(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々が少なくとも１つの狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする、２つ以上の外因性核酸分子を含む、組換えアライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ）であって、
血球凝集素（ｈａ）およびチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座の各々に少なくとも１つの前記核酸分子が挿入され、
狂犬病ウイルス糖タンパク質の供給源が、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ狂犬病株、およびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病株から選択され、
アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入されている糖タンパク質をコードする核酸分子が、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ狂犬病株に由来し、
アライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座に挿入されている糖タンパク質をコードする核酸分子が、Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病株に由来する、
前記組換えアライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ）。
【請求項２】
アライグマポックスウイルスが生存しており、複製可能である、請求項１に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクター。
【請求項３】
アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼおよび血球凝集素遺伝子座に加え、アライグマポックスウイルスゲノムの第３の非必須部位に挿入されている狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、請求項２に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクター。
【請求項４】
アライグマポックスウイルスゲノムの第３の非必須部位が、セリンプロテアーゼ阻害剤部位である、請求項３に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクター。
【請求項５】
免疫学的に有効な量の、請求項１に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクターと、所望により、好適な担体または希釈剤とを含む、組換え狂犬病ワクチン。
【請求項６】
免疫学的に有効な量の、請求項１〜４のいずれか一項に記載の１つ以上の組換えアライグマポックスウイルスベクターと、所望により、好適な担体または希釈剤とを含む、組換え狂犬病ワクチン。
【請求項７】
ネコカリシウイルス、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルスおよびバルトネラ菌からなる群から選択される１つ以上のネコ抗原との混合物をさらに含む、請求項６に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項８】
エーリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、イヌパルボウイルス、イヌジステンパー、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルスＩＩ型、イヌアデノウイルス、イヌコロナウイルス、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）およびレプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ）からなる群から選択される１つ以上のイヌ抗原との混合物をさらに含む、請求項７に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項９】
アジュバントをさらに含む、請求項５に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項１０】
前記アジュバントが、エチレン／マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む、請求項９に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項６に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項１２】
前記アジュバントが、エチレン／マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む、請求項１１に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項１３】
アジュバントをさらに含む、請求項７に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項１４】
前記アジュバントが、エチレン／マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む、請求項１３に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項８に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項１６】
前記アジュバントが、エチレン／マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む、請求項１５に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項１７】
哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１８】
哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１９】
哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項９に記載のワクチン。
【請求項２０】
哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項２１】
ネコにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項７、１３または１４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２２】
イヌにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項８、１５または１６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２３】
ウシにおいて、またはウマにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項５または７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２４】
ウシにおいて、またはウマにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項２５】
請求項１に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクターを作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ狂犬病株の糖タンパク質をコードする核酸配列を、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入する工程と、
（ｂ）Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病株の糖タンパク質をコードする核酸配列を、アライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座に挿入する工程と、
（ｃ）組換えアライグマポックスウイルスベクターを回収する工程と
を含む方法。
【請求項２６】
前記工程（ａ）および（ｂ）の核酸配列が、組換えアライグマポックスウイルスベクターによる核酸の発現ならびに第１および第２の狂犬病株の糖タンパク質の産生を可能にするために、核酸配列に作動可能に連結したプロモーター配列をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ワクチンの有効免疫量が、４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜６．７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲である、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記ワクチンの有効免疫量が、５．３８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲である、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記ワクチンが、単回用量として、または反復用量として投与される、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項３０】
前記ワクチンがアジュバントを含まない、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組換え狂犬病ワクチン。
【請求項３１】
Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ由来の核酸配列がｖｖＰ１１後期プロモーターの制御下にあり、Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病株由来の核酸配列が合成初期−後期プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ（ｔｋ）および血球凝集素（ｈａ）遺伝子座に挿入された、少なくとも２つの異なる狂犬病株の狂犬病糖タンパク質遺伝子を独特に発現する組換えアライグマポックスウイルスベクターに関する。本発明は、狂犬病ウイルスによって引き起こされる神経疾患および死亡の予防においてワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
狂犬病ウイルスは、ラブドウイルス科のマイナス鎖極性を有する、非分割型の、一本鎖、直鎖ＲＮＡラブドウイルスまたはリッサウイルスであり、一方の末端が、球形または円錐体であり、もう一方の末端が平面状であるかまたは凹面の形である砲弾様の形を有する。ウイルス粒子の球形または円錐体の末端は、糖タンパク質Ｇからなるノブ様スパイクを含むリポタンパク質外被を有する。コア構造の周囲の脂質膜またはウイルスの外被は、糖タンパク質Ｇに加え、基質タンパク質（Ｍ）からなる第２の内層を有する。外面糖タンパク質Ｇは、細胞接着に関与しており、狂犬病ウイルスの毒性または病原性ならびに宿主免疫応答に関与している抗原物質として同定されている。
【０００３】
若干の例外はあるものの、狂犬病は、常に、ヒトおよび動物に致命的な神経疾患をもたらし、世界的な公衆衛生における大きな懸念のままである。狂犬病に起因するヒトの死の大部分は、アフリカ、アジアおよび南アメリカで起こっているが、狂犬病の流行は、最近、急速に増加している感染アライグマの集団のために、米国においても問題になっている。懸念されるその他の一次ウイルスキャリアとして、中西部州に多いスカンク、および米国におけるほとんどのヒト症例における主な供給源であるコウモリがある。アライグマ、スカンク、キツネ、オオカミなどといった感染野生動物に加え、ヒトは、通常、感染しているイヌおよびネコの咬傷によって狂犬病に感染する。イヌは、イヌ狂犬病が風土性であるアフリカおよびアジアにおいて狂犬病ウイルスの主要な宿主であり続け、世界中で、依然として、狂犬病に起因するヒトの死亡のほとんどに関与している。したがって、人類にとって特に重要なことは、イヌ、ネコおよびフェレットなどの家庭内ペットにおける狂犬病ウイルス感染を防ぐことである。
【０００４】
Ｌｏｕｉｓ  ＰａｓｔｅｕｒおよびＥｍｉｌｅ  Ｒｏｕｘが、１８８５年に最初の狂犬病ワクチン接種を開発した。初期の神経組織由来ワクチンは、感染ウサギから採取し、乾燥させて病原性を減弱させたウイルスサンプルからなる。発展途上国の中には、同程度の神経組織狂犬病ワクチンを依然として使用する国もあり、それらは、現代の細胞培養ワクチンよりもかなり費用がかからないが、有効性では程遠く、神経学的副作用の重大な危険を伴う。
【０００５】
１９６７年に、ウイルスの弱毒化されたＰｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ  Ｌ５０３株を用いてヒトワクチン接種のためのヒト二倍体細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣＶ）が開発された。現在市場で入手可能なものは、あまり費用がかからない、高度精製ニワトリ胚培養ワクチン（ＰＣＥＣ）および精製ベロ細胞狂犬病ワクチンである。後者のベロ細胞培養ワクチンは、狂犬病ウイルスの弱毒化されたＷｉｓｔａｒ株を用いるが、ベロ細胞株はその宿主である。弱毒化にもかかわらず、ベロ細胞培養ワクチンは、毒性へ復帰する可能性を有する。その結果、狂犬病ワクチンの調製は、不活化プロセスで生き残った狂犬病ウイルスの結果としての株によるウイルス感染の偶発的な播種を避けるよう、作業者による細心の注意を必要とする。ＰＣＥＣワクチンは、卵またはニワトリに対するアレルギーを有するものには与えることができないという不利点が追加される。ワクチンにおいて、生存している狂犬病ウイルスを操作、製造または使用するのが、さらに困難であることはは、製薬および獣医学の技術分野の当業者にはよく知られている。
【０００６】
従来の狂犬病ウイルスワクチンの不利点を考慮して、研究は、組換えアライグマポックスウイルスの使用および狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子などの外来遺伝子を、アライグマポックスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座に挿入することを目的としてきた。組換えアライグマポックスウイルスの特定の初期構築物は、外来ウイルスの抗原物質または外来ＤＮＡを発現し、イヌおよびネコなどのその他の動物において宿主防御免疫応答を誘発できることがわかった。しかし、ワクチンとして有用である、安全で、有効な組換えアライグマポックスウイルスの構築は、複雑な事柄であり、考慮しなければならない多数の因子と関わっている。特に、既知ｔｋ遺伝子座を超えた種々の領域に挿入された、外因性または外来遺伝子の位置が異なる組換えアライグマポックスウイルスを作製する能力ならびに機能的外来抗原ＤＮＡ断片の特定の選択には、得られた組換えポックスウイルスの安定性、安全性および効力を調べるための相当な実験研究が必要である。したがって、商業的に実現可能な組換えアライグマポックスウイルスワクチンを得るためのいくつかの試みは、家畜ワクチンの分野に多くの努力を集中してきた。
【０００７】
そのため、ワクチンとしての組換えアライグマポックスウイルスという主題に関して相当な量の公開された情報がある。例えば、より最近、米国特許出願第２００５／０２８２２１０号に、アライグマ狂犬病のための、経口の遺伝子組換えウイルスワクチンが記載された。狂犬病ウイルスの外被においてタンパク質を産生する遺伝子を、組換えＤＮＡ技術を用いて生存ワクシニアウイルスに挿入した。改変ワクシニアウイルスは、正常な動物に感染すると、通常、狂犬病ウイルスによって作製される抗原性タンパク質を産生する。犠牲者の生物系は、このタンパク質を外来と認識し、この動物は、能動免疫を発達させる。具体的には、ワクシニアのウイルスベクターゲノムに挿入された狂犬病表面糖タンパク質遺伝子を包含する含むウイルスのベクターからなる組成物を投与することを含むスカンクまたはマングースにおいて免疫応答を誘発する方法について、特許出願第２００５／０２８２２１０号は書かれている。この開示内容は、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子で発現される予定のポリヌクレオチドもしくは複数のポリヌクレオチドの可能性ある挿入部位もしくは挿入部位、血球凝集素（ｈａ）遺伝子もしくは挿入部位、またはワクシニアウイルスのＡ型の封入体（ＡＴＩ）をコードする領域、カナリアポックスウイルスの場合には、ＯＲＦ（複数可）Ｃ３、Ｃ５および／またはＣ６、鶏痘ウイルスの場合にはＣ６、ＯＲＦ  Ｆ７および／またはＦ８を示唆するが、この文書は、狂犬病糖タンパク質ＧがＥＲＡ株に由来し、ワクシニアのｔｋ部位にのみ挿入される挿入されるワクシニアウイルスベクターの使用を例示するだけである。
【０００８】
米国特許第７，０７４，４１３号には、非神経浸潤性狂犬病株の糖タンパク質を、ｓｔｒｅｅｔまたは神経浸潤性狂犬病ウイルスのものと置換して、ワクチン接種のための弱毒化された組換え狂犬病ウイルスを作製することまたはアポトーシス促進性タンパク質を発現する組換え狂犬病ウイルスを構築することによる組換え狂犬病ウイルスワクチンの設計が開示されている。
【０００９】
米国特許第６，７１９，９８１号には、Ｓｔｒｅｅｔ  Ａｌａｂａｍａ  Ｄｕｆｆｅｒｉｎ株（ＳＡＤ  Ｄ２９）の組換え狂犬病ウイルス突然変異体が、ウイルスゲノムのＧタンパク質中に突然変異を含み、前記突然変異が、Ａｒｇ３３３をコードするＡＧＡコドンのＧＡＣコドンとの特定の置換を含む、弱毒化された狂犬病ウイルス突然変異体および前記突然変異体を含む生存弱毒化抗狂犬病ワクチンが示されている。
【００１０】
米国特許第６，２９４，１７６号は、アライグマポックスウイルスゲノムのＨｉｎｄ  ＩＩＩ「Ｕ」ゲノム領域、ＨｉｎｄＩＩＩ「Ｍ」ゲノム領域またはＨｉｎｄ  ＩＩＩ「Ｎ」ゲノム領域内の非必須領域挿入された外来ＤＮＡ配列を含むアライグマポックスウイルスゲノムからなる組換えアライグマポックスウイルスワクチンに関する。アライグマポックスウイルスゲノムは、ウイルスゲノムのアライグマポックスウイルス宿主域遺伝子に欠失を含有すると特許に記載されている。この特許は、アライグマポックスウイルスゲノムに外来ＤＮＡ配列を挿入することによって、組換えアライグマポックスウイルスを作製するための相同ベクターを提供する。組換えアライグマポックスウイルスは、狂犬病ウイルスに由来する抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含み得るということが広く示唆されるが、それに関連する例証はない。さらに、ＤＮＡ配列分析によって、特許権所有者によって開示されるＨｉｎｄＩＩＩ「Ｕ」ゲノム領域は、組換えアライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素（ｈａ）挿入および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）領域ではないということが示されている。
【００１１】
米国特許第６，２４１，９８９号およびその継続米国特許第７，０８７，２３４号は、チミジンキナーゼ遺伝子または血球凝集素遺伝子のいずれかに挿入された２つ以上の外因性遺伝子を含有している多価組換えアライグマポックスウイルスを扱っている。これらの特許に開示されるのは、ネコをネコ病原体に対して免疫化するワクチンとしての多価組換えアライグマポックスウイルスの使用である。また、外因性遺伝子が挿入される挿入ベクターの構築および挿入された遺伝子およびアライグマポックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子または血球凝集素遺伝子中に組換えることができる配列をフランキングすること、ならびに外因性遺伝子を含有する挿入ベクターおよびアライグマポックスウイルスの両方を感受性宿主細胞に導入すること、ならびに得られたプラークから組換えアライグマポックスウイルス選択することを含む組換え法によって、多価組換えアライグマポックスウイルスを作製する方法も開示されている。この特許の、多価の、組換えアライグマポックスウイルスは、ネコ細胞に感染し、複製することができ、ウイルス複製に必須でないアライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子またはチミジンキナーゼ遺伝子からなる領域に挿入され、各々、ネコ病原体抗原をコードする、２つ以上の外因性遺伝子を含む。これらの特許には、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ  Ｅｎｖ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ  Ｇａｇ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ  Ｅｎｖ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ  Ｍ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ  Ｎ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ  キャプシドタンパク質）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ  ＶＰ２）および狂犬病−Ｇなどのネコ病原体抗原をコードする外因性遺伝子が記載されている。
【００１２】
米国特許第６，２４１，９８９号および同第７，０８７，２３４号では、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子および血球凝集素（ｈａ）遺伝子の両方とも、組換えによる外因性遺伝子の挿入のために使用できることが示唆されており、具体的な例は、フランキングされたワクシニアウイルスｔｋ遺伝子配列の相同組換えおよびｈａ遺伝子に挿入されたＦＣＶキャプシドタンパク質遺伝子を含有する別個の相同組換えアライグマポックスウイルスによって、多価ＲＣＮＶベースの組換えＦＰＶ  ＶＰ２および狂犬病ウイルス（ＲＣＮＶ／ＦＰＶ／ＲＡＢ−Ｇ）を作製する方法を単に示すものである。チミジンキナーゼおよび血球凝集素遺伝子の両方に複数の外来抗原性物質を含有する組換えアライグマポックスウイルスを構築および／または使用する方法を教示する特許請求または例示はない。さらに、これらの特許は、アライグマポックスウイルスゲノムのｈａ部位に挿入された狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子を有する組換え構築物は全く教示または開示しない。
【００１３】
米国特許第６，１０６，８４１号は、動物を異種抗原に対して免疫化する方法に関する。この方法には、動物に結膜経路によって、異種抗原をコードする核酸分子を有する組換えアライグマポックスウイルスを含む組成物を投与することが記載されている。抗原は、カリシウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、免疫不全ウイルス、感染性腹膜炎ウイルス、白血病ウイルス、パルボウイルス抗原、狂犬病ウイルス、バルトネラ、エルシニア、イヌ糸状虫、トキソプラズマ、ノミ抗原またはノミアレルゲン、小昆虫抗原またはアレルゲン、ダニ抗原またはアレルゲンおよび腫瘍抗原として記載されている。この特許は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン、インターフェロンγなどといった免疫調節物質をコードする核酸分子を含む組換えアライグマポックスウイルスをさらに開示している。それにはまた、チミジンキナーゼ、血球凝集素、セルピン、サイトカイン受容体およびインターフェロン受容体遺伝子から選択されるアライグマポックスウイルス遺伝子中に異種核酸分子を有し、異種核酸分子が、ｐ１１ポックスウイルスプロモーター、ｐ７．５ポックスウイルスプロモーターまたは合成ポックスウイルスプロモーターからなる転写制御配列に作動可能に連結した組換えアライグマポックスウイルスゲノムを使用する方法も記載されている。
【００１４】
米国特許第６，０２４，９５３号には、狂犬病の抗原性糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列のすべてまたは一部を含むワクシニアウイルスが記載されている。特に、この特許は、７．５Ｋワクシニアウイルスプロモーターの制御下のワクシニアチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子に挿入されている狂犬病糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有するハイブリッドワクシニアウイルスおよびハイブリッドワクシニアウイルスと、製薬上許容される担体とからなる狂犬病予防および治療するワクチンを開示する。
【００１５】
米国特許第５，３４８，７４１号は、ワクシニアＰ１１後期プロモーターに作動可能に連結した狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ遺伝子を含む組換えＤＮＡを用いて構築されているプラスミドベクターを扱っている。狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ遺伝子は、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ株に由来している。遺伝子およびプロモーターは、ワクシニアまたは牛痘ウイルスベクターのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座に挿入される。この特許には、組換えワクシニアウイルスは、細胞において狂犬病ウイルス糖タンパク質の遺伝子を発現し、狂犬病に対する免疫化のための糖タンパク質の産生を誘導すると記載されている。この特許は、組換えウイルスは、抗狂犬病ワクチンの製造および研究または診断目的のＧ抗原抗体および関連免疫学的試薬の製造に適用できることを示す。特に、この特許は、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ遺伝子を、ｔｋ遺伝子座付近の任意のその他の部位に挿入することを記載しておらず、アライグマポックスウイルスをベクターとして使用することの示唆は全く与えていない。
【００１６】
初期のＤＮＡ狂犬病ワクチンは、米国特許第５，８３０，４７７号に記載されており、これは、狂犬病の抗原性糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列のすべてまたは一部を含むワクシニアウイルスに関する。この特許は、アミノ酸配列狂犬病糖タンパク質ＧをコードするＤＮＡ配列を含み、発現し、ＤＮＡ配列が、ワクシニアウイルスの非必須セグメント中に存在するハイブリッドワクシニアウイルスと、製薬上許容される担体とからなる、哺乳動物において狂犬病を予防または治療するための経口ワクチン関する。具体的には、この特許は、狂犬病糖タンパク質Ｇが、７．５Ｋワクシニアプロモーターの制御下にあり、ワクシニアチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子中に存在するハイブリッドワクシニアウイルスワクチンを単に例示するものである。
【００１７】
米国特許第５，２６６，３１３号は、アライグマポックスウイルスの、異種生物の配列をコードするヌクレオチドの挿入および発現の基質としての使用に関する。この特許には、アライグマポックスウイルスＤＮＡと、チミジンキナーゼ（ｔｋ）挿入不活化によるワクシニアウイルス組換え体の製造に使用するためのキメラプラスミド間の相同組換えによって、狂犬病ウイルス表面スパイク糖タンパク質（Ｇ）を発現する、２つの感染性アライグマポックスウイルス組換え体の製造が記載されている。
【００１８】
また、プロモーター、すなわち、挿入され、組換えベクターによって発現されている外来遺伝子または外因性遺伝子物質を含む外来遺伝子タンパク質コード配列とともに使用されるプロモーターなどの遺伝子の転写を正に調節する配列の一般的な使用に関するこれまでの特許が、本発明の背景材料として注目される。例えば、米国特許第６，９９８，２５２号は、ポックスウイルスにとって外来であるポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列と、ポックスウイルス転写調節配列とを含み、転写調節配列がＤＮＡ配列に隣接しており、ＤＮＡ配列に転写制御を及ぼし、セグメントが組換えポックスウイルスの非必須ゲノム領域内に位置するワクシニアなどの組換えポックスウイルスに関する。ワクシニアウイルスの７．５Ｋポリペプチド遺伝子（７．５Ｋ遺伝子）に由来するプロモーターと、外来タンパク質コード配列の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位と、フランキングＤＮＡとして中断されたワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子とを含有するプラスミドの構築が示されている。
【００１９】
米国特許第７，０４５，３１３号は、同様に、ワクシニアウイルスまたはその他のポックスウイルスを、外来遺伝子の発現のためのベクターとして使用するための方法および組成物に関し、これでは、発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでワクシニアウイルス転写調節配列を、中断されていない外来タンパク質コード配列と組み合わせて、キメラ遺伝子を形成することによって得られる。この特許では、キメラ遺伝子が、ワクシニアウイルスゲノムの非必須領域に由来するＤＮＡによってフランキングされて、ｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換えのための部位を提供する方法が示されている。これらの工程は、外来タンパク質コード配列の挿入のためにワクシニア転写調節配列の隣に、複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むプラスミドの構築によって、特許の開示内容において促進される。この特許では、ワクシニアウイルスにとって外来であるポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列と、ワクシニアウイルスプロモーター配列とからなるセグメントを含み、前記プロモーター配列が前記の第１のＤＮＡ配列と隣接しており、前記の第１のＤＮＡ配列に転写制御を及ぼし、前記セグメント、ワクシニアゲノムの非必須領域に由来するＤＮＡをフランキングするプラスミドがさらに示されている。具体的には、プロモーター配列は、ワクシニアウイルスにおいて、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子または７．５Ｋポリペプチドをコードするワクシニア遺伝子を調節するものである。それには、ＤＮＡを細胞に導入するためのトランスフェクション手順が示されており、その細胞で、相同組換えの結果、キメラ遺伝子がワクシニアウイルスゲノムの非必須領域へ挿入される。
【００２０】
