(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ・インターメディア（Candida intermedia）４−６−４Ｔ２と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９として寄託された酵母。
【請求項２】
グルコースとキシロースとを含有する原料液体を、請求項１に記載の酵母を用いて発酵させる工程を含むことを特徴とするエタノールの生産方法。
【請求項３】
原料液体のｐＨが３．５〜６．５である請求項２に記載の生産方法。
【請求項４】
原料液体として、セルロース系バイオマスの加水分解物を用いる請求項２又は３に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規酵母及びこれを用いたエタノールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策として世界的に大規模なバイオエタノール生産が行われている。バイオエタノールの原料はトウモロコシやサトウキビ等の可食性のバイオマスが多くを占めており、斯様な可食性のバイオマスにおいては、バイオエタノール原料としての使用と、食糧としての使用との競合が問題となる。
斯かる問題を回避するために、食糧として使用されない木材や非可食性の草本等のセルロース系バイオマス（特に、農業残渣、林業残渣等から得られるもの）からエタノールを生産する技術の開発が求められている。
斯かる技術においては、セルロース系バイオマスに含まれるセルロースや、ヘミセルロース、これらの一部分解物である多糖類を加水分解し、六炭糖であるグルコース、マンノース及びガラクトースや五炭糖であるキシロースを主成分とする糖化液を得、この糖化液中の糖を微生物で発酵させることでエタノールが得られる。
【０００３】
グルコース及びマンノースから効率よくエタノールを生産可能な酵母として、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が知られているものの、キシロースやガラクトースから効率的にエタノールを生産できる微生物はわずかな種類しか存在しない。
例えば、グルコースだけでなくキシロースからもエタノールを生産可能な微生物の数少ない例として、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）、カンジダ・シハタエ（Candida shehatae）及びパチソレン・タノフィルス（Pacysolen tannophilus）や（非特許文献１）、カンジダ・インターメディア（Candida intermedia）が知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yablochkova, EN., Bolotnikova, OI., Mikhailova, NP., Nemova, NN. And Ginak, AI. Applied Biochemistry and Microbiology, Vol.39, 302-306 (2003)
【非特許文献２】Y. Morikawa,et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol:XXVII, 509-513 (1985)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に記載の酵母は、セルロース系バイオマス由来の原料液に含まれるグルコース及びキシロースの両方の存在下でエタノール発酵を行うと、グルコースによるカタボライトリプレッション（異化代謝産物抑制）によりグルコースがほぼ完全に消費されるまでキシロースはほとんど消費されないため発酵に時間を要し、エタノール生産性が低下するという問題があった。
また、非特許文献２に記載の酵母は、本発明者が検討したところ、製造条件によってはグルコースによるカタボライトリプレッションが生じにくく、グルコース及びキシロースの両方の存在下でエタノール発酵を行ってもその両方からエタノール発酵をすることが可能な場合もあるものの、キシロースの消費効率が悪く、キシロースからエタノールを生産する能力が十分でないという問題がある。
【０００６】
したがって、本発明の課題は、グルコース及びキシロースとの共存下で、グルコース及びキシロースから短時間で効率良くエタノールを生産する能力を有する新規酵母及びこれを用いたエタノールの生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者は、鋭意研究した結果、特定の酵母がグルコース及びキシロースとの共存下で、グルコース及びキシロースから短時間で効率良くエタノールを生産する能力を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、カンジダ・インターメディア（Candida intermedia）４−６−４Ｔ２と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９として寄託された酵母を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、グルコース及びキシロースから選ばれる１種以上の単糖を含有する原料液体を、上記酵母を用いて発酵させる工程を含むことを特徴とするエタノールの生産方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の酵母は、グルコース及びキシロースとの共存下で、グルコース及びキシロースから短時間で効率良くエタノールを生産する能力を有する。また、斯かる酵母を用いれば、グルコースやキシロースを含有するセルロース系バイオマス由来の原料を用いた場合であっても短時間で効率良くエタノールを生産できる。
