(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
興味の核酸を含む生物学的サンプル中の興味の核酸を特異的に増幅する方法であって、
ａ）前記興味の核酸の少なくとも１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させるために生物学的サンプルを化学的にまたは酵素的に処理する工程、
ｂ）前記変換された興味の核酸を含む生物学的サンプルに、増幅プライマー及び増幅試薬を添加する工程であって、各プライマーが３つの異なる種類の塩基で構成されており、プライマーがα−オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、及び２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一の修飾ヌクレオチドを含み、増幅試薬は塩基変換のために化学的又は酵素的に処理されていない、工程、及び
ｃ）変換された興味の核酸を増幅する工程を含み、
混入核酸の供給源である増幅試薬を生物試料に添加する前に、１種類の核酸塩基を別の種類の塩基に変換することによって、混入核酸の増幅が回避され、且つ
該方法により、核酸増幅のために使用される試薬や器材に存在する混入核酸を回避することができ、試薬及び器材を汚染除去することを不必要とする、方法。
【請求項２】
興味の核酸を含む生物学的サンプル中の興味の核酸を特異的に検出する方法であって、
ａ）前記興味の核酸の少なくとも１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させるために生物学的サンプルを化学的に又は酵素的に処理する工程、
ｂ）生物学的サンプルに、増幅プライマー、少なくとも一の検出プローブ、及び増幅試薬を添加する工程であって、各プライマー及びプローブが異なる３種類の塩基で構成されており、プライマーがα−オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、及び２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一の修飾ヌクレオチドを含み、増幅試薬は塩基変換のために化学的又は酵素的に処理されていない、工程、
ｃ）前記変換された興味の核酸を増幅し、アンプリコンを得る工程、及び
ｄ）増幅の結果物として得られたアンプリコンを検出する工程を含み、
混入核酸の供給源である増幅試薬を生物試料に添加する前に、１種類の核酸塩基を別の種類の塩基に変換することによって、混入核酸の増幅が回避され、且つ
該方法により、核酸増幅のために使用される試薬や器材に存在する混入核酸を回避することができ、試薬及び器材を汚染除去することを不必要とする、方法。
【請求項３】
精製の少なくとも一の工程が工程ａ）とｂ）との間で実施されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルに含まれる核酸を抽出する少なくとも一の工程が工程ａ）の前に実施されることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
増幅プライマーが、変換された興味の核酸に又はそれらに相補的な核酸に特異的であることを特徴とする請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一の検出プローブが変換された標的及びアンプリコンに特異的であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
異なる３種類の塩基で構成されるプローブが少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
修飾されたヌクレオチドがα−オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドを含む群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
修飾されたヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマーが２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる化学処理が、硫黄含有化学物質の作用によって遂行されることを特徴とする請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる化学剤が、亜硫酸水素イオン（ＨＳＯ３−）を含むことを特徴とする請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる化学剤が、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、亜硫酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＳＯ３）、亜硫酸水素マグネシウム（ＭｇＨＳＯ３）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、亜硫酸水素ナトリウム及びスルフィン酸からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる酵素の薬剤がシトシンデアミナーゼであることを特徴とする請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
化学処理又は酵素処理が１種類の塩基をウラシル（Ｕ）に変換することから成ることを特徴とする請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
化学処理又は酵素処理がシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換することから成ることを特徴とする請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
変換された興味の核酸にハイブリダイズする第１のプライマーが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）から形成され、前記第１のプライマーの伸長から生じた鎖にハイブリダイズする第２のプライマーが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）から形成されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる酵素の薬剤がアデノシンデアミナーゼであることを特徴とする請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
酵素処理がアデニン（Ａ）をヒポキサンチンに変換することからなることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
変換された興味の核酸にハイブリダイズする第１のプライマーが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）及びグアニン（Ｇ）から形成され、前記第１のプライマーの伸長から生じた鎖にハイブリダイズする第２のプライマーがシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）から形成されることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
実施される増幅がＲＴ−ＰＣＲ増幅であることを特徴とする請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
実施される増幅が一本鎖上のＰＣＲ増幅であることを特徴とする請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
実施される増幅が二本鎖上のＰＣＲ増幅であることを特徴とする請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
増幅が変換された興味の核酸の各々の鎖に特異的な２対の増幅プライマーによって遂行されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
実施される増幅が転写後増幅であることを特徴とする請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
転写後増幅がＮＡＳＢＡまたはＴＭＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
興味の核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボヌクレイン酸（ＲＮＡ）であることを特徴とする請求項１から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１から２７の何れか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
ａ）前記興味の核酸の少なくとも１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる薬剤；及び
ｂ）異なる３種類の塩基で構成されており、α−オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、及び２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一の修飾ヌクレオチドを含む増幅プライマー、及び増幅試薬
