(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる空間解像度を与える顕微鏡検査法によってサンプルの像を生成するための方法であって、以下の顕微鏡検査法のうちの少なくとも２つ、すなわち、
第１の顕微鏡検査法であって、
構造化されたラインタイプ照明又は広視野照明によって、ルミネセンスを生じるように前記サンプルが励起され、
該構造化は、回転されるとともに、回転位置毎に何度かシフトされ、
少なくとも３つの回転位置、及び該回転位置毎に少なくとも３つのシフト位置が実現され、それぞれの場合に、ルミネセンスを生じるサンプルが、所定の光学解像度を有する２Ｄ検出器上に結像され、こうして得られた像から、該所定の光学解像度よりも高い空間解像度を有する第１の顕微鏡像が、フーリエ解析を含む計算処理によって生成される、第１の顕微鏡検査法、
第２の顕微鏡検査法であって、
前記サンプルはラベル分子を含み、該ラベル分子は、切替信号によって活性化された後にのみ、特定のルミネセンス放射を放出するように励起することができ、
前記切替信号は、前記サンプル内に存在する前記ラベル分子の一部のみが活性化されるように前記サンプル内に加えられ、
前記サンプル内に部分空間が存在し、該部分空間では、活性化されたラベル分子が、その最も近い隣接する活性化されたラベル分子まで、所定の光学解像度以上の距離を有し、
該活性化された分子が励起されてルミネセンス放射を放出し、
ルミネセンス放射を放出する前記サンプルは、所定の光学解像度を有する２Ｄ検出器上に結像され、該像は解析され、そこから像データが生成され、該像データは、前記光学解像度より高い局所解像度で、ルミネセンス放射を放出する該ラベル分子の幾何学的な場所を与え、該像データから第２の顕微鏡像が生成される、第２の顕微鏡検査法、及び
レーザー走査型顕微鏡検査法によって第３の顕微鏡像を生成するための第３の顕微鏡検査法、
のうちの少なくとも２つが組み合わせられ、
得られた前記少なくとも２つの顕微鏡像を組み合わせて、合成像が生成される、方法。
【請求項２】
得られた前記少なくとも２つの顕微鏡像は重ね合わせられる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１〜第３の顕微鏡検査法のすべてが組み合わせられ、得られた３つの顕微鏡像を組み合わせて合成像が生成される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第４の顕微鏡検査法であって、前記サンプルはＳＴＥＤ、ＥＳＡ又はＲＥＳＯＬＦＴ技法に適したラベル分子でラベル付けされ、ＳＴＥＤ、ＥＳＡ又はＲＥＳＯＬＦＴによって第４の顕微鏡像が生成される、第４の顕微鏡検査法がさらに組み合わされる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第１のステップにおいて、前記サンプルのメイン顕微鏡像を生成するために前記第１〜第３の顕微鏡検査法のいずれかが行われ、
第２のステップにおいて、所定のパターンを得るために、このメイン顕微鏡像が走査され、
該所定のパターンが発見される場合には、第３のステップにおいて、さらなる顕微鏡像を生成するために、残りの顕微鏡検査法のうちの少なくとも１つが行われる、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のステップ後に、かつ前記第３のステップ前に、前記サンプルにおいて行なわれる処理に関して、前記サンプルが固定される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記第３のステップの前かつ前記第２のステップの後に、発見された前記パターンに基づいてサンプル表示を選択するためにサンプル表示選択ステップが行われ、
前記第３のステップにおいて、該サンプル表示のためにのみ、さらなる顕微鏡像が生成される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
第１のステップにおいて、前記サンプルのメイン顕微鏡像を生成するために前記第１〜第３の顕微鏡検査法のいずれかが行われ、
第２のステップにおいて、このメイン顕微鏡像において像評価が実行され、他の顕微鏡像のうちの少なくとも１つを収集するための少なくとも１つの制御変数が求められ、
該制御変数は、
焦点位置、
サンプルステージ調整、
対物レンズの選択、
前記第４の顕微鏡検査法における照明放射の構造、及び
像表示の選択、
の少なくとも１つである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記顕微鏡像を重ね合わせる前に、互いに対する該顕微鏡像の位置が求められ、該顕微鏡像は、位置を調整して重ね合わせられる、請求項１，３又は４に記載の方法。
【請求項１０】
前記顕微鏡像を組み合わせて前記合成像とする前に、前記画像に生じている構造に基づいて前記複数の画像を互いに調節することで、高解像度の画像を低解像度の画像に位置合わせする、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
解像度が異なる少なくとも２つの顕微鏡検査法を用いてサンプル（２）を顕微鏡検査するように構成される組み合わせ顕微鏡であって、
該顕微鏡（１）は、
全ての顕微鏡検査法のために前記サンプル（２）を検知する対物レンズ（３）と、
検出ビーム経路（８）及び少なくとも１つの照明ビーム経路であって、少なくとも部分的に同一空間を占有するとともに、いずれも前記対物レンズ（３）を通り抜ける、検出ビーム経路及び少なくとも１つの照明ビーム経路と、
前記検出ビーム経路（８）に接続される顕微鏡モジュールであって、チューブレンズ（５）及び２Ｄ検出器（６）を有し、前記対物レンズ（３）と共に、該２Ｄ検出器（６）上に前記サンプル（２）を結像する、顕微鏡モジュールと、
前記照明ビーム経路に接続されるとともに、前記対物レンズ（３）を通して前記サンプル（２）を広視野照明するように構成されている広視野照明モジュール（１７）であって、少なくとも２つの異なる波長範囲において照明放射を選択的に放出するように構成されている、広視野照明モジュールと、
照明放射変調器（２３、２４）であって、照明方向において前記広視野照明モジュール（１７）の下流の前記照明ビーム経路内に配置され、前記照明ビーム経路内で起動状態と停止状態との間で制御可能に切替えられることができ、その起動状態において、前記照明放射にストライプ変調をかけるとともに、該ストライプ変調を前記照明ビーム経路の光学軸に対して垂直にシフトさせるように構成されている照明放射変調器と、
制御可能な回転デバイス（２５）であって、前記ストライプ変調、又は、前記起動された照明放射変調器（２３、２４）を通り抜けた前記ストライプ変調されたビーム線を、前記照明ビーム経路の前記光学軸を中心にして前記照明ビーム経路内で回転されるように構成されている制御可能な回転デバイスと、
前記顕微鏡モジュール、前記広視野照明モジュール（１７）、前記照明放射変調器（２３、２４）及び前記回転デバイス（２５）に接続され、前記顕微鏡を種々の動作モードに追い込む制御デバイス（２８）であって、請求項１に記載の前記第１の顕微鏡検査法を実行するために、第１の動作モードにおいて前記照明放射変調器（２３、２４）を起動するとともに、前記照明放射変調器を前記回転デバイス（２５）と共に駆動し、かつ前記２Ｄ検出器（６）を読み取り、該２Ｄ検出器によって供給されるデータを処理するように構成され、さらに、請求項１に記載の第２の顕微鏡検査法を実行するために、第２の動作モードにおいて前記照明放射変調器（２３、２４）を停止し、前記広視野照明モジュール（１７）を連続して駆動して、前記少なくとも２つの異なる波長範囲において前記照明放射を放出し、かつ前記２Ｄ検出器（６）を読み取り、該２Ｄ検出器によって供給されるデータを処理するように構成される、制御デバイスと、
を備える、顕微鏡。
【請求項１２】
前記制御デバイス（２８）によって駆動されるとともに、レーザー走査顕微鏡検査法によって前記サンプル（２）の共焦点像を形成するために、前記検出ビーム経路（８）及び前記照明ビーム経路内に設けられたレーザー走査モジュール（９）を備え、
前記制御デバイス（２８）は、請求項１に記載の前記第３の顕微鏡検査法を実行するために、前記レーザー走査モジュール（９）を第３の動作モードに追い込むように構成される、請求項１１に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
前記制御デバイス（２８）によって駆動されるとともに、前記サンプル（２）の蛍光特性を操作するために操作照明放射を用いてスポットタイプ走査又はラインタイプ走査で前記サンプル（２）を照明するために、前記照明ビーム経路内に設けられた操作照明放射モジュール（２２）を備える、
