(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１〜５のいずれか１つに示す配列；
（ｂ）（ａ）の配列の少なくとも９５％の同一性を有するか、ストリンジェントな条件下でその相補鎖とハイブリダイズするか、もしくは（ａ）の配列において１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む改変配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の少なくとも１５ヌクレオチドを含むフラグメント配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の相補鎖配列
を含む核酸分子であって、
該ストリンジェントな条件は、洗浄条件が０．１倍濃度のＳＳＣ、６５℃での洗浄を含む、
カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）またはイチゴ葉縁退緑病を検出することができる核酸分子。
【請求項２】
配列番号１〜５中以下の箇所：配列番号１の２１２−２３２位、配列番号１の３３０−３５１位、配列番号１の７１５−７３３位、配列番号１の７１５−７３８位、配列番号１の７４９−７６６位、配列番号１の７６９−７８８位、配列番号１の７８９−８１３位、配列番号１の８１４−８３８位、配列番号１の８３８−８５８位、配列番号１の８４１−８６２位、配列番号１の８７０−８８９位、配列番号１の８９０−９１１位、配列番号１の９２８−９４９位、配列番号２の５９６−６２０位、配列番号２の７１５−７３８位、配列番号３の８４７−８６１位、配列番号３の９１９−９４３位、配列番号４の５７２−５９１位、配列番号４の６７２−６９１位、配列番号５の１２３−１４４位、配列番号５の２１４−２３２位、配列番号５の２２３０−２２５０位および配列番号５の２３７６−２３９９位からなる群より選択される少なくとも１つの配列またはその相補配列の少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）またはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、請求項３に記載のカンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）またはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのプライマーセット。
【請求項５】
配列番号１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドと、標識とを含む、カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）またはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのプローブ。
【請求項６】
配列番号１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む、請求項５に記載のカンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）またはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのプローブ。
【請求項７】
カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）またはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのキットであって、該キットは：
（Ａ）配列番号１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセット、または配列番号１〜５に示す配列またはその相補配列のうち少なくとも１５ヌクレオチドと標識とを含むプローブ；ならびに
（Ｂ）核酸増幅用試薬
を含む、キット。
【請求項８】
前記プライマーセットは、配列番号１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、前記プローブは配列番号１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）またはイチゴ葉縁退緑病を検出するための方法であって、
（Ａ）被験サンプルを鋳型として用い、配列番号１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセットをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行う工程；および
（Ｂ）増幅された核酸分子に基づいて、該被験サンプル中にカンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）があるかどうかを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記プライマーセットは、配列番号１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、前記プローブは配列番号１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記決定する工程は、カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）に感染したイチゴから抽出したサンプルを陽性コントロールとして使用することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸増幅反応は、リアルタイムＰＣＲまたはＬＡＭＰ法によって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）を検出するためのプライマーであって、配列番号６〜２５に記載の配列から選択される配列を含むプライマー。
【請求項１４】
カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）を検出するためのプライマーセットであって、配列番号６および７のセット、配列番号８および９のセット、配列番号１０〜１１のセット、配列番号１２〜１３のセット、配列番号１４〜１５のセット、配列番号１６〜２１のセット、配列番号２２〜２３のセット、配列番号２４〜２５のセットからなる群から選択される配列セットを含むプライマーセット。
【請求項１５】
カンジダツス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）またはイチゴ葉縁退緑病を検出するための装置であって、該装置は：
（Ａ）核酸増幅反応を行うための手段；
（Ｂ）配列番号１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセット、または配列番号１〜５に示す配列またはその相補配列のうち少なくとも１５ヌクレオチドと標識とを含むプローブ；ならびに
（Ｃ）該核酸分子または該標識を検出するための手段
を含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチゴ葉縁退緑病の高精度診断技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
イチゴ葉縁退緑病は、バクテリア様微生物Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ（本明細書において、「Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ」とも省略する。）がイチゴに感染することで生じる病害であり、この病害に感染したイチゴでは生育不良、果実品質の低下等により、商品価値のある果実の生産ができなくなる。日本では２００３年に発生が初めて報告されたが、それ以前はフランスで報告されているのみであり、国外からの侵入した病害と推定される。現時点ではその発生は一部地域に留まっているが、本病は昆虫伝搬性であるとともに、イチゴに全身感染しランナー（匍匐枝）を通じて親株から子株へ伝搬するため、感染した苗が流通することにより全国的に蔓延するおそれがある。
【０００３】
イチゴ葉縁退緑病の病原体Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅは絶対寄生菌で培養できず、また菌体の大きさも幅２５ｎｍ×長さ２５０ｎｍ程度とごく小さいため、光学顕微鏡での観察は困難であり、形態観察には電子顕微鏡が必要である。しかし、形態だけでは本菌の同定は不可能であり検出および同定が可能な手段は遺伝子診断法に限られる。
【０００４】
Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅの１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を標的遺伝子としたプライマーセットＦｒａ５／Ｆｒａ４を用いたＰＣＲ法による検出（非特許文献１）が報告されている。また、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的としたＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による迅速検出法が報告されている（非特許文献２）。さらにＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのグアノシン−３’，５’−ビス（ジホスフェート）３’−ピロホスホヒドラーゼ（ｐｐＧＰＰａｓｅ）遺伝子を標的としたプライマーセットＰｆｒ１／Ｐｆｒ４を用いたＰＣＲ法により標的ＤＮＡを増幅した後、制限酵素ＲｓａＩおよびＡｌｕＩによるＲＦＬＰ解析により病原体を検出・同定する手法が報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的にしたＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法に関しては、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が原核微生物で高く保存性されているため、これらの手法を用いるとＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅと近縁な細菌も検出される、特に昆虫の共生細菌にはＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅと極めて近縁な種が存在するため、昆虫体内からの検出では非特異的な増幅が多発し、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの特異的な検出は困難である。また検出限界も低く無病徴感染イチゴから確実にＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅを検出することは困難である。一方、昆虫における非特異増幅を避けるために開発されたプライマーセットＰｆｒ１／Ｐｆｒ４を用いたＰＣＲでは、一部の昆虫共生細菌では依然として非特異増幅が生じるため、最終的な同定を行うためにはＲＦＬＰを併用する必要があり煩雑である。また、検出限界はＦｒａ５／Ｆｒａ４を用いたＰＣＲ法よりさらに１／１０程低く、実用的なＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出法として用いることは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４８：２５７−２６１，１９９８
【非特許文献２】平成１８年度関東東海北陸農業成果情報「LAMP法によるイチゴ葉縁退緑病バクテリア様微生物の迅速検出」田中穣ら、[online] Internet URL: http://www.affrc.go.jp/ja/agropedia/seika/data_kanto/h18/12_29
【非特許文献３】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６６：３４７４−３４８０，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在、イチゴ果実の生産で用いられる主要な品種のほぼ全てで、栄養繁殖によって増殖された苗を利用しているため、苗を生産するための親株が無病化されていることが極めて重要である。また、イチゴ栽培における苗生産と果実生産との間の分業化は、海外では既に普及し、日本国内でも近年になり普及しつつあるが、将来的には国際的な苗の流通（輸出入）が進むことが想定される。以上にかんがみ、本発明は、苗生産の親株および果実生産用の苗として流通するイチゴの、イチゴ葉縁退緑病に関する安全性（無病性）を評価（検疫）することを課題とする。
【０００８】
すなわち、イチゴの苗および果実生産現場から早期にＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅを検出・排除することで本病の蔓延防止および果実生産の被害の軽減が期待できることから、本発明は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅを高感度で検出することができる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、葉縁退緑病に感染したイチゴから分画遠心法によりＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの部分純化をおこない、部分純化試料からＤＮＡを抽出し、ＳＳＨ（抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ））法により、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに特異的なＤＮＡ領域をクローニングし、ＳＳＨ法により高頻度でクローニングされるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ特異的ＤＮＡ領域の塩基配列を解析し、プラスミド複製酵素（Ｒｅｐ）遺伝子の一部であることを明らかにした。
【００１０】
本発明者らはまた、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ法により、Ｒｅｐ遺伝子が環状の染色体外ＤＮＡに座乗していることを確認するとともに、Ｒｅｐ遺伝子の全塩基配列を決定した。なお、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの染色体外ＤＮＡはこれまでに報告されていないものであって、新規配列であることが明らかになった。
【００１１】
本発明者らは、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＲｅｐ遺伝子を標的としたプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法およびリアルタイムＰＣＲ法による検出・定量系を構築した。これにより、従前の技術と比べて、検出限界が１０〜１００倍以上向上し、非特異的な増幅は認められず、病原体の定量が可能であり、検出までの時間も短縮（反応時間が短く、電気泳動の必要がない。）された。
【００１２】
本発明者らは、逆ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ）法により複数の環状の染色体外ＤＮＡを見出したことになる。そのサイズや全体の塩基配列は多様であったが、Ｒｅｐ遺伝子に関しては安定して存在しており、遺伝子診断の標的遺伝子として適していると判断される。
【００１３】
これらの知見をもとに、さらに研究を進めた結果、本発明者らは、Ｒｅｐ遺伝子のみならず、Ｒｅｐ以外のＯＲＦ遺伝子、さらにはＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの染色体外ＤＮＡが、程度の差はあれ全般的にＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出、診断に使用することができることを見出した。
【００１４】
本発明者らは、本発明の検出法を用いて、実際の圃場で採集したイチゴ試料および人為的に病原体を獲得させた昆虫試料からの検出に成功した。
【００１５】
したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）（ａ）配列番号１〜５のいずれか１つに示す配列；
（ｂ）（ａ）の配列の少なくとも９５％の同一性を有するか、ストリンジェントな条件下でその相補鎖とハイブリダイズするか、もしくはその配列において１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む改変配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の少なくとも１０ヌクレオチドを含むフラグメント配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の相補鎖配列
を含む核酸分子。
（２）配列番号１の２１２−２３２位、配列番号１の３３０−３５１位、配列番号１の７１５−７３３位、配列番号１の７１５−７３８位、配列番号１の７４９−７６６位、配列番号１の７６９−７８８位、配列番号１の７８９−８１３位、配列番号１の８１４−８３８位、配列番号１の８３８−８５８位、配列番号１の８４１−８６２位、配列番号１の８７０−８８９位、配列番号１の８９０−９１１位、配列番号１の９２８−９４９位、配列番号２の５９６−６２０位、配列番号２の７１５−７３８位、配列番号３の８４７−８６１位、配列番号３の９１９−９４３位、配列番号４の５７２−５９１位、配列番号４の６７２−６９１位、配列番号５の１２３−１４４位、配列番号５の２１４−２３２位、配列番号５の２２３０−２２５０位および配列番号５の２３７６−２３９９位からなる群より選択される少なくとも１つの配列またはその相補配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含む、項目１に記載の核酸分子。
（３）配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセット。
（４）配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、項目３に記載のプライマーセット。
（５）配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、項目３または４に記載のプライマーセット。
（６）前記プライマーセットは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのものである、項目３〜５のいずれかに記載のプライマーセット。
（７）配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドと、標識とを含む、プローブ。
（８）配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドと、標識とを含む、項目７に記載のプローブ。
（９）配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む、項目７または８に記載のプローブ。
（１０）前記プローブは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのものである、項目７〜９のいずれかに記載のプローブ。
（１１）Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのキットであって、該キットは：
（Ａ）配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセット、または配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち少なくとも１０ヌクレオチドと標識とを含むプローブ；ならびに
（Ｂ）核酸増幅用試薬
を含む、キット。
（１２）前記プライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含み、あるいは、前記プローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドと、標識とを含む、項目１１に記載のキット。
（１３）前記プライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、前記プローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む、項目１１または１２に記載のキット。
（１４）  Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するための方法であって、
（Ａ）被験サンプルを鋳型として用い、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセットをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行う工程；および
（Ｂ）増幅された核酸分子に基づいて、該被験サンプル中にＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅがあるかどうかを決定する工程
を包含する、方法。
（１５）前記プライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含み、あるいは、前記プローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドと、標識とを含む、項目１４に記載の方法。
（１６）前記プライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、前記プローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む、項目１４または１５に記載の方法。
（１７）前記決定する工程は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴから抽出したサンプルを陽性コントロールとして使用することを特徴とする、項目１４〜１６のいずれかに記載の方法。
（１８）前記核酸増幅反応は、リアルタイムＰＣＲまたはＬＡＭＰ法によって行われる、項目１４〜１７のいずれかに記載の方法。
