(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類の生細胞に有効量のＵＶ光を照射する工程と、少なくとも２０回の継代の後に増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する工程とを含む連続細胞系の生成方法。
【請求項２】
前記ＵＶ光の波長が２００ｎｍ〜３００ｎｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＵＶ光の照射量が少なくとも５０ｍＪ／ｃｍ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＵＶ光の照射量が３００ｍＪ／ｃｍ２までである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選択する工程が、少なくとも４０回の継代の後に前記細胞を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、表面に接着しているか、または懸濁されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が胚の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、１を超える型の組織の混合培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が単層にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルス増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を許容する条件下で、前記選択された細胞にウイルスを感染させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルスおよびブニヤウイルスから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが、ＭＶＡ、ＴＢＥウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、ニューカレドニアウイルスまたはインフルエンザウイルスから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記選択された細胞に、組換え遺伝子産物をコードする核酸を、前記組換え遺伝子産物の生成を許容する条件下で形質移入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞系の細胞が、無血清培地中での成長に適応されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地が、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ'ｓ  Ｆ１２、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ウェイマウ
ス培地、オリゴペプチド非含有培地、既知組成培地またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞系の細胞が、非腫瘍原性および／または非癌原性であることについて選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＣＡＣＣに寄託受託番号０８０２０６０２、０８０２０６０３または０８０２０６０４で寄託された細胞系。
【請求項１９】
前記ウイルスを回収する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子産物を回収する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞系を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞系は、ワクチン製造のための有用なツールになっている。いくつかの重要なワクチンおよびウイルスベクターの生成は、有胚ニワトリ卵または初代ニワトリ胚線維芽細胞にていまだに行われている。ウイルス複製のための初代鳥類組織は、ＳＰＦ（特定病原体除去）生成プラントにより提供される。ＳＰＦ由来組織は高価であり、供給材料の品質は、しばしば制御が困難である。よって、供給が不安定でかつ不足することがＳＰＦ卵に基づく技術の最も大きな短所である。初代線維芽細胞単層培養物を用いるアプローチについても同じことが言える。細胞系を無限に増やす（ｍｕｌｔｉｐｌｙ）ためには、細胞を不死化させる必要がある。現在最も用いられている不死化細胞系は、癌細胞または融合ハイブリドーマ細胞の子孫である。しかし、最近の技術は、骨髄腫細胞との融合に限定されている。種々の型の不死化細胞を作製できる普遍的な技術は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、非連続細胞材料から連続細胞を生成することである。特に、外来ウイルス遺伝子を導入することなく増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）する能力を有する連続細胞系を提供することが目標であった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
よって、本発明は、動物またはヒトの生細胞を提供することと、前記細胞にＵＶ光を照射することと、前記細胞を増殖させることと、少なくとも２０回の継代の後に増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択することとを含む、連続細胞系の生成方法を提供する。
【０００５】