請求項１１記載の顕微鏡。
【請求項１４】
前記操作照明放射モジュール（２２）によって放出される操作照明放射は、前記照明放射変調器（２３、２４）が起動されるときに、その中も通り抜ける、請求項１３記載の顕微鏡。
【請求項１５】
前記制御デバイス（２８）によって駆動されるとともに、全反射角度の下で前記対物レンズ（３）を通して前記サンプル（２）を照明するために、前記照明ビーム経路内に設けられたＴＩＲＦ照明モジュール（１９）を備える、請求項１１記載の顕微鏡。
【請求項１６】
前記制御デバイス（２８）によって駆動されるとともに、関連する前記ビーム経路を有するそれぞれのモジュール（複数可）を接続及び切断するために設けられた切替デバイスを備える、請求項１３記載の顕微鏡。
【請求項１７】
前記切替デバイスは、少なくとも１つの折りたたみ又は旋回ミラー（１８）を有する、請求項１６に記載の顕微鏡。
【請求項１８】
前記制御デバイス（２８）によって駆動されるとともに、関連する前記ビーム経路を有するそれぞれのモジュール（複数可）を接続及び切断するために設けられた切替デバイスを備える、請求項１３記載の顕微鏡。
【請求項１９】
前記切替デバイスは、少なくとも１つの折りたたみ又は旋回ミラー（１８）を有する、請求項１８に記載の顕微鏡。
【請求項２０】
前記検出ビーム経路（８）内に設けられるとともに、前記サンプル（２）において励起された蛍光放射を前記２Ｄ検出器（６）に誘導するビームスプリッター（４）を備える、請求項１１記載の顕微鏡。
【請求項２１】
前記回転デバイス（２５）は、像域回転子、詳細にはアッベ−ケーニッヒプリズムを含む、請求項１１記載の顕微鏡。
【請求項２２】
前記制御デバイス（２８）によって駆動されるＤＭＤ（４８）が中間像平面内に設けられ、該ＤＭＤ（４８）はオフ位置とオン位置との間で各々切替え可能なミラーのアレイを含んでおり、前記ミラーは、照明放射を、前記オフ位置にあるときにはビームトラップに、前記オン位置にあるときには前記対物レンズ（３）に誘導する、請求項１１記載の顕微鏡。
【請求項２３】
位相変調器（４６）が、前記照明ビーム経路内に、かつ前記ＤＭＤの前方に配置される、請求項２２に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサンプルを顕微鏡検査するための方法及び顕微鏡に関し、解像度が異なるいくつかの顕微鏡検査法が組み合わせられる。
【０００２】
顕微鏡検査法によるサンプルの検査は、種々の技術的解決法がある広範な技術分野である。標準的な光学顕微鏡検査法から始まって、広範な異なる顕微鏡検査法が徐々に発展してきた。
【０００３】
生物学的標本を検査するための光学顕微鏡検査法の標準的な使用分野が、ルミネセンス顕微鏡検査法である。
この過程では、サンプル、たとえば、細胞の一部を特異的に標識するために、特定の色素（いわゆる、燐光体又は蛍光体）が用いられる。そのサンプルは、記述されるように、励起放射を照射され、それより励起されたルミネセンス光が適切な検出器によって記録される。
このために、通常、光学顕微鏡内に、ブロックフィルターと組み合わせてダイクロイックビームスプリッターが設けられており、それにより蛍光放射を励起放射から分離し、別々に観察できるようにする。この手順を通して、光学顕微鏡において異なる色に着色される個々の細胞部分の像を形成することができる。
当然、標本の異なる構造に対して特異的に付着する異なる色素を用いて、標本のいくつかの部分を同時に着色することもできる。この方法は、多重ルミネセンスと呼ばれる。それゆえ、標識する物質を添加することなく、そのものがルミネッセンスを生じるサンプルを調査することもできる。
【０００４】
ここで、ルミネセンスは、概ね通常通りに、燐光及び蛍光のための総称として理解されており、それゆえ、両方の過程を含む。
【０００５】
サンプルを検査するために、レーザー走査型顕微鏡検査法(laser scanning microscopy)（略して、ＬＳＭ）を用いることも知られており、レーザー走査型顕微鏡検査法は、共焦点検出構成によって（共焦点ＬＳＭと呼ばれる）、又は非線形サンプル相互作用（いわゆる、多光子顕微鏡検査法）によって、３次元で照明される像から、対物レンズの焦点面内に位置する平面のみを再現する。
光学的断面が生成され、その後、サンプルの異なる深度にあるいくつかの光学的断面を記録することによって、適切なデータ処理デバイスの助けを借りて、異なる光学的断面から構成されるサンプルの３次元像を生成できるようになる。
したがって、レーザー走査型顕微鏡検査法は、厚い標本を検査するのに適している。
【０００６】
当然、ルミネセンス顕微鏡検査法及びレーザー走査型顕微鏡検査法の組み合わせも用いられ、その組み合わせによれば、ＬＳＭの助けを借りて、ルミネセンスを生じるサンプルが異なる深度レベルにおいて結像される。
【０００７】
レーザー走査型顕微鏡は、通常の光学顕微鏡のための改良モジュールとしても供給され、それにより、通常の顕微鏡検査法に加えて、レーザー走査型顕微鏡検査法でサンプルを検査することもできるようになる。
標準的な顕微鏡検査法と同様に、レーザー走査型顕微鏡検査法、特にルミネッセンスを生じるサンプルのレーザー走査型顕微鏡検査法も、用いられる顕微鏡の光学的な解像限界によっても特徴付けられる。
但し、いずれの顕微鏡によっても、物理法則によって光学的解像度に回折限界があるが、レーザー走査型顕微鏡検査法によれば、非常に高い被写界深度が得られるようになる。
【０００８】
最近になって、回折限界を超える解像度を得るために、種々の手法が開発されている。これらの顕微鏡検査法は、標準的な顕微鏡に比べて高い横方向(lateral)及び／又は軸方向(axial)光学解像度をユーザーに提供するという事実によって特徴付けられる。
そのような顕微鏡検査法は、光学的な回折限界を超える解像度を達成するので、本説明では、それらの顕微鏡検査法は、高解像度顕微鏡検査法と呼ぶ。一方、回折限界のある顕微鏡は、標準的な顕微鏡と呼ぶ。それらの顕微鏡検査法は、既知の広視野光学顕微鏡検査法又はレーザー走査型顕微鏡検査法を実現する。
【０００９】
高解像度顕微鏡検査法では、解像度が増すことと引き換えに、測定速度が低下し、測定視野が小さくなると共に、浸入度(penetration depth)に関して、かつルミネセンス顕微鏡検査法のために用いることができる標識物質に関して制限が生じる。
【００１０】
したがって、高解像度顕微鏡検査法は、サンプル標本及び収集パラメーター（詳細には、収集速度など）に関して根本的に妥協する必要があるので、特定の検査の場合にのみ用いることができる。大きなサンプル内の小さなエリアを検査したい場合に、又は種々の速度において進行するサンプルの時間的な進展を追跡したい場合には、これは特に不適切である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それゆえ、本発明の目的は、高解像度顕微鏡検査法に付随して生じる、先行する設計及び使用に関する相容れない点(conflicts)が改善される顕微鏡及び顕微鏡検査法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この本発明の目的は、異なる空間解像度を実現する顕微鏡検査法によってサンプルの像を生成するための方法であって、以下の顕微鏡検査法のうちの少なくとも２つ、すなわち、
第１の顕微鏡検査法であって、
構造化されたラインタイプ照明又は広視野照明によって、ルミネセンスを生じるように前記サンプルが励起され、
該構造化は、回転されるとともに、回転位置毎に何度かシフトされ、
少なくとも３つの回転位置、及び該回転位置毎に少なくとも３つのシフト位置が実現され、それぞれの場合に、ルミネセンスを生じるサンプルが、所定の光学解像度を有する２Ｄ検出器上に結像され、こうして得られた像から、該所定の光学解像度よりも高い空間解像度を有する第１の顕微鏡像が、フーリエ解析を含む計算処理によって生成される、第１の顕微鏡検査法、
第２の顕微鏡検査法であって、
前記サンプルはラベル分子でラベル付けされ、該ラベル分子は、切替信号によって活性化された後にのみ、特定のルミネセンス放射を放出するように励起することができ、
前記切替信号は、前記サンプル内に存在する前記ラベル分子の一部のみが活性化されるように前記サンプルに加えられ、
前記サンプル内に部分空間が存在し、該部分空間では、活性化されたラベル分子が、その最も近い隣接する活性化されたラベル分子まで、所定の光学解像度以上の距離を有し、
該活性化された分子が励起されてルミネセンス放射を放出し、
