(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーカリプタス属（Eucalyptus）の雑種の形質を推定する方法であって、
ユーカリプタス属の被検植物体の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出工程、
得られた抽出物から該被検植物の両親種のそれぞれに特有の代謝産物である親種マーカーを検出し、かつその存在量を定量する工程、及び
一方の親種マーカーの存在量に対する他方の親種マーカーの存在量比が所定の値以上の場合、前記被検植物には該他方の親種の形質が現れると推定する工程
を含む前記推定方法。
【請求項２】
前記親種マーカーは、
各親種の植物体の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、及び
得られた抽出物中に含まれる同一代謝産物の存在量を各親種間で比較したときに、一方の親種の該存在量が他方の親種の該存在量よりも統計学的に有意に多いときに、該代謝産物を前記一方の親種に特有の親種マーカーとして選択する選択工程、
を含む親種マーカー選択方法によって得られる、請求項１に記載の推定方法。
【請求項３】
前記被検植物が個体発生初期の段階である、請求項１又は２に記載の推定方法。
【請求項４】
前記雑種がユーカリプタス・ペリータ（Eucalyptus pellita）とユーカリプタス・ブラシアーナ（Eucalyptus brassiana）の雑種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の推定方法。
【請求項５】
前記雑種がユーカリプタス・ペリータ（Eucalyptus pellita）とユーカリプタス・カマルドレンシス（Eucalyptuscamaldulensis）の雑種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の推定方法。
【請求項６】
ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ及びユーカリプタス・カマルドレンシスの親種マーカーが下記表１に記載の特性によって特定される代謝産物である、請求項４又は５に記載の推定方法。
【表１】
0005691795.tif 000006
【請求項７】
ユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナの雑種において、ユーカリプタス・ブラシアーナの親種マーカーM4の存在量に対するユーカリプタス・ペリータの親種マーカーM1の存在量比（M1/M4）が
10以上の場合、該雑種には、ユーカリプタス・ペリータの形質が強く現れると推定し、又は
10未満の場合、該雑種には、ユーカリプタス・ブラシアーナの形質が強く現れると推定する、
請求項６に記載の推定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の代謝産物を利用して植物雑種の形質を推定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の種間雑種は、雑種強勢により両親種の優良な形質を受け継ぐことが多い。これは、遺伝的ヘテロ接合により環境に対する適応性の幅が広くなることに起因する。ユーカリプタス属（Eucalyptus）（以下、本属に属する種を総称して、単に「ユーカリ」ともいう）を例に挙げると、ユーカリプタス・ペリータ（Eucalyptus pellita）（以下、しばしば「ペリータ」と略称する）は、他のユーカリ種と比べて葉枯れ病に強く、かつ植栽後期の成長速度が速い形質を有する。また、ユーカリプタス・ブラシアーナ（Eucalyptus brassiana）（以下、しばしば「ブラシアーナ」と略称する）は、初期成長が速く、青枯れ病に強いという形質を有する。一方、これらの種間雑種は、成長速度が速く、かつ葉枯れ病や青枯れ病をはじめとする種々の病原菌に対する耐病性が高いという両親種の有用な形質を兼ね備えている。このような種間雑種は、自然交雑によっても得られる他、より優良な品種を得るために人為的交配によっても作製されている。
【０００３】
ところで、両親種が同一であっても、その雑種の形質は、必ずしも一様とは限らず、一方の親種により近い形質を有する場合がしばしば見られる。例えば、前述のペリータとブラシアーナの雑種の場合、ペリータ由来の形質が強く現れる雑種（以下、「ペリータ様雑種」という)やブラシアーナ由来の形質が強く現れる雑種（以下、「ブラシアーナ様雑種」という）が存在する。いずれの雑種も雑種強勢により両親種の優良な形質を受け継いでいることが多いが、親種由来の形質的差異により、雑種間で最適生育環境が異なる等の違いが生じ得る。例えば、ブラシアーナ様雑種は、ブラシアーナと同様に、ベトナム等の雨季・乾期が明確な地域が生育環境として適しており、かつ当該地域ではブラシアーナよりも成長優良木となる。したがって、雑種強勢である利益を享受し得る。一方、ブラシアーナ様雑種をペリータが好む年中雨季の地域に植栽した場合には、雑種強勢の利益を享受し得ないばかりか、親種であるペリータよりも生育が劣る可能性がある。したがって、農林業において植物雑種を利用して最大生産効率を得るためには、当該雑種の形質がいずれの親種に近いかをより早期に、かつ正確に推定し、個体ごとにその結果に応じた適切な環境下で育成することが重要となる。
【０００４】
