(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における前立腺の状態をモニターする方法であって、対象の前立腺に由来する細胞内のペアードボックス２遺伝子−βディフェンシン１遺伝子（ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１）発現比を決定する段階を含み、１００：１以上のＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比が対象における前立腺癌の存在を意味し、４０：１以上で１００：１未満のＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比が対象における前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の存在を意味し、４０：１未満のＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比が対象における正常前立腺を意味するように、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１発現比が前立腺状態と相関する前記方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、決定する段階が
コントロール遺伝子の発現レベルに対するＰＡＸ２遺伝子の発現レベルを決定する段階、同じコントロール遺伝子の発現レベルに対するＤＥＦＢ１遺伝子の発現レベルを決定する段階、及び、ＰＡＸ２及びＤＥＦＢ１の発現レベルに基づきＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比を決定することを含む、前記方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法であって、ＰＡＸ２、ＤＥＦＢ１及びコントロール遺伝子の発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定する前記方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、コントロール遺伝子がグリセルアルデヒド  ３−ホスフェート  デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国予備出願第６０／８８５，１４２号（出願日２００７年１月１６日）の優先権を主張し、その開示内容全体を本願に援用する。
【０００２】
アルキル化剤、代謝拮抗剤及び天然物質に基づく現在の抗癌化学療法はその作用メカニズムが不均質である。従って、その大半は正常細胞にも作用し、患者に重度副作用と毒性を生じる。
【０００３】
突然変異の蓄積と細胞制御機能の低下は正常組織から上皮内腫瘍（ＩＥＮ）等の初期前癌への進行性表現型変化を引き起こし、徐々に重度のＩＥＮとなり、表在癌へと進行し、最終的に浸潤性疾患に至る。このプロセスは比較的急速進行性の場合もあるが、一般には数年間から数十年にわたって比較的ゆっくりと進行する。癌遺伝子依存は癌細胞が悪性表現型を維持するために単一癌遺伝子の持続活性化又は過剰発現に生理的に依存することである。この依存は腫瘍進行を特徴付ける他の変化の環境で生じる。
【０００４】
癌化学予防は癌の予防又は前癌状態もしくはそれ以前の治療として定義される。浸潤癌に至るまでの進行期間が長いことは大きな科学的チャンスであるが、候補化学予防薬の臨床効果の顕在を妨げる経済的障害でもある。従って、近年の化学予防薬開発研究の重要な要素は薬剤の臨床効果又は癌発生率低減効果を正確に予測する早期（前癌）エンドポイント又はバイオマーカーを同定することであった。前立腺等の多くの癌では、ＩＥＮが早期エンドポイントである。
【発明の概要】
【０００５】
本願に具体的及び概論的に記載する本発明の目的によると、本発明は前立腺癌及び前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の診断、予防、及び治療用組成物及び方法に関する。
【０００６】
開示する方法及び組成物の他の利点については、一部は以下の記載に示し、また、一部は以下の記載から自明であり、あるいは開示する方法及び組成物の実施により確認することができる。開示する方法及び組成物の利点は特許請求の範囲に特に指定する要素及び組み合わせにより実現及び達成されよう。当然のことながら、上記一般記載と以下の詳細な記載は例示と説明に過ぎず、特許請求の範囲に記載する本発明を制限するものではない。
【０００７】
本願に援用し、その一部とする添付図面は、開示する方法及び組成物の数種類の態様を例証するものであり、以下の記載と共にこれらの図面を使用し、開示する方法及び組成物の原理を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】βディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）解析を示す。ＤＥＦＢ１発現の誘導を検証するために、ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。図１Ａは根治的前立腺摘除術を受けた６人の患者からの臨床サンプルで比較したＤＥＦＢ１相対発現レベルを示す。図１ＢはＤＥＦＢ１誘導前後の良性及び悪性前立腺臨床サンプル、ｈＰｒＥＣ細胞並びに前立腺癌細胞株で比較したＤＥＦＢ１相対発現レベルを示す。図１Ｃは単一組織切片における良性組織、悪性組織及び前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）で解析したＤＥＦＢ１相対発現レベルを示す。図１Ｄは１人の患者の良性組織、悪性組織及びＰＩＮにおけるＤＥＦＢ１発現を良性組織で検出される平均ＤＥＦＢ１発現レベルに比較したものである。
【０００９】
【図２】ＤＥＦＢ１により誘導される膜完全性と細胞形態の変化の顕微鏡解析を示す。４８時間のＤＥＦＢ１誘導後にＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰの細胞形態を位相差顕微鏡により解析した。膜ラッフリングを黒矢印で示し、アポトーシス小体を白矢印で示す。
【００１０】
【図３】前立腺癌細胞におけるＤＥＦＢ１細胞傷害性の解析を示す。前立腺細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰをＰｏｎＡで処理し、ＤＥＦＢ１発現を１〜３日間誘導した後、ＭＴＴアッセイを実施し、細胞生存率を測定した。結果は平均±ｓ．ｄ．，ｎ＝９を表す。
【００１１】
【図４】ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞におけるＤＥＦＢ１による細胞死の誘導を示す。前立腺癌細胞株ＤＵ１４５（Ａ）及びＰＣ３（Ｂ）でＤＥＦＢ１発現を誘導した後、アネキシンＶ／ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウム染色とフローサイトメトリー解析を実施した。ヨウ化プロピジウムとアネキシンＶに陽性の細胞をアポトーシスとみなした。誘導時間を各パネルの下に示す。各時点についてパネルの横の数字はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）−アネキシンＶ＋細胞（右下象限）とＰＩ＋アネキシンＶ＋細胞（右上象限）の百分率を表す。データは３回の別々の実験を代表する１回の実験に由来する。
【００１２】
【図５】ＤＥＦＢ１誘導後のパンカスパーゼ解析を示す。ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞をＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ標識フルオロメチルケトンで染色し、カスパーゼ活性を検出した。各条件でＤＩＣにより細胞を検出可能であった。共焦点顕微鏡解析によると、対照ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３細胞（Ｆ）及びＬＮＣａＰ（Ｊ）にカスパーゼ染色は認められなかった。ＰｏｎＡで２４時間処理してＤＥＦＢ１を誘導した細胞はＤＵ１４５（Ｄ）とＰＣ３（Ｈ）でカスパーゼ活性を示した。ＬＮＣａＰ（Ｌ）ではカスパーゼ活性は検出されなかった。
【００１３】
【図６】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のペアードボックスホメオチック遺伝子２（ＰＡＸ２）蛋白質発現のサイレンシングを示す。図６ＡはＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘをトランスフェクトしたＰＣ３及びＤＵ１４５細胞の０日（レーン１）、２日（レーン２）、及び４日（レーン３）目のウェスタンブロット解析を示す。図６ＢはＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘをトランスフェクトしたＰＣ３及びＤＵ１４５細胞の０日（レーン１）、２日（レーン２）、４日（レーン３）及び６日（レーン４）目のウェスタンブロット解析を示す。ＰＡＸ２蛋白質はＤＵ１４５細胞では４日間処理後（レーン３）、ＰＣ３では６日間処理後という早期に検出できなくなった。ブロットを剥離し、内部対照としてβ−アクチンについてリプロービングした。
【００１４】
【図７】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる処理後の前立腺癌細胞増殖の解析を示す。通常の増殖培地の存在下で６日のＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰの位相差顕微鏡解析を示す。陰性対照ｓｉＲＮＡで処理しても細胞に何ら影響はなかった。他方、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理後には全３種類の株で細胞数が有意に減少した。
【００１５】
【図８】ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング後の細胞死の解析を示す。前立腺癌細胞株ＰＣ３、ＤＵ１４５、及びＬＮＣａＰを４個のＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ又は４個の非特異的対照ｓｉＲＮＡのプール０．５μｇで２日、４日又は６日間処理後、ＭＴＴアッセイを実施し、細胞生存率を測定した。結果は平均±ｓ．ｄ．，ｎ＝９を表す。
【００１６】
【図９】カスパーゼ活性の解析を示す。ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞をカルボキシフルオレセイン標識フルオロメチルケトンで染色し、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理後のカスパーゼ活性を検出した。未処理細胞と処理細胞の共焦点顕微鏡解析によると、ＤＩＣにより細胞を検出可能であった。蛍光下の解析によると、対照ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３細胞（Ｆ）及びＬＮＣａＰ細胞（Ｊ）でカスパーゼ染色は検出されなかった。他方、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理した細胞はＤＵ１４５（Ｄ）、ＰＣ３（Ｈ）及びＬＮＣａＰ（Ｌ）でカスパーゼ活性を誘導した。
【００１７】
【図１０】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のアポトーシス因子の解析を示す。未処理対照細胞とＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで６日間処理した細胞においてプロアポトーシス因子の発現の変化を比較した。図１０ＡはＢｃｌ−２関連Ｘ蛋白質（ＢＡＸ）発現レベルがＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰで増加したことを示す。図１０ＢはＢＨ３相互作用ドメイン死アゴニスト（ＢＩＤ）発現がＤＵ１４５とＬＮＣａＰで増加したが、ＰＣ３では異なることを示す。図１０ＣはＢｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）発現レベルが全３種類の細胞株で増加したことを示す。
【００１８】
【図１１】ＰＡＸ２とＤＮＡ認識配列の結合のモデルを示す。ＰＡＸ２転写リプレッサーはＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスのすぐ隣りのＣＣＴＴＧ（配列番号１）認識部位と結合し、転写とＤＥＦＢ１蛋白質発現を妨げる。ＰＡＸ２蛋白質発現の阻害により正常ＤＥＦＢ１発現が可能になる。
【００１９】
【図１２】ＤＥＦＢ１レポーター構築物を示す。ｍＲＮＡ開始部位の上流の最初の１６０塩基から構成されるＤＥＦＢ１プロモーターをＤＵ１４５細胞からＰＣＲ増幅し、ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポータープラスミドにライゲーションした。
【００２０】
【図１３】ＰＡＸ２の阻害によりＤＥＦＢ１発現が生じることを示す。ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ及びＨＰｒＥＣをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで４８時間処理した。処理前のＱＲＴ−ＰＣＲ解析によると、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰでＤＥＦＢ１発現は検出されなかった。他方、処理後には全細胞でＤＥＦＢ１発現が回復した。ＰＡＸ２欠損ＨｐｒＥＣのｓｉＲＮＡ処理後にＤＥＦＢ１発現に変化はなかった。
【００２１】
【図１４】ＰＡＸ２の阻害によりＤＥＦＢ１プロモーター活性が増加することを示す。ＰＣ３プロモーター／ｐＧＬ３及びＤＵ１４５プロモーター／ｐＧＬ３構築物を作製し、夫々ＰＣ３細胞とＤＵ１４５細胞にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ処理によるＰＡＸ２阻害前後のプロモーター活性を比較した。ＤＥＦＢ１プロモーター活性は処理後にＤＵ１４５では２．６５倍、ＰＣ３では３．７８倍に増加した。
【００２２】
【図１５】ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１プロモーターの結合のＣｈＩＰ解析を示す。ＤＵ１４５細胞とＰＣ３細胞でＣｈＩＰ解析を実施した。抗ＰＡＸ２抗体による免疫沈降後にＰＣＲを実施し、ＧＴＴＣＣ（配列番号２）ＰＡＸ２認識部位を含むＤＥＦＢ１プロモーター領域を検出した。この結果、ＰＡＸ２転写リプレッサーは前立腺癌細胞株でＤＥＦＢ１プロモーターと結合していることが判明した。
【００２３】
【図１６】ＤＮＡと結合したＰｒｄＰＤ及びＰｒｄＨＤの予想構造を示す。ＤＮＡと結合したＰｒｄＰＤ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）とＤＮＡと結合したＰｒｄＨＤ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）の構造の座標を使用し、これらの２個のドメインがＰＨ０部位と結合したので、これらのドメインのモデルを構築した。指定するような特定の向きで相互に隣接するように個々の結合部位を配置する。ＲＥＤドメインはＰｒｄＰＤ結晶構造に基づいて向きを決める。
【００２４】
【図１７】各種ペアードドメインのコンセンサス配列の比較を示す。Ｐｒｄペアードドメイン±ＤＮＡ複合体の結晶構造解析で示される蛋白質±ＤＮＡ接点の模式図を図面の上部に示す。白ボックスはα螺旋を示し、斜線ボックスはβシートを示し、太線はβターンを示す。接触するアミノ酸を１文字コードにより示す。直接アミノ酸±塩基接点のみを示す。白丸は主溝接点を示し、赤矢印は副溝接点を示す。このスキームをペアードドメイン蛋白質の全既知コンセンサス配列と整列させる（トップストランドのみを示す）。コンセンサス配列間の縦線は保存塩基対を示す。位置の番号を図面の下部に示す。
【００２５】
【図１８】化学予防ストラテジーとしてのＰＡＸ２のターゲティングを示す。異常ＰＡＸ２発現は癌発症及び進行における初期イベントである。異形成又は他の前癌段階中のＰＡＸ２の阻害を癌予防に使用することができる。
【００２６】
【図１９】ＤＵ１４５細胞におけるＰＡＸ２発現に及ぼすアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）の効果を示す。ＰＡＸ２発現に及ぼすＡｎｇＩＩの効果を調べるために、処理後にＤＥＦＢ１蛋白質レベルをモニターした。この場合、ＰＡＸ２発現レベルは４時間という早期に増加し、４８時間まで持続した。
【００２７】
【図２０】図２０ＡはＤＵ１４５におけるＰＡＸ２発現に及ぼすロサルタン（Ｌｏｓ）の効果を示す。ＤＵ１４５細胞をアンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（ＡＴＲ１）拮抗薬ロサルタンで処理した。ＱＲＴ−ＰＣＲによると、ＰＡＸ２メッセージレベルは処理後に少なくとも半減した。図２０ＢはＤＵ１４５におけるＰＡＸ２発現に及ぼすアンジオテンシンＩＩタイプ２受容体（ＡＴＲ２）拮抗薬の効果を示す。ＰＡＸ２発現に及ぼすＡＴＲ２受容体の効果を調べるために、ＤＵ１４５細胞をＡＴＲ２受容体拮抗薬ＰＤ１２３３１９で処理した。この場合、ＰＡＸ２発現は７〜８倍に増加した。
【００２８】
【図２１】ＬｏｓがＤＵ１４５におけるＰＡＸ２発現に及ぼすＡｎｇＩＩ効果を阻止することを示す。ＤＵ１４５細胞を５μＭのＡｎｇＩＩで７２時間処理すると、ＰＡＸ２発現は２倍に増加した。更に、１０μＭで７２時間処理すると、発現増加は３倍を上回った。細胞を５μＭのロサルタンで処理すると、増殖は５０％抑制された。更に、ＡｎｇＩＩ処理前に３０分間ロサルタンで処理すると、増殖に及ぼすＡｎｇＩＩの効果は阻止された。
【００２９】
【図２２】ＡｎｇＩＩがＤＵ１４５細胞増殖を増加することを示す。ＤＵ１４５細胞を５μＭのＡｎｇＩＩで７２時間処理すると、増殖は２倍に増加した。更に、１０μＭで７２時間処理すると、増殖の増加は３倍を上回った。
【００３０】
【図２３】ＤＵ１４５細胞におけるＰＡＸ２発現に及ぼすＬｏｓ及びＭＡＰキナーゼ阻害剤の効果を示す。図２３ＡはＤＵ１４５細胞をロサルタンで処理すると、ホスホ−ＥＲＫ１／２とＰＡＸ２の発現が抑制されることを示し、図２３ＢはＭＥＫキナーゼ阻害剤とＡＩＣＡＲがＰＡＸ２蛋白質発現を抑制することを示し、図２３ＣはＭＥＫキナーゼ阻害剤とロサルタンがホスホ−ＳＴＡＴ３蛋白質発現を抑制することを示す。
【００３１】
【図２４】ＤＵ１４５細胞におけるＰＡＸ２活性化に及ぼすＬｏｓ及びＭＥＫキナーゼ阻害剤の効果を示す。図２４ＡはＤＵ１４５細胞をＡＴ１Ｒシグナル伝達阻害剤で処理すると、ＰＡＸ２の活性形態であるホスホ−ＰＡＸ２蛋白質レベルが低下したことを示す。更に、ＡＭＰキナーゼインデューサーＡＩＣＡＲで処理すると、ＰＡＸ２発現は抑制された。図２４ＢはＡＴ１Ｒシグナル伝達をＬｏｓで阻害すると、ホスホ−ＪＮＫレベルが低下したことを示す。他方、ＡｎｇＩＩはホスホ−ＪＮＫ蛋白質レベルを増加した。
【００３２】
【図２５】ＡｎｇＩＩがｈＰｒＥＣ細胞におけるＰＡＸ２発現を増加し、ＤＥＦＢ１発現を低下させることを示す。ｈＰｒＥＣにおけるＰＡＸ２レベルに及ぼすＡｎｇＩＩの効果を調べるために、細胞を７２時間と９６時間処理し、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現をＱＲＴ−ＰＣＲにより試験した。この場合、ＡｎｇＩＩ処理により、ＰＡＸ２はＰＣ３前立腺癌細胞と同等のレベルまで激増した。逆に、ＡｎｇＩＩ処理後にＤＥＦＢ１発現は有意に低下した。
【００３３】
【図２６】ＡｎｇＩＩシグナル伝達とＰＡＸ２前立腺癌の模式図を示す。前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２発現はＡＴ１Ｒシグナル伝達経路により調節される。具体的には、ＭＥＫキナーゼシグナル伝達カスケードはＰＡＸ２発現増加をもたらす。更に、ＡＴ１ＲとＡｎｇＩＩはＪＮＫを介してＰＡＸ２活性化をアップレギュレートする。
【００３４】
【図２７】前立腺癌治療としてのＰＡＸ２発現の阻害の模式図を示す。図２７ＡはＰＡＸ２発現がＡＴ１Ｒシグナル伝達経路により調節されることを示す。ＰＡＸ２発現の阻害はＤＥＦＢ１の再発現と癌細胞死をもたらす。図２７Ｂは下流キナーゼであるＡＴ１Ｒを阻害する化合物又はＰＡＸ２を直接抑制する化合物が前立腺癌治療の新規アプローチとなることを示す。
【００３５】
【図２８】ＤＥＦＢ１及びＰＡＸ２発現とグリーソンスコアの比較を示す。根治的前立腺摘除術を受けた６人の患者からの良性臨床サンプルでＤＥＦＢ１相対発現レベルを比較した。この場合、グリーソンスコアは隣接する良性前立腺組織におけるＤＥＦＢ１発現レベルと逆相関した。相対ＤＥＦＢ１発現レベルが０．００５を上回る患者のグリーソンスコアは６であった。他方、発現レベルが０．００５未満の患者のグリーソンスコアは７であった。
【００３６】
【図２９】前立腺癌発生の予測因子としてのＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比を示す。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）前立腺組織切片でＱＲＴ−ＰＣＲを実施し、相対ＤＥＦＢ１及びＰＡＸ２発現レベルを測定した。ＤＥＦＢ１発現レベルは正常からＰＩＮ、更に癌に向かうにつれて低下した。他方、ＰＡＸ２発現は正常からＰＩＮ、更に癌に向かうにつれて増加した。更に、グリーソンスコア６の癌をもつ患者＃１４５７はグリーソンスコア７の癌をもつ患者＃１５６９に比較して正常組織とＰＩＮのＤＥＦＢ１値が高かった。逆に、患者＃１５６９は患者＃１４５７に比較して癌性領域のＰＡＸ２レベルが高かった。
【００３７】
【図３０】ドナルド予測係数（ＤＰＦ）が相対ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比に基づくことを示す。前立腺組織のＤＰＦが増加すると前立腺癌を発生する確率が増加する。ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比が０〜３９の組織はＤＰＦによると正常（良性）であった。ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比が４０〜９９の組織はＤＰＦスケールによるとＰＩＮ（前癌）に相当した。最後に、ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比が１００〜５００の組織は悪性（低〜高グレード癌）であった。
【００３８】
【図３１】ヒト前立腺組織におけるｈＢＤ−１発現の解析を示す。根治的前立腺摘除術を受けた患者からの正常臨床サンプルでｈＢＤ−１相対発現レベルを比較した。破線は肉眼的切除とＬＣＭに由来する検体で得られた値を比較するための基準点として使用し、対応するグリーソンスコアを各棒線の上部に示す。図３１Ａは肉眼的切除により得られた組織で比較したｈＢＤ−１発現レベルを示す。図３１Ｂはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより得られた組織で比較したｈＢＤ−１発現レベルを示す。
【００３９】
【図３２】前立腺細胞株におけるｈＢＤ−１発現の解析を示す。図３２ＡはｈＢＤ−１誘導前後の前立腺癌細胞株におけるｈＢＤ−１発現レベルをｈＰｒＥＣ細胞に対して比較したものである。アステリスクはｈＰｒＥＣに比較して統計的に高い発現レベルを表す。アステリスク２個はｈＢＤ−１誘導前の細胞株に比較して統計的に有意な発現レベルを表す（スチューデントのｔ検定，ｐ＜０．０５）。図３２Ｂは前立腺癌細胞株ＤＵ１４５で免疫細胞化学により検証した異所性ｈＢＤ−１発現を示す。陽性対照としてｈＰｒＥＣ細胞をｈＢＤ−１について染色した（ａ：ＤＩＣ及びｂ：蛍光）。ＤＵ１４５細胞にｈＢＤ−１をトランスフェクトし、１８時間誘導した（ｃ：ＤＩＣ及びｄ：蛍光）。スケールバー＝２０μＭ。
【００４０】
【図３３】前立腺癌細胞におけるｈＢＤ−１細胞傷害性の解析を示す。前立腺細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３，ＰＣ３／ＡＲ＋及びＬＮＣａＰをＰｏｎＡで処理し、ｈＢＤ−１発現を１〜３日間誘導した後、ＭＴＴアッセイを実施し、細胞生存率を測定した。各棒線は３本ずつ実施した３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【００４１】
【図３４】正常、ＰＩＮ及び腫瘍のＬＣＭヒト前立腺組織切片におけるｈＢＤ−１及びｃＭＹＣ発現のＱＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。各遺伝子の発現をβ−アクチンに対する発現比として表す。図３５Ａは正常、ＰＩＮ及び腫瘍切片におけるｈＢＤ−１発現レベルの比較を示す。図３５Ｂは正常、ＰＩＮ及び腫瘍切片におけるｃＭＹＣ発現レベルの比較を示す。
【００４２】
【図３５】ｓｉＲＮＡによるＰＡＸ２ノックダウン後のｈＢＤ−１発現のＱＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。ｈＢＤ−１発現レベルをβ−アクチンに対する発現比として表す。アステリスクはＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理前の細胞株に比較して統計的に高い発現レベルを表す（スチューデントのｔ検定，ｐ＜０．０５）。
【００４３】
【図３６】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＡＸ２蛋白質発現のサイレンシングを示す。図３７ＡはＨＰｒＥＣ前立腺一次細胞（レーン１）、ＤＵ１４５（レーン２）、ＰＣ３（レーン３）及びＬＮＣａＰ（レーン４）前立腺癌細胞でウェスタンブロット解析により試験したＰＡＸ２発現を示す。ブロットを剥離し、内部対照としてβ−アクチンについてリプロービングし、均等なロードを確保した。図３７ＢはＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰのウェスタンブロット解析によりいずれもＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘのトランスフェクション後にＰＡＸ２発現のノックダウンが確認されたことを示す。この場合も、ブロットを剥離し、内部対照としてβ−アクチンについてリプロービングした。
【００４４】
【図３７】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる処理後の前立腺癌細胞増殖の解析を示す。ＨＰｒＥＣ（Ａ）、ＬＮＣａＰ（Ｃ）、ＤＵ１４５（Ｅ）及びＰＣ３（Ｇ）を陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡの存在下で６日目に位相差顕微鏡により解析した。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる処理後にＤＵ１４５（Ｄ）、ＰＣ３（Ｆ）及びＬＮＣａＰ（Ｈ）では細胞数が有意に減少した。他方、ＨＰｒＥＣ（Ｂ）では何の影響もないように思われた。バー＝２０μｍ。
【００４５】
【図３８】ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング後の細胞死の解析を示す。前立腺癌細胞株ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ又は非特異的陰性対照ｓｉＲＮＡで２、４又は６日間処理後、ＭＴＴアッセイを実施した。ＰＡＸ２のノックダウンの結果、全３種類の株で相対細胞生存率が低下した。結果は平均±ＳＤ，ｎ＝９を表す。
【００４６】
【図３９】カスパーゼ活性の解析を示す。ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞をカルボキシフルオレセイン標識フルオロメチルケトンで染色し、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理後のカスパーゼ活性を検出した。蛍光解析によると、対照ＤＵ１４５（Ａ）、ＰＣ３細胞（Ｃ）及びＬＮＣａＰ細胞（Ｅ）でカスパーゼ染色は検出されなかった。他方、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理した細胞はＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３（Ｄ）及びＬＮＣａＰ（Ｆ）でカスパーゼ活性を誘導した。バー＝２０μｍ。
【００４７】
【図４０】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のアポトーシス因子の解析を示す。未処理対照細胞とＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで６日間処理した細胞でプロアポトーシス因子の発現の変化を比較した。図４１ＡはＰＡＸ２ノックダウン後にＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰでＢＡＤ発現が増加したことを示す。図４１ＢはＬＮＣａＰとＤＵ１４５ではＢＩＤ発現レベルが増加したが、ＰＣ３細胞では増加しなかったことを示す。図４１ＣはＬＮＣａＰとＤＵ１４５でＡＫＴ発現が低下したことを示す。他方、ＰＡＸ２ノックダウン後にＰＣ３細胞でＡＫＴ発現に変化はなかった。結果は平均±ＳＤ，ｎ＝９を表す。アステリスクは統計的差を表す（ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
開示する方法及び組成物は特定態様に関する以下の詳細な説明と以下の実施例に加え、図面と上記及び下記の図面の説明を参照することにより一層容易に理解することができる。
【００４９】
開示する方法及び組成物に使用可能であるか、それらと併用可能であるか、その製造に使用可能であるか、又はその生成物である材料、組成物、及び成分を開示する。本願はこれらの材料及び他の材料を開示し、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等を開示するときには、これらの化合物の個別的及び集合的な各種順列と組み合わせの特定表記を明確に開示しない場合もあるが、各々具体的に想定され、本願に記載されているものとみなす。例えば、ペプチドを開示及び記載し、ペプチドを含む多数の分子に実施することができる多数の修飾について記載する場合には、特に逆の記載がない限り、ペプチドのあらゆる順列と組み合わせと、可能な修飾が具体的に想定される。従って、分子Ａ、Ｂ、及びＣの集団と、分子Ｄ、Ｅ、及びＦの集団と、組み合わせ分子の１例Ａ−Ｄを開示する場合には、各々個々に列挙していなくても、各々個別的及び集合的に想定される。従って、この例では、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆの各々が具体的に想定され、Ａ、Ｂ及びＣと、Ｄ、Ｅ及びＦと、組み合わせ例Ａ−Ｄの開示からこれらの各組み合わせが開示されているとみなすべきである。同様に、これらの任意サブセット又は組み合わせも具体的に想定され、開示されている。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、及びＣ−Ｅのサブグループが具体的に想定され、Ａ、Ｂ及びＣと、Ｄ、Ｅ及びＦと、組み合わせ例Ａ−Ｄの開示からこれらのサブグループが開示されているとみなすべきである。この概念は本願の全側面に適用され、限定されないが、開示する組成物の製造方法及び使用方法における段階等が挙げられる。従って、実施可能な種々の付加段階がある場合には、当然のことながら、これらの付加段階は開示する方法の任意特定態様又は態様の組み合わせで各々実施することができ、このような各組み合わせが具体的に想定され、開示されているとみなすべきである。
【００５０】
当業者は本願に記載する方法及び組成物の特定態様の多数の等価態様を認識し、又は単なる日常的実験を使用して確認することができよう。このような等価態様も特許請求の範囲に含むものとする。
【００５１】
当然のことながら、開示する方法及び組成物は記載する特定手法、プロトコール、及び試薬に限定されず、種々に適用できる。同様に当然のことながら、本明細書中で使用する用語は特定態様のみを記載する目的であり、本発明の範囲を限定するものではなく、発明の範囲は特許請求の範囲のみにより限定される。
【００５２】
Ａ．前立腺癌の診断、治療及び予防
本願は前立腺癌及び前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の診断、予防、及び治療用組成物及び方法を開示する。
【００５３】
１．前立腺癌
前立腺癌は多くの国で深刻な疾患となっており、西側世界の男性で最も一般的に診断される悪性腫瘍であり、その発生は年齢と共に顕著に増加する。この増加と多くの著名人が前立腺癌で最近死亡していることから、この癌に対する対策の必要性が注目されている。スクリーニングの利用可能性が広がるにつれて前立腺癌による死亡率を抑制できることが示唆されている。
【００５４】
前立腺癌スクリーニングは現状では直腸検査と前立腺特異抗原（ＰＳＡ）値の測定から構成される。直腸指診は検査者間の変動が大きく、ＰＳＡ値は良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺炎症及び他の病態でも上昇する可能性があるので、これらの方法は特異性に欠ける。ＰＳＡが診断試験として比較的不良であることは、２２，０００人を越える男性の前向き試験であるＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙに含まれながら、３６６人が前立腺癌を発症したことから明らかになった。ＰＳＡ値は試験開始時に保存された血清中で測定され、その後４年以内に前立腺癌を発症した男性の４７％でしか高値が検出されなかった（Ｇａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）。
【００５５】
前立腺癌は当業者に周知のようにグリーソンシステムを使用して採点することができる（Ｇｌｅａｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９６６）。これは細胞学的特徴ではなく、組織構造を使用している。グレード１〜５（高度〜低度分化）を使用し、病変の最高頻度の重篤領域のスコアを加算する。グリーソンスコアは腫瘍のステージの判定（ステージング）に加え、重要であると思われる予後情報を提供する。２〜４と８〜１０のグリーソンスコアが良好な予測値であるが、腫瘍の約４分の３は中間値である。
【００５６】
前立腺癌のステージングにはＴＮＭシステムとＪｅｗｅｔｔシステムの２種類のシステムが主に使用されている（Ｂｅｎｓｏｎ  ＆  Ｏｌｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９８９）。ステージングは腫瘍の転移拡大を考慮するが、局所リンパ節病変であるか又は局所浸潤であるかを判定しにくいため、困難である。腫瘍組織を正常前立腺組織から巨視的に区別することができず、前立腺は明確な被膜をもたず、線維脂肪組織層により囲まれているため、腫瘍サイズを測定することも困難である。
【００５７】
前立腺腫瘍の（Ｔ）ステージはＴ１〜Ｔ４の４段階で表される。Ｔ１では、癌は微視的で片側であり、触診不能である。医師は腫瘍を触診で感知することや、経直腸超音波等の画像で検出することができない。ＢＰＨの治療により疾患が判明する場合もあるし、ＰＳＡの上昇により針生検により確認される場合もあった。Ｔ２では、医師はＤＲＥで癌を触診することができる。疾患は片側又は両側の前立腺に局限されるようである。Ｔ３では、癌は前立腺のすぐ外側の組織にまで進行している。Ｔ４では、癌は身体の他の部分にまで広がっている。
【００５８】
従って、現在のスクリーニング法では十分ではなく、癌を診断するため、又は大半の患者の主要死因であるその考えられる転移拡大を予測もしくは予防するための確実な方法は存在しない。
【００５９】
２．ＰＡＸ２
Ｐａｘ遺伝子群は核内転写因子をコードする９種類の発生制御遺伝子のファミリーである。これらの遺伝子は胚形成に重要な役割を果たし、非常に規則的な時間及び空間パターンで発現される。これらはいずれも進化を通して高度に保存されるＤＮＡ結合ドメインをコードする３８４塩基対の「ペアードボックス」領域を含む（Ｓｔｕａｒｔ，ＥＴ，ｅｔ  ａｌ．１９９４）。発生プロセスに及ぼすＰａｘ遺伝子群の影響はあるＰａｘ遺伝子のヘテロ接合性機能不全にも直接起因すると考えられる多数の天然マウス及びヒト症候群により立証されている。ＰＡＸ２配列はＤｒｅｓｓｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９９０に示されている。ＰＡＸ２発現が検出された癌の例を表１に挙げる。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
３．ＤＥＦＢ１
βディフェンシンは広域スペクトラム抗菌活性をもつカチオン性ペプチドであり、上皮と白血球の産生物である（Ｇａｎｚ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，１９９７）。これらの２エキソン単一遺伝子産物は上皮表面で発現され、皮膚（Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、角膜（ＭｃＮａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、舌（Ｍａｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、歯肉（Ｍａｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｒｉｓａｎａｐｒａｋｏｒｎｋｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、唾液腺（Ｍａｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、食道（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、腸（Ｏ’Ｎｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、腎臓（Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｚｕｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、泌尿生殖路（Ｖａｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、及び呼吸上皮（Ｂａｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；ＭｃＣｒａｙ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔｌｅｙ．１９９７）等の部位で分泌される。今日までに、ＤＥＦＢ１（Ｂｅｎｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、ＤＥＦＢ２（Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、ＤＥＦＢ３（Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＤＥＦＢ４、及びＨＥ２／ＥＰ２の５種類の上皮由来βディフェンシン遺伝子がヒトで同定及び特性決定されている。
【００６２】
各βディフェンシン遺伝子産物の一次構造は寸法が小さく、６個のシステインのモチーフからなり、正電荷が高く、これらの特徴以外は多様性が高いという特徴がある。ディフェンシン蛋白質の最も顕著な特徴は３個のジスルフィド結合のネットワークを形成するその６システインモチーフである。βディフェンシン蛋白質の３個のジスルフィド結合はＣ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ４及びＣ３−Ｃ６間に形成される。隣接するシステイン残基間の最も一般的な間隔は６、４、９、６、０である。βディフェンシン蛋白質のシステイン間の間隔は１又は２アミノ酸異なる場合があるが、カルボキシ末端の最近傍に位置するＣ５とＣ６は例外である。全公知脊椎動物βディフェンシン遺伝子において、これらの２個のシステイン残基は相互に隣接している。
【００６３】
βディフェンシン蛋白質の第２の特徴はそのサイズが小さいことである。各βディフェンシン遺伝子は５９〜８０アミノ酸、平均サイズ６５アミノ酸のプレプロ蛋白質をコードする。この遺伝子産物はその後、未知のメカニズムにより開裂され、３６〜４７アミノ酸、平均サイズ４５アミノ酸の成熟ペプチドを生成する。これらの範囲の例外はβディフェンシンモチーフを含み、上皮で発現されるＥＰ２／ＨＥ２遺伝子産物である。
【００６４】
βディフェンシン蛋白質の第３の特徴はカチオン性残基の濃度が高いことである。成熟ペプチドにおける正電荷残基（アルギニン、リジン、ヒスチジン）の数は６〜１４であり、平均９である。
【００６５】
βディフェンシン遺伝子産物の最後の特徴は一次構造が多様であるが、三次構造は明白に保存されているという点である。６個のシステイン以外に、この蛋白質ファミリーの全公知メンバーでは所定位置に保存された単一アミノ酸が存在しない。他方、二次及び三次構造及び機能に重要であると思われる位置は保存されている。
【００６６】
βディフェンシン蛋白質の一次アミノ酸配列は多様性が高いが、この蛋白質ファミリーの三次構造が保存されていることを示唆するデータは少ない。ＢＮＢＤ−１２とＤＥＦＢ２によりコードされる蛋白質で例示されるように、構造コアは３本鎖逆平行βシートである。３本のβ鎖はβターンとαヘアピンループにより結合され、第２のβ鎖は更にβバルジを含む。これらの構造がその適正な三次構造に折り畳まれると、カチオン性残基と疎水性残基の明白にランダムな配列が球状蛋白質の２面に集中する。一方の面は親水性であり、正電荷側鎖の多くを含み、他方は疎水性である。溶液中で、ＤＥＦＢ２遺伝子によりコードされるＨＢＤ−２蛋白質はαディフェンシン又はβディフェンシンＢＮＢＤ−１２の溶液構造に従来帰属されていないα螺旋セグメントをＮ末端の近くに示した。側鎖が蛋白質の表面側に向いたアミノ酸はβディフェンシン蛋白質間で保存度が低く、コアβシートの３本のβ鎖のアミノ酸残基はより高度に保存されている。
【００６７】
βディフェンシンペプチドはプレプロペプチドとして産生された後、開裂され、Ｃ末端活性ペプチドフラグメントを遊離するが、気道上皮におけるヒトβディフェンシンペプチドの細胞内プロセシング、貯蔵及び遊離の経路は分かっていない。
【００６８】
４．診断
本願の教示の主要な利点は本願に開示する方法が前立腺癌をもつか又はその危険のある対象を組織又は体液から同定するためのより迅速で簡単な手法となるという点である。
【００６９】
従って、本願に開示する方法は前立腺の生検サンプル等の対象の組織におけるＰＡＸ２及び／又はＤＥＦＢ１の検出（測定を含む）を含むことができる。前立腺生検は癌の存在を検査する男性の前立腺から小サンプルを採取する手法である。これは一般にＰＳＡ血液検査からのスコアが前立腺癌の存在可能性に結び付けられるレベルまで上昇する場合に実施される。
【００７０】
本願に開示する方法は対象の前立腺に由来する細胞等の対象の細胞におけるＰＡＸ２及び／又はＤＥＦＢ１の検出（測定を含む）を含むことができる。
【００７１】
更に、本願に開示する方法は血液、尿、血漿、血清、涙液、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、房水ないしガラス体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門及び膣分泌物、汗、精液、濾出液、滲出液、並びに滑液等の対象の体液中のＰＡＸ２及び／又はＤＥＦＢ１の検出（測定を含む）を含むことができる。血漿は血球が懸濁している血液の液体成分である。血漿は総血液容量の約５５％を構成する血液の最大単一成分である。血清は血漿から凝固因子（例えばフィブリン）を除去したものを意味する。血漿はフィブリノーゲン、グロブリン及びヒト血清アルブミン等の多くの重要な蛋白質を含有している。血漿はウイルスプロセシングにより抽出する必要のあるウイルス不純物を含有している場合もある。
【００７２】
癌のより正確又は早期の診断を実現する血液蛋白質マーカーの同定は癌治療及び管理にプラスの効果がある。本願に開示するように、癌進行の初期には異常なＰＡＸ２発現が生じ、腫瘍形成における開始イベントと考えられる。従って、ＰＡＸ２蛋白質又は抗原の存在をスクリーニングするために採取された患者からのサンプルを癌の早期検出に使用することができる。
【００７３】
更に、ＰＡＸ２スクリーニングの採用は発症組織又は前癌組織の予後予測因子を臨床医に提供することができる。この試験の候補としては（年齢、人種により）癌の危険の高い患者が挙げられる。診断として、陽性ＰＡＸ２試験後に癌部位を確定するためのバイオマーカーで更にスクリーニングすることができる。更に、これらの患者は患者の癌の化学予防用ＰＡＸ２阻害剤の候補とすることができる。あるいは、患者の癌治療の有効性の尺度として又は癌再発をモニターするためにこの試験を患者で使用することができる。
【００７４】
別の例として、臨床医による直腸触診中に前立腺に小結節が検出される等の癌の潜在的指標を示す患者や、ＰＳＡが急激に上昇した患者は「経過観察（Ｗａｔｃｈｆｕｌ  Ｗａｉｔｉｎｇ）」状態にあることが多い。これらの患者が癌を発症しているか又は将来発症するかを確かめることは多くの場合に困難である。これらの患者に由来する血漿／血清等のサンプル中のＰＡＸ２の検出を使用すると、前立腺癌の疑いのある男性で生検を得る決定に役立ち、不要な前立腺生検数とその疾患の初期介入を減らすことができる。
【００７５】
本願は、対象における前立腺癌の診断方法として、対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出する段階を含み、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が少なくとも約１００：１である方法も提供する。
【００７６】
本願は、対象における前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の診断方法として、対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出する段階を含み、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が少なくとも約４０：１〜約１００：１未満である方法も提供する。
【００７７】
本願は、正常前立腺をもつ対象の同定方法として、対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出する段階を含み、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が約４０：１未満である方法も提供する。
【００７８】
本願は、対象における正常、前癌性及び癌性前立腺状態の識別方法として、対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出する段階を含む方法も提供する。所定の側面では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が約４０：１未満であり、正常前立腺状態を検出する。所定の側面では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が少なくとも約４０：１〜約１００：１未満であり、前癌状態を検出する。所定の側面では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が少なくとも約１００：１であり、癌性前立腺を検出する。
【００７９】
５．診断及び治療
本願は、対象における前立腺癌の診断及び治療方法として、対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出する段階を含み、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が少なくとも約１００：１であり、更に前記対象を治療する段階を含む方法も提供する。
【００８０】
本願は、対象における前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の診断及び治療方法として、対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出する段階を含み、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が少なくとも約４０：１〜約１００：１未満であり、更に前記対象を治療する段階を含む方法も提供する。
【００８１】
開示する方法で使用する場合に、前立腺癌の治療は経過観察、外科手術、放射線療法、高密度焦点式超音波療法（ＨＩＦＵ）、化学療法、凍結外科手術、ホルモン療法、又は所定の組み合わせを含むことができる。どの選択肢が最良であるかは疾患のステージ、グリーソンスコア、及びＰＳＡ値により異なる。他の重要な因子は男性の年齢、その一般健康状態、及び潜在的治療と予測される副作用に関する感じ方により異なる。
【００８２】
癌が前立腺を越えて拡大している場合には、治療選択肢は著しく異なるので、前立腺癌を治療する大半の医師は拡大の確率を予測するために各種ノモグラムを使用する。癌が前立腺内に止まっている男性には経過観察、ＨＩＦＵ、放射線療法、凍結外科手術、及び外科手術による治療が一般に提案される。ホルモン療法と化学療法は前立腺を越えて拡大している疾患に限定されることが多い。しかし、例外もあり、進行腫瘍に放射線療法が使用される場合もあるし、初期ステージ腫瘍にホルモン療法が使用される場合もある。初期治療に失敗し、癌が進行する場合には凍結療法、ホルモン療法、及び化学療法も提案される場合がある。
【００８３】
経過観察は積極的サーベイランス（ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）とも呼ばれ、侵襲的治療を伴わない観察と定期的監視を意味する。経過観察は増殖の遅い初期ステージの前立腺癌が高齢者男性で検出された場合に使用されることが多い。外科手術、放射線療法、又はホルモン療法の危険が予想される効果を上回る場合にも経過観察を提案することができる。症状が進んでいる場合、又は癌増殖が加速している徴候（例えばＰＳＡの急上昇、反復生検でのグリーソンスコアの増加等）がある場合には、他の治療を開始することができる。初期ステージ腫瘍に経過観察を選択する大半の男性は最終的に腫瘍進行の徴候を示し、３年以内に治療を開始することか必要になると思われる。
【００８４】
前立腺の外科的摘出ないし前立腺摘除術は初期ステージ前立腺癌、又は放射線療法に応答しなかった癌に一般的な治療法である。最も一般的な方式は根治的恥骨後式前立腺摘除術であり、外科医は腹部切開により前立腺を摘出する。別の方式は根治的会陰式前立腺摘除術であり、外科医は陰嚢と肛門の間の皮膚である会陰の切開により前立腺を摘出する。根治的前立腺摘除術は外科ロボット支援下又は非支援下で腹腔鏡により一連の腹部小（１ｃｍ）切開により実施することもできる。
