(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主におけるウイルス負荷を低減することにより、宿主におけるフラビウイルス科ファミリーのウイルスによる感染を治療するための医薬品の製造における、阻害剤の使用であって、
前記ウイルスがＣ型肝炎ウイルスであり、
前記阻害剤が、式
【化１】
0005715820.tif 000064
で表される化合物、またはその薬学的塩であり、
式中、Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｎ−アリール（ｎ＝１または２）であり、
式中、Ｒ２は−Ｈと
【化４】
0005715820.tif 000065
とからなる群から選択され、
式中、Ｘは、−アルキル、および−ＯＨからなる群から選択され、
Ｒ４〜Ｒ７は各々、−Ｈ、および−ＣＨ３からなる群から独立して選択され、
前記アルキル基が、メチル基、エチル基、イソプロピル基、およびトリフルオロメチル基からなる群から独立して選択され、
前記アリール基が、独立してＡ群であり、
【化８】
0005715820.tif 000066
式中、Ｘ１〜Ｘ５は各々、Ａ群の化合物に存在する場合、
−Ｈ、−アルキル、−Ｂｒ、−Ｃｌ、および−Ｆからなる群から独立して選択され、
但し、前記化合物は、
1-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-イソプロピル-4-メチルベンゾイミダゾール、
1-(2,6-ジフルオロベンジル)-4-メチルベンゾイミダゾール、
1-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-メチルベンゾイミダゾール、
1-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-ヒドロキシメチル-4-メチルベンゾイミダゾール、および
クロルミダゾール（Chlormidazol）
からなる群より選択される化合物ではない、
使用。
【請求項２】
前記阻害剤が、下記の化合物
【化３１】
0005715820.tif 000067
およびその薬学的塩からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記阻害剤が、式
【化１４】
0005715820.tif 000068
で表される化合物、またはその薬学的塩であり、
Ｒ１は、
【化１５】
0005715820.tif 000069
−ＣＨ２−（Ｐｈ−ｐ−ｔＢｕ）、および−ＣＨ２−（Ｐｈ−ｐ−Ｍｅ）からなる群から選択され、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ３、およびＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、
Ｒ４は、−Ｈであり、
Ｒ５およびＲ６は、−Ｈ、および−ＣＨ３からなる群から独立して選択され、
Ｒ７は−Ｈである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記阻害剤を１用量あたり１５ｍｇから２００ｍｇの量で、１日１回以上投与する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記阻害剤が、抗ＨＣＶ治療薬、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼインヒビター、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、チアゾリド、持続放出性チアゾリド、ヌクレオシド類似体、およびインターフェロン−αからなる群から選択される少なくとも１種類の別の治療薬と組み合わせて投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
宿主におけるＨＣＶ複製の治療のための医薬品の製造における阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、下記の化合物
【化３１】
0005715820.tif 000070
およびその薬学的塩からなる群から選択される、使用。
【請求項７】
ウイルスに感染した宿主におけるＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合の阻害のための医薬品の製造における阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、下記の化合物
【化３１】
0005715820.tif 000071
およびその薬学的塩からなる群から選択される、使用。
【請求項８】
阻害剤を含む医薬組成物であって、
前記阻害剤が、式
【化１９】
0005715820.tif 000072
で表される化合物、またはその薬学的塩であり、
式中、Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｎ−アリール（ｎ＝１または２）であり、
式中、Ｒ２は−Ｈと
【化２２】
0005715820.tif 000073
とからなる群から選択され、
式中、Ｘは、−アルキル、および−ＯＨからなる群から選択され、
Ｒ４〜Ｒ７は各々、−Ｈ、および−ＣＨ３からなる群から独立して選択され、
前記アルキル基が、メチル基、エチル基、イソプロピル基、およびトリフルオロメチル基からなる群から独立して選択され、
前記アリール基が、独立してＡ群であり、
【化２７】
0005715820.tif 000074
式中、Ｘ１〜Ｘ５は各々、Ａ群の化合物に存在する場合、
−Ｈ、−アルキル、−Ｂｒ、−Ｃｌ、および−Ｆからなる群から独立して選択され、
但し、前記化合物は、
1-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-イソプロピル-4-メチルベンゾイミダゾール、
1-(2,6-ジフルオロベンジル)-4-メチルベンゾイミダゾール、
1-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-メチルベンゾイミダゾール、
1-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-ヒドロキシメチル-4-メチルベンゾイミダゾール、および
クロルミダゾール（Chlormidazol）
からなる群より選択される化合物ではない、
医薬組成物。
【請求項９】
前記阻害剤が、下記の化合物
【化３１】
0005715820.tif 000075
およびその薬学的塩からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
抗ＨＣＶ治療薬、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼインヒビター、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、チアゾリド、持続放出性チアゾリド、ヌクレオシド類似体、およびインターフェロン−αからなる群から選択される少なくとも１種類の別の治療薬をさらに含む、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
宿主におけるウイルス負荷を低減することにより、宿主におけるフラビウイルス科ファミリーのウイルスによる感染を治療するための医薬品の製造における、阻害剤の使用であって、
前記ウイルスがＣ型肝炎ウイルスであり、
前記阻害剤が、クレミゾールまたはその薬学的塩である、使用。
【請求項１２】
前記阻害剤を１用量あたり１５ｍｇから２００ｍｇの量で、１日１回以上投与する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記阻害剤が、抗ＨＣＶ治療薬、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼインヒビター、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、チアゾリド、持続放出性チアゾリド、ヌクレオシド類似体、およびインターフェロン−αからなる群から選択される少なくとも１種類の別の治療薬と組み合わせて投与される、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
宿主におけるＨＣＶ複製の治療のための医薬品の製造における阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、クレミゾールまたはその薬学的塩である、使用。
【請求項１５】
ウイルスに感染した宿主におけるＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合の阻害のための医薬品の製造における阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、クレミゾールまたはその薬学的塩である、使用。
【請求項１６】
Ｃ型肝炎ウイルスの感染を治療するための、阻害剤を含む医薬組成物であって、
前記阻害剤が、クレミゾールまたはその薬学的塩である、医薬組成物。
【請求項１７】
抗ＨＣＶ治療薬、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼインヒビター、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、チアゾリド、持続放出性チアゾリド、ヌクレオシド類似体、およびインターフェロン−αからなる群から選択される少なくとも１種類の別の治療薬をさらに含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ  Ｃ  ＶＩＲＵＳ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」で２００７年９月１８日に出願された、米国仮特許出願第６０／９７３３０９号の優先権の利益を主張するものであり、その全体を本明細書に援用する。
【０００２】
また、本出願は、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ  Ｃ  ＶＩＲＵＳ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」で２００８年８月１４日に出願された、米国仮特許出願第６１／０８８７５９号の優先権の利益を主張するものであり、その全体を本明細書に援用する。
【０００３】
また、本出願は、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  Ａ  ＦＬＡＶＩＶＩＲＩＤＡＥ  ＦＡＭＩＬＹ  ＶＩＲＡＬ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ，ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  Ａ  ＦＬＡＶＩＶＩＲＩＤＡＥ  ＦＡＭＩＬＹ  ＶＩＲＡＬ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ，ＡＮＤ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＡＳＳＡＹＳ  ＦＯＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  Ａ  ＦＬＡＶＩＶＩＲＩＤＡＥ  ＦＡＭＩＬＹ  ＶＩＲＡＬ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」で２００８年８月２８日に出願された、米国仮特許出願第６１／０９２５３７号の優先権の利益を主張するものであり、その全体を本明細書に援用する。
【０００４】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより認められた助成番号ＲＯ１  ＤＫ０６６７９３および１ＲＯ１  ＨＧ００２６４４−０１Ａ１のもとでなされたものである。よって、米国政府は本発明に対して一定の権利を留保する。
【背景技術】
【０００５】
世界中で１億５０００万人を超える人々がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。残念なことに、インターフェロンとリバビリンとを併用しての治療からなる現行の治療水準では、こうした個人の多くが自らの感染をなくすことができずにいる。さらに、この治療は顕著な副作用が付随し、多くの個人ではこれを使用することができない。よって、現行の治療法は大半の患者にとって不適切であり、ＨＣＶ感染を治療するための新たな薬剤が早急に必要とされている（Ａｎｎａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄ．１３２：２９６〜３０５（２０００））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
９．６ｋｂの一本鎖のプラスＲＮＡ  ＨＣＶゲノムは、タンパク質分解的に処理されて成熟ウイルスの成分である構造的タンパク質とウイルスゲノムの複製に関与する非構造的タンパク質（ＮＳ）に分けられる、３０００のアミノ酸からなるポリタンパク質をコードする（Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４２，５５〜８４（２０００））。他のプラス鎖ＲＮＡウイルス（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ  （ｅｄ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１９９６，ｉｎ “Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”））と同様に、ＨＣＶは細胞内膜構造と結合して複製されるように見える。ＨＣＶの場合、その構造は脂質膜の泡（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｗｅｂ）と呼ばれ（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６，５９７４〜５９８４（２００２））、ＮＳ４Ｂタンパク質によって誘導されると考えられている。ＮＳ４Ｂは、ＲＮＡ複製の見かけ上の部位において他のウイルス性ＮＳタンパク質を集合させるのにも必要とされる（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８，１１３９３〜１１４００（２００４））。ウイルス性ＲＮＡ、特に子孫のゲノムの産生に必要とされるマイナス鎖テンプレートが、どのようにしてこれらの複製部位に取り込まれ、あるいはそこで維持されるのかは、いまだ分かっていない。
【０００７】
当該技術分野においては、ＨＣＶ感染を治療する作用剤ならびに、ＨＣＶ感染を治療するのに適した候補作用剤を同定する方法は、依然として需要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
簡単に説明すると、この開示の実施形態は、化合物組成物、医薬組成物、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスに感染した宿主を治療する方法、宿主中のＨＣＶ複製を処置する方法、宿主中でのＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合を阻害する方法、宿主の肝線維症を治療する方法などを含む。
【０００９】
フラビウイルス科ファミリーのウイルスのいずれかのウイルスに感染した宿主を治療する一つの例示的な方法は、とりわけ、宿主に治療有効量の阻害剤を投与して、宿主におけるウイルス負荷を低減するステップを含む。一実施形態においては、阻害剤は、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物、これらの化合物各々の薬学的塩、これらの化合物のアイソスターからなる群から選択される。
【００１０】
宿主におけるＨＣＶ複製を治療する一つの例示な方法は、とりわけ、ＨＣＶウイルス感染のある宿主に阻害剤を投与するステップを含む。一実施形態においては、阻害剤は、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物、これらの化合物各々の薬学的塩、これらの化合物のアイソスターからなる群から選択される。
【００１１】
宿主中のＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合を阻害する一つの例示的な方法は、とりわけ、ウイルス感染のある宿主に阻害剤を投与するステップを含む。一実施形態においては、阻害剤は、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物、これらの化合物各々の薬学的塩、これらの化合物のアイソスターからなる群から選択される。
【００１２】
宿主中の肝線維症を治療する一つの例示的な方法は、とりわけ、宿主に治療有効量の阻害剤を投与するステップを含む。一実施形態においては、阻害剤は、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物、これらの化合物各々の薬学的塩、これらの化合物のアイソスターからなる群から選択される。
【００１３】
フラビウイルス科ファミリーのウイルスについて、ウイルス感染のある宿主を治療するための一つの例示的な医薬組成物は、とりわけ、阻害剤を含む。一実施形態においては、阻害剤は、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物、これらの化合物各々の薬学的塩、これらの化合物のアイソスターからなる群から選択される。
【００１４】
一つの例示的な組成物は、とりわけ、阻害剤を含む。一実施形態においては、阻害剤は、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物、これらの化合物各々の薬学的塩、これらの化合物のアイソスターからなる群から選択される。
【００１５】
一つの例示的な医薬組成物は、とりわけ、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物、これらの化合物各々の薬学的塩、これらの化合物のアイソスターからなる群より選択される化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＨＣＶは、クレミゾールおよびＮＳ３プロテアーゼインヒビター（ＳＣＨ５０３０３４）のさまざまな組み合わせの存在下における、ルシフェラーゼレポーター結合ＨＣＶゲノムを用いた複製アッセイで得られたデータを表すグラフを示す。
【図２】患者の血清におけるベースライン特性ならびにシリアルＨＣＶウイルス負荷を示す。
【図３】ＨＣＶプラス鎖ＲＮＡゲノムの５’非翻訳領域、およびＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’非翻訳領域のＲＮＡ鎖を示す。
【図４】図４Ａは、５，６−二置換クレミゾール化合物を合成する基本方法の実施形態を示す。  図４Ｂおよび図４Ｃは、２つの５，６−二置換クレミゾール化合物を合成する実施形態を示す。
【図５】図５ａ〜図５ｄは、マイクロ流体プラットホームで測定したタンパク質−ＲＮＡ相互作用から得られる結果を示す。
【図６】図６ａおよび図６ｂは、ＮＳ４ＢがＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’末端と特異的に結合することを示す結果を示す。
【図７】図７ａ〜図７ｄは、ＮＳ４Ｂ内でのＲＮＡ結合ドメインの同定と、これに関連した結果とを示す。
【図８】図８ａ〜図８ｄは、小分子スクリーンが、塩酸クレミゾールが、ＮＳ４Ｂおよび生体内でのＨＣＶ  ＲＮＡ複製によってＲＮＡ結合を阻害することを明らかにすることを示す。
【図９】図９ａ〜図９ｅは、クレミゾール耐性突然変異に関連する結果を示す。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｃは、マイクロ流体ベースのＲＮＡ結合アッセイの概要を示す。
【図１１】図１１ａおよび図１１ｂは、ＲＮＡ結合アッセイでのシグナル対ノイズ比を示すグラフである。
【図１２】図１２ａ〜図１２ｃは、ＥＬＡＶ様ファミリーであるＨｕＲ（ＥＬＡＶ  Ｌ１）由来の別のヒトタンパク質によるＲＮＡ結合についてのマイクロ流体ベースの解析で得られた結果を示す。
【図１３】図１３ａ〜図１３ｃは、ＨＣＶ  ＲＮＡに対するＮＳ４Ｂの結合に関連する結果を示す。
【図１４】ＡＴＡがＮＳ４Ｂによって用量依存的にＲＮＡ結合を阻害することを示す結果を示す。
【図１５】クレミゾールがＨＣＶ複製を阻害することが、リアルタイムＰＣＲアッセイによって明らかになったことを示す結果を示す。ＨＣＶ複製レベルのリアルタイムＰＣＲアッセイによって、クレミゾールが、細胞に対する測定可能な毒性のない状態で（右軸、■（上側の曲線））ＨＣＶ複製を阻害する（左軸◆（下側の曲線））ことが分かる。
【図１６】ＲＲｂ変異は複製を約４５分の１に減少させ、ＲＲａ変異のあるレプリコンではＲＮＡ複製が完全に欠けていることを示すデジタル画像である。
【図１７】図１７Ａは、塩酸クレミゾールの化学構造を示す。  図１７Ｂは、力価と薬効を高めたクレミゾール誘導体分子の化学構造を示す。  図１７Ｃは、マイクロ流体工学（結合ＲＮＡ／タンパク質比対化合物濃度（μＭ））で測定した場合のクレミゾール誘導体分子（●）および親の塩酸クレミゾール化合物（□）の試験管内阻害曲線を示すグラフを示す。  図１７Ｄは、クレミゾール誘導体分子（●）および親の塩酸クレミゾール化合物（□）の濃度を次第に高めた場合のＨＣＶ複製の用量応答曲線（ＨＣＶ感染細胞でのリアルタイムＰＣＲアッセイ（相対ウイルス複製対化合物濃度（μＭ））で測定）を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示について詳細に説明する前に、この開示がここに記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、もちろん本発明の実施形態自体が変わってもよいことを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるため、本明細書で使用する専門用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、何ら限定することを意図したものではない旨も理解されたい。
【００１８】
別途定義しないかぎり、本明細書で使用する科学技術用語はいずれも、本開示が属する分野の当業者らに一般に理解されている意味と同一の意味を持つ。本明細書に記載の方法および材料と同様または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験に用いることが可能であるが、ここでは好ましい方法および材料について説明する。
【００１９】
本明細書に引用する刊行物および特許公報については、いずれも各刊行物または特許公報を具体的かつ個々に取り入れて参照したのと同程度に本明細書に援用し、当該刊行物を引用した方法および／または材料について開示および説明するために本明細書に援用するものである。いずれの刊行物の引用も本出願の出願日前の開示を示すためのものであり、先行する開示によって当該刊行物を自らの開示に対する「従来技術」であると認めていると解釈されるべきではない。さらに、ここに記載の刊行日は実際の刊行日とは異なる可能性もあるため、個々に確認が必要な場合もあろう。
【００２０】
本開示を読めば当業者であれば自明であろうように、本明細書で説明して図示する個々の実施形態は、本開示の範囲または主旨を逸脱することなく他のいくつかの実施形態における特徴と容易に分離または組み合わせることのできる別個の構成要素と特徴を有する。ここに述べる方法はいずれも、ここに述べた事象の順序で実施してもよいし、論理的に可能な他の任意の順序で実施しても構わないものである。
【００２１】
本開示の実施形態では、特に明記しないかぎり、合成有機化学、生化学、生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、薬理学などの技術を利用しており、いずれも当業者らが想到する範囲内である。当該技術については、文献に十分説明されている。
【００２２】
本明細書に記載の実施例は、本明細書に開示して権利請求している方法をどのように実施し、化合物をどのように使用するかについての例示的な開示および説明を当業者に与えるために出されたものである。数量（たとえば、量、温度など）に関しては正確さを期するために努力をしているが、若干の誤差や偏差も考慮に入れなければならない。特に明記しないかぎり、部は重量部、温度は℃、圧力は大気圧またはその前後である。標準的な温度および圧力は、２０℃および１気圧と定義する。
【００２３】
本開示の実施形態について詳細に説明する前に、特に明記しないかぎり、本開示が特定の材料、試薬、反応材料、製造工程などに限定されるものではなく、それ自体が変わり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する専門用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、何ら限定することを意図したものではない旨も理解されたい。さらに、本開示では、論理的に可能であればステップを異なる順番で実行しても構わないことも考えられる。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その指示対象の複数形を含む（文脈から、そうでないことが明白な場合を除く）ことに注意されたい。よって、たとえば、「化合物」といえば、複数の化合物を含むといった具合である。本明細書と、これに続く特許請求の範囲では、以下の意味を持つものとして定義する（文脈から、そうでないことが明白な場合を除く）多数の用語に言及する。
【００２５】
定義
ここに開示の主題について説明および権利請求するにあたって、下記に示す定義に基づき以下の専門用語を使用する。
【００２６】
「フラビウイルス科ウイルス」とは、ヒトおよび非ヒト動物に感染するウイルスをはじめとして、フラビウイルス科ファミリーのウイルスを意味するものである。これらのウイルスをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は当該技術分野において周知であり、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４１０２、ＡＢ０３１６６３、Ｄ１１３５５、Ｄ１１１６８、ＡＪ２３８８００、ＮＣ＿００１８０９、ＮＣ＿００１４３７、ＮＣ＿００４３５５  ＮＣ＿００４１１９、ＮＣ＿００３９９６、ＮＣ＿００３６９０、ＮＣ＿００３６８７、ＮＣ＿００３６７５、ＮＣ＿００３６７６、ＮＣ＿００３２１８、ＮＣ＿００１５６３、ＮＣ＿０００９４３、ＮＣ＿００３６７９、ＮＣ＿００３６７８、ＮＣ＿００３６７７、ＮＣ＿００２６５７、ＮＣ＿００２０３２、ＮＣ＿００１４６１（これらのデータベースエントリの内容全体を本明細書に援用する）など、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースで見いだせる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「治療」、「治療して」および「治療する」という表現は、作用剤で、疾患、機能障害または症状に作用して、疾患、機能障害または症状および／またはその症候の薬理学的および／または生理学的作用を低減または寛解させるものとして定義される。本明細書で使用する場合、「治療」は、宿主（哺乳動物、一般にヒトまたは獣医学の対象となる非ヒト動物など）における疾患の治療も対象となり、（ａ）疾患の素因があると判断されたが、その疾患に対する感染が診断されていない被検体における疾患の発生の危険性を減らす、（ｂ）疾患の発症を妨害する、（ｃ）疾患を軽減すなわち疾患の退縮を引き起こすおよび／または１種類以上の疾患症候を軽減することを含む。また、「治療」は、疾患または症状が存在しない場合ですら、薬理学的作用を提供するための阻害剤の送達を包含することも意図している。たとえば、「治療」は、被検体における効果を高めるまたは被検体に望ましい効果をもたらす（たとえば、病原体負荷の低減、疾患症候の低減など）疾患阻害剤または病原体阻害剤の送達を包含する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「予防的に治療する」または「予防的に治療して」という表現は、疾患またはその症候を完全にまたは部分的に予防するおよび／または疾患の部分的または完全な治癒および／または疾患に起因する有害作用に関して治療的であり得ることを示す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「宿主」、「被検体」、「患者」または「生物体」という用語は、ヒトと哺乳動物（マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ウマなど）を含む。本開示の化合物を投与できる典型的な宿主は、哺乳動物、特に霊長類、とりわけヒトであろう。獣医学的な用途では、たとえば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、メウシ、ブタなどの家畜；ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの家禽類；特にイヌやネコなどのペットである飼いならされた動物といった多岐にわたる被検体が適しているであろう。診断または研究調査の用途では、齧歯類（マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、霊長類、近交系ブタなどのブタといった多岐にわたる哺乳動物が好適な被検体となろう。「生きた宿主」という表現は、上述の宿主または生きている別の生物体を示す。「生きた宿主」という表現は、宿主または生物体全体を示し、生きた宿主から摘出した一部分（肝臓または他の臓器など）だけを示すものではない。
【００３０】
「単離された化合物」という表現は、それが天然で生じる他の化合物に対して実質的に分離または濃縮された化合物を意味する。単離された化合物は通常、重量比で、少なくとも約８０％、少なくとも９０％純粋、少なくとも９８％純粋または少なくとも約９９％純粋である。本開示は、ジアステレオマーならびに、そのラセミおよび分解された（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）、エナンチオマー的に純粋な形態およびその薬学的に許容される塩を含むことを意図している。
【００３１】
「単位剤形」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトおよび／または動物の被検体の単位薬用量として適した物理的に別個の単位を示し、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、キャリアまたはビヒクルとの関連で所望の効果を発揮するのに十分な量で計算された、所定の量の化合物（本明細書で説明するような抗ウイルス化合物など）を含有する。単位剤形の具体的な内容は、使用する特定の化合物、投与経路および投与頻度、発揮される効果、宿主における各化合物に関連する薬物動力学によって左右される。
【００３２】
「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容されるキャリア」または「薬学的に許容されるアジュバント」は、通常は安全で無毒であり、生物学的にもそれ以外の観点からも望ましくないことがない、医薬組成物を調製するにあたって有用な賦形剤、希釈剤、キャリアおよび／またはアジュバントを意味し、獣医学的な用途および／またはヒトの製剤での用途に許容可能な賦形剤、希釈剤、キャリア、アジュバントを含む。本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリアおよび／またはアジュバント」とは、このような賦形剤、希釈剤、キャリアおよびアジュバントのうちの１種類および複数種類を含む。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、哺乳動物、特にヒトなどの被検体への投与に適した組成物を包含することを意図したものである。通常、「医薬組成物」は滅菌され、好ましくは、被検体内で望ましくない応答を誘発できる汚染物質を含まない（医薬組成物中の化合物が製剤グレードであるなど）。医薬組成物は、これを必要とする被検体または患者に、経口、静脈内、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下、吸入などを含む多数の異なる投与経路で投与できるように設計可能である。
【００３４】
「治療有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、治療対象となる宿主がかかっているまたは発症の危険性がある治療対象疾患すなわち感染の症候のうちの１種類以上をいくぶん軽減する、投与対象となる作用剤（化合物、阻害作用剤、および／または薬剤と呼ぶこともある）の実施形態の量および／または疾患すなわち感染の症候のうちの１種類以上を、いくぶん予防する量を示す。
【００３５】
「薬学的に許容される塩」とは、生物学的有効性および任意に遊離塩基の他の特性を保持し、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸などの無機酸または有機酸との反応によって得られる塩を示す。
【００３６】
ここに開示の作用剤の実施形態が塩を形成する場合、これらの塩は本開示の範囲内である。本明細書のいずれかの式で表される作用剤に対する言及は、特に明記しないかぎり、その塩に対する言及を含むものと理解される。「塩」という用語は、本明細書で用いる場合、無機および／または有機の酸および塩基との間で形成される酸性塩および／または塩基性塩を示す。また、作用剤が塩基性部分と酸性部分の両方を含む場合、双性イオン（「分子内塩」）が形成されることがあり、これも本明細書で使用する場合の「塩」という用語に含まれる。薬学的に許容される（無毒で生理学的に許容されるなど）塩が好ましいが、調製時に使用できる単離または精製のステップでは他の塩も有用である。作用剤の化合物の塩は、たとえば、塩が沈殿するものなどの媒質中で、あるいは水性媒質にて、等量などの一定量の酸または塩基と作用剤とを反応させて（水性媒質の場合はその後に凍結乾燥が続く）形成できるものである。
【００３７】
塩基性部分を含む作用剤の実施形態は、さまざまな有機酸および無機酸との間で塩を形成できる。例示としての酸付加塩には、酢酸塩（酢酸またはトリハロ酢酸、たとえば、トリフルオロ酢酸との間で形成されるものなど）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩（塩酸との間で形成）、臭化水素酸塩（臭化水素との間で形成）、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸との間で形成）、メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸との間で形成）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（硫酸との間で形成されるものなど）、スルホン酸塩（本明細書に記載するものなど）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩などのトルエンスルホン酸、ウンデカン酸塩などがある。
