(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロゲル粒子マトリックス構造内に共有結合で固定化された親和性ベイトを含む化学的親和性ベイトであって、前記ヒドロゲル粒子マトリックスはコア−シェル構造を有し、前記コア−シェル構造に含まれるコア及びシェルが２つの異なる前記親和性ベイトを含有する、化学的親和性ベイト。
【請求項２】
前記親和性ベイトが、複雑な分子混合物内の選択されたサブセットの分子を高収率で捕捉するように構成されている、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項３】
被検体濃縮及び単離が、１ｎｍ〜１００μｍの範囲のサイズの粒子により実施される、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項４】
前記親和性ベイトが、モノアゾ、ジアゾ、ポリアゾ、アントラキノン、トリフェニルメタン、キサンテン、及びインディゴ染料クラスを含む化学的染料分子を含む、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項５】
ポリマー、ペプチド、タンパク質、炭水化物、及びシリカ、二酸化チタン、アルミナ等の無機多孔性粒子で構成された粒子を更に含む、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項６】
被検体の濃縮及び未結合妨害化合物の除去を可能にすることを更に含む、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項７】
前記ヒドロゲル粒子マトリックス構造内の前記親和性ベイトに結合した被検体の分解を防止することを更に含む、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項８】
試料マトリックスに由来する有毒廃棄物と結合及び除去することを更に含む、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項９】
前記親和性ベイトが、一般式（ａ）：
【化１】
0005828194.tif 000002
を有するアントラキノン染料を含み、式中１〜８位が、ヒドロキシル基、ハロゲン基、スルホニル基、アルキル基、ベンジル基、アミノ基、カルボキシ基、シアノ基、又は亜リン酸基の結合位置である、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項１０】
前記親和性ベイトが、一般式（ｂ）：
【化２】
0005828194.tif 000003
を有する反応性染料を含み、式中Ｒ及びＲ’が、ハロゲン基から、並びに置換及び非置換アリールアミン基から独立して選択され、前記アリールアミン基が、アリールアミン、ヒドロキシル、カルボニル、スルホン酸、アルキル、及び／又は他の官能基等の官能基で置換されていてもよい、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項１１】
前記親和性ベイトが、一般式（ｃ）：
【化３】
0005828194.tif 000004
を有するアリールメタン染料を含み、式中Ｒ、Ｒ’、及びＲ’’が、フェニル、ナフチル、アントラセニル等の置換及び非置換アリール基から独立して選択され、前記アリール基が、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、スルホン酸、アルキル、及び／又は他の官能基等の官能基で置換されていてもよい、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項１２】
前記親和性ベイトが、一般式（ｄ）：
【化４】
0005828194.tif 000005
（式中Ｒ１が芳香族基であり、Ｒ２が、脂肪族基及び芳香族基からなる群から選択され、Ｘ及びＹが、水素、ハロゲン化物、−ＮＯ２、−ＮＨ２、アリール基、アルキル基、アルコキシ基、スルホナート基、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン化物等からなる群から独立して選択される。）
で表される芳香族アゾ染料、
一般式（ｅ）：
【化５】
0005828194.tif 000006
（式中Ｒ１が芳香族基であり、Ｒ２が、脂肪族基及び芳香族基からなる群から選択され、Ｘ及びＹが、水素、ハロゲン化物、−ＮＯ２、−ＮＨ２、アリール基、アルキル基、アルコキシ基、スルホナート基、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン化物等からなる群から独立して選択される。）
で表されるアゾキシ化合物、
又は一般式（ｆ）：
【化６】
0005828194.tif 000007
（式中Ｒ１が芳香族基であり、Ｒ２が、脂肪族基及び芳香族基からなる群から選択され、Ｘ及びＹが、水素、ハロゲン化物、−ＮＯ２、−ＮＨ２、アリール基、アルキル基、アルコキシ基、スルホナート基、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン化物等からなる群から独立して選択される。）
で表されるヒドラゾ化合物を含む、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項１３】
前記親和性ベイトが、一般式（ｇ）：
【化７】
0005828194.tif 000008
を有するクーマシー染料を含み、式中の融合環構造に置換されていてもよい官能基の例に、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、ハロゲン基（例えば、塩素基又は臭素基）、スルホニル基（例えば、スルホン酸塩）、アルキル基、ベンジル基、アミノ基（例えば、第一級、第二級、第三級、及び第四級アミン基）、カルボキシ基、シアノ基、亜リン酸基等が含まれる、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項１４】
親和性ベイトが、一般式（ｈ）：
【化８】
0005828194.tif 000009
を有するヘテロ環式融合環を含む染料親和性リガンド−マトリックス結合体を含み、
式中、前記融合環構造での置換が、硫黄、酸素、窒素、又は炭素等の原子であってもよく、前記融合環構造で置換されていてもよい官能基の例に、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミン（第一級、第二級、第三級、及び第四級アミン）、水素、−ＮＯ２、−ＮＨ２、アリール基、アルキル基、アルコキシ基、スルホナート基、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン化物が含まれる、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項１５】
粒子が懸濁され、前記粒子が沈殿することなく浮遊して試料液体に残留するように、被検体を含有する生物学的液体に前記ヒドロゲル粒子マトリックス構造を懸濁することを更に含む、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項１６】