【００８５】
根治的前立腺摘除術は前立腺を越えて拡大していない腫瘍に非常に有効であり、治癒率はＰＳＡ値やグリーソングレード等の危険因子により異なる。しかし、前立腺癌患者の生活の質を著しく変化させる神経損傷を生じる場合がある。性的能力をある程度回復するためにはシルデナフィル（バイアグラ）、タダラフィル（シアリス）、又はバルデナフィル（レビトラ）等の薬剤を使用することができる。臓器局限疾患をもつ大半の男性には、より限定的な「神経温存」法が尿失禁と性的不能を回避し易いと思われる。
【００８６】
根治的前立腺摘除術は癌が小さいときには伝統的に単独で使用されている。陽性マージン又は局所進行疾患が病理で検出される場合には、アジュバント放射線療法により生存率の改善が得られる。癌が放射線療法に応答しない場合には外科手術も提案することができる。しかし、放射線療法は組織変化をもたらすので、放射線照射後の前立腺摘除術は合併症の危険が高い。
【００８７】
経尿道的前立腺切除術は一般に「ＴＵＲＰ」と呼ばれ、膀胱から陰茎（尿道）への管が前立腺拡大により遮断される場合に実施される外科的手法である。ＴＵＲＰは一般に良性疾患の治療法であり、前立腺癌の決定的治療を意味しない。ＴＵＲＰ中には、小管（膀胱鏡）を陰茎に挿入し、遮断している前立腺を切除する。
【００８８】
癌が前立腺を越えて拡大している転移性疾患では、テストステロン値を低下させ、癌増殖を抑制するために精巣の摘出（精巣摘除術と言う）を実施する場合もある。
【００８９】
前立腺癌の近接照射療法は腫瘍に直接移植される小放射性ロッドである「シード」を使用して施療される。放射性療法はラジオセラピーとも言われ、前立腺癌細胞を死滅させるためにγ線を使用する。前立腺癌治療には外部照射療法と近接照射療法の２種類の異なる放射線療法が使用される。
【００９０】
外部照射療法はビームとして前立腺に送られる高エネルギーγ線を発生するために線形加速装置を使用する。腫瘍の形状に一致するように放射線ビームを調整し、膀胱と直腸の損傷を少なくしながら前立腺と精嚢に高線量を送達できるように、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）と呼ばれる方法を使用することができる。外部照射療法は一般に放射線治療センターに毎日来院して数週間施療する。
【００９１】
前立腺癌用外部照射療法はこのような線形加速装置により発生される。近接照射療法は会陰の皮膚に針を通して放射性物質（例えばヨウ素−１２５又はパラジウム−１０３）を含有する小「シード」約１００個を前立腺に直接挿入する方法である。これらのシードは短距離しか伝播することができない低エネルギーＸ線を発生する。近接照射療法シードは前立腺に永久的に留まるが、シードを移植した男性が他人に放射線を被爆させる危険はない。
【００９２】
前立腺癌治療では放射線療法が一般に使用されている。初期癌の外科手術に代用する場合もあれば、苦痛を伴う骨転移を治療するために前立腺癌の進行ステージで使用する場合もある。放射線療法単独では癌を治癒する可能性が低い中間危険疾患には放射線療法をホルモン療法と併用することもできる。中間から高危険状態には外部照射療法を近接照射療法と併用することができる。外部照射療法と、近接照射療法と、ホルモン療法の「３方式」組み合わせも考えられる。
【００９３】
放射線療法は内科疾患により外科手術が危険な男性に提案されることが多い。放射線療法は外科手術と全く同様に前立腺に局限される小腫瘍を治癒させると思われる。しかし、２００６年の時点において、放射線を骨盤の他の部分にも照射すべきか、吸収線量をどの程度にすべきか、同時にホルモン療法も併用すべきか等のいくつかの問題は解決されていない。
【００９４】
凍結外科手術は前立腺癌の別の治療方法である。根治的前立腺摘除術よりも低侵襲性であり、全身麻酔を使用することが少ない。超音波誘導下に、会陰の皮膚を通して前立腺に金属ロッドを挿入する。液体窒素を使用してロッドを冷却し、周囲組織を−１９６℃（−３２０°Ｆ）で凍結させる。前立腺細胞内の水分が凍結するにつれて細胞は死滅する。尿道は温液を充填したカテーテルにより凍結から保護する。凍結外科手術は一般に他の治療法よりも尿制限の問題が少ないが、９０％までの確率で性的不能が生じる。
【００９５】
ホルモン療法は投薬又は外科手術を使用し、前立腺で産生され、殆どの前立腺癌細胞の増殖と拡大に必要なホルモンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を前立腺癌細胞が獲得しないように阻止する。ＤＨＴを阻止すると、多くの場合に前立腺癌は増殖を停止し、縮小することさえある。しかし、初期にホルモン療法に応答する癌は一般に１〜２年後に耐性になるので、ホルモン療法で前立腺癌が治癒することは稀である。従って、ホルモン療法は癌が前立腺から拡大している場合に一般に使用される。放射線療法又は外科手術を受けた男性に癌の再発を防ぐためにも施療することができる。
【００９６】
前立腺癌のホルモン療法は身体がＤＨＴを産生するために使用する経路を標的とする。精巣、視床下部、下垂体、副腎、及び前立腺を含むフィードバックループはＤＨＴの血中濃度を制御する。先ず、低濃度の血中ＤＨＴはゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）を産生するように視床下部を刺激する。次にＧｎＲＨは黄体形成ホルモン（ＬＨ）を産生するように下垂体を刺激し、ＬＨはテストステロンを産生するように精巣を刺激する。最後に、精巣からのテストステロンと副腎からのデヒドロエピアンドステロンはＤＨＴを更に産生するように前立腺を刺激する。ホルモン療法はこの経路を任意点で遮断することにより、ＤＨＴ濃度を低下させることができる。
【００９７】
精巣摘除術は精巣を摘出する外科手術である。精巣は体内のテストステロンの大部分を産生しているので、精巣摘除術後にテストステロン濃度は低下する。こうして、前立腺はＤＨＴを産生するためのテストステロン刺激を失うのみならず、ＤＨＴに変換するために十分なテストステロンもなくなる。
【００９８】
フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、及び酢酸シプロテロン等の抗アンドロゲン剤は前立腺癌細胞内のテストステロンとＤＨＴの作用を直接阻止する薬剤である。
【００９９】
ＤＨＥＡ等の副腎アンドロゲンの産生を阻止する薬剤としてはケトコナゾールとアミノグルテチミドが挙げられる。副腎は体内のアンドロゲンの約５％しか産生しないので、これらの薬剤は一般に精巣により産生されるアンドロゲンの９５％を阻止できる他の方法と併用する場合のみに使用される。これらの併用方法を完全アンドロゲン遮断（ＴＡＢ）と呼ぶ。ＴＡＢは抗アンドロゲン薬を使用して実施することもできる。
【０１００】
ＧｎＲＨ作用は２つの方法の一方で遮断することができる。ＧｎＲＨアンタゴニストはＧｎＲＨの産生を直接抑制し、ＧｎＲＨアゴニストは初期刺激効果後にダウンレギュレーションプロセスによりＧｎＲＨを抑制する。アバレリクスはＧｎＲＨアンタゴニストの１例であり、ＧｎＲＨアゴニストとしてはロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、及びブセレリンが挙げられる。当初、これらの薬剤はＬＨの産生を増加する。しかし、薬剤の一定供給は体内の自然産生リズムと一致しないので、数週間後にＬＨとＧｎＲＨの両者の産生が低下する。
【０１０１】
６．治療／予防
本願は、対象における前立腺癌の予防方法として、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）をもつと診断された対象にＰＡＸ２発現又は活性の阻害剤を含有する組成物を投与する段階を含む方法も提供する。蛋白質の「活性」としては、例えば転写、翻訳、細胞内移行、分泌、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる開裂、他の蛋白質との同分子種間及び異分子種間結合、ユビキチン化が挙げられる。所定の側面において、「ＰＡＸ２活性」とは特にＰＡＸ２とＤＥＦＢ−１プロモーターの結合を意味する。本願は対象における前立腺癌の予防方法として、対象が前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）をもつと診断する段階と、ＰＡＸ２発現又は活性の阻害剤を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法も提供する。対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出することにより対象がＰＩＮをもつと診断することができ、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比は少なくとも約４０：１〜約１００：１未満である。
【０１０２】
所定の側面において、ＰＡＸ２はＰＩＮ以前の萎縮段階でアップレギュレートされる。従って、対象における前立腺癌の予防方法として、対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出する段階を含み、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が少なくとも約４０：１〜約１００：１未満であり、更にＰＡＸ２発現又は活性の阻害剤を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法も提供する。
【０１０３】
本願は、対象における前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の治療方法として、対象がＰＩＮをもつと診断する段階と、ＰＡＸ２発現又は活性の阻害剤を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法も提供する。対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出することにより対象がＰＩＮをもつと診断することができ、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比は少なくとも約４０：１〜約１００：１未満である。
【０１０４】
対象における前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の治療又は予防方法として、対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出することにより対象がＰＩＮをもつと診断する段階を含み、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比が少なくとも約４０：１〜約１００：１未満であり、更にＰＡＸ２発現又は活性の阻害剤を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法も提供する。
【０１０５】
本願は、対象における前立腺癌の治療方法として、対象が前立腺癌をもつと診断する段階と、ＰＡＸ２発現又は活性の阻害剤を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法も提供する。対象の前立腺に由来する細胞内のＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）の濃度を検出することにより対象が前立腺癌をもつと診断することができ、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比は少なくとも約１００：１である
【０１０６】
開示する方法の阻害剤はアンジオテンシンＩＩの選択的アンタゴニストとすることができる。開示する方法の阻害剤はアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の選択的アンタゴニストとすることができる。例えば、阻害剤はエナラプリルとすることができる。阻害剤はアンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（ＡＴ１Ｒ）の選択的アンタゴニストとすることができる。例えば、阻害剤はバルサルタン、オルメサルタン、又はテルミサルタンとすることができる。阻害剤はＭＥＫの選択的アンタゴニストとすることができる。阻害剤はＥＲＫ１，２の選択的アンタゴニストとすることができる。阻害剤はＳＴＡＴ３の選択的アンタゴニストとすることができる。阻害剤はＰＡＸ２の選択的アンタゴニストとすることができる。阻害剤はＰＡＸ２とβディフェンシン１（ＤＥＦＢ１）プロモーターの結合を阻止することができる。所定の側面において、開示するＰＡＸ２発現又は活性の阻害剤はＡＴ１Ｒ受容体アンタゴニスト以外のものである。
【０１０７】
「選択的アンタゴニスト」とは、標的と直接結合してその活性を阻害する物質を意味する。蛋白質の「活性」としては、例えば転写、翻訳、細胞内移行、分泌、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる開裂、他の蛋白質との同分子種間及び異分子種間結合、ユビキチン化が挙げられる。従って、例えば、キナーゼの選択的アンタゴニストはキナーゼと結合し、キナーゼの標的のリン酸化を阻害することができる。従って、例えば、キナーゼの選択的アンタゴニストはキナーゼと結合し、キナーゼとその基質の結合を妨害することができる。
【０１０８】
本願は、対象における前立腺癌の治療又は予防方法として、ＭＥＫ及び／又はＥＲＫ１，２の選択的アンタゴニストを含有する組成物を前記対象に投与する段階を含む方法も提供する。これはＰＡＸ２の発現の阻害方法でもよい。この方法では、先ず対象が前癌状態（例えばＰＩＮ）又は癌をもつと診断することができる。
【０１０９】
ＭＥＫ及び／又はＥＲＫ１，２の選択的阻害剤はＵ０１２６とすることができる。Ｕ０１２６は化学的に合成された有機化合物であり、当初は細胞内ＡＰ−１アンタゴニストとして認められ、そのすぐ上流の活性化剤であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１及び２（別称ＭＥＫ１及びＭＥＫ２，夫々ＩＣ５０：７０及び６０ｎＭ）を阻害することによりマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの非常に選択的且つ非常に強力な阻害剤であることが分かった。Ｕ０１２６は不活性ＭＥＫの活性化のみを阻害するＰＤ０９８０５９と異なり、活性及び不活性の両方のＭＥＫ１，２を阻害する。ＭＥＫ活性化を阻止すると、ＡＰ−１複合体の成分であるｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎの上流インデューサーであるｐ６２ＴＣＦ（Ｅｌｋ−１）を含む多数の因子の下流リン酸化が妨げられる。Ｕ０１２６によるＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害は更に癌遺伝子Ｈ−Ｒａｓ及びＫ−Ｒａｓの全作用を妨害し、増殖因子により誘発される作用の一部を阻害し、炎症性サイトカイン及びマトリックスメタロプロテイナーゼの産生を阻止する。
【０１１０】
ＭＥＫ及び／又はＥＲＫ１，２の選択的アンタゴニストはＰＤ９８０５９とすることができる。ＰＤ９８０５９（ＭＥＫ１阻害剤）はＭＥＫ１活性化とＭＡＰキナーゼカスケードの高度に選択的な阻害剤としてインビボ作用することが分かっている。ＰＤ９８０５９は不活性形態のＭＥＫ１と結合し、ｃ−Ｒａｆ等の上流アクチベーターによる活性化を妨害する。ＰＤ９８０５９は夫々４μＭ及び５０μＭのＩＣ５０値でＭＥＫ１とＭＥＫ２の活性化を阻害する。
【０１１１】
本願は、対象における前立腺癌の治療又は予防方法として、ＳＴＡＴ３の選択的アンタゴニストを含有する組成物を前記対象に投与する段階を含むも提供する。これはＰＡＸ２の発現の阻害方法でもある。この方法では、先ず対象が前癌状態（例えばＰＩＮ）又は癌をもつと診断することができる。
【０１１２】
本願に示すように、ＰＡＸ２はＤＥＦＢ１の発現を阻害し、ＤＥＦＢ１は腫瘍細胞死滅活性をもつことが明らかである。従って、ＰＡＸ２の発現を阻害することにより対象における癌を治療する方法を提供する。本方法により治療される癌の１例は前立腺癌である。本方法は後期ステージ前立腺癌の治療に特に有効である。
【０１１３】
開示する癌治療方法において、ＰＡＸ２の発現の阻害方法はＰＡＸ２のｓｉＲＮＡをコードする核酸の投与により実施することができる。ＤｈａｒｍａｃｈｏｎはこのようなｓｉＲＮＡの商業的供給業者である。
【０１１４】
例えば、前記方法で使用するｓｉＲＮＡは、
ＡＵＡＧＡＣＵＣＧＡＣＵＵＧＡＣＵＵＣＵＵ（配列番号３）、
ＡＵＣＵＵＣＡＵＣＡＣＧＵＵＵＣＣＵＣＵＵ（配列番号４）、
ＧＵＡＵＵＣＡＧＣＡＡＵＣＵＵＧＵＣＣＵＵ（配列番号５）、
ＧＡＵＵＵＧＡＵＧＵＧＣＵＣＵＧＡＵＧＵＵ（配列番号６）、又は少なくとも核酸１０個のフラグメントとその保存変異体を含むその組み合わせから構成することができる。
【０１１５】
ＰＡＸ２を阻害する分子の標的配列の他の例としては、
＃１  ＡＣＣＣＧＡＣＴＡＴＧＴＴＣＧＣＣＴＧＧ（配列番号７）、
＃２  ＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＧＡＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号８）、及び
＃４  ＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＡＣＧ（配列番号９）が挙げられる。＃４はＰＡＸ２を阻害することが判明した（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｊａｎ．１５，１３（２）；２３５）。
【０１１６】
別の文献（Ｍｕｒａｔｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｒｅｄ−Ｂｏｘ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｏｆｔｅｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００３）２２，７９８９−７９９７）は以下のｓｉＲＮＡ：ＧＵＣＧＡＧＵＣＵＡＵＣＵＧＣＡＵＣＣＴＴ（配列番号１０）及びＧＧＡＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡＣＵＣＧＡＣＴＴ（配列番号１１）を開示している。
【０１１７】
Ｐａｘ２発現をダウンレギュレートするために、Ｆｏｎｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．は腫瘍由来上皮細胞にアンチセンスＰＡＸ２ベクターをトランスフェクトした。この分子に関するその記載について本願に援用するＦｏｎｓａｔｏ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００６；１６８（２）：７０６−１参照。同様に、Ｈｕｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．はＰＡＸ２アンチセンスｃＤＮＡとＰＡＸ２−短鎖干渉性ＲＮＡ（１００ｎＭ）が内在性ＰＡＸ２蛋白質を還元すると教示している。ＰＡＸ２アンチセンス及びＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡに関するその教示について本願に援用するＨｕｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００６参照。
【０１１８】
本願に開示する方法では、ＤＥＦＢ１発現を増加するためにＰＡＸ２発現又はＰＡＸ２とＤＥＦＢ１プロモーターの結合の他の阻害剤を提供する。例えば、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１プロモーターの結合を妨害又は阻害するように本願に基づいて小分子と抗体を設計することができる。
【０１１９】
本願に示すように、ＰＡＸ２はＤＥＦＢ１の発現を阻害し、ＤＥＦＢ１は腫瘍細胞死滅活性をもつことが明らかである。従って、ＤＥＦＢ１を投与することにより対象における癌を治療する方法も提供する。本方法により治療される癌の１例は前立腺癌である。
【０１２０】
同様に、対象におけるＤＥＦＢ１の発現を増加することにより対象における癌を治療する方法も提供する。ＤＥＦＢ１を投与又はその発現を増加する本方法は後期ステージ前立腺癌の治療に特に有効である。
【０１２１】
ＤＥＦＢ１を投与又はＤＥＦＢ１発現を増加することにより（例えばＰＡＸ２の発現又は結合を阻害することにより）癌を治療するための本発明の方法の１態様において、対象は前立腺癌をもつと診断された対象である。ＤＥＦＢ１を投与又はＤＥＦＢ１発現を増加することにより（例えばＰＡＸ２の発現又は結合を阻害することにより）癌を治療するための本発明の方法の別の態様において、対象は進行（後期ステージ）前立腺癌をもつと診断された対象である。
【０１２２】
ＤＥＦＢ１の発現を増加する方法では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１プロモーターの結合を阻止することにより発現を増加することができる。ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１プロモーターの結合の阻止はＤＥＦＢ１のＰＡＸ２  ＤＮＡ結合部位を含むオリゴヌクレオチドの投与により実施することができる。このオリゴヌクレオチドはＤＥＦＢ１プロモーターと結合するＰＡＸ２の配列と相補的なものとすることができる。あるいは、オリゴヌクレオチドはＤＥＦＢ１との結合を阻害するようにＰＡＸ２と相互作用することができる。この相互作用は一次ヌクレオチド配列ではなく三次元構造に基づくものとすることができる。
【０１２３】
ＰＡＸ蛋白質群は進化中に保存され、「ペアードドメイン」及び「ホメオドメイン」と呼ばれるドメインを介して特異的ＤＮＡ配列と結合することが可能な転写因子のファミリーである。ペアードドメイン（ＰＤ）は所定のＰＡＸ蛋白質群（例えばＰＡＸ２とＰＡＸ６）で共有されるコンセンサス配列である。ＰＤはα３螺旋に配置されたアミノ酸のＤＮＡ結合を誘導し、ＤＮＡ−蛋白質複合体を形成する。ＰＡＸ２では、ＨＤにおけるアミノ酸はＣＣＴＴＧ（配列番号１）ＤＮＡコア配列を認識してこれと特異的に相互作用する。この配列又はその相補配列を含む６４塩基長までとそれを上回るオリゴヌクレオチドが阻害剤であると予想される。
【０１２４】
ＰＡＸ−８ペアードドメインのＤＮＡ結合特異性について検討した。部位選択実験によると、ＰＡＸ−８はＰＡＸ−２及びＰＡＸ−５と結合する配列と同様のコンセンサス配列と結合する。ペアードドメイン−ＤＮＡ相互作用について記載している最近の構造研究（Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．１９９５）を参考にして各種ペアードドメインのコンセンサス配列を観察すると、副溝で接触する塩基対は保存され、主溝で接触する塩基対の大半は保存されていないようである。従って、特定副溝接点のネットワークがペアードドメイン−ＤＮＡ相互作用の共通特徴である。このようなネットワークの機能的重要性はＤＥＦＢ１プロモーターのＰＡＸ２結合部位に及ぼすコンセンサス突然変異の影響を分析することにより首尾よく試験することができる。
【０１２５】
ＤＥＦＢ１のＰＡＸ２  ＤＮＡ結合部位は配列番号１（ＣＣＴＴＧ）を含むことができる。
【０１２６】
ＤＥＦＢ１のＰＡＸ２  ＤＮＡ結合部位を含むオリゴヌクレオチドはＸ１−ＣＣＴＴＧ（配列番号１２）−Ｘ２から構成される群から選択され、式中、Ｘ１はＤＥＦＢ１の１〜３５個の連続するフランキングヌクレオチドであり、Ｘ２は１〜３５個のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはＤＥＦＢ１のＰＡＸ２  ＤＮＡ結合部位を正常に挟む連続ヌクレオチドとすることができる。あるいは、オリゴヌクレオチドはＤＥＦＢ１と無関係でもよく、認識配列との干渉を避けるように常法により選択することができる。
【０１２７】
例えば、阻害オリゴヌクレオチドは、
ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣ（配列番号１３）
ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号１４）
ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１５）
ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１６）
から構成される群から選択することができる。
【０１２８】
開示する組成物は無制御の細胞増殖が生じる任意疾患（例えば癌）を治療するために使用することができる。各種癌の非限定的な例としては、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、白血病、癌、固形組織癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高グレード神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移性癌、又は癌一般が挙げられる。
【０１２９】
開示する組成物を使用して治療することができる癌の代表的且つ非限定的な例としては、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系の癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌（例えば小細胞肺癌及び非小細胞肺癌）、神経芽細胞腫／膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口腔、咽喉、咽頭及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、頸癌、乳癌、上皮癌、直腸癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血器癌、精巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、又は膵臓癌が挙げられる。本願に開示する化合物は子宮頸部及び肛門異形成、他の異形成、重度異形成、過形成、異型過形成、及び腫瘍形成等の前癌状態の治療にも使用することができる。更に、慢性炎症、例えば前立腺炎や良性前立腺肥大（ＢＰＨ）から前立腺の各種癌に至るまでの多数の疾患を本発明の方法及び化合物により処置することができる。
【０１３０】
ＤＥＦＢ１の遺伝子座（８ｐ２３．３）は欠失のホットスポットであり、予後不良患者に結び付けられている。従って、ＤＥＦＢ１（及び恐らくＰＡＸ２）は例えば前立腺癌の早期発見スクリーニングにおけるバイオマーカーとして使用することができる。更に、本願に提示するデータによると、その低下はＰＩＮと同時期（又はそれ以前）の早期に生じ、前立腺癌発症の要因であると考えられる。
【０１３１】
Ｂ．組成物
１．イムノアッセイ
当分野で公知又は新規に発見され、本願に開示する方法で使用することができる蛋白質（例えばＰＡＸ２及び／又はＤＥＦＢ１）等の検体の検出方法は多数のものがある。例えば、ＰＡＸ２及び／又はＤＥＦＢは標準免疫検出法を使用して検出することができる。有用な各種免疫検出法の段階は例えば特に免疫検出法に関するその教示について各々その開示内容全体を本願に援用するＭａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，（１９８７）及びＮａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７．１−２７．２０（１９８６）等の科学文献に記載されている。イムノアッセイはその最も単純且つ直接的な意味では、抗体と抗原の結合を利用する結合アッセイである。多数の型及びフォーマットのイムノアッセイが公知であり、いずれも本願に開示するバイオマーカーの検出に適している。イムノアッセイの例は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）、イムノビーズキャプチャーアッセイ、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、蛋白質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気キャプチャー、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、及びフォトブリーチング後の蛍光回復／位置決め（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）である。
【０１３２】
一般に、イムノアッセイは場合に応じて免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件下で該当分子（例えば本願に開示するバイオマーカー）を含有する疑いのあるサンプルを該当分子に対する抗体と接触させる段階、又は該当分子に対する抗体（例えば本願に開示するバイオマーカーに対する抗体）を抗体と結合することが可能な分子と接触させる段階を含む。免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするために有効な条件と十分な時間でサンプルを該当分子に対する抗体又は該当分子に対する抗体と結合可能な分子と接触させる段階は、一般に単に分子又は抗体とサンプルを接触させ、抗体と結合可能な分子（例えば抗原）が存在する場合に抗体がこの分子と免疫複合体を形成、即ち結合するために十分長い時間にわたって混合物をインキュベートする段階である。多くの方式のイムノアッセイでは、その後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット又はウェスタンブロット等のサンプル−抗体組成物を洗浄し、非特異的に結合した抗体種がある場合には除去し、一次免疫複合体内で特異的に結合した抗体のみを検出できるようにする。
【０１３３】
イムノアッセイとしては、サンプル中の該当分子（例えば本願に開示するバイオマーカー又はその抗体）の量の検出又は定量方法が挙げられ、前記方法は一般に結合プロセス中に形成された免疫複合体の検出又は定量を含む。一般に、免疫複合体形成の検出は当分野で周知であり、多数のアプローチの適用により実施することができる。これらの方法は一般に任意放射性、蛍光、生物もしくは酵素タグ又は他の任意公知ラベル等のラベル又はマーカーの検出に基づく。例えば、特に免疫検出法及びラベルに関する教示について各々その開示内容全体を本願に援用する米国特許第３，８１７，８３７号；３，８５０，７５２号；３，９３９，３５０号；３，９９６，３４５号；４，２７７，４３７号；４，２７５，１４９号及び４，３６６，２４１号参照。
【０１３４】
本願で使用するラベルとしては蛍光色素、結合対のメンバー（例えばビオチン／ストレプトアビジン）、金属（例えば金）、又は着色基質もしくは蛍光の発生等により検出可能な分子と特異的に相互作用することができるエピトープタグが挙げられる。蛋白質を検出可能に標識するのに適した物質としては蛍光色素（本願ではフルオロクローム又はフルオロフォアとも言う）と、発色基質と反応する酵素（例えば西洋ワサビペルオキダーゼ）が挙げられる。非常に少量を検出できるという理由から、本発明の実施には蛍光色素の使用が一般に好ましい。更に、複数の抗原を単一アレイと反応させる場合には、同時検出できるように各抗原を異なる蛍光化合物で標識することができる。アレイ上の標識スポットはフルオリメーターにより検出され、シグナルの存在が特異抗体に結合した抗原を示す。
【０１３５】
フルオロフォアは発光性の化合物又は分子である。一般に、フルオロフォアは第１の波長の電磁エネルギーを吸収し、第２の波長の電磁エネルギーを放出する。代表的なフルオロフォアとしては限定されないが、１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８−ＡＮＳ；４−メチルウンベリフェロン；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−カルボキシナフトフルオレセイン；５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）；５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＡＴ）；５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；６−カルボキシローダミン６Ｇ；６−ＣＲ  ６Ｇ；６−ＪＯＥ；７−アミノ−４−メチルクマリン；７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）；ＡＢＱ；アシッドフクシン；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビン・フォイルゲンＳＩＴＳＡ；エクオリン（発光蛋白質）；ＡＦＰ−自己蛍光蛋白質−（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ｓｇＧＦＰ，ｓｇＢＦＰ参照；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０（登録商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（登録商標）；アリザリン・コンプレクソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ，ＡＭＣＡ−Ｓ；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；ＡＭＣＡ−Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アニリンブルー；ステアリン酸アンスロシル；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ；ＡＰＴＳ；アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ；アストラゾンオレンジＲ；アストラゾンレッド６Ｂ；アストラゾンイエロー７ＧＬＬ；アタブリン；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（登録商標）ＣＢＱＣＡ；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（登録商標）ＦＱ；オーラミン；オーロホスフィンＧ；オーロホスフィン；ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；硫酸ベルベリン；β−ラクタマーゼ；ＢＦＰブルーシフトＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）；青色蛍光蛋白質；ＢＦＰ／ＧＦＰ  ＦＲＥＴ；ビマン；ビスベンズイミド；ビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）；ビス−ＢＴＣ；ブランコフォアＦＦＧ；ブランコフォアＳＶ；ＢＯＢＯ（登録商標）−１；ＢＯＢＯ（登録商標）−３；Ｂｏｄｉｐｙ４９２／５１５；Ｂｏｄｉｐｙ４９３／５０３；Ｂｏｄｉｐｙ５００／５１０；Ｂｏｄｉｐｙ；５０５／５１５；Ｂｏｄｉｐｙ５３０／５５０；Ｂｏｄｉｐｙ５４２／５６３；Ｂｏｄｉｐｙ５５８／５６８；Ｂｏｄｉｐｙ５６４／５７０；Ｂｏｄｉｐｙ５７６／５８９；Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１；Ｂｏｄｉｐｙ６３０／６５０−Ｘ；Ｂｏｄｉｐｙ６５０／６��５−Ｘ；Ｂｏｄｉｐｙ６６５／６７６；Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆ１；Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬ  ＡＴＰ；Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆ１−セラミド；Ｂｏｄｉｐｙ  Ｒ６Ｇ  ＳＥ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ−Ｘコンジュゲート；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ−Ｘ，ＳＥ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ  ＡＴＰ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥ；ＢＯ−ＰＲＯ（登録商標）−１；ＢＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３；ブリリアントスルホフラビンＦＦ；ＢＴＣ；ＢＴＣ−５Ｎ；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムゾン−；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン−１  Ｃａ２＋色素；カルシウムグリーン−２  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−５Ｎ  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−Ｃ１８  Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフロールホワイト；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）；カスケードブルー（登録商標）；カスケードイエロー；カテコールアミン；ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；ＣＦＤＡ；ＣＦＰ（シアン蛍光蛋白質）；ＣＦＰ／ＹＦＰ  ＦＲＥＴ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ−ＮＥＲＦ；ＣＭＦＤＡ；コエレンテラジン；コエレンテラジンｃｐ；コエレンテラジンｆ；コエレンテラジンｆｃｐ；コエレンテラジンｈ；コエレンテラジンｈｅｐ；コエレンテラジンｉｐ；コエレンテラジンｎ；コエレンテラジンＯ；クマリン・ファロイジン；Ｃ−フィコシアニン；ＣＰＭ  Ｉメチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣホルマザン；Ｃｙ２（登録商標）；Ｃｙ３．１  ８；Ｃｙ３．５（登録商標）；Ｃｙ３（登録商標）；Ｃｙ５．１  ８；Ｃｙ５．５（登録商標）；Ｃｙ５（登録商標）；Ｃｙ７（登録商標）；シアンＧＦＰ；環状ＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；塩化ダンシル；ダンシルＤＨＰＥ；フッ化ダンシル；ＤＡＰＩ；ダポキシル；ダポキシル２；ダポキシル３’ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（二酢酸ジクロロジヒドロフルオレセイン）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）；Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ；Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ（ノンレシオ）；ＤｉＡ（４−Ｄｉ  １６−ＡＳＰ）；二酢酸ジクロロジヒドロフルオレセイン（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ−親油性トレーサー；ＤｉＤ（ＤｉｌＣ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）；Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））；ジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（ＤｉｌＣ１８（７））；ＤＭ−ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；ドーパミン；ＤｓＲｅｄ；ＤＴＡＦ；ＤＹ−６３０−ＮＨＳ；ＤＹ−６３５−ＮＨＳ；ＥＢＦＰ；ＥＣＦＰ；ＥＧＦＰ；ＥＬＦ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；臭化エチジウム；エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）；オイクリシン；ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ；塩化ユウロピウム（ＩＩＩ）；ＥＹＦＰ；ファストブルー；ＦＤＡ；フォイルゲン（パラロサニリン）；ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）；ＦＩＴＣ；フラゾオレンジ；Ｆｌｕｏ−３；Ｆｌｕｏ−４；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；二酢酸フルオレセイン；Ｆｌｕｏｒｏ−Ｅｍｅｒａｌｄ；Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（ヒドロキシスチルバミジン）；Ｆｌｕｏｒ−Ｒｕｂｙ；Ｆｌ���ｏｒＸ；ＦＭ  １−４３（登録商標）；ＦＭ  ４−４６；Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（登録商標）（高ｐＨ）；Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（登録商標）／Ｆｌｕｏ−３；Ｆｕｒａ−２；Ｆｕｒａ−２／ＢＣＥＣＦゲナクリルブリリアントレッドＢ；ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ；ゲナクリルピンク３Ｇ；ゲナクリルイエロー５ＧＦ；ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ；（ＣＣＦ２）；ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）；ＧＦレッドシフト（ｒｓＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型、非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型、ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰｕｖ；グルオキサル酸；グラニュラーブルー；ヘマトポルフィリン；Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８；Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２；Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ）；ヒドロキシトリプタミン；Ｉｎｄｏ−１，高カルシウム；Ｉｎｄｏ−１低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；イントラホワイトＣｆ；ＪＣ−１；ＪＯ  ＪＯ−１；ＪＯ−ＰＲＯ−１；ＬａｓｅｒＰｒｏ；Ｌａｕｒｏｄａｎ；ＬＤＳ  ７５１（ＤＮＡ）；ＬＤＳ  ７５１（ＲＮＡ）；ロイコフォアＰＡＦ；ロイコフォアＳＦ；ロイコフォアＷＳ；リサミン・ローダミン；リサミン・ローダミンＢ；カルセイン／エチジウムホモダイマー；ＬＯＬＯ−１；ＬＯ−ＰＲＯ−１；ルシファーイエロー；リソトラッカーブルー；リソトラッカーブルー−ホワイト；リソトラッカーグリーン；リソトラッカーレッド；リソトラッカーイエロー；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｂｌｕｅ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒＹｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ；Ｍａｇ  Ｇｒｅｅｎ；Ｍａｇｄａｌａ  Ｒｅｄ（フロキシンＢ）；Ｍａｇ−Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ；Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−２；Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−５；Ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリアナブルー；マキシロンブリリアントフラビン１０  ＧＦＦ；マキシロンブリリアントフラビン８  ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；マイトトラッカーグリーンＦＭ；マイトトラッカーオレンジ；マイトトラッカーレッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ−ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾオキサジドール；ノルアドレナリン；ヌクレアファストレッド；ヌクレアイエロー；ナイロサンブリリアントラビンＥ８Ｇ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５００；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４；パシフィックブルー；パラロサニリン（フォイルゲン）；ＰＢＦＩ；ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−テキサスレッド（レッド６１３）；フロキシンＢ（マグダラレッド）；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＡＲ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＢＫＬ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  Ｒｅｖ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＲＰＡ；ホスフィン３Ｒ；フォトレジスト；フィコエリスリンＢ［ＰＥ］；フィコエリスリンＲ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ��ポンタクロムブルーブラック；ＰＯＰＯ−１；ＰＯＰＯ−３；ＰＯ−ＰＲＯ−１；ＰＯ−１  ＰＲＯ−３；プリムリン；プロシオンイエロー；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ；ＱＳＹ７；キナクリンマスタード；レゾルフィン；ＲＨ４１４；Ｒｈｏｄ−２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５  ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ２００；ローダミンＢエキストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミン：ファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ−フィコシアニン；Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）；ｒｓＧＦＰ；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；サファイアＧＦＰ；ＳＢＦＩ；セロトニン；セブロンブリリアントレッド２Ｂ；セブロンブリリアントレッド４Ｇ；セブロンＩブリリアントレッドＢ；セブロンオレンジ；セブロンイエローＬ；ｓｇＢＦＰ（登録商標）（ｓｕｐｅｒ  ｇｌｏｗ  ＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰ（登録商標）（ｓｕｐｅｒ  ｇｌｏｗ  ＧＦＰ）；ＳＩＴＳ（プリムリン；スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ−１；ＳＮＡＦＬ−２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦ１；ナトリウムグリーン；スペクトラムアクア；スペクトラムグリーン；スペクトラムオレンジ；スペクトラムレッド；ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢ及びＣ；スルホローダミンエキストラ；ＳＹＴＯ  １１；ＳＹＴＯ  １２；ＳＹＴＯ  １３；ＳＹＴＯ  １４；ＳＹＴＯ  １５；ＳＹＴＯ  １６；ＳＹＴＯ  １７；ＳＹＴＯ  １８；ＳＹＴＯ  ２０；ＳＹＴＯ  ２１；ＳＹＴＯ  ２２；ＳＹＴＯ  ２３；ＳＹＴＯ  ２４；ＳＹＴＯ  ２５；ＳＹＴＯ  ４０；ＳＹＴＯ  ４１；ＳＹＴＯ  ４２；ＳＹＴＯ  ４３；ＳＹＴＯ  ４４；ＳＹＴＯ  ４５；ＳＹＴＯ  ５９；ＳＹＴＯ  ６０；ＳＹＴＯ  ６１；ＳＹＴＯ  ６２；ＳＹＴＯ  ６３；ＳＹＴＯ  ６４；ＳＹＴＯ  ８０；ＳＹＴＯ  ８１；ＳＹＴＯ  ８２；ＳＹＴＯ  ８３；ＳＹＴＯ  ８４；ＳＹＴＯ  ８５；ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ；ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ；ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ；テト
ラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ（登録商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＯＮ；チオライト；チオゾールオレンジ；チノポールＣＢＳ（カルコフロールホワイト）；ＴＩＥＲ；ＴＯ−ＰＲＯ−１；ＴＯ−ＰＲＯ−３；ＴＯ−ＰＲＯ−５；ＴＯＴＯ−１；ＴＯＴＯ−３；ＴｒｉＣｏｌｏｒ（ＰＥ−Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣテトラメチルローダミンイソチオシアネート；トゥルーブルー；トゥルーレッド；ウルトラライト；ウラニンＢ；ユビテックスＳＦＣ；ｗｔＧＦＰ；ＷＷ７８１；Ｘ−ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；イエローＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ−ＰＲＯ−１；ＹＯ−ＰＲＯ−３；ＹＯＹＯ−１；ＹＯＹＯ−３；サイバーグリーン；チアゾールオレンジ（インターカレーション色素）；量子ドット等の半導体ナノ粒子；又は（光又は他の電磁エネルギー源で活性化することができる）ケージドフルオロフォア、あるいはその組み合わせが挙げられる。
