(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
BTKタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列である配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載されたタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載されたポリヌクレオチドであって、配列番号１に対応する第１のエキソンの配列を有する、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮腫瘍細胞において薬剤耐性を調節、特に減少することができる薬剤の製造のための化合物の使用に関するものであり、請求項１の前段に述べる特徴に従うものである。また、腫瘍細胞における薬剤耐性を測定する方法のみならず、腫瘍幹細胞を同定する方法をも意図する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍病態の治療における最も一般的な戦略の一つにより、同治療におけるアポトーシスの自然なプロセスを誘導するために腫瘍細胞のDNAを損傷することが可能な薬剤（化学療法）の使用が予見される。
【０００３】
しかしながら、腫瘍細胞は、薬物治療に対して予期しない挙動で応答することがあり、それどころか、同治療に対して強い耐性を示すことが知られている。また、腫瘍細胞によって示される薬剤耐性の主な原因の一つは、かなりのDNA損傷の存在下でさえ、細胞がアポトーシスのプロセスを始めるための能力がないことであることも知られている。
【０００４】
この現象は、遺伝子p53の機能の改変（突然変異または欠失）に由来し、これではもはや細胞アポトーシスのプロセスを開始することはできず、従って、細胞を薬物作用に抵抗させてしまう。
【０００５】
腫瘍細胞の薬剤耐性のレベルは非常に高い可能性がある。例えば、進行期の結腸-直腸の腫瘍細胞の場合、５−フルオロウラシル（5FU）に基づく薬物療法は、当該細胞の10-15%にしか効果的な応答を示さず、5FUと新規な薬剤、例えば、イリノテカンやオキサリプラチンなどとの組合せは40-50%までの細胞死の増加を導き、この値は、腫瘍病態に対する効果的な治療作用にとって、依然として全く満足できるものではない。
【０００６】
近年、それによって特異的な様式で遺伝子発現がサイレンス化される、「RNA干渉」（RNAi）と呼ばれる細胞現象が発見された。当該プロセスを利用することによって、未知の機能を持つ遺伝子の選択的なサイレンシングを得ることが可能であり、従って、得られる表現型の研究によって、その特異的な機能の特定が可能になる。RNAi技術を適用し、表現型の結果を研究することにより、既知の遺伝子に対して新しい機能を割り当てることがさらに可能である。
【０００７】
現在、腫瘍細胞の薬剤耐性の現象に関与する遺伝子の大部分は未知である。
【０００８】
従って、薬剤耐性に関与する新規な遺伝子を同定し、薬剤に対する腫瘍細胞の耐性を実質的に減少することのできる方法および化合物を設計する非常に大きな必要性がある。
【０００９】
発明の記載
本発明の基本的な課題は、上皮型の腫瘍細胞の薬剤耐性を減少させることができる化合物を利用可能にすることであり、それにより、関連する腫瘍病態の治療に向かう薬物の製造を可能にすることである。
【００１０】
この課題は、添付の特許請求の範囲で特定される群から選択される１つまたは１つ以上の遺伝子を機能的にブロックすることができる化合物の使用による本知見によって解決される。
【００１１】
第二の側面において、本発明はさらに、上皮腫瘍細胞株の薬剤耐性を測定する方法を提供する。
【００１２】
そのさらなる側面において、本発明はさらに、腫瘍幹細胞を同定する方法を提供する。
【００１３】
本発明の特徴および利点は、それを明確にする図面の参照により報告される試験および結果に従う詳細な説明からより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明に従う化合物および化学療法薬により治療される結腸の薬剤耐性腫瘍細胞コロニー形成能の抑制の結果を示すグラフであり、
【図２ａ】図2aおよび2bは、遺伝子GSK3のアルファおよびベータアイソフォームのサイレンシングによる２つの異なる化学療法薬に対する腫瘍細胞の耐性の回復の分析結果を示すグラフであり、
【図２ｂ】図2aおよび2bは、遺伝子GSK3のアルファおよびベータアイソフォームのサイレンシングによる２つの異なる化学療法薬に対する腫瘍細胞の耐性の回復の分析結果を示すグラフであり、
【図３ａ】図3a−3cは、当該遺伝子GSK3betaのサイレンシングによる３つの異なる結腸の腫瘍細胞株の化学療法薬に対する耐性回復試験の結果を示すグラフであり、
【図３ｂ】図3a−3cは、当該遺伝子GSK3betaのサイレンシングによる３つの異なる結腸の腫瘍細胞株の化学療法薬に対する耐性回復試験の結果を示すグラフであり、
【図３ｃ】図3a−3cは、当該遺伝子GSK3betaのサイレンシングによる３つの異なる結腸の腫瘍細胞株の化学療法薬に対する耐性回復試験の結果を示すグラフであり、
【図４ａ】図4aは、当該遺伝子GSK3betaのサイレンシングによる2つの異なる結腸の腫瘍細胞株の異なる化学療法薬に対する耐性回復試験の結果を示すグラフであり、
