(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素を含む、薬学的組成物であって、該ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして該ＧＡＬＮＳ酵素は：
（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９５％の純度を有し；
（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約５０％の変換を有し；かつ
（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８の該アスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化され、
ここで、該ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、
薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約８５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要のバンドからなる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）もしくはモルキオＡ症候群、または多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）に罹患した被験体を処置するための組成物であって、該組成物は、精製された、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素の治療上有効な量を含み、該ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして、該ＧＡＬＮＳ酵素は：
（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９５％の純度を有し；
（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約５０％の変換を有し；かつ
（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８の該アスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化され、
ここで、該ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、
組成物。
【請求項４】
前記被験体は、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群に罹患している、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記被験体は、ＭＳＤに罹患している、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約８５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要のバンドからなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、位置５３におけるシステイン残基の、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも７０％の変換を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、位置５３におけるシステイン残基の、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも９０％の変換を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約９０％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、位置５３におけるシステイン残基の、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも７０％の変換を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、位置５３におけるシステイン残基の、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも９０％の変換を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約９０％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物の効能は、前記被験体におけるケラタン硫酸（ＫＳ）の尿中排泄を測定することにより決定され、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群に罹患している前記被験体における尿のＫＳレベルは、正常な被験体、および／またはＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群に罹患している未処置の被験体、および／または前記ＧＡＬＮＳ酵素での処置の前の同じ被験体における尿のＫＳレベルと比較される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＧＡＬＮＳ酵素での処置の後、尿のＫＳの２５％を超える減少が達成される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＧＡＬＮＳ酵素での処置の後、尿のＫＳの５０％を超える減少が達成される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物の効能は、前記被験体の耐久性の機能的評価により決定され、該耐久性は、歩行試験、階段登り、または肺／呼吸の機能により測定される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記歩行試験は、６分または１２分歩いた距離を測定する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記階段登りは、１分当たりに登った段を測定する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記肺／呼吸の機能は、心臓の機能（心エコー図）、または肺の機能（ＦＶＣ、ＦＥＶ１、もしくはピークフロー）により測定される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、該ＧＡＬＮＳ酵素のＮ末端またはＣ末端に位置する細胞性のターゲッティングシグナルを含む、融合タンパク質である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記細胞性のターゲッティングシグナルは、骨組織ターゲッティングペプチドを含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記骨組織ターゲッティングペプチドは、６個のアスパラギン酸残基を含む、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、該ＧＡＬＮＳ酵素のＮ末端またはＣ末端に位置する細胞性のターゲッティングシグナルを含む、融合タンパク質である、請求項３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記細胞性のターゲッティングシグナルは、骨組織ターゲッティングペプチドを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記骨組織ターゲッティングペプチドは、６個のアスパラギン酸残基を含む、請求項２４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／０２２，１７９号、２００８年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／０９９，３７３号、および２００８年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１１０，２４６号の優先権の利益を主張し、これらの明細書は参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、細胞のおよび分子の生物学ならびに医学の技術分野、特に高度にリン酸化された活性なヒトリソソームスルファターゼ酵素の製造、およびリソソームスルファターゼ酵素の欠乏に関連づけられるリソソーム蓄積症の管理におけるそれらの使用に関連する。特に、本発明は、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の製造ならびにムコ多糖体症ＩＶａ（ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群）およびＧＡＬＮＳの欠乏に関連づけられる他のリソソーム蓄積症の管理におけるそれの使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（本発明の背景）
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム内での細胞性廃棄物の分解のために不可欠である、細胞内の特定のリソソーム酵素の欠乏から結果として生じる。そのようなリソソーム酵素の欠乏は、リソソーム中に分解されない「蓄積物質」の蓄積を導き、これは、リソソームの腫脹および機能不全ならびに最終的には細胞および組織の損傷を引き起こす。多数のリソソーム酵素は同定され、そしてそれらに関連する疾患と関連付けがされている。一旦、欠けている（ｍｉｓｓｉｎｇ）酵素が同定されれば、処置は、患者の冒された組織へ、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）酵素を効果的に送達するという唯一の問題に低減され得る。
【０００４】
リソソーム蓄積症を処置するための一つの方法は、静脈内酵素置換療法（ＥＲＴ）による（非特許文献１）。ＥＲＴは、酵素を単一の投与の部位から大部分の組織へ輸送するために脈管構造を利用する。一旦、酵素は広範囲にわたって供給されると、それは細胞中に取込まれるに違いない。細胞中への取込みのための基本原理は、リソソーム酵素の特有の特徴において見い出だされる。リソソーム酵素は、末端のマンノース残基の６位置におけるホスフェートによって定義される、糖タンパク質の個々別々のクラスを構成する。マンノース−６−リン酸は、大多数の細胞の表面上で見られる受容体によって、高い親和性および特異性で結合される（非特許文献２；非特許文献３）。マンノース−６−リン酸受容体（ＭＰＲ）（これは、ポリペプチド鎖当たり二個のマンノース−６−リン酸結合部位を有する（非特許文献４））は、血液から組織への酵素の取込みを指示し、そしてその後、リソソームへ細胞内で配送することを媒介する。
【０００５】
リソソーム酵素の大規模生産は、哺乳動物細胞株においての発現を含む。目標は、収集および下流を処理するための、取り囲んでいる増殖培地中への組換え型酵素の顕著な分泌である。リソソーム酵素の大規模生産のための理想的なシステムにおいて、酵素は効果的にリン酸化され得、そしてその後、主としてリソソームへではなく、主として細胞表面の方へ向けられる（すなわち、分泌のため）。上で記載されるように、リン酸化されたリソソーム酵素のこの区分は、正常な細胞内で起きていることのまさに正反対である。リソソーム酵素生産のために使用される生産細胞株は、酵素のモル当たりのマンノース−６−リン酸のレベルを最大にすることに焦点を合わせているが、これは低い比生産性（ｌｏｗ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）によって特徴付けられる。高いレベルのマンノース−６−リン酸部分を含むリソソーム酵素を生産することにおけるインビトロでの試みは、結果として雑多な（ｍｉｘｅｄ）成功を生じた（Ｃａｎｆｉｅｌｄら，特許文献１）。このインビトロの酵素は、高いレベルのマンノース−６−リン酸ならびに高いレベルの修飾されていない末端のマンノースを示す。リソソーム酵素についてのマンノース−６−リン酸とマンノース受容体との間の競合は、有効性のために酵素の高い用量の必要性を結果として生じ、そして処置される被験体の損傷に対するより高い免疫抗原性を導き得る。
【０００６】
スルファターゼは、リソソーム酵素の特有のサブクラスを構成する。スルファターゼは種々の基質（例えば、ステロイド、炭水化物、プロテオグリカンおよび糖脂質を含む）から硫酸エステルを切断する。全ての既知の真核細胞のスルファターゼは、それらの触媒部位においてシステイン残基を含む。スルファターゼ活性は、このシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への翻訳後修飾を必要とする。システインからＦＧｌｙへの翻訳後の酵素活性化は、リソソームへのスルファターゼのターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）の前に、小胞体内で翻訳後直ちに折りたたまれていない（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）スルファターゼ上で起きる（非特許文献５）。この反応を触媒するホルミルグリシン生成酵素は、スルファターゼ調節因子（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）１（ＳＵＭＦ１）である。この特有な翻訳後修飾の重要性を強調するのはＳＵＭＦ１における変異（これはリソソームスルファターゼ酵素における損なわれたＦＧｌｙ形成を結果として生じる）がヒトにおいて多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）を引き起こすという事実である（非特許文献６）。
【０００７】
したがって、リソソームスルファターゼ酵素調製物の治療の効果は、その調製物中のマンノース−６−リン酸のレベルおよび活性な酵素の存在に依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，５３７，７８５号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋａｋｋｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ２００２  １１（５）：６７５−６８５
【非特許文献２】Ｍｕｎｉｅｒ−Ｌｅｈｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１９９６  ２４（１）：１３３−１３６
【非特許文献３】Ｍａｒｎｅｌｌら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８４  ９９（６）：１９０７−１９１６
【非特許文献４】Ｔｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９  ２６４：７９６２−７９６９
【非特許文献５】Ｄｉｅｒｋｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９７  ９４：１１９６３−１１９６８
【非特許文献６】Ｄｉｅｚ−Ｒｕｉｚら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００５  ６：３５５−３７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それゆえ、そのようなリソソームスルファターゼ酵素の欠乏によって引き起こされるまたは関連付けられるリソソーム蓄積症の管理のため、治療上有効であり、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の大規模製造のための効率がよくかつ生産的なシステムに対し、当該分野において必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、エンドソームの酸性化に欠損があるＣＨＯ−Ｋ１細胞株誘導体（Ｇ７１と示される）が組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現するように操作される場合、上記修飾されたＧ７１細胞は、一部、生産細胞株のリソソーム区画への物質の損失を防ぐことによって、高度にリン酸化された活性な組換え型リソソームスルファターゼ酵素の高い収量を生産するという発見に関連する。一つの実施形態において、本発明は、組換え型ヒトＳＵＭＦ１および組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を共発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）するＥＮＤ３相補群細胞株を提供し、これは高度にリン酸化された活性な酵素の高い収量を結果として生じる。例示的な細胞株は、Ｇ７１、Ｇ７１Ｓ、およびそれらの誘導体であり、これらはＧ７１の所望の特性（すなわち、高度にリン酸化された活性である組換え型リソソームスルファターゼ酵素の高い収量を生産するための能力）を保持している。ＥＮＤ３相補群が修飾された、組換え型ヒトＳＵＭＦ１および組換え型リソソームスルファターゼ酵素を共発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株のこの適用は、酵素置換療法（ＥＲＴ）によるリソソーム蓄積症の管理のために用いられる、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の製造のために特に有用であり得る。
【００１２】
第一の局面において、本発明は、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞もしくはそれの誘導体中で、治療上の使用を可能にする量において、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を生産する新規な方法を特徴とする。広い実施形態において、本方法は：（ａ）ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体を培養する工程；（ｂ）ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体において、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第一の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；（ｃ）ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体において、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第二の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；（ｄ）第一のおよび第二の発現ベクターを用いてＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体をトランスフェクトする工程；（ｅ）高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現する、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体のトランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）の選択およびクローニングをする工程；ならびに（ｆ）高度にリン酸化された組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を製造するための細胞培養作業方法を最適化する工程を含む。組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ（ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ）／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される。
【００１３】
方法は、リソソームスルファターゼ酵素の全てまたは一部をコードしているｃＤＮＡおよびヒトＳＵＭＦ１の全てまたは一部をコードしているｃＤＮＡを、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中にトランスフェクトする工程を含む。いくつかの実施形態において、第一のおよび第二の発現ベクター（これらは、それぞれ、コードしている高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素およびヒトＳＵＭＦ１を発現することができる）は、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に同時にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、第一のおよび第二の発現ベクターは、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、連続してトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、全長ヒトリソソームスルファターゼ酵素をコードしているｃＤＮＡが使用され、一方他の実施形態において、それの生物学的に活性な断片、変異体、改変体または誘導体をコードしているｃＤＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、全長ヒトＳＵＭＦ１をコードしているｃＤＮＡが使用され、一方他の実施形態において、それの生物学的に活性な断片、変異体、改変体または誘導体をコードしているｃＤＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、多数の発現ベクターは、ヒトリソソームスルファターゼ酵素のｃＤＮＡおよびヒトＳＵＭＦ１のｃＤＮＡを、同時にまたは連続して、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞もしくはそれの誘導体中に移入するために使用される。いくつかの実施形態において、単一の発現ベクターは、ヒトリソソームスルファターゼ酵素のｃＤＮＡおよびヒトＳＵＭＦ１のｃＤＮＡを同時に、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に移入するために使用される。好ましい実施形態において、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株、Ｇ７１Ｓ細胞株、またはＧ７１もしくはＧ７１Ｓ誘導体である。
【００１４】
好ましい実施形態において、方法は、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素（例えば、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）またはＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））を、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはそれの誘導体から生産することを含む。特に好ましい実施形態において、方法は、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）をＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはそれの誘導体から生産することを含む。ＥＮＤ３相補群細胞株は、エンドソーム酸性化欠損などの、ＥＮＤ３相補群細胞株の特性を保持しているあらゆる修飾されたＣＨＯ細胞株である。好ましい実施形態において、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株、Ｇ７１Ｓ細胞株、またはＧ７１もしくはＧ７１Ｓ誘導体である。
【００１５】
第二の局面において、本発明は、リソソームスルファターゼ酵素の使用を治療的に可能にする量において、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を生産するその能力によって特徴付けられる、エンドソーム酸性化が欠損している哺乳動物細胞株を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、ＣＨＯ−Ｋ１に由来するＥＮＤ３相補群細胞株（Ｇ７１、Ｇ７１Ｓ、またはそれの誘導体と示される）を提供し、これは高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素の高い収量を生産することができ、それによってそのような治療用のリソソームスルファターゼ酵素の大規模生産を可能にする。より好ましい実施形態において、細胞株は、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を、少なくとも約０．５、好ましくは少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０、およびさらにより好ましくは少なくとも約１．２５ピコグラム／細胞／日の量で発現ならびに分泌する。
【００１６】
ＥＮＤ３相補群細胞株は、エンドソーム酸性化欠損などの、ＥＮＤ３相補群細胞株の特性を保持している、あらゆる修飾されたＣＨＯ細胞株である。一つの実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、Ｇ７１またはそれの誘導体に由来し、かつ（ａ）組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）のための発現ベクターおよび（ｂ）組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素のための発現ベクターを含み、ここで、上記組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される。好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のための発現ベクターを含む。より好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組換え型ヒトＧＡＬＮＳを発現および分泌する。別の好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローン４、クローン５、クローンＣ６、クローンＣ２、クローンＣ５、クローンＣ７、クローンＣ１０、クローンＣ１１およびクローンＣ３０からなる群より選択される。より好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株はクローンＣ２である。別の好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、懸濁物中での増殖に適合させられている。
【００１７】
第三の局面において、本発明は、本発明の方法に従って生産され、そしてそれによって治療的にリソソームスルファターゼ酵素を使用することを可能にする量において存在する、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を提供する。リソソームスルファターゼ酵素は、全長タンパク質、またはそれの断片、変異体、改変体もしくは誘導体であり得る。いくつかの実施形態において、本発明に従って、リソソームスルファターゼ酵素またはそれの断片、変異体、改変体もしくは誘導体は、その安定性または薬物動態学の特性を高めるために、所望のように、修飾され得る（例えば、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、変異誘発、融合、結合体化）。好ましい実施形態において、酵素はヒトリソソームスルファターゼ酵素、天然のスルファターゼ酵素の生物学的な活性を有するヒトリソソームスルファターゼ酵素の断片、またはヒトリソソームスルファターゼ酵素と実質的なアミノ酸配列の相同性を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、ヒトまたは哺乳動物の配列のオリジン（ｏｒｉｇｉｎ）もしくは誘導物（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）のタンパク質である。他の実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素はその欠乏が、異染性（Ｍｅｔａｃｈｒｏｍｉｃ）白質萎縮症またはＭＬＤ（すなわち、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ））、マロトー−ラミー症候群またはＭＰＳ  ＶＩ（すなわち、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ））、ハンター症候群またはＭＰＳ  ＩＩ（すなわち、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ））、サンフィリポＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＩＩａ（すなわち、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ））、サンフィリポＤ症候群またはＭＰＳ  ＩＩＩｄ（すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ））およびモルキオＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａ（すなわち、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））などのヒトの疾患を引き起こすようなものである。特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素はその欠乏が、モルキオＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａ（すなわち、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））を引き起こすようなものである。別の特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素はその欠乏が、多発性スルファターゼ欠損症またはＭＳＤ（すなわち、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））などのヒトの疾患と関連付けられるようなものである。
【００１８】
リソソームスルファターゼ酵素はまた、ヒトまたは哺乳動物の配列のオリジンもしくは誘導物であり得る。本発明のなお他の実施形態における、本発明の局面のそれぞれにおいて、リソソームスルファターゼ酵素は、ヒトまたは哺乳動物のリソソームスルファターゼ酵素のアミノ酸配列の対応する部分に、アミノ酸配列において、同一である。他の実施形態において、ポリペプチド部分は、ヒトまたは哺乳動物由来の天然のリソソームスルファターゼ酵素である。他の実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素のポリペプチドは、ヒトまたは哺乳動物の酵素の、天然のリソソームスルファターゼ酵素のアミノ酸配列に対して、少なくとも約２５、５０、１００、１５０、もしくは２００アミノ酸の長さにわたって、またはそのポリペプチドの全長にわたって、実質的に相同（すなわち、アミノ酸配列において、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である。他の実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素が投与される被験体はヒトである。
【００１９】
好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、エンドソーム酸性化欠損細胞株（例えば、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞株）によって生産される、高度にリン酸化された組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素である。ＥＮＤ３相補群細胞株は、エンドソーム酸性化の欠損などの、ＥＮＤ３相補群細胞株の特性を保持している、任意の修飾されたＣＨＯ細胞株である。好ましい実施形態において、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株、Ｇ７１Ｓ細胞株またはＧ７１もしくはＧ７１Ｓ誘導体である。
【００２０】
より好ましい実施形態において、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、リン酸化されたオリゴ糖の高いレベル（すなわち、タンパク質鎖当たり約０．２５より多くの、好ましくは０．５より多くの、およびより好ましくは約０．７５より多くの、ビスリン酸化された（ｂｉｓ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）オリゴマンノース鎖）を有する。さらにより好ましい実施形態において、酵素は高度にリン酸化された組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００２１】
より好ましい実施形態において、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、活性部位のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への変換の高いパーセンテージ（すなわち、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％）を有する。さらにより好ましい実施形態において、酵素は、活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００２２】
より特に好ましい実施形態において、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、リン酸化されたオリゴ糖の高いレベル（すなわち、タンパク質鎖当たり約０．２５より多くの、好ましくは０．５より多くの、およびより好ましくは約０．７５より多くの、ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖）および、活性部位のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への変換の高いパーセンテージ（すなわち、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％）を有する。最も特に好ましい（ｒｅｆｅｒｒｅｄ）実施形態において、酵素は、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００２３】
第四の局面において、本発明は、本発明の方法によって生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を精製するための方法を提供する。好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、２カラムプロセス（２−ｃｏｌｕｍｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（色素−リガンドクロマトグラフィ、例えば、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、および陰イオン交換クロマトグラフィ、例えば、ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ）を用いて精製され、これは、少なくとも５つの精製工程：（１）収集物（すなわち、ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）および組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を発現する、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはそれの誘導体由来の培地）を濾過する工程；（２）濾過された収集物をｐＨ４．５にｐＨ調節する工程（混入している（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ）タンパク質の沈殿を引き起こすため）；（３）ｐＨ調節され濾過された収集物を色素−リガンドカラム（例えば、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム）に充填し、カラムを洗浄しそしてカラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出する工程；（４）色素−リガンドカラムからの溶出液を陰イオン交換カラム（例えば、ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラム）に充填し、カラムを洗浄しそしてカラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出する工程；ならびに（５）陰イオン交換からの溶出液を限外濾過および透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）する工程を含む。必要に応じて、工程（１）において濾過された収集物は、ｐＨを調節する前に限外濾過によって、１０〜２０倍、濃縮される。必要に応じて、工程（５）において限外濾過および透析濾過されたリソソームスルファターゼ酵素は、処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）緩衝液中に処方される。特に好ましい実施形態において、リソソーム酵素は、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００２４】
別の好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、３カラムプロセス（キャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）クロマトグラフィ、例えば、陰イオン交換ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ；中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）クロマトグラフィ、例えば、色素−リガンドＣａｐｔｏＢｌｕｅＺｉｎｃ、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦまたはＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ；およびポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）クロマトグラフィ、例えば、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉ−ＳｕｂまたはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｌｏｗ−Ｓｕｂ）を用いて精製され、これは少なくとも５つの精製工程：（１）例えば、Ｓａｒｔｏｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（１０ｋＤａ、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ）によって、収集物（すなわち、ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）および組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を発現する、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはそれの誘導体由来の培地）を限外濾過する工程；（２）濾過された収集物をｐＨ４．５にｐＨ調節する工程（混入しているタンパク質の沈殿を引き起こすため）；（３）ｐＨ調節され濾過された収集物をキャプチャーカラム（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰ（Ｍ）陰イオン交換）に充填し、カラムを洗浄しそしてカラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出する工程；（４）キャプチャーカラムからの溶出液を中間カラム（例えば、色素−リガンドＣａｐｔｏ  ＢｌｕｅＺｉｎｃ、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦまたはＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ）に充填し、カラムを洗浄しそしてカラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出する工程；ならびに（５）ポリッシングカラム（例えば、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉ−ＳｕｂまたはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｌｏｗ−Ｓｕｂ）に溶出液を充填し、カラムを洗浄しそしてカラムからリソソーム酵素を溶出する工程を含む。工程（５）由来の溶出されたリソソーム酵素は、処方緩衝液中に処方される。必要に応じて、工程（５）由来の溶出されたリソソームスルファターゼ酵素は、限外濾過され、そしてその後、処方緩衝液中に処方される。必要に応じて、工程（４）におけるカラムからのリソソームスルファターゼ酵素は、工程（５）においてポリッシングカラムに充填する前に、低ｐＨウイルス不活性化のためにｐＨ３．５にさらされる。特に好ましい実施形態において、リソソーム酵素は、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００２５】
第五の局面において、本発明は、ＧＡＬＮＳ酵素における欠乏によって引き起こされるリソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）もしくはモルキオＡ症候群）またはＧＡＬＮＳ酵素における欠乏に関連付けられるリソソーム蓄積症（例えば、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ））に罹患した被験体を処置するために有用である、精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体を提供する。好ましい実施形態において、精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳは：（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９０％の純度を有し；（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約９０％の変換を有し；かつ（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８のアスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化される。精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンド（すなわち、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％である、前駆体ヒトＧＡＬＮＳ）ならびに約３９ｋＤａおよび約１９ｋＤａでの主要ではないバンド（すなわち、目に見えるタンパク質の約２５％未満、好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％未満、およびさらにより好ましくは約５％未満である、成熟したまたはプロセシングされた（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）ヒトＧＡＬＮＳ）からなる。特に好ましい実施形態において、精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、約５５〜６０ｋＤａの単一のバンド（すなわち、前駆体ヒトＧＡＬＮＳ）から本質的になる。一つの実施形態において、精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群を処置するため有用である。一つの実施形態において、精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、ＭＳＤを処置するために有用である。
