(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒトから採取された生物学的試料から核酸を抽出する工程；
（ｂ）前記（ａ）工程の核酸を鋳型とし、韓国人またはこれと類似の遺伝学的特性を有するアジア人ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；及び
（ｃ）前記（ｂ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）；及び２Ｄ６重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）からなる群より選択される少なくとも１１個のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子変異の存在有無を調査する工程を含む、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型を決定する方法。
【請求項２】
前記（ａ）工程の生物学的試料が、血液、皮膚細胞、粘膜細胞及び毛髪からなる群より選択されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｂ）工程のプライマーが、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１２１乃至配列番号１２７、配列番号１２９乃至配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４９及び配列番号１５０からなる群より選択される塩基配列を有するものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｃ）工程において、−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｃ）工程において、−１５８４Ｃ＞Ｇ；−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；２５７３ｉｎｓＣ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１２４５ｉｎｓＧＡ、−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｃ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｃ）工程において、−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１５８４Ｃ＞Ｇ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記（ｃ）工程において、−１５８４Ｃ＞Ｇ；−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；２５７３ｉｎｓＣ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１２４５ｉｎｓＧＡ、−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；−１２３５Ａ＞Ｇ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｃ）工程において、−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１６６１Ｇ＞Ｃ及び４１８０Ｇ＞Ｃからなる群より一つ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；−１２３５Ａ＞Ｇ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記（ｃ）工程において、−１５８４Ｃ＞Ｇ；−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；２５７３ｉｎｓＣ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１２４５ｉｎｓＧＡ、−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｃ）工程の変異の存在有無の調査を、スナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を用いて遂行する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記スナップショット分析を、単一塩基多型位置の直ぐそばの塩基が３'末端となり、前記単一塩基多型位置の隣接部位にアニーリングされる配列を含み、５'末端にはＴ塩基が付加されたプライマーを用いて遂行する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマーが、配列番号１４１乃至配列番号１４８、配列番号１５２及び配列番号１５３からなる群より選択される塩基配列を有する請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトクロムＰ４５０  １Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）、２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６）及び２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）、ＰＸＲ及びＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ族（ＵＧＴ１Ａ）遺伝子の遺伝型分析のためのｈｔＳＮＰ、及びそれを用いた遺伝子分析チップに関し、より詳しくは、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＲ１Ｉ２（＝ＰＸＲ）及びＵＧＴ１Ａ遺伝子のハプロタイプ分析のためのｈｔＳＮＰの選別方法、前記ｈｔＳＮＰを用いて前記遺伝子の遺伝型を決定する方法及びそのための遺伝子分析チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
個体間の遺伝的多様性は薬物の毒性及び効能において個体間の差異をもたらす。従って、薬物開発の初期段階でこのような薬剤学的に重要な蛋白質の遺伝的多様性に関する効果を考慮するのは、薬物開発の失敗に対する危険性を低めることができる重要な要素である。このような個体間遺伝的多様性を測定する一つの調査集団となるのが“ハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）”である。ハプロタイプとは、一つの調査集団内に存在する各遺伝子配列の多型性の組み合わせを意味し、これは個別的な多型性よりも遺伝的多様性に関するより正確かつ信頼できる情報を提供する。
【０００３】
一方、ヒトシトクロムＰ４５０は、薬物、発癌原及び毒素のような外来化学物質とステロイド、脂肪酸及びビタミンのような内部気質の酸化を促進するヘム蛋白質の一員である（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１-４２，１９９６）。肝を含む腎臓、腸管及び肺のような器官で多様なシトクロムＰ４５０の亜型が発見された。
【０００４】
ヒトシトクロムＰ４５０  １Ａ２（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ １Ａ２、以下‘ＣＹＰ１Ａ２’という）はＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１と共にＣＹＰ１族に属する薬物代謝酵素である。ＣＹＰ１Ａ２は肝で主に生産され、総シトクロムＰ４５０酵素量の１５％を占める。この酵素はカフェイン（ｃａｆｆｅｉｎｅ）、クロザピン（ｃｌｏｚａｐｉｎｅ）、イミパラミン（ｉｍｉｐａｒａｍｉｎｅ）、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）を含む医学的に重要な薬物の代謝に関与する。この酵素は、また１７β−エストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ウロポルフィリノーゲン（ｕｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ）ＩＩＩのような内部合成物質とポリサイクリック芳香族炭化水素エポキシ化（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｅｐｏｘｉｄａｔｉｏｎ）と芳香族/ヘテロサイクリックアミンＮ−ヒドロキシ化（ａｒｏｍａｔｉｃ/ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｍｉｎｅ Ｎ-ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）のような発癌物質生活性化（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）反応を触媒する（Ｂｒｏｓｅｎ Ｋ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ, １９９５，２９(ｓｕｐｐｌ１)：２０-２５；Ｊｏｓｅｐｈｙ ＰＤ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｏｌ. Ｍｕｔａｇｅｎ，２００１，３８：１２-１８）。
【０００５】
また、ヒトシトクロムＰ４５０  ２Ａ６（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ａ６、以下‘ＣＹＰ２Ａ６’という）遺伝子は１９番目染色体に位置しており、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の上流には塩基配列類似性の高い類似遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）であるＣＹＰ２Ａ７が位置している。
【０００６】
ＣＹＰ２Ａ６酵素はニコチン（ｎｉｃｏｔｉｎｅ）をコチニン（ｃｏｔｉｎｉｎｅ）に変換する機能を有し、ニコチン代謝の約８０％に関与する重要な酵素であり、生体内で抗癌剤であるテガフール（ｔｅｇａｆｕｒ）を活性型である５−フルオロウラシル（５-ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、５-ＦＵ）に変換させる過程に関与する酵素である。前記酵素は肝で主に生産され、肺、大腸、乳房、腎腸及び子宮のような臓器では少量発現する（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ．，２９(２)：９１-５，２００１；Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．，１８；５４(１０)：１２４５-５６，２００２）。
【０００７】
また、ヒトシトクロムＰ４５０  ２Ｄ６（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｄ６、以下‘ＣＹＰ２Ｄ６’という）遺伝子は２２番目染色体に位置しており、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の一方の面には類似遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓ）であるＣＹＰ２Ｄ７とＣＹＰ２Ｄ８が位置している。前記遺伝子によりコーディングされる酵素は精神活性薬物（ｐｓｙｃｈｏａｃｔｉｖｅ ｄｒｕｇｓ）、心血管系薬物、モルヒネ系薬物など、１００種類以上の臨床的に重要な薬物を代謝することが知られている。
【０００８】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子によりコーディングされる酵素は、肝で主に生産され、シトクロムＰ４５０酵素の総量の約２％を占めるが、３０％程度の薬物代謝に関与する重要な酵素である。
【０００９】
個体内で前記酵素の活性は非常に多様であり、これらはその活性程度によりそれぞれＰＭ（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒｓ）、ＩＭ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒｓ）、ＥＭ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒｓ）及びＵＭ（ｕｌｔｒａｒａｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｉｌｚｅｒｓ）群に分類されている。前記のように酵素の活性がそれぞれ異なるように現れるのは、前記遺伝子の遺伝的多型性による原因もある。ＣＹＰ１Ａ２の遺伝子は遺伝的多型性を現わすことが知られているが、現在までこの遺伝子のプロモーター、エクソン及びイントロンで２４種以上の変異が発見され、これら変異遺伝子の組み合わせであるハプロタイプは２００７年６月現在３６種類（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ.ｋｉ.ｓｅ/ｃｙｐ１ａ２.ｈｔｍ）、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝型は５０種類（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ.ｋｉ.ｓｅ／ｃｙｐ２ａ６.ｈｔｍ）、ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝的多型性は約８０種類知られており（ｗｗｗ.ｉｍｍ.ｋｉ.ｓｅ／ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ／ｃｙｐ２ｄ６.ｈｔｍ）、種族間の明確な差異を示している。しかしながら、このような遺伝子変異とハプロタイプに対して多様な種類が報告されているため、分析時間と費用の効率性を増大するために最小限の単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）を通じて正確なハプロタイプを決定することが重要である。
【００１０】
一方、多様な種類の薬物が体内に入って排出されるまで体内では代謝と輸送が起こるが、ここに関与する酵素系としては、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）と薬物輸送蛋白質がある。この中で薬物の酸化代謝に関与するＣＹＰ酵素に対する研究が多く行われており、現在１５種類程度のＣＹＰ酵素が遺伝的多型性を示すことが報告されており、代表的なものとしてＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＭＤＲ１及びＣＹＰ２Ｃ１９などがある。遺伝的な多型性はこれら酵素の基質薬物の臨床効果、治療効果及び副作用の発生に影響を与える重要な因子として作用するようになる。これらの中で一部の変異遺伝子は酵素喪失を招いて薬物代謝能が全くない形態で現れ、一部の変異遺伝子は酵素活性度が一部減少する形態で現れることもある。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ９などのような酵素は変異遺伝子により表現型が変わり、比較的に遺伝型と表現型間に高い相関性を示す反面、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６及びＭＤＲ１などの遺伝子は機能性変異遺伝子の有無から表現型を予測するのに困難がある。
【００１１】
ヒトの場合、服用する薬物の５０％以上を代謝させるＣＹＰ３Ａ４は個体間に多くの活性差異を示し、ＣＹＰ２Ｂ６の場合も個体間の差異が最大２７０倍程度生じることが知られている。このような個人差にもかかわらず、個人による活性の差異は遺伝型から直ちに予測し難いが、これはこれら遺伝型と表現型の相関性が低い薬物代謝酵素や薬物輸送蛋白質の場合、蛋白質の発現が外部因子により顕著に変わることがあるためである。従って、これら遺伝子の場合、変異遺伝子の有無よりは蛋白質の発現調節が代謝活性の個人差を招くより重要な要素になるだろう。また、酵素の発現誘導により酵素の生産量自体が多くなり、活性が増加する結果を示すことがあるが、これら発現誘導メカニズムは外部物質が薬物受容体と結合して標的遺伝子のプロモーターに結合することによって行われる。このような薬物受容体の代表的なものとして、プレグナンＸ受容体（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＸＲ）がある。ＰＸＲ受容体はＮＲ１Ｉ２という遺伝子で発現することが知られている。
【００１２】
ＰＸＲは個人間発現量の差異が報告されており、興味深い点は受容体の発現量がＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ２Ｂ６のような薬物代謝酵素の発現量と高い相関性を示すということである（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ, ２００５，６：３６９-３８３）。従って、個体間の薬物代謝酵素の発現量差異は変異型蛋白質によるものというよりはＰＸＲ遺伝子の発現量や活性差異に起因する。
【００１３】
このような脈絡で、最近、個人別ＰＸＲ遺伝子の遺伝的多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）研究や発現差異に対する研究が関心を引いているが、アミノ酸の配列に変化がないにもかかわらず、人体でエリスロマイシン呼吸検査法（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｂｒｅａｔｈ ｔｅｓｔ）またはリファムピン（ｒｉｆａｍｐｉｎ）によるＣＹＰ３Ａ４活性増加などの薬物反応に個人間の差異を招く一部の変異遺伝子が報告されたことがある（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１１：５５５-５７２）。このようなＰＸＲの変異は標的遺伝子の発現変化に応じた活性変化を招くため、薬物や生体分子の体内動態の差異を招くこともでき、ＰＸＲの結合子である併用薬物による薬物相互作用の個人差にも大きく寄与する。
【００１４】
一方、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ-ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＵＧＴ）は生体内で耐因性及び外因性物質にグルクロン酸が接合する反応を触媒する酵素として、フェノール、アルコール、アミン及び脂肪酸化合物などのように生体毒性を有する多様な物質のグルクロン酸接合体を生成させることによって、水溶性物質に転換させて胆汁や尿で排出されるようにする（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ Ａ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．，２４：４８-５７，１９９６）。
【００１５】
このようなＵＧＴは肝細胞の小胞体及び核膜に主に存在することが報告されており、腎腸及び皮膚のような他の組織でもその発現が報告されたことがある。ＵＧＴ酵素は一次アミノ酸配列間の類似性に基づいて大きくＵＧＴ１及びＵＧＴ２の亜族に区分することができ、この中でヒトＵＧＴ１Ａ族の場合には９種類（ＵＧＴ１Ａ１、及びＵＧＴ１Ａ３乃至ＵＧＴ１Ａ１０）の異性体が報告されており、その中の５種類（ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ６、及びＵＧＴ１Ａ９）が肝で発現することが知られている。
【００１６】
このようなＵＧＴ１Ａ族遺伝子は個人毎に遺伝的多型性を有することが知られており、最近までＵＧＴ１Ａ族の遺伝的多型性はＵＧＴ１Ａ１、及びＵＧＴ１Ａ３乃至ＵＧＴ１Ａ１０のそれぞれにより多様な種類が存在することが知られている（ｈｔｔｐ：／／ｇａｌｉｅｎ.ｐｈａ.ｕｌａｖａｌ.ｃａ／ａｌｌｅｌｅｓ／ａｌｌｅｌｅｓ.ｈｔｍｌ）。ＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の多型性は特に種族間に明確な差異を見せており、このような多型性により酵素の活性が異なるように現れることが確認され、薬物治療などに対する感受性を決定する要因として重要視されている。また、ＵＧＴ１Ａ１*６とＵＧＴ１Ａ１*２８はギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）症候群と関連があり（Ｍｏｎａｇｈａｎ Ｇ，Ｌａｎｃｅｔ，３４７：５７８-８１,１９９６）、その他にも多様な疾病と関連した多様な機能的な変異型が報告されている。
【００１７】
ところで、このような遺伝子変異とハプロタイプは多様な種類が報告されているため、検索方法の効率性を考えざるを得ない。ハプロタイプはＡｒｌｅｑｕｉｎ、ＳＮＰＡｌｙｚｅまたはこれらと類似するソフトウェアを用いて分析が可能である。各ハプロタイプに対する遺伝子変異検索を全ての単一塩基多型に対して分析するとすれば、費用及び時間の面で効率性を期待し難い。
【００１８】
効率性増大のための方法として、ハプロタイプタグ単一塩基多型（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ-ｔａｇｇｉｎｇ ＳＮＰ；ｈｔＳＮＰ）選別技術を挙げることができる。ｈｔＳＮＰ選別技術は、それぞれのハプロタイプの正確な表示のために最小限の標識セットの選択を助けるための方法として、選別された単一塩基多型（ＳＮＰ）のみを確認する場合、全てのハプロタイプを予測できる。
【００１９】
多くの遺伝子の場合に遺伝的多型性の分布は種族による差異を示すことが知られているため、前記遺伝子の場合にも韓国人に頻繁に発生される固有遺伝子変異及びハプロタイプはないか、あるとすれば頻度はどのくらいか、それぞれのハプロタイプに応じたｈｔＳＮＰの選別はどのようになるか、確認する必要がある。しかしながら、韓国人において前記遺伝子の変異、これによるハプロタイプ及びこれを分析するためのｈｔＳＮＰに対する研究は非常に不十分であるのが実情である。
【００２０】
また、最近西洋人で主に発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子変異を中心にスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を用いて１１個のＳＮＰを分析する方法（Ｓｉｓｔｏｎｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ. ２００５ Ｊｕｌ；５１(７)：１２９１-５）、及びロシュ社やジュリーラブ社のＣＹＰ２Ｄ６診断チップが報告された。しかしながら、これらはＣＹＰ２Ｄ６変異遺伝子の組み合わせが西洋人で発見される変異を中心に形成されているため、韓国人を含む東洋人に対するＣＹＰ２Ｄ６遺伝子変異診断に関する研究は非常に不十分であるのが実情である。
【００２１】
そこで、本発明者等は韓国人で主に発見されるヒトＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＲ１Ｉ２（＝ＰＸＲ）及びＵＧＴ１Ａ遺伝子の変異を短時間内に正確に確認できる方法を開発するために研究を行い、韓国人で主に発見されるヒトＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＲ１Ｉ２（＝ＰＸＲ）及びＵＧＴ１Ａ遺伝子の変異に対するｈｔＳＮＰ選別方法及び前記選別されたｈｔＳＮＰの有用性を確認することによって本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、本発明の目的は、韓国人で発見されるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＲ１Ｉ２（＝ＰＸＲ）及びＵＧＴ１Ａ遺伝子のハプロタイプを分析できるｈｔＳＮＰを選別する方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記ｈｔＳＮＰを用いてヒトＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＲ１Ｉ２（＝ＰＸＲ）及びＵＧＴ１Ａ遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供することにある。
【００２３】
また、本発明のさらに他の目的は、遺伝子分析チップを含むキットを用いてヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
前記のような目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；（ｂ）前記（ａ）工程の採取された試料から核酸を抽出する工程；（ｃ）前記（ｂ）工程の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＰＸＲ及びＵＧＴ１Ａ遺伝子からなる群より選択された遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列で変異の存在有無を確認する工程；（ｅ）前記（ｄ）工程で変異が存在すると確認されたＰＣＲ産物の塩基配列において、ハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を分析する工程；及び（ｆ）前記（ｅ）工程で分析されたハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガー（ＳＮＰｔａｇｇｅｒ）ソフトウェアを用いて分析し、ｈｔＳＮＰを選別する工程を含む、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＰＸＲ及びＵＧＴ１Ａからなる群より選択される遺伝子のｈｔＳＮＰを選別する方法を提供する。
