(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の機能的な欠陥または欠乏に関連した出血性障害を持つ哺乳動物の血液中でのＦＶＩＩＩの生体内半減期を延長させるための組成物であって、該組成物は、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子と、
（ｂ）該ＶＷＦ分子に結合した少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子と、を含むタンパク質性分子を含み、
該タンパク質性分子が少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子に対する結合能を有し、該タンパク質性分子の生体内半減期が該ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大し、そして、該タンパク質性分子に結合した該ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期が、ＶＷＦに結合しているが少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子には連結していない該ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期と比較して増大する、組成物。
【請求項２】
前記生理学的に許容可能なポリマー分子は、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）およびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質性分子の生体内半減期が前記ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質性分子の生体内半減期が前記ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子が前記ＶＷＦの糖質残基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、または、リジン残基に結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記タンパク質性分子に含まれる前記ＶＷＦが、ＶＷＦの一次止血における、血小板上の受容体およびコラーゲンに対する結合の生物学的活性を保持する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質性分子に結合した場合、前記ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期が、ＶＷＦに結合しているが少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子には連結していない該ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質性分子に結合した場合、前記ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期が、ＶＷＦに結合しているが少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子には連結していない該ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＶＷＦが組換え産物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血漿のおよび／または組換えフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）を含むタンパク質性構築物に関し、上記ＶＷＦが少なくとも１つの生理学的に許容し得るポリマー分子に結合するとともに、上記タンパク質性構築物と少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質との複合体と結合する。さらに、本発明は、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦの少なくとも１つの機能的な欠陥または不足を伴う出血障害がある哺乳動物の血液でＶＷＦまたはＦＶＩＩＩの生体内半減期を延長する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＶＷＦは、哺乳動物の血漿で存在する多量体付着性糖タンパク質であり、複数の生理機能を持つ。一次止血の間、ＶＷＦは血小板表面上の特異的な受容体とコラーゲン等の細胞外マトリックス成分と間にメディエーターとして働く。さらに、ＶＷＦはプロコアギュラントＦＶＩＩＩ用担体を安定させるタンパク質として働く。ＶＷＦは、２８１３個のアミノ酸からなる前駆体分子として血管内皮細胞および巨核球で合成される。前駆体ポリペチド（プレプロＶＷＦ）は、成熟血漿ＶＷＦで見つかる２２残基シグナルペプチド、７４１残基プロペプチド、および２０５０残基ポリペチドからなる（非特許文献１）。血漿へ分泌されると、ＶＷＦは異なる分子の大きさで多用な種類の形態で循環する。これらのＶＷＦ分子は、２０５０のアミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマーおよびマルチマーからなる。ＶＷＦは、通常、１つのダイマーから最大で５０〜１００のダイマーからなるマルチマーまでのダイマーとして、血漿で見いだされる（非特許文献２）。ヒト血行内のヒトＶＷＦの生体内半減期は、約１２〜２０時間である。
【０００３】
ヒトで最も頻繁に起こる遺伝性出血障害はフォンビルブラント病（ＶＷＤ）であり、血漿または組換え起源のコンセントレートを含むＶＷＦによる補充療法によって処置することができる。血液中のＶＷＦの半減期が短いため、ＶＷＦの生体内半減期を長期にしたＶＷＦコンセントレートを発現することが強く求められている。同じことがＦＶＩＩＩにもあてはまり、ＦＶＩＩＩも約８〜１２時間の比較的短い生体内半減期を持つことから、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの少なくとも１つの機能的な欠陥または不足を伴う出血障害の患者を処置するために頻繁に投薬を行うことを必要とする。
【０００４】
先行技術では、真核細胞培養で産生される組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）がより完全であり、血漿由来ＶＷＦよりも蛋白質加水分解による分解が少ないことが記載されている（非特許文献３）。特許文献１は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して組換え型ＶＷＦを精製することによって高純度のＶＷＦを単離する方法を記載する。相同かつ構造的に完全なＶＷＦの大量産生のための方法は、当該技術分野でも知られている（非特許文献４；非特許文献５）。組換え型ＶＷＦは、フォンビルブラント病（ＶＷＤ）のイヌ、マウス、およびブタモデルを用いたことを特徴とする（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。特許文献２は、プロＶＷＦをトロンビンで処置することによってＶＷＦ調製を生産する方法を記載する。担体の上で固定されるｒＶＷＦを用いてＶＷＦと結合するタンパク質を精製する方法は、特許文献３に開示される。血液凝固障害を処置するための血漿由来および組換えＶＷＦプロペプチド（ｐｒｏ−ＶＷＦ）の製薬的使用は、特許文献４に記載される。特許文献５は、リンカーまたはカップリング剤を介したポリ（酸化アルキレン）に対するＦＶＩＩＩおよびＩＸ因子（ＦＩＸ）の結合について記載する。特許文献６では、長期間にわたる生物学的生体内半減期を持つ組換え型ＶＷＦの使用が哺乳動物血液でＦＶＩＩＩを安定化させ、内因性ＦＶＩＩＩの産生を誘導することが示されている。にもかかわらず、ＶＷＦ−またはＦＶＩＩＩベースの出血障害がある患者にとっては、さらにＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの生体内半減期を増大させる必要性が存在する。
【０００５】
ＶＷＦは生体内でＦＶＩＩＩを安定化させることで、ＦＶＩＩＩの血漿レベルを調節する重要な役割を担うことで、結果として一次および二次止血を制御するための中心因子となることが知られている。ＶＷＦを含む治療的産物を使用した後、２４時間内に１ｍｌあたり１〜３単位まで内因性ＦＶＭＩ：Ｃが増大することが観察され、このことがＦＶＩＩＩ上でのＶＷＦの生体内安定効果を示していることも知られている
凝固ＦＶＩＩＩ欠乏（別名血友病Ａ）および／またはＶＷＦの質的および定量的欠乏（別名ＶＷＤ）に対する処置の範囲を広げるための新規の物質が強く求められている。機能性ＶＷＦが欠如していることから、ＶＷＤを有する患者は、正常値によりも低いＦＶＩＩＩ血漿レベルによって示されるＦＶＩＩＩの二次欠乏を呈する。ＶＷＤの型と疾患の重症度とに応じて、これらのＦＶＩＩＩレベルが変化し得るが、通常、健常なヒトで見出されるＦＶＩＩＩ血漿レベルよりも多少低い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０  ７８４  ６３２号明細書
【特許文献２】国際公開第００／４９０４７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／２５９６９号パンフレット
【特許文献４】欧州特許出願公開第０  ９７７  ５８４号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０３７，４５２号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第０  ７７４  ２６１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５１：３４５−３４８，１９９４
【非特許文献２】Ｒｕｇｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５７６−５８４，１９９９
【非特許文献３】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７５：２５９−２６２，１９９５
【非特許文献４】Ｓｃｈｌｏｋａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：２５７−２６７，１９９６
【非特許文献５】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＭＬＳ  ５３：９４３−９５０，１９９７
【非特許文献６】Ｔｕｒｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０：３５５５−３５６７，１９９７
【非特許文献７】Ｒｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．９：３６１−３７２，１９９８
【非特許文献８】Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ４：５３−６２，１９９８
【非特許文献９】Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２８：２１５−２２５，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、本発明は哺乳動物血液中のＶＷＦおよび／またはＦＶＩＩＩの生体内半減期を延長する新規の系を提供する。本発明のさらなる目的は、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの一方または両方の機能欠陥または欠乏を伴う出血障害に対する改善された処置のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、血漿および／または組換えフォンビルブラント因子（ＶＷＦ）またはその生物学的活性誘導体を含むタンパク質性構築物に関し、上記ＶＷＦまたは上記その生物活性誘導体が一つ以上の生理学的に許容し得るポリマー分子に結合しており、タンパク質性構築物の生体内半減期が哺乳動物（特にヒト）の血液で長くなる。さらに、本発明は上記タンパク質性構築物と少なくとも１つのＦＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質またはその生物学的活性誘導体との複合体に関し、上記ＦＶＩＩＩタンパク質または上記その上記生物学的活性誘導体の半減期が哺乳動物の血液でも長くなる。また、本発明により、上記タンパク質性構築物または上記複合体を用いたＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの少なくとも１つの機能的な欠陥または欠乏を伴う出血障害がある哺乳動物の血液でＶＷＦまたはＦＶＩＩＩの生体内半減期を延長する方法と同様に、上記タンパク質性構築物または上記複合体を含む医薬品組成物を提供する。蛋白質様構築物を作る方法も、提供する。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
タンパク質性構築物であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子と、
（ｂ）該ＶＷＦ分子に結合した少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子と、を含み、
該構築物が少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体に対する結合能を有し、該構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大している、タンパク質性構築物。
（項目２）
上記構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約１．５倍増大している、項目１に記載のタンパク質性構築物。
（項目３）
上記構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約２倍増大している、項目１に記載のタンパク質性構築物。
（項目４）
上記少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子が上記ＶＷＦまたは上記ＶＷＦの生物活性誘導体の糖質残基に結合している、項目１に記載のタンパク質性構築物。
（項目５）
上記少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子が上記ＶＷＦまたは上記ＶＷＦの生物活性誘導体のリジン残基に結合している、項目１に記載のタンパク質性構築物。
（項目６）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子は、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）からなる群から選択される、項目１に記載のタンパク質性構築物。
（項目７）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である、項目１に記載のタンパク質性構築物。
（項目８）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリシアル酸（ＰＳＡ）またはその誘導体である、項目１に記載のタンパク質性構築物。
（項目９）
上記構築物に含まれる上記ＶＷＦが、ＶＷＦの一次止血における生物学的活性を保持し、上記生物学的活性が、血小板上の受容体に対する結合および細胞間マトリックス成分上の受容体に対する結合を含み、上記成分がコラーゲンを含む、項目１に記載のタンパク質性構築物。
（項目１０）
タンパク質性構築物であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子と、
（ｂ）上記ＶＷＦ分子に結合した少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子と、を含み、
該構築物が少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体に対する結合能を有し、該構築物に結合した該ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期が、該構築物とは結合していないＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期と比較して増大している、タンパク質性構築物。
（項目１１）
上記構築物に結合した場合、上記ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期が、上記構築物とは結合していないＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約１．５倍増大している、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１２）
上記構築物に結合した場合、上記ＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期が、上記構築物とは結合していないＦＶＩＩＩ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約２倍増大している、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１３）
上記ＶＷＦまたは上記その生物活性誘導体が組換え産物である、項目１または１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１４）
項目１または１０に記載のタンパク質性構築物および少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体を含む、複合体。
（項目１５）
上記ＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体が組換え産物である、項目１４に記載の複合体。
（項目１６）
ＦＶＩＩＩの機能的な欠陥または欠乏に関連した出血性障害を持つ哺乳動物血液中でのＦＶＩＩＩまたはその生物活性誘導体の生体内半減期を延長させるための方法であって、
（ａ）項目１または１０に記載の少なくとも１つのタンパク質性構築物の第１の用量を該哺乳動物に対して投与するステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体の第１の用量を該哺乳動物に対して投与するステップと、
を含む、方法。
（項目１７）
ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦのうちの少なくとも１つの機能的な欠陥に関連した出血性障害を持つ哺乳動物血液中でのＦＶＩＩＩまたはその生物活性誘導体の生体内半減期およびＶＷＦまたはその生物活性誘導体の生体内半減期を延長させるための方法であって、
（ａ）項目１または１０に記載の少なくとも１つのタンパク質性構築物の第１の用量を該哺乳動物に対して投与するステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体の第１の用量を該哺乳動物に対して投与するステップと、
を含む、方法。
（項目１８）
ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦのうちの少なくとも１つの機能的な欠陥または欠乏に関連した出血性障害を持つ哺乳動物血液中での第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）またはその生物活性誘導体およびＶＷＦまたはその生物活性誘導体の生体内半減期を延長させるための方法であって、
（ａ）項目１または１０の少なくとも１つのタンパク質性構築物を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体を提供するステップと、
（ｃ）上記タンパク質性構築物と上記ＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体との間で複合体を形成するステップと、
を含む、方法。
（項目１９）
ＦＶＩＩＩの機能的な欠陥に関連した出血性障害またはＦＶＩＩＩの機能的な欠陥もしくは欠乏に関連した障害を持つ哺乳動物血液中での第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）またはその生物活性誘導体の生体内半減期を延長させるための方法であって、
（ａ）項目１または１０に記載の少なくとも１つのタンパク質性構築物を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体を提供するステップと、
（ｃ）該タンパク質性構築物と該ＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体との間で複合体を形成するステップと、
を含む、方法。
（項目２０）
ステップ（ｃ）の複合体を上記哺乳動物に投与する、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
上記少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体を、上記タンパク質性構築物と同時に投与する、項目１６または１７に記載の方法。
（項目２２）
上記少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはその生物活性誘導体を、上記タンパク質性構築物の投与前または投与後に、逐次投与する、項目１６または１７に記載の方法。
（項目２３）
医薬品組成物であって、
項目１、２、３、または６に記載のタンパク質性構築物の有効量と、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、塩、緩衝液および賦形剤からなる群から選択される一つ以上の化合物と、