ルミネセンス放射を放出する前記サンプルは、所定の光学解像度を有する２Ｄ検出器上に結像され、該像は解析され、そこから像データが生成され、該像データは、前記光学解像度より高い空間解像度で、ルミネセンス放射を放出する該ラベル分子の幾何学的な場所を与え、該像データから第２の顕微鏡像が生成される、第２の顕微鏡検査法、
レーザー走査型顕微鏡検査法によって第３の顕微鏡像を生成するための第３の顕微鏡検査法、及び
第４の顕微鏡検査法であって、前記サンプルはＳＴＥＤ、ＥＳＡ又はＲＥＳＯＬＦＴ技法に適した標識分子で標識され、ＳＴＥＤ、ＥＳＡ又はＲＥＳＯＬＦＴによって第４の顕微鏡像が生成される、第４の顕微鏡検査法、
のうちの少なくとも２つが組み合わせられ、
得られた前記少なくとも２つの顕微鏡像を重ね合わせて、合成像が生成される、方法によって達成される。
【００１３】
この目的は解像度が異なる少なくとも２つの顕微鏡検査法を用いてサンプルを顕微鏡検査するように形成される組み合わせ顕微鏡であって、
該顕微鏡は、
全ての顕微鏡検査法のために前記サンプルを記録する対物レンズと、
検出ビーム経路及び少なくとも１つの照明ビーム経路であって、少なくとも部分的に同一空間を占有するとともに、いずれも前記対物レンズを通り抜ける、検出ビーム経路及び少なくとも１つの照明ビーム経路と、
前記検出ビーム経路に接続される顕微鏡モジュールであって、チューブレンズ及び２Ｄ検出器を有し、前記対物レンズと共に、該２Ｄ検出器上に前記サンプルを結像する、顕微鏡モジュールと、
前記対物レンズを通して前記サンプルを広視野照明するために前記照明ビーム経路に接続される広視野照明モジュールであって、該広視野照明モジュールを駆動して、少なくとも２つの異なる波長範囲において照明放射を放出することができる、広視野照明モジュールと、
照明放射変調器であって、前記照明ビーム経路内で照明方向において前記広視野照明モジュールの下流に配置され、前記照明ビーム経路内で制御可能に起動及び停止することができ、前記照明放射の起動状態においてストライプ変調をかけ、該照明放射変調器は、該ストライプ変調が前記照明ビーム経路の光学軸に対して垂直にシフトすることができるように駆動することができ、制御可能な回転デバイスがさらに設けられ、該制御可能な回転デバイスを用いて、前記照明ビーム経路の前記光学軸を中心にして前記ストライプ変調が回転可能であるか、又は、前記起動された照明放射変調器を通り抜けそれによって前記ストライプ変調が与えられた放射線ビームが、前記照明ビーム経路の前記光学軸を中心にして前記照明ビーム経路内で回転可能である、照明放射変調器と、
前記顕微鏡モジュール、前記広視野照明モジュール、前記照明放射変調器及び前記回転デバイスに接続され、前記顕微鏡を種々の動作モードに追い込む制御デバイスであって、上述した前記第１の顕微鏡検査法を実行するために、第１の動作モードにおいて前記照明放射変調器を起動するとともに、前記照明放射変調器を前記回転デバイスと共に駆動し、かつエリア検出器を読み取り、該エリア検出器によって供給されるデータを処理するように形成され、さらに、上述した第２の顕微鏡検査法を実行するために、第２の動作モードにおいて前記照明放射変調器を停止し、前記広視野照明モジュールを連続して駆動して、前記少なくとも２つの異なる波長範囲において前記照明放射を放出し、かつ前記エリア検出器を読み取り、該エリア検出器によって供給されるデータを処理するように形成される、制御デバイスと、
を有する、顕微鏡によってさらに達成される。
【００１４】
それゆえ、本発明は、最新技術においてこれまでに未だ実現されていないか、又は記述されていない、特定の高解像度顕微鏡検査法と標準的な顕微鏡検査法との組み合わせを提供する。
それにより、高解像度において比較的小さなサンプル視野断面（対象領域(region of interest)、すなわちＲＯＩとも呼ばれる）の像を形成することができ、さらに、これらを標準的な顕微鏡検査法による収集で補うか、又はそれによりそれらを明らかに見えるようにすることができる。
また、標準的な顕微鏡検査法からのデータを用いることによって、高解像度顕微鏡検査法における測定サイクルが簡略化されるか、又はその高解像度顕微鏡検査法で得られるデータの品質が高められる。
【００１５】
本発明によれば、最新技術においてそれ自体だけで既に知られている様々な高解像度顕微鏡検査法を、レーザー走査型顕微鏡検査法と組み合わせることができるか、又は互いに組み合わせることができる。
【００１６】
本発明の枠組み内にある関連する高解像度法が米国特許第５８６６９１１号において記述されており、この点において、その開示はその全体が本明細書に援用され得る。
２つの波長を有する光放射を用いて、解像度を高める。１つの波長の光放射は、測定されることになるサンプル上に、対物レンズによって励起光ビームとして合焦され、それはルミネセンス、ここでは蛍光を励起する。ここで、空間解像度の向上が生じる。これは、他方の波長を有する光ビームが、部分的なエリアにおいて励起光ビームによって励起される蛍光状態をデポピュレート(depopulate)するためである。それゆえ、この光ビームは「デポピュレーション放射」とも呼ばれる。ここで、放射は、たとえば、デポピュレーション光ビームの主要な最大値と励起光ビームの主要な最大値が部分的に重なり合うように、行なわれる。励起放射を照射されたエリアのエッジにおけるサンプルのこの「脱励起」を通して、減少された体積(volume)だけが依然として蛍光を放出する。結果として、この体積減少によって解像度が高められる。
【００１７】
たとえば、独国特許第４４１６５５８号、米国特許第６６３３４３２号、又は独国特許出願公開第１０３２５４６０号において記述されるような、いくつかの機構がそのようなデポピュレーションを達成することができる。それらの特許は全て本明細書において使用することができる。
【００１８】
一例が、誘導放出による脱励起(de-excitation by stimulated emission)（ＳＴＥＤ）である。
励起放射が蛍光体を励起する。蛍光波長の範囲内の１つの波長を有する光放射によって、基底状態に向かって、こうして励起された状態のデポピュレーションが達成される。この誘導放出は、ルミネセンスの波長に概ね同一に対応する波長を有する。それゆえ、励起波長は、デポピュレーション放射の波長よりも、ストークスシフトの量だけ短い。
それゆえ、この手法による解像度の向上は、独国特許第４４１６５５８Ｃ２号によっても示されるように、２つの異なる光源を使用する。これに関連するその開示が完全に本明細書に援用される。
【００１９】
励起準位のためのデポピュレーションのさらなる可能な過程は、もはやルミネセンスを放出することができない、さらに高い状態における励起である。この上昇は、励起状態吸収(exited state absorption)と呼ばれ、このため、この手順は略して、ＥＳＡとも書かれる。この過程の対応する記述は、たとえば、同じく本明細書に援用される米国特許第６６３３４３２号において見つけることができる。
より高い状態では、サンプル又は色素内のエネルギー状態間の距離は減少するので、ＥＳＡ過程におけるデポピュレーションの場合、励起の場合よりも小さなエネルギー、それゆえ、長い波長を有する光源が用いられる。２つの異なる波長、それゆえ、たとえば、２つの異なる光源が再び用いられる。
【００２０】
たとえば、同じく完全に援用される独国特許出願公開第１０３２５４６０号において記述される、いわゆる、可逆的可飽和光学蛍光遷移（ＲＥＳＯＬＦＴ：reversible saturable optical fluorescence transition）は、蛍光のためのデポピュレーションのさらなる方法を表す。
空間的に高い解像度の像を形成する場合、この顕微鏡検査法は標識物質を使用する。その物質は、切替ビームの助けを借りて、蛍光が生じる第１の状態から、色素が蛍光を発しない第２の状態に繰返し変換されることができる。色素は、第２の状態から第１の状態に戻ることができる。
サンプルは、部分エリアにおいて、切替ビームを用いて第２の状態に移行し、サンプルの画定されたエリアが除外される。
その後、励起ビームを用いて蛍光が励起され、その後、記録される。その際、蛍光は、切替ビームによって以前に作用されていなかったサンプル体積からのみ生じる。
励起ビーム及び切替ビームを適切に重ね合わせることを通して、蛍光が放出される体積は、励起ビームの解像度及び切替ビームの零点の鮮鋭度によって先験的に許される体積よりも小さくなる。
この高解像度顕微鏡検査法の開発は、欧州特許第１９０７８２６号において記述されており、この点において、その明細書も参照により完全に本明細書に援用される。その場合、必要な放射源に関する要求は、適切な色素を用いることによって簡略化される。ここでは、色素の励起挙動の非線形性がデポピュレーションのために利用され、それにより、１つの波長における放射を不要にすることができる。
