(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ遺伝子、及びそれらの遺伝子と塩基配列において９０％以上の同一性を有し、且つ各遺伝子と同様の機能を有する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子が欠失又は不活性化されたバチルス属細菌（ｙｆｉＢ−ｙｆｉＸ領域を欠失したゲノム構造を有するバチルス属細菌を除く）に、目的タンパク質の遺伝子を導入した組換え微生物であって、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域が結合されており、当該転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと９０%以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である組換え微生物を用いることを特徴とする、目的タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記バチルス属細菌が枯草菌である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記目的タンパク質が、前記バチルス属細菌から分泌される、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記目的タンパク質が、セルラーゼ又はアミラーゼである、請求項１から３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
ｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ遺伝子、及びそれらの遺伝子と塩基配列において９０％以上の同一性を有し、且つ各遺伝子と同様の機能を有する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子が欠失又は不活性化されたバチルス属細菌（ｙｆｉＢ−ｙｆｉＸ領域を欠失したゲノム構造を有するバチルス属細菌を除く）に、目的タンパク質の遺伝子を導入した組換え微生物であって、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域が結合されており、当該転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと９０%以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え微生物を用いた有用なタンパク質の製造方法、及び当該方法に用いる組換え微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、あるいは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（非特許文献１）、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５（非特許文献２）、コリネバクテリウムＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３２０３２などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
細菌の細胞膜の主要な脂質は、脂肪酸がエステル結合でグリセロール−３−リン酸に結合したグリセロリン脂質である。対数増殖時における枯草菌のリン脂質は、その大部分がフォスファチジルグリセロール（ＰＧ）及びフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、それぞれ全脂質の３９．２％、２４．４％を形成している（非特許文献３）。残りのリン脂質は主にＰＧのエステル化されていないヒドロキシル化末端がリジンのカルボキシル基とエステル結合したリジルフォスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）として存在し（１５．６％）、わずか１．４％だけカルジオリピン（ＣＬ）が存在する。また、グリセロリン脂質以外の脂質ではモノ−、ジ−、トリ−グリコシルジアシルグリセロールを含むグリコリピド（ＧＬ）が約１０．６％存在する。これらの脂質は全てｓｎ−グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）からフォスファチジル酸（ＰＡ）を形成することで、リン脂質の生合成を開始する（図１）。
【０００５】
枯草菌においては、ゲノムシークエンスから得られた推定配列を利用して脂質生合成に関わる遺伝子が同定され、生合成段階の大半が明らかにされている。以下にＰＳ（ホスファチジルセリン）、ＰＥ、ＰＧ、ＣＬ、ＬＰＧ、ＧＬの合成に関与する遺伝子に関して記載する。
【０００６】
ＰＳはｐｓｓＡ  遺伝子によりコードされるＰＳシンターゼによりＣＤＰ−ジアシルグリセロールとセリンが縮合することで合成される（非特許文献４）（図１）。ＰＳは、ｐｓｄ遺伝子によりコードされるＰＳデカルボキシラーゼによってＰＥにすぐさま変換されるため、枯草菌においてマイナー成分である。枯草菌ではｐｓｓＡやｐｓｄの欠失株は生育に全く影響がなく、ＰＳ及びＰＥの生理的役割に関する報告は存在しない。一方、大腸菌ではＰＥの欠失は膜タンパク質であるラクトース透過酵素ＬａｃＹが高次構造を形成できないことから、一部の膜タンパク質の正常な形成に必要であると考えられている（非特許文献５）。
【０００７】
ＰＧはｐｇｓＡ遺伝子によりコードされるフォスファチジルグリセロールリン酸合成酵素により、酸性リン脂質であるＰＧを合成する（図１）。更に、枯草菌は大腸菌ＣＬ合成酵素のホモログとしてｙｗｊＥ遺伝子及びｙｗｎＥ遺伝子を有しており（非特許文献６）、ＰＧ２分子の縮合によりＣＬを合成する。枯草菌におけるＣＬ欠失株、ＣＬ及びＰＧ二重変異株では高浸透圧条件下で細胞の生育が阻害されることから、酸性リン脂質は浸透圧耐性に関与すると考えられている（非特許文献７）。この現象は大腸菌のＣＬ欠失株でも観察されており、また浸透圧関連のトランスポーターＰｒｏＰの局在にＣＬが関わると報告されている（非特許文献８）。また、大腸菌において酸性リン脂質（ＰＧ及びＣＬ）が一部の膜タンパク質を膜に取り込むことで活性化することが知られており、細胞質にあるＳｅｃＡやＦｔｓＹを負電荷により膜に引き寄せ、膜表在タンパク質とすることで活性化を促進することが知られている（非特許文献９；非特許文献１０）。
【０００８】
