(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１３のアミノ酸配列を含む組み換えＶＰＡＣ２−選択的受容体アゴニストであって、ＶＰＡＣ１との比較でＶＰＡＣ２に対する当該アゴニストの選好性を増大させるＮ末端メチオニンを有し、且つ、注射後の吸収相を延長させ、そして半減期を延長させるエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）をＣ末端に有し、
ＥＬＰが少なくとも６０個のＶＰＧＸＧ（配列番号：３）の反復単位を含み、Ｘが独立してＶａｌ、Ａｌａ、およびＧｌｙから選択される、アゴニスト。
【請求項２】
Ｘは５、２、および３の比率における、Ｖａｌ、Ａｌａ、およびＧｌｙである、請求項１に記載のアゴニスト。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアゴニストを含む医薬組成物であって、前記組成物は、非経口的投与のために調合される、医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物は、皮下、筋肉内、または静脈内投与のために調合される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
配列番号：１４のアミノ酸配列を含む、組み換えＶＰＡＣ２−選択的受容体アゴニスト。
【請求項６】
組み換えＶＰＡＣ２−選択的受容体アゴニストであって、アミノ酸配列が配列番号：１３であり、ＶＰＡＣ１との比較でＶＰＡＣ２に対する当該アゴニストの選好性を増大させるＮ末端メチオニンを有し、且つ、注射後の吸収相を延長させ、そして半減期を延長させるエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）をＣ末端に有し、
前記エラスチン様ポリペプチドがＶＰＧＸＧ（配列番号：３）の少なくとも６０個の反復を含み、
Ｘが５、２、および３の比率のＶａｌ、Ａｌａ、およびＧｌｙである、
アゴニスト。
【請求項７】
前記エラスチン様ポリペプチドが配列番号：３の７５〜１３０単位を有する、請求項６に記載の組み換えＶＰＡＣ２−選択的受容体アゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２００９年８月１４日出願の米国特許仮出願第６１／２３４
【０００２】
本発明は、循環半減期の延長を有し、かつ非修飾成熟ペプチドと異なる、受容体結合プロファイルを有する、ＶＩＰを含む、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）およびそれを含む医薬組成物に関する。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
【０００３】
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルのコンテンツは、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる：配列リストのコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：ＰＨＡＳ＿０１９＿０１ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、データ記録日：２０１０年８月４日、ファイルサイズ４４キロバイト）。
【背景技術】
【０００４】
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は、止血、免疫系、および神経系に関するものを含め、いくつかの生物学的効果を有する。Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５６（２）：２４９−２９０（２００４）を参照されたい。例えば、ＶＩＰは、血液および肺動脈圧ならびに広範囲に及ぶ免疫系および炎症状態に有益な影響を有する。ＶＩＰは、いくつかを挙げると、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、およびぜんそくのための活性剤としての大きな潜在性を有する。
【０００５】
ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２を含め、ＶＩＰに対して、少なくとも２つの受容体が存在する。これらの受容体は、両ＶＩＰと関連分子である下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）をある程度結合する。両受容体は、７つの膜貫通性Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーの員である。ＶＰＡＣ１は、例えば、ＣＮＳ、肝臓、肺、小腸、およびＴ−リンパ球に分布する。ＶＰＡＣ２は、例えば、ＣＮＳ、膵臓、骨格筋、心臓、腎臓、脂肪組織、精巣、および胃に認められる。
【０００６】
ＶＩＰの短半減期は、このペプチドを治療剤として非実用的にする。Ｐｏｚｏ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｕｎｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ：  Ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２８（９）：１８３３−１８４６（２００７）を参照されたい。実際、研究において、血液中のＶＩＰの半減期は、２分未満であることが示されている（Ｄｏｍｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｇｕｔ  １９：１０４９−５３；  Ｂｕｒｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ  １３：８０７−８１３）。さらに、ＶＩＰの多数の生物学的効果は、あらゆる特定の適応症のためのその開発を複雑にし得る。したがって、修飾型のＶＩＰは、例えば、半減期を延長する、および／または望ましい受容体結合プロファイルを有するように分子を設計することによって、剤を治療上実践的にする必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、修飾された血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、ならびにコードされたポリヌクレオチドおよびベクター、および修飾されたＶＩＰを含む、医薬組成物を提供する。本発明はさらに、修飾されたＶＩＰ分子を生成する方法、および患者の治療のために、修飾されたＶＩＰ剤を使用する方法を提供する。本発明によると、修飾されたＶＩＰは、体内における循環半減期または持続性の延長、および／または非修飾ＶＩＰに対して、同程度の受容体結合および／または生物学的有効性、および／または受容体結合プロファイルの改変を呈する。
【０００８】
一態様において、本発明は、修飾されたＶＩＰ分子およびそれを含む医薬組成物を提供する。修飾されたＶＩＰ分子は、体内におけるより長い循環半減期または持続性、同程度の生物学的有効性、および／または修飾された受容体結合プロファイルを提供するように、１つ以上のアミノ酸の付加によって、および／または異種アミノ酸配列の融合によって、Ｎ−および／またはＣ−末端において、組み換えで、または化学的に、修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｎ−末端Ｈｉｓから開始する、２８個のアミノ酸成熟ＶＩＰは、Ｎ−末端（例えば、Ｍｅｔ）において、単一アミノ酸等の付加的Ｎ−末端アミノ酸を含む。これらまたは他の実施形態において、修飾されたＶＩＰは、本明細書に説明されるように、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）へのＮ−またはＣ−末端融合を含有する。かかる修飾されたＶＩＰ分子は、体内における循環半減期または持続性の向上、および／またはＶＰＡＣ１よりＶＰＡＣ２に対して結合選好性の改変を示し得る。
【０００９】
例えば、ＶＩＰは、（例えば、組み換え手段によって）ＥＬＰのＮ−末端に融合されてもよい。天然成熟ＶＩＰのヒスチジンが、Ｎ−末端にあってもよい。かかる治療剤は、週に約１−７回の投薬（例えば、毎日または毎週投薬）等の融合されていない相当物より有意に低頻度の投薬を要求し得る。
【００１０】
代替実施形態において、ＶＩＰ−ＥＬＰ融合は、２位に天然成熟ＶＩＰ生成物のＨｉｓを伴うＮ−末端に、メチオニンを含有してもよい。さらに他の実施形態において、ＶＩＰ−ＥＬＰ分子は、メチオニンアラニンアラニンから開始する。細菌内で生産されると、第１のメチオニンは、失われ、生成物は、Ｎ−末端に、Ａｌａ−Ａｌａを含有する。Ａｌａ−Ａｌａは、ＤＰＰ−ＩＶペプチダーゼの作用によって、インビトロまたはインビボで除去され、それによって、天然成熟ＶＩＰ  Ｎ−末端を残す。Ｎ−末端に付加的アミノ酸を含有するこれらの構成物は、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体における結合活性に対して試験されると、有意に異なる活性を呈する。例えば、両構成物は、ＶＰＡＣ２受容体を類似ＥＣ５０によって活性化可能であるが、Ｎ−末端（および２位におけるＨｉｓ）にメチオニンを伴う構成物は、少なくとも１００倍、ＶＰＡＣ１受容体において低活性である。
【００１１】
種々の実施形態において、Ｎ−末端Ｍｅｔを有する本発明の修飾されたＶＩＰは、天然または所望のＶＩＰ  Ｎ−末端を露出させるためのさらなる発現後製造プロセスを伴わずに、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の発現系における生産によって等、組み換え手段によって、得ることが可能な利点を有する。
【００１２】
さらに他の実施形態において、ＶＩＰは、例えば、本明細書に詳細に説明されるように、１つ以上のＰＥＧまたは他の化学部分（例えば、Ｎ−末端またはその近傍）の付加によって、化学的に修飾されてもよい。
【００１３】
他の態様では、本発明は、本発明の修飾されたＶＩＰをコードする、ポリヌクレオチドおよびベクター、ならびにそれを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、既知の発現系と併用するために好適な細菌または酵母細胞等、修飾されたＶＩＰの組み換え生産のために好適であり得る。
【００１４】
他の態様では、本発明は、哺乳類におけるある状態を治療、緩和、または防止する方法を提供する。かかる状態は、種々の心臓血管系、免疫系（例えば、自己免疫系）、および神経系状態を含む。例えば、修飾されたＶＩＰは、自己免疫系疾患または炎症状態に罹患する患者を含め、患者における炎症誘発性と抗炎症性エフェクタとの間の均衡を調節するために使用されてもよい。修飾されたＶＩＰに対する例示的適応症は、とりわけ、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、糖尿病、心筋線維症、心不全、心筋症、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、およびぜんそくを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｎ−末端にＭｅｔを有する、修飾されたＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質のアミノ酸配列（Ｍ−ＶＩＰ−ＥＬＰ１−１２０、配列番号：１４）、及びＣ−末端でＶＩＰに融合された、１２０  ＥＬＰ１単位（ＶＰＧＸＧ、配列番号：３）を示す図である。
【図２】天然成熟ＶＩＰペプチドに対して活性化可能である、Ｎ−末端にＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａを有する、修飾されたＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質のアミノ酸配列（ＭＡＡ−ＶＩＰ−ＥＬＰ１−１２０、配列番号：１５）と、Ｃ−末端でＶＩＰに融合された、１２０  ＥＬＰ１単位（ＶＰＧＸＧ、配列番号：３）を示す図である。
【図３】組み換え融合の便宜的生産のために、ＥＬＰ１−１２０をコードする、ｐＰＢ１０３１のプラスミドマップである。
【図４】Ｍ−ＶＩＰ−ＥＬＰ１−１２０（配列番号：３９および４０）融合タンパク質をコードする、ｐＰＢ１０４６を描写する図である。組み換え遺伝子の構成のためのプライマー（Ｐ００４５、配列番号：３１、Ｐ００４８、配列番号：３２、およびＰ００６５、配列番号：３４）が、示される。
【図５】ＭＡＡ−ＶＩＰ−ＥＬＰ１−１２０（配列番号：４１および４２）融合タンパク質をコードする、ｐＰＢ１０４７を描写する図である。組み換え遺伝子の構成のためのプライマー（Ｐ００６６、配列番号：３５、Ｐ００６４、配列番号：３３、Ｐ００６７、配列番号：３６）が、示される。
【図６】ＥＬＰ１−１２０−ＶＩＰ（配列番号：４３および４４）融合タンパク質をコードする、ｐＰＢ１０４８を描写する図である。組み換え遺伝子を構成するためのプライマー（Ｐ００６８、配列番号：３７、Ｐ００６９、配列番号：３８）が、示される。
