(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイトで発現され、かつマラリアに対する無菌的免疫を有する個人によって免疫学的に認識される、単離されたタンパク質または該タンパク質をコードする単離された核酸分子を含み、前記単離されたタンパク質は、ＰＦＩ０９２５ｗ；ＰＦ１４＿００５１；ＰＦＤ０４８５ｗ；ＰＦＬ２１４０ｃ；ＰＦＥ１０８５ｗ；およびＰＦ１３＿０２２２からなる群から選択された遺伝子座でコードされる、またはその免疫原性断片もしくは誘導体である、免疫原性組成物。
【請求項２】
遺伝子座ＰＦＢ０２８５ｃ、ＰＦＬ１６２０ｗ、ＰＦ１０＿０２１１、ＰＦＢ０１５０ｃ、ＰＦＥ００６０ｗ、ＰＦ０８＿００３４、ＰＦ０８＿００５４、ＰＦＣ０２１０ｃ、ＰＦ１１＿０４０４、ＰＦＬ２５０５ｃ、ＭＡＬ１３Ｐ１．２２、ＰＦ１１＿０３４４およびＰＦ１３＿０２０１でコードされる１種以上の単離されたタンパク質、その免疫原性断片もしくは誘導体、または該タンパク質、該免疫原性断片もしくは該誘導体をコードする単離された核酸分子をも含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記単離されたタンパク質は、配列番号２、６、８、２４、２８および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
配列番号４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２６、３０、３２、３４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種以上のタンパク質、その免疫原性断片もしくは誘導体、または該タンパク質、該免疫原性断片もしくは該誘導体をコードする単離された核酸分子をも含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記核酸分子は、哺乳類で発現可能な１種以上の発現ベクターに挿入されている、請求項３または４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記核酸分子は、配列番号１、５、７、２３、２７および３５からなる群から選択される核酸配列からなる、またはその実質的な部分もしくはオーソログである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
配列番号３、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２９、３１、３３および３７からなる群から選択される核酸配列からなる１種以上の核酸分子、またはその実質的な部分もしくはオーソログをも含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
哺乳類におけるマラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項１から７のいずれか一項に記載された免疫原性組成物。
【請求項９】
前記発現ベクターは、ＤＮＡプラスミドまたは複製もしくは非複製ウイルスベクターである、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
１回以上のプライミングおよび１回以上のブースティング免疫付与を含むマラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項８に記載の免疫原性組成物であって、
前記プライミング免疫付与では、前記タンパク質または発現ベクターに挿入された１種以上の単離された前記核酸分子を含み、前記ブースティング免疫付与では、前記タンパク質または発現ベクターに挿入された１種以上の単離された前記核酸分子を含む、免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記発現ベクターは、ＤＮＡプラスミド、アルファウイルスレプリコン、アデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、イヌジステンバーウイルス、黄熱ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択される、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記発現ベクターは、ＤＮＡプラスミド、アルファウイルスレプリコン、アデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、イヌジステンバーウイルス、黄熱ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択される、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記プライミング免疫付与では、前記核酸分子が挿入されたベクターは、アルファウイルスベクターを含み、前記ブースティング免疫付与では、アルファウイルスベクターではない、前記核酸分子が挿入されたベクターを含む、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記プライミング免疫付与では、前記核酸分子が挿入されたＤＮＡプラスミドまたはアデノウイルスである発現ベクターを含み、前記ブースティング免疫付与では、前記プライミング免疫付与のアデノウイルスとは異種の、前記核酸分子が挿入されたアデノウイルス、ポックスウイルスまたは前記タンパク質を含む、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記アルファウイルスレプリコンの調製物は、ＲＮＡレプリコン、ＤＮＡレプリコンおよびアルファウイルスレプリコン粒子からなる群から選択される、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびシンドビスウイルスからなる群から選択される、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記アルファウイルスベクターではないベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択される、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記ポックスウイルスは、牛痘、カナリア痘、ワクシニア、改変されたワクシニアアンカラおよび鶏痘からなる群から選択される、マラリアに対する免疫応答を誘導するための方法で使用される、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、抗マラリアワクチン成分としての使用およびこれら抗原に対する免疫応答を誘導する方法のための熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来のＤＮＡ配列およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ）という生物の昆虫媒介によって起こる。この原虫は、ステージに特異的なタンパク質の発現を必要とする複雑なライフサイクルを有する。これらタンパク質は、異なるステージで発現するか、またはステージに特異的である。マラリアは、マラリア流行地で生活する３０億人以上にとって、極めて重要な疾患である。年間１００万人以上の死者がマラリアに起因している。薬剤耐性株の出現が、疾患の治療における問題をさらにこじらせている。不運なことに、ＦＤＡで認可されたワクチンは存在しない。
【０００３】
熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の全ゲノム配列が決定された（非特許文献１、非特許文献２）。また、げっ歯類のマラリア原虫であるＰ．ｙｏｅｌｉｉも、配列が決定された（非特許文献３）。しかし、こうした事情にもかかわらず、有効な抗マラリアワクチンの開発は、有望な抗原の不足によって厳しく阻まれている。熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉのゲノムの配列決定は、当該ゲノム中に５２００以上の遺伝子の同定をもたらしている。しかし、可能性のある遺伝子ターゲットが数多くあるのにもかかわらず、データセットの使用だけでは、新たなワクチン構成物を得られそうもない。その結果として、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のプロテオームのたった０．２％のみしか臨床試験の対象となっていない。その上、ワクチン候補抗原は、被験者での有意な防御を誘導できなかった。それにもかかわらず、放射線で弱毒化されたスポロゾイトでのマウスおよびヒトに対する免疫付与が高度な免疫（＞９０％）をもたらしたことは、有効な抗マラリアワクチンの開発が可能であることを示唆している。当該防御免疫は、多様なスポロゾイトおよび肝臓期の抗原を標的としているようである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４００：５３２−５３８（１９９９）