枯草菌のｕｇｔＰ遺伝子は１，２−ジアシルグリセロールにグルコース残基を付加するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼをコードしている（図１）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験から、本酵素は１，２−ジアシルグリセロールにグルコースを４個まで連続して付加することが可能であることがわかっているが、生体内ではジグリコシルアシルグリセロールが主要な糖脂質である（非特許文献１１）。ｕｇｔＰ欠失株は生育可能であり、野生株と同等の生育速度を示すが、膜脂質の脂肪酸組成が大きく変化することが報告されている（非特許文献６）。
【０００９】
ＬＰＧはｍｐｒＦ遺伝子によりコードされる酵素によりｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡｌｙｓからリジンをＰＧに転移させることで合成される。ＬＰＧはリジンにより正電荷を帯びていることから、カチオン性抗菌ペプチドに対する耐性を細胞に付与していると考えられている（非特許文献１２）。
【００１０】
以上のように膜脂質の各成分について一部その機能が解明され、膜脂質は膜形成や外界に対するバリア機能等に関与する重要な成分であると推察される。しかしながら、枯草菌の膜脂質改変によるタンパク質分泌生産性向上に関する報告は、これまでなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，３９０（６６５７），２４９−２５６，１９９７
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７（５３３１），１４５３−１４６２，１９９７
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００４，１８６，１４７５−１４８３
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９７，１３４８，２１４−２２７
【非特許文献５】ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００２，２１（９），２１０７−２１１６
【非特許文献６】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００８，１９０，７７９７−７８０７
【非特許文献７】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１５２，６０５−６１６
【非特許文献８】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００７，６４，１４５５−１４６５
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０１０，１０７（２２），１００４４−１００４９
【非特許文献１０】ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０００，１９（４），５３１−５４１
【非特許文献１１】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，２９（２），ｐ．４１９−４３０
【非特許文献１２】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００９，１９１，１３１１−１３１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、細胞膜リン脂質を改変した微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み検討した結果、特定の膜脂質の生合成に係る遺伝子を欠失又は不活性化することにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの製造効率が向上することを見出した。
【００１４】
すなわち本発明は、以下の提供に関するものである。
（１）  ｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ遺伝子、及びそれらの遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物に、目的タンパク質の遺伝子を導入した組換え微生物を用いることを特徴とする、目的タンパク質の製造方法。
（２）  前記宿主微生物がグラム陽性細菌である、前記（１）記載の製造方法。
（３）  前記宿主微生物がバチルス属細菌である、前記（２）記載の製造方法。
（４）  前記宿主微生物が枯草菌である、前記（３）記載の製造方法。
（５）  前記目的タンパク質が、前記宿主微生物から分泌される、前記（１）から（４）のいずれか１つに記載の製造方法。
（６）  前記目的タンパク質が、セルラーゼ又はアミラーゼである、前記（１）から（５）のいずれか１つに記載の製造方法。
（７）  ｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ遺伝子、及びそれらの遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物に、目的タンパク質の遺伝子を導入した組換え微生物であって、目的のタンパク質をコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域結合されており、当該転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３ 領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９ の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６ の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと８０%以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片である組換え微生物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組換え微生物及びそれを用いたタンパク質の製造方法により、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を図ることができる。特に本発明の組換え微生物は、目的タンパク質等の細胞外への分泌能力に優れているため、培養上清からの目的タンパク質等の精製を効率的に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】枯草菌における詳細なリン脂質生合成経路を示したものである。