【図７】熱変性を伴う、または伴わない、精製されたＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質の１０％  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ＮｕＰＡＧＥゲル分析の図である。
【図８】ＶＰＡＣ２受容体に対する、未変性ＶＩＰおよびＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１０４６ならびにＰＢ１０４７のインビトロ活性を示す図である。
【図９】ＶＰＡＣ１受容体に対する、未変性ＶＩＰおよびＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１０４６ならびにＰＢ１０４７のインビトロ活性を示す図である。
【図１０】ラット血圧に及ぼす、ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質のインビボ効果を示す図である。左側のパネルは、収縮期血圧を示す。右側のパネルは、拡張期血圧を示す。ＶＩＰ−ＥＬＰは、１２時間周期にわたって、血圧を降下させる。
【図１１】ＶＩＰ−ＥＬＰ１−１２０をコードする、ｐＰＢ１１２０（配列番号：４８）のプラスミドマップである。
【図１２】ＶＰＡＣ１受容体に対する、未変性ＶＩＰおよびＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０ならびにＰＢ１０４６のインビトロ活性を示す図である。
【図１３】ＶＰＡＣ２受容体に対する、未変性ＶＩＰおよびＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０ならびにＰＢ１０４６のインビトロ活性を示す図である。
【図１４Ａ】線形軸を伴う、３ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射後のサル（ｎ＝３）におけるＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図１４Ｂ】片対数軸を伴う、ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図１５Ａ】０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ用量によって、皮下注射されたラットにおける、３時間間隔にわたる収縮期圧の平均変化を示す図である。
【図１５Ｂ】０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ用量によって、皮下注射されたラットにおける、３時間間隔にわたる拡張期圧の平均変化を示す図である。
【図１５Ｃ】０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ用量によって、皮下注射されたラットにおける、３時間間隔にわたる平均動脈圧の平均変化を示す図である。
【図１５Ｄ】ＰＢ１１２０の投与後、３時間間隔にわたる、対象ラットの平均心拍数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、修飾された血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、コードポリヌクレオチドおよびベクター、ならびに修飾されたＶＩＰを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、患者の治療のために、修飾されたＶＩＰ剤を生成および使用する方法を提供する。本発明によると、ＶＩＰは、非修飾ＶＩＰに対して、体内における循環半減期または持続性の延長、同程度の受容体結合、または生物学的有効性、および／または受容体結合プロファイルの改変を呈し得る。種々の実施形態において、本発明の化合物は、非修飾相当物と比較して、投薬頻度の減少を呈する。
血管作動性腸管ペプチド
【００１７】
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は、２８個のアミノ酸残基を含有する、ペプチドホルモンであって、消化管、膵臓、および脳内の視床下部の視交叉上核を含む、人体の多くの領域で生産される。ＶＩＰは、動物およびヒトにおいて、全身血管拡張、低血圧症、心拍出量の増加、呼吸刺激、高血糖症、冠血管拡張、気管支拡張を含む、広範囲に及ぶ生物学的作用を呈する。ＶＩＰはまた、免疫系の均衡にも影響を及ぼす。
【００１８】
ＶＩＰは、身体のいくつかの部分に影響を及ぼす。消化系に対して、ＶＩＰは、円滑な筋肉の弛緩（下部食道括約筋、胃、胆嚢）を誘発し、膵液および胆汁内への水分の分泌を刺激し、腸管腔からの胃酸の分泌および吸収を阻害させ得る。小腸におけるその役割は、水分および電解液の分泌を刺激すること、ならびに腸管平滑筋を拡張し、末梢血管を拡張し、膵臓の重炭酸塩分泌を刺激し、かつガストリン刺激性の胃酸の分泌を阻害することである。これらの効果は、協働し、運動性を向上させる。ＶＩＰは、主細胞によるペプシノゲン分泌を刺激する機能を有する。
【００１９】
ＶＩＰは、心臓に認められており、心臓血管系に有意な効果を及ぼす。冠動脈拡張をもたらし、かつ陽性変力および変時効果を有する。
【００２０】
ＶＩＰは、炎症およびＴＨ１−型自己免疫疾患を治療するために有用な免疫調節ペプチドである（Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５６（２）：２４９−２９０（２００４）を参照されたい）。ＶＩＰは、神経変性疾患の治療に有用である（米国特許第５，９７２，８８３号を参照されたい（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる））。ＶＩＰおよびその構造的に関連するペプチド下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、疾患の炎症および自己免疫成分の両方を下方調整することによって、骨関節炎（ＯＡ）ならびにリウマチ性関節炎（ＲＡ）等の慢性炎症リウマチ性疾患に重要な治療効果を有する（Ｊｕａｒｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，  ２００４，  ４３：４１６−４２２）。加えて、ＶＩＰは、炎症誘発性と抗炎症性エフェクタとの間の均衡を調整することによって、または自己反応性Ｔ−細胞に対する抑制活性を有するＴ−細胞の出現を誘発することによって、免疫耐性を維持することに関与する（Ｐｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｕｎｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ｐｅｐｔｉｄｅ，  ２００７，  ２８（９）：１８３３−１８４６）。  
【００２１】
成熟ＶＩＰは、以下の配列：ＨＳＤＡＶＦＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮ（配列番号：１３）を伴う、２８個のアミノ酸残基を有する。ＶＩＰは、１７０個のアミノ酸前駆体分子である処理前ＶＩＰの処理からもたらされる。ＶＩＰおよび例示的類似体の構造は、米国特許第４，８３５，２５２号、第４，９３９，２２４号、第５，１４１，９２４号、第４，７３４，４００号、第４，６０５，６４１号、第６，０８０，８３７号、第６，３１６，５９３号、第５，６７７，４１９号、第５，９７２，８８３号、第６，４８９，２９７号、第７，０９４，７５５号、および第６，６０８，１７４号に説明されており、それぞれ、あらゆる目的に対して、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。
【００２２】
プロテアーゼ等に対するペプチド安定性を改良するためのいくつかの突然変異体は、文献に詳述されている（Ｏｎｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ    ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  ２００９（参照することによって、あらゆる目的に対して、全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。これらの修飾されたＶＩＰペプチドは、配列番号２１（Ｍ１７Ｌ、Ｍｅｔの酸化を防止するため）、配列番号２２（Ｋ１５Ｒ、Ｋ２０Ｒ、およびＫ２１Ｒ、タンパク質分解安定性を増加させるため）、および配列番号２３（Ｎ２４ＡおよびＳ２５Ａ、タンパク質分解／熱安定性を増加させるため）の配列を有する。本発明は、これらの修飾のうちの１つ以上を含む、修飾されたＶＩＰペプチドとともに、本明細書に説明される、付加的ＶＩＰ修飾を提供する。修飾されたＶＩＰ分子の実施例は、配列番号１４−１５、１７−２７、４０、４２、４４、および５０の修飾されたＶＩＰペプチドを含む。
【００２３】
本明細書に説明される種々の実施形態において、修飾されたＶＩＰ（例えば、配列番号：１３を含む）（または本明細書に説明される機能的類似体）が、提供される。概して、ＶＩＰの機能的類似体は、１、２、３、または最大約５個のアミノ酸を含む、１から１０個のアミノ酸によって、Ｎ−またはＣ−末端で切断される、機能的フラグメントを含む（配列番号：１３に対して）。かかる機能的類似体は、未変性配列（例えば、配列番号：１３）に対して、１から５個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換（集合的に）を含有してもよく、いずれの場合も、ペプチドの活性を留保する（例えば、ＶＰＡＣ２および／またはＶＰＡＣ１結合を通して）。かかる活性は、本明細書に説明されるアッセイ、およびＤｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５６（２）：２４９−２９０（２００４）に説明される、活性を判定または定量化するためのあらゆる好適なアッセイを含め、あらゆる利用可能なアッセイを使用して、確認あるいはアッセイが行われてもよい。これらまたは他の実施形態において、本発明の修飾されたＶＩＰのＶＩＰ成分は、未変性成熟配列（配列番号：１３）と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％の同一性を有する。２つの配列（例えば、未変性配列と機能的類似体）の間の配列同一性の判定は、Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １７４：２４７−２５０（１９９９）を含む、あらゆる整合ツールを使用して達成することができる。
【００２４】
一態様では、本発明は、非修飾ＶＩＰ（例えば、配列番号：１３のアミノ酸配列から成るペプチド）と比較して、ＶＰＡＣ２またはＶＰＡＣ１に対して、受容体選好性を有する、修飾されたＶＩＰ分子を提供する。例えば、修飾されたＶＩＰは、ＶＰＡＣ１よりＶＰＡＣ２に対して、少なくとも約２：１、約５：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約５００：１以上の相対結合選好性を有してもよい。他の実施形態において、修飾されたＶＩＰは、ＶＰＡＣ２よりＶＰＡＣ１に対して、少なくとも約２：１、約５：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約５００：１以上の相対結合選好性を有してもよい。例えば、ある実施形態において、修飾されたＶＩＰは、実質的に、成熟非修飾ヒトＶＩＰとして、すなわち、成熟非修飾ヒトＶＩＰ（配列番号：１３）の約２倍以内のＥＣ５０によって、ＶＰＡＣ２受容体を活性化する。しかしながら、この同一の修飾されたＶＩＰは、ＶＰＡＣ１受容体を活性化する際、成熟非修飾ヒトＶＩＰより、５０または１００倍以上、有効性が低い。
【００２５】
かかる修飾されたＶＩＰ分子は、異種哺乳類アミノ酸配列を含み得る、１から約５００個のアミノ酸をＶＩＰのＮ−末端ヒスチジンへの付加等、修飾されたＮ−末端領域を含有してもよい。例えば、修飾されたＶＩＰは、成熟ＶＩＰの天然Ｎ−末端ヒスチジンのＮ−末端側に、単一メチオニンを含有してもよい。メチオニンは、隣接するアミノ酸がヒスチジンである時、Ｅ  ｃｏｌｉによって除去されないため、この分子もまた、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の細菌発現系内で便宜的に調製される。代替として、Ｎ−末端アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、およびプロリンのいずれかであってもよい。
【００２６】
ＶＩＰのＮ−末端に付加される付加的配列は、１から約１００個、１から約５０個、１から約２０個、１から約１０個、および１から約５個のアミノ酸の生物学的に活性および生物学的に不活性配列を含む、あらゆる配列であってもよい。
【００２７】
