(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＭ１０３８、ＲＭ１３７３およびＲＭ２１８７からなる群から選択される１つ以上のＤＮＡマーカーを検出することによって、ｄ６３（ｔ）遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈晩生イネ科植物の選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）、および該遺伝子の存在を判別するためのＤＮＡマーカーを用いることを特徴とする短稈晩生イネ科植物の選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネ科植物は、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ等を含む農業上極めて重要な植物である。しかし、稈の長いイネ科植物は、強風、例えば、台風等によって倒伏していまい、果実の収穫量が大きく減少するという問題があった。そこで、稈の短いイネ科植物の育種が長年に亘って行われ、その結果、半矮性遺伝子ｓｄ１が見出された。ｓｄ１は、ジベレリン（ＧＡ）の生合成系におけるＣ２０酸化酵素遺伝子の欠損型であり、半矮性と呼ばれる、穂の長さは完全だが、植物全体の背丈が低い形質を表出する遺伝子である。
【０００３】
また近年では、半矮性遺伝子ｄ６０が新たに見出された（非特許文献１および２）。ｄ６０は、イネに普遍的に存在する配偶子致死遺伝子ｇａｌと共存すると雌雄の配偶子が致死となるため、コシヒカリｄ６０系統、北陸１００号などｄ６０を持つ品種・系統（遺伝子型ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）と他の品種・系統（Ｄ６０Ｄ６０ｇａｌｇａｌ）との交雑Ｆ１（Ｄ６０ｄ６０Ｇａｌｇａｌ）では、花粉と種子の稔性が７５％となり、後代Ｆ２では６可稔長稈（４Ｄ６０Ｄ６０：２Ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）：２部分不稔長稈（Ｄ６０ｄ６０Ｇａｌｇａｌ＝Ｆ１型）：１短稈（ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）の比に分離する特異な遺伝様式をとり、ｄ６０の遺伝にはＧａｌが不可欠である。ｄ６０はＧａｌの同時の人為突然変異なくしては自然界では得られなかった貴重な短稈遺伝子である。
【０００４】
半矮性遺伝子ｄ６０は、イネ科植物の第２染色体上に存在することが見出され、第１染色体上に存在するｓｄ１とは遺伝的にも機能的にも独立した遺伝子であることが示された（特許文献１）。さらに、ＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを利用して、ｄ６０遺伝子の存在および／またはｄ６０遺伝子の遺伝に不可欠なＧａｌ遺伝子の存在を判別することにより、ｄ６０遺伝子およびＧａｌ遺伝子を有するイネ科植物を選抜する方法が開発されている（特許文献１）。
しかしながら、ｄ６０遺伝子は、実用化には至っていない。
【０００５】
現在、世界各地でイネの短稈品種が栽培されており、例えば、米国のＣａｌｒｏｓｅ７６、東南アジアのＩＲ３６、日本のヒカリ新世紀などがある。しかしながら、これらの短稈品種について遺伝子分析を行った結果、全ての品種において半矮性遺伝子ｓｄ１と同じ遺伝子座を持つことが分かった。すなわち、現在の短稈イネ科植物の栽培は、わずか１種類の特定の遺伝子に支配され、わずか１種類の特定の遺伝子が広範囲に使用されているという弊害が生じている。
したがって、ｓｄ１遺伝子に代わる新規な短稈遺伝子が求められている。
【０００６】
加えて、近年の地球温暖化により高温登熟障害が起こり、米の品質劣悪化および収量低下という問題が生じている。したがって、登熟期が夏場の高温期から外れるような晩生品種が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２３７１３８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Tomita, M.: The gametic lethal gene gal: activated only in the presence of the semidwarfing gene d60 in rice. In Rice Genetics III (Ed. G.S. Khush, ISBN 971-22-0087-6), International Rice Research Institute, pp. 396-403 (1996)