【０１３６】
標識は直接でも間接でもよい。直接標識では、検出抗体（該当分子の抗体）又は検出分子（該当分子に対する抗体と結合可能な分子）はラベルを含む。ラベルの検出は検出抗体又は検出分子の存在を意味し、従って、夫々該当分子又は該当分子に対する抗体の存在を意味する。間接標識では、付加分子又は部分を免疫複合体と接触させるか又は免疫複合体の部位に作製する。例えば、酵素等のシグナル発生分子又は部分を検出抗体又は検出分子に付着又は結合することができる。その後、シグナル発生分子は免疫複合体の部位に検出可能なシグナルを発生することができる。例えば、酵素は適切な基質を供給されると免疫複合体の部位に可視又は検出可能な生成物を生成することができる。ＥＬＩＳＡはこの型の間接標識を使用している。
【０１３７】
間接標識の別の例として、該当分子又は該当分子に対する抗体（一次抗体）と結合することができる付加分子（結合剤と言うことができる）（例えば一次抗体に対する第２の抗体）を免疫複合体と接触させることができる。付加分子はラベル又はシグナル発生分子もしくは部分をもつことができる。付加分子は抗体とすることができ、従って、二次抗体と言うことができる。二次抗体が一次抗体と結合すると、第１（ないし一次）抗体と該当分子と共に所謂サンドイッチを形成することができる。二次免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件と十分な時間で免疫複合体を標識二次抗体と接触させることができる。その後、一般に二次免疫複合体を洗浄し、非特異的に結合した標識二次抗体を除去した後、二次免疫複合体に残留しているラベルを検出することができる。付加分子は相互に結合可能な１対の分子又は部分（例えばビオチン／アビジン対）の一方であるか又はこれを含むものでもよい。この方式では、検出抗体又は検出分子は対の他方のメンバーを含んでいなければならない。
【０１３８】
他の方式の間接標識としては、２段階アプローチによる一次免疫複合体の検出が挙げられる。例えば、上記のように、該当分子又は対応する抗体に対して結合親和性をもつ抗体等の分子（第１の結合剤と言うことができる）を使用して二次免疫複合体を形成することができる。洗浄後、再び免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件と十分な時間で第１の結合剤に対して結合親和性をもつ別の分子（第２の結合剤と言うことができる）と二次免疫複合体を接触させることができる（こうして三次免疫複合体を形成する）。こうして形成された三次免疫複合体を検出できるように、第２の結合剤を検出可能なラベル又はシグナル発生分子もしくは部分と結合することができる。このシステムはシグナル増幅を実現することができる。
【０１３９】
蛋白質又は特定蛋白質に対する抗体等の物質の検出を含むイムノアッセイとしてはラベルフリーアッセイ、蛋白質分離法（即ち電気泳動）、固体担体キャプチャーアッセイ、又はインビボ検出が挙げられる。ラベルフリーアッセイは一般にサンプル中の特定蛋白質又は特定蛋白質に対する抗体の有無を判定する診断手段である。蛋白質分離法はサイズや正味電荷等の蛋白質の物理的性質を評価するためにも有用である。キャプチャーアッセイは一般にサンプル中の特定蛋白質又は特定蛋白質に対する抗体の濃度を定量的に評価するために有用である。最後に、インビボ検出は物質の空間発現パターンを評価するため、即ち物質が対象、組織又は細胞中に存在している可能性がある場合に有用である。
【０１４０】
濃度が十分であるならば、抗体−抗原相互作用により生成される分子複合体（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）は肉眼で見えるが、光ビームの散乱性により少量でも検出・測定することができる。複合体の形成は両者反応体が存在することを意味し、免疫沈降アッセイでは一定濃度の試薬抗体を使用して特定抗原（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）を測定し、試薬抗原を使用して特定抗体（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）を検出する。試薬種を（赤血球凝集アッセイの場合のように）細胞又は（ラテックス凝集アッセイの場合のように）非常に小さい粒子に予めコーティングするならば、著しく低濃度でもコーティングした粒子の「クランピング」が目に見える。これらの基本原理に基づく各種アッセイが広く使用されており、オクタロニー免疫核酸アッセイ、ロケット免疫電気泳動法、免疫濁度測定アッセイ及び比濁アッセイが挙げられる。このようなアッセイの主な欠点はラベルを利用するアッセイに比較して感度が限られ（検出限界が低い）、場合によっては検体濃度が非常に高いために実際に複合体形成が抑制され、防止策が必要になり、操作が複雑になる場合もある。これらのグループ１のアッセイの中には抗体の発見時に正確に溯るものもあり、いずれも実際の「ラベル」（例えばＡｇ−ｅｎｚ）を使用しない。他の種のイムノアッセイとしてラベルフリーのアッセイはイムノセンサーに依存しており、抗体−抗原相互作用を直接検出することができる各種計器が現在市販されている。大半はリガンドを固定化したセンサー表面にエバネッセント波を発生し、リガンドとの結合を連続的にモニターするものである。イムノセンサーは動的相互作用を容易に調べることができ、低価格特殊機器の出現と共に、将来免疫解析に広く利用されると思われる。
【０１４１】
特定蛋白質を検出するためにイムノアッセイを使用するには、電気泳動により蛋白質を分離することが必要な場合がある。電気泳動は電場に応答する溶液中の荷電分子の移動である。その移動速度は電場の強度、正味電荷、分子のサイズと形状に依存し、更には分子が移動している媒体のイオン強度、粘度及び温度にも依存する。解析ツールとして、電気泳動は簡単で迅速で高感度である。単一荷電種の性質を試験するためや、分離技術として解析用に使用されている。
【０１４２】
一般に、紙、酢酸セルロース、澱粉ゲル、アガロース又はポリアクリルアミドゲル等の担体マトリックス中でサンプルを泳動させる。マトリックスは加熱に起因する対流混合を阻止し、電気泳動の記録を可能にする。泳動後にマトリックスを染色し、スキャン、オートラジオグラフィー又は保存用に使用することができる。更に、最も広く使用されている担体マトリックスであるアガロースとポリアクリルアミドは多孔質ゲルという点で分子をサイズにより分離する手段を提供する。多孔質ゲルは小さい分子を自由に移動させながら大きな高分子の移動を遅らせ、場合によっては完全に阻止することによりシーブとして機能することができる。希アガロースゲルは一般に同一濃度のポリアクリルアミドよりも剛性で取り扱い易いため、核酸、高分子量蛋白質及び蛋白質複合体等の大きな高分子を分離するにはアガロースを使用する。ポリアクリルアミドは取り扱い易く、高濃度で作製し易いため、遅延に小さいゲル細孔寸法を必要とする大半の蛋白質と短鎖オリゴヌクレオチドを分離するために使用される。
【０１４３】
蛋白質は両性化合物であるため、その正味電荷はそれらが懸濁している媒体のｐＨにより決定される。ｐＨがその等電点よりも高い溶液中において、蛋白質は負の正味電荷をもち、電場内でアノードに向かって移動する。その等電点よりも低い場合には、蛋白質は正電荷をもち、カソードに向かって移動する。更に、蛋白質の正味電荷はそのサイズから独立しており、即ち、分子の単位質量（又は蛋白質と核酸が直鎖状高分子である場合には長さ）当たりの電荷は蛋白質毎に異なる。従って、所定ｐＨで非変性条件下において、蛋白質の電気泳動分離は分子のサイズと電荷の両者により決定される。
【０１４４】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はポリペプチド主鎖を「取り囲む」ことにより蛋白質を変性させるアニオン界面活性剤であり、ＳＤＳは１．４：１の質量比で蛋白質とかなり特異的に結合する。こうして、ＳＤＳはその長さに比例してポリペプチドに負電荷を付与する。更に、蛋白質がサイズによる分離に必要なランダムコイル構造をとる前に蛋白質中のジスルフィド架橋を減らす（変性させる）ことが通常は必要であり、これは２−メルカプトエタノール又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて行われる。従って、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離では、泳動はポリペプチドの固有電荷ではなく、分子量により決定される。
【０１４５】
分子量の測定は特性決定しようとする蛋白質と共に既知分子量の蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施される。ＳＤＳ変性ポリペプチド又は天然核酸の分子量の対数とそのＲｆの間には直線関係が存在する。Ｒｆは分子の移動距離とマーカー色素前端の移動距離の比として計算される。相対分子量（Ｍｒ）を電気泳動により測定する簡単な方法は既知サンプルのｌｏｇ１０ＭＷに対する移動距離の標準曲線をプロットし、同一ゲル上の移動距離を測定後にサンプルのｌｏｇＭｒを読み取る方法である。
【０１４６】
二次元電気泳動では、蛋白質を先ず１つの物理的性質に基づいて分画し、第２段階で別の物理的性質に基づいて分画する。例えば、等電点電気泳動を一次元目に使用することができ、これはチューブゲルで実施すると簡便であり、二次元目にはスラブゲル内のＳＤＳ電気泳動を使用することができる。手順の１例は、二次元電気泳動法に関するその教示についてその開示内容全体を本願に援用するＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−４０２１（１９７５）の手順である。他の例としては限定されないが、電気泳動法に関する教示について各々その開示内容全体を本願に援用するＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＮＧ，Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４２１−５４２５（１９７７），Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．，Ｄｉｓｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｌ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１：３２１３４９（１９６４）に記載されているものが挙げられる。
【０１４７】
電気泳動法に関する教示についてその開示内容全体を本願に援用するＬａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０（１９７０）はＳＤＳで変性した蛋白質を分解するための不連続システムを開示している。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液系におけるリーディングイオンは塩化物であり、トレーリングイオンはグリシンである。従って、分解性ゲルとスタッキングゲルは（異なる濃度とｐＨの）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で構成され、タンク緩衝液はＴｒｉｓ−グリシンである。全緩衝液に０．１％ＳＤＳを加える。
【０１４８】
現行方法で想定される電気泳動を使用するイムノアッセイの１例はウェスタンブロット解析である。ウェスタンブロッティングないし免疫ブロッティングは蛋白質の分子量の測定と、異なるサンプル中に存在する蛋白質の相対量の測定を可能にする。検出法としては化学発光と発色検出が挙げられる。ウェスタンブロット解析の標準手法は例えばウェスタンブロット法に関する教示について各々その開示内容全体を本願に援用するＤ．Ｍ．Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９６）、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、米国特許第４，４５２，９０１号に記載されている。一般に、ゲル電気泳動、通常はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離する。蛋白質を特殊なブロッティングペーパー（例えばニトロセルロース）のシートに転写するが、他の型の紙又は膜も使用することができる。蛋白質はゲル上と同一の分離パターンを維持する。ブロットを一般的な蛋白質（例えば乳蛋白質）と共にインキュベートし、ニトロセルロース上に粘性部分が残っている場合にはこれと結合させる。次に、その特異的蛋白質と結合することが可能な抗体を溶液に加える。
【０１４９】
特定抗体と特定固定化抗原の結合は通常では発色基質（例えばアルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキダーゼ）又は化学発光基質を使用して間接酵素イムノアッセイ法により容易に可視化することができる。他の考えられるプロービング方法としては蛍光又は放射性ラベル（例えばフルオレセイン，１２５Ｉ）の使用が挙げられる。抗体結合の検出用プローブとしては、標識抗免疫グロブリン、標識ブドウ球菌プロテインＡ（ＩｇＧと結合する）、又はビオチン化一次抗体に対するプローブ（例えば標識アビジン／ストレプトアビジン）が挙げられる。
【０１５０】
手法の能力はその抗原性とその分子量による特定蛋白質の同時検出にある。先ず蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量により分離した後に、イムノアッセイ段階で特異的に検出する。従って、異種サンプル中の該当蛋白質の分子量を概算するためには、蛋白質標準（ラダー）を同時に泳動させればよい。
【０１５１】
ＤＮＡ結合性蛋白質とそのコグネイトＤＮＡ認識配列の相互作用を定性的及び定量的に検出するためにはゲルシフトアッセイないし電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用することができる。典型的な手法はゲルシフトアッセイに関する教示について各々その開示内容全体を本願に援用するＯｒｎｓｔｅｉｎ  Ｌ．，Ｄｉｓｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−１：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１：３２１−３４９（１９６４）、及びＭａｔｓｕｄｉａｒａ，ＰＴ  ａｎｄ  ＤＲ  Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＳＤＳ  ｍｉｃｒｏｓｌａｂ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８７：３８６−３９６（１９８７）に記載されている。
【０１５２】
一般的なゲルシフトアッセイでは、精製蛋白質又は粗細胞抽出液を標識（例えば３２Ｐ放射性標識）ＤＮＡ又はＲＮＡプローブと共にインキュベートした後に、非変性ポリアクリルアミドゲルにより遊離プローブから複合体を分離する。複合体は未結合プローブよりもゆっくりとゲル内を移動する。結合性蛋白質の活性に応じて、標識プローブは２本鎖又は１本鎖とすることができる。転写因子等のＤＮＡ結合性蛋白質の検出には、精製もしくは部分精製蛋白質、又は核細胞抽出液を使用することができる。ＲＮＡ結合性蛋白質の検出には、精製もしくは部分精製蛋白質、又は核もしくは細胞質細胞抽出液を使用することができる。該当蛋白質の結合部位を含むＤＮＡもしくはＲＮＡフラグメント又はオリゴヌクレオチドあるいは他の無関係の配列を使用する競合実験により、推定結合部位に対するＤＮＡ又はＲＮＡ結合性蛋白質の特異性を確認する。特異的競合剤と非特異的競合剤の存在下で形成される複合体の種類と強度の相違から特異的相互作用を確認することができる。ゲルシフト法に関する教示についてその開示内容全体を本願に援用する＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｆａｑ／ｇｅｌｓｈｆａｑ．ｈｔｍｌ＞で閲覧可能なＰｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ  ＦＡＱ（最終閲覧日２００５年３月２５日）参照。
【０１５３】
ゲルシフト法としては例えば、コロイド状クーマシー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ）ブルー染色を使用してポリアクリルアミド電気泳動ゲル等のゲル内で蛋白質を検出する方法が挙げられる。このような方法は例えば、ゲルシフト法に関する教示について各々その開示内容全体を本願に援用するＮｅｕｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ６：４２７−４４８（１９８５）、及びＮｅｕｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ９：２５５−２６２（１９８８）に記載されている。上記に挙げた従来の蛋白質アッセイ法に加え、ゲルシフト法に関するその教示についてその開示内容全体を本願に援用する米国特許第５，４２４，０００号には、洗浄組成物と蛋白質染色組成物の併用が記載されている。具体例としては、リン酸、硫酸及び硝酸と、アシッドバイオレット色素が挙げられる。
【０１５４】
放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）は放射性標識抗原を使用して血清中の特定抗体を検出する高感度アッセイである。抗原を血清と反応させた後に、例えば、プロテインＡセファロースビーズ等の特殊試薬を使用して沈降させる。結合した放射性標識免疫沈降物をその後、一般にゲル電気泳動により解析する。放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）はＨＩＶ抗体の存在を診断するための確認アッセイとして使用することが多い。ＲＩＰＡは当分野ではファールアッセイ、プレシピチンアッセイ、放射免疫プレシピチンアッセイ、放射免疫沈降解析法とも呼ばれる。
【０１５５】
特定該当蛋白質を分離・検出するために電気泳動を利用する上記イムノアッセイは蛋白質サイズを測定することができるが、蛋白質濃度を測定するほど高感度ではない。他方、夫々該当抗体又は蛋白質をサンプルから捕捉するために蛋白質又は蛋白質に特異的な抗体を固体担体（例えばチューブ、ウェル、ビーズ、又はセル）に結合するイムノアッセイと、担体上の蛋白質又は蛋白質に特異的な抗体を検出する方法を併用することも考えられる。このようなイムノアッセイの例としてはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、蛋白質アレイ、多重ビーズアッセイ、及び磁気キャプチャーが挙げられる。
【０１５６】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は放射性標識物質（放射性リガンド）を直接又は間接的に使用して未標識物質と特定抗体又は他の受容体系の結合を測定する抗原−抗体反応の検出用の古典的定量アッセイである。ラジオイムノアッセイは例えばバイオアッセイを使用する必要なしに血液中のホルモン濃度を試験するために使用される。抗体形成を誘導することが可能な大型キャリヤー蛋白質（例えばウシγグロブリンやヒト血清アルブミン）と結合するならば、非免疫物質（例えばハプテン）も測定することができる。ＲＩＡでは放射性抗原（ヨウ素原子は蛋白質中のチロシン残基に導入し易いため、放射性同位体１２５Ｉ又は１３１Ｉを使用することが多い）をこの抗原に対する抗体と混合する。抗体は一般にチューブやビーズ等の固体担体に結合する。次に既知量の未標識ないし「ｃｏｌｄ」抗原を加え、標識抗原の置換量を測定する。先ず、放射性抗原は抗体と結合する。未標識抗原を加えると、両抗原は抗体結合部位について競合し、未標識抗原の濃度が高いほど、多量に抗体と結合し、放射性変異体に置換する。結合した抗原を溶液中の未結合抗原から分離し、各々の放射能を使用して結合曲線をプロットする。この技術は非常に高感度で特異的である。
【０１５７】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ないし総称的にはＥＩＡ（酵素免疫測定法）は蛋白質に対して特異的な抗体を検出することができるイムノアッセイである。このようなアッセイにおいて、抗体結合性又は抗原結合性試薬と結合する検出可能なラベルは酵素である。この酵素はその基質と接触すると、例えば分光測光、蛍光測光又は目視手段により検出可能な化学部分を発生するように反応する。検出に有用な試薬を検出可能に標識するために使用可能な酵素としては限定されないが、西洋ワサビペルオキダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、アスパラギナーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。ＥＬＩＳＡ手法に関する記載については、特にＥＬＩＳＡ法に関する教示について各々その開示内容全体を本願に援用するＶｏｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８０；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｏｌ．１（Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９２，ｐｐ．２０９−２５９；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｉｎ：ｖａｎ  Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．７５９−８０３；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１）；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，“ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９５；米国特許第４，３７６，１１０号参照。
【０１５８】
ＥＬＩＳＡ技術の変法は当業者に公知である。１変法では、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル等の蛋白質親和性を示す選択表面に蛋白質と結合することが可能な抗体を固定化することができる。次に、マーカー抗原を含有している疑いのある試験組成物をウェルに加える。結合させ、洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合抗体を検出することができる。検出は検出可能なラベルに結合した標的蛋白質に特異的な第２の抗体を加えることにより実施することができる。この型のＥＬＩＳＡは単純型「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。第２の抗体を加えた後に、第２の抗体に対して結合親和性をもつ第３の抗体を加えることにより検出を行うこともでき、第３の抗体は検出可能なラベルに結合する。
【０１５９】
別の変法は競合ＥＬＩＳＡである。競合ＥＬＩＳＡにおいて、試験サンプルは既知量の標識抗原又は抗体との結合について競合する。コーティングしたウェルでインキュベーション前又はインキュベーション中にサンプルを既知標識種と混合することにより、サンプル中の反応種の量を測定することができる。サンプル中に反応種が存在している場合には、ウェルとの結合に利用可能な標識種の量を減らすように作用し、従って、最終シグナルが減少する。
【０１６０】
利用するフォーマットに関係なく、ＥＬＩＳＡには所定の共通の特徴があり、例えばコーティングし、インキュベーション又は結合し、洗浄して非特異的結合種を除去し、結合した免疫複合体を検出するという点である。抗原又は抗体はプレート、ビーズ、ディップスティック、膜又はカラムマトリックス等の形態の固体担体に結合することができ、固定化抗原又は抗体に被分析サンプルを加える。プレートを抗原又は抗体でコーティングする場合には、一般にプレートのウェルに抗原又は抗体の溶液を加えて一晩又は特定時間インキュベートする。次に、プレートのウェルを洗浄し、完全に吸着していない材料を除去することができる。その後、ウェルに利用可能な表面が残っている場合には試験抗血清に対して抗原的に中性の非特異的蛋白質で「コーティング」することができる。これらの蛋白質としては、ウウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン及び粉乳溶液が挙げられる。コーティングは固定化用表面上の非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、こうして表面への抗血清の非特異的結合に起因するバックグラウンドを低減することができる。
【０１６１】
ＥＬＩＳＡでは、直接法ではなく、二次又は三次検出手段も使用することができる。従って、蛋白質又は抗体をウェルに結合し、非反応性材料でコーティングしてバックグラウンドを低減し、洗浄して未結合材料を除去した後に、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするために有効な条件下で被験対照臨床又は生体サンプルと固定化用表面を接触させる。その後、免疫複合体の検出には標識二次結合剤又は二次結合剤と第３の標識結合剤が必要である。
【０１６２】
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするために有効な条件下」とは条件が非特異的結合を減らすと共に妥当なシグナル対ノイズ比を促進するように抗原と抗体をＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ等の溶液で希釈する操作を含むことを意味する。
【０１６３】
適切な条件は有効な結合を可能にするために十分な温度と時間インキュベーションを行うことも意味する。インキュベーション段階は一般に約２０℃〜３０℃の温度で約１分〜１２時間実施することができ、又は約０℃〜約１０℃で一晩インキュベートすることができる。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡにおける全インキュベーション段階後、接触させた表面を洗浄し、複合体を形成しなかった材料を除去することができる。洗浄法としては、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎや硼酸緩衝液等の溶液による洗浄が挙げられる。試験サンプルと当初に結合した材料の特異的免疫複合体の形成後、洗浄した後、微量でも免疫複合体の量を測定することができる。
【０１６５】
検出手段を提供するために、上記のように、第２又は第３の抗体にラベルを付着して検出できるようにすることができる。これは適当な発色基質と共にインキュベートした場合に発色することが可能な酵素とすることができる。従って、例えば、免疫複合体形成を更に助長する時間と条件下で第１及び第２の免疫複合体を標識抗体と接触させ、インキュベートすることができる（例えばＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ等のＰＢＳ含有溶液中で２時間室温にてインキュベーション）。
【０１６６】
標識抗体と共にインキュベーションし、洗浄して未結合材料を除去した後に、例えば尿素とブロモクレゾールパープル又は２，２’−アジド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸［ＡＢＴＳ］とＨ２Ｏ２（酵素ラベルとしてペルオキダーゼを使用する場合）等の発色基質と共にインキュベーションすることにより、ラベルの量を定量することができる。その後、例えば可視スペクトル分光光度計を使用して発色度を測定することにより定量を行うことができる。
【０１６７】
蛋白質アレイはガラス、膜、マイクロタイターウェル、質量分析計プレート、及びビーズ又は他の粒子等の表面に固定化した蛋白質を使用する固相リガンド結合アッセイシステムである。アッセイは高度に並列的であり（多重）、小型のことが多い（マイクロアレイ、蛋白質チップ）。その利点としては、迅速で自動化可能であり、高感度が可能であり、試薬が経済的であり、１回の実験で多量のデータが得られるという点が挙げられる。バイオインフォマティクス支援が重要であり、データ操作には高度ソフトウェアとデータ比較解析が要求される。しかし、ハードウェア及び検出システムの多くと同様に、ソフトウェアもＤＮＡアレイ用のものから応用することができる。
【０１６８】
主要なフォーマットの１つはキャプチャーアレイであり、通常は抗体であるが、蛋白質スカフォールド、ペプチド又は核酸アプタマーでもよいリガンド結合試薬を使用し、血漿や組織抽出物等の混合物中の標的分子を検出する。診断において、キャプチャーアレイは複数のイムノアッセイを並列的に実施するために使用することができ、例えば個体血清中の数個の検体を試験すると共に、同時に多数の血清サンプルを試験する。プロテオミクスにおいて、キャプチャーアレイは健常及び疾患の各サンプル中の蛋白質濃度を定量及び比較するため、即ち蛋白質発現プロファイリングに使用される。蛋白質−蛋白質、蛋白質−ＤＮＡ、蛋白質−薬剤、受容体−リガンド、酵素−基質等のインビトロ機能的相互作用スクリーニング用アレイフォーマットでは特定リガンド結合剤以外の蛋白質が使用される。キャプチャー試薬自体は多数の蛋白質に対して選択及びスクリーニングされ、複数の蛋白質ターゲットに対する多重アレイフォーマットでも実施可能である。
【０１６９】
アレイの構築に使用する蛋白質源としては組換え蛋白質用細胞系発現システム、天然源からの精製、無細胞翻訳系によるインビトロ産生、及びペプチド合成法が挙げられる。これらの方法の多くは高スループット製造用に自動化することができる。キャプチャーアレイ及び蛋白質機能解析では、蛋白質が正しく折り畳まれ、機能的であることが重要であるが、これは、例えば組換え蛋白質を変性条件下で細菌から抽出する場合には必ずしも当てはまらない。しかし、変性蛋白質のアレイは交差反応性に関する抗体のスクリーニング、自己抗体の同定、及びリガンド結合性蛋白質の選択には有用である。
【０１７０】
蛋白質アレイは蛍光読み出しを利用することが多いＥＬＩＳＡやドットブロッティング等の周知のイムノアッセイ法の小型化として設計されており、複数アッセイを並列的に実施できるようにロボット及び高スループット検出システムにより簡易化されている。広く使用されている物理的担体としてはガラススライド、シリコン、マイクロウェル、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜、並びに磁気及び他のマイクロビーズが挙げられる。蛋白質の微量液滴を平坦表面上に分配するのが最も一般的なフォーマットであるが、代替構成としては、マイクロフルイディクスの開発に基づくＣＤ遠心装置（Ｇｙｒｏｓ，Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ）と、プレートに作製したマイクロチャネル（例えばＴｈｅ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｈｉｐ（登録商標），Ｂｉｏｔｒｏｖｅ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）やシリコン表面に形成した微小３Ｄポスト（Ｚｙｏｍｙｘ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）等の特殊チップデザインが挙げられる。識別用にコード化する場合には、懸濁粒子もアレイの基礎として使用することができ、システムとしてはマイクロビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）や半導体ナノ結晶（例えばＱＤｏｔｓ（登録商標），Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）の色コード化と、ビーズ（ＵｌｔｒａＰｌｅｘ（登録商標），ＳｍａｒｔＢｅａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｂａｂｒａｈａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）や多金属マイクロロッド（例えばＮａｎｏｂａｒｃｏｄｅｓ（登録商標）粒子，Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のバーコード化が挙げられる。ビーズを半導体チップ上で平坦アレイに集合させてもよい（ＬＥＡＰＳ技術，ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）。
【０１７１】
蛋白質の固定化にはカップリング試薬とカップリングする表面の性質の両方が問題となる。良好な蛋白質アレイ担体表面はカップリング操作前後に化学的に安定であり、良好なスポット形態を可能にし、非特異的結合が最小であり、検出システムにバックグラウンドを生じず、各種検出システムに適合可能である。使用する固定化方法は再現可能であり、異なる性質（サイズ、親水性、疎水性）の蛋白質に適用可能であり、高スループットと自動化が可能であり、完全に機能的な蛋白質活性の保持に適合可能である。表面結合蛋白質の向きは活性状態のリガンド又は基質に提示する際の重要な因子と認められており、キャプチャーアレイでは、キャプチャー試薬が特定の向きに配置されているときに最も効率的な結合結果が得られるが、これには一般に蛋白質の部位特異的標識が必要である。
【０１７２】
共有的及び非共有的の双方の蛋白質固定化方法が使用されており、種々の利点と欠点がある。表面への受動的吸着は手法的には単純であるが、定量的又は方向的制御が殆どできず、蛋白質の機能的性質が変化する場合と変化しない場合があり、再現性と効率が一定しない。共有的結合法は安定な結合を実現し、多様な蛋白質に適用することができ、再現性が良好であるが、向きが一定せず、化学的誘導体化により蛋白質の機能が変化する場合があり、安定な相互作用性表面が必要である。蛋白質上のタグを利用する生物学的捕捉法は安定な結合を実現し、蛋白質と特異的且つ再現可能な向きで結合するが、生物学的試薬を先ず十分に固定化しなければならす、アレイに特殊な操作が必要になり、安定性が変動する場合がある。
【０１７３】
蛋白質アレイ作製用の数種類の固定化用化学物質とタグが記載されている。共有結合用基質としては、アミノ又はアルデヒド含有シラン試薬をコーティングしたガラススライドが挙げられる。Ｖｅｒｓａｌｉｎｘ（登録商標）システム（Ｐｒｏｌｉｎｘ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）では、フェニルジボロン酸で誘導体化した蛋白質と、担体表面に固定化したサリチルヒドロキサム酸の相互作用により可逆的共有結合が得られる。これは更にバックグラウンド結合が低く、固有蛍光が低く、固定化蛋白質に機能を保持させることができる。三次元ポリアクリルアミドゲルに基づくＨｙｄｒｏＧｅｌ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）等の多孔質構造内では未修飾蛋白質の非共有的結合が生じ、この基質はガラスマイクロアレイ上のバックグラウンドが特に低く、能力が高く、蛋白質機能を保持すると報告されている。蛋白質を適宜修飾したビオチン／ストレプトアビジン又はヘキサヒスチジン／Ｎｉ相互作用を介する生物学的カップリング法は広く使用されている。ビオチンは二酸化チタン（Ｚｙｏｍｙｘ）又は五酸化タンタル（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ，Ｗｉｔｔｅｒｓｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等の表面に固定化されたポリリジン主鎖に結合することができる。
【０１７４】
アレイ作製方法としてはロボット密着焼付、インクジェット、圧電スポット及びフォトリソグラフィが挙げられる。多数のアレイ作製装置［例えばＰａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］と手動装置［Ｖ  ＆  Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］が市販されている。蛋白質発現をｉｎ  ｓｉｔｕ誘導するためにロボットにより細菌コロニーをＰＶＤＦ膜上に格子上に分配することができる。
【０１７５】
１ｍｍ平方未満のシングルチップで数千の反応を実施できるようにナノメーター空間規模のスポットをもつナノアレイはスポットサイズと密度の限界にある。ＢｉｏＦｏｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは光学検出限界で８５平方ミクロン中に蛋白質スポット１５２１個（１平方ｃｍ当たり２５００万スポットに等価）をもつナノアレイを開発しており、その読み出し方法は蛍光と原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）である。
【０１７６】
蛍光標識及び検出法は広く使用されている。ＤＮＡマイクロアレイの読み出しに使用されると同一の機器が蛋白質アレイにも適用可能である。ディファレンシャルディスプレイでは、２種類の異なる細胞状態に由来する蛍光標識蛋白質でキャプチャー（例えば抗体）アレイをプロービングすることができ、細胞溶解液を異なるフルオロフォア（例えばＣｙ−３，Ｃｙ−５）で直接標識し、標的量の変化の読み出しとして色を利用できるように混合する。蛍光読み出し感度はチラミドシグナル増幅法（ＴＳＡ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）により１０〜１００倍に増加することができる。平面導波管技術（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ）は超高感度蛍光検出を可能にし、洗浄操作を挿入する必要がないという利点もある。フィコエリスリン（Ｌｕｍｉｎｅｘ）をラベルとして使用するか又は半導体ナノ結晶（量子ドット）の性質を使用し、懸濁ビーズや粒子で高感度を達成することもできる。特に商業的バイオ領域では、多数の新規代替読み出し法が開発されている。これらの方法としては表面プラズモン共鳴法（ＨＴＳ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ，Ｔｅｍｐｅ，ＡＺ）、ローリングサークル型ＤＮＡ増幅法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ  ＣＴ）、質量分析法（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、共鳴光散乱法（Ｇｅｎｉｃｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及び原子間力顕微鏡解析［ＢｉｏＦｏｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］の応用が挙げられる。
【０１７７】
キャプチャーアレイは発現プロファイリング用診断チップ及びアレイの基礎をなす。これらは特定標的リガンドと高スループットで結合するために、従来の抗体、シングルドメイン、人工スカフォールド、ペプチド又は核酸アプタマー等の高親和性キャプチャー試薬を利用する。
【０１７８】
抗体アレイは特異性と許容可能なバックグラウンドの必要な性質をもち、市販されているものもある（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；ＢｉｏＲａｄ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。キャプチャーアレイ用抗体は従来の免疫法（ポリクローナル血清とハイブリドーマ）により作製されるか、又は組換えフラグメントとして作製され、前記フラグメントは通常ではファージ又はリボソームディスプレイライブラリーから選択後に大腸菌で発現される（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；Ｂｉｏｌｎｖｅｎｔ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ；Ｂｉｏｓｉｔｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。従来の抗体であるＦａｂ及びｓｃＦｖフラグメントに加え、ラクダ科動物に由来する１本鎖Ｖドメイン又は人工ヒト等価物（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）もアレイで有用であると思われる。
【０１７９】
「スカフォールド」なる用語は特異性及び親和性の抗体様性質をもつ各種標的分子と結合することが可能な複数の変異体として構築される蛋白質のリガンド結合ドメインを意味する。変異体は遺伝子ライブラリーフォーマットで作製し、ファージ、細菌又はリボソームディスプレイにより個々のターゲットに対して選択することができる。このようなリガンド結合スカフォールドないしフレームワークとしては、黄色ブドウ球菌プロテインＡに基づく「アフィボディ」（Ａｆｆｉｂｏｄｙ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、フィブロネクチンに基づく「トリネクチン」（Ｐｈｙｌｏｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）及びリポカリン構造に基づく「アンチカリン」（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ−Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。これらは抗体と同様にキャプチャーアレイで使用することができ、堅牢で作製し易いという利点があると思われる。
【０１８０】
非蛋白質キャプチャー分子、特に高い特異性と親和性で蛋白質リガンドと結合する１本鎖核酸アプタマーもアレイで使用される（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）。アプタマーはＳｅｌｅｘ（登録商標）法によりオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択され、ブロモデオキシウリジン取込みと紫外線架橋による共有結合により、蛋白質との相互作用を強化することができる（フォトアプタマー）。リガンドとの光架橋の結果、特定立体要件によるアプタマーの交差反応性が低下する。アプタマーは自動化オリゴヌクレオチド合成により容易に作製することができ、ＤＮＡが安定で堅牢であるという利点があり、フォトアプタマーアレイでは、結合を検出するために汎用蛍光蛋白質染色を使用することができる。
【０１８１】
抗体アレイと結合する蛋白質検体は直接検出してもよいし、サンドイッチアッセイで二次抗体を介して検出してもよい。異なる色の異なるサンプルの比較には直接標識を使用する。同一蛋白質リガンドに対する抗体対が入手可能な場合には、サンドイッチイムノアッセイは特異性と感度が高いため、サイトカイン等の存在量の少ない蛋白質に適した方法であり、更に蛋白質修飾の検出も可能になる。質量分析法、表面プラズモン共鳴法及び原子間力顕微鏡解析等のラベルフリー検出法ではリガンドの改変が避けられる。どの方法でも必要な点は、感度と特異性が最適であり、バックグラウンドが低く、シグナル対ノイズ比が高いことである。検体濃度は広い範囲に及ぶため、感度を適宜調整する必要があり、この問題を解決するには、サンプルを系列希釈するか又は異なる親和性の抗体を使用する。該当蛋白質は体液及び抽出物中の濃度の低い蛋白質であることが多く、例えばサイトカインや細胞中の低発現産物ではｐｇ範囲以下の検出が必要である。
【０１８２】
キャプチャー分子アレイの代用は「分子インプリンティング」技術により形成されるものであり、この方法では（例えば蛋白質のＣ末端領域に由来する）ペプチドを鋳型として使用し、重合可能なマトリックスに構造的に相補的な配列特異的キャビティを作製し、キャビティはその後、適当な一次アミノ酸配列をもつ（変性）蛋白質を特異的に捕捉することができる（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｉｎｔ（登録商標），Ａｓｐｉｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。
【０１８３】
診断と発現プロファイリングに使用することができる別の技術はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）であり、この場合には、固相クロマトグラフィー表面が血漿や腫瘍抽出物等の混合物に由来する同様の電荷又は疎水性特徴をもつ蛋白質と結合し、保持された蛋白質を検出するためにＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を使用する。
【０１８４】
多数の精製蛋白質を固定化することにより大規模機能的チップが作製されており、他の蛋白質との蛋白質相互作用、薬剤−ターゲット相互作用、酵素−基質等の広範な生化学機能をアッセイするために使用されている。一般に、これらは発現ライブラリーが必要であり、大腸菌、酵母等にクローニングした後に発現された蛋白質を例えばＨｉｓタグにより精製し、固定化する。無細胞蛋白質転写／翻訳は細菌又は他のインビボシステムで十分に発現しない蛋白質の合成に有効な代替方法である。
【０１８５】
蛋白質−蛋白質相互作用を検出するためには、細胞系の酵母２ハイブリッドシステムのインビトロ代用として蛋白質アレイを使用することができ、分泌型蛋白質やジスルフィド橋をもつ蛋白質の相互作用のように、このようなシステムが不十分な場合に有用であると思われる。アレイでの生化学活性の高スループット解析は酵母蛋白質キナーゼと酵母プロテオームの各種機能（蛋白質−蛋白質及び蛋白質−脂質相互作用）について記載されており、全酵母オープンリーディングフレームの大部分が発現され、マイクロアレイに固定化された。大規模「プロテオームチップ」は機能的相互作用の同定、薬剤スクリーニング等に非常に有用であると期待される（Ｐｒｏｔｅｏｍｅｔｒｉｘ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）。
【０１８６】
個々のエレメントの二次元ディスプレイとして、蛋白質アレイを使用し、抗体、合成スカフォールド、ペプチド及びアプタマー等の特異的結合パートナーを選択するために、ファージ又はリボソームディスプレイライブラリーを選択することができる。こうして、「ライブラリー対ライブラリー」スクリーニングを実施することができる。ゲノムプロジェクトから同定された蛋白質のターゲットアレイに対するコンビナトリアル化学ライブラリー中の薬剤候補のスクリーニングはこのアプローチの別の適用例である。
【０１８７】
例えば、ＢＤ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ等の多重ビーズアッセイは可溶性検体を捕捉・定量するために使用することができる一連のスペクトルの異なる粒子である。この場合、検体は蛍光発光とフローサイトメトリー解析により測定される。多重ビーズアッセイはＥＬＩＳＡ型アッセイと同等のデータを「多重」的ないし同時に生成する。全サンドイッチフォーマットアッセイと同様に、即ち既知標準の使用と標準曲線に対する未知数のプロッティングにより、サイトメトリービーズアレイについて未知数の濃度を計算する。更に、多重ビーズアッセイはサンプル容量の制限により従来考慮されなかったサンプル中の可溶性検体の定量を可能にする。定量的データに加え、ユニークなプロファイル又はシグネチャを明示する強力な画像を生成することができ、使用者に一目で分かる付加情報を提供する。
【０１８８】
２．抗体
本願は、ＰＡＸ２又はＤＥＦＢ１と特異的に結合する抗体であって、本願に開示する診断方法でサンプル中のＰＡＸ２又はＤＥＦＢ１を検出するために使用することができる抗体、あるいは本願に開示する前立腺癌又はＰＩＮの治療又は予防方法でＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の相互作用を阻害するために使用することができる抗体も開示する。
【０１８９】
「抗体」なる用語は本願では広義に使用し、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。無傷の免疫グロブリン分子に加え、例えばＰＡＸ２がＤＥＦＢ１と相互作用できないように、ＰＡＸ２又はＤＥＦＢ１と相互作用できるものを選択する限り、これらの免疫グロブリン分子のフラグメント又はポリマーと、免疫グロブリン分子のヒトもしくはヒト化形態又はそのフラグメントも「抗体」なる用語に含む。ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の相互作用に関与するＰＡＸ２又はＤＥＦＢ１の開示領域と結合する抗体も開示する。抗体は本願に記載するインビトロアッセイ又は同様の方法を使用してその所望活性について試験することができ、その後、公知臨床試験方法に従ってそのインビボ治療及び／又は予防活性を試験する。
【０１９０】
本願で使用する「モノクローナル抗体」なる用語は実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を意味し、即ち集団内の個々の抗体は抗体分子の小サブセットに存在する可能性のある天然突然変異を除いて同一である。本願におけるモノクローナル抗体は所望のアンタゴニスト活性を示す限り、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定種に由来又は特定抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であり、鎖の残余が別の種に由来又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体と、このような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。
【０１９１】
本願に開示するモノクローナル抗体はモノクローナル抗体を作製する任意手法を使用して作製することができる。例えば、開示するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されている方法等のハイブリドーマ法を使用して作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適当な宿主動物を一般に免疫剤で免疫し、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することが可能なリンパ球を誘発する。あるいは、例えば本願に記載するＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４−コレセプター複合体を使用してリンパ球にインビトロ免疫してもよい。
【０１９２】
モノクローナル抗体は米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている方法等の組換えＤＮＡ法により作製することもできる。開示するモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは（例えばマウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）従来方法を使用して容易に単離し、配列決定することができる。例えば米国特許第５，８０４，４４０号（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）及び米国特許第６，０９６，４４１号（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されているようなファージディスプレイ技術を使用して抗体又は活性抗体フラグメントのライブラリーを作製し、スクリーニングすることもできる。
