(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として８−ヒドロキシヘキサデカン酸を含み、および医薬的に許容可能な担体を含む、対象者における癌の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
単離された８−ヒドロキシヘキサデカン酸または合成の８−ヒドロキシヘキサデカン酸を有効成分として含む、対象者における癌の治療に使用するための組成物。
【請求項３】
有効量の８−ヒドロキシヘキサデカン酸、またはその塩、溶媒和物、および水和物を有効成分として含む、対象者における癌の治療に使用するための組成物であって、
ａ）アルコール含有溶媒、またはアルコール含有溶媒を含む溶媒混合物で、ヒカゲノカズラ（Lycopodium clavatum）を抽出して粗抽出液を得る工程、
ｂ）工程ａの前記粗抽出液を、塩素系溶媒または塩素系溶媒を含む溶媒混合物と水との間で分配させる工程、
ｃ）工程ｂの層を分離させる工程、
ｄ）工程ｃの塩素系溶媒を含む層を濃縮する、または部分的に濃縮する工程、
ｅ）シリカゲルクロマトグラフィーにより工程ｄの濃縮物を精製し、クロマトグラフィー画分を得る工程、
ｆ）工程ｅの適切な画分を濃縮、または部分的に濃縮して、精製残渣を得る工程、および
ｇ）前記精製残渣を少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体で希釈し、前記組成物を得る工程
によって調製される、対象者における癌の治療に使用するための組成物。
【請求項４】
前記組成物が、単離された８−ヒドロキシヘキサデカン酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、合成の８−ヒドロキシヘキサデカン酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、８−ヒドロキシ−パルミチン酸のＳ−エナンチオマーを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
同時に投与される追加の治療薬剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記追加の治療薬剤が抗癌剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記癌が肝細胞性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記癌が肝臓癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記癌が肺癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記肺癌がＨＯＰ−９２癌細胞に関わる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記癌が白血病である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
対象者における癌の治療のための薬物の製造における、有効成分として８−ヒドロキシヘキサデカン酸を含み、および医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物の使用。
【請求項１６】
対象者における癌の治療のための薬物の製造における、単離された８−ヒドロキシヘキサデカン酸または合成の８−ヒドロキシヘキサデカン酸を有効成分として含む組成物の使用。
【請求項１７】
対象者における癌の治療のための薬物の製造における、有効量の８−ヒドロキシヘキサデカン酸を有効成分として含む組成物の使用であって、前記組成物が、
ａ）アルコール含有溶媒、またはアルコール含有溶媒を含む溶媒混合物で、ヒカゲノカズラ（Lycopodium clavatum）を抽出して粗抽出液を得る工程、
ｂ）工程ａの前記粗抽出液を、塩素系溶媒または塩素系溶媒を含む溶媒混合物と水との間で分配させる工程、
ｃ）工程ｂの層を分離させる工程、
ｄ）工程ｃの塩素系溶媒を含む層を濃縮する、または部分的に濃縮する工程、
ｅ）シリカゲルクロマトグラフィーにより工程ｄの濃縮物を精製し、クロマトグラフィー画分を得る工程、
ｆ）工程ｅの適切な画分を濃縮、または部分的に濃縮して、精製残渣を得る工程、および
ｇ）前記精製残渣を少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体で希釈し、前記組成物を得る工程
によって調製される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、植物抽出組成物、単離した活性薬剤、および癌の治療のための使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用途のための新しい抽出物および化合物の同定は、継続して生物医学的に重要であり、天然生成物がこの試みのために注目を集め続けている。増殖障害はヒトおよび動物の健康に問題を与え続け、このような障害に対する治療計画は、幅広い観点から未充足の必要性として残っている。増殖障害に関与する機構、信号伝達過程、および標的の変動のために、新しくかつより有効な組成物、化合物、および治療の方法の同定は、医学界ならびに一般大衆にとって大いに興味深いものである。
【０００３】
オオカミノアシ（Wolf's
Foot）およびクラブモスヒカゲノカズラ科（Club Moss Lycopodiaceae）としても知られるヒカゲノカズラ（Lycopodium clavatum）は、ヒカゲノカズラ属（genus
Lycopodium）およびヒカゲノカズラ科（family Lycopodiaceae）に属する。その名前は、枝の先端が狼の鉤爪足に似ているために狼の足に由来する（ｌｕｋｏｓは狼を意味し、ｐｏｄｏｓは足を意味する）。当該植物は、世界中の亜熱帯林および熱帯林内で遍在的に見つけられる。胞子体は、減数分裂の後に胞子嚢内で胞子を生産する。ヒカゲノカズラ類（Lycopodium）において、胞子体は、その中で各胞子嚢が葉状の胞子葉により保護される、円錐状の球果内に群生している。植物の胞子からの抽出物が、新規の治療活性を有する新しくかつ興味深い組成物の探索中に、分画されて単離した抽出物および化合物を産生した。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の概要
本発明は、本明細書における植物抽出物を用い、対象者における増殖障害を治療する方法に関する。本発明の１つの態様は、本明細書における植物抽出物からの単離した化合物を用い、対象者における増殖障害を治療する方法である。１つの実施形態では、増殖障害は癌である。特定の実施形態は、癌が、白血病、肺癌、肝臓癌、または結腸癌であると定めている。１つの実施形態では、癌は非小細胞肺癌である。別の実施形態では、癌は肝臓癌である。
【０００５】
１つの実施形態では、当該化合物は、８−ヒドロキシ−パルミチン酸（「８−ＨＨＡ」）、またはその塩、前駆薬、前駆薬塩、溶媒和物、水和物、および多形体である。別の実施形態では、本発明の方法に従って用いられる化合物は、８−ヒドロキシ−パルミチン酸のＲ−エナンチオマーおよびＳ−エナンチオマーのラセミ混合物である。１つの実施形態では、当該化合物は、８−ヒドロキシパルミチン酸のＳ−エナンチオマー（「（Ｓ）−８−ＨＨＡ」）である。別の実施形態では、当該化合物は、８−ヒドロキシ−パルミチン酸のＲ−エナンチオマー（「（Ｒ）−８−ＨＨＡ」）である。
【０００６】
本発明の別の態様は、本明細書における植物抽出物（例えば、ヒカゲノカズラ（Lycopodium clavatum）の抽出物）を含む組成物である。別の態様は、本明細書における植物抽出物からの単離した化合物を含む組成物である。別の態様は、１つ以上の置換基を有する、本明細書における植物抽出物からの単離した化合物を含む組成物である。
【０００７】
別の態様は、本明細書（または本明細書に描出されている化合物／組み合わせを用いる方法）に描出されている一つの化合物（または複数の化合物の組み合わせ）であり、そこで、当該化合物または化合物の組み合わせは、対象者（動物モデル、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、ヒト）における抗癌活性を有することが実証されている。本明細書における例は、このような効果を決定するための代表的な方法にとって有益である。
【０００８】
１つの実施形態では、本明細書に描出されている化合物（または複数の化合物の組み合わせ）は、植物からの抽出を含む手順から得られる。特定の実施形態では、化合物（または複数の化合物の組み合わせ）を得る際の使用のための手順は、植物抽出物の単離段階、蒸発段階、および分配段階の何れかをさらに含む。
【０００９】
別の実施形態では、本明細書に描出されている化合物（または複数の化合物の組み合わせ）は、合成手段から得られる。
【００１０】
本発明の別の態様は、本明細書における植物抽出物（例えば、ＢＣＰ−２１抽出物、表１または２内のＢＣＰ−２１抽出物画分の何れか）、または、本明細書における植物抽出物（例えば、ＢＣＰ−２１抽出物、表１または２内のＢＣＰ−２１抽出物画分の何れか）中に生じる化合物（例えば、８−ヒドロキシヘキサデカン酸、本明細書におけるＢＣＰ化合物１〜１０の何れか）を含む医薬組成物である。１つの実施形態では、本医薬組成物は、８−ＨＨＡのラセミ混合物、またはその塩、前駆薬、前駆薬塩、溶媒和物、水和物、および多形体を含む。１つの実施形態では、本医薬組成物は、相当なエナンチオマー的純度で８−ヒドロキシ−パルミチン酸のＳ−エナンチオマー（「（Ｓ）−８−ＨＨＡ」）を含む。別の実施形態では、本医薬組成物は、相当なエナンチオマー的純度で８−ヒドロキシ−パルミチン酸のＲ−エナンチオマー（「（Ｒ）−８−ＨＨＡ」）を含む。
【００１１】
別の態様では、このような組成物をキットに含めることができる。
【００１２】
上記の組成物（および本明細書に描出されている治療の方法）を、適正な化学治療薬剤および生物治療薬剤とさらに組み合わせることができる。このような薬剤の例としては、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミノレブリン酸、アナグレリド、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ベタメタゾン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、リン酸クロムＰ−３２、シスプラチン、クラドリビン、結合型エストロゲン類、コルチゾン、シクロホスファミド、シタラビンリポソーム、シタラビン、ａｒａ−、ダカルバジン、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシンリポソーム、デニロイキンジフチトクス、デキサメタゾン、ジクロフェナク、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、エピルビシン、エステル型エストロゲン類、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、エストラムスチン、エストロン、エチニルエストラジオール、エトポシド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロウラシル、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、グラニセトロン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、イリノテカン、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、レボチロキシン、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサートナトリウム、メトキサレン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、メチロシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、フェンプロピオン酸ナンドロロン、ニルタミド、酢酸オクトレオチド、オプレルベキン、オキシメトロン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、プリカマイシン、ポリフェプロザン２０／カルムスチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、プロゲステロン、リツキシマブ、サマリウム−１５３レキシドロナムペンタナトリウム、ヨウ化ナトリウムＩ−１３１、リン酸ナトリウムＰ−３２、ストレプトゾシン、塩化ストロンチウム−８９、滑石、クエン酸タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、エナント酸テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、クエン酸トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、トリアムシノロン、パモ酸トリプトレリン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に明記されている対象者における疾患、障害、または症状の治療または防止のための、単一の組成物または別個の剤形の何れかとしての薬物の製造における、単独での、または１つ以上の追加の治療薬剤と合わせての、本明細書における化学式の何れかの化合物の使用を提供する。本発明の別の態様は、本明細書に描出されている対象者における疾患、障害、またはその症状の治療または防止における使用のための、（単離した天然または合成の）本明細書における化学式の化合物である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＢＣＰ−２１抽出物から単離された化合物のＮＭＲスペクトルである。
【図２】ＢＣＰ−２１抽出物から単離された化合物のＮＭＲスペクトルである。
【図３】ＢＣＰ−２１抽出物から単離された化合物のＮＭＲスペクトルである。
【図４】ＢＣＰ−２１抽出物から単離された化合物のＭＳスペクトルである。
【図５】ＢＣＰ−２１抽出物から単離された化合物のＭＳスペクトルである。
【図６】ＢＣＰ−２１が、用量依存的な様態でＨｅＬａ細胞のアポトーシスを誘発することを示す。
【図７】ヒカゲノカズラ（lycopodiumclavatum）の抽出物が、時間依存的な様態でＰＡＲＰ切断を誘発することを示す、ウエスタンブロッティングの結果である。
【図８】（Ｓ）−８−ＨＨＡが、用量依存的な様態でＨＯＰ−９２の肺癌細胞株の生存を阻害したことを示す。
【図９】１００μＭの８−ＨＨＡ（ラセミ混合物、Ｓ−エナンチオマーまたはＲ−エナンチオマー）が、比色ＭＴＴ検定を用いて、ＰＣＬ５、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＳＮＵの肝臓癌細胞株の生存を減少させることを結果的にもたらしたことを示す。
【図１０】（Ｓ）−８−ＨＨＡが、用量依存的な様態でＰＬＣ−５の肝臓癌細胞株の生存を阻害したことを実証する。
【図１１】１００μＭの（Ｓ）−８−ＨＨＡが、ＳＮＵおよびＰＣＬ５の肝臓癌細胞株内にＰＡＲＰ切断を結果的にもたらしたことを示す。
【図１２】（Ｓ）−８−ＨＨＡの処理が、対照と比較してＦＡＳ受容体濃度の相当な減少を結果的にもたらしたことを実証する。
【図１３】８−ＨＨＡが、肝臓異種移植マウスモデルにおけるＰＬＣ５の肝臓癌細胞内にて腫瘍成長を減少させることを描写する。
【図１４】異種移植マウスモデルにおけるＨＯＰ９２の肺癌細胞内での８−ＨＨＡの抗腫瘍効能を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の詳細な説明
定義
「寛解させる」および「治療する」という用語は、相互交換可能に用いられ、疾患（例えば、本明細書に描出されている疾患または障害）の発生または進行を減少させ、抑制し、減弱し、軽減し、阻止し、または安定させることを両方とも意味する。
【００１６】
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷するかまたは妨げる、任意の容態または障害を意味する。
【００１７】
「標識」とは、疾患または障害と関連する任意の変化を意味する。例えば、疾患または障害と関連する発現量または活性における変化を有する、任意のタンパク質またはポリヌクレオチドである。
【００１８】
「癌」という用語は、一群の細胞が、非制御成長（正常限界を超える分裂）、侵襲（隣接する組織への侵入およびこれの破壊）、および時には転移（体内の他の場所への蔓延）を見せる一種の疾患を概して指す。癌の例としては、白血病、肺癌、肝臓癌、結腸癌、黒色腫、乳癌、ＣＮＳ癌、卵巣癌、腎臓癌、および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本開示において、「備える」、「包含する」、「含有する」、および「有する」および同様のものは、米国特許法でそれらに帰される意味を有することがあり、かつ「含める」、「含む」、および同様のものを意味することがあり、「から実質的に成る」または「実質的に成る」は、米国特許法で帰される意味を同様に有し、当該用語は変更可能であり、列挙されるものの基本的な特徴または新規の特徴が、列挙されるが先行技術の実施形態を除くものより多くの存在により変更されない限り、列挙されるものより多くの存在を考慮に入れる。
