(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１７ＢＲに結合し、かつ、以下の：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨドメイン；ならびに、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬドメイン
を含む、抗体分子であって、
当該抗体は、ヒト及びマウスＩＬ−１７ＢＲと交差反応し、そして、ヒトＩＬ−２５のヒトＩＬ−２５受容体への結合を阻害する、
前記抗体分子。
【請求項２】
ＶＨドメインがヒトのフレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
ＶＨドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項４】
ＶＬドメインがヒトのフレームワーク領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項５】
ＶＬドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項６】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１〜５のいずれか１項のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項７】
抗体定常領域を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項８】
定常領域がＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である、請求項７に記載の抗体分子。
【請求項９】
完全抗体を含む、請求項７に記載の抗体分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体分子の発現のための発現ベクターであって、発現ベクターがプロモーターに操作できるように連結された請求項１０に記載の核酸を含む、前記発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを保持する宿主細胞。
【請求項１３】
抗体分子を生成する方法であって、その方法が請求項１２に記載の宿主細胞を前記の抗体分子の産生のための条件の下で培養することを含む、前記方法。
【請求項１４】
さらに前記の抗体分子を単離することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに抗体分子を少なくとも１種類の追加の構成要素を含む組成物の中に配合することを含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子および医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１７】
凍結乾燥された粉末の形である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
喘息の処置または予防のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項１９】
炎症性腸疾患の処置または予防のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項２０】
炎症性腸疾患が潰瘍性結腸炎またはクローン病である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＩＬ−１７ＢＲに対する抗体分子を生成する方法であって、以下の：
（ａ）実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で述べられている通りであるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを提供し；
（ｂ）前記のＶＨドメインを複数の抗体ＶＬドメインと組み合わせて抗体分子を提供し；
（ｃ）前記の抗体分子をＩＬ−１７ＢＲへの結合に関してスクリーニングし；そして
（ｄ）ＩＬ−１７ＢＲに結合する抗体分子を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項２２】
ＶＨドメインが請求項２または３において定義されている通りである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬ−１７ＢＲに対する抗体分子を生成する方法であって、以下の：
（ａ）置き換えられるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３をコードする領域を欠いているかのどちらかであるＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供し；
（ｂ）前記のレパートリーを、実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で述べられている通りであるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３をコードするドナー核酸と、前記のドナー核酸がレパートリー中のＣＤＲ３領域の中に挿入されるように組み合わせて、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供し；
（ｃ）前記の生成物レパートリーの核酸を発現させ；
（ｄ）ＩＬ−１７ＢＲに特異的な抗体分子を選択し；そして
（ｅ）前記の抗体分子またはそれをコードする核酸を回収する
ことを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記の生成物レパートリーをＶＬドメインと共発現させる、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１７Ｂ受容体（ＩＬ−１７ＢＲ）に向けられた抗体（その結合断片を含む）に関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息は一般的な気道の慢性炎症性障害である。苦しんでいる人の数はここ数十年にわたって劇的に増大しており、世界保健機関は世界中で約３億人の人々が喘息で苦しんでいると見積もっている。アレルギー性喘息は、様々な誘発性刺激により誘導される制御不能の気道の反応性亢進（ＡＨＲ）により特性付けられ、肺の中への２型炎症性浸潤と関係している。
【０００３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は結腸（大腸としても知られている）の粘膜層を冒す慢性の炎症であり、それは２種類の疾患状態：潰瘍性結腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）を含む。ＩＢＤの処置に関して一般に行われる療法には、抗生物質またはステロイド由来の薬物または抗ＴＮＦ−α薬剤のいずれかが含まれる；しかし、これらは現在患者において臨床的寛解を誘導する、または維持するのに成功していない(Hanauer et al., 2008)。ＵＣはＴｈ２に仲介される疾患であると考えられており、代表的なマウスモデルは腸の炎症の発達において２型サイトカイン類が関わっていることを示している(Heller et al., 2002)。
【０００４】
ＩＬ−２５Ｒ、ＩＬ−１７ＢＲ、ＩＬ−１７ＲＢまたはＩＬ−１７ＲＨ１として様々な名前で知られているインターロイキン１７Ｂ受容体は、発現配列タグデータベース中でＩＬ−１７Ａ受容体（ＩＬ−１７ＲＡ）に対するそれの相同性により最初に同定された(Tian et al., 2000)。その後ＩＬ−１７ＢＲはＩＬ−１７ＢおよびＩＬ−２５の両方に結合することが示された(Lee et al., 2001; Shi et al., 2000; Tian et al., 2000)。ＩＬ−２５はＩＬ−１７ＢＲに対してＩＬ−１７Ｂ（７．６  ｎＭ）よりも強い親和性（１．４  ｎＭ）で結合する。
【０００５】
ＩＬ−１７サイトカインファミリー(ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７ＤおよびＩＬ−１７Ｆ−１型炎症と関係する）のメンバーであるＩＬ−２５は、それの産生が脾腫、ＩｇＧ１およびＩｇＥの上昇した血清レベルならびに好酸球性浸潤、増大した粘液分泌および上皮細胞過形成を含む肺および消化管における病的変化と関係する２型サイトカインの発現を誘導する点で他のＩＬ−１７ファミリーのメンバーと著しく異なっている(Fort et al., 2001; Lee et al., 2001; Moseley et al., 2003; Pan et al., 2001)。ＩＬ−２５の遺伝的除去またはブロッキング抗ＩＬ−２５抗体の使用は、蠕虫感染からの保護におけるＩＬ−２５の重要性を明確に示した(Fallon et al., 2006; Owyang et al., 2006)が、喘息に特有の応答の制御における重要な役割も示した(Ballantyne et al., 2007)。ＩＬ−２５はこれらの応答を、最初に自然免疫非Ｂ／非Ｔ（ＮＢＮＴ）細胞からの(Fallon et al., 2006; Fort et al., 2001)、続いて適応Ｔ細胞応答からの(Angkasekwinai et al., 2007; Wang et al., 2007)２型サイトカイン類、例えばＩＬ−１３の放出を誘導する能力により刺激するようである。
【０００６】
ｉｌ１７ｂｒのメッセージ（ｍｅｓｓａｇｅ）は肺、脳、膵臓、腎臓、甲状腺および好酸球からのライブラリーにおいて同定されている(Lee et al., 2001; Shi et al., 2000)。肺平滑筋細胞における発現は免疫学的に制御されているようである(Lajoie-Kadoch et al., 2006)。
【０００７】
喘息における役割と一致して、ＩＬ−２５のｍＲＮＡまたはタンパク質は、肺胞マクロファージ、マスト細胞、好酸球、および好塩基球を含む肺において見つかるいくつかの細胞型から検出されている(Wang et al., 2007)。より最近には、アレルゲンに刺激されたヒトおよびマウスの肺上皮細胞によるＩＬ−２５の産生は、アレルギー性の肺の応答を調節するＩＬ−２５に関する可能性のある役割を支持していた(Angkasekwinai et al., 2007)。加えて、ＩＬ−２５は肺線維芽細胞からの炎症性サイトカインおよびケモカインの産生ならびに気道平滑筋細胞からの細胞外マトリックスの構成要素を誘導することが報告されている。さらに、最近の研究は、喘息患者からの生検組織においてＩＬ−２５およびＩＬ−１７ＢＲに関する転写産物が有意に上方制御されており、好酸球性浸潤と関係していることを示した(Wang et al., 2007)。ＩＬ−２５に対して向けられたブロッキングモノクローナル抗体を用いたＯＶＡ感作マウスの処置は、結果としてＯＶＡ負荷およびメタコリン投与に応答するＡＨＲの減少および気管支肺胞洗浄におけるより低いＩＬ−１３濃度をもたらす。
【０００８】
最近、Rickelら(J Immunol 181, 4299-4310 (2008))は、ヒトの初代細胞に基づくアッセイにおいて、ヒトＩＬ−１７ＲＡに対するブロッキングモノクローナル抗体を用いてＩＬ−２５の活性を妨げた。これはＩＬ−２５の活性がＩＬ−１７ＢＲおよびＩＬ−１７ＲＡ両方を必要とすることを示した。しかし、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７ＦはＩＬ−１７ＲＡおよびＩＬ−１７ＲＣを含むヘテロマー的複合体を通してシグナル伝達していることも報告されている。
【０００９】
Rickelらは、アレルギー性喘息のマウスモデルにおけるＩＬ−２５に誘導される肺の炎症をブロックする、マウスＩＬ−１７ＢＲと反応する抗体も記述している。今までに、ヒトＩＬ−１７ＢＲと反応する抗体は報告されていない。
【００１０】
ＩＢＤにおける役割と一致して、マウスにおける慢性結腸炎の実験モデルにおいて、Ｔｈ１型の応答からＴｈ２型の応答への切り替えと関係してＩＬ−２５の産生が観察されており(Fichtner-Feigl et al,. 2008)、マウスの胃腸管全体にわたってＩＬ−２５のｍＲＮＡの高い発現が見付かった(Fort et al., 2001)。さらに、ヒトにおいてＩＬ−２５遺伝子は１４番染色体上のクローン病感受性領域内に位置しているが、それがその病気と関係している可能性はまだ調べられていない(Buning et al,. 2003)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Hanauer et al., 2008
【非特許文献２】Heller et al., 2002
【非特許文献３】Tian et al., 2000
【非特許文献４】Lee et al., 2001
【非特許文献５】Shi et al., 2000
【非特許文献６】Fort et al., 2001
【非特許文献７】Moseley et al., 2003
【非特許文献８】Pan et al., 2001
【非特許文献９】Fallon et al., 2006
【非特許文献１０】Owyang et al., 2006
【非特許文献１１】Ballantyne et al., 2007
【非特許文献１２】Angkasekwinai et al., 2007
【非特許文献１３】Wang et al., 2007
【非特許文献１４】Lajoie-Kadoch et al., 2006
【非特許文献１５】J Immunol 181, 4299-4310 (2008)
【非特許文献１６】Fichtner-Feigl et al,. 2008
【非特許文献１７】Buning et al,. 2003
【発明の概要】
【００１２】
本発明者は、ＩＬ−１７ＢＲに対して高い親和性および特異性で結合する抗体分子を同定した。
本明細書で記述される抗体分子は、インビボでのＩＬ−２５の生理活性を妨害する、ならびに気道炎症、ＡＨＲ、および結腸の炎症を防ぐのに有用である可能性がある。
【００１３】
抗原で負荷をかけたマウスにおいて、本明細書で記述される抗体分子の投与は、抗原負荷の非存在下で、または抗原で負荷をかけたＩＬ−１７ＢＲ欠損マウスにおいて見られるレベルおよび数に類似したレベルおよび数までＩＬ−１３およびＩＬ−５のレベルを低減させ（その両方が喘息の制御における重要なサイトカインである）、肺におけるＩＬ−１３産生細胞の数を低減させることが示されている。本明細書で記述される抗体分子は、気道の反応性亢進も著しく低減させることができる。さらに、本明細書で記述される抗体分子は、疾患と関係するガンマ／デルタＴ細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）をインビボで低減させることができる。これは、本明細書で記述される抗体分子が、喘息の発現において不可欠であることが知られている２つの経路であるＩＬ−１３の産生およびガンマ／デルタＴ細胞の応答性を阻害することを示している。
【００１４】
上記の抗原で負荷をかけたマウスは、喘息の実験モデルにおいてＯＶＡ（オボアルブミン）抗原で負荷をかけた。ＩＢＤの実験モデルにおいてＯＸＡ（オキサゾロン）抗原で負荷をかけたマウスにおいて、本明細書で記述される抗体分子の投与は、ＩＢＤの死亡率および臨床徴候、例えば体重の減少ならびに炎症および出血の結果もたらされる結腸の短縮を低減することが示されている。
【００１５】
本明細書で記述される抗体分子はマウスおよびヒトのＩＬ−１７ＢＲ両方と交差反応することができ、ヒトＩＬ−２５のヒトＩＬ−１７ＢＲへの結合を阻害することができる。従って、抗体分子はインビボでその作用の機構を調べるためにマウスモデルにおいて用いることができる。さらに、本明細書で記述される抗体分子はヒト細胞においてＩＬ−２５／ＩＬ−１７ＢＲ複合体の生物学的作用を妨害することができる。従って、本明細書で記述される抗体分子は疾患、例えば喘息の処置に有用である可能性を有する。
【００１６】
本発明の１観点は、ＩＬ−１７ＢＲに結合し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含む抗体分子を提供する。
好ましくは、抗体分子はＩＬ−１７ＢＲのＩＬ−２５への結合を妨害し、ＩＬ−２５に仲介されるＡＨＲ；ＩＬ−１３の産生；ＩＬ−２５に仲介されるＩＬ−５の産生；ＩＬ−２５に仲介されるＩＬ−８の産生；ならびにガンマ／デルタＴ細胞の増殖および浸潤の少なくとも１種類を低減または阻害する。
