(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルテインを抽出する方法であって、
精練溶液及び精練されたシルク材料を得るために、水相でシルク材料を精練するステップと、
前記精練溶液から精練された前記シルク材料を分離するステップと、
前記精練溶液及び精練されたシルク材料のそれぞれを抽出溶媒と接触させて前記精練溶液及び精練されたシルク材料からルテインを抽出するステップと、
接触された前記抽出溶媒を得るステップと、
得られた前記抽出溶媒を乾燥させてルテインを含む乾固残渣を得るステップと、を含み、
前記抽出溶媒は、ヘキサン、エチルアルコール及び酢酸エチルをそれぞれ３：２：１の重量比で含む混合液であり、
前記シルク材料は、黄色シルクコクーン、シルク糸及びシルク廃棄物のうちのいずれか１つ又はそれらの組み合わせである、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
得られた前記乾固残渣を溶解して第２の溶液を得るステップと、
前記第２の溶液を濾過して該第２の溶液に溶解された純粋なルテインを得るステップと、
をさらに含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記抽出溶媒は、０．１％（ｗ／ｖ）のブチル化ヒドロキシトルエン及び／又はブチル化ヒドロキシアニソールをさらに含む方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記精練するステップは、前記シルク材料及び水相を加熱するステップ、
を含む方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
前記精練溶液から前記抽出溶媒を得るステップは、前記抽出溶媒と前記水相とを分割するステップ、
を含む方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
前記分割するステップは、
含水塩化ナトリウムを前記抽出溶媒に添加するステップ、
を含む方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、
前記抽出溶媒を乾燥させるステップは、
無水硫酸ナトリウムを前記抽出溶媒に添加するステップ、
を含む方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法において、
前記第２の溶液は、ヘキサン及び酢酸エチルを３：１の重量比で含む混合液である方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
シリンジフィルターによって第２の溶液をろ過する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にシルク繊維からルテインを抽出する方法に関する。特に、本発明は、ルテイン含有シルクエキスを抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルテイン、非プロビタミンＡ活性のカロテノイドファミリーに属するキサントフィルの１つであり、脂溶性の黄色い色素である。主に、高等植物、藻類、及び光合成バクテリアに見られる。動物、昆虫類は、ルテイン及び他のカロテノイドを生合成できない。動物内のルテインと他のカロテノイドは、食物から摂取して、ある特定の組織内に蓄積されると考えられている。ルテイン及びその異性体であるゼアキサンチンは、特定の眼組織に存在する唯一のカロテノイドとされ、特に、中心視力及び高視力に関与している網膜の小さな領域である黄斑部中心窩にみられる。ルテインは、人間と植物内において、高エネルギー青色光のフィルターとして機能すると考えられており、また、高反応性であり、ＤＮＡ及び脂質を損傷し得る光誘起活性酸素種（ＲＯＳ）を捕捉して抑える酸化防止剤でもある。十分な量のルテインを日常摂取することによって、白内障、及び高齢者の失明の原因となる加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のような眼疾患に対するリスクを大幅に抑えうることは、諸研究により示されている。ルテインの、強力な抗酸化剤としての生物学的利用能に加え、キサントフィル、特にルテインが、ある種の癌の予防に直接関連しうることは、最近の研究によって示されている。皮膚ルテイン、及び経口摂取ルテインの存在は、紫外線により引き起こされる損傷から皮膚を守り、心血管疾患のリスクを低減する可能性がある。
【０００３】
ルテインは、ひとの日常の食事では、ほうれん草やケールのような色の濃い葉物野菜にもっとも豊富に含まれ、とうもろこしや卵の黄身などの黄色い食物中にも存在する。しかしながら、ルテインの平均的日常摂取量は、癌疾患、及び他の関連症状のリスクを減らすのには不十分である。加えて、ひとは、カロテノイドに対して、一定の代謝的変換しか行えず、これは、特定の食品からのカロテノイドの十分な摂取を、確実に必要とすることを示している。
【０００４】