【００２５】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）被験者から生物学的試料を採取する工程；（ｂ）前記（ａ）工程の採取された試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｃ）前記（ｂ）工程のゲノムＤＮＡの鋳型とし、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーを用いてＰＣＲを遂行する工程；及び（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−３８６０Ｇ＞Ａ、−３５９８Ｇ＞Ｔ、−３５９４Ｔ＞Ｇ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８４７Ｔ＞Ｃ、−２８０８Ａ＞Ｃ、−２６０３ｉｎｓＡ、−２４６７ｄｅｌＴ、−１７０８Ｔ＞Ｃ、−７３９Ｔ＞Ｇ、−１６３Ｃ＞Ａ、１５１４Ｇ＞Ａ、２１５９Ｇ＞Ａ、２３２１Ｇ＞Ｃ、３６１３Ｔ＞Ｃ、５３４７Ｃ＞Ｔ及び５５２１Ａ＞Ｇからなる群より選択される少なくとも１１個のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異の存在有無を調査する工程を含む、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）被験者から生物学的試料を採取する工程；（ｂ）前記（ａ）工程の採取された試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｃ）前記（ｂ）工程のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のプロモーター領域を増幅できるプライマーを用いてＰＣＲを遂行する工程；及び（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−３８６０Ｇ＞Ａ、−３５９８Ｇ＞Ｔ、−３５９４Ｔ＞Ｇ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８４７Ｔ＞Ｃ、−２８０８Ａ＞Ｃ、−２６０３ｉｎｓＡ、−２４６７ｄｅｌＴ、−１７０８Ｔ＞Ｃ、−７３９Ｔ＞Ｇ及び１６３Ｃ＞Ａを含むＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異の存在有無を調査する工程を含む、ＣＹＰ１Ａ２プロモーター遺伝子の変異を検出する方法を提供する。
【００２７】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）被験者から生物学的試料を採取する工程；（ｂ）前記工程（ａ）の採取された試料から核酸を抽出する工程；（ｃ）前記工程（ｂ）の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；及び（ｄ）前記工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−４８Ｔ＞Ｇ、１３Ｇ＞Ａ、５６７Ｃ＞Ｔ、２１３４Ａ＞Ｇ、３３９１Ｔ＞Ｃ、６４５８Ａ＞Ｔ、６５５８Ｔ＞Ｃ、６５８２Ｇ＞Ｔ、６６００Ｇ＞Ｔ、及び６０９１Ｃ＞Ｔからなる群より選択されるＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異の存在有無を調査する工程を含む、ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供する。
【００２８】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；（ｂ）前記（ａ）工程の採取された試料から核酸を抽出する工程；（ｃ）前記（ｂ）工程の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；及び（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）；及び２Ｄ６重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を含む少なくとも１１個のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子変異の存在有無をＳＮａＰｓｈｏｔ技法を用いて調査する工程を含む、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供する。
【００２９】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；（ｂ）前記工程（ａ）の採取された試料から核酸を抽出する工程；（ｃ）前記工程（ｂ）の核酸を鋳型とし、ヒトＰＸＲ遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーを用いてＰＣＲを遂行する工程；及び（ｄ）前記工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−２５３８５Ｃ＞Ｔ、−２４１１３Ｇ＞Ａ、７６３５Ａ＞Ｇ、８０５５Ｃ＞Ｔ、１１１５６Ａ＞Ｃ及び１１１９３Ｔ＞Ｃからなる群より選択されたＰＸＲ遺伝子の遺伝子変異の存在有無を調査する工程を含む、ＰＸＲ遺伝子の遺伝型を分析する方法を提供する。
【００３０】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；（ｂ）前記工程（ａ）で採取された試料から核酸を抽出する工程；（ｃ）前記工程（ｂ）で抽出された核酸を用いてヒトＵＧＴ１Ａ族個別遺伝子増幅する工程；及び（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅された遺伝子の塩基配列を分析し、ＵＧＴ１Ａ１での−３９（ＴＡ）６＞（ＴＡ）７、２１１Ｇ＞Ａ、２３３Ｃ＞Ｔ及び６８６Ｃ＞Ａ；ＵＧＴ１Ａ３での３１Ｔ＞Ｃ、１３３Ｃ＞Ｔ及び１４０Ｔ＞Ｃ；ＵＧＴ１Ａ４での３１Ｃ＞Ｔ、１４２Ｔ＞Ｇ及び２９２Ｃ＞Ｔ；ＵＧＴ１Ａ６での１９Ｔ＞Ｇ、５４１Ａ＞Ｇ及び５５２Ａ＞Ｃ；ＵＧＴ１Ａ７での３８７Ｔ＞Ｇ、３９１Ｃ＞Ａ、３９２Ｇ＜Ａ、６２２Ｔ＞Ｃ及び７０１Ｔ＞Ｃ；及びＵＧＴ１Ａ９での−１１８Ｔ９＞Ｔ１０、７２６Ｔ＞Ｇ及び７６６Ｇ＞Ａからなる群より選択されたＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型の存在有無を確認する工程を含む、ＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型を決定する方法を提供する。
【００３１】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；（ｂ）前記工程（ａ）で採取された試料から核酸を抽出する工程；（ｃ）前記工程（ｂ）で抽出された核酸を用いてヒトＵＧＴ１Ａ族遺伝子を増幅する工程；及び（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅された遺伝子の塩基配列を分析し、ＵＧＴ１Ａ１での２１１Ｇ＞Ａ、２３３Ｃ＞Ｔ及び６８６Ｃ＞Ａ；ＵＧＴ１Ａ６での１９Ｔ＞Ｇ、５４１Ａ＞Ｇ及び５５２Ａ＞Ｃ；及びＵＧＴ１Ａ９での−１１８Ｔ９＞Ｔ１０、７２６Ｔ＞Ｇ及び７６６Ｇ＞Ａからなる群より選択されたＵＧＴ１Ａ族遺伝子変異型の存在有無を確認する工程を含む、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）に対する感受性と関連したＧＴ１Ａ族遺伝子の多型性を決定する方法を提供する。
【００３２】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）検査しようとする遺伝子を抽出した後、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲを遂行して同定しようとするＳＮＰ周辺を含むＰＣＲ産物を得る工程；（ｂ）各対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）の特異的な塩基を同定できるＡＳＰＥ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）プライマーを用いてＡＳＰＥ反応を遂行する工程；（ｃ）前記反応産物を遺伝子チップに混成化させる工程；及び（ｄ）前記チップを分析する工程を含む、遺伝子分析チップを用いてヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供する。
【００３３】
また、本発明は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝型の判別のためのＳＮａＰｓｈｏｔ方法の遺伝型分析用キット及びＳＮＰ検査用ジップ・コード（ＺｉＰ  Ｃｏｄｅ）オリゴ塩基チップを含む、遺伝型分析用チップを提供する。
【００３４】
本発明で“生物学的試料”は、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞及び毛髪を含み、好ましくは血液であっても良い。
【００３５】
本発明で核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであっても良く、好ましくはＤＮＡ、より好ましくはゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡであっても良い。
【００３６】
以下、本明細書に記載された変異について説明する。
本発明で用語“ａＮ＞Ｍ”または“ＮａＭ”（この時、ａは整数、Ｎ及びＭはそれぞれ独立的にＡ、Ｃ、ＴまたはＧである。）は、遺伝子塩基配列でａ番目Ｎ塩基がＭ塩基に置換されたことを意味し、“ａｉｎｓＮ”または“ａｄｅｌＮ”（この時、ａは整数、ＮはＡ、Ｃ、ＴまたはＧである。）は、遺伝子塩基配列でａ番目にＮ塩基がもう一つ挿入され、または欠失されたことを意味する。
【００３７】
例えば、“−１５８４Ｃ＞Ｔ”変異とは、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列で−１５８４番目塩基がＣからＴに置換されたことをいう。
【００３８】
“２５７３ｉｎｓＣ”変異とは、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列で２５７３番目塩基にＣが挿入（付加）されたことをいい、“４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ”変異とは、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の４１２５番目塩基から４１３３番目塩基の位置にＧＴＧＣＣＣＡＣＴの９個の塩基が挿入されたことをいう。
【００３９】
また、“２Ｄ６欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）”変異とは、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子全体が染色体上から欠失されたことをいう。
【００４０】
ひいては、本発明で“２Ｄ６重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）”変異とは、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子が二以上同一の染色体上に重複していることをいう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の塩基配列において、本発明で初めで糾明したＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１個の変異の位置を示したものである。
【図２】本発明で選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子のｈｔＳＮＰ組み合わせの一例である。
【図３】本発明で選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子のｈｔＳＮＰ組み合わせの多の一例である。
【図４】本発明で選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子のｈｔＳＮＰ組み合わせの他の一例である。
【図５】本発明で選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子のｈｔＳＮＰ組み合わせの他の一例である。
【図６】本発明で選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子のｈｔＳＮＰ組み合わせの他の一例である。
【図７】本発明の方法により選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の機能的変異である、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターの全ての単一塩基多型が野生型である遺伝子の変異を検索した結果を示す（Ｘ軸は各プライマーの分子量による移動程度、Ｙ軸は各ピークの高さである。以下図１４まで同様）。
【図８】本発明の方法により選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の機能的変異である、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターの−３８６０Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｃ）、−２４６７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｄ）及び１６３Ｃ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｆ）の変異位置が二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有している異型接合型（ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子の場合の結果を示す。
【図９】本発明の方法により選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の機能的変異である、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターの３８６０Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｃ）、−２４６７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｄ）及び１６３Ｃ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｆ）の位置が二本のＤＮＡの全てが変異型を有している同型接合型（ｈｏｍｏ）変異遺伝子である場合の結果を示す。
【図１０】本発明の方法により選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の機能的変異である、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターの−１６３Ｃ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｆ）及び２８０８Ａ＞Ｃの位置が異型接合型変異遺伝子である場合の結果を示す。
【図１１】本発明の方法により選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の機能的変異である、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターの−１６３Ｃ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｆ）は同型接合型変異、−２４６７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｄ）、−７３９Ｔ＞Ｇ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｅ）、−３５９８Ｇ＞Ｔ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８４７Ｔ＞Ｃ及び１７０８Ｔ＞Ｃの位置は異型接合型変異遺伝子である場合の結果を示す。
【図１２】本発明の方法により選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の機能的変異である、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターの−１６３Ｃ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｆ）は同型接合型変異、−２４６７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｄ）、−３５９８Ｇ＞Ｔ及び２８４７Ｔ＞Ｃの位置は異型接合型変異遺伝子である場合の結果を示す。
【図１３】本発明の方法により選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の機能的変異である、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターの−１６３Ｃ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｆ）、−２４６７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｄ）及び３５９４Ｔ＞Ｇの位置は異型接合型変異遺伝子である場合の結果を示す。
【図１４】本発明の方法により選別されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の機能的変異である、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターの−１６３Ｃ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｆ）は同型接合型変異、−３８６０Ｇ＞Ａ（ＣＹＰ１Ａ２*Ｃ）、−２４６７ｄｅｌＴ（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｄ）及び２６０３ｉｎｓＡの位置は異型接合型変異遺伝子である場合の結果を示す。
【図１５】本発明でｈｔＳＮＰ組み合わせを選別するために用いたＣＹＰ２Ａ６の韓国人でのハプロタイプの種類及び頻度を示す。
【図１６】本発明による、機能性変異６種類と機能性が疑われる３種類の変異遺伝子を遺伝子変異検査対象に含むＣＹＰ２Ａ６遺伝子のハプロタイプを分析するためのｈｔＳＮＰ組み合わせの選別を例示したものである。
【図１７】本発明による、アミノ酸置変異が８種類、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の欠失を標識する変異３種類及び６個の頻度が高いＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異を含むＣＹＰ２Ａ６遺伝子のハプロタイプを分析するためのｈｔＳＮＰ組み合わせの選別を例示したものである。
【図１８】本発明による、アミノ酸置換変異８種類、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の欠失を標識する変異３種類及び６個の頻度が高いＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異を含むＣＹＰ２Ａ６遺伝子のハプロタイプを分析するための他のｈｔＳＮＰ組み合わせの選別を例示したものである。
【図１９】本発明による、アミノ酸置換変異８種類、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の欠失を標識する変異３種類及び６個の頻度が高いＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異を含むＣＹＰ２Ａ６遺伝子のハプロタイプを分析するための他のｈｔＳＮＰ組み合わせの選別を例示したものである。
【図２０】本発明による、アミノ酸置換変異８種類、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の欠失を標識する変異３種類及び６個の頻度が高いＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異を含んでＣＹＰ２Ａ６遺伝子のハプロタイプを分析するための他のｈｔＳＮＰ組み合わせの選別を例示したものである。
【図２１】本発明による、アミノ酸置換変異８種類、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の欠失を標識する変異３種類及び６個の頻度が高いＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異を含んでＣＹＰ２Ａ６遺伝子のハプロタイプを分析するための他のｈｔＳＮＰ組み合わせの選別を例示したものである。
【図２２】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の−４８Ｔ＞Ｇ、２１３４Ａ＞Ｇ及び６５５８Ｔ＞Ｃの変異位置が二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有している異型接合型（ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図２３】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の５６７Ｃ＞Ｔの変異位置が二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有している異型接合型（Ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図２４】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の６４５８Ａ＞Ｔ及び６５５８Ｔ＞Ｃの変異位置が二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有している異型接合型（Ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図２５】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の−４８Ｔ＞Ｇ、１３Ｇ＞Ａ及び６５５８Ｔ＞Ｃの変異位置が二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有している異型接合型（Ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図２６】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３３９１Ｔ＞Ｃの変異位置が一本は変異型、他の一本は欠失されたタイプの異型接合型（Ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図２７】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の−４８Ｔ＞Ｇ及び２１３４Ａ＞Ｇの変異位置が一本は変異型、他の一本は欠失されたタイプの異型接合型（Ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図２８】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の−４８Ｔ＞Ｇ、６５５８Ｔ＞Ｃ、及び６６００Ｇ＞Ｔの変異位置が二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有している異型接合型（Ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図２９】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の６４５８Ａ＞Ｔの変異位置が一本は変異型、他の一本は欠失されたタイプの異型接合型（Ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図３０】本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせ及びＣＹＰ２Ａ６遺伝子の６５５８Ｔ＞Ｃ及び６５８２Ｇ＞Ｔの変異位置が二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有している異型接合型（Ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図３１】ＣＹＰ２Ａ６遺伝子が相同染色体に正常に存在する遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図３２】ＣＹＰ２Ａ６遺伝子が一つの染色体には存在せず、一つの遺伝子だけを有する遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図３３】ＣＹＰ２Ａ６遺伝子が欠失されてＣＹＰ２Ａ６遺伝子の一部の残った部分とＣＹＰ２Ａ７遺伝子の接合形態にある遺伝子に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図３４】本発明で選別されたＣＹＰ２Ｄ６のｈｔＳＮＰ組み合わせの例を示す。
【図３５】本発明で選別されたＣＹＰ２Ｄ６のｈｔＳＮＰ組み合わせの他の例を示す。
【図３６】本発明で選別されたＣＹＰ２Ｄ６のｈｔＳＮＰ組み合わせの他の例を示す。
【図３７】本発明で選別されたＣＹＰ２Ｄ６のｈｔＳＮＰ組み合わせの他の例を示す。
【図３８】本発明で選別されたＣＹＰ２Ｄ６のｈｔＳＮＰ組み合わせの例を示す。示したものである。
【図３９】本発明で選別されたＣＹＰ２Ｄ６のｈｔＳＮＰ組み合わせの例を示す。
【図４０】本発明で選別されたＣＹＰ２Ｄ６のｈｔＳＮＰ組み合わせの１種類に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図４１】本発明で選別されたＣＹＰ２Ｄ６のｈｔＳＮＰ組み合わせの１種類に対してスナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析を遂行した結果を示す。
【図４２】遺伝子分析チップを用いてＣＹＰ２Ｄ６の遺伝型を分析する過程を示す。
【図４３】ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子分析チップ上のプローブを示す。
【図４４】ロング（ｌｏｎｇ）ＰＣＲを用いたＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の増幅を示す。
【図４５】ＡＳＰＥ反応過程を示す。
【図４６】実施例１２によりＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異を分析した結果を示す遺伝子チップである。
【図４７】本発明で選別されたＰＸＲ遺伝子のｈｔＳＮＰ組み合わせの例を示す。