【非特許文献２】Tomita, M., Yamagata, H. and Tanisaka, T.: Developmental cytology on gametic abortion caused by  induced complementary genes gal and d60 in ｊaponica rice. In Advances in Rice Genetics (Eds. G.S. Khush, D.S. Brar and B. Hardy, ISBN 971-22-0199-6), International Rice Research Institute, pp. 178-181 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
度重なる台風の来襲でイネの倒伏による多大の損害が昨今の社会問題になっており、短稈遺伝子を導入して台風に強い新品種を開発することは緊急課題となっている。品種の遺伝的多様性を維持・拡大しようとする育種の目的に鑑みれば、ｓｄ１遺伝子だけに頼ることなく、さらに新規の短稈遺伝子を開拓し、耐倒伏性育種への利用を推進すべきである。また、近年、地球温暖化現象により、全国的に高温障害が発生している。したがって、９月頃に登熟期が来るように晩生化して、イネの登熟期の気温を下げる必要がある。
【００１０】
遺伝的に短稈または晩生であるイネ科植物を得るには、従来、種を交配し、多数の個体を実際に栽培して、各個体が出穂した後に稈長を測定し、登熟期を記録して該個体の形質を確認しなければならず、広大な圃場や多大な尽力および相当な年月が必要であった。
【００１１】
そこで、本発明は、ＤＮＡマーカーを使用することによって、上記の所望の形質を有する植物、すなわち、短稈かつ晩生である植物を、実際に栽培を行うことなく実験室内で判別する方法を開発することを目的とする。さらに、本発明は、新規な短稈遺伝子に基づいた短稈形質を示し、かつ、晩生であるという、２つの形質を合わせ持つイネ科植物を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記のような状況下、イネ品種 黄金晴が持つ、コシヒカリよりも短稈かつ晩生な形質に注目し、遺伝子分析を行った。その結果、新規な短稈晩生ＱＴＬ（量的形質座位）ｄ６３（ｔ）を見出し、今までに短稈遺伝子の存在が報告されていないイネ科植物の第３染色体上にマッピングした。さらに、ｄ６３（ｔ）と連鎖するＤＮＡマーカーを同定した。かくして、本発明を完成するに至った。なお、本明細書中において、本発明で見出した新規な短稈晩生ＱＴＬ ｄ６３（ｔ）を「ｄ６３（ｔ）遺伝子」または「短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）」と称する。
【００１３】
すなわち、本発明は、
［１］イネ科植物の第３染色体上に存在するＤＮＡマーカーであって、ｄ６３（ｔ）遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカーを検出することによって、ｄ６３（ｔ）遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈晩生イネ科植物の選抜方法、
［２］ＤＮＡマーカーがｄ６３（ｔ）遺伝子と組換え価１５％以内で連鎖している、上記［１］記載の方法、
［３］ＤＮＡマーカーが第３染色体の短腕末端から３４〜３７Ｍｂの距離にある、上記［１］または［２］記載の方法、
［４］ＤＮＡマーカーがＲＦＬＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＳＴＳマーカー、ＳＮＰマーカー、およびＲＡＰＤマーカーからなる群から選択される、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法、
［５］ＤＮＡマーカーがＲＭ１０３８、ＲＭ１３７３およびＲＭ２１８７からなる群から選択される１つ以上である、上記［４］記載の方法、
［６］短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）、および