【００２０】
本明細書における化合物を、本明細書における化学式の化合物の塩、前駆薬、および前駆薬塩、溶媒和物、水和物、および多形体を含む化合物の形態で利用することもできる。
【００２１】
本発明の化合物の塩は、酸とアミノ官能基などの化合物の塩基性基との間に形成されるか、あるいは、塩基とカルボキシル官能基などの化合物の酸性基との間に形成される。別の好適な実施形態によれば、化合物は医薬的に許容可能な酸付加塩である。
【００２２】
本明細書で用いられる際および他に示されない限り、「前駆薬」という用語は、生物学的条件下（インビトロまたはインビボ）で加水分解し、酸化し、またはそれ以外の反応を起こし、本発明の化合物を与えることができる化合物の誘導体を意味する。前駆薬は、生物学的条件下でこのような反応において活性になるのみであり得、あるいは、その未反応の形態で活性を有し得る。本明細書で意図されている前駆薬の例としては、アミド類、エステル類、カルバミン酸塩類、炭酸塩類、およびリン酸塩類似体等の生物加水分解可能な部分を含む、本明細書で開示されている化学式の何れか一つの化合物の類似体または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。「バーガーの医薬品化学および創薬（１９９５年）１７２〜１７８ページ、９４９〜９８２ページ（マンフレッド・Ｅ．ウォルフ編、第５版）（Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982
(Manfred E. Wolff ed., 5th ed)）」により記載されている方法等の、十分に知られているものを用いて、前駆薬を典型的に調製することができ、「グッドマンおよびギルマンの治療学の薬理学的基礎、第８版、マグローヒル国際版、１９９２年、『薬物の生体変換』（Goodman and Gilman's, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8th
ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, "Biotransformation of Drugs"）」も参照されたい。
【００２３】
本明細書で用いられる際および他に示されない限り、「生物加水分解可能な部分」という用語は、１）化合物の生物学的活性を破壊せず、かつ、取り込み、作用の持続時間、または作用の発現等の、インビボでの有利な特性を化合物に付与するか、あるいは、２）それ自体は生物学的に不活性であるが、インビボで生物学的に活性な化合物に転換されるか、の何れかである官能基（例えば、アミド、エステル、カルバミン酸塩、炭酸塩、またはリン酸塩）類似体を意味する。
【００２４】
前駆薬塩は、酸とアミノ官能基などの前駆薬の塩基性基との間に形成されるか、あるいは、塩基とカルボキシル官能基などの前駆薬の酸性基との間に形成される化合物である。１つの実施形態では、前駆薬塩は医薬的に許容可能な塩である。
【００２５】
特に好ましい前駆薬および前駆薬塩は、本発明の化合物が（例えば、経口的に投与される化合物を血液中により容易に吸収することを可能にすることにより）哺乳類に投与される際に、このような化合物の生物利用可能性を増加させるか、あるいは、親種と比較して親化合物の生物学的区画（例えば、脳または中枢神経系）への運搬を強化するものである。好適な前駆薬としては、水溶性または腸膜を通じる能動輸送を強化する基が、本明細書に記載されている化学式の構造に付加される誘導体が挙げられる。例えば、「アレクサンダー・Ｊ．他、医薬品化学誌、１９８８年、第３１号、３１８〜３２２ページ（Alexander, J. et al. Journal of Medicinal Chemistry 1988, 31,
318-322）」、「バンガード・Ｈ．、前駆薬の設計、エルゼビア：アムステルダム、１９８５年、１〜９２ページ（Bundgaard,
H. Design of Prodrugs; Elsevier: Amsterdam, 1985; pp 1-92）」、「バンガード・Ｈ．、ニールセン・Ｎ．Ｍ．、医薬品化学誌、１９８７年、第３０号、４５１〜４５４ページ（Bundgaard, H.; Nielsen, N. M. Journal of Medicinal Chemistry 1987,
30, 451-454）」、「バンガード・Ｈ．、薬の設計および開発の教科書、ハーウッド・アカデミック出版：スイス、１９９１年、１１３〜１９１ページ（Bundgaard, H. A Textbook of Drug Design and Development; Harwood
Academic Publ.: Switzerland, 1991; pp 113-191）」、「ディゲニス・Ｇ．Ａ．他、実験薬理学の手引書、１９７５年、第２８号、８６〜１１２ページ（Digenis, G. A. et al. Handbook of Experimental Pharmacology 1975,
28, 86-112）」、「フリース・Ｇ．Ｊ．、バンガード・Ｈ．、薬の設計および開発の教科書、第２版、海外出版：アムステルダム、１９９６年、３５１〜３８５ページ（Friis, G. J.; Bundgaard, H. A Textbook of Drug Design and
Development; 2 ed.; Overseas Publ.: Amsterdam, 1996; pp 351-385）」、「ピットマン・Ｉ．Ｈ．、医薬品研究総説、１９８１年、第１号、１８９〜２１４ページ（Pitman, I. H. Medicinal Research Reviews 1981, 1, 189-214）」を参照されたい。
【００２６】
「医薬的に許容可能な」という用語は、本明細書で用いられる際に、健全医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、および同様のものを伴わない、ヒトおよび他の哺乳類の組織と接触する使用に適切であり、かつ、妥当な恩恵／危険比に相応である成分を指す。「医薬的に許容可能な塩」は、受容者への投与の際に、直接的にも間接的にも、本発明の化合物または化合物の前駆薬を与えることができる、任意の非毒性塩を意味する。
【００２７】
医薬的に許容可能な塩を形成するために一般に使用される酸としては、重硫化水素、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、およびリン酸等の無機酸、ならびに、パラ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、二酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、蟻酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、蓚酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、および酢酸等の有機酸、および関連する無機酸と有機酸が挙げられる。このような医薬的に許容可能な塩としては、そのため、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、蟻酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、蓚酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオール酸塩、ヘキシン−１，６−ジオール酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩、および同様の塩が挙げられる。好適な医薬的に許容可能な酸付加塩としては、塩化水素酸および臭化水素酸等の鉱酸と形成されるもの、および、特にマレイン酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。
【００２８】
医薬的に許容可能な塩を本発明の前駆薬の酸性官能基と形成するための好適な塩基としては、ナトリウム、カリウム、およびリチウム等のアルカリ金属の水酸化物、カルシウムおよびマグネシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物、アルミニウムおよび亜鉛等の他の金属の水酸化物、アンモニア、および非置換またはヒドロキシ置換のモノアルキルアミン、ジアルキルアミン、およびトリアルキルアミン等の有機アミン類、ジシクロヘキシルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン等のモノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキルアミン）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、またはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン等のＮ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）−アミン類、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ならびにアルギニン、リジン、および同様のもの等のアミノ酸類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書で用いられる際に、「水和物」という用語は、非共有分子間力により結合した、化学量論量または非化学量論量の水をさらに含む化合物を意味する。
【００３０】
「単離した」、「精製した」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で見つかる際に通常はそれを伴う成分が、実質的にまたは本質的に非含有である物質を指す。純度または均質性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高性能液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を用いて典型的に決定される。特に、実施形態では、化合物は少なくとも純度８５％、より好ましくは少なくとも純度９０％、より好ましくは少なくとも純度９５％、最も好ましくは少なくとも純度９９％である。
【００３１】
本明細書で用いられる際に、「溶媒和物」という用語は、非共有分子間力により結合した、化学量論量または非化学量論量の、水、アセトン、エタノール、メタノール、ジクロロメタン、２−プロパノール、または同様のもの等の溶媒をさらに含む化合物を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる際に、「多形体」という用語は、例えば、Ｘ線粉末回折図形または赤外分光法等の物理的手段により特徴付けることができる、化合物またはその錯体の固体結晶形態を意味する。同じ化合物の異なる多形体は、異なる物理的特性、化学的特性、および／または分光学的特性を呈することがある。異なる物理的特性としては、安定性（例えば、熱、光、または水分に対して）、圧縮性および密度（調合および製品製造において重要）、吸湿性、可溶性、および溶解率（生物利用可能性に影響し得る）が挙げられるが、これらに限定されない。安定性における差異は、化学反応性（例えば、剤形が、１つの多形体から成る際に、別の多形体から成る際よりも急速に変色するような、酸化の違い）、または力学的特徴（例えば、動力学的に有利な多形体が熱力学的により安定した多形体に転換する時に、錠剤が貯蔵の際に砕ける）、またはその両方（例えば、１つの多形体の錠剤が、高い湿度で分解の影響をより受けやすい）における変化に起因し得る。多形体の異なる物理的特性は、加工に影響し得る。例えば、１つの多形体は、より溶媒和物を形成する可能性があり得るだろうし、あるいは、例えば、それの粒子の形状または大きさの分布に起因して、別のものよりも不純物を完全に濾過または洗浄することがより困難であり得るだろう。
【００３３】
本明細書で用いられる際の「他の立体異性体が実質的に非含有の」という用語は、２５％未満の他の立体異性体、好ましくは１０％未満の他の立体異性体、より好ましくは５％未満の他の立体異性体、最も好ましくは２％未満の他の立体異性体、あるいは「Ｘ」％未満の他の立体異性体（式中、Ｘは０および１００の間の全体を含む数である）が存在することを意味する。ジアステレオマーを得るかまたは合成する方法は、当該技術分野で十分に知られており、最終化合物に対して、あるいは出発物質または中間体に対して実行可能なものとして適用されてよい。他の実施形態は、化合物が単離した化合物であるものである。本明細書で用いられる際の「少なくともＸ％がエナンチオマー的に豊富な」という用語は、化合物の少なくともＸ％が単一のエナンチオマー形態であることを意味し、式中、Ｘは０および１００の間の全体を含む数である。
【００３４】
「安定化合物」という用語は、本明細書で用いられる際に、製造を可能にするのに十分な安定性を有し、かつ、本明細書に詳述されている目的（例えば、治療薬剤に応答する疾患または障害を治療する、治療製品、治療化合物の製造の際の使用のための中間体、単離可能または貯蔵可能な中間化合物への調合）のために有用であるのに十分な期間にわたり化合物の統合性を維持する化合物を指す。
【００３５】
「立体異性体」は、エナンチオマーおよびジアステレオマーを両方とも指す。
【００３６】
本明細書で用いられる際に、「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の任意のラジカルを指す。
【００３７】
「アルク」または「アルキル」という用語は、１乃至１２個の炭素原子、好ましくは１乃至８個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素基を指す。「低級アルキル」という表現は、１乃至４（全体を含む）個の炭素原子のアルキル基を指す。「アリールアルキル」という用語は、その中でアルキルの水素原子がアリール基により置き換えられる部分を指す。「アルケニル」という用語は、２乃至１０個の、好ましくは２乃至４個の炭素原子の、少なくとも１つの二重結合を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素基を指す。アルケニル基が窒素原子に結合される場合には、このような基が二重結合を有する炭素を通じて直接的に結合されないことが好適である。
【００３８】
「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキルラジカルを指す。「アルキレンジオキソ」という用語は、−Ｏ−Ｒ−Ｏ−という構造の二価種を指し、その中で、Ｒはアルキレンを表す。
【００３９】
「アルキニル」という用語は、２乃至１０個の、好ましくは２乃至４個の炭素原子の、少なくとも１つの三重結合を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素基を指す。アルキニル基が窒素原子に結合される場合には、このような基が三重結合を有する炭素を通じて直接的に結合されないことが好適である。
【００４０】
「アルキレン」という用語は、１乃至３個の低級アルキル基で置換することができる、単結合により接続される１乃至５個の炭素原子の二価の直鎖橋（例えば、−（ＣＨ２）ｘ−、式中、ｘは１乃至５である）を指す。
【００４１】
「アルケニレン」という用語は、単結合により接続され、かつ１乃至３個の低級アルキル基で置換することができる、１つまたは２つの二重結合を有する２乃至５個の炭素原子の直鎖橋を指す。例示的なアルケニレン基は、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝ＣＨ−、および−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−ＣＨ＝ＣＨ−である。
【００４２】
「アルキニレン」という用語は、その中に一つの三重結合を有し、単結合により接続され、かつ１乃至３個の低級アルキル基で置換することができる、２乃至５個の炭素原子の直鎖橋を指す。例示的なアルキニレン基は、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ≡Ｃ−、および−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）ＣＨ２−である。
【００４３】
本明細書で使用される際の「シクロアルキル」および「シクロアルケニル」という用語は、それぞれ、飽和および部分不飽和の、３乃至１２個の炭素、好ましくは３乃至８個の炭素、より好ましくは３乃至６個の炭素を有する環式炭化水素基を含む。「Ａｒ」または「アリール」という用語は、６乃至１４個の炭素原子を含有する芳香族環式基（例えば、６員環の単環式環系、１０員環の二環式環系、または１４員環の三環式環系）を指す。例示的なアリール基としては、フェニル、ナフチル、ビフェニル、およびアントラセンが挙げられる。
【００４４】
「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される１個、２個、３個、または４個の環複素原子を含有する、５乃至１２個の環原子の単環式または縮合環（すなわち、隣接する一対の原子を共有する環）の基を指し、残りの環原子はＣであり、かつ、加えて、完全に共役したパイ電子系を有し、そこで、各環の０個、１個、２個、３個、または４個の原子を置換基により置換することができる。ヘテロアリール基の例は、制限なく、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、キナゾリン、イソキノリン、プリン、およびカルバゾールである。
