(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液の輸送の間の、血液の生体外刺激のための系であって、
前記系は、装置内に少なくとも２つの温度範囲を発生させ維持するように適合されている持ち運び可能な装置を含み、
前記装置は、
内部空洞を有する断熱装置シェルであって、前記空洞が、複数の採血管を収容するような寸法である、断熱装置シェル；
前記空洞内に置かれた加熱源であって、前記加熱源は、前記装置シェル内の温度を、初期期間２５℃から４０℃の範囲の第一温度で維持するように適合されており、前記初期期間は、前記加熱源の起動後少なくとも１時間であり、前記加熱源は、前記初期期間経過後に停止するように適合されており、そして、前記維持される温度付近の温度変動が±２．５℃以内である加熱源：及び
冷却源であって、前記冷却源は、前記加熱源が稼働している初期期間において、装置内の温度を維持できるように適合されており、
前記装置内の温度を、室温より低い第二温度に、前記初期期間経過後少なくとも４時間である二次期間において、前記第二温度付近の温度変動が±５℃以内で維持するように適合されている冷却源
を含む、血液の生体外刺激のための系。
【請求項２】
前記第一温度相が、３７℃±２．５℃の維持される温度を含み、前記第二温度相は４℃±５℃の維持される温度を含む、請求項１に記載の系。
【請求項３】
抗凝血剤及び刺激剤を含む複数の採血管をさらに含む、請求項１または２に記載の系。
【請求項４】
前記刺激剤が、化学療法剤、免疫調節剤、ワクチン、アジュバント、組換タンパク質、モノクローナル抗体、レクチン、感染因子からの誘導体、アレルゲン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の系。
【請求項５】
抗凝血剤及び前記刺激剤の対応する対照溶媒を含む、第二の複数の採血管をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の系。
【請求項６】
前記採血管が、
非ガラス管；
１種以上の抗凝血剤；
１種以上の白血球刺激剤；及び
前記採血管を密封する穴あけ可能な自己気密キャップ
を含み、
前記採血管内の圧力が、前記採血管の外の圧力に比べて負である、請求項１〜５のいずれかに記載の系。
【請求項７】
前記採血管が、負圧により活性化される可視マーカーをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の系。
【請求項８】
後の検索のために、前記空洞内の温度を連続的に記録する温度記録装置をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の系。
【請求項９】
前記持ち運び可能な装置内に配置され、前記加熱装置及び前記採血管を収容するように構成された、追加の断熱容器をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の系。
【請求項１０】
前記加熱源が電池作動式であって、前記電池は、１つ以上の一次（使い捨て）電池または１つ以上の二次（再充電可能）電池を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の系。
【請求項１１】
前記加熱源が、化学反応により熱を発生させる、請求項１〜１０のいずれかに記載の系。
【請求項１２】
前記温度記録装置が電池作動式であって、前記電池は、１つ以上の一次（使い捨て）電池または１つ以上の二次（再充電可能）電池を含む、請求項８〜１１のいずれかに記載の系。
【請求項１３】
前記冷却源が、再使用可能な冷却剤を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の系。
【請求項１４】
血液試料の生体外刺激の方法であって、
装置内に制御された環境を発生させ維持できる持ち運び可能な装置であって、前記持ち運び可能な装置が、
採血管を収容するような寸法である内部空洞を有する断熱装置シェル；
電池作動式の加熱源であって、前記加熱源の起動後に、前記内部空洞内の温度を、２５℃から４０℃の範囲の温度で少なくとも１時間維持でき、前記維持される温度付近の温度変動が±２．５℃以内である加熱源；及び
前記加熱源が稼働している期間において、装置内の温度を維持できるように適合されている冷却源であって、再使用可能な冷却剤を含み、前記装置内の温度を、室温より低い第二温度に少なくとも４時間、前記第二温度付近の温度変動が±５℃以内で維持できる冷却源を含む装置中に、対象から得られた血液試料を含む採血管を置くこと；及び
前記電池作動式加熱源を起動することを含む方法。
【請求項１５】
前記血液試料を前記持ち運び可能な装置から取り出すこと、及び前記血液試料から１種以上のターゲットｍＲＮＡ又は１種以上のターゲットタンパク質を測定することを含む、前記血液試料の生体外分析をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
血液試料の生体外刺激の方法であって、
対象から得られた血液試料を含む採血管を、請求項１〜１３のいずれかに記載の血液の生体外刺激のための系中に置くこと；
前記加熱源を前記初期期間起動し、それにより前記血液試料を生体外刺激すること；
前記加熱源を停止し、それにより前記第二温度を達成すること；
及び、前記二次期間第二温度を維持すること
を含む、血液試料の生体外刺激の方法。
【請求項１７】
血液試料の生体外刺激のためのキットであって、
非ガラス管；
１種以上の抗凝血剤；
１種以上の白血球刺激剤；及び
採血管を密封する穴あけ可能な自己気密キャップ
を含む、負圧により血液を採取するための非ガラス採血管であって、
前記採血管内の圧力が、前記採血管の外の圧力に比べて負である非ガラス採血管；並びに装置内に少なくとも２つの温度相を発生させ維持できる持ち運び可能な装置であって、
複数の前記採血管を収容するような寸法の内部空洞を有する断熱装置シェル；
加熱源の起動後に、前記装置内の温度を２５℃から４０℃の温度で少なくとも１時間維持できる加熱源であって、維持される温度付近の変動が±２．５℃以内の加熱源；及び
前記加熱源が稼働している期間において、装置内の温度を維持できるように適合されている冷却源であって、前記装置内の温度を、室温より低い第二の温度で、少なくとも４時間、前記第二の温度付近の温度変動が±５℃以内で維持できる冷却源
を含む装置を含む、血液試料の生体外刺激のためのキット。
【請求項１８】
前記１種以上の白血球刺激剤が、化学療法剤、免疫調節剤、ワクチン、アジュバント、組換タンパク質、モノクローナル抗体、レクチン、感染因子からの誘導体、アレルゲン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記管が、血液試料を凍結するのに十分低い温度での保存に好適であり、前記採血管が、前記温度で構造的に安定であり、前記管は、２５℃から４０℃の温度で少なくとも１時間のインキュベーションにも好適である、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記加熱源は、タイマーにより制御されており、前記タイマーは前記初期期間経過後に前記加熱源を停止するようにプログラムされている、請求項１〜１３のいずれかに記載の系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、それぞれ２０１０年１１月４日及び２０１１年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／４１０，２２３号及び同第６１／４４３，９０７号の利益を主張する。これらの出願のそれぞれの内容は、参照により本明細書にそのまま組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の実施形態は、全般的に、装置内に制御された環境条件を発生させ維持できる持ち運び可能な装置に関する。いくつかの実施形態は、全般的に、全血の生体外処理及び刺激のための前記装置の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
分子生物学の分野の研究は、細胞の遺伝的起源及び機能活性が、そのリボ核酸（ＲＮＡ）の研究から推測できることを明らかにした。この情報は、診療において、感染症を診断し、発癌遺伝子を発現している細胞の存在を検出し、家族性の疾患を検出し、宿主側防御機構の状態を監視し、ＨＬＡ型又は本人を示す他のマーカーの決定に役立つことがある。ＲＮＡは、機能の異なる３つの形態で存在する：リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）。安定なｒＲＮＡ及びｔＲＮＡは翻訳の触媒プロセスに関与する一方で、ｍＲＮＡ分子は遺伝情報を伝達する。全ＲＮＡの約１〜５％のみがｍＲＮＡからなり、約１５％はｔＲＮＡから、８０％はｒＲＮＡからなる。
【０００４】
ｍＲＮＡは、遺伝子の発現上昇又は発現低下を定量的に観察するのに使用される場合は特に、重要な診断ツールである。ヒトの末梢血は、ｍＲＮＡ分析のための優れた臨床資源である。例えば、血中の特異的キメラｍＲＮＡの検出は異常な細胞の存在を示し、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の分子診断に利用される(Kawasaki E.S., Clark S.S., Coyne M.Y., Smith S.D., Champlin R., Witte O.N., and McCormick F.P. 1988. Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5698-5702, Pachmann K., Zhao S., Schenk T., Kantarjian H., El-Naggar A.K., Siciliano M.J., Guo J.Q., Arlinghaus R.B., and Andreeff M. 2001. Expression of bcr-abl mRNA individual chronic myelogenous leukaemia cells as determined by in situ amplification. Br. J. Haematol. 112:749-59)。微小転移癌細胞は、癌特異的ｍＲＮＡ、例えば、結腸癌には癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺癌には前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、甲状腺癌にはサイログロブリン(Wingo S.T., Ringel M.D., Anderson J.S., Patel A.D., Lukes Y.D., Djuh Y.Y., Solomon B., Nicholson D., Balducci-Silano P.L., Levine M.A., Francis G.L., and Tuttle R.M. 1999. Quantitative reverse transcription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healthy subjects. Clin. Chem. 45:785-89)、及びメラノーマにはチロシナーゼ(Pelkey T.J., Frierson H.F. Jr., and Bruns D.E.
