(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して０．５〜５０倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得、次いで前記マッシュルーム破砕物を加熱することにより、殺菌を行うと共に、マッシュルームの組織を部分的に分解し、マッシュルーム破砕加熱物を得る工程；
（３）前記マッシュルーム破砕加熱物を、４０〜１２１℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る工程；および、
（６−１）前記マッシュルーム抽出物を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかけて、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの含有率を向上させる工程；を有する、
５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを含むエキスの製造方法。
【請求項２】
（２）前記（１）の工程に記載のマッシュルーム破砕加熱物を、４０〜６０℃の温度でセルラーゼまたはヘミセルラーゼを用いて酵素処理を行い、マッシュルーム破砕酵素処理物を得る工程；をさらに有し
前記（３）の工程に記載のマッシュルーム破砕加熱物の代わりに、前記マッシュルーム破砕酵素処理物の熱水抽出を行う、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
（１）マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して０．５〜５０倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得、次いで前記マッシュルーム破砕物を加熱することにより、殺菌を行うと共に、マッシュルームの組織を部分的に分解し、マッシュルーム破砕加熱物を得る工程；
（２）前記マッシュルーム破砕加熱物を、４０〜６０℃の温度でセルラーゼまたはヘミセルラーゼを用いて酵素処理を行い、マッシュルーム破砕酵素処理物を得る工程；
（３）前記マッシュルーム破砕酵素処理物を、４０〜１２１℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る工程；および、
（６−１）前記マッシュルーム抽出物を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかける工程；を有し、
前記（１）または（２）の工程のいずれかにおいて、マッシュルーム破砕物のｐＨが３〜６になるように、酸を添加する工程を有する、
５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マッシュルームから、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（以下、「ＭＴＡ」とも称する）を含むエキスを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、暮らしが豊かになったことによる飽食、および高脂肪食摂取への食生活の欧米化、また社会環境の変化による肉体労働の減少、それに伴う運動量の減少、そしてストレスが引き金の一つとされる暴飲暴食により、現代人は肥満になりやすい状態にある。
【０００３】
肥満は増加の一途を辿っており、ＷＨＯ（世界保健機関）は肥満に関わる糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化、脂肪肝などの生活習慣病に対するリスクの増大に対して世界各国に警告を発している。肥満による内臓脂肪の蓄積が元となって、糖代謝異常（糖尿病）、脂質代謝異常（高脂血症）、高血圧などの動脈硬化の危険因子が複数重なった状態をメタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）という。
【０００４】
メタボリックシンドロームは、日本では、平成１６年の国民健康・栄養調査において、該当者は、９４０万人いると推計され、予備軍も合わせると１，９６０万人にのぼり、とりわけ４０歳から７４歳の中年男性に多く、その４分の１を占めている。平成２０年４月からは、医療保険者（国保・被用者保険）において、４０歳以上の被保険者・被扶養者を対象とする、内蔵脂肪型肥満に着目した検診および保健指導の事業実施が義務付けられるなど、国をあげて対策に取り組んでいる。
【０００５】
メタボリックシンドロームにおいて、糖尿病を例にすると、原因の一つにインスリン抵抗性（グルコース代謝の異常）が挙げられる。インスリン抵抗性とは、インスリンの作用効果が低下している状態である。インスリン抵抗性は、肥満体の人に比較的多く見られる。基礎代謝を上回る栄養分が継続的に細胞に取り込まれると脂肪細胞が肥大化し、インスリンの働きを向上させる物質（アディポネクチン）の分泌量が減る一方、インスリンの働きを阻害する物質（ＴＮＡ−αや遊離脂肪酸）が多く分泌されるようになる。その結果、インスリンの作用効果が低下していくことにより、やがて糖尿病を疾患しうる。このインスリン抵抗性を改善する治療薬の成分として、チアゾリジン誘導体が知られている（例えば、特許文献１）。該治療薬の作用機序は、該誘導体が核内受容体であるＰＰＡＲγに結合し、ＰＰＡＲγの活性を上昇させ、前駆脂肪細胞を肥大化していない正常な脂肪細胞に分化誘導すると同時に、肥大化した脂肪細胞のアポトーシスを誘導する。分化した脂肪細胞は、アディポネクチンを積極的に分泌するため、糖および脂質代謝が活発になり、血液中からの糖の取り込みが促進され、インスリン抵抗性を改善する。このような脂肪細胞の働きで糖尿病のみならず、高脂血症の予防に繋がることになる。このような効果は、薬用ニンジンに含まれるサポニンでも確認されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献１によるように、合成化合物を使用する場合には、人体に対して有害な副作用を引き起こす可能性があり、食品のように日常的に摂取することは難しい。このため、人体に対して有害な副作用を生じさせることなく、優れた分化促進効果を発揮する物質の開発が待望されている。
【０００７】
このような問題をかんがみて、経口での摂取が可能な食品由来の抽出物であって脂肪細胞への分化を促進する効果を有するものの研究がなされている。例えば、アブラナ科植物のスプラウト由来の組成物（例えば、特許文献２）、グルカゴン分泌亢進作用を有するアミノ酸類の少なくとも１種、キサンチン誘導体の少なくとも１種、イソフラボン類の少なくとも１種、およびカルニチン類もしくはカルニチン前駆体の少なくとも１種を含有してなるメタボリックシンドロームの予防、改善または治療組成物（例えば、特許文献３）などが報告されている。特許文献２の組成物は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有し、糖尿病や関連疾患の進行防止や改善に期待できる。また、特許文献３の組成物は、生体内における脂肪の合成を抑制し、脂肪の分解を促進し、さらには効果的に脂肪を燃焼する作用を有する。
【０００８】
本発明者らは、上記したような経口での摂取が可能な食素材について、前駆脂肪細胞を脂肪細胞へと分化促進させる活性を広範にスクリーニングした。その結果、マッシュルームの抽出物にＰＰＡＲγ活性化能があり、前駆脂肪細胞を脂肪細胞へと分化促進させる活性があることを見出した（特許文献４）。この際、従来は、マッシュルームを水抽出、特に熱水抽出することによって、ＰＰＡＲγ活性化能を有するマッシュルーム抽出物を得ていた。
【０００９】
他方で、本発明者らは、従来の熱水抽出に、殺菌（前殺菌）をかねての加熱（煮沸）操作および植物組織崩壊酵素であるセルラーゼまたはヘミセルラーゼを所定のｐＨで作用させる酵素処理操作を組み合わせることで、抽出効率を上げることができることを見出している（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平８−１４３５５６号公報
【特許文献２】特開２００７−７０２７１号公報
【特許文献３】特開２００８−２９１００２号公報
【特許文献４】特開２００９−２６３３４４号公報
【特許文献５】特開２０１０−２２０５２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、従来のいずれの文献においても、マッシュルームの抽出物のどの成分がＰＰＡＲγ活性化能を有するかが特定されていなかった。一方で、さらに効率よく分化を促進する有効成分を効率よく抽出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行った。その結果、マッシュルームの抽出物中の５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンという成分が、ＰＰＡＲγ活性を有する有効成分であることを見出した。
【００１３】
