(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IGO1遺伝子及び／又はIGO2遺伝子が破壊されてなる酵母の遺伝子破壊株を用いた、エタノールの製造方法。
【請求項２】
酵母が、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、焼酎酵母、パン酵母及びバイオエタノール酵母からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
実験室酵母がBY4743株である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
バイオエタノール酵母がNCYC3233株である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
RIM15遺伝子が破壊されてなる実験室酵母BY4743株及び／又はRIM15遺伝子が破壊されてなるバイオエタノール酵母NCYC3233株を用いた、エタノールの製造方法。
【請求項６】
エタノールが清酒又はバイオエタノールである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエタノールの製造方法に関する。さらに詳しくは、高発酵性酵母を用いた、清酒、ビール、ワイン等の酒類やバイオエタノール等を含むエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類や燃料用のバイオエタノールに含まれているエタノールは、一般に、ブドウ糖などの糖類をサッカロミセス属に属する酵母により発酵させて製造する。
【０００３】
発酵中の酵母細胞は、初めのうちは環境中の栄養源を勢いよく消費しながら増殖し細胞数を増加させるが、栄養源が枯渇し、生育に適さない環境になると、そのことを感知して増殖抑制のためのシグナル伝達経路が速やかに働き、増殖が停止した定常期と呼ばれる状態に移行する。このシグナル伝達経路の中心的役割を果たすのが、定常期移行を促進する因子（「定常期移行促進因子」と表記する。）である。定常期移行促進因子としては、これまでのところRim15pが知られている。
【０００４】
Rim15pとはPASキナーゼファミリーに属するプロテインキナーゼであり、TORキナーゼやプロテインキナーゼA等を介したシグナル伝達経路により活性化され、RNA結合タンパク質であるIgo1p、Igo2pをリン酸化することにより定常期への移行に必要な遺伝子の発現を正に制御することが、非特許文献１及び２に記載されている。従って、Igo1p及びIgo2pも定常期移行促進因子の範囲に含まれる。
【０００５】
Rim15pによって発現調節を受ける遺伝子は、炭素代謝関連、脂質代謝関連、ミトコンドリアタンパク質、細胞防御反応関連、細胞内シグナル伝達関連等多岐にわたっており、Rim15pは、細胞外の環境に応答してこれらの遺伝子の発現を総合的に変化させることによって、定常期移行に寄与すると考えられている。
【０００６】
したがって、Rim15pの機能が異常になると、増殖期から定常期への切り換えに欠損が生じる。そのため、酵母が増殖を終えた後の生命維持に影響が現れ、例えば、非特許文献３では、RIM15遺伝子破壊株は、酵母細胞の経時的寿命が短くなることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Pedruzzi I., Dubouloz F., Cameroni E., Wanke V., Roosen J., Winderickx J., De Virgilio C., Mol. Cell, 12(6), 1607-1613 (2003).
【非特許文献２】Talarek N., Cameroni E., Jaquenoud M., Luo X., Bontron S., Lippman S., Devgan G., Snyder M., Broach J. R., De Virgilio C., Mol. Cell, 38, 345-355 (2010).