【００２１】
したがって、既知の高解像度顕微鏡検査法のうちの３つ全てにおいて、励起のための波長と同じでない波長を有する光放射を使用することによって、蛍光が避けられる。
同時に、この光放射は、放射電力の少なくとも１つの鮮鋭に画定される空間的な零点を有するはずであり、それが、検出される蛍光放射の最終的な解像度を決定する。
ＳＴＥＤ過程の場合、たとえば、励起放射源は、サンプル内にエアリー分布(Airy distribution)を生成することができ、それを用いて、サンプルが基底状態から励起状態に変換される。
励起状態のデポピュレーションは、デポピュレーション光源によって行なわれ、その光源は、たとえば、サンプル内でドーナツ形、又はトーラス形のビーム分布を有する。デポピュレートされない色素分子のルミネセンス放射、すなわち、脱励起されない色素分子のルミネセンス放射が、検出器の助けを借りて記録される。その顕微鏡の解像度は、デポピュレーションによって、エアリー分布から生じる回折限界を超えて高められる。これは、従来の顕微鏡と比べて、高解像度の顕微鏡の縮小された点像分布によって表される。
【００２２】
本発明の枠組み内で実現可能であるさらなる高解像度顕微鏡検査法が欧州特許第１１５７２９７Ｂ１号において検討される。
構造化された照射によって、非線形過程が利用される。蛍光の飽和が非線形性としての役割を果たす。照射放射変調器によって生成される構造化された照射を通して、光学システムの伝達関数に対する物体空間スペクトルのシフトが行なわれる。具体的には、スペクトルのシフトは、空間周波数Ｖ０〜Ｖｍにおいて物体空間周波数Ｖ０が伝達されることを意味する。ただし、Ｖｍは構造化された照射の周波数である。システムによって最大限に伝達可能な所与の空間周波数において、これにより、伝達関数の最大周波数よりも高いシフト周波数Ｖｍを有する物体の空間周波数を伝達できるようになる。
この手法は、像生成のための再構成アルゴリズムを必要とするとともに、１つの像を得るために何回かの収集を利用する必要がある。したがって、解像顕微鏡検査法の対応する記述に関して同じく完全に援用される欧州特許第１１５７２９７Ｂ１号は、サンプルの構造化された広視野照明を使用し、たとえば振幅／位相格子によって、ストライプ変調が課せられる。サンプル内の蛍光も広視野において検出される。
ここで、その変調は、少なくとも３つの異なる回転位置、たとえば、０°、１２０°及び２４０°に動かされ、各回転位置における変調は、少なくとも３つの異なる位置にシフトされる。回転位置の各シフトにおいて（それゆえ、全部で少なくとも９箇所の像位置において）、サンプルが広視野で検出される。その格子はさらに、用いられる光学構成が伝達することができる限界周波数にできる限り近い周波数を有する。その後、フーリエ解析を用いて、上記のスペクトルシフトが行なわれ、詳細には、像内の０次及び±１次の回折次数が評価される。
この顕微鏡検査法は、ＳＩＭ法とも呼ばれる。
【００２３】
ＳＩＭ法の開発は、変調のストライプ方向に対して垂直であるラインタイプ照明を用いて達成することができる。その際、１つのラインタイプの照明が存在し、そのラインに沿ってストライプ構造が繰り返される。ラインタイプ照明は、それに関する限り、変調によって構造化される。ライン照明によって、共焦点スリット検出を可能にし、それゆえ、再び解像度を高めることができる。この方法は、略してＳＬＩＭとも呼ばれる。
【００２４】
照明放射において照明放射変調が実行されるとともに、照明放射変調が非常に強く、構造化された照明の明るいエリア内でサンプルの蛍光が飽和に達するときに、さらに高い解像度が得られる。その際、サンプルに関する変調は、もはや蛍光に関して正弦分布にはならないが、飽和効果のために、光学的な限界周波数を超えてさらに高次の高調波を依然として有する。この方法は、略して、飽和パターン励起顕微鏡検査法(saturated pattern excitation microscopy)（ＳＰＥＭ）とも呼ばれる。
構造化された照明を用いて高解像度を得る顕微鏡検査法のこれら３つの変形形態も、本発明による組み合わせにおいて、又は本明細書による顕微鏡を用いて実現することができる。
【００２５】
最後に、レーザー走査型顕微鏡検査法とは関係なく、回折限界を超える解像度を達成するさらなる高解像度法も、国際公開第２００６１２７６９２号及び独国特許第１０２００６０２１３１７号から知られている。３つ全ての明細書が、この点において完全に本開示に援用される。
略してＰＡＬ（光活性化光学顕微鏡検査法:Photo Activated Light Microscopy）と呼ばれるこの顕微鏡検査法は、光学活性化信号によって活性化することができるラベル物質を使用し、その結果、活性化状態においてのみ、励起放射を用いて特定の蛍光放射を放出するように励起することができる。ラベル物質の活性化されない分子は、励起放射の照射後に、全く、又は少なくとも目立つほどの蛍光放射を放出しない。
ここで、ＰＡＬ顕微鏡検査法では、活性化信号が加えられ、それによって活性化されるラベル分子が、隣接する活性化された分子から離隔して配置され、顕微鏡の光学解像度によって測定されるように分離されるか、又は後に分離することができるようにする。こうして、活性化された分子は少なくとも大きく分離される。
これらの分離された分子について、その際、解像限界であるように生成される放射分布の中心が特定され、そこから、光学的結像そのものによって可能である精度よりも高い精度で、その分子の位置が計算によって求められる。
このように回折分布の中心を計算で求めることによって高められた解像度は、専門的な文献において「超解像(superresolution)」とも呼ばれる。その場合、活性化されるラベル分子のうちの少なくともいくつかは、蛍光放射が検出される光学解像度で、サンプル内で区別可能である必要があり、それゆえ、分離される必要がある。そのような分子の場合に、その後、高められた解像度で位置情報をもたらすことができる。
【００２６】
個々のラベル分子を分離するために、ＰＡＬ顕微鏡検査法は、活性化放射の光子を受け取った後にラベル分子が活性化される確率は全ての分子について同じである、という事実を利用する。
切替信号の強度調整することによって、それゆえ、サンプルの単位面積当たりに衝突する光子の数を調整することによって、サンプルの単位面積内に存在するラベル分子を活性化する確率が非常に小さく、光学解像度の範囲内で、区別可能なラベル分子のみが蛍光放射を放出するのに十分な面積が存在するのを確実にすることができる。
切替信号の強度を適切に選択する結果として、すなわち、光子密度を適切に選択する結果として、可能な限り、光学解像度に対して分離されるラベル分子のみが活性化され、その後、蛍光放射を放出する。
これらの分離される分子について、その後、回折を条件とする強度分布の中心、それゆえ、ラベル分子の位置が、高められた解像度で計算によって特定される。
サンプル全体の像を形成するために、可能な場合には、全てのラベル分子がサブセット内に一度含まれ、像を形成する解像度内で分離されるまで、活性化放射を導入し、その後、励起して、蛍光放射で像を形成することによって、部分的な量のラベル分子の分離が繰り返される。
ラベル分子は、励起及び再開される活性化の連続するステップ間で非活性化される。これは、付加的な（好ましくは光学的な）非活性化信号によって、又は蛍光放射の励起及び放射後にラベル分子を漂白することによって達成することができる。
【００２７】
ＰＡＬ顕微鏡検査法は、活性化のためにも、励起のためにも、高い空間解像度が不要であるという利点がある。代わりに、広視野照明において、活性化及び励起の両方を行なうことができる。
【００２８】
結果として、活性化放射の強度を適切に選択することによって、ラベル分子はサブセット内で統計的に活性化される。それゆえ、たとえば回折限界を超える解像度等で、全てのラベル分子の位置を計算によって求めることができるサンプルの完全な像を生成するために、複数のフレームが評価されなければならない。たとえば、Egner他（Biophysical Journal, pp. 3285-3290, volume 93, November 2007）において記述されるような計算手順によって、フレーム内の分子の位置が求められる。
【００２９】
本発明に従って、異なる高解像度顕微鏡検査法を互いに組み合わせるか、又はレーザー走査型顕微鏡検査法と、さらにはオプションで標準的な広視野顕微鏡検査法とも組み合わせることによって、像内で所定のパターンが生じるとき、詳細には、サンプル内で起こりつつある変化に関してサンプルが予め固定された後に、高解像度顕微鏡検査法のうちの１つを用いてサンプルの像を形成できるようになる。