修飾されたＶＩＰのＮ−末端は、構造Ｍ−Ｎを有してもよく、式中、Ｍは、メチオニンであって、Ｎは、ＶＩＰ分子のＮ−末端である（例えば、配列番号１４、図１）。このメチオニンは、細菌または真核性宿主細胞内のタンパク質の翻訳を支援する。したがって、修飾されたＶＩＰは、細菌および酵母発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む、生物系中で生成され得る。メチオニンは、時として、細菌発現系内のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡ）によって除去される可能性があるが、ヒスチジン（Ｈ）は、ＭＡに対して、最も有利に働かない２位における残基のうちの１つである。
【００２８】
さらに他の実施形態において、Ｎ−末端は、治療分子の半減期を延長させるのに有効な哺乳類タンパク質等の哺乳類異種タンパク質との融合によって修飾される。かかる配列は、アルブミン、トランスフェリン、または抗体Ｆｃ配列等の哺乳類配列であってもよい。かかる配列は、米国特許第７，２３８，６６７号（特に、アルブミン共役物に関して）、米国特許第７，１７６，２７８号（特に、トランスフェリン共役物に関して）、および米国特許第５，７６６，８８３号に説明されており、それぞれ、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。
【００２９】
他の実施形態において、ＶＩＰは、内因性ペプチダーゼまたはプロテアーゼ等のペプチダーゼまたはプロテアーゼによって、活性化可能である。かかる活性化可能配列は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８６５６号に説明されており、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。本明細書で使用されるように、用語「ペプチダーゼ」および「プロテアーゼ」は、互換性がある。例えば、ＶＩＰは、ジペプチジルペプチダーゼによって活性化可能であるように設計されてもよい。例示的ジペプチジルペプチダーゼとして、ジペプチジルペプチダーゼ−１（ＤＰＰ−Ｉ）、ジペプチジルペプチダーゼ−３（ＤＰＰ−ＩＩＩ）、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−ＩＶ）、ジペプチジルペプチダーゼ−６（ＤＰＰ−ＶＩ）、ジペプチジルペプチダーゼ−７（ＤＰＰ−ＶＩＩ）、ジペプチジルペプチダーゼ−８（ＤＰＰ−ＶＩＩＩ）、ジペプチジルペプチダーゼ−９（ＤＰＰ−ＩＸ）、ジペプチジルペプチダーゼ−１０（ＤＰＰ−Ｘ）を含む。かかるジペプチダーゼのための基質配列は、周知である。
【００３０】
活性化可能ＶＩＰのＮ−末端は、構造Ｚ−Ｎを有してもよく、式中、Ｚは、ジペプチダーゼのための基質であって（例えば、Ｚは、ジペプチダーゼ露出によって除去される）、Ｎは、ＶＩＰのＮ−末端である。活性化可能ＶＩＰは、式Ｍ−Ｘ−Ｎを伴う、Ｎ−末端配列を有してもよく、式中、Ｍは、メチオニンであって、Ｘは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、またはＳｅｒであって、Ｎは、ＶＩＰまたはＶＩＰ類似体のＮ−末端である。このように、ＭおよびＸは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．）に対して、および／または、その後、ジペプチダーゼ（例えば、ＤＰＰ−ＩＶ）に感応し、それらによって除去されるであろう。代替として、活性化可能ＶＩＰのＮ−末端配列は、Ｘ１−Ｘ２−Ｎであってもよく、式中、Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＰｒｏであって、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、またはＳｅｒであって、Ｎは、ＶＩＰのＮ−末端である。Ｘ１−Ｘ２は、ジペプチダーゼ（例えば、ＤＰＰ−ＩＶ）のための基質であって、ジペプチダーゼ消化は、ＶＩＰまたはＶＩＰ類似体（例えば、配列番号１５、図２）の所望のＮ−末端である、Ｎを露出させるであろう。かかる実施形態において、第２位におよびけるＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＰｒｏは、Ｍｅｔの除去を信号伝達し、それによって、ジペプチダーゼ（例えば、ＤＰＰ−ＩＶ）によって、インビボで活性化され得る、Ｘ１−Ｘ２をＮ−末端上に残すため、タンパク質は、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．）中のＭ−Ｘ１−Ｘ２−Ｎ（式中、Ｍは、メチオニンである）をコードする構成物の発現によって生産されてもよい。天然成熟ＶＩＰ  Ｎ−末端を保有するように活性化される、かかる活性化可能ＶＩＰ分子は、受容体選好性を示さない。
【００３１】
別の実施形態において、修飾された活性化可能ＶＩＰのＮ−末端は、構造Ｍ−Ｚ−Ｎを有してもよく、式中、Ｍは、メチオニンであって、Ｚは、ジペプチダーゼ（例えば、Ｚは、ジペプチダーゼ露出によって除去される）のための基質であって、Ｎは、活性ＶＩＰ（修飾されたＶＩＰ）の非Ｈｉｓ  Ｎ−末端である。例えば、修飾された活性化可能ＶＩＰは、式Ｍ−Ｘ−Ｎを伴う、Ｎ−末端配列を有してもよく、式中、Ｍは、メチオニンであって、Ｘは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、またはＳｅｒであって、Ｎは、活性ＶＩＰの非Ｈｉｓ  Ｎ−末端である。このように、ＭおよびＸは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．）、および／または、続いて、ジペプチダーゼ（例えば、ＤＰＰ−ＩＶ）に対して感応し、および／または、続いて、それらによって除去されるであろう。代替として、活性化可能ＶＩＰのＮ−末端配列は、Ｘ１−Ｘ２−Ｎであってもよく、式中、Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＰｒｏであって、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、またはＳｅｒであって、Ｎは、活性ＶＩＰの非Ｈｉｓ  Ｎ−末端である。Ｘ１−Ｘ２は、ジペプチダーゼ（例えば、ＤＰＰ−ＩＶ）のための基質であって、ジペプチダーゼ消化は、ＶＩＰの所望の非Ｈｉｓ  Ｎ−末端である、Ｎを露出させるであろう。
【００３２】
さらに別の実施形態において、修飾された活性化可能ＶＩＰのＮ−末端は、構造Ｍ−Ｚ−Ｓ−Ｎを有してもよく、式中、Ｍは、メチオニンであって、Ｚは、ジペプチダーゼ（例えば、Ｚは、ジペプチダーゼ露出によって除去される）のための基質であって、Ｎは、成熟ＶＩＰ（Ｈｉｓ）のＮ−末端であって、Ｓは、ジペプチダーゼ消化後に露出され、前述のように、修飾されたＶＩＰを提供する、１つ以上のアミノ酸である。例えば、修飾された活性化可能ＶＩＰは、式Ｍ−Ｘ−Ｓ−Ｎを伴う、Ｎ−末端配列を有してもよく、式中、Ｍは、メチオニンであって、Ｘは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、またはＳｅｒであって、Ｎは、成熟ＶＩＰのＮ−末端であって、Ｓは、ジペプチダーゼ消化後に露出され、受容体選好性を提供するであろう、１つ以上のアミノ酸である。代替として、活性化可能ＶＩＰのＮ−末端配列は、Ｘ１−Ｘ２−Ｓ−Ｎであってもよく、式中、Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＰｒｏであって、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、またはＳｅｒであって、Ｎは、ＶＩＰの非Ｈｉｓ  Ｎ−末端であって、Ｓは、ジペプチダーゼ消化後に露出されるであろう、１つ以上のアミノ酸である。Ｘ１−Ｘ２は、ジペプチダーゼ（例えば、ＤＰＰ−ＩＶ）のための基質であって、ジペプチダーゼ消化は、Ｓを露出させるであろう。
【００３３】
これらまたは他の実施形態において、ＶＩＰ  Ｎ−末端に対するＮ−末端化学修飾は、受容体選好性を提供してもよい。タンパク質の化学修飾およびその方法は、当技術分野において周知である。限定されない例示的化学修飾は、ペグ化、メチルグリオキサール化、還元的アルキル化、過ギ酸酸化、サクシニル化、アミノエチル化、および脂質化である（Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８５．  ＩＳＢＸ．  ０−８９６０３−１２６−８．  Ｖｏｌｕｍｅ．  ３  ｏｆ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。システイン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、トリプトファン、チロシン、カルボキシル基の修飾によって付着され得る、ペグ化等の化学基については、以前に説明されている（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９５参照）。
生体弾性ポリマーへの融合
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明のＶＩＰは、Ｎ−末端および／またはＣ−末端生体弾性ポリマー成分を含有する。「生体弾性ポリマー」は、逆温度転移を呈し得る。生体弾性ポリマーは、周知であって、例えば、Ｕｒｒｙらの米国特許第５，５２０，６７２号に説明されている。生体弾性ポリマーは、ペンタペプチド、テトラペプチド、および／またはノナペプチド（例えば、「エラスチン様ペプチド」）のエラストマー単位を含む、ポリペプチドであってもよい。本発明を実践するために使用され得る生体弾性ポリマーは、米国特許第４，４７４，８５１号に記載されており、生体弾性ポリマーを形成するために使用することができる、いくつかのテトラペプチドおよびペンタペプチドの反復単位を説明している。具体的生体弾性ポリマーもまた、米国特許第４，１３２，７４６号、第４，１８７，８５２号、第４，５００，７００号、第４，５８９，８８２号、および第４，８７０，０５５号に説明されている。生体弾性ポリマーのさらに他の実施例は、米国特許第６，６９９，２９４号、米国特許第６，７５３，３１１号、および米国特許第６，０６３，０６１号に記載されている。かかる生体弾性ポリマーの構造は、参照することによって、本明細書に組み込まれる。
【００３５】
一実施形態において、生体弾性ポリマーは、一般式（ＶＰＧＸＧ）ｍのポリペプチドであって、式中、Ｘは、任意のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ）であって、ｍは、約２０から約２０００、または約５０から約１８０である。例示的実施形態において、ｍは、６０、９０、１２０、１５０、または１８０である。第４アミノ酸としての種々のアミノ酸の頻度だけではなく、Ｘの同一性も変化する可能性がある。
【００３６】
例えば、生体弾性ポリマーは、生体弾性ペンタペプチドおよびテトラペプチドから選択される、反復エラストマー単位を含んでもよく、反復単位は、疎水性アミノ酸およびグリシン残基から成る群から選択される、アミノ酸残基を含み、反復単位は、以下の式のベータ回転を有する、配座に存在する。
0005801807.tif 000002
式中、Ｒ１−Ｒ５は、アミノ酸残基１−５の側鎖を表し、ｍは、反復単位がテトラペプチドである時、０であって、または反復単位がペンタペプチドである時、１である。ノナペプチド反復単位は、概して、連続テトラおよびペンタペプチドから成る。疎水性アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンから選択される。多くの場合、反復単位の第１アミノ酸残基は、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはフェニルアラニンの残基であって、第２アミノ酸残基は、プロリンの残基であって、第３アミノ酸残基は、グリシンの残基であって、第４アミノ酸残基は、グリシン、あるいはトリプトファン、フェニルアラニン、またはチロシン等の超疎水性残基である。特定の実施例は、テトラペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、テトラペプチドＧＧＶＰ、テトラペプチドＧＧＦＰ、テトラペプチドＧＧＡＰを含み、ペンタペプチドは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、ペンタペプチドＧＶＧＶＰ、ペンタペプチドＧＫＧＶＰ、ペンタペプチドＧＶＧＦＰ、ペンタペプチドＧＦＧＦＰ、ペンタペプチドＧＥＧＶＰ、ペンタペプチドＧＦＧＶＰ、およびペンタペプチドＧＶＧＩＰである。例えば、米国特許第６，６９９，２９４号を参照されたい。
【００３７】
ある例示的実施形態において、本発明のＶＩＰは、Ｎ−末端および／またはＣ−末端ＥＬＰ成分を含有する。ＥＬＰ成分は、エラスチンタンパク質に関連する、またはそこから誘導される、構造的ペプチド単位または配列を含む、あるいはそれから成る。かかる配列は、生物学的利用能、治療的有効用量および／または投与頻度、生物学的作用、製剤適合性、タンパク質分解に対する抵抗、溶解度、半減期または投与後の体内における持続性の他の測定基準、および／または体内からのクリアランス速度のうちの１つ以上における、治療タンパク質の特性を改良するために有用である。例えば、ＷＯ２００８／０３０９６８を参照されたい（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）。