1996. Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumors. Clin. Chem. 42:1369-81) を測定することにより、血中に検出することもできる。さらに、これらの癌特異的ｍＲＮＡのレベルは治療の後に変わることがあるので、特異的ｍＲＮＡの定量化は、治療のフォローアップの間に有用な指標を与える。
【０００５】
血液は、白血球（およそ５０００白血球／μＬ）に比べて多量の無核の赤血球（およそ
５００万細胞／μＬ）を含んでいるので、全血からの顆粒球又はリンパ球の単離は、ｍＲＮＡ分析の第一工程として通常実施される。しかし、白血球の特定のサブセットの回収は異なる試料の間で整合性がないので、単離される白血球の数は各試料に対して決定され、結果はｍＲＮＡ／血液のμＬではなく、白血球あたりのｍＲＮＡの量として表されることが多い。さらに、ｍＲＮＡの量は、非常に長い単離プロセスの間に変わりうる。
【０００６】
標準化の欠如のため、科学者集団は、遺伝子発現分析の施設間及び実験間の変動という大きな問題に直面している。最近の遺伝子増幅技術は、テンプレートＤＮＡの絶対量を与えるものの、これらの値は、ＲＮＡ回収の収率及び各試料中のｃＤＮＡ合成の効率の情報がないため、元の物質中の遺伝子の量に変換することはできない。全ＲＮＡは、ｍＲＮＡ定量の標準マーカーとして使用されることが多く、結果は、典型的には、全ＲＮＡのμｇあたりの遺伝子の量として表される。しかし、ｍＲＮＡの比率は全ＲＮＡのわずか１〜５％であり、ｍＲＮＡの体積は全ＲＮＡの量が同一の場合ですら変動するので、全ＲＮＡがｍＲＮＡを代表しないことは強調されなければならない。全ＲＮＡ又はｍＲＮＡの収率も、利用される方法により大きく変動する。ＲＮＡが抽出されると、次の工程はｃＤＮＡの合成であるが、既存の方法は各ＲＮＡテンプレートが各実験中のｃＤＮＡの単一のコピーを作り出すかどうかを示さないので、それ自体不確実性を生み出しうる。上記の問題を避けるために、ターゲット遺伝子のデータをハウスキーピング遺伝子又はｒＲＮＡのデータと比較することによる相対的定量化が広く利用されている。しかし、制御遺伝子の量は典型的には安定せず、実験中に変動することがある。さらに、各臨床検体は典型的には様々な時点で分析されるので、この変動は、臨床診断にとって重大な問題を表す。
【０００７】
全血は多量のＲＮＡアーゼ（顆粒球由来）及び無核の赤血球を含むので、典型的には、純粋なｍＲＮＡを全血から単離するのは非常に困難である。種々のＲＮＡ抽出法が全血用途に利用可能であるが(de Vries T.J., Fourkour A., Punt C.J., Ruiter D.J., and van
Muijen G.N. 2000. Analysis of melanoma cells in peripheral blood by reverse transcription-polymerase chain reaction for tyrosinase and MART-1 after mononuclear
cell collection with cell preparation tubes: a comparison with the whole blood guanidinium isothiocyanate RNA isolation method. Melanoma Research 10:119-26, Johansson M., Pisa E.K., Tormanen V., Arstrand K., and Kagedal Bl. 2000. Quantitative analysis of tyrosinase transcripts in blood. Clin. Chem. 46:921-27, Wingo S.T., Ringel M.D., Anderson J.S., Patel A.D., Lukes Y.D., Djuh Y.Y., Solomon B., Nicholson D., Balducci-Silano P.L., Levine M.A., Francis G.L., and Turtle R.M. 1999. Quantitative reverse transcription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healthy subjects. Clin. Chem. 45:785-89)、アッセイ手順は労働集約的であり、数回の遠心分離が必要であり、リボヌクレアーゼ活性を除去するのに必須である注意深い取扱いを要する。
【発明の概要】
【０００８】
（概要）
いくつかの実施形態において、血液の輸送の間の血液の生体外刺激のためのシステムであって、装置内に少なくとも２種の温度範囲を発生させ維持できる持ち運び可能な装置を含み、前記装置が、内部空洞を有する断熱装置シェル、加熱源、及び冷却源を含むシステムが本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、内部空洞は、１つ以上の採血管を収容するような寸法である。いくつかの実施形態において、加熱源は、加熱源の起動後、少なくとも１時間約２５℃から４０℃の範囲の第一温度で装置内の温度を維持でき、±２．５℃以内で維持された温度付近に温度を維持する。いくつかの実施形態において、冷却源は、室温より低い第二温度範囲で少なくとも４時間、維持される温度付近の温度変動が±５℃以内で、装置内の温度を維持できる。
【０００９】
一実施形態において、第一温度相は、３７℃±２．５℃の維持される温度を含む。一実施形態において、第二温度相は、４℃±５℃の維持される温度を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記システムは複数の採血管を含み、前記採血管は抗凝血剤及び刺激剤を含む。そのようないくつかの実施形態において、刺激剤は、化学療法剤、免疫調節剤、ワクチン、アジュバント、組換タンパク質、モノクローナル抗体、レクチン、感染因子からの誘導体、アレルゲン、及びこれらの組み合わせの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、抗凝血剤及び刺激剤の対応する対照溶媒を含む第二の複数の採血管をさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、採血管は、採血管の外の圧力と比べて負である採血管内の圧力を有する非ガラス管、１種以上の抗凝血剤、１種以上の白血球刺激剤；及び採血管を密封する穴あけ可能な自己気密キャップを含む。いくつかの実施形態において、採血管は、負圧により活性化される可視マーカーをさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、前記システムは、温度記録装置をさらに含み、前記装置は、後の検索のために空洞内の温度を連続的に記録する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記システムは、前記持ち運び可能な装置内に配置されて、加熱源及び採血管を収容するように構成された、少なくとも１つの追加の断熱容器をさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、加熱源は電池作動式である。いくつかの実施形態において、加熱源は、１つ以上の一次（使い捨て）電池で作動する。いくつかの実施形態において、加熱源は、１つ以上の二次（再充電可能）電池で作動する。他の実施形態において、加熱源は化学反応により熱を発生させる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、温度記録装置は電池作動式である。