(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射標識アネキシンであって、そこにおいてアネキシン分子が最少で２、且つ最大で２０のヒスチジン残基をそのN末端に含み、前記ヒスチジン残基の少なくとも２つが隣接しているか、または１以下の他のアミノ酸により隔てられており、且つ放射性核種に結合されており、前記他のアミノ酸はフェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニンまたはシステインではなく、前記アネキシン分子の凹部側のいずれかのアミノ酸の１つがシステイン残基により置換されている放射標識アネキシン。
【請求項２】
請求項１に記載の放射標識アネキシンであって、当該放射性核種は、ガリウム 67, ガリウム 68, インジウム 111, テクネチウム 99m, レニウム 188, 銅 64 および スズ 117mからなる群より選択される放射標識アネキシン。
【請求項３】
請求項２に記載の放射標識アネキシンであって、当該放射性核種が99mテクネチウムである放射標識アネキシン。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、そのN末端に３〜１０のヒスチジン残基を含む放射標識アネキシン。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、前記ヒスチジン残基が、配列番号７の１６位のＧｌｕ残基の上流で、アミノ酸の間に挿入されるか、またはアミノ酸から伸長するか、または１以上のアミノ酸を置換する放射標識アネキシン。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、
X4-TVTDFPGFDERADAETLRKAMK  (配列番号4)
ここにおいて、X4は、前記ヒスチジン残基を含み、且つ少なくとも６のアミノ酸の配列を表す；の当該N末端配列を有する放射標識アネキシン。
【請求項７】
請求項１〜７の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、配列番号７の1-19, 24, 28, 46-64, 86-89, 118-135, 150, 157-170, 202-219, 245-248, および280-294位で当該アミノ酸の何れか１が、システイン残基により置換されている放射標識アネキシン。
【請求項８】
請求項７に記載の放射標識アネキシンであって、前記システイン残基が薬理学的薬剤に対して結合されている放射標識アネキシン。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のアネキシン変異体であって、システイン残基をアネキシン分子の凸部側に有しないアネキシン変異体。
【請求項１０】
配列番号８のアミン酸配列を有するアネキシン変異体であって、ここにおいて、7-25, 30, 34, 52-70, 92-95, 124-141, 156, 163-176, 208-225, 251-254 および 286-300位でのアミノ酸の１つが、システイン残基により置換され、321位での当該システイン残基は、別のアミノ酸により置換され、ここにおいて、7-25, 30, 34, 52-70, 92-95, 124-141, 156, 163-176, 208-225, 251-254および286-300位の１つでの当該置換されたシステイン残基は、薬剤に対して任意に結合される放射標識アネキシン。
【請求項１１】
インビボにおいて哺乳類対象の領域内で有核細胞における細胞死イメージングにおいて使用するための、請求項１〜８の何れか1項に記載の放射標識アネキシン。
【請求項１２】
請求項１１に記載の放射標識アネキシンであって、ここにおいて、前記使用が以下を含む放射標識アネキシン；
(a) 当該対象に対して前記放射標識アネキシンを投与すること、
(b) 適用できる場合には、当該対象を放射線検出装置の検出野内に配置すること、および
(c) 当該対象における放射性核種からの放射線放出を放射線検出装置で測定し、放射線放出の画像を構成すること、
ここにおいて、前記画像は、前記哺乳類対象の前記有核細胞における細胞死の表示である。
【請求項１３】
請求項１２に記載の放射標識アネキシンであって、ここにおいて、投与された標識アネキシンの量が、１ｋｇ当たり１〜１０μｇアネキシンタンパク質である放射標識アネキシン。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の放射標識アネキシンであって、前記領域は、前記対象の頭部またはその一部分内にあるか、または前記対象の心臓またはその一部分内にあるか、または前記対象の肝臓またはその一部分内にある放射標識アネキシン。
【請求項１５】