【０１９３】
一価抗体の作製にはインビトロ法も適している。抗体を消化してそのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを生成するには、当分野で公知の日常的技術を使用することができる。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例はＷＯ９４／２９３４８（公開日１９９４年１２月２２日）及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は一般に各々１個の抗原結合部位をもつＦａｂフラグメントと呼ばれる２個の同一の抗原結合フラグメントと、残余のＦｃフラグメントを生じる。ペプシン処理は２個の抗原結合部位をもつが、依然として抗原と架橋することが可能なフラグメントを生じる。
【０１９４】
フラグメントは他の配列と結合しているか否かに拘わらず、抗体又は抗体フラグメントの活性が非修飾抗体又は抗体フラグメントに比較して著しく改変又は損傷していないという条件で特定領域又は特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、又は他の選択された修飾を更に含むことができる。これらの修飾はジスルフィド結合可能なアミノ酸の除去／付加、その生物学的寿命の延長、その分泌特性の改変等の所定の付加的特性を提供することができる。いずれの場合も、抗体又は抗体フラグメントはそのコグネイト抗原との特異的結合等の生物活性特性を有していなければならない。抗体又は抗体フラグメントの機能的又は活性領域は蛋白質の特定領域の突然変異誘発後に、発現させ、発現されたポリペプチドを試験することにより同定することができる。このような方法は当業者に自明であり、抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発が挙げられる（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
【０１９５】
本願で使用する単数又は複数の「抗体」なる用語はヒト抗体及び／又はヒト化抗体を意味する場合もある。多くの非ヒト抗体（例えばマウス、ラット、又はウサギに由来するもの）は天然ではヒトで抗原性であるため、ヒトに投与すると、望ましくない免疫応答を生じる可能性がある。従って、ヒト又はヒト化抗体を方法で使用し、ヒトに投与した抗体が望ましくない免疫応答を誘発する確率を減らすようにする。
【０１９６】
開示するヒト抗体は任意技術を使用して作製することができる。ヒトモノクローナル抗体作製技術の例としてはＣｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）とＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５，１９９１）により記載されているものが挙げられる。ヒト抗体（及びそのフラグメント）はファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１，１９９１）を使用して作製することもできる。
【０１９７】
開示するヒト抗体はトランスジェニック動物から得ることもできる。例えば、免疫に応答してヒト抗体の完全レパートリーを産生することが可能なトランスジェニック突然変異体マウスが記載されている（例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）参照）。具体的には、これらのキメラ生殖細胞系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内在性抗体産生が完全に阻害され、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子アレイをこのような生殖細胞系列突然変異体マウスに導入するのに成功すると、抗原攻撃後にヒト抗体が産生される。所望の活性をもつ抗体は本願に記載するようなＥｎｖ−ＣＤ４−コレセプター複合体を使用して選択される。
【０１９８】
抗体ヒト化技術は一般に組換えＤＮＡ技術を使用し、抗体分子の１本以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する。従って、非ヒト抗体のヒト化形態（又はそのフラグメント）はヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組込まれた非ヒト（ドナー）抗体に由来する抗原結合部位の一部を含むキメラ抗体又は抗体鎖（又はＦｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’等のそのフラグメント、もしくは抗体の他の抗原結合部分）である。
【０１９９】
ヒト化抗体を作製するためには、レシピエント（ヒト）抗体分子の１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を所望の抗原結合特徴（例えば標的抗原に対する所定レベルの特異性及び親和性）をもつことが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１個以上のＣＤＲに由来する残基で置換する。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基を対応する非ヒト残基により置換する。ヒト化抗体は更にレシピエント抗体にも移入したＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも存在しない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１個以上のアミノ酸残基が導入されている。実際に、ヒト化抗体は一般に所定のＣＤＲ残基と場合により所定のＦＲ残基が齧歯類抗体の同等部位からの残基により置換されたヒト抗体である。ヒト化抗体は一般に抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般にヒト抗体のこのような部分を含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６），Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８），及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０２００】
非ヒト抗体のヒト化方法は当分野で周知である。例えば、ヒト化抗体はヒト抗体の対応する配列を齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列で置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒら（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って作製することができる。ヒト化抗体を作製するために使用することができる方法は米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．）、及び米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．）にも記載されている。
【０２０１】
抗体の投与は本願に開示するように実施することができる。抗体送達の核酸アプローチも存在する。患者又は対象自身の細胞が核酸を取込み、コードされる抗体又は抗体フラグメントを産生・分泌するように、抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸製剤（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）として広義の意味で中和性の抗ＰＡＸ２又はＤＥＦＢ１抗体及び抗体フラグメントを患者又は対象に投与することもできる。核酸の送達は例えば本願に開示するような任意手段により実施することができる。
【０２０２】
３．配列類似度
当然のことながら、本願に記載する場合、相同度及び一致度なる用語の使用は類似度と同義である。従って、例えば、２個の非天然配列間で相同度なる用語を使用する場合には、当然のことながら、これは必ずしもこれらの２個の配列間の進化的関係を示すものではなく、むしろそれらの核酸配列間の類似度又は近縁度に着目するものである。２個の進化的に近縁の分子間の相同度を決定する方法の多くは進化的に近縁であるか否かに関係なく、常に配列類似度を測定する目的で任意２個以上の核酸又は蛋白質に適用される。
【０２０３】
一般に、当然のことながら、本願に開示する遺伝子及び蛋白質の任意既知変異体及び誘導体又は生成する可能性のある変異体及び誘導体を定義する１つの方法は特定既知配列に対する相同度として変異体及び誘導体を定義する方法である。本願に開示する特定配列のこの一致度についても本願の他の箇所に記載する。一般に、本願に開示する遺伝子及び蛋白質の変異体は一般に指定配列又は天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の相同度をもつ。２個の蛋白質又は遺伝子等の核酸の相同度の決定方法は当業者に自明である。例えば、相同度は相同度がその最高レベルとなるように２個の配列を整列させた後に計算することができる。
【０２０４】
相同度の別の計算方法は公開されているアルゴリズムにより実施することができる。比較のための最適な配列のアラインメントはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視により実施することができる。
【０２０５】
核酸についても例えば少なくとも核酸アラインメントに関連する記載について本願に援用するＺｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されているアルゴリズムにより同一型の相同度を得ることができる。当然のことながら、一般にこれらの方法の任意のものを使用することができ、場合によってはこれらの各種方法の結果が異なる場合もあるが、当業者に自明の通り、これらの方法の少なくとも１種類で一致度が認められるならば、配列は指定一致度をもつと言い、本願に開示する。
【０２０６】
例えば、本願で使用する場合に、ある配列が別の配列に対して特定百分率の相同度をもつと言うときには、上記計算方法の任意の１種類以上により計算した指定相同度をもつ配列を意味する。例えば、第１の配列がＺｕｋｅｒ計算法を使用して第２の配列に対して８０％の相同度をもつと計算される場合には、第１の配列が他の計算方法のいずれかにより計算した場合に第２の配列に対して８０％の相同度をもたないとしても、本願の定義によると、第１の配列は第２の配列に対して８０％の相同度をもつ。別の例として、第１の配列がＺｕｋｅｒ計算法とＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ計算法の両者を使用して第２の配列に対して８０％の相同度をもつと計算される場合には、第１の配列がＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法、又は他の計算方法のいずれかにより計算した場合に第２の配列に対して８０％の相同度をもたないとしても、本願の定義によると、第１の配列は第２の配列に対して８０％の相同度をもつ。更に別の例として、第１の配列が各計算法を使用して第２の配列に対して８０％の相同度をもつと計算される場合には、本願の定義によると、第１の配列は第２の配列に対して８０％の相同度をもつ（但し、実際には、計算法によって相同度百分率の計算値は異なることが多い）。
【０２０７】
４．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションなる用語は一般に少なくとも２個の核酸分子（例えばプライマー又はプローブと遺伝子）間の配列特異的相互作用を意味する。配列特異的相互作用とは、２個のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又はヌクレオチド誘導体間にヌクレオチド特異的に生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ又はＴと相互作用するＡは配列特異的相互作用である。一般に配列特異的相互作用はヌクレオチドのワトソン・クリック面又はフーグスティーン面で生じる。２個の核酸のハイブリダイゼーションは当業者に公知の多数の条件及びパラメーターにより影響を受ける。例えば、反応の塩濃度、ｐＨ、及び温度はいずれも２個の核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響する。
【０２０８】
２個の核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメーターは当業者に周知である。例えば、所定態様において、選択的ハイブリダイゼーション条件はストリンジェントハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーはハイブリダイゼーション段階と洗浄段階の一方又は両方の温度と塩濃度の両者により制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は高イオン強度溶液（６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ）中、Ｔｍ（分子の２分の１がそのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融点）よりも約１２〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーション後に、洗浄温度がＴｍよりも約５℃〜２０℃低くなるように選択した温度と塩濃度の組み合わせで洗浄する条件が挙げられる。温度と塩濃度はフィルターに固定化した基準ＤＮＡのサンプルを該当標識核酸とハイブリダイズさせた後に異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験で経験的に容易に決定される。ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションではハイブリダイゼーション温度は一般に高い。条件はストリンジェンシーを達成するために上記のように、又は当分野で公知のように使用することができる。（少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連する記載について本願に援用するＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ中、約６８℃（水溶液中）でハイブリダイゼーション後に６８℃で洗浄する条件とすることができる。ハイブリダイゼーションと洗浄のストリンジェンシーは所望により、所望される相補性の程度が下がるにつれ、また、更には変動度を調べる任意領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔ含量に応じて相応に低下させることができる。同様に、いずれも当分野で公知の通り、ハイブリダイゼーションと洗浄のストリンジェンシーは所望により、所望される相同度が増すにつれ、また、更には高い相同度が所望される任意領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔ含量に応じて増加することができる。
【０２０９】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は他方の核酸と結合した核酸の一方の量（百分率）に着目する方法である。例えば、所定態様において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、制限核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が非制限核酸と結合している場合である。一般に、非制限プライマーは例えば、１０又は１００又は１０００倍過剰である。この型のアッセイは制限プライマーと非制限プライマーの両者が例えばそのｋｄよりも１０倍又は１００倍又は１０００倍少ない条件下、あるいは核酸分子の一方のみが１０倍又は１００倍又は１０００倍である条件下、あるいは一方又は両方の核酸分子がそのｋｄを上回る条件下で実施することができる。
【０２１０】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は所望酵素操作を助長するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で酵素操作されるプライマーの百分率に着目する方法である。例えば、所定態様において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が酵素操作を助長する条件下で酵素操作される場合であり、例えば酵素操作がＤＮＡ伸長であるならば、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマー分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が伸長される場合である。好ましい条件としては、製造業者により提案される条件又は操作を実施する酵素に適しているとして当分野で指定される条件も挙げられる。
【０２１１】
相同度と全く同様に、当然のことながら、２個の核酸分子間のハイブリダイゼーションレベルの各種決定方法を本願に開示する。当然のことながら、これらの方法及び条件では２個の核酸分子間のハイブリダイゼーションの百分率が異なる場合があるが、特に指定しない限り、これらの方法のいずれかのパラメーターに合致していれば十分である。例えば８０％のハイブリダイゼーションが必要だとすると、これらの方法のいずれか１種で必要なパラメーター内でハイブリダイゼーションが生じる限り、この方法は本願に開示されているものとみなす。
【０２１２】
当然のことながら、当業者にに自明の通り、組成物又は方法が全体として又は単独でハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のいずれか１個に合致するならば、この組成物又は方法は本願に開示する組成物又は方法である。
【０２１３】
５．核酸
核酸に基づく各種分子を本願に開示する。開示する核酸は例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、又はヌクレオチド代用物から構成される。これら及び他の分子の非限定的な例を本願に記載する。当然のことながら、例えば、ベクターを細胞で発現させる場合には、発現されるｍＲＮＡは一般にＡ、Ｃ、Ｇ、及びＵから構成される。同様に、当然のことながら、例えば体外送達により例えばアンチセンス分子を細胞又は細胞内環境に導入する場合には、細胞内環境におけるアンチセンス分子の分解を抑制するヌクレオチドアナログからアンチセンス分子を構成すると有利である。
【０２１４】
ｉ．ヌクレオチド及び関連分子
ヌクレオチドは塩基部分と、糖部分と、リン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドはそのリン酸部分と糖部分を介して相互に結合し、ヌクレオシド間結合を形成することができる。ヌクレオチドの塩基部分はアデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、及びチミン−１−イル（Ｔ）とすることができる。ヌクレオチドの糖部分はリボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例としては、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）又は５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）が挙げられる。多様なこれらの型の分子が当分野で入手可能であり、本願で利用可能である。
【０２１５】
ヌクレオチドアナログは塩基、糖、又はリン酸部分に所定型の修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチド修飾は当分野で周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、及び２−アミノアデニンと、糖又はリン酸部分の修飾が挙げられる。多様なこれらの型の分子が当分野で入手可能であり、本願で利用可能である。
【０２１６】
ヌクレオチド代用物はペプチド核酸（ＰＮＡ）のように、ヌクレオチドに類似する機能的性質をもつが、リン酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド代用物はワトソン・クリック又はフーグスティーン方式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して相互に結合している分子である。ヌクレオチド代用物は適当な標的核酸と相互作用する場合に二重螺旋型構造に一致することが可能である。多様なこれらの型の分子が当分野で入手可能であり、本願で利用可能である。
【０２１７】
例えば細胞取込みを強化するために、他の型の分子（コンジュゲート）をヌクレオチドヌクレオチドアナログと結合することも可能である。コンジュゲートはヌクレオチド又はヌクレオチドアナログと化学的に結合することができる。このようなコンジュゲートとしては限定されないが、コレステロール部分等の脂質部分が挙げられる（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）。多様なこれらの型の分子が当分野で入手可能であり、本願で利用可能である。
【０２１８】
ワトソン・クリック相互作用はヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、又はヌクレオチド代用物のワトソン・クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、又はヌクレオチド代用物のワトソン・クリック面はプリンヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、又はヌクレオチド代用物のＣ２、Ｎ１、及びＣ６位と、ピリミジンヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、又はヌクレオチド代用物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。
【０２１９】
フーグスティーン相互作用は２本鎖ＤＮＡの主溝に暴露されるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログのフーグスティーン面で行われる相互作用である。フーグスティーン面はＮ７位とプリンヌクレオチドのＣ６位の反応基（ＮＨ２又はＯ）を含む。
【０２２０】
ｉｉ．配列
本願に開示するシグナル伝達経路に関与する蛋白質分子（例えばＰＡＸ２）、又はＰＡＸ２の作製用として本願に開示する全核酸はいずれも核酸によりコードされるか又は核酸であるが、これらに関連する配列は各種のものがある。これらの遺伝子のヒトアナログ及び他のアナログと、これらの遺伝子の対立遺伝子、並びにスプライス変異体及び他の型の変異体の配列はＧｅｎｂａｎｋ等の各種蛋白質及び遺伝子データベースから入手可能である。本願の出願時にＧｅｎｂａｎｋから入手可能なこれらの配列全体とこれらに含まれる個々のサブ配列を本願に援用する。Ｇｅｎｂａｎｋはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉからアクセスすることができる。配列不一致及び相違を解決し、特定配列に関する組成物と方法を他の関連配列に合うように調整する方法は当業者に自明である。本願に開示し、当分野で公知の情報に鑑み、任意所定配列に合わせてプライマー及び／又はプローブを設計することができる。
【０２２１】
ｉｉｉ．機能的核酸
提供する方法のＰＡＸ２阻害剤は機能的核酸とすることができる。機能的核酸は標的分子と結合したり、特定反応を触媒する等の特定機能をもつ核酸分子である。機能的核酸分子は以下の分類に分けることができるが、これらに限定するものではない。例えば、機能的核酸としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、トリプレックス形成分子、ＲＮＡｉ、及び外部ガイド配列が挙げられる。機能的核酸分子は標的分子がもつ特定活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーター、及び刺激剤として作用することができ、あるいは機能的核酸分子は他の分子から独立してデノボ活性をもつことができる。
【０２２２】
機能的核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、又は糖鎖等の任意高分子と相互作用することができる。従って、機能的核酸はＰＡＸ２のｍＲＮＡ又はのＰＡＸ２ゲノムＤＮＡと相互作用することができ、あるいはポリペプチドＰＡＸ２と相互作用することができる。多くの場合、機能的核酸は標的分子と機能的核酸分子の配列相同度に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況では、機能的核酸分子と標的分子の間の特異的認識は機能的核酸分子と標的分子の配列相同度ではなく、特異的認識を可能にする三次構造の形成に基づく。
【０２２３】
アンチセンス分子はカノニカル又は非カノニカル塩基対合を介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は例えば、ＲＮＡｓｅＨ介在性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解により標的分子の破壊を助長するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は標的分子で通常行われるプロセシング機能（例えば転写や複製）を妨げるように設計される。アンチセンス分子は標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も接近し易い領域を見いだすことによりアンチセンス効率を最適化するための多数の方法が存在する。典型的な方法としてはインビトロ選択実験とＤＭＳ及びＤＥＰＣを使用するＤＮＡ修飾試験が挙げられる。アンチセンス分子は１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２以下の解離定数（Ｋｄ）で標的分子と結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計と使用に役立つ方法及び技術の代表的なサンプルは米国特許第５，１３５，９１７号、５，２９４，５３３号、５，６２７，１５８号、５，６４１，７５４号、５，６９１，３１７号、５，７８０，６０７号、５，７８６，１３８号、５，８４９，９０３号、５，８５６，１０３号、５，９１９，７７２号、５，９５５，５９０号、５，９９０，０８８号、５，９９４，３２０号、５，９９８，６０２号、６，００５，０９５号、６，００７，９９５号、６，０１３，５２２号、６，０１７，８９８号、６，０１８，０４２号、６，０２５，１９８号、６，０３３，９１０号、６，０４０，２９６号、６，０４６，００４号、６，０４６，３１９号、及び６，０５７，４３７号に記載されている。
【０２２４】
アプタマーは標的分子と好ましくは特異的に相互作用する分子である。一般に、アプタマーはステム−ループ又はＧカルテット等の規定二次及び三次構造に折り畳まれた１５〜５０塩基長の短鎖核酸である。アプタマーはＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）やテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）等の小分子と、逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）やトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）等の大分子とに結合することができる。アプタマーは１０−１２Ｍ未満のＫｄで標的分子と非常に強く結合することができる。アプタマーは１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２未満のＫｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは非常に高度の特異性で標的分子と結合することができる。例えば、標的分子と分子上のただ１個の位置のみが相違する別の分子の間の結合親和性の差が１０，０００倍を上回るアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは標的分子に対するＫｄがバックグラウンド結合分子に対するＫｄよりも少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、又は１００，０００倍低いことが好ましい。例えばポリペプチドについて比較を行う場合に、バックグラウンド分子は別のポリペプチドであることが好ましい。多様な標的分子と結合するためのアプタマーの作製及び使用方法の代表例は米国特許第５，４７６，７６６号、５，５０３，９７８号、５，６３１，１４６号、５，７３１，４２４号、５，７８０，２２８号、５，７９２，６１３号、５，７９５，７２１号、５，８４６，７１３号、５，８５８，６６０号、５，８６１，２５４号、５，８６４，０２６号、５，８６９，６４１号、５，９５８，６９１号、６，００１，９８８号、６，０１１，０２０号、６，０１３，４４３号、６，０２０，１３０号、６，０２８，１８６号、６，０３０，７７６号、及び６，０５１，６９８号に記載されている。
【０２２５】
リボザイムは分子内又は分子間の化学反応を触媒することが可能な核酸分子である。従って、リボザイムは触媒核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。天然システムに存在するリボザイムに基づくヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する多数の異なる型のリボザイムがあり、例えばハンマーヘッドリボザイム（米国特許第５，３３４，７１１号、５，４３６，３３０号、５，６１６，４６６号、５，６３３，１３３号、５，６４６，０２０号、５，６５２，０９４号、５，７１２，３８４号、５，７７０，７１５号、５，８５６，４６３号、５，８６１，２８８号、５，８９１，６８３号、５，８９１，６８４号、５，９８５，６２１号、５，９８９，９０８号、５，９９８，１９３号、５，９９８，２０３号；国際特許出願ＷＯ９８５８０５８（Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  Ｓｐｒｏａｔ）、ＷＯ９８５８０５７（Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  Ｓｐｒｏａｔ）、及びＷＯ９７１８３１２（Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  Ｓｐｒｏａｔ））、ヘアピンリボザイム（例えば米国特許第５，６３１，１１５号、５，６４６，０３１号、５，６８３，９０２号、５，７１２，３８４号、５，８５６，１８８号、５，８６６，７０１号、５，８６９，３３９号、及び６，０２２，９６２号）、及びテトラヒメナリボザイム（例えば、米国特許第５，５９５，８７３号及び５，６５２，１０７号）が挙げられる。天然システムに存在しないが、特定反応を触媒するようにデノボ構築されたリボザイムも多数存在する（例えば、米国特許第５，５８０，９６７号、５，６８８，６７０号、５，８０７，７１８号、及び５，９１０，４０８号）。好ましいリボザイムはＲＮＡ又はＤＮＡ基質を開裂し、より好ましくはＲＮＡ基質を開裂する。リボザイムは一般に標的基質を認識してこれと結合した後に開裂することにより、核酸基質を開裂する。この認識は主にカノニカル又は非カノニカル塩基対相互作用に基づくことが多い。標的基質の認識は標的基質配列に基づくので、この性質によりリボザイムは核酸の標的特異的開裂の特に良好な候補となる。各種反応を触媒するためのリボザイムの作製及び使用方法の代表例は米国特許第５，６４６，０４２号、５，６９３，５３５号、５，７３１，２９５号、５，８１１，３００号、５，８３７，８５５号、５，８６９，２５３号、５，８７７，０２１号、５，８７７，０２２号、５，９７２，６９９号、５，９７２，７０４号、５，９８９，９０６号、及び６，０１７，７５６号に記載されている。
【０２２６】
トリプレックス形成機能的核酸分子は２本鎖又は１本鎖核酸と相互作用することができる分子である。トリプレックス分子が標的領域と相互作用すると、ワトソン・クリック及びフーグスティーン塩基対合の両者に依存する複合体を形成する３本鎖ＤＮＡからなるトリプレックスと呼ばれる構造が形成される。トリプレックス分子は高い親和性と特異性で標的領域と結合することができるので好ましい。トリプレックス形成分子は１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２未満のＫｄで標的分子と結合することが好ましい。各種標的分子と結合するためのトリプレックス形成分子の作製及び使用方法の代表例は米国特許第５，１７６，９９６号、５，６４５，９８５号、５，６５０，３１６号、５，６８３，８７４号、５，６９３，７７３号、５，８３４，１８５号、５，８６９，２４６号、５，８７４，５６６号、及び５，９６２，４２６号に記載されている。
【０２２７】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は標的核酸分子と結合して複合体を形成する分子であり、この複合体は標的分子を開裂するＲＮａｓｅ  Ｐにより認識される。ＥＧＳは選択ＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計することができる。ＲＮＡｓｅ  Ｐは転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の細胞内プロセシングを助長する。細菌ＲＮＡｓｅ  Ｐは標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによりほぼ任意ＲＮＡ配列を開裂するように強化することができる（ＷＯ９２／０３５６６，Ｙａｌｅ、及びＦｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｔａｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：４０７−４０９（１９９０））。
【０２２８】
同様に、真核細胞内の所望ターゲットを開裂するためにＲＮＡの真核ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ  Ｐ特異的開裂を利用することもできる。（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８００６−８０１０（１９９２）；ＷＯ９３／２２４３４，Ｙａｌｅ；ＷＯ９５／２４４８９，Ｙａｌｅ；Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ａｌｔａｉａｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５９−１６８（１９９５），及びＣａｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７−２６３１（１９９５））。各種標的分子の開裂を助長するためのＥＧＳ分子の作製及び使用方法の代表例は米国特許第５，１６８，０５３号、５，６２４，８２４号、５，６８３，８７３号、５，７２８，５２１号、５，８６９，２４８号、及び５，８７７，１６２号に記載されている。
【０２２９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現を高度に特異的に有効に抑制することもできる。このサイレンシングは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の付加により最初に確認された（Ｆｉｒｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−１１；Ｎａｐｏｌｉ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−８９；Ｈａｒｍｏｎ，ＧＪ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４−５１）。ｄｓＲＮＡが細胞に入ると、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ様酵素であるダイサーにより開裂され、３’末端に２個のヌクレオチドオーバーハングを含む２１〜２３ヌクレオチド長の短鎖２本鎖干渉性ＲＮＡとなる（ｓｉＲＮＡ）（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８−２００；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−６；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３−６）。ＡＴＰ依存段階において、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に案内するＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と通称されるマルチサブユニット蛋白質複合体に組込まれる（Ｎｙｋａｎｅｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ，１０７：３０９−２１）。所定点でｓｉＲＮＡ２本鎖は巻き戻され、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合したままであり、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組み合わせにより相補的ｍＲＮＡ配列の分解を誘導すると思われる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：５６３−７４）。しかし、ｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ又はその使用の効果は如何なる型のメカニズムにも限定されない。
【０２３０】
短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、その結果、遺伝子発現を低下又は阻害することもできる２本鎖ＲＮＡである。１例において、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡの両者の間の配列一致領域内でｍＲＮＡ等の同種ＲＮＡ分子の特異的分解を誘導する。例えば、ＷＯ０２／４４３２１は３’オーバーハング末端と塩基対合すると、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示しており、これらのｓｉＲＮＡの作製方法に関して本願に援用する。配列特異的遺伝子サイレンシングは酵素ダイサーにより産生されるｓｉＲＮＡを模倣した合成短鎖２本鎖ＲＮＡを使用して哺乳動物細胞で実施することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４  ４９８）（Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４７９：７９−８２）。ｓｉＲＮＡは化学的ないしインビトロ合成したものでもよいし、短鎖２本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が細胞の内側でプロセシングされてｓｉＲＮＡとなったものでもよい。合成ｓｉＲＮＡは一般にアルゴリズムと従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を使用して設計される。供給業者としては、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、及びＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が挙げられる。ｓｉＲＮＡはＡｍｂｉｏｎ社のＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ作製キット等のキットを使用してインビトロ合成することもできる。本願はＰＡＸ２の配列に基づいて上記のように設計された任意ｓｉＲＮＡを開示する。
【０２３１】
ベクターからｓｉＲＮＡを作製するには短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の転写により実施するのが一般的である。ｓｈＲＮＡを含むベクターの作製用キットは入手可能であり、例えば、Ｉｍｇｅｎｅｘ社のＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（登録商標）作製キットや、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢＬＯＣＫ−ＩＴ（登録商標）誘導ＲＮＡｉプラスミド及びレンチウイルスベクターが挙げられる。本願は本願に開示する炎症メディエーターの配列に基づいて上記のように設計された任意ｓｉＲＮＡを開示する。
【０２３２】
６．細胞送達システム
核酸をインビトロ又はインビボで細胞に送達するために使用することができる組成物と方法は多数のものがある。これらの方法と組成物は主にウイルス系送達システムと非ウイルス系送達システムの２種類に分類することができる。例えば、核酸はエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、又は遺伝子材料をカチオン性リポソーム等のセルもしくはキャリヤーに担持して導入する等の多数の直接送達システムにより送達することができる。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、又は物理機械的方法（例えばエレクトロポレーションやＤＮＡの直接拡散）等の適切なトランスフェクション手段は例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；及びＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。このような方法は当分野で周知であり、本願に記載する組成物と方法で使用するように容易に応用可能である。所定の場合には、大きなＤＮＡ分子で特異的に機能するように方法を改変する。更に、キャリヤーのターゲティング特性を使用することにより所定の疾患及び細胞集団を標的とするためのこれらの方法を使用することができる。
【０２３３】
ｉ．核酸系送達システム
導入ベクターは遺伝子を細胞に送達するため（例えばプラスミド）、又は遺伝子を送達するための一般ストラテジーの一部として、例えば組換えレトロウイルス又はアデノウイルスの一部として使用される任意ヌクレオチド構築物とすることができる（Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））。
【０２３４】
本願で使用するプラスミド又はウイルスベクターはＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ等の本願に開示する核酸を分解せずに細胞内に輸送する物質であり、遺伝子を送達する細胞において遺伝子の発現を誘導するプロモーターを含む。所定態様において、ベクターはウイルス又はレトロウイルスから誘導される。ウイルスベクターは例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、エイズウイルス、向神経性ウイルス、シンドビスウイルス及び他のＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶバックボーンをもつこれらのウイルスも含む。これらのウイルスをベクターとして使用するのに適切な性質を共有する任意ウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルスＭＭＬＶと、ベクターとしてＭＭＬＶの望ましい性質を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは他のウイルスベクターよりも大きい遺伝子ペイロード即ちトランスジーンやマーカー遺伝子を輸送することが可能であり、この理由から広く使用されているベクターである。しかし、非増殖性細胞ではさほど有用ではない。アデノウイルスベクターは比較的安定しており、取り扱い易く、高力価であり、エアゾール製剤で送達することができ、非分割細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大型であり、遺伝子挿入部位が数個あり、熱安定性であり、室温で保存することができる。好ましい１態様はウイルス抗原により誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように構築されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターはインターロイキン８又は１０のコーディング領域をもつ。
【０２３５】
ウイルスベクターは遺伝子を細胞に導入するための化学的又は物理的方法よりも高いトランザクション能力（遺伝子導入能力）をもつことができる。一般に、ウイルスベクターは非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写産物、複製とキャプシド形成に必要な逆方向末端反復、及びウイルスゲノムの転写と複製を制御するためのプロモーターを含む。ベクターとして構築する場合、ウイルスは一般に初期遺伝子の１個以上を除去され、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子又は遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノムに挿入する。この種の構築物は約８ｋｂまでの外来遺伝子材料を保持することができる。除去した初期遺伝子の必要な機能は一般に初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように構築された細胞株により補充される。
【０２３６】
ａ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは任意型、サブファミリー、属、又は向性を含むレトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは一般に本願に援用するＶｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）に記載されている。遺伝子治療用のレトロウイルスベクターの使用方法の例は米国特許第４，８６８，１１６号及び４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６及びＷＯ８９／０７１３６；並びにＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載されており、その教示を本願に援用する。
【０２３７】
レトロウイルスは基本的に核酸カーゴを充填したパッケージである。核酸カーゴはパッケージングシグナルを伴い、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的にパッケージングされるように確保する。パッケージシグナルに加え、複製と、複製されたウイルスのパッケージングには多数の分子がシスで必要である。一般にレトロウイルスゲノムは蛋白質皮膜の形成に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子は標的細胞に導入しようとする外来ＤＮＡにより一般に置換される。レトロウイルスベクターは一般にパッケージコート内に取り込むためのパッケージングシグナルと、ｇａｇ転写単位の開始を指示する配列と、逆転写に必要な因子（逆転写のｔＲＮＡプライマーと結合するためのプライマー結合部位を含む）と、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖の転換を誘導する末端反復配列と、ＤＮＡ合成の第２鎖の合成用開始部位として機能する３’ＬＴＲの５’側のプリンリッチ配列と、ＤＮＡ状態のレトロウイルスを宿主ゲノムに挿入できるようにするＬＴＲの末端の近傍の特定配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を除去すると、約８ｋｂの外来配列をウイルスゲノムに挿入することが可能になり、逆転写が可能になり、複製すると、新しいレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。核酸のこの量は各転写産物のサイズに応じて１個から多数の遺伝子を送達するために十分である。他の遺伝子と共にポジティブ又はネガティブ選択マーカーをインサートに加えることが好ましい。
【０２３８】
大半のレトロウイルスベクターにおける複製機構及びパッケージング蛋白質は除去されている（ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）ので、ベクターは一般にこれらをパッケージング細胞株に配置することにより作製される。パッケージング細胞株は複製及びパッケージング機構を含むが、パッケージングシグナルをもたないレトロウイルスをトランスフェクト又は導入した細胞株である。選択ＤＮＡを保持するベクターをこれらの細胞株にトランスフェクトすると、該当遺伝子を含むベクターはヘルパー細胞によりシスで提供される機構により複製され、新しいレトロウイルス粒子にパッケージングされる。機構のゲノムは必要なシグナルをもたないので、パッケージングされない。
【０２３９】
ｂ．アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築については記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ  “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。これらのウイルスは初期感染細胞内で複製することができるが、新規感染性ウイルス粒子を形成することができないので、ベクターとして使用すると、他の細胞型に拡大可能な程度が制限されるという利点がある。組換えアデノウイルスは気道上皮、肝細胞、血管上皮、ＣＮＳ実質及び多数の他の組織部位への直接インビボ送達後に高い効率の遺伝子導入を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；及びＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは特定細胞表面受容体と結合することにより遺伝子導入を達成し、その後、ウイルスは野生型又は複製欠損アデノウイルスと同様に受容体介在性エンドサイトーシスにより核内移行する（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０２４０】