【００３８】
酸性部分を含む作用剤の実施形態は、さまざまな有機塩基および無機塩基との間で塩を形成できる。例示としての塩基性塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩など）、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、有機塩基（たとえば有機アミン）との塩、たとえばベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロアビエチル）エチレンジアミンとの間で形成）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド（ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、ｔ−ブチルアミンならびに、アルギニン、リジンなどのアミノ酸との塩などがある。
【００３９】
塩基性窒素含有基は、ハロゲン化低級アルキル（塩化、臭化、ヨウ化のメチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、硫酸ジアルキル（硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、硫酸ジアミルなど）、長鎖ハロゲン化物（塩化、臭化、ヨウ化のデシル、ラウリル、ミリスチル、ステアリルなど）、ハロゲン化アラルキル（臭化ベンジルおよび臭化フェネチルなど）などの作用剤で四級化されていてもよい。
【００４０】
開示の作用剤の溶媒和物も、本明細書で企図される。
【００４１】
ここに開示の活性化合物およびその塩がその互変異性体形態で存在できるかぎりにおいて、このような互変異性体形態は、すべて本明細書にて本開示の一部として企図される。
【００４２】
エナンチオマー形態（不斉炭素の非存在下であっても存在し得る）およびジアステレオマー形態をはじめとして、さまざまな置換基の不斉炭素がゆえに存在し得るものなどの作用剤のすべての立体異性体が、本開示の範囲内で企図される。この開示の化合物の個々の立体異性体は、たとえば、実質的に他の異性体を含まないものであってもよいし、たとえば、ラセミ酸塩として、あるいは他のすべての立体異性体または他の選択した立体異性体と、混合されていてもよい。本開示の化合物の立体中心は、ＩＵＰＡＣ  １９７４勧告で定義されているように、Ｓ配置またはＲ配置を取り得る。
【００４３】
「プロドラッグ」という用語は、生体内で生物学的に活性な形態に変換される作用剤の不活性の前駆物質を示す。状況によっては親化合物よりも投与しやすいため、プロドラッグが有用なことが多い。親化合物が生体利用可能でないのに、プロドラッグは、たとえば経口投与によって生体利用可能なことがある。また、プロドラッグは、親化合物よりも、医薬組成物に対する溶解性が改善されていることがある。プロドラッグは、酵素処理や代謝加水分解をはじめとするさまざまな機序によって、親薬剤（ｐａｒｅｎｔ  ｄｒｕｇ）に変換できる。Ｈａｒｐｅｒ，  ＮＪ．  （１９６２）．Ｄｒｕｇ  Ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｊｕｃｋｅｒ，  ｅｄ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４：２２１〜２９４；Ｍｏｒｏｚｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｉｎ  Ｅ．Ｂ．  Ｒｏｃｈｅ  ｅｄ．  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，  ＡＰｈＡ；  Ａｃａｄ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ；Ｅ．Ｂ．  Ｒｏｃｈｅ，  ｅｄ．  （１９７７）．Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ＡＰｈＡ；  Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，  ｅｄ．  （１９８５）  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓｉｇｎ．  ５（４）：２６５〜２８７；Ｐａｕｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ：  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ２７：２３５〜２５６；Ｍｉｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）．  Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｏｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  β−Ｌａｃｔａｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １１，：３４５〜３６５；Ｇａｉｇｎａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）．  Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  Ｉ．  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  Ｐｒａｃｔ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ６７１〜６９６；Ｍ．  Ａｓｇｈａｒｎｅｊａｄ  （２０００）．  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｏｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｖｉａ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  ｉｎ  Ｇ．Ｌ．  Ａｍｉｄｏｎ，  Ｐ．Ｉ．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｅ．Ｍ．  Ｔｏｐｐ，  Ｅｄｓ．，  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ｐ．  １８５〜２１８；Ｂａｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ａｂｓ���ｒｐｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｕｔｅｓ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，  １５（２）：  １４３〜５３；Ｂａｌｉｍａｎｅ  ａｎｄ  Ｓｉｎｋｏ  （１９９９）．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，  ３９（１−３）：  １８３〜２０９；Ｂｒｏｗｎｅ  （１９９７）．  Ｆｏｓｐｈｅｎｙｔｏｉｎ  （Ｃｅｒｅｂｙｘ），  Ｃｌｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０（１）：  １〜１２；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  （１９７９）．  Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ，  Ａｒｃｈ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｃｈｅｍｉ．  ８６（１）：  １〜３９；Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，  ｅｄ．  （１９８５）  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  １９（２）：  １１５〜１３０；Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）．  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １１２：  ３６０〜８１；Ｆａｒｑｕｈａｒ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．；  ７２（３）：  ３２４〜３２５；Ｈａｎ，  Ｈ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ．，  ２（１）：  Ｅ６；Ｓａｄｚｕｋａ  Ｙ．  （２０００）．  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ，  Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．，  ｌ（ｌ）：３１〜４８；Ｄ．Ｍ．  Ｌａｍｂｅｒｔ  （２０００）  Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄｓ  ａｓ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ，  １１  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１５〜２７；Ｗａｎｇ，Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，５（４）：２６５〜８７。
【００４４】
「投与」という用語は、本開示の作用剤を宿主に導入することを示す。好ましい作用剤の一投与経路としては、経口投与がある。もうひとつの好ましい経路が静脈内投与である。しかしながら、局所、皮下、腹膜、動脈内、吸入、経膣、直腸、経鼻、脳脊髄液への導入または体内区画への点滴注入など、どのような投与経路でも使用可能である。
【００４５】
「脂肪族基」という用語は、飽和または不飽和で直鎖または分岐鎖の炭化水素基を示し、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基などを包含する。
【００４６】
「ａｌｋ」または「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、ｎ−オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、２−エチルヘキシルなど、１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を示す。「置換アルキル」という用語は、好ましくはアリール、置換アリール、ヘテロシクロ、置換ヘテロシクロ、カルボシクロ、置換カルボシクロ、ハロ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ７など）（置換されていてもよい）、アシル（Ｃ１〜Ｃ７など）、アリールオキシ（Ｃ１〜Ｃ７など）（置換されていてもよい）、アルキルエステル（置換されていてもよい）、アリールエステル（置換されていてもよい）、アルカノイル（置換されていてもよい）、アリオール（置換されていてもよい）、カルボキシ、保護カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、置換アミノ、（一置換）アミノ、（二置換）アミノ、保護アミノ、アミド、ラクタム、尿素、ウレタン、スルホニルなどから選択される、１つ以上の基で置換されたアルキル基を示す。
【００４７】
「アルケニル」という用語は、エテニル（ｅｔｈｅｎｙｌ）など、２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子と、少なくとも１つの二重炭素炭素結合（シスまたはトランスのいずれか）を有する、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を示す。「置換アルケニル」という用語は、好ましくはアリール、置換アリール、ヘテロシクロ、置換ヘテロシクロ、カルボシクロ、置換カルボシクロ、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ（置換されていてもよい）、アリールオキシ（置換されていてもよい）、アルキルエステル（置換されていてもよい）、アリールエステル（置換されていてもよい）、アルカノイル（置換されていてもよい）、アリオール（置換されていてもよい）、シアノ、ニトロ、アミノ、置換アミノ、アミド、ラクタム、尿素、ウレタン、スルホニルなどから選択される、１つ以上の基で置換されたアルケニル基を示す。
【００４８】
「アルキニル」という用語は、エチニル（ｅｔｈｙｎｙｌ）など、２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子と、少なくとも１つの三重炭素炭素結合を有する、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を示す。「置換アルキニル」という用語は、好ましくはアリール、置換アリール、ヘテロシクロ、置換ヘテロシクロ、カルボシクロ、置換カルボシクロ、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ（置換されていてもよい）、アリールオキシ（置換されていてもよい）、アルキルエステル（置換されていてもよい）、アリールエステル（置換されていてもよい）、アルカノイル（置換されていてもよい）、アリオール（置換されていてもよい）、シアノ、ニトロ、アミノ、置換アミノ、アミド、ラクタム、尿素、ウレタン、スルホニルなどから選択される、１つ以上の基で置換されたアルキニル基を示す。
【００４９】
「アルコキシ」という用語は、酸素に結合されてＲ−Ｏ−となったアルキル基を示す。この機能において、Ｒはアルキル基を示す。一例が、メトキシ基ＣＨ３Ｏ−であろう。
【００５０】
「有機基」は、官能化されていてもよいし、そうでなければ有機基と関連した別の官能基を含むものであってもよく（カルボキシル、アミノ、ヒドロキシルなど）、これが保護されていても保護されていなくてもよい。たとえば、「アルキル基」という言い回しは、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルなどの純粋な開放鎖飽和炭化水素アルキル置換基だけでなく、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルスルホニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシルなどの当該技術分野において周知の置換基をさらに有するアルキル置換基も含むことを意図している。よって、「アルキル基」は、エーテル、エステル、ハロアルキル、ニトロアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、スルホアルキルなどを含む。
【００５１】
「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード基を示す。同一であっても異なっていてもよい、１種類以上のハロゲンがあり得る。特に関心の高いハロゲンには、クロロ基とブロモ基を含む。
【００５２】
「ハロアルキル」という用語は、１つ以上のハロゲン原子で置換された、上記にて定義したようなアルキル基を示す。ハロゲン原子は、同一であっても異なっていてもよい。「ジハロアルキル」という用語は、同一であっても異なっていてもよい２つのハロ基で置換された、上述したようなアルキル基を示す。「トリハロアルキル」という用語は、同一であっても異なっていてもよい３つのハロ基で置換された、上述したようなアルキル基を示す。「パーハロアルキル」という用語は、アルキル基の各水素原子がハロゲン原子で置換された、上記にて定義したようなハロアルキル基を示す。「パーフルオロアルキル」という用語は、アルキル基の各水素原子がフルオロ基で置換された、上記にて定義したようなハロアルキル基を示す。
【００５３】
「シクロアルキル」という用語は、完全に飽和または部分的に不飽和である、飽和単環、二環または三環を示す。このような基の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロオクチル、シス−デカリンまたはトランスデカリン、ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エン、シクロへキセ−１−エニル、シクロペンテ−１−エニル、１，４−シクロオクタジエニルなどがあげられる。
【００５４】
「（シクロアルキル）アルキル」という用語は、上記にて定義されたアルキル基で置換された、上記にて定義されたシクロアルキル基を示す。このような基の例として、（シクロヘキシル）メチル、３−（シクロプロピル）−ｎ−プロピル、５−（シクロペンチル）ヘキシル、６−（アダマンチル）ヘキシルなどがあげられる。
【００５５】
「置換フェニル」という用語は、１つ以上の部分、場合によっては、ハロゲン、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アシル、Ｃ１〜Ｃ７アシルオキシ、カルボキシ、オキシカルボキシ、保護カルボキシ、カルボキシメチル、保護カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、保護ヒドロキシメチル、アミノ、保護アミノ、（一置換）アミノ、保護（一置換）アミノ、（二置換）アミノ、カルボキサミド、保護カルボキサミド、Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、保護Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、トリフルオロメチル、Ｎ−（（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルホニル）アミノ、Ｎ−（フェニルスルホニル）アミノまたはフェニル（たとえばビフェニルまたはナフチル基が生じるような置換または非置換のもの）からなる基から選択される１つ、２つまたは３つの部分で置換されたフェニル基を示す。
【００５６】
「置換フェニル」という用語の例は、２、３または４−クロロフェニル、２，６−ジクロロフェニル、２，５−ジクロロフェニル、３，４−ジクロロフェニル、２、３または４−ブロモフェニル、３，４−ジブロモフェニル、３−クロロ−４−フルオロフェニル、２、３または４−フルオロフェニルなどのモノ−またはジ（ハロ）フェニル基；２、３または４−ヒドロキシフェニル、２，４−ジヒドロキシフェニル、その保護−ヒドロキシ誘導体などのモノまたはジ（ヒドロキシ）フェニル基；２、３または４−ニトロフェニルなどのニトロフェニル基；シアノフェニル基、たとえば、２、３または４−シアノフェニル；２、３または４−メチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２、３または４−（イソ−プロピル）フェニル、２、３または４−エチルフェニル、２、３または４−（ｎ−プロピル）フェニルなどのモノ−またはジ（アルキル）フェニル基；モノまたはジ（アルコキシ）フェニル基、たとえば、２，６−ジメトキシフェニル、２、３または４−（イソプロポキシ）フェニル、２、３または４−（ｔ−ブトキシ）フェニル、３−エトキシ−４−メトキシフェニルなど；２、３または４−トリフルオロメチルフェニル；２、３または４−カルボキシフェニルまたは２，４−ジ（保護カルボキシ）フェニルなどのモノ−またはジカルボキシフェニルまたは（保護カルボキシ）フェニル基；２、３または４−（保護ヒドロキシメチル）フェニルまたは３，４−ジ（ヒドロキシメチル）フェニルなどのモノ−またはジ（ヒドロキシメチル）フェニルまたは（保護ヒドロキシメチル）フェニル；２、３または４−（アミノメチル）フェニルまたは２，４−（保護アミノメチル）フェニルなどのモノ−またはジ（アミノメチル）フェニルまたは（保護アミノメチル）フェニル；または２、３または４−（Ｎ−（メチルスルホニルアミノ））フェニルなどのモノ−またはジ（Ｎ−（メチルスルホニルアミノ））フェニルを含む。また、「置換フェニル」という用語は二置換フェニル基を表し、この場合の置換基は、たとえば、３−メチル−４−ヒドロキシフェニル、３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル、２−メトキシ−４−ブロモフェニル、４−エチル−２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル、２−ヒドロキシ−４−クロロフェニルなど、異なるものである。
【００５７】
「（置換フェニル）アルキル」という用語は、上述したアルキル基のうちの１つに結合された上記の置換フェニル基のうちの１つを示す。例として、２−フェニル−１−クロロエチル、２−（４’−メトキシフェニル）エチル、４−（２’，６’−ジヒドロキシフェニル）ｎ−ヘキシル、２−（５’−シアノ−３’−メトキシフェニル）ｎ−ペンチル、３−（２’，６’−ジメチルフェニル）ｎ−プロピル、４−クロロ−３−アミノベンジル、６−（４’−メトキシフェニル）−３−カルボキシ（ｎ−ヘキシル）、５−（４’−アミノメチルフェニル）−３−（アミノメチル）ｎ−ペンチル、５−フェニル−３−オキソ−ｎ−ペント−１−イル、（４−ヒドロキシナフト−２−イル）メチルなどの基があげられる。
【００５８】
「ａｒ」または「アリール」という用語は、フェニル、ナフチルおよびビフェニルなど、好ましくは６〜１２員を含む芳香族ホモ環状（すなわち炭化水素）単環含有基、二環含有基または三環含有基を示す。「置換アリール」という用語は、好ましくはアルキル、置換アルキル、アルケニル（置換されていてもよい）、アリール（置換されていてもよい）、ヘテロシクロ（置換されていてもよい）、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ（置換されていてもよい）、アリールオキシ（置換されていてもよい）、アルカノイル（置換されていてもよい）、アロイル，（置換されていてもよい）、アルキルエステル（置換されていてもよい）、アリールエステル（置換されていてもよい）、シアノ、ニトロ、アミノ、置換アミノ、アミド、ラクタム、尿素、ウレタン、スルホニルなどから選択される１つ以上の基で置換されたアリール基を示し、任意に置換基の１つ以上の対が、これらが結合する原子と一緒になって、３員環から７員環を形成する。
【００５９】
「ヘテロアリール」という用語は、酸素、硫黄および／または窒素原子など、特に窒素を、単独あるいは、硫黄環原子または酸素環原子との関連で１〜４個のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい５員環または６員環を示す。さらに、上記の置換されていてもよい５員環または６員環は、任意に、５員環または６員環の芳香族環系と縮合可能である。たとえば、環を任意に、ピリジンまたはトリアゾール系などであって、好ましくはベンゼン環である５員環または６員環の芳香族環系と縮合可能である。
【００６０】
以下の環系が、「ヘテロアリール」という用語で示される複素環（置換または非置換のいずれか）ラジカルの例である：チエニル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、イミダゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、チアトリアゾリル、オキサトリアゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニル、トリアジニル、チアジアジニルテトラゾロ、１，５−［ｂ］ピリダジニルおよびプリニルならびにベンゾ−縮合誘導体、たとえば、ベンゾキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイミダゾリルおよびインドリルなど。
【００６１】
上記の置換されていてもよいヘテロアリール環の置換基は、１〜３個のハロ、トリハロメチル、アミノ、保護アミノ、アミノ塩、一置換アミノ、二置換アミノ、カルボキシ、保護カルボキシ、カルボン酸塩、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ヒドロキシ基の塩、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換（シクロアルキル）アルキル、フェニル、置換フェニル、フェニルアルキル、（置換フェニル）アルキルを含み得る。ヘテロアリール基の置換基は、これまでに定義したように、あるいはトリハロメチルの場合、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチルまたはトリヨードメチルであり得る。ヘテロアリール環の上記の置換基との関連で使用する場合、「低級アルコキシ」はＣ１〜Ｃ４アルコキシ基を意味し、同様に、「低級アルキルチオ」はＣ１〜Ｃ４アルキルチオ基を意味する。
【００６２】
「複素環」、「複素環の」、「複素環基」または「ヘテロシクロ」という用語は、少なくとも１つの炭素原子含有環に、少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族（「ヘテロアリール」）または非芳香族環状基（たとえば、３〜１３員の単環、７〜１７員の二環または１０〜２０員の三環系、好ましくは合計３〜１０個の環原子を含有する）を含む、完全飽和または部分的に不飽和または完全に不飽和を示す。ヘテロ原子を含有する複素環基の各環は、窒素原子、酸素原子および／または硫黄原子から選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を有するものであってもよく、この場合の窒素および硫黄ヘテロ原子は酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよい。複素環基は、環または環系の任意のヘテロ原子または炭素原子で結合されていてもよい。多環複素環の環は、１つ以上のスピロ結合によって縮合、架橋および／または結合されていてもよい。
【００６３】
例示としての単環複素環基には、ピロリジニル、ピロリル、ピラゾリル、オキセタニル、ピラゾリニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チエニル、オキサジアゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロロジニル、２−オキサゼピニル、アゼピニル、４−ピペリドニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾイル、トリアゾリル、モルホリニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホン、１，３−ジオキソランおよびテトラヒドロ−１，１−ジオキソチエニルなどがある。
【００６４】
例示としての二環複素環基には、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチエニル、キヌクリジニル、キノリニル、テトラ−ヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフリル、ベンゾフラニル、ジヒドロベンゾフラニル、クロモニル、クマリニル、ベンゾジオキソリル、ジヒドロベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、シンノニリル、キノキサリニル、インダゾリル、ピロロピリジル、フロピリジニル（フロ［２，３−ｃ］ピリジニル、フロ［３，２−ｂ］ピリジニル］またはフロ［２，３−ｂ］ピリジニルなど）、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロキナゾリニル（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−キナゾリニルなど）、テトラヒドロキノリニル、アザビシクロアルキル（６−アザビシクロ［３．２．１］オクタンなど）、アザスピロアルキル（１，４ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカンなど）、イミダゾピリジニル（イミダゾ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルなど）、トリアゾロピリジニル（１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリジン−３−イルなど）、ヘキサヒドロイミダゾピリジニル（１，５，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロイミダゾ［ｌ，５−ａ］ピリジン−３−イルなど）などがある。
【００６５】
例示としての三環複素環基には、カルバゾリル、ベンジドリル、フェナントロリニル、アクリジニル、フェナントリジニル、キサンテニルなどがある。
【００６６】
「置換複素環」、「置換複素環の」、「置換複素環基」および「置換ヘテロシクロ」という用語は、好ましくはアルキル、置換アルキル、アルケニル、オキソ、アリール、置換アリール、ヘテロシクロ、置換ヘテロシクロ、カルボシクロ（置換されていてもよい）、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ（置換されていてもよい）、アリールオキシ（置換されていてもよい）、アルカノイル（置換されていてもよい）、アロイル（置換されていてもよい）、アルキルエステル（置換されていてもよい）、アリールエステル（置換されていてもよい）、シアノ、ニトロ、アミド、アミノ、置換アミノ、ラクタム、尿素、ウレタン、スルホニルなどから選択される１つ以上の基で置換された複素環、複素環基およびヘテロシクロ基を示し、任意に置換基の１つ以上の対が、これらが結合する原子と一緒になって、３員環から７員環を形成する。
【００６７】
「アルカノイル」という用語は、カルボニル基と結合されたアルキル基（すなわち−−Ｃ（Ｏ）−アルキル）（上述したように置換されていてもよい）を示す。同様に、「アロイル」という用語は、カルボニル基と結合されたアリール基（すなわち−−Ｃ（Ｏ）−アリール）（上述したように置換されていてもよい）を示す。
【００６８】
「（一置換）アミノ」という用語は、好ましくはフェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アシル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ７〜Ｃ１６アルキルアリール、Ｃ７〜Ｃ１６置換アルキルアリール、ヘテロアリール基からなる群から選択される１つの置換基を有するアミノ基を示す。（一置換）アミノはさらに、「保護（一置換）アミノ」という用語で包含されるように、アミノ保護基を有することが可能である。「（二置換）アミノ」という用語は、フェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アシル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ７〜Ｃ１６アルキルアリール、Ｃ７〜Ｃ１６置換アルキルアリール、ヘテロアリールからなる群から選択される２つの置換基を有するアミノ基を示す。２つの置換基は、同一であっても異なっていても構わない。
【００６９】
「ヘテロアリール（アルキル）」という用語は、任意の位置で上記にて定義したようなヘテロアリール基で置換された、上記にて定義したようなアルキル基を示す。
【００７０】
「アイソスター」は、分子式は異なるが、外殻電子配置が同様または同一であって、特性（薬理学的特性（薬物動態および薬物動力学など）など）も同様の異なる原子、分子またはイオンである。
【００７１】
考察
本開示の実施形態は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのいずれかによるウイルス感染を治療する方法、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのメンバーによる感染を治療するための組成物（阻害剤ならびに、このような作用剤と他の抗ウイルス療法との組み合わせを含む）などを提供するものである。特に、本発明の実施形態は、Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染を治療する方法ならびに、Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染を治療するための組成物を提供するものである。
【００７２】
本開示の実施形態は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスによるウイルス感染を予防的に治療する方法、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのメンバによる感染を予防的に治療するための組成物（阻害剤ならびに、このような作用剤と他の抗ウイルス療法との組み合わせを含む）などを提供するものである。特に、本発明の実施形態は、Ｃ型肝炎ウイルスを予防的に処理する方法ならびに、Ｃ型肝炎ウイルスを処理するための組成物を提供するものである。
【００７３】
本発明の実施形態は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスに感染した宿主の治療に使用可能な阻害剤をはじめとする組成物（医薬組成物を含む）を提供するものである。特に、阻害剤を使用して、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した宿主を治療することが可能である。阻害剤は、以下の基すなわちクレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物ならびに、上記の群のいずれかの化合物のアイソスターのうちの１種類以上であり得る。
【００７４】
実施例１で説明するように、ＨＣＶ  ＮＳ４ＢがＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに結合することが観察されている。この相互作用は、当該相互作用に干渉し、これがゆえにＨＣＶ感染を治療するための薬剤としての臨床開発の候補となる阻害剤の同定に用いられている。
【００７５】