黄色シルクコクーンは、多種にわたるカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ. ｍｏｒｉ）からのいくつかのコクーンのうちの１つである。黄色または黄金色コクーンの色素はカロテノイド由来であるのに対して、黄緑色やｓａｓａ緑色のような他の色のコクーンはフラボノイド由来である。これらの色素は、桑の葉から取り込まれ、中腸から血リンパを通り、絹糸腺に移動して、最終的にコクーンセリシンの層に貯まる。これらのカロテノイドのうち、キサントフィル、主としてルテインは、過去の研究で黄色コクーンにおける主要なカロテノイドとして示されることを強調する。絹織物のためにシルクコクーンから部分的に取り除かれた色素は、さらに他の用途に使われないことになる。さらに、セリシンのようなシルクプロテインは、コクーンの総重量の２０％〜３０％を占める２番目の主成分であり、また、 精練プロセスでコクーンより大部分が除かれる。このプロセスで出される排水は、ルテイン及びセリシンを含むが、一般的な排水処理システムによって処理されることはほとんどない。しかしながら、ルテイン及びセリシンは、その特有の機能特性により、貴重な天然成分として、食物や化粧品に使われている。それ故に、カイコ（Ｂ. ｍｏｒｉ）の特性評価と同じように、ルテイン結合タンパク質の形で単離及び抽出することが研究されてきた。
【０００５】
キサントフィル及びカロチンは、食事脂肪の吸収経路に従って生じる脂溶性分子である。その吸収は、食品マトリックスが分解するステップから、カロテノイドがリンパ管のリポタンパク質への取り込みによって消化管腔へ放出するステップまでのいくつかのステップを含む。食事脂肪の効率的な消化及び吸収は、胆汁塩ミセルの存在と同様、カロテノイドの吸収に不可欠である。吸収、輸送、及び組織による取り込みをめぐる、カロテノイドと他の食事成分との間の競争を対象とした研究はよく調査されているが、より詳しい研究が必要とされている。限られた情報から見ると、より強い極性のあるカロテノイド、キサントフィルは、カロチンや炭化水素カロテノイドより、効率的に吸収されると考えられる。それゆえ、キサントフィル、特にルテイン及びその代謝産物は、よく可溶化されており、また、カイロミクロン、ＬＤＬ及びＨＤＬなどのリポタンパク質の表面に組み込まれる。これは、血液循環系を通した後で特定の組織に蓄積するルテインの輸送を促進していると考えられるのに対して、８０％〜８５％の炭化水素カロテノイドは、脂肪組織に優先的に蓄積される。ヒト血清において、６つの主なカロテノイド、特にルテイン及びリコピンだけは、１１日〜１４日の推定半減期を持つ。カロテノイドの吸収はルテイン及びゼアキサンチンを有する組織により異なり、特に眼の黄斑部への蓄積は、ＡＭＤリスクの低減に強い関連性がある。
【０００６】
マリーゴールドの花からのルテインは、市販のルテインの重要源である。これは、９４％〜９７％のルテインエステル及び３％〜６％のゼアキサンチンから構成される。摂取した後、ルテインエステルは、血清に吸収される前に、胃の中で、遊離したルテインに酸加水分解される必要がある。いくつかの研究が示しているとおり、特定の形態のルテインのみが血清に吸収され、ある器官組織、特に黄斑の中心窩に蓄積することができる。血流中に容易に吸収され得る形でのルテインは、より高い生物活性及び生物学的利用能を有する。酸性条件は、ルテインの異性体がＥ型からＺ型への変換に影響しているとみられる。さらに、ルテインエステルが皮膚や脂肪組織に見られるのに対して、ルテイン結合タンパク質のみが黄斑の中心窩で確認される。
【０００７】
マリーゴールドの花、マリーゴールドの粉末、藻類、赤トウガラシ、及び他の植物原料などの様々な植物から、ルテインを分離、精製する典型的方法は存在する。これらの材料から分離されたルテインは、エステルの形で得られる。使用される分離プロセスは、複雑であり、ハロゲン化有機溶媒を伴う。また、使用される植物体及び花は、高レベルの除草剤及び残留農薬を含む可能性がある。
【０００８】
米国特許第５，３８２，７１４号は、鹸化マリーゴールドオレオレジンからルテインを分離、精製、及び再結晶化させるためのプロセルを記述している。出発物質となる鹸化マリーゴールドオレオレジンは、ケミン・イエロー・オイルとしても知られており、市販されている。ルテインの分離後、ルテイン結晶の濃度は約７０％である。９７％以上のルテインの純度レベルを達成するため、ルテイン結晶は、ジクロロメタンとヘキサンとの混合液で再結晶化する。ハロゲン化有機化合物の食品産業における使用は、様々な領域において、厳しい規制下に置かれている。
【０００９】
国際公開第０３０３７８３３Ａ１号は、超臨界流体抽出法によってマリーゴールドの粉末からルテインを抽出する方法を説明している。
【００１０】
米国特許第７，１７３，１４５Ｂ２号は、マリーゴールドの花及び植物体から、ルテイン、ゼアキサンチン、及び微量のカロテノイドを抽出、精製するプロセスを説明している。テトラヒドロフラン及びメタノールを含む混合液の使用は開示されている。この方法の欠点は、高腐食性条件の形成、及び抽出中のメタノールの毒性にある。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書に記載される本発明の実施形態は、シルク材料からのルテイン結合タンパク質の選択的天然源を利用する。一般的に、ヘキサン、エチルアルコール、及び酢酸エチルなどの、食品及び医薬産業で許容される溶媒は使用される。抽出は、周囲条件で、又は高温高圧で、都合よく行われることができる。そのプロセスを環境にやさしく、かつ経済的にするために、溶媒は蒸発して複数の用途に再利用される。その後、本発明によって精製されたルテインは、９５％以上の純度レベルを有するＥ型であり、網膜細胞及びマウスの両方において、高い生物活性及び生物学的利用能を有する。