そこで、本発明者らは、（１）マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して０．５〜５０倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得、次いで前記マッシュルーム破砕物を加熱することにより、殺菌を行うと共に、マッシュルームの組織を部分的に分解し、マッシュルーム破砕加熱物を得る工程；および、（３）前記マッシュルーム破砕加熱物を、４０〜１２１℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る工程；を有する、製造方法を用いることにより、より効率的に、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを含むエキスを抽出することに成功した。さらには、前記マッシュルーム抽出物を、合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかけることによって、より効率的に、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを抽出することに成功した。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＰＰＡＲγ活性化能を有する有効成分である、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを含むエキスを、マッシュルームから効率的に抽出することができる。また、マッシュルーム中の有効成分が、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンであることを特定したことによって、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの投与量（薬効）などを調節することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＰＰＡＲγ活性化能の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜本発明の第１＞
本発明の第１は、（１）マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して０．５〜５０倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得、次いで前記マッシュルーム破砕物を加熱することにより、殺菌を行うと共に、マッシュルームの組織を部分的に分解し、マッシュルーム破砕加熱物を得る工程；および、（３）前記マッシュルーム破砕加熱物を、４０〜１２１℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る工程；を有する、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを含むエキスの製造方法である。
【００１７】
本発明者らは、マッシュルーム中の有効成分が、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンであることを特定し、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに、高いＰＰＡＲγ活性化能があることを見出した。高いＰＰＡＲγ活性化能は、前駆脂肪細胞を脂肪細胞へと分化促進させる活性に優れる。ここで、「ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）」とは、ステロイド受容体スーパーファミリーに属する核内受容体タンパク質であり、現在までにα，γ，δの三つのサブタイプが報告されている。このうち、ＰＰＡＲαは、肝臓、膵臓、骨格筋に多く発現し、脂肪酸燃焼を調節し、ＰＰＡＲγは、脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしている。ＰＰＡＲγの活性が上昇すると、前駆脂肪細胞を肥大化していない正常な脂肪細胞に分化誘導すると同時に、肥大化した脂肪細胞のアポトーシスを誘導する。分化した脂肪細胞は、アディポネクチンを積極的に分泌するため、糖および脂質代謝が活発になり、血液中からの糖の取り込みが促進され、インスリン抵抗性を改善する。このような脂肪細胞の働きで糖尿病のみならず、高脂血症の予防に繋がることになる。
【００１８】
本発明によれば、マッシュルーム中の有効成分が、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンであることを特定したことによって、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの投与量（薬効）などを調節することができる。したがって、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンとしての脂肪細胞分化誘導促進物質の投与量などを適宜調節することによって、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進を目的とする医薬品、食品等（食品、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、または、病者用食品）などへの利用への期待がさらに高まる。
【００１９】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２０】
１．工程（１）
本工程では、マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して０．５〜５０倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得る。
【００２１】
本発明で用いられるマッシュルームは、生物学的分類でいえば、ハラタケ科（Ａｇａｒｉｃａｃｅａｅ）ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）に属するＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓまたはＡｇａｒｉｃｕｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓと表される。
【００２２】
品種に関しては、特に限定されることなく、ホワイト種、オフホワイト種、クリーム種、ブラウン種、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ種などが例示され、いずれも好ましく使用することができる。
【００２３】
また、前記マッシュルームの利用可能な部位についても特に限定されることはなく、傘、ひだ、管孔、柄、肉、つば、つぼ、石突き、グレバ等よりなる部位から選択される一種以上が挙げられる。すなわち、一部位を単独で用いてもよく、また、複数の部位を混合して用いてもよい。
【００２４】
さらに、マッシュルームは、生、乾燥、冷凍、凍結乾燥したもののいずれであっても好ましく使用される。
【００２５】
使用するマッシュルームは、そのままでも使用することができるが、水洗することが好ましい。水洗することによりマッシュルームに付着した不純物を取り除くことができ、抽出物の純度を向上させることができる。このような場合には、マッシュルームの水洗後、マッシュルームを乾燥してもよい。
【００２６】
本工程では、マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して、０．５〜５０倍の質量の水を加え、破砕し、マッシュルーム破砕物を得る。上記水の添加量は、上記範囲であれば特に制限されないが、マッシュルームの状態によって適宜調節されることが好ましい。例えば、マッシュルームを生や冷凍状態で使用する場合には、マッシュルームは水をある程度含んでいる。このため、このような場合には、水は比較的少量添加すれば十分であり、具体的には、水を、マッシュルームの質量に対して、０．５〜１０倍の質量で、より好ましくは１〜５倍の質量で、添加することが好ましい。また、マッシュルームを乾燥物や凍結乾燥物の形態で使用する場合には、マッシュルームは水を少量しか含んでいないあるいはほとんど含んでいない。このため、このような場合には、水を、生や冷凍状態で使用する場合に比して、比較的多量添加する必要があり、具体的には、水を、マッシュルームの質量に対して、５〜５０倍の質量で、より好ましくは１０〜３０倍の質量で、添加することが好ましい。このような範囲であれば、マッシュルームを効率よく破砕できる。なお、本明細書において、「マッシュルームの質量に対して」とは、工程（１）の出発原料であるマッシュルームの質量を基準とすることを意味する。
【００２７】
また、本工程で使用される水は、特に制限されず、水道水、蒸留水、純水、イオン交換水など、いずれを使用してもよい。
【００２８】
また、本工程の破砕は、特に制限されず、公知の方法によって行われる。例えば、ブレンダー、石臼式破砕機、ローラーミル、カッターミル、ボールミル、ジェットミル、ハンマーミル等の破砕機を使用できる。または、マッシュルームを予め上記したような粉砕機を用いて機械的処理して、マッシュルームの粗片を得た後、当該粗片をさらに超音波による破砕を行うことによって、マッシュルーム破砕物を得てもよい。後者の場合に機械的処理されるマッシュルームは、１０μｍ以下程度の大きさになるように破砕されることが好ましい。超音波破砕条件は、マッシュルームが適度な大きさになるような条件であれば特に制限されないが、５〜２０分間、処理することが好ましい。本工程で得られるマッシュルーム破砕物の大きさは、特に制限されない。好ましくは、マッシュルーム破砕物の大きさが、０．００１〜２ｍｍ、より好ましくは０．００５〜１ｍｍ程度である。このような大きさであれば、好ましい実施形態において行われうる、後の工程（２）で酵素処理が効率よく行われ、さらに工程（３）での熱水抽出操作による５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの抽出効率の向上が期待できる。
【００２９】
上記操作において、加熱処理や酵素処理等の効率の向上を目的として、破砕後に、必要であれば、さらに水を添加してもよい。この際、水の添加量は、特に制限されず、所望の効果によって適宜選択される。好ましくは、工程（１）中、マッシュルームに添加される水の全量が、マッシュルームの質量に対して上記範囲となるような量である。
