(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において口の健康を診断するために対象からの歯肉溝滲出液試料を分析する方法であって：
ａ．対象から集めた歯肉溝滲出液試料中の１種類以上の代謝産物のレベルを検出すること、および
ｂ．前記検出された代謝産物のレベルを代謝産物の参照レベルと比較し、それにより差次的レベルを生成すること
を含み、
前記代謝産物の参照レベルは、歯周疾患の参照レベルまたは健康な参照レベルのうちの１種類以上に対応し、
前記差次的レベルは、対象の歯周疾患または健康な口の状態の指標を提供し、
前記検出される代謝産物は、イソロイシンを含む、前記方法。
【請求項２】
対象において歯周疾患を監視するために対象からの歯肉溝滲出液試料を分析する方法であって：
ａ．第１の時点において対象から集められた第１の歯肉溝滲出液試料中で少なくとも１種類の代謝産物の第１のレベルを検出し；
ｂ．第２の時点において前記対象から集められた第２の歯肉溝滲出液試料中で前記代謝産物の第２のレベルを検出し；
ｃ．第１の検出された代謝産物のレベルを第２の検出された代謝産物のレベルと比較する
ことを含み、
第２の検出された代謝産物のレベルの第１の検出された代謝産物のレベルと比較した差次的レベルはその対象の歯周疾患の変化を示し、
前記代謝産物は、イソロイシンを含む、前記方法。
【請求項３】
前記差次的レベルが第２の検出された代謝産物のレベルの第１の検出された代謝産物のレベルと比較した減少に対応し、それがその対象の歯周疾患の減少を示しており、
前記代謝産物が、イソロイシンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第２の代謝産物の前記差次的レベルを決定することをさらに含み、前記第２の代謝産物の差次的レベルが第２の検出された代謝産物のレベルの第１の検出された代謝産物のレベルと比較した増大に対応し、それがその対象の歯周疾患の減少を示しており、
前記第２の代謝産物が、尿酸、アスコルビン酸、およびグルタミンから選択される少なくとも１種類の化合物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳類において歯周疾患を処置するのに有用な試験化合物の効率を決定するために対象からの歯肉溝滲出液試料を分析する方法であって：
試験化合物による処置の後に対象から集められた歯肉溝滲出液試料から処置後の代謝産物レベルを検出することを含み、
処置後の代謝産物レベルと、前記対象の処置前の代謝産物レベル、歯周疾患の参照レベル、および健康な参照レベルから選択される１種類以上との比較に基づいてその試験化合物の効率が決定され、
前記代謝産物は、イソロイシンを含む、前記方法。
【請求項６】
第１の時点において対象から集められた第１の歯肉溝滲出液試料の処置前の代謝産物レベルを検出し；そして
所定のプロトコルに従って口腔に前記試験化合物を含む歯磨剤を適用された前記対象において、その処置後の代謝産物レベルを第２の時点において検出することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試験化合物が、イソロイシンを下方制御するかどうかを決定することをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記試験化合物が、尿酸、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、アスコルビン酸、およびグルタミンから選択される少なくとも１種類の化合物を上方制御するかどうかを決定することをさらに含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周疾患における代謝産物の差次的発現プロフィールおよびこれらの差次的発現プロフィールに基づいて歯周疾患を診断する方法に関する。本発明はさらに、その差次的発現プロフィールに基づいて歯周疾患に関する療法剤の有効性を予測および／または評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周疾患はヒトにおける最も一般的な感染症の１つである(Pihlstrom et al., 2005)。口の組織を冒すことに加えて、歯周疾患は様々な全身性疾患とも関係してきた(Seymour et al., 2007)。その疾患の軽度型である歯肉炎は宿主組織の炎症および歯肉縁の周辺の細菌性プラークの蓄積により特性付けられる。向上した口腔衛生の実行による歯肉炎の処置は疾患の状態をかなり逆行させることができる。しかし、未処置のままにしておくと、歯肉炎はより重篤かつ不可逆的な歯周炎につながる可能性があり、それは歯の周囲の歯槽骨の進行性の喪失を含み、もし未処置のままにしておくと、ゆるみ（ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）およびそれに続く歯の喪失につながる可能性がある。
【０００３】
歯周疾患における宿主組織および細菌の間の複雑な相互作用の大部分は、付着上皮および歯肉溝上皮において起こる。細菌により放出される多くの物質、例えばエンドトキシン、プロテアーゼ、リパーゼおよびシアリダーゼは宿主組織の損傷において重要な役割を果たしていることが示されている(Smalley et al., 1994)。しかし、その疾患が細菌に対する宿主の炎症性応答によっても仲介されていることを示唆する証拠がますます増えている(Van Dyke and Serhan, 2003)。様々な化学的シグナルの活性化の下、宿主組織は細菌と戦うためのある範囲の複雑な応答を編成する。多形核白血球は増大するレベルの活性酸素種（ＲＯＳ）およびタンパク質分解酵素を産生する。この応答の活動過剰は宿主組織の損傷に意図せず寄与する可能性がある。
【０００４】
上皮および細菌性プラークの接触面に、血漿由来の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）がある。ＧＣＦは非侵襲的に集めることができ、部位特異的であるため、それは宿主−細菌相互作用を研究するために理想的な基質（ｍａｔｒｉｘ）である(Embery and Waddington, 1994)。様々な標的化された生化学的分析を用いることで、次のものを含む多くの歯周疾患に関する可能性のあるＧＣＦマーカーが提案されてきた：宿主および細菌の酵素、エンドトキシン、核酸、タンパク質、炭水化物および脂質、コラーゲンおよび骨からの分解産物、免疫グロブリン、サイトカインならびにホルモン(Embery and Waddington, 1994; Prapulla et al., 2007; Karthikeyan and Pradeep, 2007; Akalin et al., 2007; Pradeep et al., 2007)。しかし、公表された情報の豊富さにもかかわらず、宿主−細菌相互作用の広い範囲および細胞の生化学的代謝に基づく疾患の進行の機構的詳細はまだ明確さを欠いている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pihlstrom et al., 2005
【非特許文献２】Seymour et al., 2007
【非特許文献３】Smalley et al., 1994
【非特許文献４】Van Dyke and Serhan, 2003
【非特許文献５】Embery and Waddington, 1994
【非特許文献６】Prapulla et al., 2007
【非特許文献７】Karthikeyan and Pradeep, 2007
【非特許文献８】Akalin et al., 2007
【非特許文献９】Pradeep et al., 2007
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、対象において口の健康を診断する方法であって、その対象から歯肉溝滲出液試料を集め、その歯肉溝滲出液試料中の１種類以上の代謝産物のレベルを検出する方法を提供する。対象は検出された代謝産物のレベルに基づいて歯周疾患または健康な口の状態を有すると診断される。
【０００７】
本発明は、対象において口の健康を診断するための方法であって、その対象から歯肉溝滲出液試料を集め、その歯肉溝滲出液試料中の１種類以上の代謝産物のレベルを検出する方法も開示する。その歯肉溝滲出液試料中の検出された代謝産物のレベルを代謝産物の参照レベルと比較し、それにより差次的レベルを生成する。その代謝産物の参照レベルは次のものの１種類以上に対応する：歯周の参照レベルまたは健康な参照レベル。１態様において、検出された代謝産物および歯周の参照レベルの間の差次的レベルは歯周疾患と相関する。別の態様において、検出された代謝産物および健康な参照レベルの間の差次的レベルは健康な口の状態と相関する。
【０００８】
そのような態様において、その検出される代謝産物は以下のものから選択されてよい：アミノ酸代謝により生じる化合物、尿素サイクルにおいて生じる化合物；グルタチオン変換において生じる化合物；脂質代謝において生じる化合物；炭水化物代謝において生じる化合物；核酸代謝により生じる化合物；ビタミン類；および補因子。
【０００９】
本発明は、標準的なケアプロトコルに従う際の歯周疾患のための療法剤を用いることに対する対象の応答、例えば応答者または非応答者を予測するための方法も提供する。試験対象から集めた歯肉溝滲出液試料の代謝産物プロフィールを生成し、ここでその代謝産物プロフィールは代謝産物のアイデンティティおよび代謝産物のレベルを含む。その試験対象の代謝産物プロフィールを参照代謝産物プロフィールと比較する。その参照代謝産物プロフィールには、次のものの１種類以上が含まれていてよい：参照応答者代謝産物プロフィールおよび参照非応答者代謝産物プロフィール。その比較の結果を、その試験対象を療法剤に対する応答者または非応答者として識別するために用いることができる。その参照代謝産物プロフィールは、歯周疾患の退行または歯周疾患の予防を有する、標準的な療法剤で利益を得た対象から得ることができる。この方法は、試験対象が試験療法剤（単数または複数）の臨床試験に参加するのに適した対象であるかどうかを決定するために用いることができるであろう。
