(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ）の光反応性イオンチャネルタンパク質（ＶＣｈＲ１）を発現するように操作された哺乳動物細胞の活性を調節する方法であって、
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１を光で活性化することを含み、
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が、５３５ｎｍ〜５８９ｎｍの範囲の波長を持つ光で活性化される、方法。
【請求項２】
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞がニューロン細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１がアルファ−ＣａＭＫＩＩレンチウイルスプロモータに作動可能に結合したヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が哺乳動物細胞での発現のために最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が発現ベクターによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来の光反応性タンパク質ＣｈＲ２を更に発現するように操作されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記光反応性タンパク質ＣｈＲ２が配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、光反応性タンパク質ＮｐＨＲを更に発現するように操作されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記光反応性タンパク質ＣｈＲ２が、５８９ｎｍの波長を持つ光で活性化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ボルボックス由来の光反応性イオンチャネルタンパク質（ＶＣｈＲ１）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、哺乳動物細胞での発現のために最適化されており、
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が、５３５ｎｍ〜５８９ｎｍの範囲の波長を持つ光で活性化される、核酸。
【請求項１４】
前記核酸が発現ベクターを構成する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記発現ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記発現ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列が特定のニューロン集団での発現を誘導するプロモータに作動可能に結合する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列がアルファ−ＣａＭＫＩＩレンチウイルスプロモータに作動可能に結合する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１９】
ボルボックス由来の光反応性イオンチャネルタンパク質（ＶＣｈＲ１）を発現する哺乳動物細胞であって、
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が、５３５ｎｍ〜５８９ｎｍの範囲で興奮を示す、細胞。
【請求項２０】
幹細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
ニューロン細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２２】
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２３】
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が、アルファ−ＣａＭＫＩＩレンチウイルスプロモータに作動可能に結合したヌクレオチド配列にコードされる、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２４】
前記光反応性イオンチャネルタンパク質ＶＣｈＲ１が、哺乳動物細胞での発現のために最適化されたコドンであるヌクレオチド配列にコードされる、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、タンパク質ＮｐＨＲを更に発現する、請求項１９に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連文書
本特許明細書は、「標的細胞を光刺激するためのシステム、方法、および組成物」というタイトルの２００８年４月２３日に提出された米国仮特許出願第６１／０４７，２１９号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。この基礎となる仮出願全体を本明細書に参照により取り込む。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による取り込み
２００９年４月７日に作成された「STFD_212PCT_ST25.txt」というファイル名の、８，３４５バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルである、本明細書と同時に提出されるコンピュータで読取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストの全体を参照により組み込む。
【背景技術】
【０００３】
いくつもの有益な効果を発生させるために身体の種々の細胞を刺激することが利用されてきた。刺激方法の１つは、電極を用いて、外部で発生させたシグナルを細胞に導入に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
電極を用いた脳刺激技術の問題の１つは、特定の精神的プロセスを生じさせるニューロンが散在していることである。逆に、異なる種類のニューロンが互いに近接して存在するため、特定の作業を行っている間、脳のある領域の中の特定の細胞のみが活性化される。言い換えると、異種の神経路が並列に働く狭い閉鎖空間中を並列に動くだけでなく、細胞体自体が、混ざりまばらに埋め込まれた形態で存在し得る。処理がこのように分散されていることにより、ＣＮＳ内の正規順序を理解しようとする最良の試みさえも阻まれているようであり、神経調節を治療的に困難な試みにしている。電極は、電極が刺激するニューロンの根底にある生理機能に関して比較的無差別であるため、この脳の構造は電極を用いた刺激にとって問題となる。その代わり、しばしば、電極がニューロンに物理的に近接しているかが、どのニューロンが刺激されるかについての唯一の最大決定因子となる。したがって、通常、電極を用いて単一のクラスのニューロンに対してだけに刺激を完全に制限することは不可能である。
【０００５】
刺激に電極を用いることのもう１つの問題は、電極の配置でどのニューロンが刺激されるかが決まるので、機械的安定性がしばしば不十分であり、その結果、電極のリードが標的部位から移動してしまう。更に、身体内でしばらく時間が経つと、電極のリードがしばしばグリア細胞で包まれ、電極の実効電気抵抗が上昇し、標的細胞に到達するために必要な電力導入量が増える。しかし、それを償うために電圧、周波数、パルス幅を増大させると電流が拡散し、別の細胞への意図しない刺激が増加し得る。
【０００６】
別の刺激方法では、光に反応して標的細胞を刺激するために感光性生体分子構造体を用いる。例えば、光活性化されたタンパク質または分子は、細胞膜を介したイオンの流れを制御するために使用することができる。細胞膜を介した陽イオンまたは陰イオンの流れを促進または阻害することで、細胞を短時間だけ脱分極させたり、脱分極させてその状態を維持したり、過分極させたりすることができる。ニューロンは、脱分極によって生じる電流を用いて情報交換シグナル（すなわち神経インパルス）を発生する種類の細胞の例である。その他の電気的興奮性細胞としては、骨格筋、心筋、および内分泌細胞が含まれる。ニューロンは、素早い脱分極を用いて、運動制御（例えば筋肉収縮）、感覚反応（例えば、触覚、聴覚等の感覚）、計算的機能（例えば脳機能）等の種々の目的で身体中にシグナルを伝達する。したがって、細胞の脱分極制御は、心理療法、筋肉制御、および感覚機能を含む（ただしこれらに限定されない）多くの種々の目的に有益であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の態様は、感光性生体分子構造体および関連方法に関する。本発明は複数の実施例および応用例で例示される。以下にそのいくつかを概説する。
【０００８】
本発明の例示的な一実施形態によれば、光を発生するための光発生デバイスを有する植込み型の配置体が用いられる。配置体はまた、インビボで光発生手段によって発生された光に反応して刺激に対して標的細胞を修飾する生物学的部分を有する。
【０００９】
本発明の別の例示的実施形態によれば、植込み型配置体を用いて標的細胞が刺激される。この配置体は、光を発生するための電気的光発生手段および生物学的部分を含む。生物学的部分は、発生した光に反応してインビボで標的細胞を刺激する感光性生体分子配置体を有する。刺激は、標的における活性のアップレギュレーションとして現れてもダウンレギュレーションとして現れてもよい。
【００１０】
本発明の別の例示的実施形態によれば、植込み型デバイスは、感光性生体分子膜タンパク質の発現を誘導するウイルス等の遺伝子導入ベクターを送達する。デバイスは、外部シグナルに反応する（例えば外部シグナルで荷電されるか誘導される）光を発生するための発光器と、発生した光に反応してインビボで標的細胞と相互作用する感光性生体分子タンパク質を含む生物学的配置体とを備える。これにより、デバイスの電子部分を用いて標的細胞を光刺激することができる。刺激は、標的における活動のアップレギュレーション（例えば、ニューロン発火活動の増加）として現れてもダウンレギュレーション（例えば、ニューロンの過分極または慢性的脱分極）として現れてもよい。
【００１１】
本発明の別の例示的実施形態によれば、標的細胞と結合する感光性タンパク質を用いて標的細胞を刺激する方法が実施される。この方法は、感光性タンパク質および光発生デバイスを標的細胞の近くに植込む工程を含む。光発生デバイスを活性化すると、発生した光に反応して感光性タンパク質が標的細胞を刺激する。
【００１２】
応用例としては、ニューロン、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、インスリン分泌膵臓ベータ細胞等の任意の電気的興奮性細胞の集団に関連するものが含まれる。興奮−効果器のカップリングが変化している主要な疾患としては、心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、疼痛、脳性麻痺、麻痺、うつ病、および統合失調症が含まれる。したがって、本発明は、パーキンソン病や脳損傷から不整脈、糖尿病、および筋痙縮までの幅広い医学的状態の治療に有用である。
【００１３】
本発明の別の例示的実施形態によれば、興奮ニューロン電流を発生する方法は、ニューロン中に、光に反応して興奮電流を発生してニューロンの脱分極を促すタンパク質を設計付与することを含む。そのような方法の１つでは、タンパク質はボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）に由来する。
【００１４】
本発明の上記の概要は本発明の全ての実施形態または全ての実施例を記載することを意図するものではない。添付の図面および以下の説明でこれらの実施形態を更に具体的に例示する。
【００１５】
添付の図面と合わせて、以下に記載する本発明の種々の実施形態の詳細な説明を考慮することで、本発明がより完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】本発明の例示的な実施形態に一致する、球状藻類ボルボックスを示す図である。
【図１Ｂ】本発明の例示的な実施形態に一致する、オールトランスレチナールシッフ塩基および関連するタンパク質配列を示す図である。
【図１Ｃ】本発明の例示的な実施形態に一致する、光強度に対して誘導された光電流を示す図である。
【図１Ｄ】本発明の例示的な実施形態に一致する、内向き整流性の電流−電圧関係を示す図である。
【図１Ｅ】本発明の例示的な実施形態に一致する、特定のイオンに関する膜電流を示す図である。
【図１Ｆ】本発明の例示的な実施形態に一致する、光の波長に対する活性化の割合を示す図である。
【図２Ａ】本発明の例示的な実施形態に一致する、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰを発現し且つ膜局在するＥＹＦＰ蛍光を示すニューロンを示す図である。
【図２Ｂ】本発明の例示的な実施形態に一致する、５３１ｎｍおよび５８９ｎｍの光を照射した時のＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰニューロンの光電流を示す図である。
【図２Ｃ】本発明の例示的な実施形態に一致する、５３１ｎｍおよび５８９ｎｍの光に対するホールセル内向き電流を示す図である。
【図２Ｄ】本発明の例示的な実施形態に一致する、電流固定法においてＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰニューロンに種々の周波数で与えられた２０発の５ｍｓ光パルスを示す図である。
【図２Ｅ】本発明の例示的な実施形態に一致する、種々の周波数においてスパイクが成功した割合を示す図である。
【図２Ｆ】本発明の例示的な実施形態に一致する、光パルスの周波数を増加させると定常状態の脱分極が増加することを示す図である。
【図２Ｇ】本発明の例示的な実施形態に一致する、膜抵抗を示す図である。
【図２Ｈ】本発明の例示的な実施形態に一致する、静止膜電位を示す図である。
【図３Ａ】本発明の例示的な実施形態に一致する、種々の波長の光刺激に対する電圧反応を示す図である。
【図３Ｂ】本発明の例示的な実施形態に一致する、異なる波長および強度の光刺激においてスパイクが成功した割合を示す図である。
【図３Ｃ】本発明の例示的な実施形態に一致する、異なる波長および強度の光刺激においてスパイクが成功した割合を示す図である。
【図４】Ａ〜Ｄは局所的な視床下核（ＳＴＮ）ニューロンの直接的光抑制を示す図である。
【図５】Ａ〜Ｃは視床下核内のアストログリア細胞のターゲティングを示す図である。
【図６】Ａ〜Ｃは種々の周波数における視床下核ニューロンの光脱分極を示す図である。
【図７】Ａ〜Ｃは光学的インターベンションにより動員される組織体積の定量を示す図である。
【図８】Ａ〜Ｃは視床下核内の求心性線維の選択的光制御を示す図である。
【図９】Ａ〜Ｆは前側一次運動皮質中の第５層ニューロンの選択的光刺激を示す図である。
【図１０】Ａ〜Ｃは黒質の損傷およびカニューレの軌跡を示す図である。
【図１１】Ａ〜Ｃは更なる組織学的特徴解析を示す図である。
【図１２】Ａ〜Ｅは更なる行動試験結果を示す図である。
【図１３】Ａ〜Ｄは更なる電気生理学的結果を示す図である。
【図１４】Ａ〜Ｄは高時間分解オプトロードトレースを示す図である。
【図１５】Ａ〜Ｃは視床下核の光刺激に対するＭＩ反応の潜時を示す図である。
【図１６】Ａ〜Ｆは光刺激により発生するニューロン活性の周波数特性の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は種々の修正例および代替的形態が可能であり、それらの詳細は、図面中に例として示されており、以下に詳細に記載されている。しかし、記載した特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではないと理解されるべきである。反対に、本発明の精神および範囲内に含まれる全ての修正例、均等物、および代替物が含まれることが意図される。
【００１８】
本発明は、種々の感光性生体分子構造体の実用化の促進に有用であると考えられ、また、本発明は、細胞膜電圧の制御および刺激を扱う配置体および方法における使用に特に適していることが見出された。本発明は必ずしもそのような応用例に限定されるものではないが、この文脈で種々の例を議論することで本発明の種々の態様が理解されるであろう。
【００１９】
本発明の例示的一実施形態では、細胞中に光反応性タンパク質／分子を設計付与する。このタンパク質は、光に反応して、細胞膜を横切るイオンの流れに影響を与える。このイオン流の変化は、細胞の電気的特性、例えば細胞膜電流および電圧に、対応する変化をもたらす。例えば、このタンパク質は、インビボで内因性の補因子を利用して、細胞膜を通るイオン流を調節するように機能する。別の例では、タンパク質は、細胞中で活動電位発火を鎮めるように、細胞膜を介した電圧を変化させる。更に別の例では、タンパク質は、光が導入されて数ミリ秒以内に細胞の電気的特性を変化させることができる。
【００２０】
