(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程、
ａ）前記試料を、核酸ポリメラーゼ；前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー；第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、
ここで該第１部分および該第２部分は、標的核酸の反対鎖に存在し、かつ一方のプライマーの核酸ポリメラーゼ触媒増幅産物が他方のプライマー用鋳型鎖として働くことができるように位置づけられる、工程、
ｂ）前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより前記標的核酸を増幅し、（ｉ）二本鎖領域と（ii）前記非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程、
ｃ）前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の前記非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターと接触させる工程、
ｄ）前記リポーターの少なくとも一部を、前記増幅産物の前記一本鎖領域にアニールする工程、
ｅ）アニーリング後、前記アニールされたリポーターの少なくとも一部を切断することによって、少なくとも１つの標識化されたリポーター断片を遊離させる工程、及び
ｆ）前記少なくとも１つのリポーター断片の遊離を、前記試料中の前記標的核酸の存在と関連づける工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記核酸ポリメラーゼが、５'→３'ヌクレアーゼ活性を有し、かつ前記切断工程が、前記核酸ポリメラーゼで前記リポーターの少なくとも一部を切断し、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記核酸ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項１の方法。
【請求項４】
前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記標的核酸の増幅工程が、前記標的核酸と、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーとを、90℃〜100℃と50℃〜65℃の間で、各温度１秒保持して循環させる工程を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記試料を前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程が、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを前記標的核酸にアニールする工程を含み、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸にアニールされるとき、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーの３'末端間にゼロ〜５個の塩基のギャップを有することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項６】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域の前記非天然塩基が、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１領域に隣接して位置することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項７】
前記リポーターが、（ｉ）前記一本鎖領域の少なくとも一部に相補的であり、かつ前記非天然塩基を含む第１領域と、（ii）前記非天然塩基に隣接した第２領域とを含み、該リポーターの該第２領域は、前記第２ヌクレオチドプライマーの前記第１領域に相補的でないことを特徴とする請求項６の方法。
【請求項８】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記非天然塩基が、イソ−シトシン及びイソ−グアニンからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項９】
前記リポーターの前記標識が、シグナル生成要素と、シグナルクエンチング要素とを含み、かつ前記切断工程が、前記リポーターの少なくとも一部で切断し、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程を含み、この少なくとも１つのリポーター断片が、前記シグナル生成要素及び前記シグナルクエンチング要素の両方ではなく１つを含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１０】
前記標識が、前記リポーターの５'末端に位置することを特徴とする請求項９の方法。
【請求項１１】
前記シグナル生成要素が発蛍光団を含み、かつ前記シグナルクエンチング要素が蛍光クエンチャーを含む、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記リポーターの前記標識が、シグナル生成要素と、シグナル受取り要素とを含み、かつ前記切断工程が、前記リポーターの少なくとも一部で切断し、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程を含み、この少なくとも１つのリポーター断片が、前記シグナル生成要素及び前記シグナル受取り要素の両方ではなく１つを含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１３】
前記リポーターがオリゴヌクレオチドを含み、かつ前記アニーリング工程が、該リポーターの該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を、前記増幅産物の前記一本鎖領域にアニールする工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、少なくとも２個の非天然塩基を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記増幅工程が、前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって前記標的核酸を増幅し、増幅産物を生成する工程を含み、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記非天然塩基が、該非天然塩基を越える前記第１オリゴヌクレオチドプライマーの伸長を実質的に妨げ、その結果前記一本鎖領域となることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１６】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、該第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１領域に隣接して位置する少なくとも２個の非天然塩基を含み、かつ前記増幅工程が、試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって前記標的核酸を増幅し、増幅産物を生成する工程を含み、前記核酸ポリメラーゼが、前記第１領域に最も近い、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの第２領域の非天然塩基の向かい側にヌクレオチドを間違って組み込むが、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１領域に次に近い非天然塩基の向かい側にはヌクレオチドを組み込まないことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１７】
前記アニーリング工程が、温度を下げて、前記増幅産物の前記一本鎖領域に前記リポーターの少なくとも一部をアニールする工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記関連づけ工程が、少なくとも１つのリポーター断片を検出する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記関連づけ工程が、前記少なくとも１つのリポーター断片の遊離後に、前記増幅産物を検出する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記リポーターが前記標的核酸の増幅前に反応混合物に添加される、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国以外のすべての国々を指定して、米国民及び居住者であるDavid J.Marshall、James R.Prudent、Christopher B.Scherrill、Gideon Shapiro、Jennifer K.Grenier、Craig S.Richmond、及びSimona JurczkによってＰＣＴ出願として出願されている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡの特定セグメントの酵素的増幅方法である。ＰＣＲは、以下の基本工程の繰返しサイクルに基づいている：二本鎖ＤＮＡの変性、続くオリゴヌクレオチドプライマーのＤＮＡ鋳型へのアニーリング、及び核酸ポリメラーゼによるプライマー増幅（Mullisら及びSaikiら,1985；及び米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、及び第4,800,159号、これらの全開示は、参照によって本明細書に取り込まれる）。ＰＣＲに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、該ＤＮＡの反対鎖をアニールするように設計され、かつ一方のプライマーの核酸ポリメラーゼ触媒増幅産物が他方のプライマー用鋳型鎖として働くことができるように位置づけられる。ＰＣＲ増幅プロセスの結果、その長さが該オリゴヌクレオチドプライマーの５'末端によって規定される別々のＤＮＡ断片の指数関数的増加となる。
【０００３】
現在実施されているＰＣＲ法は、核酸配列を増幅する非常に強力な方法であるが、増幅される物質の検出には、ＰＣＲ産物をさらに操作しかつ引き続き処理して、標的ＤＮＡが存在するかどうかを決定する必要がある。新しい方法及び分析法を開発することが望ましい。
参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第5,210,015号は、標識化オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を検出する方法を教示している。この方法は、５'→３'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用い、アニールされた標識化オリゴヌクレオチドプローブを切断して、検出することができる。
参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第5,846,717号は、標的配列上に核酸切断構造を形成し、それから５'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて部位特異的様式で該核酸切断構造を切断することによる標的核酸の検出方法を教示している。
参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第5,432,272号は、ＤＮＡ又はＲＮＡ中の塩基対であるが、標準的なＡ：Ｔ又はＧ：Ｃ塩基対で観察されるパターンと異なる水素結合パターンを有する、非標準塩基を開示している。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、標的核酸の迅速な検出のための物質及び方法に関する。本発明の方法は、リポーターオリゴヌクレオチド；核酸ポリメラーゼ；及び第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。ここで、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１個の非天然塩基を含有する。
一実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸の検出方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。この方法は、前記試料を、核酸ポリメラーゼ、前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー、第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程；試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより前記標的核酸を増幅し、（ｉ）二本鎖領域と（ii）前記非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程；前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターと接触させる工程；前記リポーターの少なくとも一部を、前記増幅産物の前記一本鎖領域にアニールする工程；アニーリング後、前記リポーターの少なくとも一部を切断して、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程；及び前記少なくとも１つのリポーター断片の遊離を、前記試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。
【０００５】
別の実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸の検出方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。この方法は、前記試料を、核酸ポリメラーゼ、前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー、第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程；試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより前記標的核酸を増幅し、（ｉ）二本鎖領域と（ii）前記非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程；前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターと接触させる工程；前記リポーターを、増幅産物中に、前記一本鎖領域の前記非天然塩基の向かい側に組み込む工程；及び前記リポーターの組込みを、前記試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。
【０００６】
さらに別の実施形態では、本発明は、標的核酸の検出用キットを提供する。一実施形態では、本キットは、核酸ポリメラーゼ；前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー；第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマー；及び標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターを含む。任意に、本キットは、さらに本発明の方法を実施するための緩衝液及び試薬のような他の成分を含む。
本発明の方法は、種々のマス・スクリーニング法及び読み出しプラットフォームに組み込むことができる。
【０００７】
本発明は、以下の本発明の種々の実施形態に関する詳細な説明を添付図面と共に考慮するすることにより、さらに完全に理解することができる。
本発明は、種々の変形及び代替形態に適用できるが、そのうち特定のものが例として図面に示されており、かつ詳述される。しかし、記述される特定の実施形態に本発明を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。反対に、本発明の精神及び範囲内にあるすべての変形、均等物、及び代替物を包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】１Ａ〜１Ｅは、本発明の一実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図２】２Ａ〜２Ｅは、本発明の第２実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図３】多数の非天然塩基の化学構造を示し、式中、Ａは高分子バックボーンへの付着点であり、ＸはＮ又はＣ-Ｚであり、ＹはＮ又はＣ-Ｈであり、かつＺはＨ、置換若しくは無置換アルキル基、又はハロゲンである。
【図４】４Ａ〜４Ｄは、本発明の第３実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図５】５Ａ〜５Ｅは、本発明の第４実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図６】６Ａ〜６Ｅは、本発明の第５実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図７】７Ａ〜７Ｅは、本発明の第６実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図８】８Ａ〜８Ｅは、本発明の第７実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図９】９Ａ〜９Ｅは、本発明の第８実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１０】１０Ａ〜１０Ｅは、本発明の第９実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１１】１１Ａ〜１１Ｅは、本発明の第１０実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１２】１２Ａ〜１２Ｅは、本発明の第１１実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１３】ＰＣＲ混合物に特異的な対立遺伝子と鋳型試料を含有する分析プレートを調製するための一般的な手順を概略的に図解する。
【図１４】ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングを示すグラフであり、Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ's）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１５】方法Ａによる標識化非天然塩基の調製の合成スキームを概略的に図解する。
【図１６】方法Ｂによる標識化非天然塩基の調製の合成スキームを概略的に図解する。
【図１７Ａ】ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの“リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ's）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１７Ｂ】図１７ＡのＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析を示すグラフであり；Ｘ軸に融解温度が示される。
【図１８Ａ】ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの“リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ's）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１８Ｂ】図１８ＡのＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析を示すグラフであり；Ｘ軸に融解温度が示される。
【図１９】ゲノムＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光の増加の “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ's）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２０】種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光の増加の “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ's）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２１】ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによる種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ's）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２２】野生型、突然変異体、及び異型接合性因子Ｖ ＤＮＡ標的の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｙ軸にＨＥＸ蛍光ＲＦＵsが示され、Ｘ軸にＦＡＭ蛍光ＲＦＵｓが示される。
【図２３Ａ】種々のマウス株由来ゲノムＤＮＡのマウスＳＴＳ配列27.MMHAP25FLA6における多型性の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示され、Ｙ軸にＨＥＸ蛍光ＲＦＵsが示される。
【図２３Ｂ】種々のマウス株由来ゲノムＤＮＡのマウスＳＴＳ配列27.MMHAP25FLA6における多型性の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示され、Ｙ軸にＦＡＭ蛍光ＲＦＵsが示される。
【図２４】クエンチング化合物の部位特異的組込みによる種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅する反応によるＰＣＲ産物の融解曲線解析であり；Ｙ軸に経時的な蛍光の変化が示され、Ｘ軸に融解温度が示される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な開示
本発明は、試料中の突然変異を検出、解析、又は試料中の標的核酸の量を定量するための方法及び物質に関する。本発明の方法は、一般的にＰＣＲの使用を含む。ＰＣＲは、Fast-shotTM増幅でよい。本発明の方法は、リポーターオリゴヌクレオチド；核酸ポリメラーゼ；及び第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを利用し、この第１及び第２プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、少なくとも１個の非天然塩基を含有する。固体支持体と共に使用する他の関連する分析方法は、2000年10月14日に出願された米国特許仮出願番号60/、タイトル“非天然塩基を用いる固体支持体分析システム及び方法”、代理人事件整理番号13238.2USP1に記述されている。
