(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵によりエタノールを生産する方法であって、
ａ）槽内でジハロニトリロプロピオンアミドである少なくとも１つの非酸化性バイオサイド、少なくとも１つの多環式抗細菌ペプチド及び酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、エタノール及び固形分を生産する、発酵させることであって、前記非酸化性バイオサイドが酵母集団を低減させることなく該マッシュ中の細菌の増殖を制御し、そして前記非酸化性バイオサイドが非抗生物質バイオサイドであって、加えて、該非酸化性バイオサイドと該多環式抗細菌ペプチドがエタノール生産のための発酵中及び/又は発酵後において少なくとも１つの細菌の殺菌制御において相乗的効果を発揮すること、
ｂ）発酵マッシュを蒸留し、それにより前記固形分から該エタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留すること、
ｃ）該固形分から乾燥蒸留穀物産物を得ること、
を含む、発酵によりエタノールを生産する方法。
【請求項２】
前記乾燥蒸留穀物産物が、１００ｐｐｍ未満の該非酸化性バイオサイドを含有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）における該発酵マッシュが１０ｐｐｍ以下の抗生物質を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）における前記発酵マッシュが、蒸留後に非酸化性バイオサイドを１０ｐｐｍ未満有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）における前記発酵マッシュが、蒸留後に非酸化性バイオサイドを１ｐｐｍ未満有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細菌がラクトバチルス種、アセトバクター種、又はその組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細菌が偏性嫌気性菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における該発酵マッシュが、該非酸化性バイオサイドの非存在下において発酵させた同じ発酵マッシュよりも重量％ベースで少なくとも５倍少ない乳酸を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）における該発酵マッシュが、該非酸化性バイオサイドの非存在下において発酵させた同じ発酵マッシュよりも重量％ベースで少なくとも５倍少ない酢酸を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
非酸化性バイオサイドが２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
発酵マッシュ中に存在する非酸化性バイオサイドが、非酸化性バイオサイドを含む水の、発酵に使用される発酵槽への導入工程によって提供させる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
発酵によりエタノールを生産する方法であって、
ａ）槽内の混合物として発酵性マッシュ、ジハロニトリロプロピオンアミドである少なくとも１つの非抗生物質であって非酸化性バイオサイド、少なくとも１つの多環式抗細菌ペプチド及び少なくとも１つの酵母を、該マッシュの発酵が起こり、それによりエタノールを生産し、該少なくとも１つの非抗生物質バイオサイドが該酵母を死滅させることなく該マッシュ中の細菌の増殖を制御する条件下で準備することであって、該非酸化性バイオサイドと該多環式抗細菌ペプチドがエタノール生産のための発酵中及び/又は発酵後において少なくとも１つの細菌の殺菌制御において相乗的効果を発揮することと、
ｂ）発酵マッシュを蒸留し、それにより該発酵マッシュの固形分から該エタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することであって、該発酵マッシュが、該蒸留後に非酸化バイオサイドを１ｐｐｍ以下及び抗生物質を１０ｐｐｍ以下含むことと、
ｃ）該固形分から乾燥蒸留穀物産物を得ること、
を含む、発酵によりエタノールを生産する方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの非酸化性バイオサイドと少なくとも１つの多環式抗細菌ペプチドとを含む組成物であって、非酸化性バイオサイドが２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３ジオール若しくは２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド、又はそれらの臭素が各々フッ素、塩素、若しくはヨウ素で置換された化合物から選択される化合物であり、前記非酸化性バイオサイド及び前記多環式抗細菌ペプチドが、エタノールを生産する発酵中の少なくとも１つの細菌の制御に関して相乗的な量で存在する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質代替物により発酵プロセスにおいて細菌の増殖を制御するプロセスに関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１つの非酸化性バイオサイド及び／又は少なくとも１つの安定化した酸化剤を含む抗生物質代替物を用いる細菌制御を伴って、発酵によりエタノールを生産するプロセスに関する。
【０００２】
本願は、２０１０年３月１９日付けで出願された、先の米国仮特許出願第６１／３１５，６０７号；２０１０年６月８日付けで出願された、先の米国仮特許出願第６１／３５２，５２１号；及び２０１０年７月１９日付けで出願された、先の米国仮特許出願第６１／３６５，６５８号（その全体が参照により本明細書中に援用される）の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
燃料又は補助燃料としての、例えばガソリンと混合した上でのその有用性を鑑みて、また多くの再生可能資源及び廃棄物からのその可用性のために、業務用エタノールに関する世界的な需要が増している。
【０００４】
エタノールを、多種多様なデンプン含有原材料を用いて発酵により生産することができる。デンプンをベースとするエタノール生産は一般的に、発酵性糖を含有する又は発酵性糖に分解することができるデンプン原料の塊を準備することと、水を添加し、マッシュを作製(prepare)することと、セルロース又は他の複合糖質の発酵性糖への糖化と、糖をエタノール及び二酸化炭素へと発酵させる酵母を添加することとを含む。発酵マッシュを蒸留にかけることによりエタノールを回収する。エタノール生産における蒸留の副産物はタンパク質、繊維及び脂質（oils）を含む非デンプン固体であり、これを処理して、「可溶分を含む乾燥蒸留穀物（distillersdried grains with solubles）」すなわち「ＤＤＧＳ」を生産することができる。ＤＤＧＳは栄養分に富んでおり、動物飼料、補助飼料又は植物肥料として市販されている。
【０００５】
エタノール生産産業における課題は、エタノール発酵プロセス機器及び／又はマッシュが生産収率を低減させる細菌に汚染される可能性があることである。「乳酸菌」はこの点において問題を引き起こす細菌の一種である。乳酸菌には例えば、ラクトバチルス種、ペジオコックス種、ロイコノストック種及びウィッセラ（Weissella）種が含まれる。酢酸菌、例えばアセトバクター種も、プロセスを妨げ、エタノールの収率を低減させる酢酸又は他の有機酸を生成することにより問題を引き起こす可能性がある。酵母は糖をエタノールへと変換させるが、細菌も、これらの同じ糖を変換し、エタノールではなく乳酸又は酢酸を生成するため、エタノール生産の収率の低減が起こる。このような細菌の大発生を制御するために、抗生物質がバイオエタノール発酵プロセスに用いられている。これらの処理で使用される抗生物質には例えば、バージニアマイシン、ペニシリン、エリスロマイシン及びタイロシンが含まれ得る。これらの抗生物質は獣医学及び人間医学にも使用される。それらの使用又は過度の使用により細菌が抗生物質に対する薬剤耐性を示す危険性が知られており、その関心が高まっている。抗生物質の切り替え又は抗生物質の投与量の増大が長期的解決策を与えることなく、抗生物質耐性の問題を大きくさせるおそれがある。さらに、標的細菌及び発酵産物に対する抗生物質の非特異性に関する問題が提起されている。動物飼料用のＤＤＧＳにおける抗生物質残留物の存在に関する懸念も提起されている。エタノール発酵用途における抗生物質の使用に対する更に厳しい法的及び規制的な管理基準が制定される場合もある。エタノール発酵プロセスに関する抗生物質の代替物が必要とされる。
【０００６】
二酸化塩素（すなわちＣｌＯ２）は酸化性バイオサイドとして提唱されている。しかしながら、二酸化塩素は非選択的な抗菌作用を有する強力な酸化剤である。二酸化塩素は望ましくない細菌及び発酵プロセスに不可欠な酵母の両方を攻撃する。酵母の損失がエタノール収率の損失、及び／又は「ゆっくりとした」発酵、及び／又は発酵の「行き詰まり」につながる。二酸化塩素は、機器を腐食させ、プロセス機器における鉄の沈着又は斑腐蝕（pitting）を引き起こし、鉄及びクロムをプロセスシステムに放出することがある塩化物イオンも発生させ、これにより費用のかかる修復が必要となることがある。
【０００７】
本研究者らは、それ自体の環境への悪影響が最小限である細菌制御のために抗生物質を置き換えることができるエタノール発酵戦略に対する必要性を認識している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の特徴は、エタノール発酵における細菌の制御に抗生物質代替物を使用する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の更なる特徴は、エタノール発酵に用いられるプロセスにおける細菌の制御、例えばマッシュ発酵、ビールウェル、又はその組合せにおける細菌制御に抗生物質代替物を使用する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の特徴は、環境への悪影響が低い又はない非抗生物質処理を用いて、エタノール発酵におけるエタノール収率を増大させる方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる特徴は、エタノール発酵における細菌の制御に、プロセス最終産物では本質的に欠失する非酸化性バイオサイドを使用する方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の特徴は、エタノール発酵における細菌の制御、プロセス最終産物では本質的に欠失しており、プロセス機器を損傷させないに安定化した酸化剤を使用する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる特徴は、バイオサイドを、発酵槽へと再循環されるプロセス水の少なくとも１つの発酵後供給源に添加することによりエタノール発酵における細菌の制御に非抗生物質バイオサイドを導入する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の特徴は、エタノール発酵における細菌の制御に乾燥蒸留穀物産物では本質的に欠失する非抗生物質バイオサイドを使用する方法により、バイオエタノール生産による抗生物質無含有乾燥蒸留穀物産物を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる特徴及び利点は、続く本明細書に一部記載されるか、一部本明細書から明らかであるか、又は本発明の実施により知ることができる。本発明の目的及び他の利点は、本明細書及び添付の特許請求の範囲に具体的に指摘された要素及び組合せにより実現されるとともに得られる。
【００１６】
これらの利点及び他の利点を達成するために、また本明細書に具体化され、広く説明されているように本発明の目的に従って、本発明は一部、発酵によりエタノールを生産する方法に関する。該方法は、槽内で少なくとも１つの非酸化性バイオサイド及び酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、エタノール及び固形分を生産する、発酵させることであって、非酸化性バイオサイドが酵母集団を低減することなくマッシュ中の細菌の増殖を制御する、発酵させることを含む。それから該方法は、発酵マッシュを蒸留し、固形分からエタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することを伴う。エタノール収率は、本発酵プロセスにより抗生物質の必要なく増大することができる。さらに、エタノール及び発酵プロセスの蒸留穀物産物は使用される抗生物質代替物を含まない又は実質的に含まないものとする。細菌制御の改善が達成されることを反映して、発酵マッシュの酸含量を低減することができる。
【００１７】
本発明は、発酵によりエタノールを生産する方法であって、槽内で少なくとも１つの安定化した酸化剤及び酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させて、エタノール及び固形分を生産する、発酵させることであって、安定した酸化剤がマッシュ中の細菌の増殖を制御する、発酵させることと、発酵マッシュを蒸留し、固形分からエタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することとを含む、発酵によりエタノールを生産する方法にも関する。
【００１８】