このような連続細胞系は、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）でき、タンパク質などの生体分子の組換え発現のため、またはウイルス抗原もしくはウイルス全体の集団のような特にワクチン接種目的のためのウイルス産物の製造のために用いることができる細胞の培養物である。
【０００６】
よって、本発明は、本発明の方法により得ることができる連続細胞系の細胞を提供することと、前記細胞に前記ウイルスを感染させることと、前記ウイルスを前記細胞内で増殖させることと、前記ウイルスを回収することとを含む、ウイルスを生成する方法も提供する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、本発明の方法により得ることができる連続細胞系の細胞を提供することと、前記細胞に組換え遺伝子産物をコードする核酸で形質移入することと、前記組換え遺伝子産物を発現させることと、前記遺伝子産物を所望により回収することとを含む、前記組換え遺伝子産物を生成する方法を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、動物またはヒトの生細胞を提供し、前記細胞に有効量のＵＶ光を照射し、前記細胞を増殖させ、少なくとも２０回の継代の後に増殖できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する方法により得ることができる連続細胞系を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
動物またはヒトの生細胞に有効量のＵＶ光を照射する工程と、少なくとも２０回の継代の後に増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する工程とを含む連続細胞系の生成方法。
（項目２）
前記細胞に、１０ｎｍ〜４００ｎｍの間の波長のＵＶ光を照射する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記波長が２００ｎｍ〜３００ｎｍの間である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＵＶ光の照射量が少なくとも５０ｍＪ／ｃｍ２である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＵＶ光の照射量が３００ｍＪ／ｃｍ２までである、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記細胞が鳥類または哺乳類の細胞である、項目１に記載の方法。
（項目７）
少なくとも４０回の継代を含む前記細胞を選択する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記細胞が、表面に接着しているか、または懸濁されている、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記細胞が胚の細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が、１を超える型の組織の混合培養物である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞が内皮細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞が単層にある、項目１に記載の方法。
（項目１３）
ウイルスを生成する方法であって、項目１に記載の前記細胞に、前記ウイルスを、ウイルス増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を許容する条件下で感染させる工程と、前記ウイルスを回収する工程とを含む方法。
（項目１４）
前記ウイルスが、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルスおよびブニヤウイルスから選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ウイルスが、ＭＶＡ、ＴＢＥウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、ニューカレドニアウイルスまたはインフルエンザウイルスから選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
組換え遺伝子産物を生成する方法であって、項目１に記載の細胞に、前記組換え遺伝子産物をコードする核酸を、前記組換え遺伝子産物の生成を許容する条件下で形質移入する工程と、前記遺伝子産物を所望により回収する工程とを含む方法。
（項目１７）
前記細胞系の細胞が、無血清培地中での成長に適応されている、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記培地が、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ'ｓ  Ｆ１２、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ウェイマウ
ス培地、オリゴペプチド非含有培地、既知組成培地またはそれらの組み合わせから選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞系の細胞が、非腫瘍原性および／または非癌原性であることについて選択される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
動物またはヒトの生細胞を提供し、前記細胞にＵＶ光の有効用量を照射し、前記細胞を増殖させ、少なくとも２０回の継代の後に増殖できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する方法により得ることができる連続細胞系。
（項目２１）
前記ＵＶ光の有効用量が少なくとも５０ｍＪ／ｃｍ２である、項目２０に記載の細胞系。
（項目２２）
前記ＵＶ光の有効用量が３００ｍＪ／ｃｍ２までである、項目２０に記載の細胞系。
（項目２３）