いくつかの実施形態において、温度記録装置は１つ以上の一次（使い捨て）電池で作動する。いくつかの実施形態において、温度記録装置は１つ以上の二次（再充電可能）電池で作動する。いくつかの実施形態において、冷却源は再使用可能な冷却剤を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、非ガラス管、１種以上の抗凝血剤、１種以上の白血球刺激剤、負圧により活性化する可視マーカー、及び採血管を密封する穴あけ可能な自己気密キャップを含む、負圧により血液を採取するための非ガラス採血管が提供される。いくつかの実施形態において、採血管内の圧力は、採血管の外の圧力に比べて負であり、それにより、管内の負圧に基づいて、正確な体積の血液を採取することが可能になる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、前記１種以上の白血球刺激剤は、化学療法剤、免疫調節剤、ワクチン、アジュバント、組換タンパク質、モノクローナル抗体、レクチン、感染因子からの誘導体、アレルゲン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記１種以上の抗凝血剤はヘパリンを含む。他の実施形態において、他の抗凝血剤が、ヘパリンに加えて、又はヘパリンの替わりに使用される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記管は、約２５℃から４０℃の温度で少なくとも約１時間のインキュベーションに好適である。さらに、いくつかの実施形態において、前記管は、血液試料を凍結するのに十分低い温度での保存に好適であり、前記採血管はその温度で構造的に安定である（例えば、凍結／解凍の間にひび割れたり、壊れたりしない）。
【００２０】
いくつかの実施形態において、血液試料を得る方法であって、１種以上の抗凝血剤、１種以上の白血球刺激剤、負圧により活性化する可視マーカー、及び採血管を密封する穴あけ可能な自己気密キャップを含む非ガラス採血管を、負圧の活性化された可視マーカーが存在するか調べること、前記活性化されたマーカーが存在する場合、対象の静脈システムの静脈に穴をあけること、前記自己気密キャップに穴をあけること、及び負圧が均等化されるまで又は所望の体積が採取されるまで採血管に血液を満たすことを含む方法も提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、血液試料の生体外刺激のための方法であって、上述のとおり対象から血液試料を得ること、血液試料を含む採血管を、装置内に制御された環境を発生させ維持できる持ち運び可能な装置であって、採血管を収容するような寸法の内部空洞を有する断熱装置シェル、電池作動式の加熱源、冷却源を含む持ち運び可能な装置に置くこと、及び前記電池作動式の加熱源を起動することを含む方法が提供される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記加熱源は、加熱源の起動後に、内部空洞内の温度を、約２５℃から４０℃に少なくとも１時間維持できる。いくつかの実施形態において、冷却源は再使用可能な冷却剤を含み、装置内の温度を室温より低く少なくとも４時間維持できる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、前記方法は、１種以上の抗凝血剤及び１種以上の白血球刺激剤の対照溶媒を含む第二の非ガラス採血管を、負圧の活性化されたマーカーが存在するか調べること、前記活性化されたマーカーが存在する場合、前記非ガラス採血管の自己気密キャップに穴をあけること及び対象の静脈系の穴をあけた静脈から第二の血液試料を採取すること、並びに前記第二の血液試料を含む第二の採血管を、前記持ち運び可能な装置中に置くことをさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第一及び第二の血液試料を持ち運び可能な装置から取り出すこと、及び前記第一及び第二の血液試料から１種以上のターゲットｍＲＮＡ又は１種以上のターゲットタンパク質を測定することを含む、血液試料の生体外分析をさらに含む。
【００２５】
さらに、非ガラス管、１種以上の抗凝血剤、及び１種以上の白血球刺激剤を含む採血管に、第一の血液試料を対象から採取すること、前記採血管を、上述の血液の生体外刺激のためのシステム中に置くこと、及び電子作動式の加熱源を起動し、それにより前記血液試料を生体外刺激することを含む、血液試料の生体外刺激の方法が提供される。
【００２６】
血液試料の生体外刺激のためのキットであって、非ガラス管、１種以上の抗凝血剤、１種以上の白血球刺激剤、及び採血管を密封する穴あけ可能な自己気密キャップを含む、負圧により血液を採取するための非ガラス採血管（採血管内の圧力は、採血管の外の圧力に比べて負である）、装置内に少なくとも２つの温度相を発生させ維持できる持ち運び可能な装置であって、複数の採血管を収容するような寸法の内部空洞を有する断熱装置シェル、加熱源の起動後に、装置内の温度を約２５℃から４０℃に少なくとも１時間維持できる加熱源であって、維持される温度付近の変動が±２．５℃以内の加熱源；及び
【００２７】
装置内の温度を、室温より低い第二の温度で、少なくとも４時間、第二の温度付近の温度変動が±５℃以内で維持できる冷却源を有する装置を含む、血液試料の生体外刺激のためのキットも提供される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、前記キット中の装置は、約３７℃±２．５℃の維持された温度で、第一温度相を維持する。いくつかの実施形態において、前記キット中の装置は
、約４℃±５℃の維持された温度で、第二温度相を維持する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、前記キットは、化学療法剤、免疫調節剤、ワクチン、アジュバント、組換タンパク質、モノクローナル抗体、レクチン、感染因子からの誘導体、アレルゲン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の白血球刺激剤を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、前記キットは、単独又は追加の抗凝血剤と組み合わせたヘパリンを含む１種以上の抗凝血剤を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記キットの採血管は、約２５℃から４０℃の温度で少なくとも約１時間のインキュベーションに好適である。いくつかの実施形態において、前記採血管は、血液試料を凍結するのに十分低い温度での保存に好適であり、前記採血管はその温度で構造的に安定である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、血液の輸送の間の血液の生体外刺激のためのシステムであって、装置内に制御された環境を発生させ維持できる持ち運び可能な装置であって、複数の採血管を収容するような寸法の内部空洞を有する断熱装置シェル、抗凝血剤及び刺激剤を含む複数の採血管、電池作動式加熱源、及び冷却源を含む装置を含む、血液の生体外刺激のためのシステムが提供される。いくつかの実施形態において、前記加熱源は、加熱源の起動後に、装置内の温度を、約２５℃から４０℃に、少なくとも１時間維持できる。いくつかの実施形態において、前記冷却源は再使用可能な冷却剤を含む。いくつかの実施形態において、前記冷却源は、装置内の温度を、室温より低く少なくとも４時間維持できる。いくつかの実施形態において、前記冷却源は、装置内の温度を、室温より低く、約４から２４時間維持できる。いくつかの実施形態において、前記システムは、抗凝血剤及び刺激剤の対応する対照溶媒を含む第二の複数の採血管も含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、温度記録装置をさらに含み、前記装置は、後の検索のために空洞内の温度を連続的に記録する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】いくつかに実施形態による、血液試料で満たされた１組の真空採血管を示す。