本発明は更に、発酵によりエタノールを生産する方法であって、槽内の混合物として発酵性マッシュ、非抗生物質バイオサイド、及び酵母を、マッシュの発酵が起こり、それによりエタノールを生産し、バイオサイドが酵母の集団を低減させることなくマッシュ中の細菌の増殖を制御する条件下で準備することと、発酵マッシュを蒸留し、それによりマッシュの固形分からエタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することとを含み、非抗生物質バイオサイドが非酸化性バイオサイド、安定化した酸化剤又はその組合せである、発酵によりエタノールを生産する方法を提供する。
【００１９】
本発明は更に、発酵によりエタノールを生産する方法であって、槽内で酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、それによりエタノール及び固形分を生産する、発酵させることと、少なくとも１つの非酸化性バイオサイドの存在下においてビールウェル（複数の場合もあり）内で発酵マッシュの少なくとも一部分を貯蔵することであって、非酸化性バイオサイドがビールウェル内の細菌の増殖を制御する、貯蔵することと、貯蔵したマッシュをビールウェルから蒸留ユニットへと供給することと、蒸留ユニット内で発酵マッシュを蒸留し、それにより固形分からエタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、を含む、発酵によりエタノールを生産する方法を提供する。非酸化性バイオサイドを発酵槽内の発酵性マッシュと、ビールウェル内の発酵マッシュとの両方に添加することができる。
【００２０】
本発明は更に、発酵によりエタノールを生産する方法であって、発酵槽内で酵母及び再循環されるプロセス水の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、それによりエタノールと固形分とを含む発酵マッシュを生産する、発酵させることと、任意で発酵槽からの放出気体を水溶液で気体洗浄するとともに、気体洗浄廃溶液の少なくとも一部分を発酵槽へと再循環させることと、任意でビールウェル内に発酵マッシュの少なくとも一部分を貯蔵することと、発酵マッシュを蒸留ユニットに供給することと、蒸留ユニット内で発酵マッシュを蒸留し、それにより蒸留廃液からエタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、蒸留廃液を液体含有画分（低濃度蒸留廃液）と固体含有画分とに分離することと、任意で低濃度蒸留廃液の少なくとも一部分を発酵槽へと再循環させることと、湿潤蒸留穀物産物として少なくとも部分的に固体含有画分を回収すること、及び／又は固体含有画分の少なくとも一部分を乾燥し、乾燥蒸留穀物産物及び蒸発蒸気を生産する、乾燥することと、任意で蒸発蒸気を凝縮するとともに、凝縮した蒸気の少なくとも一部分を発酵槽へと再循環させることとを含み、再循環水を発酵槽へと（再）導入する前に、発酵槽内の細菌の制御のための非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤を、気体洗浄廃溶液、低濃度蒸留廃液、及び穀物乾燥により凝縮した蒸気、又はそれらの任意の組合せを含む再循環水の少なくとも１つの供給源に添加する（及び／又は該非酸化性バイオサイド及び／若しくは安定化した酸化剤がそこに存在する）、エタノールを生産する方法を提供する。
【００２１】
本発明は更に、発酵によりエタノール生産の乾燥蒸留穀物副産物を生産する方法であって、発酵槽内で酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、それによりエタノールと固形分とを含む発酵マッシュを生産する、発酵させることと、任意で発酵槽からの放出気体を水溶液で気体洗浄するとともに、気体洗浄廃溶液の少なくとも一部分を発酵槽へと再循環させることと、任意でビールウェル内に発酵マッシュの少なくとも一部分を貯蔵することと、発酵マッシュを蒸留ユニットに供給することと、蒸留ユニット内で発酵マッシュを蒸留し、それにより蒸留廃液からエタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、蒸留廃液を低濃度蒸留廃液としての液体含有画分と固体含有画分とに分離することと、任意で低濃度蒸留廃液の少なくとも一部分を発酵槽へと再循環させることと、固体含有画分の少なくとも一部分を乾燥させることで、固体含有画分を回収し、それにより乾燥蒸留穀物産物及び蒸発蒸気を生産する、回収することと、任意で蒸発蒸気を凝縮するとともに、凝縮した蒸気の少なくとも一部分を発酵槽へと再循環させることとを含み、発酵槽内の細菌の制御のための非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤を、発酵槽、ビールウェル及び指定の再循環する水の供給源のうちの少なくとも１つ、又はそれらの任意の組合せに添加する、発酵によりエタノール生産の乾燥蒸留穀物副産物を生産する方法を提供する。発酵プロセスの蒸留穀物副産物は使用される抗生物質代替物を含まない又は実質的に含まないものとする。蒸留穀物副産物は、本発明の方法を用いて生産される場合、細菌問題又は他の欠陥もなく抗生物質を含まない又は実質的に含まないものとする。
【００２２】
上記の概略的な説明及び下記の詳細な説明は両方とも例示的及び説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載される本発明の更なる説明を与えることのみを意図するものであることを理解されたい。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「抗生物質」は細菌、真菌又は類似の微生物の増殖を制御する物質を表し、該物質は、細菌若しくは真菌により生成される天然物質、又は化学的／生化学的に合成される物質（天然物質の類縁体であり得る）、又は天然物質の化学修飾形態であり得る。該物質は例えば化合物であり得る。
【００２４】
「発酵性糖」は、エタノール又は他の最終産物への変換において酵母又は他の微生物が使用することができる単糖類及び二糖類（例えばグルコース（デキストロース）、フルクトース、ガラクトース、スクロース、マルトース）等の単純な糖を表す。
【００２５】
「セルロース系材料」はセルロースを含有する材料を表す。セルロースは、例えば植物の茎、葉、殻、外皮及び穂軸、又は樹木の葉、枝及び本体（wood）に一般的に見られる。セルロース系材料は、草本材料、農業残留物、森林残留物、都市固形廃棄物、古紙、並びにパルプ及び製紙工場の残留物であり得るが、これらに限定されない。セルロースが混合マトリクス内にリグニン、セルロース及びヘミセルロースを含有する植物細胞壁材料であるリグノセルロースの形態であり得ることが本明細書で理解される。
【００２６】
「バイオサイド」は、選択的に細菌を制御することが可能な化学物質を表す。
【００２７】
「非酸化性バイオサイド」は、少なくとも１回の投与量に関して発酵マッシュにおける細菌に対して選択的である（すなわち少なくとも１つの細菌を攻撃するが、酵母は攻撃しない）バイオサイドを表す。
【００２８】
少なくとも１つの細菌の増殖を「制御すること」が、細菌集団を所望のレベルに維持する、集団を所望のレベルまで（更には検出限界まで）低減する、及び／又は細菌の増殖を少なくとも部分的に阻害する。さらに、少なくとも１つの細菌の増殖を「制御すること」が、発酵マッシュにおける糖との細菌の反応が軽減する、すなわち細菌増殖速度又は発酵糖に対する細菌による攻撃の速度が遅くなり、かつ／又は消失するように、少なくとも１つの細菌を低いレベルに生物静力学的に（biostatically）低減及び／又は維持することを含み得ることも理解されるものとする。
【００２９】
「乾燥蒸留穀物」（ＤＤＧ）は一般的に、乾燥穀物残留固体を含み得る、発酵によるエタノール生産の副産物を表し、これは動物飼料グレードであり得る。
【００３０】
「可溶分を含む乾燥蒸留穀物」（ＤＤＧＳ）は、可溶成分（content）、例えばプロセスシロップ又は他の可溶分を有する乾燥穀物残留固体を含み得る、発酵によるエタノール生産の副産物を表し、これは動物飼料グレードであり得る。
【００３１】
「湿潤蒸留穀物」（ＷＤＧ）は、乾燥前の穀物残留固体を含み得る、発酵によるエタノール生産の副産物を表し、これはプロセスシロップの少なくとも一部分を含有することができ、動物飼料グレードであり得る。
【００３２】
本願に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は本発明の実施形態の一部を例示するものであり、本明細書とともに本発明の原理を説明する働きがある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の一実施形態による細菌の制御のために非抗生物質バイオサイドの導入を用いたエタノール生産の方法のプロセスフロー図を示す。
【図２】本発明の一実施形態による細菌の制御のために非抗生物質バイオサイドの導入を用いた製造プラントにおけるエタノール生産の方法の別のプロセスフロー図を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態による細菌の制御のために非抗生物質バイオサイドの導入を用いた製造プラントにおけるエタノール生産の方法の別のプロセスフロー図を示す図である。
【図４】時間（時間）に対する発酵における二酸化炭素の生成による質量損失（ｇ）に基づく発酵の進行を示す図であり、ここで発酵は、実施例１に記載されるトウモロコシ発酵実験における非酸化性バイオサイド処理及び非処理対照によるものである。
【図５】実施例１に記載されるトウモロコシ発酵実験における非酸化性バイオサイド処理及び非処理対照によるものである発酵における乳酸の最終濃度（ｇ／１００ｍＬ）を示す図である。
【図６】実施例１に記載されるトウモロコシ発酵実験における非酸化性バイオサイド処理及び非処理対照でのエタノール収率（ｇ（エタノール）／ｇ（乾燥トウモロコシ））を示す図であり、ここで同じ文字で示された棒グラフは９５％の信頼度で互いに有意には異ならない。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、プロセス最終産物では欠失している又は本質的に欠失している少なくとも１つの抗生物質代替物、例えば非抗生物質バイオサイドを用いたエタノール発酵における少なくとも１つの細菌の増殖を制御する方法を提供する。抗生物質代替物は１つ又は複数の非酸化性バイオサイド、安定化した酸化剤、又はその任意の組合せであり得る。これらの抗生物質代替物は発酵酵母に比べて細菌に対して選択的であり、そのため本発明の方法ではエタノール収率を、抗生物質代替物を用いない同じ発酵プロセスと比較して、例えば少なくとも約０．５重量％、又は約０．５重量％〜約５重量％、又は約１重量％〜約３．５重量％、又は約１．２５重量％〜約２．５重量％増大することができる。産業規模での生産では、たとえ一見僅かな収率の増大であったとしても重要なものとなる。また、本発明の方法で生産される乾燥蒸留穀物（ＤＤＧ）、例えば可溶分を含む乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）は抗生物質を含まないものとする。さらに、抗生物質代替物を分解又は反応させて、それにより発酵プロセス中で、かつエタノール及びＤＤＧ（例えばＤＤＧＳ）の回収前に、たとえあったとしてもより低い環境影響しか有しない他の物質を形成することができる。本発明の方法で用いられる抗生物質代替物、すなわち非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤は、ＤＤＧ、例えばＤＤＧＳまではプロセスに残らないと考えられる（例えばバイオサイドは分解され、かつ／又はそうでなければ存在しない）。そのため、非抗生物質バイオサイドは、ＤＤＧ（例えばＤＤＧＳ）を有する動物飼料に、及びＤＤＧ（例えばＤＤＧＳ）を与えた家畜、家禽又は魚から得られるその後の最終産物、例えば市販の食肉には行き着かないと予測される。発酵プロセスのＤＤＧ副産物及びＤＤＧＳ副産物は例えば、発酵中に細菌を制御するのに用いられる非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤を含まない、又は本質的に含まないものとする。例えば、本発明の方法のＤＤＧ副産物、例えばＤＤＧＳ副産物は、約１００ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、又は約５ｐｐｍ未満、又は約１ｐｐｍ未満の量、又は検出可能な量未満（例えば０．０１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍ、０．０００１ｐｐｍ〜５ｐｐｍ、０．００１ｐｐｍ〜１ｐｐｍ）で本発明の発酵方法に使用される抗生物質代替物を含有し得る。
【００３５】
本発明は、発酵槽へと再循環されるプロセス水の少なくとも１つの発酵後供給源にバイオサイドを添加することによるエタノール発酵における細菌の制御のために非抗生物質バイオサイドを導入する方法も提供する。これらの水供給源を発酵槽へと再循環させる前の指定の非抗生物質バイオサイドによる水の発酵後供給源の処理により、発酵プロセス、又は発酵後プロセス中に水供給源を汚染し得る細菌の制御を与えることができる。発酵槽への（再）導入前に水中の細菌を制御するための指定のバイオサイドによる再循環水の処理は、再循環水による発酵槽又は他のプロセスユニットの感染の危険性を防ぐ又は低減することができる。
【００３６】