また、当技術分野で公知の標準プロモーターに関連して、米国特許第７，２０８，３１３号は、負のチミジンキナーゼ（ｔｋ）表現型および負のワクシニアウイルス増殖因子表現型を用いて作製されるワクシニアウイルス発現ベクターに関する。外来遺伝子は、ワクシニアウイルスプロモーターの制御下に置かれ、突然変異ワクシニアウイルスのゲノムに組み込まれる。あるいは、発現は、ワクシニアプロモーターによって制御される遺伝子を含有するシャトルベクターまたはプラスミドを、ワクシニアウイルスに感染している細胞にトランスフェクトすることおよび相同組換えによって外因性配列を導入することによって達成され得る。
【００２１】
合成初期−後期ワクシニアウイルスプロモーターが、米国特許第６，１８３，７５０号；同第７，０６７，２４８号、その他に示されている。米国特許第６，１８３，７５０号には、ヘルペスウイルスに由来する外来ＤＮＡおよびＤＮＡを発現するためのこのＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含有する、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスまたはカナリアポックスウイルスなどの組換えポックスウイルスが記載されており、これでは、プロモーターはＤＮＡの開始コドンに重ねられているか、連結されている。プロモーター−遺伝子連結は、連結が、両末端で、非必須遺伝子座を含有するポックスＤＮＡの領域をフランキングするＤＮＡ配列と相同なＤＮＡによってフランキングされるように、プラスミド構築物中に位置している。挿入されたＤＮＡの発現のための条件は、挿入されたＤＮＡと適当な関係にあるプロモーターの存在であり、すなわち、プロモーターは、発現される予定のＤＮＡ配列から上流に位置するように置かれるべきである。米国特許第７，０６７，２４８号は、合成初期−後期プロモーターを使用して、ワクシニアウイルスから基質タンパク質を発現する方法をさらに示す。非特許文献１を参照のこと。
【００２２】
本発明の背景と関連するその他の物質は、以下の文献引用に見ることができる：
【００２３】
【数１】
0005653751.tif 000002
【００２４】
【数２】
0005653751.tif 000003
従来の不活化狂犬病ワクチンと比較して、安全かつ有効で、アジュバントを含まないアライグマポックスウイルスベクターによる狂犬病ワクチンの開発の成功は、ネコにおけるアジュバント関連肉腫副作用を回避すること、ワクチン製造の間の従事者の安全を確実にすること、商業的製造に用いられる不活化および汚染除去手順を生き残る狂犬病ウイルスのいかなる機会も完全に排除することにおいて重要な利点をもたらす。ペットを狂犬病ウイルスに感染することから適切に保護し、順に、それらのヒトの飼い主を致命的な感染から保護する、家庭用ペットのための安全で、有効な狂犬病ウイルスワクチンに対する技術分野で認識される必要性は、依然として存在する。また、狂犬病を予防するための実行可能な方法および哺乳動物における有害な神経学的影響の回復も必要である。
【００２５】
前述の目的は、本明細書に記載される狂犬病ワクチンの新規アライグマポックスウイルスベクター構築物の形の、イヌおよびネコにおいて長期間持続する免疫をもたらす、安全で、有効な組換え狂犬病ワクチンを提供することによって達成される。
【００２６】
本明細書に引用されるすべての特許および刊行物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｓ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、「Ｃｏｍｐａｃｔ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ／ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１０９４〜１０９７頁（１９９７年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、そのもっとも広い態様では、各々、少なくとも１つの狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする、２つ以上の外因性核酸分子を含み、少なくとも２つの核酸分子が血球凝集素（ｈａ）遺伝子座またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座に挿入されており、または、少なくとも１つの核酸分子が、血球凝集素およびチミジンキナーゼ遺伝子座の各々に挿入されており、抗原が少なくとも２つの異なる狂犬病ウイルス株に由来し得る、新規の、高度に免役原性の組換えアライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ）を提供する。２つの外因性核酸が、同一の遺伝子座に挿入される場合には、それらは連続であってもよいし、介在する配列によって分離していてもよい。新規組換えアライグマポックスウイルスベクターワクチンは、ポックスウイルスゲノムの血球凝集素（ｈａ）遺伝子座で、もしくはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座で、またはポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ（ｔｋ）および血球凝集素（ｈａ）遺伝子座の両方で、狂犬病ウイルスの外因性または外来糖タンパク質遺伝子を発現し得る。本発明の新規の、高度に好ましい組換えウイルス構築物が、それぞれ、ｔｋおよびｈａ遺伝子座で、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＶＳ）およびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ（ＰＶ）株の狂犬病糖タンパク質（Ｇ２）を発現することが都合がよい。狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする核酸分子の供給源は、狂犬病ウイルスの同一株に由来してもよいが、少なくとも２つの異なる狂犬病株の遺伝子が、ポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ（ｔｋ）および血球凝集素（ｈａ）遺伝子座に挿入されることが好ましい。本発明の広域性組換えアライグマポックスウイルスベクターは、アジュバント不含ワクチンとして有用である。組換えワクチンは、動物の有効な免疫化ためにその他のネコおよびイヌ抗原の混合物を含み得ることが望ましい。また、哺乳動物に有効免役量の本発明のワクチンを投与することを含む、哺乳動物において狂犬病に対する免役応答を誘導する方法も開示される。
【００２９】
したがって、本発明の第１の態様は、各々少なくとも１つの狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする、２つ以上の外因性核酸分子を含み、少なくとも２つの核酸分子が、血球凝集素（ｈａ）遺伝子座もしくはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座に挿入されているか、または少なくとも１つの核酸分子が、血球凝集素およびチミジンキナーゼ遺伝子座の各々に挿入されている、組換えアライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ）を提供する。
【００３０】
一実施形態では、組換えアライグマポックスウイルスベクターによる構築物は、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼおよび血球凝集素遺伝子座に加えて、アライグマポックスウイルスゲノムの第３の非必須部位に、挿入された狂犬病糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。
【００３１】
一実施形態では、アライグマポックスウイルスゲノムの第３の非必須部位は、セリンプロテアーゼ阻害剤部位である。
【００３２】
一実施形態では、狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする２つの核酸分子は、狂犬病ウイルスの同一株から単離される。
【００３３】
一実施形態では、狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする２つの核酸分子は、狂犬病ウイルスの異なる株から単離される。
【００３４】
一実施形態では、狂犬病ウイルス糖タンパク質の供給源は、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  狂犬病株、Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病株、イヌ狂犬病ｓｔｒｅｅｔウイルス、ホッキョクギツネ狂犬病ウイルス、アライグマ狂犬病ウイルスおよびコウモリ狂犬病ウイルスからなる群から選択される。
【００３５】
一実施形態では、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される糖タンパク質をコードする核酸分子は、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ狂犬病株に由来するものである。
【００３６】
一実施形態では、アライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座に挿入される糖タンパク質をコードする核酸分子は、Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病株に由来するものである。
【００３７】
一実施形態では、アライグマポックスウイルスは、生存しており、複製可能である。
【００３８】
一実施形態では、組換えアライグマポックスウイルスベクターは、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼおよび血球凝集素遺伝子座に加え、アライグマポックスウイルスゲノムの第３の非必須部位に挿入される狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。
【００３９】
一実施形態では、アライグマポックスウイルスゲノムの第３の非必須部位は、セリンプロテアーゼ阻害剤部位である。
【００４０】
本発明の第２の態様は、免疫学的に有効な量の、本明細書に記載されるいずれか１つの組換えアライグマポックスウイルスベクターと、場合により好適な単体または希釈剤とを含む組換え狂犬病ワクチンを提供する。
【００４１】
一実施形態では、組換え狂犬病ワクチンは、免疫学的に有効な量の２つ以上の、本明細書に記載される組換えアライグマポックスウイルスベクターと、場合により、好適な担体または希釈剤とを含む。
【００４２】
一実施形態では、多価ワクチンは、１つのベクター構築物しか含まない。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、１つ以上の核酸分子を含み、各々の核酸分子が狂犬病抗原をコードし、
ａ）少なくとも１つの核酸分子がアライグマポックスウイルスノムの血球凝集素遺伝子座もしくはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入されているか、または
ｂ）少なくとも２つの核酸分子がアライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座またはもしくはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入されているか、または
ｃ）少なくとも１つの核酸分子が血球凝集素遺伝子座に挿入されており、かつ、少なくとも１つの核酸分子がアライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入されている、
組換え狂犬病ワクチンを提供する。
【００４４】
一実施形態では、組換え狂犬病ワクチンは、ネコカリシウイルス、ネコクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｆｅｌｉｓ）、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルスおよびバルトネラ菌からなる群から選択される１つ以上のネコ抗原との混合物をさらに含む。
【００４５】
一実施形態では、組換え狂犬病ワクチンは、エーリキ・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）、イヌパルボウイルス、イヌジステンパー、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルスＩＩ型、イヌアデノウイルス、イヌコロナウイルス、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリッポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）およびレプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  Ｐｏｍｏｎａ）からなる群から選択される１つ以上のイヌ抗原との混合物をさらに含む。
【００４６】
一実施形態では、組換え狂犬病ワクチンは、アジュバントを含まない。
【００４７】
一実施形態では、組換え狂犬病ワクチンは、アジュバントをさらに含む。
【００４８】
一実施形態では、アジュバントは、エチレン／マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む。
【００４９】
本発明の第３の態様は、哺乳動物に有効免疫量の本明細書に記載される任意のワクチンを投与することを含む哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、ネコに有効免疫量の本明細書に記載されるワクチンを、望ましくは、いかなるアジュバントも伴わずに投与することによって、ネコにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、イヌに有効免疫量の本明細書に記載される任意のワクチンを投与することによってイヌにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、ウシまたはウマに有効免疫量の本明細書に記載される任意のワクチンを投与することによって、ウシまたはウマにおいて狂犬病に対する防御免役応答を誘導する方法を提供する。
【００５３】
一実施形態では、防御免疫応答は、体液性または抗体媒介性応答である。
【００５４】
一実施形態では、防御免疫応答は、細胞媒介性またはＴ細胞媒介性免疫応答である。
【００５５】
一実施形態では、防御免疫応答は、約４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜約６．７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲であるワクチン用量を投与することによって誘導される。
【００５６】
一実施形態では、防御免疫応答は、約５．３８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜約６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲であるワクチン用量を投与することによって誘導される。
【００５７】
一実施形態では、防御応答は、ワクチンを単回用量として、または反復用量として投与することによって誘導される。
【００５８】
本発明の第４の態様は、以下の工程を含む組換えアライグマポックスウイルスベクターを作製する方法を提供する：
（ａ）第１の狂犬病株の糖タンパク質をコードする核酸配列を、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入する工程と、
（ｂ）第２の狂犬病株の糖タンパク質をコードする核酸配列を、アライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座に挿入する工程と、
（ｃ）組換えアライグマポックスウイルスベクターを回収する工程。
【００５９】
一実施形態では、工程（ａ）および（ｂ）の核酸配列は、組換えアライグマポックスウイルスベクターによる核酸の発現ならびに第１および第２の狂犬病株の糖タンパク質の産生を可能にするために、核酸配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む。
【００６０】
一実施形態では、第１の狂犬病株は、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ狂犬病株である。
【００６１】
一実施形態では、第２の狂犬病株は、Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病株である。
【００６２】
本発明の第５の態様は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するプラスミドｐＦＤ２００３−ＧＰＶ−ＰＶを提供する。
【００６３】
第６の態様は、哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導する医薬を調製するための任意の本発明のベクターまたはワクチンの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
発明の背景および当技術分野からのその発展を、添付の図面を参照して本明細書において以下にさらに説明する：
【図１Ａ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｂ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｃ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｄ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｅ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｆ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｇ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｈ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｉ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｊ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｋ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｌ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図１Ｍ】（配列番号１に対応する）プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶ（８３７３ヌクレオチド）の完全配列を示す図であり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｌ断片は塩基対位置１〜５５７含み、ＰＳＥＬ（合成初期−後期）プロモーター領域は、塩基対位置２１５３〜２１９５Ｃに及び、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、塩基対位置５７０〜２１５０Ｃを包含し、ｖｖＰ７５初期プロモーター領域は、塩基対位置２２０２〜２４６８にわたり、ｌａｃＺ  ＯＲＦレポーター遺伝子は、塩基対位置２４６９〜５５２５にわたり、ＲＣＮＶ  ＨＡ−Ｒ断片は、塩基対位置５５３２〜６１２３を包含し、アンピシリンＯＲＦは、塩基対位置６５６６〜７４２６を含む。
【図２Ａ】プラスミドを１〜３回の間で切断する主要な制限酵素、すなわち、ＢａｍＨＩ（塩基対位置２４７１、５５２６）、ＥｃｏＲＩ（位置５５８、５４６９）、ＥｃｏＲＶ（位置２６５、３２４、３５７８）、ＨｉｎｄＩＩＩ（位置２０５５）、ＨｐａＩ（位置２８９１、３５１５、５８９５）、ＫｐｎＩ（位置２１４７）、ＭｕＩ（位置３７６７、４５４７、４９７２）、ＮｃｏＩ（位置８０、２１４７）、ＮｓｉＩ（位置１８１２）、ＰｃｉＩ（位置２４、５２２４、８２４１）、ＳａｃＩ（位置４４０５、８３７２）、ＳａｌＩ（位置５６４）、ＳｐｅＩ（位置５５８３）、ＳｐｈＩ（位置１４２３、６１２８）、ＸｂａＩ（位置２１９６）およびＸｈｏＩ（位置１６３３）；およびプラスミドｐＦＤ２００３−ＧＰＶ−ＰＶを切断しない主要な制限酵素、すなわち、ＢｇｌＩＩ、ＫａｓＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｍａＩおよびＸｍａＩを示す、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶの制限酵素マップを示す図である。
【図２Ｂ】プラスミドを１〜３回の間で切断する主要な制限酵素、すなわち、ＢａｍＨＩ（塩基対位置２４７１、５５２６）、ＥｃｏＲＩ（位置５５８、５４６９）、ＥｃｏＲＶ（位置２６５、３２４、３５７８）、ＨｉｎｄＩＩＩ（位置２０５５）、ＨｐａＩ（位置２８９１、３５１５、５８９５）、ＫｐｎＩ（位置２１４７）、ＭｕＩ（位置３７６７、４５４７、４９７２）、ＮｃｏＩ（位置８０、２１４７）、ＮｓｉＩ（位置１８１２）、ＰｃｉＩ（位置２４、５２２４、８２４１）、ＳａｃＩ（位置４４０５、８３７２）、ＳａｌＩ（位置５６４）、ＳｐｅＩ（位置５５８３）、ＳｐｈＩ（位置１４２３、６１２８）、ＸｂａＩ（位置２１９６）およびＸｈｏＩ（位置１６３３）；およびプラスミドｐＦＤ２００３−ＧＰＶ−ＰＶを切断しない主要な制限酵素、すなわち、ＢｇｌＩＩ、ＫａｓＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｍａＩおよびＸｍａＩを示す、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶの制限酵素マップを示す図である。
【図３Ａ】ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の構築の重要な工程のダイアグラムを示す図である。ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ狂犬病ＧＰＶ−ＰＶ断片を、狂犬病ＤＮＡワクチンｐＶＡＸ１−ＧＰＶ−ＰＶ（ＷＯ第００／６３２４２号において調製されたような）からプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬにサブクローニングしてプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶを作製した。ｖＫＢ３−ＪＥ１３、ｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶおよびＣＯＳ−７細胞を用いる３者同時感染／トランスフェクションによって、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２のプールクローンを作製する。次の工程は、ベロ細胞におけるプラーク精製および純粋クローン選抜を含む。クローン候補は、ＰＣＲ同定試験およびｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２が得られたＩＦＡによる狂犬病Ｇタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現によって確認する。
【図３Ｂ】ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の構築の重要な工程のダイアグラムを示す図である。ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ狂犬病ＧＰＶ−ＰＶ断片を、狂犬病ＤＮＡワクチンｐＶＡＸ１−ＧＰＶ−ＰＶ（ＷＯ第００／６３２４２号において調製されたような）からプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬにサブクローニングしてプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶを作製した。ｖＫＢ３−ＪＥ１３、ｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶおよびＣＯＳ−７細胞を用いる３者同時感染／トランスフェクションによって、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２のプールクローンを作製する。次の工程は、ベロ細胞におけるプラーク精製および純粋クローン選抜を含む。クローン候補は、ＰＣＲ同定試験およびｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２が得られたＩＦＡによる狂犬病Ｇタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現によって確認する。
【図４】組換えアライグマポックスウイルス遺伝子型のＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病Ｇ２  ｌａｃＺが、ｈａ遺伝子座に構築されており、ＣＶＳ狂犬病Ｇがｔｋ遺伝子座に構築されているｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ゲノム（約２００ｋｂ直鎖ｄｓＤＮＡ）のダイアグラムを示す図である。
【図５Ａ】ｈａ遺伝子座（図５Ａ）について、およびｔｋ遺伝子座（図５Ｂ）について、ｒＲＣＮＶ−狂犬病−Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５のＰＣＲ同定試験のためのアガロースゲル電気泳動を示す図である。対照、レーン２の使用したｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、ＭＳＶ、レーン３のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、Ｘ＋５、レーン４のＤＮＡ精製陰性対照−０１、レーン５のＤＮＡ精製陰性対照−０２、レーン６のＰＣＲ陰性対照（水）、レーン７のＰＣＲ陽性対照（ＲＣＮＶ  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ−３希釈）、レーン８のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、ＭＳＶ、レーン９のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、Ｘ＋５、レーン１０のＤＮＡ精製陰性対照−０１、レーン１１のＤＮＡ精製陰性対照−０２、レーン１２のＰＣＲ陰性対照（水）およびレーン１３のＰＣＲ陽性対照（ＲＣＮＶ  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ−３希釈物）を含むサンプルのためのＤＮＡ鋳型。Ｌａｍｂｄａ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩマーカーは、レーン１にあり、１ｋｂ  ＤＮＡラダーマーカーは、レーン１４にあった。レーン２〜７については、ゲルＡ（図５Ａ）のプライマーは、ＨＡ−０８、ＨＡ−Ｐｓｔであり、ゲルＢ（図５Ｂ）のプライマーは、ＴＫ−ＬＷ、ＴＫ−ＲＷであり、標的遺伝子はｗｔ  ｈａｌｔｋであった。レーン８〜１３については、ゲルＡ（図５Ａ）のプライマーはＨＡ−Ｐｓｔ、ｇｐ−１Ｆであり、ゲルＢ（図５Ｂ）のプライマーはＴＫ−ＲＲ、ｇＪＥ−Ｆ１であり、標的遺伝子は狂犬病Ｇであった。図５に示されるように、ＰＣＲは、レーン２〜６および１０〜１３において陰性であったが、レーン７〜９ではＰＣＲは陽性であった。
【図５Ｂ】ｈａ遺伝子座（図５Ａ）について、およびｔｋ遺伝子座（図５Ｂ）について、ｒＲＣＮＶ−狂犬病−Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５のＰＣＲ同定試験のためのアガロースゲル電気泳動を示す図である。対照、レーン２の使用したｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、ＭＳＶ、レーン３のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、Ｘ＋５、レーン４のＤＮＡ精製陰性対照−０１、レーン５のＤＮＡ精製陰性対照−０２、レーン６のＰＣＲ陰性対照（水）、レーン７のＰＣＲ陽性対照（ＲＣＮＶ  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ−３希釈）、レーン８のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、ＭＳＶ、レーン９のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、Ｘ＋５、レーン１０のＤＮＡ精製陰性対照−０１、レーン１１のＤＮＡ精製陰性対照−０２、レーン１２のＰＣＲ陰性対照（水）およびレーン１３のＰＣＲ陽性対照（ＲＣＮＶ  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ−３希釈物）を含むサンプルのためのＤＮＡ鋳型。Ｌａｍｂｄａ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩマーカーは、レーン１にあり、１ｋｂ  ＤＮＡラダーマーカーは、レーン１４にあった。レーン２〜７については、ゲルＡ（図５Ａ）のプライマーは、ＨＡ−０８、ＨＡ−Ｐｓｔであり、ゲルＢ（図５Ｂ）のプライマーは、ＴＫ−ＬＷ、ＴＫ−ＲＷであり、標的遺伝子はｗｔ  ｈａｌｔｋであった。レーン８〜１３については、ゲルＡ（図５Ａ）のプライマーはＨＡ−Ｐｓｔ、ｇｐ−１Ｆであり、ゲルＢ（図５Ｂ）のプライマーはＴＫ−ＲＲ、ｇＪＥ−Ｆ１であり、標的遺伝子は狂犬病Ｇであった。図５に示されるように、ＰＣＲは、レーン２〜６および１０〜１３において陰性であったが、レーン７〜９ではＰＣＲは陽性であった。
【図５Ｃ】ｈａ遺伝子座（図５Ａ）について、およびｔｋ遺伝子座（図５Ｂ）について、ｒＲＣＮＶ−狂犬病−Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５のＰＣＲ同定試験のためのアガロースゲル電気泳動を示す図である。対照、レーン２の使用したｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、ＭＳＶ、レーン３のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、Ｘ＋５、レーン４のＤＮＡ精製陰性対照−０１、レーン５のＤＮＡ精製陰性対照−０２、レーン６のＰＣＲ陰性対照（水）、レーン７のＰＣＲ陽性対照（ＲＣＮＶ  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ−３希釈）、レーン８のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、ＭＳＶ、レーン９のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、Ｘ＋５、レーン１０のＤＮＡ精製陰性対照−０１、レーン１１のＤＮＡ精製陰性対照−０２、レーン１２のＰＣＲ陰性対照（水）およびレーン１３のＰＣＲ陽性対照（ＲＣＮＶ  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ−３希釈物）を含むサンプルのためのＤＮＡ鋳型。Ｌａｍｂｄａ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩマーカーは、レーン１にあり、１ｋｂ  ＤＮＡラダーマーカーは、レーン１４にあった。レーン２〜７については、ゲルＡ（図５Ａ）のプライマーは、ＨＡ−０８、ＨＡ−Ｐｓｔであり、ゲルＢ（図５Ｂ）のプライマーは、ＴＫ−ＬＷ、ＴＫ−ＲＷであり、標的遺伝子はｗｔ  ｈａｌｔｋであった。レーン８〜１３については、ゲルＡ（図５Ａ）のプライマーはＨＡ−Ｐｓｔ、ｇｐ−１Ｆであり、ゲルＢ（図５Ｂ）のプライマーはＴＫ−ＲＲ、ｇＪＥ−Ｆ１であり、標的遺伝子は狂犬病Ｇであった。図５に示されるように、ＰＣＲは、レーン２〜６および１０〜１３において陰性であったが、レーン７〜９ではＰＣＲは陽性であった。