【図２】いくつかの実施形態による、保存容器又はインキュベーター中の血液の生体外刺激を示す。
【図３】いくつかの実施形態による、全血試料から白血球を単離する概略プロセスを示す。
【図４】いくつかの実施形態による、全血試料から単離された白血球の保存及び発送を示す。
【図５】いくつかの実施形態による、ｍＲＮＡアッセイを準備する工程を示す概略フローチャートである。
【図６】本明細書に記載される実施形態による、装置の内部から記録された経時的な温度のグラフである。
【図７】管に引き込まれた水の重量が、管同士で著しく異ならないことを示すことにより、負圧管を製造する再現性を示す。
【図８】管に引き込まれた水の重量が、製造後１４日の保存後に著しく異ならないことを示すことにより、製造された負圧管の保存後の安定性を示す。
【図９】確立されたマルチウェルストリップ法に比べて、製造された負圧管中で実施された刺激実験の同等な結果を示す。
【図１０】製造された負圧管及び確立されたマルチウェルストリップ法における遺伝子誘導実験の間の追加の同等な結果を示す。
【図１１】経時的な、及び刺激後の血液試料の安定性に関連する
【図１２】異なる温度での刺激及びインキュベーションの結果としての遺伝子誘導のレベルに関連するデータを示す。
【図１３】温度制御されたインキュベーターに比べて、本明細書に開示される持ち運び可能な装置中でのインキュベーションの結果としての遺伝子誘導のレベルに関連するデータを示す。
【図１４】本明細書に開示される持ち運び可能な装置中でインキュベートされた６つの個別の管から記録した温度曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（詳細な説明）
生体外血液刺激の改善された方法並びにそのような方法を達成するための装置が必要とされている。生体外刺激のいくつかの既存の方法は、採血後の条件に依存する。しかし、長期間の血液の保存は生理学的でなく、血液試料及び試験に悪影響を与えうる。さらに、ｍＲＮＡ誘導は、保存中に変化することがある。理想的には、血液は、採血後直ちに刺激すべきである。血液の取扱い、３７℃でのインキュベーション、及び白血球単離、又は刺激後の血液の−８０℃の温度での保存は、多くの場合又は場所で実際的ではない。例えば、血液が、高性能な試験所又は病院の外の場所で採取される場合、生理学的な条件下でのインキュベーション又は刺激後の血液の−８０℃の温度での保存は実際的でないことがある。
【００３５】
さらに、一貫した反復可能な全血の生体外刺激に使用できる持ち運び可能な装置の必要性も存在する。刺激された血球をインキュベートできる持ち運び可能な装置及びそれを使用する方法の必要性も存在する。刺激後の血球から白血球を単離して保存できる持ち運び可能な装置及びそれを使用する方法の必要性も存在する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、全血の生体外刺激のための方法及び装置が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される装置は持ち運び可能である。いくつかの実施形態において、前記装置は、フィールドで、例えば病院又は試験所の外の場所で使用できる。いくつかの実施形態において、前記装置は、自己制御的に、例えば、装置内の特定の所望の温度を特定の期間維持するように構成されている。いくつかの実施形態において、２つ以上の温度が時間を経て維持される（例えば、連続的に所望の温度が得られる）。いくつかの実施形態において、前記装置は、以下により詳細に記載されるとおり、全血試料の刺激、そのインキュベーション及び保存、並びに輸送に連続的に使用するのに好適である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、全血は、対象から真空採血管に採取される。比較的単純明快な遺伝子特異的プライマー及びプローブの特定及び製造により、遺伝子増幅技術は、異なる遺伝子のプールからですら、特異的ｍＲＮＡのレベルの特定及び定量を可能にし、全血をｍＲＮＡ分析の理想的な物質にする。いくつかの実施形態において、１つ以上の採血管は、血液刺激剤を含む。いくつかの実施形態において、採取された全血は、採取と同時にヘパリン処理される。いくつかの実施形態において、全血は２つ以上の採血管に採取される。刺激剤は、液体でも固体でもよい。管は、全血を撹拌してヘパリン及び／又は刺激剤との混合を促進するのに十分な方法で、振盪又は動かすことができる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、前記刺激剤は、化学療法剤、免疫調節剤、ワクチン、アジュバント、組換タンパク質、モノクローナル抗体、レクチン、又は感染因子からの誘導体を含む。いくつかの実施形態において、前記化学療法剤は、シタラビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エトポシド、アクラルビシン、又はミトキサントロンを含む。いくつかの実施形態において、組換タンパク質は、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２又はインターロイキン−１０）及びインターフェロン（例えば、
インターフェロンγ）を含む。いくつかの実施形態において、感染因子からの誘導体は、精製されたタンパク質誘導体である（例えば、ツベルクリンＰＰＤなどのＰＰＤ）。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、チモサン、腫瘍壊死因子などの他の刺激剤も使用される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、血液が管に採取された後、血液は、全血の刺激を促進する条件下でインキュベートされる。好ましい実施形態において、血液は生理学的な条件下でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、約３７℃の温度が利用されて、生理学的条件が刺激される。いくつかの実施形態において、約３０℃から約３３℃、約３３℃から約３５℃、約３５℃から３７℃、又は約３７℃から約３９℃の温度が利用される。いくつかの実施形態において、試料は生理学的な温度に維持され、約３０分から約１時間、約１時間から約２時間、約２時間から約３時間、約３時間から約４時間、及びこれらの重複する範囲を含む約３０分から約４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、４時間より長くなりうる（例えば、４から６時間、６から８時間、８から１０時間、１０〜１２時間、１２〜２４時間、及びこれらの重複する範囲）。
【００４０】