粒子が試料液体により８０パーセントを超えて占められている開放多孔性構造であるように、前記ヒドロゲル粒子マトリックス構造を維持することを更に含む、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【請求項１７】
前記ヒドロゲル粒子マトリックス構造からサブセットの被検体を分離することを更に含み、隔離された前記サブセットの被検体を捕捉された粒子から取り出すために抽出緩衝液が使用される、請求項１に記載の化学的親和性ベイト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照  本出願は、「Ｂａｉｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｒｕｍ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」と題する、２００９年６月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／２１８，６７０号で開示された発明を特許請求するものである。この米国特許仮出願の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を、ここに主張するものであり、前述の出願は、参照により本明細書に組み込まれる。  
【０００２】
政府支援への謝辞  本発明は、エネルギー省により授与された補助金番号ＤＥ−ＦＣ５２−０４ＮＡ２５４５５に基づく政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。  
【０００３】
本発明は、小型で不安定な被検体を濃縮、精製、並びに血液及び他の体液中での分解から保護するために使用されるヒドロゲル粒子に染料親和性ベイトを組み込むことに関する。本発明は、医学診断、環境科学、毒性学、及び感染症の分野に有用なタンパク質及び他の生体分子を捕捉するための親和性ベイトとして使用することができる新規の非トリアジン有機染料化学物質の特定を記述する。特有の親和性染料化合物をヒドロゲル捕捉粒子内に組み込むことにより、被検体収率及び前分析的精度が向上し、分解に対して被検体を安定化させると共に、測定感受性が増加する。本発明の粒子は、日常的な臨床検査並びに低含有量の疾患バイオマーカーの発見に使用することができる。新しい高親和性ベイト化学物質を含有する例示的なヒドロゲル粒子を使用して、新しい一組のヒト血清バイオマーカーを特定した。
【背景技術】
【０００４】
近年、プロテオミクスバイオマーカーの価値及び臨床的可能性に対する関心が高まっている。疾患がより初期に治療されれば、治療結果はより良好であるというのが、医学界における一般的な確信である。したがって、初期段階の疾患に特異的なバイオマーカー検査が日常的臨床で利用可能になることは、現在使用されている治療手段を使用してでさえも、公衆衛生を劇的に向上させる大きな可能性を有している。例えば、臨床腫瘍学専門家は、胸、肺、卵巣、及び結腸の前転移性固形腫瘍のバイオマーカーを検出することは、生存の著しい向上に結び付く可能性があることを予測している。残念ながら、緊急の臨床的必要性があるにも関わらず、過去１０年間に、全ての疾患の種類を合わせても、わずかに一握りの新規バイオマーカーが日常的な臨床使用へと進んでいるに過ぎない。診断法研究における多大な努力にも関わらず、バイオマーカーパイプラインの遅延は続いている。この欠点の理由は、バイオマーカーの特定及び測定から最初の臨床的検証までのバイオマーカー開発パイプライン全体に及ぶ根本的な技術的及び生物学的な障害に起因する。これら主な障害のうちの２つは、以下の通りである：  低含有量：疾患関連バイオマーカーは、アルブミン等の高含有量タンパク質を含有する体液タンパク質の複雑な混合物内に、非常に低濃度で存在する場合がある。
不安定性：血液又は他の体液が採取された直後に（例えば、静脈穿刺により）、タンパク質の分解が生じる場合があり、分解は、内在性又は外来性のプロテイナーゼにより媒介される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ヒドロゲル粒子は、小型で不安定な被検体を濃縮、精製、並びに血液及び他の体液中での分解から保護するために使用される。粒子から抽出されたタンパク質被検体は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、逆相タンパク質アレイ、及び質量分析法により分析される。本発明は、粒子により捕捉される被検体の種類、一組の親和性ベイトの例を有するＮ−イソプロピルアクリルアミド粒子に関する作業の流れ、一般的なタンパク質バイオマーカーのゲル電気泳動法の結果、並びに患者由来の血清をスクリーニングするための質量分析法を拡張することができる新しいベイト戦略を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ベイト化学物質及び対応する標的分子の種類に関する一般的な説明である。
【図２】粒子により捕捉及び濃縮された低含有量の臨床的タンパク質バイオマーカーである。表は、臨床に関連する低含有量の不安定タンパク質を、特有な親和性ベイトの１７種の異なる例を含有するヒドロゲル粒子と共にインキュベートすることにより構築された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色実験を使用して、各染料がこれらタンパク質に結合する能力を決定した。含まれている表には、特定のタンパク質に対する各ベイトの親和性が示されている。
【図３ａ】粒子マトリックスに組み込まれた特有な一組の化学的親和性ベイトは、被検体のサブセットの親和性捕捉を実証する。粒子は以下の化学的親和性ベイトを含有する：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸（Ａｃｒｙｉｃ  Ａｃｉｄ）；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。
【図３ｂ】粒子マトリックスに組み込まれた特有な一組の化学的親和性ベイトは、被検体のサブセットの親和性捕捉を実証する。粒子は以下の化学的親和性ベイトを含有する：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸（Ａｃｒｙｉｃ  Ａｃｉｄ）；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。
【図３ｃ】粒子マトリックスに組み込まれた特有な一組の化学的親和性ベイトは、被検体のサブセットの親和性捕捉を実証する。粒子は以下の化学的親和性ベイトを含有する：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸（Ａｃｒｙｉｃ  Ａｃｉｄ）；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。
【図３ｄ】粒子マトリックスに組み込まれた特有な一組の化学的親和性ベイトは、被検体のサブセットの親和性捕捉を実証する。粒子は以下の化学的親和性ベイトを含有する：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸（Ａｃｒｙｉｃ  Ａｃｉｄ）；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。