植物雑種の識別は、通常、外部形態等の表現型の比較に基づき、熟練した育種業者の判断によって行われている。しかし、育種業者の経験に基づく主観的判断は、必ずしも正確な識別法とは言えず、時として育種業者間で結果が異なるという問題を包含する。また、雑種間の形質的差異が成木段階には明瞭な表現型の差異として現れる場合であっても、苗や苗木のような個体発生初期の段階では、当該差異が不明瞭なことが多い。例えば、上記ペリータ様雑種とブラシアーナ様雑種の識別は、植栽約3年後の成木段階では、図１で示すような、樹皮に特徴的な差異が現れるためその識別は容易であるが、幼木段階では、そのような差異は見られず、外部形態からの識別は、たとえ熟練した育種業者であっても困難を極める。
【０００５】
近年、雑種の識別方法として、客観的、かつ生物学的な方法が開発されている。例えば、特許文献１又は２に記載のような、RAPD法やゲノムDNAの種特異的塩基配列長の違い（PCR-SSCP法）に基づいた識別方法が挙げられる。
【０００６】
しかしながら、従来知られている雑種識別方法は、再現性の問題や分析時間やコスト面における問題を包含しており、実用的な方法とは言い難かった。また、公知の雑種識別方法は、いずれも雑種であるか否かを識別する方法であって、雑種間における形質の差異を推定する方法に至っては、皆無であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2005-295925号
【特許文献２】特開平10-229898号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、植物雑種の形質を推定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、両親種が同一の植物雑種であっても、それぞれの親種に特有の代謝産物の存在量が植物雑種間で異なること、また各雑種に含まれるそれぞれの親種マーカーの存在量比と、その雑種に現れる形質との間に相関関係があることを見出した。したがって、該存在量比に基づけば、その植物雑種において将来表現型として現れる形質及び／又は外部形態からは視認できない形質を推測することが可能となる。本発明は、当該知見に基づくものであって、すなわち以下を提供する。
【００１０】
（１）植物雑種の形質を推定する方法であって、被検植物体の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出工程、得られた抽出物から該被検植物の両親種のそれぞれに特有の代謝産物である親種マーカーを検出し、かつその存在量を定量する工程、及び一方の親種マーカーの存在量に対する他方の親種マーカーの存在量比が所定の値以上の場合、前記被検植物には前記他方の親種の形質が現れると推定する工程を含む前記推定方法。
（２）前記親種マーカーは、親種の植物体の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、及び得られた抽出物中に含まれる同一代謝産物の存在量を各親種間で比較したときに、一方の親種の該存在量が他方の親種の該存在量よりも統計学的に有意に多いときに該代謝産物を前記一方の親種に特有の親種マーカーとして選択する選択工程、を含む親種マーカー選択方法によって得られる、（１）に記載の推定方法。
（３）前記被検植物が個体発生初期の段階である、（１）又は（２）に記載の推定方法。
（４）前記植物雑種がユーカリプタス属（Eucalyptus）の雑種である、（１）〜（３）のいずれかに記載の推定方法。
【００１１】
（５）前記雑種がユーカリプタス・ペリータ（Eucalyptus pellita）とユーカリプタス・ブラシアーナ（Eucalyptus brassiana）の雑種である、（４）に記載の推定方法。
（６）前記雑種がユーカリプタス・ペリータ（Eucalyptus pellita）とユーカリプタス・カマルドレンシス（Eucalyptuscamaldulensis）の雑種である、（４）に記載の推定方法。
（７）ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ及びユーカリプタス・カマルドレンシスの親種マーカーが下記表１に記載の特性によって特定される代謝産物である、（５）又は（６）に記載の推定方法。
【００１２】
【表１】
0005691795.tif 000002
【００１３】
（８）ユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナの雑種において、ユーカリプタス・ブラシアーナの親種マーカーM4の存在量に対するユーカリプタス・ペリータの親種マーカーM1の存在量比（M1/M4）が10以上の場合、該雑種には、ユーカリプタス・ペリータの形質がより強く現れると推定し、又は10未満の場合、該雑種には、ユーカリプタス・ブラシアーナの形質がより強く現れると推定する、（７）に記載の推定方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の植物雑種の形質を推定する方法によれば、植物雑種において、その個体が両親種のどちらにより近い形質を有するか、それが顕著に現れていない個体発生初期の段階であっても推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】植栽3年後の成木段階におけるペリータ様雑種（A）とブラシアーナ様雑種（B）の樹皮形態を示す図である。ペリータ様雑種は、ペリータと同様に縦に紐状に裂ける樹皮形態を示すのに対して、ブラシアーナ様雑種は、ブラシアーナと同様に滑面状の樹皮形態を示す。
【図２】ユーカリプタス・ペリータ特有の代謝産物M1及びユーカリプタス・ブラシアーナ特有の代謝産物M4について、LC-MS/MSを用いてペリータ、ブラシアーナ及びペリータ／ブラシアーナ雑種の抽出物を解析した結果を示す。いずれの図も縦軸はイオン強度（cps）を、横軸は保持時間（分）を示す。