【００２６】
第六の局面において、本発明は、もっぱらまたは一部、リソソームスルファターゼ酵素の欠乏によって引き起こされる疾患、またはリソソームスルファターゼ酵素の欠乏に関連付けられる疾患を処置する方法を提供する。方法は、本発明の方法によって生産される治療用の組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を投与することを含み、ここで、リソソームスルファターゼ酵素は、ＭＰＲ受容体に結合し、そして細胞膜を横切って輸送され、細胞に入り、そして細胞内でリソソームに送達される。
【００２７】
一つの実施形態において、方法は、リソソームスルファターゼ酵素の欠乏を有する被験体を処置することを含み、この方法は、処置を必要としている被験体に、上記リソソームスルファターゼ酵素の治療上有効な量を投与することを含み、ここで、上記リソソームスルファターゼ酵素は、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体によって生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体である。いくつかの実施形態において、方法は、治療用の組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を、単独でまたは薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤と組み合わせて、投与することを含む。好ましい実施形態は、リソソームスルファターゼ酵素の欠乏を最も効果的に改善するために、投与量を、処置される被験体（好ましくは哺乳動物および最も好ましくはヒト）の必要性に対して最適化することを含む。
【００２８】
そのような治療用のリソソームスルファターゼ酵素は、例えば、異染性白質萎縮症またはＭＬＤ、ムコ多糖体症ＶＩ型（ＭＰＳ  ＶＩ）またはマロトー−ラミー症候群、ムコ多糖体症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）またはハンター症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ  ＩＩＩａ）またはサンフィリポＡ症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ  ＩＩＩｄ）またはサンフィリポＤ症候群、およびムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群に罹患した患者など、リソソームスルファターゼ酵素の欠乏によって引き起こされる、リソソーム蓄積症に罹患した患者の処置において特に有用である。特に好ましい実施形態において、リソソーム蓄積症は、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群であり、かつリソソームスルファターゼ酵素は組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。なお他の実施形態において、本発明はまた、リソソーム蓄積症を引き起こす、欠損（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）リソソームスルファターゼ酵素および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。
【００２９】
別の実施形態において、方法は、一つまたはそれより多いリソソームスルファターゼ酵素における欠乏と関連付けられるリソソーム蓄積症に罹患した被験体を処置することを含み、これは、処置を必要としている被験体にリソソームスルファターゼ酵素の治療上有効な量を投与することを含み、ここで、上記リソソームスルファターゼ酵素は、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体によって産生される、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体である。いくつかの実施形態において、方法は、治療用の組換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を、単独でまたは薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤と組み合わせて、投与することを含む。特に好ましい実施形態において、リソソーム蓄積症は多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）である。
【００３０】
特に好ましい実施形態において、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株、Ｇ７１Ｓ細胞株またはそれのＧ７１もしくＧ７１Ｓ誘導体である。
【００３１】
なお別の実施形態において、本発明は、リソソームスルファターゼ酵素の治療上有効な量を、酵素置換療法を必要としている被験体に投与することによる、酵素置換療法の方法を提供し、ここで、患者の細胞は、細胞への損傷を防ぐまたは低減するためには不十分な量のリソソームスルファターゼ酵素を含むリソソームを有し、この方法によって、リソソームスルファターゼ酵素の十分な量がリソソームに入り、細胞への損傷を防ぐまたは低減する。細胞は、ＣＮＳの範囲内またはＣＮＳ範囲外かもしれず、または、毛細血管壁によって血液から仕切られる（ｓｅｔ  ｏｆｆ）必要がないかもしれず、毛細血管壁の内皮細胞は接着結合によって、活性な薬剤の拡散に対し、厳密に密封される。
【００３２】
特定の実施形態において、本発明は活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を含む組成物および薬学的組成物を提供し、この酵素は、標的リソソームにおいて低減された、欠損したまたは存在しない生物学的活性を有し、かつ、この酵素は被験体に投与される。好ましい活性なヒトリソソームスルファターゼ酵素としては、アリールスルファターゼＡ、アリールファターゼＢ、イズロン酸−２−スルファターゼ、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼが挙げられるが、これらに制限されない。好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼは、活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素である。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明は、被験体に組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の治療上有効な量を投与することによって、ＭＰＳ  ＩＶａもしくはモルキオＡ症候群、またはＭＳＤに罹患した被験体を処置する方法を提供し、ここで、組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、活性部位のシステイン残基の変換の高いレベル（すなわち、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の変換）かつリン酸化の高いレベル（すなわち、タンパク質鎖当たり約０．２５より多くの、好ましくは０．５より多くの、およびより好ましくは約０．７５より多くの、ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖）を有する。
【００３４】
より好ましい実施形態において、本発明は、被験体にＥＮＤ３相補群細胞によって生産される組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の治療上有効な量を投与することによって、ＭＰＳ  ＩＶａもしくはモルキオＡ症候群，またはＭＳＤに罹患した被験体を処置する方法を提供し、ここで、組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、活性部位のシステイン残基の変換の高いレベル（すなわち、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の変換）かつリン酸化の高いレベル（すなわち、タンパク質鎖当たり約０．２５より多くの、好ましくは０．５より多くの、およびより好ましくは約０．７５より多くの、ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖）を有する。
【００３５】
特に好ましい実施形態において、本発明は、ＭＰＳ  ＩＶａもしくはモルキオＡ症候群、またはＭＳＤに罹患した被験体を処置する方法を提供し、この方法は、被験体に、（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９０％の純度を有し；（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約９０％の変換を有し；かつ（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化された、精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳの治療上有効な量を投与することにより、ここで、位置１７８のアスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化される。精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンド（すなわち、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％である、前駆体ヒトＧＡＬＮＳ）ならびに約３９ｋＤａおよび約１９ｋＤａでの主要ではないバンド（すなわち、目に見えるタンパク質の約２５％未満、好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％未満、およびさらにより好ましくは約５％未満である、成熟したまたはプロセシングされたヒトＧＡＬＮＳ）からなる。より特に好ましい実施形態において、精製された、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、約５５〜６０ｋＤａの単一のバンド（すなわち、前駆体ヒトＧＡＬＮＳ）から本質的になる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、被験体は、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群に罹患している。いくつかの実施形態において、被験体はＭＳＤに罹患している。
【００３７】
上に記載されたリソソーム蓄積症の処置のための医薬の調製において、本発明の高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素（これは、本発明の方法によって好ましくは生産される）の類似の使用もまた、意図される。
【００３８】
第七の局面において、本発明は、上に記載されたように、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素（これは、そのようなリソソームスルファターゼ酵素における欠乏によって、もっぱらもしくは一部、引き起こされるかまたはそれに関連付けられる疾患を処置するために有用である）ならびに一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物を提供しする。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、本発明の方法によって生産される、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体および一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む。そのような薬学的組成物は、鞘内投与、非経口投与、局所的投与、鼻内投与、吸入投与または経口投与などのいくつかの経路による投与に適切であり得る。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、非経口投与に適切である。全長リソソームスルファターゼ酵素またはそれの断片、変異体、改変体もしくは誘導体をコードしている核酸配列を特色としている実施形態は本局面の範囲内であり、これは、リソソーム酵素の欠乏に冒された細胞にインビボで投与され得る。
【００３９】
別の局面において、本発明は、リソソームスルファターゼ酵素の活性を検出するための方法を提供し、これは、（ａ）軟骨細胞の分化の維持を促進する条件下で、リソソームスルファターゼ酵素欠乏を患っている患者（例えば、モルキオ症候群に罹患した患者）由来の軟骨細胞を培養すること；（ｂ）軟骨細胞を、ケラタン硫酸を分解する（ｄｅｇｒａｄｅ）リソソームスルファターゼ酵素と接触させること；および（ｃ）細胞中のケラタン硫酸のレベルを検出することを含み、ここで、リソソームスルファターゼ酵素と接触させられていない細胞と比較して、リソソームスルファターゼ酵素と接触させられた細胞中の低減したケラタン硫酸レベルは、リソソームスルファターゼ酵素活性を示す。いくつかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素はＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。いくつかの実施形態において、培養は、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ１）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、トランスフェリン、インスリンおよびアスコルビン酸を含む培地中で行われる。いくつかの実施形態において、ケラタン硫酸は、共焦点顕微鏡によって、または抗ケラタン硫酸抗体への結合を介して検出される。方法は、任意のリソソームスルファターゼ酵素を用いて行われ得、リソソームスルファターゼ酵素は、天然に存在しているまたは組換え型ヒト酵素、またはそれらの断片もしくは改変体を含み、前駆体ヒト酵素と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含みシグナル配列を含まない改変体、またはそれの成熟した形態と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む改変体を含む。
【００４０】
なお別の局面において、本発明は、天然の基質を分解する、組換え型ヒトリソソーム酵素の活性を測定するための細胞ベースの（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ）アッセイを提供する。方法は、（ａ）リソソーム酵素に対する天然の基質が蓄積する条件下で、リソソーム酵素が不足している、単離されたヒト細胞を培養すること；（ｂ）細胞をリソソーム酵素と接触させること；（ｃ）細胞を溶解すること；（ｄ）細胞溶解産物に、（ｉ）天然の基質に対し特異的であり、かつ（ｉｉ）天然の基質から低分子（ｓｍａｌｌ）オリゴ糖を切断する酵素を添加すること；（ｅ）検出可能部分で低分子オリゴ糖を標識すること；（ｆ）標識された低分子オリゴ糖を必要に応じて分離すること；（ｇ）標識された低分子オリゴ糖を検出すること；ならびに（ｈ）（ｉ）リソソーム酵素と接触させられた細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量と（ｉｉ）リソソーム酵素と接触させられていない細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量とを比較することによって、天然の基質を分解するリソソーム酵素の活性を決定することを含み、ここで、（ｈ）（ｉｉ）と比較したときの（ｈ）（ｉ）における減少は、天然の基質を分解するリソソーム酵素の活性を示す。一つの実施形態において、低分子オリゴ糖は、単糖類、二糖類、または三糖類である。関連する実施形態において、低分子オリゴ糖は、二糖類である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、β−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳＢ）である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素はβ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）である。
【００４１】
細胞ベースのアッセイにおいて用いられ得る適切なヒト細胞としては、試験されるリソソーム酵素が不足し、その結果として、リソソーム酵素に対する天然の基質が蓄積し得る、あらゆるヒト細胞が挙げられる。例えば、活性における完全な（１００％）または部分的な欠乏（例えば、活性における３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれより大きい減少）を天然で示す細胞が用いられ得る。減少させられた活性を有する変異体酵素を発現している細胞、またはリソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖体症）に罹患した患者由来の細胞が用いられ得る。例えば、変異を、コードしている遺伝子またはそれのプロモーターもしくは他の調節領域に導入することにより、リソソーム酵素活性をノックアウトまたは低減するために組換えで変更された細胞が使用され得る。リソソーム酵素活性を低減するために処理された細胞、例えば、酵素発現を低減するためにアンチセンスまたはＲＮＡｉを用いて処理された細胞が使用され得る。
【００４２】
炭水化物から低分子オリゴ糖を切断（消化）し、かつリソソーム酵素の天然の基質に「特異的」である（すなわち、主に消化する）適切な酵素は、当業者によって選択され得る。例えば、ＧＡＬＮＳまたはＧＬＢ１（ケラタン硫酸を分解する酵素）の活性の検出のため、工程（ｄ）の酵素は、ケラタナーゼＩＩまたはケラタン硫酸に主として作用するあらゆる酵素であり得る。別の実施例として、ＩＤＵ、ＡＲＳＢ、ＩＤＳまたはＧＵＳＢ（デルマタン硫酸を分解する酵素）の検出のため、工程（ｄ）の酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはデルマタン硫酸に主として作用するあらゆる酵素であり得る。別の実施例として、ＩＤＵ、ＩＤＳ、ＳＧＨＳ、Ｇ６ＳまたはＧＵＳＢ（硫酸ヘパリンを分解する酵素）の検出のため、工程（ｄ）の酵素は、へパラナーゼＩまたはへパラナーゼＩＩ、または両方であり得る。なお別の実施例として、ＧＡＡ（グリコゲンを分解する酵素）の検出のため、工程（ｄ）の酵素は、α−アミラーゼまたはグリコゲンに主として作用するあらゆる酵素であり得る。
【００４３】
この細胞ベースの方法は、リソソーム酵素活性の検出において、高い感度を可能にする。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の濃度が、約１０ｎＭ、または約５ｎＭ、または約１ｎＭ、または約０．７５ｎＭ、または約０．５ｎＭ、または約０．２５ｎＭ、または約０．１ｎＭ、または約０．０５ｎＭ、または約０．０１ｎＭ、または約０．００５ｎＭ、または約１ｐＭ、または約０．５ｐＭ程度の低さである場合、リソソーム酵素の活性は検出可能である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体において生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現し、そしてここで、該組換え型リソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体は、高レベルの活性化および高レベルのリン酸化を有する、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
（項目２）
前記組換え型リソソームスルファターゼ酵素が、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、項目１に記載の組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
（項目３）
ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体によって生産される、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現し、そしてここで、該組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、高レベルの活性化および高レベルのリン酸化を有する、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
（項目４）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、項目１から３の何れか一項に記載の酵素。
（項目５）
高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を生産するための方法であって、該方法は：
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）に由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体を培養する工程；
（ｂ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体において、該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第一の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｃ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体において、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第二の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｄ）該第一のおよび第二の発現ベクターを用いて該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体をトランスフェクトする工程；
（ｅ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現する、該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体のトランスフェクタントの選択およびクローニングをする工程；ならびに
（ｆ）該高度にリン酸化された組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を製造するための細胞培養の作業方法を最適化する工程、
を包含し、ここで該組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、方法。
（項目６）
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において同時にトランスフェクトされる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において連続してトランスフェクトされる、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、項目５から７の何れか一項に記載の方法。
（項目９）
項目５から８の何れか一項に記載の方法によって生産される、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
（項目１０）
項目９に記載のリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体、および、一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目１１）
高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体またはそれの改変体を生産するための方法であって、該方法は：
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）に由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体を培養する工程；
（ｂ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体に適した、該高度にリン酸化された活性な組換え型ＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第一の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｃ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体に適した、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第二の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｄ）該第一のおよび第二の発現ベクターを用いて該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体をトランスフェクトする工程；
（ｅ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現する、該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体のトランスフェクタントの選択およびクローニングをする工程；ならびに
（ｆ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を製造するための細胞培養の作業方法を最適化する工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において同時にトランスフェクトされる、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において連続してトランスフェクトされる、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、項目１１から１３の何れか一項に記載の方法。
（項目１５）
項目１１から１４の何れか一項に記載の方法によって生産される、高度にリン酸化された高度に活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
（項目１６）
項目１５に記載の組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体、および、一つもしくは薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目１７）
Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）における欠乏によって引き起こされるか、またはそれに関連付けられるリソソーム蓄積症に罹患した被験体を処置するために有用である、組換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで該ＧＡＬＮＳ酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体は：
（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９０％の純度を有し；
（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約９０％の変換を有し；かつ
（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８の該アスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化される、
組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体。
（項目１８）
前記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群である、項目１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
（項目１９）
前記リソソーム蓄積症は、多発性スルファターゼ欠損症である、項目１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
（項目２０）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、項目１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
（項目２１）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、約５５〜６０ｋＤａの単一のバンドから本質的になる、項目１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
（項目２２）
リソソームスルファターゼ酵素の欠乏を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、該リソソームスルファターゼ酵素を必要としている該被験体に、該リソソームスルファターゼ酵素の治療上有効な量を投与することを包含し、ここで、該リソソームスルファターゼ酵素は、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体によって生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体である、方法。
（項目２３）前記リソソームスルファターゼ酵素欠乏は、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、ムコ多糖体症ＶＩ型（ＭＰＳ  ＶＩ）またはマロトー−ラミー症候群、ムコ多糖体症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）またはハンター症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ  ＩＩＩａ）またはサンフィリポＡ症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ  ＩＩＩｄ）またはサンフィリポＤ症候群、およびムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群からなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記リソソームスルファターゼ酵素欠乏は、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
一つまたはそれより多いリソソームスルファターゼ酵素における欠乏と関連付けられるリソソーム蓄積症を処置する方法であって、該方法は、該一つまたはそれより多いリソソームスルファターゼ酵素における欠乏を有する被験体に、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体によって産生される、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体の治療上有効な量を投与することを包含する、方法。
（項目２６）
前記リソソーム蓄積症は、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、項目２２から２６の何れか一項に記載の方法。
（項目２８）
ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）もしくはモルキオＡ症候群、または多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）に罹患した被験体を処置する方法であって、該方法は、該被験体に、精製された、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここで、該ＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体は：
（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９０％の純度を有し；
（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約９０％の変換を有し；かつ
（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８の該アスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化される、
方法。
（項目２９）
前記被験体は、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群に罹患している、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記被験体は、ＭＳＤに罹患している、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、約５５〜６０ｋＤａの単一のバンドから本質的になる、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
Ｇ７１またはそれの誘導体に由来するＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は：
（ａ）組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）のための発現ベクター；および
（ｂ）組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素のための発現ベクターを含み、ここで、該組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、Ｇ７１またはそれの誘導体に由来するＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
（項目３４）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のための前記発現ベクターを含む、項目３３に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
（項目３５）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組換え型ヒトＧＡＬＮＳを発現および分泌する、項目３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
（項目３６）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローン４、クローン５、クローンＣ６、クローンＣ２、クローンＣ５、クローンＣ７、クローンＣ１０、クローンＣ１１およびクローンＣ３０からなる群より選択される、項目３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
（項目３７）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローンＣ２である、項目３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
（項目３８）
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、懸濁物中での増殖に適合させられている、項目３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
（項目３９）
天然の基質を分解する、組換え型ヒトリソソーム酵素の活性を測定するための方法であって、該方法は：
（ａ）該リソソーム酵素に対する天然の基質が蓄積する条件下で、該リソソーム酵素が不足している、単離されたヒト細胞を培養すること；
（ｂ）該細胞を該リソソーム酵素と接触させること；
（ｃ）該細胞を溶解すること；
（ｄ）該細胞溶解産物に、（ｉ）天然の基質に対し特異的であり、かつ（ｉｉ）該天然の基質から低分子オリゴ糖を切断する酵素を添加すること；
（ｅ）検出可能部分で該低分子オリゴ糖を標識すること；
（ｆ）該標識された低分子オリゴ糖を必要に応じて分離すること；
（ｇ）該標識された低分子オリゴ糖を検出すること；および
（ｈ）（ｉ）該リソソーム酵素と接触させられた細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量と（ｉｉ）該リソソーム酵素と接触させられていない細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量とを比較することによって、天然の基質を分解する該リソソーム酵素の活性を決定すること、
を包含し、ここで、（ｈ）（ｉｉ）と比較したときの（ｈ）（ｉ）における減少は、天然の基質を分解する該リソソーム酵素の活性を示す、方法。
（項目４０）
前記リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択されるリソソームスルファターゼ酵素である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記リソソームスルファターゼ酵素は、ＧＡＬＮＳである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記リソソーム酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）である、項目３９に記載の方法。
【００４４】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明から明白になる。しかしながら、本発明の精神および範囲内での種々の変更ならびに修飾は、この詳細な説明から当業者に対し明白になるため、詳細な説明および具体的な実施例（これは、本発明の好ましい実施形態を示しているが）は、単に例示の目的で示されることが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）のヌクレオチド配列（配列番号：１）を記載する。
【図２】図２は、ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）のアミノ酸配列（配列番号：２）を記載する。
【図３】図３は、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のヌクレオチド配列（配列番号：３）を記載する。
【図４】図４は、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のアミノ酸配列（配列番号：４）を記載する。Ｎ末端の２６アミノ酸のシグナルぺプチドは、プロセシングされたＧＡＬＮＳにおいて存在しない。
【図５】図５は、プロセシングされたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）（配列番号：５）の構造および特性を描写する。
【図６】図６は、ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）発現ベクターおよびヒトＧＡＬＮＳ発現ベクターで共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）されたＧ７１Ｓ細胞由来のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の発現を示す。（Ａ）９６ウェル中での、活性なＧＡＬＮＳについてのＧ７１Ｓクローンの選別。（Ｂ）ピコグラム／細胞／日における、Ｇ７１ＳクローンのＧＡＬＮＳの生産性。
【図７】図７は、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）およびそれの改変体を発現するＧ７１Ｓ細胞の大規模生産のために使用されるＷＡＶＥバイオリアクターコントローラー（バイオリアクター  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）の概略図を示す。
【図８】図８は、４℃（ひし形）または−７０℃（三角形）で保管した際の、精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素の活性の安定性を示す。
【図９】図９は、（Ａ）Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィ、その後の（Ｂ）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰクロマトグラフィによるヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の精製を示す。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって（左）および抗ＧＡＬＮＳ（ＩＶＡ）抗体を用いたウェスタンブロッティングによって（右）決定される。
【図１０】図１０は、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐクロマトグラフィ、ＺｎキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィおよびＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０ＭクロマトグラフィによるヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の精製を示す。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって（上部左）ならびに抗ＧＡＬＮＳ抗体（上部右）、抗Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ抗体（下部左）および抗ＣＨＯＰ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ細胞タンパク質）（下部右）を用いたウェスタンブロッティングによって決定される。
【図１１】図１１は、デルマタン硫酸基質の量における用量依存的な減少が、ＩＤＵで処理されたＧＭ０１３９１細胞において観察されたことを示す。
【図１２】図１２は、デルマタン硫酸基質の量における用量依存的な減少が、ＡＲＳＢで処理されたＧＭ００５１９細胞において観察されたことを示す。
【図１３】図１３は、培養された滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）による、標識されていないヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）（丸）またはＡ４８８が結合体化されたＧＡＬＮＳ（四角）またはＡ５５５が結合体化されたＧＡＬＮＳ（三角形）のいずれかの取込みを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、リソソームのターゲッティングにおいて効率がよく、およびそれゆえ治療的に有効である、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素産物の要求を伴なう、組換え型リソソームスルファターゼ酵素の大規模製造への必要性を満足させる方法の発見に関連する。
【００４７】