いくつかの実施形態において、試料は、１つ以上の管を加熱できる熱源を有する保存容器又はインキュベーターに置かれる。好ましくは、保存容器又はインキュベーター中の熱源は、血液試料に生理学的条件（例えば、およそ生理学的温度）を維持できる。いくつかの実施形態において、前記熱源は、約３０分から１時間、約１時間から約２時間、約２時間から約３時間、約３時間から約４時間、及びこれらの重複する範囲を含む約３０分から約４時間の間、血液管に生理学的条件を維持できる。いくつかの実施形態において、インキュベーション時間は、４時間より長い（例えば、約６〜８時間又は８時間から一晩）。いくつかの実施形態において、前記熱源は加熱パッドを含む。いくつかの実施形態において、前記加熱パッド（又は他の加熱装置）は電池で作動して、熱を与える。いくつかの実施形態において、所望のインキュベーション期間の後にヒーターの電源が切れるように、タイマーがヒーターの作動時間を制御する。いくつかの実施形態において、ペルチェ熱源が使用される。いくつかの実施形態において、自己内蔵型(self-contained）燃焼燃料装置が使用されて熱が発生する。いくつかの実施形態において、加熱装置は、発熱化学反応又はプロセスにより熱を与えることができる（例えば、「スマックパック(smack-pack）」)。いくつかの実施形態において、水ジャケットが使用され、インキュベーターの内部を、所望のインキュベーション又は保存の温度に加熱（又は冷却）するために、所望の温度の水がインキュベーターの壁の中を循環する。いくつかの実施形態において、断熱材（装置全体の内部に）が使用されて、管が熱源の近傍に置かれ、経時的なインキュベーション温度の安定性を向上させる。加熱源と同様に、いくつかの実施形態において、冷却源は電池作動式でよいが、化学反応に基づいていてもよい（例えば、尿素、硫酸アンモニウム、及び水）。冷却システムは、スターリングクーラー（ＦＰＳＣ）などの発電機様装置又はペルチェクーラーなどの電気装置を任意に含んでよい。いくつかの実施形態において、自己内蔵型再使用可能なアイスパックが使用される。いくつかの実施形態において、冷却システムは、装置内の温度を、少なくとも２４時間維持する（例えば、持ち運び可能な装置の輸送の間）。いくつかの実施形態において、冷却システムは、装置内の温度を、約２４から約７２時間維持できる。いくつかの実施形態において、この期間は、加熱源が稼働している場合のインキュベーション期間を含む。したがって、いくつかの実施形態において、採血管は、加熱源が稼働している間に生理学的温度でインキュベートされ、次いで加熱源が切れると、採血管は、輸送プロセスの間により低い温度で保存される（例えば、ｍＲＮＡを安定化するため）。
【００４１】
いくつかの実施形態において、保存容器又はインキュベーターは、血液試料管中に生理学的条件を維持しながら、病院又は試験所に輸送又は発送されるように構成されている（例えば、装置の発送は、血液試料の刺激及びその後の冷却と同時である）。いくつかの実
施形態において、血液試料は、保存容器又はインキュベーターから取り出され、約−８０℃の温度に冷却され、後の処理及び試験まで保存される。いくつかの実施形態において、インキュベーターを保存容器に変えるため、インキュベーターは保存容器と兼用になり、使用者がインキュベーターの配置を変える（例えば、加熱パッドを除き、アイスパックを設置する）。しかし、いくつかの実施形態において、別々のインキュベーター及び保存容器が使用される。
【００４２】
さらに追加の実施形態において、単一の装置が、インキュベーター、保存容器、及び発送容器として機能する。例えば、いくつかの実施形態において、加熱源及び冷却源を含む単一の断熱装置（例えば、容器）が提供される。いくつかの実施形態において、前記装置は、装置内の温度履歴の分析を可能にする温度記録装置をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記装置は、採血用の管を任意に備える。そのような実施形態において、管は、本明細書に記載のものなどの所望の刺激剤を任意に含む。そのため、所望の期間生理学的温度での刺激剤による血液試料の刺激（例えば、インキュベーション）を可能にし、それに続いて、刺激された血液試料のより低い温度（例えば、室温以下の温度）でのある期間のインキュベーションを可能にして、上記のそれぞれが、遺伝子発現分析の場所への装置の発送の間に起こる、単一の装置が提供される。そのような温度での刺激の後のｍＲＮＡの安定性は確立されている。ｍＲＮＡの安定性にもかかわらず、温度記録装置は、適正な刺激条件に曝露されていなかった（例えば、低すぎる又は高すぎる温度、短い又は長いインキュベーション時間など）試料が特定でき廃棄できる、ある程度の品質管理を提供する。
【００４３】
そのような装置は、採血試験所による使用に特に有利である。生体外刺激を実施する際の試験所同士の変動を避けるため、本明細書に開示されるものなどの装置が提供され、多数の試験所にわたる制御され反復可能な生体外刺激を可能にする。試験所は、最初に、患者から血液試料を得るだろう。いくつかの実施形態において、血液は標準的な採血管に採取されるが、好ましい実施形態において、血液は、所望の刺激剤（又は対照溶媒）を含む、試験所に供給された管に直接採取される。いくつかの実施形態において、採血は、任意に管内の真空に基づき実施され、それにより採取される体積による変動を低減する。刺激剤を含む管への採取の後、管は装置内に置かれ、熱源及び冷却源が作動される。いくつかの実施形態において、熱源及び冷却源は装置と一体化しており、いくつかの実施形態においては、使用者が作動された源を装置内に配置する。いくつかの実施形態において、温度記録装置が任意に作動されて、装置内に配置されるが、他の実施形態においては、温度記録装置は装置と一体化している。最後に、試験所は、装置を密封し、その後の遺伝発現分析のための中心位置に発送できる。そのような実施形態において、標準的なゴム管キャップが使用される。刺激及び単離が試験所で実施されることになっている他の実施形態において、以下により詳細に記載されるとおり、単離マトリックス（isolation matrix）を含む特殊なキャップが使用される。
【００４４】
本明細書に記載されるとおり、前記装置は、装置内の環境に断熱効果を与える材料で構成されている（例えば、ポリスチレンフォーム、ファイバーグラスなど）。そのため、加熱源及び冷却源と組み合わせると、装置は、所望の温度で所望の期間、装置内（例えば、血液を含む管が置かれている所）の温度を維持するように機能する。いくつかの実施形態において、維持されている温度プロファイルは、およそ生理学的温度での初期期間（例えば、血液試料の刺激のため）で始まり、それに続いて、より低い温度の二次期間（例えば、ｍＲＮＡ刺激後の安定化のため）がある。例えば、図６を参照されたい。ｍＲＮＡの刺激及び関連する誘導の後、低い温度（加熱源により与えられる生理学的温度に対して）は、誘導されたｍＲＮＡを長期間維持するのに十分である（試料を長期間保存できる中央試験所に装置を発送するのに十分である）ことを認識されたい。
【００４５】
替わりとなる実施形態において、白血球は、血液試料の現場での刺激の後、現場で単離されることがある。インキュベーションの後、血液試料を含む管は、インキュベーターから取り出すことができる。採血管のキャップは外され、白血球捕捉膜を含むキャップと替えることができる。いくつかの白血球濾過膜が層になっていて、捕捉される白血球の収率を上げることができる。いくつかの実施形態において、白血球捕捉膜は、キャップが試料管に結合すると白血球膜が血液試料に面する（例えば、並列する）ようにキャップに配置されている。いくつかの実施形態において、白血球捕捉膜を含むキャップは、水分吸着材料及び前記吸着材料を外すために開くことができる蓋も含む。いくつかの実施形態において、白血球膜は、キャップの近位の端部にあり、水分吸着材料はキャップの遠位の端部にある。いくつかの実施形態において、前記白血球捕捉膜は、ロイコソーブ(leukosorb）又は白血球の捕捉に好適な他の類似の繊維若しくはガラスマトリックスを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、白血球は、試料管を反転させ、重力により試料物質を膜に通すことにより捕捉できる。他の実施形態において、遠心分離、真空、陽圧、又は他の類似の活性手段が利用されて、試料物質を膜に通して動かす。水分吸着材料は、血液試料から水及び他の物質、例えば赤血球を吸着するが、白血球は、キャップ内の濾過膜に捕捉され保持される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、保存容器又はインキュベーターを使用して、白血球単離後の試料の保存、輸送、及び／又は発送ができる。上記で議論されたとおり、いくつかの実施形態において、保存容器又はインキュベーターは、試料を冷却又は加熱して、発送及び保存の間の所望の条件を維持できる。いくつかの実施形態において、周囲条件が保存容器に利用される。いくつかの実施形態において、第二の「スマックパック」又は他の冷却若しくは発熱機構が利用され、所望の保存温度を作り出す（例えば、多重温度プロファイル）。