【００１７】
抗体分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のＶＨ  ＣＤＲ３をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のＣＤＲ１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のＣＤＲ２と一緒に含むＶＨドメインを含んでいてよい。
【００１８】
ＶＨドメインはＶＬドメイン、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＣＤＲ３を有するＶＬドメインと対をなしていてよい。一部の態様において、ＶＨドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＶＬドメインと対をなしていてよい。
【００１９】
一部の態様において、抗体分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のＶＨ  ＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のＶＨ  ＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨドメインならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のＶＬ  ＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のＶＬ  ＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含んでいてよい。
【００２０】
ＶＨドメインはさらに、ヒトまたは非ヒトのフレームワーク領域、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示したフレームワーク領域を含んでいてよい。一部の態様において、抗体分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＶＨドメインを含んでいてよい。
【００２１】
ＶＬドメインはさらに、ヒトまたは非ヒトのフレームワーク領域、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示したフレームワーク領域を含んでいてよい。一部の態様において、抗体分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＶＬドメインを含んでいてよい。
【００２２】
一部の態様において、抗体分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＶＨドメインおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＶＬドメインを含んでいてよい。
本発明の観点は、本明細書で記述される抗体分子をコードする単離された核酸、その核酸を含むベクターおよび宿主細胞中でその核酸を発現させて本発明の抗体分子を生成する方法も提供する。
【００２３】
本発明はさらに、例えば、疾患、例えばＩＬ−２５に仲介される疾患、例えばアレルギー、喘息および結腸炎の処置のための医薬組成物の形での本発明の抗体分子の使用を提供する。
【００２４】
本発明のこれらの、およびさらなる観点を、下記でさらに詳細に、付随する実施例に関連して記述する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、抗ＩＬ−１７ＢＲクローンＤ９．２がＥＬＩＳＡによるヒトおよびマウスのＩＬ−１７ＢＲとの結合に関して交差反応性であることを示す。棒は培地（白い棒）またはＤ９．２抗体クローン（黒い棒）の固定化されたマウスＩＬ−１７ＢＲ−Ｆｃ、ヒトＩＬ−１７ＢＲ−ＦｃまたはヒトＩｇＧ対照への結合を示す。
【図２】図２は、Ｄ９．２が形質移入したＣＯＳ７細胞上およびマウスの初代細胞上のＩＬ−１７ＢＲに結合することを示す。マウス（ａ）またはヒト（ｂ）のＩＬ−１７ＢＲ発現ベクターで形質移入したＣＯＳ７細胞は、Ｄ９．２により認識されるＩＬ−１７ＢＲを発現する。細胞を１μｇ／ｍｌのＤ９．２と共に２０分間インキュベートし、次いで洗浄した。２０分間のインキュベートの後にＤ９．２の結合をＦＡＣＳにより抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣを０．５μｇ／ｍｌで用いて検出した。（ｃ）インビトロで分化したＴｈ２細胞はＩＬ−１７ＢＲを発現し、Ｄ９．２はそれに結合する。Ｔｈ１細胞では発現は低い、または無い。（ｄ）４００ｎｇのＩＬ−２５の、３回の連続した毎日の腹腔内投与の後、野生型（ｄ，ｅ）の腸間膜（ｍｙｓｅｎｔｅｒｉｃ）リンパ節にＩｌ−１７ＢＲを発現する非Ｂ非Ｔ（ＮＢＮＴ）細胞の集団が出現するが、ＩＬ−１７ＢＲノックアウト（ｄ，ｆ）マウスでは出現しない。この集団はＤ９．２により認識され、ＩＬ−１３を産生する。
【図３】図３は、Ｄ９．２はＩＬ−１７ＢＲに結合するがマウスまたはヒトのＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＣ、またはＩＬ−１７ＲＤとは交差反応しないことを示す。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌのＩＬ−１７Ｒファミリーのメンバー：ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＢＲ、ＩＬ−１７ＲＣもしくはＩＬ−１７ＲＤ、またはＩＬ−１３Ｒα対照でコートし、４℃で一夜インキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％  ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳ中で室温で４時間ブロッキングした。ビオチン化Ｄ９．２の結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＥＬＩＳＡ現像溶液を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定して検出した。
【図４】図４は、マウスのモノクローナル抗体Ｄ９．２はヒトＩＬ−２５のヒトＩＬ−２５受容体への結合を阻害するが、他のマウスモノクローナル抗ＩＬ−１７ＢＲ抗体（３ｂ９、２ｃ１、５ｈ９、７ｅ１、１０ｃ６、１０ｅ６）は阻害しないことを示す。それぞれの精製されたマウスモノクローナル抗体をｈＩＬ１７Ｂｒ／Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）中で希釈（×１００）して１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ１７Ｂｒ／Ｆｃ溶液中で１μｇ／ｍｌの終濃度にした。簡潔には、[抗体×ｈＩＬ１７Ｂｒ／Ｆｃ]混合物をヒトＩＬ−２５でコートしたプレートに添加し、１時間３０分インキュベートし、３回洗浄した。抗ｈＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｅｒｏｔｅｃ）をプレートに添加し、室温で４５分間インキュベートし、３回洗浄し、ＴＭＢで現像した。１Ｍ  ＨＣＬで反応を止めた。４５０ｎｍにおいて光学密度を読み、全ての読みから試薬ブランクの読みを引いた。
【図５】図５は、Ｄ９．２抗体がＮＢＮＴ細胞およびＣＤ４＋（Ｔおよび／またはＮＫＴ）細胞のＩＬ−１３の産生をインビトロで妨害することを示す。（ａ）ＮＢＮＴ細胞。簡潔には、腸間膜（ｍｙｓｅｎｔｅｒｉｃ）リンパ節を未処置の（ｎａｉｖｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスから切り取り、ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞を激減させる。ＮＢＮＴ細胞を丸底９６ウェルプレート上に３×１０５細胞／ウェルで蒔き、ＲＰＭＩ１０％のみ（培地）または１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２５を加えたＲＰＭＩ１０％ＦＣＳ（ＩＬ−２５）中で７２時間培養した。ウェルにＤ９．２を最大濃度２μｇ／ｍｌから系列希釈で添加し、１．５時間インキュベートした後、ウェルに１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２５を添加した。次いでプレートを３７℃で７２時間インキュベートした後、上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−１３含有量に関して試験した。（ｂ）ＣＤ４＋（Ｔおよび／またはＮＫＴ）細胞。未処置の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製した。単離されたＣＤ４＋細胞を９６ウェルプレートにおいて１×１０６細胞／ｍｌで、ＲＰＭＩ単独、または１μｇ／ｍｌのＤ９．２有りもしくは無しで１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２５を補ったＲＰＭＩのどちらかの中で培養した。細胞を７２時間培養した後、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１３タンパク質レベルの分析のために上清を得た。
【図６】図６は、Ｄ９．２がＩＬ−２５に誘導されるマウス腎癌（ＲＥＮＣＡ）細胞株からのＫＣ（マウスのＩＬ−８）の産生を用量依存的様式で阻害することを示す。ＩＬ−２５（１００ｎｇ／ｍｌ）を様々な濃度のＤ９．２またはＩｇＧ１対照抗体と共に室温で３０〜６０分間前インキュベートした後、細胞に添加した。ＩＬ−２５／Ｄ９．２混合物の添加の直前に、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）をＲＥＮＣＡ細胞で覆われたプレートに添加した。抗体無しの対照試料は、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２５および１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＩＬ−２５＋ＴＮＦ−α）または培地のみの対照（Ｍｅｄｉａ）と共に２４時間インキュベートした後、細胞に添加した。ＥＬＩＳＡによるＫＣの放出の決定を、刺激の２４時間後に実施した。
【図７】図７は、Ｄ９．２がＩＬ−２５に誘導されるヒト腎癌（ＴＫ−１０）細胞株からのＩＬ−８の産生を用量依存的様式で阻害することを示す。ＩＬ−２５（１００ｎｇ／ｍｌ）を様々な濃度のＤ９．２またはＩｇＧ１対照抗体と共に室温で３０〜６０分間前インキュベートした。ＩＬ−２５／Ｄ９．２混合物の添加の直前に、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）をＴＫ−１０細胞で覆われたプレートに添加した。抗体無しの対照試料は、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２５および１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＩＬ−２５＋ＴＮＦ−α）または培地のみの対照（Ｍｅｄｉａ）と共に２４時間インキュベートした後、細胞に添加した。ＥＬＩＳＡによるＩＬ−８の放出の決定を、刺激の２４時間後に実施した。
【図８】図８は、Ｄ９．２がＩＬ−２５応答をインビボで妨害することを示す。（ａ）オボアルブミン（ＯＶＡ）で感作し、負荷をかけたマウスからの縦隔リンパ節細胞は、インビトロでＯＶＡで再刺激した際にＩＬ−１３を産生する。ＯＶＡ負荷の前のＤ９．２の投与はＩＬ−１３応答を、ＩＬ−１７ＢＲ  ＫＯマウスのＩＬ−１３応答と同程度のレベルまで低減する。（ｂ）ＯＶＡで感作し、負荷をかけたマウスからの縦隔リンパ節細胞は、インビトロでＯＶＡで再刺激した際にＩＬ−５を産生する。ＯＶＡ負荷の前のＤ９．２の投与はＩＬ−５応答を、ＩＬ−１７ＢＲ  ＫＯマウスのＩＬ−５応答と同程度のレベルまで低減する。（ｃ）Ｄ９．２処置は、ＯＶＡで感作し、負荷をかけたマウスの肺におけるＩＬ−１３産生細胞の数を低減した。ＩＬ−１３の細胞内サイトカイン染色は、ＯＶＡで感作し、負荷をかけたマウスにおけるＩＬ−１３産生細胞の集団を明らかに見えるようにし、それはＩＬ−１７ＢＲ  ＫＯマウスには存在せず、ＯＶＡ負荷の前に抗ＩＬ−１７ＢＲ抗体Ｄ９．２で処置した動物では低減している。（ｄ）ＯＶＡで感作し、負荷をかけたマウスの脾臓中のガンマ−デルタＴ細胞の数は、ＩＬ−１７ＢＲ  ＫＯマウスにおいて、およびＯＶＡ負荷の前にＤ９．２を与えられたマウスにおいて低減している。（ｅ）Ｄ９．２処置は、ＯＶＡで感作し、負荷をかけたマウスにおいてＡＨＲを低減する。
【図９】図９は、Ｄ９．２がＩＢＤのマウスモデルにおいてインビボでＩＬ−２５応答を妨害することを示す。（ａ）オキサゾロンで負荷をかけた動物の生存の百分率は、エタノールのみを与えられた対照よりも低い。感作および負荷の前のＤ９．２の投与は死亡率を低減する。（ｂ）それぞれの動物の全体的な外観およびふるまいと組み合わせた体重の減少に基づいて、臨床スコアを算出する。Ｄ９．２の投与は結果としてアイソタイプ抗体を与えられたマウスと比較して臨床スコアの向上をもたらす。（ｃ）ＩＢＤマウスでは対照と比較して結腸の長さが低減している。Ｄ９．２の投与は、ＩＢＤの動物におけるこの低減に対して保護する。
【００２６】
配列：
本発明の抗体分子を、さらに本明細書において下記の配列識別番号を参照して記述する：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１    Ｄ９．２  ＶＨをコードするヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２    Ｄ９．２  ＶＨのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３    Ｄ９．２  ＶＬをコードするヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４    Ｄ９．２  ＶＬのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５    Ｄ９．２  ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６    Ｄ９．２  ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７    Ｄ９．２  ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８    Ｄ９．２  ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９    Ｄ９．２  ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０    Ｄ９．２  ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列
添付の配列リストにおいてさらなる配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
この出願は抗原−抗体型の反応に関係している。
一般に、抗体の重鎖可変領域（ＶＨドメイン）は抗体の抗原への結合において重要な役割を果たす。ＶＨドメインのＣＤＲ３領域はＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域よりも多様であることが分かっており、従ってほとんどの抗体において抗体の標的への特異性を提供する。従って、本発明の抗体分子はＤ９．２抗体のＶＨ  ＣＤＲ３領域の周辺に基づいている。一部の好ましい態様において、本発明の抗体分子はＤ９．２抗体のＶＨ領域の３種類のＣＤＲを全て含む。
【００２８】