高解像度顕微鏡検査法によれば像収集速度は低下するので、高解像度顕微鏡検査法の場合、小さなサンプル視野が選択されるときに、迅速な像生成を達成することができる。
さらに、このようにして、動的な進展のうちの特定の状態を表す所定のパターンが生じ、そのパターンを高解像度において調査するときにのみサンプルを固定することによって、高解像度法の像収集速度に対して実際には速く進みすぎる動的な過程を検査することができる。その固定のために、たとえば、滴下によって固定液を加えるか、又は急速凍結するための、対応するサンプル固定デバイスを顕微鏡内に組み込むことが好ましい。
代替的には、たとえば、静止状態にある高解像度の生体サンプル(living sample)を検査し、光学的、化学的又は他の刺激によって迅速な動的過程を開始し、その後、これらを、より高速の他の顕微鏡検査法、たとえば、ＬＳＭ又は標準的な広視野顕微鏡検査法を用いて検査することもできる。そのような観察シーケンス（静止状態の高解像度記録、動的変化の刺激、そして低解像度、それゆえ高速の顕微鏡検査法による動的変化の観察）は、必要に応じて、周期的に繰り返すこともできる。
【００３０】
標準的な方法及び高解像度法（たとえば、ＬＳＭ及びＰＡＬＭ）が同時に用いられる場合には、たとえば、急速に変化する構造を標準的な方法で記録し、静止した物体を高解像度で記録することができる。こうして、本発明の枠組み内で、異なる顕微鏡検査法が、サンプル内の異なる像域であって、オプションで重なり合う像域を同時に記録することが提供される。たとえば、細胞膜をＰＡＬＭによって静止状態で調査することができ、同時に、標準的な解像度を有するライン走査型ＬＳＭによって、小胞を非常に動的に記録することができる。
【００３１】
本発明によれば、異なる顕微鏡像が組み合わせられる。詳細には、まとめられるか、又は重ね合わせられる。これは、２次元において、３次元において、そしていずれの場合にも、さらに経時的にも行なうことができ、上記のように、像域は異なるサイズを有することができる。
像域は完全に又は部分的に重なり合うことができるが、それらの像域を並べて配置することもできる。
組み合わせられる像の正確な相対位置を保証するために、像タグ(image tag)が評価されることが好ましい。これらのタグは、用いられる顕微鏡像内に現れる、たとえば、粒子、特に金粒子等の対応する構造をサンプルに予め与えることによって得ることができる。これらの像タグの位置は、個々の像を位置合わせして調整するために評価され、制御デバイスによって考慮に入れられる。
【００３２】
本発明による手順によれば、標準的な解像度の像を含むことによって、高解像度像素子間の結び付きを容易に示すことができることがわかっている。少なくとも２つの顕微鏡検査法を用いることによって、部分的に相補的な情報を明らかにすることもできる。たとえば、ＰＡＬ顕微鏡検査法のためにＴＩＲＦ照明が用いられる場合には、カバーガラスの境界において、高感度の像情報が記録される。浸入度が大きいことから、レーザー走査型顕微鏡検査法を同時に使用することによって、他のサンプル面からの情報を入手し、この情報をＰＡＬ顕微鏡検査法からの高解像度の詳細な像に関連付けることができる。それにより、たとえば、高解像度において膜に関する特定の活動を調査し、同時にそれらの活動を標準的な解像度で記録されている細胞又は一体の細胞構造内部の過程に関連付けることができる。
【００３３】
詳細には、他の顕微鏡像のうちの１つからの情報に応じて、位置及びサイズに関して、さらなる顕微鏡検査法、詳細には高解像度顕微鏡検査法のうちの１つを用いて像を形成されるサンプル断面を選択することができる。
【００３４】
しかしながら、本発明による手順によれば、サンプルに関する情報を増やすために異なる顕微鏡検査法の上記の組み合わせが可能であるだけでなく、それらの性能に関する顕微鏡検査法の相互作用も可能である。
このために、組み合わせ前に顕微鏡像のうちの１つにおいて像評価を実行し、そこから、他の顕微鏡像のうちの１つを収集するための少なくとも１つの制御変数を、それゆえ、他の顕微鏡検査法のうちの１つを実行するための制御変数を導出することができる。
取り得る制御変数は、焦点位置、サンプルステージ位置（すなわち、対物レンズの光学軸に対して垂直なサンプルの位置）、対物レンズの選択、ＳＴＤ、ＥＳＡ又はＲＥＳＯＬＥＴの場合の照明放射の空間分布、像断面の選択、カメラ感度の調整、サンプルの蛍光特性に影響を与えるために導入される操作放射の局所的な照明電力、像断面位置に関する座標の移動などである。
【００３５】
本発明による組み合わせ顕微鏡は対応するデバイスを有し、結果として、上記の顕微鏡検査法を組み合わせることになるときにユーザーは自由度を有し、それらの顕微鏡検査法は後に、組み合わせ顕微鏡における制御デバイスの動作モードとして調整される。
【００３６】
詳細には、起動可能な切替手段を介して個々のモジュールの照明放射が組み合わせられる場合には、これらの動作モードを簡単に調整することができる。これらの切替手段は、折りたたみ又は旋回ミラーを有することができ、ミラーは個々の照明放射を結合して照明ビーム経路を形成し、それゆえ、顕微鏡の部分的な照明ビーム経路を実現する個々のモジュールの照明ビーム経路を結合して、後にメイン照明ビーム経路として認識されるビーム経路を形成する。
【００３７】
ビームスプリッターを設けることが検出ビーム経路にとって好都合であり、ビームスプリッターは、サンプルにおいて励起される蛍光放射を２Ｄ検出器に誘導し、それゆえ、広視野検出に関して検出ビーム経路を分割する。
個々の顕微鏡検査法を実行する際に最大限可能な自由度を有するために、個々の折りたたみ又は旋回ミラー、及びダイクロイックビームスプリッターの形をとるビームスプリッターを実現することが好都合であり、そのビームスプリッターは、たとえば、既知のスプリッターホイール、又はいくつかのそのようなスプリッターホイールを用いることによって交換することができる。
スペクトル特性を適切に選択すれば、上記の顕微鏡検査法は、それに応じてサンプルを同時に照明することによって、同時に実現することもできる。
レーザー走査モジュール又は操作照明放射モジュールに関して、たとえば、レーザー走査型顕微鏡内又は操作照明放射モジュール内のスポットスキャナーと、広視野又はラインタイプ照明を誘導する照明ビーム経路の残りの部分との結合が行なわれる。こうして、対応する切替手段を、たとえば、米国特許出願公開第２００８／００８８９２０号において記述されるようなアクロマティックビームスプリッターとして実現することもでき、その明細書の開示は、この点において完全に本明細書に援用される。
【００３８】
ＳＩＭ、ＳＬＩＭ及びＳＰＥＭ顕微鏡検査法の場合、冒頭において既に記述されているように、構造化された照明の変調の方向の回転が必要である。
これらの顕微鏡検査法を実現するために、第２及び第３の照明ビーム経路の共通部分内に存在する変調器の下流に像域回転子(image-field rotator)が配置される場合には、その回転は特に簡単に実現することができる。これは、たとえば、アッベ−ケーニッヒプリズム(Abbe-Koenig prism)によって実現することができる。この下流の像域回転子は、ストライプ変調及び線形照明の垂直な位置が後に一度だけ調整される必要があり、他の方法であれば変調器の回転の場合に必要とされることになる追跡が不要になるので、ＳＬＩＭ顕微鏡検査法の場合に特に好都合である。
当然、たとえば、回転可能なストリップ格子、又は適切に駆動される変調器（たとえば、ＤＭＤ又はＬＣＤ）によって、変調器そのものを回転させることもできる。
【００３９】
本発明による顕微鏡は、モジュールの個々の部分照明ビーム経路がメイン照明ビーム経路に対してカスケードに結合され、その後、ビームスプリッターにおいてメイン照明ビーム経路が検出ビーム経路に対して結合される場合に、特に簡単な構造を有する。
それゆえ、好ましくは上記の切替手段によって、個々の部分照明ビーム経路を種々の点において結合して、全体的な照明ビーム経路が形成される。
個々の部分照明ビーム経路の起動又は停止が別の方法で行なうことができるとき、たとえば、影響を受けたモジュールそのものにおいて行なうことができるときには、当然、切替手段は不要である。
【００４０】
上記の機構、そして後にさらに説明されることになる機構は、本発明の枠組みから逸脱することなく、与えられた組み合わせにおいてだけではなく、他の組み合わせにおいても、又は単独でも用いることができることは理解されたい。
【００４１】