リソソーム酵素調製物の治療上の有効性は、その調製物中のマンノース−６−リン酸のレベルに依存する。ホスフェートは、小胞体および初期ゴルジにおいて、翻訳後修飾によって標的糖タンパク質に添加される。折りたたまれたリソソーム酵素は、オリゴ糖修飾酵素によって認識される、特有の三次（ｔｅｒｔｉａｒｙ）決定基を表す。この決定基は、一組の特異的に間隔があけられたリジンから構成され、そして一次配列の相同性が存在しないのにもかかわらず、たいていのリソソーム酵素上で見出せる。修飾酵素、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼは、タンパク質決定基に結合し、そして結合部位に最も近いオリゴ糖の末端マンノース残基の６位にＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸を添加する；第二の酵素、ホスホジエステルα−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、その後ＧｌｃＮＡｃ−リン酸結合を切断し、マンノース−６−リン酸末端オリゴ糖を生み出す（Ｃａｎｆｉｅｌｄら、米国特許第６，５３７，７８５号）。マンノース−６−リン酸修飾の目的は、細胞内での分泌経路からリソソーム経路へ、リソソーム酵素を方向転換することである。マンノース−６−リン酸を含む酵素は、トランスゴルジ内でＭＰＲによって結合され、そして、細胞表面ではなくリソソームに配送される。
【００４８】
リソソーム酵素のオリゴ糖上のマンノース−６−リン酸マーカーの存在に加えて、酵素のリソソーム配送はトランスゴルジスタック（ｓｔａｃｋ）の末端から発生する輸送エンドソームの酸性化に依存する。拡散性塩基性分子を有するこれらのエンドソーム内の、酸性環境の化学的消失は、細胞外環境へのリソソーム酵素を含む小胞の内容物の吐き出し（ｄｉｓｇｏｒｇｅｍｅｎｔ）を結果として生じる（Ｂｒａｕｌｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３（３）：３１６−３２１，１９８７）。酸性化はエンドソームの膜内に埋め込まれた特異的液胞型ＡＴＰａｓｅを必要とする（Ｎｉｓｈｉら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３（２）：９４−１０３，２００２）。このＡＴＰａｓｅの不足は、リソソーム配送を犠牲にして、リソソーム酵素の分泌を高めることが予期される。液胞型ＡＴＰａｓｅにおける欠損を含む製造細胞株は、細胞内リソソーム区画への、リン酸化された組換え型酵素の非生産的な転換を防ぐことが予期され得る。
【００４９】
１９８４年、エンドソーム酸性化に特異的に欠損があるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞変異体が作製され、そして特徴付けられた（Ｐａｒｋら、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７（２）：１３７−１５０，１９９１）。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、化学的に変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅ）され、そして、毒素存在下での高い温度における生存に対して選択された。これらの毒素は、致死性（ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）の完全な発現のために、エンドソームの酸性化を必要とする（Ｍａｒｎｅｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９９（６）：１９０７−１９１６，１９８４）。先の研究において、異なる作用のメカニズムを有する二種の毒素のカクテルが、毒素特異的抵抗性の選択を避けるために選ばれた。原理は、一つの特定の毒素への抵抗性を結果として生じる偶発性変異の確率はわずかであるが、二種の全く異なる毒素に特異的である二種の同時の偶発性変異の確率は存在しないということである。選択は、温度感受性変異を可能にするために、高い温度で行われた。この遺伝学的スクリーニングは、結果として２種の変異体を生じ、それらの一つは、Ｇ．７．１（Ｇ７１）と示され、これは高い温度において毒素に対し抵抗性であった。Ｇ７１における機能障害は、二種の毒素の取込みまたは作用のメカニズムのためではなく、そのクローンが高い温度でエンドソームを酸性化することができないことから結果として生じた。この酸性化ができないことはまた、より少ない程度ではあったが、許容温度（３４℃）においても明らかであった。Ｇ７１細胞はまた、培地からのトランスフェリンの取込みが正常であるにもかかわらず、高い温度において、鉄に対する栄養素要求株であることが見出された（Ｔｉｍｃｈａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３０）：１４１５４−１４１５９，１９８６）。鉄は、低ｐＨにおいてのみ、トランスフェリンから放出されたため、正常なトランスフェリン取込みにもかかわらず、鉄に対し栄養素要求であったことは、エンドソーム酸性化における不全を示した。別の研究は、酸性化の欠損はリソソームではなく、エンドソーム内で主として現れたことを実証した（Ｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２０）：９８８３−９８８６，１９８７）。Ｇ７１におけるデータは、変異がエンドソーム酸性化を担う液胞型ＡＴＰａｓｅの不安定化を結果として生じたという結論と一致した。不安定化は、高い温度（３９．５℃）において最も明白であったが、低い温度（３４℃）においてさえも部分的に表された。Ｇ７１細胞における２種の内因性のリソソーム酵素、カテプシンＤおよびα−グルコシダーゼの輸送の研究（Ｐａｒｋら、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７（２）：１３７−１５０，１９９１）は、両方の酵素は、高い温度で、定量的に（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ）分泌されたこと、そしてこれらの酵素のグリコシル化は影響を受けなかったことを示した。リン酸化された酸性αグルコシダーゼの分泌は、非許容温度で有意に高められた。
【００５０】
リソソームスルファターゼ酵素調製物の治療の有効性は、マンノース−６−リン酸のレベルに依存するだけでなく、その調製物中の活性な酵素の存在にも依存する。全ての既知のスルファターゼは、それらの触媒部位においてシステイン残基を含み；このシステイン残基は、この酵素を活性化するために、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）へと翻訳後修飾される。このシステインからＦＧｌｙへの翻訳後の酵素活性化（これは、スルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）によって触媒される）は、リソソームへのスルファターゼのターゲッティングの前に、小胞体内で翻訳後直ちに、折りたたまれていないスルファターゼ上で起こる（Ｄｉｅｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１９６３−１１９６８，１９９７）。この特有な翻訳後修飾の重要性は、ＳＵＭＦ１における変異（これはリソソームスルファターゼ酵素におけるＦＧｌｙ形成の減損を結果として生じる）がヒトにおいて多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）を引き起こすという事実によって、強調される（Ｄｉｅｚ−Ｒｕｉｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６：３５５−３７９，２００５）。
【００５１】
したがって、組換え型ヒトスルファターゼ調節酵素（ＳＵＭＦ１）およびヒトリソソームスルファターゼ酵素を共発現するＧ７１細胞（エンドソーム酸性化に欠損がある変異体ＣＨＯ細胞）の能力は、そのようなリソソームスルファターゼ酵素の欠乏によって引き起こされるまたは関連付けられるリソソーム蓄積症の管理のために有用である、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素の大規模生産のためのメカニズムを提供する。
【００５２】
（Ｉ．定義）
異なる定義がなされない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者によって、一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明において使用される多くの用語の一般的定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ  ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ  ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００５３】
本明細書に引用された各出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全容が、本開示と矛盾しない程度に、参照によって援用される。
【００５４】
本明細書および添付された特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なった指示をしているのでなければ、複数形への言及を含むことが、本明細書で注意されるべきである。
【００５５】
本明細書で使用される場合、以下の用語は、異なる明記がなされない限り、それらにあると考えられる意味を有する。
【００５６】
「対立遺伝子改変体」とは、同じ遺伝子座を占める遺伝子の二つまたはそれより多い多型形態のいずれかをいう。対立遺伝子の変動は、突然変異を通じて自然に生じ、そして集団内に表現型の多型性を結果として生じ得る。遺伝子変異は、サイレント（すなわち、コードされたポリペプチド中に変化なし）であり得、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。「対立遺伝子改変体」とはまた、遺伝的対立遺伝子改変体のｍＲＮＡ転写産物由来のｃＤＮＡ、ならびにそれらによってコードされるタンパク質をいう。
【００５７】
「増幅」とは、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、およびリガーゼ連鎖反応などによって、ポリヌクレオチド配列をコピーし、そして多数のポリヌクレオチド分子に拡大する、あらゆる手段をいう。
【００５８】
配列が第一配列であるポリヌクレオチドが、配列が第二配列であるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする場合、第一配列は、第二配列に関して「アンチセンス配列」である。
【００５９】
「ｃＤＮＡ」とは、一本鎖形態もしくは二本鎖形態のいずれかにおけるｍＲＮＡに対して、相補的または同一であるＤＮＡをいう。
【００６０】
従来の表記が、ポリヌクレオチド配列を記載するために、本明細書で使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は、５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向といわれる。新生ＲＮＡ転写産物に対するヌクレオチドの５’から３’への付加の方向が、転写方向といわれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」といわれ；ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であり、かつそのＲＮＡ転写産物の５’末端に対して、５’に位置される配列は、「上流配列」といわれ；そのＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であり、かつコードＲＮＡ転写産物の３’末端に対して、３’である配列は、「下流配列」といわれる。
【００６１】
「相補的」とは、２種のポリヌクレオチドの相互作用表面の位相的な適合性または互いがマッチすること（ｍａｔｃｈｉｎｇ）をいう。したがって、この二つの分子は、相補的と記載され得、そしてさらに、接触表面の特徴は、互いに相補的である。第一のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第二のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一である場合、第一のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチドに対して相補的である。したがって、配列５’−ＴＡＴＡＣ−３’であるポリヌクレオチドは、配列が５’−ＧＴＡＴＡ−３’であるポリヌクレオチドに対して相補的である。対象ヌクレオチド（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列に対し相補的な配列が、参照ヌクレオチド（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列に対して実質的に同一である場合、そのヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列に対して「実質的に相補的」である。
【００６２】
「保存的置換」とは、機能的に類似したアミノ酸を用いた、アミノ酸のポリペプチドにおける置換をいう。以下の６群は、それぞれ、お互いに保存的置換となるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６３】
ポリペプチドに関して使用される場合、用語「断片」とは、タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端のいずれか、または両方におけるトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）の理由で、および／あるいは、タンパク質の内部の部分または領域の欠失によって、全長ポリペプチドより短いポリペプチドをいう。ポリペプチドの断片は、当該分野で公知の方法によって、作製され得る。
【００６４】
ポリペプチドに関して使用される場合、用語「変異体」とは、タンパク質の一つまたはそれより多いアミノ酸が、異なるアミノ酸によって置換されている、ポリペプチドをいう。アミノ酸置換は、上で定義された、保存的置換であり得、または、非保存的置換であり得る。変異体ポリペプチドは、当該分野で公知の方法によって、作製され得る。
【００６５】
ポリペプチドに関して使用される場合、用語「誘導体」とは、（例としてかつ制限のためではなく）ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）、標識（例えば、放射性核種または種々の酵素を用いて）、ペグ化などの共有結合のポリマーの付着（すなわち、ポリエチレングリコールを用いた誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ））および、ヒトタンパク質において通常に生じないオルニチンなどの、アミノ酸の化学的合成による挿入または置換といった技術によって、化学的に修飾されたポリペプチドをいう。誘導体ポリペプチドは、当該分野で公知の方法によって、作製され得る。
【００６６】
細胞株に関して使用される場合、用語「誘導体」とは、親細胞株の子孫である細胞株をいい；例えば、この用語は、親細胞から継代されたまたはサブクローニングされかつ所望の特性を保持している細胞、変異させられそして所望の特性の保持について選択された親細胞株の子孫、および異なる発現ベクターまたは異なる外因性の添加された核酸を含むように変えられた親細胞株の子孫を含む。
【００６７】
「検出する」とは、サンプル中に分析物が存在するか、存在しないかを決定すること、またはサンプル中の分析物の量を決定することをいい、そして、サンプル中の分析物の量、またはサンプル中の細胞当たりの分析物の量を定量化することを含み得る。
【００６８】
「検出可能部分」または「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的方法によって検出可能な組成物をいう。例えば、有用な標識としては３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ）試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される）酵素、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）および抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるタンパク質、または標的に相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能部分はしばしば、放射性のシグナル、色素のシグナル、または蛍光のシグナルなどの測定可能シグナル（これはサンプル中の結合した検出可能部分の量を定量化するために使用され得る）を発生させる。検出可能部分は、共有結合で、またはイオン結合、ファンデルワールス結合もしくは水素結合を通じてのいずれかで、プライマーもしくはプローブに組み入れられまたは結合させられ得る（例えば、放射性のヌクレオチド、またはストレプトアビジンによって認識されるビオチン化されたヌクレオチドの取り込み）。検出可能部分は、直接的にまたは間接的に検出可能であり得る。間接的検出は、検出可能部分への、第二の直接的または間接的検出可能部分の結合を含み得る。例えば、検出可能部分は、ストレプトアビジンの結合パートナーであるビオチン、または相補配列の結合パートナーであり、特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列などの、結合パートナーのリガンドであり得る。結合パートナーはそれ自身直接的に検出可能であり得、例えば、抗体は、蛍光分子を用いてそれ自身標識され得る。結合パートナーはまた、間接的に検出可能であり得、例えば、相補的ヌクレオチド配列を有する核酸は、他の標識された核酸分子とのハイブリダイゼーションを通して、次に検出可能となる枝分かれＤＮＡ分子の一部であり得る（例えば、Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１６５，１９８８を参照のこと）。シグナルの定量は例えば、シンチレーション計数、デンシトメトリー、またはフローサイトメトリーによって達成される。
【００６９】
「診断」は、病的状態の存在または性質を同定することを意味する。診断方法は、特異性および選択性において異なる。特定の診断方法は、状態の最終的な診断を提供しないかもしれないが、この方法が診断において援助するような建設的な指示を提供する場合、十分である。
【００７０】
用語「有効量」は、被験体の健康状態、病状、および疾患に所望の結果をもたらすために、または診断の目的のために、十分である投与量を意味する。所望の結果は、その投与量のレシピエントにおける、主観的または客観的改善を含み得る。「治療上有効な量」とは、健康に対する、意図される有益な効果をもたらすために有効である薬剤の量をいう。
【００７１】
「コードしている」とは、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける、他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として役に立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおける、ヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、ならびにそれからの結果として生じる生物学的特性をいう。したがって、転写および遺伝子によって生産されるｍＲＮＡの翻訳が、細胞内または他の生物学的システム内でタンパク質を生産する場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡのコード鎖（これらのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列に同一であり、かつ配列表に通例提供される）および非コード鎖（転写産物のための鋳型として使用される）の両方は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質もしくは他の産物をコードしていると、いわれ得る。別のものが特定されない限り、「アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、かつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
【００７２】
「等量用量」とは、同量の活性な薬剤を含む、用量をいう。
【００７３】
「発現制御配列」とは、これに対して作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節する、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列をいう。「作動可能に連結された」とは、一つの部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が、他の部分における作用（例えば、配列の転写）を結果として生じる、２つの部分の間の機能的な関係をいう。発現制御配列としては、例としてかつ制限することなく、プロモーターの配列（例えば、誘導的または構成的）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、および終止コドンが挙げられ得る。
【００７４】
「発現ベクター」とは、組換え型ポリヌクレオチドを含むベクターをいい、組換え型ポリヌクレオチドは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメント（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはインビトロ発現システムから提供され得る。発現ベクターとしては、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソーム中に含まれる）、および組換え型ポリヌクレオチドを組み入れているウイルスなどの、当該分野で公知のあらゆる発現ベクターが挙げられる。
【００７５】
「高度にリン酸化された」、「高レベルのリン酸化」および「高レベルにリン酸化されたオリゴ糖」とは、リソソームスルファターゼ酵素の少なくとも５０％が、リン酸化されたオリゴ糖によって、陽イオン非依存的マンノース−６−リン酸受容体に結合する、リソソームスルファターゼ酵素の調製物をいう。結合は、マンノース−６−リン酸との競合に対する感受性によって、さらに特徴付けられる。高度にリン酸化されたリソソームスルファターゼ酵素はまた、タンパク質鎖当たり少なくとも０．２５、好ましくは少なくとも０．５、およびより好ましくは少なくとも０．７５の、ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有するリソソームスルファターゼ酵素をいい得る。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖」とは、リソソームスルファターゼ酵素中のアスパラギン残基に対してＮ結合されており、かつ、二つのマンノース−６−リン酸残基を含む、マンノースを含むオリゴ糖鎖をいう。一般に、ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖は、７個のマンノース残基を有し（すなわち、ビス−リン酸マンノース７（ＢＰＭ７））、これは２個のＧｌｃＮＡｃ残基に連結され、今度はリソソームスルファターゼ酵素中のアスパラギン残基に連結される。
【００７７】
「活性な」、「活性化された」および「高レベルの活性化」とは、タンパク質の活性部位のシステイン残基の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも９５％が、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）へ、翻訳後修飾されたリソソームスルファターゼ酵素の調製物をいう。
【００７８】
「高度にリン酸化された活性な」とは、タンパク質の活性部位のシステイン残基の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも９５％が、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）へ、翻訳後修飾され、かつ、タンパク質鎖当たり少なくとも０．２５、好ましくは少なくとも０．５、およびより好ましくは少なくとも０．７５のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有する、リソソームスルファターゼ酵素の調製物をいう。
【００７９】
用語「生物学的に活性な」とは、全長ポリペプチド（すなわち、酵素）の一つまたはそれより多い生物学的な活性の、少なくとも実質的な量（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、およびより好ましくは少なくとも約９０％）を保持している、ポリペプチドのポリペプチド断片、変異体、改変体または誘導体をいう。リソソームスルファターゼ酵素に関して使用される場合、それの生物学的に活性な断片、変異体、改変体または誘導体は、スルファターゼ活性（すなわち、その標的基質からの硫酸のエステルの切断）の少なくとも実質的な量を保持する。スルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）に関して使用される場合、それの生物学的に活性な断片、変異体、改変体または誘導体は、ホルミルグリシン生成活性（すなわち、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、リソソームスルファターゼ酵素の活性部位のシステイン残基の修飾）の少なくとも実質的な量を保持する。
【００８０】
ポリペプチドに関して使用される場合、用語「純度」または「純粋」とは、特定の方法を用いて検出され得る任意の混入物質との比較において分析される、ポリペプチドの量をいう。本発明の組換え型リソソームスルファターゼ酵素に関して、「純度」は、スルファターゼ酵素調製物を、還元条件もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動分離にかけることと、その後のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅもしくは銀を用いる染色によって、またはＨＰＬＣによるクロマトグラフ分離（例えば、Ｃ４逆相（ＲＰ））によって、もしくは任意の他のクロマトグラフ分離（例えば、サイズ排除（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｃｉｏｎ）（ＳＥＣ）など）によって決定され得る。これらの方法を用いる、本発明の精製された組換え型リソソームスルファターゼ酵素は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９８％または９９％の純度を有する。
【００８１】
用語「前駆体」または「前駆形態」とは、哺乳動物細胞から分泌される組換え型リソソームスルファターゼ酵素の形態（すなわち、シグナル配列は無いが、特定の修飾（例えば、タンパク質の内部の切断、これはリソソームにおいてふつうはおこる）を欠いている）をいう。用語「成熟した」、「成熟した形態」、「プロセシングされた」または「プロセシングされた形態」とは、リソソームにおいてふつうに存在する組換え型リソソームスルファターゼ酵素の形態をいう。本発明の組換え型リソソームスルファターゼ酵素に関して、「前駆体」または「前駆形態」および「成熟した」、「成熟した形態」、「プロセシングされた」または「プロセシングされた形態」の相対的存在度は、スルファターゼ酵素調製物を、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動分離にかけることと、その後のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅもしくは銀を用いる染色によって、またはＨＰＬＣによるクロマトグラフ分離（例えば、Ｃ４逆相（ＲＰ））によって、もしくは任意の他のクロマトグラフ分離（例えば、サイズ排除（ＳＥＣ）など）によって決定され得る。これらの方法を用いる、本発明の精製された組換え型リソソームスルファターゼ酵素は、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％の「前駆体」または「前駆形態」からなる。あるいは、これらの方法を用いる、本発明の精製された組換え型リソソームスルファターゼ酵素は、約２５％未満、好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％未満、およびさらにより好ましくは約５％未満の「成熟した」、「成熟した形態」、「プロセシングされた」または「プロセシングされた形態」からなる。いくつかの実施形態において、「前駆体」または「前駆形態」のみ検出される（すなわち、スルファターゼ酵素調製物は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、単一の検出可能なバンドから本質的になり、またはＨＰＬＣによって分析された場合、単一のピークから本質的になる）。
【００８２】
二つもしくはそれより多いポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の関連において、用語「同一」またはパーセント「同一性」とは、下記の配列比較アルゴリズムの一つを用いてまたは視覚による検査によって測定される場合、最大の一致を求めて比較および並べられるとき、同一である、または同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の具体的に明記されたパーセンテージを有する、二つもしくはそれより多い配列またはサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）をいう。
【００８３】
「リンカー」とは、共有結合で、またはイオン結合、ファンデルワールス結合もしくは水素結合を通じてのいずれかで、二つの異なる分子をつなぐ分子（例えば、５’末端で一つの相補的配列とハイブリダイズし、かつ、３’末端で別の相補的配列とハイブリダイズし、それゆえ二つの非相補的配列をつなぐ核酸分子）をいう。
【００８４】
「低レベルのリン酸化」または「低いリン酸化」とは、線維芽細胞への取込みが１０ｎＭを超える最大半量濃度を有する、またはマンノース−６−リン酸受容体カラムに結合するリソソームスルファターゼ酵素の画分が約２５％未満である、リソソームスルファターゼ酵素の調製物をいう。
【００８５】
対象に適用されるとき、「天然に存在している」とは、その対象が天然において見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得、かつ研究室内のヒトによって故意に修飾されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。
【００８６】
「薬学的組成物」とは、被験体の動物（ヒトおよび哺乳動物を含む）における薬学的使用に適している組成物をいう。薬学的組成物は、治療用のリソソームスルファターゼ酵素の薬理学的有効量を含み、かつ、一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤もまた含む。薬学的組成物は、活性な成分、およびキャリア、希釈剤または賦形剤を構成する不活性な成分、ならびに、任意の二つもしくはそれより多い成分の組み合わせ、錯化または凝集から、あるいは一つもしくはそれより多い成分の分離から、あるいは一つもしくはそれより多い成分の他の型の反応または相互作用から、直接的または間接的に、結果として生じるあらゆる産物を含む組成物を含む。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明のリソソームスルファターゼ酵素と一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤とを混合することによって作製されるあらゆる組成物を含む。
【００８７】
「薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤」とは、（例としてかつ制限のためではなく）リン酸緩衝生理食塩水、デキストロースの５％水溶液、およびエマルジョン（油／水もしくは水／油エマルジョンなど）ならびに種々の型の加湿薬および／またはアジュバントなどの、あらゆる標準的な薬学的キャリア、希釈剤、緩衝剤、および賦形剤をいう。適切な薬学的キャリア、希釈剤または賦形剤および処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載される。好ましい薬学的キャリア、希釈剤または賦形剤は、活性な薬剤の意図される投与の様式に依存する。代表的な投与の様式としては、（例として、かつ制限のためではなく）腸内（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは腹腔内）注入；あるいは局所的、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、または経粘膜的（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与が挙げられる。
【００８８】
「薬学的に受容可能な塩」は、薬学的使用のためにリソソームスルファターゼ酵素に処方され得る塩であり、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含む。
【００８９】
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単位からなるポリマーをいう。ポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）などの天然に存在している核酸ならびに核酸アナログを含む。核酸アナログは、天然に存在しているホスホジエステル結合以外で他のヌクレオチドとの結合に従事している天然に存在していない塩基、ヌクレオチドを含む核酸アナログ、またはホスホジエステル結合以外の結合を介して結合された塩基を含む核酸アナログを含む。したがって、ヌクレオチドアナログとしては、（例として、かつ制限のためではなく）ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、キラル−メチルホスホネート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ぺプチド−核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば，オートメーション化されたＤＮＡシンセサイザーを用いて、合成され得る。用語「核酸」とは、大きなポリヌクレオチドを一般的にいう。用語「オリゴヌクレオチド」とは、概して約５０ヌクレオチドを超えない、短いポリヌクレオチドを一般的にいう。ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表される場合、これは、「Ｕ」が「Ｔ」に取って代わっているＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）もまた含むことが、理解される。
【００９０】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基から構成されるポリマー、関連する天然に存在している構造上の改変体、および（ぺプチド結合によって連結された）それの天然に存在していない合成のアナログ、関連する天然に存在している構造上の改変体、およびそれの天然に存在していない合成のアナログをいう。合成のポリペプチドは、例えば、オートメーション化されたポリペプチドシンセサイザーを用いて、合成され得る。用語「タンパク質」とは、大きなポリペプチドを一般的にいう。用語「ぺプチド」とは、短いポリペプチドを一般的にいう。従来の表記が、ポリペプチド配列を表現するために本明細書で使用され：ポリペプチド配列の左手末端がアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右手末端がカルボキシル末端である。
【００９１】
「プライマー」とは、指定されたポリヌクレオチドの鋳型に特異的にハイブリダイズし、かつ相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始の地点を提供することができる、ポリヌクレオチドをいう。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下）に置かれた場合に起こる。プライマーは、一般に一本鎖であるが、二本鎖であり得る。プライマーは、一般にデオキシリボ核酸であるが、幅広くいろいろな、合成のおよび天然に存在しているプライマーが、多くの適用のために有用である。プライマーは、鋳型に対して相補的であり、合成の開始のための部位として役立つように、鋳型とハイブリダイズするように設計されるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合において、鋳型に対するプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは例えば、色素部分、放射性部分、または蛍光部分を用いて標識され得、そして検出可能部分として使用される。
【００９２】
ポリヌクレオチドに関して使用される場合、「プローブ」とは、別のポリヌクレオチドの指定された配列に対して特異的にハイブリダイズできるポリヌクレオチドをいう。プローブは、標的の相補的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズするが、鋳型の正確な相補的配列を反映する必要はない。そのような場合において、標的へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば、色素部分、放射性部分、または蛍光部分を用いて標識され得、そして検出可能部分として使用される。
【００９３】
「予防」処置は、疾患の徴候を示していない被験体または初期の徴候のみを示す被験体に対し、病状の発病のリスクを低減する目的のために、施される処置である。本発明の化合物は、病状が発病する可能性を減少させるための、または発病した場合、病状の重症度を最小にするための予防処置として与えられ得る。
【００９４】
「組換え型ポリヌクレオチド」とは、天然には一緒に結合されない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅されたまたは組み立てられた組換え型ポリヌクレオチドは、適切なベクター内に含まれ得、そしてそのベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。組換え型ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え型宿主細胞」といわれる。遺伝子は、その後、例えば、「組換え型ポリペプチド」を生産するために、組換え型宿主細胞中で発現される。組換え型ポリヌクレオチドは、なおその上、非コード機能（例えば、プロモーター、複製の起点、リボソーム結合部位など）を供給し得る。
【００９５】
「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」とは、配列が、複合混合物（例えば、全細胞内）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェント条件下で、特定のヌクレオチド配列に対し選択的に、核酸分子が結合すること、二本鎖になること（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、またはハイブリダイズすることをいう。
【００９６】
用語「ストリンジェント条件」とは、プローブが、その標的サブ配列と選択的にハイブリダイズし、かつ、他の配列とはより少ない程度でハイブリダイズする、または全くハイブリダイズしない条件をいう。サザンおよびノザンハイブリダイゼーションなどの、核酸ハイブリダイゼーション実験の関連において、「ストリンジェントハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、かつ、種々の環境パラメーター下において異なる。核酸ハイブリダイゼーションのための広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中に見出される。一般的に、高ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列に対する融解温度（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）標的配列の５０％が、完全にマッチされたプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴｍと等しいように選択される。
【００９７】
サザンまたはノザンブロットにおけるフィルター上での、１００より多い相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのための、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、ハイブリダイゼーションが一晩中行われるとき、４２℃で、ヘパリン１ｍｇを含む５０％ホルマリンである。高ストリンジェント洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌ、７２℃で約１５分間である。ストリンジェント洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃で１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシーの洗浄は、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシーの洗浄によって先行される。例えば１００ヌクレオチドより多い二本鎖に対する中程度のストリンジェンシーの洗浄の例は、１×ＳＳＣ、４５℃で１５分間である。例えば１００ヌクレオチドより多い２本鎖に対する低ストリンジェンシーの洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣ、４０℃で１５分間である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、無関係のプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比よりも２×（またはそれより高い）のシグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００９８】
診断または治療の「被験体」は、ヒト、または哺乳動物もしくは霊長類を含むヒトではない動物である。
【００９９】
２つの核酸またはポリペプチドの関連において、語句「実質的に相同」または「実質的に同一」は、下記の配列比較アルゴリズムの一つを用いてまたは視覚による検査によって測定される場合、最大の一致を求めて比較および並べられるとき、一般的に、少なくとも４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の同一性を有する、二つまたはそれより多い配列もしくはサブ配列をいう。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも長さ約５０残基である配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そして最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施形態において、配列は、比較の生体高分子のいずれかまたは両方の全体の長さにわたって、実質的に同一である。
【０１００】
配列比較のために、一般に、一つの配列が、参照配列としての役目を務め、試験配列はこれと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューターにインプットされ、必要であれば、サブ配列の座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは、その後、指定されたプログラムのパラメーターに基づいて、参照配列と比較して、試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【０１０１】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局地的（ｌｏｃａｌ）相同アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））によって、または視覚による検査によって、行われ得る。