［７］イネ科植物の第３染色体の短腕末端から３４〜３７Ｍｂの位置に存在する短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）
を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、イネ科植物の第３染色体上にあるＤＮＡマーカーを使用してｄ６３（ｔ）遺伝子の存在を判別することにより、短稈で晩生のイネ科植物を容易に選抜することができる。また、新規の短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）を標的とした選抜により、従来のｓｄ１遺伝子のみに依存していた短稈イネ科植物とは全く別の、短稈かつ晩生の形質を合わせ持った新規イネ科植物の育種が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）のマッピングに使用したＳＳＲマーカーの染色体位置を示す。
【図２】図２は、短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）とＳＳＲマーカー  ＲＭ１３７３、ＲＭ５９１６およびＲＭ８０６８との連鎖状況を示す電気泳動図である。
【図３】図３は、短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）の第３染色体末端へのマッピングを示す図、および短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）と、第３染色体末端にあるＳＳＲマーカー  ＲＭ１０３８、ＲＭ１３７３およびＲＭ２１８７との連鎖状況を示す電気泳動図である。
【図４】図４は、短稈遺伝子ｄ６０と短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）のＤＮＡ診断に用いたＳＳＲマーカーを示す。
【図５】図５は、短稈遺伝子ｄ６０と短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）のＤＮＡ診断による識別結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、新規の短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）は、以下の方法で見出された。コシヒカリと黄金晴の交雑Ｆ２から任意に選択したＦ３５４系統５３０個体を育成し、各個体について稈長、到穂日数および草型を調査して、後代検定により遺伝子型を決定した。その結果、Ｆ２でコシヒカリ型長稈早生であった個体の後代は、長稈早生の１２系統ならびに短稈晩生および長稈早生が分離する３１系統であった。Ｆ２で黄金晴型短稈晩生であった個体の後代１１系統は全て、短稈晩生で固定した。すなわち、Ｆ２の分離比は、コシヒカリ型（長稈早生ホモ型）１２系統：ヘテロ型３１系統：黄金晴型（短稈晩生ホモ型）１１系統となり、１：２：１の分離比に適合した（χ２＝１．２６、０．５０＜Ｐ＜０．７５）。このことから、短稈形質と晩生形質が１個の主導遺伝子によって支配されていることが明らかになった。この遺伝子を「ｄ６３（ｔ）」と命名した。
【００１７】
さらに、遺伝子連鎖を利用して、ｄ６３（ｔ）遺伝子を第３染色体上にマッピングした。具体的には、コシヒカリと黄金晴の交雑Ｆ２における短稈晩生ホモ型個体に対し、イネの全染色体を網羅するように選択した適当な数のＤＮＡマーカーを適用し、ｄ６３（ｔ）遺伝子が第３染色体上のＤＮＡマーカーと連鎖することを見出した。
【００１８】
したがって、本発明は、イネ科植物の第３染色体上に存在するＤＮＡマーカーであって、ｄ６３（ｔ）遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカーを検出することによって、ｄ６３（ｔ）遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈晩生イネ科植物の選抜方法を提供する。
【００１９】
本発明において用いられる「イネ科植物の第３染色体上に存在するＤＮＡマーカーであって、ｄ６３（ｔ）遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカー」は、例えば、以下のような方法によって見出すことができる。