本発明のＣＤＲを含む抗体分子の構造は、一般に抗体分子の重鎖もしくは軽鎖配列またはそれらの実質的な部分からなると考えられ、ここでＣＤＲは再編成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然型のＶＨおよびＶＬ抗体の可変ドメインのＣＤＲに対応する位置に位置している。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第４版. US Department of Health and Human Services. 1987およびそれらの最新版への参照により決定されてよい。いくつかの学術的な、および商業的なオンラインリソースが、このデータベースを検索するのに利用可能である。例えば、Martin, A.C.R. コンピューターによるKabat抗体配列データベースへのアクセス PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133および現在http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.htmlのウェブアドレスにある関係するオンラインリソースを参照。
【００２９】
一般に、抗体分子は抗体抗原結合ドメインを提供するためにＶＬドメインと対をなしたＶＨドメインを含むが、一部の態様において、抗原と結合するためにＶＨドメインのみを用いてよい。例えば、Ｄ９．２  ＶＨドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）はＤ９．２  ＶＬドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）と、Ｄ９．２のＶＨおよびＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位が形成されるように対をなしてよい。あるいは、Ｄ９．２  ＶＨドメインはＤ９．２  ＶＬドメイン以外のＶＬドメインと対をなしてよい。
【００３０】
軽鎖の混成（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）は、本明細書でさらに論じるように、当技術において十分に確立されている。
本明細書で記述される抗体分子はヒトのＩＬ−１７ＢＲおよび／またはマウスのＩＬ−１７ＢＲと結合してよい。例えば、抗体分子はヒトのＩＬ−１７ＢＲと結合し、マウスのＩＬ−１７ＢＲには結合を示さない、または実質的に結合を示さなくてよい。あるいは、本発明の抗体分子はマウスのＩＬ−１７ＢＲと結合し、ヒトのＩＬ−１７ＢＲには結合を示さない、または実質的に結合を示さなくてよい。
【００３１】
好ましくは、本発明の抗体分子はヒトおよびマウスのＩＬ−１７ＢＲ両方と交差反応する。例えば、交差反応性抗体分子はヒトのＩＬ−１７ＢＲおよびＩＬ−１７ＢＲ両方と結合する。
【００３２】
本明細書で記述される抗体分子はＩＬ−１７ＢＲと、Ｄ９．２の親和性に実質的に類似した親和性、例えばＤ９．２の結合親和性の９０％〜１１０％で結合することができる。抗体分子は一般にＩＬ−１７ＢＲに特異的であろう。言い換えれば、抗体分子はＩＬ−１７ＢＲに結合するがＩＬ−１７Ｒファミリーの他のメンバーには結合を示さない、または実質的に結合を示さなくてよい。好ましくは、ＩＬ−１７ＢＲに特異的な抗体分子はＩＬ−１７ＢＲに結合するが、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＣおよび／またはＩＬ−１７ＲＤには結合を示さない、または実質的に結合を示さない。
【００３３】
典型的には、特異性は一群の抗体を用いたＥＬＩＳＡのような結合アッセイを用いて決定することができる。
本明細書で記述される抗体分子のＩＬ−１７ＢＲとの結合は、組み換えＩＬ−１７ＢＲとの競合により無効にされて（ａｂｏｌｉｓｈｅｄ）よい。
【００３４】
本明細書で記述される様々な抗体分子の結合親和性および中和能力は、型にはまった技法を用いて適切な条件下で比較することができる。
抗体分子は、必要とされるＩＬ−１７ＢＲに対する特異性および／または結合を有する抗体抗原結合部位を有するあらゆる結合メンバーまたは物質を含む。抗体分子の例には、天然のものまたは完全にもしくは部分的に合成によるものを問わず、以下のものが含まれる：免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラス；抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄ；設計された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体分子、例えばＦａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）；ならびに抗体抗原結合部位を含むあらゆる他のポリペプチド。従って、別のポリペプチドに融合した抗原結合ドメインまたは均等物を含むキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現はＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３において記述されている。
【００３５】
抗体分子の例には以下のものが含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合したＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片（ｖｉｉ）２つのドメインを結合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーによりＶＨドメインおよびＶＬドメインが結合している単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988；Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988）；（ｖｉｉｉ）二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）単鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築される多価もしくは多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）断片である“ダイアボディ”（ＷＯ９４／１３８０４；P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 90 6444-6448, 1993）。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを結合するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化することができる（Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996）。ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディを作ることもできる（S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996）。抗体分子ならびにそれらの構築および使用のための方法がHolliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 (2005)に記述されている。
【００３６】
二重特異性抗体分子が用いられる場合、これらは様々な方法（Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)）で製造することができる、例えば化学的に、もしくはハイブリッドハイブリドーマから調製することができる、または上記で言及した二重特異性抗体断片のいずれかであってよい、従来の二重特異性抗体であることができる。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、抗イディオタイプ反応の作用を低減させる可能性がある可変ドメインのみを用いて、Ｆｃ領域無しで構築することができる。
【００３７】
二重特異性完全抗体とは対照的に、二重特異性ダイアボディも、それらは容易に構築して大腸菌において発現させることができるため、特に有用である。適切な結合特異性を有するダイアボディ（および抗体断片のような多くの他のポリペプチド）は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いてライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディの一本の腕が、例えば特異性がＩＬ−２１７ＢＲに対して向けられて一定に保たれる場合、他の腕が変更されたライブラリーを作製することができ、適切な特異性を有する抗体を選択することができる。ノブを穴に入れる（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）設計により二重特異性完全抗体を作製することができる（J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996）。
【００３８】
モノクローナル抗体および他の抗体を得ること、ならびに組み替えＤＮＡ技術の技法を用いて元の抗体の特異性を保持する他の抗体分子またはキメラ分子を生み出すことが可能である。そのような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補鎖決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含んでいてよい。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ  ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照。
【００３９】
好ましくは、ＣＤＲ領域はヒトのフレームワーク領域の中に移植される。ヒトのフレームワーク領域は、多くの方法により、例えばマウスのフレームワーク領域またはマウスのＶ領域の配列を既知のヒトのフレームワークまたはＶ領域の配列と比較して、それが有するアミノ酸の類似性または同一性の程度が最大である、または最大であるものの１つであるヒトのフレームワーク領域を選択することにより選択することができる。結果として得られるＣＤＲ移植抗体をさらに最適化するために、天然のヒトの配列のフレームワーク領域への改変を行うことができる。
【００４０】
一対のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体分子が好ましいが、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のどちらかに基づく単一結合ドメインを用いてもよい。単一免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインは特異的様式で標的抗原に結合することができることが知られている。
【００４１】
単鎖結合ドメインのどちらの場合においても、本明細書の下記においてさらに論じるように、これらのドメインを用いて、ＩＬ−１７ＢＲに結合することができる２ドメイン抗体分子を形成することができる相補的なドメインをスクリーニングすることができる。
【００４２】
抗体分子はさらに、抗体の定常領域またはその一部を含んでいてよい。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端において、ヒトＣκまたはＣλ鎖、好ましくはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合していてよい。同様に、ＶＨドメインに基づく抗体分子は、そのＣ末端において、いずれかの抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭならびにアイソタイプサブクラスのいずれか、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合していてよい。ＩｇＧ４が好ましい。Ｆｃ領域、例えばＷＯ９９／５８５７２において開示されているようなΔｎａｂおよびΔｎａｃを用いてもよい。
【００４３】
本発明の抗体分子のフレームワーク領域は、１個以上のグリコシル化部位を含むグリコシル化配列も含んでいてよい。抗体が発現される宿主細胞に依存して、グリコシル化のパターンは異なっていてよい。従って、グリコシル化部位をコードする核酸構築物を改変して部位を除去してよく、あるいはそのような部位をタンパク質中に導入してよい。例えば、真核生物タンパク質中のＮグリコシル化部位は、アミノ酸の３つ組Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（ここで、ＸはＰｒｏ以外のいずれかのアミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。これらの３つ組をコードするヌクレオチド配列への適切な置換、付加または欠失は、結果としてＡｓｎ側鎖における炭水化物残基の結合の阻止をもたらすであろう。例えばＡｓｎが異なるアミノ酸で置き換えられるように選択された単一ヌクレオチドの変更は、Ｎグリコシル化部位を不活性化するのに十分である。タンパク質中のＮグリコシル化部位を不活性化するための既知の手順には、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ２７６，８４６において記述されている手順が含まれる。
【００４４】
用語“抗原結合ドメイン”は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、それに相補的である領域を含む抗体分子の一部を記述する。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分のみに結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１個以上の抗体可変ドメイン（例えばＶＨドメインからなるいわゆるＦｄ抗体断片）により提供されてよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）またはその少なくとも実質的な部分および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）またはその少なくとも実質的な部分を含む。
【００４５】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも３個のＣＤＲ領域を、それらの介在するフレームワーク領域と一緒に含むであろう。好ましくは、部分は第１および第４フレームワーク領域のどちらかまたは両方の少なくとも約５０％も含み、その５０％は第１フレームワーク領域のＣ末端の５０％および第４フレームワーク領域のＮ末端の５０％であろう。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端における追加の残基は、通常天然型の可変ドメイン領域と関係しない残基であってよい。例えば、組み替えＤＮＡの技法により作製される抗体分子の構築は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されたリンカーによりコードされるＮまたはＣ末端残基の導入を結果としてもたらしてよい。他の操作工程には、本発明の可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えばダイアボディの生成において）、または下記でさらに詳細に論じるようなタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に結合させるためのリンカーの導入が含まれる。
【００４６】
抗体分子および抗体分子をコードする核酸は、一般には、それらが天然において関係している物質、例えばそれらがそれらの天然の環境、またはそのような調製がインビトロもしくはインビボで行われる組み換えＤＮＡ技術による場合にそれらが調製される環境（例えば細胞培養）において一緒に見付かる他のポリペプチドまたは核酸を含まずに、または実質的に含まずに単離されるであろう。
【００４７】
抗体分子および核酸は、希釈剤またはアジュバントとともに配合されてよく、さらに実用目的のために単離されてよい−例えば、免疫アッセイでの使用のためにマイクロタイタープレートをコートするために用いられる場合、その分子は通常はゼラチンもしくは他のキャリヤーと混合されると考えられ、または診断もしくは療法において用いられる場合、医薬的に許容できるキャリヤーもしくは希釈剤と混合されるであろう。抗体分子は、天然にもしくは異種真核細胞（例えばＣＨＯまたはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３）細胞）の系のどちらかによりグリコシル化されていてよく、またはそれらは（例えば原核細胞における発現により生成される場合）グリコシル化されていなくてよい。
