(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号
ＮＩＴＥ  Ｐ−９５５で示されるアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株。
【請求項２】
請求項１に記載のアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株が含有されていることを特徴とする環境浄化剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株を利用することを特徴とするアルカン類を含む油に汚染された環境を浄化する環境浄化方法。
【請求項４】
酸素の供給下でアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株を利用することを特徴とする請求項３に記載のアルカン類を含む油に汚染された環境を浄化する環境浄化方法。
【請求項５】
アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株に栄養塩を加えることを特徴とする請求項３又は４に記載のアルカン類を含む油に汚染された環境を浄化する環境浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は燃料油分解能を有する新規微生物、環境浄化剤、及び該微生物を利用する環境浄化方法に関する。更に詳しくは、本願発明は燃料油分解能を有する好気性のアシネトバクター属に属する新規微生物、環境浄化剤、及び該微生物を利用した、燃料油や工業油などアルカン（鎖式飽和炭化水素）類を含む油に汚染された環境の浄化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ａ重油を始めとする燃料油は現在の工業社会においては必要不可欠なものであるが、近年このような燃料油に起因する環境汚染が増大している。例えば、タンカーの座礁、油分精製施設や貯留施設の稼働に伴う漏溢、施設の老朽化に伴う燃料油の漏溢等の原因により、土壌、河川、湖沼、海洋等が汚染されて人間のみならず、動物や魚、海藻、貝類等の生物が大きな影響を受けている。また、これら燃料油は揮発性であるとともに、地下水の流れにより拡散するため、大きな社会問題になることがある。このような、汚染された土壌や水を浄化する方法として自然界に存在する種々の生物、特に微生物を利用して、汚染土壌や汚染された水の中に含まれる汚染物質を除去したり分解する、いわゆるバイオレメディエーションと称される生物学的処理法が知られている。例えば、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の微生物を利用する汚染土壌や汚染水の浄化方法（特許文献１〜３）、アゾアーカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）の微生物を利用する汚染された土壌、海洋、地下水、または排水等の浄化方法（特許文献４）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）に属する微生物を利用する環状炭化水素分解方法（特許文献５）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の微生物を利用する油脂分解処理方法（特許文献６）等の各種の微生物を利用する環境汚染の浄化方法がよく知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１３５４２５号公報
【特許文献２】特開２００３−１０２４６９号公報
【特許文献３】特許第４２３７９９８号
【特許文献４】特開２００７−２２２００４号公報
【特許文献５】特許第４２７０８３７号
【特許文献６】特許第４１７２９９２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本願発明は好気的条件下において、燃料油や工業油などアルカン類を含む油で汚染された土壌や地下水等の環境汚染を浄化するバイオレメディエーション技術を提供するものである。なお、本願発明における燃料油や工業油などアルカン類を含む油とは、主としてＡ重油、灯油、軽油、ガソリン、潤滑油などアルカン類を含有する油を意味している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明はアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属し、ｐＨ５〜９以上の幅広いｐＨ域でアルカン類の分解活性を示し、１５℃程度の低温域においても分解活性を有するとともに、燃料油や工業油などアルカン類を含む油で汚染された土壌や地下水等を浄化する能力を備えた、配列表に示されたＤＮＡ塩基配列を有する微生物に関するものである。
本願第１の発明によれば、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−９５５で示されるアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株を提供する。
本願第２の発明によれば、上記１のアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株が含有されていることを特徴とする環境浄化剤を提供する。
本願第３の発明によれば、上記１又は２のアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株を利用することを特徴とするアルカン類を含む油に汚染された環境を浄化する環境浄化方法を提供する。
