(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ２０抗体を含む、成熟Ｂ細胞枯渇による、自己免疫の異常によって生じたものではない心筋梗塞を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アテローム性動脈硬化の予防または治療に、特にアテローム性動脈硬化の予防または治療のためのＢ細胞枯渇剤に関する。
【０００２】
発明の背景
アテローム性動脈硬化は、欧米社会に最もよく見られる死因であり、２０年以内に世界中の心血管疾患の主要な原因になると予測されている。
【０００３】
アテローム性動脈硬化は、動脈硬化性血管疾患（ＡＶＤ）の一因となり、ＡＶＤは、冠動脈（虚血性心疾患を引き起こす）、脳循環（脳血管疾患を引き起こす）、大動脈（血栓症および破裂を起こしやすい動脈瘤を生成する）および末梢血管、典型的には下肢（末梢血管疾患および間欠性跛行を引き起こす）に影響を与えることがある。虚血性心疾患（ＩＨＤ）には、アンギナ（心筋への血液供給不足により起こる胸痛）および心筋梗塞（心筋の壊死）が挙げられ、脳血管疾患には、卒中および一過性脳虚血発作が挙げられる。男性３人に１人および女性４人に１人がＩＨＤが原因で死亡し、ＩＨＤについての死亡率は、１９９０年に１０万人あたり５８人であった。
【０００４】
アテローム硬化性プラークは、大きな動脈の内皮下の脂肪線条として始まる。マクロファージの動員およびそれらのその後のＬＤＬ由来コレステロールの取込みは、脂肪線条形成の一因となる主要な細胞事象である。多数の連なる証拠により、ＬＤＬの脂質およびアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）成分における酸化的または非酸化的改変が脂肪線条の初期形成を推進することが示唆されている。通常はネイティブなＬＤＬのin vitro酸化後に研究された酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）の特異的性質は、改変の程度に依存する。これは、ＬＤＬ粒子がＬＤＬレセプターによってまだ認識されうる「最小」改変（ｍｍＬＤＬ）から、ａｐｏＢ成分が断片化しており、リシン残基が酸化脂質の反応性分解産物で共有結合的に改変されている大規模な酸化まで変動しうる。そのような粒子は、ＬＤＬレセプターによって結合されないが、マクロファージおよび平滑筋細胞上に発現する、いわゆるスカベンジャーレセプターによって結合される。多数の炎症促進性およびアテローム発生促進性は、ｍｍＬＤＬおよびｏｘＬＤＬならびにそれらの成分に起因するとされてきた。例えば、リゾホスファチジルコリンまたは酸化リン脂質は、単球の接着、単球およびＴ細胞の走化性を増大させ、炎症促進性遺伝子の発現を誘導することができる。動脈壁への単球の動員およびそれに続くマクロファージへの分化は、当初は細胞傷害性および炎症促進性のｏｘＬＤＬ粒子またはアポトーシス細胞を除去することによって役割を果たすことがあるとはいえ、マクロファージの累進的蓄積およびそれらのｏｘＬＤＬ取込みは、最終的に動脈硬化病変の発生を導く。
【０００５】
比較的単純な脂肪線条からより複雑なプラークへの移行は、動脈壁中膜層（medial layer）から内弾性板および内膜もしくは内皮下の間隙への平滑筋細胞の遊走、または平滑筋細胞前駆細胞の動員によって特徴づけられる。内膜平滑筋細胞は、増殖し、改変リポタンパク質を取込むことにより泡沫細胞の形成の一因となり、線維被膜の発生を導く細胞外マトリックスタンパク質を合成することができる。したがって、進行したアテローム硬化性プラークは、模式的に二つの部分、すなわち表面層を構成する線維被膜および深層を構成する脂質コアに分けられる。この細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、コラーゲン、エラスチン、糖タンパク質およびプロテオグリカンを含めた極めて異なる高分子から構成される。大量のＥＣＭが線維被膜に沈着し、プラークの強度が維持される一方で、脂質コアでは脂質の沈着に加えてＥＣＭの分解が高まり、組織の易損性増大に至る。このプラークの易損性は、今度はプラークの脆弱性を生じ、プラーク破裂の原因となる。
【０００６】
このプラーク発生期は、広範囲の細胞性および体液性応答ならびに慢性炎症状態の多数の特徴の獲得を招く、単球／マクロファージとＴ細胞との相互作用によって影響される。発生途中の病変の細胞要素の間で重大なクロストークが起こると思われる。病変性Ｔ細胞は、活性化しており、Ｔｈ１サイトカインおよびＴｈ２サイトカインの両方を発現すると思われる）。同様に、マクロファージ、内皮細胞および平滑筋細胞は、それらのＭＨＣクラスＩＩ分子ならびにＴＮＦ、ＩＬ−６およびＭＣＰ１などの多数の炎症産物の発現に基づき活性化すると思われる。
【０００７】
そこで、アテローム性動脈硬化を処置するための新しい信頼できる方法の公認で不変の必要性がある。
【０００８】
アテローム性動脈硬化を処置するための既存のアプローチは、Ｔｈ１およびＴｈ２経路が主要な役割を果たすと思われるという事実に基づく。したがって、調節性免疫を促進する免疫調節処置は、アテローム性動脈硬化を治療および／または予防するための魅力的な手段となりうる。これは、Ｔｒ１細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞またはＴｈ３細胞のような調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の発生を促進することによって達成することができよう。それに関連して、自己および非自己抗原に対する免疫寛容を能動的に維持する自然発生性ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）調節性Ｔ細胞が、いくつかのマウスモデルにおいてアテローム性動脈硬化の強力な阻害因子であることが示された。
【０００９】
他方で、最近の研究から、マウスモデルにおいてＢ細胞欠乏がアテローム性動脈硬化を増大させることが示唆されている（Major al. 2002）。別の最近の研究から、アテローム性動脈硬化に対する防御が、Ｂ細胞によって付与されたことが示された（Caligiuri et al., 2002）。したがって、従来技術から、Ｂ細胞の枯渇がアテローム性動脈硬化を処置するための有望な方法ではないことが示唆されており、それは、以下の特許出願に開示された（が実証されていない）ことに反する：US2004/202658、US2005/186206、US2008/260641、国際公開公報第２００７／０５３６６１号およびUS2004/167619。
【００１０】
発明の概要
本発明は、アテローム性動脈硬化の治療または予防のためのＢ細胞枯渇剤に関する。
【００１１】
本発明は、また、アテローム性動脈硬化の治療または予防のための薬学的組成物に関する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明者らは、Ｂ細胞枯渇剤（すなわち抗ＣＤ２０抗体）の投与が、マウスモデルにおいてアテローム硬化性プラークの大きさを顕著に縮小させることを実証した。
【００１３】
Ｂ細胞依存性応答は、（自己）免疫障害の病理発生に関与し、Ｂ細胞枯渇は、いくつかの免疫介在性疾患の負荷を顕著に軽減する。しかし、Ｂ細胞活性化は、今日までアテローム性動脈硬化に対する防御に関連した（Caligiuri et al., 2002; Major et al., 2002; Binder et al., 2004; Miller et al., 2008）ことから、Ｂ細胞枯渇療法が、心血管リスクを高めるであろうと示唆される。
【００１４】
本明細書において本発明者らは、ＣＤ２０モノクローナル抗体を使用した成熟Ｂ細胞枯渇が、予想外にその疾患の様々なマウスモデルにおいてアテローム性動脈硬化の顕著な軽減を誘導することを示す。この処置は、ＩｇＧ型抗酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）抗体に比べて、天然で潜在的に防御性の抗ｏｘＬＤＬ ＩｇＭ自己抗体の産生を保ち、病原性Ｔ細胞活性化を著しく軽減する。Ｂ細胞枯渇のアテローム形成防御メカニズムは、Ｔ細胞由来インターフェロンγの分泌低下およびインターロイキン１７（その中和はＣＤ２０抗体介在性アテローム形成防御を打ち消す）の産生亢進に向けた免疫応答のスイッチを伴う。
【００１５】
これらの結果は、Ｂ細胞活性化がアテローム発生に全体に防御的役割を果たし、Ｂ細胞モデュレーションに基づく新しい抗アテローム発生戦略を確認し、他の免疫介在性疾患についてＣＤ２０抗体のようなＢ細胞枯渇剤で現在処置されている患者が、動脈硬化病変の発生または炎症を制限することによる心血管リスクの軽減からも利益を得られることを示唆している。
【００１６】
本発明者らは、また、Ｂ細胞枯渇が、心筋梗塞に有益であることを示した。
【００１７】
定義
「Ｂ細胞」という用語は、当該技術におけるその一般的な意味を有する。Ｂ細胞は、（Ｔ細胞によって支配される細胞性免疫応答とは対照的に）体液性免疫応答に大きな役割を果たすリンパ球である。