概して、複合糖質又はデンプンを発酵性糖に変換するプロセスには通常、多くの工程が含まれる。例えば、粒状デンプンを含有する穀物及び穀類に用いられるような典型的なプロセスでは、当該技術分野において湿式粉砕及び乾式粉砕と称される２つの粉砕プロセスが一般的に用いられる。それから粉砕したデンプン含有材料を水溶液と混合し、スラリーを作製する。乾式粉砕プロセスでは、粉砕したデンプン含有材料と混合する水溶液には典型的には、水だけでなく、様々な量の低濃度蒸留廃液及び／又は他のプロセスシステムにおいて再循環される水の供給源も含まれる。低濃度蒸留廃液及び／又は他の再循環される水の供給源を用いて、発酵性糖及び／又はアルコールの処理における水の使用を節約することができる。それからデンプンを、一般的にデンプンの糊化と同時の、又はそれに続くこの目的のための好適な酵素の添加を伴う液化プロセスにより短鎖のより粘性の低いデキストリンへと変換する。その後、液化デンプンを、典型的には好適な酵素を酵素的に使用することを含む糖化工程により低分子量の糖へと変換する。低分子量の糖を更に（例えば精製デキストロースへと）精製し、発酵性微生物、例えば酵母によりエタノールへと代謝させることができる。示すように、糖化工程及び発酵工程は連続して又は同時に実施することができる。得られる発酵塊を蒸留して、蒸留廃液からエタノール産物を分離することができ、それを更に処理して、乾燥蒸留穀物副産物（複数の場合もあり）を形成することができる。
【００３７】
ラクトバチルス種、例えばラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）がエタノール発酵槽において度々問題となる。他の細菌、例えば酢酸菌等の偏性嫌気性菌が発酵槽内で基質を攻撃することもある。不十分な酸素濃度により発酵プロセスにおける条件が嫌気性となり、酢酸菌（例えばアセトバクター）が増殖し、栄養素について好気性細菌を圧倒し、それらが過剰増殖して、異化により酢酸を生成する。生成された酢酸には、エタノール発酵において別の問題があるとされる。酵母はラクトバチルス菌よりも酢酸に対しておよそ１０倍感受性があるとされる。そのため、酵母を用いたエタノール発酵は、酢酸菌及びラクトバチルス菌により悪影響がもたらされる。酢酸は蒸留ユニットのビールウェルで発酵の閉塞を引き起こす場合がある。ビールウェルは蒸留ユニットでの発酵マッシュの原料容器である。本発明では、１つ又は複数の非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤を本発明の方法に使用して、有益な酵母を制御せずに、ラクトバチルス菌、酢酸菌、及び／又はエタノール収率を低減させるか、若しくはそうでなければ発酵プロセスを損なわせる他の細菌を選択的に制御する。このため、酵母に悪影響を与えることなく細菌を制御するための本方法における非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤等の抗生物質代替物の使用により、酵母が細菌、特に嫌気的に増殖し、かつ／又はプロセス（処理）に有害である酢酸を形成する細菌の存在又は増殖により妨げられずに適切に発酵を行うことが可能になる（例えばバイオサイドは酵母を低減又は死滅させない）。標的細菌は例えば、ラクトバチルス種、偏性嫌気性菌、又はその任意の組合せであり得る。発酵マッシュは、非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤の非存在下で処理した同じ発酵マッシュよりも重量％ベースで少なくとも約５倍（５×）、又は少なくとも約１０倍（１０×）、又は少なくとも約２５倍（２５×）少ない乳酸若しくは酢酸、又はその両方を有し得る。このことは本発明の方法で達成される細菌制御の改善を反映している。エタノール収率が改善し、特にＤＤＧＳに関する製品品質は、環境又は食物連鎖に望ましくない場合がある抗生物質及びバイオサイドを含まない又は本質的に含まない。本発明の目的のために、「酵母集団を低減させることなく」は、酵母集団の有意な低減がないこと（例えばバイオサイドを導入して３０分以内の酵母集団の１０％未満の低減）を意味すると理解される。
【００３８】
図１は本発明の非限定的な方法を説明するフローチャートを示す。本発明のプロセスのデンプンベースのエタノール生産は概して、セルロース原料又はデンプン材料の調製（例えば粉砕）１、混合／加熱処理（cooking）（液化）２、糖化３、酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤の存在下での発酵４、任意で酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤での処理によるビールウェル貯蔵５’、エタノール産物を生産するための蒸留５、蒸留廃液の濾過６、及びＤＤＧＳ副産物を回収するための穀物乾燥７というプロセス工程又は操作を含む。原料のタイプに応じて、原料材料に、図面に工程１として包括的に示される、粉砕、切断、選別、及び／又は材料を処理しやすくさせ、材料表面を処理剤へとより接近可能にさせる他の方法等の１つ又は複数の事前のユニット操作を施すことができる。工程２として示されるように、調製した原料材料（例えば破砕原料）を水２１及び可溶化剤２２と混合し、加熱処理することができる。工程２では、「液化」は、原料においてセルロース又は他の複合糖質を可溶化及び加水分解するプロセスを表す。好適な熱安定性の可溶化酵素又は酸を使用して、デンプン原材料を加水分解して、液化マッシュを提供することができる。他の添加剤、例えばｐＨ調整剤を工程２において添加することができる。工程３では、糖化剤３１、例えば糖化酵素を工程２の産物に添加し、液化マッシュを発酵性糖（例えば発酵性単糖類）に変換することができる。発酵性糖を発酵生物、例えば酵母により代謝させることができる。示されるように、複数の酵素処理が、出発セルロース又は複合糖質をより複雑性が低いデンプン、及び最終的には発酵性糖へと変換するのに必要とされ得る。工程４として示されるように、酵母４１及びバイオサイド（非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤）４２を発酵槽内のマッシュに添加することができ、これにより糖がエタノール及び二酸化炭素４３へと発酵される。例えば種タンク（図示せず）内で増殖させた酵母をマッシュに添加し、発酵性糖をエタノールへと変換させるプロセスを開始することができる。非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤をマッシュに添加し、発酵中に存在する任意の問題となる細菌を制御することができる。発酵産業で理解されるように、液化工程及び／又は糖化工程を、発酵工程と同時に又はそれとは別々に実施することができる。例えば、糖化プロセス及び酵母発酵プロセスを別々のプロセス域において、又は少なくとも一部同時に、発酵域において行うことができる。糖化は例えば、発酵工程に備えて発酵槽にマッシュを充填しながら実施することができるが、それに限定されない。その産業でも理解されるように、それぞれの糖化剤及び酵母が同じ発酵槽においてマッシュとともに存在するように、糖化反応は、酵母発酵反応を実施することができるようになる前に実施する必要がある。
【００３９】
プロセス経路５０Ａで示されるように、発酵マッシュを発酵槽から蒸留カラム又は他の蒸留ユニットへと直接導くことができる。プロセス経路５０Ｂで示されるように、発酵マッシュを工程５’に示されるビールウェル（複数の場合もあり）に貯蔵することができ、その後マッシュを蒸留カラム又は他の蒸留ユニットへと導く。ビールウェルはバッチ間に発酵ビールを貯蔵することができ、発酵マッシュの連続流を、蒸留を含むエタノール回収操作へと供給することができる。発酵マッシュに対してプロセス流路５０Ａ及び５０Ｂの一方又は両方を使用することができる。バイオサイド（非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤）５３をビールウェル内の発酵マッシュに添加し、ビールウェルに存在する任意の問題となる細菌を制御することができる。単一ビールウェル又は複数のビールウェルを使用して、バイオサイドで処理することができる。発酵反応により発生するエタノール５１を、工程５に示される蒸留を発酵マッシュに施すことにより回収する。蒸留のタイプに応じて、エタノール流５１を篩にかけ、又はそうでなければ更に処理し（図示せず）、水成分を分離し、回収したエタノール産物を更に精製することができる。エタノール生産における蒸留の副産物である蒸留廃液５２はタンパク質、繊維及び脂質を含有する非デンプン固体を含有し、これを処理して、抗生物質を含まず、かつ非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤を含まない又は本質的に含まないものとするＤＤＧＳを生産することができる。この蒸留廃液５２は、発酵及びアルコールの初期蒸留後に残留する固体含有材料（「ビール塔底液」）である場合に「総蒸留廃液」と称することができる。図示されるように、工程６に示されるように蒸留廃液５２を濾過し、プロセスに再利用することができる液体６１、例えば低濃度蒸留廃液を、工程７に示されるように乾燥して、ＤＤＧＳ  ７１を生産することができる固体５２と分離することができる。例えば蒸留廃液を遠心分離し、加圧し、篩濾過若しくはメッシュ濾過し、又はそうでなければ処理して、分離工程６において液体画分と固体画分とに分離することができる。
【００４０】
本発明の目的のために、非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤を発酵の前に、及び／又は発酵中に導入することができる。バイオサイドを固体若しくは液体又は更には気体としていずれのやり方でも導入することができる。バイオサイドを連続して又はバッチとして導入することができる。バイオサイドを発酵の前に、及び／又は発酵中に導入することができる。マッシュが発酵槽に導入される前に、バイオサイドを槽に（例えば槽の壁に）更に適用することができる。バイオサイドを、少なくとも酵母を添加する直前に、及び／又は酵母を添加するのとほぼ同時に（又は直後に）（例えば酵母を添加してから６時間以内、３時間以内、１時間以内、３０分以内、１０分以内に）導入することが好ましい。バイオサイドを発酵槽、及び／又は発酵槽に通じるライン、及び／又は発酵槽の上流にある槽（例えば糖化槽）、及び／又は発酵槽に直接、若しくは発酵槽に間接的に（例えば発酵槽の上流に）再循環される水の供給源（単数又は複数）に導入することができる。バイオサイドを単一バッチ、複数のバッチとして、ドリップライン等として導入することができる。
【００４１】
示されるように、バイオサイド（非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤）を、使用する場合、発酵マッシュを貯蔵するビールウェル（複数の場合もあり）に添加することができる。バイオサイドをマッシュのビールウェルへの導入の前に、及び／若しくは導入中に、及び／若しくは導入の後に、並びに／又はビールウェルに通じるライン、例えばマッシュをビールウェルに供給するラインに導入することができる。バイオサイドを連続して又はバッチとしてビールウェルに導入することができる。発酵マッシュがビールウェルに導入される前に、バイオサイドをビールウェルに（例えばビールウェルの壁に）適用することができる。バイオサイドを単一バッチ、複数のバッチとして、ドリップライン等としてビールウェルに導入することができる。バイオサイドをエタノール生産における任意の他のプロセスの前に、そのプロセス中に、及び／又はそのプロセスの後に添加し、問題となる細菌を制御することができる。
【００４２】
図２は、発酵槽へと再循環されるプロセス水の少なくとも１つの供給源においてバイオサイド添加を行うことができる、本発明の非限定的な方法を示すフローチャートを示す。図２におけるプロセスフロー及びプロセスユニットのレイアウトは図１のものと実質的には同様のものであり、図１で示される実質的に同様の意味を有し得る、同様の番号が付けられた要素及び単位に関しては図１で言及されている。水の保持及び／又は他の目的のために、異なる水の発酵後供給源を入口点若しくは発酵槽の上流にある点に（例えば段階１、段階２及び／又は段階３）に、及び／又は発酵４に使用される発酵槽（単数又は複数）に直接再循環させることができる。例えば、低濃度蒸留廃液６１を発酵に使用される発酵槽（複数の場合もあり）へと再循環させることができる。低濃度蒸留廃液を図２に非限定的に示されるように導入点若しくは発酵槽（複数の場合もあり）の上流にある点に、又は発酵槽に直接再循環させることができる。約１０％〜約９０％、又は約２５％〜約７５％、又は約４０％〜約６０％、又は約５０％、又は例えば他の容量の低濃度蒸留廃液を、トウモロコシスラリーを調製するのに使用するために再循環させることができる。相対量は種々の植物及び操作の間で異なるとされ、例えば水と固体とのバランスを維持するために経時的に変えることができる。上述のように、例えば低濃度蒸留廃液の任意の非再循環部に、他の処理、例えばＤＤＧＳ副産物を生産する際の乾燥の前後に固体に添加することができるプロセスシロップを作製する際の蒸発を適用することができる。ビールウェル、蒸留カラム、又はその両方内の水が細菌、例えば酢酸菌で汚染される場合があり、再循環させる、例えば低濃度蒸留廃液を再循環させる前にバイオサイドで処理しないままであれば、発酵槽（複数の場合もあり）に汚染水が充填され、前処理条件又は非処理条件に対する発酵操作を（再）感染させる危険性がある状況が生じ得る。この危険性を排除又は少なくとも低減するために、一つの選択肢として、低濃度蒸留廃液を発酵槽（複数の場合もあり）の上流に若しくは発酵槽に、又は他のプロセス位置でプロセスシステムに再導入する前に、戻り流６１においてバイオサイド６３で処理することができる。典型的に、穀物乾燥工程７を介してＤＤＧＳ  ７１へと至る、固体６２とともに持ち越される全ての水又は揮発性液体がシステムから失われるわけではない。固体６２中の大部分、例えば約８０％以上、又は他のパーセントの水をエバポレータ（乾燥器）から凝縮物として回収し、再循環水としてスラリーシステムへと戻すことができる。乾燥工程７で生じる蒸気流７２を蒸気凝縮工程９で冷却し、凝縮蒸気流７３を提供することができ、これを同様に再循環させ、発酵槽（複数の場合もあり）へと供給されるプロセス水の供給源として使用することができる。