【図６】ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２感染ベロ細胞における狂犬病糖タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示す図である。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶ−およびＸ＋５感染ベロ細胞のすべての希釈物において細胞変性効果および蛍光が観察された（図６Ａおよび６Ｂ）が、非感染ベロ細胞のみからなる陰性対照では観察されなかった（図６Ｃ）。この結果は、狂犬病Ｇタンパク質は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよび継代５において発現され、狂犬病Ｇタンパク質特異的モノクローナル抗体によって検出されるということを示した。
【図７】全長狂犬病Ｇ遺伝子を含有するＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す図である。対照を含む、試験されているサンプルは、レーン２にｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶ、レーン３にｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋５、レーン４に陰性対照（水）、レーン５にｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶ、レーン６にｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋５およびレーン７に陰性対照（水）を含み、レーン１にＬａｍｂｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカーを含み、レーン８に１ｋｂ  ＤＮＡラダーマーカーを含む。レーン２〜４については、プライマーはＨＡ−Ｐｓｔ、ＰＷ４であり、遺伝子標的は、１８０６ｂｐのＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病Ｇおよびそのフランキング領域であった。レーン５〜７については、プライマーはＴＫ−ＲＲ、ＰＷ−０３であり、遺伝子標的は１９１０ｂｐのＣＶＳ狂犬病Ｇおよびそのフランキング領域であった。図７に示されるように、ＰＣＲは対照レーン４および７において陰性であったが、ＰＣＲ産物は、レーン２、３、５および６において陽性であった。
【図８】ベロ細胞におけるｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５の青色プラーク（Ｌａｃ＋）精製によるスクリーニングを示す図であり、これでは、図８Ａは、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶ（未希釈、１００）を表し、図８Ｂは、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋５（１０−４希釈）を表す。この結果は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶは、青色プラークアッセイによって、継代５への製造前スケールアップ手順下で表現型上安定であるということを示した。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
（発明の詳細な説明）
本方法および治療方法論が記載される前に、本発明は特定の方法および記載される実験条件に限定されず、方法および条件は変わり得るということが理解されなければならない。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるので、本明細書に用いられる専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のものであって、制限であるよう意図されるものではないということも理解されなくてはならない。
【００６６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形の「冠詞」および「不定冠詞」は、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つ以上の方法および／または本明細書に記載される、および／または本開示内容などを読んだ際に当業者に明らかとなる種類の工程を含む。
【００６７】
したがって、本出願では、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｂｙｒｄ、ＣＭおよびＨｒｕｂｙ、ＤＥ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２６９巻：Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｐｏｘｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３章、３１〜４０頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩｌ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９４年）。
【００６８】
本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料はいずれも、本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料が記載されている。本明細書に言及されるすべての刊行物は、その全文が本明細書に組み込まれる。
【００６９】
定義
本明細書に使用される用語は、当業者に認識され、既知であることを意味するが、便宜上および完全性のために、特定の用語およびその意味を以下に説明する。
【００７０】
用語「約」とは、２０％内、より好ましくは、１０％内、より好ましくは５％内を意味する。
【００７１】
用語「隣接する」とは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織貯蔵所として、また、免疫応答を非特異的に増強するリンパ系アクチベーターとして働き得る（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２編、１９８４年、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、３８４頁）。状況に応じて、アジュバントの不在下での抗原単独での一次誘発は、体液性または細胞性免疫応答を誘発できない場合がある。アジュバントとして、限定されないが、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルまたは炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび有用である可能性があるヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。アジュバントは、製薬上許容されることが好ましい。用語「アジュバント不含である」とは、上記のように、アジュバントの不在下での本発明のいずれか１つのワクチンの調製を指す。
【００７２】
「コードされる」または「コードする」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、ポリペプチド配列は、少なくとも３〜５個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらにより好ましくは、少なくとも１５〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含み、ポリペプチドは核酸配列によってコードされる。また、その配列によってコードされるポリペプチドを用いて免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も包含される。したがって、抗原「ポリペプチド」、「タンパク質」または「アミノ酸」配列は、抗原のポリペプチドまたはアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の類似性、好ましくは、少なくとも約８０％の類似性、より好ましくは、約９０〜９５％の類似性、最も好ましくは、約９９％の類似性を有し得る。
【００７３】
用語「外因性」とは、外来遺伝子またはアライグマポックスウイルスゲノム外から産生された、起因する、由来する、生じた外来遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【００７４】
抗原またはワクチン組成物に対する「免疫応答」は、注目する抗原またはワクチン組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞媒介性免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的上、「体液性免疫応答」とは、抗体媒介性免疫応答であり、抗原／本発明のワクチンに対して親和性を有する抗体の生成を含み、一方で、「細胞媒介性免疫応答」とは、Ｔリンパ球および／またはその他の白血球によって媒介されるものである。「細胞媒介性免疫応答」は、クラスＩまたはクラスＩＩ分子の主要組織適合抗原（ＭＨＣ）と関連した抗原性エピトープの提示によって惹起される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）を活性化する。ＣＴＬは、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）によってコードされ、細胞表面に発現されるタンパク質に関連して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導および促進するのに役立つ。細胞性免疫の別の側面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的反応に関与している。ヘルパーＴ細胞は、その表面上にＭＨＣ分子と関連してペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性を集中させるのに役立つよう作用する。「細胞媒介性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカインならびに活性化されたＴ細胞および／またはその他の白血球によって産生される分子のようなその他のもの、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものの産生を指す。特定の抗原または組成物の、細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、いくつかのアッセイによって、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、感作された被験体において抗原に対して特異的なＴリンパ球をアッセイすることによって、または抗原での再刺激に応じたＴ細胞によるサイトカイン産生の測定によって調べることができる。このようなアッセイは、当技術分野では周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）１５１：４１８９〜４１９９頁；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４年）２４：２３６９〜２３７６頁参照のこと。
【００７５】
本明細書において同義的に使用される、「免疫学的に有効な量」または「有効免疫量」とは、当業者に公知の標準アッセイによって測定されるような、免疫応答、細胞性（Ｔ細胞）または体液性（Ｂ細胞または抗体）応答のいずれかを惹起するのに十分な抗原またはワクチンの量を指す。本発明では、「免疫学的に有効な量」または「有効免疫量」は、最小防御用量（力価）：４．５〜６．７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。免役原としての抗原の有効性は、Ｔ細胞の、その特異的標的細胞を溶解する能力を測定するためのクロム放出アッセイなどの細胞溶解アッセイによって、または血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによってＢ細胞活性のレベルを測定することのいずれかによって測定できる。さらに、免疫応答の防御のレベルは、免役化された宿主を、注射された抗原で誘発することによって測定してもよい。例えば、それに対する免疫応答が望まれる抗原が、腫瘍細胞のウイルスである場合には、「免疫学的に有効な量」の抗原によって誘導される防御のレベルは、この動物のウイルスまたは腫瘍誘導後の生存パーセントまたは死亡パーセントを検出することによって測定される。
【００７６】
本明細書において用いる場合、アライグマポックスウイルスゲノム中の「非必須部位」とは、ウイルスの感染または複製にとって必要ではないウイルスゲノム中の領域を意味する。アライグマポックスウイルスゲノム中の非必須部位の例として、限定されないが、チミジンキナーゼ（ＴＫ）部位、血球凝集素（ＨＡ）部位およびセリンプロテアーゼ阻害剤部位が挙げられる。アライグマポックスウイルスのＴＫ部位は、Ｃ．Ｌｕｔｚｅ−Ｗａｌｌａｃｅ、Ｍ．ＳｉｄｈｕおよびＡ．Ｋａｐｐｅｌｅｒ、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ１０（１９９５年）、８１〜８４頁に記載されている。アライグマポックスウイルスのＴＫ遺伝子の配列はまた、ＰｕｂＭｅｄ受託番号ＤＱ０６６５４４およびＵ０８２２８に見ることができる。アライグマポックスウイルスのＨＡ部位は、Ｃａｖａｌｌａｒｏ  ＫＦおよびＥｓｐｏｓｉｔｏ，ＪＪ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２年）、１９０（１）：４３４〜９頁に記載されている。アライグマポックスウイルスのＨＡ遺伝子の配列はまた、ＰｕｂＭｅｄ受託番号ＡＦ３７５１１６に見ることができる。
【００７７】
用語「核酸分子」または「核酸配列」とは、タンパク質合成の過程を指示するプリンおよびピリミジン塩基の反復単位などの反復するヌクレオチドの長い鎖を指す、その明白な意味を有する。すなわち、それらは、タンパク質物質をコードし、発現する。特許請求の範囲において用いる場合、核酸とは、狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする既知外因性または外来遺伝子を指す。
【００７８】
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、トランスＲＮＡによってスプライシングされ、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合には、コード配列は、細胞において転写および翻訳制御配列と、「作動可能に連結している」。
【００７９】
「防御的」免疫応答とは、ワクチンの、哺乳動物の感染からの保護に役立つ免疫応答、体液性または細胞媒介性のいずれかを惹起する能力を指す。対照集団の哺乳動物と比較して統計上有意な改善があれば、提供される防御は必ずしも完全ではない、すなわち、感染は必ずしも完全に予防されるか、または根絶されるわけではない。防御は、感染の症状の重症度または発生の速度の緩和に限定され得る。
【００８０】
本明細書において用語「組換え」とは、簡単に、標準遺伝子工学法によって作製されるアライグマポックスウイルス構築物を指す。
【００８１】
用語「複製可能な」とは、好適な宿主細胞において複製可能である（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）、複製可能である（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｎｇ）、または再生可能である、微生物、特に、アライグマポックスウイルスなどのウイルスを指す。
【００８２】
用語「ワクチン」または「ワクチン組成物」とは、本明細書において同義的に使用され、動物において免疫応答を誘導する、および／または動物を感染による疾患または死亡の可能性から保護する、少なくとも１つの免疫学的に活性な成分を含む薬剤組成物を指し、活性成分の免疫学的活性を増強する１つ以上のさらなる成分を含む場合も含まない場合もある。ワクチンは、薬剤組成物に特有のさらなる成分をさらに含んでなってもよい。
【００８３】
「ベクター」は、宿主生物において複製可能なＤＮＡ分子であり、その中に、組換えＤＮＡ分子を構築するための遺伝子が挿入される。
【００８４】
概要
本発明に従って、安定な、安全な、高度に有効な、場合によってはアジュバントを含まない製品の製造においてアライグマポックスウイルス（ＲＣＮＶ）株を用いる独特の組換え狂犬病ワクチンが提供される。具体的には、本発明は、各々、少なくとも１つの狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする、１つ以上の外因性核酸分子を含み、血球凝集素（ｈａ）遺伝子座もしくはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座に少なくとも２つの核酸分子が挿入されているか、または少なくとも１つの核酸分子が血球凝集素およびチミジンキナーゼ遺伝子座の各々に挿入されている組換えアライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ）を提供する。外因性核酸分子の供給源は、同一であっても異なっていてもよいが、少なくとも２つの異なる狂犬病株から外来遺伝子を得ることが望ましい。本発明の新規の、高度に好ましいウイルス構築物ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、２つの異なる狂犬病ウイルス株の狂犬病糖タンパク質（Ｇ）を独特に発現することが有利であり、ここで、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＶＳ）およびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ（ＰＶ）狂犬病株の抗原性糖タンパク質を、ＲＣＮＶゲノムのチミジンキナーゼ（ｔｋ）および血球凝集素（ｈａ）遺伝子座にそれぞれ挿入することが高度に望ましい。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２感染ベロ細胞における狂犬病糖タンパク質のＩｎ  ｖｉｔｒｏ  発現は、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって確認される。本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物は、極めて免役原性であり、高度に強力である。免疫継続期間（ＤＯＩ）研究におけるネコおよびイヌの接種と、それに続く病原性狂犬病ウイルス誘発によって、新規組換え狂犬病ワクチンは、哺乳動物を狂犬病感染から保護することにおいて優れた効力および有用性を有ることが実証される。
【００８５】
アライグマポックスウイルス（Ｈｅｒｍａｎ株）が、まず、１９６１〜１９６２年にメリーランド州、アバディーン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）においてＹ．Ｆ．Ｈｅｒｍａｎによって臨床症状のないアライグマの気道から単離された（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｐｒｏｃ．第６４回Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１１７頁（１９６４年）中、Ｙ．Ｆ．Ｈｅｒｍａｎ、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｒａｃｃｏｏｎｓ」）。いくつかの初期の研究では、ｔｋ遺伝子座でＣＶＳ狂犬病Ｇ遺伝子を発現するＲＣＮＶベクターは、野生動物およびペットを含む家畜の両方に投与した場合に安全であると報告された（例えば、Ａ．Ｄ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、「Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｗｉｌｄ  ｍａｍｍａｌｓ  ｉｎ  ａ  Ｃｈｅｓａｐｅａｋｅ  Ｂａｙ  ａｒｅａ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｚｏｏｎｏｓｅｓ」、Ｊ．Ｗｉｌｄｌｉｆｅ  Ｄｉｓ．８：１１９〜１２６頁（１９７２年）；Ｃ．Ｂａｈｌｏｕｌら、「ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ１６：４１７〜４２５頁（１９９８年）；Ｓ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、「Ｃｏｍｐａｃｔ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ、ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ／ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１０９４〜１０９７頁（１９９７年）；およびＪ．Ｃ．ＤｅＭａｒｔｉｎｉら、「Ｒａｃｃｏｏｎ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｒａｂｉｅｓ  ｕｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｓｈｅｅｐ」、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３３：２１１〜２２２頁（１９９３年）参照のこと）。
【００８６】
しかし、初期の構築物の中には、狂犬病Ｇ遺伝子がｈａ部位に挿入されているか、または少なくとも２つの狂犬病Ｇ遺伝子が、アライグマポックスウイルスゲノムのｔｋおよびｈａ遺伝子座の両方に挿入されている本発明の独特の設計を提供するものはない。本発明の新規構築物を示す構築物または動物研究はない。
【００８７】
ｖＫＢ３−ＪＥ１３として知られる（ＲＣＮＶ  Ｒａｂ−Ｇ、ＲＡＢＯＲＡＬ  Ｖ−ＲＧ（登録商標）としてＭｅｒｉａｌ、Ｈａｒｌｏｗ、Ｅｓｓｅｘ、ＵＫ  から商業的に販売されている）これまでの組換え狂犬病構築物は、ＲＣＮＶベクターのＨｅｒｍａｎ株を使用していたが、この構築物は、ＲＣＮＶゲノムのｔｋ遺伝子座に狂犬病ＣＶＳ株のＧ遺伝子の単一の挿入物しか有していない。本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物もまた、ＲＣＮＶベクターのＨｅｒｍａｎ株を利用するが、この新規構築物は、２つの遺伝子座に２つの異なる狂犬病株に由来する外来遺伝子を有する、すなわち、狂犬病ＣＶＳおよびＰＶ株のＧ遺伝子を含む外来遺伝子材料が、ＲＣＮＶゲノムに挿入されており、挿入部位はＲＣＮＶゲノムのｔｋ遺伝子座にＣＶＳ遺伝子由来のＤＮＡを、ｈａ遺伝子座にＰＶ遺伝子由来のＤＮＡを提供するために特異的である。本発明の新規ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物では、狂犬病Ｇ遺伝子の、ＲＣＮＶゲノムのｔｋおよびｈａ遺伝子座両方の組み合わせへの挿入は、病原性Ｈｅｒｍａｎ株をさらに弱毒化するが、同時に、強力な広域性ワクチンを提供する。
【００８８】
ｖＫＢ３−ＪＥ１３と同様に、本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、まず、ｖｖＰ  １１後期プロモーターを使用してｔｋ遺伝子座にＣＶＳ遺伝子を挿入し、次いで、さらに合成初期−後期プロモーターを使用し、駆動して、ｈａ遺伝子座にさらなるＰＶ遺伝子を挿入して調製する。ｔｋおよびｈａ遺伝子座から外来狂犬病抗原を発現できることにあるｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の安定性および有用性は、新規多価構築物の重要な特性であり、これまで未知であった。
【００８９】
著しく改善された本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物はまた、良好な構築物であるという点で先行する構築物ｖＫＢ３−ＪＥ１３を上回る、予想外の、重大な利点を提供する。驚くべきことに、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、取り扱いのための良好な安全性、実質的に良好な最小の防御用量（すなわち、著しくより強力である）およびＣｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＶＳ）およびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ（ＰＶ）狂犬病株を網羅する、より広い防御範囲を有する。
【００９０】
例えば、標準米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）マウス効力試験における、匹敵する力価のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２およびｖＫＢ３−ＪＥ１３（ＲＣＮＶ  Ｒａｂ−Ｇ）の性能は、ｖＫＢ３−ＪＥ１３（６．４Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）の０．３というかなり低いＲＰ値と比較してｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２（６．３Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）の６．８という優れた相対力（ＲＰ）値を示す。本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物は、予想外に、ｖＫＢ３−ＪＥ１３構築物よりも２３倍強力であった。
【００９１】
ＣＶＳ単独由来の狂犬病糖タンパク質遺伝子を保持する既知組換えＲＣＮＶ（ｖＫＢ３−ＪＥ１３）は、１回の単回用量を用いて皮下にワクチン接種を受けたネコにおいて有効性を示したが、ｖＫＢ３−ＪＥ１３は、高濃度のＲａｂ−Ｇを投与されたネコの９６．２％（２５／２６）が保護されたのに対し、対照の９３．８％（１５／１６）が狂犬病誘発によって死亡したことを示す、１年の免役継続期間研究（ＤＯＩ）において狂犬病に対して適切な保護を達成するために８．３Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬという高力価のＲＣＮＶ  Ｒａｂ−Ｇが必要であった。しかし、後処理プロセス研究によって、商業化のためにこのような高力価ウイルスを作製することは実行可能ではないということが示された。安全性およびベクターの懸念のために、ＶＫＢ３−ＪＥ１３は、ネコにおける実用的使用には不十分である。
【００９２】
さらに、有効性データから、イヌに対する１年のＤＯＩ研究において、この先行するｖＫＢ３−ＪＥ１３構築物は法的要件を満たすことはできないと実証された（タイトル９、連邦規則集）。８．３Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＲＣＮＶ  Ｒａｂ−Ｇという単回用量を用いて皮下にワクチン接種を受けたイヌの７９．２％（１９／２４）しか、１年の免役継続期間研究（ＤＯＩ）において狂犬病から保護されなかったが、対照の１００％（１３／１３）が狂犬病誘発のために死亡した。
【００９３】
比較として、本発明の新規ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物の１年のＤＯＩは、必要とされるｖＫＢ３−ＪＥ１３よりも、かなり低濃度でネコにおいて優れた結果を提供した。６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の力価で、誘発結果は、９／１０（９０％）の対照が狂犬病のために死亡したが、２５／２５（１００％）のワクチン接種されたものが９０日間健康なままであったと実証し、これは、狂犬病ワクチン有効性についての法的要件を満たす十分な試験である。１年ＤＯＩ研究から得た結果は、本発明の組換え狂犬病ワクチンは、ネコにおいて単回のワクチン接種後少なくとも１年間狂犬病の予防において高度に有効であると実証する。
【００９４】
イヌにおける１年ＤＯＩ研究に関して、本発明の新規ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物は、イヌにおいて優れた、成功した結果を提供したが、当技術分野のＲＣＮＶ  Ｒａｂ−Ｇは適切な保護を与えることができなかった。６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の力価で、誘発結果は、９／１０（９０％）の対照が、狂犬病のために死亡したが、２２／２５（８８％）のワクチン接種されたものは、９０日間健康なままであると実証し、これは、狂犬病ワクチン有効性についての法的要件を満たす。この１年ＤＯＩ研究から得た結果は、本発明の組換え狂犬病ワクチンは、イヌにおいて単回ワクチン接種後少なくとも１年間、狂犬病の予防において補助として有効であると実証する。
【００９５】
当技術分野で公知の先行組換えｖＫＢ３−ＪＥ１３構築物の不利点に加え、その他の従来の不活化狂犬病ワクチンもまた、獣医学の分野におけるその技術的な問題を有し、これは本発明が解決する。不活化狂犬病ワクチンは、有効な免疫応答を得るためにアジュバント補給を必要とすることが多いが、残念ながら、アジュバントは、ネコにおいて肉腫の形成の一因となることが多く、ネコおよびイヌにおいてその他の安全性の懸念を有する。本発明は、当技術分野で認識される問題を独特に解決し、アジュバントの不在下での単回のワクチン接種後に優れた免疫応答を維持する、より安全な製品として組換えアライグマポックスウイルス（ｒＲＣＮＶ）をベクターとする狂犬病ワクチンを提供する。
【００９６】
有利なことに、本発明のアジュバント不含のｒＲＣＮＶベクターによる狂犬病ワクチンはまた、ワクチン製造の間の従事者の安全性を改善し、商業的製造の間に用いられる不活化および汚染除去手順を狂犬病ウイルスが生き残るいかなる機会も完全に排除する。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、ＲＣＮＶゲノムのｔｋ遺伝子座に挿入されたＣＶＳ  Ｇ遺伝子を含有するＲＣＮＶベクターのｈａ遺伝子座へのＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病Ｇ遺伝子の挿入によってさらに弱毒化される。言い換えれば、弱毒化された狂犬病ウイルスは、中程度の可能性の健康ハザードのバイオセーフティーレベル２病原体と考えられるのに対し、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、低リスクバイオセーフティーレベル１病原体として全く安全であると見なされる。
【００９７】
新規狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（すなわち、本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物）は、通常、狂犬病感染の予防における補助として３ヶ月齢またはそれより高齢の健康なネコおよびイヌのワクチン接種のために用いられる。フェレットなどのその他の家庭用ペットも、適切な免役応答のために十分に成熟した齢で狂犬病に対する予防接種から恩恵を受ける。ワクチンはまた、ワクチンが感染後治療として必要とされる場合には、狂犬病ウイルスに曝露されるより若いネコ、イヌおよびさらなる哺乳動物において使用してもよい。