（１９）Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅを検出するためのプライマーであって、配列番号６〜２５に記載の配列から選択される配列を含むプライマー。
（２０）Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅを検出するためのプライマーであって、配列番号６および７のセット、配列番号８および９のセット、配列番号１０〜１１のセット、配列番号１２〜１３のセット、配列番号１４〜１５のセット、配列番号１６〜２１のセット、配列番号２２〜２３のセット、配列番号２４〜２５のセットに記載の配列から選択される配列セットを含むプライマーセット。
（２１）Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するための装置であって、該装置は：
（Ａ）核酸増幅反応を行うための手段；
（Ｂ）配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセット、または配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち少なくとも１０ヌクレオチドと標識とを含むプローブ；ならびに
（Ｃ）該核酸分子または該標識を検出するための手段
を含む、装置。
（２２）Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、
片方の鎖が配列番号１〜５のいずれかに示す配列を有する２本鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖上にある標的配列の３’末端から該ＤＮＡ鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃおよび第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、また該標的配列の５’末端から該ＤＮＡ鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１および第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択したとき、以下のＡ）およびＢ）からなるインナープライマー：
Ａ）該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２および該Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、または
該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２、以下の制限酵素の認識配列および該Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように切断可能な制限酵素
Ｂ）該Ｒ２と同一の配列、該制限酵素の認識配列および該Ｒ１に相補的な配列Ｒ１ｃを３’側から５’側にこの順で含むプライマー
を含むプライマーセット。
【００１６】
これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。
【００１７】
複数の実施形態が開示されるが、本発明のなお他の実施形態は、以下の詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。明らかであるように、本発明は、すべて本発明の技術思想および範囲から逸脱することなく、種々の明白な態様において修飾が可能である。従って、図面および詳細な説明は、事実上例示的であると見なされ、制限的であるとは見なされない。
【発明の効果】
【００１８】
現在、イチゴ果実の生産で用いられる主要な品種のほぼ全てで、栄養繁殖によって増殖された苗を利用しているため、苗を生産するための親株が無病化されていることが極めて重要である。また、イチゴ栽培における苗生産と果実生産の分業化は、海外では既に普及し、国内でも近年になり普及しつつあるが、将来的には国際的な苗の流通（輸出入）が進むことが想定される。本発明は、苗生産の親株や、果実生産用の苗として流通するイチゴの、本病に関する安全性（無病性）を評価（検疫）するために利用できる。また、イチゴ苗の生産地等においては、本病発生の早期発見および伝染経路の特定等のモニタリングに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ（Ｃ−１２株）に見出された染色体外ＤＮＡの模式図を示す。左からｐＰＦＣ１２−Ｌ、ｐＰＦＣ１２−Ｓ１およびｐＰＦＣ１２−Ｓ２の模式図を示す。いずれにもＲｅｐ（ＯＲＦ１）が含まれている。
【図２】図２は、Ｒｅｐ遺伝子を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す。濃度の希釈倍率である１０−１〜１０−６、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴ（Ｃ−１２株）から抽出した粗核酸試料の１０〜１０６倍希釈液（従来のＰＣＲ法での検出限界は１０３倍希釈まで）を示す。Ｘ軸は反応時間、Ｙ軸は、濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）を示す。グラフ中の数字は希釈倍率（べき乗）を示す（１０−１等の１０の右側の数値は、上付きでない文字でもべき乗を示す。）。
【図３】図３は、Ｒｅｐ遺伝子を標的にしたＬＡＭＰ法による検出限界の比較（１）を示す。図中、Ｂ１２＋Ｌ、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＲｅｐ遺伝子の塩基配列から設計したプライマーセット（ループプライマー添加）を使用した。また、ＣＰＦ２＋Ｌ、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的にしたプライマーセット（ループプライマー添加）を使用した。濃度を示す１０−１〜１０−４、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴから抽出した粗核酸試料の１０〜１０４倍希釈液を示す。実線は、Ｂ−１２＋Ｌ（Ｒｅｐ）を示す。破線は、ＣＰＦ２−＋Ｌ（１５Ｓ  ｒＤＮＡ）を示す。×は蒸留水を示す（Ｙ軸に重なっている。）。ひし形は健全とちおとめを示す（Ｙ軸に重なっている。）。Ｘ軸は反応時間、Ｙ軸は、濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）を示す。
【図４】図４は、Ｒｅｐ遺伝子を標的にしたＬＡＭＰ法による検出限界の比較（２）を示す。図中、上段に示すＢ１２＋Ｌ、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＲｅｐ遺伝子の塩基配列から設計したプライマーセット（ループプライマー添加）を使用した。また、下段に示すＣＰＦ２＋Ｌ、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的にしたプライマーセット（ループプライマー添加）を使用した。濃度を示す１０−１〜１０−６は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴから抽出した粗核酸試料の１０〜１０６倍希釈液を示す。Hは、健全とちおとめを示し、Nは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【図５】図５は、ＯＲＦ２を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとしてＥｘＯＲＦ２−Ｌ５９６（配列番号１０）／ＥｘＯＲＦ２−Ｒ７３８（配列番号１１）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った。縦軸は、蛍光強度（一次曲線）を示し、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。１０−３〜１０−６．５は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴ（Ｃ−１２株）から抽出した粗核酸試料の希釈倍数を示す（１０３〜１０６．５倍希釈液）。Ｈｅａｌｔｈｙは、健全なイチゴから抽出した粗核酸試料の１０２倍希釈液を示す。ＮＴＣは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【図６】図６は、ＯＲＦ３を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとして、ＥｘＯＲＦ３−Ｌ８４７（配列番号１２）／ＥｘＯＲＦ３−Ｒ９４３（配列番号１３）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った。縦軸は、蛍光強度（一次曲線）を示し、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。１０−３〜１０−６．５は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴ（Ｃ−１２株）から抽出した粗核酸試料の希釈倍数を示す（１０３〜１０６．５倍希釈液）。Ｈｅａｌｔｈｙは、健全なイチゴから抽出した粗核酸試料の１０２倍希釈液を示す。ＮＴＣは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【図７】図７は、ＯＲＦ３を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとしてＥｘＯＲＦ４−Ｌ５７２（配列番号１４）／ＥｘＯＲＦ４−Ｒ６９１（配列番号１５）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った。縦軸は、蛍光強度（一次曲線）を示し、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。１０−３〜１０−６．５は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴ（Ｃ−１２株）から抽出した粗核酸試料の希釈倍数を示す（１０３〜１０６．５倍希釈液）。Ｈｅａｌｔｈｙは、健全なイチゴから抽出した粗核酸試料の１０２倍希釈液を示す。ＮＴＣは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【図８】図８は、ｐＰＦＣ１２−Ｌ上のＲｅｐ遺伝子とＯＲＦ-２の間のＤＮＡ領域を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとしてＥｘＳＳＢ-Ｌ０９６（配列番号２２）／ＥｘＳＳＢ−Ｒ２６５（配列番号２３）／を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った結果である。数値は、希釈倍数を示す。Ｈｅａｌｔｈｙは、健全なイチゴから抽出した粗核酸試料の１０２倍希釈液を示す。ＮＴＣは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【図９】図９は、ＯＲＦ４とＲｅｐ遺伝子の間のＤＮＡ領域を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとして、ＥｘＥｘｄ−Ｌ２３６（配列番号２４）／ＥｘＥｘｄ−Ｒ３４５（配列番号２５）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った結果である。数値は、希釈倍数を示す。Ｈｅａｌｔｈｙは、健全なイチゴから抽出した粗核酸試料の１０２倍希釈液を示す。ＮＴＣは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【図１０】図１０は実施例７の結果である。葉縁退緑病感染イチゴを吸汁したヒシウンカ幼虫から抽出した核酸を試料として、実施例１で記したプライマーセットＢ１２−Ｌ２／Ｂ１２−Ｒ２を用いたリアルタイムＰＣＲ法により、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出を試みた結果である。数値は、希釈倍数を示す。Ｄｉｓｅａｓｅｄは病害に罹患したイチゴを示し、Ｃ−１２×１０−３は、１０３希釈のものを示す。Ｈｅａｌｔｈｙは、健全なイチゴから抽出した粗核酸試料の１０２倍希釈液を示す。ＮＴＣは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の修飾語等（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」等の冠詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２１】
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は本明細書中、統一した意味で使用し、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わされて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
【００２２】
（用語の定義）
本明細書において「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ」とは、イチゴ葉縁退緑病の原因病原菌であるバクテリア様微生物をいう。
【００２３】
本明細書においてＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅの「染色体外遺伝子」とは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅにおいて本発明においてはじめて見出された染色体外遺伝子をいい、配列番号５などで示される。
【００２４】
本明細書において「Ｒｅｐ遺伝子」とは、複製関連タンパク質に関する遺伝子であって、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅでは、配列番号１（または配列番号５のうちの配列番号１に対応する部分）に示す核酸配列もしくはその改変配列またはそれがコードするアミノ酸配列もしくは配列番号１がコードするアミノ酸配列（配列番号２６）に示すタンパク質によって定義される。本明細書において「Ｒｅｐ遺伝子」は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ由来である限り、どのようなものでも用いることができる。
【００２５】
本明細書においてＲｅｐ遺伝子がタンパク質を意図する場合、そのタンパク質は、
（ａ）配列番号２６に示すアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２６に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性（例えば、Ｒｅｐ遺伝子の機能）を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１（または配列番号５のうちの配列番号１に対応する部分）に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２６に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；または
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
【００２６】
本明細書においてＲｅｐ遺伝子が核酸を意図する場合、その核酸は、
（ａ）配列番号１（または配列番号５のうちの配列番号１に対応する部分）に示す塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２６に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１（または配列番号５のうちの配列番号１に対応する部分）に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。
【００２７】
本明細書において「ＯＲＦ２遺伝子」、「ＯＲＦ３遺伝子」および「ＯＲＦ４遺伝子」とは、それぞれ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅにおいて染色体外遺伝子として見出されたものであって、配列番号２、３または４に示す核酸配列もしくはその改変配列またはそれがコードするアミノ酸配列配列番号２７、２８または２９が構成するタンパク質によって定義される。本明細書において「ＯＲＦ２遺伝子」、「ＯＲＦ３遺伝子」および「ＯＲＦ４遺伝子」は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ由来である限り、どのようなものでも用いることができる。また、「ＯＲＦ２遺伝子」、「ＯＲＦ３遺伝子」および「ＯＲＦ４遺伝子」の生物学的機能は、当業者が当該分野において公知の手法を用いて決定することができる。
【００２８】
本明細書においてＯＲＦ２遺伝子がタンパク質を意図する場合、そのタンパク質は、
（ａ）配列番号２７に示すアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２７に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２（または配列番号５のうちの配列番号２に対応する部分）に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２７に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；または
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
【００２９】
本明細書においてＯＲＦ２遺伝子が核酸を意図する場合、その核酸は、
（ａ）配列番号２（または配列番号５のうちの配列番号２に対応する部分）に示す塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２７に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２（または配列番号５のうちの配列番号２に対応する部分）に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。
【００３０】
本明細書においてＯＲＦ３遺伝子がタンパク質を意図する場合、そのタンパク質は、
（ａ）配列番号２８に示すアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３（または配列番号５のうちの配列番号３に対応する部分）に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２８に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；または
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
【００３１】
本明細書においてＯＲＦ３遺伝子が核酸を意図する場合、その核酸は、
（ａ）配列番号３（または配列番号５のうちの配列番号３に対応する部分）に示す塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３（または配列番号５のうちの配列番号３に対応する部分）に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。
【００３２】
本明細書においてＯＲＦ４遺伝子がタンパク質を意図する場合、そのタンパク質は、
（ａ）配列番号２９に示すアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２９に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号４（または配列番号５のうちの配列番号４に対応する部分）に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２９に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；または
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
【００３３】
本明細書においてＯＲＦ４遺伝子が核酸を意図する場合、その核酸は、
（ａ）配列番号４（または配列番号５のうちの配列番号４に対応する部分）に示す塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２９に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４（または配列番号５のうちの配列番号４に対応する部分）に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。
【００３４】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。
【００３５】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００３６】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する領域を調節エレメントという。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、遺伝子の塩基配列を３塩基ずつに区切った時の３通りの枠組の１つであって、開始コドンを有し、そして途中に終止コドンが出現せずある程度の長さを持ち、実際にタンパク質をコードする可能性のある読み枠をいう。本明細書では、ヌクレオチドとしては、検出目的等に使用することができる限り、その類似体（例えば、ペプチド核酸等）も使用することができることが理解される。
【００３７】
本明細書において「対応する」遺伝子、核酸、核酸配列、核外遺伝子等とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅの配列などの遺伝子に対応する遺伝子は、同種の病原菌の他の株においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、Ｒｅｐ遺伝子など）の配列をクエリ配列として用いてその生物の配列データベースを検索することによって、またはウェットの実験でライブラリーをスクリーニングすることによって見出すことができる。
【００３８】