【００４８】
抗体配列に加えて、本明細書で記述される抗体分子は、例えばペプチドもしくはポリペプチド、例えば折りたたまれたドメインを形成する、または分子に抗原と結合する能力に加えて別の機能的特徴を与えるための他のアミノ酸を含んでいてよい。
【００４９】
一部の態様において、抗体分子は検出可能な、もしくは機能的な標識を有していてよく、またはそれは毒素もしくは酵素に（例えばペプチジル結合またはリンカーを介して）コンジュゲートしていてよい。
【００５０】
標識はシグナルを生じる、または誘導されて生じることができるあらゆる分子であることができ、それには蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、放射性標識、酵素、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）または光感作物質が含まれるが、それらに限定されない。従って、結合は蛍光もしくは発光、放射活性、酵素活性または光吸収により検出および／または測定することができる。
【００５１】
適切な標識には、１３１Ｉまたは９９Ｔｃのような放射性標識が含まれ、それは抗体画像化の技術において既知である従来の化学を用いて抗体分子に結合させることができる。標識には酵素標識、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（“Ｇ６ＰＤＨ”）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼも含まれる。標識には蛍光標識または蛍光物質、例えばフルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミン化合物および誘導体ならびにＧＦＰ（ＧＦＰは“緑色蛍光タンパク質”を表す）が含まれる。標識にはさらに、特異的な同属の検出可能な部分、例えば標識されたアビジンへの結合を介して検出することができるビオチンのような化学的部分が含まれる。
【００５２】
追加の特徴がポリペプチドドメインまたは標識である場合、その抗体分子は組み替えの技法により、すなわち抗体分子およびさらなるドメインの融合体をコードする核酸の発現により生成することができる。
【００５３】
ＩＬ−１７ＢＲと反応する抗体分子には、本明細書で述べたＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変形が含まれてよい。変形は配列変更または変異およびスクリーニングの方法により得ることができる。
【００５４】
本発明に従う抗体分子は、ＩＬ−１７ＢＲへの結合に関して、ＩＬ−１７ＢＲに結合し、かつ本明細書で開示したＶＨおよび／またはＶＬドメインを含むあらゆる抗体分子、より好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＶＨドメインおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＶＬドメインを含む抗体分子と競合する抗体分子であってもよい。従って、本発明のさらなる観点は、ＩＬ−１７ＢＲへの結合に関してＤ９．２と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む抗体分子を提供する。抗体分子間の競合は、例えばＥＬＩＳＡを用いて、および／または特異的なレポーター分子をある抗体分子にタグ付けし（それは他のタグ付けされていない抗体分子（単数または複数）の存在下で検出され得る）、同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する抗体分子（単数または複数）の同定を可能にすることにより、インビトロで容易にアッセイすることができる。
【００５５】
ＩＬ−１７ＢＲへの結合に関してＤ９．２と競合することができる、ＩＬ−１７ＢＲに対する抗体分子を得るために、様々な方法が当技術において利用可能である。
論じたように、本明細書において開示されている可変ドメインのアミノ酸配列の変形を用いることができる。個々の変形は１個以上のアミノ酸配列の変更（アミノ酸残基の付加、削除、置換および／または挿入）を含んでいてよく、それは約２０個未満の変更、約１５個未満の変更、約１０個未満の変更または約５個未満の変更、４、３、２または１個の変更であってよい。変更は１個以上のフレームワーク領域および／または１個以上ＣＤＲ中でなされてよい。
【００５６】
実質的に本明細書で述べられている通りであるＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト可変ドメインまたはその実質的な部分中でＣＤＲとして保持されていてよい。例えば、実質的に本明細書で述べられている通りであるＶＨ  ＣＤＲ３配列は、ヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的な部分中でＶＨ  ＣＤＲ３として保持されていてよい。
【００５７】
本発明の別の観点は、ＩＬ−１７ＢＲに結合し、かつ実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で述べられている通りであるＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含む抗体分子を提供する。
【００５８】
抗体分子は、それぞれ実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６および７で述べられている通りであるＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含んでいてよい。
【００５９】
ＶＨドメインはＶＬドメイン、例えばそれぞれ実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９および１０で述べられている通りであるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するＶＬドメインと対をなしてよい。
【００６０】
一部の態様において、抗体分子はそれぞれ実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６および７で述べられている通りであるＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨドメイン；ならびにそれぞれ実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９および１０で述べられている通りであるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するＶＬドメインを含んでいてよい。
【００６１】
ＶＨおよびＶＬドメインはヒトまたは非ヒトのフレームワーク領域、例えばそれぞれ実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のフレームワーク領域で述べられている通りであるフレームワーク領域を有していてよい。
【００６２】
一部の態様において、抗体分子はそれぞれ実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で述べられている通りであるＶＨおよびＶＬドメイン配列を含んでいてよい。
【００６３】
“実質的に述べられている通り”により、本発明の関係のあるＣＤＲまたはＶＨもしくはＶＬドメインが、配列が本明細書で述べられている明記された領域と同一であるか、または高度に類似しているかのどちらかであろうことを意味する。“高度に類似している”により、１から５個まで、好ましくは１から４個まで、例えば１から３個まで、または１もしく２個、または３もしくは４個のアミノ酸置換がＣＤＲおよび／またはＶＨもしくはＶＬドメイン中でなされてよいことを意図する。
【００６４】
抗体分子の配列の変形は、Ｄ９．２  ＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子の一方または両方のランダム突然変異生成を実施して可変ドメイン全体の内部に変異を生じさせることにより生成することができる。そのような技法は、エラープローンＰＣＲを用いたＧｒａｍら(1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580)により記述されている。
【００６５】
用いることができる別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に突然変異生成を誘導することである。そのような技法は、Ｂａｒｂａｓら(1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813)およびＳｃｈｉｅｒら(1996, J. Mol. Biol. 263:551-567)により開示されている。
【００６６】
上記の全ての技法はそういうものとして当技術で既知であり、それら自体は本発明の部分を形成しない。当業者はそのような技法を用いて当技術の型にはまった方法論を用いて本明細書で記述したような抗体分子を提供することができるであろう。
【００６７】
従って、本発明の別の観点は、以下の：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＣＤＲ配列の１個以上（すなわち、１個、２個、３個、４個、５個または６個全て）を有する抗体分子をコードする出発核酸を提供し；
ＣＤＲ配列（単数または複数）を変更するために前記の核酸を改変し；
前記の改変された抗体分子を発現させ；そして
前記の改変された抗体分子をＩＬ−１７ＢＲに対する結合に関して試験する
ことを含む、ＩＬ−１７ＢＲに対する抗体分子を得るための方法を提供する。
【００６８】
好ましくは、修飾は、結合親和性の多様性を有する改変された配列のレパートリーを提供するために、複数の出発核酸分子に対して実施されるであろう。
出発核酸は好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２それ自体の形または別のフレームワーク配列中に保持された形のどちらかで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の３個の重鎖ＣＤＲ全てを含む。
【００６９】
改変は単一のＣＤＲ、例えばＣＤＲ３において行われてよく、または改変は２個もしくは３個のＣＤＲ領域に対して同時に行われてよい。
本発明で用いられる可変ドメインはあらゆる生殖細胞系もしくは再編成されたヒト可変ドメインから得られてよく、または既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであってよい。本発明で記述されるＣＤＲ配列（例えばＣＤＲ３）は、組み換えＤＮＡ技術を用いてＣＤＲ（特にＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリーの中に導入することができる。
【００７０】
例えば、Ｍａｒｋｓら(Bio/Technology, 1992, 10:779-783)は、可変ドメイン領域の５’末端において、または５’末端に隣接して方向づけられたコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと合わせて用いて、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する、抗体可変ドメインのレパートリーを生成する方法を記述している。Ｍａｒｋｓらはさらに、このレパートリーをどのようにして特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせることができるかを記述している。類似の技法を用いて、本発明のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルして、シャッフルされた完全なＶＨまたはＶＬドメインを同種のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、本明細書で記述される抗体分子を提供することができる。次いで、レパートリーを適切な宿主系、例えばＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイ系で提示し、適切な抗体分子が選択されるようにすることができる。レパートリーは、１０４個以上の個々のメンバー、例えば１０６から１０８または１０１０個までのメンバーのいずれかで構成されていてよい。
【００７１】
類似のシャッフルまたは組み合わせの技法がＳｔｅｍｍｅｒ(Nature, 1994, 370:389-391)によっても開示されており、βラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記述しているが、そのアプローチを抗体の生成に関して用いることができることを認めている。
【００７２】
従って、本発明のさらなる観点はＩＬ−１７ＢＲに特異的な抗体分子を調製する方法を提供し、方法は以下の：
（ａ）置き換えられるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３をコードする領域を欠いているかのどちらかであるＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供し；
（ｂ）前記のレパートリーを、実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で述べられている通りのアミノ酸配列をコードするドナー核酸と、前記のドナー核酸がレパートリー中のＣＤＲ３領域の中に挿入されるように組み合わせて、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供し；
（ｃ）前記の生成物レパートリーの核酸を発現させ；
（ｄ）ＩＬ−１７ＢＲに特異的な抗体分子を選択し；そして
（ｅ）前記の抗体分子またはそれをコードする核酸を回収する
ことを含む。
【００７３】
生成物レパートリーは、同じベクターまたは異なるベクターからＶＬドメインと共発現させることができる。ＶＬドメインは本明細書で記述されるＶＬドメイン、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＶＬドメインであってよく、または鎖のシャッフルに関して下記で記述されるように１個以上の異なるＶＬドメインであってよい。
【００７４】
実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で述べられている通りのＶＬ  ＣＤＲ３を、置き換えられるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３をコードする領域を欠いているかのどちらかであるＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わせる類似の方法を用いてもよい。上記の方法に関して、ＶＬ生成物レパートリーは同じベクターまたは異なるベクターからＶＨドメインと共発現させることができる。ＶＨドメインは本明細書で記述されるＶＨドメイン、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＶＨドメインであってよく、または鎖のシャッフルに関して下記で記述されるように１個以上の異なるＶＨドメインであってよい。
【００７５】
同様に、３個のＣＤＲの１個以上または全てをＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーの中に移植し、次いでそれをＩＬ−１７ＢＲに特異的な抗体分子（単数または複数）に関してスクリーニングすることができる。
【００７６】
この方式で得られた抗体分子は、本発明のさらなる観点を形成する。
本発明の別の観点は、ＩＬ−１７ＢＲに関する抗体抗原結合ドメインを得るための方法であって、本明細書で記述される抗体分子のＶＨドメイン（上記で論じたような変形を含む）を１種類以上のＶＬドメインと組み合わせ、ＶＨ／ＶＬの組み合わせ（単数または複数）をＩＬ−１７ＢＲに関する抗体抗原結合ドメインに関して試験することを含む方法を提供する。
【００７７】
前記のＶＬドメインは、実質的に本明細書で述べられている通りであるアミノ酸配列を有していてよい。例えば、ＶＬドメインは実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で述べられている通りであってよい。
【００７８】