本発明のより具体的な例示的実施形態では、本発明でＶＣｈＲ１として特定されるボルボックス由来のタンパク質が、時間的に正確なニューロン活性の光制御に用いられる。ＶＣｈＲ１は、素早いスパイク列の生成を含む単一の活動電位の選択的な興奮および数分にわたるスパイク生成の持続的な遮断を可能にする。ＶＣｈＲ１の作用スペクトルは、ＣｈＲ２に比べて強くレッドシフトしているが、ＣｈＲ２と同様な光出力で作動し、外因性補因子なしで哺乳動物内で機能する。例えば、ＶＣｈＲ１は標的細胞中でＮｐＨＲおよび／またはＣｈＲ２と共発現させることができる。同様に、ＶＣｈＲ１、ＮｐＨＲ、およびＣｈＲ２は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの筋肉およびコリン作動性運動ニューロンを標的にして移動運動を双方向的に制御することができる。この点で、ＶＣｈＲ１、ＮｐｈＲ、およびＣｈＲ２は、多モードで高速な、遺伝的にターゲティングされる、全て光学的な、生きた神経回路を探索するための光遺伝学的システムを形成する。
【００２１】
本発明の実施形態は、ＶＣｈＲ１タンパク質に関する。種々の実施形態は、ＶＣｈＲ１タンパク質を発現するＤＮＡまたは塩基配列を含むプラスミドに関する。更に別の実施形態は、ＶＣｈＲ１タンパク質を発現させるための発現ベクターに関する。発現ベクターの非限定的なリストには、細菌、ウイルス、および植物のプラスミドが含まれる。本発明の別の実施形態は、ＶＣｈＲ１タンパク質を含む異種細胞に関する。
【００２２】
本発明の態様は、図１Ｂに開示するＶＣｈＲ１の具体的実施形態のバリエーションに関する。そのような態様の１つには、タンパク質の変異が含まれる。これらの変異は、例えば、ＶＣｈＲ１タンパク質の、このタンパク質を活性化する光の波長をシフトまたは変化させる部分を標的としたものであってもよい。
【００２３】
チャネルロドプシンＣｈＲ２およびハロロドプシンＮｐＨＲ等の、神経科学に適合した急速に光で活性化される微生物タンパク質は、無傷の神経組織内で遺伝的に定義される細胞型をミリ秒精度で光制御することを可能にする。ＣｈＲ２は、ニューロンを活性化できる青色光駆動型陽イオンチャネルであり、ＮｐＨＲは、ニューロンを抑制できる黄色光駆動型クロライドポンプであるので、これら２種類のタンパク質を組み合わせることで、同じ標本中でニューロンの興奮および抑制を独立して行うことができる。第３の主要な光遺伝学的ツール、すなわち、ＣｈＲ２に比べて作用スペクトルが大きくシフトしている第２の陽イオンチャネルがあれば、回路計算または行動における別個の２種類の細胞型の示差的寄与または相互作用の実験的試験が可能になる。
【００２４】
球状藻類ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）（図１Ａ）に由来するＣｈＲ２関連配列の１つが報告されているが、このタンパク質の吸収スペクトルおよび光サイクルダイナミクスは実質的にＣｈＲ２と同じである。クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のＣｈＲ１により関連のある第２のボルボックスＣｈＲ（図１Ｂ）が発見された。この新規なタンパク質およびそのバリアントを本明細書ではＶＣｈＲ１と呼ぶ。
【００２５】
実験的試験では、ＶＣｈＲ１をアフリカツメガエル卵母細胞およびＨＥＫ２９３細胞で発現させ、ＶＣｈＲ１がクラミドモナスＣｈＲ１と同様な光電流を惹起することが見出された。この光電流は光強度に応じて段階的（ｇｒａｄｅｄ）であり、早いピークから、わずかに低下した定常プラトーへの不活化を示した（図１Ｃ）。比較的強い強度の光で選択的に現れたピークは、予期される非伝導性の後期光サイクルの中間体の蓄積増加によるものと見られ（図１Ｃ）、光強度が飽和に近づくにつれ、惹起された電流は、定常状態に達する前に特徴的な極小値を示した。ＶＣｈＲ１は、内向き整流性の電流−電圧関係を示し（図１Ｄ）、神経の生理的な条件下では、主にＮａ＋を通過させたが、Ｈ＋、Ｋ＋、およびＣａ２＋も通過させた（図１Ｅ）。
【００２６】
吸収特性の変化が予想ができるように、ＶＣｈＲ１とクラミドモナスＣｈＲの一次構造の違いを特定した（図１Ｂ、配列番号００１（ＣｈＲ２）、００２（ＣｈＲ１）、および００３（ＶＣｈＲ１）を示す。一次構造の違いをハイライトで示す）。第１に、バクテリオロドプシン（ＢＲ、５７０ｎｍに吸収極大）および感覚性ロドプシンＩＩ（ＳＲＩＩ、５００ｎｍに吸収極大）の静電ポテンシャルについて先に行われた計算および更なる量子力学的分子力学計算（ＱＭ／ＭＭ）に基づくと、補因子オールトランスレチナールシッフ塩基（ＲＳＢ；図１Ｂ）の対イオン錯体が、色の調整、光異性化、および光サイクルの動力学にとって最も重要であると考えられる。三次元構造が知られている他の微生物オプシン遺伝子との相同性に基づくと、ＣｈＲ２中の対イオン錯体は、Ｒ１２０、Ｅ１２３、およびＤ２５３により規定されるはずである。しかし、これらの残基は、ＣｈＲ１およびＶＣｈＲ１（図１Ｂ、ハイライトされた列１０４）の両方で完全に保存されている。第２に、以前の変異実験に従う理論的計算によれば、ＲＳＢ結合ポケットの３つの残基が微生物ロドプシンタンパク質間の吸収の差に大きく寄与している可能性があることが予測される。これらのアミノ酸とは、ＣｈＲ２ではＧ１８１、Ｌ１８２、およびＳ２５６（図１Ｂの配列、ハイライトされた列１０６）である。最初の２つはＲＳＢのβイオノン環の近く（図１Ｂの構造、１０８）に位置すると予想され、Ｃ１８３と一緒に吸収スペクトルを決定し得る。一方、Ｓ２５６はＲＳＢのプロトン化窒素に隣接する可能性が高い（図１Ｂの構造、１１０）。ＶＣｈＲ１では、１８１位および１８３位の２ヶ所が極性のＳｅｒで置換されているため、ＲＳＢのβ−イオノン環末端がＣｈＲ１およびＣｈＲ２よりも極性が大きいことが予想され、逆に、２５６位がＡｌａであるため、ＲＳＢの窒素環境は極性が実際により低い。１８１位、１８３位、および２５６位におけるこれら３個の変換の組合せの結果、ＶＣｈＲ１では、ＲＳＢポリエン系に沿った正電荷の再分布およびＣｈＲ２と比べて４０ｎｍを超える大きなレッドシフトが予想される。
【００２７】
その他の３個のアミノ酸Ｈ１１４、Ｅ２３５、およびＥ２４５（図１Ｂ、ハイライトされた列１０２）は、ロングレンジカップリングによりＲＳＢの電荷分布を調節すると予想され、ここで、ＶＣｈＲ１およびＣｈＲ１の両方におけるＨ１１４Ｎへの置換は、β−イオノン末端におけるＲＳＢの電位を増加させると更に予想される。ＣｈＲ１（ニューロン中ではあまり発現しない）の４９５ｎｍにおける吸収極大も実際はＣｈＲ２よりわずかにレッドシフトしているが、ＶＣｈＲ１における多くの重要な変更点の組合せからは、神経科学のツールの新たなクラスを定めるのに有用なスケールの大きい波長シフトが予測される。
【００２８】
最初に波長依存性を調べるために、さまざまな波長で１０ｎｓのレーザーフラッシュを用いてＶＣｈＲ１発現卵母細胞を興奮させた。顕著にレッドシフトした作用スペクトルが描かれ、約５３５ｎｍに極大があることおよび５０５ｎｍにピークを有する第２の異性体のピークと一致する小さなショルダーが低波長側にあることが示された（図１Ｆ）。強力なタンパク質発現を駆動するアルファ−ＣａＭＫＩＩプロモーターを有するレンチウイルスを構築して、ニューロン中でのＶＣｈＲ１の機能を試験した。ＶＣｈＲ１発現を可視化するために、ＶＣｈＲ１の７回膜貫通ドメイン（残基１〜３００、ＣｈＲ２の最初の３１５残基との相同性に基づく）をインフレームで黄色蛍光タンパク質のアミノ末端に融合させた（ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰ）。ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰを発現するニューロンは、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰで以前に報告されているのと同様に、明確に膜局在するＥＹＦＰ蛍光を示し（図２Ａ）、同じレンチウイルスアルファＣａＭＫＩＩ発現ベクターを用いたＣｈＲ２−ＥＹＦＰよりも発現レベルはわずかに弱かった。にもかかわらず、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰニューロンは、５３１ｎｍ、更には５８９ｎｍの光を照射された時にも、強い光電流を示した（図２Ｂ）。細胞全体の内向き電流の平均は、サンプルに５３１ｎｍの光を１５ｍＷ／ｍｍ２で照射した時および５８９ｎｍの光を１３．８ｍＷ／ｍｍ２で照射した時、それぞれ２０８．８±２２．３ｐＡ（特に断りのない限り平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝２０）および１７７．６±２４．７ｐＡ（ｎ＝１０）であった（図２Ｃ）。光電流上昇の見かけの時定数は、吸収係数のシフトのため、活性化が最大になる波長に近いほど速く、対応する値は、τ５３１＿ｏｎ＝２．８±０．３ｍｓおよびτ５８９＿ｏｎ＝８．０±０．７ｍｓ（５３１ｎｍはｎ＝１１、５８９ｎｍはｎ＝１０）であった。対応する減衰時間定数は、τ５３１＿ｏｆｆ＝１３３．４±１１．７ｍｓ（ｎ＝１１）およびτ５８９＿ｏｆｆ＝１３５．７±９．８ｍｓ（ｎ＝１０）であった。
【００２９】
電流固定法でＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰニューロンに５３１ｎｍまたは５８９ｎｍの２０発の５ｍｓ光パルス列を与え（５８９ｎｍで興奮させた時の典型的なトレースを図２Ｄに示す。）、スパイク惹起におけるＶＣｈＲ１の周波数依存を調べた（図２Ｄ）。１０Ｈｚまでは、いずれの波長の列においても、試験した細胞の９０％超で１００％の活動電位が発火し、２０Ｈｚでは細胞は典型的には光パルスの約６５％に反応して発火した（図２Ｅ）。これらの強発現細胞では、３０Ｈｚまで確実にスパイクを惹起することができ（図２Ｄ；培養中の錐体ニューロンは典型的には５０Ｈｚ以上では電流注入またはＣｈＲ２光刺激のいずれにも反応がついていかなかった。）、５３１ｎｍでは、各光パルスに対して二重のスパイクが惹起されることがあり、これは、τｏｆｆ減衰定数がＣｈＲ２１０の１２ｍｓに対して１３３ｍｓとゆっくりであるためであろう。ＣｈＲ２同様、ＶＣｈＲ１も弱い刺激の光強度で興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）様の閾値未満の脱分極を引き起こすことができた。連続光パルスの送達は、閾値未満の膜電圧変化の典型的な総和（ｔｙｐｉｃａｌ  ｓｕｍ）を惹起し、光パルスの周波数を大きくすると定常状態の脱分極も増加した（図２Ｆ）。
【００３０】
膜の完全性に対する潜在的影響を調べるため、１）ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰ発現ニューロン、２）非形質導入ニューロン、および３）典型的な光パルスプロトコール（２０Ｈｚで１ｓ、５ｍｓの光フラッシュを１分に１回、１０分間）にさらした２４時間後に初めてパッチクランプしたＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰ発現ニューロン間で、ホールセルパッチクランプにより膜抵抗および静止膜電位を比較した（図２Ｇおよび２Ｈ）。記録した全ての細胞で値はほぼ同じであった。このことは、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰ発現が膜の電気的特性を著しく変えないことを示唆している。細胞内分布は、ＣｈＲ２同様、強く膜に局在しているように見え、ＶＣｈＲ１はこれらのニューロンによく許容されていた。更に、ＣｈＲ２およびＮｐＨＲ同様、ニューロン中にＶＣｈＲ１を形質導入した後にオールトランスレチナールの補給は不要であった。これらの遺伝子は全て微生物のオプシンをコードしており、ＲＳＢを形成して機能性ロドプシンになるためにオールトランスレチナールを組み込むことが必要であるが、一貫して、脊椎動物ニューロンは化学的補因子を補給しなくても発現されたオプシンを機能性タンパク質に変換することが見出されている。
【００３１】
ＣｈＲ２およびＶＣｈＲ１の活性化の間にある顕著なスペクトルの分離が、異なる２つの波長の光を用いた別々の活性化を可能にするのに十分であるかを調べた。作用スペクトル（図１Ｆ）に基づき、ＣｈＲ２およびＶＣｈＲ１の分離可能な活性化を探索するために最適と思われる興奮波長として４０６ｎｍおよび５８９ｎｍが選択された。ＣｈＲ２またはＶＣｈＲ１を発現しているニューロンについて、５Ｈｚで与えられる２０発の５ｍｓ光パルス列（４０６ｎｍおよび５８９ｎｍ）に反応して惹起された活動電位を調べた。各波長を複数の異なる光強度で試験し、ＣｈＲ２活性化を最大化し且つＶＣｈＲ１活性化を最小限に抑えるパラメータを４０６ｎｍと決定し、その逆のパラメータも同様に決定した。ＣｈＲ２およびＶＣｈＲ１ニューロンはそれぞれ４０６ｎｍおよび５８９ｎｍの光で別々に活性化することができることを見出した（図３Ａ）。実際、ＣｈＲ２ニューロンは、５８９ｎｍの吸収が実質的にゼロであるため、５８９ｎｍの光パルスを照射された時に活動電位を発火せず、一方、ＶＣｈＲ１ニューロンはこの波長で信頼性よく発火した。逆に、４０６ｎｍの光を照射した時、３つの光強度の全てで、全ＣｈＲ２ニューロンが２０回の活動電位を発火させた（ｎ＝１０、図３Ｂ）。ＶＣｈＲ１細胞は、４０６ｎｍのフラッシュに反応して時々活動電位を発火することができたが（一般的に、全てのロドプシンは、第２の電子状態への遷移（Ｓ０→Ｓ２遷移）により、この波長にいくらかの吸収を示す。）、４０６ｎｍの光強度を１．２ｍＷ／ｍｍ２（ｎ＝１０、図３Ｃ）に低下させるとスパイクの割合を１３±９％にまで減少させることができ、ＣｈＲ２ニューロンにおいては、この光強度でもＣｈＲ２ニューロンによるスパイク生成は強固に駆動し続けられた。
【００３２】
ここで実施されるように、ＶＣｈＲ１およびＣｈＲ２の同時使用は、回路動作の制御における種々の細胞集団の漸進的動員の試験に用いることができる。例えば、最初に黄色光で集団Ａを分離し、その後、青色光を加えて集団ＡおよびＢを合わせて駆動することで、２つの異なる介在ニューロンまたは神経調節性集団を段階的に動員することができる。この種の実験は、波長がシフトしたチャネルロドプシン開発の背景にある主要な推進力であった。なぜなら、神経情報処理および異なる神経調節系の相互作用は複雑であり、神経回路のダイナミクスおよび挙動におけるの調節的ゲート開閉および組合せの計算の重要性を調べるためには２つ以上の波長による速い光学的興奮誘発が必要なためである。
【００３３】
単一の細胞型の役割は別々の実験で調べることができるが、いくつかの実験での都合上、分けられた２つの集団を異なる時間に駆動することが有用であり得る。この種の実験のために、最適な戦略では、ＣｈＲ２およびＶＣｈＲ１の確実なスパイクを別々に引き起こすのに十分な、それぞれ最低限の４０６ｎｍおよび５８９ｎｍの光強度を用い、（図３Ａ〜Ｃに示すように）単に各実験標本について独立した較正が必要なだけである。モノクロメータまたは複数のフィルターを用いて、光の色の交差逓減（ｃｒｏｓｓ−ｔａｐｅｒ）を利用することもでき、黄色の波長では、ＶＣｈＲ１標識された集団だけが制御され、興奮誘発波長が５３５ｎｍを超えて青色側に進むにつれて、ＣｈＲ２標識された集団の寄与が安定的により優勢になる（図１Ｆ）。分子的改良（例えば、ＣｈＲ２のブルーシフトおよびＶＣｈＲ１のスペクトルの尖鋭化）を実施してスペクトルの青色側の端で更なる分離を実現することができる。
【００３４】
ここで黄色光による神経興奮についてのＶＣｈＲ１の同定及び特徴解析により、青色光で神経を興奮させるためのＣｈＲ２および黄色光で神経を抑制するためのＮｐＨＲの導入にに続く、神経回路の機構および機能の探索に利用可能な機能的に別個な第３の大きなカテゴリーの高速な光遺伝学的ツールが定義される。機能的に有意にレッドシフトした作用スペクトルに加えて、ＶＣｈＲ１はＣｈＲ２に比べて定常状態の電流に対するピークの割合が低い等の興味深い更なる特性を示している（図１Ｃ、２Ｂ）。通常、チャネルロドプシン中でのピーク電流の大きさは光強度、外部ｐＨ、および膜電圧に依存するが、定常状態のピークに対する比率は本発明者らが実験した全ての条件下においてＣｈＲ２よりＶＣｈＲ１の方が大きかった。
【００３５】
独立して制御可能な２つの興奮刺激タンパク質の存在は、種々の応用への道を開き、そのような応用としては、限定されるものではないが、種々の疾患の治療への応用および複数のそれぞれの光の波長に反応するように選択できる複数の光反応性タンパク質の使用が含まれる。単一コンポーネントのタンパク質のファミリーは複数の光の波長および強度に反応することが示されている。本発明の態様は、更なる光波長用の配列および／または個々に制御可能なタンパク質チャネルを得るための更なる変異および／または更なる検索を可能にする。光刺激のバリエーション（例えば、波長、強度、または長さ（ｄｕｒａｔｉｏｎ）特性）を用いることもできる。例えば、刺激のプロファイルは、２つの異なるイオンチャネルタンパク質の興奮波長における重なりを利用して、両方のタンパク質を同時に興奮させることができる。そのような場合、タンパク質は異なるレベルの反応性を有していてもよい。それにより、神経への応用では、１組のイオンチャネルは、第２の組のイオンチャネルと比較して異なる成功率でスパイクを生成してもよい。
【００３６】