本明細書において「対応する」アミノ酸および核酸とは、それぞれあるポリペプチドおよび核酸分子において、比較の基準となるポリペプチドおよび核酸分子における所定のアミノ酸および核酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸および核酸をいい、例えば、ユビキチンにおいては、リジンとの連結を担う配列（例えば、Ｃ末端のグリシン）と同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸およびそれをコードする核酸をいう。例えば、核酸配列であれば、その核酸配列またはそれがコードする特定の部分と同様の機能を発揮する部分であり得る。
【００３９】
本明細書において「単離された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００４０】
本明細書において「精製された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された物質におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００４１】
本明細書において「精製された」および「単離された」とは、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の物質が存在することを意味する。
【００４２】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００４３】
本明細書において「ストリンジェントなハイブリダイズ条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４４】
本明細書では配列の同一性の算出および相同性の評価は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．２３（２０１０年３月２２日発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００４５】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるプロモーターとしては、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応する配列も含まれるべきであることが意図される。
【００４６】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００４７】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１の配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、６００、７００、８００、９００、１０００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００４８】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００４９】
本明細書において通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％同一な、より好ましくは、少なくとも８０％同一な、さらに好ましくは、少なくとも９０％同一な、少なくとも９５％同一な核酸配列が含まれる。
【００５０】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００５１】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％同一な、より好ましくは、少なくとも８０％同一な、さらに好ましくは、少なくとも９０％同一な、少なくとも９５％同一な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００５２】
以下に通常のＰＣＲ反応について述べる。このようなＰＣＲ反応に用いる試薬を本明細書において「ＰＣＲ用試薬」ということがある。
【００５３】
本明細書において「ポリメラーゼ」とは、核酸を合成する能力（たとえば、重合による。）を有する任意の酵素をいい、核酸合成酵素とも称される。これは、ヌクレオチドを縮合させてポリヌクレオチドにする反応を触媒する酵素の総称である。このようなポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、などを挙げることができるがそれらに限定されない。このようなポリメラーゼとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００５４】
本明細書において「伸長反応」とは、核酸について言及するとき、その核酸が少なくとも１ヌクレオチド伸びるような任意の反応をいう。ポリメラーゼを用いた伸長反応を行う場合、通常、鋳型に基づいてヌクレオチドが導入されることから、特定の配列が標識対象核酸などの伸長すべき核酸において伸長することになる。
【００５５】
ＰＣＲの伸長反応は、通常、（ｉ）標的核酸およびその相補鎖と核酸プライマーおよび核酸プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）反応と、（ｉｉ）核酸合成酵素によるプライマー鎖の伸長反応およびプローブの分解反応からなりこれら反応（ｉ）および（ｉｉ）は、例えばトリス塩酸緩衝液等の適当な緩衝液を含む水溶液中で実施することができる。このハイブリダイゼーション反応は、代表的には、５５〜７５℃で実施することができるがそれに限定されない。酵素反応は、代表的には、３７℃で実施することができるがそれに限定されない。プライマー伸長産物の変性は、上記伸長反応で得られるプライマー鎖伸長産物を含む溶液を、例えば９４〜９５℃で０．５〜１分間加熱処理するなどを行うことによって実施することができる。
【００５６】
標的核酸の増幅は、例えば、その標的核酸（標識対象核酸）が所望の量（たとえば、検出可能な量）になるまで、工程上記伸長反応および変性を上記と同様の条件下で複数回繰り返せばよい。すなわち、上記の伸長反応および変性を、類似の条件下で複数回繰り返して行う。上記工程をｎ回行えば、理論的には標的核酸量は当初の２ｎ−１倍にまで増幅されることとなる。
【００５７】
このような伸長反応は、市販のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから販売されている）を用いれば、簡便かつ効率的に実施することができる。
【００５８】
増幅した核酸を混合物から取り出しは、当該分野において任意の方法を用いて行うことができる。そのような取り出しとしては、例えば、電気泳動、クロマトグラフィー、変性、アルコール沈澱、アフィニティー精製、抗体などを用いることができるがそれらに限定されない。
【００５９】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができるが、それらに限定されない。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することができる。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。１つの好ましい実施形態では、標識は放射能標識される。
【００６０】
本明細書において、「改変体」（ｖａｒｉａｎｔ）または「改変配列」（本明細書において「改変体」とまとめて総称することがある。）とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質または配列に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。本明細書において「改変体」は、本発明の目的を達成することができる限り、いかなるものも使用することができる。たとえば、そのような目的としては、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病の検出等であり得る。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００６１】
本明細書において「機能的改変体」とは、基準となる配列が担う生物学的活性（例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病の検出等）を保持する改変体をいう。
【００６２】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００６３】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。本発明は、そのような改変体は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病の検出等に用いることができる限りどのようなものでも使用することができる。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明は、リアルタイムＰＣＲを用いることができる。
【００６５】
本明細書において使用されるリアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによる増幅を経時的（すなわち、リアルタイム）に測定することで、増幅率に基づいて鋳型となるＤＮＡの定量を行なうものであって、遺伝子発現解析の他に、ＳＮＰsタイピング、遺伝子組み換え食品の検査、ウイルスや病原菌の検出、導入遺伝子のコピー数の解析などさまざまな用途に応用されている。リアルタイムＰＣＲは、遺伝子発現解析のような定量解析を行うことが主であるが、プラス／マイナス判定だけの定性分析のためのみでも利用されうる。これは、リアルタイムＰＣＲが反応後に電気泳動で増幅産物の確認を行う必要がないので、簡便・迅速に結果が得られ、汚染のリスクが低いといった長所も持つためである。近年、従来のＰＣＲ法で行われていた遺伝子検査は、リアルタイムＰＣＲで行うことが頻繁となりつつある。
【００６６】
リアルタイムＰＣＲによる定量の原理は以下のとおりである。リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングするため、指数関数的増幅域で正確な定量を行うことができる。これは、エンドポイントで分析するＲＴ−ＰＣＲ法などとは大きく異なる点である。以下、その定量の原理について手短に記載する。
【００６７】
ＰＣＲでは、１サイクルごとにＤＮＡが２倍、２倍、・・と指数関数的に増幅し、やがてプラトーに達する。この増幅の状態をリアルタイムモニタリングしたものが増幅曲線であり、ＰＣＲ増幅産物量が蛍光検出できる量に達すると増幅曲線が立ち上がり始め、指数関数的にシグナルが上昇した後、プラトーに達する。
【００６８】
初発のＤＮＡ量が多いほど、増幅産物量は早く検出可能な量に達するので、増幅曲線が早いサイクルで立ち上がる。従って、段階希釈したスタンダードサンプルを用いてリアルタイムＰＣＲを行うと、初発ＤＮＡ量が多い順番に等間隔で並んだ増幅曲線が得られる。ここで、相当な箇所に閾値を設定すると、閾値と増幅曲線が交わる点であるＣｔ値（ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数）が算出される。Ｃｔ値と初期鋳型量の間には直線関係がある。未知サンプルについても標準サンプルと同様にＣｔ値を算出し、この検量線に当てはめれば、初期鋳型量を求めることができる。
【００６９】
リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出することができる。蛍光検出方法には、インターカレーターを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法の２種類があり、本発明では、いずれも用いることができる。
【００７０】
本発明で利用されうるインターカレーター法には、一般的に、例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用するがこれに限定されない。インターカレーターは、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。
【００７１】
別の手法として、蛍光標識を用いる方法がある。本発明の方法で用いられうる蛍光標識プローブには多くの種類があり、以下に束縛されないが、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｎｅａｒ  Ｐｒｏｂｅの一種）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｐｒｏｂｅの一種）、サイクリングプローブ  （Ｌｉｎｅａｒ  Ｐｒｏｂｅの一種）などを挙げることができる。
【００７２】
インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡをすべて検出するため、ターゲット遺伝子ごとにプローブを用意する必要がない。実験コストが安く反応系の構築も容易なのが長所であるが、検出特異性はあまり高くない。一方、蛍光標識プローブを用いる方法は、プローブ設計のための専用ソフトが必要でコストも高いが、検出特異性が高いというメリットがある。相同性の高い配列同士を区別する場合やＳＮＰｓタイピングのようにマルチプレックス検出が必要な場合には、蛍光標識プローブがその威力を発揮する。蛍光検出方法は、実験用途に合わせて選択する。従って、一般的に、高い特異性が求められる実験には蛍光標識プローブを、それ以外の場合には簡便なインターカレーター法を用いるのがよいが、必ずしもこれに限定されないことが理解される。
【００７３】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置において実施することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲを行うには、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ専用装置を利用することができる。サーマルサイクラーでＤＮＡをＰＣＲ増幅しつつ、分光蛍光光度計でその増幅産物をモニタリングすることができる。さまざまな種類のリアルタイムＰＣＲ装置が販売されており、高速でＰＣＲ反応が行えるように工夫されたものや９６ウェルのプレート単位で反応できるものなど、それぞれ特性を備えている。分析規模や実験者の人数に合わせ、大規模解析に適した機種あるいは中規模〜小規模解析に適した小回りの利く機種を選択することができる。また、装置によって検出できる蛍光色素の種類が異なるので、複数種類の蛍光色素を使用する実験を行う場合には、その点にも注意が必要である。さらには、複数種類の蛍光色素が検出できる装置でも、それらの蛍光色素間でクロストークがあると、同時に正確な検出を行うことはできない。同時検出する蛍光色素について、クロストークがないことも確認しておくべきである。
【００７４】
（ＬＡＭＰ法）
本明細書において「ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法」とは、核酸の増幅方法で、インナープライマー対あるいはこれにアウタープライマー対、さらにループプライマー対を加えた、２種、４種あるいは６種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼおよび基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（６５℃前後）でＤＮＡまたはＲＮＡを迅速かつ安価に増幅する方法であ  る。ＬＡＭＰ法の概要については、Ｎｏｔｏｍｉ，  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１２）：ｅ６３（２０００）、国際公開ＷＯ００／２８０８２号、あるいは栄研化学（株）ウェブサイト（http://www.loopamp.eiken.co.jp/）を参照。Ｎａｇａｍｉｎｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１），Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．９，１７４２−１７４３、国際公開ＷＯ０１／３４８３８、国際公開ＷＯ０２／３４７０９等）等もまた参酌することができ、その記載の全体は、参照として本明細書中において援用される。
【００７５】
ＬＡＭＰ法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。解離した１本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、ＬＡＭＰ法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成され、微量核酸を効率的に増幅することができる。
【００７６】
ＬＡＭＰ法ではインナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーと呼ばれる、特異的プライマーが用いられる。
【００７７】
インナープライマーとはＬＡＭＰ法に必須のプライマーであって、鋳型ＤＮＡのそれぞれの鎖において、３’側に存在する任意配列Ｘ２ｃ、これより５’側の任意配列Ｘ１ｃを選択したとき、該Ｘ２ｃに相補的配列Ｘ２と該Ｘ１ｃと同一の配列Ｘ１ｃを３’側から５’側にこの順で含む（Ｘ１ｃ＋Ｘ２の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のＸ２は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、Ｘ１ｃは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。
【００７８】
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（鋳型の３’側）の任意配列Ｘ３ｃに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。
【００７９】
以上から、ＬＡＭＰ法のプライマーセットは以下のように表現することができる。
【００８０】
すなわち、ＬＡＭＰ法のプライマーセットは、２本鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖上にある標的配列の３’末端から該ＤＮＡ鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃおよび第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、また該標的配列の５’末端から該ＤＮＡ鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１および第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択したとき、以下のＡ）およびＢ）からなるインナープライマー：
Ａ）該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２および該Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、または
該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２、以下の制限酵素の認識配列および該Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように切断可能な制限酵素
Ｂ）該Ｒ２と同一の配列、該制限酵素の認識配列および該Ｒ１に相補的な配列Ｒ１ｃを３’側から５’側にこの順で含むプライマーを含む。
【００８１】
ＬＡＭＰ法のプライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記Ｘ１（Ｘ１ｃ）、Ｘ２（Ｘ２ｃ）、Ｘ３（Ｘ３ｃ）の長さは５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。
【００８２】
上記インナープライマーおよびアウタープライマーは、２本鎖（ＦおよびＲ）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（Ｆ１ｃ＋Ｆ２、Ｒ１ｃ＋Ｒ２）、アウタープライマー（Ｆ３、Ｒ３）の各々２種が設計される。
【００８３】
各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離およびＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列およびＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列およびＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。
【００８４】
また、ループプライマーとは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’末端に含むプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはＬＡＭＰ法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。
【００８５】
ＬＡＭＰ法で用いられる増幅用鋳型核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、組織または細胞等の生物学的試料から公知方法により、あるいは化学合成法により調製することができる。この場合、増幅すべき領域（標的領域という）の両側には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する。両側配列とは、当該標的領域の５’末端からポリヌクレオチド鎖の５’末端までの領域の配列、および当該標的領域の３’末端からポリヌクレオチド鎖の３’末端までの領域の配列を意味する。両側配列の長さは、標的領域の５’側および３’側のいずれの領域も、１０〜１０００塩基、好ましくは、３０〜５００塩基である。このような配列は、いったん標的となる配列（例えば、本発明のＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病の検出に使用するための標的配列。）が決定されると、上記原理にもとづいて当業者は任意に設計することができることが理解される。
【００８６】
本明細書において、「標的配列」または「標的領域」とは、１本鎖核酸として合成すべき塩基配列（あるいは領域）を意味する。また、鋳型となる２本鎖ＤＮＡのうち、該標的配列を含む方の鎖は、通常第１鎖といい、これに相補的な鎖を通常第２鎖という。
【００８７】
