(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイド（poly(N-isopropylacrylamide)  colloid）を酵素包埋材料としてユウロピウムチタン酸化物(europium  titanium  oxide：EuTixOy)を有する検知膜に使用させる生物検知器の検知方法であって、
２０ｍｌの水を１．０ｇのＮーイソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)粉末に加え、６０℃の二重鍋で加熱させ、充分に混合させてＮーイソプロピルアクリルアミド水溶液を形成させ、室温で冷却するまで放置させるステップ１と、
２００μｌの９８．７％のペルオキソ二硫酸アンモニウム(ammonium  peroxodisulfate、APS)及び５０μｌの９９％ のテトラメチルエチレンジアミン(N、N、N、N-tetramethylethylenediamine、TEMED)をＮーイソプロピルアクリルアミド水溶液中に加えて充分に混合させ、混合後に室温で３０時間放置させて透明な粘稠状になるまで内部反応を起こさせ、Ｎーイソプロピルアクリルアミドコロイド(poly-N-isopropylacrylamide、PNIPAAm)を形成させるステップ２と、
５ｍｇの酵素を１００μｌの１Ｘ  ＰＢＳ緩衝溶液に加え、充分に混合させた後、同量(１００μｌ)のＮーイソプロピルアクリルアミドコロイドを加え、再び充分に混合させた後に使用するステップ３と、
生物検知器を加熱器上に設置させて温度を３７℃に設定させ、前記生物検知器はユウロピウムチタン酸化物(europium  titanium  oxide)を検知膜とし、ステップ３で混合させた溶液２５μｌを前記生物検知器の検知膜上に滴下し、加熱された後に凝固し白色のコロイド体となるステップ４と、
最後に前記生物検知器を３７℃に加熱させた測量溶液中に置き、ステップ４で凝固させた白色コロイド体の温度を３７℃に保持させて測量を行うステップ５を含む事を特徴とする使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを酵素包埋材料としてユウロピウムチタン酸化物を有する検知膜に使用させる生物検知器の検知方法。
【請求項２】
x=1、y=7/2である事を特徴とする、請求項１に記載の使い捨てのＮーイソプロピルアクリルアミドコロイドを酵素包埋材料としてユウロピウムチタン酸化物を有する検知膜に使用させる生物検知器の検知方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、良好な感度及び安定性を達成させる使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイド（isopropylacrylamide  colloid）を酵素包埋材料としてユウロピウムチタン酸化物(europium titanium  oxide：EuTixOy)を有する検知膜に使用させる生物検知器の検知方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｐＨ検出器及び生物検知器は化学分析及び臨床試験に於いて重要な地位を占める。特定の酵素膜を結合させ各種酵素を配合させ固定させる方式により、例えば尿液検査、血糖値測定等に於いて人体の生理機能の変化を検知させ、部材の応用範囲を拡大させている。
【０００３】
イオン感応電界効果トランジスタは検知器に関する研究に於いて応用上部材の体積が小さく、反応時間も速く且つ低コストである等の長所を有する。イオン感応電界効果トランジスタを利用した検知メカニズムは生物分子の検知、例えばブドウ糖、尿素、乳酸、尿酸等の検知に広く用いられている。イオン感応電界効果トランジスタはトランジスタ表面に付装される酵素膜が反応後に発生するｐＨ値の変化により測定対象を測定するため、どのようにトランジスタ表面に酵素膜の層を固定させるかが課題となる。酵素固定方式は化学方式、物理方式、または物理化学結合方式に主に分類されるが、然しながらこれらの酵素固定方式は多くの欠点も有する。例えば化学方式は酵素の活動の制御が難しく酵素の寿命も短い。物理吸着方式は温和な環境下で行われ、酵素の活性の損失が最も小さくなるが、但し吸着力が弱いため、生体分子がすぐに流失してしまう。現在海藻のりを酵素の包埋材料として使用する者もおるが、海藻のりは洗浄が困難であるという欠点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前述した従来の技術では、従来の酵素固定の化学方式は多くの欠点を有し、例えば化学方式は酵素の活動の制御が難しく酵素の寿命も短く、物理吸着方式は温和な環境下で行え、酵素の活性の損失が最も小さいが、但し吸着力が弱く生体分子を流失し易い、また現在海藻のりを酵素の包埋材料として使用する者もおるが、海藻のりは洗浄が困難であるといった問題があった。
【０００５】
本発明は、このような従来の問題に鑑みてなされたものである。上記課題解決のため、本発明は、良好な感度及び安定性を達成させる使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイド（isopropylacrylamide  colloid）を酵素包埋材料としてユウロピウムチタン酸化物(europium titanium  oxide)を有する検知膜に使用させる生物検知器の検知方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを酵素包埋材料としてユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy)を有する検知膜に使用させる生物検知器の検知方法は、