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、シルク繊維を複数の溶媒と接触させて第１の溶液を得ることが含まれる、ルテインを抽出する方法が開示されている。複数の溶媒は、ヘキサン、エチルアルコール及び酢酸エチルを含む。その方法は、第１の溶液を非水相及び水相に分割することと、非水相を乾燥して乾固残渣を得ることと、乾固残渣を複数の溶媒のうちの1つ以上の溶媒に溶解させて第２の溶液を得ることと、第２の溶液をろ過して第２の溶液からルテインエキスを得ることとをさらに含む。
【００１３】
本発明の第２の態様によれば、シルクコクーンを精練してシルク繊維を得ることと、シルク繊維を１つ以上の溶媒と接触させて第１の溶液を得ることと、を含む、ルテインを抽出する方法が開示されている。１つ以上の溶媒は、ヘキサン、エチルアルコール、及び酢酸エチルを含む。その方法は、第１の溶液を非水相及び水相に分割することと、非水相を乾燥させて乾固残渣を得ることと、乾固残渣をヘキサン及び酢酸エチルに溶解させて第２の溶液を得ることと、第２の溶液をろ過して第２の溶液からルテインエキスを得ることとをさらに含む。
【００１４】
本発明の第３の態様によれば、シルク繊維を１つ以上の溶媒と接触させて第１の溶液を得ることを含む、ルテインを抽出する方法が開示されている。１つ以上の溶媒は、ヘキサン、エチルアルコール、及び酢酸エチルを含む。その方法は、第１の溶液を非水相及び水相に分割することと、非水相を乾燥させて乾固残渣を得ることと、乾固残渣を１つ以上の溶媒に溶解させて第２の溶液を得ることと、第２の溶液をろ過して第２の溶液からルテインエキスを得ることとをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施形態にかかるルテイン抽出方法のプロセスフロー図を示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態にかかるルテイン抽出方法に含まれる様々な溶媒系で抽出した後の、黄色シルクコクーンにおけるルテインの濃度及びスペクトル微細構造を示す表である。
【図３】図３は、ルテイン抽出方法で使用される精練プロセスの抽出効率を示す表である。
【図４】図４は、精練後コクーンにおけるルテイン含有量、精練溶液におけるルテインとセリシンの比率（Ｌ／Ｓ）、及び総ルテイン含有量に与える熱処理の影響を一覧して示す表である。
【図５】図５は、黄色シルク（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）コクーンに含まれるルテインの量及びそのスペクトル特性を示す表である。
【図６】図６は、異なるソース由来のルテインの組成を示す表である。
【図７】図７は、ＤＥＡＥカラムによるルテイン結合タンパク質の溶出プロフィールを示す。ＤＥＡＥカラムにおいで、１２１℃で１５（Ａ）、３０（Ｂ）、６０（Ｃ）、９０（Ｄ）、及び１２０（Ｅ）分間の精練プロセスからそれぞれ得られたタンパク質をＤＥＡＥに負荷し、１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ７．０のＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌによって勾配で溶出した。フラクションは、２８０ｎｍにおけるタンパク質、４６０ｎｍにおけるカロテノイド、及びペプチドのためにモニターされた。
【図８】図８は、ゲルろ過によるルテイン結合タンパク質の溶出プロフィールを示す。ゲルろ過において、１２１℃で１５（Ａ）及び３０（Ｂ）分間の精練プロセスからそれぞれ得られた色素セリシン溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラムに負荷し、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーによって溶出した。フラクションは、２８０ｎｍにおけるタンパク質、４６０ｎｍにおけるカロテノイドのためにモニターされた。
【図９ａ】図９ａは、ルテイン標準品（Ａ）のクロマトグラム、有機溶媒によって抽出されたルテイン（Ｂ）のクロマトグラムを示す。その結果は、アセトニトリル／メタノール（９：１、ｖ／ｖ）及び酢酸エチルを移動相として用いて、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図９ｂ】図９ｂは、速抽出器（ｓｐｅｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）によって圧力＝１００ｂａｒを使用する場合、３５℃の温度で１０分抽出されたルテイン（Ｃ）のクロマトグラム、３５℃の温度で２０分抽出されたルテイン（Ｄ）のクロマトグラムを示す。その結果は、アセトニトリル／メタノール（９：１、ｖ／ｖ）及び酢酸エチルを移動相として用いて、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図９ｃ】図９ｃは、５０℃の温度で１０分抽出されたルテイン（Ｅ）のクロマトグラム、１００℃の温度で１０分抽出されたルテイン（Ｆ）のクロマトグラムを示す。