本明細書で開示されているＶＬドメインの１個以上の配列の変形を１個以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法を用いてもよい。
これは、ＷＯ９２／０１０４７において開示されているようないわゆる階層的二重組み合わせアプローチ（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｄｕａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を用いるファージディスプレイスクリーニング法により達成することができ、ここで、ＨまたはＬ鎖のクローンのどちらかを含む個々のコロニーを用いて他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させ、得られた二本鎖抗体分子を、ファージディスプレイの技法、例えば参考文献において記述されている技法に従って選択する。
【００７９】
本発明の別の観点は、ＩＬ−１７ＢＲに関する抗体分子の選択のための方法を提供し、方法は以下の：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを提供し；
（ｂ）前記のＶＨドメインを複数の抗体ＶＬドメインと組み合わせて抗体分子を提供し；
（ｃ）前記の抗体分子をＩＬ−１７ＢＲへの結合に関してスクリーニングし；そして
（ｄ）ＩＬ−１７ＢＲに結合する抗体分子を選択する
ことを含む。
【００８０】
そのような方法において、ＶＨおよびＶＬドメインは組み替えＤＮＡにより、特にファージまたはファージミドＤＮＡにより発現されるタンパク質の形で提供されてよい。
複数のＶＬドメインは、１０４個以上の個々のドメイン、例えば１０６から１０８または１０１０個までのドメインのいずれかであってよい。
【００８１】
ＩＬ−１７ＢＲは当技術においてＩＬ−２５Ｒ、ＩＬ−１７ＲＢまたはＩＬ−１７ＲＨ１とも呼ばれ、商業的な供給源（例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）からＦｃ融合タンパク質として入手可能であり、またはそれは当技術において入手可能なＩＬ−１７ＢＲの配列への参照によりクローニングもしくは合成することができる。
【００８２】
マウスのＩＬ−１７ＢＲ（遺伝子ＩＤ：核酸：ＮＭ＿０１９５８３．３  ＧＩ：１４２３６８７０１；ＮＰ＿０６２５２９．２  ＧＩ：８３０２５０６４）は、Tian et al., 2000 (下記の参考文献１１)により記述されている。ヒトのＩＬ−１７ＢＲ（遺伝子ＩＤ：５５５４０、核酸：ＮＭ＿０１８７２５．３  ＧＩ：１１２３８２２５５；タンパク質  ＮＰ＿０６１１９５．２  ＧＩ：２７４７７０７４）はShi, Y., et al., 2000 (下記の参考文献１０)により記述されている。
【００８３】
抗体の産生または免疫アッセイにおける使用に関して、組み換えＩＬ−１７ＢＲの断片、特に細胞外ドメインを含む断片を用いることができる。
さらなる観点において、本発明は、上記のような抗体分子、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン、例えばそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４のＶＨまたはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、ならびに上記のような抗体分子、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを調製する方法であって、前記の核酸を前記の抗体分子、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインの生成をもたらすための条件の下で発現させ、それを回収することを含む方法を提供する。
【００８４】
本発明の別の観点は、本明細書で開示されるＶＨ  ＣＤＲまたはＶＬ  ＣＤＲ配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６および７から選択されるＶＨ  ＣＤＲ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９および１０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ、最も好ましくはＤ９．２のＶＨ  ＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）をコードする核酸、通常は単離された核酸を提供する。
【００８５】
本発明の核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列もしくはその関連する部分（例えばＣＤＲをコードする領域）、または例えば部位指定突然変異生成により本発明の他のＶＨおよびＶＬドメインをコードするように改変されたこれらの配列の変形を含んでいてよい。しかし、コドン使用頻度は、例えば、望まれる宿主細胞中での配列の発現を最適化するために変更されてよい。
【００８６】
本発明の別の観点は、本発明の抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。好ましい観点において、本発明は上記で定めたような本発明のＣＤＲまたはＶＨもしくはＶＬドメインをコードする核酸を提供する。
【００８７】
本発明に従う核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、完全に、または部分的に合成によるものであってよい。本明細書で述べられる核酸配列への参照は、文脈が別のことを要求しない限り、明記された配列を有するＤＮＡ分子を含み、ＴをＵで置き換えた明記された配列を有するＲＮＡ分子を含む。
【００８８】
本発明の観点は、少なくとも１種類の上記の核酸を含む、例えばプラスミド、ウイルス、例えばファージ、またはファージミド、コスミド、転写もしくは発現カセットの形のベクターも提供する。
【００８９】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターを選択または構築することができる。さらなる詳細に関して、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual：第２版、Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照。
【００９０】
ベクターには、インビボでヒト細胞に感染することができるウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターも含まれる。そのようなベクターは、本発明の抗体分子をヒトまたは動物の対象の細胞中で発現させて、抗体分子の産生および前記の対象への送達を提供するために有用である可能性がある。
【００９１】
本発明の抗体分子をコードする核酸配列は、１観点において、宿主細胞中で抗体分子の発現をもたらすためのプロモーターに操作できるように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されるであろう。配列は、宿主細胞中での、および／または宿主細胞からの抗体分子の発現および／または分泌を促進するためのリーダー配列をその５’末端に含んでいてよい。当技術において、数多くの適当なリーダー配列がそういうものとして既知であり、当業者は宿主細胞を考慮してそれを選択することができる。
【００９２】
例えば核酸構築物の調製、突然変異生成、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの既知の技法およびプロトコルが、Current Protocols in Molecular Biology、第２版、Ausubel et al.編、John Wiley & Sons, 1992において詳細に記述されている。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらの開示を本明細書に援用する。
【００９３】
別の観点は、本発明の核酸（例えばベクターの形の核酸配列）で形質転換された宿主細胞を提供する。
核酸は宿主細胞のゲノム（例えば染色体）の中に組み込まれてよい。組み込みは、ゲノムとの組換えを促進する配列を標準的な技法に従って含ませることにより促進することができる。
【００９４】
別の観点は、本明細書で記述される抗体分子の生成の方法であって、コードしている核酸から発現を引き起こすことを含む方法を提供する。そのような方法は、前記の抗体分子の産生のための条件の下で宿主細胞を培養することを含んでいてよい。
【００９５】
発現による生成の後、ＶＨもしくはＶＬドメインまたは抗体分子をいずれかの適切な技法を用いて単離および／または精製することができ、その後必要に応じて使用される。生成の方法は、生成物の単離および／または精製の工程を含んでいてよい。
【００９６】
生成物の精製の後、抗体分子を、例えばタンパク質の安定性または生物学的半減期を変化させる、例えば増大させる保護基を導入するために、物理的または化学的手段により修飾することができる。例えば、そのような効果を得るためのタンパク質のＰＥＧ化は当技術においてそういうものとして知られており、本発明の抗体分子はＰＥＧ化された形であってよい。
【００９７】
生成の方法は、生成物を少なくとも１種類の追加の構成要素、例えば医薬的に許容できる賦形剤を含む組成物中に配合することを含んでいてよい。
本発明は、上記の１個または核酸またはベクターを含む組み換え宿主細胞も提供する。
【００９８】
様々な異なる宿主細胞における抗体分子のクローニングおよび発現ための系は周知である。適当な宿主細胞には、細菌、哺乳類細胞、酵母およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当技術において利用可能な哺乳類細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞および多くの他のものが含まれる。一般的に好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００９９】
大腸菌のような原核細胞における抗体および抗体断片の発現は、当技術において十分に確立されている。総説に関して、例えば、Plueckthun，A. Bio/Technology 9：545-551(1991)を参照。真核生物の培養細胞における発現も抗体分子の生成のための選択肢として当業者に利用可能であり、最近の総説に関して、例えばRef, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560を参照。
【０１００】
本明細書で示すデータは、ＩＬ−１７ＢＲに対する抗体が喘息の重要な症状である気道の反応性亢進をインビボで予防または低減するのに有効であることを初めて示す。
本発明の別の観点は、それを必要とする対象（例えばヒト）において気道の反応性亢進を予防または低減する方法であって、対象にＩＬ−１７ＢＲに結合する抗体分子、例えば上記の抗体分子を投与することを含む方法を提供する。本発明の別の観点は、それを必要とする対象において喘息または他のＩＬ−２５に仲介される病気を予防、低減または処置する方法であって、対象にＩＬ−１７ＢＲに結合する抗体分子を投与することを含む方法を提供する。他のＩＬ−２５に仲介される病気にはアレルギーおよび結腸炎が含まれ、それには潰瘍性結腸炎およびクローン病が含まれる。喘息にはアレルギー性喘息が含まれる。
【０１０１】
従って、本発明の別の観点は、それを必要とする対象（例えばヒト）において結腸の炎症を予防または低減する方法であって、対象にＩＬ−１７ＢＲに結合する抗体分子、例えば上記の抗体分子を投与することを含む方法を提供する。本発明の別の観点は、ＩＢＤを予防、低減または処置する方法であって、対象にＩＬ−１７ＢＲに結合する抗体分子を投与することを含む方法を提供する。ＩＬ−２５に仲介される病気には潰瘍性結腸炎およびクローン病が含まれる。他のＩＬ−２５に仲介される病気には、慢性結腸炎を含む結腸炎（結腸の炎症）が含まれる。
【０１０２】
上記の方法は上記の抗体分子（その組成物を含む）を用いて実施することができ、それはＩＬ−１７ＢＲに結合してＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−２５結合の作用に拮抗するのに有用であり、ＩＬ−１７ＢＲが役割を果たしている様々な疾患および障害において療法的可能性を有する。その方法は、ＩＬ−１７ＢＲに結合してＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−２５結合の作用に拮抗する他の抗体分子（その組成物を含む）を用いて実施することもでき、それは下記で付随する実施例において記述されているように得ることができる。
【０１０３】
上記の抗体分子（その組成物を含む）は、ヒトまたは動物の対象における処置（予防的処置を含む）または診断の方法において用いられてよい。そのような処置または診断の方法（予防的処置を含んでよい）は、前記の対象に有効量の本発明の抗体分子を投与することを含むことができる。典型的な疾患および障害を下記でさらに論じる。
【０１０４】
本明細書で記述した抗体分子（その組成物を含む）のヒトまたは動物の対象への投与のための薬物の製造における使用も提供する。
療法的利益を提供するために抗ＩＬ−１７ＢＲ抗体分子が用いられて良い臨床的適応症には、ＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−２５結合が病理学的重要性を有するあらゆる病気が含まれる。従って、一般に、本明細書で記述される抗体分子は、例えば望ましくないＴｈ２応答または２型応答と関係するあらゆるＩＬ−２５に仲介される病気の処置において用いられてよい。一部の態様において、本発明の抗体分子はアレルギーおよび喘息、特に喘息の処置のために用いられてよい。一部の態様において、本発明の抗体分子はＩＢＤの処置、特にＵＣおよび／またはＣＤの処置のために用いられてよい。
【０１０５】
抗ＩＬ−１７ＢＲ処置は注射（例えば静脈内）または局所的送達方法により与えられてよい。抗ＩＬ−１７ＢＲは遺伝子に仲介される技術により送達されてよい。代替的な配合ストラテジーは、経口または坐剤経路に適した製剤を提供することができる。投与の経路は、処置の物理化学的特性により、有効性を最適化する、または副作用を最小限にするような疾患に関する特別な考慮により決定されてよい。
【０１０６】
提供される組成物は個体に投与されてよい。投与は好ましくは“療法上有効量”であり、これは患者に利益を示すのに十分である。そのような利益は、少なくとも１種類の症状の少なくとも改善である可能性がある。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間推移は、処置されている対象の性質および重症度に依存するであろう。処置の処方、例えば投与量等の決定は、一般的な開業医および他の医師の責任の範囲内である。抗体の適切な用量は当技術において周知である；Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922を参照。
【０１０７】
正確な用量は、抗体が診断のためのものか処置のためのものか、処置される領域の大きさおよび位置、抗体の正確な性質（例えば、完全抗体、断片またはダイアボディ）、ならびに抗体に結合されたいずれかの検出可能な標識または他の分子の性質を含む多くの要因に依存するであろう。典型的な抗体の用量は０．５ｍｇ〜１．０ｇの範囲内であると考えられ、これはボーラスとして、または必要とされる用量を達成するために必要に応じて数時間にわたる注入として静脈内に投与されてよい。他の投与の方式には、類似した総累積用量を達成するための数時間にわたる静脈内注入が含まれる。これは成人患者の単独処置のための用量であり、それは小児および幼児に関しては比例的に調節されてよく、他の抗体形式に関しても分子量に比例して調節されてよい。処置は医師の自由裁量で毎日、週２回、週１回または月１回の間隔で繰り返されてよい。
【０１０８】
さらなる投与の方式では体内留置用デバイスのプレコーティングまたはその中への組み込みが用いられ、そのための抗体の最適量は適切な実験により決定されるであろう。
一部の態様における抗体分子はＦ（ａｂ）またはｓｃＦｖのような単量体断片であってよい。そのような抗体断片は、半減期が比較的短い、および受容体のクラスター化により引き起こされる可能性のある血小板活性化の危険性がより低いという利点を有する可能性がある。血小板活性化を引き起こすクラスター化は、例えばＩＬ−１７ＢＲ分子またはＦｃγＲＩＩを有するＩＬ−１７ＢＲ分子のどちらかのクラスター化である可能性がある。