【図４ｂ】図4bは、当該遺伝子GSK3のベータアイソフォームのサイレンシングによる2つの異なる化学療法薬の組合せに対する腫瘍細胞株の耐性回復の分析結果を示すグラフであり、
【図５】図5は、GSK3非存在における5FU誘導性の細胞死のためのシトクロームCの位置を示す画像集であり、
【図６】図6は、HCT116、ならびにGSK3alphaおよびGSK3beta遺伝子サイレンス化HCT116p53KO結腸癌細胞の5FU治療に応答するカスパーゼ３およびカスパーゼ７の活性化試験の結果を示すグラフであり、
【図７】図7は、GSK3非存在における5FU誘導性の細胞死の間のAIFの核への転座を示す画像集であり、
【図８】図8は、異なる方法により得られる当該遺伝子BTKの機能的なブロッキングにより行われる、腫瘍細胞株の化学療法薬に対する耐性の回復を示すグラフであり、
【図９】図9は、HCT116結腸癌細胞におけるBTK過剰発現に際して5FUにより誘導される細胞死の割合を示すグラフであり、
【図１０ａ】図10aおよび10bは、異なる上皮腫瘍細胞株についての当該遺伝子BTKの機能的なブロッキングによる、化学療法薬に対する耐性の回復を示すグラフであり、
【図１０ｂ】図10aおよび10bは、異なる上皮腫瘍細胞株についての当該遺伝子BTKの機能的なブロッキングによる、化学療法薬に対する耐性の回復を示すグラフであり、
【図１１】図11は、異なる上皮癌に由来するいくつかの腫瘍性細胞株におけるBTK発現を示すウエスタンブロット分析であり、
【図１２ａ】図12aおよび12bは、結腸以外の上皮腫瘍細胞株についての当該遺伝子BTKの機能的なブロッキングによる、化学療法薬に対する耐性の回復を示すグラフであり、
【図１２ｂ】図12aおよび12bは、結腸以外の上皮腫瘍細胞株についての当該遺伝子BTKの機能的なブロッキングによる、化学療法薬に対する耐性の回復を示すグラフであり、
【図１３】図13は、BTK阻害時の5FU処理細胞におけるシトクロームCの細胞質蓄積を示す画像集であり、
【図１４】図14は、5FU、BTK阻害、または当該２つの組合せにより処理されたHCT116およびHCT116p53KO結腸癌細胞における、72時間および96時間後の蛍光カスパーゼ活性化試験の結果を示すグラフであり、
【図１５ａ】図15aは、抗体sc-1696がBTKタンパク質を特異的に認識すること、上皮癌細胞(HCT116p53KO)においてBTKが見かけの分子量~67kDaを有すること、および同じ形態のタンパク質が白血病細胞(Nalm6)においても「典型的な」77 kDaの型とともに存在することを示すウエスタンブロット画像であり、
【図１５ｂ】図15bは、別の抗体(BL7)もHCT116p53KO細胞におけるBTKタンパク質を~67kDaと同定すること、およびこのアイソフォームは白血病細胞(Nalm6)中で「典型的な」77kDaの型と共に存在することを確認する免疫沈降ウエスタンブロット画像であり、
【図１６】図16は、HCT116p53KO細胞からのBTKコード化mRNA中のヌクレオチド202の5’末端上流がないか、または末梢血単核細胞(PBMC)からのBTK mRNAの5’末端とは異なることを示すPCR実験の結果を示す画像であり、
【図１７】図17は、GeneBank 受託番号NM_000061により同定されるBTK転写物と、クローニングおよびシークエンシングがその後に続くHCT116p53KO細胞における5’RACE PCRにより同定される新規の転写物(代替物として示される)とのClustalWアラインメントの結果を示す画像であり、ボックスは、番号NM_000061に由来するBTK mRNAとHCT116p53KO中に見出される新規のBTK転写物との間に共通するBTK配列の部分(既知の転写物のヌクレオチド131から始まる)の輪郭を描く、
【図１８】図18は、Gen Bank 受託番号NM_000061により同定されるBTK転写物のエキソン1〜5および新規なBTK転写物の同エキソンのBlastアラインメント対ゲノムデータベースの結果を示す画像であり、点は、BTKの異なるエキソンの染色体Ｘ上の位置を示し、
【図１９】図19は、新規なBTK転写物が、ホルマリンで固定しパラフィン包埋した(FFPE)結腸癌患者からの腫瘍性組織において発現されたことを示す、ネステッドPCR実験の結果を示す画像である。
【００１５】
上皮腫瘍細胞における薬剤耐性を調節する遺伝子の同定の方法論および関連する妥当性検査試験
上述の技術的課題は、いくつかの上皮腫瘍細胞株を、興味のある表現型、すなわち、化学療法薬により誘導されるアポトーシスに対する耐性の回復を生じさせることのできる遺伝子を同定し、且つ特徴づけるための一連の試験および分析に供することにより取り組まれた。
【００１６】
当該同定は、RNAiを用いる遺伝子の拡張群の選択的サイレンシングに続く上皮腫瘍細胞の代表的な細胞株の表現型のスクリーニングによって行われた。
【００１７】