本発明のヒトへの応用の多くは、使用前に政府の承認が必要である。例えば、遺伝子治療のヒトへの使用はそのような承認が必要になり得る。しかし、ニューロンの同様な遺伝子治療（新生物のできない非増殖細胞）は急速に進んでおり、ヒトの脳へのウイルス遺伝子導入を含む、活発な、ＦＤＡに承認された臨床試験が既に進行中である。これは、幅広い用途への本発明の種々の実施形態の使用を促すであろう。以下に、そのような応用および実施形態の例の一部を非網羅的に挙げる。
【００３７】
中毒は報酬および期待を含む種々の脳機能に関連している。更に、中毒を引き起こす原因は個体間でばらつき得る。一実施形態によれば、中毒、例えばニコチン中毒を、島の小さな領域を光遺伝学的に安定化することで治療してもよい。必要に応じて、島表面上にインターベンションする正確な標的場所を決定するために、脳機能イメージング、例えばｃｕｅｄ−ｓｔａｔｅ  ＰＥＴまたはｆＭＲＩを用いて代謝が亢進している病巣を特定してもよい。
【００３８】
側坐核および中隔の光遺伝学的興奮は、物質を用いる必要なしに患者に報酬および喜びを与えることができるため、中毒治療の鍵を握っていると考えられる。逆に、中毒と関連する薬物欲求を低下させるために、側坐核および中隔の光遺伝学的な安定化を用いてもよい。別の実施形態では、薬物欲求を低下させるために、前帯状回（ＢＡ３２）の脳梁膝で観察される代謝亢進活性の光遺伝学的安定化を用いることができる。プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）のペプチド産物を含む視床下部内側野の弓状核内での細胞の光遺伝学的安定化も、薬物中毒行動を低下させるために用いることができる。この点に関する更なる情報については、参照により全体を本明細書に援用する。Naqvi NH, Rudrauf D, Damasio H, Bechara A. "Damage to the insula disrupts addiction to cigarette smoking." Science. 2007 Jan 26; 315(5811):531-534を参照することができる。
【００３９】
例えば先端巨大症において、下垂体前葉からの成長ホルモンの分泌を抑制するために、ソマトスタチンを分泌する視床下部脳室周囲核の神経内分泌ニューロンの光遺伝学的刺激を用いることができる。ソマトスタチンまたは成長ホルモンを分泌する神経内分泌ニューロンの光遺伝学的安定化を用いて、成長および身体発育を強化することができる。「正常な」加齢に伴う変化の一つとして、４０または５０代以後の、血清成長ホルモンレベルの急激な低下が挙げられる。したがって、脳室周囲核の光遺伝学的安定化によって、加齢に伴う肉体の衰えが軽減され得る。
【００４０】
視床下部の腹内側核（特に弓状核のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ））の光遺伝学的安定化を用いて、食欲を増加させ、それによって神経性食欲不振を治療することができる。あるいは、視床下部外側核の光遺伝学的刺激を用いて、食欲および摂食行動を増加させることができる。
【００４１】
側頭葉、ＮＢＭ（マイネルト基底核）、および後帯状回（ＢＡ３１）を含む患部のコリン作動性細胞の光遺伝学的興奮は刺激をもたらし、したがって、悪化部分に神経栄養上のドライブを与える。これらの患部は脳内で広く拡散しているため、植込み型電極を用いた同様な治療は光遺伝学的アプローチよりも実現性が低いであろう。
【００４２】
不安障害は通常、左側頭皮質、前頭皮質および扁桃体における活性増加に関連し、これは不安が解消すると正常になる傾向にある。したがって、患部の左側頭部および前頭部および扁桃体を光遺伝学的安定化を用いて治療して、これらの領域における活性を抑えるようにしてもよい。
【００４３】
正常な生理では、網膜の感光性神経細胞は、自身が受容した光に反応して脱分極し、受容した光パターンの視覚マップを作成する。光遺伝学的イオンチャネルを用いて、身体の多くの部位でこのプロセスを模倣することができ、目も例外ではない。網膜損傷による視力障害または失明の場合、機能的に新たな網膜を成長させることができ、これは、植込まれたデバイスからの閃光パターンではなく自然環境中の光を利用する。成長した人工網膜を、本来の網膜の位置（視覚皮質に戻る経路となる視神経を利用することができる）に配置してもよい。あるいは、脱分極シグナルのための経路が、光遺伝学的センサーマトリックスからの暗号化された情報を解読できる皮質組織に送られるのであれば、額等の別の位置に人工網膜を配置してもよい。視覚皮質の視覚路下流を刺激することで、皮質盲を治療することもできる。刺激は、視覚皮質の上流でまたは人工光センサーによって生成された視覚データに基づくものとすることができる。
【００４４】
ＣＮ  Ｘまたは迷走神経等の副交感神経系繊維への光遺伝学的刺激を用いて、頻脈の治療を行ってもよい。これは、洞房結節の拍速度を低下させ、それによって心拍数および収縮力を低下させる。同様に、脊髄神経Ｔ１〜Ｔ４内の交感神経系繊維の光遺伝学的安定化も心拍数を低下させる。病的徐脈の治療のためには、迷走神経の光遺伝学的安定化またはＴ１〜Ｔ４中の交感神経系繊維の光遺伝学的刺激が心拍数上昇に役立つ。洞房結節よりも速い異常な電気的病巣（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｆｏｃｕｓ）により生じる心律動異常が、適度な光遺伝学的安定化を用いて異常な電気的病巣を治療することで、抑制され得る。これにより、治療された組織内での内的発火率が低下し、洞房結節に心臓の電気系をペーシングする役割を回復させる。同様な方法であらゆる種類の心不整脈が治療され得る。心筋症またはうっ血性心不全で起こる心臓組織の変性も本発明を用いて治療することができ、残った組織を本発明の種々の実施形態を用いて興奮させることができる。
【００４５】
前頭葉、頭頂葉、および海馬を含む脳領域の光遺伝学的興奮刺激は、処理速度の上昇、記憶の向上、ならびに、神経前駆細胞の発達刺激を含むニューロンの成長および相互結合の刺激を起こし得る。例として、本発明のそのような応用の１つは、患者をほぼ植物状態（意識がほとんどない状態）から抜け出させることを目的とした、視床中の標的ニューロンの光遺伝学的興奮刺激に関する。標的視床神経の膜において光でゲート開閉されるイオンチャネルまたはポンプを成長させる。次いで、修飾されたニューロン上に閃光を向けることによって（例えば、同じ経路からアクセスできる光学部品を介して）修飾ニューロンを刺激し、それにより標的ニューロンおよび／または周囲の細胞の機能を調節する。適切な調節技術に関する更なる情報またはそのような患者の関連する脳領域に関する更なる情報については、Schiff ND, Giacino JT, Kalmar K, Victor JD, Baker K, Gerber M, Fritz B, Eisenberg B, O'Connor JO, Kobylarz EJ, Farris S, Machado A, McCagg C, Plum F, Fins JJ, Rezai AR "Behavioral improvements with thalamic stimulation after severe traumatic brain injury," Nature, Vol. 448, Aug 2, 2007, pp. 600-604を参照することができる。
【００４６】
別の実施形態では、光遺伝学的興奮を用いて、うっ血性心不全等の状態における弱った心筋を治療してもよい。心臓壁が薄く伸びた脆弱な状態であり、また、電極と筋肉の間の均一に分布された電気的結合が困難であるため、ＣＨＦの不全心筋を電気的に補助するのは一般的に実用的ではない。このため、心収縮性を増大させるためのこれまでの好ましい方法には、ベータアゴニスト等の薬理学的方法および循環補助装置等の機械的アプローチが含まれた。本発明のこの実施形態では、心臓を囲む被覆物の内表面上の、または別の様式で患部心臓壁に対置された発光要素によって、弱った心筋に光遺伝学的興奮を与える。広範囲の筋肉を滑らかに覆うように、光を当該技術分野で公知の手段を用いて拡散させてもよく、それにより各光パルスによる収縮が促進される。
【００４７】
帯状回膝下野（Ｃｇ２５）の光遺伝学的安定化に、植込みデバイスを用いて黄色光を適用してもよい。その目的は、その全体を参照により本明細書に援用するMayberg HS et al. , "Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression," Neuron, Vol. 45, 651-660, March 3, 2005, pp. 651-660に教示されているのと同様な様式で標的活性を抑制することでうつ病を治療することである。別の実施形態では、光遺伝学的興奮刺激方法は、その全体を参照により本明細書に援用するSchlaepfer et al., "Deep Brain stimulation to Reward Circuitry Alleviates Anhedonia in Refractory Major Depression," Neuropsychopharmacology 2007, pp. 1-10により教示されているのと同様な様式で同じ領域における活性を上昇させる。
【００４８】
更に別の実施形態では、左背外側前頭前皮質（ＬＤＰＦＣ）が光遺伝学的興奮刺激方法の標的となる。ＬＤＬＰＦＣを５〜２０Ｈｚのペースとすると、回路の連絡を介してこの構造の基礎代謝レベルが上昇し、これはＣｇ２５中の活性を低下させ、進行中のうつ病を改善する。右背外側前頭前皮質（ＲＤＬＰＦＣ）の抑制もうつ病治療の有効な戦略である。この抑制は、ＲＤＬＰＦＣ上での光遺伝学的安定化により達成することができ、また、光遺伝学的興奮刺激および遅いパルス（例えば１Ｈｚ以下）を用いても達成することができ、進行中のうつ病が改善される。光遺伝学的アプローチを用いて迷走神経刺激（ＶＮＳ）を改善することができる。節上神経節、頸静脈神経節等の脳への求心性迷走神経だけを刺激するために、光遺伝学的興奮を使用してもよい。脳からの遠心性神経はこのアプローチによる刺激を受けないため、のどの不快感、せき、嚥下困難、嗄声等のＶＮＳの副作用の一部が取り除かれる。別の実施形態では、海馬を光遺伝学的に興奮させてもよく、これは、樹状細胞および軸索の発芽ならびに海馬の全体的な成長を引き起こす。本発明を用いて治療され得るうつ病に関連するその他の脳領域としては、扁桃体、側坐核、眼窩前頭皮質、眼窩皮質（ｏｒｂｉｔｏｍｅｄｉａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）、海馬、嗅皮質、ならびにドーパミン作動性、セロトニン作動性、およびノルアドレナリン作動性の神経投射が含まれる。光遺伝学的アプローチは、海馬等の構造体を介した活性の拡散を調節して抑うつ症状を調節するために用いることもできる。
【００４９】
ランゲルハンス膵島中に生きたアルファまたはベータ細胞集団が存在する限り、膵島は糖尿病治療の標的となり得る。例えば血清グルコースが高い場合（手動でまたは閉ループグルコース検出システムによって決定される）、膵臓ランゲルハンス島ベータ細胞からのインスリン放出を引き起こすために光遺伝学的興奮を用いてもよく、一方、膵臓ランゲルハンス島アルファ細胞からのグルカゴン放出を防止するために光遺伝学的安定化が用いられる。逆に、血糖値が低すぎる場合（手動でまたは閉ループグルコース検出システムによって決定される）、ベータ細胞のインスリン分泌を停止させるために光遺伝学的安定化を用いてもよく、アルファ細胞のグルカゴン分泌を増加させるために光遺伝学的刺激を用いてもよい。
【００５０】
てんかんの治療には、てんかん発作性活性のクエンチングまたはブロッキングが光遺伝学的アプローチに適している。ほとんどのてんかん患者は、てんかん病巣により、定型的な活性拡散パターンを有している。異常な活性が拡散する前にその活性を抑制するか、異常な活性をその拡散の初期で止めるために、光遺伝学的安定化を用いることができる。あるいは、光遺伝学的興奮刺激による興奮性組織の活性化を一連の意図的に非同期とされたパターンの形で導入して、出現しつつあるてんかん発作活性を止めることができる。別の方法では、ＧＡＢＡ作動性ニューロン中で光遺伝学的興奮刺激を活性化して同様な結果を得る。異常なＥＥＧパターンの検出を引き金とした光遺伝学的安定化を用いて、視床での中継を標的にしてもよい。
【００５１】
別の実施形態では、消化器疾患を治療する。消化系は、感覚ニューロン、運動ニューロン、および介在ニューロンを含む独自の半自律的な神経系を有する。これらのニューロンは、ＧＩ管の動きを制御し、また、腸の特定の細胞による酸、消化酵素、ならびにガストリン、コレシストキニン、およびセクレチンを含むホルモンの放出を起こさせる。これら細胞産物のいずれかの不十分な分泌を含む症候群を、産生細胞型の光遺伝学的刺激またはそれらの活性を促すニューロンの光遺伝学的刺激を用いて治療してもよい。逆に、内分泌産物または外分泌産物が過剰生成される症候群を、光遺伝学的安定化を用いて治療してもよい。腸の運動ニューロンの光遺伝学的興奮を用いて、便秘（特に脊髄損傷患者における便秘）から巨大結腸症（ｍｅｇａｃｏｌａｎ）にわたる腸運動低下疾患を治療してもよい。運動を制御するニューロンの光遺伝学的安定化を用いて、いくつかの形態の過敏性腸症候群を含む腸運動過剰疾患を治療してもよい。幽門のニューロンおよび筋系の光遺伝学的安定化を用いて、神経性の幽門閉塞を治療してもよい。運動低下症候群（ｈｙｐｏｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に対する別のアプローチは、腸壁にある伸長感受性のニューロンに光遺伝学的興奮を与え、腸がいっぱいであり排出が必要であるというシグナルを増加させることである。
【００５２】
この同じパラダイムで、腸の過剰運動症候群に対するアプローチは、下部消化管の伸張受容ニューロンに光遺伝学的安定化を与えることで、腸が空であり排出の必要がないという「偽の合図」を与えることである。明らかな便失禁の場合、管全体の運動性を下げるために、内括約筋および外括約筋の調節向上が好ましいことがある。患者が大便を我慢する必要がある時間の間、内肛門括約筋を光遺伝学的に興奮させることで保持させることができるであろう。更に我慢できるように、外括約筋への光遺伝学的刺激を用いてもよい。患者が排便する必要がある場合には、光遺伝学的刺激を停止するか、光遺伝学的安定化を与えることで、内肛門括約筋、次いで外肛門括約筋をリラックスさせるべきである。
【００５３】
光学的蝸牛インプラントを用いて伝音難聴を治療してもよい。光遺伝学的刺激用の蝸牛インプラントを製造したら、光をフラッシュする蝸牛インプラントを使用してもよい。聴覚伝導路の下流にある標的の光刺激によって感音難聴を治療してもよい。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、高血圧等の血圧疾患の治療に関する。大動脈（大動脈体および大動脈傍体）および頸動脈（「頸動脈小体」）等の領域の圧受容器および化学受容器は、迷走神経（ＣＮ  Ｘ）およびその他の経路を介して髄および橋（特に孤束および孤束核）に求心性インパルスを送ることで、血圧および呼吸の制御に関与する。頸動脈小体、大動脈体、大動脈傍体の光遺伝学的興奮を用いて、「高血圧」という誤ったメッセージを孤束核および孤束に送って、血圧を下げるべきだという指令を出させることができる。血圧を下げるために脳幹の適切な部位への直接的な光遺伝学的興奮または安定化を用いてもよい。逆の様式では、光遺伝学的アプローチに昇圧薬としての役割をさせ、血圧を上昇させる。迷走神経の光遺伝学的興奮または脊髄神経Ｔ１〜Ｔ４内の交感神経線維の光遺伝学的安定化によって同様な効果を得てもよい。別の実施形態では、高血圧を、心臓の光遺伝学的安定化によって心拍出量を下げて血圧を低下させることで治療してもよい。別の実施形態によれば、副腎皮質内のアルドステロン産生細胞の光遺伝学的安定化を用いて血圧を低下させてもよい。更に別の代替的な実施形態では、血管平滑筋の光遺伝学的安定化によって高血圧を治療してもよい。活性光は、末梢血管床へと経皮的に通過するようにしてもよい。
【００５５】
別の例示的実施形態は、視床下部−下垂体−副腎系の疾患の治療に関する。甲状腺機能低下症の治療では、室旁核および視床下部前核中の小細胞性神経内分泌ニューロンの光遺伝学的興奮を用いて甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）の分泌を増加させることができる。ＴＲＨは下垂体前葉を刺激してＴＳＨを分泌させる。逆に、甲状腺機能亢進症を、小細胞性神経内分泌ニューロンの光遺伝学的安定化を用いて治療してもよい。副腎不全またはアジソン病の治療では、視索上核および室傍核中の小細胞性神経内分泌ニューロンの光遺伝学的興奮を用いて、バソプレシンの分泌を増加させてもよい。バソプレシンは、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）に補助されて、ＡＣＴＨを分泌させるよう下垂体前葉を刺激する。クッシング症候群はしばしばＡＣＴＨの過剰分泌により引き起こされるが、視索上核の小細胞性神経内分泌ニューロンの光遺伝学的安定化を用いて、上記と同じ生理学的効果の連鎖を介して治療してもよい。弓状核の神経内分泌ニューロンはドーパミンを産生し、ドーパミンは下垂体前葉からのプロラクチンの分泌を抑制する。したがって、弓状核の神経内分泌細胞の光遺伝学的興奮を介して高プロラクチン血症を治療することができ、一方、光遺伝学的安定化を介して低プロラクチン血症を治療することができる。