【００１０】
本明細書で使用する場合、“核酸”は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は化学的バックボーンによって結合される塩基であって、該塩基が塩基対を形成するか又は相補的化学構造とハイブリダイズする能力を有する塩基として一般的に言及されるものの配列のようなポリマー分子を包含する。好適な非ヌクレオチドバックボーンとしては、例えばポリアミド及びポリモルフォリノバックボーンが挙げられる。用語“核酸”は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド配列、及びその断片又は部分を包含する。核酸は、いずれの適切な、例えば天然源から単離された、組換え的に生産された、又は人工的に合成された形態でも供給され、一本鎖又は二本鎖でよく、かつセンス又はアンチセンス鎖を意味しうる。
【００１１】
用語“オリゴヌクレオチド”は、一般的に短い鎖（例えば、約100ヌクレオチド長未満、典型的には長さ約６〜50ヌクレオチド長）の核酸を指し、例えば、固体支持体核酸合成、ＤＮＡ複製、逆転写、制限消化、流出転写等のような技術で現在利用可能な技法を用いて調製することができる。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは多くの因子によって決まり、順次該オリゴヌクレオチドの究極的な機能又は用途によって決まる。
“配列”は、ヌクレオチドの順序付けられた配置を意味する。
用語“試料”は、その最も広い意味で使用される。この用語は、標本又は培養（例えば、微生物培養）、並びに生物学的及び非生物学的試料を包含する。
【００１２】
本明細書で使用する場合、“標的”又は“標的核酸”は、試料中にあると推測され、かつ本発明の方法又はシステムで検出又は定量すべき核酸配列を含有する核酸を意味する。標的核酸は、分析手順の際に実際に分析される標的核酸配列を含有する。標的は、直接的又は間接的に分析することができる。少なくともいくつかの実施形態では、標的核酸が試料中に存在する場合、本発明の方法による増幅用鋳型として標的核酸が使用される。
【００１３】
本明細書で使用する場合、用語“相補的”又は“相補性”は、核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的核酸のようなヌクレオチドの配列）を指して使用されるときは、塩基の対合規則によって関係づけられる配列を意味する。天然塩基については、塩基の対合規則は、ワトソンとクリックによって開発されたものである。本明細書で述べるような非天然塩基については、塩基の対合規則は、ワトソン−クリックの塩基の対合規則と同様な様式で、又は疎水的、エントロピー的、若しくはファンデルワールス力による水素結合の形成を含む。例として、配列“Ｔ-Ｇ-Ａ”では、相補的配列は“Ａ-Ｃ-Ｔ”である。相補性は、“部分的”でよく、該核酸の塩基のいくつかだけが、塩基の対合規則に適合する。代わりに、核酸間の“完全な”又は“全体的な”相補性もありうる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強さに影響する。
【００１４】
用語“ハイブリダイゼーション”は、相補的核酸の対合を指して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与するハイブリダイゼーション条件の厳密さ、形成されるハイブリッドの融解温度（Ｔm）、及び核酸内のＧ：Ｃ比のような因子によって影響を受ける。
本明細書で使用する場合、“標識”は、検出可能な（好ましくは定量化できる）シグナルを与えることができ、かつ核酸又はタンパク質に結合できるいずれの原子又は分子をも意味する。標識は、比色、蛍光、電気泳動、電気化学的、分光学的、クロマトグラフ的、濃度測定、又はラジオグラフ法等のような技法によって検出可能なシグナルを与えることができる。標識は、それ自体検出可能なシグナルを生成しないが、別の標識と併用したときに検出可能なシグナルを生成又はクエンチできる分子でよい。例えば、標識は、クエンチャー−染料対のクエンチャーでよい。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語“熱安定性核酸ポリメラーゼ”は、ヌクレオシドの重合を触媒し、かつ例えば大腸菌由来のヌクレオチドポリメラーゼと比較した場合、相対的に熱に安定な酵素を意味する。一般的に、この酵素は、標的配列にアニールされたプライマーの３'末端で合成を開始し、かつ鋳型に沿って５'方向に進行し、かつ５'→３'ヌクレアーゼ活性を有する場合、合成が終了するまで、介在するアニールされたオリゴヌクレオチドを加水分解して、介在するヌクレオチド塩基又はヌクレオチド断片を遊離させる。熱安定性酵素は、少なくとも約37℃〜約42℃、典型的には約50℃〜約75℃の範囲内の温度で活性を有する。代表的な熱安定性ポリメラーゼとしては、例えば、天然及び限定するものではないが、Thermus aquaticus（Taq）、Thermus flavus（Tfl）、及びThermus thermophilus（Tth）を含むThermus種、及び限定するものではないが、Thermotoga neapolitanaを含むThermotoga種の変性ポリメラーゼが挙げられる。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語“ＤＮＡ多型性”は、ＤＮＡ中の特定部位に２つ以上の異なるヌクレオチド配列が存在することができ、かつ単数又は複数のヌクレオチド置換、欠失又は挿入のようないずれのヌクレオチド変化をも含む状態を意味する。これらヌクレオチド変化は、突然変異体又は多型性対立遺伝子変異体でありうる。本明細書で述べる方法の少なくともいくつかの実施形態は、単一塩基の突然変異、付加若しくは欠失によって引き起こされるβ-グロブリン遺伝病（いくつかのβ-サラセミア、鎌状細胞貧血、ヘモグロビンＣ病等）で生じるような核酸中の単一核酸の変化、及びα-サラセミア又はいくつかのβ-サラメニアに付随するような複数塩基の変化を検出することできる。さらに、本明細書の方法は、病気とは必ずしも関係ないが、単に、集団中の核酸の特定部位に２つ以上の異なるヌクレオチド配列（置換、欠失又は挿入されたヌクレオチド塩基対を有するかどうか）が、ヒトゲノムのＨＬＡ領域を有し、かつミトコンドリアＤＮＡのようなランダム多型性として存在できる状態を検出できる。
【００１７】
本発明は、試料中の標的核酸を検出するための方法及び物質を提供する。一実施形態では、方法は、標的核酸を含有すると推測される試料を、核酸ポリメラーゼと、第１及び第２プライマーと接触させる工程；試料中に前記標的核酸が存在する場合、該標的核酸を、前記第１及び第２プライマーを用いてＰＣＲによって増幅して、二本鎖領域と、少なくとも１つの非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程；前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基（又は複数の塩基）に相補的である非天然塩基（又は複数の塩基）とを含むリポーターと接触させる工程；前記リポーターの少なくとも一部を、前記増幅産物の前記一本鎖領域にアニールする工程；アニーリング後、前記リポーターの少なくとも一部を切断して、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程；及び前記少なくとも１つのリポーター断片の遊離を、前記試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。
【００１８】
別の実施形態では、方法は、標的核酸が含有すると推測される試料を、ポリメラーゼと、第１及び第２プライマーと接触させる工程；試料中に前記標的核酸が存在する場合、該標的核酸を、前記第１及び第２プライマーを用いてＰＣＲによよって増幅して、二本鎖領域と、少なくとも１つの非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程；前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基に相補的である非天然塩基（又は複数の塩基）とを含むリポーターと接触させる工程；前記リポーターを前記増幅産物中に組み込む工程；及び前記リポーターの組込みを、前記試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。
【００１９】
本発明は、本明細書で述べる１種以上の方法を用いる試料中の標的核酸の検出で使用する対応キットをも包含する。
本発明は、所望により、いくつかの実施形態における洗浄又は分離（例えば、ゲル電気泳動法による）のような反応後処理を必要とせずに試料中の標的核酸を検出する能力を含め、多くの利点を提供することができる。さらに、いくつかの実施形態では、本方法は、１セットの反応条件で処理される１つの反応混合物中に全要素を添加することによって実施することができる。これは、順次、複数の反応工程及び試薬に付随する問題又は心配事を回避或いは低減できる。
【００２０】
一般的議論
さて、本発明の一実施形態について図１に示される概略図を参照しながら一般用語で説明する。図１Ａを参照すると、試料は、標的核酸100を含有すると推測され、標的核酸100は、第１部分102と、第２部分104を含む。示されるように、標的核酸100は、鎖100a及び100bで構成される二本鎖分子である。
図１Ｂを参照すると、示されるように、第１プライマー106及び第２プライマー108と試料を接触させる。第１プライマー106は、標的核酸100の第１部分に相補的である。第２プライマー108は、第１領域110と第２領域112を含み、第１領域110は、標的核酸100の第２部分104に相補的である配列を含む。第２プライマー108の第２領域112は、非天然塩基114を含む。第２領域112は、標的核酸100に相補的でない。
【００２１】
第１及び第２プライマーに加え、試料をポリメラーゼにも接触させ、本明細書で述べるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される。標的核酸100が試料中に存在する場合、第１プライマー106の相補的部分及び第２プライマー108の相補的部分が、標準的な塩基の対合規則に従って標的核酸100の対応する領域102及び104にアニールする。示されるように、プライマーが標的にアニールされるとき、第１プライマー106の３'末端ヌクレオチドは、図１Ｂ中107と示されるヌクレオチドの配列、つまり“ギャップ”によって、第２プライマー108の３'末端ヌクレオチドから分離される。好ましい実施形態では、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸にアニールされるとき、鋳型核酸上の約ゼロ(０)〜約５個の塩基のギャップ107が、ＰＣＲプライマーの３'末端間に存在するように設計される。
【００２２】
図１Ｂに示されるように、ポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ、つまりFast-shotTM増幅により、各プライマーの３'-ＯＨ末端から一本鎖が合成される。すなわち、図１Ｃに示されるように、第１プライマー106を用いて、標的核酸100の鎖100aの少なくとも一部に相補的である鎖120aが合成され、第２プライマー108を用いて、標的核酸100の鎖100bの少なくとも一部に相補的である鎖120bが合成される。ポリメラーゼ連鎖反応を所望のサイクル数進め、増幅産物120を得ることができる。
図１Ｃに示されるように、増幅産物120は、二本鎖領域122と、一本鎖領域124を含む。この実施形態で示されるように、非天然塩基114は、二本鎖領域122に隣接する、一本鎖領域124中に位置する。一本鎖領域124は、１個より多くの非天然塩基を含むことができる。
【００２３】
図１Ｄを参照すると、増幅産物120をリポーター126に接触させる。リポーター126は、標的核酸の増幅が起こる前、その間、又はその後に、反応に添加できると考えられる。リポーター126は、標識128、132及び増幅産物120の一本鎖領域124の非天然塩基114に相補的である非天然塩基130を含む。図１Ｄの実施形態では、リポーター126は、染料128とクエンチャー132を含む標識と、非天然塩基130を含む。リポーター126は、増幅産物120にアニールさせることができる。アニーリング後、図１Ｅに示されるように、リポーター126の少なくとも一部が切断され、染料128を含むリポーター断片134が生成される。リポーター断片134の遊離が、試料中の標的核酸の存在と関連づけられる。図示される場合では、リポーター断片の非クエンチド染料の存在が検出される。別の実施形態では、染料及びクエンチャーの位置が逆転され、切断時にリポーター断片がクエンチャーを持ち去る。
【００２４】
図８は、別の分析法を示しており、クエンチャー132は、リポーターの代わりに第２プライマー108に結合されている。クエンチャー132は、リポーター126の一部が切断され、染料128を含むリポーター断片134を生成するまで、リポーター126の染料128の蛍光をクエンチする。代替として、クエンチャーがリポーターに結合し、染料が第２プライマーに結合することもできる。本説明では、実施形態の図で共通する要素は同じ番号を付し、該要素について個々に説明する必要がない。
図９Ａ〜９Ｅ、１０Ａ〜１０Ｅ、１１Ａ〜１１Ｅ、及び１２Ａ〜１２Ｅは、図１Ａ〜１Ｅの分析と同様の多数の実施形態であり、Ｘ及びＹは、非標準塩基を表す。例えば、Ｘはイソ−シチジンを表し、Ｙはイソ−グアノシンを意味しうる。以下の記述は、図１Ａ〜１Ｅとこれら実施形態の分析との相異について説明する。その他の点では、同一の考察及び条件を適用できる。
【００２５】
図９Ａ〜９Ｅの分析では、第１及び第２プライマー106、108は、図９Ａに示されるように、二本鎖核酸100と接触させられる。第２プライマーは、標的核酸の一部に相補的である第１部分110と、標的核酸に相補的でなく、通常標的核酸にハイブリダイズしない第２部分112とを有する。第２プライマー108は、第２部分112内で、かつ標的核酸にアニールする第２プライマーの第１部分110に隣接する非標準塩基114を有する。図９Ｂ及び９Ｃに示されるように、第１及び第２プライマーを用いて、ＰＣＲにより、標的核酸の部分に相補的である増幅産物120が合成される。増幅産物120は、二本鎖領域122と一本鎖領域124を有する。図９Ｃに示されるように、リポーター126は、増幅産物120の一本鎖領域124と接触させられる。リポーターは、一本鎖領域124の非標準塩基114に相補的である非標準塩基119を含む。図９Ｄに示されるように、リポーター126は、一本鎖領域124にアニールする。リポーター126では、非標準塩基119に隣接する塩基127は、一本鎖領域の非標準塩基114に隣接する二本鎖領域の塩基131に相補的でありうるが、必ずしもそうでなくてもよい。図９Ｅに示されるように、塩基127がポリメラーゼによって切断され、リポーター断片134が生成し、通常、発蛍光団又はクエンチャーのような標識又は標識の一部128を含有し、増幅産物120のリポーター断片の検出を可能にする。任意に、塩基127は、通常標識128を含むオリゴヌクレオチド配列で置換され、かつリポーターの残部から切断される。
【００２６】
図１０Ａ〜１０Ｅには別の実施形態が示される。この実施形態では、塩基131は、標的核酸に相補的である第２プライマー108の第１領域110の一部ではなく、代わりに塩基131は標的核酸配列に非相補的であり、かつ第２プライマー108の第に２領域112の一部である。その他の点では、この分析法の工程及び手順は、図９Ａ〜９Ｅの分析法と同一である。
【００２７】
別の実施形態では、図１１Ａに示されるように、第１及び第２プライマー106、108が、二本鎖標的核酸100と接触させられる。第２プライマーは、標的核酸の一部に相補的である第１部分110と、標的核酸に相補的でなく、かつ通常標的核酸にハイブリダイズしない第２部分112を有する。第２プライマー108は、第２部分112内で、かつ標的核酸にアニールする第２プライマーの第１部分110に隣接する少なくとも２個の連続した非標準塩基114、117を有する。図１１Ｂ及び１１Ｃに示されるように、第１及び第２プライマーを用いて、ＰＣＲにより、標的核酸の部分に相補的である増幅産物120が合成される。増幅産物120は、二本鎖領域122と、一本鎖領域124を有する。任意に、非標準塩基114、117の最初の向かいに塩基141が誤って組み込まれる。図１１Ｃに示されるように、リポーター126は、増幅産物120の一本鎖領域124と接触させられる。リポーターは、第２プライマーの非標準塩基に相補的である非標準塩基を含む。図１１Ｄに示されるように、リポーター126が一本鎖領域124にアニールする。図１１Ｅに示されるように、非標準塩基127がポリメラーゼによって切断され、リポーター断片134が生成し、通常、発蛍光団又はクエンチャーのような標識又は標識の一部128を含有し、増幅産物120のリポーター断片の検出を可能にする。任意に、塩基127は、通常標識128を含むオリゴヌクレオチド配列で置換され、かつリポーターの残部から切断される。
【００２８】
さらに別の実施形態では、図１２Ａに示されるように、第１及び第２プライマー106、108が、二本鎖標的核酸100に接触させられる。第２プライマーは、標的核酸の一部に相補的である第１部分110と、標的核酸に相補的でなく、かつ通常標的核酸にハイブリダイズしない第２部分112を有する。第２プライマー108は、第２部分112内で、かつ標的核酸にアニールする第２プライマーの第１部分110に隣接する２個の非標準塩基114、117を有する。図１２Ｂ及び１２Ｃに示されるように、第１及び第２プライマーを用いて、ＰＣＲにより、標的核酸の部分に相補的である増幅産物120が合成される。増幅産物120は、二本鎖領域122と、一本鎖領域124を有する。任意に、非標準塩基117の向かいにポリメラーゼによって誤って組み込まれた塩基121を含む。図１２Ｃに示されるように、リポーター126は、増幅産物120の一本鎖領域124と接触させられる。リポーターは、第２プライマーの非標準塩基114に相補的である非標準塩基を含む。図１２Ｄに示されるように、リポーター126が一本鎖領域124にアニールする。リポーター126は、一本鎖領域の塩基114にアニールする非標準塩基119に結合された塩基127を含むが、塩基127は一本鎖領域の塩基117に相補的でない。図１２Ｅに示されるように、塩基127がポリメラーゼによって切断され、リポーター断片134が生成し、通常、発蛍光団又はクエンチャーのような標識又は標識の一部128を含有し、増幅産物120のリポーター断片の検出を可能にする。任意に、塩基127は、通常標識128を含むオリゴヌクレオチド配列で置換され、かつリポーターの残部から切断される。
【００２９】
図２には、本発明の別の実施形態が概略的に示される。図２Ａに示されるように、二本鎖標的核酸100は、第１部分102及び第２部分104を含む。試料が、第１プライマー106及び第２プライマー108に接触される。第１プライマー106は、標的核酸100の第１部分102に相補的である。第２プライマー108は、標的核酸100の第２部分104に相補的である第１領域110と、非天然塩基114を含み、かつ標的核酸100に相補的でない第２領域114とを含む。
第１プライマー106及び第２プライマー108に加え、試料はポリメラーゼ（図示せず）と接触させられ、ポリメラーゼ連鎖反応が行われる。図１に示される実施形態と同様に、標的核酸100が試料中に存在する場合、第１プライマー106の相補性部分及び第２プライマー108の相補性部分が、標準的な塩基の対合規則に従い、標的核酸100の対応する部分102、104にアニールする。図１に示される実施形態と同様に、プライマーがアニールされるとき、第１プライマー106の３'末端ヌクレオチドは、ヌクレオチドの配列、つまり“ギャップ”107によって第２プライマー108の３'末端ヌクレオチドから分離される。好ましい実施形態では、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸にアニールされるとき、鋳型核酸上の約ゼロ(０)〜約５個の塩基のギャップが、ＰＣＲプライマーの３'末端間に存在するように設計される。
【００３０】
図２Ｂ及び２Ｃに示されるように、ポリメラーゼを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応、つまりFast-shotTM増幅により、各プライマーの３'-ＯＨ末端から一本鎖120a、120bが合成される。ポリメラーゼ連鎖反応を所望のサイクル数進め、図２Ｃに示される増幅産物120を得ることができる。
図２Ｃに示されるように、増幅産物120は、二本鎖領域122と、一本鎖領域124を含む。示されるように、一本鎖領域124は、第２プライマー108の非天然塩基114を含む。一本鎖領域124は単一の非天然塩基を含んで示されているが、本発明は、それに限定されず、一本鎖領域は１個より多くの非天然塩基を含むことができる。
【００３１】
さて、図２Ｄを参照すると、増幅産物120がリポーター150に接触している。リポーター150は、ＰＣＲ増幅の前、その間又はその後に添加される。リポーター150は、図２Ｅに示されるように、標識154と、増幅産物120の一本鎖領域124の非天然塩基114に相補的である非天然塩基152とを含む。リポーター150は、非天然塩基114の反対側の増幅産物中に組み込まれる。さらに詳細に後述するが、リポーター150の組込みは、例えば、ポリメラーゼ又はリガーゼのようないずれの適切な酵素を用いても達成することができる。試料中の標的核酸の存在は、増幅産物中のリポーターの存在と関連づけることによって決定される。図示した場合では、例えば、標的核酸の存在は、例えば蛍光若しくは他の可視化方法により標識154を検出することによって決定される。適切な検出及び可視化方法については、さらに詳細に後述する。
【００３２】
図１及び２の概略図は、本発明の構成要素の相対的な位置及び大きさを示すが、これらの提示は例示目的だけのためである。本明細書の議論から明かなように、第１プライマー及び第２プライマー、並びに標的核酸の第１部分及び第２部分の相対的な大きさは、特定の用途によって変わるだろう。さらに、標的核酸に沿う第１プライマー及び第２プライマーの相対的な位置は変化するだろう。また、本発明で用いる非天然塩基及び標識の位置も用途によって変わるだろう。
【００３３】
ポリメラーゼ
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応、つまりFast-shotTM増幅を利用して試料中の関心のある標的核酸を検出する方法及び物質を提供する。適切な核酸ポリメラーゼとしては、例えば、鋳型オリゴヌクレオチドに相補的な核酸を組み込むことでオリゴヌクレオチドを伸長できるポリメラーゼが挙げられる。例えば、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼでよい。