請求項１２〜１４の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、前記領域が前記対象内の腫瘍またはその一部分内にあるか、または前記対象の移植片またはその一部分内にあるか、または前記対象の虚血部位またはその一部分にある放射標識アネキシン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、重金属、特に放射性金属のための結合部位を有するアネキシン分子に関する。本発明は更に、放射標識アネキシン（Annexin）分子の画像診断における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
［背景技術］
インビボでのバイオマーカーホスファチジルセリン（PS）の分子画像法は、疾患の診断および治療の有効性の評価のために重要である。有効なPS認識剤はアネキシンA5およびその変異体である。テクネチウム標識アネキシンA5は、対象の中にインジェクションすることが可能であり、続いて、単光子放射型コンピューター断層撮影法（Single Photon Emission Tomography (SPECT)）をバイオマーカーPSを評価するために適用することが可能である。感度よく且つ特異的にバイオマーカーPSを評価するために、テクネチウムとアネキシンA5との間の複合体がインビボにおいて安定であり、迅速に血液循環からクリアされることが必須である。
【０００３】
現行のテクネチウムとアネキシンA5の複合体は、Tc（テクネチウム）のアネキシン分子の非特異的部位への化学結合に基礎付けられている。例えば、JP2006-316004は、4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサミドのアネキシンVへのリンカーによる結合によって得られた化合物を開示し、当該化合物は、テクネチウムの複合体化が可能である。WO 98/48699はTc99mがアネキシンに対してスクシンイミドヒドラジノニコチネート(HYNIC)を介して結合される複合体を開示する。そのような複合体は、不十分な安定性に悩まされる。更に、アネキシンの特異的部位、特に、その親和性プロフィールに干渉しない部位での標識に向けることは不可能である。Jung et al., J. Nucl. Med. 2008 49 (Supplement 1):304Pは、小動物PET（電子放射断層撮影(positron emission tomography)）を用いたアポトーシスイメージングのためのI-124標識組み換えアネキシン分子に言及している。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ヒスチジン残基を含み、そのN末端の伸長を有し、テクネチウムなどの放射性核種とアキネシンとの間の安定な複合体形成を可能にする新規アネキシンを提供する。本発明はまた、そのような放射性核種を有するアネキシン、即ち、放射標識アネキシンに属する。更に本発明は、診断および治療において使用するためのアネキシン放射標識複合体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】記載なし
【図２】記載なし
【発明を実施するための形態】
【０００６】
［発明の説明］
従って、本発明は、（放射標識）アネキシンであって、最少でも2で最大でも20のヒスチジン残基をそのN末端に含むアネキシンに属する。特に本発明のアネキシンは、最少でも3、好ましくは少なくとも4のヒスチジン残基をそのN末端で含む。当該最大の数は、あまり臨界ではなく、実際には、当該N末端で、12までのヒスチジン残基、または好ましくは10までのヒスチジン残基、または8までのヒスチジン残基でさえあってよい。
【０００７】
好ましくは、当該ヒスチジン残基は、隣接し、即ち、その間に他のアミン酸を含まないか、またはその間において１つのみのアミノ酸が含まれる。特に、これは2または3つのヒスチジン残に適用する。従って、当該N末端での好ましい部分配列は、H-H; H-H-H; H-X-H; H-X-H-H; H-H-X-H; H-X-H-H; または H-X-H-Hを含む。介在アミノ酸Xは、もし提示するならば、好ましくは大型の無極のアミン酸、例えば、Phe, Tyr, Leu, Ile または Val, または Met または Cysなどではない。好ましくは、介在アミノ酸は、もし提示するならば、Gly, Ala, Ser, Lys, および Argから選択され、2または2以上のXの場合においては、これらは異なってもよい。最も好ましくは、本発明の当該アネキシン変異体は、少なくとも3の隣接するヒスチジン残基をそのN末端に、特に、極めて末端に含む。
【０００８】