ＥＣＡＣＣに寄託受託番号０８０２０６０２、０８０２０６０３または０８０２０６０４で寄託された細胞系。
（項目２４）
前記細胞系の細胞が非腫瘍原性および／または非癌原性である、項目２０に記載の細胞系。
（項目２５）
前記細胞系の細胞が固体表面で培養できるかまたは懸濁液で培養できる、項目２０に記載の細胞系。
（項目２６）
前記細胞系の細胞が無血清培地で培養できる、項目２０に記載の細胞系。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＵＶ処理手順のスキームを示す。
【図２】図２は、連続ウズラ細胞培養物を示す。
【図３】図３は、系統樹と、連続ウズラ細胞系を生成する処理経路とを示す。
【図４】図４は、連続細胞を生成するために用いる設定での照射時間に対するＵＶ照射量（ＵＶ  ｄｏｓａｇｅ）の相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、細胞のＵＶ処理による連続細胞系の生成を提供する。
【００１１】
細胞系は、初代細胞培養物からの１つまたは複数の継代培養物により形成される細胞の集団である。継代培養の各ラウンドは、継代という。細胞が継代培養される場合、これらは継代されたという。細胞の特定の集団または細胞系は、それが継代された回数で特徴付けることができる。初代培養物は、組織からの細胞の単離の後の最初の培養物である。最初の継代培養の後に、細胞は、２次培養物（１回の継代）と記載される。２番目の継代培養の後に、細胞は３次培養物（継代２）になり、以下同様である。継代の期間中に、多くの集団倍加があり得ることが当業者により理解される。よって、培養物の集団倍加の数は、継代数よりも大きい。継代間の期間中の細胞の増殖（すなわち集団倍加の数）は、それらに限定されないが播種密度、基質、培地、成長条件および継代間の時間を含む多くの因子に依存する。培養は、細胞培地への播種と、細胞により集密な細胞培養物または連続的なフィルムが形成されるまで細胞を成長させることと、集密な細胞の一部を新しい細胞培地に播種することにより行うことができる。それにもかかわらず、継代は、増殖する能力を評価するツールである。通常、組織から単離される非照射細胞を含む細胞は、さらなる増殖または細胞倍加が生じない状態に到達するまで、約１０〜２０回継代できる。次いで、細胞は、そこからさらなる継代培養物を得ることができない老化状態に入る。これとは反対に、連続細胞系は、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０回を超える継代後のような２０回を超える継代後に増殖できる。今回、本発明者らにより、２０回の継代を超える複数回継代できるこのような連続細胞系、特に不死化細胞が、ＵＶ処理、すなわちこれらの細胞に有効量のＵＶ光を照射することによる細胞の改変により得ることができることが見出された。本発明による用語「有効量のＵＶ光」は、非連続細胞系を連続細胞系に変換するために必要な照射量であるものとする。ＵＶ光の有効量は、このような変換に必要とされる最小照射量から、細胞培養物全体について致死的な結果をもたらすことなくこれらの細胞が耐える最大照射量までの範囲である。有効量の限度を超えるかまたはそれより低いと、連続細胞系を得ることができないことが明らかである。当業者は、通常の最適化をしながら、本明細書に含まれる情報および手引きに基づいて、それぞれの細胞系について最適な有効照射量を容易に決定できる。細胞は、初代細胞または数回の継代の後に増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）可能な細胞であってよい。細胞系の培養は、Ｔフラスコ系もしくはローラーボトル系、または撹拌タンクもしくはその他のバイオリアクターフォーマットのような標準的な細胞培養技術を用いて行うことができる。本発明のいくつかの実施形態において、培養は、無血清条件に適応されているか、無血清条件に保たれる。
【００１２】
本出願において、用語「ＵＶ光」は、１０〜４００ｎｍ、特に１００〜４００ｎｍの波長を有する紫外線を意味する。ＵＶ光は、ＵＶＣ（１００〜２８０ｎｍ）、ＵＶＢ（２８０〜３２０ｎｍ）およびＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ）からなる群より選択してよい。本発明のいくつかの実施形態において、波長は、２００〜３００ｎｍの間である。ＤＮＡ中にインターカレートし、ＵＶ光により活性化される光感作剤などの光感作剤を用いて、ＵＶ照射の改変効果を増進してよいが、これらは本発明の全ての実施形態において必要なわけではない。本発明のある実施形態において、ＵＶ光は約１００〜約２８０ｎｍの波長を有するＵＶＣである。本発明の別の実施形態において、ＵＶ光は約２４０〜約２９０ｎｍの波長を有する。本発明の別の実施形態において、ＵＶ光の約８５％以上は、約２５４ｎｍの波長を有する。
【００１３】
いずれの理論にも結び付けられることなく、ＵＶ光は、細胞の遺伝子材料を改変し、変異を導入すると考えられている。このような改変は、細胞の修復機構により、通常、修復できるが、いくらかの改変が残る場合がある。これらの改変は、致死的な変異と、細胞の不死化をもたらす改変とを導入できる。ＵＶ照射実験から、不死化され、かつ培養され得る大部分の細胞をもたらすように最適な照射量を選択できる。継代の後に、不死化をもたらす少なくとも１つの改変を含むいくつかの小さい改変のみを有すると予測される増殖できる生細胞のみが選択されると考えられる。照射細胞の大部分は不死化されないが、アポトーシス細胞または壊死性細胞に導く異なる改変を獲得する。しかし、原則的に、不死化を誘導する改変を有する１つの細胞のみが、連続細胞培養物を得るために十分である。なぜなら、この細胞が、本明細書に記載される複数ラウンドの継代の間に増殖および生存を続けるからである。
【００１４】