ポリメラーゼ活性を有する酵素は、核酸プライマーの成長末端の３'ヒドロキシル基と、ヌクレオチド三リン酸の５'リン酸基との間の結合の形成を触媒する。これらヌクレオチド三リン酸は、通常デオキシアデノシン三リン酸（Ａ）、デオキシチミジン三リン酸（Ｔ）、デオキシシチジン三リン酸（Ｃ）及びデオキシグアノシン三リン酸（Ｇ）から選択される。しかし、少なくともいくつかの実施形態では、本発明の方法で有用なポリメラーゼは、それらの非天然塩基のヌクレオチド三リン酸を用いて非天然塩基を組み込むこともできる。
【００３４】
ＰＣＲのような方法の際、鎖の変性に必要なかなり高い温度は、多くの核酸ポリメラーゼの不可逆的な不活性化をもたらしうるので、本発明で有用な核酸ポリメラーゼ酵素は、好ましくはＰＣＲのような方法の高温にさらされたときに反応を達成するのに十分なポリメラーゼ活性を保持する。好ましくは、本発明の方法に有用な核酸ポリメラーゼ酵素は、熱安定性核酸ポリメラーゼである。好適な熱安定性核酸ポリメラーゼとしては、限定するものではないが、好熱性生体由来の酵素が挙げられる。好適な熱安定性核酸ポリメラーゼを誘導できる好熱性生体の例としては、限定するものではないが、Thermus aquaticus、Thermus thermophius、Thermus flavus、Thermotoga neapolitana及びBacillus、Thermococcus、Sulfobus、及びPyrococcus属の種が挙げられる。核酸ポリメラーゼは、これら好熱性生体から直接精製できる。しかし、まず組換えＤＮＡ技法によって、該酵素をコードする遺伝子を多コピー発現ベクター中でクローン化し、そのベクターを、該酵素を発現可能な宿主細胞株中に挿入し、そのベクター含有宿主細胞を培養してから、該酵素を発現している宿主細胞株から核酸ポリメラーゼを抽出することによって、収率がかなり高い核酸ポリメラーゼを得ることができる。
【００３５】
多くの核酸ポリメラーゼは、核酸ポリメラーゼ活性に加え、他の活性を有し；これら活性としては、５'-３'エキソヌクレアーゼ活性及び３'-５'エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。５'-３'及び３'-５'エキソヌクレアーゼ活性は、本技術の当業者に公知である。３'-５'エキソヌクレアーゼ活性は、組み込まれた間違った塩基を除去することによって、新しく合成される鎖の精度を高める。対照的に、核酸ポリメラーゼ酵素中にしばしば存在する５'-３'エキソヌクレアーゼ活性は、プライマーを含め、非保護５'末端を有する核酸を消化しうるので、特定用途では望ましくないことがある。従って、５'-３'エキソヌクレアーゼ活性が弱力化しているか、又は該活性が存在しない熱安定性核酸ポリメラーゼが、本発明の少なくともいくつかの実施形態で使用するために望ましい特性の酵素である。他の実施形態では、ポリメラーゼは、リポーターを切断し、かつ直接的又は間接的にシグナルが生成されるような標識断片を遊離させるのに十分な５'-３'エキソヌクレアーゼ活性を有することが望ましい。
【００３６】
５'-３'エキソヌクレアーゼ活性の無い又は弱力化した５'-３'エキソヌクレアーゼ活性を有する適切な核酸ポリメラーゼは技術的に公知である。この目的を達成する核酸ポリメラーゼに修飾が導入された種々の核酸ポリメラーゼ酵素について記述されている。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片は、５'-３'エキソヌクレアーゼ活性を制御するタンパク質のドメインが除去されたホロ酵素のタンパク分解断片として生成されうる。５'-３'エキソヌクレアーゼ活性が欠乏している好適な核酸ポリメラーゼは商業的に入手可能なである。５'-３'エキソヌクレアーゼ活性が欠乏している商業的に入手可能なポリメラーゼの例としては、AMPLITAQ STOFFELTMＤＮＡポリメラーゼ及びKlenTaqTMＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３７】
ポリメラーゼは、ＰＣＲの際に塩基を“間違って組み込む”ことがある。他言すれば、ポリメラーゼは、合成鎖上の３'位に、鋳型核酸鎖上の対をなすヌクレオチド（例えば、シトシン）と正準の水素塩基対を形成しないヌクレオチド（例えば、アデニン）を組み込みうる。ＰＣＲ条件を変えて、塩基の間違った組込みの発生を少なくすることができる。例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、清浄剤濃度、金属のタイプ、金属の濃度等のような反応条件を変えて、ポリメラーゼが鋳型鎖に相補的でない塩基を組み込むようなことを低減することができる。
単一のポリメラーゼを使用する代替として、本明細書で述べる方法のいくつかは、複数の酵素を使用して実施することができる。例えば、エキソヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼのようなポリメラーゼ、及びエキソヌクレアーゼは、組み合わせて使用することができる。別の例は、エキソヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼと熱安定性フラップエンドヌクレアーゼの使用である。さらに、ＲＮＡを試料として用いること、及び逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写できることがわかるだろう。転写は、ＰＣＲ増幅の前又は増幅時に起こりうる。
【００３８】
第１プライマー及び第２プライマー
本発明は、ポリメラーゼ、第１プライマー及び第２プライマーを含むＰＣＲを用いて標的核酸を検出する方法を提供する。図１、２及び９〜１２に示されるように、第１プライマー106は、標的核酸100の第１部分102に相補的な配列を含む。第２プライマー108は、第１領域110及び第２領域112を含み、第１領域110は標的核酸の第２部分104に相補的な配列を含み、第２領域112は、少なくとも１個の非天然塩基を含む。第２領域は、一般的に標的核酸に相補的でない。
【００３９】
ＰＣＲ法では、プライマーは、増幅すべき標的核酸中に存在することが分かっている配列に相補的に設計される。通常、プライマーは、増幅すべき標的核酸配列に隣接する（かつその一部でありうる）配列に相補的であるように選択される。好ましくは、プライマーは、検出すべき標的核酸に隣接する配列に相補的であるように選択される。標的核酸の配列が分かれば、プライマーの配列は、まず検出すべき標的核酸の長さ又は大きさを決定し、標的核酸配列の５'及び３'末端に近いか、又は５'及び３'末端に近接している適切なフランキング配列を決定し、かつ標準的なワトソン−クリックの塩基の対合規則を用いて標的核酸のフランキング領域に相補的な核酸配列を決定してから、その決定したプライマー配列を合成することによって調製することができる。この調製法は、技術的に公知のいずれの適切な方法、例えば、適切な配列のクローニング及び制限及び直接化学合成によっても達成することができる。化学合成法としては、例えば、Narangら(1979)Metods in Enzymology68:90によって記載されているホスホトリエステル法、Brownら(1979)Metods in Enzymology68:109によって開示されているホスホジエステル法、Beaucageら(1981)Tetrahedron Letters 22:1859に開示されているジエチルホスホラミデート法、及び米国特許第4,458,066号に開示されている固体担持法が挙げられる。これらはすべて参照によって本明細書に取り込まれる。
【００４０】
第１プライマー及び第２プライマーの標的核酸に対して十分に安定なハイブリッドを形成する能力は、いくつかの因子、例えば、プライマーと標的核酸との間で発現される相補性の程度によって決まる。典型的には、その標的に対して高度な相補性を有するオリゴヌクレオチドは、該標的と安定なハイブリッドを形成するだろう。
さらに、プライマーの長さは、プライマーが標的核酸にハイブリダイズする温度に影響を及ぼす。一般に、より長いプライマーは、より短いプライマーよりも高温で標的核酸配列に対して十分に安定なハイブリッドを形成する。
さらに、プライマー中に高割合のＧ若しくはＣ又は特定の非天然塩基が存在すると、プライマーと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの安定性を高めることができる。この増加した安定性は、例えば、Ａ-Ｔ相互作用における２つの水素結合と比較した、Ｇ-Ｃ相互作用又は他の非天然塩基対相互作用における３つの水素結合の存在のためでありうる。
【００４１】
核酸二本鎖の安定性は、融解温度、つまり“Ｔm”によって評価又は表すことができる。特定条件下における特定の核酸二本鎖のＴmは、該核酸二本鎖の集団の50％が一本鎖核酸分子に溶解する温度である。特定の核酸二本鎖のＴmは、いずれの適宜の方法によっても予測することができる。特定の核酸二本鎖のＴmを決定する好適な方法としては、例えば、ソフトウェアプログラムが挙げられる。本発明の方法及びキットで使用するのに好適なプライマーは、該プライマーを含むオリゴヌクレオチド二本鎖の予想されたＴmに基づいて予め決定することができる。
図１及び２に示されるように、第１プライマー及び第２プライマーが標的核酸にアニールされるとき、第１プライマー106の３'末端ヌクレオチドと第２プライマー108の３'末端ヌクレオチドとの間にギャップ107が存在する。ギャップ107は、標的核酸の多数のヌクレオチドを含む。ギャップは、ポリメラーゼが伸長鎖中に十分にヌクレオチドを組み込んで、一回りのＰＣＲ反応（例えば、一回りのアニーリング、伸長、変性）の際に、該ギャップを満たすことができることを条件として、いずれの数のヌクレオチドでもよい。典型的には、ポリメラーゼは、１秒当たり約30〜約100塩基を配置することができる。従って、プライマー間のギャップの最大長は、温度が、ポリメラーゼが活性であり、かつプライマーがアニールされる範囲内である一回りのＰＣＲでかかる時間量によって決まる。
【００４２】
標準的な熱サイクラーを用いるFast-shotTM増幅では、ペルチエ冷却及び加熱の限界を考えると、温度変化は比較的遅い。標準的な熱サイクラーを用いる場合、Fast-shotTM増幅反応条件が、ポリメラーゼが活性であり、かつプライマーがアニールされる温度範囲内である時間は、約10〜約15秒である。本発明の方法は、試料の温度を迅速に熱循環できる微量流体系を用いて遂行することができ、伸長時間はかなり短く、かつ温度変化がかなり速い。このような迅速な熱循環は、例えば、LabChipTM技術（Caliper Technology,Palo Alto,CA）を用いて達成できる。一実施形態では、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸にアニールされるときに、ＰＣＲプライマーの３'末端間に、標的核酸上の約ゼロ(０)〜約５個の塩基のギャップが存在するように設計される。
【００４３】
非天然塩基
本発明で考えられるように、第２プライマーの第２領域は、通常少なくとも１個の非天然塩基を含む。ＤＮＡ及びＲＮＡは、それぞれホスホジエステル結合によって結合されているデオキシリボース又はリボースを含むオリゴヌクレオチドである。各デオキシリボース又はリボースは、糖に結合された塩基を含む。天然に存在するＤＮＡ及びＲＮＡに組み込まれる塩基は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、及びウリジン（Ｕ）である。これら５個の塩基が“天然塩基”である。ワトソンとクリックによって考案された塩基の対合規則に従い、天然塩基はハイブリダイズしてプリン−ピリミジン塩基対を形成し、ＧはＣと対になり、ＡはＴ又はＵと対になる。これら対合規則は、オリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドとの特異的なハイブリダイゼーションを促進する。
【００４４】
これら天然塩基による塩基対の形成は、各塩基対の２個の塩基間の２又は３個の水素結合の生成によって促進される。各塩基は、２又は３個の水素結合供与体と水素結合受容体を含む。塩基対の水素結合は、一方の塩基上の少なくとも１個の水素結合供与体と、他方の塩基上の水素結合受容体との相互作用によって、それぞれ形成される。水素結合供与体は、例えば、少なくとも１個の水素に結合されているヘテロ原子（例えば、酸素又は窒素）を含む。水素結合受容体は、例えば、孤立電子対を有するヘテロ原子（例えば、酸素又は窒素）を含む。
天然塩基、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＵを、非水素結合部位における置換によって誘導して改変天然塩基を形成することができる。例えば、天然塩基は、反応性官能基（例えば、チオール、ヒドラジン、アルコール、アミン等）を塩基の非水素結合原子に結合することで支持体への付着に誘導することができる。他の可能な置換としては、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光性基、アルキル基（例えば、メチル又はエチル）等が挙げられる。
【００４５】
また、水素結合塩基対を形成する非天然塩基は、例えば、米国特許第5,432,272号、第5,965,364号、第6,001,983号、及び第6,037,120号及び米国特許出願第08/775,401号に記載されているように構成することができる。これらすべての開示は参照によって本明細書に取り込まれる。図３は、適切な塩基及びその対応する塩基対のいくつかの例を示す。これら塩基の特定の例は、塩基対の組合せ（iso-Ｃ／iso-Ｇ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ、及びＭ／Ｎ）に以下の塩基を含み：
【００４６】
【化１】
0005685561.tif 000002
【００４７】
【化２】
0005685561.tif 000003
【００４８】
式中、Ａは、高分子バックボーンの糖又は他の部分への結合点であり、Ｒは、Ｈ又は置換若しくは無置換アルキル基である。水素結合を利用する他の非天然塩基のみならず、塩基の非水素結合原子での官能基の組込みによる、上で特定した非天然塩基の変形を調製できることがわかるだろう。
【００４９】
これら非天然塩基対の水素結合は、天然塩基の場合と同様であり、非天然塩基と対になる水素結合受容体と水素結合供与体との間に、２又は３個の水素結合が形成される。天然塩基とこれら非天然塩基との相異の１つは、水素結合受容体と水素結合供与体の数及び位置である。例えば、シトシンは、供与体／受容体／受容体塩基で、受容体／供与体／供与体塩基であるグアニンと相補性である。参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第6,037,120号に示されように、iso-Ｃは受容体／受容体／供与体塩基であり、iso-Ｇは相補的な供与体／供与体／受容体塩基である。
【００５０】
オリゴヌクレオチドに使用される他の非天然塩基としては、例えば、両方とも参照によって本明細書に取り込まれる、Renら,J.Am.Chem.Soc.118,1671(1996)及びMcMinnら,J.Am.Chem.Soc.121,11585(1999)で議論されているナフタレン、フェナントレン、及びピレン誘導体が挙げられる。これら塩基は、安定化のために水素結合を利用しないが、代わりに疎水的又はファンデルワールス相互作用によって塩基対を形成する。
【００５１】
本発明に従い、非天然塩基を使用すると、試料中に存在する核酸配列の検出及び定量化を拡張可能である。例えば、非天然塩基は、核酸に伴う反応を触媒する多くの酵素によって認識されうる。ポリメラーゼは、伸長オリゴヌクレオチド鎖を重合し続けるために相補的なヌクレオチドを必要とするが、他の酵素は、相補的なヌクレオチドを必要としない。非天然塩基塩基が鋳型中に存在し、その相補的な非天然塩基が反応混合物中に存在しない場合、ポリメラーゼは、通常、該非天然塩基を通り過ぎて伸長プライマーを伸長しようと試みてエンストする（又は、十分量の時間が与えられた場合には、塩基を間違って組み込む）。しかし、リガーゼ、キナーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ等のような、核酸に伴う反応を触媒する他の酵素は、非天然塩基を含む反応を触媒することができる。このような非天然塩基の特徴は、本発明に利用され、かつ本発明の範囲内である。
【００５２】
例えば、非天然塩基を用いて、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸配列を生成することができる。これは、ＰＣＲ反応を行い、試料中の標的核酸を検出することで達成することができ、該標的核酸は第１部分と第２部分を有し、この反応系は全４個の天然に存在するｄＮＴＰ's、標的核酸の第１部分に相補的な第１プライマー、第１領域と第２領域を有する第２プライマーを含み、該第１領域は標的核酸の第１部分に相補的であり、かつ該第２領域は標的核酸に非相補的である。第２プライマーの第２領域は非天然塩基を含む。標的核酸が存在する場合、第１プライマー及び第２プライマーの第１領域が該標的核酸にハイブリダイズする。数回のＰＣＲで、（ｉ）二本鎖領域及び（ii）一本鎖領域を含有する増幅産物が生成する。二本鎖領域は、ＰＣＲの際に第１及び第２プライマーの伸長によって形成される。一本鎖領域は１個以上の非天然塩基を含む。ポリメラーゼは、相補的な非天然塩基のヌクレオチド三リン酸の非存在下では非天然塩基を越えて重合により伸長産物を形成できないので、増幅産物の一本鎖領域が生じる。このように、非天然塩基が作用して、増幅産物の一本鎖領域を維持する。
【００５３】
上述したように、ポリメラーゼは、場合によっては、非天然塩基の反対の塩基を間違って組み込むことがある。この実施形態では、反応混合物が相補的な非天然塩基を含まないので、間違った組込みが起こる。従って、十分量の時間が与えられると、ポリメラーゼは、場合により、反応混合物の中に存在する、非天然塩基と反対の塩基を間違って組み込むことがある。
【００５４】
増幅
ＰＣＲの際、ポリメラーゼ酵素、第１プライマー及び第２プライマーを用いて本明細書で述べるような増幅産物を生成する。使用可能な１つのＰＣＲ法は改変ＰＣＲ、Fast-shotTM増幅である。本明細書で使用する場合、用語“Fast-shotTM増幅”は、改変ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
伝統的なＰＣＲ法は以下の工程を含む：二本鎖核酸の変性、又は融解；プライマーのアニーリング；及びポリメラーゼによるプライマーの伸長。伸長されたプライマーを変性し、再び開始することにより、このサイクルが繰り返される。標的核酸のコピー数は、理論的には指数関数的に増加する。実際には、コピー数は、通常酵素が該サイクルの間に伸長できるより多くのプライマー鋳型が集積するプラトーに達するまで、各サイクルで倍加し；そして標的核酸の増加が線形になる。
【００５５】
Fast-shot増幅は、改変ポリメラーゼ連鎖反応であり、伸長工程のみならず、アニーリング及び融解工程が非常に短いか或いは除去される。本明細書で使用する場合、ＰＣＲの“工程”を指すとき、工程は、反応が所望の温度で、当該温度が実質的に変動せずに維持される時間である。例えば、典型的なＰＣＲの伸長工程は約30秒〜約60秒である。Fast-shotTM増幅の伸長工程は、通常、約０秒〜約20秒の範囲である。好ましくは、伸長工程は約１秒以下である。好ましい実施形態では、伸長工程が除去される。典型的なＰＣＲのアニーリング及び融解工程の時間は、30秒〜60秒の範囲である。Fast-shotTM増幅のアニーリング及び融解工程は、通常約０秒〜約60秒の範囲である。Fast-shotTM増幅では、アニーリング及び融解工程は、通常約２秒を超えず、好ましくは約１秒以下である。伸長工程が除去される場合、温度は、アニーリング温度と融解温度との間に中間の伸長工程を含まずに、アニーリング工程と融解工程の間で循環される。
【００５６】
さらに、どうやってアニーリング温度から融解温度に速く変えるかという限界は、伸長プライマー上への塩基の組込みにおけるポリメラーゼの効率と、プライマー間のギャップとプライマーの長さによって決まる組み込まなければならない塩基の数によって決まる。実施例では、Fast-shotTM増幅の例が示される。
試料中の核酸配列の存在を決定するために必要なFast-shotTM増幅のサイクル数は、試料中の標的分子の数によって変化しうる。後述する一実施例では、100個程度の標的核酸を検出するためには全部で37サイクルで十分である。
【００５７】
増幅産物
例えば、図１、２、及び９〜１２に示されるように、ＰＣＲを用いて、二本鎖領域122と一本鎖領域124を含む増幅産物120が生成される。これらの図に示されるように、二本鎖領域122は、第１及び第２プライマー106及び108の伸長によって生じる。上述したように、一本鎖領域124は、本発明の第２プライマー内の非天然塩基の組込みから生じる。第２プライマー108の第２領域112は標的核酸100に相補的でない。上述したように、非天然塩基はワトソンとクリックの塩基の対合規則に従って他の非天然塩基と結合を形成するので、非天然塩基の存在は増幅産物120内の一本鎖領域124としての第２領域を維持する。
これとは別の実施形態では、一本鎖領域124は、１個より多くの非天然塩基を含む。第２プライマー108の第２領域112に含まれる非天然塩基の数は、所望通りに選択することができる。
【００５８】
リポーター
本明細書で使用する場合、用語“リポーター”は、第２プライマーの第２部分に相補的であり、それゆえに二本鎖構造を形成する成分（例えば、オリゴヌクレオチド）を指す。例えば、図１、２、及び９〜１２に示されるような実施形態を参照すると、リポーターは、標識128、132（図２では154）と、一本鎖領域124の非天然塩基114に相補的である少なくとも１個の非天然塩基130（図２では152）とを含む。好ましくは、リポーターはポリメラーゼ連鎖反応の第１プライマー又は第２プライマーのどちらにも相補的でない。好ましくは、リポーターの３'末端は、“遮断”され、プライマー伸長産物中へのリポーターの組込みを阻害する。“遮断”は非相補性塩基を用いて、又は最後のヌクレオチドの３'ヒドロキシルに、ビオチン若しくはリン酸基のような化学成分を付加することで達成することができ、選択する成分によっては、標識としても作用することで、二重に目的に役立ちうる。
【００５９】
本発明で有用なリポーターは１個より多くの非天然塩基を含むことができる。リポーターに含まれる非天然塩基の数は、使用者によって決めることができ、例えば、第２プライマーの第２領域の長さと塩基組成及び所望のハイブリダイゼーション条件とハイブリダイゼーション特異性のような因子よって決まるだろう。
リポーターのヌクレオチド含量は、通常第２プライマーの第２領域のヌクレオチド含量によって決定される。すなわち、リポーターの配列は、第２プライマーの第２領域の配列を決定し、かつワトソンとクリックによって開発された標準規則を用いて当該第２領域に対する補体を決定することで決められる。一実施形態では、例えば、第２プライマーの第２領域は単一の非天然塩基を含む。この実施形態では、リポーターは、好ましくは第２プライマーに含まれる非天然塩基に相補的な単一の非天然塩基を含む。同様に、１個より多くの非天然塩基が第２プライマーの第２領域に含まれる場合、第２領域の配列は、当該配列に対する補体を決定し、その結果によりリポーターが合成される。
【００６０】
第２プライマーの第２部分にハイブリダイズ可能な同一配列を有するリポーターは、第２プライマーの第２部分が、それら分析においても同じであることを条件として、種々の分析に使用することができる。他言すれば、“万能な”リポーターと第２プライマーの第２部分とを使用することができる。そして、第１部分が該標的核酸に特異的である第２プライマーの“万能な”第２部分を第２プライマーの一部に結合し或いは一部として合成することができる。これは、例えば、所望の標的核酸のために使用者の注文によって特製されるキットで使用することができる。