【００４５】
「複素環」、「複素環式」、または「ヘテロシクロ」という用語は、完全飽和または部分不飽和の環式基、例えば、３乃至７員環の単環式、７乃至１２員環の二環式、または１０乃至１５員環の三環式の環系を指し、これらは少なくとも１個の複素原子を少なくとも１個の環内に有し、そこで、各環の０個、１個、２個、または３個の原子を置換基により置換することができる。複素原子を含有する複素環式基の各環は、窒素原子、酸素原子、および／または硫黄原子から選択される１個、２個、３個、または４個の複素原子を有し得、そこで、窒素および硫黄の複素原子を随意に酸化させることができ、かつ、窒素複素原子を随意に四級化することができる。複素環式基は、環または環系の任意の複素原子または炭素原子にて結合させることができる。
【００４６】
「置換基」という用語は、本明細書に描出されている任意の官能基上、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロシクリル基、またはヘテロアリール基上にて、その基の任意の原子において「置換された」基を指す。態様では、本明細書に描出されている官能基、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールを、一つの置換基（例えば、下記に列挙されているもの）で置換することができる。適切な置換基としては、制限なく、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ１５、ＳＲ１５、Ｓ（Ｏ）２Ｒ１５、ＮＲ１５Ｒ１６、Ｃ１〜Ｃ２のペルフルオロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２のペルフルオロアルコキシ、１，２−メチレンジオキシ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、Ｃ（ＮＲ１６）ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＲ１５Ｃ（ＮＲ１６）ＮＲ１５Ｒ１６、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１５Ｒ１６、Ｒ１７、Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、Ｓ（Ｏ）Ｒ１７、Ｓ（Ｏ）２Ｒ１７、Ｒ１６、オキソ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１６、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨ２）ｎＯＲ１５、（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＲ１５Ｓ（Ｏ）２Ｒ１７が挙げられ、式中、ｎは独立して０〜６の全体を含むものである。各Ｒ１５は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル、またはＣ３〜Ｃ６のシクロアルキルである。各Ｒ１６は、独立して、水素、アルケニル、アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル、あるいは、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールで置換されたＣ１〜Ｃ４のアルキルである。各Ｒ１７は、独立して、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル、あるいは、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールで置換されたＣ１〜Ｃ４のアルキルである。各Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７中の各Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、およびＣ１〜Ｃ４のアルキルを、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４のジアルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ２のペルフルオロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２のペルフルオロアルコキシ、または１，２−メチレンジオキシで随意に置換することができる。
【００４７】
「オキソ」という用語は、炭素に結合される際にはカルボニル、窒素に結合される際にはＮ−オキシド、および硫黄に結合される際にはスルホキシドまたはスルホンを形成する、酸素原子を指す。
【００４８】
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニルの置換基を指し、これらの何れかを置換基によりさらに置換することができる。
【００４９】
一可変物の任意の定義における化学基の一覧の詳述は、本明細書において、任意の単一の基または列挙されている基の組み合わせとしてのその可変物の定義を含む。一可変物についての一実施形態の詳述は、本明細書において、任意の単一の実施形態としての、あるいは、任意の他の実施形態またはその部分と組み合わせるその実施形態を含む。
【００５０】
本発明の化合物は、１つ以上の不斉中心を含有することがあり、そのため、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、各個のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じることがある。これらの化合物の全てのこのような異性形態は、本発明に明確に含まれる。本発明の化合物を多数の互変異性形態にて表すこともでき、このような場合において、本発明は、本明細書に記載されている化合物の全ての互変異性形態を明確に含む。このような化合物の全てのこのような異性形態は、本発明に明確に含まれる。本明細書に記載されている化合物の全ての結晶形態は、本発明に明確に含まれる。
【００５１】
本明細書における化学式の化合物を合成するための他の手法を、本明細書で引用されている参考文献から容易に適合させることができる。これらの手順の変化形およびそれらの最適化は、通常の実務者の技能の範囲内にある。
【００５２】
上記で示されている特定の手法および化合物は、限定的であることを目的としていない。本明細書における図式内の化学構造は、同じ可変物名（例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ、Ｒ’、Ｘなど）により識別されるか否かにかかわらず、本明細書における化合物の化学式内の対応する位置の化学基の定義（部分、原子など）に相応に本明細書により定義される可変物を描写する。ある化合物構造内の化学基の、別の化合物構造の合成の際の使用のための適合性は、当該技術分野における通常の技能を有する者の知識の範囲内にある。本明細書における図式内に明白に示されていない経路内にあるものを含む、本明細書における化合物およびその合成前駆体を合成する追加の方法は、当該技術分野における通常の技能を有する化学者の技量の範囲内にある。反応条件を最適化し、必要であれば競合副生成物を最小化するための方法は、当該技術分野で知られている。本明細書に記載されている方法は、本明細書に具体的に記載されている段階の前でも後でも、本明細書における化合物の合成を最終的に可能にするために、適切な保護基を追加または除去する段階を追加的に含むこともある。加えて、様々な合成段階を交互の順序または順番で行い、所望の化合物を与えることができる。適用可能な化合物を合成する際に有用な、合成化学の変換および保護基の方法論（保護および脱保護）は、当該技術分野で知られており、例えば、「Ｒ．ラロック、包括的有機変換、ＶＣＨ出版（１９８９年）（R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers
(1989)）」、「Ｔ．Ｗ．グリーンおよびＰ．Ｇ．Ｍ．ウッツ、有機合成における保護基、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（１９９９年）（T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis,
3rd Ed., John Wiley and Sons (1999)）」、「Ｌ．フィーザーおよびＭ．フィーザー、フィーザーおよびフィーザーの試薬または有機合成、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（１９９４年）（L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents or Organic
Synthesis, John Wiley and Sons (1994)）」、および、「Ｌ．パケット編、有機合成のための試薬の百科事典、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（１９９５年）（L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,
John Wiley and Sons (1995)）」、およびそれらの後続版に記載されているものが挙げられる。
【００５３】
本明細書に記載されている合成法は、任意の図式に記載されている段階の何れかの前でも後でも、本明細書に記載されている化学式の化合物の合成を最終的に可能にするために、適切な保護基を追加または除去する段階を追加的に含むこともある。本明細書に描出されている方法は、１つの化学式の化合物を別の化学式の化合物に転換することを意図している。転換する工程は、その場で行うことができるか、あるいは中間化合物の単離を伴う、１つ以上の化学変換を指す。当該変換は、本明細書で引用されている参考文献中にあるものを含む、当該技術分野で知られている技術および実験計画法を用いて、出発化合物または中間体を追加の試薬と反応させることを含み得る。精製（例えば、濾過、蒸留、昇華、結晶化、研和、固相抽出、およびクロマトグラフィー）を伴うか否かにかかわらず、中間体を用いることができる。
【００５４】
本発明により想定される置換基および可変物の組み合わせは、安定化合物の形成を結果的にもたらすもののみである。
【００５５】
本発明は、有効量の本明細書における化合物、または、妥当な場合、前記化合物の医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは前駆薬、および許容可能な担体を含む組成物も提供する。好ましくは、本発明の組成物は医薬用途のために調合され（医薬組成物）、そこで、担体は医薬的に許容可能な担体である。１つ（または複数）の担体は、調合物の他の成分と相溶性があるという意味で「許容可能」でなければならず、かつ、医薬的に許容可能な担体の場合には、薬物中に典型的に用いられる量でその受容者に有害であってはならない。
【００５６】
本発明の医薬組成物において用いることができる、医薬的に許容可能な担体、補助剤、および媒介物としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩類等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素ジナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩類、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン等の塩または電解質、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩類、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の医薬組成物としては、経口、直腸、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）の投与に適したものが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書における化学式の化合物は、（例えば、経皮貼布を用いて）経皮的に投与される。他の調合物を、単位剤形、例えば、錠剤および持続放出型カプセルで、およびリポソームで便利に提供することができ、かつ、薬学の技術分野において十分に知られている任意の方法により調製することができる。例えば、「レミントンの薬科学、マック出版社、ペンシルヴァニア州、フィラデルフィア（第１７版、１９８５年）（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Philadelphia, PA (17th ed. 1985)）」を参照されたい。
【００５８】
このような調製法は、１つ以上の付属成分を構成する担体等の成分を、投与されることになる分子との関連に至らせる段階を含む。一般的に、本組成物は、活性成分を、液状担体、リポソームつまり微細化した固体担体、あるいはその両方との関連に均一にかつ密接に至らせ、その後必要であれば生成物を成形することにより調製される。
【００５９】
特定の好適な実施形態では、化合物は経口的に投与される。経口投与に適した本発明の組成物を、所定量の活性成分をそれぞれ含有するカプセル、小袋、または錠剤等の不連続単位として、粉末または顆粒として、水性液体または非水液体中の溶液または懸濁液として、または水中油型液状乳濁液もしくは油中水型液状乳濁液として提供することができ、あるいは、リポソーム中におよび急速静注薬などとして包装することができる。軟質のゼラチンカプセルは、化合物の吸収の速度を有益に増加させることができるような懸濁液を含有するのに有用であり得る。
【００６０】
随意に１つ以上の付属成分を用いて、圧縮または成形により錠剤を作ることができる。適切な機械内で、粉末または顆粒等の自由流動形態にある活性成分を、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤、または分散剤と随意に混合されて圧縮することにより、圧縮錠剤を調製することができる。適切な機械内で、不活性液状希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することにより、成形錠剤を作ることができる。当該錠剤を随意に被覆するかまたは刻み付けることができ、かつ、その中の活性成分の徐放つまり制御放出を提供するように調合することができる。本明細書におけるものおよび当該技術分野で知られている他の化合物等の、医薬的に活性な成分のこのような徐放または制御放出の組成物を調合する方法は、当該技術分野で知られかついくつかの発行された米国特許に記載されており、その一部としては、米国特許第４，３６９，１７２号、および第４，８４２，８６６号、および当該特許で引用されている参考文献が挙げられるが、これらに限定されない。化合物の腸への運搬のために、被覆剤を用いることができる（例えば、米国特許第６，６３８，５３４号、第５，２１７，７２０号、および第６，５６９，４５７号、第６，４６１，６３１号、第６，５２８，０８０号、第６，８００，６６３号、および当該特許で引用されている参考文献を参照されたい）。本発明の化合物のための有用な調合物は、腸溶層が酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む形態の腸溶性丸薬である。
【００６１】
経口用途のための錠剤の場合において、一般に用いられる担体としては、乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤も、典型的に添加される。カプセル形態における経口投与のために、有用な希釈剤としては、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁液が経口的に投与される際に、活性成分は乳化剤および懸濁剤と混合される。所望であれば、特定の甘味剤および／または香味剤および／または着色剤を添加してよい。
【００６２】
局所投与に適した組成物としては、通常は蔗糖およびアカシアまたはトラガカントである香味基礎中に成分を含む飴剤、ならびに、ゼラチンおよびグリセリン、または蔗糖およびアカシア等の不活性基礎中に活性成分を含む香錠が挙げられる。
【００６３】
非経口投与に適した組成物としては、調合物を対象とする受容者の血液と等張にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および溶質を含有することがある、水性および非水の無菌注入溶液、ならびに、懸濁剤および増粘剤を含むことがある、水性および非水の無菌懸濁液が挙げられる。調合物を、単位用量または多重用量の容器、例えば、封止したアンプルおよび薬瓶内で提供することができ、ならびに、使用の直前に、無菌液状担体、例えば注入用の水の添加のみを必要とする凍結乾燥（氷結乾燥）条件において貯蔵することができる。即時の注入溶液および懸濁液を、無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００６４】