【００１８】
「Ｂ細胞枯渇剤」は、患者のＢ細胞を枯渇もしくは破壊する分子であって、かつ／または例えばＢ細胞によって誘発される体液性応答を軽減もしくは予防することによって、一つもしくは複数のＢ細胞機能を妨害する分子である。Ｂ細胞枯渇剤は、好ましくはＢ細胞表面マーカーに結合する。Ｂ細胞枯渇剤は、好ましくはそれで処置された患者のＢ細胞を枯渇する（すなわち循環Ｂ細胞レベルを低下させる）ことができる。そのような枯渇は、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｂ細胞増殖の阻害および／またはＢ細胞死の誘導（例えばアポトーシスによる）のような様々なメカニズムにより達成することができる。Ｂ細胞枯渇剤には、非限定的に、好ましくはＢ細胞表面マーカーに結合し、場合により細胞傷害剤とコンジュゲーションまたは融合した抗体、合成またはネイティブな配列のペプチドおよび低分子アンタゴニストが挙げられる。好ましいＢ細胞枯渇剤は、抗体、さらに好ましくはＢ細胞枯渇抗体を含む。
【００１９】
好ましい態様では、Ｂ細胞枯渇剤は、形質細胞を枯渇する能力を有さない。別の好ましい態様では、Ｂ細胞枯渇剤は、Ｂ１０細胞（またはＢｒｅｇ細胞）を枯渇する能力を有さない。別の好ましい態様では、Ｂ細胞枯渇剤は、Ｂ１細胞を枯渇する能力を有さない。したがって、特に好ましい態様では、Ｂ細胞枯渇剤は、形質細胞およびＢ１０細胞を枯渇する能力を有さない。したがって特に好ましい態様では、Ｂ細胞枯渇剤は、形質細胞、Ｂ１０細胞およびＢ１細胞を枯渇する能力を有さない。
【００２０】
「補体依存性細胞傷害作用」または「ＣＤＣ」は、補体存在下でのターゲット細胞の溶解を表す。古典的補体経路の活性化は、そのコグネイト抗原に結合した抗体への補体系第１成分の結合によって開始する。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoroら（1997）に記載されたようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。
【００２１】
「抗体依存性細胞性細胞傷害作用」または「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、単球およびマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター（ＦｃＲ）に結合した分泌抗体が、これらの細胞傷害性エフエクター細胞が抗原担持ターゲット細胞に特異的に結合して、続いてターゲット細胞を死滅させることができるようにする、細胞傷害作用の一形態を表す。関心が持たれる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたようなin vitro ＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。
【００２２】
本明細書における「Ｂ細胞表面マーカー」または「Ｂ細胞ターゲット」または「Ｂ細胞抗原」は、それに結合するＢ細胞枯渇剤でターゲティングすることができる、Ｂ細胞表面に発現される抗原である。例示的なＢ細胞表面マーカーには、非限定的にＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５およびＣＤ８６白血球表面マーカーが挙げられる。特に関心が持たれるＢ細胞表面マーカーは、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織に比べて、Ｂ細胞に優先的に発現され、前駆Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞の両方に発現することができる。一態様では、マーカーは、幹細胞期から形質細胞に終末分化する直前の工程までの系列分化にわたりＢ細胞上に見出されるＣＤ２０またはＣＤ１９のようなマーカーである。
【００２３】
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血またはリンパ器官のＢ細胞の９０％超の表面に見出される３５kDaの非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は、初期プレＢ細胞の発生の間に発現され、形質細胞の分化まで存続する。ＣＤ２０は、正常Ｂ細胞に加えて悪性Ｂ細胞の両方に存在する。文献におけるＣＤ２０についての他の名称には、「Ｂリンパ球拘束性抗原」および「Ｂｐ３５」が挙げられる。ＣＤ２０抗原は、例えばClark et al. PNAS (USA) 82:1766 (1985)に記載されている。
【００２４】
本発明によると、「抗体」または「免疫グロブリン」は、同じ意味を有し、本発明において等しく使用される。本明細書に使用されるような「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を表す。このように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体フラグメントに加えて、抗体および抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）を包含する。天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合により相互に結合し、各重鎖が、ジスルフィド結合により軽鎖に結合している。軽鎖にはλ（ｌ）およびκ（ｋ）の２種類がある。重鎖には抗体分子の機能的活性を決定する５種類の主要クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを有する。軽鎖は、２個のドメイン、すなわち１個の可変ドメイン（ＶＬ）および１個の定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４個のドメイン、すなわち１個の可変ドメイン（ＶＨ）および３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖および重鎖両方の可変領域（それぞれＶＬおよびＶＨ）は、結合認識および抗原への特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の関連、分泌、経胎盤移動、補体結合、およびＦｃレセプター（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的性質を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１本の軽鎖の可変部分および１本の重鎖の可変部分から成る。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基から構成される。場合によっては、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基が、全体的なドメイン構造に、故に結合部位に影響を与える。相補性決定領域またはＣＤＲは、一緒になってネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を確定するアミノ酸配列を表す。免疫グロブリンの各軽鎖および重鎖は、それぞれ、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と呼ばれる３個のＣＤＲを有する。したがって、抗原結合部位は、それぞれ重鎖および軽鎖のＶ領域由来のＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挟まれたアミノ酸配列を表す。
【００２５】
「キメラ抗体」という用語は、本発明の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ならびにヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインを含む抗体を表す。
【００２６】
本発明によると「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体由来の可変領域フレームワークおよび定常領域を有する抗体であって、本発明の抗体のＣＤＲを保持する抗体を表す。
【００２７】
「Ｆａｂ」という用語は、約５００００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで処理することによって得られたフラグメントのうちＨ鎖のＮ末端側約半分およびＬ鎖全体がジスルフィド結合により一緒に結合しているフラグメントを意味する。
【００２８】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１０００００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるペプシンで処理することによって得られたフラグメントのうちヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合した、Ｆａｂよりわずかに大きなフラグメントを表す。