【図３ｅ】粒子マトリックスに組み込まれた特有な一組の化学的親和性ベイトは、被検体のサブセットの親和性捕捉を実証する。粒子は以下の化学的親和性ベイトを含有する：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸（Ａｃｒｙｉｃ  Ａｃｉｄ）；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。
【図３ｆ】粒子マトリックスに組み込まれた特有な一組の化学的親和性ベイトは、被検体のサブセットの親和性捕捉を実証する。粒子は以下の化学的親和性ベイトを含有する：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸（Ａｃｒｙｉｃ  Ａｃｉｄ）；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。
【図３ｇ】粒子マトリックスに組み込まれた特有な一組の化学的親和性ベイトは、被検体のサブセットの親和性捕捉を実証する。粒子は以下の化学的親和性ベイトを含有する：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸（Ａｃｒｙｉｃ  Ａｃｉｄ）；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。
【図３ｈ】粒子マトリックスに組み込まれた特有な一組の化学的親和性ベイトは、被検体のサブセットの親和性捕捉を実証する。粒子は以下の化学的親和性ベイトを含有する：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸（Ａｃｒｙｉｃ  Ａｃｉｄ）；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。
【図４ａ】血清中で以前にまったく配列決定されていない新しいタンパク質（ＨＵＰＯの血漿プロテオームプロジェクト総合リスト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｕｐｏ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｈｐｐｐ／に存在しない）を、以下のベイトを担持する粒子で血清処理した後でナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定した：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸、１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡを使用した。１００μＬ等量のナノ粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、１００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、化学的に溶出した。この表に列挙されているタンパク質は、親和性ベイト負荷粒子の少なくとも１つに見出された。示されているタンパク質は全て、０．０５以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択された。
【図４ｂ】血清中で以前にまったく配列決定されていない新しいタンパク質（ＨＵＰＯの血漿プロテオームプロジェクト総合リスト、ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｕｐｏ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｈｐｐｐ／に存在しない）を、以下のベイトを担持する粒子で血清処理した後でナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定した：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸、１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡを使用した。１００μＬ等量のナノ粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、１００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、化学的に溶出した。この表に列挙されているタンパク質は、親和性ベイト負荷粒子の少なくとも１つに見出された。示されているタンパク質は全て、０．０５以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択された。
【図５ａ】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のシバクロンブルーＦ３ＧＡ親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、シバクロンブルーＦ３ＧＡ官能化粒子で処理した試料には見出されたが、未処理血清では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図５ｂ】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のシバクロンブルーＦ３ＧＡ親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、シバクロンブルーＦ３ＧＡ官能化粒子で処理した試料には見出されたが、未処理血清では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図６】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のシバクロンブルーＦ３ＧＡ親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、シバクロンブルーＦ３ＧＡ負荷粒子のみに見出され、代替的化学的親和性染料を含有する粒子では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図７】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のディスパースイエロー９親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、ディスパースイエロー９官能化粒子で処理した試料には見出されたが、未処理血清では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図８】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のディスパースイエロー９親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、ディスパースイエロー９負荷粒子のみに見出され、代替的な化学的親和性染料を含有する粒子では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図９】