【図３】本発明の形質推定方法によって分類されたユーカリ雑種における個体発生初期の成長速度との関連性を示す図である。ブラシアーナ様雑種と推定された個体は、一方の親種であるブラシアーナ純種、ペリータ様雑種と推定された個体、及び他方の親種であるペリータ純種の経時的成長を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．概要及び定義
本発明は、植物雑種の形質推定方法である。本発明の方法は、植物雑種の両親種のそれぞれの親種マーカーの存在量の比に基づいて、該雑種の形質がどちらの親種により近いか推定することを特徴とする。
【００１７】
本発明において「植物」とは、コケ植物、シダ植物及び種子植物をいう。好ましくは種子植物である。種子植物の場合、裸子植物若しくは被子植物、又は草本類若しくは木本類の種類は問わない。好ましくは木本類であり、より好ましくはユーカリである。ユーカリは、例えば、ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・カマルドレンシス（以下、しばしば「カマルドレンシス」と略称する）、ユーカリプタス・グランディス、ユーカリプタス・グロブラス、ユーカリプタス・ユーロフィラ、ユーカリプタス・デグルプタ、及び／又はユーカリプタス・テレティコンティス等が該当する。
【００１８】
本発明において「植物雑種」とは、植物の種間雑種をいう。ここでいう植物の種とは、原則として生物分類学上の種を意味する。したがって、下位概念である亜種又は品種は、種に包含される。ただし、形態学及び／又は分子系統学に基づく生物分類学上の分類が、実際の生物集団における近縁関係を必ずしも正確に反映しているとは言えないことから、本発明において「植物雑種」は、生物分類学上の属間雑種や亜種間雑種に相当する雑種も含み得るものとする。植物雑種として前述のユーカリの雑種を例に挙げれば、ペリータとブラシアーナの雑種（以下、しばしば「ペリータ／ブラシアーナ雑種」と示す）やペリータとカマルドレンシスの雑種（以下、しばしば「ペリータ／カマルドレンシス雑種」と示す）が挙げられる。なお、本明細書では、「植物雑種」をしばしば「雑種」と略称する。
【００１９】
「形質」とは、生物の遺伝的な特徴又は性質である。本明細書においては、葉型、樹皮形態、色彩のように外部形態的特徴として現れる視認可能な形質を表現型とし、耐湿性、耐暑性、耐病性、成長速度のようにその外部形態からは直ちに認識できない形質（以下、「性質」とする）と区別する。したがって、本明細書で単に形質と表現したときには、表現型及び性質の双方を含む概念である。
【００２０】
２．植物雑種の形質推定方法
本発明の植物雑種の形質推定方法は、「抽出工程」、「検出・定量工程」及び「推定工程」を含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
【００２１】
２−１．抽出工程
「抽出工程」とは、被検植物体の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する工程である。
本発明において「被検植物」とは、本発明の形質推定方法に供される植物であり、「被検植物体」とは、その植物体をいう。本発明において被検植物は、雑種であることを前提とするが、本発明に供される前に雑種であることが明らかにされている必要はなく、雑種である蓋然性があれば足りる。この場合、被検植物が雑種ではない可能性を包含し得るが、この可能性は、後述する検出・定量工程で排除することができる。
【００２２】
被検植物体は、個体発生段階において、どちらの親種由来の形質をより強く反映するかが識別可能となる前の段階の個体を本発明に適用することが好ましい。そのような段階としては、通常、個体発生初期の段階が該当する。例えば、種子植物の草本類であれば、種子発芽から本葉が数枚程度出現するまでの段階、木本類であれば、いわゆる幼木と称される段階が相当する。具体的な個体発生初期段階は、植物種によって異なることから、被検植物の種類によって適宜勘案すればよい。例えば、ペリータ／ブラシアーナ雑種やペリータ／カマルドレンシス雑種の場合であれば、種子発芽後約2年以内が該当する。
【００２３】
本明細書において植物体の「全部」とは、植物体を構成する全てをいう。また、植物体の「一部」とは、植物体を構成する一部領域、具体的には、器官（例えば、根部、茎部、葉部、花部、又は胞子若しくは種子等）、形態的及び／若しくは機能的に分化した細胞群からなる組織、又は前記組織を構成する細胞をいう。植物体の一部で好ましい部位は、葉部である。入手が容易であり、採取する植物体に与える負荷も比較的小さく、また植物体の中でも後述する代謝産物を最も多く含有しているためである。
【００２４】
本明細書において「代謝」とは、呼吸に代表される異化代謝及び光合成に代表される同化代謝のいずれも包含する。したがって、本明細書において「代謝産物」とは、水、二酸化炭素を除き、植物の代謝によって生じるあらゆる物質を含む。例えば、タンパク質（酵素を含む）、低分子化合物（植物ホルモン、ポリフェノール、糖、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオチドを含む）が該当する。好ましくは低分子化合物である。代謝産物は、水溶性又は脂溶性を問わない。なお、本発明において、代謝産物は、後述する公知の分析手法を用いて目的とする単一物質を特定できればよく、必ずしも化学構造まで決定されている必要はない。例えば、質量分析法により代謝産物を分析した場合には、単一物質を特定し得るプリカーサイオン及び／又はプロダクトイオンの質量電荷比、及び保持時間が特定されていれば足りる。