用語「アネキシン」は、リン脂質、特にホスファチジルセリンに対してカルシウム依存的な様式で結合することが可能な何れかのタンパク質をいい、所謂アネキシンファミリーのメンバーである。これらの物質は、負に電荷したリン脂質に対して結合する性質を有し、好ましくは、Ca2+イオンの存在において10-6Ｍ未満の解離定数を有する。当該ファミリーは多くのメンバーを包含する；そこにおける、および当該タンパク質における情報、並びにヌクレオチド配列は、例えば、http://www.structuralchemistry.-org/Annexins/seq/search.phpに見出すことが可能である。様々なアネキシンの配列アラインメントも、WO 2007/069895に見出されるべきであり、それは引用することによりここに組み込まれるに。好ましい例は、アネキシンA5であり、配列番号７（図１）のアミノ酸配列を有するが、しかしながら他のアネキシンも、本発明のアネキシン変異体の生成および使用のために用いることが可能である。例えば、アネキシンA4およびA8も使用できる。アネキシンA5のアミノ酸配列および位置について言及するとき、これはまた、対応する位置を選択することにより、他のアネキシン、特にヒトアネキシンに対しても適用する。対応する位置は当業者に公知であり、例えば、容易に同定でき、例えば、A5の19-21位のトリプレットDAE（Asp-Ala-Glu）を使用でき、これは殆どのアネキシンに亘り保存され、幾つかのアネキシンにおいて小さな逸脱があり、例えば、A4, A9 および A10におけるDAQなどに対する。当該アネキシンは何れの種が起源であってもよく、好ましくは、鳥類または哺乳類、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。野生型アネキシンは、制限された数のヒスチジン残基、および間に他のアミン酸がないか、または１のみの他のアミノ酸を有する２また２以上では決してない(H-H or H-X-H)。例えば、野生型哺乳類アネキシンA5は、97, 204 および266位にHis残基を含むのみである。従って、最大の１の介在する他のアミン酸を有する2〜20のヒスチジン残基の存在は、本発明のアネキシン変異体の独自の特徴である。
【０００９】
ここで使用するとき、アネキシン変異体のN末端は、配列番号７の16位または他のアネキシンにおける対応する領域のグルタミン酸残基(E)の上流の配列を含む。特に、本発明のアネキシン変異体は、優先の順序を大きくしながら、N末端配列番号１〜６を有する：
X1-ERADAETLRKAMK    (SEQ ID No.1)
X2-GFDERADAETLRKAMK    (SEQ ID No.2)
X3-DFPGFDERADAETLRKAMK    (SEQ ID No.3)
X4-TVTDFPGFDERADAETLRKAMK    (SEQ ID No.4)
X5-LRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMK    (SEQ ID No.5)
X6-AQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMK    (SEQ ID No.6)
ここにおいて、
各X1-X6は、1以下の他のアミン酸残基により隔てられた2〜20ヒスチジン残基を有し；および
X1は、少なくとも１５のアミン酸を配列を表し；
X2は、少なくとも１２のアミン酸を配列を表し；
X3は、少なくとも９のアミン酸を配列を表し；
X4は、少なくとも６のアミン酸を配列を表し；
X5は、少なくとも３のアミン酸を配列を表し；
X6は、少なくとも２のアミン酸を配列を表す。
【００１０】
ここにおいて、配列番号１の第1のE(Glu)（＝配列番号７における16位）で始まる部分は、他のアネキシンでは異なることが可能である。例えば、ヒトA4においては、それはAMEDAQTLRKAMKであり、ヒトA8においてはPDPDAETLYKAMKである。他のアネキシンに対応するその部分における単一アミノ酸の置換は許容され、例えば、16位のGlu(E)はAla (A) または Pro (P)により置換されてよい。
【００１１】
本発明の特別な態様において、アネキシン変異体は1または1以上の、好ましくは1〜3のシステイン残基、最も好ましくはまさに１のシステイン残基を、アネキシン分子の凹部側に有する。アネキシン分子の凹部側は、図１の配列（配列番号７）において観戦を付したアミノ酸に対応する。従って、システイン残基は、好ましくは、アネキシンA5の1-19, 24, 28, 46-64, 86-89, 118-135, 150, 157-170, 202-219, 245-248, および 280-294位または他のアネキシンの対応する位置の１つで存在する。
【００１２】