【００９８】
高レベルの生存ＲＣＮＶを用いてネコに接種した後にウイルス排出は示されず、このことから、ＲＣＮＶはネコにおいて非複製性であり、非病原性であることが確認される。ネコは、ネコがＲＣＮＶに対してイヌよりも感受性であるために試験動物として選択された。ＲＣＮＶの天然の感染経路は、主に、口腔粘膜、皮膚擦過傷および気道を介してである。扁桃腺が、これらのウイルスが複製するのに好ましい位置である。したがって、以下の発明を示す実施例のためのいくつかの研究において組換えウイルスを投与するために、口腔経路、最も一般的な感染経路を選択した。しかし、本発明のワクチンは、種々の従来経路によって投与してよいということは考慮される。
【００９９】
ＮＩＨ（米国国立衛生研究所）マウス効力試験によって、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物は、極めて免役原性であり、高度に強力であると示される。用量漸増研究によって、ネコおよびイヌが、免疫学的に有効な投与量のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を用いて皮下にワクチン接種される場合には、狂犬病誘発からの完全保護（ワクチン接種後３ヶ月）が示される。狂犬病ワクチン、本発明の生存アライグマポックスウイルスベクターの、ネコおよびイヌにおける３ヶ月の免役継続期間（ＤＯＩ）研究、１年のＤＯＩ研究およびネコにおける毒性への復帰の研究は、優れた結果を示す。非常に有利なことに、アライグマポックスウイルスベクターによるワクチンの経口投与は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋３の濃縮保存液がネコおよびイヌにおいて皮下に投与された後に、毒性に復帰せず、体液または糞便中に播種することなく、好ましくない反応は観察されなかった。
【０１００】
ネコおよびイヌは、３種の異なる力価のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンを用いたワクチン接種、続いて、単回のワクチン接種の３ヶ月後に病原性狂犬病ウイルス誘発を受け、短期間の有効性を示し、より長期間の免役研究のための適切な投与量を求めた。ネコでは、６．５、５．５および４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬのｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の単回用量を用いて皮下にワクチン接種を受けたネコの１００％（１０／１０）が、有益に保護されたのに対し、対照の８０％（８／１０）が狂犬病誘発のために死亡した。イヌでは、６．５、５．５および４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬのｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の単回用量を用いて皮下にワクチン接種を受けたイヌの１００％（１０／１０）、９０％（９／１０）および７０％（７／１０）が、それぞれ保護されたのに対し、対照の１００％（１０／１０）が狂犬病誘発のために死亡した。後者のイヌにおける結果は、４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価は、イヌを狂犬病から保護するのに不十分な濃度であるが、６．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬおよび５．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの実行可能な力価でワクチンはイヌにおいて効力を示す、新規ワクチン製品の適切な投与量を得るために家畜ワクチンの技術分野において用いられる標準力価設定研究を示す。
【０１０１】
上記で本明細書に記載され、以下の実施例において例示されるように、ネコおよびイヌへの本発明の組換えｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンの単回投与後の１年免役継続期間（ＤＯＩ）から得られた結果はまた、ワクチンの優れた効力および有用性を示す。組換え狂犬病ワクチンは、驚くべきことに、単回接種後に長期間持続する免役をもたらし、有益である。
【０１０２】
一般に、狂犬病糖タンパク質遺伝子、例えば、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ糖タンパク質遺伝子（Ｇ）の、ｖＫＢ３−ＪＥ１３ゲノムの血球凝集（ｈａ）遺伝子座への挿入によってウイルスｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は構築され得る。既知ウイルスｖＫＢ３−ＪＥ１３は、アライグマポックスウイルス野生型のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座でＣｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＶＳ）株の狂犬病糖タンパク質を発現する。一実施形態では、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の構築方法は、２つの主要な工程によって提供される。第１に、ＰＣＲ増幅された１，５７５ｂｐの狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子（ＧＰＶ−ＰＶ）を、構築された本発明のｐＦＤ２００３ＳＥＬベクター中にクローニングし、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶを作製する。この工程は、ＦＤＡＨの狂犬病ＤＮＡワクチン構築物ｐＶＡＸ１−ＧＰＶ−ＰＶ（ＷＯ第００／６３２４２号において調製されるような）から得たＫｐｎＩ−ＳａｌＩ狂犬病ＧＰＶ−ＰＶ断片を、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬにサブクローニングし、それによって、ｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶを作製することを含む。第２に、ＣＯＳ−７細胞におけるｖＫＢ３−ＪＥ１３およびプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶの３者同時感染／トランスフェクションを実施して、ｈａ遺伝子座での対立遺伝子交換によってｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を作製する。青色プラーク（Ｌａｃ＋）を、ベロ細胞におけるプラーク精製の４回の連続ラウンドによってクローニングする。クローン候補を、ベロ細胞において、０．０５％ラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ）、３０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン、および５％ウシ胎児血清を補給した最小必須培地（ＭＥＭ）を用いてさらに３倍以上増殖させ、ゲル特異的ＰＣＲおよび間接免役蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって確認した。７回継代物を用いてプレマスターシードを調製する。マスターシードは、プレマスターシード、生存ベクターとしてアライグマポックスウイルスがｈａおよびｔｋ遺伝子座でＰａｓｔｅｕｒ−ＰａｒｉｓおよびＣＶＳ株の狂犬病糖タンパク質をそれぞれ発現する、設計されたｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の１：１０，０００希釈によって確立すればよい。このマスターシードは、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターのさらなる製造において有用である。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物は、狂犬病に対する予防において動物のワクチンとして高度に強力で、安全で、極めて有効である。
【０１０３】
本発明に記載される新規方法は、当業者によって、その他の狂犬病株から得られる抗原性糖タンパク質に適用され得ることが考慮され、これでは、例示されるＣＶＳおよびＰＶ株以外の株の狂犬病糖タンパク質が使用され、ｔｋおよび／またはｈａ遺伝子座に挿入されるか、またはｔｋおよびｈａ遺伝子座両方の場合には、別の糖タンパク質遺伝子は、例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤遺伝子などのアライグマポックスウイルスベクターのさらなる第３の非必須領域に挿入されて、狂犬病感染に対する保護のための免役原性のワクチンを提供する。例えば、イヌ狂犬病ｓｔｒｅｅｔウイルス、ホッキョクギツネウイルス、アライグマ狂犬病ウイルスまたはコウモリ狂犬病ウイルス株などといったその他の狂犬病株に由来する抗原性糖タンパク質をコードするヌクレオチドまたは核酸分子は、容易にＣＶＳおよび／またはＰＶ株と置換するか、それらに加えて使用され得る。あるいは、新規野生分離株または狂犬病突然変異体の糖タンパク質遺伝子を、ＣＶＳおよび／またはＰＶ遺伝子の代わりに本発明の組換えワクチンにおいて単離し、利用してもよい。第３の狂犬病株のさらなる抗原性糖タンパク質をコードする遺伝子が、アライグマポックスウイルスゲノムの第３の非必須部位に挿入され得ることも考慮される。ｔｋおよびｈａ遺伝子座を超えるその他の非必須遺伝子として、例えば、成長および増殖にとって必須ではない領域が挙げられる。
【０１０４】
実施例は、ｔｋ遺伝子座に挿入されているＣＶＳ株の糖タンパク質遺伝子およびｈａ遺伝子座に挿入されているＰＶ株の糖タンパク質遺伝子を示すが、ＣＶＳのＧ遺伝子がｈａ遺伝子座にあり、ＰＶのＧ遺伝子がｔｋ遺伝子座にある、逆に、遺伝子が挿入されるか、または病原性狂犬病ウイルスに対する高められた免役応答のために、より強力に有効な組換えワクチンを構築するために同一の狂犬病ウイルスの同一の糖タンパク質遺伝子がｔｋおよびｈａの両方に挿入されることがさらに考慮される。狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする核酸が、アライグマポックスウイルスゲノムのｈａ部位のみに挿入されている組換えワクチンを構築することが望ましいと思われる場合もある。
【０１０５】
当業者に公知の任意の方法を使用して、本発明の遺伝子構築物を調製してもよい。例えば、標準法を用いて任意の所望の核酸配列をアライグマポックスウイルスベクターに挿入するために、特定の制限部位を利用してもよい。あるいは、大きな配列の挿入が望まれる場合には、または本明細書に記載される、複数の遺伝子が挿入されることが望ましい場合には、相同組換え技術を利用してもよい。この方法では、複数の遺伝子が挿入される予定の挿入部位をフランキングするプラスミド配列は、アライグマポックスウイルスゲノム中に存在する配列と十分な相同性を有する配列を含み、組換えを媒介する。フランキング配列は、アライグマポックスウイルスの成長および増殖にとって必須でないアライグマポックスウイルスの領域、例えば、血球凝集素遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座またはセリンプロテアーゼ阻害剤遺伝子座と相同でなければならない。１つのプロモーターを使用して、組み換えられるべき２つの外因性遺伝子の発現を駆動してもよいが、挿入ベクター中に、各々、個々の遺伝子に作動可能に連結した２つのプロモーターを使用することも、効率的な発現を提供する。
【０１０６】
本発明はまた、保護を必要とする哺乳動物に強力な新規組換えワクチンを投与することによって、狂犬病から哺乳動物を保護する、または狂犬病ウイルスに感染した後に動物を治療する新規方法を提供する。
【０１０７】
本発明の方法では、狂犬病に対する防御免役応答を誘導するために、狂犬病感染からの保護または治療を必要とする哺乳動物、特に、ネコおよびイヌに本発明の免疫学的に有効な量のワクチンを投与する。また、狂犬病に対してウシおよびウマを免役化するためのワクチンの使用も考慮される。哺乳動物に投与される有効免疫量は、哺乳動物を狂犬病ウイルスの致命的な神経学的効果から保護するためにワクチンに対する十分な免疫学的応答が得られるものである。狂犬病に対する防御免疫応答は、ワクチンが、ＵＳＤＡによって認可される狂犬病ワクチンの法定ガイドラインを満たすか、超える場合に得られると考えられる。動物に接種し、十分なワクチン接種効果を誘発する免疫学的に有効な投与量または有効免疫量は、例えば、標準力価測定研究などの通例の試験によって容易に決定できるか、容易に力価測定できる。
【０１０８】
ワクチンは、単回用量で、または反復用量で、特に、感染後治療として投与してよい。ワクチンは、単回接種で健康な動物に投与され、少なくとも１年〜３年以上の間、狂犬病から動物を保護する、狂犬病からの長期間の保護を提供することが望ましい。投与量は、例えば、ネコおよびイヌに投与される場合、約５．４〜約６．７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（最小防御用量）の範囲であり得るが、より小さいネコの中には、４．５Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ以上の投与量から恩恵を受けるものもある。フェレットは、ネコおよびイヌにおいて使用されるのと同様の投与量を投与され得る。
【０１０９】
いくつかの国では、ウマおよびウシにおける狂犬病の問題があるので、大きな動物には、通常、体重によってではなく用量（１〜２ｍＬ）あたりの力価として表される好適なワクチン接種用量が投与される。力価は、獣医学の技術分野の当業者に公知の通例の力価測定研究によって決定できる。本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２はまた、狂犬病の蔓延を制御する手段として、キツネ、スカンク、マングース、アライグマ、コウモリなどといった野生動物において利用を見い出すこともできるということが考慮される。
【０１１０】
ワクチンは、免疫学的に有効な量の、本明細書に記載される組換えアライグマポックスウイルスベクター構築物の任意の１つを含み得る。もう１つの実施形態では、、ワクチンは、免疫学的に有効な量の、本明細書に記載される組換えアライグマポックスウイルスベクター構築物の任意の２つ以上を含み得る。一実施形態では、多価ワクチンが１つのベクター構築物のみを含む。
【０１１１】
ワクチンは、任意の投与経路、経口的に、鼻腔内に、経皮的に（すなわち、全身吸収のために皮膚表面上に、または皮膚上面に塗布される）、非経口的になどによって容易に投与できるが、いくつかの経路は、動物および取扱者に応じてロジスティックに、より困難であり得る。非経口投与経路として、限定されないが、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内（すなわち、注射されるか、そうでなければ皮膚の下に置かれる）経路などが挙げられる。好ましい。ワクチンは健康なネコ、イヌおよびその他の家庭用ペットに皮下に投与されることが好ましい。
【０１１２】
ポックスウイルスベクターは、生存していてもよいし、不活化ウイルスベクターを調製するための従来の手順によって、ＢＥＩ（バイナリーエチレンイミン）、ホルマリンなどを用いて不活化されていてもよく、ＢＥＩが好ましい不活化剤（ｉｎａｃｔｉｖａｎｔ）であるが、本発明のワクチンにとって、最適および強力な免疫学的有効性のために生存アライグマポックスウイルスを使用することが高度に望ましい。生存アライグマポックスウイルスはまた、複製可能であり、マスターシードウイルスからワクチンを開発するために、好適な培養において複製し、それ自体のコピーを作製できることを意味する。狂犬病Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＶＳ）およびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ株の狂犬病糖タンパク質（Ｇ２）を発現する生存組換えＲＣＮＶが、単独で、または好適な担体、希釈剤およびアジュバントと組み合わせてのいずれかで、ワクチンとして有用であることは有益である。好適な担体とは、すべての哺乳動物に投与するために非毒性で、製薬上許容されるものである。しかし、ネコの接種に使用される製品はアジュバント不含であることが考慮される。ワクチン製品は、液体または使用直前に標準の非毒性希釈剤で再構成される凍結乾燥粉末の形であり得る。凍結乾燥した粉末は、長期保存下でその効力を維持し、凍結乾燥され、２〜７℃で保存される場合には力価喪失がないという利点を有する。
【０１１３】
液体として投与される場合には、本ワクチンは、従来の形の水性溶液、シロップ剤、エリキシル剤、チンキ剤などで調製され得る。このような製剤は当技術分野では公知であり、通常、投与のために、抗原およびその他の添加剤を適当な担体または溶媒系に溶解または分散することによって調製される。好適な非毒性の、生理学的に許容される担体または溶媒として、限定されないが、水、生理食塩水、エチレングリコール、グリセロールなどが挙げられる。ワクチンはまた、凍結乾燥、またはそうでなければ、凍結−乾燥され、次いで、使用直前に好適な希釈剤を用いて無菌的に再構成または再水和されてもよい。好適な希釈剤として、限定されないが、生理食塩水、イーグル最小必須培地などが挙げられる。通常の添加剤または製剤補助剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｎｔｓ）として、例えば、認定色素、フレーバー、甘味料および１つ以上の抗菌性保存料、例えば、チメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、アムホテリシンＢなどがある。このような溶液は、例えば、部分加水分ゼラチン、ソルビトールまたは細胞培養培値を添加することによって安定化することができ、当技術分野で公知の試薬、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、それらの混合物などを用いる従来法によって緩衝することができる。
【０１１４】
液体製剤としてまた、懸濁剤または乳化剤を、その他の標準の製剤補助剤と組み合わせて含む懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。これらの種類の液体製剤は、従来法によって調製できる。懸濁液は、例えば、コロイドミルを用いて調製できる。エマルジョンは、例えば、ホモジナイザーを用いて調製できる。
【０１１５】
体液系に注射されるよう設計される非経口製剤は、ネコ体液の対応するレベルへの適切な等張性およびｐＨ緩衝を必要とする。等張性は、必要に応じて塩化ナトリウムおよびその他の塩を用いて適合して調整することができる。ワクチン接種時に、ウイルスを解凍（凍結されている場合には）するか、または脱イオン水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などといった生理学的に許容される担体を用いて再構成（凍結乾燥されている場合には）する。好適な溶媒、例えば、プロピレングリコールを用いて、製剤中の成分の溶解度および液体製剤の安定性を高めることができる。
【０１１６】
免疫増強アジュバント系からの有害な効果を有さないイヌおよびその他の動物の接種には、ワクチン製剤は、種々の通常の、非毒性の、製薬上許容される添加剤、希釈剤およびアジュバントを場合により含んでもよく、限定されないが、保存料、安定化剤、乳化剤、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化ナトリウム、塩酸などといったｐＨ調節剤、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート８０、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている）などの界面活性剤、リポソーム、イスコムアジュバント、ムラミルジペプチドなどの合成糖ペプチド、デキストランまたは例えば、リン酸アルミニウムとのデキストラン組み合わせ、硫酸デキストラン、ＤＥＡＥ−デキストランなどといった増量剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏから市販されているポリアクリル酸ポリマー）などのカルボキシポリメチレン、エチレン無水マレイン酸またはエチレン無水マレイン酸共重合体（Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている、ＥＭＡ（登録商標）、およそ等量のエチレンおよび無水マレイン酸を有し、約７５，０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する直鎖エチレン無水マレイン酸共重合体）、ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）Ａ６４０（例えば、米国特許第５，０４７，２３８号、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから市販されているアクリル酸と、スチレンと混合されたメタクリル酸の合体していない水性アクリル酸共重合体）のようなスチレンの、アクリル酸およびメタクリル酸の混合物との共重合体などのアクリル酸共重合体エマルジョン、マイコバクテリア細胞壁抽出物などの細菌細胞壁、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などのコリネバクテリウム由来アジュバント、プロピオニバクテリウム・アクネ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅ）などのプロピオニバクテリウム由来アジュバント、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）（カルメット・ゲラン桿菌またはＢＣＧ）、オルビウイルスなどのサブウイルス（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子アジュバント、コレラ毒素、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン（アブリジン）、モノホスホリル脂質Ａ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹから市販されているＤＤＡ）、合成物質およびそれらの混合物が挙げられる。本ワクチンにおいて使用してよいさらなる添加剤として、限定されないが、デキストロース、従来の抗酸化物質および従来のキレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。ワクチン製剤を場合により補完してよいその他の製薬上許容されるアジュバントとして、限定されないが、ポリアニオン、ポリカチオン、ペプチド、ミネラルオイルエマルジョン、免疫調節物質、種々の組み合わせなどが挙げられる。好適なアジュバントのさらなる限定されない例として、スクアランおよびスクアレン（または動物起源の���の他のオイル）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）（例えば、ＢＡＳＦ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販されているＬ１２１）、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ（キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）の精製された形の商業的名称、Ｉｓｃｏｔｅｃ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  ａ／ｓ、Ｖｅｄｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ  から入手可能）、ＭＡＲＣＯＬ（登録商標）（液体飽和炭化水素の精製された混合物、市販の  ｆｒｏｍ）；  植物油、Ｅｘｘｏｎ−Ｍｏｂｉｌ、Ｆａｉｒｆａｘ、ＶＡからから市販されている）などのミネラルオイル、植物油、例えば、ピーナッツオイル、インターロイキン、例えば、インターロイキン−２およびインターロイキン−１２、インターフェロン、例えば、γインターフェロン、動物ポックスウイルスタンパク質またはそれらの混合物が挙げられる。好適な安定化剤の例として、限定されないが、スクロース、ゼラチン、ペプトン、消化タンパク質抽出物、例えば、ＮＺ−アミンまたはＮＺ−アミンＡＳが挙げられる。乳化剤の例として、限定されないが、ミネラルオイル、植物油、ピーナッツオイルおよび注射用または鼻腔内ワクチンにとって有用であるその他の標準の、代謝可能な、非毒性のオイルが挙げられる。水酸化アルミニウムは、サポニンまたはＱｕｉｌ  Ａなどのその他のアジュバントと混合されて、サポニン−水酸化アルミニウムまたはＱｕｉｌ  Ａ−水酸化アルミニウムなどの組み合わせを形成することが望ましい。好ましいアジュバントは、エチレン無水マレイン酸共重合体、スチレンの、アクリル酸とメタクリル酸の混合物との共重合体、ミネラルオイルエマルジョンまたはそれらの組み合わせを含む。
【０１１７】
イヌ使用のための本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物の効力を大幅に増強する特に好ましいアジュバント系は、エチレン／マレイン酸共重合体、例えば、ＥＭＡ−３１（登録商標）（およそ等量のエチレンおよび無水マレイン酸を有し、約７５，０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する直鎖エチレン無水マレイン酸共重合体、Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている）およびアクリル酸共重合体エマルジョン、例えば、ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）（アクリル酸と、スチレンと混合されメタクリル酸の合体していない水性アクリル酸共重合体（アクリル酸−スチレンエマルジョン）、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから市販されている）の組み合わせを含む。研究により、６．４Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の力価のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物は、ＥＭＡ−３１（登録商標）およびＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）を含む組み合わせアジュバント系の存在下で高度に有効であることが実証された。誘発結果は、１０／１０（１００％）の対照イヌが死亡するか、狂犬病の徴候を示し、この研究は妥当な誘発試験であるということを示した。一方、３つの接種群では、９／１０（９０％）、１０／１０（１００％）および１０／１０（１００％）がワクチン接種を受け、研究期間にわたって健康なままであった。
【０１１８】
イヌの場合には、本発明の組換え狂犬病ワクチンはまた、１つ以上のさらなるイヌ抗原、例えば、エーリキア・カニス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌジステンパー、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、イヌアデノウイルスＩＩ型（ＣＡＶ−２）、イヌアデノウイルス（ＣＤＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）（ＬＩ）、レプトスピラ・カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）（ＬＣ）、レプトスピラ・グリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）（ＬＧ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ）（ＬＰ）などとの混合物を場合により含んでもよい。特に好ましい抗原の組み合わせは、コロナウイルスおよびレプトスピラ（例えば、新興血清型、Ｌ．  グリポティフォーサ（ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）およびＬ．ポモナ（ｐｏｍｏｎａ））を伴うか伴わない、イヌパルボウイルス、イヌジステンパー、イヌアデノウイルスおよびイヌパラインフルエンザの単離物を包含する。
【０１１９】
ネコの場合には、本発明の組換え狂犬病ワクチンはまた、１つ以上のさらなるネコ抗原、例えば、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｆｅｌｉｓ）（これまでは、通常、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（ＦＣＰ）として知られる、Ｃ．フェリス（ｆｅｌｉｓ））、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）、ネコ鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、バルトネラ菌（例えば、特有のネコ引っ掻き病）などとの混合物を場合により含んでいてもよい。
【０１２０】
用語を本明細書に用いる場合、当業者に公知の従来の意味が使われる。例えば、用語「核酸分子」または「核酸配列」は、タンパク質合成の過程に向かう、すなわち、タンパク質物質をコードし、発現するプリンおよびピリミジン塩基の反復される単位などの反復するヌクレオチドの長い鎖を指す、その明白な意味を有する。この用語を特許請求の範囲において使用する場合、核酸とは、狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする既知外因性または外来遺伝子を指す。本明細書において使用する場合、用語「組換え」とは、標準の遺伝子工学法によって作製されるアライグマポックスウイルス構築物を指す。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を実証する。しかし、これらの実施例は単に例示であって、本発明の条件および範囲について、完全に確定的なものであることを意味しないと理解されなければならない。当然のことながら、通常の反応条件（例えば、温度、反応時間など）が示されている場合には、指定の範囲より上および下の条件も使用できるが、概して、好都合ではない。実施例は、室温（約２３℃〜約２８℃）および大気圧で実施される。本明細書において言及されるすべての部およびパーセントは、重量ベースであり、すべての温度は、特に断りのない限り摂氏度で表される。
【０１２２】
本発明のさらなる理解を、以下の実施例から得ることができる。これらの実施例は、本発明を、その範囲を制限することなく例示するよう意図されている。
【０１２３】
実施例１：ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の構築
手短には、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−  Ｐａｒｉｓ糖タンパク質遺伝子（Ｇ）を、ｖＫＢ３−ＪＥ１３ゲノムの血球凝集（ｈａ）遺伝子座に挿入することによってウイルスｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を構築した。完全構築物は、ＲＣＮＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）および血球凝集（ｈａ）遺伝子座にそれぞれ挿入されたＣＶＳおよびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ株の狂犬病糖タンパク質遺伝子、さらなる弱毒野生型アライグマポックスウイルス、病原性Ｈｅｒｍａｎ株を含む。