本発明は、本発明に不可欠である機構を開示する添付の図面を用いて、例として以下に詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】組み合わせ顕微鏡の概略図である。
【図２】図１の組み合わせ顕微鏡を用いて得られた種々の像の重ね合わせの概略図である。
【図３】図１の組み合わせ顕微鏡を制御するための概略図である。
【図４】図１の組み合わせ顕微鏡に類似しているさらなる組み合わせ顕微鏡を示す図である。
【００４３】
図１には、標準的な顕微鏡検査法、すなわち、その解像度が回折限界によって制限される顕微鏡検査法と、高解像度顕微鏡検査法、すなわち、その解像度が回折限界を超えて高められる顕微鏡検査法とを同時に実行することができる顕微鏡１が示されている。
顕微鏡１はモジュール式の構造であり、本発明をさらに良好に例示するために、包括的な拡張ステージ内に示される。しかしながら、少ないモジュールを有する縮小された構造も実現可能である。モジュール式構造は必要ない場合もある。一体型又は非モジュール型の設計も同様に可能である。この図１の例の顕微鏡１は、従来のレーザー走査型顕微鏡に基づいて構成され、サンプル２を検知する。
【００４４】
顕微鏡１は対物レンズ３を有し、その中を全ての顕微鏡検査法のための放射が通り抜ける。ビームスプリッター４を介して、対物レンズ３は、チューブレンズ５と共にサンプルをＣＣＤ検出器６上に結像する。その検出器は、一般的に実現可能な２Ｄ検出器の一例である。
この点において、顕微鏡１は、従来の光学顕微鏡モジュール７を有し、サンプル２から対物レンズ３及びチューブレンズ５を通ってＣＣＤ検出器６までのビーム経路は、従来の広視野検出ビーム経路８に対応する。
ビームスプリッター４は、図において両矢印によって示されるように交換可能である。これは、異なるダイクロイック特性を有するビームスプリッター、又は米国特許出願公開第２００８／００８８９２０号によるアクロマティックビームスプリッターと切り替えることができるようにするためである。
【００４５】
対物レンズ３へのビーム経路には、レーザー走査モジュール９が接続され、そのＬＳＭ照明及び検出ビーム経路は、ビームスプリッター機能も有する切替ミラー１１を介して、対物レンズ３へのビーム経路に結合される。それゆえ、切替ミラー１１からビームスプリッター４を通って対物レンズ３までのビーム経路は、照明ビーム経路及び検出ビーム経路が組み合わされるビーム経路である。
これは、レーザー走査モジュール９及び広視野検出ビーム経路８の両方に関して当てはまる。後にさらに説明されるように、広視野検出ビーム経路８、すなわち、ＣＣＤ検出器６と共に顕微鏡検査法を実現する照明放射も切替ミラー１１において結合されるためである。
【００４６】
切替ミラー１１及びビームスプリッター４を組み合わせてビームスプリッターモジュール１２が構成され、それにより、用途に応じて、切替ミラー１１及びビームスプリッター４を交換することができる。これは両矢印によって示される。
広視野検出ビーム経路８内に存在し、広視野ビーム経路８を通って伝搬することができるスペクトル部分を適切にフィルターリングするエミッションフィルター１３が、ビームスプリッターモジュール１２内にさらに設けられる。当然、ビームスプリッターモジュール１２内のエミッションフィルター１３も交換可能である。
【００４７】
レーザー走査モジュール９は、光ファイバ１４を介して、レーザーモジュール１５から、動作のために必要なレーザー放射を得る。
【００４８】
図１において示される設計では、異なる顕微鏡検査法のための照明放射がその中を通り抜ける収集照明ビーム経路１６が、ビームスプリッターモジュール１２において、さらに正確には切替ミラー１４において結合される。
個々の照明モジュールの異なる部分照明ビーム経路が結合され、このメイン照明ビーム経路１６が形成される。たとえば、広視野照明モジュール１７が、切替ミラー１８を介して広視野照明放射をメイン照明ビーム経路１６の中に結合し、結果として、チューブレンズ２７及び対物レンズ３を介して、サンプル２が広視野照明される。広視野照明モジュールは、たとえば、ＨＢＯランプを有することができる。
切替ミラー１８の適切な位置を得るためのＴＩＲＦ照明を実現するＴＩＲＦ照明モジュール１９が、さらなる照明モジュールとして設けられる。このために、ＴＩＲＦ照明モジュール１９は、光ファイバ２０を介して、レーザーモジュール１５から放射を受光する。
ＴＩＲＦ照明モジュール１９は、縦方向に動かすことができるミラー２１を有する。ＴＩＲＦ照明モジュール１９によって放出される照明ビームは、縦方向のシフトによって、放出された照明ビームの主伝搬方向に対して垂直に動かされ、それにより、ＴＩＲＦ照明は、結果として、対物レンズ３の光学軸に対して調整可能な角度で対物レンズ３に入射する。
このようにして、カバーガラスにおいて全反射するのに必要な角度を容易に保証することができる。当然、この角度調整を達成するための他の手段も適している。照明ビームが光学軸に入射するようにミラー２１を調整することによって、ＴＩＲＦ照明モジュール１９は、広視野照明源として動作することもできる。
【００４９】
詳細には示されない光ファイバを介してレーザーモジュール１５から同様に放射を受光し、サンプル２じゅうを(over)走査されるようにスポット又はラインタイプビーム分布を誘導する、マニピュレーターモジュール２２の照明ビーム経路が、メイン照明ビーム経路にさらに結合される。
したがって、マニピュレーターモジュール２２は、レーザー走査型顕微鏡の照明モジュールに概ね対応し、それゆえ、マニピュレーターモジュール２２は、レーザー走査モジュール９の検出器と組み合わせて、又はＣＣＤ検出器６による広視野検出と組み合わせて動作することもできる。
【００５０】
照明ビーム経路の中間像平面内に存在し、その格子定数が顕微鏡１を用いてサンプル２内に透過することができる限界周波数未満であるストリップ格子２３が、メイン照明ビーム経路１６内に放射変調器としてさらに設けられる。格子２３は、そこに入射する照明放射のストライプ変調を成し遂げる。格子２３は、メイン照明ビーム経路１６の光学軸に対して横方向にシフトすることができ、旋回してビーム経路外に動くこともできる。このために、対応するシフトドライブ２４が設けられる。
【００５１】
回転子ドライブ２６によって回転する像域回転子２５がさらに、収集照明ビーム経路１６内の照明方向において格子の下流にさらに位置する。像域回転子は、たとえば、アッベ−ケーニッヒプリズムとすることができる。
【００５２】
顕微鏡１のモジュール及びドライブ並びに検出器は全て、詳細には示されないラインを介して、制御デバイス２８に接続される。この接続は、たとえば、データ及び制御バスを介して行なうことができる。制御デバイス２８は顕微鏡１を種々の動作モードで動作させる。
【００５３】
制御デバイス２８は、標準的な顕微鏡検査法、すなわち広視野顕微鏡検査法（ＷＦ）、レーザー走査型顕微鏡検査法（ＬＳＭ）、さらには内部全反射蛍光顕微鏡検査法（ＴＩＲＦ）を顕微鏡１に実行させるように、そして、これを冒頭において記述された、ＰＡＬＭ、ＳＩＭ、ＳＬＩＭ、ＳＰＥＭ、ＳＴＥＤ、ＲＥＳＯＬＦＴのような高解像度顕微鏡検査法と組み合わせるように、さらにはこれらを互いに組み合わせるように構成される。
図１の顕微鏡１は、基本的に、レーザースキャナー照明に適した２つのモジュール、すなわち、レーザー走査モジュール９及びマニピュレーターモジュール２２を有する。当然、他の組み合わせも可能である。これらのモジュールは、チューブレンズ及び対物レンズ３を介して、サンプル２に結合される。
マニピュレーターモジュール２２は、レーザー走査モジュールの励起部分のみを含み、すなわち、検出は行なわない。それにより、スポット単位でサンプルを照明することができ、サンプル２じゅうで照明スポットを走査することができる。
スポット単位の照明とラインタイプの照明との切替が行なわれる切替ユニット、たとえば、切替レンズ又は円柱レンズも、マニピュレーターモジュール２２内に配置されることが好ましい。
このラインタイプ照明は、メイン照明ビーム経路１６の中間像内に配置される格子２３が経路内に旋回され、ラインタイプ照明のラインに対して垂直に存在するときに特に好都合である。その際、マニピュレーターモジュール２２によってＳＬＩＭ顕微鏡検査法を容易に実現することができる。
【００５４】
格子２３に対する代替物として、様々に調整可能なストライプ変調器又はＤＭＤを用いて、サンプル２内に構造化された照明を生成することもできる。当然、その際、シフトドライブ２４、及び格子２３が経路内外に旋回できることは、もはや不要である。
【００５５】