本明細書にて説明する阻害剤は、ウイルスがＮＳ４Ｂ−コードウイルスである場合のウイルス感染の治療に有用である。ＮＳ４Ｂコードウイルスは、フラビウイルス科ファミリーのウイルスを含み、一例として、フラビウイルス、ペスチウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスがあげられるが、これらに限定されるものではない。他のＮＳ４Ｂコードウイルスとして、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）；デング１型〜４型を含むデングウイルス；日本脳炎ウイルス；マレー渓谷脳炎ウイルス；セントルイス脳炎ウイルス；ウェストナイルウイルス；ダニ媒介脳炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；クンジンウイルス；中央ヨーロッパ脳炎ウイルス；ロシア春夏脳炎ウイルス；ポワッサンウイルス；キャサヌール森林病ウイルス；オムスク出血熱ウイルスがあげられる。一実施形態では、ＨＣＶ複製の阻害とＨＣＶ感染の治療に用いられる阻害剤（抗ＨＣＶ作用剤など）が、特に注目される。本開示で企図されるＨＣＶは、どのような遺伝子型（遺伝子型１、２、３、４、５、６など）であってもよく、ＨＣＶ遺伝子型のどのようなサブタイプ（１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａなど）であってもよい。ＨＣＶ遺伝子型１は一般に治療が最も困難であるため、ＨＣＶ遺伝子型１および遺伝子型１サブタイプによる感染を治療するための本発明の方法および組成物が、特に注目される。
【００７６】
以下の明細書ではＨＣＶを取り上げるが、このような言及は分かりやすくするためのものにすぎず、以下において詳細に説明するような開示をＨＣＶに限定することを意図したものではない。上述したように、本発明の方法および組成物は、ヌクレオチド−結合ＮＳ４Ｂタンパク質をコードするどのようなウイルス（ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’−ＵＴＲに結合するＮＳ４Ｂポリペプチドを有するフラビウイルス科のウイルスなど）にも適用可能である。
【００７７】
本開示は、ＲＮＡ−結合タンパク質へのＲＮＡ結合を調節する作用剤（阻害剤）を同定する、試験管内での細胞を使用しない方法について説明するものである。ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合を阻害する被験作用剤を、細胞ベースのアッセイでＨＣＶ複製を阻害する能力についてさらに試験することが可能である。たとえば、目的の被験作用剤を、ＨＣＶゲノムの全部または一部を有する哺乳類細胞と接触させることが可能であり、被験作用剤がＨＣＶ複製に対しておよぼす影響を判断する。好適な細胞としては、ＨＣＶに許容的な不死化ヒト肝細胞系など、ＨＣＶ複製に許容的な哺乳類の肝臓細胞があげられる。たとえば、好適な哺乳類細胞にＨｕｈ７肝細胞またはＨｕｈ７肝細胞のサブクローン（Ｈｕｈ−７．５など）がある。好適な細胞系が、Ｂｌｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：１３００１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１４４８などに記載されている。一実施形態では、細胞のＨＣＶゲノムが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質あるいは、検出可能なシグナルが得られる他のタンパク質をコードするヌクレオチド配列などのレポーターを含み、ＨＣＶ複製に対する被験作用剤による作用がある場合に、その判断が、レポーターからのシグナルの検出によって実現される。
【００７８】
一実施形態では、被験作用剤が有機部分である。この実施形態では、概要が国際公開第９４／２４３１４号パンフレット（本明細書に援用する）に説明されているように、化学修飾可能な一連の基質から被験作用剤を合成する。本明細書の「化学修飾」とは、伝統的な化学反応ならびに酵素反応を含む。これらの基質は通常、アルキル基（アルカン、アルケン、アルキン、ヘテロアルキルを含む）、アリール基（アレーンおよびヘテロアリールを含む）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環化合物、複素環化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、β−ラクタム、テトラシリン、セファロスポリン、炭水化物を含む）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、エコダイソンなどを含む）、アルカロイド（麦角、ビンカ、クラーレ、ピロリジン、マイトマイシンを含む）、有機金属化合物、ヘテロ原子含有化合物、アミノ酸、ヌクレオシドを含むが、これに限定されるものではない。これらの部分で化学（酵素を含む）反応を実施して、新たな基剤または候補作用剤を形成してもよく、これを本方法で試験することも可能である。
【００７９】
このように、一実施形態では、目的の被験作用剤（本発明の阻害剤など）が、被験作用剤の非存在下でのＨＣＶ複製のレベルと比較して、ＨＣＶ複製を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％あるいは、それよりも多く阻害する。
【００８０】
特に、本発明の実施形態は、被験作用剤の非存在下でのＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合と比較して、ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％あるいは、それよりも多く阻害する阻害剤を含む。
【００８１】
一実施形態では、阻害剤が、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）約１００μＭから５０μＭ、約５０μＭから２５μＭ、約２５μＭから１０μＭ、約１０μＭから５μＭ、約５μＭから１μＭ、約１μＭから５００ｎＭ、約５００ｎＭから４００ｎＭ、約４００ｎＭから３００ｎＭ、約３００ｎＭから２５０ｎＭ、約２５０ｎＭから２００ｎＭ、約２００ｎＭから１５０ｎＭ、約１５０ｎＭから１００ｎＭ、約１００ｎＭから５０ｎＭ、約５０ｎＭから３０ｎＭ、約３０ｎＭから２５ｎＭ、約２５ｎＭから２０ｎＭ、約２０ｎＭから１５ｎＭ、約１５ｎＭから１０ｎＭ、約１０ｎＭから５ｎＭまたは約５ｎＭ未満で、ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲ（配列番号２）に対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合を阻害するものである。
【００８２】
一実施形態では、阻害剤が、マイナス鎖ＨＣＶ  ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を阻害する。一実施形態では、阻害剤が、マイナス鎖ＨＣＶ  ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を、ＩＣ５０約５００ｎＭ未満で阻害する。たとえば、いくつかの実施形態では、阻害剤が、マイナス鎖ＨＣＶ  ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を、ＩＣ５０約５００ｎＭから４００ｎＭ、約４００ｎＭから３００ｎＭ、約３００ｎＭから２５０ｎＭ、約２５０ｎＭから２００ｎＭ、約２００ｎＭから１５０ｎＭ、約１５０ｎＭから１００ｎＭ、約１００ｎＭから５０ｎＭ、約５０ｎＭから３０ｎＭ、約３０ｎＭから２５ｎＭ、約２５ｎＭから２０ｎＭ、約２０ｎＭから１５ｎＭ、約１５ｎＭから１０ｎＭ、約１０ｎＭから５ｎＭまたは約５ｎＭ未満で阻害する。
【００８３】
一実施形態では、阻害剤が、ＨＣＶ感染細胞（ＨＣＶ感染肝臓細胞など）と接触すると、阻害剤と接触していないＨＣＶ感染細胞におけるＨＣＶ複製のレベルと比較して、細胞におけるＨＣＶ複製を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％あるいは、それよりも多く阻害する。
【００８４】
一実施形態では、阻害剤が、ＨＣＶ感染細胞（ＨＣＶ感染肝臓細胞など）と接触すると、阻害剤と接触していない細胞によって産生される感染性ＨＣＶウイルス粒子の数と比較して、ＨＣＶ感染細胞によって産生される感染性ＨＣＶウイルス粒子の量を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％あるいは、それよりも多く低減する。
【００８５】
一実施形態では、ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂ結合阻害に対して被験作用剤がおよぼす影響を判断することに加えて、被験作用剤によって生きた真核細胞で認められることがある細胞傷害活性について、トリパンブルー色素排除法、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）アッセイなどの周知のアッセイを用いて、被験作用剤を評価する。有意な細胞傷害活性を呈さない作用剤が、薬剤としての以後の開発に好ましい作用剤とみなされる。
【００８６】
一実施形態では、１以上の用量でＨＣＶ感染個体（ヒトなど）に投与すると、阻害剤が、阻害剤で治療していない個体におけるＨＣＶウイルス負荷と比較して、個体におけるＨＣＶウイルス負荷を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％あるいは、それより多く低減する。
【００８７】
阻害剤
本開示の実施形態は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスに感染した宿主の治療に使用可能な阻害剤を提供するものである。特に、この阻害剤は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した宿主の治療に使用可能である。この阻害剤は、以下の基すなわち、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物；これらの化合物各々の薬学的塩；上述した群のいずれかにおける化合物のアイソスターのうちの１種類以上であり得る。本発明の実施形態は、阻害剤の塩を含む。本発明の実施形態は、阻害剤のプロドラッグを含む。本発明の実施形態は、組成物に、医薬組成物、液体組成物、ゲル組成物などを含み、その各々が本明細書で同定する阻害剤を含有し、これらの組成物が各々、一実施形態では、徐放製剤または持続放出製剤の形を取り得る。一実施形態では、フラビウイルス科ファミリーのウイルス感染の治療に用いられている別の作用剤と阻害剤を併用することが可能であり、上述したように、いずれか一方の作用剤（阻害剤および他の作用剤）または両方の作用剤が徐放または持続放出の形を取り得る。場合によっては、「阻害剤」という用語は、活性な作用剤または薬剤を示すこともある。
【００８８】
上述したように、阻害剤は、以下の基すなわち、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物；上述した群のいずれかにおける化合物のアイソスターのうちの１種類以上であり得る。たとえば、本発明の実施形態の阻害剤は、クレミゾールと構造的に類似しており、抗ウイルス活性を呈する、Ｈ１受容体アンタゴニストを含む。
【００８９】
化合物についての以下の説明では、上記にて定義した用語は定義したとおりの意味を持ち、以下で述べる定義は、ここに記載の阻害剤の好ましい実施形態を説明するものである。この章で説明する好ましい実施形態の「アリール基」および／または「アルキル基」といえば、アリールおよびアルキルの好ましい実施形態の定義を示す。
【００９０】
「アルキル」という用語は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、トリフルオロメチル基などの基を示す。これらの実施形態に加えて、アルキルという用語は、以下の構造のうちの１つを有する基を含む。
【化１】
0005715820.tif 000002
【００９１】
「アリール」という用語は、以下のグループＡ〜Ｆから選択される基を示す。
【化２】
0005715820.tif 000003
式中、Ｘ１〜Ｘ５は各々、グループＡ、Ｂ、Ｃの化合物に存在する場合、
【化３】
0005715820.tif 000004
からなる群から独立して選択される。一実施形態では、グループＣの少なくとも１つの位置（Ｘ１〜Ｘ４およびＸ５）が、置換（非水素）されている。
【化４】
0005715820.tif 000005
式中、グループＤ、Ｅ、Ｆの化合物において、Ｙは、−Ｏ、−Ｓ、−ＮＨ、−Ｎ−アルキル、−Ｎ−アシルからなる群から選択され、Ｘ３は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｆ、ＣＦ３、−ＯＣＨ３からなる群から選択され、Ｘ４およびＸ５は、存在する場合、ＨおよびＣＨ３からなる群から独立して選択される。
【００９２】
上述したように、阻害剤は、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物；上記の群のうちのいずれかの任意の化合物のアイソスターを含むが、これに限定されるものではない。
【００９３】
したがって、本発明の実施形態は、クレミゾールならびに、クレミゾール骨格を有する阻害剤を含む。クレミゾールおよびクレミゾール骨格を有する化合物の構造を以下に示す（クレミゾール骨格を左に、クレミゾールを右に示す）。
【化５】
0005715820.tif 000006
【００９４】
クレミゾール骨格の一実施形態では、Ｒ１が、−Ｈ、
【化６】
0005715820.tif 000007
および
【化７】
0005715820.tif 000008
からなる群から選択される。一実施形態では、Ｒ１が
【化８】
0005715820.tif 000009
であり、アリール基（上記のグループＡ〜Ｆ）がＸ３で置換されている。一実施形態では、この章で説明する好ましい実施形態からアリール基とアルキル基を選択可能である。
【００９５】
クレミゾール骨格の一実施形態では、Ｒ２が、−Ｈと
【化９】
0005715820.tif 000010
からなる群から選択され、式中、Ｘは、
【化１０】
0005715820.tif 000011
からなる群から選択される。一実施形態では、この章で説明する好ましい実施形態からアリール基とアルキル基を選択可能である。
【００９６】
クレミゾール骨格の一実施形態では、Ｒ４〜Ｒ７が各々、
【化１１】
0005715820.tif 000012
からなる群から独立して選択される。一実施形態では、この章で説明する好ましい実施形態からアルキル基を選択可能である。一実施形態では、これらの位置のうちの２つ（Ｒ４〜Ｒ７のうちの２つ）だけが置換され、置換部分は、各置換位置について、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３からなる群から独立して選択されるのに対し、他の位置は非置換（そのような位置に−Ｈを有する）である。もうひとつの実施形態では、Ｒ５およびＲ６が置換され、置換部分は、各置換位置について、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３からなる群から独立して選択されるのに対し、Ｒ４およびＲ７は非置換である。
【００９７】
クレミゾール骨格の一実施形態では、１組以上の隣接する基（Ｒ４およびＲ５、Ｒ５およびＲ６またはＲ６およびＲ７）が、５〜７個の原子を含有する環によって接続される。一実施形態では、環が、
【化１２】
0005715820.tif 000013
からなる群から選択される構造で構成される。一実施形態では、Ｒ５およびＲ６が、
【化１３】
0005715820.tif 000014
からなる群から選択される構造を有する環のうちの１つによって接続される。
【００９８】
クレミゾール骨格の一実施形態では、Ｒ１が、
【化１４】
0005715820.tif 000015
からなる群から選択され、Ｒ２が、
【化１５】
0005715820.tif 000016
からなる群から選択され、Ｒ４が、−Ｈと−ＮＨ２からなる群から選択され、Ｒ５およびＲ６が、
【化１６】
0005715820.tif 000017
からなる群から独立して選択され、Ｒ７が−Ｈである。一実施形態では、この章で説明する好ましい実施形態から、アルキル基を選択可能である。
【００９９】
本発明による阻害剤の別の実施形態では、クレミゾールおよびクレミゾール骨格を有する化合物のアイソスターを含む。クレミゾールのベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターとしては、以下の構造で定義される化合物があげられる（参考にベンゾイミダゾールコア構造を示す；各構造において、Ｒ１〜Ｒ２およびＲ４〜Ｒ７は上記にて定義したとおりであり、Ｒ３は、Ｒ４〜Ｒ７によって説明されるような基であり得る）
【０１００】
以下の構造が、ベンゾイミダゾールコア構造である。
【化１７】
0005715820.tif 000018
【０１０１】
以下の化合物が、インダゾールコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化１８】
0005715820.tif 000019
【０１０２】
以下の化合物が、インドールコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化１９】
0005715820.tif 000020
【０１０３】
以下の化合物が、ベンゾイソキサゾールコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２０】
0005715820.tif 000021
【０１０４】
以下の化合物が、イミダゾピリジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２１】
0005715820.tif 000022
【０１０５】
以下の化合物が、ピラゾロピリジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２２】
0005715820.tif 000023
【０１０６】
以下の化合物が、ピロロピリジン（アザインドール）コア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２３】
0005715820.tif 000024
【０１０７】
以下の化合物が、イソキサゾロピリジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２４】
0005715820.tif 000025
【０１０８】
以下の化合物が、イミダゾピラジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２５】
0005715820.tif 000026
【０１０９】
以下の化合物が、ピラゾロピラジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２６】
0005715820.tif 000027
【０１１０】
以下の化合物が、ピロロピラジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２７】
0005715820.tif 000028
【０１１１】
以下の化合物が、イソキサゾロピラジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２８】
0005715820.tif 000029
【０１１２】
以下の化合物が、イミダゾピラジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化２９】
0005715820.tif 000030
【０１１３】
以下の化合物が、ピラゾロピリミジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化３０】
0005715820.tif 000031
【０１１４】
以下の化合物が、ピロロピリミジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化３１】
0005715820.tif 000032
【０１１５】
以下の化合物が、イソキサゾロピリミジンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化３２】
0005715820.tif 000033
【０１１６】
以下の化合物が、プリンコア構造、ベンゾイミダゾールコア構造のアイソスターである。
【化３３】
0005715820.tif 000034
【０１１７】
一実施形態では、阻害剤が以下の構造のうちの１つを有する化合物である。
【化３４】
0005715820.tif 000035
【０１１８】
一実施形態では、阻害剤が以下の構造のうちの１つを有する化合物である。
【化３５】
0005715820.tif 000036
【０１１９】
一実施形態では、阻害剤は、５，６−二置換クレミゾール化合物を含む。一実施形態では、阻害剤は、新規な５，６−二置換クレミゾール化合物を含み、この場合の置換はジエトキシ置換を含まない。一実施形態では、阻害剤が、以下の構造を有する５，６−二置換クレミゾール化合物を含み得る。
【化３６】
0005715820.tif 000037
式中、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ５およびＲ６について上述した基を含む。もうひとつの実施形態では、Ｒ５は、
【化３７】
0005715820.tif 000038
からなる群から選択され、Ｒ６が、
【化３８】
0005715820.tif 000039
からなる群から選択される。一実施形態では、この章で説明する好ましい実施形態からアルキルを選択可能である。
【０１２０】
本発明による別の阻害剤の構造と、これらを調製するための一例としての開始材料を、表１に示す。
【０１２１】
【表１】
0005715820.tif 000040
0005715820.tif 000041
0005715820.tif 000042
0005715820.tif 000043
【０１２２】
以下の構造に基づく本発明による別の阻害剤の構造を表２に示す。
【化３９】
0005715820.tif 000044
【０１２３】
【表２】
0005715820.tif 000045
0005715820.tif 000046
0005715820.tif 000047
0005715820.tif 000048
0005715820.tif 000049
0005715820.tif 000050
0005715820.tif 000051
0005715820.tif 000052
0005715820.tif 000053
0005715820.tif 000054
0005715820.tif 000055
0005715820.tif 000056
0005715820.tif 000057
【０１２４】
クレミゾールはＨ１受容体アンタゴニストであり、クレミゾールと構造的に類似した他のＨ１受容体アンタゴニストも、本発明の方法の実施形態において有用であり得る。クレミゾールと構造的に類似した一例としてのＨ１受容体アンタゴニストとして、アルコールアミンとして知られるクラスの化合物（ジフェンヒドラミン、カルビノキサミン、クレマスチンなど）、エチレンジアミン（メピラミンおよびトリペレナミン（クレミゾールはこのクラスである）など）、アルキルアミン（トリプロリジンおよびクロルフェニラミンなど）、ピペラジン（メクリジンおよびホモクロルシクリジンなど）、フェノチアジン（プロメタジンなど）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１２５】
本発明の実施形態は、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物のプロドラッグならびに、肝臓の酵素（ＣＹＰ３Ａによる酸化開裂反応を促進する基で置換された環状−１，３−プロパニルエステルなど）によって活性化される、これらのアイソスターを含む。これらの修飾によって、肝臓で活性化されるまでクレミゾールを不活性にするか、あるいは活性を弱めることが可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  ２００６  Ｖｏｌ  ７  Ｎｏ  ２，１０９〜１１７；Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ２００８，５１，  ２３２８〜２３４５；Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２４  （５−７）：３７５〜３８１，（２００５）（各々、対応する説明について本明細書に援用する））。
【０１２６】
クレミゾールは、１９５２年にＺｉｅｒｚおよびＧｒｅｉｔｈｅｒによって説明され（Ａｒｔｚｔｌｉｃｈｅ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ  ７：３０，  ７０４〜７、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｃｕｒ、ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅ）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ製の製品について報告されている）。Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９６０）Ｊ  Ａｍ  Ｐｈａｒｍ  Ａｓｓｏｃ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ；  ４９：１８〜２２）には、塩酸クレミゾールの薬理学について報告されており、塩酸クレミゾールが、抗ヒスタミン薬活性の有効値が遷延し、抗ヒスタミン特異度が比較的高い、ヒスタミンエアロゾル気管支痙攣と拮抗する上で極めて有効であったと述べていた。報告によれば、単離したウサギ回腸の自発活性と麻酔をかけたイヌの腸運動が低下し、慢性胃瘻のイヌでヒスタミン誘導胃液分泌に有意な効果はなかったことから、Ｈ１受容体に対する選択性が示された。
【０１２７】
Ａ．Ａ．  Ｊａｃｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｖ．Ｈ．  Ｆｕｃｈｓ  （１９６０，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｒｄ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  “Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｅｍｉｚｏｌｅ  ｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｒｈｉｎｉｔｉｓ”）には、クレミゾールがアレルギー性疾患の管理で臨床研究に利用できるようになっていた旨が報告されていた。著者らの報告では、クレミゾールの抗ヒスタミン活性がモルモットおよび人間で評価され、モルモットでのヒスタミン誘導喘息の予防という観点でクレミゾールのほうがアトロピンや他の抗ヒスタミン薬よりも優れていた。ヒスタミンならびに、ヒスタミンとクレミゾールとの混合物を、ヒトの被検体への皮下注射で生じる作用の点で比較した。報告によれば、ヒスタミンにクレミゾールを加えると、ヒスタミンによる膨疹が減り、注射の疼痛が軽減された。この調査では、季節性および通年性の花粉症や、さまざまな皮膚科学的症状（蕁麻疹、神経皮膚炎、湿疹、食物アレルギー、薬物アレルギーなど）に羅患した５００名を超える患者で優れた臨床結果が報告されており、アレルギー症候がすみやかに軽減されて副作用の出現率が顕著に低かった過去の臨床報告に基づいて、クレミゾールが選択された。ＪａｃｑｕｅｓおよびＦｕｃｈｓがまとめているように、クレミゾールを用いる過去の臨床経験では、長期間の投与では抗ヒスタミン薬が例外的に優れた耐容性を持つことが示された。
【０１２８】
ＺｉｅｒｚおよびＧｒｅｉｔｈｅｒの報告によれば、治療した患者のうち眠気が生じたのはわずか１．３パーセントであり、Ｄｕｌｃｅは日用量１２０ｍｇでも特に副作用が認められなかった。２４名の患者に、最大５日間にわたって９０〜３００ｍｇのクレミゾールを毎日投与したところ、わずかな疲労感があったのみであり、胃圧はほとんどなかった。他の抗ヒスタミン薬に対する寛容度の低い患者でも、クレミゾールに対する反応は見られなかったと報告された。子どもの場合、クレミゾールを投与しても寛容の徴候は生じなかった。アレルギー性鼻炎、喘息、血管運動性鼻炎、さまざまな併発症状に関連する症候の軽減を目的として、成人と子どもにタンニン酸クレミゾールまたは塩酸クレミゾールを与えた。症候には、アレルギー性鼻漏、くしゃみ、後鼻漏、流涙、鼻や眼のかゆみと一般に関連しているものが含まれていた。研究には３種類の剤形を用いたが、通常これらの剤形は患者の年齢や症候の重篤度に応じて採用される。成人４名に１０ｍｇ（１ｍｌ）のクレミゾールを筋肉内投与のみで与えたのに対し、さらに３名の患者で１０ｍｇ（１ｍｌ）用量の塩酸クレミゾールを１回筋肉内投与した後、茶匙２杯の経口懸濁液を５日間１日４回与えた。他の患者には、１週間または２週間の期間にわたって、１錠または２錠（合計用量２０または４０ｍｇ）の塩酸クレミゾールを１日２〜４回与えた。成人１名には、１週間毎日、１錠ずつ１日６回与えた。他の患者には、茶匙１杯または２杯（合計用量２０または４０ｍｇのクレミゾールを塩酸塩として）の経口懸濁液を、５〜６日間にわたって毎日１日２〜４回与えた。さまざまな剤形でクレミゾールを与えられた１０４名の被検体のうち、９２名が治療に応答した。クレミゾールは、くしゃみと鼻漏の軽減に特に効果的であった。クレミゾールは副作用の出現率が顕著に低い有効な抗ヒスタミン薬であると思われるという結論に至った。この薬剤を使うことによる悪影響といえば、眠気だけであった。治療した１０４名の患者のうち、この副作用が明らかに認められたのはわずか２名であり、治療を中断する必要はなかった。
【０１２９】
Ｂ．Ａ．Ｗａｎｓｋｅｒ（１９６２、Ｓｋｉｎ、“Ｃｌｅｍｉｚｏｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  Ａｎｔｉｐｒｕｒｉｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ”）は、かゆみが皮膚科学的疾患の顕著な症候である患者を無作為に選択して実施した臨床研究について報告した。有効性の判断基準は、かゆみの軽減であった。塩酸クレミゾールの薬用量を掻痒の重篤度に応じて個別化した。大半の患者には１日のうちに２０ｍｇを３回と寝る前に４０ｍｇの合計１００ｍｇを２４時間のあいだに与えた。いずれも、薬用量は毎日４０〜１６０ｍｇとした。治療期間には１週間から１２週間までの幅があった。４３名の患者の治療は２週間以内で、２４名については２週間を超えて治療した。治療が１週間未満の患者はいなかった。７７名の患者にはクレミゾール（２０ｍｇの錠剤の形）または偽薬（見た目が全く同じスターチとラクトースの錠剤）のいずれかを与えた。４０〜１６０ｍｇ／日（ほとんどが１００ｍｇ）で患者を治療した。２４名の患者について２週間を超えて治療し、なかには最大１２週間まで治療した患者もいた。６６％がすばらしいと報告し、２３％でかゆみが良好に軽減された。４名の患者で穏やかな副作用（眠気が最も多い）が記録された。塩酸クレミゾールは、安全で耐容性が良好な薬剤であるという結論に至った。この化合物は、臨床的に観察可能な副作用が基本的に皆無で、かゆみを軽減する効力が通常は２４〜４８時間という極めて短時間で作用するように見える。
【０１３０】
クレミゾールは、米国内ではＪ．Ｂ．  Ｒｏｅｒｉｇ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｄｉｖ．，  Ｃｈａｓ．  Ｐｆｉｚｅｒ  ＆  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．の商品であるＡｌｌｅｒｃｕｒ（登録商標）として販売されている。タンニン酸クレミゾールに対するＪ．Ｂ．  Ｒｏｅｒｉｇ  ＆  Ｃｏ．  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｃｈａｓ．  Ｐｆｉｚｅｒ  ＆  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．の商品名はＡｌｌｅｒｃｕｒ経口懸濁液、塩酸クレミゾールの場合は、Ａｌｋｒｃｕｒ非経口薬とＡｌｌｅｒｃｕｒ錠であった。１９６６  ＰＤＲでは、クレミゾールの利点を耐容性が並外れて良好であることとして宣伝していた。しかしながら、この薬剤は現在、米国内で販売されていない。ただし、化合物は純粋な形態でＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから容易に入手できる。
【０１３１】
本発明の一実施形態によれば、ＨＣＶ感染のある患者を治療するための単純で便利な投与計画として、クレミゾールを鎮痒薬として用いると有効であることが過去に示されている計画があげられる。一実施形態では、ＢＩＤ投与計画を採用する。一実施形態では、投与計画は１００ｍｇ  ｐｏ  ＢＩＤである。本発明の実施形態は、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇの単位用量形態をはじめとして、クレミゾールの新規な単位用量形態を提供するものである。一実施形態では、単位用量形態は錠剤である。別の実施形態では、単位用量形態はカプセルである。一実施形態では、クレミゾールの持続放出製剤が、本発明によって得られる錠剤およびカプセル状である。もうひとつの実施形態では、単位用量形態は液体である。
【０１３２】
ＨＣＶ（遺伝子型４）に慢性感染した３名の患者を、本発明の方法の一実施形態に基づいて治療した。いずれも男性で、ベースラインのＡＬＴが上昇し、ＨＣＶウイルス負荷は２９０，０００〜７３０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲の有意な値であった。いずれの患者もクレミゾール投与計画（１００ｍｇ  ｐｏ  ＢＩＤ）の２週目に次の測定をしたときにはＨＣＶウイルス負荷が低下しており、４週目までには、全員のＨＣＶレベルがほぼＨＣＶ検出限界またはそれ未満であった。仮にクレミゾール単独療法での治療のさらに数日後にウイルス負荷の測定をすれば、患者全員のＨＣＶレベルが検出限界を下回る可能性が高い。４週間のクレミゾール単独療法に加えて、クレミゾール−標準用量ペグ化インターフェロンを用いる４週間の治療後、患者全員のＨＣＶウイルス負荷が検出限界未満であった。
【０１３３】
本発明の方法の実施形態によれば、クレミゾールは（進化年齢とインターフェロンに対する応答の観点でＨＣＶ遺伝子型の全域にわたる）遺伝子型１、２、４に対する抗ＨＣＶ活性を有することが示されているため、遺伝子型を問わず、あらゆるＨＣＶ患者の治療にクレミゾールが理想的である。
【０１３４】
本発明の方法の実施形態によるクレミゾールの有効な投薬は、１５０ｍｇ  ｐｏ  ＢＩＤ、７５ｍｇ  ｐｏ  ＢＩＤ、５０ｍｇ  ｐｏ  ＢＩＤでの投薬も含む。合計日用量を複数の用量に分割することも可能であり、このようにすると１回の投与あたりの用量を抑えて十分な薬効を維持しつつ鎮静の可能性を減らすことができる。あるいは、特に治療が困難な症例では、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１５０ｍｇまたはさらに多い用量について、本発明の方法による頻度を増した投薬スケジュール（たとえば、ＴＩＤ投与あるいは、４時間ごとまたは６時間ごとの投与））を用いることも可能である。