を含む、医薬品組成物。
（項目２４）
医薬品組成物であって、
項目１０、１１、または１２に記載のタンパク質性構築物の有効量と、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、塩、緩衝液および賦形剤からなる群から選択される一つ以上の化合物と、
を含む、医薬品組成物。
（項目２５）
複合体であって、
（ａ）タンパク質性構築物であって、
（ｉ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子と、
（ｉｉ）該ＶＷＦ分子に結合した少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子とを含む、タンパク質性構築物と、
（ｂ）該タンパク質性構築物に結合した少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と、
を含み、
上記複合体の生体内半減期が、ＶＷＦに結合したＦＶＩＩＩの生体内半減期と比較して、増大している、複合体。
（項目２６）
上記複合体の生体内半減期が、ＶＷＦに結合したＦＶＩＩＩの生体内半減期と比較して、少なくとも約１．５倍増大している、項目２５に記載の複合体。
（項目２７）
上記複合体の生体内半減期が、ＶＷＦに結合したＦＶＩＩＩの生体内半減期と比較して、少なくとも約２倍増大している、項目２５に記載の複合体。
（項目２８）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つの糖質残基に共有結合したＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子上の糖質残基を酸化するステップと、
（ｃ）該糖質残基を、ヒドラジド基含有ＰＥＧ試薬と接触させるステップと、
（ｄ）該試薬ＰＥＧヒドラジドを該ＶＷＦ上の少なくとも１つの糖質残基と共有結合させることにより、上記構築物を形成させるステップとを含み、
上記構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
上記構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体に結合することが可能である、方法。
（項目２９）
上記酸化ステップ（ｂ）が化学的酸化剤を使用して実行される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記化学的酸化剤がＮａＩＯ４である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
上記酸化ステップ（ｂ）が酵素的酸化剤を使用して実行される、項目２８の方法。
（項目３２）
上記酵素的酸化剤がガラクトースオキシダーゼである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
上記ＰＥＧ試薬が、直鎖状アルコキシＰＥＧ、直鎖状二官能性ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、ポリオール核に結合したＰＥＧ、樹状ＰＥＧ、安定な結合を有するＰＥＧ、分解可能な結合を有するＰＥＧ、および加水分解可能な結合を有するＰＥＧからなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
上記ＰＥＧ試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
項目２８に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目３６）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約１．５倍増大している、項目３５に記載のタンパク質性構築物。
（項目３７）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも約２倍増大している、項目３５に記載のタンパク質性構築物。
（項目３８）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも約１．５倍増大している、項目３５に記載のタンパク質性構築物。
（項目３９）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも約２倍増大している、項目３５に記載のタンパク質性構築物。
（項目４０）
上記ＰＥＧ試薬が約０．１〜約２００ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目２８に記載の方法。
（項目４１）
上記ＰＥＧ試薬が約１．０〜約２５ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目２８に記載の方法。
（項目４２）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つの一級アミノ基に共有結合したＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子上の該一級アミノ基をＰＥＧ試薬と接触させるステップと、
（ｃ）該ＰＥＧ試薬を該ＶＷＦ上の該一級アミノ基と共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
該構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体に結合することが可能である、方法。
（項目４３）
上記一級アミノ基が、上記ＶＷＦ分子のリジン残基上に含まれる、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記一級アミノ基が、上記ＶＷＦ分子のＮ末端上に含まれる、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
上記ＰＥＧ試薬が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル、ＰＥＧカーボネート、カルボキシル基含有ＰＥＧ誘導体、およびアルデヒド基含有ＰＥＧ誘導体からなる群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
上記試薬が、ＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ＰＥＧ−スクシンイミジルグルタレート、ＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート、ＰＥＧ−スクシンイミジルヘキサノエート、分解性ＰＥＧ試薬、および加水分解性ＰＥＧ試薬からなる群から選択されるＮ−ヒドロキシスクシンイミド−エステルである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
上記試薬が、ｐ−ニトロフェニルカーボネートまたはスクシンイミジルカーボネートであるＰＥＧカーボネートである、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
上記試薬が、水溶性カルボジイミドの使用によって一級アミノ基に連結することができるカルボキシル基を含むＰＥＧ誘導体の群から選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
上記試薬がＰＥＧプロピオンアルデヒドであり、還元性アミノ化によって一級アミノ基に連結することができる、項目４５に記載の方法。
（項目５０）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つの一級アミノ基に、還元的アミノ化によって共有結合したＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）溶液中で該ＶＷＦ分子上のリジン残基をアルデヒド基含有ＰＥＧ試薬と接触させてシッフ塩基を形成するステップと、
（ｃ）該溶液を還元剤と接触させて二級アミド結合を形成するステップと、
（ｄ）該ＰＥＧ試薬を上記ＶＷＦ分子に共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合することができる、方法。
（項目５１）
上記還元剤がＮａＣＮＢＨ３である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
上記一級アミノ基が上記ＶＷＦ分子上のＮ末端アミノ基であり、該Ｎ末端アミノ基が選択的にＰＥＧ付加されている、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
上記ＰＥＧ試薬が、直鎖状アルコキシＰＥＧ、直鎖状二官能性ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、ポリオール核に結合したＰＥＧ、樹状ＰＥＧ、安定な結合を有するＰＥＧ、分解可能な結合を有するＰＥＧ、および加水分解可能な結合を有するＰＥＧからなる群から選択される、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
上記ＰＥＧ試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
項目５０に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目５６）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目５５に記載のタンパク質性構築物。
（項目５７）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目５５に記載のタンパク質性構築物。
（項目５８）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目５５に記載のタンパク質性構築物。
（項目５９）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目５５に記載のタンパク質性構築物。
（項目６０）
上記ＰＥＧ試薬が約０．１〜約２００ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目５０に記載の方法。
（項目６１）
上記ＰＥＧ試薬が約１．０〜約２５ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目５０に記載の方法。
（項目６２）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つのリジン残基に共有結合したＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）溶液中で該ＶＷＦ分子上のリジン残基を試薬ＰＥＧアルデヒドと接触させてシッフ塩基を形成するステップと、
（ｃ）該溶液を反応性試薬と接触させて二級アミド結合を形成するステップと、
（ｄ）該ＰＥＧ試薬を該ＶＷＦ分子に共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合することができる、方法。
（項目６３）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つの遊離または生成スルフヒドリル基に共有結合したＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子上の該スルフヒドリル基を、マレイミド基含有ＰＥＧ試薬と接触させるステップと、
（ｃ）該ＰＥＧ試薬を該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つのスルフヒドリル基に共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合することができる、方法。
（項目６４）
上記ＰＥＧ試薬が、直鎖状アルコキシＰＥＧ、直鎖状二官能性ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、ポリオール核に結合したＰＥＧ、樹状ＰＥＧ、安定な結合を有するＰＥＧ、分解可能な結合を有するＰＥＧ、および加水分解可能な結合を有するＰＥＧからなる群から選択される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
上記ＰＥＧ試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
項目６３に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目６７）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目６６に記載のタンパク質性構築物。
（項目６８）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目６６に記載のタンパク質性構築物。
（項目６９）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目６６に記載のタンパク質性構築物。
（項目７０）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目６６に記載のタンパク質性構築物。
（項目７１）
上記ＰＥＧ試薬が約０．１〜約２００ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目６３に記載の方法。
（項目７２）
上記ＰＥＧ試薬が約１．０〜約２５ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つのカルボキシル基に共有結合したＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子上のカルボキシル基を、アミノ基および水溶性カルボジイミドを含むＰＥＧ試薬と接触させてアミド結合を形成するステップと、
（ｃ）該ＰＥＧ部分を該ＶＷＦに共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合することができる、方法。
（項目７４）
上記ＰＥＧ試薬が、直鎖状アルコキシＰＥＧ、直鎖状二官能性ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、ポリオール核に結合したＰＥＧ、樹状ＰＥＧ、安定な結合を有するＰＥＧ、分解可能な結合を有するＰＥＧ、および加水分解可能な結合を有するＰＥＧからなる群から選択される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
上記ＰＥＧ試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
項目７３に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目７７）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目７６に記載の構築物。
（項目７８）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目７６に記載の構築物。
（項目７９）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目７６に記載の構築物。
（項目８０）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目７６に記載の構築物。
（項目８１）
上記ＰＥＧ試薬が約０．１〜約２００ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目７３に記載の方法。
（項目８２）
上記ＰＥＧ試薬が約１．０〜約２５ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上に共有結合しており、該ＶＷＦ分子のＦＶＩＩＩ結合部位に対しては結合していないＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子上のＦＶＩＩＩ結合部位を第ＶＩＩＩ因子結合部位保護剤と接触させることにより、保護されたＦＶＩＩＩ結合部位を持つＶＷＦ分子を形成させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の該ＶＷＦ分子上の反応部位をＰＥＧ試薬と接触させるステップと、
（ｄ）該ＰＥＧ試薬を該ＶＷＦ分子と共有結合させるステップと、
（ｅ）該ＶＷＦ分子から該ＦＶＩＩＩ結合部位保護剤を分離することにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合することができる、方法。
（項目８４）
上記第ＶＩＩＩ因子結合部位保護剤が親和性カラムに含まれる、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
上記第ＶＩＩＩ因子結合部位保護剤が、第ＶＩＩＩ因子、ＦＶＩＩＩの誘導体、ヘパリン、およびヘパリンの誘導体からなる群から選択される、項目８３の方法。
（項目８６）
上記ＰＥＧ試薬が、直鎖状アルコキシＰＥＧ、直鎖状二官能性ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、ポリオール核に結合したＰＥＧ、樹状ＰＥＧ、安定な結合を有するＰＥＧ、分解可能な結合を有するＰＥＧ、および加水分解可能な結合を有するＰＥＧからなる群から選択される、項目８３に記載の方法。
（項目８７）
上記ＰＥＧ試薬が、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される内部構造を有する、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
項目８３に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目８９）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目８８に記載の構築物。
（項目９０）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目８８に記載の構築物。
（項目９１）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目８８に記載の構築物。
（項目９２）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目８８に記載の構築物。
（項目９３）
上記ＰＥＧ試薬が約０．１〜約２００ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目８３に記載の方法。
（項目９４）
上記ＰＥＧ試薬が約１．０〜約２５ｍｇ  ＰＥＧ／ｍｇ  ＶＷＦタンパク質の比率で提供される、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つのリジン残基と共有結合したポリシアル酸（ＰＳＡ）部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）溶液中で、ＰＳＡを、アルデヒド含有ＰＥＧ試薬と接触させてシッフ塩基を形成するステップと、
（ｃ）該溶液を還元剤と接触させて二級アミド結合を形成するステップと、
（ｄ）該ＰＳＡを該ＶＷＦ上の少なくとも１つのリジン残基と共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
該構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合することができる、方法。
（項目９６）
上記還元剤がＮａＣＮＢＨ３である、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
項目９５に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目９８）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目９７に記載の構築物。
（項目９９）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目９７に記載の構築物。
（項目１００）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目９７に記載のタンパク質性構築物。
（項目１０１）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目９７に記載のタンパク質性構築物。
（項目１０２）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子と共有結合により架橋したポリシアル酸（ＰＳＡ）部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子を、ＰＳＡとグルタルアルデヒドとを含む溶液と接触させるステップと、
（ｃ）該ＰＳＡを該ＶＷＦへと共有結合により架橋させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
該構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合することができる、方法。
（項目１０３）
項目１０２に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目１０４）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目１０３に記載の構築物。
（項目１０５）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目１０３に記載の構築物。
（項目１０６）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目１０３に記載のタンパク質性構築物。