【００１０】
本発明は、標準的な非ケア（ｎｏｎ−ｃａｒｅ）プロトコルに従う際の歯周疾患の発現に対する試験対象の応答、例えば応答者または非応答者を予測するための方法にも関係する。その対象から集めた歯肉溝滲出液試料の代謝産物プロフィールを生成し、ここでその代謝産物プロフィールは代謝産物のアイデンティティおよび代謝産物のレベルを含む。その試験対象の代謝産物プロフィールを参照代謝産物プロフィールと比較し、ここでその参照代謝産物プロフィールは参照応答者の対象および参照非応答者の対象から生成される。その参照代謝産物プロフィールは参照代謝産物のアイデンティティおよび参照代謝産物のレベルを含む。その比較の結果を、その試験対象を歯周疾患の発現に対する応答者または非応答者として識別するために用いることができる。
【００１１】
本発明はさらに、使用者にその使用者の口の健康状態の指標を提供することができる口腔ケア試験キットを提供する。そのキットは１種類以上の歯肉炎溝滲出液（ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ  ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）収集細片（ｓｔｒｉｐｓ）およびその対象の口の健康状態の診断法を含んでいてよい。その歯肉炎溝滲出液収集細片は、歯肉溝滲出液試料を集めるために、および歯肉溝滲出液試料中に含まれる代謝産物の回収のために用いることができる。対象の口の健康の診断は、この発明の方法に基づいていてよい。
【００１２】
本発明はさらに、歯磨組成物を提供する。その組成物は、有効量の代謝産物療法剤を含んでいてよい。その療法剤は少なくとも１ヶ月の期間にわたって代謝産物レベルの変化をもたらし、ここでその代謝産物レベルの変化は対照歯磨組成物により影響を及ぼされる代謝産物参照レベルの対応する変化よりも大きい。
【００１３】
さらに別の観点に従って、本発明は代謝産物を示す歯磨剤（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｄｅｎｔｉｆｒｉｃｅ）およびそれの使用の方法を提供し、ここでその歯磨剤は代謝産物を示す組成物を含み、それは歯周疾患と関係する代謝産物および代謝産物レベルへの曝露の際に使用者に識別可能な指標を提供する。１態様において、その使用者に識別可能な指標は歯磨剤の色の変化に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
全体において用いられるように、範囲はその範囲内にあるそれぞれおよび全ての値を記述するための略記として用いられる。範囲内のあらゆる値は、範囲の末端として選択することができる。加えて、本明細書において引用される全ての参考文献をそのまま本明細書に援用する。
【００１５】
定義：
本明細書で用いられる用語である、代謝産物の“差次的レベル”は、あらゆる増大した、または減少したレベルを含んでいてよい。１態様において、差次的レベルは少なくとも５％；少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも３０％；少なくとも４０％；少なくとも５０％；少なくとも６０％；少なくとも７０％；少なくとも８０％；少なくとも９０％；少なくとも１００％；少なくとも１１０％；少なくとも１２０％；少なくとも１３０％；少なくとも１４０％；少なくとも１５０％；またはより多く増大したレベルを意味する。別の態様において、差次的レベルは少なくとも５％；少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも３０％；少なくとも４０％；少なくとも５０％；少なくとも６０％；少なくとも７０％；少なくとも８０％；少なくとも９０％；少なくとも１００％（すなわちその代謝産物は存在しない）減少したレベルを意味する。代謝産物は、統計学的に有意である差次的レベルで発現している（すなわち、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定、ＷｅｌｃｈのＴ検定またはＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定のいずれかを用いて決定された、０．０５未満のｐ値および／または０．１０未満のｑ値）。
【００１６】
本明細書で用いられる“歯肉溝滲出液”は、支持線維組織を有し、顎の歯を支える境界を覆う粘膜である歯茎を含む歯肉の周辺で見つかる流体を意味する。
本明細書で用いられる“歯肉炎”は、歯茎および歯の間の小さな間隙に蓄積する細菌性のプラークにより、ならびに歯の上に形成される歯石により引き起こされる歯茎の刺激を意味する。
【００１７】
本明細書で用いられる“健康な口の状態”は、歯肉炎および／または歯周疾患が存在しないことを意味する。
本明細書で用いられる用語である、１種類以上の代謝産物の“レベル”は、試料中の代謝産物の絶対的または相対的な量または濃度を意味する。
【００１８】
本明細書で用いられる用語“代謝産物”は、代謝により生成される、または個々の代謝プロセスに必要な、もしくはそれに参加しているあらゆる物質を意味する。その用語は大きな高分子、例えば大きなタンパク質（例えば２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００を超える分子量を有するタンパク質）；大きな核酸（例えば２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００を超える分子量を有する核酸）；または大きな多糖類（例えば２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００を超える分子量を有する多糖類）を含まない。代謝産物という用語には、シグナル伝達分子および食物に由来するエネルギーを利用可能な形に変換する化学反応における中間体が含まれ、それには次のものが含まれるがそれらに限定されない：糖類、脂肪酸類、アミノ酸類、ヌクレオチド類、抗酸化物質、ビタミン類、補因子、脂質類、細胞のプロセスの間に形成される中間体、および他の小分子。
【００１９】
本明細書で用いられる“歯周疾患”は、歯肉、または歯茎組織；セメント質、または歯の根の外側の層；歯槽骨、またはその中に歯が据えつけられている（ａｎｃｈｏｒｅｄ）骨性窩（ｂｏｎｙ  ｓｏｃｋｅｔｓ）；ならびにセメント質および歯槽骨の間を通っている結合組織線維である歯周靭帯を含む歯周組織の炎症を意味し、歯肉炎を含む。
【００２０】
本明細書で用いられる用語である、代謝産物の“参照レベル”は、特定の疾患状態、口の状態、表現型、またはそれらの欠如、および疾患状態、表現型、またはそれらの欠如の組み合わせを示す代謝産物のレベルを意味する。１態様において、代謝産物の歯周の参照レベルは、対象における歯周疾患の陽性の診断結果を示す代謝産物のレベルを意味する。別の態様において、代謝産物の“健康な参照レベル”は、対象における健康な口の状態の陽性の診断結果を示す代謝産物のレベルを意味する。
【００２１】
１態様において、代謝産物の“参照レベル”は、次のものの１種類以上であってよい：その代謝産物の絶対的または相対的な量または濃度；その代謝産物の存在または不在；その代謝産物の量または濃度の範囲；その代謝産物の最小および／または最大の量または濃度；その代謝産物の平均の量または濃度；および／またはその代謝産物の量または濃度の中央値。別の態様において、代謝産物の組み合わせに関する“参照レベル”は、２種類以上の代謝産物の絶対的または相対的な量または濃度の互いに関する比率であってもよい。特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に関する代謝産物の適切な陽性および陰性の参照レベルは、１人以上の適切な対象において望まれる代謝産物のレベルを測定することにより決定されてよく、そのような参照レベルは特定の対象の集団に合わせてよい（例えば、参照レベルは、特定の年齢の対象からの試料中の代謝産物のレベルと特定の年齢のグループにおける特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に関する参照レベルの間で比較をすることができるように年齢を合わせてよい）。別の態様において、その参照レベルは生物学的試料中の代謝産物のレベルを測定するために用いられる特定の技法（例えばＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ等）に合わせることができ、ここでその代謝産物のレベルは用いられる特定の技法に基づいて異なっていてよい。
【００２２】
別のそのような態様において、“参照代謝産物”は、次のものから選択される少なくとも１種類の化合物を含んでいてよい：アミノ酸代謝により生じる化合物、尿素サイクルにおいて生じる化合物；グルタチオン変換において生じる化合物；脂質代謝において生じる化合物；炭水化物代謝において生じる化合物；核酸代謝により生じる化合物；ビタミン類；および補因子。別の態様において、その“参照レベル”は、表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上を含んでいてよい。さらに別の態様において、その“参照レベル”は、次の化合物の１種類以上を含んでいてよい：イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、グアノシン、グアニン、ロイシン、イソロイシン、リシン（ｌｙｓｉｅ）、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニル酢酸、α−ヒドロキシイソカプロン酸（α−ｈｙｄｒｏｘｙｉｏｓｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、５−アミノ吉草酸、コリン、グリセロール−３−リン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、尿酸、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、アスコルビン酸、およびグルタミン。さらになお別の態様において、その“参照代謝産物”は表５においてリストされている未知の化合物の１種類以上を含んでいてよい。