【０１０２】
有用なアルゴリズムの一つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性およびパーセント配列同一性を示すため、プログレッシブ（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）アライメント、ペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）アライメントを用いて、関連する配列の群からマルチプル配列アライメントを生み出す。これはまた、アライメントを生み出すために使用されるクラスタリング関係を示す系図（ｔｒｅｅ）または樹状図（ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０，１９８７のプログレッシブアライメント法の単純化を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３，１９８９によって記載された方法と類似する。このプログラムは、各最長５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を、３００配列まで並べ得る。マルチプルアライメントの手順は、２つの最も類似する配列のペアワイズアライメントから始める（これは２つの並べられた配列のクラスターを生じる）。このクラスターは、その後、次に最も関連する配列または（並べられた配列の）クラスターと並べられる。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列のペアワイズアライメントの単純な拡張によって、並べられる。最終的なアライメントは、一連の、プログレッシブアライメント、ペアワイズアライメントで達成される。このプログラムは、特定の配列、および配列比較領域に対するそれらのアミノ酸またはヌクレオチドの座標を指定することにより、ならびにプログラムのパラメーターを指定することにより実行される。例えば、参照配列は、以下のパラメーター（デフォルトギャップウェイト（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デフォルトギャップ長ウェイト（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）（０．１０）、および荷重されたエンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ））を用いて、配列同一性関連性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）のパーセントを決定するために、他の試験配列と比較され得る。配列のマルチプルアライメントを生み出すために有用である別のアルゴリズムは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０，１９９４）である。
【０１０３】
配列同一性、および配列類似性のパーセントを決定するために適切であるアルゴリズムの他の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手できる。このアルゴリズムは、クエリー（ｑｕｅｒｙ）配列内の、長さＷの短いワード（ｓｈｏｒｔ  ｗｏｒｄｓ）（これは、データベース配列中の同じ長さのワードと並べた場合、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするまたは閾値スコアＴを満たすかのいずれかである）を同定することによって、高スコアである配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近傍のワードスコアの閾値といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。これらの初期（ｉｎｉｔｉａｌ）近傍ワードのヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを発見するために、探索を開始するための種（ｓｅｅｄ）として働く。その後、このワードのヒットは、累積アライメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方の方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対しては、パラメーターＭ（一対のマッチする残基に対するリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）、およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティ（ｐｅｎａｌｔｙ）スコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリング（ｓｃｏｒｉｎｇ）マトリクスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアが、その達成された最大値から量Ｘだけ減少する場合；一つまたはそれより多くの負のスコアの残基アライメントの蓄積によって、累積スコアが、ゼロまたはそれより下に至る場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターである、Ｗ、Ｔ、およびＸはアライメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および、両方の鎖の比較をデフォルトして使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，１９８９を参照のこと）。
【０１０４】
配列同一性のパーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例として、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの測定値は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であって、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じ得る確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、その核酸は参照配列と類似していると考えられる。
【０１０５】
二つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第二の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、二つのペプチドが保存的置換によってのみ異なるとき、ポリペプチドは、第二のポリペプチドに対して、一般に、実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、その二つの分子が、本明細書に記載のようなストリンジェント条件の下、お互いにハイブリダイズすることである。
【０１０６】
「実質的に純粋」または「単離された」は、対象の種が、現在の優勢な種である（すなわち、モル濃度の基準において、組成物中の他のあらゆる個々の高分子の種よりも豊富である）ことを意味し、そして実質的に精製された画分は、対象の種が、存在する全ての高分子の種の少なくとも約５０％（モル濃度の基準において）を構成している組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する高分子の種の約８０％から９０％またはそれより多くが、精製された目的の種であることを意味する。組成物が単一の高分子の種から本質的になる場合、対象の種は、本質的な均質性まで精製される（混入している種は、通常の検出方法によって、組成物中に検出され得ない）。溶媒の種、小分子（＜５００ダルトン）、安定薬（例えばＢＳＡ）、および元素イオン種は、この定義の意図にかなう高分子種とはみなされない。いくつかの実施形態において、本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、実質的に純粋であるか、または単離される。いくつかの実施形態において、本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、それらの合成において使用される高分子出発物質に関して、実質的に純粋であるか、または単離される。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と混合された、実質的に精製または単離された治療用のリソソームスルファターゼ酵素を含む。
【０１０７】
「治療の」処置は、病理学の徴候または症状を示す被験体に、それらの徴候もしくは症状を低減させるまたは除く目的のために、施される処置である。徴候または症状は、生化学的、細胞性、組織学的、機能的、主観的または客観的であり得る。本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、治療の処置としてまたは診断のために与えられ得る。
【０１０８】
「治療指数」とは、最小治療量を超え、かつ受容できない有毒量を下回る用量範囲（量および／またはタイミング）をいう。
【０１０９】
「処置」とは、予防処置または治療処置または診断処置をいう。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、用語「単位投薬形態」とは、ヒトおよび動物被験体に対する単一の投薬として適している物理的に別々な単位をいい、各単位は、一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と共に、所望の効果を生じさせるために十分な量において計算された本発明のリソソームスルファターゼ酵素の所定の
量を含む。本発明の新規の単位投薬形態の詳細は、使用される特定のリソソームスルファターゼ酵素、および達成される効果、および宿主内の各リソソームスルファターゼ酵素に関連する薬力学に依存する。
【０１１１】
（ＩＩ．リソソームスルファターゼ酵素の生産）
一つの局面において、本発明は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の治療上の使用を可能にする量において、そのような酵素を生産する新規な方法を特徴とする。一般に、この方法は、ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）をコードしているｃＤＮＡまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体、および全長リソソームスルファターゼ酵素をコードしているｃＤＮＡまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を用いた、適切な細胞株の形質転換を特徴とする。当業者は、発現構築物でトランスフェクトされた適切な細胞株における、そのようなリソソームスルファターゼ酵素の最適な生産のために、本明細書で明示的に記載されたもの以外の発現構築物を調製し得る。さらに、当業者は、天然に存在する全長酵素と同一または類似の生物学的な活性を有する、天然に存在するＳＵＭＦ１またはリソソームスルファターゼ酵素の生物学的に活性な断片、改変体、変異体もしくは誘導体をコードしているｃＤＮＡの断片を容易に設計し得る。
【０１１２】
（宿主細胞）
組換え型リソソームスルファターゼ酵素を生産するために用いられる宿主細胞は、酵素の治療的な使用を可能にする量において、そのようなリソソームスルファターゼ酵素を生産する能力によって特徴付けられる、エンドソーム酸性化が不足している細胞株である。本発明は、ＣＨＯ−Ｋ１に由来するＥＮＤ３相補群細胞株（Ｇ７１と示される）を提供する。本発明はまた、血清を含まない懸濁培養液における増殖に適合させられたＧ７１細胞株（Ｇ７１Ｓと示される）を提供する。本発明はまた、さらにサブクローニングされたまたは異なる発現プラスミドを含む、Ｇ７１およびＧ７１Ｓ細胞株の誘導体を提供する。
【０１１３】
組換え型タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを含みそして発現する細胞は、本明細書で、遺伝学的に改変された細胞といわれる。組換え型タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを含みそして発現する哺乳動物細胞は、遺伝学的に改変された哺乳動物細胞といわれる。細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの導入は、（例としてかつ制限のためではなく）電気穿孔法、微量注入、微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リン酸カルシウム沈殿、改変されたリン酸カルシウム沈殿、陽イオン脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ）処理、フォトポレーション（ｐｈｏｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、融合（ｆｕｓｉｏｎ）方法論、受容体が媒介する移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）、またはポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）沈殿などの公知のトランスフェクション法による。あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルスベクターを用いた感染によって導入され得る。組換え型タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを発現する細胞（哺乳動物細胞を含む）を生産する方法は、同時係属中の特許出願である、表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．ＴｒｅｃｏおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｈｅａｒｔｌｅｉｎによる）の、米国出願番号０８／３３４，７９７（１９９４年１１月４日出願）；表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｏｒ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．Ｔｒｅｃｏ  および  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｈｅａｒｔｌｅｉｎによる）の、米国出願番号０８／３３４，４５５（１９９４年１１月４日出願）ならびに、表題「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｉｎｔｏ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｒ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．Ｔｒｅｃｏ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．ＨｅａｒｔｌｅｉｎおよびＲｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎによる）の、米国出願番号０８／２３１，４３９（１９９４年４月２０日出願）に記載される。これらの各出願の教示は、その全容において、参照によって、本細書に明示的に援用される。
【０１１４】
好ましい実施形態において、組換え型リソソームスルファターゼ酵素を生産するために使用される宿主細胞は、その酵素の使用を治療的に可能にする量において、そのようなリソソームスルファターゼ酵素を生産するその能力によって特徴付けられる、エンドソーム酸性化が不足している細胞株である。好ましい実施形態において、本発明は、ＣＨＯ−Ｋ１に由来するＥＮＤ３相補群細胞株（Ｇ７１Ｓと示される）、および血清を含まない懸濁培養液における増殖に適合させられたＧ７１細胞株（Ｇ７１Ｓと示される）を提供し、これらは、ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）および組換え型リソソームスルファターゼ酵素を共発現し、したがって、「定義」において明記されたように、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の高い収量を生産することができ、これによって、治療用のリソソームスルファターゼ酵素の大規模生産を可能にする。最も好ましい実施形態において、Ｇ７１もしくはＧ７１Ｓ細胞株、またはそれらの誘導体は、少なくとも約０．５、好ましくは少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０、およびさらにより好ましくは少なくとも約１．２５ピコグラム／細胞／日の量において、組換え型リソソームスルファターゼ酵素を発現および分泌する。
【０１１５】
（ベクターおよび核酸構築物）
組換え型タンパク質（ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）もしくはリソソームスルファターゼ酵素のいずれかまたは両方）を発現するために使用される核酸構築物は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞において染色体外で（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ）（エピゾーム的に（ｅｐｉｓｏｍａｌｌｙ））発現されるものであり得、またはレシピエント細胞のゲノム中に、無作為にもしくは相同組換えを通してあらかじめ選択された標的部位に、組込まれるものであり得る。染色体外で発現される構築物は、組換え型タンパク質をコードしている配列に加えて、その細胞中でのそのタンパク質の発現のために十分である配列、および、必要に応じて、その構築物の複製のための配列を含む。染色体外で発現される構築物は、一般的には、プロモーター、組換え型タンパク質をコードしているＤＮＡおよびポリアデニル化部位を含む。組換え型タンパク質をコードしているＤＮＡは、その発現がプロモーターの制御下にあるような様式で、構築物中に配置される。必要に応じて、この構築物は、一つまたはそれより多い以下のような追加成分を含み得る：スプライス部位、エンハンサー配列、適切なプロモーターの制御下にある選択可能マーカー遺伝子、適切なプロモーターの制御下にある増幅可能マーカー遺伝子、およびマトリックス付着領域（ＭＡＲ）または挿入された領域の発現を高める当該分野で公知の他のエレメント。
【０１１６】
ＤＮＡ構築物が細胞のゲノム中に組み込まれる実施形態において、ＤＮＡ構築物は、組換え型タンパク質をコードしている核酸配列のみを含むことを必要とする。必要に応じて、ＤＮＡ構築物は、プロモーターおよびエンハンサー配列、一つもしくは複数のポリアデニル化部位、一つもしくは複数のスプライス部位、一つもしくは複数の選択可能マーカーをコードする核酸配列、増幅可能マーカーをコードする核酸配列、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）もしくはそれが挿入された領域の発現を高める当該分野で公知の他のエレメント、ならびに／またはゲノム中の選択した部位へのＤＮＡの組込みを標的とするため（ＤＮＡもしくはＤＮＡ配列を標的とするため）、レシピエント細胞中のゲノムＤＮＡに相同であるＤＮＡを含み得る。
【０１１７】
（細胞培養の方法）
組換え型タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを含む哺乳動物細胞は、その細胞の増殖およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適した条件下で培養される。組換え型タンパク質を発現する細胞は、公知の方法および本明細書に記載の方法を用いて同定され得、そして、組換え型タンパク質は、組換え型タンパク質生産の拡大を伴ないまたは伴なわず、公知の方法および本明細書にも記載の方法を用いて単離ならびに精製され得る。同定は、例えば、組換え型タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの存在の指標となる表現型を表す遺伝学的に修飾された哺乳動物細胞のスクリーニング（ＰＣＲスクリーニング、サザンブロット分析によるスクリーニング、または組換え型タンパク質の発現についてのスクリーニングなど）を通して行われ得る。組み入れられた組換え型タンパク質をコードしているＤＮＡを含む細胞の選択は、ＤＮＡ構築物中に選択可能マーカーを含めることと、その後の、その選択可能マーカー遺伝子を発現している細胞のみの生存に適切である条件下で、選択可能マーカー遺伝子を含むトランスフェクトされたまたは感染した細胞を培養することによって達成され得る。導入されたＤＮＡ構築物のさらなる増幅は、適切な条件下で、遺伝学的に修飾された哺乳動物細胞を培養すること（例えば、増幅可能マーカー遺伝子の多数のコピーを含む細胞のみ生き残ることができる薬物の濃度の存在下で、増幅可能マーカー遺伝子を含む遺伝学的に修飾された哺乳動物細胞を培養すること）によって、達成され得る。
【０１１８】
組換え型タンパク質を発現している遺伝学的に修飾された哺乳動物細胞は、本明細書に記載されているように、発現産物の検出によって同定され得る。例えば、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を発現している哺乳動物細胞は、サンドイッチ酵素免疫法によって同定され得る。抗体は、活性な作用物質部分に対し、向けられ得る。
【０１１９】
（リソソームスルファターゼ酵素の改変体）
特定の実施形態において、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の変異体または改変体が調製され得、そしてそれらは高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素が使用され得るいろいろな適用において有用である。ポリペプチドのアミノ酸配列の変異体または改変体は、置換の、挿入のもしくは欠失の変異体または改変体であり得る。欠失変異体または改変体は、機能または免疫抗原性の活性に不可欠ではない、天然のタンパク質の一つまたはそれより多い残基を欠いている。欠失変異体または改変体の一般的な型は、分泌シグナル配列を欠いているもの、またはタンパク質を細胞の特定の部分へ結合させるように指示するシグナル配列を欠いているものである。挿入変異体または改変体は、一般的に、ポリペプチドの末端ではない地点での、物質の付加を含む。これは、免疫反応性エピトープまたは単に単一の残基の挿入を含み得る。末端への付加（これはまた、融合タンパク質と呼ばれる）は、以下で議論される。
【０１２０】
改変体は、上で述べられたような修飾されていないリソソームスルファターゼ酵素と、実質的に相同または実質的に同一であり得る。好ましい改変体は、リソソームスルファターゼ酵素の少なくとも一部の生物学的な活性（例えば、スルファターゼ活性）を保持している、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドの改変体である。他の好ましい改変体としては、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼのスルファターゼ活性の少なくとも一部を保持している、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼポリペプチドの改変体が挙げられる。
【０１２１】
置換変異体または改変体は、一般に、タンパク質内の一つもしくはそれより多い部位で、野生型ポリペプチドのあるアミノ酸を別のものに交換し、そしてポリペプチドの一つもしくはそれより多い特性（例としてかつ制限のためではなく、タンパク質の分解性の切断に対する安定性など）を、他の機能または特性の喪失を伴なわずに調節するために設計され得る。この種の置換は、好ましくは保存的であり、すなわち、アミノ酸は類似した形および電荷のものと取って代わられる。保存的置換は、当該分野で周知であり、そして、例として：アラニンからセリンへの；アルギニンからリジンへの；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの；アスパラギン酸からグルタミン酸への；システインからセリンへの；グルタミンからアスパラギンへの；グルタミン酸からアスパラギン酸への；グリシンからプロリンへの；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの；イソロイシンからロイシンまたはバリンへの；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの；リジンからアルギニンへの；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの；セリンからスレオニンへの；スレオニンからセリンへの；トリプトファンからチロシンへの；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。
【０１２２】
本発明の一つの局面は、リソソームスルファターゼ酵素のＯ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位が変異させられた、グリコシル化部位の変異体または改変体を作製することを意図する。そのような変異体または改変体は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の生物学的な活性、物理的構造および基質結合可能性に関連する、重要な情報をもたらす。特定の局面において、生物学的な活性を保持しているが、増大または減少した基質結合活性を有する、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドの他の変異体または改変体が作製され得ることが意図される。そのようなものとして、活性部位または触媒領域の変異は、変更された基質結合活性を有するタンパク質の変異体または改変体を作製するために、特に意図される。そのような実施形態において、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の配列は、他の関連する酵素の配列と比較され、そして選択された残基は、特に変異させられる。
【０１２３】
有用であり得る例示的な変異としては、例えば、潜在的なグリコシル化アスパラギンの全てまたは一部の置換が挙げられ、潜在的なグリコシル化アスパラギンは、（アミノ酸番号１として、推定上のアミノ末端から成熟したタンパク質のアミノ酸に番号をつけるとき）組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の位置１７８および３９７を含む（図５を参照のこと）。
【０１２４】
基質結合は、リソソームスルファターゼ酵素の活性部位における／活性部位の近くの変異によって変更され得る。そのような変異は例示的であることを考慮に入れ、当業者は、この酵素配列の他の変異が、このタンパク質およびその活性についてのさらなる構造的ならびに機能的情報を提供するために作製され得ることを認識する。
【０１２５】
上に記載されたような、変異体または改変体を構築するために、当業者は周知の標準的技術を使用し得る。特に意図されるのは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、内部欠失、ならびに無作為および点変異誘発である。
【０１２６】
Ｎ末端およびＣ末端欠失は、例えば、ＣまたはＮ末端領域の末端近くの適切な単一の制限酵素認識部位の存在を利用する、欠失変異誘発の形態である。ＤＮＡは、上記部位で切断され、そしてその切断末端は、ＢＡＬ３１、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、およびＳ１ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによって分解される。２つの末端を再結合することは、その制限酵素認識部位の周囲における様々な大きさの欠失を有する、一連のＤＮＡを生産する。そのような変異体から発現されるタンパク質は、当該分野で標準的な技術を用いて、適切な生物学的機能（例えば、酵素の活性）について評価され得、そして本明細書中に記載され得る。二つの適切に配置された制限酵素認識部位を使用し、それによって正確に定義される欠失を作製し、上記のように末端を再連結（ｒｅｌｉｇａｔｅ）させることによる、類似の技術が内部欠失変異体のために使用され得る。
【０１２７】
部分的消化変異体もまた意図される。そのような例において、当業者は、反応時間の長さに依存して数多くの場所でＤＮＡを切断する「フリークエントカッター（ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｃｕｔｔｅｒ）」を使用する。このように、反応条件を変えることにより、さまざまな大きさの一連の変異体を作製することが可能であり、これらは、その後、活性についてスクリーニングされ得る。
【０１２８】
無作為な挿入変異はまた、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉを用いてＤＮＡ配列を切断すること、そして３、６、９、１２個などのアミノ酸をコードするヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を挿入すること、そして末端を再連結することによって行われ得る。一旦、そのような変異が作製されると、その変異体は、野生型タンパク質より示される種々の活性について、スクリーニングされ得る。
【０１２９】
点変異誘発はまた、詳細に、どのアミノ酸残基が、リソソームスルファターゼ酵素の生物学的活性に関連する特定の活性において重要であるかを同定するために使用され得る。このように、当業者は、変更されたコドンおよびミスセンス変異を結果として生じるために、ＤＮＡ鎖中の一塩基変化を生み出すことができる。
【０１３０】
特定のタンパク質のアミノ酸は、等価な、またはさらに改良された第二世代の分子を生み出すために変化させられ得る。そのような変更は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子もしくは受容体上の結合部位などの構造との、相互作用の結合能力の容易に感知できる喪失を伴なわない、タンパク質の特定のアミノ酸の置換を意図する。タンパク質の生物学的機能の活性を定義するのは、そのタンパク質の相互作用の能力および性質であるため、特定のアミノ酸置換が、タンパク質配列およびその基礎をなすＤＮＡコード配列中において生じさせられ得、そして、それにもかかわらず、特定のアミノ酸置換は類似の性質を有するタンパク質を取得させ得る。このように、種々の変化が、以下で論じられるように、それらの生物学的有用性または活性の容易に感知できる喪失を伴なわずに、遺伝子のＤＮＡ配列中に生じさせられ得る。
【０１３１】
そのような変化を生じさせる上で、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。アミノ酸の相対的な疎水性親水性の特性は、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与すること、そして今度は、タンパク質の二次構造が、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などの他の分子と、このタンパク質との相互作用を規定することが理解される。各アミノ酸は、疎水性、および電荷の特性に基づき、疎水性親水性指数が割り当てられている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７（１）：１０５−１３２，１９８２、参照によって本明細書に援用される）。一般的に、アミノ酸は、類似の疎水性親水性指数またはスコアを有する他のアミノ酸により置換され得、そして類似の生物学的活性を有するタンパク質を依然として、結果として生じる（すなわち、生物学的機能上等価であるタンパク質を依然として得る）。
【０１３２】
加えて、同様のアミノ酸の置換は、親水性の基準に基づいて効果的に行われ得る。米国特許第４，５５４，１０１号（参照によって本明細書に援用される）は、タンパク質の最も大きな局所平均親水性は、（隣接アミノ酸の親水性によって左右されるが）タンパク質の生物学的特性と関連があると述べている。このように、アミノ酸は、類似した親水性の値を有する別のものと置換され得、そして生物学的に等価および免疫学的に等価なタンパク質を依然として得る。
【０１３３】
本発明との関連において使用され得る例示的なアミノ酸置換としては、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリンとロイシンとイソロイシンを交換することが挙げられるが、これらに制限されない。タンパク質の二次構造を変更するが、生物学的活性の一部または全てを保持することへの必要性を考慮している、他の置換は当業者に周知である。
【０１３４】
本発明に関連するポリペプチドの調製のために意図される別の種類の改変体は、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）の使用である。模倣物は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＹにおける「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ」，Ｐｅｚｚｕｔｏら．，Ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。ペプチド模倣物の使用の背後にある基本的な理論的根拠は、タンパク質のペプチドバックボーンが、分子の相互作用（抗体および抗原の相互作用など）を促進するように、アミノ酸側鎖を配向するために、主として存在することである。ペプチド模倣物は、天然の分子と類似する分子間相互作用を可能にすることが期待される。上に記載された原理と併せて、これらの原理は、リソソームスルファターゼ酵素の天然の特性の多くを有するが、変更されそしてさらに改良された特徴を有する第二世代分子を設計するために使用され得る。
【０１３５】
（リソソームスルファターゼ酵素の修飾されたグリコシル化）
高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の改変体はまた、親のポリペプチドと比較して修飾されたグリコシル化パターン（例えば、一つもしくはそれより多い炭水化物部分の欠失、および／または天然のポリペプチド中には存在しない一つもしくはそれより多いグリコシル化部位の付加）を有するように生産され得る。
【０１３６】
グリコシル化は、一般的にＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加をいう。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的な付加のための認識配列である。ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生み出す。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位は、一つまたはそれより多いこれらのトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、ポリペプチドに付加され得る。Ｏ結合型グリコシル化は、糖類のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニン（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得るが）に付加することをいう。Ｏ結合型グリコシル化部位は、本来のポリペプチドの配列中へ、一つもしくはそれより多いセリンまたはスレオニン残基を挿入すること、あるいは一つもしくはそれより多いセリンまたはスレオニン残基に置換することによって付加され得る。
【０１３７】
（ドメインスイッチング）
リソソームスルファターゼ酵素タンパク質の種々の部分は、相当量の配列相同性を有する。機能を変更し得る変異が、リソソームスルファターゼ酵素ポリペプチド中で同定され得る。これらの研究は、少なくとも２つの理由で、潜在的に重要である。第一に、これらの研究は、この遺伝子のさらに他の相同体、対立遺伝子改変体、および変異体が、関連する種（ラット、ウサギ、サル、テナガザル、チンパンジー、猿人類、ヒヒ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジおよびネコなど）において存在し得るという、もっともな期待を提供する。これらの相同体、改変体、および変異体の単離に際し、そして他の分析と併せて、特定の活性なドメインまたは機能的ドメインが同定され得る。第二に、これは、上に記載されたような分子のさらなる変異分析についての出発点を提供する。この情報が引き出され（ｅｘｐｌｏｉｔ）得る一つの方法は、「ドメインスイッチング」である。
【０１３８】
ドメインスイッチングは、異なっているが関連するポリペプチドを使用した組換え型分子の作製を含む。例えば、リソソームスルファターゼ酵素（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ）の配列と、別の供給源由来の類似のリソソームスルファターゼ酵素の配列ならびにこれらのポリペプチドの変異体および対立遺伝子改変体とを比較することによって、これらの分子の機能的に重要な領域について予想し得る。その後、酵素機能に対するこれらの領域の臨界（ｃｒｉｔｉｃａｌｉｔｙ）、およびリソソーム蓄積症における効果を決定するための作業において、これらの分子の関連ドメインを変更することが可能である。これらの分子は、これらの「キメラ」が、（もしかすると同様のまたはさらに高められた機能を提供するかもしれないが）天然の分子と区別され得る点において、さらなる価値を有し得る。
【０１３９】
現在同定されている多くのリソソームスルファターゼ酵素に基づいた、変異および二次構造におけるそれらの予測される影響のさらなる分析は、この理解の一助となる。リソソームスルファターゼ酵素間でドメインを変更する変異体は、それらの分子間の構造的／機能的関係についての有用な情報およびそれらと相互作用するポリペプチドについての有用な情報を提供することが予想される。
（融合タンパク質）
上に記載された変異に加えて、本発明は、特殊な種類の挿入改変体（融合タンパク質として公知である）の作製をさらに意図する。この分子は一般的に、Ｎ末端またはＣ末端において、第二のポリペプチドの全てもしくは部分が連結された、天然分子の全ての部分または実質的な部分を有する。例えば、融合は、一般に、異種の宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能とするために、他の種由来のリーダー配列を使用する。別の有用な融合としては、融合タンパク質の精製を容易にするための、免疫学的に活性なドメイン（抗体のエピトープなど）の付加が挙げられる。融合接合部におけるまたは融合接合部の近くでの切断部位の含有は、精製後の、外来のポリペプチドの除去を容易にする。他の有用な融合としては、酵素由来の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞性のターゲッティングシグナルまたは膜貫通領域などの、機能的ドメインの連結を含む。
【０１４０】
本発明において使用され得る、種々の商業的に入手可能な融合タンパク質発現システムがある。特に有用なシステムとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、マルトース結合タンパク質システム（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）、ＦＬＡＧシステム（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ），６×Ｈｉｓシステム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）が挙げられるが、これらに制限されない。これらのシステムは、ほんの少数の追加アミノ酸しか有さない組換え型ポリペプチドを生産することが可能であり、少数の追加アミノ酸は、組換え型ポリペプチドの抗原性能力に影響する可能性が低い。例えば、ＦＬＡＧシステムおよび６×Ｈｉｓシステムの両者は、短い配列しか付加せず、それらの両者は、抗原性が乏しいことが公知であり、かつ本来のコンフォメーションへのポリペプチドのフォールディングに悪影響を与えない。有用であると予想される別のＮ末端融合は、タンパク質またはペプチドのＮ末端領域でのＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。そのような融合は、タンパク質の発現または活性における、有益な上昇を引き起こし得る。
【０１４１】
特に有用な融合構築物は、リソソームスルファターゼ酵素融合構築物の免疫抗原性を高めるため、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドまたはそれの断片がハプテンと融合されるものであり得る。これは、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の検出を可能にする、このタンパク質（高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素）に対する抗体の生産において有用であり得る。他の実施形態において、融合構築物は、特定の部位または細胞への、リソソームスルファターゼ酵素に関連する組成物のターゲッティングを高めるように作製され得る。
【０１４２】
他の融合構築物は、所望の特性（例えば、リソソームスルファターゼ酵素を特定の器官、組織、または細胞の種類にターゲッティングさせるためのモチーフ）を有する異種のぺプチドを含む。好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素に融合された骨組織ターゲッティングぺプチド（例えば、６つのアスパラギン酸残基（６×Ａｓｐまたは６Ｄ））を含む融合構築物は、酵素を骨組織における特定の部位にターゲッティングさせ得る。
【０１４３】
所望の特性を有する異種ポリペプチド（例えば、血清半減期を延長するためのＩｇ定常領域またはターゲッティングのための抗体もしくはそれらの断片）を含む他の融合構築物もまた意図される。他の融合システムは、所望のポリペプチドから融合パートナーを切除することが望ましいポリペプチドハイブリッドを生産する。一つの実施形態において、融合パートナーは、プロテアーゼのための特定の認識配列を含むペプチド配列によって、組換え型の高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドに連結される。適切な配列の例は、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＸａ因子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）によって認識されるものである。
【０１４４】
（誘導体）
上で述べられたように、誘導体とは、（例としてかつ制限のためではなく）ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種または種々の酵素を用いて）、ペグ化などの共有結合のポリマーの付着（ポリエチレングリコールを用いた誘導体化）および、オルニチンなどの、アミノ酸の化学的合成による挿入または置換といった技術によって、化学的に修飾されたポリペプチドをいう。リソソームスルファターゼ酵素の誘導体はまた、治療薬として有用であり、かつ本発明の方法によって生産され得る。
【０１４５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、インビボでのより長い半減期を提供するために、本発明の方法によって生産されるリソソームスルファターゼ酵素に付加され得る。ＰＥＧ基は、任意の使いやすい分子量であってよく、かつ、直鎖であり得るかまたは分岐され得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤａ」）〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は、一般的に、本発明のリソソームスルファターゼ酵素に、上記タンパク質部分の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）へのＰＥＧ部分における反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）を介する、アシル化または還元的アルキル化によって付加される。目的のポリペプチドへのＰＥＧ部分の付加は、当該分野において周知の技術を使用して実施され得る。例えば、国際公開第９６／１１９５３号、および米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと。