【００３８】
ＥＬＰが、ＶＩＰのＣ−末端に位置付けられると、前述のように、１つ以上のアミノ酸の付加等、付加的修飾が、ＶＩＰ  Ｎ−末端において行われてもよい。代替実施形態において、ＶＩＰ  Ｎ−末端におけるかかる修飾は存在しない。
【００３９】
ＥＬＰ成分は、３個から約２０個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、５個または６個のアミノ酸等、４個から１０個のアミノ酸の構造単位から構成される。個々の構造単位の長さは、特定のＥＬＰ成分では、変動してもよく、または均一であってもよい。ある実施形態において、ＥＬＰ成分は、反復構造単位のポリテトラ、ポリペンタ、ポリヘキサ、ポリヘプタ、ポリオクタ、およびポリノナペプチドモチーフから構成される。例示的構造単位は、タンデム反復単位を含む、反復構造単位として採用され、またはいくつかの組み合わせにおいて採用され、治療成分の特性を改良するために有効なＥＬＰを生成し得る、配列番号：１−１２（以下参照）によって定義される単位を含む。したがって、ＥＬＰ成分は、以下に定義されるように、配列番号：１−１２から選択される、構造単位を含む、または本質的に、それから成ってもよい。
【００４０】
かかる構造単位を含む、ＥＬＰ成分は、可変サイズであってもよい。例えば、ＥＬＰ成分は、配列番号：１−１２によって定義される単位の１つまたは組み合わせを含む、約１０から約５００個の構造単位、またはある実施形態において、約２０から約２００個の構造単位、またはある実施形態において、約５０から約１５０個の構造単位、または約７５から約１３０個の構造単位を含む、または本質的に、それから成ってもよい。ＥＬＰ成分は、配列番号：３（以下に定義される）によって定義される構造単位の反復等、約１２０個の構造単位を含んでもよい。したがって、ＥＬＰ成分は、約５０から約２０００個のアミノ酸残基、または約１００から約６００個のアミノ酸残基、または約２００から約５００個のアミノ酸残基、または約２００から約４００個のアミノ酸残基の長さを有してもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＥＬＰ成分、またはある場合には、治療剤は、約１５０ｋＤａ未満、または約１００ｋＤａ未満、または約５５ｋＤａ未満、または約５０ｋＤａ未満、または約４０ｋＤａ未満、または約３０または２５ｋＤａ未満のサイズを有する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、非転移状態にあるＥＬＰ成分は、腎臓濾過から逃れるように、伸長された、比較的に非構造化かつ非球状形態を有してもよい。かかる実施形態において、本発明の治療剤は、約６０ｋＤ未満、またはいくつかの実施形態において、約５５、５０、４５、４０、３０、または２５ｋＤａ未満等、概して認知されている腎臓を通した濾過に対するカットオフ未満の分子量を有し、それでもなお、非結合（例えば、非融合または非共役）治療相当物より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍長く、体内に存在する。
【００４３】
これらまたは他の実施形態において、ＥＬＰ成分は、治療ペプチドの生物学的作用に実質的または有意に影響を及ぼさない。したがって、本発明のＥＬＰ融合を伴うＶＩＰは、その非融合相当物と同一または類似の有効性（生物学的作用）を呈してもよい。本発明のＥＬＰ融合を伴うＶＩＰは、同一アッセイにおける非融合相当物によって呈されるものの１０−１００％の生物学的作用（例えば、インビトロまたはインビボで試験されるように）の有効性またはレベルを呈してもよい。種々の実施形態において、（活性化された）本発明のＥＬＰ融合を伴うＶＩＰは、非融合相当物によって呈されるものの少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％以上の生物学的作用（例えば、インビトロまたはインビボで試験されるように）の有効性またはレベルを呈してもよい。
【００４４】
ある実施形態において、ＥＬＰ成分は、可逆的逆相転移を受ける。すなわち、ＥＬＰ成分は、構造的に無秩序であって、転移温度（Ｔｔ）を下回る水中において、非常に可溶性であるが、温度がＴｔを上回って上昇されると、急激な（２−３°Ｃ範囲）無秩序から秩序への相転移を呈し、ＥＬＰ成分の脱溶媒和および凝集につながる。例えば、ＥＬＰは、遠心分離によって、溶液から容易に除去および単離され得る、十分なサイズに到達すると、不溶性ポリマーを形成する。かかる相転移は、可逆的であって、単離された不溶性ＥＬＰは、温度がＥＬＰのＴｔを下回るように戻ると、緩衝溶液中に完全に再溶解され得る。したがって、本発明の治療剤は、いくつかの実施形態において、逆転移循環手順を使用して、例えば、治療剤の温度依存性溶解度、または媒体への塩付加を利用して、他の汚染タンパク質から高純度に分離され得る。連続逆相転移サイクルは、高純度を得るために使用することができる。温度およびイオン強度に加え、治療剤の逆転移を変調するために有用な他の環境変数は、ｐＨ、無機および有機溶質ならびに溶媒の添加、側鎖イオン化または化学修飾、および圧力を含む。
【００４５】
ある実施形態において、ＥＬＰ成分は、可逆的逆相転移を受けない、または生物学的に関連するＴｔにおいてかかる転移を受けない。したがって、分子の生物学的および／または生理学的特性（本明細書のいずれかに説明されるように）における改良は、あらゆる相転移特性から完全または実質的に独立し得る。それでもなお、かかる相転移特性は、例えば、かかる分子の復元および精製に関連して、付加的実践的利点を付与し得る。
【００４６】
本発明の実践では、ＥＬＰ成分は、治療用組成物中のＶＩＰ成分を安定化させる、または別様に改良するように機能する。ＶＩＰ治療剤を必要とする患者への結合されたＶＩＰ−ＥＬＰ構成物の投与後、ＶＩＰ成分およびＥＬＰは、相互に結合したままである一方、ＶＩＰは、例えば、疾患状態または生理学的状態の治療あるいは予防、もしくは他の治療介入に対して、治療的に活性である。
【００４７】
ある実施形態において、ＥＬＰ成分は、以下を含むが、それらに限定されない、構造単位から形成されてもよい。
（ａ）テトラペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＧ（配列番号：１）；
（ｂ）テトラペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＧ（配列番号：２）；
（ｃ）ペンタペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号：３）、またはＶＰＧＸＧ、式中、Ｘは、任意の天然または非天然アミノ酸残基であって、式中、Ｘは、随意に、ポリマーまたはオリゴマー反復間を変動する；
（ｄ）ペンタペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、またはＡＶＧＶＰ（配列番号：４）；
（ｅ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＸＧ（配列番号：５）、式中、Ｘは、任意の天然または非天然アミノ酸残基であって、式中、Ｘは、随意に、ポリマーまたはオリゴマー反復間を変動する；
（ｅ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＶＧ（配列番号：６）；
（ｆ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ、またはＬＰＧＸＧ（配列番号：７）、式中、Ｘは、任意の天然または非天然アミノ酸残基であって、式中、Ｘは、随意に、ポリマーまたはオリゴマー反復間を変動する；
（ｇ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＬＰＧＶＧ（配列番号：８）；       
（ｈ）ヘキサペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＶＡＰＧＶＧ（配列番号：９）；
（Ｉ）オクタペプチドＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号：１０）；
（Ｊ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＦＧＶＧＡＧ（配列番号：１１）；および
（Ｋ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＶＧＶＰＧＧ（配列番号：１２）。
【００４８】
配列番号：１−１２によって定義されるかかる構造単位は、本発明によると、構造的反復単位を形成してもよく、またはＥＬＰ成分を形成するように組み合わせて使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ＥＬＰ成分は、全体的に（または、略全体的に）、配列番号：１−１２から選択される構造単位の１つまたは組み合わせ（例えば、２、３、または４）から形成される。他の実施形態において、ＥＬＰ成分の少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、配列番号：１−１２から選択される構造単位の１つまたは組み合わせから形成され、反復単位として存在してもよい。
【００４９】
ある実施形態において、ＥＬＰ成分は、ペンタペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号：３）のタンデム反復単位を含む、反復単位を含有し、式中、Ｘは、前述に定義されるようなものであって、ＥＬＰ成分全体（ＶＰＧＸＧ（配列番号：３）以外の構造単位を含んでもよい）に対して考慮される、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号：３）ペンタペプチド単位の割合は、ＥＬＰ成分の約７５％を上回る、または約８５％を上回る、または約９５％を上回る。ＥＬＰ成分は、各反復内の構造単位の少なくとも２個または少なくとも３個間で変動するゲスト残基Ｘとともに、配列番号：３のペンタペプチドの５から１５単位反復（例えば、約１０単位または約１２単位反復）を有する、モチーフを含有してもよい。ゲスト残基は、アミノ酸Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｇ、およびＷ等から独立選択されてもよい（かつ、所望の逆相転移特性を留保するように選択されてもよい）。例示的モチーフとして、ＶＰＧＸＧ（配列番号：３）を含み、式中、ゲスト残基は、Ｖ（構造単位の４０％から６０％中に存在し得る）、Ｇ（構造単位の２０％から４０％中に存在し得る）、およびＡ（構造単位の１０％から３０％中に存在し得る）である。反復モチーフ自体が、例えば、約８から１５回（例えば、約１２回）等、約５から約２０回反復され、例示的ＥＬＰ成分を生成してもよい。ＥＬＰ成分は、この段落に説明されるように、当然ながら、配列番号：１−１２によって定義される構造単位のうちのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせから構成されてもよい。例示的ＥＬＰ成分は、ＶＩＰのＣ−末端に融合された、図１に示される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＥＬＰ単位は、エラスチン様特性（例えば、逆相転移）を提供する、β−ターン構造を形成してもよい。β−ターン構造を生成するために好適な例示的ペプチド配列は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６に説明されており、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。例えば、エラスチンペンタペプチド配列、ＶＰＧＸＧ（配列番号：３）における第４残基（Ｘ）は、β−ターンの形成を排除せずに、改変され得る。
【００５１】
ある実施形態において、ＥＬＰ成分は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号：３）のポリマーまたはオリゴマー反復を含み、式中、ゲスト残基Ｘは、任意のアミノ酸である。Ｘは、自然発生または非自然発生アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘは、プロリンまたはシステイン以外の天然アミノ酸である。
【００５２】
ゲスト残基Ｘ（例えば、配列番号：３、または他のＥＬＰ構造単位に対して）は、非古典的（非遺伝的にコードされた）アミノ酸であってもよい。非古典的アミノ酸の実施例は、以下を含む：一般的アミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、Ａ−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸類似体。