【非特許文献２】Ｇａｒｄｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４１９：４９８−５１１（２００２）
【非特許文献３】Ｃａｒｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４１９：５１２−５１９（２００２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対するワクチン組成物および免疫付与の方法に関する。本発明の組成物は、感染性の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対する無菌的防御に関連する熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の肝臓期のタンパク質を含む。１つの実施の形態では、タンパク質は、単独で、または複数を組み合わせて、サブユニット抗原として免疫原性組成物に組み込まれる。他の実施の態様では、最大の免疫原性のために、すべての同定されたタンパク質が１つの免疫原性組成物に含まれる。あるいは、タンパク質の複数の組み合わせが、複数の免疫原性組成物による免疫付与レジメンで投与され、各組み合わせは、該免疫原性タンパク質の特異的な組み合わせを含む。１つの実施の形態では、免疫原性組成物は、同定された１種のタンパク質を含み、該タンパク質は単離および精製されたものである。他の実施の態様では、免疫原性組成物は、同定された２種以上で、全部で１９種までのタンパク質を含み、該タンパク質は単離および精製されたものである。
【０００６】
他の実施の態様では、１種以上のタンパク質をコードするＤＮＡが、哺乳類宿主でのｉｎ  ｖｉｖｏ発現に適切なベクターに組み込まれる。発現され、精製されたタンパク質は、次に１つまたは複数の投与量で、ヒトなどの哺乳類に投与される。この実施の形態では、１種以上の無菌的免疫関連タンパク質をコードするＤＮＡが適切な発現系に挿入されてもよい。適切な発現系は、限定されないが、Ｂｒｕｄｅｒらのアデノウイルスをベースにした系（２００８年１０月９日に公開された米国出願公開第２００８／０２４８０６０号明細書）、またはＤＮＡプラスミド系などである。この実施の形態では、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）をコードするＤＮＡを含む他のベクター系が、適切な発現系のインサートとして投与され、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現される。この実施の形態では、免疫原性組成物は、１種以上、またはすべての無菌的免疫関連タンパク質をコードするＤＮＡを含んでもよい。タンパク質は、１種以上のタンパク質をコードする１つのベクターによって、または哺乳類におけるＤＮＡの発現に適切な複数の発現系によって発現される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、選択基準およびＡＵＣプロファイルの概要を示す。（Ａ）スポロゾイトで誘導される防御に関連する抗原を同定するために分析が行われた。スポット定量後、分散を調整するためにシグナル強度がａｓｉｎｈ／ｖｓｎログ変換され、陰性対照で標準化され、免疫付与後（ｐｏｓｔ−Ｉ）および惹起前（ｐｒｅ−Ｃ）の時点が組み合わされ、次に、定義された統計的（ベイズ−正規化ｔ検定、受信者操作特性曲線下面積（ＡＵＣ）分析）および生物学的基準に従って解析された。合計８６種の断片（熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の７８種のタンパク質）が放射線を受けたスポロゾイトの全リストを介するいずれかの方法で同定された。無菌的免疫関連タンパク質は、両方の方法で共通していた。（Ｂ）非防御群および防御群に関するすべての抗原のＡＵＣ値がＲ統計環境ソフトウェア（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇから利用可能）で決定された。抗原の順位がそれらのＡＵＣ値に対して表示される。１．０に近いＡＵＣ値は、放射線を受けたスポロゾイトの免疫付与で誘導される防御に対する抗原の強い関連を示唆する。ＡＵＣ値０．５は、偶然であることを示唆する。ＡＵＣ値０．７が、陽性の閾値として選択された。
【図２】図２は、放射線を受けたスポロゾイトで誘導される防御に関連する表１におけるタンパク質の認識の程度と頻度とを示す。（ＡＵＣで順位付けされた）抗原に関して、防御群および非防御群のすべての被験者による各抗原に関するシグナル強度の合計を表す累積シグナル強度が示される。＊＊＊Ｐ＜０．００５５である。
【図３】図３は、放射線を受けたスポロゾイトで誘導される防御に関連する表１におけるタンパク質の認識の程度と頻度とを示す。防御（Ｐ）および非防御（ＮＰ）の個人によるタンパク質の認識の頻度である。♯は、現在の臨床候補：ＡＭＡ１（ＰＦ１１＿０３４４）；ＣＳＰ（ＰＦＣ０２１０ｃ）；ＳＳＰ２／ＴＲＡＰ（ＰＦ１３＿０２０１）を表す。
【図４】図４は、放射線を受けたスポロゾイトで誘導される防御に関連する表１におけるタンパク質の認識の大きさと頻度とを示す。各臨床群（防御が白いバー；非防御が黒いバー）における抗原の平均シグナル強度は、抗原ＩＤがｘ軸に付されたヒストグラムで表されている。各抗原の平均シグナル強度（±ｓ．ｅ．ｍ）が示されている。抗原は、ＡＵＣ値の降順で並んでいる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書で用いられる場合、“無菌的免疫”は、標的疾患を引き起こす有機体の原因物質が排除され、または疾患を引き起こすことが阻害される免疫を意味する。
【０００９】
本明細書で用いられる場合、“ポリペプチド”は、アミノ酸のポリマーを意味し、産物の特定の長さを意味しない。タンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。本明細書で用いられる場合、タンパク質は、本明細書に記載された１種以上のポリペプチドの有効量を、複数の方法で免疫原性組成物に包含させるように調製されてもよい。例えば、それらは、分子法、プラスミドからの発現またはウイルス系のような他の発現系による適切な遺伝子断片を最初に発現させ、その後単離されることを含んでもよい。
【００１０】
本明細書で用いられる場合、タンパク質の“免疫原性断片”は、少なくとも８アミノ酸の長さのタンパク質の領域を意味し、該アミノ酸配列は、該タンパク質由来であって、当該断片は、免疫応答を誘導できる、または免疫細胞で認識される。
【００１１】
本明細書で用いられる場合、タンパク質の“誘導体”は、本明細書に記載された配列に対して８０％より高いアミノ酸配列同一性を有するタンパク質である。これに関連して、用語“同一性”は、最大に一致させたときに、同一または同一であるアミノ酸残基が特定の割合である２つ以上の配列またはサブ配列を意味する。配列が保存的置換、すなわち同一特性を有する残基での置換で異なる場合、置換について保存された特性に関して補正するために、パーセント配列同一性は高く調整されてもよい。
【００１２】
本明細書で用いられる場合、本発明の特徴は、同定されたタンパク質もしくはその実質的な部分をコードするアミノ酸配列のすべて、もしくは実質的な部分をコードするヌクレオチド配列に関する。タンパク質の“実質的な部分”は、当該配列がコードするタンパク質の推定上の同定をもたらすのに十分なアミノ酸配列を含む（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３））。また一般には、これは、既知のタンパク質に相同性のあるタンパク質の同定を可能にする隣接するおよそ９以上のアミノ酸である。“オーソロガス”なヌクレオチド配列は、同一機能であるが異なる種におけるタンパク質をコードする配列である。
【００１３】