【非特許文献３】Wei M., Fabrizio P., Hu J., Ge H., Cheng C., Li L., Longo V. D., PLoS Genet., 4(1), 139-149 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
酵母を用いたエタノール生産において、エタノール生産速度を上げることは、エタノール発酵の生産性を高めるために極めて重要である。しかしながら、エタノール生産速度の観点から、酵母の増殖期から定常期への切り換えに着目したという発想は従来には無く、しかも、定常期移行促進因子をコードするRIM15遺伝子に変異を導入することにより改変し、高発酵性を獲得した例も知られていない。
【０００９】
本発明の課題は、酵母を用いて、生産性高くエタノールを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、従来の知見から、酵母のエタノール発酵は増殖停止後の定常期でも継続するので、効率的なエタノール発酵のためには定常期移行が正常に行われ、発酵環境における酵母の寿命が長期間維持されることが必要であると考えた。そして、そのことを証明するために、RIM15遺伝子を破壊した形質転換酵母を用いて発酵試験を行い、遺伝子破壊がエタノール発酵に与える影響を解析したところ、意外なことに、RIM15遺伝子を破壊した形質転換酵母が著しく高い発酵性を示すことが判明した。これは、従来の知見から全く予想できない結果であった。そこで、本発明者らは、この現象は酵母のエタノール発酵性を改善させるために利用可能であると考え、RIM15遺伝子の破壊とエタノール発酵についてさらに詳細な研究を行うことにより、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の要旨は、
定常期移行促進因子をコードする遺伝子が破壊されてなる酵母の遺伝子破壊株を用いた、エタノールの製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、酵母のエタノール発酵において、従来より顕著に速い生産速度でエタノールを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、親株である実験室酵母BY4743株及び遺伝子破壊株（BY4743 Δrim15）を用いて清酒製造を行った際の二酸化炭素発生速度（左）及び二酸化炭素総発生量（右）を示す図である。点線が親株、実線がRIM15遺伝子破壊株のデータを示す。
【図２】図２は、親株である実験室酵母BY4743株及び遺伝子破壊株（BY4743 Δrim15）を用いてエタノール発酵試験を行った際の二酸化炭素発生速度（左）及び二酸化炭素総発生量（右）を示す図である。点線が親株、実線がRIM15遺伝子破壊株のデータを示す。
【図３】図３は、親株である実験室酵母BY4743株及び遺伝子破壊株（BY4743 Δigo1及びBY4743 Δigo2）を用いてエタノール発酵試験を行った際の二酸化炭素発生速度（左）及び二酸化炭素総発生量（右）を示す図である。白丸印が親株、白四角印がBY4743 Δigo1株、黒四角印がBY4743 Δigo2株のデータを示す。
【図４】図４は、親株であるバイオエタノール酵母由来NCYC3233-27c株及び遺伝子破壊株（NCYC3233-27c rim15Δ株）を用いて廃糖蜜培地からのエタノール製造を行った際の二酸化炭素発生速度（上段左）、二酸化炭素総発生量（上段右）及びエタノール濃度の時間経過（下段）を示す図である。いずれも、点線が親株、実線がRIM15遺伝子破壊株のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のエタノールの製造方法は、酵母を用いてエタノールを製造するものであって、定常期移行促進因子をコードする遺伝子、例えばRIM15遺伝子、IGO1遺伝子及びIGO2遺伝子の少なくとも一つの破壊株を用いることに大きな特徴を有する。
【００１５】
RIM15遺伝子については、SGD(Saccharomyces Genome Database)のホームページ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces)に配列が記載されており、かかる配列に基づいて、PCRプライマーを設計して遺伝子破壊や部位特異的変異を行うことができる。例えば、RIM15を破壊するために用いるDNAのプライマーとしては、RIM15+URA3-Fw（配列表の配列番号４）、RIM15+URA3-Rv（配列表の配列番号５）等が例示される。