【０１３５】
同様に、本発明の実施形態の持続放出製剤は、ウイルス阻害濃度をさらに長時間にわたって維持する一助となり得る。持続放出製剤の用量は、一例としての実施形態では、５０、７５、１００、１５０ｍｇ  ｐｏ  ＢＩＤであり、１００、１５０、２００、３００ｍｇ  ｐｏ  ｑｄである。また、本発明の方法の実施形態によれば、経皮、舌下、筋肉内または直腸経路でクレミゾールを投与することも可能である。一実施形態では、ＨＣＶに羅患しているが他には抗ヒスタミン薬での治療が必要な症状がない患者に、クレミゾールを投与する。もうひとつの実施形態では、患者にはＨＣＶに加えて抗ヒスタミン薬での治療が必要な症状があり、クレミゾールとクレミゾール以外の抗ヒスタミン薬とを併用して、患者のＨＣＶ感染と抗ヒスタミン薬での治療法が必要な症状をそれぞれ治療する。
【０１３６】
上述した３名の患者では、４週目でクレミゾール単独療法を停止したが、本発明の方法によれば、単独療法として最大１２、２４、３６または４８週間あるいは、それよりも長期間にわたって継続し、持続性のウイルス学的応答を得ることもできたであろうし、本発明のいくつかの実施形態では、投薬を漫然と続けるか、それ以上の治療をしても利点がないことが明らかになるまで継続する。
【０１３７】
ＨＣＶ関連の末期肝臓疾患（ＥＳＬＤ）が原因で肝臓移植を受けることになっている患者の場合、移植時にウイルス血症が存在すると、新たな移植片がＨＣＶに感染する確率がほぼ１００％であることが知られている。しかしながら、移植前にＨＣＶを効果的に治療すれば、新たな移植片でのＨＣＶ再発を低減または回避できることも周知である。このため、肝臓移植前に本発明の方法によるクレミゾール単独療法での治療を実施すれば、ＨＣＶウイルス負荷を低減または回避することが可能であり、移植後のＨＣＶ再発予防の一助となり得る。さらに、ＥＳＬＤのある移植前患者あるいはＨＣＶ再発の認められる移植後患者は、介護治療での標準的全用量（ペグ化インターフェロンおよびリバビリン）に耐えられないことが多い。よって、クレミゾール単独療法にするか、あるいはクレミゾールに加えてペグ化インターフェロンおよびリバビリンの用量を減らして使用し、本発明の方法でこれらの患者を治療することが可能である。同様に、クレミゾールとニタゾキサニド（または別のチアゾリド、あるいはこれらのいずれかの持続性製剤）とを併用して、これらの患者を治療することも可能であるし、クレミゾールとニタゾキサニド（または別のチアゾリド、あるいはこれらのいずれかの持続性製剤）に介護医薬品の標準を（耐容度に応じて用量を減らすか正規の用量で）併用することも可能である。
【０１３８】
４週間のクレミゾール単独療法に続いて、クレミゾールと標準用量のペグ化インターフェロンで４週間治療した患者を、さらにニタゾキサニドとペグ化インターフェロンとの併用療法で治療した。しかしながら、本発明の方法によれば、クレミゾールとペグ化インターフェロンとの組み合わせを合計１２、２４、３６または４８週間あるいは、さらに長い期間のインターフェロンを継続して、持続性のウイルス学的応答を促進しやすくすることも可能であろう。同様に、ペグ化インターフェロンでの治療期間に（あるいは治療開始時から）リバビリンを加え、インターフェロンでの治療時に３種類の併用療法としてもよい。あるいは、このような治療で、ペグ化インターフェロンと一緒に、あるいはペグ化インターフェロンおよびリバビリンと一緒に、ニタゾキサニドを用いてもよい。
【０１３９】
同様に、上述した計画でのクレミゾール単独療法の期間は、たとえば、限定することなく４週間または１２週間にすることができる。また、他の実施形態では、３日、７日または２週間にすることもでき、あるいは、本発明の方法でクレミゾール併用療法をすぐに開始することも可能である（すなわち、クレミゾール単独療法での治療期がない）。
【０１４０】
本発明の方法の実施形態によるクレミゾールを用いる併用療法としては、たとえば、限定することなく、クレミゾールに加えてニタゾキサニドを用いる治療、クレミゾールの後にニタゾキサニドを用いる治療、クレミゾールに加えてニタゾキサニドおよびＮＳ３プロテアーゼインヒビターを用いる治療、クレミゾールに加えてニタゾキサニドとＮＳ３プロテアーゼインヒビター、さらにはＮＳ５Ｂポリメラーゼインヒビターを用いる治療、クレミゾールに加えてＮＳ３プロテアーゼインヒビターとＮＳ５Ｂポリメラーゼインヒビターを用いる治療、クレミゾールに加えてニタゾキサニドとＮＳ３プロテアーゼインヒビター、さらにはＮＳ４Ｂの第２の両親媒性らせんインヒビターを用いる治療、クレミゾールに加えてニタゾキサニドとＮＳ４Ｂの第２の両親媒性らせんインヒビターを用いる治療、クレミゾールに加えてＮＳ３プロテアーゼインヒビターとＮＳ４Ｂの第２の両親媒性らせんインヒビターを用いる治療ならびに、上記のすべてに、リバビリン、クレミゾールを加え、さらにリバビリン、クレミゾールに続いてニタゾキサニドとリバビリンを加えるものがあげられる。
【０１４１】
本発明の併用療法によるニタゾキサニド投与は、一例として、５００ｍｇ  ｐｏ  ＢＩＤにすることが可能であるが、これに限定されない。他の用量、他のチアゾリドまたは他のニタゾキサニド製剤または別のチアゾリド（持続放出製剤など）を本発明の併用療法に用いることも可能である。
【０１４２】
本発明の実施形態によって得られる他の方法および単位用量形態では、上記の治療方法および単位用量形態におけるクレミゾールに代えて、本明細書に記載のクレミゾール誘導体および類似体を使用する。
【０１４３】
医薬製剤と投与経路
本開示の実施形態は、本明細書にて同定される１種類以上の阻害剤を含み、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリアおよび／またはアジュバントと一緒に配合される。また、本発明の実施形態は、１種類以上の薬学的に許容される補助物質と一緒に配合される阻害剤を含む。特に、１種類以上の阻害剤を１種類以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリアおよび／またはアジュバントと一緒に配合して、本発明の組成物の実施形態を提供することが可能である。
【０１４４】
一実施形態では、阻害剤を別の抗ウイルス剤と組み合わせて、本発明の組成物を調製することが可能であり、この組成物は、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリアおよび／またはアジュバントを含み得る。
【０１４５】
一実施形態では、ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合を阻害する阻害剤（以下、「当該活性作用剤」または「薬剤」と呼ぶ）を、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリアおよび／またはアジュバントと一緒に配合することが可能である。
【０１４６】
多岐にわたる薬学的に許容される賦形剤が、当該技術分野において周知である。薬学的に許容される賦形剤については、たとえば、Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  （２０００）  “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，”  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （１９９９）  Ｈ．Ｃ．  Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  ７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  （２０００）  Ａ．Ｈ．  Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ａｍｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．をはじめとするさまざまな刊行物に、十分に説明されている。
【０１４７】
ビヒクル、アジュバント、キャリアまたは希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、容易に一般利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質も、容易に一般利用可能である。
【０１４８】
本開示の一実施形態では、所望の作用（ウイルス負荷の低減、肝線維症の低減、肝機能の亢進など）につなげることのできる手段であれば、どのような手段で宿主に阻害剤を投与してもよい。このため、治療投与用のさまざまな製剤に阻害剤を取り入れることが可能である。たとえば、薬学的に許容される適当なキャリアまたは希釈剤と組み合わせることで、阻害剤を医薬組成物に配合可能であり、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射液、吸入剤、エアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体状の調製物として配合してもよい。
【０１４９】
製剤の剤形では、阻害剤をその薬学的に許容される塩の形で投与してもよく、あるいは、当該活性作用剤を単独で使用してもよいし、適当な会合状態で使用してもよく、他の薬学的に活性な化合物との組み合わせで用いてもよい。以下の方法および賦形剤は単に一例にすぎず、何ら限定するものではない。
【０１５０】
経口調製物では、阻害剤を単独あるいは、錠剤、粉末、顆粒またはカプセルを作るための適当な添加剤との組み合わせで用いることが可能であり、たとえば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはポテトスターチなどの従来の添加剤との併用；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどのバインダーとの併用；コーンスターチ、ポテトスターチまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースなどの崩壊剤との併用；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤との併用；さらに必要があれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味料との併用も可能である。
【０１５１】
植物油や他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールなどの水性溶媒または非水性溶媒に溶解、懸濁または乳化させることによって、阻害剤の実施形態を注射用調製物に配合することも可能である（必要があれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、保存剤などの従来の添加剤を併用）。
【０１５２】
吸入によって投与されるエアロゾル製剤に、阻害剤の実施形態を利用することも可能である。阻害剤の実施形態を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧下の許容可能な推進剤に配合することが可能である。
【０１５３】
さらに、乳化ベースや水溶性ベースなどのさまざまな基剤と混合することで、阻害剤の実施形態を坐剤にすることも可能である。阻害剤の実施形態を坐剤によって経直腸的に投与することが可能である。坐剤は、体温で溶けるが室温では固化状態のカカオバター、カルボワックス、ポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことが可能である。
【０１５４】
シロップ剤、エリキシル剤、懸濁液などの経口投与用または直腸投与用の単位剤形を提供してもよく、茶匙１杯、大さじ一杯、錠剤または坐剤などの各薬用単位に、所定の量の組成物（１種類以上の阻害剤を含有）を含ませるようにする。同様に、注射または静脈投与用の単位剤形であれば、滅菌水、通常の生理食塩水または別の薬学的に許容されるキャリアなどの溶液としての組成物中に阻害剤を含むようにすればよい。
【０１５５】
本発明によれば、阻害剤の実施形態を注射可能な組成物に配合することが可能である。一般に、注射可能な組成物は、液体の溶液または懸濁液として調製される。注射前に液体ビヒクルに加えて溶液または懸濁液にするのに適した固体の形態も調製できる。本発明によって、この調製物を乳化してもよいし、有効成分（阻害剤）をリポソームビヒクルに封入してもよい。
【０１５６】
一実施形態では、連続送達系による送達用に阻害剤を配合する。「連続送達系」という用語は、本明細書では「制御送達系」と同義に用いられ、カテーテル、注射器具など（さまざまなものが当該技術分野において周知である）との組み合わせで、連続（制御など）送達装置（ポンプなど）を包含する。
【０１５７】
機械的または電気機械的注入ポンプも、本開示との併用に適したものとなり得る。このような装置の例として、たとえば、米国特許第４６９２１４７号明細書、同第４３６００１９号明細書、同第４４８７６０３号明細書、同第４３６００１９号明細書、同第４７２５８５２号明細書、同第５８２０５８９号明細書、同第５６４３２０７号明細書、同第６１９８９６６号明細書などに記載されているものがあげられる。通常、阻害剤の送達は、詰め替え可能なさまざまなポンプ系のうちのいずれかを用いて達成可能である。ポンプを用いると、時間をかけて一定量を制御しながら放出できる。いくつかの実施形態では、阻害剤が、薬剤不浸透性リザーバ内の液体製剤であり、連続的に個体に送達される。
【０１５８】
一実施形態では、薬剤送達系が少なくとも部分的に埋め込み型装置である。埋め込み型装置は、当該技術分野において周知の方法および装置を用いて好適な移植部位に移植可能である。移植部位は、薬剤送達装置を導入して位置決めする被検体の体内部位である。移植部位としては、真皮下、皮下、筋肉内または被検体の体内の他の好適な部位があげられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。薬剤送達装置の移植と除去の際に都合がよいことから、いくつかの実施形態では皮下の移植部位を利用する。
【０１５９】
この開示で使用するのに適している薬剤放出装置は、さまざまな動作モードのいずれに基づくものであってもよい。たとえば、拡散系、対流系または浸食可能な系（浸食ベースの系など）に基づく薬剤放出装置が可能である。たとえば、薬剤放出装置には、電気化学ポンプ、浸透ポンプ、電気浸透ポンプ、蒸気圧ポンプまたは浸透破裂マトリクスを用いることが可能であり、この場合たとえば、薬剤をポリマーに取り込んで、薬剤含浸ポリマー材料（生分解性薬剤含浸ポリマー材料など）の崩壊に伴ってポリマーから薬剤の製剤を放出する。他の実施形態では、薬剤放出装置が、電気拡散系、電解ポンプ、発泡（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ）ポンプ、圧電ポンプ、加水分解系などに基づくものである。
【０１６０】
機械的または電気機械的な注入ポンプに基づく薬剤放出装置も、本開示で用いるのに好適なことがある。このような装置の例として、たとえば、米国特許第４６９２１４７号明細書、同第４３６００１９号明細書、同第４４８７６０３号明細書、同第４３６００１９号明細書、同第４７２５８５２号明細書などに記載されているものがあげられる。通常、当該治療方法は、詰め替え可能な非交換式のさまざまなポンプ系を用いて達成可能である。通常は時間をかけて、より一層一貫した徐放が可能であるがゆえに、一般にポンプや他の対流系が好ましい。徐放性が一層一貫しており、なおかつ比較的小型であるという利点を兼ね備えていることから、いくつかの実施形態では浸透ポンプを使用する（ＰＣＴ国際公開第９７／２７８４０号パンフレットならびに、米国特許第５９８５３０５号および同第５７２８３９６号明細書などを参照のこと）。この開示で用いるのに適した例示としての浸透圧駆動式の装置としては、米国特許第３７６０９８４号明細書、同第３８４５７７０号明細書、同第３９１６８９９号明細書、同第３９２３４２６号明細書、同第３９８７７９０号明細書、同第３９９５６３１号明細書、同第３９１６８９９号明細書、同第４０１６８８０号明細書、同第４０３６２２８号明細書、同第４１１１２０２号明細書、同第４１１１２０３号明細書、同第４２０３４４０号明細書、同第４２０３４４２号明細書、同第４２１０１３９号明細書、同第４３２７７２５号明細書、同第４６２７８５０号明細書、同第４８６５８４５号明細書、同第５０５７３１８号明細書、同第５０５９４２３号明細書、同第５１１２６１４号明細書、同第５１３７７２７号明細書、同第５２３４６９２号明細書、同第５２３４６９３号明細書、同第５７２８３９６号明細書などに記載されているものがあげられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【０１６１】
いくつかの実施形態においては、薬剤送達装置は埋め込み型装置である。薬剤送達装置は、当該技術分野において周知の方法および装置を用いて好適な移植部位に移植可能である。本明細書にて記載したとおり、移植部位は、薬剤送達装置を導入して位置決めする被検体の体内部位である。移植部位としては、真皮下、皮下、筋肉内または被検体の体内の他の好適な部位があげられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、作用剤を投与するためのプログラム可能な系などの埋め込み型の薬剤送達系を用いて、活性作用剤を送達する。例示としてのプログラム可能な埋め込み型の系として、埋め込み型注入ポンプがあげられる。当該ポンプとの関連で有用な、例示としての埋め込み型注入ポンプまたは装置が、たとえば、米国特許第４３５０１５５号明細書、同第５４４３４５０号明細書、同第５８１４０１９号明細書、同第５９７６１０９号明細書、同第６０１７３２８号明細書、同第６１７１２７６号明細書、同第６２４１７０４号明細書、同第６４６４６８７号明細書、同第６４７５１８０号明細書、同第６５１２９５４号明細書に記載されている。本開示に適応できる例示としての別の装置に、Ｓｙｎｃｈｒｏｍｅｄ注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）がある。
【０１６３】
阻害剤の好適な賦形剤ビヒクルは、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどならびに、これらの組み合わせである。また、必要があれば、ビヒクルに、湿潤剤または乳化剤あるいはｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有してもよい。このような剤形を調製するための方法は周知であるか、本開示を考慮すれば当業者らに自明であろう。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  １７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８５などを参照のこと。投与対象となる組成物または製剤は、いずれにしても、治療対象となる被検体の所望の状態を達成するのに適した一定量の阻害剤を含有する。
【０１６４】
本発明の組成物は、持続放出または徐放性マトリクス（ｍａｔｒｉｘ）を有するものを含む。また、本発明の実施形態は、持続放出製剤を用いる他の治療と併用可能なものである。本明細書で使用する場合、持続放出マトリクスは、通常は酵素的に分解可能あるいは、酸ベースの加水分解または溶解によって分解可能なポリマーである材料から作られるマトリクスである。体内に挿入されると、このマトリクスは、酵素および体液によって作用する。持続放出マトリクスは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドコ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニンなどのアミノ酸、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、シリコーンなどの生体適合性材料から選択されると望ましい。一例としての生分解可能なマトリックスとしては、ポリラクチドマトリクス、ポリグリコリドマトリクス、ポリラクチドコ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）マトリクスがあげられる。
【０１６５】
もうひとつの実施形態では、本開示の医薬組成物（ならびに組み合わせ組成物）を徐放系で送達する。たとえば、阻害剤の投与には、静脈点滴、埋め込み型浸透ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与モードを使用できる。一実施形態では、ポンプを使用すればよい（Ｓｅｆｔｏｎ  （１９８７）．  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）．  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｎ．Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３２１：５７４）。もうひとつの実施形態では、ポリマー材料を使用する。さらに別の実施形態では、徐放系を治療標的すなわち肝臓の近傍に配置するため、全身用量の一部だけが必要になる。さらに別の実施形態では、徐放系を治療標的の近傍に配置するため、全身の一部だけが必要になる。Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３の概説には、他の徐放系が説明されている。
【０１６６】
もうひとつの実施形態では、本発明の組成物（ならびに組み合わせ組成物を別々にまたは一緒に）が、この組成物を送達するために、本明細書に記載の阻害剤を、縫合糸、包帯、ガーゼなどの吸収性材料に含浸させるか、あるいは手術用ステープラー、ジッパー、カテーテルなどの固相材料の表面にコーティングして形成されるものを含む。このタイプの他の送達系は、本開示を参照すれば当業者には容易に分かるであろう。
【０１６７】
治療方法
本発明の実施形態は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスによる感染を治療する方法を含む。特に、本明細書に記載の阻害剤は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスによる感染を治療するのに使用可能である。一実施形態では、本開示が、宿主に治療有効量の阻害剤を１以上の用量で投与し、宿主におけるウイルス負荷を低減することによって、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスに感染した宿主を治療する方法を提供するものである。一実施形態では、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスに感染した宿主を治療する方法、宿主に治療有効量の阻害剤を投与して、宿主におけるウイルス負荷を低減することを含む方法である。
【０１６８】
本発明の実施形態は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスによる感染を予防的に治療する方法を含む。特に、本明細書に記載の阻害剤は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスによる感染を予防的に治療するのに使用可能である。一実施形態では、本開示が、宿主に治療有効量の阻害剤を１以上の用量で投与し、宿主におけるウイルス負荷を低減することによって、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスに感染した宿主を予防的に治療する方法を提供するものである。一実施形態では、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスに感染した宿主を予防的に治療する治療する方法、宿主に治療有効量の阻害剤を投与して、宿主におけるウイルス負荷を低減することを含む方法。クレミゾールならびに、クレミゾールの投薬についてのさらなる詳細は上述のとおりである。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書に記載の阻害剤を別の作用剤（抗ウイルス剤など）と併用して、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスによる感染を治療する。一実施形態では、本明細書に記載の阻害剤を、別の作用剤（抗ウイルス剤など）と併用して、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのうちのいずれかのウイルスによる感染を予防的に治療する。この方法の実施形態は、ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂポリペプチドの結合を阻害する１種類以上の阻害剤を、それを必要とする個体に投与することを含む。一実施形態では、本発明は、ＨＣＶ感染などのフラビウイルス感染を治療する方法ならびに、ＨＣＶ感染の続発症として発生し得る肝線維症を低減する方法を提供するものである。
【０１７０】
一実施形態では、阻害剤は、上述した１種類以上の阻害剤を含む。さまざまな実施形態では、阻害剤が、クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物ならびに、これらの化合物のアイソスターである。さまざまな実施形態では、阻害剤が、塩酸クレミゾール（１−ｐ−クロロベンジル−２−（１−ピロリジニル）メチルベンズイミダゾール塩酸塩）、類似体またはクレミゾールあるいは、その誘導体である。クレミゾールならびに、クレミゾールの投薬についてのさらなる詳細は上述のとおりである。
【０１７１】
一実施形態では、阻害剤の有効量とは、それを必要とする宿主（ヒトなど）に１以上の用量で投与した場合に、阻害剤で治療していない個体におけるウイルス負荷と比較して、個体におけるＨＣＶウイルス負荷を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％、あるいはそれよりも多く低減する量である。
【０１７２】
力価または血清中のウイルスレベルを測定することで、ウイルス負荷は測定可能である。これらの方法は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）試験を含むが、これらに限定されるものではない。ＨＣＶ  ＲＮＡのウイルス負荷（力価）を測定するための定量的アッセイが開発されている。多くのこのようなアッセイは業務利用可能であり、一例として、定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；分岐ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）シグナル増幅アッセイ（Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ（商標）  ＨＣＶ  ＲＮＡアッセイ（ｂＤＮＡ）、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）があげられる。Ｇｒｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２３：３２１〜３２９などを参照のこと。また、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商品名Ｐｒｏｃｌｅｉｘ（登録商標）で販売されている核酸試験（ＮＡＴ）も対象となるが、このＮＡＴではＨＩＶ−１とＨＣＶの有無を同時に試験する。Ｖａｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４２：８７６〜８８５などを参照のこと。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、阻害剤の有効量とは、それを必要とする宿主（ヒトなど）に１以上の用量で投与した場合に、阻害剤で治療していない個体における肝機能と比較して、個体における肝機能を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％、あるいはそれよりも高める量である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、阻害剤の有効量とは、それを必要とする宿主（ヒトなど）に１以上の用量で投与した場合に、阻害剤で治療していない個体における肝線維症の度合いと比較して、宿主における肝線維症を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％、あるいはそれよりも多く低減する量である。
【０１７５】
肝線維症の低減は、肝臓の生検試料サンプルを分析して判断される。肝臓の生検試料の解析は、重篤度および進行中の疾患活動性の尺度としての「グレード」で評価される壊死性炎症と、長期の疾患進行を反映している「ステージ」で評価される線維症の病変および実質または脈管再構成の２つの主要な要素の評価を含む。Ｂｒｕｎｔ（２０００）Ｈｅｐａｔｏｌ．３１：２４１〜２４６；ＭＥＴＡＶＩＲ（１９９４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０：１５〜２０などを参照のこと。肝臓生検試料の解析結果に基づいて、評点を割り振る。線維症の度合いと重篤度を定量的に評価する多数の標準化されたスコアリングシステムが存在する。一例として、ＭＥＴＡＶＩＲ、Ｋｎｏｄｅｌｌ、Ｓｃｈｅｕｅｒ、ＬｕｄｗｉｇおよびＩｓｈａｋスコアリングシステムがあげられる。
【０１７６】
ＭＥＴＡＶＩＲスコアリングシステムは、線維症（門脈線維症、小葉中心性線維症、肝硬変）；壊死（漸次および小葉壊死、好酸性退縮、風船様変性）；炎症（門脈域の炎症、門脈リンパ球凝集、門脈炎症の分布）；胆管変化；Ｋｎｏｄｅｌｌ指数（門脈周囲の壊死、小葉壊死、門脈炎症、線維症、全体的な疾患活動性のスコア）をはじめとする肝臓生検試料のさまざまな特徴の解析に基づくものである。ＭＥＴＡＶＩＲ系における各ステージの定義は以下のとおりである：スコア０、線維症なし；スコア１、中隔形成を伴わない門脈域の星状拡大；スコア２、まれに中隔形成を伴う門脈域の拡大；スコア３、肝硬変を伴わない多数の中隔；スコア４、肝硬変。
【０１７７】
肝炎活動度指数とも呼ばれるＫｎｏｄｅｌｌスコアリングシステムでは、スコアに基づいて、検体を組織学的特徴の４つのカテゴリに分類する：Ｉ．門脈周囲および／または架橋壊死、ＩＩ．小葉内変性および巣状壊死；ＩＩＩ．門脈炎症、ＩＶ．線維症。Ｋｎｏｄｅｌｌのステージング系では、スコアは以下のとおりである：スコア０、線維症なし；スコア１、軽度の線維症（線維性門脈拡大）；スコア２、中程度の線維症；スコア３、重篤な線維症（架橋線維症）；スコア４、肝硬変。スコアが高いほど、肝臓組織の損傷が重い。Ｋｎｏｄｅｌｌ（１９８１）Ｈｅｐａｔｏｌ．１：４３１。
【０１７８】
Ｓｃｈｅｕｅｒスコアリングシステムでは、スコアは以下のとおりである：スコア０、線維症なし；スコア１、拡大、線維性門脈域；スコア２、構造には影響のない門脈周囲または門脈間中隔；スコア３、明らかな肝硬変を認めない、構造が変形した線維症；スコア４、肝硬変（推定または確定）。Ｓｃｈｅｕｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１３：３７２。
【０１７９】
Ｉｓｈａｋスコアリングシステムは、Ｉｓｈａｋ（１９９５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２２：６９６〜６９９に説明されている。ステージ０、線維症なし；ステージ１、短い線維性中隔を含むか含まない一部の門脈領域の線維性拡大；ステージ２、短い線維性中隔を含むか含まない、ほとんどの門脈領域の線維性拡大；ステージ３、門脈間（Ｐ−Ｐ）架橋が時折認められる、ほとんどの門脈領域の線維性拡大；ステージ４、顕著な（Ｐ−Ｐ）ならびに門脈−中心（Ｐ−Ｃ）架橋を含む門脈領域の線維性拡大；ステージ５、時折小結節を含む顕著な架橋（Ｐ−Ｐおよび／またはＰ−Ｃ）（不完全な肝硬変）；ステージ６、肝硬変（推定または確定）。
【０１８０】
本発明によって得られる治療法の利点は、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアリングシステムを用いて測定・評価することも可能であるが、このシステムは、血清ビリルビン濃度、血清アルブミン濃度、プロトロンビン時間の異常、腹水症の存在と重篤度、ならびに脳症の存在と重篤度に基づく多成分ポイントシステムを含む。これらのパラメータの異常の存在および重篤度に基づいて、臨床疾患の重篤度の高さに応じたＡ、ＢまたはＣの３つのカテゴリのうちの１つに患者を分類することができる。
【０１８１】
本開示の実施形態は、ウイルス感染のある患者の治療にあたって有用な方法、阻害剤、医薬製剤を提供するものである。一実施形態では、患者は、ＨＣＶに感染しているが、ＨＩＶを含むが、これらに限定されるものではない、別のウイルスに感染しているかどうかは分からない。もうひとつの実施形態では、患者は、ＨＣＶと、ＨＩＶを含むが、これらに限定されるものではない１種類以上の別のウイルスに感染している。一実施形態では、ＨＣＶ感染の治療に有用なものとして、本明細書に記載したような単一の阻害剤だけを投与することで、患者のウイルス感染を治療する。もうひとつの実施形態では、ＨＣＶ感染の治療に有用なものとしての本明細書に記載の阻害剤と、ウイルス感染の治療に有用なことが分かっている１種類以上の別の作用剤とを投与することで、患者のウイルス感染を治療する。一実施形態では、１種類以上の別の作用剤が、ＣＣＲ−５アンタゴニストを含まない。もうひとつの実施形態では、１種類以上の別の作用剤が、ＣＣＲ−５アンタゴニストを含まず、患者がＨＣＶに感染しているがＨＩＶに感染している（または感染していない）かどうかは分からない。
【０１８２】
薬用量
阻害剤の実施形態を１以上の用量で宿主に投与することが可能である。一実施形態では、１用量あたり約１０ｍｇから１０００ｍｇ、たとえば、１用量あたり約１０ｍｇから２０ｍｇ、約２０ｍｇから２５ｍｇ、約２５ｍｇから５０ｍｇ、約５０ｍｇから７５ｍｇ、約７５ｍｇから１００ｍｇ、約１００ｍｇから１２５ｍｇ、約１２５ｍｇから１５０ｍｇ、約１５０ｍｇから１７５ｍｇ、約１７５ｍｇから２００ｍｇ、約２００ｍｇから２２５ｍｇ、約２２５ｍｇから２５０ｍｇ、約２５０ｍｇから３００ｍｇ、約３００ｍｇから３５０ｍｇ、約３５０ｍｇから４００ｍｇ、約４００ｍｇから４５０ｍｇ、約４５０ｍｇから５００ｍｇ、約５００ｍｇから７５０ｍｇ，または約７５０ｍｇから１０００ｍｇの量で阻害剤を投与することが可能である。
【０１８３】
一実施形態では、１用量あたりの阻害剤の量を体重基準で判断する。たとえば、一実施形態では、約０．５ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．５ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇから７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（１用量あたり）、約５０ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇから７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇから８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇから９０ｍｇ／ｋｇまたは約９０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいは、約１００ｍｇ／ｋｇを超える量で阻害剤を投与することが可能である。