別の選択肢では、発酵槽（複数の場合もあり）の上流に若しくは発酵槽に、又は他のプロセス位置でプロセスシステムに再導入する前に、凝縮蒸気流７３をバイオサイド７４で処理することができる。蒸留廃液の水成分の大部分、例えば約５０体積％〜約９５体積％、又は約７５体積％〜約９２体積％、又は約９０体積％、又は他のパーセントがどのような形であ���スラリーシステムに戻ることができるため、指定のバイオサイドによるこれらのプロセス水の再循環供給源の処理により、発酵槽、ビールウェル、又は他のプロセスユニット若しくはラインにおける細菌感染及び／又は増殖問題の危険性を防ぐ又は低減するのに効果的なアプローチを提供することができる。発酵槽（複数の場合もあり）へと供給されるスラリーシステム、又は直接的な発酵槽（複数の場合もあり）への別の水の投入の選択肢は気体洗浄水であり得る。酵母は糖を発酵させると、二酸化炭素ガス４３を揮発性有機化合物及び水蒸気のような他の発酵ガスとともに放出することができる。二酸化炭素を大気へと直接放出することができるか、又は図示されるように、放出前に気体洗浄工程８において気体洗浄器を用いて精製することができる。気体洗浄工程を用いて、二酸化炭素を含有する発酵ガスから揮発性有機化合物（例えばエタノールを含む）を除去することができる。水４４は気体洗浄工程８において気体洗浄器を通して供給され、発酵ガスと接触し、汚染物質を除去するとともに、そうしなければ発酵槽からの蒸発により失われるであろうエタノールを回収する。気体洗浄工程からの水性廃液４５も発酵のためのプロセス水の供給源として再循環させることができる。別の選択肢として、気体洗浄器廃液４５を発酵槽（複数の場合もあり）の上流に若しくは発酵槽に、又は他のプロセス位置でプロセスシステムに再導入する前に、バイオサイド４６で処理することができる。発酵プロセス又は他の処理の水要件のため望まれ得る又は使用され得る任意の更なる水の供給源を例えば、プラントの水供給元（例えば都市用水、井戸等）から直接もたらすことができ、その量は比較的少量であっても又はそうでなくてもよい。システムのためのこれらの他の潜在的な水の供給源は必ずしも、バイオサイドによる処理が必要であるわけではないが、所望又は必要に応じてかかる処理を適用することができる。
【００４３】
本発明を用いて、非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤で処理することができる、発酵中及び／又は発酵後の（例えばマッシュ、発酵マッシュ、又は回収されたエタノール、又は回収されたＤＤＧＳ、又は発酵槽へと再循環された水の供給源における）細菌（例えば乳酸菌）レベルは、約１０９ＣＦＵ／ｍｌ（１ｍｌ当たりのコロニー形成単位）未満、又は約１０８ＣＦＵ／ｍｌ未満、又は約１０７ＣＦＵ／ｍｌ未満、又は約１０６ＣＦＵ／ｍｌ未満、又は約１０４ＣＦＵ／ｍｌ未満、又は約１ＣＦＵ／ｍｌ〜約１０９ＣＦＵ／ｍｌ、又は約１０ＣＦＵ／ｍｌ〜約１０８ＣＦＵ／ｍｌ、又は約１０２ＣＦＵ／ｍｌ〜約１０７ＣＦＵ／ｍｌ、又は約１０３ＣＦＵ／ｍｌ〜約１０６ＣＦＵ／ｍｌ、又は他のレベルであり得る。
【００４４】
本発明の方法における非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤の使用は、発酵性糖の供給源を含有する任意の原料材料を用いたエタノール生産を包含することが理解される。原料材料は微生物発酵により分解することができる任意の多様な糖質であり得る。例えば、本発明の方法のための原料材料は、発酵性糖の供給源（発酵性糖の直接的な供給源として又は元の若しくは中間のデンプン、セルロース、若しくはその多糖類構成要素の分解若しくは変換により発酵性糖を提供することができる材料として）である任意の糖質又はデンプン材料であり得る。好適な原料材料の供給源の例は、農作物、例えば穀物（例えばトウモロコシ、コムギ、穀実用モロコシ（ミロ））、オオムギ、コメ、ライムギ、サトウキビ、サトウダイコン、飼料用ビート、糖蜜、ジャガイモ、ニンジン、キャッサバ、ダイオウ、アメリカボウフウ、及びサトウモロコシである。作物に関連した農業廃棄物を使用することができる。エタノールを、バイオマス等、例えば木片、おが屑、スイッチグラス（パニクム・ウィルガツム（Panicum virgatum））、トウモロコシ茎葉、トウモロコシの穂軸、藁、穀物の殻、並びに再生紙及び古紙の材料及び製品、又はそれらの任意の組合せのような他のデンプン原料材料を用いた本発明の方法による発酵により生産することができる。バイオマス材料は、リグノセルロース系バイオマス材料、例えば木材材料であり得るか、又はリグニン量が低い草本材料、例えばスイッチグラスであり得る。更なる原料材料には、果実及び／又は果汁（例えばブドウ、プラム、ベリー類、リンゴ、西洋ナシ、チェリー）、ガマ、精糖（例えばスクロース）、蜂蜜、樹液（メープル、パーム）、花（タンポポ、ハイビスカス）、又はそれらの任意の組合せが含まれ得る。この産業では、エタノール発酵のためのこれらの原料及び／又は他の異なる原料は、例えば異なるデンプン含量及び組成、並びに異なる副産物のために異なるエタノール収率を有し得ることが理解される。示されるように、エタノール生産における細菌制御のために非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤を用いる本発明の方法は、デンプン原料に関して限定されずに使用することができると考えられる。
【００４５】
直接的な発酵性糖ではなくセルロース含有原料又は他の複合糖質を含有する原料を使用する場合、典型的には幾つかの反応を用いて、複合糖質をエタノールへと変換させる。示されるように、「液化」及び「糖化」は通常、「発酵」と併せて使用され、ここでは酵母とともに、直接的な発酵性糖ではない複合糖質を含有するが、分解して、発酵性糖を放出又は提供することができる、エタノール生産のための原料が使用される。
【００４６】
液化及び糖化を、酵素又は酸を用いて行うことができる。第１の反応は例えば、セルロース又は他の複合糖質の発酵性糖又はそのより小さい前駆体への酵素加水分解又は酸加水分解であり得る。酵素加水分解は例えば、発酵性糖を得るのに更なる酵素触媒が必要となるサッカリド中間体をもたらし得る。酸、例えば希鉱酸の添加による糖化が、例えば米国特許第１，３２３，５４０号及び同第４，２０１，５９６号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。例えばセルロース含有原料に対する酵素により触媒される加水分解による、例えばセルロース分解酵素（cellulytic enzymes）又はセルラーゼを用いた糖化は、例えば米国特許第３，７６４，４７５号及び同第３，６４２，５８０号（全てその全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。セルロースの微生物による糖化を誘導する更なる微生物因子又は酵素因子には例えば、米国特許第４，０９４，７４２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているようにアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）突然変異株８１７、及び好熱性のセルロース分解性のスポロキトファガ（sporocytophaga）が含まれ得る。例えばトウモロコシでは、デンプンは通常、発酵前に酵素によりデキストリン及びデキストロースへと分解される。例えばトウモロコシの液化及び糖化はそれぞれ、例えばトウモロコシデンプンを短鎖デキストリンへと分解するのに用いられるα−アミラーゼ酵素により段階的に実施することができ、例えばデキストリンを分解して発酵性糖を形成するのに、グルコアミラーゼ酵素を使用することができる。コムギのエタノール生産はトウモロコシのエタノール生産とほとんど変わらず、この産業で既知であり、また使用されている僅かな操作の調整によりトウモロコシの代わりに利用することができる。またコムギは、トウモロコシよりもタンパク質含量が高いが、デンプン含量は僅かに低く、より多くの繊維及びペントサン（粘性が高く、デンプンに分解しにくいヘミセルロースである）を有する。デンプン含量が低いために、コムギは一般的にトウモロコシより少ないエタノールしか生産しないが、より多くの蒸留穀物を生産する。サトウキビの繊維部分（例えばバガス）を酵素により処理し、セルロースを発酵性糖へと分解することができる。サトウキビ汁（及び一部の果汁）は直接発酵に好適であり得る。選択及び使用される原料のタイプに応じたエタノール収率及び副産物のタイプ、並びに処理の容易さに関する多くの代償は発酵産業の当業者により一般的に知られている。本発明の方法における発酵中の細菌の制御のための非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤の使用は、この点において様々な可能性及び選択肢に適合させることができる。セルロース系材料の糖化のために添加されるそれぞれの酵素（例えばセルロース分解酵素（複数の場合もあり））の量は例えば、発酵性材料に基づき固体重量ベースで約０．００１重量％〜約２重量％の酵素、又は約０．０１重量％〜約１重量％の酵素、又は約０．０１５重量％〜約０．５重量％の酵素、又は約０．２重量％〜約０．７５重量％の酵素、又は約０．１重量％〜約０．５％重量％の酵素、又は約０．２重量％〜約０．４重量％の酵素であり得るが、他の量を使用してもよい。液化工程で添加される可溶化酵素の量は同様の範囲の量であり得る。本明細書で示される酵素の任意の量は活性酵素に基づくもとであり得る。
【００４７】
発酵は発酵性糖のエタノールへの変換を伴うものとし、これは通常、本発明の方法において酵母による発酵により行われる。糖からのエタノールの形成は米国特許第２，８０２，７７４号に記載されるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びフサリウム・オキシスポラム（Fusariumoxysporum）等の酵母により達成することができる。他の有用な微生物は、例えば米国特許第４，０９４，７４２号（参照によりその全体が本明細書中に全て援用される）に記載のエタノール産生桿菌である。発酵糖に添加される酵素（例えばサッカロミセス・セレビシエ由来の酵素）の濃度は例えば、発酵性材料に基づき固体重量ベースで約０．００１重量％〜約２重量％の酵素、又は約０．０１重量％〜約１重量％の酵素、又は約０．０１５重量％〜約０．５重量％の酵素、又は約０．２重量％〜約０．７５重量％の酵素、又は約０．１重量％〜約０．５％重量％の酵素、又は約０．２重量％〜約０．４重量％の酵素であり得るが、他の量を使用してもよい。
【００４８】
本発明の方法において発酵中での（及び／又は発酵前での、及び／又は発酵後での）細菌の制御に用いられる非酸化性バイオサイドは例えば、ジブロモニトリロプロピオンアミド（例えば２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド）、ブロモ−ニトロアルカン−ジオール（例えば２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール）、メチレンビスチオシアネート、２−（チオシアノメチル−チオ）ベンゾチアゾール、シアノジチオカルビメート塩、Ｎ−メチルジチオカルバメート塩、ポリ［オキシエチレン（ジメチルイミニオ）−エチレン（ジメチルイミニオ）エチレンジクロリド、テトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）ニトロメタン、グルタルアルデヒド、１，５−ペンタンジアール、アルキルベンジルアンモニウムクロリド、２−ブロモ−２−ニトロ−プロパン−１，３−ジオール、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジチオカルバメート塩、ドデシルグアニジン塩酸塩、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、ｎ−オクチルイソチアゾリノン、ジクロロ−ｎ−オクチルイソチアゾリノン、ブロモニトロスチレン、テトラヒドロ−３，５−ジメチル−２Ｈ−１，３，５−チアジアジン−２−チオン、又はそれらの任意の組合せであり得る。非酸化性バイオサイドは例えば、ジブロモニトリロプロピオンアミド（例えば２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド）、ジクロロニトリロプロピオンアミド（例えば２，２−ジクロロ−３−ニトリロプロピオンアミド）、ジヨードニトリロプロピオンアミド（例えば２，２−ジヨード−３−ニトリロプロピオンアミド）、ジフルオロニトリロプロピオンアミド（例えば２，２−ジフルオロ−３−ニトリロプロピオンアミド）を含むが、これらに限定されないジハロニトリロプロピオンアミド（例えば２，２−ジハロ−３−ニトリロプロピオンアミド）、又はそれらの任意の組合せであり得る。他の例としては、他のバイオサイドを有する又は有しない、ヒドロキシプロピルメタンチオスルホネート（ＨＰＭＴＳ）及び／又は２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。全体を通して同定された化合物及び組成物のいずれにおいても、特定のハロゲン化物を異なるハロゲン化物に置き換えることができることが理解される。例えば、ブロモをクロロ又はヨードに置き換えることができ、またその反対も同様である。
【００４９】