【００２９】
「Ｆａｂ’」という用語は、約５００００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られるフラグメントを表す。
【００３０】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、通常、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子がペプチドをコードするリンカーによって繋がったものを含む、遺伝子融合体から発現される共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価ｓｃ（Ｆｖ）２のような二価および多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合により自然に形成するか、または一価ｓｃＦｖをペプチドリンカーによって結合させることにより生成させることができる。
【００３１】
「二重特異性抗体」という用語は、２個の抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合して同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）になったものを含むフラグメントを表す。同じ鎖の２個のドメインの間に対形成させるには短すぎるリンカーを使用することによって、それらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成されて２個の抗原結合部位を創出する。
【００３２】
「Ｂ細胞枯渇抗体」は、Ｂ細胞表面のＢ細胞表面マーカーに結合し、Ｂ細胞が該細胞表面マーカーに結合したときにＢ細胞の破壊または枯渇を仲介する抗体として定義される。この用語には、抗体フラグメントが含まれる。そのような抗体には、非限定的に、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２１、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３７、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ５２抗体が挙げられる。抗ＣＤ２０抗体の一例は、RITUXAN（登録商標）（リツキシマブ）である。Ｂ細胞枯渇抗体には、また、他のメカニズムによりＢ細胞を破壊する抗体が含まれる。例えば、これらには、Ｂ細胞表面に結合し、致死線量の放射線を送達することによってＢ細胞の破壊を促進する放射性ラベル化抗体が含まれる。これらには、１３１Ｉ−Ｌｙｍ−１（抗ＨＬＡ−Ｄ）、１３１Ｉ−トシツモマブ（BEXXAR（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（Ｙ−９０、Ｉｎ−Ｉｌｌ ZEVALIN（登録商標））および９０Ｙ−エピラツズマブが挙げられる。
【００３３】
本発明に関連して、本明細書に使用されるような「処置する」または「処置」という用語は、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはそのような障害もしくは状態の一つもしくは複数の症状の進行を後退、緩和、または抑制することを意味する。「治療有効量」は、対象に治療上の利益を与えることが必要な活性薬の最少量が意図される。例えば、患者に対する「治療有効量」は、病的症状、疾患の進行、または障害に関連する生理学的状態もしくは障害の屈服への抵抗性を誘導する、回復させる、またはさもなければ改善を引き起こす量である。「予防する」または「予防」は、その最も広い意味で、まだ疾患または状態を有すると診断されていない対象に、その疾患または状態が起こることを予防することを表す。
【００３４】
「患者」という用語は、アテローム性動脈硬化を患うか、または患い易い任意の対象（好ましくはヒト）を表す。
【００３５】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を表す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意の種類の無毒の固形、半固形または液体のフィラー、希釈剤、封入薬または製剤補助物質を表す。
【００３６】
処置方法
本発明は、アテローム性動脈硬化の予防または治療を必要とする患者におけるその予防または治療のための方法であって、該患者のＢ細胞集団を枯渇させる工程を含む方法に関する。
【００３７】
さらに詳細には、本発明は、アテローム性動脈硬化の予防または治療を必要とする患者におけるその予防または治療のための方法であって、該患者にＢ細胞枯渇剤を投与する工程を含む方法に関する。
【００３８】
本発明による方法は、以下の冠動脈障害の一つを示していると診断された患者に供給することができる：
・  無症候性虚血を有するかまたは虚血を有さない無症候性冠動脈性冠疾患；
・  安定狭心症または労作性狭心症などの心筋壊死を有さない慢性虚血性障害；
・  不安定狭心症などの心筋壊死を有さない急性虚血性障害；
・  ＳＴ部分上昇心筋梗塞または非ＳＴ部分上昇心筋梗塞などの心筋壊死を有する虚血性障害。
【００３９】
実際に、該病態は、アテローム性動脈硬化の合併症であり、それ故にアテローム性動脈硬化の徴候と見なされる。
【００４０】
本発明のさらなる局面は、血管障害または冠動脈障害の予防または治療を必要とする患者におけるそれを治療または予防するための方法であって、該患者のＢ細胞集団を枯渇させる工程を含む方法に関する。
【００４１】
さらに詳細には、本発明は、血管障害または冠動脈障害を予防または治療するための方法であって、それを必要とする患者にＢ細胞枯渇剤を投与する工程を含む方法に関する。
【００４２】
特定の態様では、該冠動脈障害または血管障害は、動脈瘤または卒中などのアテローム硬化性血管疾患、無症候性冠動脈性冠疾患、安定狭心症または労作性狭心症などの心筋壊死を有さない慢性虚血性障害；不安定狭心症などの心筋壊死を有さない急性虚血性障害；および心筋梗塞などの虚血性障害から成る群より選択される。
【００４３】
特定の態様では、本発明は、心筋梗塞の予防または治療を必要とする患者におけるそれを予防または治療するための方法であって、該患者のＢ細胞集団を枯渇させる工程を含む方法に関する。
【００４４】
さらに詳細には、本発明は、心筋梗塞を予防または治療するための方法であって、それを必要とする患者にＢ細胞枯渇剤を投与する工程を含む方法に関する。
【００４５】
別の特定の態様では、本発明は、動脈瘤の予防または治療を必要とする患者におけるそれを予防または治療するための方法であって、該患者のＢ細胞集団を枯渇させる工程を含む方法に関する。
【００４６】
さらに詳細には、本発明は、動脈瘤を予防または治療するための方法であって、それを必要とする患者にＢ細胞枯渇剤を投与する工程を含む方法に関する。
【００４７】
特定の態様では、Ｂ細胞枯渇剤は、Ｂ細胞枯渇抗体にあってもよい。
【００４８】
Ｂ細胞表面マーカーに対する抗体は、公知の方法により、例えばとりわけブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスより選択されるホスト動物に適切な抗原またはエピトープを投与することによって産生させることができる。当技術分野で公知の様々なアジュバントは、抗体産生を高めるために使用することができる。本発明の実施に有用な抗体は、ポリクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００４９】
モノクローナル抗体は、培養した持続的細胞系により抗体分子の産生をもたらす任意の技法を使用して調製および単離することができる。産生および単離のための技法には、非限定的にハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法が挙げられる。または、一本鎖抗体の産生について記載された技法（例えば米国特許第４，９４６，７７８号参照）を、Ｂ細胞表面マーカーに対する一本鎖抗体を産生するために適合させることができる。本発明による有用な抗体には、また、非限定的にＦ（ａｂ’）２フラグメント（インタクトな抗体分子のペプシン消化により生成しうる）およびＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２  フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成しうる）を含めた抗体フラグメントが挙げられる。または、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築して、Ｂ細胞表面マーカーに対して所望の特異性を有するフラグメントを迅速に同定可能にすることができる。
【００５０】