“抗原”は、抗体またはＴ細胞のような免疫物質を刺激または免疫物質と反応できる少なくとも１つのエピトープを含む化学的部分である。“免疫原性組成物”は、投与されると免疫応答を引き起こす化学物質、化合物または製剤を意味する。“ワクチン”は、防御免疫を誘導するために用いられる免疫原性組成物である。“ＤＮＡ発現系”は、ポリペプチドとして挿入されたＤＮＡ配列を発現するための要素を含むプラスミドまたは閉じたループＤＮＡを含む分子系である。“ウイルス発現系”は、ウイルス様粒子またはウイルスのレプリコンなどの任意のウイルスをベースにした系であって、ポリペプチドとして挿入されたＤＮＡ配列を発現するための要素を含む。
【実施例】
【００１４】
実施例１：無菌的免疫関連タンパク質の同定
本実施例は、マラリアに対する無菌的免疫に関連するタンパク質の同定を例示する。この実施例では、放射線で弱毒化された熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト（ＩｒｒＳｐｚ）で実験的に免疫付与された被験者が感染性の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイトでの惹起後に臨床的に分けられ、６人は無菌的に防御されてスポロゾイト−免疫（ＩｒｒＳｐｚ防御）として分類され、５人は血液期の原虫血症になり、スポロゾイトに暴露されたが非免疫（ＩｒｒＳｐｚ非防御）として分類された。
【００１５】
対象者は、放射線で弱毒化された熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、（Ｐｆ（３Ｄ７））のスポロゾイトで実験的に免疫付与され、過去に公表されたように（Ｈｏｆｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８５：１１５５−１１６４（２００２）；Ｅｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．４９：１６６−１７３（１９９３））、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に感染したハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｉｎｅ）の蚊で惹起された。対象者は、惹起後、血液期マラリア症になっているかを調べるために薄層血液塗抹標本によって、毎日監視された。２８日のフォローアップの間、血液期の原虫血症がまったく見られない場合、無菌的防御と判断された。
【００１６】
スポロゾイトで免疫付与された６人の被験者は、スポロゾイト惹起に対して防御され、５人は防御されなかった（すなわち、臨床的なマラリアになった）。１人は、最初の惹起では防御されなかったが２回目の一連の免疫付与後に防御されたので両方の群である。血漿が免疫付与の前（免疫付与前）、３回目の免疫付与後、免疫付与系列の完了時（５回目、６回目、または７回目の免疫付与）、惹起直前（惹起前）および惹起の後（惹起後）に各個人から収集された。原虫の感染性を明らかにするために、感染性対照群（ｎ＝３）が、惹起に用いられた同一の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に感染した蚊で同時に感染された。血漿が惹起の前（惹起前）及び惹起の後（惹起後）に対応する時点でこれら個人から収集された。付加的な群（ｎ＝５）が非感染の蚊に刺されることで擬似免疫付与され、ＩｒｒＳｐｚで免疫付与された対象者の免疫付与前、３回目の免疫付与後および最後の免疫付与後の時点に対応する時点で血漿が収集された。また、これまでにマラリアに暴露したことが判明していない被験者（ｎ＝１０）から収集した血漿が評価された。
【００１７】
ＩｒｒＳｐｚ−誘導防御に関連する抗原を同定するために、防御、非防御、感染性、擬似免疫付与および未感作の個人から、免疫付与過程の異なる段階（または非免疫付与の個人に関しては対応する時点）で収集された血漿が、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の１２００種のタンパク質に対応する２３２０種の断片に対する熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マイクロアレイで調べられた。次に、各断片の抗体認識が評価された。
【００１８】
各免疫付与群において異なる抗体プロファイルが得られ、すべての群内の個人間で応答にばらつきがあった。概して、抗体認識において著しく異なるパターンが防御群と非防御群との間で見られ、これは過去のデータと一致する（Ｄｏｏｌａｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：４６８０−４６９４）。血液期の原虫血症または臨床上疾患にならなかった防御された個人に関して、惹起前および惹起後の時点で抗体の反応性に違いはなく（Ｐ＜０．６）、かつ認識された抗原の数に変化はなかった（惹起前の３４０種に対して惹起後の３８０種）。
【００１９】
推定上のタンパク質、ならびにタンパク質配列およびＤＮＡ配列が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のゲノム配列データベース（ｗｗｗ．ｌａｓｍｏｄｂ．ｏｒｇ）から得られ、ステージ特異的な転写またはタンパク質発現、細胞内局在性、タンパク質の二次構造、およびヒトまたは動物モデルにおいて文献で確認された免疫原性に基づいて選択された。当該リストは、抗原選択の際に、原虫のライフサイクルの間の同じ時点におけるＭｕｄＰＩＴ（多次元タンパク質同定技術）（Ｆｌｏｒｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１９：５２０−５２６（２００２）、ｗｗｗ．ｌａｓｍｏＤＢ．ｏｒｇ）による発現の証拠を伴うすべての推定上の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のタンパク質を含んでいた（ｎ＝１０４９）。
【００２０】
選択された遺伝子は、ｐＸＴ７プラスミド（Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）  １０２：５４７−５５２（２００５））に相同なクローニングサイトを含むカスタムＰＣＲプライマーを用いて、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のゲノムＤＮＡ（３Ｄ７株）に対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって増幅された。長いＰＣＲ産物の合成を制限するために、３０００ｂｐより長いエキソンを有するタンパク質は、５０ヌクレオチドが重複する複数の重複部位に分けられた。ＰＣＲ反応は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（３Ｄ７株）を１−１０ｎｇ、０．０４Ｕ／μｌのプルーフリーディングＴａｑポリメラーゼ（Ｔｒｉｐｌｅｍａｓｔｅｒ（商標）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ホーポージ、ニューヨーク州）および０．４ｍＭの各ｄＮＴＰを含有する５０μｌの反応量で、９５℃で３分間、９５℃で１５秒間を３５サイクル、４０℃で３０秒間および５０℃で６０秒／ｋｂおよび５０℃で１０分間の最終伸長のサイクル条件で行われた。増幅が難しいことが判明したいくつかのタンパク質については、５０ｎｇのｇＤＮＡが用いられた。産物は、アガロースゲル電気泳動法で可視化され、蛍光光度法で定量された（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバット、カリフォルニア州）。
【００２１】
プラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えクローニングおよびｐＸＴ７クローニングベクターを用いてＰＣＲ増幅された断片から作製され、該プラスミドは、Ｎ末端に１０ｘヒスチジン（Ｈｉｓ）タグおよびＣ末端に血球凝集素（ＨＡ）タグをコードしている（３．２ｋｂ、ＫａｎＲ）。簡潔には、１ｎｇのＢａｍ  ＨＩ、切断されて、連結されたｐＸＴ７テンプレートならびにカスタムプライマー５’−ＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＣおよび５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧが用いられ、０．０２Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ、０．１ｍｇ／ｍｌのゼラチン（ブタ）および０．２ｍＭの各ｄＮＴＰでのＰＣＲ（５０μｌの反応）によって標的遺伝子を含む線状のアクセプタベクターを生成した。サイクル条件として、９５℃で５分間、９５℃で０．５分間を３０サイクル、５０℃で０．５分間および７２℃で３．５分間、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長が用いられた。精製後（Ｑｉａｇｅｎ社、ヴァレンシア、カリフォルニア州）、ＰＣＲ産物はゲル電気泳動法で可視化され、蛍光光度法で定量された（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバット、カリフォルニア州）。
【００２２】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）が、過去に公表されたように（Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  １０２：５４７−５５２（２００５））、組み換え反応によって線状のｐＸＴ７プラスミドにクローン化された。簡潔には、ベクターとインサートとの間が１：１のモル比で線状ベクターとＰＣＲで合成したＯＲＦ断片との混合物２０μｌが、追加の精製をすることなく、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換され、３７℃で１時間インキュベートされた後、一晩培養のための５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する３ｍｌのＬＢ培養液へ希釈された。プラスミドは、単離され、さらに選別されることなく、ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヴァレンシア、カリフォルニア州）を用いて精製された。これらのプラスミドのサブセットは確認された配列であった。
【００２３】
タンパク質の発現および検出は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞転写および翻訳反応（ｒａｐｉｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＲＴＳ）  １００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  ｋｉｔｓ、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行われた。反応は、製造者の使用説明書に従って、２５μｌの量で、３０℃で５時間のインキュベーションで行われた。品質管理の目的で、ニトロセルロース（ＮＣ）上に０．３μｌのＲＴＳ反応液をスポットし、０．０５％ポリソルベート２０を含有するＴＢＳ中の５％の無脂肪ミルク粉末でブロッキングする前に空気乾燥することによるイムノドットブロットで、全ＯＲＦの約３１％に対する相対的なタンパク質の発現効率が評価された。ドットブロットは、マウス抗ポリＨｉｓモノクローナル抗体（クローンＨＩＳ−１；Ｓｉｇｍａ社）およびラット抗ＨＡモノクローナル抗体（クローン３Ｆ１０）（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社、バーゼル、スイス）で染色され、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）もしくはヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体のそれぞれ、またはヒト高度免疫性の血漿（１０％の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を伴うブロッキングバッファに１：１０００で希釈された）に続くアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｈ＋Ｌ）で検出された。ブロットは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）顕色剤で可視化された。
【００２４】
１０μｌの０．１２５％ポリソルベート２０／ＰＢＳと１５μｌのＲＴＳ反応液とを混合することでマイクロチップが調製され、次に１５μｌの量が３８４穴プレートに移された。すべての沈殿物をペレットにするために、プレートが遠心分離機にかけられ（１６００ｘｇ、５分間）、ＯｍｎｉＧｒｉｄ  １００  マイクロアレイプリンタを用いて、上清中のタンパク質が追加の精製なしに３−パッドＮＣ被覆ＦＡＳＴ（商標）ガラススライド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、キーン、ニューハンプシャー州）に直ちにプリントされた。アレイは、乾燥され、乾燥機内に室温で遮光して保管された。
【００２５】
ＤＮＡプラスミドを欠いて行われたＲＴＳ反応液が、陰性または非特異的に認識される対照スポットとして各アレイについてプリントされた。また、精製されたヒト総ＩｇＧおよびエプスタイン−バー核抗原（ＥＢＮＡ１）タンパク質が、それぞれプローブ対照および血漿対照として、連続的に希釈された濃度で各アレイにプリントされた。
【００２６】
ヒト血漿中に存在する抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体の高い力価がアレイにおけるタンパク質に特異的な反応性を隠してしまうため、血漿が３０分間室温でタンパク質アレイブロッキングバッファ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）  （１：１００希釈）で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の溶解物に対して事前に吸収された（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  １０２：５４７−５５２（２００５））。
【００２７】
スライドは水で元に戻され、３０分間室温においてブロッキングバッファ中でブロックされた。次に、ブロッキングバッファで１：１００に希釈された５００μｌの血漿が各パッドに加えられ、スライドが揺れ台（Ｒａｔｅｋ（商標）、ＩｎＶｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）上で、４℃で一晩、穏やかな一定速度でインキュベートされた。血清抗体は、ビオチン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（１：１０００希釈、室温で１時間、穏やかな一定速度で、Ｆｃ断片、（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ウエストグローブ、ペンシルベニア州）で検出され、ストレプトアビジンＰ−３結合抗体（１：２００希釈、室温で１時間、穏やかな一定速度で）で可視化された。空気乾燥されたスライドがＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ（商標）４３００Ａアレイスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州）でスキャンされ、蛍光強度がＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ７（商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール、カリフォルニア州）を用いて定量化された。ソフトウェアを用いて、すべてのシグナル強度がスポット特異的バックグラウンドに関して補正され、ここで、スポットに関する当該バックグラウンド値は、スポット周囲領域から算出された。
【００２８】
熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のタンパク質マイクロアレイを確認するために、よく特徴付けられた３つのマラリアワクチン候補であるＣＳＰ、ＡＭＡ１およびメロゾイト表面タンパク質２（ＭＳＰ２）に対する抗体反応性がＲＴＳシステムを介して、または従来の方法を用いて示され、同じタンパク質マイクロアレイチップにプリントされた。２つの方法によって出されたタンパク質に対する反応性の間における相関の程度は高かった（ＣＳＰ（ｒ＝０．７７；Ｐ＜０．００１）、ＡＭＡ１（ｒ＝０．７８；Ｐ＜０．００１）、ＭＳＰ２（ｒ＝０．９６；Ｐ＜０．００１））。アレイ検査の再現性を検討するために、２つの独立したチップにおけるすべてのＨＡスポットに対する反応性が評価され、高度に相関していた（ｒ＝０．９２、Ｐ＜０．００１）。さらに、より小さいマイクロアレイチップが熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の４９種のタンパク質のサブセットで製造され、より多い２３２０種の断片の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のタンパク質アレイを検査するために使用したものと同じ血漿について検査された。２つのマイクロアレイにおける血漿の反応性の間には強い相関があった（ｒ＝０．９１、Ｐ＜０．００１）。
【００２９】
標準の統計手法を用いて低いおよび高いシグナル強度（特異的認識）を解析するために、マイクロアレイプラットフォームの異分散の性質（Ｄｕｒｂｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８  Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ１０５−１１０（２００２）；Ｉｄｅｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ  ７：８０５−８１７（２０００）およびデータにおける固有の分散−平均依存性（Ｓｕｎｄａｒｅｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２：１７６０−１７６６（２００６）；Ｓｕｎｄａｒｅｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：ｉ５０８−５１８（２００７））が考慮され、安定化される必要があった。したがって、未処理のシグナル強度が、ａｓｉｎｈ（Ｅｘｃｅｌ  ２００７、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社；（Ｓｕｎｄａｒｅｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２：１７６０−１７６６（２００６））または分散安定正規化（ｖｓｎ）（バイオコンダクタソフトウェア（ｗｗｗ．ｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）（Ｈｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８  ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ９６−１０４（２００２））のいずれかを用いて変量ログに変換され、特異的に認識された抗原間の未処理のシグナルにおける分散と実験の影響とが減らされた。
【００３０】
抗原の順位付けおよび選択の前に、各血漿試料に関するデータは、すべての血漿に同一の基準値を適用するために、標準化比（ある個人に関するすべての陰性対照の平均ＳＩ／全個人に関するすべての陰性対照の平均ＳＩ）の乗算によって基準化された。各群における各個人に関する免疫付与後および惹起前の時点は、データがそれらの時点の間で有意な差が見られない場合、試料サイズの目的のために組み合わされ、データは生物学的および統計学的に解析された。受信者操作特性曲線（ＲＯＣ）下面積（ＡＵＣ）およびベイズの正規化ｔ検定（Ｒ統計環境ソフトウェア、ｗｗｗ．ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）が防御群と非防御群との間で特異的に認識された抗体を同定するために用いられた（Ｂａｌｄｉ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：５０９−５１９（２００１））（図１）。統計的解析（ＡＵＣおよびｐ値の両方）は、多重検定補正で行われておらず、むしろ、これらの統計データは、結果的に２群の比較するため、およびデータを順位付けるための方法として用いられたことに留意されたい。関心のある抗原の同定は、他の関連する基準、すなわち異なる群における認識に加えて、順位の組み合わせでなされた。
【００３１】
両方の変換方法における所定タンパク質に対する陽性の免疫応答性に関する基準は、平均シグナル強度、陰性対照（すべての個人）を上回る２つの標準偏差として決定された。データは、色が抗原に関するＳＩ範囲を示すヒートマップで可視的に表された。赤は高いＳＩ（反応性）を表し、黒は中間の反応性を表し、緑は低い反応性を表す。遺伝子オントロジー（ＧＯ）の注釈解析がＧＯｓｔａｔｓおよびｏｒｇ．Ｐｆ．ｐｌａｓｍｏ．ｄｂ  Ｒ  ｐａｃｋａｇｅを用いて行われた。注釈の増加に関する有意性は、フィッシャーの直接確率検定を用いて評価された。
【００３２】
血清反応性における著しい変化が、惹起前の時点と惹起後の時点とを対比して非防御の個人に認められ、全体のシグナル強度（ＳＩ）（Ｐ＜２ｅ−９１）および認識された抗原の数（惹起前の２９２種に対して惹起後の７３９種）の顕著な増加が見られ、これは明らかな原虫血症が進行するうえでの血液期抗原への暴露と整合する。
【００３３】
また、対照の個人の感染性に関する分析結果は、抗原のサブセット（惹起前の２８９種に対して惹起後の５４６種）において、惹起前と惹起後とを対比したＳＩで有意な増加を示し（Ｐ＜２ｅ−３０）、惹起後認識された抗原の８９％（５４６種）も非防御群の惹起後によって認識されたため、血液期の原虫で発現されたことがわかる。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原に対する最小の反応性がマラリア未感作の個人または擬似免疫付与された個人由来の血漿で認められ、これは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に暴露されていないことと整合がとれている。
【００３４】
スポロゾイトでの惹起に対する防御に推定上相関がある熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の抗原を同定するために、ｖｓｎ法およびａｓｉｎｈ法のいずれかを用いて標準化および分散補正が行われた。防御群および非防御群の両方に関して、ＳＩまたは３回目の免疫付与後または最後の免疫付与後（惹起前）の時点で認識された抗原の数に有意な変化がなかったため［Ｐ＜０．２５（非防御群）、Ｐ＜０．２（防御群）］、生物学的に類似する時点のこれらのデータは後の解析のために組み合わされた。ＣｙｂｅｒＴ（商標）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、アーバイン、カリフォルニア州）（ベイズの正規化ｔ検定）の平均ＳＩのｐ値および受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線が防御群および非防御群を判別する抗原の能力を測定するために用いられたため、同定している抗原は、推定上、スポロゾイト誘導の防御に関連がある。選択基準は図１に示される。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）の値１．０が完全な予測であって、０．５が無作為機会、および０．５未満が間違った方向への予測である。
【００３５】
ｖｓｎ法およびａｓｉｎｈ法の両方に関して、抗原が次の基準に従って選択された：（ｉ）抗原性（防御）；すなわち陰性対照を上回る２つの標準偏差（ＳＤ）より大きい平均ＳＩ；（ｉｉ）少なくとも２人の防御された個人によって認識された；（ｉｉｉ）防御群において非防御群よりも大きい平均ＳＩ；（ｉｖ）０．７以上のＡＵＣ値；および（ｖ）ＣｙｂｅｒＴ（商標）ｐ値＜０．０５（防御に対する非防御）。
【００３６】
いずれかの方法で同定された抗原の組み合わせは、７７種のタンパク質に対応する合計８６種の断片を明らかにし、これが“全体的なＩｒｒＳｐｚ”リストと呼ばれた。３０００ｂｐより大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が重複した部分としてクローン化されたため、５種のタンパク質（ＰＦ１４＿００５１、ＰＦＩ０２４０ｃ、ＰＦ１０＿０１８３、ＰＦ１０＿０２１１、ＭＡＬ１３Ｐ１．１０７）は当該リストにおいて２種の免疫応答性断片を有し、２種のタンパク質（ＰＦ１１＿０３９５、ＭＡＬ７Ｐ１．１４６）は３種の断片を有する。ＡＵＣ値で順位付けされた場合、リスト内の５種の抗原（６％）が０．９より大きいＡＵＣ値を有し（１．５ｅ−３＜Ｐ＞３．８ｅ−３）、３１種の抗原（３６％）が０．８より大きいＡＵＣ値を有する（１．５ｅ−３＜Ｐ＞４．４３ｅ−２）。