【図４８】本発明の方法により選別された−２５３８５Ｃ＞Ｔ、−２４１１３Ｇ＞Ａ、７６３５Ａ＞Ｇ、８０５５Ｃ＞Ｔ、１１１５６Ａ＞Ｃ及び１１１９３Ｔ＞Ｃが全て野生型であるＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を検索した結果を示す（Ｘ軸は各プライマーの分子量による移動程度、Ｙ軸は各ピークの高さを示す。）。
【図４９】本発明の方法により選別された−２５３８５Ｃ＞Ｔ、−２４１１３Ｇ＞Ａ、７６３５Ａ＞Ｇ、８０５５Ｃ＞Ｔ、１１１５６Ａ＞Ｃ及び１１１９３Ｔ＞Ｃの変異位置が二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有している異型接合型（ｈｅｔｅｒｏ）変異遺伝子であるＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を検索した結果を示す。
【図５０】本発明の方法により選別された−２５３８５Ｃ＞Ｔ、−２４１１３Ｇ＞Ａ、７６３５Ａ＞Ｇ、８０５５Ｃ＞Ｔ、１１１５６Ａ＞Ｃ及び１１１９３Ｔ＞Ｃの位置が二本のＤＮＡの全てが変異型を有している同型接合型（ｈｏｍｏ）変異遺伝子であるＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を検索した結果を示す。
【図５１】韓国人５０名を対象としてＵＧＴ１Ａ１（ａ）及びＵＧＴ１Ａ３（ｂ）族遺伝子の機能的変異型を分析した結果を示す（図中、Ｔはチアミン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ａはアデニンを意味する。）。
【図５２】韓国人５０名を対象としてＵＧＴ１Ａ４（ａ）及びＵＧＴ１Ａ６（ｂ）族遺伝子の機能的変異型を分析した結果を示す。
【図５３】韓国人５０名を対象としてＵＧＴ１Ａ７族遺伝子の機能的変異型を分析した結果を示す。
【図５４】韓国人５０名を対象としてＵＧＴ１Ａ９族遺伝子の機能的変異型を分析した結果を示す。
【図５５】韓国人５０名を対象としてＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ６及びＵＧＴ１Ａ９族遺伝子のイリノテカン感受性関連多型性を分析した結果であり、（ａ）は、ＵＧＴ１Ａ１で２１１Ｇ＞Ａ、２３３Ｃ＞Ｔ及び６８６Ｃ＞Ａ；ＵＧＴ１Ａ６で１９Ｔ＞Ｇ、５４１Ａ＞Ｇ及び５５２Ａ＞Ｃ；及びＵＧＴ１Ａ９で７２６Ｔ＞Ｇ及び７６６Ｇ＞Ａが全て野生型でＣ＞Ａが異型（ｈｅｔｅｒｏ）；ＵＧＴ１Ａ６で１９Ｔ＞Ｇ及び５５２Ａ＞Ｃが異型、５４１Ａ＞Ｇが野生型；及びＵＧＴ１Ａ９で７２６Ｔ＞Ｇ及び７６６Ｇ＞Ａが野生型である場合の、（ｃ）は、ＵＧＴ１Ａ１で２１１Ｇ＞Ａ、２３３Ｃ＞Ｔ及び６８６Ｃ＞Ａが野生型；ＵＧＴ１Ａ６で１９Ｔ＞Ｇ、５４１Ａ＞Ｇ及び５５２Ａ＞Ｃが異型；及びＵＧＴ１Ａ９で７２６Ｔ＞Ｇが異型、７６６Ｇ＞Ａが野生型である場合の、（ｄ）は、ＵＧＴ１Ａ１で２１１Ｇ＞Ａ及び２３３Ｃ＞Ｔが異型、６８６Ｃ＞Ａが野生型；ＵＧＴ１Ａ６で１９Ｔ＞Ｇ、５４１Ａ＞Ｇ及び５５２Ａ＞Ｃが異型；及びＵＧＴ１Ａ９で７２６Ｔ＞Ｇ及び７６６Ｇ＞Ａが野生型である場合の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の上記した特徴及び／または他の特徴は添付図面を参照した下記の実施態様の説明により明らかになり、また容易に理解できるであろう。
【００４３】
１．ＣＹＰ２Ａ６
本発明は、韓国人ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異分析を通じて韓国人において発見されるＣＹＰ１Ａ２遺伝子の遺伝型を糾明し、これに基づいてそれぞれのハプロタイプの最適の標識セットであるｈｔＳＮＰを選別し、その有用性を確認したという点に特徴がある。また、本発明は、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子の新規なハプロタイプを糾明したという点に特徴がある。
【００４４】
本発明によるヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のｈｔＳＮＰを選別する方法は次の工程を含む：
（ａ）被験者から生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記（ａ）工程で採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記（ｂ）工程の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列を分析して変異の存在有無を確認する工程；及び
（ｅ）前記（ｄ）工程で変異が存在すると確認されたＰＣＲ産物の塩基配列をＳＮＰタガー（ＳＮＰｔａｇｇｅｒ）ソフトウェアを用いて分析する工程。
【００４５】
前記（ａ）工程で採取された試料から核酸を抽出する方法は、特に限定されず、当業界に公知となった技術または市販されている抽出用キットを使用することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出用キットはＱｉａｇｅｎ（米国）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国）で購入できる。前記でＲＮＡを抽出して使用する場合には逆転写によりｃＤＮＡを製造して使用する。
【００４６】
前記（ｃ）工程で前記ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子の断片は、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子の公知となった変異、例えば単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）を含んでいる断片をいう。前記ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーは、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子またはその断片の塩基配列に基づいてデザインすることができ、例えば、配列番号２乃至配列番号３１のプライマーからなる群より選択されることができるが、これに制限されない。
【００４７】
前記（ｄ）工程で変異は、単一塩基多型、遺伝子の欠失及び遺伝子の重複を含むが、これに制限されず、例えば、表５に示す１７個の変異を含むことができる。
【００４８】
また、塩基配列を分析する方法としては、特に限定されず、当業界に公知となった方法を使用することができる。例えば、その配列部分を直接決定するために、自動塩基配列分析器を使用するか、またはパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を遂行できる。前記パイロシーケンシングはＤＮＡシーケンシングに利用されることもある公知のＳＮＰ分析方法として、ＤＮＡが重合される間に放出されるＰＰｉ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の光の発現を検出する方法である。前記塩基配列分析は、例えば、配列番号３２乃至６１のプライマーからなる群より選択されたプライマーを用いて遂行されることができるが、これに制限されない。
【００４９】
また、前記（ｄ）工程で変異の存在有無は、野生型ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の塩基配列と比較して確認できる。野生型ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の塩基配列、例えば、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.：ＮＴ_０１０１９４）の塩基配列、または当業界に公知となったＣＹＰ１Ａ２遺伝型の各塩基配列に基づいて比較して確認できる（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ. Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，２００５，２０(１)：２４-３３）。
【００５０】
前記でハプロタイプの頻度及び種類を予測することは当業界で公知の技術プログラムまたは市販されるプログラムを使用して分析できる。例えば、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗプログラムは無料で配布されるプログラムで利用でき、ＳＮＰＡｌｙｚｅのような商用化されたプログラムを使用することもできる。前記 Ｈａｐｌｏｖｉｅｗソフトウェアは当業界に公知となっており、好ましくはインターネットウェブサイトである ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｐｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ を利用することができる。
【００５１】
本発明の方法は前記（ａ）乃至（ｄ）工程を反復する工程を追加的に含むことができる。種族や患者などのようなある特定集団におけるＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異様相及びこれに対するハプロタイプを分析しようとする場合には、各ＣＹＰ１Ａ２遺伝型の頻度を調査して前記集団で多く発見されるＣＹＰ１Ａ２遺伝型を選定した後、これを対象として以降の（ｅ）工程を遂行することができる。
【００５２】
前記（ｅ）工程では、前記（ｅ）工程で予測されたＣＹＰ１Ａ２のハプロタイプ資料をＳＮＰタガーソフトウェアで分析してｈｔＳＮＰを選別する。前記ＳＮＰタガーソフトウェアは当業界に公知となっており、例えば、Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ、  Ｍｅｒｌｉｎ、Ａｌｌｅｇｒｏ、ＳＮＰＨＡＰ、ｈｔＳＮＰ ｆｉｎｄｅｒ（ＰＣＡ  ｂａｓｅｄ）などが挙げられ、好ましくは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｌｌ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／〜ｘｉａｙｉ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅまたは ｈｔｔｐ：／／ｓｌａｃｋ．ｓｅｒ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｇｓ／ｈｔｓｎｐ．ｈｔｍｌのウェブサイトを利用することができる。
【００５３】
このように選別されたｈｔＳＮＰはディプロタイプ（ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ）決定時に正確度を高めるために検証され得る。人体の遺伝型は二本の染色体により決定されるので、遺伝型を判読すれば二つのハプロタイプ組み合わせで判定される。しかしながら、複数個のＳＮＰを同時に分析した場合、特定のハプロタイプの組み合わせが他のハプロタイプの組み合わせと同一な変異分析結果を示す可能性がある。従って、本発明により開発された診断法を用いて遺伝型が判読された場合、正確な遺伝型を決定できることが検証されなければならない。このような検証は、Ｍａｔｌａｂ（Ｔｈｅ Ｍａｔｈ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，  米国）プログラムを用いて遺伝子分析結果から正確な遺伝型判読が可能である否かが分析される。
【００５４】
本発明の一実施例では、韓国人で発見されるＣＹＰ１Ａ２遺伝型に対するｈｔＳＮＰを選別するために、まず韓国人におけるＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異を調査した。その結果、韓国人のＣＹＰ１Ａ２遺伝子で総１７個の単一塩基多型を発見した（表５参照）。その中の１個の単一塩基多型（−２６０３ｉｎｓＡ）は新規なものである。
【００５５】
本発明で初めて提供される前記１個の単一塩基多型は二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有していることが示された（図１参照）。
【００５６】
本発明の他の実施例では、韓国人で発見される１７個の単一塩基多型によるハプロタイプを分析した。その結果、本発明では今まで明らかになったことのないＣＹＰ１Ａ２遺伝子に対する韓国人のハプロタイプ（表６参照）及びこれに基づいた遺伝型を糾明した。例えば、表６に記載されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子のハプロタイプ２（ＣＹＰ１Ａ２*１Ｌ）は、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の塩基配列において−３８６０、−２４６７及び１６３塩基位置に単一塩基多型がある遺伝型をいうものとして、より具体的には−３８６０Ｇ＞Ａ、−２４６７Ｔ＞ｄｅｌＴ（−２４６７ｄｅｌＴ）及び１６３Ｃ＞Ａの単一塩基多型を有することを示す。
【００５７】
本発明の他の実施例では、韓国人で発見されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異による１７種のハプロタイプに対する最小マーカであるｈｔＳＮＰを選別するために、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異を有している塩基配列を用いて分析されたハプロタイプに基づいてＳＮＰタガーソフトウェアを用いて分析した。本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせの例を図２乃至図６に示した。
【００５８】
前記方法により本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせは、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のハプロタイプを分析することに使用することができる。従って、本発明はヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のハプロタイプを決定する方法を提供する。前記方法は次の工程を含む：
【００５９】
（ａ）被験者から生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記（ａ）工程の採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記（ｂ）工程の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；及び
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−３８６０Ｇ＞Ａ、−３５９８Ｇ＞Ｔ、−３５９４Ｔ＞Ｇ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８４７Ｔ＞Ｃ、−２８０８Ａ＞Ｃ、−２６０３ｉｎｓＡ、−２４６７ｄｅｌＴ、−１７０８Ｔ＞Ｃ、−７３９Ｔ＞Ｇ、−１６３Ｃ＞Ａ、１５１４Ｇ＞Ａ、２１５９Ｇ＞Ａ、２３２１Ｇ＞Ｃ、３６１３Ｔ＞Ｃ、５３４７Ｃ＞Ｔ及び５５２１Ａ＞Ｇからなる群より選択されるＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異の存在有無を調査する工程。
【００６０】
前記（ｂ）工程で核酸を抽出する方法は前記の通りである。
前記ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子の断片は、前記の通り、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子の公知となった単一塩基多型を含む断片をいう。前記（ｃ）工程で使用され得るプライマーは、これに制限されないが、配列番号２乃至配列番号３１からなる群より選択される。
【００６１】
前記（ｄ）工程で調査される単一塩基多型は、図４乃至図６に示すｈｔＳＮＰの中で選択することができ、図４に示す−３８６０Ｇ＞Ａ、−３５９８Ｇ＞Ｔ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８０８Ａ＞Ｃ、−２６０３ｉｎｓＡ、−２４６７ｄｅｌＴ、−１６３Ｃ＞Ａ、１５１４Ｇ＞Ａ、２１５９Ｇ＞Ａ、５３４７Ｃ＞Ｔ及び５５２１Ａ＞Ｇの単一塩基多型；図５に示す−３８６０Ｇ＞Ａ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８０８Ａ＞Ｃ、−２６０３ｉｎｓＡ、−２４６７ｄｅｌＴ、−７３９Ｔ＞Ｇ、−１６３Ｃ＞Ａ、１５１４Ｇ＞Ａ、２１５９Ｇ＞Ａ、５３４７Ｃ＞Ｔ及び５５２１Ａ＞Ｇの単一塩基多型；及び図６に示す−３８６０Ｇ＞Ａ、−３５９８Ｇ＞Ｔ、−３５９４Ｔ＞Ｇ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８０８Ａ＞Ｃ、−２６０３ｉｎｓＡ、−２４６７ｄｅｌＴ、−１６３Ｃ＞Ａ、１５１４Ｇ＞Ａ、２１５９Ｇ＞Ａ、５３４７Ｃ＞Ｔ及び５５２１Ａ＞Ｇの単一塩基多型または−３８６０Ｇ＞Ａ、−３５９８Ｇ＞Ｔ２３２１Ｇ＞Ｃ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８０８Ａ＞Ｃ、−２６０３ｉｎｓＡ、−２４６７ｄｅｌＴ、−１６３Ｃ＞Ａ、１５１４Ｇ＞Ａ、２１５９Ｇ＞Ａ、５３４７Ｃ＞Ｔ及び５５２１Ａ＞Ｇの単一塩基多型の存在有無を調査することもできる。
【００６２】
このように前記（ｄ）工程で調査される単一塩基多型は、韓国人で発見されるＣＹＰ１Ａ２遺伝子変異に関するものであるため、韓国人ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のハプロタイプと遺伝型の決定に非常に特異的である。
【００６３】
前記（ｄ）工程で前記ＰＣＲ産物の塩基配列にＣＹＰ１Ａ２遺伝子の単一塩基多型が存在するか否かの調査は、当業界で公知の多型性分析方法を用いて遂行することができる。好ましくはスナップショット分析（[Ｐｅｔｅｒ Ｍ. Ｖａｌｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ，２００４，１１８：１４７-１５７]参照）、電気泳動分析またはこれらの組み合わせ、より好ましくはスナップショット分析を用いて遂行することができる。
【００６４】
前記スナップショット分析はＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）される配列（前記ＳＮＰ部位は含まない）を有するプライマーとｄｄＮＴＰを用いたＰＣＲ反応を通じて遺伝子型を分析する方法である。本発明に使用されるスナップショット分析は、前記工程（ｃ）で調査されるＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰに基づいて公知の方法により設計及び製作したものを使用することができ、ＳＮＰ位置のすぐそばの塩基が３'末端となり、前記ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリングされる配列を含み、５'末端にはＴ塩基が付加されたものであれば制限なしに使用されることができ、好ましくは配列番号６４乃至７４のプライマーからなる群より選択されるプライマーを使用することができる。この時、前記ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリングされる配列は、約２０ｂｐの長さを有することが好ましく、同時に複数個のＳＮＰを決定しようとする場合、各ＳＮＰに対するスナップショットプライマーの５'末端Ｔ塩基の長さをそれぞれ異なるように設計、例えばＴ塩基を５個ずつ５'位置にさらに添加し、プライマー間にサイズ差異を作り合成してＰＣＲ産物の長さをそれぞれ異なるようにすることができる。このように作られたスナップショットプライマーに各ＳＮＰに相補的なｄｄＮＴＰが結合するようになり、これら合成物はＳＮＰにより長さの差異が発生することによって同時に複数個のＳＮＰの決定が可能である。
【００６５】
その後、スナップショット分析で判定された遺伝型診断結果が正確であるかを検査するために、遺伝型が分かる他の遺伝子分析法を通じた結果との一致性を調査することができるが、ここで他の遺伝子分析法とは、特別に限定されないが、好ましくは自動塩基配列分析法またはパイロシーケンシング法であっても良い。
【００６６】
本発明により韓国人で発見されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異総１７個の中で１１個の単一塩基多型はプロモーター領域に位置する。前記１１個の単一塩基多型には本発明で初めて糾明した−２６０３ｉｎｓＡ変異が含まれる。従って、本発明ではヒトＣＹＰ１Ａ２プロモーター遺伝子の変異を分析する方法を提供する。前記方法は次の工程を含む：
【００６７】
（ａ）被験者から生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記（ａ）工程の採取された試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（ｃ）前記（ｂ）工程のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のプロモーター領域を増幅できるプライマーを用いてＰＣＲを遂行する工程；及び
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−３８６０Ｇ＞Ａ、−３５９８Ｇ＞Ｔ、−３５９４Ｔ＞Ｇ、−３１１３Ｇ＞Ａ、−２８４７Ｔ＞Ｃ、−２８０８Ａ＞Ｃ、−２６０３ｉｎｓＡ、−２４６７ｄｅｌＴ、−１７０８Ｔ＞Ｃ、−７３９Ｔ＞Ｇ及び１６３Ｃ＞ＡからなるＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異の存在有無を調査する工程。
【００６８】
前記（ｂ）工程で核酸を抽出する方法は前記の通りである。
前記（ｃ）工程でヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のプロモーター領域を増幅できるプライマーは、配列番号１の−３８６０Ｇ＞Ａから−１６３Ｃ＞Ａまでの単一塩基多型を増幅できるプライマーであれば、制限なしに使用することができ、好ましくは配列番号６２及び配列番号６３のプライマーを使用することができる。
【００６９】
前記（ｄ）工程で前記ＰＣＲ産物の塩基配列にＣＹＰ１Ａ２遺伝子の単一塩基多型が存在するか否かの調査は、当業界に公知となった多型性分析方法を用いて遂行することができる。好ましくはスナップショット分析を用いて遂行することができる。本発明に使用されるスナップショット分析は、前記１１個のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の単一塩基多型に基づいてデザインされたプライマーを用いて遂行することができる。本発明に使用されるスナップショットプライマーは、単一塩基多型を含まない隣接した配列の塩基配列が含まれるようにデザインされたものであれば、制限なしに使用することができる。好ましくは配列番号６４乃至配列番号７４からなる群より選択される塩基配列を有するプライマーを使用することができる。
【００７０】
本発明の他の実施例では、ＣＹＰ１Ａ２酵素活性に影響を与えるプロモーター部分の１１個の単一塩基多型を用いてＣＹＰ１Ａ２プロモーター遺伝子の変異をＳＮａＰｓｈｏｔ分析により検出した。その結果、本発明の方法によりＣＹＰ１Ａ２プロモーター遺伝子の変異を高速に正確に検出できることが確認された（図７乃至図１４参照）。
【００７１】
２．ＣＹＰ２Ａ６
本発明は韓国人ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異分析を通じて韓国人で主に発見されるＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝型を糾明し、これに基づいてそれぞれのハプロタイプの最適の標識セットであるｈｔＳＮＰを選別し、その有用性を確認したという点に特徴がある。
本発明によるヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子のｈｔＳＮＰを選別する方法は次の工程を含む：
【００７２】
（ａ）被験者から生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物の塩基配列で変異の存在有無を確認する工程；
（ｅ）前記工程（ｄ）で変異が存在すると確認されたＰＣＲ産物の塩基配列でハプロタイプを分析する工程；及び
（ｆ）前記工程（ｅ）で分析されたハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｗｅｌｌ.ｏｘ.ａｃ.ｕｋ／〜ｘｉａｙｉ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅ／）を用いて分析してｈｔＳＮＰを選別する工程。
【００７３】
前記工程（ａ）で採取された試料から核酸を抽出する方法は特に限定されず、当業界に公知となった技術または市販されている抽出用キットを使用することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出用キットはＱｉａｇｅｎ（米国）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国）などで購入できる。前記でＲＮＡを抽出して使用する場合には逆転写によりｃＤＮＡを製造して使用する。
【００７４】
前記工程（ｃ）で前記ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子の断片は、ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子の公知の変異、例えば単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）を含む断片をいう。ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーはヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子またはその断片の塩基配列に基づいてデザインすることができ、例えば、配列番号７６乃至８９のプライマーからなる群より選択することができるが、これに制限されない。
【００７５】
前記工程（ｄ）で確認される変異は、ＳＮＰ、遺伝子の欠失及び遺伝子の重複を含むが、これに制限されず、例えば、表１５に示す３０個の変異を含むことができる。
【００７６】