ヒト化抗体およびそれ由来の抗体フラグメントは、また、公知の技法により調製することができる。「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えばげっ歯類）免疫グロブリン由来の最小配列を有する非ヒトキメラ抗体の形態である。大体において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために加えられる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも部分もまた含む。ヒト化抗体を製造するための方法は、例えばWinter（米国特許第５，２２５，５３９号）およびBoss（Celltech、米国特許第４，８１６，３９７号）により記載されている。
【００５１】
次に、上記のようにＢ細胞表面マーカーに対する抗体を産生させた後に、当業者は、Ｂ細胞を枯渇させる、例えば抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｂ細胞増殖の阻害またはＢ細胞死の誘導（例えばアポトーシスによる）によりＢ細胞を枯渇させる抗体を容易に選択することができる。
【００５２】
特定の態様では、Ｂ細胞枯渇抗体は、細胞毒性剤または成長阻害剤にコンジュゲーションした、Ｂ細胞表面マーカーに対する抗体にありうる。
【００５３】
したがって、本発明は、細胞毒性剤または成長阻害剤にコンジュゲーションした、Ｂ細胞表面マーカーに対する抗体を含む免疫コンジュゲートの使用を考えている。
【００５４】
本明細書に使用されるときの「成長阻害剤」は、細胞、特にＢ細胞の成長をin vitroまたはin vivoのいずれかで阻害する化合物または組成物を表す。成長阻害剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を遮断する薬剤が挙げられる。古典的Ｍ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、およびドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が挙げられる。例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、および５−フルオロウラシルなどのＤＮＡアルキル化剤のように、Ｇ１に停止させる薬剤は、Ｓ期停止にも及ぶ。
【００５５】
本明細書に使用されるときの「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を表す。この用語は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレート剤、核酸分解酵素などの酵素およびそのフラグメント、抗生物質、および細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素（そのフラグメントおよび／または変異体を含む）、例えば、ゲロニン、リシン、サポニン、および下記に開示された様々な抗腫瘍剤または抗ガン薬を含むことが意図される。他の細胞毒性剤を下に記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００５６】
本発明の抗体と細胞毒性剤または成長阻害剤とのコンジュゲーションは、非限定的にＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を含めた多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して行うことができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら（1987）に記載されたように調製することができる。炭素ラベル化１−イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするためのキレート剤の一例である（国際公開公報第９４／１１０２６号）。
【００５７】
または、抗体と、細胞毒性剤または成長阻害剤とを含む融合タンパク質は、リコンビナント技法またはペプチド合成により製造することができる。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの二つの部分をコードするそれぞれの領域を含んでもよく、それらの領域は、互いに隣接しているか、またはコンジュゲートの所望の性質を損なわないリンカーペプチドをコードする領域により分離されているかのいずれかである。
【００５８】
特定の態様では、好ましいＢ細胞表面マーカーはＣＤ２０である。
【００５９】
したがって、本発明の好ましい態様では、Ｂ細胞枯渇剤は抗ＣＤ２０抗体である。
【００６０】
本発明により考えられている枯渇抗体の例には、ＣＤ２０抗原に結合する抗体：「リツキシマブ」である「Ｃ２Ｂ８」（「RITUXAN（登録商標）」）（米国特許第５，７３６，１３７号、参照により本明細書に明白に組み入れられる）；「Ｙ２Ｂ８」という名称のイットリウム−［９０］−ラベル化２１３８マウス抗体（米国特許第５，７３６，１３７号、参照により本明細書に明白に組み入れられる）；マウスＩｇＧ２ａ「１３１」（場合により１３１１でラベル化して「１３１１−Ｂｌ」抗体（BEXXAR（商標）（登録商標））を産生させる）（米国特許第５，５９５，７２１号、参照により本明細書に明白に組み入れられる）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Press et al. Blood 69(2): 584-591 (1987)）；「キメラ２Ｈ７」抗体（米国特許第５，６７７，１８０号、参照により本明細書に明白に組み入れられる）；およびInternational Leukocyte Typing Workshopから入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１１３３、Ｂ−ＣｌまたはＮＵ−Ｂ２（Valentineら、出典: Leukocyte Typing III (M cMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)）が挙げられる。
【００６１】
本明細書における「リツキシマブ」または「RITUXAN（登録商標）」は、米国特許第５，７３６，１３７号（参照により本明細書に明白に組み入れられる）において「Ｃ２Ｂ８」と名付けられた、ＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を表す。この抗体は、マウス軽鎖および重鎖可変領域配列ならびにヒト定常領域配列を有するＩｇＧκ免疫グロブリンである。リツキシマブは、約８．０nMのＣＤ２０抗原に対して結合親和性を有する。これは、例えばGenentech（South San Francisco, CA）から市販されている。
【００６２】
本発明のＢ細胞枯渇剤は、下記のように薬学的組成物の形態で投与することができる。
【００６３】
好ましくは、該Ｂ細胞枯渇剤は、治療有効量で投与される。
【００６４】
「治療有効量」により、任意の医学的処置に適用可能な妥当な受益度／危険度比で、アテローム性動脈硬化を治療または予防するために十分な量のＢ細胞枯渇剤を意味する。
【００６５】
本発明の化合物および組成物の定期的な総使用は、健全な医学的判断の範囲内で担当医師により決定されることが了解されているであろう。任意の特定の患者についての特異的治療有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度、採用される特定の化合物の活性；採用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；採用される特定の化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；処置期間；採用される特定のポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物などの、医学の技術で周知の要因を含めた多様な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで薬用量を徐々に増加させることが当該技術の範囲内であることは、周知である。しかし、製品の１日薬用量は、大人１人あたり１日に０．０１〜１０００mgの広い範囲を変動しうる。好ましくは、処置される患者の薬用量を症状から調整するために、組成物は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgの活性成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含有する。薬物の有効量は、通常、１日に０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、特に１日に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の薬用量レベルで供給される。
【００６６】
薬学的組成物
本発明のＢ細胞枯渇剤は、薬学的に許容される賦形剤、および場合により生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて治療用組成物を形成させることができる。