ＵＶ光放射は、ＵＶ光放射の連続的な形態、例えば水銀ランプ技術、またはパルスＵＶ光、例えば単色性レーザ技術であってよい。所望のＵＶ強度は、２つ以上のランプを組み合わせることにより生じさせてよい。少なくとも２つの照射手順を、それらの間に休止をもたせて組み合わせてよい。本発明の主題は、任意の有効照射量のＵＶ光、すなわち、連続的に増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）するように細胞を改変させる任意の照射量のＵＶ光を含む。有効照射量は、当該分野において通常公知の種々の因子、例えばランプおよびチャンバのサイズならびに直径、細胞含有培地とＵＶ光源との間の距離、チャンバの材料の光吸収および反射の特性のようなＵＶ照射チャンバの物理的なパラメータに依存し得る。本発明の特定の実施形態において、細胞は、単層、すなわち表面上の１つの細胞層において照射される。その上、ＵＶ光の波長および強度ならびに細胞がＵＶ光に曝露される接触時間も、有効照射量にとって重要である。さらに、有効照射量は、細胞自体、ウイルスを含有する培地およびそれらの光吸収特性によっても影響される。本発明の種々の実施形態において、有効照射量は、試料に含まれる細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を改変するのに十分であり、別の実施形態において、有効照射量は、細胞の少なくとも１０％が連続的に成長するように改変するレベルにまで細胞を改変するのに十分である。細胞の１０％〜９０％が照射により死滅され得る。本発明のあるいくつかの実施形態において、細胞を含有する試料は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０ｍＪ／ｃｍ２の有効照射量に曝露される。いくつかの実施形態において、有効照射量は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１８０、１５０、１３０または１０５ｍＪ／ｃｍ２までである。本発明の特定の実施形態において、ＵＶ照射量は、約７０〜１０５ｍＪ／ｃｍ２の間である。いくつかの実施形態において、ＵＶＣ光によりこれらの照射量が使用される。用語「約」は、（レーザでのように）単一波長にて不連続のＵＶ光を提供しないが、近傍波長の光も放射するガウス型スペクトルを有する通常のＵＶランプの特性のことをいう。これらのランプのいくつかを用いる実施形態において、「約」は、１０％の波長の値の偏差のことをいう。
【００１５】
照射もしくは継代の前または後に、細胞系は、滅菌性、マイコプラズマ汚染がないこと、外来ウイルス汚染がないこと、および／または逆転写酵素活性の存在についてのＦ−Ｐｅｒｔ試験に合格することのような品質管理基準、ならびに医療用バイオテクノロジーにおける使用のための細胞系を選択するための当該技術分野において用いられるその他の品質管理基準を満たすことについてさらに選択できる。この意味において、「・・・がないこと」とは、現在の品質試験手順の検出限界未満に汚染が低減されると理解される。本発明の技術は、ウイルスベクターを使用せずにまたはレトロウイルスを導入せずに連続細胞系を作製できるので、本発明の細胞系は、逆転写酵素活性についてのアッセイにより調べることができるように、頻繁に、いずれのレトロウイルス活性も有さない。しかし、このようなレトロウイルス活性は、例えば、細胞系におけるウイルスまたはタンパク質の生成を目的とする分子工学技術により本発明の細胞系に特異的に導入してよい。
【００１６】
細胞系は、任意の真核生物のもの、特に魚類、鳥類、爬虫類、両生類または哺乳類の細胞に加えて、昆虫または植物の細胞のような高等生物のものであり得る。いくつかの実施形態では、ハムスター、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウシ、霊長類またはヒトのような哺乳類細胞を用いる。その他の実施形態では、ニワトリ、アヒル、カナリヤ、オウム、ウズラ、ダチョウ、エミュー、シチメンチョウまたはガチョウのような鳥類細胞を用いる。一般的に、任意の鳥の種が、本発明において用いるため鳥類細胞の起源となり得る。いくつかの実施形態において、あまり頻繁に家畜化されていない（ウズラまたはエミューのような）種を用いて、より一般に家畜化されている（ニワトリのような）種において流行しているウイルスとの保存組織（ｓｔｏｃｋ  ｔｉｓｓｕｅ）の汚染の可能性を避けることが有利である。
【００１７】
照射細胞は、任意の型の組織のものであり得る。いくつかの実施形態において、組織は胚に由来する。多くの実施形態において、崩壊組織または複数の組織により得ることができるような１つを超える型の組織の混合培養物が用いられる。さらなる実施形態において、細胞は胚の臍帯のものである。照射細胞または組織（複数可）は、例えば内皮細胞、上皮細胞、多分化能性もしくは全能性の幹細胞、胚性幹細胞、神経細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、結腸細胞、白血球、肺細胞、卵巣細胞、皮膚細胞、脾臓細胞、胃細胞、甲状腺細胞、血管細胞、膵臓細胞ならびに／またはそれらの前駆細胞ならびにそれらの組み合わせのものであり得るか、あるいは照射細胞または組織（複数可）は、例えば内皮細胞、上皮細胞、多分化能性もしくは全能性の幹細胞、胚性幹細胞、神経細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、結腸細胞、白血球、肺細胞、卵巣細胞、皮膚細胞、脾臓細胞、胃細胞、甲状腺細胞、血管細胞、膵臓細胞ならびに／またはそれらの前駆細胞ならびにそれらの組み合わせを含み得る。
【００１８】
多くの実施形態において、細胞は、照射中または培養中に表面に接着する。表面上での培養は内皮細胞にとって特に適切であり、そのことにより細胞を、ＵＶ照射量により大きすぎる損傷変化が導入されると妨げられ得る単層の形成能力のようなさらなる品質基準を満たすことについてさらに選択できる。このような表面上で、細胞は単層を形成し得る。特に、細胞は、微小担体上で培養または照射される。代わりに、細胞は、懸濁物中で照射もしくは培養のいずれかまたはその両方を行ってよい。表面上で最初に照射または培養される細胞は、後になって、懸濁培養において成長するように適応させてよい。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明の方法により得ることができる連続細胞系の細胞を提供することと、前記細胞に前記ウイルスを感染させることと、前記ウイルスを前記細胞内で増殖させることと、前記ウイルスを回収することとを含む、ウイルスを生成する方法を提供する。