【００２５】
本明細書において「抽出物」とは、複数の代謝産物を包含する植物抽出物であって、通常は植物抽出液をいう。抽出物には、細胞片等の植物体の一部や、代謝産物以外の物質、例えば、肥料のように植物が外界から直接取り込んだ物質が混在していても構わない。肥料等は、施肥又は添加した物質が明らかであれば、代謝産物と区別し得るからである。代謝産物は、水溶性及び脂溶性を問わないことから、抽出物の抽出に用いる溶媒は、水溶液又は有機溶媒（例えば、低級アルコール、エーテル、クロロホルム、酢酸エチルエステル、キシレン等）のいずれであってもよい。
【００２６】
抽出工程では、被検植物体の全部又は一部から抽出物を抽出する。抽出物を抽出する方法は、植物体から代謝産物を抽出できる方法であれば特に限定しない。例えば、水溶性の代謝産物を得る場合には、必要に応じて植物体を粉砕等した後、加水し、圧搾後、ろ過すればよい。また脂溶性の代謝産物を得る場合には、必要に応じて植物体を粉砕等した後、メタノール等の有機溶媒に所定の期間浸漬し、その後、ろ過すればよい。これらの抽出方法の詳細については、当該分野で公知の技術を用いることができる。例えば、Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962、又はSuzuki et al., Phytochemistry (2008) 69, 99-111に記載の方法を参照すればよい。
【００２７】
２−２．検出・定量工程
「検出・定量工程」とは、前記抽出工程で得られた抽出物から両親種それぞれの親種マーカーを検出し、その存在量を定量する工程である。
本発明において「親種マーカー」とは、被検植物の親種に特有の代謝産物をいう。
【００２８】
「被検植物の親種」とは、被検植物の親種となった植物種をいう。被検植物が雑種であれば、親種は、その両親種となった互いに異なる2種が該当する。例えば、ペリータ／ブラシアーナ雑種の場合、その両親種は、ペリータとブラシアーナである。また、被検植物が雑種である蓋然性が高く、その両親種が明らかでない場合には、推定される両親候補種が両親種となる。この場合、両親候補種は、必ずしも2種である必要はなく、両親種の可能性を有する3種以上であってもよい。例えば、被検植物が、ペリータ、ブラシアーナ及びカマルドレンシスの3種のうちいずれか2種を両親種とする雑種の蓋然性が高い場合、前記3種を両親候補種とすることができる。両親種でない種が混在していても、本工程の親種マーカーの有無から両親種以外の種を排除し得るからである。
【００２９】
「両親種のそれぞれに特有の代謝産物」とは、それぞれの親種間で抽出物中に含まれる同一代謝産物の存在量を比較したときに、一方の親種におけるその存在量が他方の親種におけるその存在量よりも統計学的に有意に多い代謝産物をいう。また、ここでいう「特有」は、対象となる両親種間、すなわち原則としては2種間、また両親候補種が3種以上の場合にはそれらの種間で特有であれば足りる。例えば、ペリータ／ブラシアーナ雑種において、ペリータ特有の代謝産物とは、ペリータとブラシアーナ間においてペリータに特有の代謝産物であれば、それをペリータに特有の親種マーカーとして用いることができる。また、ペリータ、ブラシアーナ及びカマルドレンシスの3種のうちいずれか2種を両親種とする雑種において、ペリータ特有の代謝産物とは、前記3種間においてペリータに特有の代謝産物であれば足りる。同属間において、その種のみで検出される種特異的な代謝産物は、親種マーカーとして非常に好ましいが、通常は、そこまでの種特異性を要しない。したがって、ペリータ特有の代謝産物がユーカリプタス属内でペリータ特有である必要はない。
【００３０】
親種マーカーは、各種に特異的に存在することが公知の代謝産物が利用できる他、親種マーカーとして特有の代謝産物を新たに選択し、それを用いてもよい。
【００３１】
親種マーカーを新たに選択する場合、その選択方法は特に限定はしない。以下、一例を挙げて具体的に説明をする。
【００３２】
２−２−１．親種マーカー選択方法
ここでは、親種マーカー選択方法として、「抽出ステップ」及び「選択ステップ」を含む方法を例に挙げて説明する。
【００３３】
（１）抽出ステップ
「抽出ステップ」とは、両親種のそれぞれの植物体の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。
抽出物を抽出する方法は、前記抽出工程の方法と同様に行えばよい。ただし、植物体の一部から抽出物を抽出する場合、その一部は、親種間で同一部分を用いることが好ましい。例えば、ペリータとブラシアーナが親種の場合、ペリータの葉から抽出物を抽出するのであれば、ブラシアーナも葉から抽出物を抽出することが好ましい。両種の条件を可能な限り統一するためである。また、本ステップに供する親種は、栄養状態、気象条件（例えば、気温、日照時間、湿度）、土壌条件、時間的条件（例えば、生育期間、生育時期）及び健康状態等の生育諸条件も互いに可能な限り同一にしておくことが好ましい。同一バックグラウンドの植物から得られる抽出物中で、その存在量に顕著な差異がある代謝産物は、擬陽性の低い高精度な親種マーカーとなり得るからである。親種の生育条件を同一にする方法としては、例えば、人工気象器内のような人工的環境下で合成培地によって、好適には水耕栽培で、育成する方法等が挙げられる。
【００３４】
（２）選択ステップ
「選択ステップ」とは、得られた抽出物中に含まれる同一代謝産物の存在量を両親種間で比較したときに、一方の親種のその存在量が他方の親種のその存在量よりも統計学的に有意に多い代謝産物を前記一方の親種に特有の親種マーカーとして選択するステップである。