【００６７】
本発明の薬学的組成物では、活性主薬を、単独または別の活性主薬と組み合わせて、従来の薬学的支持体との混合物として単位投薬剤形で動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口用懸濁剤または液剤、舌下および口内投与剤形、エアロゾル、植込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内および鼻腔内投与剤形などの経口経路剤形ならびに直腸投与剤形を含む。
【００６８】
好ましくは、薬学的組成物は、注射可能な製剤に薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に等張で無菌の塩類溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはそれらの塩の混合物）、または場合に応じて無菌水もしくは生理食塩水を添加したときに注射液の構成を許す、乾燥、特に凍結乾燥された組成物であってもよい。
【００６９】
注射への使用に適した薬学的剤形には、無菌水性液剤または分散物；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射液または分散物の即時調製用の無菌散剤が含まれる。全ての場合で、その剤形は、無菌でなければならず、容易に注入できる（syringability）程度に流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対抗して貯蔵しなければならない。
【００７０】
本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容される塩として含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水に入れて調製することができる。分散物は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物に入れて、ならびに油に入れて調製することができる。保存および使用の通常の条件で、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するための保存料を含有する。
【００７１】
本発明のＢ細胞枯渇剤は、中性形態または塩形態の組成物に処方することができる。薬学的に許容され得る塩には、例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成された酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成する）が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成された塩は、また、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基由来であってもよい。
【００７２】
担体は、また、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。妥当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散物の場合は必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の阻止は、様々な抗細菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合で、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含ませることが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたらすことができる。
【００７３】
無菌注射液は、適切な溶媒に活性ポリペプチドを必要な量で、必要に応じて上に列挙された様々な他の成分と共に組み入れ、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に分散物は、塩基性分散媒および上に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに、様々な無菌活性成分を組み入れることにより調製される。無菌注射液を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、以前に無菌濾過された活性成分溶液から活性成分の粉末および任意の追加的な所望の成分を回収する真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【００７４】
液剤は、処方の際に処方に適合する方法および治療に有効な量で投与される。製剤は、上記種類の注射液などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。
【００７５】
水溶液での非経口投与のために、例えば溶液は必要ならば適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤は、最初に十分な塩類溶液またはグルコースで等張にする。これらの特別な水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この点について、採用できる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１回分を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解させ、皮下点滴液１０００mlに添加するかまたは提案された注入部位に注射するかのいずれかを行うことができる。処置される対象の状態に応じて、必然的に幾分の変更が投薬量に加えられるであろう。いずれにしても、投与の責任者が、個別の対象について適切な用量を決定するであろう。
【００７６】
本発明のＢ細胞枯渇剤は、治療用混合物の中に１回あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム、または約０．００１〜０．１ミリグラム、もしくは約０．１〜１．０または約１０ミリグラム程度さえ含むように処方することができる。複数用量もまた投与することができる。
【００７７】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与のために処方された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形には、例えば経口投与用の錠剤または他の固形剤；リポソーム製剤；適時放出カプセル剤；および現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【００７８】
以下の図面および実施例を参照して、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】３週間毎に１回の腹腔内注射（２００μg）で３ヶ月間抗マウスＣＤ２０で処置後の血中Ｂ細胞枯渇を示す図である。
【図２】３週間毎に１回の腹腔内注射（２００μg）で３ヶ月間抗ＣＤ２０で処置後の脾臓におけるＢ細胞枯渇を示す図である。図２Ａおよび２Ｂは、２回の異なる実験でのＢ細胞枯渇を示す。
【図３】３週間毎に１回の腹腔内注射（２００μg）で３ヶ月間抗ＣＤ２０で処置後の骨髄におけるＢ細胞枯渇（Ｂ２２０ｈｉｇｈ）を示す図である。
【図４】Ｂ細胞枯渇が脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞によるＣＤ６９発現減少を誘導し、それがＣＤ４ Ｔ細胞の脱活性化を示唆することを示す図である。
【図５】Ｂ細胞枯渇が脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞によるＣＤ４４ｈｉｇｈ発現減少を誘導し、それがＣＤ４ Ｔ細胞の脱活性化を示唆することを示す図である。
【図６】Ｂ細胞枯渇が脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞によるin vivoのＢｒｄＵ取込み減少を誘導し、それがin vivo ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の減少を示す図である。
【図７】精製ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の存在下で抗ＣＤ３抗体でin vitro刺激された精製脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す図である。