【０１４６】
リソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドとＰＥＧの連結反応は、通常、水相で生じ、かつ逆相分析的ＨＰＬＣにより、容易にモニターされ得る。ＰＥＧ化されたペプチドは、分取（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣにより容易に精製され得、そして分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびレーザー脱離質量分析法により特徴付けられ得る。
【０１４７】
（標識）
いくつかの実施形態において、治療用のリソソームスルファターゼ酵素は、その検出を容易にするために標識される。「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、本発明における使用に適切である標識としては、放射性標識（例えば、３２Ｐ）、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）（例えば、フルオレセイン）、高電子密度試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに、例えば、放射性標識をハプテンもしくはペプチドに組み入れることによって検出可能にされ得るタンパク質または、ハプテンもしくはぺプチドと特異的に反応性である抗体を検出するために用いられ得るタンパク質が挙げられるが、これらに制限されない。
【０１４８】
本発明における使用に適している標識の例としては、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他のもの）、ならびに金コロイド、色ガラス（ｃｏｌｏｒｅｄ  ｇｌａｓｓ）もしくはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色定量の標識が挙げられるが、これらに制限されない。
【０１４９】
標識は、当該分野において周知である方法に従い、リソソームスルファターゼ酵素の所望の成分に直接的または間接的に連結され得る。好ましくは、一つの実施形態において標識は、本発明にしたがう活性な作用物質の結合体化のため、イソシアネート試薬を使用して、リソソームスルファターゼ酵素に共有結合される。本発明の一つの局面において、本発明の二官能性のイソシアネート試薬は、リソソームスルファターゼ酵素に標識を結合体化するために使用され得、そこに付加される活性な作用物質を伴なわずに、標識リソソームスルファターゼ酵素結合体を形成する。標識リソソームスルファターゼ酵素結合体は、本発明にしたがう、標識された結合体の合成のための中間体として使用され得、またはリソソームスルファターゼ酵素結合体を検出するために使用され得る。上で示されるように、要求される感度、リソソームスルファターゼ酵素の所望の成分との結合体化の容易さ、安定性の要求、入手可能な器具、および処分への規定に依存する標識の選択をともなって、幅広い種類の標識が使用される。非放射性の標識は、間接的手段によりしばしば付加される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、リソソームスルファターゼ酵素に共有結合され得る。その後、リガンドは別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合し、そしてそれは、そもそも検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物、あるいは化学発光化合物などのシグナルシステムに対し共有結合されるかのいずれかである。
【０１５０】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素はまた、例えば、酵素またはフルオロフォアとの結合体化によって、シグナルを発生させる化合物に直接結合され得る。標識としての使用に適している酵素としては、ヒドロラーゼ（特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ）、またはオキシドターゼ（特にペルオキシダーゼ）が挙げられるが、これらに制限されない。標識としての使用に適している蛍光化合物（すなわちフルオロフォア）としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられるが、これらに制限されない。適切なフルオロフォアのさらなる例としては、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミン、Ｂスルホニル  クロリド  エリスロセイン（ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｓｃｅｉｎ）、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム（ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ））、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ニコチンアミド  アデニン  ジヌクレオチド、フラビン  アデニン  ジヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに制限されない。標識としての使用に適切である化学発光化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅ）（例えば、ルミノール）などが挙げられるが、これらに制限されない。本発明の方法において使用され得る種々の標識システムまたはシグナルを生み出すシステムの概観のためには、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【０１５１】
標識を検出するための手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性であるとき、検出のための手段としては、シンチレーションカウンターまたは写真用フィルム（オートラジオグラフィーなど）が挙げられる。標識が蛍光標識であるときは、光の適切な波長で蛍光色素を励起すること、および結果として生じた蛍光を検出することによって、検出され得る。蛍光は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）または増倍型光電管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）などの電子検出器の使用によって、視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、その酵素に対する適切な基質を提供すること、および結果として生じた反応産物を検出することによって、検出され得る。比色定量の標識または化学発光標識は、標識に関連する色を観察することによって、容易に検出され得る。本発明の方法における使用に適した他の標識および検出システムは、当業者にとって、容易に明白である。そのような標識された調節因子およびリガンドは、疾患または健康状態の診断において使用され得る。
【０１５２】
好ましい実施形態において、方法は、エンドソーム輸送における欠損を有する細胞株から、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を生産する工程を含む。特に好ましい実施形態において、方法は、ＣＨＯ細胞株Ｇ７１、またはそれの誘導体から、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を生産する工程を含む。リソソームスルファターゼ酵素（例としてかつ制限のためではなくＧＡＬＮＳなど）の生産は；（ａ）組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素（例えばＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））、および組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を共発現するＧ７１細胞株またはＧ７１誘導体の細胞株を開発する工程；（ｂ）ヒトリソソームスルファターゼ酵素およびＳＵＭＦ１を共発現する細胞株を培養する工程；および（ｃ）リソソームスルファターゼ酵素の生産のためのバイオリアクターまで、ヒトリソソームスルファターゼ酵素およびＳＵＭＦ１を共発現する細胞株をスケールアップ（ｓｃａｌｅ  ｕｐ）する工程を含む。好ましい実施形態において、ヒトリソソームスルファターゼ酵素（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））のｃＤＮＡおよびヒトＳＵＭＦ１のｃＤＮＡは、基本的には、本明細書において以下に記載されるように、哺乳動物の発現ベクター中にサブクローニングされる。
【０１５３】
細胞株の開発のために、Ｇ７１またはＧ７１Ｓ（血清を含まない懸濁培養液における増殖に適合させられたＧ７１クローン）を、ヒトＧＡＬＮＳの哺乳動物発現ベクター、ヒトＳＵＭＦ１の哺乳動物発現ベクターおよび選択可能マーカー遺伝子で共トランスフェクトし、そして、安定な形質転換体を選択した。安定なトランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）のサブクローニングの第一ラウンドの後、細胞株を、蛍光の基質を用いて選択し、そして具体的に示した。Ｇ７１またはＧ７１Ｓ細胞株を、マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）を有するスピナー（ｓｐｉｎｎｅｒ）または懸濁培養液のそれぞれにおける細胞特異的生産性（産物のｐｇ／細胞）について分析した。ヒトＧＡＬＮＳの最もよい生産者を同定し、そして前臨床物質の生産のためのバイオリアクターまで、スケールアップした。
【０１５４】
別の実施形態において、本発明は、天然の基質を分解する、組換え型ヒトリソソーム酵素の活性を測定するための細胞ベースのアッセイを提供する。方法は、（ａ）リソソーム酵素に対する天然の基質が蓄積する条件下で、リソソーム酵素が不足している、単離されたヒト細胞を培養すること；（ｂ）細胞をリソソーム酵素と接触させること；（ｃ）細胞を溶解すること；（ｄ）細胞溶解産物に、（ｉ）天然の基質に対し特異的であり、かつ（ｉｉ）天然の基質から低分子オリゴ糖を切断する酵素を添加すること；（ｅ）検出可能部分で低分子オリゴ糖を標識すること；（ｆ）標識された低分子オリゴ糖を必要に応じて分離すること；（ｇ）標識された低分子オリゴ糖を検出すること；ならびに（ｈ）（ｉ）リソソーム酵素と接触させられた細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量と（ｉｉ）リソソーム酵素と接触させられていない細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量とを比較することによって、天然の基質を分解するリソソーム酵素の活性を決定することを含み、ここで、（ｈ）（ｉｉ）と比較したときの（ｈ）（ｉ）における減少は、天然の基質を分解するリソソーム酵素の活性を示す。一つの実施形態において、低分子オリゴ糖は、単糖類、二糖類、または三糖類である。関連する実施形態において、低分子オリゴ糖は、二糖類である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）である。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素はβ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）である。
【０１５６】
細胞ベースのアッセイにおいて用いられ得る適切なヒト細胞としては、試験されるリソソーム酵素が不足し、その結果として、リソソーム酵素に対する天然の基質が蓄積し得る、あらゆるヒト細胞が挙げられる。例えば、活性における完全な（１００％）または部分的な欠乏（例えば、活性における３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれより大きい減少）を天然で示す細胞が用いられ得る。減少させられた活性を有する変異体酵素を発現している細胞、またはリソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖体症）に罹患した患者由来の細胞が用いられ得る。例えば、変異を、コードしている遺伝子またはそれのプロモーターもしくは他の調節領域に導入することにより、リソソーム酵素活性をノックアウトまたは低減するために組換えで変更された細胞が使用され得る。リソソーム酵素活性を低減するために処理された細胞、例えば、酵素発現を低減するためにアンチセンスまたはＲＮＡｉを用いて処理された細胞が使用され得る。
【０１５７】
炭水化物から低分子オリゴ糖を切断（消化）し、かつリソソーム酵素の天然の基質に「特異的」である（すなわち、主に消化する）適切な酵素は、当業者によって選択され得る。例えば、ＧＡＬＮＳまたはＧＬＢ１（ケラタン硫酸を分解する酵素）の活性の検出のため、工程（ｄ）の酵素は、ケラタナーゼＩＩまたはケラタン硫酸に主として作用するあらゆる酵素であり得る。別の実施例として、ＩＤＵ、ＡＲＳＢ、ＩＤＳまたはＧＵＳＢ（デルマタン硫酸を分解する酵素）の検出のため、工程（ｄ）の酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはデルマタン硫酸に主として作用するあらゆる酵素であり得る。別の実施例として、ＩＤＵ、ＩＤＳ、ＳＧＨＳ、Ｇ６ＳまたはＧＵＳＢ（硫酸ヘパリンを分解する酵素）の検出のため、工程（ｄ）の酵素は、へパラナーゼＩまたはへパラナーゼＩＩ、またはそれらの両方であり得る。なお別の実施例として、ＧＡＡ（グリコゲンを分解する酵素）の検出のため、工程（ｄ）の酵素は、α−アミラーゼまたはグリコゲンに主として作用するあらゆる酵素であり得る。
【０１５８】
この細胞ベースの方法は、リソソーム酵素活性の検出において、高い感度を可能にする。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素の濃度が、約１０ｎＭ、または約５ｎＭ、または約１ｎＭ、または約０．７５ｎＭ、または約０．５ｎＭ、または約０．２５ｎＭ、または約０．１ｎＭ、または約０．０５ｎＭ、または約０．０１ｎＭ、または約０．００５ｎＭ、または約１ｐＭ、または約０．５ｐＭ程度の低さである場合、リソソーム酵素の活性は検出可能である。
【０１５９】
（ＩＩＩ．リソソームスルファターゼ酵素の精製）
組換え型ヒトＧＡＬＮＳを含むバイオリアクターの物質は、０．２μｍフィルターで滅菌濾過され、そして４℃で保存された。バイオリアクターの物質は、キャプチャーカラムに直接充填されたか、またはキャプチャーカラムに充填する前に限外濾過によって１０〜２０倍に濃縮されたかのいずれかである。バイオリアクターの物質または濃縮されたバイオリアクターの物質は、ｐＨ４．５にｐＨ調節され、そしてその後、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填され、２０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５および２０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて連続して洗浄され、そして２０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて溶出された。Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出液は、その後、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐに充填され、２０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０および２０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を用いて連続して洗浄され、そして２０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０〜３５０ｍＭ勾配のＮａＣｌ、ｐＨ５．５を用いて溶出された。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ溶出液は、１０ｍＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．００５％のＴｗｅｅｎ−８０、ｐＨ５．５中に処方された。
【０１６０】
あるいは、組換え型ヒトＧＡＬＮＳを含むバイオリアクターの物質は、キャプチャーカラムに充填する前に限外濾過によって、２０倍に濃縮された。濃縮されたバイオリアクターの物質は、ｐＨ４．５にｐＨ調節され、濾過され、そしてその後、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムに充填され、１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５および１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いて連続して洗浄され、１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いて溶出された。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラム溶出液は、その後、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に適合させられ、そしてＺｎキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムに充填され、１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０を用いて洗浄され、そして１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭのＮａＣｌ、９０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０を用いて溶出された。ＺｎキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラム溶出液は、低ｐＨウイルス不活性化のためにｐＨ３．５に調節され、１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に適合させられ、そしてその後、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムに充填され、１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いて洗浄され、そして１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、０．７ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いて溶出された。ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ溶出液は、２０ｍＭの酢酸塩、１ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５において限外濾過および透析濾過され、そしてその後、２０ｍＭの酢酸塩、１ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５中に処方された。
【０１６１】
組換え型ヒトＧＡＬＮＳの精製は、以下に詳細に記載され、そして、上記のプロトコルから変更された手順に従う、組換え型ヒトＧＡＬＮＳの精製は、以下に詳細に記載される。
【０１６２】
組換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素は、実施例ＩＩＩに記載されたようにＧ７１Ｓ細胞において発現され、そして実施例Ｖに記載されたように精製された。本発明の精製された組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、他の記録されたＧＡＬＮＳの調製物と比較され得る。Ｍａｓｕｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０：９６５−９７０，１９９１は、ヒトの胎盤由来のＧＡＬＮＳの精製および特徴付けを記載した。精製された酵素は、１２０ｋＤａの分子質量を有することが見出されており、これは、４０ｋＤａおよび１５ｋＤａのポリペプチドから成り、これらのうちの後者は、糖タンパク質であることが示された。したがって、ＭａｓｕｅらのＧＡＬＮＳ酵素は、図５において描写される、プロセシングされた形態に相当すると思われる。Ｂｉｅｌｉｃｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７９：５１５−５２０，１９９１は、ヒトの肝臓由来のＧＡＬＮＳの精製および特徴付けを記載した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される場合、酵素は、非還元条件下においては、７０ｋＤａの分子質量を有し、そして還元条件下においては、５７ｋＤａ、３９ｋＤａおよび１９ｋＤａの分子質量を有した。Ｂｉｅｌｉｃｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３１１：３３３−３３９，１９９５は、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来の組換え型ヒトＧＡＬＮＳの精製および特徴付けを記載した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、精製された酵素は、非還元条件下においては、５８〜６０ｋＤａの分子質量を有すること、ならびに還元条件下においては、５５〜５７ｋＤａ、３９ｋＤａおよび３８ｋＤａの分子質量を有することが見出された。したがって、ＢｉｅｌｉｃｋｉらのＧＡＬＮＳ酵素は、酵素のプロセシング前の（前駆体の）形態、および図５において描写される、プロセシングされた形態の混合物に相当すると思われる。対照的に、本発明の組換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素は、ほとんど完全に、酵素の前駆形態から成り（図９を参照のこと）、または主に（すなわち、少なくとも約８５％は）、酵素の前駆形態から成る（図１０を参照のこと）。
【０１６３】
（ＩＶ．リソソームスルファターゼ酵素およびリソソーム蓄積症）
リソソームスルファターゼ酵素は、全長の酵素、またはその酵素の治療上の活性もしくは生物学的な活性（例えば、スルファターゼ活性）の少なくとも実質的な量を保持する（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、およびより好ましくは少なくとも約９０％）、実質的に全てを保持する、または全てを保持する、全長の酵素のあらゆる断片、変異体、改変体もしくは誘導体である。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、発現も生産もされない場合、または発現もしくは生産が実質的に低減する場合、疾患（リソソーム蓄積症が挙げられるが、これに制限されない）を引き起こすものである。いくつかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、発現も生産もされない場合、または発現もしくは生産が実質的に低減する場合、疾患を引き起こさないかもしれないが、リソソームスルファターゼ酵素の欠乏または発現もしくは生産の低減が疾患（リソソーム蓄積症が挙げられるが、これに制限されない）に関連付けられるものである。好ましくは、リソソームスルファターゼ酵素は、ヒトに由来し、またはヒトから得られる。
【０１６５】
好ましくは、リソソーム蓄積症の処置において、リソソームスルファターゼ酵素は、細胞中で見出される酵素であり、発現も生産もされない、または発現もしくは生産が実質的に低減する場合、リソソーム蓄積症を引き起こす酵素である。あるいは、リソソーム蓄積症の処置において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠乏または発現もしくは生産の実質的な低減が、それ自体は疾患を引き起こさないかもしれないが、その欠乏または発現もしくは生産の実質的な低減が、疾患に関連付けられる酵素である。好ましくは、リソソームスルファターゼ酵素は、ヒトに由来し、またはヒトから得られる。
【０１６６】
好ましくは、酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００４７８（アイソフォームａ）、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０７８８９７（アイソフォームｂ）および他の改変体）、アリールスルファターゼＢ／Ｎ−アセチルグルコサミン４−スルファターゼ（ＡＲＳＢ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ１５８４８）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００１９３（アイソフォームａ）、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００６１１４（アイソフォームｂ））、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００１９０）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２０６７）ならびにガラクトース６−スルファターゼ／Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００５０３）などのリソソームスルファターゼ酵素である。リソソーム蓄積症およびそれらにおいて不足しているリソソームスルファターゼ酵素（これらは、治療剤として有用である）の表が、次に続く。
【０１６７】
【数１】
0005687069.tif 000002
好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、エンドソームの酸性化に欠損がある細胞株によって生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素である。より好ましい実施形態において、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、「定義」の中で具体的に明記されたように、活性であり、かつリン酸化されたオリゴ糖の高いレベルを有する。最も好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【０１６８】
したがって、本発明の方法を用いて処置または予防され得るリソソーム蓄積症としては、異染性白質萎縮症またはＭＬＤ、マロトー−ラミー症候群またはＭＰＳ  ＶＩ、ハンター症候群またはＭＰＳ  ＩＩ、サンフィリポＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＩＩａ、サンフィリポＤ症候群またはＭＰＳ  ＩＩＩｄ、およびモルキオＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａが挙げられるが、これらに制限されない。特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠乏がモルキオＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａを引き起こすようなものである。別の特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠乏が多発性スルファターゼ欠損症またはＭＳＤなどのヒトリソソーム蓄積症と関連付けられるようなものである。
【０１６９】
したがって、上記の表によれば、各疾患に対して、リソソームスルファターゼ酵素は、その疾患において不足している特定の活性なリソソームスルファターゼ酵素を好ましくは含む。例えば、ＭＰＳ  ＩＩを含む方法にとって、好ましい酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＡを含む方法にとって、好ましい酵素は、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＤを含む方法にとって、好ましい酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＶＡを含む方法にとって、好ましい酵素は、ガラクトース６−スルファターゼ／Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼである。ＭＰＳＶＩを含む方法にとって、好ましい酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼである。異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）を含む方法にとって、好ましい酵素は、アリールスルファターゼＡである。多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）を含む方法にとって、酵素は、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ／Ｎ−アセチルグルコサミン４−スルファターゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼまたはガラクトース６−スルファターゼ／Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼであり得、そして好ましい酵素は、ガラクトース６−スルファターゼ／Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼである。
【０１７０】
（Ｖ．ムコ多糖体症ＩＶＡ型（モルキオ症候群、ＭＰＳ  ＩＶＡ））
ムコ多糖体症ＩＶＡ型（モルキオ症候群、ＭＰＳ  ＩＶａ）は、ムコ多糖類蓄積症の群に属する、遺伝性の常染色体性劣性疾患である。モルキオ症候群は、２種のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）およびコンドロイチン−６−硫酸（Ｃ６Ｓ）の分解のために必要とされる、リソソーム酵素の欠乏によって引き起こされる。具体的には、ＭＰＳ  ＩＶａは、酵素Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の欠乏および尿におけるＫＳの排出によって特徴付けられる。ＧＡＬＮＳ欠乏は、硝子軟骨（骨格組織の主要な成分）における、異常に多い量のムコ多糖類の蓄積を結果として生じる。全ての患者は、全身性の骨格の形成異常を有する。他の症状は、重症度において患者の間で様々であり、そして、他の症状としては、とりわけ、聴覚障害、白内障、脊椎不安定性、心臓の弁の疾患および呼吸性の問題が挙げられ得る。
【０１７１】
ＧＡＬＮＳは、ＫＳのガラクトース−６−硫酸の硫酸エステル結合を加水分解し、ならびにＣ６ＳのＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸の硫酸エステル結合を加水分解する。ヒトＧＡＬＮＳは、潜在的な、アスパラギンに連結されるたった２個のグリコシル化部位を有する、５５〜６０ｋＤａの前駆体タンパク質として発現される。マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）は、ＧＡＬＮＳ分子上に存在するオリゴ糖の一部である。Ｍ６Ｐは、リソソーム細胞表面における受容体によって認識され、よって必然的に、ＧＡＬＮＳの効率的な取込みにとって必須である。
【０１７２】
全てのスルファターゼと同様に、ＧＡＬＮＳは、活性を得るために、スルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）遺伝子によってコードされる、ホルミルグリシン活性化酵素（ｆｏｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）（ＦＧＥ）によって、プロセシングされることを必要とする。この活性化の工程（Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、活性部位のシステイン残基の翻訳後修飾を含む）のために、組換え型スルファターゼの過剰な発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、低い比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有するスルファターゼ酵素（すなわち、活性化されたスルファターゼ酵素および活性化されていないスルファターゼ酵素の混合物）、および低い生産力価（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｉｔｅｒ）を有するスルファターゼ酵素（すなわち、活性化されていないスルファターゼの分解および／または活性化されていないスルファターゼが分泌されないこと）の両方の生産を導き得る。
【０１７３】
本発明の目的は、モルキオ症候群および、例えば多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）などの他の疾患（これらは、酵素Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼの欠乏によって引き起こされる、または関連付けられる）の処置に有用である、高度にリン酸化された活性なヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ酵素を提供することである。そのような高度にリン酸化された活性なヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ酵素は、ＫＳおよびＣ６Ｓが蓄積している組織に局在（ｌｏｃａｌｉｚｅ）する能力、効率的な取込みのために十分なＭ６Ｐレベル、酵素活性のために十分に高いＦＧｌｙのパーセンテージ、ならびに比較的高い生産レベルを有する。
【０１７４】
本明細書に記載される、本発明の方法は、他のリソソームスルファターゼ酵素（例えば、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ／Ｎ−アセチルグルコサミン４−スルファターゼ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）およびＮ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ））の欠乏によって引き起されるまたは特徴付けられるリソソーム蓄積症の処置に有用な、他のリソソームスルファターゼ酵素の生産に適用できることが、理解されるべきである。
【０１７５】
（ＶＩ．薬学的組成物および投与）
本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、多様な経路によって投与され得る。経口の調製物において、リソソームスルファターゼ酵素は、単独でまたは錠剤、散剤、顆粒剤もしくはカプセル剤を作製するために適した添加物との組み合わせにおいて使用され得、それは例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはポテトスターチなどの従来の添加物との組み合わせ；結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤との組み合わせ；コーンスターチ、ポテトスターチまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤との組み合わせ；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤との組み合わせ；ならびに、所望の場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤（ｍｏｉｓｔｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、保存薬、および矯味矯臭薬との組み合わせである。
【０１７６】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、所望の場合に従来の添加物（可溶化剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、懸濁剤、乳化剤、安定薬、および保存薬など）を有する、水性溶媒または非水性溶媒（植物性油または他の類似する油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸もしくはプロピレングリコールのエステルなど）の中で、それらを溶解、懸濁または乳化することにより、注射のための調製物中に処方され得る。
【０１７７】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、吸入によって投与されるエアロゾル処方物において利用され得る。本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの、加圧された許容可能な噴霧剤中に処方され得る。
【０１７８】
さらに、本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、乳化基剤または水溶性の基剤などのいろいろな基剤と混合することにより、坐剤にされ得る。本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、坐剤によって直腸投与され得る。坐薬は、ココアバター、カーボワックス、およびポリエチレングリコールなどのビヒクルを含み得、これらは、体温で融解するが室温で凝固される。
【０１７９】
経口投与または直腸投与のための、本発明のリソソームスルファターゼ酵素の単位投薬形態（シロップ、エリキシル剤、および懸濁剤など）が提供され得、ここで、各投薬単位（例えば、茶さじ一杯分、テーブルスプーン一杯分、錠剤または坐剤）は、活性な作用物質を含むリソソームスルファターゼ酵素の所定の量を含む。同様に、注射または静脈内投与のための単位投薬形態は、滅菌水、ノーマルセーラインまたは別の薬学的に受容可能なキャリアにおける溶液としてのリソソームスルファターゼ酵素を含み得る。
【０１８０】
実用的な使用において、本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、従来の薬学的合成技術にしたがって、活性な成分として、密接な混合物中において、一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わされ得る。キャリア、希釈剤または賦形剤は、投与（例えば、経口または非経口（静脈内を含む））のために所望される調製物の好ましい形態に依存して、広範にわたる多様な形態をとり得る。経口の投薬形態のためのリソソームスルファターゼ酵素組成物の調製において、任意の通例の薬学的媒体が使用され得、例えば、経口の液体調製物の場合は、水、グリコール、油、アルコール、矯味矯臭薬、保存薬、着色剤など、例えば、経口の固体調製物（例えば、散剤、硬いカプセル剤および柔らかいカプセル剤、ならびに錠剤）の場合は、懸濁剤、エリキシル剤、および溶液；またはデンプン、糖、微晶質のセルロース、希釈剤、造粒剤、滑剤、結合剤、崩壊剤などのキャリア（固体の経口調製物は液体の調製物よりも好ましい）などである。
【０１８１】
投与の経皮性経路に関して、薬物の経皮性投与のための方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｇｅｎｎａｒｏら，Ｅｄｓ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９８５）において開示される。皮膚（ｄｅｒｍａｌ）または皮膚（ｓｋｉｎ）のパッチ（ｐａｔｃｈ）は、本発明のリソソームスルファターゼ酵素の経皮性送達のための好ましい手段である。パッチは、好ましくは、リソソームスルファターゼ酵素の吸収を増進するため、ＤＭＳＯなどの吸収のエンハンサーを提供する。経皮性薬物送達のための他の方法は、米国特許第５，９６２，０１２号、同第６，２６１，５９５号、および同第６，２６１，５９５号において開示され、これらのそれぞれは、その全容が参照によって援用される。
【０１８２】
薬学的に受容可能な賦形剤（ビヒクル、アジュバント、キャリアまたは希釈剤など）は、商業的に入手可能である。さらに、薬学的に受容可能な補助物質（ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤、安定薬、加湿薬など）もまた、商業的に入手可能である。
【０１８３】
あらゆる所定の場合において、最も適切な経路は、一部は、処置される病状の性質および重症度ならびに活性成分の性質に依存するが、これらの局面のそれぞれにおいて、リソソームスルファターゼ酵素組成物は、経口投与、直腸投与、局所的投与、非経口投与（皮下、筋肉内、および静脈内を含む）、肺投与（経鼻または口腔（ｂｕｃｃａｌ）吸入）、または経鼻投与に適した組成物を含むが、これらに制限されない。投与の例示的な経路は、経口、および静脈内経路である。リソソームスルファターゼ酵素組成物は、便利よく、単位投薬形態において存在し得、かつ、調剤業の分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。
【０１８４】
投与の容易さのため、錠剤およびカプセル剤は最も都合のよい経口投薬単位形態の典型であり、この場合、固体の薬学的キャリアが明らかに使用される。所望の場合、錠剤は、標準的な水性技術または非水性技術によってコーティングされ得る。これらの組成物中の活性なリソソームスルファターゼ酵素のパーセンテージは、当然、さまざまであり得、そして、便利よく、上記単位の約２重量パーセント〜約６０重量パーセントの間であり得る。
【０１８５】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素組成物は、ウイルスのエンベロープもしくは小胞の中に被膜され、またはウイルスのエンベロープもしくは小胞に付加され、あるいは細胞内に組み入れられて投与され得る。小胞は、ふつうは球状であり、かつしばしば脂質であるミセル（ｍｉｃｅｌｌｕｌａｒ）の粒子である。リポソームは、二重膜（ｂｉｌａｙｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）から形成される小胞である。適切な小胞としては、単層の小胞および多層の脂質小胞またはリポソームが挙げられるが、これらに制限されない。そのような小胞およびリポソームは、例えば米国特許第４，３９４，４４８号に記載されるような標準的技術を使用して、幅広い範囲の脂質またはリン脂質化合物（ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、糖脂質、ガングリオシドなど）から作製され得る。そのような小胞またはリポソームは、細胞内に、リソソームスルファターゼ酵素を投与するため、および標的器官へリソソームスルファターゼ酵素を送達するために使用され得る。目的のリソソームスルファターゼ酵素の制御された放出はまた、被包を使用して達成され得る（例えば、米国特許第５，１８６，９４１号を参照のこと）。
【０１８６】
血流中に、または好ましくは、血液脳関門の少なくとも外側で、リソソームスルファターゼ酵素組成物を希釈する任意の投与の経路が使用され得る。好ましくは、リソソームスルファターゼ酵素組成物は、末梢に投与され、最も好ましくは静脈内に投与されまたは心臓カテーテルによって投与される。頸静脈内（ｉｎｔｒａｊｕｇｕｌａｒ）および頚動脈内（ｉｎｔｒａｃａｒｏｔｉｄ）注射もまた有用である。リソソームスルファターゼ酵素組成物は、局部的または局所的（腹腔内、皮下もしくは筋肉内など）に投与され得る。一つの局面において、リソソームスルファターゼ酵素組成物は、一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と共に投与される。
【０１８７】