本願第４の発明によれば、酸素の供給下でアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株を利用することを特徴とする上記３に記載のアルカン類を含む油に汚染された環境を浄化する環境浄化方法を提供する。
本願第５の発明によれば、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株に栄養塩を加えることを特徴とする上記３又は４のアルカン類を含む油に汚染された環境を浄化する環境浄化方法を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明はアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）における特定の属性を示す微生物を利用することにより、燃料油で汚染された土壌や地下水等の環境汚染を速やかに浄化できるため、給油所敷地内の油汚染現場等においても優れた浄化能力を有することが可能となる。本願第１の発明によれば、アルカン類を含む油に対して優れた分解能力を有する微生物として、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株を提供することができる。
本願第２の発明によれば、上記の微生物が含有された環境浄化剤を使用することにより燃料油で汚染された土壌や地下水を速やかに浄化することができる。
本願第３の発明によれば、上記微生物を利用することにより燃料油や工業油などアルカン類を含む油に汚染された土壌や地下水等の環境汚染を速やかに浄化することができる。
本願第４の発明によれば、上記の効果に加えて酸素供給を行うことにより微生物を活性化させて環境汚染をさらに効率的に浄化することができる。
本願第５の発明によれば、上記の効果に加えて、栄養塩を加えることにより微生物を活性化させてさらに効率的に環境汚染を浄化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＫＯ１４−１株を分類した際の系統樹を示したものである。
【図２】ｐＨがＡ重油中のアルカン分解に与える影響を示したものである。
【図３】温度がＡ重油中のアルカン分解に与える影響を示したものである。
【図４】Ａ重油中のアルカン分解の経時変化を示したものである。
【図５】酸素供給がＡ重油中のアルカン分解に与える影響を示したものである。
【図６】栄養塩添加がＡ重油中のアルカン分解に与える影響を示したものである。
【図７】栄養塩濃度がＡ重油中のアルカン分解に与える影響を示したものである。
【図８】給油所敷地内の油汚染土壌の浄化経過を示したものである。
【図９】給油所敷地内の油汚染地下水の浄化経過を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本願発明はアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属し、ｐＨ５〜９以上の幅広いｐＨ域でアルカン類の分解活性を示し、１５℃程度の低温域においてもアルカン類に対して好適な分解能力を有する微生物であり、１６ｓ−ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列は配列表に示されており、ＫＯ１４−１株として分離されている。
本願発明はこのアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する微生物に係るものであり、また、該微生物を利用して汚染された土壌や地下水を速やかに浄化するものである。本願発明で得られるアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株の分離、同定及び安全性についての評価は下記の方法によって実施した。
なお、本願発明のアルカン類を含む油を分解する微生物は石川県工業試験場敷地内のＡ重油供給口付近より採取した土壌から得られたものであり、アルカン類を含む油の分解実験の基質としては市販のＡ重油を用いた。
【実施例】
【０００９】
以下、実施例及び比較例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１０】
＜使用培地＞
ＫＯ１４−１株の分離、分解実験には、ＬＢ培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、ｐＨ７）、無機培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＮＯ３、Ｋ２ＨＰＯ４を任意の割合で混合後、１０μｍのフィルターで沈殿物を濾過したもの）、又は最小培地（無機培地にＬＢ培地を１０００ｐｐｍ添加したもの）を用いた。また、寒天平板培地は寒天を２．０％（ｗ／ｖ）となるように添加した。なお、本願発明で使用する培地は予めオートクレーブ滅菌し、使用した。
【００１１】
＜ＫＯ１４−１株の分離＞
Ｌ字型試験管に無機培地１０ｍＬ、Ａ重油１０μＬ、土壌１ｇを加え、懸濁するまで３０℃で斜方振とう培養した。懸濁液を１００μＬ分取して、同様に無機培地１０ｍＬ、Ａ重油１０μＬとを加えたＬ字試験管に添加し、無機培地が懸濁するまで振とう培養した。この操作を６回繰り返した後、寒天平板培地へ段階的に希釈した懸濁液１００μＬを滴下し、コンラージ棒で塗沫して３０℃で２４時間培養した。
なお、寒天培地はＡ重油を塗布した無機寒天培地を用い、これらの培地上にコロニーが適度に形成された培養シャーレを選び、形状の整ったコロニーを新たなＬＢ寒天培地に取り分けて菌体を分離した。
【００１２】
＜ＫＯ１４−１株の同定＞