【図８】フローサイトメトリー（第１セットの実験）を使用して好中球数（Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋）および単球数（ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｇ−／Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ、ｌｏｗまたは−）を評価したことを示す図である。本発明者らは、３ヶ月の抗ＣＤ２０処置後に好中球数および単球数の増加を見出した。
【図９】フローサイトメトリー（第２セットの実験）を使用して好中球数（Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋）および単球数（ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｇ−／Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ、ｌｏｗまたは−）を評価したことを示す図である。本発明者らは、３ヶ月の抗ＣＤ２０処置後に好中球数および単球数の増加を見出した。
【図１０】体重および血漿コレステロール濃度は、３ヶ月の処置後に群間で類似していたことを示す図である。
【図１１】抗ＣＤ２０抗体（ＭＢ２０−１１）で６または１２週間処置後のマウス群における大動脈洞病変サイズの有意な縮小を示す図である。
【図１２Ａ】ＣＤ２０ｍＡｂ（α−ＣＤ２０）処置がＢ細胞を枯渇させ、アテローム性動脈硬化の発生を軽減することを示す図である。Ａ〜Ｄ欄は、固形飼料（ＣＤ）または欧米型の食事（ＷＤ）のいずれかを給餌されたＡｐｏｅ−／−またはＬｄｌｒ−／−マウスを使用した４回の異なる実験でα−ＣＤ２０で治療後のアテローム性動脈硬化発生の軽減を示す図である。各実験の設定についてオイルレッドＯ染色した大動脈洞の代表的な顕微鏡写真を内膜の病変サイズの定量と共に示す。棒線は、中央値を示す。
【図１２Ｂ】ＣＤ２０ｍＡｂ（α−ＣＤ２０）処置がＢ細胞を枯渇させ、アテローム性動脈硬化の発生を軽減することを示す図である。Ａ〜Ｄ欄は、固形飼料（ＣＤ）または欧米型の食事（ＷＤ）のいずれかを給餌されたＡｐｏｅ−／−またはＬｄｌｒ−／−マウスを使用した４回の異なる実験でα−ＣＤ２０で治療後のアテローム性動脈硬化発生の軽減を示す図である。各実験の設定についてオイルレッドＯ染色した大動脈洞の代表的な顕微鏡写真を内膜の病変サイズの定量と共に示す。棒線は、中央値を示す。
【図１２Ｃ】ＣＤ２０ｍＡｂ（α−ＣＤ２０）処置がＢ細胞を枯渇させ、アテローム性動脈硬化の発生を軽減することを示す図である。Ａ〜Ｄ欄は、固形飼料（ＣＤ）または欧米型の食事（ＷＤ）のいずれかを給餌されたＡｐｏｅ−／−またはＬｄｌｒ−／−マウスを使用した４回の異なる実験でα−ＣＤ２０で治療後のアテローム性動脈硬化発生の軽減を示す図である。各実験の設定についてオイルレッドＯ染色した大動脈洞の代表的な顕微鏡写真を内膜の病変サイズの定量と共に示す。棒線は、中央値を示す。
【図１２Ｄ】ＣＤ２０ｍＡｂ（α−ＣＤ２０）処置がＢ細胞を枯渇させ、アテローム性動脈硬化の発生を軽減することを示す図である。Ａ〜Ｄ欄は、固形飼料（ＣＤ）または欧米型の食事（ＷＤ）のいずれかを給餌されたＡｐｏｅ−／−またはＬｄｌｒ−／−マウスを使用した４回の異なる実験でα−ＣＤ２０で治療後のアテローム性動脈硬化発生の軽減を示す図である。各実験の設定についてオイルレッドＯ染色した大動脈洞の代表的な顕微鏡写真を内膜の病変サイズの定量と共に示す。棒線は、中央値を示す。
【図１３】ＣＤ２０ｍＡｂ（α−ＣＤ２０）処置が胸部大動脈におけるアテローム性動脈硬化の発生を軽減することを示す図である。欧米型の食事を１２週間給餌し、α−ＣＤ２０または対照抗体で処置したＡｐｏｅ−／−マウスの胸部大動脈におけるオイルレッドＯ染色の程度の定量分析。データ（平均値±ｓ．ｅ．ｍ．）は、１群あたり９匹（対照Ｃｔｒ）〜１０匹のマウス（α−ＣＤ２０）を代表する。
【図１４】心筋梗塞後のＢ細胞枯渇を示す図である。定量的な心機能を示す。
【００８０】
実施例１：Ｂ細胞枯渇およびアテローム性動脈硬化
結果および考察
アテローム性動脈硬化の発生は、Ｂ細胞活性化の徴候に、特に天然ＩｇＭ型および適応ＩｇＧ型の抗酸化低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）（自己）抗体の産生亢進によって明らかになる徴候に関連する（Caligiuri et al., 2002; Shaw et al., 2000）。しかし、他の免疫介在性疾患、すなわち関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスとは対照的に、Ｂ細胞は、アテローム性動脈硬化に防御的な役割を割り当てられてきた（Caligiuri et al., 2002; Major et al., 2002; Binder et al., 2004; Miller et al., 2008）。ＩｇＧ型抗ｏｘ−ＬＤＬ抗体は血管リスクと多様な関連を示すが、多くの場合にＩｇＭ型抗ｏｘ−ＬＤＬ抗体の循環濃度の方がヒトにおける血管リスク低減と関係した（Karvonen et al., 2003; Tsimikas et al., 2007）。マウスにおいて、ＩＬ−５およびＩＬ−３３介在性アテローム形成防御作用は、特異的Ｂ１細胞活性化および天然ＩｇＭ型抗ｏｘＬＤＬ抗体の産生亢進と間接的に関連していた（Binder CJ et al, 2004; Miller AM et al, 2005）。他方で、脾臓摘出または致死的照射されたアテローム性動脈硬化感受性マウスへのμＭＴ欠損（Ｂ細胞欠損）骨髄の移植は、ＩｇＧまたは総抗ｏｘＬＤＬ抗体産生の顕著な低減を招き、病変発生の加速と関連した。
【００８１】
これらの研究は、全体的なＢ細胞活性化がアテローム形成防御性であるという現在の規範に導いた。
【００８２】
しかし驚くことに、以前の研究から予想されるように免疫適格マウスにおいて成熟Ｂ細胞の枯渇が動脈硬化病変の発生を加速するかどうかは、まだ調査されていない。心血管疾患のリスクが特に高い、重症の関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスの患者におけるＢ細胞枯渇性ＣＤ２０−ターゲット免疫療法の臨床的使用から起こりうる心血管合併症の潜在的に重大なリスクを考えれば、これは重要な疑問である。
【００８３】
アテローム性動脈硬化に果たすＢ細胞の役割を直接評価するために、本発明者らは、Ｂ細胞枯渇を有するまたは有さないマウスにおける病変発生を検討した。本発明者らは、最初に、欧米型高脂肪食を給餌されたＡｐｏｅ−／−マウスを使用した。これは、有意なＢ細胞活性化および抗ｏｘ−ＬＤＬ抗体の高い産生と関連することが以前に示され、アテローム性動脈硬化にＢ細胞が果たす形成防御的な役割を評価するために以前に使用されたモデルである。Ｂ細胞を枯渇させるために、６週間または１２週間のいずれかにわたり、以前に検証されたマウスモノクローナルＣＤ２０抗体で３週間毎にマウスを処置した（Uchida et al., Int Immunol, 2004; Uchida et al., J Exp Med, 2004）。対照マウスには対照モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を与えた。予想通り、ＣＤ２０ｍＡｂ処置は、血液（図１）、脾臓（図２）、腹膜および骨髄中の成熟Ｂ細胞数の持続的で顕著な低減を導いた。Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋細胞は、検討した全ての部位で激しく枯渇した（９２％〜１００％）。脾臓Ｂ２２０ｌｏｗＩｇＭ＋細胞もまた顕著な低減（約８０％）を示したが、以前に観察されたように未熟骨髄Ｂ２２０ｌｏｗ（ＩｇＭ＋）細胞（図３）の方がＣＤ２０ｍＡｂ−介在性枯渇に対する感受性が低かった。ＣＤ２０ｍＡｂで６週間処置しても血漿コレステロール濃度は影響されなかった（対照群およびＣＤ２０ｍＡｂ処置群でそれぞれ６．４±０．９対６．３±０．８g/L、Ｐ＝０．８８）が、予想外に動脈硬化病変の発生の加速ではなく有意な軽減に至った（図１２Ａ）。本発明者らは、その後、高脂肪食で１２週間処置されたＡｐｏｅ−／−マウスの実験を分析し、類似した血漿コレステロール濃度（対照ＩｇＧ群および抗ＣＤ２０処置群でそれぞれ１８．７±１．１対１７．９±１．０g/L、Ｐ＝０．６８）にかかわらず、２ヶ所の異なる血管部位でのアテローム性動脈硬化の有意な軽減をさらに見出した（図１２Ｂおよび図１３）。ＣＤ２０ｍＡｂ処置のアテローム形成防御作用は、非常に高い脂質過負荷に応答して過剰な炎症を発生するマウスモデルの使用が原因であったという可能性を排除するために、固形飼料を給餌されたＡｐｏｅ−／−マウスでＢ細胞枯渇の作用を検討した。ＣＤ２０抗体を用いたこれらのマウスの１２週間の処置もまた、類似した血漿中コレステロール濃度（対照ＩｇＧおよびＣＤ２０ｍＡｂ処置群でそれぞれ５．５±０．６対５．７±０．８g/L、Ｐ＝０．９６）にかかわらず、病変発生の有意な軽減を招いた（図１２Ｃ）。Ａｐｏｅ−／−マウスにおいて上昇した血漿中コレステロール濃度は、主に超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）サブタイプの濃度である一方で、ヒトではＬＤＬ上昇がアテローム性動脈硬化の主要なリスク因子である。したがって、本発明者らは、ＬＤＬレセプター欠損（ＬＤＬｒ−／−）マウスモデルにおけるＢ細胞枯渇の作用を検討した。再度、ＬＤＬｒ−／−マウスをＣＤ２０ｍＡｂで処置すると、顕著なＢ細胞枯渇およびアテローム性動脈硬化の有意な軽減に至った（図１２Ｄ）。
