(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖及び軽鎖を含み、ここで、該重鎖が配列番号２で示されるＨＣＨＶＲ１、配列番号４で示されるＨＣＨＶＲ２及び配列番号６で示されるＨＣＨＶＲ３の抗原結合領域を含み、該軽鎖が配列番号１０で示されるＬＣＨＶＲ１、配列番号１２で示されるＬＣＨＶＲ２及び配列番号１４で示されるＬＣＨＶＲ３の抗原結合領域を含む、抗ヘッジホッグ抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗ヘッジホッグ抗体に接触させ、結合強度を測定することにより、組織中のヘッジホッグの発現を検出することを含む、組織中のヘッジホッグ発現の検出方法。
【請求項３】
組織が腫瘍又は癌である、請求項２の方法。
【請求項４】
組織が測定の前に宿主から除かれたものである、請求項３の方法。
【請求項５】
抗ヘッジホッグ抗体に接触させる前の組織サンプルがＦＦＰＥである、請求項４の方法。
【請求項６】
検出方法が、ＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の抗ヘッジホッグ抗体に接触させ、結合強度を測定することにより、組織中のヘッジホッグの発現を検出する手段を含む、組織中のヘッジホッグ発現の検出キット。
【請求項８】
腫瘍又は腫瘍の周辺組織に、請求項１に記載の抗ヘッジホッグ抗体を接触させること、及びヘッジホッグが正常組織に比べ、前記組織内で過剰に発現しているかどうかを決定することを含む、ヘッジホッグアンタゴニストに応答する腫瘍を同定するための方法。
【請求項９】
腫瘍又は組織が、決定の前に宿主から取り除かれたものである、請求項８の方法。
【請求項１０】
抗ヘッジホッグ抗体に接触させる前の組織サンプルがＦＦＰＥである、請求項９の方法。
【請求項１１】
決定方法が、ＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される、請求項８の方法。
【請求項１２】
抗体が、９５．９である、請求項８の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗ヘッジホッグ抗体を含む、ヘッジホッグアンタゴニストに応答する腫瘍を同定するためのキット。
【請求項１４】
（ａ）患者から切除した腫瘍及び／又は腫瘍の周辺組織に、請求項１に記載の抗ヘッジホッグ抗体を接触させ、
（ｂ）ヘッジホッグの発現の存在を検出し、
（ｃ）ヘッジホッグの発現を、正常又は腫瘍に関連しない同じ型又は由来の組織の発現と比較し、ここで、ヘッジホッグの過剰発現は、ヘッジホッグアンタゴニスト応答癌細胞の存在を示唆する、
ヘッジホッグアンタゴニスト応答癌細胞を検出する方法。
【請求項１５】
組織が、検出の前に患者から取り除かれたものである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
抗ヘッジホッグ抗体に接触させる前の組織サンプルがＦＦＰＥである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
検出方法が、ＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される、請求項１４の方法。
【請求項１８】
抗ヘッジホッグ抗体が、９５．９である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の抗ヘッジホッグ抗体、及び組織中でヘッジホッグが過剰発現しているかどうかを決定するための指示書を含む、ヘッジホッグ発現を測定するための製造品。
【請求項２０】
組織が腫瘍又は癌である、請求項１９の製造品。
【請求項２１】
決定の前に宿主から組織を取り除く、請求項１９の製造品。
【請求項２２】
抗ヘッジホッグ抗体に接触させる前の組織サンプルがＦＦＰＥである、請求項２１の製造品。
【請求項２３】
決定方法が、ＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される、請求項１９の製造品。
【請求項２４】
抗ヘッジホッグ抗体が、９５．９である、請求項２３の製造品。
【請求項２５】
組織を請求項１に記載の抗ヘッジホッグ抗体と接触させること、及び組織がヘッジホッグシグナルを過剰発現しているかどうかを決定するために結合の強度を測定することを含む、癌を発生するリスクについて異常な組織増殖を有する患者をスクリーニングするためにデータを収集する方法。
【請求項２６】
組織が腫瘍又は癌である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
組織が、決定の前に患者から取り除かれたものである、請求項２５の方法。
【請求項２８】
抗ヘッジホッグ抗体に接触させる前の組織サンプルがＦＦＰＥである、請求項２７の方法。
【請求項２９】
決定方法が、ＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項３０】
抗ヘッジホッグ抗体が、９５．９である、請求項２９の方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の抗ヘッジホッグ抗体を含む、癌を発生するリスクについて異常な組織増殖を有する患者をスクリーニングするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は開示の全体が出典明示によりここに援用される２００７年１２月２８日出願の米国仮出願第６０／０１７２３２号及び２００８年９月２４日出願の米国仮出願第６１／０９９８６４号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に、癌の診断及び腫瘍におけるタンパク質発現の検知の方法に関する。より具体的には、本発明は、ほ乳類のヘッジホッグに結合する抗体、及びその診断における使用と、癌を含むヘッジホッグ発現によって特徴付けられる症状の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
シグナル伝達分子であるヘッジホッグファミリーメンバーは、無脊椎動物及び脊椎動物の胚、胎児及び成体の発生において、多くの重要な短期的及び長期的なパターン形成過程を媒介する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒでは、単一のヘッジホッグ遺伝子が、分節性成虫原基のパターン形成を制御する。対照的に脊椎動物では、ヘッジホッグ遺伝子ファミリー（例えば、哺乳類における、Ｓｈｈ、Ｄｈｈ、Ｉｈｈ、集約的に「Ｈｈ」）が、３種類全ての胚葉から生じる、例えば左右非対称性、ＣＮＳの発生、大節及び肢のパターン形成、軟骨形成、骨格形成及び精子成形を含む細胞及び組織の増殖、分化、移動及び生存の制御に関与している。
【０００４】
ヘッジホッグシグナル伝達は、ヘッジホッグタンパク質と、ヘッジホッグ受容体であるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）及び補助受容体のＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）との相互作用により生じる。Ｐｔｃｈには、２種類の哺乳動物ホモログ、Ｐｔｃｈ−ｌ及びＰｔｃｈ−２（集約的に「Ｐｔｃｈ」）が存在し、これらはいずれも、ステロール感受性ドメインを含む１２回膜貫通型タンパク質である（Motoyama等,ature Genetics l8:104-106(1998),Carpenter等,P.N.A.S.(U.S.A.)95(23):13630-40(1998)）。ＨｈとＰｔｃｈとの相互作用により、シグナルカスケードが誘発され、結果的にＧｌｉファミリーのジンクフィンガー転写因子による転写制御が起こる。
【０００５】
悪性腫瘍（癌）は、米国において、心疾患に次ぐ第２の主要死因である（Ｂｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ．４３：７（１９９３））。癌は、以下の１つ以上の特徴から特徴付けられる：（１）増殖して腫瘤を生成する正常組織から生じる異常細胞、即ち新生物細胞の数の増加、（２）これら新生物の腫瘍細胞による隣接組織の浸潤、（３）最終的に血液又はリンパ系を通して局所リンパ節に広がり、また転移と称されるプロセスにより遠隔部位に広がる悪性細胞の発生。癌状態では、細胞は、正常細胞が成長しない条件下で増殖する。癌は様々な形態で表れ、種々の程度の感染度と病原力により特徴付けられる。
【０００６】
多くの場合、発生において活性であり、成人において殆ど非活性の経路、ヘッジホッグシグナルの再活性化が、幅広い種類の癌及び発がんに関わる。癌におけるＨｈシグナルの最初の例は、患者が頻繁に基底細胞癌に罹患し、また髄芽細胞腫及び横紋筋肉腫を生じやすく、Ｐｔｃｈにおける非活性化変異、結果としてＨｈ経路の活性化が原因である、Ｇｏｒｌｉｎ症候群の発見において見出された（Hahn等1998 Cell 85 p841; Johnson等1996, Science 272 p1668）。Ｐｔｃｈにおける二次的な非活性化変異（約９０％）及び／又はＳｍｏにおける活性化変異（約１０％）が散発性基底細胞癌（Xie等1998, Nature 391 p90）の原因として見出された。
【０００７】
近年、異なる種類のＨｈ関連癌が存在し、それは、経路活性化の変異活性化というよりは、むしろＨｈリガンドの分泌に依存していることが明らかとなった。このような癌は、前立腺、膵臓及び小細胞肺癌を含む（Watkins等2003, Nature 422 p313; Thayer等2003 Nature 425 p851; Berman et al 2003 Nature 425 p846）。このような癌の集団は、Ｓｍｏ又は抗Ｈｈ抗体５Ｅ１の小分子アンタゴニストのようなＨｈアンタゴニストによって治療することができる（Chen等2002,PNAS 99 p14071; Williams等2003 PNAS 100 p4616; Rubin及びSauvage 2006 Nature Reviews Drug Discovery 5 p1026）。全てのＨｈ発現腫瘍がこのようなアンタゴニストに応答するのではないが、Ｈｈを発現しないこれらは、応答しない；実際、Ｈｈ陰性のＤＬＤ−１結腸異種移植モデルは、Ｈｈ−陽性ＬＳ１８０、ＨＴ２９及びＨＴ５５腫瘍モデルが（Yauch/de Sauvage等 Jan 2008）である条件下、このような治療によって阻害されない。結果として、全体の応答速度を最大化するために、ヘッジホッグ分泌腫瘍を同定するために、ヘッジホッグアンタゴニストを適用する以前のヘッジホッグ発現を決定する効果的な技術が必要とされている。
【０００８】
現在利用可能な、哺乳類のヘッジホッグに結合する抗体（例えば、Ｈ１６０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）は、バックグラウンド染色の非存在下で十分な感度を示さないので、ヘッジホッグシグナルの存在を検出するための効果的ではない試薬である。これは、特にＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包理）組織標本について当てはまる。
【０００９】
結果として、特区にＦＦＰＥ組織標本において、診断アッセイ及び治療計画の両者においてヘッジホッグの発現を検出するための使用のために、哺乳類のヘッジホッグ（例えば、ソニックヘッジホッグ、インディアンソニックヘッジホッグ及びデザートヘッジホッグ）に結合する抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、抗ヘッジホッグ抗体、及びヘッジホッグ発現の検出及びヘッジホッグ応答癌を含む治療におけるそれらの使用を提供する。
【００１１】
一実施態様では、本発明は重鎖及び軽鎖、ここで重鎖は、ＨＣＦＲ１−ＨＣＨＶＲ１−ＨＣＦＲ２−ＨＣＨＶＲ２−ＨＣＦＲ３−ＨＣＨＶＲ３−ＨＣＦＲ４−ＣＲを、軽鎖は、ＬＣＦＲ１−ＬＣＣＤＲ１−ＬＣＦＲ２−ＬＣＣＤＲ２−ＬＣＦＲ３−ＬＣＣＤＲ３−ＬＣＦＲ４を含む、抗ヘッジホッグ抗体に関する。特定の態様では、抗Ｈｈ抗体は、９５．９の重鎖及び軽鎖配列を含む。
【００１２】
別の実施態様では、本発明は、組織を抗ヘッジホッグ抗体に接触させ、結合強度を測定することを含み、ここで、抗ヘッジホッグ抗体が、アミノ酸残基７０から９６の領域中のエピトープにおけるヘッジホッグに結合する、組織中のヘッジホッグ発現の検出方法に関する。特定の態様では、組織は腫瘍又は癌である。更に別の態様では、組織は測定の前に宿主から除かれる。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体に接触する前の組織サンプルがＦＦＰＥである。更に特定の実施態様では、測定方法がＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される。特定の実施態様では、結合強度は、抗Ｈ１６０抗体のものより大きい。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体は、ｐｔｃｈのＳｈｈへの結合に競合しない。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈは、９５．３、９５．７及び９５．９からなる群から選択される。
【００１３】
更に別の実施態様では、本発明は、抗ヘッジホッグ抗体がアミノ酸残基の７０から９６の領域中のエピトープにおけるヘッジホッグポリペプチドに結合する、腫瘍組織又は腫瘍の周辺組織に、抗ヘッジホッグ抗体を接触させること、及びヘッジホッグが正常組織に比べ、前記組織内で過剰に発現しているかどうかを決定することを含み、ヘッジホッグアンタゴニストに応答する腫瘍を同定するための方法に関する。特定の実施態様では、組織は測定の前に宿主から除かれる。特定の態様では、組織は測定の前に宿主から除かれる。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体に接触する前の組織サンプルがＦＦＰＥである。更に特定の実施態様では、測定方法がＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される。特定の実施態様では、結合強度は、抗Ｈ１６０抗体のものより大きい。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体は、ｐｔｃｈのＳｈｈへの結合に競合しない。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈは、９５．３、９５．７及び９５．９からなる群から選択される。
【００１４】
更なる実施態様では、本発明は、
（ａ）患者から切除した腫瘍組織及び／又は腫瘍の周辺組織に、抗ヘッジホッグ抗体を接触させることを含み、ここで、前記抗ヘッジホッグ抗体が、アミノ酸残基の７０から９６の領域中のエピトープにおけるヘッジホッグポリペプチドに結合し、
（ｂ）ヘッジホッグの発現の存在を検知し、
（ｃ）ヘッジホッグの発現を、正常又は腫瘍に関連しない同じ型又は由来の組織の発現と比較し、ヘッジホッグが過剰に発現している場合は、
（ｄ）患者をヘッジホッグアンタゴニストで治療すること
を含む患者の癌の治療計画に関する。
【００１５】
特定の態様では、組織は測定の前に宿主から除かれる。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体に接触する前の組織サンプルがＦＦＰＥである。更に特定の実施態様では、測定方法がＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される。特定の実施態様では、結合強度は、抗Ｈ１６０抗体のものより大きい。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体は、ｐｔｃｈのＳｈｈへの結合に競合しない。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈは、９５．３、９５．７及び９５．９からなる群から選択される。
【００１６】
更なる実施態様では、本発明は、抗ヘッジホッグ抗体がアミノ酸残基の７０から９６の領域中のエピトープにおけるヘッジホッグポリペプチドに結合する抗ヘッジホッグ抗体、並びにそのような組織をそのような抗ヘッジホッグ抗体と接触させること、及び結合の強度を測定することを含む、組織中でヘッジホッグが過剰発現しているかどうかを決定するための指示書を含む、ヘッジホッグ発現を測定するための製造品（キット）に関する。特定の態様では、組織は腫瘍又は癌である。更に別の態様では、組織は測定の前に宿主から除かれる。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体に接触する前の組織サンプルがＦＦＰＥである。更に特定の実施態様では、測定方法がＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される。特定の実施態様では、結合強度は、抗Ｈ１６０抗体のものより大きい。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体は、ｐｔｃｈのＳｈｈへの結合に競合しない。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈは、９５．３、９５．７及び９５．９からなる群から選択される。
【００１７】
更なる実施態様では、本発明は、組織を抗ヘッジホッグ抗体と接触させること、及び結合の強度を測定することを含み、組織がヘッジホッグ抗体に結合して、ヘッジホッグシグナルを過剰発現しているかどうかを決定することを含み、ここで、抗ヘッジホッグ抗体は、アミノ酸残基の７０から９６の領域中のエピトープにおけるヘッジホッグポリペプチドに結合する、癌を発生するリスクのある患者の異常組織の成長をスクリーニングする方法に関する。特定の態様では、組織は腫瘍又は癌である。更に別の態様では、組織は測定の前に宿主から除かれる。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体に接触する前の組織サンプルがＦＦＰＥである。特定の実施態様では、結合強度は、抗Ｈ１６０抗体のものより大きい。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体は、ｐｔｃｈのＳｈｈへの結合に競合しない。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈは、９５．３、９５．７及び９５．９からなる群から選択される。更に特定の実施態様では、測定方法がＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される。
【００１８】
更なる実施態様では、本発明は、（ａ）癌の存在が疑われる組織又はそのような癌の周辺組織に、抗ヘッジホッグ抗体を接触させ、ここで、前記抗ヘッジホッグ抗体が、アミノ酸残基の７０から９６の領域中のエピトープにおけるヘッジホッグポリペプチドに結合し、（ｂ）ヘッジホッグが過剰発現していることを決定し、（ｃ）ヘッジホッグアンタゴニストで処理することを含む、癌を治療する方法に関する。更に別の態様では、組織は測定の前に宿主から除かれる。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体に接触する前の組織サンプルがＦＦＰＥである。更に特定の実施態様では、測定方法がＩＨＣ及びウェスタンブロットからなる群から選択される。特定の実施態様では、結合強度は、抗Ｈ１６０抗体のものより大きい。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈ抗体は、ｐｔｃｈのＳｈｈへの結合に競合しない。更に特定の実施態様では、抗Ｈｈは、９５．３、９５．７及び９５．９からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図１ＡからＦは免疫蛍光（ＩＦ）による、Ｓｈｈで形質転換したＣＯＳを特異的に認識する、親のポリクローナル抗Ｓｈｈ抗体（「５９ｐＡｂ」）及びその誘導体である、モノクローナルｒＭａｂの結合を示す、ミクログラフを示す。安定に形質転換したヒトＳｈｈの存在下又は非存在下のＣｏｓ−７を固定化し、透過し、ウサギ抗体で染色し、Ｃｙ−３をコンジュゲート化した抗ヒトで検知し、蛍光顕微鏡で調べた。Ｓｈｈ−ＣＯＳ（Ａ）又は形質転換していない（Ｂ）細胞における５９Ａ＋Ｂポリクローナル；Ｃ）Ｓｈｈ−ＣＯＳ細胞におけるＨ−１６０；Ｄ）Ｓｈｈ−ＣＯＳにおける無関係ｒｍＡｂ；Ｓｈｈ−ＣＯＳにおける精製９５．９ｒＭａｂ（Ｅ）及び形質転換していない（Ｆ）細胞。スケールバーは３０μｍである。
【００２０】
図２ＡからＦは、ポリクローナル抗Ｓｈｈ抗体（「５９ｐＡｂ」）及びその誘導体であるｒＭａｂが、Ｓｈｈで形質転換した２９３細胞を特異的に認識することをＩＨＣによって示す。形質転換していない（Ｂ、Ｆ）又はヒトＳｈｈで一時的に形質転換した（Ａ、Ｃ、Ｅ）２９３細胞ペレットのＦＦＰＥ切片を、ＴＡＲＧＥＴｒｅｔｒｉｅｖａｌで処理し、示したウサギ抗体、次いでＨＲＰ抗ウサギ抗体で処理し、ＡＢＣペルオキシダーゼＥｌｉｔｅで検出した。Ａ）Ｓｈｈ−２９３細胞におけるイレレバントウサギ抗体（Ｒ＆Ｄシステム）；Ｂ）Ｓｈｈ−２９３細胞におけるＨ−１６０（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）（Ｃ）又は形質転換していない（Ｄ）Ｓｈｈ２９３における精製９５．９ｒＭａｂ（Ｅ）及び形質転換していない（Ｆ）細胞。サンプルＡ、Ｂ及びＤは、ＴＳＡ−ＨＲＰ増幅にかけ、結果して、幾らかバックグラウンドを染色し、したがってこの工程は残りのサンプルから省略される。スケールバーは５０μｍである。
【００２１】
図３：パネルＡ、ＡからＬはモノクローナル抗体９５．９、９５．７及び９５．３はまたＩｈｈ及びＤｈｈと交差反応をすることを示すミクログラフである。全長ヒトＳｈｈ（上段）、Ｉｈｈ（中段）及びＤｈｈ（下段）で形質転換したＣＯＳ細胞は、アフィニティー精製した９５．３（１−３）、９５．７（４−６）、９５．９（７−９）又はＨ−１６０（１０−１２）を用いて、図１の通り免疫蛍光処理した。スケールバーは３０μｍである。パネルＢ、形質転換していない（ＷＴ）又はＤｈｈ、Ｉｈｈ又はＳｈｈ全長タンパク質で指示したとおり形質転換し、５ｍｇ／ｍｌの精製９５．９ｒＭａｂ（パネルの上部）又はＨ−１６０（パネルの下段）で免疫染色した、２９３細胞のウェスタンブロットである。９５．９は、形質転換していない細胞で染色されるＨ−１６０である、約９８ｋＤａのバックグラウンドバンドを認識しないが、両方の抗体は、分泌されたＨｈ−Ｎ末端（約２２ｋＤａ）だけでなく、３つの全長（ＦＬ）Ｈｈタンパク質（約５０ｋＤａ）を認識する。ｋＤａで目印を付けた分子量を左に示す。
【００２２】
図４ＡからＢは、９５．９、９５．７及び９５．３のＮ末端の配列を示す。これは、同じサブクローンである可能性があることを示す。A)９５のサブクローンと同一であると仮定される３個のサブクローンの軽鎖のＮ末端配列は、配列に揺らぎがある位置と実質的に同一である。括弧内のアミノ酸残基は、曖昧なアミノ酸を示し、ダッシュは、決定できないアミノ酸の位置を示し、斜体は、得られたＮ末端配列とＤＮＡシーククエンシング及びコンセプト翻訳（２列目）によって決定される９５．９の実際にクローニングされた配列の差異を示す。アミノ酸位置番号（１において開始する欠失シグナル配列と共に番号付けられる）は、表の最上段において示される。Ｂ）９５サブクローン重鎖のＮ末端の配列は、内因性メラノーマ細胞重鎖の存在によって複雑化し、よって２（部分的に混合した）個の配列がそれぞれのサブクローンについて示される。位置２０のグルタミンの存在が予想される。
【００２３】
図５は、９５．９エピトープが、ヒトソニックヘッジホッグ（配列番号：１６）のアミノ酸７６から９０に位置することを示す。アガロースビーズに結合させた９５．９を、組み換えＳｈｈと共にインキュベートし、次いでトリプシン消化にかけた。ペプチドは、９５．９の結合によって、トリプシンから保護され、溶離され、質量分析計で同定され、Ｉｈｈ（配列番号：１７）と同一のＳｈｈ領域である、アミノ酸７６から９０のアミノ酸配列によって確認され、Ｄｈｈ（配列番号：１８）（１として指定されるシグナル配列（示されていない）の最初のアミノ酸残基と共に番号付けられる、３個のＨｈのＮ末端リガンドのアラインメントにおける四角で囲った領域）と異なる３個のアミノ酸残基を含む。
【００２４】
図６ＡからＦは、ＩＨＣ染色を介した、９５．９がマウス胚ミクログラフを示す。Ａ）９５．９は、Ｅ１０．５マウス胚の横断面の神経管腹側底盤（ＦＰ）及び脊索（ＮＣ）におけるＨｈを同様の条件下でＨ−１６０より強く染める（Ｂ）。Ｃ）９５．９によって染色される神経管腹側底盤（ＦＰ）及び脊索（ＮＣ）のＥ１１．５矢状断面。Ｄ）神経管(矢印)に沿った神経管腹側からのＨｈの可能性のある拡散グラジエントを示すＥ１１．５胚を示す。Ｅ）９５．９は、下の拡大に示すＥ１１．５マウスの脳の発生の神経上皮細胞を染める。ＴＶ、終脳胞；第４脳質。Ｆ）中腸の発生を通じた、Ｅ１１．５矢状断面であり、ルーメン（矢印）を囲む上皮細胞における期待される発現及び間充組織におけるシグナルの欠如を示す。
【００２５】
図７ＡからＥは、抗ＨｈＡｂ９５．９によるＩＨＣ染色がＳｈｈの翻訳レベルとよく一致することを示す。３６個のヒト結腸癌細胞株をＳｈｈのｍＲＮＡのＱ−ＰＣＲ分析及び精製９５．９抗ＨｈｒＭａｂを用いたＩＨＣ分析（ＦＦＰＥ）に平行してかけた。上部のパネルは、以下の４個のＩＨＣスコアリングカテゴリー：Ａ）幾つかの非特異的な核染色は、認められないが、Ｈｈネガティブ細胞株、ＩＨＣスコア０＋、Ｂ）ＩＨＣスコア１＋（弱い染色）、Ｃ）２＋ＩＨＣスコア（穏やかな染色）を示す細胞、Ｄ）強い染色（３＋ＩＨＣスコア）を示す細胞、に入る代表的な細胞ペレットの像を示す。スケールバーは５０μｍである。図６Ｅは、それぞれのスコアグループにおける相対的なＳｈｈのｍＲＮＡのレベル（Ｑ−ＰＣＲ分析からのデルタＣｔ値）を示し、より低いＣｔ値を有する（より高いｍＲＮＡレベル）より強い９５．９染色に対する傾向を示す。この相関のスピアマンの係数は、−０．１６０であり、統計的に有意である（ｐ＝０．０００１）。