同時に好ましくは、アネキシン変異体は当該分子の凸部側面でシステイン残基を有していない。これは、例えば、アネキシンA5においては、315位のシステイン残基（のみ）が他のアミノ酸、例えば、Ser, Ala または Valなどにより好ましく置換される。システイン分子の位置についての詳細は、それらを導入する様式はWO 2006/003488において見出すことが可能であり、引用によりここに組み込まれる。
【００１３】
本発明の特に好ましいポリヒスチジンアネキシン変異体は、図２（配列番号８）に記述されるアミノ酸配列を有するアネキシン変異体、または記載された通りの当該6の代わりに3, 4, 5, 7, 8, 9 または10のN末端を含むHis残基を含む変異体である。更に好ましい変異体は、図２のアミノ酸配列番号を有するものであり、ここにおいて、7-25, 30, 34, 52-70, 92-95, 124-141, 156, 163-176, 208-225, 251-254, および 286-300位でアミノ酸の1つ。他の好ましい変異体は、図２のここで上述された位置（7-25等）でアミノ酸の1つにCys残基を含むものであり、ここにおいて更に、321位でシステイン残基が他のアミノ酸、特にSer, Thr, Ala または Valにより置換される。
【００１４】
更なるアミノ酸の置換が、本発明のアネキシン変異体および放射標識アネキシンにおいて存在してもよい。例えば、アネキシンA5の16-29, 59-74, 88-102, 135-145, 156-169, 202-231, 259-266 および 305-317位（または図２のポリHisアネキシンA5に対における各6よりも高い位置）の1または1以上でのアミン酸置換が置換され、それにより標的細胞へのアネキシン変異体の吸収が阻害されてもよく、これは所望に応じてなされてよい。そのような置換は、好ましくは、WO 2007/069895に記載されるような、極性アミノ酸の無極性アミノ酸による置換である。他のアミノ酸置換もまた、それらがアネキシンのホスファチジルセリンに対する結合を顕著に妨げない限り、可能である。この条件は、その置換が、他のアネキシンの種類において同じ位置で存在するアミノ酸による置換である場合、特に、もし他の種類がアネキシンA4またはA8である場合、または他の種類から同じ種類のアネキシンおける同じ位置で存在するアミノ酸による置換である場合に適合されるべきであると思われる。
【００１５】
所望のアミノ酸付加または置換は、当該技術分野において周知の組み換え技術により、および以下の例において説明されるにように実施することができる。ヒスチジン残基は、本発明のアネキシン変異体をコードするDNAの中に、コドン（CAU/CAT またはCAC）をコードするヒスチジンによりN末端アミノ酸をコードする2または2以上のコドンの置換により、例えば、3つのヒスチジンコドンによりアネキシンA5のN末端AQV（Ala-Gln-Val）のためのコドンの置換により導入される。
【００１６】
或いは、または更に、アネキシンをコードする遺伝子を、そのN末端で、2または2以上の、例えば、3, 4, 5 または 6のヒスチジンコドンにより伸長することも可能である。アネキシン分子の伸長は、当該技術分野において公知である。例えば、WO2005/086955は、6-Hisタグを有するヒトアネキシンVホモダイマーを開示し、Tabata et al., J. Biosc. Bioeng. 1001 (2006) 190-197は、6-His-タグ付与アネキシンA2を記載する。ポリヒスチジン誘導体は、当該技術分野において公知の組み換え法により産生できる。それらは、精製目的のために慣習的に使用され、特定のタンパク分解によりポリヒスチジンタグの除去を容易にする更なるアミノ酸を多くの場合において含む。これに対して、当該ポリヒスチジン変異体は、タンパク分解されるべきではなく、好ましくは、そのような更なる特定のタンパク分解部位を含まない。ポリヒスチジンタグを産生するためのベクターは、商業的に入手可能であり、例えば、Qiagen, Venlo, NLから入手可能である。
【００１７】
所望に応じて、図１の下線部のアミノ酸の何れか１つのためのコドン、例えば、11位のPheをコードするコドンなどが、システインコドンにより置換でき、および/または315位のCysコドンを他のアミノ酸、例えば、Serのコドンにより置換できる。修飾されたアネキシン遺伝子は、次に、適切なホストにおいて発現でき、所望の本願発明のアネキシン変異体を生産することが可能である。
【００１８】