また、前記工程（ｄ）で変異の存在有無の確認は当業界に公知となった変異検出方法により遂行されることができ、好ましくは配列分析、電気泳動分析を用いて当業界に公知となっている野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の塩基配列、例えば、配列番号７５（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.：ＮＣ_００００１９）の塩基配列、または当業界に公知のＣＹＰ２Ａ６遺伝型の各塩基配列に基づいて比較することによって遂行したり、ＲＦＬＰ分析などを用いて野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の制限酵素切断様相と比較することによって遂行することができる。また、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の欠失または重複変異の場合にはＰＣＲ産物の電気泳動分析を通じて確認できる。前記配列分析は自動塩基配列分析器を使用して、またはパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて遂行できる。
【００７７】
前記工程（ｅ）で変異が存在することが確認されたＰＣＲ産物の塩基配列中のハプロタイプは、ＳＮＰＡｌｙｚｅやＨａｐｌｏｔｙｐｅｒ、Ａｒｌｅｑｕｉｎなどのプログラムを使用して分析できる。
【００７８】
本発明の方法は、前記工程（ａ）乃至（ｅ）を反復する工程を追加的に含むことができる。種族や患者などのようなある特定集団におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異様相を分析しようとする場合には、各ＣＹＰ２Ａ６遺伝型の頻度を調査して前記集団で多く発見されるＣＹＰ２Ａ６遺伝型を選定した後、これを対象として以降の工程（ｆ）を遂行できる。
【００７９】
前記工程（ｆ）では前記工程（ｅ）で分析されたハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェアで分析してｈｔＳＮＰを選別し、ｈｔＳＮＰの選別に用いられるソフトウェアとしてはＳＮＰｔａｇｇｅｒ以外にも、ＨａｐＢｌｏｃｋ、ＬＤＳｅｌｅｃｔ、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ、ｈｔＳＮＰ、ＴａｇＩＴ、ｔａｇＳＮＰｓなど多様なものが使用され得る。前記ＳＮＰｔａｇｇｅｒソフトウェアは当業界に公知となっており、好ましくはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｌｌ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／〜ｘｉａｙｉ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅ／を用いることができる。このように選別されたｈｔＳＮＰは、正確度を高めディプロタイプ（ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ）を決定できることが検証された。前記検証はＭａｔｌａｂ（Ｔｈｅ Ｍａｔｈ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，  米国）を用いて遂行することができる。
【００８０】
本発明の一実施例では、韓国人のＣＹＰ２Ａ６遺伝型に対するｈｔＳＮＰを選別するために、まず韓国人で発見されるＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異を調査した。その結果、韓国人のＣＹＰ２Ａ６遺伝子で総３０個のＳＮＰを発見した（表１５参照）。
【００８１】
本発明の他の実施例では、前記で選別された３０個のＳＮＰのうち、機能性遺伝子変異を含むアミノ酸置換を招く変異８個及び頻度が高い変異６個を含む１４個ＳＮＰに対してＤＹＮＡＣＯＭ社のＳＮＰＡｌｙｚｅプログラムを用いてハプロタイプを分析し、総１９個の１％以上頻度のハプロタイプを確認することができた。ハプロタイプの分析に用いられるプログラムは、前記ＳＮＰＡｌｙｚｅプログラムに制限されず、Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｐｅｏｐｌｅ.ｆａｓ.ｈａｒｖａｒｄ.ｅｄｕ／〜ｊｕｎｌｉｕ／Ｈａｐｌｏ／ｄｏｃＭａｉｎ.ｈｔｍ）、Ａｒｌｅｑｕｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｌｇｂ.ｕｎｉｆｅ.ｃｈ／ａｒｌｅｑｕｉｎ）、イズテック社のＳＮＰ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｉｓｔｅｃｈ２１.ｃｏｍ／）など、多くの類似ソフトウェアが当業界に公知となっている
【００８２】
本発明のさらに他の実施例では、韓国人で主に発見されるＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝型を容易に決定できる最小マーカであるｈｔＳＮＰを選別するために、前記１９個のハプロタイプと遺伝子欠失の場合を含む２０種類のハプロタイプに対する塩基配列及び頻度をＳＮＰタガーソフトウェアを用いて分析してｈｔＳＮＰを選別し、その例を図１６乃至２１に示した。
【００８３】
前記方法により本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせはヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝型を分析することに使用され得る。従って、本発明はヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供する。前記方法は次の工程を含む：
【００８４】
（ａ）被験者から生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；及び
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−４８Ｔ＞Ｇ、１３Ｇ＞Ａ、５６７Ｃ＞Ｔ、２１３４Ａ＞Ｇ、３３９１Ｔ＞Ｃ、６４５８Ａ＞Ｔ、６５５８Ｔ＞Ｃ、６５８２Ｇ＞Ｔ、６６００Ｇ＞Ｔ、及び６０９１Ｃ＞Ｔからなる群より選択されるＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異の存在有無を調査する工程。
【００８５】
前記工程（ｂ）で核酸を抽出する方法は前記の通りである。
前記ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子の断片は、前記の通り、ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子の公知となった変異、例えばＳＮＰを含んでいる断片をいう。前記工程（ｃ）で用いられるプライマーは、これに制限されないが、配列番号９０、９１、１２０及び１０３のプライマーであっても良い。
【００８６】
前記工程（ｄ）で調査される変異は、図１６乃至図２１に示すｈｔＳＮＰの中で選択され得る。例えば、前記工程（ｄ）では図１６に示す−４８Ｔ＞Ｇ；２２Ｃ＞Ｔ；５６７Ｃ＞Ｔ；２１３４Ａ＞Ｇ；３３９１Ｔ＞Ｃ；６４５８Ａ＞Ｔ；６５５８Ｔ＞Ｃ；６５８２Ｇ＞Ｔ；６６００Ｇ＞Ｔ；６０９１Ｃ＞Ｔ、５９７１Ｇ＞Ａ及び５９８３Ｔ＞Ｇの中の一つ；及び１３Ｇ＞Ａ；５１Ｇ＞Ａ；１６２０Ｔ＞Ｃ；及び１８３６Ｇ＞Ｔからなる変異の存在有無を調査でき、
【００８７】
図１７に示す−４８Ｔ＞Ｇ；２２Ｃ＞Ｔ；５１Ｇ＞Ａ；５６７Ｃ＞Ｔ；１６２０Ｔ＞Ｃ；１８３６Ｇ＞Ｔ；３３９１Ｔ＞Ｃ；６４５８Ａ＞Ｔ；６５５８Ｔ＞Ｃ；６６００Ｇ＞Ｔ；及び６０９１Ｃ＞Ｔ、５９７１Ｇ＞Ａ及び５９８３Ｔ＞Ｇの中の一つからなる変異の存在有無を調査でき、
【００８８】
図１８に示す２２Ｃ＞Ｔ；５１Ｇ＞Ａ；５６７Ｃ＞Ｔ；１６２０Ｔ＞Ｃ；１８３６Ｇ＞Ｔ；３３９１Ｔ＞Ｃ；６３５４Ｔ＞Ｃ；６４５８Ａ＞Ｔ；６５５８Ｔ＞Ｃ；６６００Ｇ＞Ｔ；及び６０９１Ｃ＞Ｔ、５９７１Ｇ＞Ａ及び５９８３Ｔ＞Ｇの中の一つからなる変異の存在有無を調査でき、
【００８９】
図１９に示す−４８Ｔ＞Ｇ；１３Ｇ＞Ａ；２２Ｃ＞Ｔ；５１Ｇ＞Ａ；５６７Ｃ＞Ｔ；１６２０Ｔ＞Ｃ；１８３６Ｇ＞Ｔ；２１３４Ａ＞Ｇ；３３９１Ｔ＞Ｃ；６４５８Ａ＞Ｔ；６５５８Ｔ＞Ｃ；及び６０９１Ｃ＞Ｔ、５９７１Ｇ＞Ａ及び５９８３Ｔ＞Ｇの中の一つからなる変異の存在有無を調査でき、
【００９０】
図２０に示す−４８Ｔ＞Ｇ；１３Ｇ＞Ａ；２２Ｃ＞Ｔ；５１Ｇ＞Ａ；５６７Ｃ＞Ｔ；１６２０Ｔ＞Ｃ；１８３６Ｇ＞Ｔ；３３９１Ｔ＞Ｃ；６４５８Ａ＞Ｔ；６５５８Ｔ＞Ｃ；及び６０９１Ｃ＞Ｔ、５９７１Ｇ＞Ａ及び５９８３Ｔ＞Ｇの中の一つからなる変異の存在有無を調査でき、
【００９１】
図２１に示す−４８Ｔ＞Ｇ；２２Ｃ＞Ｔ；５１Ｇ＞Ａ；５６７Ｃ＞Ｔ；１６２０Ｔ＞Ｃ；１８３６Ｇ＞Ｔ；２１３４Ａ＞Ｇ；３３９１Ｔ＞Ｃ；６４５８Ａ＞Ｔ；６５５８Ｔ＞Ｃ；６６００Ｇ＞Ｔ；及び６０９１Ｃ＞Ｔ、５９７１Ｇ＞Ａ及び５９８３Ｔ＞Ｇの中の一つからなる変異の存在有無を調査でき、好ましくは図１６に例示した変異の存在有無を調査できる。
【００９２】
図１６に例示した変異の中で機能性が立証されるか、機能性が最も有力に予想される変異は、アミノ酸を置換する変異または遺伝子の欠失を招く変異である。従って、図１６の変異の中で機能性ＣＹＰ２Ａ６変異を検出するためには、最も好ましくは、図１６の例示変異の中でアミノ酸置換変異や遺伝子欠失変異が調査される。遺伝子欠失の場合、単一塩基多型により判別し難いため、遺伝子欠失を標識できる変異を探さなければならないが、この過程で６０９１Ｃ＞Ｔ変異を発見した。６０９１Ｃ＞Ｔ変異は、前記工程（ｃ）で増幅されるＰＣＲ産物の中でＣＹＰ２Ａ６遺伝子が欠失された染色体で特異的に発見される単一塩基多型であり、遺伝子欠失に対する標識変異として用いることができる。このような機能性の判別目的により選定された変異組み合わせは、−４８Ｔ＞Ｇ；１３Ｇ＞Ａ；５６７Ｃ＞Ｔ；２１３４Ａ＞Ｇ；３３９１Ｔ＞Ｃ；６４５８Ａ＞Ｔ；６５５８Ｔ＞Ｃ；６５８２Ｇ＞Ｔ；６６００Ｇ＞Ｔ；及び６０９１Ｃ＞Ｔの１０個の変異である。６０９１Ｃ＞Ｔ変異の代わりに遺伝子欠失を標識する他の変異として、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子基準に５９７１Ｇ＞Ａ及び５９８３Ｔ＞Ｇを用いても良い。
【００９３】
前記工程（ｄ）で調査される変異は、韓国人で主に発見されるＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異に対するものであるので、韓国人のＣＹＰ２Ａ６遺伝子のハプロタイプと遺伝型の決定に非常に特異的である。
【００９４】
前記工程（ｄ）で前記ＰＣＲ産物の塩基配列にＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異が存在するか否かの調査は、当業界に公知となった多型性分析方法を用いて遂行することができる。スナップショット分析（[Ｐｅｔｅｒ Ｍ. Ｖａｌｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ，２００４，１１８：１４７-１５７]参照）、電気泳動分析またはこれらの組み合わせ、最も好ましくはスナップショット分析が変異を調査するために用いられる。
【００９５】
前記スナップショット分析はＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）される配列（前記ＳＮＰ部位は含まない）を有するプライマーとｄｄＮＴＰを用いたＰＣＲ反応を通じて遺伝子型を分析する方法である。本発明に使用されるスナップショット分析は、前記工程（ｃ）で調査されるＣＹＰ２Ａ６遺伝子のＳＮＰに基づいて公知となった方法により設計及び製作したものを使用することができ、ＳＮＰ位置のすぐそばの塩基が３'末端となり、前記ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリングされる配列を含み、５'末端にはＴ塩基が付加されたものであれば制限なしに使用されることができ、好ましくは配列番号９７乃至１０２のプライマーからなる群より選択されるプライマーを使用することができる。この時、前記ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリングされる配列は約２０ｂｐの長さを有することが好ましく、同時に複数個のＳＮＰを決定しようとする場合、各ＳＮＰに対するスナップショットプライマーの５'末端Ｔ塩基の長さをそれぞれ異なるように設計、例えばＴ塩基を５個ずつ５'位置にさらに添加してプライマー間にサイズ差異を作って合成し、ＰＣＲ産物の長さをそれぞれ異なるようにすることができる。このように作られたスナップショットプライマーに各ＳＮＰに相補的なｄｄＮＴＰが結合するようになり、これら合成物はＳＮＰにより長さの差異が発生することによって同時に複数個のＳＮＰの決定が可能である。
【００９６】
その後、スナップショット分析のために増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を当業界に公知となった配列分析法で分析でき、特別に限定されないが、好ましくは自動塩基配列分析法であっても良い。
【００９７】
例えば、前記工程（ｃ）で図１６に示すｈｔＳＮＰ組み合わせを調査する場合には、配列番号９２乃至配列番号１０１からなる群より選択される塩基配列を有するプライマーを使用することができ、好ましくは配列番号９２乃至配列番号１０１のプライマーを全て使用することができるが、これに限定されない。
【００９８】
その後、スナップショット分析で増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を当業界に公知となった配列分析法で分析でき、特別に限定されないが、好ましくは自動塩基配列分析法であっても良い。
【００９９】
本発明のさらに他の実施例では、本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせの有用性を確認した。このために図１６に示すｈｔＳＮＰ組み合わせの中で１０個の機能性または機能性予想ＣＹＰ２Ａ６変異を選定してスナップショット分析を実施するために、工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物の塩基配列を分析した。その結果、本発明の方法が韓国人で発見されるＣＹＰ２Ａ６遺伝型を同時に高速に分析できることを確認した（図２２乃至図３２参照）。
【０１００】
本発明の方法により分析されることができるＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝型は、−４８Ｔ＞Ｇ、１３Ｇ＞Ａ、５６７Ｃ＞Ｔ、２１３４Ａ＞Ｇ、３３９１Ｔ＞Ｃ、６４５８Ａ＞Ｔ、６５５８Ｔ＞Ｃ、６５８２Ｇ＞Ｔ、６６００Ｇ＞Ｔ、及び６０９１Ｃ＞Ｔを含み、各遺伝型及びこれによる変異について図２２乃至３２に示した。例えば、図２２を参照して説明すれば、−４８Ｔ＞Ｇ、６５５８Ｔ＞Ｃ、２１３４Ａ＞Ｇの３個の位置で変異を有しており、残りの７個の位置では野生型を示す遺伝型である。図２３は５６７Ｃ＞Ｔ位置だけで変異を有しており、残りの９個の位置では野生型を有する遺伝型である。また、ＣＹＰ２Ａ６*４遺伝型は２Ａ６欠失変異を含む遺伝型であり、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子がヒト染色体上で欠失されて酵素生産が全く生じない。ＣＹＰ２Ａ６遺伝子が欠失された場合、遺伝子の形態はＣＹＰ２Ａ６遺伝子の一部とＣＹＰ２Ａ７の一部が互いに連結された形態をしているので、この部分を調査して欠失に特異的な変異を探すことができる。
【０１０１】
３．ＣＹＰ２Ｄ６
本発明は韓国人ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異分析を通じて韓国人で主に発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型を糾明し、これに基づいてそれぞれのハプロタイプの最適の標識セットであるｈｔＳＮＰを選別し、その有用性を確認したという点に特徴がある。
【０１０２】
本発明によるヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のｈｔＳＮＰを選別する方法は次の工程を含む：
（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記（ａ）工程の採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記（ｂ）工程の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列で変異の存在有無を確認する工程；
（ｅ）前記（ｄ）工程で変異が存在すると確認されたＰＣＲ産物の塩基配列でハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を分析する工程；及び
（ｆ）前記（ｅ）工程で分析されたハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェアを用いて分析してｈｔＳＮＰを選別する工程。
【０１０３】
前記（ａ）工程で採取された試料から核酸を抽出する方法は、特に限定されず、当業界に公知となった技術または市販されている抽出用キットを使用することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出用キットは、Ｑｉａｇｅｎ（米国）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国）で購入できる。前記でＲＮＡを抽出して使用する場合には逆転写によりｃＤＮＡを製造して使用する。
【０１０４】
前記（ｃ）工程で前記ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の断片は、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の公知となった変異、例えば単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ；ＳＮＰ）を含んでいる断片をいう。前記ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーはヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子またはその断片の塩基配列に基づいてデザインすることができ、例えば、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１２１乃至配列番号１２７、配列番号１２９乃至配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４９及び配列番号１５０からなる群より選択される塩基配列を有するものであっても良いが、これに制限されない。
【０１０５】
前記（ｄ）工程で確認される変異は、単一塩基多型、遺伝子の欠失及び遺伝子の重複を含むが、これに制限されず、例えば、表３４に示す３３個の変異を含むことができる。
【０１０６】
また、前記（ｄ）工程で変異の存在有無の確認は、当業界に公知となった変異検出方法により遂行することができ、好ましくは配列分析、電気泳動分析、ＲＦＬＰ分析などを用いて遂行することができる。前記配列分析は自動塩基配列分析器を使用するかパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて遂行することができる。前記パイロシーケンシングはＤＮＡシーケンシングに利用されることもある公知のＳＮＰ分析方法によりＤＮＡが重合される間に放出されるＰＰｉ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の光の発現を検出する方法である。
【０１０７】
変異の存在有無は野生型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列と比較して確認できる。野生型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列は当業界に公知となっている。例えば、配列番号１０５（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＹ５４５２１６）の塩基配列、または当業界に公知となったＣＹＰ２Ｄ６遺伝型の各塩基配列または情報に基づいて比較して確認できる（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. Ｍ３３３８８，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ.ｋｉ.ｓｅ／ｃｙｐ２ｄ６.ｈｔｍ）。または、ＲＦＬＰを遂行して野生型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の制限酵素切断様相と比較して確認することもできる。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の欠失または重複変異の場合にはＰＣＲ産物の電気泳動分析を通じて確認できる。
【０１０８】
前記（ｄ）工程で変異が存在することが確認されたＰＣＲ産物の塩基配列中のハプロタイプの分析は全長塩基配列を通じて遂行できる。
【０１０９】
本発明の方法は前記（ａ）乃至（ｅ）工程を反復する工程を追加的に含むことができる。種族や患者などのようなある特定集団でＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異様相を分析しようとする場合には、各ＣＹＰ２Ｄ６遺伝型の頻度を調査して前記集団で多く発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝型を選定した後、これを対象として以下の（ｆ）工程を遂行できる。
【０１１０】
前記（ｆ）工程では、前記（ｅ）工程で分析されたハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェアで分析してｈｔＳＮＰを選別する。前記ＳＮＰタガーソフトウェアは当業界に公知となっており、例えば Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ、Ｍｅｒｌｉｎ、Ａｌｌｅｇｒｏ、ＳＮＰＨＡＰ、ｈｔＳＮＰ ｆｉｎｄｅｒ（ＰＣＡ ｂａｓｅｄ）などが挙げられ、好ましくは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｌｌ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／〜ｘｉａｙｉ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅまたは ｈｔｔｐ：／／ｓｌａｃｋ．ｓｅｒ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｇｓ／ｈｔｓｎｐ．ｈｔｍｌのウェブサイトを利用することができる。
【０１１１】
このように選別されたｈｔＳＮＰはディプロタイプ（ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ）決定時に正確度を高めるために検証され得る。人体の遺伝型は二本の染色体により決定されるので、遺伝型を判読すれば二つのハプロタイプ組み合わせで判定される。しかしながら、複数個のＳＮＰを同時に分析した場合、特定のハプロタイプの組み合わせが他のハプロタイプの組み合わせと同一の変異分析結果を示す可能性がある。従って、本発明により開発された診断法を用いて遺伝型が判読された場合、正確な遺伝型を決定できることが検証されなければならない。このような検証は、Ｍａｔｌａｂ（Ｔｈｅ Ｍａｔｈ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，  米国）プログラムを用いた遺伝子分析結果から正確な遺伝型判読が可能であるか否かを分析することによって遂行される。
【０１１２】
本発明の一実施例では韓国人で発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝型に対するｈｔＳＮＰを選別するために、まず韓国人で発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異を調査した。その結果、韓国人で主に発見される３３個の変異とこれによる１２種のハプロタイプ（遺伝型）を糾明した（表３４及び３５参照）。
【０１１３】
本発明の他の実施例では韓国人で主に発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝型を容易に決定できる最小マーカであるｈｔＳＮＰを選別するために、１２種のＣＹＰ２Ｄ６遺伝型の塩基配列をＳＮＰｔａｇｇｅｒソフトウェアを用いて分析した。本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせの例を図３４乃至図３９に示した。
【０１１４】
前記方法により本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせは、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型を分析することに使用され得る。従って、本発明はヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供する。前記方法は次の工程を含む：
【０１１５】
（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記（ａ）工程の採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記（ｂ）工程の核酸を鋳型とし、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；及び
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複からなる群より選択される一つを含む少なくとも１１個のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子変異の存在有無を調査する工程。
【０１１６】
前記（ｂ）工程で核酸を抽出する方法は前記の通りである。