【００３５】
本明細書において「存在量」とは、前記抽出ステップで得られた抽出物中に含まれる特定の代謝産物の分量である。存在量は、質量分析法におけるイオン強度又は濃度のような相対量であってもよいし、容量のように、等量の抽出物中の代謝産物の絶対量であってもよい。
【００３６】
本ステップでは、前記抽出ステップで各親種から得られた抽出物に含まれる同一代謝産物を検出及び定量し、その存在量を両親種の間で比較する。代謝産物を検出及び定量する方法は、特に限定はしないが、例えば、質量分析法又はNMR法を利用することができる。質量分析法は、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）を含む。これらの分析方法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962、Hirai et al. Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101(27) 10205-10210、Sato et al., The Plant Journal (2004) 40(1)151-163、又はShimizu et al., Proteomics (2005) 5,3919-3931を参照にすればよい。
【００３７】
比較の結果、代謝産物の存在量が一方の親種において他方の親種よりも統計学的に有意に多い場合には、その代謝産物をその一方の親種に特有の親種マーカーとして選択する。ここで「統計学的に有意」とは、両親種間で同一代謝産物の量的差異を統計学的に処理したときに有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の方法であれば、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、多重比較検定法を用いることができる。具体的には、鈴木▼完▲之；統計学の基礎、永田靖ら；統計的多重比較法の基礎に記載の方法に準じて行えばよい。
【００３８】
代謝産物の存在量を両親種間で比較したときに、一方の親種に、他方の親種よりも統計学的に有意に多い代謝産物が複数存在する場合には、いずれの代謝産物もその一方の親種に特有の親種マーカーとなり得る。
【００３９】
親種マーカーは、通常は両親種である2種間の抽出物から上記方法で選択されるが、両親候補種が3種以上の場合には、例えば、全両親候補種間の抽出物から上記方法で同様に選択すればよい。親種マーカーの具体例として、3種のユーカリ（ペリータ、ブラシアーナ、カマルドレンシス）間で上記方法によって選択された親種マーカーを表２に示す。
【００４０】
【表２】
0005691795.tif 000003
【００４１】
表中のM1、M4、M6及びM7は、上記親種マーカー選択方法によって抽出物から得られた親種マーカーとしての代謝産物を示している。また、表中の「○」又は「×」は、3種のユーカリにおいて、それぞれの代謝産物が抽出物中に統計学的に有意に存在する（○）か否（×）かを示す。例えば、M1は、前記3種の中で、ペリータのみに存在する代謝産物なので、ペリータ特有の親種マーカー（以降、「ペリータマーカー」とする）となり得る。同様に、M4は、ブラシアーナ特有の親種マーカー（以降、「ブラシアーナマーカー」とする）に、またM6又はM7は、カマルドレンシス特有の親種マーカー（以降、「カマルドレンシスマーカー」とする）になり得る。なお、各代謝産物は、プリカーサイオン及びプロダクトイオンの各質量電荷比、並びにMSにおける保持時間（分）によって物質を特定している。
【００４２】
表２に示した親種マーカーは、3種のうちのいずれか2種を両親種とする雑種が被検植物の場合、それぞれの親種マーカーとして用いることができる。例えば、本発明をペリータ／ブラシアーナ雑種に適用する場合、両親種はペリータ及びブラシアーナであることから、表２よりM1をペリータマーカーに、またM4をブラシアーナマーカーにすればよい。同様に、本発明をペリータ／カマルドレンシス雑種に適用する場合、両親種はペリータ及びカマルドレンシスであることから、表２よりM1をペリータマーカーに、またM6又はM7をカマルドレンシスマーカーにすればよい。この場合、カマルドレンシスマーカーが、2種存在することになるが、いずれか一方を用いれば足りる。
【００４３】
さらに、親種マーカーは、雑種である蓋然性が高いがその両親種が不明な場合に、両親種と推定される両親候補種の中から真の両親種を選択する上でも有用である。例えば、被検植物がペリータ、ブラシアーナ及びカマルドレンシスのいずれかを両親種とする雑種であることまでは推定できるが、真の両親種が不明な場合に、その被検植物の抽出物から、表１に記載のいずれの代謝産物が検出できるかを調べればよい。M1は、ペリータには存在するがブラシアーナとカマルドレンシスには存在せず、M4は、ブラシアーナには存在するがペリータとカマルドレンシスには存在しない。また、M6及びM7は、カマルドレンシスには存在するがペリータとブラシアーナには存在しない。したがって、存在量の多寡にかかわらずM1及びM4が検出され、M6及び／又はM7が検出されなかった場合、その被検植物の両親種がペリータとブラシアーナであると同定できる。つまり、両親候補種が3種以上存在した場合であっても、本工程で被検植物の真の両親種を特定することができる。
【００４４】