【００３７】
全体的なＩｒｒＳｐｚリストは、３種の現在のワクチン候補：ＡＭＡ１（ＰＦ１１＿０３４４）、ＣＳＰ（ＰＦＣ０２１０ｃ）、およびＳＳＰ２／ＴＲＡＰ（ＰＦ１３＿０２０１）を含んでいた。興味深いことに、それらは、防御された個人において高度な抗原性を示し、当該群内で９２％（ＡＭＡ１）、１００％（ＣＳＰ）および１００％（ＳＳＰ２／ＴＲＡＰ）の認識であったが、非防御の個人によっても同程度認識された（それぞれ９２％、１００％、１００％）。このリスト内の他の７５種のタンパク質は、過去に特徴付けられていた。
【００３８】
１９種のタンパク質に対応する２０種の断片のサブセットは、ｖｓｎ法およびａｓｉｎｈ法で共通した。これらは、表１に示されている。これら抗原の３種（すなわち、ＰＦＢ０２８５ｃ、ＰＦＥ１０８５ｗ、ＰＦ０８＿００５４）は、非防御の個人によって認識されず、１０種の抗原は、非防御群と比較して防御群で高い頻度で認識された。７種の抗原（ＣＳＰ、ＳＳＰ２／ＴＲＡＰ、およびＡＭＡ１を含む）は、２群で似たような頻度で認識されたが、防御された個人は、有意に高い応答の程度を有していた（０．００３４＜Ｐ＞０．００７７、２−４倍高い平均ＳＩ）（図２）。
【００３９】
【表１】
0005813854.tif 000002
【００４０】
また、全体的なリスト内の最高のＡＵＣ値（０．８６−０．９３）である１０種の抗原は、かなり低いｐ値であった（防御に対する非防御；０．００１５−０．０３３）。予想外に、これら抗原のすべてが３０００未満の平均ＳＩ（防御）であったことは、単一の抗原に対する高い抗体認識および反応性（すなわち、血清優性（ｓｅｒｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ））がスポロゾイト誘導防御に相関しないことを示唆している。実際には、８６種の抗原のうち７５種に関する平均ＳＩは、５０００未満であって、８６種のうち８０種は、１００００未満であった。
【００４１】
図２に示すように、防御された個人は、非防御の個人と比較して表１の抗原に対する有意に大きい累積された抗体反応を有していた（Ｐ＜０．００５５）。図４は、各臨床群に関して表１における２０種の抗原の平均シグナル強度を示す。防御された個人と非防御の個人との間における累積された応答のこの顕著な違いは、個々の抗原ではなく、１群の抗原に関連する無菌的免疫を示唆する。
【００４２】
全体的なＩｒｒＳｐｚリスト（９３％、７２／７７タンパク質）および表１の遺伝子（８９％、１７／１９タンパク質）の多数が、スポロゾイトの独立した質量分析（ＭＳ／ＭＳ）分析（Ｆｌｏｒｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１９：５２０−５２６（２００２）；Ｈａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：８２−８６（２００５）；Ｌａｓｏｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．４：ｅ１０００１９５（２００８）；Ｋａｐｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９８：９８９５−９９００（２００１））または肝臓期および／またはスポロゾイトの遺伝子発現データ（Ｋａｐｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９８：９８９５−９９００（２００１）；Ｌｅ  Ｒｏｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１５０３−１５０８（２００３）；Ｒｏｓｉｎｓｋｉ−Ｃｈｕｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：４６６（２００７）；Ｓｉａｕ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．４：ｅ１０００１２１（２００８）；Ｔａｒｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５：３０５−３１０（２００８）），ＰｌａｓｍｏＤＢ（商標））を介して検出され、原虫ライフサイクルの前赤血球期の間での遺伝子の発現が確認される。
【００４３】
実施例２：防御に関連する抗原の特徴
本実施例は、防御に関連するタンパク質の特徴を説明する。ＩｒｒＳｐｚ−誘導防御に推定上関連する抗原の特異的なゲノムのまたはプロテオームの特徴を同定するために、全体的なＩｒｒＳｐｚリストおよび表１に挙げたタンパク質について選択された特徴が、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のゲノムに対して、ならびに既知の血液期の抗原（ＢＳＡ）およびスポロゾイト／肝臓期抗原（ＳＬＡ）に対して比較された。全体的なＩｒｒＳｐｚリスト由来の抗原および表１に挙げられた遺伝子は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ゲノム、ＢＳＡまたはＳＬＡ（表２）と比較して、それらの転写長、タンパク質の長さおよび分子量それぞれが平均３および２．５倍である；これは、大きいタンパク質が抗体認識に関してより多くの個数のＢ細胞エピトープを潜在的に提示するという事実と整合する。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ゲノムと比較して、等電点（ｐＩ）またはエキソン数の平均に差はなかったが、ＢＳＡおよびＳＬＡは、他の群よりｐＩの平均値が小さかった（表２）。
【００４４】
【表２】
0005813854.tif 000003
【００４５】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｅｘｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＰＥＸＥＬ）モチーフの増加が、全ゲノムおよび既知のＢＳＡと比較して、全体的なＩｒｒＳｐｚリストで確認された（２倍、表２）。７７種のタンパク質に対応する明らかになった８６種の断片の全体的なリスト。
【００４６】
既知の７種のＳＬＡの内、５種でＰＥＸＥＬモチーフが見られることは、肝臓期の原虫の肝細胞への移行における機能に整合する。シグナルペプチドがすべての既知のＳＬＡと１７種の既知のＢＳＡにおける１１種とで同定されたことは、抗体反応を誘導する分泌の役割と整合するが、シグナルペプチドを含む抗原は表１（３５％、７／２０、ｐ値＝０．０８）または全体的なリスト（２４％、２１／６８、ｐ値＝０．３１）におけるタンパク質で多くはなかった。これらデータは、ＩｒｒＳｐｚ防御が抗体よりもむしろＴ細胞によって仲介されるという概念に合致する。またこれは、表１の遺伝子または全体的なＩｒｒＳｐｚリストの抗原において、それぞれたった３０％（ｐ値＝０．６４）および３４％（ｐ値＝０．９）が、抗体認識のための表面の暴露に関連する膜貫通ドメインを定義していたという知見とも合致する（表２）。
【００４７】
同定されたタンパク質は、ＰｌａｓｍｏＤＢ（ＰｌａｓｍｏＤＢ：ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８  Ｏｃｔ  ３１．Ａｕｒｒｅｃｏｅｃｈｅａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ）から取得可能な注釈情報に基づく機能カテゴリを割り当てられた。全体の５６％および２０種の無菌的免疫関連タンパク質の４０％が仮定のタンパク質であって、残りが複数の機能化カテゴリに割り当てられた。興味深いことに、表１のタンパク質の機能カテゴリでは、ＤＮＡプロセシング／細胞周期（２０％）およびタンパク質合成（２０％）に関連する、または制御する遺伝子／タンパク質が注目すべき多さであった；細胞伝達、輸送促進およびタンパク質分解が当該サブセットで示された。また、遺伝子オントロジー解析は、ＤＮＡに関連する生物学的プロセス、侵入および代謝プロセス、ＤＮＡ関連活性ならびに、おそらく侵入目的のためのこれらタンパク質の局在の過剰提示を示唆した。
【００４８】
実施例３：免疫原性組成物および同定したタンパク質を用いたマラリアに対する免疫付与のための使用方法