【０１８４】
クレミゾールの投薬についてのさらなる詳細は上述のとおりである。
【０１８５】
投与する具体的な阻害剤、症候の重篤度および被検体の副作用に対する羅患性の関数として用量レベルを変更できることは、当業者であれば容易に分かるであろう。特定の化合物についての好ましい薬用量は、当業者がさまざまな手段で容易に判断可能なものである。
【０１８６】
一実施形態では、複数回用量の阻害剤を投与する。阻害剤の投与頻度は、症候の重篤度などのさまざまな要因のうちのいずれに応じて変化させてもよいものである。たとえば、一実施形態では、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、１週間おき（ｑｏｗ）、１週間に１回（ｑｗ）、１週間に２回（ｂｉｗ）、１週間に３回（ｔｉｗ）、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、１日おき（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）または１日３回（ｔｉｄ）、阻害剤を投与する。上述したように、一実施形態では、阻害剤を連続的に投与する。
【０１８７】
阻害剤の投与期間、たとえば、阻害剤を投与する期間は、患者の応答などのさまざまな要因のうちのいずれに応じて変化させてもよいものである。たとえば、約１日から約１週間、約２週から約４週間、約１ヶ月から２ヶ月、約２ヶ月から４ヶ月、約４ヶ月から６ヶ月、約６ヶ月から８ヶ月、約８ヶ月から１年、約１年から２年または約２年から４年もしくはそれ以上の期間にわたって、阻害剤を投与することが可能である。
【０１８８】
投与経路
本発明の実施形態は、生体内および生体外での方法ならびに、全身および局所的な投与経路をはじめとして、薬剤送達に適した利用可能な任意の経路と方法で、宿主（ヒトなど）に阻害剤を投与するための方法および組成物を提供するものである。
【０１８９】
投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所塗布、静脈内、直腸、経鼻、経口ならびに、他の経腸および非経口的な投与経路があげられる。必要があれば、投与経路を組み合わせてもよいし、作用剤および／または所望の作用に応じて調節することもできる。活性作用剤は一用量または複数回用量で投与することが可能である。
【０１９０】
阻害剤の実施形態は、全身または局所的な経路を含む従来の薬剤の送達に適した、利用可能な従来の経路と方法を用いて、宿主に投与可能である。通常、本開示で企図される投与経路は、経腸、非経口または吸入経路を含むが、これに限定されるものではない。
【０１９１】
吸入投与以外の非経口の投与経路としては、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、脊髄内、肋骨下、静脈内経路すなわち、消化管を経由する以外の任意の投与経路があげられるが、これに限定されるものではない。非経口投与は、阻害剤の全身または局所的な送達を実現するよう実施可能である。全身送達が望ましい場合、投与は一般に侵襲的であるか、医薬製剤の全身吸収される局所または粘膜投与を伴う。
【０１９２】
また、阻害剤を経腸投与で被検体に送達することも可能である。経腸投与経路としては、経口および直腸（坐剤を使うなど）送達があげられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９３】
皮膚または粘膜経由での阻害剤の投与方法としては、好適な医薬製剤の局所塗布、経皮浸透、注射、上皮投与があげられるが、これに限定されるものではない。経皮浸透では、吸収促進剤またはイオン泳動が好適な方法である。イオン泳動浸透は、数日の期間またはそれよりも長期にわたって、傷のない皮膚を介した電気パルスによって生成物を連続的に送達する市販の「パッチ」を用いて実現できる。
【０１９４】
併用療法
本発明の実施形態は、ウイルス感染の治療用の方法、阻害剤、医薬製剤を含む。本開示の方法に有用な阻害剤および医薬製剤の実施形態を、他の抗ウイルス剤と組み合わせて利用し、ウイルス感染を治療することが可能である。一実施形態では、本発明の方法によれば、フラビウイルス科ファミリーのウイルス感染によって感染した宿主の治療に用いられる阻害剤を、１種類以上の他の抗ＨＣＶ作用剤と併用し、ＨＣＶ感染を治療する。一実施形態では、本発明の方法によれば、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止する阻害剤（本明細書では「ＨＣＶ  ＮＳ４Ｂアンタゴニスト」とも呼ぶ）を、１種類以上の他の抗ＨＣＶ作用剤と併用して、ＨＣＶ感染を治療することが可能である。
【０１９５】
ＨＣＶ感染を治療するための現行の医療では一般に、インターフェロン−α単独療法またはリバビリン（ＲｅｂｅｔｏｌまたはＣｏｐｅｇｕｓなど）とインターフェロン−α（インターフェロンα  ２ｂなど）またはペグ化インターフェロン（Ｒｏｃｈｅから販売されているＰｅｇａｓｙｓあるいは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈから販売されているＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎなど）のいずれかとの併用療法を採用している。本開示の方法によれば、これらの標準的な治療法と阻害用の化合物とを併用し、ＨＣＶ感染を治療することが可能である。
【０１９６】
ＨＣＶ感染の治療用に、多数のＨＣＶプロテアーゼインヒビターが開発中であり、本開示の方法によれば、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止する阻害剤と、ＨＣＶプロテアーゼインヒビターとの併用投与が、ＨＣＶの治療に有効となり得る。一実施形態では、インターフェロンαおよび／またはリバビリンなどのヌクレオシド類似体も、この併用療法で使用される。好適なＨＣＶプロテアーゼインヒビターとしては、テラプレビル（ＶＸ−９５０、Ｖｅｒｔｅｘ）、ＢＩＬＮ  ２０６１およびＢＩ１２２０２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ボセプレビル（ＳＣＨ  ５０３０３４、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ＩＴＭＮ１９１（Ｒｏｃｈｅ／ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ／Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ）、ＭＫ−７００９（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＭＣ４３５３５０（Ｔｉｂｏｔｅｃ／Ｍｅｄｉｖｉｒ）、ＡＣＨ−１０９５およびＡＣＨ−８０６（Ａｃｈｉｌｌｉｏｎ／Ｇｉｌｅａｄ）、ＮＳ３／ＮＳ４Ａプロテアーゼの他のインヒビター（Ｐｒｅｓｉｄｉｏによって開発中の化合物を含むが、これに限定されるものではない）があげられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９７】
ＨＣＶ感染の治療用に、多数のＨＣＶ  ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）インヒビターが開発中であり、本開示の方法によれば、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止する阻害剤と、ＨＣＶ  ＲＮＡポリメラーゼインヒビターとの併用投与が、ＨＣＶの治療に有効となり得る。一実施形態では、インターフェロンαおよび／またはリバビリンなどのヌクレオシド類似体および／またはＨＣＶプロテアーゼインヒビターも、この併用療法で使用される。好適なＨＣＶ  ＲＮＡポリメラーゼインヒビターとしては、バロピシタビン（ＮＭ２８３、Ｉｄｅｎｉｘ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＨＣＶ−７９６（Ｗｙｅｔｈ／ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）、Ｒ１６２６（Ｒｏｃｈｅ）、Ｒ７１２８（Ｒｏｃｈｅ／Ｐｈａｒｍａｓｓｅｔ）、ＧＳ−９１９０（Ｇｉｌｅａｄ）、ＭＫ−０６０８（Ｍｅｒｃｋ）、ＰＳＩ−６１３０（Ｐｈａｒｍａｓｓｅｔ）、およびＰＦＥ−８６８、５５４（ＰＦＥ）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１９８】
ＨＣＶ感染の治療用に、多数のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストが開発中であり、本開示の方法によれば、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止するＮＳ４Ｂアンタゴニストと、ＴＬＲアゴニストとの併用投与が、ＨＣＶの治療に有効となり得る。一実施形態では、インターフェロンαおよび／またはリバビリンなどのヌクレオシド類似体および／またはＨＣＶプロテアーゼインヒビターおよび／またはＨＣＶ  ＲＮＡポリメラーゼインヒビターも、この併用療法で使用される。好適なＴＬＲアゴニストとしては、ＴＬＲ７アゴニスト（すなわち、ＡＮＡ２４５およびＡＮＡ９７５（Ａｎａｄｙｓ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ））およびＴＬＲ９アゴニスト（すなわち、Ａｃｔｉｌｏｎ（Ｃｏｌｅｙ）およびＩＭＯ−２１２５（Ｉｄｅｒａ））があげられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９９】
ＨＣＶ感染の治療用に、多数のチアゾリド誘導体が開発中であり、本開示の方法によれば、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止するＮＳ４Ｂアンタゴニストと、ニタゾキサニド（Ａｌｉｎｉａまたはニタゾキサニドの他の持続放出製剤または他のチアゾリド、Ｒｏｍａｒｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むがこれに限定されるものではないチアゾリドとの併用投与が、ＨＣＶの治療に有効となり得る。一実施形態では、インターフェロンαおよび／またはリバビリンなどのヌクレオシド類似体および／またはＨＣＶプロテアーゼインヒビターおよび／またはＨＣＶ  ＲＮＡポリメラーゼインヒビターおよび／またはＴＬＲアゴニストも、この併用療法で使用される。
【０２００】
本開示の方法のもうひとつの実施形態では、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止する阻害剤と、シクロフィリンインヒビター（すなわち、ＮＩＭ−８１１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＤＥＢＩＯ−０２５（Ｄｅｂｉｏｐｈａｒｍ））および／またはα−グルコシダーゼインヒビター（すなわち、Ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ（Ｍｉｇｅｎｉｘ））および／または本明細書にて記載の１種類以上の他のクラスのＨＣＶ治療薬からの１種類以上の作用剤の併用投与を用いて、ＨＣＶ感染を治療する。さらに、ＮＳ４Ｂ内にはいくつかの標的があり、これらの他の標的と相互作用する化合物を、本開示の方法によれば、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止するＮＳ４Ｂアンタゴニストと、任意に、本明細書にて言及する１種類以上の他のクラスの阻害剤とを併用し、ＨＣＶ感染を治療することが可能である。このような別のＮＳ４Ｂ標的として、Ｎ末端両親媒性らせん（ＰＣＴ国際公開第２００２／０８９７３１号パンフレット（本明細書に援用））、ＮＳ４Ｂ  ＧＴＰａｓｅ（ＰＣＴ国際公開第２００５／０３２３２９号パンフレット（本明細書に援用））、第２の両親媒性らせん、ＮＳ４Ｂにおける第１の両親媒性らせんのＰＩＰ２結合活性（米国仮特許出願第６０／０５７１８８号明細書（本明細書に援用）を参照のこと）があげられる。
【０２０１】
ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止する本開示の阻害剤と併用可能な他の作用剤として、（ｉ）Ａ−８３１（Ａｒｒｏｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＺＤ２８３６（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＸＴＬ／ＰｒｅｓｉｄｉｏまたはＢＭＳによって開発中の作用剤（ＰＣＴ国際公開第２００６／１３３３２６号パンフレットならびに、同第２００８／０２１９２８号パンフレット（本明細書に援用）を参照のこと）を含むがこれに限定されるものではない、ＮＳ５Ａを標的する作用剤、（ｉｉ）ＴＢＣ１Ｄ２０および／またはＮＳ５ＡとＴＢＣ１Ｄ２０との相互作用を標的する作用剤（ＰＣＴ出願公開第２００７／０１８６９２号パンフレットおよび米国特許出願第１１／８４４９９３号明細書（本明細書に援用）を参照のこと）、（ｉｉｉ）ＮＳ４ＢのＧＴＰａｓｅ活性を標的する作用剤（ＰＣＴ国際公開第２００５／０３２３２９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００６／０１９９１７４号明細書（本明細書に援用する）を参照のこと）；（ｉｖ）ＮＳ５Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂに見られるものなど、ＨＣＶ両親媒性らせんによる膜会合を阻害する作用剤（ＰＣＴ国際公開第２００２／０８９７３１号パンフレット（上掲）を参照のこと）、（ｖ）ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａに見られるものなど、ＨＣＶタンパク質のＰＩＰ２またはＢＡＡＰＰドメインを標的する作用剤（米国仮特許出願第６０／０５７１８８号明細書（上掲）を参照のこと）；（ｖｉ）共受容体への抗体を含むＨＣＶのエントリ、アセンブリまたは放出を標的する作用剤；（ｖｉｉ）ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼを標的する作用剤；（ｖｉｉｉ）ＨＣＶの配列を標的するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたは他のＲＮＡベースの分子；（ｉｘ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ１２２またはＨＣＶ複製を調節する他のｍｉｃｒｏＲＮＡを標的する作用剤；（ｘ）ＰＤ−１、ＰＤ−ＬｌまたはＰＤ−Ｌ２相互作用または経路を標的する作用剤（米国特許出願公開第２００８０１１８５１１号明細書、同第２００７００６５４２７号明細書、同第２００７０１２２３７８号明細書（本明細書に援用）を参照のこと）；（ｘｉ）ＡＨ２インヒビターなどのＨＣＶ両親媒性らせん機能を標的する作用剤があげられる。
【０２０２】
本開示のもうひとつの実施形態では、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止する阻害剤を、ＨＩＶ感染を治療できる１種類以上の薬剤と併用して、ＨＩＶとＨＣＶに同時感染した患者を治療する。本開示のもうひとつの実施形態では、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止する阻害剤を、ＨＢＶ感染を治療できる１種類以上の薬剤と併用して、ＨＢＶとＨＣＶに同時感染した患者を治療する。一実施形態では、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するＮＳ４Ｂの結合を防止する阻害剤をＰＤ−Ｌ１インヒビターと併用して、ウイルス感染を治療する。
【０２０３】
上述したように、本発明の実施形態は、少なくとも１つの別の治療薬との関連で本明細書にて（または本発明のスクリーニングの実施形態を用いて）同定される阻害剤を投与して、ウイルス感染を治療することを含む。好適な別の治療薬として、リバビリン；ヌクレオシド類似体（レボビリン、ビラミジンなど）；ＮＳ３インヒビター；ＮＳ５インヒビター；インターフェロン；副作用管理作用剤があげられるが、これに限定されるものではない。
【０２０４】
一実施形態では、少なくとも１つの別の好適な治療薬が、リバビリンを含む。リバビリンすなわち、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，  Ｃａｌｉｆから入手可能な１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドは、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘの化合物番号８１９９、第１１版に記載されている。その製造と製剤については、米国特許第４２１１７７１号明細書に記載されている。この開示は、リバビリンの誘導体の使用も企図している。（米国特許第６２７７８３０号明細書などを参照のこと）。
【０２０５】
一実施形態では、少なくとも１つの別の好適な治療薬が、レボビリンを含む。レボビリンは、リバビリンのＬ−エナンチオマーであり、Ｔｈ２免疫応答よりもＴｈ１免疫応答を亢進する特性を呈する。レボビリンは、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって製造されている。
【０２０６】
一実施形態では、少なくとも１つの別の好適な治療薬が、ビラミジンを含む。ビラミジンは、リバビリンの３−カルボキサミジン誘導体であり、リバビリンのプロドラッグとして作用する。これは、アデノシンデアミナーゼによって効率的にリバビリンに変換される。
【０２０７】
併用療法で使用するのに適したヌクレオシド類似体として、リバビリン、レボビリン、ビラミジン、イサトリビン、米国特許第５５５９１０１号明細書に開示され、米国特許第５５５９１０１号明細書の式Ｉに包含されているようなＬ−リボフラノシルヌクレオシド（１−β−Ｌ−リボフラノシルウラシル、１−β−Ｌ−リボフラノシル−５−フルオロウラシル、１−β−Ｌ−リボフラノシルシトシン、９−β−Ｌ−リボフラノシルアデニン、９−β−Ｌ−リボフラノシルヒポキサンチン、９−β−Ｌ−リボフラノシルグアニン、９−β−Ｌ−リボフラノシル−６−チオグアニン、２−アミノ−α−Ｌ−リボフラニル［１’，２’：４，５］オキサゾリン、Ｏ２，Ｏ２−アンヒドロ−１−α−Ｌ−リボフラノシルウラシル、１−α−Ｌ−リボフラノシルウラシル、１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−リボフラノシル）−４−チオウラシル、１−α−Ｌ−リボフラノシルシトシン、１−α−Ｌ−リボフラノシル−４−チオウラシル、１−α−Ｌ−リボフラノシル−５−フルオロウラシル、２−アミノ−β−Ｌ−アラビノフラノ［１’，２’：４，５］オキサゾリン、Ｏ２，Ｏ２−アンヒドロ−β−Ｌ−アラビノフラノシルウラシル、２’−デオキシ−β−Ｌ−ウリジン、３’５’−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２’デオキシ−４−チオβ−Ｌ−ウリジン、２’−デオキシ−β−Ｌ−シチジン、２’−デオキシ−β−Ｌ−４−チオウリジン、２’−デオキシ−β−Ｌ−チミジン、２’−デオキシ−β−Ｌ−５−フルオロウリジン、２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−ウリジン、２’−デオキシ−β−Ｌ−５−フルオロウリジン、２’−デオキシ−β−Ｌ−イノシンなど）；米国特許第６４２３６９５号明細書に開示され、米国特許第６４２３６９５号明細書の式Ｉに包含されているような化合物；米国特許出願公開第２００２／００５８６３５号明細書に開示され、米国特許出願公開第２００２／００５８６３５号明細書の式１に包含されているような化合物；国際公開第０１／９０１２１  Ａ２号パンフレット（Ｉｄｅｎｉｘ）に開示されているようなヌクレオシド類似体；国際公開第０２／０６９９０３  Ａ２号パンフレット（Ｂｉｏｃｒｙｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）に開示されているようなヌクレオシド類似体；国際公開第０２／０５７２８７  Ａ２号パンフレットまたは国際公開第０２／０５７４２５  Ａ２号パンフレット（いずれもＭｅｒｃｋ／Ｉｓｉｓ）に開示されているようなヌクレオシド類似体などがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０２０８】
一実施形態では、少なくとも１つの別の好適な治療薬が、ＨＣＶ  ＮＳ３インヒビターを含み得る。好適なＨＣＶ非構造的タンパク質−３（ＮＳ３）インヒビターとしては、米国特許第６６４２２０４号明細書、同第６５３４５２３号明細書、同第６４２０３８０号明細書、同第６４１０５３１号明細書、同第６３２９４１７号明細書、同第６３２９３７９号明細書、同第６３２３１８０号明細書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）に開示されているようなトリペプチド；米国特許第６１４３７１５号明細書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）に開示されているような化合物；米国特許第６６０８０２７号明細書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）に開示されているような大環状化合物；米国特許第６６１７３０９号明細書、同第６６０８０６７号明細書、同第６２６５３８０号明細書（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に開示されているようなＮＳ３インヒビター；米国特許第６６２４２９０号明細書（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）に開示されているようなアザペプチド化合物；米国特許第５９９０２７６号明細書（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）に開示されているような化合物；Ｐａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２０３７４〜２０３８０に開示されているような化合物；ＮＳ３インヒビターＢＩＬＮ  ２０６１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ；Ｌａｍａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３６：３０１Ａ；Ｌａｍａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｃｔ．２６，２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０２０９９）；ＮＳ３インヒビターＶＸ−９５０（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｏｃｔ．  ２４〜２８，  ２００３）  ５４ｔｈ  Ａｎｎ．  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ＡＡＳＬＤ）；ＮＳ３インヒビターＳＣＨ６（Ａｂｉｂ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２４〜２８，  ２００３）  Ａｂｓｔｒａｃｔ  １３７．  Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｎｄ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５４ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （ＡＡＳＬＤ）．Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２４〜２８，２００３．  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ．）；国際公開第９９／０７７３３号パンフレット、国際公開第９９／０７７３４号パンフレット、国際公開第００／０９５５８号パンフレット、国際公開第００／０９５４３号パンフレット、国際公開第００／５９９２９号パンフレットまたは国際公開第０２／０６０９２６号パンフレットに開示されているＮＳ３プロテアーゼインヒビター（国際公開第０２／０６０９２６号パンフレットの２２４〜２２６ページの表に化合物２、３、５、６、８、１０、１１、１８、１９、２９、３０、３１、３２、３３、３７、３８、５５、５９、７１、９１、１０３、１０４、１０５、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２０、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７など）；米国特許出願公開第２００３０１９０６７号明細書、同第２００３０１８７０１８号明細書、同第２００３０１８６８９５号明細書のいずれか１つに開示されているようなＮＳ３プロテアーゼインヒビターなどがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０２０９】
一実施形態では、本発明の併用療法に用いられるＮＳ３インヒビターが、ＮＳ３セリンプロテアーゼ活性を阻害し、ヒト白血球エラスターゼ、ブタ膵エラスターゼまたはウシ膵キモトリプシンなどの他のセリンプロテアーゼあるいは、ヒト肝カテプシンＢなどのシステインプロテアーゼに対して有意な阻害活性を示さないＮＳ３インヒビターなどの特定のＮＳ３インヒビターのクラスのメンバである。
【０２１０】
一実施形態では、少なくとも１つの別の好適な治療薬が、ＮＳ５Ｂインヒビターを含む。好適なＨＣＶ非構造的タンパク質−５（ＮＳ５；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）インヒビターとしては、米国特許第６，４７９，５０８号明細書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）に開示されているような化合物；国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／０１１２７号パンフレット、同第ＰＣＴ／ＣＡ０２／０１１２８号パンフレット、同第ＰＣＴ／ＣＡ０２／０１１２９号パンフレット（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍによって２００２年７月１８日に出願）のいずれかに開示されているような化合物；米国特許第６４４０９８５号明細書（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）に開示されているような化合物；国際公開第０１／４７８８３号パンフレットに開示されているような化合物、たとえば、ＪＴＫ−００３（日本たばこ産業）；Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７：２６７４〜２６８１に開示されているようなジヌクレオチド類似体；Ｄｈａｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７（４１）：３８３２２〜７に開示されているようなベンゾチアジアジン化合物；国際公開第０２／１００８４６  Ａ１号パンフレットまたは国際公開第０２／１００８５１  Ａ２号パンフレット（いずれもＳｈｉｒｅ）に開示されているようなＮＳ５Ｂインヒビター；国際公開第０１／８５１７２  Ａ１号パンフレットまたは国際公開第０２／０９８４２４  Ａ１号パンフレット（いずれもＧｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）に開示されているようなＮＳ５Ｂインヒビター；国際公開第００／０６５２９号パンフレットまたは国際公開第０２／０６２４６  Ａ１号パンフレット（いずれもＭｅｒｃｋ）に開示されているようなＮＳ５Ｂインヒビター；国際公開第０３／０００２５４号パンフレット（日本たばこ産業）に開示されているようなＮＳ５Ｂインヒビター；ＥＰ１２５６６２８  Ａ２号（Ａｇｏｕｒｏｎ）に開示されているようなＮＳ５Ｂインヒビター；ＪＴＫ−００２（日本たばこ産業）；ＪＴＫ−１０９（日本たばこ産業）などがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０２１１】
一実施形態では、本発明の併用療法に用いられるＮＳ５インヒビターは、ＮＳ５  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを阻害し、他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する有意な阻害作用を欠いたＮＳ５インヒビターなど、特定のＮＳ５インヒビターのクラスのメンバである。
【０２１２】
一実施形態では、少なくとも１つの別の治療薬が、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）などのインターフェロンである。本発明の治療方法に、周知のＩＦＮ−αを用いることが可能である。「インターフェロン−α」という用語は、本明細書で使用する場合、ウイルス複製と細胞増殖を阻害し、免疫応答を調節する関連ポリペプチドのファミリーを示す。「ＩＦＮ−α」という用語は、天然に生じるＩＦＮ−α；合成ＩＦＮ−α；誘導体化ＩＦＮ−α（ＰＥＧ化ＩＦＮ−α、グリコシル化ＩＦＮ−αなど）；天然に生じるまたは合成のＩＦＮ−αの類似体；天然に生じるＩＦＮ−αで説明したような抗ウイルス特性を有する、基本的にあらゆるＩＦＮ−αを含む。
【０２１３】
好適なαインターフェロンとしては、天然に生じるＩＦＮ−α（天然に生じるＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂを含むが、これに限定されるものではない）；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ．から入手可能なイントロン−Ａインターフェロンなどの組換えインターフェロンα−２ｂ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，  Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．から入手可能なＲｏｆｅｒｏｎインターフェロンなどの組換えインターフェロンα−２ａ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎ．から入手可能なＢｅｒｏｆｏｒ  α２インターフェロンなどの組換えインターフェロンα−２Ｃ；インターフェロンα−ｎ１、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ，Ｊａｐａｎから入手可能なＳｕｍｉｆｅｒｏｎなど、あるいはＧｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎから入手可能なＷｅｌｌｆｅｒｏｎインターフェロンα−ｎｌ（ＩＮＳ）などの天然αインターフェロンの精製ブレンド；インターフェロンα−ｎ３、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製でＰｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃｏ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．から商品名Ａｌｆｅｒｏｎで入手可能な天然αインターフェロンの混合物があげられるが、これに限定されるものではない。
【０２１４】
「ＩＦＮ−α」という用語は、コンセンサスＩＦＮ−αも包含する。コンセンサスＩＦＮ−α（「ＣＩＦＮ」および「ＩＦＮ−ｃｏｎ」および「コンセンサスインターフェロン」とも呼ばれる）は、米国特許第４６９５６２３号明細書および同第４８９７４７１号明細書に開示されているＩＦＮ−ｃｏｎ１、ＩＦＮ−ｃｏｎ２、ＩＦＮ−ｃｏｎ３で示されるアミノ酸配列；天然に生じるインターフェロンαのコンセンサス配列の決定によって定義されるようなコンセンサスインターフェロン（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，Ｃａｌｉｆ．など）を包含するが、これに限定されるものではない。ＩＦＮ−ｃｏｎ１は、Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）アルファコン−１製品のコンセンサスインターフェロン作用剤である。Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）コンセンサスインターフェロン製品を、本明細書ではそのブランド名（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標））またはその一般名（インターフェロンアルファコン−１）で呼ぶ。ＩＦＮ−ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列は、上述した特許に記載されているようにして、あるいは他の標準的な方法で、合成できるものである。一実施形態では、少なくとも１つの別の治療薬がＣＩＦＮである。
【０２１５】
一実施形態では、ＩＦＮ−αを含む融合ポリペプチドおよび異種ポリペプチドも、本発明の併用療法に使用可能である。好適なＩＦＮ−α融合ポリペプチドとしては、Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ（商標）（ヒトアルブミンとＩＦＮ−αの融合産物；Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．３０３：５４０〜５４８などを参照のこと）。また、本開示で用いるのに適しているのは、ＩＦＮ−αの遺伝子シャッフルされた形態である。Ｍａｓｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．  ５：１０８〜１１３などを参照のこと。他の好適なインターフェロンとして）、Ｍｕｌｔｉｆｅｒｏｎ（Ｖｉｒａｇｅｎ）、Ｍｅｄｕｓａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（Ｆｌａｍｅｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｌｏｃｔｅｒｏｎ（Ｏｃｔｏｐｕｓ）、Ｏｍｅｇａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（Ｉｎｔａｒｃｉａ／Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０２１６】