【図２】ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【図３】遺伝子欠失用プラスミドを用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【図４】リン脂質改変株における、酵素の生産性評価（培養開始後３日目における、セルラーゼＳ２３７の生産性）を示したものである。
【図５】リン脂質改変株における、酵素の生産性評価（培養開始後３日目における、アミラーゼＫ３８の生産性）を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の目的タンパク質又はポリペプチドの製造に用いられる組換え微生物は、リシルホスファチジルグリセロール、グリコリピド及びカルジオリピンの遺伝子であるｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化してなるものである。例として、以下に、枯草菌のｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ遺伝子の遺伝子番号を示す。これらは、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）や、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）において公開されている（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／、２００６年１月１８日更新）。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
上述した各遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を有し、好ましくは上述した各遺伝子と同様の、脂質の生合成機能を有する遺伝子は、当該遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失又は不活性化される遺伝子に含まれる。
【００２０】
アミノ酸配列及び塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法  （Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２１】
本発明で使用される組換え微生物を構築するための親微生物としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌や、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌等のグラム陽性細菌が挙げられ、中でもバチルス属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。なお、これらの親微生物は、野生型でも変異を施したものでもよい。
【００２２】
本発明の製造方法に用いる組換え微生物を作製するために、上記親微生物において、ｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ遺伝子、及びそれらの遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる遺伝子が欠失又は不活性化される。具体的には、ｍｐｒＦ遺伝子若しくはそれに相当する遺伝子、ｕｇｔＰ遺伝子若しくはそれに相当する遺伝子、ｙｗｎＥ遺伝子若しくはそれに相当する遺伝子、及びｙｗｊＥ遺伝子若しくはそれに相当する遺伝子のいずれか１つ若しくは２つ以上が欠失又は不活性化される。
【００２３】
更に、上記遺伝子群の欠失又は不活性化に加えて、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性の向上に寄与し得る他の遺伝子群（例えば、ｐｒｓＡ遺伝子等）の発現強化及び機能強化のための改変を組み合わせてもよい。
【００２４】
人為的な遺伝子の欠失又は不活性化は、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、あるいは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができる。好適には、当該遺伝子を物理的に欠失させる。より具体的には、ｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ又はｙｗｊＥ遺伝子、又はそれらの遺伝子に相当する遺伝子（以下、標的遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法、及びランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行って所望の変異を選択する方法が挙げられる。
【００２５】
標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。あるいは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることによって不活性化させることが可能である。
【００２６】
例えば、本発明方法に使用する微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，２６８，１９９０等）、こうした方法を繰り返すことによって、本発明のための微生物を得ることができる。
【００２７】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についても、ランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によって実施可能である。
【００２８】
以下に、具体例として、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）によって調製される欠失用ＤＮＡ断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明における遺伝子欠失又は不活性化方法は下記に限定されるものではない。
【００２９】