を含むキット。
【請求項２９】
前記キットは、更に
ｃ）形成されたアンプリコンに適合している少なくとも一の検出プローブであって、３種類の塩基で構成されている検出プローブ；及び
ｄ）検出に必要とされる試薬
を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記薬剤が亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、亜硫酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＳＯ３）、亜硫酸水素マグネシウム（ＭｇＨＳＯ３）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、亜硫酸水素ナトリウム及びスルフィン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２８又は２９に記載のキット。
【請求項３１】
薬剤がアデノシンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼを含む群から選択されることを特徴とする請求項２８又は２９に記載のキット。
【請求項３２】
真正細菌および／または菌類および／またはウイルスおよび／またはイースト標的を増幅し検出するための請求項１から２７の何れか一項に記載の方法の使用、または請求項２８から３１の何れか一項に記載のキットの使用。
【請求項３３】
増幅プライマーが細菌の属に特異的であり、各々の検出プローブが少なくとも一つの細菌の種に特異的であることを特徴とする請求項３２に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増幅したい関心の核酸を含む液体生物学的サンプルの混入物を取り除くための増幅の方法であって、  生物学的サンプルは、興味の前記核酸の塩基のうちの１つを他の塩基に変換させるために処理し、プライマーを導入すること、及び変換された核酸に特異的な検出プローブによって処理する方法に関する。本発明は、前記方法を使用するためのキット、並びに細菌、真正細菌、菌類、汎菌類、ウイルスまたは酵母の標的を特異的に増幅し検出するための前記方法及びキットの使用に関する。
【０００２】
分子生物学の進歩は、核酸を操作することを可能にした。生物学的診断法において、インビトロ遺伝子増幅の方法は現在不可欠なツールになっており、公知のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、比較的短時間に、１０億のオーダーの増倍率によって、多数が複製されることを可能にした。これらの技術の主な欠点は、不必要な核酸の増幅であり、間違った結果、すなわち求める標的の非存在下でさえ陽性の結果となる。これらは、混入による偽陽性と呼ばれている。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、ＴＭＡ（転写介在増幅）または遺伝物質の増幅のための任意の他の技術による細菌の標的の増幅は、混入核酸のトレースが全くない水溶液、酵素、試薬等、及びプラスチック容器の使用を必要とする、感度が高い技術である。実際に、これらの技術の感受性のため、これらの混入核酸は増幅される可能性があり、診断検査の信頼性を著しく減じる偽陽性を生み出す可能性がある。これは、細菌または菌類の増幅の場合で真実であり、使用するプライマー（とプローブ）が細菌又は菌類の標的の大部分を増幅（及び検出）することができる汎細菌（真正細菌とも呼ばれる）又は汎菌類の標的の増幅において、より顕著である。さらに、この特定の場合において、増幅キットの製造において使用される大部分の試薬は、天然源（ヌクレオチド、酵素等）に由来するものであり、結果的に、外因性核酸による混入の潜在的なリスクは高い。したがって、生物学的サンプルの細菌の汚染のレベルを評価することを目的として、増幅によって実施されるテストにおいて、使用するいくつかの酵素が細菌のクローニングに由来し、増幅される可能性がある核酸を供給するので、誤った診断につながる陽性の結果がシステマチックに生成される。
【０００３】
この混入は、更に環境及び十分に除染されなかった器材、例えば、実験台、スタッフ、器材及びピペット装置、プラスチック容器さえにも由来しうる。これらの混入を制限することを意図するいくつかの推奨が、実施されている。これらは、例えば試料（特に殺菌技術）または実験装置の操作に関している予防的方法を含む（物理的に区切られたワークゾーン、排気フードの使用、外部と内部の気圧勾配、それにより流れが常に所望の方向に排出にされるようにできる等）。
【０００４】
すでに言及されるように、混入のごくわずかではない供給源が、実際に、増幅反応において使われる原材料（例えば酵素、試薬、プラスチック容器）にある。したがって、Corless C.E. et al(J. Clin. Microbiol.; (2000); May; 38(5): 1747-52)は、ＲＮＡ  １６Ｓの検出のためのリアルタイムＰＣＲの感受性におけるＴａｑポリメラーゼの混入の弊害を記載する。増幅のために必要な酵素の汚染の修正の第１の方法は、酵素の汚染除去の方法を含む。Ashkenas S. et al. (Biotechniques; 2005; Jul.; 39(1): 69-73)によって記載された酵素の方法は、増幅のために必要な成分の全てを含む溶液を除染することから成る。これは、ＲＴ−ＰＣＲの範囲内で使用する制限酵素のカクテルを含む。これらの酵素は、増幅される標的ＲＮＡを含む増幅のための反応混合物に存在する二本鎖ＤＮＡを分解させる。次に、逆転写が起こる場合、それらは熱によって不活性化される。従って標的二本鎖ＤＮＡの存在下において、ＰＣＲ適用のためのこの方法の代わりは、１種類の制限酵素（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｒｅ）の使用が記載されているが、それに限られている。しかしながら、制限酵素の使用には、２本鎖デオキシリボ核酸のみを分解するという欠点があり、さらには使用する酵素の特異的な制限部位を有しなければならない。したがって、一本鎖の形態の成分の混入したもの及び／又は上記の任意の制限部位を少数しか有しないものは、除去されない。
【０００５】
汚染除去の他の酵素の方法は、核酸標的酸によって接触させる前に溶液からの望ましくない核酸を除去することから成る。特許出願ＷＯ−Ａ−９９／０７８８７は、核酸標的酸によって接触させる前に反応混合物に含まれる二本鎖デオキシリボ核酸を分解させるための不耐熱性ＤＮＡ分解酵素の使用を記載する。酵素は、次に熱によって不活性化される。この技術の主な欠点は、反応混合物の熱によるこの酵素の不活性化は、耐熱性ポリメラーゼの使用を必要とするということである。さらに、反応混合物に存在する試薬は、温度によって変化する可能性もある。また、従来技術も、試薬または原材料を処理する非酵素的な方法を記載する。例えば、Mohammadi T. et al. (J. Clin. Microbiol.; 2003; Oct.; 41(10): 4796-8)は、抽出のための試薬、場合により増幅前にＰＣＲ試薬の制限酵素（Ｓａｕ３ＡＩ）による消化のための試薬のカラム濾過からなる技術を記載する。濾過技術の欠点は、これらの技術が、それらの濃度または特性を変えることのなしに、複雑な媒質に適用することができないということである。さらに、この技術は、プラスチック容器に存在する混入成分の除去を提供しない。
【０００６】
特許出願ＷＯ−Ａ−９４／１２５１５は、潜在的に光反応性化合物を使用して、Ｔａｑポリメラーゼを含む溶液及び潜在的に混入している核酸を処理する方法を記載する。この光反応性化合物、例えばフロクマリン誘導体は、紫外線暴露によって活性化される。この技術の主な欠点は、その限定的な適用とは別に、前記核酸のランダム分解のためにあまり有効でないということと、まだ増幅することができる断片を生成する可能性である。この技術の別の欠点は、それが使用するＴａｑポリメラーゼの酵素の調製物を除染するだけであるということである。核酸増幅のプロセスのために必要な他の試薬、例えば水、バッファー、プラスチック容器などは、いくつかの他の手順によって除染されなければならない。これは、時間がかかり、高価かもしれない追加の操作を必要とする。Delehanty J.B. et al., (RNA.; 2005; May; 11(5): 831-6) によって記載されている別の非酵素的な方法は、翻訳の阻害のためのコバルト錯体を使用する。この複合体は、ＤＮＡ及びＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解させる。この技術の主な欠点は、核酸の不完全分解と汚染除去反応の遅さ（２４時間）である。本出願人の特許出願ＷＯ−Ａ−２００８／１３２４１２は、金属キレートによってヌクレオチドの配列を機能させない方法を記載する。ビス（１，１０−フェナントロリン）／Ｃｕのような断片複合体は、増幅工程後に、存在する全ての核酸の溶液を除染するために使用される。これは、前の増幅反応から生じたアンプリコンによる新規試料の混入を避けることを可能にする。第１の使用の場合、この方法の主な欠点は、それが混入核酸の全ての分解が本当にできるというわけではなく、前の増幅反応から生じたアンプリコンだけを分解させる。別の手順が、核酸増幅反応のために必要な原材料を除染するこの方法の上流で又は並列に、用いられなければならない。従って、興味がある核酸のために、生物学的溶液または液体生物学的サンプルを処理するための単純且つ強力な技術のための要求が依然として存在し、それにより核酸増幅を実施するために必要な全ての試薬及び装置への混入物の存在の影響は非常に減じられるか、または除去されさえする。更に、これは、再混入のリスクがあるので、試薬及び環境の汚染除去の従来技術（非常に複雑で、効果がないことがある）の使用を不必要なものとする。