（項目１０７）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目１０３に記載のタンパク質性構築物。
（項目１０８）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つの糖質残基に共有結合したＰＳＡ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子上の糖質残基を酸化するステップと
（ｃ）該糖質残基を、ヒドラジド基含有ＰＳＡ試薬と接触させるステップと、
（ｄ）該ＰＳＡ試薬を該ＶＷＦ上の少なくとも１つの糖質残基と共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
該構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合できる、方法。
（項目１０９）
上記酸化ステップ（ｂ）が酵素的酸化剤を用いて実行される、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
上記酵素的酸化剤がガラクトースオキシダーゼである、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子上の少なくとも１つのリジン残基に共有結合したヒアルロン酸（ＨＡ）部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）ＨＡの溶液を酸化剤と接触させて活性化ＨＡを形成させるステップと、
（ｃ）該ＶＷＦ分子を該活性化ＨＡと接触させることにより、該構築物を形成させるステップとを含み、
上記構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大している、上記構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ因子分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合できる、方法。
（項目１１２）
項目１１１に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目１１３）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目１１２に記載の構築物。
（項目１１４）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目１１２に記載のタンパク質性構築物。
（項目１１５）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目１１２に記載のタンパク質性構築物。
（項目１１６）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目１１２に記載のタンパク質性構築物。
（項目１１７）
ＶＷＦ分子と、上記ＶＷＦ分子上の少なくとも１つの糖質基に共有結合したＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子上の糖質基を酸化酵素と接触させて、該ＶＷＦ上で酸化型の糖質部分を形成させるステップと、
（ｃ）該ＶＷＦ上の該酸化型の糖質部分をヒドラジド基含有ＰＥＧ試薬と接触させるステップと、
（ｄ）該ＰＥＧ部分を該ＶＷＦに共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合できる、方法。
（項目１１８）
項目１１７に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目１１９）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目１１８に記載の構築物。
（項目１２０）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目１１８に記載の構築物。
（項目１２１）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目１１８に記載のタンパク質性構築物。
（項目１２２）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目１１８に記載のタンパク質性構築物。
（項目１２３）
ＶＷＦ分子と、該ＶＷＦ分子に共有結合したＰＥＧ部分とを含むタンパク質性構築物を形成するための方法であって、
（ａ）血漿フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、組換え型ＶＷＦ、ＶＷＦの生物活性誘導体、ならびにそれらのダイマーおよびマルチマーからなる群から選択されるＶＷＦ分子を提供するステップと、
（ｂ）該ＶＷＦ分子をＰＥＧ試薬に接触させて溶液を形成するステップと、
（ｃ）該溶液を灌流チェンバーに入れ、蠕動ポンプの使用により上記ＶＷＦ分子上に剪断応力を発生させるステップと、
（ｃ）該ＰＥＧ試薬を該ＶＷＦに共有結合させることにより、該構築物を形成させるステップと、
を含み、
該構築物の生体内半減期がＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して増大しており、
該構築物が、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体と結合することができる、方法。
（項目１２４）
上記ＰＥＧ試薬が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル、ＰＥＧカーボネート、カルボキシル基含有ＰＥＧ誘導体、およびアミノ基含有ＰＥＧ誘導体からなる群から選択される、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
上記ＰＥＧ試薬がＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ＰＥＧ−スクシンイミジルグルタレート、ＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート、ＰＥＧ−スクシンイミジルヘキサノエート、加水分解感受性のエステルまたはアミド結合によって結合される加水分解性ＰＥＧ、ｍＰＥＧ−（カルボキシメチル）−３−ヒドロキシ−ブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート、および、ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートからなる群から選択される、項目１２３に記載の方法。
（項目１２６）
項目１２３に記載の方法によって調製されたタンパク質性構築物。
（項目１２７）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目１２６に記載の構築物。
（項目１２８）
上記構築物の生体内半減期が、ＶＷＦ分子の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目１２６に記載の構築物。
（項目１２９）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増大している、項目１２６に記載の構築物。
（項目１３０）
上記構築物に結合した場合、ＦＶＩＩＩ分子またはＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期が、該構築物に結合していない該ＦＶＩＩＩ分子または該ＦＶＩＩＩの生物活性誘導体の生体内半減期と比較して、少なくとも２倍増大している、項目１２６に記載の構築物。
（項目１３１）
上記少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子が上記ＶＷＦまたは上記ＶＷＦの生物活性誘導体の糖質残基に結合している、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１３２）
上記少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子が上記ＶＷＦまたは上記ＶＷＦの生物活性誘導体のリジン残基に結合している、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１３３）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子は、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）からなる群から選択される、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１３４）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１３５）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリシアル酸（ＰＳＡ）またはその誘導体である、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１３６）
上記構築物に含まれる上記ＶＷＦが、ＶＷＦの一次止血における生物学的活性を保持し、上記生物学的活性が、血小板上の受容体に対する結合および細胞間マトリックス成分上の受容体に対する結合を含み、上記成分がコラーゲンを含む、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１３７）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子は、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）からなる群から選択される、項目１０に記載のタンパク質性構築物。
（項目１３８）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である、項目２５に記載の複合体。
（項目１３９）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である、項目２６に記載の複合体。
（項目１４０）
上記生理学的に許容可能なポリマー分子がポリシアル酸（ＰＳＡ）またはその誘導体である、項目２６に記載の複合体。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、結合標的部位に関する実施例によるＶＷＦの模式的構造を示す。図１Ａの灰色の点は少なくとも１つのポリマー分子によって結合し得るＶＷＦのリジン残基を示し、図１Ｂは少なくとも１つのポリマー分子によって結合し得るＶＷＦの糖質残基を示す。
【図２】図２は、ＶＷＤを有するマウスでの非結合体化ＶＷＦと比較したポリマーＶＷＦ結合体の薬物動態を示す。
【図３】図３は、血友病マウスでの非結合体化ＶＷＦと比較したポリマーＶＷＦ結合体の薬物動態を示す。
【図４】図４は、ｒＶＷＦまたはＰＥＧ−ｒＶＷＦで処置されるＶＷＤマウスでのＦＶＩＩＩの薬物動態を示す。
【図５】図５は、ポリマーＶＷＦ結合体と複合体を形成したｒＦＶＩＩＩおよびＶＷＦと複合体を形成したｒＦＶＩＩＩを適用した後の血友病マウスにおけるｒＦＶＩＩＩの回収率を示す。
【図６】図６は、ポリマーＶＷＦ結合体と複合体を形成したｒＦＶＩＩＩおよびＶＷＦと複合体を形成したｒＦＶＩＩＩを適用した後の血友病マウスにおけるＶＷＦの回収率を示す。
【図７】図７は、ＦＶＩＩＩ×ＶＷＦダブルノックアウトマウスにおけるｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＶＷＦの薬物動態を示す。
【図８】図８は、雑種−マウスにおけるｒＦＶＩＩＩとＰＥＧ−ｒＶＷＦの薬物動態を示す。
【図９】図９は、マウス血漿におけるＶＷＦ：Ａｇ増加（リジンおよび糖質結合）を示す。
【図１０】図１０は、非結合体化ｒＶＷＦと比較した場合のＰＥＧに結合したｒＶＷＦの生体分子相互作用検討（左側図）とＦＶＩＩＩ（右側図）の結合能の比較とを示す。
【図１１】図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって計測されるポリマー結合の後のＶＷＦの大量の増加を示す。
【図１２】図１２は、ＶＷＦマルチマーを分析するためにアガロース電気泳動で計測されるポリマー結合後のＶＷＦの大量の増加を示す。
【図１３】図１３は、ポリマーＶＷＦ結合体（ＰＥＧ付加リジン残基を有するｒＶＷＦ）と複合体を形成したｒＦＶＩＩＩと、ｒＶＷＦと複合体を形成したｒＦＶＩＩＩの適用後のＦＶＩＩＩ−Ｋ．Ｏ．マウスにおけるｒＦＶＩＩＩの薬物動態を示す。
【図１４】図１４は、ポリマーＶＷＦ結合体（ＰＥＧ付加リジン残基によるｒＶＷＦ）と複合体を形成したｒＦＶＩＩＩおよびｒＶＷＦと複合体を形成したｒＦＶＩＩＩの適用後のＦＶＩＩＩ−Ｋ．Ｏ．マウスにおけるｒＶＷＦの薬物動態を示す。
【図１５】図１５は、組み合わされたＥＬＩＳＡおよび色素アッセイ（ＥＣＡ）を使用して、非結合体化ｒＶＷＦと比較した場合のＰＥＧと結合したｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合能の測定を示す。
【図１６】図１６は、表面プラズモン共鳴技術を使用したＰＥＧと結合したｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合能の側定を示す。
【図１７】図１７は、実施例１３に記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで計測されるポリマー結合後のＶＷＦの大量増加を示す。
【図１８】図１８は、組み合わされたＥＬＩＳＡおよび色素アッセイ（ＥＣＡ）を用いたｐｄＶＷＦおよび無処置ｒＶＷＦと比較した場合のフリン成熟ｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合能の測定を示す。
【図１９】図１９は、表面プラズモン共鳴技術を使用してｐｄＶＷＦおよび無処置ｒＶＷＦと比較した場合のフリン成熟ｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合能の測定を示す。
【図２０】図２０は、還元条件下でのｒＶＷＦ−ポリシアル酸結合体およびｒＶＷＦの等電点電気泳動パターンを示す。
【図２１】図２１は、ＶＷＦ欠乏マウスにおけるｒＶＷＦ−ポリシアル酸結合体およびｒＶＷＦの薬物動態を示す。
【図２２】図２２は、ＶＷＦ欠乏マウスにおけるｒＶＷＦ−ポリシアル酸結合体またはｒＶＷＦの使用後、マウスＦＶＩＩＩ活性の時間経過を示す。
【図２３】図２３は、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスにおけるＰＥＧ−ｒＶＷＦ（分枝ＰＥＧ２０Ｋ  ＳＧ）およびｒＶＷＦの薬物動態を示す。
【図２４】図２４は、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスでのＰＥＧ−ｒＶＷＦ（分枝ＰＥＧ２０Ｋ  ＳＧ）またはｒＶＷＦを共に注入したｒＦＶＩＩの薬物動態を示す。
【図２５】図２５は、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスで種々の濃度のＰＥＧ−ｒＶＷＦ（分枝ＰＥＧ２０Ｋ  ＳＧ）を注入したｒＦＶＩＩの薬物動態を示す。
【図２６】図２６は、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスにおけるＰＥＧ−ｒＶＷＦ＃Ａ（５ｍｇＰＥＧ／ｍｇタンパク質）、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ＃Ｂ（２０ｍｇＰＥＧ／ｍｇタンパク質）とネイティブｒＶＷＦの薬物動態を示す。
【図２７】図２７は、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ＃Ａ（５ｍｇＰＥＧ／ｍｇタンパク質）、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ  ＃Ｂ（２０ｍｇＰＥＧ／ｍｇタンパク質）またはネイティブｒＶＷＦを同時注入した場合のｒＦＶＩＩＩの薬物動態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明の一態様は、血漿および／または組換えＶＷＦあるいはその生物活性誘導体を含むタンパク質性構築物（また、以下で「ポリマーＶＷＦ結合体」と称される）に関し、上記ＶＷＦまたは上記その生物活性誘導体が一種類以上の生理学的に許容可能なポリマー分子に結合しており、上記ＶＷＦまたは上記その生物活性誘導体の生体内半減期が哺乳動物血液で長くなる。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、ポリマーＶＷＦ結合体を提供することであり、該ポリマーＶＷＦ結合体は、２つの形態の中間にある特徴を有する上記ポリマーＶＷＦ結合体の形態をなす。１つの形態は、ＶＷＦと結合体を形成するポリマーを安定して担持し、哺乳動物への適用の後、時間が経つにつれて内在性分子として除去される。他の形態は、ＶＷＦに結合体を形成するポリマーの可逆性を特徴とする。哺乳動物に対する投与の後、ＶＷＦに結合したポリマー分子はＶＷＦから段階的に遊離され、非結合ＶＷＦは薬理的機能因子として利用可能となる。剥離性は、共役化学に依存するとともに、ＶＷＦに結合したポリマー分子の組成および構造に依存する。
【００１３】
ポリマーＶＷＦ結合体は、ＶＷＤの処置に対して単独で、または半減期の増大に関してＦＶＩＩＩを安定化させるためにＦＶＩＩＩと結合して、あるいは両方で、有用である。ＶＷＤの処置に対して単独使用される場合、結合体は２つの形態のうちの一方を取ると考えらえる。第１の形態は、ポリマーが遊離自在にＶＷＦに結合するものである。このようにして、ＶＷＦは、ポリマーが遊離または分解するにつれて活性化される。第２の形態は、ＶＷＦに結合したポリマー濃度がＶＷＦ活性と干渉しない程度のものである。結合体がＦＶＩＩＩを結合して安定させるために調製される場合、ＶＷＦに結合したポリマーの度合いまたはレベルは、ＶＷＦの結合領域と干渉しないように提供される。実施例で示されるように、ＶＷＦに対する満足のいくポリマーの結合は、ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの結合能に干渉することなく達成し得る。ポリマー結合の度合いもまた、制御または修飾してＶＷＦ活性を保つ一方で、ＦＶＩＩＩに対して結合するＶＷＦの能力も保たれる。この形態で、ポリマーＶＷＦ結合体は治療的活性ＶＷＦを提供する一方で、半減期増大に関してＦＶＩＩＩを安定化させる。
【００１４】
本発明に有用なＶＷＦおよびＦＶＩＩＩ分子として、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたはフラグメント、ならびにその機能的誘導体が挙げられる。ＶＷＦおおびＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩへの言及は、このようなタンパク質のすべての潜在的形態を含むものと考える。
【００１５】
本明細書中で用いられる場合「生物活性誘導体」は、分子の任意の誘導体を含み、該誘導体は、上記分子の同じ機能的なおよび／または生物学的な性質（例えば結合性を持つ）および／または同じ構造的基礎（例えばペプチドの主鎖または基本的高分子単位）を、実質的に持つ。
【００１６】