「ＩＦＮ−α」という用語は、血清半減期などの特定の特性を変化させるよう誘導体化された（天然に生じるペプチドに比して化学的に修飾されているなど）ＩＦＮ−αの誘導体も包含する。それ自体、「ＩＦＮ−α」という用語は、グリコシル化されたＩＦＮ−α；ポリエチレングリコールで誘導体化されたＩＦＮ−α（「ＰＥＧ化ＩＦＮ−α」）などを含む。ＰＥＧ化ＩＦＮ−αならびに、これを製造するための方法が、米国特許第５３８２６５７号明細書、同第５９８１７０９号明細書、同第５９５１９７４号明細書などに記載されている。ＰＥＧ化ＩＦＮ−αは、ＰＥＧのコンジュゲートならびに、上述したＩＦＮ−α分子を包含し、一例として、インターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ．）、インターフェロンα２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ，  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、インターフェロンα−２ｃ（Ｂｅｒｏｆｏｒ  Ａｌｐｈａ，  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にコンジュゲートしたＰＥＧ；天然に生じるインターフェロンαのコンセンサス配列の判断して定義されるようなコンセンサスインターフェロン（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｒｉｓｂａｎｅ，  Ｃａｌｉｆ．）があげられるが、これらに限定されるものではない。
【０２１７】
一実施形態では、ＩＦＮ−αポリペプチドは、１種類以上のポリエチレングリコール部分で修飾可能すなわち、ＰＥＧ化可能である。ＰＥＧ化ＩＦＮ−αポリペプチドのＰＥＧ分子は、ＩＦＮ−αポリペプチドの１種類以上のアミノ酸側鎖にコンジュゲートされる。一実施形態では、ＰＥＧ化ＩＦＮ−αが、１つのアミノ酸だけにＰＥＧ部分を含有する。もうひとつの実施形態では、ＰＥＧ化ＩＦＮ−αが、ＰＥＧ部分を２つ以上のアミノ酸で含有し、たとえば、ＩＦＮ−αが、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なるアミノ酸残基に結合したＰＥＧ部分を含有する。ＩＦＮ−αは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基によってＰＥＧに直接カップリングされた（すなわち、架橋基なし）ものであってもよい。
【０２１８】
クレミゾールなどの阻害剤と他の抗ＨＣＶ作用剤との最適な組み合わせを判断するには、さまざまな抗ＨＣＶ作用剤のさまざまな組み合わせの存在下、ＨＣＶ複製アッセイおよび／または動物研究を実施すればよい。別の作用剤の存在下で複製の阻害が（単独療法で観察されるよりも）大きくなれば、それが併用療法の潜在的な利点の証拠である。
【０２１９】
たとえば、さまざまな組み合わせのクレミゾールとＮＳ３プロテアーゼインヒビター（ＳＣＨ５０３０３４）の存在下でのルシフェラーゼレポーター結合ＨＣＶゲノムを用いるＨＣＶ複製アッセイを、図１Ａおよび図１Ｂに示す。このようなアッセイでは、ルシフェラーゼ活性がＨＣＶ  ＲＮＡゲノム複製と正比例する。この方法では、基本的に（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，１０１９〜１０２７（２００８）（本明細書に援用））に記載されているようにして、野生型ルシフェラーゼレポーター結合ＨＣＶゲノムを用いてＨｕｈ７．５細胞を電気穿孔し、播種した複製をクレミゾールおよびＳＣＨ５０３０３４（ＳＣＨ）の指示濃度の存在下にて７２時間培養した後、細胞溶解してルシフェラーゼ活性を判断した。結果を線形またはログスケールで薬剤濃度の関数としてプロットし、複製阻害曲線を生成することができる。ＮＳ３インヒビターの阻害曲線には、クレミゾールの濃度を増すと有意に多くの阻害が認められる。特に、低マイクロモル濃度のＳＣＨ５０３０３４（１〜５マイクロモルなど）では、クレミゾールを加えることでＨＣＶ複製の阻害を、最大数ログまで用量依存的に増すことが可能である。同様に、本発明の方法では、ＮＳ４Ｂアンタゴニストを他のＮＳ３プロテアーゼインヒビターならびに、クレミゾールと同一の作用機序を持つＮＳ４Ｂアンタゴニストとは作用機序が異なる他の抗ＨＣＶ作用剤と併用投与すると、併用療法の薬効が（単独療法よりも）増えると想定される。これらの結果は、クレミゾールとＳＣＨ５０３０３４との併用療法の利点の明らかな証拠となるだけでなく、本開示によって得られるこの併用療法および同様の併用療法で生体内での治療後に薬効の改善と耐性低下の可能性が想定されることを示す。さらに、これらの結果は、本明細書の開示に鑑みて当業者がアッセイを容易に実施して、本発明の方法の実施形態において有用なＮＳ４Ｂアンタゴニストおよび他の抗ＨＣＶ作用剤との最適な併用療法を判断できることをことを示すものである。
【０２２０】
一実施形態では、本発明の治療方法に副作用管理作用剤を使用でき、これには疼痛管理に効果的な作用剤；胃腸の不快感を寛解させる作用剤；鎮痛薬、抗炎症薬、抗精神薬、抗神経症薬、精神安定剤、造血剤を含む。また、本発明の実施形態は、当該治療法での治療の過程で疼痛または他の副作用が生じている患者の対症療法用に化合物を使用することも企図している。例示としての対症療法剤には、アセトアミノフェン、イブプロフェン、他のＮＳＡＩＤ、Ｈ２ブロッカーおよび制酸薬がある。
【０２２１】
治療に適した宿主
阻害剤の実施形態または方法の実施形態での治療に適した宿主は、フラビンウイルスに感染した宿主を含む。本明細書で使用する場合、「フラビウイルス」という用語は、デングウイルス１型、デングウイルス２型、デングウイルス３型、デングウイルス４型を含むデングウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２３０２７、Ｍ１９１９７、Ａ３４７７４、Ｍ１４９３１などを参照のこと）；黄熱病ウイルス；ウェストナイルウイルス；日本脳炎ウイルス；セントルイス脳炎ウイルス；ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；上記のいずれかのセロタイプ、菌株、遺伝子型、サブタイプ、疑似種または単離物などであるが、これに限定されるものではない、フラビウイルス科ファミリーのメンバを含む。フラビウイルスがＨＣＶである場合、ＨＣＶは多数の遺伝子型、サブタイプまたは疑似種のいずれであってもよく、一例として、遺伝子型１（１ａおよび１ｂ、２、３、４、６などを含む）ならびにサブタイプ（２ａ、２ｂ、３ａ、４ａ、４ｃなど）および疑似種があげられる。
【０２２２】
本発明の実施形態での治療に適した宿主として、治療に失敗した患者があげられる。「治療に失敗した患者」という表現（または「治療失敗」）は、本明細書で使用する場合、通常は、ＨＣＶ（「非応答者」と呼ぶ）での過去の治療法に応答しなかった、あるいは最初は過去の治療法に応答したが、治療応答が維持されなかった（「再発者」と呼ぶ）ＨＣＶ感染患者を示す。過去の治療法は通常、本開示の阻害剤以外はどのような抗ウイルス剤での治療でも含むことが可能である。
【０２２３】
本開示の実施形態での治療に適した宿主は、ＨＣＶに感染していると臨床的に診断された個体を含む。血中のＨＣＶ  ＲＮＡを検出および／または血清中に抗ＨＣＶ抗体を有することで、ＨＣＶに感染している個体を識別することが可能である。
【０２２４】
ＨＣＶに感染していると臨床的に診断された個体は、ナイーブな個体（ＨＣＶを治療していない個体など）を含む。
【０２２５】
本開示の実施形態での治療に適した宿主は、ＨＣＶ力価が、血清１ミリリットルあたりのＨＣＶゲノムコピーで少なくとも約１０５、少なくとも約５ｘ１０５または少なくとも約１０６の個体を含む。患者は、ＨＣＶ遺伝子型（遺伝子型１、１ａおよび１ｂ、２、３、４、６などとサブタイプ（２ａ、２ｂ、３ａなど）を含む）、特に、ＨＣＶ遺伝子型１および特定のＨＣＶサブタイプならびに疑似種などの治療が困難な遺伝子型に感染している場合がある。
【０２２６】
また、慢性ＨＣＶ感染がゆえに、重篤な線維症または初期の肝硬変（非代償性ではなく、チャイルド・ピュー分類のクラスＡ以下）またはさらに進行した硬変（非代償性、チャイルド・ピュー分類のクラスＢまたはＣ）を呈する（上述したような）ＨＣＶ陽性宿主あるいは、過去の抗ウイルス治療にもかかわらずウイルス血症のある患者、あるいは周知の抗ウイルス剤による治療法に対する禁忌のある患者も治療に適している。
【０２２７】
一実施形態では、ＭＥＴＡＶＩＲスコアリングシステムでステージ３または４の肝線維症のＨＣＶ−陽性宿主が、本開示の方法での治療に適している。もうひとつの実施形態では、本開示の実施形態での治療に適した宿主が、臨床所見のある非代償性硬変患者（肝臓移植を待っている患者をはじめとして、肝臓の硬変がかなり進んだ患者を含む）である。さらに別の実施形態では、本開示の実施形態での治療に適した宿主は、初期の線維症（ＭＥＴＡＶＩＲ、Ｌｕｄｗｉｇ、Ｓｃｈｅｕｅｒスコアリングシステムでステージ１および２；あるいはＩｓｈａｋスコアリングシステムでステージ１、２または３）の患者をはじめとして、軽めの線維症のある患者を含む。
【０２２８】
本開示の一実施形態では、治療法で利点が得られる可能性の最も高い患者を最適に選択しやすくし、なおかつ治療法の薬効−特に潜在的な薬剤耐性突然変異ウイルスを前にした場合−を観察するために、本発明によって得られる適切な診断試験の使用に大きな利点があり得る。たとえば、企図した治療法に対する特定の患者で認められた特定のウイルスの感受性を評価することで、候補患者と対応する適切な治療法とのベストマッチを識別しやすくなる。クレミゾール、クレミゾール類似体、クレミゾール骨格を有する化合物または本明細書にて同定される他の阻害剤の場合、これは、特定の患者のＨＣＶ単離物からＮＳ４Ｂ配列を単離し、患者のＮＳ４Ｂアイソフォームによる薬剤のＲＮＡ結合阻害の薬効を求めることで実現可能である。患者由来の種菌を容易に培養できないことから、現段階では特定の患者のウイルスの薬剤感受性についての効率的な研究方法がないため、これは特に重要である。このような診断アッセイを用いて治療法の手助けとすることの価値は、ＨＩＶにおいて広く有効となっている。
【０２２９】
複製アッセイのプロトコール
一実施形態では、複製アッセイのプロトコールに以下のステージを含み得る。以下の複製アッセイのプロトコールは限定的なものではなく、複製アッセイのプロトコールを示す実施形態としてあげたものにすぎない点に注意されたい。
【０２３０】
ステージ１：ＲＮＡ転写
１）ＦＬ−Ｊ６／ＪＦＨ−５’Ｃ１９Ｒｌｕｃ２ＡＵｂｉプラスミドをＸｂａＩによって３７℃で２時間直線化し、１％アガロースゲルに流して消化の完全性を確認する。
２）マングビーンヌクレアーゼを用いて３０℃で３０分間処理し、５’オーバーハングを消化する。
３）Ｂａｒｔ７９Ｉ−ｌｕｃプラスミド（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子がホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子に代わっていること以外は、Ｅｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３，７７（１０）：６０５５〜６１に記載されているようなＢａｒｔ７９Ｉプラスミドと類似）の直線化のために、ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼを使用し、続いて直線化したテンプレートＤＮＡをゲル上で検査して切断が終了していることを確認し、続いてプロテイナーゼｋで消化する。
４）プロテイナーゼＫで３０分間消化し、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、続いて１μｇ／μｌで再懸濁させてテンプレートを精製する。
５）転写反応用に、ＦＬ−Ｊ６／ＪＦＨ−５’Ｃ１９Ｒｌｕｃ２ＡＵｂｉ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）ではＴ７  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット、Ｂａｒｔ７９Ｉ−ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）ではＲｉｂｏＭａｘ（商標）キットを用いて、精製したテンプレート１μｇを使用する。反応物を３７℃で４時間インキュベートする。
６）ＤＮＡｓｅを１５分間加える。
７）同容量のフェノール／クロロホルムで抽出した後、同容量のクロロホルムで抽出する。水性相を回収し、新たな試験管に移す。
８）１容量のイソプロパノールを加えて十分に混合することで、ＲＮＡを沈殿させる。
９）混合物を少なくとも１５分間、−２０℃で冷却する。４℃で１５分間、最大速度で遠心処理し、ＲＮＡをペレット化する。
１０）上清溶液を慎重に取り除き、ＲＮＡをＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含有しない水に１μｇ／μｌで再懸濁させる。
１１）ゲルに流し、ＲＮＡ濃度を確認する。
１２）アリコートを生成し、−８０℃で保管する。
【０２３１】
ステージ２：Ｈｕｈ７．５細胞の電気穿孔
１）細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン化する。
２）５０ｍｌの試験管で、細胞を完全培地の１０ｃｍのプレートあたり合計容量５ｍｌで再懸濁させる（一緒に引く）。
３）細胞を４℃にて１０００ｘＲＰＭで５分間ペレット化する。上清を吸引し、１０ｍｌの氷冷ＲＮＡｓｅフリー濾過１ｘＰＢＳ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ）に再懸濁させる−上下に約５回静かにピペットで吸い上げ、細胞凝集塊を取り除く。
４）再度１０００ｘＲＰＭで前回と同様にして細胞をペレット化し、１０ｍｌの氷冷ＰＢＳ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ）に再懸濁させる。
５）１０μｌのアリコートを取り出して細胞濃度を判断する。
６）細胞を再度ペレット化し、最終濃度を細胞１．５ｘ１０７個／ｍｌで氷冷ＲＮＡｓｅフリーＰＢＳに再懸濁させる。
必要：各電気穿孔（ｅｐ）につき０．４ｍｌ中に細胞を６ｘ１０６個と５μｇのＦＬ−Ｊ６／ＪＦＨ−５’Ｃ１９Ｒｌｕｃ２ＡＵｂｉ  ＲＮＡまたはＢａｒｔ７９Ｉ−ｌｕｃ  ＲＮＡ
７）５μｇのＲＮＡアリコートをエッペンドルフ管に入れる（ｅｐ１回あたり１本）
８）０．４ｍｌの細胞懸濁液を取り出し、ＲＮＡに加える。ピペットで２回混合する。
９）０．４ｍｌを２ｍｍ間隔のｅｐキュベットにすみやかに移す。
１０）細胞にパルスをかける：８２０ｖ、５パルス、９９μ秒、２２０ｍｓ間隔、単極。
１１）細胞を１５分間放置する。
１２）パスツールピペットを用いてキュベットパッケージ内の細胞を培地に移す。すべての試験管から共通のストックを作る。
１３）９６ウェルのプレートで１ウェルあたり細胞１０，０００個を播種する。
１４）プレートを少し回転させ、細胞を一様に播種する。
１５）処理前に２４時間インキュベートする。
【０２３２】
ステージ３：プレートを処理する
１）電気穿孔の約２４時間後に、所望の濃度の薬剤を用いて培地を調製する。
２）培地を吸引し、１００μｌの新鮮な培地と薬剤を加える。開始時には未処理のウェルを残し最後にも未処理のウェルを残す。
３）さらに２日間、毎日繰り返す。
【０２３３】
ステージ４：収穫（電気穿孔から５日目）
１）Ａｌａｍａｒブルーアッセイ−
ａ）バックグラウンド減算用（と、色の変化を容易に確認できるように）培地を含む。
ｂ）培地を吸引する。
ｃ）培地のストックに１０％Ａｌａｍａｒブルーを加えたものを作る。１ウェルあたりの合計容量は１００μｌである。
ｄ）３７℃で（あるいは色が変化するまで）２〜２．５時間インキュベートする。
ｅ）ｆｌｅｘ  ｓｔａｔｉｏｎでプレートを読み取る。
２）ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼアッセイ−
ａ）Ａｌａｍａｒブルーと一緒に培地を吸引する。
ｂ）１ｘＰＢＳで洗浄する。
ｃ）完全に吸引する（吸引した後、傾けて残りの緩衝液を再度吸引する）。
ｄ）どの溶解緩衝液が必要か確認する：ホタルまたはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）。
ｅ）３０μｌの１ｘ溶解緩衝液を加える（１容量の５ｘ溶解緩衝液を４容量の滅菌水に加える）。
ｆ）プレートを１５分間振盪する。
ｇ）−８０℃で冷凍する。この時点で、次のフェーズをやめてもよいし、継続してもよい。
【０２３４】
ステージ５：ルミノメーターでの読み取り
ａ）プレートを解凍する。
ｂ）読み取りの準備が整うまで、プレートを氷の上に置いたままにする。
ｃ）必要な基質試薬を調製する；ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）の場合：ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）緩衝液を解凍し、１容量の１００ｘウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ｌｕｃ基質に１００容量のｌｕｃアッセイ緩衝液を加えたもの＋プライミングルミノメーター用に２ｍｌを作る。（４ｍｌのウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ｌｕｃ基質で、４０ｕｌのアッセイ緩衝液を加えるなど）。ホタルの場合；１０ｍｌのホタル緩衝液を解凍し、ルシフェラーゼ試薬に加える。
ｄ）標準的なルミノメーターを用いて、製造業者の指示に従ってプレートを読み取る。
【実施例】
【０２３５】
以下の実施例は、本開示をどのように製造および使用するのかについて当業者に完全に開示および説明すべくまとめたものであり、本発明者らが自らの開示とみなす範囲を限定することを意図したものではなければ、以下の実験が実施した実験のすべてまたは唯一のものであると表すことを意図したものでもない。使用した数（量、温度など）については正確を期するよう最善を尽くしているが、若干の実験誤差や偏差を念頭におく必要がある。特に明記しないかぎり、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏であり、圧力は大気圧前後である。また、塩基対にｂｐ；キロベースにｋｂ；ピコリットルにｐｌ；秒にｓまたはｓｅｃ；分にｍｉｎ；時間にｈまたはｈｒ；アミノ酸にａａ；キロベースにｋｂ；塩基対にｂｐ；ヌクレオチドにｎｔ；筋肉内の（に）にｉ．ｍ．；腹腔内の（に）にｉ．ｐ．；皮下（に）にｓ．ｃ．などの標準的な略記を使用することもある。
【０２３６】
実施例１：
世界中で１億５０００万人を超える人々がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。残念なことに、インターフェロンとリバビリンとを併用しての治療からなる現行の治療水準１では、こうした個人の多くが自らの感染をなくすことができずにいる（本実施例の最後に添付した番号付きの参考文献リストを参照のこと）。さらに、この治療は有意な副作用と関連し、多くの個人ではこれを使用することができない。よって、現行の治療法は大半の患者にとって不適切１であり、新たなＨＣＶ薬剤に対する差し迫った必要性がある１。
【０２３７】
９．６ｋｂの一本鎖のプラスＲＮＡ  ＨＣＶゲノムは、タンパク質分解的に処理されて成熟ウイルスの成分である構造的タンパク質とウイルスゲノムの複製に関与する非構造的タンパク質（ＮＳ）に分けられる、３，０００のアミノ酸からなるポリタンパク質をコードする。他のプラス鎖ＲＮＡウイルス３と同様に、ＨＣＶは細胞内膜構造と会合して複製されるように見える。ＨＣＶの場合、その構造はｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｗｅｂ４と呼ばれ、ＮＳ４Ｂタンパク質によって誘導されると考えられている。ＮＳ４Ｂは、ＲＮＡ複製の見かけ上の部位内での他のウイルス性ＮＳタンパク質を構築するのにも必要とされる５。ウイルス性ＲＮＡ、特に後代のゲノムの産生に必要とされるマイナス鎖テンプレートが、どのようにしてこれらの複製部位に取り込まれ、あるいはそこで維持されるのかは、いまだ分かっていない。
【０２３８】
ＮＳ４ＢおよびＨＣＶ  ＲＮＡがｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｗｅｂと共存することが明らかになっている６，７ことから、真のウイルスＲＮＡ複製の観点で、ＮＳ４ＢがウイルスＲＮＡと密に接触しているのではないかと考えられる。Ａ型肝炎やポリオピコルナウイルスは２Ｃと呼ばれるタンパク質を有するが、このタンパク質は複製やＲＮＡの結合に必要８，９であり、Ｎ末端両親媒性らせんとヌクレオチド結合モチーフを有する８〜１０。ＮＳ４Ｂは同一の構造的特徴を持ち、どちらもＨＣＶの複製に必要である５，１１。本発明の方法は、ある意味では、ＮＳ４Ｂが同様にＲＮＡを結合し、この相互作用がＨＣＶの生活環に重要であり、ＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合が薬理学的な崩壊の影響を受けやすいという発見に端を発したものである。本発明は、複数の症状、突然変異、複製物、定量的解離定数（Ｋｄ）測定値、潜在的な薬理学的インヒビターの高スループットスクリーニングについての同時解析を可能にするフォーマットの試験管内でのＲＮＡ結合アッセイを提供するものである。
【０２３９】
大半の薬剤標的１２と同様に、ＮＳ４Ｂも図７ｂに示すような膜タンパク質（配列番号１３）である。膜タンパク質は、生化学的、特に薬学的スクリーニングに必要な量での発現とキャラクタライゼーションが困難なことで有名である。さらに、洗剤による可溶化でその天然の膜会合トポロジーが変わってしまう可能性もある。これらの問題を改善するために、本発明は、タンパク質の消費量がナノリットル単位の結合アッセイを実施するためのマイクロ流体ツールを提供するものである。これによって、試験管内での細胞可溶化物発現系を用いることができ、これにミクロソーム膜を補充して一層天然の畳み込み状態を作り、そこで現時点で得られる最高のＮＳ４Ｂトポロジーデータが得られている１３。従来の発現方法に比して収率が落ちる分は、試料消費量が少ないことで相殺される。
【０２４０】
薬剤の相互作用を測定するための過去のマイクロ流体ツールは、蛍光基質の形成を触媒できる酵素標的に限定されている１４。本発明の一実施形態では、分子相互作用の機械的な捕捉（ＭＩＴＯＭＩ）すなわち、過去に転写因子とＤＮＡとの間の相互作用の測定に用いられているマイクロ流体親和性アッセイを利用して、結合定数を直接測定する１５。本発明の方法を用いて得られた結果から、膜タンパク質−ＲＮＡ相互作用の結合定数の測定と、高スループットのスクリーニングにおける小分子によるこのような相互作用の阻害の測定の両方に、ＭＩＴＯＭＩを利用できるということが分かる。装置の製造に用いるエラストマーが化学的な相溶性に限度があることが分かっているものであっただけに、後者の特質は特に驚くべきことである１６，１７；ここで、本発明者らは、これが薬剤スクリーニングでのその用途を妨げるものではなく、所望の薬理学的特性を有する小分子の発見を妨げるものでもないことを示す。総合すれば、本発明のこれらの方法を用いて得られる結果は、新規なＨＣＶ標的を明らかにするとともに、マイクロ流体ツールを薬剤の発見に応用する１８,１９という十年以上も前からの取り組みの実現に成功したことで、マイクロ流体技術を用いて新たな製剤を発見できる旨を初めて示した例となる。
【０２４１】
結果
胚性致死異常視角系（ＥＬＡＶ）ファミリー由来の２つのヒトタンパク質（そのＲＮＡ結合活性については過去に十分特徴付けられている）を研究して、ＲＮＡ結合用のマイクロ流体プラットホームを検証した。次に、この方法論を適用し、膜貫通ＨＣＶ  ＮＳ４Ｂタンパク質とのＲＮＡ相互作用について研究した。このプラットホームを用いて、（ｉ）ＨＣＶ  ＮＳ４ＢがＲＮＡを結合するという仮説を試験し、（ｉｉ）この相互作用のＫｄを求め、（ｉｉｉ）この結合の基質特異性を研究し、（ｉｖ）ＲＮＡ結合に必要なＮＳ４Ｂ内のアミノ酸を判断し、（ｖ）ＮＳ４Ｂ  ＲＮＡ結合およびＨＣＶ複製の薬理学的インヒビターについて化合物ライブラリをスクリーニングした。
【０２４２】
マイクロ流体アッセイ検証：ＲＮＡへのＨｕＤの結合。ＨｕＤは、ＲＮＡ結合活性が十分にキャラクタライズされたＥＬＡＶ様ファミリー由来の宿主細胞タンパク質である２０〜２２。これは、３つの保存ＲＮＡ認識モチーフを含有する細胞質タンパク質であり、これらのモチーフを介して、サイトカインおよびプロトオンコジーンをコードするものなどの遺伝子の３’ＵＴＲ（未翻訳領域）のＡＵを豊富に含む要素（ＡＲＥ）と結合する。ＨｕＤ結合が損なわれる周知のＡＵ３突然変異２１，２２とＡＵ３の２つのＣｙ３標識ＲＮＡプローブに対して結合を試験した（図５）。ＭＩＴＯＭＩを用いるＲＮＡ結合実験については、この例ではＤＮＡではなくＲＮＡを用いたこと以外、基本的にＭａｅｒｋｌおよびＱｕａｋｅ１５に説明されているようにして実施した（図１０）。
【０２４３】
簡単に説明すると、Ｃｙ３で標識した標的ＲＮＡ配列のマイクロアレイをエポキシコートスライドガラスにスポットした。これらのアレイを使用して、アレイの各スポットを装置のユニットセルと整列配置させることで、マイクロ流体装置をプログラムした。マイクロ流体装置をマイクロアレイに結合した後、各ユニットセル内で円形部分がビオチン化抗ヒスチジン抗体で覆われるように、表面パターニングをほどこした。次に、インフレームでＣ末端Ｖ５−６ヒスチジンタグ（ＨｕＤ−Ｖ５−ｈｉｓ）と縮合したＨｕＤあるいは、インフレームでＣ末端６ヒスチジンタグ（Ｇｕｓ−ｈｉｓ）と縮合したＧｕｓタンパク質をコードするＤＮＡテンプレートを含有する試験管内転写／翻訳混合物を、装置にロードした。Ｂｏｄｉｐｙ標識したｔＲＮＡＬｙｓをタンパク質標識用に加えた。次に、マイクロメカニカルバルブを用いて各ユニットセルを単離した後にインキュベーションし、タンパク質の合成、合成後のタンパク質と表面ビオチン化抗ｈｉｓ抗体との結合、標的ＲＮＡの溶媒和、タンパク質と標的ＲＮＡの平衡を得た。次に、溶液相の分子をすべて追い出しながら、「ボタン」膜を作動させてＭＩＴＯＭＩを実施して表面結合複合体を捕捉した。軽く洗浄して捕捉されなかった未結合材料を除去した後、捕捉分子と発現タンパク質をアレイスキャナで検出した。データ点ごとに、ｂｏｄｉｐｙのメジアンシグナルに対するＣｙ３のメジアンシグナルを測定して結合ＲＮＡと発現タンパク質との比を求めた。
【０２４４】
図５ａに示すように、このアッセイではＨｕＤとＡＵ３  ＲＮＡプローブとの強い結合が検出された；Ｇｕｓ−ｈｉｓによるバックグラウンド結合は、ＨｕＤシグナルの７〜１６分の１であった。このバックグラウンドレベルは、ＲＮＡプローブ濃度によっては増加せず、すべてのチャンバから減算した（図１１）。ＡＵ３プローブに対するＨｕＤの結合親和性は、ＡＵ３突然変異プローブに対するよりもかなり高かった：ＡＵ３結合のＫｄを求めたところ、２３±５ｎＭであり、ＡＵ３突然変異では２６８±９５ｎＭ（図５ａ）であった。これらの値は、ゲルシフトアッセイ２１，２２での過去の測定値と一致し、ＭＩＴＯＭＩマイクロ流体親和性アッセイをＲＮＡ−タンパク質相互作用について検証する役割を果たしている。ＥＬＡＶ様ファミリー由来のもうひとつのタンパク質であるＨｕＲのＲＮＡ結合解析を図１２に示す。
【０２４５】
ＮＳ４ＢはＨＣＶ  ＲＮＡと結合、およびマイクロ流体によるＫｄの決定。この系を利用して、ＨＣＶ  ＮＳ４ＢがＲＮＡに結合するか否かを試験した。ＮＳ４ＢはウイルスＲＮＡの複製において重要であり、プラス鎖ＲＮＡ合成はマイナス鎖ＲＮＡの３’末端から開始される可能性が高いため、３’マイナス末端と表示したプローブを用いて、この領域に対するＮＳ４Ｂの結合を最初に試験した。ＮＳ５Ａの両親媒性らせん（ＡＨ）とＧＦＰのＮ末端との融合５を負の対照として利用した。このタンパク質は、膜にも結合し、ＧＦＰと抗ＧＦＰとの相互作用によってミクロソーム膜を装置表面に固着させることが可能である（図５ｃ）。ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’末端に対するＮＳ４Ｂ結合のＫｄを、３．４＋１．０ｎＭで測定した（図５ｄ）。これは、ＨＣＶ  ＮＳ４ＢがＲＮＡに結合するという最初の証拠であるように思われる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された組換え形態の精製ＮＳ４Ｂを用いる従来のＧＳＴプルダウンアッセイおよびＲＮＡフィルタ結合アッセイも、この所見を裏付けた（図１３）が、これらはあまり便利ではなく、本発明の方法によって提供される分析のタイプと高スループットフォーマットに影響されやすい。
【０２４６】
ＮＳ４Ｂは、マイナスウイルス鎖の３’末端に特異的に結合する。３種類の別のＨＣＶプローブを用いて、観察されたＮＳ４Ｂ−ＨＣＶ  ＲＮＡ相互作用の基質特異性を測定した（図６ａ）。５’ＵＴＲ  ｐｏｓおよび３’ＵＴＲ  ｐｏｓで示すプローブが、ウイルスのプラス鎖の５’ＵＴＲ配列と３’ＵＴＲ配列にそれぞれ対応し、５’マイナス末端がマイナス鎖の５’末端に対応する。ＲＮＡ結合実験を繰り返し、等モル濃度（３ｎＭ）のさまざまなプローブへのＮＳ４Ｂの結合を比較した。図６ｂから明らかなように、ＮＳ４Ｂは４つのＨＣＶプローブすべてと結合するが、３’マイナス末端プローブに対するその見かけの親和性は、試験した他の３つのＨＣＶ  ＲＮＡ領域あるいは無関係のデルタウイルスＲＮＡゲノム配列よりも５〜１２倍高い２３，２４（図６ｂ参照）。これらの所見は、マイナス鎖の３’末端へのＮＳ４Ｂ結合の特異性を決めるのがＲＮＡ配列であり、二次ＲＮＡ構造の可能性が高いという結論を裏付けている。
【０２４７】
ＲＮＡ結合とＨＣＶ複製には、ＮＳ４Ｂのアルギニンリッチ様モチーフが必須である。タンパク質とＲＮＡとの相互作用を担うさまざまな構造的モチーフが報告されている２５。このうちの１つが、アルギニンリッチモチーフ（ＡＲＭ）である。ＡＲＭは、もともとはウイルス、バクテリオファージ、リボソームのタンパク質に見られる短い（１０〜２０アミノ酸）アルギニンリッチ配列として定義された（図７ａ）９，２５，２６。アルギニン残基が優勢であること以外は、ＡＲＭ配列間の同一性はほとんどない。続いて、アルギニンの含有数がそれよりも少ない、長めの配列からなるＡＲＭ様モチーフが同定された９，２６。ＮＳ４Ｂの一次配列を調べたところ、複数の正に荷電したアミノ酸があることが分かっている（図７ｂ参照）。これらのアルギニン残基の大半が、ＮＳ４ＢのＣ末端領域の最後の７１個のアミノ酸にある（図７ｂおよび図７ｃ）。グリコシル化マーカーを用いる経験的トポロジー研究によれば、この領域が細胞質セグメントを形成するのではないかと予想される１３。この領域の要素は、過去に説明されているＡＲＭ様モチーフを確認するものでもある。
【０２４８】
一連の点変異を利用して、本発明者らは、ＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合がその正に荷電した残基のいくつかによって媒介されるか否かを試験した。位置１９２〜１９３におけるＡｒｇ−ＡｒｇがＡｌａ−Ａｌａに置換されたものを「ＲＲａ突然変異」と呼び、位置２４７〜２４８に同様の置換があるものを「ＲＲｂ突然変異」とした。図７ｄから明らかなように、ＲＲｂ突然変異はＮＳ４Ｂによる３’マイナス末端プローブへの結合を５分の１に減らしたが、ＲＲａ突然変異へのＲＮＡ結合活性は同一のプローブ濃度（１．５ｎＭ）で完全に消失した。これらの結果は、試験したアルギニン残基が試験管内にてＮＳ４ＢによってＲＮＡ結合を媒介するという仮説を裏付けている。これらの正に荷電した残基もＨＣＶ複製に重要であるという仮説を検証するために、これらの変異を高効率のサブゲノムＨＣＶレプリコンに導入し、これらのレプリコンを標準的なレプリコンコロニー形成アッセイでアッセイした。図１６に示すように、ＲＲｂ変異では複製が約４５分の１に減ったが、ＲＲａ変異を持つレプリコンではＲＮＡ複製が完全に欠けていた。さらに、複製阻害の度合いは、さまざまな変異によって引き起こされるＮＳ４Ｂ  ＲＮＡ結合障害の度合いと相関していた（図７ｄ参照）。さらに、対照実験から、複製に対する劇的な作用は、発現の変化やタンパク質のミスローカリゼーションの結果ではないことが示唆された。むしろ、これらの微妙な変異は、ＮＳ４Ｂの鍵となる調節部位に影響しているように見える。これらの結果は、試験管内でのウイルス複製にはＨＣＶ  ＲＮＡの効率的な結合が必要であるという結論を裏付けるものである。データベースにおいて現段階で入手可能な天然ＨＣＶ単離物の配列のアライメントから、これらの正に荷電した残基が全ＨＣＶ遺伝子型にわたって高度に保存されていることが分かる。この保存は、生体内での増殖性のウイルス感染のためにはＲＮＡ結合残基に要件があるという結論を裏付けるものである。
【０２４９】
阻害化合物の高スループットのスクリーニング。化合物ライブラリを、本発明の方法に従ってスクリーニングし、ＲＮＡ−ＮＳ４Ｂ相互作用を阻害し得る小分子を同定した。図８ａに示すように、小さな分子ライブラリの１２８０の化合物をエポキシコートスライドガラスにマイクロアレイとしてスポットした。上述したように、アレイを乾燥させ、整列配置してマイクロ流体装置に結合した。アッセイの残りの部分については、装置にＮＳ４Ｂ−ＧＦＰをロードした後、Ｃｙ５−標識３’末端マイナスＲＮＡプローブをロードしたこと以外は、前と同じようにして実施した。一次スクリーニングでは、濃度約１ｍＭで化合物をスポットした。マイクロ流体装置を２つだけ用いて、ライブラリ全体を二重にスクリーニングした。１２８０の化合物のうち、１０４の化合物でＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合に対する阻害作用（＞９０％阻害）が認められた。また、２つの試験した複製に有意な相違があったか、あるいは測定値のうちの１つまたは２つが技術的な理由で乱れた化合物が、１１０あった。
【０２５０】
一次スクリーニングで同定された２１４の化合物（１０４＋１１０）に対し、二次スクリーニングを実施した（図８ａ）。これは、小さめの装置を使用し、スポットした化合物の濃度を一次スクリーニングの１０分の１にして、化合物ごとに５組重複させてスポットしたこと以外は、同様に実施した。試験した２１４の化合物のうち、１８の化合物がＮＳ４ＢによってＲＮＡ結合を有意に阻害することが確認された（図８ｂ）。同定された化合物の大半は、自己の４Ａ標的ＲＮＡ配列へのＨｕＲタンパク質の結合を阻害せず（図１２）、過去に説明されているＨＣＶ  ＲＮＡ標的：ウイルスのマイナス鎖の３’末端に対するＨｕＲ結合も阻害しなかった２７ことから、これらのヒットが特異的であると考えられた。スクリーニングの有効性を裏付けているこのデータおよび別のデータを図１４にあげておく。
【０２５１】