システイン残基は、薬剤または更なるアネキシンに対する診断剤と組み合わせるために使用できる。リンカー、例えば、N-スクシンイミド 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート, N-スクシンイミドマレイミドアセテート, N-スクシンイミド 3-マレイミドプロピオネート, ピリジル, マレイミド含有基, ハロゲン含有基をCys残基に対する薬剤の連結のために使用できる。薬剤は、例えば、トキシン、酵素、脂質、炭水化物、免疫グロブリンまたはその断片、免疫複合体、化学療法用化合物、光増感剤、放射性核種、細胞死誘導剤、細胞死阻害剤、線溶性化合物から選択されてよい。（更なる）診断用化合物は、例えば、蛍光性基、コントラスト剤、感光剤、超音波剤などから選択されてよい。更なる詳細は、WO 2006/003488に記載される。
【００１９】
少なくとも2のヒスチジン残基の存在が、本発明のアネキシン変異体が放射性核種、特に金属放射性核種を結合することを可能にする。ここにおいて、ヒスチジン残基は、（金属）放射性核種のための多機能性キレート剤として作用する。従って、本発明はまた、放射標識アネキシンに関連し、それは上述のようなヒスチジン置換アネキシン変異体と放射性核種との複合体である。放射性核種は、好ましくは生体適合性であり、好ましくは、Gallium 67, Gallium 68, Indium 111, Technetium 99m, Rhenium 188, Copper 64 および Tin 117m（ガリウム 67, ガリウム 68, インジウム 111, テクネチウム 99m, レニウム 188, 銅 64 およびスズ117m）から選択される。最も好ましくは、本発明に従う放射標識アネキシンにおける放射性核種はTc99m または Re188、最も特にTc99mが好ましい。
【００２０】
放射性核種は、当該技術分野において公知の様式においてヒスチジン含有アネキシン変異体に対して連結されてよい。例えば、当該変異体は、放射性核種、例えば、テクネチウムまたはレニウムなどのトリカルボニル 複合体と接触し、放射性核種結合アネキシンが製造されてよい。例えば、99mTcトリカルボニル、試薬キットは商業的に入手可能である(Mallinckrodt, Petten, NL)。
【００２１】
放射標識アネキシンは、インビボにおいて哺乳類対象の領域内の遊郭細胞における細胞死をイメージングする方法において使用されてよい。そのような方法は以下を含んでよい：
(a) 当該対象に対して前記放射標識アネキシンを投与すること、 
(b) 適用できる場合には、当該対象を放射線検出装置の検出野内に配置すること、および
(c) 当該対象における放射性核種からの放射線放出を放射線検出装置で測定し、放射線放出の画像を構成すること、
ここにおいて、前記画像は、前記哺乳類対象の前記有核細胞における細胞死の表示である。
【００２２】
この方法の工程(a)において、放射標識アネキシン (例えば、テクネチウム 99m標識アネキシンV)が、標準的なプロトコールを用いて対象に投与される。次に、時間経過が、対象における放射標識アネキシンの局在化を達成する。次に、任意の工程(b)において、患者は、放射線検出装置の検出野内に配置される。放射性核種からの放射が放射線検出装置を用いて測定される間、対象は、実質的に固定された状態で維持される(工程(c))。測定されたデータは、次に放射線放出の画像化のために処理される。このように得られた画像は、哺乳類対象における、または分析されている哺乳類対象の領域における細胞死の領域のマップまたは局在化を用いて所属する臨床家に提供されるために使用されてよい。
【００２３】
放射標識アネキシンは、幾つかの方法で投与されてよい。好ましい態様において、放射標識アネキシンは静脈内投与される。或いは、腹腔内に投与されてもよい。更なる選択肢は、標識アネキシンをクモ膜下腔内に投与することである。また、放射標識アネキシンは、肺膜内投与されてもよい。投与の更なる方法は、髄板内投与または代替的に筋肉内投与を含む。
【００２４】
投与されるべき放射標識アネキシンの用量は、使用される放射性核種、標的にされる器官の組織、および診断の条件および対象に依存する。好ましくは、放射標識アネキシンは、約3〜約30mCiの用量を生じる量で投与される。テクネチウム 99mは、成人に対して約20mCiまでの用量で投与され得る。単一Tc99m投与のための好ましい用量は約5〜20mCi、好ましくは約7.5〜15mCiである。他の放射性核種の量は適宜決定され得る。
【００２５】
（例えば、アネキシンの量に基づいて計算される）投与されるべき放射標識アネキシンの量は、好ましくは、体重1ｋｇ当たり少なくとも0.3μg、体重1ｋｇ当たり300μgである。典型的には、その量は、体重1ｋｇ当たり少なくとも約100μ未満であり、当該量は体重1ｋｇ当たり0.5〜20μg、最も好ましくは体重1ｋｇ当たり約1〜20μgである。
【００２６】