欠失用ＤＮＡ断片は、例えば、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約１．０ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約１．０ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図２）。
【００３０】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したＤＮＡ断片を得ることができる（図２）。以上のＰＣＲは、市販のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、成書（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ２５１，１９９３、Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）等に示される通常の条件により行うことができる。
【００３１】
かくして得られた遺伝子欠失用ＤＮＡ断片を、コンピテント法等の定法によって微生物細胞内に導入すると、対応する欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域において、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換された細胞、あるいは標的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が生じ得る（図３）。これを薬剤耐性マーカーによる選択によって分離する。即ち、遺伝子導入した微生物を、上記薬剤を含む寒天培地上で培養し、生育するコロニーを分離した後、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによってゲノム上の標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。
【００３２】
斯くして得られた標的遺伝子が欠失又は不活性化された微生物に、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入して、本発明の組換え微生物を作製する。ＤＮＡ断片の導入は、適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて上記微生物に取り込ませることによって行う。また、当該ＤＮＡ断片に上記微生物のゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、当該微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３３】
本発明の組換え微生物に導入される目的タンパク質又は目的ポリペプチドは、特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられる。産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素としては、機能別に、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれる。好適には、セルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等の転移酵素が挙げられ、より好適には、セルラーゼが挙げられる。
【００３４】
セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９，１９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ、又は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ、あるいは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。
【００３５】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼ、又は配列番号５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼが挙げられる。
【００３６】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３７６）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。
【００３７】
宿主枯草菌に導入される上記異種タンパク質又はポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントの条件でハイブリダイズし且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。またここで言うストリンジェントな条件とは、例えば［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）］に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００３８】
本発明の方法による目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、上記組換え微生物を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、当該目的のタンパク質又はポリペプチドを精製することにより行えばよい。培養に使用される培地の組成及び培養条件については、使用する微生物の種類や目的タンパク質又はポリペプチドの種類等にしたがって、当業者が適宜選択することができる。目的タンパク質又はポリペプチドの精製は、培養終了後の菌体を材料として行っても良いが、本発明の組換え微生物は多量の目的タンパク質又はポリペプチドを細胞外に分泌する能力を有するため、培養終了後に遠心分離又は膜分離等により培養上清を回収し、さらに硫安沈殿、溶媒沈殿、膜濃縮、透析又は各種クロマトグラフィー等の通常の方法によりタンパク質又はポリペプチドを培養上清より採取・精製を行えばよい。
【００３９】
実施例に示すように、ｍｐｒＦ、ｕｇｔＰ、ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ遺伝子、及びそれらの遺伝子に相当する遺伝子のいずれかを欠失している組換え微生物を用いた本発明の方法における目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性は、当該遺伝子を欠失又は不活性化していない微生物を用いた場合と比較して向上した。以下の実施例において、本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【００４０】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法について具体的に説明する。