ｄ６３（ｔ）遺伝子を有する系統とｄ６３（ｔ）遺伝子を持たない他の系統との交雑Ｆ２を展開し、ｄ６３（ｔ）ホモ型Ｆ２個体から得たゲノムＤＮＡに対し、特異的なパターンを示すイネ科植物の第３染色体上のＤＮＡマーカーを見出す。ｄ６３（ｔ）遺伝子を有する系統としては、例えば、黄金晴を用いる。ｄ６３（ｔ）遺伝子を持たない他の系統としては、限定するものではないが、例えば、コシヒカリを用いることができる。
【００２０】
このようにして見出されたｄ６３（ｔ）遺伝子と連鎖している遺伝子または染色体部位を、本発明において、ＤＮＡマーカーとして使用する。
「ＤＮＡマーカー」とは、遺伝分析のための目印（マーカー）として利用することができる、個体または系統によって塩基配列に違いが見られるＤＮＡ多型を意味し、例えば、ＲＦＬＰ（制限酵素ＤＮＡ断片長多型）、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型）、ＳＳＲ（単純反復配列）、ＳＴＳ（配列タグ部位）、ＳＮＰ（一塩基多型）、ＲＡＰＤ（ランダム増幅断片多型）などの種類がある。
【００２１】
本発明においては、完全に連鎖している場合の組み換え価（０％）と比較して、ｄ６３（ｔ）遺伝子と組換え価が１５％以内、好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内、さらになお好ましくは１％以内で連鎖する遺伝子または染色体部位をＤＮＡマーカーとして用いることが、判別の精度向上の点から好ましい。
なお、組換え価は以下の式によって求められる。
組換え価（％）＝（組換え型配偶子数／全配偶子数）×１００
【００２２】
本発明において、好ましいＤＮＡマーカーは、イネ科植物の第３染色体の長腕に存在し、より好ましくは、長腕末端付近に存在する。さらに好ましいＤＮＡマーカーは、イネ科植物の第３染色体の短腕末端から約３０Ｍｂ〜長腕末端、好ましくは約３２〜３７Ｍｂ、より好ましくは約３３〜３７Ｍｂ、さらに好ましくは約３４〜３７Ｍｂの距離にあるマーカーである。
【００２３】
本発明において、ＤＮＡマーカーとして、ＲＦＬＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＳＴＳマーカー、ＳＮＰマーカー、またはＲＡＰＤマーカーのいずれのマーカーを用いてもよい。
【００２４】
本発明において用いられるＲＦＬＰマーカーの例としては、ＡＵ０９０４６７（Ｃ５）、Ｃ９８２９６（Ｃ１４６８）、Ｄ４６７８２（Ｓ１１６６９）、ＡＵ０２９９５９（Ｅ５０３４１Ｓ）、Ｃ１９１５１（Ｅ１００３０Ｓ）、Ｄ２３９７１（Ｒ６８９）、ＡＵ０３１９００（Ｒ２４６２）、Ｄ１５４０９（Ｃ５９５）、ＡＵ０２９５４５（Ｅ３１０５７Ｓ）、Ｄ１３５３０（Ｇ２４９）、ＡＵ０３２９９２（Ｓ７７０）、Ｃ９８２８５（Ｃ１４０１）、ＡＵ０３１７７５（Ｒ１６１８）、Ｃ２６９４５（Ｃ５０５１８Ｓ）、Ｄ４０１４０（Ｓ１９１２）、Ｃ９１６９１（Ｅ３１２５４）、Ｄ２８３１８（Ｒ２３１１）、ＡＵ０３１９１９（Ｒ２６２８）、Ｄ２３２８０（Ｃ２５４０）、ＡＵ０３１８８９（Ｒ２４０４）、Ｃ９８８５０（Ｅ３１８０Ｓ）、Ｄ２５３４６（Ｇ１０１５）、ＡＵ０３３０７１（Ｓ２５１６）、ＡＵ０６９８８２（Ｅ１１３８２ＳＡ）、Ｃ２０２５８（Ｅ１１７５７Ｓ）、Ｃ９７９５９（Ｃ２１７）、ＡＵ０３１８９５（Ｒ２４４３）、Ｃ９８２４８（Ｃ１３２９）、Ｃ２３５８９（Ｓ１３４２８）、Ｄ４６１６８（Ｓ１０６５６）、ＡＵ０９０４６８（Ｃ８３１）、ＡＵ０３２９９９（Ｓ８５１）、Ｄ２４５９３（Ｒ２２２４）、ＡＵ０６８８７４（Ｃ５０７７１Ｓ）、Ｃ９８０２６（Ｃ３９３Ａ）、ＡＵ０６３８１８（Ｅ７６５Ｓ）、ＡＵ０３１７０９（Ｒ７０７）、Ｃ９８２８９（Ｃ１４４２）、ＡＵ０３１８１６（Ｒ１９２７）、Ｃ９８２１０（Ｃ１１４１）、ＡＵ０３１９８０（Ｒ３０２０）、ＡＵ０８２６６２（Ｃ１４８４）、Ｄ１３５２８（Ｇ１６４）、ＡＵ０６９８６９（Ｅ１０５７９Ｓ）、ＡＵ０３１６５４（Ｒ２７３）、ＡＵ０３２４６９（Ｓ１０５９４）、ＡＵ０３２０５６（Ｒ３３８５）、Ｃ９８０２６（Ｃ３９３８）、Ｃ９８２２２（Ｃ１２１９）、Ｃ９８２１４（Ｃ１１６４）、Ｄ４７６４４（Ｓ１３２６２）、Ｄ４０１１３（Ｓ１８６６）、ＡＵ０８６０１８（Ｓ１１３０１）、Ｄ３９８４５（Ｓ１４６９）、ＡＵ０３１８１５（Ｒ１９２５）、Ｃ１９２７６（Ｅ１０１９５Ｓ）、Ｃ９８２６５（Ｃ１３５４）、Ｄ２５３７８（Ｇ１３１８）、ＡＵ０３２８４１（Ｓ１５１７９Ｓ）、およびＡＵ０３２６６１（Ｓ１３１２２）が挙げられる。
【００２５】