当業者は、特定のリソソームスルファターゼ酵素、症状の重症度、および副作用に対する被験体の感受性の関数として、用量のレベルが変動し得ることを容易に認識する。所定のリソソームスルファターゼ酵素についての好ましい投与量は、種々の手段（患者、試験動物、およびインビトロにおいて行われる用量応答の評価ならびに薬物動態学の評価が挙げられるが、これらに制限されない）により、当業者によって容易に決定できる。
【０１８８】
与えられる投与量はまた、個人の要求、所望の効果、使用される特定のスルファターゼ酵素、および選択された投与の経路に依存し得る。リソソームスルファターゼ酵素の投与量は、約０．２ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約２０ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、好ましい投与量は、２ｐｍｏｌ／ｋｇ〜２ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、そして特に好ましい投与量は２ｐｍｏｌ／ｋｇ〜２００ｐｍｏｌ／ｋｇの範囲である。あるいは、リソソームスルファターゼ酵素の投与量は、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得、好ましい投与量は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得，そして特に好ましい投与量は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。これらの投与量は、（例としてかつ制限のためではなく）特定のリソソームスルファターゼ酵素、薬学的組成物の形態、投与の経路、および特定のリソソームスルファターゼ酵素の作用の部位によって影響される。
【０１８９】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、動物、および特にヒトにおける治療、予防ならびに診断の介入のために有用である。リソソームスルファターゼ酵素は、特定の組織における選択的な蓄積を示し得る。診断の用途のための好ましい医学的指標は、例えば、目的の標的器官（例えば、肺、肝臓、腎臓、脾臓）に関連するあらゆる病状を含む。
【０１９０】
対象の方法は、種々の異なる疾患の状態の処置における使用を見出す。特定の実施形態において、特に関心をそそるのは、所望の活性を有するリソソームスルファターゼ酵素が前もって同定されているが、そのリソソームスルファターゼ酵素が、完全に満足な治療の結果を引き起こすようには、標的部位、領域または区画に十分に送達されていない、疾患の状態における対象の方法の使用である。そのようなリソソームスルファターゼ酵素に関し、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を生産する対象の方法は、リソソームスルファターゼ酵素の治療上の効能および治療指数を高めるために使用され得る。
【０１９１】
処置は、リソソームスルファターゼ酵素の投与に関連する、被験体にとってのあらゆる有益な結果を含むことが意味され、この有益な結果としては、疾患にかかることの低減された可能性、疾患の予防、疾患の進行を遅らせること、止めることもしくは逆転させること、または宿主を苦しめている疾患の状態に関連する症状の改善が挙げられ、ここで改善または利益は、広い意味において使用され、パラメーター（例えば、病的な状態に関連する炎症および痛みなどの、処置される病的な状態に関連する症状）の大きさにおける少なくとも低減をいう。そのようなものとして、処置はまた、病的な状態または少なくともそれらに関連する症状が、完全に抑制され（例えば、発生が防がれる、または止められる、例えば、終結させられる）、それによって、宿主が病的な状態にもはや苦しまない、または少なくとも病的な状態を特徴付ける症状にもはや苦しまない状態を含む。
【０１９２】
種々の宿主または被験体は、対象の方法にしたがって処置可能である。一般に、そのような宿主は、「哺乳動物（ｍａｍｍａｌ）」または「哺乳動物（ｍａｍｍａｌｉａｎ）」であり、ここでこれらの用語は、哺乳動物綱（肉食動物目（例えばイヌおよびネコ），げっ歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、ならびに霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む）内の生物を記載するために幅広く使用される。多くの実施形態において、宿主はヒトである。
【０１９３】
目下のところ本発明について一般的に記載してきたが、同様のことは、下記の参考事項から下記の実施例を通じて、より容易に理解され得、下記の実施例は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の生産および精製のための例示的なプロトコル、ならびにリソソーム蓄積症の処置におけるそれらの使用のための例示的なプロトコルを提供する。実施例は、単に例証の目的のために提供され、よって本発明の範囲を制限することは、少しも意図されない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して、正確さを確保するための努力が行われたが、いくつかの実験誤差および偏差は、当然、許されるべきである。
【実施例】
【０１９４】
（実施例Ｉ）
ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）およびヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のための哺乳動物発現ベクター
目的は、安定にトランスフェクトされた細胞において、改良されたリン酸化レベルを有する、十分な量の、活性なリソソームスルファターゼ酵素を生産するために適切である、哺乳動物の発現ベクターを構築することであった。
【０１９５】
３７４アミノ酸のポリペプチドをコードする、全長ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）のｃＤＮＡ（２００５年６月９日公開の米国特許出願番号ＵＳ２０００５／０１２３９４９、および２００４年１１月８日公開の米国特許出願番号ＵＳ２００４／０２２９２５０（これらの両方は、その全容が、参照によって本明細書に援用される）を参照のこと）を、ヒトＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよびマルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を含む、哺乳動物発現ベクターのｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。効率的な転写終結を、ウシの増殖ホルモンのポリアデニル化配列の存在によって保証した。選択マーカーは、ＥＭ−７プロモーターの制御下のゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）耐性遺伝子およびＳＶ４０初期ポリアデニル化配列であった。結果として生じたプラスミドを、ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１と示した。ヒトＳＵＭＦ１のポリヌクレオチド（配列番号：１）配列およびポリペプチド（配列番号：２）配列を、それぞれ図１および図２に示す。
【０１９６】
２６アミノ酸のシグナルぺプチドを含む５２２アミノ酸のポリペプチドをコードする、全長ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のｃＤＮＡ（Ｔｏｍａｔｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１（２）：６７７−６８３，１９９１を参照のこと）を、ウサギβ−グロビンＩＶＳ２イントロンに連結されたヒトＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよびマルチクローニングサイトを含む、哺乳動物発現ベクターのｐＣＩＮ（ＢｉｏＭａｒｉｎ）中にクローニングした。効率的な転写終結を、ウシの増殖ホルモンのポリアデニル化配列の存在によって保証した。選択マーカーは、酵素の能力を減少させる点変異を含む、ネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼ遺伝子であった。この弱められたマーカーに、弱いＨＳＶ−ｔｋプロモーターを用いて、さらにハンディキャップをつけた。結果として生じたプラスミドを、ｐＣＩＮ  ４Ａと示した。ヒトＧＡＬＮＳポリヌクレオチド（配列番号：３）配列およびポリペプチド（配列番号：４）配列を、それぞれ図３および図４に示す。
【０１９７】
ＳＵＭＦ１およびＧＡＬＮＳの発現レベルを上昇させるために、スカフォールド／マトリクス付着領域（ＭＡＲ）エレメント（Ｍｅｒｍｏｄら、米国特許第７，１２９，０６２号を参照のこと）を、ＳＵＭＦ１発現プラスミドおよびＧＡＬＮＳ発現プラスミド中にクローニングした。
【０１９８】
ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃＩＩを用いて、Ｐ＜１＿６８  Ｘ＿Ｘ  ＮｃｏＩ  ｆｉｌｌｅｄ  ＭＡＲ（Ｓｅｌｅｘｉｓ）を消化すること、およびその後、放出されたＭＡＲ断片を、ＢｇｌＩＩおよびＮｒｕＩを用いて消化されたｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１中に挿入することによって作製した。
【０１９９】
ＰＭＡＲ  ＳＵＭＦ１を、ＥＧＦＰ遺伝子を除去するためにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて、Ｐ＜１＿６８  ＮｃｏＩ  ｆｉｌｌｅｄ  （ＭＡＲ）ＳＶ４０  ＥＧＦＰ（Ｓｅｌｅｘｉｓ）を消化すること、およびその後、ＳＵＭＦ１遺伝子（これは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いた消化によってｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１から放出された）を挿入することによって、作製した。
【０２００】
ＢＭＡＲ  ４Ａを、ＳＵＭＦ１遺伝子を除去するためにＰｍｅＩおよびＳｐｅＩを用いてＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１を消化すること、およびその後、ＧＡＬＮＳ遺伝子（これは、ＰｍｅＩおよびＳｐｅＩを用いた消化によってｐＣＩＮ４Ａから放出された）を挿入することによって、作製した。
【０２０１】
ＰＭＡＲ  ４Ａを、ＥＧＦＰ遺伝子を除去するためにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて、Ｐ＜１＿６８  ＮｃｏＩ  ｆｉｌｌｅｄ  （ＭＡＲ）ＳＶ４０  ＥＧＦＰ（Ｓｅｌｅｘｉｓ）を消化すること、およびその後、ＧＡＬＮＳ遺伝子（これは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いた消化によってｐＣＩＮ  ４Ａから放出された）を挿入することによって、作製した。
【０２０２】
全長ヒトＧＡＬＮＳのｃＤＮＡもまた、哺乳動物発現ベクターのｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。ｐＣＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１を、ＳＵＭＦ１のｃＤＮＡを除去するためにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、そしてｐＣＩＮ  ４Ａを、ＧＡＬＮＳのｃＤＮＡを単離するためにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて消化した。ＧＡＬＮＳのｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片を、ｐｃＤＮＡ４ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片に連結した。結果として生じたプラスミドをｐｃＤＮＡ４−４Ａと示した。
【０２０３】
ｐＣＩＮ  ４Ａ、ＢＭＡＲおよびｐＣＤＮＡ４−４Ａ発現ベクター中のＧＡＬＮＳ遺伝子の完全性を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した酵素を用いた、制限酵素マッピング（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ）によって確認した。ＰＭＡＲ  ４Ａ発現ベクターは、マッピングしなかった。
【０２０４】
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の完全にプロセシングされた形態の構造を図５に描写する。ＧＡＬＮＳは、２６アミノ酸のシグナルぺプチド配列を有する、５２２アミノ酸のポリペプチドとして発現する。４９６アミノ酸のＧＡＬＮＳポリペプチドを、約５５〜６０ｋＤａの分子量を有する、酵素のプロセシング前の（前駆体の）形態として分泌する。活性なＧＡＬＮＳにおいて、前駆体または完全にプロセシングされたＧＡＬＮＳポリペプチドの位置５３におけるシステイン残基（全長ＧＡＬＮＳのポリペプチドの位置７９に対応する）を、スルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）によってＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に変換している。リソソームにおいて、ＧＡＬＮＳを、完全にプロセシングされたＧＡＬＮＳポリペプチドの位置３２５の後ろで切断し、約４０ｋＤａおよび１９ｋＤａのＧＡＬＮＳぺプチド断片を結果として生じる。これらのＧＡＬＮＳぺプチドを、完全にプロセシングされたＧＡＬＮＳポリペプチドの位置２８２のシステイン（Ｃ）残基と位置３９３のシステイン（Ｃ）残基との間のジスルフィド架橋によって連結する。完全にプロセシングされたＧＡＬＮＳポリペプチドの位置１７８および３９７に、二個の正規なＮ結合型グリコシル化部位がある。ビスリン酸化されたマンノース７（ＢＰＭ７）（これは、２個のマンノース−６−リン酸残基を含む）を、Ｎ３９７上ではなくＮ１７８上に見出している。
【０２０５】
（実施例ＩＩ）
ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）およびヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を共発現するＧ７１Ｓ細胞株
目的は、改良されたリン酸化レベルを有する、活性なリソソームスルファターゼ酵素を生産する能力がある細胞株を開発することであった。
【０２０６】
Ｇ７１細胞（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｋ．Ｄｒａｐｅｒ）をＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）から直接的に得た。Ｇ７１細胞株は、エンドソームの酸性化についての、ＣＨＯ−Ｋ１の温度感受性変異体であり、Ｇ７１細胞株は、高い温度において、全タンパク質の分泌およびいくつかの酵素におけるマンノース残基でのリン酸化において差異を生じることを観察している（Ｐａｒｋら，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７（２）：１３７−１５０，１９９１；Ｍａｒｎｅｌｌら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９９（６）：１９０７−１９１６，１９８４）。
【０２０７】
Ｇ７１細胞を、２．５％の胎児の子ウシの血清、２ｍＭのグルタミン、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）およびアンホテリシンが補われたＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  ＵｌｔｒａＣＨＯ培地において、３４℃で維持した。
【０２０８】
タンパク質生産のための細胞株の、より容易な使用を可能にするために、付着Ｇ７１細胞を、足場依存性、血清依存性の哺乳動物細胞を高密度の血清を含まない懸濁培養液に適合させるためのプロトコル（Ｓｉｎａｃｏｒｅら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２４９−２５７，２０００）を用いて、血清を含まない増殖培地にプレ適合（ｐｒｅ−ａｄａｐｔ）させ、結果として、血清を含まない懸濁培養液に適合させられた細胞株であるＧ７１Ｓを生じた。あるいは、下に記載されるように安定にトランスフェクトさせた後、付着Ｇ７１細胞を、Ｓｉｎａｃｏｒｅらによって概説されるように、血清を含まない増殖培地に適合させてもよい。
【０２０９】
ヒトＳＵＭＦ１発現ベクターおよびヒトＧＡＬＮＳ発現ベクターの対にした組み合わせである（実施例Ｉ）、ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１とｐＣＩＮ４  ４Ａ、ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１とＢＭＡＲ  ４Ａ、またはＰＭＡＲ  ＳＵＭＦ１とＰＭＡＲ  ４Ａのいずれかを、Ｓｅｌｅｘｉｓによって記載されたＭＡＲｔｅｃｈ  ＩＩプロトコルにしたがって、抗生抗真菌性の溶液（１００ＩＵのペニシリン、１０ｍｇのストレプトマイシン、２５μｇのアンホテリシンＢ、Ｃｅｌｌｇｒｏ）が補われた培地において増殖させられたＧ７１Ｓ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクタントのプールを、γ照射された５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ，ＪＲＨ）、２００μｇ／ｍＬのＧ４１８（ＡＧ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および２００μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補われたＵｌｔｒａＣＨＯ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で増殖させ、そして、９６ウェルプレートにおける同じ増殖培地中での限界希釈によって、クローニングした。クローンの増殖を、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）イメージングによってモニターした。全てのクローンを、活性なＧＡＬＮＳについての酵素キャプチャー活性ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした（実施例ＩＶを参照のこと）。細胞の生産性を、４日間の期間にわたる、ＧＡＬＮＳ活性についての酵素キャプチャー活性ＥＬＩＳＡを、一日当たりの細胞増殖（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で割ることによって計算した。
【０２１０】
２０２個のＧ７１Ｓクローンを作製し、そして活性なＧＡＬＮＳについてスクリーニングした：ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１とｐＣＩＮ  ４Ａとを用いて共トランスフェクトされた８６クローン，ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１とＢＭＡＲ  ４Ａとを用いて共トランスフェクトされた６５クローン、およびＰＭＡＲ  ＳＵＭＦ１とＰＭＡＲ  ４Ａとを用いて共トランスフェクトされた５１クローン。クローンを、最初に、上記の９６ウェルの組織培養プレートから、高レベルの活性なＧＡＬＮＳという基準に基づいて選び出した（図６Ａ）。ＧＡＬＮＳ活性を酵素キャプチャー活性ＥＬＩＳＡを用いて測定し、ｎｇ／ｍＬ（ｙ軸）で表した。ｘ軸は、ＳＵＭＦ１およびＧＡＬＮＳ発現のために用いられた、三つの共トランスフェクション条件を示す：ＭＡＲを含まないｈＣＭＶプロモーター、ＭＡＲを含むｈＣＭＶプロモーター、およびＭＡＲを含むＳＶ４０プロモーター。各棒は、それぞれの母集団に由来する単一のクローンを表す。細胞密度は、この９６ウェルクローンスクリーニングにおいて原因とはならず、そして共トランスフェクトされたＧ７１Ｓクローンの全てを、この図の中に示しているのではない。
【０２１１】
最も高く活性なＧＡＬＮＳを生産するＧ７１Ｓクローンを、生産性分析のために選んだ（図６Ｂ）。日ごとの細胞の生産性をｐｇ／細胞／日において測定し、そしてＧＡＬＮＳ活性をその日の細胞密度で割って取得した。この図は、５×１０５細胞／フラスコで蒔いた後の４日目（９６時間）を表している。クローンを、ｐｇ／細胞／日（ｙ軸）において、酵素キャプチャー活性ＥＬＩＳＡを用いて、ＧＡＬＮＳについて分析した。ポジティブコントロールは、ＧＡＬＮＳを発現するＢＨＫクローンおよびＧＡＬＮＳを発現するＣＨＯクローン（ＢｉｏＭａｒｉｎ）からなった。各縦棒は、単一のクローンを表す。活性なＧＡＬＮＳをｐＣＩＮ  ４Ａクローンは生産したが、それは、このアッセイのバックグラウンドをほんのわずかに超えているにすぎなかった。
【０２１２】
９６ウェルスクリーニングおよび４日間の生産性アッセイによるクローンの分析は、発現ベクターとＭＡＲエレメントの共トランスフェクションが、ＭＡＲエレメントを伴なわない発現ベクターの共トランスフェクションと比較して、Ｇ７１Ｓクローンの生産性を増大させたことを実証した。ＢＭＡＲ  ４Ａ＋ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１が共トランスフェクトされたクローンは、プールの速い発生、速いクローンの増殖、ならびにより活性なＧＡＬＮＳを、最も多く生産するＰＭＡＲ  ４Ａクローンより２倍より多く、およびＭＡＲエレメントを欠いているＣＨＯ  ４ＡクローンおよびＢＨＫ  ４Ａクローンと比較して１０倍の上昇に至るほど生産する能力を実証した。
【０２１３】
ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローンを、Ｓｉｎａｃｏｒｅら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２４９−２５７，２０００において概説されるプロトコルを用いて、血清を含まない増殖培地に適合させた。完全な適合を、両方の選択薬剤（２００μｇ／ｍＬのゼオシンおよび２００μｇ／ｍＬのネオマイシン）の存在下で行った。Ｔフラスコ中で培養された、ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１クローンを、以下のように分けた：（１）Ｃａｍｂｒｅｘ  ＵｌｔｒａＣＨＯ培地および５％のＦＢＳ（ロット♯８Ｌ２２４２）を含む１２５ｍＬのシェイカー中へ；（２）ＪＲＨ  ３０２Ｍ培地（生産培地）および５％のＦＢＳを含む１２５ｍＬのシェイカー中へ；ならびに（３）予備としてＴフラスコの中へ（ＵｌｔｒａＣＨＯ、５％のＦＢＳ）。一旦、懸濁培養を確立させたら、付着細胞を捨て、そしてＦＢＳからの離脱を始めた。増殖速度が３回の継代の間に＞０．５（１／日）に戻り、かつ生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が＞９５％であったときに、ＦＢＳ濃度を５０％低減させた。細胞を、最低３回の継代の間、任意の所定のＦＢＳ濃度においておいた。一旦、細胞が、２．５％のＦＢＳでの増殖に適合したら、細胞を、血清を含まない培地中に直接入れた。細胞を１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含む新しい培地において貯蔵した。試験的な解凍を、細胞が凍結の過程を生き残ったことを保証するために調べた。ＢＭＡＲ  ４Ａ＋ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１のトランスフェクション由来の２個のＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン、クローン４および５は、血清を含まない懸濁培養液への適合のため、約１５回の継代を必要とした。１個のｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１とｐＣＩＮ  ４Ａとのトランスフェクション由来のＧＡＬＮＳ発現クローン、Ｃ６もまた単離し、そして血清を含まない培地に適合させた。
【０２１４】
ヒトＳＵＭＦ１発現ベクターおよびヒトＧＡＬＮＳ発現ベクターの対にした組み合わせ（実施例Ｉ）、ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１とｐＣＤＮＡ４−４Ａを、２００μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を選択のために使用したこと以外は基本的に上に記載されたように、Ｇ７１Ｓ細胞中にトランスフェクトした。６個のＧＡＬＮＳ発現クローン、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ１１およびＣ３０を単離し、そして基本的に上に記載されたように、血清を含まない懸濁培養液に適合させた。
【０２１５】
（実施例ＩＩＩ）
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を発現するＧ７１Ｓ細胞株の大規模培養
目的は、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を発現するＧ７１Ｓクローンからの酵素生産を測定することであった。ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＧＡＬＮＳを共発現する、血清を含まない懸濁培養液に適合したＧ７１Ｓ細胞株を大きな規模において培養し、そして活性なＧＡＬＮＳ酵素の生産について評価した。
【０２１６】
血清を含まない懸濁培養液への適合が、Ｇ７１Ｓ宿主細胞株に関しては比較的速かったため、生産を灌流様式において運転されるＷＡＶＥバイオリアクター中で行うことができると結論付けた。ＷＡＶＥバイオリアクターは、スケールアップを、直接的にバッグの中でできるため（これは汚染の危険を低減し、そして物質の生産を促進する）、接種材料の量におけるより高い柔軟性を可能にする。図７は、ＷＡＶＥバイオリアクターの機構の概要を示す。この図は、灌流様式において、ロードセル（ｌｏａｄ  ｃｅｌｌ）が、所望の量を維持するためにバッグの重量を決定することならびに供給速度および収集速度を調節することによって、バッグの中の培地量をモニターすることを示す。１０Ｌのバックにおいて、ｐＨをまた、バッグの中に挿入したプローブによって、所望の設定値まで制御する。
【０２１７】
ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン４および５由来の物質を１Ｌの規模で生産した。培養液のｐＨをこれらの運転において、制御しなかった。ＷＡＶＥバッグの運転上の限界は、一日３容器量（ｖｅｓｓｅｌ  ｖｏｌｕｍｅ）の処理量（ＶＶ／日）である。物質のあらゆる不活性化を防ぐため、標的の細胞に特異的な灌流速度（ＣＳＰＲ）は０．３ｎｌ／細胞／日であり、これは結果として、ＧＡＬＮＳ酵素について、８時間の平均滞留時間を生じた。したがって、バッグ内の細胞密度を約１０〜１２×１０６細胞／ｍＬに維持した。ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン４および５についての増殖速度は、それぞれ０．１６および０．２０であった。標的の細胞密度を維持するための液体の抜き取りは、バッグから直接的に行った。
【０２１８】
ＧＡＬＮＳが以前に、ｐＨ６において、安定であることを示していたので、収集物の流体のｐＨを、酵素活性を維持するために、５．５と６．５との間のｐＨに調節した。これを、リアクターから出ている、収集物と調和して混合される、５体積％、ｐＨ４．０のクエン酸ナトリウム緩衝液の、適時のボーラス添加によって達成した。調節された収集物の流体を、下流の処理の前に４℃で保管した。２個のＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン４および５は、約１．２５ｐｇ／細胞／日の、関連する比生産性を有する、平均約４．２ｍｇ／Ｌの力価になった。
【０２１９】
ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ１１およびＣ３０を大きな規模において同様に培養し、そして活性なＧＡＬＮＳ酵素生産について評価した。
【０２２０】
（実施例ＩＶ）
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の濃度および活性の測定
酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を、ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を共発現するＧ７１Ｓクローン由来のＧＡＬＮＳ酵素の濃度および活性を測定するために開発した。
【０２２１】
（酵素キャプチャー活性ＥＬＩＳＡ）
酵素キャプチャー活性ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートに結合された抗ＧＡＬＮＳ特異的抗体によるキャプチャーの後で、固相においてＧＡＬＮＳ酵素の活性を測定する。
【０２２２】
緩衝液。緩衝液Ａ（炭酸塩緩衝液）：９００ｍＬの脱イオン（ＤＩ）Ｈ２Ｏ中に３．０９グラムのＮａ２ＣＯ３および５．８８グラムのＮａＨＣＯ３を溶解し、その後、ＤＩ  Ｈ２Ｏを最終的な体積である１０００ｍＬまで添加する。ｐＨが９．４と９．６との間であることを確かめ、その後、濾過滅菌する。ウェル当たり１００μＬを用いて、１枚の９６ウェルマイクロプレートを完全にコーティングするために、チューブ（ｔｕｂｅ）（１２ｍＬ）の中で１９μＬの抗ＧＡＬＮＳ抗体を希釈する。緩衝液Ｂ（ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液および連続希釈緩衝液）：酸性の１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０および２％のＢＳＡを、酢酸を用いてｐＨ６．５に調節した。緩衝液ＢＷ（洗浄緩衝液）：１００ｍＭのＮａＯＡｃおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を、酢酸を用いてｐＨ６．５に調節した。緩衝液Ｃ（基質緩衝液）：２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍＬの脱塩したＢＳＡおよび０．０１％のアジ化ナトリウムを、氷酢酸を用いてｐＨ４．０に調節した。緩衝液Ｄ（β−ガラクトシダーゼ緩衝液）：３００ｍＭのリン酸二ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０１％のアジ化ナトリウムおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を、リン酸を用いてｐＨ７．２に調節した。緩衝液Ｅ（停止緩衝液）：３５０ｍＭグリシンおよび４４０ｍＭの炭酸塩緩衝液を、６ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ１０．７に調節した。
【０２２３】
試薬。抗ＧＡＬＮＳ  ＩｇＧ抗体：ポリクローナルのウサギ抗体を血清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇで精製する。Ｄ−ＰＢＳにおいて、全タンパク質＝３．１７ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）である。アリコート（１９μＬ）を各々一回限りの使用（ｏｎｅ−ｔｉｍｅ  ｕｓｅ  ｅａｃｈ）のために−２０℃で保管する。４ＭＵ−Ｇａｌ−６−Ｓ基質（固体；４４０ＭＷ）：１００ｍＭのストックをＤＩ水中で調製し、そして４℃で保管した。β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−４１５５）：使用の前に、緩衝液Ｄ中で１２μｇ／ｍＬに希釈する。
【０２２４】
プロトコル：抗ＧＡＬＮＳ抗体のプレートへの結合：Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ／Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｉｓｈｅｒ♯１２−５６５−１３５）を抗ＧＡＬＮＳ抗体（緩衝液Ａにおいて５μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度）を用いてコーティングする。この溶液を調製するために、１つの１９μＬのアリコートを解凍し、その液体を収集するために、微量遠心分離機（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）の中で少しの間（１０秒）回転させる。１９μＬの全てを１２ｍＬの緩衝液Ａの中に移す。倒置によって激しく混合し、そしてレザーバの中に注ぎ、その後、マルチチャンネルピペッタ（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｉｐｅｔｔｏｒ）を用いてプレートに入れる（ウェル当たり１００μＬ）。プレートを覆い、そして一晩中４℃でインキュベートする。結合していない抗ＧＡＬＮＳ抗体の除去：３回、緩衝液ＢＷを多量に注ぐことによってプレートを洗浄する。ブロッキング：プレートを緩衝液Ｂを用いてブロッキングし（ウェル当たり３２０μＬ）、その後プレートを覆い、そして３７℃で１時間インキュベートする。ブロッキング工程の間の、精製されたＧＡＬＮＳ標準および試験サンプル（未知）の希釈系列の調製：標準を、このアッセイの線形範囲の高い方の末端に合わせて、緩衝液Ｂ中に希釈し（列Ａにおいて１２８ｎｇ／ｍＬ）、その後、９６ウェルプレートにおける列Ｂ〜Ｇに連続的に希釈（２倍）する。レーンＨは緩衝液のブランクである（すなわち、ＧＡＬＮＳ酵素なし）。最初に、緩衝液Ｂ中で１２８ｎｇ／ｍＬの濃度を５００μＬ調製する。その後、２ｎｇ／ｍＬに達するまで、緩衝液Ｂ中で連続的に２倍に希釈する（２５０μＬを２５０μＬに入れる）。ブロッキング緩衝液の除去：ブロッキングの工程の後、緩衝液Ｂを捨てる。ＧＡＬＮＳ酵素標準および試験サンプルの抗ＧＡＬＮＳ抗体への結合：プレートに１００μＬ／ウェルの、連続的に希釈された標準および試験サンプルを入れる（二連で作業）。プレートを覆い、そして３７℃で１時間インキュベートする。ＧＡＬＮＳインヒビターの除去：３回、緩衝液ＢＷを多量に注ぐことによって、プレートに洗浄する。ＧＡＬＮＳの基質の添加（第一の反応）：ウェル当たり１００μＬを入れるために十分な、最終基質溶液を調製する（使用前の一時間以内に調製した）。４ＭＵ−Ｇａｌ−６−Ｓストック溶液（１００ｍＭ）を緩衝液Ｃ中で１ｍＭに希釈する。ウェル当たり１００μＬを入れる。プレートを覆い、そして３７℃で３０分間インキュベートする。β−ガラクトシダーゼの添加（第二の反応）：緩衝液Ｄにおいて１２μｇ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ、５０μＬを、各ウェルに添加する。プレートを覆い、そして３７℃で１５分間インキュベートする。反応の停止：放出された４ＭＵをイオン化するため、１００μＬの緩衝液Ｅ（停止緩衝液）を各ウェルに添加する。フルオロプレート（ｆｌｕｏｒｏｐｌａｔｅ）への移動：ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル由来の２５０μＬのうち、２００μＬを、処理されていない黒い平らな底のマイクロタイタープレート（Ｆｌｕｏｒｏｐｌａｔｅ，Ｃｏｓｔａｒ♯３９１５）に移す（一度に８ウェル）。蛍光の読み取り：ＳＯＦＴｍａｘ  ＰＲＯプロ��ラム（３６６ｎｍ励起、４４６ｎｍ放出、４３５ｎｍカットオフ）を用いて、Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中でプレートを読み取る。
【０２２５】
（ＧＡＬＮＳ  ＥＬＩＳＡ）
ＧＡＬＮＳ  ＥＬＩＳＡは、サンドイッチ免疫測定法を用いて、細胞培養の馴化培地、または他のプロセスのサンプルにおいて、ＧＡＬＮＳ酵素の濃度を測定する。
【０２２６】
緩衝液。緩衝液Ａ（炭酸塩緩衝液）：９００ｍＬの脱イオン（ＤＩ）Ｈ２Ｏ中に３．０９グラムのＮａ２ＣＯ３および５．８８グラムのＮａＨＣＯ３を溶解し、その後、ＤＩ  Ｈ２Ｏを最終的な体積である１０００ｍＬまで添加する。ｐＨが９．４と９．６との間であることを確かめ、その後、濾過滅菌する。ウェル当たり１００μＬを用いて、１枚の９６ウェルマイクロプレートを完全にコーティングするために、１本のチューブ（１２ｍＬ）の中で１９μＬの抗ＧＡＬＮＳ抗体を希釈する。緩衝液Ｂ（ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液および連続希釈緩衝液）：酸性の１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０および２％のＢＳＡを、酢酸を用いてｐＨ６．５に調節した。緩衝液ＢＷ（洗浄緩衝液）：１００ｍＭのＮａＯＡｃおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を、酢酸を用いてｐＨ６．５に調節した。緩衝液Ｆ（停止緩衝液）：２ＮのＨ２ＳＯ４：全６００ｍＬにおいては、１００ｍＬの１２ＮのＨ２ＳＯ４および５００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水を添加する。
【０２２７】
試薬。抗ＧＡＬＮＳ  ＩｇＧ抗体：ウサギのポリクローナル抗体を血清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇで精製する。Ｄ−ＰＢＳにおいて、全タンパク質＝３．１７ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）である。アリコート（１９μＬ）を一回限りの使用のために−２０℃で保管する。ＨＲＰが結合体化した検出抗体（ＲＩＶＡＨ）：最終的な、結合体化した抗体を、Ｄ−ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に１：１００で希釈し、そして一回限りの使用のために、−２０℃で１２０μＬのアリコートを保管する。ＴＭＢ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ＃１７２−１０６７）。
【０２２８】
プロトコル：抗ＧＡＬＮＳ抗体のプレートへの結合：Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ／Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｉｓｈｅｒ♯１２−５６５−１３５）を抗ＧＡＬＮＳ抗体（緩衝液Ａにおいて５μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度）を用いてコーティングする。この溶液を調製するために１つの１９μＬのアリコートを解凍し、その液体を収集するために微量遠心分離機の中で少しの間（１０秒）回転させる。１９μＬの全てを１２ｍＬの緩衝液Ａの中に移す。倒置によって激しく混合し、そしてレザーバの中に注ぎ、その後、マルチチャンネルピペッタを用いてプレートに入れる（ウェル当たり１００μＬ）。プレートを覆い、そして３７℃（対流インキュベーター）で２時間インキュベートする。ホットブロック（ｈｏｔ  ｂｌｏｃｋ）を使用しないこと。結合していない抗ＧＡＬＮＳ抗体の除去：３回、緩衝液ＢＷを多量に注ぐことによってプレートを洗浄する。ブロッキング：プレートを緩衝液Ｂを用いてブロッキングし（ウェル当たり３２０μＬ）、その後プレートを覆い、そして３７℃で１時間インキュベートする。ブロッキング工程の間の、精製されたＧＡＬＮＳ標準および試験サンプル（未知）の希釈系列の調製：標準を、このアッセイの線形範囲の高い方の末端に合わせて、緩衝液Ｂ中に希釈し（列Ａにおいて４０ｎｇ／ｍＬ）、その後、９６ウェルプレートにおける列Ｂ〜Ｇに連続的に希釈（２倍）する。レーンＨは緩衝液のブランクである（すなわち、ＧＡＬＮＳ酵素なし）。最初に、緩衝液Ｂ中で４０ｎｇ／ｍＬの濃度を５００μＬ調製する。その後、０．６２５ｎｇ／ｍＬに達するまで、緩衝液Ｂ中で連続的に２倍に希釈する（２５０μＬを２５０μＬに入れる）。ブロッキング緩衝液の除去：ブロッキングの工程の後、緩衝液Ｂを捨てる。ＧＡＬＮＳ酵素標準および試験サンプルの抗ＧＡＬＮＳ抗体への結合：プレートに１００μＬ／ウェルの、連続的に希釈された標準および試験サンプルを入れる（二連で作業）。プレートを覆い、そして３７℃で１時間インキュベートする。洗浄：３回、緩衝液ＢＷを多量に注ぐことによって、プレートに洗浄する。検出抗体結合体の結合：抗体ＲＩＶＡＨの１つのアリコート（１２０μＬ）を解凍し、その液体を収集するために、微量遠心分離機の中で少しの間（１０秒）回転させる。１２０μＬの全てを１１．９ｍＬの緩衝液Ｂの中へ希釈し、そして混合のためにチューブを激しく倒置する。レザーバの中に注ぎ、そして、マルチチャンネルピペッタを用いて、ウェル当たり１００μＬを添加する。プレートを覆い、そして３７℃で３０分間インキュベートする。洗浄：３回、緩衝液ＢＷを多量に注ぐことによって、プレートを洗浄する。ＴＭＢ基質：１．２ｍＬの溶液Ｂと１０．８ｍＬの溶液Ａとを混合することによって、最終基質溶液を調製する。レザーバの中に注ぎ、そして、マルチチャンネルピペッタを用いて、ウェル当たり１００μＬを添加する。プレートを覆い、そして３７℃で１５分間インキュベートする。停止溶液：１２ｍＬの２ＮのＨ２ＳＯ４停止溶液をピペットでレザーバに移し（ｐｉｐｅｔｔｅ）、そしてマルチチャンネルピペッタを用いて、ウェル当たり１００μＬを添加する。混合するため穏やかにたたく。Ａ４５０の読み取り：プレートリーダー中でプレートを読み取る。
【０２２９】
（ＧＡＬＮ比活性のアッセイ）
ＧＡＬＮＳ比活性のアッセイは、ＧＡＬＮＳ特異的基質を用いて、溶液中のＧＡＬＮＳの酵素活性を測定する。
【０２３０】
緩衝液。ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏを全ての緩衝液について使用する。希釈緩衝液（ＤＢ）：１ＬのＤＢのために、１．７４ｍＬの酢酸、０．７５ｇの酢酸ナトリウム、２３３．６ｍｇのＮａＣｌ、２ｍＬの５０％のＴｗｅｅｎ−２０および１０ｍＬの１％のアジ化ナトリウムをＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ中に溶解し、そしてｐＨが３．９５未満の場合は、０．１ＭのＮａＯＨを用いて、およびｐＨが４．０５より大きい場合は、０．１Ｍの酢酸を用いて、ｐＨを４．０＋／−０．５に調節する。最終濃度は：１９．５ｍＭの酢酸、５．５ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０および０．０１％のアジ化ナトリウムである。リン酸塩緩衝液（ＰＢ）：１ＬのＰＢのために、１３．９ｇのＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏおよび５５ｇのＮａＨＰＯ４−７Ｈ２ＯをＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ中に溶解し、そしてｐＨを７．２に調節する。最終濃度は３００ｍＭのＮａＰｉである。停止緩衝液（ＳＢ）：１ＬのＳＢのために、２６．２ｇのグリシンおよび４６．６ｇの炭酸ナトリウムをＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ中に溶解し、そしてＮａＯＨを用いて、ｐＨを１０．６に調節する。アッセイ緩衝液（ＡＢ）：４ＭＵ−Ｇａｌ−６Ｓストックを１：５０にＤＢ中で希釈する（最終２ｍＭ）。β−ガラクトシダーゼ緩衝液（βＧＢ）：３００ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．２中での、２５μｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ。
【０２３１】
試薬。４ＭＵ−Ｇａｌ−６Ｓ：Ｈ２Ｏ中で１００ｍＭ（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃａｔ．♯Ｍ３３４４８０）。β−ガラクトシダーゼ：Ｓｉｇｍａ  Ｇ−４１５５。４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ標準）：Ｓｉｇｍａ  Ｍ−１３８１（ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストック）。