【００５６】
過自律状態（ｈｙｐｅｒａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｓｔａｔｅ）、例えば不安障害の治療では、副腎髄質の光遺伝学的安定化を用いてノルエピネフリンの生産量を低下させてもよい。同様に、アドレナリンの急上昇が必要な患者（例えば重度のぜん息患者または慢性的な眠気として現れる障害を有する患者）で、副腎髄質の光遺伝学的刺激を用いてもよい。
【００５７】
副腎皮質の光遺伝学的刺激は、コルチゾール、テストステロン、およびアルドステロンを含む化学物質の放出を引き起こす。副腎髄質と異なり、副腎皮質は下垂体および視床下部、肺、ならびに腎臓から分泌される神経内分泌ホルモンから指令を受ける。しかし、副腎皮質は光遺伝学的刺激が可能である。副腎皮質のコルチゾール産生細胞の光遺伝学的刺激をアジソン病の治療に用いてもよい。副腎皮質のコルチゾール産生細胞の光遺伝学的安定化をクッシング病の治療に用いてもよい。テストステロン産生細胞の光遺伝学的刺激を、女性の性的関心障害の治療に用いてもよく、テストステロン産生細胞の光遺伝学的安定化を、女性の顔の毛を薄くするために用いてもよい。副腎皮質内のアルドステロン産生細胞の光遺伝学的安定化を、血圧を低下させるために用いてもよい。副腎皮質内のアルドステロン産生細胞の光遺伝学的興奮を、血圧を上昇させるために用いてもよい。
【００５８】
特定の患部脳領域の光遺伝学的興奮刺激を、処理速度の向上、神経前駆細胞の成熟刺激を含むニューロンの成長および相互結合の刺激に用いてもよい。そのような使用は、精神遅滞の治療に特に有用であり得る。
【００５９】
本発明の別の実施形態によれば、種々の筋肉疾患および筋障害を治療することができる。筋損傷、末梢神経の損傷、およびジストロフィー疾患に関連する麻痺症を、光遺伝学的興奮により収縮させたり、光遺伝学的安定化により弛緩させることで、治療することができる。この後者の光遺伝学的安定化アプローチによる弛緩は、筋消耗を予防し、緊張を維持し、および反対側の筋肉群が収縮する際の協調運動を可能にするためにも用いることができる。同様に、光遺伝学的安定化を介して明らかな痙縮を治療することができる。
【００６０】
末梢神経切断、脳卒中、外傷性脳損傷、および脊髄損傷といった幅広い領域で、新たなニューロンの増殖を促し、それらが他のニューロンおよび標的組織との機能的ネットワークに組み込まれるのを支援する必要がある。光遺伝学的興奮によって新たな神経路の再発達を促すことができ、光遺伝学的興奮は、幹細胞に軸索および樹状突起を発芽させて自身をネットワークに統合させるシグナルとして働く。（電極ではなく）光遺伝学的技術の使用は、無傷組織によるシグナルの受容を防ぎ、電極で発生する電流のような人工的シグナルとではなく発達中のニューロンと情報交換が行われることで、新しい標的組織が確実に成長する。
【００６１】
視床下部腹内側核、特に弓状核のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）への光遺伝学的興奮を用いて肥満を治療することができる。別の実施形態では、視床下部外側核の光遺伝学的安定化を介して肥満を治療することができる。別の実施形態では、視床下部内のレプチン産生細胞またはレプチン受容体を有する細胞の光遺伝学的刺激を用いて、食欲を低下させることによって肥満を治療することができる。
【００６２】
前嚢の病変破壊および類似なその部位への脳深部刺激（ＤＢＳ）が、重篤な難治性強迫性障害４８（ＯＣＤ４８）の確立された治療手段である。内包前脚、またはＯＣＤが寛解するにつれて代謝が低下するＢＡ３２およびＣｇ２４等の部位への光遺伝学的安定化によってこのようなアプローチを真似ることができる。
【００６３】
本発明の別の実施形態を用いて慢性疼痛を治療することができる。電気刺激方法は、局所末梢神経刺激、局所脳神経刺激、および「閾下」運動皮質刺激を含む。合理的な自律性アプローチには、局所的有痛部位の光遺伝学的安定化が含まれる。プロモーターの選択に注意することで、他の感覚神経繊維および運動神経繊維が影響を受けないようにすることができよう。一次運動野での介在ニューロンの選択的光遺伝学的興奮も鎮痛に効果的であろう。また、感覚系視床（特に内側視床核）、脳室周囲灰白質、および腹側縫線核における光遺伝学的安定化を用いて鎮痛することもできる。別の実施形態では、標的戦略としてパルブアルブミン発現細胞標的の光遺伝学的安定化を用いて、サブスタンスＰの産生を低下させることにより疼痛を治療してもよい。光遺伝学的興奮を用いて側坐核の活性を増大させることで内因性オピオイドの放出が達成され得る。別の実施形態では、視床下部内側野弓状核のＰＯＭＣニューロンを光遺伝学的に興奮させた時、ベータエンドルフィンが増加し、うつ病および慢性疼痛に対する実行可能な治療方法が実現される。
【００６４】
境界型および反社会型を含むある種の人格障害は、「前頭葉機能低下」を含む脳障害における局所的障害を示す。これらの領域の直接的または間接的な光遺伝学的興奮は症状を改善することが期待される。扁桃体における活性の異常なバーストも、突発的で自発的な、怒りへの発作を引き起こすことが知られており、これは境界性人格障害およびその他の状態の症状であり、扁桃体の光遺伝学的安定化が有益であり得る。光遺伝学的アプローチは、扁桃体、線条体、および前頭皮質を含む脳の異なる部分の情報交換および同期化を向上させ得、これは衝動性の軽減および洞察の向上の助けとなり得る。
【００６５】
扁桃体に焦点を当てた外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）のモデルは、扁桃体の過覚醒ならびに内側前頭前皮質および海馬によるトップ−ダウン制御が不十分であることがＰＴＳＤに関連していると提唱している。したがって、ＰＴＳＤを、扁桃体（ａｍｙｇｄａｌｅ）または海馬の光遺伝学的安定化を用いて治療してもよい。
【００６６】
統合失調症は幻聴等の異常を特徴とする。これらは、光遺伝学的安定化を用いた聴覚皮質の抑制により治療され得る。統合失調症に付随する前頭葉機能低下は、前頭部患部における光遺伝学的興奮によって治療され得る。光遺伝学的アプローチは、脳の異なる部位間の情報交換および同期化を向上させ得、これは、自身が発生した刺激を誤って外来刺激に帰属することを減らす助けとなり得る。
【００６７】
プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）のペプチド産物を含む視床下部内側野弓状核内の細胞の光遺伝学的安定化を、脅迫的性行動の低減に用いることができる。プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）のペプチド産物を含む視床下部内側野弓状核内の細胞の光遺伝学的刺激を、性欲障害の病状の治療において性的関心を増大させるために用いることができる。性的欲求低下障害の治療では、下垂体の光遺伝学的興奮を介して精巣および副腎によるテストステロン産生を増加させることができる。側坐核の光遺伝学的興奮は無オルガスム症の治療に用いることができる。
【００６８】
視交差上核はメラトニンを分泌し、メラトニンには睡眠覚醒サイクルを制御する働きがある。視交差上核の光遺伝学的興奮を用いて、メラトニン生成を増加させ、睡眠を誘導し、それによって不眠症を治療することができる。オレキシン（ヒポクレチン）ニューロンは、覚醒状態を促進するために多くの脳神経核を強く興奮させる。オレキシン産生細胞集団の光遺伝学的興奮を用いて、ナルコレプシーおよび慢性的な日中の眠気を治療することができる。
【００６９】
視索上核の光遺伝学的刺激は、オキシトシン分泌の誘導に用いることができ、出産中の分娩促進に用いることができ、社会性障害の治療に用いることができる。
【００７０】
筋肉麻痺同様、脊髄損傷により求心路が遮断された運動機能も、収縮を起こさせる光遺伝学的興奮および弛緩を起こさせる光遺伝学的安定化により治療することができる。この後者の光遺伝学的安定化アプローチによる弛緩は、筋消耗の予防、緊張の維持、および反対側の筋肉群が収縮される際の協調運動可能化に用いてもよい。同様に、明らかな痙縮を光遺伝学的安定化で治療してもよい。光遺伝学的興奮によって新たな脊髄神経路の再発達を促すことができ、光遺伝学的興奮は、幹細胞に軸索および樹状突起を発芽させて自身をネットワークに統合させるシグナルとして働く。
【００７１】
脳卒中障害（ｓｔｒｏｋｅ  ｄｅｆｉｃｉｔ）には、人格変化、運動障害、感覚障害、認識障害、および情動不安定が含まれる。脳卒中障害を治療するための戦略の１つは、興奮性結合から求心路遮断された脳および身体構造に光遺伝学的刺激を与えることである。同様に、抑制性結合から求心路遮断された脳および身体構造に光遺伝学的安定化能を付与することができる。
【００７２】
トゥレット症候群の根底にある病理は皮質領、皮質下領、視床、大脳基底核、および前頭皮質におけるドーパミン伝達の一過性の不全であることが研究により指摘されている。治療を提供するために、脳機能イメージングおよび脳磁図（ＭＥＧ）等の技術を用いて最初に患部を特定することが好ましい。具体的に特定されてもされなくても、候補となる路の光遺伝学的安定化を、運動性チックを抑制するために用いてもよい。移植後にデバイスパラメータを実証的に調べることで、光遺伝学的安定化の部位および続ける必要のない部位が明らかになる。
【００７３】
泌尿器障害または便失禁を治療するために、例えば膀胱排尿平滑筋またはその神経支配の光遺伝学的安定化を介して、括約筋に光遺伝学的安定化を用いることができる。排尿が必要な場合、（外）尿道括約筋を光遺伝学的に安定化し、膀胱排尿筋またはその神経支配を光遺伝学的に興奮させるようにすれば、これらの光遺伝学的プロセスをオフにするか、あるいは逆向きにすることができる。膀胱が求心路遮断されている場合、例えば、ヒトにおける脊髄癆等の後根の疾患によって仙椎の後根が切断または破壊されている場合、膀胱の反射収縮が全て消失しており、膀胱は拡張する。排尿筋の緊張を回復するため、腎臓の損傷を避けるため、および排尿プロセスを支援するために、筋肉の光遺伝学的興奮を直接用いることができる。膀胱が「神経中枢から隔離されて」運動に過敏になっている場合、したがって失禁しやすくなっている場合、膀胱のこの反応性を最小限に抑えるために膀胱筋への光遺伝学的安定化を用いることができる。
【００７４】
特定のニューロン集団、例えばある疾病の病状に関わるニューロン集団を選択的に興奮／抑制するために、複数の戦略を用いて光遺伝学的タンパク質／分子を特定の集団にターゲティングすることができる。
【００７５】
本発明の種々実施形態で、種々の光遺伝学的タンパク質または分子を発現させるために遺伝的ターゲティングを用いてもよい。そのようなターゲティングには、プロモーター（例えば、パルブアルブミン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ＧＦＡＰ）、エンハンサー／サイレンサー（例えば、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー）、およびその他の転写または翻訳調節因子（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子）等の遺伝調節領域を介した光遺伝学的タンパク質／分子の標的化された発現が含まれる。光遺伝学的プローブの発現を遺伝学的に定義された集団に制限するために、プロモーター＋エンハンサー＋調節因子の順列を用いることができる。
【００７６】
空間的／解剖学的ターゲティングを用いて本発明の種々の実施形態を実施してもよい。そのようなターゲティングはニューロンの投射パターンを利用し、ウイルスまたは遺伝情報を保持するその他の試薬（ＤＮＡプラスミド、断片等）を特定のニューロン集団が投射される領域に局所的に送達することができる。遺伝材料は、その後ニューロン本体へと逆に輸送され、光遺伝学的プローブの発現を仲介する。あるいは、局所的領域の細胞を標識することが望ましい場合、局所的発現を仲介するために目的の領域にウイルスまたは遺伝的材料を局所的に導入してもよい。
【００７７】
本発明の１または複数の実施形態の実施で種々の遺伝子導入システムが有用である。そのような導入システムの１つはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、プロモーター＋光遺伝学的プローブカセットを目的の特定の領域に導入するために用いることができる。プロモーターは、特定のニューロン集団中での発現を促すように選択される。例えば、ＣａＭＫＩＩａプロモーターを用いると、興奮性ニューロン特異的な光遺伝学的プローブの発現が促される。ＡＡＶは、少なくとも１年以上にわたる光遺伝学的プローブの長期発現を仲介する。更なる特異性を達成するために、種々の細胞型に対してそれぞれ異なる栄養性を有する特異的な血清型１〜８を用いてＡＡＶをシュードタイプ化してもよい。例えば、血清型２および５はニューロン特異的栄養性が高いことが知られている。
【００７８】
別の遺伝子導入機構として、レトロウイルスの使用が挙げられる。目的の特定領域にプロモーター＋光遺伝学的プローブカセットを導入するために、ＨＩＶまたはその他のレンチウイルス系レトロウイルスベクターを用いることができる。レトロウイルスも、軸索投射パターンに基づいて細胞を標識するための逆行性輸送を達成するために、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化してよい。レトロウイルスは、宿主細胞ゲノムと一体化するので、光遺伝学的プローブの永久的発現を仲介することができる。非レンチウイルス系レトロウイルスベクターを用いて分裂細胞を選択的に標識することができる。
【００７９】
ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の２つも、脳の特定の領域にプロモーター＋光遺伝学的プローブカセットを導入するために用いることができるＤＮＡウイルスである。ＨＳＶおよびアデノウイルスははるかにパッケージング容量が大きいので、はるかに大きいプロモーター領域を載せることができ、また複数の光遺伝学的プローブまたは光遺伝学的プローブに加えて別の治療的遺伝子を導入するためにも用いることができる。
【００８０】
ニューロンを一時的にトランスフェクトするために局所的なエレクトロポレーションを用いることもできる。ＤＮＡプラスミドまたは断片を脳の特定の領域に局所的に導入することができる。穏やかな電流を印加することで、周囲の局所細胞でＤＮＡ物質が受け取られ、光遺伝学的プローブ発現される。
【００８１】
別の例では、局所細胞のトランスフェクションを仲介するために、遺伝物質を脂質試薬と混合し、その後脳に注入するリポフェクションを用いることができる。
【００８２】
種々の実施形態で、種々の調節領域を用いる。遺伝的調節領域に加えて、その他の調節領域（特に、活性が化学的・磁気的刺激、または赤外照射に感受性であるプロモーターおよびエンハンサー）を、光遺伝学的プローブの時間制御発現の仲介に用いることができる。例えば、転写活性が赤外照射の影響を受けるプロモーターは、焦点を絞った照射を用いて、所望の時間だけ、局所領域での光遺伝学的プローブの発現を微調整することを可能にする。
【００８３】
ＣａＭＫＩＩα等の興奮性特異的プロモーターを用いて、視床下核（ＳＴＮ）または淡蒼球内節（ＧＰｉ）中のグルタミン酸作動性ニューロンにおいて光遺伝学的安定化を発現させ光遺伝学的安定化を与えることでパーキンソン病を治療することができる。全ての細胞型が影響を受ける電気的調節とは異なり、グルタミン酸作動性視床下核ニューロンだけが抑制される。
【００８４】
本発明の態様は、神経回路または神経疾患のモデルの試験に関する。このモデルは、入力シグナルの関数として回路の出力反応を決定することができる。出力反応は、複数の異なる測定可能な特性を用いて評価することができる。例えば、特性には、下流ニューロンの電気的反応および／または患者の行動反応が含まれる。モデルを試験するために、モデルの入力位置で光遺伝的プローブを発現させる。光遺伝学的プローブを刺激し、出力特性をモニターし、モデルから予測される出力と比較する。
【００８５】
特定の実施態様においては、光遺伝学的プローブを使用することで、電気的プローブを用いて決定されたモデルを微調整することができる。電気的プローブは刺激を向ける能力が限定され、近くの領域を直接刺激することなく特定の領域を刺激するのにはあまり適していない。本明細書に開示する光遺伝学的プローブは、刺激場所をより正確に選択する機構を提供する。例えば、光遺伝学的プローブからの刺激は、求心性線維等の非常に特定された種類の回路／細胞に向けることができる。以下の記載は、そのような実施形態に係る実施例を提供するものであり、本発明の態様の実行可能性および広い適用性を示すことを意図する。
【００８６】
本発明の一実施形態によれば、本発明は、治療効果に関与する標的細胞型（激しく議論される領域であり、臨床的に極めて重要である。）を特定するために、脳深部刺激のモデル動物、例えばパーキンソン病ラット、において用いてもよい。この知見だけでも、ヒトの疾患を治療するための改善された薬理学的・外科的戦略の進展につながり得る。
【００８７】