【００２３】
本明細書で用いられる用語“試料”または“生物学的試料”は、対象から分離された生物学的物質を意味する。その生物学的試料は、望まれる代謝産物を検出するのに適したあらゆる生物学的物質を含んでいてよく、その対象からの細胞性および／または非細胞性物質を含んでいてよい。１態様において、その試料はあらゆる適切な歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）から分離することができる。
【００２４】
本明細書は、歯周疾患における代謝産物の異なる発現プロフィール、およびこれらの差次的発現プロフィールに基づく方法に関する。
Ｉ．差次的発現プロフィール
Ａ．代謝産物
本明細書で記述される歯周疾患の代謝産物は、メタボロミクスプロファイリングの技法を用いて発見された。そのようなメタボロミクスプロファイリングの技法は、下記で述べる実施例において、ならびに米国特許第７，００５，２５５号および米国特許出願一連番号１１／３５７，７３２、１０／６９５，２６５（公開番号２００５／００１４１３２）、１１／３０１，０７７（公開番号２００６／０１３４６７６）、１１／３０１，０７８（公開番号２００６／０１３４６７７）、１１／３０１，０７９（公開番号２００６／０１３４６７８）、および１１／４０５，０３３においてより詳細に記述されており、その内容全体を本明細書に援用する。
【００２５】
表１〜５は、健康な口の状態または歯周疾患と相関する一連の代謝産物を表にしている。
その代謝産物および代謝産物では無い化合物の一部のアイデンティティはこの時点では未知であるが、その“名前の無い”化合物はそのような同定を可能にする分析的技法により十分に特性付けられているため、そのようなアイデンティティは、対象からの生物学的試料中の代謝産物または代謝産物では無い化合物の同定には必要では無い。全てのそのような“名前の無い”化合物の分析的特性付けを表５においてリストする。そのような“名前の無い”代謝産物および代謝産物では無い化合物は、本明細書では“Ｄｅｎｔａｌ”の後に特定の化合物番号を付ける命名法を用いて指定する。表５は、健康な口の状態または歯周疾患と相関する未知の代謝産物のグループをリストしている。
【００２６】
Ｂ．発現プロフィール
概して、歯周疾患を有すると診断されたヒトの対象から、および健康なヒトの対象からの生物学的試料に関して代謝産物プロフィールを決定する。歯周疾患の対象からの生物学的試料に関する発現プロフィールを、健康な対象から集められた生物学的試料に関する発現プロフィールと比較する。統計学的に有意であるレベルで差次的に発現している分子または化合物を含め、疾患では無い試料と比較した場合に歯周疾患の試料の発現プロフィールにおいて差次的に発現している分子または化合物を同定する。
【００２７】
実験の設計、代謝産物発現プロファイリングのプラットフォーム、統計学的方法および分析、ならびに結果を実施例においてさらに詳細に論じる。
ＩＩ．代謝産物プロフィールに基づく方法
一部の態様において、本発明は、以下のものを含むがそれらに限定されない、歯周疾患に関する代謝産物プロフィールに基づく分析および診断法に関する：歯周疾患の診断のための方法、歯周疾患の進行／退行を監視する方法、歯周疾患を処置するための組成物の有効性を評価する方法、歯周疾患を処置する方法、および同様のもの。１態様において、その代謝産物プロフィールは試料の歯肉溝滲出液から生成されてよい。
【００２８】
Ａ．口の健康または歯周疾患の診断のための方法
本発明の１観点は、歯周疾患の発現の診断に関する。１態様において、その診断は疾患の発現の臨床徴候の出現の前になされてよい。１態様において、本発明は、対象において口の健康を診断するための方法であって、その対象から歯肉溝滲出液試料を集め、その歯肉溝滲出液試料中の１種類以上の代謝産物のレベルを検出する方法を提供する。その対象は、検出された代謝産物（単数または複数）のレベルに基づいて歯周疾患または健康な口の状態を有すると診断される。１つのそのような態様において、その検出される代謝産物は以下のものから選択される少なくとも１種類の化合物である：アミノ酸代謝により生じる化合物、尿素サイクルにおいて生じる化合物；グルタチオン変換において生じる化合物；脂質代謝において生じる化合物；炭水化物代謝において生じる化合物；核酸代謝により生じる化合物；ビタミン類；および補因子。別の態様において、その検出される代謝産物は表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上を含んでいてよい。１態様において、歯周疾患の診断は次の化合物の１種類以上の上方制御に対応する：イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、グアノシン、グアニン、ロイシン、イソロイシン、リシン（ｌｙｓｉｅ）、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニル酢酸、α−ヒドロキシイソカプロン酸（α−ｈｙｄｒｏｘｙｉｏｓｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、５−アミノ吉草酸、コリン、グリセロール−３−リン酸、およびＮ−アセチルノイラミン酸。別の態様において、歯周疾患の診断は次の化合物の１種類以上の下方制御に対応する：尿酸、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、アスコルビン酸、およびグルタミン。
【００２９】
別の態様において、本発明は、対象において口の健康を診断するための方法であって、その対象から歯肉溝滲出液試料を集め、その歯肉溝滲出液試料中の１種類以上の代謝産物のレベルを検出する方法を開示する。その歯肉溝滲出液試料中の検出された代謝産物のレベルを代謝産物の参照レベルと比較し、ここでその代謝産物の参照レベルは次のものの１種類以上と相関する：歯周疾患または健康な口の状態。１つのそのような態様において、その検出された代謝産物のレベルを次のもの：歯周の参照レベル；および健康な参照レベルの１種類以上と比較し、その対象が歯周疾患を有するか、または健康な口の状態を有するかを診断するのを助ける、またはそれを診断する。１態様において、その１種類以上の代謝産物の検出されたレベルを単純な比較（例えば人手による比較）を用いて比較してよい。別の態様において、その１種類以上の代謝産物の検出されたレベルを１種類以上の統計学的分析（例えばｔ検定、Ｗｅｌｃｈのｔ検定またはＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定、ランダムフォレスト）を用いて比較することもできる。
【００３０】
１つのそのような態様において、その試料は対象の口腔から得られた歯肉溝滲出液であることができる。１つのそのような態様において、その検出される代謝産物は次のものから選択される化合物であってよい：アミノ酸代謝により生じる化合物、尿素サイクルにおいて生じる化合物；グルタチオン変換において生じる化合物；脂質代謝において生じる化合物；炭水化物代謝において生じる化合物；核酸代謝により生じる化合物；ビタミン類；および補因子。別の態様において、その代謝産物は表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上を含んでいてよい。
【００３１】
別の態様において、その比較の段階は、その検出された代謝産物のレベルを歯周の参照レベルまたは健康な参照レベルと比較することを含んでいてよい。１つのそのような態様において、歯周の参照レベルに対応する試料中の１種類以上の代謝産物の検出されたレベルは、次のものの１種類以上であってよい：歯周の参照レベルと同じである検出されたレベル；歯周の参照レベルと実質的に同じである検出されたレベル；歯周の参照レベルの最小値および／または最大値より上および／または下である検出されたレベル；および／または、歯周の参照レベルの範囲内である検出されたレベル。そのような検出されたレベルは、その対象における歯周疾患の診断結果を示している可能性がある。別のそのような態様において、健康な参照レベルに対応する試料中の１種類以上の代謝産物の検出されたレベルは、次のものの１種類以上であってよい：健康な参照レベルと同じである検出されたレベル；健康な参照レベルと実質的に同じである検出されたレベル；健康な参照レベルの最小値および／または最大値より上および／または下である検出されたレベル；および／または、健康な参照レベルの範囲内である検出されたレベル。そのようなレベルは、その対象における健康な口の状態の診断結果を示している可能性がある。
【００３２】
１態様において、試験対象が歯周の参照レベルと比較して（特に統計学的に有意であるレベルで）差次的に発現している１種類以上の代謝産物の検出されたレベルは、対象における歯周疾患の診断結果を示している可能性がある。別の態様において、試験対象が健康な参照レベルと比較して（特に統計学的に有意であるレベルで）差次的に発現している１種類以上の代謝産物の検出されたレベルは、対象における健康な口の状態の診断結果を示している可能性がある。
【００３３】