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のディスパースイエロー３親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、ディスパースイエロー３官能化粒子で処理した試料には見出されたが、未処理血清では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図１０】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のディスパースイエロー３親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、ディスパースイエロー３負荷粒子のみに見出され、代替的な化学的親和性染料を含有する粒子では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図１１ａ】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のレマゾールブリリアントブルーＲ親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、レマゾールブリリアントブルーＲ官能化粒子で処理した試料には見出されたが、未処理血清では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図１１ｂ】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のレマゾールブリリアントブルーＲ親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、レマゾールブリリアントブルーＲ官能化粒子で処理した試料には見出されたが、未処理血清では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図１２ａ】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のレマゾールブリリアントブルーＲ親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、レマゾールブリリアントブルーＲ負荷粒子のみに見出され、代替的な化学的親和性染料を含有する粒子では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図１２ｂ】粒子で血清処理した後にナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のレマゾールブリリアントブルーＲ親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、レマゾールブリリアントブルーＲ負荷粒子のみに見出され、代替的な化学的親和性染料を含有する粒子では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図１３】レマゾールブリリアントブルーＲ、ディスパースイエロー３、及びディスパースイエローの混合物を含有する粒子で血清処理した後で、ナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬ等量のシバクロンブルーＦ３ＧＡ親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、官能化粒子の混合物で処理した試料には見出されたが、未処理血清では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図１４】レマゾールブリリアントブルーＲ、ディスパースイエロー３、及びディスパースイエローの混合物を含有する粒子で血清処理した後で、ナノスプレータンデム型質量分析法により配列決定されたタンパク質である。５００μＬの等量混合親和性ベイト含有粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離により分離し、７０％ＡＣＮ−１０％水酸化アンモニウムで溶出した。列１に列挙されているタンパク質は、混合物負荷粒子のみに見出され、代替的な化学的親和性染料を含有する粒子では見出されなかった。示されているタンパク質は全て、０．０１以下のｐ値（無作為特定の確率）を有するように選択されている。
【図１５】３０ｍＬのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）溶液（０．２４２ｎｇ／ｍＬ）と共に合成尿中でインキュベートされたＮＩＰＡｍ／レマゾールブリリアントブルーＲ粒子は、溶液中に存在するｈＧＨを全て隔離し、ｈＧＨの濃度は６０倍を超えて増加した（１４．９ｎｇ／ｍＬ）。
【図１６】ＮＩＰＡｍ／アシッドブラック４８粒子は、上清を完全に枯渇させ、１ｎｇ／ｍＬの濃度で合成尿中にスパイクされたｈＧＨの濃度は３０倍を超えて増幅される。粒子をｈＧＨ溶液でインキュベートし、遠心分離により分離し、上清及び粒子内容物をＩｍｍｕｌｉｔｅ  １０００により測定した。
【図１７】ＮＩＰＡｍ／アシッドブラック４８粒子は、合成尿中のｈＧＨ回収の９５％収率を示す。粒子を、８．７４ｎｇ／ｍＬのｈＧＨを含有する１ｍＬの合成尿と共にインキュベートし、遠心分離により分離し、粒子内容物を溶出し、同じ開始容積中に再構成した。最初の溶液及び粒子溶出液をＩｍｍｕｌｉｔｅ  １０００により測定した。
【図１８】ＮＩＰＡｍ／ディスパースイエロー９粒子は、合成汗中のインターロイキン６（ＩＬ６）回収の９５％収率を示す。粒子を、７９１２．５ｐｇ／ｍＬのＩＬ６を含有する５０μＬの合成汗と共にインキュベートし、遠心分離により分離し、粒子内容物を溶出し、同じ開始容積中に再構成した。溶出液中のＩＬ６濃度は、７８７５ｐｇ／ｍＬだった。最初の溶液及び粒子溶出液をＩｍｍｕｌｉｔｅ  １０００により測定した。
【図１９】ＳＤＳページ分析は、コア及びシェルで２つの親和性ベイトにより官能化された粒子が、２つのベイトを加算した挙動を獲得し、外部シェルベイトは、内部コアベイトに対するタンパク質の結合を妨害しないことを示した。レーン１、血清；２  ビニルスルホン酸粒子；３  シバクロンブルーＦ３ＧＡ粒子；４  Ｎ−イソプロピルアクリルアミドシェル−シバクロンブルーＦ３ＧＡコアの粒子；５  シバクロンブルーＦ３ＧＡコア−ビニルスルホン酸シェルの粒子。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下の例は、本明細書で請求されている化合物、組成物、物品、デバイス、及び／又は方法を、如何にして製作及び評価するかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために示されており、本発明の純粋な例示であることが意図されており、本発明者らが自らの発明であるとみなす範囲を制限することは意図されていない。正確さを保証するための努力がなされている。  
【０００８】
実施例１．粒子合成及び染料カップリング
新規の親和性ベイトを含有するヒドロゲル粒子捕捉粒子は、コア及びコア−シェル構造の両方として合成することができる。コア−シェル構造に含まれる外側シェルは、複雑な生体液中のより高分子量のタンパク質のサイズふるい分けを可能にする。主題発明では、コア及びシェルは両方とも、固定化された染料分子又はその誘導体を含有することができる。