ＨＣＶ  ＲＮＡ複製のインヒビター。上記のスクリーニングで同定された阻害化合物のＨＣＶ  ＲＮＡ複製に対する生体内抗ウイルス作用を測定した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する全長ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムでの電気穿孔後２８、これらの化合物の濃度を高めながらＨｕｈ７．５細胞を増殖させた。７２時間の時点でルシフェラーゼアッセイを実施した。平行して、化合物の存在下での細胞の生存度をＡｌａｍａｒブルーベースのアッセイで評価した。この化合物のうちの６つで、単に細胞毒性によるものを超えた何らかの抗ウイルス作用を示した。塩酸クレミゾール（１−ｐ−クロロベンジル−２−（１−ピロリジニル）メチルベンズイミダゾール塩酸塩）すなわちＨ１ヒスタミン受容体アンタゴニストが、ＨＣＶ複製を有意に阻害することが明らかになった。２０μＭの薬剤濃度でウイルス複製が１０分の１に低下することが測定され、ＥＣ５０は約８μＭ（図８ｃ）であった。これらの濃度で、測定可能な細胞毒性はなかった（図８ｃ）。感染性ＨＣＶクローン（Ｊ６／ＪＦＨ）に感染したクレミゾール処理Ｈｕｈ７．５細胞で実施したリアルタイムＰＣＲアッセイでも、同様の結果が得られた２９（図１５）。ＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合の場合のクレミゾールの試験管内でのＩＣ５０は約２４±１ｎＭ（図８ｄ）であった。
【０２５２】
塩酸クレミゾール誘導体分子の力価および薬効の向上：本出願の本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングを実施し、力価が高くなったクレミゾール類似体を同定した。このような一分子の例を図１７に示す。この図は、以下のデータを有する。
図１７Ａ−塩酸クレミゾールの化学構造。
図１７Ｂ−力価と薬効が向上したクレミゾール誘導体分子の化学構造。  図１７Ｃ−マイクロ流体で測定した場合のクレミゾール誘導体分子（●）および親の塩酸クレミゾール化合物（□）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害曲線。
図１７Ｄ−ＨＣＶ感染細胞のリアルタイムＰＣＲアッセイで測定した、クレミゾール誘導体分子（●）および塩酸クレミゾール（□）の濃度を高めた場合のＨＣＶ複製の用量応答曲線。
【０２５３】
バーは標準偏差を表す。
【０２５４】
見れば分かるように、この誘導体化合物では試験管内での力価が増加している（ＩＣ５０が６ｎＭ、これに対しクレミゾールでは２４ｍＭ）（図１７Ｃ）。重要なことに、この化合物では、ＥＣ５０が１μＭ（これに対し、クレミゾールでは８μＭ）の細胞でのＨＣＶ複製に対する抗ウイルス活性も高くなった（図１７８Ｄ）。
【０２５５】
総合すれば、上記のデータを耐性突然変異の解析と組み合わせたところ、クレミゾールの作用機序についての遺伝学的、生化学的、薬理学的にみて有力な証拠が得られる。さらに、これらのデータは、本発明の方法を用いれば一層強力な阻害分子を同定できる可能性があることを示している。
【０２５６】
クレミゾール耐性突然変異。クレミゾール耐性ＨＣＶ突然変異を選択することで、クレミゾールの抗ウイルス活性の作用機序をさらに立証した。樹立ＨＣＶレプリコン保持細胞と、遺伝子型１ｂサブゲノムＨＣＶレプリコン（Ｂａｒｔ  ７９Ｉ）３０で新たに電気穿孔したＨｕｈ７細胞とを、薬剤の存在下で継代し、化合物の存在下で増殖できる約６０のコロニーを得た。１１の個々のコロニーが伸長に成功し、５〜１０回継代され、細胞で複製しているＨＣＶ  ＲＮＡを配列解析した。また、クレミゾール耐性コロニーのプールから得たＲＮＡを単離し、同様の解析を実施した。３つのコロニーが、ＮＳ４Ｂ領域にマッピングされた変異のあるレプリコンを持ち、６つのコロニーがマイナス鎖３’末端ＲＮＡ領域にマッピングされた変異のあるレプリコンを持つことが明らかになった。（図１７Ｂのクレミゾール誘導体分子の存在下で選択された耐性変異の場所が、ＨＣＶゲノム内の同様の場所にマッピングされたことに留意されたい）。また、ＮＳ４Ｂとマイナス鎖３’末端の両方にマッピングされた変異を持つコロニーが１つあり、また、クレミゾールに耐性を与えている変異の場所が今のところ同定されないコロニーが１つあった。薬剤の非存在下で平行して継代させた１０のレプリコンコロニーでは、このような変異は同定されなかった。
【０２５７】
クレミゾール耐性ＮＳ４Ｂ突然変異のうちの２つを詳細にキャラクタライズした。第１に、Ｗ５５Ｒを図９ａに示す。これは、細胞質的に配向されたＮＳ４Ｂの予測セグメント内のアミノ酸５５位でのトリプトファンに対するアルギニンの置換を伴う。この変異は、細胞でクレミゾール耐性表現型を与えるのに十分なものである：Ｗ５５Ｒ突然変異細胞から抽出された全細胞ＲＮＡ（図９ｂ）あるいは、この点変異と結合ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする試験管内転写Ｊ６／ＪＦＨ  ＲＮＡ（図９ｃ）のいずれかでトランスフェクトされたＨｕｈ７．５細胞は、１０μＭのクレミゾールの影響を受けなかった。Ｗ５５Ｒ突然変異Ｊ６／ＪＦＨ  ＲＮＡについてのクレミゾールのＥＣ５０は約１８μＭ（野生型ＲＮＡのＥＣ５０の２．２５倍）であった。ＮＳ３プロテアーゼインヒビターに対する耐性のある他のＨＣＶ突然変異と同様に３１、Ｗ５５Ｒ突然変異の複製の絶対レベルは野生型ゲノムの場合よりも低かったことから、薬剤耐性変異が複製の適応度を損なうという犠牲を払って生じるものであることが分かった。
【０２５８】
この変異をＮＳ４Ｂ−ＧＦＰベクターにも導入し、得られたベクターのＲＮＡ結合活性を、本発明の試験管内マイクロ流体アッセイで試験した。突然変異と野生型ＮＳ４Ｂタンパク質のどちらも１０ｎＭのクレミゾールの存在下でＲＮＡ結合が約２分の１になったが、突然変異のベースラインＲＮＡ結合が高くなるため、クレミゾールの存在下で突然変異に結合されたＲＮＡの残留量は、クレミゾールの非存在下で野生型に結合された量に匹敵した（図９ｄ）。さらに、図９ｅから明らかなように、この突然変異は、Ｋｄ０．７５ｎＭ（これに対し、野生型ＮＳ４Ｂでは３．４ｎＭ）でウイルスＲＮＡに対する見かけ上の親和性が高くなっている。
【０２５９】
Ｒ２１４Ｑと呼ぶ第２のクレミゾール耐性変異を、耐性コロニーならびにプールされた耐性細胞で同定した。これは、ＮＳ４Ｂの細胞質Ｃ末端セグメント内でのアミノ酸２１４位でのアルギニンに対するグルタミンの置換を伴う。この変異に対してなされた細胞解析と試験管内解析で第１の変異に対する同様の結果が得られ、ルシフェラーゼレポーター結合複製アッセイでのＥＣ５０は４０．３μＭ（野生型ＲＮＡのＥＣ５０よりも約５倍高い）、試験管内結合アッセイでのＫｄは０．６ｎＭであった。おそらく、これらの変異は両方とも、ウイルスＲＮＡに対する自らの親和性を高めるためにＮＳ４Ｂのコンホメーションを変化させる。特に、試験管内でのＲＮＡ結合アッセイによって測定されるＫｄが、これを反映している。総合すれば、上記のデータは、クレミゾールの作用機序についての有力な遺伝学的証拠や生物学的証拠を提供するものである。
【０２６０】
考察
上記の結果から、ＨＣＶ  ＮＳ４ＢがＲＮＡに結合し、この結合がウイルスゲノムのマイナス鎖の３’末端に特異的であるということが分かる。この相互作用の生体内での特異性はいまだ定量的には判断されていないため、ここに報告した試験管内での結果の数値を外挿する際には通常の注意を払う必要がある。ＮＳ４Ｂのアルギニンリッチ様モチーフは、ＲＮＡ結合とＨＣＶ複製に必須である。塩酸クレミゾールは、宿主細胞にとっての毒性がほとんどなく、ＮＳ４ＢのＲＮＡ結合の阻害によって媒介される、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製に対して有意な生体内抗ウイルス作用を持つことが明らかになっている。
【０２６１】
ＮＳ４Ｂは膜と関連して５おり、膜複製部位を誘導することが知られている４ため、そのＲＮＡ結合活性は、ウイルスゲノムをＨＣＶ複製コンパートメントに取り込むための機序を提供するものである。これは、膜固着マイナス鎖から新生プラス鎖を作る合成の開始を容易にすることもある。ＮＳ４Ｂは、複製複合体３２のＮＳ５Ｂポリメラーゼまたは他の成分との相互作用によって、ＨＣＶ  ＲＮＡに対するポリメラーゼ複合体を呼び出して作用することもある。
【０２６２】
ＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合に対するクレミゾールの試験管内でのＩＣ５０は、約２４±１ｎＭであるのに対し、そのウイルス性複製のＥＣ５０は約８μＭである。細胞浸透性の低さは、ＮＳ４Ｂによる試験管内のＲＮＡ結合で測定されたＩＣ５０と、細胞で抗ウイルス作用について測定されたＥＣ５０との間に約４００倍の差があることに起因している可能性がある。構造−活性関係（ＳＡＲ）解析後の薬剤送達の改善と化合物の最適化によって、一層強力な抗ウイルス剤が得られると想定され，本発明のマイクロ流体系およびスクリーニング方法によってこのプロセスを容易にすることが可能である。
【０２６３】
この研究は、マイクロ流体アプローチの用途を示すものでもある。マイクロ流体親和性アッセイには、現段階で用いられている方法に比していくつかの重要な利点があり、それがゆえに、薬剤、特に膜結合標的の発見のための将来性があって汎用的なツールになる。第１に、マイクロソーム膜の存在下での哺乳類網状赤血球ライセートによるタンパク質合成のおかげで、タンパク質の畳み込みに必要な天然の状態が得られる。第２に、マイクロ流体アッセイを用いると、高レベルのタンパク質発現と精製が不要になり、現段階で用いられている方法に固有の問題がなくなる。第３に、このアッセイは、一過性かつ低親和性の相互作用１５を検出することができる。第４に、マイクロ流体装置は、多くの並列測定が可能であり、よって、高スループットのスクリーニングに使用可能である。最後に、この装置の製造に用いられるエラストマーには周知の化学的相溶性の問題があるにもかかわらず、この装置および方法を用いてうまくスクリーニングして所望の薬理学的特性を備えた小分子を発見することが可能である。
【０２６４】
ＨＩＶおよび結核と同様に、ＨＣＶの効果的な薬理学的制御は、独立したウイルス特異的標的に対する複数の薬剤のカクテルで最もよく実現される可能性が高い。中程度のＮＳ４Ｂインヒビターと既存のおよび／または他の出現している抗ＨＣＶ作用剤とを組み合わせることで、現行のウイルス学的応答速度を高めるための魅力的なパラダイムが提示される。クレミゾールよりも強力なインヒビターを得ることは可能であるが、クレミゾールはすでにヒトで広範囲にわたって用いられている（適応は異なるが）ため、抗ＨＣＶ治療薬としてすぐに用途が考えられる上、本発明による次世代抗ＨＣＶ戦略の重要な構成要素ともなり得るものである。
【０２６５】
方法
プラスミド：標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、すべてのプラスミドを構成および精製した。ＰＣＲで増幅された全領域を自動ＤＮＡ配列決定によって解析した。大規模細菌培養からプラスミドＤＮＡを調製し、Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｍａｒｌｉｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから制限酵素を購入した。
【０２６６】
ｃＤＮＡクローンのＯＲＦｅｏｍｅライブラリ（Ｏｐｅｎ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から、ＨｕＲおよびＨｕＤのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。ゲートウェイ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃ末端Ｖ５−ｈｉｓタグの付加が可能になるようにこれらのＯＲＦを発現ベクターｐｃＤＮＡ−Ｄｅｓｔ  ４０  ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。
【０２６７】
インフレームでＣ末端ＧＦＰに縮合された遺伝子型１ａのＮＳ４ＢをコードするプラスミドｐｃＤＮＡ−ＮＳ４Ｂ−ＧＦＰについては、過去に説明がなされている５。このプラスミドに、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用）によって、変異ＲＲａ、ＲＲｂおよびＷ５５Ｒを導入した。過去に報告されているようにして、プラスミドＮＳ５Ａ（ＡＨ）ＧＦＰを構成した。Ｇｕｓ−ｈｉｓベクターをＲｏｃｈｅから入手した。
【０２６８】
ＥｃｏＲＶ制限部位を含有するプライマーを用いてＢａｒｔ７９Ｉプラスミド３３からの５’ＵＴＲ陽性配列を増幅し、ＥｃｏＲＶで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の対応する部位にライゲーションすることで、ウイルスのプラス鎖の５’ＵＴＲをコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−５’ＵＴＲ  ｐｏｓを生成した。ＥｃｏＲＶフランクインサートを逆向きにライゲートしたこと以外は同様にして、マイナスＲＮＡ鎖の３’末端領域をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−３’マイナス末端を生成した。
【０２６９】
挿入した遺伝子がＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏｌ制限部位でフランクされたものであること以外は同様にして、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−３’ＵＴＲ  ｐｏｓおよび５’マイナス末端を生成した。
【０２７０】
ＮｈｅＩフランクＨＤＶ配列を、ＸｂａＩで切断したｐＳＰＴ１９ベクター（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に挿入することで、デルタウイルスゲノムＲＮＡ配列をコードするベクターをクローニングした２３，２４。
【０２７１】
全長ＨＣＶゲノムからなり、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを発現するプラスミドＦＬ−Ｊ６／ＪＦＨ−５’Ｃ１９Ｒｌｕｃ２ＡＵｂｉは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｒｉｃｅ博士からの贈り物２８であった。このプラスミドに、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用）によってＷ５５Ｒ変異を導入した。
【０２７２】
試験管内  ＲＮＡ転写ならびに、蛍光標識および放射性標識。ウイルスのマイナス鎖とプラス鎖の５’末端および３’末端領域のプラスミドＤＮＡを、ＸｂａＩで直線化した。デルタゲノム配列のプラスミドＤＮＡを、ＸｂａＩで直線化した。直線化後のプラスミドをプロテイナーゼＫで処理した後、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを最終濃度が１μｇ／μｌになるようにＲＮａｓｅフリー水に再懸濁させた。４μｇのＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＴ７  ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ）での転写用のテンプレートとして使用した。５ＵのＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を加えてテンプレートＤＮＡを消化し、３７℃で１５分間インキュベーションした。取り込まれなかったリボヌクレオチドを、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｐ−３０カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でのサイズ排除によって除去し、転写ＲＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出した後、エタノール中で沈殿させた。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、Ｈ２Ｏに再懸濁させた。２６０ｎｍでの光学密度を測定して、ＲＮＡ濃度を判断した。１％アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色で、ＲＮＡの完全性とその濃度を確認した。
【０２７３】
Ｌａｂｅｌ  ＩＴキット（Ｍｉｒｕｓ）を製造業者のプロトコールどおりに用いてＣｙ５でＲＮＡ配列を標識した後、マイクロスピンカラム（Ｍｉｒｕｓ）で精製し、エタノール沈殿させた。２６０ｎｍと、Ｃｙ５（６５０ｎｍ）の場合はλＭＡＸで、核−染料コンジュゲートの分光光度吸光度を測定して、ＲＮＡ分子１つあたりの蛍光標識数を求めた。これはプローブ長に比例し、結合実験結果の調節に使用された。
【０２７４】
ＨｕＲおよびＨｕＤによるＲＮＡ結合の研究に用いたＣｙ３−標識ＲＮＡプローブをＩＤＴから購入した。
【０２７５】
過去に説明されているようにして３４３２ＰでのＲＮＡプローブの放射性標識を実施した。
【０２７６】
装置の設計：装置の製造と設計は、基本的に説明がなされているように実施した１５。簡単に説明すると、バルブを作動させるのに必要なすべてのチャネルがある「制御」層を、制御対象となるチャネルのネットワークを含む「フロー」層の上に配置する。生物学的アッセイならびに流体操作はすべて、フロー層で実施する。制御チャネルがフローチャネルと交差する部分にバルブを作製する。こうして２本のチャネル間の結合部分に得られる薄い膜は、油圧作動によって変形可能である。多重バルブ系を用いることで、多数のエラストマーマイクロバルブで、これらの装置内での複雑な流体操作を行うことができるようになる。これらの装置への流体の導入は、シリコーンに穿孔した穴に挿入されたスチールピンを介して達成される。コンピュータ制御した外部のソレノイドバルブによってマルチプレクサを作動させることができ、それによって複雑な多数のマイクロバルブの複雑なアドレス指定が可能になる。各ユニットセルは、３つのマイクロメカニカルバルブならびに「ボタン」膜（図１０）によって制御される。各ユニットセルの「ボタン膜」は、２つの「サンドイッチ」バルブ間でフローチャネル内の円形部分をマスクする。マイクロアレイを整列配置して装置に結合すると、スポット材料（ＲＮＡプローブまたは阻害化合物）を各ユニットセルの「ＲＮＡチャンバ」内に位置決めすることができるようになる。このようにしておけば、「ネックバルブ」を制御してフローチャネルに対してオープンにすることができる。使用した装置は、６４０ユニットセルまたは２４００ユニットセルのいずれかであった。
【０２７７】
ＲＮＡ結合アッセイ。使用したアプローチは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用について過去に説明されている方法１５を改変したものである（図１０）。
【０２７８】
１．可溶性タンパク質：Ａ．ＲＮＡのアレイ化と装置の整列配置。まず、ＣＭＰ３Ｂピン（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を用いるＯｍｎｉＧｒｉｄ  Ｍｉｃｒｏ（ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ）マイクロアレイヤーによって、Ｃｙ３−標識標的ＲＮＡ配列（ＩＤＴ）の希釈系列をエポキシコートガラス基板スライド（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）に列間と行間がそれぞれ６８０ｍｍおよび３２０ｍｍのマイクロアレイとしてスポットした。各試料溶液には、エポキシ官能基に対する標的ＲＮＡの共有結合を防止するためならびに、整列配置時の可視化目的で、ｄＨ２Ｏ中に１％ＢＳＡを含有していた。スポット後、アレイをＧｅｎｅＰｉｘ４０００ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で品質制御した。次に、ＳＭＺｌ５００（Ｎｉｋｏｎ）立体鏡にてアレイを手でマイクロ流体装置と整列配置させ、４０℃に加熱したプレート上で、暗所にて一晩結合した。
【０２７９】
Ｂ．表面化学（図１０ｃ）。すべての装置を制御ラインでは１０から１５ｐｓｉの間、フローラインでは４から６ｐｓｉの間で駆動した。最初の表面誘導体化ステップでは、チャンババルブを閉じたままにして、スポットしたＲＮＡ標的のあるチャンバに液体が入るのを防止した。最初に、２ｍｇ／ｍＬのｄＨ２Ｏに再懸濁させたビオチン化ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）をすべてのチャネルに３０分間流すことで、到達可能な表面部分をすべて誘導体化した後、ＰＢＳで１０分間洗浄した。次に、５００μｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）をＰＢＳに入れた溶液を２０分間表面に流した後、ＰＢＳで１０分間洗浄した。次に、「ボタン」膜を閉じ、ＰＢＳ洗浄をさらに５分間継続した。続いて、ボタンでマスクした６０μｍの円形部分以外の残っているすべての到達可能な表面部分を、上記と同一のビオチン化溶液で３０分間不動態化した後、ＰＢＳで１０分間洗浄した。最後に、ビオチン化−５−ヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ）の２％ＢＳＡ溶液をＰＢＳに入れた１：１溶液を２〜５分間ロードし、その後で「ボタン」膜を開いて流れを２０分間継続し、事前にマスクした円形部分の特異的官能化を可能にした。その後、ＰＢＳで１０分間洗浄し、表面誘導体化の手順を終了した。
【０２８０】
Ｃ．タンパク質合成およびＭＩＴＯＭＩ。次に、標準的な２５μＬのＴＮＴ  Ｔ７カップリングコムギ胚芽エキス混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を調製し、１μＬのｔＲＮＡＬｙｓ−ｂｏｄｉｐｙ−ｆｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および適当なタンパク質（ＨｕＲ、ＨｕＤまたはＧｕｓ）をコードする２μＬのプラスミドＤＮＡテンプレートでスパイクした。混合物をすみやかに装置にロードし、５分間フラッシュした後、チャンバのバルブを開いてチャンバの行き止まりの液溜めにコムギ胚芽エキスが充填されるようにした。チャンバのバルブを再度閉じ、さらに５分間フラッシュを続けた。次に、各ユニットセルを隔てている隔離バルブを閉じた後、チャンババルブを開いて、拡散によってユニットセルを平衡させた。温度制御した顕微鏡ステージで装置全体を３０℃まで加熱し、最大９０分間インキュベートしてタンパク質合成、表面結合ビオチン化−５−ヒスチジン抗体へのタンパク質の結合、標的ＲＮＡの溶媒和、タンパク質と標的ＲＮＡとの平衡を終了させた。次に、「ボタン」膜ならびにチャンババルブを閉じて、溶液相の分子をすべて追い出しながらＭＩＴＯＭＩを実施し、表面結合複合体を捕捉できるようにした。半径方向に閉鎖することで、２つの界面間に溶媒ポケットが形成されないようにし、検出対象となる分子相互作用の平衡濃度を保ったままでゼロ不感（ｚｅｒｏ  ｄｅａｄ）容量を効果的に生成している。続いて５分間のＰＢＳ洗浄をして、捕捉されなかった未結合材料を除去した。次に改変したａｒｒａｙＷｏＲｘｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＰｒｅｃｉｓｉｏｎ）マイクロアレイスキャナで装置を画像化し、タンパク質合成と捕捉された分子を検出した。
【０２８１】
Ｄ．画像およびデータ解析。画像はいずれもＧｅｎｅＰｉｘ３．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で解析した。各実験で、ＭＩＴＯＭＩの後と最終ＰＢＳ洗浄後に画像を得た。これを使って表面結合タンパク質（ＦＩＴＣチャネル）ならびに表面結合標的ＲＮＡ（Ｃｙ３チャネル）の濃度を判断した。各ユニットセルでは、Ｃｙ３のメジアンシグナルとｂｏｄｉｐｙのメジアンシグナルとの比からなる単一のデータ点を生成したため、表面結合ＲＮＡ対表面結合発現タンパク質の比が表されている。複数のデータ点からのデータを平均し、その標準偏差を求めた。さらに、結果を１に正規化した。試験したプローブごとに１０〜２０回の重複を含めた。対照タンパク質であるＧｕｓ−ｈｉｓ（Ｒｏｃｈｅ）を各実験に含め、同一の解析を実施した。存在する場合、Ｇｕｓ−ｈｉｓで検出されたシグナルをバックグラウンド減算に利用した。
【０２８２】
２．膜会合タンパク質の場合。ＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合の検出を、以下の変更を加えた以外は上述したプロセスと同様に実施した。マイクロ流体装置にロードする前に、カップリングさせた転写／翻訳ウサギ網状赤血球系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＮＳ４Ｂを発現させた。反応混合物に２μＬのイヌミクロソーム膜（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて、適当なタンパク質の畳み込みを可能にした。ＮＳ４Ｂ−ＧＦＰコンストラクトを使用したため、反応混合物にｔＲＮＡＬｙｓ−ｂｏｄｉｐｙ−ｆｌの必要性はなかった。ビオチン化抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して、ボタンで画定されて保護された円形部分を特異的に官能化した。表面結合抗ＧＦＰ抗体との相互作用によってタンパク質をチップに固着させた。表面結合タンパク質とＣｙ５−標識ＨＣＶ  ＲＮＡプローブをチップにロードし、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ＫＯＨ（ｐＨ６．８）緩衝液中で５〜２０分間インキュベートしておいた。次に、ＭＩＴＯＭＩを実施した後、Ｈｅｐｅｓ  ＫＯＨ（ｐＨ６．８）緩衝液中で軽く洗浄した。次に、上述したようにして装置をスキャンし、結果を定量化した。ＮＳ４Ｂ−ＧＦＰ突然変異およびＮＳ５Ａ（ＡＨ）−ＧＦＰを同じようにしてアッセイした。ＮＳ５Ａ（ＡＨ）−ＧＦＰで検出されたシグナルをバックグラウンド減算に利用した。
【０２８３】
阻害化合物ライブラリのスクリーニング。ＯｍｎｉＧｒｉｄ  Ｍｉｃｒｏ（ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ）マイクロアレイヤーとＣＭＰ３Ｂピン（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．）を用いて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶化したＬｏｐａｃ  ｌｉｂｒａｒｙ（Ｓｉｇｍａ）の１２８０の化合物をエポキシコートガラス基板スライド（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）にマイクロアレイとしてスポットした。一次スクリーンでは、化合物を高濃度（約１ｍＭ）で二重にスポットした。アレイを乾燥させ、整列配置してマイクロ流体装置に結合した。一次スクリーニングには、大きな装置（装置１台あたり２４００ユニットセル）２つを使用した。残りの手順は、上述した（ＲＮＡ結合アッセイ）ものと同様に実施した。簡単に説明すると、装置に表面パターニングをほどこして、各ユニットセル内にビオチン化抗ＧＦＰ抗体で覆われた円形部分が得られるようにした。次に、ミクロソーム膜（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下で、カップリングされた転写／翻訳ウサギ網状赤血球系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＮＳ４Ｂ−ＧＦＰ発現調製した「オフチップ」をチップにロードし、表面ビオチン化抗ＧＦＰ抗体に結合させた。次に、Ｃｙ５−標識３’ｎｅｇ末端ＲＮＡプローブを濃度１．５ｎＭでロードした。各ユニットセルを単離した後、３０分間インキュベーションして、タンパク質を表面ビオチン化抗ＧＦＰ抗体に結合させ、ライブラリ化合物の溶媒和、タンパク質と標的ＲＮＡとの平衡を可能にした。次に、溶液相の分子をすべて追い出しながら、表面結合複合体を捕捉してＭＩＴＯＭＩを実施した。軽く洗浄して捕捉されなかった未結合材料を除去した後、装置をスキャンして結果を解析した。各データ点ごとに、ｂｏｄｉｐｙのメジアンシグナルに対するＣｙ３のメジアンシグナルを測定して結合ＲＮＡと発現タンパク質との比を求めた。これらの結果を、阻害化合物を含まないユニットセルで測定したシグナルに対して正規化した。一次スクリーニングでは、９０％を超える阻害が阻害のカットオフと定義された。このカットオフを超えた１０４の化合物と、結果が不明瞭だった別の１１０に対し、二次スクリーニングを実施した。これは、小さめの装置（各６４０ユニットセル）を２つ使用し、スポットした化合物の濃度を一次スクリーニングの１０分の１にして、化合物ごとに５組重複させてスポットしたこと以外は、同様に実施した。２．５倍を上回る阻害を有意とみなした。このスクリーニングで同定された１８の化合物のＨＣＶ  ＲＮＡ複製に対する抗ウイルス作用を、さらに分析した。
【０２８４】
試験管内  ＲＮＡ結合のＩＣ５０の判定。ＩＣ５０を正確に測定するために、フローチャネル内の化合物濃度を一定に保ちながら、阻害化合物の段階希釈物を連続フローによってマイクロ流体装置にロードした。これによって、不完全な可溶化および／または不完全なＰＤＭＳへの化合物の結合が原因で想定されるスポットした化合物の減少を回避しやすくなった。この実験は基本的に、阻害化合物の存在下またはその非存在下で発現されるタンパク質とＣｙ５−標識ＨＣＶ  ＲＮＡプローブを装置でインキュベートしたこと以外、膜貫通タンパク質のＲＮＡ結合アッセイで説明したようにして実施した。統計解析の章で後述するようにして、ＩＣ５０を測定した。
【０２８５】
組換えＮＳ４Ｂの発現および精製。ＧＳＴ−ＮＳ４ＢおよびＧＳＴを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１で発現させ、他のところで説明されている１１ようにして精製した。ＮＳ４ＢをインフレームでＮ末端の６ｈｉｓ−ＭＩＳＴＩＣタンパク質（１Ｍタンパク質コンストラクトの翻訳用の膜組み込み配列）３５と縮合させた。ｍｉｓｔｉｃ−ＮＳ４Ｂプラスミドで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一晩培養を４００ｍｌの新鮮な培地で１：１００に希釈し、３７℃でＯＤ０．８まで増殖させた。次に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最終濃度が０．１ｍＭになるように加えた。３７℃で３時間増殖させた後、細胞をペレット化し、３０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣＬ（ｐＨ８）、１００ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのデシルマルトシド、コンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））に再懸濁させた。細胞をＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓで圧力１０，０００ｐｓｉにて１分で１サイクル溶解させた後、１２，０００ｇで４℃にて５分間遠心処理した。上清をニッケルカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にロードした。洗浄後、４００ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液にタンパク質を溶出させた。グリセロールを最終濃度２０％で加え、試料を−２０℃で保管した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製を監視した。ＲＣ−ＤＣアッセイ（Ｂｉｏ−  Ｒａｄ）を用いてタンパク質の総濃度を測定した。６−ｈｉｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＮＳ４Ｂ（Ｖｉｒｏｓｔａｔ）に対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット解析で、ＮＳ４Ｂ−ｍｉｓｔｉｃを同定した。同様にして６ｈｉｓ−ｍｉｓｔｉｃを発現させ、精製した。
【０２８６】
ＧＳＴプルダウンアッセイ。過去に説明されている戦略３６と同様にして、３２Ｐ−標識試験管内転写ＨＣＶ  ＲＮＡ（ウイルスのマイナス鎖の３’末端と対応）と結合緩衝液（１０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＮａ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、３３ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）とを含有する反応混合物５０μｌ中にて、１μｇの精製ＧＳＴ−ＮＳ４ＢまたはＧＳＴを３７℃で１時間インキュベートした。次に、５０μｌのｔＲＮＡプレコートグルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を加えた後、４℃で１時間インキュベーションして、ＧＳＴをビーズに結合させた。続いて、ビーズを結合緩衝液中で３回洗浄し、試料アリコートの液体シンチレーションカウントで結合ＲＮＡを測定した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの非存在下で調製したＲＮＡプローブを用いる対照インキュベーションを、バックグラウンド減算用に利用した。
【０２８７】
ＲＮＡフィルタ結合アッセイ。基本的には説明されているようにして３４アッセイを実施した。簡単に説明すると、さまざまな濃度のｍｉｓｔｉｃ−ＮＳ４Ｂタンパク質またはｍｉｓｔｉｃ対照を、３．３ｎＭの３２Ｐ−標識試験管内転写ＨＣＶ  ＲＮＡプローブと一緒に、最終容量４０μｌの結合緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｎｇ／μｌのｔＲＮＡ、０．２ｍＭのデシルマルトシド）中で、３０℃で１時間インキュベートした。膜をあらかじめ結合緩衝液に浸し、上から下まで以下の構成となっているドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｌｌ）に組み入れておいた。ニトロセルロース（Ｂｉｏｒａｄ）、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｗｈａｔｍａｎの３ｍｍ濾紙。結合反応物をドットプロット装置にロードし、膜で濾過した。洗浄後、膜を空気乾燥させ、蛍光画像形成法で可視化した。結果は、ニトロセルロース膜で検出されたシグナルを、ニトロセルロースとＨｙｂｏｎｄ膜で検出されたシグナルの合計で割って求めた結合ＲＮＡの比率を表す。
【０２８８】