ウイルスベクターはＥ１遺伝子を除去したアデノウイルスに基づくものとすることができ、これらのビリオンはヒト２９３細胞株等の細胞株で作製される。別の好ましい態様では、Ｅ１及びＥ３遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから除去する。
【０２４１】
ｃ．アデノ随伴ウイルスベクター
別の型のウイルスベクターはアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは多くの細胞型に感染することができ、ヒトに非病原性であるため、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは染色体１９に安定に挿入されることが知られむている。この部位特異的組込み性質をもつベクターが好ましい。この型のベクターの特に好ましい１態様はＡｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡの製品であるＰ４．１  Ｃベクターであり、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ−ｔｋ、及び／又はマーカー遺伝子（例えば緑色蛍光蛋白質ＧＦＰをコードする遺伝子）を含むことができる。
【０２４２】
別の型のＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは細胞特異的発現を誘導するプロモーターを異種遺伝子に機能的に連結した少なくとも１個のカセットを挟む１対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。この場合の異種とはＡＡＶ又はＢ１９パルボウイルスに内在しない任意ヌクレオチド配列又は遺伝子を意味する。
【０２４３】
一般に、ＡＡＶ及びＢ１９コーディング領域は欠失しているため、安全な非細胞傷害性ベクターとなる。ＡＡＶ  ＩＴＲ又はその修飾は感染性と部位特異的組込みを付与するが、細胞傷害性は付与せず、プロモーターは細胞特異的発現を誘導する。ＡＡＶベクターに関連する記載について、米国特許第６，２６１，８３４号を本願に援用する。
【０２４４】
従って、開示するベクターは実質的な毒性を伴わずに哺乳動物染色体への組込みが可能なＤＮＡ分子を提供する。
【０２４５】
ウイルス及びレトロウイルスに挿入された遺伝子は通常、所望遺伝子産物の発現の制御を助長するためにプロモーター、及び／又はエンハンサーを含む。プロモーターは一般に転写開始部位に対して比較的固定された位置にあるときに機能する１又は複数のＤＮＡ配列である。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントと応答エレメントも加えてもよい。
【０２４６】
ｄ．高ペイロードウイルスベクター
大型ヒトヘルペスウイルスによる分子遺伝実験の結果、大きな異種ＤＮＡフラグメントをヘルペスウイルス感染許容性細胞にクローニングし、増殖させ、定着させることが可能な手段が得られた（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１，１９９４；Ｃｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの大型ＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）とエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ））は＞１５０ｋｂのヒト異種ＤＮＡのフラグメントを特定細胞に送達する能力をもつ。ＥＢＶ組換え体は感染Ｂ細胞内の大きなＤＮＡ断片をエピソームＤＮＡとして維持することができる。３３０ｋｂまでのヒトゲノムインサートを保持する個体クローンは遺伝的に安定であると思われた。これらのエピソームの維持にはＥＢＶ感染中に構成的に発現される特定のＥＢＶ核蛋白質ＥＢＮＡ１が必要である。更に、これらのベクターをトランスフェクションに使用することができ、大量の蛋白質を一過的にインビトロ作製することができる。＞２２０ｋｂのＤＮＡ断片をパッケージングし、ＤＮＡをエピソームとして安定に維持することができる細胞に感染させるためにヘルペスウイルスアンプリコンシステムも使用されている。
【０２４７】
他の有用なシステムとしては、例えば、複製及び宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
【０２４８】
ｉｉ．非核酸系システム
開示する組成物は種々の方法で標的細胞に送達することができる。例えば、組成物はエレクトロポレーション、又はリポフェクション、又はリン酸カルシウム沈殿法により送達することができる。選択する送達メカニズムは標的細胞型と、送達が例えばインビボで行われるか、インビトロで行われているかによっても異なる。
【０２４９】
従って、組成物はカチオン性リポソーム（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）又はアニオン性リポソーム等の脂質を含むことができる。リポソームは更に所望により特定細胞へのターゲティングを助長するための蛋白質を含むことができる。化合物とカチオン性リポソームを含有する組成物の投与は標的臓器に通じる血管に投与するか、又は気道の標的細胞に向けて気道に吸入することができる。リポソームについては、例えばＢｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号参照。更に、マクロファージ等の特定細胞型に標的送達可能なマイクロカプセルの成分として化合物を投与することもでき、あるいは、特定速度又は用量に合わせてマイクロカプセルからの化合物を拡散又は化合物を送達するように設計する。
【０２５０】
対象の細胞への外来ＤＮＡの投与と取込み（即ち遺伝子導入又はトランスフェクション）を含む上記方法では、組成物の細胞送達は種々のメカニズムにより実施することができる。１例として、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）等の市販リポソーム製剤や、当分野の標準手法に従って開発された他のリポソームを使用してリポソームにより送達することができる。更に、開示する核酸又はベクターはＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な技術であるエレクトロポレーションや、ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮマシン（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によりインビボ送達することもできる。
【０２５１】
材料は溶液、懸濁液とすることができる（例えば、微粒子、リポソーム、又はセルに封入する）。これらは抗体、受容体、又は受容体リガンドを介して特定細胞型に標的送達することができる。特定蛋白質を腫瘍組織に標的送達するためのこの技術の使用の例は以下の文献に記載されている（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。これらの技術は各種の他の特定細胞型に使用することができる。「ステルス」及び他の抗体修飾リポソーム（結腸癌への脂質介在性薬剤ターゲティングを含む）等のビヒクル、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体介在性ターゲティング、リンパ球特異的腫瘍ターゲティング、及びマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療レトロウイルスインビボターゲティング。特定蛋白質を腫瘍組織に標的送達するためのこの技術の使用の例は以下の文献に記載されている（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、エンドサイトーシスの経路には受容体が構成的又はリガンド誘導的に関与している。これらの受容体はクラスリンで覆われた窪みで集合し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、酸性化エンドソームを通過し、受容体の選別後、細胞表面に戻り、細胞内に貯蔵されるか、又はリソソームで分解される。核内移行経路は栄養素取込み、活性化蛋白質の除去、高分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル調節等の各種機能を担う。多くの受容体は細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド原子価、及びリガンド濃度に応じて２種類以上の細胞内経路を辿る。受容体介在性エンドサイトーシスの分子及び細胞メカニズムについては文献に記載されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０２５２】
宿主細胞ゲノムに組込むために細胞に送達される核酸は一般に組込み配列を含む。これらの配列は特にウイルス系システムを使用する場合にはウイルス関連配列であることが多い。これらのウイルス組込みシステムは送達システムに含まれる核酸が宿主ゲノムに組込まれるように、リポソーム等の非核酸系送達システムを使用して送達しようとする核酸に加えることができる。
【０２５３】
宿主ゲノムに組込むための他の一般技術としては、例えば、宿主ゲノムとの相同組換えを助長するように設計されたシステムが挙げられる。これらのシステムは一般に発現させようとする核酸を挟む配列に依存し、このような配列は、ベクター核酸と標的核酸との組換えが行われ、送達された核酸を宿主ゲノムに組込ませるように宿主ゲノム内の標的核酸に対して十分な相同度をもつ。これらのシステムと相同組換えを促進するために必要な方法は当業者に公知である。
【０２５４】
ｉｉｉ．インビボ／エクスビボ
上記のように、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーに加えて投与することができ、当分野で周知の各種メカニズム（例えば裸のＤＮＡの取込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉内注入、エンドサイトーシス等）により対象＝ｓ細胞にインビボ及び／又はエクスビボ送達することができる。
【０２５５】
エクスビボ法を利用する場合には、当分野で周知の標準プロトコールに従って細胞又は組織を体外に取り出して保存する。組成物は例えば、リン酸カルシウムによる遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、又はプロテオリポソーム等の任意遺伝子導入メカニズムにより細胞に導入することができる。導入した細胞をその後、細胞又は組織型に適した標準方法に従って対象に（例えば医薬的に許容可能なキャリヤーに加えて）輸液注入又は同位置に再移植することができる。各種細胞を対象に移植又は輸液注入するための標準方法は公知である。
【０２５６】
７．キット
上記材料及び他の材料は、開示する方法を実施又はその実施を補助するために有用なキットとして適切な任意組み合わせでまとめてパッケージングすることができる。所与キットのキット成分が開示の方法で併用できるように設計・調整されているならば有用である。例えば前立腺癌又はＰＩＮの検出、治療、又は予防用キットとして、ＰＡＸ２及びＤＥＦＢ１と特異的に結合するペプチド又は抗体を含むキットを開示する。
【０２５７】
８．システムの発現
細胞に送達される核酸は一般に発現制御システムを含む。例えば、ウイルス及びレトロウイルスシステムに挿入された遺伝子は通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を助長するためにプロモーター、及び／又はエンハンサーを含む。プロモーターは一般に、転写開始部位に対して相対的に固定された位置にあるときに機能する１個以上のＤＮＡ配列である。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントと応答エレメントも加えてもよい。
【０２５８】
ｉ．ウイルスプロモーター及びエンハンサー
哺乳動物宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは各種起源から得ることができ、例えば、ポリオーマ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサイトメガロウイルス等のウイルスのゲノム、又は異種哺乳動物プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターはＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの極初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。当然のことなが、本願では宿主細胞又は近縁種に由来するプロモーターも有用である。
【０２５９】
エンハンサーとは一般に、転写開始部位から不定距離で機能し、転写単位の５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））でも３’ 側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））でもよいＤＮＡ配列を意味する。更に、エンハンサーはイントロンの内側（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））でもよいし、コーディング配列自体の内側（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））でもよい。エンハンサーは通常では１０〜３００ｂｐ長であり、シスで機能する。エンハンサーは近接するプロモーターからの転写を増加するように機能する。エンハンサーは多くの場合には転写の制御を媒介する応答因子を更に含む。プロモーターは更に転写の制御を媒介する応答因子を含む場合がある。エンハンサーは多くの場合には遺伝子の発現調節を決定する。多数のエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）から現在公知であるが、一般の発現には真核細胞に由来するウイルスエンハンサーを使用することが多い。好ましい例は複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。
【０２６０】
プロモーター及び／又はエンハンサーは光又はその機能を誘発する特定化学イベントにより特異的に活性化することができる。システムはテトラサイクリンやデキサメタゾン等の試薬により調節することができる。γ線等の放射線の照射や、アルキル化化学治療薬によりウイルスベクター遺伝子発現を強化する方法もある。
【０２６１】
所定態様において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は転写させようとする転写単位の領域の発現を最大限にするための構成的プロモーター及び／又はエンハンサーとして作用することができる領域。所定の構築物において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は特定型の細胞で特定時点にしか発現されないとしても、全真核細胞型で活性である。この型の好ましいプロモーターの１例はＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターはＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、及びレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【０２６２】
黒肉腫細胞等の特定細胞型で選択的に発現される発現ベクターを構築するために全特定調節エレメントをクローニング及び使用できることが分かっている。グリア由来細胞で遺伝子を選択的に発現させるためにグリア線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）プロモーターが使用されている。
【０２６３】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）で使用される発現ベクターは更にｍＲＮＡ発現に影響を与える可能性のある転写終了に必要な配列を含む場合がある。これらの領域は組織因子蛋白質をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分にポリアデニル化セグメントとして転写される。３’未翻訳領域は更に転写終結部位を含む。転写単位は更にポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は転写された単位がｍＲＮＡと同様にプロセシング・輸送される確率が増すという点である。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定と使用は定着している。トランスジーン構築物では同種ポリアデニル化シグナルを使用することが好ましい。所定の転写単位において、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基から構成される。転写された単位は更に他の標準配列を単独又は上記配列と共に含み、構築物からの発現又はその安定性を改善することが好ましい。
【０２６４】
ｉｉ．マーカー
ウイルスベクターはマーカー物質をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー物質は、遺伝子が細胞に送達されているか否か、送達後に発現されているか否かを判断するために使用される。好ましいマーカー遺伝子はβ−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子と緑色蛍光蛋白質である。
【０２６５】
所定の態様において、マーカーは選択マーカーとすることができる。哺乳動物細胞用の適切な選択マーカーの例はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン、及びピューロマイシンである。このような選択マーカーを哺乳動物宿主細胞に導入するのに成功すると、形質転換した哺乳動物宿主細胞は選択圧下でも生存することができる。２種類の異なる分類の選択的レジームが広く使用されている。第１の分類は細胞の代謝と、栄養補充培地に依存せずに増殖することができない突然変異体細胞株の使用に基づく。２例を挙げると、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞とマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞はチミジンやヒポキサンチン等の栄養素を添加せずに増殖することができない。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な所定の遺伝子をもたないため、欠失しているヌクレオチドを栄養補充培地に加えない限り、生存することができない。培地の栄養補充の代用として、各遺伝子をもたない細胞に無傷ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を導入し、その増殖要件を改変する方法がある。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換していない個々の細胞は非栄養補充培地で生存することができない。
【０２６６】
第２の分類は任意細胞型で使用される選択スキームを意味するドミナント選択であり、突然変異体細胞株を使用する必要がない。これらのスキームは一般に宿主細胞の増殖を阻止するために薬剤を使用する。新規遺伝子を導入された細胞は薬剤耐性を付与する蛋白質を発現し、選択に耐える。このようなドミナント選択の例は薬剤としてネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））又はハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。これらの３種類の例は夫々適切な薬剤Ｇ４１８又はネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性を付与するために真核制御下に細菌遺伝子を利用する。その他にネオマイシンアナログＧ４１８とピューロマイシンも挙げられる。
【０２６７】
９．医薬キャリヤー
開示する組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーと共に治療薬として使用することができる。「医薬的に許容可能」とは生物学的又は他の点で有害でない材料を意味し、即ち材料は望ましくない生物学的作用を生じずに又はこれを含有する医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な相互作用を生じずに、核酸又はベクターと共に対象に投与することができる。当業者に周知の通り、キャリヤーは当然のことながら、活性成分の分解を最小限にすると共に、対象における副作用を最小限にするように選択される。
【０２６８】
適切なキャリヤーとその製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。一般に、適量の医薬的に許容可能な塩を製剤で使用し、製剤を等張にする。医薬的に許容可能なキャリヤーの例としては限定されないが、食塩水、リンゲル液及びブドウ糖溶液が挙げられる。溶液のｐＨは約５〜約８が好ましく、約７〜約７．５がより好ましい。他のキャリヤーとしては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス等の徐放製剤が挙げられ、前記マトリックスは成形品、例えばフィルム、リポソーム又は微粒子の形態である。当業者に自明の通り、例えば、投与経路や投与する組成物の濃度に応じて所定のキャリヤーがより好ましい場合がある。
【０２６９】
医薬キャリヤーは当業者に公知である。これらは最も一般には薬剤をヒトに投与するための標準キャリヤーであり、滅菌水、食塩水、生理的ｐＨの緩衝溶液等の溶液が挙げられる。組成物は筋肉内又は皮下投与することができる。他の化合物も当業者により使用される標準手順に従って投与される。
【０２７０】
医薬組成物は選択分子に加えてキャリヤー、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤等を添加することができる。医薬組成物は更に抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等の１種類以上の活性成分を添加することができる。
【０２７１】
非経口投与用製剤としては滅菌水性溶液又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、及び注射用有機エステル（例えばオレイン酸エチル）が挙げられる。水性キャリヤーとしては水、アルコール／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられ、食塩水や緩衝溶媒が挙げられる。非経口ビヒクルとしては塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては液体又は栄養補給剤、電解質補給剤（例えばリンゲルブドウ糖をベースとするもの）等が挙げられる。例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性ガス等の防腐剤や他の添加剤も加えることができる。
【０２７２】
局所投与用製剤としては軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、座剤、スプレー、液剤及び散剤が挙げられる。従来の医薬キャリヤー、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤等が必要又は望ましい場合もある。
【０２７３】
経口投与用製剤としては散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ剤、又は錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合もある。
【０２７４】
組成物の所定のものは塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、琥珀酸、マレイン酸及びフマル酸等の有機酸との反応、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基や、モノ、ジ、トリアルキル及びアリールアミン並びに置換エタノールアミン等の有機塩基との反応により形成される医薬的に許容可能な酸又は塩基付加塩として投与することができる。
【０２７５】
材料は溶液、懸濁液とすることができる（例えば、微粒子、リポソーム、又はセルに封入する）。これらは抗体、受容体、又は受容体リガンドを介して特定細胞型に標的送達することができる。特定蛋白質を腫瘍組織に標的送達するためのこの技術の使用の例は以下の文献に記載されている（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」及び他の抗体修飾リポソーム（結腸癌への脂質介在性薬剤ターゲティングを含む）等のビヒクル、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体介在性ターゲティング、リンパ球特異的腫瘍ターゲティング、及びマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療レトロウイルスインビボターゲティング。特定蛋白質を腫瘍組織に標的送達するためのこの技術の使用の例は以下の文献に記載されている（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、エンドサイトーシスの経路には受容体が構成的又はリガンド誘導的に関与している。これらの受容体はクラスリンで覆われた窪みで集合し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、酸性化エンドソームを通過し、受容体の選別後、細胞表面に戻り、細胞内に貯蔵されるか、又はリソソームで分解される。核内移行経路は栄養素取込み、活性化蛋白質の除去、高分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル調節等の各種機能を担う。多くの受容体は細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド原子価、及びリガンド濃度に応じて２種類以上の細胞内経路を辿る。受容体介在性エンドサイトーシスの分子及び細胞メカニズムについては文献に記載されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０２７６】
１０．コンビナトリアルケミストリー
開示する組成物は開示する組成物と所望の方法で相互作用する分子又は高分子を同定するための任意コンビナトリアル技術のターゲットとして使用することができる。コンビナトリアル技術又はスクリーニング技術により道程される組成物も開示し、ＰＡＸ２配列又はその部分（例えばＰＡＸ２  ＤＮＡ結合ドメイン）として開示する組成物をコンビナトリアル又はスクリーニングプロトコールでターゲットとして使用する．
【０２７７】
当然のことながら、開示する組成物をコンビナトリアル技術又はスクリーニング法で使用する場合には、標的分子の機能の阻害又は刺激等の特定の所望性質をもつ高分子等の分子が同定されよう。開示する組成物を使用する場合に同定・単離されるＤＥＦＢ１やＰＡＸ２等の分子も開示する。従って、開示する組成物からコンビナトリアル又はスクリーニングアプローチを使用して作製される産物も本願に開示されているものとみなす。
【０２７８】
当然のことながら、例えば、ＤＥＦＢ１プロモーターとＰＡＸ２の相互作用を阻害する分子を同定するための本願に開示する方法は高スループット手段を使用して実施することができる。例えば、相互作用を迅速に同定するために蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）を使用して推定阻害剤を同定することができる。この技術の基本理論は２個の分子が空間内で近接しているとき、即ちバックグラウンドを越えるレベルで相互作用しているときにはシグナルが発生されるか又はシグナルを消滅させることができる。その後、例えば、推定阻害剤の添加等の各種実験を実施することができる。阻害剤が２個のシグナル発生分子間の相互作用と競合する場合には、シグナルは空間内で相殺され、その結果、使用するシグナルの種類に応じてシグナルが増減する。このシグナルの増減を推定阻害剤の有無に相関させることができる。任意シグナル発生手段を使用することができる。例えば、開示する分子の任意２個の間の相互作用の阻害剤の同定方法として、推定阻害剤の存在下で第１の分子と第２の分子を相互に接触させる段階（なお、第１の分子又は第２の分子は蛍光ドナーを含み、第１の分子又は第２の分子、一般にドナーを含まない分子は蛍光アクセプターを含む）と；推定阻害剤の存在下と推定阻害剤の不在下で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定し、推定阻害剤の存在下のＦＲＥＴがその不在下のＦＲＥＴ測定値に比較して低下した場合には、推定阻害剤は２個の分子間の結合を阻害すると判定する段階を含む方法を開示する。この型の方法は細胞システムでも実施することができる。
【０２７９】
コンビナトリアルケミストリーとしては限定されないが、一般に反復プロセスで小分子又は別の高分子と結合することが可能な小分子又は高分子を単離するための全方法が挙げられる。高分子の例は蛋白質、オリゴヌクレオチド、及び糖類である。例えば、「インビトロジェネティクス」と呼ばれている方法でランダムオリゴヌクレオチドの複雑な混合物から触媒性又はリガンド結合性の所定機能をもつオリゴヌクレオチド分子を単離することができる（Ｓｚｏｓｔａｋ，ＴＩＢＳ  １９：８９，１９９２）。ランダム配列と規定配列をもつ分子の大きなプールを合成し、例えば、１００ヌクレオチドＲＮＡ１００μｇ中に約１０１５個の個々の配列を含むこの複雑な混合物に所定の選択及び集積プロセスを実施する。カラム上でリガンドに結合した分子のアフィニティークロマトグラフィーとＰＣＲ増幅の反復サイクルにより、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）はＲＮＡ分子１０１０個のうちの１個が小分子色素と結合するように折り畳まれると推定した。このようなリガンド結合挙動をもつＤＮＡ分子も単離されている（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９２；Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。有機小分子、蛋白質、抗体及び当業者にに公知の他の高分子用の同様の目的の技術も存在する。小型有機物ライブラリー、オリゴヌクレオチド、又は抗体のいずれに基づくかに関係なく、所望活性に関する分子のスクリーニングセットを広い意味でコンビナトリアルケミストリーと呼ぶ。コンビナトリアル技術は分子間の結合相互作用を定義するため、及び特定結合活性をもつ分子を単離するために特に適しており、高分子が核酸である場合にはアプタマーと呼ぶことが多い。
【０２８０】
デノボ活性又は改変活性をもつ蛋白質の単離方法は多数のものがある。例えば、特定ターゲットと相互作用する多数のペプチドを単離するためにファージディスプレイライブラリーが使用されている。（例えば、少なくともファージディスプレイに関連する記載とコンビナトリアルケミストリーに関連する方法について本願に援用する米国特許第６，０３１，０７１号；５，８２４，５２０号；５，５９６，０７９号；及び５，５６５，３３２号参照）。
【０２８１】
所定機能をもつ蛋白質の好ましい単離方法の１例はＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）１２９９７−３０２（１９９７））により記載されている。このコンビナトリアルケミストリー法は蛋白質の機能性と核酸の遺伝性を組み合わせたものである。ピューロマイシン分子をＲＮＡ分子の３’末端と共有結合したＲＮＡ分子を作製する。この修飾ＲＮＡ分子のインビトロ翻訳により、翻訳すべきＲＮＡによりコードされる正しい蛋白質が生じる。更に、伸長することができないペプチドアクセプターであるピューロマイシンの結合により、成長中のペプチド鎖はＲＮＡに結合したピューロマイシンと結合する。従って、蛋白質分子はこの分子をコードする遺伝子材料に結合する。そこで、通常のインビトロ選択手順を実施し、機能的ペプチドを単離することができる。ペプチド機能の選択手順が完了したら、慣用核酸操作手順を実施し、選択された機能的ペプチドをコードする核酸を増幅する。遺伝子材料の増幅後、新３’末端にピューロマイシンを付けてしいＲＮＡを転写し、新しいペプチドを翻訳し、別の機能的な選択ラウンドを実施する。従って、蛋白質選択は核酸選択法と全く同様に反復的に実施することができる。翻訳されるペプチドはピューロマイシンに結合したＲＮＡの配列により制御される。この配列は最適翻訳（即ち停止コドンが不在等）に合わせて構築されたランダム配列に由来する任意配列でもよいし、既知ペプチドの機能改善又は改変を求めるために既知ＲＮＡ分子の縮重配列でもよい。核酸増幅とインビトロ翻訳の条件は当業者に周知であり、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）１２９９７−３０２（１９９７））に記載されているように実施することが好ましい。
【０２８２】
ペプチドを単離するように設計されたコンビナトリアル法の別の好ましい方法はＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている（Ｃｏｈｅｎ  Ｂ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（２４）：１４２７２−７（１９９８））。この方法は２ハイブリッド技術を利用し、改変するものである。酵母２ハイブリッドシステムは蛋白質：蛋白質相互作用の検出と解析に有用である。２ハイブリッドシステムは最初に酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで記載され、該当蛋白質に特異的な新規調節分子を同定するための強力な分子遺伝技術である（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−６（１９８９））。Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は選択分子と結合する合成又は人工ペプチド配列間の新規相互作用を同定できるようにこの技術を改変している。この型の技術の利点は細胞内環境で選択を実施する点である。この方法は酸性活性化ドメインに結合したペプチド分子のライブラリーを利用する。
【０２８３】
当業者に周知の手法を各種コンビナトリアルライブラリーと併用し、所望ターゲットと結合又は相互作用する小分子又は高分子を単離し、特性決定することができる。これらの化合物の相対結合親和性を比較し、当業者にに周知の競合結合試験を使用して最適化合物を同定することができる。
【０２８４】
所望ターゲットと結合する分子を単離するためにコンビナトリアルライブラリーを作製し、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための技術は当業者に周知である。代表的な技術及び方法は限定されないが、米国特許第５，０８４，８２４号、５，２８８，５１４号、５，４４９，７５４号、５，５０６，３３７号、５，５３９，０８３号、５，５４５，５６８号、５，５５６，７６２号、５，５６５，３２４号、５，５６５，３３２号、５，５７３，９０５号、５，６１８，８２５号、５，６１９，６８０号、５，６２７，２１０号、５，６４６，２８５号、５，６６３，０４６号、５，６７０，３２６号、５，６７７，１９５号、５，６８３，８９９号、５，６８８，６９６号、５，６８８，９９７号、５，６９８，６８５号、５，７１２，１４６号、５，７２１，０９９号、５，７２３，５９８号、５，７４１，７１３号、５，７９２，４３１号、５，８０７，６８３号、５，８０７，７５４号、５，８２１，１３０号、５，８３１，０１４号、５，８３４，１９５号、５，８３４，３１８号、５，８３４，５８８号、５，８４０，５００号、５，８４７，１５０号、５，８５６，１０７号、５，８５６，４９６号、５，８５９，１９０号、５，８６４，０１０号、５，８７４，４４３号、５，８７７，２１４号、５，８８０，９７２号、５，８８６，１２６号、５，８８６，１２７号、５，８９１，７３７号、５，９１６，８９９号、５，９１９，９５５号、５，９２５，５２７号、５，９３９，２６８号、５，９４２，３８７号、５，９４５，０７０号、５，９４８，６９６号、５，９５８，７０２号、５，９５８，７９２号、５，９６２，３３７号、５，９６５，７１９号、５，９７２，７１９号、５，９７６，８９４号、５，９８０，７０４号、５，９８５，３５６号、５，９９９，０８６号、６，００１，５７９号、６，００４，６１７号、６，００８，３２１号、６，０１７，７６８号、６，０２５，３７１号、６，０３０，９１７号、６，０４０，１９３号、６，０４５，６７１号、６，０４５，７５５号、６，０６０，５９６号及び６，０６１，６３６号に記載されている。
【０２８５】
コンビナトリアルライブラリーは多数の異なる合成技術を使用して広範な分子から作製することができる。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン（米国特許第６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号及び５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシアミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）、糖鎖（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環状化合物（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環状テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントイン及びチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドール及びイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）、置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、タグ含有化合物（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノサブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号及び５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）、並びにベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含むライブラリーが挙げられる。
【０２８６】
ＤＥＦＢ１発現のＰＡＸ２抑制の阻害に用いる本願に開示するｓｉＲＮＡ分子に類似する分子のスクリーニングは所望化合物の単離方法である。
【０２８７】
単離される分子は競合的阻害剤でも非競合的阻害剤でもよい。
【０２８８】
別の態様において、阻害剤は非競合的阻害剤である。ある種の非競合的阻害剤はアロステリック転位を生じる。
【０２８９】
本願で使用するコンビナトリアル法及びライブラリーは慣用スクリーニング法及びライブラリーに加え、反復プロセスで使用される方法とライブラリーも含む。
【０２９０】
１１．コンピュータ支援薬剤設計
開示する組成物は開示する組成物の構造を同定するため、又は開示する組成物と望ましい方法で相互作用する潜在的もしくは実在の分子（例えば小分子）を同定するための任意分子モデル化技術のターゲットとして使用することができる。本願に開示する核酸、ペプチド及び関連分子は任意分子モデル化プログラム又はアプローチのターゲットとして使用することができる。
【０２９１】
当然のことながら、開示する組成物をモデル化技術で使用する場合には、標的分子の機能の阻害又は刺激等の特定の望ましい性質をもつ高分子等の分子が同定される。開示する組成物を使用する場合に同定及び単離される分子（例えば配列番号１）も開示する。従って、開示する組成物に関する分子モデル化アプローチを使用して作製される産物（例えば配列番号１）も本願に開示されているものとみなす。
【０２９２】
従って、選択分子と結合する分子を単離する１つの方法は理論的設計である。これは構造情報とコンピュータモデル化により実施される。コンピュータモデル化技術は選択された分子の三次元原子構造の視覚化と、分子と相互作用する新規化合物の理論的設計を可能にする。三次元構築物は一般に選択された分子のＸ線結晶構造解析又はＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィクスシステムは新規化合物が標的分子とどのように結合するかを予測できるようにし、化合物と標的分子の構造の実験操作により結合特異性を完全にすることができる。分子と化合物の一方又は両方で小さな変化が起きるときの相互作用がどのようなものであるかを予測するには、分子メカニズムソフトウェアと計算集約型コンピュータが必要であり、通常は分子設計プログラムとユーザの間のユーザにやさしいメニュー式のインタフェースと併用する。
【０２９３】
分子モデル化システムの例はＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム，Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡである。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化及び分子ダイナミクス機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは構築、グラフィックモデル化及び分子構造解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは相互作用的構築、修飾、可視化、及び分子相互の挙動解析を可能にする。
【０２９４】
特定蛋白質に対して相互作用性の薬剤のコンピュータモデル化については多数の論文に記載されており、例えば、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７，１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７（Ｊｕｎｅ  １６，１９８８）；ＭｃＫｉｎａｌｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｍａｎｎ，１９８９  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９，１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｐ．１８９−１９３（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ，１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６，１２５−１４０及び１４１−１６２に記載されており、更に核酸成分のモデル酵素については、Ａｓｋｅｗ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，１０８２−１０９０に記載されている。化学成分をスクリーニングし、グラフィック表示する他のコンピュータプログラムもＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ．、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｌｉｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ、及びＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ等の企業から入手可能である。これらは主に特定蛋白質に特異的な薬剤に適用するように設計されているが、ＤＮＡ又はＲＮＡの特定領域が同定されれば、この領域と特異的に相互作用する分子の設計にも応用することができる。
【０２９５】
以上、結合を変化させることができる化合物の設計と作製について記載したが、天然物質又は合成化学成分を含む公知化合物と、蛋白質を含む生物学的に活性な材料のライブラリーも、基質結合又は酵素活性を変化させる化合物についてスクリーニングすることができる。
【０２９６】
１２．コンピュータ読み取り可能な媒体
当然のことながら、開示する核酸及び蛋白質はアミノ酸のヌクレオチドから構成される配列として表すことができる。これらの配列を表す方法には種々のものがあり、例えばヌクレオチドグアノシンはＧ又はｇにより表すことができる。同様に、アミノ酸バリンはＶａＩ又はＶにより表すことができる。存在する各種方法の任意のもので任意核酸又は蛋白質を表示及び表現する方法は当業者に自明であり、各々本願に開示されているものとみなす。本願では、例えば市販フロッピーディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、及びビデオディスク等のコンピュータ読み取り可能な媒体、又は他のコンピュータ読み取り可能な媒体にこれらの配列を表示することが特に考えられる。開示する配列のバイナリコード表示も開示する。コンピュータ読み取り可能な媒体については当業者に自明である。従って、核酸又は蛋白質配列を記録、格納、又は保存したコンピュータ読み取り可能な媒体が挙げられる。
【０２９７】
本願に記載する配列と配列に関する情報を含むコンピュータ読み取り可能な媒体も開示する。記載する配列と配列に関する情報を含むコンピュータ読み取り可能な媒体も開示する。
【０２９８】
Ｃ．方法
１．投与
本願に開示する組成物は局所治療と全身治療のどちらが望ましいかと、治療する領域に応じて多数の方法で投与することができる。例えば、組成物は経口、非経口（例えば静脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内注射）、吸入、体外、局所（経皮、眼球、膣、直腸、鼻孔内）等の経路で投与することができる。
【０２９９】
本願で使用する「局所鼻孔内投与」とは鼻孔の一方又は両方を介して鼻と鼻の通路に組成物を送達することを意味し、噴霧メカニズム又は滴剤メカニズムや、核酸又はベクターのエアゾール化による送達が挙げられる。吸入剤による組成物の投与は噴霧又は滴剤メカニズムによる送達により鼻又は口から行うことができる。挿管により呼吸系（例えば肺）の任意領域に直接送達することもできる。
【０３００】
組成物の非経口投与を使用する場合には、一般に注射が使用される。注射剤は液体溶液もしくは懸濁液、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するのに適した固体形態、又はエマルションとして従来の形態で調製することができる。非経口投与のごく最近考案されたアプローチでは、一定用量を維持するような遅延放出又は持続放出システムを使用している。例えば本願に援用する米国特許第３，６１０，７９５号参照。
【０３０１】
組成物の厳密な必要量は対象の種、年齢、体重及び一般健康状態、治療中のアレルギー疾患の重篤度、使用する特定核酸又はベクター、その投与方式等に応じて対象毎に異なる。従って、全組成物の厳密な量を特定することは不可能である。しかし、当業者は本願の教示に鑑みて単なる日常的な実験を使用して適量を決定することができる。従って、組成物の有効用量と投与スケジュールは経験により決定することができ、このような決定を行うことは当業者が容易に可能である。組成物の投与用量範囲は疾患症状に所望効果を生じるために十分な量とする。用量は望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等の副作用を生じるほど多量にすべきではない。一般に、用量は患者の年齢、状態、性別、疾患の程度、投与経路、又は他の薬剤がレジメンに含まれるか否かにより異なり、当業者が決定することができる。禁忌がある場合には、個々の医師が用量を調節することができる。用量は変動させることができ、１日又は数日間にわたって１日１回以上投与することができる。所定分類の薬剤に適した用量に関する手引きは文献に記載されている。
【０３０２】
例えば、開示する組成物を単独使用する場合の典型的な１日用量は上記因子に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重／日まで又はそれ以上とすることができる。
【０３０３】
開示する組成物を前立腺癌又はＰＩＮの治療、阻害、又は予防のために投与後、当業者に周知の各種方法で治療の効力を判定することができる。例えば、当業者は、本願に開示する組成物がＰＳＡ抗原を低減させるか又は前立腺腫瘍のサイズをそれ以上増加させないことを確認することにより、組成物が対象における前立腺癌の治療又は阻害に有効であることを理解するであろう。ＰＳＡ抗原は当分野で公知の方法により測定することができ、例えば、抗体アッセイを使用して対象もしくは患者からのサンプル（限定されないが、例えば血液）中のＰＳＡ蛋白質の存在を検出する方法や、患者の循環ＰＳＡ濃度のレベルを測定する方法が挙げられる。
【０３０４】
本願に開示する相互作用を阻害する組成物は前立腺癌の危険のある患者もしくは対象又はＰＩＮもしくは前立腺癌をもつと新規に診断された患者もしくは対象に予防薬として投与することができる。
【０３０５】
ＰＳＡ又はＤＥＦＢ１と相互作用し、特定医薬機能をもたない相互作用を阻害するが、例えば細胞染色体内の変化を追跡するため又は診断ツールの送達のために使用することができる他の分子も薬剤について記載したと同様の方法で送達することができる。
【０３０６】
２．製造
本願に開示する組成物と、開示する方法を実施するために必要な組成物は、特に指定しない限り、特定試薬又は化合物に関して当業者に公知の任意方法を使用して製造することができる。
【０３０７】
ｉ．核酸合成
例えば、プライマーとして使用するオリゴヌクレオチド等の核酸は標準化学合成法を使用して作製することができ、あるいは酵素法又は他の任意公知方法を使用して作製することができる。このような方法としては、標準酵素消化後にヌクレオチドフラグメントを単離する方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５，６参照）から、例えばＭｉｌｌｉｇｅｎ又はＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成器（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動合成器又はＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用するシアノエチルホスホロアミダイト法による純粋な合成法までが挙げられる。オリゴヌクレオチドの作製に有用な合成法はＩｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４），（ホスホトリエステル及びホスファイト−トリエステル法）、及びＮａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０），（ホスホトリエステル法）にも記載されている。蛋白質核酸分子はＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）に記載されている方法等の公知方法を使用して作製することができる。
