(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、分裂酵母（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する酵母の存在下で糖組成物を発酵させるステップと、
ｂ）発酵産物を回収するステップを含んでなり、
前記酵母が遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤを含む混合糖細胞であり、前記糖組成物がグルコース、ガラクトース、およびアラビノースを含んでなり、
前記グルコース、ガラクトース、およびアラビノース糖が発酵産物に変換され、
前記発酵産物がエタノールを含む、
ガラクトースを発酵産物に転換する方法。
【請求項２】
ａ）１つ以上のリグノセルロース系材料を前処理して前処理されたリグノセルロース系材料を生成するステップと；
ｂ）前記前処理されたリグノセルロース系材料を酵素処理して前記糖組成物を生成するステップ
によって、前記糖組成物がリグノセルロース系材料から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合糖細胞がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合糖細胞がサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記混合糖細胞がアルドース還元酵素遺伝子の欠失を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記発酵が嫌気的または酸素限定条件下で実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記混合糖細胞が、過剰発現されたＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１、およびＲＫＩ１を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記混合糖細胞がｘｙｌＡ遺伝子および／またはＸＫＳ１遺伝子を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子が、
ａ）強力なプロモーター制御下のＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１からなるクラスター；
ｂ）どちらも構成的プロモーター制御下のｘｙｌＡ遺伝子およびＸＫＳ１遺伝子からなるクラスター；
ｃ）遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤからなるクラスターおよび／またはｘｙｌＡ遺伝子およびＸＫＳ１遺伝子のクラスター；
ｄ）アルドース還元酵素遺伝子の欠失
の宿主細胞への導入と、前記混合糖細胞を生じる混合糖コンストラクトの適応進化によって、前記混合糖細胞に導入される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が阻害物質抵抗性細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が工業株である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵産物が、エタノール；ｎ−ブタノール；イソブタノール；乳酸；３−ヒドロキシ−プロピオン酸；アクリル酸；酢酸；コハク酸；フマル酸；リンゴ酸；イタコン酸；マレイン酸；クエン酸；アジピン酸；リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸などのアミノ酸；１，３−プロパン−ジオール；エチレン；グリセロール；β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン；ビタミン；医薬品；動物飼料補給剤；特殊化学薬品；化学原料；プラスチック；溶剤；生物燃料およびバイオガスまたは有機ポリマーを含む燃料；およびプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシド還元酵素、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼなどの工業用酵素からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
発現を通じて、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、分裂酵母（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属するグルコース発酵酵母に、グルコースの枯渇後に、アラビノースの存在下でガラクトースを嫌気的に発酵する能力をもたらす、遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、混合糖の発酵、特にグルコース、ガラクトース、およびアラビノースを含んでなる糖組成物の発酵に関する。糖組成は、リグノセルロース系材料が起源であってもよい。
【０００２】
[背景技術］
化石燃料代替物として生産されるエタノールのほとんどは、目下、コーンスターチおよびサトウキビベースのスクロースの発酵に由来する。再生可能燃料を生産するという意欲的目標に到達するために、非食物バイオマスをエタノールなどの発酵産物に転換する新たな技術が開発されている。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、エタノール産業において一般に好まれる生物であるが、それはバイオマス原材料のヘミセルロース構成要素に含有される五炭素糖を利用し得ない。ヘミセルロースは、バイオマスの２０〜３０％を構成し得て、キシロースおよびアラビノースが最も豊富なＣ５糖である。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）の異種性発現は、酵母細胞がキシロースを代謝して発酵できるようにするための一つの選択肢である。同様にＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株中における細菌遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤの発現は、アラビノースの利用と効率的なアルコール発酵をもたらす。ガラクトースはＣ６糖であり、それは頻繁に経済的理由のために無視できない量（全糖の約４％）でリグノセルロース中に存在することが多い糖でもある。
【０００３】
Ｊ．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）１５５，１３４０−１３５０は、グルコースがサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の好む炭素源であり、嫌気的条件下において、グルコース限定的発酵条件からガラクトース過剰条件への切り替えに際して、ガラクトースが消費されなかったことを開示する。
【０００４】
今までのところ、グルコースおよび１つ以上のＣ５糖を用いるのと同じ方法で、ガラクトースを発酵産物に転換する方法は開示されていない。したがって本発明の目的は、グルコースおよび１つ以上のＣ５糖を用いるのと同じ方法で、ガラクトースを発酵産物に転換する方法を提供することである。
【０００５】
[発明の概要]
本発明は、
ａ）サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する酵母の存在下で糖組成物を発酵させるステップと、
ｂ）発酵産物を回収するステップ
を含んでなる、糖組成物から１つ以上の発酵産物を生産する方法を提供し、酵母は遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤを含んでなり、糖組成物はグルコース、ガラクトース、およびアラビノースを含んでなる。
【０００６】
有利には糖グルコース、ガラクトース、およびアラビノースは、発酵産物に変換される。
【０００７】
好ましくは混合糖細胞は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）より好ましくはサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）属に属する。
【０００８】
本発明は、グルコース発酵株上における、これらの遺伝子の発現を通じて、アラビノース存在下でガラクトースを嫌気的に発酵する能力をもたらす、遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤの使用にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プラスミドｐＰＷＴ００６の物理的地図を示す。
【図２】プラスミドｐＰＷＴ０１８の物理的地図を示す。
【図３】サザンブロット法オートラジオグラムを示す。野生型株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（レーン１）およびＢＩＥ１０４Ａ２（レーン２）の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの双方で消化する。ブロットを特異的ＳＩＴ２プローブとハイブリダイズする。
【図４】野生型ＳＩＴ２遺伝子座の物理的地図（パネルａ）、およびプラスミドｐＰＷＴ０１８組み込みによるａｒａ遺伝子導入と、それに続く、ベクター損失と選択可能なマーカー配列をもたらす分子内遺伝子組み換え後の物理的地図（パネルｂ）を示す。プローブのハイブリダイゼーションが表示される。
【図５】配列が配列番号４に記載される、プラスミドｐＰＷＴ０８０の物理的地図を示す。
【図６−１】野生型ＧＲＥ３遺伝子座の物理的地図（パネルａ）、およびＧＲＥ３遺伝子座への１コピーのＰＷＴ０８０の組み込みの物理的地図を示す（パネルｂはプライマー結合部位を示し、パネルｃはＲＫＩ１プローブ結合部位を示す）。
【図６−２】野生型ＧＲＥ３遺伝子座の物理的地図（パネルａ）、およびＧＲＥ３遺伝子座への１コピーのＰＷＴ０８０の組み込みの物理的地図を示す（パネルｂはプライマー結合部位を示し、パネルｃはＲＫＩ１プローブ結合部位を示す）。
【図７】ＧＲＥ３遺伝子のコード領域がＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＫＩ１、およびＲＰＥ１の組み込みによって置換されたＧＲＥ３遺伝子座の物理的地図を示す。パネルａは配列番号５および６のプライマー結合部位を示し、パネルｂはＲＫＩ１プローブ結合部位を示す。
【図８】異なる培地上でのＢＩＥ１０４Ｐ１Ａ２の好気的条件下の成長曲線を示す。ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１株は、ＹＮＢ２％ガラクトース上で前培養された。成長曲線は２％ガラクトースおよび１％アラビノースで開始され、グラフで番号（１）で示される事象である２％アラビノースを唯一の炭素源とするＹＮＢへの移動がそれに続いた。ＯＤ６００が１を超えた後、培養物を０．２の開始ＯＤ６００で新鮮な培地に移した。純粋アラビノース培地上での３回の移動後、得られた株をＢＩＥ１０４Ｐ１Ａ２ｃと命名した。
【図９】嫌気的条件下における、２％アラビノースを唯一の炭素源とするＹＮＢ上でのＢＩＥ１０４Ｐ１Ａ２ｃの成長曲線を示す。ＯＤ６００が１を超えた後、培養物を０．２の開始ＯＤ６００で新鮮な培地に移した。数回の移動後、得られた株をＢＩＥ１０４Ｐ１Ａ２ｄ（＝ＢＩＥ２０１）と命名した。
【図１０】合成トウモロコシ繊維モデル培地上でのＢＩＥ１０４の糖転換および生成物形成を示す。ＣＯ２生成を絶えず測定した。成長は培養物の光学濃度を追跡してモニターした。前培養は２％グルコース上で成長させた。
【図１１】合成トウモロコシ繊維モデル培地上でのＢＩＥ１０４Ｐ１Ａ２ｃの糖転換および生成物形成を示す。ＣＯ２生成を絶えず測定した。成長は培養物の光学濃度を追跡してモニターした。前培養は２％グルコース上で成長させた。
【図１２】合成トウモロコシ繊維モデル培地上でのＢＩＥ２０１の糖転換および生成物形成を示す。ＣＯ２生成を絶えず測定した。成長は培養物の光学濃度を追跡してモニターした。前培養は２％グルコース上で成長させた。
【図１３】合成トウモロコシ繊維モデル培地上でのＢＩＥ１０４Ａ２の糖転換および生成物形成を示す。ＣＯ２生成を絶えず測定した。成長は培養物の光学濃度を追跡してモニターした。前培養は２％グルコース上で成長させた。
【図１４】合成トウモロコシ繊維モデル培地上でのＢＩＥ１０５Ａ２の糖転換および生成物形成を示す。ＣＯ２生成を絶えず測定した。成長は培養物の光学濃度を追跡してモニターした。前培養は２％グルコース上で成長させた。
【図１５】プラスミドｐＰＷＴ００７の物理的地図を示す。
【図１６】プラスミドｐＰＷＴ０４２の物理的地図を示す。
【図１７】野生型ＳＩＴ４遺伝子座の物理的地図を示す（パネルａ）、およびＳＩＴ４遺伝子座への１コピーのＰＷＴ０８０組み込み（パネルｂはプライマー結合部位を示す）。
【図１８−１】異なる培地上でのＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株の成長曲線グラフである。パネルａ：ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株をグルコース上で成長させて、グラフで番号（１）で示される事象である１％アラビノース＋１％キシロースへの移動、（２）２％キシロース＋０．２％アラビノースへの移動がそれに続いた。パネルｂ：ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株をガラクトース上で成長させて、（１）１％アラビノース＋１％キシロースへの移動、および（２）２％キシロース＋０．２％アラビノースへの移動がそれに続いた。
【図１８−２】異なる培地上でのＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株の成長曲線グラフである。パネルａ：ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株をグルコース上で成長させて、グラフで番号（１）で示される事象である１％アラビノース＋１％キシロースへの移動、（２）２％キシロース＋０．２％アラビノースへの移動がそれに続いた。パネルｂ：ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株をガラクトース上で成長させて、（１）１％アラビノース＋１％キシロースへの移動、および（２）２％キシロース＋０．２％アラビノースへの移動がそれに続いた。
【図１９】２％キシロースを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地上でのＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株の成長を示す。２つの独立したコロニーを試験した。ＯＤ６００が２に達した後、株を新鮮な培地に移して、即座にキシロース上での生育を再開した。
【図２０】プラスミドｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＡＢＤの物理的地図を示す。
【００１０】
［配列表の簡単な説明］
配列番号１は、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ８４９２からの野生型キシロースイソメラーゼ配列を示す。Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＹＨ０２００００３６。
配列番号２は、配列番号１に由来するコドン最適化された配列を示す。
配列番号３は、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ８４９２からのキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、プラスミドｐＰＷＴ０８０の配列を示す。
配列番号５は、順方向プライマーの配列を示す。
配列番号６は、逆方向プライマーの配列を示す。
配列番号７は、診断ＰＣＲのための順方向多官能性プライマーの配列を示す。
配列番号８は、診断ＰＣＲのための逆方向多官能性プライマーの配列を示す。
配列番号９は、順方向プライマーＲＫＩ１プローブの配列を示す。
配列番号１０は、逆方向プライマーＲＫＩ１プローブの配列を示す。
配列番号１１は、順方向プライマーｋａｎＭＸ−カセットの配列を示す。
配列番号１２は、逆方向プライマーｋａｎＭＸ−カセットの配列を示す。
配列番号１３は、順方向プライマーの配列を示す。
配列番号１４は、逆方向プライマーの配列を示す。
配列番号１５は、診断ＰＣＲのための順方向多官能性プライマーの配列を示す。
配列番号１６は、診断ＰＣＲのための逆方向多官能性プライマーの配列を示す。
配列番号１７は、プラスミドｐＰＷＴ０１８の配列を示す。
配列番号１８は、順方向プライマー組み込みｐＰＷＴ０１８の配列を示す。
配列番号１９は、逆方向プライマー組み込みｐＰＷＴ０１８の配列を示す。
配列番号２０は、順方向プライマーＳＩＴ２プローブの配列を示す。
配列番号２１は、逆方向プライマーＳＩＴ２プローブの配列を示す。
配列番号２２は、ａｒａＡＢＤ発現カセットを増幅する順方向プライマーの配列を示す。
配列番号２３は、ａｒａＡＢＤ発現カセットを増幅する逆方向プライマーの配列を示す。
【００１１】
[発明の詳細な説明］
本明細書および添付の特許請求の範囲全体を通じて、語句「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、および「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などのバリエーションは、包括的に解釈されるものとする。すなわちこれらの語句は、文脈が許せば、具体的に列挙されないその他の要素または整数の可能な包含を伝えることが意図される。
【００１２】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、１つまたは１つを超える（すなわち１つのまたは少なくとも１つの）冠詞の文法的目的語に言及するために使用される。一例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つを超える要素を意味してもよい。
【００１３】
本明細書に記載される本発明の様々な実施態様は、交差して組み合わせされてもよい。
【００１４】
［糖組成物］
本発明に従った糖組成物は、グルコース、アラビノース、およびガラクトースを含んでなる。本発明の方法では、有利には、糖グルコース、ガラクトース、およびアラビノースは、発酵産物に変換される。
【００１５】