その結果は、アセトニトリル／メタノール（９：１、ｖ／ｖ）及び酢酸エチルを移動相として用いて、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図１０】図１０は、ルテインの網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）における脂質過酸化に対する効果を示す。コクーンからのルテイン（ルテイン）及びマリーゴールドの花からのルテイン（ｃ−ルテイン）を、１μＭ、１０μＭ、及び５０μＭの濃度で、２時間脂質過酸化反応させ、その後、２００μＭ（Ａ）又は４００μＭ（Ｂ）のＨ２Ｏ２を添加し、２４時間後ＴＢＡＲｓアッセイによって脂質過酸化効果を測定した（その結果は、それぞれ二重反復試験された３つの実験から、グラフで表示されたＭｅａｎ±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）によって、ＭＤＡの量で示された）。
【図１１】図１１は、市販ルテインに比べて、黄色コクーンからのルテインのＬＰＳ誘導のリンパ球増殖に対する効果を示す。グラフＡはＬＰＳ＝２．５ｕｇ／ｍｌ、グラフＢはＬＰＳ = ５ ｕｇ／ｍｌである（数値は、Ｍｅａｎ±ＳＥＭとして表され、サンプリング周期内における処理の間で比較した場合、異なる上付き記号を付けた平均値には有意差がある：Ｐ＜０．０５、ｓＬＴ１０、ｓＬＴ２０、シルクルテイン投与量１０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ／ｄａｙ、２０ｍｇ／ｋｇＢＷ／ｄａｙ、ｃＬＴ１０、ｃＬＴ２０、市販ルテイン投与量１０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ／ｄａｙ、２０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ／ｄａｙ。）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書は、ここで、本発明の例示的実施形態の詳細に参照され、その実施例は添付図面に示される。本発明は、実施形態とともに説明されるが、これら実施形態に制限されるものではないと理解されるべきである。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく代替、変更、同等案を包含することを意図している。さらに、説明本発明の例示的な実施形態についての次の詳細な説明では、本発明を完全に理解するため、多くの特定の詳細が述べられている。しかしながら、本発明はこの特定の詳細を知ることなしに実施されうることが、当業者にとって、理解されるだろう。このほか、公知の方法や、手順、構成要素、及び回路は、本発明の実施形態において、不要で不明瞭な要素とならないように、十分に述べられていない。
【００１７】
簡潔で明確にするため、本発明の実施形態の説明は、以下、ルテイン抽出方法１００に限定されている。しかし、このことは、使用上、機能上、もしくは性能上の特徴などの、本発明の様々な実施形態の間で共通した基礎事項が要求される部分で、本発明の実施形態を妨げることはない。
【００１８】
本発明の例示的実施形態では、以下、図１〜８を参照して、シルク繊維からのルテイン抽出方法１００を説明する。ルテイン抽出方法１００は、また、下記のように、ルテイン含有シルクエキスを得られる方法にも関する。シルク繊維の原料は、そのルテインに対する自然選択能力から、シルクコクーンが好ましい。ルテイン抽出方法は、毒性のない溶媒により行なわれる。使用される溶媒は、後にルテインを抽出する際に、再利用も可能である。好ましくは、ルテインを抽出する方法は、中性ｐＨ、常温常圧で行なわれる。しかしながら、短時間でのルテイン製造が必要な場合、この方法によるルテイン抽出は、高温高圧の状態で、ルテイン異性体に変わることなく、行なえる。シルク由来のルテイン結合タンパク質は、細胞培養と動物モデルの両方において、市販のルテインエステルより高い生物活性と生物学的利用能を有する。シルク由来のルテインによる脂質過酸化反応の防止は、網膜細胞内のルテインエステルより、５倍効果的であると見られる。シルク由来ルテインを餌として与えたマウスの免疫力もまた、ルテインエステルを餌として与えたマウスの２倍高い。よって、シルク繊維から抽出したルテインは、栄養補助食品、及び医薬品に非常に適している。
【００１９】
ルテイン抽出方法１００では、まず、ステップ１１０において、黄色シルクコクーンは精練され、粘性シルクタンパク質セリシンが部分的に取り除かれる。そして、黄色シルクコクーン片を、１：３０の比例で、あらかじめ１２１℃で加熱した蒸留水に、１５分間浸した。加熱後、精練したコクーン、及び色素セリシン溶液と呼ばれる精練溶液を分離して、精練したコクーンを残した。また、精練したコクーンは、シルク繊維として知られる。シルクコクーン以外では、シルク糸、及びシルク廃棄物は、そこからシルク繊維を得るための、シルクコクーンの代用品として使われうる。
【００２０】
次に、精練したコクーンは、ステップ１２０において、抽出溶媒と接触させ、第１の溶液をそこから得た。具体的には、ステップ１１０で、精練したコクーンを、３ｇの初期重量で、容器、好ましくは２５０ｍＬの三角フラスコに入れて、上記９０ｍＬの抽出溶媒と混合させた。抽出溶媒は、好ましくは、ヘキサン、エチルアルコール、及び酢酸エチルのうちの１つ以上を含む。さらに好ましくは、抽出溶媒は、０．１％（ｗ／ｖ）のブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及び０．１％（ｗ／ｖ）のブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）を含む。