【００４８】
いくつかの実施形態において、白血球が血液試料から単離された後で、ｍＲＮＡアッセイが準備される。ｍＲＮＡアッセイは、白血球を細胞溶解に付してｍＲＮＡを含む溶解物をつくり、前記溶解物をＧＥＮＥＰＬＡＴＥに移してｍＲＮＡを捕捉し、ｍＲＮＡを定量化することにより準備できる。いくつかの実施形態において、単離はフィールドで実施され、次いで分析のために凍結される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換はフィールドで実施され（例えば、試験所の外）、次いで、後の増殖分析（又は他の種々の遺伝子発現分析）のために凍結される。
【００４９】
白血球捕捉キャップを有する管を使用するいくつかの実施形態において、白血球捕捉膜を含むキャップは採血管から外される。いくつかの実施形態において、次いで、キャップの蓋が開けられ、水分吸着材料が除かれるが、これは廃棄してよい（又は再使用されるか、かつ／又は追加の分析に使用される）。次いで、新しい管を、白血球捕捉膜及び白血球を含むキャップに接続できる。水分吸着材料を除くのに利用した蓋に通して、溶解バッファーを管に加えることができる。濾過膜に捕らえられた白血球は、溶解バッファーの使用により溶解し、白血球からｍＲＮＡが放出される。溶解物のジーンプレート(geneplate）又は追加の採血管への移動は、遠心分離、真空吸引、陽圧、又はエタノールによる洗浄とそれに次ぐ真空吸引により達成できる。ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡの産生及びＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅により定量化される。特に好ましい実施形態は、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを利用してｍＲＮＡを定量化する。
【００５０】
いくつかの実施形態に使用できる溶解バッファーの組成に関するさらなる詳細は、２００６年３月１５日に出願された米国特許出願第１１／３７６，０１８号に見いだされるが、これは現在係属中であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡはｍＲＮＡから合成される。好ましい実施形態において、次
いで、ｃＤＮＡは、特定の望まれる遺伝子（例えば、確立された、又は推定される疾病マーカー）の増幅のために特別に設計されたプライマーによりリアルタイムＰＣＲを利用して増幅される。いくつかの実施形態において利用されるＰＣＲ反応に関するさらなる詳細も、米国特許出願第１１／３７６，０１８号に見いだされる。全血球からのｍＲＮＡの定量化に関するさらなる詳細は、２００４年３月９日に出願され、現在米国特許第７，７４５，１８０号として発行されている米国特許出願第１０／７９６，２９８号に見いだすことができるが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５１】
ＰＣＲ反応の完了後、１つ以上の遺伝子（例えば、疾病マーカー）のｍＲＮＡ（検出されたＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの量により表される）は定量化される。特定の実施形態において、定量化は、１つ以上のマーカーをコードするｍＲＮＡの量を基準値と比較することにより計算される。他の実施形態において、基準値は、刺激剤により誘導されない遺伝子、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。当分野に周知であるハウスキーピング遺伝子を、基準値として使用することもできる。他の実施形態において、ハウスキーピング遺伝子は補正係数として使用され、根本的な比較は、誘導されない（対照）試料由来の１つ以上のマーカーに比べた、同じマーカーの誘導された発現レベルである。さらに他の実施形態において、基準値は零であり、１つ以上のマーカーの定量化は絶対数により表される。いくつかの実施形態において、１つ以上の攻撃免疫マーカー(offensive immune marker)の発現を１つ以上の防御免疫マーカー(defensive immune marker)に比較する比がなされる。さらに他の実施形態において、標準化は全く行われない。
【００５２】
特定の実施形態において、本明細書に開示される装置のいずれかの組み合わせを含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、前記キットは、ヘパリンを含む真空採血管、ヘパリン及び刺激剤を含む真空採血管、及び真空採血管を生理学的温度に少なくとも３０分間維持できる加熱パッド（又は他の熱源）を含む。いくつかの実施形態において、前記キットは、１つ以上の真空採血管を保存及び発送できる保存容器を含む。いくつかの実施形態において、前記キットは、白血球膜及び水分吸着材料を含むキャップを含む。
【実施例】
【００５３】
具体的な実施形態は、限定的でなく説明的な意味にみなすべき下記の実施例に関連して説明される。
（実施例１−生体外血液刺激）
【００５４】
図１〜５は、いくつかの実施形態による、採血、試料の処理、処理された血液試料に対するｍＲＮＡアッセイの実施のための方法及び装置を示す。図１に示されるとおり、管Ａ及びＢは、全血球で満たされる前に、両方ともヘパリンを含む。他の実施形態において、ヘパリン（又は他の抗凝血剤）は、手作業で管に加えられることがある。管Ａは、刺激剤を全く含まないので対照として使用される。管Ｂは乾燥した刺激剤を含む。上述のとおり、いくつかの実施形態において、追加の刺激剤を含む刺激剤は、手作業で加えられる。血液を試料管に採取し、次いで管を振盪又は撹拌して、ヘパリン及び／又は刺激剤を、採取した血液と確実に混合させる。
【００５５】
次に、図２に示されるとおり、使い捨てインキュベーターを使用して、図１の血液試料をインキュベートする。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、生理学的条件下で実施される。いくつかの実施形態において、約３７℃の温度が利用される。使い捨てインキュベーターは、試料を２〜４時間加熱できる加熱パッドを有する。他の実施形態において、インキュベーションの時間及び／又は温度は、所望のとおり増加又は減少させることができる。
【００５６】
次に、図３に示されるとおり、刺激された血液試料をインキュベーターから取り出す。
管のキャップを除き、白血球膜及び吸着材料を含むキャップと替える。キャップが管に取り付けられると、白血球膜は管中の血液に近くなる。次に、インキュベーションの後、管を反転させ、それにより血液を白血球膜と接触させる。重力（又は、実施形態によっては他の力、例えば真空）は、血液試料の濾過を助ける。白血球は膜上に捕捉され、水分吸着材料は白血球膜を通る物質（例えば、血漿、赤血球など）を捕捉する。次に、２つの試料管を、所望の条件（例えば、保存用に−８０℃）のインキュベーターに戻す。図４に示されるとおり、次いで、インキュベーターを使用して、試料を保存又は発送する。