本発明では、これらの基準を満たすあらゆる糖組成物を使用してもよい。好ましい実施態様では、糖組成物は１つ以上のリグノセルロース系材料の加水分解産物である。本明細書でリグノセルロースは、ヘミセルロースおよびバイオマスのヘミセルロース部分を含む。またリグノセルロースは、バイオマスのリグノセルロース性画分も含む。適切なリグノセルロース系材料は、以下の一覧にあってもよい：果樹園の剪定物、シャパラル、製材廃棄物、都市木材廃棄物、一般廃棄物、伐採廃棄物、森林間伐材、短期輪作木質作物、産業廃棄物、麦わら、オート麦わら、稲わら、大麦わら、ライ麦わら、亜麻のわら、大豆殻、もみ殻、稲わら、コーングルテン飼料、オート麦外皮、サトウキビ、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ茎、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、スイッチグラス、ススキ、サトウモロコシ、菜種茎、大豆茎、プレリーグラス、ガマグラス、エノコログサ；甜菜パルプ、柑橘類パルプ、種子殻、セルロース性家畜排泄物、刈り取った芝草、綿、海藻、樹木、針葉樹、広葉樹、ポプラ、松、灌木、草、小麦、麦わら、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ穀粒、穀物の湿式または乾式製粉からの製品または副産物、都市固形廃棄物、古紙、庭ごみ、草質材料、農業残渣、林業残渣、都市固体廃棄物、古紙、パルプ、製紙工場残渣、枝、茂み、籐類、トウモロコシ、トウモロコシ苞葉、エネルギー作物、森林、果物、花、穀物、草、草本作物、葉、樹皮、針葉、原木、根、苗木、灌木、スイッチグラス、木、野菜、果皮、つる植物、甜菜パルプ、ミドリング粉、オート麦外皮、硬材または軟材、農産加工から発生する有機廃棄物、林業木材廃棄物、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせ。
【００１６】
リグノセルロースに由来するいくつかの適切な糖組成物、およびそれらの加水分解産物の糖組成の概要を表１に示す。列挙したリグノセルロースには、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ繊維、もみ殻、メロンの皮、甜菜パルプ、麦わら、サトウキビバガス、木材、草、およびオリブ絞りかすが含まれる。
【００１７】
【表１】
0005832431.tif 000002
【００１８】
表１から、これらのリグノセルロース中では、かなりの量の糖（平均して３．８％）がガラクトースであることが明らかである。したがってガラクトースの発酵産物への転換は、経済上重大である。
【００１９】
［混合糖細胞］
混合糖細胞は、以下で定義されるように、遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤを含んでなる。これはグルコース、アラビノース、およびガラクトースを発酵できる。本発明の一実施態様では、混合糖細胞は、好ましくはＣ５および／またはＣ６糖である１つ以上の追加的糖を発酵できる。本発明の実施態様では、混合糖細胞は、以下の１つ以上を含んでなる：混合糖細胞がキシロースを発酵できるようにするｘｙｌＡ遺伝子および／またはＸＫＳ１遺伝子；アルドース還元酵素（ＧＲＥ３）遺伝子の欠失；細胞中のペントースリン酸経路を通じた流量を増大させるＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１の過剰発現。
【００２０】
本発明の一実施態様では、混合糖細胞は好ましくはＣ５および／またはＣ６糖である１つ以上の追加的糖を発酵できる。本発明の一実施態様では、混合糖細胞は以下の１つ以上を含んでなる：混合糖細胞にキシロースを発酵させるｘｙｌＡ遺伝子、ＸＹＬ１遺伝子、およびＸＹＬ２遺伝子および／またはＸＫＳ１遺伝子；アルドース還元酵素（ＧＲＥ３）遺伝子の欠失；細胞中のペントースリン酸経路を通じた流量を増大させるＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１、およびＲＫＩ１の過剰発現。
【００２１】
一実施態様では、混合糖細胞は工業用細胞であり、より好ましくは工業用酵母である。工業用細胞および工業用酵母細胞は、次のように定義されてもよい。工業工程における（酵母）細胞の生存環境が、実験室の環境とは顕著に異なる。工業用酵母細胞は、工程中に変動し得る複数の環境条件下で良好に機能できなくてはならない。このような変動としては、一緒になってサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞の成長とエタノール産生に潜在的影響を及ぼす栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度の変化などが挙げられる。有害工業条件の下で、環境耐性株は、頑強な成長および生産が可能であるべきである。工業酵母株は、一般に製パン工業、醸造業、ぶどう酒醸造、およびエタノール産業などのそれらが使用される用途において起こり得るこれらの環境条件の変化に対してより頑強である。一実施態様では、工業混合糖細胞は工業宿主細胞に基づいて構築され、構築は下述するように実施される。工業酵母（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）、Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）、およびＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
【００２２】
一実施態様では、混合糖細胞は阻害物質耐性である。阻害物質耐性は、阻害性化合物に対する抵抗性である。リグノセルロース中の阻害性化合物の存在およびレベルは、原材料、前処理方法、加水分解処理の変動にともなって、変化に富んでもよい。阻害物質カテゴリーの例は、カルボン酸、フランおよび／またはフェノール化合物である。カルボン酸の例は、乳酸、酢酸またはギ酸である。フランの例は、フルフラールおよびヒドロキシメチルフルフラールである。フェノール化合物の例は、バニリン、シリング酸、フェルラ酸、およびクマル酸である。阻害物質の典型的量は次のとおりである。カルボン酸では、原材料、前処理、および加水分解条件次第で、１リットル当たり数グラム、１リットル当たり２０グラム以上まで。フランでは、原材料、前処理、および加水分解条件次第で、１リットル当たり数百ミリグラム、１リットル当たり数グラムまで。フェノール類では、原材料、前処理、および加水分解条件次第で、１リットル当たり数十ミリグラム、１リットル当たり１グラムまで。
【００２３】
本発明に従った混合糖株は、阻害物質耐性であり、すなわちそれらは、混合糖株が幅広い用途に適用することができ、すなわちそれが異なる原材料、異なる前処理方法、および異なる加水分解条件に対して高い適用性を有するように、一般的な前処理および加水分解条件レベルで、それらが典型的に有する一般的な阻害物質に耐え得る。
【００２４】
一実施態様では、工業混合糖細胞は、阻害物質耐性宿主細胞に基づいて構築され、構築は下述するように実施される。阻害物質耐性宿主細胞は、阻害物質耐性Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ２６６０２株が選択された、Ｋａｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８で示されるような阻害物質含有材料上での成長について、株をスクリーニングすることで選択されてもよい。
【００２５】
一実施態様では、混合糖細胞はマーカーフリーである。本明細書での用法では、「マーカー」という用語は、マーカーを含有する宿主細胞を選択またはスクリーニングできるようにする形質または表現型をコードする遺伝子を指す。マーカーフリーとは、混合糖細胞内にマーカーが本質的に不在であることを意味する。マーカーフリーであることは、混合糖細胞の構築において抗生物質マーカーが使用され、その後除去される場合に特に有利である。マーカーの除去は、例えば分子内組み換えなどのあらゆる適切な先行技術を使用して実施されてもよい。マーカーを除去する適切な方法は、実施例で示される。
【００２６】
混合糖細胞は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、スクロース、乳糖、およびグリセロールを例えば発酵性糖に転換できてもよい。したがって混合糖細胞は、セルロースのグルコースモノマーへの、そしてヘミセルロースのキシロースおよびアラビノースモノマーへの転換に必要なセルラーゼ（エンドセルラーゼまたはエキソセルラーゼ）、ヘミセルラーゼ（エンドまたはエキソキシラナーゼまたはアラビナーゼ）；ペクチンをグルクロン酸およびガラクツロン酸に転換できるペクチナーゼ；またはデンプンをグルコースモノマーに転換するアミラーゼなどの１つ以上の酵素を発現してもよい。
【００２７】
混合糖細胞は、ピルビン酸から、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンなどの所望の発酵産物への転換に必要とされる酵素活性をさらに含んでなってもよい。
【００２８】
一実施態様では、混合糖細胞は、天然でアルコール発酵、好ましくは嫌気的アルコール発酵できる細胞である。混合糖細胞は、好ましくは高いエタノール耐性、高い低ｐＨ耐性（すなわち約５、約４、約３、または約２．５よりも低いｐＨで成長できる）、および有機物に対する高い耐性、および／または高い高温耐性を有する。
【００２９】
上記のいずれかの混合糖細胞の特徴または活性は、細胞内に天然に存在してもよく、または遺伝子改変によって導入または修飾されてもよい。
【００３０】
［混合糖株の構築］
遺伝子は、
ａ）強力なプロモーター制御下のＰＰＰ遺伝子、ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１、およびＲＫＩ１からなるクラスター；
ｂ）どちらも構成的プロモーター制御下のｘｙｌＡ遺伝子およびＸＫＳ１遺伝子からなるクラスター；
ｃ）遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤからなるクラスターおよび／またはｘｙｌＡ遺伝子および／またはＸＫＳ１遺伝子のクラスター；および
ｄ）アルドース還元酵素遺伝子の欠失
の宿主細胞への導入と、混合糖細胞を生じる適応進化によって、混合糖細胞に導入されてもよい。上記細胞は、組み換え発現技術を使用して構築されてもよい。
【００３１】
［組み換え発現］
本発明の細胞は、組み換え細胞である。すなわち本発明の細胞は、問題となっている細胞中では天然では生じないヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれによって形質転換され、またはそれによって遺伝子改変されている。
【００３２】
細胞中の酵素組み換え発現技術、ならびに本発明の細胞の追加的遺伝子改変は、当業者に良く知られている。典型的に、このような技術は、妥当な配列を含んでなる核酸コンストラクトによる細胞の形質転換を伴う。このような方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）などの標準的手引き書から知られている。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変方法は、例えば欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレット、国際公開第００／３７６７１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書、および米国特許第６，２６５，１８６号明細書から知られている。
【００３３】
典型的に、核酸コンストラクトは、プラスミド、例えば低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドであってもよい。本発明に従った細胞は、例えばヌクレオチドコンストラクトの複数コピーによって、または酵素配列の複数コピーを有するコンストラクトの使用によって、酵素をコードするヌクレオチド配列の単数または複数コピーを含んでなってもよい。
【００３４】
核酸コンストラクトはエピソームに保持されてもよく、したがって常染色体性複製配列などの自律複製配列を含んでなってもよい。適切なエピソームの核酸コンストラクトは、例えば酵母２μまたはｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５）に、またはＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）に基づいてもよい。代案としては、各核酸コンストラクトが１つ以上のコピーで、細胞ゲノムに組み込まれてもよい。細胞ゲノムへの組み込みは非相同的組換えによってランダムに生じてもよいが、好ましくは核酸コンストラクトは、当該技術分野で良く知られている相同的組換えによって細胞のゲノムに組み込まれてもよい（例えば国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開Ａ−０６３５５７４号明細書、および米国特許第６，２６５，１８６号明細書参照）。
【００３５】
ほとんどのエピソームのプラスミドまたは２μプラスミドは比較的不安定であり、各世代毎におよそ１０ー２個以上の細胞内で失われる。選択的成長条件下でさえも、細胞の６０％〜９５％のみがエピソームのプラスミドを保持する。ほとんどのエピソームのプラスミドのコピー数は、ｃｉｒ＋宿主の細胞当たり１０〜４０個の範囲である。しかしプラスミドは細胞間で均等に分布しておらず、集団中の細胞当たりのコピー数には大きな相違がある。組み込みプラスミドで形質転換された株は、選択的圧力の不在下でさえも極めて安定している。しかしプラスミドの損失は、縦列反復ＤＮＡ間の相同的組換えによっておよそ１０ー３〜１０ー４の頻度で起こり得て、ベクター配列のループアウトにつながる。したがって、好ましくは安定した組み込みの場合のベクターデザインは、（分子内相同的組換えによっても起きる）選択マーカー遺伝子の損失に際して、組み込みコンストラクトのループアウトはもはや可能でない。好ましくは遺伝子はこのようにして安定して組み込まれる。安定した組み込みは、本明細書では、組み込みコンストラクトのループアウトがもはや可能でない、ゲノムへの組み込みと定義される。好ましくは選択マーカーは不在である。典型的に酵素をコードする配列は、酵素配列の転写および／または翻訳を提供でき、またはそれを助けることができる、１つ以上の核酸配列と作動的に連結する。
【００３６】
「作動的に連結する」という用語は、記載される構成要素がそれらの意図される様式で機能できる関係にある並置を指す。例えばプロモーターまたはエンハンサーは、コード配列と作動的に連結し、上記プロモーターまたはエンハンサーはコード配列の転写に影響を及ぼす。
【００３７】
本明細書での用法では、「プロモーター」という用語は、１つ以上の遺伝子の転写を制御するよう機能する核酸断片を指し、それは遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、およびあらゆるその他の当業者に知られているＤＮＡ配列の存在によって、構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生的条件の下で活性のプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生的調節下で活性のプロモーターである。
【００３８】
本発明に従った酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するのに使用できるプロモーターは、発現される酵素をコードするヌクレオチド配列にもともと備わっていなくてもよく、すなわちそれが作動的に連結するヌクレオチド配列（コード配列）に異種性のプロモーターであってもよい。しかしプロモーターは、宿主細胞に相同的、すなわち内在性であってもよい。
【００３９】
プロモーターは広く入手でき、当業者に知られている。このようなプロモーターの適切な例としては、例えば酵母または糸状菌からのホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどの解糖作用遺伝子からのプロモーターが挙げられ、このような酵母からのプロモーターについてより詳しくは、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に見つかる。その他の別の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質コーディング遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨＩ、ＡＤＨ４など）、およびエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。構成および誘導性の双方のその他のプロモーター、およびエンハンサーまたは上流活性化配列については、当業者に知られている。本発明の宿主細胞で使用されるプロモーターは、所望ならば修飾して、それらの制御特性に影響を及ぼしてもよい。本明細書の文脈で適切なプロモーターとしては、構成および誘導性双方の天然プロモーターならびに当業者に良く知られている遺伝子操作されたプロモーターが挙げられる。真核生物の宿主細胞中の適切なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、またはＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮ０１、ＴＰＩ１、およびＡＯＸ１であってもよい。その他の適切なプロモーターとしては、ＰＤＣ１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、およびＴＤＨ３が挙げられる。
【００４０】
本発明の細胞中では、酵素をコードするヌクレオチド酸配列の３’末端は、好ましくは転写ターミネーター配列と作動的に連結する。好ましくはターミネーター配列は、例えば選択された酵母種などの選択された宿主細胞中で作動可能である。いずれの場合もターミネーターの選択は重要でなく、それは例えばあらゆる酵母遺伝子からのものであってもよいが、非酵母、真核生物遺伝子からのものであれば、ターミネーターが時に機能することもある。通常酵素をコードするヌクレオチド配列は、ターミネーターを含んでなる。好ましくは、このようなターミネーターは、本発明の宿主細胞中のナンセンス仲介ｍＲＮＡ崩壊を妨げる変異と組み合わせられる（例えばＳｈｉｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１４６５−１４８２を参照されたい）。
【００４１】
転写終結配列は、好ましくはさらにポリアデニル化シグナルを含んでなる。
【００４２】