【００６１】
他の実施形態では、特定の分析において、それぞれ第２領域に異なった配列を有するいくつかの第２プライマーと、それぞれそのいくつかの異なった第２プライマーの１つの第２部分に相補的な配列を有するいくつかのリポーターとを使用することが有益である。このような分析では、各リポーターが異なった標識を有することが有利である。いくつかの実施形態では、リポーターを、その３'末端によって固体又は他の独特な支持体の別個の領域に結合させることができる。
リポーターの、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドに対して十分に安定なハイブリッドを形成する能力は、プライマーについて上述したような因子によって決まる。
【００６２】
これとは別の実施形態では、第２プライマーとリポーターが単一化合物である。この実施形態は図４に示される。図４Ａに示されるように、標的核酸100は、第１プライマー106及び第２プライマー108と接触している。この実施形態では、第２プライマーは以下を含む：第１領域110、第２領域112、リンカー180、リポーター190、及びクエンチャー196。この実施形態では、リンカー180が第２プライマー108をリポーター190と連結する。リポーター190は、染料192、非天然塩基194、及びクエンチャー196を含む。非天然塩基194は第２プライマー108の非天然塩基114に相補的である。図４Ｂに示されるように、第１領域110が標的核酸100の第１部分102にアニールする。リンカー180は、一方のヌクレオチドの５'末端をもう一方のヌクレオチドの３'末端に結合させる化学的リンカーを含む。リンカー180は、図４Ｂに示されるように、リポーター126を折り返し、かつ第２プライマー102の第２領域112と塩基対を形成させる。一実施形態では、リンカー180は、リポーター126を第２領域112とハイブリダイズさせるのに十分な長さのヌクレオチドの配列を含む。好ましくは、この実施形態におけるリンカー180を含むヌクレオチドは、ヘアピンループ182を形成可能である。別の実施形態では、リポーター126が第２領域112にハイブリダイズする温度が、第１領域110が標的100の第２部分104にハイブリダイズする温度より低い。
【００６３】
図４Ｃは、ＰＣＲ、つまりFast-shotTM増幅の際にプライマー104及び106の伸長の結果生じる増幅産物200を示す。増幅産物200は、二本鎖領域202及び一本鎖領域204を含む。リポーター190が増幅産物の一本鎖領域204にアニールする。
図４Ｄに示されるように、リポーター190は、例えば、ポリメラーゼ又は他の適宜な酵素によって切断され、ひいてはリポーター断片198を遊離させる。遊離されたリポーター断片198は染料192を含む。ここで述べるように、クエンチャー196の近接による染料192の遊離によって、可視化されうる。いくつかの実施形態では、図４に示されるように、リポーター126が第２領域112にハイブリダイズされ、第１及び第２プライマー106、108が伸長する。これは、第１プライマー106が十分に伸長したときにポリメラーゼがリポーター断片198を切断するのを可能にし、かつＰＣＲプロセスの際に、リポーターの引き続き添加せずに、該分析の“リアルタイム”モニタリングを可能にする。しかし、第１及び第２プライマーの伸長時におけるリポーターの第２領域へのハイブリダイゼーションは必要な特徴ではない。リポーターの第２領域へのハイブリダイゼーションは、図１で示される分析について述べたのと同一様式で伸長後に起こりうる。
【００６４】
標識
本発明により、リポーターは標識を含む。ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的分析によって検出可能な成分を組み込むことによって標識化できる。標識をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに連結又は結合する方法は、使用する標識のタイプと、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド上の該標識の位置によって決まる。
本発明の用途に適する種々の標識、及びプローブ内にそれを封入する方法は技術的に公知であり、限定するものではないが、酵素基質、放射性原子、蛍光染料、発色団、化学発光標識、ORI-TAGTM（Igen）のような電気化学発光標識、特異的な結合パターンを有するリガンド、又はシグナルを増強し、変化させ、若しくは減少させるために相互作用しうる他のいずれの標識も挙げられる。熱サイクラー設備を用いてＰＣＲを実施し、この自動プロセスで必要な温度循環を存続するように標識を選択すべきであることが理解される。
本発明の方法の標識に好適な１つの放射性原子は、32Ｐである。32Ｐを核酸中に導入する方法は技術的に公知であり、例えば、キナーゼによる５'標識化、又はニックトランスレーションによるランダム挿入が挙げられる。
【００６５】
上記説明は、同一標識は、いくつかの異なる態様で働きうるので、種々の標識を明確なクラスに分類することを意図したものでないことを理解すべきである。例えば、125Ｉは、放射性標識として、又は電子高密度試薬として貢献しうる。さらに、所望の効果のために種々の標識を組み合わせることができる。例えば、ヌクレオチドをビオチンで標識し、かつその存在を125Ｉで標識されたアビジンで検出することができる。他の変更及び可能性は、本技術の当業者には明かであり、本発明の範囲内で考えられる。
ある場合には、オリゴヌクレオチド上に標識の適切な間隔を維持して、オリゴヌクレオチドの加水分解時における標識の分離を許容するために正当な考慮を払って、単一のオリゴヌクレオチド上に２個の相互作用的標識を使用することが望ましい。同様に、例えば、リポーターと第２プライマーの第２領域のような異なるオリゴヌクレオチド上に２個の相互作用的標識を使用することが望ましい。この実施形態では、リポーターと第２領域は、相互にハイブリダイズするように設計される。この場合もやはり、ハイブリダイズ時にオリゴヌクレオチド間の標識の適当な間隔を維持することに考慮が払われる。
【００６６】
相互作用的標識対の１種は、クエンチャー−染料対である。好ましくは、クエンチャー−染料対は、発蛍光団とクエンチャーで構成される。好適な発蛍光団としては、例えば、フルオレッセイン、カスケードブルー、ヘキサクロロ−フルオレッセイン、テトラクロロフルオレッセイン、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、4,4-ジフルオロ-5,7-ジフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-インダセン-3-プロピオン酸、4,4-ジフルオロ-5,p-メトキシフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸、4,4-ジフルオロ-5-スチリル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-S-インダセン-3-プロピオン酸、6-カルボキシ-X-ローダミン、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン、テキサスレッド、エオシン、フルオレッセイン、4,4-ジフルオロ-5,7-ジフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸、4,4-ジフルオロ-5,p-エトキシフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸及び4,4-ジフルオロ-5-スチリル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-S-インダセンプロピオン酸が挙げられる。好適なクエンチャーとしては、例えば、Dabcyl、QSY7TM（Molecular Probes，Eugene，OR）等が挙げられる。さらに、染料は、それらが別の染料の放射光線を吸収する場合、クエンチャーとしても使用できる。
【００６７】
標識は、非天然塩基を含むヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドに、種々の技法により直接又は間接的に結合させることができる。使用する標識の正確なタイプによって、標識はリポーターの５'又は３'末端に位置づけ、リポーターのヌクレオチド配列の内部に位置づけ、又はリポーターから伸長し、かつ種々の大きさ及び組成を有するスペーサーアームに結合させて、シグナルの相互作用を促すことができる。商業的に入手可能なホスホラミダイト試薬を用いて、例えば、リン酸結合の形成による５'塩基の５'ヒドロキシルにホスホラミダイト染料を結合させることによって、又は内部的に適切に保護されたホスホラミダイトを介して、各末端に官能基（例えば、チオール又は一級アミン）を含有するオリゴヌクレオチドを生成し、かつ例えば、参照によって本明細書に取り込まれるＰＣＲプロトコル：A Guide to Methods and Applications,Innisら編集,Academic Press,Inc.,1990に記載されているプロトコルを用いてそれらを標識化することができる。
【００６８】
１種以上のスルフヒドリル、アミノ又はヒドロキシル成分を有する試薬を官能化するオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドリポーター配列中、通常５'末端に組み込む方法は、参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第4,914,210号に記載されている。例えば、５'リン酸基はポリヌクレオチドキナーゼと[γ32Ｐ]ＡＴＰを用いて放射性同位体として組み込み、リポーター基を与えることができる。ビオチンは、合成時に導入されたアミノチミジン残基を、ビオチンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって、５'末端に付加することができる。
３'末端における標識は、例えば、ポリヌクレオチド末端トランスフェラーゼを利用して、例えば、コルジセピン、35Ｓ-ｄＡＴＰ、及びビオチン化ｄＵＴＰのような所望成分を付加することができる。
【００６９】
オリゴヌクレオチド誘導体は標識としても利用できる。例えば、エテノ-ｄＡ及びエテノ-Ａは、リポーター中に組み込むことのできる公知の蛍光アデニンヌクレオチドである。同様に、エテノ-ｄＣは、リポーター合成に使用できる別の類似体である。このようなヌクレオチド誘導体を含有するリポーターは、ＰＣＲの際に核酸ポリメラーゼがプライマーを伸長するとき、ポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性によって加水分解され、ずっと強い蛍光性のモノヌクレオチドを遊離しうる。
いくつかの実施形態では、標識化リポーターが第１及び第２標識を含み、第１標識はヌクレアーゼ感受性切断部位によって第２標識から分離されている。
【００７０】
リポーターの標識は、リポーターのいずれの適切な位置に位置づけることもできる。例えば、リポーターが１個より多くのヌクレオチドを含む場合、標識はリポーター配列のいずれの適切なヌクレオチドにも結合させることができる。標識は、リポーターの５'末端に位置づけ、非相補的配列によって標的核酸に相補的なリポーター配列から分離することができる。この実施形態では、増幅産物の非天然塩基に相補的な非天然塩基、及び第２プライマーの第２領域に非相補的な配列を含み、かつ該標識は第２領域に非相補的な配列内に位置づけられる。さらに、標識は、適切なスペーサー又は化学的リンカーを用いて、リポーターのヌクレオチドに間接的に結合させることができる。
【００７１】
別の実施形態では、標識化リポーターは、リポーター上又はリポーター上及び分析の第２構成要素（第２オリゴヌクレオチドのような）上に有効に位置づけられた１対の相互作用的シグナル生成標識を含み、この相互作用的シグナル生成標識が相互に十分に近接したときに検出可能なシグナルの生成をクエンチする。好ましくは、これら標識はヌクレアーゼ切断に感受性なリポーター内の部位によって分離され、それによって核酸ポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性が、ヌクレアーゼ感受性部位でリポーターを切断することにより、第１の相互作用的シグナル生成標識を第２の相互作用的シグナル生成標識から分離させる。相互作用的シグナル生成成分の分離（例えば、該標識の一方を含有するリポーター断片を遊離させるためのリポーターの切断）の結果、検出可能なシグナルの生成となる。このような標識の例としては、染料／クエンチャー対又は２種の染料対（一方の染料の放射が第２染料による放射を刺激する）が挙げられる。
【００７２】
例示実施形態では、相互作用的シグナル生成対は、発蛍光団、例えばフルオレッセイン、5-[(2-アミノエチル)アミノ]ナフタレン-1-スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、テトラメチルローダミン等と、発蛍光団の蛍光放射をクエンチすることができるクエンチャー、例えば、ジメチルアミノアゾベンゼンアミノエキサル-3-アクリイニド（Dabcyl）とを含む。当業者は、特定の発蛍光団の放射をクエンチすることができる適切なクエンチャー成分を選択することができる。例示実施形態では、Dabcylクエンチャーが発蛍光団成分からの蛍光の放射を吸収する。発蛍光団−クエンチャー対については、参照によって本明細書に取り込まれるMorrison,Detection of Energy Transfer and Fluoresence Quenching in Nonisotpic Probing,Blotting and Sequencing Academic Press,1995に記述されている。
これとは別に、これら相互作用的シグナル生成標識は、第２プライマーの第２領域が少なくとも１個の非天然塩基と標識を含む場合の検出方法で使用することができる。この対の第２標識は、第２プライマーの非天然塩基に相補的な少なくとも１個の非天然塩基と、第２標識とを含むリポーターによって供給される。この実施形態は図６に示される。例えば、染料／クエンチャー対を使用すると、リポーターのハイブリダイゼーション又は増幅産物の組込みの結果、蛍光の減少となる。
【００７３】
これとは別に、２つの標識の近接は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）又は蛍光偏光によって検出することができる。ＦＲＥＴは２個の染料分子の電子励起状態間の距離依存性相互作用であり、光子の放射無しで、励起が供与体分子から受容体分子へ転移する。ＦＲＥＴの供与体／受容体染料対の例は、フルオレッセイン／テトラメチルローダミン、IAEDANSTM／フルオレッセイン（Molecular Probes，Eugene，OR）、EDANSTM／Dabcyl、フルオレッセイン／フルオレッセイン（Molecular Probes，Eugene，OR）、BODIPYTM FL（Molecular Probes，Eugene，OR）、及びフルオレッセイン／QSY7TMである。
【００７４】
アニーリング
リポーターは、検出方法の際適宜の時に試料に付加される。図１に示される実施形態では、ＰＣＲが十分な増幅産物120を生成した後、増幅産物120の一本鎖領域124にリポーター126がアニールされる。この図解される実施形態では、リポーター126は、染料128、クエンチャー132、及び第２プライマー108の非天然塩基114に相補的な非天然塩基130を含む。リポーター126は、第２プライマー108の第２領域112に対応する配列にアニールする。ＰＣＲが十分な増幅産物120を生成した後に反応混合物にリポーター126を添加するか、又はＰＣＲ増幅の前に反応混合物にリポーター126を添加することができる。好ましくは、ＰＣＲ増幅の前にリポーター126が反応混合物に添加される。増幅後、好ましくは、リポーター／増幅産物の融解温度未満に温度を下げ、リポーターを増幅産物の一本鎖領域にアニーリングさせる。一実施形態では、リポーターの一本鎖オーバーハング領域へのアニーリング工程の際、反応温度は約49℃以下である。アニーリングは、上述したような他のリポーター及び他のタイプの標識を用いる実施形態を含め、本発明の他の実施形態と同様に行われる。別の実施形態では、リポーター126は、第１及び第２プライマー106、108と増幅産物120の融解温度又はそれ以上の温度でアニールされる。この実施形態は、ＰＣＲ増幅産物の“リアルタイム”検出を行う場合に特に有用である。
【００７５】
切断
本発明の一実施形態では、リポーターが増幅産物にアニールした後、切断事象が起こって少なくとも１つのリポーター断片を遊離する。このリポーター断片の遊離は、後述するように、標的核酸の存在に関連づけられる。リポーターが増幅産物の一本鎖領域にアニールすると、これがリポーター／増幅産物複合体を形成し、複合体を切断してリポーター断片を遊離させる酵素によって認識されうる。この実施形態で使用するために考えられる酵素は、一般的に種々のリポーター／増幅産物複合体構造を認識することができる。例えば、リポーター126の５'末端部は、増幅産物の配列と重なることができ、一本鎖オーバーハング領域160を形成する（図１Ｄ参照）。
【００７６】
別の実施形態では、リポーター126はオーバーラップ領域を含まないで一本鎖オーバーハング領域を形成するが、リポーターが増幅産物にアニールされるときは（図５参照）、むしろリポーターはニック様構造を形成する。図５Ｄに示されるように、この実施形態では増幅産物中にニック様構造が形成される。一般的に、二本鎖ＤＮＡ中の“ニック”は、１本の鎖上の２個の隣接するヌクレオチド間にホスホジエステル結合が存在しないことである。本明細書で使用する場合、用語“ニック様”構造は、リポーター126の５'末端ヌクレオチドと増幅産物の鎖100aの３'末端ヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合が存在しない場合に形成される。二本鎖ＤＮＡの１本の鎖が新物質の再合成によって分解及び置換されうる開始点として、二本鎖ＤＮＡ中のニックを使用することができる、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのようないくつかの酵素がある。
【００７７】
この実施形態では、リポーター210は、増幅産物の非天然塩基114に相補的である非天然塩基216、染料212、及びクエンチャー214を含む。リポーター210が増幅産物の一本鎖部分にアニールする。従って、ニックは、非天然塩基216と増幅産物の隣接するヌクレオチドとの間に生成される。この実施形態では、ポリメラーゼは、リポーター／増幅産物複合体中に形成されたニック様構造を認識し、かつ当該ニック部位でリポーターを切断する。複合体の切断がリポーター断片134を遊離し、シグナルが検出される。
リポーター／増幅産物複合体によって形成される特定構造のいくつかは、いくらか詳細に議論されるが、他のリポーター／増幅産物複合体は、本明細書で述べるように切断を行うことで形成することができる。
【００７８】
図１Ｄに示される実施形態を参照すると、アニーリング後、リポーター126の５'末端160の部分は標的にアニールされず、一本鎖である。アニールされたリポーター断片を増幅産物から切断するためのポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性の能力が維持されることを条件として、塩基中のいずれの長さの一本鎖オーバーハング領域160も考えられることが分かる。図１Ｄで例示される実施形態では、検出のため、ポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性を、アニールされたリポーター126の切断を可能にするのに十分な条件下で反応が続けられる。リポーター126の切断が切断断片134（標識又は標識の一部を含有する）を生成し、それが検出される（又は、代わりに残存リポーター／増幅産物複合体が検出され）、かつそれらは試料中における標的核酸の存在の指標である。少なくともいくつかの実施形態では、リポーター断片はモノ−、ジ−、及びより大きいヌクレオチド断片の混合物を含むことができる。
【００７９】
図１Ｅに示されるように、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性が一本鎖領域160を切断し、リポーター断片134を遊離させる。この実施形態では、リポーター断片は染料128を含む。クエンチャー132を含む増幅産物からの染料128の遊離が染料の検出を可能にする。従って、リポーター断片の遊離は、リポーター断片がクエンチャーへの近接から遊離されるときに染料の検出を可能にする。これは、順次、リポーター断片の遊離と標的核酸の存在との関係を斟酌する。そうでなければ、染料とクエンチャーの配置が逆にされ、クエンチャーがリポーター断片と共に遊離され、リポーター／増幅産物上の染料が検出される。
【００８０】
組込み
さて、図２を参照すると、本発明の別の実施形態が示される。この実施形態では、第２プライマーの第２領域124が非天然塩基124を含む。非天然塩基124に相補的な非天然塩基152が、適切な酵素を用いて増幅産物中に組み込まれる。この実施形態では、リポーターの組込みが試料中の標的核酸の存在と関連づけられる。
図２に示されるように、本発明の方法はリポーター150；核酸ポリメラーゼ（図示せず）；第１プライマー106及び第２プライマー108を利用する。ＰＣＲ反応混合物は、４個の天然に存在するヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）及び１個以上の非天然ヌクレオチド三リン酸（又は非天然ヌクレオチド三リン酸を含有するオリゴヌクレオチド）をもリポーター150として含有する。例示実施形態では、反応混合物中の１個以上の非天然ヌクレオチド三リン酸152が標識154を含む。ＰＣＲはFast-shotTM増幅でよい。
【００８１】
第１プライマー106は、標的核酸100の一部に相補的な配列を含み、かつ標的核酸100の当該部分にハイブリダイズすることができる。第２プライマー108は第１領域110と第２領域112を有する。第１領域110は、標的核酸100の一部に相補的な配列を含む。第２プライマー108の第２領域112は非天然塩基114を含み、この第２領域112は標的核酸100に相補的でない。単一のヌクレオチドだけが第２領域112に図示されているが、第２領域はさらにヌクレオチドを含みうることが分かるだろう。好ましくは、非天然塩基114は、第２プライマー108の第１領域110と第２領域112との接合部に位置する。いくつかの実施形態では、第２オリゴヌクレオチドプライマーの第２領域112中に存在する非天然塩基114は、iso-Ｃ又はiso-Ｇである。
【００８２】
第１プライマー106及び第２プライマー108に加え、試料はポリメラーゼに接触させられ（図示せず）、ポリメラーゼ連鎖反応が行われる。標的核酸100が試料中に存在する場合、塩基の標準的な対合規則に従って、第１プライマー106の相補性部分と第２プライマー108の相補性部分110が、標的核酸100の対応領域102、104にアニールする。図１に示される実施形態と同様に、プライマーが標的にアニールされるとき、第１プライマー106の３'末端ヌクレオチドは、ヌクレオチドの配列、つまり“ギャップ”によって、第２プライマー108の３'末端ヌクレオチドから分離される。好ましい実施形態では、第１及び第２プライマーは、鋳型核酸にアニールされるとき、ＰＣＲプライマーの３'末端間に、鋳型核酸上の約ゼロ(０)〜約５個の塩基のギャップが存在するように設計される。