本実施例では、マラリアに対する免疫応答の誘導方法を説明する。好ましい実施の態様では、表１に挙げられた同定された無菌的免疫関連タンパク質の１種以上がワクチンなどの免疫原性組成物に組み入れられる。一例では、表１に挙げられたすべてのタンパク質が免疫原性組成物に組み入れられる。
【００４９】
本実施の形態では、免疫原性組成物は、サブユニットとしての免疫原性組成物またはワクチンであってもよく、マラリアに対する無菌的防御を与える表１のタンパク質のリストから選択された１種以上の、単離されたタンパク質、または当該タンパク質の免疫原性断片もしくは誘導体を含む。また、免疫原性組成物またはワクチンは、表１の１種以上のタンパク質をコードする核酸、またはヒトなどの哺乳類での発現に好適な１つ以上の発現システムに挿入されたタンパク質の免疫原性断片もしくは誘導体から構成されてもよい。表３は、表１からのタンパク質およびそれらに関連する配列番号を挙げている。
【００５０】
【表３】
0005813854.tif 000004
【００５１】
抗原はＤＮＡワクチンまたは他のプラットフォーム系のいずれかの成分として発現されることが予期される。予期される発現系の例は、限定されないが、ウイルス系などであって、複製および非複製ベクターを含む。予期されるウイルスベクターの例は、アデノウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、サイトメガロウイルス、イヌジステンバーウイルスおよび黄熱ウイルスなどである。抗原は、ＤＮＡまたは他のワクチン発現系のインサートとして、単一または複数のプロモータからの単一の抗原または複数の抗原発現系のいずれかとして組み込まれる。
【００５２】
予期される発明は、ヒトなどの哺乳類における免疫応答を誘導するための方法を含む。本実施例では、抗原は、ポリペプチドとして、またはＤＮＡもしくはウイルス系のような核酸発現系に組み込まれるもののいずれかとして、１つ以上の用量で投与される。また、方法は、プライムブースト免疫付与レジメンを利用する免疫応答を誘導することが予期される。本実施の形態では、１回以上のプライミング免疫付与の用量が投与された後に、１回以上のブースティング免疫付与が行われる。
【００５３】
プライミングおよびブースティング免疫付与は、マラリアのポリペプチドを含む組成物を含み、該ポリペプチドは、表３の１つ以上のポリペプチド配列、またはその免疫原性誘導体を含む。あるいは、免疫原性組成物は、哺乳類でポリペプチドを発現することができる発現系を含んでもよい。本実施の形態では、表３に挙げられた、または表３のポリペプチドもしくはその誘導体をコードする核酸分子がＤＮＡプラスミドもしくはウイルス発現ベクターに挿入されてもよい。発現ベクター系の例は、アルファウイルス（およびアルファウイルスレプリコン）、アデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、イヌジステンバーウイルス、黄熱ウイルスおよびレトロウイルスなどである。
【００５４】
また、予期される方法は、免疫付与レジメンを含み、プライミング免疫付与がＤＮＡプラスミド発現ベクターまたはアデノウイルスで発現されたマラリアのペプチドを含む一方、ブースティング免疫付与がアデノウイルス、プライミングのアデノウイルスとは異種のアデノウイルス、ポックスウイルスもしくは１種以上のマラリアのポリペプチドのいずれかで発現されたマラリアのペプチドを含む。発現されたマラリアのポリペプチドおよびコードする核酸は、表３の任意の数のマラリアのポリペプチドおよび核酸配列、またはそのポリペプチドの免疫原性誘導体であってもよい。
【００５５】
実施例４：血液期に特異的な抗原
また、十分に特徴付けられたすべての血液期の抗原に対する強い免疫応答が防御されなかった群において惹起後に見られた。予期されたように、血液期で発現されることが知られた抗原に対するわずかな反応が防御群で認められ、試験の時間経過を通してそれらのヒートマップに変化はなかった。
【００５６】
非防御群に関する惹起後の反応の解析は、次の基準を用いて、血液期に特異的な新たな熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の抗原を同定することを可能にした：（ｉ）抗原性；すなわち、平均ＳＩが少なくとも２人の非防御の個人において陰性対照を超えた２つのＳＤより大きい；（ｉｉ）惹起前と比較して惹起後の認識（ｐ）が統計的に有意＜０．０５（非防御）；および（ｉｉｉ）防御された対象者によって認識されない。
【００５７】
表４に示されたように、合計２３種の抗原が基準を満たし、その２種が以前特徴付けられたもので（ＭＳＰ１［ＰＦＩ１４７５ｗ］および肝臓期抗原３［ＬＳＡ３、ＰＦＢ０９１５ｗ］）および２１種が新規なものであった。表４のタンパク質およびこれらのタンパク質をコードするＤＮＡの配列番号が表５に示されている。
【００５８】
【表４】
0005813854.tif 000005
【００５９】
【表５】
0005813854.tif 000006
【００６０】
２３種の抗原の内の２２種に関して、血液期でのそれらの発現の証拠が、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に感染された赤血球細胞ＭＳ／ＭＳ（Ｆｌｏｒｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａａｓｉｔｏｌ．１３５：１−１１（２００４））、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のメロゾイトＭＳ／ＭＳ（Ｆｌｏｒｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１９：５２０−５２６（２００２））、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ  １７ＸＮＬの無性血液期ＥＳＴデータセット（熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のオーソログ）（Ｗａｔａｎａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：Ｄ４３１−４３８（２００７））および血液期マラリアに感染した個人由来の血漿を解析した過去の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のタンパク質マイクロアレイのデータセットから独立に報告された（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７：６９５８−６９６３（２０１０）；Ｄｏｏｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，８：４６８０−４６９４（２００８））。また、原虫のライフサイクルにおける血液期およびスポロゾイト／肝臓期の両方で発現される４種の抗原が同定された。
【００６１】
好ましい実施の形態では、配列番号が表５に示されている表４の１種以上のタンパク質、またはこれらタンパク質の免疫原性断片もしくは誘導体が免疫原性組成物に組み入れられる。また、免疫原性組成物は、タンパク質、断片または誘導体をコードするＤＮＡを含んでもよい。本実施の形態では、配列番号が表５に示されている表４のタンパク質をコードするＤＮＡが、哺乳類宿主で発現可能な１つ以上の発現ベクターであってもよい。さらなる実施の態様では、表４の１種以上のタンパク質、免疫原性断片もしくは誘導体、またはこれらタンパク質をコードするＤＮＡは、表３の１種以上のタンパク質またはこれらのタンパク質の免疫原性断片もしくは誘導体、あるいはこれらのタンパク質をコードするＤＮＡとともに免疫原性のある免疫原性組成物に組み入れられてもよい。
【００６２】
抗原は、ＤＮＡワクチンまたは他のプラットフォーム系のいずれかの成分として発現されることが予期される。予期される発現系の例は、限定されないが、複製および非複製ベクターを含むウイルス系などである。予期されるウイルスベクターの例は、アデノウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、サイトメガロウイルス、イヌジステンバーウイルスおよび黄熱ウイルスなどである。抗原は、ＤＮＡまたは他のワクチン発現系のインサートとして、単一または複数のプロモータからの単一の抗原または複数の抗原発現系のいずれかとして組み込まれる。
【００６３】