一連の反応は、酵素反応に好ましいｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、あるいは（ＮＨ４）２ＳＯ４等が、酵素の活性維持とＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温 度（Ｔｍ）調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。
【００８８】
ＬＡＭＰ法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
（ｉ）インナープライマー２種、あるいはさらにアウタープライマー２種、あるいはさらにループプライマー２種
（ｉｉ）鎖置換型ポリメラーゼ
（ｉｉｉ）基質ヌクレオチド。
【００８９】
（核酸定量装置）
本発明はまた、核酸定量のための装置を提供する。該装置は、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間を備える容器内に、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを導入する手段と；前記容器を一定温度に加熱して核酸増幅反応を行わせるための手段と；前記増幅反応によって得られた増幅産物を計測するための手段と；得られた計測結果を解析して、標的核酸の初期量を定量するための手段とを備える。
【００９０】
ここで、容器に標的核酸、核酸検出試薬、プライマー、ポリメラーゼ、および基質ヌクレオチドを導入する手段は、標的核酸、プライマー、ポリメラーゼ、および基質ヌクレオチドをそれぞれを順番に、あるいはこれら全て含む反応液を、一定量自動的に導入する手段である。前記容器を一定温度に加熱して核酸増幅反応を行わせるための手段としては、例えば、装置内に備えられたヒートブロックによって容器を上または下から、好ましくは上下両面から挟んで、増幅反応に適した一定温度に加熱する手段が挙げられる。この手段には、試料を導入口で密封する手段を含みうる。
【００９１】
前記増幅反応によって得られた蛍光輝点等を計測するための手段については、公知の蛍光画像解析手段を利用することができる。本発明の装置には、さらに得られた測定データをコンピューター処理する手段を備えていてもよい。
【００９２】
（本明細書において用いられる一般的技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
【００９３】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９４】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ  ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００９５】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【００９６】
１つの局面において、本発明は、（ａ）配列番号１〜５のいずれか１つに示す配列；
（ｂ）（ａ）の配列の少なくとも９５％の同一性を有するか、ストリンジェントな条件下でその相補鎖とハイブリダイズするか、もしくはその配列において１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む改変配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の少なくとも１０ヌクレオチドを含むフラグメント配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の相補鎖配列
を含む核酸分子を提供する。
【００９７】
本発明の核酸分子は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅに特異的な配列を有することが本発明において初めて見出された。したがって、本発明の核酸分子は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅを他のＣａｎｄｉｄａｔｕｓの微生物から識別するために直接または間接に用いることができる。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅは、イチゴ葉縁退緑病の病原体であるから、本発明の核酸分子を用いることによって、イチゴ葉縁退緑病を検出することができる。
【００９８】
本発明の核酸配列において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅに特に特異的なあるいは識別性が高い配列部分としては、配列番号１〜５のうち、以下を挙げることができるがこれらに限定されない：
配列番号１の２１２−２３２位、配列番号１の３３０−３５１位、配列番号１の７１５−７３３位、配列番号１の７６９−７８８位、配列番号１の７８９−８１３位、配列番号１の８１４−８３８位、配列番号１の８３８−８５８位、配列番号１の８４１−８６２位、配列番号１の８７０−８８９位、配列番号１の８９０−９１１位、配列番号１の９２８−９４９位、配列番号２の５９６−６２０位、配列番号２の７１５−７３８位、配列番号３の８４７−８６１位、配列番号３の９１９−９４３位、配列番号４の５７２−５９１位、配列番号４の６７２−６９１位、配列番号５の１２３−１４４位、配列番号５の２１４−２３２位、配列番号５の２２３０−２２５０位、および配列番号５の２３７６−２３９９位からなる群より選択される少なくとも１つの配列またはその相補配列の少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、あるいは最低限の長さはそれより長くありうる。
【００９９】
１つの局面において、本発明は、配列番号は１〜５に示す配列（相補配列を含む）に基づくプライマーセットを提供する。
【０１００】
１つの実施形態では、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセットを提供する。好ましくは、この核酸分子の長さは、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、あるいは最低限の長さはそれより長くありうる。したがって、ここで使用されるプライマーの長さは、これら以外の任意の長さであってもよく、本明細書の説明を参照して適宜設計することができる。
【０１０１】
１つの実施形態では、本発明のプライマーセットは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのものである。
【０１０２】
１つの局面において、本発明は、配列番号は１〜５に示す配列（相補配列を含む）に基づくプローブを提供する。
【０１０３】
１つの実施形態では、本発明のプローブは、配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドと、標識とを含む。好ましくは、この核酸分子の長さは、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、あるいは最低限の長さはそれより長くありうる。したがって、ここで使用されるプローブの長さは、これら以外の任意の長さであってもよく、本明細書の説明を参照して適宜設計することができる。
【０１０４】
本発明のプローブに用いられる標識は、検出を可能にするものであれば、どのような標識であってもよく、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）であればどのようなものでも用いることができる。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができるが、それらに限定されない。
【０１０５】
１つの実施形態では、本発明のプローブは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのものである。
【０１０６】
このようなプローブは、標識を検出することによって、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出することができる。そのような検出は、標識に応じて適宜当業者は実施することができる。ラジオアイソトープであれば、放射能検出器、蛍光であれば蛍光測定器、あるいは可視光を発するものであれば肉眼でも標識の検出を行うことができる。
【０１０７】
別の局面において、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するためのキットを提供する。このキットは、（Ａ）配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセット、または配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち少なくとも１０ヌクレオチドと標識とを含むプローブ；ならびに（Ｂ）核酸増幅用試薬を備える。本発明で使用される核酸増幅用試薬は、ＰＣＲ用試薬、ＬＡＭＰ試薬などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含み、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドと、標識とを含む。
【０１０９】
１つの実施形態では、本発明において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む。
【０１１０】
１つの実施形態では、本発明において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドと、標識とを含む。ここで使用されるプローブおよびプライマーの長さは、これら以外の任意の長さであってもよく、本明細書の説明を参照して適宜設計することができる。
【０１１１】
本発明のキットにおいて使用されるプライマー、プローブ、標識などは、本明細書において他の場所で詳述される任意の形態を使用することができることが理解される。
【０１１２】
別の局面において、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するための方法を提供する。本発明の方法は、（Ａ）被験サンプルを鋳型として用い、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセットをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行う工程；および（Ｂ）増幅された核酸分子に基づいて、該被験サンプル中にＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅがあるかどうかを決定する工程を包含する。
【０１１３】
１つの実施形態において、本発明の方法において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含み、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドと、標識とを含む。
【０１１４】
別の実施形態において、本発明の方法において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明の方法において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドと、標識とを含む。ここで使用されるプローブおよびプライマーの長さは、これら以外の任意の長さであってもよく、本明細書の説明を参照して適宜設計することができる。
【０１１６】
１つの実施形態では、本発明の方法における決定する工程は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴから抽出したサンプルを陽性コントロールとして使用することを特徴とする。
【０１１７】
１つの実施形態では、本発明において使用される核酸増幅反応は、リアルタイムＰＣＲまたはＬＡＭＰ法によって行われる。
【０１１８】
本発明の方法において使用されるプライマー、プローブ、標識などは、本明細書において他の場所で詳述される任意の形態を使用することができることが理解される。
【０１１９】
別の局面では、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅまたはイチゴ葉縁退緑病を検出するための装置を提供する。本発明の装置は、（Ａ）核酸増幅反応を行うための手段；（Ｂ）配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、プライマーセット、または配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち少なくとも１０ヌクレオチドと標識とを含むプローブ；ならびに（Ｃ）該核酸分子または該標識を検出するための手段を含む。
【０１２０】
本発明の装置において使用される、核酸増幅のための手段は、核酸を増幅することができる手段であれば、どのような手段であっても用いることができ、例えば、PCRのための手段、LAMPのための手段などを挙げることができるがそれに限定されない。
【０１２１】
本発明の装置において用いられる核酸分子または標識を検出するための手段は、目的とする核酸分子または標識を検出することができれば、どのような手段であっても用いることができ、例えば、核酸分子または標識の種類に応じて適宜当業者は実施することができる。ラジオアイソトープであれば、放射能検出器、蛍光であれば蛍光測定器を用いることができ、あるいは可視光を発するものであれば肉眼またはそれに相当する検出機器でも標識を検出することができる。
【０１２２】
１つの実施形態において、本発明の装置において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子とを含み、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１５ヌクレオチドと、標識とを含む。
【０１２３】
別の実施形態において、本発明の装置において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも１７ヌクレオチドと、標識とを含む。
【０１２４】
別の実施形態において、本発明の装置において用いられるプライマーセットは、配列番号は１〜５に示す配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドを含む核酸分子と、配列番号は１〜５に示す配列の相補配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドを含む核酸分子とを含む、あるいは、本発明の装置において用いられるプローブは配列番号は１〜５に示す配列またはその相補配列のうち、少なくとも２０ヌクレオチドと、標識とを含む。ここで使用されるプローブおよびプライマーの長さは、これら以外の任意の長さであってもよく、本明細書の説明を参照して適宜設計することができる。
【０１２５】
本発明の装置において使用されるプライマー、プローブ、標識などは、本明細書において他の場所で詳述される任意の形態を使用することができることが理解される。
【０１２６】
別の局面では、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅを検出するためのプライマーであって、配列番号６〜２５に記載の配列から選択される配列を含むプライマーを提供する。あるいは、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅを検出するためのプライマーであって、配列番号６および７のセット、配列番号８および９のセット、配列番号１０〜１１のセット、配列番号１２〜１３のセット、配列番号１４〜１５のセット、配列番号１６〜２１のセット、配列番号２２〜２３のセット、配列番号２４〜２５のセットに記載の配列から選択される配列セットを含むプライマーセットを提供する。
【０１２７】
１つの局面では、本発明は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、
片方の鎖が配列番号１〜５のいずれかに示す配列を有する２本鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖上にある標的配列の３’末端から該ＤＮＡ鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃおよび第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、また該標的配列の５’末端から該ＤＮＡ鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１および第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択したとき、以下のＡ）およびＢ）からなるインナープライマー：
Ａ）上記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２および上記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、または
上記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２、以下の制限酵素の認識配列および上記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように切断可能な制限酵素
Ｂ）上記Ｒ２と同一の配列、上記制限酵素の認識配列および上記Ｒ１に相補的な配列Ｒ１ｃを３’側から５’側にこの順で含むプライマー
を含むプライマーセットを提供する。
【０１２８】
このようなプライマーセットは、具体的には、当業者は、本明細書に記載される概括的説明および実施例を参照して、必要に応じてＬＡＭＰ法の文献等（例えば、Ｎｏｔｏｍｉ，  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１２）：ｅ６３（２０００）、国際公開ＷＯ００／２８０８２号、栄研化学（株）ウェブサイト（http://www.loopamp.eiken.co.jp/）を参照。Ｎａｇａｍｉｎｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１），Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．９，１７４２−１７４３、国際公開ＷＯ０１／３４８３８、国際公開ＷＯ０２／３４７０９など）を参考にして、実施することができる。ここで使用されるプライマーの長さは、これら以外の任意の長さであってもよく、本明細書の説明を参照して適宜設計することができる。
【０１２９】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【実施例】
【０１３０】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。以下に示した実施例において使用した試薬、樹脂等は、特に言及しない限り栄研化学、タカラバイオ、和光純薬、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等から得ることができる。
【０１３１】
本実施例で用いられる略語は以下の意味を有する。
【０１３２】
Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ：Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇａｒｉａｅ
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＬＡＭＰ：ループ媒介定温増幅（Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
（調製実施例）
本調整実施例では、葉縁退緑病に感染したイチゴから、イチゴの葉柄組織からＣＴＡＢ法で粗核酸を抽出する方法（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５７：３５７０−３５７５）に従って、２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．０）、１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−１０）を用いて核酸を調製し、ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−２、ＯＲＦ−３、およびＯＲＦ−４をクローニングし、新規配列であることを確認した。ＯＲＦ−１はＲｅｐ遺伝子であることが判明した。
【０１３３】
Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ法により、ＯＲＦ−１〜ＯＲＦ−４が環状の染色体外ＤＮＡに座乗していることを確認するとともに、Ｒｅｐ遺伝子の全塩基配列を決定した（Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの染色体外ＤＮＡはこれまでに報告されていない）。
【０１３４】
その配列は、配列番号１〜４に示す。染色体外ＤＮＡ全体の配列は配列番号５に示す。
【０１３５】
以下に示すＩｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ法により、ＯＲＦ−１〜ＯＲＦ−４が環状の染色体外ＤＮＡに座乗していることを確認した。Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲを用いれば、その結果が陽性である（すなわち、妥当な大きさのＤＮＡ断片が増幅する）ことを確認することにより、目的となる遺伝子が環状の染色体に乗っている（すなわち、ＤＮＡが増幅する＝対象のＤＮＡ断片が、環状かつＰＣＲで増幅可能な大きさ（＜＜染色体ＤＮＡ）のＤＮＡ上に座乗している場合である）のか、そうでない（すなわち、ＰＣＲでＤＮＡが増幅しない＝対象のＤＮＡが線状のＤＮＡに座乗しているか、または環状であっても巨大なＤＮＡ（＝染色体ＤＮＡ）に座乗している場合である）のかを理解することができる。理論に束縛されないが、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲで染色体外における存在を確認できるのは、以下のとおりである。詳細には、健全イチゴには存在せず、イチゴ葉縁退緑病に特異的に存在する、すなわち病原体であるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＤＮＡ断片Ｂ１２をＳＳＨ法で選抜し、クローニングした。Ｂ１２の塩基配列情報を用いて、通常のＰＣＲ（ＤＮＡ断片の両端から内にむかって増幅する）とは逆にＤＮＡ断片の内側から両端に向けてＤＮＡ合成するように設計されたプライマーセットを用いてＩｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲを行い、その結果ＤＮＡ増幅が認められれば、Ｂ１２が含まれるＤＮＡは比較的低分子の環状構造をとっていることが分かる。これによりＢ１２がＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのゲノム上に存在するか、ゲノムＤＮＡと比べて低分子の環状ＤＮＡ（染色体外ＤＮＡ）上に存在するかを判断することができる。なお、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲで陰性の場合、さらなる確定手法により確認することにより、染色体外ＤＮＡに座乗していないと断定することが好ましい。