そのような応用の１つは、２つのニューロン群の間における長期増強（ＬＴＰ）および／または長期抑圧（ＬＴＤ）を含む。ＶＣｈＲ１およびＣｈＲ２の発現を異なるニューロン集団にターゲティングし、それぞれを異なる周波数の光で刺激することで、２群間でＬＴＰまたはＬＴＤを達成することができる。それぞれの波長の光を用いることで群を個別に制御することができる。これは、同じ波長の光を用いて個別に制御する際に２群の空間的配置が問題となる用途で特に有用であり得る。したがって、光送達デバイスは、間違ったニューロン群を興奮させにくく、光刺激の正確な空間的位置への依存が少なくなり得る。
【００８８】
インビボでの細胞へのタンパク質導入は、複数の異なる導入デバイス、方法、およびシステムを用いて達成することができる。そのような導入デバイスの１つは、インビボで細胞を修飾するための塩基配列、例えばウイルスベクター、を導入する植込み型デバイスである。植込み型デバイスは光送達機構も備えてよい。光送達は、例えば発光ダイオード（ＬＥＤ）、光ファイバー、および／またはレーザーを用いて達成することができる。
【００８９】
本発明の別の実施形態では、生存／死滅、分化、および複製を含む幹細胞の運命に影響を与えるためにＶＣｈＲ１を使用する。電気的特性を調節することで幹細胞の運命が制御されることが示されている。幹細胞の運命を調節する刺激パターンを与えるために種々の技術を用いることができる。具体例としては、その全体を参照により本明細書に援用するDeisseroth, K. et al. "Excitation-neurogenesis coupling in adult neural stem/progenitor cells," Neuron 42, pp. 535-552 (2004)で用いられている技術に従うものが挙げられる。
【００９０】
本発明の別の実施形態は、治療効果を評価するためのＶＣｈＲ１の使用に関する。これには、薬物スクリーニング、治療レジメン、または治療／疾患のモデリングが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、そのような評価における主要な光反応性タンパク質としてＶＣｈＲ１が用いられる。別の実施形態では、ＶＣｈＲ１は、異なる波長に反応する別の種類の光反応性タンパク質（例えばＣｈＲ２および／またはＮｐＨＲ）と一緒に用いられる。
【００９１】
本発明の特定の実施形態では、哺乳動物のコドンに最適化されたｃＤＮＡ配列を作製するためにＶＣｈＲ１を使用し、合成した（カリフォルニア州メンローパークのＤＮＡ２．０社）。
【００９２】
以下の方法を用いてレンチウイルスベクターを構築した。ＮｏｔＩ制限酵素部位を介してＶＣｈＲ１（１〜３００）をＥＹＦＰと融合させることでＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰを構築した。次いで、融合遺伝子を、アルファ−ＣａＭＫＩＩレンチウイルスバックボーンのＡｇｅＩ部位とＥｃｏＲＩ部位にライゲーションし、ｐＬｅｎｔｉ−ＣａＭＫＩＩａ−ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥベクターを作製した。ｐＬｅｎｔｉ−ＣａＭＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥベクターの構築は以前に報告されている。組換えレンチウイルスを作製した。そのようなベクターの構築または使用に関する更なる詳細については、その全体を参照により本明細書に援用するZhang, F., et al. "Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry," Nature 446, pp. 633-639 (2007)を参照することができる。
【００９３】
その全体を参照により本明細書に援用するBoyden, E.S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G. & Deisseroth, K. "Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity," Nat Neurosci 8, pp. 1263-1268 (2005)に記載されているように、培養した海馬ニューロンを準備した。
【００９４】
培養海馬ニューロン中のホールセル記録では、細胞内液は、１２９ｍＭ  グルコン酸カリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、および０．３ｍＭ  Ｎａ３ＧＴＰを含んでおり、ｐＨ７．２に滴定された。培養海馬ニューロンでは、タイロード液を細胞外液として用いた（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ  グルコース、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３に滴定）。記録は、４０×水浸対物レンズを備えた縦型のライカＤＭ−ＬＦＳＡ顕微鏡上で行った。ボロシリケートグラス（サッター・インスツルメンツ社（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）ピペット抵抗は約５ＭΩであり、４〜６ＭΩの範囲であった。アクセス抵抗は１０〜３０ＭΩであり、記録している間、安定性をモニターした。全ての記録は、Boyden, E.S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G. & Deisseroth, K. "Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity," Nat Neurosci 8, pp. 1263-1268 (2005)に記載されているように、シナプス伝達ブロッカー存在下で行った。
【００９５】
海馬ニューロンの光刺激には、３００Ｗキセノンランプを備えたラムダＤＧ−４光スイッチ（サッターインスツルメンツ社製）中で以下の３つのフィルターを用いた：４０６ｎｍ（ＦＦ０１−４０６／１５−２５）、５３１ｎｍ（ＦＦ０１−５３１／２２−２５）、および５８９ｎｍ（ＦＦ０１−５８９／１５−２５）（セムロック社（Ｓｅｍｒｏｃｋ）製）。
【００９６】
卵母細胞実験には、ＶＣｈＲ１の１〜３１３に対応する合成ＤＮＡ配列（ｖｃｈｏｐ１；ヒトコドン使用頻度に適応；ドイツ、レーゲンスブルクのジーンアート社（Ｇｅｎｅａｒｔ）製）をＶＣｈＲ１  ｐＧＥＭＨＥおよびｐＥＧＦＰ中にサブクローニングした。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）製）によってｐＧＥＭＨＥプラスミドからインビトロで合成されたＣｈＲ２およびＶＣｈＲ１をコードするｃＲＮＡを卵母細胞中に注入した（５０ｎｇ／細胞）。卵母細胞は、１ｍｇ／ｍｌ  ペニシリン、１ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、１μＭ  オール−トランスレチナール、および０．５ｍＭ  テオフィリン存在下、リンゲル液（９６ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５）中で、１８℃、暗黒下にて３〜７日間保存した。
【００９７】
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞上で２電極電位固定法を行い、作用スペクトルを得た。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂ  Ｎｄ−ＹＡＧ−Ｌａｓｅｒ（フランス、レズリス（Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ  Ｃｅｄｅｘ）のクォンテル社（Ｑｕａｎｔｅｌ）製）の第三高調波で出力してＲａｉｎｂｏｗ  ＯＰＯ（カリフォルニア州カールズバッドのＯＰＯＴＥＫ社製）から放出された１０ｎｓのレーザーフラッシュ（４００〜６２０ｎｍ、４〜９×１０１９フォトン・ｓ−１ｍ−２）を１ｍｍの光ガイドを用いて卵母細胞に当てた。増幅器Ｔｅｃ−０５Ｘ（ドイツ、タムのＮＰＩエレクトロニク社製）を補整して、１／２飽和レーザーフラッシュにおける電圧変化を０．０５ｍＶ未満に維持した。データ取得および光始動（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）は、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア（米国サニーベールのモレキュラーデバイス社製）を用いてＤｉｇｉＤａｔａ  １４４０Ａインターフェースを介して調節した。
【００９８】
以下の議論は、パーキンソン病（ＰＤ）の治療および特徴解析への応用例の結果に関する詳細な記載を含む。この具体的な実施例および対応する結果は限定することを意図するものではない。
【００９９】
この分野で最も広く支持されている仮説に最初に取り組むために、局所回路興奮性視床下核ニューロンの直接的且つ可逆的な真の阻害がパーキンソン病の治療効果を有するかを調べた。ラットの視床下核は１ｍｍ３未満であるが、視床下核は隣接領域と識別可能な特定の発火パターンにより特徴付けられるため、オプシンベクター導入中に細胞外記録することでターゲティング精度を上げることができる（図４Ａ、図１０Ｃ）。
【０１００】
視床下核は、抑制性ネットワーク内に埋もれた主に興奮性の構造体である。この解剖学的配置により、抑制性細胞、通過繊維（ｆｉｂｅｒｓ  ｏｆ  ｐａｓｓａｇｅ）、グリア、および隣接構造体に選択的でなくグルタミン酸作動性興奮性ニューロンに選択的なＣａＭＫＩＩαプロモーター制御下でｅＮｐＨＲを発現させる、選択的視床下核抑制のためのターゲティング戦略が可能になる（図４Ｂ）。このようにすることで、真の光抑制が、視床下核内の優勢な局所的ニューロンタイプにターゲティングされる。
【０１０１】
右の内側前脳束（ＭＦＢ）片側だけに６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を注入して片側パーキンソン病にしたラットにおいて、光回路インターベンションを試験した。黒質緻密部の片側だけでチロシンヒドロキシラーゼレベルが低下していたことから、６−ＯＨＤＡ投与後の異質ドーパミン作動性細胞の消失が確認された（図１０Ａ）。これらの片側パーキンソン病げっ歯類は、反対側（左）の肢の使用に特定の欠陥を有し、損傷と同じ側（右方向）への回転を示し、これは、機能的評価を容易にするために対象にアンフェタミンを与えた時に頻度が増加し、ドーパミンアゴニストでの治療後または電気的脳深部刺激後には頻度が減少する（図４Ｄ、右）。このアンフェタミン誘発回転試験は、片側パーキンソン病げっ歯類の治療同定に広く用いられており、移動運動、よじ登り、および頭位置の偏り等のその他の行動試験で補うことができる。興奮性視床下核ニューロンを直接抑制するために、本発明者らは、ＣａＭＫＩＩαプロモーターの下にｅＮｐＨＲを有するレンチウイルスを片側パーキンソン病ラットの右視床下核に導入した。ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰの発現は、興奮性ニューロン特異的であり（ＣａＭＫＩＩαおよびグルタミン酸の発現により示される；図４Ｂ、右；図１１Ａ）、強く（ｎ＝２２０ＣａＭＫＩＩａ陽性細胞で評価した感染率：９５．７３％±１．９６ｓ．ｅ．ｍ）、視床下核に限定されていた（図４Ｂ、左および真ん中）。得られた光制御の生理学的効果を確認するために、イソフルランで麻酔した動物にハイブリッド光刺激／電気記録デバイス（オプトロード）を用い、ｅＮｐＨＲがインビボで機能性であり、記録した視床下核中のニューロンのスパイク生成を強力に抑制する（＞８０％）ことを確認した（図４Ｃ；図１３Ａ、Ｂ；図１４Ａ）。この細胞型を標的とした抑制は時間的に正確、可逆的であり、全ての周波数帯のニューロン発火に及んだ（図４Ｃ、図１６Ａ）。
【０１０２】
片側パーキンソン病ラットの回転行動試験のために、視床下核標的光ファイバーを５６１ｎｍレーザーダイオードに接続して、ｅＮｐＨＲを駆動した。電気的脳深部刺激は病的回転行動の減少に非常に効果的であった。しかし、ｅＮｐＨＲ抑制の正確なターゲティングおよび強力な生理学的効果にも関わらず、局所的な興奮性視床下核ニューロンの真の直接的光抑制では、片側パーキンソン病動物は回転行動に最低限の変化も示さなかった（図４Ｄ）。更に、これらの実験中、移動距離および頭位置の偏りにも光に反応した影響は全くなかった（補足の方法参照）。サルおよびげっ歯類の視床下核領域へのムシモールおよびリドカインの投与は、パーキンソン病の症状を軽減することができる（３０）が、図４のデータは、視床下核の興奮性局所ニューロンにおいて選択的に活性を低下させる、より特異的なインターベンションが、それだけでは運動症状に影響を与えるのに十分ではないようであることを示している。
【０１０３】
別の可能性として、脳深部刺激は、局所視床下核回路を調節する能力を有するグリア調節物質の分泌を刺激している可能性がある。これは、脳深部刺激中にグリア由来因子（アデノシン）が蓄積して、脳深部刺激が仲介する視床的振戦の減弱に一役買っていることを示す最近の知見と一致する。実際、視床下核は、視床下核のシナプス後電流を抑制できるグリア由来調節物質の受容体を発現する。ＣｈＲ２は、グリアを動員する興味深い可能性を示し、光で開けられた場合、ＣｈＲ２は、Ｎａ＋およびＫ＋イオンと一緒に、Ｃａ２＋波を引き起こしＣｈＲ２発現アストログリアを活性化することができるわずかなＣａ２＋流も内側に通過させることができる。本発明者らは、ＧＦＡＰプロモーターを用いてＣｈＲ２を局所アストログリアにターゲティングし、ＧＦＡＰおよびＳ１００βの染色を用いて確認した（図５Ａ、図１１Ｂ）。オプトロード記録から、ＧＦＡＰ：：ＣｈＲ２を形質導入した後に視床下核を青色光刺激すると、秒単位での不定な遅延があるが、視床下核中のニューロン発火が可逆的に抑制されることが示された（図５Ｂ、図１２Ａ）。しかし、この機構によるアストログリア細胞の動員は、パーキンソン病げっ歯類の運動病態にわずかな反応すら生じさせるのに十分でなかった（図５Ｃ、図１２Ｂ）。これらの実験中、移動距離および頭位置の偏りも光による影響は受けなかった。間接的なグリア調節により全ての視床下核ニューロンが同じように影響されていない可能性があるので、これらのデータは脳深部刺激反応における寄与因子としての局所視床下核抑制の重要性を否定するものではないが、局所的グリア細胞の直接的活性化は、パーキンソン病の症状を治療するには不十分なようであり、他の回路機構の存在が示唆される。
【０１０４】
特定の周波数でのネットワーク振動はパーキンソン病の病理および治療の両方で重要な役割を果たし得る。例えば、パーキンソン病は、大脳基底核中の病的レベルのベータ振動を特徴とし、ガンマ周波数で視床下核を同期させるとパーキンソン病の症状が回復し得、ベータ周波数は症状を悪化させ得る。視床下核中の興奮性細胞体を単純に抑制しても行動異常には影響せず、電気的脳深部刺激には高周波刺激（ＨＦＳ：９０〜１３０Ｈｚ）が用いられることから、本発明者らは、ＣｈＲ２を用いて視床下核内でこの範囲の高周波振動を駆動した。本発明者らは、ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２を視床下核に注入し（図６Ａ）、パーキンソン病げっ歯類の行動試験（図６Ｃ、図１２Ｃ）中に、４７３ｎｍレーザーダイオードによるパルス照射を用いて視床下核中の興奮性ニューロンを活性化した（図６Ｂ、図１４Ｂ）。麻酔動物の視床下核中における高周波出力はニューロンのスパイク率に強く影響したにも関わらず（図１６Ｂ）、視床下核領域に局所的に導入された高周波数刺激（ＨＦＳ）はパーキンソン病の行動症状に影響を与えることができなかった（移動距離および頭位置の偏りは光によって変わらなかった。補足の方法参照）。並行して行ったベータ周波数パルスを用いた試験の動物も行動的反応を示さなかった。このことは、視床下核興奮性ニューロン内で直接発生された振動は治療効果を説明するのに十分ではないことを示している（寄与的役割を否定するものではない）。
【０１０５】
本発明者らは以前に、皮質組織および視床下部組織中で、レーザーダイオード光ファイバー照射条件下での青色光伝播を測定し、生理学的に大きな微生物オプシン流を駆動するのに十分な光出力密度で、かなりの組織体積（視床下核とほぼ同じ）が確かに動員され得ることを観察した。これらの測定を繰り返してパーキンソン病の状況にも拡張することが重要であった。最初に、本発明者らは、５６１ｎｍレーザーダイオードから送達される低エネルギー光子は散乱が少ないので、脳組織中の青色光（４７３ｎｍ）伝播測定値が、動員される組織体積の下限になることを確認した。その結果、いずれの波長の光でも、ファイバーから１．５ｍｍ以内であればオプシンを活性化するのに十分な光出力が存在することを確認した（図７Ａ）。次に、本発明者らは、行動実験を模倣した条件下で組織の動員に対する機能的アッセイを用いてこれらの発見を拡張した（図７Ｂ、Ｃ）。自由行動下のラット中でＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２発現視床下核を標的としたインビボ光刺激パラダイムの後、ニューロン活性化の生化学的マーカーであるｃ−ｆｏｓの免疫組織化学を実施した。幅広い体積にわたる（図７Ｃ）視床下核中でｃ−ｆｏｓの強い活性化が観察された（図７Ｂ）。実際、本発明者らの光散乱測定および組織の形状から予想されるように、光刺激によって少なくとも０．７ｍｍ３の視床下核が動員されることを見出した。これは視床下核の実際の体積とかなり一致する（図７Ｃ）。したがって、図４〜６の光調節パラダイムにより視床下核全体が動員されるので、光の透過は制限ではなかった。