本発明において、用いられるＳＳＲマーカーの例としては、ＲＭ３８２９、ＲＭ８２６９、ＲＭ８２０３、ＲＭ６９７０、ＲＭ６８０６、ＲＭ６８７６、ＲＭ３６８４、ＲＭ６９８７、ＲＭ３８１５、ＲＭ６７３６、ＲＭ２５９３、Ｏｓ０３ｓｓｒ０２４１９００、Ｏｓ０３ｓｓｒ０２４２０００、Ｏｓ０３ｓｓｒ０２４２１００、ＲＭ１５８８０、ＲＭ１５８８１、Ｏｓ０３ｓｓｒ０２４２４００、Ｏｓ０３ｓｓｒ０２４２５００、Ｏｓ０３ｓｓｒ０２４２６００、ＲＭ１５８８３、ＲＭ１５８８４、ＲＭ１５８８５、Ｏｓ０３ｓｓｒ０２４３０００、ＲＭ１５８８６、ＲＭ１５８８７、ＲＭ１５８８８、ＲＭ１５８８９、ＲＭ１５８９０、ＲＭ１５８９１、ＲＭ１５８９２、ＲＭ１５８９３、ＲＭ１５８９４、ＲＭ１５８９５、ＲＭ１５８９８、ＲＭ１５８９９、ＲＭ１５９００、ＲＭ１５９０２、ＲＭ１５９０３、ＲＭ１５９０４、ＲＭ１５９０６、ＲＭ１５９０７、ＲＭ１５９０９、ＲＭ１５９１４、ＲＭ１５９１５、ＲＭ１５９１８、ＲＭ１５９１９、ＲＭ１５９２１、ＲＭ１５９２２、ＲＭ１５９２４、ＲＭ１５９２５、ＲＭ１５９２６、ＲＭ１５９２７、ＲＭ１５９２９、ＲＭ１５９３０、ＲＭ１５９３１、ＲＭ６８９６、ＲＭ３７１９、ＲＭ４６８、ＲＭ１２３０、９４Ｏ０３−４、ＲＭ１６０８８、ＲＭ１３７３、ＲＭ１６０９２、ＲＭ１０３８、ＲＭ２１８７、およびＲＭ２３２が挙げられ、好ましくは、ＲＭ１０３８（配列番号１および配列番号２）、ＲＭ１３７３（配列番号３および配列番号４）およびＲＭ２１８７（配列番号５および配列番号６）からなる群から選択される１つ以上のマーカーが用いられる。
【００２６】
本発明において、「検出」とは、上記ＤＮＡマーカーを検出するための当該分野で常套の方法を用いて実施すればよく、使用されるＤＮＡマーカーの種類に応じて当業者が適当に選択することができる。例えば、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法、ＡＦＬＰ法などが挙げられる。
【００２７】
ＰＣＲを利用するＤＮＡマーカーの検出方法としては、例えば下記のとおりに行うことができる。
〔ＤＮＡ抽出〕
植物体（またはその一部）を液体窒素で凍結粉砕し、ＤＮＡ抽出液を加え、振盪しながらインキュベートする。この溶液をから、抽出および重合沈殿によって、高分子ＤＮＡをスプールアウトする。スプールアウトしたＤＮＡを精製し、ＤＮＡ溶液を製造する。
〔ＰＣＲ〕
各イネ科植物体から抽出した上記ゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＤＮＡマーカーに特異的なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液を調製する。サーマルサイクラー等を用いて、変性・アニーリング・伸長の一連の反応を繰り返し行う。次いで、得られたＰＣＲ産物を電気泳動する。ＰＣＲの反応条件およびプライマーは、例えばTheor Appl Genet (2000)100:697-712を参考にすることができる（この文献を、参照により本明細書の一部とする）。
【００２８】
さらに、本発明は、新規の短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）を提供する。ｄ６３（ｔ）遺伝子を用いれば、短稈および晩生という２つの形質を合わせ持つイネ科植物を選抜、育種を可能とするだけでなく、イネ科植物に直接導入して新規な短稈晩生品種を開発することも可能となる。
【実施例１】
【００２９】
短稈晩生ＱＴＬの検出
コシヒカリと黄金晴の交雑Ｆ２を育成し、Ｆ２系統から任意に選択したＦ３５４系統５３０個体を育成し、全個体について稈長、到穂日数および草型を調査した。
その結果、Ｆ２でコシヒカリ型長稈早生であった４３系統のうち、１２系統がＦ３で長稈早生であり、３１系統がＦ３で短稈晩生および長稈早生に分離した。Ｆ２で黄金晴型短稈晩生であった個体の後代１１系統は全て、短稈晩生で固定した。すなわち、Ｆ２の分離比は、コシヒカリ型長稈早生ホモ接合（Ｄ６３（ｔ）Ｄ６３（ｔ））１２系統：ヘテロ型（Ｄ６３（ｔ）ｄ６３（ｔ））３１系統：黄金晴型短稈晩生ホモ接合（ｄ６３（ｔ）ｄ６３（ｔ））１１系統となり、１：２：１の分離比に適合した（χ２＝１．２６、０．５０＜Ｐ＜０．７５）。このことから、短稈形質と晩生形質が１個の主導遺伝子によって支配されていることが明らかになった。この遺伝子を「ｄ６３（ｔ）」と命名した。
【実施例２】
【００３０】
短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）のマッピング