【００５３】
Ｘの選択は、各ＥＬＰ構造単位において（例えば、ゲスト残基Ｘを有する、本明細書に定義される各構造単位に対して）独立であってもよい。例えば、Ｘは、いくつかの実施形態において、疎水性側鎖を含め、正電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸、負電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸、または中性側鎖を有するアミノ酸として、各構造単位に対して独立して選択されてもよい。
【００５４】
さらに他の実施形態において、ＥＬＰ成分は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号：３）、ＩＰＧＸＧ（配列番号：５）、またはＬＰＧＸＧ（配列番号：７）、あるいはそれらの組み合わせのポリマーまたはオリゴマー反復を含んでもよく、式中、Ｘは、前述に定義されるようなものである。
【００５５】
各実施形態において、ＥＬＰ配列の構造単位、またはある場合には、ポリマーまたはオリゴマー反復は、分子の全体的効果を排除しない、１つ以上のアミノ酸残基によって、すなわち、説明されるように、治療成分にある改良を付与する際、分離されてもよい。ある実施形態において、かかる１つ以上のアミノ酸はまた、ＥＬＰ成分の相転移特性を排除しない、または実質的に影響を及ぼさない（かかる１つ以上のアミノ酸の欠失と比較して）。
【００５６】
結果として生じるＥＬＰ成分の構造は、表記ＥＬＰｋ［ＸｉＹｊ−ｎ］を使用して説明されてもよく、式中、ｋは、特定のＥＬＰ反復単位を指し、括弧内の大文字は、１文字のアミノ酸コードであって、それらの対応する添字は、構造単位中の各ゲスト残基Ｘの相対比率を指し（該当する場合）、ｎは、構造的反復の数において、ＥＬＰの全長を示す。例えば、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号：３）の１０個の反復単位を含有するＥＬＰ成分を指し、式中、Ｘは、相対比率５：２：３のバリン、アラニン、およびグリシンであって、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号：３）の４個の反復単位を含有するＥＬＰ成分を指し、式中、Ｘは、相対比率１：２：１のリシン、バリン、およびフェニルアラニンであって、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号：３）の９個の反復単位を含有するポリペプチドを指し、式中、Ｘは、相対比率１：７：１のリシン、バリン、およびフェニルアラニンであって、ＥＬＰ１［Ｖ１Ａ８Ｇ７−１０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号：３）の１０個の反復単位を含有するＥＬＰ成分を指し、式中、Ｘは、相対比率１：８：７のバリン、アラニン、およびグリシンであって、ＥＬＰ１［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号：３）の５個の反復単位を含有するポリペプチドを指し、式中、Ｘは、排他的に、バリンであって、ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号：３）の２０個の反復単位を含有するポリペプチドを指し、式中、Ｘは、排他的に、バリンであって、ＥＬＰ２［５］は、ペンタペプチドＡＶＧＶＰ（配列番号：４）の５個の反復単位を含有するポリペプチドを指し、ＥＬＰ３［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＩＰＧＸＧ（配列番号：５）の５個の反復単位を含有するポリペプチドを指し、式中、Ｘは、排他的に、バリンであって、ＥＬＰ４［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＬＰＧＸＧ（配列番号：７）の５個の反復単位を含有するポリペプチドを指し、式中、Ｘは、排他的に、バリンである。この段落に説明されるかかるＥＬＰ成分は、本発明と併用され、治療成分の治療特性を増加させ得る。
【００５７】
さらに、Ｔｔは、ゲスト残基の疎水性の関数である。したがって、ゲスト残基の同一性およびそれらのモル分率を変動させることによって、０−１００°Ｃ範囲にわたって逆転移を呈するＥＬＰが合成され得る。したがって、所与のＥＬＰ長さにおけるＴｔは、ＥＬＰ配列における疎水性ゲスト残基のより大きな分率を組み込むことによって、低下されてもよい。好適な疎水性ゲスト残基の実施例は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。中等度に疎水性である、チロシンもまた、使用されてもよい。反対に、Ｔｔは、グルタミン酸、システイン、リシン、アスパラギン酸塩、アラニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グリシン、アルギニン、およびグルタミンから成る群から選択される、好ましくは、アラニン、セリン、トレオニン、およびグルタミン酸から選択されるもの等、残基を組み込むことによって、向上されてもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ＥＬＰ成分は、約３５から約６０°Ｃ、または約３８から約４５°Ｃ等の約１０から約８０°Ｃの範囲のＴｔ（生理学的状態下）を提供するように選択または設計される。いくつかの実施形態において、Ｔｔは、約４０°Ｃを上回る、または約４２°Ｃを上回る、または約４５°Ｃを上回る、または約５０°Ｃを上回る。転移温度は、いくつかの実施形態において、対象または患者の体温を上回り（例えば、＞３７°Ｃ）、それによって、インビボで可溶性のままであって、または他の実施形態において、Ｔｔは、体温を下回り（例えば、＜３７°Ｃ）、治療剤の徐放のための薬物デポーのインビボ形成等の代替利点を提供する。例えば、ＵＳ２００７／０００９６０２を参照されたい（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）。
【００５９】
Ｔｔは、概して、ＭＷの減少に伴って上昇するため、ＥＬＰ成分のＴｔは、可変ＥＬＰ鎖長を変動させることによって、修正され得る。分子量＞１００，０００を有するポリペプチドの場合、Ｕｒｒｙらによって開発された疎水性スケール（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）は、具体的ＥＬＰ配列の概算Ｔｔを予測するための１つの手段を提供する。しかしながら、いくつかの実施形態において、ＥＬＰ成分長は、ＥＬＰ配列に、疎水性ゲスト残基（例えば、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基）のより大きな分率を組み込むことによって、標的Ｔｔを維持しながら、比較的に小さく保つことができる。分子量＜１００，０００を有するポリペプチドの場合、Ｔｔは、以下の二次関数：Ｔｔ＝Ｍ０＋Ｍ１Ｘ＋Ｍ２Ｘ２によって、予測または判定されてもよく、式中、Ｘは、融合タンパク質のＭＷであって、Ｍ０＝１１６．２１、Ｍ１＝−１．７４９９、Ｍ２＝０．０１０３４９である。
【００６０】
ＥＬＰ成分、したがって、治療成分と結合されたＥＬＰ成分のＴｔは、ゲスト残基Ｘの同一性および疎水性によって影響を受けるが、分子の付加的特性もまた、影響を受け得る。かかる特性は、分子の溶解度、生物学的利用能、持続性、半減期、有効性、および安全性を含むが、それらに限定されない。
【００６１】
以下の実施例セクションでは、ＥＬＰ結合ＶＩＰ剤が、ＶＩＰの非融合形態と比較して、有意な量の未変性ＶＩＰの生物学的活性を留保することが分かる。加えて、ＥＬＰが、長半減期を呈することが示される。対応して、ＥＬＰは、本発明にしたがって、治療剤の遊離（非共役）形態の半減期と比較して、ＥＬＰと共役されるＶＩＰの半減期を実質的に増加させる（例えば、具体的実施形態において、１０％、２０％、３０％、５０％、１００％、２００％以上を上回って）ために使用され得る。循環半減期の延長を有する、修飾されたＶＩＰは、週１から約５回、または１から約３回等、週１から約１０回、投与されてもよい。それを含む、修飾されたＶＩＰまたは医薬組成物は、約１日１回、または約１日おき、または約３日おき、または約週１回（すなわち、週１回投薬）投与されてもよい。
共役および結合
【００６２】
本発明のある実施形態による組み換えで生産されたＶＩＰ融合タンパク質は、融合成分（例えば、ＥＬＰ）と、ＶＩＰまたは遺伝子融合によって相互に関連付けられたＶＩＰの類似体と、を含む。例えば、融合タンパク質は、ＶＩＰまたはＥＬＰ成分によってインフレームでクローニングされたＶＩＰの類似体をコードするポリヌクレオチドの翻訳によって、発生されてもよい。
【００６３】
ある実施形態において、ＥＬＰ成分およびＶＩＰまたはＶＩＰの類似体は、種々の長さのリンカーペプチドを使用して融合され、より大きな物理的分離を提供し、融合された部分間の空間移動をより可能にし、したがって、例えば、その同種受容体に結合するために、ＶＩＰまたはＶＩＰの類似体の近接性を最大限にすることができる。リンカーペプチドは、柔軟性またはより剛性である、アミノ酸から成ってもよい。例えば、柔軟性リンカーは、比較的に小さい側鎖を有し、かつ親水性であり得る、アミノ酸を含んでもよい。限定ではないが、柔軟性リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基を含んでもよい。より剛性であるリンカーは、例えば、（限定ではないが）チロシンまたはヒスチジン等のより立体障害のあるアミノ酸側鎖を含有してもよい。リンカーは、約５０、４０、３０、２０、１０、または５個未満のアミノ酸残基であってもよい。リンカーは、例えば、組み換え融合を介して、ＶＩＰまたはＶＩＰの類似体とＥＬＰ成分に、かつそれらの間に共有結合され得る。
【００６４】
リンカーまたはペプチドスペーサは、プロテアーゼ開裂可能または非開裂可能であってもよい。一例として、開裂可能ペプチドスペーサは、限定ではないが、Ｔｅｖ、トロンビン、Ｘａ因子、プラスミン（血液プロテアーゼ）、金属プロテアーゼ、カテプシン（例えば、ＧＦＬＧ、配列番号：４７等）、および他の身体区画に認められるプロテアーゼ等、可変タイプのプロテアーゼ（インビトロまたはインビボ）によって認識されるペプチド配列を含む。開裂可能リンカーを採用するいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、不活性、低活性、または低融合能であってもよく、次いで、スペーサの開裂に応じて、インビボで活性化される。代替として、治療剤が融合として十分に活性である場合、非開裂可能スペーサが、採用されてもよい。非開裂可能スペーサは、例えば、式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ］ｍを有する、非開裂可能スペーサ部分を含む、任意の好適なタイプであってもよく、式中、ｎは、１から４（含有）であって、ｍは、１から４（含有）である。代替として、主鎖ＥＬＰと異なる短ＥＬＰ配列が、必要な効果を達成しながら、リンカーまたはスペーサの代わりに採用され得る。
【００６５】
さらに他の実施形態において、治療剤は、ＥＬＰ成分によって、各末端の側面に位置された治療成分を有する、組み換え融合物である。上記ＥＬＰ成分のうちの少なくとも１つは、治療成分が、不活性であるが、単一ＥＬＰ成分のタンパク質分解除去によって、インビボで活性化されるように、開裂可能スペーサを介して、付着されてもよい。結果として生じる単一ＥＬＰ融合は、活性であって、インビボで半減期（または、本明細書に説明される他の特性）の向上を有する。
【００６６】
他の実施形態において、本発明は、ＶＩＰまたはＶＩＰの類似体およびＥＬＰ成分の化学共役物を提供する。共役物は、当技術分野において周知の任意多くの方法によって、ＥＬＰ成分をＶＩＰまたはＶＩＰの類似体に化学的に結合することによって作成され得る（例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔａｌ．，  ２００５，  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３４：９１−１１８参照）。いくつかの実施形態において、化学共役物は、直接、あるいは短または長リンカー部分を通して、治療タンパク性成分上の１つ以上の官能基、例えば、アミン、カルボキシル、フェニル、チオール、またはヒドロキシル基を通して、ＶＩＰまたはＶＩＰの類似体をＥＬＰ成分に共有結合し、共有結合共役物を形成することによって、形成され得る。例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアナート、カルボジイミド、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド等の種々の従来のリンカーが、使用され得る。
【００６７】