本発明に有用なＶＷＦは、単一および多量体形態を含むすべての潜在的形態を含む。ＶＷＦの１つの特に有用な形態は、少なくとも２つのＶＷＦからなるホモマルチマーである。ＶＷＦタンパク質は、いずれの生物活性誘導体であってもよく、あるいはＦＶＩＩＩの安定剤として単独で使用される場合、ＶＷＦが生物学的に不活性である形態であってもよい。併用使用されるＶＷＦの異なる形態を本発明が含むことも理解すべきである。例えば、本発明に有用な組成物は、異なるマルチマー、異なる誘導体、ならびに生物活性誘導体と生物活性のない誘導体とを含むものであってもよい。一次止血において、ＶＷＦは血小板と特異的な細胞外マトリックス成分（例えばコラーゲン）間の架橋として働く。このプロセスでのＶＷＦの生物学的活性を、２つの異なる生体外アッセイで計測することができる（Ｔｕｒｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２８：１４９−１６０，２００２）。リストセチンコファクターアッセイは、ＶＷＦ存在下で抗生物質のリストセチンによって誘発される新鮮またはホルマリン固定血小板の凝集に基づく。血小板凝集反応の程度は、ＶＷＦ濃度次第であって、比濁法によって、例えば血小板凝集計を使用することで計測することができる（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２７０８−２７１６，１９７３；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．３４：３０６−３０８，１９７５）。第２の方法はコラーゲン結合実験であり、これはＥＬＩＳＡ技術に基づく（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  Ｂｏｓａｋ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．４３：３０３−３１１，１９８６；Ｆａｖａｌｏｒｏ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８３：１２７−１３５，２０００）。マイクロタイタープレートは、Ｉ型またはＩＩＩ型のコラーゲンで被覆されている。さらに、ＶＷＦはコラーゲン面に結合し、続いて、酵素で標識されたポリクローナル抗体で検出される。最後のステップは、基質反応であり、ＥＬＩＳＡリーダーで光度分析的にモニターすることができる。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、「血漿由来ＶＷＦ（ｐｄＶＷＦ）」は血液中に見いだされるタンパク質のすべての形態を含むもので、該形態として、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子を生体内安定化（例えば結合）させる性質がある哺乳動物から得られる成熟ＶＷＦが挙げられる。しかし、本発明は成熟ＶＷＦに限らない。１つに、上記ｐＶＷＦの生物活性誘導体は、プロペプチドを含むプロＶＷＦである。本発明に有用な他の型のＶＷＦとして、タンパク質性構築物が挙げられる。このタンパク質性構築物は未熟なＶＷＦを含み、該未熟ＶＷＦとして、血管内皮細胞および巨核球によって合成される前駆体ＶＷＦ分子（プレプロＶＷＦ）および／またはシグナルペプチドおよびプロペプチドの開裂で得られるＶＷＦプロペプチド（プロＶＷＦ）および／または成熟ｐｄＶＷＦ（それぞれ前駆体分子のもの）が挙げられる。ｐｄＶＷＦの生物活性誘導体のさらなる例として、プロドラッグが挙げられ、該プロドラッグは、処理または変換され、生物活性形態となる。あるいは、プロドラッグは、天然型と比べて、生物学的に活性があることから、切断形態、欠失を持つ形態、置換を持つ形態、プロ形態以外の付加を有する形態、成熟形態のフラグメント、キメラ形態、および後翻訳修飾を持つ形態である。本発明に有用なＰｄＶＷＦも、生物学的活性のないそれらの形態を含む。このことは、血液中見いだされる成熟ＶＷＦまたは他の天然形態の修飾によって達成し得る。本発明に有用なＶＷＦの供給源は、ブタおよびヒトバージョンを含む哺乳動物である。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、「組換え型ＶＷＦ（ｒＶＷＦ）」は組換えＤＮＡ技術を経て得られるＶＷＦを含む。有用なｒＶＷＦの１つの形態は、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子の少なくとも生体内安定化（例えば結合）の性質を持ち、薬理学的に許容可能なグリコシル化パターンを任意に有する。その具体例として、Ａ２領域を持たないことからタンパク質分解に対して耐性を持つＶＷＦ（Ｌａｎｋｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１００８−１０１３，１９９７）、糖タンパク質Ｉｂ結合領域とコラーゲンおよびヘパリンの結合部位とをＶａｌ４４９からＡｓｎ７３０までのＶＷＦフラグメント（Ｐｉｅｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：１３３９−１３４７，１９８９）が挙げられる。少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子の安定化の側定は、当該技術分野における状態で公知の方法によって、ＶＷＦ欠乏哺乳動物で行うことができる。例えば、下記の実施例８に記載のように、ＶＷＦ欠乏マウスに対してＶＷＦを経尾静脈静注することにより処置すると、その血漿のＦＶＩＩＩ活性のレベルが時間とともに変化する。例えば、ＦＶＩＩＩ活性のレベルは、色素アッセイ（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａで発表されているもの）で計測することができる（Ｐｈ．Ｅｕｒ．，３ｒｄ  Ｅｄ．１９９７：２．７．４）。
【００１９】
ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩｌＩ：Ｃ）含有試料を、カルシウム含有緩衝液中でトロンビン、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質、および第Ｘ因子（ＦＸ）と混合する。ＦＶＩＩＩはトロンビンにより活性化され、続いてリン脂質、ＦＩＸａおよびカルシウムイオンと複合体を形成する。この複合体は、ＦＸおよびＦＸａを活性化し、順次に色素基質（例えば、ＡｃＯＨ＊ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を切断する。放出されたｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の時間経過を、４０５ｎｍで計測する。反応の傾斜は、試料中のＦＶＩＩＩ濃度に比例している。
【００２０】
本発明のｒＶＷＦは、当該技術分野で知られている任意の方法によって生産可能である。一具体例が、ＷＯ８６／０６０９６（１９８６年１０月２３日発行）および米国特許出願第０７／５５９５０９号（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．名義で１９９０年７月２３日出願）に開示されており、組換え型ＶＷＦを生産する方法に関連して本明細書中に援用する。これは、当該技術分野で公知の任意の方法を含むものであってよく、該方法は、（ｉ）遺伝子工学による組換えＤＮＡの産生（例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅を介する）、（ｉｉ）トランスフェクションによって組換えＤＮＡを原核または真核細胞に導入すること（例えば電気穿孔法またはマイクロインジェクションを介する）、（ｉｉｉ）上記形質転換細胞を培養すること（例えば連続またはバッチ方式によるもの）、（ｉｖ）ＶＷＦを発現すること（例えば構成的または誘導的）、ならびに（ｖ）上記ＶＷＦを単離すること（例えば、培地から、または形質転換細胞を収集することによって）、そのために（ｖｉ）精製されたｒＶＷＦ（例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーを経て）を得ることのためのものである。
【００２１】
薬理学的に許容可能なＶＷＦ分子を生産することを特徴とする適当な原核生物または真核生物宿主系での発現によって、ｒＶＷＦを生産することができる。真核細胞の例は、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ  ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２）である。本発明によるＶＷＦを生産または単離するための試薬または条件に対しては何ら特定の制限はなく、当該技術分野で公知または市販されている任意の系を用いることができる。本発明の好ましい実施形態では、先端技術に記載の方法でｒＶＷＦが得られる。
【００２２】
多種多様なベクターをｒＶＷＦの調製に使用することができ、該ベクターを真核生物および原核生物発現ベクターから選択することができる。原核生物発現のためのベクターの例として、プラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤ、その他）が挙げられ、原核生物発現ベクターで使用されるプロモーターとして、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、その他が挙げられる。真核生物発現のためのベクターの例として、以下のものが挙げられる。すなわち、（ｉ）酵母での発現用として、プロモーター（例えば、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１、その他）を用いるベクター（例えば、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴ）、（ｉｉ）昆虫細胞での発現用として、プロモーター（例えば、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐｌＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈ、その他）を用いるベクター（例えば、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐｌＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ，その他）、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞での発現として、ベクター（例えば、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶ、その他）、およびプロモーター（例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、β−ａｃｔｉｎ）を用いたこのようなウイルス系に由来するベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ関連性ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス）が挙げられる。
【００２３】
本発明に有用なＦＶＩＩＩは、それらの形態を含み、該形態は、生物学的に活性があり、完全長ＦＶＩＩＩ、凝固ＦＩＸの活性化でコファクターとして働く任意の派生的な能力、およびＶＷＦで複合体を形成する能力が含まれる。本発明によって使用されるＦＶＩＩＩは、血漿由来ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩ）または組換え型ＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）またはその生物活性誘導体であってもよい。ｐｄＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩは、当該技術分野で知られている任意の方法によって生産することが可能である。ＰｄＦＶＩＩＩは、任意の適当な手段で精製可能である。１つの有用な方法は米国特許第５，４７０，９５４号に記載されており、該特許文献を本明細書中に援用する。ＲＦＶＩＩＩタンパク質は、任意の適当な手段で調製可能である。このようなｒＦＶＩＩＩの例として、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社によって製造販売されているＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥとＡＤＶＡＴＥ、Ｗｙｅｔｈ社によって製造販売されているＲＥＦＡＣＴＯ（ＦＶＩＩＩのＢ−領域が欠失した形態）、およびＢａｙｅｒ社によって製造販売されているＫＯＧＥＮＡＴＥが挙げられる。ｒＦＶＩＩＩの方法および例は、米国特許第４，７５７，００６号、第４，９６５，１９９号、および第５，６１８，７８８号（いずれも本明細書中に援用）に記載されている。
【００２４】
本明細書中で用いられる場合、「生理学的に許容し得るポリマー」は、水溶液または懸濁液に可溶であり、医薬的に有効な量のポリマーＶＷＦ結合体の投与に際して哺乳動物に対し陰性影響（例えば副作用）がないポリマーを含む。本発明によって使用される生理学的に許容し得るポリマーは、特に制限されるものではない。ポリマーは、反復単位を好ましくは２ないし約３００持つことによって一般に特徴づけられる。このようなポリマーの例として、限定されるものではないが、ポリ（アルキレングリコール）、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、その他、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル酸塩）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−重合開始剤）、ならびに前述のいずれかの組合せが挙げられる。
【００２５】
生理学的に許容し得るポリマーは特定の構造に限定されず、直鎖状（例えばアルコキシＰＥＧまたは二官能性ＰＥＧ）、分岐状、またはマルチアーム（例えばフォーク状ＰＥＧまたはポリオール核に結合したＰＥＧ）、樹状、または分解可能な結合を有することができる。さらに、ポリマーの内部構造は、任意の数の異なるパターンで系統化され、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群から選択される。
【００２６】
これらのポリマーもまた、ポリ（酸化アルキレン）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、例えばカルボキシメチルセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸およびキチン、ならびにポリ（メセドリン）アクリレート系が挙げられる。
【００２７】
本発明の実施形態において、生理学的に許容し得るポリマーはそのＰＥＧと誘導体である。ＰＥＧ側鎖は直鎖状、分岐状、フォーク状、マルチアームからなることができる。本発明によって使用されるＰＥＧは、特に限定されない。特に有用なＰＥＧは、３，０００〜２０，０００の範囲に、分子量を持つ。パブリックドメイン（すなわち、決して特許権を得なかったか、現在は特許期限切れ．）にあるいくつかの有用なＰＥＧ分子がある。他の有用なＰＥＧ分子は、ＷＯ０３／０４０２１１、ＵＳ６，５６６，５０６、ＵＳ６，８６４，３５０、およびＵＳ６，４５５，６３９に開示されている。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、生理学的に許容し得るポリマーはポリシアル酸（ＰＳＡ）とその誘導体である。ＰＳＡはＵＳ４，３５６，１７０（本明細書中に援用）に記載の方法によってＶＷＦに結合することができる。本発明の一実施形態において、多糖化合物を、天然に存在する多糖類、天然に存在する多糖類の誘導体または天然に存在する多糖誘導体することが可能である。化合物の多糖部分は、５以上（概して少なくとも１０）のシアル酸残基をポリマー鎖に有し、別の実施形態では少なくとも２０〜５０のシアル酸残基をポリマー鎖に有する。すぐに利用できる多糖化合物は全体で最高５００のサッカライド残基を持つと考えられ、通常ポリマー鎖で３００未満の残基を持つものであってもよい。通常、化合物のサッカライド残基の全てが、シアル酸残基である。
【００２９】
多糖化合物で少なくともポリシアル酸部分、また一実施形態では全ての化合物で、高度に親水性である。親水性は、水酸基と同様に、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基によって主に与えられる。サッカライド単位は、他の官能基（例えばアミン、ヒドロキシル基または硫酸塩基）またはその組合せを含むものであってもよい。これらの基は天然のサッカライド化合物上に存在可能であり、あるいは派生的な多糖化合物に導入されるものであってもよい。
【００３０】
本発明の特定用途の多糖化合物は、細菌によって産生されるものである。これらの天然の多糖の一部は、グリコリピドとして知られている。特に有利なことは、多糖化合物が末端ガラクトース単位を実質的に有しない場合であり、このことは肝細胞およびクッパー細胞のガラクトース受容体によって認識される傾向にある。
【００３１】
ＶＷＦマルチマーは、当業者に知られている種々の技術のいずれかによって、多糖化合物に共有結合可能である。実施例は、ＶＷＦまたは多糖のいずれか一方の上にあるカルボキシル基と他方のアミン基との間のペプチド結合、あるいは一方のカルボキシ基と他方の水酸基との間のエステル結合を介した結合を含む。あるいは、シッフ塩基は一方のアミノ基と他方のアルデヒド基との間に形成することができる。結合の他の機構は、当該技術分野の通常の技量内である。種々の例が米国特許第５，８４６，９５１号の第７欄１５合目から第８欄第５行目までに同定される。
【００３２】
本明細書中で用いられる場合、一つ以上の生理学的に許容し得るポリマー分子に結合しているＶＷＦへの言及は任意の適当な化学的結合、例えば共有結合または非共有結合（例えばイオン性、疎水性、親和性、生物親和性相互作用）を含む。ポリマーを、二価性試薬の使用によって、またスペーサーアームを経てタンパク質に連結させることもできる。加えて、ポリマー分子は親和性相互作用によってＶＷＦに連結することができる。例えば、ＶＷＦをビオチン標識させることができ、アビジンまたはストレプトアビジン結合ポリマーをＶＷＦに結合させることができる。また、ポリクローナルまたはモノクローナル抗ＶＷＦ抗体およびそのフラグメントをポリマーに結合することができ、この複合体をＶＷＦに結合させることができる。ポリマーを酵素的方法、例えばＵＳ６，３７９，９３３に教示されるポリグリコシルトランスフェラーゼによるサッカライドの転移またはＵＳ２００４０１３２６４０Ａ１に教示されるものとしてのグリコペジレーション（ｇｌｙｃｏｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）の転移によってもＶＷＦに結合させることができ、それらの特許文献を本明細書中に援用する。もう一つのアプローチは、ＶＷＦのＡ１およびＡ３領域に対するＰＥＧ付加コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの結合のようなそれらの生体機能を基礎としたＶＷＦに対するポリマーの結合である。この目的のために、ＶＷＦで強い相互作用を示すＩおよびＩＩＩ型（例えばヒト胎盤由来）由来コラーゲンを使うことができる。ポリマーの結合は、タンパク質性構築物の生体内使用の後、安定または可逆的であると思われる。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、「ＰＥＧ付加ＶＷＦ」は一つ以上のＰＥＧに結合するＶＷＦを含み、また本明細書中で用いられる場合、「ＰＥＧ付加（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）」はＶＷＦに一つ以上のＰＥＧを結合させるプロセスを含む。ＰＥＧ付加の適当な方法は、米国特許第５，１２２，６１４号および第５，５３９，０６３号（ＰＥＧ付加方法の全てを本明細書中に援用）に開示されている。
【００３４】
本発明の実施形態によれば、生理学的に許容し得るポリマーはＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体であり、当該技術分野で知られている任意の戦略と方法によってＶＷＦに共有結合する。最も頻度が高い修飾戦略は、リジン残基のアミノ基を経た少なくとも１つのポリマー分子の結合、糖質側鎖を経た少なくとも１つのポリマー分子の結合、スルフヒドリル基を経た少なくとも１つのポリマー分子の結合、水酸基の少なくとも１つのポリマー分子の結合と同様にアスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基を経た少なくとも１つのポリマー分子の結合、ならびにＮ末端の少なくとも１つのポリマー分子の結合である。
【００３５】
本発明の一実施形態において、ＶＷＦに対する少なくとも１つのポリマー分子の結合は、上記ポリマー分子をＶＷＦのリジン側鎖のアミノ基に連結される共有結合によって行うことができる。ヒトＶＷＦは側鎖でＮＨ２基とともに遊離の１０８リジン残基を含み、少なくとも１つのポリマー分子の結合の影響を受けやすい。ポリマー分子が本発明によって共有結合であるＶＷＦのリジン残基の実施例を図１Ａに示す。ＶＷＦのリジン残基に共有結合である可能性がある適当なＰＥＧ誘導体は、例えば、活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）（例えばスクシンイミジル琥珀酸エステル、スクシンイミジルグルタラートまたはスクシンイミジルプロピオン酸）を有するポリエチレングリコールであり、それらはアミド結合を形成することによって、温和な条件下でリジン残基と反応する。活性ＰＥＧの他の例として、活性カーボネート（例えばスクシンイミジルカーボネート（ＳＣ−ＰＥＧ）、およびベンゾトリアゾールカーボネート（ＢＴＣ−ＰＥＧ））を持つものが挙げられる（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９−４７６，２００２の４６３ページを参照）。ＳＣ−ＰＥＧおよびＢＴＣ−ＰＥＧは、カルバミン酸塩結合を形成するためにリジン残基に優先して反応するが、ヒスチジンおよびチロシン残基と反応することも知られている。別の方法は、ウレタン結合を形成するＰＥＧカーボネートまたは第二級アミンを形成するアルデヒドまたはケトンと、例えばナトリウムシアノホウ化水素による還元の後、少なくとも１つのポリマー分子との結合である。ウレタンを生産する他の試薬をアシル化しているＰＥＧは、タンパク質を連結したｐ−ニトロフェニルカーボネート、トリクロロフェニルカーボネート、およびカルボニルイミダゾールを含む。これらの試薬は、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）（前述のＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．の４６４ページを参照）上で、末期の水酸基とクロロギ酸エステルまたはカルボニルイミダゾールとを反応させることによって調製される。もう一つの実施例は、所謂「第二世代」ＰＥＧ付加化学に関するもので、それによって、酸性条件下のｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒドが、Ｎ末端ａ−アミンに対して選択的である（上記のＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．の４６４ページを参照）。遊離可能なＰＥＧ試薬（例えばＰＥＧ無水マレイン酸、ｍＰＥＧフェニルエーテルスクシンイミジルカーボネート、およびｍＰＥＧベンズアミドスクシンイミジルカーボネート）は、結合体の生産に用いることが可能である。上記のＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．の４６９ページに記載のように、結合体は、生理学的条件下において「非標識（ノータグ）」で治療的タンパク質を遊離する。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態において、ＶＷＦはその糖質残基を経て少なくとも１つのポリマー分子に結合することができる。このことは、例えば糖質のマイルド酸化（例えば、ＮａＩＯ４による）によって、実施することができ、アルデヒド機能を形成するとともに、その後ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−ヒドラジド）に対して連結する。この手法の長所は、以下の事実に基づく。すなわち、ＶＷＦのＡ１およびＡ３ループは、コラーゲン結合部位を含むことから、それらはＶＷＦの生物学的活性について重要な領域であり、また糖質残基を含まずに、図１Ｂで分かるように、この手法によって修飾されない場合もある。この図は、アスパラギンＮ結合型ＧＩｃＮＡｃとスレオニンまたはセリンＯ結合型ＧａＩＮＡｃ残基の実施例を表し、それらは酸化型であり、その後少なくとも１つのポリマー分子によって結合し得る。ＶＷＦの糖質が特定の領域に集まるという事実のため、ＶＷＦはこの修飾手法の使用によって少なくとも１つのポリマー分子と直接結合する部位であると考えられる。ＶＷＦの治療的活性形態が求められる場合、糖質残基に対するポリマーの結合が特に有利である。これは、既知の方法によってＮ結合型残基またはＯ結合型残基のいずれかに対してポリマーが選択的に反応することによって高められる。例えば、酵素グルコースオキシダーゼは複数の反応性アルデヒド基を生成するためにＶＷＦ上の糖質残基を酸化する際に用いることができ、ＰＥＧ−ヒドラジドと反応してヒドラゾン結合を生産することができ、またはＰＥＧ−アミンと反応して可逆性シッフ塩基を生産することができる（前述のＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．の４６７ページを参照）。特定の状況下では、ＶＷＦのＮ末端セリンまたはスレオニンを、過沃素酸酸化によってグリオキシル誘導体に変換することによって、部位特異的結合に用いることができる（前述のＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．の４６７ページを参照）。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、スルフヒドリル基を経たＶＷＦに対する少なくとも１つのポリマー分子の結合である。ヒトＶＷＦは、例えばＰＥＧマレイミドによって、１７７個の遊離ＳＨ基（修飾し得る）を持ち、安定なスルフィドを形成している。システイン残基のＰＥＧ付加は、例えば、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミドまたはＰＥＧ−オルソピリジルジスルフィドを使用して、行うことが可能である（前述のＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．の４６６ページを参照）。