【００４１】
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μｌ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２．５Ｕ添加して、反応液総量を５０μｌとした。ＰＣＲの反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０回繰り返した後、７２℃で５分間反応させることにより行った。
【００４２】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの３’側に続く領域を示す。
【００４３】
更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）でインターネット公開（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／、２００４年３月１０日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００４４】
枯草菌の形質転換はコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３，１９２５（１９６７））にて行った。すなわち、枯草菌をＳＰＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０２％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２５μＭ塩化マンガン、５０μｇ／ｍｌトリプトファン）において３７℃で、生育度（ＯＤ600）の値が１程度になるまで振とう培養した。振とう培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４０μＭ塩化マンガン、５μｇ／ｍｌトリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ600）の値が０．４程度になるまで振とう培養することで、枯草菌のコンピテントセルを調製した。
【００４５】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μｌに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μｌを添加し、３７℃で１時間振とう培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、１．５％  寒天）に全量を塗沫した。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００４６】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））により行った。組換え微生物によるタンパク質生産の際の培養には、ＬＢ培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ）、２×Ｌ−マルトース培地（２％  トリプトン、１％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、７．５％  マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）を用いた。
【００４７】
実施例１（脂質改変株の構築）
ｍｐｒＦ欠失株の構築：
ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））によって調製したＤＮＡ断片を用いた二重交差法によりｍｐｒＦ欠失株の構築を行なった。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したｍｐｒＦ＋１Ｆ−ＰｔｕａとｍｐｒＦ＋５２１Ｒ−Ｃｍ及びｍｐｒＦ＋１２２１Ｆ−ＣｍとｍｐｒＦ＋１７８７Ｒの各プライマーセットを用いて、配列番号７に示すｍｐｒＦ遺伝子の５’末端側の５２１ｂｐ断片（Ａ）、及び３’末端側の５６７ｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドｐＣ１９４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０（２），８１５（１９８２））のＤＮＡを鋳型とし、ＣｍＦＷ、ＣｍＲＶ（表２）のプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子領域を増幅した（Ｃ）。得られた（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、ｍｐｒＦ＋１Ｆ−ＰｔｕａとｍｐｒＦ＋１７８７Ｒプライマーを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法により、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。調製したＤＮＡ断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌１６８株の形質転換を行い、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってｍｐｒＦが欠失してクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のｍｐｒＦが欠失した菌株を構築し、ΔｍｐｒＦ株と命名した。
【００４８】
ｕｇｔＰ欠失株の構築：