１態様において、検出される代謝産物の組み合わせのレベルの決定は：歯周疾患または健康な口の状態の診断においてより大きな感度および特異性を可能にする；歯周疾患または健康な口の状態の診断を助ける；ならびに、類似の、または重複する代謝産物を有する可能性のある歯周疾患および健康な口の状態の間のよりよい識別を可能にすることができる。１態様において、生物学的試料中の特定の代謝産物（および代謝産物では無い化合物）の検出されるレベルの比率は：歯周疾患または健康な口の状態の診断においてより大きな感度および特異性を可能にする；歯周の口の状態の診断を助ける；ならびに、類似の、または重複する代謝産物を有する可能性のある健康な口の状態、歯肉炎の口の状態または歯周疾患の、互いからの、および他の疾患からのよりよい識別を可能にすることができる。
【００３４】
Ｂ．臨床試験に関する対象の識別のための方法
本発明は、歯周疾患に関して療法剤を用いることまたは歯周疾患に関して療法剤を用いないことに対する対象の応答、例えば応答者または非応答者を予測するための方法にも関係する。
【００３５】
本明細書で用いられる“応答者”は、次のことを示す対象を意味する：歯周疾患と相関する代謝産物レベルの減少；歯周疾患と相関する代謝産物レベルの増大；健康な口の状態と相関する代謝産物レベルの減少；および健康な口の状態と相関する代謝産物レベルの増大。
【００３６】
本明細書で用いられる“非応答者”は、歯周疾患または健康な口の状態と相関する代謝産物レベルの変化を示さない対象を意味する。
１．療法剤に対する応答者または非応答者を識別するための方法
本発明の１観点は、対象が歯周疾患の処置のための試験療法剤（単数または複数）の臨床試験に参加するのに適しているかどうかを決定するために用いることができる方法に関する。試験療法剤に関する臨床試験の過程の間に、一部の対象はその試験の期間の間試験プロトコルに従う際にその試験療法剤への応答の証拠を示さない可能性があり、これがすなわち非応答者である。例えば、その対象の口の試験は症状、例えば：腫大した、赤い、または出血している歯茎；後退している歯肉線；緩んだ、または分離した歯、口臭等の変化を示さない可能性がある。非応答者の対象は、その非応答者の対象のその試験への参加からはたとえ得られるとしても限られた情報しか得られない可能性があるため、臨床試験における望ましい参加者では無い。臨床試験の開始時に、または臨床試験の初期段階の間に非応答者を識別し、その非応答者の対象を試験対象のグループから排除するのが好都合であろう。
【００３７】
下記で記述する本発明の方法は、療法剤に対する応答者の対象および非応答者の対象の識別を提供する。１態様において、その方法は、試験プロトコルに従う際に試験対象から集められた歯肉溝滲出液試料の代謝産物プロフィールを生成し、その試験対象の代謝産物プロフィールを参照代謝産物プロフィールと比較することを含み、ここでその代謝産物プロフィールには代謝産物のアイデンティティおよび代謝産物のレベルが含まれる。その参照代謝産物プロフィールは、次のものの１種類以上を含んでいてよい：参照応答者代謝産物プロフィールおよび参照非応答者代謝産物プロフィール。その比較の結果を、その試験対象を療法剤に対する応答者または非応答者として識別するために用いることができる。１態様において、その比較は単純な比較（例えば人手による比較）を用いてなされてよい。別の態様において、その比較は１種類以上の統計学的分析（例えばｔ検定、ＷｅｌｃｈのＴ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定、ランダムフォレスト）を用いてなされてよい。
【００３８】
１つのそのような態様において、参照応答者代謝産物プロフィールは、標準的なケアプロトコルに従ってその標準的なケアプロトコルの日数の間標準的な療法剤を含む歯磨剤を用いた際に歯周疾患の退行、または歯周疾患の予防を示した１人以上の参照応答者の対象の歯肉溝滲出液試料から生成することができる。別の態様において、その参照非応答者代謝産物プロフィールは、標準的なケアプロトコルに従ってその標準的なケアプロトコルの日数の間標準的な療法剤を含む歯磨剤を用いた際に歯周疾患の変化を示さなかった１人以上の参照非応答者の対象の歯肉溝滲出液試料から生成することができる。その標準的なケアプロトコルは、ブラッシングの期間、１日あたりの回数、日数、他の口腔ケア製品の使用等の指示を含んでいてよい。
【００３９】
その参照応答者の対象および／または参照非応答者の対象は、次の内の１種類以上であってよい：歯科の専門家による臨床評価に基づいて健康な口の状態を有すると識別された参照応答者の対象および／または参照非応答者の対象；歯科の専門家による臨床評価に基づいて歯肉炎を有すると識別された参照応答者の対象および／または参照非応答者の対象；ならびに、歯科の専門家による臨床評価に基づいて歯周疾患を有すると識別された参照応答者の対象および／または参照非応答者の対象。
【００４０】
１態様において、その標準的な療法剤は、参照対象に関して次のものから選択される少なくとも１つのメンバーを下方制御する：イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、グアノシン、グアニン、ロイシン、イソロイシン、リシン（ｌｙｓｉｅ）、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニル酢酸、α−ヒドロキシイソカプロン酸（α−ｈｙｄｒｏｘｙｉｏｓｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、５−アミノ吉草酸、コリン、グリセロール−３−リン酸、およびＮ−アセチルノイラミン酸。別の態様において、その標準的な療法剤は、次のものから選択される少なくとも１つのメンバーを上方制御する：尿酸、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、アスコルビン酸、およびグルタミン。さらに別の態様において、その標準的な療法剤は、表５においてリストされている未知のものの少なくとも１つのメンバーを上方制御または下方制御する。
【００４１】
１態様において、その試験対象の代謝産物プロフィールは、標準的なケアプロトコルを開始する前に単一の収集工程でその試験対象から集めることができる１個以上の歯肉溝滲出液試料から生成することができる。別の態様において、その試験対象の代謝産物プロフィールは、その試験対象が所定の日数の間標準的なケアプロトコルに従った後に単一の収集工程でその試験対象から得ることができる１個以上の歯肉溝滲出液試料から集めることができる。１態様において、その試験対象の代謝産物プロフィールは多数の収集工程でその試験対象から集めることができる１個以上の歯肉溝滲出液試料から決定することができ、それぞれの収集工程はその試験対象が所定の日数の間標準的なケアプロトコルに従った後の異なる日において行われる。
【００４２】
１つのそのような態様において、その試験対象の代謝産物のアイデンティティは次のものから選択される化合物に対応している可能性がある：アミノ酸代謝により生じる化合物、尿素サイクルにおいて生じる化合物；グルタチオン変換において生じる化合物；脂質代謝において生じる化合物；炭水化物代謝において生じる化合物；核酸代謝により生じる化合物；ビタミン類；および補因子。別の態様において、その試験対象の代謝産物のアイデンティティは表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上を含んでいてよい。
【００４３】
別の態様において、その比較の段階は、その試験対象の代謝産物のレベルを参照応答者のレベルおよび参照非応答者のレベルと比較することを含んでいてよい。１つのそのような態様において、参照応答者の代謝産物レベルに対応している可能性のあるその試験対象の代謝産物レベルは、次のものの１種類以上である可能性がある：参照応答者の代謝産物レベルと同じである代謝産物レベル；参照応答者の代謝産物レベルと実質的に同じである代謝産物レベル；参照応答者の代謝産物レベルの最小値および／または最大値より上および／または下である代謝産物レベル；および／または、参照応答者の代謝産物レベルの範囲内である代謝産物レベル。そのような代謝産物レベルは、その試験対象が療法剤に対する応答者であるとの識別を示している可能性がある。別のそのような態様において、参照非応答者の代謝産物レベルに対応している可能性のあるその試験対象の代謝産物レベルは、次のものの１種類以上である可能性がある：参照非応答者の代謝産物レベルと同じである代謝産物レベル；参照非応答者の代謝産物レベルと実質的に同じである代謝産物レベル；参照非応答者の代謝産物レベルの最小値および／または最大値より上および／または下である代謝産物レベル；および／または、参照非応答者の代謝産物レベルの範囲内である代謝産物レベル。そのようなレベルは、その試験対象が療法剤に対する非応答者であるとの識別の診断結果を示している可能性がある。
【００４４】
１態様において、その試験対象の、応答者の参照レベルと比較して（特に統計学的に有意であるレベルで）差次的に発現しているその１種類以上の代謝産物の代謝産物レベルは、対象が療法剤に対する応答者であるとの識別を示している可能性がある。別の態様において、その試験対象の、非応答者の参照レベルと比較して（特に統計学的に有意であるレベルで）差次的に発現しているその１種類以上の代謝産物の代謝産物レベルは、対象が療法剤に対する非応答者であるとの識別を示している可能性がある。
【００４５】
２．歯周疾患の発現に対する応答者または非応答者を同定するための方法
１観点に従って、本発明は、対象が歯周疾患の処置のための試験療法剤（単数または複数）の臨床試験に参加するのに適しているかどうかを決定するために用いることができる方法を提供し、ここでその対象は歯周疾患の発現の影響を受けやすい。一部の場合において、試験療法剤の臨床試験はまず対象の口腔中の歯の１個以上の部分において歯肉炎を生じさせることにより実施されてよい。これは、歯の１個以上の部分の上に、歯の遮蔽された部分（単数または複数）がいかなる形の口腔衛生も受けないように遮蔽物を設置する非ケアプロトコルを用いることにより成し遂げることができる。歯肉炎の発現の後、その対象は歯肉炎を処置するためのケアプロトコルに従って試験療法剤を用いることができる。一部の場合において、対象は非ケアプロトコルの期間の間歯肉炎の証拠を示さない可能性がある。