【００３８】
その複数の機能によって、ＶＷＦ分子は、特異的な受容体またはリガンドに対するいくつかの結合部位を有する（Ｇｉｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．７４：１５６−６０，１９９５）。１つの重要な結合部位はＦＶＩＩＩ結合領域であり、成熟サブユニット（アミノ酸１〜２７２）のＮ末端に位置する。このエピトープを、遊離ＦＶＩＩＩによるインキュベーションと複雑なＦＶＩＩＩ／ＶＷＦの形成にとよって保護することができる。その後、複合体を化学的に修飾（ＰＥＧ付加またはポリシアル酸付加）し、遊離ＦＶＩＩＩ結合部位によるポリマー結合ＶＷＦを、ＦＶＩＩＩから分離する（例えば０．３ＭＣａＣｌ２または２ＭＮａＣｌによるサイズ排除クロマトグラフィーによる）。同様に、ＶＷＦを固定ＦＶＩＩＩを持つ親和性樹脂に結合させることができる。その後、ＶＷＦとポリマー（例えばポリエチレングリコールまたはポリシアル酸誘導体）とから化学的に結合させ、バッチモードまたはクロマトグラフィーカラムの使用により、このマトリックス（例えば高塩条件下、例えば０．３ＭＣａＣｌ２または２ＭＮａＣｌ）から溶出させる。
【００３９】
ＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合エピトープは、ヘパリン結合部位位とほとんど同一である。このように、ＦＶＩＩＩ結合部位はヘパリンに対するＶＷＦの結合または固定化ヘパリンを有する親和性樹脂に対するＶＷＦの結合によって、化学修飾法の過程でブロックおよび保護される。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、用語「第ＶＩＩＩ因子結合部位保護剤」とは、ＶＷＦ分子上でＦＶＩＩＩ結合領域またはエピトープと結合する任意の薬剤のことをいう。第ＶＩＩＩ因子結合部位保護剤は、第ＶＩＩＩ因子、ＦＶＩＩＩの誘導体、ヘパリン、およびヘパリン誘導体から選択可能である。
【００４１】
本発明は、少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子に連結されないＶＷＦの生体内半減期と比較して、ＶＷＦまたはその生物活性誘導体の生体内半減期の増大に関する。本発明の一実施形態において、別の実施形態で生体内半減期が少なくとも３倍増大している一方で、ＶＷＦの生体内半減期は少なくとも２倍長くなる。さらに別の実施例において、生体内半減期は少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子の結合によって、５倍に増大する。下記の実施例７に記載のように、ＶＷＦ半減期の増大または延長を、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスでＶＷＦの薬物動態学を計測することによって評価することができる。手短に言うと、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスは尾静脈を経てＦＶＩＩＩで予備混合されるＶＷＦの大量瞬時投与で処置され、ＶＷＦ抗原量は種々の時点で、血漿サンプルで計測される。ＶＷＦ抗原（ＦＶＩＩＩ抗原と同様に）を、ＥＬＩＳＡアッセイを介して計測することができる。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、ＦＶＩＩＩの生体内半減期がポリマーＶＷＦ結合体によって哺乳動物血液中で長くなる、少なくとも１つのポリマーＶＷＦ結合体と少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子との間に形成される複合体に関する。
【００４３】
ポリマーＶＷＦ結合体とＦＶＩＩＩとの結合は、ＦＶＩＩＩの生体内半減期と比較すると、上記ＦＶＩＩＩの生体内半減期を延長または増加させ、ＶＷＦを少なくとも１つの生理学的に許容可能なポリマー分子に連結していない複合体を形成する。本発明の一実施形態において、ＦＶＩＩＩの生体内半減期は、少なくとも１．５倍であり、別の実施形態では少なくとも２倍、別の実施形態では少なくとも３倍、さらに別の実施形態では少なくとも５倍である。
【００４４】
本発明のポリマーＶＷＦ結合体を、血友病Ａおよび／またはＶＷＤの処置またはこれらの２つの疾患の亜型の処置に使用することができる。ＶＷＤの場合、ポリマーＶＷＦ結合体の使用は、予防プロトコルまたはオンデマンド処置とも各々呼ばれる規則的または不規則な処置によってコンセントレートを含むＶＷＦによる現在の補充療法と類似している。ポリマーＶＷＦ結合体を、血友病Ａ予防のアジュバント処置として用いることもできる。これらの処置状況下で、ポリマーＶＷＦ結合体は、血漿由来または組換え型のＦＶＩＩＩコンセントレートとは別個に時間間隔で投与され、血友病Ａの規則的な処置のために現在使われる同じことが通常通り与えられるが、ポリマーＶＷＦ結合体の半減期延長能力による長期間の処置間隔による。
【００４５】
血友病ＡおよびＶＷＤの予防と血友病ＡおよびＶＷＤの急性出血の処置とに関する本発明の一実施形態では、血友病ＡまたはＶＷＤを有する患者に、ポリマーＶＷＦ結合体をＦＶＩＩＩと共に投与するか、あるいはＦＶＩＩＩで複合体の形で投与する。このような場合、体内または外部の出血の停止が、治療的に有効なレベルにＶＷＦおよび／またはＦＶＩＩＩのいずれかのさもなければ低い血漿レベルを上げることで、直ちに達成することが必要である。ポリマーＶＷＦ結合体を免疫寛容療法に用いて、阻害抗体を根絶することもでき、該阻害抗体はＦＶＩＩＩ（凝血抑制因子増加性血友病としても公知の臨床状況、またはＶＷＦに対して）に対して発現した。このような状況下で、ＦＶＩＩＩの超生理学的および超薬理学レベルを、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦに対する発現した阻害因子を有する患者に投与する。治療のこの形態は、上記製剤を投与された患者の血行で通常より高い回復とＶＷＦより長い持続性とを持っているポリマーＶＷＦ結合体の使用によって促進される。
【００４６】
治療の技術水準によれば、また国際的なガイドラインと規則に従って、注入されたＦＶＩＩＩの薬物動態学が認識され、有効性のための妥当な代用のマーカーと認められる。このことは、機能的な活性のために標準検査によって特徴づけられる注入されたＦＶＩＩＩ産物が血流量で見いだされること、またテナーゼ複合体（ＦＩＸａおよびリン脂質に結合することによる第Ｘ因子の活性化複合体）のコファクターとして予想されたようにそこで作用するという、確証された仮定に基づく（Ｅｌｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．２１：６９５−７００，１９８１）。したがって、動物モデルの任意の薬動力学の分析は、ＦＶＩＩＩ産物で処置される患者で、期待される有効性を予測する。
【００４７】
ＦＩＸコファクター活性を判定するために、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａ試料（トロンビンで完全に活性化されるＦＶＩＩＩ）を、ＦＩＸａ、ＦＸ、燐脂質、およびＣａＣｌ２からなる調製された混合物に加える。この反応混合物を３７℃でインキュベートして複合体形成を可能にするとともに、その後のＦＸａ生成を可能にする。副試料を最高２０分の間隔で採血し、ＦＸａによって選択的に分けられる色素基質に加える。１５分のインキュベーションの後、酢酸を添加することで反応を停止させる。吸光度（Ａ４０５）値（それはＦＸａ濃度に比例）をＥＬＩＳＡリーダーで計測し、反応混合物のインキュベーション時間に対してプロットする。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの少なくとも１つの機能的な欠陥または欠乏を伴う出血障害がある哺乳動物血液でＦＶＩＩＩの生体内半減期を延長する方法の提供であり、該方法は、
（ａ）上記に定義された少なくとも１種類のタンパク質性構築物を提供するステップと、
（ｂ）上記に定義した少なくとも１種類のＦＶＩＩＩを提供するステップと、
（ｃ）上記タンパク質性構築物と上記ＦＶＩＩＩとの間の複合体を形成するステップと、を有する。
【００４９】
上記の方法の一実施形態では、ステップ（ｃ）の複合体は、例えばタンパク質性構築物と上記ＦＶＩＩＩとを混合することによって「体外」（すなわち、哺乳動物の体外）で形成され、このように形成された複合体を上記出血障害がある哺乳動物に対して有効量投与する。
【００５０】
上記の方法のさらなる実施形態では、ステップ（ｃ）の複合体は、上記哺乳動物に有効な量でタンパク質性構築物を投与すると即座に、上記出血障害がある哺乳動物血液中に存在するタンパク質性構築物と内因性ＦＶＩＩＩとの間に体内（すなわち哺乳動物の体内）で形成される。
【００５１】
上記の方法のさらに別の実施例では、ステップ（ｃ）の複合体は、上記哺乳動物に有効な量でタンパク質性構築物を投与すると即座に、上記出血障害がある哺乳動物血液で存在する外因性ＦＶＩＩＩとタンパク質性構築物との間に「体内で」形成される。外因性ＦＶＩＩＩを有効量で上記タンパク質性構築物と同時に、または経時的に、例えば上記タンパク質性構築物の前または後に、投与することが可能である。
【００５２】
本明細書中で用いられる場合、「内因性ＦＶＩＩＩ」は上記哺乳動物から生じるＦＶＩＩＩを含む。上記哺乳動物に存在する導入遺伝子または任意の他の外来性ＤＮＡから転写されるＦＶＩＩＩも含む。本明細書中で用いられる場合、「外因性ＦＶＩＩＩ」は既に概説されたｐｄＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩを含むＦＶＩＩＩ（上記哺乳動物からは生じない）を有するとともに、ｐｄＦＶＩＩＩ（上記の定義された複合体を形成した後に単離された哺乳動物に再投与される）、さらにｒＦＶＩＩＩ（ＤＮＡが上記ｒＦＶＩＩＩの産生で使われた哺乳動物に投与される）が挙げられる。
【００５３】
本明細書中で用いられる場合、上で概説されるように、「有効量」は出血障害がある哺乳動物を処置するための適当な用量を含み、例えば、ヒトに関して、好ましくは１回の注入あたり５〜１，０００ＩＵ、より好ましくは１回の注入あたり１０〜２５０ＩＵの範囲内である。
【００５４】
投与経路は特に制限されるものではなく、一実施形態において、タンパク質性構築物または本発明の複合体を注射（例えば静脈内、筋内、または腹腔内注射）によって投与することも可能である。
【００５５】
本発明も、本明細書中で用いられるＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの少なくとも１つの機能的な欠陥または欠乏を伴う出血障害を処置することに関し、出血障害の原因が、ＦＶＩＩＩおよび／またはＶＷＦの短くなる生体内半減期、ＦＶＩＩＩおよび／またはＶＷＦの改変された結着性、ＦＶＩＩＩおよび／またはＶＷＦの遺伝子欠損とＦＶＩＩＩおよび／またはＶＷＦの減少した発現からなる群から選択されるものであってもよい出血障害が含まれる。本発明の一実施形態において、出血障害は血友病Ａ、ＶＷＤまたはＶＷＦの障害のある機能または他の分子によるＶＷＦの障害のある相互作用に関連した他の疾患からなる群から選択される。
【００５６】
さらに、本発明は上記に定義されたタンパク質性構築物の有効量または上記に定義された複合体の有効量を含む医薬品組成物に関する。医薬品組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、塩、緩衝液、または賦形剤をさらに含む可能性がある。医薬品組成物が、上記に定義された出血障害を処置するために使用し得る。本発明の医薬品組成物は、溶液または凍結乾燥された産物である可能性がある。タンパク質と特にＶＷＦとＦＶＩＩＩの安定溶液を形成する多くの既知の方法がある。例えば、米国特許第６，５８６，５７３号、第５，５６５，４２７号、第５，７６３，４０１号、第５，７３３，８７３号、第４，８７７，６０８号、第５，６０５，８８４号、および第５，３２８，６９４号が挙げられる。これらの溶液は任意の適当な凍結乾燥プロセス（例えばＵＳ  ６，５８６，５７３に記載のプロセス）にかけることができ、そのことは本明細書中に援用する。本発明は、単独ポリマーＶＷＦ結合体単独またはＦＶＩＩＩと組み合わせた他の適当な形態を含む。
【００５７】
本発明は、以下の実施例でさらに詳しく説明されるが、それらになんら限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
（実施例１：糖質残基の修飾によるポリマーＶＷＦ結合体の調製）
糖質残基（図１Ｂ）を介してポリマーＶＷＦ結合体を調製するために、ｒＶＷＦ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）の溶液を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で調製し、ＮａＩＯ４を糖質残基の酸化のために添加した（５ｍＭ最終濃度）。酸化を４℃で２０分間行い、亜硫酸水素ナトリウム（５ｍＭ最終濃度）を添加して反応を停止させた。その後、ｍＰＥＧヒドラジド（鎖長：３ｋＤ）を添加し（１０ｍＭ最終濃度）、さらにＶＷＦのＰＥＧ付加を室温で１時間行った。次に、ＰＥＧ付加ＶＷＦをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物をセファクリルＳ−３００ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）充填クロマトグラフィーカラム（寸法２６ｍｍ×８４０ｍｍ）に加え、ＰＥＧ付加ＶＷＦを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、５％トレハロース含有）を用いて、試薬から分離した。２８０ナノメートルＶＷＦ抗原量およびＯＤの計測によって示されるように、修飾ＶＷＦをボイド容量で溶出させた。ＶＷＦ含有分画を、さらに精製するために、ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０Ｍ（Ｍｅｒｃｋ）充填陰イオン交換カラムに直接載せた（寸法：１０ｍｍ×１０８ｍｍ）。次に、ＰＥＧ付加ＶＷＦを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（５％トレハロースおよび１０００ｍＭ  ＮａＣｌ含有）で溶出させた。
【００５９】
（実施例２：ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネートによるＶＷＦのリジン残基のＰＥＧ付加）
リジン残基（図１Ａ）を介したＶＷＦのＰＥＧ付加のために、ｒＶＷＦ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）溶液を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、５％ショ糖含有）で調製し、ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（鎖長：５ｋＤ）を添加した（１０ｍＭ最終濃度）。ＶＷＦを室温で１時間、ＰＥＧ付加した。その後、ＰＥＧ付加ＶＷＦをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物をセファクリルＳ−３００ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）充填クロマトグラフィーカラムに載せ、ＰＥＧ付加ＶＷＦを、ＰＥＧ付加反応に使用されるのと同じ緩衝系によって分離した。ＶＷＦ抗原量およびＯＤ２８０ｎｍの計測によって示されるように、修飾ＶＷＦをボイド容量で溶出させた。ＶＷＦ含有分画を、さらに精製するために、ＥＭＤ  ＴＭＡＥ６５０Ｍ（Ｍｅｒｃｋ）充填陰イオン交換カラムに直接載せた（寸法：２６ｍｍ×８４０ｍｍ）。次に、ＰＥＧ付加ＶＷＦを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（５％ショ糖および１０００ｍＭ  ＮａＣｌ含有）で溶出させた。
【００６０】
（実施例３：ｍＰＥＧｐ−ニトロフェニルカーボネートによるＶＷＦのリジン残基のＰＥＧ付加）
ｍＰＥＧ  ｐ−ニトロフェニルカーボネートによるＶＷＦのＰＥＧ付加のために、血漿由来ＶＷＦ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６、５％ショ糖含有）で調製し、ｍＰＥＧ  ｐ−ニトロフェニルカーボネート（鎖長：２ｋＤ）を添加した（最終濃度：１０ｍＭ）。ＶＷＦを室温で２時間、ＰＥＧ付加した。その後、ＰＥＧ付加ＶＷＦをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物をセファクリルＳ−３００ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）充填クロマトグラフィーカラムに載せ、ＰＥＧ付加ＶＷＦを、ＰＥＧ付加反応に使用されるのと同じ緩衝系によって分離した。ＶＷＦ抗原量およびＯＤ２８０ｎｍの計測によって示されるように、ＶＷＦをボイド容量で溶出させた。
【００６１】
（実施例４：ｍＰＥＧマレイミドによるＶＷＦのスルフヒドリル残基のＰＥＧ付加）
ｍＰＥＧマレイミドによる遊離ＳＨ残基を介したＶＷＦのＰＥＧ付加のために、ｒＶＷＦ溶液（最終濃度：５００μｇ／ｍ）を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６、４％マンノースおよび１％トレハロース含有）で調製し、ｍＰＥＧ  マレイミド（鎖長：１０ｋＤ）を添加した（最終濃度：１０ｍＭ）。ＶＷＦを室温で２時間、ＰＥＧ付加した。その後、ＰＥＧ付加ＶＷＦをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物をセファクリルＳ−３００ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）充填クロマトグラフィーカラムに載せ、ＰＥＧ付加ＶＷＦを、ＰＥＧ付加反応に使用されるのと同じ緩衝系によって分離した。ＶＷＦ抗原量およびＯＤ２８０ｎｍの計測によって示されるように、修飾ＶＷＦをボイド容量で溶出させた。
【００６２】
（実施例５：デキストランとＶＷＦとの結合）
６ｍｇ／ｍｌのデキストラン（ＭＷ４０ｋＤ）溶液を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で調製し、ＮａＩＯ４を添加した（最終濃度１０ｍＭ）を添加して遊離アルデヒド基を生成した。酸化を暗所で４℃、１時間実施し、亜硫酸水素ナトリウム（最終濃度５ｍＭ）を添加して反応を停止させた。活性化デキストランを０．１５ＭＮａＣｌ（ＰＢＳ緩衝液）含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で透析した。次に、この活性化デキストラン溶液２．４ｍｌを１０ｍｌのｒＶＷＦ溶液（濃度：ＰＢＳ緩衝液中０．６ｍｇ／ｍｌ）に添加した。この混合物に、５ｍｌのシクラミン酸ナトリウム溶液（ＰＢＳ緩衝液中６４ｍｇ／ｍｌ）を添加し、暗所で室温、一晩にわたってインキュベートした。次に、３ｍｌの１．０ＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．２）を添加して残留アルデヒド基をブロックし、室温で１時間インキュベートし、さらに２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、５％ショ糖含有）でインキュベートした。次に、ｒＶＷＦ誘導体に結合したデキストランをさらに、セファクリルＳ−３００ＨＲ（緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％ショ糖、ｐＨ７．４）を充填したクロマトグラフィーカラム（寸法：５０ｍｍ×８６０ｍｍ）に混合物を載せることで、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ｒＶＷＦ誘導体を、ＶＷＦ抗原量およびＯＤ２８０ｎｍの計測によって示されるように、ＶＷＦをボイド容量で溶出させた。これらの分画を回収し、１００ｋＤの再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、限界濾過法によって濃縮した。