【００２６】
図８ＡからＤは、９５．９がＳｈｈ−ではなく、Ｓｈｈ＋の卵巣癌標本を染めることを示す。ヒト卵巣癌標本のＳｈｈに対するアンチセンスプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーションは、腫瘍上皮Ａ）及び他のＢ）におけるＳｈｈのｍＲＮＡ（黒点）を発現する、１個の標本は、バックグラウンドのセンスプローブよりも大きなシグナルを示さない（示さず）。同じ腫瘍の９５．９染色は、Ｓｈｈ＋腫瘍上皮においてのみ、ポジティブの細胞質及び膜シグナル（褐色）を示し、Ｓｈｈネガティブ標本では示さない。スケールバーは２５μｍである。
【００２７】
図９ＡからＢは、抗ＨｈＡｂ９５，９による腫瘍ＴＭＡのＩＨＣ染色は、それぞれ、結腸におけるＨｈ発現、卵巣及び膵臓癌、における異なる部レベルのＨｈの発現を検出することを示す。９５．９抗体で染めた通常及び腫瘍サンプルのアレイからの、Ａ）結腸（上段）、卵巣（中段）及び膵臓（下段）の代表的なＨｈネガティブ（０＋）、低い（１＋）、中程度（２＋）、高い（３＋）の像を示す。Ｂ）染色されたサンプルの総数をそれぞれの腫瘍のタイプについて示し、調査した合計の数及びパーセントが各発現レベルのカテゴリーに入る９５．９染色について示される。
【００２８】
図１０ＡからＦは、ＩＨＣ染色によって、抗ＨｈＡｂ９５．９が、毛嚢におけるＨｈの低レベルを検知するために十分に感度があることを示す。Ａ）９５．９でラベル化したＣ５７ＢＬ／６の４週齢のマウスの皮膚は、毛嚢が、髪が成長期にある４週齢においてＳｈｈシグナルを示す。Ｂ）外毛根鞘におけるシグナルを示す、アンチセンスＳｈｈプローブを使用する胎児ヒト皮膚（頭皮）の水位縦断面図のインサイツハイブリダイゼーション。９５．９（Ｃ）又はＨ１６０（Ｄ）で染めたヒト胎児頭皮の横断面図。（Ｂ）におけるＩＳＨシグナルに一致する、皮膚乳頭の上の近傍上皮における染色を示す、９５．９（Ｅ）又はＨ１６０（Ｆ）で染めた胎児ヒト頭皮の、水位縦断面図。スケールバーはＣ、Ｄにおいて、５０μｍであり、全ての他のパネルにおいて、２５μｍである。
【００２９】
図１１ＡからＢは９５．９アミノ酸配列を示す。９５．９の成熟配列重鎖（Ａ）（配列番号：１９）又は軽鎖（Ｂ）（配列番号：２０）（Ｆｃドメインを含む）をコードするクローン化したＤＮＡを、インフレームで、一般的な抗体のシグナル配列（四角）融合し、翻訳した。
【００３０】
図１２は、正常卵巣（ＩＳＨ−）及び卵巣癌組織（ＩＳＨ＋）におけるｍＡｂ９５．５及びｍＡｂＨ−１６０を使用する免疫組織化学を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．定義
「ＦＦＰＥ」は、ホルマリン固定パラフィン包埋を意味し、これは、解剖又は生検から得られる組織であり、これは次いで、変性を妨げるために、固定化され、組織学的、病理学的又は細胞学的な研究を可能にする。この固定化した組織は、次いで、その微細切片を切断するために、ワックス中に包理され、次いで、ヘモトキシリン及びエドシン染色で染め、その後、微細切片へと切断することにより、ミクロトーム処理が実施される。固定化は、組織が更なる研究のために固定化、殺傷、保存される工程である。固定化は、染色試薬を通しやすくし、所定の場所に固定化し、係止するため、高分子をクロスリンクする。任意の適切な固定化剤、例えば、ウシ溶液、ホルマリン、又は液体窒素がこの目的のために使用される。
【００３２】
「ヘッジホッグ応答性癌」は、ヘッジホッグシグナルに媒介される又は関連する癌又は腫瘍であり、従って、ヘッジホッグの存在（即ち、ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ及び／又はデザートヘッジホッグ）が癌又は腫瘍の生存及び／又は成長のために必要又は不可欠である。そのようなヘッジホッグは、自己分泌（即ち、腫瘍自身によって産生される）又は傍分泌であり、ヘッジホッグは腫瘍又は癌の周辺の細胞によって産生される。特定の実施態様では、「ヘッジホッグ応答性癌」は、ヘッジホッグアンタゴニストの適用によって処理される。
【００３３】
特定の組織又は腫瘍中の、ヘッジホッグの「過剰発現」は、同じ組織型又は由来の非疾患組織のために存在するものより高いレベルで発現しているか、又はヘッジホッグ応答性癌である腫瘍又は癌の近辺にあり、正常、又は非疾患状態のような、ヘッジホッグ応答性癌が存在しない場合に発現されるヘッジホッグと比較して、より高レベルでヘッジホッグを発現しているような、ポリペプチドをコードするポリペプチド及び／又は核酸のような、ヘッジホッグに関する。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加させることにより引き起こされてもよい。ヘッジホッグ過剰発現は、細胞表面のヘッジホッグタンパク質の増加レベルを評価することにより、診断又は予後アッセイで決定されうる(例えば、本発明の抗ヘッジホッグ抗体を使用する免疫組織化学アッセイによる)。あるいは、又は加えて、細胞中のヘッジホッグポリペプチドコード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよい、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ；１９９８年１０月公開の国際公開第98/45479号参照)、サザンブロット法、ノザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)。また、血清のような生体液中の脱落抗原を測定することにより(例えば、１９９０年６月１２日に公開の米国特許第4,933,294号；１９９１年４月１８日公開の国際公開第91/15264号；1995年3月28日公開の米国特許第5,401,638号；及びSiasら, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990)もまた参照されたい)ヘッジホッグポリペプチド過剰発現を研究してもよい。前記アッセイのみならず、様々なインビボアッセイが技術熟練者において利用できる。例えば、検知できるラベル、例えば放射性同位体で任意に標識された抗体に患者の体にある細胞を暴露してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば放射活性の外側スキャンニングにより、又は抗体に先に暴露された患者から得られたバイオプシーを分析することにより評価される。
【００３４】
「ヘッジホッグアンタゴニスト」は、ヘッジホッグシグナルを、ヘッジホッグシグナル経路の因子に直接結合し、それによって、そのような因子間のシグナル伝達を阻害するか、又はヘッジホッグシグナル経路の因子が、ヘッジホッグシグナル伝達を阻害するために、天然の結合相手に結合することを阻害することによって、拮抗又は阻害する、抗体、その抗原結合断片、他の生物学的分子又は小分子である。
【００３５】
ここで用いる「ヘッジホッグシグナル経路」、「ヘッジホッグ経路」及び「ヘッジホッグシグナル伝達経路」という用語は、ヘッジホッグ及びそのレセプター（例えば、ｐａｔｃｈｅｄ、ｐａｔｃｈｅｄ−２）により媒介されるシグナルカスケード、及び遺伝子発現の変化や他のヘッジホッグ活性に典型的な表現型の変化を生じさせるものを、互換性をもって参照する。ヘッジホッグが存在しない場合であっても、下流の構成成分の活性化によってヘッジホッグ経路が活性化される場合がある（例えば、ヘッジホッグの不存在下であっても、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの過剰発現又はＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ若しくはＰａｔｃｈｅｄの変異体のトランスフェクションにより、ヘッジホッグシグナルが恒常的に活性化される）。転写因子のＧｌｉファミリーは、しばしばヘッジホッグ経路活性化のマーカー又は指標として用いられる。
【００３６】
「Ｈｈシグナル構成成分」という用語は、Ｈｈシグナル経路に関与する遺伝子産物を指す。Ｈｈシグナル構成成分は、多くの場合、細胞又は組織内でのＨｈシグナルの伝達に有形的又は実質的に作用し、これによって下流遺伝子の発現レベル及び／又はヘッジホッグ経路の活性化と関連する他の表現径の変化に影響を及ぼす。
【００３７】
各Ｈｈシグナル構成成分は、その生物学的機能及び下流遺伝子の活性化又は発現の最終的な結果の作用にもよるが、正又は負の調節因子のいずれかに分類できる。正の調節因子は、Ｈｈシグナル伝達に性に作用する、即ち、Ｈｈが存在する場合に下流の生命現象を促進するＨｈシグナル構成成分である。負の調節因子は、Ｈｈシグナル伝達に負に作用する、即ち、Ｈｈが存在する場合に下流の生命現象を阻害するＨｈシグナル構成成分である。
【００３８】
ＨｈがＰｔｃｈに結合すると、７回膜貫通型Ｇ結合タンパク質であるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）が放出され、次いで複雑な細胞内シグナル伝達経路が活性化される。その後、Ｓｍｏの活性化によりＣｏｓｔａｌ２（Ｃｏｓ２）、Ｆｕｓｅｄ（Ｆｕ）及びＦｕｓｅｄ（Ｓｕ（Ｆｕ））のサプレッサーを含む多分子複合体によるシグナル伝達が生じ、転写因子Ｇｌｉの核内輸送が起こる（Ho et al.,Curr.Opin.Neurobiol 12:57-63(2002);Nybakken et al,Curr.Opin.Genet.Dev.12:503-511(2002);i Altaba et al.,Nat.Rev.Neurosci.3:24-33(2002)）。脊椎動物では、３種類のＧｌｉ転写因子が存在することが知られている：Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３。Ｇｌｉ１は、Ｈｈ−応答性細胞内で全般的に誘起されている転写活性化因子であるが、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３は、細胞の内部状態により転写の活性化因子又は抑制因子のいずれとしても作用し得る。Ｈｈシグナル伝達がないと、Ｇｌｉ３は完全長Ｇｌｉ３のＣ末端領域を欠く、より小さい核内転写抑制因子にプロセシングされる。Ｓｍｏが活性化されると、Ｇｌｉ３タンパク質の開裂が抑止され、転写−活性化機能を有する完全長型が生成する。Ｇｌｉ２はそのＣ末端切断型において抑制因子機能もコードするが、Ｇｌｉ２の形成はＨｈシグナル伝達の制御を受けないと考えられる（Stecca et al.,J.Biol.1(2):9(2002)）。
【００３９】
標準的な定義：
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００４０】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならば、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合する」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００４１】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広義に用いられ、ヘッジホッグシグナル又はヘッジホッグシグナル経路因子の生物学的活性を、部分的又は完全にブロックし、阻害し、又は中和する任意の分子を含む。適切なヘッジホッグアンタゴニスト分子は具体的には、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ヘッジホッグポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等が含まれる。ヘッジホッグアンタゴニストを同定する方法は、ヘッジホッグシグナルが活性である細胞とＧＬＭ−Ｒポリペプチドと候補アンタゴニスト分子を接触させ、通常はヘッジホッグシグナルに関連している一つ又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含みうる（例えば、核のＧｌｉ発現）。
【００４２】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。ヘッジホッグアンタゴニストの治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、ヘッジホッグ応答癌に関して成功裏に「治療された」ことになる：癌細胞の数の減少、又は癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の軽減；疾病率及び死亡率の減少、及び生命問題の質の改善。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
【００４３】
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメーターは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。転移は、ステージング試験によって、骨のスキャン及び骨への広がりを確かめるためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって確かめることができる。ＣＴスキャンは、また、領域の骨盤及びリンパ節への広がりを探索することで行うことができる。胸のＸ線、及び既知の方法による肝臓の酵素レベルの測定を、それぞれ肺及び肝臓への転移を探索するために用いる。疾患をモニタリングする他の常套的方法には、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が含まれる。
【００４４】
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【００４５】
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４６】
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００４７】
ここに開示する、そのヘッジホッグアゴニストの「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量のことである。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的及び常套的な形で決定することができる。
【００４８】
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体、ヘッジホッグアンタゴニストの量を指す。癌の場合、特にヘッジホッグ応答性癌の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。
【００４９】
「パッケージ挿入物」という用語は効能、用法、用量、投与方法、禁忌及び／又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の市販用パッケージに通常含まれる指示書を意味するために使用される。
【００５０】
抗体の定義：
「抗体」なる用語は、(完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む)モノクローナル抗体、多価特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び単鎖分子、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、及びＦｖ)）を含む。「イムノグロブリン」（Ｉｇ）なる用語は、ここで「抗体」と可換で使用される。
【００５１】
ＣＨ
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＳは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
【００５２】
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
【００５３】
「単離された」抗体とは、その産生環境（例えば、自然から又は組み換えによる）の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その産生環境の他の全ての成分が付随していない。その酸性環境の汚染成分とは、抗体の治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれてもよい。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％以上の抗体まで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００５４】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般的には、抗体の最も可変の部位であり（同じクラスの他の抗体と比較して）、抗原結合部位を含む。
【００５５】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。その代わりに、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、ベータシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたベータシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００５６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む通常のポリクローナル抗体製剤とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他のイムノグロブリンを含まないハイブリドーマ培地によって合成する点で、有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；及び同第５６６１０１６号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【００５７】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線形抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００５８】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残留「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００５９】
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
【００６０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００６１】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113,  Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
【００６２】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。例えば、高頻度可変領域は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例えば、Xu等 Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。例えば、Hamers-Casterman等 Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等 Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照のこと。
【００６３】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「コンタクト」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
【００６４】
0005715420.tif 000002
【００６５】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる：ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５（好ましい実施態様）(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら拡大ＨＶＲの各々を規定するために、上掲のKabat等上掲に従って番号を付した。
【００６６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義するＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６７】
「Kabatによる可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
【００６８】
本願明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。ある実施態様では、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。
【００６９】
その代わりに、本明細書のヒトＨｈ抗体のフレームワーク及びＨＶＲの定義は下記の通り定義され得る：（ａ）重鎖はＨＣＦＲ１−ＨＣＨＶＲ１−ＨＣＦＲ２−ＨＣＨＶＲ２−ＨＣＦＲ３−ＨＣＨＶＲ３−ＨＣＦＲ４−ＣＲ；ここで、ＨＣＦＲ１＝ＱＳＶＫＥＳＧＧＧＬＶＱＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＶＳ（配列番号：１）、ＨＣＨＶＲ１＝ＧＦＳＬＳＳＹＤＭＳ（配列番号：２）、ＨＣＦＲ２＝ＷＶＲＱＡＰＧＳＧＬＥＷＩ（配列番号：３）、ＨＣＨＶＲ２＝ＧＧＩＬＳＧＧＳＡＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：４）、ＨＣＦＲ３＝ＲＳＴＩＴＫＮＴＮＬＮＴＶＴＬＫＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣ（配列番号：５）、ＨＣＨＶＲ３＝ＡＲＧＩＹＰＶＧＴＮＹＮＩ（配列番号：６）、ＨＣＦＲ４＝ＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧ（配列番号：７）、ＣＲ＝ＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号：８）を含み得る。
【００７０】
（ｂ）軽鎖は、ＬＣＦＲ１−ＬＣＣＤＲ１−ＬＣＦＲ２−ＬＣＣＤＲ２−ＬＣＦＲ３−ＬＣＣＤＲ３−ＬＣＦＲ４；ここでＬＣＦＲ１＝ＤＩＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣ（配列番号：９）、ＬＣＨＶＲ１＝ＱＳＳＰＳＶＹＳＮＹＬＡ（配列番号：１０）、ＬＣＦＲ２＝ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩ（配列番号：１１）、ＬＣＨＶＲ２＝ＹＹＡＳＴＬＡＳ（配列番号：１２）、ＬＣＦＲ３＝ＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号：１３）、ＬＣＨＶＲ３＝ＡＧＧＹＩＤＴＳＤＴＡ（配列番号：１４）、ＬＣＦＲ４＝ＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ（配列番号：１５）を含み得る。
【００７１】
特定位置、例えば、Ｆｃ領域「におけるアミノ酸修飾」とは、特定されたアミノ酸残基の置換もしくは欠失、または特定されたアミノ酸残基の隣接位置に少なくとも一つのアミノ酸を挿入することを指す。特定されたアミノ酸残基の「隣接位置」への挿入とは、１または２残基以内の挿入を意味する。その挿入は、特定された残基のN末端側、もしくはC末端側の場合があり得る。
【００７２】
「親和性成熟」抗体は、その一又は複数のＣＤＲに一又は複数の変更を有するものであって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善される。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の又は更にはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において既知の方法により生産される。例えば、Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992年)は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas等, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等, J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００７３】
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドにおけるエピトープに「特異的に結合する」又は、「特異的な」抗体は、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドにおけるエピトープに任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく結合するものである。例えば、本発明の抗Ｈｈ抗体は、Ｈｈに特異的に結合するが（例えば、ヒトソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）、ヒトインディアンヘッジホッグ（ｉｈｈ）又はヒトデザートヘッジホッグ（ｄｈｈ））、他の任意のポリペプチドに結合しない。