【００５７】
図５に示されるとおり、試料管は、ｍＲＮＡアッセイの準備のさらなる工程を受けることができる。白血球濾過膜及び水分吸着材料を含むキャップを、管から外す。次いで、水分吸着材料をキャップの蓋から外す。次いで、濾過された白血球を含む白血球濾材を、きれいな試料管に取り付ける。次に、溶解バッファーを、キャップの蓋に通して加え、白血球を処理する。次いで、管を回転又は遠心分離して、溶解物を管の底部に回収し、ＧＥＮＥＰＬＡＴＥ又は他の回収容器（複数可）に移す。次いで、溶解物中のターゲットＲＮＡの量を、ＰＣＲ及び当分野に公知である他の方法により決定する。
（実施例２−採血管製造及び試験）
【００５８】
多くの場合、採血管はガラスでできているが、製造時の欠陥、温度の変動への曝露、又は手荒な取扱いにより壊れることがある。血液試料が採取されるのは患者の健康状態を評価する目的であることが多いと仮定すると、血液試料は、病原体、化学物質、又は血液試料を採取及び／若しくは分析する個体（複数可）にとって危険性を示す他の物質を含みうる。したがって、いくつかの実施形態において、管の破損及び作業員が患者の血液試料に意図せず曝露するリスクを低減する非ガラス採血管が提供される。本明細書に開示されるものなどの非ガラス採血管は、採取された血液試料を−７０℃より低温で凍結保存できるので（例えば、刺激プロトコルの後に）、従来のガラス管に比べて有利であるが、最終的な分析に先立つ解凍プロセスの間に破損するリスクが少しある。いくつかの実施形態において、非ガラス管はポリプロピレンを含む。他の実施形態において、ポリスチレン管が使用される。さらに追加の実施形態において、管内の負圧の発生（及び維持）及び１つ以上の凍結解凍サイクルに十分耐える他のポリマー管又はプラスチック管が使用される。
【００５９】
多くの採血管は、血液を患者（又は別な採血装置）から採血管に流させる負の内圧（外的環境に対して）を有することにより作用する。これにより、患者にあまり不快感を与えずに血液が採取可能であるだけでなく、血液が患者の静脈系に逆流することも防ぐ。
【００６０】
負の内圧を有する非ガラス（例えば、プラスチック）管を製造する再現性を決定するため、自己気密性で穴あけ可能なキャップを有するプラスチック管を、負の内圧を有するように手作業で作成した。３つの管を、４つの実験のそれぞれで作成した（合計１２個の管）。一端が水に浸かっている２１ゲージ針を使用してキャップに穴をあけ、負圧により水を管の中に引き込んだ。次いで、各組の管の重量を秤量した。図７に示されるとおり、実験の間で管の平均重量に著しい差はなく、そのような採血管の製造に再現性があることを示している。
【００６１】
試料採取に関する再現性に加えて、管内の負圧の維持及び管自体の耐久性に関する十分な貯蔵寿命を管が有することが重要である。したがって、追加の管を、上述のとおり準備した。次いで、それらを室温で０〜１４日間保存した。上述のとおり、２１ゲージ針を使用して、水を採取し、管を秤量した。図８は重量を示し、２日間保存又は製造後すぐの使用に比べて、管を１４日間保存した場合、管内の負圧が異ならなかったことを示す。
（実施例３−製造された採血管とマルチウェルストリップとの比較）
【００６２】
非ガラス採血管の製造の再現性を確認した後、下記の実験を実施して、そのような採血
管が、より従来の生体外血液刺激法（例えば、少量の血液をウェルに配置し、個別に刺激剤を加える）と同様に十分良好に作用するかを評価した。
【００６３】
採血管を、上述のとおり製造した。３つの管を、４℃（図９のＰＨＡ  ４Ｃ＃１、＃２、及び＃３）又は室温（図９のＰＨＡ  ＲＴ）で２０日間保存した。次いで、血液を、６つの管：対照ヘパリン管、普通のヘパリン管、４つのＰＨＡ含有管に採取した。対照ヘパリン管の血液を、マイクロプレートチューブストリップ（それぞれ３ウェル、６０μｌ血液／ウェル）中で（ＰＢＳ又はＰＨＡにより）刺激した。残りの５つの管を３７℃で４時間インキュベートした。種々のｍＲＮＡを、既報のとおり(Mitsuhashi M et al. Clin. Chem. 52:634-642, 2006)、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲを利用して定量化した。
【００６４】
簡単に述べると、９６ウェルフィルタープレートを、白血球低減膜(leukocyte reduction membranes)(Leukosorb; Pall)と組み合わせ、オリゴ（ｄＴ）固定化回収プレートの上に置いた。１５０μＬの５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）をアプライして、濾過膜を濡らした。１２０ｇで、４℃で１分間遠心分離してＴｒｉｓ溶液を膜から除去した後、５０μＬの刺激された全血試料を各ウェルにアプライし、直ちに１２０ｇで、４℃で２分間遠心分離した。次いで、ウェルを、３００μＬのリン酸緩衝食塩水で１回洗浄した。２０００ｇで、４℃で５分間遠心分離してリン酸緩衝食塩水を除去した後、６０μＬのストック溶解バッファー[５ｇ／ＬのＮ−ラウロイルサルコシン、４×標準クエン酸緩衝液、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１ｍＬ／ＬのＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（ＮＰ−４０の代替）、１．７９ｍｏｌ／Ｌのグアニジンチオシアン酸塩（全てＳｉｇｍａ製）］に、１０ｍＬ／Ｌの２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、０．５ｇ／ＬのプロテイナーゼＫ（Ｐｉｅｒｃｅ）、０．１ｇ／Ｌのサケ精子ＤＮＡ（５  Ｐｒｉｍｅ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ／Ｂｒｉｎｋｍａｎ）、０．１ｇ／Ｌの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、５ｎｍｏｌ／Ｌの特異的リバースプライマーのそれぞれ、及び１０１０分子／Ｌの合成ＲＮＡ３４（外部対照として）を補ったものを、フィルタープレートの各ウェルに加えた。次いで、プレートを３７℃で１０分間インキュベートし、オリゴ（ｄＴ）固定化回収マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ；ＲＮＡｔｕｒｅ）の上に置き、２０００ｇで、４℃で５分間遠心分離した。４℃で一晩保存した後、マイクロプレートを、１００μＬの普通の溶解バッファーで３回、次いで１５０μＬの４℃の洗浄バッファー［０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ］で３回洗浄した。
【００６５】