【０００９】
ポリ（ＮＩＰＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ）コア粒子合成
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（４．７５０ｇ、０．０４２モル）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（０．４００ｇ、０．００２６モル）、及びアクリル酸（ＡＡｃ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）；（．５２５μＬ）、０．００７３モル）を、５００ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、その後ニトロセルロース膜ディスクフィルター（細孔径０．４５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使用してろ過し、三つ口丸底フラスコに移した。溶液を、中程度の速さで撹拌しながら室温にて１時間窒素で通気し、その後７０℃に加熱したポリ（ＮＩＰＡｍ−ｃｏ−ＡＡ）コアの重合方法におけるこの特定のステップの根拠は、他所に見出すことができる。過硫酸カリウム（ＫＰＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（０．２７６ｇ、０．００１モル）を５ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、溶液に添加して重合を開始させた。反応を窒素下にて６時間７０℃で維持した。粒子を、遠心分離（１９０００ｒｐｍ、５０分間、室温）により５回洗浄し、未反応単量体を除去し、その後６００ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁した。
【００１０】
ポリ（ＮＩＰＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ）コア−シェル粒子合成
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（１．５５ｇ、０．０１３モル）、ビス−アクリルアミド（ＢＩＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（１６２ｍｇ、０．００１０モル）、及びＫＰＳ（０．０９２ｇ、０．０００３ミリモル）を、１５０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、その後０．４５μｍフィルターに通過させた。溶液を、中程度の速さで撹拌しながら室温にて２時間窒素で通気した。２００ｍＬのｐ−ＮＩＰＡｍ−co−ＡＡｃコア粒子を７０℃に加熱し、窒素下で１時間通気した。その後、ＮＩＰＡｍ及びＢＩＳを含有する溶液２５ｍｌを粒子に添加し、７０℃で１５分間反応させ、その後、残りの１２５ｍＬシェル溶液を、２時間３０分間の期間にわたって２５ｍＬ等量で添加した。反応を窒素下にて３時間７０℃で維持し、その後一晩冷却し、上述のように洗浄した。洗浄された粒子を、２００ｍＬのＨ２Ｏに再懸濁した。
【００１１】
水媒質におけるアミノ−染料−ベイトで官能化されたＮＩＰＡｍ粒子の合成
（ピグメントレッド１７７；オレンジ３；パラロザニリン（Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎａ）；アシッドブルー２２；アシッドブラック４８；レマゾールブリリアントブルー；アリザリンブルーブラックＢ；ブリリアントブルー；トルイジンブルー；ローダミン１２３；ディスパースイエロー３；ディスパースブルー３）。
第一級アミン基を含有する染料分子を、縮合によりアクリル酸基のカルボキシル酸基と結合させることにより、ＮＩＰＡｍ粒子と共有結合で結合させた。  
【００１２】
１０ｍＬのＮＩＰＡｍ／ＡＡｃ粒子を遠心分離（１６．１ｒｃｆ、２５Ｃ、１５分間）し、１０ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４にｐＨ５で再懸濁した。粒子、１ｍＬのＳＤＳ  １％（重量／容積）、８２４ｍｇのＥＤＣ（Ｎ−（３ジメチルアミノプロピル）Ｎ’エチルカルボジイミド塩酸塩；Ｆｌｕｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）、及び６１２ｍｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、三つ口丸底フラスコ中で混合し、中程度の速さで撹拌しながら室温で反応させた。１５分後、遠心分離により反応を停止させ、２０ｍＬの０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ＞８）に再懸濁した。過剰量の染料を、１８０ｍＬの０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４に溶解し、０．２２μｍのＣＡフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ニューヨーク州、米国）でろ過し、活性化粒子に添加し、中程度の速さで撹拌しながら反応を室温で一晩維持した。染料モル／ＡＡｃモルの比率が１０：１であり、アクリル酸のモル数が０．００００１２１となるように、反応に必要な染料の量を計算した。図３ａ〜３ｃには、反応に使用した染料の量が示されている。粒子を水で洗浄して未反応染料を除去し、その後、１６．１ｒｃｆ、２５ｕＣ、１５分間で遠心分離した。上清を破棄し、粒子を１０ｍＬの水に再懸濁した。
【００１３】
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）媒質におけるアミノ−染料−ベイトで官能化されたＮＩＰＡｍ粒子１３．８０％ＡＡｃの合成。
（オレンジ３；パラロザニリン；ディスパースイエロー９、ピグメントレッド１７７）
アミノ染料を、ジメチルホルムアミド媒質中で、ホスホニウム／ウラン活性化によりＮＩＰＡｍ／ＡＡｃＮＰと結合させた。
【００１４】
１０ｍＬのＮＩＰＡｍ／ＡＡｃを凍結乾燥し、１０ｍＬのＤＭＦ（ジメチルホルムアミド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に再懸濁した。粒子溶液を、中程度の速さで撹拌しながら室温にて１５分間窒素で通気した。その後、６８．８４ｍｇのＨＢＴＵ、２４．５２ｍｇのＨＯＢＴ、及び４０μＬのＮｍｍ（Ｎ−メチルモホリン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｍｏｐｈｏｌｉｎｅ）；Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ社製）を粒子溶液に添加し、中程度の速さで撹拌しながら室温にて５分間反応させた（ＨＢＴＵ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）及びＨＯＢｔ（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社製、上海）の量は、試薬／ＡＡｃの比率が１．５であり、アクリル酸のモル数が０．００００１２１だったことを考慮して計算した）。反応を窒素下で維持した。過剰量の染料をＤＭＦに溶解し、三つ口丸底フラスコに添加した。染料モル／ＡＡｃモルの比率が１０：１となるように、反応に必要な各染料の量を計算した。反応を窒素下にて６時間維持した。１６．１ｒｃｆ、２５ｕＣ、１５分間の遠心分離により、減少する濃度のＤＭＦで粒子を５回洗浄して未反応の染料を除去し、粒子再水和を促進させた。上清を破棄し、粒子を１０ｍＬの水に再懸濁した。