【０１３６】
（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ）
○試料：Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ  分離株Ｃ−１２に感染したイチゴからＣＴＡＢ法で抽出した粗核酸原液を１００倍に希釈したもの
○試薬：タカラバイオ社  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ
○機器：バイオ・ラッド社  ｉＣｙｃｌｅｒ
○プライマーセット：
ＰｆＲｅｐ-ＲＦ１／ＰｆＲｅｐ−ＲＲ１あるいは
ＰｆＲｅｐ−ＲＦ１／Ｂ１２−Ｓ２
各プライマーの配列は以下のとおりである。
ＰｆＲｅｐ−ＲＦ１：ＡＴＡＴＣＣＣＴＴＡＣＧＡＴＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＴＡＣＧ（配列番号３０）
ＰｆＲｅｐ−ＲＲ１：ＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＧ（配列番号３１）
Ｂ１２−Ｓ２：ＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＧＧＣＡＡＧ（配列番号３２）
○ＰＣＲ反応液
調製    
滅菌蒸留水                                    ２８．５μｌ
１０ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ              ５    μｌ（終濃度１×）
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）                        ８    μｌ（終濃度各０．４ｍＭ）
Ｍｇ２＋溶液（２５ｍＭ）                        ５    μｌ（終濃度２．５ｍＭ）
プライマー１（１０ｍＭ）                        １    μｌ（終濃度０．２μＭ）  
プライマー２（１０ｍＭ）                        １    μｌ（終濃度０．２μＭ）
ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ（試料）                              １    μｌ
計                                                ５０  μｌ
○ＰＣＲのプログラム
１    ９５℃  １分
２  １）９５℃  ３０秒
２）５５℃  ３０秒
３）７２℃  ６分
３０回繰り返す
３  ７２℃  ４分。
【０１３７】
○電気泳動
ＰＣＲ終了後、得られたＰＣＲ産物を以下の緩衝液に入れ、電気泳動にかけた。
【０１３８】
ゲル  ：１％アガロースゲル（ナカライテスク社、ＭＥアガロース）
緩衝液：１ｘＴＡＥ
泳動槽：ミューピッド
泳動条件：５０Ｖで１．５時間程度
ゲルは、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶトランスイルミネーター上で蛍光を励起して、写真撮影した。
【０１３９】
［結果］
１）ＰｆＲｅｐ−ＲＦ１／ＰｆＲｅｐ−ＲＲ１では約１５００および１０００塩基対の二種のＤＮＡが増幅した。
２）ＰｆＲｅｐ−ＲＦ１／Ｂ１２−Ｓ２では、約１９００塩基対および６４００塩基対の二種のＤＮＡが増幅した。
【０１４０】
○ゲルからのＤＮＡ精製
以下のように、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動後にＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてアガロースゲルから回収、精製した。
１）泳動後のアガロースゲルから目的とする増幅ＤＮＡを含む箇所を切り出してマイクロチューブに移し、重量を測定した（通常１００−２００ｍｇ程度）。
２）マイクロチューブにキット付属のＰＧ液をゲル重量の３倍量加えた。
３）チューブを５０℃の恒温装置に移し、時々混ぜながら１０分間置き完全に溶かした。
４）ゲルと等量の２−プロパノールを加えて混和した。
５）溶液をＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（カラムはキット付属の２ｍｌチューブの上にセットしてある）に通した。
６）１３，０００ｒｐｍ、１分間、室温で遠心分離した。
７）２ｍｌチューブに落ちたろ液を捨てた。
８）カラムに５００μｌのＰＧ液を加えた。
９）１３，０００ｒｐｍ、１分間、室温で遠心分離した。
１０）２ｍｌチューブに落ちたろ液を捨てた。
１１）カラムに７５０μｌのキット付属のＰＥ液を加えた。
１２）３分間静置した。
１３）１３，０００ｒｐｍ、１分間、室温で遠心分離した。
１４）２ｍｌチューブに落ちたろ液を捨てた。
１５）１３，０００ｒｐｍ、１分間、室温で遠心分離する。
１６）カラムを新しい１．５ｍｌチューブに移した。
１７）１０μｌのキット付属ＥＢ液をカラムの中心に加えた。
１８）１分間静置した。
１９）１３，０００ｒｐｍ、１分間、室温で遠心分離した。
２０）マイクロチューブに落ちたＤＮＡ溶液を回収し、使用時まで−２０℃で保存した。
○  配列決定反応
プライマーセット、ＰｆＲｅｐ−ＲＦ１／ＰｆＲｅｐ−ＲＲ１を用いたＰＣＲで増幅した約１５００および１０００塩基対のＤＮＡ断片については、直接の配列決定（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって塩基配列を決定した。
【０１４１】
直接の配列決定には以下のプライマーを用いた
ＰｆＲｅｐ−ＲＦ１  ＡＴＡＴＣＣＣＴＴＡＣＧＡＴＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＴＡＣＧ（ｐＰＦＣ１２−Ｓ１、Ｓ２共）（配列番号３０）
Ｂ１２Ｉｎｖ−Ｆ２  ＡＴＣＡＧＴＡＴＧＡＧＣＡＣＧＣＴＴＡＣ（ｐＰＦＣ１２−Ｓ１、Ｓ２共）（配列番号３３）
Ｂ１２Ｉｎｖ−Ｆ３  ＡＴＣＣＧＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣ（ｐＰＦＣ１２−Ｓ１のみ）（配列番号３４）
ＰｆＲｅｐ−ＲＲ１  ＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＧ（ｐＰＦＣ１２−Ｓ１、Ｓ２共）（配列番号３１）
Ｂ１２Ｉｎｖ−Ｒ２  ＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＣＧ（ｐＰＦＣ１２−Ｓ１のみ）（配列番号３５）
Ｂ１２Ｉｎｖ−Ｒ３  ＡＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＡＧＴＡＣＣ（ｐＰＦＣ１２−Ｓ１のみ）（配列番号３６）
Ｂ１２Ｉｎｖ−Ｒ４  ＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＡＡＣＧＴＣ（ｐＰＦＣ１２−Ｓ２のみ）（配列番号３７）。
【０１４２】
アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）社のＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、同社が供給する日本語版プロトコールに従って配列決定反応を行った。
【０１４３】
１）反応液の調製
０．２ｍｌのＰＣＲチューブ１本あたり
Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｅｍｉｘ                ４μｌ
ＢｉｇＤｙｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（５ｘ）  ２μｌ
プライマー（１．６ｐｍｏｌ／μｌ）                        ２μｌ
テンプレート（ゲル精製したＤＮＡ、約２０ｎｇ／μｌ）      ２μｌ
滅菌脱イオン水                                          １０μｌ
になるように反応液を調製する。
【０１４４】
２）サーマルサイクラーを用いた配列決定反応
以下の条件を使用してサーマルサイクラーを用いた配列決定反応を行った。
【０１４５】
機器：バイオ・ラッド社製  ｉＣｙｃｌｅｒ  
カラム：Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（ＣＳ−９０１，アプライドバイオシステムズ社）  
プログラム：
（１）９６℃  １分
（２）９６℃  １０秒
５０℃  ５秒
６０℃  ４分  
を２５サイクル
（３）４℃  
３）ＰＣＲ産物の精製
ＰＣＲ産物は、以下のようにＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ  を用いてプロトコール通りに精製した。
（１）反応終了後のＰＣＲ産物に２％ＳＤＳ溶液を２μｌ加え混和した。
（２）サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社製  ｉＣｃｙｃｌｅｒ）にセットして熱処理（９８℃５分→２５℃１０分）した。
（３）あらかじめ（二時間以上前）、０．８ｍｌの蒸留水を加えて膨潤させておいたカラムの上下のフタをとり、水を自然落下させた。
（４）カラムを付属のウォッシュチューブにセットし、７３０ｘｇ、２分間遠心分離した。
（５）カラムを付属のサンプルコレクションチューブにセットした。
（６）（２）のＳＤＳ処理後の反応液をカラム中央に加えた。
（７）７３０ｘｇ、２分間遠心分離した。
（８）カラムを捨て、サンプルコレクションチューブに落下した反応液を遠心エバポレーターで乾燥させた（２０〜３０分間）。
【０１４６】
４）  配列決定
配列決定は、３１３０  ジェネティックアナライザ（ＡＢＩ社）を用いて以下の手順で行った。
【０１４７】
（プロトコール）
（１）乾燥させたＰＣＲ産物に２０μｌのＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＡＢＩ社）を加えて溶かした。
（２）溶液を９５℃、２分間の熱変性処理を行った後、氷水上に移し急冷し、そのまま５分間静置した。
（３）  溶液をマイクロプイレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−ｗｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  （ＡＢＩ社）に移し、プレートベースに乗せ、プレートセプタ、プレートリテーナーをセットした。
（４）３１３０ジェネティックアナライザにセットし、配列を決定した。
【０１４８】
（結果）
図１に得られたＯＲＦ−１〜ＯＲＦ−４の核酸が含まれる各々のプラスミドの模式図を示す。左側に示すプラスミド（ｐＰＦＣ１２−Ｌ）は、６，８４０  ｂｐ長であり、ＯＲＦ１〜ＯＲＦ４を含む。中央のプラスミド（ｐＰＦＣ１２−Ｓ１）は、２２５０ｂｐ長であり、ＯＲＦ１のみが含まれる。右側のプラスミド（ｐＰＦＣ１２−Ｓ２）は、１６３５ｂｐ長であり、ＯＲＦ１のみが含まれる。
【０１４９】
この段階では、ｐＰＦＣ１２−Ｓ１およびＳ２の情報のみが判明した。次に、ｐＰＦＣ１２−Ｌの塩基配列を決定するために、以下の工程を行った。なぜなら、ＤＮＡ断片長が大きく、クローニングが必要であったためである。
【０１５０】
（ＯＲＦ−１〜ＯＲＦ−４の塩基配列決定）
プライマーセットＰｆＲｅｐ−ＲＦ１／Ｂ１２−Ｓ２を用いたＰＣＲで増幅した約および６４００塩基対のＤＮＡ断片については、大腸菌にクローニング後、デリーションクローンを作製し、それぞれから精製したプラスミドを鋳型に配列決定反応を行い、塩基配列の決定を行った。
【０１５１】
１）  ＤＮＡ断片のベクターへの結合
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｋ４７００−２０）を用いてマニュアルに準じて以下のようにクローニングを行った。
（１）滅菌済マイクロチューブにゲル精製済みのＰＣＲ産物４μｌおよびｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ  １μｌを入れ混和した。
（２）室温で５分間反応させた。
（３）６×ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて混和し、反応を停止する。
（４）短時間遠心して反応液をチューブの底に集め氷上に静置した。
【０１５２】
２）エレクトロポレーション法での大腸菌への導入
作製したベクターをＥ．ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ（バイオ・ラッド社）を用いてエレクトロポレーション法で以下のように大腸菌に導入した。
（１）キット付属のＴＯＰ１０  Ｅｌｅｃｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌを氷上で溶解し、２μｌの１）の反応液を加え穏やかに混和した。
（２）氷上で冷やしておいた０．１ｃｍキュベットに（１）の液を移した。
（３）１．８ｋＶの電圧でエレクトロポレーションを行った。
（４）速やかにキュベットに４５０μｌのＳＯＣ液体培地（室温）を加えた。
（５）キュベットから液体を滅菌済のチューブ（ファルコン２０５９）に移し、３７℃で１時間浸透培養した。
（６）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ培養液を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地にシャーレ１枚当たり５０−１００μｌ塗布し、３７℃で一晩培養した。
（７）ＬＢ寒天培地上に形成されたコロニーを、滅菌済み爪楊枝を用いて、新しいＬＢ寒天培地に移植して菌株を保存した。同時にコロニーＰＣＲを行い、目的のＤＮＡがプラスミドに挿入されているか確認した。
（８）目的のＤＮＡが挿入されていることが確認された菌株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地（３ｍｌ）に植菌し、３７℃で一晩（約１４時間）培養した。
（９）培養液を、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）でプラスミドを精製した。
（１０）精製プラスミドを、制限酵素ＡｐａＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩで消化し、目的遺伝子内の制限酵素サイトの有無を確認した。
（１１）精製プラスミドを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで消化し、消化産物をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、遠心エバポレーターで乾燥させた。
（１２）精製した制限酵素消化産物をＫｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、プラスミドに挿入されている目的ＤＮＡ断片を段階的に短く欠損させた（デリーション）。
（１３）Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔで作製したデリーション産物をライゲーションして、環状プラスミドに戻し、（２）−（６）と同様にエレクトロポレーションにより、大腸菌にクローニングした。
（１４）（７）と同様にＬＢ寒天培地上に形成されたコロニーについて、菌株保存およびコロニーＰＣＲを行い、挿入ＤＮＡの全長をカバーするようにデリーションクローンの菌株を選抜した。
（１５）デリーション前の全長プラスミド、および選抜されたデリーションクローンから精製したプラスミドを鋳型に、Ｍ１３  ｆｏｒｗａｒｄ（−２０）プライマー＜ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（配列番号３８）＞、Ｍ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ  プライマー＜ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ（配列番号３９）＞を用いて配列決定を行った。
（１６）得られた配列決定結果を、ＤＮＡ解析ソフトウエア（ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ、日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）で解析してＰＣＲ増幅産物の全長塩基配列を決定し、さらにＩｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲの基となったＤＮＡ断片B12の塩基配列とあわせて染色体外ＤＮＡの全長塩基配列を決定した。本発明において、ＯＲＦ以外の配列であっても、別の箇所において説明したように、検出に使用しうることが明らかになった。
【０１５３】
（結果）
以上により、ｐＰＦＣ１２−Ｌ等の塩基配列が判明した。ＯＲＦ−１〜ＯＲＦ−４の配列は、配列番号１〜４に示すとおりである。ｐＰＦＣ１２−Ｌの全塩基配列は、配列番号５に示す。
【０１５４】
（実施例１：Ｒｅｐ遺伝子を用いたリアルタイムＰＣＲによるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出）
本実施例では、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＲｅｐ遺伝子を標的としたプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法による検出・定量系を構築した。これにより、従前の技術と比べて、検出限界が１０−１００倍以上向上し、非特異的な増幅は認められず、病原体の定量が可能であり、検出までの時間も短縮（反応時間が短く、電気泳動の必要がない）されることを実証した。
【０１５５】
（プロトコール）
当該分野で公知の文献（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．（Ｅｄｓ．）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９５）．）に基づきリアルタイムＰＣＲを行った。
【０１５６】
（試料）
本実験に使用した試験材料は、千葉県館山市の圃場から採集した。Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴ（品種、とちおとめ）を、中央農業総合研究センター（茨城県つくば市）の精密温室内（夏期２４℃、冬季２２℃に設定）で維持増殖した株（以後Ｃ−１２株）を、感染試料として用いた。また同様に維持増殖した健全なイチゴ（品種、とちおとめ）を陰性対照試料として用いた。核酸抽出は、約０．１ｇのイチゴ試料（葉柄）からＣＴＡＢ法（前述）により抽出し、最終的に５０μｌのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ）に溶解したものをの原液（１倍）とし、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌ）で１０倍ずつ段階希釈したものを検出限界の測定に供した。健全試料については、ＴＥ緩衝液で１００倍に希釈したものを用いた。
【０１５７】
（試薬）
タカラバイオ社製のＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ（登録商標）ＩＩ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）を用いてリアルタイムＰＣＲ反応液を調製した。一検体あたりの反応液は２５μｌで組成は以下のとおりである。  
ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＩＩ  （２×）  １２．５μｌ
滅菌蒸留水                                              ９．５μｌ
フォワードプライマー（１０ｍＭ）                        ０．５μｌ
リバースプライマー（１０ｍＭ）                          ０．５μｌ
（検定試料）                                                ２μｌ
合計                                                      ２５μｌ
。
【０１５８】
クリーンベンチ内で、検定試料以外の試薬を検体数に２を加えた数の分をまとめて調製し、ＰＣＲチューブに２３μｌずつ分注する。クリーンベンチ外で検定試料を２μｌ加える。
ＰＣＲチューブはタカラバイオ社製  ０．２ｍｌ  ８−ｓｔｒｉｐ  ｔｕｂｅ，  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｆｌａｔ  ｃａｐｓ（ＮＪ６００）、あるい同社製は９６ｗｅｌｌ  Ｈｉ−Ｐｌａｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（ＮＪ４００）を用い、ＮＪ４００を用いる際は、同社製Ｓｅａｌｉｎｇ  Ｆｉｌｍ  ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（ＮＪ５００）を用いてシーリングを行った。
【０１５９】
（機器、プログラム）
検定試料を加えた反応液は、速やかにリアルタイムＰＣＲ装置（タカラバイオ社製  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＴＰ８００）にセットし、反応及び蛍光測定を行った。