加えて、非ペプチド化学スペーサは、例えば、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．から出版されているＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９５）に説明されている官能性リンカー、およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｏｇｙ，  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手可能なＣｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに規定されているものを含め（その開示は、それらのそれぞれ全体として、参照することによって、本明細書に組み込まれる）、あらゆる好適なタイプであることができる。例証的化学スペーサは、Ｌｙｓのアミン基に付着することができる、ホモ二官能性リンカー、ならびに一方の末端において、Ｃｙｓに、他方の末端において、Ｌｙｓに付着することができる、ヘテロ二官能性リンカーを含む。
【００６８】
ある実施形態において、室温（または、ヒト体温、例えば、Ｔｔ＞３７°Ｃ）で転移しない、比較的に小さいＥＬＰ成分（例えば、約３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ、または１０ｋＤａ未満のＥＬＰ成分）は、化学的に連結される、または架橋結合される。例えば、同一または異なる特性を有する、２つの比較的に小さいＥＬＰ成分は、化学的に結合されてもよい。かかる結合は、いくつかの実施形態において、ＥＬＰのＣ−末端またはその周囲において、単一システイン残基の付与によって、インビボで行われてもよい。かかるＥＬＰ成分はそれぞれ、標的における活性または親和性を増加させるように、１つ以上の治療成分に融合されてもよい。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および生産のための方法
【００６９】
別の態様では、本発明は、本発明の修飾されたＶＩＰをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドはさらに、ＶＩＰまたはＶＩＰ類似体をコードする配列および融合配列に加え、１つ以上の発現制御要素を含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御要素として、１つ以上のプロモーターまたは転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結信号、およびポリアデニル化信号を含んでもよい。ポリヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ．等の発現のための任意の好適な宿主細胞内に含有され得る、任意の好適なベクター内に挿入されてもよい。
【００７０】
概して、ポリヌクレオチドを含むベクターは、治療剤の発現のための細胞中に導入され得る。ベクターは、治療剤をコードする挿入が、転写されることができる限り、エピソーム性のままである、または染色体に組み込まれた状態になることができる。ベクターは、標準的組み換えＤＮＡ技術によって構成され得る。ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス、または原核または真核性細胞における複製および発現のために使用される、当技術分野において周知の任意の他のタイプであることができる。当業者は、プロモーター上へのＲＮＡポリメラーゼの結合を調整する、プロモーターおよび他の配列等の広範囲に及ぶ転写信号を含む、当技術分野において周知の広範囲に及ぶ成分（発現制御要素等）が、かかるベクターに含まれてもよいことを理解するであろう。ベクターが発現される細胞内で有効であることが知られている任意のプロモーターは、治療剤の発現を開始させるために使用され得る。好適なプロモーターは、誘発性または構造性であってもよい。
【００７１】
ある実施形態において、修飾されたＶＩＰは、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の細菌発現系から発現される。Ｅ．ｃｏｌｉは、概して、修飾されたＶＩＰ分子が受容体特異性を維持するように、発現の際、Ｎ−末端メチオニンを除去しないであろう。本発明にしたがって、酵母発現系、哺乳類細胞発現系、およびバキュロウイルス系を含め、他の発現系が採用されてもよい。
【００７２】
治療タンパク質は、ＥＬＰ融合配列を採用する時、逆温度循環によって、復元されてもよい。具体的には、前述のように、ＥＬＰ成分は、可逆的逆相転移を受ける。すなわち、ＥＬＰ成分は、転移温度（Ｔｔ）を下回る場合、構造的に無秩序であって、水に非常に可溶性であるが、温度がＴｔを上回って上昇されると、急激な（２−３°Ｃ範囲）無秩序から秩序への相転移を呈し、ＥＬＰ成分の脱溶媒和および凝集につながる。例えば、ＥＬＰは、遠心分離によって、溶液から容易に除去および単離され得る、十分なサイズに到達すると、不溶性ポリマーを形成する。かかる相転移は、可逆的であって、単離された不溶性ＥＬＰは、温度がＥＬＰのＴｔを下回るように戻ると、緩衝溶液中に完全に再溶解され得る。したがって、本発明の治療剤は、いくつかの実施形態において、逆転移循環手順を使用して、例えば、治療剤の温度依存性溶解度、または媒体への塩付加を利用して、他の汚染タンパク質から高純度に分離され得る。連続逆相転移サイクルは、高純度を得るために使用され得る。温度およびイオン強度に加え、治療剤の逆転移を変調するために有用な他の環境変数として、ｐＨ、無機および有機溶質ならびに溶媒の添加、側鎖イオン化または化学修飾、および圧力を含む。
医薬組成物および投与の方法
【００７３】
本発明はさらに、効果的量の本発明の修飾されたＶＩＰ（前述のように）とともに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、本明細書に説明されるように、例えば、自己免疫または炎症疾患を治療あるいは寛解するために有効である。
【００７４】
本発明の治療剤は、それ自体で、ならびに薬学的に許容可能なエステル、塩、およびそれらの他の生理学的官能性誘導体を含む、種々の形態で投与されてもよい。かかる医薬製剤では、治療剤は、単独で、または（抗炎症剤または免疫抑制剤等の他の治療原料とともに使用される（それとともに調合されることを含む）ことができる。
【００７５】
担体は、製剤の他の原料との適合性の観点から、薬学的に許容可能であって、それらの受容体に過度に有害となってはならない。
【００７６】
治療剤の製剤は、非経口ならびに経口投与のために好適なものを含む。例示的投与モダリティは、とりわけ、経口、頬、局所、経鼻、皮下、筋肉内、および静脈内を含む。非経口投与のための好適な製剤が、好ましい。
【００７７】
本発明の治療剤を含む製剤は、便宜上、単位用量形態として存在してもよく、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。かかる方法は、概して、治療剤を１つ以上の付属原料を形成する担体と結び付けるステップを含む。典型的には、製剤は、均一かつ密接に治療剤を液体担体、微粉化された固体担体、または両方と結び付け、次いで、必要に応じて、生成物を所望の製剤の用量形態に成形することによって、調製される。
【００７８】
非経口投与のために好適な製剤は、便宜上、好ましくは、レピシエントの血液と等浸透圧である、治療剤の滅菌水溶液調製を含む（例えば、生理食塩水）。かかる製剤は、循環または１つ以上の器官に治療剤を標的化するように設計される、懸濁剤および濃化剤または他の微粒子系を含んでもよい。製剤は、単回投薬または複数回投薬形態として存在してもよい。
【００７９】
前述の原料に加え、本発明の製剤はさらに、希釈剤、緩衝剤、香味剤、崩壊剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存料（抗酸化物質を含む）等から選択される、１つ以上の付属原料を含んでもよい。
【００８０】
当業者は、各場合において（デポー投与のための単位用量を含む）望ましい用量を判定することができるが、治療利点を達成するための治療剤の好適な用量は、例えば、レピシエントの体重１キログラムあたり約１マイクログラム（μｇ）から約１００ミリグラム（ｍｇ）の範囲内、または体重１キログラムあたり約１０μｇから約５０ｍｇの範囲内、または体重１キログラムあたり約１０μｇから約１０ｍｇの範囲内であってもよい。所望の用量は、投薬周期（例えば、１週間、２週間等…）を通して、適切な間隔において投与される、単回用量または２回以上のサブ用量として存在してもよい。これらのサブ用量は、例えば、単位用量形態あたり約１０μｇから約５００ｍｇ、または約５０μｇから約２００ｍｇ、または約５０μｇから約１００ｍｇの活性原料を含有する、単位用量形態で投与されることが可能である。代替として、レピシエントの状態がそのように要求する場合、用量は、継続注入として投与されてもよい。
【００８１】
投与のモードおよび用量形態は、当然ながら、所与の治療用途に望ましく、かつ有効である、ペプチド活性治療剤の治療量に影響を及ぼすであろう。例えば、経口的に投与される用量は、非経口投与方法において使用される用量レベルの少なくとも２倍、例えば、２−１０倍である可能性がある。デポー製剤はまた、剤が経時的徐放を有するように、有意により多くの治療剤が送達されることを可能にするであろう。
【００８２】
正常な個人の血漿中に循環するＶＩＰは、胃腸管内のＶＩＰ含有神経線維から生じ、かつ、脈管神経からのペプチド溢流を反映する（Ｃｕｇｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｒｅｇ  Ｐｅｐｔ  ３４：１４１−８）。大部分の血管作動性タンパク質のように、ＶＩＰは、比較的に短い半減期を有する。血液中のＶＩＰの半減期は、２分未満である（Ｄｏｍｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８、Ｇｕｔ  １９：１０４９−５３；  Ｂｕｒｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ  １３：８０７−８１３）。本明細書に説明される修飾されたＶＩＰの利点の１つは、体内における半減期または持続性の延長である。本発明のある実施形態によると、ＶＩＰは、週１から約５回、または１から約３回等、週１から約１０回、投与されてもよい。それを含む、修飾されたＶＩＰまたは医薬組成物は、約１日１回、または約１日おき、または約３日おき、または約週１回、投与されてもよい。
【００８３】
ある実施形態において、修飾されたＶＩＰは、皮下または筋肉内注射によって、非経口投与される。投与は、本明細書に説明されるように、修飾されたＶＩＰの単位用量であってもよい。
【００８４】
修飾されたＶＩＰは、非経口投与されると、１日１回、または週１回または２回、または月１回から５回、投与されてもよい。これらの実施形態において、修飾されたＶＩＰは、本明細書に説明されるように、循環中に存続する、可溶性融合ペプチドとして投与され、比較的低頻度投与によって、持続的活性を提供してもよい。修飾されたＶＩＰは、同様に本明細書に説明されるように、薬物デポーとして投与され、経時的に、循環中に融合ペプチドの徐放を提供してもよい。参照することによって、本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００７／０００９６０２を参照されたい。
使用の方法
【００８５】
他の態様では、本発明は、哺乳類における状態を治療、寛解、または防止する方法を提供する。かかる状態は、種々の心臓血管、免疫系（例えば、自己免疫）、および神経系状態を含む。例えば、修飾されたＶＩＰは、自己免疫疾患または炎症状態に罹患する患者を含む、患者において、炎症誘発性と抗炎症性エフェクタとの間の均衡を調節するために使用されてもよい。修飾されたＶＩＰに対する例示的適応症は、とりわけ、高血圧症、心筋線維症、心不全、心筋症、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、パーキンソン病、脳外傷、およびぜんそくを含む。
【００８６】
したがって、本発明は、自己免疫または炎症によって特徴付けられる状態を含む、種々の状態を治療するための方法を提供する。方法は、本発明の有効量の修飾されたＶＩＰをそれを必要とする患者に投与することを含む。
高血圧症
【００８７】
本明細書に説明される種々の実施形態において、本発明は、有効量の修飾されたＶＩＰを投与することを含む、それを必要とする患者における高血圧症を治療または防止する方法を提供する。本発明の修飾されたＶＩＰによって治療可能な高血圧症の形態は、肺高血圧症、制御不良本態性高血圧症、および抵抗性高血圧症を含む。
【００８８】