このような注入溶液は、例えば、無菌注入可能な水性または油性の懸濁液の形態にあってよい。当該技術分野で知られている技術により、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０等）および懸濁剤を用いて、この懸濁液を調合することができる。無菌注入可能な調製物は、非毒性で非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注入可能な溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてであってもよい。使用することができる許容可能な媒介物および溶媒の中には、マンニトール、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来的に使用される。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性の固定油を使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は、注入剤の調製において有用であり、特にそのポリオキシエチル化型にある、オリーブ油またはヒマシ油等の、天然の医薬的に許容可能な油も同様である。こうした油の溶液または懸濁液は、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤を含有することもある。
【００６５】
直腸投与のための坐剤の形態で、本発明の医薬組成物を投与することができる。室温で固体であるが直腸温度で液体であり、そのため、直腸内で溶けて活性成分を放出することになる、適切な非刺激性の賦形剤と、本発明の化合物を混合することにより、こうした組成物を調製することができる。このような物質としては、ココアバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコール類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
経鼻の噴霧または吸入により、本発明の医薬組成物を投与することができる。このような組成物は、医薬調合の技術分野で十分に知られている技術により調製され、かつ、生理食塩水中の溶液として調製し、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生物利用可能性を高める吸収促進剤、フッ化炭素類、および／または、当該技術分野で知られている他の可溶化剤または分散剤を使用することができる。
【００６７】
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の治療が局所適用により容易に到達可能な領域または器官に影響を及ぼす際に特に有用である。皮膚への局所的な適用のためには、担体中に懸濁または溶存した活性成分を含有する適切な軟膏を用いて、本医薬組成物を調合するべきである。本発明の化合物の局所投与のための担体としては、鉱油、液状石油、白色石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、および水が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、担体中に懸濁または溶存した活性成分を含有する適切なローションまたはクリームを用いて、本医薬組成物を調合することができる。適切な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステル類、蝋、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物を、直腸坐剤調合物により、または、適切な浣腸調合物中で、下部腸管に局所的に適用することもできる。局所経皮貼布およびイオン導入投与も、本発明に含まれる。
【００６８】
特に好ましい誘導体および前駆薬は、本発明の化合物が（例えば、経口的に投与される化合物を血液中により容易に吸収することを可能にすることにより）哺乳類に投与される際に、このような化合物の生物利用可能性を増加させるか、あるいは、親種と比較して親化合物の生物学的区画（例えば、脳または中枢神経系）への運搬を強化するものである。好適な前駆薬としては、水溶性または腸膜を通じる能動輸送を強化する基が、本明細書に記載されている化学式の構造に付加される誘導体が挙げられる。例えば、「アレクサンダー・Ｊ．他、医薬品化学誌、１９８８年、第３１号、３１８〜３２２ページ（Alexander, J. et al. Journal of Medicinal Chemistry 1988, 31,
318-322）」、「バンガード・Ｈ．、前駆薬の設計、エルゼビア：アムステルダム、１９８５年、１〜９２ページ（Bundgaard,
H. Design of Prodrugs; Elsevier: Amsterdam, 1985; pp 1-92）」、「バンガード・Ｈ．、ニールセン・Ｎ．Ｍ．、医薬品化学誌、１９８７年、第３０号、４５１〜４５４ページ（Bundgaard, H.; Nielsen, N. M. Journal of Medicinal Chemistry 1987,
30, 451-454）」、「バンガード・Ｈ．、薬の設計および開発の教科書、ハーウッド・アカデミック出版：スイス、１９９１年、１１３〜１９１ページ（Bundgaard, H. A Textbook of Drug Design and Development; Harwood
Academic Publ.: Switzerland, 1991; pp 113-191）」、「ディゲニス・Ｇ．Ａ．他、実験薬理学の手引書、１９７５年、第２８号、８６〜１１２ページ（Digenis, G. A. et al. Handbook of Experimental Pharmacology 1975,
28, 86-112）」、「フリース・Ｇ．Ｊ．、バンガード・Ｈ．、薬の設計および開発の教科書、第２版、海外出版：アムステルダム、１９９６年、３５１〜３８５ページ（Friis, G. J.; Bundgaard, H. A Textbook of Drug Design and
Development; 2 ed.; Overseas Publ.: Amsterdam, 1996; pp 351-385）」、「ピットマン・Ｉ．Ｈ．、医薬品研究総説、１９８１年、第１号、１８９〜２１４ページ（Pitman, I. H. Medicinal Research Reviews 1981, 1, 189-214）」を参照されたい。
【００６９】
本治療法の適用は、関心部位に投与が行なわれるように局所的であり得る。関心部位に本組成物を提供するために、注入、カテーテル、套管針、発射体、プルロンゲル、ステント、持続薬物放出重合体、または内部到達を提供する他の機器の使用等の、様々な技術を用いることができる。
【００７０】
別の実施形態によれば、本発明は、移植可能な薬物放出機器を本発明の化合物または組成物と接触させる段階を含む、前記薬物放出機器を含浸させる方法を提供する。移植可能な薬物放出機器としては、生分解性重合体のカプセルまたは弾丸、非生分解性で拡散性の重合体のカプセル、および生分解性重合体の薄板が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
別の実施形態によれば、本発明は、化合物、または本発明の化合物を含む組成物で、前記化合物が治療的に活性であるように被覆された移植可能な医療機器を提供する。
【００７２】
別の実施形態では、本発明の組成物は第２の治療薬剤をさらに含む。第２の治療薬剤は、単独で、または、本明細書における化学式の何れかの化合物と投与される際に、有利な特性を有すると知られているかまたは実証する任意の化合物または治療薬剤を含む。こうした化合物と有用に組み合わせることができるだろう薬物としては、他のキナーゼ阻害剤、および／または、上記で検討されている疾患および障害の治療のための他の化学治療薬剤が挙げられる。
【００７３】
このような薬剤は、当該技術分野で詳細に説明されている。好ましくは、第２の治療薬剤は、癌から選択される疾患または容態の治療または防止において有用な薬剤である。
【００７４】
さらにより好ましくは、本発明の化合物と共調合された第２の治療薬剤は、癌、免疫障害、心血管疾患、ウイルス感染、炎症、代謝／内分泌の障害、および神経学的障害等の、キナーゼ媒介の疾患／障害の治療において有用な薬剤である。
【００７５】
別の実施形態では、本発明は、互いに関連する、本発明の化合物および第２の治療薬剤の別個の剤形を提供する。本明細書で用いられる際の「互いに関連する」という用語は、別個の剤形が共に包装され、またはそうでなければ、別個の剤形が（連続的または同時に、互いに２４時間未満以内に）一緒に販売、かつ投与されることを目的とすることが容易に明白であるように互いに付着されることを意味する。
【００７６】
本発明の医薬組成物において、本発明の化合物は有効量で存在する。本明細書で用いられる際に、「有効量」という用語は、適切な投与計画内で投与される際に、治療される障害の重症度、持続時間、または進行を低減するかまたは寛解させるのに十分であり、治療される障害の前進を防止し、治療される障害の後退を引き起こし、あるいは、別の治療の１つ（または複数）の予防効果または治療効果を強化または改善する量を指す。
【００７７】
動物およびヒトに対する用量の相互関係（体表面の１平方メートル当たりのミリグラム数に基づく）は、「フライライヒ他、（１９６６年）癌化学療法報告書第５０号：２１９ページ（Freireich et al., (1966) Cancer Chemother Rep 50: 219）」に記載されている。患者の身長および体重から、体表面積をおおよそ決定することができる。例えば、「科学表、ガイギー製薬、ニューヨーク州、アードリー、１９７０年、５３７ページ（Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N. Y., 1970, 537）」を参照されたい。本発明の化合物の有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまで、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ乃至約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ乃至約２．５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。有効用量も、当業者により認識されるように、治療される疾患、当該疾患の重症度、投与の経路、患者の性別、年齢、および一般的健康状態、賦形剤の利用、他の薬剤の使用等の他の治療処置との共利用の可能性、および治療する医師の判断に応じて変化することになる。
【００７８】
第２の治療薬剤を含む医薬組成物について、当該第２の治療薬剤の有効量は、その薬剤のみを用いる単独治療計画で通常利用される用量の約２０％および１００％の間である。好ましくは、有効量は通常の単独治療用量の約７０％および１００％の間である。こうした第２の治療薬剤の通常の単独治療用量は、当該技術分野で十分に知られている。例えば、「ウェルズ他編、薬物治療の手引書、第２版、アップルトン・アンド・ラング、コネティカット州、スタムフォード（２０００年）（Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton
and Lange, Stamford, Conn. (2000)）」、「ＰＤＲ薬局方、タラスコン小型薬局方２０００、豪華版、タラスコン出版、カリフォルニア州、ロマ・リンダ（２０００年）（PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe
Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)）」を参照されたく、その参考文献のそれぞれは、本明細書に参照により全体的に組み込まれている。
【００７９】
上記で参照されている第２の治療薬剤のいくつかは、本発明の化合物と相乗的に作用することになることが予想される。これが起こる際に、それにより、第２の治療薬剤および／または本発明の化合物の有効用量を、単独治療に必要とされるものから減らすことが可能になることになる。これは、第２の治療薬剤または本発明の化合物の何れか毒性の副作用の最小化、有効性における相乗的改善、投与または使用の改善した容易さ、および／または化合物の調製または調合の低減した全体の費用、という利点を有する。
【００８０】
治療の方法
１つの態様によれば、本発明は、対象者に有効量の化合物（例えば、単離した化合物、本明細書における化合物）または本発明の組成物を投与する段階を含む、疾患または障害またはその症状（例えば、本明細書で描出されているもの）を患っているか、またはこれらの影響を受けやすい前記対象者を治療する方法を提供する。このような疾患は当該技術分野で十分に知られており、かつ本明細書でも開示されている。
【００８１】
本方法は、組成物が、ヒカゲノカズラ（Lycopodium clavatum）の抽出物（例えば、ＢＣＰ−２１抽出物、表１または２内のＢＣＰ−２１抽出物画分の何れか）、または、本明細書における植物抽出物（例えば、ＢＣＰ−２１抽出物、表１または２内のＢＣＰ−２１抽出物画分の何れか）中に生じる単離した化合物（例えば、８−ヒドロキシヘキサデカン酸（８−ＨＨＡ）、本明細書におけるＢＣＰ化合物１〜１０の何れか）であるものをさらに含み得る。
【００８２】
本発明の１つの実施形態では、単離した化合物は、８−ヒドロキシヘキサデカン酸（「８−ＨＨＡ」）、またはその塩、前駆薬、前駆薬塩、溶媒和物、水和物、および多形体である。特定の実施形態は、当該化合物が、８−ヒドロキシ−パルミチン酸のＲ−エナンチオマーおよびＳ−エナンチオマーのラセミ混合物であることを規定している。１つの実施形態では、当該化合物は、８−ヒドロキシ−パルミチン酸のＳ−エナンチオマー（「（Ｓ）−８−ＨＨＡ」）である。別の実施形態では、当該化合物は、８−ヒドロキシ−パルミチン酸のＲ−エナンチオマー（「（Ｒ）−８−ＨＨＡ」）である。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の方法において用いられる化合物（または組成物）は、合成手段を通じて得られる。
【００８４】
本発明の１つの態様では、当該疾患または障害は、カスパーゼ媒介の疾患または障害である。
【００８５】
本発明の１つの態様では、当該疾患または障害は、カスパーゼ−３媒介の細胞死により媒介される。
【００８６】
本発明の１つの態様では、当該疾患または障害は、カスパーゼ−３媒介の疾患または障害である。
【００８７】
本発明の１つの態様では、当該疾患または障害は、細胞死を誘発することにより治療される。
【００８８】
本発明の１つの態様では、当該疾患または障害は、カスパーゼ−３により媒介される細胞死を誘発することにより治療される。
【００８９】
本発明の１つの態様では、当該疾患または障害をカスパーゼ−３により調節することができる。
【００９０】
１つの態様では、治療する方法は、増殖障害である障害またはその症状の治療を伴う。これらは、癌、腫瘍、腫瘍剤が適切である任意の疾患を含む。
【００９１】
本化合物、組成物、および治療の方法を用いて治療することができる癌の例としては、癌（例えば、白血病、肝臓癌、肺癌、結腸癌、ＣＮＳ癌、黒色腫、腎臓癌、およびカスパーゼ−３媒介癌）、アレルギー性障害、および炎症性障害が挙げられる。増殖障害、例えば、癌を患っているヒトまたは動物の患者を、そのため、上記で定義されている通りの本発明の化合物の当該患者への投与を含む方法により治療することができる。患者の容態を、それにより、改善するかまたは寛解させることができる。本発明の方法により治療可能な疾患および容態としては、癌および炎症性障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法により治療することができる癌としては、肝臓癌、肝細胞性、白血病、肺癌、結腸癌、ＣＮＳ癌、黒色腫、腎臓癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
１つの実施形態は、本発明の方法により治療可能な癌が、白血病、肺癌、肝臓癌、または結腸癌であることを規定している。１つの実施形態では、当該癌は肝臓癌である。別の実施形態は、当該癌が肺癌であることを規定している。１つの実施形態では、当該肺癌は非小細胞肺癌である。特定の実例は、本発明の方法により治療可能な癌が、ＨＯＰ−９２媒介の疾患（例えば、非小細胞肺癌）に関することを規定している。
【００９３】
さらに別の実施形態では、本発明の方法により治療することができる癌は、白血病である。
【００９４】
本明細書に描出されている方法としては、対象者が特定の所定の治療を必要としていると確認されるものが挙げられる。このような治療を必要としている対象者を確認することは、対象者または健康管理専門家の判断のうちにあり得、かつ、主観的（例えば、意見）または客観的（例えば、試験または診断法により測定可能）であり得る。
【００９５】
１つの実施形態では、本発明は、本明細書における化学式の何れかの１つ以上の化合物と細胞を接触させることを含む、細胞内のカスパーゼ酵素（例えば、カスパーゼ−３）活性を調節する方法を提供する。
【００９６】
別の実施形態では、上記の治療の方法は、前記患者に１つ以上の第２の治療薬剤を共投与するさらなる段階を含む。第２の治療薬剤の選択を、本明細書における適応症に有用であると知られている任意の第２の治療薬剤から行うことができる。
【００９７】