【０１６０】
ＰＣＲプログラムは、
［２ｓｔｅｐ  ＰＣＲによる増幅反応］
１．９５℃、１０秒  １サイクル
２．９５℃、５秒  →  ６０℃、３０秒  ４０サイクル
［増幅産物の融点の測定］
３．９５℃、１５秒  →  ６０℃、３０秒  １サイクル
で、行った。
【０１６１】
なお、リアルタイムＰＣＲ用のプライマー設計は、増幅効率を１００％近くに上げるために、増幅産物の長さを８０−１５０塩基対と短くして行った以外は、上記文献等に記載される通常のプライマー設計と同様の原理で行った。以下に使用したプライマーの配列およびその設計手順を示す。
【０１６２】
（使用したプライマー）
○１）ＯＲＦ−１のリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット（Ｂ１２−Ｌ２／Ｂ１２−Ｒ２）
配列番号６：Ｂ１２−Ｌ２  ＧＧＴＧＣＧＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣ  （配列番号１の８３８−８５８）
配列番号７：Ｂ１２−Ｒ２  ＡＴＣＴＴＧＣＣＧＴＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣ（配列番号１の９２８−９４９の相補鎖）
２）Ｒｅｐ−Ｌ２１２／Ｒｅｐ−Ｒ３５１
リアルタイムＰＣＲ用プライマーセット  Ｒｅｐ−Ｌ２１２／Ｒｅｐ−Ｒ３５１
Ｒｅｐ−Ｌ２１２  ＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧ  （配列番号８：配列番号１の２１２−２３２）
リアルタイムＰＣＲ用プライマーセット  Ｒｅｐ−Ｌ２１２／Ｒｅｐ−Ｒ３５１
Ｒｅｐ−Ｒ３５１  ＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧ  （配列番号９：配列番号１の３３０−３５１の相補鎖）。
【０１６３】
（プライマーの設計）
○リアルタイムＰＣＲプライマーの設計手順
１）ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ／ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ．ｃｇｉ）のサイトにアクセスした。なお、プライマー設計は、このウェブサイト以外にも、例えば、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト）などに組み込まれており、これらのスタンドアローンソフトウェアを利用することもできる。
２）「Ｍａｉｎ」タブで検出対象ＤＮＡの塩基配列をペーストした。
「Ｔａｓｋ」を「ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」に（デフォルト値）し、
「Ｐｉｃｋ  ｌｅｆｔ  ｐｒｉｍｅｒ  ｏｒ  ｕｓｅ  ｌｅｆｔ  ｐｒｉｍｅｒ  ｂｅｌｏｗ．」にチェック（デフォルト値）し、
「Ｐｉｃｋ  ｒｉｇｈｔ  ｐｒｉｍｅｒ  ｏｒ  ｕｓｅ  ｒｉｇｈｔ  ｐｒｉｍｅｒ」にチェック（デフォルト値）した。
３）「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ」タブで、「Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｓｉｚｅ  Ｒａｎｇｅ」に「８０−１５０」を入力し、
「Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｉｚｅ」「Ｍｉｎ：」に「１７」、「Ｏｐｔ：」に「２０」、「Ｍａｘ：」に「２５」を入力し、
「Ｐｒｉｍｅｒ  Ｔｍ」「Ｍｉｎ：」に「６０」、「Ｏｐｔ：」に「６２」、「Ｍａｘ：」に「６５」を入力し、
「Ｐｒｉｍｅｒ  ＧＣ％」「Ｍｉｎ：」に「４５」、「Ｏｐｔ：」に「５０」、「Ｍａｘ：」に「５５」を入力し、
「Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｔｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ」に「４」を入力し、他はデフォルト値のままで行った。
４）「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｔｔｅｉｎｇｓ」タブで、
「Ｍａｘ  Ｐｏｌｙ−Ｘ」に「４」を入力し、
「Ｎｕｍｂｅｒ  Ｔｏ  Ｒｅｔｕｒｎ」に適当な数値（表示したいプライマーセット候補の数）を入力し、
「Ｍａｘ  Ｓｅｌｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ」に「８」を入力（デフォルト値）し、
「Ｍａｘ  ３’  Ｓｅｌｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ」に「３」を入力（デフォルト値）し、他はデフォルト値のままで行った。
５）「Ｐｅｎａｌｔｙ  Ｗｅｉｇｈｔｓ」タブで、
「Ｆｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」の列の、
「Ｔｍ」「Ｌｔ：」に「０．５」、「Ｇｔ：」に「０．５」を入力し、
「Ｓｅｌｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ」に「０．５」を入力し、
「３’  Ｓｅｌｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ」に「１．０」を入力し、
「Ｆｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐａｉｒｓ」の列の、
「Ｔｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ」に「０．５」を入力し、
「Ａｎｙ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ」に「０．５」を入力し、
「３’  Ｓｅｌｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  」に「１．０」を入力し、
他の欄は全て「０」にして行った。
６）「Ｐｉｃｋ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」ボタンを押した。
（プライマーセット候補が表示された）。
７）ソフトでは対応していない注意点であって、本実施例で注意すべき点（３’末端領域のＧＣ％の偏り、３’末端は「Ｇ」か「Ｃ」にするなど）をチェックした。
８）ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌなど）で、特異性を確認した。
９）プライマー合成を注文し、入手した（製造：北海道システムサイエンス株式会社  簡易カラム精製）
１０）陽性対照（感染イチゴから抽出した粗核酸）、陰性対照（健全イチゴから抽出した粗核酸）、陰性対照（鋳型核酸なし、緩衝液のみ）を用いて、実際にリアルタイムＰＣＲ装置で、特異性、増幅性を検証した。
【０１６４】
（結果）
本実施例の結果を図２に示す。具体的には、図２に示されるように、Ｒｅｐ遺伝子（ＯＲＦ−１）またはＯＲＦ−２〜ＯＲＦ−４を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界が実証された。
【０１６５】
１０−１〜１０−６、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴ（Ｃ−１２株）から抽出した粗核酸試料の１０〜１０６倍希釈液（従来のＰＣＲ法での検出限界は１０３倍希釈まで）を示す。
【０１６６】
配列番号５および６の組合せ、ならびに配列番号７および８の組み合わせは、ＯＲＦ−１遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子）を検出するのに非常に高感度であることが明らかになった。
【０１６７】
（考察）
従来入手可能であったリボゾームＲＮＡ遺伝子の  配列情報に基づいて可能であったＰＣＲ法ではＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出限界は、同様の手順で抽出した核酸を用いた場合に１０３〜１０４倍希釈であり、本実施例ではその１０〜１００倍の検出感度の向上が認められる。一方で健全イチゴ試料や鋳型ＤＮＡを含まない検体における非特異的な増幅は全く認められなかった。また、従来のＰＣＲ法ではＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出に、ＰＣＲ反応及び電気泳動を合わせて５時間程度必要であったが、本実施例では１時間３０分程度に短縮された。これらの結果はＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに特異的かつ細胞内のコピー数が多い、染色体外ＤＮＡをＰＣＲの標的ＤＮＡに用いた効果と考えられる。
【０１６８】
（実施例２：他の染色体外遺伝子ＯＲＦ−２〜ＯＲＦ−４を用いたリアルタイムＰＣＲによるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出）
実施例１と同様のプロトコールを用いて、ＯＲＦ−２，ＯＲＦ−３およびＯＲＦ−４の配列を用いて、同様にリアルタイムＰＣＲによるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出実験を行った。
【０１６９】
検出用プライマーとしてＯＲＦ−２〜ＯＲＦ−４に由来するプライマーを用いたこと以外は、実施例１と同様にリアルタイムＰＣＲによるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出を実証した。
【０１７０】
（材料および装置、プロトコール）
実施例１と同様のものを利用したが、以下を変更して使用した。
【０１７１】
すなわち、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出限界測定に、Ｃ−１２株感染イチゴから抽出した核酸を√１０（３．１６）倍ずつ希釈した試料を用いた。
【０１７２】
（使用したプライマーセット）
○ＯＲＦ−２検出に有効なリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット
ＥｘＯＲＦ２−Ｌ５９６／ＥｘＯＲＦ２−Ｒ７３８
ＥｘＯＲＦ２−Ｌ５９６：ＡＡＣＣＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣ  （５９６−６２０）（配列番号１０）
ＥｘＯＲＦ２−Ｒ７３８：  ＡＴＣＴＴＧＣＣＧＴＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣ（７１５−７３８）の相補鎖）（配列番号１１）
○ＯＲＦ−３検出に有効なリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット
ＥｘＯＲＦ３−Ｌ８４７／ＥｘＯＲＦ３−Ｒ９４３
ＥｘＯＲＦ３−Ｌ８４７：ＴＴＧＴＣＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＴＧＣＴＧ  （８４７−８６１）（配列番号１２）
ＥｘＯＲＦ３−Ｒ９４３：ＡＧＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＴＧＣＣＣＣＴＧ（９１９−９４３）の相補鎖）（配列番号１３）
○ＯＲＦ−４検出に有効なリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット
ＥｘＯＲＦ４−Ｌ５７２／ＥｘＯＲＦ４−Ｒ６９１
ＥｘＯＲＦ４−Ｌ５７２：ＴＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＧＣＧＴＡＴＧＴＣ（５７２−５９１）（配列番号１４）
ＥｘＯＲＦ４−Ｒ６９１：ＡＴＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＡＣＣＣＡＴＣ（６７２−６９１）の相補鎖）（配列番号１５）。
【０１７３】
（結果）
結果を図５〜７に示す。
【０１７４】
図５は、ＯＲＦ２を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとしてＥｘＯＲＦ２−Ｌ５９６（配列番号１０）／ＥｘＯＲＦ２−Ｒ７３８（配列番号１１）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った結果である。図６は、ＯＲＦ３を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとして、ＥｘＯＲＦ３−Ｌ８４７（配列番号１２）／ＥｘＯＲＦ３−Ｒ９４３（配列番号１３）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った結果である。図７は、ＯＲＦ３を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとしてＥｘＯＲＦ４−Ｌ５７２（配列番号１４）／ＥｘＯＲＦ４−Ｒ６９１（配列番号１５）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った。
【０１７５】
図５〜７において、縦軸は、蛍光強度（一次曲線）を示し、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。１０−３〜１０−６．５は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴ（Ｃ−１２株）から抽出した粗核酸試料の希釈倍数を示す（１０３〜１０６．５倍希釈液）。Ｈは、健全なイチゴから抽出した粗核酸試料の１０２倍希釈液を示す。Ｎは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【０１７６】
図５〜７の結果から明らかなように、Ｒｅｐ遺伝子の検出限界と同様な増幅曲線の図が示され、健全イチゴ、鋳型無しでは増幅せず、感染イチゴのみで増幅していることが示される。
【０１７７】
（考察）
Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ法により複数の環状の染色体外ＤＮＡが見出され、そのサイズや全体の塩基配列は多様であったが、Ｒｅｐ遺伝子のほか、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４についても、遺伝子診断の標的遺伝子として適していると判断される。これらの結果から、ＯＲＦ１（Ｒｅｐ遺伝子）を標的ＤＮＡに用いた場合と同様に、従来のＰＣＲ法に比べて検出感度及び精度の向上が認められる。
【０１７８】
（実施例３：Ｒｅｐ遺伝子を用いたＬＡＭＰ法によるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出）
本実施例では、本発明で同定したＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＲｅｐ遺伝子の配列情報に基づいて、ＬＡＭＰ法による検出を実証した。
【０１７９】
（材料および装置）
（ＬＡＭＰ法のための試薬・装置）
本実施例におけるＬＡＭＰ法のために、以下の試薬、および装置を使用した。
【０１８０】
（試薬）
本実施例におけるＬＡＭＰ法のために、以下の試薬を使用した。
【０１８１】
Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）  ＤＮＡ増幅試薬キット  （栄研化学；ＬＭＰ２０６）
ＤＮＡ増幅を肉眼で明瞭に観察したい場合には、試薬に栄研化学  Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）蛍光・目視検出試薬（ＬＭＰ２０１）を加えて、反応後にＵＶトランスイルミネーター等を用いて蛍光を観察する。
【０１８２】
（装置）
Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）リアルタイム濁度測定装置  ＬＡ−２００（テラメックス株式会社；ＬＡＭＰ反応と同時に濁度を測定する場合に使用する。蛍光は測定できない）または
アルミブロック恒温槽  ＣｏｏｌＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔ  ＣＴＵ−Ｎ（タイテック社；ＬＡＭＰ反応のみを行う、結果は反応終了後に濁度あるいは蛍光を肉眼で観察する）
ＵＶトランスイルミネーター  ＴＭ−４０（フナコシ株式会社；蛍光観察する場合）
反応チューブ：栄研化学Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）反応チューブ（ＬＭＰ９０５）。
【０１８３】
（サンプル）
サンプルとして用いたプライマーは北海道システム・サイエンス株式会社の受託ＤＮＡ合成サービスにより、合成およびＨＰＬＣ精製されたものを利用した。
【０１８４】
（プライマー設計）
Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに対するＬＡＭＰ法のプライマーの設計は、製造業者のマニュアル（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖｅｒ．４；栄研化学株式会社）にしたがって行った。
【０１８５】
簡潔には、ＬＡＭＰ法プライマーの設計は標的配列の５′側から、Ｆ３領域、Ｆ２領域、Ｆ１領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域、Ｂ３領域という６つの領域を利用して実施する。基本的なＬＡＭＰ法では４種類（インナープライマー２種類およびアウタープライマー２種類）のプライマーを使用する。インナープライマーは、Ｆ１ｃとＦ２、Ｂ１ｃとＢ２を連結する。さらにＦ１領域とＦ２領域の間の領域に対する相補鎖にＦｏｒｗａｒｄ側のループプライマーを設定し、Ｂ１領域とＢ２領域の間の領域の相補鎖にＢａｃｋｗａｒｄ側のループプライマーを設定する。この際、Ｔｍ値、各プライマー領域の末端安定性、ＧＣ含量、二次構造の４つの事項を考慮して設計された。
【０１８６】
（プライマー配列）
その配列は以下のとおりである。
ＬＡＭＰ法用のプライマーセット
Ｂ１２−Ｆ３  ＧＣＧＴＴＡＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡ（配列番号１の７１５−７３３）（配列番号１６）
Ｂ１２−Ｂ３  ＴＣＣＴＣＣＧＴＡＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴ（配列番号１の８９０−９１１の相補鎖）（配列番号１７）
Ｂ１２−ＦＩＰ  ＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＣＡＡＣ−ＣＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＴ（配列番号１の７８９−８１３の相補鎖−配列番号１の７４９−７６６）（配列番号１８）
Ｂ１２−ＢＩＰ  ＣＧＴＴＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＧＴＣＴＧＧＴＧ−ＣＡＴＣＣＧＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣ（配列番号１の８１４−８３８−配列番号１の８６９−８８８の相補鎖）（配列番号１９）
Ｂ１２−ＬＦ  ＧＣＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号１の７６９−７８８の相補鎖）
（配列番号２０）
Ｂ１２−ＬＢ  ＧＣＧＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＣ（配列番号１の８４１−８６２）（配列番号２１）。
【０１８７】
（プロトコール：ＬＡＭＰ法の実施）
本実施例におけるＬＡＭＰ法は、製造業者のマニュアルに基づいて以下のように行った。
【０１８８】
（ａ）サンプルおよびサンプルからのＤＮＡの調製
葉縁退緑病に感染したイチゴおよび健全イチゴの葉柄からCTAB法により抽出した粗核酸を検出用試料として用いた。
【０１８９】
（ｂ）試薬の調製
製造業者のマニュアルに基づき、クリーンベンチ内で、以下を調製した。
Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）  ＤＮＡ増幅試薬キットに含まれる、２ｘ  ＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ．、ｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（ＤＷ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ。
【０１９０】
（ｃ）サンプルＤＮＡ／ＲＮＡの添加
調製した上記試薬に、上記調整したＤＮＡまたはＲＮＡを添加した。
【０１９１】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応（増幅）
６０〜６５℃（または、使用した酵素または他の条件の変更に応じて他の適切な温度）に１５分〜１時間または目的物の視認もしくは別の手段での検出が可能になるまでインキュベートした。
【０１９２】
（ｅ）検出は、目視ないしリアルタイム濁度検出でおこなった。
【０１９３】
（結果）
図３は、本実施例の結果を示し、Ｒｅｐ遺伝子を標的にしたＬＡＭＰ法による検出限界の比較（１）を示す。図中、Ｂ１２＋Ｌ、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＲｅｐ遺伝子の塩基配列から設計したプライマーセット（ループプライマー添加）を使用した。また、ＣＰＦ２＋Ｌ、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的にしたプライマーセット（ループプライマー添加）を使用した。濃度を示す１０−１〜１０−４、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴから抽出した粗核酸試料の１０〜１０４倍希釈液を示す。
【０１９４】