【００３０】
次に、得られたマッシュルーム破砕物を加熱（殺菌）する。マッシュルームには、多数の微生物が付着しているため、殺菌処理を行わないと、好ましい実施形態である、次工程（２）において、これら微生物が増殖し、微生物そのものあるいは微生物からの分泌物が次工程（２）における酵素処理を阻害する可能性がある。また、次工程（２）もしくは（３）において繁殖した微生物が抽出成分を資化する、もしくは食品としては好ましくない毒素等を分泌する可能性があるため、このような加熱（殺菌）操作により、マッシュルームに付着している細菌の繁殖を以降の製造工程において防ぐことができる。また、マッシュルーム破砕物の組織（例えば、細胞壁）を更に部分的に熱分解することもできるため、得られるマッシュルーム破砕加熱物は、好ましい実施形態である、次の工程（２）で酵素処理を受けやすくなり、その結果、工程（３）での抽出効率を上げることができる。
【００３１】
マッシュルーム破砕物の加熱条件は、上記したような効果が達成できるような条件であれば、特に制限されない。例えば、マッシュルーム破砕物を、８０〜１２１℃で５〜６０分間、加熱することが好ましく、８０〜１２１℃で１０〜３０分間、加熱することがより好ましい。
【００３２】
２．工程（２）
本発明の好ましい実施形態によれば、工程（２）において、上記工程（１）で得られたマッシュルーム破砕加熱物を、４０〜６０℃程度まで冷却後、セルラーゼまたはヘミセルラーゼを添加して酵素処理し、マッシュルーム破砕酵素処理物を得る。酵素処理を行うことにより、マッシュルームの細胞壁を分解し、細胞から５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを効率よく放出させて、工程（３）による抽出効率を向上することが可能となる。
【００３３】
ここで、セルラーゼまたはヘミセルラーゼは、植物組織崩壊酵素である。また、セルラーゼ及びヘミセルラーゼは、一方を単独で使用してもあるいは双方を組み合わせて使用してもよい。ここで、セルラーゼやヘミセルラーゼは、セルラーゼ活性やヘミセルラーゼ活性を有するいずれの源由来であってもよく、特に制限されない。例えば、Aspergillus niger、Trichoderma reesei、Trichoderma viride、Trichoderma longibrachiatum、Streptomyces lividans、Bacillus subtilis、Pyrococcus horikoshii、Clostridium thermocellum、Humicola、Pyrococcus horikoshii等の細菌由来；アワビ、エゾボラ、ヒメエゾボラ、エゾバイ、サザエ、タマキビ等の巻き貝、二枚貝等の貝由来；マツノザイセンチュウ等の線虫由来；ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）、タカサゴシロアリ（Nasutitermes takasagoensis）、イエシロアリ（Coptotermes formosanus）および豪州産イエシロアリ近縁種（C. acinaciformis）等のシロアリ由来などが挙げられる。また、セルラーゼやヘミセルラーゼは、上記適当な源から公知の方法によって製造してもよいが、市販品を使用してもよい。セルラーゼの市販品としては、例えば、セルラーゼ Ａ「アマノ」３、セルラーゼ Ｔ「アマノ」４（いずれも天野エンザイム（株）製）；スペザイム ＣＰ、ＧＣ２２０、マルチフェクト ＣＬ、プリマファースト、インディエイジ、インディエイジ ニュートラ、アクセレラーゼ、オプチマッシュ、マルチフェクトＣＸ１０Ｌ、オプチマーゼＣＸ４０Ｌ、ピュラダックス ＨＡ（いずれもジェネンコア協和（株）製）；ＧＯＤＯ−ＴＣＦ、ＧＯＤＯ−ＴＣＬ、ＧＯＤＯ ＴＣＤ−Ｈ３（いずれも合同酒精（株）製）；ソフィターゲン・Ｃ−１（タイショーテクノス（株）製）；超耐熱性セルラーゼ（（株）耐熱性酵素研究所製）；セルライザー、セルラーゼ ＸＬ−５２２、セルチーム Ｃ、セルライザー ＨＴ コンク、セルラーゼ ＳＳ、セルラーゼ ＸＬ−５３１（いずれもナガセケムテックス（株）製）；ベイクザイム ＸＥ（日本シイベルヘグナー（株）製）；セルソフト、デニマックス、ケアザイム、セルザイム、セルクラスト（いずれもノボザイムズジャパン（株）製）；セルロシン ＡＣ４０、セルロシン ＡＬ、セルロシンＴ３、セルロシンＴＦ（Ａ飼料）（いずれもエイチビイアイ（株）製）；セルラーゼ ”オノズカ” ３Ｓ、セルラーゼＹ−ＮＣ、パンセラーゼ ｂｒ（いずれもヤクルト薬品工業（株）製）；ＣｅｌｌＳＥＢ Ｔｓ（（株）樋口商会製）；スミチームＡＣ、スミチームＣ（いずれも新日本化学工業（株）製）；スクラーゼ Ｃ（三菱化学フーズ（株）製）；エンチロンＣＭ、エンチロンＭＣＨ、バイオヒット、バイオスター、フェドラーゼ（いずれも洛東化成工業（株）製）などが挙げられる。また、ヘミセルラーゼの市販品としては、例えば、ヘミセルラーゼ 「アマノ」９０（天野エンザイム（株）製）；ベイクザイム ＨＳ２０００、ベイクザイム ｌ Ｃｏｎｃ（いずれも日本シイベルヘグナー（株）製）；エンチロンＬＱ（洛東化成工業（株）製）などが挙げられる。なお、上記セルラーゼまたはヘミセルラーゼは、上記に限定されるものではない。また、上記セルラーゼまたはヘミセルラーゼは、それぞれ、単独で使用されてももしくは２種以上を組み合わせて使用されてもよく、またはセルラーゼとヘミセルラーゼとを適宜組��合わせて使用してもよい。
【００３４】
また、上記セルラーゼまたはヘミセルラーゼの添加量は、上記工程（１）で得られたマッシュルーム破砕加熱物を十分酵素処理できる量であれば特に制限されず、また、使用する酵素の種類などによって適宜選択できる。例えば、セルラーゼまたはヘミセルラーゼの添加量は、工程（１）の出発原料であるマッシュルームの質量に対して、０．０１〜１０質量％であることが好ましく、０．０２〜５質量％であることがより好ましい。このような範囲であれば、マッシュルーム破砕加熱物を十分酵素処理できる。なお、酵素処理中は、マッシュルーム破砕加熱物と酵素（セルラーゼやヘミセルラーゼ）とが均一にかつ十分混合できるように、攪拌機等で混合することが好ましい。
【００３５】
酵素処理条件もまた、上記工程（１）で得られたマッシュルーム破砕加熱物を十分酵素処理できる条件であれば特に制限されない。例えば、酵素処理温度は、３０〜６０℃、より好ましくは３５〜５５℃の範囲が好ましく、酵素処理時間は、０．１〜１６時間、より好ましくは１〜８時間の範囲が好ましい。なお、２種以上の酵素を併用する場合には、同時に添加して酵素処理を行っても、あるいは各酵素を単独で使用して酵素処理を繰り返し行ってもよい。このうち、各酵素の至適条件が異なる場合には、後者の処理を行うことが好ましい。なお、酵素処理を繰り返し行う場合には、各酵素処理間にも酵素失活処理を行うことが好ましい。
【００３６】
３．工程（３）
本工程では、前記（１）で得られたマッシュルーム破砕加熱物または前記（２）で得られたマッシュルーム破砕酵素処理物を、４０〜１２１℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る。当該工程によって、マッシュルーム破砕酵素処理物から、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを高い効率で抽出することができる。
【００３７】
本工程において、熱水抽出条件は、マッシュルーム破砕加熱物またはマッシュルーム破砕酵素処理物から５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを効率よく抽出できる条件であれば特に制限されない。前述したように、工程（１）において、水を添加しているため、本工程で別途水を添加しなくとも、マッシュルーム破砕酵素処理物を十分熱水抽出できる。しかし、本工程において、水を別途添加してもよく、このような場合の水の添加量は、特に制限されないが、通常、マッシュルーム破砕加熱物またはマッシュルーム破砕酵素処理物の質量に対して、１．５〜３倍の質量の水を加えることもできる。
【００３８】
また、熱水抽出温度は、４０〜１２１℃であり、好ましくは４０〜９０℃である。ここで、熱水抽出温度が４０℃未満であると、水の温度が低すぎて、抽出効率が十分でなく、逆に、１２１℃を超えると、温度が高すぎて、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンが分解する可能性がある。また、熱水抽出時間は、１〜１６時間、より好ましくは１〜８時間の範囲であることが好ましい。上記抽出操作中は、マッシュルーム破砕加熱物またはマッシュルーム破砕酵素処理物を攪拌していてもよい。攪拌により、熱がマッシュルーム破砕加熱物またはマッシュルーム破砕酵素処理物に均一にいきわたり、熱水抽出が均等に行える。なお、上記抽出工程は、１回行ってもよいが、抽出効率が低い場合には、２回以上、繰り返し行ってもよい。なお、１００℃超にするためには、適宜、加圧するなどして行えばよい。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記（１）または（２）の工程のいずれかにおいて、マッシュルーム破砕物またはマッシュルーム破砕加熱物のｐＨが３〜６になるように、酸を添加することが好ましい。本明細書中では、簡略して、「酸は、マッシュルーム破砕物に添加される」と一括して記載することもある。
【００４０】