【００１５】
ＮＩＰＡｍ／ビニルスルホン酸粒子の合成  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（０．４７５ｇ、０．００４２モル）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（０．０４０ｇ、０．０２６モル）及びビニルスルホン酸（ＶＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）；（．８０．４μＬ）、０．０００７３モル）を、６０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、その後ニトロセルロース膜ディスクフィルター（細孔径０．４５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使用してろ過し、三つ口丸底フラスコに移した。溶液を、中程度の速さで撹拌しながら室温にて１時間窒素で通気し、その後７０℃に加熱した。ＫＰＳ（０．０２８ｇ、０．０００１モル）を２．５ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、溶液に添加して重合を開始させた。反応を窒素下にて６時間７０℃で維持した。粒子を、上述のように５回洗浄し、その後６０ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁した。  
【００１６】
ボロン酸含有粒子の合成。  ボロン酸含有粒子を、沈殿重合により得た。０．９３ｇのＮＩＰＡｍ及び０．０２８ｇのＢＩＳを、３０ｍＬの水に溶解し、真空ろ過し、窒素でよく通気した。０．０６６ｇのビニルフェニルボロン酸（ＶＰＢＡ）を２ｍＬのエタノールに溶解し、水溶液に添加し、それを常に撹拌しながら窒素で更に通気した。温度を７５℃に上昇させ、１５分間一定に維持した。０．００５ｇの過硫酸カリウム（ＫＰＳ）を溶液に添加して反応を開始させた。反応を、窒素下で連続的に撹拌しながら７５℃で４時間維持した。粒子を光散乱で研究したところ、ヒドロゲルの形成及びＶＰＢＡの組み込みを示唆する温度及びｐＨ感受性を示した。粒子のボロン酸含有量は、カーミンアッセイにより定量化することになろう。  
【００１７】
実施例２．  ＳＤＳページによって染料は様々な低含有量タンパク質と結合する。  図２ａ〜２ｂに示されているように、特定の化学的側鎖置換を有する特定のクラスの染料は、臨床的に関連する被検体と優先的に結合する。幾つかの染料クラスは、限定的な一組の被検体に結合するが、他の染料クラスは、より幅広い範囲の結合親和性を有する。置換の化学的構造及びその選択は、染料ベイトの結合親和性及び選択性を強く決定する。  
【００１８】
等量の粒子を、図２ａ〜２ｂに示されている一組の臨床的タンパク質と共に３０分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、粒子を遠心分離し（７分間、２５℃、１６１００ｒｃｆ）、上清を保存し、ペレットを１ｍＬの水に再懸濁し遠心分離（７分間、２５℃、１６１００ｒｃｆ）することにより、粒子を３回洗浄した。その後、粒子及び上清を２％試料緩衝液に再懸濁し、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルに直接負荷した。粒子をゲルのスタッキング領域に残留させ、タンパク質をゲルで電気泳動溶出及び分離した。銀染色法を使用してタンパク質を検出した。
【００１９】
以下の染料を含有するヒドロゲル粒子をＳＤＳページ結合研究に使用した（図２ａ〜２ｂ）：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ。タンパク結合の要約を使用して、その結果生じた結合を特徴付けた。特定の目的タンパク質の全てが捕捉され、粒子から溶出された場合、結果を完全結合とした。タンパク質の一部分が上清に残留し、タンパク質の残りの部分が粒子により捕捉された場合、結果を部分的結合とした。粒子がタンパク質を捕捉しなかった場合、結果を「非捕捉」とした。タンパク質の全てが上清に残留した。
【００２０】
実施例３．  粒子は、臨床級イムノアッセイの感受性を増加させる。  等量の粒子を、等量の合成尿及び合成汗と共に、ゆっくりと回転させながら３０分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、粒子を遠心分離し（７分間、２５℃、１６１００ｒｃｆ）、上清を保存し、ペレットを１ｍＬの水に再懸濁し遠心分離（７分間、２５℃、１６１００ｒｃｆ）することにより、粒子を３回洗浄した。その後、粒子を、溶出緩衝液（７０％アセトニトリル、１０％水酸化アンモニウム）と共にインキュベートした。３０ｍＬのＳｕｒｉｎｅとのインキュベーションを、５０ｍＬ遠心チューブ（Ｎａｌｇｅｎｅ社製）で実施し、遠心分離（４５分間、２５℃、毎分１８０００回転（ｒｐｍ））により、粒子を尿から分離し、上述のように洗浄した。
【００２１】
捕捉被検体の粒子からの溶出  ヒドロゲル親和性ベイト捕捉粒子は、様々な被検体、様々な化学的ベイト、並びに尿、汗、及び血清等の様々な生物学的関連液体で実証されたように、標的被検体を回収することができる。  
【００２２】
洗浄された粒子のペレットを、適切な量の溶出緩衝液と共に１５分間室温にてインキュベートした。インキュベーション後、粒子を遠心分離し（７分間、２５℃、１６１００  ｒｃｆ）、溶出液を保存した。溶出ステップを２回繰り返し、溶出液を一緒に貯溜した。溶出液を凍結乾燥した。
【００２３】
粒子から溶出されたｈＧＨの濃度は、Ｉｍｍｕｌｉｔｅ  １０００成長ホルモンシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製）を使用して測定した。溶出物をＧＨ試料希釈液で希釈し、製造業者の説明書に従って分析した。
【００２４】
結果  ８．７ｎｇ／ｍＬの濃度のヒト成長ホルモンを含有する１ｍＬ等量の合成尿を、１ｍＬのＮ−イソプロピルアクリルアミド／アシッドブラック４８と共にインキュベートした。粒子を、７０％アセトニトリル−１０％水酸化アンモニウムで溶出し、溶出タンパク質を、最初の溶液（１ｍＬ）と同じ容積に再懸濁した。上清を、標的被検体（ｈＧＨ）から完全に枯渇させた。プロセスの全収率は、（９５％）に近かった。（図１）
【００２５】
捕捉−溶出プロセスの効率が、１つの特定の被検体及び１つの特定の体液に依存しなかったことを検証するために、７９１２．５ｐｇ／ｍＬの濃度のインターロイキン−６でスパイクした５０μＬの人工汗を、５０μＬのＮ−イソプロピルアクリルアミド／ディスパースイエロー９粒子（１ｍｇ／ｍＬ）で処理した。粒子を、７０％アセトニトリル−１０％水酸化アンモニウムで溶出し、溶出タンパク質を、最初の溶液と同じ容積に再懸濁した。このプロセスの全収率は、９５％超だった。（図２ａ〜２ｂ）  