任意選択的に、選択可能なマーカーは、本発明で使用するのに適した核酸コンストラクト中に存在してもよい。本明細書での用法では、「マーカー」という用語は、マーカーを含有する宿主細胞を選択またはスクリーニングできるようにする、形質または表現型をコードする遺伝子を指す。マーカー遺伝子は、それによって適切な抗生物質を使用して、形質転換されていない細胞から形質転換された細胞を選択し得る、抗生物質耐性遺伝子であってもよい。適切な抗生物質耐性マーカーの例としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン−Ｂ−リン酸転移酵素、３’−Ｏ−リン酸転移酵素Ｉｌ（カナマイシン、ネオマイシン、およびＧ４１８耐性）が挙げられる。抗生物質耐性マーカーは、倍数体宿主細胞の形質転換のために最も都合よいかもしれず、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰＩ、ＬＥＵ２）またはＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子などの非抗生物質耐性マーカーもまた使用してもよい（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｐ  Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ  ４０：１２５−１３０によって記載される）。好ましい実施態様では、核酸コンストラクトによって形質転換される宿主細胞は、マーカー遺伝子フリーである。組み換えマーカー遺伝子フリー微生物宿主細胞を構築する方法は、欧州特許出願公開Ａ−０６３５５７４号明細書で開示され、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子または酵母ＵＲＡ３、およびＬＹＳ２遺伝子などの二方向性マーカーの使用に基づく。代案としては、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＬ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼなどのスクリーニング可能マーカーを本発明の核酸コンストラクトに組み込んで、形質転換された細胞をスクリーニングできるようにしてもよい。
【００４３】
本発明で使用するのに適した中核酸コンストラクトに存在してもよい任意のさらなる要素としては、１つ以上のリーダー配列、エンハンサー、組み込み因子、および／またはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロマーおよび／またはマトリックス付着（ＭＡＲ）配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の核酸コンストラクトは、ＡＲＳ配列などの自律複製のための配列をさらに含んでなってもよい。
【００４４】
したがって遺伝子組み換え過程は、既知の遺伝子組み換え技術を使用して実施されてもよい。本発明の細胞中での酵素発現および過剰発現のための様々な手段が、当業者に知られている。特に、例えば遺伝子の追加的コピーを宿主細胞のゲノム中に組み込むことによって、エピソームのマルチコピー発現ベクターからの遺伝子を発現することによって、または遺伝子の複数コピーを含んでなるエピソームの発現ベクターを導入することによって、宿主細胞中で酵素をコードする遺伝子のコピー数を増大させ酵素を過剰発現させてもよい。
【００４５】
代案としては、本発明の宿主細胞中の酵素の過剰発現は、過剰発現させる酵素をコードする配列に天然でないプロモーター、すなわちそれが作動的に連結するコード配列に異種性のプロモーターを使用することによって達成してもよい。プロモーターは、好ましくはそれが作動的に連結するコード配列に異種性であるが、プロモーターが相同的である、すなわち宿主細胞に内在性であることもまた好ましい。好ましくは異種性プロモーターは、コード配列に天然のプロモーターよりも、コード配列を含んでなる転写物のより高い定常状態レベルを生じることができる（または単位時間当たりより多くの転写物分子、すなわちｍＲＮＡ分子を生成できる）。この文脈で適切なプロモーターとしては、構成および誘導性双方の天然プロモーターならびに改変プロモーターが挙げられる。
【００４６】
一実施態様では、混合糖細胞はマーカーフリーであり、それは栄養要求性または優勢マーカー、特に抗生物質耐性マーカーが、ゲノム中または染色体外に存在しないことを意味する。
【００４７】
上述の酵素の過剰発現で使用されるコード配列は、好ましくは本発明の宿主細胞と相同的であってもよい。しかし本発明の宿主細胞と異種性のコード配列を使用してもよい。
【００４８】
酵素の過剰発現は、遺伝子改変細胞中での酵素生成について言及する場合、同一条件下の未改変宿主細胞と比較して、特定の酵素活性がより高レベルで酵素が生成されることを意味する。通常これは、酵素的に活性なタンパク質（またはマルチサブユニット酵素の場合は複数のタンパク質）が、同一条件下の未改変宿主細胞と比較してより多量に、またはかなりより高い定常状態レベルで生成されることを意味する。同様にこれは通常、酵素的に活性なタンパク質をコードするｍＲＮＡが、同一条件下の未改変宿主細胞と比較してより多量に、またはかなりより高い定常状態レベルで生成されることを意味する。好ましくは本発明の宿主細胞中では、過剰発現される酵素は、過剰発現を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一の株と比較して、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍過剰発現される。これらの過剰発現レベルは、酵素活性の定常状態レベルに、酵素タンパク質の定常状態レベルに、ならびに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに当てはめられてもよいものと理解されるものとする。
【００４９】
［適応］
適応は、それによって集団がその生息環境または複数の生息環境により良く適する（順応する）進化の過程である。この過程は、数世代から多世代にわたって起き、基本的な生物学的現象の１つである。
【００５０】
適応という用語は、生物の生存に特に重要な特徴もまた指してもよい。このような適応は、より良く適した形態がより成功裏に繁殖することによって、自然淘汰によって可変集団中で生じる。
【００５１】
環境条件の変化は、自然淘汰の結果を変化させ、新しい条件下における生物の適応度を改善する引き続く適応の選択的利点に影響を及ぼす。極端な環境変化の場合、有益な適応の出現と固定化が生存のために必須であり得る。例えば養分利用性、温度、酸素利用性などの多数の異なる要因が、適応進化を駆動し得る。
【００５２】
［適合］
適応（生物が特定の生息環境内で生きて繁殖できる程度）と適合の間には、明らかな関係がある。適合は、自然淘汰率の推定および予測である。自然淘汰の適用によって、代替の表現型の相対頻度は、それらが遺伝性であるならば経時的に変動する。
【００５３】
［遺伝的変化］
自然淘汰が集団の遺伝的変動に作用する場合、遺伝的変化が根底にある機序である。これは集団が、その状況に遺伝的に適応することを意味する。遺伝的変化は、生息環境の変化に適するように、可視的構造をもたらしてもよく、または生物の生理学的活性を調節してもよい。
【００５４】
［適応進化］
混合糖細胞は、それらの調製中に適応進化を被る。本発明の細胞は、好ましくは唯一の炭素源としての所望の糖の上での、より好ましくは嫌気的条件下における成長について、自然発生または誘発的（例えば放射線または化学薬品による）いずれかの変異体を選択することで、糖利用のために適応させてもよい。変異体の選択は、例えばＫｕｙｐｅｒら（２００４，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６５５−６６４）によって記述される継代培養をはじめとする技術によって、またはケモスタット培養中の選択的圧力下における培養によって実施されてもよい。例えば本発明の好ましい宿主細胞中で、変異体の選択によって得られる改変をはじめとする上述の遺伝子改変の少なくとも１つは、炭素源として、好ましくは唯一の炭素源としてキシロース上で、好ましくは嫌気的条件下で、生育する能力を宿主細胞にもたらす。好ましくは細胞は本質的にキシリトールを生成せず、例えば生成するキシリトールが検出限界未満であり、または例えばモル基準で消費される炭素の約５、約２、約１、約０．５、または約０．３％未満である。
【００５５】
適応進化についてはまた、例えばＨ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｇ．２００７，ｐ．４８８１−４８９１でも記載される。
【００５６】
適応進化の一実施態様では、異なる培地、例えば組成の異なる３種類の培地中（グルコース、キシロース、およびアラビノース；キシロースおよびアラビノース）における、連続成長を用いた反復バッチ培養からなる投与計画が適用されるＷｉｓｓｅｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．２００９，ｐ．９０７−９１４参照。
【００５７】
［酵母形質転換および遺伝的安定性］
組み換えＤＮＡを用いた酵母細胞の遺伝子操作、すなわち形質転換は、１９７８年に初めて実行可能になった［Ｂｅｇｇｓ，１９７８；Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８］。酵母中の組み換えＤＮＡ技術は、それ以来地位を確立した。多数の異なるベクターコンストラクトが利用可能である。一般にシャトルベクターと称されるこれらのプラスミドベクターは、酵母細胞への形質転換に先だって、それらが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増殖できるようにする、複製起点と選択可能なマーカー（βラクタマーゼ遺伝子、ａｍｐＲであることが多い）からなる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターに由来する遺伝物質を含有する。さらにシャトルベクターは酵母中における選択のための選択可能なマーカーを含有する。マーカーは、対応するゲノムの欠失（または突然変異）を保有する細胞が、栄養要求性または独立栄養性について補足されるような、特定のアミノ酸またはヌクレオチド合成のための酵素をコードする遺伝子であり得る。代案としては、これらのベクターは、ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、ハイグロマイシンＢまたはフレオマイシンのような特定の抗生物質に対する耐性を組み換え酵母細胞（すなわちＤＮＡを取り込んでマーカー遺伝子を発現する細胞）に提供する、異種性顕性耐性マーカーを含有する。さらにこれらのベクターは、外来性ＤＮＡをこれらの部位にクローンできるようにする（組み合わされた）制限部位（多重クローニング部位またはＭＣＳ）配列を含有してもよいが、代案の方法もまた存在する。
【００５８】
伝統的に、追加的遺伝的要素の不在または存在によって、４種のシャトルベクターを区別し得る。
●組み込みプラスミド（ＹＩｐ）。限定酵素によって開裂され、酵母細胞の形質転換のために直線化ＤＮＡが使用される場合は、これはマーカーまたは別の遺伝子の遺伝子座において、相同的組換えにより宿主ゲノムに組み込まれる。これは一般に、ゲノム中のこの特定部位に挿入された外来性ＤＮＡの１コピーの存在をもたらす。
●エピソームプラスミド（ＹＥｐ）。これは酵母細胞中の自律複製に必要な２μプラスミドＤＮＡ配列の部分を保有する。複数コピーの形質転換プラスミドが酵母細胞中で増殖され、エピソームとして維持される。
●自己複製プラスミド（ＹＲｐ）。これは形質転換プラスミドを数百倍に増殖できるようにする、酵母複製起点（ＡＲＳ、自律的複製配列）を保有する。
●ＣＥＮプラスミド（ＹＣｐ）。これはＡＲＳ配列に加えて、常態では安定した有糸分裂分離を保証し、通常は自己複製プラスミドのコピー数を１つだけに減少させるセントロメア配列（核染色体の１つに由来する）を保有する。
【００５９】
これらのプラスミドは、形質転換によって酵母細胞に導入される。酵母細胞の形質転換は、酢酸リチウムによる細胞透過性上昇（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９８３）、および電気穿孔方法などのいくつかの異なる技術によって達成されてもよい。
【００６０】
組み換え微生物の商業的用途では、プラスミドの不安定性が最重要課題である。不安定性は、形質転換された細胞が、プラスミドの変化または損失のためにそれらの改変された特性を失う傾向である。この問題は、Ｚｈａｎｇら（Ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．４，ｐｐ．４０１−４３５，１９９６）で、詳細に考察されている。組み込みプラスミドで形質転換された株は、選択圧力の不在下であってさえも極めて安定している（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ｈｔｔｐ：／／ｄｂｂ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ｌａｂｓ／ｓｈｅｒｍａｎ＿ｆ／ｙｅａｓｔ／９．ｈｔｍｌおよびその中の参考文献）。
【００６１】
異種性ＤＮＡは、通常、染色体外プラスミドの形態（ＹＥｐ、ＹＣｐ、およびＹＲｐ）で生物に導入される。残念ながら、特に淘汰圧が連続的にかからない場合は、細菌および酵母のどちらでも新しい特徴が保持されないこともあり得ることが分かった。これは組み換え細胞が長期にわたって成長した際のハイブリッドプラスミドの分離不安定性のためである。これは、集団不均一性、クローン変動性、最終的にはその中で大部分の細胞が形質転換により導入された特性を失う細胞集団をもたらす。栄養要求性マーカーを持つベクターが使用される場合、ベクターは最少培地中でのみ維持されるので、富栄養培地中の培養はベクターの迅速な損失をもたらすことが多い。代案である顕性抗生物質耐性マーカーの使用は、製造工程に適合しないことが多い。抗生物質の使用はまた、登録の観点（微量の抗生物質が最終製品中に入る可能性）から、または経済的理由（工業規模での抗生物質の使用コスト）のために、所望されないこともあり得る。
【００６２】
ベクターの損失は、大量生産状況において問題をもたらす。組み込みプラスミド（ＹＩｐ）の使用などのＤＮＡを導入する代案の方法が、酵母に対して存在する。ＤＮＡは遺伝子組み換えによって宿主ゲノムに組み込まれ、高い安定性がもたらされる（Ｃａｕｎｔ，Ｐ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１９８８）１７３−１９２）。我々は、宿主トランスポゾンを使用した組み込み法が、良い代案であることを発見した。
【００６３】
［トランスポゾン］
本発明の実施態様では、細胞は、所望の遺伝子の１つを超えるコピーを含んでなってもよい。例えば２つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子またはキシロース還元酵素遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼが、混合糖細胞ゲノムに組み込まれてもよい。これは遺伝子の導入をもたらすことが当該技術分野で知られているあらゆる方法によって、実施されてもよい。好ましい実施態様では、これは宿主細胞の反復配列（トランスポゾン）と相同的な部分がある、ベクターを使用して達成されてもよい。宿主細胞が酵母細胞である場合、適切な反復配列はδ配列として知られているＴｙ因子の長い末端反復（ＬＴＲ）である。
【００６４】
Ｔｙ因子は、Ｔｙ１およびＴｙ２と称される、２つのかなり類似した亜科に分類される。これらの因子は、長さが約６キロベース（ｋｂ）であり、約３３５塩基対の配列である長い末端反復（ＬＴＲ）と境を接する（Ｂｏｅｋｅ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｔｙ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒ．１９８８，ｐ．１４３２−１４４２  Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４）。完全に配列決定されたＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８ｃ株中で最も豊富なトランスポゾンは、Ｔｙ１（３１コピー）およびＴｙ２（１３コピー）である（Ｇａｂｒｉｅｌ  Ａ，Ｄａｐｐｒｉｃｈ  Ｊ，Ｋｕｎｋｅｌ  Ｍ，Ｇｒｅｓｈａｍ  Ｄ，Ｐｒａｔｔ  ＳＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｇｌｏｂａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｌｏｃａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ２（１２）：ｅ２１２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．００２０２１２）。これらのトランスポゾンは、そのそれぞれがいくつかのタンパク質をコードする、２つの重複する読み取り枠（ＯＲＦ）から構成される。コード領域は、前述のほぼ同一のＬＴＲで挟まれる。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の別のものであるが、より少なくより特徴的であるＴｙ因子は、Ｔｙ３、Ｔｙ４、およびＴｙ５からなる。全長Ｔｙ因子の各ファミリーで、一桁多い単独ＬＴＲ因子がゲノム全体に分散する。これらは、内部タンパク質コード領域のループアウトと共に、全長因子のＬＴＲ−ＬＴＲ組み換えによって生じると考えられる。
【００６５】
Ｔｙレトロトランスポゾンのレトロ転位機序は、ゲノム全体に複数コピーを組み込むのに利用されている（Ｂｏｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。δ配列として知られているＴｙ因子の長い末端反復（ＬＴＲ）はまた、Ｔｙ結合または単独部位のどちらかである約１５０〜２００コピーで存在するので、相同的組換えによる組み込みの良好な標的でもある。（Ｂｏｅｋｅ，１９８９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍａｎ，１９８８）（Ｐａｒｅｋｈ  Ｒ．Ｎ．（１９９６）．Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｔｕｎａｂｌｅ，  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｐｙ，Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  Ｔｙ  ＤＥＬＴＡ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９９６，１２，１６−２１）。
【００６６】
［宿主細胞］
宿主細胞は、有用な生成物の生産に適したあらゆる宿主細胞であってもよい。本発明の細胞は、細菌などの原核細胞、または真核細胞などのあらゆる適切な細胞であってもよい。典型的に細胞は、例えば酵母または糸状菌などの真核細胞である。
【００６７】
酵母は、本明細書で真核微生物と定義され、大部分は単細胞形態で成長する真菌植物亜門（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の全ての種を含む。
【００６８】
酵母は単細胞性葉状体の出芽によって成長してもよく、または生物体の分裂によって成長してもよい。本発明の細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属してもよい。好ましくは酵母は、嫌気的または酸素限定発酵ができるものであり、より好ましくは嫌気的アルコール発酵ができるものである。