他の実施の形態は、表４に挙げられた発現したタンパク質を利用するヒトを含む哺乳類での免疫応答を誘導するための方法である。遺伝子のＤＮＡ配列に対応する列挙された配列、およびそれらのタンパク質発現産物は、表５に挙げられている。本実施の形態では、抗原は、ポリペプチドとして、またはＤＮＡもしくはウイルス系のような核酸発現系に組み込まれるもののいずれかとして、１つ以上の用量で投与される。また、方法は、プライム−ブースト免疫付与のレジメンを利用する免疫応答を誘導することが予期される。本実施の形態では、１回以上のプライミング免疫付与の用量が投与された後に、１回以上のブースティング免疫付与が行われる。
【００６４】
プライミングおよびブースティング免疫付与は、マラリアのポリペプチドを含む組成物を含み、該ポリペプチドは、表５の１つ以上のポリペプチド配列、またはそれらの免疫原性誘導体を含む。あるいは、免疫原性組成物は、哺乳類でポリペプチドを発現可能な発現系を含んでもよい。本実施の形態では、表５に挙げられた、または表５のポリペプチドもしくはその誘導体をコードする核酸分子が、ＤＮＡプラスミドまたはウイルス発現ベクターに挿入されてもよい。発現ベクター系の例は、アルファウイルス（およびアルファウイルスレプリコン）、アデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、イヌジステンバーウイルス、黄熱ウイルスおよびレトロウイルスなどである。
【００６５】
また、予期される方法は、免疫付与レジメンを含み、プライミング免疫付与がＤＮＡプラスミド発現ベクターまたはアデノウイルスから発現されたマラリアのペプチドを含む一方、ブースティング免疫付与がアデノウイルス、プライミングのアデノウイルスとは異種のアデノウイルス、ポックスウイルスもしくは１種以上のマラリアのポリペプチドのいずれかから発現されたマラリアのペプチドを含む。発現されたマラリアのポリペプチドおよびコードする核酸は、表５の任意の数のマラリアのポリペプチドおよび核酸配列、またはそのポリペプチドの免疫原性誘導体であってもよい。
【００６６】
文献、特許出願公開明細書および特許明細書などの引用されたすべての参照は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
本願発明が説明されたように、当業者は、上記技術を考慮すると本発明に係る多くの改変および変形が添付された特許請求の範囲で可能であることを理解する。したがって、添付された特許請求の範囲の範囲内で、明確に記載されていなくても本発明が実施されうることが理解される。
【００６８】
本願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１１年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／４６７，５１７号明細書に対する優先権を主張する。
（付記）
（付記１）
単離されたタンパク質、またはその免疫原性断片もしくは誘導体を含み、前記タンパク質は、マラリアに対する無菌的免疫に関連する、免疫原性組成物。
（付記２）
１種以上の前記単離されたタンパク質、免疫原性断片または誘導体を含み、前記単離されたタンパク質は、ＰＦＩ０９２５ｗ；ＰＦＢ０２８５ｃ；ＰＦ１４＿００５１；ＰＦＤ０４８５ｗ；ＰＦＬ１６２０ｗ；ＰＦ１０＿０２１１；ＰＦＢ０１５０ｃ；ＰＦＥ００６０ｗ；ＰＦ０８＿００３４；ＰＦ０８＿００５４；ＰＦＬ２１４０ｃ；ＰＦＣ０２１０ｃ；ＰＦＥ１０８５ｗ；ＰＦ１１＿０４０４；ＰＦＬ２５０５ｃ；ＰＦ１３＿０２２２；およびＭＡＬ１３Ｐ１．２２からなる群から選択された遺伝子座またはその免疫原性断片もしくは誘導体に関連する、付記１に記載された免疫原性組成物。
（付記３）
遺伝子座ＰＦ１１＿０３４４およびＰＦｆ１３＿０２０１の一方もしくは両方またはその免疫原性断片もしくは誘導体に関連する単離されたタンパク質、免疫原性断片もしくは誘導体をも含む、付記２に記載の免疫原性組成物。
（付記４）
前記単離されたタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはその免疫原性断片もしくは誘導体を有する、付記２に記載の免疫原性組成物。
（付記５）
配列番号１６および３２のアミノ酸配列を有するタンパク質の一方もしくは両方、またはその免疫原性断片もしくは誘導体をも含む、付記４に記載の免疫原性組成物。
（付記６）
１種以上のタンパク質、または免疫原性断片もしくは誘導体をコードする１種以上の単離された核酸分子を含み、前記タンパク質は、マラリアに対する無菌的免疫に関連し、前記単離された核酸分子は、哺乳類で発現可能な発現ベクターで発現される、免疫原性組成物。
（付記７）
前記核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３３、３５および３７からなる群から選択される核酸配列またはその実質的な部分もしくはオーソログでコードされる、付記６に記載の免疫原性組成物。
（付記８）
ＤＮＡ配列１５および３１の一方もしくは両方、またはその実質的な部分もしくはオーソログをも含む、付記６に記載の免疫原性組成物。
（付記９）
哺乳類におけるマラリアに対する免疫応答を誘導する方法であって、適切な発現ベクターに挿入され、単離されたマラリアのポリペプチドをコードする１種以上の単離された核酸分子を含む組成物を哺乳類に投与することを含み、前記単離された核酸分子は、付記４または５に記載されたものである、方法。
（付記１０）
適切な発現系は、ＤＮＡプラスミドまたは複製もしくは非複製ウイルスベクターである、付記９に記載の方法。
（付記１１）
１回以上のプライミングおよび１回以上のブースティング免疫付与をさらに含み、前記プライミング免疫付与は、付記２または３に記載されたマラリアの１種以上のポリペプチドを含み、または付記７もしくは８に記載され、適切な発現ベクターに挿入された１種以上の単離された核酸分子を含む組成物を含み、前記ブースティング免疫付与は、付記２または３に記載されたマラリアのポリペプチドを含み、または付記７もしくは８に記載され、適切な発現ベクターに挿入された１種以上の単離された核酸分子を含む組成物を含む、付記９に記載の方法。
（付記１２）
前記適切な発現ベクターは、ＤＮＡプラスミドアルファウイルスレプリコン、アデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、イヌジステンバーウイルス、黄熱ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択される、付記９に記載の方法。
（付記１３）
前記適切な発現ベクターは、ＤＮＡプラスミド、アルファウイルスレプリコン、アデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、イヌジステンバーウイルス、黄熱ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択される、付記１１に記載の方法。
（付記１４）
前記プライミング免疫付与ベクターは、アルファウイルスベクターであって、前記ブースティング免疫付与ベクターは、アルファウイルスベクターではない、付記１１に記載の方法。
（付記１５）
前記プライミング免疫付与は、ＤＮＡプラスミドまたはアデノウイルスである発現ベクターを含み、前記ブースティング免疫付与は、アデノウイルス、プライミングのアデノウイルスとは異種のアデノウイルス、ポックスウイルスおよびポリペプチドからなる群から選択され、該ポリペプチドは、付記４に記載のアミノ酸配列を有する、付記１１に記載の方法。
（付記１６）
前記アルファウイルスレプリコンの調製物は、ＲＮＡレプリコン、ＤＮＡレプリコンおよびアルファウイルスレプリコン粒子からなる群から選択される、付記１２に記載の方法。
（付記１７）
前記アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびシンドビスウイルスからなる群から選択される、付記１２に記載の方法。
（付記１８）
前記アルファウイルスベクターではないウイルス発現系は、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択される、付記１４に記載の方法。
（付記１９）
前記ポックスウイルスは、牛痘、カナリア痘、ワクシニア、改変されたワクシニアアンカラまたは鶏痘からなる群から選択される、付記１５に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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