像域回転子２５は、格子２３（又はこれに代わる構成要素）によって生成される構造化された照明がメイン照明ビーム経路１６の光学軸を中心にして回転できるようにし、結果として、構造化された照明が、サンプル２内に種々の角度で存在するようになる。
こうして、マニピュレーターモジュール２２又は広視野照明モジュール１７を、それぞれの場合に制御デバイス２８による格子２３の適切な調整と組み合わせて動作させることによって、顕微鏡１を用いてＳＩＭ、ＳＬＩＭ又はＳＰＥＭ顕微鏡検査法を実行することができる。当然、その際、切替ミラー１８が、適切な位置に動かされることになる。
【００５６】
格子２３が経路外に旋回するときに、広視野照明モジュール１７による標準的な広視野照明、又はＴＩＲＦ照明モジュール１９による標準的なＴＩＲＦ照明を達成することができる。
【００５７】
個々の動作モード間を切り替えるために、切替ミラー１８及び１１並びにビームスプリッター４が適切に調整される。このために、その実施態様において折りたたみ又は旋回ミラーを用いることができ、結果として、動作タイプ間の切替を順次に達成できるようになる。代替的には、異なるモジュールが同時に動作できるようにするダイクロイックミラーも実現可能である。
【００５８】
ビームスプリッター４はダイクロイックビームスプリッターとして設計されることが好ましく、そのビームスプリッターのスペクトル特性は、ＣＣＤ検出器６の助けを借りて検出されることになる標識分子の蛍光放射のスペクトル部分が広視野検出ビーム経路８に入り、残りのスペクトル成分が最大限可能な程度まで透過されるように、を調整することができる。
種々の放射特性を有する標識分子の利用可能性に関する自由度を高めるために、いくつかの異なるビームスプリッター４及びエミッションフィルター１３が、ビームスプリッターモジュール１２内、たとえば、フィルターホイール上に交換可能に配置される。
【００５９】
例として、ダイクロイックビームスプリッター又は切替ミラー４、１１及び１８を使用するＬＳＭ及びＰＡＬＭの組み合わせが以下に記述される。
たとえば、サンプル２は５４３ｎｍの波長において励起することができるＡｌｅｘａ５４３ラベルを与えられ、５５０ｎｍより上において蛍光放射を放出する。
ＰＡＬ顕微鏡検査法の場合、ＥＯＳＦＰラベルが用いられ、そのラベルは、４０５ｎｍの放射で活性化することができ、４８８ｎｍにおいて励起することができ、その蛍光放射は４９０ｎｍ〜５４０ｎｍの範囲内で検出される。
この動作モードの場合、格子２３は経路外に旋回され、４８８ｎｍでＴＩＲＦ照明が行なわれるように、ＴＩＲＦ照明モジュール１９が調整される。
ラベル物質ＥＯＳＦＰの活性化は、マニピュレーターモジュール２２を利用することによって達成され、このために、マニピュレーターモジュール２２は、４０５ｎｍのレーザー放射でサンプル２を照明する。個々のビームスプリッター又は切替ミラーに対して以下のパラメーターが設定される。
【００６０】
【表１】
0005687201.tif 000002
【００６１】
上で与えられる波長データは全てｎｍ単位である。
【００６２】
さらなる動作タイプでは、ＳＩＭがＰＡＬＭと組み合わせられ、像収集は順次に達成される。このために、サンプル２は、たとえば、４０５ｎｍにおいて励起することができ、その蛍光放射が４２０ｎｍ〜５２０ｎｍに存在するＤＡＰＩラベル物質を与えられる。
ＰＡＬＭ法の場合、サンプルのｔｄＥＯＳラベルが用いられ、そのラベルは、４８８ｎｍで活性化することができ、５６１ｎｍにおいて励起することができ、５６５ｎｍより上において検出することができる。このラベルの活性化は、ＴＩＲＦ照明モジュール１９によって達成される。
ＰＡＬＭ像を収集するために、格子２３が経路外に旋回され、ＴＩＲＦ照明モジュール１９が起動される。ＳＩＭ像を収集するために、格子２３が経路内に旋回され、サンプルが、広視野照明モジュール１７から広視野で照明される。その際、ビームスプリッター／切替ミラーは以下のように設定される。
【００６３】
【表２】
0005687201.tif 000003
【００６４】
上で与えられる波長データは全てｎｍ単位である。
【００６５】
図２は、図１の組み合わせ顕微鏡１の助けを借りて得られる異なる顕微鏡像の重ね合わせを概略的に示す。
顕微鏡像２９は、標準的な顕微鏡検査法、たとえば、広視野照明源１７及び広視野検出を用いる通常の蛍光顕微鏡検査法から生じる。一方、顕微鏡像３０は、高解像度法、たとえば、ＳＩＭ又はＰＡＬ顕微鏡検査法から生じる。図２は、高解像度像３０が、顕微鏡像２９よりもはるかに小さな、サンプル２の物体域を含むことを示す。顕微鏡像２９内に構造３１が存在する。構造３２が高解像度顕微鏡像３０内に存在する。
ここで、制御デバイス２８は、矢印によって記号化される重ね合わせ手順３３において、個々の像を重ね合わせて、全体的な１つの像を生成する。重ね合わせは、２次元において、３次元において、さらには、それぞれの場合の両方の形態に対して、さらに経時的にも行なうことができる。図２は、例として２次元表示を示す。
図２はさらに、高い解像度の顕微鏡像３０が低い解像度の顕微鏡像２９と組み合わせられること、すなわち、異なる解像度を有する２つの顕微鏡検査法を組み合わせる結果として、１つの全体的な像が生成されることを概略的に示す。高い解像度の顕微鏡像３０の高解像度の細かい部分間の関係は、低い解像度の顕微鏡像２９の助けを借りることによってのみもたらされ得ることが図２において明らかである。
【００６６】
顕微鏡像２９は、たとえば、ＳＩＭ又はＬＳＭによって生成することができ、第１のタイプのラベル分子、たとえば、ＦＩＴＣ又はＡｌｅｘａが結像に寄与する。
高い解像度の像は、たとえば、ＰＡＬ顕微鏡検査法から生じることができ、別のラベル色素、たとえば、ＤＲＯＮＰＡのための詳細な情報をもたらす。
重ね合わせ手順によって、それらの方法の部分的に相補的な情報を、構成された像内で組み合わせることができるようになる。たとえば、ＴＩＲＦ照明を用いるＰＡＬＭは、カバーガラスとサンプル２との間の境界に関する情報のみを検知する。
ＬＳＭ顕微鏡像が並行して収集される場合には、より大きな浸入度に起因して他のサンプル面からの情報も得ることができ、これを高解像度顕微鏡像及びその詳細な情報に関連付けることができる。
【００６７】
したがって、制御デバイス２８の制御下で、たとえば、膜に関して高解像度において特定のシーケンスを調査し、同時に、それを、たとえば、細胞又は一体の細胞構造内で、他の過程に関連付けることができる。
像収集速度(image-acquisition rate)は、低解像度又は標準的な解像度を有する方法を用いる場合よりも、高解像度の方法の場合に遅いので、高解像度の方法によれば、動的な過程は、限られた程度までしか検査することができないか、又は全く検査することができない。それゆえ、サンプルがずれないようにするために、又はサンプル２内の拡散を防ぐために、サンプル２の特定の固定手段も知られている。
顕微鏡１の助けを借りて、ここで、比較的低い解像度を有するが、高速である顕微鏡検査法によって、サンプル２内の動的なシーケンスを最初に検査することができ、サンプル２において特定の事象が生じるときに、サンプル２を固定して、高解像度において調査することができる。その事象は、対応して生成される顕微鏡像において、たとえば、所定のパターンで現れる。このために、サンプル固定デバイス、たとえば、サンプル２上に固定液を滴下するか、又はサンプル２を急速凍結するためのデバイスを顕微鏡２内に組み込むことが好ましい。
静止状態において、生細胞を高解像度で検査することもでき、その後、光学的（たとえば、マニピュレーターモジュール２２を用いる）、化学的又は他の刺激によって急速な動的過程を開始することができ、低解像度顕微鏡検査法（たとえば、ＬＳＭ又はＷＦ）を用いてこれらの過程を観察することができる。この観察シーケンス（静止状態の高解像度顕微鏡検査法−動的過程の刺激−生じている動的変化の低解像度顕微鏡検査法）は、必要に応じて、周期的に繰り返すこともできる。
一実施形態では、制御デバイス２８は、４次元合成像において重ね合わせられる顕微鏡像を表示する。
【００６８】
たとえば、標準的な方法（ＬＳＭ及びＷＦ）及び高解像度法（ＳＩＭ、ＳＬＩＭ、ＳＴＥＭ、ＰＡＬＭ、ＳＴＥＤ、ＲＥＳＯＬＦＴ）が同時に用いられる場合には、急速な変化が予想されるサンプル２の部分的エリアを、低解像度において高い像サンプル周波数で収集することができ、サンプル２内の静止した部分的エリアを、高解像度において低い像サンプル周波数で収集することができる。
こうして、顕微鏡検査法の組み合わせをサンプル内で同時に行なうこともでき、特に、サンプル２内の物体域の異なる視野を記録することができる。この一例は、静止した細胞膜をＥＯＳＦＰでラベル付けし、それをＰＡＬＭによって調査し、同時に細胞小胞をローダミンで着色し、それを共焦点ラインスキャナー（ライン走査ＬＳＭ）によって表示することである。