【００８４】
全体的に見てこれらの研究は、三つのアテローム性動脈硬化のマウスモデルにおいてＢ細胞が果たす疑いのないアテローム発生促進的な役割の確固たる証拠を提供する。
【００８５】
次に本発明者らは、Ｂ細胞枯渇後のアテローム形成防御を担う潜在的メカニズムについて取り組んだ。本発明者らは、ＣＤ２０枯渇抗体を用いた処置が、６週間および１２週間の処置の両方でＩｇＧ型抗ｏｘＬＤＬ抗体の顕著な低減を招いたことを見出したが、それは、血液、脾臓および骨髄におけるＢ２２０ｈｉｇｈ細胞の顕著な枯渇と一致した。抗ｏｘＬＤＬ ＩｇＧの低減が、アテローム性動脈硬化に対するの免疫複合体の形成が潜在的に有害な成り行きを制限した可能性があると主張することができよう。しかし、他の研究において、特に脾臓摘出後に、アテローム性動脈硬化の軽減ではなく加速に関連して、抗ｏｘＬＤＬ ＩｇＧレベルの顕著な低減が観察された。したがって、アテローム性動脈硬化にＩｇＧ型抗ｏｘＬＤＬ抗体が果たす役割について直接取り組む研究を行わないと、ＣＤ２０ｍＡｂ処置後の抗ｏｘＬＤＬ ＩｇＧレベルの変化を、病変軽減の一因にしておくことができないであろう。銅酸化ＬＤＬまたはマロンジアルデヒド改変ＬＤＬのいずれかに対するＩｇＭ型抗体のレベルもまた、６または１２週間のＣＤ２０−ターゲット療法後に低減した。ＩｇＭ型抗体はアテローム形成防御性に恵まれていることから、ＣＤ２０ｍＡｂ療法後のその低減は、アテローム形成防御の原因とすることはできず、その代わりにアテローム性動脈硬化の軽減を妨げたおそれがある。しかし、ＩｇＭ型抗ｏｘＬＤＬ抗体およびＴ１５ｉｄ＋ＩｇＭ抗体がＩｇＧ型抗体よりもずっと小さな低減を示したことに注目すると興味深く、それが、アテローム形成防御経路を維持した可能性がある。ＩｇＭ型抗体は、Ａｐｏｅ−／−マウスにおいてｏｘＬＤＬに対する体液性応答を支配し、若齢であっても増加し（本研究においてＣＤ２０ｍＡｂ処置を開始する前）、このことが、既存の抗体力価に劇的には影響しない処置であるＣＤ２０免疫療法後の顕著なＩｇＭレベルの持続を少なくとも部分的に説明することができる。ＩｇＭの持続は、また、ＣＤ２０ｍＡｂを使用して腹腔Ｂ１細胞を顕著に枯渇させるために要する遅れに関係する可能性がある。
【００８６】
本発明者らは、次にアテローム形成防御のメカニズムにさらなる洞察を得るために動脈硬化病変組成物を検討した。興味深いことに、ＣＤ２０ｍＡｂ処置は、病変内のＴリンパ球蓄積の有意で特異的な低減に関連し、これは、Ｔ細胞依存性病変炎症の推進にＢ細胞が果たす役割を示唆している。この段階の病変形成で予想されるように、処置群に関係なくプラーク内または外膜層内で非常に少数のＢ細胞が検出され、これは、ＣＤ２０ｍＡｂ療法による病変のＴ細胞蓄積のモデュレーションが、最も可能性があることには全身Ｂ細胞枯渇後のＴ細胞機能の全身モデュレーションの結果として起こったことを示唆している。この仮説に取り組むために、本発明者らは、Ｔ細胞の活性化および増殖を検討した。興味深いことに、本発明者らは、高脂肪食を６週間および１２週間与えたときの両方で、ＣＤ２０抗体で処置されたマウスの脾臓由来ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９およびＣＤ４４ｈｉｇｈの発現が、対照に比べて顕著に低減したことを一貫して見出したが、これは、Ｔ細胞活性化の軽減を示している。Ｂ細胞枯渇は、また、エフエクターＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のin vivo ＢｒｄＵ染色の有意な低減を導いたが、これは、増殖低減を示唆している。ＣＤ２０ｍＡｂ処置マウスにおけるＴ細胞活性化の軽減は、また、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞上のＣＤ４０発現の顕著な低減と一致した。したがって、ＣＤ２０抗体を使用したＢ細胞枯渇の主な成り行きは、in vivo Ｔ細胞活性化の顕著な低減であり、それにより、そのアテローム形成防御作用を潜在的に説明することができよう。
【００８７】
Ｔ細胞由来サイトカインは、病変の発生を有意に変化させる。したがって、本発明者らは、精製Ｔ細胞によるサイトカイン産生にＢ細胞枯渇が及ぼす成り行きを検討した。本発明者らは、対照に比べて、ＣＤ２０ｍＡｂ処置マウスから回収した精製Ｔ細胞によりアテローム発生促進性ＩＦＮ−γが顕著に低減することを見出した。注目すべきことには、これは、ＣＤ２０ｍＡｂ処置動物におけるＴ細胞由来ＩＬ−１７Ａ産生の有意な増加に向けた免疫応答の偏向と関連した。本発明者らの研究所での最近の研究から、ＩＬ−１７Ａ産生がアテローム性動脈硬化に果たす予想外の調節的で防御的な役割が確認された。ＩＬ１７Ａは、また、Ｔｈ１極性化をモデュレーションすることが示された。Ｔ細胞サイトカインプロファイルにおけるＣＤ２０ｍＡｂ誘導性変化（Ｔｈ１減少およびＩＬ１７増加）がＣＤ２０ｍＡｂ依存性アテローム形成防御の原因となりうるかどうかを検討するために、ＣＤ２０ｍＡｂを対照抗体または抗ＩＬ１７Ａ中和抗体の存在下でＡｐｏｅ−／−マウス（高脂肪食を６週間給餌）に投与した。ＩＬ１７の中和は、アテローム硬化性大動脈におけるＩＦＮ−γ産生増加を導き、循環コレステロール濃度が類似しているにもかかわらず、そして抗ｏｘＬＤＬ抗体レベルに有意な変化がないにもかかわらず、ＣＤ２０ｍＡｂ療法のアテローム形成防御作用を完全に打ち消した。
【００８８】
まとめると、これらの結果から、Ｂ細胞がＴ細胞活性化およびサイトカイン産生のモデュレーションを介してアテローム性動脈硬化の発生推進に果たす、今までに思いもよらない役割が確認される。この結果は、μＭＴ欠乏および脾臓摘出の両方がマウスにおけるアテローム性動脈硬化を加速することを示している先行研究と対照的に見えるおそれがある。しかし、これらの研究は、免疫適格マウスにおいて成熟Ｂ細胞の枯渇がアテローム性動脈硬化に果たす役割に直接取り組んだわけではない。他の付随する免疫細胞機能障害のいくつかが、μＭＴ欠損動物における病変発生亢進の一因となったおそれがある。さらに、精製Ｂ細胞で再構成後の脾臓摘出マウスにおいて報告されたアテローム性動脈硬化加速の制限は、Ｂ細胞再構成マウスにおける血漿コレステロール濃度の有意な低減と交絡したおそれがあり、Ｔ細胞の再構成もアテローム形成防御を招いたことから、それを選択的にＢ細胞のせいにすることはできないであろう。最終的に、本研究においてＢ細胞枯渇が病変発生を有意に制限したが、特定のサブタイプのＢ細胞がアテローム性動脈硬化の推進またはコントロールに果たす役割は、さらなる研究に値することに注目すべきである。さらに詳細には、これらの過程における調節性Ｂ細胞対非調節性Ｂ細胞のそれぞれの役割に取り組むことが重要であろう。
【００８９】
結論として、本発明者らは、成熟Ｂ細胞の枯渇が、マウスにおいてアテローム性動脈硬化発生を軽減するという強い証拠を提供する。これらの結果は、全体的なＢ細胞機能がアテローム形成防御性であるという規範に異議を申し立てるものであり、アテローム性動脈硬化に果たすＢ細胞の主な役割が、アテローム発生促進性Ｔｈ１免疫応答亢進およびアテローム形成防御性ＩＬ−１７の産生制限に向けてＴ細胞活性化を推進することであると示している。血管Ｂ細胞浸潤の制限が初期のアテローム性動脈硬化で検出可能であるが、Ｂ細胞の蓄積は、マウスおよびヒトの両方で進行性のアテローム硬化性冠動脈病変およびアテローム硬化性腹部大動脈瘤の内部および周囲で時間と共に実質的に増加し、他の免疫介在性疾患に伴う血管炎では顕著でさえある。枯渇または免疫モデュレーションのいずれかによるＢ細胞の過剰活性化の阻害は、血管炎および動脈硬化病変の発生を実質的に制限する可能性がある。
【００９０】
方法
動物。全てのマウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドであった。Ａｐｏｅ−／−マウスは、固形飼料で１２週間維持されたか、または欧米食（２０％脂肪、０．１５％コレステロール、０％コール酸塩）で６または１２週間のいずれか与えられた１０週齢雄であった。Ｌｄｌｒ−／−マウスは、６週間欧米食を与えられた１０週齢雄であった。１０週齢で、先に検証されたマウスモノクローナルＣＤ２０抗体（Uchida et al., Int Immunol, 2004; Uchida et al., J Exp Med, 2004）または対照ＩｇＧ（２００μg、３週間毎）でマウスを６または１２週間のいずれかの間腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。一部の実験では、精製中和抗ＩＬ−１７Ａ特異性抗体（２００μg/マウス、１週間に２回）（Uyttenhove et al., 2006および2007; Wang et al., 2009）または対照ＩｇＧのいずれかをマウスに６週間にわたりｉ．ｐ．注射した。実験は、フランス獣医学ガイドラインのガイドラインおよび実験動物の使用のために欧州共同体により公定化されたガイドライン（Ｌ３５８−８６／６０９ＥＥＣ）にしたがって行い、本発明者らの施設であるInsermによって承認された。