２０ｍｌの水を１．０ｇのＮーイソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)粉末に加え、６０℃の二重鍋で加熱させ、充分に混合させてＮーイソプロピルアクリルアミド水溶液を形成させ、室温で冷却するまで放置させるステップ１と、
２００μｌの９８．７％のペルオキソ二硫酸アンモニウム(ammonium  peroxodisulfate、APS)及び５０μｌの９９％ のテトラメチルエチレンジアミン(N、N、N、N-tetramethylethylenediamine、TEMED)をＮーイソプロピルアクリルアミド水溶液中に加えて充分に混合させ、混合後に室温で３０時間放置させて透明な粘稠状になるまで内部反応を起こさせ、Ｎーイソプロピルアクリルアミドコロイド(poly-N-isopropylacrylamide、PNIPAAm)を形成させるステップ２と、
５ｍｇの酵素を１００μｌの１Ｘ  ＰＢＳ緩衝溶液に加え、充分に混合させた後、同量(１００μｌ)のＮーイソプロピルアクリルアミドコロイドを加え、再び充分に混合させた後に使用するステップ３と、
生物検知器を加熱器上に設置させて温度を３７℃に設定させ、前記生物検知器はユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy)をＥＩＳ部材の検知膜とし、ステップ３で混合させた溶液２５μｌを前記生物検知器の検知膜上に滴下し、加熱された後に凝固し白色のコロイド体となるステップ４と、
最後に前記生物検知器を３７℃に加熱させた測量溶液中に置き、ステップ４で凝固させた白色コロイド体の温度を３７℃に保持させて測量を行うステップ５を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明はポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドの加熱されると凝固するという特性を利用して酵素包埋材料とし、測量後に直接冷却させ水で洗い、洗浄過程が容易でコストも低く、同時に本発明はユウロピウムチタン酸化物(europium  titanium  oxide)をＥＩＳ部材として使用する検知膜の生物検知器であり、感度や精度も従来のものより良好となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明に係る方法のステップのフローチャート図である。
【図２】本発明に係るPNIPAAmコロイド体が酵素を結合させて酵素膜を製造し検知膜表面に固定させる操作のフローチャート図である。
【図３】本発明に係る生物検知器の構造概略図である。
【図４】ユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy, x=1、y=7/2)を検知膜として利用し測量した結果図である。
【図５】チタンツリウム酸化物(Tm2Ti2O7)を検知膜として利用し測量した結果図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に図面を参照して、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。
まず、本発明の一実施形態について説明する。
（一実施形態）
図１によると、本発明に係る使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを酵素包埋材料としてユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy)を有する検知膜に使用させる生物検知器の検知方法は、
２０ｍｌの水を１．０ｇのＮーイソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)粉末に加え、６０℃の二重鍋で加熱させ、充分に混合させてＮーイソプロピルアクリルアミド水溶液を形成させ、室温で冷却するまで放置させる、Ｎーイソプロピルアクリルアミド水溶液を製作するステップ１Ｓ１と、
２００μｌの９８．７％のペルオキソ二硫酸アンモニウム(ammonium  peroxodisulfate、APS)及び５０μｌの９９％ のテトラメチルエチレンジアミン(N、N、N、N-tetramethylethylenediamine、TEMED)をＮーイソプロピルアクリルアミド水溶液中に加えて充分に混合させ、混合後に室温で３０時間放置させて透明な粘稠状になるまで内部反応を起こさせ、Ｎーイソプロピルアクリルアミドコロイド(poly-N-isopropylacrylamide、PNIPAAm)を形成させる、ポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを製作するステップ２Ｓ２と、
５ｍｇの酵素を１００μｌの１Ｘ  ＰＢＳ緩衝溶液に加え、充分に混合させた後、同量(１００μｌ)のＮーイソプロピルアクリルアミドコロイドを加え、再び充分に混合させた後に使用し、前記酵素はブドウ糖、尿素、乳酸或いは尿酸のいずれかの一つである、酵素を緩衝溶液に加えた後にＮーイソプロピルアクリルアミドコロイドと混合させるステップ３Ｓ３と、
酵素をポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドで包埋させ且つ生物検知器の検知膜上に固定し、前記生物検知器はユウロピウムチタン酸化物(europium  titanium  oxide)をＥＩＳ部材の検知膜とするステップ４Ｓ４を含み、前記生物検知器の詳述については後述する。
【００１０】
【化１】
0005653389.tif 000002
以下に図２を参照してサブステップを説明する。
サブステップ１Ｓ４１では、まず生物検知器を加熱器上に設置させて温度を３７℃に設定させ、