【０２３２】
プロトコル。ＧＡＬＮＳ酵素の連続的希釈を行う。精製され、そして処方されたＧＡＬＮＳ（約１．５ｍｇ／ｍｌ）について、１：１の連続的希釈の前に、ＤＢを含むタンパク質低付着性微量遠心分離チューブ（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ♯１４１５−２６００）中でサンプルを１：１０，０００に希釈する。タンパク質低結合性９６ウェルプレート中に１００μＬのＤＢを入れる（ｐｌａｃｅ）。第一の列に、１００μＬのＧＡＬＮＳサンプルをピペットで入れる。次に、プレートに沿って（９６ウェルプレートのＡ〜Ｇ）、連続的に希釈（１：１）する。ウェルＨには、サンプルを添加しない（ブランク）。このアッセイの線形範囲は、１〜７５ｎｇ／ｍＬである。４ＭＵの標準曲線を作製するために、同様の手順を用いる。ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの４ＭＵストックを、ＤＢにおいて、１：１００に希釈する。第一のウェルに５０μＬの、５０μＭの４ＭＵを添加することによって、４ＭＵ標準曲線を開始し、そして連続的に希釈する。ＡＢにおいて希釈された５０μＬの基質（ＤＢにおいて、２ｍＭの４ＭＵ−ガラクトース−６Ｓ）を、９６ウェル蛍光プレートに添加する。基質を３７℃で１０分間プレインキュベート（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）する。ＧＡＬＮＳおよび４ＭＵの標準の１００μＬの連続的希釈物のうち５０μＬを、ＡＢ中の５０μＬの基質に添加する。３７℃で３０分間インキュベートし、（この第一の反応は、基質から硫酸塩を除去する）、第一の反応を止め、そして５０μＬのβ−ガラクトシダーゼ（β−ガラクトシダーゼストックをβＧＢ中で２５μｇ／ｍＬに希釈する）を添加することによって第二の反応を開始させる。リン酸塩は、ＧＡＬＮＳを阻害し、そしてｐＨの上昇もまた、ＧＡＬＮＳ反応を停止させる。結果として生じるｐＨは、現在、β−ガラクトシダーゼの最適ｐＨ範囲内である。この第二の反応は、１５分間３７℃でインキュベートする。放出された４ＭＵを、１００μＬのＳＢを添加することによってイオン化する。９６ウェル蛍光プレートリーダーにおいて、Ｅｘ３５５  Ｅｍ４６０を読み取る。酵素活性の計算（３７℃、ｐＨ４．０の緩衝液において）：１単位＝μｍｏｌ  放出された４ＭＵ／分；活性＝μｍｏｌ  ４ＭＵ／分／ｍＬ；比活性＝μｍｏｌ  ４ＭＵ／分／ｍｇ。タンパク質濃度の計算：ＧＡＬＮＳの吸光率を使う（１ｍｇ／ｍＬ＝２８０ｎｍにおいて、１．７０８吸光度単位）。
【０２３３】
（実施例Ｖ）
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の精製
目的は、大量の組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を取得することであった。ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＧＡＬＮＳを共発現する、安定にトランスフェクトされたＧ７１細胞を、バイオリアクター培養条件下で増殖させ、そして活性なＧＡＬＮＳ酵素をこの細胞培地から精製した。
【０２３４】
液体クロマトグラフィの装置。Ｕｎｉｃｏｒｎ制御ソフトウェアを利用する、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００システム。
【０２３５】
タンパク質分析の方法。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色（Ｂ１０１−０２−ＣＯＯＭ）、ウェスタンブロッティングおよびブラッドフォードタンパク質アッセイについては、標準的な手順に従った。精製作業を活性の収量によって評価し、そしてＧＡＬＮＳ産物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚的に評価した。プロセシングされた不純物の存在を、抗ＧＡＬＮＳ抗体を用いるウェスタンブロッティングによって検出した。タンパク質の濃度を、ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて測定した。最終的な精製されたＧＡＬＮＳタンパク質の濃度を、１．７０８の吸光率を用いる、Ａ２８０測定によって測定した。
【０２３６】
クロマトグラフィの樹脂。Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ロット♯３０６３４６）およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ，ＦＣ０４０８９４４４９）。
【０２３７】
ＧＡＬＮＳ酵素活性の決定。ＧＡＬＮＳ比活性を、低分子蛍光基質４−メチルウンべリフェリル−６−Ｓ−ＧＡＬ（４−ＭＵ−６−Ｓ−ＧＡＬ）を用いて決定した。ＧＡＬＮＳ比活性のアッセイは、２つの工程の反応を含み、ここで、b−ガラクトシダーゼの添加は、蛍光タグの放出のための、特定の時間の間の、基質とのＧＡＬＮＳのインキュベーションの後で必要である。測定を、蛍光プレートリーダーを用いて行う。
【０２３８】
１０ＤＧ脱塩カラム（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）を、平衡緩衝液（ＥＱＢ、５０ｍＭのＮａＯＡｃ、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．８）を用いて平衡化した。ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏを全ての緩衝液について使用する。３（３）ｍＬの精製されたＧＡＬＮＳ（０．５〜２ｍｇ／ｍＬ）を脱塩カラムに充填し、溶出し、そしてＥＱＢを用いた別個の試験管中に４ｍＬのアリコートの状態で収集した。タンパク質濃度を、ＧＡＬＮＳの吸光率（２８０ｎｍにおいて、１ｍｇ／ｍＬ＝１．７０８吸光度単位）を用いて計算した。
【０２３９】
脱塩したＧＡＬＮＳサンプルを、希釈緩衝液（ＤＢ、５０ｍＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．０＋０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中で連続的に希釈した（１：１）。ＢＳＡストックを、ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏで前もって平衡化しておいたＧ２５カラムに、５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡストック（５％ＣＶ以下）を充填することによって、使用の前に脱塩した。１００μＬの脱塩したＧＡＬＮＳサンプルを、タンパク質低結合性の９６ウェルプレートの第一の列にピペットで移し、そして、連続的に希釈されたＧＡＬＮＳサンプルをプレートに沿ってピペットで移した（９６ウェルプレートの列Ａ〜Ｇ）。１００μＬのＤＢを最後のウェル（Ｈ）にピペットで移した。このアッセイの線形範囲の高い方の末端は２００ｎｇ／ｍＬであり、そして線形範囲は、３〜２００ｎｇ／ｍＬである。同様の手順を、４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）（Ｓｉｇｍａ  Ｍ−１３８１、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストック）に関する標準曲線を作製するために行った。ＧＡＬＮＳおよび４ＭＵの、１００μＬの連続的希釈物のうち５０μＬを、新たな９６ウェル蛍光プレート（黒い底のプレート）に移した。２ｍＭの４ＭＵ−ガラクトース−６Ｓ（ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ中）の５０μＬを、分析されるサンプルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この第一の反応を止め、そして第二の反応を、５０μＬのβ−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−４１５５、３００ｍＭのＮａＰｉ中で１２μｇ／ｍＬに希釈されたストック、ｐＨ７．２）を添加することによって始め、そして３７℃で１５分間インキュベートした。放出された４ＭＵを、１００μＬの停止緩衝液（グリシン／炭酸塩、ｐＨ１０．６）の添加によってイオン化した。プレートを９６ウェル蛍光プレートリーダー（励起３５５ｎｍ、放出４６０ｎｍ）で読み取った。１単位を、１μｍｏｌの放出された４ＭＵ／分として定義し、酵素活性をμｍｏｌ  ４ＭＵ／分／ｍＬで示し、そして比活性をμｍｏｌ  ４ＭＵ／分／ｍｇで示す（全てｐＨ４．０の緩衝液中で、３７℃において）。
【０２４０】
第一の精製プロセス。第一の精製プロセスは、限外濾過（ＵＦ）工程とその後の２カラム精製プロセスを含んだ。
【０２４１】
１．収集物の濾過（ＨＦ）：バイオリアクターの物質を０．２μｍのフィルターで滅菌濾過した（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ）。
【０２４２】
２．限外濾過（ＵＦ）：バイオリアクターの物質を、３０ｋＤ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ膜を通す限外濾過によって１０〜２０倍に濃縮した。
【０２４３】
３．ｐＨ４．５に調節：濃縮されたバイオリアクターの物質（ＵＦ（２０×））を、室温において、ｐＨ調節緩衝液（１．７５ＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０）を用いてｐＨ４．５に調節し、そしてＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填する前に滅菌濾過した。
【０２４４】
４．Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）：上記のｐＨ４．５に調節されたＵＦ（２０×）をＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填し、そしてＧＡＬＮＳタンパク質を表１および図９Ａにおいて示されるように溶出した。
【０２４５】
【表１】
0005687069.tif 000003
＊ＣＶ：カラムの容量。流速＝９２ｃｍ  ｈｒ−１
５．Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ：Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出液をｐＨ４．３に調節し、そしてＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムに充填し、そしてＧＡＬＮＳタンパク質を表２および図９Ｂにおいて示されるように溶出した。
【０２４６】
【表２】
0005687069.tif 000004
＊ＣＶ：カラムの容量。流速＝１５０ｃｍ  ｈｒ−１
溶出液中のＧＡＬＮＳタンパク質を、分画によって収集し、溶出前のショルダー（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）および溶出後のテイル（尾）を捨てた。
【０２４７】
６．最終のＵＦ／ＨＦ：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰカラムからの溶出液を、上で記載されたように限外濾過によって濃縮し、そして滅菌濾過した。
【０２４８】
処方物。精製されたＧＡＬＮＳタンパク質を、１０ｍＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．００５％のＴｗｅｅｎ−８０、ｐＨ５．５中に処方した。
【０２４９】
安定性の研究。最終的に処方され、精製されたＧＡＬＮＳの安定性を、４℃および−７０℃において、ＧＡＬＮＳサンプルのわずかなアリコートを保管することにより、時間の関数としてそれぞれの温度においてモニターした。特定の時点において、凍結されたサンプルのアリコートを、活性測定の前に、３７℃の水浴内で敏速に解凍した。図８は、精製されたＧＡＬＮＳが、処方緩衝液において、少なくとも７９日目に至るまでの期間にわたって、４℃および−７０℃において安定であったことを示す。
【０２５０】
第一の精製プロセスの結果。表３は、懸濁培養バイオリアクター内のＧ７１Ｓクローン４から生産された、ＧＡＬＮＳタンパク質の３つの調製物についての精製の収率を示す。純度を、全ての場合において約９５％であると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚的に推定した。
【０２５１】
【表３】
0005687069.tif 000005
図９は、（Ａ）Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィとその後の（Ｂ）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰクロマトグラフィによって分離されたＧＡＬＮＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ（左）または抗ＧＡＬＮＳ抗体（右）を用いて染色した。ウェスタンブロットに関して、抗ＧＡＬＮＳウサギ抗体を１：５０００に希釈し、そして二次抗体は抗アルカリホスファターゼウサギ抗体であった。ＧＡＬＮＳタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約５５〜６０ｋＤａの見かけの分子量を有し、これは、（２６アミノ酸残基のシグナルぺプチドを欠いており、かつ、位置３２５の後ろでの切断もまた欠いている）酵素の分泌される、プロセシング前の（前駆体の）形態の予期される大きさに一致する。
【０２５２】
Ｎ末端の特徴付け。精製されたＧＡＬＮＳタンパク質のＮ末端をＬＣ／ＭＳによって決定した。Ｎ末端配列はＡＰＱＰＰＮであり、これは、２６アミノ酸残基のシグナルぺプチドを欠いている、ＧＡＬＮＳの分泌される形態の予想されるＮ末端に対応する（図４におけるヒトＧＡＬＮＳポリペプチド配列と図５におけるヒトＧＡＬＮＳポリペプチド配列とを比較のこと）。
【０２５３】
第二の精製プロセス。第二の精製プロセスは、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程とその後の３カラム精製プロセスを含んだ。
【０２５４】
１．限外濾過（ＵＦ／ＤＦ）：バイオリアクターの物質を、ｐＨ５．５において、３０ｋＤ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ膜を通す限外濾過／透析濾過によって２０倍に濃縮した。
【０２５５】
２．ｐＨ４．５に調節：濃縮されたバイオリアクターの物質（ＵＦ／ＤＦ（２０×））を、室温において、ｐＨ調節緩衝液（１．７５ＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０）を用いてｐＨ４．５に調節し、そしてＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムに充填する前に滅菌濾過した。
【０２５６】
３．Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ：ｐＨ４．５に調節されたＵＦ／ＤＦ（２０×）をＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムに充填し、１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５および１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いて連続して洗浄し、そしてＧＡＬＮＳタンパク質を１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いて溶出した。
【０２５７】
５．ＺｎキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムからの溶出液を５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に適合させ、そしてＺｎキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムに充填し、１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０を用いて洗浄し、そしてＧＡＬＮＳタンパク質を１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭのＮａＣｌ、９０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０を用いて溶出した。
【０２５８】
６．ｐＨ３．５に調節：ＧＡＬＮＳタンパク質を含むＺｎキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムからの溶出液を、低ｐＨウイルス不活性化のためにｐＨ３．５に調節し、その後１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に適合させた。
【０２５９】
７．ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ：ＺｎキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムからの低ｐＨに調節された溶出液を、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムに充填し、１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いて洗浄し、そしてＧＡＬＮＳタンパク質を１０ｍＭの酢酸塩／リン酸塩、０．７ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いて溶出した。
【０２６０】
８．最終のＵＦ／ＨＦ：ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの溶出液を、２０ｍＭの酢酸塩、１ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５において、限外濾過および透析濾過した。
【０２６１】
処方物。精製されたＧＡＬＮＳタンパク質を、１０ｍＭのＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５中に処方した。
【０２６２】
第二の精製プロセスの結果。表４は、第二の精製プロセスを用いる、懸濁培養バイオリアクター中の、Ｇ７１ＳクローンＣ２から生産されたＧＡＬＮＳタンパク質の回収を示す。処方されたＧＡＬＮＳ酵素の純度（すなわち、前駆体および成熟したまたはプロセシングされた形態を合わせて）は、Ｃ３  ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定される場合に、約９８％であった。ＧＡＬＮＳ酵素の前駆形態のパーセンテージは、ＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動によって決定される場合に、約８５％であった。
【０２６３】
【表４】
0005687069.tif 000006
図１０は、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰクロマトグラフィ、ＺｎキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦクロマトグラフィおよびＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍクロマトグラフィによって分離された、ＧＡＬＮＳ酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ（上部左）、抗ＧＡＬＮＳ抗体（上部右）、抗カテプシンＬ（下部左）および抗ＣＨＯタンパク質（ＣＨＯＰ、下部右）を用いて染色した。ウェスタンブロットに関して、抗ＧＡＬＮＳウサギポリクローナル抗体を１：５０００に希釈し、そして二次抗体は抗ウサギＡＰ結合体であり；抗カテプシンＬヤギポリクローナル抗体を１：１０００に希釈し、そして二次抗体は抗ヤギＨＲＰ結合体であり；および抗ＣＨＯＰウサギポリクローナル抗体を１：１０００に希釈し、そして二次抗体は抗ウサギＨＲＰ結合体であった。前駆体のＧＡＬＮＳ酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約５５〜６０ｋＤａの見かけの分子量を有し、そしてＧＡＬＮＳ酵素の成熟したまたはプロセシングされた形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約３９ｋＤａおよび約１９ｋＤａの見かけの分子量を有する。
【０２６４】
第一の精製プロセスの概略。ＧＡＬＮＳ酵素を、標準的な手順から変更された精製手順を用いて精製した（表５を参照のこと）。バイオリアクターの収集物質を０．２μｍフィルターで滅菌濾過し、そしてＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅキャプチャーカラムに充填する前に４℃に置いておいた。濾過されたバイオリアクターの物質を、直接充填するか、または限外濾過によって１５倍まで濃縮した。下流の精製工程（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィとその後のＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィ）が純粋なＧＡＬＮＳを十分に産出しなかったので、精製手順の変更が必要であった。２つの下流の精製カラムの代わりとしてＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐクロマトグラフィを使用することは、結果として、有意に改善された最終的な物質の純度および約２２％から約８０％に有意に上昇した全体としてのＧＡＬＮＳの回収を伴なう、２カラム精製プロセスを生じた。ＧＡＬＮＳ酵素（これは、前駆形態から本質的になる、図９を参照のこと）の純度を、Ｃ４−ＲＰクロマトグラフィによって決定される場合に、おおよそ＞９５％と見積もり、そして精製されたＧＡＬＮＳ酵素は、４℃および−７０℃の両方において、７９日を超える期間において処方緩衝液中で安定のままであった。
【０２６５】
【表５】
0005687069.tif 000007
＊この工程は任意である。
【０２６６】
第二の精製プロセスの概略。ＧＡＬＮＳ酵素をまた、第二の精製プロセスを用いて精製した（表６を参照のこと）。全体としてのＧＡＬＮＳの回収は約７０％であり、そして、Ｃ４−ＲＰクロマトグラフィによって決定される場合に、ＧＡＬＮＳ酵素（前駆体および成熟したまたはプロセシングされた形態の両方を含む、図１０を参照のこと）の純度は、おおよそ、約９７％であると見積もった。
【０２６７】
【表６】
0005687069.tif 000008
これらのアッセイは、組換え型リソソームスルファターゼ酵素を調製するための上に記載されたプロトコルが、高度に精製された酵素、特に、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の、分泌されるプロセシング前の（前駆体の）形態の、大量生産のための効率的な方法を提供することを示す。
【０２６８】
（実施例ＶＩ）
精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の特徴付け
Ｇ７１細胞株は、平均的な哺乳動物細胞株において示されるよりも高いレベルで、高マンノースリン酸化を有するタンパク質（例えば、リソソーム酵素）、および対応して、平均的な哺乳動物細胞株において示されるよりも低いレベルで、リン酸化されていない高マンノースオリゴ糖を有するタンパク質（例えば、リソソーム酵素）を生産する。本明細書において規定される、高いレベルのビスリン酸化された高マンノースオリゴ糖を含むリソソームスルファターゼ酵素（例えば、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））を、Ｃａｎｆｉｅｌｄら、米国特許第６，５３７，７８５号において取得される分子（これは、複合オリゴ糖を含まず、そして高マンノースオリゴ糖のみを示す）と比較する。
【０２６９】
リソソームスルファターゼ酵素における、リン酸化されていない高マンノースのレベルを決定するために、当業者は、放出されたオリゴ糖のエキソグリコシダーゼ（ｅｘｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）シークエンス法（「ＦＡＣＥシークエンス法」）を使用し得、リン酸化されていない高マンノースオリゴ糖鎖のパーセンテージを正確に把握する。通常のロット発売のＦＡＣＥプロファイリングゲル上で、リン酸化されていない高マンノースは、特定の複合オリゴ糖（例えば、オリゴマンノース６、および完全にシアル酸が付加された二分岐の複合体）と、共に移動（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｅ）する。リン酸化されていない高マンノースは、その後、酵素的シークエンス法により他のオリゴ糖と区別する。
【０２７０】
Ｇ７１Ｓ細胞において発現される、精製されたリソソームスルファターゼ酵素（例えば、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））が増強したリン酸化を示すかどうかを決定するために、リソソームスルファターゼ酵素におけるマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）のレベル、ならびにこの酵素のＭ６Ｐ受容体（ＭＰＲ）への結合の能力も決定した。
【０２７１】
Ｇ７１Ｓ細胞において発現そして精製された、組換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素を、蛍光標識糖鎖電気泳動法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＦＡＣＥ）およびＭＰＲ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅレジンでのクロマトグラフィによって分析した。ＦＡＣＥシステムは、糖タンパク質から放出されたオリゴ糖の配列を、分離、定量化、および決定するために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する。ＦＡＣＥ上のオリゴマンノース７ビス−リン酸（Ｏ７Ｐ）のバンドの相対強度（Ｈａｇｕｅら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１９（１５）：２６１２−２０，１９９８）、およびＭＰＲカラムに保持されるパーセント活性（Ｃａｃｉａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７（４３）：１５１５４−６１，１９９８）は、タンパク質１モルあたりのリン酸化レベルの信頼できる基準を与える。
【０２７２】
比活性。組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の比活性を、３７℃において、低分子蛍光基質の４−メチルウンべリフェリル−６−Ｓ−ＧＡＬ（４ＭＵ−Ｇａｌ−６Ｓ）を用いて決定した。このアッセイを用いたときの、精製されたＧＡＬＮＳの比活性は、１６５μｍｏｌ／分／ｍｇ（０．１６５Ｕ／ｍｇ）であった。
【０２７３】
ヒトの血清での安定性。ＧＡＬＮＳのエクスビボの血清での安定性を決定した。ヒト血清（Ｓｉｇｍａ  Ｈ−４５２２）を０．２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過滅菌し、そして４ｍＬのこの濾過滅菌されたヒト血清を、Ｔ−２５細胞培養フラスコ内で、３７℃、１０％のＣＯ２の雰囲気（この点におけるｐＨは７．４±０．１である）において１時間プレインキュベート（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。０．４ｍＬの脱塩され、精製されたＧＡＬＮＳ（２ｍｇ／ｍＬの精製されたＧＡＬＮＳをＢｉｏ−ＲＡＤ  １０ＤＧカラムを用いてＰＢＳ中に脱塩した）を、プレインキュベートされたヒト血清または０．５ｍｇ／ＬのＢＳＡを含むＰＢＳコントロールに添加した。１００μＬのサンプルを、指定された時点（例えば０、１、３．５、７．５および２６時間）で回収し、そして９００ｍＬのクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）緩衝液（ＱＢ、５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．６＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ＋０．００１％のＴｗｅｅｎ−８０）を添加した。サンプルを、ＧＡＬＮＳの酵素活性を測定するための準備が出来るまで４℃で保管した。
【０２７４】
ＧＡＬＮＳ酵素活性を、酵素キャプチャー活性ＥＬＩＳＡを用いて測定した。％残留ＧＡＬＮＳ酵素活性の指数関数的減衰曲線を外挿法によって推定することによって、精製されたＧＡＬＮＳのエクスビボの血清での半減期を、２１７時間と見積もった。
【０２７５】
滑膜細胞（軟骨細胞（Ｃｈｒｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））への取込み。滑膜細胞（軟骨細胞）に取り込まれるＧＡＬＮＳの能力を決定した。
【０２７６】
軟骨細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１８３２）を１２ウェルディッシュにおいて、３７℃、５％のＣＯ２で、増殖培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％のＦＢＳ）内で培養した。３つのサンプルの取込みの分析は、４×１２ウェルプレートを必要とする。精製されたＧＡＬＮＳサンプルおよびＧＡＬＮＳ基準物（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）をａｃＰＢＳ／ＢＳＡ（酸性ＰＢＳ＋２００μｇ／ｍＬのＢＳＡ）において１μＭに希釈した。この１μＭストックから、ＧＡＬＮＳサンプルおよび基準物についての、取込みの希釈曲線を作製した：５ｍＬの取込みアッセイ希釈剤（ＵＡＤ、ＤＭＥＭ＋２ｍＭのＬ−グルタミン＋０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中に５０．５μＬ（１μＭのｒｈＡＳＢ）を入れ、結果として１０ｎＭのＧＡＬＮＳサンプルおよび基準物を生じさせ、これをさらに、ＵＡＤ中での連続二倍希釈によって、５、２．５、１．２５、０．６２、０．３１および０．１６ｎＭに連続的に希釈した。コンフルエントな軟骨細胞の１２ウェルディッシュ由来の増殖培地を吸引し、１ｍＬのＵＡＤ（ブランク）または１ｍＬのＧＡＬＮＳサンプルの連続希釈物もしくは基準物の連続希釈物のいずれかをウェルに添加し、そして１０％のＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で４時間インキュベートした。取込み培地を吸引し（完璧にするため、各ディッシュを傾けながら）、そして各ウェルを１ｍＬのＰＢＳで１回すすいだ。ＰＢＳを吸引し、そして軟骨細胞を、ウェル当たり０．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％のトリプシン／０．１％のＥＤＴＡ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ２５−０５３−ＣＩ、ロット２５０５３０２５））を添加することによって剥離させた。プレートからの剥離の後、軟骨細胞をあらかじめ冷やしておいた氷上のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（全３０チューブ）中に一定分量ずつ入れた（ａｌｉｑｕｏｔ）。トリプシン処理された軟骨細胞を冷やし、そしてその後、微量遠心分離機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）において低速度でペレットにした（ｐｅｌｌｅｔ）（４０００ｒｐｍで３分間）。トリプシンを完全に吸引し、細胞ペレットを１ｍＬのＰＢＳですすぎ、この微量遠心分離および吸引の工程を１回繰り返した。２００μＬの細胞溶解緩衝液（ＣＬＢ、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６＋０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を各チューブに添加した。細胞ペレットを、３回、短時間ボルテックスをすること（ｐｕｌｓｅ−ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）によって再懸濁させた。再懸濁の後、細胞溶解混合物を−８０℃で一晩保管したか、または直ちに分析した。
【０２７７】
細胞溶解産物を室温で解凍し、そして溶解された場合、氷上に移した。この細胞溶解産物を、目に見えるあらゆる固体の物質を再懸濁させるためにボルテックスし、その後、不溶性の物質をペレットにするために、微量遠心分離機において、４℃で１０分間、１４Ｋｒｐｍで回転させた。上清を新しいチューブの組に移し、そしてペレットを捨てた。次に、ＧＡＬＮＳ活性アッセイを上清で行った。７点での希釈曲線（１０ｎＭで開始しそして０．１６ｎＭで終わらせた、連続二倍希釈）を普通に作製した。この希釈曲線は、両側で均等に、予想されるＫｕｐｔａｋｅをほとんど挟む。開始サンプルのモル濃度を、タンパク質のみの分子量を用いることによって計算する。
【０２７８】
精製されたＧＡＬＮＳは、単一部位でのリガンド結合に基づき、滑膜細胞への取込みについて４．９ｎＭのＫｄを有した。
【０２７９】
マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体プレート結合アッセイ。ＧＡＬＮＳのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体への結合の能力を、プレート結合アッセイにおいて決定した。ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ高結合性プレートを４μｇ／ｍＬのＭ６Ｐ受容体を用いてコーティングした。コーティングされたプレートを２５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（ＷＢ、ＴＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）を用いて２回洗浄し、そして非特異的結合を２００μＬ／ウェルのブロッキングおよび希釈緩衝液（ＢＤＢ、Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ緩衝液、ロット♯ＣＡ４６４８５）を用いて妨げた。プレートを室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。このブロッキング工程の間、精製されたＧＡＬＮＳサンプル（０．５〜２ｍｇ／ｍＬ、４℃で２週間保管された）をＢＤＢ中で１０ｎＭに希釈し、その後、希釈緩衝液（ＤＢ、５０ｍＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．０＋０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中で、５、２．５、１．２５、０．６２、０．３１および０．１６ｎＭと下がるように、連続的に希釈した（２５０μＬ＋２５０μＬ）。ブロッキングされたプレートを、上のように、ＷＢを用いて洗浄し、そして希釈されたＧＡＬＮＳサンプルをウェルに二連で、１００μＬ／ウェルで分配し、そしてＲＴで１時間インキュベートした。このインキュベーション工程の間、２ｍＭの活性基質を、１００ｍＭの６Ｓ−ガラクトース−４ＭＵストック（Ｈ２Ｏ中で保管、−２０℃）の０．１ｍＬを５ｍＬのＤＢ中に希釈することによって調製し、そして３７℃の水浴において、予め温めた。インキュベーション後、プレートを、上のように、ＷＢを用いて２回洗浄し、そして１００μＬの希釈された基質を添加し、そしてＧＡＬＮＳ比活性を決定した。
【０２８０】
このアッセイを用いたとき、精製されたＧＡＬＮＳは、単一部位での結合に基づき、Ｍ６Ｐ受容体への結合について２．４ｎＭのＫｄを有した。
【０２８１】
マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体カラム結合。ＧＡＬＮＳのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体への結合の能力を、カラム結合アッセイにおいて決定した。Ｍ６Ｐ受容体カラムを、製造業者の指示書に従って調製した。Ｍ６Ｐ受容体は、Ｐｅｔｅｒ  Ｌｏｂｅｌの研究室に由来し、カラムレジンはＮＨＳで活性化されるレジン（Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １５）であり、そしてカラムの大きさは０．７ｍＬであった。Ｍ６Ｐ受容体カラムを、０．２５ｍＬ／分の流速で、１０カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液（ＥＱ、５ｍＭのβ−グリセロリン酸、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、５ｍＭのグルコース−１−リン酸および０．０２％のＮａＮ３含む酸性ＰＢＳ、ｐＨ６．０）を用いて平衡化した。６μｇの精製されたＧＡＬＮＳ（２００μｌ当たり）を、０．１ｍＬ／分の流速で、Ｍ６Ｐ受容体カラムに充填した。結合していないＧＡＬＮＳを０．２５ｍＬ／分の流速で、１０ＣＶのＥＱを用いてカラムから洗い落とした。結合しているＧＡＬＮＳを、０〜１００％の溶出緩衝液（ＥＬ、５ｍＭのβ−グリセロリン酸、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、５ｍＭのマンノース−６−リン酸および０．０２％のＮａＮ３を含む酸性ＰＢＳ、ｐＨ６．０）（１０ＣＶ）勾配とその後の２ＣＶの１００％のＥＬを用いて、カラムから溶出した。カラムを３ＣＶのＥＱを用いて再平衡化した。
【０２８２】
ＧＡＬＮＳのＥＬＩＳＡを用いて、Ｍ６Ｐ受容体に結合した、精製されたＧＡＬＮＳのパーセントを５６％と決定した。
【０２８３】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）による全オリゴ糖分析。ＧＡＬＮＳにおけるマンノース−６−リン酸化のレベルを決定するために、ＧＡＬＮＳにおける全オリゴ糖のＮ結合型炭水化物のプロファイルを、Ｍａら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１（２２）：５１８５−５１９２，１９９９において記載されたように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。この方法は、アスパラギンのＮ結合型オリゴ糖を切断するためにＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いた。切断されたオリゴ糖を単離し、そして蛍光色素を用いて誘導体化し（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）、そして余分の色素を除去するためにＧ１０スピンカラムに入れた。この精製され、蛍光で標識されたオリゴ糖を電気泳動で分離し、そしてピークをＭＤＱ−ＣＥソフトウェア（３２  Ｋａｒａｔ  Ｖｅｒ．７．０）を用いてその後定量化した。
【０２８４】
このアッセイを用いたとき、精製されたＧＡＬＮＳについての、ビスリン酸化されたマンノース７（ＢＰＭ７）、モノリン酸化されたマンノース６（ＭＰＭ６）およびオリゴ糖を含むシアリン酸の量は、それぞれ、０．５８ｍｏｌ／モル酵素、０．０８ｍｏｌ／ｍｏｌ酵素および検出不能であった。ＢＰＭ７を含むＧＡＬＮＳタンパク質のパーセントを２９％と見積もった。
【０２８５】
ビス７オリゴ糖の特徴付け。ＧＡＬＮＳ上のビスリン酸化されたマンノース７（ＢＰＭ７）オリゴ糖の位置を決定した。位置１７８のアスパラギン（Ａｓｎ）残基はＢＰＭ７に対し、Ｎ結合型でグリコシル化した。位置３９７のＡｓｎ残基は、ＢＰＭ７に対しＮ結合型でグリコシル化しなかったが、これは、主にオリゴマンノース型の糖であると見出した。
【０２８６】
ヒドロキシアパタイト親和性。インビトロの骨組織モデルを、ＧＡＬＮＳが骨組織にターゲッティングする能力を有するか否かを決定するために開発した。４ｍｇ／ｍＬのＨＴＰ−ＤＮＡグレードヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）懸濁物を調製し、そしてＤＢＳ＋５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４の中で平衡化した。５０μｇ／ｍＬのＢＳＡの添加後、精製されたＧＡＬＮＳをＤＢＳ、ｐＨ７．４の中で脱塩した。脱塩したＧＡＬＮＳ（約２ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、９６ウェルプレートにおいて、ＤＢＳ＋５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４の中で連続的に希釈した。５０μＬの連続的に希釈したＧＡＬＮＳを、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ♯ＭＳＧＶＮ２２１０、親水性ＰＶＤＦ、タンパク質低結合性、２２μｍの孔の大きさ）に移した。５０μＬのヒドロキシアパタイト懸濁物を、連続的に希釈したＧＡＬＮＳを含むフィルタープレートのウェルに添加し、そして穏やかに振り動かしながら３７℃で１時間インキュベートした。プレートを吸引（ｖａｃｕｕｍ）濾過にかけた。
【０２８７】
吸引フィルターの上清を、上に記載されたように、ＨＰＬＣまたはＧＡＬＮＳ酵素活性のいずれかによって分析した。精製されたＧＡＬＮＳは、ヒドロキシアパタイトについて３〜４．０μＭのＫｄを有した。
【０２８８】
ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現するＧ７１Ｓ細胞株は、より高い量の活性化（すなわち、活性部位のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への変換）を有する、リソソームスルファターゼ酵素を生産する。
【０２８９】
Ｇ７１Ｓ細胞においてＳＵＭＦ１と共発現される、精製された組換え型リソソームスルファターゼ酵素（例えば、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））が増強された活性化を示すかどうかを決定するために、精製されたリソソームスルファターゼ酵素における、活性部位のシステイン残基のＦＧｌｙへの変換の量を決定した。
【０２９０】
ＧＡＬＮＳの活性化。ＧＡＬＮＳのパーセント活性化（すなわち、活性部位のシステイン（Ｃｙｓ）残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）へのパーセント変換）を、ＬＣ／ＭＳ（ＴＦＡ）によって決定した。Ｃｙｓ、ＦＧｌｙおよびＧｌｙについてのＴＩＣ／１０００は、それぞれ、３９、１８４０および１８３であり、これは、精製されたＧＡＬＮＳの約９０％が活性な（すなわち、ＦＧｌｙ）形態であることを示す。
【０２９１】
概略。表７は、Ｇ７１Ｓクローン４細胞において発現された、組換え型ＧＡＬＮＳの特徴付けの概略を示す。表８は、Ｇ７１ＳクローンＣ２細胞において発現された、組換え型ＧＡＬＮＳの特徴付けの概略を示す。
【０２９２】
【表７】
0005687069.tif 000009
【０２９３】
【表８】
0005687069.tif 000010
これらの結果は、精製された組換え型ヒトＧＡＬＮＳが、高レベルの活性化および高レベルのマンノース６−リン酸のリン酸化を有することを実証する。このように、ＳＵＭＦ１およびリソソームスルファターゼ酵素（すなわち、ＧＡＬＮＳ）を共発現するＧ７１Ｓ細胞は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を効率的に生産する。そのようなリソソームスルファターゼ酵素における高マンノース残基の増強されたレベルは、細胞上のＭＰＲによる、増強された取込みを導く。
【０２９４】
（実施例ＶＩＩ）
インビトロにおける、モルキオ軟骨細胞への組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の取込みおよび活性