したがって、本発明のエタノールの生産方法によれば、セルロース系バイオマス由来の原料を用いて短時間で効率よくエタノールを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】グルコース及びキシロースを親株で発酵させたときの各成分の経時変化を示す図である。
【図２】グルコース及びキシロースを４−６−４Ｔ２株で発酵させたときの各成分の経時変化を示す図である。
【図３】キシロースを親株で発酵させたときの各成分の経時変化を示す図である。
【図４】キシロースを４−６−４Ｔ２株で発酵させたときの各成分の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜酵母＞
本発明の酵母は、カンジダ・インターメディア（Candida intermedia）４−６−４Ｔ２と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９として独立行政法人  製品評価基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託された酵母である。斯かる酵母は、カンジタ・インターメディア（Candida intermedia）「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として、常法に従い自然変異させ、親株よりもエタノール生産能が高い株を選抜することにより取得したものである。なお、上記「ＮＢＲＣ１０６０１」は独立行政法人  製品評価基盤機構（ＮＩＴＥ）から入手可能な酵母である。
そして、本発明の酵母は、グルコース及びキシロースとの共存下で、グルコース及びキシロースから短時間で効率良くエタノールを生産する能力を有する。
ここで、グルコース及びキシロースとの共存下とは、少なくともグルコースとキシロースを含む原料液体（発酵液）中に本発明の酵母が共存することを意味する。従来の酵母は、前述のようにキシロースの消費効率が十分でないもの、或いはグルコース又はキシロースのうちいずれか一方からのエタノール生産能を有するものの、グルコース及びキシロースの両方が存在する場合は、カタボライトリプレッションによりグルコースが完全に消費されるまでキシロースがほとんど消費されないものであったが、本発明の酵母は、グルコース及びキシロースの両方が存在する場合であっても、その両方から短時間で効率よくエタノールを生産する能力を有する。
また、本発明の酵母は、グルコース及びキシロースを含有する原料液体から短時間で効率良くエタノールを生産するが、このとき副生成物としてのキシリトールがほとんど生成されない。また、本発明の酵母は、このような糖からのエタノールの生産能力以外については親株と同等の性質を有する。
【００１３】
＜エタノール生産方法＞
本発明のエタノールの生産方法は、グルコース及びキシロースから選ばれる１種以上の単糖を含有する原料液体を、上記酵母を用いて発酵させる工程（以下、発酵工程ともいう）を含むことを特徴とする。斯かる生産方法によれば、短時間で効率良くエタノールを生産できる。
【００１４】
酵母の使用量は特に限定されないが、上記単糖１質量部に対し０．０１〜１００質量部程度であり、好ましくは０．１〜１０質量部である。
【００１５】
また、上記原料液体（例えば、糖化液）としては、グルコースとキシロースとを含むものが好ましい。また、これら単糖にくわえてマンノース、ガラクトース等の他の単糖（六炭糖）を含んでいてもよい。本発明の生産方法はカタボライトリプレッションの影響を受けにくいため、斯かる方法によれば、グルコースとともに上記のような単糖（キシロースや、マンノース、ガラクトース）を含んでいたとしても、効率よくエタノールを生産することができる。
【００１６】
また、上記原料液体がグルコース及びキシロースを含む場合、グルコースとキシロースの含有比率としては、グルコース１質量部に対し、キシロースが０．１〜５質量部が好ましく、０．５〜３質量部がより好ましい。本発明の酵母を用いれば、グルコースとキシロースの含有比率が上記のような範囲であっても、グルコースと同時にキシロースからもエタノールを生産できる。また、原料液体中のグルコース含有量及びキシロース含有量は、それぞれ１〜１００ｇ／Ｌが好ましく、５〜５０ｇ／Ｌがより好ましい。本発明の酵母を用いれば、グルコースやキシロースの含有量が斯様な範囲であってもエタノールを生産できる。また、原料液体に含まれる糖に対するグルコースの含有割合は特に限定されないが、原料液体に含まれる糖全量中、５〜９９質量％が好ましく、１０〜７０質量％がより好ましい。
【００１７】
また、上記原料液体に含まれる単糖の合計含有量としては１〜１００ｇ／Ｌが好ましい。
【００１８】
また、エタノール生産に用いる原料液体は、動物由来のもの、植物由来のもの、工業廃棄物由来のもの等のいずれであってもよいが、植物由来のものが好ましく、バイオエタノール原料としての使用と食糧としての使用との競合を避ける観点から、セルロース系バイオマスの加水分解物がより好ましい。ここで、セルロース系バイオマスとは、セルロースとヘミセルロースを含むバイオマスをいう。斯かるバイオマス中のセルロースが加水分解されることでグルコースが得られ、一方、ヘミセルロースが加水分解されることでグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースが得られる。
斯かるセルロース系バイオマスとしては、エタノール生産における経済的優位性の観点から、農業残渣（稲わら、麦わら等）、林業残渣（材木等）等から得られるものが好ましい。
【００１９】