表２に示したｙｐｆＰ−３３７ＦとｙｐｆＰ＋２０１Ｒ及びｙｐｆＰ＋８２７ＦとｙｐｆＰ＋５２９Ｒの各プライマーセットを用いて、配列番号９に示すｕｇｔＰ遺伝子の上流を含む５’末端側の５０４ｂｐ断片（Ａ）、及びｕｇｔＰ遺伝子の下流を含む３’末端側の８２３ｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。得られた断片（Ａ）はＳｐｈＩ及びＳａｌＩ、（Ｂ）はＢａｍＨＩ及びＳｃａＩ処理した。一方、プラスミドｐＤＧ７８０（Ｇｅｎｅ，１６７，３３５，（１９９５））のＳａｌＩ及びＳｍａＩ制限酵素切断点よりカナマイシン耐性遺伝子領域を切り出した（Ｃ）。次に、３断片を（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順になる様に、ｐＵＣ１１９（ＴＡＫＡＲＡ）に（Ａ）はＳｐｈＩ及びＳａｌＩ、（Ｃ）はＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ、（Ｂ）はＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ制限酵素切断点にそれぞれ挿入した。この結果得られた組換えプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで処理して直鎖状ＤＮＡにし、形質転換用の供与体ＤＮＡとした（図２参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法による枯草菌１６８株の形質転換を行い、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってｕｇｔＰ遺伝子が欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域の（Ａ）及び（Ｂ）のＤＮＡ配列についてシーケンスを行った。（Ａ）領域でｕｇｔＰ遺伝子上流−９ｂｐのＴがＣに置換されていたが、ｕｇｔＰ遺伝子の上流ｍｅｔＡ遺伝子及び下流ｃｓｐＤ遺伝子の発現に影響を及ぼさないことを確認した。以上の様にして、枯草菌のｕｇｔＰ遺伝子が欠失した菌株を構築し、ΔｕｇｔＰ株と命名した。
【００４９】
ｐｓｓＡ欠失株の構築：
ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））によって調製したＤＮＡ断片を用いた二重交差法によりｐｓｓＡ欠失株の構築を行なった。配列番号１１に示すｐｓｓＡ遺伝子はｐｓｓＡ−ｙｂｆＭ−ｐｓｄの順でオペロン構造をとっており、またＹｂｆＭのスタートコドンはＰｓｓＡのＣ末端とオーバーラップしている。下流遺伝子のｙｂｆＭ遺伝子及びｐｓｄ遺伝子の転写にできるだけ影響を及ぼさないようにｐｓｓＡ欠失株を構築した。すなわち、ｐｓｓＡ遺伝子の＋１から＋５０１ｂｐ（ｙｂｆＭ遺伝子のＳＤ配列上流まで）をエリスロマイシン耐性遺伝子に置き換え、またエリスロマイシン耐性遺伝子はターミーネーターを含まず、遺伝子配列はｐｓｓＡ遺伝子と同方向になるようにした。以下に具体的な構築方法を記載した。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したｐｓｓＡ−５４５ＦとＰｓｓＡ−１Ｒｅｍ及びＹｂｆＭ−２３ＦｅｍとＹｂｆＭ＋４５７Ｒの各プライマーセットを用いて、ｐｓｓＡ遺伝子の上流の５４５ｂｐ断片（Ａ）、及び３’末端側の４９７ｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドｐＭＵＴＩＮ４（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：３０９７−３１０４（１９９８））のＤＮＡを鋳型とし、Ｅｍ−Ｆ５とＥｍ−Ｒ６（表２）のプライマーセットを用いてエリスロマイシン耐性遺伝子領域を増幅した（Ｃ）。得られた（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、ｐｓｓＡ−５４５ＦとＹｂｆＭ＋４５７Ｒプライマーを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法により、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。調製したＤＮＡ断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌１６８株の形質転換を行い、エリスロマイシン（０．３μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってｐｓｓＡ遺伝子が欠失してエリスロマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域（Ａ）及び（Ｂ）のＤＮＡ配列に変異がないことをシーケンスにて確認した。以上の様にして、枯草菌のｐｓｓＡ遺伝子が欠失した菌株を構築し、ΔｐｓｓＡ株と命名した。
【００５０】
ｐｓｄ欠失株の構築：
ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））によって調製したＤＮＡ断片を用いた二重交差法によりｐｓｄ欠失株の構築を行なった。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したｐｓｓＡ＋５１８ＦとＰｓｄ＋６３Ｒｅｍ及びＰｓｄ＋６４０ＦｅｍとＰｓｄ＋１１４４Ｒの各プライマーセットを用いて、配列番号１３に示すｐｓｄ遺伝子の上流ｙｂｆＭ遺伝子を含む５’末端側の５６７ｂｐ断片（Ａ）、及び下流ｙｂｆＮ遺伝子を含む３’末端側の５０５ｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドｐＭＵＴＩＮ４（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：３０９７−３１０４（１９９８））のＤＮＡを鋳型とし、Ｅｍ−Ｆ５とＥｍ−Ｒ５（表２）のプライマーセットを用いてエリスロマイシン耐性遺伝子領域を増幅した（Ｃ）。得られた（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、ｐｓｓＡ＋５１８ＦとＰｓｄ＋１１４４Ｒプライマーを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法により、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。調製したＤＮＡ断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌１６８株の形質転換を行い、エリスロマイシン（０．３μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってｐｓｄ遺伝子が欠失してエリスロマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域（Ａ）及び（Ｂ）のＤＮＡ配列に変異がないことをシーケンスにて確認した。以上の様にして、枯草菌のｐｓｄ遺伝子が欠失した菌株を構築し、Δｐｓｄ株と命名した。
【００５１】
ｙｗｎＥ欠失株の構築
ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））によって調製したＤＮＡ断片を用いた二重交差法によりｙｗｎＥ欠失株の構築を行なった。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したｙｗｎＥ＋１Ｆ−ＰｔｕａとｙｗｎＥ＋５２２ＲＳｐ及びｙｗｎＥ＋８８９ＦＳｐとｙｗｎＥ＋１４５５Ｒの各プライマーセットを用いて、配列番号１５に示すｙｗｎＥ遺伝子の５’末端側の５２２ｂｐ断片（Ａ）、及び３’末端側の５６７ｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドｐＤＧ１７２７（Ｇｅｎｅ，１６７，３３５，（１９９５））のＥｃｏＲＩ制限酵素切断点よりスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を切り出し、ｐＵＣ１１９（ＴＡＫＡＲＡ）にＥｃｏＲＩ制限酵素切断点に挿入し、ｐＵＣＳｐを構築した。ｐＵＣＳｐのＤＮＡを鋳型とし、ＰＢ−Ｍ１３−２０、ＰＢ−Ｍ１３Ｒｅｖ（表２）のプライマーセットを用いてスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を増幅した（Ｃ）。得られた（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、ｙｗｎＥ＋１Ｆ−ＰｔｕａとｙｗｎＥ＋１４５５Ｒプライマーを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法により、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。調製したＤＮＡ断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌１６８株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってｙｗｎＥが欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のｙｗｎＥが欠失した菌株を構築し、ΔｙｗｎＥ株と命名した。
【００５２】
ｙｗｊＥ欠失株の構築：
ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））によって調製したＤＮＡ断片を用いた二重交差法によりｙｗｊＥ欠失株の構築を行なった。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したｙｗｊＥ−９ＦとｙｗｊＥ＋４９９Ｒｋｍ及びｙｗｊＥ＋６８６ＦｋｍとｙｗｊＥ＋１１８８Ｒの各プライマーセットを用いて、配列番号１７に示すｙｗｊＥ遺伝子の５’末端側の５０８ｂｐ断片（Ａ）、及び３’末端側の５０３ｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドｐＤＧ８７３（Ｇｅｎｅ，１６７，３３５，（１９９５））のＥｃｏＲＩ制限酵素切断点よりカナマイシン耐性遺伝子領域を切り出し、ｐＵＣ１１９（ＴＡＫＡＲＡ）にＥｃｏＲＩ制限酵素切断点に挿入し、ｐＵＣＫｍを構築した。ｐＵＣＫｍのＤＮＡを鋳型とし、ＰＢ−Ｍ１３−２０、ＰＢ−Ｍ１３Ｒｅｖ（表２）のプライマーセットを用いてカナマイシン耐性遺伝子領域を増幅した（Ｃ）。得られた（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、ｙｗｊＥ−９ＦとｙｗｊＥ＋１１８８Ｒプライマーを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法により、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。調製したＤＮＡ断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌１６８株の形質転換を行い、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってｙｗｊＥが欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のｙｗｊＥが欠失した菌株を構築し、ΔｙｗｊＥ株と命名した。
【００５３】
ｙｗｎＥ及びｙｗｊＥ２重欠失株の構築：
既に構築したΔｙｗｎＥ株を親株として、ｙｗｊＥ欠失株構築の際に作製した遺伝子欠失用ＤＮＡ断片を用いて、コンピテントセル形質転換法による形質転換を行った。カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離し、ＰＣＲによってｙｗｊＥが欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のｙｗｎＥ及びｙｗｊＥが欠失した菌株を構築し、ΔｙｗｎＥΔｙｗｊＥ株と命名した。
【００５４】
【表２】
0005828634.tif 000003
【００５５】
実施例２（セルラーゼ生産量評価）
実施例１にて構築したΔｍｐｒＦ株、ΔｕｇｔＰ株、ΔｐｓｓＡ株、Δｐｓｄ株、ΔｙｗｎＥ株、ΔｙｗｊＥ株、ΔｙｗｎＥΔｙｗｊＥ株及び親株である１６８株にアルカリセルラーゼ遺伝子を導入した。具体的には、バチルス属細菌  ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７セルラーゼ（特開２０００−２１００８１号公報参照）（配列番号２）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ；配列番号１の塩基番号１３〜３１２４）を鋳型として、表３に示されるプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｆ及びプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｒのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を構築し、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。
【００５６】