本明細書で用いられる際の「共投与される」という用語は、単一の剤形（上記に記載されているような本発明の化合物および第２の治療薬剤を含む、本発明の組成物等）の一部として、あるいは、別々の複数の剤形として、第２の治療薬剤を本発明の化合物と共に投与することができることを意味する。代替的には、本発明の化合物の投与より前に、これと連続して、またはこれの後に、追加の薬剤を投与することができる。このような組み合わせの治療処置では、本発明の化合物および１つ（または複数）の第２の治療薬剤の両方が、従来の方法により投与される。本発明の化合物および第２の治療薬剤を含む、本発明の組成物の対象者への投与は、治療の経過中の別の時間における、その同じ治療薬剤、任意の他の第２の治療薬剤、または本発明の任意の化合物の前記対象者への別個の投与を除外しない。
【００９８】
こうした第２の治療薬剤の有効量は当業者に十分に知られており、本明細書で参照されている特許および公開特許出願、ならびに、「ウェルズ他編、薬物治療の手引書、第２版、アップルトン・アンド・ラング、コネティカット州、スタムフォード（２０００年）（Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton
and Lange, Stamford, Conn. (2000)）」、「ＰＤＲ薬局方、タラスコン小型薬局方２０００、豪華版、タラスコン出版、カリフォルニア州、ロマ・リンダ（２０００年）（PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition,
Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)）」、および他の医学書で投薬の指針を見つけることができる。しかしながら、第２の治療薬剤の最適な有効量の範囲を決定することは、十分に当業者の能力が及ぶ範囲内にある。
【００９９】
第２の治療薬剤が対象者に投与される本発明の１つの実施形態では、本発明の化合物の有効量は、その有効量が当該第２の治療薬剤が投与されない場合のものより少ない。別の実施形態では、当該第２の治療薬剤の有効量は、その有効量が本発明の化合物が投与されない場合のものより少ない。このようにして、両方の薬剤の高い用量と関連する非所望の副作用を最小化することができる。他の潜在的な利点（制限なく、改善した投薬計画および／または低減した薬物費用を含む）は、当業者にとって明白であることになる。
【０１００】
さらに別の態様では、本発明は、上記で明記されている対象者における疾患、障害、または症状の治療または防止のための、単一の組成物または別個の剤形の何れかとしての薬物の製造における、単独での、または、上記に記載されている第２の治療薬剤のうち１つ以上と合わせての、本明細書における化学式の何れかの化合物の使用を提供する。本発明の別の態様は、本明細書に描出されている対象者における疾患、障害、またはその症状の治療または防止における使用のための、本明細書における化学式の化合物である。
【０１０１】
他の態様では、本明細書における方法としては、治療投与に対する対象者の応答を監視することをさらに含むものが挙げられる。このような監視は、治療計画の標識または指標としての、対象者の組織、体液、検体、細胞、タンパク質、化学標識、遺伝物質などの周期的な試料抽出を含み得る。他の方法では、当該対象者は、このような治療に対する適切性の関連する標識または指標に対する評価により、前検査されるかまたはこのような治療を必要としていると確認される。
【０１０２】
１つの実施形態では、本発明は治療経過を監視する方法を提供する。当該方法は、本明細書に描出されている障害またはその症状を患っているか、またはこれらの影響を受けやすい患者における、診断標識（標識）（例えば、本明細書における化合物により調節される、本明細書に描出されている任意の標的または細胞型）の濃度の決定、または診断測定（例えば、検査、検定）の段階を含み、ここで、この対象者は、疾患またはその症状を治療するのに十分な治療量の本明細書における化合物を投与されている。当該方法において決定される標識の濃度を、健常な通常の対照または他の罹患した患者の何れかにおける標識の既知の濃度と比較し、対象者の疾患状態を確証することができる。好適な実施形態では、対象者における標識の第２の濃度は、第１の濃度の決定より遅い時点で決定され、２つの濃度は、疾患の経過または治療の有効性を監視するために比較される。特定の好適な実施形態では、対象者における標識の前治療濃度は、本発明による治療を始めるより前に決定され、この標識の前治療濃度を、その後、治療を開始した後の対象者における標識の濃度と比較し、治療の有効性を決定することができる。
【０１０３】
特定の方法の実施形態では、対象者における標識の濃度または標識活性は、少なくとも１回決定される。標識濃度の、例えば、同じ患者、別の患者、または通常の患者から前にまたは後に得られる標識濃度の別の測定結果との比較は、本発明による治療が所望の効果を有しているかどうかを決定する際に有用であり、それにより、投薬濃度の調節を必要に応じて可能にすることができる。当該技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている、任意の適切な試料抽出法／発現検定法を用いて、標識濃度の決定を行うことができる。好ましくは、組織または体液の試料は対象者から最初に取り出される。適切な試料の例としては、血液、尿、組織、口または頬の細胞、および毛根を含有する毛髪試料が挙げられる。他の適切な試料が、当業者に公知であろう。当該試料中のタンパク質濃度および／またはｍＲＮＡ濃度（例えば、標識濃度）の決定を、酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ、放射標識技術／検定技術、吸い取り法／化学発光法、実時間ＰＣＲ、および同様のものを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を用いて行うことができる。
【０１０４】
本発明の化合物の使用
本発明は、本明細書に描出されているものを含む、疾患、障害、またはその症状を治療する使用のためのキットも提供する。こうしたキットは、ａ）本明細書における化学式の何れかの１つ以上の化合物もしくはその塩、またはその前駆薬もしくはその前駆薬の塩、またはその水和物、溶媒和物、もしくは多形体を含む医薬組成物（例えば、本明細書における組成物、本明細書における任意の特定の化合物）であって、前記医薬組成物が容器内にある、医薬組成物と、ｂ）当該医薬組成物を用いて、本明細書に描出されているものを含む、疾患、障害、またはその症状を治療する方法を説明している取扱説明書と、を備える。放射線治療の実施と逐次的に、または同時に、当該化合物／組成物を投与することができる。
【０１０５】
当該容器は、前記医薬組成物を保持することができる、任意の器あるいは他の封止された装置または封止可能な装置であってよい。例としては、瓶、各区分または室が単一用量の前記組成物を含む分割型または多室型の保持瓶、各区分が単一用量の前記組成物を含む分割型箔包、または、単一用量の前記組成物を分注する分注器が挙げられる。当該容器は、医薬的に許容可能な物質で作られる、当該技術分野で知られているような任意の従来の形状または形態にあり、例えば、紙または段ボール箱、ガラスまたはプラスチックの瓶または広口瓶、再封止可能な袋（例えば、異なる容器内への配置のために錠剤の「補充分」を保持する）、または、治療予定により包装から押し出すための各個の用量を有するブリスターパックであってよい。使用される容器は関連する的確な剤形に依存し得、例えば、従来の段ボール箱は一般的に液状懸濁液を保持するために用いられることはないだろう。単一の剤形を市販するために、１つより多くの容器を単一の包装内において共に用いることができることが可能である。例えば、錠剤を瓶内に包含することができ、これは同様に箱の中に包含される。好ましくは、当該容器はブリスターパックである。
【０１０６】
当該キットは、医師、薬剤師、または対象者のための情報および／または取扱説明書を追加的に備え得る。このような記憶補助としては、そのように規定される錠剤またはカプセルが対象者に摂取または投与されるべきである投与計画の日数と一致する投薬量を包含する各室または区分上に印刷される数、または各室または区分上に印刷される週の日数、または同じ種類の情報を含有するカードが挙げられる。１つの態様では、当該取扱説明書はさらに、対象者への放射線管理に関する。
【０１０７】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に明記されている対象者における疾患、障害、または症状の治療または防止のための、単一の組成物または別個の剤形の何れかとしての薬物の製造における、単独での、または、１つ以上の追加の治療薬剤と合わせての、本発明の一つの化合物（または複数の化合物の組み合わせ）の使用を提供する。本発明の別の態様は、本明細書に描出されている対象者における疾患、障害、またはその症状の治療または防止における使用のための、本発明の一つの化合物（または複数の化合物の組み合わせ）である。
【０１０８】
本明細書で引用されている全ての参考文献は、印刷媒体、電子媒体、コンピュータ可読記憶媒体、または他の形態にあるかどうかにかかわらず、参照により全体として明確に組み込まれ、要約書、記事、機関誌、刊行物、教科書、論文、技術資料集、インターネットウェブサイト、データベース、特許、特許出願、および特許公開を含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１０９】
実施例
一般的な手順：
用いた溶媒（ＣＤＣｌ３）を参照したＪＥＯＬ  ＥＣＬＩＰＳＥ  ４００  ＭＨｚ  ＮＭＲの分光計にて、ＮＭＲスペクトルを取得した。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性モード）をＨｉｔａｃｈｉ  Ｍ−８０００の質量分光計を用いて得た。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＺＢ−ＷＡＸのカラム（３００ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｍ）およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ５８９０のガスクロマトグラフィーを有する、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ５９７  ＩＡの質量分光計（範囲：７０〜５５０ａｍｕ）を用いて分析を行った。
【０１１０】
ＨＰＬＣ検定法１（逆相法）：この勾配法を用いて、抽出物およびカラムの画分を検定することができる。そのカラムは、４．６×１００ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（２）、３μ  Ｃ１８カラム（ＰＩＮ  ００Ｄ−４２５１−ＥＯ）である。流速は１．０ｍＬ／分、温度は４０℃、注入は１０μＬである。検出は、ＥＬＳＤおよび２００ｎｍでのＵＶである。順相クロマトグラフィーの試料を蒸発させ、注入する前にアセトン中で元に戻す。
【０１１１】
ＨＰＬＣ検定法２（順相法）：この勾配法を用いて、カラム画分および最終生成物を検定することができる。そのカラムは、４．６×２５０ｍｍ、５μ、Ａｌｌｔｅｃｈ、Ａｄｓｏｒｂｏｓｉｌのシリカカラム（Ｐ／Ｎ  ２９８０１７）である。移動相：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、流速は１．０ｍＬ／分、温度は４０℃、注入は１０μＬである。検出はＥＬＳＤである。順相クロマトグラフィーの試料を直接的に注入することができ、注入する前に固体試料をＥｔＯＡｃ中で元に戻す。アセトン溶液を用いれば、ブロードまたは二重ピークを与え得るだろう。
【０１１２】
ＨＰＬＣ画分のアポトーシス活性についての生物検定：１００，０００個のＨｅＬａ細胞／穴を、２４穴の細胞培養板中に蒔いた。その細胞を、２４時間にわたり細胞培養恒温器内で成長させた。２４時間後に、ＢＣＰ２１の精製から生じた化合物でその細胞を処理した。その精製の最中にＨＰＬＣにより発生させた画分を乾燥させ、ＤＭＳＯ中で再懸濁させた。各画分中の３つの異なる濃度の化合物でその細胞を処理した。その細胞を２４時間後に採取し、アポトーシス（細胞死）（％）を決定した。その細胞をトリパンブルーで処理し、細胞死を推定した。１０％未満の細胞死を＋と標識付け、一方で、１００％を＋＋＋＋により表し、５０および７５％を＋＋および＋＋＋でそれぞれ標識付けた。
【０１１３】
実施例１．ヒカゲノカズラ（Lycopodium
clavatum）からの抽出および単離
ＢＣＰ−２１の単離：ヒカゲノカズラ（Lycopodium clavatum）の胞子を、９５％のエタノールを用いて抽出する。その結果として生じた抽出相を混合し、９５％のエタノール中の溶液として貯蔵することができるか、あるいは濃縮することができる。
【０１１４】
抽出物の蒸発および分割：ＢＣＰ２１のエタノール溶液（１Ｌ）を４５℃にて真空下で蒸発させ、少量の沈殿物を含有する懸濁液を与えた。５０ｍＬの水をその懸濁液に添加し、２００ｍＬの塩化メチレン（ＭＣ）で分割した。そのＭＣ層を分液漏斗内で分離して蒸発乾固させ、１８．９ｇの油性残留物を与えた。その水層を乾燥させ、２．８４ｇの固体を与えた。ＢＣＰ２１のエタノール抽出物およびＭＣ可溶性残留物のＨＰＬＣ特性描写を行った。
【０１１５】
実施例２．４０ＭのＳｉｌｉｃａ  Ｂｉｏｔａｇｅの分画：
前述したＭＣ可溶性残留物が活性化合物を含有していると生物検定が示したので、５ｇのこの物質を１５ｍＬのＭＣ中に溶解させ、８００ｍＬのヘキサンで平衡化させていた４０Ｍのシリカカートリッジ上に装填した。１０％のアセトン／ヘキサン（Ａ／Ｈ）（１Ｌ）、２０％のＡ／Ｈ（１Ｌ）、２５％のＡ／Ｈ（１．２Ｌ）、およびアセトン（０．５Ｌ）と共に、そのカラムを溶出させた。生物検定の結果に基づき、２５％のＡ／Ｈ溶出液のＦ５乃至Ｆ８、およびＦ９乃至Ｆ１１を混合して窒素流により乾燥させ、２６１５−１８２−８（４３．４ｍｇ）および２６１５−１８２−９（３６．３ｍｇ）をそれぞれ与えた。表１は、アポトーシス検定により導いた画分試料抽出の結果を詳記している。
【表１】
0005748670.tif 000002
【０１１６】
実施例３．１２ＭのＳｉｌｉｃａ  Ｂｉｏｔａｇｅの分画：
前述した溜めた活性生成物２６１５−１８２−８（４３．４ｍｇ）を、２ｍＬの３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン中に５０℃にて溶解させ、１００ｍＬの３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで平衡化させた１２ＭのＢｉｏｔａｇｅのシリカカートリッジ上にその溶液を注入した。６０ｍＬの３５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１００ｍＬの４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、６０ｍＬの４５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、６０ｍＬの８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンと共にそのカラムを溶出させ、２６個の画分を得た。１ｍＬのそれぞれを乾燥後に生物検定へ送った。各画分の残りの溶液を乾燥させて重量を得た。表２は、アポトーシス検定により導いた画分試料抽出の結果を詳記している。
【表２】
0005748670.tif 000003
【表３】
0005748670.tif 000004
【０１１７】
実施例４．検定のための試験化合物試料の調製。
前述した化合物の画分の調製を、下記の通りに表４に描出しているものに従って行った：
【表４】
0005748670.tif 000005
【０１１８】
実施例５．ラセミ８−ヒドロキシパルミチン酸（「８−ＨＨＡ」）の合成
【化１】
0005748670.tif 000006
ラセミ８−ヒドロキシパルミチン酸の合成についての合成図式
【０１１９】
２つの三つ口フラスコは、気体注入補助具、隔壁、および撹拌子を備えており、その後、フラスコをアルゴンで浄化した。スベリン酸モノメチルエステル（１０．０ｇ、５３．１ｍｍｏｌ、１当量）を、ＴＨＦ（３８０ｍＬ、０．１７Ｍ）中に１つのフラスコ内で溶解させた。トリエチルアミン（０．９５ｍＬ、６４．１ｍｍｏｌ、１．２当量）を徐々に（４分にわたり、気密注射器を用いて）添加し、その混合物を室温で１．２５時間にわたり撹拌した。無水ＤＣＭ中でＰＰｈ３Ｃｌ２（２４．４ｇ、７３．２ｍｍｏｌ、１．４当量）から別個の溶液を作り、これは後で＜３０℃に冷却される。そのスベリン酸溶液を、黄色のＰＰｈ３Ｃｌ２溶液に滴下して添加し、２時間にわたり−３５乃至−２０℃で撹拌した。そのグリニャール試薬を、その後、温度を−４１乃至−７℃に維持しつつ、４５分にわたり滴下して添加した。その反応混合物を１．５時間にわたり撹拌し、その後、依然として冷たい間に２ＮのＨＣｌ（７５ｍＬ）で反応停止した。２０分にわたり撹拌した後に、その黄色は薄れる。薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０、２５％のアセトン／ヘキサン類）が、２つの主生成物のスポットに加えてＰＰｈ３およびＯＰＰｈ３として反応混合物を与える。
【０１２０】
その反応混合物を、酢酸エチル（２００ｍＬ）および２ＮのＨＣｌ（２００ｍＬ）と共に分液漏斗に添加した。その有機層を収集し、その水層を２×８０ｍＬの酢酸エチルで逆抽出した。１つにまとめた有機相を、ＮａＨＣＯ３（飽和溶液、２×９０ｍＬ）で洗浄することにより中和し、その後塩水（９０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４（２０ｇ、３０分）で乾燥させ、濾過し、２５℃で回転蒸発させ、高真空下で３時間にわたり乾燥させた。酢酸エチルを除去するために、その物質を２０ｍＬのＤＣＭと混合して再蒸発させ、３３ｇの粗製物質を与える。