このように酸の添加によりマッシュルーム、マッシュルーム破砕物、マッシュルーム破砕加熱物またはマッシュルーム破砕酵素処理物のｐＨを酵素が作用しやすいｐＨにすることで、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンのマッシュルーム破砕加熱物からの抽出効率を更に高めることができる。ここで、酸の添加（ｐＨ調整）時期は、上記工程（１）または工程（２）の工程いずれかにおいてなされればよい。具体的には、（ア）破砕を行う前に酸をマッシュルームに添加する；（イ）破砕後加熱を行う前に酸をマッシュルーム破砕物に添加する；（ウ）工程（１）終了後酵素処理前に酸をマッシュルーム破砕加熱物に添加する；（エ）工程（２）終了後工程（３）開始前に酸をマッシュルーム破砕酵素処理物に添加する、などが挙げられる。上記（ア）〜（エ）は、単独で実施されてもあるいは２種以上を組み合わせて実施されてもよい。
【００４１】
当該ｐＨ調整工程において、好ましくは、マッシュルーム破砕物またはマッシュルーム破砕加熱物のｐＨが３〜６、より好ましくは３．５〜５．５になるように酸が添加される。このようなｐＨ範囲であると、酵素の活性が高まり５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンのマッシュルーム破砕加熱物からの抽出効率を更により高めることができる。
【００４２】
ここで、酸としては、マッシュルーム破砕物またはマッシュルーム破砕加熱物のｐＨを所定のレベルに調節して５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの抽出効率を高められるものであれば特に制限されず、無機酸または有機酸のいずれも使用されうる。具体的には、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸、フッ化水素酸等の無機酸；およびリンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、酢酸、フマル酸、フタル酸、グルコン酸、アジピン酸、食酢、ギ酸、シュウ酸、安息香酸、パラトルエンスルホン酸等の有機酸などが挙げられる。これらのうち、安全性、ｐＨの調節しやすさ、などを考慮すると、有機酸が好ましく使用される。また、例えば、医薬品、食品（健康食品）または飲料（健康飲料）に使用される場合には、安全性などを考慮して、食品添加物として認められているものが好ましい。この点を考慮すると、食品添加物として認められている塩酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、酢酸、フマル酸、フタル酸、グルコン酸、アジピン酸、食酢等が好ましい。リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、酢酸、フマル酸、フタル酸、グルコン酸、アジピン酸、食酢等がより好ましい。この際、酸は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。また、酸は、ｐＨ調整を目的として、そのままの形態で添加されてもよいが、水溶液等の他の形態で添加されてよい。後者の場合、溶液中の酸濃度は、マッシュルーム破砕物／マッシュルーム破砕加熱物のｐＨを所定のレベルに調節できる濃度であれば特に制限されず、取り扱いのしやすさ、酸の種類などによって適宜調節されうる。
【００４３】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記工程（３）後に、前記工程（３）で得られたマッシュルーム抽出物を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかけて、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの含有率を向上させる工程（工程（６−１））；をさらに有する。
【００４４】
本発明のさらに別の好ましい実施形態によれば、上記工程（３）後に、前記工程（３）で得られたマッシュルーム抽出物をさらに遠心分離または濾過して、残渣を分離して、抽出液を得る（工程（４））。（４）で得られた抽出液を濃縮して、濃縮液を得（工程（５））、かかる濃縮液を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかけて、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの含有率を向上させる（工程（６−１））。
【００４５】
以下、工程（３）、工程（４）、工程（５）、工程（６−１）の順で経る方法について詳説するが、工程（３）から直接工程（６−１）を行ってもよいし、あるいは、工程（３）、工程（４）、工程（６−１）の順で経てもよい（つまり、工程（４）の抽出液を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかけて、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの含有率を向上させてもよい）。また、工程（６−１）の後に、工程（６−２）、工程（７）、工程（８）を経てもよい。
【００４６】
４．工程（４）
遠心分離条件は、水不溶性部分を分離できる条件であれば特に制限されない。具体的には、マッシュルーム抽出物を、４〜５０℃で、３０００〜１２０００ｒｐｍ、５〜３０分間、遠心分離することが好ましく、４〜３０℃で、４０００〜１００００ｒｐｍ、５分〜３０分間、遠心分離することがより好ましい。
【００４７】
濾過操作は、水不溶性部分を分離できれば特に制限されず、公知の方法が採用できる。例えば、濾紙、ミクロフィルターなどが使用される。また、上記フィルターの孔径は、有効成分は残しつつ水不溶性部分を分離できれば特に制限されない。具体的には、フィルターの孔径は、好ましくは０．１〜５μｍ、より好ましくは０．２〜３μｍである。
【００４８】
なお、上記遠心分離または濾過操作は、それぞれ、１回行われてももしくは２回以上繰り返し行われてもよく、または上記遠心分離及び濾過操作を適宜組み合わせて行ってもよい。また、繰り返し行う場合には、各操作条件は、それぞれ、同一であってもあるいは異なる条件であってもよい。
【００４９】
上記工程（３）後に、さらに、前記（４）で得られた抽出液を濃縮して、濃縮液を得る（工程（５））ことが好ましい。
【００５０】
５．工程（５）
濃縮方法は、特に制限されず、減圧濃縮、限外濾過、真空濃縮、凍結濃縮、膜濃縮等、公知の方法が使用できる。また、濃縮条件は、特に制限されないが、通常、８０℃以下、より好ましくは３０〜７０℃で、濃縮装置により減圧下濃縮することが好ましい。また、濃縮後の液量もまた、特に制限されず、使用する状況により適当な質量とすればよい。
【００５１】
なお、濃縮液中のＭＴＡの含有量を測定するために、かかる濃縮液を凍結乾燥させてエキス末とした場合、かかるエキス末１ｇ中のＭＴＡの含有量（μｇ）は、好ましくは１０〜２５０μｇ、より好ましくは３０〜２００μｇ、さらに好ましくは５０〜１５０μｇの範囲である。
【００５２】
６．１．工程（６−１）
前記濃縮液を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかけて、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの含有率を向上させる。このようにすることによって、高い含有率を有するＭＴＡエキスを得る。以下、工程（６−１）の好ましい態様を説明する。
【００５３】
前記濃縮液は、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンのさらなる含有率の向上という観点からは、逆相カラムクロマトグラフィーでも処理されることにより精製されることが好ましいが、かかる処理前又は後に（好ましくは処理前に）、合成吸着樹脂処理に供することが特に望ましい。合成吸着樹脂の使用方法としては、処理する液中に樹脂を直接投入して攪拌、接触させるバッチ方式と、樹脂を充填したカラムに液を通液する方式が知られているが、一般的にはカラムを用いる方法がよく用いられている。
【００５４】
本工程の好ましい形態によれば、カラムに、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと、不純物とを含む前記濃縮液を通液し、先ず樹脂に５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン成分を吸着させる。その後、水もしくは低濃度のアルコール水溶液（１）（好ましくは濃度１０〜５５体積％、より好ましくは２０〜５０体積％）または水および低濃度のアルコール水溶液（１）の双方で樹脂を洗浄して親水性の不純物を溶出させ、その後、３０〜６０体積％のメタノール水溶液で５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン成分（溶出画分）を回収する方法が好ましい。なお、本明細書中に記載の「アルコール」は、メタノール、エタノールまたはプロパノールが好ましい。
【００５５】
かかる合成吸着樹脂は、特に限定されないが、例えば、比表面積が約３００〜約１５００ｍ２／ｇ程度、最頻度半径が２０〜７００Å程度の無極性の多孔質吸着樹脂が好ましい。このような合成吸着剤の具体例としては、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ、ＨＰ２０、ＨＰ２１等のＨＰ樹脂、セパピーズ（登録商標）ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ２０７等のＳＰ樹脂（以上、三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６（以上、ローム  アンド  ハース社製）等のスチレン−ジビニルベンゼン系樹脂；ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２ＭＧ（三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ−７、ＸＡＤ−８（以上、ローム  アンド  ハース社製）等のアクリル系樹脂などが挙げられる。