肺高血圧症は、比較的稀であるが、進行性肺動脈高血圧症ならびにより小さい肺動脈および細動脈の増加した厚さによって特徴付けられ、右心（ＲＶ）不全に至らせる、高度致死病である（Ｓａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１５：１２６０−８）。ＶＩＰは、肺および体循環と関連している。肺血管床およびその肺高血圧症の変化に対して、ＶＩＰは、いくつかの哺乳類種の肺血管平滑筋をインビトロで弛緩させ、エンドセリンおよび他の血管収縮の作用を無力化または軽減し、低酸素性肺血管収縮を低減させ、肺高血圧症患者の肺血管平滑筋の増殖を阻害する。さらに、ＶＩＰは、肺血管平滑筋弛緩の生理学的非アドレナリン、非コリン系の共存伝達物質である。さらに、ＶＩＰ含有神経は、通常、肺動脈に豊富であるが、肺高血圧症患者の肺動脈には存在せず、ペプチドの吸入が、それらの患者に有益な治療効果を及ぼしたことが報告されている（Ｐｅｔｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１１：１３３９−１３４６）。最後に、研究は、ＶＩＰ−／−マウスにおけるＶＩＰ補充療法が、肺高血圧症において重要となる病理変化の進行を防止または少なくとも減速させることが可能であることを示した（Ｓａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１５：１２６０−８）。したがって、肺高血圧症患者へのＶＩＰの適用は、疾患の血液動態および予後パラメータの実質的改善をもたらすことが期待される可能性がある（Ｐｅｔｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１１：１３３９−１３４６）。
【００８９】
制御不良本態性高血圧症は、血圧が一貫して正常値より高く、高血圧の原因が見出され得ない。本態性高血圧症は、最も一般的高血圧症タイプであって、高血圧症患者の９０−９５％に影響を及ぼしており（Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１：３２９−３５）、  専門家らは、いくつかの未発見要因によって生じていると考えている。ＶＩＰの濃度は、発作誘発性本態性高血圧症ラットでは、低下しており（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊｐｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  ３４：７８５−９４）、ヒトＶＩＰと立体的に安定化したリポソームの併用によって、自然発生高血圧ハムスターにおいて、全身動脈血圧を正常化することができる（Ｏｎｙｕｋｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２７：２２７１−５）。
【００９０】
抵抗性高血圧症は、治療に応答しない、高血圧の形態である（すなわち、薬物の組み合わせが投与される場合でも、血圧は、高いままである）。血圧制御不良の原因は、多数ある。最も可能性のある原因は、過剰なナトリウム摂取、薬物への不耐性、服薬不履行、および二次性高血圧症のいずれかによる循環血液量の増加である（Ｇｒａｖｅｓ  ＪＷ，  ２０００，  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃ  ７５：２７８−８４）。潜在的全身血管拡張剤として、ＶＩＰは、抵抗性高血圧症の顕著な特徴を生産する患者において、高血圧症の治療および防止のための有用性を有する。
心臓病
【００９１】
付加的実施形態において、本発明は、有効量の修飾されたＶＩＰを投与することを含む、それを必要とする患者における心臓病を治療または防止する方法を提供する。本発明の修飾されたＶＩＰによって治療可能な心臓病の形態は、心筋線維症、心不全、および心筋症を含む。
【００９２】
心臓におけるＶＩＰの合成および分泌の変化は、心不全および心筋線維症等のいくつかの疾患の病因に役割を果たすと考えられる（Ｄｖｏｒaｋｏｖa  ＭＣ，  ２００５，  Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  １８：３８７−９１）。例えば、ＶＩＰの濃度は、心筋症患者の組織および心不全の動物モデルの心臓組織の両方において、有意に低下される（Ｕｎｖｅｒｆｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｊ．  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １０８：１１−１６）。さらに、ＶＩＰの減成は、線維症を伴う心臓において増加し、その結果、心筋ＶＩＰ濃度が低下する。したがって、減少したＶＩＰは、疾患の病因における重要な要因であると考えられ（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  １７９：３５３−６０）、低下したＶＩＰ濃度は、心不全の進行性悪化と関連付けられる。ＶＩＰの代謝クリアランス速度を低下させることが知られている、バソペプチダーゼ阻害薬オマパトリラトの使用は、対照と比較して、収縮期血圧の低下、ならびに心筋線維症の減少をもたらした（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４８５：２３５−４２）。ＶＩＰの防止効果もまた、虚血性および再潅流心筋において報告された（Ｋａｌｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２６８：９５２−８）。したがって、本発明の修飾されたＶＩＰの適用は、心不全、心筋症、および心筋線維症を含む、種々の病理学的状態において、有益な効果を有すると期待され得る。
２型真性糖尿病
【００９３】
付加的実施形態において、本発明は、有効量の修飾されたＶＩＰを投与することを含む、それを必要とする患者に、糖尿病を治療または防止する方法を提供する。具体的には、本発明の修飾されたＶＩＰは、２型真性糖尿病の治療および防止のための有用性を有する。
【００９４】
研究は、糖尿病ラットの胃洞および十二指腸のＶＩＰ含有量が、正常ラットのものより有意に低いことを示している（Ｇｏｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １８：６２３−６４０）。胃十二指腸管におけるＶＩＰの低組織レベルは、糖尿病患者において観察された異常消化管運動性に、部分的に寄与し得る（Ａｄｅｇｈａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ａｒｃｈ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｃ  １０９：２４６−５１）。ＶＩＰは、インスリノーマ細胞、マウス膵島、および潅流ラット膵臓からのインスリン分泌を刺激する。ＶＰＡＣ１の活性化は、グルコース生産の向上に関与している（Ｇｏｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １８：６２３−６４０）一方、ＶＩＰ受容体ＶＰＡＣ２は、膵島β−細胞内に発現され、その活性化は、循環ＡＭＰの向上およびインスリン分泌の刺激を生じさせる（ＤｅＳｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８：３６１−７）。さらに、ＶＩＰは、ヒトにおけるグルカゴン分泌を刺激し、肝臓からのグルコース放出をもたらす。統合すると、これらの研究は、ＶＩＰが、グルコース代謝に広範囲に及ぶ直接的効果を有することを明らかにする。故に、ＶＩＰおよび本明細書に開示される融合ペプチド等の修飾された形態のＶＩＰは、２型糖尿病の治療および防止のために有用な療法であることが期待され得る。
ＶＰＡＣ２受容体選好性
【００９５】
いくつかの実施形態において、修飾されたＶＩＰが、非修飾ＶＩＰと比較して、ＶＰＡＣ２に対してより高い選好性を有する場合等、修飾されたＶＩＰは、患者において、遅延型過敏性反応等、炎症応答を減少させ得る。いくつかのかかる実施形態において、修飾されたＶＩＰは、自己反応性Ｔ−細胞の発達を低減させる。これらの実施形態において、患者は、関節炎（ＲＡを含む）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病）、１型糖尿病、多発性硬化症、移植拒絶反応、シェーグレン症候群、膵炎、ぶどう膜網膜炎、角膜炎、および敗血性ショック等、ＴＨ１型炎症またはＴＨ１自己免疫によって定義される、１つ以上の状態を有し得る。
ＶＰＡＣ１受容体選好性
【００９６】
いくつかの実施形態において、修飾されたＶＩＰが非修飾ＶＩＰと比較して、ＶＰＡＣ１に対してより高い選好性を有する場合等、修飾されたＶＩＰは、患者において、遅延型過敏性反応等、ＴＨ１炎症応答を助長し得る。これらの実施形態において、患者は、ぜんそくまたは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等のＴＨ２免疫と関連付けられた１つ以上の状態を有し得る。
【００９７】
ＣＯＰＤは、先進工業国における個人の８％にも影響を及ぼしている、気道の慢性炎症疾患である。ＣＯＰＤに罹患する女性および男性の数が増加している。肺高血圧症は、慢性気道閉塞の一般的症状であるが、増加した血管抵抗の正確な機構は、不明である。ＣＯＰＤにおける肺高血圧症の潜在的原因は、毛細血管床の気腫性破壊、肺血管のリモデリング、および低酸素性肺血管収縮を含む。
【００９８】
ＶＩＰは、気道に認められる最も豊富な分子のうちの１つである。その抗炎症性および気管支拡張特性によって、ＣＯＰＤおよびぜんそくのための新規治療として提案されている。ＶＰＡＣ１上方調整が優勢であるが、両ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２が、最適な抗炎症性信号伝達のために必要である（Ｂｕｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３１：６０３−８）。故に、ＶＩＰおよび本明細書に開示される融合ペプチド等の修飾された形態のＶＩＰによる治療は、ＣＯＰＤおよびぜんそく患者の肺における慢性炎症を低減させるのに有用であることが期待され得る。
【００９９】
本発明はさらに、限定として解釈されるべきではない、以下の実施例によって例証される。本願全体を通して引用される、すべての参考文献、特許、および公開特許出願の内容は、図面とともに、あらゆる目的に対して、参照することによって、全体として、本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１００】
実施例１
ＶＩＰ−ＥＬＰ構成物のクローニング
【０１０１】
ＶＩＰペプチドに対するＤＮＡ配列は、Ｓｉｍｏｎｃｓｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｅｌｏｎｇａｔｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８８，  １７８（２）：３４３−３５０、あらゆる目的に対して、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）に説明されるようなものであるが、残基１７は、未変性メチオニンであって、説明されるＣ−末端伸張のいずれも有しなかった（配列番号１６参照）。
【０１０２】
２つの初期変異体を生成し、１つは、必要とされるＡＴＧ開始コドンによって、Ｎ−末端にメチオニンを伴い（ＰＢ１０４６、配列番号１７）、１つは、Ｎ−末端にトリペプチドＭＡＡを伴う（ＰＢ１０４７、配列番号１８）ものとした。ＰＢ１０４６上のメチオニンは、通常、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡ）によって除去されるが、ヒスチジンは、第２残基であって、ＭＡに対するこの位置において、最も好ましくないアミノ酸のうちの１つであるため、メチオニンは、除去されない。ＰＢ１０４７上のメチオニンを除去し、ＡＡを残し、次いで、ＤＰＰＩＶによって、インビトロまたはインビボで除去し、Ｎ−末端残基として、ヒスチジンを得ることができる。ＥＬＰ１−１２０  ＤＮＡ配列を担持する、ＶＩＰ  ＤＮＡ配列をベクターｐＰＢ１０３１（図３参照）にクローニングし、Ｔ７プロモーターの制御下、発現カセットを得た。
【０１０３】
合成オリゴヌクレオチドＰ００４５（配列番号３１）、Ｐ００４８（配列番号３２）、Ｐ００６４（配列番号３３）、およびＰ００６５（配列番号３４）をともにアニールし、制限酵素ＸｂａＩで消化し、制限酵素ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化し、発現プラスミドｐＰＢ１０４６を得た、プラスミドｐＰＢ１０３１に結合した（図４参照）。
【０１０４】
合成オリゴヌクレオチドＰ００６６（配列番号３５）、Ｐ００６４（配列番号３３）、Ｐ００６７（配列番号３６）、およびＰ００６５（配列番号３４）をともにアニールし、制限酵素ＸｂａＩで消化し、制限酵素ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化し、発現プラスミドｐＰＢ１０４７を得た、プラスミドｐＰＢ１０３１に結合した（図５参照）。
【０１０５】
加えて、Ｎ−末端が活性のための絶対的要件ではないと仮定して、Ｃ−末端融合は、ｐＰＢ１０４８もまた、生成した（図６参照）。合成オリゴヌクレオチドＰ００６８（配列番号３７）およびＰ００６９（配列番号３８）をともにアニールし、制限酵素ＢｇｌＩ／ＮｈｅＩで消化し、発現プラスミドｐＰＢ１０４８を得た、プラスミドｐＰＢ１０３１に結合した。