【０１０９】
完全抗体が用いられる場合、それは好ましくは血小板を活性化および／または破壊できない形である。ＩｇＧ４アイソタイプあるいはＩｇＧ１バックボーン由来の“デザイナー”アイソタイプ（新規のＦｃ遺伝子構築物  ＷＯ９９／５８５７２，Ｃｌａｒｋ，Ａｒｍｏｕｒ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）が好ましい選択肢である。Ｆ（ａｂ’）２のようなより小さな抗体断片を用いてもよい。加えて、二重エピトープ特異性(例えば、ｓｃＦｖ  Ｄ９．２により認識されるエピトープに関する)を有する完全抗体または断片(例えば、Ｆ（ａｂ’）２またはダイアボディ)を用いてもよい。そのような態様は受容体のクラスター化を促進する可能性があるが、個々の受容体に対する高い結合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）はこの問題を排除することができる。
【０１１０】
本明細書で記述される抗体分子は通常は医薬組成物の形で投与されると考えられ、それは抗体分子に加えて少なくとも１種類の構成要素を含んでいてよい。
従って、本発明に従う、および本発明に従う使用のための医薬組成物は、有効成分に加えて、医薬的に許容できる賦形剤、キャリヤー、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の物質を含んでいてよい。そのような物質は非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨げるべきでは無い。キャリヤーまたは他の物質の正確な性質は投与経路に依存すると考えられ、それは経口であってよく、または注射、例えば静脈内注射によるものであってよい。
【０１１１】
抗体分子の療法的配合物は、望まれる程度の純度を有する抗体分子を任意の生理学的に許容できるキャリヤー、賦形剤、または安定剤（例えば“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”、第２０版、2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkinsを参照）と混合することにより、凍結乾燥された粉末または水溶液の形で貯蔵用に調製することができる。許容できるキャリヤー、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度において受容者に対して非毒性であり、以下のものを含む：緩衝剤、例えばホスフェート、シトレートおよび他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール類、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
【０１１２】
インビボ投与に用いられる抗体分子に関して、それは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後での滅菌濾過膜を通す濾過により容易に成し遂げられる。抗体分子は通常は凍結乾燥された形で、または溶液で保管されるであろう。
【０１１３】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形であってよい。錠剤は、固体のキャリヤー、例えばゼラチンまたは補助剤を含んでいてよい。液体の医薬組成物は、一般に液体のキャリヤー、例えば水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖類の溶液またはグリコール類、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールが含まれていてよい。
【０１１４】
静脈内注射、または苦痛のある部位における注射に関して、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口で許容できる水溶液の形であろう。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、乳酸加リンゲル注射剤を用いて適当な溶液を調製する能力が十分にある。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤が必要に応じて含まれてよい。
【０１１５】
本発明の抗体分子は単独で、または他の処置との組み合わせで、処置される病気に応じて同時または順次のどちらかで投与されてよい。他の処置には、適切な用量の鎮痛薬、例えば非ステロイド系抗炎症薬（例えばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェンもしくはケトプロフェン）もしくはアヘン剤、例えばモルヒネの投与；制吐剤の投与；または喘息に対して有効な少なくとも１種類の他の化合物、一般には気道の弛緩をもたらす、もしくは粘液の排除を増進する気管支拡張剤、例えばベータ作動薬（例えばサルブタモール、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏｌ））、クロモグリク酸二ナトリウム、ステロイド類もしくはＰＤＥＩＶの阻害剤の投与が含まれてよい。
【０１１６】
本発明の別の観点は、本明細書で提供される抗体分子のＩＬ−１７ＢＲへの結合を引き起こす、またはそれを可能にすることを含む方法を提供する。記載したように、そのような結合は、例えば、抗体分子、または抗体分子をコードする核酸の投与後にインビボで起こる可能性があり、またはそれは例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降もしくは親和性クロマトグラフィーにおいてインビトロで起こる可能性がある。
【０１１７】
ＩＬ−１７ＢＲへの抗体分子の結合の量を測定することができる。定量は試験試料中の抗原の量と関連づけられる可能性があり、それは診断上重要である可能性がある。
試料に対する抗体分子の反応性は、あらゆる適切な手段により決定されてよい。放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）は１つの可能性である。放射性標識された抗原を標識されていない抗原（試験試料）と混合し、抗体分子に結合させる。結合した抗原を結合していない抗原から物理的に分離し、抗体に結合した放射性抗原の量を測定する。試験試料中に存在する抗原が多ければ多いほど、抗体分子に結合する放射性抗原は少なくなるであろう。レポーター分子に連結された抗原またはアナログを用いて、非放射性抗原での競合的結合アッセイを用いることもできる。レポーター分子は、スペクトル的に孤立した吸収または発光特性を有する蛍光色素、リン光体（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）またはレーザー色素であってよい。適当な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが含まれる。適当な色原体色素には、ジアミノベンジジンが含まれる。
【０１１８】
他のレポーターには、視覚的に観察される、電気的に検出またはそうでなければ記録される検出可能なシグナルを直接または間接的に生じさせることができる、高分子コロイド状粒子または粒子性物質、例えば着色された、磁性または常磁性であるラテックスビーズ、および生物学的に、または化学的に活性な薬剤が含まれる。これらの分子は、例えば色を発するもしくは変化させる、または電気的特性の変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってよい。それらは、エネルギー状態間の電子遷移が結果として特徴的なスペクトル吸光または発光をもたらすように分子的に励起可能であってよい。それらにはバイオセンサーと共に用いられる化学成分が含まれてよい。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出系を用いてもよい。
【０１１９】
個々の抗体−レポーターコンジュゲートにより生成されるシグナルは、（正常および試験）試料中の関係のある抗体結合の定量可能な絶対的または相対的データを得るために用いることができる。
【０１２０】
本発明は、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための上記の抗体分子の使用、すなわち、競合アッセイにおいて本明細書で提供される抗体分子を用いることにより試料中の抗原のレベルを測定する方法も提供する。これは、結合した抗原の結合していない抗原からの物理的分離が必要とされない場合であってよい。結合すると物理的または光学的変化が起こるような抗体分子へのレポーター分子の連結は１つの可能性である。レポーター分子は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを直接または間接的に生成することができる。レポーター分子の連結は、直接または間接的、例えばペプチド結合を介して共有結合的、または非共有結合的であってよい。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合物の組み換え発現の結果であってよい。
【０１２１】
本発明は、例えばバイオセンサー系において本明細書で記述される抗体分子を用いることにより抗原のレベルを直接測定することも提供する。
結合を決定する方式は本発明の特徴では無く、当業者は彼らの好みおよび一般的知識に従って適切な方式を選択することができる。
【０１２２】
本発明はさらに、ＩＬ−１７ＢＲへの結合に関して、抗原に結合し、かつ実質的に本明細書で述べられている通りであるアミノ酸を有するＣＤＲを含むＶＨおよび／またはＶＬドメインまたは実質的に本明細書で述べられている通りであるアミノ酸配列を有するＶＨおよび／またはＶＬドメインを含むあらゆる抗体分子と競合する抗体分子に及ぶ。抗体分子間の競合は、例えば特定のレポーター分子を他のタグ付けされていない抗体分子（単数または複数）の存在下で検出され得る１つの抗体分子にタグ付けし、同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する抗体分子の同定を可能にすることにより、インビトロで容易にアッセイすることができる。競合は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーを用いて決定することができる。
【０１２３】
競合反応は１種類以上の追加の、または向上した特性を有している可能性のある１種類以上の抗体分子、例えばＤ９．２の誘導体を選択するために用いることができる。これは、ＩＬ−１７ＢＲがそのミニリガンドからではなく抗体分子から溶出されること以外は、本発明に従うＤ９．２に関する選択方法に類似している。これは、親と直接競合するより大きな割合の娘抗体分子をもたらすはずであるため、重要である可能性がある。実際、選択されるそのような娘抗体分子は親よりも大きな抗原への親和性を有している可能性がある（ファージ１個あたり１個より多くの抗体分子の提示の結果もたらされる可能性のある結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）の増強が可能になる）。向上した親和性を有する“娘”ファージ抗体分子に関する現在の選択方法には、以下のことが含まれる：
元の親抗体の解離定数よりも低い（標識された）標的抗原の濃度の使用；
Hawkins et al. (1992)において示されたような、競合相手としての過剰量の標識されていない標的抗原の使用。しかし、それらは、“向上した”抗体が親と同じエピトープを置き換え/占有するに違いないことを必ずしも明確に示さない。溶出工程の組み込みは、親と置き換わるより高い割合の娘抗体分子をもたらすはずである。この方法で選択された娘抗体分子は、親抗体分子に非常に類似したエピトープに結合するが、より大きな親和性を有する可能性がある。
【０１２４】
競合に関する試験において、ＩＬ−１７ＢＲのペプチド断片、特に目的のエピトープを含むペプチドを用いることができる。どちらかの末端にエピトープ配列に加えて１個以上のアミノ酸を有するペプチドを用いることができる。そのようなペプチドは“本質的に特定の配列からなる”と言われてよい。本発明に従う抗体分子は、それらのＩＬ−１７ＢＲへの結合が、所与の配列を有する、または含むペプチドにより阻害されるようなものであってよい。これに関する試験において、どちらかの配列に加えて１個以上のアミノ酸を有するペプチドを用いることができる。
【０１２５】
特定のペプチドに結合する抗体分子は、例えばペプチド（単数または複数）を用いたパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）によりファージディスプレイライブラリーから単離することができる。
【０１２６】
本発明の様々なさらなる観点および態様は、本開示を考慮して、当業者には明らかであろう。この明細書中で言及された全ての文書をそのまま本明細書に援用する。
“および／または”は、本明細書で用いられる場合、２つの明記された特徴または構成要素のそれぞれの、他方を含む、または含まない、具体的な開示として受け取られるべきである。例えば“Ａおよび／またはＢ”は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示として、まさにあたかも本明細書においてそれぞれを個別に述べたかのように受け取られるべきである。
【０１２７】
文脈が別途指示しない限り、上記で述べた特徴の記述および定義は本発明のあらゆる特定の観点または態様に限定されず、記述されている全ての観点および態様に等しく適用される。
【０１２８】
本発明の特定の観点および態様は、ここで実施例として、上記の図と関連して説明されるであろう。
【実施例】
【０１２９】
材料および方法
ＥＬＩＳＡによる上清のスクリーニング
９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌ／ウェルの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中１μｇ／ｍｌのマウスまたはヒトのＩＬ−１７Ｂｒ−Ｆｃ融合タンパク質で、４℃において一夜または室温でにおいて３時間コートした。次の日に、ウェルをＰＢＳ  ０．０５％  ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、次いでＰＢＳ  １０％  ＦＣＳ中で室温において４時間ブロッキングした。その同じ４時間の期間の間に、ハイブリドーマ細胞培養からの上清を５０μｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧと共に保温した。これは、融合タンパク質のＦｃ部分に対して産生された上清中のあらゆる抗体をブロッキングするためのものであった。それぞれの試料中の抗Ｆｃ抗体の量の指標を与えるために、この処置を受けなかった上清もＥＬＩＳＡに含められた。
【０１３０】
４時間のブロッキングの工程の後、イムノプレートをＰＢＳ  ０．０５％  ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、上清を５０μｌ／ウェルでそのまま（ｎｅａｔ）添加した。上清を４℃で一夜または室温で３時間プレート上でそのままにした後、ウェルをＰＢＳ  ０．０５％  ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。５０μｌのＰＢＳ  １０％  ＦＣＳ中０．５μｇ／ｍｌ抗マウス免疫グロブリン−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）をそれぞれのウェルに添加し、室温で１時間そのままにした後、ＰＢＳ  ０．０５％  ｔｗｅｅｎでの最後の８回の洗浄を行った。結合した抗体をＥＬＩＳＡ現像溶液で検出し、Ａ４０５をＴｅｃａｎイムノプレートリーダー上で記録した。
【０１３１】
融合タンパク質のＦｃ部分に対して産生された抗体をＩＬ−１７ＢＲに対して誘導された抗体から識別するため、対照のプレートを上記のプロトコルに従ってｈＩｇＧでコートし、上清を添加した。ｈＩｇＧでコートされたプレート上で高いＡ４０５を与えた試料は、さらなる試験に関して考慮されなかった。
【０１３２】
形質移入されたＣＯＳ７細胞のフローサイトメトリーによるスクリーニング
マウスおよびヒトのＩＬ−１７ＢＲ遺伝子に関するｃＤＮＡをｐＭＥ１８Ｓ発現ベクターの中に別々にクローニングし、これをそれぞれｍＩＬ１７ＢＲ−ｐＭＥ１８ＳおよびｈＩＬ１７ＢＲ−ｐＭＥ１８Ｓと名付けた。