【０００７】
従って、本発明者は興味がある核酸を含む溶液の処理の完全に新規な方法を提案する。それは、増幅反応の、原材料を含む増幅試薬の直接の汚染除去をするものではないが、初めの生物学的サンプルに存在する関心の標的核酸に絶対的に特異的な増幅を行う。従って、この目的のためには、本出願人は、興味がある核酸を変換するために、生物学的サンプルの標的核酸の配列を修飾するための化学又は酵素の試薬を使用することを提案する。この操作は、増幅の直前であるが、前記増幅ができるようにする増幅のために必要な試薬が加えられる前に実施される。従って、増幅及び検出の工程は、変換された標的に特異的にハイブリダイズするが、例えば試薬、水またはプラスチック容器に由来する如何なる混入成分には特異的にハイブリダイズしないプライマー及び検出プローブによって実施される。この方法は、標的の抽出からその増幅までに使用する試薬及び器材の全てを除染することを不必要とする。
【０００８】
第１の実施態様によれば、本発明は増幅したい興味がある核酸を含む液体生物学的サンプルの混入物を除去するために増幅の方法であって、
ａ）興味がある前記核酸の１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させるために生物学的サンプルを化学的にまたは酵素で処理する工程；
ｂ）興味がある前記変換された核酸を特異的に増幅することを目的とする増幅プライマーであって、各プライマーが異なる３種類の塩基で構成されている増幅プライマーを添加する工程；
ｃ）前もって合成された前記プライマーと、水溶液、溶媒、ヌクレオチド、酵素のような増幅のために必要な試薬を、これらの処理後に、生物学的サンプルに添加する工程；
ｄ）増幅および／または変換された核酸の検出ができるような条件下に前記溶液と試薬を置く工程を含む方法に関する。
【０００９】
第２の実施形態によれば、本発明は増幅し検出したい興味のある核酸を含んでいる液体生物学的サンプルの混入物を除去するために検出する方法であって、
ａ）興味がある前記核酸の少なくとも１つの種類の塩基を別の種類の塩基に変換させるために生物学的サンプルを化学的にまたは酵素で処理する工程；
ｂ）興味がある核酸の増幅により生じたアンプリコンを特異的に増幅すること及び検出することをそれぞれ目的とする増幅プライマー及び検出プローブであって、各プライマー及びプローブが異なる３種類の塩基で構成されている増幅プライマー及び検出プローブを添加する工程；
ｃ）前もって合成された前記プライマー及びプローブと、水溶液、溶媒、ヌクレオチド、酵素のような増幅及び検出のために必要な試薬を、これらの処理後に、生物学的サンプルに添加する工程；
ｄ）変換された核酸の増幅および／または生成されたアンプリコンの検出ができるような条件下に前記溶液と試薬を置く工程を含む方法に関する。
【００１０】
前のどの方法が用いられるかに関わらず、本発明の好ましい実施例によれば、少なくとも一つの精製工程は、工程ａ）とｂ）との間に実施される。前のどの方法が用いられるかに関わらず、本発明の更に好ましい実施例によれば、液体生物学的サンプルに含まれる核酸の抽出の少なくとも１の工程は、工程ａ）の前に実施される。前の例の任意の一つによれば、増幅プライマーは、興味がある変換された核酸またはそれらの相補的核酸に特異的である。本発明による方法の第２の実施形態によれば、検出プローブまたは検出プローブは、変換された標的及びアンプリコンに特異的である。前の全ての例において、特定の実施態様によれば、プライマーおよび／またはプローブは少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む異なる３種類の塩基から構成される。最後の実施態様によれば、修飾されたヌクレオチドは、α−オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドを含む群から選択される。この最後の実施態様によれば、修飾されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。前の全ての例において、塩基の１種類を別の種類の塩基に変換させる化学処理は、硫黄含有化学物質の作用によって遂行される。前の全ての例において、１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる化学剤は、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、亜硫酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＳＯ３）、亜硫酸水素マグネシウム（ＭｇＨＳＯ３）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、亜硫酸水素ナトリウムまたはスルフィン酸のような亜硫酸水素イオン（ＨＳＯ３−）を含む。別の実施態様によれば、１種類の塩基を別の種類の塩基に変換できるようにする酵素の薬剤はシトシンデアミナーゼである。別の実施態様によれば、化学処理又は酵素処理は１種類の塩基をウラシル（Ｕ）に変換することから成る。更に別の実施態様によれば、化学処理又は酵素処理がシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換することから成る。方法のこの最後の実施態様によれば、興味がある変換された核酸にハイブリダイズする第１のプライマーが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）および／またはチミン（Ｔ）から形成され、前記第１のプライマーの伸長から生じた鎖にハイブリダイズする第２のプライマーが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）および／またはチミン（Ｔ）から形成される。
【００１１】
化学剤の代わりに、酵素の薬剤を用いることが可能であり、１種類の塩基を別の種類の塩基に変換できるようにする酵素の薬剤が、好ましくはアデノシンデアミナーゼである。この最後の実施態様によれば、酵素処理がアデニン（Ａ）をヒポキサンチンに変換することから成る。酵素の薬剤の場合において、興味がある変換された核酸にハイブリダイズする第１のプライマーは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）および／またはグアニン（Ｇ）から形成され、前記第１のプライマーの伸長から生じた鎖にハイブリダイズする第２のプライマーはシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）および／またはチミン（Ｔ）から形成される。上記のどの方法を使用した場合でも、第１の実施態様によれば、実施される増幅はＲＴ−ＰＣＲ増幅である。上記のどの方法を使用した場合でも、第２の実施態様によれば、実施される増幅は一本鎖のＰＣＲ増幅である。上記のどの方法を使用した場合でも、第３の実施態様によれば、実施される増幅は二本鎖のＰＣＲ増幅である。後者の場合、増幅は、興味がある変換された核酸の各々の鎖に特異的な２対の増幅プライマーによって遂行される。上記のどの方法を使用した場合でも、第４の実施態様によれば、実施される増幅は、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡのような転写後増幅である。前述の全ての例において、興味がある核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００１２】
さらに、本発明は上記の方法を実施するためのキットであって、
ａ）興味がある前記核酸の少なくとも１種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる薬剤; 
ｂ）変換された興味の核酸又は生成されたアンプリコンに適した増幅プライマー及び場合により検出プローブであって、これらの配列が3つの異なる種類の塩基で構成されている増幅プライマー、及び場合により検出プローブ；
ｃ）水溶液、溶媒、ヌクレオチド、酵素のような増幅及び場合により検出に必要とされる試薬を含むキットに関する。
キットのある実施態様によれば、変換剤は、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、亜硫酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＳＯ３）、亜硫酸水素マグネシウム（ＭｇＨＳＯ３）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、亜硫酸水素ナトリウムまたはスルフィン酸を含む群から選択される。
キットの別の実施態様によれば、薬剤はアデノシンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼを含む群から選択される。
本発明は、最終的に、真正細菌および／または菌類および／またはウイルスおよび／またはイーストの標的を増幅するために、上記方法の使用又はキットの使用に関する。変形の使用によれば、増幅プライマーは細菌の属に特異的であり、各々の検出プローブは少なくとも一つの細菌の種に特異的である。
以下の用語は、単数形又は複数形で区別なしに使用することができる。
【００１３】