１×逆転写バッファー［５０ｍＭのＫＣ１、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｎＬ／μＬのＴｗｅｅｎ２０］、１．２５ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ；プライマーなし）を含む３０μＬのバッファーを加え、３７℃で２時間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡを各ウェル中で直接合成した。各３０μＬの反応物から、４μＬのｃＤＮＡを３８４ウェルのＰＣＲプレートに直接移し、５μＬのＴａｑＭａｎユニバーサルマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＬの５μΜの各ｍＲＮＡ又はβアクチンのフォワード若しくはリバースプライマーのそれぞれを加えた。ＰＣＲを、９５℃で１０分間を１サイクル、次いで９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６０℃で１分間を４５サイクル、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。各遺伝子を、別々のウェルで増幅した。サイクル閾値（Ｃｔ）、すなわち、特定量のＰＣＲ産物（蛍光に基づく）が生じるサイクルは、分析ソフトウェア（ＳＤＳ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により決定した。ΔＣｔは、ＰＢＳ処理対照試料の各ＣｔからＰＨＡ処理試料の各Ｃｔを引くことにより決定し、増加倍率は、２＾−ΔＣｔにより計算した。
【００６６】
図９Ａ〜９Ｄに示されるとおり、採血管は、対照反応に対して同等の結果を示す（例えば、ＰＢＳストリップと普通の真空管を比較されたい）。また、室温で保存されたＰＨＡ含有管と４℃で保存されたものとの間に差違は全く検出されなかった。最後に、試験した遺伝子の全てで（βアクチン、インターフェロンγ、インターロイキン２、及びＧＭ−ＣＳＦ）、マルチウェルストリップフォーマットで実施したＰＨＡ刺激と、ＰＨＡ含有採血管内で実施したものとの間で差違は全く検出されなかった。これらの結果は、採血管内の血液の刺激が、マルチウェルストリップフォーマット中での刺激の実施と等しく信頼性があり再現性があることを示す。
【００６７】
追加の実験を実施して、血液試料の採取と試料の刺激との間の遅れの効果を決定した。血液を、上述のとおり製造した４つのヘパリン含有真空管に採取した（３つの普通の管及び１つのインターフェロンα２ｂ、ＩＦＮａ２ｂを含む管）。血液を採取した直後、普通の管１つとＩＦＮａ２ｂ管を、３７℃のインキュベーターに２時間置いた。追加の普通の管を、直ちに、マルチウェルストリップチューブに等分し、ＰＢＳ又はＩＦＮａ２ｂ（それぞれ３ウェル、６０μＬ血液／ウェル）により３７℃で２時間刺激した。インキュベーション後、各管を−８０℃で保存した。最後の普通の管を４℃で６時間保存し、次いでＩＦＮａ２ｂによる刺激のためにマルチウェルストリップに等分した。図１０Ａ〜１０Ｃに示されているとおり、ＩＦＮａ２ｂ管の性能（白三角）は、従来のストリップウェル中のＩＦＮａ２ｂ刺激の性能（白丸）と同一であった。対照的に、最初に生体外刺激の前に４℃で６時間保存した血液は、ＧＩＰ２及びＣＸＣＬ１０（黒四角）に関してＩＦＮａ２ｂによる誘導が少ないことが示された。実際、βアクチンのレベルが低下しているので、そのインキュベーションの間にｍＲＮＡの分解があったかもしれない（図１０Ａ）。
（実施例４−刺激後の血液試料の安定性）
【００６８】
刺激後の試料の安定性を評価するために、血液を、ＤＮＲ（最終濃度１０μＭ）、ＡｒａＣ（最終濃度１００μΜ）、又はＰＢＳにより、ストリップウェル中３７℃で４時間刺激し、次いで４℃で０〜３日間保存した。４℃のインキュベーションの後、試料を−８０℃の冷凍機で、分析まで保存した。これらの実験条件は、本明細書に記載される持ち運び可能なインキュベーション装置中での輸送の間に試料が曝されるだろう、可能性のある条件を表すように設計する。３種のｍＲＮＡ（ＡＣＴＢ、ｐ２１、及びＰＵＭＡ)を、上述のとおり定量化した。
【００６９】
図１１Ａ〜１１Ｂに示されるとおり、βアクチンはどの薬剤にも誘導されず（白い印はＰＢＳ対照であり、黒い印はＤＮＲ又はＡｒａＣ刺激である）、βアクチンｍＲＮＡのレベルは３日にわたって比較的安定であった。図１１Ａは、ＤＮＲがｐ２１に著しい誘導を誘導したことを示す（白い三角と黒い三角の間の矢印）。類似の結果が、ＡｒａＣ刺激でも得られた（図１１Ｂ）。同様に、どちらの薬剤もＰＵＭＡ発現を誘導した。刺激後の１日の保存の後、ｐ２１及びＰＵＭＡの発現レベルは、０日のものに類似であった。しかし、刺激後の３日間の保存後に、ｐ２１及びＰＵＭＡの両方のレベルは、両刺激剤に関して低下したようである（より高いＣｔ値）。刺激後１日でやはり明らかな上昇がある。したがって、これらの結果は、いくつかの実施形態において、刺激後の２日間の保存が可能であることを示す。しかし、いくつかの実施形態において、刺激後の血液は、４℃で１日間保存できる。
【００７０】
誘導の時間経過を、２つの異なるインキュベーション温度で評価した。これは、試料がインキュベーション温度に曝されるがそれでも信頼性があり一貫した遺伝子発現データを提供できる時間を評価するものである。血液を、ＰＨＡ、ＩＦＮａ２ｂ、又はＰＢＳ（三連で）により、ストリップウェル中で、３７℃又は４２℃で、０〜９時間刺激し、次いで−８０℃で凍結保存した。これらの温度は、本明細書に開示される持ち運び可能なインキュベーション及び保存装置のいくつかの実施形態において使用される小型の持ち運び可能
なヒーターの操作範囲を表す。ＡＣＴＢ、ＩＬ２、及びＣＸＣＬ９  ｍＲＮＡを定量化した。
【００７１】
図１２Ａ及び１２Ｄに示されるとおり、４０℃又は３７℃のいずれかでの血液試料のインキュベーションは、刺激剤にかかわらず、βアクチンの発現を変えなかった。図１２Ｂ及び１２Ｅは、ＰＨＡを含むインキュベーションによるＩＬ−２  ｍＲＮＡの誘導が、４２℃で実施されようと３７℃で実施されようと類似であることを示す。さらに、１時間と９時間の刺激の間の任意の点で実施されると、発現レベルは類似である。同様に、図１２Ｃ及び１２Ｆにおいて、ＣＸＣＬ−９は、インキュベーション温度又はインキュベーションの期間にかかわらず、インターフェロンにより類似の程度誘導された。このため、いくつかの実施形態において、利用される刺激条件の点で、多大な柔軟性が存在する。これにより、１時間のインキュベーションに対して９時間のインキュベーション期間においては、より長い距離が網羅されうるので、幅広い地点からの試料の発送が可能になる。また、いくつかの実施形態において、幅広い範囲のインキュベーション時間があるとすれば、利用される加熱装置の種類の選択肢が広がるので、この柔軟性は加熱要素の選択において有利である。
【００７２】
図１３Ａ及び１３Ｂは、ＰＨＡ又はＩＦＮαにより刺激され、本明細書に開示された持ち運び可能な装置又は制御されたインキュベーター（種々の温度で）でインキュベートされた場合のＩＬ２又はＣＸＣＬ９の誘導のレベルの比較を表す。示されるとおり、ＩＬ２及びＣＸＣＬ９誘導の両方とも、制御されたインキュベーターに対して持ち運び可能な装置を使用してインキュベートした場合、著しく異なってはいなかった。これは、やはり、血液試料の生体外刺激を実施するのに利用できる温度及び時間（上記に開示されるとおり）における柔軟性の程度を表す。
【００７３】
図１４は、それぞれ６つの採血管の１つに装填され、電池作動式熱源に接続した銅の箱に配置された、６つの温度記録装置から記録した温度プロファイルを表す。銅の箱は、２つのブルーアイスパックと共に、上述の持ち運び可能な装置中に配置した。これらのデータは、ブルーアイスの存在下ですら、銅の箱内の温度は、熱源の結果として、４０℃に２時間維持されたことを表す。熱源がきれると、温度は２℃に下がり、１６時間まで維持された。管同士のはっきり分かる変動は全くなく、銅の箱内の試料管の位置がインキュベーション温度に影響しないことを示す。
【００７４】
本発明の範囲から逸脱することなく、上述の装置及び方法に、種々の省略、追加、及び修正が可能であることが、当業者には認識されるだろうが、そのような修正及び変更の全ては、添付される請求項により定義される本発明の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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