また、図４は、Ｒｅｐ遺伝子を標的にしたＬＡＭＰ法による検出限界の比較（２）を示す。図中、Ｂ１２＋Ｌ、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＲｅｐ遺伝子の塩基配列から設計したプライマーセット（ループプライマー添加）を使用した。また、ＣＰＦ２＋Ｌ、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的にしたプライマーセット（ループプライマー添加）を使用した。濃度を示す１０−１〜１０−６は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴから抽出した粗核酸試料の１０〜１０６倍希釈液を示す。
【０１９５】
（考察）
Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅのＲｅｐ遺伝子を標的としたプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法による検出・定量系を構築した。これにより、従前の技術と比べて、検出限界が１０−１００倍以上向上し、非特異的な増幅は認められず、病原体の定量が可能であり、検出までの時間も短縮（反応時間が短く、電気泳動の必要がない）されることが実証された。
【０１９６】
（実施例４：他の染色体外遺伝子ＯＲＦ−２，ＯＲＦ−３およびＯＲＦ−４を用いたＬＡＭＰ法によるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出）
実施例３と同様のプロトコールを用いて、ＯＲＦ−２，ＯＲＦ−３およびＯＲＦ−４の配列を用いて、同様にＬＡＭＰ法によるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出実験を行うことができる。
【０１９７】
（実施例５：染色体外遺伝子のＯＲＦ領域以外の領域を用いたリアルタイムＰＣＲ法によるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出）
実施例１と同様のプロトコールを用いて、染色体外遺伝子のＯＲＦ領域以外の領域の配列を用いて、同様にリアルタイムＰＣＲ法によるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出実験を行った。
【０１９８】
（材料および装置、プロトコール）
実施例１と同様のものを利用したが、以下を変更して実施した。
【０１９９】
（使用したプライマーセット）
○  Ｒｅｐ遺伝子（ＯＲＦ１）とＯＲＦ−２の間の領域に存在
する一本鎖結合タンパク質（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＳＢ）遺伝子に相同性のあるＤＮＡ領域から設計したリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット
検出に有効なリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット
ＥｘＳＳＢ-Ｌ０９６／ＥｘＳＳＢ−Ｒ２６５
ＥｘＳＳＢ-Ｌ０９６：ＧＣＣＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣ（配列番号５の中の２２３０−２２５０）（配列番号２２）
ＥｘＳＳＢ−Ｒ２６５：  ＣＡＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＡＣ（配列番号５の中の２３７６−２３９９）（配列番号２３）
○ＯＲＦ−４とＯＲＦ１の間のＤＮＡ領域から設計したリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット
ＥｘＥｘｄ−Ｌ２３６／ＥｘＥｘｄ−Ｒ３４５
ＥｘＥｘｄ−Ｌ２３６：ＡＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＴＴＡＧＣＡＴＣＣ（配列番号５の中の１２３−１４４）（配列番号２４）
ＥｘＥｘｄ−Ｒ３４５：ＴＡＡＡＧＧＣＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＡＣ（配列番号５の中の２１４−２３２の相補鎖）（配列番号２５）
（プログラム）  以上のプライマーセットを用いると、他のプライマーセットを用いた場合と同様にリアルタイムＰＣＲ反応において４０サイクルの増幅反応を行うと、３５サイクル以降にプライマーダイマーの生成が生じることが多いため、ＰＣＲ増幅反応を３５サイクルに短縮した。
すなわち、ＰＣＲプログラムは
［２ｓｔｅｐ  ＰＣＲによる増幅反応］
１．９５℃、１０秒  １サイクル
２．９５℃、５秒  →  ６０℃、３０秒  ３５サイクル
［増幅産物の融点の測定］
３．９５℃、１５秒  →  ６０℃、３０秒  １サイクル
で、行った。
【０２００】
（結果）
結果を図８〜図９に示す。図８は、ｐＰＦＣ１２−Ｌ上のＲｅｐ遺伝子とＯＲＦ-２の間のＤＮＡ領域を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとしてＥｘＳＳＢ-Ｌ０９６（配列番号２２）／ＥｘＳＳＢ−Ｒ２６５（配列番号２３）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った結果である。
【０２０１】
図９は、ＯＲＦ４とＲｅｐ遺伝子の間のＤＮＡ領域を標的にしたリアルタイムＰＣＲによる検出限界を示す図である。プライマーセットとして、ＥｘＥｘｄ−Ｌ２３６（配列番号２４）／ＥｘＥｘｄ−Ｒ３４５（配列番号２５）を使用し、実施例１に記載の手順に基づいて、リアルタイムＰＣＲを行った結果である。
【０２０２】
図８〜９において、縦軸は、蛍光強度（一次曲線）を示し、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。１０−３〜１０−7は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅに感染したイチゴ（Ｃ−１２株）から抽出した粗核酸試料の希釈倍数を示す（１０３〜１０7倍希釈液）。Ｈは、健全なイチゴから抽出した粗核酸試料の１０２倍希釈液を示す。Ｎは鋳型ＤＮＡ無添加のコントロールを示す。
【０２０３】
図８〜９の結果から明らかなように、Ｒｅｐ遺伝子の検出限界と同様な増幅曲線の図が示され、健全イチゴ、鋳型無しでは増幅せず、感染イチゴのみで増幅していることが示される。図８〜９は染色体外遺伝子のＯＲＦ領域以外の領域であるｐＰＦＣ１２−Ｌ上のＲｅｐ遺伝子とＯＲＦ-２との間の領域を標的にしたプライマーセットＥｘＳＳＢ-Ｌ０９６／ＥｘＳＳＢ−Ｒ２６５を用いたリアルタイムＰＣＲの結果である。
【０２０４】
図８〜９はの結果で示した増幅曲線から、ＯＲＦ以外を標的にした場合の検出限界は、Ｒｅｐ遺伝子や他のＯＲＦを標的とした場合より若干低下するものの、同様な増幅曲線の結果が示され、健全イチゴ、鋳型無しでは増幅せず、感染イチゴのみで増幅していることが示され、検出に使用可能であることが理解される。
【０２０５】
（考察）
Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ法により多数の染色体外遺伝子が見いだされ、そして染色体外遺伝子のＯＲＦ領域以外の領域について、そのサイズや全体の塩基配列は多様であったが、染色体外遺伝子に関しては安定して存在しており、遺伝子診断の標的遺伝子として適していると判断される。
【０２０６】
（実施例６：染色体外遺伝子のＯＲＦ領域以外の領域を用いたＬＡＭＰ法によるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出）
実施例３と同様のプロトコールを用いて、染色体外遺伝子のＯＲＦ領域以外の領域の配列を用いて、同様の方法にもとづいて、適宜変更を加えＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出実験を行うことができる。
【０２０７】
（実施例７：人為的に病原体を獲得させた昆虫試料からの検出）
本検出法を用いて、人為的に病原体を獲得させた昆虫試料からの検出に成功している。
【０２０８】
（材料および装置）
北海道栗山町で採集したヒシウンカ（学名Ｐｅｎｔａｓｔｒｉｄｉｕｓ  ａｐｉｃａｌｉｓ）雌成虫を、筒状のケージ内でＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅが感染したイチゴ（品種、とちおとめ）及び健全イチゴ上に放飼して産卵させる。イチゴ上で孵化したヒシウンカ幼虫は少なくとも半年程度はイチゴの根を吸汁して生存が可能である。孵化から約２ヶ月後に、ヒシウンカ幼虫をとりだし、１頭づつＣＴＡＢ法により核酸抽出を行い、最終的に２０μｌのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ）に再懸濁した核酸溶液をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２０倍希釈したものを試料として、実施例１で記したプライマーセットＢ１２−Ｌ２／Ｂ１２−Ｒ２を用いたリアルタイムＰＣＲ法により、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの検出を試みた。
【０２０９】
（プロトコール）
実施例１と同様のものを利用したが、以下を変更して実験を行った。
【０２１０】
ヒシウンカから抽出した核酸試料を鋳型に用いてプライマーセットＢ１２−Ｌ２／Ｂ１２−Ｒ２を用いてリアルタイムＰＣＲを行うと、３５サイクル前後からプライマーダイマーの生成あるいは非特異的増幅が生じる場合があることから、ＰＣＲプログラムのサイクルを３５サイクルとした。
【０２１１】
（結果）
図１０の結果で示した増幅曲線から、感染イチゴを吸汁したヒシウンカ幼虫は５頭中３頭の試料で、２０サイクル前後から明瞭な増幅が認められ、幼虫体内におけるＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの存在（増殖）が検知できた。一方で、健全イチゴを吸汁したヒシウンカ幼虫の試料ではＰＣＲ産物の増幅は認められなかった。
（考察）
従来の１６ＳリボソームRNA遺伝子を標的にしたＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの遺伝子診断技術では、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅが昆虫共生細菌及び腸内細菌に近縁であることから、特異的にＣａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅを検出することは困難であったが、本実施例が示すように、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの染色体外ＤＮＡを標的にすることで、特異性の高い検出が可能である。この技術は、Ｃａ．Ｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅの媒介昆虫の特定や保毒虫率の検定に利用することができる。
【０２１２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２１３】
本発明は、苗生産の親株や、果実生産用の苗として流通するイチゴの、本病に関する安全性（無病性）を評価（検疫）するために利用できる。また、イチゴ苗の生産地等においては、本病発生の早期発見および伝染経路の特定等のモニタリングに利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０２１４】
配列番号１：本発明のＯＲＦ−１（Ｒｅｐ遺伝子）（1015塩基対）（本説明では、下線は、プライマー等に使用された配列を示す。）
ATGAGTCAAAAGGACGTTAAGTGGGATAGTAAGCGTGCTCATACTGATATGTTGGCGGAATTTTTAGCTAATTTTTCTGGCAGTAATTCGTTACTACAAAATTCTTACCCACATCTTTTCCTTAAATTTGCTGATTGCAGCATAAAATGGCAGAAATGGGCGAACAGAATGGTTGACTGTTCTGGTTTTCTTCGTTTTGCCATGGTCATTTCTCCTGAAACGGGTGAACTTGCGTTAAAATTAAGACAGGCATATTTTTGTCATTTCAGACATTGTCCTGTTTGTAATTGGAGACGCCAGTTGAAATTATTAGCTCGTTTTTTGGAATACCTTCCTGTTGTTGCTGAAGACAATCCTAAATCCCGTTGGGTTTTTATGACTTTAACGGTGCCAAATGTGCCTATTGAATATCTGCGCGAAGAATTAAACAACATGAATAAGGCGTGGAATCGTTTAAAAGGGCGCAAAGAGTTTAAGCCAGTTAAAGGCTGGGTTCGTACTACGGAAGTCACTCGTGAAGGTAGCCGTAAGGGTTATTCGAATCGTAAGGGATATGCCCATCCGCATTTTCATTGTTTGTTAATGGTGCCGTCTTATTGGTTTACTAGCGCATATACGAAGCAGAACAGATGGGCTGAAATCTGGGGTGAGTGTATGCGCGCGGATTCGGATTTGATGGTTGATATTCGGGCGGTGAAAAATGGTGTCGATAAAGCGTTATTAGAGACCACGAAAACATTTACTTATTCGGTGAAACCTGAGGAATTAGAGGCAGATCCAGAATGGGCGTTGAGTTATTTTGAGCAGGTTCAACGTTTGAAATTCATTACGTCTGGTGGTGCGCTAAAAGATGTGACCAAGCGGATTGAGACGAAAAAAGAGACGGATGAGGATTTGATTTATACGGAGGATAATCCAGCGCCTGATGGTTCTGAGGATACGGCAAGATTGGCCTTTAAATGGGGAAATGCAGAAAAAAGATTTAAGCGTTTTCCTAAGGGGGATGTGAAGTGA
配列番号２：本発明のＯＲＦ−２（1161塩基対）
ATGCGCTTGGGCGGTTATACAAGGATTGGACTCCTGATTTTTTCCATTTTTTTTGCGGGCTTTTCGTCGGCGCAGGTGTGGGAAAGCGTCAAGATATTGAAGCATACGGCGTTTAAGGTGGGCGATGATGAAAATGATGGGCAAGCGAAAACAAAAGCCTGTGAGGAAGCAAAAGCCGAAGTATGGGGTTTGTTTGAATCTCATAAAAGAAATTTTAGTCGTCAGTATCCGGATGCCACTTATCGTCTTTTGATGGATGGGAATTGCCAGTTTGATATGACGAAATATAGGGATTATGTCCGTTTTTCAGCAACCATATCGGGCGATATGCAGCGGTCATTTGTCGATAAAACCGCAAAGTCACCAGAGCAGATTTGTAAAGAGAAGCCGATTTTAAATCAAACAGCATTGGGTGTTTCTCGTAAGGTTGGTTCTGATTATTTTGTTTATCTTGATGGCTGTGAATATATTGCCACCGGGGTGATTTTACTGGTTGGCGGTAATGTTACTGCAGACTGGAAGACGACGGGTGAAGTGGCAGGTGATGGTGATGGTAAGGTGAGTGGGACGATGGCGTCTGTTTCGTCGCAGGATAAACCGAAAGCGGCGGAATCTTCATCATCGGAGTTGTTATCACAGGGAGAGGCGGATAAGTCATCTGGTTTGATTAAAGGTACGCCGGTTAGTCCGGGGAGTGCCAGTCATTCAGCATCGGTTTCTCCGCAGCATTCAGGCGTTTCCGCAGAGGCGGGAAAAATGCCATCAGAGGGTGGTTTATCTCGTTCGGAAAATGAGCCTAGGAAGCAGTCTTTCAGTCCGTTAGCGGCGGATCATGCGTCTTCGGCTTCTGGTATATCTGTGGGTAGGGGAGGGCAAGGTGATAGGCTGGATCTATCTCATCCTGATAAGGGTGAACCTGATTTGGATCCACCGACAGCTGAGAAGATTTTATCACCGTTGCAAAATTTGTTTCCTTTCCTGAAAAAGTTCAGTTTGCCGGAACGTCAGGTCAAATGTCCGGTGGTAAGTTTTGATGTGTTTGATCGTCATTATGTGATGGATTCCCATTGTTTTCTGTTTGAAAAAGTCCGTGACCTGTTAAGGCTTTTTTCCATGATTTGCTGGTCTTTTCTTGGGCTGCGTATTGTGCTGTCTGCTTAA
配列番号３：本発明のＯＲＦ−３（1029塩基対）
ATGGCGATTTCTGCGTATGTTGGGATCCCGGGCAGCGGTAAATCCTATGAAGTGGTTTGTAATGTCATTATTCCGGCTTTTATGAAGGGTCGGCGGGTAGTGACCAATATTTATGGTCTTTCGGTAGAAAAGATCACTGCTTATTGTCTGGAGAAGAAAAAGGCGGATGAAAGTCAGTTTGGCGAGCTGGTTTTTGTTGAAAATGAACGGATTAAAGAAGGTAATTTTTTCCCATTTAAAACGGAAACGGGGATAGCAGAGGATACGTTTTGTCAGGCAGGGGATTTGATTTGTATTGATGAAGCGTGGTGCGTTTGGAAGAGTGATAAAATTTTGCCACAACATCGCTCATTCATTGCCGAACATCGGCATTTTGTTAATGCAGAAGGTGTTACCTGTGATTTGGTGGTATTAAATCAGTCGGTGTCGGGTTTGCCAAAGTTTATTAAAGATCGGATTGAGACGACTTATCAAATGACCAAACTGGTGATGTTAGGATTACGCAGTCGTTATCGGGTTGATGTGTATCCCGGTATTAAGGTGGCCAAAAACAATCGTACCTCATCTTATCAGTGCAGTTATGACAAAGCGATTTTCCCACTTTATCATTCTTATGAAGGCGGTCATGGACAGGAACAGGTGGTTGATAAGCGTCAGAGTATTTTTAGTCTGCGTCGAGTTTTGATAATCGGATTGGTGTTTTTGTTGATGCTGTCTTTCTCGTTTTATTATCTGAGTCGTTTTTTTTCTGGTCAGGCGATGATCCCTAAAAATCAGTCGGCGTCTGAATCTGTTAATAAGCCAGTAATGGGGCAAAATTCATTTCAGAATTCGTCGCAACAGAATTTGTCTGTTCGGTGGCGTATTGCTGGCAAGGTCAGTCAGCGGGGTCAGGCGTGGGTAGTATTATTGGGTGATCAGGGGCAACTCAGGATCGAATCCTTGTCGAAATTTCGTTTTTCGGATTTGCGTATGATGGGTGAGATTGAGGGTGATGTTGTAACAACATACTCAGGAGCCGTCAAATGA
配列番号４：本発明のＯＲＦ−４（1218塩基対）
ATGAAAAAGGCAGTGTTAGGCGTATTATGTTTGATGAGTCCGTTACTTTTTGCCAAAGGGGTAATGGTAGAGTTGAATAGTGTGCCGTTACCGCAAGCCTTGAATGTGCTTTACAGTCAGGTTTTTTTGCGTCCTTTCATGTTATCGCCAGAGTTGATCAATGATCCCCGTAAAGTGACTTTTCGTATTACTCAAGATATTGATGAACGGGCTTTTGTTAAGCGTTATTTGCATAATTTACAGATTGCGATCCATGAACGTGAAGGTGTTGATTATTTGGTCACGTTTACGCCAAGGCAGCCGATTGTGCTTAAGGAAACTTATGTCTATCAACCAGTTTATCGTTCAGTTGAATATTTGTCTGATTTGTTACGCGGTCAGTTTGCAGGTAATTTTAATGCGTTGGGACAGGGGATTTCTGGTAGTCAAATAGCACCACAGGATGCGGTATCAGGTACGGCGTCTGATTTTTTGAACCGGACGGGCGATGTACTGGTTTATTACGGTACCCGAGCGGATATTGTACGGTTAAAGGCACTGTTACCGAAAATTGATACGGTGACTGATGAGGTGGTGGTTTCGGCGTATGTCTTTGAAGTACAGACAGCGGAGCGTAATGGTTCAGGCTTGGCGCTGGCAGCTAAACTGGTTTCCGGTAAATTGAATATAGGGATGGGTAAGGAAGCGGGATTTGATAATTTTGTTCGTTTTAATTTAGGTTCATTGGATGCTTTGTATGAGCTGTTTCGGACGGATAGCCGTTTCCATGTGGTGAGTTCGCCGAGACTGCGGGTAAAAAATGGGGCGAGGGCGTCGTTTCTGGTGGGCTCTGAGGTGCCGGTATTAGGTCAGGTCAGTTATGCCGATAATAAGCCTGTTCAGTCGATAGAATATCGCTCTAGTGGGGTTATCTTGAATGTGCGTCCGCAAATTCGGCAACAGGGCGTTGATTTAATTATTGACCAGCAATTATCCAATTTTGCGAAAACGGAAACGGGCGTGAATAACAGTCCAACCCTTATCAAGCGTGAAGTGAGTACGCAGGTGAGTGTGGCGGATGGCGATATTATCCTGTTAGGCGGTTTGGCGGAAAACAAGCTGACAGAAGCGGATACCGGATTTTCGTTTTTTCCAAAAGGTGTGTTTACCGGTGCTTCGGCGGAGAATAATAAGACTGATATTTTAGTGGTTTTGCAGGTTAAGAAGGTTAAACGTTAG
配列番号５：ｐＰＦＣ１２−Ｌの全塩基配列（6840塩基対）