サブステップ２Ｓ４２では、ステップ３Ｓ３で混合させたポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイド溶液２５μｌを前記生物検知器の検知膜上に滴下し、
サブステップ３Ｓ４３ではガラス片により溶液を水平に伸ばし凝固させて白色コロイド体にさせ、
ステップ５Ｓ５では、進行測量:前記生物検知器を３７℃に加熱させた測量溶液中に置き、ステップ４で凝固させた白色コロイド体の温度を３７℃に保持させて測量を行い、測量終了後に、本来白色コロイド体状態を保持させたポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを冷却させた後、再度溶解して液状ポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドとし、この際蒸留水により直接洗浄が可能である。
【００１１】
これにより、本発明のステップを経て製作された使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを酵素包埋材料とし、またPNIPAAmの加熱されると凝固するという特性を利用し包埋された酵素に酵素膜の層を形成させ、測量を行う。従来使用される海藻のりによる酵素包埋と比較し、本発明のコロイド体は測量終了し冷却された後、すぐに液状コロイド体状態に回復し、容易に水で洗浄し除去でき、また高い感度及び好ましい安定性を有する。さらに、ポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドは低コストの化学製品から製作可能であるため、製作が容易で大量に配置出来るのみならず、使用後に簡単に除去出来る。
【００１２】
前述の生物検知器１は、図３によれば、前記生物検知器１はユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy)を電解液ー絶縁体ー半導体(electrolyte-insulator-  semiconductor、EIS)部材の検知膜１０とし、また前記検知膜１０は半導体基板２０上に堆積され、前記半導体基板２０はシリコン基板であり、前記半導体基板２０の下方には導電層３０を設け、導電層３０は電極３０１を備え、金属導線３０２が前記電極３０１及び前記検知膜１０に接続されることにより、前記検知膜１０及び前記半導体基板２０の外部が包装材料４０に包装され、前記検知膜１０上の検知エリアが露出される。
【００１３】
これにより、本発明では使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを酵素包埋材料として利用し、前記酵素はブドウ糖、尿素、乳酸或いは尿酸の何れか一つであり、前記生物検知器１を加熱器上に設置させ温度を３７℃に設定させ、ポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを凝固させて白色コロイド体とすると共に酵素膜を前記検知膜１０上に固定させて検査を行う。本発明では実験中にポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを利用して尿酸酵素を包埋させ、再びPNIPAAmが加熱されて凝固する特性により尿酸酵素膜の層を前記生物検知器１のユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy)の前記検知膜１０上に形成させて尿酸溶液を測量させる。本発明のユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy,  x=1、y=7/2)をＥＩＳ部材として利用する検知膜１０の生物検知器は高い感度を有し、検知値はＳ＝１７．６ｍＶ／ｍＭ、直線性はＲ２＝０．９９４７６(図４に図示する)である。また本発明はチタンツリウム酸化物(Tm2Ti2O7)をＥＩＳ部材とする検知膜と比較すると、尿酸酵素の測量の結果得た検知値はＳ＝１５．１１ｍＶ／ｍＭ、直線性はＲ２＝０．９８１３(図５に図示する)であり、故に本発明の高い誘電性を有する上述のユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy)をＥＩＳ部材として利用する検知膜１０の前記生物検知器１は、使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドに併用されて簡単な方法で酵素を包埋させ、酵素の活性を保持させるのみならず、生物検知器の感度も高める。
【００１４】
以上を総合すると、本発明で提供する使い捨てのポリ[N-イソプロピルアクリルアミド]コロイドを酵素包埋材料としてユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy)を有する検知膜に使用させる生物検知器の検知方法にユウロピウムチタン酸化物(EuTixOy)をＥＩＳ部材として使用する検知膜１０の生物検知器を併用させる事で、操作が容易になるのみならず、更には高感度、高精度、低コスト等の効果を達成させる。
【００１５】
上述の実施形態は本発明の技術思想及び特徴を説明するためのものにすぎず、当前記技術分野を熟知する者に本発明の内容を理解させると共にこれをもって実施させることを目的とし、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。従って、本発明の精神を逸脱せずに行う各種の同様の効果をもつ改良又は変更は、後述の請求項に含まれるものとする。
【符号の説明】
【００１６】
１      生物検知器
１０    検知膜
２０    半導体基板
３０    導電層
３０１  電極
３０２  金属導線
５０    包装材料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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