【００５６】
精製処理の際の合成吸着樹脂への５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン成分を含む溶液の通過速度は特に限定されない。通過速度が速いほど単位時間当たりの処理量を確保できるが、有効成分のロスが多くなったり精製が不十分となったりする場合がある。また、通過速度が遅いほど、有効成分と不純物との分離性を向上させることができるが、逆に単位時間当たりの処理量が低下する。従って、通過速度としては、ＳＶ値が通常０．１以上、中でも０．５以上が好ましく、また、通常１０以下、中でも５以下が好ましい。
【００５７】
このようにして得られた５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン成分を含む溶液（溶出画分）は、そのままの形態で使用しても良いが、保存時の安定性や流通時・使用時の取り扱いの容易性の観点から、好ましくは濃縮又は乾燥粉末化した形態とした上で使用することが好ましい。濃縮又は乾燥粉末化の方法は、上記工程（５）で述べた方法を必要に応じ適宜組み合わせて適用することができる。
【００５８】
このようにして得られた濃縮乾燥粉末をアルコール水溶液（２）（好ましくは濃度１０〜８０体積％、より好ましくは２０〜６０体積％）に溶解する。この際、必要に応じ、ボルテックスなどで攪拌を行えばよい。このようにして得られた濃縮乾燥粉末のアルコール水溶液は、より含有率を高めた５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを得たい場合は、このまま逆相カラムクロマトグラフィーで処理して精製してもよいが、好ましくは、不純物をさらに除去することが好ましい。不純物を除去する方法も特に制限はなく、遠心分離を用いる場合の、遠心分離条件は、水不溶性部分を分離できる条件であれば特に制限されない。具体的には、０〜３５℃で、５０００〜２００００ｒｐｍ、５〜３０分間、遠心分離することが好ましく、０〜２５℃で、５０００〜１５０００ｒｐｍ、５〜２０分間、遠心分離することがより好ましい。
【００５９】
なお、溶出画分中のＭＴＡの含有量を測定するために、かかる溶出画分を凍結乾燥させて、溶出画分エキス末とした場合、かかる溶出画分エキス末１ｇ中のＭＴＡの含有量（μｇ）は、好ましくは５０〜２５００μｇであり、より好ましくは、１６０〜２５００μｇである。
【００６０】
６．２．工程（６−２）
逆相カラムクロマトグラフィーは、移動相に、水、メタノール、アセトニトリル等の極性を有する溶出溶媒を用い、固定相に、オクタデシル基等を化学結合した無極性の充鎮剤を用いたカラムクロマトグラフィーのことであり、移動相より固定相に溶け易い成分ほど遅く溶出するため、極性の大きいものほど早く溶出する。
【００６１】
逆相カラムクロマトグラフィーを用いてアルコール水溶液（２）（アルコール水溶液の溶解画分）から有効成分を抽出する方法は、従来公知の知見を参照し、あるいは組み合わせて適用することができる。充填するシリカゲルの形状にも、特に制限はなく、破砕形状、立方体形状、円柱形状、円錐形状、三角錐形、状雲形形状、星型形状、球状などが挙げられるが、中でも、球状のものが好ましく用いられ、特には、全多孔性球状シリカゲルが好ましい。また、シリカゲルの粒径にも特に制限はないが、抽出効率の観点から、３０〜２００μｍ程度が好ましく、１００〜１５０μｍ程度が好ましい。シリカゲルの平均細孔径に関しても特に制限はないが、抽出効率の観点から、１００〜１４０Å程度が好ましい。また、シリカゲルの比表面積についても特に制限はないが、抽出効率の観点から、２００〜４００ｍ２／ｇ程度が好ましい。化学結合基は、上記のように、オクタデシル基であることが好ましく、残存シラノール基を有しているとよい。かような固定相として、特に、ナカライテスク株式会社のコスモシール（登録商標）Ｃ１８−ＯＰＮを使用することが好ましい。コスモシールＣ１８−ＯＰＮ  充填剤は、Ｃ１８型充填剤の外側表面を親水性化し、極性の高い展開溶媒との親和性を向上させ、かつ充填剤の細孔内部のオクタデシル基の疎水性によって、疎水性相互作用による逆相分配型の分離を達成させる浸水型の逆相充填剤である。
【００６２】
本工程における好ましい形態によれば、一般的なクロマト管に、オクタデシル基等を化学結合した無極性の充鎮剤を充填し、展開溶媒で洗浄を行う。次いで、上記のアルコール水溶液の溶解画分を添加し、分離を行う。展開溶媒としては、アルコール水溶液を用いることが好ましく、ＴＬＣなどを適宜活用しながら、有効成分が含まれる活性画分を得る。この際のアルコール水溶液に関しては、適宜濃度を変えながら抽出することが好ましい。本発明の有効成分は、１０〜８０体積％のアルコール水溶液を用いる際に、活性画分を効率よく得ることができる。
【００６３】
上記工程（６−２）まで経ることによって、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを単離することができる。
【００６４】
上記工程（６−１）あるいは（６−２）後に、溶出画分または活性画分を８０℃以上で滅菌して、滅菌抽出液を得る（工程（７））ことが好ましい。このような操作により、安全性が確保され、医薬品、食品（健康食品）または飲料（健康飲料）などに好適に使用される。
【００６５】
７．工程（７）
滅菌条件は、８０℃以上であれば、十分、滅菌できるが、好ましくは８０〜１２１℃、より好ましくは９０〜１２１℃の温度で、好ましくは１０〜６０分間、より好ましくは１０〜３０分間、滅菌する。このような温度および時間範囲であれば、濃縮液中の有効成分の活性は維持しつつ、滅菌を十分行うことができる。なお、上記滅菌操作は、１回行われてもあるいは２回以上繰り返し行われてもよく、また、繰り返し行う場合には、各操作条件は、同一であってもあるいは異なる条件であってもよい。
【００６６】
上記工程（７）後に、さらに、前記工程（７）で得られた滅菌抽出液を乾燥する（工程（８））ことが好ましい。当該工程（８）によって得られた乾燥粉末は、水が存在しないため、保存（貯蔵）安定性に優れ、また、軽質量であるため、運搬などにも便利である。
【００６７】
８．工程（８）
滅菌抽出液の乾燥方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、凍結乾燥、スプレードライ乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、蒸気乾燥、バレル乾燥、スピン乾燥、吸引乾燥、赤外線乾燥、対流伝熱乾燥、気流乾燥、流動層乾燥、加熱水蒸気乾燥、回転ドラム乾燥、マイクロ波乾燥、超臨界乾燥等の方法によって、滅菌抽出液を乾燥粉末化することもできる。
【００６８】
本発明の製造方法を適用することによって、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを含むエキスを、マッシュルームから効率的に抽出することができる。このように効率的に抽出した５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを含むエキスを、食品等、あるいは、医薬品に適用する際に、含有量をどの程度にするのかが適切であるかの判断が容易となる。特に、本発明においては、マッシュルーム（天然物）を出発原料とするが、含有される有効成分の量のバラツキに関らず、その判断を容易とすることができる。
【００６９】
このように、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンとしての脂肪細胞分化誘導促進物質の投与量などを適宜調節することができるようになったことによって、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進を目的とする、食品等、あるいは、医薬品などへの利用への期待がさらに高まる。
【００７０】
さらに、本発明の好ましい実施形態においては、天然物を出発原料とし、さらに、食品等での安全性に問題のある溶媒、条件などを使用していないため、得られる有効成分（５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン）は、医薬品、食品（健康食品）または飲料（健康飲料に、そのままの形態（濃縮・乾燥した粉末形態）で、あるいは上記形態を適宜加工し、使用することができる。つまり、既知の合成ルートで合成するような場合とは異なり、安全性の問題を大きく低減することができる。要するに、既知の合成ルートで合成した場合、不純物を完全に除去することができずに、下記本発明の第２または第３に適用した場合、安全性に問題が残る。本発明によれば、天然物であるマッシュルームを出発物質としているので、仮に、ＭＴＡ以外の不純物が残ったとしても、それはマッシュルーム由来であるため、安全性に問題がない。
【００７１】
＜本発明の第２＞
本発明の第２は、本発明の第１の製造方法によって製造された５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを含むエキスを有効成分（以下、単に「本発明のエキス」とも称する）として含有する、医薬品である。本発明の第２の医薬品としては、インスリン抵抗性に起因する疾病に対する予防剤若しくは治療剤であれば特に制限させることはなく、例えば、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症、アルツハイマー（特開２００８−２８５４３８号公報  参照）などに対する予防剤または治療剤などが挙げられる。