【００６９】
糸状菌は、本明細書で、真菌植物亜門の全ての糸状体を含む真核微生物と定義される。これらの真菌は、キチン、セルロース、および複合多糖からなる栄養菌糸体によって特徴付けられる。本発明の細胞として使用するのに適した糸状菌は、形態的、生理的、および遺伝的に酵母と異なる。ほとんどの真菌は増殖のために無菌条件を必要とせず、バクテリオファージ感染に感受性がないので、有利には糸状菌細胞を使用してもよい。糸状菌による栄養成長は菌糸伸長と炭素異化作用により、ほとんどの糸状菌で偏性好気性である。本発明の宿主細胞として好ましい糸状菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属してもよい。より好ましくは、糸状菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、またはリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞であってもよい。
【００７０】
一実施態様では宿主細胞は、酵母であってもよい。
【００７１】
好ましくは宿主は、工業宿主、より好ましくは工業酵母である。工業宿主および工業酵母細胞は、以下のように定義されてもよい。工業工程中の酵母細胞の生息環境は、実験室のそれと顕著に異なる。工業用酵母細胞は、工程中に変動し得る複数の環境条件下で良好に機能できなくてはならない。このような変動としては、一緒になってサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞の成長とエタノール産生に潜在的影響を及ぼす栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度の変化などが挙げられる。有害工業条件の下で、環境耐性株は、頑強な成長および生産が可能であるべきである。工業酵母株は、一般に、製パン工業、醸造業、ぶどう酒醸造、およびエタノール産業などのそれらが使用される用途において起こり得るこれらの環境条件の変化に対してより頑強である。工業酵母（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）、Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）、およびＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
【００７２】
一実施態様では宿主は、阻害物質耐性である。阻害物質耐性宿主細胞は、阻害物質耐性Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ２６６０２株が選択された、Ｋａｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８で示されるような阻害物質含有材料上での成長について、株をスクリーニングすることで選択されてもよい。
【００７３】
好ましくは、宿主細胞は工業用および阻害物質耐性である。
【００７４】
［ＡｒａＡ、ＡｒａＢ、およびＡｒａＤ遺伝子］
本発明の細胞は、アラビノースを使用できる。したがって本発明の細胞は、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース−５−リン酸、および／または例えば本明細書で言及されるものなどの所望の発酵産物に転換できる。
【００７５】
Ｌ−アラビノースからエタノールを生成できる生物、例えばＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、好適な起源からのａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ）、ａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）、およびａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ）遺伝子を導入して細胞を改変することにより、生成されてもよい。このような遺伝子は、本発明の細胞がアラビノースを使用できるように導入されてもよい。このようなアプローチについては、国際公開第２００３／０９５６２７号パンフレットに記載される。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ遺伝子を使用してもよく、国際公開第２００８／０４１８４０号パンフレットで開示される。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｒａＡ遺伝子、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子を使用してもよく、欧州特許第１４９９７０８号明細書で開示される。別の実施態様では、ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ遺伝子は、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）および／またはグラメラ（Ｇｒａｍｅｌｌａ）属の少なくとも１つ、特に国際公開第２００９０１１５９１号パンフレットで開示されるようなクラビバクター・ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、アルスロバクター・アウレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、および／またはグラメラ・フォルセティ（Ｇｒａｍｅｌｌａ  ｆｏｒｓｅｔｉｉ）の１つに由来してもよい。
【００７６】
［ＰＰＰ遺伝子］
本発明の細胞は、ペントースリン酸経路の流量を増大させる１つ以上の遺伝子改変を含んでなってもよい。特に遺伝子改変は、非酸化的部分ペントースリン酸経路を通じて、流量の増大をもたらしてもよい。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量の増大を引き起こす遺伝子改変は、本明細書では、流量の増大を引き起こす遺伝子改変以外は、遺伝的に同一の株中の流量と比較して、流量を少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍増大させる改変を意味するものと理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量は、いくらかでもキシリトールが生成される場合は、唯一の炭素源としてのキシロース上で改変宿主を成長させてキシロース特異的消費速度を判定し、キシロース特異的消費速度からキシリトール特異的生成速度を差し引くことによって測定されてもよい。しかしペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量は、唯一の炭素源としてのキシロース上での成長速度、好ましくは唯一の炭素源としてのキシロース上での嫌気的成長速度と比例する。唯一の炭素源としてのキシロース上での成長速度（μｍａｘ）とペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量の間には直線関係がある。（嫌気性、増殖培地、ｐＨ、株の遺伝的背景などの所定の条件の組の下では）糖の上でのバイオマス収率は一定であるので、キシロースの比消費速度（Ｑｓ）は、糖の上でのバイオマス収率（Ｙｘｓ）で除した成長速度（μ）に等しい（すなわちＱｓ＝μ／Ｙｘｓ）。したがってペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量の増大は、輸送（取り込）みが制限されない限り、これらの条件下の最大成長速度の増大から推定されてもよい。
【００７７】
ペントースリン酸経路流量を増大させる１つ以上の遺伝子改変は、様々なやり方で宿主細胞に導入されてもよい。これらとしては、例えばキシルロースキナーゼの、および／または非酸化的部分ペントースリン酸経路酵素の１つ以上の、より高い定常状態活性レベルを達成すること、および／または非特異的アルドース還元酵素の低下した定常状態活性レベルを達成することが挙げられる。定常状態活性レベルにおけるこれらの変化は、（自然発生または化学薬品または放射線により誘発される）変異体の選択によって、および／または組み換えＤＮＡ技術によって、例えばそれぞれ遺伝子をコードする酵素またはこれらの遺伝子を制御する因子の過剰発現または不活性化によって、達成されてもよい。
【００７８】
好ましい宿主細胞では、遺伝子改変は、（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含んでなる。好ましくは酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択される。（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の酵素の様々な組み合わせが過剰発現されてもよい。例えば過剰発現される酵素は、少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスケトラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスケトラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５ホスフェートエピメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスケトラーゼであってもよい。本発明の一実施態様では、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼ酵素のそれぞれが、宿主細胞中で過剰発現される。より好ましいのは、その中の遺伝子改変が、少なくともトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素双方の過剰発現を含んでなる宿主細胞であり、それはこのような宿主細胞が既にキシロース上で嫌気的成長できるためである。実際には、条件によっては、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼのみを過剰に発現する宿主細胞は、４つの酵素全て、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼを過剰に発現する宿主細胞と同一の嫌気的成長速度をキシロース上で既に有する。さらに酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼの双方を過剰に発現する宿主細胞が、イソメラーゼのみまたはエピメラーゼのみを過剰に発現する宿主細胞よりも好ましいが、それはこれらの酵素の１つのみの過剰発現が代謝不均衡を生じ得るためである。
【００７９】
本明細書で酵素「リブロース−５−リン酸エピメラーゼ」（ＥＣ５．１．３．１）は、Ｄ−キシルロース−５−リン酸のＤ−リブロース−５−リン酸へのエピマー化を触媒する酵素と定義され、逆の場合も同じである。酵素は、ホスホリブロースエピメラーゼ；エリスロース−４−ホスフェートイソメラーゼ；ホスホケトペントース３−エピメラーゼ；キシルロースホスフェート３−エピメラーゼ；ホスホケトペントースエピメラーゼ；リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロースホスフェート−３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロース−５−リン酸エピメラーゼ；Ｄ−リブロース−５−Ｐ３−エピメラーゼ；Ｄ−キシルロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；ペントースー５−ホスフェート３−エピメラーゼ；またはＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼとしてもまた知られている。リブロース−５−リン酸エピメラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義されてもよい。同様にリブロース−５−リン酸エピメラーゼは、酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにリブロース−５−リン酸エピメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリッドするヌクレオチド配列によって、定義されてもよい。リブロース−５−リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書でＲＰＥ１と命名される。
【００８０】
本明細書で酵素「リブロース−５−リン酸イソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．６）は、Ｄ−リボース５−ホスフェートのＤ−リブロース５−ホスフェートへの直接異性化を触媒する酵素と定義され、逆の場合も同じである。酵素は、ホスホペントースイソメラーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リボースホスフェートイソメラーゼ；５−ホスホリボースイソメラーゼ；Ｄ−リボース５−ホスフェートイソメラーゼ；Ｄ−リボース−５−ホスフェートケトール−イソメラーゼ；またはＤ−リボース−５−ホスフェートアルドース−ケトース−イソメラーゼとしてもまた知られている。リブロース−５−リン酸イソメラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義されてもよい。同様にリブロース−５−リン酸イソメラーゼは、酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびリブロース−５−リン酸イソメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリッドするヌクレオチド配列によって定義されてもよい。リブロース−５−リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書でＲＫＩ１と命名される。
【００８１】
本明細書において酵素「トランスケトラーゼ」（ＥＣ２．２．１．１）は、Ｄ−リボース５−ホスフェート＋Ｄ−キシルロース−５−リン酸←→セドヘプツロース７−ホスフェート＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートの反応を触媒する酵素と定義され、逆の場合も同じである。この酵素は、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼまたはセドヘプツロース−７−ホスフェート：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとしてもまた知られている。トランスケトラーゼは、そのアミノ酸によってさらに定義されてもよい。同様にトランスケトラーゼは、酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにトランスケトラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリッドするヌクレオチド配列によって定義されてもよい。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書でＴＫＬ１と命名される。
【００８２】
本明細書で酵素「トランスアルドラーゼ」（ＥＣ２．２．１．２）は、セドヘプツロース７−ホスフェート＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスフェート←→Ｄ−エリスロース４−ホスフェート＋Ｄ−果糖６−ホスフェートの反応を触媒する酵素と定義され、逆の場合も同じである。酵素は、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ；ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ；またはセドヘプツロース−７−ホスフェート：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートグリセロントランスフェラーゼとしてもまた知られている。トランスアルドラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義されてもよい。同様にトランスアルドラーゼは、酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにトランスアルドラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリッドするヌクレオチド配列によって、定義されてもよい。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書でＴＡＬ１と命名される。
【００８３】
［キシロースイソメラーゼまたはキシロース還元酵素およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子］
本発明に従って、１つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子および／または１つ以上のキシロース還元酵素およびキシリトールデヒドロゲナーゼのコピーの１つ、２つまたはそれ以上のコピーが、宿主細胞のゲノムに導入される。これらの２つ以上の遺伝要素の存在は、細胞に異性化または還元によってキシロースを転換する能力を与える。
【００８４】
一実施態様では１つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子の１つ、２つまたはそれ以上のコピーが宿主細胞のゲノムに導入される。
【００８５】
本明細書で「キシロースイソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．５）は、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの直接異性化を触媒する酵素と定義され、逆もまた同様である。酵素は、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼとしてもまた知られている。本明細書でキシロースイソメラーゼはまた、Ｄ−グルコースとＤ−果糖の間の転換を触媒できてもよい（したがって適宜にグルコースイソメラーゼと称されてもよい）。本明細書でキシロースイソメラーゼは、補助因子としてマグネシウム、マンガンまたはコバルトなどの二価のカチオンを必要としてもよい。
【００８６】
したがってこのような混合糖細胞は、キシロースをキシルロースに異性化できる。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、定義されたキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸コンストラクトで宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞に与えられる。混合糖細胞は、キシロースのキシルロースへの直接異性化によって、キシロースをキシルロースに異性化する。