【００２０】
本発明において、生成されるウイルスは、１本鎖もしくは２本鎖（ＤＮＡ）で、センスもしくはアンチセンスで、連続型もしくは分節型のゲノムを有する包膜もしくは非包膜ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスから選択される。ウイルスは、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルスおよびブニヤウイルスからなる群より選択してよい。本発明のいくつかの実施形態において、ウイルスは、フラビウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アレナウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスを含む包膜ウイルスの群より選択される。その他の実施形態において、ウイルスは、インフルエンザＡ、ＢもしくはＣを含むインフルエンザ、ウエストナイルウイルス、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスまたはロスリバーウイルスのような包膜ウイルスである。本発明のその他の実施形態において、ウイルスは、フラビウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルスおよびアレナウイルスを含む包膜ＲＮＡウイルスの群から選択される。特定の実施形態において、ウイルスは、ＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）、ＴＢＥ（ダニ媒介脳炎）ウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、ニューカレドニアウイルスまたはインフルエンザウイルスである。
【００２１】
回収ステップの後に、ウイルスを、例えば本明細書に参照により組み込まれる米国特許公開番号２００６／０２７００１７Ａ１に開示されるようなウイルス不活化のための任意の公知の手段により不活化させることができる。特に、不活化は、単独または組み合わせでのホルムアルデヒド処理および／もしくはＵＶ照射により行うことができる。
【００２２】
一般に、血清、または例えばアルブミン、トランスフェリンもしくはインスリンのような血清由来物質は、細胞培養物およびそれから得られる生物学的産物に混入し得る望ましくない物質（ａｇｅｎｔ）を含む場合がある。さらに、ヒト血清由来添加物は、血清により伝播できる肝炎ウイルスおよびＨＩＶを含む全ての公知のウイルスについて調べられなければならない。よって、本発明の方法のいくつかの実施形態によると、細胞系の細胞は、無血清培地における成長に適応されており、例えば、これらは、無血清培地で成長する能力について選択される。培地は、血清もしくは血清画分、または一般的な血液構成成分も含まない場合がある。本発明のこれらの実施形態のための培地は、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ウェイマウス培地、特に本明細書にその全体が参照により組み込まれるＵＳ２００７／０２１２７７０に記載されるようなオリゴペプチド非含有もしくはタンパク質非含有の培地またはそれらの組み合わせから選択される。上記のオリゴペプチド非含有培地は、血液タンパク質または１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５もしくは４アミノ酸を超えるサイズのオリゴペプチドを含まなくてもよいが、グルタチオンを含んでよい。タンパク質非含有培地は、タンパク質を実質的に含まないが、細胞系により生成されるタンパク質またはプロテアーゼを含んでよい。特に、培地は、成長促進剤としてのポリアミドを含み、かつ／またはＵＳ２００７／０２１２７７０に記載されるような既知組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）であってよい。用語「既知組成（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ）」は、培地が、例えば動物成分、器官、腺、植物または酵母の抽出物のようないずれの規定されない補足成分も含まないことを意味する。よって、既知組成培地のそれぞれの成分は、厳密に規定される。既知組成培地は、タンパク質または細胞加水分解産物を実質的に含まないが、細胞系により生成されるタンパク質またはプロテアーゼを含んでよい。このような培地の例は、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｂｒｏｃｈｕｒｅｓ／３３２−０３２４４２＿ＳＦＭＢｒｏｃｈｕｒｅ．ｐｄｆにてＷＷＷが利用可能な「Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、ＧＩＢＣＯ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ（２００３年）に示される。
【００２３】