【０１２４】
Ｄｒ．Ｊｏｓｅｐｈ  Ｊ．  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ（米国疾病対策予防センター（ＣＤＣ）、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）から入手したウイルスｖＫＢ３−ＪＥ１３は、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＶＳ）株の狂犬病糖タンパク質を、アライグマポックスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座で発現する（さらなる情報については、米国特許第７，０８７，２３４号、同第６，２４１，９８９号、同５，３４８，７４１号および同第５，２６６，３１３号も参照のこと）。Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子は、ＷＯ００／６３２４２の方法に従って製造できる狂犬病ＤＮＡワクチンから入手した。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の構築方法は、２つの主要な工程によって提供された。第１に、ＦＤＡＨの狂犬病ＤＮＡワクチン構築物ｐＶＡＸ１−ＧＰＶ−ＰＶ由来の、ＰＣＲ増幅された１，５７５ｂｐの狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子（ＧＰＶ−ＰＶ）を、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬベクターにクローニングして、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶを作製した。第２に、ＣＯＳ−７細胞においてｖＫＢ３−ＪＥ１３およびプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶの３者同時感染／トランスフェクションを実施して、ｈａ遺伝子座での対立遺伝子交換によってｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を作製した。青色プラーク（Ｌａｃ＋）を、ベロ細胞におけるプラーク精製の４回の連続ラウンドによってクローニングした。クローン候補を、ベロ細胞において、０．０５％ラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ）、３０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシンおよび５％ウシ胎児血清を補給した最小必須培地（ＭＥＭ）を用いてさらに３倍以上増殖させ、その後、遺伝子特異的ＰＣＲおよび間接免役蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって確認した。７回継代物を用いてプレマスターシードを調製した。マスターシードは、プレマスターシード、生存ベクターとしてアライグマポックスウイルスがｈａおよびｔｋ遺伝子座でＰａｓｔｅｕｒ−ＰａｒｉｓおよびＣＶＳ株の狂犬病糖タンパク質をそれぞれ発現できる設計されたｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の１：１０，０００希釈によって確立すればよい。狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２）のマスターシードは、ＲＣＮＶ  ｈａ、ｔｋおよび狂犬病Ｇ遺伝子特異的ＰＣＲ試験によって同定された。狂犬病糖タンパク質の発現は、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ製の狂犬病Ｇタンパク質特異的モノクローナル抗体を用いるＩＦＡによって確認された。ネコおよびイヌにおける細菌、真菌およびマイコプラズマ汚染の検出のための純度試験および安全性試験を、ＡＰＨＩＳ標準プロトコールに従って実施した。すべての純度および安全性試験の満足のいく結果が報告された。
【０１２５】
より詳しくは、以下のプロトコールをたどって、組換え生物ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を調製した：
レシピエント特性決定に関しては、上記で記載および説明したように、親生物は、１９６１〜１９６２年にメリーランド州、アバディーン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）においてＹ．Ｆ．Ｈｅｒｍａｎによって臨床症状のないアライグマの気道から最初に単離されたアライグマポックスウイルス（ＲＣＮＶ）のＨｅｒｍａｎ株とした。ＲＣＮＶは、直鎖の、ほぼ２００ｋｂの、各末端にヘアピンループを含む二本鎖ＤＮＡゲノムを含有するポックスウイルス科のメンバーである。その他のポックスウイルス（ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルス）と同様に、ＲＣＮＶは細胞質中で複製し、その自身の転写系を使用し、ワクチン開発のための外来遺伝子を発現するために生存ベクターとして用いられてきた。しかし、ＲＣＮＶのこれまでの、既知の使用は、アライグマポックスウイルスゲノムのｔｋ遺伝子座での１つのみの狂犬病ウイルス株の糖タンパク質Ｇの挿入に制限されてきた。
【０１２６】
遺伝子マーカーについて、ＲＣＮＶ野生型は、ｔｋ遺伝子を含み、ＴＫ＋表現型と表される。先のウイルスｖＫＢ３−ＪＥ１３構築物中への狂犬病ＣＶＳ  Ｇ遺伝子の挿入は、ｔｋ遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊し、ＲＣＮＶ  ＴＫ−にする。同様に、ＲＣＮＶ野生型は、ｈａ遺伝子を含み、ＨＡ＋表現型と表される。本発明の方法による狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子の挿入は、ｈａ遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊し、ＲＣＮＶ  ＨＡ−にする。
【０１２７】
ドナー特性決定に関しては、ドナー生物は以下のように記載される：狂犬病ウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、ラブドウイルス科内のリッサウイルス属のメンバーである。狂犬病ウイルスは、すべての温血動物に感染し得る。このウイルスによる感染は、致命的な神経疾患をもたらし得る。５種の構造タンパク質：核タンパク質（Ｎ）、リン酸化タンパク質（Ｍ１）、基質タンパク質（Ｍ２）、膜貫通糖タンパク質（Ｇ）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）が、１２ｋｂのウイルスゲノムによってコードされる。ウイルス抗原Ｇタンパク質が、ウイルス中和抗体および致死性の狂犬病ウイルス誘発からの保護を誘導できることは知られている。
【０１２８】
ドナー遺伝子を得るために、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲを用いて狂犬病ＣＶＳおよびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ株から狂犬病Ｇ−ｃＤＮＡを増幅した。ＣＶＳおよびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病Ｇ遺伝子の大きさは、１５７５ｂｐである。プラスミドｐＦＤ２００３−ＧＰＶ−ＰＶの完全核酸配列および制限酵素マップが図１および２に示されている。さらなるＤＮＡ配列分析によって、狂犬病ＣＶＳ  Ｇ遺伝子は、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子と８９％の同一性を共有することが示され、これら２つの狂犬病Ｇ遺伝子を、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ゲノムの、それぞれ、ｔｋおよびｈａ遺伝子座に反対方向に挿入した。
【０１２９】
組換え生物を構築するために、ウイルスｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ糖タンパク質遺伝子（Ｇ）を、ｖＫＢ３−ＪＥ１３ゲノムの血球凝集（ｈａ）遺伝子座に挿入することによって構築した。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の構築方法は、２つの主要な工程を含んでいた。第１に、鋳型としてプラスミドｐＧＰＶ−ＰＶから構築されたプラスミドｐＶＡＸ１−ＧＰＶ−ＰＶ（ＷＯ００／６３２４２において調製された狂犬病ＤＮＡワクチンおよびｐＧＰＶ−ＰＶ参照のこと）を用いてＰＣＲによって増幅された１，５７５ｂｐの狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ  ｃＤＮＡ（ＧＰＶ−ＰＶ）を含有するＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＦＤ２００３ＳＥＬベクターに挿入して、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶを作製した。この構築物では、ＧＰＶ−ＰＶの発現は、合成初期−後期プロモーター（ＰＳＥＬ）によって調節され、レポーター遺伝子としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼの発現は、反対方向のワクシニアウイルス７．５ｋＤａプロモーター（Ｐ７５）の転写制御下にあった。全発現カセットを、ＲＣＮＶ  ｈａ配列によってフランキングした。第２に、ＣＯＳ−７細胞においてｖＫＢ３−ＪＥ１３およびプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶの三者感染／トランスフェクションを実施して、ｈａ遺伝子座での対立遺伝子交換によってｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を作製した。青色プラーク（Ｌａｃ＋）を、ベロ細胞におけるプラーク精製の５回の連続ラウンドによってクローニングした。遺伝子（ｈａまたはｔｋ）特異的ＰＣＲを用いて、混合集団が存在しないことを確認し、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を用いて、狂犬病糖タンパク質の発現を調べた。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の構築における重要な工程の例示については図３参照のこと、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ゲノムのダイアグラムについては図４参照のこと。
【０１３０】
中間体クローニングベクターとして、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶを本明細書に記載されるとおりに構築した。プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ−ＧＰＶ−ＰＶの完全配列および制限酵素マップは、図１および２にそれぞれ示されている。
【０１３１】
レシピエントに遺伝子修飾を導入するために、狂犬病ＣＶＳおよびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓの  Ｇ遺伝子を、相同組換えによってＲＣＮＶゲノムのｔｋおよびｈａ遺伝子座にそれぞれ挿入した。ワクシニアウイルスを用いてこれまでに記載された手順（Ｊ．Ｊ．Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、「Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒａｂｉｅｓ」、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ１：７〜２１頁（１９８７年）参照のこと）を用いて、本発明の新規遺伝子修飾をアライグマポックスウイルスに導入するこの方法を達成した。
【０１３２】
組換え生物を同定および精製するためのスクリーニング法およびプロトコールは、以下のとおりに実施した：組換えウイルスを、標準ウイルスプラーク精製技術によって精製した。ｖＫＢ３−ＪＥ１３を、ＣＶ−１細胞内の相同組換えによって作製した。ＴＫ−ウイルスは、変異原性化合物５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）の存在下で選択し、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよび狂犬病糖タンパク質タンパク質発現の免疫学的スクリーニングを含めた種々の方法によって組換え体をさらにスクリーニングした。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、ブルプラーク（Ｌａｃ＋）精製、遺伝子（ｈａまたはｔｋ）特異的ＰＣＲおよびＩＦＡによってスクリーニングした。
【０１３３】
実施例２：ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５のＰＣＲ同定試験
ＲＣＮＶ野生型においてｈａおよびｔｋ遺伝子を、およびｒＲＣＮＶ−狂犬病−Ｇ２ゲノムのｈａおよびｔｋ遺伝子座療法に挿入された狂犬病糖タンパク質（Ｇ）遺伝子を同定するために、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５中に存在する混合集団がないことを実証するために、以下の材料および方法を用いて包括的ＰＣＲ試験を実施した。
【０１３４】
材料
１．ウイルス：
ａ）ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶ
ｂ）ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋５
ｃ）ＲＣＮＶ野生型エスポシト（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ）
２．ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡから市販されている）
３．遺伝子特異的プライマー：
ａ）同定試験のために、プライマーＨＡ−０８およびＨＡ−Ｐｓｔを用いてＲＣＮＶ野生型の５６３ｂｐのｈａ遺伝子断片を増幅した。
【０１３５】
ｉ）ＨＡ−０８：５’−ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ−３’（配列番号２に対応する）
ｉｉ）ＨＡ−Ｐｓｔ：５’−ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＡＣＴ−３’（配列番号３に対応する）
ｂ）  同定試験のために、プライマーＨＡ−Ｐｓｔおよびｇｐ−１Ｆを用いて、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ゲノムのｈａ遺伝子座で、１３０３ｂｐの狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−ＰａｒｉｓのＧ遺伝子断片を増幅した。
【０１３６】
ｉ）ＨＡ−Ｐｓｔ：上記の配列を参照のこと
ｉｉ）ｇｐ−１Ｆ：５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＧＴＴ−５’（配列番号４に対応する）
ｃ）同定試験のために、プライマーＴＫ−ＬＷおよびＴＫ−ＲＷを用いて、５０３ｂｐのＲＣＮＶ野生型のｔｋ遺伝子断片を増幅した。
【０１３７】
ｉ）ＴＫ−ＬＷ：５’−ＡＡＣ  ＧＴＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＴＣＴ−３’（配列番号５に対応する）
ｉｉ）ＴＫ−ＲＷ：５’−ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＡＡＧ−３’（配列番号６に対応する）
ｄ）同定試験のために、プライマーＴＫ−ＲＲおよびｇＪＥ−Ｆ１を用いて、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ゲノムのｔｋ遺伝子座で、１６３７ｂｐの狂犬病ＣＶＳのＧ遺伝子断片を増幅した。
【０１３８】
ｉ）ＴＫ−ＲＲ：５’−ＧＡＡ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＡＡＧ−３’（配列番号７に対応する）
ｉｉ）ｇＪＥ−Ｆ１：５’−ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＣＡ−３’（配列番号８に対応する）
４．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから市販されている）
５．Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから市販されている）
６．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから市販されている）
方法
Ａ．ＤＮＡ調製
ｒＲＣＮＶゲノムＤＮＡ調製は、ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡから市販されている）を用い、Ｑｉａｇｅｎによって提供される取扱説明書に記載のとおりに実施した。
【０１３９】
Ｂ．ＰＣＲ試験
この包括的ＰＣＲ試験では、プライマーＨＡ−０８およびＨＡ−Ｐｓｔを用いて、ＲＣＮＶ野生型をスクリーニングし、プライマーＨＡ−Ｐｓｔおよびｇｐ−１Ｆを用いて、ｈａ遺伝子座でｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２をスクリーニングし、プライマーＴＫ−ＬＷおよびＴＫ−ＲＷを用いて、ＲＣＮＶ野生型をスクリーニングし、プライマーＴＫ−ＲＲおよびｇＪＥ−Ｆ１を用いて、ｔｋ遺伝子座でｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２をスクリーニングした。
【０１４０】
１．各ＰＣＲ反応のために、以下の反応混合物を調製する：
５μＬ        １０×ＰＣＲバッファー
３μＬ        ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５μＬ        ２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
５μＬ        各プライマー（１０μＭ）
５μＬ        ＤＮＡ鋳型
０．５μＬ    ５ユニット／μＬ  ＡＢＩ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ
２１．５μＬ  ｄｄＨ２０
２．９５℃のサーマルサイクラー中で、１０分間、サンプルをインキュベートして、ＤＮＡ鋳型を完全に変性する。
【０１４１】
３．標的鋳型を３５サイクルの間、増幅する。
【０１４２】
工程                    温度                時間
変性                    ９４℃              １．０分
アニーリング            ５９０Ｃ            １．０分
伸長                    ７２０Ｃ            ２．０分
４．サンプルを７２℃で、さらに５分間維持する。
【０１４３】
５．サンプルを４℃で無期限に維持する。
【０１４４】
Ｃ．アガロースゲル電気泳動
１．１０μＬの各ＰＣＲ産物を、２μＬのローディングバッファーと合わせる。
【０１４５】
２．サンプルを、マーカーとしてＰｒｏｍｅｇａ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＰｒｏｍｅｇａ  １ｋｂ  ＤＮＡラダーとともに１％アガロースゲルに流す（両製品とも、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから市販されている）。
【０１４６】
結果
遺伝子特異的プライマーを用いた、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５のＰＣＲ同定試験の結果が図５に示されている。プライマーＨＡ−０８およびＨＡ−Ｐｓｔを用いて、ＲＣＮＶ  ｈａ遺伝子（図５Ａ、ゲルＡ）を検出し、プライマーＴＫ−ＬＷおよびＴＫ−ＲＷを用いて、ＲＣＮＶ  ｔｋ遺伝子（図５Ｂ、ゲルＢ）を検出し、ＭＳＶおよびＸ＋５（レーン２〜６）ではバンドは観察されなかった。対照的に、ＲＣＮＶ野生型Ｅｓｐｏｓｉｔｏ（レーン７）では、ｈａ遺伝子座の５６３ｂｐバンドおよびｔｋ遺伝子座の５０３ｂｐバンドの両方が観察された。これらの結果は、ＲＣＮＶ野生型は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２中に混合されているということを示した。プライマーＨＡ−Ｐｓｔおよびｇｐ−１Ｆを用いて、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ  Ｇ遺伝子がｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ゲノムのｈａ遺伝子座に挿入されているかどうかを調べた場合、プライマーＴＫ−ＲＲおよびｇＪＥ−Ｆ１を用いて、狂犬病ＣＶＳ  Ｇ遺伝子がｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ゲノムのｔｋ遺伝子座に挿入されているかどうかを調べた場合には、ｈａ遺伝子座の１３０３ｂｐバンドおよびｔｋ遺伝子座の１６３７ｂｐバンドの両方が、それぞれ、ＭＳＶおよびＸ＋５（レーン８〜９）において観察された。対照的に、ＲＣＮＶ野生型Ｅｓｐｏｓｉｔｏ（レーン１３）ではバンドは観察されなかった。これらの結果は、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−ＰａｒｉｓおよびＣＶＳ  Ｇ遺伝子は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ゲノムのｈａおよびｔｋ遺伝子座にそれぞれ挿入されているということを示した。これらの結果は以下の表１に要約されている：
【０１４７】
【表１−１】
0005653751.tif 000004
【０１４８】
【表１−２】
0005653751.tif 000005
結論
このＰＣＲ同定試験の結果から、狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−ＰａｒｉｓおよびＣＶＳ  Ｇ遺伝子は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ゲノムのｈａおよびｔｋ遺伝子座に物理的に存在していたこと、およびＲＣＮＶ野生型は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５中には混合されていないことが結論付けられる。このＰＣＲ試験はまた、１）ＲＣＮＶ野生型の、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ゲノムのｈａおよびｔｋ遺伝子座中の狂犬病Ｐａｓｔｅｕｒ−ＰａｒｉｓおよびＣＶＳ  Ｇ遺伝子の同定試験；および２）組換えウイルス構築のプラーク精製の際にｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２をＲＣＮＶ野生型と区別するためのクローンスクリーニングのために使用できる。
【０１４９】
実施例３：ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５における狂犬病糖タンパク質のＩｎ  Ｖｉｔｒｏ発現
ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよび継代５の感染ベロ細胞における狂犬病糖タンパク質の発現を調べるために、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を実施した。
【０１５０】
材料
ウイルス：            ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶ
ｒＲＣＮＶ−狂犬病  Ｇ２  Ｘ＋５
ベロ細胞：            Ｐ１８−ベロ−１２
培地：                ｗ／０．０５％のＬＡＨ  ＆  Ｇｅｎｔを補給した１×ＭＥＭ
一次抗体：          抗狂犬病ＩｇＧ２ｍＡｂ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹから市販されている）
二次抗体：          蛍光がコンジュゲートしているヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）０．５ｍｇ
希釈剤／洗浄バッファー：  ０．０１Ｍ  ＰＢＳ
増強溶液：              １ｍｇ／ｍＬ  ｐ−フェニレンジアミン
９０％  グリセロール
１０％  ０．０１Ｍ  ＰＢＳ
０．５Ｍ  炭酸バッファー
ｐＨ９．０、−２０℃、暗所で保管
蛍光顕微鏡：            Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１
方法
１．２個の８ウェルチャンバースライドに、０．０５％のラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ）、３０μＬ／ｍＬのゲンタマイシンおよび５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した、５００μＬの１×最小必須培地（ＭＥＭ）中、１．０×１０５個のベロ細胞を植え付ける。
【０１５１】
２．５％  ＣＯ２チャンバー中、３７℃で一晩インキュベートする。
【０１５２】
３．１×ＭＥＭ  ｗ／０．０５％ＬＡＨ  ＆  Ｇｅｎｔ培地を用いて、サンプルで、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶについては、未希釈から１０−１まで、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋５については、１０−２〜１０−４の連続１０倍希釈を行う
４．１００μＬの各希釈物をチャンバースライドのウェルに２連で入れ、４番目のウェルは陰性対照として残しておく。
【０１５３】
５．５％  ＣＯ２中、３７℃でチャンバーを一晩４８時間インキュベートする。
【０１５４】
６．細胞変性効果を観察し、狂犬病Ｇタンパク質特異的モノクローナル抗体（Ｇタンパク質特異的ＭＡｂ）を用いるＩＦＡ（間接免疫蛍光アッセイ）によって狂犬病Ｇタンパク質発現のプラークをらに調べる。
【０１５５】
結果
結果は図６Ａ〜６Ｃに示されている。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５感染ベロ細胞のすべての希釈物において、細胞変性効果および蛍光が観察された（図６Ａおよび６ｂ参照のこと）が、非感染ベロ細胞のみを含有する陰性対照では観察されなかった（図６Ｃ参照のこと）。この結果は、狂犬病Ｇタンパク質は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよび継代５において発現され、狂犬病Ｇタンパク質特異的モノクローナル抗体によって検出されるということを示した。
【０１５６】
実施例４：ＮＩＨマウス効力試験
標準ＮＩＨマウス効力試験を用いて、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２およびｖＫＢ３−ＪＥ１３（ＲＣＮＶ  Ｒａｂ−Ｇ）構築物の最初の比較研究を実施した。結果は、以下の表２に要約されている：
【０１５７】
【表２】
0005653751.tif 000006
上記の結果は、本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物は、驚くべきことに、ｖＫＢ３−ＪＥ１３  構築物よりも２３倍強力であることを示した。
【０１５８】
その後、同業界によって認識される技術を用いて、以下により詳細に記載される、さらなる研究を実施して、種々の製剤における狂犬病ワクチン、本発明の生存アライグマポックスウイルスベクターのＮＩＨマウス効力、当技術分野で公知のこれまでの狂犬病ワクチンと比較して調べた。
【０１５９】
材料
ウイルスまたはワクチン：
ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、生存ベクター（７．０Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）
ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、生存ベクター（６．５Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）
ｖＫＢ３−ＪＥ１３（ＣＤＣ旧構築物）（７．２Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）
Ｍｅｒｉａｌ  ＰＵＲＥＶＡＸ（登録商標）ネコ狂犬病（生存カナリアポックスベクターを用いる一価の狂犬病糖タンパク質ワクチン、Ｍｅｒｉａｌ、Ｈａｒｌｏｗ、Ｅｓｓｅｘ、ＵＫから市販されている）
ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２（６．３８Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）
不活化ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２（不活化前力価：６．３８Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）
ＮＩＨ狂犬病参照ワクチン：アジュバントを含む不活化狂犬病ワクチン、ＮＩＨマウス効力試験において参照として用いられる究極の判断基準ワクチン。
【０１６０】
方法
ＮＩＨマウス効力試験：
この試験は、元の方法では、１：５、１：２５、１：１２５および１：６２５の、または改正法では未希釈、１：１０、１：１００および１：１０００の試験ウイルス／ワクチンを用いて標準法「狂犬病ワクチンのＮＩＨマウス効力試験」を実施した。手短には、１６匹のマウスに、７日間隔（特記されない限り）で、２用量の０．５ｍＬの試験ウイルス（希釈された、もしくは未希釈の）またはＮＩＨ狂犬病参照ワクチンを用いて、腹膜内に（ＩＰ）ワクチン接種した。最初のワクチン接種の１４日後、すべてのワクチン接種したマウスに、０．０３ｍＬの、１：８０，０００希釈の病原性狂犬病（チャレンジウイルスは、ワクチン接種されていないマウス（各希釈１０マウス）において５倍希釈で逆滴定して、適切な攻撃用量を確実にした。）を用いて脳内に攻撃した（ＩＣ）。すべてのマウスは、攻撃後１４日間毎日観察した。
【０１６１】
結果