【００８７】
本明細書で、キシロースイソメラーゼ活性単位（Ｕ）は、Ｋｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６９−７８）によって記述される条件下で、１分当たり１ｎｍｏｌのキシルロースを生成する酵素量と定義されてもよい。キシロース異性化遺伝子は、例えば国際公開第２００６／００９４３４号パンフレットで開示されるようなピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）種などの様々な起源を有してもよい。その他の適切な起源は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、特にＰＣＴ欧州特許第２００９／５２６２３号明細書に記載されるようなバクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特にＰＣＴ欧州特許第２００９／０５２６２５号明細書に記載されるようなバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。
【００８８】
別の実施態様では、１つ以上のキシロース還元酵素およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の２つ以上のコピーが宿主細胞ゲノムに導入される。この実施態様では、キシロースの転換は、それぞれキシロース還元酵素およびキシリトールデヒドロゲナーゼによって触媒される、キシロースからキシリトール中間体を経由するキシルロースへの転換の二段階で実施される。一実施態様では、国際公開第２００４０８５６２７号パンフレットで開示されるように、キシロース還元酵素（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）が過剰発現されてもよく、任意にＮＡＤＰＨ生成酵素をコードする遺伝子の１つ以上が上方制御されて、ＮＡＤＨ消費酵素をコードする遺伝子の１つ以上が上方制御される。
【００８９】
［ＸＫＳ１遺伝子］
本発明の細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増大させる、１つ以上の遺伝子改変を含んでなってもよい。好ましくは１つまたは複数の遺伝子改変は、例えばキシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によってキシルロースキナーゼの過剰発現を引き起こす。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は宿主細胞に内在性であってもよく、または宿主細胞に異種性のキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の宿主細胞中におけるキシルロースキナーゼ過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性があるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００９０】
本明細書で酵素「キシルロースキナーゼ」（ＥＣ２．７．１．１７）は、ＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース−５−リン酸の反応を触媒する酵素と定義される。酵素はホスホリル化キシルロキナーゼ、Ｄ−キシルロキナーゼまたはＡＴＰ：Ｄ−キシルロース５−リン酸転移酵素としてもまた知られている。本発明のキシルロースキナーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義されてもよい。同様にキシルロースキナーゼは、酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにキシルロースキナーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリッドするヌクレオチド配列によって定義されてもよい。
【００９１】
本発明の細胞中では、特異的キシルロースキナーゼ活性を増大させる１つまたは複数の遺伝子改変は、上述のようなペントースリン酸経路の流量を増大させる修飾のいずれかと組み合わされてもよい。しかしこれは必須でない。
【００９２】
したがって本発明の宿主細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝子改変修飾のみを含んでなってもよい。本発明宿主細胞中でのキシルロースキナーゼの過剰発現を達成し分析するための当該技術分野で利用できる様々な手段は、ペントースリン酸経路酵素について上述したのと同じである。好ましくは本発明の宿主細胞中では、過剰発現されるキシルロースキナーゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一の株と比較して、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍過剰発現される。これらの過剰発現レベルは、酵素活性の定常状態レベルに、酵素タンパク質の定常状態レベルに、ならびに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに当てはまってもよいと理解されるものとする。
【００９３】
［アルドース還元酵素（ＧＲＥ３）遺伝子欠失］
ＸＩがキシロースを転換する遺伝子として使用される実施態様では、アルドース還元酵素活性を低下させることが都合良いこともあり得る。したがって本発明の細胞は、宿主細胞の非特異的アルドース還元酵素活性を低下させる、１つ以上の遺伝子改変を含んでなってもよい。好ましくは、非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の発現を低下させまたは不活性化する１つ以上の遺伝子改変によって、宿主細胞中で非特異的アルドース還元酵素活性が低下する。好ましくは遺伝子改変は、宿主細胞中で非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の各内在性コピーの発現を低下させまたは不活性化する（本明細書中でＧＲＥ３欠失と称する）。宿主細胞は二倍性、倍数性または異数性の結果として、非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の複数コピーを含んでなってもよく、および／または宿主細胞はアミノ酸配列が異なり、それぞれ異なる遺伝子によってコードされるアルドース還元酵素活性があるいくつかの異なる酵素（アイソザイム）を含有してもよい。またこのような場合、好ましくは、非特異的アルドース還元酵素をコードする各遺伝子の発現が低下し、または不活性化される。好ましくは、遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、または遺伝子中断によって不活性化され、この文脈では、遺伝子という用語は、その（部分的）欠失または不活性化が宿主細胞中における非特異的アルドース還元酵素活性の発現低下をもたらすコード配列の上流または下流にある、いかなる非コード配列もまた含む。
【００９４】
本発明の宿主細胞中でその活性が低下されるアルドース還元酵素をコードするヌクレオチド配列は、アルドース還元酵素活性があるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００９５】
したがって宿主細胞中で非特異的アルドース還元酵素活性を低下させる遺伝子改変のみを含んでなる本発明の宿主細胞は、明確に本発明に含まれる。
【００９６】
酵素「アルドース還元酵素」（ＥＣ１．１．１．２１）は、本明細書でキシロースまたはキシルロースをキシリトールに還元できるあらゆる酵素と定義される。本発明の文脈でアルドース還元酵素は、本発明の宿主細胞に天然（内在性）であり、キシロースまたはキシルロースをキシリトールに還元できるあらゆる非特異的アルドース還元酵素であってもよい。非特異的アルドース還元酵素は、次の反応を触媒する。
アルドース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋←→アルジトール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
【００９７】
酵素は広い特異性を有し、アルドース還元酵素；ポリオールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）；アルジトール：ＮＡＤＰオキシド還元酵素；アルジトール：ＮＡＤＰ＋１−オキシド還元酵素；ＮＡＤＰＨ−アルドペントース還元酵素；またはＮＡＤＰＨ−アルドース還元酵素としてもまた知られている。
【００９８】
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に内在性であるこのような非特異的アルドース還元酵素の特定の例は、ＧＲＥ３遺伝子によってコードされる（Ｔｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８−７４）。したがって本発明のアルドース還元酵素は、そのアミノ酸配列によってさらに定義されてもよい。同様にアルドース還元酵素は、酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびに参照ヌクレオチド配列とハイブリッドする、アルドース還元酵素をコードするヌクレオチド配列によって定義されてもよい。
【００９９】
［配列同一性］
本明細書で配列同一性（または配列類似性）とは、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列を比較して判定される、配列間の関係と定義される。通常、配列アイデンティティまたは類似性が比較され、典型的に全長にわたって配列が比較される。しかし配列は、より短い比較ウィンドウにわたって比較されてもよい。当該技術分野で「アイデンティティ」はまた、場合によってはそのような配列のストリング間のマッチによって判定される。アミノ酸または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。
【０１００】
アイデンティティを判定する好ましい方法は、試験される配列間に最大のマッチを与えるようにデザインされる。アイデンティティおよび類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化される。２つの配列間のアイデンティティおよび類似性を判定する好ましいコンピュータプログラム法としては、例えばＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、ＮＣＢＩおよびその他の情報源から公的に入手可能（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを使用したアミノ酸配列比較の好ましいパラメーターは、ｇａｐ  ｏｐｅｎ  １１．０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ  １、Ｂｌｏｓｕｍ６２  ｍａｔｒｉｘである。ＢＬＡＳＴＰを使用した核酸配列比較の好ましいパラメーターは、ｇａｐ  ｏｐｅｎ  １１．０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ  １、ＤＮＡ  ｆｕｌｌ  ｍａｔｒｉｘ（ＤＮＡ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘ）である。
【０１０１】
任意選択的に、アミノ酸の類似度を判定する上で、当業者はまた、当業者には明らかであるように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮してもよい。
【０１０２】
保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有する一群のアミノ酸はセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有する一群のアミノ酸はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有する一群のアミノ酸はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸はリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；イオウ含有側鎖を有する一群のアミノ酸はシステインおよびメチオニンである。
【０１０３】
好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書で開示される置換変異型アミノ酸配列とは、その中で開示される配列の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されるものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然アミノ酸のそれぞれについて、好ましい保存的置換を下に示す。Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎ；Ｈｅからｌｅｕまたはｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎまたはｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅ；およびＶａｌからｉｌｅまたはｌｅｕ。
【０１０４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本明細書で、少なくとも約２５個、好ましくは約５０個のヌクレオチド、７５個または１００個および最も好ましくは約２００個以上のヌクレオチドの核酸配列を約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）を含んでなる溶液中、または比較できるイオン強度を有するあらゆるその他の溶液中において、約６５℃の温度でハイブリッド形成させ、約０．１Ｍ以下の塩、好ましくは０．２×ＳＳＣを含んでなる溶液、または比較できるイオン強度を有するあらゆるその他の溶液中において、６５℃で洗浄する条件と定義される。好ましくはハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち少なくとも１０時間にわたり実施され、好ましくは洗浄は、洗浄溶液を少なくとも２回取り替えて少なくとも１時間にわたり実施される。これらの条件は、通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列が特異的にハイブリダイゼーションできるようにする。
【０１０５】
本明細書で中程度の条件は、少なくとも５０個のヌクレオチド、好ましくは約２００個以上のヌクレオチドの核酸配列を約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣを含んでなる溶液中、または比較できるイオン強度を有するあらゆるその他の溶液中において、約４５℃の温度でハイブリッド形成させ、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含んでなる溶液、または比較できるイオン強度を有するあらゆるその他の溶液中において、室温で洗浄する条件と定義される。好ましくはハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち少なくとも１０時間にわたり実施され、好ましくは洗浄は、洗浄溶液を少なくとも２回取り替えて少なくとも１時間にわたり実施される。これらの条件は、通常、５０％以下の配列同一性を有する配列が特異的にハイブリダイゼーションできるようにする。当業者は、アイデンティティが５０％〜９０％で変動する配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を変更できる。
【０１０６】
導入された酵素が本発明の細胞中において活性形態で発現する可能性を増大させるために、対応するコードディングヌクレオチド配列を適応させて、そのコドン使用頻度を選択された酵母細胞にとって最適化させてもよい。いくつかのコドン最適化法が、当該技術分野で知られている。酵母のヌクレオチド配列のコドン使用頻度を最適化する好ましい方法は、国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／または国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットで開示されるようなコドンペア最適化技術である。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットは、コドンペア最適化に対処する。コドンペア最適化は、ポリペプチドコードするヌクレオチド配列をそれらのコドン、特に使用されるコドンペアの使用頻度について改変し、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の改善された発現および／またはコードされたポリペプチドの改善された生成を得る方法である。コドンペアは、コード配中の２個の引き続く三塩基（コドン）の組と定義される。
【０１０７】
本明細書では、遺伝子発現および翻訳効率の簡単な尺度として、Ｘｕｈｕａ  Ｘｉａ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７，：３  ５３−５８で記載されるコドン適応指数（ＣＡＩ）を使用する。指数は、高度に発現される種からの遺伝子の参照集合を使用して各コドンの優劣を評価し、遺伝子のスコアをその遺伝子中の全コドンの使用頻度から計算する。指数は、コドン使用頻度パターンを形成する上で選択が効果的である程度を評価する。その点において、それらの宿主に対するウィルス性遺伝子の適応を評価するために、異なる生物中のコドン使用頻度の比較を行うために、遺伝子発現レベルを予測することが有用である。指数はまた、異種遺伝子発現の成功可能性のおよその指標も与えてもよい。本発明に従ったコドンペア最適化された遺伝子中では、ＣＡＩは０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．８５以上、０．８７以上、０．９０以上、０．９５以上、または約１．０である。
【０１０８】
したがって本発明の細胞は、上で定義されるａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸コンストラクトを含んでなる、すなわちそれで形質転換された細胞である。ａｒａＡコード配列を含んでなる核酸コンストラクトは、好ましくは宿主細胞中でａｒａＡ遺伝子を発現できる。
【０１０９】
好ましくは遺伝子は、細胞質ゾル中で発現される。細胞質性発現は、ミトコンドリアまたはペルオキシソーム標的シグナルの欠失または修飾によって達成されてもよい。
【０１１０】
［バイオ製品生産］