ＫＯ１４−１株は、１６Ｓ−ｒＤＮＡの全塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学試験により同定を行った。なお、全塩基配列解析は９Ｆ及び１５１０Ｒプライマーを用いてＤＮＡを増幅した後、シークエンスは５１５Ｆ、１０９９Ｆ、９２６Ｒ、１５１０Ｒプライマーを用いて増幅し、塩基配列を決定した。相同性検索及び簡易分子系統解析のソフトウェアはアポロン２．０、データベースはアポロンＤＢ−ＢＡ４．０を使用した。
また、細胞形態は光学顕微鏡で観察し、コロニー形態はＬＢ寒天培地上で３０℃、４８時間培養して観察した。生理・生化学試験はカタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、グルコースからの酸／ガス産生、Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）を行った。
１６Ｓ−ｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統解析結果を図１に示す。ＫＯ１４−１株はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ由来の１６Ｓ−ｒＤＮＡに対し高い相同性を示した。基準株では、Ａ．Ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ２３０５５株に対し最も高い相同性を示したが、Ａ．Ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓには分子系統学的に近縁な位置に３つのＧｅｎｏｍｏ  ｓｐｅｃｉｅｓが報告されており、これらを含めると、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｐ．‘ｂｅｔｗｅｅｎ  １  ａｎｄ  ３’に最も近縁であることが示された。しかし、１６Ｓ−ｒＤＮＡはどの株にも完全に一致していなかった。
さらに、生理・生化学性状試験においては、培養温度を４１℃にしても生育したため、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の性状とは異なっていた。これらより、新規な微生物であることが認められたため、この微生物をアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株と命名した。
なお、このアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにおいて、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−９５５として寄託されている。本願発明のアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株の分類系統樹（図１）とその属性を表１に示す（なお、図１及び表１におけるＳＩＩＤ７０７０−０２は実験名である）。
【表１】
0005715477.tif 000002
【００１３】
＜分析方法＞
新規微生物（ＫＯ１４−１株）によるアルカン類の分解率は、ガスクロマトグラフィーを用いて求めた。すなわち、Ａ重油分解実験後の残存油分の抽出は、分解液全量を１０ｍＬのバイアル瓶に移し、酢酸エチル（内部標準：トルエン１００μＬ／ｍＬ）でＬ字型試験管に付着した油分を共洗いした後、振とう抽出した。なお、抽出は２ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬの３回に分けて行った。また、振とうした際にエマルジョンが発生した場合、遠心分離でエマルジョンを消滅させた後、抽出を行った。抽出液は無水硫酸ナトリウムで脱水し、ＧＣ分析を行った。ＧＣ本体はＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ１７Ａ（ソフト：ＣＬＡＳＳ−ＧＣ１０）を用いた。検出器は水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を用い、カラムはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｊ＆Ｗ  ＧＣ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  ＤＢ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ）、キャリアガスはヘリウムガス、スプリット比１：１２、定圧モード（１００ＫＰａ）で測定した。なお、カラム温度は、５０℃で１分、６℃／ｍｉｎで２６０℃まで昇温させ、４分保持した。
【００１４】
＜新規微生物（ＫＯ１４−１株）を用いたＡ重油中のアルカン類の分解＞
Ｌ字型試験管にＬＢ培地５ｍＬとＫＯ１４−１株を１白金耳加え、３０℃で一晩、斜方振とうし、前培養を行った。分解実験は、Ｌ字型試験管に最小培地５ｍＬ、Ａ重油５μＬ、前培養液５０μＬ加え、所定のｐＨ、温度で斜方振とうした。３０℃にてｐＨ３〜１１で２４時間分解を行った結果を図２に示す。図２より、ｐＨ５〜９までアルカン類（Ａ重油中）の分解活性が示され、ｐＨ７において最大の分解率８２％を示した。また、ｐＨ７にて１５℃〜３５℃で２４時間分解実験を行った結果を図３に示す。図３より、１５℃においてもアルカン類の分解が進み５４％の分解率を示した。また、２０℃〜３０℃まで８０％以上の高い分解活性が示され、２５℃において最大の分解率８４％が示された。３０℃、ｐＨ７にて７２時間分解を行った経時変化を図４に示す。図４よりアルカン類の分解は速やかに進行し、１０時間後には４３％、２４時間後には８２％、７２時間後には８３％の分解率を示した。