TATAAAACGGGAAGTGTGAGTCAGCTTTTTTGATGGCGTTAGCCATGTAAGGCGACTAGTTGGATATTTAGGGGGCGTTTTAAGTCCATTCGCCGATACAGAGAGTGGACTTATCGAGTAGCAATTTACCCTGCGTTAGCATCCTGCTAGACGGGTTTTTTGGGGTAGTCTCTTCTTAAATTTATAATACAGATGGTGTTTCAAACTTTTTTTGTGGTGCGTGAGGCCTTTACTGGCGTGGGTTTTGTGGGAAACTTGACATAACGAAGAAAACCTTGTAGATTTAATGGAGTCTAAGCCAAAATCAAACAAGGTTTTTTTCTGTGACGATCGGACGTCTTAATCATTATTGTAGCGAGAAAATTTGCGGATGCAATAGGGGAAGTGAGATTTCTTCTGTTGAATCTGATATTTTTTTGTCGGATATGAGTCAAAAGGACGTTAAGTGGGATAGTAAGCGTGCTCATACTGATATGTTGGCGGAATTTTTAGCTAATTTTTCTGGCAGTAATTCGTTACTACAAAATTCTTACCCACATCTTTTCCTTAAATTTGCTGATTGCAGCATAAAATGGCAGAAATGGGCGAACAGAATGGTTGACTGTTCTGGTTTTCTTCGTTTTGCCATGGTCATTTCTCCTGAAACGGGTGAACTTGCGTTAAAATTAAGACAGGCATATTTTTGTCATTTCAGACATTGTCCTGTTTGTAATTGGAGACGCCAGTTGAAATTATTAGCTCGTTTTTTGGAATACCTTCCTGTTGTTGCTGAAGACAATCCTAAATCCCGTTGGGTTTTTATGACTTTAACGGTGCCAAATGTGCCTATTGAATATCTGCGCGAAGAATTAAACAACATGAATAAGGCGTGGAATCGTTTAAAAGGGCGCAAAGAGTTTAAGCCAGTTAAAGGCTGGGTTCGTACTACGGAAGTCACTCGTGAAGGTAGCCGTAAGGGTTATTCGAATCGTAAGGGATATGCCCATCCGCATTTTCATTGTTTGTTAATGGTGCCGTCTTATTGGTTTACTAGCGCATATACGAAGCAGAACAGATGGGCTGAAATCTGGGGTGAGTGTATGCGCGCGGATTCGGATTTGATGGTTGATATTCGGGCGGTGAAAAATGGTGTCGATAAAGCGTTATTAGAGACCACGAAAACATTTACTTATTCGGTGAAACCTGAGGAATTAGAGGCAGATCCAGAATGGGCGTTGAGTTATTTTGAGCAGGTTCAACGTTTGAAATTCATTACGTCTGGTGGTGCGCTAAAAGATGTGACCAAGCGGATTGAGACGAAAAAAGAGACGGATGAGGATTTGATTTATACGGAGGATAATCCAGCGCCTGATGGTTCTGAGGATACGGCAAGATTGGCCTTTAAATGGGGAAATGCAGAAAAAAGATTTAAGCGTTTTCCTAAGGGGGATGTGAAGTGAAAAAATTTGTGGTTTCTACTTCTAATATGAATTTTACACCTAAATTTTTTAGTTCCAAGAATTTAGCGGGTGAGTACTGTTTAAGGAATAATGCTTATTACTTTTTTGAGATGCGTGAGAATTCTGTTGATTACCCAAAAAGAGTTTGGGTGGTTAAAAGACAGGCGGGTTCGTTGAAATATAACTTTTTCACGTGGGAAGAGTATTCATTATTGAAGGATCTTTTTTCTTGTTATGCCGAAGGTAGTCGTCAATGTAAATTGTTACATTAGTTTTTTGTTCTAGGCGCTGTATAGCCGGACTGAGAATCCGACCATACAGCTATCACACAAACCTTTCATGGGAGGTTCATATGAGTCGTTCCGATCTTAATAACTTTTCAGATTTGTTCAAGGCTATTTCTGTGCTTTGTGATTCAGTTGATTCAATTCAGCTGGCCGCTTATCAGTTGCCGTCTTCGTCAGATGATATGAGTTTTTTCGTGAAGTTGTGTGATGACTGTCAGTTAAATTTGACGCATTTGCGCGAAGAGCTTTTCATCTTGCTTGAAGAACCATTTAAAAATTCCCCTAAAACGTCCTGAGAGCCATTCTAAGCCTTTTTTTAGGTTTTGGAATGTTATGTCATGGATTGTGATTCTTTACGTCTTAAGGGAGCGTTTTAGGCTTTTCTGTTGACATGTAGGAGAAAGTATTATGGCAGTTTCAAGTATTAATAAAGCGTTTATTACTGGGAAGATCCTTAAATCTGAGAATTCCGATAAAGGGGAGTTTTATACGTTGGTGGTTTTGCCTGCCGACGATTCTTATTCATTGCCGCCAGTTGTGAAGGTCAGTTCTAAACGTCGTTTAGGGGCACAGGGTGATGTCGTTAATGATCTGGCTTGCCGTTTTCGGGGTTTTGTTAGGACTTTTACGCTTAGTTCCGGAGGAAAAGGTGAAGAACTCAGAATGTGGCTTGAATTGGTGGAGTAAGAGATCGTGATGCGTTTTTTCGGCAATATTATCGGACGATTGATGGCGAATATCGTAATGATTTCGGCGCTTTTTGTTGCGGGTATTTCCGTTTCTTATGGCGATGAGATGAATGTGAAATTATTGAAGGTTGAATCTTTGGTAATTTCCAGTCAGGGAGGTCTTGATATTGATTATGCTCAGGCAGCTCAGTTTTGGGGTCTTTCTTTTACGACGGTCATTTCCCTTTGGTTATTTTCGAAAGGGGTAGAGGCAGTCATTAATATGTTTAAAGGAGGTTAGTTATGGTTAAGCAAATTAAGCGTATTTTGCTGGGTTTATCGGTGGCGATGTTTTCTGCGGTTTCAGTTGCAGGGGATCCGCCTAAAATGGATTTTTCTTCATTGACCAATTCGATTAATTTGGAAGCGGTTATTACGGGCGTTTTGGGGATCGCAGCAGCACTTCTTTTTATCTATGTTGCTGTTAAGGGTGCAAAAACGTTGGTTGCTTTCTTCAGAGGGGCTTAATGAGGATAGGGGCAGATAAATGCCCCTTTTTTTGCGTATGTTACCTGTAATGTTTAATTATCTGTGTTTCCTCTGGGGGTTGTTATGCGCTTGGGCGGTTATACAAGGATTGGACTCCTGATTTTTTCCATTTTTTTTGCGGGCTTTTCGTCGGCGCAGGTGTGGGAAAGCGTCAAGATATTGAAGCATACGGCGTTTAAGGTGGGCGATGATGAAAATGATGGGCAAGCGAAAACAAAAGCCTGTGAGGAAGCAAAAGCCGAAGTATGGGGTTTGTTTGAATCTCATAAAAGAAATTTTAGTCGTCAGTATCCGGATGCCACTTATCGTCTTTTGATGGATGGGAATTGCCAGTTTGATATGACGAAATATAGGGATTATGTCCGTTTTTCAGCAACCATATCGGGCGATATGCAGCGGTCATTTGTCGATAAAACCGCAAAGTCACCAGAGCAGATTTGTAAAGAGAAGCCGATTTTAAATCAAACAGCATTGGGTGTTTCTCGTAAGGTTGGTTCTGATTATTTTGTTTATCTTGATGGCTGTGAATATATTGCCACCGGGGTGATTTTACTGGTTGGCGGTAATGTTACTGCAGACTGGAAGACGACGGGTGAAGTGGCAGGTGATGGTGATGGTAAGGTGAGTGGGACGATGGCGTCTGTTTCGTCGCAGGATAAACCGAAAGCGGCGGAATCTTCATCATCGGAGTTGTTATCACAGGGAGAGGCGGATAAGTCATCTGGTTTGATTAAAGGTACGCCGGTTAGTCCGGGGAGTGCCAGTCATTCAGCATCGGTTTCTCCGCAGCATTCAGGCGTTTCCGCAGAGGCGGGAAAAATGCCATCAGAGGGTGGTTTATCTCGTTCGGAAAATGAGCCTAGGAAGCAGTCTTTCAGTCCGTTAGCGGCGGATCATGCGTCTTCGGCTTCTGGTATATCTGTGGGTAGGGGAGGGCAAGGTGATAGGCTGGATCTATCTCATCCTGATAAGGGTGAACCTGATTTGGATCCACCGACAGCTGAGAAGATTTTATCACCGTTGCAAAATTTGTTTCCTTTCCTGAAAAAGTTCAGTTTGCCGGAACGTCAGGTCAAATGTCCGGTGGTAAGTTTTGATGTGTTTGATCGTCATTATGTGATGGATTCCCATTGTTTTCTGTTTGAAAAAGTCCGTGACCTGTTAAGGCTTTTTTCCATGATTTGCTGGTCTTTTCTTGGGCTGCGTATTGTGCTGTCTGCTTAAGGGGGTGAGAGATGTATGCATTGATTGTCTCGGCGCTTAATGGCATGTTGGCGTTTATATTTCGTACCCTTGTCGTTAAGTTTGTGGTTTTTTCTGTGCTGTTTCTTATTGTGTCGGAATTTTTGCCGATTTTACTGTCTTTGTTACCTGCGTCGACTAATTTGCCGGATCTGTTTCAGAAGTTACCTGATAGTGCGTGGTATTTCATGAATATGTTTGCCGTGACAGAGGGCGTGAAGATCGTGATTTCAGCTTATCTGACTCGTTTTACGATCCGACGTATTCCAGTTATAGGGTGATTTATGGCGATTTCTGCGTATGTTGGGATCCCGGGCAGCGGTAAATCCTATGAAGTGGTTTGTAATGTCATTATTCCGGCTTTTATGAAGGGTCGGCGGGTAGTGACCAATATTTATGGTCTTTCGGTAGAAAAGATCACTGCTTATTGTCTGGAGAAGAAAAAGGCGGATGAAAGTCAGTTTGGCGAGCTGGTTTTTGTTGAAAATGAACGGATTAAAGAAGGTAATTTTTTCCCATTTAAAACGGAAACGGGGATAGCAGAGGATACGTTTTGTCAGGCAGGGGATTTGATTTGTATTGATGAAGCGTGGTGCGTTTGGAAGAGTGATAAAATTTTGCCACAACATCGCTCATTCATTGCCGAACATCGGCATTTTGTTAATGCAGAAGGTGTTACCTGTGATTTGGTGGTATTAAATCAGTCGGTGTCGGGTTTGCCAAAGTTTATTAAAGATCGGATTGAGACGACTTATCAAATGACCAAACTGGTGATGTTAGGATTACGCAGTCGTTATCGGGTTGATGTGTATCCCGGTATTAAGGTGGCCAAAAACAATCGTACCTCATCTTATCAGTGCAGTTATGACAAAGCGATTTTCCCACTTTATCATTCTTATGAAGGCGGTCATGGACAGGAACAGGTGGTTGATAAGCGTCAGAGTATTTTTAGTCTGCGTCGAGTTTTGATAATCGGATTGGTGTTTTTGTTGATGCTGTCTTTCTCGTTTTATTATCTGAGTCGTTTTTTTTCTGGTCAGGCGATGATCCCTAAAAATCAGTCGGCGTCTGAATCTGTTAATAAGCCAGTAATGGGGCAAAATTCATTTCAGAATTCGTCGCAACAGAATTTGTCTGTTCGGTGGCGTATTGCTGGCAAGGTCAGTCAGCGGGGTCAGGCGTGGGTAGTATTATTGGGTGATCAGGGGCAACTCAGGATCGAATCCTTGTCGAAATTTCGTTTTTCGGATTTGCGTATGATGGGTGAGATTGAGGGTGATGTTGTAACAACATACTCAGGAGCCGTCAAATGAAAAAGGCAGTGTTAGGCGTATTATGTTTGATGAGTCCGTTACTTTTTGCCAAAGGGGTAATGGTAGAGTTGAATAGTGTGCCGTTACCGCAAGCCTTGAATGTGCTTTACAGTCAGGTTTTTTTGCGTCCTTTCATGTTATCGCCAGAGTTGATCAATGATCCCCGTAAAGTGACTTTTCGTATTACTCAAGATATTGATGAACGGGCTTTTGTTAAGCGTTATTTGCATAATTTACAGATTGCGATCCATGAACGTGAAGGTGTTGATTATTTGGTCACGTTTACGCCAAGGCAGCCGATTGTGCTTAAGGAAACTTATGTCTATCAACCAGTTTATCGTTCAGTTGAATATTTGTCTGATTTGTTACGCGGTCAGTTTGCAGGTAATTTTAATGCGTTGGGACAGGGGATTTCTGGTAGTCAAATAGCACCACAGGATGCGGTATCAGGTACGGCGTCTGATTTTTTGAACCGGACGGGCGATGTACTGGTTTATTACGGTACCCGAGCGGATATTGTACGGTTAAAGGCACTGTTACCGAAAATTGATACGGTGACTGATGAGGTGGTGGTTTCGGCGTATGTCTTTGAAGTACAGACAGCGGAGCGTAATGGTTCAGGCTTGGCGCTGGCAGCTAAACTGGTTTCCGGTAAATTGAATATAGGGATGGGTAAGGAAGCGGGATTTGATAATTTTGTTCGTTTTAATTTAGGTTCATTGGATGCTTTGTATGAGCTGTTTCGGACGGATAGCCGTTTCCATGTGGTGAGTTCGCCGAGACTGCGGGTAAAAAATGGGGCGAGGGCGTCGTTTCTGGTGGGCTCTGAGGTGCCGGTATTAGGTCAGGTCAGTTATGCCGATAATAAGCCTGTTCAGTCGATAGAATATCGCTCTAGTGGGGTTATCTTGAATGTGCGTCCGCAAATTCGGCAACAGGGCGTTGATTTAATTATTGACCAGCAATTATCCAATTTTGCGAAAACGGAAACGGGCGTGAATAACAGTCCAACCCTTATCAAGCGTGAAGTGAGTACGCAGGTGAGTGTGGCGGATGGCGATATTATCCTGTTAGGCGGTTTGGCGGAAAACAAGCTGACAGAAGCGGATACCGGATTTTCGTTTTTTCCAAAAGGTGTGTTTACCGGTGCTTCGGCGGAGAATAATAAGACTGATATTTTAGTGGTTTTGCAGGTTAAGAAGGTTAAACGTTAGATGAATCGGCTCTTCCCGTTTTTTTTCAACTGAAGAAAGATTGATGATGAGAAGGTAGGGGACACACCACAGCGAGAGTCGAGCGAGGAGTGACCCCTATCTTCGAAGAAGAAAACAATAAGCAGAAG
配列番号６：実施例1で用いたＯＲＦ−１増幅に使用したプライマー（ＯＲＦ−１のリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット（Ｂ１２−Ｌ２；配列番号１の８３８−８５８位））：ＧＧＴＧＣＧＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣ
配列番号７：実施例1で用いたＯＲＦ−１増幅に使用したプライマー（ＯＲＦ−１のリアルタイムＰＣＲ用プライマーセット（Ｂ１２−Ｒ２；配列番号１の９２８−９４９位の相補鎖））：ＡＴＣＴＴＧＣＣＧＴＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣ
配列番号８：実施例1で用いたリアルタイムＰＣＲ用プライマーＲｅｐ−Ｌ２１２（配列番号１の２１２−２３２位）：ＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧ
配列番号９：実施例1で用いたリアルタイムＰＣＲ用プライマーＲｅｐ−Ｒ３５１（配列番号１の３３０−３５１位の相補鎖）：ＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧ
配列番号１０：実施例２で用いたプライマーＥｘＯＲＦ２−Ｌ５９６（配列番号２の５９６−６２０位）：ＡＡＣＣＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣ
配列番号１１：実施例２で用いたプライマーＥｘＯＲＦ２−Ｒ７３８（配列番号２の７１５−７３８位の相補鎖）：ＡＡＣＧＣＣＴＧＡＡＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＣ
配列番号１２：実施例２で用いたプライマーＥｘＯＲＦ３−Ｌ８４７（配列番号３の８４７−８６１位）：ＴＴＧＴＣＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＴＧＣＴＧ
配列番号１３：実施例２で用いたプライマーＥｘＯＲＦ３−Ｒ９４３（配列番号３の９１９−９４３位の相補鎖）：ＡＧＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＴＧＣＣＣＣＴＧ
配列番号１４：実施例２で用いたプライマーＥｘＯＲＦ４−Ｌ５７２（配列番号４の５７２−５９１位）：ＴＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＧＣＧＴＡＴＧＴＣ
配列番号１５：実施例２で用いたプライマーＥｘＯＲＦ４−Ｒ６９１（配列番号４の６７２−６９１位の相補鎖）：ＡＴＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＡＣＣＣＡＴＣ
配列番号１６：実施例３で用いたＬＡＭＰ法用のプライマーＢ１２−Ｆ３（配列番号１の７１５−７３３位）：ＧＣＧＴＴＡＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡ
配列番号１７：実施例３で用いたＬＡＭＰ法用のプライマーＢ１２−Ｂ３（配列番号１の８９０−９１１位の相補鎖）：ＴＣＣＴＣＣＧＴＡＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴ
配列番号１８：実施例３で用いたＬＡＭＰ法用のプライマーＢ１２−ＦＩＰ（配列番号１の７８９−８１３位の相補鎖−配列番号１の７４９−７６６位）：ＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＣＡＡＣ−ＣＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＴ
配列番号１９：実施例３で用いたＬＡＭＰ法用のプライマーＢ１２−ＢＩＰ（配列番号１の８１４−８３８位−配列番号１の８７０−８８９位の相補鎖）：ＣＧＴＴＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＧＴＣＴＧＧＴＧ−ＣＡＴＣＣＧＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣ
配列番号２０：実施例３で用いたＬＡＭＰ法用のプライマーＢ１２−ＬＦ（配列番号１の７６９−７８８位の相補鎖）：ＧＣＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣ
配列番号２１：実施例３で用いたＬＡＭＰ法用のプライマーＢ１２−ＬＢ（配列番号１の８４１−８６２位）：ＧＣＧＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＣ
配列番号２２：実施例５で用いたＥｘＳＳＢ-Ｌ０９６（配列番号５の２２３０−２２５０位）：ＧＣＣＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣ
配列番号２３：実施例５で用いたＥｘＳＳＢ−Ｒ２６５（配列番号５の２３７６−２３９９位の相補鎖）：ＣＡＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＡＣ
配列番号２４：実施例５で用いたＥｘＥｘｄ−Ｌ２３６（配列番号５の１２３−１４４位）：ＡＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＴＴＡＧＣＡＴＣＣ
配列番号２５：実施例５で用いたＥｘＥｘｄ−Ｒ３４５（配列番号５の２１４−２３２位の相補鎖）：ＴＡＡＡＧＧＣＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＡＣ
配列番号２６：配列番号１がコードするアミノ酸配列
配列番号２７：配列番号２がコードするアミノ酸配列
配列番号２８：配列番号３がコードするアミノ酸配列
配列番号２９：配列番号４がコードするアミノ酸配列
配列番号３０：調製実施例で用いたＰｆＲｅｐ−ＲＦ１プライマー：ＡＴＡＴＣＣＣＴＴＡＣＧＡＴＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＴＡＣＧ
配列番号３１：調製実施例で用いたＰｆＲｅｐ−ＲＲ１プライマー：ＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＧ
配列番号３２：調製実施例で用いたＢ１２−Ｓ２プライマー：ＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＧＧＣＡＡＧ
配列番号３３：調製実施例で用いたＢ１２Ｉｎｖ−Ｆ２プライマー：ＡＴＣＡＧＴＡＴＧＡＧＣＡＣＧＣＴＴＡＣ
配列番号３４：調製実施例で用いたＢ１２Ｉｎｖ−Ｆ３プライマー：ＡＴＣＣＧＡＣＴＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣ
配列番号３５：調製実施例で用いたＢ１２Ｉｎｖ−Ｒ２プライマー：ＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＣＧ
配列番号３６：調製実施例で用いたＢ１２Ｉｎｖ−Ｒ３プライマー：ＡＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＡＧＴＡＣＣ
配列番号３７：調製実施例で用いたＢ１２Ｉｎｖ−Ｒ４プライマー：ＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＡＡＣＧＴＣ
配列番号３８：調製実施例で用いたＭ１３  ｆｏｒｗａｒｄ（−２０）プライマー
ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
配列番号３９：調製実施例で用いたＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー
ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ
【図１】
0005741894.tif 000002
【図２】
0005741894.tif 000003
【図３】
0005741894.tif 000004
【図４】
0005741894.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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