加えて、親種マーカーは、被検植物が雑種であるか否かを判定する上でも有用である。前述のように、本発明は、雑種の形質推定方法であって、被検植物は、その前提として雑種であることを要する。しかし、被検植物は、雑種であることが予め明らかである必要はなく、雑種である蓋然性があれば足りることから、被検植物が雑種でない可能性、すなわち、どちらかの親種である可能性を含み得る。しかしながら、本工程では、被検植物が雑種であるか、又はどちらか一方の親種であるかを親種マーカーの検出結果に基づいて判定し得る。例えば、ペリータ／ブラシアーナ雑種である蓋然性が高かった被検植物からペリータマーカーM1は検出されたが、ブラシアーナマーカーM4が検出されなかった場合、さらに他の可能性のあるカマルドレンシスマーカーM6又はM7も検出されなかった場合、その被検植物は、雑種ではなくペリータであると判定できる。つまり、本工程では、被検植物が雑種であるか否かを判定することができる。
【００４５】
上記親種マーカー選択方法によって得られた親種マーカーのデータは、それを得た際の両親種の組合せや、親種マーカーを特定し得る数値データ（例えば、プリカーサイオン及びプロダクトイオンの質量電荷比やMSの保持時間等）をデータベース化して保存しておけば、その後、同様の両親種の雑種に対して本発明の推定方法を適用する場合に、直ちに親種マーカーとして利用できることから本発明に資する。
【００４６】
２−２−２．検出・定量方法
前記抽出工程で得られた被検植物の抽出物に含まれる代謝産物を検出し、その存在量を定量する方法は、親種マーカーを検出及び定量可能な方法であれば特に限定はしない。例えば、上述の質量分析法及びNMR法を用いることができる。また抗原抗体反応を応用した方法も利用できる。例えば、各親種マーカーに特異的な抗体を作製し、それを用いてELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法、表面プラズモン共鳴（SPR）法、又は水晶振動子マイクロバランス（QCM）法によって検出及び定量する方法が挙げられる。これらの方法は、いずれも当該分野で公知の技術であり、例えば、永田和弘、及び半田宏, 生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法, シュプリンガー・フェアラーク東京, 東京, 2000、J.Christopher Love,L.A.Estroff，J.K.Kriebel,R.G.Nuzzo,G.M.Whitesides(2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169；森泉豊榮，中本高道，(1997) センサ工学，昭晃堂等に記載の方法に準じて行うことができる。より正確な検出及び定量結果を得るために二以上の方法を組み合わせて使用してもよい。
【００４７】
具体例として、質量分析法により、被検植物の代謝産物からブラシアーナマーカーであるM4を検出する方法について説明をする。タンデム型質量分析器には、通常、4重極（Quadruple）がQ1、Q2、Q3と3つ直列に並んでいる。被検植物から得られた抽出物を質量分析器に適用した場合、その抽出物は、3つの4重極を順番に通過した後、検出器で検出される。ブラシアーナマーカーを検出する場合であれば、まず、M4のプリカーサイオンの質量電荷比である497.2を予めQ1に設定しておく。この設定によって497.2の質量電荷比をもった代謝産物はQ1を通過できるが、それ以外の質量電荷比を有する代謝産物は排除され、次のQ2に進むことはできない。次に、Q2では高電圧がかけられ代謝産物が分解され、プロダクトイオンが発生する。ここで、ブラシアーナマーカーのプロダクトイオンの質量電荷比である166.8をQ3に予め設定しておく。この設定によって、Q2を通過した代謝産物から166.8の質量電荷比をもったプロダクトイオンを発生する代謝産物のみがQ3を通過し、検出器にて検出される。したがって、被検植物の抽出物中にブラシアーナマーカーM4が存在していれば、検出器にて検出されることとなる。
【００４８】
なお、前記具体例は、プリカーサイオンとプロダクトイオンの二つの質量電荷比を用いた方法である。この方法は、より高精度に親種マーカーである代謝産物を同定することが可能であるが、通常はプリカーサイオンの質量電荷比のみでも親種マーカーの検出は可能である。
【００４９】
２−３．推定工程
「推定工程」とは、一方の親種マーカーの存在量に対する他方の親種マーカーの存在量比が所定の値以上の場合、前記被検植物には前記他方の親種の形質が現れると推定する工程をいう。
【００５０】
本工程における形質の推定は、被検植物において、その個体発生段階にかかわらず、両親種のいずれの形質が現在現れているか及び／又は将来強く現れるかを推定することをいう。ここで「現在現れている(形質)」とは、その個体に既に現れてはいるが、視認による識別が困難な形質、すなわち性質を意味する。また、「将来現れる(形質)」とは、前述の性質、及び／又は現在は被検植物において顕著に現れていないが将来強く現れることが予測される形質を意味する。この形質推定は、親種マーカーの存在量比に基づいて推定し得る。
【００５１】
本工程において「存在量比」とは、存在量の比である。すなわち、一方の親種マーカーの存在量に対して他方の親種マーカーの存在量が何倍あるかを意味する。存在量比を算出する場合、「一方の親種」が両親種のどちらの親種であるかは限定しない。例えば、被検植物がペリータ／ブラシアーナ雑種の場合、当該一方の親種がブラシアーナであってもよい。この場合、前記存在量比は、ブラシアーナマーカーM4の存在量に対するペリータマーカーM1の存在量比、すなわちM1／M4によって求められる値となる。逆に、一方の親種がペリータである場合は、前記存在量比は、ペリータマーカーM1の存在量に対するブラシアーナマーカーM4の存在量、すなわちM4／M1によって求められる値となる。
【００５２】