無血清培地、オリゴペプチド非含有培地または既知組成培地を含むこれらの培地は、グルタチオンおよび／またはプロテアーゼ、特にブタもしくは組換えのトリプシンのようなトリプシンを、ウイルス接種の前または後に含んでもよい（Ｋｌｅｎｋら（１９７５年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８巻：４２６〜４３９頁）。このようなプロテアーゼは、細胞系の培養中にも必要とされる場合もある。なぜなら、表面に接着する細胞は強い接着から非常に弱い接着までを示すからである。強く接着する細胞は、プロテアーゼおよび／またはＥＤＴＡのようなキレート化剤により剥離できる（Ｄｏｙｌｅら、Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、ＥＣＡＣＣ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ（１９９６年）中の第４章：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。さらに、培地、特にタンパク質非含有培地は、接種の前または後に、植物または酵母の加水分解産物を含んでよい。もちろん、培地は、本発明の細胞系により生成されるタンパク質または代謝産物を含むことも予測される。
【００２４】
本発明の方法により得ることができる細胞系は、通常、非腫瘍原性および／または非癌原性である。いくつかの実施形態において、細胞系の細胞は、Ｆ−ｐｅｒｔ試験のような品質試験に合格することについて調べられ、選択される。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、組換え遺伝子産物を生成する方法であって、本発明の方法により得ることができる連続細胞系の細胞を提供することと、前記細胞に前記遺伝子産物をコードする核酸を形質移入することと、前記遺伝子産物を発現させることと、前記遺伝子産物を所望により回収することとを含む方法を提供する。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであってよい。遺伝子に加えて、核酸は、細胞における発現のためのプロモーター、および選択マーカーを含んでよい。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、動物またはヒトの生細胞を提供し、前記細胞に有効量のＵＶ光を照射し、前記細胞を増殖させ、少なくとも２０回の継代の後に増殖できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する方法により得ることができる連続細胞系を提供する。本発明の細胞系は、このように生成される細胞系の子孫も含む。特に、細胞系は、本明細書に記載される方法の実施形態により得ることができると規定される。得ることができる連続細胞系は、連続細胞系を生成するために必要なＵＶ照射に関連する特定の核型（ｃａｒｙｏｔｙｐｅ）のテロメア活性のような特有の特徴を有してよい。本発明の特定の実施形態において、細胞系の細胞は、非腫瘍原性および／または非癌原性であり、特に、Ｆ−ｐｅｒｔ試験のような品質試験にも合格する。
【００２７】
特定の実施形態において、細胞系は、ＥＣＡＣＣに、それぞれＱＯＲ／ＲＥ０７−１６９、ＱＯＲ１ＣＪ０７およびＣＯＲＥＣＢ／ＳＦ０８−０６のファイル参照番号に対応する寄託受託番号０８０２０６０２、０８０２０６０３または０８０２０６０４で寄託された細胞系である。さらに、本発明の細胞系は、上記の寄託された細胞系と同様の増殖する能力、細胞周期パターン、テロメラーゼ活性、核型、染色体パターンまたはテロメア長、およびもちろん連続細胞系であることのような特有の特徴を有する。
【実施例】
【００２８】
本発明を、これらを限定しない以下の実施例によりさらに説明する。
【００２９】
（実施例１）変異体を生成するためのＵＶ光でのベロ細胞の時間的に異なる輻射
材料：
ＴＣ−ベロ培地
Ｎ１バッファー
トリプシン（１：１０希釈）
トリプシン阻害剤
６ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３５１６
２５ｃｍ２Ｔフラスコ、Ｎｕｎｃ  Ｃａｔ．Ｎｏ．：１６３３７１
ＵＶランプ、ＶＬ５０Ｃ、２４０ｎｍグリッド−チューブ、５０Ｗ、Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍｅｔ社
手順：
６ウェルプレート中、１×１０６細胞／ウェルおよび５ｍｌの培地容量（二重の設定において）で設定する。合計で７枚のプレート（各回２ウェル／プレート）を設定する。
【００３０】
２４時間後に、良好な単層培養物が得られた。
【００３１】
５ｍｌの培地を１ｍｌまで排出し、開放したプレートにＵＶ光を照射した（ＵＶランプからプレートまでの距離＝９ｃｍ）。
プレートＡ：１５分
プレートＢ：３０分
プレートＣ：４５分
プレートＤ：６０分
プレートＥ：９０分
プレートＦ：１２０分
プレートＧ：対照、照射なし
照射の後に、両方のウェルの細胞をトリプシン処理し（１ｍｌトリプシン＋０．５ｍｌトリプシン阻害剤／ウェル）、ここで、第１ウェルの細胞を、細胞数（ＣＣ）および生存率の決定のために用い、第２ウェルの細胞を、１０ｍｌの培地を含む２５ｃｍ２のルー（ｒｏｕｘ）中で継代する。
【００３２】
【表２】
0005653223.tif 000002
Ｔフラスコ２５の内容物をトリプシン処理し、Ｃｅｄｅｘを用いてＴＣＣおよび生存率を決定する。
【００３３】
【表３】
0005653223.tif 000003
（実施例２）鳥類細胞のＵＶ照射
本研究の目的は、ワクチン生成のために適切な連続細胞系の作製のためのツールとしてのＵＶ光処理の使用の可能性を探索することであった。
【００３４】
初代ニワトリおよびウズラの胚を、最初の初代単層培養物の生成のための出発材料として用いた。それらに由来する品質管理された細胞培養物を、ＵＶ光曝露に基づく誘導手順のために用いた。
【００３５】
初代細胞のＵＶ光（２５４ｎｍ）への曝露。連続細胞系を、ＵＶ照射により、コリンウズラまたはニワトリの胚の初代細胞から発展させた。
【００３６】
ウズラ胚の初代細胞に由来する細胞系の発展の、安全バンクの製造までの詳細な経過は、系統樹の形態で図３に示す。
【００３７】
ＵＶ照射のための出発材料として、それぞれの場合に、ニワトリ胚、ニホンウズラ胚およびコリンウズラ胚の細胞調製物（崩壊完全胚の混合培養物）を起源とする最初の評価細胞バンク（ニワトリ、ニホンウズラおよびコリンウズラ）の１アンプルを解凍した。