放射標識アネキシンの投与後、それは標的組織または器官に局在化される。局在化と非局在化または非結合アネキシンとの平衡または準平衡が、通常、10〜240分、特に20〜120分で達成されたときに、測定が開始可能となる。必要であれば、時間の関数としての局在化の状態に続き、標識アネキシンからの放射信号をイメージング（画像化）してよい。評者性核種がテクネチウム99mであるとき、放射線はγ放射であろう。WO 98/48699が引用することによりここに組み込まれ、それは更に哺乳類対象における細胞死のイメージングの上方および例を示す。
【００２７】
放射標識アネキシンの好ましい使用は、病状における不適当なアポトーシスの検出、それは、例えば、ループス、移植片拒絶、または虚血に対する対象の細胞において望ましくなく；且つ不十分なアポトーシスの検出、それは、例えば、腫瘍またはウイルス感染した細胞について望ましい。特に、細胞死はネクローシスによって引き起こされる。
【００２８】
放射標識アネキシンは、種々の臨床学的設定において使用でき、そこにおいて、アポトーシスおよび／またはネクローシス細胞死は、モニターされるべきであり、例えば、器官および骨髄移植片拒絶または障害、観戦および非感染性炎症性疾患、自己免疫疾患、脳および心筋梗塞および虚血、心筋症、アテローム効果型状態、神経および神経筋変性疾患、鎌状細胞疾患、β-サラセミア、がん治療、AIDS、脊髄形成異常症候群(myelodysplastic syndromes)、およびトキシン誘導性肝疾患などがモニターされる。放射標識アネキシンは、また臨床学的リサーチツールとしても有用であり、正常な免疫系、発生学的発達および免疫耐性およびアレルギーの研究のために有用である。
【００２９】
放射標識アネキシンVは、例えば、正常および治療を受けている悪性組織におけるアポトーシス細胞死のイメージングおよび定量のために使用できる。放射標識アネキシンを使用する逐次イメージング研究によるアポトーシスをモニタリングは、迅速な試験および新薬の開発、および種々の疾患における治療のために使用することができる。加えて、当該方法は、治療、疾患の進行のモニタリング、またはその両方をモニターするために使用されてよい。更に、それらは特定の疾患の早期検出における援助のために使用されてよい。
【００３０】
細胞死が、インビボにおいてイメージングされるべきものである哺乳類対象の領域は、対象の何れかの一部分、組織または器官であってよい。特に、前記領域は、前記対象の器官またはその一部分にある。本発明の好ましい態様において、当該領域は、前記対象の頭部またはその一部分である。他の好ましい態様において、前記領域は前記対象の心臓またはその一部分である。更なる特異的な態様において、前記領域は前記対象の肝臓またはその一部分である。（所望の）細胞死がイメージングされるべきものである領域は、特に、哺乳類対象またはその一部分における腫瘍内にあってよい。また、（望まれない）細胞死の領域は、対象またはその一部分内の移植片であってよく、前記領域は、対象またはその一部分内の虚血部位であってよもよい。
【００３１】
当該イメージングは、当該技術分野において公知の方法および装置を使用して実施されてよい。例えば、放射線検出装置は、例えば、Cu64を放射性核種として使用する場合、単光子放射型コンピューター断層撮影法である。ガンマ放射型の放射性核種、例えば、Tc99m, Sn117m および Re188については、ガンマ線イメージング装置(gamma ray imaging devices)が使用できる。その信号は、標準的な技術を使用して、検出、増幅、加工することが可能である。例えば、単光子放射型コンピューター断層撮影法(SPECT)は、ここにおいて記されたガンマ線放出型の放射性核種、例えば、Tc99mなどを使用してよい。
【００３２】
［例１］：6ヒスチジン残基のN末端延長を有するアネキシンA5はホスファチジルセリンに対して結合する
アネキシンA5のcDNAの5’端を、ヒスチジンを各々コードする6ヌクレオチドトリプレット(CATまたはCAC)で当業者に公知の標準的な分子クローン技術を用いて伸長した。アネキシンA5のcDNAは、ヒト野生型アネキシンA5またはその変異体の何れかをコードし得る。
【００３３】
伸長されたcDNAを、細菌によるヒスチジン伸長アネキシンA5の産生に適切な原核生物発現ベクターにクローニングする。他の発現系、例えば、真核生物発現系もまたHis-anxA5の産生のために使用できる。次にcDNAを真核生物発現系のために適切な発現ベクターにクローニングする。
【００３４】
細菌により産生されたHis-anxA5は、他の細菌構成物からヒスチジン残基の金属結合特性を使用することにより精製する。タンパク質の混合物を5〜20mMのイミダゾールに調整し、この混合物をニッケルまたはコバルト親和性クロマトグラフィに添加する。洗浄後、結合したHis-anxA5を50-1000mMのイミダゾールのグラジエントによりカラムから溶出する。溶出されたHis-anxA5は高純度(＞90% 純度)を有し、生物学的分析のために使用できる。