【００２１】
混合物は、弱い光の下、室温で、１４０ｒｐｍ／分で、撹拌器に２時間撹拌された。有機溶液は、そこから回収され、４℃で、褐色ガラス試料瓶に保存された。精練したコクーンは、同じ条件下で、３回繰り返して抽出溶媒と接触させ、多重有機溶液部分を得た。多重有機溶液部分は、合わせてプールされ、第１の溶液を得た。
【００２２】
そして、ステップ１３０において、第１の溶液を、非水相と水相に分割した。ステップ１３０では、１０％（ｗ／ｖ）の含水塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１００ｍＬを、第１の溶液に加え、第１の溶液から非水相を抽出した。その後、そこからさらに非水相を抽出する前に、非水相から上澄みを分離した。非水相の抽出は、上澄みが実質的に無色になるまで繰り返されるとともに、残りの無色の上澄み部分が水相となる。
【００２３】
その後、ステップ１４０において、水及び／又は極性物質を除去するか、又は乾燥させることによって、非水相は濃縮されて、そこから乾固残渣を得る。非水相の乾燥は、無水硫酸ナトリウム、好ましくは２ｇの無水硫酸ナトリウムを非水相に加えることで行われる。無水硫酸ナトリウムの代用品、もしくはそれに加えるものとして、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及びナトリウムイオンを含む溶液のうちの１つ、またはこれらの組み合わせは、非水相を乾燥するために使用されてもよい。また、非水相は、３５℃以下における真空蒸発によってさらに乾燥し、乾固残渣を得た。
【００２４】
ステップ１５０では、乾固残渣は、１つ以上の溶媒に溶解させ、そこから第２の溶液を得た。好ましくは、カロテノイドの容積によって、５１０ｍＬ〜１０ｍＬの望ましい容積を得るために、乾固残渣はヘキサン／酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）に溶解させる。そして、ステップ１６０において、第２の溶液は、０．４５μｍＰＴＦＴ（ポリテトラフルオロエチレン）シリンジフィルターでろ過され、そこからルテインエキスを得る。その後、ルテインエキスは、次の分析まで、暗所で−２０℃の窒素ガスにおいて保持される。
【００２５】
ルテイン抽出方法１００の抽出効率を評価するため、ヘキサン、エタノール、及び酢酸エチル（３：２：１、ｖ／ｖ／ｖ）を抽出溶媒に使用して抽出したルテイン、並びに総カロテノイドを、他の溶媒系で抽出されたものと比較した。ここで、他の溶媒系は、（Ｓ１）ヘキサン／エタノール（３：４、ｖ／ｖ）、（Ｓ２）ヘキサン／アセトン（５：３、ｖ／ｖ）、（Ｓ３）ヘキサン／アセトン／エタノール（３：１：２、ｖ／ｖ／ｖ）、（Ｓ４）ヘキサン／酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）、（Ｓ５）酢酸エチル（１００％）、（Ｓ６）ヘキサン（１００％）を含む。アセトン系抽出溶媒（Ｓ２及びＳ３）の抽出溶液には、アセトンを除くために、１００ｍＬの蒸留水を加えた。抽出溶媒の抽出効率は、総カロテノイド量及びルテイン含有量の分光光度定量によって比較された。色素エキスのＵＶ／ＶＩＳ吸収スペクトラムは、カロテノイド組成物の同定、及び解析を第１の基準として測定された。
【００２６】
以下、ルテイン抽出方法１００の２つの具体的な適用例を説明する。
【００２７】
（実施例１）
ルテイン抽出方法１００の第１の適用例では、シルクコクーンのサンプル（１±０．０００２ｇ）を、３０ｍＬの蒸留水によって、１２１℃で１５分間精練した。その精練したコクーン（Ｐ１）を、０．１％のブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（ｗ／ｖ）を含む、３０ｍＬのヘキサン、エタノール、及び酢酸エチル（３：２：１、ｖ／ｖ／ｖ）により、無色になるまで、４回抽出した。色素セリシン溶液（Ｐ２）のため、分割する前に、同じ抽出溶媒６０ｍＬを使用して、褐色ガラス分液漏斗で抽出を行ない、上部の相を得た。そして、上部の相を、真空下で乾燥するまで蒸発させ、乾固残渣が残った。乾固残渣は、ＨＰＬＣグレードのｎ−ヘキサン及び酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）に溶解し、０．４５μｍのフィルター膜でろ過される前に、５ｍＬの最終量になるように調節した。そして、ろ過後の溶液は、後の分析のため、−２０℃の窒素ガス内で保持された。精練したコクーンから抽出したカロテノイド、及び色素セリシン溶液は、ＨＰＬＣにより同定された。色素エキス内のカロテノイド及びルテインの吸収スペクトラム及び濃度は、分光光度計を用い、エタノールにおいて測定された。
【００２８】
（実施例２）