前記ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の断片は、前記の通り、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の公知となった変異、例えば単一塩基多型を含んでいる断片をいう。前記（ｃ）工程で使用され得るプライマーは、これに制限されないが、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１２１乃至配列番号１２７、配列番号１２９乃至配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４９及び配列番号１５０からなる群より選択される塩基配列を有するものであっても良い。
【０１１７】
前記（ｄ）工程で調査される変異は、図３４乃至図３９に示すｈｔＳＮＰの中で選択され得る。前記（ｄ）工程では、図３４に示す−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複からなる一つを含む変異の存在有無を調査できる。
【０１１８】
また、図３５に示す−１５８４Ｃ＞Ｇ；−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；２５７３ｉｎｓＣ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１２４５ｉｎｓＧＡ、−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｃ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査することもできる。
【０１１９】
また、図３６に示す−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１５８４Ｃ＞Ｇ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複から選択される一つを含む変異の存在有無を調査することもできる。
【０１２０】
また、図３７に示す−１５８４Ｃ＞Ｇ；−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；２５７３ｉｎｓＣ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１２４５ｉｎｓＧＡ、−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；−１２３５Ａ＞Ｇ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査することもできる。
【０１２１】
また、図３８に示す−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１６６１Ｇ＞Ｃ及び４１８０Ｇ＞Ｃからなる群より一つ；１７５８Ｇ＞Ａ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２５７３ｉｎｓＣ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５〜４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；−１２３５Ａ＞Ｇ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複から選択される一つを含む変異の存在有無を前記（ｄ）工程で調査することもできる。
【０１２２】
また、図３９に示す−１５８４Ｃ＞Ｇ；−１４２６Ｃ＞Ｔ、１００Ｃ＞Ｔ及び１０３９Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１６１１Ｔ＞Ａ；１７５８Ｇ＞Ａ；２５７３ｉｎｓＣ；−７４０Ｃ＞Ｔ、−６７８Ｇ＞Ａ、２１４Ｇ＞Ｃ、２２１Ｃ＞Ａ、２２３Ｃ＞Ｇ、２２７Ｔ＞Ｃ、２３２Ｇ＞Ｃ、２３３Ａ＞Ｃ、２４５Ａ＞Ｇ及び２８５０Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；−１２４５ｉｎｓＧＡ、−１０２８Ｔ＞Ｃ、−３７７Ａ＞Ｇ、３８７７Ｇ＞Ａ、４３８８Ｃ＞Ｔ及び４４０１Ｃ＞Ｔからなる群より一つ；１８８７ｉｎｓＴＡ；２９８８Ｇ＞Ａ；４１２５−４１３３ｉｎｓＧＴＧＣＣＣＡＣＴ；２Ｄ６欠失；及び２Ｄ６重複を含む変異の存在有無を調査することもできる。
【０１２３】
好ましくは図３４に例示した変異の存在有無を調査できる。このように前記（ｄ）工程で調査される変異は、韓国人で主に発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子変異に関するものであるので、韓国人のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のハプロタイプと遺伝型の決定に非常に特異的である。
【０１２４】
前記（ｄ）工程で前記ＰＣＲ産物の塩基配列にＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異が存在するか否かの調査は、当業界に公知となった多型性分析方法を用いて遂行できる。好ましくはスナップショット分析（[Ｐｅｔｅｒ Ｍ. Ｖａｌｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ，２００４，１１８：１４７-１５７]参照）、電気泳動分析またはこれらの組み合わせを用いて遂行できる。前記ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異が単一塩基多型である場合にはスナップショット分析を利用することができる。
【０１２５】
前記スナップショット分析は、ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）される配列（前記ＳＮＰ部位は含まない）を有するプライマーとｄｄＮＴＰを用いたＰＣＲ反応を通じて遺伝子型を分析する方法である。本発明に使用されるスナップショット分析は、前記工程（ｃ）で調査されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＳＮＰに基づいて公知の方法により設計及び製作したものを使用することができ、ＳＮＰ位置のすぐそばの塩基が３'末端となり、前記ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリングされる配列を含み、５'末端にはＴ塩基が付加されたものであれば制限なしに使用することができる。この時、前記ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリングされる配列は約２０ｂｐの長さを有することが好ましく、同時に複数個のＳＮＰを決定しようとする場合、各ＳＮＰに対するスナップショットプライマーの５'末端Ｔ塩基の長さをそれぞれ異なるように設計、例えばＴ塩基を５個ずつ５'位置にさらに添加してプライマー間のサイズに差を作って合成し、ＰＣＲ産物の長さをそれぞれ異なるようにすることができる。このように作られたスナップショットプライマーに各ＳＮＰに相補的なｄｄＮＴＰが結合するようになり、これら合成物はＳＮＰにより長さの差異が発生することによって同時に複数個のＳＮＰの決定が可能である。
【０１２６】
例えば、前記（ｃ）工程で図３４に示すｈｔＳＮＰ組み合わせを調査する場合には、配列番号１４１乃至配列番号１４８、配列番号１５２及び配列番号１５３からなる群より選択される塩基配列を有するプライマーを使用することができ、好ましくは配列番号１４１乃至配列番号１４８、配列番号１５２及び配列番号１５３のプライマーを全て使用することができる。その後、スナップショット分析で増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を公知となった配列分析法で分析できる。前記配列分析法としては当業界に公知となった方法であれば制限なしに使用されることができ、好ましくは自動塩基配列分析法であっても良い。
【０１２７】
本発明のさらに他の実施例では、本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせの有用性を確認した。このために図３４に示すｈｔＳＮＰ組み合わせを用いてスナップショット分析を実施した後、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を分析した。その結果、本発明の方法が韓国人で発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝型を同時に高速で分析できることを確認した（図４０及び４１参照）。
【０１２８】
本発明の方法により分析することができるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型は、ＣＹＰ２Ｄ６*１Ａ、ＣＹＰ２Ｄ６*２Ａ、ＣＹＰ２Ｄ６*５、ＣＹＰ２Ｄ６*２Ｎ、ＣＹＰ２Ｄ６*１０Ｂ、ＣＹＰ２Ｄ６*１４Ｂ、ＣＹＰ２Ｄ６*１８、ＣＹＰ２Ｄ６*２１Ｂ、ＣＹＰ２Ｄ６*４１Ａ、ＣＹＰ２Ｄ６*４９、ＣＹＰ２Ｄ６*５２及びＣＹＰ２Ｄ６*６０を含む。各遺伝型及びこれによる変異を表３４に示した。表３４を参照して説明すれば、例えばＣＹＰ２Ｄ６*１Ａ遺伝型は野生型であり、ＣＹＰ２Ｄ６*２Ａ遺伝型は野生型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列でＳＮＰ１、ＳＮＰ５、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１２−ＳＮＰ１８、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２５及びＳＮＰ２８位置に変異を含む遺伝型である。また、ＣＹＰ２Ｄ６*５遺伝型は２Ｄ６欠失変異を含む遺伝型として、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子がヒト染色体上で完全欠如したものであって酵素生産が全く生じない。ＣＹＰ２Ｄ６*２Ｎ遺伝型は２Ｄ６重複変異を含む遺伝型として、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子が２個以上同一染色体に存在する。
【０１２９】
また、本発明は遺伝子分析チップを用いてヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供する。前記方法は次の工程を含む：
【０１３０】
（ａ）検査しようとする遺伝子を抽出した後、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲを遂行して同定しようとするＳＮＰ周辺を含むＰＣＲ産物を得る工程；
（ｂ）各対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）の特異的な塩基を同定できるＡＳＰＥ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）プライマーを用いてＡＳＰＥ反応を遂行する工程；
（ｃ）前記反応産物を遺伝子チップに混成化させる工程；及び
（ｄ）前記チップを分析する工程。
また、本発明はＳＮＰ検査用ジップ・コード（ＺｉＰ  Ｃｏｄｅ）オリゴ塩基チップを含む遺伝型分析用キットを提供する（図４２参照）。
【０１３１】
前記工程（ｂ）で、ＡＳＰＥ反応のためにはそれぞれのＳＮＰに合う一対のプライマーを製作するようになるが、前記ＡＳＰＥプライマーは多型性を示す塩基（ＳＮＰ ｓｉｔｅ）を３’末端に含んで対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）と特異的に結合するシークエンスで製作され、５’方向には２４ｂｐのオリゴヌクレオチドであるＺｉＰ  Ｃｏｄｅが含まれており、前記ＺｉＰ  Ｃｏｄｅはそれぞれの対立遺伝子ごとに異なる配列を有するように製作される。
【０１３２】
本発明では、論文などを通じて公開された配列及び生命情報学技法を通じて選別され設計された配列のうち、実験的検証を通じて他の試料と相互交差反応が起こらない最適のＺｉＰ  Ｃｏｄｅ配列を選別し、選別された配列はＴM値が６１℃±２であり、ＺｉＰ  Ｃｏｄｅの相互間に干渉がないように製作され、ヘアピン二次構造のΔＧ値が−２以上である配列だけが選択された。
【０１３３】
前記のように構成されたＡＳＰＥプライマーを用いてＡＳＰＥ反応を遂行すれば、プライマーの３’末端に該当する対立遺伝子を有している試料だけがプライマーと反応して対立遺伝子特異的延長反応が生じるようになる。この時、シアニン５（Ｃｙａｎｉｎｅ ５、ＣＹ５）蛍光物質が共有結合されたｄＵＴＰ（Ｃｙ５-ｄＵＴＰ）を混合して延長反応を遂行すれば、各対立遺伝子を有している試料だけがＣｙ５蛍光物質を標識するようになる（図４５参照）。この時、蛍光物質はＣｙ５に制限されず、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、Ｃｙ３．５、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  ６Ｇ、ＳｙＢＲ  Ｇｒｅｅｎなど、当該分野で使用可能な種々のものが代替して使用され得る。
【０１３４】
本発明の分析チップ上には、前記ＺｉＰ  Ｃｏｄｅと相補的に結合するオリゴヌクレオチドをプローブ（ｃＺｉｐ Ｃｏｄｅ）が植えられており、前記のようにＺｉＰ  Ｃｏｄｅプライマーを用いて延長された試料に含まれている各対立遺伝子を同定できるようになる（図４３参照）。
【０１３５】
前記プローブは３’方向に１０ｂｐの塩基配列をスペーサで挿入してターゲットと交雑反応がよく生じるように誘導し、例えば、前記スペーサ配列は５’−ＣＡＧ  ＧＣＣＡ  ＡＧＴ−３’であることが好ましい。
【０１３６】
また、本発明において、前記プローブは配列番号１５８乃至配列番号１８４の塩基配列を有することが好ましい。
【０１３７】
前記工程（ｃ）及び（ｄ）で前記反応産物を遺伝子チップに混成化させ、混成化されたチップを分析する方法は、当業界に公知となった方法により遂行されることができ、一般的なＤＮＡチップスキャナーは如何なるものでも使用することができる。より好ましくは、Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４１００Ｂスキャナーを用い、スキャニングされたイメージをＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析できる。
【０１３８】
本発明の遺伝子分析チップを用いてＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異を分析すれば、配列分析を通じて確認された結果と同一の結果を得ることができる。従って、本発明の遺伝子分析チップによれば多様な遺伝子の変異を経済的に容易に分析することができる。
【０１３９】
４．ＰＸＲ
本発明の方法は韓国人のＰＸＲ遺伝子の変異に基づいて選別された、ｈｔＳＮＰを用いてＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を分析することを特徴とする。
本発明によるヒトＰＸＲ遺伝子のｈｔＳＮＰを選別する方法は次の工程を含む：
【０１４０】
（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）の核酸を鋳型とし、ヒトＰＸＲ遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物の塩基配列を分析して変異の存在有無を確認する工程；
（ｅ）前記工程（ｄ）で変異が存在することが確認されたＰＣＲ産物の塩基配列中のハプロタイプを分析する工程；及び
（ｆ）前記工程（ｅ）で分析されたハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェアを用いて分析してｈｔＳＮＰを選別する工程。
【０１４１】
前記工程（ａ）で採取された試料から核酸を抽出する方法は、特別に限定されず、当業界に公知となった技術または市販されている抽出用キットを使用することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出用キットは、Ｑｉａｇｅｎ（米国）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国）などで購入できる。前記でＲＮＡを抽出して使用する場合には逆転写によりｃＤＮＡを製造して使用する。
【０１４２】
前記工程（ｃ）で前記ヒトＰＸＲ遺伝子の断片は、ヒトＰＸＲ遺伝子の公知となった変異、例えば単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）を含んでいる断片をいう。前記ヒトＰＸＲ遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーは、ヒトＰＸＲ遺伝子またはその断片の塩基配列に基づいてデザインすることができ、例えば、配列番号２２１乃至２４０のプライマーからなる群より選択することができるが、これに制限されない。
【０１４３】
前記工程（ｄ）で確認される変異は、単一塩基多型、遺伝子の欠失及び遺伝子の重複を含むが、これに制限されず、例えば、表４８に示す２２個の変異を含むことができる。
【０１４４】
また、前記工程（ｄ）で変異の存在有無の確認は、当業界に公知となった変異検出方法により遂行でき、好ましくは配列分析、電気泳動分析、ＲＦＬＰ分析などを用いて遂行できる。前記配列分析は自動塩基配列分析器を使用するかパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて遂行できる。
【０１４５】
また、前記工程（ｄ）で変異の存在有無は、当業界に公知となっている野生型ＰＸＲ遺伝子の塩基配列、例えば、配列番号２２００（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.：ＮＴ_００５６１２）の塩基配列、または当業界に公知となったＰＸＲ遺伝型の各塩基配列に基づいて比較して確認したり、ＲＦＬＰを遂行して野生型ＰＸＲ遺伝子の制限酵素切断様相と比較して確認することもできる。ＰＸＲ遺伝子の欠失または重複変異の場合にはＰＣＲ産物の電気泳動分析を通じて確認できる。
【０１４６】
前記工程（ｄ）で変異が存在することが確認されたＰＣＲ産物の塩基配列でハプロタイプの頻度及び種類を予測することは、当業界に公知となった技術プログラムまたは市販されるプログラムを使用して分析できる。例えば、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗプログラムは無料で配布されるプログラムとして利用でき、ＳＮＰＡｌｙｚｅのような商用化されたプログラムを使用することもできる。前記 Ｈａｐｌｏｖｉｅｗソフトウェアは当業界に公知となっており、好ましくはインターネットウェブサイトである ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｐｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗを利用することができる。
本発明の方法は前記工程（ａ）乃至（ｅ）を反復する工程を追加的に含むことができる。種族や患者などのようなある特定集団におけるＰＸＲ遺伝子の変異様相及びこれに対するハプロタイプを分析しようとする場合には、各ＰＸＲ遺伝型の頻度を調査して前記集団で多く発見されるＰＸＲ遺伝型を選定した後、これを対象として工程（ｆ）を遂行できる。
【０１４７】
前記工程（ｆ）では前記工程（ｅ）で分析されたハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェアで分析してｈｔＳＮＰを選別する。前記ＳＮＰタガーソフトウェアは当業界に公知となっており、例えば Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ、Ｍｅｒｌｉｎ、Ａｌｌｅｇｒｏ、ＳＮＰＨＡＰ、ｈｔＳＮＰ ｆｉｎｄｅｒ（ＰＣＡ ｂａｓｅｄ）などが挙げられ、好ましくは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｌｌ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／〜ｘｉａｙｉ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅまたは ｈｔｔｐ：／／ｓｌａｃｋ．ｓｅｒ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｇｓ／ｈｔｓｎｐ．ｈｔｍｌのウェブサイトを利用することができる。
【０１４８】
このように選別されたｈｔＳＮＰはディプロタイプ（ｄｉｐｌｏｔｙｐ）決定時に正確度を高めるために検証することができる。人体の遺伝型は二本の染色体により決定されるので、遺伝型は二つのハプロタイプ組み合わせで判読される。しかしながら、複数個のＳＮＰを同時に分析した場合、特定のハプロタイプの組み合わせが他のハプロタイプの組み合わせと同一の変異分析結果を示す可能性がある。従って、本発明により開発された診断法を用いて遺伝型が判読された場合、正確な遺伝型を決定できることが検証されなければならない。このような検証は、Ｍａｔｌａｂ（Ｔｈｅ Ｍａｔｈ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，  米国）プログラムを用いた遺伝子分析結果から遺伝型が判読される分析によって遂行される。
【０１４９】
本発明の一実施例では、韓国人のＰＸＲ遺伝子の機能的変異型に対するｈｔＳＮＰを選別するために、まず韓国人でＰＸＲ遺伝子の変異を調査した。その結果、韓国人のＰＸＲ遺伝子で総２２個のＳＮＰを発見した（表４８参照）。
本発明の他の実施例では、前記で選別された２２個のＳＮＰの中で６個の機能的変異によるハプロタイプをＤＹＮＡＣＯＭ社のＳＮＰＡｌｙｚｅプログラムを用いて分析し、総１４個のハプロタイプを確認した（表４９参照）。
【０１５０】
本発明のさらに他の実施例では、韓国人で発見されたＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を容易に決定できる最小マーカであるｈｔＳＮＰを選別するために、前記１４個のハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェアを用いて分析してｈｔＳＮＰを選別した（図４７参照）。
【０１５１】
前記方法で本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせは、ヒトＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を分析することに使用することができる。従って、本発明はヒトＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を決定する方法を提供する。前記方法は次の工程を含む：
【０１５２】
（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）の核酸を鋳型とし、ヒトＰＸＲ遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでＰＣＲを遂行する工程；及び
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られたＰＣＲ産物の塩基配列において、−２５３８５Ｃ＞Ｔ、−２４１１３Ｇ＞Ａ、７６３５Ａ＞Ｇ、８０５５Ｃ＞Ｔ、１１１５６Ａ＞Ｃ及び１１１９３Ｔ＞Ｃからなる群より選択されたＰＸＲ遺伝子の機能的変異の存在有無を調査する工程。
【０１５３】
前記工程（ｂ）で核酸を抽出する方法は前記の通りである。
前記ヒトＰＸＲ遺伝子の断片は、前記の通り、ヒトＰＸＲ遺伝子の公知となった変異、例えばＳＮＰを含む断片をいう。前記工程（ｃ）で使用されるプライマーは、これに制限されないが、配列番号２４２乃至２４７のプライマーからなる群より選択され得る。
【０１５４】
このように前記工程（ｄ）で調査されるＳＮＰは韓国人で発見されるＰＸＲの機能的変異遺伝子に関するものであり、韓国人ＰＸＲ遺伝子の機能的変異のハプロタイプ及と機能的変異型の決定に非常に特異的である。
【０１５５】
前記工程（ｄ）で前記ＰＣＲ産物の塩基配列にＰＸＲ遺伝子の変異が存在するか否かの調査は、当業界に公知となった多型性分析方法を用いて遂行できる。好ましくはスナップショット分析（[Ｐｅｔｅｒ Ｍ. Ｖａｌｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ，２００４，１１８：１４７-１５７]参照）、電気泳動分析またはこれらの組み合わせ、より好ましくはスナップショット分析を用いて遂行できる。
【０１５６】
前記スナップショット分析は、ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）される配列（前記ＳＮＰ部位は含まない）を有するプライマーとｄｄＮＴＰを用いたＰＣＲ反応を通じて遺伝子型を分析する方法である。本発明に使用されるスナップショット分析は、前記工程（ｃ）で調査されるＰＸＲ遺伝子のＳＮＰに基づいて公知の方法により設計及び製作したものを使用することができ、ＳＮＰ位置のすぐそばの塩基が３'末端となり、前記ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリングされる配列を含み、５'末端にはＴ塩基が付加されたものであれば制限なしに使用することができ、好ましくは配列番号２４２乃至２４５７のプライマーからなる群より選択されるプライマーを使用することができる。この時、前記ＳＮＰ位置の隣接部位にアニーリングされる配列は約２０ｂｐの長さを有することが好ましく、同時に複数個のＳＮＰを決定しようとする場合、各ＳＮＰに対するスナップショットプライマーの５'末端Ｔ塩基の長さをそれぞれ異なるように設計、例えばＴ塩基を５個ずつ５'位置にさらに添加してプライマー間にサイズ差異を作って合成し、ＰＣＲ産物の長さをそれぞれ異なるようにすることができる。このように作られたスナップショットプライマーに各ＳＮＰに相補的なｄｄＮＴＰが結合するようになり、これら合成物はＳＮＰにより長さの差異が発生することによって同時に複数個のＳＮＰの決定が可能である。
【０１５７】
その後、スナップショット分析で判定された遺伝型診断結果が正確であることを検査するために、遺伝型が分かる他の遺伝子分析法を通じた結果との一致性を調査することができる。ここで他の遺伝子分析法は、特に限定されないが、好ましくは自動塩基配列分析法またはパイロシーケンシング法であっても良い。
【０１５８】
本発明の他の実施例では、本発明で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせの有用性を確認した。このために図４７に示すｈｔＳＮＰ組み合わせを用いてスナップショット分析を実施した後、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を分析した。その結果、本発明の方法が韓国人で発見されるＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を同時に高速に分析できることを確認した（図４８乃至図５０参照）。