「試薬」、「増幅試薬」、「抽出試薬」または「精製試薬」または「原材料」なる用語は、核酸の抽出反応、精製反応又は酵素反応を実施するために必要とされる反応バッファー、酵素、モノホスファートヌクレオシド、溶媒、塩類を意味する。
【００１４】
「容器」または「プラスチック容器」は、本発明の意味において、プラスチック、ガラス又は他の任意の材料かどうかに関係なく、チューブ、コーン又はピペットのチップのような任意の容器を意味する。
【００１５】
「核酸」は、本発明の意味において、核酸がＤＮＡであれば遺伝コードの４種類のヌクレオシド、すなわちｄＡＭＰ（デオキシアデノシン５’−モノホスファート）、ｄＧＭＰ（デオキシグアノシン５’−モノホスファート）、ｄＴＭＰ（デオキシチミジン５’−モノホスファート）及びｄＣＭＰ（デオキシシチジン５’−モノホスファート）から選択されるか、または核酸がＲＮＡであればＡＭＰ（アデノシン５’−モノホスファート）、ＧＭＰ（グアノシン５’−モノホスファート）、ＵＭＰ（ウリジン５’−モノホスファート）及びＣＭＰ（シチジン５’−モノホスファート）から選択される少なくとの２つのヌクレオシド、好ましくは少なくとも１０のヌクレオチドの配列を意味する。
さらに、核酸は、場合により、少なくとも一つのイノシンおよび／または少なくとも一つの修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。
【００１６】
本発明において「修飾されたヌクレオチド」なる用語は、ヌクレオチド、例えば修飾塩基、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたは好ましくは５‐メチルシトシンを除く他の任意の修飾塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドを意味する。
さらに、核酸は、ヌクレオチド間結合のレベル、例えばホスホロチオネート、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネートでの修飾でもよく、例えばα−オリゴヌクレオチド（ＦＲ−Ａ−２６０７５０７）またはポリアミド核酸（ＰＭＡ）(Egholm M. et al.; J. Am. Chem. Soc.; 1992; 114; 1895-97)または２’−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチドおよび／または２’−Ｏ−フルオロヌクレオチドおよび／または２’−アミンヌクレオチドおよび／またはアラビノースヌクレオチド及びＬＮＡ(Sun B.W. et al., Biochemistry; 2004; Apr 13; 43 (14): 4160-69)のような主鎖レベルの修飾でもよい。２’−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチドの中で、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドが好ましいが、５−プロピニルピリミジンオリゴヌクレオチドもまた使用することができる (Seitz O., Angewandte Chemie International Edition 1999; 38(23); Dec: 3466-69)。
「ヌクレオチド」なる用語は、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドを規定する。
【００１７】
本発明の意味において、「生物学的サンプル」または「液体生物学的サンプル」は、核酸を含むことができる任意の試料を意味する。後者は、患者の組織、血液、血清、唾液または循環細胞から抽出されてもよく、または農業または食品に由来してもよく、または環境起源でもよい。抽出は当業者に知られている任意のプロトコルによって実施され、例えば、特許ＥＰ−Ｂ−０３６９０６３に記載されている単離の方法に従う。
【００１８】
「混入物」または「混入した酸」または「混入核酸」または「混入成分」は、本発明の意味において、増幅が望まれない任意の核酸であって、検出の間、偽陽性の結果を生成する可能性がある任意の核酸を意味する。
【００１９】
「亜硫酸水素塩」は、本発明の意味において、反応性の種が亜硫酸水素イオンである任意の化学試薬を意味する。当業者は、例えば、化学試薬として、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、亜硫酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＳＯ３）、亜硫酸水素マグネシウム（ＭｇＨＳＯ３）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、亜硫酸水素ナトリウムまたはスルフィン酸を使用することができる。化学試薬はメタ重亜硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【００２０】
「増幅」または「増幅反応」は、当業者によく知られている核酸の増幅の任意の技術を意味し、例えば以下である：
特許ＵＳ−Ａ−４６８３１９５、ＵＳ−Ａ−４６８３２０２及びＵＳ−Ａ−４８００１５９に記載されているＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、特許ＥＰ−Ｂ−０５６９２７２にて記載されている、特に１段階様式の派生的なＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）。
好ましくは、ＰＣＲは、一本鎖について、単一のプライマー対で実施される。
例えば特許出願ＥＰ−Ｂ−０２０１１８４に開示されているＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、
特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０１０６９に記載されているＲＣＲ（修復連鎖反応）、
特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０６９９５の３ＳＲ（自家持続配列複製法）、
特許出願ＷＯ−Ａ−９１／０２８１８のＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、
特許ＵＳ−５３９９４９１のＴＭＡ（転写介在増幅）及び
特許ＵＳ−６５７６４４８に記載されているＲＣＡ（ローリングサークル増幅）。
ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）。
【００２１】
本発明の意味において、「標的」または「核酸標的」または「核の標的」または「興味がある標的」または「興味がある核酸」は、増幅されるおよび／または検出される核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ）を意味する。標的は、細胞から抽出されても、化学的に合成されてもよい。標的は、溶液において自由であっても、固体支持体に結合されてもよい。
「溶液」なる用語は、均質又は不均一な水溶液を示す。「固体支持体」は粒子を意味し、ラテックス、ガラス（ＣＰＧ）、シリカ、ポリスチレン、アガロース、セファロース、ナイロン等であってもよい。これらの材料は、場合により磁性材料のカプセル化を許可してもよい。更に、それはフィルター、フィルム、メンブレンまたはストリップであってもよい。これらの材料は、当業者によく知られている。標的は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの一本鎖又は二本鎖の形態の、混合物中に存在するウイルス、細菌、菌類、または酵母核酸であってもよい。通常は、標的は５０から１００００ヌクレオチドの長さであるが、多くの場合、１００から１０００ヌクレオチドである。
【００２２】
「天然標的」（ＣＮＴと呼ばれている）なる用語は、本発明の意味では、少なくとも４つのヌクレオチドのヌクレオチド配列から構成される、増幅される標的核酸を意味し、塩基は４つの異なる種類であり、アデニン、グアニン、シトシンとチミン（ＤＮＡの場合）またはウラシル（ＲＮＡ場合）から選択される。場合により、前に記載されている修飾されたヌクレオチドが存在してもよい。当然ながら、ＣＮＴを増幅させる、いわゆる天然プライマーは、ＰＮＴ１及びＰＮＴ２と呼ばれる。いくつかの増幅が平行にある場合、例えば、プライマーは第１のペアーについてＰＮＴ１ａとＰＮＴ２ａ、第２のペアーについてＰＮＴ１ｂとＰＮＴ２ｂと呼ばれる。
【００２３】