【０３０８】
ｉｉ．ペプチド合成
配列番号４９等の開示する蛋白質の作製方法の１つは２個以上のペプチド又はポリペプチドを蛋白質化学技術により相互に連結する方法である。例えば、ペプチド又はポリペプチドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して現在入手可能な実験室装置により化学的に合成することができる。当業者に自明の通り、例えば開示する蛋白質に対応するペプチド又はポリペプチドは標準化学反応により合成することができる。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、その合成樹脂から開裂しないでおき、ペプチド又は蛋白質の他のフラグメントを合成した後に樹脂から開裂し、他のフラグメントで機能的にブロックされた末端基を暴露させる。ペプチド縮合反応により、これらの２個のフラグメントを夫々そのカルボキシル末端とアミノ末端でペプチド結合により共有結合させ、抗体又はそのフラグメントを形成することができる。（少なくともペプチド合成に関連する記載について本願に援用する）Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ。あるいは、ペプチド又はポリペプチドを本願に記載するように個々にインビボ合成する。単離後、これらの個々のペプチド又はポリペプチドを同様のペプチド縮合反応により連結し、ペプチド又はそのフラグメントを形成することができる。
【０３０９】
例えば、クローン化又は合成ペプチドセグメントの酵素ライゲーションにより、比較的短いペプチドフラグメントを相互に結合し、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチド又は全長蛋白質ドメインを形成することができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然化学ライゲーションを利用し、短いペプチドフラグメントから大きなペプチド又はポリペプチドを合成により構築することができる。この方法は２段階化学反応から構成される（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。第１段階は、未保護合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の未保護ペプチドセグメントの化学選択的反応により、初期共有結合生成物としてチオエステル結合中間体を得る。反応条件を変えなければ、この中間体は迅速な自然分子内反応を生じ、ライゲーション部位に天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｍｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０３１０】
あるいは、未保護ペプチドセグメントを化学的に連結する方法もあり、この場合には、化学ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成される結合は非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この手法は蛋白質ドメインのアナログと、完全な生物活性をもつ大量の比較的純粋な蛋白質を合成するために使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【０３１１】
Ｄ．定義
特に定義しない限り、本願で使用する全科学技術用語は開示する方法及び組成物が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。本願の方法及び組成物の実施又は試験には本願に記載するものと同様又は等価の任意方法及び材料を使用することができるが、特に有用な方法、装置、及び材料は記載するものである。本願に引用する刊行物及び引用の根拠となる記載は特に本願に援用する。本願は、本発明がこのような開示に対して先発明権がないと認めるものではない。文献が先行技術を構成すると認めるものではない。文献に関する記載はその著者が主張することを述べているものであり、出願人は引用文献の正確性と妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。
【０３１２】
なお、本明細書及び特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「１個のペプチド」と言う場合には複数のこのようなペプチドを含み、「ペプチド」と言う場合には当業者に公知の１個以上のペプチドとその等価物を意味し、他の用語についても同様である。
【０３１３】
「場合による」又は「場合により」とは直後に記載するイベント、状況、又は材料が発生又は存在してもしなくてもよいことを意味し、その記載がイベント、状況、又は材料の発生又は存在する場合と、発生又は存在しない場合を含むことを意味する。
【０３１４】
本願ではある特定数値に「約」を付けた数値から、及び／又は別の特定数値に「約」を付けた数値までとして範囲を表す場合がある。このような範囲を表す場合に、別の態様では、ある特定数値から、及び／又は他の特定数値までを含む。同様に、数値の前に「約」を付けて概算値として表す場合には、当然のことながら、この特定数値は別の態様を構成する。更に当然のことながら、各範囲の端点は他方の端点に対して有効であると同時に、他方の端点から独立して有効である。同様に当然のことながら、本願には多数の数値を開示しており、数値自体に加え、各数値をその特定数値に「約」を付けた数値も本願に開示されているものとする。例えば、「１０」なる数値を開示する場合には、「約１０」も開示されているものとする。同様に当然のことながら、ある数値を開示する場合には、当業者に適宜判断される通り、この数値よりも「以下」、「以上」及び数値間の可能な範囲も開示されているものとする。例えば、「１０」なる数値を開示する場合には、「１０以下」と「１０以上」も開示されているものとする。同様に当然のことながら、本願全体を通して多数の異なるフォーマットでデータを示すが、このデータは終点及び始点と、データ点の任意組み合わせの範囲を表す。例えば、特定データ点「１０」と特定データ点１５を開示する場合には、当然のことながら、１０と１５よりも大、以上、未満、以下及び等値に加え、１０から１５の間も開示されているものとみなす。同様に当然のことながら、２個の特定単位間の各単位も開示されているものとする。例えば、１０と１５を開示する場合には、１１、１２、１３、及び１４も開示されているものとする。
【０３１５】
本明細書の記載及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」なる用語と「含んでいる」等のこの用語の変形は限定されないが、例えば、他の添加剤、成分、整数又は段階も含むことを意味し、これらを排除するものではない。
【０３１６】
本明細書全体を通して各種刊行物を参照する。本願が属する技術の現状をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示内容全体を本願に援用する。更に、開示する文献は、これらの文献に含まれる内容のうち、参照の基礎となる文章中に記載されている内容については個々に具体的に本願に援用する。
【実施例１】
【０３１７】
ヒトβディフェンシン１は後期ステージ前立腺癌に対して細胞傷害性であり、前立腺癌腫瘍免疫において役割を果たす。
要約
ＤＥＦＢ１を誘導発現システムにクローニングし、正常前立腺上皮細胞と、アンドロゲン受容体陽性（ＡＲ＋）及びアンドロゲン受容体陰性（ＡＲ−）前立腺癌細胞株にどのような影響を与えるかについて検討した。ＤＥＦＢ１発現の誘導の結果、ＡＲ−細胞ＤＵ１４５及びＰＣ３では細胞増殖が低下したが、ＡＲ＋前立腺癌細胞ＬＮＣａＰの増殖には何ら影響なかった。ＤＥＦＢ１はカスパーゼ介在性アポトーシスの迅速な誘導も引き起こした。本実施例に提示するデータは初めて生得腫瘍免疫におけるその役割を立証し、その低下が前立腺癌における腫瘍進行を助長することを示すものである。
【０３１８】
材料と方法
細胞株：細胞株ＤＵ１４５はＤＭＥＭ培地で培養し、ＰＣ３はＦ１２培地で増殖させ、ＬＮＣａＰはＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で増殖させた。全３種類の株の増殖培地には１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。ｈＰｒＥＣ細胞は前立腺上皮基礎培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で培養した。全細胞株は３７℃で５％ＣＯ２下に維持した。
【０３１９】
組織サンプルとレーザーキャプチャーマイクロダイセクション：同意の下に根治的前立腺摘除術を受けた患者から得られた前立腺組織を治験審査委員会承認プロトコールに従い、ホリングス癌センター腫瘍バンクを通して入手した。このプロトコールはサンプルの処理、切片作成、組織学的特性決定、ＲＮＡ精製及びＰＣＲ増幅のガイドラインを含むものであった。凍結組織切片の病理試験後、アッセイする組織サンプルが良性前立腺細胞の純集団から構成されるように、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を実施した。分析する組織切片毎に、良性組織を含む３個の異なる領域でＬＣＭを実施した後、採取した細胞をプールした。
【０３２０】
ＤＥＦＢ１遺伝子のクローニング：逆転写ＰＣＲによりＤＥＦＢ１  ｃＤＮＡをＲＮＡから作製した。ＰＣＲプライマーはＣｌａＩ及びＫｐｎＩ制限部位を含むように設計した。ＤＥＦＢ１  ＰＣＲ産物をＣｌａＩとＫｐｎＩで制限消化し、ＴＡクローニングベクターにライゲーションした。次にＴＡ／ＤＥＦＢ１ベクターを熱ショックにより大腸菌にトランスフェクトし、個々のクローンを選択し、増殖させた。プラスミドをＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により単離し、自動シーケンシングにより配列完全性を検証した。次に、ＣｌａＩとＫｐｎＩで消化したｐＴＲＥ２を方向決定用の中間ベクターとして利用し、これにＤＥＦＢ１遺伝子フラグメントをライゲーションした。ｐＴＲＥ２／ＤＥＦＢ１構築物をＡｐａＩとＫｐｎＩで消化してＤＥＦＢ１インサートを切り出し、同様にＡｐａＩとＫｐｎＩで二重消化したエクジソン誘導発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のｐＩＮＤベクターにライゲーションした。構築物を再び大腸菌にトランスフェクトし、個々のクローンを選択し、増殖させた。プラスミドを単離し、再び自動シーケンシングによりｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１の配列完全性を検証した。
【０３２１】
トランスフェクション：細胞（１×１０６個）を１００ｍｍシャーレに撒き、一晩増殖させた。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、ヘテロダイマーエクジソン受容体を発現するｐＶｇＲＸＲプラスミド１μｇと、ｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１ベクター構築物又は空のｐＩＮＤ対照ベクター１μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で希釈して細胞に同時トランスフェクトした。
【０３２２】
ＲＮＡ単離及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＤＥＦＢ１構築物をトランスフェクトした細胞におけるＤＥＦＢ１蛋白質発現を検証するために、ポナステロンＡ（ＰｏｎＡ）で２４時間誘導後にＲＮＡを採取した。要約すると、トリプシン処理により回収した細胞約１×１０６個からＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して全ＲＮＡを単離した。この場合、細胞を溶解させ、スピンカラムで遠心することにより全ＲＮＡを単離した。ＬＣＭにより採取した細胞については、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用して全ＲＮＡを単離した。ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して両者手法に由来する全ＲＮＡ（反応当たり０．５μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。製造業者のプロトコールに従い、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＩＩ酵素（反応当たり５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）を第１鎖合成用に使用し、Ｔｆｌ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（反応当たり５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）を第２鎖合成用に使用した。各場合に、後続ＰＣＲ反応毎にｃＤＮＡ  ５０ｐｇを使用した。ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社製品のＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐａｔａｓｅとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作製したｃＤＮＡで２段階ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０３２３】
公開ＤＥＦＢ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ５０９３０）からＤＥＦＢ１のプライマー対（表２）を作製した。５６℃のアニーリング温度を使用して標準条件下にＰＣＲ４０サイクルを実施した。更に、ハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチン（表２）を増幅し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した。ＤＥＦＢ１とβ−アクチンの相対発現比としてＤＥＦＢ１発現を計算し、ＤＥＦＢ１発現を誘導した細胞株及び非誘導株と、ＬＣＭ良性前立腺組織で比較した。陰性対照として、ｃＤＮＡ鋳型を使用しないＱＲＴ−ＰＣＲ反応も実施した。全反応は３本ずつ３回実施した。
【０３２４】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ：細胞増殖に及ぼすＤＥＦＢ１の影響を試験するために、代謝３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施した。ｐＶｇＲＸＲプラスミドとｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１構築物又は空のｐＩＮＤベクターを同時トランスフェクトしたＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１〜５×１０３個の割合で撒いた。播種後２４時間から、１０μＭポナステロンＡを加えた新鮮な増殖培地を毎日加え、ＤＥＦＢ１発現を２４時間、４８時間及び７２時間誘導した後に、製造業者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＭＴＴアッセイを実施した。反応は３本ずつ３回実施した。
【０３２５】
フローサイトメトリー：ＤＥＦＢ１発現システムを同時トランスフェクトしたＰＣ３及びＤＵ１４５細胞を６０ｍｍ皿で増殖させ、１０μＭポナステロンＡで１２時間、２４時間、及び４８時間誘導した。各インキュベーション時間後、（剥がれた細胞を保持するために）培地をプレートから採取し、プレートを洗浄するために使用したＰＢＳと合わせた。残りの付着した細胞をトリプシン処理により回収し、剥がれた細胞とＰＢＳと合わせた。次に細胞を４℃（５００×ｇ）で５分間ペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ  ５μｌとＰＩ  ５μｌを加えた１×アネキシン結合緩衝液（０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ，ｐＨ７．４，１．４Ｍ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＣａＣｌ２）１００ｕｌに再懸濁した。細胞を暗所で室温にて１５分間インキュベートし、１×アネキシン結合緩衝液４００μｌで希釈し、ＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により解析した。全反応は３回実施した。
【０３２６】
顕微鏡解析：位相差顕微鏡により細胞形態を解析した。ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞にベクターを導入しないもの、空のプラスミドを導入したもの又はＤＥＦＢ１プラスミドを導入したものを６ウェル培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）に撒いた。翌日、１０μＭポナステロンＡを加えた培地でプラスミド含有細胞を４８時間誘導し、対照細胞には新鮮な培地を加えた。その後、倒立型Ｚｅｉｓｓ  ＩＭ  ３５顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で細胞を観察した。ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｍｏｓａｉｃ  ４．２カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使用して細胞の１領域の位相コントラスト写真を撮影した。細胞を３２倍の倍率の位相差顕微鏡により試験し、デジタル画像を無圧縮デシタルＴＩＦＦファイルとして保存し、画像処理とハードコピー表示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）にエクスポートした。
【０３２７】
カスパーゼ検出
ＡＰＯ  ＬＯＧＩＸ（登録商標）カルボキシフルオレセインカスパーゼ検出キット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を行った。活性カスパーゼと不可逆的に結合するＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ阻害剤を利用して活性カスパーゼを検出した。要約すると、ＤＥＦＢ１発現システムを導入したＤＵ１４５及びＰＣ３細胞（１．５〜３×１０５個）を３５ｍｍガラス底マイクロウェル皿（Ｍａｔｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）に撒き、先述のように培地単独又はＰｏｎＡを加えた培地で２４時間処理した。次に、カルボキシフルオレセイン標識ペプチドフルオロメチルケトン（ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）の３０倍ワーキング希釈液１０μｌを培地３００μｌに加え、各３５ｍｍ皿に加えた。次に細胞を３７℃で５％ＣＯ２下に１時間インキュベートした。次に、培地を吸引し、細胞を１倍ワーキング希釈液洗浄緩衝液２ｍｌで２回洗浄した。細胞を微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）又は４８８ｎｍレーザー励起により観察した。共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）と６３倍ＤＩＣオイルレンズをＶａｒｉｏ  ２  ＲＧＢレーザー走査モジュールと併用して蛍光シグナルを解析した。
【０３２８】
統計解析
対応のない値のスチューデントのｔ検定を使用して統計的差を求めた。両側計算によりＰ値を求め、０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
【０３２９】
結果
前立腺組織及び細胞株におけるＤＥＦＢ１発現：良性及び悪性前立腺組織と、ｈＰｒＥＣ前立腺上皮細胞と、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ前立腺癌細胞でＱＲＴ−ＰＣＲによりＤＥＦＢ１発現レベルを測定した。全ての良性臨床サンプルでＤＥＦＢ１発現が検出された。ＤＥＦＢ１相対発現の平均量は０．００７３であった。更に、ｈＰｒＥＣ細胞におけるＤＥＦＢ１相対発現は０．００８９であった。良性前立腺組織サンプルとｈＰｒＥＣで検出されたＤＥＦＢ１発現に有意差はなかった（図１Ａ）。前立腺癌細胞株における相対ＤＥＦＢ１発現レベルの解析によると、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰにおけるレベルは有意に低いことが判明した。別の参照点として、患者＃１２１５からの前立腺組織の隣接悪性切片で相対ＤＥＦＢ１発現を測定した。患者＃１２１５からの悪性前立腺組織に比較して３種類の前立腺癌株で観察されたＤＥＦＢ１発現レベルに有意差はなかった（図１Ｂ）。更に、全４個のサンプルにおける発現レベルは鋳型なしの陰性対照に近く、内在性ＤＥＦＢ１発現は殆ど〜全くないことが確認された（データは示さず）。ＤＥＦＢ１発現システムをトランスフェクトした前立腺癌細胞株でもＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。２４時間誘導後に、相対発現レベルはＤＵ１４５で０．０１３６０であり、ＰＣ３で０．０１５０３であり、ＬＮＣａＰで０．１３８であった。増幅産物をゲル電気泳動により検証した。
【０３３０】
良性、ＰＥＳｆ及び癌を含むＬＣＭ組織領域でＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＤＥＦＢ１相対発現は良性領域では０．０１４６であり、これに対して悪性領域では０．０００９であった（図１Ｃ）。これは９４％の低下に相当し、ここでも発現の有意なダウンレギュレーションが明らかである。更に、ＰＩＮの解析によると、ＤＥＦＢ１発現レベルは０．０４４であり、７０％低下することが判明した。患者＃１４５７の発現を６人の他の患者の良性領域で検出された平均発現レベルに比較すると（図１Ａ）、ほぼ２倍の発現に相当する１．９９７の比であることが判明した（図１Ｄ）。他方、良性組織の平均発現レベルに対する発現比はＰＩＮでは０．０５９５であり、悪性組織では０．１２５であった。
【０３３１】
ＤＥＦＢ１は細胞膜透過性とラッフリングを引き起こす：前立腺癌細胞株におけるＤＥＦＢ１の誘導の結果、ＤＵ１４５とＰＣ３の細胞数は有意に減少したが、ＬＮＣａＰでは細胞増殖に何ら影響なかった（図２）。陰性対照として、空のプラスミドを導入した全３種類の株で細胞増殖をモニターした。ＰｏｎＡの添加後にＤＵ１４５、ＰＣ３又はＬＮＣａＰ細胞の細胞形態に観測可能な変化はなかった。更に、ＤＥＦＢ１誘導の結果、ＤＵ１４５とＰＣ３の両者で形態変化が生じた。この場合、細胞は丸みを増した外観であり、細胞死を意味する膜ラッフリングを示した。両者株にはアポトーシス小体も存在していた。
【０３３２】
ＤＥＦＢ１の発現は細胞生存率の低下をもたらす：ＭＴＴアッセイによると、ＰＣ３及びＤＵ１４５細胞ではＤＥＦＢ１により細胞生存率が低下したが、ＬＮＣａＰ細胞には有意影響がなかった（図３）。２４時間後に、相対細胞生存率はＤＵ１４５では７２％であり、ＰＣ３では５６％であった。誘導から４８時間後の解析によると、ＤＵ１４５の細胞生存率は４９％であり、ＰＣ３の細胞生存率は３７％であることが判明した。７２時間のＤＥＦＢ１発現後にＤＵ１４５細胞とＰＣ３細胞における相対細胞生存率は夫々４４％と２９％であった。
【０３３３】
ＤＥＦＢ１は後期ステージ前立腺癌細胞において迅速なカスパーゼ介在性アポトーシスを引き起こす：ＰＣ３とＤＵ１４５に及ぼすＤＥＦＢ１の作用が細胞増殖抑制性であるのか又は細胞傷害性であるのかを調べるために、ＦＡＣＳ解析を実施した。通常の増殖条件下で、ＰＣ３及びＤＵ１４５培養物の９０％を上回る細胞が生存可能であり、非アポトーシス性であり（左下象限）、アネキシンＶ又はＰＩで染色しなかった（図４）。ＰＣ３細胞におけるＤＥＦＢ１発現の誘導後、アポトーシス細胞数（右下及び右上象限）を合計すると、１２時間で１０％、２４時間で２０％、４８時間で４４％であった。ＤＵ１４５細胞では、アポトーシス細胞数を合計すると、１２時間誘導後で１２％、２４時間で３４％、４８時間で５９％であった。ＰｏｎＡで誘導後に、空のプラスミドを導入した細胞でアポトーシスの増加は認められなかった（データは示さず）。
【０３３４】
共焦点レーザー顕微鏡解析によりカスパーゼ活性を検討した（図５）。ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞をＤＥＦＢ１発現誘導し、アポトーシスが活発に生じている細胞で緑色蛍光性のＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫとカスパーゼの結合に基づいて活性をモニターした。細胞のＤＩＣ解析によると、０時間では生存可能な対照ＤＵ１４５（Ａ）、ＰＣ３（Ｅ）及びＬＮＣａＰ（Ｉ）細胞が存在していた。４８８ｎｍで共焦点レーザーにより励起すると、検出可能な緑色染色は生じず、ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３（Ｆ）又はＬＮＣａＰ（Ｊ）にカスパーゼ活性は存在しないと判断された。２４時間誘導後、再びＤＩＣによりＤＵ１４５（Ｃ）、ＰＣ３（Ｇ）及びＬＮＣａＰ（Ｋ）細胞が検出可能であった。蛍光下の共焦点解析によると、ＤＵ１４５（Ｄ）及びＰＣ３（Ｈ）細胞でカスパーゼ活性を意味する緑色染色が観測された。他方、ＬＮＣａＰ（Ｌ）に緑色染色は認められず、ＤＥＦＢ１によりアポトーシスは誘導されないと判断された。
【０３３５】
結論
その機能的役割を推定するために、ＤＥＦＢ１遺伝子をエクジソン誘導発現システムにクローニングし、前立腺癌細胞に及ぼすその影響を試験した。本実施例のデータは後期ステージアンドロゲン受容体陰性ホルモン不応性前立腺癌細胞に対するＤＥＦＢ１細胞傷害活性を立証するものである。結論として、本試験は前立腺癌におけるＤＥＦＢ１の機能的役割を実証する。更に、これらの知見はＤＥＦＢ１が腫瘍免疫に関与する生得免疫系の一部であることを示す。本実施例に提示するデータは生理的レベルで発現されるＤＥＦＢ１がＡＲ−ホルモン不応性前立腺癌細胞に対して細胞傷害性であるが、ＡＲ＋ホルモン感受性前立腺癌細胞や正常前立腺上皮細胞に対してはそうでないことを立証する。ＤＥＦＢ１が細胞傷害性を生じずに正常前立腺細胞で構成的に発現されるならば、後期ステージＡＲ−前立腺癌細胞はこれらの細胞をＤＥＦＢ１細胞傷害性に対して感受性にするような顕著な表現型特徴をもつと思われる。従って、ＤＥＦＢ１は後期ステージ前立腺癌の治療に有効な治療剤である。
【実施例２】
【０３３６】
ＰＡＸ２発現のｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンはｐ５３状態に非依存性の前立腺癌細胞死を生じる。
要約
本実施例ではｐ５３遺伝子状態の異なる前立腺癌細胞においてＲＮＡ干渉によりＰＡＸ２発現を阻害する効果を試験する。これらの結果によると、ＰＡＸ２の阻害はｐ５３状態に関係なく細胞死を生じ、前立腺癌でＰＡＸ２により阻害される別の腫瘍サプレッサー遺伝子又は細胞死経路が存在すると考えられる。
【０３３７】
材料と方法
細胞株：細胞株ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。ＰＣ３細胞はＦ−１２培地で増殖させ、ＤＵ１４５はＤＭＥＭで増殖させ、ＬＮＣａＰはＲＰＭＩ培地で増殖させ、いずれの培地も１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清を加えた。細胞は３７℃で５％ＣＯ２下に維持した。
【０３３８】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング：効率的な遺伝子サイレンシングを達成するために、ヒトＰＡＸ２  ｍＲＮＡ（アクセション番号ＮＭ＿００３９８９．１）を標的とする４個の相補的短鎖干渉性リボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）のプールを合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）。４個のｓｉＲＮＡの第２のプールを内部対照として使用し、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの特異性を試験した。合成した配列の２個はＧＬ２ルシフェラーゼｍＲＮＡ（アクセション番号Ｘ６５３２４）を標的とし、２個は非配列特異的であった（表３）。ｓｉＲＮＡのアニーリングのために、３５Ｍの１本鎖をアニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．４，２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で１分間９０℃にてインキュベーションした後、１時間３７℃でインキュベーションした。
【０３３９】
ウェスタン解析：要約すると、細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。溶解用緩衝液を製造業者の指示（Ｓｉｇｍａ）に従って調製した後、細胞に加えた。オービタルシェーカーで４℃にて１５分間インキュベーション後、細胞溶解液を採取し、１０分間１２０００×ｇで遠心し、細胞破片をペレット化した。次に、蛋白質を含有する上清を採取し、定量した。次に、蛋白質抽出物２５μｇを８−１６％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）にロードした。電気泳動後、蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した後、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）中５％脱脂粉乳で１時間ブロックした。次に２０００倍に希釈したウサギ抗ＰＡＸ２一次抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）でブロットをプロービングした。洗浄後、西洋ワサビペルオキダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ウサギ抗体（５０００倍希釈；Ｓｉｇｍａ）と共に膜をインキュベートし、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８９００で化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗β−アクチン一次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とＨＲＰ標識抗マウス二次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でリプロービングし、再びシグナル検出を可視化した。
【０３４０】
位相差顕微鏡解析：細胞増殖に及ぼすＰＡＸ２ノックダウンの影響を位相差顕微鏡により解析した。この場合、細胞１〜２×１０４個を６ウェル培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）に撒いた。翌日、細胞を培地単独、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡ又はＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、６日間インキュベートした。その後、３２倍の倍率の倒立型Ｚｅｉｓｓ  ＩＭ  ３５顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で細胞を観察した。ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｍｏｓａｉｃ  ４．２カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使用して細胞の１領域の位相コントラスト写真を撮影した。
【０３４１】
ＭＴＴ細胞傷害性アッセイ：トランスフェクション試薬を製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って使用してＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞（１×１０５個）にＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡプール又は対照ｓｉＲＮＡプール０．５μｇをトランスフェクトした。次に、細胞懸濁液を希釈し、９６ウェルプレートに細胞１〜５×１０３個／ウェルの割合で撒き、２日間、４日間又は６日間増殖させた。培養後、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド，ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から着色ホルマザン産物への変換を測定することにより、細胞生存率を測定した。走査型マルチウェル分光光度計で５４０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０３４２】
パンカスパーゼ検出：ＡＰＯ  ＬＯＧＩＸ（登録商標）カルボキシフルオレセインカスパーゼ検出キット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を行った。活性カスパーゼと不可逆的に結合するＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ阻害剤を利用して活性カスパーゼを検出した。要約すると、細胞（１〜２×１０４個）を３５ｍｍガラス底マイクロウェル皿（Ｍａｔｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）に撒き、先述のように培地単独又はＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理した。次に、カルボキシフルオレセイン標識ペプチドフルオロメチルケトン（ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）の３０倍ワーキング希釈液１０μｌを培地３００μｌに加え、各３５ｍｍ皿に加えた。次に細胞を３７℃で５％ＣＯ２下に１時間インキュベートした。次に、培地を吸引し、細胞を１倍ワーキング希釈液洗浄緩衝液２ｍｌで２回洗浄した。細胞を微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）又は４８８ｎｍレーザー励起により観察した。共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）と６３倍ＤＩＣオイルレンズをＶａｒｉｏ  ２  ＲＧＢレーザー走査モジュールと併用して蛍光シグナルを解析した。
【０３４３】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞株におけるＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後の遺伝子発現を検証するために、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して全ＲＮＡを単離した。要約すると、細胞約１×１０６個をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳで洗浄した。次に細胞を溶解させ、スピンカラムで遠心することにより全ＲＮＡを単離した。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、第１鎖合成用としてＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＩＩ酵素（反応当たり５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）と、第２鎖合成用としてＴｆｌ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（反応当たり５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコールに従って使用し、ＲＴ酵素の不在下で処理した同一の対照サンプルと共に、全ＲＮＡ（反応当たり０．５μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。一般に、後続ＰＣＲ反応毎に各ｃＤＮＡ５０ｐｇを使用した。ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社製品のＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐａｔａｓｅとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作製したｃＤＮＡで２段階ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。公開配列からＢＡＸ、ＢＩＤ及びＢＡＤのプライマー対を作製した（表３）。ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応を実施した。６０℃のアニーリング温度を使用して標準条件下にＰＣＲ４０サイクルを実施した。指数的増幅が開始したサイクル数（閾値）により定量を行い、３回反復から得られた値から平均した。メッセージレベルと閾値の間には逆関係があった。更に、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した。プロアポトーシス遺伝子とＧＡＰＤＨの相対発現比として遺伝子発現を計算した。全反応は３本ずつ実施した。
【０３４４】
結果
ＰＡＸ２蛋白質のｓｉＲＮＡ阻害：ｓｉＲＮＡがＰＡＸ２  ｍＲＮＡに有効に標的送達されたことを確認するために、ウェスタン解析を実施し、６日間の処理期間にわたってＰＡＸ２蛋白質発現レベルをモニターした。細胞にＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡのプールのトランスフェクション１ラウンドを実施した。その結果、ＤＵ１４５では４日まで（図６ａ）、ＰＣ３では６日まで（図６ｂ）にＰＡＸ２蛋白質のノックダウンを示したことから、ＰＡＸ２  ｍＲＮＡの特異的ターゲティングが確認された。
【０３４５】
ＰＡＸ２のノックダウンは前立腺癌細胞増殖を抑制する：培地単独、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡ又はＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで６日間処理後に細胞を解析した（図７）。ＤＵ１４５（ａ）、ＰＣ３（ｄ）及びＬＮＣａＰ（ｇ）細胞はいずれも培地のみを加えた培養皿で少なくとも９０％コンフルエントに達した。ＤＵ１４５（ｂ）、ＰＣ３（ｅ）及びＬＮＣａＰ（ｈ）を陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡで処理しても細胞増殖に影響なく、細胞は６日後にやはりコンフルエントに達した。他方、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理すると、細胞数は有意に減少した。ＤＵ１４５細胞は約１５％コンフルエント（ｃ）であり、ＰＣ３細胞は１０％コンフルエント（ｆ）に止まった。ＬＮＣａＰ細胞はｓｉＲＮＡ処理後に５％コンフルエントであった。
【０３４６】
細胞傷害性アッセイ：２日間、４日間又は６日間処理後に細胞生存率を測定し、処理細胞の５７０〜６３０ｎｍ吸光度を未処理対照細胞の吸光度で割った比として表す（図８）。２日間処理後の相対細胞生存率はＬＮＣａＰでは７７％、ＤＵ１４５では８２％、ＰＣ３では７８％であった。４日後に、相対細胞生存率はＬＮＣａＰでは４６％、ＤＵ１４５では５３％、ＰＣ３では６３％であった。６日間処理後、相対生存率はＬＮＣａＰでは３１％、ＰＣ３では３７％まで低下し、ＤＵ１４５では５３％であった。陰性対照として、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡ又はトランスフェクション試薬単独で６日間処理後に細胞生存率を測定した。どちらの条件でも、通常の増殖培地に比較して細胞生存率に統計的に有意な変化はなかった。
【０３４７】
パンカスパーゼ検出：共焦点レーザー顕微鏡解析によりカスパーゼ活性を検出した。ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、アポトーシスが活発に生じている細胞（緑色に蛍光発光する）でＦＡＭ標識ペプチドとカスパーゼの結合に基づいて活性をモニターした。培地単独を加えた細胞のＤＩＣ解析によると、０時間では生存可能なＤＵ１４５（Ａ）、ＰＣ３（Ｅ）及びＬＮＣａＰ（Ｉ）細胞が存在する（図９）。４８８ｎｍで共焦点レーザーにより励起すると、検出可能な緑色染色は生じず、未処理ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３（Ｆ）又はＬＮＣａＰ（Ｊ）にカスパーゼ活性は存在しないと判断された。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで４日間処理後、再びＤＩＣによりＤＵ１４５（Ｃ）ＰＣ３（Ｇ）及びＬＮＣａＰ（Ｋ）細胞が検出可能であった。蛍光下で、処理後のＤＵ１４５（Ｄ）、ＰＣ３（Ｈ）及びＬＮＣａＰ（Ｌ）細胞はカスパーゼ活性を意味する緑色染色を示した。
【０３４８】
プロアポトーシス因子に及ぼすＰＡＸ２阻害の影響
ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞をＰＡＸ２に対するｓｉＲＮＡで６日間処理し、ｐ５３転写調節に依存性及び非依存性のプロアポトーシス遺伝子の発現を測定し、細胞死経路をモニターした。ＢＡＸについては、ＬＮＣａＰで１．８１倍の増加、ＤＵ１４５で２．７３倍の増加、ＰＣ３で１．８７倍の増加が認められた（図１０ａ）。ＢＩＤの発現レベルはＬＮＣａＰで１．３８倍、ＤＵ１４５で１．７７倍に増加した（図１０ｂ）。他方、処理後のＰＣ３におけるＢＩＤ発現レベルは１．４４倍低下した（図１０ｃ）。ＢＡＤの解析によると、ＬＮＣａＰで２．０倍の発現増加、ＤＵ１４５で１．３８倍の増加、ＰＣで３１．５８倍の増加が判明した。
【０３４９】
結論
癌治療は著しく前進しているが、進行型疾患の治療はいまだに殆ど進歩していない。前立腺癌の薬剤治療の成功には、宿主への臨床作用を最小限に維持しながら標的細胞に特異的作用のある治療薬を使用する必要がある。癌治療の目標は腫瘍選択的細胞死を誘発することである。従って、特定治療の効力の判定にはこのような死におけるメカニズムの解明が不可欠である。
【０３５０】
本実施例では、前立腺癌細胞生存がＰＡＸ２発現に依存性であることを示す。ｐ５３を発現する細胞株ＬＮＣａＰ、ｐ５３突然変異株ＤＵ１４５、及びｐ５３欠損株ＰＣ３で観察される死を区別するために、ＰＡＸ２ノックダウンの結果としてｐ５３活性化後に生じる下流イベントを検討した。プログラム細胞死の開始を意味するカスパーゼ活性が全３種類の細胞株で検出された。このため、プロアポトーシス遺伝子の発現の変化を試験した。この場合、ＢＡＸ発現はｐ５３状態に依存せずに全３種類の細胞株でアップレギュレートされた。プロアポトーシス因子ＢＡＤの発現はＰＡＸ２阻害後に全３種類の株で増加した。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理後、ＢＩＤ発現はＬＮＣａＰとＤＵ１４５では増加したが、ＰＣ３では実際に低下した。このことから、前立腺癌で観察される細胞死はｐ５３発現に影響されるが、依存性ではないと判断される。前立腺癌細胞におけるアポトーシスがｐ５３状態に関係なく各種細胞死経路を介して開始することから、ＰＡＸ２は他の腫瘍サプレッサーを阻害すると考えられる。
【実施例３】
【０３５１】
ＰＡＸ２癌遺伝子の阻害は前立腺癌細胞のＤＥＦＢ１介在性細胞死を生じる。
要約
新規制癌剤開発のターゲットとして利用される腫瘍特異的分子の同定は癌研究の主要目標であるとみなされている。実施例Ｉでは、前立腺癌に高頻度のＤＥＦＢ１発現低下が生じることと、ＤＥＦＢ１発現の誘導によりアンドロゲン受容体陰性ステージ前立腺癌で迅速なアポトーシスが生じることを実証した。これらのデータはＤＥＦＢ１が前立腺腫瘍抑制に役割を果たすことを示している。更に、正常前立腺上皮の免疫系の天然成分であるならば、ＤＥＦＢ１は副作用が殆ど〜全くない有効な治療剤であると予想される。実施例ＩＩではＰＡＸ２発現の阻害がｐ５３に依存せずに前立腺癌細胞死を生じることを実証した。これらのデータはＰＡＸ２により阻害される別のプロアポトーシス因子又は腫瘍サプレッサーが存在することを示唆している。更に、これらのデータは前立腺癌で過剰発現される癌遺伝子因子ＰＡＸ２がＤＥＦＢ１の転写リプレッサーであることを示している。本試験の目的はＤＥＦＢ１発現低下がＰＡＸ２癌遺伝子の異常発現に起因するか否かと、ＰＡＸ２の阻害がＤＥＦＢ１介在性細胞死を生じるか否かを調べることにある。
【０３５２】
データによると、ＤＥＦＢ１発現の低下は転写レベルで生じる。更に、ＤＥＦＢ１プロモーターのコンピュータ解析によると、ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックス（図１）の近くにＰＡＸ２転写リプレッサーのＧＴＴＣＣ（配列番号２）ＤＮＡ結合部位が存在することが判明した。本実施例に提示する結果から明らかなように、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１は細胞死の抑制における役割を含む適切な癌ターゲットの数種類の属性を示す。従って、ＤＥＦＢ１は腫瘍免疫において役割を果たし、その発現はＰＡＸ２癌遺伝子の治療ダウンレギュレーションにより調節される。
【０３５３】
材料と方法
ＲＮＡ単離と定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＤＥＦＢ１発現レベルの変化を検証するために、４日間のＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後にＲＮＡを採取した。要約すると、トリプシン処理により回収した細胞約１×１０６個からＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して全ＲＮＡを単離した。この場合、細胞を溶解させ、スピンカラムで遠心することにより全ＲＮＡを単離した。ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して両者手法に由来する全ＲＮＡ（反応当たり０．５μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。製造業者のプロトコールに従い、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＩＩ酵素（反応当たり５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）を第１鎖合成用に使用し、Ｔｆｌ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（反応当たり５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）を第２鎖合成用に使用した。各場合に、後続ＰＣＲ反応毎にｃＤＮＡ  ５０ｐｇを使用した。ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社製品のＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐａｔａｓｅとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作製したｃＤＮＡで２段階ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０３５４】
公開ＤＥＦＢ１配列（アクセション番号Ｕ５０９３０）からＤＥＦＢ１のプライマー対を作製した。５６℃のアニーリング温度を使用して標準条件下にＰＣＲ４０サイクルを実施した。更に、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを増幅し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した。ＤＥＦＢ１とＧＡＰＤＨの相対発現比としてＤＥＦＢ１発現を計算し、ＰＡＸ２発現のｓｉＲＮＡノックダウン前後の細胞株で比較した。全反応は３本ずつ３回実施した。
【０３５５】
ＤＥＦＢ１レポーター構築物の作製：ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用し、ＤＥＦＢ１レポーター活性をモニターした。この場合、ＤＥＦＢ１転写開始部位から１６０塩基上流の領域がＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスを含んでいた。この領域はＰＡＸ２結合に必要なＧＴＴＣＣ配列（配列番号２）も含んでいた。ＰＣＲプライマーはＫｐｎＩ及びＮｈｅＩ制限部位を含むように設計した。ＤＥＦＢ１プロモーターＰＣＲ産物をＫｐｎＩとＮｈｅＩで制限消化し、同様に制限消化したｐＧＬ３プラスミドにライゲーションした（図２）。構築物を大腸菌にトランスフェクトし、個々のクローンを選択し、増殖させた。プラスミドを単離し、自動シーケンシングによりＤＥＦＢ１／ｐＧＬ３構築物の配列完全性を検証した。
【０３５６】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ：この場合、ＤＥＦＢ１レポーター構築物又は対照ｐＧＬ３プラスミド１μｇをＤＵ１４５細胞１×１０６個にトランスフェクトした。次に、細胞０．５×ｌ０３個を９６ウェルプレートの各ウェルに撒き、一晩増殖させた。次に、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡを加えた新鮮な培地又は培地単独を加え、細胞を４８時間インキュベートした。製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＢｒｉｇｈｔＧｌｏキットによりルシフェラーゼを検出し、プレートをＶｅｒｉｔａｓ自動９６ウェルルミノメーターで読み取った。相対発光量としてプロモーター活性を表した。