長年にわたって、糖科作物からバイオエタノールを生産するために、様々な生物の導入が提案されてきた。しかし実際には、全ての主要なバイオエタノール製造工程は、エタノール生産菌としてサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母を使用し続けている。これは工業的方法のための、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種の数多くの魅力的な特徴、すなわち高い酸、エタノール、および浸透圧耐性、嫌気的成長能力、そしてもちろんその高いアルコール発酵能力のためである。宿主細胞として好ましい酵母種としては、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ディアスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、またはＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）が挙げられる。
【０１１１】
本発明の細胞は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、果糖、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、スクロース、乳糖およびグリセロールを例えば発酵性糖に転換できてもよい。したがって本発明の細胞は、セルロースのグルコースモノマーへの、そしてヘミセルロースのキシロースおよびアラビノースモノマーへの転換に必要なセルラーゼ（エンドセルラーゼまたはエキソセルラーゼ）、ヘミセルラーゼ（エンドまたはエキソキシラナーゼまたはアラビナーゼ）；ペクチンをグルクロン酸およびガラクツロン酸に転換できるペクチナーゼ；またはデンプンをグルコースモノマーに転換するアミラーゼなどの１つ以上の酵素を発現してもよい。
【０１１２】
本細胞は、さらに好ましくは、ピルビン酸から、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンなどの所望の発酵産物への転換に必要とされる酵素活性をさらに含んでなる。
【０１１３】
好ましい本発明の細胞は、天然でアルコール発酵、好ましくは嫌気性アルコール発酵できる細胞である。本発明の細胞は好ましくは、高いエタノール耐性、高い低ｐＨ耐性（すなわち約５、約４、約３、または約２．５よりも低いｐＨで成長できる）、および乳酸、酢酸またはギ酸のような有機酸、および／またはフルフラールおよびヒドロキシメチルフルフラールなどの糖分解生成物に対する高い耐性、および／または高い高温耐性を有する。
【０１１４】
上記のいずれかの本発明の細胞の特徴または活性は、細胞内に天然に存在してもよく、または遺伝子改変によって導入または改変されてもよい。
【０１１５】
本発明の細胞は、エタノール生産に適した細胞であってもよい。しかし本発明の細胞は、エタノール以外の発酵産物生産に適していてもよい。このような非エタノール発酵産物としては、原則的には、酵母または糸状菌などの真核微生物が生成可能なあらゆるバルクまたはファインケミカルが挙げられる。
【０１１６】
このような発酵産物は、例えばブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンであってもよい。非エタノール発酵産物のための好ましい本発明の細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低下をもたらす遺伝子改変を含有する宿主細胞である。
【０１１７】
さらなる態様では、本発明は、その中で本発明細胞が、キシロースなどのキシロース源を含んでなる炭素源発酵のために使用される発酵工程に関する。キシロース源に加えて発酵培地中の炭素源は、グルコース源もまた含んでなってもよい。キシロースまたはグルコース源は、キシロースまたはグルコースそれ自体であってもよく、または例えばリグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプンなどのキシロースまたはグルコース単位を含んでなる、あらゆる炭水化物オリゴマーまたはポリマーであってもよい。このような炭水化物からのキシロースまたはグルコース単位の放出のために、適切なカルボヒドラーゼ（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）が発酵培地に添加されてもよく、または細胞によって生成されてもよい。後者の場合、細胞は遺伝子操作されて、このようなカルボヒドラーゼを生成し分泌してもよい。オリゴまたはポリマーグルコース源を使用することの追加的利点は、例えば律速量のカルボヒドラーゼを使用することにより、それが発酵中に（より）低い濃度の遊離グルコースを維持できるようにすることである。これは、次に、キシロースなどの非グルコース糖の代謝および輸送に必要とされるシステムの抑制を防止する。
【０１１８】
好ましい方法では、細胞はキシロースおよびグルコースの双方を好ましくは同時に発酵し、その場合、好ましくはジオーキシー成長を妨げるグルコース抑制に非感受性の細胞が使用される。炭素源としてのキシロース（およびグルコース）源に加えて、発酵培地は、細胞成長に必要とされる適切な成分をさらに含んでなる。酵母などの微生物の成長のための発酵培地組成物は、当該技術分野で良く知られている。発酵過程は、例えばエタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ペニシリンＧまたはペニシリンＶとその発酵誘導体などのβ−ラクタム抗生物質、およびセファロスポリンなどの発酵産物生産のための過程である。
【０１１９】
［リグノセルロース］
潜在的な再生可能原材料とみなされてもよいリグノセルロースは、一般に多糖類セルロース（グルカン）およびヘミセルロース（キシラン、ヘテロキシラン、およびキシログルカン）を含んでなる。これに加えて例えば木材由来原材料の中に、ある種のヘミセルロースがグルコマンナンとして存在してもよい。例えばこれらの多糖類のグルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、果糖、マンノース、ラムノース、リボース、ガラクツロン酸、グルクロン酸、およびその他のヘキソースおよび五炭糖などのモノマーおよび多量体の双方をはじめとする可溶性糖への酵素加水分解は、協調して作用する異なる酵素作用の下で起きる。
【０１２０】
さらにペクチン、およびアラビナンなどのその他のペクチン質が、典型的な非木本組織からの細胞壁の乾燥質量のかなりの部分を構成してもよい（乾燥質量の約４分の１から２分の１がペクチンであってもよい）。
【０１２１】
［前処理］
（ヘミセルロース系をはじめとする）リグノセルロース系材料から、本発明に従って発酵させてもよい糖を放出させるために前処理が望ましいこともあり得る。このステップは、例えば以下のような従来の方法で実施してもよい。
【０１２２】
［酵素加水分解］
酵素加水分解は、従来の方法で実施してもよい。
【０１２３】
［発酵］
発酵工程は、好気的または嫌気的発酵工程であってもよい。嫌気的発酵工程は、本明細書で、酸素不在下で進行する発酵工程、またはその中で実質的に酸素が消費されず、好ましくは約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満が消費され（すなわち酸素消費が検出可能でない）、その中で有機分子が電子供与体および電子受容体の双方の役割を果たす発酵工程と定義される。酸素の不在下で、解糖およびバイオマス形成中に生じるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によって酸化され得ない。この問題を解決するために、多数の微生物は、電子および水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の１つを使用し、それによってＮＡＤ＋を再生する。
【０１２４】
したがって好ましい嫌気的発酵工程では、ピルビン酸が電子（および水素受容体）として使用され、還元されて、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質、およびセファロスポリンなどの発酵産物になる。
【０１２５】
発酵工程は、好ましくは細胞にとって最適の温度で実施される。したがってほとんどの酵母または真菌宿主細胞では、発酵工程は、約４２℃未満、好ましくは約３８℃未満の温度で実施される。酵母または糸状菌宿主細胞では、発酵工程は好ましくは約３５、約３３、約３０または約２８℃よりも低い温度、および約２０、約２２、または約２５℃よりも高い温度で実施される。
【０１２６】
工程におけるキシロースおよび／またはグルコース上のエタノール収率は、好ましくは少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５または約９８％である。エタノール収率は、本明細書で理論的最大収率の百分率と定義される。
【０１２７】
本発明はまた、発酵産物を製造する方法にも関する。
【０１２８】
発酵工程は、バッチ、流加または連続様式で実施してもよい。別個の加水分解および発酵（ＳＨＦ）工程、または同時の糖化および発酵（ＳＳＦ）工程もまた適用してもよい。最適生産性のために、これらの発酵工程様式の併用もまた可能であってもよい。
【０１２９】
本発明に従った発酵工程は、好気的および嫌気的条件下で進行してもよい。好ましくは工程は、微好気的または酸素限定条件下で実施される。
【０１３０】
嫌気的発酵工程は、本明細書では、酸素不在下で進行し、またはその中で実質的に酸素が消費されず、好ましくは約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満が消費され、有機分子が電子供与体および電子受容体の双方の役割を果たす発酵工程、と定義される。
【０１３１】
酸素限定発酵工程は、気体から液体への酸素移動によって、酸素消費が制限される工程である。酸素制限の程度は、流入ガス流量および組成、ならびに使用される発酵装置の実際の混合／質量移動特性によって定まる。好ましくは、酸素限定条件下の工程では、酸素消費速度は、少なくとも約５．５、より好ましくは少なくとも約６、少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈなどである。本発明の方法は、発酵産物の回収を含んでなる。
【０１３２】
好ましい方法では、細胞はキシロースおよびグルコースの双方を好ましくは同時に発酵し、その場合、好ましくはジオーキシー成長を妨げるグルコース抑制に非感受性の細胞が使用される。炭素源としてのキシロース（およびグルコース）源に加えて、発酵培地は、細胞成長に必要とされる適切な成分をさらに含んでなる。酵母などの微生物の成長のための発酵培地組成物は、当該技術分野で周知である。
【０１３３】
発酵工程は、バッチ、流加または連続様式で実施してもよい。別個の加水分解および発酵（ＳＨＦ）工程、または同時の糖化および発酵（ＳＳＦ）工程もまた応用してもよい。最適生産性のために、これらの発酵工程様式の併用もまた可能であり得る。これらの工程については、以下でより詳細に説明する。
【０１３４】
［ＳＳＦ様式］
同時糖化および発酵（ＳＳＦ）様式では、液化／加水分解または前糖化工程のための反応時間は、所望の収率、すなわちセルロースからグルコースへの収率を実現する時間に左右される。このような収率は、好ましくは可能な限り高く、好ましくは６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上または９９．９％以上でさえある。
【０１３５】
本発明に従って、ＳＨＦ様式における非常に高い糖濃度力、およびＳＳＦ様式における非常に高い生成物（例えばエタノール）濃度が実現する。ＳＨＦ操作では、グルコース濃度は、２５ｇ／Ｌ以上、３０ｇ／Ｌ以上、３５ｇ／Ｌ以上、４０ｇ／Ｌ以上、４５ｇ／Ｌ以上、５０ｇ／Ｌ以上、５５ｇ／Ｌ以上、６０ｇ／Ｌ以上、６５ｇ／Ｌ以上、７０ｇ／Ｌ以上、７５ｇ／Ｌ以上、８０ｇ／Ｌ以上、８５ｇ／Ｌ以上、９０ｇ／Ｌ以上、９５ｇ／Ｌ以上、１００ｇ／Ｌ以上、１１０ｇ／Ｌ以上、１２０ｇ／Ｌ以上であり、または例えば２５ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌ、３０ｇｌ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであってもよい。
【０１３６】
［ＳＳＦ様式における生成物濃度］
ＳＳＦ操作では、生成物濃度（ｇ／Ｌ）は生成されるグルコース量に左右されるが、糖はＳＳＦ中で生成物に転換され、生成物濃度は、理論的な最小収率の増大により根底にあるグルコース濃度に関連し得る（Ｙｐｓ  ｍａｘは、グルコース１グラム当たりの生成物グラムである）ので、これは目に見えない。
【０１３７】
発酵産物の理論的最大収率（Ｙｐｓ  ｍａｘは、グルコース１グラム当たりの生成物グラムである）は、教科書通りの生化学から導かれ得る。エタノールでは、１モルのグルコース（１８０ｇ）は、酵母中の通常解糖発酵経路に従って、２モルのエタノール（＝２×４６＝９２グラムのエタノール）を生じる。したがってグルコース上のエタノールの理論的最大収率は、９２／１８０＝０．５１１ｇのエタノール／グルコース１グラムである。
【０１３８】
ブタノール（ＭＷ７４ｇ／モル）またはイソブタノールでは、理論的最大収率はグルコース１グラム当たり１モルのブタノールである。したがって（イソ−）ブタノールのＹｐｓ  ｍａｘ＝７４／１８０＝０．４１１ｇ（イソ−）ブタノール／グルコース１グラムである。
【０１３９】
乳酸では、ホモ乳酸発酵の発酵収率は、１モルのグルコース当たり２モルの乳酸（ＭＷ＝９０ｇ／モル）である。この化学量論によれば、Ｙｐｓ  ｍａｘ＝乳酸１ｇ／グルコース１ｇである。
【０１４０】
その他の発酵産物についても、同様の計算を実施してもよい。
【０１４１】
［ＳＳＦ様式］
ＳＳＦ操作では、生成物濃度は、２５ｇ＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ／Ｌ以上、３０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、３５ｇ＊Ｙｐｓ／Ｌ以上、４０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、４５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、５５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、６０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、６５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、７０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、７５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、８５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、９０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、９５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１１０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１２０ｇ／Ｌ＊Ｙｐｓ以上であり、または例えば２５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、３０＊Ｙｐｓ  ｇｌ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、４０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、６０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、７０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、９０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌであってもよい。
【０１４２】
したがって本発明は発酵産物を調製する方法を提供し、方法は、
ａ．本明細書に記載される方法を使用してリグノセルロースを分解するステップと；
ｂ．得られた物質を発酵し、
それによって発酵産物を調製するステップ
を含んでなる。
【０１４３】
［発酵産物］
本発明の発酵産物は、いかなる有用な生成物であってもよい。一実施態様では、これは、エタノール；ｎ−ブタノール；イソブタノール；乳酸；３−ヒドロキシ−プロピオン酸；アクリル酸；酢酸；コハク酸；フマル酸；リンゴ酸；イタコン酸；マレイン酸；クエン酸；アジピン酸；リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸などのアミノ酸；１，３−プロパン−ジオール；エチレン；グリセロール；β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン；ビタミン；医薬品；動物飼料補給剤；特殊化学薬品；化学原料；プラスチック；溶剤；生物燃料およびバイオガスまたは有機ポリマーをはじめとする燃料；およびプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシド還元酵素、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼなどの工業用酵素からなる群から選択される生成物である。
【０１４４】
［発酵産物の回収］
発酵生成物の回収のためには、既存の技術が使用される。異なる発酵産物では、異なる回収工程が適切である。水性混合物からエタノールを回収する既存の方法は、一般に分留および吸着技術を使用する。例えばビール蒸留缶を使用して、エタノールを水性混合物中に含有する発酵産物を処理して濃縮エタノール含有混合物を生成し、次に分留（例えば分別蒸留またはその他の類似技術）を実施し得る。次に最高濃度のエタノールを含有する留分を吸収材に通過させ、エタノールから残りの水の全部ではないが大部分を除去し得る。
【０１４５】
以下の実施例は、本発明を例証する。
【０１４６】
［実施例］
特に断りのない限り、使用された方法は標準生化学的技術である。適切な一般方法の教科書は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を含む。
【０１４７】
［Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換］
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換は、Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（２００２；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬｉＡｃ／ＳＳ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ＰＥＧ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３５０：８７−９６）に記載されるようにして実施した。