【００２６】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アシッドブラック４８粒子は、臨床級イムノアッセイ（Ｉｍｍｕｌｉｔｅ  １０００）の感受性を増加させる。ヒト成長ホルモンを、１０ｍＬの合成尿にスパイクし、溶液を、１ｍＬのアシッドブラック４８官能化粒子と共にインキュベートした。粒子を遠心分離により分離し、水で洗浄した。タンパク質を化学的に溶出し、凍結乾燥した。タンパク質を３００μＬの容積に再懸濁し、Ｉｍｍｕｌｉｔｅ  １０００で分析した。開始濃度の３０倍を超える濃縮係数が達成された（図３ａ〜３ｃ）。
レマゾールブリリアントブルーＲ粒子を、０．２４２ｎｇ／ｍＬの濃度のヒト成長ホルモンを含有する３０ｍＬの合成尿と共にインキュベートした。洗浄した粒子から溶出されたタンパク質を、３００ｍＬに再懸濁した。達成された濃縮係数は、６０倍を超えていた（図４ａ〜４ｂ）。
【００２７】
実施例４．  質量分析−血清とのベイト負荷粒子のインキュベーション。  新規ベイト化学物質を使用して、低含有量血清タンパク質を隔離、濃縮、及び保存することができる。質量分析法を使用する血清バイオマーカー発見に本主題発明を応用することにより、血液中に存在することが以前に知られていなかった多数の診断関連タンパク質を発見するための有用性が示される。
【００２８】
５００μＬ等量の血清を５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７で１：２に希釈し、図２ａ〜２ｂに列挙されている５００μＬのベイト負荷粒子と共にインキュベートした。粒子−血清インキュベーション時間は３０分間だった。粒子を遠心分離により分離し（１６．１ｒｃｆ、２５Ｃ、１０分間）、１ｍＬの０．５ＸＰＢＳで洗浄した。遠心分離した後（１６．１ｒｃｆ、２５Ｃ、１０分間）、上清を破棄し、ペレットを０．５ＸＰＢＳ／２０％アセトニトリルに再懸濁した。懸濁液を再び遠心分離し（１６．１ｒｃｆ、２５Ｃ、１０分間）、上清を廃棄した。ペレットを１００℃で５分間、１％ＴＦＡ、０．１Ｍ尿素、８０％ＡＣＮで構成された６００μＬの溶出緩衝液と共にインキュベートし、その後遠心分離した（１６．１ｒｃｆ、２５Ｃ、１０分間）。溶出ステップを２回繰り返し、溶出液を混合した。
【００２９】
ＮＩＰＡｍ／ＣＢ粒子を、０．２５Ｍ  ＮａＳＣＮで２回洗浄し、７０％ＡＣＮ、１０％ＮＨ４ＯＨで２回溶出した。
【００３０】
ＮａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析  粒子からの溶出物を質量分析法により分析した。ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥したタンパク質を８Ｍ尿素に再構成し、１０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、５０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで一晩３７℃にて消化した。トリプシンペプチドをＺｉｐ−Ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で更に精製し、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析機（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を使用した逆相液体クロマトグラフィーナノスプレータンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で分析した。オートサンプラーによる試料注入後、Ｃ１８カラム（０．２ｘ５０ｍｍ、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を、移動相Ａ（０．１％ギ酸）で２分間洗浄し、ペプチドを、５００ナノリットル／分にて５０分間かけて０％移動相Ｂ（０．１％ギ酸、８０％アセトニトリル）から５０％移動相Ｂへ、その後更に５分間で１００％移動相Ｂへの線形濃度勾配を使用して溶出した。ＬＴＱ質量分析機は、データ依存性モードで操作し、このモードでは、各々の完全なＭＳスキャン後に５回のＭＳ／ＭＳスキャンを行ない、５つの最も豊富な分子イオンが、３５％の正規化衝突エネルギーを使用して衝突誘起解離（ＣＩＤ）用に動的に選択された。タンデム質量スペクトルを、トリプシン切断による制約を使用し、ＳＥＱＵＥＳＴを用いてＮＣＢＩヒトデータベースに対して探索した。以下のフィルター基準を検索結果に適用することにより、高信頼性のペプチド特定を得た：１＋、２＋、３＋イオンの場合、Ｘｃｏｒｒ対電荷≧１．９、２．２、３．５；ΔＣｎ＞０．１；無作為特定の可能性≦０．０１。  
【００３１】
結果  以下のベイトを担持する粒子をスクリーニングした：１  アリザリンブルーブラックＢ；２  ディスパースブルー３；３  レマゾールブリリアントブルーＲ；４  ピグメントレッド１７７；５  アシッドブラック４８；６  ディスパースイエロー３；７  ナフトールブルーブラックＢ（Ａｂ１）；８  ディスパースオレンジ３；９  ディスパースイエロー９；１０  ローダミン１２３；１１  トルイジンブルーＯ；１２  アクリル酸；１３  パラロザニリン塩基、１４  ブリリアントブルーＲ；１５  アシッドブルー２２；１６  ビニルスルホン酸；１７  シバクロンブルーＦ３ＧＡ（３）。１００μＬ等量の粒子を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７で１：２に希釈した１００μＬの血清と共にインキュベートした。粒子を血清と共に３０分間インキュベートさせ、その後遠心分離で分離した。粒子により捕捉されたタンパク質を化学的に溶出し、トリプシンで消化し、質量分析法で配列決定した。
【００３２】
図４ａ〜４ｂに報告されている結果は、ほとんどの染料官能化粒子が、血清中で以前にまったく配列決定されていない（ＨＵＰＯ血漿プロテオームプロジェクト総合リスト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｕｐｏ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｈｐｐｐ／に存在しない）新しいタンパク質の配列決定を可能にしたことを実証した。
【００３３】
以下の化学的親和性ベイトを担持する粒子を選択した：レマゾールブリリアントブルーＲ、ディスパースイエロー３、ディスパースイエロー９、アクリル酸、シバクロンブルーＦ３ＧＡ、並びにｍｉｘ＝レマゾールブリリアントブルーＲ、ディスパースイエロー３、及びディスパースイエロー９の混合物。５００μＬ等量の粒子（１ｍｇ／ｍＬ）を、５００μＬの血清と共に３０分間インキュベートし、遠心分離で分離し、化学的に溶出した。タンパク質をトリプシンで消化し、質量分析法で配列決定した（図５〜１４）。
結果は、様々な染料を担持する粒子が、様々な群のタンパク質と結合することを実証した。タンパク質の隔離は、親和性ベイトの化学構造に依存する。  
【００３４】