本発明の方法により分析され得るＰＸＲ遺伝子の機能的変異型は−２５３８５Ｃ＞Ｔ、−２４１１３Ｇ＞Ａ、７６３５Ａ＞Ｇ、８０５５Ｃ＞Ｔ、１１１５６Ａ＞Ｃ及び１１１９３Ｔ＞Ｃを含む。
【０１５９】
５．ＵＧＴ１Ａ
本発明によるヒトＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型を決定する方法は次の工程を含む：
（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）で抽出された核酸を用いてヒトＵＧＴ１Ａ族個別遺伝子を増幅する工程；及び
（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅された遺伝子の塩基配列を分析し、ＵＧＴ１Ａ１での−３９（ＴＡ）６＞（ＴＡ）７、２１１Ｇ＞Ａ、２３３Ｃ＞Ｔ及び６８６Ｃ＞Ａ；ＵＧＴ１Ａ３での３１Ｔ＞Ｃ、１３３Ｃ＞Ｔ及び１４０Ｔ＞Ｃ；ＵＧＴ１Ａ４での３１Ｃ＞Ｔ、１４２Ｔ＞Ｇ及び２９２Ｃ＞Ｔ；ＵＧＴ１Ａ６での１９Ｔ＞Ｇ、５４１Ａ＞Ｇ及び５５２Ａ＞Ｃ；ＵＧＴ１Ａ７での３８７Ｔ＞Ｇ、３９１Ｃ＞Ａ、３９２Ｇ＜Ａ、６２２Ｔ＞Ｃ及び７０１Ｔ＞Ｃ；及びＵＧＴ１Ａ９での−１１８Ｔ９＞Ｔ１０、７２６Ｔ＞Ｇ及び７６６Ｇ＞Ａからなる群より選択されたＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型の存在有無を確認する工程。
【０１６０】
また、本発明によるイリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）に対する感受性と関連したＵＧＴ１Ａ族遺伝子の多型性を決定する方法は次の工程を含む：
（ａ）ヒトから生物学的試料を採取する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で採取された試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）で抽出された核酸を用いてヒトＵＧＴ１Ａ族遺伝子を増幅する工程；及び
（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅された遺伝子の塩基配列を分析し、ＵＧＴ１Ａ１での２１１Ｇ＞Ａ、２３３Ｃ＞Ｔ及び６８６Ｃ＞Ａ；ＵＧＴ１Ａ６での１９Ｔ＞Ｇ、５４１Ａ＞Ｇ及び５５２Ａ＞Ｃ；及びＵＧＴ１Ａ９での−１１８Ｔ９＞Ｔ１０、７２６Ｔ＞Ｇ及び７６６Ｇ＞Ａからなる群より選択されたＵＧＴ１Ａ族遺伝子変異型の存在有無を確認する工程。
【０１６１】
本発明の方法は、韓国人で主に発見されるＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の多型性に基づいて選別された、最適のＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型または薬物感受性を決定する多型性標識セットを用いることを特徴とするため、既存の方法と比較して韓国人を対象として時間及び費用の面で効率的に分析できる効果を奏する。
【０１６２】
本発明の工程（ａ）では、ヒト、好ましくは韓国人、中国人及び日本人などのアジア人、さらに好ましくは韓国人から生物学的試料を採取する。前記生物学的試料は、血液、皮膚細胞、粘膜細胞または毛髪などであり、好ましくは血液であっても良い。
【０１６３】
本発明の工程（ｂ）では、前記工程（ａ）で採取された生物学的試料から核酸を抽出する。前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡなどであっても良く、好ましくはＤＮＡ、より好ましくはゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡであっても良い。また、採取された試料から核酸を抽出する工程は特に限定されないが、当業界に公知となった技術により遂行したり、市販されている抽出用キット、例えばＱｉａｇｅｎ社（米国）またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）で市販されているＤＮＡまたはＲＮＡ抽出用キットを使用して遂行できる。
【０１６４】
本発明の工程（ｃ）では、前記工程（ｂ）で抽出された核酸を鋳型とし、ヒトＵＧＴ１Ａ族の各遺伝子を増幅できるプライマーを使用してＵＧＴ１Ａ族遺伝子が増幅される。この時、前記工程（ｂ）で抽出された核酸がＲＮＡである場合には、逆転写を用いてｃＤＮＡに転換してこれを鋳型として使用する。前記各プライマーはヒトＵＧＴ１Ａ族遺伝子またはその断片の塩基配列に基づいて公知の方法により設計し製作される。
【０１６５】
本発明の工程（ｃ）で、ＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型を決める方法の場合には、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７及びＵＧＴ１Ａ９族の各遺伝子を増幅することが好ましく、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）に対する感受性を決定するＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の多型性を決定する方法の場合には、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ６及びＵＧＴ１Ａ９族の各遺伝子を増幅することが好ましい。
【０１６６】
本発明の工程（ｄ）では、前記工程（ｃ）で増幅された各ＵＧＴ１Ａ族遺伝子を使用してＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型または薬物感受性と関連した多型を分析する。この時、当該分野で公知の多型性分析法を用いて機能的変異型または多型が分析される。例えば、スナップショット（ＳＮａＰｓｈｏｔ）分析、電気泳動分析、パイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはこれらの組み合わせが行われる。
【０１６７】
具体的には、分析するＵＧＴ１Ａ遺伝子の変異型が単一塩基多型である場合には、スナップショット分析を遂行することが好ましい。、この時のスナップショット分析では単一塩基多型（ＳＮＰ）位置の隣接部位にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）されるプライマー及びｄｄＮＴＰを用いてＰＣＲ反応を遂行する。この時、スナップショット分析で使用されるプライマーは、ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の単一塩基多型に基づいて公知の方法により設計及び製作したものである。例えば、単一塩基多型位置のすぐそばの塩基が３'末端となり、隣接部位にアニーリングされる配列を含み、５'末端にはＴ塩基が付加されるように設計及び製作される。この時、アニーリングされる配列は約２０ｂｐの長さを有することが好ましく、同時に複数個の単一塩基多型を決定しようとする場合は、各単一塩基多型に対するスナップショットプライマーの５'末端Ｔ塩基の長さをそれぞれ異なるように設計し、ＰＣＲ産物の長さをそれぞれ異なるようにする。
【０１６８】
本発明の一実施様態によれば、ＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型を確認するスナップショット分析では、配列番号：２９０５乃至３１４の配列を有するプライマーを使用することができ、ＵＧＴ１Ａ族遺伝子群のイリノテカン感受性関連多型性を確認するスナップショット分析には配列番号：３１５乃至３２２の配列を有するプライマーを使用することができる。
【０１６９】
一方、スナップショット分析で増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を公知の配列分析法で分析することができる。好ましくは自動塩基配列分析法により分析することができるがこれに限定されない。
【０１７０】
また、分析するＵＧＴ１Ａ遺伝子の変異型が単一塩基多型ではない場合（例えば、ＵＧＴ１Ａ１での−３９（ＴＡ）６＞（ＴＡ）７型）にはスナップショット分析の代わりに公知のパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）分析を遂行でき、この時のパイロシーケンシングは、公知の通り、ＤＮＡが重合される間に放出されるＰＰｉ（無機ピロリン酸塩）の発光程度を測定して分析を遂行できる。本発明の一実施様態によれば、ＵＧＴ１Ａ１族遺伝子の−３９（ＴＡ）６＞（ＴＡ）７型を確認するパイロシーケンシング分析には、配列番号：２９２乃至２９４の配列を有するプライマーを使用することができる。
【実施例】
【０１７１】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【０１７２】
＜ＣＹＰ１Ａ２＞
実施例１：韓国人におけるＣＹＰ１Ａ２遺伝子の遺伝型分析
＜１−１＞ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の増幅
４８名の健康な被験者から血液を分離した後、Ｑｉａｇｅｎ社のゲノムＤＮＡ分離キットを使用してＤＮＡをそれぞれ分離した。ＣＹＰ１Ａ２遺伝子は７個のエクソンを含み総遺伝子の長さが約１１ｋｂである。従って、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を１５個の断片に分けてＰＣＲを遂行した。各ＰＣＲに使用したプライマーは下記の表１の通りである。本明細書に記載された塩基配列でＡ、Ｔ、Ｇ及びＣはそれぞれアデニン、チミン、グアニン及びシトシンを意味する。
【０１７３】
【表１】
0005687721.tif 000002
【０１７４】
各プライマーの位置とＰＣＲ産物の大きさは下記の表２の通りである。また、ヌクレオチドの位置はＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０（ＣＹＰ）  Ａｌｌｅｌｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ.ｋｉ.ｓｅ／ｃｙｐ１ａ２.ｈｔｍ）の命名法により記載した。
【０１７５】
【表２】
0005687721.tif 000003
【０１７６】
各ＰＣＲ断片に対する反応条件は下記の表３の通りである。
【０１７７】
【表３】
0005687721.tif 000004
【０１７８】
＜１−２＞ＰＣＲ産物の塩基配列分析
前記実施例＜１−１＞で得られた各ＰＣＲ産物の塩基配列を自動配列分析器を用いて分析した。この時に使用したプライマーは下記の表４の通りである。
【０１７９】
【表４】
0005687721.tif 000005
【０１８０】
前記実施例＜１−１＞で増幅されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の全体塩基配列を自動塩基配列分析器を用いて分析した。その後、野生型ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の塩基配列（配列番号１）と比較した結果、総１７個の単一塩基多型を発見し、その結果を下記の表５に示した。その中で単一塩基多型−２６０３ｉｎｓＡは新規なものであることを確認した。
【０１８１】
【表５】
0005687721.tif 000006
【０１８２】
その後、本発明者等は前記新規な１個の単一塩基多型がＣＹＰ１Ａ２の一本に位置するか否かと、同一なＤＮＡ本に他の遺伝子変異はないか、染色体の他の部分に位置した類似遺伝子から起因したものではないかどうかを調査するために、前記単一塩基多型が発見された変異遺伝子を含む被験者のＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号３８及び３９のプライマーを使用してＰＣＲを遂行し、増幅された産物の配列を前記と同様な方法で分析した。
その結果、前記１個の単一塩基多型は全てプロモーター部位−２６０３ｉｎｓＡに位置した。この変異型の単一塩基多型は二本のＤＮＡのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有していることが示された（図１）。
【０１８３】
実施例２：ＣＹＰ１Ａ２変異型のハプロタイプ分析
前記実施例１で糾明された１７個のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異は、その組み合わせによりＣＹＰ１Ａ２の酵素活性に影響を与える可能性があり、幾つかのハプロタイプに対する酵素活性変異は既に報告されている。従って、本発明者等は実施例１で確認した変異によるハプロタイプをＤＹＮＡＣＯＭ社のＳＮＰＡｌｙｚｅプログラムを使用して分析した。その結果、下記の表６に示した通り、他種族で発見されない韓国型の新たなハプロタイプが確認された。
【０１８４】
【表６】
0005687721.tif 000007
□：各単一塩基多型の変異
【０１８５】
実施例３：ｈｔＳＮＰの選別及び検証
ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の単一塩基多型の組み合わせであるハプロタイプがＣＹＰ１Ａ２の酵素活性に影響を与える可能性が多くのハプロタイプで報告されたことがある。このように作られた詳細なハプロタイプの情報は最小マーカで確認することができる。これら最小マーカをｈｔＳＮＰといい、前記ｈｔＳＮＰはそれぞれのハプロタイプの正確な表示のために必要なマーカであり、色々な組み合わせを構成するようになる。この最適化された標識セットであるｈｔＳＮＰ組み合わせをＳＮＰタガーソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｗｅｌｌ.ｏｘ.ａｃ.ｕｋ／〜ｘｉａｙｉ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を用いて選別した。選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせの例を図２乃至図６に示し、各選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせは最適の標識セットのうちの一つとして、「１」は野生型を、「２」は変異型、そして「Ｖ」表示は選択されたそれぞれのｈｔＳＮＰを示す。ｈｔＳＮＰの選別は図２乃至６の組み合わせ以外にも他の組み合わせが可能である。
その後、探し出した組み合わせの中でディプロタイプを考慮して互いに重ならずにディプロタイプ遺伝型を決定できるかをＭａｔｌａｂソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ７.１，Ｔｈｅ Ｍａｔｈ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，  米国）を使用して分析し、これを用いてチェックした後に組み合わせを決定した。
【０１８６】
検証の結果、互いに重ならずにディプロタイプ遺伝型を決定できることを確認した。これは本発明で選択したｈｔＳＮＰ組み合わせが互いに同一なものがなく、遺伝型を決定するに当たって不正確な分析が全くないことを示す。
【０１８７】
実施例４：高速のＣＹＰ１Ａ２プロモーター遺伝子変異検索
前記実施例１で確認された韓国人で発見されたＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１７個の単一塩基多型の中で、ＣＹＰ１Ａ２酵素活性に影響を与えるプロモーター部分の単一塩基多型１１個を高速に検索するためにスナップショット分析を実施した。被験者のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを遂行し、増幅された産物をスナップショット分析した。ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のプロモーターは約４，０００ｂａｓｅであり、ＰＣＲに使用したプライマーは下記の表７の通りである。
【０１８８】
【表７】
0005687721.tif 000008
【０１８９】
ＰＣＲ産物に対する反応条件は下記の表８の通りである。
【０１９０】
【表８】
0005687721.tif 000009
【０１９１】
前記のように増幅されたＰＣＲ産物の反応されていないプライマーとｄＮＴＰなどは残っていればスナップショット過程に影響を与えるので、これらを除去するために、混合されたＰＣＲ産物５μｌ当たりＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）２μｌを入れて３７℃で３０分間反応させた後、８０℃で１５分間反応させて残っている酵素を非活性化させた。酵素処理された産物は下記の表９に示すプライマーを用いてマルチプレックススナップショット（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＳＮａＰｓｈｏｔ）反応物を作ってＰＣＲ反応した。マルチプレックススナップショット反応物及びＰＣＲ反応条件をそれぞれ表１０及び表１１に示した。
【０１９２】
【表９】
0005687721.tif 000010
【０１９３】
【表１０】
0005687721.tif 000011
【０１９４】
【表１１】
0005687721.tif 000012
【０１９５】
反応が終わった後、[Ｆ]ｄｄＮＴＰを除去するためにＳＮａＰｓｈｏｔ産物５μｌにＳＡＰ（ＵＳＢ社）２μｌを入れて３７℃で３０分、８０℃で１５分間反応させた。反応が全て終わると、反応物０．５μｌ、Ｈｉ−Ｄｉホルムアミド（ＡＢＩ社）９．２５μｌ及びジーンスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ）−ＬＩＺサイズ標準物質（ＡＢＩ社）０．２５μｌを混合して９５℃で５分間変成させた。その後、３１３０ＸＬ遺伝子分析器（３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、 ＡＢＩ社）で分析し、その結果を図７乃至図１４に示した。
【０１９６】
その結果、図７乃至１４に示すように、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異型によりピークの色と位置が異なるように表示されて野生型、異型の対立形質を有する変異型（異型）、同型の対立形質を有する変異型（同型）を容易に識別できることを確認した。従って、本発明による分析方法を通じて時間及び費用の面で効率的かつ容易にＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異型を分析できることが分かる。
【０１９７】
＜ＣＹＰ２Ａ６＞
実施例５：韓国人における２Ａ６遺伝子の遺伝型分析
＜５−１＞２Ａ６遺伝子の増幅
５０名の健康な被験者から血液を分離した後、Ｑｉａｇｅｎ社のゲノムＤＮＡ分離キットを使用してＤＮＡをそれぞれ分離した。ＣＹＰ２Ａ６遺伝子は９個のエクソンを含む総遺伝子の長さが約６．９ｋｂである。従って、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子を７個の断片に分けてＰＣＲを遂行した。各ＰＣＲに使用したプライマーは下記の表１２の通りである。本明細書に記載された塩基配列でＡ、Ｔ、Ｇ及びＣはそれぞれアデニン、チミン、グアニン及びシトシンを意味する。
【０１９８】
【表１２】
0005687721.tif 000013
【０１９９】
各プライマーの位置とＰＣＲ産物の大きさは下記の表１３の通りである。また、ヌクレオチドの位置はＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０（ＣＹＰ）  Ａｌｌｅｌｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ.ｋｉ.ｓｅ/ｃｙｐ２ａ６.ｈｔｍ）の命名法により記載した。
【０２００】
【表１３】
0005687721.tif 000014
【０２０１】
各ＰＣＲ断片に対する反応条件は下記の表１４の通りである。
【０２０２】
【表１４】
0005687721.tif 000015
【０２０３】
＜５−２＞ＰＣＲ産物の塩基配列分析
前記実施例＜５−１＞で得られた各ＰＣＲ産物の塩基配列を自動配列分析器及び配列番号：７６乃至８９のプライマーを用いて分析した。
【０２０４】
その後、野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の塩基配列（配列番号：７５）と比較した結果、総２７個のＳＮＰを発見し、その中で２つは現在まで報告されたことがない新たなＳＮＰである。また、遺伝子欠失による構造分析を通じて３個のＳＮＰを発掘し、総３０個のＳＮＰは下記の表１５に記載された通りである。
【０２０５】
【表１５】
0005687721.tif 000016
【０２０６】
前記の表で「＋」はＣＹＰ２Ａ６遺伝子が欠失されてＣＹＰ２Ａ６遺伝子の一部の残った部分とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との接合形態（図３３、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の１番から８番エクソンまで全てなくなり、ＣＹＰ２Ａ７のエクソン９部分末端にＣＹＰ２Ａ６のエクソン９番が一部置換された形態）の遺伝子で発見される変異として、数字はＣＹＰ２Ａ６遺伝子が完全にあることを仮定して塩基配列に合わせた番号を使用した（ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の欠失であるため、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のＳＮＰと見ることは困難である）。
【０２０７】
このような構造でＳＮＰを用いて欠失されたハプロタイプを決定するためには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７のシークエンスが同一な部分内で５’位置の正方向プライマーをデザインし、ＣＹＰ２Ａ６に特異的でありＣＹＰ２Ａ７遺伝子は増幅できないエクソン９部分で逆方向プライマーをデザインし、純粋にＣＹＰ２Ａ７遺伝子は増幅されず、完全なＣＹＰ２Ａ６遺伝子またはＣＹＰ２Ａ６遺伝子が欠失されてＣＹＰ２Ａ７遺伝子と接合された形態の遺伝子部分を増幅されるようにできる。
【０２０８】
増幅されたＰＣＲ産物でＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７に特異的な塩基を選択するが、ＣＹＰ２Ａ６翻訳開示コドンであるＡＴＧを基準にＣＹＰ２Ａ６（配列番号：７５）の６０９１Ｃ＞Ｔ塩基例をみれば、次の通りＣＹＰ２Ａ６  ６０９１Ｃ周辺の部分はＣＹＰ２Ａ７（配列番号：１０４）６５２１Ｔの塩基配列周辺と類似することが分かる。このようなサイトが６０９１だけではなく、ＣＹＰ２Ａ６配列で５９７１Ｇ及び５９８３Ｔ部分もＣＹＰ２Ａ７と差異があることを確認できる。
【０２０９】
また、前記の表で「＊」が意味するところは、国際ＣＹＰ明明委員会から対立遺伝形質と認められて命名された変異の表示であり、例えば、＊１１は野生型に比べて２２４番目アミノ酸がセリンからプロリンに変わる変異を有しているハプロタイプを意味し、国際命名法はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ．ｋｉ．ｓｅ／ｃｙｐ２ａ６．ｈｔｍを従った。
また、前記の表で「♯」は新規変異を意味する。
【０２１０】
実施例６：ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝型のハプロタイプ分析
前記実施例５で糾明された２７個のＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異と３個のＣＹＰ２Ａ６欠失標識変異は、その組み合わせに応じてＣＹＰ２Ａ６の酵素活性に影響を与える可能性がある。従って、本発明者等は実施例５で確認した変異によるハプロタイプをＤＹＮＡＣＯＭ社のＳＮＰＡｌｙｚｅプログラムを使用して分析した。通常的にハプロタイプの分析で頻度が低い変異の場合、統計的有意性を確保し難いため、主に５％または１０％以上の頻度を有する変異を選別してハプロタイプの分布を予測する。しかしながら、アミノ酸の置換を招く場合には、頻度が低いにもかかわらず、明確な機能性を有しているため、本発明では頻度が高い変異である−４８Ｔ＞Ｇ、２２Ｃ＞Ｔ、５１Ｇ＞Ａ、１６２０Ｔ＞Ｃ、１８３６Ｇ＞Ｔ、及び６３５４Ｔ＞Ｃの６個の変異とアミノ酸の変化を招く１３Ｇ＞Ａ、５６７Ｃ＞Ｔ、２１３４Ａ＞Ｇ、３３９１Ｔ＞Ｃ、６４５８Ａ＞Ｔ、６５５８Ｔ＞Ｃ、６５８２Ｇ＞Ｔ、６６００Ｇ＞Ｔの８個の変異を用いてハプロタイプ分析を遂行し、遺伝子の欠失がある場合、これを標識できる変異である５９７１Ｇ＞Ａ、５９８３Ｔ＞Ｇ、６０９１Ｃ＞Ｔ変異を検査変異対象に追加した。総１７個の変異を用いてハプロタイプを分析した結果、図１５のように総２０個の韓国人におけるハプロタイプ分布を得ることができた。
【０２１１】
実施例７：ｈｔＳＮＰの選別及び検証
ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のＳＮＰの組み合わせであるハプロタイプがＣＹＰ２Ａ６の酵素活性に影響を与える可能性が多くのハプロタイプで報告されたことがある。このような詳細なハプロタイプの情報は最小マーカで確認することができる。これら最小マーカをｈｔＳＮＰといい、前記ｈｔＳＮＰはそれぞれのハプロタイプの正確な表示のために必要なマーカであり、色々な組み合わせを構成するようになる。この最適化された標識セットであるｈｔＳＮＰ組み合わせを選別するために、前記実施例６で選別された総２０個のハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｗｅｌｌ.ｏｘ.ａｃ.ｕｋ/〜ｘｉａｙｉ/ｈａｐｌｏｔｙｐｅ/）を用いて分析した。
【０２１２】
その結果、図１６乃至図２１に示すｈｔＳＮＰ組み合わせを選別した。図１６乃至図２１に図示されている、各選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせは最適の標識セットとして、「１」は野生型を、「２」は変異型、そして「Ｖ」表示は選択されたそれぞれのｈｔＳＮＰを示す。
【０２１３】