この複合体スクリーニング研究は、近年、Barnards Laboratoriesにより作製されたレトロウイルスのpRetroSuper (pRS)ベクターのライブラリーによって可能となった。当該ベクターは、安定な様式で特定のオリゴヌクレオチドを発現できることが知られており、これは低分子干渉RNA、即ち、siRNAとして知られ、対応するタンパク質における特異的なメッセンジャーRNA (mRNA)の翻訳過程をブロックすることができる。即ち、当該機序は、siRNA分子（あるいは、むしろそのフィラメント）がRISC酵素複合体と結合し、それを活性化することを予測するものであり、それにより、後者はそれに結合したsiRNAに相補的なmRNAを認識し、且つ結合し、次に分解することができる。siRNAにより特異的な様式で識別されるmRNAは、対応するアミノ酸鎖に翻訳されず、従って、mRNAが転写された遺伝子のサイレンシングが得られる。当該干渉のプロセスは特異的であり、そのため、siRNA分子が、通常、１つのmRNAだけを分解し、従って単一の遺伝子をサイレンシングすることができる。他方で、その代わりとして、RISCを経由し、異なるsiRNAによって同じmRNAを分解することが可能となる。
【００１８】
この機序は、機能的に遺伝子をブロックするための異なる可能な様式のうちのひとつである（機能的ノックアウト）。しかしながら、結果として生じるRISCによるsiRNAの分解は、タンパク質レベルに対して一過性の効果しか生じず、従って、結果が長期間においては関連し得ない短期間の実験のみ可能とする。この課題を克服するために、ショートヘアピンRNA(shRNAs)、ヘアピン形状に折りたたまれたRNA配列が機能的ノックアウトの機構として用いられた。即ち、ベクターがshRNAを細胞染色体に導入および組み込むために用いられる。DNAの転写物は、続いて、細胞の機構、DICERにより切断されてsiRNAになるshRNAを生成する。次に、当該siRNAが前述した通りに機能する。当該shRNAベクターの細胞染色体への組み込みにより、遺伝子サイレンシングは娘細胞に受け継がれる。従って、shRNAの使用が、長期間の実験に使用することができる機能的ノックアウト細胞を可能にする。
【００１９】
当該文献から、siRNAの形質移入の効率が決して100％にはならないことも知られている。従って、形質移入されるsiRNAの使用は、すべての処理された細胞から標的のタンパク質を首尾よく取り除くことを保証するものではない。選択可能なマーカーの欠如はさらに、均一な細胞集団を扱う上で問題を生じる。選択可能なマーカー、例えばピューロマイシン耐性遺伝子などをレトロウイルスライブラリーとともに用いることにより、shRNAを有する細胞だけを回収することができる。その上、shRNAの発現選択に従い、サイレンシングが通常の細胞の生存および増殖と矛盾しない遺伝子のみが選択される。これらの遺伝子の欠如は、通常の細胞の生理学に影響を与えないが、抗癌剤、これは抗癌治療の開発の間、非常に重要な考慮すべき事項であるが、これに対する応答には影響を与える。
【００２０】
それでもなお、一般的に、遺伝子のタンパク質をコードするプロセスの何れの他の段階、例えばmRNAにおける遺伝子の転写の段階、もしくはmRNAの形質導入の段階などにおいても作用することにより、または当該コードする過程の結果生じるタンパク質の阻害により、同じ効果に達することを特定することは重要である。
【００２１】
当該課題の解決において、本質的かつ重要な手段は、所望の表現型の原因遺伝子の同定により代表される。
【００２２】
Bernards laboratoriesにより整理されたレトロウイルスのライブラリーは約25,000種類の異なる要素から成り、それぞれの遺伝子について約３つの異なるベクターを用いる割合でヒトゲノムの8,300遺伝子をサイレンシングすることができる。
【００２３】
当該試験は、最初にインビトロで行われ、続いてエキソビボで異なる上皮腫瘍細胞株について確認され、p53遺伝子の欠失または変異により特徴付けられ、故に、化学療法薬に対する著しい耐性を備える。
【００２４】
詳細には、ヒトRNAiライブラリー(NKiライブラリー)が確立され、これはサイレンシングのための8,300の標的遺伝子からなる。当該標的遺伝子は、キナーゼ、ホスファターゼ、腫瘍遺伝子、腫瘍抑制因子、転写因子、形質転換、転移、細胞周期、分化、アポトーシス、代謝および同化プロセスに関与する遺伝子を含んでいた。プロトコールは、先行の刊行物（Berns et al. NATURE vol. 428, 25 March 2004）において述べられたものと同様のものに従った。この刊行物の内容は、引用によりこの出願に組み込まれる。それぞれの標的遺伝子のmRNA配列はUniGeneから選択された。当該配列をRepeatMaskerを用いてマスクし、繰り返しの配列を除き、UniVecに対してNCBI BLASTにより検索し、ベクターのコンタミネーションをマスクした。それぞれの標的遺伝子をサイレンシングするための３つの異なる１９ヌクレオチド(19-mer)の配列が、ショートヘアピンRNA (shRNA)を特定する合計約25,000の59-merオリゴヌクレオチドのために設計された。当該19-merの配列は、Bernsの刊行物に記載された選択基準を用いて選択され、a) ４つまたは４つ以上の連続するTまたはA残基のストレッチはなく（これは早発のポリメラーゼIII転写終結シグナルを回避する）、b) 全体のGC含有量は30〜70％であり、c) 標的遺伝子のコード配列内にあり、d) GまたはC残基で始まり（これは、最近確立されたストランドの傾向の法則と矛盾しない）、e) 5’フランキング配列のAAダイマーの後で始まり、f) 3’フランキング配列のTT、TGまたはGTダブレットの直前で終わり、g) その後のベクター骨格に対するノックダウンカセットのシャットリングを促進するXhoIまたはEcoRI制限酵素部位を含まず、h) 他の遺伝子と最小の配列同一性を共有し、i) RefSeq mRNAにより代表される転写変異体のすべてを標的とし、j) 同じ標的配列から選択された他の19-merと重複しない。当該59-merオリゴヌクレオチドは、19-mer配列、その相補的19-mer配列、polIII転写開始部位、polIII終結部位、およびHindIII/Bg/IIクローニング部位を含むよう設計された。当該HindIII/Bg/IIクローニング部位を利用し、当該オリゴヌクレオチドは、pRetroSuper (pRS)レトロウイルスベクターに結紮され、これはピューロマイシン耐性のための選択カセットを含んでいた。同じ遺伝子を標的とした当該３つの異なるベクターからのDNAをプールし、標的細胞に感染させるためにウイルスを作出した。