実施例５  シバクロンブルーＦ３ＧＡコア−ビニルスルホン酸シェル粒子の調製。  シェル及びコアに２つの異なるクラスの染料ベイトを含有するコアシェルベイト含有粒子を調製した。この二重ベイト設計は、新規の捕捉親和性特性を提供する。不要な夾雑物アルブミンが、外側シェルの染料により除外され、同時に、所望の被検体がコアにより捕捉される（図５）。
【００３５】
総単量体に対して１０％のＡＡを含有するＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）／アリールアミン（ＡＡ）粒子を調製した。ＮＩＰＡｍ（０．８９ｇ、７．８３ミリモル）及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ、０．０４２ｇ、０．２７ミリモル）を３０ｍＬの水に溶解し、その後０．２μｍフィルターナイロン膜を通過させた。溶液を、中程度の速さで撹拌しながら室温にて１５分間窒素で通気し、その後ＡＡ（０．０５１ｇ、０．９０ミリモル）を添加した。溶液を、更に１５分間窒素で通気し、その後７５℃に加熱した。１．０ｍＬ水中のＫＰＳ（０．００７０ｇ、０．０２５モル）を、溶液に添加して重合を開始させた。反応を、窒素下で３時間７５℃にて維持した。その後、反応を室温に冷却させ、一晩撹拌した。その後、反応混合物を２ｍＬの微量遠心チューブに移し、遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製５４１５Ｒ遠心機）により、粒子を回収及び洗浄した。粒子懸濁液を２３℃及び１６１００相対遠心力（ｒｃｆ）で２０分間遠心した後、各チューブの上清をデカントし、粒子を１．０ｍＬの水に再分散した。この濃縮／再分散プロセスを繰り返して、合計５回の洗浄をした。ＮＩＰＡｍ／シバクロンブルーＦ３ＧＡ（ＣＢ）粒子を得るために、ＣＢ（０．７６ｇ、０．９０ミリモル）を、１０ｍＬの０．１モル／Ｌ炭酸ナトリウム水溶液に溶解した。ＮＩＰＡｍ／ＡＡ粒子懸濁液（１０ｍＬ容積）を、１００ｍＬ三つ口丸底フラスコ中で中程度の速さで撹拌しながら１５分間窒素で通気し、その後固形炭酸ナトリウム（０．１０６ｇ、１．０ミリモル）を懸濁液に添加した。その後、懸濁液を窒素下で約１分間室温にて撹拌した。その後、ＣＢ溶液をＮＩＰＡｍ／ＡＡ粒子懸濁液に添加し、その後、混合した反応混合物を窒素下で４８時間室温にて撹拌した。その結果生じたＮＩＰＡｍ／ＣＢ粒子を、ＮＩＰＡｍ／ＡＡ粒子の調製について上述されているように、遠心分離を使用して回収及び洗浄した。染料負荷量は、分光光度法により決定した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ社製２０＋）。既知濃度のＣＢ原液を使用して検量線を構築した。濃縮／再分散プロセス全体からの上清を混合し、６０８ｎｍの波長におけるそれらの吸光度を決定した。混合した上清のＣＢ濃度を、検量線を使用して推定した。サブミクロン粒径分析器、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製で測定したところ、室温でのＮＩＰＡｍ／ＣＢ粒子直径は、３１２ｎｍである。粒子直径の測定は、希釈液として水を使用して実施した（屈折率（ＲＩ）＝１．３３３、希釈液粘度＝０．８９０ｃＰ）。試験角度は９０°だった。２００秒間の積分時間を使用した３回の測定の平均値を計算し、各回の測定前に、溶液を１０分間熱的に平衡化させた。その後、ストークスアインシュタインの関係により、測定値を粒径に変換した。
【００３６】
ＮＩＰＡｍ／ＣＢコアにビニルスルホン酸（ＶＳＡ）シェルを構築するために、上述のようにして得た２０ｍＬのＮＩＰＡｍ／ＣＢ粒子懸濁液を、７０℃に加熱し、１時間窒素で通気した。ＮＩＰＡｍ（０．１５６ｇ、１．３８ミリモル）、ＢＩＳ（０．０１３ｇ、０．０８４ミリモル）、ビニルスルホン酸（２６μｌ、０．３３４ミリモル）、及びＫＰＳ（０．０９２ｇ、０．３２８ミリモル）を水に溶解し、０．２μｍフィルターナイロン膜を通過させた。１時間後、３ｍＬのこの溶液を、ＮＩＰＡｍ／ＣＢ粒子懸濁液に添加し、残りの１７ｍＬの溶液を５分毎に３ｍＬ等量で添加した。サブミクロン粒径分析器で測定したところ、シェル合成反応後の粒子直径は、３６８ｎｍだった。  
【００３７】
結果  コア区画及びシェル区画に２つの異なるベイトを含む構造の有用性を証明するために、シバクロンブルーＦ３ＧＡコアで構成され、ビニルスルホン酸シェルを含有する粒子を得た。以下の特性を有する粒子を実験的に比較した：ビニルスルホン酸コア粒子、シバクロンブルーＦ３ＧＡ粒子、シバクロンブルーＦ３ＧＡ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドシェル、及びシバクロンブルーＦ３ＧＡコア−ビニルスルホン酸シェル。１００μＬ等量の粒子を、１０μＬの血清と共にインキュベートし、遠心分離で分離し、水で２回洗浄した。粒子を、４〜２０％ＴｒｉｓＧｌｙゲルに負荷した。ＳＤＳページ分析は、以下を明らかにした：１）ビニルスルホン酸官能化粒子は、アルブミンを著しい量では取り込まない（レーン２）、２）シバクロンブルーＦ３ＧＡ粒子は、ビニルスルホン酸粒子と比べて、異なるより多様な捕捉タンパク質のパターンを示し、ある程度の量のアルブミンを捕捉する（レーン３）、３）シバクロンブルーＦ３ＧＡコア−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドシェル粒子は、シバクロンブルーＦ３ＧＡコア粒子と同様の挙動を維持する（レーン４）、４）シバクロンブルーＦ３ＧＡコア−ビニルスルホン酸シェル粒子は、アルブミンを著しい量では取り込まず、シバクロンブルーＦ３ＧＡコアと同様の回収低分子量タンパク質のパターンを維持する。したがって、コア及びシェルに２つの異なるベイトを含有する粒子は、２つのベイトの特徴を加算した挙動を獲得する。特に、本発明のこの実施形態では、ビニルスルホン酸シェルは、低分子量タンパク質がシバクロンブルーＦ３ＧＡコアと相互作用するのを防止しなかった。  
【００３８】
実施例６
タンパク質被検体に対する粒子の親和性に対する化学的ベイト構造の影響。  粒子の結合特性に対する親和性ベイトの化学構造の影響を調査するために、構造番号５（アシッドブラック４８）を開始構造として選択した。アシッドブラック４８は、２つのアントラキノン環及び多数のスルホナート側鎖基を含有する。構造１〜４は、アシッドブラック４８とそれらが類似しているため選択した。
構造１〜４は、アントラキノン環、スルホナート置換基、及びメチル基（構造２）、アリール基（構造１及び３）、又は無置換基（構造４）等の他の置換基を含有する。ビニルスルホン酸を担持する粒子は、図６において１６番と表示されている。上述のベイトを担持する粒子を、低含有量で低分子量のタンパク質被検体と共にインキュベートし、ＳＤＳページで分析した。結果は、化学的ベイトの構造変化が粒子の結合特性に影響を及ぼし、その結果様々なベイトで官能化された粒子が、様々な結合パターンを示すことを示した。例えば、ケモカインエオタキシン２は、構造番号１、４、及び５を含有する粒子により完全に捕捉され、構造２を担持する粒子と部分的に結合し、構造３を担持する粒子によっては捕捉されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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