細胞培養と電気穿孔。１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１Ｘ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したダルベッコ変法基礎培地（Ｇｉｂｃｏ）に、Ｈｕｈ−７．５細胞を維持した。０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡで処理した後に細胞系を週に２回継代し、希釈率１：５で播種した。サブコンフルエントなＨｕｈ−７．５細胞をトリプシン処理し、７００ｇで５分間の遠心分離によって回収した。次に、細胞を氷冷ＲＮａｓｅ−フリーＰＢＳ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で３回洗浄し、細胞１．５ｘ１０７個／ｍｌでＰＢＳに再懸濁させた。Ｔ７  ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ＸｂａＩ−直線化ＤＮＡテンプレートを試験管内転写した後、基本的には上述したようにして精製して（試験管内ＲＮＡ転写および蛍光標識）、電気穿孔用の野生型または突然変異ＦＬ−Ｊ６／ＪＦＨ−５’Ｃ１９Ｒｌｕｃ２ＡＵｂｉ  ＲＮＡを生成した。５μｇのＲＮＡを２ｍｍ間隔のキュベット（ＢＴＸ）で４００μｌの洗浄Ｈｕｈ−７．５細胞と混合した後、ＢＴＸ−８３０電気穿孔装置ですみやかにパルスをかけた（０．８２ｋＶ、９９μｓのパルスを５回）。２５℃で１０分間の回復後、パルスをかけた細胞をあらかじめ温めた成長培地１０ｍｌで希釈した。何度かの電気穿孔での細胞を共通のストックにプールし、６ウェルのプレート（１ウェルあたり細胞５ｘ１０５個）に播種した。２４時間後、培地を交換し、スクリーニングで同定されたさまざまな阻害化合物（Ｓｉｇｍａ）の段階希釈物の存在下にて細胞を増殖した。同定された１８の化合物のうち、商業入手可能な１７の化合物を分析した。未処理の細胞を、水溶性化合物の負の対照として用いた。ＤＭＳＯに可溶化された化合物では、未処理の細胞を、対応する濃度の溶媒の存在下にて負の対照として増殖させた。培地を毎日交換した。処理の７２時間後、細胞に対してａｌａｍａｒブルーベースの生存度アッセイおよびルシフェラーゼアッセイを実施した。
【０２８９】
生存度アッセイ。７２時間の処理後、１０％Ａｌａｍａｒブルー試薬（ＴＲＥＫ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。次に、プレートをスキャンし、ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ  ＩＩ  ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて蛍光を検出した。阻害化合物の溶媒が、水（ＤＭＳＯ中にはない他の化合物）か、またはＤＭＳＯ（Ｄ０４２，（アリルノラポモルヒネ）、Ｒ−１０８、トロピカミド、サリドマイド、グリブリド、ＬＦＭ−Ａ１３）かに応じて、未処理試料またはＤＭＳＯの存在下にて増殖させた試料に対して、シグナルをそれぞれ正規化した。
【０２９０】
ルシフェラーゼアッセイ。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ウイルスＲＮＡ複製を判断した。上述した生存度アッセイを実施した同じ試料を、このアッセイで解析した。製造業者のプロトコールに従って、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、プレートを掻爬して２５０μｌの氷冷ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）溶解緩衝液に入れた。次に、細胞可溶化物２０μｌを９６ウェルのプレートにロードした。アッセイ基質を含有するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液１００μｌを注入し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９６  Ｖルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。上記と同様に、未処理試料あるいは、対応する濃度のＤＭＳＯの存在下にて増殖させた試料に対して、シグナルを正規化した。
【０２９１】
１００ｕ／ｍｌのインターフェロンαＢ２（ＰＢＬ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｌａｂｓ）で処理した試料で検出されたルシフェラーゼ活性を、７２時間の処置で３つのｌｏｇ低減が認められる陽性対照として使用した。実験を４回繰り返し、毎回三重にした。式Ｙ＝ａ＋（ｂ−ａ）／（１＋１０（Ｘ−ｃ））（ＢｉｏＤａｔａＦｉｔ，Ｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）を用いてデータを３パラメータのロジスティック曲線にフィットさせて、ＩＣ５０を測定した。
【０２９２】
リアルタイムＰＣＲ。説明されているように２９、５ｘ１０４Ｈｕｈ７．５細胞に、１．４ｘ１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌで滴定した細胞培養増殖ＨＣＶを感染させた。感染２時間後、細胞を培養液中で３回洗浄した。次に、細胞を毎日さまざまな濃度のクレミゾールで処理した。７２時間後、上述した試料の生存度アッセイを実施し、続いてＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、製造業者の指示どおりに全細胞ＲＮＡを３回重複して抽出した。次に、ランダムヘキサマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて逆転写を実施した。こうして得られたｃＤＮＡに対してリアルタイムＰＣＲを実施し、各試料のＨＣＶおよびアクチンＲＮＡの量を（別々の反応で）定量化した。試験管内にて転写したＨＣＶ  ＲＮＡおよびヒトアクチン標準（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて標準を作成した。プライマーＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴ（配列番号１７）およびＣＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣ（配列番号１８）とプローブ６−カルボキシフルオレセイン−ＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧＧ−６（配列番号１９）カルボキシテトラメチルローダミンを用いてＨＣＶを定量化した。β−アクチン対照試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の指示どおりに用いてアクチンを定量化した。ＨＣＶ  ＲＮＡレベルをアクチンレベルに調節し、未処理試料に対して正規化した。
【０２９３】
耐性突然変異の選択。樹立ＨＣＶレプリコン保持細胞と、遺伝子型１ｂサブゲノムＨＣＶレプリコン（Ｂａｒｔ  ７９Ｉ）３０で新たに電気穿孔したＨｕｈ７細胞とを、ネオマイシンの存在下かつクレミゾールの濃度を高めながら（１〜１６μＭ）継代した。化合物の存在下で増殖できたコロニーを単離し、５〜１０継代ほど繁殖させた。（約６０のうち）１１のコロニーが継代後も生き残り、過去に説明されているようにして配列解析を実施した１１。
【０２９４】
全細胞ＲＮＡ電気穿孔。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、クレミゾール耐性レプリコンクローンおよび未処理のレプリコン細胞から全細胞ＲＮＡを抽出した。等量の全細胞ＲＮＡ（５０μｇ）を、上述したようにしてＨｕｈ７．５細胞に電気穿孔した。クレミゾールの存在下または非存在下で３週間、細胞をＧ４１８選択下で増殖させた。固定とクリスタルバイオレットでの染色後に、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）を用いてコロニー数を求めた。
【０２９５】
統計解析。平衡結合；非線形最小二乗回帰フィッティング（ＢｉｏＤａｔａＦｉｔ，  Ｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって、Ｙ＝ａ＊Ｘ／（ｂ＋Ｘ）（ａおよびｂは、それぞれ最大結合とＫｄを示す）を説明する式にデータをフィットさせ、解離平衡定数を求めた。式Ｙ＝ａ＋（ｂ−ａ）／（１＋１０（Ｘ−ｃ））（ａ、ｂ、ｃはそれぞれ、最小結合、最大結合、ｌｏｇＥＣ５０を示す）（ＢｉｏＤａｔａＦｉｔ，  Ｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）を用いて３パラメータのロジスティック曲線にデータをフィットさせ、ＩＣ５０を測定した。
【０２９６】
付加情報
較正曲線：乾燥したスポットＲＮＡプローブの適切な可溶化を確認し、溶媒の大部分が、マイクロ流体装置を構成するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に貼り付いた可能性を排除するために、較正曲線を生成した。濃度が分かっている可溶性標識ＲＮＡプローブを、連続フローによって装置にロードし、複数のユニットセルからのＣｙ３シグナルの平均値を平均によって求めた。この曲線に基づいて、アッセイで用いた標的ＲＮＡ配列の実濃度を計算した。平均で、実際のアッセイ濃度はスポットしたものの０．５５±０．０２であった。ここで、典型的なプリント容量とユニットセル容量との比に基づいて、同様の係数（０．５７）を計算した。提示したデータはすべて、この係数で調整した。
【０２９７】
高イオン強度の緩衝液でのＲＮＡ結合実験：ＲＮＡ結合実験で使用する緩衝液のイオン強度が、タンパク質−ＲＮＡ相互作用に影響する場合がある。ＲＮＡ結合アッセイで検出された高親和性相互作用が、低イオン強度緩衝液による静電相互作用亢進の結果ではないことを確認するために、高（１５０ｍＭ）イオン強度の条件を用いるマイクロ流体でＮＳ４ＢのＲＮＡ結合実験を実施した。ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）または１５０ｍＭのＨｅｐｅｓの存在下でのＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合は、他者によるＲＮＡ結合アッセイで一般に用いられている５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液を用いて検出されたものと同様であった（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，３６４１７〜３６４２８（２００５）およびＪ  Ｖｉｒｏｌ  ８０，  ９８６５〜９８７５（２００６）（各々本明細書に援用する））。高イオン強度条件でのＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’末端に対するＮＳ４Ｂ結合のＫｄを測定したところ、６．６±３．３ｎＭであった（低（５０ｍＭ）イオン強度条件下でのＫｄ３．４±１．０ｎＭと対比）。これらの結果から、観察されたＲＮＡ結合には、わずかな静電成分があることが示唆される。
【０２９８】
ＡＴＡは、ＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合を用量依存的に阻害する：ライブラリをスクリーニングする前に、ＮＳ４ＢによるＨＣＶ  ＲＮＡ結合を薬理学的に阻害可能であるかどうかを判断した。アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）は、タンパク質と核酸との相互作用を阻害することが分かっている化合物である（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ  ４，  ３０５５〜３０６４（１９７７）（本明細書に援用する））。よって、ＡＴＡはＨＣＶ  ＲＮＡに対するＮＳ４Ｂの結合を阻害するはずである。この仮説を検証するために、ＡＴＡの濃度を高めながらＮＳ４Ｂ  ＲＮＡ結合アッセイを繰り返した。特に、ＡＴＡは、ＮＳ４ＢによるＨＣＶ  ＲＮＡの結合を用量依存的に阻害することが明らかになり、ＩＣ５０は０．４９±０．０１μＭ（ｐ値−０．０００３）（図１４）であった。
【０２９９】
この結果と一致して、ＡＴＡは、ＬＯＰＡＣライブラリのスクリーニングで同定された１８の化合物のうちの１つであった。この化合物は、ＮＳ４ＢのＲＮＡ結合活性を阻害することがすでに分かっているため、有効性のスクリーニングでは、この化合物が有用な内部対照として機能した。
【０３００】
小分子スクリーニングで同定されたヒットの特異性：小分子スクリーニングで同定されたヒットの特異性を判断するために、ＨｕＲタンパク質（本発明者らのＲＮＡ結合アッセイの検証に使用したヒトＲＮＡ結合タンパク質のうちの１つ）を選択した。興味深いことに、その標的ＲＮＡ配列４Ａ（図１２）への結合以外、このタンパク質は、マイナスＨＣＶ鎖の３’末端に結合することがすでに他者によって示されていたものであった（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７４，３７８〜３９０（２０００）（本明細書に援用する））。コンセンサス４Ａ  ＲＮＡ配列へのＨｕＲの結合を、ＮＳ４ＢによってＲＮＡ結合を阻害することが分かっている阻害分子の存在下にて試験した。濃度０．１ｍＭのクレミゾールをはじめとして、大半のヒットで、ＲＮＡ結合に対する阻害作用は何ら検出されなかった。同様に、０．１ｍＭの同定された化合物も、マイナスＨＣＶ  ＲＮＡ鎖の３’末端に対するＨｕＲの結合に阻害作用を持たなかった。他のヒットとは対照的に、タンパク質−核酸相互作用の非特異的インヒビターとして周知のＡＴＡが、マイナスＨＣＶ鎖の３’末端と４Ａの両方に対するＨｕＲ結合を有意に阻害した。これらの結果は、クレミゾールをはじめとして同定されたヒットが特にＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合に対して特異的であるという結論を裏付けるものである。
【０３０１】
実施例１の図の説明
図４Ａは、５，６−二置換クレミゾール化合物を合成する基本方法の実施形態を示す。図４Ｂおよび図４Ｃは、２つの５，６−二置換クレミゾール化合物を合成する実施形態を示す。
【０３０２】
図５ａ〜図５ｄは、マイクロ流体プラットホームで測定したタンパク質−ＲＮＡ相互作用から得られる結果を示す。図５ａは、ＲＮＡへのＨｕＤの結合の研究に用いる標的ＲＮＡ配列を示し、マイクロ流体親和性解析を用いて測定したＫｄ値と、ゲルシフトアッセイによって過去に測定した値２１，２２とを比較した表である。ＮＤ＝判定せず。図５ｂは、マイクロ流体親和性アッセイで求めた、ＡＵ３（●）およびＡＵ３突然変異（△）ＲＮＡの濃度を増した場合のＨｕＤの結合曲線を示す。２つの独立した実験で測定した１０〜２０回分を正規化した平均値を各グラフに示す。エラーバーが標準偏差を示す。図５ｃは、マイクロ流体チップからの蛍光画像のデジタル画像である。左：ＮＳ４Ｂ−ＧＦＰおよびＮＳ５Ａ（ＡＨ）−ＧＦＰが、抗ＧＦＰとのその相互作用によってマイクロ流体装置表面に対してアンカー結合されている；中央：ウイルスのマイナス鎖の３’末端領域に対応するＲＮＡプローブをＣｙ５で標識し、装置でタンパク質と一緒にインキュベートした。結合ＲＮＡを表すＣｙ５シグナルが軽く洗浄した後に認められる；右：結合ＲＮＡ対タンパク質比を表すＣｙ５シグナルおよびＧＦＰシグナルの重層。図５ｄは、ＲＮＡプローブの段階希釈に対するＮＳ４Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合曲線を示すグラフである。
【０３０３】
図６ａおよび図６ｂは、ＮＳ４ＢがＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの３’末端と特異的に結合することを示す結果を示す。図６ａは、本開示の実施形態のために設計された４つのＨＣＶプローブを示す。５’ＵＴＲ（非翻訳領域）ｐｏｓおよび３’ＵＴＲ  ｐｏｓはそれぞれ、ウイルスのプラス鎖の５’ＵＴＲ配列と３’ＵＴＲ配列にそれぞれ対応し、５’マイナス末端および３’マイナス末端が、マイナス鎖の５’および３’末端領域にそれぞれ対応していた。ＨＣＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対するこれらの配列の位置を示す。図６ｂは、等モル濃度の４つのＨＣＶプローブおよび非ＨＣＶ  ＲＮＡ（デルタウイルスＲＮＡ）プローブへの分画ＮＳ４Ｂの結合を示すグラフである。マイナスゲノム鎖の３’末端が＞５ｘまで好ましい。
【０３０４】
図７ａ〜図７ｄは、ＮＳ４Ｂ内でのＲＮＡ結合ドメインの同定と、結果とを示す。図７ａは、ＲＮＡ結合を与えることが知られているアルギニンリッチ配列がウイルスタンパク質およびバクテリオファージタンパク質に見いだされたことを示す９，２５，２６。アルギニンリッチ様モチーフと極めてうまく一致するＮＳ４Ｂの末端ループの要素を一番下に示す。列挙したタンパク質は、ＨＩＶ  ＲｅｖおよびＴａｔ２５；λ、φ２１およびＰ２２バクテリオファージ抗ターミネーターＮタンパク質２５；タケモザイクウイルス（ＢａＭＶ）２６およびポリオウイルス２Ｃ９のトリプル遺伝子ブロックタンパク質１（ＴＧＢｐ１）である。図７ｂは、ＮＳ４Ｂ（遺伝子型１ａ）の一次配列内の正に荷電した、そのアミノ酸（ＲおよびＲＲ、太字で下線付き）を示す。図７ｃは、ＮＳ４Ｂの予測膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを示す概略図である。ＮＳ４ＢのＣ末端セグメントにおける保存された正に荷電したアミノ酸をＲまたはＲＲで示す。図７ｄは、アルギニン残基がＮＳ４ＢによってＲＮＡ結合を媒介することを示すグラフである。ウイルスのマイナスＲＮＡ鎖（１．５ｎＭ）の３’末端に対する野生型ＮＳ４Ｂ−ＧＦＰ、ＲＲａおよびＲＲｂＮＳ４Ｂ−ＧＦＰ突然変異およびＮＳ５Ａ（ＡＨ）−ＧＦＰの結合をマイクロ流体親和性解析で求めた。バーは標準偏差を示す。
【０３０５】
図８ａ〜図８ｄは、小分子スクリーンが、塩酸クレミゾールが、ＮＳ４Ｂおよび生体内でのＨＣＶ  ＲＮＡ複製によってＲＮＡ結合を阻害することを明らかにする結果を示す。図８ａは、１２８０の化合物の阻害の低ストリンジェンシーの測定を表す第１のスクリーンのデジタル画像であり、後者を高（明るい灰色）、不明瞭（黒）または阻害なし（灰色）に分類した。最初のスクリーン結果に基づいて、ストリンジェンシーを高めて重複数も増して２１４の化合物を再度測定し、結果が一番良かった１８のインヒビターについて、生体内細胞アッセイでＨＣＶ複製を阻害する機能を試験した。図８ｂは、上位１８の小分子によるＮＳ４Ｂ−ＲＮＡ結合の試験管内阻害を示すグラフを示す。図８ｃは、Ａｌａｍａｒブルーで測定した場合（右軸、上の線□）に細胞に対して測定可能な毒性を持たずにクレミゾールがＨＣＶ複製を阻害する（左軸、下の線◆）ことを示す、生体内  ＨＣＶルシフェラーゼ結合レポーター細胞アッセイを示すグラフである。図８ｄは、クレミゾールの試験管内  ＮＳ４Ｂ−ＲＮＡ結合：阻害曲線を示すグラフである。
【０３０６】
図９ａ〜図９ｅは、クレミゾール耐性突然変異データに関連する結果を示す。レプリコン細胞をクレミゾールの存在下にて継代し、個々のコロニーを単離し、繁殖させ、その中にあるＨＣＶゲノムを配列解析した。図９ａは、ＮＳ４Ｂの予測膜貫通と細胞内セグメントを示す概略図である。保存された、正に荷電したアミノ酸をＲまたはＲＲで示す。クレミゾール耐性変異Ｗ５５ＲをＷＲで示す。図９ｂは、野生型またはＷ５５Ｒ突然変異クローンのいずれかを持つ細胞から抽出した全細胞ＲＮＡを５０μｇで電気穿孔した後、１０μＭのクレミゾールの非存在下（白いバー）または存在下（灰色のバー）で成長させたＨｕｈ７．５細胞におけるＨＣＶ複製を示すグラフである。結果は、対応する各々の未処理対照と比較した場合に、得られたコロニーの相対数を示す。図９ｃは、１０μＭのクレミゾールの非存在下（白いバー）または存在下（灰色のバー）で実施した、試験管内で転写したルシフェラーゼレポーター結合野生型またはＷ５５Ｒ突然変異ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの電気穿孔によって開始されたＨＣＶ複製アッセイを示す。結果は、未処理レベルに対する各ゲノムの複製レベルを示す。図９ｄは、１０μＭのクレミゾールの存在下（灰色のバー）または非存在下（白いバー）にてマイクロ流体によって試験管内で測定した場合の野生型ＮＳ４ＢおよびＷ５５Ｒ  ＮＳ４Ｂ突然変異のＨＣＶ  ＲＮＡ結合を示す。図９ｅは、ＲＮＡプローブの段階希釈に対するＷ５５Ｒ  ＮＳ４Ｂ突然変異（実線○）と野生型ＮＳ４Ｂ（点線▲）の試験管内結合曲線を示す。
【０３０７】
図１０ａ〜図１０ｃは、マイクロ流体ベースのＲＮＡ結合アッセイの概要を示す。１マイクロ流体装置あたり数百／数千のうちの３つの個別のユニットセル）を、このスキームに示す。図１０ａは、コンパートメントとマイクロメカニカルバルブを示す。バルブは制御チャネルがフローチャネルと交差する部分に作られている。２本のチャネル間の結合部分で得られる薄い膜は、油圧作動によって変形可能である。多重バルブ系を用いることで、多数のエラストマーマイクロバルブで、これらの装置内での複雑な流体操作を行うことができるようになる。
【０３０８】
図１０ａは、実験プロトコールを示す。一番上の●はＣｙ３標識ＲＮＡプローブを示す。下の○は表面結合ｂｏｄｉｐｙ−標識タンパク質を示す。
【０３０９】
図１０ｂ（１）は、Ｃｙ３で標識された標的ＲＮＡ配列をエポキシコートスライドガラスにマイクロアレイとして滴下した状態を示す。
【０３１０】
図１０ｂ（２）は、アレイの各スポットが装置のユニットセルと接触するように、マイクロ流体装置を整列配置させてスライドガラスに付着させた状態を示す。各ユニットセル内で円形の部分がビオチン化抗ヒスチジン抗体で覆われるように、装置に表面パターニングをほどこした（補助的に図１０ｃも参照のこと）。ＲＮＡチャンバからのフローチャネルを分離している「ネックバルブ」については、このプロセスの間は閉じたままにしておいた。
【０３１１】
図１０ｂ（３）は、ｈｉｓ−標識タンパク質をコードするＤＮＡテンプレートを含有する試験管内転写／翻訳混合物を装置にロードした状態を示す。タンパク質標識用にＢｏｄｉｐｙ−標識ｔＲＮＡＬｙｓを加えた。
【０３１２】
図１０ｂ（４）は、２つの「サンドイッチ」マイクロメカニカルバルブによって各ユニットセルを単離した状態を示す。
【０３１３】
図１０ｂ（５）は、フローチャネルコンパートメントとＲＮＡチャンバとを結合して、「ネックバルブ」を開いて単一のコンパートメントを形成したことを示す。これに続いて、インキュベーションを実施し、タンパク質の合成、合成後のタンパク質と表面ビオチン化抗ｈｉｓ抗体との結合、標的ＲＮＡの溶媒和、タンパク質と標的ＲＮＡの平衡を得た。
【０３１４】
図１０ｂ（６）は、溶液相の分子をすべて追い出しながら、「ボタン」膜を作動させてＭＩＴＯＭＩを実施して表面結合複合体を捕捉したことを示す。
【０３１５】
図１０ｂ（７）は、「サンドイッチ」バルブを開いた後、軽く洗浄して捕捉されなかった未結合材料を除去したことを示す。
【０３１６】
図１０ｂ（８）は、「ボタン」膜を開いて装置をアレイスキャナでスキャンしたことを示す。捕捉されたＲＮＡ分子と発現されたタンパク質とを検出した。データ点ごとに、ｂｏｄｉｐｙのメジアンシグナルに対するＣｙ３のメジアンシグナルを測定して、結合ＲＮＡ対発現タンパク質の比を求めた（一番下に○で示される）。
【０３１７】
0005715820.tif 000058
【０３１８】
図１１ａ〜図１１ｂは、本発明者らのＲＮＡ結合アッセイでの信号対雑音比を示すグラフを示す。図１１ａは、ＡＵ３  ＲＮＡプローブの濃度を高めていった場合のＨｕＤ−ｈｉｓ（●）およびＧｕｓ−ｈｉｓ（□）の結合を示すグラフである。代表的な実験を示す。バーは標準偏差を表す。図１１ａおよび図１１ｂは、マイナス鎖の３’末端の濃度を高めていった場合のＮＳ４Ｂの結合−ＧＦＰ−ミクロソーム膜（ｍｍ）（●、連続線）とＮＳ５Ａ（ＡＨ）−ＧＦＰ−ｍｍ（■、点線）を示すグラフである。灰色の縞を入れたカラムは、信号対雑音比が最大になったプローブ濃度の範囲を示す。本発明者らが報告した実験はいずれも、この範囲内で実施した。代表的な実験を示す。バーは標準偏差を表す。
【０３１９】
図１２ａ〜図１２ｃは、ＥＬＡＶ様ファミリーであるＨｕＲ（ＥＬＡＶ  Ｌ１）由来の別のヒトタンパク質によるＲＮＡ結合についてのマイクロ流体ベースの解析で得られた結果を示す。図１２ａは、ＲＮＡに対するＨｕＲの結合を研究するのに用いた標的ＲＮＡ配列と、従来のＲＮＡ結合方法で得られた表現型を示す（ＥＭＢＯ  Ｊ  １６，２１３０〜２１３９（１９９７）（本明細書に援用する））。
【０３２０】
図１２ｂは、マイクロ流体によってＨｕＲがＲＮＡに結合することを示す。Ｃｙ３標識標的ＲＮＡ配列のマイクロアレイを利用して、マイクロ流体装置をプログラムし、装置で発現されたｂｏｄｉｂｙ標識タンパク質のＲＮＡ配列に対する結合をアッセイした。結果は、結合ＲＮＡ（メジアンＣｙ３シグナル）対発現タンパク質（メジアンｂｏｄｉｐｙシグナル）の比を表す。２つの独立した実験で測定した１０〜２０回分を正規化した平均値を示す。エラーバーが標準偏差を示す。灰色のバーはＨｕＲ−ｈｉｓの結合を示し、Ｇｕｓ−ｈｉｓの白いバーを負の対照として用いた。
【０３２１】
図１２ｃは、ＨＵＲ結合が５種類の最も活性が高い化合物に影響されないが、ＡＴＡには影響されることを示す。本発明者らは、ＮＳ４Ｂ  ＲＮＡ結合インヒビターの存在下と非存在下で、その４Ａ  ＲＮＡ標的に対するＨＵＲの結合を試験した。データは１０〜２０回分の平均値を表し、バーは標準偏差を表す。
【０３２２】
図１３ａ〜図１３ｃは、従来の方法によるＨＣＶ  ＲＮＡに対するＮＳ４Ｂの結合の結果を示す。ＮＳ４Ｂについては、ＧＳＴまたはｍｉｓｔｉｃ−６ｈｉｓに縮合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、精製した。図１３ａは、ＧＳＴプルダウンアッセイで測定した場合のウイルスのマイナス鎖の３’末端に対応する３２Ｐ−標識ＲＮＡプローブに対するＧＳＴ−ＮＳ４ＢおよびＧＳＴの結合活性を示す。図１３ｂは、代表的なＲＮＡフィルタ結合アッセイからのニトロセルロース膜を示す。１０ｍＭ（左パネル）または２ｍＭ（右パネル）のｍｉｓｔｉｃ−ＮＳ４Ｂまたはｍｉｓｔｉｃ対照に結合した３２Ｐ−標識ＨＣＶ  ＲＮＡプローブを示す。図１３ｃは、フィルタ結合アッセイで測定した場合のタンパク質濃度１０ｍＭ（灰色のバー）および２ｍＭ（白いバー）でのｍｉｓｔｉｃ−ＮＳ４Ｂおよびｍｉｓｔｉｃタンパク質に対する結合ＲＮＡの比率を示す。
【０３２３】
図１４は、ＡＴＡがＮＳ４Ｂによって用量依存的にＲＮＡ結合を阻害することを示す結果を示す。マイクロ流体学で測定した、ＡＴＡ濃度を高めていった場合のＮＳ４ＢによるＲＮＡ結合の用量応答曲線。Ｙカテゴリは、ＡＴＡの非存在下での結合に対する結合ＲＮＡ対タンパク質比である。Ｘカテゴリは、ＡＴＡ濃度（μＭ）である。式Ｙ＝ａ＋（ｂ−ａ）／（１＋１０（Ｘ−ｃ））（ＢｉｏＤａｔａＦｉｔ、Ｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３パラメータのロジスティック曲線にデータをフィットさせ、ＩＣ５０を計算したところ０．４９±０．０１μＭ（ｐ値−０．０００３）であった。
【０３２４】
図１５は、リアルタイムＰＣＲアッセイによってクレミゾールがＨＣＶ複製を阻害することを示す結果を示す。クレミゾールが、細胞に対する測定可能な毒性のない状態で（右軸、■（上側の曲線））ＨＣＶ複製を阻害する（左軸◆（下側の曲線））ことを示す、ＨＣＶ複製レベルのリアルタイムＰＣＲアッセイ。
【０３２５】
図１６は、ＲＲｂ変異は複製を約４５分の１に減少させ、ＲＲａ変異のあるレプリコンではＲＮＡ複製が完全に欠けていることを示すデジタル画像である。
【０３２６】
図１７Ａは、塩酸クレミゾールの化学構造を示す。
【０３２７】
図１７Ｂは、力価と薬効を高めたクレミゾール誘導体分子の化学構造を示す。
【０３２８】
図１７Ｃは、マイクロ流体工学（結合ＲＮＡ／タンパク質比対化合物濃度（μＭ））で測定した場合のクレミゾール誘導体分子（●）および親の塩酸クレミゾール化合物（□）の試験管内阻害曲線を示すグラフを示す。
【０３２９】
図１７Ｄは、クレミゾール誘導体分子（●）および親の塩酸クレミゾール化合物（□）の濃度を次第に高めた場合のＨＣＶ複製の用量応答曲線（ＨＣＶ感染細胞でのリアルタイムＰＣＲアッセイ（相対ウイルス複製対化合物濃度（μＭ））で測定）を示すグラフを示す。
【０３３０】
各々を本明細書に援用する参考文献：
［文献１］
0005715820.tif 000059
0005715820.tif 000060
0005715820.tif 000061
【０３３１】
実施例２：
ＨＣＶに感染した患者の治療におけるクレミゾールの生体内での薬効を示すために、ＨＣＶに慢性感染した３名の患者をクレミゾール１００ミリグラムｐ．ｏ．で治療した。８週間のＢＩＤ。クレミゾール単独療法で最初の４週間経過後、ペグ化インターフェロン（１週あたり１８０マイクログラムＰｅｇａｓｕｓ（Ｒｏｃｈｅ）ｓ．ｑ．）を加えた。その後、患者にペグ化インターフェロンとニタゾキサニド（５００ｍｇ．（Ｒｏｍａｒｋ）ｐ．ｏ．ＢＩＤを継続する。血清におけるシリアルＨＣＶウイルス負荷とベースライン特性を図２に示す。クレミゾール単独での治療時にＨＣＶウイルス負荷が大幅に低下し、治療４週間後には完全に検出不能またはほぼ検出不能となった。これらの結果から、クレミゾールがＨＣＶ感染患者の治療に効果的であることが分かる。
【０３３２】
実施例３：
図４Ａに、５，６−二置換クレミゾール化合物の生成に使用できる方法を示す。特に、この方法は、化合物１（５位および６位にてメチル基で二置換（図４Ｂ））と化合物２（５位および６位にてＣｌ基で二置換（図４Ｃ））を生成できるものである。
【０３３３】
以下のようにして、二置換クレミゾールを合成することが可能である。４，５−二置換−ベンゼン−１，２−ジアミン（Ａ）と２−クロロ−アセトイミド酸エチルエステル（Ｂ）との縮合によって、２−クロロメチル−５，６−二置換−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（Ｃ）を生成した後、１−ブロモメチル−４−クロロ−ベンゼン（Ｄ）でアルキル化して１−（４−クロロ−ベンジル）−２−クロロメチル−５，６−二置換−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（Ｅ）を得て、最後に１−（４−クロロ−ベンジル）−２−クロロメチル−５，６−二置換−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（Ｅ）をピロリジンでアルキル化すると、５，６−二置換クレミゾール（１−（４−クロロ−ベンジル）−５，６−二置換−２−ピロリジン−１−イルメチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール）（Ｇ）が得られる。
【０３３４】
実施例４：
本明細書にて説明したルシフェラーゼとＡｌａｍａｒブルーでのアッセイを用いた場合に、クレミゾール類似体がＨＣＶ  ＲＮＡ複製（ＡＶ）および細胞生存度（Ｖｉａｂ）に対しておよぼす作用を、以下に示す表３にあげておく。化合物の活性を２とおりの濃度で測定し、この作用が用量依存性であるか否かを判断した。数値は、化合物での治療後に残っている正常な活性（ウイルス複製または細胞生存度のいずれか）の比率を示す。これらの値をグループ分け（ｂｉｎｎｅｄ）して、相対活性の大まかな測定値も得た。
【０３３５】
化合物ごとの薬剤なしの対照に対する阻害率を、５マイクロモルと１０マイクロモルの２とおりの化合物濃度で判断し、表に記録した。また、これらの比率を以下のようにしてスコアリングシステムに変換した。「−」＝残留活性９０〜１００％（すなわち影響なし）；「＋」＝残留活性６０〜９０％；「＋＋」＝残留活性３０〜６０％；「＋＋＋」＝残留活性０〜３０％。よって、複製アッセイで＋＋＋のスコアのついた化合物のほうが、＋のスコアのついた化合物よりも抗ウイルス活性（ＡＶ）が高い。同様に、細胞代謝アッセイ（Ｖｉａｂ＝生存度）で＋スコアのついた化合物は、＋＋＋のスコアのついた化合物よりも毒性が低い。
【０３３６】
これらの結果から、Ｈ１拮抗作用を抗ウイルス活性と分離できることが分かり、Ｈ１活性に必要な第３級アミン基のない化合物は、クレミゾールに対して認められる抗ウイルス作用が高くなることがある。さまざまな化合物が、抗ウイルス活性と細胞生存度に対する影響との間に強い分離を示し、前者の活性がＮＳ４Ｂ／ＲＮＡ結合の特異的阻害によるものであるという結論を裏付けている。また、濃度が高くなると（１０ｕＭ）ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の阻害が一層顕著になるため、多くの化合物が用量依存性の活性を示す。総合すれば、これらの構造と活性との関係から、本明細書に記載のクレミゾールの周知の類似体および新規な類似体でＨＣＶ複製を予防することができ、Ｈ１拮抗作用（ならびに附随するＣＮＳ作用）のない類似体は許容可能な治療比を維持することが分かる。
【０３３７】
【表３】
0005715820.tif 000062
0005715820.tif 000063
キー：
−  残留活性９０〜１００％（影響なし）
＋  残留活性６０〜９０％
＋＋  残留活性３０〜６０％
＋＋＋  残留活性０〜３０％
【０３３８】
比、濃度、量および他の数値データが、本明細書で範囲の形式で表記されることがある点に注意されたい。このような範囲の形式は、便宜上用いたものであるため、範囲の限界値として明示的に示された数値を含むだけでなく、個々の数値すべてまたはその範囲に包含される部分範囲も、それぞれの数値や部分範囲を明示的に示したのと同様に含むよう柔軟に解釈されるべきである旨を理解されたい。一例をあげると、「約０．１％から約５％」という濃度範囲は、明示的に示された濃度である約０．１ｗｔ％から約５ｗｔ％を含むことはもとより、表記の範囲内の個々の濃度（１％、２％、３％、４％など）ならびに部分範囲（０．５％、１．１％、２．２％、３．３％、４．４％など）も含むものと解釈される。「約」という用語は、±１％、±２％、±３％、±４％、±５％、±６％、±７％、±８％、±９％または±１０％あるいはそれよりも多くの数値が修正されることを含み得る。また、『約「ｘ」から「ｙ」』という言い回しは、『約「ｘ」から約「ｙ」』を含む。
【０３３９】
本開示の上述した実施形態は単に考えられる実施の例にすぎず、開示の原理をはっきりと理解できるよう記載しただけのものである旨を強調しておく。この開示の原理および主旨から実質的に逸脱することなく開示の上述した実施形態に対して多くの変更および修正をほどこすことができる。このような修正および変更は、この開示の範囲内で本明細書に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
0005715820.tif 000077
【図３】
0005715820.tif 000078
【図４Ａ−Ｂ】
0005715820.tif 000079
【図４Ｃ】
0005715820.tif 000080
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0005715820.tif 000090
【図１５】
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【図１６】
0005715820.tif 000092
【図１７】
0005715820.tif 000093
【配列表】
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