【０１０６】
脳深部刺激電極は局所細胞およびその遠心性繊維だけでなく求心性線維も強力に調節するので、治療効果は、視床下核に入る軸索投射の駆動から生じている可能性がある。レンチウイルスは求心性軸索には形質導入せず細胞体に形質導入するので、光遺伝学はこれら２つの可能性を区別する。視床下核への求心性投射を標的とすることでパーキンソン病の運動行動反応が調節されている可能性を評価するために、本発明者らは、投射ニューロン中でＣｈＲ２を発現するＴｈｙ１：：ＣｈＲ２トランスジェニックマウスを用い、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２のライン１８においてＣｈＲ２−ＹＦＰが視床下核の細胞体からは排除されているが求心性線維には大量にあることを確認した（図８Ａ）。
【０１０７】
本発明者らは、麻酔した６−ＯＨＤＡマウス（図１０Ｂ）でオプトロード記録を行い、求心性軸索を選択的に駆動することによる視床下核生理への局所的影響を評価し、周波数依存的影響を見出した（図８Ｂ）。最初に、本発明者らは、視床下核への求心性繊維の高周波数刺激が、全ての周波数帯にわたって視床下核のスパイク生成を強力に減少させることを観察した。刺激中、低振幅高周波数の振動が持続したことから、この効果は局所回路を完全には遮断していなかった（図８Ｂ；図１３Ｃ、Ｄ；図１４Ｃ）。次に、本発明者らは、求心性繊維の低周波数刺激（ＬＦＳ）が、内因性のバーストには影響を与えずに視床下核中でベータ周波数の発火を増加させることを見出した（図８Ｂ、図１４Ｄ）。次に、本発明者らは、６−ＯＨＤＡマウスにおいて、パーキンソン病の行動に対するこれらの特異的なインターベンションの影響を評価し、光遺伝学的インターベンションでは初めて顕著な効果を観察した。高周波数刺激を用いた視床下核求心性繊維の駆動は、回転行動および頭位置の偏りによって測定されるパーキンソン病の症状を強力且つ可逆的に回復させた（図８Ｃ）。高周波数刺激の効果はわずかではなく、実際、ほとんど全ての症例で、これら重度のパーキンソン病動物は正常動物と行動的に区別できないほどに回復し、全ての症例において、治療効果はすぐに得られ、完全に可逆的であり、光パルスパラダイムを中断するとすぐに同側回転が戻った。特に、治療された動物は移動方向および頭位置を左から右および右から左に自由に変えることができた。光学的高周波数刺激とは顕著に対照的に、同じ求心線維の光学的低周波数刺激（２０Ｈｚ）は、同側回転行動を増加させ、パーキンソン病症状を悪化させた（図８Ｃ）。このことは、観察された行動的効果が、単に一方向的な活性を駆動することによるものでないことを示している。したがって、直接的視床下核細胞インターベンションとは対照的に、高周波数刺激および低周波数刺激を用いた視床下核求心性線維の駆動は、刺激周波数に応じて異なる様式でパーキンソン病の症状を調節し、これは臨床的にはパーキンソン病症状の寛解または増悪に関連付けられる。
【０１０８】
広い脳領域の様々に配列された繊維が視床下核で収束する。これがおそらく局所的脳深部刺激標的として視床下核が有用である理由であろう。これらの求心性繊維の多くがおそらく一緒になって治療効果に寄与し、観察される行動効果が１つのソースの繊維で完全に説明されるとは考えにくい。しかし、本発明者らは、寄与し得る繊維の一般的なクラスを決定するために、これらの求心性繊維を更に詳細に調べた。
【０１０９】
Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２動物は主に興奮性投射ニューロン中でＣｈＲ２発現を示す。実際、視床下核内のＴｈｙ１：：ＣｈＲ２繊維中に抑制性マーカーＧＡＤ６７およびＧＡＢＡは検出されなかった（図９Ａ、左）ので、ＧＡＢＡ作動性淡蒼球投射（ＬＧＰ／ＧＰｅ）の寄与は事実上除外された。本発明者らはまた、主要な神経調節性マーカー（ドーパミンおよびアセチルコリン）が視床下核のＴｈｙ１：：ＣｈＲ２繊維内に局在しないことを見出した（図１１Ｃ）。これにより、ドーパミン作動性ＳＮｒも適切な繊維の起点から除外された。本発明者らは次に、可能性のある興奮性繊維の出所を調べ、視床下核への興奮性線維に寄与し得る興奮性の束傍核または大脳脚橋核の細胞体でＣｈＲ２−ＹＦＰが発現していないことを見出した。しかし、これらのマウスの新皮質内では、視床下核に投射する興奮性ニューロン内でＣｈＲ２−ＹＦＰが強く発現している。視床下核と一次運動皮質Ｍ１の間の強い病理学的関連がパーキンソン病回路不全の根底にあることが示唆されているので、寄与体である可能性があるＭ１を調べた。
【０１１０】
本発明者らは、第５層ニューロンおよび対応する先端樹状突起に主に制限された選択的且つ強いＣｈＲ２発現が、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２Ｍ１中には存在するが、その他の層の細胞中には存在しないことを確認した（図９Ａ、右）。パーキンソン病動物においてこれらの第５層投射ニューロンと視床下核との機能的結合性を調べるために、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２動物の異なる２ヶ所の脳領域に光ファイバーおよび記録電極を設置し、麻酔動物中で分離オプトロード実験を行った（図９Ｂ）。Ｍ１第５層投射ニューロンを駆動すると同時にＭ１および視床下核の両方で記録することで、この種の正確なＭ１刺激が視床下核中のニューロン活性に大きな影響を与えること（図９Ｃ、図１６Ｃ、Ｄ）および視床下核中の光刺激によってＭ１第５層ニューロンが逆行的に動員され得ることを見出した（図１５）。前述した通り、ＺＩからのものを含む視床下核領域中の多くの局所的求心性繊維が脳深部刺激の複雑な治療効果に寄与しているであろうが、Ｍ１第５層と視床下核との間の機能的影響は大きな寄与源であり得る。実際、本発明者らは、選択的なＭ１第５層の高周波数刺激光刺激が、回転行動（図９Ｄ）から頭位置の偏りおよび移動運動（図９Ｅ、Ｆ）の一連の測定において、視床下核刺激と同様な様式でパーキンソン病の症状を緩解するのに十分であることを見出した。視床下核刺激同様、Ｍ１への光学的高周波数刺激によって病的回転および頭位置の偏りが低減され、対照的に、Ｍ１への光学的な２０Ｈｚ（低周波数刺激）の刺激は、病態を悪化させはしないものの、治療効果を全く有さず（図９Ｄ、Ｅ、Ｆ）、対側回転を惹起することができるＭ２低周波数刺激皮質刺激と異なり、てんかん発作を起こさずに可能な最も強い光強度でさえ、Ｍ１の低周波数刺激は回転行動を刺激または変更しなかった。最後に、パーキンソン病  Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウスにおける移動運動の距離および速度の増加の定量により、機能的移動性がＭ１の高周波数刺激では増加するが、低周波数刺激では増加しないことおよびアンフェタミン非存在下では、Ｍ１の高周波数刺激は、動作緩慢な動物が回転行動を惹起されずに自由に運動することを可能にすることが確認された（図９Ｆ）。
【０１１１】
図４は、局所視床下核ニューロンの直接的光抑制を示す。（Ａ）サイレントな不確帯（ＺＩ）および内包（ＩＣ）に囲まれた視床下核を記録することで、カニューレの配置、ウイルス注入、およびファイバーの深さをガイドした。（Ｂ）ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰを発現し興奮性ニューロン特異的ＣａＭＫＩＩαで標識された視床下核ニューロンの共焦点画像（右）。（Ｃ）麻酔した６−ＯＨＤＡラットにおいて、ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰを発現する視床下核を連続的に５６１ｎｍ照射すると視床下核活性が低下した。代表的なオプトロードによるトレースおよび振幅スペクトルを示す。平均スパイク頻度は２９±３Ｈｚから５±１Ｈｚに減少した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ、ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定、ｎ＝２頭の異なる視床下核座標からとった８トレース）。（Ｄ）これらの動物において視床下核刺激はアンフェタミン誘発回転に影響を与えなかった（ｐ＞０  ．０５、ｎ＝４ラット、μ＝０のｔ検定）。赤色の矢印は病的影響の方向を表し、緑色の矢印は治療的影響の方向を表す。刺激電極の植込みの電気的制御は、高周波数刺激で治療的効果を示した（１２０〜１３０Ｈｚ、６０μｓパルス幅、１３０〜２００μＡ、ｐ＜０．０５、μ＝０のｔ検定）。−１００％の変化率は、このげっ歯類が完全に矯正されていることを示している。全ての図のデータは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｎｓ  ｐ＞０．０５、＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１。
【０１１２】
図５は、視床下核内のアストログリアのターゲティングを示す図である。（Ａ）共焦点画像は、ＧＦＡＰ：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核アストロサイトを示し、ＧＦＡＰと共染色している（右）。（Ｂ）麻酔した６−ＯＨＤＡラットにけるＧＦＡＰ：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核の４７３ｎｍ照射。オプトロードの記録により、連続的照射で視床下核の活性が抑制され、発生までの遅れが４０４±３９ｍｓ、停止までの遅れが７７０±８２ｍｓであり（ｎ＝２頭の異なる視床下核座標からとった５つのトレース）、５０％デューティサイクルもスパイク生成を抑制し、発生までの遅れが５２０±４０ｍｓ、停止までの遅れが８８０±２９ｍｓである（ｎ＝２頭の異なる視床下核座標からとった３トレース）ことが示された（ｐ＜０．００１）。（Ｃ）これらの動物において、５０％デューティサイクルの照射はアンフェタミン誘発回転に影響を与えなかった（右、ｐ＞０．０５、ｎ＝７ラット、μ＝０のｔ検定）。
【０１１３】
図６は、異なる周波数を用いた視床下核ニューロンの光脱分極を示す図である。（Ａ）ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現し興奮性ニューロン特異的ＣａＭＫＩＩαマーカーで標識された視床下核ニューロンの共焦点画像である。（Ｂ）４７３ｎｍのレーザーダイオードに接続したオプトロードで記録した、６−ＯＨＤＡラットにおけるＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核の光学的高周波数刺激（１２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）（代表的なトレースおよび振幅スペクトルを示す）。スパイク生成頻度は４１±２Ｈｚから８５±２Ｈｚに増加した（高周波数刺激対ｐｒｅ、ｎ＝５トレース：ｐ＜０．００１、ｔ検定、ｐｏｓｔ、ｎ＝３トレース；トレースは１頭の異なる視床下核座標からサンプリングした）。（Ｃ）アンフェタミン誘発回転は、高周波光刺激（左、１３０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝５ラット）または低周波光刺激（真ん中、２０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝２ラット）による影響を受けなかった。
【０１１４】
図７は、光学的インターベンションにより動員された組織体積の定量を示す図である。（Ａ）４００μｍのファイバーについて、脳組織の深さに対する４７３ｎｍ（青色）および５６１ｎｍ（黄色）の光強度の値を示す。１ｍＷ／ｍｍ２の点線（３０ｍＷ光源）は、チャネルロドプシンおよびハロロドプシンの活性化に必要な最低限の強度を示す。（Ｂ）ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現し前初期遺伝子産物ｃ−ｆｏｓ標識された視床下核ニューロンの共焦点画像は、光刺激により、インビボで強くニューロンが活性化されていることを示している。矢頭はｃ−ｆｏｓ陽性細胞を示す。視床下核においてＣｈＲ２を発現する自由行動下のラット（図６と同じ動物）を４７３ｎｍの光（２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）で刺激した。（Ｃ）強いｃ−ｆｏｓ活性化を示した視床下核体積は、少なくとも０．７ｍｍ３と推定された（点線は視床下核の境界を示す）。強いｃ−ｆｏｓ活性化はＤＡＰＩで対比染色して共焦点顕微鏡で画像化した視床下切片上の内外方向（１．１５５ｍｍ）、前後方向（０．８００ｍｍ）、および背腹方向（０．７７０ｍｍ）で観察された。
【０１１５】
図８は、視床下核中の求心性線維の選択的光制御を示す図である。（Ａ）視床下核中でのＴｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ発現および核のＤＡＰＩ染色の共焦点画像は、細胞体ではなく繊維での選択的発現を示している（右）。（Ｂ）麻酔したＴｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ  ６−ＯＨＤＡマウスにおける、４７３ｎｍの光を用いた視床下核領域の光学的高周波数刺激（１３０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）は、視床下核の大きな振幅のスパイクを抑制し（サンプルトレース、左上）、小さな振幅の高周波数の振動を誘発した（図１３Ｃ、Ｄ；１４Ｃ）。光学的低周波数刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）は、２０Ｈｚで確かなスパイクを生成した（左下）。高周波数刺激はバースト発生を防止した（右上、ｐ＜０．００１、ｎ＝３）が、低周波数刺激は２標本ｔ検定でバースト頻度に何ら大きな影響を与えず（ｐ＞０．０５、ｎ＝３トレース）、スパイク／バーストにも何ら大きな影響を与えなかった（右下、ｐ＞０．０５、ｎ＝３トレース）。（Ｃ）これらの動物において視床下核への光学的高周波数刺激（左、１００〜１３０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝５マウス）は、強い治療的効果を生み出し、同側回転を減少させ、動物は自由に方向を変えることができるようになった。対照的に、光学的低周波数刺激（左から２番目、２０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝５マウス）は病的影響を増悪させ、同側回転を増加させた。どちらの影響も可逆的であった（Ｐｏｓｔ）。変化は、高周波数刺激および低周波数刺激の両方で、μ＝０のｔ検定でベースライン（光オフ）と比較して有意であった（高周波数刺激：ｐ＜０．００１、ｎ＝５マウス；低周波数刺激：ｐ＜０．０５、ｎ＝５マウス）。（Ｆ）２標本ｔ検定で、対側の頭位置の偏りも高周波数刺激で強く矯正された（高周波数刺激対光オフ：ｐ＜０．０５、ｎ＝２マウス）が、低周波数刺激では矯正されなかった（低周波数刺激対光オフ：ｐ＞０．０５、ｎ＝２マウス）。
【０１１６】
図９は、前側一次運動皮質の第５層ニューロンの選択的光刺激を示す図である。（Ａ）ＧＡＤ６７およびＧＡＢＡ染色は、視床下核でＴｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰとの共局在を示さなかった（左）。第５層ニューロンの先端樹状突起は、軟膜表面への上昇が見られた（２２、２３）（右）。（Ｂ）Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウスのＭ１の光刺激および視床下核における同時記録のための模式図。（Ｃ）麻酔したＴｈｙ１：：ＣｈＲ２マウスのＭ１の光刺激（４７３ｎｍ）および視床下核における同時記録。Ｍ１の光学的高周波数刺激（１３０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）は、Ｍ１および視床下核の両方において活性を調節した。Ｍ１の光学的低周波数刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓ）は、Ｍ１および視床下核の両方において２０Ｈｚの持続性発火を発生させた。（Ｄ）光学的高周波数刺激（１３０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）は、６−ＯＨＤＡ  Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウスのアンフェタミン誘発同側回転を減少させ（ｐ＜０．０１、ｎ＝５マウス）、光学的低周波数刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）とは対照的であった（ｐ＞０．０５、ｎ＝４マウス）；μ＝０のｔ検定。（Ｅ）対側頭位置の偏りは高周波数刺激で矯正されたが（高周波数刺激  ｖｓ．光オフ：ｐ＜０．００１、ｎ＝４マウス）、低周波数刺激はほとんど影響しなかった（低周波数刺激  ｖｓ．光オフ：ｐ＞０．０５、ｎ＝３マウス）；２標本ｔ検定。（Ｆ）Ｍ１への高周波数刺激は移動距離（高周波数刺激、ｐ＜０．０１、ｎ＝２マウス）およびよじ登り（ｐ＜０．０５、ｎ＝３マウス）を有意に増加させたが低周波数刺激は増加させなかった（２標本ｔ検定）。高周波数刺激の前、最中、および後のサンプル経路を示す（それぞれ１００秒、移動距離をｃｍで示す）。