ルテイン抽出方法１００の第２の最適例では、色素セリシン複合体は、５つの異なる処理により、黄色シルクコクーンから分離した。この５つの異なる処理とは、１２１℃下で、黄色シルクコクーンを１５分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間続いて精練することを含む。それぞれの処理において、黄色シルクコクーンは、暗所において、１：３０の比例で、脱イオン水によって精練された。処理のためのそれぞれの持続時間の経過後、混合物を室温まで冷却し、精練溶液を分離した。脱イオン水を使用して、異なる処理から得た各々の色素セリシン溶液を、１００ｍＬの最終容積に調整した。すべての処理は３回行われた。色素セリシン溶液内の総タンパク質値は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質分析キットを用いて測定された。分析は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準品として、３７℃で、３０分間行われた。
【００２９】
さらなる精製と濃縮は、最小限の照明のもと、硫酸アンモニウム沈殿法にて行われた。連続的に撹拌しながら、固体硫酸アンモニウムをそれぞれの色素セリシン溶液に徐々に加え、４５％の飽和液を得た。懸濁液は、氷浴で３０分間維持され、それから、４℃で、１００００ｘｇで３０分間遠心分離された。そこで得たペレットを廃棄した後、残りの懸濁液を、塩化ナトリウム１５０ｍＭが含まれる２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩでｐＨ７．０に中和した。色素セリシン複合体の濃縮液は、０．４５μｍの再生セルロースシリンジフィルター膜でろ過した。
【００３０】
タンパク質結合型、あるいはセリシン・ルテイン複合型のルテインの特性評価には、変性陰イオン交換クロマトグラフィーを利用した。分別は、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｓｙｓｔｅｍで行われた。５つの処理それぞれから得た水性の色素セリシン溶液は、０．４５μｍのシリンジフィルター膜でろ過した。そして、タンパク質のサンプルを、ｐＨ７．０.のＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣＩ１０ｍＭによって前平衡し、弱陰イオン交換ＤＥＡＥ Ｈｉ−Ｔｒａｐ １−ｍｌカラムに負荷した。そのフラクション は、同じ緩衝液における１ＭのNaClを用いて直線勾配で溶出され、５ｍＬのフラクションを収集した。すべてのフラクションは、ペプチド、タンパク質、及びルテインに対し、２５４ｎｍ、２８０ｎｍ、及び４６０ｎｍにて、観測された。分離を最大限にするため、強陰イオン交換ＱＸＬ‐１ｍｌカラム が比較に使用された。
【００３１】
塩化ナトリウム１５０ｍＭを含むｐＨ７．０のＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液２０ｍＭにおける、色素セリシン溶液の濃縮サンプルは、分子サイズにより特性評価される。このサンプルを、塩化ナトリウム１５０ｍＭを含むｐＨ７．０.のＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液２０ｍＭによって前平衡し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラム（１．６ｃｍ×８０ｃｍ）に負荷した。溶出は、前述したＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｓｙｓｔｅｍにおいて、０．５ｍＬ・ｍｉｎ−１の流速で、同じ緩衝液で行われた。すべてのフラクションは、ペプチド、タンパク質、及びルテインに対し、２５４ｎｍ、２８０ｎｍ、及び４６０ｎｍにて観測され、それぞれ０．５ｍＬのフラクションを収集した。このサンプルの溶出プロフィールが評価された。
【００３２】
＜高温抽出＞
ルテイン抽出方法１００を用い、高温下、様々な時間分で、ルテインを抽出した。図９ａ〜９ｃは、（Ａ）有機溶媒により抽出したルテインのクロマトグラム、（Ｂ）高速抽出器により１００ｂａｒの圧力下、１００℃で、１０分間抽出したルテインのクロマトグラム、（Ｃ）高速抽出器により１００ｂａｒの圧力下、１００℃で、３０分間抽出したルテインのクロマトグラム、（Ｄ）高速抽出器により１００ｂａｒの圧力下、１５０℃で、１０分間抽出したルテインのクロマトグラムを示している。クロマトグラムの結果は、Ｃ１８ＲＰ‐ＨＰＬＣによって分析され、移動相としてアセトニトリル／メタノール（９：１，ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ）、及び酢酸エチルが用いられた。高温高圧におけるルテインの抽出（ルテイン抽出方法１００の溶媒を用いた）は、高温高圧が、ルテインエキスを弱めない、または、損傷しないということが観察された。
【００３３】
＜ルテインの網膜色素上皮細胞における脂質過酸化への効果＞
ルテイン抽出方法から得られたルテインの効果は、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞培養で試験された。ＲＰＥ細胞株、ＡＲＰＥ‐１９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）は、ＤＭＥＭ／Ｆ‐１２細胞培地にて、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％並びにペニシリン／ストレプトマイシンを用いて、二酸化炭素５％細胞培養器内で、３７℃で培養された（トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液による二次培養にて、３日〜４日毎に、細胞培地の変更あり）。結果は図１０に示される。