「変換された標的」又は「４塩基標的」（Ｃ４Ｂと呼ばれている）は、標的または標的核酸が、化学又は酵素の薬剤によって処理され、ヌクレオチドによって持たれる１種類の塩基を別の異なる種類の塩基に変換させることを意味する。ヌクレオチドの数と配列順序は、薬剤の作用によって変わらない。従って、変換された標的核酸（Ｃ４Ｂ）は、変換されていない標的核酸（ＣＮＴ）と同じヌクレオチドの総数を有するが、少なくとも１種類の塩基が別の種類の塩基に変化したヌクレオチド配列で構成される。好ましくは、変換された標的は、アデニン、チミン、グアニン、ウラシル、シトシン及びヒポキサンチンから選択される塩基を有する種類のヌクレオチド配列で構成される。従って、４塩基標的は増幅される標的核酸であってもよく、亜硫酸水素塩によって変換されている：すなわち、アデニン、グアニン及びチミンは変わらないが、シトシンはウラシル（ＤＮＡの場合）に変換される。アデニン、グアニン及びウラシルは変わらないが、更にシトシンはウラシル（ＲＮＡの場合）に変換される。この場合、変換により、天然にあるウラシルは変わらないままであり、シトシンはウラシルに変換されている、３つの塩基により変換された標的を得ることが可能である。このＲＮＡは、３種類の塩基すなわちアデニン、グアニン及びウラシルだけで構成されるヌクレオチド配列で構成される。使用する用語を単純化するために、Ｃ４Ｂなる用語は、変換されたＤＮＡ標的（４塩基）と、更に変換されたＲＮＡ標的（３塩基）のためにも使われる。いずれの場合でも、これは、上流プライマーについてＰ３Ｂ１と呼ばれており、下流プライマーについてＰ３Ｂ２と呼ばれている特異的プライマーによって、Ｃ４Ｂから開始される標的核酸の増幅に影響を及ぼさず、アンプリコンＣ３Ｂは常に３塩基を有する（以下を参照）。同様に、多重増幅の場合、上流プライマーについてＰ３Ｂ１ａ及びＰ３Ｂ１ｂと呼ばれており、下流プライマーのについてＰ３Ｂ２ａ及びＰ３Ｂ２ｂと呼ばれている特異的プライマーである。この変換は、シトシンデアミナーゼに適用することができ、この場合アデニン、グアニン及びチミンは変化しないが、シトシンがウラシル（ＤＮＡの場合）に変換される。アデニン、グアニン及びウラシルは変化しないが、シトシンがウラシル（ＲＮＡの場合）に変換される（参照、特許ＥＰ−Ｂ−１６５４３８８）。この場合、変換により、天然にあるウラシルは変わらないままであり、シトシンはウラシルに変換されている、３つの塩基により変換された標的を得ることが可能である。このＲＮＡは、３種類の塩基すなわちアデニン、グアニン及びウラシルだけで構成されるヌクレオチド配列で構成される。もう一度、使用する用語を単純化するために、Ｃ４Ｂなる用語は、変換されたＲＮＡ標的（３塩基）のためにも使われる。いずれの場合でも、これは、上流プライマーについてＰ３Ｂ１と呼ばれており、下流プライマーについてＰ３Ｂ２と呼ばれている特異的プライマーによって、Ｃ４Ｂから開始される標的核酸の増幅に影響を及ぼさず、アンプリコンＣ３Ｂは常に３塩基を有する（以下を参照）。この変換は、デアミナーゼに適用することができ、この場合アデニン、グアニン及びチミンは変化しないが、アデニンがヒポキサンチン（ＤＮＡの場合）に変換される。アデニン、グアニン及びウラシルは変化しないが、シトシンがヒポキサンチン（ＲＮＡの場合）に変換される。これに関して、Gerber A. P. et al. （Science; 1999; Nov 5; 286 (5442): 1146-49）をあげることができる。
【００２４】
「３−塩基標的」（Ｃ３Ｂと呼ばれている）なる用語は、本発明の意味において、Ｃ４Ｂから増幅した標的核酸であって、参考として、Ｐ３Ｂ１と呼ばれている上流の（または「フォワード」）プライマー用及びＰ３Ｂ２と呼ばれている下流の（または「リバース」）プライマーの特異的プライマーによって増幅される標的核酸を意味する。
【００２５】
「塩基の種類」なる用語は、それらがリボース（場合により、例えば２’−Ｏ−メチル基の存在下で置換される）及び場合により１、２、または３つのリン酸基に関連するという事実にかかわらず、塩基の性質、すなわち、アデニン（Ａ）、またはチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）、またはグアニン（Ｇ）、またはウラシル（Ｕ）、またはヒポキサンチンを定義する。
【００２６】
「３塩基プライマー」（Ｐ３Ｂ１とＰ３Ｂ２と呼ばれている）は、アデニン、チミン、グアニン、シトシンを含む群から選択される塩基の３つの異なる種類から構成される、修飾されているかまたは修飾されていない、少なくとも３つのヌクレオチドの配列から構成されている１本鎖配列を意味する。３塩基センスプライマー（Ｐ３Ｂ１）は、変換された標的核酸（Ｃ４Ｂ）の配列の少なくとも部分に、または少なくともアンチセンスプライマー（アンプリコン）から開始された合成された核酸のヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的であり、増幅試薬がある場合には、核酸の合成の開始のポイントとして役立つ。
アンチセンス３塩基プライマー（Ｐ３Ｂ２）は、センスプライマーから合成される核酸のヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的である。これらのプライマーは、１０から１００ヌクレオチドのサイズであり、好ましくは１２から５０であり、より好ましくは、１５から３０ヌクレオチドである。使用される増幅技術に従い、プライマーは、変換された標的へハイブリダイズする配列に加えて、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ型の転写後増幅の場合、プロモーター（例えばＴ３、Ｔ７またはＳＰ６）のヌクレオチド配列を含むことができる。これらの転写後増幅の場合、プライマーが、４種類の異なる塩基のヌクレオチドから成るヌクレオチド配列である配列（プロモータ配列）及び３種類の異なる塩基のヌクレオチドから成るヌクレオチド配列である配列（変換された標的へのプライマーのハイブリダイズができるような配列）の部分から構成されることは、当業者によく知られている。
【００２７】
「検出プローブ」または「プローブ」（ＳＮＴと呼ばれている）は、アデニン、チミン、グアニン、ウラシル、シトシンを含む群から選択される異なる４種類の塩基のヌクレオチドの核酸配列を意味し、アンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができて、少なくとも一つのマーカーを有する。プローブは、丸い形態のプローブ（Ｏ−プローブと呼ばれる、本出願人の２００８年７月４日付け特許出願ＦＲ０８／５４５４９号を参照）、分子ビーコン、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブまたはＦＲＥＴプローブであっても良い。
プローブのこれらの最後の３種類は、当業者にとってよく知られている。これらのプローブは、場合により修飾されたヌクレオチドから、完全にまたは部分的に構成されてもよい。各々のプローブは、マーカーと、場合によりクエンチャーを有する。
【００２８】
「マーカー」は、ヌクレオチドによって担持される分子を意味する。マーカーとヌクレオチドとの間の結合は、当業者に知られているさまざまな方法で達成することができる。手動のカップリングは、活性化された基、典型的にはカルボキシルまたはチオールを有するマーカーを使用して実施され、それは対応する反応基（例えば、アミンまたはチオール）を有する修飾された内部ヌクレオチドに結合するか、またはこれらの同じ反応基によって修飾されるヌクレオチド鎖の一端に結合する。自動カップリングは、マーカーを有するホスホロアミダイトを用いて実施され、結合は使用するホスホロアミダイトの種類に従い、ヌクレオチド鎖の自動化された合成の間に、鎖の一端に、または内部位置に起こる。マーカーは、フルオロフォアまたは蛍光クエンチャーであってもよい。
【００２９】
「フルオロフォア」は、それが適切な波長の光に励起している場合、蛍光シグナルを放出する分子を意味する。フルオロフォアは、特に、ローダミンまたは誘導体（例えばテキサスレッド）、フルオレセインまたは誘導体（例えばＦＡＭ）、Ａｌｅｘａ系統のフルオロフォア（例えばＡｌｅｘａ  ５３２及びＡｌｅｘａ  ６４７、Ａｌｅｘａ  ４０５、Ａｌｅｘａ  ７００、Ａｌｅｘａ  ６８０、Ｃｙ５または使用する測定機器に応じた適切な他の任意のフルオロフォア）であってもよい。検出プローブで利用可能なフルオロフォアは、非常に多様であり、当業者に知られている。
【００３０】
本発明の意味において、「フルオレセイン」は、領域４９０〜５００ｎｍ、好ましくは４９５ｎｍの波長の光で励起した場合に、５３０ｎｍ辺りで発光最大を有する蛍光シグナルを放出し、芳香族の化学分子を意味する。
【００３１】
「蛍光クエンチャー」または「クエンチャー」は、フルオロフォアによって放出される蛍光を妨げる分子を意味する。このクエンチャーは、寄生的な放出を回避するために非蛍光性の芳香族分子から選択されてもよい。好ましくは、前記クエンチャーはダブシル（ＤａｂｓｙｌまたはＤａｂｃｙｌ）または「ブラックホールクエンチャー」（ＢＨＱ）であり、それらが物理的にフルオロフォアに近接している場合に、それは蛍光の放出を防ぐ非蛍光性の芳香族分子である。例えばFluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes, p. 4, Ed. V.V. Didenko, Humana Press 2006, ISSN 1064-3745に記載されているような、蛍光共鳴エネルギー転送（ＦＲＥＴ）技術を使用することができる。更に、クエンチャーは、また、蛍光分子、例えばＴＡＭＲＡ（カルボキシ・テトラメチルローダミン）から選択されることができる。
【００３２】
「３塩基検出プローブ」または「３塩基プローブ」（Ｓ３Ｂと呼ばれている）は、前に定められたプローブであり、前の特性に加えて、アデニン、チミン、グアニン、シトシンを含む群から選択した３つの異なる種類の塩基のヌクレオチド配列で構成される。プローブ（ビーコン、Ｏ−プローブ等）の形態に従い、プローブが、４種類の異なる塩基を有するヌクレオチドから成るヌクレオチド配列の部分配列及び３種類の異なる塩基を有するのヌクレオチドから成るヌクレオチド配列の部分配列から構成されることは、当業者によって容易に理解される（アンプリコンのハイブリダイゼーションと検出を可能にする配列）。特定の場合において、アンプリコンへのハイブリダイゼーション及びその検出を改良するために、本発明によるプローブは、チミンの代わりにウラシルを必要に応じて含むことができる。この場合、本発明によるプローブは、塩基（ウラシル、グアニン、アデニン、チミン）の４つの異なる種類を有するヌクレオチド配列から構成される。使用する用語を単純化するために、「３塩基プローブ」なる用語またはＳ３Ｂが、より良好なハイブリダイゼーションが必要であるこの種類のプローブのために使われる。いずれの場合でも、これは、Ｃ３Ｂアンプリコンの検出および／または相補鎖、常に３つの塩基を有するＣ３Ｂｃ、Ｃ３Ｂ及びＣ３Ｂｃアンプリコンの検出に影響を及ぼさない（上記を参照）。