ｈｔＳＮＰ分析で各変異の遺伝型が決定されると、その結果から二倍体型を予測することができる。しかしながら、互いに異なるハプロタイプの組み合わせが同一な遺伝型を有する可能性もあるので、ｈｔＳＮＰ組み合わせの中でディプロタイプ（二倍体型）を考慮する時、互いに重ならずに二倍体型遺伝型を決定できるかをＭａｔｌａｂソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ７.１,Ｔｈｅ Ｍａｔｈ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，  米国）を使用して分析した。
【０２１４】
検査の結果、本実施例により決定されたｈｔＳＮＰだけでも互いに重ならずに二倍体型を決定できることを確認した。これは本発明で選択したｈｔＳＮＰ組み合わせが互いに同一なものがなく、遺伝型を決定するに当たって不確実な分析が全くないことを示す。
【０２１５】
実施例８：高速のＣＹＰ２Ａ６遺伝子の機能的変異検索
前記実施例５で確認された韓国人で発見されたＣＹＰ２Ａ６遺伝子の２７個の変異とＣＹＰ２Ａ６遺伝子欠失を標識する３個の変異のうち、機能性を変化させるＣＹＰ２Ａ６の遺伝型が遺伝子診断に有用に使用され得る。従って、図１６にある変異の中でアミノ酸の変化を起こしているか、または既に機能性が立証されている変異である−４８Ｔ＞Ｇ、１３Ｇ＞Ａ、５６７Ｃ＞Ｔ、２１３４Ａ＞Ｇ、３３９１Ｔ＞Ｃ、６４５８Ａ＞Ｔ、６５５８Ｔ＞Ｃ、６５８２Ｇ＞Ｔ、６６００Ｇ＞Ｔの９個の変異と遺伝子欠失を標識する６０９１Ｃ＞Ｔ変異とを含む総１０個の機能的変異を高速に検索するために、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の高速遺伝型分析技術の一つであるスナップショット分析を実施した。選別されたｈｔＳＮＰは図１６のｈｔＳＮＰ組み合わせの中で機能性を反映する１０個の変異が選択されたものであり、変異の位置は下記の表１７の通りである。
【０２１６】
【表１７】
0005687721.tif 000017
【０２１７】
具体的に、被験者のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを遂行し、増幅された産物をスナップショット分析した。この時、ＰＣＲに使用したプライマーは下記の表１８の通りである。
【０２１８】
この時、ＣＹＰ２Ａ６_ｌｏｎｇを増幅するためのプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子全長を増幅するプライマーであるので、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子欠失の場合には適用できず、遺伝子欠失を標識する６０９１Ｃ＞Ｔを判別するためにはＣＹＰ２Ａ６*４産物を増幅できるＣＹＰ２Ａ６  ｄｅｌＦとＣＹＰ２Ａ６  ｄｅｌＲのプライマー対を利用しなければならない。
【０２１９】
【表１８】
0005687721.tif 000018
【０２２０】
ＰＣＲ産物に対する反応条件は下記の表１９の通りである。
【０２２１】
【表１９】
0005687721.tif 000019
【０２２２】
前記のように増幅されたＰＣＲ産物の反応されていないプライマーとｄＮＴＰなどは残っていればスナップショット過程に影響を与えるので、これらを除去するために、混合されたＰＣＲ産物５μｌ当たりＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）２μｌを入れて３７℃で３０分間反応させた後、８０℃で１５分間反応させて残っている酵素を非活性化させた。酵素処理された産物は下記の表２０に示すプライマーを用いてマルチプレックススナップショット（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＳＮａＰｓｈｏｔ）反応物を作ってＰＣＲ反応した。マルチプレックススナップショット反応物及びＰＣＲ反応条件をそれぞれ表２１及び表２２に示した。
【０２２３】
【表２０】
0005687721.tif 000020
【０２２４】
【表２１】
0005687721.tif 000021
【０２２５】
【表２２】
0005687721.tif 000022
反応が終わった後に残ったｄｄＮＴＰを除去するために、スナップショット産物１０μｌにＳＡＰ（ＵＳＢ社）１μｌを入れて３７℃で６０分、６５℃で１５分間反応させた。反応が全て終わると、反応物０．５μｌ、Ｈｉ−Ｄｉホルムアミド（ＡＢＩ社）９．３μｌ及びジーンスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ）−ＬＩＺサイズ標準物質（ＡＢＩ社）０．２μｌを混合して９５℃で５分間変成させた。その後、３１００遺伝子分析器（３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社）で分析した。その結果を図２２乃至３０に示す。この遺伝型分析は下記の表２３の通りである。
【０２２６】
【表２３】
0005687721.tif 000023
【０２２７】
図２２乃至３０に示すように、各ＳＮＰによりピークの色と大きさが一致し、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の機能的変異型によりピークの色と位置が異なるように表示されて野生型、異型の対立形質を有する変異型（異型）、同型の対立形質を有する変異型（同型）を容易に識別できることを確認した。図２２乃至３０のグラフでＸ軸は各プライマーの長さの差異により自動塩基配列分析器でプライマーが移動した距離であり、Ｙ軸は各塩基に含まれた特異的な波長の蛍光物質から放出される蛍光の強さを示す。
【０２２８】
また、図３１及び３２は前記図２２乃至図３０の遺伝子変異以外にＣＹＰ２Ａ６遺伝子が欠失された場合を追加的に検査するために、図２２乃至図３０の遺伝子検査に並行して遂行するスナップショット方法の例示として、図３１はＣＹＰ２Ａ６遺伝子が相同染色体に正常に存在する場合であり、図３２はＣＹＰ２Ａ６遺伝子が一つの染色体には存在しないため、一つの遺伝子だけを有する場合である。
【０２２９】
以上の発明を通じて開発したスナップショット方法により５０個の試料を分析し、同一の試料に対して全長塩基配列を分析した結果、遺伝型判読結果が１００％一致した。これは本発明方法の再現性が高く、正確であることを示す。
【０２３０】
従って、本発明による分析方法を通じて時間及び費用の面で効率的かつ容易にＣＹＰ２Ａ６遺伝子の機能的変異型を分析できることが分かる
従って、前記方法は韓国人で主に発見される１０種のＣＹＰ２Ａ６ハプロタイプを決定することによって、これら組み合わせによるＣＹＰ２Ａ６遺伝型を同時に高速に分析できる方法であり、韓国人で発見される遺伝的変異を含むので、遺伝型決定の正確度が高い。また、韓国人と遺伝的特性が非常に類似する日本人の場合にもほとんど全ての遺伝型分析が可能であり、既に知られた結果から中国人でも９０％以上の範囲でＣＹＰ２Ａ６遺伝型を判別できる技術であると思料される。
【０２３１】
＜ＣＹＰ２Ｄ６＞
実施例９：韓国人のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝型分析
＜９−１＞ゲノムＤＮＡの分離
１７４名の韓国人から採取した血液試料からゲノムＤＮＡ分離キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡをそれぞれ分離した。
【０２３２】
＜９−２＞ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の増幅及び全長塩基配列分析
前記実施例＜９−１＞で分離された総１７４個のゲノムＤＮＡサンプルの中で任意に選んだ５１個のサンプルを鋳型とし、下記のプライマー対でＰＣＲを遂行してヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を構成する９個のエクソンと１．８ｋｂのプロモーター部位が増幅されるようにした。
【０２３３】
【表２４】
0005687721.tif 000024
【０２３４】
ＰＣＲは９４℃で１分間反応させた後、９８℃で１０秒、６４℃で３０秒及び７２℃で７分間３０サイクルを反復し、最終的に７２℃で１０分間反応させた。その結果、６，５６９ｂｐの大きさのＰＣＲ産物を収得した（下記の表２５参照）。
【０２３５】
【表２５】
0005687721.tif 000025
【０２３６】
その後、増幅されたＰＣＲ産物を鋳型とし、下記の表２６に示す総１３種のプライマーを用いて増幅されたＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列を分析した。
【０２３７】
【表２６】
0005687721.tif 000026
【０２３８】
＜９−３＞各遺伝型による個別的分析
前記実施例＜９−１＞から分離した残りの１２３個のゲノムＤＮＡサンプルについては、下記の方法により東洋人で主に発見される*２Ａ、*５、*２Ｎ、*１０Ｂ、*１４Ｂ、*１８、*２１Ｂ、*４１Ａ、*４９、*５２、*６０変異に対する遺伝型分析を個別的に遂行した。
【０２３９】
ａ）ＣＹＰ２Ｄ６*５遺伝型の分析
ＣＹＰ２Ｄ６*５遺伝型を分析するために、下記の表２７に記載されたプライマーを使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ反応条件としては、９４℃で１分間反応させた後に９８℃で１０秒、６４℃で３０秒及び７２℃で５分間３０サイクルを反復して７２℃で１０分間反応させた。その結果、野生型の場合、９個のエクソンを含む５．１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅され、ＣＹＰ２Ｄ６*５変異型の場合、３．５ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。
【０２４０】
【表２７】
0005687721.tif 000027
【０２４１】
ｂ）ＣＹＰ２Ｄ６*２Ｎ遺伝型の分析
ＣＹＰ２Ｄ６*２Ｎ遺伝型を分析するために、下記の表２８に記載されたプライマーを使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲは９４℃で１分間反応させた後に９８℃で１０秒、６４℃で３０秒及び７２℃で８分間３０サイクルを反復して７２℃で１０分間反応させた。その結果、ＣＹＰ２Ｄ６*２Ｎ変異型の場合、７．８ｋｂのＰＣＲ産物を収得した。
【０２４２】
【表２８】
0005687721.tif 000028
【０２４３】
ｃ）ＣＹＰ２Ｄ６*２及び*４１遺伝型の分析
ＣＹＰ２Ｄ６*２遺伝型とＣＹＰ２Ｄ６*４１遺伝型の場合、−１５８４Ｃ＞Ｇ変異を除いて同一の変異（１２３５Ａ＞Ｇ；−７４０Ｃ＞Ｔ；−６７８Ｇ＞Ａ；イントロン１でのＣＹＰ２Ｄ７への遺伝子転換（ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）；１６６１Ｇ＞Ｃ；２８５０Ｃ＞Ｔ；４１８０Ｇ＞Ｃ）を有する。従って、先ずイントロン１でのＣＹＰ２Ｄ７への遺伝子転換の変異配列を下記の表２９に記載されたプライマーを用いてＡＳ−ＰＣＲ方法（Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４６：４５２-４５９，１９９４）で分析した。
【０２４４】
イントロン１でのＣＹＰ２Ｄ７への遺伝子転換が起こった場合、配列番号１２９のプライマー９と配列番号１２５のプライマー１０Ｂを使用してＰＣＲ反応を行うことにより増幅産物を得ることができ、正常の場合には配列番号１２９のプライマー９と配列番号１３０のプライマー１０の組み合わせで反応をした場合にのみ増幅産物が得られる。従って、２個のプライマー組み合わせ、つまり、プライマー９／プライマー１０とプライマー９／プライマー１０Ｂの組み合わせでそれぞれ反応して増幅された産物の有無に応じてイントロン１でのＣＹＰ２Ｄ７への遺伝子転換を確認することができる。
ＰＣＲは９４℃で５分間反応させた後に９４℃で３０秒、６４℃で３０秒及び７２℃で３０秒間３５サイクルを反復して７２℃で１０分間反応させた。その後、−１５８４Ｃ＞Ｇ変異を下記の表２９に記載されたシーケンシングプライマーを用いてパイロシーケンシングで分析して−１５８４Ｇである場合をＣＹＰ２Ｄ６*２遺伝型に、−１５８４Ｃである場合をＣＹＰ２Ｄ６*４１遺伝型に決定した。
【０２４５】
【表２９】
0005687721.tif 000029
【０２４６】
ｄ）ＣＹＰ２Ｄ６*１０Ｂ、*１４、*１８及び*４９遺伝型の分析
ＣＹＰ２Ｄ６*１０Ｂ、*１４、*１８及び*４９遺伝型はＰＣＲ−ＲＦＬＰ方法で分析した（Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４６：４５２-４５９，１９９４; Ｗａｎｇ，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｏｓｉｔｉｏｎ，２７：３８５-３８８，１９９８; 及び Ｇｅａｄｉｇｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：６６９-６８２，１９９９）。この時に使用したプライマーは下記の表３０の通りであり、実験条件は下記の表３１に示す通りである。
【０２４７】
【表３０】
0005687721.tif 000030
【０２４８】
【表３１】
0005687721.tif 000031
【０２４９】
ｅ）ＣＹＰ２Ｄ６*２１、*５２及び*６０遺伝型の分析
ＣＹＰ２Ｄ６*２１、*５２及び*６０遺伝型の分析はＰＣＲ−パイロシーケンシング法で分析した。分析に使用したプライマーの配列は下記の表３２に示す通りである。
【０２５０】
【表３２】
0005687721.tif 000032
【０２５１】
前記実施例＜９−２＞及び＜９−３＞で得られたデータをＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｍ３３３８８で公知のＣＹＰ２Ｄ６の配列に基づいて比較分析し、各対立因子の頻度を調査した。その結果、韓国人で主に発見されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子ハプロタイプの種類及び頻度は下記の表３３の通りである。
【０２５２】
【表３３】
0005687721.tif 000033
【０２５３】
前記の表３３でＮｏｒｍａｌは「正常水準」、Ｉｎｃｒは「増加」、Ｄｅｃｒは「減少」、Ｎｏｎｅは「活性ない」をそれぞれ示す。また、括弧内の表記は分析に使用した標識薬物の略字である： ｂ，  ｂｕｆｕｒａｌｏｌ；ｄ，  ｄｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎｅ；ｄｘ，  ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ；ｓ，  ｓｐａｒｔｅｉｎｅ。
【０２５４】
韓国人で主に発見される１２種の遺伝型を中心に遺伝子を選択してＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０（ＣＹＰ）  Ａｌｌｅｌｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ (ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ.ｋｉ.ｓｅ/ｃｙｐ２ｄ６.ｈｔｍ）を基準として各遺伝型の変異を下記の表３４に示した。表３４で「１」は野生型を、「２」は変異型をそれぞれ示す。
【０２５５】
【表３４】
0005687721.tif 000034
【０２５６】
実施例１０：ｈｔＳＮＰの選別及び検証
前記実施例９で確認した韓国人で発見される１２種のＣＹＰ２Ｄ６遺伝型を決定するために、表３４に示す３３個の変異を全て分析することは、時間と費用的な面で効率性が非常に落ちる。従って、詳細なハプロタイプの情報を用いて標識遺伝子変異であるｈｔＳＮＰを選定して遺伝型を決定すれば経済的な遺伝型判別が可能である。前記ｈｔＳＮＰはそれぞれのハプロタイプの正確な表示のために必要なマーカであり、色々な組み合わせを構成するようになる。この最適化された標識セットであるｈｔＳＮＰ組み合わせをＳＮＰタガーソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｗｅｌｌ.ｏｘ.ａｃ.ｕｋ/〜ｘｉａｙｉ/ｈａｐｌｏｔｙｐｅ/）を用いて選別した。選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせの例を図３４乃至図３９に示し、各選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせは最適の標識セットとして、「１」は野生型を、「２」は変異型を示し、「Ｖ」表示はｈｔＳＮＰを示す。
【０２５７】
その後、探し出した組み合わせの中でディプロタイプ（ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ）を考慮して互いに重ならずにディプロタイプ遺伝型を決定できるかをＭａｔｌａｂソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ７.１，Ｔｈｅ Ｍａｔｈ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）を使用して分析し、これを用いてチェックした後に組み合わせを決定した。
検証の結果、互いに重ならずにディプロタイプ遺伝型を決定できることを確認した。これは本発明で選択したｈｔＳＮＰ組み合わせが互いに同一なものがなく、遺伝型を決定するに当たって不正確な分析が全くないことを示す。
【０２５８】
実施例１１：ＳＮａＰｓｈｏｔ分析
前記実施例１０で選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせを用いてＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の高速遺伝型分析技術の一つであるスナップショット分析を遂行した。このために図３４のｈｔＳＮＰ組み合わせを選択した。各ｈｔＳＮＰで選別される変異の位置は下記の表３５の通りである。下記の表３５でｈｔＳＮＰ１乃至ｈｔＳＮＰ３の場合には該当する複数個の変異の中で一つのＳＮＰだけを分析しても遺伝型判別が可能である。また、ｈｔＳＮＰ９の場合には９個の塩基（ＧＴＧＣＣＣＡＣＴ）が挿入されて反復される様相を示すようになるので、４１２５番目塩基から４１３３番目塩基位置のうちのいずれか一つの塩基位置だけを分析し、野生型遺伝子の塩基配列と比較することによって遺伝型判別が可能である。
【０２５９】
【表３５】
0005687721.tif 000035
【０２６０】
前記実施例＜９−２＞と同様の方法によりＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を増幅して約６．７ｋｂの産物を得た。そして、ＣＹＰ２Ｄ６*５を決定するために配列番号１５４のプライマーＣＹＰ２Ｄ６_３（５'−ＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡ−３'）と配列番号１２３のプライマー３‘２Ｄ６*５を用いてＣＹＰ−ＲＥＰ−Ｄｅｌ部位を増幅し、ＰＣＲは９４℃で１分間反応させた後に９８℃で１０秒、６４℃で３０秒及び７２℃で３分間３０サイクルを反復し、最終的に７２℃で１０分間反応させた。その結果、６，５６９ｂｐ大きさのＰＣＲ産物を収得した。
【０２６１】
前記のように増幅されたＰＣＲ産物の反応されていないプライマーとｄＮＴＰなどは残っていればスナップショット過程に影響を与えるので、これらを除去するために、ＰＣＲ産物５μｌ当たりＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２μｌを入れて３７℃で３０分間反応させた後、８０℃で１５分間反応させて残っている酵素を非活性化させた。酵素処理された産物を鋳型３μｌ（６．７ｋｂのＣＹＰ２Ｄ６遺伝子２μｌと３．５ｋｂのＣＹＰ−ＲＥＰ−ＤＥＬ１μｌの混合物）、スナップショットマルチプレックスレディーリアクションミックス（ＳＮａＰｓｈｏｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ, ＡＢＩ）１μｌ、１/２ターム（ｔｅｒｍ）緩衝液（２００ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，５ ｍＭ ＭｇＣｌ2，ｐＨ ９）４μｌ及びＰｏｏｌｅｄ  ＳＮａＰｓｈｏｔプライマーを入れて全体反応物の量を１０μｌに合わせた後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で３０秒間４０サイクル反復してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ反応した。使用したＰｏｏｌｅｄ  ＳＮａＰｓｈｏｔプライマーの処理濃度を下記の表３６に示した。
【０２６２】
【表３６】
0005687721.tif 000036
【０２６３】
反応が終わった後に反応物１０μｌにＳＡＰ（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１μｌを入れて３７℃で１時間、６５℃で１５分間反応させた。反応が全て終わると、反応物０．５μｌ、ＬＩＺ１２０（ＡＢＩ）０．２μｌ、Ｈｉ−Ｄｉホルムアミド（ＡＢＩ）９．３μｌを混合して９６ウェルプレートに分注した。分注されたサンプルを９５℃で２分間反応させた後、３１００遺伝子分析器（ＡＢＩ）で分析した。分析した結果は図４０に示す通りである。
【０２６４】
その結果、図４０に示すように、各ＳＮＰによりピークの色と大きさが一致し、野生型と変異型が明確に決定されることが分かる。
【０２６５】
また、ＣＹＰ２Ｄ６重複をスナップショットを用いて分析するために、ＣＹＰ−ＲＥＰ−Ｄｕｐ部位を配列番号１５５のＤｕｐ−Ｆ_２（５’−ＣＣＴＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣ−３’）と配列番号１５６のＤｕｐ−Ｒ（５’−ＣＡＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＣＴＡＧＡＴ−３’）を用いたことを除いては前記と同様な方法で増幅して３．３ｋｂ大きさのＰＣＲ産物を収得した。ＰＣＲ反応以降、ＰＣＲ産物から反応して残ったプライマーなどを除去するためにＰＣＲ産物５μｌ当たりＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２μｌを入れて３７℃で３０分間反応させた。
【０２６６】
その後、８０℃で１５分間反応させて残っているＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを非活性化させた。酵素処理された産物を鋳型３μｌ、スナップショットマルチプレックスレディーリアクションミックス１μｌ、１/２ターム緩衝液４μｌ及び配列番号１５７のスナップショットプライマー（ＣＹＰ２Ｄ６−５Ｒ、５’−ＣＴＣＧＴＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＧＧＧＴＣ−３’）を入れて全体反応物の量を１０μｌに合わせた後、前記と同一な条件でスナップショット反応を遂行した後、３１００遺伝子分析器で分析してその結果を図４１に示した。
【０２６７】
その結果、図４１に示すように、ＳＮＰによりピークの色と大きさが一致し、野生型と変異型が明確に決定されることが分かる。
【０２６８】
このような方法により野生型及び変異遺伝型を含む５０個のサンプルに対してシーケンシングを通じた妥当性検査（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を遂行した結果、１００％一致する結果を得た。この結果は本発明方法が再現性が高く、正確であることを示す。
【０２６９】
従って、前記方法はこれら組み合わせて高速で、韓国人で主に発見される１２種のＣＹＰ２Ｄ６ハプロタイプを決定し、同時にＣＹＰ２Ｄ６遺伝型を決定する。韓国人で発見される遺伝的変異を含むので、遺伝型決定における正確度が高い。また、韓国人と遺伝的特性が非常に類似する日本人の場合にもほとんど全ての遺伝型分析が可能であり、既に知られた結果から中国人でも９０％以上の範囲でＣＹＰ２Ｄ６遺伝型を判別できる技術であると思料される。
【０２７０】
実施例１２：遺伝子分析チップを用いた遺伝型分析
＜１２−１＞ＺｉＰ  Ｃｏｄｅチップの製作
１）プローブ製作
ＡＳＰＥ  ＰＣＲ反応に使用するＺｉＰＣｏｄｅと相補的な塩基配列でデザインし、プローブは３’方向に１０ｂｐのヌクレオチド配列（５’−ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＧＴ−３’）をスペーサで挿入してターゲットと交雑反応がよく生じるように誘導した。
【０２７１】
また、前記スペーサの５’方向に２４ｂｐのＺｉＰ  Ｃｏｄｅオリゴ塩基が含まれており、前記プローブ（ｃＺｉＰ  Ｃｏｄｅ）の塩基配列は下記の表３７に記載された通りである。この時、下線部は１０個のスペーサ配列である（図４３）。
【０２７２】
【表３７】
0005687721.tif 000037
【０２７３】
２）スポッティング及びプローブ固定
チップ製作のための基板はアミンがコーティングされているコーニン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社のＧＡＰＳＩＩガラススライドを使用した。ＳＭＰ４ＸＢピンを使用してＯｍｎｉＧｇｉｄ１００スポッターでスポッティングし、スポッティング条件は温度−２２℃、湿度−５４％とし、２７種のプローブはそれぞれ２回反復でスポッティングした。スポッティング後、７，５００μＪ/ｃｍ2のＵＶを照査してガラススライドにプローブを固定させた。
【０２７４】
３）ＺｉＰ  Ｃｏｄｅテスト用遺伝型分析チップの構成
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の９個の遺伝型標識（ＳＮＰ；前記の表で下線にて表示）を用いて１１個の遺伝型（ＣＹＰ２Ｄ６*１、*２、*５、*１０Ｂ、*１４Ａ、*１４Ｂ、*１８、*２１、*４１、*４９、*２Ｎ）を検証した。
【０２７５】
【表３８】
0005687721.tif 000038
【０２７６】
＜１２−２＞ターゲット製作
１）ロング（Ｌｏｎｇ）ＰＣＲ
ＣＹＰ  ２Ｄ６ゲノムＤＮＡサンプル２μｌ、１Ｘ  ＬＡ緩衝液、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、下記の表１６の各０．２ｐｍｏｌ/μｌプライマー、ＬＡタクＤＮＡポリメラーゼ（ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ,ＴＡＫＡＲＡ：ｃａｔ. Ｎｏ. ＲＲ００２Ａ）２．５ユニット、３次蒸溜水を入れて５０μｌに合わせた後、９４℃で１分間１回変成させた後、９８℃１０秒、６４℃３０秒、７２℃６分間３０サイクル反応後、７２℃で１分間延長反応して増幅させた（図４４）。（ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は、*５、*２Ｎ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）、及びその他対立遺伝子用として各３種類の１STＰＣＲ産物を得た。各条件は前記と同一である。）