コシヒカリと黄金晴の交雑Ｆ３により固定が確認されたＦ２短稈晩生ホモ型（ｄ６３（ｔ）ｄ６３（ｔ））個体に対し、イネのゲノムを網羅するように１２本の各染色体当たり３〜５個ずつ（但し、第３染色体においては１０個）合計５７個のＤＮＡ多型を示すＳＳＲマーカーを適用して、各ＳＳＲマーカーとの連鎖について調べた。なお、第３染色体上のＳＳＲマーカーは全て、両親品種間でＤＮＡ多型を示すものであった（図１）。
【００３１】
Ｆ２の各個体から、下記のようにゲノムＤＮＡを抽出した。植物体から採葉し、−８０℃で凍結保存した。葉を液体窒素で凍結し、粉砕した。これに葉の粉末の重量と等量のＤＮＡ抽出液（２％ＣＴＡＢ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を加え、５５℃で振盪しながら９０分間インキュベートした。この溶液をクロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。上清に１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウムｐＨ５．２を加えた後、等量の−２０℃の９９．５％イソプロパノールを加えて重合沈殿した高分子ＤＮＡをスプールアウトした。スプールアウトしたＤＮＡを１．５ｍｌのＨｉｇｈ−Ｓａｌｔ  ＴＥ（１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０）に溶解し、エタノール沈殿後、５００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０）に溶解した。これに１／１００量のＲＮａｓｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で一晩インキュベートした。さらに、フェノール−クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を１回ずつ行った後、エタノール沈殿して５００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０）に溶解した。
【００３２】
上記のようにして抽出した各Ｆ２植物体由来のゲノムＤＮＡ２００ｎｇを鋳型にして、２００ｎＭのフォワードプライマー、リバースプライマー、４００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒII（ＴＡＫＡＲＡ）、０．５Ｕ  ＬＡ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を含む全量２５μｌの反応液を作製した。サーマルサイクラーを用いて、変性９４℃３０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃１分間の一連の反応を３５回行った。また、最初の変性９４℃と最後の合成７２℃を５分間ずつ行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで１００Ｖで４５分間電気泳動した（図２、図３）。
【００３３】
ＰＣＲにおいて使用されたプライマーは、下記のとおりである。
マーカーＲＭ１０３８について、フォワードプライマー：TGGTTCGATTCGGATTTC（配列番号１）およびリバースプライマー：AAGCTATTCACAAGCAGCTC（配列番号２）。
マーカーＲＭ１３７３について、フォワードプライマー：TGCTATACCCAAATGTCCAAGC（配列番号３）およびリバースプライマー：ATCTTCTGAGTGCTGCCAAGC（配列番号４）。
マーカーＲＭ２１８７について、フォワードプライマー：GTCATTTGAAGTAAATCCGT（配列番号５）およびリバースプライマー：GGTCTACTTGCGAAATAAGT（配列番号６）。
マーカーＲＭ５９１６について、フォワードプライマー：GCTATAAGAATCGTATTAAG（配列番号７）およびリバースプライマー：TACTGCTATTAAAGTCAGAA（配列番号８）。
マーカーＲＭ８０６８について、フォワードプライマー：AAACCTCTCGCTGTAATTAG（配列番号９）およびリバースプライマー：TGAACATTTATTGATATGGTAAA（配列番号１０）。
【００３４】