【００１６】
本発明における酵母とは、サッカロミセス属に属するエタノール発酵に用いることのできる酵母であって、例えば、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、焼酎酵母、パン酵母、及びバイオエタノール酵母が挙げられる。実験室酵母としては、サッカロミセス・セレビシエに属するBY4743株が好ましい。バイオエタノール酵母としては、サッカロミセス・セレビシエに属するNCYC3233株が好ましい。エタノールとしては、清酒又はバイオエタノールが挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「破壊」とは、破壊される遺伝子の機能を喪失させたり、失活させたりするような遺伝子操作のことをいい、目的遺伝子領域の全遺伝子を喪失させる遺伝子操作や正常な機能に必要な部位を欠失又は変異させる遺伝子操作のことをいう。具体的には、定常期移行促進因子をコードするRIM15遺伝子を全喪失させる遺伝子操作が例示される。かかる遺伝子操作を行う方法としては、特に限定はなく公知の方法を用いることができ、例えば、変異剤処理による突然変異、遺伝子工学を用いた遺伝子破壊、遺伝子工学を用いた部位特異的変異などが挙げられる。なお、本発明においては、自然突然変異により破壊が生じた遺伝子破壊株も用いることができる。
【００１８】
なお、上記遺伝子操作を行う際には、アミノ酸などの栄養要求マーカーや、薬剤に対する耐性マーカーなどを選択マーカーとして使用してもよい。
【００１９】
IGO1遺伝子及びIGO2遺伝子については、SGD(Saccharomyces Genome Database)のホームページ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces)に配列が記載されている。従って、上記で説明したようなRIM15遺伝子と同様の方法によって、このような遺伝子の破壊株を得ることができる。
【００２０】
定常期移行促進因子をコードする遺伝子の破壊株の代表株としては、BY4743 Δrim15株及びNCYC3233-27c rim15Δ株が挙げられる。前者はEUROSCARF(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html)からY37281として入手可能であり、後者は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号NITE P-1017（寄託日：2010年12月13日）として寄託されている。さらに、IGO1遺伝子が破壊された破壊株の代表株としてはBY4743 Δigo1株が、及びIGO2遺伝子が破壊された破壊株の代表株としてはBY4743 Δigo2株が挙げられる。これらはEUROSCARF(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html)からY32055及びY37298としてそれぞれ入手可能である。所望の遺伝子破壊株が上記のような寄託機関に寄託されている場合、そのような寄託されている株を用いることができる。
【００２１】
本発明のエタノールの製造方法は、上記で説明された酵母の遺伝子破壊株を用いて実施されるが、酵母が特定のものである以外は、公知の方法や条件を採用することができる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら制限されるものではない。
【００２３】
〔実施例１〕
サッカロミセス・セレビシエBY4743株及びこれを親株としたRIM15遺伝子破壊株を用いた清酒製造試験を行った。なお、BY4743株、BY4743 Δrim15株については、いずれもEUROSCARFから、それぞれY20000、Y37281として入手可能である。
【００２４】
親株であるBY4743株とBY4743 Δrim15株を用いて、以下に示す方法で清酒を製造した。
【００２５】
掛米40g、麹米10g、水80mL、90％乳酸17.8μL混合による一段仕込を実施した。掛米として精米歩合70％のアルファー化米、麹米として精白歩合70％の乾燥麹を用いた。各酵母は、YPD培地（酵母エキス1％、ペプトン2％、ブドウ糖2％含有）において一晩振とう培養した後、滅菌蒸留水により洗浄し、酵母数が1×107cells/mLになるように仕込時に添加した。発酵温度は15℃とした。仕込試験は各株について4回ずつ繰り返した。仕込後、発酵モニター装置（アトー株式会社製ファーモグラフII）を用いて発酵に伴う二酸化炭素発生量を求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。結果を図１に示す。