【００７４】
「遮断」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減するものである。幾つかの実施態様では、遮蔽抗体又はアンタゴニスト抗体は、実質的又は完全に、抗原の生物学的活性を阻害する。本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、一度ヘッジホッグに結合し、ヘッジホッグのｐａｔｃｈｅｄへの結合を阻害しないという意味で、遮断ではない。
【００７５】
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。特定の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【００７６】
「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本発明の抗体の使用のための適切な天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
【００７７】
ＩＩ．ヘッジホッグアンタゴニスト法
ヘッジホッグ発現は、ヘッジホッグアンタゴニストに応答するであろう癌を含む、複数の生理学的条件及び病状に関連するので、本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、そのような応答性癌を同定するためだけではなく、そのようなイベント及び疾患状態を検出するために有用である。
【００７８】
Ａ．血管新生
ヘッジホッグが血管新生を促進することが知られていることから、特に、血管新生に一定の強度のヘッジホッグシグナルが必要な場合には、ヘッジホッグ活性を阻害する抗ヘッジホッグ抗体が、血管形成を阻害することが期待される。血管新生は、多くの疾患の基礎となっている。持続的な、非制御下の血管新生により、種々の疾患状態、腫瘍の転移及び内皮細胞の異常増殖が引き起こされる。血管新生プロセスの結果作り出された脈管構造は、これらの疾患に見られる病理学的損傷の証拠となる。
【００７９】
血管新生と関連する疾患及び血管新生により生じる疾患には、以下が含まれる：腫瘍増殖、腫瘍転移又は内皮細胞の異常増殖、例えば、血管新生疾患、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、末熟児網膜症、角膜移植後拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、乾燥性角結膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡、フィルクテヌローシス（ｐｈｙｌｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、ミコバクテリア感染、脂質変性、化学薬品による火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解（ｍａｒｇｉｎａｌ ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、慢性関節リウマチ、全身性の狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、強膜炎、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群、類天疱瘡、放射状角膜切開、角膜移植拒絶、慢性関節リウマチ、全身性の狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、強膜炎、スティーヴンズ‐ジョンソン症候群、類天疱瘡、放射状角膜切開、角膜移植拒絶、慢性関節リウマチ、変形性関節症、慢性炎症（例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病）、血管腫、オスラー−ウェーバー・ランデュ病、及び遺伝性出血性毛細血管拡張。
【００８０】
血管新生は、癌において決定的な役割を果たす。栄養を供給して細胞排泄物を取り除く血液供給なくして、腫瘍は拡張することができない。血管新生が重要となる腫瘍には、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫等の固形腫瘍、及び聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫等の良性腫瘍が含まれる。血管新生因子は、複数種の固形腫瘍と関連があることが判明しており、血管新生を防ぐことで、これらの腫瘍の増殖と腫瘍の存在に起因する動物への結果的な損傷をくい止め得る。血管新生は、白血病等の血液由来の腫瘍、及び、通常、貧血、血液凝固障害、並びにリンパ節、肝臓及び脾臓の腫脹を伴う、白血球の非抑制的増殖が起こっている骨髄の種々の急性又は慢性腫瘍疾患とも関連している。血管新生は、白血球様の腫瘍を生じる骨髄内での障害に関与していると考えられている。
【００８１】
腫瘍の増殖に加え、血管新生は、転移においても重要である。初期において、血管新生は、腫瘍の脈管化において重要であり、癌細胞が血流内へ侵入して全身を循環することを可能にする。腫瘍細胞が原発部位を離脱して、第２の転移部位に定着した後には、その新たな腫瘍が増殖して拡張する前に血管新生が起こる必要がある。従って、血管新生を妨げることにより、腫瘍の転移が予防され、恐らく、新生物の増殖を原発部位に抑制することが可能になる。
【００８２】
血管新生は、生殖や創傷治癒等の正常な生理学的プロセスにも関与している。血管新生は、排卵、並びに受精後の胞胚の着床において重要な工程である。血管新生の防止を利用することで、無月経を誘導し、排卵を遮断し、又は胞胚の着床を予防し得る。
【００８３】
Ｂ．ヘッジホッグシグナルの過活性により生じる疾患
本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、ヘッジホッグ過剰発現を示す特定の組織及び／又は細胞の決定のために使用され得る。これは、ヘッジホッグシグナル経路によって活性化されるｇｌｉ遺伝子の発現の測定によるような、他のヘッジホッグ経路活性化の測定と組み合わせることによって起き得る。ｇｌｉ−１、ｇｌｉ−２及びｇｌｉ−３は、広範囲の組織及び疾患におけるヘッジホッグシグナルと最も一貫して関連しているが、一方で、ｇｌｉ−３は、比較的関連性が低い。ｇｌｉ遺伝子には、ヘッジホッグシグナル伝達の完全な効果を発揮するのに必要な数多くの遺伝子の発現を活性化させる転写因子がコードされている。しかしながら、Ｇｌｉ−３転写因子は、ヘッジホッグエフェクター遺伝子のレプレッサーとしても作用する場合があり、従って、ｇｌｉ−３の発現は、ヘッジホッグシグナル伝達の効果を減少させる可能性がある。ｇｌｉ−３が、翻訳後の現象に応じて転写アクチベーター又は転写リプレッサーのいずれかとして作用することから、Ｇｌｉ−３タンパク質の（抑制型に対する）活性化型の検出方法が、ヘッジホッグ経路活性の信頼性のある測定法となることが期待される。ｇｌｉ−１遺伝子は、種々の癌、過形成及び未熟児の肺で強く発現しており、ヘッジホッグ経路の相対的な活性化のマーカーとして機能する。更に、高いｇｌｉ遺伝子発現を示す、未熟児の肺のような組織は、ヘッジホッグ阻害剤により強い影響を受ける。従って、ｇｌｉ遺伝子発現の検出が、ヘッジホッグアンタゴニストを用いた治療が特に有効な組織及び疾患を同定する強力な予測ツールとして使用可能であることが考えられる。
【００８４】
ｇｌｉ−１の発現レベルは、転写物の直接的な検出又はタンパク質レベル若しくはタンパク質活性の検出のいずれかにより検出される。転写物については、主にｇｌｉ−１転写物又はこれから合成されるｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーション又はプローブに基づく種々の技術を用いて検出可能である。良く知られる技術には、転写物のレベルでは、ノーザンブロッティング、逆転写酵素ＰＣＲ及びマイクロアレイ解析が含まれる。Ｇｌｉタンパク質レベルでの検出法には、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ‐Ｇｌｉタンパク質の位置が決定できるよう、スタンダードと比較できることが好ましい）、及び質量分析法が含まれる。質量分析は、特定のサンプル中の多数の異なるタンパク質レベルのハイスループットな同定を可能にする、一連の精製工程が組み合されていてもよい。質量分析と２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いることで、タンパク質分解、ユビキチン結合、リン酸化、脂質修飾等を含むタンパク質に対する転写後修飾を同定することも可能である。基質ＤＮＡへの結合又はインビトロでの標的プロモーターの転写活性化を解析することでＧｌｉ活性を評価し得る。ゲルシフトアッセイ、ＤＮＡフットプリンティングアッセイ及びＤＮＡ−タンパク質架橋アッセイの全ては、その使用により、ＤＮＡ上のＧｌｉ結合部位に結合可能なタンパク質の存在を評価できる方法である。J Mol.Med 77(6):459-68(1999);Cell 100(4):423-34(2000);Development 127(19):4923-4301(2000)。
【００８５】
特定の実施態様では、ｇｌｉ転写レベルを測定して、異常に高いｇｌｉレベルを示す疾患組織又は障害組織を抗ヘッジホッグ抗体で処置する。別の実施態様では、ｇｌｉ発現レベルの測定が、治療される組織において行われていない場合であっても、治療される症状が、異常なヘッジホッグ経路の活性化と有意な相関関係を示すことが知られている。未熟児の肺組織、肺癌（例えば、腺癌、気管支肺胞腺癌、小細胞癌）、乳癌（例えば、下部腺管癌、下部小葉癌、管状腺癌）、前立腺癌（例えば、腺癌）及び、良性の前立腺過形成の全ては、一定の事例において、強力で高いｇｌｉ−１発現レベルを示す。従って、ｇｌｉ−１発現レベルは、これらのどの組織を抗ヘッジホッグ抗体で治療すべきかを決定するための強力な診断デバイスとなる。更に、尿路上皮細胞の癌（例えば、膀胱癌、他の尿生殖器の癌）も、一定の事例において高いｇｌｉ−１レベルを示すことの確固たる関連証拠が存在する。例えば、染色体９ｑ２２におけるヘテロ接合の喪失が、膀胱癌に共通していることが知られている。Ｐｔｃｈ−１遺伝子は、上記部位に位置しており、ｐｔｃｈ−１の機能喪失は、恐らく、多くの他の多くの種類の癌においても、過剰増殖の部分的要因となっているであろう。従って、このようは癌は、高いｇｌｉ発現を示し、ヘッジホッグアンタゴニストを用いた治療に特に適している。
【００８６】
ｐｔｃｈ−１とｐｔｃｈ−２の発現も、ヘッジホッグシグナル伝達経路によって活性化されるが、典型的には、ｇｌｉ遺伝子と同程度に活性化される訳ではなく、結果的に、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしてはｇｌｉ遺伝子に劣ることになる。特定の組織では、ヘッジホッグ経路の活性が高くてもｐｔｃｈ−１又はｐｔｃｈ−２の片方のみが発現している。例えば、精巣の発達においては、ｄｅｓｅｒｔ ヘッジホッグが重要な役割を果たし、ヘッジホッグ経路が活性されているが、ｐｔｃｈ−２のみが発現している。従って、これらの遺伝子は、単独では、ヘッジホッグ経路活性のマーカーとして信頼性がないが、両方の遺伝子の同時測定は、ヘッジホッグアンタゴニストで治療すべき組織に関するより有用な指標になると考えられる。
【００８７】
ヘッジホッグ活性化の間、ｇｌｉが遍在的に発現されることから、あらゆるｇｌｉ過剰発現の程度が、抗ヘッジホッグ抗体が有効な治療薬であることの決定において有用となるはずである。このような実施態様では、ｇｌｉが、正常レベルより少なくとも２倍高いレベルで発現されるべきである。特定の実施態様では、発現は、正常レベルより４倍、６倍、８倍又は１０倍高い。
【００８８】
脊椎動物の分化した組織の秩序だった空間配置の形成におけるヘッジホッグシグナル伝達の幅広い関与を考慮するに、本発明のヘッジホッグアンタゴニストは、インビトロ及びインビボの両方において異なる脊椎動物組織の配置を作り出すプロセス及び／又は維持するプロセスに用いてもよい。抗ヘッジホッグ抗体は、いつヘッジホッグアンタゴニストの適用が、考慮される組織型の増幅又は分化に関連し誘導的であれ、非誘導的であれ、適切な上記の任意の製剤であり得るかを決定するために使用し得る。
【００８９】
Ｃ．神経細胞の培養
本発明のヘッジホッグ抗体は、更に、ヘッジホッグシグナルの低下が望まれる細胞培養技術に適用可能である。インビトロでの神経培養系は、神経発生の研究並びに、神経成長因子（ＮＧＦ）、繊毛栄養因子（ＣＮＴＦ）及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）等の神経栄養因子の同定の基礎となる欠くことのできないツールであることが証明されている。本発明の方法の１の使用法は、例えば、新たな神経及びグリアを作り出すための培養の使用といった、神経幹細胞の培養であってもよい。培養物中の神経幹細胞の増殖速度を変化させたり、そして／又は分化速度を変化させたり、又は特定の最終分化した神経細胞の培養の完全性を維持するために、これらの培養物をヘッジホッグアンタゴニストと接触させ得る。例示的な実施態様では、対象方法を用いて特定の種類のニューロン（例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン等）を培養し得る。このような神経培養物は、簡便なアッセイ系並びに治療用の移植可能細胞の供給源として用いてもよい。
【００９０】
本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、更に、中枢神経系の疾患の新たな治療法としての大脳内移植にも適用可能である。例えば、損傷を受けた脳組織を修復するための１つの方法では、動物胎児又は新生児由来細胞の、成体の脳への移植を伴う。Dunnett et al.,J.Exp.Biol.123:265-289(1987)。種々の脳領域に由来する胎児ニューロンの、成体の脳への組み込みを成功させることが可能であり、このような移植片は、行動障害を軽減し得る。例えば、基底核へのドーパミン投射の損傷により誘導される運動障害は、胚性ドーパミン産性ニューロンの移植により防ぎ得る。新皮質の損傷後に悪化する複雑な認知機能は、胚性皮質細胞の移植により、部分的に回復させ得る。対象の方法を用いることで、培養内の増殖状態を調節するか、又は胎児組織、特に神経幹細胞が用いられる場合には、その幹細胞の分化の速度を変化させ得る。
【００９１】
本発明に有用な幹細胞は、一般的に知られている。例えば、複数の神経堤細胞が同定されており、このうちの数種類は、多分化能を示し、恐らく特定の系統に入っていない神経堤細胞を代表するものと考えられ、残りの種類は、感覚ニューロン等、唯１種類の細胞のみを生み出すことが可能であり、恐らく特定の系統に入った前駆細胞を代表するものと考えられる。本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、特定の系統に入っていない前駆細胞の分化を調節すること、又は特定の系統に入った前駆細胞の発生学的運命の更なる限定を調節すること、又は特定の系統に入った前駆細胞の発生学的運命の更なる限定を、最終分化したニューロン細胞になるように調節することのために、培養幹細胞に適用されるヘッジホッグアンタゴニストの効果を調節し得る。例えば、本発明の方法をインビトロで用いて、神経堤細胞からグリア細胞、シュワン細胞、クロム親和細胞、コリン作動性ニューロン、交感ニューロン又は副交感ニューロン、並びにペプチド作動性ニューロン及びセロトニン作動性ニューロンへの分化を調節し得る。ヘッジホッグアンタゴニストは、単独、又は神経前駆細胞の特定の分化の運命をより重点的に促進するように作用する他の神経栄養因子との組合せで用いてもよい。
【００９２】
Ｄ．神経の増殖と分化の調節
本発明の抗ヘッジホッグ抗体を細胞培養物の移植と組み合わせて使用することに加え、本発明の別の態様は、中枢神経系と末梢神経系の両方のニューロン及び他の神経細胞の増殖状態を調節するためのヘッジホッグアンタゴニストの治療用途に関する。ヘッジホッグ経路の構成成分（例えば、ｐｔｃｈ、ヘッジホッグ、及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）が、神経系の発生過程及び恐らく成体の状態においても神経分化を調節しる能力は、特定の場合において、対象のヘッジホッグアンタゴニストが、正常細胞の維持、機能の発揮、及び老化に関する成体ニューロンの調節；化学的又は機械的な損傷を受けた細胞の修復と再生工程；並びに特定の病理学的状態における神経変性の治療を容易化することが期待され得る。上記の見解に照らし、本発明では、特に、以下によって生じる神経学的状態の治療（例えば、予防、症状の軽減等）への対象方法の応用が意図されている：（ｉ）外傷、化学的損傷、血管の創傷及び血管（脳卒中により生じる虚血等）、並びに感染性／炎症性損傷及び腫瘍誘導性の損傷；（ｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症等の神経系の老化、並びに脊髄小脳変性症；並びに（ｉｖ）多発性硬化症を含む、神経系の、又は神経系を患う慢性の免疫疾患。
【００９３】
適切な場合には、対象の方法を、中枢神経及び末梢神経の損傷の修復のための神経プロテーゼの製造に用いてもよい。特に、つぶれた又は切断された軸索が、プロテーゼ装置の使用により管状となっていない場合、そのプロテーゼ装置にヘッジホッグアンタゴニストを添加して樹状突起の増殖速度と再生を調節し得る。代表的な神経誘導チャネルが、米国特許第5,092,871号及び同第4,955,892号に記載されている。
【００９４】
別の実施態様では、中枢神経系で起こるであろう、新生物又は過形成の変態の治療に対象方法を用いてもよい。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを利用して、このような変態した細胞に分裂終了又はアポトーシスを生じ得る。従って、本発明の方法は、例えば、悪性の神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、神経外胚葉性腫瘍及び上衣細胞腫の治療の一部として用いてもよい。
【００９５】
Ｅ．神経癌
ヘッジホッグ抗体は、悪性の髄芽腫及び他の原発性のＣＮＳの悪性の神経外胚葉性腫瘍の治療計画の一環として用いてもよい。原発性脳腫瘍である髄芽腫は、子供に最も高頻度に発症する脳腫瘍である。髄芽腫は、後頭蓋窩に生じる原発性の神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）である。髄芽腫は、全ての小児脳腫瘍の約２５％を占める。組織学的には、これらは、通常、真性ロゼット様に配置される小円形細胞の腫瘍であり、星状細胞、上衣細胞又はニューロンへの一定の分化を示す場合がある。ＰＮＥＴは、松果体（松果体芽細胞腫）及び大脳を含む、脳の他の領域に生じる可能性がある。テント上の領域に生じたＰＮＥＴは、一般的に、他の領域の生じたＰＮＥＴと比べて悪い予後を示す。
【００９６】
髄芽腫／ＰＮＥＴは、切除後において、ＣＮＳのあらゆる場所で再発することが知られており、骨に転移する場合もある。従って、治療前評価には、「下がった転移」の可能性を排除するため、脊髄を検査することも含まれる。この目的のため、ミエログラフィーがガドリニウム増幅性ＭＲＩに大きく取って代わられ、ルーチンなプロセスとして、手術後にＣＳＦサイトロジーが得られる。本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、ヘッジホッグアンタゴニストの効果を決定するための治療計画の一部として、原発、及び／又は転移腫瘍におけるヘッジホッグの発現レベルを検出するために使用し得る。
【００９７】
別の実施態様では、対象の方法は、上衣細胞腫の治療プログラムの一環として用いられる。上衣細胞腫は、子供の小児脳腫瘍の約１０％を占める。巨視的には、これらは、脳室の上衣層から生じる腫瘍であり、微視的には、ロゼット、環状構造及び脈管周囲ロゼットを形成している。上衣細胞腫を患う５１人の子供のＣＨＯＰシリーズにおいて、３／４が組織学的に良性であった。約３分の２が、第４心室の領域から生じていた。３分の１が、テント上の領域に発症していた。ＳＥＥＲデータ並びにＣＨＯＰから得たデータが示すように、発症のピークは、誕生から４歳の間である。年齢の中央値は、約５歳である。この疾患を患う子供の多くが、赤子であるため、多くの場合、集学的治療を必要とする。
【００９８】
Ｆ．非神経細胞の培養
抗ヘッジホッグ抗体は、非神経組織の製造及び維持に関する細胞培養並びに治療法で用いてもよい。このような使用は、別の脊椎動物の器官発生経路、例えば、内皮のパターン形成及び、中胚葉及び内胚葉の分化の形態形成シグナルにおけるヘッジホッグシグナル構成要素（例えば、ｐｔｃｈ、ヘッジホッグ、ｓｍｏ等）の関与の結果意図されるものである。
【００９９】
ヘッジホッグシグナル、特に、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄは、消化管、肝臓、肺及び他の原始腸管由来の器官の形成に関与する幹細胞の発生の調節に関わっている。Ｓｈｈは、内胚葉から中胚葉への誘導性シグナルであり、腸管の形態形成に決定的に重要である。従って、例えば、本発明の方法の抗ヘッジホッグ抗体は、正常細胞の複数の分泌機能を示すことが可能な人工肝臓の発生及び維持の調節に用いてもよい。例示的な実施態様では、対象方法を用いて、正常肝臓の機能を調節し得る。例えば、対象方法を用いて、消化管の幹細胞の増殖と分化を制御して、細胞外マトリックスの構成に使用可能な、又は生体適合性ポリマー内に封入可能な肝細胞培養物を形成し、移植可能な人工肝臓と体外人工肝臓の両方を形成し得る。
【０１００】
別の実施態様では、対象方法を治療に使用して、物理的、化学的又は病理学的な障害を受けたこのような器官を調節し得る。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを含む治療法を、部分的な肝臓摘出の後の肝修復に使用し得る。
【０１０１】
別の実施態様では、対象方法を用いて、インビボ及びインビトロの両方において膵臓組織の増殖及び／又は分化を制御又は調節し得る。胚性腸管からの膵臓と小腸の発生は、腸管の内胚葉細胞と中胚葉細胞間の細胞間シグナルに依存する。特に、腸の中胚葉から平滑筋への分化は、隣接する内胚葉細胞からのシグナルに依存することが示唆されている。胚性後腸内の内胚葉からのシグナルの１つの媒体候補は、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）である。Apelqvist等,Curr.Biol.7:801-4(1997)。Ｓｈｈ遺伝子は、膵芽の内胚葉を除く胚芽の内胚葉の至るところで発現しており、膵芽の内胚葉では、代わりに膵臓発生初期の必須の調節因子であるホメオドメインタンパク質Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１（インシュリンプロモーター因子１／膵臓十二指腸ホメオボックス１）が高レベルで発現している。Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１を用いて、発生過程にある膵臓上皮内で選択的にＳｈｈを発現させている。Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１−Ｓｈｈトランスジェニックマウスの膵臓中胚葉は、平滑筋とカハル（膵臓の間葉や脾臓よりもむしろ腸に特徴的な細胞）の間質細胞へ発達した。Apelqvist等、上記。更に、Ｓｈｈに曝露した膵臓の体外移植組織は、内皮由来のＳｈｈコントロールと同様の発現を示し、腸管の異なる領域において隣接する中胚葉の運命を経た。
【０１０２】
別の実施態様では、抗ヘッジホッグ抗体を用いて、間葉系細胞及び中葉系組織由来の肝細胞を含む、非内胚葉系幹細胞由来の内胚葉組織の発生を変化させる。幹細胞を単離可能な代表的な中胚葉系組織には、骨格筋、心筋、腎臓、軟骨及び脂肪が含まれる。
【０１０３】
Ｇ．膵臓の状態／疾患
本発明の抗ヘッジホッグ抗体が、ヘッジホッグアンタゴニストと組み合わせて使用される場合、治療上の利点を提供し得る、種々の病理学的な細胞増殖及び分化に関する膵臓状態が存在する。より具体的には、このような治療上の利点は、異常なインシュリン発現の修正、又は膵臓細胞の分化の変更に関する。しかしながら、より一般的には、本発明は、膵臓細胞を対象ヘッジホッグアンタゴニストと接触させることによる、膵臓細胞の分化状態の促進及び／又は維持、生存率の向上及び／又は増殖に対する作用の方法に関する。例えば、本発明では、膵臓組織の秩序だった空間配置の形成におけるｐｔｃ、ヘッジホッグ及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの明らかな関与に鑑み、対象方法が、インビトロ及びインビボの両方で、このような組織を作り出し、そして／又は維持する技術の一部として用いられることを意図している。例えば、ヘッジホッグシグナル伝達の調節は、β膵島細胞の発生及び維持、及び、恐らく消化管、脾臓、肺、尿生殖器官（例えば膀胱）、並びに原子腸管由来の他の器官等の非膵臓組織からのβ膵島細胞の発生及び維持も含む細胞培養と治療方法の両方に用いてもよい。
【０１０４】