【０２７７】
【表３９】
0005687721.tif 000039
【０２７８】
前記で得られたロングＰＣＲ産物０．５μｌ、１Ｘ  ａｍｐｌｉｔａｑ緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、各プライマー０．５ｐｍｏｌ/μｌずつ及びＡｍｐｌｉ  ｔａｑ  ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ： ｃａｔ. Ｎｏ. Ｎ８０８０２４２）０．５ｕｎｉｔに３次蒸溜水を入れて１０μｌに合わせた後、４℃で５分間１回変成させた後、９４℃４５秒、５７℃４５秒、７２℃１分間３０サイクル反応後、７２℃で１分間延長反応して増幅させた。２ND  ＰＣＲは多重ＰＣＲで遂行し、下記の表４０の４個のセットで増幅させた。プライマー配列は表４１に記載した通りである。
【０２７９】
【表４０】
0005687721.tif 000040
【０２８０】
【表４１】
0005687721.tif 000041
【０２８１】
３）ＡＳＰＥ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）反応
前記で得られた多重ＰＣＲ産物の各６μｌ、１Ｘ  ａｍｐｌｉｔａｑ緩衝液、Ｃｙ５ｄＵＴＰ（ジーンケム）１０μＭ、各ＡＳＰＥプライマー１２５ｎＭ、  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ｃａｔ. Ｎｏ. Ｎ８０８０２４２）１ユニット、１Ｘ  Ｂａｎｄ  ｄｏｃｔｏｒ（ソルジェント）及び３次蒸溜水を入れて２０μｌに合わせた後、９４℃で５分間１回変成させた後、９４℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で１分間３０回のサイクルで反応して増幅させた（図４５参照）。ＡＳＰＥ反応セット及びプライマー配列は下記の表４２及び４３に記載した通りである。
【０２８２】
【表４２】
0005687721.tif 000042
【０２８３】
【表４３】
0005687721.tif 000043
【０２８４】
４）ＰＣＲ精製
ＡＳＰＥ反応で得られた１乃至４セットの産物をｐｏｏｌｉｎｇしてＱｉａｇｅｎ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ：ｃａ. ｎｏ. ２８１０６）を用いて製造会社のマニュアルにより精製し、最終溶出体積を５０μｌとした。
【０２８５】
精製された各産物を濃縮器（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，ＢｉｏＴｒｏｎ社ｍｏｄｕｌｅ ４０８０Ｃ）を用いて体積が１乃至２μｌ程度残るまで乾燥させた。
【０２８６】
５）チップ混成化
前混成化（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）緩衝液（２５％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡ）を４２℃で温めた後、チップを前記緩衝液に漬けて４２℃で３０分以上培養した。前記チップを蒸溜水で１分ずつ３回洗浄した後、チップをコニカル（ｃｏｎｉｃａｌ）チューブに入れて８００ｒｐｍで５分間遠心分離して乾燥させた。
【０２８７】
その後、混成化緩衝液（２５％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌポリＡ、２５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｔ−１ＤＮＡ、１０％デキストランスルフェート）を予め４２℃で温めた後、前記で得られた乾燥されたサンプルをここに溶かした。よく溶かしたサンプル０．５ｍｌをＰＣＲチューブに移した後、９５℃で５分間加熱した。混成化チャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）を準備してチャンバー空間に３Ｍペーパ切れを入れて３Ｘ  ＳＳＣを２０μｌ程度落とした。加熱されたサンプルを前混成化されたチップ上にローディングした後、チャンバーにチップを入れて組立てた後、４２℃で一晩混成化させた。
【０２８８】
前記チップを予め５０℃に温められた２Ｘ  ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ溶液で１０分間１回洗浄した後、０．１Ｘ  ＳＳＣ溶液にて１分ずつ常温で４回洗浄した。洗浄したチップを直ちにコニカルチューブに入れて８００ｒｐｍで５分間遠心分離して乾燥させた。
【０２８９】
６）分析
前記のように準備されたチップをＡｘｏｎのＧｅｎｅＰｉｘ  ４１００Ｂスキャナーを使用して出力波長は６５０ｎｍ付近でスキャニングし、スキャニングされたイメージはＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して蛍光信号の強さを分析し、その結果を図４６及び下記の表４４に示した。
【０２９０】
【表４４】
0005687721.tif 000044
【０２９１】
その結果、遺伝子分析チップを用いて分析したＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異は配列分析を通じて確認された結果と同一であった。
【０２９２】
＜ＰＸＲ＞
実施例１３：韓国人のＰＸＲ遺伝子の遺伝型分析
＜１３−１＞ＰＸＲ遺伝子の増幅
５４名の健康な被験者から血液を分離した後、Ｑｉａｇｅｎ社のゲノムＤＮＡ分離キットを使用してＤＮＡをそれぞれ分離した。ＰＸＲ遺伝子の全体塩基配列を自動塩基配列分析器（ＡＢＩ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３１３０ＸＬ）を用いて分析した結果、現在まで報告された総１８個の機能的変異の中で６個を確認した。ＰＸＲ遺伝子は９個のエクソンを含んで総遺伝子の長さが約３８ｋｂである。従って、ＰＸＲ遺伝子を機能的変異があるエクソンを中心に１０個の断片に分けてＰＣＲを遂行した。各ＰＣＲに使用したプライマーは下記の表４５の通りである。本明細書に記載された塩基配列でＡ、Ｔ、Ｇ及びＣはそれぞれアデニン、チミン、グアニン及びシトシンを意味する。
【０２９３】
【表４５】
0005687721.tif 000045
【０２９４】
各プライマーの位置とＰＣＲ産物の大きさは下記の表４６の通りである。また、ヌクレオチドの位置は文献[ＨＵＭＡＮ ＭＵＴＡＴＩＯＮ １１：１. ３ (１９９８)]の命名法により記載した。
【０２９５】
【表４６】
0005687721.tif 000046
【０２９６】
各ＰＣＲ断片に対する反応条件は下記の表４７の通りである。
【０２９７】
【表４７】
0005687721.tif 000047
【０２９８】
＜１３−２＞ＰＣＲ産物の塩基配列分析
前記実施例＜１３−１＞で得られた各ＰＣＲ産物の塩基配列を自動配列分析器及び配列番号：１３１乃至１５０のプライマーを用いて分析した。
【０２９９】
その後、野生型ＰＸＲ遺伝子の塩基配列（配列番号：１３０）と比較した結果、総２２個のＳＮＰを発見し、そのうち、６個は現在まで報告された機能的変異１８個の一部である。２２個のＳＮＰは下記の表４８に記載された通りであり、その中で報告された機能的変異は♯で表示した。
【０３００】
【表４８】
0005687721.tif 000048
【０３０１】
前記の表４８に示すように、ＰＸＲの変異遺伝子は７個がプロモーター地域で現れ、残りは３'ＵＴＲとイントロン地域で現れ、アミノ酸置換を見せる変異は現れなかった。
【０３０２】
実施例１４：ＰＸＲ機能的変異型のハプロタイプ分析
前記実施例１３で機能性が研究されたことがある６個のＰＸＲ遺伝子の機能的変異はその組み合わせによりＰＸＲの機能性に影響を与える可能性がある。
【０３０３】
従って、本発明者等は実施例１３で確認した変異によるハプロタイプをＤＹＮＡＣＯＭ社のＳＮＰＡｌｙｚｅプログラムを使用して分析した。その結果、下記の表４９に示したように１４種以上の１％以上の頻度を有するハプロタイプを確認することができた。
【０３０４】
【表４９】
0005687721.tif 000049
□：各ＳＮＰの変異型
【０３０５】
実施例１５：ｈｔＳＮＰの選別及び検証
ＰＸＲ遺伝子のＳＮＰの組み合わせであるハプロタイプがＰＸＲの活性に影響を与える可能性が多くのハプロタイプで報告されたことがある。このように作られたハプロタイプの詳細な情報は最小マーカで確認できる。これら最小マーカをｈｔＳＮＰといい、前記ｈｔＳＮＰはそれぞれのハプロタイプの正確な表示のために必要なマーカであり、種々の組み合わせを含む。この最適化された標識セットであるｈｔＳＮＰ組み合わせを選別するために、前記実施例１４で選別された１４個のハプロタイプの塩基配列をＳＮＰタガーソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｗｅｌｌ.ｏｘ.ａｃ.ｕｋ/〜ｘｉａｙｉ/ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を用いて分析した。
【０３０６】
その結果、図４７に示すようなｈｔＳＮＰ組み合わせを選別した。図４７に示されている、各選別されたｈｔＳＮＰ組み合わせは最適の標識セットのうちの一つとして、「１」は野生型を、「２」は変異型、そして「Ｖ」表示は選択されたそれぞれのｈｔＳＮＰを示す。ｈｔＳＮＰの選別は図１の組み合わせ以外にも他の組み合わせが可能である。
【０３０７】
その後、探し出した組み合わせの中でディプロタイプを考慮して互いに重ならずにディプロタイプ遺伝型を決定できるかをＭａｔｌａｂソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ７.１，Ｔｈｅ Ｍａｔｈ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，米国）を使用して分析し、これを用いてチェックした後に組み合わせを決定した。
【０３０８】
検証の結果、互いに重ならずにディプロタイプ遺伝型を決定できることを確認した。これは本発明で選択したｈｔＳＮＰ組み合わせが互いに同一なものがなく、遺伝型を決定することに当たって不正確な分析が全くないことを示す。
【０３０９】
実施例１６：高速のＰＸＲ遺伝子の機能的変異検索
前記実施例１３で確認された韓国人で発見されたＰＸＲ遺伝子の６個の機能的変異の中で、ＰＸＲ機能に影響を与える機能的変異を高速に検索するためにスナップショット分析を実施した。被験者のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを遂行し、増幅された産物をスナップショット分析した。ＰＣＲに使用したプライマーは下記の表５０の通りである。
【０３１０】
【表５０】
0005687721.tif 000050
【０３１１】
ＰＣＲ産物に対する反応条件は下記の表５１の通りである。
【０３１２】
【表５１】
0005687721.tif 000051
【０３１３】
前記のように増幅された４種類のＰＣＲ産物を同量で混合した後、混合されたＰＣＲ産物の反応していないプライマーとｄＮＴＰなどは残っていればスナップショット過程に影響を与えるので、これらを除去するために、混合されたＰＣＲ産物５μｌ当たりＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）２μｌを入れて３７℃で３０分間反応させた後、８０℃で１５分間反応させて残っている酵素を非活性化させた。酵素処理された産物は下記の表５２に示すプライマーを用いてマルチプレックススナップショット（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＳＮａＰｓｈｏｔ）反応物を作ってＰＣＲ反応した。マルチプレックススナップショット反応物及びＰＣＲ反応条件をそれぞれ表５３及び表５４に示した。
【０３１４】
【表５２】
0005687721.tif 000052
【０３１５】
【表５３】
0005687721.tif 000053
【０３１６】
【表５４】
0005687721.tif 000054
【０３１７】
反応が終わった後に[Ｆ]ｄｄＮＴＰを除去するためにスナップショット産物１０μｌにＳＡＰ（ＵＳＢ社）１μｌを入れて３７℃で６０分、６５℃で１５分間反応させた。反応が全て終わると、反応物０．５μｌ、Ｈｉ−Ｄｉホルムアミド（ＡＢＩ社）９．３μｌ及びジーンスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ）−ＬＩＺサイズ標準物質（ＡＢＩ社）０．２μｌを混合して９５℃で５分間変成させた。その後、３１３０ＸＬ遺伝子分析器（３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ,  ＡＢＩ社）で分析した。その結果を図４８乃至図５０に示した。
【０３１８】
図４８乃至５０に示されるように、ＰＸＲ遺伝子の機能的変異型によりピークの色と位置が異なるように表示され、野生型、異型の対立形質を有する変異型（異型）、同型の対立形質を有する変異型（同型）を容易に識別できることを確認した。従って、本発明による分析方法を通じて時間及び費用の面で効率的かつ容易にＰＸＲ遺伝子の機能的変異型を分析できることが分かる。
【０３１９】
＜ＵＧＴ１Ａ＞
実施例１７：韓国人由来のＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の変異遺伝子選別
工程１）遺伝体ＤＮＡの分離
５０名の韓国人を対象として血液をそれぞれ採取した後、遺伝体ＤＮＡ分離キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて採取された各血液試料から遺伝体ＤＮＡを分離した。
工程２）ＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の増幅及び全長塩基配列分析
【０３２０】
前記工程１で分離された総５０個の遺伝体ＤＮＡ試料をそれぞれ鋳型として使用し、下記の表５５に記載された各プライマー対を使用してＰＣＲを遂行することによって、各ヒトＵＧＴ１Ａ族遺伝子を増幅した。この時、増幅されたＵＧＴ１Ａ族の遺伝子名、位置、使用されたプライマー名、その配列番号、大きさ、及びＰＣＲ反応条件は下記の表５５にそれぞれ示す通りである。
【０３２１】
【表５５】
0005687721.tif 000055
【０３２２】
工程３）各ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の変異型分析
前記工程２で増幅させた各ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の全長配列を対象として公知の３１００遺伝子分析器（３１３０ｘ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列を分析し、その結果をそれぞれ野生型ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.：ＮＴ_００５１２０）と比較した。結果を下記の表５６及び５７に示した。
【０３２３】
【表５６】
0005687721.tif 000056
【０３２４】
【表５７】
0005687721.tif 000057
【０３２５】
工程１７−１）ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の機能的変異型選別
前記工程３で得られた韓国人５０名で発見されたＵＧＴ１Ａ族遺伝子の多型性に基づき、酵素活性の増加または減少のように機能的に関連したと報告された変異型を選別して下記の表５８に示した。この時、ＵＧＴ１Ａ９でのＧ７６６Ａ変異型は工程３では確認されなかったが、日本人で報告された機能的変異型であるので下記の表５８に追加した。「ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ」は蛋白質が翻訳過程中間に突然変異により非正常的に翻訳終結されることを意味する。
【０３２６】
【表５８】
0005687721.tif 000058
【０３２７】
工程１７−２）ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の薬物感受性関連多型性選別
前記工程３で得られた韓国人５０名で発見されたＵＧＴ１Ａ族遺伝子の多型性に基づき、大腸癌治療用抗癌剤であるイリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）の代謝に関与すると知られたＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ６及びＵＧＴ１Ａ９の多型性を選別して下記の表５９に示した。この時、ＵＧＴ１Ａ９でのＧ７６６Ａ変異型は工程３では確認されなかったが、日本人で報告された機能的変異型であるので下記の表５９に追加した。
【０３２８】
【表５９】
0005687721.tif 000059
【０３２９】
実施例１８：ＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型及び薬物感受性関連多型性分析
１８−１）ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の機能的変異型分析
前記実施例１７の被験者の中で各ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の野生型、異型の対立形質を有する変異型、同型の対立形質を有する変異型を有するヒトからの血液を対象として、次の通り本発明によるヒトＵＧＴ１Ａ族遺伝子の機能的変異型を確認した。
【０３３０】
前記実施例１７の工程１及び２と同様な方法によりＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７及びＵＧＴ１Ａ９族遺伝子の配列をそれぞれ増幅した。その後、得られた各ＵＧＴ１Ａ族遺伝子のＰＣＲ産物５μｌ当りエクソＳＡＰ−ＩＴ（ＥｘｏＳＡＰ-ＩＴTM，ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２μｌずつを加えた後、３７℃で３０分間反応させて残余プライマーなどを除去した。得られた反応物を８０℃で１５分間反応させて残っているエクソＳＡＰ−ＩＴを非活性化させた後、これを２μｌずつ取ってスナップショットマルチプレックスレディーリアクションミックス（ＳＮａＰｓｈｏｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ,  ＡＢＩ）１μｌ、ハーフターム溶液（Ｈａｌｆ ｔｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ、組成： ２００ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，５ ｍＭ ＭｇＣｌ2，ｐＨ ９）４μｌ及び下記の表６０に提示された各スナップショットプライマーと混合してスナップショット反応溶液を得た。この時、全体反応溶液の量は１０μｌになるようにした。
【０３３１】
【表６０】
0005687721.tif 000060
【０３３２】
前記各反応溶液を[９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で３０秒]の４０サイクル反復条件下でＰＣＲ反応させ、反応が終わった反応溶液１０μｌにＳＡＰ（ｓｈｒｉｍｐ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＵＳＢ社）１μｌずつを加えて３７℃で１時間、６５℃で１５分間反応させた。これをそれぞれ０．５μｌずつ取った後、ＬＩＺ１２０（ＡＢＩ）０．２μｌとＨｉ−Ｄｉホルムアミド（ＡＢＩ）９．３μｌと混合して９６ウェルプレートに分注した。分注された反応試料を９５℃で２分間反応させた後、３１３０ｘ遺伝子分析器（３１３０ｘ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析し、その結果を図５１乃至５４に示した。
【０３３３】
図５１乃至５４に示されるように、各ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の機能的変異型によりピークの色と位置が異なるように表示され、野生型、異型の対立形質を有する変異型（異型）、同型の対立形質を有する変異型（同型）を容易に識別できることを確認し、得られたピークの大きさと種類が前記実施例１７において配列分析で得られた表５５の結果と１００％一致することを確認した。従って、本発明による分析方法を通じて時間及び費用の面で効率的かつ容易にＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型を分析できることが分かる。
【０３３４】
また、ＵＧＴ１Ａ１族遺伝子の−３９ｉｎｓＴＡ遺伝型は単一塩基変異に該当せず、 前記のようなスナップショット分析が不可能であるので、次のようなＰＣＲ−パイロシーケンシング法を遂行して変異型を確認した。この時、分析に使用したプライマーの配列を下記の表６１に示した。この時、プライマーＵＧＴ１Ａ１*２８Ｆの場合、５’末端にビオチンが付着していた（配列番号：２０２参照）。パイロシーケンシングに使用されたプライマーは文献［Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．，Ｊｕｌ；４９(７)：１１８２-５,２００３］を参考にした。
【０３３５】
具体的には、配列番号２０２と２０３を用いて収得したＰＣＲ産物を鋳型として配列番号２０４の塩基配列分析用プライマーを反応させた後、パイロシーケンサー（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ社）を用いて変異有無を確認した。
【０３３６】
収得したＰＣＲ産物にバインディングバッファー３７μｌ（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ ７.６、組成：１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣＩ、２ Ｍ ＮａＣＩ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１% Ｔｗｅｅｎ２０）にセファロースビーズ （Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）３μｌを入れて混合した後、９６ウェルプレートに分注して常温で１，４０００ｒｐｍで５分間反応させた。そして、下記の配列番号２０４のプライマー（１００ｐｍｏｌ）０．３μｌ当たり１００μｌアニーリングバッファー（１Ｘ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ ７.６、組成：２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ａｃｅｔａｔｅ、２ ｍＭ ＭｇＡｃ2）を９６ウェルプレートに分注した。反応させたサンプルを真空プレップツール（ｖａｃｕｕｍ Ｐｒｅｐ Ｔｏｏｌ）を用いて試料を準備し、９０℃で３分間加熱した後、常温で冷却した。冷却プレートに Ｐｙｒｏ  Ｇｏｌｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ(Ｂｉｏｔａｇｅ)で提供されている酵素混合物（ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）、気質混合物（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを入れた後、パイロシーケンサーを用いて変異有無を確認した。
【０３３７】
【表６１】
0005687721.tif 000061
【０３３８】
１８−２）ＵＧＴ１Ａ族遺伝子の機能的変異型分析
前記の表６０に提示されたプライマーの代わりに、下記の表６２に提示されたプライマーを同時に使用したことを除いて、前記１８−１でのスナップショット分析と同一な工程を遂行してイリノテカン感受性と関連したＵＧＴ１Ａ族多型性を分析し、その結果を図５５に示した。この時、表６２に提示されたプライマーを５'末端に互いに異なる長さのＴ反復配列を付けてそれぞれの長さを異なるようにした。
【０３３９】
【表６２】
0005687721.tif 000062
【０３４０】
その結果、図５５に示したように、ＵＧＴ１Ａ族のイリノテカン感受性関連の色々な多型性を同時に容易に識別できることを確認し、得られたピークの大きさと種類が前記実施例１７で配列分析により得られた表５５の結果と１００％一致することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０３４１】
前記で考察した通り、本発明によるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＰＸＲ及びＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型または薬物感受性関連多型性を分析する方法は、今まで確認されたことのない韓国人のＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＰＸＲ及びＵＧＴ１Ａ族遺伝子の多型性に基づいて得られた最適の探索セットを用いて時間及び費用の面で効率的にＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＰＸＲ及びＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の機能的変異型またはＵＧＴ１Ａ族遺伝子群の薬物感受性関連多型性を容易に確認できる方法であるため、韓国人だけではなく、韓国人と遺伝的特性が類似する日本、中国などのアジア圏人種のＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＰＸＲ及びＵＧＴ１Ａ族遺伝子の遺伝型分析にも有用に活用され得る。
【図１】
0005687721.tif 000063
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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