【００４６】
本発明の１態様において、方法は、標準的な非ケアプロトコルに従っている間に試験対象から集められた歯肉溝滲出液試料の代謝産物プロフィールを生成し、その試験対象の代謝産物プロフィールを参照代謝産物プロフィールと比較することを含み、ここでその代謝産物プロフィールには代謝産物のアイデンティティおよび代謝産物のレベルが含まれる。その参照代謝産物プロフィールは、次のものの１種類以上を含んでいてよい：参照応答者代謝産物プロフィールおよび参照非応答者代謝産物プロフィール。その比較の結果を、その試験対象を歯周疾患の発現に対する応答者または非応答者として識別するために用いることができる。１態様において、その比較は単純な比較（例えば人手による比較）を用いてなされてよい。別の態様において、その比較は１種類以上の統計学的分析（例えばｔ検定、ＷｅｌｃｈのＴ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定、ランダムフォレスト）を用いてなされてよい。
【００４７】
１つのそのような態様において、参照応答者代謝産物プロフィールは、そのプロトコルの期間の間非ケアの標準的なプロトコルに従って歯周疾患を発現した１人以上の参照応答者の対象の歯肉溝滲出液試料から得ることができる。別のそのような態様において、その参照非応答者代謝産物プロフィールは、標準的な非ケアプロトコルの期間の間に歯周疾患を発現しなかった１人以上の参照非応答者の対象の歯肉溝滲出液試料から得ることができる。その標準的な非口腔ケアプロトコルは、次の内の１種類以上を含んでいてよい：所定の日数ブラッシングを行わないこと、歯の１個以上の部分の上に遮蔽物を装着し、一方で歯の他の部分に関してブラッシングの期間、１日あたりのブラッシングの回数、日数、および機械的な口腔衛生装置の使用を記述したプロトコルに従ってケアを行うこと。
【００４８】
１態様において、その標準的な非ケアプロトコルは、その参照対象に関して次のものから選択される少なくとも１つのメンバーを上方制御する：イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、グアノシン、グアニン、ロイシン、イソロイシン、リシン（ｌｙｓｉｅ）、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニル酢酸、α−ヒドロキシイソカプロン酸（α−ｈｙｄｒｏｘｙｉｏｓｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、５−アミノ吉草酸、コリン、グリセロール−３−リン酸、およびＮ−アセチルノイラミン酸。別の態様において、その標準的な非ケアプロトコルは、その参照対象に関して次のものから選択される少なくとも１つのメンバーを下方制御する：尿酸、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、アスコルビン酸、およびグルタミン。さらに別の態様において、その標準的な療法剤は、表５においてリストされている未知のものの少なくとも１つのメンバーを上方制御または下方制御する。
【００４９】
１態様において、その試験対象の代謝産物プロフィールは、標準的な非ケアプロトコルを開始する前に単一の収集工程でその試験対象から得ることができる１個以上の歯肉溝滲出液試料から生成することができる。別の態様において、その試験対象の代謝産物プロフィールは、その試験対象が所定の日数の間標準的な非ケアプロトコルに従った後に単一の収集工程でその試験対象から得ることができる１個以上の歯肉溝滲出液試料から生成することができる。１態様において、その試験対象の代謝産物プロフィールは複数の収集工程でその試験対象から得ることができる１個以上の歯肉溝滲出液試料から決定することができ、それぞれの収集工程はその試験対象が所定の日数の間標準的な非ケアプロトコルに従った後の異なる日において行われる。
【００５０】
１つのそのような態様において、その試験対象の代謝産物のアイデンティティは次のものから選択される化合物に対応している可能性がある：アミノ酸代謝により生じる化合物、尿素サイクルにおいて生じる化合物；グルタチオン変換において生じる化合物；脂質代謝において生じる化合物；炭水化物代謝において生じる化合物；核酸代謝により生じる化合物；ビタミン類；および補因子。別の態様において、その試験対象の代謝産物のアイデンティティは表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上を含んでいてよい。
【００５１】
別の態様において、その比較の段階は、その代謝産物のレベルを参照応答者のレベルおよび参照非応答者のレベルと比較することを含んでいてよい。１つのそのような態様において、参照応答者の代謝産物レベルに対応している可能性のあるその試験対象の代謝産物レベルは、次のものの１種類以上である可能性がある：参照応答者の代謝産物レベルと同じである代謝産物レベル；参照応答者の代謝産物レベルと実質的に同じである代謝産物レベル；参照応答者の代謝産物レベルの最小値および／または最大値より上および／または下である代謝産物レベル；および／または、参照応答者の代謝産物レベルの範囲内である代謝産物レベル。そのような代謝産物レベルは、その試験対象が非ケアプロトコル、例えば歯肉炎および／または歯周疾患の発現に対する応答者であるとの識別を示している可能性がある。別のそのような態様において、参照非応答者の代謝産物レベルに対応している可能性のあるその試験対象の代謝産物レベルは、次のものの１種類以上である可能性がある：参照非応答者の代謝産物レベルと同じである代謝産物レベル；参照非応答者の代謝産物レベルと実質的に同じである代謝産物レベル；参照非応答者の代謝産物レベルの最小値および／または最大値より上および／または下である代謝産物レベル；および／または、参照非応答者の代謝産物レベルの範囲内である代謝産物レベル。そのようなレベルは、その試験対象が非ケアプロトコルに対する非応答者であり、例えば歯肉炎および／または歯周疾患を発現しないとの識別の診断結果を示している可能性がある。
【００５２】
１態様において、その試験対象が応答者の参照レベルと比較して（特に統計学的に有意であるレベルで）差次的に発現しているその１種類以上の代謝産物の代謝産物レベルは、対象が非ケアプロトコルに対する応答者であるとの識別を示している可能性がある。別の態様において、その試験対象が非応答者の参照レベルと比較して（特に統計学的に有意であるレベルで）差次的に発現しているその１種類以上の代謝産物の代謝産物レベルは、対象が非ケアプロトコルに対する非応答者であるとの識別を示している可能性がある。
【００５３】
Ｃ．歯磨剤における試験化合物の効率を評価するための方法
本発明は、哺乳類において歯周疾患の発現を処置するのに有用な試験化合物の効率を決定する方法も提供する。１態様において、その方法は、試験化合物による処置の後に対象から集められた歯肉溝滲出液試料から処置後の代謝産物レベルを検出することを含む。その処置後の代謝産物レベルは、次のものの１種類以上と比較されてよい：その対象の処置前の代謝産物レベル；歯周の参照レベルおよび健康な参照レベル。１つのそのような態様において、その方法は、その試験化合物が次のものから選択される少なくとも１つのメンバーを下方制御するかどうかを決定する段階を含んでいてよい：イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、グアノシン、グアニン、ロイシン、イソロイシン、リシン（ｌｙｓｉｅ）、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニル酢酸、α−ヒドロキシイソカプロン酸（α−ｈｙｄｒｏｘｙｉｏｓｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、５−アミノ吉草酸、コリン、グリセロール−３−リン酸、およびＮ−アセチルノイラミン酸。別のそのような態様において、その方法は、その試験化合物が次のものから選択される少なくとも１つのメンバーを上方制御するかどうかを決定する段階を含んでいてよい：尿酸、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、アスコルビン酸、およびグルタミン。さらに別の態様において、その方法は、その試験化合物が表５においてリストされている未知のものの少なくとも１つのメンバーを上方制御または下方制御するかどうかを決定する段階を含んでいてよい。
【００５４】
別の態様において、その処置前の代謝産物レベルは、第１の時点においてその対象から集められた第１の歯肉溝滲出液試料の処置前の代謝産物レベルを検出することにより得ることができる。その試験化合物を含む歯磨剤は、所定のプロトコルに従ってその対象の口腔に適用することができる。その歯磨剤を適用した後の第２の時点において、第２の歯肉溝滲出液試料の処置後の代謝産物レベルを検出する。その処置前の代謝産物レベルをその処置後の代謝産物レベルと比較することができる。その比較に基づいて、その試験化合物の効率を決定することができる。１つのそのような態様において、処置後の代謝産物レベルの処置前の代謝産物レベルと比較した減少は、その試験化合物が歯周疾患を処置する有効性を有することを示している可能性がある。別のそのような態様において、処置後の代謝産物レベルの処置前の代謝産物レベルと比較した増大は、その試験化合物が歯周疾患を処置する有効性を有することを示している可能性がある。さらに別のそのような態様において、処置後の代謝産物レベルの減少または増大が無いことは、その試験化合物が歯周疾患を処置する有効性を欠いていることを示している可能性がある。
【００５５】