【００８３】
図２Ｂ及び２Ｃに示されるように、ポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応、つまりFast-shotTM増幅によって、各プライマーの３'-ＯＨ末端から一本鎖120a、120bが合成される。ポリメラーゼ連鎖反応は所望のサイクル数続け、図２Ｃに示される増幅産物120を得ることができる。
図２Ｃに示されるように、増幅産物120は二本鎖領域122及び一本鎖領域124を含む。示されるように、一本鎖領域124は第２プライマー108の非天然塩基114を含む。一本鎖領域124は単一の非天然塩基を含んで示されているが、この領域は、１個より多くの非天然塩基を含むことができる。
【００８４】
さて、図２Ｄを参照すると、増幅産物120がリポーター150と接触させられる。リポーター150は標識154と非天然塩基152を含む。図２Ｅに示されるように、リポーター150は、増幅産物中非天然塩基114の反対側に組み込まれる。一実施形態では、リポーター150の非天然塩基152は、増幅産物120の一本鎖領域124の非天然塩基114に相補的なヌクレオチド三リン酸を含む。この実施形態では、ＰＣＲ反応は、４個の天然に存在するヌクレオチド三リン酸塩基（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）に加え、標識された非天然ヌクレオチド三リン酸塩基の存在を含む。ＰＣＲ反応における非天然ヌクレオチド三リン酸塩基の濃度は、例えば、１μM〜100μMの範囲でよい。
【００８５】
リポーター150を増幅産物120中に組み込むための好適な酵素としては、例えば、ポリメラーゼ及びリガーゼが挙げられる。伸長プライマー鎖中に天然ヌクレオチドを組み込むことができる多くのポリメラーゼを使用して、増幅産物中相補的な非天然塩基の向かい側に非天然塩基を組み込むこともできる。典型的には、クレノウ、Tfl、Tth、Taq、Hot Tub、及びBstのようなクラスＡ ＤＮＡポリメラーゼが、Pfu、Tli、Vent exo-、T4、及びPwoのようなクラスＢポリメラーゼよりも非天然塩基をうまく組み込むことができる。HIV-1のような逆転写酵素を使用しても、伸長プライマー中に、鋳型内のその相補性非天然塩基の向かい側に非天然塩基を組み込むことができる。この実施形態では、ポリメラーゼはヌクレアーゼ欠乏性であるか、又は低減されたヌクレアーゼ活性を有することができる。本発明を限定する意図ではないが、ヌクレアーゼ活性はいくつかのＰＣＲ反応を妨害することが分かっているので（Gene 1192 112(1):29-35及びScience 1993
260(5109):778-83）、ヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼが、より強力であると考えられる。
【００８６】
試料中の標的核酸の存在は、増幅産物中のリポーターの存在と関連づけることによって決定される。適切な検出及び可視化方法を用いて標的核酸を検出する。例えば、例示の場合、標的核酸の存在は、例えば、蛍光又は他の可視化方法によって、標識154を検出することによって決定される。例えば、蛍光偏光を利用して、増幅産物中へのリポーターの組込みを検出することができる。
好ましくは、この実施形態では、洗浄工程又は分離工程は、リポーター150の増幅産物120中への組込み後、かつ検出前に行われる。この洗浄又は分離工程は、系から未結合リポーター150を除去するので、シグナルの検出は組み込まれたリポーターに依存する。当業者は、ゲル電気泳動法等によるサイズ分離等を含め、いずれの公知の洗浄又は分離工程も本発明と共に使用できることが容易にわかるだろう。代わりに、検出の方法として蛍光偏光を用いる場合、洗浄工程は必要ない。
【００８７】
この実施形態で使用するリポーター150は、少なくとも１個の非天然塩基152を含む。リポーターの非天然塩基は、好ましくは標識154を含む。リポーター150の非天然塩基152は、ＰＣＲ増幅の際、第２プライマー108の少なくとも１個の非天然塩基114の反対側にポリメラーゼによって増幅産物中に挿入される。
別の実施形態では、図６に示されるように、リポーター170は、第２プライマー108の非天然塩基114に相補的な非天然塩基172と、クエンチャー129とを含む。この実施形態では、第２プライマー108の非天然塩基114は染料162を含む。この実施形態では、リポーター170の組込みにより、クエンチャー129を染料162に近接させる。これは、順次、染料162のシグナル出力を減少させ、このシグナルの減少を検出し、標的核酸の存在と関連づけられる。好適な染料−クエンチャー対については上述した。これとは別に、染料−染料対を使用できる。標的核酸が存在する場合、ＰＣＲは、近接して２つの染料を配置する二重産物を生成し、標識の蛍光出力が変化する。この変化は、ベンチトップ蛍光プレートリーダーによって検出可能である。
この実施形態で用いるポリメラーゼは、ヌクレアーゼ活性を有し、又は低減したヌクレアーゼ活性を有し、又はヌクレアーゼ活性欠乏性でよい。好ましくは、このポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼである。
【００８８】
検出
リポーターオリゴヌクレオチド断片の検出と解析は、技術的に公知のいずれの方法によっても達成することができる。上記標識を含有する核酸の検出に多くの方法が利用できる。例えば、ビオチン標識オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ接合体のようなアビジン接合体を利用する非放射性同位体検出法を用いて検出することができる。フルオレッセイン標識オリゴヌクレオチドは、フルオレッセイン−イメージャーを用いて検出することができる。
一実施形態では、さらに処理することなくＰＣＲ反応混合物内でリポーターオリゴヌクレオチドを検出することができる。例えば、切断されたオリゴヌクレオチドからのシグナルは、物理的分離の無い未切断オリゴヌクレオチドのシグナルから解明することができる。これは、例えば蛍光偏光解析によって達成することができ、蛍光分子の溶液中での大きさひいては回転速度の変化を検出することができる。
【００８９】
一実施形態では、標的が存在する場合、第１及び第２標識（例えば、染料／染料対）を近接して配置する二重産物が生成される。２つの標識が近接すると、リポーター分子標識の蛍光出力が変化する。この変化は、ほとんどのベンチトップ蛍光プレートリーダーで検出できる。これとは別に、標識対は近接したクエンチャー−標識対を含む。この実施形態では、リポーター分子標識の蛍光出力が変化し、この変化は検出可能である。この発明では、他の適切な検出方法が考えられる。
別の実施形態では、さらに処理した後にリポーターが検出される。オリゴヌクレオチドを分離するのに有用な技術的に公知の多くの技法のいずれを用いても反応からリポーターオリゴヌクレオチド断片を分離できると考えられる。例えば、固相抽出によって反応混合物からリポーターオリゴヌクレオチド断片を分離することができる。電気泳動法又は電気泳動法以外の方法でリポーターオリゴヌクレオチド断片を分離することができる。例えば、ビオチン−標識オリゴヌクレオチドは、常磁性若しくは磁性ビーズ、又はアビジン（若しくはストレプトアビジン）で被覆された粒子を用いて反応混合物から分離することができる。この様式では、ビオチン化オリゴヌクレオチド／アビジン−磁性ビーズ複合体は、該複合体を磁場にさらすことによって、混合物中の他の成分から物理的に分離されうる。一実施形態では、リポーターオリゴヌクレオチド断片は、質量分析法によって解析される。
【００９０】
いくつかの実施形態において、熱循環時に蛍光を読み取ることのできる機器上で増幅が行われ、かつ検出される場合、非特異性ＰＣＲ産物から意図したＰＣＲ産物を区別することができる。鋳型核酸の量が制限されている場合、意図した産物以外の増幅産物が形成されうる。これは、第２プライマー108が、それ自体又は第１プライマー106と共にプライマー二量体に合体されるプライマー二量体形成のためである。プライマー二量体形成の際、２つのプライマーの３'末端がハイブリダイズし、かつ核酸ポリメラーゼにより、関与する各プライマーの５'末端まで伸長される。これが、次の一回りの増幅でこの非特異的産物をさらに指数関数的に生じさせるのに関与するプライマーの形成時の完全基質である基質を生じさせる。従って、プライマー二量体の最初の形成は、それが非常に珍しい事象である場合でさえ、特に鋳型核酸が制限され或いは不在のとき、増幅プロセスが二量体産物を該反応に打ち勝たせることができるので、有利な相互作用である必要はない。第２オリゴヌクレオチドプライマー106がこの産物中に組み込まれるとき、標識された非標準塩基170は、第２プライマー106の非標準塩基114に対して直交に配置される。この結果、リポーターの標識129と第２プライマーの162との間に相互作用をもたらし、図６Ｅに示されるような意図した産物120の形成におけるのと同一の蛍光出力の変化を与えるだろう。プライマー二量体産物は、通常意図した産物より長さが短く、それゆえより低い融解温度を有する。図６Ｅに示されるように標識は二本鎖を越えて近接に保持されるので、２本の鎖を分離する事象は、標識の相互作用を破壊するだろう。反応産物を含有する反応の温度をプライマー二量体の二本鎖ＤＮＡsのＴｍより高く上昇させると、意図した産物は、該産物のＤＮＡ二本鎖を融解し、かつ標識の相互作用を破壊して蛍光の測定可能な変化を与えるだろう。増幅及びシグナル生成後、徐々に反応温度を上げながら蛍光の変化を測定することによって、意図した産物のＴｍ及び非特異的産物のＴｍを決定することができる。
【００９１】
入れ子状ＰＣＲ
本発明の方法を用いて入れ子状ＰＣＲを行うことができる。例として、第１、第２、及び第３プライマー（又はそれより多い）を用いて入れ子状ＰＣＲを行うことができる。第２プライマーは、標的配列に相補的な第１領域と、リポーターオリゴヌクレオチドに相補的な第２領域を有する。第１及び第３プライマーは、第２プライマーより高温で標的にハイブリダイズすることができる。変性及びアニーリング温度間の循環が第１及び第３プライマーを標的核酸にアニールさせるが、第２プライマーはアニールさせない、数回のＰＣＲサイクルが行われた後、第１増幅産物が生成されうる。その後、ＰＣＲアニーリング温度を下げて、第２プライマーの第１領域を第１増幅産物にハイブリダイズさせることができる。この下げたアニーリング温度での数サイクルのＰＣＲにより、第１及び第２プライマー間の第２増幅産物が生成する。温度を下げて、リポーターオリゴヌクレオチドの第２プライマーの第２領域へのハイブリダイゼーションを可能にする。
【００９２】
ＤＮＡ多型性の検出における使用
本発明の方法は、核酸配列の配列変異を検出するのに有用である。本明細書で使用する場合、用語“配列変異”は、２核酸間の核酸配列の相異を指す。例えば、野生型遺伝子とこの遺伝子の突然変異体は、単一塩基の置換若しくは欠失又は１個以上のヌクレオチド挿入の存在によって、配列が変化しうる。これら２つの遺伝子の型は、相互に配列が変わると言われている。配列変異の一例は、ＤＮＡ多型性である。図７に示される実施形態では、単一のヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）の検出が例示されており、ＰＣＲを用い、蛍光プレートリーダー上にＰＣＲ反応プレートを配置すること以外はさらに試料の操作を必要としない。対立遺伝子特異性標識を含む対立遺伝子特異性リポーター又はプライマーが使用される。例えば、２つの対立遺伝子系は、異なった色の標識を有する対立遺伝子特異性リポーター又はプライマーを含んでよい。試料中の当該対立遺伝子の存在を指標するどちらかの色の存在及び当該両方の対立遺伝子を指標する２色の組合せの存在が試料中にある。
【００９３】
この実施形態では、プライマーは以下のように単一のヌクレオチド多型性を検出するように設計される。好ましくは、使用するプライマーの１つは対立遺伝子特異性プライマーを含む。好ましくは、プライマーの１つは非天然塩基を含む。一実施形態では、これら両特徴が単一のプライマーによって与えられる。代わりに、対立遺伝子特異性プライマーは、非天然塩基を含むプライマーとは別個のプライマーである。
本明細書で使用する場合、用語“対立遺伝子特異性プライマー”は、ＳＮＰを含有すると推測される領域内の標的核酸に完全に相補的であるプライマーを意味する。
【００９４】
ＳＮＰ対立遺伝子を区別するために使用可能な対立遺伝子特異性ＰＣＲプライマーは、関心のある多型性塩基が該プライマーの３'末端に位置するように、各対立遺伝子に相補的に設計される。高レベルの対立遺伝子の区別は、その３'末端で標的ＤＮＡの３'末端、すなわち、プライマーが特異的でない対応する対立遺伝子とヌクレオチドのミスマッチがあるプライマーを伸長するポリメラーゼの能力の制限によって部分的に達成される。さらに、対立遺伝子の区別は、対立遺伝子特異性プライマー内の他の位置にミスマッチを配置することで達成することができる。一般に、対立遺伝子特異的な位置は、ミスマッチがあるとポリメラーゼがプライマーを有効に伸長できないという条件で、プライマー内のどこでもよい。好ましくは、対立遺伝子ミスマッチが、選択されたＰＣＲ条件では異なった対立遺伝子の標的核酸配列への対立遺伝子特異性プライマーのハイブリダイゼーションを十分に不安定にするようにプライマーが選択される。一実施形態では、対立遺伝子特異的な位置は、プライマーの３'末端から約５塩基以内である。例えば、対立遺伝子特異的な位置は、プライマーの３'末端塩基でよい。プライマー中の対立遺伝子特異的な位置のこれら交代性の位置を用いて、以下の２つの主な方法で選択的な増幅を達成することができる：１）プライマーのＴｍを下げ、ポリメラーゼの熱循環の際に鋳型ＤＮＡ上でプライマーがハイブリダイズして伸長しないようにすることにより、又は２）ポリメラーゼが伸長しないであろう不都合なプライマー／鋳型構造を創造することによる。特異性の向上は、伸長停止時間、及びアニーリングと融解の停止時間が短いか、又は存在しないFast-shotTM増幅を利用することによって達成される。このような一実施形態では、反応は約90〜100℃と約50〜65℃との間で迅速に循環され、各温度で最大約１秒保持され、それによってポリメラーゼにミスマッチのプライマーを伸長する時間をほとんど残さない。例示した実施形態では、反応は約95℃と約58℃の間で循環され、各温度で最大約１秒保持される。この迅速な循環は、最短の可能なＰＣＲ産物を生成することで、一般的に、ＰＣＲプライマーの３'塩基間の鋳型核酸上の約ゼロ(０)〜約５塩基のギャップを残すことによって可能にされる。好ましくは、プライマーは、可能な最短配列及び約55〜60℃のＴｍを有するように設計される。ゲノムＤＮＡ試料に関するＳＮＰ解析を含む一実施形態では、30個程度の標的分子を検出するには、総計約37サイクルで十分だった。
【００９５】
図７には対立遺伝子特異的分析法の１例が示される。本明細書で議論される他の分析法を使用し、又は対立遺伝子特異的分析のために改変できることが分かるだろう。図７Ａを参照すると、試料は標的核酸100を含有すると推測され、該標的核酸100は、第１部分102と第２部分104を含む。示されるように、標的核酸100は、鎖100aと100bで構成される二本鎖分子である。
図７Ｂを参照すると、示されるように、試料が２つ以上の対立遺伝子特異性第１プライマー106a、106ｂと、第２プライマー108と接触させられる。一方の対立遺伝子特異性第１プライマー106aは標的核酸100の第１部分102に相補的である。他方の対立遺伝子特異性プライマー106bは、標的核酸100の第１部分102に完全には相補的でない。第２プライマー108は、第１領域110と第２領域112を含み、第１領域110は標的核酸100の第２部分104に相補的な配列を含む。第２プライマー108の第２領域112は、非天然塩基114を含む。第２領域112は、標的核酸100に相補的でない。
【００９６】
第１プライマー及び第２プライマーに加え、試料はポリメラーゼとも接触させられ、本明細書で述べるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される。試料中に標的核酸100が存在する場合、対立遺伝子特異性第１プライマー106aの相補性部分及び第２プライマー108の相補性部分が、塩基の標準的な対合規則に従って標的核酸100の対応する領域102及び104にアニールする。
図７Ｂに示されるように、ポリメラーゼを用い、ＰＣＲ、つまりFast-shotTM増幅により、各プライマー106a、108の３'-ＯＨ末端から一本鎖が合成される。すなわち、対立遺伝子特異性第１プライマー106aを用い、標的核酸100の鎖100aの少なくとも一部に相補的な鎖120aが合成され、第２プライマー108を用い、標的核酸100の鎖100bの少なくとも一部に相補的な鎖120bが合成される。対立遺伝子特異性第１プライマー106bは、標的核酸100に完全には相補的でないので、実質的に伸長しない。ポリメラーゼ連鎖反応を所望のサイクル数進め、図７Ｃに示される増幅産物120を得ることができる。そして、図１に示される分析で述べたように分析を進める。
【００９７】
キット
本発明の方法で使用する試薬を診断キットに詰めることができる。診断キットは、標識化リポーター、第１プライマー、及び第２プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ポリメラーゼによって伸長オリゴヌクレオチド中に組み込むことができる非天然塩基を含む。一実施形態では、この非天然塩基は標識される。オリゴヌクレオチドと非天然塩基が標識されない場合、特異的な標識試薬もキットに含めることができる。キットは、他の適宜の梱包試薬及び増幅に必要な物質、例えば、緩衝液、ｄＴＮＰs、重合酵素、及び検出解析のために、例えば、酵素及び固相抽出用溶媒を含むこともできる。
本発明の方法に有用な試薬は、溶液で貯蔵することができ、又は凍結乾燥することができる。凍結乾燥する場合、試薬のいくつか又はすべては、再構成後簡単に使用するため微量定量プレートウェル内に直ちに貯蔵することができる。凍結乾燥試薬の技術的に公知のいずれの方法も、本発明の方法で有用な試薬を乾かして調製するのに適すると考えられる。
【００９８】
本明細書で参照又は引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、その全体がこの明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲まで、参照によって本明細書に取り込まれる。
以下は、本発明を実施する手順を説明する実施例である。これら実施例は、限定するものと考えるべきでない。特に言及しない限り、すべてのパーセンテージは質量についてであり、すべての溶媒混合割合は体積についてである。
【実施例】
【００９９】
実施例１
プライマー設計
核酸成分の配列中に示される記号は以下の通りである：Ａ＝デオキシアデニレート；Ｔ＝デオキシチミジレート；Ｃ＝デオキシシチジレート；Ｇ＝デオキシグアニレート；Ｘ＝デオキシ−イソ−シトシン（ｄ-isoＣ）；Ｙ＝デオキシ−イソ−グアニン（ｄ-isoＧ）；Ｐ＝標的核酸中の多型性ヌクレオチドに相補的な第１プライマーのヌクレオチド；Ｂ＝核酸ポリメラーゼと、リポーターの伸長を遮断するために機能する３'末端へのビオチンTEGCPG（Glen Reserch,Sterling,VA）の付加によるリポーター核酸の３'修飾；Ｑ＝5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[(N-4'-カルボキシ-4(ジメチルアミノ)-アゾベンゼン)-アミノヘキシル-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト（Dabcyl dT；Glen Reserch,Sterling,VA）の付加によってリポーター中に組み込まれるシグナルクエンチング要素（5'-5-[(N-4'-カルボキシ-4(ジメチルアミノ)-アゾベンゼン)-アミノヘキシル-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン（Dabcyl dT；Glen Reserch,Sterling,VA）；ＦＡＭ＝シグナル生成要素（6-カルボキシフルオレッセイン(６-ＦＡＭ)；Glen Reserch,Sterling,VA）。下線は、鋳型に相補的でない核酸成分の部分を示す。
【０１００】
核酸成分の設計は、以下のように示される。
【０１０１】
0005685561.tif 000004
【０１０２】
第１プライマーは、約60℃のＴmを有するように設計される。第２プライマーは、約61℃のＴmを有するように設計される。Ｔmは、参照によって本明細書に取り込まれるPeyretら,Biochemistry,38,3468-77(1999)を含め、種々の公知技術によって推定することができる。
ハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである。
【０１０３】
0005685561.tif 000005
【０１０４】
3'Ｇは、TaqポリメラーゼのＧミスマッチを広げる傾向のため、対立遺伝子特異性プライマーの設計では避けた。
第２プライマーの第１領域、つまり３'末端は、標的核酸の第２部分、つまり下流領域に相補的だった。標的核酸上の第２プライマーの位置は、ギャップ、つまり第１及び第２プライマーの３'末端間にある標的核酸の領域を与え、０〜約５ヌクレオチドでありうる。第２プライマーの合成では、第２プライマーの第２領域内のイソ−シトシンヌクレオチド組込みは、標準的なＤＮＡ合成条件を用いて行った。
【０１０５】
実施例２
対立遺伝子特異性ＰＣＲ
蛍光に基づいたＰＣＲ反応では、以下の核酸成分を使用した。
【０１０６】
0005685561.tif 000006
【０１０７】
個々に20μlのＰＣＲ反応量に対するＰＣＲ反応中の成分の作用濃度（１Ｘ）は以下に示される。
【０１０８】
0005685561.tif 000007
【０１０９】
氷上で各成分を解凍し、一緒に穏やかに混合した。10Ｘ ＰＣＲ緩衝液を調製し、100mM トリスｐＨ8.0、0.1％ＢＳＡ、0.1％Triton X-100、１mg/mlの分解したニシン精子ＤＮＡ（Sigma D-3159）、400mMの酢酸カリウム、及び20mM ＭｇＣｌ2で構成された。マスターミックス及び対立遺伝子特異性ミックスは、下記の割合で試薬を添加して調製した。
【０１１０】
0005685561.tif 000008
【０１１１】
反応の最終体積は20μLだった。マスターミックスと第１プライマーを合わせて15μLに５μLの標的核酸を添加した。標的核酸の量は、最終利用者のニーズに応じてマスターミックスに添加する水の量を調整することで増減できる。５μLは、多チャネルピペッターで供給するのに便利な量である、対立遺伝子特異性ミックスは、以下に示されるように調製した。
【０１１２】
0005685561.tif 000009
【０１１３】