【００３８】
ＵＶ照射のための設定は、６ウェルプレート中で、１×１０６細胞／ウェルの播種細胞および５ｍｌの培地容量で行った。５％のＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン）を含むＴＢＥ培地（ＦＳＭＥ）を、培地として用いた。それぞれ２ウェル／プレートでの合計７枚のプレートを設定した。２４時間後に、均質な単層培養物がウェル中で観察できた。細胞の照射のために、５ｍｌの培地を１ｍｌまで排出し、開放されたプレートに、層流ベンチ中でＵＶ光を以下のようにして照射した。ＵＶランプからプレートまでの距離は９ｃｍであった。Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍｅｔ社のＵＶランプ（ＶＬ５０Ｃ、２４０ｎｍグリッド−チューブ、５０Ｗ）をＵＶ光源として用いた。
プレートＡ：０．５分
プレートＢ：１分
プレートＣ：２分
プレートＤ：３分
プレートＥ：４分
プレートＦ：５分
プレートＧ：対照、照射なし
照射の後に、細胞をウェル中でトリプシン処理し（Ｎ１バッファーで１：１０希釈した１ｍｌトリプシン）、ここで、細胞懸濁物の１ｍｌ（合計６ｍｌ）をＣＣおよび生存率の決定のために用い、残りの細胞を、２５ｃｍ２のルー中の５ｍｌの培地を用いて継代した。結果を、本実施例の表にまとめる。
【００３９】
最初の培養期間中に（約２５〜３５日間）、培地交換のみを行い、細胞の形態および接着を、個別の試験において光学的に評価した。Ｔ−２５フラスコ内で接着して成長する細胞の島の形成が観察された後にのみ、試験Ａ〜Ｅの細胞をトリプシン処理し、均質な接着細胞のコロニー形成を促進するために、６ウェルプレート（Ｔ−２５フラスコよりも小さい表面）に移した。およそＫ４０〜Ｋ５０のこの時点から、８０〜１００％の集密に到達した細胞を、Ｔ−２５およびＴ−７５のフラスコ中で６〜９日ごとにさらに継代し、１〜２本の安全アンプルを設定し、これらは評価細胞バンク（約１０アンプル）を生成するための出発材料として用いた。上記の細胞集団のトリプシン処理および継代は、実施例３に記載する。
【００４０】
用いた調製物
培地：−ＴＢＥ培地（ＦＳＭＥ）＋５％ＦＢＳ＋抗生物質混合物（ペニシリン／ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｌおよび５０ｍｇ／ｌゲンタマイシン）
−ＴＢＥ培地（ＦＳＭＥ）＋１０％ＦＢＳ
−ＴＣベロ培地＋１０％ＦＢＳ
−Ｎ１バッファー
−ガンマトリプシン
−ＤＭＳＯ  Ｓｉｇｍａ社
略語：ＣＣ．．．細胞数、Ｔ−２５／７５／１７５．．．２５／７５／１７５ｃｍ２のＴフラスコ
【００４１】
【表４】
0005653223.tif 000004
個別の試験設定Ａ〜Ｇの細胞数の値および生存率がよく似ていたので、細胞のＵＶ照射時間に関して著しい差を示すことができなかった。これが、比較した培養物の形態および接着をほぼ毎日評価して、特殊性を認識した理由である。
【００４２】
試験設定Ａ〜Ｆの全てのうち、設定Ｅからの細胞集団が、均質な細胞構造、異なるＴフラスコでの培養、数回の継代の後の変わらない細胞成長、凍結保存ができること、およびウイルス増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）（例えばＭＶＡウイルス）に適することのような、接着して成長する連続細胞系の最良の特性を示した。
【００４３】
ウズラ細胞の場合、設定Ｆからの細胞集団は、うまく培養できなかった。不均質な細胞ローン（ｃｅｌｌ−ｌａｗｎ）の形成（大きな全体）とともに細胞成長の低減が、ＵＶ光を照射しなかった細胞（試験Ｇ）を用いて６回を超える継代の後に観察できた。１６回以降の継代から、細胞はその分裂能力を喪失し、もはや培養できなかった。全体として、ウズラおよびニワトリの細胞試験を用いて、同様の結果を得ることができた。
【００４４】
（実施例３）細胞のトリプシン処理および継代
接着して成長するウズラ細胞のトリプシン処理および継代を、ベロ細胞について通常用いられるものと同様の継代スキームで行った。培養培地を捨てた後に、洗浄ステップを、Ｎ１バッファーを用いて行い、その後、培養物を、１：１０に希釈した対応する量のガンマトリプシンの層（複数可）で覆い、３７℃の温度（６ウェルプレートおよびＴ−２５（Ｔ−２５．．．２５ｃｍ２Ｔフラスコ）を用いては室温で十分である）にて、培養容器から細胞が剥離する（穏やかにたたくことにより）までインキュベートする。トリプシン阻害剤を加えてトリプシンの効果を停止することは、培養培地にＦＢＳが含まれているので必要でない。その後、細胞を新しい培養培地に移し、それぞれの分割に対応する培養容器にさらに分配し、再び放置して成長させる。
【００４５】
以下の表は、トリプシン処理中に用いた量を示す。
【００４６】
【表５】
0005653223.tif 000005
（実施例４）ＵＶランプＶＬ５０Ｃを用いる細胞不死化のためのＵＶ−Ｃ照射量測定（ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ）
ＵＶ照射を用いて連続細胞系を得るための照射量を測定した。照射量測定の設定は、細胞処理についての設定と同様であった。ＵＶ−Ｃ光での輻射は、バッファー溶液中に溶解したヨウ化カリウムおよびヨウ素酸カリウムの、茶色〜黄色の３ヨウ化物への変換を引き起こす。３ヨウ化物は、その最大吸収が３５２ｎｍにあり、分光光度計において定量的に測定できる。この原理により、曝露時間に依存する細胞単層曝露中に加えられたＵＶ照射量を測定することが可能になる。よって、６ウェルプレート中での測定に基づいて、０．５〜５分間の曝露時間は、２０〜１２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ照射量に相当する（図４）。
【００４７】