また、上記原料液体のｐＨ（３０℃）は、好ましくは３．５〜６．５であり、より好ましくは４〜６であり、更に好ましくは４．５〜５．５であり、特に好ましくは４．５〜５である。本発明の酵母によれば、斯様な低ｐＨ領域であってもエタノール生産が可能であり、酢酸等を含有する糖化液（バイオマス系セルロースの酸加水分解物）を用いた場合でもエタノールを生産できる。
なお、酸を用いてセルロース系バイオマスを加水分解することによって得られる低ｐＨの糖化液には、微生物によるエタノール生産を阻害する酢酸等の阻害物質が含まれることが報告されており（Nigam JN. Journal of Applied Microbiology, Vol.90,208-215 (2001)）、特に、キシロースからエタノール生産可能な微生物は、ｐＨ５以下という低ｐＨ領域ではエタノール発酵が阻害されることが報告されている（Palmqvist E., Hahn-Hagardal B. Bioresource Technology Vol.74,25-33 (2000)）。
また、上記生産方法は、好ましくは２０〜３５℃、より好ましくは２５〜３０℃で行われる。
【００２０】
また、上記生産方法においては、上記酵母を生育条件におき生育させつつエタノールを生産してもよく、また、休止菌体状態、すなわち窒素源を酵母の生育には不十分な程度に制限しかつエタノールの原料となる炭素源が豊富な条件下におき、酵母の生育を止めた状態でエタノールを生産することもできる。このうち、酢酸や亜硫酸等のエタノール生産阻害物の影響を受けにくいという点から、休止菌体の状態でエタノールを生産することが好ましい。休止菌体で生産を行う場合、酵母の濃度は５〜１００ｇ／Ｌで行うことが好ましい。また、休止菌体でエタノールを生産する場合には、窒素源や酵母エキスなどを含有させなくてもよいが、リン酸緩衝液や水酸化ナトリウム等で前記のｐＨに調整することが好ましい。なお、エタノールの回収は、蒸留等の通常の手段で行えばよい。
【００２１】
また、上記生産方法においては、菌体量の観点から、上記発酵工程に先立って前培養を行うことが好ましい。斯かる前培養に用いる培地としては、グルコースと、マンノース、ガラクトース及びキシロースから選ばれる１種以上の糖を含有する培地が好ましい。斯様な培地として、前記セルロース系バイオマス加水分解物を含有するものを用いてもよい。
また、上記糖の濃度としては、合計で１〜１００ｇ／Ｌが好ましく、１０〜５０ｇ／Ｌがより好ましい。なお、マンノース、ガラクトース及びキシロースから選ばれる１種以上とグルコースとの含有量の比率は特に限定されない。
また、上記前培養において、セルロース系バイオマス加水分解物を炭素源として用いる場合、斯かる加水分解物の使用量は、通常、培地容量の２０容量％以下であるが、好ましくは１０容量％以下である。なお、培地に含まれる他の成分は特に限定されるものではないが、生育に適したアミノ酸、尿素、ポリペプトン、アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源；酵母エキス等が挙げられる。前培養の温度は、好ましくは１０℃〜３７℃であり、より好ましくは２５℃〜３０℃である。一方、ｐＨは、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５である。また、前培養は好気条件で行うことが好ましい。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
以下の手順に従い、独立行政法人  製品評価基盤機構（ＮＩＴＥ）に保存されている酵母カンジタ・インターメディア（Candida intermedia）「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として、馴養及び自然変異により４−６−４Ｔ２株を取得した。
【００２４】
まず、グルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液のｐＨを水酸化マグネシウムにて５．０に調整し、この溶液２０％と液体培地（酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％）８０％を混合した。この混合溶液１０ｍＬにキシロースを１％添加し、酵母カンジタ・インターメディア（Candida intermedia）「ＮＢＲＣ１０６０１」を１白金耳植菌し、３０℃で３日間培養し培養液を得た。
次いで、上記と同様にしてｐＨを５．０に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液と液体培地を５０％ずつ混合し、この混合液１０ｍＬに上記３日間培養した培養液を１００μＬ添加し、更に７日間培養した。更に、上記と同様にしてｐＨを５．０に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液８０％と培地２０％を混合し、この混合液１０ｍＬに上記７日間培養した培養液を１００μＬ加え３０日間更に培養し、馴養株液とした。
上記馴養株液を１０００倍希釈し、ＹＮＢ寒天培地（グルコース：５％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％、寒天：２％）の培地に塗布し、２５℃で４日間培養した後、コロニーを形成した株を取得した。
【００２５】
上記取得した株をＹＮＢ寒天培地（トレハロース：２％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％、寒天：２％）の培地に塗布し、２５℃で３日間培養した後、コロニーが形成されたのを確認し、４℃で保管した。４℃において拡大したコロニーを選抜し、リン酸緩衝液（キシロース：２．５％、ＫＨ2ＰＯ4：０．１Ｍ、ｐＨ＝５．０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ2Ｏ：０．００６Ｍ）でエタノール生産試験を実施し、親株よりもエタノール生産能の高い株を選抜した。