以下のように分析プレートを調製した：15μLの対立遺伝子特異性ミックス（上述したような）を96−ウェル分析プレートに等分した。（対立遺伝子特異性ミックスは、分析で使用される各特異性第１プライマーについて調製かつ実験することができる）。標的核酸試料を、対立遺伝子特異性ミックスを含有する各ウェルに体積５μLで繰返し添加した。特定数のウェルを対照として取っておいた：各対立遺伝子特異性ミックスについてネガティブ対照（標的核酸無し）を実験すべきである。標的核酸の添加後、20μLの鉱油で反応を覆い、分析プレートをＤＮＡ熱サイクラーに移した。この手順の実際の時間は、多チャネルピペッターの使用により非常に短縮された。
分析プレートの熱循環パラメーターは以下に示される。
【０１１４】
0005685561.tif 000010
【０１１５】
ＰＣＲ循環反応後、分析プレートを蛍光シグナルの放射について調べた。分析プレートをPerSeptive Biosystems CytofluorTM4000蛍光プレートリーダーに移し、プレートの上部から読み取るように装置をセットした。プレートリーダーのパラメーターは次の通りである：485±10nmに励起フィルター設定；530±12.5nmに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲインを50に設定。そして、試料を読み取った。
表１は、対立遺伝子特異性プライマーを用いて得られた示度を示す。
【０１１６】
表１
0005685561.tif 000011
ＲＦＵ＝相対蛍光単位
【０１１７】
実施例３
ＳＮＰ検出における“Fast-shotTM”増幅と標準ＰＣＲとの比較
この実施例は、標的レベルの大きさを３桁にわたって変えることにり、“Fast-shotTM”増幅と伝統的なＰＣＲ循環パラメーターとの間の対立遺伝子の区別の相対的なレベルを示す。Fast-shotTM増幅は、プライマーの変性及びアニーリング温度間の循環を含み、これら温度は非常に短時間で停止する。
【０１１８】
以下の核酸成分を用いた。
【０１１９】
0005685561.tif 000012
【０１２０】
鋳型核酸濃度は、アトモル範囲にあった。個々の20μLのＰＣＲ反応量に対するＰＣＲ反応における成分の作用濃度（１Ｘ）は、以下に示される。
【０１２１】
0005685561.tif 000013
【０１２２】
ＰＣＲ反応は、実施例２で述べたのと同一手順で調製した。
“fast shot”ＰＣＲでは、以下のＰＣＲパラメーターを用いた。
【０１２３】
0005685561.tif 000014
【０１２４】
伝統的なＰＣＲでは、以下のＰＣＲパラメーターを用いた。
【０１２５】
0005685561.tif 000015
【０１２６】
AmplitaqTMGoldは、５'→３'エキソヌクレアーゼポジティブTaqポリメラーゼであり、AmplitaqTMStoffelは、５'→３'エキソヌクレアーゼ欠乏性Taqポリメラーゼである。
表２に示されるデータは、標的核酸レベルの大きさを３桁にわたって変えることによる“Fast-shotTM”増幅と伝統的なＰＣＲ循環パラメーターとの間の対立遺伝子の区別の相対的なレベルを示す。特異的反応（Ｃ-プライマー／Ｇ-標的、及びＡ-プライマー／Ｔ-標的）と、ミスマッチ反応（Ｃ-プライマー／Ｔ-標的、及びＡ-プライマー／Ｇ-標的）のバンド強度の比較により、対立遺伝子区別のレベルを決定することができる。表２は、これら実験で見られた区別のレベルを要約している。
【０１２７】
表２
0005685561.tif 000016
【０１２８】
この結果に示されるように、特定の３'ミスマッチは、核酸ポリメラーゼによって容易に拡大される。この場合、伝統的なＰＣＲパラメーターでは、AmplitaqTMGoldを含有する５'→３'エキソヌクレアーゼ及び５'→３'エキソヌクレアーゼ欠乏性AmplitaqTMStoffelＤＮＡポリメラーゼの両者で、Ｃ／Ｔミスマッチが、Ａ／Ｇミスマッチよりずっと多く拡大する。“Fast-shotTM”増幅を利用することで、どちらかの酵素を用いて両対立遺伝子間の１：1000レベルの区別が達成される。
【０１２９】
実施例４
ＰＣＲ及びリポーターアニーリング
蛍光に基づいたＰＣＲ反応には、以下の核酸を使用した。
【０１３０】
0005685561.tif 000017
【０１３１】
２μg/mlニシン精子ＤＮＡ中の２fMの合成鋳型対照、及び２mM MOPS ｐＨ7.0を用いた。
次の反応の反応成分は、以下に示される。
【０１３２】
0005685561.tif 000018
AMPLITAQ GOLDTM５Ｕ/μlは、Perkin Elmerから得た。
【０１３３】
試薬を解凍し、穏やかに混合して２つのマスターミックスを調製した。一方のマスターミックス（Ａ）は、第２プライマーＡとリポーターＡを含んでいた。他方のマスターミックス（Ｂ）は、第２プライマーＢとリポーターＢを含んでいた。以下のようにマスターミックスを調製した。
【０１３４】
0005685561.tif 000019
【０１３５】
反応の最終体積は20μlだった。マスターミックスと第１プライマーを合わせて15μLに５μlの標的核酸を添加した。標的核酸の量は、マスターミックスに添加する水の量を調整することで、最終利用者のニーズに応じて増減できる。
分析プレートは次にように調製した：15μlのマスターミックスを96−ウェル分析プレートのウェルに等分した（Low Profile MultiplateTM96ウェル;MJ Reseach,MLL-9601）。標的核酸試料を、マスターミックスを含有するウェルに体積５μlで繰返し添加した。いくつかのウェルには、ネガティブ対照として、標的核酸ではなく５μlの水を添加した。標的核酸又はネガティブ対照の添加後、20μLの鉱油Mineral Oil(明白色油；Sigma,M-3516)で反応を覆い、分析プレートをＤＮＡ熱サイクラーに移した。
【０１３６】
分析プレートの熱循環パラメーターは以下に示される。
【０１３７】
0005685561.tif 000020
【０１３８】
追加の対照として、試料のいくつかはＰＣＲ熱循環に供しなかった。
ＰＣＲ循環反応後、蛍光シグナルの放射について分析プレートを調べた。分析プレートをPerSeptive Biosystems CytofluorTM4000蛍光プレートリーダーに移し、プレートの上部から読み取るように装置をセットした。プレートリーダーのパラメーターは次の通りである：485±10nmに励起フィルター設定；530±12.5nmに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲインを50に設定。そして、試料を読み取った。対照としてＰＣＲ増幅前の蛍光シグナルの放射についても分析プレートを調べた。
引き続き試料を10％未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で追跡し、次に臭化エチジウム染色を行い、増幅産物の存在を検出かつ分析プレートから得られた蛍光示度を確認した。
標的核酸鋳型の蛍光検出の結果は、表３に示される。増幅産物は、ＰＡＧＥ後の臭化エチジウムによっても検出された。表３では、（−）は、鋳型又は熱循環プロセスの非存在を示し、（＋）は存在を示す。表３中の数は、相対蛍光単位を示す（ＲＦＵs）。
【０１３９】
表３
0005685561.tif 000021
【０１４０】
表３に示されるように、いくつかの第２プライマー及びリポーターは、試料中に存在する標的核酸配列の存在の検出にうまく使用できる。マスターミックスＡ中の第２プライマー／リポーターの組合せは、マスターミックスＢ中の第２プライマー／リポーター組合せより強いシグナルを生成した。（シグナル強度のいくらかの差を斟酌し、マスターミックスＡは、マスターミックスＢよりも多くのＰＣＲ産物を含むことも分かるだろう。）シグナル強度の差は、より低温で大きいようである。しかし、マスターミックスＢ中の第２プライマーとリポーターは、すべての保持温度でバックグラウンドを超えるシグナルを生成したので、標的核酸配列の検出及び定量には十分だった。
【０１４１】
ＰＣＲ産物は、ＰＡＧＥ及び臭化エチジウムによる染色か或いはMolecular Dynamics（Sunnyvale,CA）595 FluoroimagerTMによるフルオレッセイン蛍光の走査によって分離した。マスターミックスＡとマスターミックスＢの両反応について、鋳型含有反応に対応するレーンでＰＡＧＥ後の臭化エチジウム染色によって増幅産物が検出された（＋）。核酸鋳型を含有しない反応に対応するレーンでは、増幅産物は見られなかった（−）。これら結果は、上記分析で検出された蛍光シグナルの増加が、試料中の標的核酸配列の存在がによることを確証した。
【０１４２】
マスターミックスＡの第２プライマー／リポーターの組合せと、マスターミックスＢの第２プライマー／リポーターの組合せとの間のシグナル強度の差は、反応時の非天然塩基、isoＣの分解が原因のようだった。非天然塩基、isoＣは、トリス緩衝液含有溶液のような求核物質含有溶液中では、高温で分解する傾向がある。しかし、上で提示した結果は、isoＣがトリス緩衝液中、高温で使用するのに適することを示している。
本発明の方法の効率を最適化するため、非天然塩基、isoＣを使用する場合は、ホットスタート活性化を必要としないポリメラーゼと、事実上非求核性である緩衝液を使用すべきである。
【０１４３】
実施例５
乾燥プレート調製
本発明の方法に必要な試薬のいくらか又はすべては、貯蔵に便利かつ使用しやすいように乾燥することができる。例えば、40mM酢酸カリウム、20mM ＭｇＣｌ2、50μM ｄＮＴＰs（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１単位／反応のAMPLITAQ GOLDTMポリメラーゼ、後述するような糖、及び８μMリポーターを含有するマスターミックスとして反応を設定することができる。マスターミックスを96ウェル微量定量プレートのウェル内に等分し、SPEEDVACTM（Savant Instruments,Holbrook,New York）内で45〜50分間（加熱せず）乾燥する。乾燥後、１
DESPIAKTM（Trocken,Germany）を有する真空バッグ内に置かれたMICROSEAL ATMフィルム（MJ Research,Waltham,MA）でプレートを覆い、バッグをアルゴンで充填し、FOOD SAVERTM（Tilia,San Franscisco,CA）で封鎖することができる。種々の糖（マンノース、ラフィノース、スクロース、及びトレハロース（Sigma,St.Louis,MO））を種々の濃度（１質量％、２質量％、５質量％、及び10質量％）で使用することができる。
【０１４４】
反応ミックスは、核酸標的、第１プライマー、第２プライマー、及び任意にリポーターを含有する水中で再構成することができる。そして、反応ミックスをＰＣＲに供することができる。
このように、乾燥した試薬は、容易に再構成し、かつＰＣＲでうまく使用することができる。このような凍結乾燥試薬は長期間室温で貯蔵することができる。試薬のいくつか又はすべては、乾燥することができる。本発明の所定の方法で必要な凍結乾燥試薬のいくつか又はすべては、再構成後の使用のため微量定量プレートのウェル内に貯蔵することができる。
【０１４５】
実施例６
非天然塩基のＰＣＲ組込みを含む分析
以下の実施例は、第２プライマーの標識近傍の位置におけるＤＮＡ二重鎖を横切るヌクレオチド三リン酸の部位特異性組込み（ＳＳＩ）による第２プライマー上の標識のシグナルをクエンチすることによるＰＣＲ産物の集積を監視する方法を説明する。標識化ヌクレオチド三リン酸は、ＰＣＲ伸長の際、伸長している第１プライマー中に組み込まれる。標識化ヌクレオチド三リン酸の標識は、第２プライマー上の標識をクエンチすることができる。代わりに、第２プライマーの標識（供与体染料）とリポーターの標識（受容体染料）との間に蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を観察することができる。ＰＣＲ産物の検出は、供与体染料を励起し、かつ組み込まれた受容体染料の放射を読み取ることによって観察できる。
【０１４６】
ＰＣＲ反応には、以下の核酸成分を使用した。
【０１４７】
0005685561.tif 000022
【０１４８】
“c3”は、プロピルスペーサーを示し、第１プライマーの合成の際にヌクレオチドの代わりに化学的に導入された。第１プライマーの合成で用いるホスホラミダイトは、3-O-ジメチルトリチル-プロピル-1-[2-シアノエチル-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト（スペーサーホスホラミダイトC3;Glen Reserch,Sterling,VA）だった。任意に、ヌクレオチド修飾を含め、同一のヌクレオチド配列を含有するが、プロピルスペーサーを欠いたオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応の第１プライマー用の代用物として使用することができる。
【０１４９】
これら系の設計では、標識化ヌクレオチド三リン酸が第２プライマーＡ又はＢの標識近傍の塩基に相補的であることが好ましい。標識される天然に存在するヌクレオチド塩基を使用する場合、第２プライマーＡ又はＢの標識近傍の該相補性塩基を組み込む能力は、限定された場合のみに可能である。これは、すべての４つの天然に存在するヌクレオチド塩基は、おそらく他の位置で組み込まれるからである。例えば、isoＧ及びisoＣのような標識化非天然塩基を使用することによって、標識化非天然塩基は、相補的な非天然塩基の向かい側だけに組み込まれ、第２プライマーＡ又はＢの標識近傍に配置されるうる。
【０１５０】
標識された非天然塩基及び天然に存在するヌクレオチド三リン酸を使用する系は、試料中に存在する標的核酸（鋳型）の量を検出又は定量する分析において、クエンチャー染料（QSY7TM）で標識された天然に存在するヌクレオチド（ｄＴＴＰ）を利用する。この実施例では、標識された天然に存在するヌクレオチドが、ＰＣＲ伸長の際、第２プライマーＡの標識（ＦＡＭ）の向かい側、かつ近傍の位置で第１プライマー中に組み込まれた。試料中に存在する標的核酸（鋳型）の量を検出又は定量するための分析において、クエンチャー染料（QSY7TM）で標識された非天然塩基、isoＧ（ｄＧisoＴＰ）を使用する系も実施することができる。この実施例では、標識された天然に存在するヌクレオチドが、ＰＣＲ伸長の際、isoＣ（Ｘ）の向かい側、第２プライマーＢの標識（ＦＡＢ）の近傍の位置で、第１プライマー中に組み込まれた。QSY7TMｄＴＴＰ及びQSY7TMｄＧisoＴＰの化学構造は以下に示される。
【０１５１】
【化３】
0005685561.tif 000023
【０１５２】
【化４】
0005685561.tif 000024
【０１５３】
ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲにおける部位特異的組込みによる蛍光クエンチングを示した。ＰＣＲ条件：25μlの反応量中、0.2μMの第１プライマー、0.2μMの第２プライマーＡ、0.4pMの鋳型核酸、50μMのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、10mMトリスｐＨ８、0.1％ＢＳＡ、0.1％TritonTMX-100、0.1μg/μl分解ニシン精子ＤＮＡ、40mM ＫＡｃ、２mM ＭｇＣｌ2、１単位のKlentaqTMＤＮＡポリメラーゼ（Ab Peptides,St/Louis,MO）、及び０又は3.9uM QSY7TMｄＴＴＰ。
ＰＣＲ条件は、以下に示される。
【０１５４】
0005685561.tif 000025
【０１５５】
反応は、CytofluorTM4000蛍光プレートリーダー（485nm励起／530nm放射）による蛍光について、又はゲル電気泳動法によって解析した。70℃で６秒の保持時間を使用して、正確な蛍光示度を得た。結果は、表４に示される。
ＰＣＲ反応は、TypoonTM蛍光スキャナー（Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA）を用いて６ＦＡＭについて走査した10％未変性ポリアクリルアミドゲルに基づいて解明した。産物バンドに含まれ相対蛍光単位（ＲＦＵ's）は、（＋）QSY7TMｄＴＴＰ反応では1,325,644であり、（−）QSY7TMｄＴＴＰ反応では41,462,945だった。ポリアクリルアミドゲルは、臭化エチジウム（10mMトリス-ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ中50μg/ml）で染色もした。臭化エチジウム染色からの産物バンドの定量化は、（＋）QSY7TMｄＴＴＰ反応では21,993ＲＦＵ's、（−）QSY7TMｄＴＴＰ反応では25,537ＲＦＵ'sを示した。
【０１５６】
表４は、35サイクルのＰＣＲの前後でＰＣＲ反応ウェル内で読み取られた正味のＲＦＵ'sを示す。
【０１５７】
表４
0005685561.tif 000026
【０１５８】
これらの結果は、標識化ヌクレオチド三リン酸（QSY7TMｄＴＴＰ）が、ＰＣＲの際に第２プライマーのフルオレッセイン標識（ＦＡＭ）の向かい側で二重鎖中に組み込まれるとき、蛍光強度が27倍減少することを示す。
この実施例の核酸成分を用いて、部位特異的組込み（ＳＳＩ）によるＰＣＲ産物の集積の“リアルタイム”モニタリングをも実証した。
【０１５９】
ＰＣＲ条件は以下の通りだった：15μlの反応量中、0.2μMの第１プライマー、0.2μMの第２プライマーＡ、0.33pMの鋳型、50μMのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、10mMトリスｐＨ８、0.1％ＢＳＡ、0.1％Triton X-100、0.1μg/μl分解ニシン精子ＤＮＡ、40mM ＫＡｃ、２mM ＭｇＣｌ2、１単位のKlentaqTMＤＮＡポリメラーゼ（Ab Peptides,St/Louis,MO）、及び０又は３uM QSY7TMｄＴＴＰ。
【０１６０】
ＰＣＲ条件：
0005685561.tif 000027
（*Ｘ＝6,11,16,21,26,31,又は36）
【０１６１】
反応は、CytofluorTM4000蛍光プレートリーダー（PE Biosystems,Foster City,CA）による蛍光について（485nm励起／530nm放射）、又はゲル電気泳動法によって解析した。図１４に結果を示す。
図１４は、相対蛍光対ＰＣＲサイクル数を示す。QSY7TMｄＴＴＰ含有反応もゲル電気泳動法で調べた（10％未変性ポリアクリルアミドゲルについて５μl）。臭化エチジウム（10mMトリス-ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ中50μg/ml）によるゲルの染色は、予想された産物の集積を示した。QSY7TMｄＴＴＰ含有反応の蛍光は、ゲル解析で示されたＰＣＲ産物の状況及び集積と一致する。これら結果は、標的濃度に対するクエンチングに相関するＰＣＲの回数は、試料中に存在する標的の量を数量化できることをも示した。例えば、存在する標的が多いほど、クエンチングが速く起こるだろう。
【０１６２】
上述の実施例では、正確な蛍光測定のために70℃で６秒の保持時間を用いた。このような保持時間は、プライマー間のギャップを越え、かつプライマーを越えて組み込まれる不可欠な数の塩基については必要ない。蛍光が測定されない場合、70℃での保持時間は必要ない。蛍光示度、又は他の適切な測定値を得るために保持時間が必要な場合、保持温度は、第１プライマーが標的配列に効率的にハイブリダイズできる温度より高い温度が好ましい。一実施形態では、保持温度は、第１プライマーの融解温度より10℃以上高い。
【０１６３】
実施例７
標識化非天然塩基の合成
本発明の方法及びキットに好適な標識化非天然塩基は種々の方法で製造することができる。標識化−デオキシイソグアノシン5'-三リン酸の２種の合成スキームが提供される：方法Ａは図１５に示され、方法Ａの化合物（化合物１〜８、８a〜８dを含む）はセクションＡで述べられ；方法Ｂは図１６に示され、方法Ｂの化合物（化合物９〜18）はセクションＢで述べられる。
【０１６４】
セクションＡ
方法Ａによる標識化−デオキシイソグアノシン5'-三リン酸の合成に関与する以下の化学反応のため、SephadexTMDEAEセルロース、ω-アミノブチルアガロースゲル及びトリブチルアンモニウムピロリン酸はSigmaから購入し；ビオチン2-ニトロフェニルエステル、6-カルボキシフルオレッセイン N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、及び6-カルボキシテトラメチルローダミン N-ヒドロキシスクシンイミドはBerry & Associatesから購入し；QSY7TM NヒドロキシスクシンイミドエステルはMolecular Probesから購入し；他の全化学薬品はAldrich Chemical Co.又はFisher Chemical Co.から購入し、さらに精製せずに使用した。溶媒は、４Å分子ふるい上で乾燥した。反応は、乾燥アルゴン下、オーブン−ドライガラスシステム内で行った。“エバポレーション”は、膜ポンプによる揮発性溶媒の除去を指す。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（230〜425メッシュ）で行った。
【０１６５】
6-(6-アミノヘキシル)-アミノ-2-クロロプリン 2'-デオキシ-3',5'-ジ-トルイルリボシド２：
DMF(100ml)に溶解した2,6-ジクロロ-2'-デオキシ-3',5'-ジトルイルリボシド１(1当量, 5mmol，2.705g）を、室温で、200ml DMF中ヘキサメチレンジアミン(20当量, 100mmol, 11.60g)の撹拌溶液に40分かけて添加した。溶液を50℃で2.5時間撹拌してから室温に冷まし、濃縮して残留物を抽出した（水／酢酸エチル）。有機層を水で洗浄し（5×50ml）、乾燥し（Na2SO4）、溶媒をエバポレートしてフォームとして2.673ｇ（4.308mmol, 86％）の生成物２を得た。
【０１６６】
6-(6-アミノヘキシル)-アミノ-2-クロロプリン2'-デオキシリボシド３：
上で得られた化合物２（4.308mmol,2.673ｇ）を20mlメタノールに溶解し、０℃にてアンモニアで飽和させ、封管に入れた。それを80℃で１時間加熱し、０℃に冷却した。管を開け、溶媒を膜ポンプ真空下でエバポレートした。残留物をエーテル／ヘキサンで３回処理し、得られた粉末を真空中乾燥し、さらに精製せずに次工程で使用した。
【０１６７】
6-(6-アミノヘキシル)-アミノ-2-フェノキシプリン2'-デオキシリボシド４：
上で得られた化合物３（最大4.308mmol）をDMF(15ml)に溶解し、ベンジルアルコール（43ml）中のNaH溶液（12当量,51.69mmol,鉱油に60％分散の2.068ｇ）を添加した。それを100℃で２時間撹拌し、室温に冷却した。酢酸を添加（12当量）して反応混合物を中和した。その結果の溶液をCeliteTM上でろ過し、ろ液をエバポレートし、得られた残留物をさらに精製せずに次工程で使用した。
【０１６８】
6-(6-トリフルオロアセチルアミドヘキシル)-アミノ-2-フェノキシプリン2'-デオキシリボシド５：
上で得られた生成物をメタノール（30ml）／トリフルオロ酢酸エチル（30ml）の混合物に溶解し、室温で24時間撹拌した。溶媒及び過剰のトリフルオロ酢酸エチルをエバポレーションで除去し、残留物をクロロホルム中1.5％メタノール、そしてクロロホルム中17.5メタノールの一段階勾配を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：626mg（1.134mmol,３段階で26％）。
【０１６９】
6-(6-トリフルオロアセチルアミドヘキシル)-アミノ-3-フェノキシプリン2'-デオキシリボシド5'-三リン酸６：