【００３３】
本発明の原理のより良好な理解のために、例証として、仮定的配列である標的であって、ＣＮＴに対応するものを以下のように示す（配列番号１）。亜硫酸水素塩による変換の範囲内で、４塩基標的、３塩基標的及びプライマーとプローブは、以下の配列を有する：
0005816094.tif 000002
従って、Ｃ３ＢはＣ３Ｂｃに相補的である:
0005816094.tif 000003
これは、ＣＮＴに比較して完全に異なる:
0005816094.tif 000004
【００３４】
「ハイブリダイゼーション」はその間に、適切な条件において、完全にまたは部分的に相補的な配列を有する２つの一本鎖ヌクレオチド断片が、核酸塩基の間の水素結合によって安定化された二重鎖または「デュプレックス」を形成することができるプロセスを意味する。ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェンシーによって決定される（すなわち操作条件の厳しさと低い塩分濃度）。ハイブリダイゼーションは、より大きなストリンジェンシーで実施された場合に、ますます特異的である。ストリンジェンシーは、プローブ／標的デュプレックスの塩基の組成物および２つの核酸間の誤対合の程度の関数として、特に定義される。更に、ストリンジェンシーは、反応パラメーター、例えばハイブリダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度と種類、変性剤の性質及び濃度、および／またはハイブリダイゼーション温度の関数である。ハイブリダイゼーション反応が実施されなければならない条件のストリンジェンシーは、使用するハイブリッド形成プローブによって主に決まる。これらの全データは周知であり、適切な条件は当業者によって決定されることができる。
【００３５】
「Ｃｅｑ」なる用語は、細胞当量、真正細菌のＰＣＲ増幅で使用する単位であって、ＤＮＡの１０００のコピーに相当する単位を定義する。細胞は、ＲＮＡ１６ｓの約１０３コピーのＲＮＡを含むことができる（真正細菌のプライマーとプローブの標的）。実施例と添付の図は特定の実施態様を表しており、本発明の範囲を制限するものとして考慮されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】増幅の前に亜硫酸水素ナトリウムによる核酸標的の変換工程を使用する有利な条件を示す。増幅が従来どおり行われる場合、すなわち天然標的（非変換、図においては天然またはＣＮＴと呼ばれる）については、正常なヌクレオチド・プライマー（図においてはＰＮＴ１とＰＮＴ２と呼ばれる）を使用する場合、増幅混合物に天然に存在する混入成分は場合により興味の標的とともに増幅する。反対に、標的が増幅前に変換されて（図でＣ４Ｂと呼ばれている）、増幅が変換された標的のために設計された３塩基ヌクレオチドプライマー（Ｐ３Ｂ１とＰ３Ｂ２と呼ばれている）を使用して行われる場合、この特異的な標的だけが増幅されて、検出される。溶液に依然として存在するにもかかわらず、混入物は増幅されることができない。実際に、本発明のプライマー（３塩基プライマーＰ３Ｂ）は、非特異的にさえ、４種類の異なる塩基を有するヌクレオチドを有する混入核酸にハイブリダイズすることができない。増幅反応は、変換された標的Ｃ４Ｂから開始され、図ではＣ３Ｂと呼ばれているアンプリコンを生じ、次にＣ３Ｂに相補的鎖のＣ３Ｂｃを生じる。本発明は、細菌、真正細菌、菌類、汎菌類、ウイルスまたはイースト標的の増幅（ＮＡＳＢＡ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴＭＡ等）のための非常に特定の有利なものである。
【図２】シトシン塩基をウラシル塩基  に変換させる化学反応を記載する(Hayatsu H.; Mut. Research; 2008; 659: 77-82による)。
【図３】エレクトロスプレー・イオン化質量分析（ＥＳＩ）による、ＤＮＡの組成物の分析スペクトルを示す。解析は、亜硫酸水素ナトリウムによる変換の前（ａ）と後（ｂ）にＤＮＡ標的について実施された。横軸は分で時間を示し、縦軸は任意の単位の吸光度を示す。値Ｍ＋Ｈは、１モルのプロトンの質量が加えられる分子の分子量を表す。例えば、デオキシ・シトシンの存在は、この分子に対応する質量の出現によって示される。
【図４】異なる種類の増幅プライマー（上記のＰＮＴまたはＰ３Ｂ）によって行われる真正細菌のＮＡＳＢＡ増幅のネガティブコントロールの比較である（標的は、水と交換される）。アンプリコンの検出は、４８８ｎｍで蛍光を測定することによって、リアルタイムにおいて遂行され、縦軸上は任意の単位（相対的蛍光単位、ＲＦＵ）であり、横軸は分で経過時間を示す。実験条件（ａ）が、プライマー（ＰＮＴ）と天然検出プローブ（ＳＮＴ）によるネガティブコントロールの増幅及び検出に対応する。実験条件（ｂ）は、３塩基プライマー（Ｐ３Ｂ）と３塩基検出プローブ（Ｓ３Ｂ）によるネガティブコントロールの増幅及び検出に対応する。
【図５】変換された標的が二本鎖ＤＮＡである場合、本発明の原理に従ったＰＣＲによる増幅の概略図である。２つのプライマー対Ｐ３Ｂは、この増幅を実施するために必要である。
【図６】真正細菌のＮＡＳＢＡ増幅の標的の希釈シリーズの比較を示す。アンプリコンの検出は、時間の関数として（分、横軸）、４８８ｎｍ（任意の単位ＲＦＵ、縦軸）で蛍光を測定することによって、リアルタイムにおいて遂行される：（図６Ａ）４種類の異なる塩基（ＣＮＴ）から成る合成標的の０から１０ｅ７コピーまで変動している希釈シリーズの増幅（プライマーＰＮＴ）及び検出（プローブＳＮＴ）。（図６Ｂ）３種類の異なる塩基（Ｃ３Ｂｃ）から成る合成標的の０から１０ｅ７コピーまで変動している希釈シリーズの増幅（プライマーＰ３Ｂ）及び検出（プローブＳ３Ｂ）。
【図７】真正細菌のＰＣＲ増幅を示す。アンプリコンの検出は、４８８ｎｍ（任意の単位ＲＦＵ）で蛍光を測定することによって、サイクルの各々の終わりで遂行される。以下については、横軸はサイクル数を示し、縦軸は任意の単位の蛍光を示す：（図７Ａ）４種類の異なる塩基（ＣＮＴ）から成る合成標的の０から１０ｅ５コピーまで変動している希釈シリーズの増幅（プライマーＰＮＴ）及び検出（プローブＳＮＴ）。（図７Ｂ）３種類の異なる塩基（Ｃ３Ｂｃ）から成る合成標的の０から１０ｅ５コピーまで変動している希釈シリーズの増幅（プライマーＰ３Ｂ）及び検出（プローブＳ３Ｂ）。
【図８】大腸菌のｇＤＮＡの希釈シリーズの真正細菌のＰＣＲ増幅である。すでに言及されるように、アンプリコンの検出は、４８８ｎｍ（任意の単位ＲＦＵ）で蛍光を測定することによって、各サイクルの終わりで遂行される。以下については、横軸はサイクル数を示し、縦軸は任意の単位の蛍光を示す：（図８Ａ）大腸菌（ＣＮＴ）のｇＤＮＡの０から１０ｅ５コピーまで変動している希釈シリーズの増幅（プライマーＰＮＴ）及び検出（プローブＳＮＴ）。（図８Ｂ）亜硫酸水素塩（Ｃ４Ｂ）による処理によって変換される大腸菌のｇＤＮＡの０から１０ｅ５コピーまで変動している希釈シリーズの増幅（プライマーＰ３Ｂ）及び検出（プローブＳ３Ｂ）。
【００３７】
図１及び２を参照して、より正確には、亜硫酸水素ナトリウムによる標的の変換は、以下の通りに行われる。４つの工程を含むプロトコルである：
（１）初めに、変換は水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）による標的の変性から開始し、次に、亜硫酸水素ナトリウムとハイドロキノン（後者は、亜硫酸水素塩の酸化を制限することができる）の付加。
（２）次に  標的はカラム濾過によって精製される。
（３）標的は、塩基性媒体中で脱スルホン酸化される。
（４）終わりに、最後のカラム精製は、増幅される準備ができている変換された標的を与える。
【００３８】
亜硫酸水素塩による核酸の化学変換は、従来技術ですでに知られている。これに関しては、以下の仕事がある。
１）そのなかにはShapiro及びHayatsuを含む最初期の仕事がある：
・「Reaction of Cytosine and Uracil with sodium bisulfite" Shapiro R. et al., J. Biol. Chem.; 1973; Jun; 248: 4060-64」及び
・「The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine" Hayatsu H. et al., J. Am. Chem. Soc.; 1970; 40(26): 724-26」。
これは、多数の文献がこの分野で出版されているが、その時点では、診断法においての意味を実際には定義していないことを証明する。
２）同一起源の種に属している一組の核酸を増幅するために、一群の非縮重プライマーを使用する、亜硫酸水素塩によるＤＮＡの処理の技術に関する特許出願：
・細菌（WO-A-2006/058393及びWO-A-2007/140506）、及び
・ウイルス（WO-A-2007/030882）。
３）ＤＮＡのゲノム配列のメチル化のモティーフを検出するための亜硫酸水素塩による核酸の処理方法方法の改良：Clark S.J., Nucleic. Acids Res.; 1994 August 11; Vol. 22 (15): 2990-97の「High Sensitivity mapping of methylated cytosines」。