特定の実施態様では、本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、膵臓組織を患う過形成及び新生物疾患、特に、膵臓細胞の異常増殖を特徴とする過形成及び新生物疾患の治療に用いてもよい。例えば、膵臓癌は、膵臓細胞の異常増殖を特徴としており、膵臓のインシュリン分泌能に変化をきたす可能性がある。例えば、膵臓癌等の、特定の膵臓の過形成は、β細胞の機能不全又は膵島細胞の量の減少に起因する低インスリン血症を生じさせる可能性がある。更にまた、異なる時点におけるヘッジホッグシグナル伝達特性の操作は、インビボ及びインビトロの両方で脾臓組織を再構築／修復するための戦略の一環として有用であろう。一実施態様では、本発明は、膵臓組織の発生を制御するｐｔｃ、ヘッジホッグ及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの明確な関与を利用する。別の実施態様では、対象の抗ヘッジホッグ抗体を治療に用いて、物理的、化学的又は病理学的傷害後に膵臓を制御し得る。更に別の実施態様では、対象方法を細胞培養技術に応用することが可能であり、特に、対象方法を用いて、プロテーゼの膵臓組織装置の最初の統合を促進し得る。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの使用等により、膵臓組織の増殖と分化を操作することにより、培養組織の特徴をより慎重に制御するための手段を提供し得る。代表的な実施態様では、対象方法を用いて、例えば、米国特許第4,892,538号、同第5,106,627号、同第4,391,909号及び同第4353,888号に記載されるような封入装置に使用可能な、β膵島細胞を要するプロテーゼ装置の生産を増大させることも可能である。膵島の初期前駆細胞は、多能性であり、これらが現れた時点から明確に全ての膵島特異的遺伝子を共活性化させる。発生がすすむにつれて、インシュリン等の膵島特異的ホルモンの発現が、成熟した膵島細胞に特徴的な発現パターへと制限されていく。しかしながら、成熟膵島細胞の表現型は、培養において不安定であり、成熟したβ細胞においても胚の特徴が再出現することが観察される場合もある。対象の抗ヘッジホッグ抗体を用いることにより、細胞の分化経路又は増殖指標を制御し得る。
【０１０５】
更にまた、膵臓組織の異なる段階における操作は、人工膵臓の移植と併せて用いてもよい。例えば、組織分化に影響を及ぼすヘッジホッグ機能の操作は、移植片の生存能を維持するための手段として用いてもよい。
【０１０６】
Ｈ．細胞増殖性疾患、腫瘍及び癌
本発明の抗ヘッジホッグ抗体を用いて、肺癌及び肺腺癌、並びに肺上皮に関する他の増殖性疾患を治療し得る。ヒトの肺扁平上皮癌細胞と腺癌細胞内でＳｈｈが発現されていることが知られている。Fujita et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.238:658(1997)。Ｓｈｈの発現は、ヒトの胚扁平上皮がん組織においても検出されているが、同じ患者の正常な肺組織内では検出されていない。また、Ｓｈｈが癌細胞へのＢｒｄＵの取り込みを促進して、その細胞増殖を促進する一方で、抗Ｓｈｈ−Ｈがそのような増殖を阻害したことが観察された。これらの結果から、ｐｔｃ、ヘッジホッグ、及び／又はｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄが、このように編成した肺組織の細胞増殖に関与することが示されており、従って、ヘッジホッグアンタゴニストを用いることで、肺癌及び肺腺癌、並びに肺上皮に関する他の増殖性疾患を治療し得ることが示されている。
【０１０７】
本発明の抗ヘッジホッグ抗体、ヘッジホッグアンタゴニストは、ヘッジホッグシグナルが腫瘍の存在又は病因と関連する腫瘍を同定するためにまた使用されてもよく、従って、ヘッジホッグアンタゴニストの適用に応答するであろう。このような腫瘍には、これらに限定される訳ではないが、以下が含まれる：ゴーリン症候群関連腫瘍（例えば、髄芽腫、髄膜腫等）、ｐｔｃノックアウトマウスに明らかな腫瘍（例えば、血管腫、横紋筋肉腫等）、ｇｌｉ−１増幅により生じる腫瘍（例えば、グリア芽細胞腫、肉腫等）、Ｓｍｏ機能不全により生じる腫瘍（例えば、基底細胞癌等）、ｐｔｃホモログのＴＲＣ８と関連する腫瘍（例えば、腎癌、甲状腺癌等）、Ｅｘｔ−１関連腫瘍（例えば、骨肉腫等）、Ｓｈｈ誘導性腫瘍（例えば、肺癌、軟骨肉腫等）、並びに、その他の腫瘍（例えば、乳癌、尿生殖器の癌（例えば、腎臓、膀胱、尿管、前立腺等）、副腎癌、胃腸の癌（例えば、胃、腸等）。
【０１０８】
本発明の抗ヘッジホッグ抗体を用いて、ヘッジホッグアンタゴニストの適用に応答するであろう、癌を同定し得る。このような癌には、これらに限定される訳ではないが、以下が含まれる：前立腺癌、膀胱癌、胆道癌、肺癌（小細胞癌と非小細胞癌を含む）、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、乳癌、卵巣頸癌、卵巣内膜癌又は他の卵巣癌、卵巣癌、精巣癌、陰茎の癌、膣癌、尿道の癌、胆嚢癌、食道癌、又は膵臓癌。更なる癌の種類には、骨格筋又は平滑筋の癌、胃癌、小腸の癌、唾液腺の癌、肛門の癌、直腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体癌、及び鼻咽腔癌が含まれる。本発明のヘッジホッグアンタゴニストで治療可能な例示的な更なる癌の形態には、ヘッジホッグ発現細胞を含む癌が包含される。本発明のヘッジホッグアンタゴニストで治療可能な更なる代表的な癌の形態には、ｇｌｉ発現細胞を含む癌が包含される。一実施態様において、癌は、ｐａｔｃｈｅｄ−１の変異によって特徴付けられることはない。
【０１０９】
Ｉ．上皮組織
本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、上皮組織を侵す疾患の治療（予防を含む）にも用いることができる。一般的に、このような治療には、治療する上皮組織の増殖状態を変化させるのに効果的な量のヘッジホッグアンタゴニストを投与することが含まれる。投与方法と投与計画は、治療すべき上皮細胞（例えば、皮膚、粘膜、腺等）に応じて変更されることになる。具体的な態様では、この方法を用いて、上皮由来組織のＳｈｈ誘導性分化の誘導を制御し、そして／又は増殖を阻害することができる。従って、本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、上皮組織に関する過形成及び／又は新生物状態の治療方法に用いることができる。
【０１１０】
（１）発毛
本発明の抗ヘッジホッグ抗体を用いて発毛を調節することも可能である。毛は、主として、頑強で不溶性のタンパク質であるケラチンから構成されている。個々の毛は円柱状の長幹と毛根を含み、皮膚のフラスコ状の凹みである小胞に含まれている。小胞の底部には、乳頭と呼ばれる指状の突起物が含まれ、乳頭は、そこから毛が成長する結合組織から成り、この結合組織を通じて血管から細胞に栄養が供給される。長幹は、皮膚表面から外に向かって伸びる部分であり、毛根は、既に記載したように、毛の埋め込まれる部分である。毛根の基底部は、乳頭上に存在する毛球へと広がる。毛が作られる細胞は、小胞の毛球内で増殖する；これらは、細胞が小胞内で増殖するにつれて、繊維の形態で押し出される。毛の「成長」とは、分裂細胞による毛の繊維の形成と伸長を指す。
【０１１１】
当該技術分野においてよく知られるように、通常の毛の周期は、３段階に分けられる：成長期、退行期及び休止期である。活性期（成長期）には、真皮乳頭の表皮幹細胞の分裂が早い。娘細胞は上に向かって移動し、分化して、その毛の同心円層を形成する。移行期の退行期は、小胞内の幹細胞の有糸分裂の休止を特徴とする。休止段階は、休止期として知られており、毛は、頭皮の下で成長する新たに出現する毛が、小胞から休止期の長幹を押し出すまで、数週間も頭皮内に留まっている。上記のモデルから、毛細胞に分化する分裂幹細胞のプールが大きい程、より発毛が生じることが明らかとなった。従って、これらの幹細胞の増殖を増強又は阻害することにより、それぞれ発毛を増加又は低下させる方法を実施することができる。
【０１１２】
抗ヘッジホッグ抗体は、切るか、剃るか、又は脱毛による除去に代わり、又はこれらとの組合せで、ヒトの毛の増殖を低下させる方法に用いることができる。例えば、本発明の方法は、多毛症等の、異常に迅速又は重度の発毛を特徴とする毛髪病の治療に用いることができる。例示的な実施態様では、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて、異常な毛深さを特徴とする障害である男性型多毛症を管理することができる。また、対象の方法は、脱毛効果の期間を延長する方法も提供することができる。
【０１１３】
更にまた、ヘッジホッグアンタゴニストは多くの場合上皮細胞に対して、細胞毒性というよりはむしろ細胞増殖抑制性であるため、このような薬剤を用いて、例えば、放射線誘導性の死といった効力のために細胞周期のＳ期への細胞進行を要する細胞毒性薬剤から毛包細胞を保護することができる。ヘッジホッグアンタゴニストで処理することで、例えば、細胞のＳ期への進入を防ぐことにより、毛包細胞を静止状態にさせ、それによって、毛包細胞の有糸分裂のカタストロフィー又はプログラム化された細胞死を防ぐことによる保護が提供される。例えば、既に毛髪を喪失した、化学療法又は放射線療法を受けている患者に、ヘッジホッグアンタゴニストを用いることもできる。このような治療中の細胞周期の進行を阻害することにより、対象治療は、一方で、静止状態の不存在による細胞死プログラムの活性化を生じる可能性のある、死から毛包細胞を保護することができる。抗ヘッジホッグ抗体の治療が完了した後には、本発明の方法を取り除き、それに付随して毛包細胞増殖の阻害を解くこともできる。本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、ヘッジホッグシグナルが活性であるような組織を同定するために使用でき、従って、ヘッジホッグアンタゴニストの適用から恩恵を受ける。
【０１１４】
本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、脱毛性毛包炎、網状痕跡性紅斑性毛嚢包炎又はケロイド性毛包炎等の毛包炎の治療に用いることができる。例えば、抗ヘッジホッグ抗体の美容用製剤を偽性毛嚢炎（髭剃りに伴って、首の顎下領域に最もよく発生する慢性疾患であり、紅斑様の丘疹と包埋された毛を含む膿疱から成る病変を特徴とする）の治療において局所的に適用することもできる。
【０１１５】
本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、ヒトの毛髪の成長の調節方法に用いることができる。Sato et al,J.Clin.Invest.104:855-864(1999)では、新生児の皮膚内でのＳｈｈ活性の上方制御は、静止中の毛包を成長期に進入させ、続いて発毛を生じさせるように誘導する生物スイッチとして機能することが報告されている。Ｓａｔｏらは、アデノウイルスベクターＡｄＳｈｈを用いて、マウスＳｈｈ ｃＤＮＡを生後１９日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚に導入している。処理した皮膚では、Ｓｈｈ、Ｐａｔｃｈｅｄ及びＧｌｉ−１のｍＲＮＡ発現の増加が示された。ＡｄＳｈｈを受容したマウスでは、毛包のサイズとメラニン形成が増加し、毛髪特異的なケラチンｇｈＨｂ−１とメラニン合成関連チロシナーゼのｍＲＮＡが蓄積していたことから、成長期への加速が確認された（コントロールでは確認されなかった）。最後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＡｄＳｈｈを皮膚に投与した領域において、処置から数週間後に、新たな育毛発生の顕著な促進を示したが、コントロールベクターで処理した領域又は非処理領域では示さなかった。６月後、ＡｄＳｈｈ処置した皮膚は、正常な毛と正常な皮膚の形態を示した。従って、本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、Ｓｈｈ誘導性の発毛の制御又は調節に有用であろう。
【０１１６】
（２）過剰な上皮増殖
本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、過形成状態（例えば、角化症）及び高い増殖速度を特徴とする表皮の腫瘍状態（例えば、扁平細胞癌）の治療方法に用いることができる。また、対象方法は、皮膚を患う自己免疫疾患の治療、特に、乾癬又はアトピー性皮膚炎等の、表皮の病的な増殖及び／又は角質化を伴う皮膚病の治療にも用いることができる。局所的な皮膚の異常増殖を特徴とする通常の皮膚病（例えば、乾癬、扁平細胞癌、光線性角化症等）も、本発明の抗ヘッジホッグ抗体の適用により治療できることが期待される。
【０１１７】
角化性病変を特徴とする他の種々の疾患も、本発明の抗ヘッジホッグ抗体を用いた治療の候補である。例えば、光線性角化症は、太陽光に曝されて、照射された皮膚上に生じる、表層の炎症性の前悪性腫瘍である。現行の治療には、切除と冷凍外科手術が含まれる。これらの治療は、苦痛を伴うが、美容上許容不可能な瘢痕を作り出す場合がある。従って、光線性角化症等の角化症の治療には、損傷部位の表皮細胞／類表皮細胞の過剰増殖を阻害するのに十分な量のヘッジホッグアンタゴニスト組成物を適用することが含まれる。
【０１１８】
（３）アクネ
アクネは、本発明の抗ヘッジホッグ抗体により治療可能な更なる別の皮膚病を代表する。１０代及び若い成人に最も頻繁に生じる多因性疾患である尋常性ざ瘡は、顔及び体幹上半部の炎症性損傷及び非炎症性損傷の出現を特徴とする。尋常性ざ瘡に生じる基本的な欠陥は、過活性な皮脂腺の管の角質化過剰である。角質化過剰により、皮膚と小胞の微生物の正常な移動がブロックされ、その際に細菌のＰｒｏｐｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、並びに酵母のＰｉｔｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅによるリパーゼの放出が促進される。本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、ヘッジホッグアンタゴニストを用いた治療が有効であろう患者又は組織の同定のために使用し得る。特に局所用製剤を用いた治療は、例えば、角質化過剰等、損傷を形成するに至る管の移行特徴を防ぐためにも有用であろう。このようなヘッジホッグアンタゴニストを含む治療計画には、更に、抗生物質、レチノイド及び抗男性ホルモン等が含まれていてもよい。
【０１１９】
（４）皮膚炎及び他の皮膚病
本発明の抗ヘッジホッグ抗体は、種々の形態の皮膚炎の治療方法に用いることもできる。皮膚炎は、そう痒性、紅斑性、落屑性で、疱疹を伴い、湿潤性で、亀裂を有するか又は表面が硬い、境界があいまいな損傷を指す記述的用語である。これらの損傷は、広範囲な種々の要因のいずれによっても生じる。最も一般的な種類の皮膚炎は、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎及びおむつ皮膚炎である。例えば、脂漏性皮膚炎は、慢性の、通常そう痒性の皮膚炎であり、種々の領域、特に過剰量の乾燥板状鱗屑の落屑を伴う頭皮に、紅斑性、乾燥、湿潤、又は油脂性の板状鱗屑と黄色く表面が硬いパッチを伴う。対象方法の抗ヘッジホッグ抗体は、多くの場合慢性であり、通常は湿疹様の皮膚炎である、うっ血性皮膚炎の治療にも用いることができる。光線性皮膚炎は、例えば太陽光線、紫外線、又はＸ線若しくはγ腺照射等の光線照射への曝露に起因する皮膚炎である。本発明によれば、対象の方法を、上皮細胞の望ましくない増殖によって生じた皮膚炎の特定の症状の治療及び／又は予防に用いることができる。これら種々の形態の皮膚炎の治療には、局所的及び全身性のコルチコステロイド、止痒剤及び抗生物質が含まれる。
【０１２０】
対象方法により治療可能な更なる疾患は、ダニ症等、人間以外に特異的な疾患である。
【０１２１】
Ｊ．非標準的なヘッジホッグシグナル
本発明の抗ヘッジホッグ抗体を用いて、Ｐａｔｃｈｅｄ−Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄレセプター複合体及びＧｌｉ転写因子から独立した非標準的なＳｈｈ経路の活性を調節することができる。最近の報告、Jarov et al.,Dev.Biol.261(2):520-536(2003)には、Ｓｈｈを基質（細胞外マトリックス）に固定するか又はトランスフェクション後に神経上皮細胞により生産された場合、神経板体外移植組織は、分散できず、代わりに小型構造体を形成したことが記載されている。Ｓｈｈにより生じる神経上皮細胞の接着能力の変化は、表面のβ１−インテグリンの不活性化とＮ−角へリン媒介性細胞接着の増加の組み合わせによるものと考えられる。固定化されたＳｈｈは、可溶性のＳｈｈと同じ強さで、神経上皮細胞の運動ニューロン及び底板細胞への分化を促進したことから、このような固定Ｓｈｈ媒介性の接着は、既知の（可溶性の）Ｓｈｈ媒介性の誘導機能、有し分裂促進機能、及び栄養機能に抵触又は干渉することはない。神経管の形態発生における接着特性のＳｈｈによる調節は、迅速で可逆性であり、古典的なＰａｔｃｈｅｄ−Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ−Ｇｌｉシグナル伝達を伴うことなく、Ｓｈｈ媒介性の細胞分化から独立しており、識別可能であることが証明されている。Ｓｈｈに誘導される神経上皮細胞の接着特性の変更は、その分化促進作用に起因すると考えることはできないが、今まで説明されていなかった、この組織内でのＳｈｈの新たな機能が解明されたことになる。従って、本発明の抗ヘッジホッグ抗体を用いて、Ｐｔｃｈ、Ｓｍｏ、Ｆｕ、Ｓｕ（Ｆｕ）及び／又はＧｌｉから独立した非標準的なヘッジホッグ経路を制御することができる。より具体的には、このような抗ヘッジホッグ抗体を、好ましくは特定の発生段階において、神経組織又は他の適用可能な組織内での上記機能を混乱させる方法に用いることができる。
【０１２２】
ＩＩＩ．組成物及び方法
Ａ．抗ヘッジホッグ抗体
このような目的のために使用される例示的な抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。「抗体」なる用語は、また、抗原結合断片を含むこともある。
【０１２３】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
【０１２４】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０１２５】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
【０１２６】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０１２７】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親ミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１２８】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。これらの中でも、好ましいミエローマ細胞株は、マウスミエローマ株、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、及び例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものである。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１２９】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
【０１３０】
３．抗体断片
特定の状況において、抗体断片の使用は、全体の抗体より利点がある。
【０１３１】
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開９３/１６１８５；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である；したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
【０１３２】
Ｂ．抗ヘッジホッグ抗体
ここに記載した抗ヘッジホッグ抗体に加えて、本発明で使用するために、このような分子の変異体を調製し得ると考えられる。このような変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化が、ヘッジホッグ結合能を高めるために、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのこれらの分子の翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。アミノ酸配列の変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列と比較してアミノ酸配列の変化を生じる、アミノ酸配列をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。場合によっては、変異は、関心のあるポリペプチドの一つ又は複数のドメインにおける、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、関心のあるアミノ酸配列の配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
【０１３３】
種々の抗ヘッジホッグ抗体がここで提供されている。このような断片は、例えば完全長天然抗体又はタンパク質と比較した時に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。このような、所望の生物学的活性に必須ではない、アミノ酸残基を欠く断片は、また開示の方法に有用である。
【０１３４】
上のポリペプチド断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによって抗体又はポリペプチド断片を生成することが含まれる。さらにその他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の抗体又はポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、このような断片は、対応する全長分子と少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１３５】
特定の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換の項目で表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【０１３６】
表１
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【０１３７】
抗ヘッジホッグ変異体の機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は分子疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；  及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１３８】
非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又はより好ましくは、残された（非保存）部位に導入されうる。
【０１３９】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ変異などの、この分野で知られた方法を用いて行うことができる。部位特異的変異［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット変異［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限選択変異［Wells等, Philos. Trans.R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］又は他の周知の技術などをクローニングされたＤＮＡに対して行って抗ヘッジホッグ抗体分子を生産することができる。
【０１４０】
また、隣接する配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのに、スキャニングアミノ酸分析も用いることができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖高次構造を変える可能性が低いので、これらの群の中の典型的に好適なスキャンニングアミノ酸である[CunninghamおよびWells, Science, 244:1081-1085(1989)]。また、アラニンは、最も普通のアミノ酸であるので典型的に好ましい。さらに、隠れた及び露出した位置の両方で頻繁に見いだされる［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman &amp; Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)］。アラニン置換が適当な量の変異を生じない場合、アイソテリック(isoteric)なアミノ酸を用いることができる。
【０１４１】
また、抗ヘッジホッグ抗体変異体の適当な構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は、通常、セリンで置換することで、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をこのような分子に付加することにより、その安定性を向上させることができる（特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片の場合）。