1,2,4-トリアゾール（4.5当量,0.585mmol,40mg）を0.5mlのアセトニトリル／4.5当量のトリエチルアミン（0.585mmol,0.081ml）の混合物に溶解し、そのフラスコを氷浴内に入れた。オキシ塩化リン（1.5当量,0.195mmol,0.018ml）を添加し、それを室温で30分間撹拌した。それをろ過し、固体を最小量のアセトニトリルで洗浄し、ろ液を化合物５（１当量,0.13mmol,72mg）に添加した。をれを30分間室温で撹拌してからDMF（２ml）中トリブチルアンモニウムピロリン酸（89mg）の溶液を添加し、19時間撹拌を続けた。そして、水（１ml）を添加して残存トリアゾリド基を加水分解した。30分間撹拌後、反応混合物を真空中30℃で濃縮し、0.05Ｍ〜0.5Ｍ TEAB緩衝液の勾配を用いてDEAEセルロース上のカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を0.4〜0.5Ｍの緩衝液濃度で溶離した。生成物含有フラクションを30℃でエバポレートし、さらに使用した。
【０１７０】
N6-(6-アミノヘキシル)-2'-デオキシイソグアノシン5'-三リン酸７：
上で得られた化合物をメタノールと共にエバポレートし、メタノール（５ml）に溶解した。Pd/C（10質量％,10mg）及びHCOONH4（63mg）を添加し、還流下45分間撹拌した。それを室温に冷却し、触媒からろ過し、かつ触媒を熱水で洗浄し、その混合ろ液を真空中で濃縮した。残留物を28％水酸化アンモニウム水溶液（３ml）に溶解し、室温で３時間撹拌し、真空中濃縮し、0.05Ｍ〜0.5Ｍ TEAB緩衝液の勾配を用いてDEAEセルロース上のカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を0.3〜0.4Ｍの緩衝液濃度で溶離した。生成物含有フラクションをエバポレートし、さらに使用した。
【０１７１】
N6-(6-Tamra-アミドヘキシル)-2'-デオキシイソグアノシン5'-三リン酸８ａ：
化合物７（そのトリエチルアンモニウム塩として約１mg）を0.2mlの0.1Ｍ TEAB緩衝液に溶解し、DMF（0.2ml）に溶解した6-カルボキシテトラメチルローダミンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（10mg）を添加した。それを35℃で３時間撹拌してからω-アミノブチルアガロースを添加して過剰のTamraTMを結合させ、さらに１時間撹拌し、反応混合物をDEAEセルロースカラムに装填し、0.05Ｍ〜0.5Ｍ TEAB緩衝液の勾配で溶離した。生成物を0.4Ｍの緩衝液濃度で溶離した。生成物含有フラクションを30℃でエバポレートした。
化合物８ｂ及び８ｄは、6-カルボキシテトラメチルローダミンN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの代わりに、それぞれ、6-カルボキシフルオレッセインN-ヒドロキシスクシンイミドエステル及びQSY7TM N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、化合物８ａと同様に調製される。
【０１７２】
N6-(6-ビオチニルアミドヘキシル)-2'-デオキシイソグアノシン5'-三リン酸８ｃ：
化合物７（そのトリエチルアンモニウム塩として約１mg）を0.2mlの水に溶解し、DMF（0.2ml）に溶解したビオチン2-ニトロフェニルエステル（10mg）を添加した。溶液は明黄色に変わった。それを35℃で１時間撹拌し、ω-アミノブチルアガロースを添加して過剰のビオチンを結合させ、さらに１時間撹拌し、反応混合物をDEAEセルロースカラムに装填し、0.05Ｍ〜0.5Ｍ TEAB緩衝液の勾配で溶離した。生成物を0.4Ｍの緩衝液濃度で溶離した。生成物含有フラクションを30℃でエバポレートした。
【０１７３】
セクションＢ
方法Ａによる標識化−デオキシイソグアノシン5'-三リン酸の合成に関与する以下の化学反応のため、トリブチルアンモニウムピロリン酸はSigmaから購入し；ビオチンNヒドロキシスクシンイミドエステルはPierce Chemical Companyから購入し；QSY7TM N-ヒドロキシスクシンイミドエステル及びDabcyl N-ヒドロキシスクシンイミドはMolecular Probesから購入し；他の全化学薬品はAldrich Chemical Co.又はFisher Chemical Co.から購入し、さらに精製せずに使用した。溶媒は、４Å分子ふるい上で乾燥した。反応は、乾燥アルゴン下、オーブン−ドライガラス製品内で行った。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（230〜425メッシュ）で行った。
以下の略語を使用した：Ac2O（無水酢酸）；DMF（N,N-ジメチルホルムアミド）；DMAP（4,4'-ジメチルアミノピリジン）；DMT（4,4'-ジメトキシトリチル）；Et3N（トリエチルアミン）；MeCN（アセトニトリル）；MeOH（メチルアルコール）；Tol（p-トルイル）。
【０１７４】
1-(p,p'-ジメトキシトリチル)-ヘキサメチレンジアミン（９）
ヘキサメチレンジアミン（10当量,375mmol,43.5ｇ）を２回ピリジンから共エバポレートし、100mlのピリジンに溶解した。DMAP（0.1当量,3.75mmol,457mg）を添加し、反応フラスコを氷浴内に置いた。100mlピリジンに溶解したDMT-クロライド（１当量,37.5mmol,12.69ｇ）を２時間かけて滴下添加した。それを室温で４時間撹拌し、MeOH（５ml）を添加し、反応混合物を濃縮し、残存残留物を水性NaHCO3／酢酸エチルで抽出した。有機層を２回NaHCO3水溶液で洗浄し、乾燥し、溶媒をエバポレートした。得られた生成物をさらに精製せずに次工程で使用した。
収量：14.895ｇ（65.634mmol,95％）粘着性油。
【０１７５】
2-クロロ-6-(6-p,p'-ジメトキシトリチルアミノヘキシル)-アミノプリン-2'-デオキシ-3',5'-ジトルイルリボシド（１０）
化合物９（1.3当量,31.916mmol,13.34ｇ）をDMFと共に共エバポレートし、100mlのDMFに溶解した。100mlのDMFに溶解したジイソプロピルエチルアミン（3.9当量,95.748mmol,16.65ml）及び化合物１（１当量,24.551mmol,13.282ｇ）を添加し、室温で３時間撹拌した。それを濃縮し、残留物を水性NaHCO3／酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥し、溶媒をエバポレートした。残留物をエーテルと共に２回こね、固体生成物を得、さらに真空中で乾燥後さらに精製せずに使用した。
【０１７６】
2-ベンジルオキシ-6-(6-p,p'-ジメトキシトリチルアミノヘキシル)-アミノプリン-2'-デオキシリボシド（１１）
化合物１０（１当量,19.23mmol,17.74ｇ）をDMF（25ml）に溶解し、ベンジルアルコール（128mL）中のNaH（10当量,192.3mmol, 鉱油中に分散の7.69ｇ）溶液に添加した。反応混合物を加熱してから（120℃,６時間）室温で（15時間）撹拌後、CeliteTM上でろ過し、ろ液をエバポレートし、残留物を抽出し（酢酸エチル／水）、有機層を洗浄（NaHCO3−溶液）、乾燥し、溶媒を除去し、残留物をエーテル／ヘキサン1:10と共に５回こねた。TLC：CHCl3／10％MeOH ＲF＝0.26。収量：10.280ｇ（13.562mmol,２段階で70.5％）フォーム。
【０１７７】
2-ベンジルオキシ-6-(6-p,p'-ジメトキシトリチルアミノヘキシル)-アミノプリン-2'-デオキシ-5'-O-p,p'-ジメトキシトリチルリボシド（１２）
化合物１１（14.7388mmol,11.172ｇ）をピリミジンで共エバポレートし、150mlのピリジンに溶解し、DMAP（0.25当量,3.6847mmol,450mg）を添加した。フラスコを氷浴内に置き、DMTC1（1.5当量,22.108mmol,7.848ｇ）を２時間かけてゆっくり添加した。それを室温で22時間撹拌してからMeOH（１ml）を添加し、反応混合物を濃縮し、残留物を抽出した（クロロホルム／水性NaHCO3）。有機層を乾燥し、溶媒をエバポレートし、残留物をエーテル／ヘキサン１：１と共ににこねて過剰のDMTを除去し、不溶性の固体生成物を乾燥し、精製せずにさらに使用した。
収量：14.890ｇ（14.047mmol,95％）明褐色フォーム。
【０１７８】
2-ベンジルオキシ-6-(6-p,p'-ジメトキシトリチルアミノヘキシル)-アミノプリン-3'-O-アセチル-2'-デオキシ-5'-O-p,p'-ジメトキシトリチルリボシド（１３）
化合物１２（14.047mmol,14.89ｇ）をピリミジンで共エバポレートし、200mlのピリジンに溶解し、DMAP（0.25当量,3.5117mmol,428mg）、ET3N（５当量,70.235mmol,9.7ml）及びAc2O（2.5当量,35.1175mmol,3.582ｇ）を添加した。それを室温で4.5時間撹拌してからMeOH（２ml）を添加し、反応混合物を濃縮し、残留物を抽出した（酢酸エチル／水性NaHCO3）。有機層を乾燥し、溶媒をエバポレートし、残留物を、酢酸エチル／ヘキサン／ET3N 30:60:1、それから65:35:3の一段階勾配を用いてカラムクロマトグラフィーで精製した。収量：5.93ｇ（5.385mmol,38％）黄色フォーム。
【０１７９】
2-ベンジルオキシ-6-(6-アミノヘキシル)-アミノプリン-3'-O-アセチル-2'-デオキシリボシド（１４）
化合物１４（2.471mmol,2.723ｇ）を50mlのアセトニトリル／２mlの水に溶解し、Ce(CH4)2(NO3)3（0.3当量,0.74mmol,406mg）を添加した。それを45分間還流し、さらに0.15当量のCe(CH4)2(NO3)3（0.37mmol,205mg）を添加し、１時間還流を続けた。それをエバポレートし、残留物をエーテルと共にこねてDMTを除去し、不溶性生成物を乾燥し、さらに精製せずにさらに使用した。
【０１８０】
2-ベンジルオキシ-6-(6-トリフルオロアセトアミドヘキシル)-アミノプリン-3'-O-アセチル-2'-デオキシリボシド（１５）
上で得られた化合物１４（最大5.385mmol）を30mlのMeOH／50mlのトリフルオロ酢酸エチル／５mlのEt2Nに溶解し、反応混合物を室温で21.5時間撹拌した。TLC（クロロホルム／17.5％MeOH）：ＲF＝0.72）は完全な転換を示した。それをエバポレートし、残留物を抽出し（食塩水／酢酸エチル）、有機層を乾燥し、溶媒をエバポレートして残留物をクロロホルム／1.5％MeOH、それから17.5％MeOHの一段階勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：2.80ｇ（4.714mmol,87％）フォーム。
【０１８１】
2-ベンジルオキシ-6-(6-トリフルオロアセトアミドヘキシル)-アミノプリン-3'-O-アセチル-5'-トリホスホリル-2'-デオキシリボシド（１６）
イミダゾール（61当量,306mg,4.5mmol,再結晶）をアセトニトリル（3.6mL）に溶解し、冷却した（０℃）。POCl3（19当量,0.128mL）及びトリエチルアミン（61当量,0.633mL）を添加し、混合物を撹拌後（０℃,0.5時間）一部（0.309mL）を化合物１５（１当量,0.074mmol,44mg）に添加した。この混合物を撹拌後（室温,0.5時間）、トリブチルアンモニウムピロリン酸（２当量,0.16mmol,73mg）を含有するDMF（1.5mL）を添加した。24時間後に反応をクエンチし（２mL,10％NH4COO）、凍結乾燥した。生成物を20％MeCN及び(NH4)2CO3／20％MeCNの勾配を用いてアニオン交換クロマトグラフィー（Dionex ProPacTMSAX-10;Dionex,Sunnyvale,CA）によって精製した。集めた生成物を繰返し凍結乾燥し、過剰の塩を除去した。収量0.007mmol（10％）、白色固体。
【０１８２】
6-(6-アミノヘキシル)-アミノプリン-5'-トリホスホリル-2'-デオキシリボシド（７）
化合物１６（0.007mmol）をメタノール（2.5mL）に溶解後、Pd/C（10％,５mg）及びNH4COO（0.05mmol,31mg）を添加した。懸濁液を還流後（１時間）触媒をろ過して除き、溶媒をエバポレートした。残留物を28％水酸化アンモニウムで処理後（1.5mL,３時間,室温）反応生成物を乾燥し、20％MeCN及び(NH4)2CO3／20％MeCNの勾配を用いてアニオン交換クロマトグラフィー（Dionex ProPacTMSAX-10;Dionex,Sunnyvale,CA）によって精製した。集めた生成物を繰返し凍結乾燥し、過剰の塩を除去した。収量0.0063mmol（90％）、白色固体。
【０１８３】
6-(6-ビオチニルアミドヘキシル)-アミノプリン-5'-トリホスホリル-2'-デオキシリボシド（８ｃ）、6-(6-dabcylアミドヘキシル)-アミノプリン-5'-トリホスホリル-2'-デオキシリボシド（17a）、6-(6-QSY7TMアミドヘキシル)-アミノプリン-5'-トリホスホリル-2'-デオキシリボシド（17ｂ）
H2O中（40μL）化合物７（0.88μmol,トリエチルアンモニウム塩）に、ホウ酸ナトリウム（10.5μL,１Ｍ,ｐＨ8.5）を添加し、次いでビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、dabcyl N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はQSY7TM N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（2.6μmol,３当量）を含有するDMF（216mL）を添加した。反応を進行後（３時間,55℃）、それを20％MeCNで希釈し、生成物を、20％MeCN及び(NH4)2CO3／20％MeCNの勾配を用いてアニオン交換クロマトグラフィー（Dionex ProPacTMSAX-10;Dionex,Sunnyvale,CA）によって精製した。収率50〜80％。
【０１８４】
実施例８
蛍光−クエンチング非標準デオキシ−ヌクレオチド三リン酸の部位特異的組込みの“リアルタイム”モニタリング。
ＰＣＲ反応の循環の際に、ＰＣＲ反応の蛍光のモニタリングを行った。ＰＣＲ反応は、第１及び第２プライマーを含み、第２プライマーは、その５'末端に発蛍光団結合ヌクレオチド（ＦＡＭ-ｄＴ）を含む。鋳型核酸の増幅の際、蛍光クエンチング化合物（Dabcy又はQSY7TM）に結合している標準のヌクレオシド三リン酸（反応Ａ；ｄＴＴＰ）又はisoＧヌクレオシド三リン酸（反応Ｂ；ｄＧisoＴＰ）が、第２プライマーの発蛍光団−結合ヌクレオシドに（ＦＡＭ-ｄＴ）[向かい側かつ隣接して]組み込まれ、ＰＣＲ反応における蛍光シグナルが減少する。
【０１８５】
この実施例では、以下の核酸をＰＣＲ反応に使用した。
【０１８６】
0005685561.tif 000028
【０１８７】
“c3”は、プロピルスペーサーを示し、第１プライマーの合成時にヌクレオチドの代わりに化学的に導入された。第１プライマーの合成で用いたホスホラミダイトは、3-O-ジメチルトリチル-プロピル-1-[2-シアノエチル-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイトだった（スペーサーホスホラミダイトC3；Glen Research,Sterling,VA）。任意に、ヌクレオチド修飾を含め、同一のヌクレオチド配列を含有するが、プロピルスペーサーを欠いているオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応の第１プライマーの代用物として使用できる。
【０１８８】
全ＰＣＲ反応で、以下の成分（基本ＰＣＲ反応成分）が指示濃度で存在した。
【０１８９】
0005685561.tif 000029
上記成分を調製した。
【０１９０】
第２プライマーＡ、第２プライマーＢ、ｄＴＴＰ、DabcylｄＴＴＰ（Glen Research,Sterling,VA）、DabcylＧisoＴＰ及びQSY7TMｄＧisoＴＰは、以下のＰＣＲ反応で可変成分だった。これら成分を、以下に示されるように、ＰＣＲ反応Ａ〜Ｊに下記濃度で添加した。
【０１９１】
0005685561.tif 000030
【０１９２】
反応は、最終体積25μLに調製した。反応混合物を25μLのSmart Cycler ＰＣＲ管（Cepheid,Sunnyvale,CA）に充填した。ＰＣＲ管を微小遠心分離機内で６秒間回転させ、反応チャンバー内に液体を引いた。ＰＣＲ反応を含む管をSmart CyclerTM（Cepheid,Sunnyvale,CA）内に置き、全ＰＣＲ反応の間、蛍光を絶え間なく監視した。
【０１９３】
熱循環パラメーター：
0005685561.tif 000031
*２〜41循環の３工程時に、Smart CyclerTMのオプティクスを活性化し、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。
【０１９４】
41サイクルのＰＣＲ増幅後、蛍光モニタリングオプティクスにて毎秒0.2℃の割合でＰＣＲ管内の温度を60℃から95℃に上昇させることによって、ＰＣＲ反応産物を融解曲線解析に供した。
ＰＣＲ反応Ａ、Ｂ、及びＣからのＰＣＲ反応産物の蛍光クエンチングが図１７Ａに示され、これらＰＣＲ産物の融解曲線解析が図１７Ａに示される。これら結果は、それぞれ、発蛍光団−結合標準ヌクレオシド含有第２プライマー又は非標準ヌクレオシド含有第２プライマーと組み合わせてクエンチング化合物−結合標準ヌクレオシド三リン酸又はクエンチング化合物−結合isoＧヌクレオシド三リン酸を含む試料内でＰＣＲ反応の蛍光がクエンチされることを示している。融解曲線データは、発蛍光団−結合核酸鎖をクエンチング化合物−結合核鎖から分離することで反応産物内の蛍光が復元されることを示している。
ＰＣＲ反応Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧからのＰＣＲ反応産物の蛍光クエンチングは、図１８Ａに示される。ＰＣＲ反応Ｈ、Ｉ、及びＪからのＰＣＲ反応産物の蛍光クエンチングは、図１８Ｂに示される。
【０１９５】
実施例９
ゲノムＤＮＡのリアルタイム定量化
ＰＣＲ反応の循環及びゲノムＤＮＡ試料からの核酸鋳型の増幅時に、ＰＣＲ反応の蛍光のモニタリングを行った。ＰＣＲ反応は、第１プライマーと、２個の非標準ヌクレオチド（iso-Ｇ及びiso-Ｃ）を含有する第２プライマーとを含み；プライマーはハイブリダイズしてマウスゲノムＤＮＡの領域を増幅するように設計した。ＰＣＲ反応は、非標準ヌクレオチド（iso-Ｇ）を含有するリポーター核酸、蛍光クエンチング化合物−結合ヌクレオチド（Dabcyl ｄＴ）、及び該リポーターの５'塩基（Ｔ）に結合した発蛍光団（６ＦＡＭ）をも含んでいた。非標準ヌクレオチドの対合を含む増幅産物へのリポーター核酸のアニーリングが、蛍光クエンチング化合物−結合ヌクレオチドを含有するリポーター核酸からの核酸ポリメラーゼ活性による発蛍光団の切断をもたらしうる。
【０１９６】
この実施例では、以下の核酸をＰＣＲ反応で使用した。
【０１９７】
0005685561.tif 000032
【０１９８】
マウスゲノムＤＮＡは、Jackson研究所（Bar Harbor,ME）から得、１mM ＭＯＰＳｐＨ7.5、0.01mM ＥＤＴＡ中に希釈した。鋳型Ａでは、マウス株A/JゲノムＤＮＡを連続的に濃度５ng/μl、2.5ng/μl、1.25ng/μl、0.63ng/μl、0.31ng/μl、及び0.16ng/μlに希釈した。鋳型Ｂでは、マウス株C57BL/6JゲノムＤＮＡを連続的に濃度20ng/μl、２ng/μl、0.2ng/μl、20pg/μl、２pg/μl、及び0.2pg/μlに希釈した。ゲノムＤＮＡ希釈シリーズを５分間煮沸し、氷上に５分間置き、-20℃で貯蔵した。
【０１９９】
マウスゲノム中の特定の標的核酸配列のＰＣＲ増幅及び検出用にプライマーを合成した。最初の標的核酸配列は、A/JマウスゲノムＤＮＡ、座L11316、染色体3−9.679P（設計Ａ）を用いてこの手順の実行可能性を評価するために選択した。さらなるゲノムＤＮＡ定量化のために選択した標的配列は、マウス株C57BL/6J、座R75378、染色体10−41.5F（設計Ｂ）だった。第１プライマーＡ及び第１プライマーＢは、60.0〜63.0℃のＴｍを有するように設計される。第２プライマーＡ及び第２プライマーＢは、61.0〜63.0℃のＴｍを有するように設計される。Macintosh用のOligo 4.0TMソフトウェア（National Bioscience,Minneapolis,MN）を用いて、全プライマーを二次構造形成について評価した。
【０２００】
この実施例の全ＰＣＲ反応には、以下の成分（基本ＰＣＲ成分）が指示濃度で存在した。
【０２０１】
0005685561.tif 000033
【０２０２】
上記成分を含有する（第１プライマーＡ及び第２プライマーＡと共に）マスターミックスＡは、25μLの最終反応量に対して1.04Ｘ濃度で調製した。
上記成分を含有する（第１プライマーＢ及び第２プライマーＢと共に）マスターミックスＢは、25μLの最終反応量に対して1.25Ｘ濃度で調製した。
設計Ａ反応混合物は、５ng/μL、2.5ng/μL、1.25ng/μL、0.63ng/μL、0.31ng/μL、及び0.16ng/μLの各A/Jゲノム標的ＤＮＡ希釈１μLを、24μLのＰＣＲ Ａマスターミックスを含有する25μLのSmart CyclerTMＰＣＲ管に添加することによって作製した。管を微小遠心分離機内で６秒間回転させ、液体を反応チャンバー内に引いた。個々のＰＣＲ管は、それぞれ核酸標的数1500、750、375、188、94、及び47ハプロイド当量に相当する５ng、2.5ng、1.25ng、630pg、30pg、及び160pgのA/Jゲノム標的ＤＮＡを含んでいた。
【０２０３】
設計Ｂ反応混合物は、20ng/μL、２ng/μL、0.2ng/μL、20pg/μL、及び２pg/μLの各C57BL/6Jゲノム標的ＤＮＡ希釈５μLを、20μLのＰＣＲマスターミックスＢを含有する熱循環プレートウェル又は各リアルタイム熱サイクラー特有の管に添加することによって作製した。個々のＰＣＲ管又はウェルは、それぞれ核酸標的数30,000標的、3,000標的、300標的、30標的、及び３標的に相当する100ng、10ng、１ng、100pg、及び10pgのC57BL/6Jゲノム標的ＤＮＡを含んでいた。反応を微量定量プレート内で行うときは、試料量の蒸発を防ぐため熱循環の前に15μLの鉱油オーバレイを各ウェルに添加した。
【０２０４】
設計Ａ反応混合物をSmart CyclerTM内に置き、次の条件下で循環させた。
【０２０５】
0005685561.tif 000034
*サイクル＃17〜51の２工程時に、動的プロットを生成するため、リアルタイムＰＣＲ熱サイクラーのオプティクスを活性化してＦＡＭ−生成蛍光を読み、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。
これら反応の蛍光示度は、図１９に示される。
【０２０６】
設計Ｂ反応混合物を、下記のリアルタイムＰＣＲ熱サイクラー内に個々別々に置き：
１）Smart CyclerTM25μL管（Cepheid;Sunnyvale,CA）を用いるSmart CyclerTM（Cepheid;Sunnyvale,CA）