【００２６】
二酸化炭素発生速度のピーク値及び二酸化炭素総発生量について、親株と遺伝子破壊株における値の有意差検定も行った。さらに、仕込後20日目には、遠心分離によって回収した清酒におけるエタノール濃度を測定し、各株について平均エタノール濃度を算出した。また、得られた平均エタノール濃度について、親株と遺伝子破壊株における濃度の有意差検定も行った。なお、エタノール濃度の測定は、株式会社島津製作所製ガスクロマトグラフGC-17Aを用いて行った。
【００２７】
RIM15遺伝子破壊株は、親株に比べて発酵に伴う二酸化炭素発生速度のピーク値が大きく（親株：14.7±0.8mg/30min、RIM15遺伝子破壊株：20.5±0.7mg/30min、0.1％未満の危険率で有意に親株より大きい）、二酸化炭素総発生量の値も大きかった（親株：5.60±0.00g、RIM15遺伝子破壊株：10.07±0.24g、0.1％未満の危険率で有意に親株より大きい）。さらに、最終的なエタノール濃度も、親株が11.2±0.3％であるのに対し、RIM15遺伝子破壊株が17.0±0.2％と著しく高い（0.1％未満の危険率で有意に親株より高い）ことから、RIM15遺伝子破壊株を用いた場合、エタノール発酵速度が速く、エタノール生産性に優れることが分かった。
【００２８】
〔実施例２〕
上述のサッカロミセス・セレビシエBY4743株及びBY4743 Δrim15株を用いてエタノール発酵試験を実施した。
【００２９】
高濃度ブドウ糖含有YPD培地（酵母エキス1％、ペプトン2％、ブドウ糖20％含有）50mLを用いたエタノール発酵試験を実施した。各酵母は、YPD培地において一晩振とう培養した後、酵母密度がOD660=0.1/mLになるように高濃度ブドウ糖含有YPD培地に添加し、5日間静置培養した。発酵温度は30℃とした。発酵試験は各株について4回ずつ繰り返した。培養開始後、発酵モニター装置（アトー株式会社製ファーモグラフII）を用いて発酵に伴う二酸化炭素発生量を求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。結果を図２に示す。二酸化炭素発生速度のピーク値及び二酸化炭素総発生量については、親株と遺伝子破壊株における値の有意差検定も行った。
【００３０】
RIM15遺伝子破壊株は、親株に比べて発酵に伴う二酸化炭素発生速度のピーク値が大きく（親株：11.3±1.5mg/15min、RIM15遺伝子破壊株：16.3±2.7mg/15min、5％未満の危険率で有意に親株より大きい）二酸化炭素総発生量の値も大きいことから（親株：2.74±0.13g、RIM15遺伝子破壊株：3.23±0.21g、0.1％未満の危険率で有意に親株より大きい）、RIM15遺伝子破壊株を用いた場合、エタノール発酵速度が速く、エタノール生産性に優れることが分かった。
【００３１】
〔実施例３〕
サッカロミセス・セレビシエBY4743株、並びにこれを親株としたIGO1遺伝子破壊株及びIGO2遺伝子破壊株のそれぞれを用いたエタノール発酵試験を行った。なお、BY4743株、BY4743 Δigo1株、BY4743 Δigo2株については、いずれもEUROSCARFから、それぞれY20000、Y32055、Y37298として入手可能である。
【００３２】
実施例２と同じ条件でエタノール発酵試験を行い、各株について3回ずつ繰り返した。培養開始後、発酵モニター装置（アトー株式会社製ファーモグラフII）を用いて発酵に伴う二酸化炭素発生量を求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。結果を図３に示す。二酸化炭素発生速度のピーク値については、親株と遺伝子破壊株における値の有意差検定も行った。
【００３３】
IGO1遺伝子破壊株及びIGO2遺伝子破壊株は、親株に比べて発酵に伴う二酸化炭素発生速度のピーク値が大きく（親株：301±38mg/6h、IGO1遺伝子破壊株：359±23mg/6h、IGO2遺伝子破壊株：420±71mg/6h、5％未満の危険率で有意に親株より大きい）二酸化炭素総発生量の値も大きいことから（親株：3.06±0.28g、IGO1遺伝子破壊株：3.41±0.13g、IGO2遺伝子破壊株：3.55±0.08g）、IGO1遺伝子破壊株及びIGO2遺伝子破壊株を用いた場合、エタノール発酵速度が速く、エタノール生産性に優れることが分かった。実施例２及び３の結果は、定常期移行促進因子をコードする遺伝子が破壊された酵母の遺伝子破壊株が優れたエタノール生産性を発揮することを強く示唆する。