【０１４８】
［コロニーＰＣＲ］
単一コロニー分離株をプラスチック爪楊枝で拾って５０μｌミリＱ水に再懸濁した。サンプルを９９℃で１０分間インキュベートした。５μｌのインキュベートしたサンプルをＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用したＰＣＲ反応のためのテンプレートとして、供給元によって提供される使用説明書に従って使用した。
【０１４９】
【表２】
0005832431.tif 000003
【０１５０】
［培地組成］
成長実験：サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を以下の組成を有する培地上で成長させた。０．６７％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベースまたは合成培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）およびグルコース、アラビノース、ガラクトースまたはキシロースのいずれか、またはこれらの基質の組み合わせ（下記参照）。寒天プレートでは、培地に２％（ｗ／ｖ）細菌用寒天を添加した。
【０１５１】
［エタノール生成］
培養は、３０℃でＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ；オランダ国（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＨａｌｏｔｅｃ）内において、１００ｍｌの合成モデル培地（５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノースおよび１〜１．５％ガラクトースを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２））中で実施した。滅菌に先だって、培地のｐＨを２ＭのＮａＯＨ／Ｈ２ＳＯ４で４．２に調節した。嫌気的培養のための合成培地に、エタノールに溶解させた０．０１ｇ／Ｌのエルゴステロールおよび０．４２ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０を添加した（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：２３−３６，１９５３；およびＡｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：２７１−２８１，１９５４）。培養物を磁気撹拌機によって撹拌した。培養物に通気しなかったために、嫌気的条件は発酵中に迅速に発生した。ＣＯ２の生成を絶えずモニターした。糖転換および生成物形成をＮＭＲによって分析した。培養物の光学濃度をＬＫＢ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  Ｋ分光光度計上で６００ｎｍで追跡することにより、成長をモニターした。
【０１５２】
１００ｍｌ振盪フラスコ内の２％グルコースを添加した２５ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）に、冷凍保存培養または寒天プレートからの単一コロニーを接種して、前培養を調製した。軌道振盪機（２００ｒｐｍ）内における３０℃でおよそ２４時間のインキュベーション後にこの培養物を収集し、およそ２のＯＤ６００でＢＡＭ接種のために使用した。
【０１５３】
［実施例１］
「Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムへの遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤの導入］
［１．１  アラビノース経路の遺伝子を含有する発現ベクターの構築］
図２に記載されるプラスミドｐＰＷＴ０１８を次のようにして構築した。ベクターｐＰＷＴ００６（図１、ＳＩＴ２遺伝子座からなる（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ  ａｎｄ  Ｋａｂａｃｋ（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６，ｎｏ．６，２１８５−２１９７））と、抗生物質Ｇ４１８上およびアセトアミド上で成長する能力（上記参照）により形質転換体を選択できるようにするマーカーとを制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＭｌｕＩで消化した。Ｇ４１８耐性をもたらすｋａｎＭＸ−マーカーは、ｐ４２７ＴＥＦ（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）から単離され、ａｍｄＳマーカーを含有する断片については文献で記載されている（Ｓｗｉｎｋｅｌｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒ，Ａ．Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｅｎｎｉｅｒｓ，Ａ．Ｃ．Ｈ．Ｍ（１９９５）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｄＳ  ｃＤＮＡ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｓ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ，ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｙｅａｓｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１，Ｉｓｓｕｅ  １９９５Ａ，ｐａｇｅ  Ｓ５７９；および米国特許第６０５１４３１号明細書）。国際公開第２００８／０４１８４０号パンフレットで開示されるような、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのアラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）、Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）、およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードする遺伝子は、のＢａｓｅＣｌｅａｒ（オランダ国ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））によって合成された。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの強力なプロモーター、すなわちａｒａＡ遺伝子の発現を制御するＴＤＨ３プロモーター、ａｒａＢ遺伝子を制御するＥＮＯ１プロモーター、およびａｒａＤ遺伝子を制御するＰＧＩ１プロモーターの制御下にある（またはそれらと作動可能に結合している）上述の３つのアラビノース遺伝子を含む、１個の大きな断片が合成された。この断片は、ユニークな制限酵素Ａｃｃ６５ｌおよびＭｌｕＩで取り囲まれた。この断片のｐＰＷＴ００６へのクローニング、ＢｓｉＷＩおよびＭｌｕＩによる消化は、プラスミドｐＰＷＴ０１８をもたらした（図２）。プラスミドｐＰＷＴ０１８の配列を配列番号１７で記載する。
【０１５４】
［１．２  酵母形質転換］
供給元によって提供される使用説明書に従って、あらかじめＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で直線化したプラスミドｐＰＷＴ０１８でＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ［ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２）を形質転換した。合成ＳｆｉＩ部位をＳＩＴ２遺伝子の５’−ｆｌａｎｋ中にデザインした（図２参照）。形質転換混合物を１ｍｌ当たり１００μｇのＧ４１８（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））を含有するＹＰＤ−寒天（１リットル当たり１０グラムの酵母抽出物、１リットル当たり２０グラムのペプトン、１リットル当たり２０グラムのデキストロース、２０グラムの寒天）上に播種した。２〜４日後にはコロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち形質転換実験中でＤＮＡ添加なし）はブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートをもたらした。プラスミドｐＰＷＴ０１８の組み込みは、ＳＩＴ２遺伝子座を対象とする。質転換体は、ＰＣＲおよびサザンブロット技術を使用して特性決定した。
【０１５５】
配列番号１８および１５と、１５および１４で示されるプライマーを用いて、プラスミドｐＰＷＴ０１８の１コピーの正しい組み込みの指標となるＰＣＲ反応を実施した（図４参照）。配列番号１８および１５のプライマー対によって、ＳＩＴ２遺伝子座での正しい組み込みをチェックした。プラスミドｐＰＷＴ０１８が複数コピー組み込まれれば（頭尾組み込み）、配列番号１５および１４のプライマー対はＰＣＲ生成物を与える。後者のＰＣＲ産物が不在であれば、これはｐＰＷＴ０１８の１コピー組み込みの徴候である。プラスミドｐＰＷＴ０１８の１コピーがＳＩＴ２遺伝子座中に組み込まれた株をＢＩＥ１０４Ｒ２と命名した。
【０１５６】
［１．３  マーカーレスキュー］
同一選択マーカーを使用して、酵母株をその他のコンストラクトで形質転換できるようにするためには、選択可能なマーカーを除去することが必要である。プラスミドｐＰＷＴ０１８のデザインによって、染色体へのｐＰＷＴ０１８組み込みに際し、相同的な配列が互いにごく接近するようになる。このデザインは、これらの相同領域の突発性分子内組み換えによって、選択可能なマーカーが喪失できるようにする。
【０１５７】
栄養成長に際して、低頻度ではあるが分子内組み換えが起きる。この遺伝子組み換え頻度は、相同性の長さおよびゲノム中の遺伝子座（結果未公開）に左右される。培養物副画分の新鮮培地への連続的移動に際して、分子内組み換えは経時的に蓄積する。
【０１５８】
この目的を達成するために、単一コロニー分離株から開始して、ＹＰＤ培地（１リットル当たり１０グラムの酵母抽出物、１リットル当たり２０グラムのペプトン、１リットル当たり２０グラムのデキストロース）中でＢＩＥ１０４Ｒ２株を培養した。２５μｌの一晩培養物を使用して、新鮮なＹＰＤ培地に接種した。少なくとも５回のこのような連続的移動後、培養物の光学濃度を測定し、１ｍｌあたりおよそ５０００個の濃度に細胞を希釈した。１００μｌの細胞懸濁液を３０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭのフルオロ−アセトアミド（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、および１．８％の寒天（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））を含有する酵母炭素ベース培地（ディフコ）に播種した。ＢＩＥ１０４Ｒ２株の細胞と同一である、すなわち細胞内組み換えのない細胞は、依然としてａｍｄＳ遺伝子を含有した。これらの細胞にとって、フルオロ−アセトアミドは有毒である。これらの細胞はフルオロアセトアミド含有培地上で成長できず、コロニーを形成しない。しかし分子内組み換えが起きた場合、選択可能なマーカーを失ったＢＩＥ１０４Ｒ２変異株はフルオロ−アセトアミドを成長阻害化合物に転換できないので、フルオロアセトアミド培地上で成長できる。これらの細胞はこの寒天培地上でコロニーを形成する。
【０１５９】
このようにして得られたフルオロ−アセトアミド抵抗性コロニーに、配列番号１８および１５と、１４および１９のプライマーを使用したＰＣＲ分析を実施した。配列番号１８および５のプライマーは、選択可能なマーカーの組み換えが意図したように起きていればバンドを与える。その結果、強力酵母プロモーター制御下の遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤのあるカセットが、宿主株のゲノムＳＩＴ２遺伝子座に組み込まれた。この場合、プライマー１４は組み換えのために失われたはずの領域内でプライムするので、配列番号１４および１９のプライマーを使用したＰＣＲ反応は、ＰＣＲ産物をもたらさないはずである。後者のプライマーによってバンドが得られた場合、これはゲノム中の完全なプラスミドｐＰＷＴ０１８の存在の徴候であり、したがって組み換えは起きていない。
【０１６０】
配列番号１８および１５のプライマーがＰＣＲ産物をもたらさなければ、組み換えは起きているが、完全なプラスミドｐＰＷＴ０１８は組み換えによってゲノムの外にある。選択可能なマーカーだけでなく、アラビノース遺伝子もまた失われた。実際、野生型酵母が回復されていた。
【０１６１】
ｐＰＷＴ０１８の１コピーの組み込みに従ってＰＣＲ結果を示す分離株に、サザンブロット分析を実施した。ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ株の染色体ＤＮＡと正確な組み換体えをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した（二重消化）。テンプレートとしてＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの染色体ＤＮＡを使用して、配列番号２０および２１プライマーによりＳＩＴ２プローブを調製した。ハイブリダイゼーション実験の結果を図３に示す。予期されるハイブリダイゼーションパターンは、図４（パネルａおよびｂ）に示すような物理的地図から推定されてもよい。
【０１６２】
野生型株では、２．３５ｋｂのバンドが観察され、それは野性型遺伝子（図４、パネルａ）の予期されるサイズに一致した。プラスミドｐＰＷＴ０１８の組み換えによる組み込みおよび部分的損失に際して、１．０６ｋｂのバンドが予期された（図４、パネルｂ）。実際、このバンドは図３（レーン２）に示すように観察された。
【０１６３】
サザンブロット法でバンドの正確なパターン（図３から推定し得るような）を示した株の１つは、ＢＩＥ１０４Ａ２と命名された株である。
【０１６４】
［１．４  非酸化的ペントースリン酸経路の４つの構成的に発現される遺伝子の導入］
遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤを構成的に発現するサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ１０４Ａ２をプラスミドｐＰＷＴ０８０で形質転換した（図５）。プラスミドｐＰＷＴ０８０の配列は、配列番号４に記載される。１コピーの形質転換体を選択した後の形質転換および選択手順は、１．１、１．２、および１．３節で上述したのと同じであった。手短に言えば、ＢＩＥ１０４Ａ２をＳｆｉＩ消化ｐＰＷＴ０８０で形質転換した。形質転換混合物を１ｍｌあたり１００μｇのＧ４１８（シグマアルドリッチ）を含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり１０グラムの酵母抽出物、１リットル当たり２０グラムのペプトン、１リットル当たり２０グラムのデキストロース、２０グラムの寒天）上に播種した。
【０１６５】
２〜４日後にはコロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち形質転換実験中でＤＮＡ添加なし）はブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートをもたらした。
【０１６６】
プラスミドｐＰＷＴ０８０の組み込みは、ＧＲＥ３遺伝子座を対象とする。形質転換体は、ＰＣＲおよびサザンブロット技術を使用して特性決定した。
【０１６７】
予期されるハイブリダイゼーションパターンに従って、プラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピーの正しい組み込みを示す形質転換体をＢＩＥ１０４Ａ２Ｆ１と命名した。
【０１６８】
キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を導入できるように（実施例５）、プラスミドｐＰＷＴ０８０の組み込みによって導入された選択マーカーを除去することが必要である。この目的を達成するために、コロニー分離株から開始して、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｆ１株をＹＰＤ培地中で培養した。２５μｌの一晩培養物を使用して新鮮なＹＰＤ培地に接種した。５回の連続的移動後、培養物の光学濃度を測定し、１ｍｌ当たりおよそ５０００個の濃度に細胞を希釈した。１００μｌの細胞懸濁液を３０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％のＨ２ＳＯ４、４０ｍＭのフルオロ−アセトアミド（アマシャム）、および１．８％の寒天（ディフコ）を含有する酵母炭素ベース培地（ディフコ）に播種した。フルオロアセトアミド抵抗性コロニーにＰＣＲ分析を実施して、正確なＰＣＲプロフィールの場合は、サザンブロット分析を実施した（実施例１の１．３節）。サザンブロット法で正確なバンドパターンを示す株の１つは、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１と命名された株である。
【０１６９】
［実施例２］
［適応進化］
［２．１  適応進化（好気的）］
ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１株の単一コロニー分離株を使用して、２％ガラクトースを添加したＹＮＢ培地（ディフコ）に接種した。前培養を３０℃および２８０ｒｐｍでおよそ２４時間インキュベートした。細胞を収集して、０．２の開始ＯＤ６００で１％ガラクトースおよび１％アラビノースを含有するＹＮＢ培地に接種した（図８）。細胞を３０℃および２８０ｒｐｍで成長させた。６００ｎｍでの光学濃度を定期的にモニターした。
【０１７０】
光学濃度の値が５に達した際、培養物のアリコートを同一培地を含有する新鮮なＹＮＢ培地に移した。添加された細胞量は、培養物の開始ＯＤ６００が０．２になるような量であった。ＯＤ６００が再度５に達したら、培養物のアリコートを唯一の炭素源として２％アラビノースを含有するＹＮＢ培地に移した（図８の（１）で示される事象）。
【０１７１】
唯一の炭素源として２％アラビノース添加ＹＮＢに移すと、およそ２週間後に成長が観察できた。６００ｎｍでの光学濃度の値が少なくとも１に達した際、細胞を０．２の開始ＯＤ６００で、２％アラビノースを添加した新鮮なＹＮＢ培地を入れた振盪フラスコに移した（図８）。
【０１７２】
図８に示すように連続的移動を３回繰り返した。得られたアラビノースで迅速に成長できる株をＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃと命名した。