【０１１７】
特定の実施例によれば、本明細書に記載の結果を得るために以下のステップが行われた。細胞の表現型を確認してｃ−ｆｏｓ活性を測定するために、げっ歯類を６５ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムで麻酔し、氷冷したＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ｐＨ７．４）で経心臓的に灌流した。脳を４％ＰＦＡ中で一晩固定し、その後、３０％スクロースのＰＢＳ溶液中で平衡させた。凍結ミクロトーム上で４０μｍ厚の冠状切片を切り出し、免疫組織化学用に処理するまで抗凍結剤中で４℃にて保存した。自由に浮遊している薄片をＰＢＳ中で洗浄した後、０．３％トリトンＸ−１００（Ｔｘ１００）および３％ｎｏｒｍａｌ  ｄｏｎｋｅｙ  ｓｅｒｕｍ（ＮＤＳ）中で３０分間インキュベートした。切片を、一次抗体を含む０．０１％Ｔｘ１００および３％ＮＤＳと共に一晩インキュベートした（ウサギ抗ｃｆｏｓ  １：５００、ウサギ抗ＧＦＡＰ  １：５００、マウス抗ＭＡＰ２  １：５００、マウス抗ＧＡＤ６７  １：５００、ウサギ抗ＧＡＢＡ  １：２００、マウス抗ｖＧｌｕｔ１  １：５００、マウス抗ｖＧｌｕｔ２  １：５００、マウス抗ＣａＭＫＩＩα  １：２００、マウス抗Ｓ１００β  １：２５０、ウサギ抗グルタミン酸  １：２００、鶏抗チロシンヒドロキシラーゼ  １：５００、およびヤギ抗コリンアセチルトランスフェラーゼ  １：２００）。次いで、薄片を洗浄し、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、またはＣｙ５にコンジュゲートさせた二次抗体と共に室温で３時間インキュベートした（１：１０００）。ＤＡＰＩと２０分間インキュベート（１：５０，０００）した後、薄片を洗浄し、ＰＶＡ−ＤＡＢＣＯで顕微鏡用スライドにマウントした。
【０１１８】
走査型レーザー顕微鏡で２０×／０．７０ＮＡまたは４０×／１．２５ＮＡの油浸対物レンズを用いて共焦点蛍光画像を得た。ｃ−ｆｏｓ活性化の体積を決定するため、同様な設定を用いて複数の内外方向、前後方向、背腹方向の視床下切片の深さ２０μｍをカバーする連続スタック画像を得た。画像分析ソフトウェアで、背景レベルより強いｃ−ｆｏｓ免疫反応を閾値化し、ＤＡＰＩ染色で核を可視化することで、視野当たりのｃ−ｆｏｓ陽性細胞の数を算出した。ウイルスの形質導入率を求めるために、視床下切片の複数の連続スタック画像でｅＮｐＨＲ−ＹＦＰ陽性でもあった、４０倍の視野当たりのＣａＭＫＩＩα免疫反応性ニューロンの割合を求めた。全切片の大きな視野画像をライカＭＺ１６ＦＡ実体顕微鏡上で収集した。
【０１１９】
使用した遺伝子を載せたレンチウイルスベクターはクローニング技術を用いて構築した。以前に公開されているｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰコンストラクトのＰＣＲ増幅によってＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲコンストラクトを作製し、ＣａＭＫＩＩαプロモーターを有するレンチウイルスのＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位にインフレームでクローニングした。ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙコンストラクトのＰＣＲ増幅によってＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２コンストラクトを作製し、これもＣａＭＫＩＩαプロモーターを有するレンチウイルスのＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位にインフレームでクローニングした。ＡｇｅＩおよびＰａｃＩ制限酵素部位を用いてＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙコンストラクト中のＣａＭＫＩＩαプロモーターをＧＦＡＰプロモーターで置換することでＧＦＡＰ：：ＣｈＲ２コンストラクトを作製した。
【０１２０】
次いで、リン酸カルシウム法を用いて２９３ＦＴ細胞にレンチウイルスベクターｐＣＭＶΔＲ８．７４およびｐＭＤ２．Ｇを共トランスフェクションし、高タイターレンチウイルス（>１０９ｐｆｕ／ｍＬ）を作製した（Ｓ２）。トランスフェクション２４時間後、２９３ＦＴ細胞を５ｍＭ酪酸ナトリウムを含む無血清培地に移し、１６時間後に上清を回収し、２０％スクロースクッションを用いた５０，０００×ｇの超遠心で濃縮した。得られたウイルスペレットをリン酸バッファー生理食塩水に元の体積の１／１０００になるように再懸濁した。
【０１２１】
非標的細胞型に大きなリーク発現がないように、ｌｏｘＰが２つ導入された逆方向オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するＣｒｅ誘導ＡＡＶベクターを使用した。このアンチセンス方向にＣｈＲ２−ＥＹＦＰ配列が存在する。形質導入されるとすぐに、Ｃｒｅ発現細胞はＣｈＲ２−ＥＹＦＰのＯＲＦを安定且つ不可逆的に反転し、それによって、強力且つ構成的に活性な伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーターの制御下で持続的にＣｈＲ２−ＥＹＦＰの発現を活性化する（Feng Zhang、未発表の結果）。Ｃｒｅ活性化組換えＡＡＶベクターを構築するために、２対の不適合なｌｏｘ部位（ｌｏｘＰおよびｌｏｘ２７２２）を有するＤＮＡカセットを合成し、ｌｏｘＰ部位とｌｏｘ２７２２部位の間に逆向きに導入遺伝子ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを挿入した。得られたｌｏｘＰを２つ有する逆向きＣｈＲ２−ＥＹＦＰカセットを、発現を高めるためにＥＦ−１αプロモーターおよびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）を載せた改変型ｐＡＡＶ２−ＭＣＳベクターにクローニングした。組換えＡＡＶベクターはＡＡＶ５コートタンパク質で血清型分類され、ノースカロライナ大学でウイルスベクターコアによってパッケージングした。最終ウイルス濃度は２×１０１２ゲノムコピー（ｇｃ）／ｍＬであった。
【０１２２】
成体ラット（雌のフィッシャーラット、２００〜３００ｇ）およびマウス（雌雄、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、１５〜３０ｇ）をこれらの実験の対象とした。畜産および動物の実験操作の全ての操作はアメリカ国立保健研究所の指針に厳密に従い、スタンフォード実験動物委員会委員の承認を受けた。全ての手術は無菌状態で行った。げっ歯類は、１．５％イソフルランを用いて（手術では１時間超）またはｉ．ｐ．投与（ラットには９０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシラジン；マウスにはそれぞれ８０ｍｇ／ｋｇおよび１５〜２０ｍｇ／ｋｇ）により麻酔した。動物の頭頂を剃毛し、７０％エタノールおよびベタジンで浄化し、その後、定位固定装置にかけた。眼軟膏剤を塗布して目の乾燥を防いだ。頭皮を正中切開した後、定位固定装置に取り付けられたドリルを用いて小さく開頭術を行い、内側前脳束に６−ＯＨＤＡを注入し（ラット：−２  ＡＰ、２  ＭＬ、−７．５  ＤＶ；マウス：−１．２  ＡＰ、１．２  ＭＬ、−４．７５  ＤＶ）、視床下核にウイルスを注入した（ラット：−３．６ｍｍ  ＡＰ、２．５ｍｍ  ＭＬ；マウス：−１．９ｍｍ  ＡＰ、１．７ｍｍ  ＭＬ）。
【０１２３】
視床下核にレンチウイルスを注入されるげっ歯類では、インビボ細胞外記録を用いて背腹軸に沿って視床下核の位置を正確に決定した。深さは、ラットでは約−７ｍｍ、マウスでは−４ｍｍであった。１０μｌのシリンジおよび細い３４ゲージ金属針を用いて、濃縮したレンチウイルス（前述）を視床下核に送達した。注入の体積および流速（背腹軸に沿って視床下核内で３ヶ所；各注入は、０．１μｌ／分で０．６μｌ）はインジェクションポンプで調節した。最後の注入の後、針は、更に１０分間留置した後、ゆっくりと引抜いた。
【０１２４】
次いで、６−ＯＨＤＡを用いて黒質を破壊してヘミパーキンソン病げっ歯類を作製した。デシプラミン（ラットでは２０ｍｇ／ｋｇ；マウスでは１０ｍｇ／ｋｇ；ノルアドレナリン作動性終末へのダメージを防止するためのノルアドレナリン作動性再取り込み阻害薬）を投与し、約３０分後に６−ＯＨＤＡ（ラットでは８μｇ／４μｌ；マウスでは６μｇ／２μｌ）を０．１％アスコルビン酸と共に（６−ＯＨＤＡの分解を防ぐため）を右内側前脳束に投与した（ラット：−２  ＡＰ、＋２  ＭＬ、および−７．５  ＤＶ；マウス：−１．２  ＡＰ、＋１．２  ＭＬ、および−４．７５  ＤＶ）。６−ＯＨＤＡ注入（ラット：４μｌ、マウス、２μｌ）のための灌流は１．２μｌ／分の速度で４分間行い、針は更に５分間留置した。
【０１２５】
ファイバーガイド（ラット：Ｃ３１２Ｇ、マウス：Ｃ３１３Ｇ）を斜めに切って鋭い先端を形成し（より容易に脳組織を貫通して組織の移動を減らすため）、その後、開頭部を通して視床下核または前側一次運動皮質の上約４００μｍの深さに挿入した（マウス：２  ＡＰ、２  ＭＬ、０．５  ＤＶ）。１層の接着セメントの後にクラニオプラスチックセメントを用いて、頭蓋骨にファイバーガイドシステムを固定した。２０分後、組織接着剤を用いて頭皮をふさいだ。麻酔から回復するまで動物を加熱パッドの上に保った。外科手技の後にブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与して不快感を最小限に抑えた。ダミーのカニューレ（ラット：Ｃ３１２Ｇ、マウス：Ｃ３１３Ｇ）を挿入してファイバーガイドの開存性を維持した。
【０１２６】
電気的脳深部刺激対照げっ歯類には、刺激電極（ＭＳ３０３／３−Ｂ）を視床下核中に植え込んだ。続いてＯＨＤＡ注入のために上記の手技を行い、次いでインビボ細胞外記録を用いて視床下核の深さを決定し、刺激電極をその深さまで挿入し、１層の接着セメントの後にクラニオプラスチックセメントを用いて固定した。組織接着剤を用いて頭蓋骨を再度ふさぎ、麻酔から回復するまで動物を加熱パッドの上に保ち、ブプレノルフィンを与えて不快感を最小限に抑えた。次いで、ちりよけキャップ（３０３ＤＣ／１）を用いて電極の接点を覆った。
【０１２７】
生きたげっ歯類の単一領域における同時の光刺激および電気的記録を、既に記載されているように、光ファイバー（約２００μｍ）にしっかりと結合した細胞外タングステン電極からなるオプトロード（１ＭΩ、約１２５μｍ）を用いて行った。ここで、記録されるニューロンを確実に照射するために電極の先端はファイバーの先端よりも深くしている（約０．４ｍｍ）。２つの異なる領域で刺激および記録を行うために、両方の標的領域の上に小さく開頭術を行い、ファイバーまたはオプトロードを１つの開頭部を介して一方の領域の上に配置し、別の開頭部を介してもう一方の領域中にプレーン電極またはオプトロードを配置した（ダイアグラムについては図９Ｂ参照）。前側運動皮質の刺激は、脳表面のすぐ上に光ファイバーを配置して皮質の第５層を活性化することでなされた。視床下核刺激では、ファイバーは視床下核の３００μｍ上方であった。視床下核は、その非常に決まった発火パターンおよび背腹側がサイレントな領域で囲まれていることを利用して特定した。光ファイバーはクリスタレーザから出る４７３ｎｍまたは５６１ｎｍレーザーダイオード（３０ｍＷのファイバー出力）に接続した。１．５％イソフルランで麻酔したラットおよびケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１５〜２０ｍｇ／ｋｇ）カクテルの腹腔内注入で麻酔したマウスにおいて、単一ユニット記録を行った。データの収集およびファイバーを介した光パルスの生成の両方にｐＣｌａｍｐ１０およびＤｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａボードを用いた。記録されたシグナルを、３００Ｈｚ（ｌｏｗ）／５ｋＨｚ（ｈｉｇｈ）でバンドパスフィルターに通した（１８００  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ＡＣ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）。ファイバー／電極対の正確な配置には、定位固定装置を用いた。
【０１２８】
行動試験のために、マルチモード光ファイバー（ＮＡ  ０．３７；ラット：４００μｍコア、ＢＦＬ３７−４００；マウス：３００μｍコア、ＢＦＬ３７−３００）を、光を受容する視床下核の体積が最大になる最適な長さに正確に切断した。行動試験の約１週間前に、細胞外記録電極を用いて、視床下核の背側境界の、ガイドカニューレの先端からの深さを決定し、ファイバーをそれより２００〜３００μｍ短く切断した。前側運動皮質の刺激用には、ファイバーを第５層の上に配置した（深さ１ミリメートル未満）。行動下の動物において試験中のファイバーの安定性を確保するために、剥いた光ファイバーに内部カニューレアダプターを接着した。ファイバーを挿入するために、げっ歯類を短時間イソフルラン下に置き、動物が麻酔から回復する間にファイバーを挿入した。内部カニューレアダプターをガイドカニューレにパチンと嵌め、また、ガイドカニューレ上部へのアダプターの連結を維持するために、ダミーカニューレのプラスチック部分の下半分も用いた。
【０１２９】
光刺激には、ＦＣ／ＰＣアダプターを介してファイバーを４７３ｎｍまたは５６１ｎｍレーザーダイオード（２０ｍＷファイバー出力）に接続した。ファンクションジェネレーター（３３２２０Ａ）を用いて周波数、デューティサイクル、および強度を変えることでレーザー出力を調節した。Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２動物では、治療的行動を得るために用いられた平均最低強度は１０ｍＷであった。カスタムのアルミニウム回転型光学的コミュテーターを用いて、動物の回転によって生じるファイバー中でのねじれを解消した。
【０１３０】
アンフェタミン誘発回転、頭位置の偏り、よじ登り、および軌跡長（ｔｒａｃｋ  ｌｅｎｇｔｈ）を用いて運動行動を評価した。黒質の６−ＯＨＤＡ損傷を裏付ける同側方向への回転をアンフェタミンが確実に誘発した場合にのみ、動物を実験的研究に用いた。各刺激試行の前および後に、同じ長さの光オフの試行を対照として用いた。これらの試行はそれぞれ約３分間とし、オフ−オン−オフの順序で全体は９分間とした。アンフェタミン誘発行動には、アンフェタミン（ラット：２ｍｇ／ｋｇ；マウス２．６ｍｇ／ｋｇ）を行動測定の３０分前に注入した。ファイバーをカニューレ中に挿入し、行動実験の１０分前にげっ歯類を不透明な無反射のシリンダー（ラット：直径２５ｃｍ、高さ６１ｃｍ；マウス：直径２０ｃｍ、高さ４６ｃｍ）に入れた。６−ＯＨＤＡ損傷部と同じ側への回転（時計回り）を数え、逆側回転を引いた。変化のパーセンテージの計算には、刺激のない期間に関する回転傾向の変化を考慮した。頭位置の偏りは、期間中の頭部傾斜（正中線の左または右への偏位が１０°超）の回数を計数することで決定した。げっ歯類が立ち上がり足のいずれかをシリンダーの壁に接触させる度によじ登りとして計数した。軌跡長はビューアーで測定した。行動実験完了後、スライスし、カニューレの配置を確認した。
【０１３１】
光刺激でげっ歯類の行動が変化しなかった実験について、本発明者らは、げっ歯類がアンフェタミン下にある間の移動距離および頭位置の偏りのデータも収集した。６−ＯＨＤＡラットにおいてＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰを発現する視床下核の連続的５６１ｎｍ照射は、移動距離（ｃｍ／分；光オン ｖｓ．光オフ：７５７．０５±１６３．１１ ｖｓ．７８５．７４±１５７．５６、ｐ＝０．９０、ｎ＝４ラット；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．；２標本ｔ検定）または頭位置の偏り（右に偏った時間の％；光オン ｖｓ．光オフ：９９．９２±０．０８ ｖｓ．９９．７５±０．２５、ｐ＝０．５６、ｎ＝４ラット；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．；２標本ｔ検定）に影響を与えなかった。６−ＯＨＤＡラットにおいてＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核の光学的高周波数刺激（１２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）または低周波数刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）は、移動距離（ｃｍ／分；高周波数刺激 ｖｓ．光オフ：８０３．８２±１２９．０４ ｖｓ．８５１．９５±１６６．２０、ｐ＝０．８３、ｎ＝５ラット；低周波数刺激 ｖｓ．光オフ：８４７．１５±１４１．９５ ｖｓ．７７９．１１±１０４．０１、ｐ＝０．７４、ｎ＝２ラット；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．；２標本ｔ検定）または頭位置の偏り（右に偏った時間の％；高周波数刺激 ｖｓ．光オフ：９３．９７±３．７８ ｖｓ．９４．２０±２．９６、ｐ＝０．９６、ｎ＝５ラット；低周波数刺激 ｖｓ．光オフ：９８．５０±１．５０ ｖｓ．９８．５０±０．５０、ｐ＝１．００、ｎ＝２ラット；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．；２標本ｔ検定）に影響を与えなかった。６−ＯＨＤＡラットにおいてＧＦＡＰ：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核の４７３ｎｍ照射も、移動距離（ｃｍ／分：光オン光 ｖｓ．オフ：１０４２．５２±１１３．７３ ｖｓ．１０２５．４７±１１３．６３、ｐ＝０．９２、ｎ＝４ラット；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．；２標本ｔ検定）または頭位置の偏り（右に偏った時間の％；光オン ｖｓ．光オフ：９８．１６±０．９８ ｖｓ．９８．９８±０．６５、ｐ＝０．５２、ｎ＝４ラット；平均値±ｓ．ｅ．ｍ；２標本ｔ検定）に影響を与えなかった。