【０１３３】
ＤＭＥＭ  １０％ＦＣＳ中の２×１０６個のＣＯＳ７細胞を１０ｃｍディッシュ上に蒔き、３７℃で一夜培養した。次の日に、４μｇのｍＩＬ１７ＢＲ−ｐＭＥ１８ＳまたはｈＩＬ１７ＢＲ−ｐＭＥ１８Ｓを５００μｌの血清を含まないＯｐｔｉｍｅｍ中の１０μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと混合し、室温で３０分間インキュベートした後、蒔かれた細胞の上に添加した。次いで細胞を３７℃で６時間インキュベートした後新しい培地を添加した。形質移入の４８時間後にＦＡＣＳ分析のために細胞を回収した。
【０１３４】
ＦＡＣＳ分析のため、形質移入された、または形質移入されていない細胞を、ＰＢＳ  ２％ＦＣＳ中の様々な濃度の候補の抗ＩＬ１７ＢＲ抗体と共に３０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄した後、ＰＢＳ  ２％ＦＣＳ中２μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にさらに３０分間インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ  ２％ＦＣＳ中で２回洗浄し、ＩＬ−１７Ｂｒの発現に関してＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ機械上で分析した。
【０１３５】
Ｄ９．２の交差反応性
ＥＬＩＳＡプレートを、２μｇ／ｍｌのＩＬ−１７ＲファミリーのメンバーであるＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＢＲ、ＩＬ−１７ＲＣ、もしくはＩＬ−１７ＲＤ、またはＩＬ−１３Ｒα対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、４℃において一夜コートした後、ＰＢＳ／０．０５％  ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳで室温において４時間ブロッキングした。ビオチン化Ｄ９．２をＰＢＳ／１０％ＦＣＳ中１μｇ／ｍｌで添加し、４℃において一夜インキュベートした。次いでプレートを洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを最後に洗浄した後、ＥＬＩＳＡ現像溶液を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１３６】
マウスモノクローナル抗体−ヒトＩＬ−１７ＢＲ結合アッセイ
ヒトＩＬ−２５（ｈＩＬ１７ｅ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓ）をＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロウェルプレート上に０．５μｇ／ｍｌでコートし、室温で１時間３０分インキュベートした。プレートを３回洗浄し、次いでＴｒｉｓ／１％  ＢＳＡで１時間ブロッキングした。ｈＩＬ１７Ｂｒ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓ）を１００ｎｇ／ｍｌに希釈した。それぞれの精製されたマウスモノクローナル抗体をｈＩＬ１７Ｂｒ／Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）中で希釈し（×１００）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ１７Ｂｒ／Ｆｃ溶液中で１μｇ／ｍｌの終濃度にした。[抗体×ｈＩＬ１７Ｂｒ／Ｆｃ]混合物を室温で１時間３０分インキュベートした。[抗体×ｈＩＬ１７Ｂｒ／Ｆｃ]混合物をｈＩＬ１７ｅでコートされたプレートに添加して１時間３０分インキュベートした後、３回洗浄した。抗ｈＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｅｒｏｔｅｃ）をプレートに添加し、室温で４５分間インキュベートした後、３回洗浄し、ＴＭＢで現像した。反応を１Ｍ  ＨＣＬで止めた。光学密度を４５０ｎｍにおいて読み、全ての読みから試薬ブランクの読みを引いた。
【０１３７】
ＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ２５阻害アッセイ
腸間膜（Ｍｙｓｅｎｔｅｒｉｃ）リンパ節を未処置のＢＡＬＢ／ｃマウスから取り出し、７０μｍのセルストレーナーを通過させて単一細胞懸濁液を得た。細胞をＰＢＳ  ２％ＦＣＳ中で洗浄し、次いでＴ細胞およびＢ細胞を激減させた。これは、細胞を５μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３抗体と共に氷上で３０分間インキュベートし、次いで抗ビオチンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に細胞あたりビーズ４個の濃度で４℃で２０分間インキュベートすることにより達成された。次いで混合物を洗浄した後、磁石の上を通過させて標識されたＴおよびＢ細胞を標識されていない非Ｂ非Ｔ（ＮＢＮＴ）細胞画分から分離した。ＮＢＮＴ画分の純度をＦＡＣＳにより試験し、Ｂ２２０、ＣＤ４およびＣＤ８に関して染色した。
【０１３８】
次いでＮＢＮＴ細胞を丸底９６ウェルプレート上に３×１０５細胞／ウェルで蒔き、ＲＰＭＩ１０％のみまたは１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２５を含むＲＰＭＩ  １０％ＦＣＳ中で７２時間培養した。候補のＩＬ−１７ＢＲブロッキング抗体をウェルに最大濃度２μｇ／ｍｌから系列希釈で添加し、１．５時間インキュベートした後、ウェルに１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２５を添加した。次いでプレートを３７℃で７２時間保温した後、上清を集め、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＬ−１３タンパク質含有量に関して試験した。
【０１３９】
ＣＤ４＋（Ｔおよび／またはＮＫＴ）細胞に関して、未処置の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製した。赤血球溶解を行った後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）中で洗浄した。ＣＤ４＋細胞の単離を、ＣＤ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた正の選択により、製造業者の説明書に従って実施した。次いでＣＤ４＋細胞を９６ウェルプレートにおいて１×１０６細胞／ｍｌで、ＲＰＭＩ単独、または１μｇ／ｍｌのＤ９．２有りもしくは無しで１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２５を補ったＲＰＭＩのどちらかの中で培養した。細胞を７２時間培養し、次いでＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＩＬ−１３タンパク質レベルの分析のために上清を得た。
【０１４０】
腎癌細胞株のバイオアッセイ
ヒトＴＫ−１０腎癌細胞を国立癌研究所（ＮＣＩ）から得た。ＲＥＮＣＡ細胞をＣｅｎｔｏｃｏｒ  Ｒ＆Ｄの細胞生物学部門から得た。両方の細胞株を、１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭ増殖培地中で、３７℃、５％ＣＯ２において加湿した雰囲気中で維持した。細胞を９６ウェル平底組織培養処理プレートにおいて完全増殖培地１００μｌの総体積中で２．５×１０４細胞／ウェルの密度で蒔いた。一夜培養した後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、次いでＯｐｔｉＭＥＭ減少血清培地中で１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２５および１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、または培地のみの対照と共に２４時間培養した。細胞上清をＩＬ−２５刺激の２０〜２４時間後に集め、その後のＫＣに関するマウスＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡまたはＩＬ−８に関するヒトＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた可溶性ＫＣ／ＩＬ−８の放出の分析のために−２０℃で保管した。
【０１４１】
Ｄ９．２またはＩｇＧ１対照を、ＩＬ−２５に仲介されるＩＬ−８（ＫＣ）の放出を妨げる能力に関して試験した。阻害実験に関して、一定量のＩＬ−２５（１００ｎｇ／ｍｌ）を異なる濃度のＤ９．２または抗ｃ−ｍｙｃマウスＩｇＧ１（クローン９Ｅ１０．２）対照抗体と共に室温で３０〜６０分間前インキュベートした後、それぞれの細胞に添加した。ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を、ＩＬ−２５タンパク質／Ｄ９．２の添加の直前に細胞に添加した。ＩＬ−８（ＫＣ）の放出の決定を、上記のように刺激の２４時間後に実施した。
【０１４２】
マウス
アレルギー性喘息の実験モデルにおける使用のためのＢＡＬＢ／ｃマウスはＨａｒｌａｎ  ＵＫから得て、ＩＢＤの実験モデルにおける使用のためのＢＡＬＢ／ｃマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。マウスはＳＡＢＵ／ＣＢＳ／Ａｒｅｓ−ＭＲＣまたは国立心臓・肺研究所の施設で特定病原体除去環境において維持された。この報告で概説されている全ての動物実験は、英国内務省の認可を得て行われた。
【０１４３】
感作およびアレルゲンへの曝露
アレルギー性喘息の実験モデルに関して、ＢＡＬＢ／ｃマウスの野生型マウスまたはＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドでのＩＬ−１７ＢＲノックアウトマウスを、０日目および１２日目において、ミョウバンと複合体化したＯＶＡ（２０μｇ／注入）または１：１  ＰＢＳ：ミョウバン（対照）の腹腔内投与により感作した。１９、２０、２１日目に、１日あたり２０分間のＰＢＳまたは１％ＯＶＡのエアロゾル投与を行った。２２日目に動物を屠殺し、組織を収集した。
【０１４４】
ＩＢＤの実験モデルに関して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを０日目においてオキサゾロン（ＯＸＡ）の１００％エタノール中における４％（ｗ／ｖ）溶液またはエタノールのみ（対照）の皮膚適用により感作した。オキサゾロンの５０％エタノール中における３％（ｗ／ｖ）溶液または５０％エタノールのみ（対照）の直腸内投与を７日目に実施した。９日目に動物を屠殺し、組織を収集した。
【０１４５】
抗ＩＬ−１７ＢＲ抗体の投与
アレルギー性喘息の実験モデルにおいて、抗体処置を受けるマウスに関して、ＰＢＳ中２５０μｇのＤ９．２または抗ｃ−ｍｙｃマウスＩｇＧ１対照抗体（クローン９Ｅ１０．２）の腹腔内注入を、それぞれの噴霧の２時間前に与えた。それぞれのマウスは３用量の抗体を与えられた。
【０１４６】
ＩＢＤの実験モデルにおいて、抗体処置を受けるマウスに関して、ＰＢＳ中５００μｇのＤ９．２または抗ＫＬＨマウスＩｇＧ１対照抗体の腹腔内注入を、感作の２４時間前（−１日目）および負荷の２４時間前（６日目）に与えた。従って、それぞれのマウスは２用量の抗体を与えられた。
【０１４７】
ＡＨＲの評価
図８（ｅ）に関して、マウスを低エンドトキシンオボアルブミンの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与により感作し、６日間毎日エアロゾル化したＰＢＳ（対照）またはＯＶＡを用いた噴霧により負荷をかけた。
【０１４８】
Ｄ９．２抗体処置を受けたマウスは、ＰＢＳ中２５０μｇのＤ９．２または抗ｃ−ｍｙｃマウスＩｇＧ１対照抗体（クローン９Ｅ１０．２）の腹腔内注入を、最後の３回の噴霧のそれぞれの２時間前に与えられた。最後のエアロゾル負荷の２４時間後に、拘束全身プレチスモグラフ（ＥＭＭＳ，ＵＫ）を用いてＡＨＲを評価した。動物に麻酔をかけ、気管開口し（ｔｒａｃｈｅｏｓｔｏｍｉｓｅｄ）、１７５呼吸／分の速度で、２００μｌ／１拍の一回呼吸量で人工呼吸した（ＭｉｎｉＶｅｎｔ  ８４５人工呼吸器、ＥＭＭＳ，ＵＫ）。安定なベースライン肺抵抗を３分間記録した後、増大する濃度の塩化アセチル−β−メチルコリン（メタコリン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を超音波噴霧器を用いてエアロゾルにより１０秒間投与し、肺抵抗を３分間の期間記録した。ｅＤａｑソフトウェアを用いて気道抵抗、コンプライアンス、および標準的な肺のパラメーターを分析した。
【０１４９】
縦隔リンパ節の再刺激
ＰＢＳまたはＯＶＡで処理されたマウスからの縦隔リンパ節を７０μｍのセルストレーナーを押し通して単一細胞懸濁液を得た。細胞を計数し、丸底９６ウェルプレート上に３×１０５細胞／ウェルで蒔いた。細胞をＲＰＭＩ  １０％ＦＣＳ単独中で、または１００μｇ／ｍｌ  ＯＶＡの存在下で７２時間培養した。次いで上清を集め、ＩＬ−１３濃度に関してＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアッセイした。
【０１５０】
ＩＢＤの評価
図９に関して、マウスを０日目においてオキサゾロンのエタノール中における溶液の皮膚適用により感作し、７日目にオキサゾロンのエタノール中における溶液で負荷をかけた。対照はエタノールのみを与えられた。抗体処置を受けたマウスは、Ｄ９．２または抗ＫＬＨマウスＩｇＧ１抗体（対照）の腹腔内注入を、−１日目および６日目に与えられた。９日目において動物を屠殺し、組織を収集した。（図９（ａ）および９（ｂ）において、７、８および９日目はそれぞれ０、１および２日目と番号を付けられている）。
【０１５１】
７、８および９日目にマウスの体重を量り、それぞれの動物に０から３までの臨床スコアを割り当てるために、Wang et al., 2004において記述されている方法に基づいてそれらの全体的な外観および行動を評価し、７日目の臨床スコアを０と設定した（図９ｂ）。９日目においてマウスを屠殺し、それぞれのマウスの結腸を回収し、詳しく調べ、測定した（図９（ｃ））。
【０１５２】
実施例１：ＩＬ−１７ＢＲに対する抗体の生成
我々は初めに、マウスをヒトＩＬ−１７ＢＲのアミノ酸配列に由来する合成ペプチドで免疫することにより抗体を生成することを試みた。モノクローナル抗ペプチド抗体が生成されたにも関わらず、我々は成熟したヒトＩＬ−１７ＢＲタンパク質を認識するであろう抗体を生成できなかった。次に我々は、野生型のマウスを免疫することによりヒトＩＬ−１７ＢＲタンパク質の融合タンパク質に対する抗体を生成することを試みた。多数の免疫処置およびハイブリドーマ融合にも関わらず、我々はＩＬ−１７ＢＲに対する高親和性交代を生成できなかった。
【０１５３】
マウスもある形のＩＬ−１７ＢＲを発現しており、我々は我々が有用な抗体を産生させることができないのはマウスおよびヒトのＩＬ−１７ＢＲ分子の間での新規のエピトープの欠如により抑制されているのかどうかを仮定した。我々は、もはやＩＬ−１７ＢＲを発現しないであろうＩＬ−１７ＢＲ欠損マウス系列を生成した。ＩＬ−１７ＢＲ欠損マウスは、オルタナティブスプライシングした変種を含むあらゆる形のＩＬ−１７ＢＲを除去するように設計された。ヒトおよびマウスのＩＬ−１７ＢＲの間で結合面が高い程度で保存されていることは野生型のマウスにおいてブロッキング抗体を産生させる可能性を低減させる可能性があり、従って内在性のＩＬ−１７ＢＲを除去することは、ＩＬ−１７ＢＲのリガンド結合部位に対する抗体の開発を促進する可能性がある。この戦略は、マウスおよびヒト両方のＩＬ−２５の結合を妨害するであろうＩＬ−１７ＢＲに対する抗体を産生させる可能性も増大させた。交差反応性抗体は疾患のマウスモデルにおいて有効性を試験することができるため、これは有用である。
【０１５４】
ＩＬ−１７ＢＲ欠損動物の生成および特性付けの後、ＩＬ−１７ＢＲ−Ｆｃ融合タンパク質による免疫処理を実施した。この戦略は野生型のマウスを用いるよりも上手くいくことが判明したが、まだ候補抗体を同定するために多数のハイブリドーマをスクリーニングする必要があった。
【０１５５】