【０１４２】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟がふくまれる。簡潔に言えば、高頻度可変領域部位（例えば、６-７部位）を変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と標的ポリペプチドとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
【０１４３】
抗ヘッジホッグ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で周知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、そして抗-ＴＡＴ抗体の早期に調製した変異体又は非変異体形のカセット突然変異誘発による、天然ソースからの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又は調製が含まれる。
【０１４４】
Ｃ．抗ヘッジホッグ抗体の調製
以下の記述は、主として、このような抗体をコードする核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより抗ヘッジホッグ抗体を生産することに関する。当然ながら、当該分野においてよく知られている他の方法を用いて、このような抗体を調製することができると考えられる。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。このような抗体のの種々の部分は別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望の生成物を生産してもよい。
【０１４５】
１．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載した抗ヘッジホッグ抗体生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
【０１４６】
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。上掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第89/05859号に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4399216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１４７】
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC31,446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC31,537)；大腸菌株Ｗ３１１０(ATCC27,325)及びＫ５７７２(ATCC53,635)である。他の適切な原核動物宿主細胞は、エシュリキア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異に影響を与えるように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒ２５を有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ＡＴＣＣ５５２４４)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
【０１４８】
完全長抗体及び抗体断片は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。完全長抗体は、血液循環でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、例えば、アイソタイプによってプロテインＡ又はＧカラムを介して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現させた抗体を精製するための工程と同じようにしておこなうことができる。
【０１４９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ヘッジホッグポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１５０】
グリコシル化ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
【０１５１】
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
【０１５２】
宿主細胞は、抗ヘッジホッグ抗体の生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【０１５３】
２．複製可能なベクターの選択及び使用
それぞれの抗ヘッジホッグ抗体をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入され得る。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【０１５４】
抗ヘッジホッグ抗体の軽鎖及び重鎖は、は直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入される抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１５５】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は種々の細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０１５６】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１５７】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、所望のタンパク質をコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【０１５８】
発現及びクローニングベクターは、通常、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列に作用可能に関連し、ｍＲＮＡ合成に指向するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第36,776号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまた所望のタンパク質配列をコードするＤＮＡと作用可能に関連したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０１５９】
酵母宿主と共に用いる好適なプロモーター配列の例には、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１６０】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に用いられる適切なベクターとプロモータは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【０１６１】
哺乳動物の宿主細胞におけるＤＮＡ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノム、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【０１６２】
抗ヘッジホッグ抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、前記のアミノ酸配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１６３】
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、所望のそれぞれの抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１６４】
組換え脊椎動物細胞培養でのそれぞれの抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【０１６５】
３．宿主細胞の培養
抗ヘッジホッグ抗体の生成に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてよい。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)、Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、Sigma)が、宿主細胞の培養に適している。さらに、 Hamら, Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnesら, Anal. Biochem.102:255(1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許第Ｒｅ．３０９８５号に記載されている任意の培地も、宿主細胞用の培養培地として使用されてよい。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばガラマイシン：ゲンタマイシン(登録商標))、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１６６】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０１６７】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１６８】
５．精製
抗ヘッジホッグ抗体は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。前記の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【０１６９】
前記は、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び所望分子ののエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定の抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドの性質に依存する。
【０１７０】
組換え技術を使用する場合、抗ヘッジホッグ抗体は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第１段階として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１７１】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986]）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１７２】
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５-４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０-０．２５Ｍ塩）で実施される。
【０１７３】
Ｄ．製造品及びキット
治療的な応用のため、製造品は、容器と、ヘッジホッグアンタゴニストとの組み合わせを含む、ヘッジホッグの発現検出のための使用を示す、容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、抗ヘッジホッグ抗体を含む組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る。ラベル又はパッケージ挿入物は、抗ヘッジホッグ抗体の使用のための指示書を更に含む。
【０１７４】
例えば、ヘッジホッグ発現細胞殺傷アッセイ、細胞からのヘッジホッグの精製又は免疫沈降のような、様々な他の目的のために有用なキットもまた提供され得る。ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの単離及び精製のため、キットはビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合させた、それぞれのヘッジホッグキナーゼ結合試薬を含み得る。例えば、ＩＨＣ、ＩＣＣ、ＩＳＨ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、インビトロでヘッジホッグポリペプチドを検知及び定量するためのような分子を含むキットが提供され得る。製造品と共に、キット及び容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を含む。容器は少なくとも１つのこのような本発明で使用することのできる抗ヘッジホッグ抗体を含む組成物を収容する。付加的な容器は、例えば、希釈剤及びバッファー、コントロール抗体を含み得る。ラベル又はパッケージ挿入物は、インビトロ又は診断における使用を意図した指示書だけでなく、組成物の詳細を提供し得る。
Ｅ．アンタゴニストを用いた治療
【０１７５】
本発明は、ヘッジホッグシグナルによって特徴付けられる疾患の診断方法を提供する。従って、治療を必要とする患者の同定に際して（即ち、ヘッジホッグシグナルの阻害）、ヘッジホッグアンタゴニストはそのような患者に投与され得る。ヘッジホッグアンタゴニストは、抗体、ｓｉＲＮＡ、小分子阻害剤、イムノアドヘシン、変異ヘッジホッグタンパク質又は当業者に周知の任意のヘッジホッグアンタゴニストであり得る。
【０１７６】
小分子アンタゴニストは、ＸＬ１３９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＩＰＩ−９２６（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）、ＩＰＩ−６０９（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）、ＷＯ２００６／０５０３５１に開示される化合物、及び任意の他の小分子ヘッジホッグ経路のアンタゴニストを含む、発明の診断方法によって同定される患者を治療するために、使用し得る。
【０１７７】
特に、小分子アンタゴニストは、Ａ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３がここに定義される通りの、一般式Ｉ：
0005715420.tif 000004
を有する化合物を含む発明の診断方法によって同定される患者を治療するために使用され得る。
【０１７８】
Ａは、それぞれが、ヒドロキシル, ハロゲン, アミノ, ニトロ, アルキル, アシル, アルキルスルホニル又はアルコキシで置換されていてもよい、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アシル又はアルコキシからなる群から選択される、０から３個（例えば、ｎは０から３である）のＲ２で置換される炭素環又は複素環であり；特定の実施態様では、Ａはアリール又はヘテロアリールで置換されていてもよい。特定の実施態様では、Ａはアリール又はヘテロアリールで置換されていてもよい。特定の実施態様では、Ａはベンゼン、チオフェン、チアゾール、イミダゾール、ピロール、Ｎ-アルキル ピロール、ピリジン、ピラゾール又はＮ-アルキルピラゾールで置換されていてもよい。特定の実施態様では、ＡはＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６及びＡ７：
0005715420.tif 000005
［上式中、
Ｚ１はＯ、Ｓ又はＮＲ５であり、ここでＲ５はＨ又はアルキルであり；Ｚ２はＣＨ、ＣＲ２’又はＮであり；Ｒ２はハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アシル又はアルコキシであり、それぞれは、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、アルキル、アシル、アルキルスルホニル又はアルコキシで置換されていてもよく；Ｒ２’はＨ、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アシル又はアルコキシであり、それぞれは、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、アルキル、アシル、アルキルスルホニル又はアルコキシで置換されていてもよく；ｎは０−３である
］
からなる群から選択される。特定の実施態様では、Ａは式Ａ１の環である。特定の実施態様では、Ａは、Ｚ１がＳであり、Ｚ２がＣＨ又はＮである、式Ａ１の環である。別の実施態様では、 Ａは、Ｚ１がＳであり、Ｚ２がＣＨである、即ち、チオフェンの、式Ａ１の環である。別の実施態様では、Ａは、Ｚ１がＳであり、Ｚ２がＮである、即ち、チアゾールの、式Ａ１の環である。別の実施態様では、Ａは、Ｒ２’がＨである、式Ａ１の環である。一実施態様では、Ａは、Ｒ２’がメチルである、式Ａ１の環である。別の実施態様では、Ａは、Ｒ２’がメチルである、環Ａ１である。特定の実施態様では、 Ａは環Ａ２である。.  別の実施態様では、ＡはＲ２が存在しなくてもよい、即ち、ｎが０である、式Ａ１の環である。別の実施態様では、ｎは１であり、Ｒ２はＣｌである。別の特定の実施態様では、式Ａ３の環である。一実施態様では、Ａは、Ｚ１がＳであり、Ｚ２がＮである、即ち、チアゾールの、式Ａ３の環である。別の実施態様では、Ａは、Ｚ１がＳであり、Ｚ２がＮであり、Ｒ２’がＣｌである、式Ａ３の環である。別の実施態様では、Ａは、Ｚ１がＳであり、Ｚ２がＣＨ（即ち、チオフェン）であり、Ｒ２’がＣｌである、式Ａ３の環である。
【０１７９】
特定の実施態様では、Ａは環Ａ１ａ、Ａ１ｂ、Ａ２ａ、Ａ３ａ、Ａ３ｂ、Ａ４ａ、Ａ５ａ、Ａ６ａ、Ａ７ａ：
0005715420.tif 000006
である。
【０１８０】
特定の実施態様では、Ａは式Ａ１ａの環である。別の実施態様では、Ａは式Ａ１ｂの環である。別の実施態様では、Ａは式Ａ２ａの環である。別の実施態様では、Ａは式Ａ３ａの環である。別の実施態様では、Ａは式Ａ３ｂの環である。別の実施態様では、Ａは式Ａ４ａの環である。
【０１８１】
Ｘは、Ｒ４はＨ又はアルキルである、アルキレン、ＮＲ４Ｃ(Ｏ)、ＮＲ４Ｃ(Ｓ)、Ｎ(Ｃ(Ｏ)Ｒ１)Ｃ(Ｏ)、ＮＲ４ＳＯ、ＮＲ４ＳＯ２、ＮＲ４Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＮＲ４Ｃ(Ｓ)ＮＨ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ４、Ｃ(Ｓ)ＮＲ４、ＮＲ４ＰＯ又はＮＲ４ＰＯ(ＯＨ)である。特定の実施態様では、Ｘは、環ＡとＲ１の間にアミド結合を形成する、ＮＲ４Ｃ(Ｏ)である。別の実施態様では、Ｘは、環ＡとＲ１の間にチオアミド結合を形成する、Ｎ４Ｃ(Ｓ)である。別の実施態様では、Ｘは、環ＡとＲ１の間に尿素結合を形成するＮＲ４Ｃ(Ｏ)ＮＨである。別の実施態様では、Ｘは、環ＡとＲ１の間にチオ尿素結合を形成するＮＲ４Ｃ(Ｓ)ＮＨである。別の実施態様では、Ｘは、Ｎ(Ｃ(Ｏ)Ｒ１)Ｃ(Ｏ)、即ち、窒素原子に、２個の-Ｃ(Ｏ)Ｒ１基が連結している。
【０１８２】
Ｙは存在しないか、ＣＨＲ４、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２又はＮＲ４であり、ここで、Ｒ４はここで定義される通りである。特定の実施態様では、ＹはＣＨＲ４である。特定の実施態様では、ＹはＮＲ４である。特定の実施態様では、ＹはＯである。特定の実施態様では、ＹはＳである。特定の実施態様では、ＹはＳＯである。特定の実施態様では、ＹはＳＯ２である。別の実施態様では、Ｙは存在しない、即ち、環Ａは直接ピリジル環の位置２に結合している。
【０１８３】
Ｒ１は、アルキル、炭素環又は複素環からなる群から選択され、それぞれは、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、カルボキシル、アミジノ、グアニジノ、カルボニル（即ち、＝Ｏ）、ニトロ、シアノ、アシル、アルキル、ハロアルキル、スルホニル、スルフニル、アルコキシ、アキルチオ、カルバモイル、アシルアミノ、スルファモイル、スルホンアミド、炭素環又は複素環で置換されていてもよく；ここで、前記アミノ、アミジノ、アルキル、アシル、スルホニル、スルフィニル、アルコキシ、アルキルチオ、カルバモイル、アシルアミノ、スルファモイル、スルホンアミド、炭素環及び複素環は、ハロゲン、ハロアキル、ヒドロキシ、カルボキシル、カルボニル，又アミノ、アルキル、アルコキシ、アシル、スルホニル、スルフニル、ホスフィネート、炭素環又は複素環で置換されていてもよく、これらは、ヒドロキシ、カルボキシル、カルボニル、アミノ、ハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、スルホニル、スルフィニル、アシル、炭素環又は複素環で置換されていてもよい。
【０１８４】
別の実施態様では、Ｒ１は、アルキル、炭素環又は複素環からなる群から選択され、それぞれは、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、カルボニル、ニトロ、シアノ、アシル、アルキル、ハロアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルコキシ、アルキルカルバモイル（即ち、ＲがＨ又はアルキルである、-ＣＯＮＲ-アルキル）、アルカノイルアミン（即ち、ＲがＨ又はアルキルである、-ＮＲＣＯ-アルキル）、アルキルスルファモイル（即ち、ＲがＨ又はアルキルである、-ＳＯ２ＮＲ-アルキル）、アルキルスルホンアミド（即ち、ＲがＨ又はアルキルである、-ＮＲ-ＳＯ２-アルキル）、炭素環又は複素環で置換さていてもよく；ここで前記アミノ、アルキル、アシル、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルコキシ、アルキルカルバモイル、アルカノイルアミン、アルキルスルファモイル、アルキルスルフォンアミド、炭素環又は複素環置換基は、アミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボニル、又は炭素環又は複素環で置換されていてもよく、これらは、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アルコキシ又はアシルで置換されていてもよい。
【０１８５】
特定の実施態様では、Ｒ１はアリール又はヘテロアリールで置換されていてもよい。特定の実施態様では、Ｒ１はフェニル基で置換されていてもよい。別の特定の実施態様では、Ｒ１はピリジン基で置換されていてもよい。特定の実施態様では、Ｒ１は式ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅ、ＩＩｆ、ＩＩｇ、ＩＩｈ、ＩＩｉ、ＩＩｊ、ＩＩｋ、ＩＩｌ、ＩＩｍ、ＩＩｎ又はＩＩｏ
0005715420.tif 000007
であり：
ここで、ＷはＯ、Ｓ又はＮＲ７であり、ここで、Ｒ７はＨ、アルキル、アシル、炭素環又は複素環であり、ここで、前記アルキル、アシル、炭素環又は複素環は、１−３  アミノ、ハロゲン、ヒドロキシ及びハロアルキルでそれぞれ置換されていてもよく；０は０から３である。特定の実施態様では、ＷはＳである。
【０１８６】
それぞれの例でＲ６は、独立に、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、カルボキシル、アミジノ、グアニジノ、カルボニル、ニトロ、シアノ、アシル、アルキル、ハロアルキル、スルホニル、スルフィニル、アルコキシ、アキルチオ、カルバモイル、アシルアミノ、スルファモイル、スルホンアミド、炭素環又は複素環であり、；ここで、前記アミノ、アミジノ、アルキル、アシル、スルホニル、スルフィニル、アルコキシ、アルキルチオ、カルバモイル、アシルアミノ、スルファモイル、スルホンアミド、炭素環又は複素環置換基は、ハロゲン、ハロアキル、ヒドロキシ、カルボキシル、カルボニル、又はアミノ、アルキル、アルコキシ、アシル、スルホニル、スルフィニル、ホスフィネート、炭素環又は複素環で置換されていてもよく、これらは、ヒドロキシ、カルボキシル、カルボニル、アミノ、ハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、スルホニル、スルフィニル、アシル、炭素環又は複素環で置換されていてもよい。
特定の実施態様では、それぞれの例でＲ６は、独立に、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、カルボニル、ニトロ、シアノ、アシル、アルキル、スルホニル、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルコキシ、アルキルカルバモイル、アルカノイルアミン、アルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミド、炭素環又は複素環であり；ここで前記アミノ、アルキル、カルボニル、アシル、スルホニル、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルコキシ、アルキルカルバモイル、アルカノイルアミン、アルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミド、炭素環又は複素環置換基は、アミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボニル、又は炭素環又は複素環で置換されていてもよく、これらは、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アルコキシ又はアシルで置換されていてもよい。
【０１８７】