別の態様において、その処置後の代謝産物レベルを次のものの１種類以上と比較することができる：歯周疾患の参照レベルおよび健康な口の状態の参照レベル。１態様において、その比較は単純な比較（例えば人手による比較）を用いてなされてよい。別の態様において、その比較は１種類以上の統計学的分析（例えばｔ検定、ＷｅｌｃｈのＴ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定、ランダムフォレスト）を用いてなされてよい。１つのそのような態様において、その処置後の代謝産物レベルが次のものの１種類以上である場合、その比較の結果はその試験化合物の有効性を示している可能性がある：歯周の参照レベルと同じである処置後の代謝産物レベル；処置後の代謝産物レベルが歯周の参照レベルと実質的に同じである；処置後の代謝産物レベルが歯周の参照レベルの最小値および／または最大値より上および／または下である；および／または、処置後の代謝産物レベルが歯周の参照レベルの範囲内である。別のそのような態様において、その処置後の代謝産物レベルが次のものの１種類以上である場合、その比較の結果はその試験化合物の有効性を示している可能性がある：健康な参照レベルと同じである処置後の代謝産物レベル；処置後の代謝産物レベルが健康な参照レベルと実質的に同じである；処置後の代謝産物レベルが健康な参照レベルの最小値および／または最大値より上および／または下である；および／または処置後の代謝産物レベルが、健康な参照レベルの範囲内である。
【００５６】
本発明はさらに、細胞を試験化合物と接触させ、その試験化合物が次のものから選択される少なくとも１つのメンバーを下方制御するかどうかを決定することにより哺乳類において歯周疾患を処置するのに有用な試験化合物を同定する方法を提供する：イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、グアノシン、グアニン、ロイシン、イソロイシン、リシン（ｌｙｓｉｅ）、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニル酢酸、α−ヒドロキシイソカプロン酸（α−ｈｙｄｒｏｘｙｉｏｓｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、５−アミノ吉草酸、コリン、グリセロール−３−リン酸、およびＮ−アセチルノイラミン酸。
【００５７】
本発明はさらにその上、細胞を試験化合物と接触させ、その試験化合物が次のものから選択される少なくとも１つのメンバーを上方制御するかどうかを決定することにより哺乳類において歯周疾患を処置するのに有用な試験化合物を同定する方法を提供する：尿酸、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、アスコルビン酸、およびグルタミン。
【００５８】
本発明はさらにその上、細胞を試験化合物と接触させ、その試験化合物が表５においてリストされている未知のものの少なくとも１つのメンバーを上方制御または下方制御するかどうかを決定することにより哺乳類において歯周疾患を処置するのに有用な試験化合物を同定する方法を提供する。
【００５９】
Ｄ．口腔ケア試験キット
本発明はさらに、使用者にその使用者の口の健康状態の指標を提供することができる口腔ケア試験キットを提供する。そのキットは１種類以上の歯肉炎溝滲出液収集細片およびその対象の口の健康状態の診断法を含んでいてよい。その歯肉炎溝滲出液収集細片は、歯肉溝滲出液試料を集めるために、および歯肉溝滲出液試料中に含まれる代謝産物の回収のために用いることができる。対象の口の健康の診断は、この発明の方法に基づいていてよい。１つのそのような態様において、そのキットはその歯肉炎溝滲出液収集細片を用いて試料を集めるための説明書を含んでいてよい。別のそのような態様において、そのキットは集めた液体を含む歯肉炎溝滲出液収集細片を試験場所に送るための指示を含んでいてよい。
【００６０】
Ｅ．歯磨組成物
本発明はさらに歯磨組成物を提供する。その組成物は有効量の口の健康の代謝産物療法剤を含んでいてよい。その療法剤は少なくとも１ヶ月の期間にわたって代謝産物レベルの変化をもたらし、ここでその代謝産物レベルの変化は対照歯磨組成物により影響を及ぼされる代謝産物参照レベルの対応する変化よりも大きい。１態様において、代謝産物レベルの変化は対照歯磨組成物により影響を及ぼされる代謝産物参照レベルの対応する変化よりも１％大きい。別の態様において、代謝産物レベルの変化は対照歯磨組成物により影響を及ぼされる代謝産物参照レベルの対応する変化よりも５％大きい。さらに別の態様において、代謝産物レベルの変化は対照歯磨組成物により影響を及ぼされる代謝産物参照レベルの対応する変化よりも２０％大きい。１態様において、その対照歯磨剤は標準的な療法剤を実質的に含まない。別の態様において、その対照歯磨剤は標準的な療法剤を含む。別の態様において、その対照歯磨剤はトリクロサンを含む。その対照歯磨剤は米国特許第７，４０２，４１６号において記述されているような歯磨組成物中で典型的に見つかる成分を含んでいてもよく、それを本明細書にそのまま援用する。
【００６１】
Ｆ．代謝産物を示す歯磨剤
別の観点において、本発明は歯周疾患を示す代謝産物の存在を示すための口腔用組成物を提供する。その口腔用組成物は歯磨剤、例えば練り歯磨き、ゲル、マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈ  ｗａｓｈ）、デンタルフロス、粉末、歯肉に接着する細片、歯ブラシ等の内部に含まれていてよい。その口腔用組成物は代謝産物を示す組成物を含んでいてよい。１態様において、その代謝産物を示す組成物は表１、２、３、４および５においてリストされている１種類以上の化合物の存在を示すことができる。別の態様において、その代謝産物を示す組成物は次のものの１種類以上の上方制御の際に使用者に識別可能な指標を提供することができる：イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、グアノシン、グアニン、ロイシン、イソロイシン、リシン（ｌｙｓｉｅ）、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニル酢酸、α−ヒドロキシイソカプロン酸（α−ｈｙｄｒｏｘｙｉｏｓｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、５−アミノ吉草酸、コリン、グリセロール−３−リン酸、およびＮ−アセチルノイラミン酸。別の態様において、その代謝産物を示す組成物は次のものの１種類以上の下方制御であってよい：尿酸、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、アスコルビン酸、およびグルタミン。１態様において、その代謝産物を示す組成物は、表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上に曝露された際に、結果として使用者に識別可能な指標をもたらすことができる。１態様において、その代謝産物を示す組成物は、表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上に曝露された際に、結果としその歯磨剤の色の変化をもたらすことができる。
【００６２】
１態様において、その歯磨剤は、歯肉縁に接着し、代謝産物を示す組成物を含むゲルを含んでいてよい。１つのそのような態様において、そのゲルは対象の口腔の１個以上の歯の４分円（ｑｕａｄｒａｎｔｓ）に適用されてよく、ここでその代謝産物を示す組成物は、表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上に曝露された際に、結果として使用者に識別可能な指標の出現をもたらすことができる。１態様において、その使用者に識別可能な指標は色の変化に対応していてよい。
【００６３】
別の態様において、その歯磨剤は代謝産物を示す組成物でコートされたデンタルフロスを含んでいてよい。１つのそのような態様において、その代謝産物でコートされたデンタルフロスを使用者の隣接する歯の間を通過させてよく、ここでその代謝産物を示す組成物は、結果として表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上に曝露された際に使用者に識別可能な指標を示すフロスをもたらすことができる。１態様において、その使用者に識別可能な指標はそのフロスが色の変化を示すことに対応していてよい。
【００６４】
さらに別の態様において、その歯磨剤は代謝産物を示す組成物を含むマウスウォッシュを含むことができる。１つのそのような態様において、使用者はその歯をそのマウスウォッシュと接触させることができ、ここでその代謝産物を示す組成物は、表１、２、３、４および５においてリストされている化合物の１種類以上に曝露された際に、結果としてそのマウスウォッシュの使用者に識別可能な指標の出現をもたらすことができる。１態様において、その使用者に識別可能な指標はそのマウスウォッシュの色の変化に対応していてよい。
【実施例】
【００６５】
下記の実施例は本発明の範囲内の一部の態様をさらに記述および実証する。これらの実施例は説明のためにのみ与えられるものであり、本発明の範囲および精神から逸脱すること無くその多くの変形が可能であるため、本発明を限定するものとして解釈されるべきでは無い。
【００６６】
Ｉ．実験の手順
Ａ．実験の設計および患者