以下の表３では、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の相対効力（ＲＰ）は、それぞれ、６．５Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬで２７．９および７．０Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ  で１０１．９である。表４では、６．５Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬのｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、７．２Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＭｅｒｉａｌ  ＰＵＲＥＶＡＸ（登録商標）ネコ狂犬病ワクチン（Ｍｅｒｉａｌ、Ｈａｒｌｏｗ、Ｅｓｓｅｘ、ＵＫから市販されている生存カナリアポックスベクターを用いる一価の狂犬病糖タンパク質ワクチン、これは、市場からこの実験比較の目的で購入した）およびＶＫＢ３−ＪＥ１３（ＣＤＣ旧構築物）よりも強力であった。以下の表５では、結果は、生存ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、不活化ワクチン製品よりも強力であると示した。
【０１６２】
結論
ＮＩＨマウス効力試験は、本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物はマウスモデルにおいて高度に強力であるということを示した。
【０１６３】
【表３】
0005653751.tif 000007
【０１６４】
【表４】
0005653751.tif 000008
【０１６５】
【表５】
0005653751.tif 000009
実施例５：ＰＣＲ試験によるｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５の遺伝的安定性試験
実験研究の目的は、ＰＣＲ試験によってｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５の遺伝的安定性を調べることである。
【０１６６】
材料
１．ウイルス：
ａ）ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶ
ｂ）ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋５
２．プライマー：
ａ）ｈａ遺伝子座での１８０６ｂｐのＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病Ｇ遺伝子およびその部分フランキング領域の増幅のために、
ＨＡ−Ｐｓｔ：５’−ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＡＣＴ−３’（配列番号３に対応する）
ＰＷ−０４：  ５’−ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＴＧＡ−３’（配列番号９に対応する）
ｂ）  ｔｋ遺伝子座での１９１０ｂｐのＣｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＶＳ）狂犬病Ｇ遺伝子およびその部分フランキング領域の増幅のために
ＴＫ−ＲＲ：５’−ＧＡＡ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＡＡＧ−３’（配列番号７に対応する）
ＰＷ−０３：５’−ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＣＡＴ−３’（配列番号１０に対応する）
３．ＤＮＡ精製およびＰＣＲクローニングのためのキット／試薬
ａ）ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡから市販されている）
ｂ）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから市販されている）
ｃ）Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから市販されている）
４．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから市販されている）
方法
Ａ．ＤＮＡ調製
ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡから市販されている）を用い、Ｑｉａｇｅｎによって提供される取扱説明書に記載のとおりに、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５からのゲノムＤＮＡの調製を実施した。
【０１６７】
Ｂ．ＰＣＲ試験
このＰＣＲ試験では、プライマーＨＡ−ＰｓｔおよびＰＷ−０４を用いて、ｈａ遺伝子座で１８０６ｂｐのＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病Ｇ遺伝子およびその挿入フランキング領域を増幅し、プライマーＴＫ−ＲＲおよびＰＷ−０３を用いて、ｔｋ遺伝子座で１９１０ｂｐのＣＶＳ狂犬病Ｇ遺伝子およびその挿入フランキング領域を増幅した。
【０１６８】
１．各ＰＣＲ反応のために、以下の反応混合物を調製する：
５μＬ        １０×ＰＣＲバッファー
３μＬ        ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５μＬ        ２ｍＭ  ｄＮＴＰ
５μＬ        各プライマー（１０μＭ）
５μＬ        ＤＮＡ鋳型
０．５μＬ    ５ユニット／μＬ  ＡＢＩ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ
２１．５μＬ  ｄｄＨ２０
２．９５℃のサーマルサイクラー中で、１０分間サンプルをインキュベートして、ＤＮＡ鋳型を完全に変性する。
【０１６９】
３．標的鋳型を３５サイクルの間、増幅する。
【０１７０】
工程 温度 時間
変性                    ９４℃              １．０分
アニーリング            ５９０Ｃ            １．０分
伸長                    ７２０Ｃ            ２．０分
４．サンプルを７２℃で、さらに５分間維持する。
【０１７１】
５．サンプルを４℃で無期限に維持する。
【０１７２】
Ｃ．アガロースゲル電気泳動
１．１０μＬの各ＰＣＲ産物を、２μＬのローディングバッファーと合わせる。
【０１７３】
２．サンプルを、マーカーとしてＰｒｏｍｅｇａ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよび１ｋｂ  ＤＮＡラダーとともに１％アガロースゲルに流す（両製品とも、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから市販されている）（図７参照のこと）。
【０１７４】
結果
ＰＣＲ結果は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５から、１８０６ｂｐ（ｈａ遺伝子座）および１９１０ｂｐ（ｔｋ遺伝子座）の同一のバンドが増幅されることを示した（図７参照のこと）。この結果は、それぞれ、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５から得た、挿入フランキング領域およびｔｋ遺伝子座のＣＶＳ狂犬病株の、およびｈａ  遺伝子座のＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ狂犬病株の狂犬病Ｇ遺伝子内に、注目すべき挿入または欠失は生じていないことを示した。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５間のバンド密度の相違は、継代５のウイルスの力価が、マスターシードよりお約１０，０００倍高かったからである。結果は表６に要約されている。
【０１７５】
【表６】
0005653751.tif 000010
結論
ＰＣＲ試験から、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶは、継代５への製造前スケールアップ手順下で遺伝的に安定であると結論付けられる。
【０１７６】
実施例６：青色プラークアッセイによる、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５の表現型安定性試験
この研究は、青色プラークアッセイによって、継代５（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋５）への製造前スケールアップ手順下でｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶ（マスターシードウイルス）が表現型上安定であったかどうかを調べる。
【０１７７】
方法
Ａ．ベロ細胞を播種する
１．細胞を、７×１０５個／ｍＬ（１×ＭＥＭ／０．０５％  ＬＡＨ／Ｇｅｎｔ培地＋５％ＦＢＳ中１０ｍＬ）の濃度で１００ｍｍディッシュ上に植え付け、細胞が感染のために約８０％のコンフルエンシーに達するよう一晩増殖させる。
【０１７８】
Ｂ．ウイルス希釈
２．  Ｔｈａｗ  ｏｕｔ  ウイルスを室温で解凍し、場合により、氷上で１５秒間、３回、超音波処理する。
【０１７９】
３．１×ＭＥＭ／０．０５％  ＬＡＨ／Ｇｅｎｔ培地で連続１０倍希釈を作製する：
ａ）ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶを１０−１に希釈した。
【０１８０】
ｂ）ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  Ｘ＋５を１０−５に希釈した。
【０１８１】
Ｃ．感染
４．１００ｍｍディッシュから培地を除去し、６ｍｌの０．０１Ｍ  ＰＢＳを用いて２回すすぐ。
【０１８２】
５．プレートからすべての液体を除去し、各ディッシュに希釈したウイルスを加える。
【０１８３】
ａ）ＭＳＶについて：１ｍＬの１００および１０−１希釈したウイルスを３連で加えた。
【０１８４】
ｂ）Ｘ＋５について：１ｍＬの１０−３、１０−４および１０−５希釈したウイルスを３連で加えた。
【０１８５】
６．各ディッシュに４ｍＬの１×ＭＥＭ／０．０５％  ＬＡＨ／Ｇｅｎｔ培地を加え、各ディッシュ中の総容積を５ｍＬとする。
【０１８６】
７．３７℃、５％ＣＯ２で２時間ンキュベートし、ベロ細胞にウイルスを感染させる。
【０１８７】
Ｄ．寒天オーバーレイ
８．２×ＭＥＭ／０．０５％ＬＡＨ／Ｇｅｎｔ培地に１０％  ＦＢＳを加え、４２℃に加温する。
【０１８８】
９．溶解した後、Ｎｏｂｌｅ寒天を５６℃に冷却する。
【０１８９】
１０．等容積の２．５％Ｎｏｂｌｅ寒天を、２×ＭＥＭ／０．０５％ＬＡＨ／Ｇｅｎｔ培地＋１０％  ＦＢＳと混合し、５６℃の水のビーカー中、室温で１０分間静置しておく。
【０１９０】
１１．２時間の感染後、工程７のプレートから全培地を除去し、細胞単層巣を、１５ｍＬの工程１０から得た増殖培地／Ｎｏｂｌｅ寒天混合物で覆う。
【０１９１】
１２．寒天を１０〜１５分間固化させる。
【０１９２】
１３．３７℃および５％  ＣＯ２でディッシュをインキュベートする。
【０１９３】
Ｅ．染色
５日間インキュベーションした後、以下のとおりに７ｍＬの染色溶液でディッシュを覆う：
１４．染色溶液（１００ｍＬ）：５０ｍＬの２．５％Ｎｏｂｌｅ寒天、５０ｍＬのＰＢＳおよび１ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを調製する。
【０１９４】
１５．混合する前に、Ｎｏｂｌｅ寒天を５６℃に冷却し、ＰＢＳを４２℃に加温する。まず、ＰＢＳおよびＸ−Ｇａｌを混合し、次いで、Ｘ−Ｇａｌ／ＰＢＳをＮｏｂｌｅ寒天中に加える。混合物を、５６℃の水を含有するビーカー中、室温で１０分間静置する。
【０１９５】
１６．１０分後、各プレート上に７ｍＬの染色溶液を加える。
【０１９６】
１７．寒天を１０〜１５分間固化させる
１８．３７℃で４〜６時間インキュベートする。
【０１９７】
１９．青色プラークを計数し、デジタル画像を記録する。
【０１９８】
結果
各プレート上で総青色プラークを計数し、以下の表７に要約した。いずれのプレートにおいても白色プラークは観察されなかった。ベロ細胞におけるｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５に由来する青色プラークのデジタル画像が図８Ａおよび８Ｂにそれぞれ示されている。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５の算出された力価を以下に示す。
【０１９９】
結論
ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶおよびＸ＋５のいずれにおいても白色プラークは大きな力価喪失は観察されなかった。この結果は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ＭＳＶは、継代５への製造前スケールアップ手順下で表現型上安定であることを示した。
【０２００】
【表７】
0005653751.tif 000011
実施例７：ネコにおけるｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の力価測定研究
この研究は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンの短期間（３ヶ月）の有効性を実証するために実施した。
【０２０１】
ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の力価測定研究は、４０匹のネコで実施した。アジュバント不含試験ワクチンは、生存ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２および１×ＭＥＭ（最小必須培地）からなっていた。ワクチンは、２〜７℃で保管した。この研究では、４群（各群につき１２週齢の１０匹のネコ）があった：群１〜３のネコには、単回用量（１ｍＬ／用量）の６．５、５．５および４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬのｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２をそれぞれ皮下（ＳＱ）に投与したのに対し、群４（対照）のネコにはワクチン接種を行わなかった。ネコはワクチン接種時に１２週齢であった。ワクチン接種の３ヶ月後、狂犬病ＮＹＣ  ｓｔｒｅｅｔ株を用いてネコを攻撃した。攻撃の４２日後、ワクチン接種を受けたネコは死亡しなかったのに対し、対照ネコの８０％（８／１０）が狂犬病感染のために死亡した。３種の異なる投与量でワクチン接種を受けたネコの１００％が保護されたと示し、この研究の優れた結果は、本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物が、ネコにおいて狂犬病攻撃に対して完全な保護を誘導できることを示した。
【０２０２】
この用量漸増研究では、４群：ネコ（ｎ＝３×１０）があり、３つのワクチン接種群には、それぞれ、３種の異なる力価（６．５０、５．３９および４．４２Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ／用量）を有する単回用量の狂犬病ワクチン、生存アイグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２）を、１２週齢で投与し、対照群のネコ（ｎ＝１０）には、ワクチン接種を行わなかった。ワクチン接種後２８、６３および９８日に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたネコの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２０３】
ワクチン接種の３ヶ月より後に（９８ＤＰＶで）、すべてのネコ（３０匹のワクチン接種および１０匹の対照）を、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ＮＹＣ株ロット９２−５の１：１５０直接希釈物を用いて攻撃した。すべての攻撃されたネコを、４２日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。攻撃結果は、８／１０（８０％）の対照が狂犬病のために死亡したが、各ワクチン接種群では１０／１０（１００％）のワクチン接種を受けたものが４２日間健康なままであったということを実証した。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。ワクチン有効性は、３つのワクチン接種群すべてについて１００％であった。
【０２０４】
要約すれば、この用量漸増研究から得られた結果は、生存アライグマポックスウイルスベクターを用いる本発明の組換え狂犬病ワクチンは、ネコにおける、単回ワクチン接種後少なくとも３ヶ月間の狂犬病の予防において、４．４２Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）ほどの低い力価であっても有効であることを実証した。
【０２０５】
ワクチン接種の３ヶ月より後に（９８ＤＰＶで）、すべてのネコを、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅウイルス（ロット９２−５、３−１−９２、キツネにおけるＮＹＣ株）の１：１５０直接希釈物を用いて攻撃した。手短には、動物を接種前に鎮静化し、次いで、０．５ｍＬの咀嚼筋への希釈した攻撃（合計１．０ｍＬ）を用いて筋肉内に接種した。動物を、４２日の観察期間の間、狂犬病攻撃領域内の個々のケージに入れ、確保した。４２日後、すべての狂犬病動物が攻撃後最初の４週間のうちに死亡した、これまでの狂犬病攻撃結果によって、攻撃観察期間は正当であるとした。
【０２０６】
致死的攻撃用量は、この研究における対照ネコの死亡率によって条件が満たされるものと決定した。攻撃結果は、８／１０（８０％）の対照が狂犬病のために死亡したことを示した。したがって、これは妥当な攻撃試験であった。
【０２０７】
各ネコから６ｍＬの全血を、ワクチン接種後０日（ＤＰＶ）、２８ＤＰＶ、６３および９８ＤＰＶに血清のために採取した。
【０２０８】
血清サンプルは、迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）、ＮＶＳＬ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ））によって公開された組織培養蛍光抗体手順によって試験して、狂犬病ウイルスに対する血清中和（ＳＮ）力価を調べた。
【０２０９】
この研究に用いたｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンは、ベロ細胞で力価測定した。試験ワクチンの平均力価は、それぞれ、６．５０（Ｖ１）、５．３９（Ｖ２）および４．４２（Ｖ３）Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）であった。
【０２１０】
ワクチン接種の２８、６３および９８日後に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを、ＲＦＦＩＴによって狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたネコの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２１１】
攻撃後、ネコは４２日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡を記録した。８／１０（８０％）のワクチン接種を受けていない対照ネコが死亡するか、または狂犬病の徴候を示し、このことは、これが妥当な攻撃試験であったことを示す。対照的に、３つの群において、すべてのワクチン接種を受けたネコ（１０／１０、１００％）が健康なまｍであった。狂犬病感染による８匹のネコの死亡は、１２ＤＰＣから２５ＤＰＣの間に起こることがわかった。ワクチン接種を受けたものと対照群の間の死亡率には有意差があった。ワクチン有効性は、３つのワクチン接種を受けた群すべてについて１００％であった。
【０２１２】
この用量漸増研究から、生存アライグマポックスウイルスベクターを用いる新規狂犬病ワクチン（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２）は、ネコにおける、単回ワクチン接種後少なくとも３ヶ月間の狂犬病の予防において、用量あたり４．４２Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬほどの低い力価であっても有効であると結論付けられる。
【０２１３】
実施例８：イヌにおけるｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の用量漸増研究
この研究の目的は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンの短期間（３ヶ月）の有効性を実証することであった。
【０２１４】
ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の用量漸増研究は、４０匹のイヌで実施した。試験ワクチンは、生存ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２および１×ＭＥＭからなり、アジュバントは含んでいなかった。この研究では、４群（各群につき、１２週齢の１０匹のイヌ）：群１〜３中のイヌには、それぞれ、６．５、５．５および４．５Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬのｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の単回用量（１ｍＬ／用量）を皮下に投与したが（ＳＱ）、群４（対照）のイヌには、ワクチン接種を行わなかった。イヌはワクチン接種時に１２週齢であった。ワクチン接種の３ヶ月後、狂犬病ＮＹＣ  ｓｔｒｅｅｔ株を用いてイヌを攻撃した。攻撃の４２日後、群１では０％（０／１０）群２では、１０％（１／１０）および群３では３０％（３／１０）のイヌが死亡したが、対照イヌの１００％（１０／１０）が狂犬病感染のために死亡した。群１の１００％（１０／１０）イヌが感染から保護された優れた結果は、本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、イヌが６．５Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの有効免役量でワクチン接種を受けた場合に、狂犬病攻撃に対する完全な保護を誘発し、うまく達成したことを示す。５．５Ｌｏｇｓ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの有効量でワクチン接種を受けたイヌの９０％（９／１０）が、感染から保護されたことを実証する群２もまた、満足のいく結果であった。この研究は、標準用量漸増技術によって、生存狂犬病ワクチンの承認のための米国政府の必要条件（９Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１１３．３１２）を満たす、満足のいく結果を有する本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物の有効免疫量または投与量を確立できることを示す。
【０２１５】
この用量漸増研究では、４群があった：３つのワクチン接種群のイヌ（ｎ＝３×１０）には、それぞれ、３種の異なる力価（６．５０、５．３９および４．４２  Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ／用量）を有する単回用量の狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２）を、１２週齢で投与し、対照群のイヌ（ｎ＝１０）には、ワクチン接種を行わなかった。ワクチン接種後２８、６４および９１日に、すべてのイヌを出血させ、個々の血清サンプルを狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたイヌの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないイヌは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２１６】
ワクチン接種の３ヶ月より後に（９８ＤＰＶで）、すべてのイヌ（３０匹のワクチン接種および１０匹の対照）を、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ＮＹＣ株（キツネにおけるＮＹＣ株）の１：１０−５直接希釈物を用いて攻撃した。手短には、動物を接種前に鎮静化し、次いで、各０．５ｍＬの咀嚼筋への希釈した攻撃（合計１．０ｍＬ）を用いて筋肉内に接種した。すべての攻撃されたイヌを、４２日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。攻撃結果は、１０／１０（１００％）の対照が狂犬病のために死亡したが、それぞれ、６．５０、５．３９および４．４２Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ／用量の用量でワクチン接種を受けたイヌの１０／１０（１００％）、９／１０（９０％）および７／１０（７０％）が４２日間健康なままであったことを実証した。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。ワクチン有効性は、それぞれ、１００％（Ｖ１）、９０％（Ｖ２）および７０％（Ｖ３）であった。
【０２１７】
要約すれば、この用量漸増研究から得られた結果は、生存ＲＣＮＶを用いる新規狂犬病ワクチンは、イヌにおける、単回ワクチン接種後少なくとも３ヶ月間の狂犬病の予防において補助として、５．３９Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）ほどの低い力価であっても有効であることを実証した。
【０２１８】
致死的攻撃用量は、この研究における対照ネコの死亡率によって条件が満たされるものと決定した。攻撃結果は、１０／１０（１００％）の対照が狂犬病のために死亡したことを示した。これは明らかに妥当な攻撃試験であった。
【０２１９】
血清サンプルを採取した。各イヌから８ｍＬの全血を、ワクチン接種後０日（ＤＰＶ）、２８ＤＰＶ、６３および９１ＤＰＶに血清のために採取した。血清サンプルは、迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）、ＮＶＳＬ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ））によって公開された組織培養蛍光抗体手順によって試験して、狂犬病ウイルスに対する血清中和（ＳＮ）力価を調べた。
【０２２０】
この研究に用いたｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンは、ベロ細胞で５つの複製で力価測定した。試験ワクチンの平均力価は、それぞれ、６．５０（Ｖ１）、５．３９（Ｖ２）および４．４２（Ｖ３）Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）であった。
【０２２１】
ワクチン接種の２８、６３および９１日後に、すべてのイヌを出血させ、個々の血清サンプルを、ＲＦＦＩＴによって狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたイヌの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないイヌは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２２２】
攻撃後観察：攻撃後、イヌは４２日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡を記録した。１０／１０（１００％）のワクチン接種を受けていない対照イヌが死亡するか、狂犬病の徴候を示し、これが妥当な攻撃試験であったことを示す。対照的に、それぞれ、６．５０、５．３９および４．４２Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ／用量でワクチン接種を受けたイヌの１０／１０（１００％）、９／１０（９０％）および７／１０（７０％）が４２日間健康なままであった。興味深いことに、狂犬病感染による１４匹のイヌの死亡は、１３ＤＰＣから２５ＤＰＣの間に起こることがわかった。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。ワクチン有効性は、それぞれ、１００％（Ｖ１）、９０％（Ｖ２）および７０％（Ｖ３）であった。
【０２２３】
この用量漸増研究から、生存アライグマポックスウイルスベクターを用いる狂犬病ワクチン（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２）は、イヌにおける、単回ワクチン接種後少なくとも３ヶ月間の狂犬病の予防において補助として、５．３９Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬほどの低い力価であっても有効であると結論付けられる。
【０２２４】
実施例９：ネコにおける、狂犬病ワクチン（低用量および常用量）、生存アライグマポックスウイルスベクターの１年の免役継続期間研究
ネコにおいてワクチン製剤を使用するための防御用量を調べるために、２つの、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンの１年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究を実施し、病原性狂犬病ウイルス攻撃によって有効性が実証された。これらの研究の目的は、２つの異なる用量、５．３８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの低用量および６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの常用量の狂犬病ウイルスワクチンを用いた単回ワクチン接種後、１年の期間後、ネコにおいてアジュバント不含組換え狂犬病ワクチンの有効性および免疫原性を調べることであった。
【０２２５】
Ａ．低用量研究概要
手短には、この１年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究では、２群があった：ワクチン接種群のネコ（ｎ＝２８）には、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ＶＳコード１９０１．Ｒ５）の単回用量を、１２週齢で投与し、対照群のネコ（ｎ＝１３）には、ワクチン接種を行わなかった。ワクチン接種後２８、９１、１８３、２７２および３６５日に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種の１年より後に（４２１日目）、狂犬病攻撃のために３５匹のネコ（２５匹のワクチン接種されたものおよび１０匹の対照）を無作為に選択した。攻撃材料は、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ＮＹＣ株ロット９２−５の１：４０直接希釈によって調製した。すべての攻撃されたネコを、９０日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。死亡した、または安楽死させたネコの脳を各々、蛍光抗体（ＦＡ）試験によって狂犬病について調べた。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、この研究におけるワクチン接種、攻撃材料調製および攻撃のすべての手順を観察した。
【０２２６】
狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターは、５つの複製で力価測定し、「低」用量と呼ばれる、５．３８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の平均力価を有していた。ワクチン接種を受けたネコでは相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２２７】