【００２５】
例１
初めに使用された腫瘍細胞株は、HCT116p53KO（これは、p53遺伝子の欠失のため、野生型wt HCT116とは異なる）であり、結腸腫瘍に関連し、一方、特定の遺伝子のさらなる詳細な研究が、他の薬剤耐性の結腸の腫瘍細胞株、例えば、DLD-1およびSW480だけでなく、他の肺や卵巣の腫瘍細胞などについても行われた。特に、当該分析の目的であるすべての細胞株は上皮型の腫瘍に関連していた。
【００２６】
予備的に、細胞株HCT116p53KO、DLD-1およびSW480を、その薬物誘導性のアポトーシスに対する耐性を確認するため、共通の化学療法薬により処理した。
【００２７】
本発明に従う使用可能な化学療法薬は、罹患した腫瘍細胞におけるアポトーシスのプロセスを誘発するために適したいかなる種類であってもよく、例えば、代謝拮抗物質、またはトポイソメラーゼIのインヒビター、トポイソメラーゼIIのインヒビター、白金配位化合物、およびアルキル化剤を含む、いかなるDNA損傷剤であってもよい。
【００２８】
前述の予備的な試験は、200 μM 5FUにおける72時間の処理の後、95％よりも高いwt HCR116の細胞死亡率に対して、細胞死亡率が10%より低いことを示した。
【００２９】
コロニー形成アッセイ(CFA)の補足的な試験により、さらに、当該薬剤耐性が、非一過性の種類であることが証明された。
【００３０】
一旦、化学療法薬により誘導されたアポトーシスに対する耐性が確認されれば、200×106 HCT116p53KO細胞を、先に同定したBernards laboratoriesにより提供されるpRestroSuperライブラリーに感染させた。このライブラリーのそれぞれのベクターは、有利にピューロマイシン耐性遺伝子のための選択カセットを備えており、そのため、ピューロマイシンによる治療(培地中に2mg/l、2日間)によって、当該ライブラリーのベクターに実際に感染したHCT116p53KO細胞を選択することが可能であった。
【００３１】
その後、抗生物質治療の終わりに、まだ生きている細胞を回収し、それによって、これは、サイレンス化された遺伝子が細胞の生存と矛盾しなかったライブラリーのレトロウイルスに感染したすべての細胞を含んだ。
【００３２】
そのようにして回収された細胞を次に、200 μM 5FUにより72時間処理し、一方、同時にwt HCT116細胞および未感染のHCT116p53KO細胞もまたコントロールとして同じ処理に供した。
【００３３】
当該治療の終わりに、当該細胞の約半分が培地に浮かび、それにより死が判定された。当該細胞は求められている表現型を表すので、それらを回収し、レトロウイルスのライブラリーによりサイレンス化された遺伝子の同定に必要な処理に供した。
【００３４】
要するに、当該処理は、DNAの抽出並びに、特定のプロモーターの領域H1および興味のあるヌクレオチド配列をコードする近隣の領域を含む643塩基対の領域のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)による増幅を含む。PCR増幅は、pRS-fwプライマー：5’-CCCTTGAACCTCCTC GTTCGACC-3’およびpRS-revプライマー：5’-GAGACGTGCTACTTCCATTTGTC-3’を用いて行われた。増幅により得られた産物は次に、pRSレトロウイルスベクター中で結合され、HCT115p53KO細胞の感染プロセスは新規のベクターにより完全に繰り返され、それによりスクリーニングが洗練 (refine)された。当該産物はEcoRI/XhoIにより消化され、pRSに再びクローンされた。
【００３５】
5FUによる新しい処理の後に死細胞から集菌されたDNAについてのPCRによる2回目の増幅処理から得られた産物を新たに単離し、レトロウイルスベクターpRSにおいて結合し、次に、それぞれのプラスミドが重要な表現型の発現を生じさせた遺伝子の同定のためにシークエンスされたDH5アルファバクテリアを変形させるために用いた。
【００３６】
一旦、RNAによる干渉によるサイレンシングが試験された腫瘍細胞の5FUに対する耐性の回復を生じた単一の遺伝子を得て特定すると、当該単一遺伝子の分離かつ独立した妥当性検査を行った。
【００３７】
最初に、妥当性検査をHCT116p53KO腫瘍細胞サンプルについてインビトロで行い、そのそれぞれのサンプルを以前に作製されたプラスミドのうちの一つに別々に感染させたが、これは特異的かつ安定な様式で先行するスクリーニングにより示された遺伝子の一つをサイレンス化し、薬剤に対する耐性を調節する能力を確認するためである。当該サンプルを次にピューロマイシンにより選択し、ペトリ皿に50％の集密で配置し、200 μMの5FUで12時間処理した。
【００３８】