マウスＩＬ−１７ＢＲ−Ｆｃ融合タンパク質に対して免疫されたｉｌ１７ｂｒ−／−マウスにおいて生成された抗体の大きな集団を、ヒトおよびマウスのＩＬ−１７ＢＲに対する結合に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。同定された抗ＩＬ−１７ＢＲ抗体の１つ（Ｄ９．２）は、ＥＬＩＳＡによりマウスおよびヒトのＩＬ−１７ＢＲ両方に（図１）、ならびにマウスＩＬ−１７ＢＲ  ｃＤＮＡまたはヒトＩＬ−１７ＢＲ  ｃＤＮＡを形質移入したＣＯＳ細胞上で発現された天然型のマウスおよびヒトのＩＬ−１７ＢＲタンパク質両方に（図２）十分に結合した。
【０１５６】
実施例２：Ｄ９．２のインビトロ試験
Ｄ９．２の特異性を、Ｄ９．２と他のＩＬ−１７受容体ファミリーのメンバーとの相互作用をアッセイすることにより試験した。Ｄ９．２はＩＬ−１７Ａ受容体（ＩＬ−１７ＲＡ）、ＩＬ−１７Ｃ受容体（ＩＬ−１７ＲＣ）またはＩＬ−１７Ｄ受容体（ＩＬ−１７ＲＤ）と交差反応しなかった（図３）。
【０１５７】
スクリーニングはＩＬ−１７ＢＲと結合するいくつかの抗体を同定したが、Ｄ９．２のみがヒトＩＬ−２５とヒトＩＬ−１７ＢＲの間の相互作用を阻害することができた（図４）。
【０１５８】
Ｄ９．２を、それのＩＬ−２５の生物学的活性を阻害する能力に関して試験した。ＩＬ−２５は２型サイトカイン類、例えばＩＬ−１３の放出を、最初に自然免疫非Ｂ／非Ｔ（ＮＢＮＴ）細胞から(Fallon et al., 2006; Fort et al., 2001)、およびＴ細胞から(Angkasekwinai et al., 2007)誘導する。さらに、ヒトＴＫ−１０（腎癌細胞株）およびマウス腎癌（ＲＥＮＣＡ）細胞株は共に、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２５による刺激に応答してケモカインＩＬ−８（マウスではＫＣとして知られている）を分泌する(Sayers et al., 1990)。
【０１５９】
インビトロのバイオアッセイにおいて、Ｄ９．２はＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−２５結合により引き起こされる生理活性−すなわちマウス初代ＮＢＮＴ細胞（図５ａ）およびＣＤ４＋Ｔ／ＮＫＴ細胞（図５ｂ）によるＩＬ−２５依存性のＩＬ−１３の産生を阻害した。
【０１６０】
さらに、Ｄ９．２はＩＬ−２５に刺激されたマウスＲＥＮＣＡ細胞からのＫＣの産生をインビトロで阻害した（図６）。
意味深いことに、Ｄ９．２はヒトＩＬ−２５の生物学的活性も阻害することができた。Ｄ９．２はヒトＴＫ−１０細胞によるＩＬ−２５依存性のＩＬ−８の分泌を用量依存的様式で阻害した（図７）。
【０１６１】
これらの特性の組み合わせを、喘息の処置における有用性を実証するために、インビボの系においてさらに調べた。追加の実験はＩＢＤの処置における有効性を実証する。
実施例３：アレルギー性喘息の実験モデル
ＢＡＬＢ／ｃマウスをまず抗原ＯＶＡで感作した後、エアロゾル化したＯＶＡで負荷をかけた。感作し、負荷をかけたＢＡＬＢ／ｃマウスは特徴的な喘息の表現型を発現する。これは、ＰＢＳで負荷をかけた対照ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較した、誘発剤メタコリンへの曝露の後のＡＨＲの増大、気道の好酸球浸潤、杯状細胞過形成および血清ＩｇＥの分泌を特徴とする。
【０１６２】
このモデルを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを負荷をかける時期においてアイソタイプ対照である抗−ｃ−ｍｙｃ  ＩｇＧ１（クローン９Ｅ１０．２）または抗ＩＬ−１７ＢＲクローンＤ９．２のどちらかで処置した。意味深いことに、Ｄ９．２の投与は抗原負荷の後に産生されるＩＬ−１３および抗原再刺激の後に産生されるＩＬ−５のレベルを、抗原負荷の非存在下で、またはＩＬ−１７ＢＲ欠損マウスにおいて見られるレベルに類似したレベルまで低減した（図８ａおよびｂ）。抗原で負荷をかけたマウスの肺におけるＩＬ−１３産生細胞の数も、そのようなレベルまで低減した（図８ｃ）。同様に、ガンマ／デルタＴ細胞の疾患に関連する増殖も、Ｄ９．２を用いた処置の後に妨げられていたことが分かった（図８ｄ）。Ｊｉｎら(2007, J Immunol.)は、ガンマ／デルタＴ細胞が存在しないことはＡＨＲを発現できないことをもたらすことを示し、これは抗ＩＬ−１７ＢＲ抗体が喘息の発現において不可欠であることが知られている２種類の経路−ＩＬ−１３の産生およびガンマ／デルタＴ細胞の反応性を阻害することができることを示唆している。さらに、Ｄ９．２を用いた処置は、ヒトの喘息の重要な特徴である気道の反応性亢進を、喘息のマウスモデルにおいて低減した。
【０１６３】
実施例４：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の実験モデル
ＢＡＬＢ／ｃマウスをまずハプテンオキサゾロン（ＯＸＡ）で感作した後、同じ化学物質の直腸内注入により負荷をかけた。感作し、負荷をかけたマウスは、（エタノールのみの対照と比較して）体重の減少、糞便中の血を伴う結腸の短縮および大腸における炎症を特徴とする、特徴的なＩＢＤの表現型を発現する。
【０１６４】
このモデルを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＯＸＡを用いた感作および負荷両方の前にアイソタイプ対照である抗ＫＬＨ  ＩｇＧ１または抗ＩＬ−１７ＢＲ（クローンＤ９．２）のどちらかで処置した。Ｄ９．２の投与は動物の疾患指数を低減させ、これは結果としてより低い死亡率（図９（ａ））および臨床スコアの向上、すなわち体重の減少ならびに動物の行動および外観において示されるＩＢＤの臨床徴候の低減（図９（ｂ））をもたらした。さらに、Ｄ９．２は炎症および出血の結果もたらされる結腸の短縮に対して保護し（図９（ｃ））、Ｄ９．２で処置されたマウスの結腸は抗ＫＬＨ対照抗体を与えられたマウスと比較してより少ない炎症および出血を示した。
【０１６５】
実施例５：Ｄ９．２のクローニングおよび配列決定
Ｄ９．２から免疫グロブリン配列をクローニングするため、Ｄ９．２細胞クローンからＲＮＡを単離し、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製した。
【０１６６】
免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）ｃＤＮＡを、保存された５’ＶＨ領域のプライマーであるＭＨＶ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）をＩｇＧ１定常領域のプライマーであるＭＨＣＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と組み合わせて用いるＰＣＲにより増幅した。
【０１６７】
同様に、免疫グロブリン軽鎖（ＩｇＫ）を、保存された５’ＩｇＫ領域のプライマーであるＭＫＶ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）をカッパ定常領域のプライマーであるＭＫＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）と組み合わせて用いて増幅した。
【０１６８】
ＰＣＲ反応全体を通して、耐熱性ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（ＮＥＢ  Ｆ−５３１Ｌ）を用いた。
Ｄ９．２のＶＨ２＋ＭＨＣＧ１による増幅産物をｐＣＲＩＩ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターの中に、ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｃａｔ  ４５−０２４５）を用いて直接ライゲーションし、軽鎖の増幅反応の増幅産物も同様にした。ライゲーションされたｐＣＲＩＩ−ｂｌｕｎｔベクター構築物で形質転換した大腸菌ＴＯＰ１０細菌を、ＬＢ−アンピシリン−ＸＧａｌ寒天プレート上で、白いコロニーを選んで寒天の格子の上に移し、ＰＣＲスクリーニング混合物の中に入れることによりクローニングした。クローニングされたプラスミド挿入断片をＰＣＲで増幅した。増幅産物をゲル電気泳動し、予想された産物を同定した。正しい大きさのＰＣＲ増幅産物を生成するそれぞれのクローンの一夜培養物（５ｍｌ）をＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ｃａｔ  ２７１０６）を用いて処理し、ＤＮＡプラスミドのミニプレップを生成した。それぞれの選択されたプラスミドを、Ｍ１３順方向および逆方向プライマーを用いて両方向で配列決定した。
【０１６９】
ＲＴ−ＰＣＲ、クローニング、およびＤＮＡ配列分析の完全なサイクルを繰り返して、それぞれの免疫グロブリン鎖に関する２つの完全に独立した配列情報のセットを得た。
ＶＨおよびＶカッパ遺伝子の完全な推測されたヌクレオチド配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として示す。これらの配列はそれぞれの可変遺伝子分節の開始部分においてリーダー配列を含んでおり、それは新しく合成された抗体鎖を小胞体の中に輸送するために用いられるシグナル配列をコードしている；それらは最終的な重鎖および軽鎖には存在しない。
【０１７０】
免疫学および分子生物学の試薬
【０１７１】
【表１】
0005767625.tif 000002
【０１７２】
略語
ＡＨＲ        気道反応性亢進
℃            摂氏温度
ｂｐ          塩基対
ＣＤ          クローン病
ＣＤＲ        相補性決定領域
ＤＭＥＭ      ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＮＡ        デオキシリボ核酸
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着検査法
ＦＡＣＳ      蛍光活性化細胞選別
ＦＣＳ        ウシ胎児血清
ｇ            グラム
ｈｒ          時間
ＨＲＰ        ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＩＢＤ        炎症性腸疾患
Ｉｇ          免疫グロブリン
ｉ．ｐ．      腹腔内
ＫＬＨ        キーホールリンペットヘモシニアン
ｍＡｂ        モノクローナル抗体
ｍｉｎ        分
ＮＢＮＴ      マウス腸間膜リンパ節から単離された非Ｂ／非Ｔ細胞
ｎｍ          ナノメートル
ＯＤ          光学密度
ＯＶＡ        オボアルブミン
ＯＸＡ        オキサゾロン
ＰＢＳ        リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ        ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＥＮＣＡ    腎癌
ＲＨ          組み換え重鎖
ＲＫ          組み換えカッパ鎖
ＴＭＢ        ３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン
ＵＣ          潰瘍性結腸炎
ＶＨ          免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＬ          免疫グロブリン軽鎖可変領域
ＶＫ          免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１    Ｄ９．２  ＶＨをコードするヌクレオチド配列
【０１７３】
【化１】
0005767625.tif 000003
【０１７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２    Ｄ９．２  ＶＨのアミノ酸配列
【０１７５】
【化２】
0005767625.tif 000004
【０１７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３    Ｄ９．２  ＶＬをコードするヌクレオチド配列
【０１７７】
【化３】
0005767625.tif 000005
【０１７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４    Ｄ９．２  ＶＬのアミノ酸配列
【０１７９】
【化４】
0005767625.tif 000006
【０１８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５    Ｄ９．２  ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列
【０１８１】
【化５】
0005767625.tif 000007
【０１８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６    Ｄ９．２  ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列
【０１８３】
【化６】
0005767625.tif 000008
【０１８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７    Ｄ９．２  ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列
【０１８５】
【化７】
0005767625.tif 000009
【０１８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８    Ｄ９．２  ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列
【０１８７】
【化８】
0005767625.tif 000010
【０１８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９    Ｄ９．２  ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列
【０１８９】
【化９】
0005767625.tif 000011
【０１９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０    Ｄ９．２  ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列
【０１９１】
【化１０】
0005767625.tif 000012
【０１９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１    ＭＨＶ２プライマーの配列
【０１９３】
【化１１】
0005767625.tif 000013
【０１９４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２    ＭＨＣＧ１プライマーの配列
【０１９５】
【化１２】
0005767625.tif 000014
【０１９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３    ＭＫＶ３プライマーの配列
【０１９７】
【化１３】
0005767625.tif 000015
【０１９８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４    ＭＫＣプライマーの配列
【０１９９】
【化１４】
0005767625.tif 000016
【０２００】
参考文献
【０２０１】
【化１５】
0005767625.tif 000017
【図１】
0005767625.tif 000018
【図２】
0005767625.tif 000019
【図３】
0005767625.tif 000020
【図４】
0005767625.tif 000021
【図５】
0005767625.tif 000022
【図６】
0005767625.tif 000023
【図７】
0005767625.tif 000024
【図８】
0005767625.tif 000025
【図９】
0005767625.tif 000026
【配列表】
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