【００３５】
当該His-anxA5のホスファチジルセリン結合特性は、楕円偏光法(Andree et al. JBC 1990)とアポトーシス細胞のフローサイトメトリー(Van Genderen et al. Nature Prot. 2006, 363)とにより分析することにより野生型アネキシンA5に対して比較する。
【００３６】
従って、アネキシンA5の6ヒスチジン残基でのN末端の伸長は、生物学的特性を変えず、ホスファチジルセリンに対して結合する。
【００３７】
［例２］：ヒスチジン伸長アネキシンA5の放射標識
His-anxA5を商業的に入手可能なアイソリンクキット（Isolink kit）を使用し、アイソリンク（Isolink (Mallinckrodt, Petten, the Netherlands)）の製造者のインストラクションに従って、放射性核種 99mテクネチウムで標識した。サイズ排他クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography (BioSep-SEC-S3000)）による分析は、99mテクネチウム標識His-anxA5の放射化学的純度および放射化学的収率は共に、95％よりも高いことが示された。高収率および純度が、放射標識後の精製工程の必要性を回避する。
【００３８】
［例３］：放射標識ヒスチジン伸長アネキシンA5の安定性
His-anxA5を、例２により記載された通りに99mテクネチウムで放射標識した。99mテクネチウム標識His-anxA5を、1〜24時間に亘り37℃で血漿中でインキュベーションした。その後、分析により、99mテクネチウム標識His-anxA5が血漿中で安定であり、分解もせず、または血漿タンパク質のトランスキレートを生じる、例えば、他の血漿タンパク質に対して99mテクネチウム同位元素が移動することもないことを明らかになった。この安定性は、核画像法技術において核試薬としてのその使用のために極めて重要である。
【００３９】
［例４］：インビトロにおけるアポトーシス細胞に対する99mテクネチウム標識His-anxA5の結合
His-anxA5を、例２により記載された通りに99mテクネチウムで放射標識した。T-リンパ腫細胞(ジャーカット細胞(Jurkat cells))をインビトロで培養し、誘引してアポトーシスを引き起こし、ホスファチジルセリンを露出した。処理されたジャーカット細胞を99mテクネチウム標識His-anxA5と混合し、5〜30分間引用インキュベートし、遠心してペレットにした。上清を細胞から分離した。細胞の部分をカルシウム含有緩衝液(0.5-10 mM CaCl2)に再懸濁し、放射能を測定した。細胞の部分をEDTA含有緩衝液(1-10 mM EDTA)に再懸濁し、再遠心した。得られた上清の放射能を測定した。これらの分析は、99mテクネチウム標識His-anxA5が、カルシウム依存的な様式においてアポトーシス細胞およびホスファチジルセリンに対して結合する生物学的特性を有し、これはアネキシンA5に匹敵することが示された。
【００４０】
［例５］：肝臓アポトーシスのマウスモデルにおける99mテクネチウム標識His-anxA5を使用したアポトーシスの核画像法
肝アポトーシスを誘導するために、マウスを、抗Fas抗体またはシクロヘキシミドの静脈注射で処理した。アポトーシス誘導剤のインジェクションに続く30〜120分間、99mテクネチウム標識His-anxA5を静脈内にインジェクションした。99mテクネチウム標識His-anxA5を例２に記載した通りに調製した。99mテクネチウム標識His-anxA5のインジェクションに続く30〜240分間、SPECT分析を実施した。その後、肝臓をオートラジオグラフィおよびカスパーゼ3の免疫組織化学的染色による分析のために摘出した。結果により、テクネチウム標識His-anxA5を使用し、非侵襲性細胞死のイメージングが可能であることが示される。
【００４１】
［例６］：癌のマウスモデルにおける99mテクネチウム標識His-anxA5を使用したアポトーシスの核画像法
マウスの脇腹に、ダウジ細胞（Daudi cells）またはグランタ519細胞（Granta519 cells）をインジェクションした。4〜6時間後、可視の腫瘍が発生した。マウスに、99mTc-標識His-anxA5を静脈内にインジェクションし、静脈内インジェクションされた99mTc-標識His-anxA5は、例２により記載された通りに調製されたものである。腫瘍による99mTc標識His-anxA5の取り込みは、SPECTにより非侵襲的に測定した。次にマウスを、ドキソルビシンおよびシクロホスファミドなどの細胞分裂停止剤で処理した。処理に続き24〜72時間、マウスに99mTc標識His-anxA5を静脈内にインジェクションした。腫瘍による取り込みは、SPECTにより非侵襲的に評価した。結果は、抗腫瘍療法の有効性が、99mTc標識His-anxA5を非侵襲的に使用して評価できることを示した。