【０１２１】
その粗製物質を、１０％のアセトン／ＤＣＭ中に取り出し、シリカゲル栓（２４０ｍｌ）上に装填し、４ＣＶの１０％のアセトン／ＤＣＭで洗い流した。その第１の栓は１０．４ｇのＯＰＰｈ３を除去し、第２の栓は６．８ｇのＯＰＰｈ３を除去した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製を継続し、その中で、５×２９ｃｍのカラムを１０％のアセトン／ヘキサン類中のシリカゲル６０で充填する。５５％のＤＣＭ／ヘキサン類の最小体積で、その粗製物質を装填した。所望の化合物を、１０％のＤＣＭ／５％のアセトン／８５％のヘキサン類と共に溶出させる。１つの画分の蒸発および乾燥は、２．７ｇの化合物１（８−ケトパルミチン酸メチルエステル）を与え、いくつかの不純な画分上の反復カラムは、さらに２．０ｇの化合物１を与えた。全収率は、スベリン酸モノメチルエステルに基づいて３１％であった。化合物１（８−ケトパルミチン酸メチルエステル）は、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中）：３．６５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），２．３７（ｍ，２Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２），２．２９（ｔ，２Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２），１．５７および１．２８（ｂｒ．，２２Ｈ，ＣＨ２），０．８７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３末端）により同定した。
【０１２２】
化合物１（２．８６ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのエタノール中に溶解させ、氷浴内で冷却した。水素化ホウ素ナトリウム（１．９ｇ、５９．５ｍｍｏｌ）を、一部分ずつ１〜１７Ｃで添加した。その反応をＴＬＣ（２５％のアセトン／ヘキサン類中で展開した板）により監視し、そこで、Ｒｆは、ケトンについて０．５６であり、メチルエステルについて０．２８であった。固体ＮａＢＨ４の追加分を、出発物質を全く検出しなくなるまで２時間の期間にわたり添加した（全部で６０当量を用いた）。その反応を、２ＮのＨＣｌ（６０ｍＬ）をその冷溶液にゆっくり添加することにより停止し、分液漏斗に移し、ＤＣＭ（３×３５ｍＬ）で洗浄した。１つにまとめた有機層を、ＮａＨＣＯ３（飽和、３５ｍＬ）および塩水（３５ｍＬ）で洗浄し、その後ＭｇＳＯ４で乾燥させ（７ｇ、３０分）、濾過し、回転蒸発させて澄んだ油を与え、これは４℃で貯蔵する際に白色で蝋状の固体となった（収量は２．８６ｇ）。
【０１２３】
その物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル６０、２０％のアセトン／ヘプタン）により精製した。回転蒸発乾固させた後は、その化合物は油であり、高真空上で乾燥させた後は、その生成物は白色で蝋状の固体である。その１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は、その優勢生成物を、少量の未知の不純物を有する化合物２として示した。化合物２（８−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステル）は、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中）：３．６６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），（ｂｒ，１Ｈ，メチン），２．２９（ｔ，２Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２），１．６２および１．３１（ｂｒ．，２８Ｈ，ＣＨ２），０．８７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３末端）により同定した。
【０１２４】
化合物２（１．９７ｇ、６．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２８ｍＬ）中に溶解させた。水酸化リチウムを水（Ｎａｎｏｐｕｒｅ、１５ｍＬ）中に溶解させ、５分撹拌して溶解した。そのＬｉＯＨ溶液を、５分にわたりそのエステル溶液にゆっくり添加し、室温で撹拌した。その生成物が消え、新たなスポットが基線に現れるまで（４時間）、その反応をＴＬＣ（２０％のアセトン／ヘキサン）により監視した。単離精製操作は、その反応混合物を回転蒸発させ、揮発物を除去し、豊富な白色の固体を得ることを伴った。その固体をＤＣＭですすぎ、その後、２ＮのＨＣｌ（固体はほとんど不溶）およびクロロホルムと混合した。その水層をＣＨＣｌ３（３×７５ｍＬ）３で抽出した。１つにまとめた有機相を、塩水およびＭｇＳＯ４で乾燥させ（３０分）、その後濾過し、回転蒸発させ、高真空下で一晩にわたり乾燥させ、１．６７ｇの白色の固体を最終生成物として得た（８９％の収率）。
【０１２５】
その最終生成物の分析は、８−ヒドロキシ−パルミチン酸としての同定を、その優勢生成物として支持した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中）：５．５（非常に広範，１Ｈ，ＯＨ），３．５８（ｂｒ，１Ｈ，メチン），２．３４（ｔ，２Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２），１．６４および１．３３，（ｂｒ．，２８Ｈ，ＣＨ２），０．８７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３末端）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中）：１７８．４０，７２．０８，３７．５９，３７．４３，３３．７９，３１．９７，２９．７９，２９．６８，２９．３７，２９．０９，２５．７３，２５．５１，２４．６９，２２．７６，１４．２０。ＬＣ−ＭＳ（ＡＣＮ−ＮＨ４ＯＨ中でＥＳＩモード）。親イオン  ２７１．１３  ｍ／ｚ，理論：２７２（１００％）  ２７３（１７％）。融点：７０．５℃。
【０１２６】
実施例６．（Ｓ）−８−ヒドロキシパルミチン酸および（Ｒ）−８−ヒドロキシパルミチン酸の両方の合成
Ｒ、Ｓ、またはラセミ１，２エポキシデカンの１，２−デカンジオールからの形成
【化２】
0005748670.tif 000007
塩基の存在下における、ラセミ１，２−デカンジオール類の塩化ｐ−トルエンスルホニルとの反応は、所望の第一級トシル酸塩、ビス−トシル酸塩、および少量の第二級トシル酸塩の混合物を与えることが知られている（「韓国化学会会報、２００９年、第３０巻、第７号、１６７１−４（Bull. Korean Chem. Soc. 2009 Vol. 30, No. 7, 1671-4）」）。任意の第二級トシル酸塩の発生は、２位での閉環の最中における立体中心の反転が原因で、その結果として生じるエポキシドの立体化学的純度に不利に影響し得るだろう。
【０１２７】
この反応では、１０ｍｌの無水ジクロロメタン中の２３．９ｍｌ（０．１７２ｍｏｌ、３．０当量）のトリエチルアミンを、１０．００ｇ（０．０５７４ｍｏｌ）の１，２（Ｓ）−デカンジオール（９９．５％、「Ｓ」）、１３．７ｇ（０．０７１７ｍｏｌ、１．２５当量）の塩化ｐ−トルエンスルホニル、０．７０ｇ（０．００５７４ｍｏｌ、０．１０当量）かつ３０ｍｌの無水ジクロロメタンの溶液に、＜１０℃において、ゆっくり４０分の期間にわたり添加した。２０分にわたり＜１０℃で撹拌した後に、その反応はＴＬＣ（１００％のＣＨ２Ｃｌ２）により完了した。室温に温めた後に、２００ｍｌのＭＴＢＥおよび１２０ｍｌの１ＭのＨＣｌの添加により、その生成物の混合物を有機相に分配した。その有機層を、１×８０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液、１×８０ｍｌの水、および１×８０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムでの乾燥および濃縮は、直接的にエポキシドへの転換まで進めた２１．７ｇの残留物を結果的にもたらした。この残留物を２１７ｍｌの無水ＴＨＦ中に溶解させ、９．６４ｇ（０．０８６ｍｏｌ、１．３０当量）のカリウムｔ−ブトキシドを室温で冷却することなしに添加した。３０分後に、その反応はＴＬＣ（１０：１のヘプタン／酢酸エチル）により完了した。その反応を１００ｍｌの水の添加により停止し、ＴＨＦを真空中で除去した。その生成物の混合物を３００ｍｌのＭＴＢＥ中に分配し、その水層を１×５０ｍｌのＭＴＢＥで逆抽出した。１つにまとめた有機物を、その後、１×８０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムでの乾燥および濃縮は、１０．４ｇの残留物を結果的にもたらした。その残留物を短経路蒸留し、１，２（Ｓ）−エポキシデカンを約６０℃および１ｍｍｇＨｇで収集した。＞９９％のＧＣ−ＭＳ純度、６８％の回収率で、６．１１ｇを結果的にもたらした。
【０１２８】
臭化アルケニルマグネシウム類のＲ、Ｓ、またはラセミ１，２−エポキシデカンとの反応
【化３】
0005748670.tif 000008
グリニャール試薬の形成、およびラセミまたは不斉の１−エポキシデカンへの添加を、文献の手順に従って行った（「有機化学誌、２００９年、第７４号、５０６３〜５０６６ページ（J. Org. Chem. 2009, 74, 5063-5066）」）。そのグリニャール試薬を、自己連結生成物を最小化するために約０．５Ｍで＜１０℃にて調製した。そのグリニャール試薬を滴定する試みを全く行わず、それらを０．５Ｍであると想定した。マグネシウムの削り屑を活性化してそのグリニャール反応を開始させるために、Ｉ２の添加を必要としなかった。
【０１２９】
乾燥した２５０ｍｌのフラスコに、Ｎ２下、ＴＨＦ（上記で調製した通り）中で約０．５Ｍの９８ｍｌ（０．０４９ｍｏｌ、１．５当量）の臭化ヘプト−６−エニルマグネシウムを投入する。そのフラスコの内容物を、撹拌しながら−４０℃に冷却する。１．２４ｇ（０．００６５３ｍｏｌ、０．２０当量）のヨウ化銅（Ｉ）を、そのフラスコに投入する。−４０℃で０．５時間後に、５１ｍｌの無水ＴＨＦ中の５．１０ｇ（０．０３２６ｍｏｌ）の１，２（Ｓ）−エポキシデカンの溶液を、少なくとも１時間にわたり−４０±５℃でゆっくり添加する。その添加の完了後、−４０℃で２時間にわたり撹拌し続け、その後、その反応は、通常、ＴＬＣ（ヘプタン中で４０％のＥｔＯＡｃ）により完了する。完了後に、５００ｍｌのＭＴＢＥ、１２５ｍｌの飽和塩化アンモニウム、および５０ｍｌの水を添加し、１５分にわたり十分に混ぜる。層を切り、その有機物を、１部の飽和塩化アンモニウムおよび１部の水の混合物１００ｍｌで洗浄する。その有機物を、その後、３×１００ｍｌの水、１×５０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、静置の際に凝固する油になるまで濃縮する（８．６ｇの結果物）。その生成物を、２２０ｇのシリカ上でクロマトグラフィーに掛け、いかなる非極性不純物をも除去するために５００ｍｌのヘプタンで最初に溶出し、その後、１０：１（ｖ：ｖ）のヘプタン／酢酸エチルで溶出する。その生成物を含有する画分を溜めて濃縮し、８．１１ｇ（９７．６％の収率）の９（Ｓ）−ヒドロキシヘプタデス−１−エンを、ＧＣ−ＭＳで９６．７％純粋である蝋状の固体として得る。
【０１３０】
【化４】
0005748670.tif 000009
１．５０当量の塩化ｔ−ブチルジメチルシリルの、２．０当量のイミダゾールを塩基として有するアルケノール類のＴＨＦ溶液への添加により、アルコールの保護を達成した。概して、室温で１６〜２０時間後に、その反応は９２〜９６％完了した。追加の塩化ＴＢＳおよびイミダゾールは、その反応を完了まで完全には推進しなかった。ヘプタンへの分配を伴う酸性で水性の単離精製操作は、酸感受性のＴＢＳにより保護したアルコールの分解なしに、イミダゾールの除去を可能にした。シリカ上のヘプタンを用いたフラッシュクロマトグラフィーは、その残余の未反応のアルコールを容易に除去し、その中間体を高い純度（ＧＣ−ＭＳで＞９９％）をもって単離することを可能にした（１３６２−４２、４５、８６、１３４１−８９、１３８０−１５に留意されたい）。
【０１３１】
ＴＢＳにより保護した酸へのオゾン分解／ピニック酸化の経路
【化５】
0005748670.tif 000010
１３８ｍｌのジクロロメタンおよび１３８ｍｌのメタノール中の９．８３ｇ（０．０２６７ｍｏｌ）の９（Ｓ）−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ヘプタデス−１−エン、０．１０ｇ（０．０００２７ｍｏｌ、０．０１当量）のスーダンレッド７Ｂの溶液を、−２５±５℃にてオゾンで処理した。指示薬の色が脱色した後に、オゾンの添加をさらに６〜７分にわたり継続した。その溶液に、その後Ｎ２を少なくとも３０分にわたり注入する。１３．９９ｇ（０．０５３３ｍｏｌ、２．００当量）のトリフェニルホスフィンの溶液を、その後４〜５分にわたり＜−１５℃で添加し、その後室温に温まるようにした。３０分にわたり室温で撹拌した後に、その反応をＧＣ−ＭＳにより検査し、１．２５時間および３時間で再び検査する。全ての３回の検査は、同じ濃度のトリフェニルホスフィン、酸化トリフェニルホスフィン、および生成物を概して示し、オゾン化物が消費されたことを示す。その反応混合物を、その後糊状の固体になるまで濃縮し、（メタノールを除去するために）１００ｍｌのジクロロメタンから１回再濃縮する。その残留物を、その後、ヘプタン、続いて２０：１のヘプタン／酢酸エチルと共に溶出する、３００ｇのシリカ上でクロマトグラフィーに掛けた。その生成物を含有する画分を溜めて濃縮し、ＧＣ−ＭＳで３１％のトリフェニルホスフィンを依然として含有する１３ｇの油を与える。その油を５００ｇのシリカ上で再度クロマトグラフィーに掛け、そのトリフェニルホスフィン濃度はその時１３％であった。この油を１００ｍｌのジクロロメタン中に溶解させた。０．４６ｍｌ（０．００７４ｍｏｌ）のヨードメタンを添加し、その混合物を一晩にわたり撹拌し、その後、トリフェニルホスフィンの全てが消費されていた（ＧＣ−ＭＳにより監視した）。最後に、その生成物を、１０：１のヘプタン／酢酸エチルと共に溶出する、２００ｇのシリカ上でフラッシュクロマトグラフィーに掛けた。濃縮後に、８．００ｇ（８９％の収率）の８（Ｓ）−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ヘキサデカナールを、９８．７％のＧＣ−ＭＳ純度をもって結果的にもたらした。
【０１３２】
３１５ｍｌのｔ−ブタノール中の３．７９ｇ（０．０１０２ｍｏｌ）の８（Ｓ）−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ヘキサデカナールの溶液に、１２５ｍｌの水中の８．４９ｇ（０．０９３９ｍｏｌ、９．１７当量）の亜塩素酸ナトリウムおよび８．５０ｇ（０．０７０８ｍｏｌ）のリン酸二水素ナトリウムの溶液を、室温で３０分にわたり添加した。その温和な発熱を水浴により制御した。一晩にわたり撹拌した後に、その反応はＴＬＣ（１：１：０．０１のヘプタン：ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ）により完了した。ｔ−ブタノールを真空中で除去した。その残留物を２００ｍｌの水および３００ｍｌのヘプタン中に溶解させ、その後、８０ｍｌの１．０ＭのＨＣｌを添加した。その結果として生じたヘプタン層を、３×１００ｍｌの水、１×７５ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、３．７９ｇ（９５．７％の収率）の８（Ｓ）−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ヘキサデカン酸（ＧＣ−ＭＳで９９．４％の純度）を（ＴＭＳＣＨＮ２からのメチルエステルとして）得た。
【０１３３】
ＴＢＳ保護基の除去および８（Ｓ）−ヒドロキシパルミチン酸の精製
【化６】
0005748670.tif 000011
３．７９ｇ（０．００９８０ｍｏｌ）の８（Ｓ）−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ヘキサデカン酸、４８ｍｌのＡＣＮ、および２．１３ｍｌ（０．０５９ｍｏｌ、６当量）の４８％のフッ化水素酸を混合し、１時間にわたり撹拌した。２０〜３０分後に、その油性の混合物は懸濁液となる。１時間後に、その出発物質を完全に消費した（ＴＬＣ（１：１：０．０１のヘプタン：ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ）により監視した通り）。完了の際に、３００ｍｌのＭＴＢＥおよび３００ｍｌの水を添加し、徹底的に混ぜた。その水層を除去し、その有機層を、３×１００ｍｌの水、１×１００ｍｌの飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、２．５０ｇの固体を得た。その固体はこの時点で９５．６％ｅｅであった（１３８０−５１に留意されたい）。その固体を４０ｍｌの熱いＡＣＮ中に溶解させ、撹拌しながら冷ました。その結果として生じた懸濁液を、＜１０℃に３０分にわたり冷却し、濾過により収集し、２０ｍｌの冷たいＡＣＮで洗浄し、真空下にて４０℃で乾燥させ、２．１８ｇ（８２％の収率）の８（Ｓ）−ヒドロキシパルミチン酸が得られ、それは、ＧＣ−ＭＳで＞９９％であり（ＴＭＳＣＨＮ２からのメチルエステルとして）、ＨＰＬＣ−ＭＳで９８．４％ｅｅであった。