【０３５７】
膜透過性の解析：アクリジンオレンジ（ＡＯ）／臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）二重染色を実施し、細胞膜完全性の変化と濃縮クロマチン染色によるアポトーシス細胞を確認した。ＡＯは生存細胞と初期アポトーシス細胞を染色し、ＥｔＢｒは膜透過性が低下した後期ステージアポトーシス細胞を染色する。要約すると、細胞を２穴チャンバー培養スライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）に撒いた。空のｐＩＮＤプラスミド／ｐｖｇＲＸＲ又はｐＩＮＤ  ＤＥＦＢ１／ｐｖｇＲＸＲをトランスフェクトした細胞を、１０μＭポナステロンＡを加えた培地で２４時間又は４８時間誘導した。対照細胞には２４時間と４８時間に新鮮な培地を加えた。膜完全性に及ぼすＰＡＸ２阻害の影響を調べるために、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰを加えた各培養スライドをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、４日間インキュベートした。この後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＡＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とＥｔＢｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（５μｇ／ｍｌ）の混液（１：１）２ｍｌで５分間染色した。染色後、細胞を再びＰＢＳで洗浄した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ  Ｖａｒｉｏ  ２共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により蛍光を観察した。励起カラーホイールはＢＳ５０５−５３０（緑）及びＬＰ５６０（赤）フィルターブロックを含み、ＡＯからの緑色発光とＥｔＢｒからの赤色発光を緑色チャネルと赤色チャネルに分離することができた。各実験内のレーザー出力及び利得制御設定は対照とＤＥＦＢ１誘導細胞で同一とした。ＡＯは５４３ｎｍ、ＥｔＢｒは４８８ｎｍの波長のＫｒ／Ａｒ混合ガスレーザーにより励起した。スライドを４０倍の倍率で解析し、デジタル画像を無圧縮デシタルＴＩＦＦファイルとして保存し、画像処理とハードコピー表示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）にエクスポートした。
【０３５８】
ＰＡＸ２のＣｈＩＰ解析：クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）は転写因子によるプロモーターのインビボ占有と転写因子と結合したクロマチンの免疫沈降による集積に基づいてＤＮＡ結合性蛋白質の結合部位を同定することができる。ファーンハム研究所により記載されているプロトコール（ｈｔｔｐ：／／ｍｃａｒｄｌｅ．ｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｆａｒｎｈａｍ／からオンライン閲覧も可能）の変法を使用した。ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞株はＰＡＸ２蛋白質を過剰発現するが、ＤＥＦＢ１を発現しない。１．０％ホルムアルデヒドを加えたＰＢＳと共に細胞を１０分間インキュベートし、蛋白質をＤＮＡに架橋させた。次にサンプルを音波処理し、平均長６００ｂｐのＤＮＡを得た。音波処理したクロマチンをプロテインＡダイナビーズで前処理した後にＰＡＸ２特異抗体又は「無抗体」対照［アイソタイプを一致させた対照抗体］と共にインキュベートした。次に洗浄した免疫沈降物を採取した。架橋を元に戻した後に、プロモーター特異的プライマーを使用してＰＣＲによりＤＮＡを解析し、ＰＡＸ２−免疫沈降サンプル中にＤＥＦＢ１が現れるか否かを調べた。ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスと機能的ＧＴＴＣＣ（配列番号２）ＰＡＸ２認識部位を含むＤＥＦＢ１  ｍＲＮＡ開始部位のすぐ上流１６０ｂｐ領域を増幅するようにプライマーを設計した。これらの試験では、陽性対照として（免疫沈降前であるが、架橋を元に戻した）インプットクロマチンのアリコートのＰＣＲを実施した。全段階はプロテアーゼ阻害剤の存在下で実施した。
【０３５９】
結果
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡ阻害はＤＥＦＢ１発現を増加する：ｓｉＲＮＡ処理前のＤＥＦＢ１発現のＱＲＴ−ＰＣＲ解析によると、相対発現レベルはＤＵ１４５で０．０００９７、ＰＣ３で０．００００１、ＬＮＣａＰで．００００４であった（図１３）。ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡノックダウン後、相対発現はＤＵ１４５で．０３２９４（３３８倍の増加）、ＰＣ３で．０００２０（２２．２倍の増加）、ＬＮＣａＰで０．０００１９（４．９２倍の増加）であった。陰性対照として、ＰＡＸ２欠損株であるヒト前立腺上皮細胞株（ｈＰｒＥＣ）は発現レベルが処理前に０．００６８７であり、ｓｉＲＮＡ処理後に０．００６６１となることが判明し、ＤＥＦＢ１発現に統計的変化のないことが確認された。
【０３６０】
ＤＥＦＢ１は細胞膜透過性を引き起こす：共焦点解析により膜完全性をモニターした（図１４）。この場合、無傷の細胞は膜透過性のＡＯにより緑色に染色される。更に、原形質膜が損傷した細胞は膜不透過性のＥｔＢｒにより赤色に染色される。この場合、誘導していないＤＵ１４５（Ａ）及びＰＣ３（Ｄ）細胞はＡＯで陽性染色され、緑色を発生したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。他方、ＤＵ１４５（Ｂ）とＰＣ３（Ｅ）の両者におけるＤＥＦＢ１誘導の結果、２４時間で細胞質にＥｔＢｒが蓄積し、赤色染色が認められた。４８時間までに、ＤＵ１４５（Ｃ）とＰＣ３（Ｆ）では核が濃縮し、夫々ＡＯとＥｔＢｒの蓄積に起因する緑と赤の染色の混在により、黄色に見えた。
【０３６１】
ＰＡＸ２の阻害は膜透過性をもたらす：細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで４日間処理し、共焦点解析により再び膜完全性をモニターした。この場合、ＤＵ１４５とＰＣ３は核が濃縮し、黄色に見えた。他方、ＬＮＣａＰ細胞の細胞膜と核はｓｉＲＮＡ処理後も緑色のままであった。細胞周辺が赤に染色していることからも、細胞膜完全性の維持が明らかである。これらの知見から、ＰＡＸ２の阻害はＤＵ１１４５とＰＣ３に特異的にＤＥＦＢ１介在性細胞死を生じるが、ＬＮＣａＰ細胞には生じないと判断される。ＬＮＣａＰに認められる死はＰＡＸ２阻害後のＬＮＣａｐにおける既存野生型ｐ５３のトランス活性化によるものである。
【０３６２】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡ阻害はＤＥＦＢ１プロモーター活性を増加する：ＤＥＦＢ１／ｐＧＬ３構築物を導入したＤＵ１４５細胞におけるＤＥＦＢ１プロモーター活性の解析によると、４８時間処理後の相対光量単位は未処理細胞に比較して２．６５倍に増加することが判明した。ＰＣ３細胞では、相対光量単位は未処理細胞に比較して３．７８倍に増加した。
【０３６３】
ＰＡＸ２はＤＥＦＢ１プロモーターと結合する：ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞でＣｈＩＰ解析を実施し、ＰＡＸ２転写リプレッサーがＤＥＦＢ１プロモーターと結合するか否かを調べた（図１５）。レーン１は１００ｂｐ分子量マーカーを含む。レーン２は架橋と免疫沈降前にＤＵ１４５から増幅したＤＥＦＢ１プロモーターの１６０ｂｐ領域に相当する陽性対照である。レーン３はＤＮＡを使用せずに実施したＰＣＲに相当する陰性対照である。レーン４及び５は夫々架橋ＤＵ１４５及びＰＣ３からのＩｇＧで実施した免疫沈降からのＰＣＲに相当する陰性対照である。架橋後に抗ＰＡＸ２抗体で免疫沈降させたＤＮＡ２５ｐｇ（レーン６及び８）とＤＮＡ５０ｐｇ（レーン７及び９）のＰＣＲ増幅は夫々ＤＵ１４５及びＰＣ３で１６０ｂｐプロモーターフラグメントを示す。
【０３６４】
結論
本実施例の新規データは前立腺癌腫瘍免疫におけるＤＥＦＢ１の役割を初めて開示するものである。これらのデータは発癌因子ＰＡＸ２がＤＥＦＢ１発現を抑制することも示す。ディフェンシン細胞傷害性の顕著な特徴の１つは膜完全性の破壊である。本実施例のデータは前立腺癌細胞におけるＤＥＦＢ１の異所性発現が細胞膜の損傷により膜電位の低下をもたらすことを示す。ＰＡＸ２蛋白質発現の阻害後にも同一現象が認められる。ＣｈＩＰ解析も実施し、ＰＡＸ２がＤＥＦＢ１プロモーターと結合する結果、ＤＥＦＢ１発現を抑制することを確認した。従って、ＰＡＸ２発現又は機能の抑制はＤＥＦＢ１発現の回復をもたらした後に、ＤＥＦＢ１介在性細胞死を生じる。更に、本実施例のデータは生得免疫による前立腺癌治療の特異的治療としてのＤＥＦＢ１の有用性を立証する。
【実施例４】
【０３６５】
ＤＥＦＢ１の発現は腫瘍萎縮を生じる。
ＤＥＦＢ１を過剰発現する腫瘍細胞をヌードマウスに注入することによりＤＥＦＢ１の抗腫瘍能を検討する。両方向テトラサイクリン応答性プロモーターをもつｐＢＩ−ＥＧＦＰベクターにＤＥＦＢ１をクローニングする。ｐＴｅｔ−ＯｆｆをＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８で選択することによりＴｅｔ−Ｏｆｆ細胞株を作製する。ｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ＤＥＦＢ１プラスミドをｐＴＫ−Ｈｙｇと共にＴｅｔ−ｏｆｆ細胞株に同時トランスフェクトし、ハイグロマイシンで選択する。生存率＞９０％の単細胞懸濁液のみを使用する。各雌性ヌードマウスの右脇腹に細胞約５００，０００個を皮下投与する。ベクタークローン単独を注入した対照群と、ＤＥＦＢ１を過剰発現するクローンを注入したした群の２群に分ける。統計学者の判断により、各群マウス３５匹とする。動物を週２回計量し、カリパーにより腫瘍増殖をモニターし、以下の式：体積＝０．５×（幅）２×長さを使用して腫瘍体積を求める。腫瘍サイズが２ｍｍ３に達した時又は移植から６カ月後にＣＯ２過剰投与により全動物を屠殺し、腫瘍を摘出し、計量し、病理試験に備えて中性緩衝ホルマリン中で保存する。群間の腫瘍増殖の差を要約統計量とグラフィック表示により記述的に特性決定する。ｔ検定又はノンパラメトリックな同等方法で統計的有意性を検討する。
【実施例５】
【０３６６】
ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの発現はインビボでＤＥＦＢ１発現のアップレギュレーションと腫瘍萎縮を生じる。
インビトロ試験で利用したヘアピンＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ鋳型オリゴヌクレオチドを利用し、インビボＤＥＦＢ１発現のアップレギュレーションに及ぼす影響を試験する。センス鎖とアンチセンス鎖（表３参照）をアニールし、ヒトＵ６  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下にｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ２．１  Ｕ６  ｈｙｇｒｏ  ｓｉＲＮＡ発現ベクター（Ａｍｂｉｏｎ）にクローニングする。クローニングしたプラスミドを配列決定し、検証し、ＰＣ３、ＤＵ１４５、及びＬＮＣａｐ細胞株にトランスフェクトする。本試験ではスクランブルｓｈＲＮＡをクローニングし、陰性対照として使用する。ハイグロマイシン耐性コロニーを選択し、細胞をマウスに皮下導入し、腫瘍増殖を上記のようにモニターする。
【実施例６】
【０３６７】
ＰＡＸ２結合の小分子阻害剤はインビボでＤＥＦＢ１発現のアップレギュレーションと腫瘍萎縮を生じる。
ＰＡＸ２結合のＤＮＡ認識配列はヌクレオチド−７５〜−７１［＋１が転写開始部位を意味する］のＤＥＦＢ１プロモーターに位置していた。ＰＡＸ２  ＤＮＡ結合ドメインに相補的な短鎖オリゴヌクレオチドを準備する。このようなオリゴヌクレオチドの例としては、ＧＴＴＣＣ認識配列（配列番号２）を含む下記２０量体及び４０量体オリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの長さをランダムに選択し、他の長さは結合の遮断剤として有効であると予想する。陰性対照として、スクランブル配列（ＣＴＣＴＧ）（配列番号１７）をもつオリゴヌクレオチドを設計し、特異性を検証した。リポフェクタミン試薬又はＣｏｄｅｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ）を使用してオリゴヌクレオチドを前立腺癌細胞とＨＰｒＥＣ細胞にトランスフェクトする。ＤＮＡ−蛋白質相互作用を確認するために、２本鎖オリゴヌクレオチドを［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、電気泳動移動度シフトアッセイを実施する。更に、オリゴヌクレオチドで処理後にＱＲＴ−ＰＣＲとウェスタン解析によりＤＥＦＢ１発現をモニターする。最後に、先述のようにＭＴＴアッセイとフローサイトメトリーにより細胞死を検出する。
認識配列＃１：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣ（配列番号１３）
認識配列＃２：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号１４）
スクランブル配列＃１：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号１８）
認識配列＃３：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１５）
認識配列＃４：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１６）
スクランブル配列＃２：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１９）。
【０３６８】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の例を以下に挙げる。
認識配列＃１：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２０）
認識配列＃２：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２１）
スクランブル配列＃１：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２２）
認識配列＃３：５’−ＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２３）
認識配列＃４：５’−ＧＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２４）
スクランブル配列＃２：５’−ＧＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２５）。
【０３６９】
代替阻害オリゴヌクレオチドのこのセットは（ＣＣＴＴＧ（配列番号１）コア配列と共に）ＰＡＸ２結合ドメイン及びホメオボックスの認識配列に相当する。これらの配列としてはＤＥＦＢ１プロモーターに由来する実際の配列が挙げられる。
【０３７０】
前立腺を含む各種癌細胞の増殖と生存にはＰＡＸ２遺伝子が必要である。更に、ＰＡＸ２発現の阻害は生得免疫成分ＤＥＦＢ１により介在される細胞死を生じる。ＤＥＦＢ１発現及び活性の抑制はＰＡＸ２蛋白質とＤＥＦＢ１プロモーターにおけるＧＴＴＣＣ（配列番号２）認識部位の結合により行われる。従って、この経路は前立腺癌の治療に有効な治療ターゲットとなる。この方法において、配列はＰＡＸ２  ＤＮＡ結合部位と結合し、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１プロモーターの結合を遮断し、こうしてＤＥＦＢ１発現及び活性を可能にする。上記オリゴヌクレオチド配列及び実験は付加的ＰＡＸ２阻害薬の設計の例であり、そのモデルを実証するものである。
【０３７１】
ＧＴＴＣＣ配列(配列番号２)がインターロイキン−３、インターロイキン−４、インスリン受容体等に存在するならば、ＰＡＸ２はそれらの発現と活性も調節する。従って、本願に開示するＰＡＸ２阻害剤は前立腺炎や良性前立腺肥大（ＢＰＨ）等の炎症に特異的に関連する疾患を含む多数の他の疾患にも有用である。
【実施例７】
【０３７２】
ＤＥＦＢ１発現の低下は腫瘍形成増加を生じる。
機能低下マウスの作製：Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムは前立腺癌発生の基礎となる分子メカニズムの解明に有用であった。本実施例では、ＤＥＦＢ１  Ｃｒｅ条件付きＫＯを前立腺内の誘導破壊に使用する。ＤＥＦＢ１  Ｃｒｅ条件付きＫＯはＤＥＦＢ１コーディングエクソンを挟むｌｏｘＰ部位を含むターゲティングベクターを作製する段階と、このベクターを導入した標的ＥＳ細胞を作製する段階と、これらの標的ＥＳ細胞から生殖細胞系列キメラマウスを作製する段階を含む。ヘテロ接合体を前立腺特異的Ｃｒｅトランスジェニックと交配し、ヘテロ接合性インタークロスを使用して前立腺特異的ＤＥＦＢ１  ＫＯマウスを作製する。Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、Ｎ−ニトロソビス−２−オキソプロピルアミン（ＢＯＰ）、３，２Ｘ−ジメチル−４−アミノビフェニル（ＭＡＢ）及び２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ＰｈＩＰ）の４種類の遺伝毒性化合物は齧歯類で前立腺癌を誘導することが分かっている。前立腺腫及び前立腺癌誘導試験用として、ＤＥＦＢ１−トランスジェニックマウスに胃内投与又は静脈内注射によりこれらの発癌性化合物を投与する。組織学的、免疫組織学的、ｍＲＮＡ及び蛋白質解析により腫瘍増殖の相違と遺伝子発現変化について前立腺サンプルを試験する。
【０３７３】
ＧＯＦマウスの作製：ＰＡＸ２誘導型ＧＯＦマウスについては、ＰＡＸ２  ＧＯＦ（バイトランスジェニック）及び野生型（モノトランスジェニック）同腹仔に５週齢からドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を投与し、前立腺特異的ＰＡＸ２発現を誘導する。要約すると、ＰＲＯＢＡＳＩＮ−ｒｔＴＡモノトランスジェニックマウス（ｔｅｔ依存性ｒｔＴＡインデューサーの前立腺細胞特異的発現）を本発明のＰＡＸ２トランスジェニックレスポンダー系統と異種交配する。誘導のために、Ｄｏｘを飲料水に混ぜてバイトランスジェニックマウスに与える（週に２回新たに調製して５００ｍｇ／Ｌを与える）。初期実験でバイトランスジェニックマウスにおけるトランスジェニックファウンダー系統を使用し、低バックグラウンドレベル、良好な誘導性及びＰＡＸ２とＥＧＦＰレポーターの細胞型特異的発現を確認する。実験群サイズについては、各群（野生型とＧＯＦ）で年齢と性別を一致させた個体５〜７匹とすることにより統計的有意性を判断することができる。本試験の全動物について、まず解析と比較のために週１回の間隔で前立腺組織を採取し、発癌時間パラメーターを調べる。
【０３７４】
ＰＣＲジェノタイピング、ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲ：ＰＲＯＢＡＳＩＮ−ｒｔＴＡトランスジェニックマウスは以下のＰＣＲプライマー及び条件を使用してジェノタイピングする。
ＰＲＯＢＡＳＩＮ５（フォワード）５’−ＡＣＴＧＣＣＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＣ−３’（配列番号２６）；
ＲＴＴＡ３（リバース）５’−ＡＡＡＡＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＣ−３’（配列番号２７）；
９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル後、７２℃で５分間伸長させ、６００ｂｐ産物を得る。ＰＡＸ２誘導型トランスジェニックマウスは以下のＰＣＲプライマー及び条件を使用してジェノタイピングする。
ＰＡＸ２Ｆｏｒ  ５’−ＧＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号２８）；
Ｒｅｖ５’ＩＲＥＳ  ５’−ＴＡＡＣＡＴＡＴＡＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧ−３’（配列番号２９）；
９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で３０秒を３４サイクル後、７２℃で５分間伸長させ、４６０ｂｐ産物を得る。Ｉｍｍｏｒｔｏｍｏｕｓｅヘミ接合体は以下のＰＣＲプライマー及び条件を使用してジェノタイピングする。
Ｉｍｍｏｌｌ，５’−ＧＣＧＣＴＴＧＴＧＴＣ  ＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴＴＣ−３’（配列番号３０）；
Ｉｍｍｏｌ２，５’−ＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号３１）；
９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で分３０秒を３０サイクル実施し、〜１ｋｂトランスジーンバンドを得る。ＰＡＸ２ノックアウトマウスのジェノタイピングには、以下のＰＣＲプライマー及び条件を使用する。
ＰＡＸ２  Ｆｏｒ  ５’−ＧＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号３２）；
ＰＡＸ２  Ｒｅｖ  ５’−ＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＣ−３’（配列番号３３）；
９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で３０秒を３６サイクル実施し、２８０ｂｐバンドを得る。
【０３７５】
ＤＥＦＢ１ペプチド動物試験：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した６週齢雄性胸腺欠損（ヌード）マウスに生存ＰＣ３細胞１０６個を肩甲骨上に皮下注射する。注射から１週間後に、グループＩ：対照；グループＩＩ：１００μｇ／日のＤＥＦＢ１を週に５日ずつ２〜１４週間腹腔内注射；グループＩＩＩ：１００ｍｇ／日のＤＥＦＢ１を週に５日ずつ８〜１４週間腹腔内注射の３群の１つに動物をランダムに割り当てる。動物を４匹ずつ無菌檻に入れて飼育し、毎日観察する。１０日おきにカリパーを使用して腫瘍を測定し、Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を使用することにより腫瘍の体積を計算する。
【０３７６】
【表２】
0005653042.tif 000003
【０３７７】
【表３】
0005653042.tif 000004
【０３７８】
【表４】
0005653042.tif 000005
【実施例８】
【０３７９】
上皮内腫瘍及び癌の化学予防のためのＰＡＸ２発現ターゲティング
要約
突然変異の蓄積と細胞制御機能の低下は正常組織から上皮内腫瘍（ＩＥＮ）等の初期前癌への進行性表現型変化を引き起こし、徐々に重度のＩＥＮとなり、表在癌へと進行し、最終的に浸潤性疾患に至る。このプロセスは比較的急速進行性の場合もあるが、一般には数年間から数十年にわたって比較的ゆっくりと進行する。Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎらにより記載されているように、癌遺伝子依存は癌細胞が悪性表現型を維持するために単一癌遺伝子の持続活性化又は過剰発現に生理的に依存することである。この依存は腫瘍進行を特徴付ける他の変化の環境で生じる。癌細胞が増殖と細胞生存のためにＰＡＸ２癌遺伝子に依存・依拠するのはこのような１例である。逆に、ＰＡＸ２により転写抑制されるＤＥＦＢ１等の腫瘍サプレッサー遺伝子の不在も同様の前癌依存をもたらす。
【０３８０】
癌化学予防は癌の予防又は前癌状態もしくはそれ以前の治療として定義される。浸潤癌に至るまでの進行期間が長いことは大きな科学的チャンスであるが、候補化学予防薬の臨床効果の顕在を妨げる経済的障害でもある。従って、近年の化学予防薬開発研究の重要な要素は薬剤の臨床効果又は癌発生率低減効果を正確に予測する（癌よりも）早期のエンドポイント又はバイオマーカーを同定することであった。前立腺等の多くの癌では、ＩＥＮが早期エンドポイントである。ＰＡＸ２／ＤＥＦＢ１経路がＩＥＮ中と恐らくもっと早期の組織病理段階でも調節解除されるならば、強力な予測バイオマーカーとなり、癌の化学予防のすぐれたターゲットとなる。ＰＡＸ２を抑制し、ＤＥＦＢ１発現を増加し、前立腺癌の化学予防剤として有用であると思われる多数の化合物を示す。
【０３８１】
背景
ＰＡＸ遺伝子は細胞増殖とアポトーシスを制御し、前立腺癌における強力な生存シグナルとなる転写因子及び遺伝子の構造変化により原癌遺伝子として作用することができる。更に、数種類の癌が異常ＰＡＸ２発現をもつことが示されている（図１８）。アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）は血圧と心臓血管系恒常性の主要なレギュレーターであり、強力なマイトジェンとして認められている。ＡｎｇＩＩはＧ蛋白質共役受容体のスーパーファミリーに属するが、異なる組織分布と細胞内シグナル伝達経路をもつ２種類の受容体サブタイプであるアンジオテンシンタイプＩ受容体（ＡＴ１Ｒ）及びアンジオテンシンタイプＩＩ受容体（ＡＴ２Ｒ）と結合することによりその生物学的作用を発揮する。血圧に及ぼすその作用に加え、ＡｎｇＩＩは創傷治癒等の組織リモデリング、心臓肥大及び発生に関連する各種病理状況で役割を果たすことが示されている。実際に、最近の研究によると、前立腺を含む各種癌細胞及び組織におけるレニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の数種類の成分の局所発現が明らかになっている。ＡＴ１Ｒのアップレギュレーションはアポトーシスと増殖調節因子を避けるように学習した癌細胞に対して著しく有利である。
【０３８２】
本試験は前立腺癌におけるＰＡＸ２癌遺伝子のアップレギュレーションがＲＡＳシグナル伝達の調節解除に起因することを実証する。ＰＡＸ２発現はアンジオテンシンタイプＩ受容体を介するＥＲＫ１／２シグナル伝達経路により調節される。更に、ＡＴ１Ｒをロサルタン（Ｌｏｓ）で遮断すると、ＰＡＸ２発現が抑制される。更に、ＡＭＰＫアクチベーターであるＡＩＣＡＲが潜在的ＰＡＸ２阻害剤として有望であることも分かっている。総合すると、これらの試験はこれらの分類の薬剤がＰＡＸ２発現の潜在的サプレッサーであり、最終的に新規化学予防剤として利用できることを強く示唆するものである（表５）。癌の数を数えるとＰＡＸ２を異常に発現することが示された。標的ＰＡＸ２発現を介する化学予防が癌関連死に有意な影響を有している可能性がある。
【０３８３】
【表５】
0005653042.tif 000006
【０３８４】
材料と方法
細胞培養：細胞株ＤＵ１４５はＤＭＥＭ培地で培養し、ＰＣ３はＦ１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で増殖させた。全３種類の株の増殖培地には１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。ｈＰｒＥＣ細胞は前立腺上皮基礎培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で培養した。全細胞株は３７℃で５％ＣＯ２下に維持した。
【０３８５】
試薬と処理：５もしくは１０ｕＭのＡｎｇＩＩ、５ｕＭのＡＴＲ１アンタゴニストＬｏｓ、５ｕＭのＡＴＲ２アンタゴニストＰＤ１２３３１９、２５ｕＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６、２０ｕＭのＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９又は２５０μＭのＡＭＰキナーゼインデューサーＡＩＣＡＲで細胞を処理した。
【０３８６】
ウェスタン解析：要約すると、細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。溶解用緩衝液を製造業者の指示（Ｓｉｇｍａ）に従って調製した後、細胞に加えた。オービタルシェーカーで４℃にて１５分間インキュベーション後、細胞溶解液を採取し、１０分間１２０００×ｇで遠心し、細胞破片をペレット化した。次に、蛋白質を含有する上清を採取し、定量した。次に、蛋白質抽出物２５μｇを８−１６％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）にロードした。電気泳動後、蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した後、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）中５％脱脂粉乳で１時間ブロックした。次に１０００〜２０００倍に希釈した一次抗体（抗ＰＡＸ２、抗ホスホ−ＰＡＸ２、抗ＪＮＫ、抗ホスホ−ＪＮＫ、抗ＥＲＫ１／２、又は抗ホスホ−ＥＲＫ１／２）（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）でブロットをプロービングした。洗浄後、西洋ワサビペルオキダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ウサギ抗体（５０００倍希釈；Ｓｉｇｍａ）と共に膜をインキュベートし、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８９００で化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗β−アクチン一次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とＨＲＰ標識抗マウス二次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でリプロービングし、再びシグナル検出を可視化した。
【０３８７】
ＱＲＴ−ＰＣＲ解析：ＰＣ３及びＤＵ１４５前立腺癌細胞株とｈＰｒＥＣ正常前立腺上皮細胞におけるＰＡＸ２ノックダウン後の遺伝子発現の変化を検証するために、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。細胞約１×１０６個をトリプシン処理により回収し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に細胞を溶解させ、ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してスピンカラムで遠心することにより全ＲＮＡを単離した。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、第１鎖合成用としてＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＩＩ酵素（反応当たり５００Ｕ；Ｐｒｏｍｅｇａ）と、第２鎖合成用としてＴｆｌ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（反応当たり５００Ｕ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコールに従って使用して逆転写によりｃＤＮＡを作製した（反応当たり０．５μｇ）。一般に、後続ＰＣＲ反応毎に各ｃＤＮＡ５０ｐｇを使用した。ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社製品のＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐａｔａｓｅとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作製したｃＤＮＡで２段階ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応を実施した。６０℃のアニーリング温度を使用して標準条件下にＰＣＲ４０サイクルを実施した。指数的増幅が開始したサイクル数（閾値）により定量を行い、３回反復から得られた値から平均した。メッセージレベルと閾値の間には逆関係があった。更に、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した。各遺伝子とＧＡＰＤＨの比として相対発現を計算した。全反応は３本ずつ実施した。
【０３８８】
チミジン取り込み：［３Ｈ］チミジンリボチド（［３Ｈ］ＴｄＲ）のＤＮＡ取り込みにより細胞増殖を測定した。懸濁ＤＵ１４５細胞０．５×１０６個／ウェルをその適当な培地に撒いた。細胞を指定濃度のＡｎｇＩＩの存在下又は不在下で７２時間インキュベートした。細胞を同一培地中で３７ｋＢｑ／ｍｌ［メチル−３Ｈ］チミジンと６時間接触させた。接着細胞を５％トリクロロ酢酸により固定し、ＳＤＳ／ＮａＯＨ溶解用緩衝液で一晩溶解させた。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ３８０１液体シンチレーションカウンター（Ｃａｎａｄａ）により放射能を測定した。懸濁細胞培養物をセルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）により回収し、１４５０マイクロベータ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により放射能を測定した。
【０３８９】
統計解析：対応のない値のスチューデントのｔ検定を使用して統計的差を求めた。両側計算によりＰ値を求め、０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
【０３９０】
結果
ＤＵ１４５前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２発現に及ぼすＡｎｇＩＩの影響を調べるために、３０分〜４８時間かけてＡｎｇＩＩで処理後にＰＡＸ２発現を試験した。図１９に示すように、ＰＡＸ２発現はＡｎｇＩＩ処理後に累進的に増加した。ＤＵ１４５をＬｏｓで処理することによりＲＡＳシグナル伝達を遮断すると、ＰＡＸ２発現は有意に低下した（図２０Ａ）。この場合、ＰＡＸ２発現は未処理対照ＤＵ１４５細胞に比較して４８時間Ｌｏｓ処理後に３７％であり、７２時間後では５０％であった（図２１）。ＡＴ２Ｒ受容体がＡＴ１Ｒの作用を妨害することは知られている。従って、ＰＡＸ２発現に及ぼすＡＴ２Ｒ受容体の遮断効果を検討した。ＤＵ１４５をＡＴ２Ｒ拮抗薬ＰＤ１２３３１９で処理すると、４８時間処理後にＰＡＸ２発現は７倍に増加し、９６時間処理後に８倍に増加した（図２０Ｂ）。総合すると、これらの知見から、ＰＡＸ２発現はＡＴＲ１受容体により調節されることが明らかである。
【０３９１】
ＡｎｇＩＩがＭＡＰＫとＳＴＡＴ３のリン酸化のＡＴ１Ｒ介在性活性化により前立腺癌細胞の増殖に調節影響することは知られている。ＤＵ１４５をＡｎｇＩＩで処理すると、増殖率は２〜３倍に増加した（図２１）。他方、Ｌｏｓで処理すると、増殖率は５０％低下した。更に、Ｌｏｓで３０分間前処理することによりＡＴ１Ｒ受容体を遮断すると、増殖に及ぼすＡｎｇＩＩの影響は抑制された。
【０３９２】
ＰＡＸ２発現及び活性化の調節におけるＡＴ１Ｒシグナル伝達の役割を更に検討するために、ＰＡＸ２発現に及ぼすＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の各種成分の遮断効果を試験した。この場合、ＤＵ１４５細胞をＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６で処理すると、ＰＡＸ２発現は有意に低下した（図２２）。更に、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９で処理した場合もＰＡＸ２は低下した。ＤＵ１４５細胞をＬｏｓで処理してもＥＲＫ蛋白質レベルには何の影響もなかったが、ホスホ−ＥＲＫの量が減少した（図２３Ａ）。他方、ＤＵ１４５をＬｏｓで処理すると、ＰＡＸ２発現は有意に低下した。Ｕ０１２６とＰＤ９８０５９でも同様の結果が認められた。ＰＡＸ２発現がＥＲＫの下流のターゲットであるＳＴＡＴ３により調節されることも知られている。ＤＵ１４５をＬｏｓ、Ｕ０１２６、及びＰＤ９８０５９で処理すると、ホスホ−ＳＴＡＴ３蛋白質レベルは低下した（図２３Ｃ）。これらの結果から、ＰＡＸ２は前立腺癌細胞においてＡＴ１Ｒを介して調節されることが明らかである。
【０３９３】
更に、ＪＮＫによるＰＡＸ２活性化に及ぼすＡＴ１Ｒシグナル伝達の影響を検討した。ＤＵ１４５をＬｏｓ、Ｕ０１２６、及びＰＤ９８０５９で処理すると、いずれもホスホ−ＰＡＸ２蛋白質レベルは有意に低下するか又は抑制された（図２４Ａ）。他方、ＬｏｓとＵ０１２６ではホスホ−ＪＮＫ蛋白質レベルは低下しなかった（図２４Ｂ）。従って、ホスホ−ＰＡＸ２の低下はＰＡＸ２レベルの低下に起因するものであり、リン酸化の低下に起因するものではないと思われる。
【０３９４】
５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−４−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）はエネルギー恒常性と代謝ストレスに対する応答を調節するＡＭＰ−キナーゼアクチベーターとして広く使用されている。最近の報告では薬物又はＡＭＰＫ過剰発現を使用して活性化ＡＭＰＫの抗増殖及びプロアポトーシス作用が示されている。ＡＭＰＫ活性化はヒト胃癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌、膵臓細胞、及び肝臓癌細胞でアポトーシスを誘導し、脂肪酸シンターゼ経路の阻害や、ストレスキナーゼ及びカスパーゼ３の誘導を含む各種メカニズムにより、マウス神経芽細胞腫において酸化性ストレスにより誘導されるアポトーシスを増進することが示されている。更に、ＰＣ３前立腺癌細胞を処理すると、ｐ２１、ｐ２７、及びｐ５３蛋白質の発現と、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の阻害が増加した。これらの全経路はＰＡＸ２により直接又は間接的に調節される。前立腺癌細胞をＡＩＣＡＲで処理すると、ＰＡＸ２発現（図２３Ｂ）とその活性化形態であるホスホ−ＰＡＸ２（図２４Ａ）が抑制された。更に、ＰＡＸ２発現を調節するホスホ−ＳＴＡＴ３も抑制された（図２３Ｃ）。
【０３９５】
最後に、ＰＡＸ２のアップレギュレーションと過剰発現をもたらす異常ＲＡＳシグナル伝達はＤＥＦＢ１腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制すると仮定される。これを調べるために、正常前立腺上皮一次培養ｈＰｒＥＣをＡｎｇＩＩで処理し、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現レベルを試験した。前立腺癌細胞に対して正常前立腺細胞ではＤＥＦＢ１とＰＡＸ２の発現の間に逆関係が認められた。未処理ｈＰｒＥＣはＰＣ３前立腺癌細胞における発現に対して１０％の相対ＰＡＸ２発現を示した。逆に、未処理ＰＡＸ２はｈＰｒＥＣにおける発現に比較して２％の相対ＤＥＦＢ１発現しか示さなかった。１０ｕＭのＡｎｇＩＩで７２時間処理後に、ＤＥＦＢ１発現は未処理ｈＰｒＥＣに比較して３５％低下し、９６時間までにＤＥＦＢ１発現は未処理ｈＰｒＥＣ細胞に比較して５０％低下した。他方、ＰＡＸ２発現は未処理ｈＰｒＥＣ細胞に比較して７２時間で６６％増加し、９６時間までにＰＡＸ２発現は７９％増加した。更に、７２時間後のｈＰｒＥＣにおけるＰＡＸ２発現の増加はＰＣ３前立腺癌細胞で観察されるＰＡＸ２レベルの７７％であった。９６時間のＡｎｇＩＩ処理後に、ＰＡＸ２発現はＰＣ３におけるＰＡＸ２発現の８９％であった。これらの結果から、調節解除されたＲＡＳシグナル伝達は前立腺細胞においてＰＡＸ２発現のアップレギュレーションによりＤＥＦＢ１発現を抑制することが明らかである。
【０３９６】
考察
レニン−アンジオテンシン系ＡｎｇＩＩは血圧と心臓血管系恒常性の主要なレギュレーターであり、強力なマイトジェンとして認められている。ＡｎｇＩＩはＧ蛋白質共役受容体のスーパーファミリーに属するが、異なる組織分布と細胞内シグナル伝達経路をもつ２種類の受容体サブタイプであるＡＴ１Ｒ及びＡＴ２Ｒと結合することによりその生物学的作用を発揮する。ＡＴ１のアップレギュレーションはアポトーシスと増殖調節因子を避けるように学習した癌細胞に対して著しく有利である。更に、前立腺癌組織では正常ヒト前立腺における発現レベルに比較してＡＴ１Ｒの発現増加が検出されている。
【０３９７】
ＡＴ１Ｒが増殖因子刺激に通常結び付けられる蛋白質キナーゼの各種細胞内カスケードを活性化することにより、ヒト癌細胞を含む各種細胞モデルで細胞増殖を誘導することは現在定説である。最も特筆すべき点として、ＡＴ１Ｒは前立腺癌細胞においてＥＧＦＲをトランス活性化し、細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性化、シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）のリン酸化をもたらす。ＥＧＦＲ増幅は腫瘍進行に結び付けられることが多いので、ＥＧＦＲのＡＴ１Ｒ介在性トランス活性化は特に癌に関係がある。実際に、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃ，Ｉｎｃ．）等のＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体を使用して効率的な抗癌ストラテジーが現在開発中である。
【０３９８】
最近では抗高血圧薬が抗癌治療に役割を果たすのではないかという点に関心が集まっている。例えば実験動物モデルでＡＣＥを使用した結果、腫瘍発生に対するこれらの薬剤の保護作用が明らかになっている。また、いずれもＡＴ１ＲアンタゴニストであるＬｏｓとカンデサルタンはヒト前立腺癌細胞の異種移植モデルで腫瘍増殖と血管新生を低減することが示されている。更に、良性前立腺肥大でＡＣＥのアップレギュレーションが検出されている。ＰＡＸ２はＰＩＮと前立腺癌をもつ患者の良性領域でアップレギュレートされた。従って、ＰＡＸ２は前立腺癌の病態生理における開始イベントであり、前立腺癌発生の予防の有効な化学予防ターゲットとなり得ると思われる。
【０３９９】
アポトーシスの抑制は前立腺癌の発生を助長する重要な病態生理学的因子である。癌治療は著しく前進しているが、進行型疾患の治療はいまだに殆ど進歩していない。発癌は多層、多段階、多経路で進行する疾患であるため、このプロセスを阻害、遅延、又は逆行させるための薬剤又は他の物質の使用による化学予防が癌研究の非常に有望な分野であると認められている。前立腺癌の化学予防用薬剤治療の成功には、癌発生の抑制を総合目標として、宿主への臨床作用を最小限に維持しながら標的細胞に特異的作用のある治療薬を使用する必要がある。従って、特定治療の効力を判定するには、早期ステージ癌発生におけるメカニズムの解明が不可欠である。異常ＰＡＸ２発現とそのアポトーシス抑制とそれに伴う腫瘍形成促進の重要性に鑑みると、ＰＡＸ２は前立腺癌治療の適切なターゲットとなり得ると考えられる。ＰＡＸ２は前立腺癌においてＡＴ１Ｒにより調節された（図２６）。この場合には、ＲＡＳシグナル伝達の調節解除の結果としてＰＡＸ２癌遺伝子発現が増加し、ＤＥＦＢ１腫瘍サプレッサーの発現が低下した。従って、ＡＴ１Ｒアンタゴニストを使用すると、ＰＡＸ２発現が低下し、ＤＥＦＢ１の再発現により前立腺癌細胞死が増加する（図２７）。これらの結果はレニン−アンジオテンシンシグナル伝達経路、ＡＭＰキナーゼ経路、又はＰＡＸ２蛋白質の不活性化（即ち抗ＰＡＸ２抗体ワクチン接種）を伴う他の方法によるＰＡＸ２発現ターゲティングが癌予防の有効なターゲットとなり得るという新規知見を提供する（表７）。
【０４００】
【表６】
0005653042.tif 000007
【実施例９】
【０４０１】
前立腺組織の等級付けツール及び前立腺癌発生の予測因子としてのＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現レベル
材料と方法
ＱＲＴ−ＰＣＲ解析：根治的前立腺摘除術を受けた患者から前立腺切片を採取した。病理試験後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを実施し、正常、増殖性上皮内腫瘍（ＰＩＮ）及び癌組織の領域を単離した。先述のようにＱＲＴ−ＰＣＲを実施し、発現を判定した。各領域とＧＡＰＤＨにおけるＤＥＦＢ１及びＰＡＸ２発現を内部対照として使用した。
【０４０２】
採血及びＲＮＡ単離：ＱＲＴ−ＰＣＲ用として、各個体からの血液（２．５ｍｌ）を製造業者のプロトコールに従ってＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ（ＱＩＡＧＥＮ）に採取した。全血をＰＡＸ遺伝子安定化試薬と十分に混合し、ＲＮＡ抽出まで６時間室温で保存した。次に、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキットを製造業者の指示（ＱＩＡＧＥＮ）に従って使用して全ＲＮＡを抽出した。汚染性ゲノムＤＮＡを除去するために、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍスピンカラムに吸着した全ＲＮＡサンプルをＤＮａｓｅ  Ｉ（ＱＩＡＧＥＮ）と共に２５℃で２０分間インキュベートし、ゲノムＤＮＡを除去した。全ＲＮＡを溶出させ、定量し、先述のようにＱＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比を比較した。
【０４０３】
結果
ＬＣＭ正常組織のＱＲＴ−ＰＣＲ解析によると、相対ＤＥＦＢ１発現レベルが０．００５を上回る患者は発現レベルが０．００５未満の患者に比較してグリーソンスコアが低いことが実証された（図２８Ａ）。従って、ＤＥＦＢ１発現とグリーソンスコアの間には逆関係がある。逆に、悪性前立腺組織とＰＩＮではＰＡＸ２発現とグリーソンスコアの間に正相関があった（図２８Ｂ）。
【０４０４】
別個の患者からの正常、ＰＩＮ及び癌性組織におけるＰＡＸ２及びＤＥＦＢ１発現レベルを計算し、比較した（図２９）。全般に、ＧＡＰＤＨ内部対照に対するＰＡＸ２発現レベルは正常（良性）組織で０〜０．２であり、ＰＩＮで０．２〜０．３であり、癌性（悪性）組織で０．３〜０．５であった（図３０）。ＤＥＦＢ１では、ＰＡＸ２に対して逆の関係があった。この場合、ＧＡＰＤＨ内部対照に対するＤＥＦＢ１発現レベルは正常（良性）組織で０．０６〜０．００５であり、ＰＩＮで０．００５〜０．００３であり、癌性（悪性）組織で０．００３〜０．００１であった。従って、ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比を良性、前癌（ＰＩＮ）及び悪性前立腺組織の予後予測因子として利用する予測スケール（ＤＰＦ）を開示する。ＤＰＦによるＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比が０〜３９の組織は正常（病理的に良性）に相当する。ＤＰＦスケールによるＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比が４０〜９９の組織はＰＩＮ（前癌）に相当する。最後に、ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比が１００〜５００の組織は悪性（低〜高グレード癌）となる。
【０４０５】
結論
現在、前立腺癌発生の予測バイオマーカーが緊急に必要とされている。前立腺癌の発症は疾患がＰＳＡ試験やデジタル直腸試験等の現在のスクリーニング法により検出可能になるよりもずっと以前に起きていることが知られている。前立腺癌の進行と初期発症をモニターする確実な試験があるならば、より有効な疾患管理により死亡率を大幅に低下できると考えられる。本願では医師が前立腺の病理状態を予め熟知できるようにするための予測指数を開示する。ＤＰＦは前立腺疾患進行に結び付けられるＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比の低下を測定する。この強力な手段は前立腺癌を発症している患者の確率を予測できるのみならず、悪性になる前の癌の初期発症を突き止めることもできる。最終的に、このツールにより、医師はより急速進行性の疾患をもつ患者をそうでない患者から区別することができる。
【０４０６】
癌特異的マーカーの同定は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の同定を助長するために利用されている。末梢血中の播種性腫瘍細胞の検出により、腫瘍ステージング、予後予測、及びアジュバント治療の有効性の初期評価の代用マーカーの同定に臨床的に重要なデータを提供できることを実証する証拠も現れつつある。更に、全循環細胞の遺伝子発現プロファイリングを比較することにより、夫々前立腺癌の早期検出の予後予測因子として「免疫監視」及び「癌生存」において役割を果たすＤＥＦＢ１及びＰＡＸ２遺伝子の発現を試験することができる。
【実施例１０】
【０４０７】
宿主防御ペプチドヒトβディフェンシン１の機能解析：癌におけるその潜在的役割の新規洞察
材料と方法
細胞培養：前立腺癌細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＤＵ１４５細胞はＤＭＥＭ培地で培養し、ＰＣ３とＰＣ３／ＡＲ＋はＦ１２培地で増殖させ、ＬＮＣａＰはＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で増殖させた。全３種類の株の増殖培地には１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。ｈＰｒＥＣ一次培養物はＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、細胞を前立腺上皮基礎培地で増殖させた。全細胞は３７℃で５％ＣＯ２下に維持した。
【０４０８】