本工程では、前記存在量比が所定の値以上であった場合に、被検植物に一方の親種の形質が現れると推測する。「所定の値」とは、予め定められた値であって、被検植物の両親種の種類及び両親種のどちらの親種を基準とするかによって適宜定められる。
【００５３】
所定の値を決定する方法は、特に限定はしないが、通常は、両親種が同一であることが明らかな複数の雑種個体において、その雑種が両親種のいずれにより近い形質を有するかが明瞭な差異として現れた段階で、親種マーカーを検出・定量し、得られたそれぞれの親種マーカーの存在量比を個体ごとに算出し、算出された存在量比とその個体において明瞭な差異として現れた形質との関連性を比較し、一方の親種の形質が強く現れた群と他方の親種の形質が強く現れた群の2つの群に雑種集団を分割し得る存在量比を所定の値として導き出せばよい。一例として、被検植物がペリータ／ブラシアーナ雑種であって、ブラシアーナマーカーM4の存在量に対するペリータマーカーM1の存在量比（＝M1／M4）の場合であれば、実施例１の結果から前記所定の値は、10となる。逆に、ペリータマーカーM1の存在量に対するブラシアーナマーカーM4の存在量比（＝M4／M1）の場合であれば、所定の値は0.1となる。
【００５４】
したがって、ペリータ／ブラシアーナ雑種において、M1／M4≧10の場合に、該雑種では、ペリータの形質がブラシアーナの形質よりも強く現れると推定する。一方、M1／M4＜10％の場合に、該雑種では、ブラシアーナの形質がペリータの形質よりも強く現れると推定する。逆に、ペリータ／ブラシアーナ雑種において、M4／M1≧0.1の場合に、該雑種では、ブラシアーナの形質が強く現れると推定する。一方、M4／M1＜0.1％の場合に、該雑種では、ペリータの形質が強く現れると推定する。
【実施例】
【００５５】
＜実施例１＞植物雑種における親種マーカーと形質との関連性（１）
本発明者は、植物雑種がその両親種のそれぞれに含まれる特有の代謝産物をいずれも包含すること、その包含する代謝産物の結果に基づいて、その個体が雑種であるか否かを判定する方法を以前に開発した（PCT/JP2010/070219参照）。すなわち、LC-MS/MSを用いて、ユーカリプタス・ペリータ特有の代謝産物M1及びユーカリプタス・ブラシアーナ特有の代謝産物M4について植物の抽出物を解析した場合、図２に示すように、ペリータ由来の抽出物からはM1のみが、ブラシアーナ由来の抽出物からはM4のみが、それぞれピークとして検出されるのに対して、ペリータ／ブラシアーナ雑種の抽出物からは、M1とM4の双方がピークとして検出されるという知見に基づき、雑種判定方法の発明を完成させた。
【００５６】
本発明では、該雑種に含まれる両親種のそれぞれに特有の代謝産物（親種マーカー）の存在量と該雑種の形質との関連性の有無について、ペリータ／ブラシアーナ雑種を用いて検証した。
【００５７】
（材料及び方法）
ペリータ／ブラシアーナ雑種の5〜7年生の成木50個体について検証した。前記雑種のそれぞれが、いずれの親種由来の形質を有するかについては、各個体の樹皮に基づいて鑑別した。すなわち、図１に示すようにブラシアーナ様雑種は、一方の親種であるブラシアーナと同様に滑面状の樹皮を示すのに対して、ペリータ様雑種は、もう一方の親種であるペリータと同様に縦に紐状に裂けた樹皮を示す。この外部形態上の基準によって上記雑種を分類した結果、50個体のうち、8個体がペリータ様雑種であり、42個体がブラシアーナ個体であることが明らかとなった。
【００５８】
上記表１より、ペリータマーカーであるM1及びブラシアーナマーカーであるM4を用いて、各雑種個体についてその存在量をLC-MS/MSのピーク面積で算出した。具体的には、以下の通りである。
【００５９】
（１）代謝物の抽出
前記各雑種個体のそれぞれから健全な葉を1枚採取し、乾燥重量で約30mgとなるように計量して、セイフロックチューブに入れた。直径5mmのジルコニアボール（東ソー株式会社）を前記チューブに加え、Tissue Lyser II（株式会社キアゲン）で前記葉を25Hzにて30秒間振動させて粉砕した。続いて、チューブに水／メタノール／クロロホルム混合用液（それぞれ重量比で1:2.5:1）を1ml加え、Tissue Lyser IIを用いて25Hzで120秒間振動させることによって抽出液を抽出した。抽出液を12000×gで10分間遠心分離した後、上清約0.9mLを別のチューブにとり、そこに水0.4mlを加え、12000×gで10分間遠心分離させることにより上層（メタノール／水）と下層（クロロホルム）に分離させた。得られた上層をMillex-LG（ミリポア株式会社)を用いてろ過した後、ろ液をガラスバイアルに移した。
【００６０】
（２）LC-MS/MS分析
上記ろ液のうち2μLを以下の分析条件にてLC-MS/MS分析に供した。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。
【００６１】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
・使用機器：UFLC (島津製作所)
・溶離液A：0.1%ギ酸（和光）入り  水クロマトグラフィー用リクロゾルブ (メルク株式会社) 
・溶離液B: 0.1%ギ酸（和光）入り  アセトニトリルLC/MS用ハイパーグレードリクロゾルブ (メルク株式会社)
・カラム： TSKgel ODS-100V  4.6x100mm 粒子3μｍ  （東ソー株式会社）
・ガードカラム： TSKguardgel ODS-100V, 粒子5μｍ  （東ソー株式会社）
・カラム温度：40℃
・流速：0.8 mL/分
・タイムスケジュールグラジュエントB%
0分:40%, 3分:70%, 3.01分：97%, 5分:97%, 5.01:40%, 