【００３４】
酸化ストレス状態は、２つの異なる処理中で、細胞培養で誘発された。第１の処理では、第1のＲＰＥ細胞培養部分は、Ｈ２Ｏ２によって４時間処理され、２４時間後の結果評価を行う。第２の処理では、第２のＲＰＥ細胞培養部分は、Ｈ２Ｏ２によって２時間処理され、１２時間後及び２４時間後の結果評価を行う。
【００３５】
第１の処理では、ＡＲＰＥ‐１９及びＨＬＥ‐Ｂ３細胞は、９６ウェルプレート（２０，０００細胞／ウェル）で、上記に述べた方法により、ＤＭＥＭ／Ｆ‐１２細胞培地において培養された。２４時間経過した細胞は、細胞培地を無血清培地に変えた。そののち、５０μＭ〜８００μＭのＨ２Ｏ２溶液（あるいは、いくつかの実験では、より濃度の高い溶液）を加えることによって細胞の酸化ストレス状態を誘発し、その後、５％ＣＯ２の細胞培養器において３７℃で４時間及び２４時間培養し、続いて、細胞の生存試験を行った。
【００３６】
第２の処理では、ＡＲＰＥ‐１９細胞を、９６ウェルプレートで、１０％のＦＢＳ‐ＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培地において２４時間培養し、また、レンズＨＬＥ‐Ｂ３細胞を、２０％のＦＢＳ‐ＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培地において２４時間培養し、その後、細胞培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培地に変えた。そして、２５μＭ〜１６００μＭのＨ２Ｏ２溶液を加えた後、３７℃、５％ＣＯ２で２時間培養した。それから、細胞培地を、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培地に変えた後、３７℃、５％ＣＯ２で、１２時間及び２４時間培養した。その後、細胞生存率試験を行った。
【００３７】
第３の処理では、網膜上皮細胞ＡＲＰＥ‐１９は、１０％のＦＢＳを用い、黒色９６ウェルプレートで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培養された。レンズＨＬＥ‐Ｂ３細胞は、２０％のＦＢＳ‐ＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培地で、２４時間培養した後、フェノールレッドなしの無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培地に変え、その後、細胞をＵＶ‐Ｂ５０μｌで照射した。細胞は、２０ｍＪ／ｃｍ2〜５００ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ‐Ｂ紫外線量の紫外線照射室で、紫外線照射された。そして、細胞培地を、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２に変えた後、細胞を３７℃、二酸化炭素（ＣＯ２）５％で、１２時間及び２４時間培養した。その後、細胞生存率試験を行った。
【００３８】
様々な処理に対する細胞生存量は、ＭＴＴ分析法−２，５−ジフェニルテトラ［３−（３，５−ジメチルチアゾル−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］を用いて測定された。様々な処理の２時間前、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）を、最終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで、細胞培地に加えた。それから、細胞培地は取り除かれ、ホルマザン結晶を溶解するために２００μｌのＤＭＳＯ及びエタノール（１：１）が加えられた。その後、吸光度は、ＥＬＩＳＡリーダーにより、５９５ｎｍで、測定された。
【００３９】
脂質過酸化反応は、酸化ストレス状態がＨ２Ｏ２又はＵＶにより細胞内に誘発された後、チオバルビツール酸反応性物質(ＴＢＡＲｓ  ａｓｓａｙ)により測定された。その後、ＴＢＡＲｓ試薬（１０％のトリクロロ酢酸、１％のチオバルビツール酸、５％のＨＣＩ及び１％のＳＤＳ）を加え、９０℃で１時間培養した後、冷却させ、５０００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。それから、その上澄みの蛍光発光値は、Ｅｘ５３５ｎｍ及びＥｍ５９５ｎｍにて、測定された。
【００４０】
＜実験動物を用いたルテイン効果の研究＞
マウスを使って、ルテイン抽出方法１００を用いて黄色シルクコクーンから抽出したルテインと、他の原料からのルテインとの、比較効果を研究した。マウスは、一般的に、カロテノイド群の免疫調節効果の研究に用いられる実験動物である。この研究には、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍａｈｉｄｏｌ  Ｕｎｉｖeｒｓｉｔｙ（タイ、バンコク）からの生後７週間のメスＢＡＬＢ／ｃマウスが使用され、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａl  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎａｒｅｓｕａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（タイ、ピトサヌロク（Ｐｈｉｔｓａｎｕｌｏｋ））において、照明制御された部屋で、１２時間：１２時間の明暗サイクルで、２５±１℃にて行われた。マウスは、この実験のため、滅菌蒸留水を与えた。