発酵マッシュでの非酸化性バイオサイドの処理速度は、酵母を低減させることなく発酵に問題となる細菌を制御するのに十分な濃度であるとする。他に記載がなければ濃度は一般的に限定されない。発酵マッシュを処理するのに用いられる非酸化性バイオサイドの濃度は例えば、発酵性マッシュに基づき乾燥固体重量／重量ベースで少なくとも約０．１ｐｐｍ、又は少なくとも約１ｐｐｍ、又は少なくとも約１０ｐｐｍ、又は約０．１ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍ、又は約５０ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍ、又は約７５ｐｐｍ〜約２５０ｐｐｍ、又は約１００ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍであり得るが、他の濃度を使用してもよい。例えば１ｐｐｍのバイオサイドによる発酵性マッシュの処理は１００００００ポンドの発酵性マッシュ当たり１ポンドのバイオサイドによる処理と同等である。ビールウェルで発酵マッシュを処理するのに使用することができる非酸化性バイオサイドの濃度は、発酵槽で発酵マッシュに使用される指定のレベル同程度であるか、又は他の濃度とであり得る。発酵槽へと再循環されるプロセス水、例えば再循環される低濃度蒸留廃液、再循環される気体洗浄器廃液、及び／又は再循環される穀物乾燥による凝縮蒸気を処理するのに使用される非酸化性バイオサイドの濃度は、発酵槽で発酵マッシュに使用される指定のレベルと同じ若しくは又は同程度であるか、又は他の濃度であり得る。
【００５０】
本発酵方法において細菌制御に使用することができる安定化した酸化剤は、元よりも遅い速度で材料の酸化副産物を放出するように、合成、配合、又はそうでなければ修飾した酸化剤材料であり得る。安定化した（stabilized）酸化剤は細菌に対して選択的であり得るが、必ずしもそうである必要はない。
【００５１】
細菌の制御に使用される安定化した酸化剤は、安定化した次亜塩素酸、安定化した次亜塩素酸塩、安定化したクロラミン（chloramine）、安定化した次亜臭素酸（例えば臭素化ナトリウムスルファメートとして又は任意の他の安定化形態として安定化されたもの）、安定化した二酸化塩素（例えば徐放性ＣｌＯ２）、安定化した過酢酸（例えば徐放性Ｈ３Ｃ−ＣＯＯＯＨ）、ヨウ素若しくは安定化したヨウ素生成物（例えば固体のヨウ素若しくはヨウ化物、又は電解により（electrolytically）発生したヨウ素）、徐放性塩素トリオン、徐放性トリクロロ−ｓ−トリアジントリオンナトリウム、徐放性ジクロロ−ｓ−トリアジントリオンナトリウム（例えば細菌を死滅させることができるが、酵母を死滅させる前に停止すると考えられる徐放性酸化剤）、徐放性塩素トリオン、徐放性トリクロロ（trichloro）−ｓ−トリアジントリオンナトリウム、安定化したクロロヒダントイン、安定化したブロモヒダントイン若しくは安定化した変性ヒダントイン、又はそれらの任意の組合せであり得る。
【００５２】
これらの安定化した酸化剤を、例えば微粒剤又は緩衝化合物等の材料の酸化副産物の放出速度を遅らせるタイプの調製物として配合することができる。安定化した二酸化塩素は例えば、緩衝化亜塩素酸ナトリウムであり得る。発酵槽における細菌の酸性成分（nature）、例えば乳酸は、亜塩素酸ナトリウムを、プロセスにおいて遊離の塩素又はダイオキシンを生成せずに、塩化物及びナトリウムイオン（塩）の非毒性構成要素へと分解することができる抗細菌剤である二酸化塩素に変換することができる。液体中で、安定化剤はスルファミン酸系又はアンモニウム塩系であり得る。示されるように、一部の酸化剤を固体形態で安定化させることができる。
【００５３】
マッシュでの安定化した酸化剤の処理速度は酵母を低減させることなく発酵に問題となる細菌を制御するのに十分な濃度であるものとする。他に記載がなければ濃度は一般的に限定されない。発酵マッシュを処理するのに用いられる安定化した酸化剤の濃度は例えば、発酵性材料に基づき乾燥固体重量／重量ベースで少なくとも約０．１ｐｐｍ、又は少なくとも約１ｐｐｍ、又は少なくとも約１０ｐｐｍ、又は約０．１ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍ、又は約５０ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍ、又は約７５ｐｐｍ〜約２５０ｐｐｍ、又は約１００ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍであり得るが、他の濃度を使用してもよい。ビールウェルで発酵マッシュを処理するのに使用することができる安定化した酸化剤の濃度は、発酵槽で発酵マッシュに使用される指定のレベル又は他の濃度と同じ又は同程度であり得る。発酵槽へと再循環されるプロセス水、例えば再循環される低濃度蒸留廃液、再循環される気体洗浄器廃液、及び／又は穀物乾燥由来の再循環される凝縮気体を処理するのに使用される安定化した酸化剤の濃度は、発酵槽で発酵マッシュに使用される指定のレベル、又は他の濃度と同じ又は同程度であり得る。
【００５４】
選択肢として、本発明の任意のプロセス又は組成物は、１つ又は複数の抗細菌ペプチド、例えばナイシン等の多環式抗細菌ペプチドを含み得る。このペプチド（複数の場合もあり）は任意の量、例えば約０．０１ｐｐｍ〜５００ｐｐｍ又はそれ以上で存在することができ、この量は発酵の開始時に（例えば発酵槽において）存在する濃度であるか、又はプロセスに添加される組成物全体の重量をベースにするものであり得る。選択肢として、１つ又は複数の多環式抗細菌ペプチドは、１：２〜１：１０００、例えば１：５〜１：５００、若しくは１：１０〜１：２５０、若しくは１：２０〜１：２００、若しくは１：３０〜１：１００、若しくは１：４０〜１：１００、若しくは１：５０〜１：１５０、又はこれらの範囲内若しくはこれらの範囲外の他の比率の（多環式抗細菌ペプチド）と（非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤）との重量比で存在し得る。
【００５５】
選択肢として、本明細書に記載のような１つ又は複数のバイオサイドと組み合わせた場合、１つ又は複数の多環式抗細菌ペプチドは、細菌、特にラクトバチルス種の抑制又は制御における相乗的な結果を与えることができる。換言すると、この組合せは、エタノール発酵システム又はプロセス（例えば本明細書で例示されるようなもの）における微生物による損傷又は汚染の抑制又は制御において特に相乗的に効果的であり得る。
【００５６】
本発明による方法を、本発明を鑑みて容易にすることができる修正を加えて、従来型のエタノール生産プラントにおいて実施することができる。図３を参照すると、本発明の方法を適合させて利用することができる乾式粉砕プロセスベースのエタノール生産プラント１００が示されている。穀物をエタノールプラントに送達することができ、ここで穀物を少なくとも１回の生産運転のためにプラントに供給するのに十分な穀物を保持するように設計された貯蔵瓶１０１に充填することができる。穀物を選別して、残屑を取り除き、粉砕１０２等によって粗粉末へと製粉することができる。粉末を加熱処理し、液化することができる。加熱処理プロセス１０３中、粉末中のデンプンを発酵のために物理的かつ化学的に調製する。粉砕した穀物をプロセス水と混合することができ、ｐＨを酸性ｐＨ、例えば約５．５〜約６．０へと調整することができ、それにα−アミラーゼ酵素を添加することができる。粘性を低減させるために、スラリーを約１８０°Ｆ〜１９０°Ｆになるまで約３０分間〜４５分間、加熱することができる。それから得られるスラリーを約２２１°Ｆで加圧式ジェットクッカー１０４に送り込むことができ、そこで約５分間保持することができる。その後混合物を大気圧復水器又は瞬間真空復水器により冷却することができる。瞬間復水冷却の後、混合物を約１８０°Ｆ〜１９０°Ｆで約１時間〜２時間、液化タンクに保持し、α−アミラーゼ酵素にデンプンを短鎖デキストリンに分解する時間を与えることができる。ｐＨ及び温度の調整後、混合物を発酵タンクに送り込む際に第２の酵素グルコアミラーゼを添加することができる。一度発酵タンク内に入ると、混合物はマッシュと称される。グルコアミラーゼ酵素がデキストリンを分解し、発酵反応に好適な単糖を形成する。発酵１０６では、酵母を添加し、この糖をエタノール及び二酸化炭素へと変換させる。非酸化性バイオサイドを第１の発酵タンク内でマッシュと組み合わせる。非酸化性バイオサイド又は安定化した酸化剤の量を特定の作用物質に応じて変えることができる。添加量は酵母を低減させることなく、プラントの存在する細菌による感染を根絶若しくは制御するのに又は細菌の発生を防ぐのに効果的な量であり得る。マッシュを約７０°Ｆ〜約１１５°Ｆ又は約８０°Ｆ〜約１００°Ｆで約２４時間〜６０時間、発酵させることができ、それにより最大で約１５％のエタノールと、穀物及び添加酵母由来の固体とを含有する混合物が得られる。また、５．６〜６．０のｐＨで酵母発酵を開始することにより、微生物汚染の危険性が高まる可能性があるため、液化後のｐＨを例えば希酸（例えば硫酸）を用いて５．０未満のｐＨへと低下させる調整を行うことができる。発酵マッシュを蒸留ユニット、例えばマルチカラム蒸留システムへと送り込むことができ、ここで蒸留１０７のために更なる熱を加える。１つ又は複数のビールウェル１２６を蒸留カラムへの供給材料として発酵マッシュを貯蔵するための容器として使用することができる。蒸留カラムはエタノールの沸点と水の沸点との差異を利用し、それによりエタノールを煮沸除去し、分離することができる。産物流が蒸留カラムを離れる状態となるまで、産物流は約９５体積％（１９０ｐｒｏ��ｆ）のエタノールを含有し得る。このプロセスの残屑（蒸留廃液と呼ばれる）は非発酵性固体と水とを含有し、カラムの底部から遠心分離器又は他の濾過手段へと送り出すことができる。１９０ｐｒｏｏｆのエタノールは約５％の水を含有したままであり得る。これを分子篩１０８に通し、異なる分子サイズに基づきエタノールから残留水を物理的に分離するか、又はそうでなければエタノールから水成分を分離するのに用いられる他の従来型のやり方で処理することができる。この工程により、２００ｐｒｏｏｆの無水（水なし）エタノールを生産することができる。エタノールを貯蔵タンク１１０へと送る前に、少量の変性剤１０９を添加することができる（そうすると、エタノールは食用に適さないものとなる）。燃料エタノール１１１はバイオサイド又は抗生物質を含有しない。エタノール生産プロセス中、２つの商業的に価値のある副産物、すなわち二酸化炭素及び蒸留穀物が作られる。酵母が糖を発酵させると、酵母は揮発性の有機化合物及び水蒸気等の他の発酵ガスとともに大量の二酸化炭素ガス１１２を放出する。示されるように、（１つの選択肢として）二酸化炭素を直接排出される二酸化炭素１１２として大気中に放出することができるか、又は（別の選択肢として）二酸化炭素１１２Ａを放出若しくは捕捉前に気体洗浄器１２３で精製することができる。気体洗浄器１２３を用いて、発酵ガスから揮発性の有機化合物（例えばエタノールを含む）を取り出すことができる。気体洗浄器は発酵ガス（典型的に多くの場合、二酸化炭素）を水１２５と接触させ、それにより汚染物質を取り除き、そうしなければ発酵槽からの蒸発により失われるであろうエタノールを回収する。気体洗浄器１２３からの水性廃液を発酵のためのプロセス水の供給源として再循環させることができる。示されるように、発酵のための水供給源として再循環させる場合、任意でプロセスシステムに再導入する前に気体洗浄器廃液１２４を非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤で処理することができる。任意で気体洗浄器から精製した二酸化炭素を捕捉して、炭酸飲料及び急速冷凍の用途に使用するために食品加工産業で市販することができる。蒸留タンクの底部からの蒸留廃液１１３（例えば総蒸留廃液）は穀物及び添加酵母由来の固体と、プロセス中に添加される水由来の液体とを含有する。この蒸留廃液は低濃度蒸留廃液１１５(約５％〜１０％の固体を有する液体）と、蒸留穀物へと処理することができる固体含有画分１１６とに分離するために遠心分離器１１４へと送ることができる。低濃度蒸留廃液１１５の一部を補充水として加熱処理／スラリータンクに送り戻し、加熱処理プロセスに必要とされる新たな水の量を低減することができる。示されるように、発酵のための水供給源として再循環される場合、任意でプロセスシステムに再導入する前に低濃度蒸留廃液１１５を非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤で処理することができる。スラリーへの低濃度蒸留廃液の添加には多くの場合、スラリーのｐＨ調整が必要となる。例えば、粉砕した総製粉トウモロコシ穀物をデンプン含有材料として使用し、水と混合する場合、スラリーのｐＨは例えば、約ｐＨ５．８〜約ｐＨ６．２であり得る。しか���ながら、スラリーのｐＨを、低濃度蒸留廃液の添加により、糖化剤を不活性化させることができる約ｐＨ４．８〜ｐＨ５．２へと低減することができる。そのため、液体蒸留廃液を再利用する場合、スラリーのｐＨを、好適なアルカリ（例えば水酸化ナトリウム若しくは水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム又はアンモニア）を用いて約ｐＨ５．６〜ｐＨ６．０へと調整することができる。蒸留廃液の残り１１７を多重効用蒸発システム１１８へと送ることができ、そこでこれをシロップ（例えば２５％〜５０％の固体）へと濃縮することができる（１１９）。それからこのシロップ（タンパク質含量及び脂肪含量が高い）を固体含有画分１１６へ戻し混合し、湿潤蒸留穀物（ＷＤＧ）１２０を提供することができる。添加したシロップとともに、ＷＤＧは元の原料と添加酵母との栄養価のほとんどを含有したままであり、そのためＷＤＧは地方のフィードロット及び酪農場で優れた家畜食料、又は他のタイプの動物飼料となる。シロップの添加後に、これをＷＤＧ  １２０として湿潤ケーキパッドへと運ぶことができ、そこに輸送のために積み込むことができる。多くのエタノール施設では全てのＷＤＧを利用できるほど十分近くには家畜はいない。損傷を避けるために、ＷＤＧは通常、生産した直後に使用される。そのため、一般的にＷＤＧは乾燥システム１２１へと送られ、水分を取り除き、その保存期間を延長させる。この点において使用することができる従来型の乾燥の実行には、１００ｐｓｉａ〜２５０ｐｓｉａの圧力での間接流又は乾燥用の熱を提供する高温の燃焼排ガスが含まれる。復水器１２８（例えば熱交換器）等（such as）を用いて、乾燥器で生じる蒸気１２７を凝縮し、水性副産物を形成することができるか、又は代替的に大気中に排出することができる（図示せず）。示されるように、凝縮気体１２９を発酵システムのための再循環されるプロセス水、例えば発酵槽（複数の場合もあり）のための水供給源として使用することができる。同様に示されるように、発酵のための水供給源として再循環される場合、任意でプロセスシステムに再導入させる前に凝縮気体１２９を非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤で処理することができる。この得られる可溶分を含む乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）１２２は動物飼料において高タンパク質成分、例えばウシ、ブタ、家禽及び魚用の飼料として一般的に使用される。図３に関しては連続プロセス又は半連続プロセスとして有用であるが、本発明のエタノール発酵プロセスはバッチ式でも実施することができる。