CFAにより規定されるプロトコールに従い、コロニー形成の観察および、wt HCT116サンプルと非感染のHCT116p53KOサンプルとの比較により薬剤耐性の回復の評価を行った。
【００３９】
図１において、結果は、第一のインビトロ妥当性検査により得られたグラフの形式において報告される。グラフにより明らかに示される通り、機能的にブロックされる場合、同定される遺伝子の高い割合が、5FU処理したHCT116p53KO細胞のコロニー形成能を一貫して回復することができる。HCT116およびKOは陽性および陰性のコントロールを示す。
【００４０】
当該第一の妥当性検査は、特に、特異的なサイレンシングがHCT116p53KOサンプルに対して、50％よりも大きい腫瘍コロニーの成長の5FU誘導性の阻害を生じた遺伝子群の特定を可能にした。
【００４１】
これらの遺伝子はそれ自体既知で特徴付けられており、以下に、NCBI Entrez Gene Data bankに報告された識別番号（かっこ内）とともにその公式の記号により示される：
EphA1 (2041), EphA2 (1969), EphA8 (2046), EphB2 (2048), CSF1R (1436), VEGFR2 (3791), RAMP2 (10266), RAMP3 (10268), CLRN1 (7401), MAPK4 (5596), PIK3C2A (5286), PIK3CG (5294), GSK3beta (2932), IRAK3 (11213), DAPK1 (1612), JAK1 (3716), CHEK1 (1111), PIM1 (5292), TRB3 (57761), BTG1 (694), LATS1 (9113), LIMK2 (3985), MYLK (4638), PAK1 (5058), PAK2 (5062), CDC2 (983), BTK (695), PNRC2 (55629), NCOA4 (8031), NR2C1 (7181), TPR (7185), RBBP8 (5932), TRPC7 (57113), FXYD1 (5348), ERN1 (2081), PRSS16 (10279), RPS3 (6188), CCL23 (6368)およびSERPINE1 (5054)。
【００４２】
上記の遺伝子の中で、一番目の下位群はまた、サイレンシングが有利に腫瘍細胞の成長の75％以上の阻害を導く遺伝子を同定可能である。
【００４３】
当該第一の下位群は以下の遺伝子により形成される：
EphA1 (2041), EphA2 (1969), EphA8 (2046), EphB2 (2048), CSF1R (1436), VEGFR2 (3791), RAMP2 (10266), RAMP3 (10268), MAPK4 (5596), PIK3C2A (5286), PIK3CG (5294), GSK3beta (2932), IRAK3 (11213), DAPK1 (1612), JAK1 (3716), CHEK1 (1111), PIM1 (5292), TRB3 (57761), BTG1 (694), LATS1 (9113), LIMK2 (3985), BTK (695), PNRC2 (55629), NCOA4 (8031), NR2C1 (7181), TPR (7185), TRPC7 (57113), FXYD1 (5348), ERN1 (2081), RPS3 (6188)およびSERPINE1 (5054)。
【００４４】
２つ目の下位群は、より有利な様式で、サイレンシングが有利に腫瘍細胞の成長の95％以上の阻害に導く遺伝子をさらに同定した。
【００４５】
当該下位群は、以下の遺伝子により形成される：
EphA1 (2041), EphA2 (1969), EphA8 (2046), RAMP3 (10268), PIK3C2A (5286), GSK3beta (2932), IRAK3 (11213), DAPK1 (1612), CHEK1 (1111), PIM1 (5292), BTK (695), NCOA4 (8031), TPR (7185)。
【００４６】
遺伝子GSKalpha (2931)は、遺伝子GSK3betaのアイソフォームであるが、これは上記の遺伝子に加えられなければならない；結果が図2aおよび2bのグラフにより示される別々の試験において、HCT116p53KO中の5FUおよびオキサリプラチンの両者に対する耐性の回復における最適な効率を示しており、完全にそのベータアイソフォームと比較可能である。詳しくは、図2aが、野生型(wt)HCT116細胞、HCT116p53KO薬剤耐性細胞、GSK3alphaおよびGSKbetaサイレンス化遺伝子細胞について、200 μM 5FU(72時間治療)、非存在下（「−」の記号）および存在下（「＋」の記号）での細胞死の割合を比較する。HCT116p53KO薬剤耐性細胞と比較して、サイレンス化されたGSK3alphaおよびGSK3beta遺伝子を伴うHCT116p53KO細胞は、5FUの存在下で腫瘍細胞死が高い割合となった。図２bは、wtHCT116細胞、HCT116p53KO薬剤耐性細胞、GSK3alphaおよびGSKbetaサイレンス化遺伝子細胞について、50 μM オキサリプラチン (72時間治療)、非存在下（「−」の記号）および存在下（「＋」の記号）での細胞死の割合を比較する。HCT116p53KO薬剤耐性細胞と比較して、サイレンス化されたGSK3alphaおよびGSK3beta遺伝子を伴うHCT116p53KO細胞は、オキサリプラチンの存在下で腫瘍細胞死が高い割合となった。