【００７２】
本発明の第２の医薬品としては、本発明のエキスを単体で、または製薬上許容される担体と配合した、または製薬上許容される溶剤に溶解もしくは懸濁した組成物として、治療の施行前または施行中、または施行後に、経口的または非経口的に患者に投与される。
【００７３】
本剤を経口投与用とする場合には、本発明のエキスを単体で、または適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルロースカルシウム、カルボシキメチルセルロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤または希釈剤等と適宜混合して、錠剤、粉剤、乳剤、懸濁剤、液剤、散剤（粉末）、丸剤、および顆粒剤等の固形製剤にすることができる。また、硬質または軟質のゼラチンカプセル等を用いてカプセル剤としてもよい。これらの固形製剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート、メタアクリレートコポリマー等の被覆用基剤（コーティング剤）を用いて腸溶性被覆（腸溶性コーティング）を施してもよい。さらに、本発明のエキスを、精製水、生理食塩水等の一般的に用いられる不活性希釈剤に溶解して、必要に応じて、この溶液に浸潤剤、乳化剤、分散助剤、界面活性剤、甘味料、フレーバー、芳香物質等を適宜添加することにより、シロップ剤、エリキシル剤等の液状製剤とすることもできる。
【００７４】
また、非経口投与用とする場合には、本発明のエキスを精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理的食塩水、リンガー溶液（リンゲル液）、ロック溶液等の生理的塩類溶液、エタノール、グリセリン及び慣用される界面活性剤等と適当に組み合わせた滅菌された水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソームまたはエマルジョンとして、好ましくは注射用滅菌水溶液として、静脈内、皮下、筋肉内等に投与する形態とする。この際、液状製剤は、生理学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨを有することが好ましい。また、ローション剤、懸濁剤、乳剤等の液状製剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏等の半固形製剤、散剤、粉剤（粉状）もしくは用時溶解（液状）して塗布するための顆粒剤等の固形製剤として、または貼付剤などの外用剤として、標的部位およびその周辺部位に経皮的に投与してもよい。さらに、ペレットによる埋め込み、または坐薬用基剤を用いた坐薬として投与されることも可能である。上述したうち、好ましい製剤や投与形態等は、担当の医師によって選択される。前記医薬品のローション剤、クリーム剤及び軟膏などの半固形製剤は、前記医薬品を、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤及び懸濁化剤などよりなる群から選択される一種以上と適宜混和することにより得られる。
【００７５】
本発明の第２の医薬品に含まれる、本発明のエキスの濃度は、投与形態、疾病の種類や重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、一般的には、医薬品の原料の全質量に対して、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン換算で、０．０１〜８０質量％、好ましくは０．１〜６０質量％である。特に、本発明の製剤が経口投与される場合には、医薬品の原料の全質量に対して、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン換算で、０．００１〜１００質量％、好ましくは０．０１〜１００質量％であり、非経口投与される場合には、医薬品の原料の全質量に対して、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン換算で、０．０１〜８０質量％、好ましくは０．１〜６０質量％であることが好ましい。
【００７６】
本発明の第２の医薬品に含まれる、本発明のエキスの用量は、患者の年齢、体重及び症状、目的とする投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって異なり、正確な量は医師により決定されるものであるが、通常、経口、非経口投与ともに、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの投与量換算で、毎回０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量の範囲である。より好ましくは、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの投与量換算で、毎回０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量の範囲である。
【００７７】
＜本発明の第３＞
本発明の第３は、本発明のエキスを含む、食品である。
【００７８】
本発明の第３において、「食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が経口摂取可能な形態のものであれば特に制限はなく、その形態も液状物（溶液、懸濁液、乳濁液など）、半液体状物、粉末、または固体成形物のいずれのものであってもよい。このため食品は、例えば飲料の形態であってもよく、また、サプリメントのような栄養補助食品の錠剤形態であってもよい。
【００７９】
食品として具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、ようかん、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、牛乳、乳清飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、プリン、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品などの水産加工品；畜肉ハム・ソーセージなどの畜産加工品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品；栄養食品などが挙げられる。
【００８０】
また、通常の食品原料として使用されているもの、すなわち、デキストリン、セルロース、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料及び保存剤よりなる群から選択される１種以上を適宜配合してもよい。
【００８１】
本発明の第３の食品は、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症に罹患しているか、または罹患していることが疑われる者、あるいは糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症への罹患のリスクが高い者に対して好適に使用することができる。ここで、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症への罹患のリスクが高い者としては、例えば、体組成や食生活をはじめとする各種の指標を考慮して、または、健康診断等の診断・診察から、当該リスクが高いと判断された者や、そのようなリスクが高いと本人または周囲の者から認識されるに至った者が含まれる。
【００８２】
本発明において「食品」には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、栄養機能食品、または、病者用食品のような分類のものも包含される。さらに「食品」という用語は、ヒト以外の哺乳動物を対象として使用される場合には、飼料を含む意味で用いられうる。ここでいう特定保健用食品とは、体の生理学的機能などに影響を与える保健機能成分を含む食品で、血圧、血中のコレステロールなどを正常に保つことを助けたり、おなかの調子を整えるのに役立つなどの特定の保健の用途に資する旨を表示するものをいう。このような食品は、食品が疾病リスクを低減する可能性があること表示した食品、すなわち、疾病リスク低減表示を付した食品であってもよい。ここで、疾病リスク低減表示とは、疾病リスクを低減する可能性のある食品の表示であって、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会（コーデックス委員会）の定める規格に基づいて、またはその規格を参考にして、定められた表示または認められた表示でありうる。
【００８３】
本発明の他の形態によれば、本発明のエキスを有効量含有する食品であって、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症を予防および／または改善する機能を有し、その機能表示が付された食品が提供される。ここで食品に付される機能表示は、例えば、製品の本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかに付することができる。
【００８４】
本発明の第３の食品の製造にあたっては、通常の食品の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品添加剤、安定剤などを適宜添加することができる。食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術を参照して実施することができる。