【００６３】
（実施例６：ＶＷＤマウスにおける薬物動態）
Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  ９５：９５２４−９５２９，１９９８）に詳述されているＶＷＦ欠乏マウスを、重度ＩＩＩ型ＶＷＤ類似ヒトＶＷＤモデルとして使用した。マウス５匹からなる群に対して、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ（鎖長３ｋＤ、実施例１によるｒＶＷＦのＰＥＧ付加）または対照としてのネイティブｒＶＷＦを、ＰＥＧ付加後、検出可能なＶＷＦ（ＥＬＩＳＡ）に基づいて、４０単位（Ｕ）ＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇ体重の用量で、経尾静脈ボーラス注入法により投与した。ＰＥＧ−ｒＶＷＦ群を、注射後５分、３０分、１時間、２時間、６時間、１０時間、および２４時間（対照群の場合、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、および２４時間）麻酔し、クエン酸血漿を心臓穿刺から調製した。血漿でＶＷＦ抗原量を追跡した。この実験の結果を図２にまとめる。ネイティブｒＶＷＦを、文献（Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１２１０２−１２１０９，２００４）に記載されているように、典型的な二相法で血行から除去することで、６００分と１４４０分（１０時間および２４時間に等しい）との間の検出限界以下に落とす。対照的に、注射時の０から注射後１０時間の約０．６Ｕ／ｍｌ血漿までの初期増加後のＰＥＧ付加ｒＶＷＦは、依然として注射後２４時間であっても約０．４Ｕ／ｍｌの実質的に高いレベルに存在し、１０時間ないし２４時間の範囲では平坦な勾配となったことから、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦがより長期にわたって持続することが示される。経時的な計測可能ＶＷＦの漸増は、ＶＷＦによって結合体を形成したポリマーＰＥＧの結合の可逆性を示すもので、ポリマーからの放出後、計測のためにアクセス可能になる。このモデルでのＰＥＧ−ＶＷＦの長い循環時間は、この調製物がＶＷＤの予防療法に使用し得ることを示す。
【００６４】
（実施例７：ＦＶＩＩＩ−Ｋ．Ｏ．マウスにおける薬物動態）
Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１９−１２１，１９９５）に詳しく記載されているＦＶＩＩＩ欠乏マウスを、重度ヒト血友病Ａのモデルとして使用した。マウス５匹からなる群に対して、各々をｒＦＶＩＩＩと事前に混合して３ＵＦＶＩＩＩ／ｍｌおよび３ＵＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌを達成するためにＰＥＧ−ｒＶＷＦ（鎖長３ｋＤ、実施例１によるｒＶＷＦのＰＥＧ付加）またはネイティブｒＶＷＦのいずれかによる経尾静脈ボーラス注入法による投与（１３ｍｌ／ｋｇ）を行った。麻酔後、生成物を注射してから５分および６時間後に、心臓穿刺によってクエン酸血漿を各々の群から調製した。対照群に対しては緩衝液を注射し、注射５分後に出血させた。ＶＷＦ抗原量を血漿サンプルで計測した。この実験の結果を図３にまとめた。曲線は、ＶＷＦのベースレベルの近くまで落ち込んだ、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスに存在するｒＶＷＦの典型的除去を示し、その一方でＰＥＧ付加ｒＶＷＦの使用後、レベルが６時間の観察期間中に増加したことを示す。このことは再び、ポリマーＰＥＧの結合の可逆性がＶＷＦと結合体を形成したことを示し、ポリマーからの放出の後、計測のためにアクセス可能になり、適用後３６０分（６時間）経過しても増加を持続することを示している。
【００６５】
（実施例８：ＶＷＤマウスでのＦＶＩＩＩ増加）
Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  ９５：９５２４−９５２９，１９９８）によって詳述されるフォンビルブラント欠乏マウスを、重度ＩＩＩ型ＶＷＤ類似ヒトＶＷＤモデルとして使用した。４〜５匹のマウスからなる群に対して、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ（鎖長５ｋＤ、実施例２によるｒＶＷＦのＰＥＧ付加）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％ショ糖、ｐＨ７．４）またはネイティブｒＶＷＦを、尾静脈を経る静脈内注射した。対照群を緩衝液で処置した。（ＥＬＩＳＡ換算ＰＥＧ−ｒＶＷＦ−用量１８ＵＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇ、２７００μｇ／ｋｇ、ｒＶＷＦネイティブ用量：２４００μｇ／ｋｇ）。
【００６６】
各マウスに対して、１０ｍｌ／ｋｇ体積用量を投与した。ＰＥＧ−ｒＶＷＦ投与後の時点（５分、１時間、３時間、６時間、１０時間、２４時間、および４８時間）またはネイティブｒＶＷＦ投与後の時点（５分、１５分、３０分、１時間、２時間、６時間、２４時間、および３２時間）の注射の後の時点で、マウス４〜５匹からなる群を麻酔し、クエン酸血漿を心臓穿刺から調製し、ＦＶＩＩＩ活性（ハウスアッセイにおける発色）のレベルを血漿で追跡した。対照群を注射１５分後に出血させた。この実験の結果を図４にまとめた。
【００６７】
マウスにおける内因性ＦＶＩＩＩのレベルは、ｒＶＷＦ注入の結果として増加する。ＰＥＧ付加ｒＶＷＦ適用後の血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、ｒＶＷＦ使用後のたったの３．３Ｕ＊ｈ／ｍｌと比較して、８．０Ｕ＊ｈ／ｍｌであった。これは、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦのための実質的により長い循環時間を示す。結果は、ＰＥＧ付加ＶＷＦがＶＷＤにおける二次ＦＶＩＩＩ欠乏の予防療法に使用し得ることを示す。
【００６８】
（実施例９：ＦＶＩＩＩ−Ｋ．Ｏ．マウスでのｒＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの回収）
Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１０：１１９−１２１，１９９５）に詳しく記載されているＦＶＩＩＩ欠乏マウスを、重度ヒト血友病Ａのモデルとして使用した。マウス５匹からなる群に対して、各々をｒＦＶＩＩＩと事前に混合して３ＵＦＶＩＩＩ／ｍｌを達成するためにＰＥＧ−ｒＶＷＦ（ＨＺ−ＰＥＧ、３Ｋ、糖質を介して結合）またはネイティブｒＶＷＦのいずれかによる経尾静脈ボーラス注入法による投与（１３ｍｌ／ｋｇ）を行った。麻酔後、注射してから５分および６時間後に、心臓穿刺によってクエン酸血漿を各々の群から調製した。ＦＶＩＩＩ活性およびＶＷＦ抗原回収量を血漿サンプルで計測した。この実験の結果を図５および図６にまとめた。
【００６９】
無処置のｒＶＷＦと比較して、両調製物のＰＥＧ付加ｒＶＷＦは、同時注射されたｒＦＶＩｌｌのより高度な回収をもたらした。経時的にＰＥＧ付加ｒＶＷＦに対するＶＷＦレベルが上昇し、その一方で正常ｒＶＷＦが３６０分以内に完全に除去された。結果は、ＦＶＩＩＩと複合体を形成したＰＥＧ付加ＶＷＦを、ＦＶＩＩＩ循環時間の増大という利点をもって血友病Ａの急性処置に用いることができることを示している。
【００７０】
（実施例１０：ＦＶＩＩＩ×ＶＷＦダブルノックアウトマウスにおけるＦＶＩＩＩ半減期の増大）
ＦＶＩＩＩ×ＶＷＦダブルノックアウトマウスは、ＦＶＩＩＩ欠乏およびＶＷＦ欠乏マウスの交雑育種によって得られた。それらのマウスはＶＷＦ欠乏と同様にＦＶＩＩＩ欠乏を患う。このように、動物モデルにおけるＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ相互作用を研究するための理想的なモデルを提供する。
【００７１】
ＦＶＩＩＩ×ＶＷＦダブルノックアウトマウス（ＦＶＩＩＩ欠乏マウスをＶＷＦ欠乏マウスと交雑育種した）５匹からなる群に対して、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ（鎖長５ｋＤ、ｒＶＷＦのＰＥＧ付加を、ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネートのリジン残基の修飾によって、実施例２により行った）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％ショ糖、ｐＨ７．４（またはネイティブｒＶＷＦＳＳ−ＰＥＧまたはネイティブｒＶＷＦ（各々をｒＦＶＩＩＩと事前に混ぜ合わせ、９ＵＦＶＩＩＩ／ｍｌおよび９ＵＶＷＦ抗原／ｍｌおよび０．６７ＵＶＷＦ：ＲＣｏ／ｍｌを達成）を、経尾静脈によりボーラス注入（１１ｍｌ／ｋｇ）を行った。公開（Ｉｎｇｅｒｓｌｅｖ（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ）．Ｉｎｖｅｓｔ．４７：１４３−１４９（１９８７））されているようにして、ＶＷＦ−抗原値をＥＬＩＳＡ法で計測した。一次止血のプロセスにおけるＶＷＦの血小板結着性を反映している機能的なＶＷＦ：ＲＣｏ活性をＭａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．３４：３０６−３０８，１９７５）により、計測した。注射後５分、３時間、６時間、１０時間、および２４時間、麻酔後の心臓穿刺によるクエン酸血漿を、それぞれの群から調製した。ＦＶＩＩＩ活性およびＶＷＦ抗原量を、血漿サンプルで計測した。
【００７２】
ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの半減期を、薬物動態学ライブラリーの１つの区画をモデルとして使用するＭｉｃｒｏＭａｔｈ科学者プログラム（Ｍｉｃｒｏｍａｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）を用いて算出した。ｒＶＷＦまたはＰＥＧ付加ｒＶＷＦのいずれかと同時注入されたＦＶＩＩＩの半減期は、１．８８時間から２．５８時間へと増大し、血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は４．３から７．３Ｕ＊ｈ／ｍｌへと増大した。ＶＷＦの半減期は、３．１から１０．４へと増大し、血中濃度時間曲線下面積は、５．７から２２．８に増やされる。結果を図７および図８にまとめた。データによれば、ＰＥＧ−ＶＷＦを、ＶＷＤおよびＦＶＩＩＩの循環時間を長くするという利点とともに、血友病ＡおよびＶＷＤの急性処置および予防処置のために使用し得ることが示された。
【００７３】
（実施例１１：マウス血漿におけるＰＥＧ付加の可逆性の実証）
ＰＥＧ付加の可逆性を、ＶＷＦ欠乏血漿による試験管内実験によって示した。クエン酸血漿を、４℃、１５分間、１１００ｘｇの遠心によって、ＶＷＦ欠乏マウスから得た（Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ９５：９５２４−９５２９，１９９８）。４容量のマウス血漿を、実施例１（糖質を経たＰＥＧカップリング）または実施例２（リジン残基を経たＰＥＧカップリング）によって調製し、４８時間にわたり３７℃に保ち、１容量のＰＥＧ付加ｒＶＷＦと混ぜ合わせた。非ＰＥＧ付加ｒＶＷＦが、両方の実験における対照として用いた。副試料を混合直後、ならびに１時間、５．５時間、２４時間、および４８時間後に回収し、ＶＷＦ抗原量を、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムを用いて凍結試料からアッセイした。ポリクローナル抗ＶＷＦ抗体（ＤＡＫＯ）を用いて、９６穴ＥＬＩＳＡプレートを被覆し、ヤギ−抗ウサギ−ｌｇＧ−ＨＲＰ−結合体（ＡＸＥＬＬ）を結合ＶＷＦ因子検出のためにアッセイした。経時的にＶＷＦ抗原の増加性量を計測し、生体外血漿サンプルにおける場合も含めＶＷＦに対するポリエチレングリコールの結合の可逆性が示された（図９）。
【００７４】
（実施例１２：ＰＥＧ付加ＶＷＦ調製試料のＦＶＩＩＩ結合能の側定）
異なるＰＥＧ付加ｒＶＷＦ調製試料のＦＶＩＩＩ結合能を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００装置（ＢＩＡＣＯＲＥ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して表面プラズモン共鳴実験によって比較した（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  Ｆａｌｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００：１２１−３３，１９９７）。通常、リガンドをセンサチップに固定し、該リガンドに対する他の構成要素の結合を表面プラズモン共鳴によって測定する。この技術の使用によって、チップ表面の近くの溶液の屈折率の変化が計測される。チップの表面の結合した構成要素の濃度変化を信号として検出し、それを任意の共鳴音単位（ＲＵ）で表す。固定リガンドに結合したタンパク質量と観察されるＲＵとのあいだに、比例関係が存在する。ＰＥＧ付加ＶＷＦ調製試料を、７０００〜９０００ＲＵおよび２５℃で、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）センサチップのデキストラン表面に２５℃で固定した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ緩衝液、ＢＩＡＣＯＲＥ）を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を流速１５μｌ／分で使用した。図１０に例示されるように、市販のＦＶＩＩＩ産物（ＡＤＶＡＴＥ、Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）の異なる量の結合が計測された。この図は、ｍＰＥＧマレイミド５０００で修飾され、かつ実施例４によって調製されるＰＥＧ付加ｒＶＷＦ調製試料のＦＶＩＩＩ結合能を示す。異なるＰＥＧ付加ｒＶＷＦ調製試料のＢＩＡＣＯＲＥ実験の結果を表１にまとめている。この表では、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦ調製試料の異なるＦＶＩＩＩ結合能は、１０〜２０ＩＵＦＶＩＩＩ／ｍｌ（色素アッセイ）の範囲にある参照の最大レベルでの非ＰＥＧ付加参照調製試料のＲＵ値の割合として与えられる。
【００７５】
【表１】
0005715983.tif 000002
（実施例１３：ポリマー結合後のＶＷＦの質量増加）
ｒＶＷＦを、種々の濃度（１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、および１０ｍＭ）でｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（鎖長：５ｋＤ）を使用して、実施例２により、ＰＥＧ付加した。ＰＥＧ付加ＶＷＦ種を２つの異なる方法で分析した。すなわち、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＶＷＦマルチマー分析である。ＳＤＳゲル電気泳動を、３〜８％勾配ゲルを使用して還元条件下で行った（Ｔｒｉｓ  Ａｃｅｔａｔ  Ｇｅｌ／Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。ＶＷＦマルチマー分析を、１．６％のアガロースゲルを使用してＲｕｇｇｅｒｉ  ｅｔ  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ（Ｂｌｏｏｄ  ５７：１１４０−４３，１９８１）により行った。ＶＷＦマルチマーの明視化を、Ａｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５５：２６３−６７，１９８６）によって実施した。
【００７６】
ＳＤＳゲル電気泳動（図１１）は、成熟ＶＷＦ（下部のバンド）とプロＶＷＦ（上層ブライトバンド）とからなるｒＶＷＦ調製試料を示すとともに、異なる試薬濃度の使用によってＰＥＧ付加後の分子量が増加することを示す。ＰＥＧ付加の後、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）調製試料（ＰＥＧ付加は、実施例２によって実施）からの分子量の推移は、参照調製試料として示される。ＨＳＡの分子量が６６，０００のダルトンから１９０，０００のダルトンまでシフトしていることで、ＰＥＧ付加手法が有効であることが示されることが明らかになった。
【００７７】
図１２は、異なる試薬濃度でのＰＥＧ付加前後におけるｒＶＷＦの多量体パターンを示す。試薬濃度の上昇に伴って異なるマルチマーの分子量がより高いほうへ移行および広幅化することが明らかに示される。
【００７８】
（実施例１４：ｍＰＥＧスクシンイミジルグルタレートによるＶＷＦのリジン残基のＰＥＧ付加）
リジン残基（図１Ａ）を介したＶＷＦのＰＥＧ付加のために、ｒＶＷＦ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、５％スクロース含有）で調製し、ｍＰＥＧスクシンイミジルグルタレート（鎖長：５ｋＤ）を添加した（最終濃度：２００ｍｇＰＥＧスクシンイミジルグルタレート／ｍｇタンパク質）。つぎに、ｐＨ値を０．１ＭＮａＯＨで７．４に合わせた。ＶＷＦを室温で１時間、ＰＥＧ付加し、実施例２の記載に従って精製した。
【００７９】
（実施例１５：ＦＶＩＩＩ−Ｋ．Ｏ．マウスでのＦＶＩＩＩ半減期の増大）
Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１９−１２１，１９９５）に詳しく記載されているＦＶＩＩＩ欠乏マウスを、重度ヒト血友病Ａのモデルとして使用した。マウス５匹からなる群に対して、各々を組換え型ＦＶＩＩＩと事前に混合して１０ＵＦＶＩＩＩ／ｍｌおよび１０ＵＶＷＦ／ｍｌを達成するために、実施例２により調製したＰＥＧ−ｒＶＷＦ（ＳＳ−ＰＥＧ、５Ｋ）またはネイティブｒＶＷＦのいずれかによる経尾静脈ボーラス注入法による投与（１０ｍｌ／ｋｇ）を行った。麻酔後、生成物を注射してから５分、３時間、９時間、および２４時間後に、心臓穿刺によるクエン酸血漿を調製した。ＦＶＩＩＩ活性およびＶＷＦ抗原回収量を血漿サンプルで計測した。この実験の結果を図１３および図１４にまとめた。
【００８０】
ＦＶＩＩＩのための半減期は１．８時間（ネイティブｒＶＷＦ存在下）から３．９時間（ＰＥＧ−ｒＶＷＦと併用）へと増大し、血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）が４．１から７．８Ｕ＊ｈへと増大した。ＶＷＦ半減期は３．２時間から１３．６時間へと増大し、ＶＷＦのＡＵＣは７．７から３２．１Ｕ＊ｈへとほぼ４倍になった。
【００８１】
（実施例１６：異なる方法によるＳＳ−ＰＥＧ付加ＶＷＦ調製試料のＦＶＩＩＩ結合能の測定）
異なるＰＥＧ付加ｒＶＷＦ調製試料のＦＶＩＩＩ結合能を、ＥＬＩＳＡと色素アッセイシステム（ＥＣＡ）とを組み合わせ、Ｂｅｎｄｅｔｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ  ９２：５２９−５３８，１９９８）の方法の変法によって計測した。マイクロタイタープレートを、２００μｌの２．６μｇ／ｍＬ抗ｖＷＦポリクローナル抗体含有５０ｍｍｏｌ／ｌＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）で覆った。プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で、各ステップの後に洗った。プレートを、０．１％粉ミルク／２ｍＭベンズアミジン含有ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３７℃、１時間にわたりブロックした。ＶＷＦの増加量を３７℃、２５分間にわたり、０．２Ｕ／ｍｌｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ，Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）とともにプレインキュベートし、これらの混合物の１００μｌをプレートに添加した。インキュベーション後、捕獲されたＶＷＦに結合したＦＶＩＩＩの量を、ＦＶＩＩＩ色素アッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）で計測した。ＦＶＩＩＩ結合能を、１分内で４０５ｎｍ（ｄＡ４０５）で計測される吸光度の変化として表した。図１５は、２つのＰＥＧ付加ＶＷＦ調製試料（両方ともｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）で修飾）のＶＷＦ用量依存性ＦＶＩＩＩ結合を示す。修飾ＶＷＦ調製試料のＦＶＩＩＩ結合能は、非修飾開始ＶＷＦ調製試料の％として算出され、ＰＥＧ−ＳＳ−ｒＶＷＦ−１では２０％およびＰＥＧ−ＳＳ−ｒＶＷＦ−２では５０％であると算出された。
【００８２】
図１６は、実施例１２に記載の表面プラズモン共鳴方法で計測される２つのＰＥＧ−ＳＳ−ｒＶＷＦ調製試料のＦＶＩＩＩ結合能を示す。算出結合能は、それぞれ２５および４５％であった。
【００８３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで計測されるＰＥＧ−ＳＳ結合後のｒＶＷＦ分子の分子質量における適当な増加を、図１７に示す。
【００８４】
（実施例１７：分枝ＰＥＧマレイミドによるＶＷＦにおけるスルフヒドリル基のＰＥＧ付加）