【０１３４】
８（Ｒ）エナンチオマーを与える光延反転
【化７】
0005748670.tif 000012
８−ヒドロキシ酸の立体中心を光延条件下で反転させるためには、カルボン酸をそのメチルエステルとして保護する必要があった。最初は小規模に、ジアゾメタンを転換の迅速で効率的な方法として用いた。ジアゾメタンの危険な性質のために、より安全な代替物、ＴＭＳジアゾメタンをより大規模に用いた。ＭＴＢＥ／メタノール中の酸を完全にエステル化するために、２．６当量のＴＭＳジアゾメタンを必要とした。立体中心を光延条件下で酢酸を用いて反転させる試みは、決して理想的でないと判明した。４−ニトロ安息香酸を置換する同じ条件（「有機合成、全集第９巻、６０７ページ（Organic Synthesis, Collective Volume 9, page 607）」）は、８（Ｒ）−４−ニトロ安息香酸塩を清浄に提供した。ＴＨＦ／水中のＬｉＯＨを用いた鹸化、続いてＡＣＮからの再結晶は、ＨＰＬＣ−ＭＳで１００％ｅｅである所望の８（Ｒ）−ヒドロキシパルミチン酸を提供した。
【０１３５】
実施例７：Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ検定によるＨｅＬａ細胞の生存能の決定のための一般的な検定手順。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ還元法による細胞生存能の評価は、候補薬物の細胞傷害能を例解するために日常的に用いられる。Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅは、細胞代謝中間体により桃色の蛍光染料のレゾルフィンに転換される、青色の非蛍光染料のレサズリンを利用することにより、細胞生存能を検出する。本検定から発生した蛍光信号は、試料中の生細胞の数に比例する。Ｔ−７５フラスコ内で成長させた集密的なＨｅＬａ細胞（７０〜８０％）を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離した。遠心分離に続いて、その細胞の沈渣をＤＭＥＭ媒体中で再懸濁させ、血球計を用いて計数した。細胞を９６穴板に１０，０００細胞／１００μｌ／穴の密度で播種し、３７℃／５％のＣＯ２で８時間にわたり培養した。媒体を除去し、試験化合物を１００μｌの体積で添加した。その板を２２時間、４６時間、および７０時間にわたり培養し、その後、穴１つ当たり１０μｌのａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅを添加した。試験化合物での２４時間、４８時間、および７２時間の終わりに、マイクロプレートリーダーを用いて５３０ｎｍの励起および５９０ｎｍの発光で蛍光を測定した。対照（％）として表現した生存能を、薬物濃度に対して描図した。テルフェナジンを実験計画法における参照化合物として用い、これは、再現可能なＩＣ５０値を有する全ての時点（２４時間、４８時間、および７２時間）において用量依存的な阻害を示した。異なる化合物は異なる生存能を示した。
【０１３６】
実施例８．実施例７の検定のデータ分析。２つの反復サンプルとしての穴の平均値を算出した。対照細胞の生存能を、全ての試験濃度について１００％と考えた。試験試料の細胞生存能の百分率を、
【数１】
0005748670.tif 000013
として算出した。Ｓ字状の用量応答（変数）等式（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４のソフトウェア）を用いて、薬物濃度に対する百分率生存能データの非線形回帰分析（曲線適合）により、ＩＣ５０値を決定した。ＢＣＰ−６およびＢＣＰ−７は、細胞に対する格別の影響を実証した。
質的管理：本検定を以下の質的検査について評価した：
ｉ．参照化合物のＩＣ５０値：テルフェナジンのＩＣ５０値
ｉｉ．反復サンプル間の変動係数（％）：反復サンプル間のＣＶ（％）は許容可能限界（１０％）以内であった。
【０１３７】
実施例９．試験化合物試料の調製。前述した化合物の画分の調製を、表５に描出したものに従って行った。
【表５】
0005748670.tif 000014
【０１３８】
実施例１０：ＨｅｐＧ２細胞に対するカスパーゼ−３活性の決定のための一般的な検定手順：
疑わしい、つまり、アポトーシスを経るように誘発されている細胞を最初に溶解させ、その細胞内内容物を収集する。我々の試験系では、蛍光レポーター分子の７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）に共役するカスパーゼ特異的ペプチドの添加により、スタウロスポリンで処理した細胞からの溶解物をプロテアーゼ活性について試験した。そのカスパーゼによるそのペプチドの開裂は、３８０ｎｍの波長で励起される際に、４６０ｎｍで蛍光を発する蛍光色素を放出する。その細胞溶解物中のカスパーゼ酵素活性の程度は、蛍光マイクロプレートリーダーで検出した蛍光信号に直接的に比例する。Ｔ−７５フラスコ内で成長させた集密的なＨｅｐＧ２細胞（７０〜８０％）を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離した。遠心分離に続いて、その細胞の沈渣をＤＭＥＭ媒体中で再懸濁させ、血球計を用いて計数した。細胞を９６穴板に４０，０００細胞／１００μｌ／穴の密度で播種し、３７℃／５％のＣＯ２で８時間にわたり培養した。媒体を除去し、試験化合物を１００μｌの体積で添加した。３０分の上記のような前処理の後に、５０μＬの３×濃縮のスタウロスポリン（２０μＭの最終濃度）、または５０μＬの媒体（未処理の対照）を、それぞれの穴に添加した。スタウロスポリンで１６時間にわたり誘発した後、５０μｌの溶解緩衝液の添加、続いて３０分の培養により細胞を溶解した。顕微鏡下で観察されるような完全な溶解の後に、１００μｌの冷やした緩衝液（検定緩衝液）を各穴に添加した。次に、ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（基質、最終濃度は１５μＭ）を添加し、その反応が２時間にわたり継続することを可能にした。ＢＭＧ  Ｐｏｌａｒｓｔａｒの蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、３８０ｎＭで励起させ、４６０ｎＭで発光を捕捉することにより、その蛍光を測定した。
【０１３９】
実施例１１：実施例１０の検定のデータ分析。各標準、ブランク、および試料について、反復サンプルの相対蛍光値（ＲＦＵ）を平均する。対照（阻害剤なしで処理したスタウロスポリン）の酵素活性を、１００％の活性（０％の阻害）と考えた。試験化合物／参照化合物の蛍光値（ＲＦＵ）を、阻害（％）を算出するためにこれに対して比較する。試験化合物／参照化合物の百分率阻害を、下記のように算出した：
【数２】
0005748670.tif 000015
Ｓ字状の用量応答（変数）等式（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４のソフトウェア）を用いて、薬物濃度に対する百分率生存能データの非線形回帰分析（曲線適合）により、ＩＣ５０値を決定した。ＢＣＰ−６およびＢＣＰ−７は、カスパーゼ３阻害に対する格別の影響を実証した。
質的管理：本検定を以下の質的検査について評価した：
（ｉ）参照化合物のＩＣ５０値：Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのＩＣ５０値
（ｉｉ）反復サンプル間の変動係数（％）：反復サンプル間のＣＶ（％）は許容可能限界（１０％）以内であった。
【０１４０】
実施例１２：ヒカゲノカズラ（Lycopodium
Clavatum）の抽出物が、アポトーシスと一致する形態学的特徴を誘発する
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）から得られたＨｅＬａ細胞（子宮頸癌）を、４８時間にわたりヒカゲノカズラ（Lycopodium Clavatum）からの抽出物で処理し、抗チューブリン抗体で染色してその細胞骨格を検査し、ＤＮＡに強く結合する蛍光染色液である、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核を染色した。媒介物で処理した細胞は、無傷の細胞質構造および核を暴露した。その抽出物で処理した細胞がその細胞質構造（丸い細胞）を失うと同時に、核中の空所として現れるＤＮＡの喪失により明らかであるように、細胞中の核ＤＮＡは完全に喪失した。こうした形態学的変化は、ＢＣＰ−２１が子宮頸癌細胞株内にアポトーシスを誘発することを示唆している。
【０１４１】
実施例１３：ヒカゲノカズラ（Lycopodium
Clavatum）の抽出物が、ｓｕｂ−Ｇ１集団を誘発する
ヒカゲノカズラ（Lycopodium
Clavatum）の抽出物がアポトーシスを示唆する変化を誘発するため、流動細胞計測法を用いてＤＮＡ含量を測定することによりアポトーシスを評価した。そのアポトーシス細胞は断片化によりＤＮＡを失い、それ故、２ｎ未満のＤＮＡ含量を有することになるだろう。流動細胞計測法の分析の際には、その細胞はＧ１ピークの左に延びるように見えることになり、それ故、「ｓｕｂ−Ｇ１ピーク」と呼ばれる。対照および様々な希釈液（１：５００）および１：２５０のヒカゲノカズラ（Lycopodium Clavatum）の抽出物で処理したＨｅＬａ細胞を、無水エタノール中に固定し、ヨウ化プロピジウムで３０分にわたりＲＮＡｓｅと共に染色した。ハーバード医学校、ダナ・ファーバー癌研究所（Dana Farber Cancer Institute, Harvard Medical School）（マサチューセッツ州、ボストン）の中核施設にて、その細胞を分析した。フェニックス・フロー・システムズ（Phoenix Flow Systems）（カリフォルニア州、サンディエゴ）製のＭｕｌｔｉＣｙｃｌｅのソフトウェアを用い、細胞ＤＮＡ含量の柱状図を逆畳み込みし、ｓｕｂ−Ｇ１相内の細胞の百分率の定量化を得ることになる。
【０１４２】
ヒカゲノカズラ（Lycopodium
Clavatum）の粗製抽出物は、用量依存的な様態でその対照（６．７％）に比べてｓｕｂ−Ｇ１ピーク（２３％）を増加させた（図６）。そのデータは、その抽出物が用量依存的な様態でＨｅＬａ細胞のアポトーシスを誘発することを強く示している。
【０１４３】
実施例１４：ヒカゲノカズラ（Lycopodium
Clavatum）の抽出物が、ＰＡＲＰ切断を誘発する
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、７．６のｐＨ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で、完全プロテアーゼ阻害剤（（ロシェ）Roche）を用いて細胞を溶解させた。タンパク質試料を、適切な百分率のゲル上にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。概して、２０〜６０μｇのタンパク質を内因性タンパク質について、１０〜１５μｇを形質移入タンパク質について分析した。タンパク質を０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に、１時間にわたり４℃で１時間にわたり移した。５％の乳および０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（アメリカン・バイオアナリティカル（American Bioanalytical））を含有するＰＢＳ溶液中にて、膜を４５分にわたり室温（ＲＴ）でブロッキングした。そのニトロセルロース膜を、その後、ＲＴで２時間または４℃で一晩中の何れかにわたり、１％の乳および０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中にて、適切な濃度で希釈した一次抗体中で培養した。その一次抗体の除去の際に、洗浄緩衝液（１％の乳および０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を有する１×ＰＢＳ）中にて、その膜を１０分にわたりＲＴで３回洗浄した。その膜を、その後、洗浄緩衝液中で希釈した適切な二次抗体中にて、１時間にわたりＲＴで培養した。膜をその後１０分にわたり３回洗浄した。製造者の取扱説明書に従い、ＥＣＬ（ピアース研究所（Pierce Laboratories））を用いてウエスタンブロットを発色させた。
【０１４４】
その結果は、全長ＰＡＲＰ（分子量は１１６ｋＤａ）が２４時間後に完全に切断されたことを示した。その抽出物で処理したＨｅＬａ細胞は、時間依存的な様態でＰＡＲＰ切断における増加を示している（図７）。このデータは、ヒカゲノカズラ類（Lycopodium）の抽出物がアポトーシスを誘発することを強く示している。
【０１４５】
実施例１５：ヒト腫瘍細胞株に対する８−ＨＨＡのラセミ混合物の検査
ＤＭＣ中に溶解させた８−ＨＨＡの合成ラセミ混合物を、６０のヒト腫瘍細胞株のパネルに対して検査するために、ＮＩＨ、国立癌研究所、癌診療部（the Division of Cancer Diagnosis and Treatment, National Cancer
Institute, NIH）が受け取った。その検査は、生存細胞中のテトラゾリウム染料の有色ホルマザン生成物への代謝還元に依存する、単純な比色（ＭＴＴ）検定に基づくマイクロプレート細胞毒性検定である。その化合物の検査のために修正実験計画法を用い、これは様々な腫瘍細胞株の成長の阻害を測定する。この検定において試験した８−ＨＨＡは、１０μＭの濃度にあった。
【０１４６】
その結果は、８−ＨＨＡが、４０〜９６％の範囲で、白血病細胞株（例えば、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｋ−５６２、ＳＲ、ＭＯＬＴ−４、ＲＰＭＩ−８２２６、およびＨＬ−６０（ＴＢ））の成長を著しく抑制していることを示している。それは、非小細胞肺癌細胞株（例えば、ＨＯＰ−９２およびＮＣＩ−Ｈ４６０）上における成長の顕著な阻害も実証した。また、検査した７つの結腸直腸癌細胞株のうち３つ（すなわち、ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１５、およびＫＭ１２）は、成長抑制の中等度の証拠を示した。このデータは、８−ＨＨＡが、その程度は様々ではあるが、白血病、肺、およびの結腸直腸の癌細胞株等の、様々な癌細胞株に対して成長阻害活性を有することを示している。
【０１４７】
実施例１６：癌細胞株の生存に対する８−ＨＨＡの影響
１）肺癌細胞株に対して：８−ＨＨＡのラセミ混合物の影響、および、各個のエナンチオマー、つまりＳエナンチオマーおよびＲエナンチオマーのそれを、ＨＯＰ−９２肺癌細胞株の生存に対して検査した。その細胞生存能を、比色ＭＴＴ検定を用いて、対数増殖期にて１００μＭの８−ＨＨＡで７２時間にわたり検査した。別個の検定において、２０〜１００μＭに及ぶ、異なる濃度の８−ＨＨＡのＳ−エナンチオマーで７２時間にわたり、ＨＯＰ−９２細胞を処理した。
【０１４８】
その結果は、８−ＨＨＡのラセミ混合物が、ＨＯＰ９２細胞株の生存を２５％低減したことを示している。そのＲ−エナンチオマーは、ＨＯＰ９２細胞株の生存を１３％低減した。対照的に、そのＳ−エナンチオマーは、肺癌細胞株の生存に対して最大の影響を有した（７２％低減した）。このデータは、８−ＨＨＡのＳエナンチオマーが、ＨＯＰ９２肺癌細胞の生存に対して強力な阻害効果を有することを示している。さらに、図８は、増加する濃度の（Ｓ）−８−ＨＨＡが、用量依存的な様態で肺癌細胞株の生存を阻害したことを示している。細胞生存における５０％の低減（ＩＣ５０）が、８−ＨＨＡのＳ−エナンチオマーのおおよそ９０μＭの用量にて観察された。このデータは、８−ＨＨＡのＳエナンチオマーが、肺癌細胞株に対して用量依存的な阻害効果を有することを示している。
【０１４９】
２）肝臓癌細胞株に対して：８−ＨＨＡのラセミ混合物の影響、および、各個のエナンチオマー、つまりＳエナンチオマーおよびＲエナンチオマーのそれを、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（「ＰＬＣ−５」または「ＰＬＣ５」とも呼ばれる）、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＳＮＵ４４９（「ＳＮＵ」とも呼ばれる）の肝臓癌細胞株の生存に対して検査した。その細胞生存能を、比色ＭＴＴ検定を用いて、対数増殖期にて１００μＭの８−ＨＨＡで７２時間にわたり検査した。別個の検定において、２０〜１００μＭに及ぶ、異なる濃度の８−ＨＨＡのＳ−エナンチオマーで７２時間にわたり、ＰＬＣ−５細胞を処理した。
【０１５０】
その結果（図９）は、８−ＨＨＡのラセミ混合物が、ＰＬＣ−５およびＨｅｐ３Ｂの細胞株の生存をそれぞれ５２〜２５％低減したことを示している。それは、ＳＮＵ細胞株に対して全く大きな影響を有しなかった。一方、８−ＨＨＡのＳ−エナンチオマーは、ラセミ混合物またはＲ−エナンチオマーの何れかと比較して、全ての肝臓癌細胞株の生存に対して最大の影響（ほとんど７５％の細胞生存の低減）を有した。このデータは、８−ＨＨＡのＳエナンチオマーが、肝臓癌細胞の生存の全てに対して強力な阻害効果を有することを示している。
【０１５１】