２）Light CyclerTM管（Roche;Basel,Switzerland）を用いるSmart CyclerTM（Roche;Basel,Switzerland）
３）96-ウェル微量定量プレート（MJ Research Inc.;Waltham,MA）を用いるiCyclerTM（BioRad;Hercules,CA）
４）MicroAmpTM光学96-ウェル反応プレートウェル（Applied Biosystems;Foster City,CA）を用いる7700（Applied Biosystems,Foster City,CA）かつ以下の条件下で循環させた。
【０２０７】
0005685561.tif 000035
*２〜41循環の３工程時に、Smart CyclerTMのオプティクスを活性化し、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。
【０２０８】
閾値サイクル（Ｃt）及び分散の相関関係（Ｃv）法によって、蛍光の読取り情報を解析した。閾値サイクルは、システムが、対数−線形期の際にＰＣＲ産物の指数関数的成長に伴うシグナルの増加を検出し始める時である。対数−線形期の傾斜は増幅効率の反映であり、真正な増幅は該傾斜の屈折点、すなわち対数−線形期が始まる時の成長曲線上の点で示される。この点は、成長曲線に沿った変化の最大割合をも表す。核酸定量化はＣtに関連し、核酸の初期量が多いほどＣt値は低い。Ｃtは、どのベースライン活性より上、かつ指数関数的増加期以内に置かれるべきである。
【０２０９】
実施例１０
ＲＮＡのリアルタイム定量化
ＰＣＲ反応の循環及びＲＮＡ試料からの核酸鋳型の増幅の際に、ＰＣＲ反応の蛍光のモニタリングを行った。ヒトβ-アクチンｍＲＮＡの検出及び定量化のためにＤＮＡプライマーを合成した。ｃＤＮＡ／第１プライマーがヒトβ-アクチンｍＲＮＡの５'領域上の配列にハイブリダイズし、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成を開始する。ｃＤＮＡ／第１プライマーと、２個の非標準ヌクレオチド（iso-Ｃ及びiso-Ｇ）を含む第２プライマーとを、鋳型としてｃＤＮＡを用いるヒトβ-アクチン配列の増幅に用いた。ＰＣＲ反応はリポーター核酸をも含み、これは非標準ヌクレオチド（iso-Ｇ）、蛍光クエンチング化合物−結合ヌクレオチド（Dabcyl ｄＴ）、及び該リポーターの５'塩基（Ｔ）に結合した発蛍光団（６ＦＡＭ）を含有する。非標準ヌクレオチドの対合を含む増幅産物にリポーター核酸をアニーリングすると、核酸ポリメラーゼ活性による蛍光クエンチング化合物に結合したリポーター核酸からの発蛍光団の切断が起こる。
【０２１０】
この実施例の逆転写-ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）反応に以下の核酸を使用した。
【０２１１】
0005685561.tif 000036
【０２１２】
単一ドナー由来の全ヒト心臓ＲＮＡは、Clontech（Palo Alto,CA）から得た。ＲＮＡ試料は、５mMビス-トリス-プロパンｐＨ8.9、0.1mM ＥＴＤＡ、100ng/ml酵母ｔＲＮＡ（Sigma, St.Louis,MO）及び100ng/mlの剪断されたニシン精子ＤＮＡ（Sigma, St.Louis,MO）で構成される緩衝液に20ng/μl、２ng/μl、200pg/μl、20pg/μl、２pg/μl及び0.2 pg/μlに希釈した。
【０２１３】
全ＰＣＲ反応で、以下の成分（基本ＰＣＲ反応成分）が指示濃度で存在した。
【０２１４】
0005685561.tif 000037
【０２１５】
表Ｘに示される試薬を含有するＲＴ-ＰＣＲマスターミックスは、25μLの最終反応量のためにヌクレアーゼの無いＨ2Ｏを用いて1.25Ｘ濃度で調製した。ＲＴ-ＰＣＲ反応混合物は、20μLの1.25Ｘ ＲＴ-ＰＣＲマスターミックスを25μLのSmart CyclerTMＰＣＲ管にそれぞれ希釈したＲＮＡ試料５μLに添加することによって調製した。そして、管を微小遠心分離機内で６秒間回転させて反応チャンバー内に液体を引いた。
【０２１６】
遠心分離後、すぐに反応混合物をSmart CyclerTMに入れ、下記の条件下で循環させた。
【０２１７】
0005685561.tif 000038
*サイクル＃３〜52の２工程時に、動的プロットを生成するため、リアルタイムＰＣＲ熱サイクラーのオプティクスを活性化してＦＡＭ−生成蛍光を読み、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。結果は、図２０に示される。
【０２１８】
実施例１１
標識化非標準塩基の部位特異的組込みによるＲＮＡのリアルタイム定量化
ＰＣＲ反応の循環及びＲＮＡ試料からの核酸鋳型の増幅の際に、ＰＣＲ反応の蛍光のモニタリングを行った。ヒトβ-アクチンｍＲＮＡの検出及び定量化のためにＤＮＡプライマーを合成した。ｃＤＮＡ／第１プライマーがヒトβ-アクチンｍＲＮＡの５'領域上の配列にハイブリダイズし、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成を開始する。ｃＤＮＡ／第１プライマーと、リポーターの５'塩基（Ｔ）に結合した発蛍光団（６ＦＡＭ）及び５'の最後から２番目の非標準ヌクレオチド（iso-ｄＣ）を含有する第２プライマーとを、鋳型としてｃＤＮＡを用いるヒトβ-アクチン配列の増幅に用いた。鋳型核酸の増幅時、発蛍光団クエンチング化合物−結合非標準ヌクレオシド三リン酸（Dabcyl-d-isoＧＴＰ）がＰＣＲ反応に存在し、発蛍光団−結合５'-ヌクレオチド（ＦＡＭ-ｄＴ）に隣接し、かつＰＣＲ反応の蛍光シグナルを減少させる第２プライマーの非標準ヌクレオチド（iso-ｄＣ）の向かい側に組み込まれた。
【０２１９】
この実施例では、以下の核酸をＲＴ-ＰＣＲ反応に使用した。
【０２２０】
0005685561.tif 000039
【０２２１】
単一ドナー由来の全ヒト心臓ＲＮＡは、Clontech（Palo Alto,CA）から得た。ＲＮＡ試料は、５mMビス-トリス-プロパンｐＨ8.9、0.1mM ＥＴＤＡ、100ng/mL酵母ｔＲＮＡ（Sigma, St.Louis,MO）及び100ng/mLの剪断されたニシン精子ＤＮＡで構成される緩衝液中、20ng/μL、２ng/μL、200pg/μL、20pg/μL、２pg/μL及び0.2pg/μLに希釈した。
【０２２２】
全ＰＣＲ反応で、以下の成分（基本ＰＣＲ反応成分）が指示濃度で存在した。
【０２２３】
0005685561.tif 000040
【０２２４】
ＲＴ-ＰＣＲマスターミックスは、25μLの最終反応量のためにヌクレアーゼの無いＨ2Ｏを用いて1.25Ｘ濃度で調製した。ＲＴ-ＰＣＲ反応混合物は、20μLの1.25Ｘ ＲＴ-ＰＣＲマスターミックスを、25μLのSmart CyclerTM25μL管（Cepheid,Sunnyvale,CA）にそれぞれ希釈したＲＮＡ試料５μLに添加することによって調製した。そして、管を微小遠心分離機内で６秒間回転させて反応チャンバー内に液体を引いた。
【０２２５】
遠心分離後、すぐに反応混合物をSmart CyclerTM（Cepheid,Sunnyvale,CA）内に入れ、下記の条件下で循環させた。
【０２２６】
0005685561.tif 000041
*サイクル＃23〜52の３工程時に、図２１に示されるような動的プロットを生成するため、Smart CyclerTMのオプティクスを活性化してＦＡＭ−生成蛍光を読み、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。
【０２２７】
実施例１２
多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
多重蛍光に基づいたＰＣＲ反応を行い、種々のマウス株由来の単一ヌクレオチド多型性マウスＳＴＳ配列27.MMHAP25FLA6の配列を決定した。この実施例では、多重ＰＣＲ反応は、標的核酸上の下流の非多型性配列にハイブリダイズする共通の第１プライマーと、２つの上流第２プライマー、すなわち第２プライマーＡ及び第２プライマーＢとを含み、各第２プライマーは対立遺伝子特異的であり、特異性は、異なる３'ヌクレオチドによって決まる。第２プライマーＡ及び第２プライマーＢは、標的核酸ハイブリダイゼーションには寄与しないが、それぞれリポーターＡ及びリポーターＢのハイブリダイゼーションを許容する、異なる５'領域をも有していた。リポーター核酸は、それぞれ５'の最後の２番目の非標準ヌクレオチド及び発蛍光団クエンチング化合物−結合ヌクレオチドを含み、かつそれぞれ５'ヌクレオチドに結合した異なる発蛍光団（ＦＡＭ又はＨＥＸ）を有する５'ヌクレオチドを含んでいた。異なる発蛍光団は、励起により異なる波長の光を放射した。非標準ヌクレオチドの対合を含む増幅産物へのリポーター核酸のアニーリングが、核酸ポリメラーゼ活性によるクエンチング化合物−結合リポーター核酸からの発蛍光団（単数又は複数）の切断を引き起こしうる。対立遺伝子特異性核酸標的の優勢の結果、切断されたリポーターからの発蛍光団の特有の蛍光放射となる。
【０２２８】
この実施例では、以下の核酸をＲＴ-ＰＣＲ反応に使用した。
【０２２９】
0005685561.tif 000042
0005685561.tif 000043
±＝近交系。**＝F1ハイブリッド系。
マウスｇＤＮＡ試料は、Jackson研究所（Bar Harbor,ME）から購入した。すべてのｇＤＮＡ試料は、１mM ＭＯＰＳｐＨ7.5、0.01mM ＥＤＴＡ中、２ng/μLに希釈した。
【０２３０】
0005685561.tif 000044
【０２３１】
上記成分を含有するマスターミックスは、10μLの最終反応量のために２Ｘ濃度で調製した。５μLのマスターミックスを分析プレートの個々のウェルに等分し、個々のウェルに５μLの標的ＤＮＡs（10ng）を添加した。ポジティブ対照（完全適合鋳型）及びネガティブ対照（不適合鋳型又は鋳型無し）用にＰＣＲ反応を調製した。鋳型核酸の添加後、各ウェルを15μLの鉱油で覆い、簡単に遠心分離した。ＰＣＲ反応を行う前に、分析プレートを蛍光シグナルの強度について走査し、530及び580nmにベースライン蛍光を設置した。
【０２３２】
以下のＰＣＲパラメーターを使用した。
【０２３３】
0005685561.tif 000045
【０２３４】
ＰＣＲ循環反応後、分析プレートを蛍光シグナルの放射について調べた。分析プレートを、プレートの上部から読むように設定された装置を有するCytofluorTM4000蛍光プレートリーダー（Applied Biosystems,Foster City,CA）に移した。プレートリーダーのパラメーターは以下の通り：（６ＦＡＭ蛍光検出）485±10nmに励起フィルター設定；530±12.5nmに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲイン50に設定、（ＨＥＸ蛍光検出）530±12.5nmに励起フィルター設定；580±25nmに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲイン50に設定。
【０２３５】
実施例１３
因子Ｖ遺伝子型の多重ＰＣＲ解析
多重蛍光に基づいたＰＣＲ反応を行い、ヒトゲノムＤＮＡの因子Ｖ遺伝子における対立遺伝子特異的ヌクレオチド変異を決定した。この実施例で用いた手順は、実施例１２で用いた手順と同様である。
【０２３６】
0005685561.tif 000046
【０２３７】
合成因子Ｖ標的は、自動ＤＮＡ解析によって調製した。因子Ｖ標的を含むヒトゲノムＤＮＡは、Cornell/NIGMSヒト遺伝子細胞貯蔵所（Camden,NJ）から得た。全ｇＤＮＡ試料は、１mM ＭＯＰＳｐＨ7.5、0.1mM ＥＤＴＡ内せ１又は５ng/μLに希釈し、５分間煮沸してからＰＣＲ前に氷上に置いた。合成標的は、連続的に、1mMトリスｐＨ8.0（Fisher Scientific,Pittsburgh,PA）及び0.1μg/mLニシン精子ＤＮＡ（St.Louis,MO）中、１又は10fMに希釈した。
【０２３８】
0005685561.tif 000047
【０２３９】
上記成分を含有するマスターミックスは、10μLの最終反応量のために２Ｘ濃度で調製した。５μLのマスターミックスを分析プレート（Low Profile MultiplateTM,96ウェル；MJ Research,Waltham,MA）の個々のウェルに等分し、個々のウェルに５μLの標的ＤＮＡsを添加した。５又は50zmol（約3000又は30,000分子）の突然変異、野生型、又は異型接合的合成標的をウェルに添加した。５又は25ngの異型接合的、又は野生型ヒトゲノムＤＮＡをウェルに添加した。対照として標的ＤＮＡを含有しないウェルを用いた。鋳型核酸の添加後、各ウェルを15μLの鉱油で覆い、簡単に遠心分離した。ＰＣＲ反応を行う前に、分析プレートを蛍光シグナルの強度について走査し、530nm及び580nmにベースライン蛍光を設置した。
【０２４０】
以下のＰＣＲパラメーターを使用した。
【０２４１】
0005685561.tif 000048
【０２４２】
ＰＣＲ循環反応後、分析プレートを蛍光シグナルの放射について調べた。分析プレートを、プレートの上部から読むように設定された装置を有するCytofluorTM4000蛍光プレートリーダー（Applied Biosystems,Foster City,CA）に移した。プレートリーダーのパラメーターは以下の通り：（６ＦＡＭ蛍光検出）485±10nmに励起フィルター設定；530±12.5nmに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲイン50に設定、（ＨＥＸ蛍光検出）530±12.5nmに励起フィルター設定；580±25nmに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲイン50に設定。行われる各多重ＰＣＲ反応について、それぞれＹ及びＸ軸に示されるＨＥＸ及びＦＡＭ蛍光の相対蛍光単位（ＲＦＵs）が合わせて図２２に示される。
【０２４３】
実施例１４
エキソヌクレアーゼ欠乏性核酸ポリメラーゼ及び切断剤としてFlapエンドヌクレアーゼを用いる多重リアルタイム対立遺伝子特異的ＰＣＲ
種々のマウス株由来のゲノムＤＮＡのマウスＳＴＳ配列27.MMHAP25FLA6内の単一ヌクレオチド多型の配列に対し、多重蛍光に基づいたＰＣＲ反応を行った。この実施例では、多重ＰＣＲ反応は、標的核酸上の下流の非多型性配列にハイブリダイズする共通の第１プライマーと、２つの上流第２プライマー、すなわち第２プライマーＡ及び第２プライマーＢとを含み、各第２プライマーは対立遺伝子特異的であり、特異性は、異なる３'ヌクレオチドによって決まる。第２プライマーＡ及び第２プライマーＢは、標的核酸ハイブリダイゼーションには寄与しないが、それぞれリポーターＡ及びリポーターＢのハイブリダイゼーションを許容する、異なる５'領域をも有していた。リポーター核酸は、それぞれ５'の最後の２番目の非標準ヌクレオチド及び発蛍光団クエンチング化合物−結合ヌクレオチドを含むが、５'ヌクレオチドに結合した異なる発蛍光団（ＦＡＭ又はＨＥＸ）を有する５'ヌクレオチドを含んでいた。異なる発蛍光団は、励起により異なる波長の光を放射した。非標準ヌクレオチドの対合を含む増幅産物へのリポーター核酸のアニーリングが、フラップエンドヌクレアーゼ-１（ＦＥＮ-１）酵素活性によるクエンチング化合物−結合リポーター核酸からの発蛍光団（単数又は複数）の切断を引き起こしうる。対立遺伝子特異性核酸標的の優勢の結果、切断されたリポーターからの発蛍光団の特有の蛍光放射となる。
【０２４４】
この実施例では、以下の核酸をＲＴ-ＰＣＲ反応に使用した。
【０２４５】
0005685561.tif 000049
±＝近交系。**＝F1ハイブリッド系。
マウスｇＤＮＡ試料は、Jackson研究所（Bar Harbor,ME）から購入した。すべてのｇＤＮＡ試料は、１mM ＭＯＰＳｐＨ7.5、0.01mM ＥＤＴＡ中、20ng/μLに希釈し、95℃に５分間加熱し、氷上で急冷した。
【０２４６】
0005685561.tif 000050
【０２４７】
Mja ＦＥＮ-１は、参照によって本明細書に取り込まれるHosfieldら,J.Biol.Chem(1998)273:27154-61に記載されている方法を修正した方法に従って発現させ、かつ精製した。Mja ＦＥＮ-１配列を含むGenBank受入番号はU67585である。Mja ＦＥＮ-１は、米国特許第5,843,669号、及びBultら,Science(1996)273:1058-1073に記載されており、両者とも参照によって本明細書に取り込まれる。Methanococcus jannaschii ＦＥＮ-１遺伝子を含有するプラスミドを大腸菌株BL21(DE3)（Novagen,Madison,WI）中に形質転換し、最終濃度0.4mMまでイソプロピルチオガラクトピラノシド（Sigma, St.Louis,MO）の添加により、対数期にタンパク質過剰発現を誘発した。さらに２時間の成長後細胞を3000Ｘｇでペレット化し、緩衝液１（10mMトリス,ｐＨ7.5（Fisher Scientific,Pittsburgh,PA），150mM ＮａＣｌ（Sigma, St.Louis,MO），10mM イミダゾール（Aldrich,Milwaukee,WI））に再懸濁させ、簡単に超音波処理し、75℃で45分間加熱して可溶化してから氷上で０℃に急冷した。この手順は、細胞を可溶化し、混入している中温性の自然の大腸菌タンパク質の大部分を沈殿させた。生成溶液を25,000Ｘｇで遠心分離し、緩衝液１で予め平衡させたTALONTM金属親和性樹脂（Clontech,Palo Alto,CA）と上清を合わせ、重力流カラム内に装填し、緩衝液１で広範に洗浄した。100mM、200mM、350mM及び500mMの段階的なイミダゾール勾配を含むように調整した緩衝液１を用いてＦＥＮ-１を溶離した。ＦＥＮ-１含有フラクションを収集し、10mMトリス、ｐＨ7.5（Fisher Scientific,Pittsburgh,PA）、150mM ＫＣｌ、及び１mM ＥＤＴＡを含有する緩衝液に対して広範に透析した。透析した原料を50％グリセロール（Fisher Scientific,Pittsburgh,PA）、0.5％TweenTM20（EM Sciences,Gibbstown,NJ）、及び0.5％NonidetTMP-40（Roche,Indianapolis,IN）に調整した。
【０２４８】
上記成分を含有するマスターミックスを1.5Ｘ以上の最終濃度に調製した。これらミックスの15μlを分析プレートの個々のウェルに等分し、標的ＤＮＡs（100ng）５μLを個々のウェルに添加して吸引によって混合した。ポジティブ対照（完全適合鋳型）、ネガティブ対照（不適合鋳型又は鋳型無し）、及び異種接合性試料（適合及び不適合鋳型）用にＰＣＲ反応を調製した。鋳型核酸添加後、各ウェルを20μLの鉱油で覆い、簡単に遠心分離した。
分析プレートをiCycler iQリアルタイムＰＣＲ検出システム（BioRad,Hercules,CA）に移し、下記のパラメーターを用いて循環させた。シグナル検出に使用したフィルター設定は以下の通り：（６ＦＡＭ）−励起フィルター490±10nm、放射フィルター530±15nm；（ＨＥＸ）励起フィルター530±15nm、放射フィルター575±10nm。
【０２４９】
以下のＰＣＲパラメーターを使用した。
【０２５０】
0005685561.tif 000051
*サイクル＃27〜42の２工程時に、動的プロットを生成するためiCycler iQTMリアルタイムＰＣＲ検出システムのオプティクスを活性化してＦＡＭ及びＨＥＸ生成蛍光を読み、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。結果は、図２３Ａ〜Ｂに示される。
【０２５１】
実施例１５
蛍光クエンチドＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析及び蛍光クエンチドＰＣＲ増幅産物
クエンチング化合物を有するＳＳＩによってクエンチされた発蛍光団を含有するＰＣＲ反応産物の融解曲線解析を用いてクエンチャー組込みプライマー／二量体の存在を調べることができる。クエンチャー組込みプライマー／二量体は、通常クエンチャー組込みＰＣＲ産物より低温で融解する。融解曲線解析は、クエンチャー組込みプライマー／二量体と、ＰＣＲ増幅後の産物として両者が存在する場合はクエンチャー組込みＰＣＲ産物との融点における蛍光の増加を示すことができる。
【０２５２】
実施例１１からのＰＣＲ増幅産物をSmart CyclerTM（Cepheid,Sunnyvale,CA）を用いる融解曲線解析に供した。毎秒0.1℃の割合でＰＣＲ反応産物の温度を徐々に上昇させながら蛍光の変化を監視した。意図した産物（クエンチャー組込みＰＣＲ産物）のＴｍ及び非特異的産物（クエンチャー組込みプライマー／二量体）のＴｍが図２５に示される。出発量１pgのＲＮＡ鋳型を含むＲＴ-ＰＣＲ反応についての融解解析は、約71℃のＴｍを有する有意量の非特異的産物及び約79℃のＴｍを有する意図した産物を示した。100ngのＲＮＡ鋳型を含む反応についての融解解析は、79℃のＴｍを有する意図した産物の形成のみを示した。一端意図した産物のＴｍが分かると、意図した産物によって生成されるシグナルを特異的に観察するために、非特異的産物のＴｍより高い温度、及び意図した産物のＴｍ未満の温度で、反応の蛍光測定を行うことによって観察することが有用である考えられる。融解曲線解析の結果は、図２４に示される。
【図１】
0005685561.tif 000052
【図２】
0005685561.tif 000053
【図３】
0005685561.tif 000054
【図４】
0005685561.tif 000055
【図５】
0005685561.tif 000056
【図６】
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【図７】
0005685561.tif 000058
【図８】
0005685561.tif 000059
【図９】
0005685561.tif 000060
【図１０】
0005685561.tif 000061
【図１１】
0005685561.tif 000062
【図１２】
0005685561.tif 000063
【図１３】
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【図１４】
0005685561.tif 000065
【図１５】
0005685561.tif 000066
【図１６】
0005685561.tif 000067
【図１７Ａ】
0005685561.tif 000068
【図１７Ｂ】
0005685561.tif 000069
【図１８Ａ】
0005685561.tif 000070
【図１８Ｂ】
0005685561.tif 000071
【図１９】
0005685561.tif 000072
【図２０】
0005685561.tif 000073
【図２１】
0005685561.tif 000074
【図２２】
0005685561.tif 000075
【図２３Ａ】
0005685561.tif 000076
【図２３Ｂ】
0005685561.tif 000077
【図２４】
0005685561.tif 000078
【配列表】
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