【００３４】
〔実施例４〕
サッカロミセス・セレビシエ二倍体バイオエタノール酵母NCYC3233株由来の一倍体ウラシル要求性株を親株としてRIM15遺伝子の破壊株を作成し、エタノール製造試験を行った。なお、NCYC3233株は、NCYC(National Collection of Yeast Cultures; http://www.ncyc.co.uk/)より入手可能である。
【００３５】
〔NCYC3233一倍体株の作成〕
まず、遺伝子操作を容易にするために、二倍体として知られるNCYC3233株由来の一倍体株を作成した。NCYC3233株をYPD寒天培地にて30℃で一晩培養後、胞子形成寒天培地（酢酸カリウム1％含有）に菌体を移し、30℃で約3日間培養することにより、一倍体胞子の形成を誘導した。顕微鏡にて胞子形成を確認した後、マイクロマニピュレータを用いて胞子分離を行った。MAT遺伝子座のPCR及びフローサイトメトリーによるDNA含量解析により、正常な一倍体が得られたことを確認した。このうち、増殖が良好な1株を選抜し、NCYC3233-27c株と命名した。この株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号NITE P-1061（寄託日：2011年1月19日）として寄託された。
【００３６】
〔NCYC3233一倍体ウラシル要求性株の作成〕
次に、得られた一倍体株を宿主として、選択マーカーとしてウラシル要求性を付与した。本例では、ウラシル要求性を付与するため、ウラシル合成に必須なURA3遺伝子のORF領域を完全に欠失したura3Δ0アレルを有する実験室酵母BY4743株のゲノムDNAを鋳型としたPCRによってURA3遺伝子破壊用DNA断片を作成した。具体的には、プライマーURA3(-2045)-Fw（配列表の配列番号１）及びURA3下流-Rv（配列表の配列番号２）を用いてPCRを行い、BY4743株のura3Δ0アレルを増幅した。このPCR産物を用いてNCYC3233-27c株を形質転換し、5-FOA含有寒天培地（yeast nitrogen base without amino acids 0.67％、complete supplement mixture 0.79g/L、5-FOA 0.1％、ブドウ糖2％含有）で増殖するコロニーを選抜した。
【００３７】
これらの各コロニーからゲノムDNAを抽出し、プライマーURA3(-2045)-Fw及びURA3下流-Rvを用いてPCRを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、URA3遺伝子が破壊されていることを確認した。このうちURA3遺伝子破壊が確認された株については、SD-Ura寒天培地（yeast nitrogen base without amino acids 0.67％、complete supplement mixture minus uracil 0.77g/L、ブドウ糖2％含有）での生育を調べ、ウラシル要求性の表現型を示すことを確認した。この株は、NCYC3233-27c ura3Δ0株と命名され、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号NITE P-1016（寄託日：2010年12月13日）として寄託された。
【００３８】
〔RIM15遺伝子破壊株の作成〕
RIM15遺伝子の破壊は、URA3マーカー遺伝子をRIM15遺伝子のORF領域と置換することにより行った。具体的には、まず、URA3遺伝子を有するサッカロミセス・セレビシエのゲノムを鋳型として、プライマーURA3上流-Fw（配列表の配列番号３）及びURA3下流-Rvを用いてPCRを行い、URA3遺伝子のORF領域の全長を含むDNA断片を増幅した。次に、このPCR産物を鋳型として、プライマーRIM15+URA3-Fw（配列表の配列番号４）及びRIM15+URA3-Rv（配列表の配列番号５）を用いてPCRを行い、マーカーであるURA3の両側に、RIM15のORFに隣接する上流部分及び下流部分のDNA配列を持つ遺伝子破壊用DNA断片を作成した。このPCR産物を用いてNCYC3233-27c ura3Δ0株を形質転換し、SD-Ura寒天培地で増殖するコロニーを選抜した。
【００３９】