【００９１】
動脈硬化病変の程度と組成。病変のサイズと組成の定量は、以前に記載されたように行った（Taleb et al., 2007）。
【００９２】
細胞の回収および精製、培養、増殖およびサイトカインアッセイ。ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ４＋細胞を精製し、以前に詳細に記載されたように、細胞増殖アッセイおよびサイトカイン産生のために処理した（Taleb et al., 2007）。上清中のＩＬ−１７およびＩＦＮ−γ産生は、特異的ＥＬＩＳＡ（BD BiosciencesおよびR&D Systems）を使用して測定した。
【００９３】
フローサイトメトリー。ＡＰＣとコンジュゲーションした抗ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）、ＦＩＴＣまたはＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲーションした抗ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＡＰＣとコンジュゲーションした抗ＣＤ２５（ＰＣ６１．５）、ＰＥとコンジュゲーションした抗ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、ＡＰＣとコンジュゲーションした抗ＩｇＭ（ＩＩ／４１）、ＦＩＴＣとコンジュゲーションした抗ＣＤ８６（ＧＬ１）、ＰＥとコンジュゲーションした抗ＣＤ８０（１６−１０Ａ１）、ＡＰＣとコンジュゲーションした抗ＣＤ４０（１Ｃ１０）、ＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲーションした抗ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲーションした抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）およびＰＥとコンジュゲーションした抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）（ＲＡ３−６Ｂ２）は、eBioscience製であった。ＦＩＴＣとコンジュゲーションした抗ＣＤ５（５３−７．３）、ビオチンとコンジュゲーションした抗ＣＤ４４に続いてＡＰＣとコンジュゲーションしたストレプトアビジン、ＡＰＣ−Ｃｙ７とコンジュゲーションした抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＡＰＣとコンジュゲーションした抗ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）およびＰＥとコンジュゲーションした抗ＩＬ１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）は、BD Biosciences製であった。血液染色のために、BD FACS溶解溶液（BD Biosciences）を使用して赤血球を溶解させた。細胞内サイトカイン染色のために、製造業者の説明書にしたがって白血球活性化カクテル（BD Biosciences）で白血球を４時間in vitro刺激した。表面染色は、透過処理の前に細胞内染色キット（eBioscience）を用いて行った。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を使用して、総脾臓細胞、リンパ節、骨髄および腹膜集団中の赤血球、破片、および細胞凝集物を除いて生細胞をゲートで制御するために使用した。BD CantoIIまたはBD LSRIIフローサイトメーター（Becton Dickinson）を使用して細胞を分析した。
【００９４】
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）ラベル化および細胞分析。ＢｒｄＵラベル化は、以前に記載されたように行った（Fisson et al., 2007）。１日に１．２mgのＢｒｄＵ（Sigma-Aldrich）を７日間送達するミニ浸透圧ポンプ（ALZET1007D; Charles River Laboratories）を、屠殺の１週間前にイソフルラン麻酔下でマウスに皮下移植した。リンパ節細胞および脾臓細胞を、ＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲーションした抗ＣＤ４（ＲＭ４−５）およびＡＰＣとコンジュゲーションした抗ＣＤ２５（ＰＣ６１．５）で染色した。ＢｒｄＵの検出は、製造業者の説明書にしたがってFITC BrdU Flowキット（BD Pharmingen）を使用して行った。BD CantoIIまたはBD LSRIIフローサイトメーター（Becton Dickinson）を使用して細胞を分析した。
【００９５】
定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応。定量リアルタイムＰＣＲは、ABI prizm 7700で３回の繰り返しで行った。ＧＡＰＤＨについてのＣＴを使用して遺伝子発現を標準化した。以下のタンパク質について定量リアルタイムＰＣＲを行った：ＩＬ１０、ＴＧＦ−βおよびＩＦＮ−γ。
【００９６】
循環抗体の測定。血漿中の所与の抗原に対する特異的抗体の力価は、以前に記載されたように化学ルミネセンスＥＬＩＳＡにより測定した（Friguet et al., 1985; Binder et al., 2003; Chou et al., 2009）。
【００９７】
統計解析。値を平均±ｓ．ｅ．ｍとして表現する。値の差は、ノンパラメトリックMann-WhitneyまたはKruskal-Wallis検定を使用して検定し、Ｐ＜０．０５で有意と見なした。
【００９８】
実施例２：Ｂ細胞枯渇は心筋梗塞モデルにおける短縮率の増加と関連する
左前下行枝の結紮により８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスに心筋梗塞を誘導した。心筋虚血傷害の１時間後に、マウスモノクローナルＣＤ２０抗体（１６０μg）の腹腔内注射によりマウスを処置するか、または非処置とした。本発明者らは、Ｂ細胞が梗塞領域に浸潤したことを示した。ＭＩの１、３、７および１４日後にフローサイトメトリーにより血中Ｂ細胞レベルを分析した。ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞の百分率は、ＣＤ２０抗体処置後に顕著に低減した。ＭＩの１４日後にマウスを屠殺し、心エコー法により心機能を測定した（図１４）。そのような処置は短縮率の増加と関連したが、これは、該処置が心筋梗塞の処置に有益でありうることを示唆している。
【００９９】
実施例３：腹部大動脈瘤におけるＢ細胞枯渇の作用
まず、本発明者らは、動脈瘤形成の検証済みマウスモデルを使用する。固形飼料または高脂肪食を給餌されたＡｐｏｅ−／−マウスは、アンジオテンシン（Ａｎｇ）ＩＩを２８日間注入されると腹部大動脈瘤を発生する（Daugherty A et al, 2000）。このモデルは、動脈瘤の血管内および血管周囲にＢ細胞を含めた炎症細胞の蓄積を再現する。
【０１００】
さらに正確な結果について、本発明者らはまた、特許出願である国際公開公報第２００９０５６４１９号に記載された、高い動脈瘤破裂の発生率を有する大動脈瘤の新しいモデルを使用してもよい。このモデルは、Ａｐｏｅ＋／＋またはＡｐｏｅ−／−マウスを使用し、ヒト疾患に対して高い関連性がある二つの因子であるＡｎｇＩＩ注入とＴＧＦ−β活性の中和との両者を結びつける。このモデルでは、ＴＧＦ−β活性の全身中和は、ＡｎｇＩＩ誘導性大動脈瘤に対するこれらのマウスの感受性の予想外で顕著な増加（９２．５％）、および大動脈の解離および破裂による高レベルの死亡率（６５％）を導く。
【０１０１】
動脈瘤発生に抗ＣＤ２０ｍＡｂが果たす作用を評価するために、動脈瘤誘導時に抗ＣＤ２０ｍＡｂを使用したＢ細胞枯渇を開始する。動脈瘤誘導の１時間後に２００μg i.p.の初回注入を行い、２週間後に２回目を行う。
【０１０２】
４週間後にマウスを屠殺する。腹部大動脈瘤および免疫応答を評価し、心エコー法を行う。
【０１０３】
参考文献
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を記載している。これらの参考文献の開示は、ここに参照により本開示に組み入れられる。
【０１０４】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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