その結果、第３染色体上のＳＳＲマーカーとの連鎖が認められ、第３染色体以外では連鎖が認められなかった（図２、図３参照）。第３染色体上のマーカーＲＭ１０３８、ＲＭ１３７３、およびＲＭ２１８７は、両親間（コシヒカリと黄金晴）でＤＮＡ多型を示すが、交雑Ｆ２における短稈ｄ６３（ｔ）ホモ個体の約８５〜９５％が黄金晴（すなわち短稈型）と同じＤＮＡパターンを示した（図２、図３参照）。一方、第２染色体上のマーカーＲＭ５９１６および第１染色体上のマーカーＲＭ８０６８は、両親間でＤＮＡ多型を示すが、交雑Ｆ２における短稈ｄ６３（ｔ）ホモ個体において、短稈型、コシヒカリ型およびヘテロ型のＤＮＡパターンを示し、独立して遺伝した。したがって、ｄ６３（ｔ）遺伝子を第３染色体上にマッピングすることができた。
【００３５】
さらに、第３染色体の長腕末端付近にあるマーカーＲＭ１３７３との組換え価が４．３％、ＲＭ１０３８との組換え価が８．６％、ＲＭ２１８７との組換え価が１３．４％であることが示され、ｄ６３（ｔ）が第３染色体の長腕末端付近にあることが分かった（図３）。したがって、第３染色体の短腕末端から約３０Ｍｂ〜長腕末端の距離にあるＤＮＡマーカーが短稈晩生イネ科植物の選抜において使用可能である。
【実施例３】
【００３６】
短稈遺伝子ｄ６０と短稈晩生遺伝子ｄ６３（ｔ）のＤＮＡ診断による識別
コシヒカリｄ６０系統と黄金晴の交雑Ｆ２１４４個体を育成し、全個体について出穂日、稈長、草型を調査した。その結果、Ｆ２では、その両親イネ品種（コシヒカリｄ６０系統および黄金晴）を上回る長稈個体から下回る極短稈個体まで分離した。
【００３７】
次いで、Ｆ２全１４４個体について、ｄ６３（ｔ）とｄ６０のそれぞれに連鎖しているＳＳＲマーカーを用いてＤＮＡ診断を行った。ｄ６３（ｔ）のマーカーとして、第３染色体のＲＭ１０３８を使用し、ｄ６０のマーカーとして、第２染色体のＲＭ６３７５（配列番号９）を使用した（図４）。なお、ＲＭ６３７５は、ｄ６０マーカーとして有用であることが知られている。
【００３８】
ＤＮＡ診断方法は、下記のとおりに行った。
実施例２に記載の方法にしたがって、Ｆ２の各個体からゲノムＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型とし、マーカーに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＲＭ１０３８に対するプライマーは実施例２に記載のとおりである。ＲＭ６３７５に対するプライマーは、フォワードプライマー：CGAATGGAACGACAAGAGATGC（配列番号１１）およびリバースプライマー：ATAGATCGACAACGTAGATCCACAG（配列番号１２）であった。
【００３９】
その結果、ｄ６３（ｔ）遺伝子ホモ型の短稈個体が３０個体、ｄ６０遺伝子ホモ型の短稈個体が１３個体、ｄ６３（ｔ）遺伝子とｄ６０遺伝子がともにホモ型の極短稈個体が３個体検出された。これは、ｄ６３（ｔ）とｄ６０が独立遺伝する場合の理論頻度１／４：１／９：１／３６によく一致した（χ２＝０．０８，０．９５０＜Ｐ＜０．９７５）。ここで、短稈遺伝子ｄ６０は配偶子致死遺伝子ｇａｌと共存すると不稔となるため、ｄ６０の遺伝にはＧａｌが不可欠であり、ｄ６０ホモ型短稈個体のＦ２分離比の理論値は１／９となる。
したがって、これら２つのＳＳＲマーカーによって、品種育成のプロセスにおいてｄ６３（ｔ）遺伝子とｄ６０遺伝子を明確に区別してＤＮＡ診断でき、ｄ６３（ｔ）遺伝子を持つ短稈イネならびにｄ６３（ｔ）遺伝子とｄ６０遺伝子を共に持つ短稈イネを迅速に選抜することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、短稈品種の遺伝的多様性を拡大し、不測の気象変動に対抗するため、ｓｄ１とは遺伝的に異なる新規の短稈遺伝子ｄ６３（ｔ）に密接に連鎖していて選抜効率が高いＤＮＡマーカーを開発し、ｄ６３（ｔ）のマーカー選抜による短稈晩生イネの開発法を提供する。本法を敷衍することによってさらに、ｄ６３（ｔ）本体の単離が可能であり、ｄ６３（ｔ）の機能解明による草型調節も可能になる。短稈遺伝子ｄ６３（ｔ）のマーカー選抜によりＧＡに偏重した短稈育種のポテンシャルを広げて、全国の農業試験場や植物工場に関連する公民の試験研究機関における品種開発の一助となる。したがって、本発明は、農業分野、特にイネ科植物の品種改良の分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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