照射量測定は、細胞系試験と同様に、できる限り正確に行う。それぞれの場合において、約２．５／ｃｍ、４．５／ｃｍおよび７．５／ｃｍの吸収係数（３６７ｍｎ）を有するモデル溶液１ｍｌに対して、６ウェルプレートの１つのウェル中で照射を行う。それぞれのモデル溶液は６回照射される。照射時間＝３０秒、１分、２分、３分、４分および５分。それぞれの照射時間についての厳密な照射量を見出すために、用いた培地のＯＤ（２５３．７ｎｍ）を決定する。
【００４８】
用いた材料：
−ポータブルＵＶランプ、ＶＬ５０Ｃ、２５４ｎｍ、５０Ｗ、Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍａｔ社
−分光光度計、Ｔｈｅｒｍａ社、デバイスＮｏ．：ＰＡ５００７−０１２ＭＭ
−６ウェルプレート
−ホウ酸９９．９％、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ社、ロットＮｏ．：６０４６０
−ＮａＯＨペレット、Ｂａｘｔｅｒ社、ロットＮｏ．：３１８６０８
−ＰＶＰ  Ｋ１７  ＰＦ（ポリビニルピロリドンＣｏｌｌｉｄｏｎ  Ｋ１７）、Ｂａｓｆ社、ロットＮｏ．：３０４０８６０９Ｔ０
−ヨウ化カリウム、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、ロットＮｏ．：Ｐ２９６３−５００Ｇ
−ヨウ素酸カリウム、Ｍｅｒｃｋ社、ロットＮｏ．：Ｋ３２５７７４５１６２２
−ＴＣ  ＶＥＲＯ培地（ＶＴ）、管理：ＯＲＳＦＶＴＣ０７００４０１
−ＷＦＩ水、Ｂａｘｔｅｒ社、ＰＰ２
３つのモデル溶液を、十分な量で調製する。
【００４９】
【表１】
0005653223.tif 000006
モデル溶液は、暗所で用時まで貯蔵できるが、少なくとも４７日目までである。
【００５０】
モデル溶液１、２および３のそれぞれの６０ｍｌを用いて、検量線を作製する。入射光から保護して、これらの試料を、検量線を確立するＩＢＣに送る。モデル溶液１、２および３のそれぞれから１００ｍｌをＳｃｈｏｔｔフラスコに移し、入射光から保護する。ポータブルＵＶランプＶＬ５０Ｃを枠（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に配置する。テーブルプレートとポータブルＵＶランプの底側との間の距離は９ｃｍである。ポータブルＵＶランプを、フィルタがテーブルプレートを指すように（すなわち下向き）調節する。
【００５１】
ポータブルＵＶランプを、使用の３０分前に点ランプする。
【００５２】
１００ｍｌのモデル溶液１、２および３を含む３つのＳｃｈｏｔｔフラスコ、ピペット、ピペットボーイ、空のＳｃｈｏｔｔフラスコならびに３枚の６ウェルプレートを準備する。１ｍｌのモデル溶液１を、６ウェルプレートの左上のウェルにピペットを用いて入れる。このウェルを、ポータブルＵＶランプの下に、覆いをせずに、フィルタの下の中央に配置されるように配置する。３０秒間の照射の後に、ウェルを、ポータブルＵＶランプの下のその位置から迅速に移動させる。照射した１ｍｌ溶液のうちの３７０μｌを、薄層シリカキュベットに移し、ＯＤ３６７ｎｍを５分以内に決定する。同じ測定を３回行い、記録する。これらの３つの値の平均値を決定する。測定値が光度計の較正範囲を超える場合は、それに応じて、異なる厚さの層を有するキュベットを用いる。ウェル中の上清を吸い上げて廃棄する。
【００５３】
これらのステップを、全ての照射時間について反復する。得られた曲線関数およびＶＴ培地のＯＤ（２５３．７ｎｍ）に基づいて、それぞれのＵＶ照射量［ｍＪ／ｃｍ２］を、３０秒から５分まで算出する。結果を、以下の表に示す。
【００５４】
【表６】
0005653223.tif 000007
この表からわかるように、照射量の曲線関数は、ｙ＝２４．０９ｘ＋４．３１２５である。ｘは分での照射時間であり、ｙはｍＪ／ｃｍ２での照射量である（図４）。
【００５５】
（実施例５）連続細胞におけるウイルス生成
ＭＶＡ、ｒ−ＭＶＡ、ＴＢＥおよびインフルエンザを、連続ウズラ細胞において増殖させた。ウズラ細胞のローラーボトル培養物を、上記のようにして確立した。培養物に、（ＧＭＰ）ＭＶＡ、ＴｒｏＶａｘ、ＴＢＥおよびインフルエンザウイルスを感染させた。ＭＯＩは、現在のＭＶＡ生成プロセスに従って選択した。ウイルス産物を、３〜４日後に採集した。ＡＳ培養培地ＴＣ−ベロ１０％ＦＢＳを、３２℃のインキュベーションでのインキュベーションの間に用いた。
【００５６】
感染：１時間後に１０ｍｌを用いて最終容量（６０ｍｌ）にて行った。
【００５７】
ＴＢＥ：５０μｌウイルス
ＭＶＡ：２５０μｌウイルス
ニューカレドニア（ＮＣ）：５０μｌ
略語：ＫＸＸ．．．培養第ＸＸ日目
試料の採取：３×１ｍｌ試料、ＮＯＶＡ、ＮＣを含むＮａＢｒ−、ＨＡ、顕微鏡写真
【００５８】
【表７】
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ローラーボトル実験で成長させたＭＶＡおよびｒ−ＭＶＡについて達成されたウイルス力価：
【００５９】
【表８】
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ローラーボトル実験で成長させたＴＢＥおよびインフルエンザについて達成されたウイルス力価：
【００６０】
【表９】
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（実施例６）異なる細胞培養物のＦ−Ｐｅｒｔアッセイ
Ｆ−Ｐｅｒｔアッセイは、ＰＣＲにより逆転写酵素活性を検出することを可能にし、安全性検証のために必要である。異なる培養物（ベロ細胞（陰性対照）、初代ニワトリ細胞（陽性対照）、連続ウズラ細胞および連続ニワトリ細胞）を、同じ手順に従って調製した。培養上清を採集し、Ｆ−Ｐｅｒｔ品質管理試験のために処理した。
【００６１】
Ｆ−Ｐｅｒｔ試験の結果
【００６２】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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