これらの各コロニーからゲノムDNAを抽出し、プライマーRIM15上流-Fw（配列表の配列番号６）及びURA3 ORF-Rv（配列表の配列番号７）を用いてPCRを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、RIM15遺伝子が破壊されていることを確認した。この株は、NCYC3233-27c rim15Δ株と命名され、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号NITE P-1017（寄託日：2010年12月13日）として寄託された。
【００４０】
〔エタノールの製造〕
バイオエタノール酵母由来一倍体株である親株NCYC3233-27c株と、上記で得られたRIM15遺伝子破壊株であるNCYC3233-27c rim15Δ株を用いて、以下に示す方法でエタノールを製造した。
【００４１】
廃糖蜜培地（ケーンモラセス原液を蒸留水にてBrix 24.8％に調整後、0.025％硫酸アンモニウムを添加したもの）50mLを用いたエタノール発酵試験を実施した。各酵母は、YPD培地において一晩振とう培養した後、滅菌蒸留水により洗浄し、酵母密度がOD660=0.1/mLになるように両培地に添加し、54時間振とう培養した。発酵温度は35℃とした。発酵試験は各株について4回繰り返した。培養開始後、発酵モニター装置（アトー株式会社製ファーモグラフII）を用いて発酵に伴う二酸化炭素発生量を求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。二酸化炭素発生速度が0となった時点を発酵終了とした。各時点における二酸化炭素発生速度及びそのピーク値について、親株と遺伝子破壊株における値の有意差検定も行った。また、培養開始から12、24、30、36、54時間後には、遠心分離によって回収した培養液上清におけるエタノール濃度を測定し、各株について平均エタノール濃度及び標準偏差を算出した。また、得られた平均エタノール濃度について、親株と遺伝子破壊株における濃度の有意差検定も行った。なお、エタノール濃度の測定は、株式会社島津製作所製ガスクロマトグラフGC-17Aを用いて行った。結果を図４に示す。
【００４２】
RIM15遺伝子破壊株は、発酵初期には親株と同様の二酸化炭素発生速度を示すが、二酸化炭素発生速度のピーク値が親株より大きく（親株：108.3±1.6mL/h、RIM15遺伝子破壊株：113.9±3.7mL/h、5％未満の危険率で有意に親株より大きい）、ピーク値からの急激な二酸化炭素発生速度減少が抑えられていた（16〜30時間においてはRIM15遺伝子破壊株の二酸化炭素発生速度が5％未満の危険率で有意に親株より大きい）。さらに、トータルで発酵終了までにかかる時間が短いことから（親株：53.3±0.8時間、RIM15遺伝子破壊株：43.8±0.7時間、0.1％未満の危険率で有意に親株より短い）、RIM15遺伝子破壊株を用いた場合、エタノール発酵速度が速く、エタノール生産性に優れることが分かった。
【００４３】
エタノール濃度について平均値の差の検定を行った結果、培養開始24、30、36時間後において、RIM15遺伝子破壊株は親株と比較して0.1％未満の危険率で有意にエタノール濃度が高いことから（親株：6.04±0.06vol％（24時間後）／7.24±0.03vol％（30時間後）／8.23±0.06vol％（36時間後）、RIM15遺伝子破壊株：6.80±0.06vol％（24時間後）／8.36±0.05vol％（30時間後）／9.16±0.07vol％（36時間後））、エタノール発酵速度が速く、エタノール生産性に優れることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の製造方法は、清酒、ビール、ワイン、焼酎等の酒類や、バイオエタノール等を含むエタノールの製造に好適に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列表の配列番号１は、URA3破壊用DNA作成・URA3増幅用プライマーである。
配列表の配列番号２は、URA3破壊用DNA作成・URA3増幅用プライマーである。
配列表の配列番号３は、URA3増幅用プライマーである。
配列表の配列番号４は、RIM15破壊用DNA作成用プライマーである。
配列表の配列番号５は、RIM15破壊用DNA作成用プライマーである。
配列表の配列番号６は、RIM15破壊確認用プライマーである。
配列表の配列番号７は、RIM15破壊確認用プライマーである。
【図１】
0005828447.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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