フォーサイス研究所の歯科診療所において、２２（２２）人の３３〜６７歳（５３±１１）の慢性歯周炎の対象（４１％が男性）を研究ボランティアから選択した。対象は、少なくとも２０本の天然の無冠の歯（ｕｎｃｒｏｗｎｅｄ  ｔｅｅｔｈ）、８箇所以上の、ポケットの深さが５ｍｍ以上であり臨床的アタッチメントレベル（ＣＡＬ）が３ｍｍ以上である部位を有していた。対象は休薬期間の間その歯磨剤に対するアレルギーの既知の病歴が無かった（下記参照）。除外基準には次のものが含まれていた：歯科矯正装置の存在；異常な唾液機能；処方薬の使用；試験の１ヶ月前または試験の間の抗生物質の使用；鎮痛薬以外のいずれかの処方箋無しでの薬物療法の使用；ビタミンサプリメントの常用；５個以上の齲歯の部位；軟らかい、または硬い口の組織の疾患および全身性の病気。その試験プロトコルはフォーサイス研究所の施設内審査委員会により承認され、全ての試験対象は登録の前にインフォームドコンセントの用紙に署名した。最初の来診において、対象はＣｏｌｇａｔｅ  Ｒｅｇｕｌａｒ歯磨剤のチューブおよび歯ブラシを受け取り、彼らの試料採取来診の前に最低１週間（休薬期間）その製品を使用するように指示された。他の機械的な口腔衛生装置はこの休薬期間の間は許可されたが、他の口腔ケア製品は許可されなかった。
【００６７】
Ｂ．歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料の収集
唾液の混入を防ぐために巻き綿を用いて部位を分離した後、歯肉縁上のプラークをキューレットを用いて除去し、部位を穏やかに空気乾燥させ、３個の異なる部位のカテゴリーからＧＣＦ試料を得た。それぞれの対象に関して、６個の健康な部位（Ｈ；ＰＤが３ｍｍ未満、およびプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）の際の出血[ＢＯＰ]が無い）；６個の歯肉炎の部位（Ｇ；ＰＤが３ｍｍ未満、およびＢＯＰ）；および３個の歯周炎の部位（Ｐ；ＰＤが５ｍｍ以上、およびＢＯＰ）を試料採取した。それぞれの部位から、濾紙細片（Ｐｅｒｉｏｐａｐｅｒ（登録商標）、Ｉｎｔｅｒｓｔａｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ、ニューヨーク州アミティービル）を用いて歯周ポケットの開口部の中に緩やかに挿入してＧＣＦ試料を集めた。Ｐｅｒｉｏｐａｐｅｒの細片をその場所に３０秒間留め、集められたＧＣＦの体積を、あらかじめ較正したＰｅｒｉｏｔｒｏｎ  ８０００（登録商標）（Ｏｒａｆｌｏｗ  Ｉｎｃ．ニューヨーク州プレーンビュー）を用いて決定した。それぞれの対象からの試料を異なる部位のカテゴリーの中に集め、別々のエッペンドルフチューブの中に入れ、アッセイまで−８０℃で保管した。
【００６８】
Ｃ．代謝産物発現プロファイリング技術
代謝産物発現プロファイリング技術を、以前に記述されたように実施した（Ｌａｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。要約すると、４段階の順次の抽出手順を用いてＧＣＦ収集細片から代謝産物を回収した。その抽出物をＧＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳにより分析した。クロマトグラフィーによる分離およびそれに続く完全スキャン質量スペクトルを行い、その試料中に存在していた全ての検出可能なイオンを記録および定量した。既知の化学構造を有する代謝産物は、そのイオンのクロマトグラフィー保持指数および質量スペクトルの断片化サインをその実験試料と同じ分析手順の下で信頼できる標準の代謝産物から作り出された参照ライブラリーの登録情報と照合することにより同定された。その標準が及ばなかったイオンに関しては、それらの固有のイオンのサイン（クロマトグラフィーおよび質量スペクトル）に基づいて追加のライブラリーの登録情報を追加した。この後、これらのイオンは型にはまった手順で検出および定量することができる。
【００６９】
Ｄ，統計学的分析
Ｐｅｒｉｏｔｒｏｎ（登録商標）により記録されたＧＳＦの体積を用いてデータを標準化した。ＡＮＯＶＡおよびＴ検定を実施し、健康な部位、歯肉炎の部位および歯周炎の部位から得られたデータを比較した。それぞれの生化学的物質に関して観察された相対的濃度に対数変換を適用した。
【００７０】
Ｅ．結果
合計で３３０人分のＧＣＦ試料を集め、結果として６６個のプールされた試料を得た。そのＧＣＦ試料は０．０１μｌから１．１５μｌまでの範囲であった。健康な部位、歯肉炎の部位および歯周炎の部位のカテゴリーに関するμｌでの平均体積（±ＳＤ）は、それぞれ０．１８±０．１０、０．２５±０．１３および０．４２±０．１９であった。
【００７１】
その試料を、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，  Ｉｎｃ．による代謝産物プロファイリングのプラットフォームにおいて分析した。次いでその化合物に関する相対的な定量された値を、試料の体積に従って調整した。２２８（２２８）種類の代謝産物が検出され、その内の１０３（１０３）種類はＭｅｔａｂｏｌｏｎ化学参照ライブラリー中の既知の化学構造と一致した。マッチドペアＴ検定を用いて健康な部位、歯肉炎の部位および歯周炎の部位の間の違いを分析した。検出された代謝産物のおおよそ５０％は、その３種類の部位の間で変化したレベルを示した（ｐ＜０．０５）。既知の化学構造と一致する代謝産物を、それらのそれぞれの全体的な生化学的経路の中に位置付けた。ＡＮＯＶＡ分析はそのｔ検定と異なる代謝産物のリストを生成しなかった（データは示していない）。濃度が変化した代謝産物の大部分に関して、歯肉炎の部位におけるレベルは健康な部位と歯周炎の部位におけるレベルの間にあり、これは歯肉炎により誘導される代謝の変化は歯周炎により誘導される代謝の変化への連続体（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）であることを示唆している。
【００７２】
１．核酸
細菌は宿主の核酸を分解および代謝する。核酸分解の最終産物および中間体の上昇したレベルは、細菌感染による核酸分解経路の加速を示唆している。プリンヌクレオチドであるアデノシン１リン酸（ＡＭＰ）およびグアノシン１リン酸（ＧＭＰ）の分解の最終産物は尿酸である。その経路における中間体には、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、グアノシンおよびグアニンが含まれる。下記の表１を参照、プリン分解経路中間体に関する差次的発現プロフィールを表にした。
【００７３】
本試験において、イノシンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でイノシンのレベルにおいて１．２２倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で１．６３倍の増大があった。ヒポキサンチンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でヒポキサンチンのレベルにおいて１．２７倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で２．６５倍の増大があった。キサンチンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でキサンチンのレベルにおいて１．１５倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で２．１５倍の増大があった。グアノシンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でグアノシンのレベルにおいて１．０２倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で１．３５倍の増大があった。グアニンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でグアニンのレベルにおいて１．２２倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で１．６６倍の増大があった。本試験における疾患部位でのこれらの中間体の増大した発現−すなわち“上方制御”−は、細菌感染によるプリン分解経路の加速された代謝の流れを示している。
【００７４】
その中間体の増大にも関わらず、最終産物である尿酸のレベルは疾患部位において減少していた。歯肉炎の対象および健康な対象の間で尿酸のレベルにおいて０．９２倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．７０倍の減少があった。しかし、尿酸は既知の細胞性抗酸化物質であり、次の節において記述されるように、その疾患部位においては酸化性のストレスも強められていたという明らかな証拠がある。尿酸の減少は、フリーラジカル類の除去（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ）の際のそれの枯渇の結果である可能性がある。さらに、ヒポキサンチンのキサンチンへの、次いで尿酸への変換の連続する段階は共にキサンチンオキシダーゼにより触媒される。その反応は、酸素を還元してＯ２−およびＨ２Ｏ２の形のスーパーオキシドを生成することと共役している。ここで観察されたプリン分解経路の変化は、増大した活性酸素種（ＲＯＳ）の産生が歯周疾患によるこの経路の上方制御に由来する重要な結果であることを示している。
【００７５】
表１
核酸の分解経路の化合物
【００７６】
【表１】
0005653998.tif 000002
【００７７】
ピリミジンヌクレオチドであるシチジン１リン酸（ＣＭＰ）およびウリジン１リン酸（ＵＭＰ）の分解の最終産物はウラシルである。その経路の中間体はウリジンであり、疾患部位におけるそれの上方制御は、細菌感染によるピリミジン分解経路の加速された代謝の流れを示している。歯肉炎の対象および健康な対象の間でウリジンのレベルにおいて１．２０倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で１．８２倍の増大があった。ウリジンに関する差次的発現プロフィールも上記の表１において要約されている。
【００７８】
２．抗酸化物質