【００５７】
別の実例として、ジブロモニトリロプロピオンアミド（例えば２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド）又は他のジハロニトリロプロピオンアミドは図１、図２及び図３に示されるようなものであるが、それに限定されないエタノール発酵プロセスにおいて細菌制御に用いられる抗生物質代替物であり得る。２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）の商業的供給源には例えば、Buckman Laboratories International, Inc., Memphis TNで市販されているＢＲＯＮＡＭ（商標）２０が含まれる。発酵プロセス中、ＤＢＮＰＡをタンク（撹拌型）で希釈することができ、そこで発酵を約９０°Ｆ〜９５°Ｆで約２４時間〜４８時間行う。約５０ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍ、又は約１００ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍ（活性成分をベースとして生成物として）、又は他の範囲のＤＢＮＰＡの処理速度は、発酵プロセスにおいてラクトバチルス菌を制御することができるが、酵母（複数の場合もあり）には影響を与えず、そのため抗菌剤はＤＤＧＳへと至ることはない。発酵プロセスは例えば、１回の生産運転当たり約６０００００ガロン〜約１００万ガロンのプロセス材料を伴い得る。それから発酵マッシュを約２時間〜３時間「ビールウェル」に送り出し、そこで発酵を約１０５°Ｆのビール中に約２０時間もの間行うことができ、その後発酵マッシュを蒸留する。ＤＢＮＰＡを第１の発酵タンク（複数のタンクを使用する場合）に添加するのが好ましく、この活性成分を反応させた後、約２４時間〜４８時間にわたって分解する。ＤＢＮＰＡを第１の発酵タンクに直接、又は示されるように再循環されるプロセス水、又は他の導入方法を介して導入することができる。ビールウェル及び／又は発酵マッシュに接触するビールウェルの一部分（例えば内部タンク壁）内の発酵マッシュをＤＢＮＰＡで処理することができる。ビールウェルにおいて発酵マッシュを処理するのに使用されるＤＢＮＰＡの濃度は発酵タンクに使用される指定のレベルと同程度であり得る。
【００５８】
発酵タンク内の条件下において、ＤＢＮＰＡは研究室での作業に基づき約１時間〜２時間だけそのままであることが期待される。蒸留の蒸留廃液、すなわち蒸発していない発酵産物（「ビールタンク」後）を遠心分離し、乾燥して（例えば約２５０°Ｆ〜３００°Ｆで約１時間）、その後混合物を最終タンクへと送り出し、そこではこの混合物はＤＤＧＳと呼ばれる。ＤＤＧＳはトウモロコシでは出発原材料の約１／３質量である。ＤＢＮＰＡの化学構造（chemistry）は可溶分を含む乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）段階に入る前の遠心分離及び乾燥熱に耐え、残存するとは予測されない。トウモロコシからエタノールへのプロセスでは、例えばＤＢＮＰＡが二酸化炭素及び水蒸気へと分解することが予測され、またそのようなものは環境への影響が低い。実験結果に基づき、ＤＢＮＰＡは細菌（ラクトバチルス菌）を死滅させるが、発酵に関わる酵母を死滅させず、またＤＢＮＰＡはＤＤＧＳへと持ち越されるとは考えられない。ＤＢＮＰＡの適用が抗生物質の使用を回避し、プロセスを通して安定性を維持することができる。ＤＢＮＰＡの使用により、抗生物質の使用が必要なくなる。ＤＢＮＰＡの使用は、（広範に利用されている唯一の処理としての）抗生物質のコストが比較的高く、発酵にもコストがかかり得るため、より経済的である。さらに、ＤＢＮＰＡが、非処理の感染発酵マッシュと比較したエタノール収率の増加、例えば約０．５重量％〜約５重量％、若しくは約１重量％〜約４重量％、若しくは約１重量％〜約３．５重量％、若しくは約１．２５重量％〜約２．５重量％、若しくは約２重量％〜約３重量％、又は他の増加量を可能にし、これはプロセッサに明らかに有益である。
【００５９】
本発明は例えば、バイオマスの燃料グレードのアルコールへの抗生物質を含まない変換を提供することができ、これにより無鉛ガソリンとブレンドし、「ガソホール」燃料又は他の燃焼燃料を生産することができる。本発明の方法は、食品グレードのエタノールの生産にも適用可能である。発酵プロセスにおいて本明細書に示されるような非抗生物質バイオサイドの予想外の活性が、本明細書で説明されるような標準的な実験技法を用いて確認されている。
【００６０】
本発明は、以下の態様／実施形態／特徴を任意の順序及び／又は任意の組み合わせで含む：
１．本発明は、発酵によりエタノールを生産する方法であって、
ａ）槽内で少なくとも１つの非酸化性バイオサイド及び酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、エタノール及び固形分を生産する、発酵させることであって、上記非酸化性バイオサイドが酵母集団を低減させることなく該マッシュ中の細菌の増殖を制御する、発酵させることと、
ｂ）発酵マッシュを蒸留し、それにより上記固形分から該エタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、
を含む、発酵によりエタノールを生産する方法に関する。
２．約１００ｐｐｍ未満の該非酸化性バイオサイドを含有する上記固形分から乾燥蒸留穀物産物を得ることを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
３．工程（ｂ）における該発酵マッシュが１０ｐｐｍ以下の抗生物質を含有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
４．工程ｂ）における上記発酵マッシュが、蒸留後に存在する非酸化性バイオサイドを約１０ｐｐｍ未満有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
５．工程ｂ）における上記発酵マッシュが、蒸留後に存在する非酸化性バイオサイドを約１ｐｐｍ未満有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
６．細菌がラクトバチルス種、アセトバクター種、又はその組合せである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
７．細菌が偏性嫌気性菌である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
８．工程（ａ）における該発酵マッシュが、該非酸化性バイオサイドの非存在下において発酵させた同じ発酵マッシュよりも重量％ベースで少なくとも約５倍少ない乳酸を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
９．工程（ａ）における該発酵マッシュが、該非酸化性バイオサイドの非存在下において発酵させた同じ発酵マッシュよりも重量％ベースで少なくとも約５倍少ない酢酸を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様１に記載の方法。
１０．非酸化性バイオサイドが、２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド、メチレンビスチオシアネート、２−（チオシアノメチル−チオ）ベンゾチアゾール、シアノジチオカルビメート塩、Ｎ−メチルジチオカルバメート塩、ポリ［オキシエチレン（ジメチルイミニオ）−エチレン（ジメチルイミニオ）エチレンジクロリド、テトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）ニトロメタン、グルタルアルデヒド、１，５−ペンタンジアール、アルキルベンジルアンモニウムクロリド、２−ブロモ−２−ニトロ−プロパン−１，３−ジオール、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジチオカルバメート塩、ドデシルグアニジン塩酸塩、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、ｎ−オクチルイソチアゾリノン、ジクロロ−ｎ−オクチルイソチアゾリノン、ブロモニトロスチレン、若しくはテトラヒドロ−３，５−ジメチル−２Ｈ−１，３，５−チアジアジン−２−チオン、又はこれらの任意の組合せである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
１１．非酸化性バイオサイドがジハロニトリロプロピオンアミドである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
１２．非酸化性バイオサイドが２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミドである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
１３．発酵によりエタノールを生産する方法であって、
ａ）槽内で少なくとも１つの安定化した酸化剤及び酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、エタノール及び固形分を生産する、発酵させることであって、上記安定化した酸化剤が酵母集団を低減させることなく該マッシュ中の細菌の増殖を制御する、発酵させることと、
ｂ）発酵マッシュを蒸留し、それにより該発酵マッシュの該固形分から該エタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、
を含む、発酵によりエタノールを生産する方法。
１４．約１００ｐｐｍ未満の該安定化した酸化剤を含有する上記固形分から乾燥蒸留穀物産物を得ることを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
１５．安定化した酸化剤が、安定化した次亜塩素酸、安定化した次亜塩素酸塩、安定化したクロラミン、安定化した次亜臭素酸（例えばブロモスルファメート）、安定化した二酸化塩素、安定化した過酢酸、ヨウ素、安定化したヨウ素生成物、徐放性塩素トリオンであるトリクロロ−ｓ−トリアジントリオンナトリウム、徐放性ジクロロ−ｓ−トリアジントリオンナトリウム、徐放性塩素トリオン、徐放性トリクロロ−ｓ−トリアジントリオンナトリウム、安定化したクロロヒダントイン、安定化したブロモヒダントイン若しくは安定化した変性ヒダントイン、又はそれらの任意の組合せである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
１６．工程（ｂ）における該発酵マッシュが１０ｐｐｍ以下の抗生物質を含有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
１７．工程ｂ）における上記発酵マッシュが、蒸留後に存在する安定化した酸化剤を約１０ｐｐｍ未満有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
１８．工程ｂ）における上記発酵マッシュが、蒸留後に存在する安定化した酸化剤を約１ｐｐｍ未満有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
１９．細菌がラクトバチルス種、アセトバクター種、又はその任意の組合せである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
２０．細菌が偏性嫌気性菌である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
２１．工程（ａ）における該発酵マッシュが、該安定化した酸化剤バイオサイドの非存在下において発酵させた同じ発酵マッシュよりも重量％ベースで少なくとも約５倍少ない酸を有し、該酸が乳酸又は酢酸である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
２２．発酵によりエタノールを生産する方法であって、
ａ）槽内の混合物として発酵性マッシュ、少なくとも１つの非抗生物質バイオサイド、及び少なくとも１つの酵母を、該マッシュの発酵が起こり、それによりエタノールを生産し、該少なくとも１つの非抗生物質バイオサイドが該酵母を死滅させることなく該マッシュ中の細菌の増殖を制御する条件下で準備することであって、該非抗生物質バイオサイドが非酸化性バイオサイド、安定化した酸化剤、又はその組合せである、準備することと、