４）亜硫酸水素塩による核酸の処理方法、固体支持体に取り付けられる核酸に適している処理方法の新規開発（ＥＰ−Ｂ−１５９０３６２及びＥＰ−Ａ−１３９４１７３）。
５）ゲノムＤＮＡの配列決定のための亜硫酸水素塩による核酸の処理とメチル化されたシトシンのモティーフの同定の最高水準の技術をまとめたする刊行物。この概要は、亜硫酸水素塩技術の開発者によって記載された：Hayatsu H., Mut. Research; 2008; 659: 77-82。
【００３９】
従って、亜硫酸水素塩を使用する変換の化学作用が３５年以上前にすでにかなり記載されていたことは、明らかである。対照的に、化学又は酵素の変換は、標的核酸の抽出、精製及び増幅の間に、使用する試薬による混入核酸を取り除くために、確実には記載されていないか、または言及さえされていない。従って、本発明は、混入核酸によるバックグラウンド・ノイズのない変換された標的の特異的な増幅に関する。
従って、目的は、以下の有利な条件を有する方法を提供することである：
１）単純且つ迅速、
２）増幅工程の直前に使用できる、
３）高収率で標的を変換することができる、
４）ＰＣＲ及びいわゆる転写後増幅（ＮＡＳＢＡとＴＭＡ）を含む多数の増幅技術と互換性を持つ。
５）自動化することができ、強力なおよび／または磁気支持体に適用することができる。
【実施例】
【００４０】
実施例１：亜硫酸水素塩による核酸標的の変換の例証：
（目的）
亜硫酸水素塩によって、４種類の塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、すなわちＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）とＣ（シトシン）を有する生物学的標的を、４つの塩基Ａ、Ｔ、ＧとＵ（ウラシル）を有する標的に変換することを例証するためである。
（手順）
変換は、市販キットＺＹＭＯ―ＥＺ  ＤＮＡメチル化−ＧｏｌｄＴＭキット、ＺＹＭＯリサーチ、＃Ｄ５００５（Orange、CA 92867−アメリカ合衆国）によって、キットと共に提供されたプロトコルに従って行われる。変換される標的は、細菌の大腸菌Ｏ１５７、#IRMM449-1EA、Sigma-Aldrich Chimie(L'Isle d'Abeau Chesnes−フランス）から抽出される５００〜４０００の二本鎖ヌクレオチドのゲノムＤＮＡの市販のサンプルである。
亜硫酸水素塩による変換：キットのプロトコルに従って、１３０μｌのＣＴ変換試薬を２０μｌの試料（大腸菌から抽出したゲノムＤＮＡの２００ｎｇに相当する）に添加する。混合物は、標的の大腸菌ゲノムの変性のために、９８℃で１０分間、次に６４℃で１５０分、４℃で５分間インキュベートする。これは、変換された標的を含む溶液を生じる。
精製：キットの結合バッファーと呼ばれている固定バッファーの６００μｌは、変換された標的を含む１５０μｌの溶液に加える。混合物は、キットで供給されているカラムに置かれて、１００００ｘｇで３０秒間遠心分離機にかけられる。洗浄バッファーの容量１００μｌはカラムに置かれて、１２０００ｘｇで３０秒間遠心分離機にかけられる。
脱スルホン化：脱スルホン・バッファーの容量２００μｌは同じカラムに置かれて、室温で１５分間インキュベートされて、次に１２０００ｘｇで３０秒間遠心分離機にかけられる。次に、カラムは、洗浄バッファーの２００μｌを加えることによって二回洗われて、１２０００ｘｇで３０秒間遠心分離機にかけられる。
溶出：カラムは、きれいなチューブに置かれる。溶出バッファー（Ｍ−Ｅｌｕｔｉｏｎバッファーと呼ばれている）の容量１０μｌはカラムの中央に置かれ、１２０００ｘｇで３０秒間遠心分離機にかけられる。１０μｌの溶出液は、亜硫酸水素塩によって変換されるＤＮＡを含み、増幅のために使われる準備ができる。次に、大腸菌由来のｇＤＮＡの変換された試料は、ヌクレアーゼＰ１（１３Ｕ）(N8630-1VL、Sigma Aldrich、St Louis, U.S.A.)とアルカリホスファターゼ（３Ｕ）(P7923-2KU、Sigma Aldrich, St Louis, U.S.A.)の混合物は、一晩３７℃で加水分解される。次に、加水分解されたゲノムＤＮＡは、ＨＰＬＣによって分析される。
ＨＰＬＣの条件とエレクトロスプレー・イオン化質量分析による検出：
このために、以下を使用する：
・WATERS Alliance 2795 HPLC チェーン (Milford, Connecticut (CT) USA), 
・WATERS XTerra MS C18カラム (Milford, CT, USA) 4.6 x 30 2.5μm, ３０℃で１ｍｌ／分の流速で、ｐＨ７の１０ｍＭの蟻酸アンモニウム中でアセトニトリルの以下の直線的勾配によって使用：０％〜５％（４分）；５％〜１２％（５分）；１２％〜９０％（２分）及び９０％〜０％（３分）。
・ＰＤＡ 996ダイオードアレイ検出器、ソフトウェア・エンパワーバージョン2（Milford, CT, USA）、質量検出器（ZQ Electrospray WATERS (Milford, CT, USA)）。
【００４１】
結論：
図３（ａ）は、亜硫酸水素塩によって変換されない大腸菌由来の加水分解されたｇＤＮＡの組成物の、エレクトロスプレー・イオン化質量分析（ＥＳＩ）による解析の結果を示す。ヌクレオシドの４つの種類に対応する４つのメインピークを見ることができる：デオキシアデノシンｄＡ、デオキシチミジンｄＴ、デオキシグアノシンｄＧ、デオキシシトシンｄＣ及びデオキシイノシンｄＩの痕跡。デオキシイノシンは、アデノシンデアミナーゼがデオキシアデノシンに及ぼす酵素作用から来る。アデノシンデアミナーゼは、アルカリホスファターゼの市販の調製物の痕跡レベルで見いだされる混入物である。
図３（ｂ）は、亜硫酸水素塩による変換後に大腸菌由来の加水分解されたｇＤＮＡの組成物の解析を示す。デオキシウリジンｄＵに対応する新規な溶出ピーク（ピーク７）の出現とｄＣのピーク（ピーク２）の準消失である。他の溶出ピーク（ピーク３、４及び５）は変わらず、ｄＧ、ｄＴ及びｄＡの存在に対応する。このクロマトグラムはこのＤＮＡが４つのヌクレオシドｄＵ、ｄＡ、ｄＴ及びｄＧから成ることを示す。この例では、これらの実験条件の変換効率は８０％である。この効率は、処理される興味のＤＮＡのサイズの関数である。変換率（または効率のレベル）は、短い断片のＤＮＡの、非常に高くなる。この実験条件において、処理されたＤＮＡは、大腸菌由来のゲノムＤＮＡであり、すなわち大きな長さの標的ＤＮＡであり、変性して変換するのが非常に困難である。しかしながら、大部分のｄＣのｄＵへの変換が証明されている。
【００４２】
実施例２：３または４塩基合成オリゴヌクレオチド（それぞれＣ３ＢとＣＮＴと呼ばれる）の希釈度シリーズから４塩基（ＰＮＴ）又は３塩基（Ｐ３Ｂ）増幅プライマーによる真正細菌のＮＡＳＢＡ増幅の実施：
（目的）
発想の証明、すなわち、３塩基プライマー（Ｐ３Ｂ１とＰ３Ｂ２）と塩基プローブ（Ｓ３Ｂ）を使用して行われる真正細菌のＮＡＳＢＡは、混入細菌標的のような天然標的（ＣＮＴ）を増幅することなしに、３塩基合成標的の増幅と特異的な検出ができることを実証することである。検出は、４塩基検出プローブまたはプローブ（Ｓ３Ｂ）を検出している３−塩基検出プローブによってリアルタイムにおいて遂行される。
（手順）
このテストは、真正細菌のＮＡＳＢＡを実施することによって、増幅を行う：一方では
−ＣＮＴと呼ばれる４−塩基オリゴヌクレオチド標的の希釈シリーズ、４塩基プライマー（ＰＮＴ１とＰＮＴ２と呼ばれる）及び４塩基検出プローブ（ＳＮＴ）、Ａ、Ｔ、ＧとＣである４種類の塩基；
一方では：
−Ｃ３Ｂと呼ばれる３−塩基オリゴヌクレオチド標的の希釈度シリーズ、プライマー（Ｐ３Ｂ１とＰ３Ｂ２）及びＣ３Ｂとハイブリダイズできる３−塩基検出プローブ。希釈シリーズは、テストにつき０から１０７コピーの標的である。
オリゴヌクレオチド標的、プライマー及びプローブをEurogentec（Seraing, Belgium）に注文し、それらは亜硫酸水素塩の変換なしに、以下の配列を有する：
0005816094.tif 000005
これらの配列において、プロモータＴ７の配列は小文字に対応する；検出プローブが分子ビーコンである時は、ループの配列はステムの大文字で示され、ステムの配列は太字の小文字で示される。ＮＡＳＢＡ増幅は、キットNASBA NucliSENS EasyQ ＨＩＶ−１ v1.2（ref. 285036、ビオメリュー、Marcy l'Etoile, France）で供給される製造業者の指示に従って行われる。簡潔には、増幅混合物（ミックス）と酵素混合物は、以下の通りに調製される：
増幅混合物（８チューブ用の量）：
・ＮＡＳＢＡ等級の水（ＮＡＳＢＡ水と呼ばれている）：１１．２μｌ
・試薬希釈液：６４μｌ
・ＫＣｌ：１２．８μｌ、
・試薬の粒子：１粒、及び
・プライマーとプローブの混合物：８μｌ
酵素混合物（８チューブ用の量）：
・酵素希釈剤：４５μｌ（８チューブ用）、及び
・試薬の粒子：１粒、
【００４３】
準備：増幅混合物の量１０μｌは、０．２ｍｌのチューブに置かれ、そこに標的核酸の量５μｌを加える。酵素混合物の量５μｌは、チューブのストッパーに置かれる。チューブは閉じて、６５℃で５分間、次に４１℃で５分間インキュベートする。チューブは短時間遠心し、２つの混合物は撹拌しないで組合わせられ、次に４１℃で９０分間のNucliSens EasyQ蛍光光度計（ref. 200309、ビオメリュー、Marcy l'Etoile, France）においてインキュベートされる（標準プログラムＱＬ１-９０）。蛍光は、反応の間、４８８ｎｍで読みとられる。