組織サンプルとレーザーキャプチャーマイクロダイセクション：前立腺組織はインフォームドコンセント後に根治的前立腺摘除術を受けた患者から入手した。サンプルは治験審査委員会承認プロトコールに従い、ホリングス癌センター腫瘍バンクを通して入手した。このプロトコールはサンプルの処理、切片作成、組織学的特性決定、ＲＮＡ精製及びＰＣＲ増幅のガイドラインを含むものであった。外科医と病理学者から受け取った前立腺検体をすぐにＯＣＴ化合物で凍結させた。各ＯＣＴブロックを切断して連続切片を作成し、染色及び試験した。良性細胞、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、及び癌を含む領域を同定し、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  ＰｉｘＣｅｌｌ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して未染色スライドから本願の領域選択を誘導するために使用した。捕捉した材料を含むキャップをＡｒｃｔｕｒｕｓ  Ｐｉｃｏ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔからの溶解液２０μｌと接触させ、すぐに処理した。５’アンプリコンを生成するプライマーセットを使用してＲＮＡ量と品質を検討した。プライマーセットはリボソーム蛋白質Ｌ３２（３’アンプリコンから５’アンプリコンまでの間隔は２９８塩基）、グルコースリン酸イソメラーゼ（３９１塩基間隔）、及びグルコースリン酸イソメラーゼ（８４２塩基間隔）のセットを含む。作製した各種組織からのサンプルを使用してこれらのプライマーセットで常に０．９５〜０．８０の比が得られた。付加的な腫瘍サンプルと正常サンプルも病理学者に肉眼的に切除してもらい、液体窒素で瞬間凍結させ、ｈＢＤ−１及びｃＭＹＣ発現について検討した。
【０４０９】
ｈＢＤ−１遺伝子のクローニング：公開ｈＢＤ−１配列（アクセション番号Ｕ５０９３０）（Ｇａｎｚ，２００４）から作製したプライマーを使用して逆転写ＰＣＲによりＲＮＡからｈＢＤ−１  ｃＤＮＡを作製した。ＰＣＲプライマーはＣｌａＩ及びＫｐｎＩ制限部位を含むように設計した。ｈＢＤ−１  ＰＣＲ産物をＣｌａＩとＫｐｎＩで制限消化し、ＴＡクローニングベクターにライゲーションした。次にＴＡ／ｈＢＤｌベクターを熱ショックにより大腸菌のＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株にトランスフェクトし、個々のクローンを選択し、増殖させた。プラスミドをＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により単離し、自動シーケンシングにより配列完全性を検証した。次に、ＣｌａＩとＫｐｎＩで消化したｐＴＲＥ２を方向決定用の中間ベクターとして利用し、これにｈＢＤ−１遺伝子フラグメントをライゲーションした。ｐＴＲＥ２／ｈＢＤ−１構築物をＡｐａＩとＫｐｎＩで消化してｈＢＤ−１インサートを切り出した。同様にＡｐａＩとＫｐｎＩで二重消化したエクジソン誘導発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のｐＩＮＤベクターにインサートをライゲーションした。構築物を大腸菌にトランスフェクトし、個々のクローンを選択し、増殖させた。プラスミドを単離し、再び自動シーケンシングによりｐＩＮＤ／ｈＢＤ−１の配列完全性を検証した。
【０４１０】
トランスフェクション：細胞（１×１０６個）を１００ｍｍシャーレに撒き、一晩増殖させた。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、ヘテロダイマーエクジソン受容体を発現するｐＶｇＲＸＲプラスミド１μｇと、ｐＩＮＤ／ｈＢＤ−１ベクター構築物又はｐＩＮＤ／β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）対照ベクター１μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で希釈して細胞に同時トランスフェクトした。β−ｇａｌ発現をポナステロンＡ（ＰｏｎＡ）で誘導し、細胞をβ−ガラクトシダーゼ検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することによりトランスフェクション効率を測定した。陽性染色（青）コロニーを計数することによりトランスフェクション効率を調べた処、これらの細胞株では細胞の６０〜８５％がβ−ガラクトシダーゼを発現することが判明した。
【０４１１】
免疫細胞化学：ｈＢＤ−１蛋白質発現を検証するために、ＤＵ１４５及びｈＰｒＥＣ細胞を２穴チャンバー培養スライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）にチャンバー当たり細胞１．５〜２×１０４個の割合で撒いた。ｐｖｇＲＸＲ単独（対照）又はｈＢＤ−１プラスミドをトランスフェクトしたＤＵ１４５細胞を、１０μＭ  ＰｏｎＡを加えた培地で１８時間誘導し、トランスフェクトしない細胞には新鮮な増殖培地を加えた。誘導後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１時間室温にて固定した。次に細胞を１×ＰＢＳで６回洗浄し、２％ＢＳＡ、０．８％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）及び０．４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を加えた１×ＰＢＳで１時間室温にてブロックした。次に、ブロッキング溶液で１０００倍に希釈した一次ウサギ抗ヒトＢＤ−１ポリクローナル抗体（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）中で細胞を一晩インキュベートした。この後、細胞をブロッキング溶液で６回洗浄し、ブロッキング溶液で１０００倍に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体中で１時間室温にてインキュベートした。細胞をブロッキング溶液で６回洗浄後、カバースリップにＧｅｌ  Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をマウントした。最後に、細胞を微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）と４８８ｎｍレーザー励起により観察した。６３倍ＤＩＣオイルレンズとＶａｒｉｏ  ２  ＲＧＢレーザー走査モジュールを併用して共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）により蛍光シグナルを解析した。デジタル画像を画像処理とハードコピー表示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にエクスポートした。
【０４１２】
ＲＮＡ単離及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ：従来記載されているようにＱＲＴ−ＰＣＲを実施した（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。要約すると、ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して組織切片からの全ＲＮＡ（反応当たり０．５μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社製品のＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して作製したｃＤＮＡで２段階ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。公開配列からｈＢＤ−１とｃ−ＭＹＣのプライマー対を作製した（表７）。ｈＢＤ−１とｃ−ＭＹＣには５６．４℃、ＰＡＸ２には５５℃のアニーリング温度を使用して標準条件下にＰＣＲ４０サイクルを実施した。更に、ハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチン（表７）を増幅し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した。良性前立腺組織サンプルにおける遺伝子発現をβ−アクチンに対する発現比として計算した。誘導前後の悪性前立腺組織、ｈＰＲＥＣ前立腺一次培養物、及び前立腺癌細胞株におけるｈＢＤ−１発現レベルをｈＰｒＥＣ細胞におけるｈＢＤ−１発現の平均レベルに対して計算した。陰性対照として、ｃＤＮＡ鋳型を使用しないＱＲＴ−ＰＣＲ反応も実施した。全反応は最低３回実施した。
【０４１３】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ：細胞増殖に及ぼすｈＢＤ−１の影響を試験するために、代謝３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施した。ｐｖｇＲＸＲプラスミドとｐＩＮＤ／ｈＢＤ−１構築物又は対照ｐｖｇＲＸＲプラスミドを同時トランスフェクトしたＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３及びＰＣ３／ＡＲ＋細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１〜５×１０３個の割合で撒いた。播種後２４時間から、１０μＭ  ＰｏｎＡを加えた新鮮な増殖培地を毎日加え、ｈＢＤ−１発現を２４時間、４８時間及び７２時間誘導した後に、製造業者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＭＴＴアッセイを実施した。反応は３本ずつ３回実施した。
【０４１４】
膜完全性の解析：アクリジンオレンジ（ＡＯ）／臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）二重染色を実施し、細胞膜完全性の変化と濃縮クロマチン染色によるアポトーシス細胞を確認した。ＡＯは生存細胞と初期アポトーシス細胞を染色し、ＥｔＢｒは膜が損傷した後期ステージアポトーシス細胞を染色する。要約すると、ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞を２穴チャンバー培養スライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に撒いた。空のプラスミド又はｈＢＤ−１プラスミドをトランスフェクトした細胞を、１０μＭ  ＰｏｎＡを加えた培地で２４時間又は４８時間誘導し、対照細胞には各時点で新鮮な増殖培地を加えた。誘導後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＡＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とＥｔＢｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（５μｇ／ｍｌ）の混液（１：１）２ｍｌで５分間染色し、再びＰＢＳで洗浄した。
【０４１５】
Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ  Ｖａｒｉｏ  ２共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）により蛍光を観察した。励起カラーホイールはＢＳ５０５−５３０（緑）及びＬＰ５６０（赤）フィルターブロックを含み、ＡＯからの緑色発光とＥｔＢｒからの赤色発光を緑色チャネルと赤色チャネルに分離することができた。各実験内のレーザー出力及び利得制御設定は対照とｈＢＤ−１誘導細胞で同一とした。ＡＯは５４３ｎｍ、ＥｔＢｒは４８８ｎｍの波長のＫｒ／Ａｒ混合ガスレーザーにより励起した。スライドを４０倍の倍率で解析し、デジタル画像を無圧縮デシタルＴＩＦＦファイルとして保存し、画像処理とハードコピー表示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にエクスポートした。
【０４１６】
【表７】
0005653042.tif 000008
【０４１７】
フローサイトメトリー：ｈＢＤ−１発現システムを同時トランスフェクトしたＰＣ３及びＤＵ１４５細胞を６０ｍｍ皿で増殖させ、１０μＭ  ＰｏｎＡで１２時間、２４時間、及び４８時間誘導した。各インキュベーション時間後、（剥がれた細胞を保持するために）培地をプレートから採取し、プレートを洗浄するために使用したＰＢＳと合わせた。残りの付着した細胞をトリプシン処理により回収し、剥がれた細胞とＰＢＳと合わせた。次に細胞を４℃（５００×ｇ）で５分間ペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ  ５μｌとＰＩ  ５μｌを加えた１×アネキシン結合緩衝液（０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ，ｐＨ７．４，１．４Ｍ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＣａＣｌ２）１００ｕｌに再懸濁した。細胞を暗所で室温にて１５分間インキュベートした後、１×アネキシン結合緩衝液４００μｌで希釈し、ＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により解析した。全反応は３回実施した。
【０４１８】
カスパーゼ検出：ＡＰＯ  ＬＯＧＩＸ（登録商標）カルボキシフルオレセインカスパーゼ検出キット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を行った。活性カスパーゼと不可逆的に結合するカルボキシフルオレセイン標識ペプチドフルオロメチルケトン（ＦＡＭＶＡＤ−ＦＭＫ）を利用して活性カスパーゼを検出した。要約すると、ｈＢＤ−１発現システムを導入したＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞（１．５〜３×１０５個）を３５ｍｍガラス底皿（Ｍａｔｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）に撒き、先述のように培地単独又はＰｏｎＡを加えた培地で２４時間処理した。次に、ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫの３０倍ワーキング希釈液１０μｌを培地３００μｌに加え、各３５ｍｍ皿に加えた。細胞を３７℃で５％ＣＯ２下に１時間インキュベートした。培地を吸引し、細胞を１倍ワーキング希釈液洗浄緩衝液２ｍｌで２回洗浄した。細胞を微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）又は４８８ｎｍレーザー励起により観察した。上記のように共焦点顕微鏡により蛍光シグナルを解析した。
【０４１９】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング：従来記載されているようにＳｉＲＮＡノックダウンと検証を実施した（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。要約すると、ヒトＰＡＸ２  ｍＲＮＡ（アクセション番号ＮＭ００３９８９．１）を標的とする４個の相補的ｓｉＲＮＡのプールを合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）。更に、４個の非特異的ｓｉＲＮＡの第２のプールを陰性対照として使用し、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの特異性を試験した。処理前にＳｉＲＮＡ分子を製造業者の指示に従ってＣｏｄｅＢｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）でコーティングした。
【０４２０】
統計解析：対応のない値のスチューデントのｔ検定を使用することにより統計解析を実施した。両側計算によりＰ値を求め、０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。統計的差をアステリスクにより示す。
【０４２１】
結果
前立腺組織におけるｈＢＤ−１発現：解析した前立腺癌凍結組織切片の８２％はｈＢＤ−１の発現を殆ど又は全く示さなかった（Ｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ｈＢＤ−１発現レベルを比較するために、ランダムに選択した悪性領域に隣接する正常前立腺組織の肉眼的切除又はＬＣＭにより得られた正常前立腺組織でＱＲＴＰＣＲ解析を実施した。この場合、肉眼的に切除した全正常臨床サンプルにおいて発現レベルの約６．６倍の差に相当する発現範囲でｈＢＤ−１が検出された（図３１Ａ）。ＬＣＭにより捕捉した正常組織サンプルは３２倍の発現差に相当する範囲のレベルでｈＢＤ−１を発現した（図３１Ｂ）。サンプル数を対応する患者プロファイルに一致させると、殆どの場合、ｈＢＤ−１発現レベルはグリーソンスコア６の患者サンプルのほうがグリーソンスコア７の患者サンプルよりも高かった。更に、同一患者＃１３４３から肉眼的切除とＬＣＭにより得られた組織中のｈＢＤ−１発現レベルを比較すると、２種類の単離法の間で８５４倍の発現差があることが判明した。従って、これらの結果から、ＬＣＭは前立腺組織におけるｈＢＤ−１発現を判定するためのより高感度の技術であると考えられる。
【０４２２】
前立腺細胞株におけるｈＢＤ−１発現：ｈＢＤ−１発現システムのトランスフェクション後の前立腺癌細胞株におけるｈＢＤ−１のアップレギュレーションを検証するために、ＱＲＴＰＣＲを実施した。更に、鋳型なしの陰性対照も実施し、増幅産物をゲル電気泳動により検証した。この場合、ｈＢＤ−１発現はｈＰｒＥＣ細胞に比較して前立腺癌細胞株のほうが有意に低かった。２４時間の誘導時間後、ｈＢＤ−１誘導前の細胞株に比較してＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰにおけるｈＢＤ−１の相対発現レベルは有意に増加した（図３２Ａ）。
【０４２３】
次に、ｈＢＤ−１発現システムをトランスフェクトしたＤＵ１４５細胞におけるＰｏｎＡ誘導後のｈＢＤ−１の蛋白質発現を免疫細胞化学により検証した。陽性対照として、ｈＢＤ−１を発現するｈＰｒＥＣ前立腺上皮細胞も試験した。ｈＢＤ−１に対する一次抗体で細胞を染色し、二次抗体の緑色蛍光に基づいて蛋白質発現をモニターした（図３２Ｂ）。細胞のＤＩＣ解析により、ｈＢＤ−１発現を誘導したｈＰｒＥＣ細胞とＤＵ１４５細胞は１８時間後に存在していることを検証する。４８８ｎｍで共焦点レーザーにより励起すると、緑色蛍光が発生し、陽性対照としてのｈＰｒＥＣにはｈＢＤ−１蛋白質が存在すると判断された。他方、対照ＤＵ１４５細胞と空のプラスミドを導入して誘導したＤＵ１４５細胞に検出可能な緑色蛍光は認められず、ｈＢＤ−１発現の不在が実証された。ｈＢＤ−１発現を誘導したＤＵ１４５細胞の共焦点解析によると、緑色蛍光が観測され、ＰｏｎＡで誘導後にｈＢＤ−１蛋白質が存在すると判断された。
【０４２４】
ｈＢＤ−１の発現は細胞生存率低下を生じる：ＤＵ１４５、ＰＣ３，ＰＣ３／ＡＲ＋及びＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株における相対細胞生存率に及ぼすｈＢＤ−１発現の影響を判定するためにＭＴＴアッセイを実施した。空のベクターのＭＴＴ解析では、細胞生存率に統計的に有意な変化は認められなかった。ｈＢＤ−１誘導から２４時間後では、相対細胞生存率はＤＵ１４５細胞で７２％、ＰＣ３細胞で５６％であり、４８時間後に細胞生存率はＤＵ１４５細胞で４９％、ＰＣ３細胞で３７％まで低下した（図３３Ａ）。７２時間ｈＢＤ−１誘導後に、相対細胞生存率はＤＵ１４５で４４％、ＰＣ３細胞で２９％まで更に低下した。逆に、ＬＮＣａＰ細胞の生存率には何ら顕著な影響はなかった。ＬＮＣａＰに認められるｈＢＤ−１細胞傷害性に対する耐性がアンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在に起因するのか否かを調べるために、ＰＣ３細胞におけるｈＢＤ−１細胞傷害性を異所性ＡＲ発現（ＰＣ３／ＡＲ＋）で試験した。この場合、ＰＣ３／ＡＲ＋細胞とＰＣ３細胞の間に差はなかった。従って、データによると、ｈＢＤ−１は後期ステージ前立腺癌細胞に特異的に細胞傷害性である。
【０４２５】
ＰＣ３とＤＵ１４５に及ぼすｈＢＤ−１の作用が細胞増殖抑制性であるのか又は細胞傷害性であるのかを調べるために、ＦＡＣＳ解析を実施し、細胞死を測定した。通常の増殖条件下で、ＰＣ３及びＤＵ１４５培養物の９０％を上回る細胞が生存可能であり、非アポトーシス性であり（左下象限）、アネキシンＶ又はＰＩで染色しなかった（図４）。ＰＣ３細胞におけるｈＢＤ−１発現の誘導後、初期アポトーシスと後期アポトーシス／壊死（夫々右下及び右上象限）を生じた細胞数を合計すると、１２時間で１０％、２４時間で２０％、４８時間で４４％であった。ＤＵ１４５細胞では、初期アポトーシスと後期アポトーシス／壊死を生じた細胞数を合計すると、１２時間誘導後で１２％、２４時間で３４％、４８時間で５９％であった。ＰｏｎＡで誘導後に、空のプラスミドを導入した細胞にアポトーシスの増加は認められなかった。アネキシンＶとヨウ化プロピジウムの取り込み試験によると、ｈＢＤ−１はＤＵ１４５及びＰＣ３前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性をもつことが判明し、その結果、アポトーシスは細胞死のメカニズムであると判断される。
【０４２６】
ｈＢＤ−１は膜完全性とカスパーゼ活性化に変化をもたらす：ｈＢＤ−１誘導後に前立腺癌細胞で認められる細胞死がカスパーゼ介在性アポトーシスであるのか否かを調べた。ｈＢＤ−１発現に関与する細胞メカニズムを更に解明するために、ｈＢＤ−１発現を誘導したＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞で共焦点レーザー顕微鏡解析を実施した（図５）。アポトーシスが活発に生じている細胞で緑色蛍光性のＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫとカスパーゼの結合と開裂に基づいてパンカスパーゼ活性化をモニターした。細胞のＤＩＣ解析によると、０時間では生存可能な対照ＤＵ１４５（図５Ａ）及びＬＮＣａＰ（図５Ｅ）細胞が存在していた。４８８ｎｍで共焦点レーザーにより励起すると、検出可能な緑色染色は生じず、ＤＵ１４５（図５Ｂ）又はＬＮＣａＰ（図５Ｆ）対照細胞にカスパーゼ活性は存在しないと判断された。２４時間誘導後、再びＤＩＣによりＤＵ１４５（図５Ｃ）及びＬＮＣａＰ（図５Ｇ）細胞が検出可能であった。蛍光下の共焦点解析によると、ＤＵ１４５（図５Ｄ）細胞ではｈＢＤ−１発現の誘導後にパンカスパーゼ活性を意味する緑色染色が観測された。他方、ｈＢＤ−１発現を誘導したＬＮＣａＰ（図５Ｈ）細胞に緑色染色は生じなかった。従って、ｈＢＤ−１の誘導後に認められる細胞死はカスパーゼ介在性アポトーシスである。
【０４２７】
ディフェンシンペプチドの抗菌活性の提示されているメカニズムは孔形成による微生物膜の破壊である（Ｐａｐｏ  ａｎｄ  Ｓｈａｉ，２００５）。ｈＢＤ−１発現が膜完全性を変化させるか否かを調べるために、ＥｔＢｒ取り込みを共焦点解析により試験した。無傷の細胞は膜透過性のＡＯにより緑色に染色され、原形質膜が損傷した細胞のみが膜不透過性ＥｔＢｒの取り込みにより赤色に染色された。対照ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞はＡＯで陽性染色され、緑色を発生したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。他方、ＤＵ１４５とＰＣ３ではいずれもｈＢＤ−１誘導の結果、２４時間で細胞質にＥｔＢｒが蓄積し、赤色染色が認められた。４８時間までに、ＤＵ１４５とＰＣ３では核が濃縮し、夫々ＡＯとＥｔＢｒからの緑と赤の染色の共局在により黄色に見えた。逆に、４８時間誘導後のＬＮＣａＰ細胞では膜完全性に観測可能な変化はなく、ＡＯによる陽性緑色蛍光が発生し、赤色ＥｔＢｒ蛍光は発生しなかった。この知見から、ｈＢＤ−１発現に応答する膜完全性と透過性の変化は初期ステージと後期ステージの前立腺癌細胞で異なると判断される。
【０４２８】
ｈＢＤ−１及びｃＭＹＣ発現レベルの比較：３人の患者からのＬＣＭ前立腺組織切片でＱＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した（図３４）。患者＃１４５７では、ｈＢＤ−１発現は正常からＰＩＮまでの間に２．７倍の低下、ＰＩＮから腫瘍までの間に３．５倍の低下、正常から腫瘍までの間に９．３倍の低下を示した（図３４Ａ）。同様に、ｃＭＹＣ発現も患者＃１４５７では同様の発現パターンに従い、発現は正常からＰＩＮまでの間に１．７倍、ＰＩＮから腫瘍までの間に１．７倍、正常から腫瘍までの間に２．８倍低下した（図３４Ｂ）。更に、他の２人の患者では、ｃＭＹＣ発現の統計的に有意な低下が認められた。患者＃１５６９では正常からＰＩＮまでの間に２．３倍低下し、患者＃１５８６では正常からＰＩＮまでの間に１．８倍低下し、ＰＩＮから腫瘍までの間に４．３倍低下し、正常から腫瘍までの間に７．９倍低下した。
【０４２９】
ＰＡＸ２阻害後のｈＢＤ−１発現の誘導：ｈＢＤ−１発現の調節におけるＰＡＸ２の役割を更に検討するために、ｓｉＲＮＡを利用してＰＡＸ２発現をノックダウンし、ＱＲＴ−ＰＣＲを実施してｈＢＤ−１発現をモニターした。ｈＰｒＥＣ細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理してもｈＢＤ−１発現に何ら影響なかった（図３５）。他方、ＰＡＸ２ノックダウンの結果、ｈＢＤ−１の発現は未処理細胞に比較してＬＮＣａＰでは４２倍に増加し、ＰＣ３では３７倍に増加し、ＤＵ１４５では１０２６倍に増加した。陰性対照として、ｈＢＤ−１発現に顕著な影響のない非特異的ｓｉＲＮＡで細胞を処理した。
【実施例１１】
【０４３０】
ＰＡＸ２発現の阻害はｐ５３状態の異なる前立腺癌細胞に代替細胞死経路を生じる。
材料と方法
細胞株：癌細胞株ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰはいずれもｐ５３突然変異状態が異なるものであり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。ＰＣ３細胞はＦ−１２培地、ＤＵ１４５はＤＭＥＭ、ＬＮＣａＰはＲＰＭＩで増殖させ、全培地に１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清を加えた。前立腺上皮細胞株ＨＰｒＥＣはＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、前立腺上皮基礎培地で培養した。細胞は３７℃で５％ＣＯ２下に維持した。
【０４３１】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング：効率的な遺伝子サイレンシングを達成するために、ヒトＰＡＸ２  ｍＲＮＡ（アクセション番号ＮＭ＿００３９８９．１）を標的とする４個の相補的短鎖干渉性リボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）のプールを合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）。特異性を確保するために、ｓｉＲＮＡはＰＡＸファミリーの他のメンバーのノックダウンを伴うことがないようにＰＡＸ２配列に固有の領域を標的とするように設計した。更に、４個のｓｉＲＮＡの第２のプールを内部対照として使用し、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの特異性を試験した。合成した配列の２個はＧＬ２ルシフェラーゼｍＲＮＡ（アクセション番号Ｘ６５３２４）を標的とし、他の２個はスクランブルＰＡＸ２  ｍＲＮＡを標的とした（表９）。
【０４３２】
ウェスタン解析：要約すると、細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。溶解用緩衝液を製造業者の指示（Ｓｉｇｍａ）に従って調製した後、細胞に加えた。オービタルシェーカーで４℃にて１５分間インキュベーション後、細胞溶解液を採取し、１０分間１２０００×ｇで遠心し、細胞破片をペレット化した。次に、蛋白質を含有する上清を採取し、定量した。次に、蛋白質抽出物２５μｇを８−１６％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）にロードした。電気泳動後、蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した後、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）中５％脱脂粉乳で１時間ブロックした。次に１０００倍に希釈したウサギ抗ＰＡＸ２一次抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）でブロットをプロービングした。洗浄後、西洋ワサビペルオキダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ウサギ抗体（５０００倍希釈；Ｓｉｇｍａ）と共に膜をインキュベートし、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８９００で化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗β−アクチン一次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とＨＲＰ標識抗マウス二次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でリプロービングし、再びシグナル検出を可視化した。
【０４３３】
【表８】
0005653042.tif 000009
【０４３４】
【表９】
0005653042.tif 000010
【０４３５】
位相差顕微鏡解析：細胞数に及ぼすＰＡＸ２ノックダウンの影響を位相差顕微鏡により解析した。この場合、細胞１〜２×１０４個を６ウェル培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）に撒いた。次に、細胞を培地単独、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡ又はＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、６日間インキュベートした。その後、倒立型Ｚｅｉｓｓ  ＩＭ  ３５顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で細胞を観察した。ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｍｏｓａｉｃ  ４．２カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使用して細胞の１領域の位相コントラスト写真を撮影した。
【０４３６】
ＭＴＴ細胞傷害性アッセイ：ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞懸濁液を希釈し、９６ウェルプレートに細胞１〜５×１０３個／ウェルの割合で撒いた。次に、製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡプール、対照ｓｉＲＮＡプール、又はＣｏｄｅｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬単独５ｐｇ／細胞を細胞にトランスフェクトした。処理後、全細胞を２日間、４日間又は６日間増殖させた。次に、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド，ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から着色ホルマザン産物への変換を測定することにより、細胞生存率を求めた。走査型マルチウェル分光光度計で５４０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０４３７】
パンカスパーゼ検出：ＡＰＯ  ＬＯＧＩＸ（登録商標）カルボキシフルオレセインカスパーゼ検出キット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を行った。活性カスパーゼと不可逆的に結合するＦＡＭＶＡＤ−ＦＭＫ阻害剤で活性カスパーゼを検出した。要約すると、細胞１〜２×１０４個を３５ｍｍガラス底マイクロウェル皿（Ｍａｔｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）に撒き、先述のように培地単独又はＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理した。次に、カルボキシフルオレセイン標識ペプチドフルオロメチルケトン（ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）３００μｌを各３５ｍｍ皿に加え、３７℃で５％ＣＯ２下に１時間インキュベートした。最後に、細胞を洗浄緩衝液２ｍｌで２回洗浄し、微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）又は４８８ｎｍレーザー励起により観察した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ共焦点顕微鏡とＶａｒｉｏ  ２  ＲＧＢレーザー走査モジュールを併用して蛍光シグナルを解析した。
【０４３８】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞株におけるＰＡＸ２ノックダウン後の遺伝子発現の変化を検証するために、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。細胞約１×１０６個をトリプシン処理により回収し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に細胞を溶解させ、ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してスピンカラムで遠心することにより全ＲＮＡを単離した。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、第１鎖合成用としてＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＩＩ酵素（反応当たり５００Ｕ；Ｐｒｏｍｅｇａ）と、第２鎖合成用としてＴｆｌ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（反応当たり５００Ｕ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコールに従って使用して逆転写によりｃＤＮＡを作製した（反応当たり０．５μｇ）。一般に、後続ＰＣＲ反応毎に各ｃＤＮＡ５０ｐｇを使用した。ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社製品のＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作製したｃＤＮＡで２段階ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。公開配列からＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＣＬ−２、ＡＫＴ及びＢＡＤのプライマー対を作製した（表１０）。ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応を実施した。６０℃のアニーリング温度を使用して標準条件下にＰＣＲ４０サイクルを実施した。指数的増幅が開始したサイクル数（閾値）により定量を行い、３回反復から得られた値から平均した。メッセージレベルと閾値の間には逆関係があった。更に、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した。各遺伝子とＧＡＰＤＨの比として相対発現を計算した。全反応は３本ずつ実施した。
【０４３９】
【表１０】
0005653042.tif 000011
【０４４０】
膜透過性アッセイ：アクリジンオレンジ（ＡＯ）／臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）二重染色を実施し、細胞膜完全性の変化と濃縮クロマチン染色によるアポトーシス細胞を確認した。ＡＯは生存細胞と初期アポトーシス細胞を染色し、ＥｔＢｒは膜完全性が損なわれた後期ステージアポトーシス細胞を染色する。要約すると、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞を２穴チャンバー培養スライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に撒き、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ、非特異的ｓｉＲＮＡ又は培地単独を細胞にトランスフェクトした。処理後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＡＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とＥｔＢｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（５μｇ／ｍｌ）の混液（１：１）２ｍｌで５分間染色した。染色後、細胞を再びＰＢＳで洗浄した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ  Ｖａｒｉｏ  ２共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）により蛍光を観察した。励起カラーホイールはＢＳ５０５−５３０（緑）及びＬＰ５６０（赤）フィルターブロックを含み、ＡＯからの緑色発光とＥｔＢｒからの赤色発光を緑色チャネルと赤色チャネルに分離することができた。各実験内のレーザー出力及び利得制御設定は対照とＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理した細胞で同一とした。ＡＯは５４３ｎｍ、ＥｔＢｒは４８８ｎｍの波長のＫｒ／Ａｒ混合ガスレーザーにより励起した。スライドを４０倍の倍率で解析し、デジタル画像を無圧縮デシタルＴＩＦＦファイルとして保存し、画像処理とハードコピー表示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にエクスポートした。
【０４４１】
統計解析
対応のない値のスチューデントのｔ検定を使用して統計的差を判定した。両側計算によりＰ値を求め、０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
【０４４２】
結果
前立腺細胞におけるＰＡＸ２蛋白質発現の解析：ＰＡＸ２蛋白質発現をＨＰｒＥＣ前立腺一次培養物とＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５及びＰＣ３前立腺癌細胞株でウェスタン解析により試験した。この場合、全前立腺癌細胞株でＰＡＸ２蛋白質が検出された（図３６Ａ）。他方、ＨＰｒＥＣではＰＡＸ２蛋白質を検出することができなかった。ブロットを剥離し、内部対照としてβ−アクチンについてリプロービングし、均等なロードを確保した。ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＰＡＸ２特異的ｓｉＲＮＡによる選択的ターゲティングと阻害後のＰＡＸ２蛋白質発現もモニターした。６日間の処理期間にわたって細胞にＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡのプールのトランスフェクションを１ラウンド実施した。ＰＡＸ２蛋白質は培地単独で処理した対照細胞で発現された。全３種類の細胞株でＰＡＸ２蛋白質のノックダウンが認められたことから、ＰＡＸ２  ｍＲＮＡの特異的ターゲティングが確認された（図３６Ｂ）。
【０４４３】
前立腺癌細胞増殖に及ぼすＰＡＸ２ノックダウンの影響：細胞数と細胞生存率に及ぼすＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの影響を光学顕微鏡とＭＴＴ解析により分析した。細胞数に及ぼすＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの影響を検討するために、ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞株に培地単独、非特異的ｓｉＲＮＡ又はＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡを６日間トランスフェクトした。培地単独を加えた６０ｍｍ培養皿では各細胞株が８０〜９０％コンフルエントに達した。ＨＰｒＥＣ、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞を非特異的ｓｉＲＮＡで処理した場合には、培地単独で処理した細胞に比較して細胞増殖に殆ど〜全く影響がないと思われた（夫々図３８Ａ、３８Ｃ及び３８Ｅ）。ＰＡＸ２欠損細胞株ＨＰｒＥＣをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理しても細胞増殖に有意影響はないと思われた（図３７Ｂ）。他方、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理すると、細胞数は有意に減少した（夫々図３８Ｄ、３８Ｆ及び３８Ｈ）。
【０４４４】
前立腺癌細胞生存率に及ぼすＰＡＸ２ノックダウンの影響：２日間、４日間又は６日間処理後に細胞生存率を測定した。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理した細胞の５７０〜６３０ｎｍ吸光度を未処理対照細胞の吸光度で割った比として生存率百分率を計算した。陰性対照として、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡによる各処理時間後又は試薬単独をトランスフェクション後に細胞生存率を測定した。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後の生存率百分率を非特異的ｓｉＲＮＡで処理後の生存率百分率で割ることにより相対細胞生存率を計算した（図３８）。２日間処理後に、相対生存率はＤＵ１４５で１１６％、ＰＣ３で８１％、ＬＮＣａＰで９８％であった。４日間処理後に、相対細胞生存率はＤＵ１４５で６９％、ＰＣ３で７９％、ＬＮＣａＰで８０％まで低下した。最後に、６日までに相対生存率はＤＵ１４５で６３％、ＰＣ３で４３％、ＬＮＣａＰで４４％となった。更に、トランスフェクション試薬単独で処理後にも細胞生存率を測定した。この場合、各細胞株は細胞生存率の有意低下を示さなかった。
【０４４５】
パンカスパーゼ活性の検出：共焦点レーザー顕微鏡解析によりカスパーゼ活性を検出した。ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、アポトーシスが活発に生じている細胞（緑色に蛍光発光する）でＦＡＭ標識ペプチドとカスパーゼの結合に基づいて活性をモニターした。培地単独を導入した細胞を解析すると、夫々生存可能なＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞が存在している。４８８ｎｍで共焦点レーザーにより励起すると、検出可能な緑色染色は生じず、未処理細胞にカスパーゼ活性は存在しないと判断された（夫々図３９Ａ、３９Ｃ及び３９Ｅ）。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで４日間処理後に、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞は蛍光下でカスパーゼ活性を意味する緑色染色を示した（夫々図３９Ｂ、３９Ｄ及び３９Ｆ）。
【０４４６】
アポトーシス因子に及ぼすＰＡＸ２阻害の影響：ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞をＰＡＸ２に対するｓｉＲＮＡで４日間処理し、プロ及び抗アポトーシス因子の両者の発現をＱＲＴＰＣＲにより測定した。ＰＡＸ２ノックダウン後にＢＡＤを解析した処、ＬＮＣａＰでは２倍、ＤＵ１４５では１．５８倍、ＰＣ３では１．３７５倍になっていた（図４０Ａ）。ＢＩＤの発現レベルはＬＮＣａＰでは１．３８倍、ＤＵ１４５では１．７８倍に増加したが、ＰＡＸ２発現の抑制後にＰＣ３で観測されたＢＩＤに統計的有意差はなかった（図４０Ｂ）。抗アポトーシス因子ＡＫＴの解析によると、処理後に発現はＬＮＣａＰで１．２５倍低下し、ＤＵ１４５では１．２８倍低下したが、ＰＣ３では何の変化も認められなかった（図４０Ｃ）。
【０４４７】
膜完全性と壊死の解析：ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞で共焦点解析により膜完全性をモニターした。この場合、無傷の細胞は膜透過性のＡＯにより緑色に染色され、原形質膜が損傷した細胞は膜不透過性ＥｔＢｒの細胞質取り込みにより赤に染色されると共に、ＡＯとＥｔＢｒの核内共局在により黄色に染色された。未処理ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞はＡＯで陽性染色され、緑色を発生したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。ＰＡＸ２ノックダウン後、ＬＮＣａＰ細胞の膜完全性に観測可能な変化はなく、ＡＯによる陽性緑色蛍光が発生し、赤色ＥｔＢｒ蛍光は発生しなかった。これらの知見から更に、ＬＮＣａＰ細胞はＰＡＸ２ノックダウン後にアポトーシスを生じている可能性があるが、壊死性細胞死は生じていないと考えられる。逆に、ＤＵ１４５とＰＣ３ではＰＡＸ２ノックダウンの結果、細胞質にＥｔＢｒが蓄積し、赤色染色が認められた。更に、ＤＵ１４５とＰＣ３ではいずれも核が濃縮し、夫々ＡＯとＥｔＢｒからの緑と赤の染色の共局在により黄色に見えた。これらの結果から、ＤＵ１４５とＰＣ３はＬＮＣａＰに比較して壊死性細胞死を伴う代替細胞死経路を辿っていると考えられる。
【０４４８】
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【０４４９】
【表１１】
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【０４５０】
【表１２】
0005653042.tif 000013
【０４５１】
【表１３】
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【０４５２】
【表１４】
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【０４５３】
【表１５】
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【０４５４】
【表１６】
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【０４５５】
【表１７】
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【０４５６】
【表１８】
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【０４５７】
【表１９】
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【０４５８】
【表２０】
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【０４５９】
【表２１】
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【０４６０】
【表２２】
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【０４６１】
【表２３】
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【図１Ａ】
0005653042.tif 000025
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
0005653042.tif 000031
【図４Ｂ】
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【図５Ａ−Ｄ】
0005653042.tif 000033
【図５Ｅ−Ｈ】
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【図５Ｉ−Ｌ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
0005653042.tif 000040
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
0005653042.tif 000044
【図１３】
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【図１４】
0005653042.tif 000046
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0005653042.tif 000050
【図１９】
0005653042.tif 000051
【図２０Ａ】
0005653042.tif 000052
【図２０Ｂ】
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【図２１】
0005653042.tif 000054
【図２２】
0005653042.tif 000055
【図２３Ａ】
0005653042.tif 000056
【図２３Ｂ】
0005653042.tif 000057
【図２３Ｃ】
0005653042.tif 000058
【図２４Ａ】
0005653042.tif 000059
【図２４Ｂ】
0005653042.tif 000060
【図２５】
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【図２６】
0005653042.tif 000062
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
0005653042.tif 000066
【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
0005653042.tif 000072
【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
0005653042.tif 000076
【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
0005653042.tif 000080
【図４０Ｂ】
0005653042.tif 000081
【図４０Ｃ】
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【配列表】
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