ｂ）発酵マッシュを蒸留し、それにより該発酵マッシュの固形分から該エタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、
を含む、発酵によりエタノールを生産する方法。
２３．発酵によりエタノールを生産する方法であって、
ａ）槽内で少なくとも１つの酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、それによりエタノール及び固形分を生産する、発酵させることと、
ｂ）少なくとも１つの非酸化性バイオサイドの存在下において少なくとも１つのビールウェル内で発酵マッシュの少なくとも一部分を貯蔵することであって、該非酸化性バイオサイドが該少なくとも１つのビールウェル内の細菌の増殖を制御する、貯蔵することと、
ｃ）貯蔵したマッシュを該少なくとも１つのビールウェルから少なくとも１つの蒸留ユニットへと供給することと、
ｄ）該少なくとも１つの蒸留ユニット内で該発酵マッシュを蒸留し、それにより該固形分から該エタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、
を含む、発酵によりエタノールを生産する方法。
２４．エタノールを生産する方法であって、
ａ）発酵槽内で酵母及び再循環されるプロセス水の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、それによりエタノールと固形分とを含む発酵マッシュを生産する、発酵させることと、
ｂ）任意で該発酵槽からの放出気体を水溶液で気体洗浄するとともに、気体洗浄廃溶液の少なくとも一部分を該発酵槽へと再循環させることと、
ｃ）任意で少なくとも１つのビールウェル内に該発酵マッシュの少なくとも一部分を貯蔵することと、
ｄ）発酵マッシュを蒸留ユニットに供給することと、
ｅ）該蒸留ユニット内で該発酵マッシュを蒸留し、それにより蒸留廃液から該エタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、
ｆ）該蒸留廃液を液体含有画分及び固体含有画分に分離することと、
ｇ）任意でｆ）の該液体含有画分の少なくとも一部分を該発酵槽へと再循環させることと、
ｈ）湿潤蒸留穀物産物として少なくとも部分的にｆ）の該固体含有画分を回収すること、及び／又は該固体含有画分の少なくとも一部分を乾燥し、乾燥蒸留穀物産物及び蒸発蒸気を生産する、乾燥することと、
ｉ）任意でｈ）の該蒸発蒸気を凝縮するとともに、凝縮した蒸気の少なくとも一部分を該発酵槽へと再循環させることと、
を含み、水供給源を該発酵槽へと再循環させる前に、非酸化性バイオサイド及び／若しくは安定化した酸化剤を、ｂ）の該気体洗浄廃溶液、ｆ）の蒸留廃液分離による該液体含有画分、及びｉ）の蒸留穀物乾燥により凝縮した蒸気、若しくはそれらの任意の組合せの再循環水の少なくとも１つの供給源に添加するか、又は該非酸化性バイオサイド及び／若しくは安定化した酸化剤がそこに存在する、エタノールを生産する方法。
２５．エタノール生産の乾燥蒸留穀物副産物を生産する方法であって、
ａ）発酵槽内で酵母の存在下において発酵性マッシュを発酵させ、それによりエタノールと固形分とを含む発酵マッシュを生産する、発酵させることと、
ｂ）任意で該発酵槽からの放出気体を水溶液で気体洗浄するとともに、気体洗浄廃溶液の少なくとも一部分を該発酵槽へと再循環させることと、
ｃ）任意で少なくとも１つのビールウェル内に該発酵マッシュの少なくとも一部分を貯蔵することと、
ｄ）発酵マッシュを蒸留ユニットに供給することと、
ｅ）該蒸留ユニット内で該発酵マッシュを蒸留し、それにより蒸留廃液から該エタノールの少なくとも一部分を分離する、蒸留することと、
ｆ）該蒸留廃液を液体含有画分と固体含有画分とに分離することと、
ｇ）任意でｆ）の該液体含有画分の少なくとも一部分を該発酵槽へと再循環させることと、
ｈ）該固体含有画分の少なくとも一部分を乾燥させることで、ｆ）の該固体含有画分を回収し、それにより乾燥蒸留穀物産物及び蒸発蒸気を生産する、回収することと、
ｉ）任意でｈ）の該蒸発蒸気を凝縮するとともに、凝縮した蒸気の少なくとも一部分を該発酵槽へと再循環させることと、
を含み、該発酵槽内の細菌の制御のための非酸化性バイオサイド及び／若しくは安定化した酸化剤を、該発酵槽、ビールウェル及び再循環する水の供給源のうちの少なくとも１つ、若しくはそれらの任意の組合せに添加するか、又は該非酸化性バイオサイド及び／若しくは安定化した酸化剤がそこに存在する、エタノール生産の乾燥蒸留穀物副産物を生産する方法。
２６．約１００ｐｐｍ未満の該非酸化性バイオサイド及び／又は安定化した酸化剤を含有する乾燥蒸留穀物産物を得ることを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
２７．上記発酵が少なくとも１つの抗細菌ペプチドの存在下でも起こる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
２８．上記発酵が少なくとも１つの多環式抗細菌ペプチドの存在下でも起こる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
２９．上記非酸化性バイオサイドと上記多環式抗細菌ペプチドとが、エタノールを生産する発酵中、及び／又は発酵後の少なくとも１つの細菌の殺菌制御に関して相乗的である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の方法。
３０．少なくとも１つの非酸化性バイオサイドと少なくとも１つの多環式抗細菌ペプチドとを含む組成物。
３１．上記非酸化性バイオサイド及び上記多環式抗細菌ペプチドが、エタノールを生産する発酵中の少なくとも１つの細菌の制御に関して相乗的な量で存在する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の組成物。
３２．上記非酸化性バイオサイドが、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３ジオール若しくは２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド、又はそれらのハロゲン化物類縁体である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様に記載の組成物。
【００６１】
本発明は、上記及び／又は下記の文章及び／又は段落で記載されるこれらの様々な特徴又は実施形態の任意の組合せを含むことができる。本明細書中に開示される特徴の任意の組合せは本発明の一部と考えられ、組み合わせ可能な特徴に関する限定は意図されない。
【００６２】
以下の実施例は、本発明例示することを意図しており、本発明を限定することは意図するものではない。以下の実施例では、特に明示のない限り、あらゆる部分が重量による割合で示される。
【実施例】
【００６３】
実施例１
実験を実施し、エタノール発酵におけるラクトバチルス感染の制御のための抗菌剤としての非酸化性バイオサイドの有効性を評価した。非酸化性バイオサイドはＢＲＯＮＡＭ（商標）２０（２０％  ２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド）とした。ラクトバチルス菌はラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）とした。酵母はサッカロミセス・セレビシエとした。およそ３０％（ｗ／ｗ）の乾燥固体を含有するトウモロコシマッシュを使用した。
【００６４】
実験手順
スラリー調製のために、乾燥時に起こる質量損失を測定することにより重力測定法で水分バランスを利用して製粉トウモロコシの水分を決定した。それぞれの反復操作に対して３０％（ｗ／ｗ）の総乾燥固体濃度で１６０ｇのトウモロコシスラリーを調製するのに必要なトウモロコシ、脱イオン（ＤＩ）水及び酵素の量を決定した。それぞれの処理では、３つの独立した反復スラリーを、所要量のＤＩ水をラベル付きのＬａｂｏｍａｔビーカー内で量り取り、その後所要質量のトウモロコシ粉を添加することにより調製した。α−アミラーゼ酵素（Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ  ＳＣ  ＤＳ、Novozymes）を希釈して、酵素をそれぞれのフラスコにより正確に送達させた。０．１３ｇ／ｍｌのαアミラーゼの希釈標準溶液を用いて、トウモロコシの湿重量ベースで０．０２％（ｗ／ｗ）の用量で添加した。全ての構成要素をＬａｂｏｍａｔビーカーに入れた後、スラリーを手動で回転させた。封をしたビーカーをＬａｂｏｍａｔ（モデルＢＦＬ１２  ８０５、Mathis, Switzerland）において垂直に設置されたホイールに取り付け、これをインキュベーション中、５０ｒｐｍで回転させた。ホイールは、混合効率を改善するため、５０秒ごとに逆方向になるようにプログラムした。サンプルを８３℃で９０分間インキュベートすることにより液化し、その後サンプルをＬａｂｏｍａｔにおいて４０℃に冷却した。
【００６５】
発酵に関しては、マッシュを冷却させたら、それぞれのＬａｂｏｍａｔビーカーの内容物全体（およそ１６０ｇ）を滅菌した２５０ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコに移した。マッシュ及びフラスコの質量を記録し、発酵フラスコに移したマッシュの質量を算出した。マッシュのｐＨを１５０μｌの１０Ｎ硫酸の添加により５．２未満に調整した。フラスコを全てのマッシュの調製が完了するまで３２℃でインキュベーター／振とう器（Sartorius、Ｃｅｒｔｏｍａｔ  ＢＳ−１）において１７０ｒｐｍで振とうした。
【００６６】
発酵フラスコに加える全ての酵素、栄養素及び他の変更物（amendments）を使用前に新たに調製した。酵母栄養素（ＡＹＦ１１７７;EthanolTechnology, Milwaukee, WI）を０．２ｇ／ｍｌの溶液として調製し、１５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ、トウモロコシの湿重量ベースで）の用量を用いた。尿素を窒素の最終濃度が５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ、マッシュの総質量ベースで）になるまで滅菌した０．２ｇ／ｍｌの溶液として添加した。グルコアミラーゼ酵素（Spirizyme Fuel, Novozymes）を０．２５ｇ／ｍｌの溶液として調製し、０．０１５％（ｗ／ｗ、トウモロコシの湿重量ベースで）の用量で添加した。
【００６７】
ラクトバチルス・プランタラム培養物を接種のために１００ｍｌのＭＲＳブロス中で１日を通して増殖させることにより調製した。トウモロコシマッシュにおいて１０７ＣＦＵ／ｍｌの初期濃度を達成するのに必要とされる培養物の量はＭＲＳブロスにおけるラクトバチルス・プランタラムに関する増殖曲線データから推測した。培養物の連続希釈液を、シクロヘキシミドを含有するＭＲＳ寒天上にプレーティングし、コロニーの数を数える前に３２℃で２日間インキュベートすることにより、細菌の初期濃度を決定した。発酵フラスコに、２×１０９ＣＦＵ／ｍｌの細菌細胞濃度を有する０．５ｍｌのこのラクトバチルス・プランタラム培養物を接種した。これにより、標的濃度よりも僅かに低いが、本研究の目的には十分である６×１０６ＣＦＵ／ｍｌの初期濃度が得られた。
【００６８】
細菌の接種後に、発酵フラスコに衛生処理した発酵トラップを取り付け、１７０ｒｐｍで１時間振とうしながら３２℃でインキュベートした。これにより実物大の燃料エタノール設備での発酵装置への充填の開始と、酵母の接種との間の典型的な時間をシミュレートした。
【００６９】
０．２ｇ／ｍｌの酵母（サッカロミセス・セレビシエ;Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ; Fermentis, Marcq-en-Baroeul,France）懸濁液を滅菌した２５０ｍｌ容のフラスコ内で調製した。この懸濁液をインキュベートし、４０℃で２０分間混合した後、発酵フラスコへと接種した。それぞれの発酵フラスコに１６０μｌの酵母懸濁液を接種し、１０７酵母細胞／ｍｌの初期濃度を達成した。最初の１時間の細菌によるインキュベーションの後、フラスコに酵母を接種し、ＢＲＯＮＡＭ（商標）２０を投与した。燃料エタノール発酵において乳酸菌による感染を制御する際のＢＲＯＮＡＭ（商標）２０の有効性を研究するのに本研究で用いられる処理（細菌及びＢＲＯＮＡＭ（商標）２０投与）を表１に示す。
【００７０】
【表１】
0005828460.tif 000002
【００７１】
全ての添加を行った後、それぞれのフラスコの質量を記録し、衛生処理した発酵トラップをそれぞれのフラスコに再び差し込んだ。適所にトラップを備えたそれぞれのフラスコの質量も記録した。フラスコをインキュベーター／振とう器（Sartorius、Ｃｅｒｔｏｍａｔ  ＢＳ−１）において１７０ｒｐｍで６１時間振とうしながら３２℃でインキュベートした。適所にトラップを備えたそれぞれのフラスコの質量を、発酵を通じて定期的に測定し、発酵の速度を推測した（泡立たせる（bubbling：沸騰させる）ことにより二酸化炭素が発酵トラップの外へと失われると、発酵フラスコの質量が低減する）。
【００７２】
６１時間のインキュベーション後、トラップを取り外す前後のフラスコの質量をそれぞれ測定した。手動で回転させながら、１．０ｍｌのマッシュをそれぞれのサンプルからピペットにより採取し、９．０ｍｌの０．０５Ｍリン酸バッファーの入った試験管に移した。それから１０５〜１０７の希釈倍率を達成するために、これらのサンプルを連続希釈した。その後１００マイクロリットルの最も希釈倍率が高い３つの希釈液をそれぞれＭＲＳ寒天上にプレーティングして、それぞれのフラスコ内のラクトバチルス・プランタラムの最終濃度を推測した。コロニーの数を数えようとする前に、プレートを３２℃で２日間インキュベートした。