【０１３２】
３００ｇのフィッシャーラット２頭から調製した脳組織ブロックを用いてすぐに試験を行い、光透過測定を行った。厚さ２ｍｍの組織ブロックを０〜４℃のスクロース溶液中でビブラトームを用いてカットした。次いで、電力計の光検出器の上で、同じスクロース溶液の入ったペトリ皿中に組織を置いた。青色または黄色のダイオードレーザー（４７３ｎｍまたは５６１ｎｍ、３０ｍＷファイバー出力）に接続した直径２００μｍの光ファイバーの先端をマイクロマニピュレーターに乗せた。最初に、溶液を通して出力を測定した。次いで、ファイバーの先端を１００μｍずつ組織中に入れていき、出力を測定した。ファイバーがペトリ皿に達した時、測定された出力を、最初の溶液を通した測定値と比較し、ファイバーを通る全出力を確認した。次いで、透過率のパーセントを、組織を通して測定された出力と溶液を通して測定された出力の比として算出した。次いで、ファイバーの開口数が０．３７であることに基づいて、４００μｍファイバーからの３０ｍＷ光出力の円錐形状による光強度の拡散を考慮して、出力強度を算出した。ファイバーの出力は円錐直径にわたって均一であると想定した。各波長について、３個の脳組織ブロックで灰白質の測定を行い、その際には各ブロックを、視床の前後方向、皮質の前後方向、および視床の背腹方向に動かした。
【０１３３】
Ｃｌａｍｐｆｉｔの閾値サーチを用い、複数ユニット記録におけるスパイクを自動検出し、次いで目視検査で確認した。Ｃｌａｍｐｆｉｔで示されたスパイク波形を観察してスパイク検出の質を確認した。複数のスパイク群のトレースには、全てのスパイクを捕捉するように閾値を設定した。バースト生成中は複数のニューロンが同時に記録されやすい。バーストはＣｌａｍｐｆｉｔで同定し、３００ｍｓ未満の間隔で生じている連続する２つのスパイクは全て同じバーストに属するものとして数え、少なくとも３スパイクのバーストのみを含めた。異なる周波数での神経活性を定量するために、トレースをバイナリスパイク列に変換した後にウェーブレット変換を用いて、インビボ細胞外記録トレースのスペクトルを生成した。次いで、このトレースを、期間を合わせた刺激前期、刺激期、および刺激後期のそれぞれの区間幅が０．５ｍｓのヒストグラムに変換した。各セグメントの開始時間および終了時間およびスパイク数を以下に記載する。
【０１３４】
【表１】
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表１．各出力スペクトルの３個のセグメントを時間で合わせた。各トレースのセグメント（秒で表した開始時間および終了時間）および各期間中に検出されたスパイクの数を示す。生理学的影響の発生または停止の時間的遅れを補うために、時間間隔は、各トレースの刺激前、刺激中、刺激後の定常状態を反映するように選択した。
【０１３５】
次いで、スパイクのヒストグラムのウェーブレット畳み込みを行い、期間中の周波数が１５０Ｈｚ未満のスペクトルの振幅を測定した。各周波数について期間中の平均振幅をプロットした。用いたウェーブレットを以下に再現する。
【０１３６】
【数１】
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【０１３７】
複数の周波数帯の活性変化を求めるために、複数の期間を合わせたベースラインおよび刺激のスイープについて、振幅スペクトルを上記のように計算した。各周波数帯の平均振幅を求め、この値の比（刺激／ベースライン）を計算した。Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ  ６−ＯＨＤＡマウスのＭ１および視床下核の同時オプトロード記録における最初のピークの遅れを測定することで、視床下核の光刺激に対するＭ１の反応のスパイク潜時を求めた。視床下核の活性化には２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅の４７３ｎｍ光を用いた。
【０１３８】
図１０は、黒質の損傷およびカニューレの軌跡を示す図である。（Ａ）ラットおよび（Ｂ）マウスにおける、６−ＯＨＤＡ投与後の黒質ドーパミン作動性細胞の消失。冠状切片（ラット：ＡＰ  −５．８；マウス：ＡＰ  −３）は、黒質緻密部の片側でチロシンヒドロキシラーゼレベルが低下していることを示している（赤色）。白色の角括弧でＳＮｃを囲んだ。下の挿入図は、黒質の損傷した側（左）および損傷していない側（右）の、より解像度の高い画像を示す。（Ｃ）冠状切片中にカニューレの軌跡を見ることができ、カニューレが視床下核領域の上に正しく配置されたことを示している。
【０１３９】
図１１は、更なる組織学的特徴解析を示す図である。（Ａ）興奮性ニューロン特異的グルタミン酸マーカー標識（赤色）に対する、ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ（緑色）標識を発現する視床下核細胞。（Ｂ）ＧＦＡＰ：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核細胞（赤色）の、アストログリア特異的マーカーＳ１００β（緑色）との共染色。（Ａ）および（Ｂ）の両方で、黄色は２つのマーカーの共局在を示す。（Ｃ）ドーパミンに対するＴＨ染色（上）およびアセチルコリンに対するＣＨＡＴ染色（下）の代表的な共焦点画像は、視床下核においてＴｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ発現との共局在を示さなかった。
【０１４０】
図１２は、更なる行動試験結果を示す図である。（Ａ）麻酔した６−ＯＨＤＡマウスにおいてＧＦＡＰ：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核の連続的４７３ｎｍ照射は視床下核活性を完全に抑制した。（Ｂ）および（Ｃ）：マウスの結果の拡張。（Ｂ）アンフェタミン誘発回転は、６−ＯＨＤＡマウスにおいてＧＦＡＰ：：ＣｈＲ２発現視床下核の５０％デューティーサイクルの照射では影響を受けなかった（ｎ＝１マウスおよび２セッション）。（Ｃ）アンフェタミン誘発回転は、６−ＯＨＤＡマウスにおいて、ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２発現視床下核の高周波光刺激（１３０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅、ｎ＝１マウスおよび２セッション）または低周波光刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝１マウスおよび１セッション）の影響を受けなかった。（Ｄ）および（Ｃ）：行動中の抑制性ニューロンの調節。視床下核は主に興奮性であるが、ＧＡＤ６５／６７およびパルブアルブミン等の抑制性ニューロンマーカーで染色される細胞を約７〜１０％パーセント有する（Ａｌｌｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓ）。ＧＡＤ６７またはパルブアルブミンニューロン中に特異的な発現を得るため、それぞれＧＡＤ６７−Ｃｒｅマウスおよびパルブアルブミン−Ｃｒｅマウス（Ｓｙｌｖｉａ  Ａｒｂｅｒからの寄贈）に、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを有するＣｒｅ誘導アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを注入した（方法）。Ｃｒｅ依存性のオプシン発現が視床下核領域中で観察されたが、光刺激によって行動は変化しなかった。（Ｄ）アンフェタミン誘発回転は、６−ＯＨＤＡ  ＧＡＤ６７−Ｃｒｅマウスにおいて高周波光刺激（１３０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝２マウスおよび４セッション）または低周波光刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝１マウスおよび２セッション）の影響を受けなかった。（Ｅ）アンフェタミン誘発回転は、６−ＯＨＤＡ  パルブアルブミン−Ｃｒｅマウスにおいて高周波光刺激（１３０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝２マウスおよび２セッション）または低周波光刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓ、ｎ＝２マウスおよび２セッション）の影響を受けなかった。
【０１４１】
図１３は、更なる電気生理学的結果を示す図である。図４Ｃのトレースおよび対応する出力スペクトルからの大振幅単位（Ａ）および小振幅単位（Ｂ）の分離。赤線は、７０ｓのベースライン活性の間に生じた全スパイクの重畳の平均波形を表す（大振幅単位ではｎ＝２０５スパイク、小振幅単位ではｎ＝４２８スパイク）。大小どちらの振幅単位も、光照射中に活性低下を示し、刺激後には正常なベースラインレベルに戻った。（Ｃ）Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ  ６−ＯＨＤＡマウスにおける視床下核の９０Ｈｚ光刺激に対する視床下核の反応。視床下核は最初興奮するが、新たに生じた定常状態において活性は減少し、このことはベースライン中に見られる大振幅スパイクの消失から測定される。しかし、刺激の間中、かなりの低振幅活性が持続した。（Ｄ）Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ  ６−ＯＨＤＡマウスにおける視床下核の１３０Ｈｚ光刺激に対する視床下核の反応の高時間分解トレース（完全なトレースについては図５Ｂ参照）。やはり、視床下核は最初反応して１個のスパイクを発生し、その後は刺激の間中、小振幅活性が続く。局所回路反応の振幅変化は、動員される細胞数の変化または動員される細胞要素の興奮性の変化を反映し得る。オプトロード記録では、活性の発生に関与する正確な細胞型は分からないが、電気刺激のアーチファクトを除去することで、これらの記録から、電気刺激では不可能な、視床下核領域中の局所的な興奮性または抑制性の細胞型および繊維から生じる局所回路電気反応の振幅およびタイミング特性を見ることができる。
【０１４２】
図１４は、高時間分解オプトロードトレースを示す図である。（Ａ）麻酔した６−ＯＨＤＡラットにおいて連続的５６１ｎｍ光照射を用いた、ＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ発現視床下核における単一ユニットの活性（図４Ｃのトレースに対応）。（Ｂ）麻酔した６−ＯＨＤＡラットにおける、高周波光刺激（１２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅、４７３ｎｍ）を用いたＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙ発現視床下核におけるニューロン活性（図３Ｂのトレースに対応）。（Ｃ）および（Ｄ）麻酔したＴｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ  ６−ＯＨＤＡマウスにおける、４７３ｎｍの光を用いた高周波光刺激（高周波数刺激、１３０Ｈｚ、５ｍｓ）および低周波光刺激（低周波数刺激、２０Ｈｚ、５ｍｓ）に反応した視床下核領域の活性。高周波数刺激トレース中の低振幅の活性に注意されたい（図５Ｂのトレースに対応）。
【０１４３】
図１５は、視床下核の光刺激に対するＭ１の反応の潜時を示す図である。（Ａ）Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ  ６−ＯＨＤＡマウスにおける、２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅の視床下核光刺激に対するＭ１第５層（Ｌ５）の反応。（Ｂ）光で視床下核を刺激している間、視床下核（上のトレース）およびＭ１／Ｌ５（下のトレース）における光誘導活性の同時記録から、逆行性のスパイク生成と一致する第１ピーク間の短い潜時差が明らかになった。（Ｃ）刺激を１６回行い、視床下核とＭ１／Ｌ５の第１ピーク間の個々の潜時差から、周知のＭ１−視床下核投射における逆行性スパイク生成と一致して、ジターが最小限であることが明らかになった（Ｓ．Ｄ．＝０．０３２ｍｓ）。
【０１４４】
図１６は、光刺激によって発生したニューロン活性の周波数特性の変化を示す図である。（Ａ）麻酔した６−ＯＨＤＡラットにおいてＣａＭＫＩＩα：：ｅＮｐＨＲ−ＥＹＦＰを発現する視床下核の連続的５６１ｎｍ照射によって全ての周波数帯の活性が低下した（ｎ＝５スイープ）。周波数帯は以下のように定義した：デルタ  １〜３Ｈｚ；シータ  ４〜８Ｈｚ；アルファ  ９〜１２Ｈｚ；ベータ  １３〜３０Ｈｚ；ガンマ  ３１〜８０Ｈｚ；高周波（ＨＦ）  ８１〜１３０Ｈｚ。（Ｂ）６−ＯＨＤＡラットにおいてＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核の光学的高周波数刺激（１２０Ｈｚ、５ｍｓパルス幅）は、４〜８０Ｈｚの周波数では活性を低下させたが、ＨＦ帯では活性を上昇させた（ｎ＝３）。（Ｃ）６−ＯＨＤＡ  Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウスにおいてＭ１の光学的高周波数刺激（１３０Ｈｚ、５ｍｓ）刺激によって生じたＭ１（左、ｎ＝４）および視床下核（右、ｎ＝４）の活性変化。Ｍ１および視床下核の両方でデルタ活性が低下した。（Ｄ）６−ＯＨＤＡ  Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウスにおいてＭ１の光学的低周波数刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓ）刺激で生じたＭ１（左、ｎ＝４）および視床下核（右、ｎ＝４）の活性変化。Ｍ１および視床下核の両方でベータ、ガンマ、およびＨＦ活性が上昇した。（Ｅ）６−ＯＨＤＡ  Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウスにおいて視床下核の光学的低周波数刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓ）はベータ、ガンマ、およびＨＦ帯で活性を上昇させた（ｎ＝３）。（Ｆ）各実験タイプの、期間を合わせたベースラインおよび光刺激セグメントのスパイク数。ＣａＭＫＩＩα：：ＧＦＡＰ−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する視床下核の光刺激および６−ＯＨＤＡ  Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウスにおける光学的高周波数刺激はスパイク生成活性を消失させ、全周波数にわたって活性をゼロに低下させた（示さず）。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．である。統計にはμ＝１００のｔ検定を用いた（＊  ｐ＜０．０５）。
【０１４５】
上記した種々の実施形態は説明のために提供するものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。上記の議論および説明に基づいて、本明細書に説明および記載した例示的な実施形態および応用例に厳密に従わずに本発明に種々の修正および変更が加えられ得ることが当業者には容易に理解されよう。例えば、そのような変更には、ＶＣｈＲ１をベースにした配列への更なる修飾が含まれる。そのような修正および変更は、添付の請求項に記載する本発明の真の精神および範囲から逸脱しない。
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
0005801188.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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