攻撃結果は、８／１０（８０％）のワクチン接種を受けていない対照が狂犬病によって死亡したが、ワクチン接種を受けたネコの３／２５すなわち１２％しか狂犬病によって死亡せず、２２／２５（８８％）のワクチン接種を受けたものは９０日間健康なままであったことを実証した。９匹の死亡した対照ネコの脳は、ＦＡ試験によって狂犬病ウイルスについて陽性と確認された。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。狂犬病の予防のためのワクチン有効性は、８５％（９５％ＣＩ５５，９７）であった。これは、狂犬病ワクチン有効性のための法的要件（タイトル９、連邦およびＥＰの規則集）を満たす満足のいく試験である。
【０２２８】
低用量研究のためのプロトコール
この研究のプロトコールを以下にさらに詳細に記載する：
ワクチン接種時には、２８匹の試験動物および１３匹の対照動物があった。攻撃のために３５匹のこれらのネコ（２５匹のワクチン接種されたものおよび１０匹の対照）を無作為に選択した。ネコは、ワクチン接種時に１２週齢であった。この研究のための凍結乾燥したｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンは、２〜７℃で保存した。凍結乾燥ワクチンは、生存ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２およびＳＧＧＫ安定化剤からなっていた。試験組換え狂犬病ワクチンは、アジュバント不含であった。試験ワクチンは、５つの複製アッセイで力価測定し、この研究においてネコに投与される用量を定めた。ワクチンの平均力価は、５．３８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）であった。
【０２２９】
ワクチン接種時には、４１実験単位（２８のワクチン接種されたものおよび１３の対照）があった。攻撃のために、これらのネコのうち３５匹（２５匹のワクチン接種されたもの、および１０匹の対照）を無作為に選択した。同腹の子に従って、動物を、ワクチン接種されるものおよび対照に無作為化した。無作為化プロセスは、マイクロソフトエクセルを用いた各同腹仔の動物への乱数割り当てによって完了した。各同腹仔中の乱数を、その同腹仔から各群への動物の配置について昇順に分けた。このプロセスを、すべての同腹仔からの動物が無作為化されるまで反復した。
【０２３０】
本研究は、無作為化完備ブロック計画であった。４１匹のネコを、以下のように無作為に２群に分けた：
【０２３１】
【表８】
0005653751.tif 000012
ワクチン接種プロトコール
凍結乾燥ワクチンを、１．０ｍＬの供給された滅菌水希釈剤によって再水和した。ワクチン接種経路は皮下とした。ワクチン接種群中の各動物には、１回用量（１ｍＬ／用量）のワクチンを襟首に投与した。対照動物には、ワクチン接種を行わなかった。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、ワクチン接種の全手順を観察した。長期の研究機関のために、Ｆｅｌ−Ｏ−Ｖａｘ  ＰＣＴを用い、ラベルの指示に従って、すべてのネコにワクチン接種した。
【０２３２】
攻撃プロトコール
ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンを用いたワクチン接種の１年より後に（４２１ＤＰＶ）、攻撃のために１０匹の対照および２５匹のワクチン接種されたものを無作為に選択した。無作為化は、マイクロソフトエクセル中の乱数発生器を用いて実施した：ワクチン接種されたものに数を割り当て、分け、ワクチン接種されたものの数が２５に等しくなるまで最大数をつけたネコを攻撃から除外し；類似の手順を用いて、対照の数を１０に減らした。結果として、３匹の対照および２匹のワクチン接種されたものを、攻撃相から無作為に排除した。さらに、１匹の、種々の皮膚疾患を有していたワクチン接種されたものを、攻撃の前にこの研究から排除した。
【０２３３】
３５匹のネコのすべてを、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅウイルス（キツネにおけるＮＹＣ株）の１：４０直接希釈物を用いて攻撃した。手短には、動物を接種前に鎮静化し、次いで、０．５ｍＬの各咀嚼筋への希釈した攻撃（合計１．０ｍＬ）を用いて筋肉内に接種した。動物を、９０日の観察期間の間、狂犬病攻撃領域内の個々のケージに入れ、確保した。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、攻撃ウイルス希釈および狂犬病攻撃の全手順を観察した。
【０２３４】
致死的攻撃用量は、この研究における対照ネコの死亡率によって条件が満たされるものと決定した。攻撃結果は、８／１０（８０％）の対照が狂犬病のために死亡したことを示した。したがって、これは妥当な攻撃試験であった。
【０２３５】
サンプル採取および試験
血清サンプル
血清サンプルを採取した。各ネコから６ｍＬの全血を、ワクチン接種後０日（ＤＰＶ）、２８ＤＰＶ、９１ＤＰＶ、１８３ＤＰＶ、２７２ＤＰＶおよび３６５ＤＰＶに血清のために採取した。
【０２３６】
血清学試験
血清サンプルは、迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）、ＮＶＳＬ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ））によって公開された組織培養蛍光抗体手順によって試験して、狂犬病ウイルスに対する血清中和（ＳＮ）力価を調べた。
【０２３７】
動物の試験
攻撃後観察期間の間、安楽死させた、または死亡しているように見えたすべての動物を、狂犬病ウイルスについて試験した。より詳しくは、脳を採取し（アンモン角）、切片を作製し、加工し、蛍光抗体技術によって染色した。
【０２３８】
結果
ワクチン力価測定
この研究に用いたワクチンは、標準技術によってベロ細胞で５つの複製で力価測定した。試験ワクチンの平均力価は、５．３８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）であった。
【０２３９】
狂犬病に対する中和抗体
ワクチン接種の２８、９１、１８３、２７２および３６５日後に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを、ＲＦＦＩＴによって狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたネコの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２４０】
攻撃後観察
攻撃後、ネコは９０日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡を記録した。８／１０（８０％）のワクチン接種を受けていない対照ネコが死亡するか、または狂犬病の徴候を示さず、これが妥当な攻撃試験であったことを示すことがわかった。対照的に、３／２５（１２％）のワクチン接種を受けたネコしか死亡または狂犬病の徴候を示さなかった。狂犬病感染による１１匹のネコの死亡は、１０ＤＰＣから２０ＤＰＣの間に起こることがわかった。研究の最後に、２２匹のワクチン接種されたものおよび２匹の対照が健康なままであった。ワクチン接種されたものと対照群の間の死亡率には有意差があった。予防できる確率は８５％であった（９５％ＣＩ５５，９７）。
【０２４１】
蛍光抗体試験
上記の安楽死させたネコの脳（８匹の対照および３匹のワクチン接種されたもの）の試験結果は、狂犬病ウイルスについて陽性であり、それによって、これら１１匹のネコの死亡は、狂犬病感染によるものであったことが確認された。
【０２４２】
結論
この１年ＤＯＩ研究から、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターは、ネコの単回ワクチン接種後少なくとも１年間の狂犬病の予防において補助として、５．３８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬほどの低い力価であっても有効であると結論付けられる。
【０２４３】
Ｂ．常用量研究概要
１年の免役継続期間研究を反復した、ただし、組換えワクチンの平均力価は、「標準」用量と呼ばれる、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）であった。凍結乾燥ワクチンは、生存ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２およびＳＧＧＫ安定化剤からなっていた。この組換え狂犬病ワクチンは、アジュバント不含であった。試験ワクチンは、５つの複製アッセイで力価測定し、この研究においてネコに投与される用量を定めた。
【０２４４】
この１年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究では、２群があった：ワクチン接種群のネコ（ｎ＝２８）には、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ＶＳコード１９０１．Ｒ５）の単回用量を、１２週齢で投与し、対照群のネコ（ｎ＝１３）には、ワクチン接種を行わなかった。ワクチン接種後３１、９１、１８２、２７３および３６４日後に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種の１年より後に（３９９日目）、狂犬病攻撃のために３５匹のネコ（２５匹のワクチン接種されたものおよび１０匹の対照）を無作為に選択した。攻撃材料は、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡによって供給された、ロット９２−５の狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ＮＹＣ株の１：４０直接希釈によって調製した。すべての攻撃されたネコを９０日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。死亡した、または安楽死させたネコ各々の脳を、蛍光抗体（ＦＡ）試験によって狂犬病について調べた。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、この研究におけるワクチン接種、攻撃材料調製および攻撃のすべての手順を観察した。
【０２４５】
狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターは、５つの複製で力価測定し、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の平均力価を有していた。すべてのワクチン接種を受けたネコは相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていない対照ネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２４６】
攻撃結果は、９／１０（９０％）対照が狂犬病によって死亡したが、２５／２５（１００％）のワクチン接種を受けたネコは、９０日間健康なままであったことを実証した。９匹の死亡した対照ネコの脳は、ＦＡ試験によって狂犬病ウイルスについて陽性と確認された。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。狂犬病の予防のためのワクチン有効性は、１００％（９５％ＣＩ  ８４，１００）であった。これは、狂犬病ワクチン有効性のための９ＣＦＲおよびＥＰ必要条件を満たす満足のいく試験である。
【０２４７】
要約すれば、この１年のＤＯＩ研究から得られた結果は、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈの狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターは、単回ワクチン接種後少なくとも１年間の狂犬病の予防において、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の力価で有効であることを実証する。
【０２４８】
常用量研究のプロトコール
これは、無作為化完備ブロック計画であった。４１匹のネコを、以下のように無作為に２群に分けた：
【０２４９】
【表９】
0005653751.tif 000013
ワクチン接種プロトコール
凍結乾燥ワクチンを、１．０ｍＬの供給された滅菌水希釈剤によって再水和した。ワクチン接種経路は皮下とした。ワクチン接種群中の各動物には、１回用量（１ｍＬ／用量）のワクチンを襟首に投与した。対照動物には、ワクチン接種を行わなかった。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、ワクチン接種の全手順を観察した。長期の研究機関のために、Ｆｅｌ−Ｏ−Ｖａｘ  ＰＣＴを用い、ラベルの指示に従って、すべてのネコにワクチン接種した。
【０２５０】
攻撃プロトコール
ワクチン接種の１年より後に（３９９日目）、攻撃のために１０匹の対照および２５匹のワクチン接種されたものを無作為に選択した。無作為化は、マイクロソフトエクセル中の乱数発生器を用いて実施した：ワクチン接種されたものに数を割り当て、分け、ワクチン接種されたものの数が２５に等しくなるまで最大数をつけたネコを攻撃から除外し；類似の手順を用いて、対照の数を１０に減らした。結果として、３匹の対照を、攻撃相から無作為に排除し、安全性試験のためにＱＣに移した。３匹のワクチン接種されたものも、攻撃相から無作為に排除し、安楽死させた。
【０２５１】
３５匹のネコのすべてを、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅウイルス（キツネにおけるＮＹＣ株）の１：４０直接希釈物を用いて攻撃した。手短には、動物を接種前に鎮静化し、次いで、０．５ｍＬの各咀嚼筋への希釈した攻撃（合計１．０ｍＬ）を用いて筋肉内に接種した。動物を、９０日の観察期間の間、狂犬病攻撃領域内の個々のケージに入れ、確保した。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、攻撃ウイルス希釈および狂犬病攻撃の全手順を観察した。
【０２５２】
致死的攻撃用量は、この研究における対照ネコの死亡率によって条件が満たされるものと決定した。攻撃結果は、９／１０（９０％）の対照が狂犬病のために死亡したことを示した。したがって、これは妥当な攻撃試験であった。
【０２５３】
結果
ワクチン力価測定
この研究に使用したワクチンは、ベロ細胞で５つの複製で力価測定した。試験ワクチンの平均力価は、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）であった。
【０２５４】
サンプル採取および試験
血清サンプル
６ミリリットルの全血を、ワクチン接種後０日およびワクチン接種後３１、９１、１８２、２７３および３６４日に採取した。
【０２５５】
血清学試験
ワクチン接種後３１、９１、１８２、２７３および３６４日に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを、ＲＦＦＩＴによって狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたネコの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２５６】
攻撃後観察
攻撃後、ネコは９０日間観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡を記録した。９／１０（９０％）のワクチン接種を受けていない対照ネコが死亡するか、狂犬病の徴候を示し、これが妥当な攻撃試験であったことを示す。対照的に、ワクチン接種を受けたネコのうち死亡または狂犬病の徴候を示したものはなかった（０／２５、０％）。狂犬病感染による９匹のネコの死亡は、１０ＤＰＣから１５ＤＰＣの間に起こることがわかった。研究の最後に、２５匹のワクチン接種されたものすべておよび１匹の対照が健康なままであった。ワクチン接種されたものと対照群の間の死亡率には有意差があった。予防できる確率は１００％であった（９５％ＣＩ８４，１００）。
【０２５７】
蛍光抗体試験
攻撃後観察期間の間に死亡した、および安楽死させたネコを、蛍光抗体試験のためにアイオワ州立大学獣医学部の獣医診断検査所（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に確実に運んだ。９匹の死亡したネコの脳（９匹の対照）は、狂犬病ウイルスについて試験の結果、陽性であった。これらの結果から、９匹のネコの死亡は狂犬病によるものであったことがさらに確認された。
【０２５８】
結論
この１年のＤＯＩ研究の結果から、新規狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物）は、単回ワクチン接種後少なくとも１年間の狂犬病の予防において、ネコにおいて、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価で有効であると結論付けられる。
【０２５９】
実施例１０：イヌにおける、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターの１年免役継続期間研究
イヌにおける狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターの防御用量を決定するために、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンの１年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究を実施し、イヌにおいて病原性狂犬病ウイルス攻撃によって有効性を実証した。この研究の目的は、単回ワクチン接種の１年後の、イヌにおけるアジュバント不含組換え狂犬病ワクチンの有効性を実証することであった。
【０２６０】
手短には、この１年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究では、２群があった：ワクチン接種群のイヌ（ｎ＝２８）には、単回用量の狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ＶＳコード１９０１．Ｒ５）を、１２週齢で投与し、対照群のイヌ（ｎ＝１３）には、ワクチン接種を行わなかった。ワクチン接種後２８、９１、１８２、２７３および３６５日に、すべてのイヌを出血させ、個々の血清サンプルを狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種の１年より後に（４２０日目）、狂犬病攻撃のために３５匹のイヌ（２５匹のワクチン接種されたものおよび１０匹の対照）を無作為に選択した。攻撃材料は、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ＮＹＣ株ロット９２−５の１０−４直接希釈によって調製した。すべての攻撃されたイヌを、９０日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。死亡した、または安楽死させたイヌ各々の脳を、蛍光抗体（ＦＡ）試験によって狂犬病について調べた。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、この研究におけるワクチン接種、攻撃材料調製および攻撃のすべての手順を観察した。
【０２６１】
狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターは、５つの複製で力価測定し、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の平均力価を有していた。ワクチン接種を受けたイヌの大部分で相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないイヌは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２６２】
攻撃結果は、９／１０（９０％）の対照が狂犬病によって死亡したが、２２／２５（８８％）のワクチン接種を受けたものは９０日間健康なままであったことを実証した。９匹の死亡した対照および３匹のワクチン接種を受けたイヌの脳は、ＦＡ試験によって狂犬病ウイルスについて陽性と確認された。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。狂犬病の予防のためのワクチン有効性は、８７％（９５％ＣＩ６２，９７）であった。これは、狂犬病ワクチン有効性のための法的要件（タイトル９、連邦規則集）を満たす満足のいく試験である。
【０２６３】
具体的に言えば、、ワクチン接種時に２８匹の試験動物および１３匹の対照動物があった。これらのイヌのうち３５匹（２５匹のワクチン接種されたもの、および１０匹の対照）を、攻撃のために無作為に選択した。イヌはワクチン接種時に１２週齢であった。この研究に使用された凍結乾燥ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ワクチンは、２〜７℃で保存し、生存ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２およびＳＧＧＫ安定化剤からなっていた。この組換え狂犬病ワクチンは、アジュバント不含であった。試験ワクチンは、５つの複製アッセイで力価測定し、この研究においてイヌに投与される用量を定めた。ワクチンの平均力価は、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）であった。
【０２６４】
対照群においてプラセボは用いなかった。プラセボがないので、特定の観察バイアスは取り込まれなかった。結果は、ワクチン接種日後丸１年を超えて盲検化した観察者によって判断され、その時点では、プラセボがないことの一時的効果の可能性はとうに終わっている。
【０２６５】
ワクチン接種時には、４１実験単位（２８のワクチン接種されたものおよび１３の対照）があった。攻撃のために、これらのイヌのうち３５匹（２５匹のワクチン接種されたもの、および１０匹の対照）を無作為に選択した。同腹の子に従って、動物を、ワクチン接種されるものおよび対照に無作為化した。無作為化プロセスは、マイクロソフトエクセルを用いた各同腹仔の動物への乱数割り当てによって完了した。各同腹仔中の乱数を、その同腹仔から各群への動物の配置について昇順に分けた。このプロセスを、すべての同腹仔からの動物が無作為化されるまで反復した。
【０２６６】
この研究は、ワクチン接種されたものおよび対照が、群を越える脱落の可能性を防ぐために別個に飼育されるので、最初の３週間は盲検化されなかった。群を超えるワクチンキャリーオーバーがないことを確実にするために、群は、動物管理スタッフに知られなくてはならなかった。ワクチン接種の３週間後、動物を再度無作為化し、研究の残りを盲検化した。
【０２６７】
本研究は、無作為化完備ブロック計画であった。４１匹のイヌを、以下のように無作為に２群に分けた：
【０２６８】
【表１０−１】
0005653751.tif 000014
【０２６９】
【表１０−２】
0005653751.tif 000015
ワクチン接種
凍結乾燥ワクチンを、１．０ｍＬの供給された滅菌水希釈剤によって再水和した。ワクチン接種経路は皮下とした。ワクチン接種群中の各動物には、１用量（１ｍＬ／用量）のワクチンを襟首に投与した。対照動物には、ワクチン接種を行わなかった。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、ワクチン接種の全手順を観察した。
【０２７０】
攻撃
ワクチン接種の１年より後に（４２０日）、攻撃のために１０匹の対照および２５匹のワクチン接種されたものを選択した。４匹のイヌ（２匹のワクチン接種されたものおよび２匹の対照）を再発性耳感染のために排除した。２匹のイヌ（１匹のワクチン接種されたものおよび１匹の対照）を無作為に排除した。無作為化は、マイクロソフトエクセル中の乱数発生器を用いて実施した：ワクチン接種されたものに数を割り当て、分け、ワクチン接種されたものの数が２５に等しくなるまで最大数をつけたイヌを攻撃から除外し；類似の手順を用いて、対照の数を１０に減らした。結果として、１匹の対照および１匹のワクチン接種されたものを、攻撃相から無作為に排除した。
【０２７１】
３５匹のイヌのすべてを、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅウイルス（キツネにおけるＮＹＣ株）の１０−４直接希釈物を用いて攻撃した。手短には、動物を接種前に鎮静化し、次いで、０．５ｍＬの各咀嚼筋への希釈した攻撃（合計１．０ｍＬ）を用いて筋肉内に接種した。動物を、９０日の観察期間の間、狂犬病攻撃領域内の個々のケージに入れ、確保した。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、攻撃ウイルス希釈および狂犬病攻撃の全手順を観察した。
【０２７２】
致死的攻撃用量は、この研究における対照イヌの死亡率によって条件が満たされるものと決定した。攻撃結果は、９／１０（９０％）の対照が狂犬病のために死亡したことを示した。したがって、これは妥当な攻撃試験であった。
【０２７３】
攻撃前２日間、３５匹の健康なイヌにおいて異常な徴候は観察されなかった。血清サンプルを採取した。各イヌから６ｍＬの全血を、ワクチン接種後０日（ＤＰＶ）、２８ＤＰＶ、９１ＤＰＶおよび１８２ＤＰＶ、２７３ＤＰＶおよび３６５ＤＰＶに血清のために採取した。血清サンプルは、迅速蛍光フォーカス抑制試験（ＲＦＦＩＴ）、ＮＶＳＬ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ））によって公開された組織培養蛍光抗体手順によって試験して、狂犬病ウイルスに対する血清中和（ＳＮ）力価を調べた。
【０２７４】
この研究に用いたワクチンは、標準手順によってベロ細胞で５つの複製で力価測定した。試験ワクチンの平均力価は、それぞれ、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）であった。
【０２７５】
ワクチン接種の２８、９１、１８２、２７３および３６５日後に、すべてのイヌを出血させ、個々の血清サンプルを、ＲＦＦＩＴによって狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたイヌの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないイヌは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０２７６】
攻撃後、イヌは９０日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡を記録した。９／１０（９０％）のワクチン接種を受けていない対照のイヌは死亡するか、または狂犬病の徴候を示し、これが妥当な攻撃試験であったことを示す。対照的に、３／２５（１２％）のワクチン接種を受けたイヌが、死亡または狂犬病の徴候を示した。狂犬病感染によるイヌの死亡は、１１ＤＰＣから１７ＤＰＣの間に起こることがわかった。研究の最後に、２２匹のワクチン接種されたものおよび１匹の対照が健康なままであった。ワクチン接種されたものと対照群の間の死亡率には有意差があった。予防できる確率は８７％であった（９５％ＣＩ６２，９７）。
【０２７７】
攻撃後観察期間の間に死亡した、および安楽死させたイヌを、蛍光抗体試験のためにアイオワ州立大学獣医学部の獣医診断検査所（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に確実に運んだ。１２匹の死亡したイヌの脳（９匹の対照および３匹のワクチン接種されたもの）は、狂犬病ウイルスについて試験の結果、陽性であった。これらの結果から、１３匹のイヌの死亡は狂犬病によるものであったことがさらに確認された。
【０２７８】
結論
この１年のＤＯＩ研究の結果から、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２構築物）は、イヌの単回ワクチン接種後少なくとも１年間の狂犬病の予防において、ネコにおいて補助として、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価で有効であると結論付けられる。
【０２７９】
実施例１１：ネコにおける、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターの毒性への復帰研究
この研究の目的は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２が、ネコにおける戻し継代の際に病原性へ復帰できるかどうかを調べることおよびウイルス排出およびネコの間でのウイルスの蔓延の可能性を調べることであった。
【０２８０】
それぞれ、チミジンキナーゼおよび血球凝集遺伝子座でＣｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｖｉｒｕｓ  ＳｔａｎｄａｒｄおよびＰａｓｔｅｕｒ−Ｐａｒｉｓ株の狂犬病糖タンパク質を発現する生存組換えアライグマポックスウイルス（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２）の毒性への復帰を、この研究で評価した。８周齢の全部で３５匹の健康なネコで最初の継代および確認的戻し継代を実施した。３５匹のネコすべてが、接種の時点でアライグマポックスウイルスについて血清学的に陰性であった。
【０２８１】
最初の継代は、全部で１５匹のネコを用いて実施した：１０匹の１．０ｍＬの用量の７．４１Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を用いて経口的に接種されたネコおよび５匹の接種を行っていない接触対照としてのネコ。口腔スワブおよび５種の無作為糞便サンプルを、接種後−２日〜１５日後（ＤＰＩ）まで毎日採取した。１５ＤＰＩに、組織サンプル採取のために、すべてのネコを剖検した。肉眼的病変は観察されず、口腔スワブ、糞便および組織サンプルのいずれからもウイルスは単離されなかった。
【０２８２】
正確性を確保するために、２０匹のネコ：１０匹の、１．０ｍＬ用量の、最初の継代においてと同じウイルス（７．５７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を用いて経口的に接種されたネコおよび１０匹の、１．０ｍＬ用量の、最初の継代から採取されたプールされた組織ホモジネートを用いて経口的に接種されたネコにおいて確認的戻し継代を実施した。口腔スワブおよび５種の無作為糞便サンプルを，−２〜２１ＤＰＩの間毎日採取した。２１ＤＰＩでは、組織サンプル採取のためにすべてのネコを剖検した。最初の継代におけるのと同様、肉眼的病変は観察されず、採取したサンプルのいずれからもウイルスは単離できなかった。
【０２８３】
両継代において、すべてのネコを、直腸温、アライグマポックスウイルスの感染と関連している臨床徴候および研究機関の間の任意のその他の局所または全身反応または相当な直腸温上昇について毎日モニターした。
【０２８４】
要約すれば、この研究から得た結果気化は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、ネコを通過する場合に、毒性へ復帰することおよび／または体液もしくは糞便中に播種することはできないことを実証した。さらに、試験したネコのうち臨床徴候を発症したものはなかった。これらの結果は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、ネコにおいて非複製的であり、非病原性であることをさらに示唆する。
【０２８５】