分枝ＰＥＧマレイミドによる遊離ＳＨ残基を経たＶＷＦのＰＥＧ付加のために組換え型ＶＷＦ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）の溶液を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６、３％トレハロース含有）によって調製する。次に、ＮＯＦ社（ＮＯＦ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｇｒｏｂｂｅｎｄｏｎｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって供給される分岐ｍＰＥＧマレイミド（鎖長：２０ｋＤ）を添加した（最終濃度１０ｍＭ）。ＶＷＦを静かに撹拌しながら室温で２時間にわたり、ＰＥＧ付加した。その後、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦを、再生セルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）からなる１００ｋＤ膜を使用して、限界濾過法／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によって、試薬から分離する。
【００８５】
（実施例１８：ｍＰＥＧヒドラジド／ＥＤＣによるＶＷＦのカルボキシル基のＰＥＧ付加）
実施例２３により、フリン成熟ｒＶＷＦを調製および精製した。調製試料を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に対して透析し、４００μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。次に、鎖長５ｋＤのｍＰＥＧヒドラジド（ｍＰＥＧ  Ｈｚ）を添加した（濃度：６０ｍｇ  ｍＰＥＧ  Ｈｚ／ｍｇＶＷＦ）。５００ｍＭ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の新しく調製された溶液３０μｌを、１ｍｌのＶＷＦ含有混合物の１ｍｌに添加し、５時間にわたって静かに振とうさせながら室温でインキュベートした。１００ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して、ＵＦ／ＤＦによりＰＥＧ付加ｒＶＷＦから試薬を分離する。
【００８６】
（実施例１９：ポリシアル酸によるＶＷＦのリジン残基の修飾）
ポリシアル酸（コロミン酸、ＣＡ）によるリジン残基の修飾を、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３４１：２６−３４，１９９７）およびＪｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  Ｌｕｇｏｗｓｋｉ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１０１１−１０１８，１９８１）に記載のようにして、実施した。０．１ＭＮａＩＯ４含有コロミン酸（濃度：２０ｍｇ／ｍｌ）溶液を暗所、室温で１５分間撹拌させて、ＣＡを酸化した。活性化ＣＡ溶液１ｍｌあたり２ｍｌのエチレングリコールを添加し、暗所、室温でさらに３０分間撹拌した。溶液を一晩にわたって暗所で０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析した。その後、この溶液のアリコートをｒＶＷＦ溶液（４００μｇ／ｍｌ）含有０．０５Ｍリン酸ナトリウムに添加し、１ｍｇＶＷＦあたり５０ｍｇ活性化ＣＡの最終濃度を得た。この混合物を暗所、室温で３０分間撹拌した。ＮａＣＮＢＨ３を添加し（１ｍｇ／ｍｇｒＶＷＦ）、混合物を暗所、室温で１８時間、静かに撹拌しながらインキュベートした。１ＭＴＲＩＳ水溶液（ｐＨ７．２）を添加し（５０μｌ／ｍｇＮａＣＮＢＨ３）、１時間にわたって撹拌することで反応を停止させた。遊離試薬を、１００ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＵＦ／ＤＦによりｒＶＷＦ−ポリシアル酸結合体から分離した。
【００８７】
この調製試料のＦＶＩＩＩ結合能を実施例１６の記載通りに測定した。
【００８８】
ポリシアル酸によるｒＶＷＦの結合を、還元条件の下で等電点電気泳動（ＩＥＦ）によって検出される等電点（ＰＩ）の移動によって示した。図２０は、この実施例によりポリシアル酸による結合の前後におけるＶＷＦ調製試料の比較を示す。製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の指示により、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ  ＰＡＧｐｌａｔｅシステム（ｐＨ３．５ないし９．５）を用いた。ポリシアル酸との結合による酸性基の導入によって、修飾ｒＶＷＦの１つの酸性バンドが生ずる。
【００８９】
実施例１６に記載のように、５４％のＦＶＩＩＩ結合能がＥＣＡ試験を用いて側定された。７０％のＦＶＩＩＩ結合能を表面プラズモン共鳴方法（実施例１２）を用いて側定した。
【００９０】
（実施例２０：剪断応力条件下のＰＥＧ付加）
Ｓａｋａｒｉａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０２：５２２−５３５，１９８３）に記載のように、灌流チェンバーを作製し、剪断応力条件下でのｒＶＷＦのＰＥＧ付加に使用した。ｒＶＷＦ（５００μｇ／ｍｌ）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、３％トレハロース含有）の溶液を調製した。次に、ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（最終濃度：５ｍＭ）を添加し、０．１ＭＮａＯＨを添加してｐＨを７．４に調製し、直ちに灌流システムに充填した。次に、ＰＥＧ付加はＳａｋａｒｉａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０２：５２２−５３５，１９８３に記載のように、灌流条件下で、蠕動ポンプを使用することで、２５００秒−１の剪断速度で、室温で行った。
【００９１】
（実施例２１：ｐｄＶＷＦの調製）
ｄＶＷＦの調製を、改良を加えたＴｈｏｒｅｌｌ  ｅｔ  Ｂｌｏｍｂａｃｋ（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．３５：４３１−４５０，１９８４）により実施した。ｐｄＶＷＦの調製のために、１．５ｋｇのクリオプレシピテートを２０ないし３０℃で６リットルの水に溶解した。１時間撹拌させた後に、フィブロネクチン沈殿物を遠心によって除去した。上清１リットルあたり８ｇＮａＣｌを添加し、溶液を室温まで温め、ウイルスを失活させるためにＳＤストック試薬（１％Ｔｗｅｅｎ８０＋０．１８％アセチルトリエチルシトレート最終濃度）を添加した。
【００９２】
溶液を、０．２ＭＮａＣｌ、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）（洗浄用緩衝液）で事前に平衡化されたＥＭＤ−ＴＭＡＥフラクトゲル６５０Ｍカラム（ＸＫ５０／１８０）上で精製した。洗浄用緩衝液２０カラム容量で洗浄した後、ＶＷＦを０．５ＭＮａＣｌ、０．０２ＭＮａクエン酸塩（ｐＨ６．９）で溶出させた。ＶＷＦを沈降させるために、グリシン（１Ｍ最終濃度）およびＮａＣｌ（３Ｍ最終濃度）を添加した。沈殿物を緩衝液に溶解し、最終濃度に対して０．３ＭＣａＣｌ２、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したカラムをセファクリルＳ−４００ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に載せた。
【００９３】
【表２】
0005715983.tif 000003
（実施例２２：ＰＥＧＳＳによるｐｄＶＷＦのリジン残基のＰＥＧ付加）
ＰｄＶＷＦを実施例２１により調製し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３％ショ糖を含む）で希釈し、最終濃度を４００μｇ／ｍｌとする。次に、ｍＰＥＧスクシイミジルスクシネート（鎖長：５ｋＤ）を添加し（濃度：１０ｍｇＰＥＧＳＳ５０００／ｍｇ  ＶＷＦ）、ｐｄＶＷＦを室温で、１時間にわたりＰＥＧ付加した。次に、再生セルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）からなる１００ｋＤ膜を使用して、ＵＦ／ＤＦによって、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦから試薬を分離した。
【００９４】
（実施例２３：フリン成熟ｒＶＷＦのフリン成熟および精製）
ｒＦＶＩＩＩ発酵および精製プロセス由来の抗ＦＶＩＩＩ抗体カラムのフロースルー分画の１４３ｋｇを、Ｓｃｈｌｏｋａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：２５７−２６７，１９９６）に記載のように、プロペプチド除去のためにフリンで処理し、滅菌濾過した。このプロセスは、初期の研究に基づいた（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７５：２５９−２６２，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ／ＡＴ９８／０００３４［ＷＯ９８／３８２１９］，１−３３，１９９８，１８−２−１９９８  ａｎｄ  Ｋａｅｒｓｇａａｒｄ  ｅｔ  Ｂａｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ７１５：３５７−３６７，１９９８）。
【００９５】
水で４倍希釈して１６ｍＳ／ｃｍにした後、６３３ｋｇの希釈溶液を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＡｃ、８６ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５、ｍＳ／ｃｍ（平衡緩衝液）により平衡化させたＸＫ５０／１５ＥＭＤ−ＴＭＡＥフラクトゲル６５０Ｍカラム（３００ｍｌゲル；Ｍｅｒｃｋ；＃Ｋ１４５４０２８１）に載せた。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、１００ｍＭ  ＮａＡｃ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、３ｍＭ  ＣａＣｌ２で溶出した。
【００９６】
４５０６ｇのＴＭＡＥ溶出液をＳａｒｔｏｃｌｅａｎ  ＧＦ（０．８及び０．６５μ）およびＳａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ（０．４５及び０．２μ）上で濾過し、１．５倍希釈して２９ｍＳ／ｃｍとし、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルター（＃ＩＨ１８７７０９３２）を介してポンピングする。２２＋／−２℃で６０分間にわたりＳＤ処置し、かつ水で２倍に希釈して１６ｍＳ／ｃｍにした後、溶液を、ＴＭＡＥステップの平衡用緩衝液で平衡化させたＡｍｉｃｏｎ  ７０／２９  ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラム（６００ｍｌゲル；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃７８９６０Ｃ）に載せた。カラムを平衡用緩衝液で洗浄し、そしてＴＭＡＥステップの溶離緩衝液で溶出させた。
【００９７】
３２２３ｇのＵＮＯ−Ｓ溶出液を、再生セルロースからなる３０ｋＤａの０．１ｍ２膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ＃０１０８０２１７、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して限界濾過法により１５倍濃縮した。コンセントレートの２０１ｇを、１００ｍＭ  ＮａＡｃ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（１６９８ｍｌのゲル；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−０４８９−０１）で平衡化させたＸＫ５０／８６．５Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅカラム上で、サイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に精製された。
【００９８】
【表３】
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（実施例２４：フリン成熟ｒＶＷＦのＰＥＧ付加）
フリン成熟ＶＷＦを実施例２３により調製し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３％ショ糖を含有）に対して透析した。次に、溶液を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３％ショ糖を含有）により最終濃度を３００μｇ／ｍｌに希釈した。続いて、ｍＰＥＧスクシミジルスクシネート（鎖長：５ｋＤ）を添加し（濃度：２５ｍｇＰＥＧＳＳ５０００／ｍｇＶＷＦ）、フリン成熟ＶＷＦを室温で１時間にわたってＰＥＧ付加した。次に、再生セルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）からなる１００ｋＤ膜を使用して、ＵＦ／ＤＦによって、ＰＥＧ付加ＶＷＦから試薬を分離した。
【００９９】
（実施例２５：フリン成熟ｒＶＷＦの生体外特徴付け）
実施例１２および図１５に記載のように、フリン成熟ｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合能を表面プラズモン共鳴技術およびＥＣＡによって測定した。結果を、実施例２１によって調製されるアルブミンを含まない血漿由来ＶＷＦ調製試料と比較した。
【０１００】
図１８および図１９に示されるように、フリン成熟ｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合能は血漿由来参照調製試料と同等だった。
【０１０１】
（実施例２６：グルタルアルデヒドで架橋させることによるポリシアル酸とＶＷＦとの結合）
グルタルアルデヒドを架橋試薬（Ｍｉｇｎｅａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３７：７９０−７９６，２００４）として用いたｒＶＷＦとポリシアル酸（コロミン酸）との結合のために、コロミン酸（濃度：２０ｍｇ／ｍｌ）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の溶液４ｍｌを調製し、０．１ＭＮａＯＨを添加してｐＨを７．４に合わせた。グルタルアルデヒドを添加して最終濃度を０．０１％にした。続いて、ｒＶＷＦ（４００μｇ／ｍｌ）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の溶液１ｍｌを１００μｌのアリコートに添加し、混合物を静かに振とうさせながら１時間インキュベートした。次に、混合物を透析し、トレハロースを添加し（最終濃度：３％）、ｒＶＷＦポリシアル酸結合体を限界濾過法によって濃縮した。
【０１０２】
（実施例２７：ＶＷＦ欠乏マウスでのＶＷＦ半減期の増大）
Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  ９５：９５２４−９５２９，１９９８）により記載されたＶＷＦ欠乏マウスを、ヒトＶＷＤの動物モデルとして使用した。マウス５匹からなる群に対して、１００ＵＶＷＦ：Ａｇ／ｋｇを達成するために、実施例１９により調製したｒＶＷＦポリシアル酸結合体またはネイティブｒＶＷＦのいずれかをボーラス注入法（１０ｍｌ／ｋｇ）によって経尾静脈により投与した。麻酔後の心臓穿刺によるクエン酸血漿は、注射後５分、１、３、６、９、および２１時間で、それぞれの群から調製した。ＶＷＦ抗原回収および内因性マウスＦＶＩＩＩ活性レベルを血漿サンプルで計測した。この実験の結果は、図２１および図２２にまとめられている。
【０１０３】
ＶＷＦの半減期を、薬物動態学ライブラリーの１つの区画をモデルとして使用するＭｉｃｒｏＭａｔｈ科学者プログラム（Ｍｉｃｒｏｍａｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）を用いて算出した。ＦＶＩＩＩ活性の曲線下面積は、ベースラインサブトラクションによる台形モデルで算出した。
【０１０４】
ＶＷＦの半減期は１．３時間（ネイティブｒＶＷＦ）から２．４時間（ｒＶＷＦ−ポリシアル酸結合体）へと増大し、ＦＶＩＩＩのＡＵＣがそれぞれ３．３Ｕ＊ｈｒ／ｍｌから５．３Ｕ＊ｈｒ／ｍｌへと増大した。
【０１０５】
（実施例２８：還元性アミノ化によるリジン基に対するｍＰＥＧプロピオンアルデヒドの結合）
ｒＶＷＦ溶液（４００μｇ／ｍｌ）を０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に調製し、ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド（５ｋＤａ鎖長）を添加して最終濃度を１ｍｇＶＷＦあたり１０ｍｇのｍＰＥＧプロピオンアルデヒドとする。この混合物を３０分間撹拌する。つぎに、ＮａＣＮＢＨ３を添加し（１ｍｇ／ｍｇのｒＶＷＦ）、混合物を静かに撹拌させながら室温で１５時間にわたりインキュベートする。１ＭのＴＲＩＳ水溶液（ｐＨ７．２）を添加し（１ｍｇのＮａＣＮＢＨ３あたり５０μｌ）、１時間にわたって撹拌することで反応を停止させる。その後、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦは、１００ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用している限界濾過法／ダイアフィルトレーションによって、試薬から分離される。
【０１０６】
（実施例２９：ＶＷＦのＮ末端ＰＥＧ付加）
ｒＶＷＦのＮ末端ＰＥＧ付加をＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：８１８−８２５，２００３）の記載のように行う。ｒＶＷＦ溶液（最終濃度：５００のμｇ／ｍｌ）を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に調製し、ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド（鎖長：５ｋＤ）を添加した（濃度：１０ｍｇ  ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド／ｍｇＶＷＦ）。ＰＥＧ付加を、還元剤として２ｍＭのＮａＣＮＢＨ３の存在下、室温で２４時間にわたって行う。その後、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦを、１００ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して限界濾過法／ダイアフィルトレーションにより試薬から分離される。
【０１０７】
（実施例３０：リジン残基およびｒＶＷＦのＳＨ残基の逐次的なＰＥＧ付加）
ＲＶＷＦを、実施例２によりｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（鎖長：５ｋＤ）で、リジン残基を経てＰＥＧ付加する。ＰＥＧ付加を１時間にわたって室温で行い、遊離試薬を、１００ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、５％サッカロース）に対してＵＦ／ＤＦによりｒＶＷＦＰＥＧ結合体から分離する。次に、溶液のｐＨ値を、０．１ＭＮａＯＨで７．６に合わせ、ｍＰＥＧマレイミド（１０ｍＭ鎖長５ｋＤ／最終濃度）を加えて、遊離ＳＨ基のＰＥＧ付加を行う。静かに振とうしながら、室温で２時間にわたってＰＥＧ付加を行う。次に、試薬を再び、１００ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して反応混合物から分離する。
【０１０８】
（実施例３１：糖質残基の酵素酸化とＰＥＧ−Ｈｚによるその後のＰＥＧ付加）
Ａｖｉｇａｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７：２７３６−４３，１９６２）に記載のように、アルデヒド基を生じさせるｒＶＷＦの糖質残基（Ｗｉｌｃｈｅｋ  ｅｔ  Ｂａｙｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８；４２９−４４２，１９８７）の酵素酸化を、Ｄａｃｔｙｌｉｕｍ  ｄｅｎｄｒｏｉｄｅｓ（Ｓｉｇｍａ）由来のガラクトースオキシダーゼを使用して行う。得られた溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析し、希釈してＶＷＦ濃度を４００μｇ／ｍｌにする。次に、鎖長５ｋＤのｍＰＥＧヒドラジド（ｍＰＥＧ  Ｈｚ）（最終濃度：４０ｍｇ  ｍＰＥＧ−Ｈｚ／ｍｇ  ＶＷＦ）を添加する。混合物を静かに振とうさせながら室温で３時間インキュベートする。試薬を、１００ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、５％のサッカロース含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して、ＵＦ／ＤＦによりＰＥＧ付加ｒＶＷＦから分離する。
【０１０９】
（実施例３２：ｒＦＶＩＩＩによるＦＶＩＩＩ結合部位のブロッキングによるｒＶＷＦのＰＥＧ付加）