【００７３】
それぞれのフラスコを、オーバーヘッドアジテーターを用いて混合し、サンプルを以下の測定のために回収した：酵母細胞計数、基質（グルコース、ＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ４＋；ここで「ＤＰｘ」は「ｘ」個のサブユニットを有するグルコースオリゴマーを表す）の最終濃度、発酵産物（エタノール、グリセロール、乳酸及び酢酸）、総乾燥固体及び溶解乾燥固体、及びビール液体相の密度。全ての測定を、標準的な操作手順を用いて行った。サンプルを酵母細胞計数のために脱イオン水中で１００倍に希釈し、メチレンブルーで染色することにより調製し、その後顕微鏡により血球計を使用して計測を行い、生存率を推測した。基質及び発酵産物の最終濃度をＨＰＬＣにより決定した。ＨＰＬＣのために遠心分離（８０００×ｇ、３分）により大きい固体を取り除いた後、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、最終濃度が０．０１Ｎになるまで硫酸で酸性化させることによりサンプルを調製した。総固体濃度及び溶解した固体濃度を１０５℃で３時間の乾燥時の質量損失に基づき重力測定法により測定した。溶解した固体及び液体相の密度の測定のために、遠心分離した後、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して上清を濾過することによりサンプルを調製した。ビール液体相の密度を、Ａｎｔｏｎ−Ｐａｒｒ密度計を使用して測定した。
【００７４】
全ての処理での発酵速度を図４に示す。処理間での見かけの差異の１つは感染対照（ＩＣ）であり、これは他の処理よりも総質量損失が低いように見えた。しかしながら、これは完全に１つの発酵フラスコによるものであり、その影響は他の処理に対してＩＣ処理に関する大きい誤差バーにより示される。そのため、最終質量損失における差異は統計的に有意ではないと考えられる。約１６時間後の質量損失は２つの最も高いＢＲＯＮＡＭ（商標）２０用量で僅かに低いように見えることも観察される。これらの差異には再現性があり、統計的に有意であるが、これら２つの処理の質量損失が、産業標準のインキュベーション時間の僅か約半分である２４時間後の感染していない対照（ＩＦＣ）と同一であったことから、これは重要ではないと思われる。
【００７５】
乳酸の最終濃度及びそれぞれの処理でのエタノール収率を図５及び図６に示す。分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、両方のエンドポイントでの処理間に有意な差異が存在することが示された。可能性のある全ての処理対を比較する一対比較に関するチューキー検定を用い、有意差を特定し、これらを両方の図におけるそれぞれのバーでラベルにより示す。同じ文字で標識した任意の処理は互いに有意な差異はない。
【００７６】
図５で示されるように、最終乳酸濃度で明らかな差異が観察された。ＩＦＣで乳酸の最低濃度、及びＩＣで最高濃度が観察された。例えば、感染対照（ＩＣ）等で非酸化性バイオサイドを用いないラクトバチルス・プランタラムによるトウモロコシマッシュの感染が、感染していない対照（ＩＦＣ）に対して１４倍近く乳酸の最終濃度を増大させた。ＢＲＯＮＡＭ（商標）２０は全ての用量で生じる乳酸の量を低減し、明らかな用量応答関係が存在した。最低乳酸濃度は２００ｐｐｍｖ用量のＢＲＯＮＡＭ（商標）２０で処理した感染トウモロコシマッシュで観察され、この濃度は感染していない対照（ＩＦＣ）で観察されたものよりも僅かに高いだけであった（ＩＦＣでの０．０６±０．００３ｇ／１００ｍｌに対する０．１１±０．０１ｇ／１００ｍｌ）。「Ｂｒｏｎａｍ−２００」及びＩＦＣ処理における最終乳酸濃度の差異は統計的に有意であった：Ｐ＝０．０１２（Ｐは２つの濃度が同じである確率である）。ＢＲＯＮＡＭ（商標）２０が最大用量であっても最終乳酸濃度における増大を完全には排除することができないのは、乳酸菌の接種と、抗菌化合物の添加との間での１時間インキュベーション期間によるものであり得る。
【００７７】
観察されるエタノール収率における差異は統計学的に有意であると考えられ、図５で示されるこの傾向に一致するパターンに従うものであった。ＩＣのエタノール収率は「Ｂｒｏｎａｍ−５０」処理を除く全ての他の処理のエタノール収率よりも有意に低かった。感染対照（ＩＣ）におけるラクトバチルス・プランタラムでの感染が感染していない対照（ＩＦＣ）に比べてエタノール収率を約２％低減した。ＢＲＯＮＡＭ（商標）２０の添加は全ての試験用量レベルで感染対照（ＩＣ）に比べて細菌感染の効果を低減させ、少なくとも１００ｐｐｍｖの濃度で、細菌感染の効果は感染対照（ＩＣ）に比べて完全に排除された。「Ｂｒｏｎａｍ−２０」では、例えばエタノール収率における増大は感染対照（ＩＣ）に比べて２．６％であることが見出された。
【００７８】
本研究の結果は、ＢＲＯＮＡＭ（商標）２０が、燃料エタノール産業で用いられるものに特有である発酵条件下でラクトバチルス・プランタラムの感染を制御することが可能であることをはっきりと示している。３０％（ｗ／ｗ）トウモロコシ乾燥固体を含有するマッシュに、ラクトバチルス・プランタラムを感染させた場合、乳酸濃度が１０倍超（０．０６％（ｗ／ｖ）から０．７６％（ｗ／ｖ）へ）増大し、エタノール収率は２％低減した。少なくとも１００ｐｐｍの濃度のＢＲＯＮＡＭ（商標）２０による処理はエタノール収率に対する細菌感染の影響を完全に排除し、感染対照（ＩＣ）に比べて８０％以上最終乳酸濃度を低減した。
【００７９】
本研究の結果に基づき、非酸化性バイオサイド、例えばＢＲＯＮＡＭ（商標）２０は、燃料エタノール生産における発酵に有益な酵母を死滅させることなくトウモロコシ発酵プロセスにおいて細菌感染を制御することができることが示された。更にこれらの結果を鑑みて、非酸化性バイオサイド、例えばＢＲＯＮＡＭ（商標）２０は燃料エタノール発酵において細菌感染を制御するための抗生物質の実現可能な代替物を与えると考えられる。
【００８０】
実施例２
ラクトバチルス菌ＭＲＳブロス（２５％強度）を調製し、試験管内に１０ｍｌ量で分注し、１２１℃で２０分間オートクレーブにかけた。バイオサイドを所望の濃度で試験管に添加し、それから１００マイクロリットルのラクトバチルス・ファーメンタンス（Lactobacillus fermentans）の一晩ブロスを各試験管に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００８１】
本実施例では、上に記載の方法を用いて一連の試験において、細菌ラクトバチルス・ファーメンタンスに対して様々な比率及び濃度範囲で構成要素Ａと表されるナイシンと、構成要素Ｂと表される２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオールとの組合せを試験することにより相乗効果が実証された。結果を下に示す。
【００８２】
エンドポイントをもたらす量
【表２】
0005828460.tif 000003
【００８３】
相乗効果は、Kull, E.C., Eisman, P.C., Sylwestrwicz, H. D., and Mayer, R. L. 1961, APPLIED MICROBIOLOGY, 9:538-541に記載の方法により実証されたが、ここでは
ＱＡ／Ｑａ＋ＱＢ／Ｑｂが１未満である。
Ｑａ＝評価基準をもたらした、単独で作用する化合物Ａの濃度（百万分率単位で）；
Ｑｂ＝評価基準をもたらした、単独で作用する化合物Ｂの濃度（百万分率単位で）；
ＱＡ＝評価基準をもたらした、混合物における化合物Ａの濃度（百万分率単位で）；
ＱＢ＝評価基準をもたらした、混合物における化合物Ｂの濃度（百万分率単位で）。
【００８４】
ＱＡ／ＱａとＱＢ／Ｑｂとの合計が１より大きい場合、拮抗効果を示し、合計が１と等しい場合、相加効果を示す。この値の合計が１未満である場合、相乗効果が存在する。
【００８５】
上記の表では、示されるように、ナイシンと２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオールとの組合せが様々な組合せで相乗的結果を与えた。この有効性はエタノールを生産する発酵の前、及び／又は発酵中、細菌を制御するのに極めて有用であろう。
【００８６】
実施例３
本実施例では、上に記載の方法を用いて一連の試験において、細菌ラクトバチルス・ファーメンタンスに対して様々な比率及び濃度範囲で構成要素Ａと表されるナイシンと、構成要素Ｂと表される２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミドとの組合せを試験することにより相乗効果が実証された。結果を下記に示す。
【００８７】
エンドポイントをもたらす量
【表３】
0005828460.tif 000004
【００８８】
上記の表では、示されるように、ナイシンと２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミドとの組合せが様々な組合せで相乗的結果を与えた。この有効性はエタノールを生産する発酵の前、及び／又は発酵中、細菌を制御するのに極めて有用であろう。
【００８９】
本出願人は全ての引用文献の全内容を本開示において具体的に援用する。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲又は上側の好ましい値及び下側の好ましい値のリストのいずれかとして挙げられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかに関係なく、任意の上側の範囲限定又は好ましい値と、任意の下側の範囲限定又は好ましい値との任意の対からなる全ての範囲を具体的に開示していることを理解されたい。数値の範囲が本明細書中に列挙される場合、特に指定のない限り、その範囲は、その端点、並びにその範囲内の全ての整数及び小数を含むことを意図する。範囲を規定する場合、本発明の範囲が記載の特定の値に限定されることを意図するものではない。
【００９０】
本発明の他の実施形態は、本明細書及び本明細書中に開示される本発明の実施を考慮することにより、当業者に明らかとなるであろう。本明細書及び実施例は、例示的なものにすぎないとみなされ、本発明の真の範囲及び精神は添付の特許請求の範囲及びその均等範囲によって示されることが意図される。
【符号の説明】
【００９１】
図１
Cellulose/StarchPreparation  セルロース／デンプン調製
Mixing/Cooking(liquefaction)  混合／加熱処理（液化）
enzyme andadditives  酵素及び添加物
water  水
Saccharification  糖化
enzyme  酵素
Fermentation  発酵
carbondioxide  二酸化炭素
biocide  バイオサイド
yeasts  酵母
Distillation  蒸留
ethanol  エタノール
Beer Well  ビールウェル
stillage  蒸留廃液
Filtering  濾過
liquids  液体
solids  固体
Grain Drying  穀物乾燥
図２
Cellulose/StarchPreparation  セルロース／デンプン調製
Mixing/Cooking(liquefaction)  混合／加熱処理（液化）
enzyme andadditives  酵素及び添加物
water  水
Saccharification  糖化
enzyme  酵素
Fermentation  発酵
carbondioxide  二酸化炭素
scrubber  気体洗浄器
biocide  バイオサイド
yeasts  酵母
Distillation  蒸留
ethanol  エタノール
Beer Well  ビールウェル
stillage  蒸留廃液
Filtering  濾過
liquids  液体
solids  固体
Grain Drying  穀物乾燥
vaporcondensing  蒸気凝縮
図３
GRAINRECEIVING  穀物貯留
Grain Storage  穀物貯蔵
Hammer Mill  ハンマーミル
Cook/SlurryTanks  加熱処理／スラリータンク
Jet Cooker  ジェットクッカー
LiquefactionTanks  液化タンク
EthanolFermentation  エタノール発酵
Scrubber  気体洗浄器
Water  水
effluent/recyclewater  廃液／再循環水
Beer Well  ビールウェル
Distillation  蒸留
MolecularSieve  分子篩
Denaturant  変性剤
EthanolStorage  エタノール貯蔵
FUEL ETHANOL  燃料エタノール
CentrifugeGrain Recovery  穀物回収物の遠心分離
Liquids  液体
EvaporationSystem  蒸発システム
Syrup Tanks  シロップタンク
Solids  固体
Grain Drying  穀物乾燥
Vapors  蒸気
Condenser  凝縮器
Recycle Water  再循環水
図４
mass loss  質量損失
time（hrs）  時間（時間）
図５
lactic acidconcentration  乳酸濃度
treatment  処理
図６
ethanol yield（g/g dry corn）  エタノール収率（ｇ／ｇ（乾燥トウモロコシ））
treatment  処理
【図１】
0005828460.tif 000005
【図２】
0005828460.tif 000006
【図３】
0005828460.tif 000007
【図４】
0005828460.tif 000008
【図５】
0005828460.tif 000009
【図６】
0005828460.tif 000010