ウイルス排出は、高レベルの生存ＲＣＮＶを用いた接種後に実証されず、これから、ＲＣＮＶは、ネコにおいて非複製的であり、非病原性であることが確認された。
【０２８６】
具体的には、合計３５匹の健康なネコをこの研究に用いた。最初の継代では１０匹の接種したネコおよび５匹の未処理（対照）ネコを使用した。確認用継代では、２０匹のネコを使用し、そのうち１０匹が、最初の継代から得られたプールされた組織ホモジネートを用いて播種され、１０匹は、最初の継代と同じウイルスを用いて播種された。
【０２８７】
ネコは、両継代において、接種時にほぼ８週齢であった。標的集団は健康なネコであった。その免疫機能に関しては、この研究のために選択された動物はネコを代表するように思われた。すべてのネコが、試験の結果、ＲＣＮＶに対して陰性であった（ＳＮ力価＜２）。
【０２８８】
最初の継代は、１５匹のネコ、１０匹の、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ｘ＋３を接種されたものおよび５匹の未処理接触対照からなっていた。確認的戻し継代は、２０匹のネコを含んでいた。１０匹のネコは、最初の継代殻得られたプールした組織ホモジネートを接種し、１０匹のネコは、最初の継代と同じウイルス（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ｘ＋３）を用いて播種した。
【０２８９】
最初の接種および確認的戻し継代に使用したネコは、同腹仔によって適当な群に無作為化した。無作為化は、マイクロソフトエクセルを用いて各同腹仔の動物へ乱数を割り当てることによって完了した。乱数を昇順に分け、各同腹仔の動物をそのそれぞれの群に入れた。この研究は、研究の観察、サンプル採取ならびに最初の継代および確認的戻し継代のための試験を実施する科学者には盲検化した。
【０２９０】
最初の継代
１０匹の接種したネコは、５匹の未処理（接触）対照ネコとまとめて飼育し、ワクチンウイルスの、動物対動物の接触によって蔓延する能力を評価した。口腔スワブおよび糞便サンプルを、接種後−２〜１５日（ＤＰＩ）まで毎日採取した。直腸温および全身の健康および臨床徴候の観察を、−２〜１５ＤＰＩまで毎日モニターした。
【０２９１】
１５ＤＰＩに、１０匹の接種されたものおよび５匹の接触対照ネコを安楽死させ、剖検した。ウイルス単離のために、組織サンプル（頸部リンパ節、肝臓、脾臓および扁桃腺）を無菌的に採取した。
【０２９２】
確認的戻し継代
最初の継代では、口腔スワブ、糞便サンプルまたは組織サンプルからウイルスが単離されなかったので、２０匹のネコを用いて確認的戻し継代を実施した。１０匹のネコに、プールした組織ホモジネートを接種し、１０匹のネコに最初の接種におけるようなウイルスを接種した。これらのネコは、−２ＤＰＩ〜２１ＤＰＩまで観察した。２１ＤＰＩに、これらのネコを安楽死させ、剖検した。
【０２９３】
接種
接触対照（接種なし）を除くすべてのネコに、最初および確認的戻し継代の両方において１．０ｍＬの投与容量を用いて経口的に投与した。
【０２９４】
観察および手順
直腸温、および咳、くしゃみ、鼻汁および眼漏、舌炎および口内炎などの臨床徴候を、最初の継代については、−２〜１５ＤＰＩまで、確認的戻し継代については、−２〜２１ＤＰＩまで毎日モニターした。剖検後、血清サンプル、口腔スワブ、糞便サンプルおよび組織サンプルを採取し、分析した。
【０２９５】
ＲＣＮＶに対する抗体を、一定ウイルス（５０〜３００ＴＣＩＤ５０）変動血清法を用いる血清中和によって測定した。エンドポイントは、ベロ細胞でのＲＣＮＶ感染に特徴的な細胞変性効果（ＣＰＥ）の顕微鏡検査によって読み取った。力価は、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法に従って、ウイルス複製の５０％阻害を引き起こす血清希釈として算出した。
【０２９６】
最初のおよび確認的戻し継代において使用したｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２接種は、２４ウェルプレート中のベロ細胞で力価測定した。
【０２９７】
手短には、０．０５％  ＬＡＨおよびゲンタマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する１×ＭＥＭを用いてｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の連続１０倍希釈物を作製した。ウェルあたり１００μＬの希釈したウイルスを、９０％を超えるコンフルエントの単層に接種した。プレートを、４〜６％ＣＯ２を用い、３６±２℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに、０．０５％  ＬＡＨ、ゲンタマイシン（３０μｇ／ｍＬ）および５％  ＦＢＳを含有する１．０〜１．５ｍＬの１×ＭＥＭを加え、プレートを４〜６％ＣＯ２を用い、３６±２℃で５日間さらにインキュベートした。インキュベーション後、プレートを、典型的なＣＰＥまたはプラークの観察のために染色した。ＴＣＩＤ５０力価は、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を用いて算出した。
【０２９８】
ウイルス単離法の感度を調べるために、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を、プールされた口腔スワブ、組織ホモジネートおよび糞便サンプルで希釈し（スパイクし）、上記の方法によって力価測定した。
【０２９９】
ネコを通過した場合に、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の毒性への復帰がないことを実証するには、以下の基準を満たさなければならない：
ａ）ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を接種されたネコは、臨床疾患の徴候を示さないはずである。咽門炎などの軽度の一時的な臨床異常が、開園生存ウイルスの経口投与のために予測され、接種の正常な反応と考えられるべきである。
【０３００】
ｂ）確認的戻し継代から単離されたｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２には、最初の継代において接種されたウイルスと比較して、表現型及び／または遺伝子型の変化は観察されない。
【０３０１】
ｃ）糞便、口腔および組織サンプルからウイルスが単離されない場合には、ウイルス排出および蔓延がない。
【０３０２】
接種ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ｘ＋３の力価測定は、５つの複製で実施した。最初の継代の平均力価は、７．４１Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり、確認的戻し継代については、７．５７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。これらの力価は、１年の免役継続期間研究においてネコおよびイヌに投与される常用量（６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）よりも約１３〜２０倍高かった。
【０３０３】
ＲＣＮＶに対する抗体を血清中和によって測定し、ネコがＲＣＮＶ抗体について陰性であることを確認した。血清中和アッセイは、両継代において、すべてのネコが、ＲＣＮＶ抗体について接種時に陰性である（ＳＮ＜２）ことを示した。
【０３０４】
すべてのネコの直腸温および臨床徴候を最初の継代および確認的戻し継代においていつものように記録した。対照および接種群両方において、ネコの中には、温度が上昇（１０３．０°Ｆ〜１０３．９°Ｆ）したものがあったが、これは、ネコが観察時、拘束されている間に興奮したためである可能性が最も高い。研究期間の間、異常な徴候は観察されなかった。１５ＤＰＩ（最初の継代）および２１ＤＰＩ（確認的戻し継代）で、すべてのネコを剖検し、肉眼的病変は全く観察されなかった。これらの結果は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、ネコにとって非病原性であることを示した。
【０３０５】
最初の継代および確認的戻し継代のすべての口腔スワブ、糞便および組織サンプルからのウイルス単離は陰性であった。いずれかの継代からもウイルスが全く単離されなかったので、ウイルス力価は算出しなかった。これらの結果は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２はネコにおいて非複製性であることを示した。
【０３０６】
口腔スワブ、糞便および組織サンプルが、ウイルス力価測定に何らかの負の影響を与えているかどうかを調べるために、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ｘ＋３を、希釈剤として上記のサンプルを用いて２連で力価測定し、対照としてＭＥＭ培地と比較した。ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ｘ＋３の平均力価は、それぞれ、７．６（口腔スワブ）、７．０（糞便）、７．０（組織）および７．６Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（ＭＥＭ）であった。これらの結果は、力価測定アッセイに対する口腔スワブ、糞便および組織サンプルの有意な影響を全く示さなかった。感度についての、さらなるスパイク試験は、単離は、試験サンプル中にウイルス粒子がある場合には陽性となることを示した。
【０３０７】
いずれの試験サンプルからもウイルスが単離されなかったので、最初の継代と確認的戻し継代の間のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２表現型および／または遺伝子型の変化の比較は実施しなかった。
【０３０８】
結論
この研究から得られた結果は、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２は、ネコを通過した場合に病原性に復帰できないことを示した。また、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２ウイルスは、排出しない、またはネコの間で播種しないことも実証した。
【０３０９】
実施例１２：イヌにおけるＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｖまたはＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｖ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰ不活化ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２画分の用量設定
手短には、この用量設定研究では、４群があった：３つのワクチン接種群中のイヌ（ｎ＝３×１０）には、単回用量の、それぞれ、６．７もしくは６．４Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの不活化前力価（希釈）を有するＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｖ（ケーキ）／不活化ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２、または６．７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの不活化前力価（希釈）を有するＣｖＫ／ＬＣＩＧＰ／不活化ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２を、１２週齢で投与し、対照群中のイヌ（ｎ＝１０）には、ＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｖ（ケーキ）／水（希釈剤）を用いてワクチン接種した。ワクチン接種の時点で、すべての試験イヌは狂犬病血清陰性であった。
【０３１０】
ワクチン接種の２０週間後（１４０ＤＰＶで）、すべてのイヌ（３０ワクチン接種されたものおよび１０匹の対照）を、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ＮＹＣ株の１：１０−５直接希釈を用いて攻撃した。すべての攻撃されたイヌを、３３日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。攻撃結果は、１０／１０（１００％）の対照が狂犬病のために死亡したが、群１中の９／１０（９０％）のワクチン接種されたもの、群２中の１０／１０（１００％）のワクチン接種されたものおよび群３中の１０／１０（１００％）のワクチン接種されたものは、３３日間、健康なままであったことを示した。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。このワクチン有効性は、それぞれ、９０％（Ｖ１）、１００％（Ｖ２）および１００％（Ｖ３）であった。
【０３１１】
ＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）１０併用製剤（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｗｙｅｔｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪの事業部から市販されている）、イヌジステンパー−アデノウイルス２型−コロナウイルス−パラインフルエンザ−パルボウイルスワクチン、改変生存および死滅ウイルス、レプトスピラバクトリン（ＤＡ２ＰＰｖ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰ）は、ＵＳＤＡが認可したワクチンである。凍結乾燥ＤＡＰＰｖ改変生存画分は、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ２）、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）を含む。希釈剤ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰ画分は、不活化イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）およびレプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）およびレプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ）の外膜タンパク質（ＯＭＣ）からなるレプトスピラバクテリン（Ｌ）を含む。ＤＡ２ＰＰｖケーキは、ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰ希釈剤で再構成し、ＣＤＶ、感染性イヌ肝炎ウイルス（ＩＣＨＶ）、ＣＡＶ２、ＣＰＶ、ＣＰＩ、ＣＣＶ、レプトスピラ・カニコーラ（Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・グリポティフォーサ（Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）およびレプトスピラ・ポモナ（Ｌ．ｐｏｍｏｎａ）によって引き起こされる疾患から保護するための補助として、皮下（ＳＱ）経路によって６週齢以上の子犬に投与する。
【０３１２】
この用量設定研究では、イヌをＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｖ／不活化ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２またはＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｉ／ＣｖＫ／ＬＣＩＧＰ／不活化ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の単回用量でワクチン接種し、ワクチン接種の約５ヶ月後に病原性狂犬病ウイルスを用いて攻撃した。この研究の目的は、（１）組換えウイルス（ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２）が、不活化ワクチンとして免役原性であるかどうかを調べること、（２）ＤＡ２ＰＰｖまたはＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｉと組み合わせた不活化ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２の５ヶ月ＤＯＩを評価することおよび（３）免疫原性のための投与量を最適化することであった。
【０３１３】
３０匹の試験動物および１０匹の対照動物があった。イヌは、ワクチン接種時に１２週であった。
【０３１４】
試験ワクチンの組成物
ワクチン１（Ｖ１）は、凍結乾燥ＤＡ２ＰＰｖケーキおよび希釈剤１からなるものであった。希釈剤１は、不活化ｒＲＣＮＶ狂犬病Ｇ２画分（用量あたり約６．７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の不活化前力価）およびアジュバント（１％  ＥＭＡ（登録商標）３％  ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標））を含んでいた。
【０３１５】
ワクチン２（Ｖ２）は、凍結乾燥ＤＡ２ＰＰｖケーキおよび希釈剤２からなるものであった。希釈剤２は、不活化ｒＲＣＮＶ狂犬病Ｇ２画分（用量あたり約６．４Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０不活化前力価）およびアジュバント（１％  ＥＭＡ（登録商標）および３％  ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標））を含んでいた。
【０３１６】
ワクチン３（Ｖ３）は、凍結乾燥ＤＡＰＰｖケーキおよび希釈剤３からなるものであった。希釈剤３は、不活化ｒＲＣＮＶ狂犬病Ｇ２画分（用量あたり約６．７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０不活化前力価）、不活化イヌコロナウイルス（ＣｖＫ）、レプトスピラバクテリン（ＬＣＩＧＰ−レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）およびレプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ）のＯＭＣ）およびアジュバント（１％  ＥＭＡ（登録商標）および３％  ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標））を含んでいた。
【０３１７】
凍結乾燥ＤＡ２ＰＰｖ画分およびＣｖＫ／ＬＣＩＧＰ希釈剤を、従来の製造方法に従って製造した。不活化ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２画分を、ワクチン調製のためにウイルス培養物を不活化するための標準技術によってＢＥＩ（バイナリーエチレンイミン）によって不活化した。凍結乾燥ＤＡ２ＰＰｖ画分を、ワクチン接種時にそれぞれの希釈剤によって再水和した。この研究では、ＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｖケーキを、１ｍＬの滅菌Ｓｕｐｅｒ  Ｑ水で再構成し、再水和したＤＡ２ＰＰｖをプラセボとして使用した。
【０３１８】
方法
イヌを以下のように無作為に４群に分けた：
【０３１９】
【表１１】
0005653751.tif 000016
ワクチン接種
ワクチン接種経路は皮下（ＳＱ）であった。各動物に１用量（１ｍＬ／用量）のワクチン／プラセボを襟首に投与した。
【０３２０】
攻撃
ワクチン接種の２０週間（約５ヶ月）後、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅウイルス（キツネにおけるＮＹＣ株）の１：１０−５直接希釈物を用いてすべてのイヌを攻撃した。手短には、動物を接種前に鎮静化し、次いで、０．５ｍＬの各咀嚼筋への希釈した攻撃（合計１．０ｍＬ）を用いて筋肉内に接種した。動物を、３３日の観察期間の間、狂犬病攻撃領域内の個々のケージに入れ、確保した。３３日の攻撃後観察期間は、すべての狂犬病動物が攻撃後最初の４週間に死亡した、これまでの狂犬病攻撃結果によって正当であるとした。
【０３２１】
致死的攻撃用量は、この研究における対照イヌの死亡率によって条件が満たされるものと決定した。攻撃結果は、１０／１０（１００％）の対照が狂犬病のために死亡したことを示した。これは、明らかに妥当な攻撃試験であった。
【０３２２】
観察
攻撃前２日間、４０匹の健康なイヌにおいて異常な徴候は観察されなかった。
【０３２３】
攻撃後、攻撃後３３日（ＤＰＣ）まで、狂犬病の徴候を認識するために動物を臨床獣医によって訓練された人材によって毎日モニターした。観察結果は記録し、狂犬病ワクチンの法的要件の通りに類別した。
【０３２４】
攻撃後、イヌは３３日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡を記録した。１０／１０（１００％）の対照のイヌは死亡するか、または狂犬病の徴候を示し、これが妥当な攻撃試験であったことを示す。対照的に、群１、２または３中の９／１０（９０％）、１０／１０（１００％）および１０／１０（１００％）のワクチン接種を受けたものは、それぞれ、３３日間健康なままであった。興味深いことに、狂犬病感染による１１匹のイヌの死亡は、１１ＤＰＣ〜２２ＤＰＣの間に起こることがわかった。ワクチン接種されたものと対照群の間の死亡率には有意差があった。ワクチン有効性は、それぞれ、９０％（Ｖ１）、１００％（Ｖ２）および１００％（Ｖ３）であった。
【０３２５】
結論
この用量漸増研究の結果は、ＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡ２ＰＰｖまたはＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＤＡＰ２Ｐｖ／ＬＣＩＧＰと組み合わせた本発明のｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２画分は、イヌにおける、単回ワクチン接種後少なくとも５ヶ月間の狂犬病の予防において補助として、６．４Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の不活化前力価でさえ有効であると結論付けられる。
【０３２６】
実施例１３：ネコにおける、狂犬病ワクチン（常用量）、生存アライグマポックスウイルスベクターの３年免役継続期間研究
ネコにおけるワクチン製剤の使用のために防御用量を決定するために、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２  ワクチンの３年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究を、実施例９において先に記載したものと同様の材料および方法を用いて実施し、有効性が病原性狂犬病ウイルス攻撃によって実証された。本発明の目的は、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量を用いて単回ワクチン接種した後の３年間後に、ネコにおけるアジュバント不含組換え狂犬病ワクチンの有効性および免疫原性を実証することであった。
【０３２７】
手短には、この１年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究では、２群があった：ワクチン接種を受ける群のネコ（ｎ＝２８）には、単回用量の狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ＶＳコード１９０１．Ｒ５）を、１２週齢で投与し、対照群のネコ（ｎ＝１３）には、ワクチン接種を行わなかった。ワクチン接種後０、２８、９１、１８１、２７３、３６５、５４９、７３０、９１２および１０９５日に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを、先に記載した狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種の３年より後に（１１２８日目）、狂犬病攻撃のために３５匹のネコ（２５匹のワクチン接種されたものおよび１０匹の対照）を無作為に選択した。攻撃材料は、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ＮＹＣ株ロット９２−５の１：２５直接希釈によって調製した。すべての攻撃されたネコを、９０日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。死亡した、または安楽死させたネコ各々の脳を、蛍光抗体（ＦＡ）試験によって狂犬病について調べた。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、この研究におけるワクチン接種、攻撃材料調製および攻撃のすべての手順を観察した。
【０３２８】
狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターは、５つの複製で力価測定し、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の平均力価を有していた。ワクチン接種を受けたネコでは相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０３２９】
攻撃結果は、１０／１０（１００％）の対照が狂犬病によって死亡したが、２１／２５（８４％）のワクチン接種を受けたものは９０日間健康なままであったことを実証した。１０匹の死亡した対照および４匹のワクチン接種を受けたネコの脳は、ＦＡ試験によって狂犬病ウイルスについて陽性と確認された。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。狂犬病の予防のためのワクチン有効性は、８４％（９５％ＣＩ６４，９６）であった。
【０３３０】
実施例１４：ネコにおける、Ｆｅｌ−Ｏ−Ｖａｘ−ＬｖＫ  ＩＶ＋ＣａｌｉＶａｘと組み合わせた、狂犬病ワクチン（常用量）、生存アライグマポックスウイルスベクターの１年の免役継続期間研究
ネコにおいてワクチン製剤を使用するための防御用量を調べるために、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２画分の１年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究を実施し、病原性狂犬病ウイルス攻撃によって有効性が実証された。これらの研究の目的は、１年間後のネコにおけるＦｅｌ−Ｏ−Ｖａｘ−ＬｖＫ  ＩＶ＋ＣａｌｉＶａｘと組み合わせた、ｒＲＣＮＶ−狂犬病Ｇ２画分の有効性および免疫原性を実証することであった。
【０３３１】
手短には、この１年の免役継続期間（ＤＯＩ）研究では、２群があった：ワクチン接種を受ける群のネコ（ｎ＝２８）には、１ｍｌの、Ｆｅｌ−Ｏ−Ｖａｘ  ＬｖＫ  ＩＶ＋ＣａｌｉＶａｘ（希釈剤）と組み合わせた、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター（ケーキ）を、１２週齢で皮下投与し、対照群のネコ（ｎ＝１３）には、１ｍｌのＦｅｌ−Ｏ−Ｖａｘ  ＬｖＫ  ＩＶ＋ＣａｌｉＶａｘ（希釈剤）を皮下投与した。８週齢ですべてのネコに１ｍＬのＦｅｌ−Ｏ−Ｖａｘ  ＬｖＫ  ＩＶ＋ＣａｌｉＶａｘを投与した。ワクチン接種後０、２８、９１、１８２、２７４および３９８日に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを、狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種の１年より後に（４００日目）、狂犬病攻撃のために３５匹のネコ（２５匹のワクチン接種されたものおよび１０匹の対照）を無作為に選択した。攻撃材料は、ＮＶＳＬ−ＢＶＬ、ＵＳＤＡ（米国農業省の国立獣医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）および全豪検査機関協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）（ＮＡＴＡ）品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって供給された、狂犬病ｓｔｒｅｅｔ  ＮＹＣ株ロット９２−５の１：２５直接希釈によって調製した。すべての攻撃されたネコを、９０日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。死亡した、または安楽死させたネコ各々の脳を、蛍光抗体（ＦＡ）試験によって狂犬病について調べた。ＡＰＨＩＳ／ＣＶＢ調査官は現場で、この研究におけるワクチン接種、攻撃材料調製および攻撃のすべての手順を観察した。
【０３３２】
狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターは、５つの複製で力価測定し、６．２８Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（用量あたり）の平均力価を有していた。ワクチン接種を受けたネコでは相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
【０３３３】
攻撃結果は、７／１０（７０％）の対照が狂犬病によって死亡したが、２５／２５（１００％）のワクチン接種を受けたものは９０日間健康なままであったことを実証した。７匹の死亡した対照のネコの脳は、ＦＡ試験によって狂犬病ウイルスについて陽性と確認された。ワクチン接種群と対照群の間の死亡率には有意差があった。狂犬病の予防のためのワクチン有効性は、１００％（９５％ＣＩ８２，１００）であった。
【０３３４】
前述では、例示目的で、制限ではなく、本発明の特定の実施形態の詳細な説明を提供した。この開示内容に基づいて当業者に明らかな、すべてのその他の改変、波及および等価物は、特許請求される本発明の範囲内に含まれる容易とされることは理解されるべきである。
【０３３５】
【表１２】
0005653751.tif 000017
【図１Ａ】
0005653751.tif 000018
【図１Ｂ】
0005653751.tif 000019
【図１Ｃ】
0005653751.tif 000020
【図１Ｄ】
0005653751.tif 000021
【図１Ｅ】
0005653751.tif 000022
【図１Ｆ】
0005653751.tif 000023
【図１Ｇ】
0005653751.tif 000024
【図１Ｈ】
0005653751.tif 000025
【図１Ｉ】
0005653751.tif 000026
【図１Ｊ】
0005653751.tif 000027
【図１Ｋ】
0005653751.tif 000028
【図１Ｌ】
0005653751.tif 000029
【図１Ｍ】
0005653751.tif 000030
【図２Ａ】
0005653751.tif 000031
【図２Ｂ】
0005653751.tif 000032
【図３Ａ】
0005653751.tif 000033
【図３Ｂ】
0005653751.tif 000034
【図４】
0005653751.tif 000035
【図５Ｃ】
0005653751.tif 000036
【図５Ａ】
0005653751.tif 000037
【図５Ｂ】
0005653751.tif 000038
【図６】
0005653751.tif 000039
【図７】
0005653751.tif 000040
【図８】
0005653751.tif 000041
【配列表】
0005653751000001.xml