これによって得られた菌株を５ｍＬのＬＢ培地で３０℃において１５時間振とう培養を行い、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２ｘＬ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン、任意の濃度のキシロースを添加）に接種し、３０℃で３日間、振とう培養を行った（この際、測定誤差を算出する目的で培養を３回行っている）。サンプリングは３日目に行い、培養液濁度（ＯＤ600）を測定した。また、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定した。セルラーゼ活性測定については、１／７．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４  和光純薬）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｔｒｉｏｓｉｄｅ（生化学工業）を５０μＬ加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ420）変化により定量した。アルカリセルラーゼの活性値は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕと定義した。結果を表４に示す。表４のセルラーゼ生産量は各株のセルラーゼ生産量を比較対象株である１６８株の生産量に対する相対値で表記した（表４；表の値は平均値±標準偏差（Ｎ＝３）を示す）。
【００５７】
結果として、ΔｍｐｒＦ株、ΔｕｇｔＰ株、ΔｙｗｎＥ株、ΔｙｗｊＥ株、ΔｙｗｎＥΔｙｗｊＥ株株を用いた場合、比較対象である１６８株よりも有意に高いアルカリセルラーゼ生産量を発揮することが明らかとなった（表４）。
【００５８】
【表３】
0005828634.tif 000004
【００５９】
【表４】
0005828634.tif 000005
【００６０】
実施例３（アミラーゼ生産量評価）
実施例１にて構築したΔｍｐｒＦ株及び親株である１６８株にアルカリアミラーゼ遺伝子を導入した。
【００６１】
まず、発現用ＤＮＡの構築に際して、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４６）より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、表５に示されるＫ３８ｍａｔｕ−Ｆ２（ＡＬＡＡ）とＳＰ６４Ｋ３８−Ｒ（ＸｂａＩ）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、アルカリアミラーゼＡｍｙＫ３８（特開２０００−１８４８８２号公報、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６８，２９７４，２００１）をコードする領域を含む１．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片のうち、ＡｍｙＫ３８の成熟配列をコードする領域及びその下流を配列番号５に示す。またバチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、表５に示されるＳ２３７ｐｐｐ−Ｆ２（ＢａｍＨＩ）とＳ２３７ｐｐｐ−Ｒ２（ＡＬＡＡ）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、配列番号１で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む０．６ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。次いで、得られた２断片を混合して鋳型とし、表５に示されるＳ２３７ｐｐｐ−Ｆ２（ＢａｍＨＩ）とＳＰ６４Ｋ３８−Ｒ（ＸｂａＩ）のプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流に成熟型のアルカリアミラーゼをコードする遺伝子が連結した２．１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られた２．２ｋｂのＤＮＡ断片をシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト）のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドｐＨＹＫ３８（Ｓ２３７ｐｓ）を構築した。
【００６２】
【表５】
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【００６３】
更に、構築したプラスミドｐＨＹＫ３８（Ｓ２３７ｐｓ）をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を５ｍＬのＬＢ培地で一夜３７℃において振とう培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地に接種し、３０℃にて３日間振とう培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。
【００６４】
培養上清中のアミラーゼの活性測定にはリキテックＡｍｙ  ＥＰＳ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を使用した。すなわち１％  ＮａＣｌ−１／７．５Ｍ  リン酸緩衝液  （ｐＨ７．４  和光純薬工業）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに、１００μＬのＲ１・Ｒ２混合液（Ｒ１（カップリング酵素）：Ｒ２（アミラーゼ基質）＝５：１（Ｖｏｌ．））を加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４０５ｎｍ）変化により定量した。吸光度変化の直線領域の傾き（ｍＯＤ４０５ｎｍ／ｍｉｎ）に係数２．９２６５を乗じて得られる値をＵ／Ｌとし、アミラーゼ生産性は比活性（４２２１Ｕ／ｍｇ）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，１７４４−１７５０，２００１）より算出した。１Ｕｎｉｔは可溶性デンプンを基質とした場合に１分間で１μＭのグルコースを遊離する酵素量である。結果を表６に示す。表６のアミラーゼ生産量はΔｍｐｒＦ株のアミラーゼ生産量を比較対象株である１６８株の生産量に対する相対値で表記した（表６；表の値は平均値±標準偏差（Ｎ＝３）を示す）。
【００６５】
結果として、ΔｍｐｒＦ株を用いた場合、比較対象である１６８株よりも有意に高いアルカリアミラーゼ生産量を発揮することが明らかとなった（表６）。
【００６６】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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