【００１５】
＜酸素供給の有効性＞
土壌中において、新規微生物（ＫＯ１４−１株）のアルカン類（Ａ重油中）分解における酸素供給の有効性試験を、Ａ重油濃度：１０００ｐｐｍ、栄養塩濃度：５ｇ／Ｌ、温度２０℃の条件で８週間行った。その結果を図５に示す。図５から、新規微生物（ＫＯ１４−１株）は酸素（空気）を供給することでアルカン類（Ａ重油中）の分解率が向上していることが分かる。
【００１６】
＜栄養塩添加の有効性＞
土壌中において、新規微生物（ＫＯ１４−１株）のアルカン類（Ａ重油中）分解における栄養塩添加の有効性試験を、Ａ重油濃度：５０００ｐｐｍ、栄養塩濃度：５ｇ／Ｌ、温度２０℃の条件で８週間行った。その結果を図６に示す。図６から、新規微生物（ＫＯ１４−１株）は栄養塩を添加することでアルカン類（Ａ重油中）の分解率が向上していることが分かる。
【００１７】
＜栄養塩濃度の差による有効性＞
水中において、新規微生物（ＫＯ１４−１株）のアルカン類（Ａ重油中）分解における栄養塩の濃度を０．５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌにして濃度の変化による有効性を、Ａ重油濃度：１０００ｐｐｍ、温度３０℃の条件で行いその結果を図７に示す。図７からも新規微生物（ＫＯ１４−１株）は栄養塩濃度を高めることで菌数が増大し、アルカン類（Ａ重油中）の分解率が向上していることが分かる。
【００１８】
＜フィールド試験＞
新規微生物（ＫＯ１４−１株）を自社が保有する従来の油分解微生物（アシネトバクター属２株、ロドコッカス属１株）に混合したものと、従来微生物（同左）のみのものについて、給油所敷地内の油汚染土壌でフィールド試験を行った。試験は掘削機で給油所敷地内をボーリングし、汚染状況を調査した後、汚染が確認された箇所（区画１：地中１ｍおよび３ｍ、区画２：地中１ｍおよび２ｍ）について、所定量の油分解微生物と栄養剤を注入して土壌と地下水の浄化を行った。なお、区画１は従来微生物に新規微生物を混合し、区画２は従来微生物のみで実施した。また、菌体及び栄養剤は、各箇所とも総量が同じとなるように注入した。土壌の浄化状況を表２、図８に、地下水の浄化状況を図９に示す。表２及び図８より、従来の微生物のみでは浄化に４〜６カ月必要であったのに対して、新規微生物を混合したものは２カ月以内で浄化が完了（油分濃度が土壌中１０００ｍｇ／Ｋｇ以下）していることが分かる。また、図９より従来微生物のみでは４ヶ月後に油分濃度の増加が認められたが、新規微生物を混合した系では４ヶ月後においても増加せず、減少傾向が示された。これらから明らかなように新規微生物の油分解性能の有効性が分かる。
【表２】
0005715477.tif 000003
【００１９】
＜ＫＯ１４−１株の安全性評価＞
新規微生物（ＫＯ１４−１株）の安全性を調べるために、マウスを用いて下記の方法で急性経口毒性試験を行った。
（１）試験方法
検体投与量として２０００ｍｇ／ｋｇを投与する試験群及び溶媒対照として注射用水を投与する対照群を設定し、各群につき雌雄それぞれ５匹を用いた。
投与前に約４時間試験動物を絶食させた。体重を測定した後、試験群に試験液、対照群には注射用水をそれぞれ２０ｍＬ／ｋｇの投与容量で胃ゾンデを用いて強制単回経口投与した。観察期間は１４日間とし、投与日は頻回、翌日から１日１回の観察を行った。投与後７日及び１４日に体重を測定しｔ−検定により有意水準５％で群間の比較を行った。
観察期間終了後に試験動物すべてを解剖した。その結果を表３及び表４に示す。
【表３】
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【表４】
0005715477.tif 000005
（２）試験結果
〈死亡例〉
雌雄ともにいずれの投与群においても、観察期間中に死亡例は認められなかった。
〈体重変化〉
投与後７日及び１４日の体重測定において、雌雄ともに試験群は対照群と比べ体重値の変化は見られなかった。
〈その他の状態〉
雌雄ともにいずれの投与群においても、観察期間中に異常は見られなかった。
〈剖検結果〉
観察期間終了時の剖検では、雌雄ともにすべての試験動物に異常は見られなかった。
検体を２０００ｍｇ／ｋｇの容量で単回経口投与する急性経口毒性試験（限度試験）をマウスを用いて行った結果、観察期間中に異常及び死亡例は認められず、検体のマウスにおける単回経口投与によるＬＤ５０値は雌雄ともに２０００ｍｇ／ｋｇ以上である。
以上の結果から、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株に病原性は認められないと認定した。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本願発明によって提供される新規な微生物、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＯ１４−１株は、汚染された土壌や地下水や排水に含まれている燃料油や工業油などアルカン類を含む油を分解することができるため、タンカーの座礁、油分精製施設や貯留施設の稼働に伴う漏溢、施設の老朽化に伴う燃料油の漏溢等の原因による、土壌、河川、湖沼、海洋等の汚染を浄化することができる。
【図１】
0005715477.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005715477.tif 000013
【図９】
0005715477.tif 000014
【配列表】
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