以下に、出願当初の請求項の記載を実施態様として付記する。
（１）
放射標識アネキシンであって、そこにおいてアネキシン分子が最少で２、且つ最大で２０のヒスチジン残基をそのN末端に含み、前記ヒスチジン残基の少なくとも２が隣接しているか、または１以下の他のアミノ酸により隔てられており、且つ放射性核種に結合されている放射性アネキシン。
（２）
（１）に記載の放射標識アネキシンであって、当該放射性核種は、ガリウム 67, ガリウム 68, インジウム 111, テクネチウム 99m, レニウム 188, 銅 64 および スズ 117mからなる群より選択される放射標識アネキシン。
（３）
（２）に記載の放射標識アネキシンであって、当該放射性核種が99mテクネチウムである放射標識アネキシン。
（４）
（１）〜（３）の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、そのN末端に３〜１０のヒスチジン残基を含む放射標識アネキシン。
（５）
（１）〜（４）の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、前記ヒスチジン残基が配列番号７の１６位のＧｌｕ残基の上流に位置する放射標識アネキシン。
（６）
（１）〜（５）の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、
X4-TVTDFPGFDERADAETLRKAMK  (配列番号4)
ここにおいて、X4は、前記ヒスチジン残基を含み、且つ少なくとも６のアミン酸の配列を表す；
の当該N末端配列を有する放射標識アネキシン。
（７）
（１）〜（７）の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、配列番号７の1-19, 24, 28, 46-64, 86-89, 118-135, 150, 157-170, 202-219, 245-248, および280-294位で当該アミノ酸の何れか１が、システイン残基により置換されている放射標識アネキシン。
（８）
（７）に記載の放射標識アネキシンであって、前記システイン残基が薬理学的薬剤に対して結合されている放射標識アネキシン。
（９）
配列番号８のアミノ酸配列を有するアネキシン 変異体。
（１０）
配列番号８のアミン酸配列を有するアネキシン変異体であって、ここにおいて、7-25, 30, 34, 52-70, 92-95, 124-141, 156, 163-176, 208-225, 251-254 および 286-300位でのアミノ酸の１つが、システイン残基により置換され、321位での当該システイン残基は、別のアミンの酸により置換され、ここにおいて、7-25, 30, 34, 52-70, 92-95, 124-141, 156, 163-176, 208-225, 251-254および286-300位の１つでの当該置換されたシステイン残基は、薬剤に対して任意に結合される放射標識アネキシン。
（１１）
インビボにおいて哺乳類対象の領域内で有核細胞における細胞死イメージングにおいて使用するための、（１）〜（８）の何れか1項に記載の放射標識アネキシン。
（１２）
（１１）に記載の放射標識アネキシンであって、ここにおいて、前記使用が以下を含む放射標識アネキシン；
(a) 当該対象に対して前記放射標識アネキシンを投与すること、 
(b) 適用できる場合には、当該対象を放射線検出装置の検出野内に配置すること、および
(c) 当該対象における放射性核種からの放射線放出を放射線検出装置で測定し、放射線放出の画像を構成すること、
ここにおいて、前記画像は、前記哺乳類対象の前記有核細胞における細胞死の表示である。
（１３）
（１２）に記載の放射標識アネキシンであって、ここにおいて、投与された標識アネキシンの量が、１ｋｇ当たり１〜１０μｇアネキシンタンパク質である放射標識アネキシン。
（１４）
（１２）または（１３）に記載の放射標識アネキシンであって、前記領域は、前記対象の頭部またはその一部分内にあるか、または前記対象の心臓またはその一部分内にあるか、または前記対象の肝臓またはその一部分内にある放射標識アネキシン。
（１５）
（１２）〜（１４）の何れか1項に記載の放射標識アネキシンであって、前記領域が前記対象内の腫瘍またはその一部分内にあるか、または前記対象の移植片またはその一部分内にあるか、または前記対象の虚血部位またはその一部分にある放射標識アネキシン。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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