【００４７】
もし抗体が商業上入手可能ならば（EphA1, EphA2, CSF1R, VEGFR, GSK3, JAK1, CHEK1, LIMK2, CDC2, BTK）、干渉による特定の遺伝子のサイレンシングの正式な確認は、それらによりコードされるタンパク質レベルのウエスタンブロット分析によって行った。ウエスタンブロット分析はピューロマイシン選択された細胞をEA1緩衝液（50 mM Hepes pH 8; 500 mM NaCl; 0.1% NP 40; DTT 1M; EDTA 1Mm）に溶解させて行った。8〜12%のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を30 μgのタンパク質を分離するために用い、これをその後、ポリビニリデンジフルオライドの膜に移動した。次に抗体を用いてウエスタンブロットを探索した。
【００４８】
上で同定した群に属する遺伝子をサイレンシングすることができるプラスミドの有効性を、DLD-1およびSW480についてさらに試験したが、これらは変異したp53を有することとその薬剤耐性で知られる結腸の他の腫瘍細胞株である。
【００４９】
一般的に、化学療法薬に対する耐性を減少させる能力は、異なるパフォーマンスによって更に確認された。特に、3つの細胞株すべてに亘る薬物治療の後、コロニーの成長の阻害の割合は、以下の遺伝子がサイレンス化された場合に最適であった：
EphA1 (2041), EphA2 (1969), EphA8 (2046), EphB2 (2048), CSF1R (1436), VEGFR2 (3791), PIK3C2A (5286), PIK3CG (5294), GSK3alpha (2931), GSK3beta (2932), IRAK3 (11213), CDC2 (983), CHEK1 (1111), LATS1 (9113), TRB3 (57761), JAK1 (3716), BTK (695), PIM1 (5292), LIMK2 (3985), PAK2 (5062)。
【００５０】
例２
一例として、図3a〜3cにおいて、試験された3つの腫瘍細胞株における遺伝子GSK3betaのサイレンシング試験に従ってグラフを報告し、ここにおいて、前述の遺伝子のサイレンシングが可能なベクターに感染したサンプル中で5FUによる治療後の死細胞の画分を報告し、空のベクターに感染したサンプルと比較する。詳しくは、図3aがwt HCT116細胞、HCT116p53KO薬剤耐性細胞、およびGSKbetaサイレンス化遺伝子細胞について、200 μM 5FU（72時間治療）の非存在下（記号「−」）および存在下（記号「＋」）での細胞死の割合を比較する。HCT116p53KO薬剤耐性細胞と比較して、サイレンス化されたGSK3beta遺伝子を伴うHCT116p53KO細胞は、5FUの存在下で腫瘍細胞死が高い割合となった。図3bは、wt DLD-1細胞およびGSK3betaサイレンス化遺伝子DLD-1細胞について、200 μM 5FU非存在下（記号「−」）および存在下（記号「＋」）での細胞死の割合を比較する。wt DLD-1細胞と比較して、GSKbetaサイレンス化遺伝子DLD-1細胞は、5FUの存在下で腫瘍細胞死が高い割合となった。図3cはwt SW480細胞およびGSKbetaサイレンス遺伝子SW480細胞について、200 μM 5FU（72時間治療）の非存在下(記号「−」)および存在下（記号「＋」）での細胞死の割合を比較する。wt SW480細胞と比較して、GSKbetaサイレンス化遺伝子SW840細胞は、5FU存在下で腫瘍細胞死が高い割合となった。
【００５１】
5FU、これは代謝拮抗タイプの化学療法薬のファミリーの代表例であるが、これに加え、異なる種類の化学療法薬、例えばオキサリプラチンなどについても薬剤に対する耐性の回復が試験された。
【００５２】
図4aにおいて、オキサリプラチン（50 μm）による治療により誘導される死細胞の画分は、結腸腫瘍細胞株DLD-1およびSW480のサンプルにおいて報告されているが、これらは、それぞれ空のベクターおよび当該遺伝子GSK3betaをサイレンシングするベクターに感染している。
【００５３】
GSK3betaがサイレンス化されたサンプルにおける、オキサリプラチンに誘導されるアポトーシスに対する耐性の実質的な減少は明らかである。図4bにおいて、類似の試験の結果が細胞株SW480について示されるグラフが報告され、ここで、用いられる薬剤は5FUおよびオキサリプラチンの組合せであった。
【００５４】
前述した通り、ならびに、図2aおよび2bに示される通り、GSK3alphaサイレンシングは、5FUおよびオキサリプラチンに対するアポトーシス応答の調節において同じ効果を持つ。
【００５５】
さらなる研究が行われ、GSK3非存在下での5FU誘導性の細胞死がシトクロームＣ依存性か、または非依存性かを決定した。抗シトクロームCおよびDAPI染色を利用し、図５に示される通り、GSK3非存在下での5FU誘導性の細胞死がシトクロームＣ非依存性であることが明らかにされた。より具体的には、抗AIFおよびDAPI染色を利用し、図7に示される通り、GSK3非存在下でAIFが核に転座し、細胞死につながることが発見された。これは、さらに、図6に示される通り、カスパーゼ３および７がGSK3サイレンス化細胞において5FU誘導性の細胞死の間に活性化されなかったという知見に支持された。