４塩基標的のＮＡＳＢＡ増幅の場合、標的ＣＮＴのＮＡＳＢＡ増幅は、図４の曲線（ａ）に対応し、混入している核酸は非常に強く増幅されているが、４塩基標的のＮＡＳＢＡ増幅の場合、図４の曲線（ｂ）のシグナルは非常に弱いままであることが分かる。これは、プライマーＰ３Ｂ１とＰ３Ｂ２による混入物の増幅はほとんどないこと、及びプローブＳ３Ｂによるそれらの検出はほとんどないことを証明するものである。
図６Ａは、プライマーＰＮＴ１及びＰＮＴ２によって実施されるＮＡＳＢＡ増幅がネガティブコントロール（テストにつき０コピー）から特異的な標的ＣＮＴを区別しないことを示す（テストにつき０から１０７コピーの濃度）。反対に、３塩基標的Ｃ３Ｂ（図６Ｂ）上のプライマーＰ３Ｂ１とＰ３Ｂ２によって行われるＮＡＳＢＡ増幅は、良好な検出感度を有する特異的な標的Ｃ３Ｂの希釈シリーズを与える。この例では、感受性は、テストにつき１０３コピーである。
結論：
この実験は、約４つのログの標的の検出感度の増加ができるようにするように、３−塩基標的上のこの増幅によって提供される有利な条件を明確に示す。標的ＣＮＴのＮＡＳＢＡ増幅の実験において、ネガティブコントロールは、約１０ｅ７コピー／テストに対応するシグナルと同定され、一方でこのシグナルは標的Ｃ３ＢのＮＡＳＢＡ増幅において１０ｅ３コピー／テストより下である。
【００４４】
実施例３：３または４塩基合成オリゴヌクレオチド標的の希釈シリーズからＰＮＴ又はＰ３Ｂプライマーによる真正細菌のＰＣＲ増幅の実行：
目的：
４塩基プライマー（ＰＮＴ）と４塩基プローブ（ＳＮＴ）による天然標的（ＣＮＴ）上の真正細菌のＰＣＲによる増幅に比較した、３塩基標的（Ｃ３Ｂ）に特異的な３塩基プライマー（Ｐ３Ｂ）を使用した真正細菌のＰＣＲによる増幅後の３塩基合成細菌の標的（Ｃ３Ｂ）の検出感度の増加を示すことである。
手順：
真正細菌のＰＣＲ増幅は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）、ＳＮＴまたはＳ３Ｂと呼ばれる蛍光検出プライマーとプローブを使用して実施される。標的は、４塩基配列（ＣＮＴのためのＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ；配列番号８）または３塩基配列（Ｃ３ＢのためのＡ、Ｔ、Ｇ；配列番号１２）を有する９２ヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドである。増幅は、テストにつき０から１０５コピーの範囲の標的の希釈度で実施される。
増幅は、キット・ロシュLightCycler FastStart DNAマスターHyprobe、#030003248001（Basle, Switzerland）で供給される製造業者の指示書に従って行われる。使用するプライマー及びプローブの配列は、以下の通りである：
0005816094.tif 000006
ヌクレオチド２’−Ｏ−Ｍｅは、３塩基プローブの配列のＣ塩基の消失と連結されたハイブリダイゼーション温度の減失に補うことを可能にする。このＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの設計のウラシル（この場合、修飾したウラシル）の点導入は、アンプリコンによるハイブリダイゼーションを改良することを可能にする。
増幅混合物：（１チューブ用）
・ＰＣＲ用の水：１０．４μｌ
・プライマーＰ１（１０μＭ）：１μｌ
・プライマーＰ２（１０μＭ）：１μｌ
・プローブ（２．５μＭ）：２μｌ
・ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）：１．６μｌ及び
・増幅混合物（１０ｘマスターミックス）：２μｌ。
最終的な増幅混合物は９５℃で１０分間プレインキュベートし、次に９５℃１０秒の変性段階、５０℃１５秒のハイブリダイゼーション段階、６０℃１５秒で伸長段階からなる４５サイクルで増幅される。増幅は、９５℃で５分間のインキュベーションによって止められる。伸長サイクルの間、蛍光は、５３０ｎｍで読みとられる。
【００４５】
図７Ａは、テストにつき１０３コピー以下のＣＮＴ標的で、ＰＣＲシグナルはネガティブコントロール（０コピー）のシグナルから区別できないことを示す。
従って、ＣＮＴ標的の真正細菌ＰＣＲの感受性は、テストにつき１０３コピーである。
図７Ｂにおいて、３−塩基オリゴヌクレオチド標的（Ｃ３Ｂ）上の真正細菌のＰＣＲ増幅は、優れた感受性を示し、ネガティブコントロールでは水平のままである曲線を有し、テストにつき１０コピーより大きい感受性を有する。
結論：
この実験は、３−塩基合成標的Ｃ３Ｂ上の真正細菌のＰＣＲ増幅を使用することが４つのログの感受性の増加を与えることを示す。
３塩基標的の増幅の感受性は、増幅技術及び使用する検出の手段とは独立している。これらの実験は、増幅技術及び使用した３塩基の検出プローブの形態を問わず、本発明の３塩基標的の増幅の感受性は、天然標的（ＣＮＴ）の従来の増幅のそれよりはるかに大きいことを示す。
【００４６】
実施例４：細菌ＤＮＡ標的の変換及びＰ３Ｂプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって提供される感受性の増加の例証：
目的：
合成モデル上の例証後（実施例２と３）、アッセイは、亜硫酸水素塩によって実験的に変換される現実の生物学的モデルについて行われる。目的は、変換されて次に変換された標的に特異的なＰ３Ｂ増幅プライマーを使用してＰＣＲによって増幅された細菌標的の検出感度の増加を示すことである。
手順：
この例証は、市販の変換キットZymo Researchを使用して、キットの供給元の指示書に従って行われる（実施例１を参照）。変換は、５０〜４０００ヌクレオチドの核酸から成る大腸菌（Ｏ１５７、シグマIRMM449-1EA）由来のゲノムＤＮＡの抽出物について行われる。真正細菌のＰＣＲ増幅は、実施例３に記載されているものと同じ実験条件、同じプライマーと同じ検出プローブにより、実施される。蛍光は、伸長サイクルの間、５３０ｎｍで読みとられる。
【００４７】
図８Ａは、大腸菌由来の標的ＤＮＡが亜硫酸水素塩で処理されなかった実験条件に対応する。従って、このＤＮＡは、４種類の異なる塩基、すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣを有するヌクレオチド配列で構成される。このＤＮＡの増幅は４種類の異なる塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ）の配列で構成されるアンプリコンを生成する。
図８Ｂは、大腸菌由来のＤＮＡが亜硫酸水素塩による処理後に変換された実験条件に対応する。この変換されたＤＮＡ（４−塩基が変換された標的）は、４種類の異なる塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕ）を有するヌクレオチド配列から成る。本発明によるプライマー（３−塩基プライマー）によって変換されたこのＤＮＡの増幅は、３種類の異なる塩基を有するヌクレオチド配列で構成されるアンプリコンを生成する：Ａ、Ｔ、ＣまたはＡ、Ｔ、Ｇ。
図８Ａで示したように、大腸菌由来の変換されていないＤＮＡの真正細菌のＰＣＲ増幅の場合、感受性のレベルは、テストにつき１０００Ｃｅｑである。テストにつき０Ｃｅｑのネガティブコントロールは、テストにつき１００Ｃｅｑと区別がつかない。この図は、標的ＤＮＡの１０００００コピーの閾値以下で、使用するさまざまな試薬に存在する混入ＤＮＡ由来の標的ＤＮＡを区別することが可能でないことを示す。
図８Ｂは亜硫酸水素塩による試料の変換及び真正細菌のＰＣＲ増幅後に、得られた感受性のレベルはテストにつき０．１から１Ｃｅｑまでであることを示す。ネガティブコントロールは、非常に弱いシグナルを与える。この実験は、本発明による方法が、全ての混入成分を避けることを可能にし、感受性の非常に有意な増加を得ることを可能にすることを示す。
さらに、我々の実験条件の大腸菌由来のゲノムＤＮＡの変換の効率が８０％（上記を参照）であるにもかかわらず、検出感度は比較的高く、変換されなかった大腸菌由来のゲノムＤＮＡの２０％に影響を受けているように見えない。ゲノムＤＮＡのこの２０％が塩基の種類のレベルで変化しなかった場合、それはその事実自体によって混入となり、本発明の方法によって増幅されない。
結論：
亜硫酸水素塩によって変換された細菌ＤＮＡの標的上の真正細菌のＰＣＲ増幅のこの実施例は、試料のこの処理が提供することができる感受性の増加を明らかに示す。実際には、感受性の増加は、４つのログの中である。変換処理の効率のレベルが１００％近くでない場合であっても、亜硫酸水素塩による前処理を伴う増幅を使用することによって、ネガティブコントロール由来の信号は、消されることができる。
従って、抽出試薬、精製試薬及び増幅試薬に存在する細菌性の混入成分を完全に避けるための選択肢の方法である。
【図１】
0005816094.tif 000007
【図２】
0005816094.tif 000008
【図３Ａ】
0005816094.tif 000009
【図３Ｂ】
0005816094.tif 000010
【図４】
0005816094.tif 000011
【図５】
0005816094.tif 000012
【図６Ａ】
0005816094.tif 000013
【図６Ｂ】
0005816094.tif 000014
【図７Ａ】
0005816094.tif 000015
【図７Ｂ】
0005816094.tif 000016
【図８Ａ】
0005816094.tif 000017
【図８Ｂ】
0005816094.tif 000018
【配列表】
0005816094000001.app