細菌感染は酸化的ストレスおよび抗酸化物質のレベルの減少を誘導する。グルタチオンはＲＯＳ（酸素イオン類、フリーラジカルおよび過酸化物を含む）および非生体物質に対する細胞の防御において中心的な役割を果たしている。本試験において、還元型および酸化型グルタチオン両方のレベルが歯肉炎および歯周炎の部位において減少していた。グルタチオンおよびグルタチオン生合成経路における関連する代謝産物のレベルの減少は、細菌感染の結果もたらされる酸化的ストレス環境の増大およびグルタチオン産生に関する能力の減少を示している。歯肉炎の対象および健康な対象の間で還元型グルタチオンのレベルにおいて０．６５倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．３５倍の減少があった。歯肉炎の対象および健康な対象の間で酸化型グルタチオンのレベルにおいて０．７５倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．４７倍の減少があった。
【００７９】
加えて、２種類の他の主要な細胞性抗酸化物質であるアスコルビン酸および尿酸もその疾患部位において減少していた。歯肉炎の対象および健康な対象の間でアスコルビン酸のレベルにおいて０．８７倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．３９倍の減少があった。上記で論じたように、歯肉炎の対象および健康な対象の間で尿酸のレベルにおいて０．９２倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．７０倍の減少があった。これらの代謝産物の変化した発現プロフィールは疾患状態における酸化的ストレス環境を明確に実証しており、これを下記の表２において要約する。
【００８０】
表２
抗酸化化合物
【００８１】
【表２】
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【００８２】
３．アミノ酸
組織の損傷による宿主のタンパク質の分解と一致して、様々な遊離のアミノ酸およびアミノ酸代謝産物の発現レベルが歯周疾患により増大した。下記の表３を参照、プリン分解経路中間体に関する差次的発現プロフィールを表にした。
【００８３】
本試験において、イソロイシンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でイソロイシンのレベルにおいて１．２１倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で１．９２倍の増大があった。ロイシンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でロイシンのレベルにおいて１．１２倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で２．０２倍の増大があった。リシンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でリシンのレベルにおいて１．２倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で２．７９倍の増大があった。フェニルアラニンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でフェニルアラニンのレベルにおいて１．０９倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で１．６１倍の増大があった。チロシンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でチロシンのレベルにおいて１．０４倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で１．４１倍の増大があった。本試験における疾患部位でのこれらのアミノ酸の上方制御は、細菌による宿主タンパク質の分解を示している。
【００８４】
加えて、２種類のポリアミンでありアミノ酸分解の最終産物であるプトレッシンおよびカダベリン（１，５−ジアミノペンタン）が、その歯周疾患により上方制御されていることが分かった。プトレッシンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でプトレッシンのレベルにおいて１．４２倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で２．７５倍の増大があった。カダベリンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でカダベリンのレベルにおいて１．４３倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で２．８８倍の増大があった。プトレッシンは哺乳類および細菌の経路両方により産生され得るが、カダベリンはほとんど排他的に細菌由来である(Fothergill and Guest, 1977)。カダベリンは細菌のリシンデカルボキシラーゼによりリシンから合成され、上昇した発現レベルは細菌感染の程度を示している可能性がある。
【００８５】
本試験におけるアミノ酸の発現の増大に対する唯一の例外はグルタミンであり、それは疾患の進行と共に明らかな減少を示した。歯肉炎の対象および健康な対象の間でグルタミンのレベルにおいて０．８４倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．６０倍の減少があった。１つの可能性のある説明は、グルタミンが細菌により主要な窒素源として急速に消費されたというものである。別の窒素を有するアミノ酸であるグルタミン酸もその疾患において減少を示したが、その変化は統計的カットオフ値より上であった（データは示していない）。別の説明は、タンパク質におけるそれの提示に加え、グルタミンは遊離のグルタミンジペプチドとしてかなりの量で存在しているというものである。細菌Ｐ．ジンジバリス（Ｐ．  ｇｉｎｉｖａｌｉｓ）は単独のアミノ酸よりもむしろペプチドを代謝することが報告されており、この遊離のグルタミンの減少は、細菌によるジペプチドの、それらの単独のアミノ酸への分解の前の著しい利用と一致している。
【００８６】
表３
アミノ酸
【００８７】
【表３】
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【００８８】
４．尿素サイクル
タンパク質のアミノ酸への分解はアンモニアを放出し、次いでそれは生物によりより毒性の低い窒素の形に変換されなければならない。ヒトにおいて、その尿素サイクルはアンモニアを尿素および他の最終産物に変換するように機能している。尿素サイクルの中間体および最終産物は、プトレッシンおよび４−グアニジノブタン酸を含め、有意に上方制御されていた。上記の表３を参照、尿素経路中間体に関する差次的発現プロフィールを表にした。上記で論じたように、プトレッシンに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でプトレッシンのレベルにおいて１．４２倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で２．７５倍の増大があった。４−グアニジノブタン酸に関して、本試験において、歯肉炎の対象および健康な対象の間で４−グアニジノブタン酸のレベルにおいて１．８３倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で２．３３倍の増大があった。
【００８９】
５．炭水化物
様々な糖類および炭水化物の代謝産物の発現の変化は、宿主の組織および細菌の間の相互作用をさらに説明する。下記の表４を参照、その疾患部位における、マルトトリオース、マルトースおよびマルトトリイトールを含む３および２糖類の減少したレベルは、循環における細菌のこれらの食物由来の栄養素の消費の結果である可能性がある。歯肉炎の対象および健康な対象の間でマルトトリオースのレベルにおいて０．９０倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．５９倍の減少があった。歯肉炎の対象および健康な対象の間でマルトースのレベルにおいて０．９３倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．７２倍の減少があった。歯肉炎の対象および健康な対象の間でマルトトリイトール（ｍａｌｔｏｔｒｉｉｏｌ）のレベルにおいて０．８６倍の減少があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で０．４３倍の減少があった。
【００９０】
これらの３および２糖類の分解は、結果としてその最終産物であるグルコースの増大したレベルをもたらす。グルコースに関して、歯肉炎の対象および健康な対象の間でグルコースのレベルにおいて１．３５倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で１．９６倍の増大があった。生化学経路により高度に制御されている増大したグルコースは、それにより結果としてクレブス回路の上方制御およびα−ケトグルタル酸を含む中間体の発現の増大をもたらす。歯肉炎の対象および健康な対象の間でα−ケトグルタル酸のレベルにおいて１．６５倍の増大があり、歯周炎の対象および健康な対象の間で３．１５倍の増大があった。
【００９１】
表４
炭水化物
【００９２】
【表４】
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【００９３】
未知のもの
様々な未知のものも観察され、表５に示したように、それは健康な口の状態、歯肉炎および歯周疾患に関して代謝産物のアイデンティティおよび代謝産物のレベルの間の関係を示した。
【００９４】
表５
【００９５】
【表５】
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