【００８５】
本発明の第３の食品に含まれる、本発明のエキスの含有量は、各食品の組成などによって様々であるため特に限定されることはないが、前記食品の全質量に対して、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン換算で、０．０００１〜５０質量％であることが好ましく、０．０００１〜１０質量％であることがより好ましい。上記した範囲内の場合、食事療法などの効果が有意に向上しうる。
【００８６】
上記、本発明の第１〜第３で述べたように、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンが、ＰＰＡＲγ活性を示し、インスリン抵抗性を改善する治療薬の成分として用いられることによって、つまり、本発明の第２の医薬品または本発明の第３の食品として用いられることによって、以下の機構を有する。すなわち、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンがペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）に結合し、核内受容体転写因子であるレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子のプロモーター領域にあるＰＰＡＲ応答配列（ＰＰＲＥ）にリガンド依存的に結合し、標的遺伝子の転写を促進させ、前駆脂肪細胞を肥大化していない正常な脂肪細胞（成熟脂肪細胞（小型脂肪細胞））に分化誘導する。また、肥大化した脂肪細胞（肥大化脂肪細胞）のアポトーシスを誘導する。分化した脂肪細胞は、アディポネクチンを積極的に分泌するため、糖や脂質の代謝が活発になり、血液中からの糖の取り込みが促進され、インスリン抵抗性を改善する。
【００８７】
なお、本発明の範囲は、上記した実施態様に限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変更を加えることができる。
【実施例】
【００８８】
本発明について、下記の実施例によりさらに詳細に説明するが、当該実施例はあくまで例示にすぎず、本発明は以下に限定されることはない。
【００８９】
１．ＭＴＡの精製法
市販の生のマッシュルーム１０００ｇを測り採り、水洗したものに、等量の蒸留水１０００ｍｌを加え、ブレンダーで破砕し、約１ｍｍ以下の大きさのマッシュルーム破砕物を得た。得られたマッシュルーム破砕物に、マッシュルーム破砕物の細胞壁を部分的に分解すること、および殺菌を目的として、１００℃で１０分間、煮沸を行い、マッシュルーム破砕加熱物を得た。次に、このマッシュルーム破砕加熱物に蒸留水２０００ｇを加えた。その後、生マッシュルームの質量に対して、１．０５質量％のクエン酸を加え、ｐＨを４に調節し、４０℃まで冷却した。さらに、この冷却したマッシュルーム破砕加熱物に、生マッシュルームの質量に対して、０．１質量％の植物組織崩壊酵素であるセルラーゼ製剤を加え、緩やかに攪拌させながら、４０℃で１時間、酵素処理を行い、マッシュルーム破砕酵素処理物を得た。
【００９０】
次に、このマッシュルーム破砕酵素処理物を６０℃まで加温し、ゆるやかに攪拌させながら２時間、熱水（６０℃）抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得た。得られたマッシュルーム抽出物を、８０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離を行った後、ろ紙で濾過し、残渣を除いて、抽出液を得た。この抽出液をエバポレーターを用いて減圧濃縮し、濃縮液を得た。また、ＭＴＡ含有量測定用に、一部凍結乾燥を行い、乾燥粉末を得た。
【００９１】
得られた濃縮液を、合成吸着樹脂ＨＰ２０充填カラム（ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０）にＳＶ＝３で通液した。その後、蒸留水６Ｌ、４０％メタノール６ＬでＳＶ＝３で洗浄した後、６０％メタノール６Ｌで通液し、６０％メタノール溶出画分を得た。得られた６０％メタノール溶出画分を濃縮後、凍結乾燥を行い、乾燥粉末を０．７９２ｇ得た。
【００９２】
得られた乾燥粉末０．５ｇに５０ｍｌの２０％  ＭｅＯＨを添加しボルテックスにて撹拌した。その後、１０，０００ｒｐｍ，  １０ｍｉｎ，  ４℃にて遠心分離を行い不溶物の除去を行った。２０％  ＭＥＯＨ溶解画分について下記の条件に基づき逆相クロマトグラフィーを行った。
【００９３】
１１０  ｘ  ４０ｍｍのガラスクロマト管にＣｏｓｍｏｓｉｌ  １４０Ｃ１８−ＯＰＮをＭｅＯＨを用いて充填し、１０倍量の２０％  ＭｅＯＨを用いて平衡化を行った。その後、上述の遠心にて得られた２０％  ＭｅＯＨ溶解画分を添加した。その後、４００ｍＬの２０，  ３０，  ４０及び１００％  ＭｅＯＨにて溶出を行った。溶出液は２００ｍＬ毎に分離した。ＰＰＡＲγ活性化能の認められた３０％ＭｅＯＨの画分（３００−４００ｍＬ画分）を、減圧下濃縮を行うことにより活性成分を得た。
【００９４】
２．活性成分の構造解析
高分解能Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ＦＡＢマススペクトルを測定したところ、ｍ／ｚ  ２９８．０９９にＭ＋Ｈのシグナルが観察され、その分子式はＣ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓであることが示された。また１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、下記に示したように６−ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎ，ｒｉｂｏｓｅおよびＳ−ｍｅｔｈｙｌ基の存在を示すシグナルが観察された。これらシグナルは、５−ｄｅｏｘｙ−５’−（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）−ａｄｅｎｏｓｉｎｅのシグナルと完全に一致した。以上の結果から、以下の構造を同定した。
【００９５】
【化１】
0005832105.tif 000002
【００９６】
【表１】
0005832105.tif 000003
【００９７】
３．ＭＴＡ含有量の測定
上記で調製したマッシュルームエキス末（ＭＴＡ含有量測定用乾燥粉末）８０ｍｇをエッペンチューブに測り取り、５倍量（４００μＬ）のＭｅＯＨを加えてホモジナイザーで３０秒間ホモジナイズした。その後、遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、１０分）、上清を回収した。
【００９８】
次に、沈殿に上記と同量のＭｅＯＨを加え、ホモジナイザーで３０秒間ホモジナイズを行い、遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、１０分）、上清を回収した。ホモジナイズ処理を計５回実施した。回収した上清をＮ２ガスおよび真空下で乾燥させ、乾燥粉末を得た。得られた粉末に２０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４−ＣＨ３ＣＯＯＨ（ｐＨ４．１）/ＭｅＯＨ（９０/１０）を０．８ｍＬ加え十分に攪拌した後、０．４５μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｄｅｓｍｉｃ ２５−ｃｓ）のフィルターを通し、下記の条件のＨＰＬＣで分析を行った。
【００９９】
分析条件は、カラムとしてＨｙｄｒｏｓｐｈｉｒｅ  Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ＹＭＣ社）を用い、溶離液は、Ａ溶液には２０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４−ＣＨ３ＣＯＯＨ（ｐＨ４．１）、Ｂ溶液にはＭｅＯＨを用い、流速は１．０ｍＬ/ｍｉｎで、Ａ：Ｂ＝９０：１０でイソクラティック溶出を行った。カラム温度は３５℃、ＭＴＡの検出は２５４ｎｍの吸光度の測定により行い、ピークの面積値からＭＴＡを定量した。ＨＰＬＣはＬｃ−１０Ａｖｐ（島津製作所）を用いた。
【０１００】
結果、上記エキス末１ｇ当たり約８０μｇ含まれていることを確認した。
【０１０１】
４．ＰＰＡＲγ活性化能の評価法
４．１
２．で同定した活性成分をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１０００μｇ/ｍＬになるように、溶解させた。
【０１０２】
４．２  ＣＯＳ−１細胞の形質転換および被検試料の添加
ＣＯＳ−１細胞をトリプシン処理により回収し、１０００ｒｐｍ、４℃で、３分間遠心分離した後、上清を除去した。得られた細胞を、２ｍｌの培地（ＤＭＥＭ培地）に分散して、６０ｍｍ培養シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で播いた後、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、２４時間、培養した。
【０１０３】