実施例２
ＶＩＰ−ＥＬＰ構成物の発現
【０１０６】
Ｅ．ｃｏｌｉ生産菌株ＢＬＲ（Ｎｏｖｏｇｅｎ）を、プラスミドｐＢ１０４６、ｐＰＢ１０４７、およびｐＰＢ１０４８で形質転換し、振とうフラスコ内において、３７℃で、一晩かけて、富栄養培地で成長させた。細胞ペレットを、ＴＥｐＨ８．０緩衝剤に再懸濁させ、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通して溶解し、遠心分離し、ＮａＣｌの３Ｍへの添加による「転移」（参照）によって、結果として生じる可溶性溶解物から精製された不溶性材料および生成物を除去した。試料をさらに２回の転移に通し、最終精製試料を得た。これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＰＢ１０４６ならびにＰＢ１０４７は、２つのバンドを得たことが認められた（図７参照）。これは、タンパク質分解の結果であると仮定し、培養物を再び成長させたが、今回は、溶解前に、１５分間、６０℃まで加熱した。１０％  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ＮｕＰＡＧＥゲルによる分析は、タンパク質分解が阻害されたことを示した（図７参照）。
【０１０７】
タンパク質分解は、分解がＣ−末端融合ＰＢ１０４８上で見られなかったため、ペプチド内と、可能性として、ペプチドとＥＬＰの接合部近傍で生じた可能性が最も高い。そのタンパク質分解は、細胞質プロテアーゼ、あるいは溶解に応じて、活性化された、または異なって挙動する、細胞質プロテアーゼよりも、ペリプラスムプロテアーゼに関与する傾向にあるであろう、細胞の溶解前のプロテアーゼの熱変性によって防止され得る。
実施例３
修飾されたＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質のインビトロ活性
【０１０８】
ＶＩＰまたはＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質のインビトロ生物学的活性および有効性を測定するために、細胞ベースのバイオアッセイを使用した。アッセイは、ヒト血管作動性腸管ペプチド受容体２（ＶＰＡＣ２）またはヒト血管作動性腸管ペプチド受容体１（ＶＰＡＣ１）のいずれかを発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、ＶＩＰまたはＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質による治療に応答して、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）濃度の増加を測定する。両ＶＩＰおよびＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質は、これらの細胞において、ｃＡＭＰの生産を刺激することができ、融合タンパク質が、受容体を結合し、活性化する能力を留保することを示す。受容体媒介リガンド結合および活性化後の細胞内のｃＡＭＰ蓄積量は、存在する無傷ペプチドまたは融合タンパク質の量に直接比例するため、アッセイは、生体活性および相対的有効性を判定するために使用することができる。
【０１０９】
本実施例では、ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１０４６ならびにＰＢ１０４７の活性を試験した。構成物ＰＢ１０４６は、Ｎ−末端にＭｅｔを伴うＶＩＰを含有し、構成物ＰＢ１０４７は、そのＮ−末端にＡｌａ−Ａｌａを伴うＶＩＰを含有する。両構成物は、それらのＣ−末端にＥＬＰ（１−１２０）を有する。第１の実験では、構成物の活性を、ＶＩＰ受容体ＶＰＡＣ２を発現するＣＨＯ細胞を使用して試験した。細胞による種々の濃度の融合タンパク質の培養の３０分後、細胞を溶解し、生産されたｃＡＭＰの量を、市販のキットを使用して、測定した。ＰＢ１０４７は、細胞への添加に先立って、ＤＰＰ−ＩＶ処理された。図８は、その結果を示す。示されるように、修飾されたＶＩＰ融合タンパク質ＰＢ１０４６は、未変性ＶＩＰタンパク質より幾分活性である一方、ＰＢ１０４７は、活性が少ない。
【０１１０】
ＰＢ１０４６ならびにＰＢ１０４７の活性はまた、ＶＩＰ受容体ＶＰＡＣ１を発現するＣＨＯ細胞を使用して試験した。細胞による種々の濃度の融合タンパク質の培養の３０分後、細胞を溶解し、生産されたｃＡＭＰの量を、市販のキットを使用して、測定した。ＰＢ１０４７は、細胞への添加に先立って、ＤＰＰ−ＩＶ処理された。図９は、その結果を示す。今回、修飾されたＶＩＰ融合タンパク質ＰＢ１０４６は、未変性ＶＩＰタンパク質より遥かに活性が少ない一方、未変性ＶＩＰに対するＰＢ１０４７の相対的活性は、ＶＰＡＣ２受容体に対する試験のものと略同一である。これらの結果は、ＰＢ１０４６が、ＶＰＡＣ１受容体よりＶＰＡＣ２受容体を選択的に活性化させることを示唆する。
実施例４
ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質の血圧効果
【０１１１】
修飾されたＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１０４７の活性もまた、インビボで試験した。具体的には、血圧に及ぼすＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質の効果を試験した。自然発生高血圧ラットを、ＰＢ１０４７（１０ｍｇ／ｋｇ）または緩衝対照で皮下処理し、それらの血圧を、融合タンパク質の投与後、いくつかの時点で測定した。各群に対して、５匹の動物を使用し、グラフは、平均および標準偏差を示す。ＰＢ１０４７は、投与後少なくとも１２時間の間、これらの動物において、収縮期および拡張期血圧を有意に低下させ（図１０参照）、ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質が活性であって、ＶＩＰ関連疾患の治療における医薬品として、潜在的に使用される可能性があることを示した。
実施例５
付加的ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質
【０１１２】
ＰＢ１０４７のＤＰＰＩＶ治療は、Ｎ−末端から両ＡＡおよびＨＳの除去ならびにペプチドの不活性化をもたらした。したがって、プラスミドｐＰＢ１０６４は、ＨＧが、ＨＳよりＤＰＰ  ＩＶに対して抵抗性があるため、Ｎ−末端が、ＭＡＡＨＳ、配列番号：４６の代わりに、ＭＡＡＨＧ、配列番号：４５に変更されるように構成される。
【０１１３】
プラスミドｐＰＢ１０５６はまた、ＶＰＧＸＧ、配列番号：３に基づいて、逆帯電したリンカー（配列番号２０）によって、ＶＩＰをコードし、ＥＬＰ前で反復するように構成される。
実施例６
付加的ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０のクローニング、発現、および分析
【０１１４】
ＶＩＰ  ＤＮＡ配列をＥＬＰ１−１２０  ＤＮＡ配列を担持するベクターｐＰＢ１１２０（配列番号：４８）（図１１参照）にクローニングし、Ｔ７プロモーターの制御下、発現カセットを得た。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ生産菌株ＢＬＲを、前述のように、ｐＰＢ１１２０プラスミドによって形質転換し、富栄養培地で成長させた。結果として生じるＶＩＰ−ＥＬＰ１−１２０融合ペプチドＰＢ１１２０の試料を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析した。
【０１１５】
ＰＢ１１２０融合ペプチドの活性を、インビトロで試験した。実施例３に前述のように、ＶＩＰ受容体（ＶＰＡＣ１）を発現するＣＨＯ細胞を利用したアッセイを使用して、活性を試験した。図１２が実証するように、ＰＢ１１２０は、ＶＰＡＣ１受容体上の未変性ＶＩＰペプチドより約１．４倍活性が低かった。比較すると、Ｎ−末端メチオニン残基を含有する構成物ＰＢ１０４６は、未変性ＶＩＰペプチドより約１１倍活性が低かった。複数の実験の過程にわたって、ＰＢ１１２０は、ＶＰＡＣ１受容体上の未変性ＶＩＰペプチドより１．４から６倍活性が低かった。
【０１１６】
図１３は、ＶＰＡＣ２受容体に対するＰＢ１１２０の活性を例証する。ＶＰＡＣ１受容体に対して見られた結果同様に、ＰＢ１１２０は、ＶＰＡＣ２に対する未変性ＶＩＰペプチドより若干低い活性を示す（約１．５倍未満）。しかしながら、ＶＰＡＣ１に関して見られた結果と対照的に、ＰＢ１０４６は、未変性ペプチドと比較して、ＶＰＡＣ２に対して等しい効力を有した。複数の実験の過程にわたって、ＰＢ１１２０は、ＶＰＡＣ２受容体上の未変性ＶＩＰペプチドより１．５から７倍活性が低かった。
実施例７
修飾されたＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０の薬物動態プロファイル
【０１１７】
前述の生物学的有効性アッセイに加え、ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０の薬物動態プロファイルもまた、検証した。サルに、ＰＢ１１２０の単回皮下（ＳＣ）注射（３ｍｇ／ｋｇで投薬）を与え、血漿薬物濃度を、１週間にわたって、毎日測定した。３匹の動物を使用し、グラフは、平均および標準偏差を示す。ＰＢ１１２０の初期用量の半分以上が、第４日目まで循環中に残留した（図１４Ａおよび１４Ｂ参照、それぞれ、線形および片対数軸を使用して、ＳＣ投与後のＰＢ１１２０の平均血漿濃度を例証する）。
【０１１８】
このデータに基づいて、投与部位からの緩慢な吸収に一致して、ＰＢ１１２０の皮下投与後の吸収相が延長されたと考えられる。明白な消失半減期（ｔ1/2）は、血漿濃度の減衰に基づいて、９．９から４５．８時間の範囲に及んでおり、真の消失より緩慢な吸収を反映している可能性が高い。これらのデータは、ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質が、未変性ＶＩＰと比較して、劇的半減期の延長を有し、潜在的に、間隔を延長して投与することができることを示す（例えば、約１日１回、約１日おき、約３日おき、または約週１回、投与されてもよい）。
実施例８
血圧に及ぼす修飾されたＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０の効果
【０１１９】
収縮期、拡張期、および平均動脈血圧に及ぼす修飾されたＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０の効果を測定するために、ラットに、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇのＰＢ１１２０の単回皮下注射を与え、３時間間隔にわたって評価した。図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、それぞれ、収縮期、拡張期、および平均動脈圧における平均変化を示す。図１５Ｄは、ＰＢ１１２０の投与後の３時間間隔にわたる平均心拍数を示す。図１５Ａ−Ｃが実証するように、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＰＢ１１２０を注射されたラットは、注射９時間後、収縮期、拡張期、および平均動脈圧に有意な低下を示し、ＶＩＰ−ＥＬＰ融合タンパク質ＰＢ１１２０が、潜在的に、罹患した個人において、高血圧症を治療または防止する目的のために投与され得ることを示す。
【０１２０】
別様に定義されない限り、本明細書のすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同一意味を有する。本明細書に説明されるものと類似または同等のあらゆる方法および材料が、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が、本明細書に説明される。引用されるすべての刊行物、特許、および特許公開は、あらゆる目的に対して、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
本明細書に論じられる刊行物は、本願の出願日に先立つそれらの開示に対してのみ提供される。本発明は、本発明が、先行発明を理由として、かかる刊行物に先行する権利が与えられないことの承認として、いかようにも解釈されるものではない。
【０１２２】
本発明は、その具体的実施形態と関連して説明されたが、さらなる修正も可能であって、本願は、一般に、本発明の原理に従う、本発明のあらゆる変形例、使用、または適応を網羅することを意図し、本発明が属する当技術分野において周知または慣行の範囲内であって、前述および後続の添付の請求項の範囲内の本質的特徴に適用され得る、本開示からの逸脱も含むことを理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【配列表】
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