インビトロにおいて、モルキオ軟骨細胞のリソソームによる組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の取込み、およびＧＡＬＮＳのケラタン硫酸（ＫＳ）を分解する能力を評価した。
【０２９５】
ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ、モルキオ症候群）を有する患者由来の軟骨細胞は、低減したＧＡＬＮＳ活性を有し、かつＫＳのリソソーム蓄積を示す。ＭＰＳ  ＩＶａのインビトロモデルを、ＭＰＳ  ＩＶａ患者の腸骨稜生検から単離された軟骨細胞を用いて樹立した。しかしながら、初代軟骨細胞は脱分化し、そして培養中に軟骨細胞の特性を失う。したがって、培養条件を、インビトロで軟骨細胞の分化を誘導するために確立した。
【０２９６】
ＭＰＳ  ＩＶａ患者から単離された軟骨細胞（ＭＱＣＨと示される）を、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β、トランスフェリン、インスリンおよびアスコルビン酸（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｏｎｚａ♯ＣＣ−３２２５）の存在下で、アルギネートビーズ中で培養した。培地を、６週から１５週にかけて、実験期間の間１週間に２度取り替えた。これらの培養条件は、軟骨細胞の表現型の発現および分化を誘導した。これらのＭＱＣＨ細胞は、ＭＱＣＨ細胞の培養から単離されたＲＮＡを用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定されるとき、軟骨細胞マーカー（性決定領域Ｙ−ｂｏｘ  ９（Ｓｏｘ  ９）、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＸ、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質およびアグレカン（ａｇｇｒｅｇａｎ）のｍＲＮＡを含む）を発現した。これらの培養されたＭＱＣＨ細胞はまた、細胞外のマトリックスを合成した。
【０２９７】
共焦点顕微鏡検査を、ＭＱＣＨ細胞がＫＳを蓄積したことを確認するために行った。８週の培養におけるＭＱＣＨ細胞を、トリプシン処理し、スライドガラス上にサイトスピンし（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）、アセトン中で固定し、そして使用まで冷凍した。解凍後、細胞を再水和し、そして一次抗体および二次抗体として、抗ＫＳモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびＡｌｅｘａ−４８８（緑）が結合体化したヤギ抗ウサギ抗体をそれぞれ用いて染色した。ＭＱ−ＣＨ細胞は、リソソームのＫＳ蓄積と一致する、点状の細胞内染色を表した。
【０２９８】
精製された組換え型ヒトＧＡＬＮＳがＭＱＣＨ細胞によってリソソームに取込まれ得、そしてＫＳを分解し得るか否かを決定するため、６週のＭＱＣＨ細胞培養物を、９週間の間、週に２回、１０ｎＭの組換え型ヒトＧＡＬＮＳと共にインキュベートした。ＧＡＬＮＳの取込みおよびＫＳの除去を共焦点顕微鏡検査によって測定した。使用した一次抗体は：（ａ）抗ＧＡＬＮＳウサギポリクローナル抗体および抗リソソームに付随した膜タンパク質（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）−１（ＬＡＭＰ−１）モノクローナル抗体、または（ｂ）抗ＫＳモノクローナル抗体および抗ＬＡＭＰ−１ポリクローナル抗体であった。使用した二次抗体は：抗ＧＡＬＮＳ抗体もしくは抗ＫＳ抗体を検出するためのＡｌｅｘａ−４８８（緑）が結合体化した抗体、または抗ＬＡＭＰ−１抗体を検出するためのＡｌｅｘａ−５５５もしくは−５９４（赤）が結合体化した抗体であった。ＭＱＣＨ細胞調製物をＤＡＰＩ（これは核を染色する）を含む包理剤（ｍｏｕｎｔａｎｔ）中でマウントした。
【０２９９】
ＧＡＬＮＳ酵素およびＫＳとリソソームマーカー（ＬＡＭＰ−１）との顕著な共局在化（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を、ＧＡＬＮＳで処理したＭＱＣＨ細胞において観察した。ＭＱＣＨの組換え型ヒトＧＡＬＮＳへの曝露に際し、細胞内ＫＳの量が減少した。
【０３００】
ＧＡＬＮＳ取込みをまた、ＧＡＬＮＳ酵素キャプチャーＥＬＩＳＡおよびＧＡＬＮＳ比活性ＥＬＩＳＡ（両方とも上記の実施例ＩＶに記載）を用いて測定した。正常なヒト軟骨細胞（ＮＨＫＣ）（これはＧＡＬＮＳを発現する）をポジティブコントロールとして用いた。表９および１０に示されるように、処理されていないＭＱＣＨ細胞は、検出可能なＧＡＬＮＳ酵素も活性も有しなかったが、一方、１０ｎＭのＧＡＬＮＳを用いて９週間処理したＭＣＱＨ細胞は、有意なＧＡＬＮＳ酵素および活性を有した。
【０３０１】
【表９】
0005687069.tif 000011
ａ検出しなかった；ｂｎｇ  ＧＡＬＮＳ抗原／μｇ  全タンパク質
【０３０２】
【表１０】
0005687069.tif 000012
ａ検出しなかった；ｂＧＡＬＮＳ活性／ｎｇ  抗原  。
【０３０３】
これらの結果は、インビトロで、精製された組換え型ヒトＧＡＬＮＳがモルキオ軟骨細胞によってリソソームに取込まれ、そしてリソソームのＫＳを分解し得ることを実証する。これらのモルキオ軟骨細胞は、ＧＡＬＮＳ（これは、ＫＳを分解する）などのリソソームスルファターゼ酵素を試験するためのインビトロ効能モデルとして有用である。
【０３０４】
（実施例ＶＩＩＩ）
インビトロの細胞ベースのアッセイにおける、天然の基質を分解する組換え型ヒトリソソーム酵素の活性
細胞ベースのインビトロアッセイを、天然の基質を分解する組換え型ヒトリソソーム酵素（例えばリソソームスルファターゼ酵素）の活性を測定するために開発した。
【０３０５】
組換え型ヒトリソソーム酵素（例えば、リソソームスルファターゼ酵素）の酵素活性を、代表的には、人工の蛍光原基質を用いる、セルフリー（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）のインビトロアッセイによって測定する（ＧＡＬＮＳについては実施例４を参照のこと）。しかしながら、測定される酵素活性は、人工の基質の大きさ（すなわち、単糖類単位の数）に依存する。加えて、酵素活性を、インビボの状態を反映しない環境において測定する。したがって、このセルフリーのインビトロアッセイは、リソソーム酵素の天然の基質を切断する能力も、リソソーム酵素の標的細胞に取込まれそしてリソソームに局在する能力のいずれも、考慮に入れていない。
【０３０６】
細胞ベースのインビトロアッセイを、２種の組換え型ヒトリソソーム酵素であるα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）およびアリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）が、それらの天然の基質（すなわち細胞内のデルマタン硫酸（ＤＳ）含有基質）を分解する活性を測定するために開発した。ＤＳは、変動的に硫酸化されたイズロン酸β（１−３）−Ｎ−アセチル−ガラクトサミンβ（１−４）二糖類単位を含む。
【０３０７】
ＡＲＳＢが不足したＧＭ００５１９ヒト線維芽細胞またはＩＤＵが不足したＧＭ０１３９１ヒト線維芽細胞を、１２ウェルプレートにおいて密集するまで（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）培養し、そしてこの培養物を、細胞内のＤＳの蓄積を可能にするために、３〜６週間、密集後維持した。
【０３０８】
密集後のＧＭ００５１９細胞またはＧＭ０１３９１細胞を、その後、飽和用量の組換え型ヒトＡＲＳＢ（１０ｎＭ）または組換え型ヒトＩＤＵ（２５ｎＭ）のそれぞれに４〜５日間曝露した。処理していない細胞およびリソソームスルファターゼ酵素で処理した細胞を収集し、溶解し、そして遠心分離した。
【０３０９】
細胞溶解産物中のリソソーム酵素活性を：（１）細胞を溶解すること；（２）細胞溶解産物において、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（ＥＣ４．２．２．４）を用いてＤＳ含有基質を二糖類に特異的に消化すること；（３）蛍光色素（例えば、２−アミノ−アクリドン、ＡＭＡＣ）を用いてＤＳ二糖類を標識すること；（４）ＤＳ二糖類を分離すること（例えば、キャピラリーゾーン電気泳動、ＣＺＥによって）；および（５）標識されたＤＳ二糖類を検出すること（例えば、レーザーで誘導される蛍光、ＬＩＦによって）によって、細胞の残余のＤＳ含有量を決定することにより測定した。そのような方法を、例えば、Ｚｉｎｅｌｌｕら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２：２４３９−２４４７，２００７、およびＬａｍａｒｉら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ７３０：１２９−１３３，１９９９において記載する（Ｖｏｌｐｉら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２９：３０９５−３１０６，２００８において概観する）。
【０３１０】
表１１は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸（４Ｓ二糖類）を含む二糖類（これは優勢なＤＳ二糖類である）の量を測定することによって決定されるときの、ＡＲＳＢを用いて処理されたＧＭ００５１９細胞を用いる、ＤＳのパーセント分解を示す。類似した結果を、ＩＤＵを用いて処理されたＧＭ０１３９１細胞を用いて取得した。
【０３１１】
【表１１】
0005687069.tif 000013
ａパーセント分解を、ＡＲＳＢで処理された細胞由来の溶解産物におけるＣＺＥ−ＬＩＦスキャンにおいて検出された、４Ｓ二糖類の曲線下の領域を、処理されていない細胞由来のものと比較して測定することによって計算した。
【０３１２】
上記のアッセイは、標的細胞が組換え型ヒトＡＲＳＢおよびＩＤＵを取込み、これらが、その後リソソームに局在し、そこで、これらの天然の基質（細胞内ＤＳ）分解することを示した。
【０３１３】
用量発見実験（ｄｏｓｅ  ｆｉｎｄｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を、ＩＤＵがこの細胞ベースのアッセイにおいて律速になる濃度を決定するために行った。ＧＭ０１３９１細胞を、１２ウェルプレートにおいて培養した。密集から４週間後に、細胞を、６または２６時間の間、種々の濃度のＩＤＵ（０．８ｎＭから２５ｎＭ）に曝露した。細胞溶解産物を、上に記載されたように調製しそして処理した。ＩＤＵは、１ｎＭ未満で律速にならないと決定した。
【０３１４】
第二の用量発見実験において、密集から３週間後のＧＭ０１３９１細胞を、２日間の間、種々の濃度のＩＤＵ（０．０１から０．２ｎＭ）に曝露した。細胞溶解産物を上に記載されたように調製しそして処理した。この実験において、既知量の内部標準単糖類（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｓ）を、処理の間の回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を制御するために細胞溶解産物に添加（ｓｐｉｋｅ）した。図１１において示されるように、ＤＳ基質の量における用量依存的減少を、ＩＤＵで処理したＧＭ０１３９１細胞において観察した。
【０３１５】
同様の用量発見実験において、密集から３週間後のＧＭ００５１９細胞を、５日間の間、種々の濃度のＡＲＳＢ（０．００１から０．０６ｎＭ）に曝露した。細胞溶解産物を上に記載されたように調製しそして処理した。この実験において、既知量の内部標準単糖類（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｓ）を、処理の間の回収を制御するために細胞溶解産物に添加した。図１２において示されるように、ＤＳ基質の量における用量依存的減少を、ＡＲＳＢで処理したＧＭ００５１９細胞において観察した。
【０３１６】
細胞ベースのインビトロアッセイを、天然の基質（すなわち、細胞内のケラタン硫酸（ＫＳ）含有基質）を分解する、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素（ＧＡＬＮＳ）の活性を測定するために開発した。
【０３１７】
ＧＡＬＮＳが不足しているＭＱＣＨ細胞を、上記の実施例７において記載されるように培養し、そして１または１０ｎＭの組換え型ヒトＧＡＬＮＳを用いて処理した。処理後、ＭＱＣＨ細胞溶解産物を調製し、そしてケラタナーゼＩＩ（ＥＣ３．２．１）を用いて消化した（これは大きなＫＳオリゴ糖をＫＳ二糖類に分解する）。このＫＳ二糖類を、ＤＳ二糖類について上に記載されたように、ＡＭＡＣを用いて標識し、ＣＺＥによって分離し、そしてＬＩＦによって検出した。ＧｌｃＮＡｃ−６Ｓ（ＫＳ単糖類）を、処理の間の回収を制御するために、内部標準として、細胞溶解産物に添加した。２種の特徴的なＫＳ二糖類（Ｇａｌ６Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ６ＳおよびＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ）の量を測定し、そしてその取得したデータを、回収されたＧｌｃＮＡｃ６Ｓの量で補正した。表１２は、２種の特徴的なＫＳ二糖類の量を測定することによって決定されるときの、ＧＡＬＮＳで処理されたＭＱＣＨ細胞を用いた、ＫＳのパーセント分解を示す。
【０３１８】
【表１２】
0005687069.tif 000014
ａ，ｂパーセント分解を、ＧＡＬＮＳで処理されたＭＱＣＨ細胞由来の溶解産物におけるＣＺＥ−ＬＩＦスキャンにおいて検出される、Ｇａｌ６Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ６ＳおよびＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓの曲線下の面積を、処理されていないＭＱＣＨ細胞由来のものと比較して測定すること、および添加したコントロールのＧｌｃＮＡｃ６Ｓの曲線下の面積について調節することによって計算した。
【０３１９】
上記のアッセイは、標的細胞が組換え型ヒトＧＡＬＮＳを取込み、これが、その後リソソームに局在し、そこでＧＡＬＮＳがその天然の基質（細胞内ＫＳ）を分解したことを示した。
【０３２０】
全体として、これらの結果は、組換え型ヒトリソソーム酵素（ＡＲＳＢ、ＩＤＵおよびＧＡＬＮＳ）が、これらの天然の基質を分解する活性を、細胞ベースのインビトロアッセイにおいて測定および定量化し得ることを実証した。この細胞ベースのインビトロアッセイを、他のリソソームスルファターゼ酵素ならびに幅広く多様な組換え型リソソーム酵素の活性を測定および定量化するために、容易に変更し得ることを正しく認識すべきである。
【０３２１】
（実施例ＩＸ）
特定の組織への組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の送達
Ｇ７１細胞において発現そして精製された組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）が、マウスへの投与に際し、ＧＡＬＮＳの欠乏に影響されるか、またはそれに関連する特定の組織へ送達される能力を評価した。
【０３２２】
ケラタン硫酸の高度に特異的な分布は、ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶＡ）またはモルキオ症候群の非常に特徴的な表現型を与える。ケラタン硫酸は、もともと、軟骨（骨組織骨端軟骨板の連結、心臓弁、喉頭および鼻中隔）および角膜において見出され、そしてＭＰＳ  ＩＶＡ患者においてケラタン硫酸の蓄積を示すのは、これらの組織である。したがって、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）（これはＭＰＳ  ＩＶＡまたはモルキオ症候群において不足している）に関して、長骨の骨端軟骨板、心臓弁、角膜、喉頭および鼻へのＧＡＬＮＳ酵素の送達を示すことは重要である。これらの特定の組織（これらは、十分に血管化されていない標的である）を調べるため、蛍光ＧＡＬＮＳの送達をマウスにおいて調査した。
【０３２３】
２つの免疫組織化学的染色方法を、マウスにおいて試験した：（１）Ａｌｅｘａ  ４８８が結合体化したヒトＧＡＬＮＳおよび（２）結合体化されていないヒトＧＡＬＮＳ。ヒトＧＡＬＮＳのＡｌｅｘａ  ４８８への結合体化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｃ５マレイミド標識キット（Ａ−１０２５４）を用いて行った。マレイミド結合体化化学は、結果として、１：１の標識対タンパク質の比を生じた。
【０３２４】
蛍光タグがＧＡＬＮＳの取込みを妨げなかったことを確認するため、免疫細胞学実験を、培養された滑膜細胞（ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ−１８３２）を用いて行った。標準取込みアッセイを、結合体化されていないＧＡＬＮＳと結合体化したＧＡＬＮＳ（ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８またはＧＡＬＮＳ−Ａ５５５）とを比較するために用いた。細胞を、ＧＡＬＮＳ酵素と共に４時間インキュベートし、その後、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）を用いて２時間追跡した。この結果は、Ａｌｅｘａ  ４８８の結合体化が、細胞内への取込みを妨げなかったことを示した。図１３は、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８、およびＧＡＬＮＳ−Ａ５５５についての、推定されるＫｄを示す。標識が、酵素を不活性化したので、この取込みを、酵素活性ではなく細胞溶解産物の抗原ＥＬＩＳＡによって測定した。結合体化されていないＧＡＬＮＳ酵素および結合体化したＧＡＬＮＳ酵素のＫｄを、ほとんど同等であると決定した。
【０３２５】
一旦、ＧＡＬＮＳ酵素を細胞中に組込んだなら、蛍光タグの安定性を決定するために、結合体化されていないＧＡＬＮＳおよび結合体化したＧＡＬＮＳについての免疫染色を行った。この染色のために用いられた一次抗体は、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇで精製された１μｇ／ｍＬの濃度の抗ＧＡＬＮＳウサギ抗体であった。全てのイメージを、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いた、Ｌｅｉｃａ  ＩＲＥ２広視野落射蛍光（ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ  ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）顕微鏡上で取得した。面外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｌａｎｅ）光の存在のため、イメージスタックのデコンヴォルーションを、これらのイメージにおいて共局在を測定するために必要とした。このデコンヴォルーションを、理論的点拡散関数（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（ブラインドアルゴリズム（ｂｌｉｎｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ））を用いたＡｕｔｏＱｕａｎｔ／ＡｕｔｏＤｅｂｌｕｒ可視化ソフトウェアを使用して行った。
【０３２６】
この免疫染色は、ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８物質によって増幅されたシグナルと、かなりよいオーバーラップを示した。感度において観察された上昇は、一次抗体および二次抗体がともにポリクローナルであることに起因した。
【０３２７】
ＧＡＬＮＳ酵素がリソソームにターゲッティングしたかどうかを決定するために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒまたはリソソームに局在する別の酵素を用いて、培養された滑膜細胞の免疫染色を行った。Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒは、ＧＡＬＮＳ−４８８酵素との多少のオーバーラップを示しているようだった；しかしながら、この染色は均一ではなかった。組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトースアミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）（リソソーム酵素）を用いた２時間の追跡は、ＧＡＬＮＳとの多少の共局在を示した。
【０３２８】
上記の実験は、ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８酵素が細胞によって取込まれ、そしてリソソームに局在すること、かつ、ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８酵素をインビボでの生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を決定するために用い得ることを示した。
【０３２９】
２つのインビボ研究を行った。第一の予備的研究は、正常なＢａｌｂ／ｃマウスの尾の静脈への単一用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のボーラス注射であり、その後の、第二の研究は、正常なＢａｌｂ／ｃマウスの尾の静脈への１０ｍｇ／ｋｇの一日おきの複数回（５回）注射であった。表１３および表１４２は、それぞれ、第一の研究および第二の研究についての実験計画を記載する。
【０３３０】
【表１３】
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【０３３１】
【表１４】
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第一の予備的研究において、心臓、肝臓および脛骨／大腿関節を、２時間および２４時間の時点で収集した。第二の研究において、心臓、腎臓、肝臓、ならびに四頭筋およびヒラメ筋を有する骨組織を、２時間、４時間および８時間の時点で収集した。両方の研究において、心臓、腎臓、および肝臓を、４日間、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で液浸固定し、パラフィン包埋し、その後、７μｍの厚さで薄片にした。骨組織（第二の研究における筋肉を含む）を、８日間、４％のＰＦＡ中で液浸固定し、脱石灰し、パラフィン包埋し、そして７μｍの厚さで薄片にした。
【０３３２】
ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８が注射されたマウスのイメージを、Ｚｅｉｓｓレーザー走査共焦点顕微鏡上で取得した。第一の予備的研究における分析のため、サンプル当たり、１つの共焦点のスタックを心臓弁および肝臓について取得し、そして容量分析に用いた。２つの共焦点のスタック／サンプルを骨端軟骨板について取得し、そして容量分析に用いた。第二の研究において、心臓弁、腎臓および肝臓についての１つの共焦点のスタック／サンプルを取得し、そして容量分析に用いた；骨端軟骨板および残余の軟骨の領域（ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｒｅｓｔ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）（ｚｒｃ）についての２つの共焦点のスタック／サンプルを取得し、そして容量分析に用いた。
【０３３３】
共焦点顕微鏡での画像化の研究からの結論は：（１）インビボで蛍光ＧＡＬＮＳを検出することが可能であった；（２）シグナルは特異的であり（バックグラウンドが無い）、かつ、その局在はリソソームであった；（３）ＧＡＬＮＳの存在を、肝臓中の洞様毛細血管の細胞において実証した；（５）心臓において、ＧＡＬＮＳ酵素は中隔および心房において存在するが、より重要なことに、ＧＡＬＮＳ酵素は心臓弁のレベルにおいて（ここにおいて、ＧＡＬＮＳ酵素は、複数回の注射後、より強く分布していた）、明らかに可視であった；（６）大腿／脛骨接合部において、ＧＡＬＮＳ酵素は、骨組織の鉱化された部分（骨端）、ならびに骨髄において存在した、であった。ＧＡＬＮＳは骨端軟骨板において存在した。さらにとりわけ、ＧＡＬＮＳは、残余の領域の軟骨細胞（または貯蔵軟骨の領域）において豊富であり、増殖性の領域の最初の部分に存在し、そして骨端軟骨板の末端における骨形成の領域において再び豊富に現れた。複数回の注射の累積的な効果を定量化することは困難であるが、第二の研究は、より広い分布を示していると思われた。表１５は、共焦点顕微鏡での画像化の研究の概略を示す。
【０３３４】
【表１５】
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二次染色のため、最初の工程は、ＧＡＬＮＳ一次抗体の最適化であった。種々の組織をｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇで精製された抗ＧＡＬＮＳウサギ抗体を用いた１：１００から１：４００の希釈物を用いて染色した。第一の予備的研究の結果は、１：１００の希釈が、高いシグナル対ノイズ比にとって最適であったことを示した。この結果を、第二の研究において確認した。残余のスライドを、１：１００の一次抗体の希釈および１：１０００の二次抗体の希釈で処理した。
【０３３５】
ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇで精製された抗ＧＡＬＮＳ抗体を用いて染色した場合、ＧＡＬＮＳを投与されたＢａｌｂ／ｃマウスについてのシグナルは、コントロール（すなわち、ＰＢＳ−Ｃｙｓが投与されたマウス）よりも高いシグナルを有した。ＧＡＬＮＳ酵素がリソソームに局在したことを確認するため、切片を抗ＬＡＭＰ１抗体を用いて染色した。ＬＡＭＰ１は、リソソームについてのマーカーである。このイメージは、抗ＬＡＭＰ１抗体と抗ＧＡＬＮＳ抗体との間でのオーバーラップを示し、これは、ＧＡＬＮＳ酵素がリソソームに局在したことを示した。
【０３３６】
全体として、２つのインビボ研究は、ＧＡＬＮＳの生体内分布が血管新生と関連づけられる（すなわち、より血管化された組織が、より多くの蛍光シグナルを含む）ことを示す。さらに重要なことには、この研究は、モルキオ症候群におけるケラタン硫酸蓄積の部位は血管化が不十分であるとしても、これらの部位におけるＧＡＬＮＳの存在を実証する。
【０３３７】
（実施例Ｘ）
リソソームスルファターゼ酵素活性が不足しているマウスにおける、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）および他のリソソームスルファターゼ酵素の効果
リソソームスルファターゼ酵素活性が不足しているマウスにおける、本発明の高度にリン酸化された活性なヒトリソソームスルファターゼ酵素（例えば、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））の効果を評価する。
【０３３８】
組換え型ヒトＧＡＬＮＳタンパク質を、Ｇ７１Ｓ細胞で発現させ、そして精製する。他の組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を、基本的には本明細書に記載された方法にしたがって、または当該分野で公知の手順によって、発現そして精製し得る。
【０３３９】
ヒトリソソームスルファターゼ酵素欠乏のいくつかのマウスモデルをすでに記載しており：それらは、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）（アリールスルファターゼＡ欠乏）（Ｈｅｓｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４８２１−１４８２６，１９９６）、ムコ多糖体症ＶＩ型（ＭＰＳ  ＶＩ）またはマロトー−ラミー症候群（アリールスルファターゼＢ欠乏）（Ｅｖｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８２１４−８２１９，１９９６）、ムコ多糖体症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）またはハンター症候群（イズロン酸−２−スルファターゼ欠乏）（Ｍｕｅｎｚｅｒら，Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｐｐｌ．９１（４３９）：９８−９９，２００２；Ｃａｒｄｏｎｅら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１２２５−１２３６，２００６）、ムコ多糖体症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ  ＩＩＩａ）またはサンフィリポＡ症候群（スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ欠乏）（Ｂｈａｕｍｉｋら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１２）：１３８９−１３９６，１９９９）、ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群（Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ欠乏）（Ｔｏｍａｔｓｕら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３４９−３３５８，２００３）、および多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）（スルファターゼ調節因子１欠乏）（Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：４５０６−４５１１，２００７）を含む。ムコ多糖体症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ  ＩＩＩｄ）またはサンフィリポＤ症候群（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ欠乏）のマウスモデルは、まだ、記載されていない。
【０３４０】
ヒトリソソームスルファターゼ酵素欠乏のマウスモデルを、リソソーム蓄積障害を処置するための手段としての、酵素置換療法（ＥＲＴ）の実行可能性を評価するために使用し得る。例えば、ＭＰＳ  ＩＶａノックアウトマウス（ＧＡＬＮＳ−／−マウス；Ｔｏｍａｔｓｕら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３４９−３３５８，２００３）は、検出可能なＧＡＬＮＳ酵素活性を有さず、そして尿のムコ多糖類（ＧＡＧ）（すなわち、ケラタン硫酸およびコンドロイチン−６−硫酸）の上昇、ならびに多数の組織および器官（例えば、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、脳、骨髄および軟骨）におけるＧＡＧの蓄積を示す。しかしながら、このＧＡＬＮＳ−／−マウスは、ヒト疾患と関連付けられる、骨格異常を示さない。不活性なヒトＧＡＬＮＳおよび変異させられた不活性な内因性のマウスＧＡＬＮＳを発現する、別のＭＰＳ  ＩＶａマウスモデルを開発した（ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ  マウス；Ｔｏｍａｔｓｕら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３３２１−３３３５，２００５）。ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウス（これは検出可能なＧＡＬＮＳ酵素活性を有さない）においては、尿のＧＡＧ排出が上昇し、ＧＡＧが多数の組織（内臓器官、脳、角膜、骨組織、靭帯および骨髄を含む）において蓄積し、リソソーム蓄積が多数の組織において示され、そして骨組織蓄積が明らかである。ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスにおける病理学的変質は、ＧＡＬＮＳ−／−マウスにおいて観察されるものと異なる。しかしながら、ＧＡＬＮＳ−／−マウスと同様に、ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスは、ヒト疾患と関連付けられる、骨格異常を示さない。したがって、ＧＡＬＮＳ−／−マウスまたはＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスを、尿のＧＡＧの上昇および上記の組織におけるＧＡＧの蓄積に対する、組換え型ヒトＧＡＬＮＳの投与の効果を調査するために使用し得る。
【０３４１】
４週間が経過したＧＡＬＮＳ−／−マウス、ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスまたは野生型マウスに、１６〜２０週齢の間、週に１回、組換え型ヒトＧＡＬＮＳ（例えば、０．１、０．３、１、３、１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルコントロールの種々の用量の静脈内注射（１群当たり、ｎ＝少なくとも６または８）を与え、その後、これらのマウスを組織学的検査のために犠牲にする。尿をマウスから収集し、そして尿のＧＡＧ排出を、記載されたように決定する（Ｔｏｍａｔｓｕら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３４９−３３５８，２００３）。種々の組織の病理学的検査を、記載されたように行う（Ｔｏｍａｔｓｕら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３４９−３３５８，２００３）。
【０３４２】
ＧＡＬＮＳ−／−マウスまたはＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスを用いて、本発明の組換え型ヒトＧＡＬＮＳが：（１）尿のＧＡＧ排出；（２）多数の組織（例えば、内臓器官、脳、角膜、骨組織、靭帯および骨髄）におけるＧＡＧの蓄積；（３）多数の組織におけるリソソーム蓄積；ならびに（４）骨組織の蓄積を低減する能力を実証することが予想される。
【０３４３】
組換え型ヒトＧＡＬＮＳの効果を、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）のマウスモデル（ＳＵＭＦ１−／−マウス；Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：４５０６−４５１１，２００７）において調査する。ＳＵＭＦ１−／−マウスは、寿命の初期において頻繁に死亡を示すため、組換え型ヒトＧＡＬＮＳを用いたこれらのマウスへの注射を、ＧＡＬＮＳ−／−マウスに関して上に記載したときよりも早く始める。
【０３４４】
当該分野で公知の手順に従って、他の組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素（すなわち、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、イズロン酸−２−スルファターゼ、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、およびＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ）の効果を、ＭＬＤのマウスモデル（ＡＳＡ−／−マウス；Ｈｅｓｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４８２１−１４８２６，１９９６）、ＭＰＳ  ＶＩのマウスモデル（Ａｓ１−ｓ−／−マウス；Ｅｖｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８２１４−８２１９，１９９６）、ＭＰＳ  ＩＩのマウスモデル（ｉｄｓｙ／−マウス；Ｃａｒｄｏｎｅら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１２２５−１２３６，２００６）、ＭＰＳ  ＩＩＩａのマウスモデル（Ｂｈａｕｍｉｋら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１２）：１３８９−１３９６，１９９９）およびＭＳＤのマウスモデル（ＳＵＭＦ１−／−マウス；Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：４５０６−４５１１，２００７）において調査する。
【０３４５】
（実施例ＸＩ）
組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）および他のリソソームスルファターゼ酵素を用いた、ムコ多糖体症ＩＶＡ型（もしくはモルキオ症候群）または他のリソソームスルファターゼ酵素欠乏を有するヒト患者の処置
リソソームスルファターゼ酵素欠乏の臨床上の表現型が現れているヒト患者（ムコ多糖体症ＩＶＡ型（ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオ症候群）と診断された患者などにおける）が、組換え型酵素（すなわち、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））を用いる酵素置換療法に対して意図される。リソソームスルファターゼ酵素欠乏を有する全ての患者は、特定のリソソーム蓄積症に関連する機能的欠陥の程度が変動すること、または特定のリソソーム蓄積症に関連する健康状態が悪化することによって現されるような、内臓および軟組織のリソソームにおける貯蔵物質の過度のまたは有害な蓄積などの、何らかの臨床的証拠を示す。全てのＭＰＳ  ＩＶａ患者は、機能的欠陥の程度がさまざまである、骨組織の変形、低身長および歩行異常、ならびに／または血液もしくは尿におけるムコ多糖類（ＧＡＧ）の蓄積などの何らかの臨床的証拠を示す。
【０３４６】
好ましくは、酵素レベルを、リソソームスルファターゼ酵素欠乏を有する患者の組織におけるリソソームスルファターゼ酵素の活性の欠如または低減を確認するために、これらの患者においてモニターする。１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満およびさらにより好ましくは１％未満のリソソーム酵素活性を有する患者（その他の点では正常な被験体である）は、適切なリソソームスルファターゼ酵素を用いて処置するための適切な候補である。データを、治療の前、治療の間および治療の後における、患者のリソソームスルファターゼ酵素活性を決定するために収集し得る。
【０３４７】
効能を、時間をわたっての、リソソームスルファターゼ酵素の基質（すなわち、ムコ多糖類（ＧＡＧ））の尿の排出における、パーセンテージ減少を測定することによって決定する。リソソームスルファターゼ酵素欠乏を有する患者における尿のＧＡＧレベルを、正常な排出レベル、および／または同じリソソームスルファターゼ酵素欠乏を有する、処置されていない患者におけるレベル、および／またはリソソームスルファターゼ酵素を用いる治療の前の、同じ患者におけるレベルと比較する。リソソームスルファターゼ酵素を用いる治療後の、分解されていないＧＡＧの排出における、２５％を超える減少、好ましくは５０％を超える減少は、治療への個体の応答を評価するための有効な手段である。
【０３４８】
効能をまた、リソソーム蓄積症に関連する病理学の徴候および症状の低減を基準として、決定し得る。効能を、ＧＡＧがリソソーム、細胞または組織において低減した程度を決定するための、組織生検ならびに細胞および／またはリソソームの検査によって決定し得る。効能を、機能的評価（これは、客観的または主観的であり得る（例えば、痛みまたは機能における障害の低減、筋肉の強さまたは耐久力の増進、心拍出量と運動耐久性の増進、体重、身長または外見における変化、など））によって決定し得る。
【０３４９】
Ｇ７１Ｓ細胞において発現され、精製され、そして当該分野で公知の手順にしたがって処方された、組換え型ヒトＧＡＬＮＳを含む薬学的組成物。本発明の薬学的組成物は、静脈内に投与することが好ましい。
【０３５０】
ＭＰＳ  ＩＶａ患者に対する組換え型ヒトＧＡＬＮＳの投与の効果を調査するための、最初の臨床的研究の基本的なデザインは、非盲検（ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ）、用量増大、安全性／効能研究を含み、これは種々の用量の酵素を、固定された間隔（例としてかつ制限のためではなく、週に１回の酵素注射）で、患者に静脈内に投与する。
【０３５１】
ＭＰＳ  ＩＶａ患者に関して、効能を、例えば、血液または尿のＧＡＧの減少（数週間以内のＥＲＴでおそらく観察される）、心臓の機能、肺の機能および／もしくは運動性の機能の試験における耐久性の増進（数ヶ月以内のＥＲＴでおそらく観察される）ならびに／または、骨格の変化および／もしくは身体の成長（数年以内のＥＲＴでおそらく観察される）を測定することによって決定する。
【０３５２】
時間をわたっての、尿のＧＡＧ排出におけるパーセンテージ減少を測定することによる、尿のＧＡＧ測定は、適切な用量レジメンを確立することならびに効能を決定することに対し有用である。
【０３５３】
種々の耐久性試験を使用し得、これは（例としてかつ制限のためではなく）、歩行試験（６または１２分間に歩いた距離）、階段登り（１分当たりの段）、および肺／呼吸の機能（心臓の機能（ＥＣＧ、心エコー図）、肺の機能（ＦＶＣ、ＦＥＶ１、ピークフロー）を含む）を含む。
【０３５４】
長期間、処置を受けている若い患者に関しては、成長（身長）を測定し得る。
【０３５５】
本発明の方法を用いて処置または予防され得る、リソソームスルファターゼ酵素活性の欠乏に関連したリソソーム蓄積症は：異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、ムコ多糖体症ＶＩ型（ＭＰＳ  ＶＩ）もしくはマロトー−ラミー症候群、ムコ多糖体症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）もしくはハンター症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ  ＩＩＩａ）もしくはサンフィリポＡ症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ  ＩＩＩｄ）もしくはサンフィリポＤ症候群、ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）もしくはモルキオＡ症候群、または多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）である。各リソソーム蓄積症に対し、組換え型リソソームスルファターゼ酵素は、特異的なリソソームスルファターゼ酵素を含む。
【０３５６】
ＭＬＤを含む方法にとって、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡである。ＭＰＳ  ＶＩを含む方法にとって、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＢである。ＭＰＳ  ＩＩを含む方法にとって、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＡを含む方法にとって、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＤを含む方法にとって、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＶＡを含む方法にとって、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼである。ＭＳＤを含む方法にとって、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼである。
【０３５７】
上記の例証のための実施例において説明されたように、本発明の多数の変更および変化は、当業者の心に思い浮かぶと予期される。したがって、添付の特許請求の範囲において明らかであるような制限のみが、本発明に置かれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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