【００５６】
例３
上で同定した遺伝子群のもう一つの特別な代表例は、遺伝子BTKにより構成され、これに基づき、いくつかの検討を行った。
【００５７】
BTKキナーゼは、Ｂ細胞の発達および分化にとって重要な細胞質タンパク質チロシンキナーゼである。BTK変異は、実際のところX染色体性無ガンマグロブリン血症(XLA)の原因であり、主要な免疫不全は主に成熟Ｂ細胞の欠損だけでなく免疫グロブリンのレベルの低さによっても特徴付けられる。Ｂ細胞において、BTKがプロアポトーシスまたは抗アポトーシスのいずれかの機能を持つと報告された。さらに、BTKはこれまでは骨髄由来の系列、例えばＢ細胞やマスト細胞、赤血球前駆体、血小板などにおいてのみ発現すると考えられていた。BTKは、サイレンシングが細胞毒性作用に対する耐性を回復する遺伝子であるという我々の知見は、BTKが造血系の細胞以外の細胞型においても発現されるということを初めて証明した。最初に、タンパク質BTKのインヒビター化合物により処理されるHCT116p53KO腫瘍細胞中での薬剤に対する耐性の回復の有効性を試験し、興味のある遺伝子の機能的ブロッキングが、RNAiによるサイレンシングのための択一的な方法においてどのように行われるのかを証明した。
【００５８】
これらの試験で用いられた化合物は、(2Z)-2-シアン-N-(2,5-ジブロモフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブテンアミドであり、これはLFM-A13として知られており、その構造式は以下に式１として報告される。
【化１】
0005832721.tif 000002
【００５９】
図８において、比較試験の結果は、5FUにより処理されるHCT116p53KO細胞のサンプル中のプラスミド、siRNA、またはLFM-A13を用いてBTK遺伝子の機能的ブロッキングのグラフにおいて報告される。得られた薬剤耐性の回復のレベルを死細胞の百分率割合によって表し、完全に比較できることが容易に分かる。詳細には、図8は、wt HCT116細胞および、一過性のsiRNA形質移入（記号「BTKi」）、安定なレトロウイルス介在性のRNA干渉（記号「shBTK」）に従い、BTKのインヒビター化合物であるLFMA13を用いるBTKの特定の欠損を伴うか、または伴わない（記号「空」および「−」）HCT116p53KO薬剤耐性細胞について、200 μM 5FU（72時間治療）の存在下での細胞死の割合を比較する。
【００６０】
上述の阻害実験により明らかにされたBTKの保護的効果に従い、BTKの過剰発現は、敏感なHCT116 wtを5FU誘導性の細胞死から保護する。詳細には、図９は、空のpBabeベクターに感染したwt HCT116細胞、pBabe BTKベクターに感染したHCT116細胞、およびHCT116p53KO薬剤耐性細胞について、200 μM 5FU（72時間治療）の存在下での細胞死の割合を比較する。
【００６１】
BTK阻害はオキサリプラチン（図10a）およびDLD-1（図10b）に対する耐性をも回復することも判定された。
【００６２】
LFM-A13を用いた当該遺伝子BTKの機能的ブロッキングに続く、化学療法薬に対する耐性の減少は、インビトロで結腸腫瘍細胞株とは異なる上皮腫瘍細胞株について行われた試験により、さらに確認された。図11において、そのほとんどにおいてキナーゼが発現されることを示す、いくつかの異なる上皮癌細胞株において、BTKのレベルがウエスタンブロットにより調査された。特に、図12aおよび12bにおいて、SKOV細胞株（卵巣腫瘍に関連する）およびA549細胞株(肺腫瘍に関連する)について得られた回復試験のグラフを報告する。
【００６３】
詳細には、図12aは、LMFA13の使用によるBTK阻害を伴う、あるいは伴わない耐性卵巣（SKOV）細胞について、200 μM 5FU、50 μM OxPt、およびこの2つの組合せの非存在下（記号「NT」および「−」）および存在下での細胞死の割合を比較する。LMFA13を伴わないSKOVと比較して、LMFA13を伴うSKOVは腫瘍細胞死の割合が高くなった。図12bは、LMFA13の使用によるBTK阻害を伴う、あるいは伴わない耐性肺(A549)細胞について、200 μM 5FU、50 μM OxPt、および当該2つの組合せの非存在下（記号「NT」および「−」）および存在下での細胞死の割合を比較する。LMFA13を伴わないA549と比較して、LMFA13を伴うA549は腫瘍細胞死の割合が高くなった。
【００６４】
どちらの場合も、5FUもしくはオキサリプラチンまたは双方の薬剤への暴露の後、BTK遺伝子の機能的インヒビターであるLFM-A13による細胞株の処理が細胞死亡率のかなりの増加を導くことは特筆すべきである。
【００６５】
その上、これらの細胞株における薬剤耐性の減少作用の高い有効性は、先行する試験において得られた結果の妥当性が少なくとも上皮細胞のすべての種類、例えば、肺腫瘍、卵巣腫瘍、および胸部の腫瘍などにまでも拡張できることを確信させる。
【００６６】
上で指摘した最適な結果は、上皮ヒト腫瘍サンプルについてのエキソビボの分析によっても遺伝子BTKを確認することを示唆した。
【００６７】
最初に、ウエスタンブロットにより、病気の進行期および／または化学療法薬耐性の患者から取り出した卵巣腫瘍細胞のサンプルの30％においてBTKタンパク質のレベルが高いことを確認した。