特定の実施態様では、それぞれの例でＲ６は、独立に、アルキル（例えばメチル，トリフルオロメチル、ジメチルアミノメチル、ピペリジニルメチル、モルフォリノメチル、チオモルフォリノメチル）；ハロゲン（例えば、クロロ）；アルコキシ（例えば、メトキシ）；カルボニル（例えば、モルフォリノカルボニル、アセチル）；複素環（例えばモルフォリノ、Ｎ-メチル-ピペラジン-４-イル、Ｎ-アセチル-ピペラジン-４-イル、１Ｈ-１,２,４-トリアゾールｅ）；アルキルアミノ（例えば、ｉ-ブチルアミノ、ベンジルアミノ、ヒドロキシエチルアミノ、メトキシエチルアミノ、ジメチルアミノエチルアミノ、モルフォリノエチルアミノ、モルフォリノプロピルアミノ、ピロリジン-２-オン-置換プロピルアミノ、イミダゾール-エチルアミノ、イミダゾール-プロピルアミノ）；アリールアミノ（例えば、フェニルアミノ）；アルキルカルバモイル（例えば、ジメチルカルバモイル、ｉ-ブチルアミノカルボニル）；アルキルスルファモイル（例えば、プロピルアミノスルホニル、ｉ-ブチルアミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、ジメチルアミノエチルヒドロキシエチルアミノスルホニル、メトキシエチルアミノスルホニル、メトキシプロピルアミノスルホニル、メチルスルホニルエチルアミノスルホニル、イミダゾール-置換プロピルアミノスルホニル、ヒドロキシプロピルアミノスルホニル、２-ヒドロキシプロピルアミノスルホニル）；又はスルホニル（例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、アミノスルホニル、ジメチルアミノプロピルスルホニル、Ｎ-メチル-ピペラジン-４-イル-スルホニル、モルフォリノ-４-イル-スルホニル、トリフルオロメチルスルホニル）である。
【０１８８】
特定の実施態様では、Ｒ７はＨである。別の特定の実施態様では、Ｒ７はアシルで置換されていてもよい。別の特定の実施態様では、Ｒ７はアルキル（例えば、メチル）で置換されていてもよい。別の特定の実施態様では、  Ｒ７はアシル（例えば、アセチル、ベンゾイル）で置換されていてもよい。別の特定の実施態様では、Ｒ７はアリール基（例えば、フェニル、ベンジル）で置換されていてもよい。
【０１８９】
特定の実施態様では、Ｒ１式ＩＩａの群である。そのような実施態様では、Ｒ６はアルコキシであってもよく、ｏは１、２又は３である。特定のＩＩａ群はＩＩａ１−ＩＩａ２：
0005715420.tif 000008
である。
【０１９０】
別の特定の実施態様では、Ｒ１は式ＩＩｂの群である。このような実施態様では、Ｒ６はアルキル又はハロアルキル（例えば、ＣＦ３）であり得る。特定のＩＩｂ群は、ＩＩｂ１−ＩＩｂ３： 
0005715420.tif 000009
である。
【０１９１】
特定の実施態様では、式ＩＩｃの群である。このような実施態様では、ＷはＳであり得、ｏが０である。 別の特定の実施態様では 、Ｒ１は式ＩＩｄの群である。このような実施態様では、ｏは０であり得る。別の特定の実施態様では、Ｒ１は式ＩＩｅの群である。このような実施態様では、ｏは０であり得る。Ｒ１は式ＩＩｆの群である。このような実施態様では、ｏは０であり得る。
【０１９２】
別の特定の実施態様では、 Ｒ１は式ＩＩｎの群である。このような実施態様では、ｏは０又は２であり得、Ｒ６はアルキル又はアリールであり得る。 特定の実施態様では、群ＩＩｎは式ＩＩｎ１：
0005715420.tif 000010
を有する。
【０１９３】
別の特定の実施態様では、Ｒ１は式ＩＩｏの群である。このような実施態様では、ｏは０又は２であり得、Ｒ６はアルキル又はアリールであり得る。特定の実施態様では、群ＩＩｏは式ＩＩｏ１：
0005715420.tif 000011
を有する。
【０１９４】
Ｒ２は、それぞれが、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、アルキル、アシル、アルキルスルホニル又はアルコキシで置換されていてもよい、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アシル又はアルコキシである。ｎは０から３であり、例えば、０又は１である。特定の実施態様では、Ｒ２はヒドロキシである。特定の実施態様では、Ｒ２はアルキル又はハロゲン、メチル又はトリフルオロメチルで置換されたアルキルである。
特定の実施態様では、Ｒ２はアシルであり、例えば、アルカノイル（例えば、アセチル）である。特定の実施態様では、Ｒ２はハロゲンであり、例えば、Ｃｌ又はＦである。別の特定の実施態様では  Ｒ２はアルコキシであり、例えば、メトキシ又はエトキシである。 
【０１９５】
Ｒ３はハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシル、アルキル、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、アルキルスルフィド、スルフィニル、スルホニル、炭素環又は複素環であり、ここで、それぞれのアルキル、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、アルキルスルフィド、スルフィニル、スルホニル、炭素環又は複素環は、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、アルキル、アシル、スルホニル又はアルコキシで置換されていてもよい。特定の実施態様では、Ｒ３はハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシル、アルキル、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、アルキルスルフィド、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、炭素環又は複素環であり、ここで、それぞれのアルキル、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、アルキルスルフィド、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、炭素環又は複素環は、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、ニトロ、アルキル、アシル、アルキルスルホニル又はアルコキシで置換されていてもよく；一方で、ｍは０から３である。特定の実施態様では、Ｒ３はハロゲン（例えばＦ）、カルボキシル、又は置換されていてもよいアルキル（例えば、メチル、ヒドロキシメチル、ジメチルアミノメチル）、アルコキシカルボニル（例えば、メトキシカルボニル）又はカルバモイル（例えばジメチルアミノカルボニル）である。特定の実施態様では、ｍは０であり、即ち、Ｒ３は存在しない。別の特定の実施態様では、ｍは１から３である。
【０１９６】
特定の実施態様では、本発明の化合物は、Ｘ、Ｒ１、Ｒ３及びｍがここに定義される通りであり、Ｒ８はハロゲンである、一般式Ｉｂ：
0005715420.tif 000012
によって表される。一実施態様では、本発明の化合物は、一般式Ｉｂを有し、ＸはＮＲ４ＣＯである。更なる実施態様では、化合物は式Ｉｂであり、Ｒ３はＨ又はメチルである。
【０１９７】
別の特定の実施態様では、本発明の診断方法によって同定される患者の治療のために使用され得るアンタゴニストは、Ｘ、Ｒ３、Ｒ６、ｍ及びｏがここに定義される通りであり；Ｒ８はハロゲンであり；環Ｂは炭素環又は複素環である、一般式Ｉｂ’：
0005715420.tif 000013
によって表される。特定の実施態様では、Ｒ８はＣｌである。特定の実施態様では、環Ｂはフェニル又はピリジルである。特定の実施態様では、ＸはＮＲ４Ｃ(Ｏ)であり、Ｒ４はここで定義される通りである。
【０１９８】
別の特定の実施態様では、本発明の診断方法によって同定される患者の治療のために使用され得るアンタゴニストは、Ｘ、Ｒ１、Ｒ３及びｍがここに定義される通りの、一般式Ｉｃ：
0005715420.tif 000014
を有する。一実施態様では、本発明の診断方法によって同定される患者の治療のために使用され得るアンタゴニストは、一般式Ｉｂを有し、ＸはＮＲ４ＣＯである。更なる実施態様では、診断方法によって同定される患者の治療のために使用され得るアンタゴニストは、式Ｉｃであり、Ｒ３はＨ又はメチルであり、ｍは０又は１である。
【０１９９】
別の特定の実施態様では、本発明の診断方法によって同定される患者の治療のために使用され得るアンタゴニストは、Ｘ、Ｒ１、Ｒ３及びｍがここに定義される通りの、一般式Ｉｄ：
0005715420.tif 000015
を有する。一実施態様では、本発明の診断方法によって同定される患者の治療のために使用され得るアンタゴニストは、一般式Ｉｂを有し、ＸはＮＲ４ＣＯである。更なる実施態様では、診断方法によって同定される患者の治療のために使用され得るアンタゴニストは、式Ｉｄであり、Ｒ３はＨ、Ｃｌ又はトリフルオロメチルであり、ｍは０又は１である。
【０２００】
特に、本発明の診断方法で同定される患者の治療のために使用されるアンタゴニストは、限定されるものではないが、以下の通りである：
0005715420.tif 000016
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【０２０１】
本発明の診断方法によって同定される患者の治療のために使用され得るアンタゴニストは、一以上の非対称の炭素原子を含み得る。従って、化合物はジアステレオマー、エナンチオマー又はその混合物として存在し得る。化合物の合成は、ラセミ体、ジアステレオマー又はエナンチオマーを開始物質又は中間体とし得る。ジアステレオマー化合物は、クロマトグラフィー又は結晶法によって分離しうる。同様に、エナンチオマー混合体は、同様の技術又は当該分野に周知の技術を用いて分離し得る。それぞれの非対称炭素は、Ｒ又はＳ体であり得、両者のこれらの配置は、アンタゴニストとして使用し得る。
【実施例】
【０２０２】
実施例１
抗Ｈｈ抗体の調製
抗体調製：
ｐｈｏＡプロモーターの下流の天然シグナル配列の代わりに、Ｎ末端にユニザイムヒスチジン（ＨＱ）タグを有する、ｐＳＴ２９３ベクターに、ヒトＳｈｈ（ａａ２４から１９７）のＮ末端を、サブクローニングし、５８Ｆ３の大腸菌を形質転換した。開始培養液を、５０μ／ｍｌのカルベンシリンを含む、３０℃において、２４時間、５００ｍｌのＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸限定培地で、１：１００で希釈した。１００μｌの硫酸亜鉛をＳｈｈフォールディングを促進するために添加する、ＯＤ６００が約２（約７時間後）において、一旦、リン酸が培地から消失すると、ｐｈｏＡプロモーターは、タンパク質発現を誘導する。細胞ペレットは、５倍容量（ｗ／ｖ）の、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ３００を添加した溶解バッファー（２５ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ８．０、０．１５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）中に再懸濁し、マイクロ流動化装置を１０，０００ｐｓｉで３回通して溶解した。ホモジネートは４℃で６０分間１４，０００ｇで遠心し、Ｍｅｓ  ｐＨ５．０を添加し、５０ｍＭの最終濃度にした。溶解液を、５ｍｌの、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むバッファーＡ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム  ｐＨ５．５、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で事前に平衡化した、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに乗せた。カラムを４カラム容量（ＣＶ）のバッファーＡ、次いで４ＣＶの１５０ｍＭのＮａＣＬを含むバッファーＡで洗浄し、タンパク質を０．３から１．０ＭのＮａＣｌのグラジエントで、同じバッファーで溶出した。Ｓｈｈ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく）を含む画分を集め、イミダゾール（ｐＨ７．０）を添加し、最終濃度２０ｍＭとし、該物質を５ｍｌの、バッファーＢ（２５ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールで平衡化したＨｉｓ  Ｔｒａｐ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに乗せた。バッファーＢ中で５ＣＶの２０ｍＭのイミダゾール及び５ＣＶの２０から５０ｍＭのイミダゾールのグラジエントで洗浄した後、タンパク質は、同じバッファー中で５ＣＶの２５０ｍＭのイミダゾールで溶出した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、集めた溶出液の濃度を２８０ｎｍの吸光度から、Ｓｈｈの吸光係数１．１７（ｇ／ｌ）−１ｃｍ−１を用いて決定した。タンパク質を０．２μＭの濾過で滅菌し、一回使用分のアリコートを−８０℃で保存し、次いで、使用の直前に冷水で融解した。
【０２０３】
抗Ｓｈｈウサギポリクローナル抗体の産生
上記の方法で調製した２５０μｇのｈｉｓ−Ｓｈｈ−Ｎ抗原を２匹の３月齢のニュージーランド白ネズミ（５９Ａと５９Ｂと番号付け）に１：１の抗原：完全フロイントアジュバントを用いて注射し、次いで、（３０から４１週の空白期間をおいて）１週間おきに１：１の抗原：非完全フロイントアジュバント（Ｊｏｓｍａｎ  ｌａｂｓ、ＬＬＣ）で増強した。免疫血清を、同じ抗原（抗原溶液、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）において、９週目で１：２０００００の最大量を有するウサギ５９Ａ及び１１週目で１：２００００００を超える５９Ｂを用いて、連続希釈ＥＬＩＳＡで定量した。７から１１週目のウサギ５９Ａ及び３から１１週目のウサギ５９Ｂからの血液を、ＣＮＢ活性化セファロースビーズに結合したＳｈｈ−Ｎ抗原上で、アフィニティー精製し、精製した抗体をＰＢＳに対し透析し、保存のために−２０℃でフラッシュ凍結した。比較のため、ウサギポリクローナル抗Ｓｈｈ抗体Ｈ−１６０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−９２０、番号Ｋ０１０４）をヒトＳｈｈアミノ酸断片４１−２００に対し用いた。
【０２０４】
抗Ｓｈｈウサギモノクローナル抗体
４５及び５２週の増強に続き、ウサギ５９Ｂの脾臓（４６週において、１：１５０００の量）を切除してウサギミエローマ細胞（２４０−Ｅ１、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）とした。ハイブリドーマ上清をＨＱ−ｈＳｈｈ−Ｎ抗原においてＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ポジティブのものを（３２）更に、免疫蛍光によってＰＦＡ固定化ｈＳｈｈ形質転換ＣＯＳ細胞において、次いで下記の通りの免疫組織化学によって、ホルマリン固定化パラフィン包理ｈＳｈｈで形質転換した２９３細胞における再現性の確認のためにスクリーニングした。選出した４個のクローンを増やし、限定希釈によってサブクローニングし、上記の通り再試験した。１個の残りのポジティブ親（番号９５）からの３個の最も優れたサブクローンを、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコ９５．３、９５．７及び９５．９におけるスケールアップのために選択した。低血清培地における３ヶ月の培養後、上清をタンパクＡセファロースにおいて精製し、約１ｍｇの９５．３（Ｓｈｈ：４６６７）、１．２ｍｇの９５．７（Ｓｈｈ：４６６８）及び２ｍｇの９５．９（Ｓｈｈ：４６６９）を得た。
【０２０５】
免疫蛍光
ＣＯＳ−７細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を用いて、製造元のプロトコル従って、８ウェルのＬａｂＴｅｋＩＩスライド又は９６ウェルｂｌａｃｋ  ｗａｌｌｅｄ顕微鏡プレート（Ｗｈａｔｍａｎ）中で、スクリーニングのために、一時的にタグ化していないｐＣＭＶ．Ｓｐｏｒｔ６中の全長のヒトＳｈｈ（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＰ＿０００１８４）、Ｉｈｈ（ＮＰ＿００２１７２）又はＤｈｈ（ＮＰ＿０６６３８２）で形質転換した。６０時間の形質転換後、細胞を３％のＰＦＡで２０分間室温で固定化し、１０分間５０ｍＭの塩化アンモニウム中でクエンチし、１％のＢＳＡ及び２％のＦＢＳを含むＰＢＳ中の０．４％サポニン（Ｓｉｇｍａ）を用いて透過させた。親和精製ウサギポリクローナル及びモノクローナルは、５０ｍｇ／ｍｌで使用し、一方でハイブリドーマの上清は、１：２に希釈した。１０ｍｇ／ｍｌの５Ｅ１モノクローナル抗Ｓｈｈ（Ericson/Jessell 1998 Cell 87 p661）をポジティブコントロールとして使用した。抗体染色はＣｙ３ラベル化ウマ抗ウサギ（又は５Ｅ１に関してマウス）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出し、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１高容量スクリーニング顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及び／又はＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ及びローダミンフィルターを備えるＤｅｌｔａＶｉｓｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）顕微鏡を用いて落射蛍光顕微鏡で可視化した。
【０２０６】
免疫組織化学
ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を用いて、製造元のプロトコルに従って、１０個の１５ｃｍディッシュ中で、一時的にｐｃＤＮＡ３．１中のタグ化していないヒトＳｈｈ全長ｈＳｈｈ（Ｈ２００６−２２３（５））、Ｄｈｈ（Ｈ２００６−１６７６）又はｈＩｈｈ（Ｈ２００６−１６７７）で形質転換し、４８時間後にＰＢＳ中の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて回収した。細胞ペレットをホルマリン固定化及びパラフィン包理のために、標準のプロトコルに従って処理した。簡潔には、細胞を１０％のＮｅｕｔｒａｌＢｕｆｆｅｒｅｄＦｏｒｍａｌｉｎで固定化し、自動化処理器で処理し、パラフィン包理（ＦＦＰＥ）し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓスライドにおいて３μｍに切片化した。次いでスライドを脱パラフィン化し、Ｌｅｉｃａ（登録商標）自動染色器中で、キシレン及びアルコールの連続処理する前に、水で水和し、抗原再生のためにＰＴモジュール（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）中のＤａｋｏ（登録商標）ＴＡＲＧＥＴ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで事前処理した；この方法は９５．９に関して、ＤａｋｏＲ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ  ａｎｄ  Ｔｒｉｏｌｏｇｙ再生法よりよく機能する。内在性のペルオキシダーゼ活性を次いで、スライドをＫＰＬ溶液（ＫＰＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）中、室温で４分間クエンチした。内在性のイムノグロブリンを遮断血清で遮断した後、スライドを３工程のプロトコルにおいて、種々のウサギ抗Ｈｈ一次抗体又はニートのハイブリドーマ上清次いでビオチン化した抗ウサギ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）次いでＡＢＣ複合体（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）用いるＤａｋｏ（登録商標）自動染色器上で染色し、色原体としてＤＡＢ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて可視化した。上清中の弱い抗体の検出を最大化するために、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）次いでＡＢＣ複合体の代わりにストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＴＳＡ  ｋｉｔ）を用いて、更なる増幅工程を加えた。メイヤーズヘマトキシリンでスライドをカウンター染色し、アルコール及びキシレンで連続して脱水し、有機マウント溶媒（Ｐｅｒｍａｍｏｕｎｔ）を用いてカバースリップした。天然のウサギＩｇＧ（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をネガティブコントロールとして使用し、ウサギ抗ＨｈＨ−１６０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｃ−９０２４）をポジティブコントロールとして使用した。精製した９５．９ｒＭａｂの染色は、５μg／ｍｌで最適となり、これとＨ−１６０の両者はＴＳＡ増幅なしに最もよく機能し、バックグラウンドを最小化した。
【０２０７】
ＨｈサンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍｌの抗Ｓｈｈ／Ｉｈｈモノクローナル抗体ＡＡ．Ｆ１０（Ｃｒｕｉｓ、Ｉｎｃ）又は９５．９で４℃において、終夜被覆し、漸増濃度の組み換えオクチルＳｈｈと共に、室温で１時間アッセイ希釈剤（ＰＢＳ中の、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１５ｐｐｍのプロクリン）中でインキュベートした。洗浄後、結合したオクチルＳｈｈを０．１μｇ／ｍｌのビオチン化５Ｅ１抗Ｈｈ（抗Ｓｈｈ／Ｉｈｈ／Ｄｈｈ）で１時間、５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン化ＨＲＰで３０分間、連続してインキュベーションすることにより、検出し、次いで、ＴＭＢ基質で可視化し、６５０ｎｍを測定した。ＥＬＩＳＡは、３回実施し、ＯＤ６５０をオクチルＳｈｈの濃度±平均標準誤差に対しプロットした。被覆ＡｂとしてＡＡ．Ｆ１０を使用し、このアッセイは、再現性のある７８ｐｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの範囲のオクチルＳｈｈを検出した。
【０２０８】
結果
Ｈｈに対するウサギモノクローナルの産生
Ｎ末端にユニザイムタグを有する、大腸菌で発現するヒトＳｈｈ−Ｎに対する２個のウサギポリクローナル抗体を産生した。ウサギ５９Ａ及び５９Ｂの両者がよく応答し、１１週目の追加免疫によって、価数はそれぞれ、１：２０００００及び１：２００万を越えた。価数が１：７０００を越える全ての血液を集め、抗原においてアフィニティー精製し、得られた抗体を現行の「代表標準」であるＨ−１６０抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、Ｓｈｈ−形質転換細胞の免疫蛍光（ＩＦ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）及びウェスタンブロットにより比較した。ウサギポリクローナル抗体は、Ｈ−１６０によって得られた染色（図１Ｃ）と同様に、定常形質転換したＳｈｈ−ＣＯＳ細胞の小胞体においてＳｈｈを染色した（図１Ａ）が、形質転換していないＣＯＳ細胞において明確な核のバックグラウンドが幾らかあった（図１Ｂ）。ＩＨＣ（図２Ｃ）によって、それは細胞質及びホルマリン−５で固定化し、パラフィン包理した２９３細胞ペレットの細胞膜中のＳｈｈをまた認識し（図２Ｃ）、再び、形質転換していない細胞における幾らかのバックグラウンド染色を伴ったが（図２Ｄ）、そうでなければＨ−１６０染色よりもわずかに強かった（図２Ｂ）。
【０２０９】
ウサギモノクローナル抗体（ｒｍＡｂｓ）は理論的に無制限の試薬の供給を提供するだけでなく、より特異的なエピトープを混合ポリクローナルより高い親和性で認識する利点を有する。より価数の高いウサギ５９Ｂの脾臓は、従ってウサギミエローマ細胞とウサギハイブリドーマを産生するために融合した。。９６ウェルのこれらの上清は、ＳｈｈＮ抗原においてＥＬＩＳＡによってスクリーニングし（データ示さず）、更に増やし、ＩＦ及びＩＨＣによって上記の通り再現性について選択した。３２個の初期ＥＬＩＳＡ＋親クローンのうち、１個（クローン番号９５）は、ポジティブとして残り、次いでサブクローニングし、３個の最も強いＩＨＣ＋サブクローン：９５．３、９５．７及び９５．９を選択した。全ての３個のサブクローンは、ミエローマ融合相手の内在性（非Ｓｈｈ反応性）重鎖の存在が配列解析を複雑にするが、Ｓｈｈ形質転換細胞の類似した免疫染色（図３上段）に基づけば、同じ可能性があり、実際Ｎ末端配列は同じである（図４Ａ）。
【０２１０】
そのより高い収率によって、９５．９をスケールアップ及び精製のために選択した。ＩＦ（図１Ｅ）及びＩＨＣ（図２Ｅ）によって、それは形質転換した細胞におけるＳｈｈを認識するが、ＩＦによる非形質転換細胞におけるより低いバックグラウンド染色（図１Ｆ、２Ｄ）によって判断されるように、それが由来するポリクローナルよりもきれいである。９５．９ｒｍＡｂは、その抗原を検出するためにＴＳＡ増幅を必要としなかった。無関係抗原に対する別のウサギモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステム）は、バックグラウンドの細胞質染色の結果となる（図２Ａ、データ示さず）ので、Ｓｈｈ形質転換細胞は、特異的である。更に、Ｓｈｈ特異的な染色は、Ｈ−１６０抗体よりも強い（図２Ｅと２Ｂを比較されたい）。