【００６２】
＜MS条件＞
・使用機器：3200QTRAP (アプライドバイオシステムズ)
・スキャンモード：Multiple Reaction Monitoring
・検出方法：ESI-Negtative
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 (アプライドバイオシステムズ)
・Mass Target: 
M1マーカー：Q1: m/z :433.2, Q3: m/z:300.2
M4マーカー：Q1: m/z :497.2, Q3: m/z:166.8
【００６３】
（３）親種マーカーの存在量比と各個体の表現型との関連性
LC-MS/MS分析によって得られたM1及びM4のそれぞれのピーク面積を存在量として、ブラシアーナマーカーM4の存在量に対するペリータマーカーM1の存在量比（M1/M4）を算出し、それぞれの雑種の表現型との関係を検証した。
【００６４】
（結果）
結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
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カッコ内は、サンプル個体数を示す。
【００６６】
表３で示すように、検証した50個体において、外部形態から判定したペリータ様雑種8個体は、M1/M4≧10の範囲に全て（100％）包含された。一方、ブラシアーナ様雑種は、解析不能であった1個体を除けば、41個体全て（97.6％）がM1/M4＜10の範囲内であった。上記の結果から、ペリータ／ブラシアーナ雑種では、M1/M4の値が10以上の場合には、その雑種個体はペリータ様雑種であり、10未満の場合にはブラシアーナ様雑種であることが明らかとなった。
【００６７】
上記の結果から、雑種における形質（本実施例では樹皮形態）とその親種マーカーの存在量比（M1/M4）の間に、強い関連性があることが立証された。
【００６８】
＜実施例２＞植物雑種における親種マーカーと形質との関連性（２）
植物雑種における親種マーカーと形質との関連性において、親種マーカーによって分類されたペリータ様雑種とブラシアーナ様雑種が、実際にそれぞれ一方の親種に類似した形質を示すかを成長性について検証した。
【００６９】
（材料及び方法）
種播3ヶ月後で、苗高約20cm程度のMERU WP産ペリータ実生集団100個体の中から、本発明の雑種の形質推定方法により、M1/M4≧10に基づいてペリータ様雑種3個体を、及びM1/M4＜10に基づいてブラシアーナ雑種2個体を選択した。実生集団には、しばしばこのような雑種が混在することが知られている。
【００７０】
ペリータ純種（親種）10個体、ペリータ様雑種3個体、ブラシアーナ様雑種2個体、ブラシアーナ純種（親種）5個体を土壌量13Lを入れた直径30cmのポットに植栽し、70日間の成長評価試験を実施し、経時的に成長性を調査した。当該分野では、ブラシアーナ純種は個体発生初期の成長が早く、ペリータは個体発生後期の成長速度が速いものの、初期の速度はブラシアーナに比べて遅いとされている。
【００７１】
（結果）
図３に結果を示す。
【００７２】
本発明で分類されたブラシアーナ様雑種は、ブラシアーナ純種とほとんど同じ成長性を示し、個体発生初期の成長速度が速いことが明らかとなった。一方、本発明で分類されたペリータ様雑種は、ペリータ様純種と類似する個体発生初期の成長速度が遅い形質を示した。
【００７３】
以上の結果から、植物雑種における親種マーカーと形質とは、実施例１で立証した樹皮形態に限られず、成長性にも密接な関連性があることが明らかとなった。さらに本発明によって雑種に現れる形質を推定できることが立証された。
【００７４】
＜実施例３＞ユーカリプタス・ペリータ実生苗集団中のユーカリプタス・ブラシアーナ様雑種個体の存在割合
親種マーカーの存在量比に基づいて、ペリータ実生集団600個体中におけるペリータ／ブラシアーナ雑種の混入可能性及びその雑種の混在率を本発明の推定方法を用いて検証した。
【００７５】
（材料）
下記の3産地のペリータ実生苗（種播後3ヶ月個体）を材料に用いた。
【００７６】
・Kiriwo産ペリータ：200個体  （Seed Lot. 19206）
・MERU WP産ペリータ：100個体  （Seed Lot. 20659）
・SSO KAIRI IRIAN JAYA産ペリータ：300個体  （Seed Lot. 19672）
【００７７】
（方法）
基本的な方法は、実施例１に準じた。
【００７８】
（結果）
結果を表４に示す。3産地のペリータ実生集団600個体中にブラシアーナ様雑種個体21個体存在することが推定された。また、それらの内訳は、kiriwo産17個体、Meru WP産3個体、KAIRI IRIAN JAYA産1個体であり、kiriwo産ペリータに最もブラシアーナ様雑種が混入していることが分かった。
【００７９】
Kiriwoは、ブラシアーナとの天然分布域と一致していることから、今回解析した3つの産地の中では、最もペリータ／ブラシアーナ雑種が混入している可能性が高いことが、植林関係者の間で経験的に知られている。表４の3つの産地の中で、Kiriwo産ペリータが最もペリータ／ブラシアーナ雑種の混入割合が高く、かつブラシアーナ様雑種の存在割合も高くなったが、この結果は、上記産地事情とも一致しており、本発明の有効性がさらに示唆された。
【００８０】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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