【０１７３】
［２．２適応進化（嫌気的）］
好気的条件下におけるアラビノース上での成長適応後、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ株からの単一コロニーを２％グルコースを添加したＹＮＢ培地上に接種した。前培養を３０℃および２８０ｒｐｍでおよそ２４時間インキュベートした。
【０１７４】
細胞を収集して２％アラビノースを含有するＹＮＢ培地中に、０．２の光学濃度ＯＤ６００で接種した。フラスコをウォーターロックで閉鎖して、培地およびヘッドスペースから酸素が枯渇した後の嫌気的成長条件を確実にした。ＯＤ６００が最低３に達したら、培養物のアリコートを２％アラビノースを含有する新鮮なＹＮＢ培地にそれぞれ０．２の光学濃度ＯＤ６００で移した（図９）。
【０１７５】
数回の移動後、得られた株をＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｄ（＝ＢＩＥ２０１）と命名した。
【０１７６】
［実施例３］
［発酵能力測定］
ＢＩＥ１０４、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ、およびＢＩＥ２０１株の単一コロニー分離株を使用して、２％グルコースを添加したＹＮＢ培地（ディフコ）に接種した。前培養を３０℃および２８０ｒｐｍでおよそ２４時間インキュベートした。細胞を収集し、ＢＡＭ内で合成モデル培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７、１９９２；５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１％ガラクトース）におよそ２の開始ＯＤ６００で接種した。ＣＯ２生成を絶えずモニターした。糖転換および生成物形成をＮＭＲによって分析した。データは指定の糖の残留量（１リットルあたりのグルコース、アラビノース、ガラクトースおよびキシロースのグラム数）および（副）生成物形成（エタノール、グリセロール）を表す。６００ｎｍで培養物の光学濃度を追跡して成長をモニターした（図１０、１１、１２）。実験はおよそ１４０時間実施した。
【０１７７】
実験は参照株ＢＩＥ１０４がグルコースを迅速に転換したが、アラビノースまたはガラクトースのどちらも１４０時間以内に転換できなかったことを明らかに示した（図１０）。しかしＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１株は、アラビノースおよびガラクトースを転換できた（それぞれ図１１および１２）。ガラクトースおよびアラビノース利用は、２０時間以内にグルコース枯渇の直後に始まった。どちらの糖も同時に転換された。しかし嫌気的条件下におけるアラビノース成長のために改善されたＢＩＥ２０１株は、双方の糖をより迅速に消費した（図１２）。全ての発酵で、副産物としてはグリセロールのみが生じた。ＢＩＥ２０１の発酵のデータは、本明細書で表２に示す。
【０１７８】
【表３】
0005832431.tif 000004
【０１７９】
以下からの最大エタノール濃度（ｇ／ｌ）
グルコース  ２１．８
アラビノース  １６．１
ガラクトース  ６．６
合計  ４４．５
実験的エタノール収率０．４５ｇエタノール／ｇ糖
【０１８０】
この計算から、糖グルコース、ガラクトース、およびアラビノースが、それぞれエタノールに変換されることが明らかである。
【０１８１】
［実施例４］
［糖転換に対するＰＰＰ遺伝子の影響］
ＰＰＰ遺伝子が糖転換におよぼす影響を試験するために、ＢＩＥ１０４Ａ２およびＢＩＥ１０５Ａ２株からの単一コロニーを２％グルコースを添加したＹＮＢ培地（ディフコ）に接種した。どちらの株もアラビノース遺伝子を含有し、アラビノース上での成長のために進化させた（実施例２、２．１節に記載されるように）。ＢＩＥ１０５Ａ２株は工業株のバックグラウンドを有する。しかしこれは前述したのと同じ方法およびコンストラクトで形質転換された（実施例１、１．２節）。
【０１８２】
前培養を収集し、ＢＡＭ内で合成トウモロコシ繊維モデル培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７、１９９２；５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１．５％ガラクトース）におよそ２の開始ＯＤ６００で接種した。ＣＯ２生成を絶えずモニターした。糖転換および生成物形成をＮＭＲによって分析した。データは指定の糖の残留量（１リットルあたりのグルコース、アラビノース、ガラクトースおよびキシロースのグラム数）および（副）生成物形成（エタノール、グリセロール）を表す。６００ｎｍで培養物の光学濃度を追跡して成長をモニターした。実験はおよそ１６０時間実施した。
【０１８３】
実験はどちらの株もグルコース枯渇直後に、ＰＰＰ遺伝子を過剰発現することなく、アラビノースおよびガラクトースを転換できることを示す（図１３および１４）。
【０１８４】
［実施例５］
［キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする構成的に発現される遺伝子の導入］
［５．１  酵母形質転換］
ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１株（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２  ＳＩＴ２：：［ＴＤＨ３−ａｒａＡ、ＥＮＯ１−ａｒａＢ、ＰＧＩ１−ａｒａＤ］  ΔＧＲＥ３：：［ＴＰＩ１ｐ−ＴＡＬ１、ＡＤＨ１ｐ−ＴＫＬ１、ＰＧＩ１ｐ−ＲＰＥ１、ＥＮＯ１  Ｐ−ＲＫＩ１］）をプラスミドｐＰＷＴ０４２で形質転換した（図１６）。プラスミドｐＰＷＴ０４２は、ベクターｐＰＷＴ００７に由来する（図１５）。それはＰＣＴ欧州特許第２００９／５２６２３号明細書で開示されるように、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのコドンペア最適化されたキシルロキナーゼ、およびバクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのコドンペア最適化されたキシロースイソメラーゼ（配列番号Ｑ２）を含有する。ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の形質転換に先だって、供給元が提供する使用説明書に従って、制限酵素ＳｆｉＩを使用してｐＰＷＴ０４２を直線化した。形質転換混合物を１ｍｌあたり１００μｇのＧ４１８（シグマアルドリッチ）を含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり１０グラムの酵母抽出物、１リットル当たり２０グラムのペプトン、１リットル当たり２０グラムのデキストロース、２０グラムの寒天）上に播種した。
【０１８５】
２〜４日後にはコロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち形質転換実験中でＤＮＡ添加なし）はブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートをもたらした。
【０１８６】
プラスミドをＳｆｉＩでｐＰＷＴ０４２消化すると、その組み込みはゲノム中のＳＩＴ４遺伝子座を対象とする（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ  ａｎｄ  Ｋａｂａｃｋ（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．６，２１８５−２１９７）（図１７）。形質転換体は、実施例１（１．２節）に記載されるようにして、ＰＣＲおよびサザンブロティング技術を使用して特性決定した。
【０１８７】
１コピーのｐＰＷＴ０４２プラスミドがゲノムに組み込まれた株をＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９と命名した。
【０１８８】
［５．２  成長実験］
ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株の単一コロニー分離株を使用して、２％グルコースまたは２％ガラクトースを添加したＹＮＢ培地（ディフコ）に接種した。接種されたフラスコは、６００ｎｍでの光学濃度が少なくとも２．０の値に達するまで、３０℃および２８０ｒｐｍでインキュベートした。
【０１８９】
１％アラビノースおよび１％キシロースを添加したＹＮＢ培地に、０．２の開始ＯＤ６００で一晩培養物を接種した。細胞を３０℃および２８０ｒｐｍで成長させた。６００ｎｍの光学濃度を定期的にモニターした。光学濃度が２．０を超える値に達した際、培養物のアリコートを２％キシロースおよび０．２％アラビノースを含有する新鮮なＹＮＢ培地に移した。添加された細胞量は、培養物の開始ＯＤ６００が０．２になるような量であった。
【０１９０】
光学濃度を定期的にモニターした。結果を図１８のパネルａ（ガラクトース上の前培養）およびパネルｂ（グルコース上の前培養）に示す。
【０１９１】
結果は株が、グルコース、ガラクトース、アラビノース、およびキシロースを利用できることを明らかに示す。
【０１９２】
［５．３  マーカーレスキュー］
プラスミドｐＰＷＴ０４２の組み込みによって導入された選択マーカー除去するために、コロニー分離株から開始して、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株をＹＰＤ培地中で培養した。２５μｌの一晩培養物を使用して新鮮なＹＰＤ培地に接種した。連続的移動後、培養物の光学濃度を測定し、１ｍｌ当たりおよそ５０００個の濃度に細胞を希釈した。１００μｌの細胞懸濁液を３０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭのフルオロ−アセトアミド（アマシャム）、および１．８％の寒天（ディフコ）を含有する酵母炭素ベース培地（ディフコ）に播種した。フルオロアセトアミド抵抗性コロニーにＰＣＲ分析を実施して、正確なＰＣＲプロフィールの場合は、サザンブロット分析を実施した（実施例１、１．３節）。サザンブロット法で正確なバンドパターンを示す株の１つは、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｘ９と命名された株である。
【０１９３】
［５．４  成長実験］
ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｘ９（ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｘ９ａ１およびＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｘ９ａ２）株の単一コロニー分離株を使用して、２％グルコースを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地（ディフコ）に接種した。接種したフラスコを３０℃および２８０ｒｐｍでおよそ２４時間インキュベートした。
【０１９４】
２％キシロースを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地に一晩培養物を０．２の開始ＯＤ６００で接種した。細胞を３０℃および２８０ｒｐｍで成長させた。６００ｎｍでの光学濃度を定期的にモニターした。結果を図１９に示す。結果は、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｘ９株の独立したコロニーの双方が、マーカーレスキュー後に依然としてキシロースを利用できることを明らかに示す。実施例３で既に示されたように、株はグルコース、アラビノース、およびガラクトースを利用できる（図１１および図１２）。
【０１９５】
［実施例６］
［アラビノースおよびガラクトース上のコハク酸生成のためのＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）形質転換］
［６．１．  発現コンストラクト］
アクチノバチルス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）からのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼＰＣＫａ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．４９）と、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）からのグリコソームフマル酸還元酵素ＦＲＤｇ（Ｅ．Ｃ．１．３．１．６）とを含んでなる発現コンストラクトｐＧＢＳ４１４ＰＰＫ−３、およびリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）からのフマラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２．）と、ペルオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼＭＤＨ３（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）を含んでなる発現コンストラクトｐＧＢＳ４１５ＦＵＭ３を本明細書に図および配列表を含めて参照として組み込んだ国際公開第２００９／０６５７７８号パンフレットの１９〜２０および２２〜３０頁で既述されたようにして作成する。
【０１９６】
プラスミドｐＰＷＴ０１８からのａｒａＡＢＤ発現カセットを含んでなるＰＣＲ産物をプラスミドｐＲＳ４１６にクローニングすることで、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来する遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤを含んでなる発現コンストラクトｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＡＢＤを構築する。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）と、本明細書で配列番号２２および配列番号２３で定義されるＰＣＲプライマーとを使用してＰＣＲ断片を作成する。ＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断し、プラスミドｐＲＳ４１６も同様にする。ライゲーションおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０への形質転換後、制限酵素分析に基づいて正しい組み換え体を選択する。プラスミドｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＡＢＤの物理的地図を図２０に記載する。
【０１９７】
［６．２．  Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株］
プラスミドｐＧＢＳ４１４ＰＰＫ−３、ｐＧＢＳ４１５−ＦＵＭ−３をＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−６Ｂ［ＭＡＴＡ  ｕｒａ３−５２  Ｉｅｕ２−１１２  ｔｒｐ１−２８９）に形質転換する。さらにプラスミドｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＡＢＤをこの酵母に形質転換して、原栄養酵母株を作り出す。発現ベクターを電気穿孔によって酵母に形質転換する。形質転換混合物を酵母窒素ベース（ＹＮＢ）ｗ／ｏ  ＡＡ（ディフコ）＋２％グルコース上に播種する。
【０１９８】
株に、唯一の炭素源としてのアラビノース上での成長のための適応進化（２節参照）を実施する。
【０１９９】
［６．３．  成長実験およびコハク酸生成］
形質転換体を２％ガラクトース（ｗ／ｖ）を含んでなるＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ．Ｊｕｌ；８（７）：５０１−１７）からなる２０ｍｌの前培養液に接種して、好気的条件下で振盪恒温器内の１００ｍｌ振盪フラスコ内で３０℃および２５０ｒｐｍで成長させる。およそ２４時間後、細胞を２％グルコース、２％ガラクトースまたは２％アラビノース、またはそれらの混合物のいずれかを含有する新鮮なＶｅｒｄｕｙｎ培地に４連で移す。２本のフラスコは好気的条件下でインキュベートし、２本のフラスコは、例えばウォーターロックを使用してフラスコを閉鎖して、または嫌気性軌道振盪機内でのインキュベーションによって、嫌気的条件下でインキュベートする。周期的に培養サンプルを採取する。サンプルを４７５０ｒｐｍで５分間遠心分離する。１ｍｌの上清を使用し、６．４．節に記載されるようにしてＨＰＬＣによりコハク酸レベルを測定する。
【０２００】
［６．４．  ＨＰＬＣ分析］
有機酸および糖の定量のためにＨＰＬＣを実施する。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ−ＲＨＭ−単糖類カラムの分離の原理は、逆相機序を使用した、サイズ排除、イオン排除、およびイオン交換に基づく。検出を示差屈折率および紫外線検出器によって実施する。
【０２０１】
［文献］
文献番号  出典
（１）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９４  Ｖｏｌ．４７  ２８３−２８４頁
（２）Ｍｉｃａｒｄ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  Ｖｏｌ  １９  １６３−１７０頁
（３）ＤＯＥ  Ｒａｄｋｅ，Ｉｄａｈｏ  ｗｈｅａｔ  ｓｔｒａｗ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
（４）Ｇｒｏｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｏｔａｓｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７  Ｖｏｌ．３２  Ｎｏ  ５  ４０５−４１５
（５）Ｓａｓｋａ  Ｂ  ＆  Ｂ  １９９５  ５１７−５２３
（６）ＰＣＴ／欧州特許第２００９／５２６２３号明細書
（７）Ｚｈｅｎｇ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，Ｖｏｌ．１３６−１４０  ４２３−４３６頁
（８）Ｂｒａｄｓｈａｗ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７  Ｖｏｌ  １３６−１４０  ３９５−４０６頁
（９）Ｃａｒａ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７  Ｖｏｌ  １３６−１４０  ３７９−３９４頁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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