【００２６】
このようにして目的とする酵母を選抜し、これをカンジダ・インターメディア（Candida intermedia）４−６−４Ｔ２株と命名した。本菌株は、独立行政法人  産業総合研究所特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９である。
【００２７】
実施例２
親株（ＮＢＲＣ１０６０１株）及び４−６−４Ｔ２株をＹＮＢ培地（グルコース：０．５％、キシロース：２％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％）にそれぞれ植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った（２４〜４８時間、ＯＤ660＝１８〜２５）。培養液１ｍＬ中の乾燥菌体重量は経験的に得られた以下の関係式（１）にて算出した（式（１）によれば、例えばＯＤ660＝２０のとき乾燥菌体重量は０．００６２ｇに相当すると算出できる）。
【００２８】
乾燥菌体重量（ｇ／ｍＬ）＝０．０００３２×ＯＤ660−０．０００１７・・・（１）
【００２９】
菌体量が乾燥重量で２％となるように必要量の培養液をそれぞれ遠心分離（３０００ｒｐｍ、２分）で回収し、リン酸緩衝液（ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4：０．０１Ｍ、ｐＨ＝５．０）に下記表１〜４に示す糖（エタノール原料）を混合した発酵用液をそれぞれの菌体に添加して発酵させエタノール生産量の経時変化を確認した。結果を表１〜４及び図１〜４に示す。なお、表及び図中のＧはグルコースをＸはキシロースをそれぞれ示す。
【００３０】
【表１】
0005715930.tif 000002
【００３１】
【表２】
0005715930.tif 000003
【００３２】
【表３】
0005715930.tif 000004
【００３３】
【表４】
0005715930.tif 000005
【００３４】
表１及び図１に示すように、親株（２％）を用いて、グルコース及びキシロース（それぞれ２．５％）を炭素源としてエタノールを生産させた場合は、発酵初期ではグルコースとキシロースの双方は消費されエタノールが生産されているが、グルコースを消費しきったところでエタノール生産は停止し、キシロースの消費もほとんど停止状態となっている。このことから、親株は、グルコースによるカタボライトリプレッションの影響をうけにくいものの、キシロースからのエタノール生産能が低いことがわかる。
これに対し、表２及び図２に示すように、４−６−４Ｔ２株（２％）を用いて、グルコースとキシロース（それぞれ２．５％）を炭素源としてエタノールを生産させた場合は、親株と同様に発酵初期でグルコースとキシロースの双方が消費されエタノールが生産されているだけでなく、グルコース消費後もキシロースの消費がほとんど変わらない速度で進行しており、グルコースだけでなくキシロースも充分に消費され、それに伴いエタノール生産量も増加している。このことから、４−６−４Ｔ２株は、グルコースによるカタボライトリプレッションの影響を受けにくい性質を親株から受け継ぎつつ、キシロースからのエタノール生産能が親株と比較して格段に向上したものであることがわかる。
【００３５】
また、表３及び図３に示すように、親株（２％）を用いて、キシロース（５％）を炭素源としてエタノールを生産させた場合は、発酵２４時間でも３０％以上のキシロースが残存した。
これに対し、表４及び図４に示すように、４−６−４Ｔ２株（２％）を用いて、キシロース（５％）を炭素源としてエタノールを生産させた場合は、発酵時間２４時間で９０％以上のキシロースが消費され、親株と比較して約１．４倍のエタノールが生産されていた。
【００３６】
４−６−４Ｔ２株と親株でキシロースからのエタノール生産能力に差がある理由は必ずしも明らかではないが、キシロースからエタノールが生産される際の中間代謝物であるキシリトールが蓄積することでキシロースからのエタノール生産が抑制・阻害されるものと上記図１〜４から推測される。
すなわち、上記親株を用いた発酵の経時変化を追った図１及び３と４−６−４Ｔ２株を用いた発酵の経時変化を追った図２及び４との比較から、いずれも親株ではキシリトールの生産量が多く、このキシリトールの増加に伴うようにしてキシロース消費が低下し、エタノール生産が停止する傾向があると考えられる。
【００３７】
このように本発明の酵母を用いることでエタノールを効率良く生産できるのは、グルコースによるカタボライトリプレッションの影響が少ないことと共に、キシリトールの生産が抑制されているためキシリトールによるエタノール生産性が阻害されにくいことも影響していると推察される。
【００３８】
実施例３
表５に示す糖を含む発酵用液（リン酸緩衝液：０．０１Ｍ、ｐＨ５．０）に同表に示す酵母をそれぞれ２％乾燥重量相当添加し、１２時間後のエタノール生産量（％（ｖ／ｖ））を測定した。結果を表５に示す。
【００３９】
【表５】
0005715930.tif 000006
【００４０】
表５から、いずれの糖を用いた場合においても、４−６−４Ｔ２株は親株や公知酵母と比較して高いエタノール生産能を示すことがわかる。
【図１】
0005715930.tif 000007
【図２】
0005715930.tif 000008
【図３】
0005715930.tif 000009
【図４】
0005715930.tif 000010