その際、高い解像度の細胞膜（たとえば、２０ｎｍ解像度）の前に高い時間分解能（たとえば、２００ｎｍ空間解像度及び１０ｍｓ時間分解能）で、合成像内に小胞が現れる。
像が重ね合わせられるときに、原理的には、重ね合わせ中に高解像度像３０の構造３２を低解像度像２９の適切な構造３１に適切に位置合わせすることによって、個々の顕微鏡像２０及び３０を調和又は調整することができる。
このために、サンプル２内に、いわゆる調整構造、たとえば、蛍光性の金粒子を導入することもできる。これらの調整構造の助けを借りて、その後、顕微鏡像を重ね合わせて合成像を形成する前に、それらの像の位置の調整が達成される。
【００６９】
２つの顕微鏡像の重ね合わせが本明細書において記述される場合、当然、これは単なる例として理解されるべきである。当然、さらに多くの数の像を重ね合わせることもできる。
【００７０】
しかしながら、順次又は同時に実行される異なる顕微鏡検査法は、より多くの像情報を与えるだけでなく、別の顕微鏡検査法からの情報を利用することによって、顕微鏡検査法の像収集条件を改善できるようにする。
図３は、閉ループ調整を概略的に示しており、そこでは、低解像度顕微鏡像２９からの情報及び／又は高解像度顕微鏡像３０からの情報を利用して、影響３５を及ぼす。
低解像度顕微鏡像２９の評価は、像全体においても、又は像部分３４、たとえば、高解像度顕微鏡像３０において結像される物体域に対応する像部分３４においても、達成することができる。
顕微鏡像のうちの一方又は両方において、特徴解析３６又は３７が達成され、それが図３において概略的に示される。この特徴解析から顕微鏡１の動作のための補正変数が導出され、顕微鏡１の制御変数３８への作用３９は相互に影響を及ぼし合う結果を生じることもでき、それにより、高解像度顕微鏡像３０の収集に影響を及ぼす制御変数３８の変化が低解像度顕微鏡像２９から導出され、その逆もある。
たとえば、低解像度顕微鏡像２９からコントラストを求めることができ、そのコントラストから、焦点位置ｚの位置が補正される。サンプル２の構造の位置を求めることによって、サンプルドリフトｘｙの補正を達成することができる。
【００７１】
構造サイズを用いて、適切な対物レンズ３を選択することができる。サンプルの輝度解析、それゆえ、色素濃度の解析を用いて、適切な格子２３を選択することができるか、又はマニピュレーター２２の照明電力を設定することができる。ＳＬＩＭ照明を実現することもでき、又は広視野検出の２Ｄ検出器を具現するＣＣＤ検出器２２若しくはカメラの感度を調整することができる。
【００７２】
対象とする像表示３４の確立を用いて、マニピュレーターモジュール２２の局所的な照明電力を設定することもできる。高解像度顕微鏡像２９のための像域３４を決定するか又は予め設定するために、座標ｘ、ｙ、ｚを移動することもできる。
【００７３】
高解像度顕微鏡像３０からさらに構造を解析することができ、低解像度顕微鏡像３０を通して、対応するさらなる像を形成することができるか、又は蛍光特性を操作するための放射を用いて、適切な点において、マニピュレーターモジュール２２によってサンプルを励起することができる。
【００７４】
図４は組み合わせ顕微鏡１のさらなる実施形態を概略的に示している。既に記述されているモジュールは、同じ参照番号を付与されており、それゆえ、ここで再び説明される必要はない。
しかしながら、個々のモジュール、特にレーザー走査モジュール９、マニピュレーターモジュール２２、広視野照明モジュール１７、及びＴＩＲＦモジュール１９は、照明ビーム経路、又は照明及び検出ビーム経路内の他の場所に配置することもできることを指摘することができる。
これが、例として、ＴＩＲＦモジュール１９の場合に図４において示されており、ここでは、ＴＩＲＦモジュールは、対応する照明放射を、ビームスプリッター４と対物レンズ３との間のひとみ(pupil)４３内に結合する。
【００７５】
図４では、組み合わせ顕微鏡１の個々のモジュールに制御デバイス２８が接続される際に経由されるデータ及び制御ネットワーク４１にも接続される、ディスプレイ４０、又はディスプレイ４０を備える対応するコンピューターが例としてさらに示される。
【００７６】
制御デバイス２８の制御下でサンプル２を動かすことができるサンプルステージ４２も図４において示される。そのようなサンプルステージは、当然、図４の他の全ての細部と同様に、図１の顕微鏡において実現することもできる。
【００７７】
図１のレーザー走査モジュール９は、いくつかの構成要素と共に図４において示される。レーザーデバイス４４がレーザー４５を備えており、レーザーは制御デバイス２８によって駆動される位相変調器４６に作用する。その後、レンズ系４７が放射をＤＭＤ４８上に合焦する。ＬＳＭモジュール９の検出アームの場合、図４では、例として、ＬＳＭ検出器４９と、中間像平面５０内に配置される共焦点絞りとが示される。
【００７８】
図１又は図４の組み合わせ顕微鏡１によれば、ＬＳＭ顕微鏡像及びＰＡＬＭ顕微鏡像を順次又は同時に記録し、ＬＳＭ顕微鏡像から得られた情報を用いてＰＡＬＭ顕微鏡像の収集をオンラインで調整することができる。
【００７９】
このために、第１のステップでは、サンプル２のＬＳＭ像が記録され、画面４０上に表示される。
ここで、特定の対象領域(regions of particular interest)（ＲＯＩ）を、ユーザーだけで選択できるか、コンピューターの支援を受けてユーザーが選択できるか、又は顕微鏡像から自動的に選択することができ、それに応じて、レーザーモジュール４４からの活性化放射の制御に影響が及ぼされる。このために、レーザー４５からのレーザー放射によってその表面全体にわたって照明されるＤＭＤ４８が用いられる。
ここで、選択されたＲＯＩのみが照明されるようにＤＭＤの個々のミラーが設定され、それゆえ、色素（たとえば、ＤＲＯＮＰＡ又はＥＯＳＦＰ）の光学的活性化がこれらの領域においてのみ実行される。
ＤＭＤの残りのミラーはスイッチオフ位置のままであり、それらのミラーに向けられる放射はビームトラップ（図示せず）において吸収される。
当然、活性化電力を絶えず減少させるために、スイッチオンのミラーを時間変調することもできる。それにより、活性化電力を分子濃度に効率的に合わせることができ、ＰＡＬ法の場合に特に好都合であり、結果として、局所的なマーカー濃度に関係なく、活性化された分子が、顕微鏡１の光学解像度よりも長い距離に配置されることになる。
こうして、特に、低解像度顕微鏡像から予め分っているか又は低解像度顕微鏡像において同時に特定されるサンプル内の分子の濃度によって、活性化を適切に設定することができるので、サンプル２を特に迅速に調査することができる。
強い局所的濃度変化が生じる場合、たとえば、弱く着色されたエリアに隣接して明るいエリアが存在する場合に、局所的な調整が特に好都合である。たとえば、サンプル２内の構造的な変化のために生じる可能性がある標識物質の局所的に異なる漂白によって、局所的な濃度変化がさらに生じる可能性があり、それは、ここで、活性化調整によって特に都合良く調和させることができる。
【００８０】
代替的に又は付加的に、位相変調器４６を用いて所定のＲＯＩ内で活性化する事例では、ＤＭＤ４８全体において予め形成されたＲＯＩパターンを結像することができ、その後、細かい調整のみがさらに実行される。こうして、レーザー４５の電力を概ね完全に用いて、サンプル２内のマーカー分子を活性化する。
このために、位相変調器４６が、（レーザー４５から見て）ＤＭＤ４８の手前にあるひとみ面内に配置されるとともに、レンズ系４７（１つのレンズによって実現することもできる）の焦点距離ｓまでの或る距離に配置される。
ＤＭＤ４８はさらに、レンズ系４７の後方の距離ｆに配置される。代替的には、たとえば、位相変調器４６を通してＲＯＩ選択が行なわれるとともに、たとえば、レーザーの下流にある強度変調器によってレーザー４５を強度変調するか又はレーザー４５を直に強度変調することによって、レーザー源４５の強度が全体的に調整される場合には、ＤＭＤ４８を省くこともできる。
【００８１】
本明細書において、顕微鏡像の組み合わせ又は評価が検討されてきたが、これらは、単なる例として理解されるべきであり、上記の像が基にする顕微鏡検査法を限定するものと理解されるべきではない。むしろ、上記の評価、組み合わせ、制御の影響などを、上記の顕微鏡検査法の他のものと共に用いることもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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