さらに、図１０は、増加する濃度の（Ｓ）−８−ＨＨＡが、用量依存的な様態でＰＬＣ−５肝臓癌細胞株の生存を阻害したことを実証している。細胞生存における５０％の低減（ＩＣ５０）が、８−ＨＨＡのＳ−エナンチオマーのおおよそ５０μＭの用量にて観察された。このデータは、８−ＨＨＡのＳエナンチオマーが、肺癌細胞株に対して用量依存的な阻害効果を有することを強く示している。
【０１５２】
実施例１７：８−ＨＨＡは、肝臓および肺の癌細胞株内でアポトーシスを誘発する
ＰＡＲＰ切断は、アポトーシスの特異的でかつ十分に確立した標識と見なされる。アポトーシスの最中に、ＦＡＳ受容体は下方調節を受け、これはアポトーシスの確立した指標と見なされる。ＦＡＳ配位子に結合するＦＡＳ受容体により活性化した経路によりアポトーシスを誘発することができ、外因性機構と呼ぶ。この経路によるアポトーシスは、ＦＡＳ受容体の低減を結果的にもたらす。従って、ＦＡＳ受容体のタンパク質濃度における低減は、アポトーシスが外因性機構により誘発されることを示している。
【０１５３】
１）肝臓癌細胞株に対して：８−ＨＨＡの影響を肝臓癌細胞株内でのアポトーシスに対して検査した。図１１は、１００μＭの８−ＨＨＡのＳ−エナンチオマーの処理が、ＳＮＵおよびＰＬＣ−５の肝臓癌細胞株内におけるＰＡＲＰ切断を結果的にもたらしたことを示している。このデータは、８−ＨＨＡが肝臓癌細胞株内でアポトーシスを誘発することを示している。
【０１５４】
ＰＬＣ−５細胞株を、１００μＭの８−ＨＨＡで７２時間にわたり処理した。これは、対照と比較して、（Ｓ）−８−ＨＨＡの処理を用いて、ＦＡＳ受容体濃度における相当な低減を結果的にもたらした（図１２）。このデータは、（Ｓ）−８−ＨＨＡが、外因性機構により肝臓癌細胞株内でアポトーシスを誘発することを示唆している。
【０１５５】
２）肺癌細胞株に対して：ＨＯＰ−９２肺癌細胞株を、１００μＭの（Ｓ）−８−ＨＨＡで７２時間にわたり処理した。その（Ｓ）−８−ＨＨＡ処理は、ＨＯＰ９２細胞株内におけるＦＡＳタンパク質濃度の低減を結果的にもたらした。このデータは、８−ＨＨＡが、外因性機構を通じてＨＯＰ９２細胞株内でアポトーシスを誘発することを示している。
【０１５６】
実施例１８：肺癌細胞株内のプロアポトーシスＢｉｍ１に対する８−ＨＨＡ処理の影響。
Ｂｉｍ１は、その上方調節がアポトーシスを引き起こすプロアポトーシスタンパク質である。ＨＯＰ９２細胞株を、１００μＭの８−ＨＨＡのＳ−エナンチオマーで７２時間にわたり処理した。その結果は、Ｂｉｍ１が、対照試料と比較して、処理した８−ＨＨＡ中で２倍に増加したことを示している。このデータは、８−ＨＨＡが肺癌細胞株内でアポトーシスを誘発することを示している。
【０１５７】
実施例１９：インビボの動物モデルに対する、８−ＨＨＡの最大耐用量（ＭＴＤ）の決定：本研究の目的は、ＩＣＲマウスにおける静脈内（ＩＶ）投与に続く、８−ＨＨＡの最大耐用量を決定することであった。８−ＨＨＡのラセミ混合物、偽薬、および媒介物を、２５〜３０グラムの体重を有する２０匹のＩＣＲ雌マウスにそれぞれ投与した。８−ＨＨＡを、ナノ脂質中にて、０、１０、２０、および４０ｍｇ／ｍｌの濃度で調合した。一群当たり４匹の動物がおり、それらに８−ＨＨＡの０、１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇの用量を注射した。マウスに単一の急速静注用量を、尾静脈を通じて群割り当てに従って与えた。投薬の１週間後に、マウスを屠殺した。毎日の臨床観察を、投与後１５分および１時間に行った。研究８日目での屍検まで、そのマウスを任意の有害作用について毎日観察した。試験物質投与より前に、かつ試験期間中を通して１日置きに、体重を全てのマウスについて記録した。この全体の研究を、トキシコン社（Toxikon Corporation）、マサチューセッツ州、ベッドフォードで行った。その結果を表６に描写する。
【表６】
0005748670.tif 000016
【０１５８】
結果および考察：６日目および８日目の体重は、投薬前の体重から変化しなかった。６日目および８日目の体重は、投薬前の体重から変化しなかった。高用量（４０ｍｇ／ｋｇ）を投薬した２匹のマウスは、投薬した直後に死んだ。偽薬、１０ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇを投薬した動物は、８ＨＨＡに十分に耐性があり、いかなる留意すべき臨床的異常も実証しなかった。２０ｍｇ／ｋｇの用量を、その後８−ＨＨＡの最大耐用量と考えた。
【０１５９】
実施例２０：肝臓異種移植マウスモデル：
本研究の目的は、ＰＬＣ５細胞、肝細胞癌細胞株を用いて、肝臓癌における８−ＨＨＡの抗腫瘍効能を決定することであった。腫瘍成長および動物の生存を主要評価項目と考えた。
【０１６０】
動物および飼育：生後５〜６週間でかつ１６〜２０ｇｍの体重がある、３０匹のＢＡＢＬ／ｃの、非妊娠で、かつ未経産の雌ヌードマウスを本研究で用いた。薬物候補の抗腫瘍効能試験のための異種移植の研究において歴史的に用いられてきたために、ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕのマウスを用いた。実際の試験用と同じ条件下で、マウスを最小で５日にわたり順化させた。３０〜７０％の室内相対湿度、時間当たり最小で１０回の交換という時間当たりの空気交換、１２時間の明暗周期の光曝露、全領域蛍光灯を用いて、マウスを６８±５°Ｆの室温で収容した。ポリカーボネートでできている換気したマイクロアイソレーターケージ内に、マウスを集団で収容した。マウスは、高圧滅菌した実験室等級の寝藁を用いており、放射線照射したペレットおよび高圧滅菌した水を自由に提供された。飼料、水、または寝藁には、試験データに干渉すると予想される既知の汚染物は全くなかった。実験室および動物室を、出入り制限施設として維持した。
【０１６１】
注射および投薬の経路：８−ＨＨＡを、腹腔内（ＩＰ）注射を通じて投与した。８−ＨＨＡは不十分に水溶性であり、それ故、１００ｍＭに対応する２７．２ｍｇ／ｍｌの濃度でナノ脂質分散溶液（ｅＰｈａｒｓｅ、スイス、バーゼル）中に懸濁する。ＭＴＤ検定（予備データ）は、マウスが２０ｍｇ／ｋｇという最大用量に耐えたことを示した。本研究のために、２つの用量―１０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを用いた。
【０１６２】
動物の準備
腫瘍誘発：細胞株ＰＬＣ５をヴァナス・オンコロジー（Vanas Oncology）での推奨仕様に従って培養し、そこで細胞を成長させ、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのストレプトマイシン、および１００単位／ｍｌのペニシリンを含有するＲＰＭＩ媒体内に保持した。血球計を用いたトリパンブルー生存能試験を用いて、細胞をトリプシン処理および計数した。血球計の象限における細胞計数を細胞／ｍＬ値に換算し、これにより、マウス１匹につき適切な数の細胞の単離が可能になることになる。腫瘍細胞（５×１０６細胞／マウス）の懸濁液を含有する０．２ｍＬの５０％のＲＰＭＩ／５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の混合物を、各マウスに右側腹部内に皮下接種した。十分に確定するまで、細胞を週に２回観察した。式：腫瘍重量（ｍｇ）＝（ａ×ｂ２／２）（式中、「ｂ」はミリメートルでの最小直径であり、「ａ」は最大直径である）を用いて、腫瘍量を算出した。
【０１６３】
動物の割り当て：確定した腫瘍がおおよそ５０〜１００ｍｇの平均算出量に到達した時点で、一群当たりの腫瘍の大きさの変動性を低減するために、マウスを適切なソフトウェアを用いて無作為に処理群とした。
【０１６４】
投薬前の手順：１日目における投薬より前に、順化させた動物を秤量し、毒性の臨床的兆候について観察した。
【０１６５】
用量の管理：２つの用量の１および１０ｍｇ／ｋｇを、ＭＴＤ検定指針に基づいて投与した。第１の投薬日が１日目である。１日目には、８−ＨＨＡ、および媒介物の注射を、下記の表７における研究設計に従って投与した。
【表７】
0005748670.tif 000017
【０１６６】
投薬後の手順：処理に続いて、腫瘍およびマウスの体重の測定結果を週に２回記録し、総括的観察を毎日少なくとも１回行った。触知可能でない腫瘍を有するマウスを、完全退縮と考えた。マウス死亡率の百分率および死期を、本研究における全ての群について記録することになる。下記の判定基準のうち１つ以上を満たす場合に、動物を瀕死と定義し、屠殺してよい：
・１週間の期間内における２０％以上の体重の減少。
・摂食、飲水、運動性、および排尿および／または排便する能力等の、正常な生理的機能を阻害するマウス。
・測径器で測定する際に２，０００ｍｇの最大寸法を超える腫瘍。
・潰瘍化した腫瘍、あるいは出血するか滲出液を生じる腫瘍。
・過度の体重減少（＞２０％）に繋がる長期で過度の下痢。
・持続性喘鳴および呼吸窮迫。
・衰弱、猫背姿勢、麻痺／不全麻痺、膨隆腹、潰瘍化、膿瘍、発作、および／または出血等の、臨床観察で定義する際の長期または過度の痛みまたは苦痛。
投薬の完了後に、マウスを追加の２週間にわたり観察し、腫瘍の再成長について検査した。
【０１６７】
屠殺：全ての動物を本研究の終了時に屠殺することになり、その腫瘍を採取することになる。その腫瘍の一部をＯＣＴ溶液中で凍結させることになり、その他部をホルマリン中で固定することになる。凍結および固定した組織を、出資者に送ることになる。全ての動物実験を、トキシコン社（Toxikon Corporation）（マサチューセッツ州、ベッドフォード）で行った。
【０１６８】
結果：８−ＨＨＡ処理の１日目に、マウスを一群当たり１０匹のマウスを有する３つの群に無作為に分けた：媒介物のみの対照群（Ｃ１）、１０ｍｇ／ｋｇ体重の８−ＨＨＡ（Ｔ１）、および１００ｍｇ／ｋｇ体重の８−ＨＨＡ（Ｔ２）。群Ｔ１およびＴ２は両方とも、８−ＨＨＡ処理の４日目からマウスにおける腫瘍成長を著しく阻害した。対照的に、８−ＨＨＡで処理した群（Ｔ１）において、腫瘍量は、対照群と比較して、４４．５％、４９．８％、７２．３％、７７．７％、および７８．４％（それぞれ、４日目、９日目、１１日目、１６日目、および１８日目に）減少した。Ｔ２群において、腫瘍量は、５６．３％、６１．１％、８１．１％、８７．９％、および８８．３％（それぞれ、４日目、９日目、１１日目、１６日目、および１８日目に）減少した（図１３および表８を参照されたい）。
【０１６９】
これらの結果は、本研究で用いた２つの濃度の８−ＨＨＡが、ＰＬＣ−５細胞を用いる我々のインビトロ実験から明らかなように、抗増殖効果およびプロアポトーシス効果により、肝臓癌マウスモデルにおいて腫瘍成長を減少させることを示している。８−ＨＨＡは、そのため、標準的な化学療法計画の非常に効果的で、安全で、かつ安価な補助薬であることが判明し得る。
（＊Ｓ：対照群と比較して有意、Ｎ＝１０／群）
平均±ＳＥＭの腫瘍量（ＰＬＣ−５）
【表８】
0005748670.tif 000018
【０１７０】
実施例２１：小細胞肺癌異種移植マウスモデル：
本研究の目的は、ＨＯＰ９２を用いて、肺癌における８−ＨＨＡの抗腫瘍効能を決定することであった。
【０１７１】
動物および飼育：生後５〜６週間でかつ１６〜２０ｇｍの体重がある、３０匹のＢＡＢＬ／ｃの、非妊娠で、かつ未経産の雌ヌードマウスを本研究で用いた。薬物候補の抗腫瘍効能試験のための異種移植の研究において歴史的に用いられてきたために、ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕのマウスを用いた。実際の試験用と同じ条件下で、マウスを最小で５日にわたり順化させた。３０〜７０％の室内相対湿度、時間当たり最小で１０回の交換という時間当たりの空気交換、１２時間の明暗周期の光曝露、全領域蛍光灯を用いて、マウスを６８±５°Ｆの室温で収容した。ポリカーボネートでできている換気したマイクロマイクロアイソレーターケージ内に、マウスを集団で収容した。マウスは、高圧滅菌した実験室等級の寝藁を用いており、放射線照射したペレットおよび高圧滅菌した水を自由に提供された。飼料、水、または寝藁には、試験データに干渉すると予想される既知の汚染物は全くなかった。実験室および動物室を、出入り制限施設として維持した。
【０１７２】
注射および投薬の経路：８−ＨＨＡを、腹腔内（ＩＰ）注射を通じて投与した。８−ＨＨＡは不十分に水溶性であり、それ故、１００ｍＭに対応する２７．２ｍｇ／ｍｌの濃度でナノ脂質分散溶液（ｅＰｈａｒｓｅ、スイス、バーゼル）中に懸濁する。ＭＴＤ検定（予備データ）は、マウスが２０ｍｇ／ｋｇという最大用量に耐えたことを示した。
【０１７３】
実験設計：
動物の準備
腫瘍誘発：細胞株ＨＯＰ９２を、実施例２０にて上記で検討したように、ヴァナス・オンコロジー（Vanas Oncology）での推奨仕様に従って培養した。血球計を用いたトリパンブルー生存能試験を用いて、細胞をトリプシン処理および計数した。血球計の象限における細胞計数を細胞／ｍＬ値に換算し、これにより、マウス１匹につき適切な数の細胞の単離が可能になることになる。腫瘍細胞（５×１０６細胞／マウス）の懸濁液を含有する０．２ｍＬの５０％のＲＰＭＩ／５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の混合物を、各マウスに右側腹部内に皮下接種した。十分に確定するまで、細胞を週に２回観察した。式：腫瘍重量（ｍｇ）＝（ａ×ｂ２／２）（式中、「ｂ」はミリメートルでの最小直径であり、「ａ」は最大直径である）を用いて、腫瘍量を算出した。
【０１７４】
動物の割り当て：確定した腫瘍がおおよそ５０〜１００ｍｇの平均算出量に到達した時点で、一群当たりの腫瘍の大きさの変動性を低減するために、マウスを適切なソフトウェアを用いて無作為に処理群とした。
【０１７５】
投薬前の手順：１日目における投薬より前に、順化させた動物を秤量し、毒性の臨床的兆候について観察した。
【０１７６】
用量の管理：２つの用量の１および１０ｍｇ／ｋｇを投与した。第１の投薬日が１日目である。１日目には、８−ＨＨＡ、および媒介物の注射を、下記の表９における研究設計に従って投与した。
【表９】
0005748670.tif 000019
【０１７７】
投薬後の手順：処理に続いて、腫瘍およびマウスの体重の測定結果を週に２回記録し、総括的観察を毎日少なくとも１回行った。触知可能でない腫瘍を有するマウスを、完全退縮と考えた。マウス死亡率の百分率および死期を、本研究における全ての群について記録した。下記の判定基準のうち１つ以上を満たす場合に、動物を瀕死と定義し、屠殺してよい：
・１週間の期間内における２０％以上の体重の減少。
・摂食、飲水、運動性、および排尿および／または排便する能力等の、正常な生理的機能を阻害するマウス。
・測径器で測定する際に２，０００ｍｇの最大寸法を超える腫瘍。
・潰瘍化した腫瘍、あるいは出血するか滲出液を生じる腫瘍。
・過度の体重減少（＞２０％）に繋がる長期で過度の下痢。
・持続性喘鳴および呼吸窮迫。
・衰弱、猫背姿勢、麻痺／不全麻痺、膨隆腹、潰瘍化、膿瘍、発作、および／または出血等の、臨床観察で定義する際の長期または過度の痛みまたは苦痛。
投薬の完了後に、マウスを追加の２週間にわたり観察し、腫瘍の再成長について検査した。
【０１７８】
屠殺：全ての動物を本研究の終了時に屠殺することになり、その腫瘍を採取することになる。その腫瘍の一部をＯＣＴ溶液中で凍結させることになり、その他部をホルマリン中で固定することになる。凍結および固定した組織を出資者に送った。
【０１７９】
結果：８−ＨＨＡ処理の１日目に、マウスを一群当たり１０匹のマウスを有する３つの群に無作為に分けた：媒介物のみの対照群（Ｃ１）、１０ｍｇ／ｋｇ体重の８−ＨＨＡ（Ｔ１）、および１００ｍｇ／ｋｇ体重の８−ＨＨＡ（Ｔ２）。群Ｔ１およびＴ２は両方とも、８−ＨＨＡ処理の１６日目からマウスにおける腫瘍成長を著しく阻害した。腫瘍量は、対照群において、１６日目および１８日目にそれぞれ２１４．６±３８．６５ｍｍ３および２５８．４±６４．９６ｍｍ３であった。対照的に、８−ＨＨＡで処理した群（Ｔ１）において、腫瘍量は、１６日目および１８日目にそれぞれ８８．７８±２８．６１ｍｍ３および８２．０２±２５．９３ｍｍ３であり、１６日目および１８日目での３２．６３ｍｍ３の腫瘍における５８．６％および６８．２％の減少にそれぞれ相当し、腫瘍量における５６．５％および７３．１％の減少に相当した（表１０および図１４を参照されたい）。
【表１０】
0005748670.tif 000020
＊Ｓ：対照群と比較して有意
平均±ＳＥＭの腫瘍量（ＨＯＰ−９２）（Ｎ＝１０／群）
【０１８０】
結論として、本研究で用いた２つの濃度の８−ＨＨＡが、ＨＯＰ９２細胞を用いる我々のインビトロ実験から明らかなように、抗増殖効果およびプロアポトーシス効果により、肺癌マウスモデルにおいて腫瘍成長を減少させた。８−ＨＨＡは、そのため、標準的な化学療法計画の非常に効果的で、安全で、かつ安価な補助薬であることが判明し得る。
【０１８１】
本発明は特定の実施形態を参照して開示されてきたが、本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく、他の当業者が本発明の他の実施形態および変化形を考案することができることは明白である。
【図１】
0005748670.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0005748670.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0005748670.tif 000033
【図１４】
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