【０２１１】
Ｓｈｈ−Ｎに対して挙げられたが、９５．９及びその姉妹クローンの９５．３及び９５．７は、Ｈ−１６０に類似した、形質転換した全長のクローンＩＦ（図３Ａ）、ＩＨＣ（データ示さず）、及びウエスタンブロット（図３Ｂ）によって判断されるように、８９％同一のＩｈｈ−Ｎ及び７４％同一のＤｈｈ−Ｎと交差反応し、従って、我々はこれらの抗体を抗Ｈｈと呼ぶ。ウェスタンブロットによって、Ｈｈの未処理ＥＲ形態である全長Ｈｈ（約５０ｋＤａ）及び切断Ｈｈ−Ｎ（約２５ｋＤａ）の両者が形質転換した細胞において検出された（全長Ｓｈｈの発現がより少ない安定Ｓｈｈ／ＣＯＳ細胞において、全長バンドはより明確ではないか又は存在しないが（データ示さず））。Ｈ−１６０によって検出された約９５ｋＤａのバンドは、その大きさ及び非形質転換細胞における存在ゆえに、非特異的であると考えられているが、非形質転換細胞において９５．９によって認識されなかった（Ｄｈｈ形質転換細胞において出現するが、Ｄｈｈダイマーの一種であろう。）唯一のアミノ酸の違い（ヒト配列のＳｅｒ６７はマウスにおいてはＴｈｒである）があるだけなので、９５．９の特異性及び感度を調べる方法の１つとしてマウス胚を染めることが可能であると期待されるように、全ての３個の抗Ｈｈクローン及びＨ−１６０は、また全ての３個の技術を使用することにより、マウスのＳｈｈ−Ｎと交差反応する。
【０２１２】
９５．９のエピトープは、ヒスタグ化ｈＳｈｈのトリプシン消化によって残基７５から９６に位置付けられ、これは、ｈＩｈｈにおいて１００％同一であり、ｈＤｈｈにおいて、３個のアミノ酸残基だけが異なり（図５）、従って、９５．９はＳｈｈ及びＩｈｈを、同じではない場合でも、類似の感度で検知するであろうことを示唆し、該抗体が、全ての３個のリガンドと交差反応することができる能力を説明する。それに加えて、このペプチドは、以前に確立されたＰｔｃｈ及び５Ｅ１阻害抗体の結合部位（Pepinsky等(2000) J. Biol. Chem. 275(15):10995-11001）に対してＳｈｈの反対の面において見出され、９５．９がＨｈ結合に関して５Ｅ１と競合することができないことを支持する（データは示さないが、図１１を参照されたい）。
【０２１３】
９５．９抗ＨｈｒｍＡｂは、ＩＨＣ染色によってＨ−１６０ポリクローナルより優れた感度及び特異性を示す。
幾つかの抗Ｈｈ抗体は、組み換えＨｈを認識することを示すが、内在組織又は腫瘍における低レベルの存在の染色は、特にＦＦＰＥ標本において、より成功しにくい。９５．９は、ＦＦＰＥ固定化Ｈｈを認識する能力に関して９５．９は選択されたので、内在性のＨｈの検出のために十分に感度があり特異的かどうかを決定することは興味深いことであった。この目的のために、発生におけるＳｈｈｍＲＮＡの分布は、Ｅ１０．５段階において、脊索及び神経管腹側底盤（ここからＳｈｈは神経管に拡散し、種々の神経の運命を特定するために、モルフォゲングラジエントを形成すると考えられている）（Wilson及びMaden (2005) Dev. Biol. 282(1):1-13)を参照されたい）、並びに中腸（ここで、腸の上皮の形態形成に関する）（Bitgood and McMahon (1995) Dev. Biol. 172(1):126-138）及び後肢芽（ここで、適切な指の形成を制御する）（Chuong等(2000) Cell Mol Life Sci. 57(12):1672-1681； Johnson等(1994) Curr Opin Genet Dev. 4(4):535-542）において豊富であることがインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によってよく報告されているので、我々はマウス胚の発生を調べた。ｍＲＮＡが翻訳されている直接の証拠は、モノクローナル抗Ｓｈｈ抗体５Ｅ１を用いた凍結した胚の脊索及び底盤の染色であるが、この抗体は、所定の腫瘍バイオプシーのようなＦＦＰＥ固定化標本におけるｓｈｈを不十分に染色し、従って、試験的なＨｈ発現腫瘍の診断としての可能性を制限する。これに対し、抗Ｓｈｈ抗体９５．９は、Ｅ１０．５マウス胚の脊索及び神経管腹側底盤を、（以前にまたＳｈｈ／２９３細胞におけるＨ−１６０に関して最適であった）同じ染色条件下で、Ｈ−１６０（図６Ｂ）よりもはるかに強く特異的に染めた（図６Ａの茶染色）。Ｅ１１．５において、神経管腹側及び底盤だけでなく（図６Ｃ）、底盤から離れて広がる構造のわずかな染色もまた明らかである（図６Ｄ）。このことは、Ｈｈのモルフォゲンとしての予想される役割に一致し得る一方で、ＳｈｈのｍＲＮＡは受ける細胞において重ならないであろうから、この発現が確かなものかどうか決定するためにＧｌｉ１又はＰｔｃ１との任意の重なりを確認するためのＩＳＨによってこのことを確認するべきである。もし真実であれば、それは最初のＨｈグラジエントの直接的な可視化を示唆するものである。Ｈｈ染色は、先のＩＳＨの結果から予想されるように、また神経上皮が発生する終脳胞及び第４脳室の間の脳（Ｅ１１．５；図６Ｅ）並びに中腸上皮（図６Ｆ）においても存在した。Ｈｈが見出されることが予想されない胚の如何なる場所においても染色はなく、９５．９の特異性が示された。
【０２１４】
９５．９の感度の更なる試験として、我々は、Ｑ−ＰＣＲによってＳｈｈ（及びＩｈｈ及びＤｈｈ）のｍＲＮＡのレベルを事前に決定し、ＩＨＣによって３６個のヒト結腸癌細胞のパネルを解析した。Ｓｈｈの決定的閾値（Ｃｔ）は、ＲＫＯ及びＣｏｌｏ３２０細胞において検知できないもの（３８のＣｔより下）から、最も発現する細胞株の２４の範囲であった。重要なことには、全ての３個のＨｈｍＲＮＡを欠いた（ＤＬＤ−１のような）細胞株はいずれも９５．９による如何なる染色も示さず、従って、抗体のヘッジホッグへの特異性が示された。９５．９による細胞質及び膜の染色に基づき、種々の細胞株を３個のポジティブカテゴリーにグループ化することができる：低い（１＋のようなスコア；例えば図７Ｂ）；穏やかな（２＋；例えば図７Ｃ）又は高い（３＋；例えば図７Ｄ）Ｈｈ発現。ハウスキーピング遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）に対して正規化したΔＣｔ値をＩＨＣスコアに対しプロットし、より高いＩＨＣスコアにより高いｍＲＮＡ値が伴い（より低いΔＣｔ値）、Ｓｐｅａｒｍａｎ係数が−５  ０．６１（図７Ｅ）であることを示した（図７Ｅ）。Ｓｈｈに加えて（特に３＋細胞株のＳＷ４０３及び２＋細胞株ＨＴ２９）、幾つかの細胞株はまたＩｈｈを発現し、９５．９によって同等によく認識され（エピトープ中の１００％配列相同性に基づく）、それにもかかわらず統計上有意（ｐ＝０．０００１）なので、相関は完全ではなかった。これらのデータはＩＨＣによって、９５．９がＨｈ発現ＦＦＰＥ処理癌細胞株を便利に同定することができることを示唆する。重要なことには、インビボでＧＤＣ−０４９９（及び５Ｅ１）、ＬＳ１８０及びＨＴ５５（データ示さず）によく応答する、２個の結腸のゼノグラフト細胞株は、Ｈｈを１＋レベルだけ発現し（図７Ｅ）、Ｈｈアンタゴニスト治療のための腫瘍選択において重要なＨｈの高発現よりも、Ｈｈが存在し得ることを示唆する。この点において、Ｈ１６０よりも高い９５．９の感度は、より高割合の１＋の発現検出を可能にし得、従って、より優れた抗体とする。
【０２１５】
Ｈｈを発現しない腫瘍は、そのような治療に応答しないであろうから、一次腫瘍バイオプシーにおけるＨｈの検出は、Ｈｈアンタゴニストを用いた治療のための、ＩＩＩ型（膵臓のＨｈリガンドドリブンの）癌患者の選択のために有用であり得る。我々は、従って、以前にＩＳＨによってＳｈｈが発現することが示されたヒト卵巣癌において、９５．９がＨｈを検出することが可能であるかどうかを決定するために探求した。実際に、９５．９は、Ｓｈｈ−（＋）を強くラベル化し、異なるＳｈｈ−（−）卵巣腫瘍はせず（図８）、その有用性及び特異性が確認された。
【０２１６】
９５．９のＨ−１６０への特異性及び明らかに優れた感度に助長され、我々は、卵巣（７２個の腫瘍及び２個の正常、データ示さず）、結腸（９９腫瘍及び４４正常）及び膵臓（１０５腫瘍及び１７正常）からの、より多数の標本におけるＨｈ発現の普及の決定を進め、細胞質染色を、それぞれの組織型のそれぞれのカテゴリーからのそれぞれの像を図９Ａに示す、なし（０＋）、弱い（１＋）、穏やか（２＋）、強い（３＋）に分類した。約２０％の両方の腫瘍及び正常結腸サンプル（図９Ｂ）は、特異的な細胞質及び膜Ｈｈ染色（Ｈｈは、細胞のこの部位に存在していると予想されないので、如何なる核のバックグラウンドも、非特異的と見なされる。）を欠いた。残りの８０％は、Ｈｈポジティブであり、ほとんどが１＋発現（６８％腫瘍及び５４％正常）、より少ないものが２＋発現（１０％腫瘍及び２３％正常）及び更に少ないものが３＋染色（３％腫瘍及び正常はなし）であった。同様に、より低い発現が殆どの卵巣サンプル（５７％腫瘍及び２／２正常が１＋と見なされる）で見出され、３１％が２＋、６％が３＋カテゴリーであり、７％がネガティブ腫瘍であった。同様に、４１％の正常膵臓標本と比較して、１０５個の腫瘍の２３％がネガティブと見なされ；７０％の腫瘍及び４１％の正常が低レベル（１＋）のＨｈを発現し；７％の腫瘍及び１８％の正常が、２＋レベルの発現をし；強い染色を示す標本は無かった。これらの結果は、Ｈｈ発現は、正常組織よりも腫瘍において非常に強いように見えず、標本間で発現の範囲があることを示唆する。重要なことには、２３％までの腫瘍のサンプルは、この分析においてＨｈ発現を欠いており、Ｈｈ発現の欠損に関連する何らかの応答の欠損があるかどうかを決定するために、Ｈｈアンタゴニストを用いた臨床試験を受けている患者におけるＨｈ発現を評価することは価値があり得ることを示唆する。本発明の抗Ｈｈ抗体をＨｈ発現レベルがアンタゴニスト治療への応答に関連するかどうかを決定するために使用できる可能性もある。
【０２１７】
最終的に、我々は、毛嚢のような、低発現組織における抗Ｈｈ抗体９５．９の感度の決定を望んだ。Ｈｈ  ｍＲＮＡは、毛嚢において、インサイツハイブリダイゼーションによって、検出され（Iseki 等(1996) Biochem Biophys Res Commun. 218(3):688-693）、更に、ブロッキング抗体５Ｅ１又はＨｈアンタゴニストシクロパミンの注射は、マウス胚における髪の発生を阻害し（Wang 等(2000) J. Invest. Dermatol. 114(5):901-901; Chiang, 等  (1999) Dev. Biol. 205(1):1-9）、この組織におけるＨｈシグナルが必須であることを強く示唆する。しかし、Ｈｈタンパク質は、ＦＦＰＥ皮膚標本において、ＩＨＣによって認められなかったが、これは、不適切な抗体の感度が最も確からしい原因である。Ｈｈシグナルは、髪の成長期において高まるが、休止期において活性が低いことが知られており（Sato 等(1999) J. Clin. Invest. 104(7):855-864）、成体マウスにおいては、髪の成長は、成長期が４週齢において起きるように同調し、９５．９染色で検知された通り、両者のＳｈｈタンパク質について成長のこの時期において、強いシグナルを示した（図１０Ａ）。ヒトにおいて、髪の成長は同調せず、毛嚢のサブセットは、任意の時間において、成長期にあるはずである。実際我々は約１０％のヒト胎児頭皮の髪嚢が、アンチセンス（図１０Ｂ）を用いて、Ｓｈｈ特異的シグナルを示したが、センスプロープでは示さない（データ記さず）ことを観察した。従って、髪嚢のサブセットは、Ｈ１６０で得られた非常にわずかな染色（図１０Ｄ、Ｆ）に比べはるかに強い、真皮乳頭より上の近傍上皮のよく知られた染色（図１０Ｃ、Ｅ）を伴う、９５．９の反応性を示した。従って、９５．９は、成長期毛嚢における低レベルのＨｈの検知できるほど十分に高感度であり、この点において、Ｈ１６０よりも優れている。このことは、９５．９が、Ｈ１６０より大きな割合のＨｈ発現腫瘍サンプルを検出する可能性があり、Ｈｈアンタゴニスト治療の見込み患者の臨床選択のためのＩＨＣキット開発のための試薬の選択肢となることを示唆する。
【０２１８】
実施例２
癌又は腫瘍中のヘッジホッグキナーゼポリペプチドの上方制御を検出するためのマイクロアレイ解析
多くの場合数千種類の遺伝子配列を含む核酸マイクロアレイは、疾患組織とその正常な同等物との比較において、差次的に発現される遺伝子の同定に有用である。核酸マイクロアレイを用いる際には、試験組織サンプル及びコントロール組織サンプルからの試験ｍＲＮＡサンプル及びコントロールｍＲＮＡサンプルを逆転写して標識することでｃＤＮＡプローブを作製する。次にｃＤＮＡプローブを、固相支持体に固相化された核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイは、アレイの各メンバーの配列と位置が分かるように配置されている。例えば、特定の疾患状態で発現することが知られている遺伝子の選択物を、固相支持体上にアレイすることもできる。特定のアレイメンバーを有する標識プローブがハイブリダイズした場合には、このプローブが由来するサンプルで、その遺伝子が発現されていることを示す。試験サンプル（疾患組織）由来のプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロールサンプル（正常組織）由来のプローブのハイブリダイゼーションよりも強い場合、疾患組織内で発現される遺伝子又は遺伝子群が同定されたことになる。この結果は、疾患組織内で過剰発現されるタンパク質は、疾患状態の存在の診断マーカーとして有用なだけでなく、その疾患状態の処置のための、治療標的としても有用であることを示している。
【０２１９】
核酸のハイブリダイゼーション方法及びマイクロアレイ技術は、当該技術分野においてよく知られている。本実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ用の核酸の具体的調整、スライド、並びにハイブリダイゼーション条件は、全て２００１年３月３０日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２号に詳細に記載されており、この出願の記載は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
実施例３
ヘッジホッグキナーゼｍＲＮＡ発現の定量的解析
本アッセイにおいて、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）等）及びリアルタイム定量的ＰＣＲ（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｚｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ事業部、フォスターシティー、カリフォルニア州））を用いて、癌性の神経膠腫に、他の癌腫又は正常な非癌性組織と比べて、有意に過剰発現する遺伝子を見つける。５’ヌクレアーゼアッセイは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、リアルタイムで遺伝子発現をモニターする蛍光ＰＣＲを基礎とする技術である。２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（その配列は、目的の遺伝子又はＥＳＴ配列に基づく）を用いて、ＰＣＲ反応に典型的な増幅産物を作り出す。第３のオリゴヌクレオチド、又はプライマーは、これら２種類のＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。プローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によっても伸長することはできず、レポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素で標識されている。レポーター色素からのレーザー誘起されたいずれの放出も、レポーター色素とクエンチャー色素がプローブ上に存在することで相互に近く位置する場合には、クエンチャー色素によってクエンチングされている。ＰＣＲ増幅反応時に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、鋳型依存的にプローブを切断する。生じるプローブ断片は溶液中で解離して、レポーター色素から放出されるシグナルは、第２のフルオロフォアによるクエンチング効果から解放される。新しい分子が合成される度に１分子のレポーター色素が遊離することになり、クエンチングされていないレポーター色素の検出により、データの定量的な解釈の基礎が提供される。当該技術分野においては、このアッセイはよく知られており、２種類の異なるヒト組織サンプル間の遺伝子発現の差を定量的に同定するためにルーチン的に使用されている。例えば、以下を参照：Higuchi等、Biotechnology 10:413-417(1992)；Livak等、PCR Methods Appl.、4:357-362(1995)；Heid等、Genome Res.6:986-994(1996)；Pennica等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(25):14717-14722(1998)；Pitti等、Nature 396(6712):699-703(1998)及びBieche等、Int.J.Cancer 78:661-666(1998)。
【０２２１】
５’ヌクレアーゼ処理は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ等のリアルタイム定量的ＰＣＲ装置上で行う。このシステムは、サーマルサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及びコンピューターから構成される。このシステムは、サーマルサイクラー上の９６ウェルフォーマット中でサンプルを増幅させる。増幅期間中、レーザーで誘起された蛍光シグナルは、９６ウェル全てについて、光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムに回収され、ＣＣＤで検出される。このシステムには、装置の運転用とデータの解析用のソフトウェアが含まれる。
【０２２２】
スクリーニング用の開始材料は、種々の癌組織から単離されたｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、例えば、蛍光定量的に、正確に定量される。ネガティブコントロールとしては、テストする癌組織と同一組織種の種々の正常組織からＲＮＡを単離する。多くの場合、腫瘍サンプルは、同一組織種の「マッチした（ｍａｔｃｈｅｄ）」正常サンプルと直接比較される。即ち、腫瘍サンプルと正常サンプルは、同一の個体から得られることを意味する。
【０２２３】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクル数として表示される。これは、レポーターシグナルが、蛍光のバックグラウンドレベルを上回るまで蓄積したサイクル数として定義される。ΔＣｔ値は、癌のｍＲＮＡの結果を正常なヒトｍＲＮＡの結果と比較する際に、核酸サンプル中の特定の標的配列の開始時における相対的なコピー数の定量的測定値として用いられる。１Ｃｔ単位は、１ＰＣＲサイクル又は正常に対して約２倍の相対的増加に相当することから、２単位は４倍の相対的増加に相当し、３単位は８倍の相対的増加に相当する等、２種類以上の異なる組織間のｍＲＮＡ発現の相対的倍数増加を定量的に測定することが可能である。上記の点に関しては、このアッセイが、ヒト腫瘍組織における、正常コントロールと比較して少なくとも２倍のｍＲＮＡ発現の増加を再現性をもって検出するのに十分な技術的感度を有することが当該技術分野において十分に認められている。
【０２２４】
実施例４：インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織試料中の核酸配列の検出及び位置決定のための強力で多様性に富む技術である。例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の解析、ウイルス感染の同定及び位置決定、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡、及び染色体マッピングの補助において有用であろう。
【０２２５】
インサイツハイブリダイゼーションは、ＰＣＲで作製した３３Ｐ−標識リボプローブを用いて、Lu and Gillett,Cell Vision 1:169-176(1994）によるプロトコルを最適化したバージョンに従って行う。簡潔に言うと、ホルマリン固定してパラフィン包埋したヒト組織を切片にして、脱パラフィンして、プロテイナーゼＫ（２０ ｇ／ｍｌ）中にて３１℃で１５分間かけて除タンパクし、更に上記のＬｕ ａｎｄ Ｇｉｌｌｅｔｔに記載されるようにインサイツハイブリダイゼーション用に加工する。［３３−Ｐ］ ＵＴＰ標識したアンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から作製して、５５℃で一晩かけてバイブリダイズさせる。スライドを、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｃｋ ｅｍｕｌｓｉｏｎに浸して、４週間露光させる。
【０２２６】
３３Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ ｍＣｉ）の３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １００２、ＳＡ＜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を高速真空乾燥させた。乾燥した３３Ｐ−ＵＴＰを含む各チューブに、以下の成分を添加した。
２．０μｌ ５ｘ 転写バッファー
１．０μｌ ＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌ ＮＴＰミックス（２．５ｍＭ：１０μ；各１０ｍＭのＧＴＰ、ＣＴＰ及びＡＴＰ ＋ １０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌ ＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌ Ｒｎａｓｉｎ
１．０μｌ ＤＮＡ鋳型（１μｇ）
１．０μｌ Ｈ２Ｏ
１．０μｌ ＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ産物Ｔ３ ＝ ＡＳ、Ｔ７ ＝ Ｓ）
【０２２７】
チューブを３７℃で１時間インキュベートする。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートする。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．６）／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０））を添加し、混合物をＤＥ８１ペーパー上にピペットする。残った溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ− ５０限外濾過ユニットに注入し、プログラム１０を用いてスピンする（６分間）。ろ過ユニットを第２チューブ上に反転して装着し、プログラム２を用いてスピンする（３分間）。最後の回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加する。１μｌの最終産物をＤＥ８１上にピペットし、６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ ＩＩの中でカウントする。
【０２２８】
プローブはＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動させる。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩを３μｌのローディングバッファーに添加する、９５℃ヒートブロック上で３分間加熱した後、プローブを直ちに氷上に静置する。ゲルのウェルを洗い流し、サンプルをローディングして、１８０−２５０ボルトで４５分間泳動する。ゲルをサランラップで包み、‐７０℃の冷凍庫にて増感スクリーンと共にＸＡＲフィルムに１時間ないし一晩暴露させる。
【０２２９】
３３Ｐ−ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の事前処理
スライドを冷凍庫から取り出してアルミニウム製トレー上において、室温で５分間かけて解凍する。トレーを５５℃のインキュベーター内に５分間静置して、濃度を低下させる。スライドは、ドラフト内において氷上にて４％ホルムアルデヒド中で１０分間かけて固定し、０．５ ｘ ＳＳＣで、室温で５分間かけて洗浄する（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ2Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌ のプロテイナーゼＫ中で３７℃で１０分間かけて脱タンパクした後（２５０ｍｌの事前に暖めたＲＮａｓｅ不含ＲＮＡｓｅバッファー中に１２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）、切片を０．５ｘＳＳＣ中で室温で１０分間かけて洗浄する。切片は、７０％、９５％、１００％エタノール中で、各２分間かけて脱水する。
【０２３０】
Ｂ．パラフィン包埋した切片の事前処理