非修飾ＦＶＩＩＩ結合部位を持つＰＥＧ付加ｒＶＷＦを調製するために、ｒＦＶＩＩＩ（２００Ｕ／ｍｌ）およびｒＶＷＦ（４０Ｕ  ＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２％トレハロース、ｐＨ７．４）の溶液３ｍｌを調製して、３７℃で１時間インキュベートする。混合物を、室温まで冷やし、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＰＥＧ−ＳＳ／鎖長：５ｋＤ）を添加し（最終濃度：１ｍｇＰＥＧ−ＳＳ／ＵＶＷＦ：Ａｇ）、静かに振とうさせながら１時間インキュベートする。次に、ＣａＣｌ２を静かに振とうさせながら添加することで、最終濃度で４００ｍＭを得る。この溶液を、セファクリルＳ−４００ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）充填クロマトグラフィーカラム（２．６×８０ｃｍ）に載せ、ＦＶＩＩＩの遊離結合部位を持つＰＥＧ付加ｒＶＷＦを、サイズ排除クロマトグラフィー（溶離緩衝液：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、４００ｍＭ  ＣａＣＩ２、ｐＨ７．４）によって、ｒＦＶＩＩＩから分離する。
【０１１０】
（実施例３３：ヘパリンによるＦＶＩＩＩ結合部位のブロッキングによるｒＶＷＦのＰＥＧ付加）
ｒＶＷＦ（３００μｇ／ｍｌ）含有５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の溶液５ｍｌを調製し、同一緩衝液のヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ懸濁液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）２ｍｌに添加する。この混合物を静かに振とうさせながら２時間にわたってインキュベートし、ＶＷＦをゲルに結合させる（ｄｅ  Ｒｏｍｅｕｆ  ｅｔ  Ｍａｚｕｒｉｅｒ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｍｏｓｔ．６９：４３６−４４０，１９９３）。その後、ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（２００ｍｇ／ｍｇのＶＷＦ）を混合物に加え、静かに振とうさせなら、ＰＥＧ付加を室温で１時間行う。混合物を等量の２ＭＮａＣｌ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈する。ゲルを濾過によって上清から分離する。次に、ゲルは２ｍｌＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ＭＮａＣｌ）で３回洗浄し、上清および洗い溶液を組み合わせる。続いて、ＰＥＧ付加ＶＷＦを含む溶液を限界濾過法によって濃縮し、再生セルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）からなる１００ｋＤ膜を用いて２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３％のサッカロース）に対して透析する。得られた誘導体は、バイアコア技術またはＥＣＡ試験（試験システムは、米国仮特許出願第６０／６６８，３７８号（２００５年４月４日出願）に記載されている）の使用によって、完全なＦＶＩＩＩ結合能を示す。
【０１１１】
（実施例３４：ヒアルロン酸とＶＷＦとの結合）
ヒアルロン酸（ＨＡ）によるリジン残基の修飾を、Ｓｉｇｍａ（Ｃ５３７４７）から得られるヒアルロン酸を使用して還元性アミノ化によって行った。ＨＡを、新たに調製された０．１ＭのＮａＩＯ４溶液に溶解して最終濃度を５ｍｇＨＡ／ｍｌにした。次に、静かに撹拌させながら１５分間にわたり酸化を行った。１ｍｌの酸化ＨＡ溶液に対して２ｍｌのエチレングリコールを添加し、室温、暗所で３０分間さらに撹拌することで、反応を停止させた。溶液を、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に対して、暗所４℃で一晩透析を行った。続いて、この溶液のアリコートを、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２））からなるｒＶＷＦ溶液（４０ＵＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌ）に添加して、最終濃度５０ｍｇの活性化ＨＡ／ｍｇタンパク質を得た。この混合物を、暗所、室温で１２０分間にわたり撹拌した。ＮａＣＮＢＨ３を添加し（１ｍｇ／ｍｇタンパク質）、混合物を静かに振とうさせながら、１８時間、室温でインキュベートした。つぎに、１００μｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）をこの混合物１ｍｌに対して添加し、１時間にわたり撹拌することで、反応を停止させた。遊離試薬を、１００ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＵＦ／ＤＦによりｒＶＷＦＨＡ結合体から分離した。
【０１１２】
（実施例３５：ＰＳＡ結合ＶＷＦの生体外生化学的特徴づけ）
実施例１９によりＲＶＷＦをポリシアル化した。この実施例に記載のパラメーター、例えば等電点電気泳動（図２０）、実施例１６によるＥＣＡ試験（５４％）および実施例１２による表面プラズモン共鳴（７０％）によってＦＶＩＩＩ結合能の測定に加えて、比率ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇを算出した。ＶＷＦ抗原量を、市販のアッセイシステム（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ｖＷＦ，Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて側定した。Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ  ３４：３０６−３０８，１９７５）に記載のように、調製試料の機能的な活性をリストセチンコファクターアッセイで測定した。ｒＶＷＦ出発原料に関して算出される０．３９という比率の値は、ポリシアル酸付加後に減少して０．１３となる。
【０１１３】
（実施例３６：リジン残基を介した分岐ＰＥＧによるｒＶＷＦの結合）
成熟ｒＶＷＦ（３５ＵＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌ）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．５％ショ糖含有）の溶液を実施例２３により調製した。次に、静かに撹拌させながら、ＮＯＦ会社（ＮＯＦ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｇｒｏｂｂｅｎｄｏｎｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって供給される分枝ｍＰＥＧスクシンイミジルグルタレート（ＰＥ−ＳＧ／鎖長：２０ｋＤ）を、この溶液に添加し（５ｍｇＰＥＧ−ＳＧ／ｍｇタンパク質）、０．５ＭＮａＯＨを滴加することでｐＨ値を７．４に合わせた。次に、室温で１時間、静かに撹拌させながらＰＥＧ付加を行った。続いて、反応混合物を平衡イオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０Ｍ）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．５％ショ糖含有）に載せた。次に、このカラムを２０ＣＶ平衡化緩衝液で洗い、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦを溶離緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ＭＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４）で溶出した。溶出液を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４からなる緩衝系を用い、再生セルロースからなる膜および１００ｋＤ分子量カットオフで、限界濾過法／ダイアフィルトレーションにより濃縮した。得られたＰＥＧ付加誘導体のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ  比は、ｒＶＷＦ出発材料（ＶＷＦ：Ｒｃｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比：０．８９）と比較して、わずかに減少して０．７９であった。また、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦ出発原料のＦＶＩＩＩ結合能は、ＥＣＡ試験（実施例１６）で計測されたように、８３％であった。
【０１１４】
（実施例３７：ＦＶＩＩＩ−Ｋ．Ｏ．マウスでの分岐ＰＥＧと結合体を形成したＶＷＦの薬物動態）
ＦＶＩＩＩ欠乏マウス（Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１９−１２１，１９９５）を、重度ヒト血友病Ａのモデルとして使用した。マウス５匹からなる群に対して、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ（分岐ＰＥＧ，ＳＧ）およびｒＦＶＩＩＩの混合物またはネイティブｒＶＷＦおよびｒＦＶＩＩＩの混合物を経尾静脈によるボーラス注入法（１０ｍｌ／ｋｇ）によって投与することで、３０ＵＦＶＩＩＩ／ｍｌおよび２５ＵＶＷＦ／ｍｌを達成した。注射後５分、３、９、２４、および３２時間、麻酔後の心臓穿刺によってそれぞれの群からクエン酸血漿を調製した。ＦＶＩＩＩ活性およびＶＷＦ抗原回収濃度を血漿サンプルで計測した。ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの抽出曲線を図２３および図２４に示す。ＶＷＦ半減期は１．４から９．７時間へと増大し、ＶＷＦのＡＵＣは１１．８から４９．２Ｕ＊ｈ／ｍｌに増加した。ＦＶＩＩＩの半減期は、１．２時間（ネイティブｒＶＷＦ存在下）から４．４時間（ＰＥＧ−ｒＶＷＦとともに適用）へと増大し、血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）が１２．１から３０．５Ｕ＊ｈ／ｍｌへと増大した。
【０１１５】
（実施例３８：ＦＶＩＩＩ−Ｋ．Ｏ．マウスにおける異なる量のＰＥＧ−ＶＷＦと混合されたＦＶＩＩＩの比較薬物動態）
ＦＶＩＩＩ欠乏Ｋ．Ｏ．マウス５匹からなる群に対して、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ（２５ｍｇ分岐ＰＥＧ−ＳＧ２００００／ｍｇタンパク質）とｒＦＶＩＩＩ（Ａ：２０ＩＵＰＥＧ−ｒＶＷＦ／ｍｌ＋２０ＩＵＦＶＩＩＩ／ｍｌ、Ｂ：１０ＩＵＰＥＧ−ｒＶＷＦ／ｍｌ＋２０ＩＵＦＶＩＩＩ／ｍｌ、Ｃ：３ＩＵＰＥＧ−ｒＶＷＦ／ｍｌ＋２０ＩＵＦＶＩＩＩ／ｍｌ）の種々の混合物を経尾静脈によるボーラス注入法（１０ｍｌ／ｋｇ）によって投与した。ＰＥＧ付加ｒＶＷＦについて、算出された比率は３モルＰＥＧ／ｍｏｌｅリジンであった。異なるＰＥＧ−ｒＶＷＦ／ｒＦＶＩＩＩ混合物において等量（単位換算）のＰＥＧ−ｒＶＷＦとｒＦＶＩＩＩとを比較すると、以下のＰＥＧ／ＦＶＩＩＩ比が算出された。すなわち、３：１（Ａ）、１．５：１（Ｂ）、０．４５：１（Ｃ）である。麻酔後、クエン酸血漿を注射後５分、１、３、９、および２４時間で、それぞれの群から心臓穿刺によって調製した。ＦＶＩＩＩ半減期（Ａ：２．１時間（Ｂ）：２．０時間、および（Ｃ）：２．５時間）とＡＵＣ（Ａ：１８．９（Ｂ）：１４．５、およびＣ：１３．２Ｕ＊ｈｒ／ｍｌ）との間に関連した違いは見出されなかった。ＦＶＩＩＩの抽出曲線を図２５に示す。
【０１１６】
（実施例３９：ＰＥＧ付加の度合いが異なるＰＥＧ−ＶＷＦ調製試料を用いた比較薬物動態）
ＦＶＩＩＩ×ＶＷＦダブルノックアウトマウスを、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスとＶＷＦ欠乏マウスとの交雑育種によって得た。それらのマウスは、ＶＷＦ欠乏と同様にＦＶＩＩＩ欠乏を患う。ＦＶＩＩＩ×ＶＷＦダブルノックアウトマウス５匹からなる群に対して、ネイティブｒＶＷＦ／ｒＦＶＩＩＩ（１００／１５０ＩＵ／ｋｇ）混合物、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦ＃ＡとｒＦＶＩＩＩとの混合物（１００／１５０ＩＵ／ｋｇ）、あるいはＰＥＧ付加ｒＶＷＦ＃ＢとｒＦＶＩＩＩとの混合物（１５０／１５０ＩＵ／ｋｇ）を経尾静脈により注入した。ＰＥＧ−ｒＶＷＦ＃Ａ（５ｍｇ  ＰＥＧ−ＳＳ  ５０００／ｍｇタンパク質）およびＰＥＧ−ｒＶＷＦ＃Ｂ（２０ｍｇ  ＰＥＧ−ＳＳ  ５０００／ｍｇタンパク質）を実施例２４により調製した。調製試料＃Ａに関しては、算出された比率は２．５ｍｏｌｅＰＥＧ／ｍｏｌｅリジンであった。調製試料＃Ｂに関しては、算出された比率は１０ｍｏｌｅＰＥＧ／ｍｏｌｅリジンであった。このクエン酸血漿に関して、試料適用後５分、１、３、９、および２４時間、試料を調製した。ＶＷＦ：Ａｇの血漿レベルおよびＦＶＩＩＩ活性を計測し、最大血漿レベルのパーセントに概ね注射後５分で達する。ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの抽出曲線を、それぞれ図２６および図２７に示す。半減期は、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ  ＃Ａおよび＃Ｂに関して、それぞれ６．３時間および８．１時間であった。ネイティブｒＶＷＦに関しては、算出された半減期は２．０時間であった。ＰＥＧ付加ｒＶＷＦ両方の正規化ＡＵＣ（％最大×ｈ）は、３６０％＊ｈ（ネイティブｒＶＷＦ）から９０１％＊ｈ（＃Ａ）および１０６４％＊ｈ（＃Ｂ）へと増大した。同時注入されたｒＦＶＩＩＩの循環時間は、ネイティブＶＷＦと比較してＰＥＧ付加ｒＶＷＦによって改善された。ＦＶＩＩＩの半減期は、ネイティブｒＶＷＦの存在下で０．８時間であって、それぞれＰＥＧ付加ｒＶＷＦ＃Ａおよび＃Ｂが注入される場合、１．５および１．８時間へと増大した。ＦＶＩＩＩのＡＵＣは、２１４、３７０、および３５８％＊ｈであった。
【０１１７】
（実施例４０：ＶＷＦダイマーのＰＥＧ付加）
ＶＷＦダイマー（５８ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌ）（組換えＣＨＯ細胞株の条件培地から精製（Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ））を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．５％ショ糖）で調製した。ＮＯＦ社から供給された分岐ｍＰＥＧスクシンイミジルグルタレート（ＰＥ−ＳＧ／鎖長：２０ｋＤ）を、静かに撹拌しながらこの溶液に添加し（５ｍｇＰＥＧ−ＳＧ／ｍｇタンパク質）、０．５ＭＮａＯＨを滴加してｐＨ値を７．４に合わせた。ＰＥＧ付加を、室温で１時間、静かに撹拌させながら行った。続いて、反応混合物を、反応混合物を平衡イオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０Ｍ）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．５％ショ糖含有）に載せた。次に、カラムを２０ＣＶ平衡化緩衝液で洗い、過剰の試薬を取り除いた。ＰＥＧ付加ｒＶＷＦダイマーを溶離緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ＭＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４）で溶離させた。溶出液を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４からなる緩衝系を使用し、再生セルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）からなる膜および１００ｋＤ分子量カットオフで、限界濾過法／ダイアフィルトレーションによって濃縮した。
【０１１８】
（実施例４１：低マルチマーｒＶＷＦのＰＥＧ付加および生体外特徴付け）
成熟ｒＶＷＦを、実施例２３により精製した。精製手法は、イオン交換クロマトグラフィーステップおよびスペローズ６上での最終ゲル濾過ステップを含むもので、該手法を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で実行し、高マルチマーｒＶＷＦ（１７のマルチマー）がボイド容量で溶出した。ＶＷＦマルチマー分析を、１．０％のアガロースゲルを使用してＲｕｇｇｅｒｉ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ（Ｂｌｏｏｄ  ５７：１１４０−４３，１９８１）により行った。低マルチマーｒＶＷＦ調製試料（６マルチマー）がサイド分画から得られ、より高い持続時間で溶離した。０．５％のショ糖ｐＨ７．４を加えることにより、この分画を安定化させた。次に、低マルチマーｒＶＷＦを、ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＰＥＧ−ＳＳ）を使用してＰＥＧ付加した。ＰＥＧ−ＳＳを、静かに撹拌させながらこの溶液に添加し（５ｍｇＰＥＧ−ＳＳ／ｍｇタンパク質）、０．５ＭＮａＯＨを滴加することでｐＨ値を７．４に合わせた。ＰＥＧ付加を、室温で１時間、静かに撹拌させながら行った。その後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４からなる緩衝系を用いて過剰試薬を、再生セルロースからなる膜および１００ｋＤの分子量カットオフで、限界濾過法／ダイアフィルトレーションによって除去した。実施例１６によるＥＣＡアッセイによって測定されるＦＶＩＩＩ結合能は、出発原料の４９％からＰＥＧ付加調製試料の３４％まで、わずかに減少した。低マルチマーｒＶＷＦについて計測されたＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比率の値は、０．０２であり、ＰＥＧ付加手法の影響を受けなかった。
【０１１９】
（実施例４２：可逆的にブロックされたＦＶＩＩＩ結合エピトープ（ＦＶＩＩＩおよびヘパリンでブロック）によるＶＷＦの誘導体化）
クロマトグラフィーカラム（１５ｍｍ×１４８ｍｍ）をヘパリンハイパーＤ（Ｂｉｏ−Ｓｅｐｒａ）で充填し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４からなる平衡化緩衝液で平衡させた。次に、成熟ｒＶＷＦ（４８ＩＵＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌ）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ショ糖）の溶液をＨ２Ｏで希釈することで伝導率を７〜８ｍＳ／ｃｍとし、線流速１．５ｃｍ／分を使用してカラム上に載せた。その後、ＮＯＦ社（ＮＯＦ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｇｒｏｂｂｅｎｄｏｎｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって供給された分枝ｍＰＥＧスクシンイミジルグルタレート（鎖長：２０ｋＤ）を新たに１５ｍｌの平衡化緩衝液に溶かし、最終濃度を５ｍｇＰＥＧ−ＳＧ／ｍｇ結合タンパク質とした。次に、この試薬液をカラム上にポンプで送り、ＰＥＧ付加を静的条件下で２時間行った。次に、０．０５％リジンを含む１０ＣＶ平衡化緩衝液でカラムを洗った。次に、保護されたＦＶＩＩＩ結合エピトープによるＰＥＧ付加ｒＶＷＦを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ＭＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４からなる緩衝液で溶出させた。最終的に、再生セルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）からなる１００ｋＤ膜を使用して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ショ糖）に対する限界濾過法／ダイアフィルトレーションによって、この溶液を濃縮した。得られた誘導体のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比率は０．４８であり、ｒＶＷＦ出発原料（比率０．４７）と同一であった。実施例３６に記載の分枝ＰＥＧ−ＳＧ２００００によるｒＶＷＦのＰＥＧ付加手法と対照的にＦＶＩＩＩ結合能は、ＥＣＡ試験（実施例１６）によって計測されるように、ＦＶＩＩＩエピトープキャッピングでこのＰＥＧ付加手法に影響を受けなかった。
【０１２０】
（実施例４３：リジン残基を介した分解可能ＰＥＧによるＶＷＦの結合）
成熟ｒＶＷＦを、実施例２３によって精製する。次に、このｒＶＷＦ（４０ＵＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌ）含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．５％ショ糖含有）の溶液を、調製する。続いて、ＰＥＧ付加は、静かに撹拌させながら、ｍＰＥＧ−（カルボキシメチル）−３−ヒドロキシ−ブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（鎖長：５ｋＤ）をこの溶液に加えることによって行い（５ｍｇのＰＥＧ試薬／ｍｇタンパク質）、０．５ＭＮａＯＨを滴加することでｐＨ値を７．４に合わせた。次に、ＰＥＧ付加反応を、室温で１時間、静かに撹拌させながら行った。その後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４からなる緩衝系を用いて過剰試薬を、再生セルロースからなる膜および１００ｋＤの分子量カットオフで、限界濾過法／ダイアフィルトレーションによって、ＰＥＧ付加ｒＶＷＦから分離した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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