形質転換には、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ  社）を使用した。即ち、１．５ｍｌのチューブに、Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＣ  １５０μｌ、ｐＭ−ｈＰＰＡＲγ−ＧＡＬ４  １μｇ、ｐＵＡＳｇ−ｔｋ−Ｌｕｃ  １μｇ、ｐＳＥＡＰ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ  １μｇ、及び最後にＥｎｈａｎｃｅｒ  ２４μｌを入れ、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）で１秒間攪拌した。２５℃で３分間放置した後、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅを２５μｌ加え、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）で１０秒間攪拌した後、２５℃で７分間放置した。この間に、６０ｍｍ培養シャーレの培地（ＤＭＥＭ培地）を除去し、新しく培地（ＤＭＥＭ培地）を４ｍｌ入れて培地交換をした。７分後、１．５ｍｌのチューブに培地を１ｍｌ加え、２回、ピペッティングにより懸濁して６０ｍｍ培養シャーレに全量を滴下し、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、１６時間、培養した。
【０１０４】
形質転換した細胞をトリプシン処理により回収し、１０００ｒｐｍ、４℃で、３分間、遠心分離した後、上清を除去した。得られた細胞を、１０ｍｌの培地（ＤＭＥＭ培地）に懸濁して９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ）に１２５μｌ／ｗｅｌｌ播き、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、１〜２時間、培養した。その後、４．１で調製した被検試料を最終濃度２５０μｇ/ｍＬとなるように添加し、穏やかに攪拌して、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、２４時間培養した。
【０１０５】
４．３  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性測定
４．２における、被検試料添加から２４時間後、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅから培地を２５μｌ／ｗｅｌｌ回収し、９６ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅに移した。その後、残りの１００μｌ／ｗｅｌｌに、３７℃にて融解したルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性測定用溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、暗所にて３５分間反応させた後、それぞれのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光強度（下記式中の、「被検試料のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発光強度」）を測定した。なお、上記方法において、比較対照として、被検試料を添加する代わりにＤＭＳＯを添加する以外は、同様の実験を行った（下記式中の、「ＤＭＳＯのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発光強度」）。また、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性測定用溶液は、下記に従って調製された。
【０１０６】
４．４  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＥＡＰ）活性の測定
４．２における、被検試料添加から２４時間後、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅから回収した培地２５μｌ／ｗｅｌｌに、１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μｌ／ｗｅｌｌを添加した。セロハンテープで蓋をした後、穏やかに攪拌し、６５℃で３０分間、放置した。その後、４℃に冷却し、２５℃に戻してから、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ９０μｌ／ｗｅｌｌを添加して、穏やかに攪拌した。２５℃で５分間放置し、ＭＵＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １０μｌ／ｗｅｌｌを添加して、穏やかに攪拌した。暗所にて２５℃で６０分間反応させた後、４−ｍｅｔｈｙｌ  ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅに基づくＳＥＡＰの蛍光強度（Ｅｘ＝３６０ｎｍ、Ｅｍ＝４６０ｎｍ）（下記式中の、「被検試料のＳＥＡＰ蛍光強度」）を測定した。なお、上記方法において、比較対照として、被検試料を添加する代わりにＤＭＳＯを添加する以外は、同様の実験を行った（下記式中の、「ＤＭＳＯのＳＥＡＰ蛍光強度」）。また、１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ及びＭＵＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、１．５に従って調製された。
【０１０７】
４．５  試薬の調製法
４．３で使用されるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性測定用溶液は、以下のようにして調製した。すなわち、６０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．８）、１６ｍＭ  （ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ（塩基性ＭｇＣＯ３）、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ  Ｘ−１００（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．５ｍＭ  Ｄ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ（ナカライテスク）、１．５ｍＭ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＩＧＭＡ）、０．５ｍＭ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ（ＳＩＧＭＡ）、及び０．１ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏ  ｅｔｈａｎｏｌを超純水で調製し、１０ｍｌ程度ずつ分注して使用直前まで−２０℃で保存した。
【０１０８】
また、４．４で使用される１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒは、以下のようにして調製した。すなわち、使用直前に、５×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  ＢｕｆｆｅｒをＨ２Ｏで希釈した。ここで、５×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒは、ＮａＣｌ  ４．３８ｇ、Ｔｒｉｓ  ２．４２ｇを９０ｍｌの超純水で溶解することによって調製した。１２Ｎ  ＨＣｌを加えてｐＨ７．２に調整し、使用直前まで４℃で保存した。
【０１０９】
また、４．４で使用されるＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒは、以下のようにして調製した。すなわち、Ｌ−ｈｏｍｏａｒｇｉｎｉｎｅ  ０．９ｇ、ＭｇＣｌ２０．０４ｇを超純水１５８ｍｌに溶解し、ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ４２ｍｌを加えた。１２Ｎ  ＨＣｌを加えてｐＨ９．８に調整し、使用直前まで４℃に保存した。
【０１１０】
また、４．４で使用されるＭＵＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、以下のようにして調製した。すなわち、１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．７μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ７μｌ／ｗｅｌｌ、１０×ＭＵＰ  ０．３μｌ／ｗｅｌｌを混ぜた。１０×ＭＵＰ、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＭＵＰ）２．５６ｍｇを超純水１０００μｌで溶解し、使用直前まで−２０℃にて保存した。
【０１１１】
４．６  ＰＰＡＲγ活性化能の評価
４．３で測定されたＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光強度、および４．４で測定されたＳＥＡＰの蛍光強度から、下記数式１に従い、ＰＰＡＲγ活性化能を算出した。結果、９３７３であった。ＰＰＡＲγ活性化能の結果を図１に示す。
【０１１２】
【数１】
0005832105.tif 000004
【０１１３】
＜実施例２＞
最終濃度を１２５μｇ/ｍＬとなるように添加した以外は、実施例１と同様に実験を行い、ＰＰＡＲγ活性化能を算出した。結果、６０８０であった。ＰＰＡＲγ活性化能の結果を図１に示す。
【０１１４】
＜実施例３＞
最終濃度を６３μｇ/ｍＬとなるように添加した以外は、実施例１と同様に実験を行い、ＰＰＡＲγ活性化能を算出した。結果、３３４８であった。ＰＰＡＲγ活性化能の結果を図１に示す。
【図１】
0005832105.tif 000005