切片を脱パラフィンしてＳＱ Ｈ2Ｏ中に静置し、２ｘＳＳＣで、室温にて各５分間かけて２回リンスする。切片を、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ不含ＲＮＡｓｅバッファー中に５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲｎａｓｅバッファー中に１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織中で除タンパクする。これに続く０．５ｘＳＳＣ中でのリンスと脱水は、上記のように行う。
【０２３１】
Ｃ．プレハイブリダイゼーション
切片は、Ｂｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）で飽和した濾紙で覆ったプラスチック製のボックス中に並べる。
【０２３２】
Ｄ．ハイブリダイゼーション
１．０ｘ１０６ｃｐｍのプローブと切片１枚当たり１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱する。切片を氷上で冷却し、切片１枚当たり４８μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。ボルテックス撹拌した後、５０μｌの３３Ｐミックスをスライド上の５０μｌプレハイブリダイゼーションに添加する。切片を５５℃で一晩インキュベートする。
【０２３３】
Ｅ．洗浄
洗浄は、室温で１０分間かけて、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて２回行い（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）、続いて３７℃で３０分間かけてＲＮａｓｅＡ処理する（２５０ｍｌのＲｎａｓｅバッファー中に５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。切片を、室温で１０分間かけて、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて２回洗浄する。ストリンジェントな洗浄条件は、以下のようなものであってもよい：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）。
【０２３４】
Ｆ．オリゴヌクレオチド
本明細書に開示する種々のＤＮＡ配列に対してインサイツ解析を行う。これらの解析に用いるオリゴヌクレオチドは、添付する図面に示す核酸に相補的なもの（又はその相補物）を入手する。
【０２３５】
実施例５
Ｅ．ｃｏｌｉ中での抗Ｈｈ抗体の発現
本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ中での組換え発現による抗ヘッジホッグ抗体の非グリコシル化型の調製を例示する。
【０２３６】
先の抗体配列をコードするＤＮＡ配列は、最初に、選択したＰＣＲプライマーを用いて増幅させる。プライマーには、制限酵素部位が含まれているべきであり、これらの制限酵素部位は、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する。種々の発現ベクターを用いることができる。適切なベクターの例としてはｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ由来；Bolivar et al.,Gene,2:95(1977)参照）が挙げられ、このベクターにはアンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれる。ベクターを制限酵素処理して脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅した配列をベクター内にライゲーションする。ベクターには、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリＨｉｓリーダー配列（最初の６個のＳＴＩＩコドン、ポリＨｉｓ配列及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、抗ヘッジホッグ抗体コード領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列が含まれていることが好ましい。
【０２３７】
次いで、ライゲーション用混合物を用いて、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載される方法により、選択したＥ．ｃｏｌｉ種を形質転換する。形質転換体は、ＬＢプレート上で増殖する能力により同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより確認することができる。
【０２３８】
選択したクローンは、抗生物質を補充したＬＢブロス等の液体培地中で一晩増殖させることができる。次いで、一晩培養したものを用いて、より大きなスケールの培養に播種してもよい。次いで、細胞を所望の吸光度にまで増殖させるが、この間に発現プロモーターは活性化されている。
【０２３９】
細胞を更に数時間培養した後、遠心により細胞を回収できる。遠心により得られた細胞ペレットは、当該技術分野で公知の種々の薬剤を用いて溶解でき、次いで、溶解された抗ヘッジホッグ抗体の重及び軽鎖は、タンパク質の強固な結合を可能にする条件下で、金属キレート化カラムを用いて精製することができる。
【０２４０】
先の重及び軽鎖ポリペプチド配列は、以下の方法を用いることにより、ポリＨｉｓタグ化型でＥ．ｃｏｌｉ内で発現させることができる。抗ヘッジホッグ抗体の重及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、最初に、選択したＰＣＲプライマーを用いて増幅させる。プライマーには、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位と効率的で信頼性のある翻訳開始、迅速な金属キレート化カラム上での精製及びエンテロキナーゼによるタンパク質分解による取り出しを可能にする他の有用な配列が含まれる。次いで、ＰＣＲ増幅したポリＨｉｓタグ化配列を発現ベクター内にライゲーションし、これを用いて５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））株を基礎とするＥ．ｃｏｌｉ宿主に形質転換する。形質転換体は、最初、Ｏ．Ｄ．６００の３‐５に達するまで、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ上で３０℃にて撹拌と共に増殖させる。次いで、培養物をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ ｍＬの水中に５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ（ｐＨ７．３）、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４を混合することにより調製）中に５０−１００倍希釈し、撹拌と共に３０℃で約２０−３０時間増殖させる。サンプルを取り出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により発現を確認し、大量の培養物を遠心して細胞をペレット化する。細胞ペレットは、精製とリフォールディングまで凍結させる。
【０２４１】
０．５ないし１Ｌの発酵物由来のＥ．ｃｏｌｉペースト（６−１０ｇのペレット）を１０当量（ｗ／ｖ）の７Ｍグアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）に再懸濁する。固体の亜硫酸ナトリウムとテトラチオン酸ナトリウムを添加して、終濃度をそれぞれ０．１Ｍと０．０２Ｍにして、この溶液を４０℃で一晩撹拌する。この工程により、全てのシステイン残基がスルフィトライゼーション（ｓｕｌｆｉｔｏｌｉｚａｔｉｏｎ）によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅにて４０，０００ ｒｐｍで３０分間遠心する。上清を、３‐５当量の金属キレートカラム用バッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４）で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通してろ過して透明にする。透明になった抽出物を、金属キレートカラム用バッファーで平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムにローディングする。５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｕｔｒｏｌグレード）を含む追加のバッファー（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄する。このタンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを含むバッファーで溶離させる。所望のタンパク質を含む分画をプールして４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した消衰係数を用いて２８０ｎｍの吸光度により評価する。
【０２４２】
タンパク質は、新たに調製した以下から成るリフォールディング用バッファー内にサンプルをゆっくりと希釈することによりリフォールドさせる：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２．５Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシン及び１ｍＭ ＥＤＴＡ。リフォールディング用量は、タンパク質の終濃度が５０ないし１００マイクログラム／ｍｌになるように選択する。リフォールディング溶液を４℃にて１２−３６時間緩やかに撹拌する。ＴＦＡの添加によりリフォールディング反応をクエンチングして、終濃度を０．４％（約ｐＨ３）にする。タンパク質を更に精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターに通してろ過し、アセトニトリルを添加して２−１０％の終濃度にする。０．１％ ＴＦＡの移動バッファーを用いたＰｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラム上でリフォールドしたタンパク質のクロマトグラフィーを行い、１０ないし８０％のアセトニトリル勾配を用いて溶離する。Ａ２８０吸光を示す分画のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析し、一様なリフォールドしたタンパク質を含む分画をプールする。殆どのタンパク質について正しくリフォールドした種は、逆相樹脂との相互作用から保護された疎水性内部を有することで最もコンパクトな状態にあることから、一般的に、最も低いアセトニトリル濃度で溶離する。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離する。誤ってフォールディングされた形態のタンパク質を所望の形態のタンパク質から分離することに加え、逆相工程は、サンプルからエンドトキシンをも取り除く。
【０２４３】
所望のフォールドしたタンパク質を含む分画をプールし、この溶液に向けた緩やかな窒素の流れを用いてアセトニトリルを取り除く。タンパク質は、透析により、又は製剤用バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を用いたゲルろ過と無菌濾過により、０．１４Ｍ塩化ナトリウム及び４％マンニトールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．８）中に製剤する。
【０２４４】
実施例６
哺乳動物細胞内での抗ヘッジホッグ抗体５の発現
本実施例では、哺乳動物細胞中での組換え発現による抗ヘッジホッグ抗体の潜在的にグリコシル化された型の調製を例示する。
【０２４５】
ベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第ＥＰ ３０７，２４７号を参照されたい）を発現ベクターとして用いてもよい。随意に、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されるようなライゲーション方法を用いて、本明細書に記載する抗ヘッジホッグ抗体の重及び軽鎖をコードするＤＮＡを、このようなＤＮＡの挿入を可能にする選択した制限酵素を用いてｐＲＫ５内にライゲーションしてもよい。生じるベクターを抗ＨｈＤＮＡと呼ぶ。
【０２４６】
一実施態様では、選択される宿主細胞は２９３細胞であってもよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、組織培養プレート内で、ウシ胎児血清と、随意に栄養成分及び／又は抗生物質とを補充したＤＭＥＭ等の培地中でコンフルエントになるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５抗ＨｈＤＮＡを、約１μｇのＶＡ ＲＮＡ［Thimmappaya et al.,Cell,31:543(1982)］をコードするＤＮＡと混合し、５００μｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解する。この混合物に５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を滴下により添加し、２５℃で１０分間かけて沈殿を形成させる。沈殿物を再懸濁して２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間かけて沈降させる。培養培地をアスピレーションにより除去し、２ ｍｌの２０％グリセロールＰＢＳ溶液を３０秒間かけて添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加して、細胞を約５日間インキュベートする。
【０２４７】
トランスフェクションから約２４時間後に培養培地を取り除いて、培養培地（単体）又は２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地と交換する。１２時間インキュベートした後に、コンディションドメディウムを回収し、スピンフィルター上で濃縮して、１５％のＳＤＳゲル上にローディングする。加工したゲルを乾燥させて、選択した時間フィルムに曝露して、抗ヘッジホッグ抗体の重及び軽鎖の存在を明らかにする。トランスフェクトした細胞を含む培養物は、（無血清培地中で）更にインキュベートしてもよく、その培地を選択したバイオアッセイにおいてテストする。
【０２４８】
別の実施態様では、抗ヘッジホッグ抗体は、ＣＨＯ細胞内で発現できる。ｐＲＫ５抗Ｈｈは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストラン等の公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞内にトランスフェクトできる。上記のように、細胞培養をインキュベートして、培地を培養培地（単体）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地と交換することができる。ヘッジホッグキナーゼの存在を決定した後に、培養培地を無血清培地と交換してもよい。培養物は、好ましくは、約６日間インキュベートして、次いで、コンディションドメディウムを回収する。次いで、発現した抗Ｈｈ抗体を含む培地を、あらゆる選択した方法で濃縮して精製することができる。
【０２４９】
ＣＨＯ細胞内での安定な発現は、以下の方法により達成される。タンパク質は、個々のタンパク質の溶解型（例えば、細胞外ドメイン）のコーディング配列が、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域に融合しているか、そして／又はポリＨｉｓタグ化した形態にある、ＩｇＧコンストラクト（イムノアドヘシン）として発現される。
【０２５０】
ＰＣＲ増幅後、個々のＤＮＡを、Ausubel等,Current Protocols of Molecular Biology,Unit 3.16,John Wiley and Sons(1997)に記載される標準的な技法を用いてＣＨＯ発現ベクター内にサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、ｃＤＮＡの簡便なシャトリングを可能にするような、目的のＤＮＡの５’側と３’側に適合性のある制限酵素部位を有するように構築する。ＣＨＯ細胞内での発現に用いられるベクターは、Lucas等,Nucl.Acids Res.24:9(1774-1779(1996)にも記載されており、目的ｃＤＮＡとジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現により、トランスフェクション後のプラスミドの安定な維持のためのセレクションが可能になる。
【０２５１】
市販のトランスフェクション用試薬ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ＤＯＳＰＥＲ（登録商標）又はＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、１２マイクログラムの所望のプラスミドＤＮＡを、約１０００万個のＣＨＯ細胞内に導入する。細胞は、上記のＬｕｃａｓ等に記載されるように増殖させる。更なる増殖と生産のため、下記のように、約３ｘ１０７個の細胞をアンプル内で凍結させる。
【０２５２】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルをウォーターバス内に静置して融解し、ボルテックスで混和する。内容物を、１０ ｍＬの培地を含む遠心チューブ内にピペットし、１０００ ｒｐｍで５分間遠心する。上清をアスピレートし、細胞を１０ｍＬの選択用培地（５％の０．２μｍ ｄｉａｆｉｌｔｅｒを通したウシ胎児血清を含む０．２μｍフィルターを通したＰＳ２０）に再懸濁する。次いで、細胞を、９０ｍＬの選択用培地を含む１００ ｍＬスピナー内に分注する。１から２日後、１５０ ｍＬの選択用増殖培地を充填した２５０ ｍＬスピナー内に細胞を移し、３７℃でインキュベートする。更に２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーに３ｘ１０５細胞／ｍＬを播種する。細胞用培地を遠心によって新鮮な培地に交換し、生産用培地中に再懸濁する。いかなる適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載される生産用培地を実際に用いてもよい。３Ｌの生産用スピナーに１．２ ｘ １０６細胞／ｍＬを播種する。０日目に、細胞数ｐＨを決定する。１日目に、スピナーをサンプリングし、フィルターを通した空気の散布を開始する。２日目に、スピナーをサンプリングして、温度を３３℃に変更し、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースと０．６ｍＬの１０％泡止め剤（例えば、３５％のポリジメチルシロキサンエマルジョン、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５医療用グレードエマルジョン等）を添加する。生産を通して、ｐＨは、約７．２に維持するために必要なように調節する。１０日後、又は生存率が７０％未満に低下した時点で、細胞培養物を遠心により回収して、０．２２μｍフィルターを通してろ過する。ろ液は、４℃で保存するか、又は、精製するために直ちにカラム上にローディングする。
【０２５３】
ポリＨｉｓタグ化したコンストラクトについては、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。精製前に、イミダゾールを５ｍＭの濃度になるようにコンディションドメディウムに添加する。４−５ｍｌ／分の流速で、０．３ＭのＮａＣｌと５ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．４）で平衡化した６ ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラム上にコンディションドメディウムをポンプで注入する。ローディング後に、カラムを追加量の平衡化バッファーで洗浄し、０．２５Ｍのイミダゾールを含む平衡化バッファーでタンパク質を溶離する。高度に精製されたタンパク質は、次いで、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ及び４％マンニトールを含む保存用バッファー（ｐＨ６．８）内に脱塩し、−８０℃で保存する。
【０２５４】
以下のように、イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）コンストラクトをコンディションドメディウムから精製する。コンディションドメディウムを、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にポンプで注入する。ローディング後に、平衡化バッファーでカラムを十分に洗浄して、その後に、１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．５）で溶離する。溶離したタンパク質は、２７５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ９）を含むチューブ内に１ｍｌの分画を回収することで、直ちに中和する。高度に精製されたタンパク質は、次いで、ポリＨｉｓタグ化タンパク質のために、上記のように保存用バッファー内に脱塩する。均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン分解によるＮ末端アミノ酸シーケンシングにより評価する。
【０２５５】
実施例７
抗Ｈｈ特異的抗体を用いた抗Ｈｈ抗体の精製
天然又は組換え体のヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、タンパク質精製の技術分野における種々の標準的技術で精製することができる。例えば、先の重鎖及び軽鎖配列は、このような配列に特異的な抗体アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。一般的に、イムノアフィニティーカラムは、抗Ｈｈ抗体の重及び軽鎖を活性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合することにより構築する。
【０２５６】
ポリクローナルイムノグロブリンは、硫酸アンモニウムを用いた沈殿形成によるか、又は固定化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）上での精製により、免疫血清から調製する。同様に、モノクローナル抗体も、硫安沈殿又は固定化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ上でのクロマトグラフィーにより、マウスの腹水から調製する。部分的に精製したイムノグロブリンを、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させる。抗体を樹脂に結合させ、樹脂をブロッキングして、誘導体樹脂を製造元の使用説明書に従って洗浄する。
【０２５７】
このようなイムノアフィニティーカラムは、溶解型にある先の重及び型鎖配列を含む細胞から分画を調製する、この配列の精製において利用される。この製剤は、完全な細胞の可溶化若しくは界面活性剤の添加により差次的遠心を介して得られた細胞成分分画の可溶化、又は当該技術分野でよく知られる別の方法により得られる。その代わりに、シグナル配列を含む可溶性重及び軽鎖ポリペプチドを、細胞を増殖させた培地中に、有用な量で分泌させてもよい。
【０２５８】
可溶性重及び軽鎖ポリペプチド製剤をイムノアフィニティーカラムに通し、このような配列の優先的吸着を可能にする条件（例えば、界面活性剤の存在下での高イオン強度バッファー等）下でカラムを洗浄する。次いで、抗体／基質間の結合を分裂させる条件（例えば、約ｐＨ２−３等の低ｐＨバッファー、又は高濃度の、尿素若しくはチオシアネートイオン等のカオトロープ）下でカラムを溶離し、重及び／又は軽鎖ポリペプチドを、それぞれ、回収する。
【０２５９】
実施例８
抗ヒト抗体を用いた免疫組織化学
実験計画：我々は、１ｕｇ／ｍｌ及び５ｕｇ／ｍｌの９５．９抗体を用いた、結腸及び卵巣癌中のＨｈリガンドタンパク質の発現を調べた。２０個の結腸及び２０個の卵巣癌を以前に確立したプロトコルを用いて、１ｕｇ／ｍｌ及び５ｕｇ／ｍｌの９５．９抗Ｈｈ抗体で染色した。数字と英数字スコアリングシステムの両者を、腫瘍上皮染色の量を補足するために使用した。数字スコアリングシステムは、それぞれの標本の染色の全レベルを算出する（０＝染色無し、１＝弱い、２＝穏やか、３＝強い）。英数字スコアは、１）任意の染色レベル（０＝染色無し、１＝＜２５％、２＝２５−７５％、３＝＞７５％）を示す腫瘍上皮の％、及び２）優勢な染色強度（Ａ＝弱い、Ｂ＝穏やか、Ｃ＝強い）を補足する。５％よりも小さい腫瘍上皮染色を示す腫瘍は、０のスコアを受ける。結果は表２に示す。我々は、５ｕｇ／ｍｌ一次抗体で、より大きな範囲の染色強度が観察されることを見出した。我々は、神経管細胞及び卵巣癌細胞において、また９５．５によるＳｈｈの染色を見出したが、正常卵巣組織では見出されなかった。このように、ｍＡｂ９５．５は、特に免疫組織学染色において、癌の診断使用のために有用かつ感度の高い抗体である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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