【００４１】
マウスは５グループに分けられ、
グループ１は、ルテインの溶媒のみをマウスに与え（ＰＢＳ  ｐＨ７．４の中に１％  Ｔｗｅｅｎ８０、溶剤対象群）、
グループ２は、黄色コクーンから抽出したルテインを、１０ｍｇ／ｋｇ体重で、マウスに与え（ｓＬＴ１０）、
グループ３は、黄色コクーンから抽出したルテインを、２０ｍｇ／ｋｇ体重で、マウスに与え（ｓＬＴ２０）、
グループ４は、マリーゴールドの花から抽出した市販のルテイン（キサントフィル≧９５％、中国製）を、１０ｍｇ／ｋｇ体重で、マウスに与え（ｃＬＴ１０）、
グループ５は、マリーゴールドの花から抽出した市販のルテイン（キサントフィル≧９５％、中国製）を、２０ｍｇ／ｋｇ体重で、マウスに与えた（ｃＬＴ２０）。
【００４２】
このマウスの５グループは、すべて、１２週間の毎日（午前７時半から午前８時半の間に）に、２００ｕｌ／匹の量のルテイン又は溶媒を、（経口投与により）マウスに投与した。各マウスの体重は、実験開始前記録され、また、実験終了まで毎週１回記録された。
【００４３】
免疫活性の応答時間を調べるため、ルテイン又は溶媒を与えたのち、２ 週目、４週目、８週目及び１２週目で、グループ１〜グループ５のそれぞれから、マウス５匹を選出した。選ばれたマウスを、腹膜内にペントバルビタールナトリウムを過量与え、安楽死させた。そして、マウスの胸部及び腹部を開き、心臓、並びに胸腺、脾臓、肝臓、腎臓及び肺を含む他の器官から、血液を採取した。各グループのそれぞれのマウスにおける各器官の重量は、個々のマウスの血液及び脾臓により免疫活性を調べる際に記録した。
【００４４】
ルテインを投与し、ミトゲン（２．５及び５ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ型）により活性化されたマウスから、リンパ球活性を調べた結果、４週間、１日に、１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙ及び２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙで黄色コクーン由来のルテインを投与したマウスのリンパ球は、ルテインを投与しなかったマウスのリンパ球より、よりよい増殖活性を示した。マリーゴールドの花由来のルテインを、２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙでマウスに与えたとき、リンパ球は、図１１に示すように増殖した。図１１は、黄色コクーン由来のルテインを１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙ及び２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙで、マリーゴールドの花由来のルテインを２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙで、それぞれ４週間マウスに与えたときに、Ｂリンパ球の活性に効果があることを示す。また、マウスに与えた黄色コクーン由来のルテインの投与量が１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙである場合、マリーゴールドの花由来のルテインの高投与量（２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙ）の場合とは、Ｂリンパ球の増殖能力において、同じ効果があるということに注目すべきである。このＰＷＭ型ミトゲンにより活性化されたリンパ球活性に対する試験結果は、ＬＰＳ型のものの試験結果と同じであった。黄色コクーン由来のルテインを、１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙ及び２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙで投与することで、もっと強いリンパ球活性を発生できる。しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙ及び２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／ｄａｙでマウスに与えた場合、いかなる投与量のマリーゴールドの花由来のルテインであっても、リンパ球の活性に影響はしない。
【００４５】
以上のように、本発明の例示的実施形態により、ルテイン抽出の方法を説明している。本明細書において、本発明の実施形態を１つのみ開示しているが、この公開された実施形態を見ると、その公開された実施形態に対して本発明の範囲及び意図から逸脱することなく幾多の変更及び／又は改良が可能であることは、当業者にとって自明のことであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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