【００６８】
次に、調査された遺伝子がこの細胞型においても発現されるかどうか（どの程度）を確認するために、患者から単離された結腸腫瘍幹細胞について実験を行った。事実、最近の研究（Dean et al., 2005）によると、これらの幹細胞は薬剤耐性の重要な原因であろう。
【００６９】
分析された４つの腫瘍幹細胞株、これらは異なる患者から単離されたものであるが、これらにおいてタンパク質BTKの発現は非常に高く、機能的実験において用いられる結腸癌細胞株について検出された発現よりも少なくとも４〜５倍高く、これは、BTKレベルの測定が試験された腫瘍細胞の幹細胞の特性を定義するための方法として有利に用いられ得ることについて、また結果的に、その治療薬に対する耐性についても示唆している。
【００７０】
当該結果は、BTKレベルが腫瘍細胞の5FUに対する感受性を決定すること、およびBTK阻害は薬剤耐性を逆転させることを示した。5FU処理された細胞における抗シトクロームCの免疫染色（図13）は、BTKが阻害される場合のみ、耐性細胞における5FU処理後の細胞質の蓄積を示し、これは、BTK阻害に対する薬剤耐性の逆転はアポトーシスの活性化のためである、という知見を裏付ける。同知見は、図14に報告されるグラフによっても裏付けられ、これはBTKインヒビターLFM-A13の存在下または非存在下でのHCT116p53KO耐性細胞における5FU処理に対するカスパーゼ3/7活性化のレベルを評価するものである。カスパーゼ3/7活性化の高いレベルは、RLU／細胞の数としての発光測定アッセイによって測定され、BTKが阻害される場合のみ、5FU処理されたHCT116p53KO細胞において観察される。
【００７１】
当該予測され、且つ報告されたBTKタンパク質の分子量は77kDaである。HCT116p53KOおよび他の試験された全ての上皮癌細胞株（６つの胸部細胞株、７つの肺細胞株、５つの結腸細胞株）における特定の抗体（sc-1696, Santa Cruz Biotechnologyより）により当該ウエスタンブロットにおいてBTKとして同定されたタンパク質は、対照的に、上皮細胞株においてより短いBTKアイソフォームが発現されることを示唆する、65-68 kDaの見かけの分子量を有する（図11、図15a）。
【００７２】
これらの結果を確認するために、2つの異なる特異的なBTK抗体（上記sc-1696およびBL7、英国、バーミンガム大学のMike Tomlinson博士からの好意の贈り物）を用いて免疫沈降分析を行った。図15bの結果は、この新規なアイソフォームだけが上皮細胞株において発現され、一方、白血病細胞株(Nalm 6)、これは文献から典型的な77kDaの形状を発現することが既に知られているが、これにおいては双方のアイソフォームが存在するということを示す。
【００７３】
従って、BTKのコード配列(cds)の生物情報学的な分析が行われ、よって、BTK (nt 164-166)を翻訳するのに用いられることが知られ、タンパク質の翻訳を開始するのに感受性の高いものを持つフレーム中の2番目のヌクレオチドトリプレットATG(nt 428-430)が特定された。この2番目のATGから始まり、翻訳される推定上のタンパク質の予想分子量は67kDaであり、上皮癌細胞中の異なるBTK抗体により特定されたバンドの見かけの分子量と矛盾しない。より短く新規なBTKタンパク質のアイソフォームをコードするmRNAにおいてどの部分が欠失しているかを特定するために、異なるプライマー対（図16の上方のダイアグラムに示される通り、cdsの異なる部分でアニールする）を用いるPCR実験が行われた。図16に示す通り、これらの実験は、ヌクレオチド202の上流である5’末端がHCT116p53KO細胞において存在しないか、または異なることを示す。
【００７４】
5’RACE／シークエンシング実験が、未知の5’末端の同一性を決定するために、HCT116p53KO細胞からのmRNAについて行われた。続いて、ClustalWコンピュータプログラムを用いた、HCT116p53KO細胞からのmRNA由来のcDNAと、GenBank寄託番号NM_00061により特定される標準のBTKmRNA由来のcDNAとのアラインメント分析（図17に示される結果）により、２番目のエキソンの上流の配列（cdsのnt134から始まる）が文献において報告されるもの、すなわち、上皮結腸癌細胞が異なる１番目のエキソンを発現するものとは異なることが示された。
【００７５】
ゲノムデータベースを用いるBLAST分析（図18）は、BTK遺伝子座の開始に対応して、染色体Xコンティグについて、101160KでNM_000061 BTK転写物の１番目のエキソンを局在化する。それに反して、新規なBTK転写物の１番目のエキソンは、RPL36A遺伝子座のすぐ下流の１番目の既知のBTKのエキソンの15192塩基5’を整列させ、このことは、それがこれまでに認識されていないBTKエキソンと対応することを示唆する。その上、この新規なエキソンは、HCT116p53KOにおいて１番目の「典型的な」エキソンの代わりに存在し、これが「代替の」１番目のエキソンであることを示唆し、その使用は、細胞において転写され、このより短いBTKアイソフォームを発現する、別のBTK mRNAを生じる。
【００７６】
PCR／シークエンシング実験は、試験されたすべての結腸癌細胞株（HCT116p53KO、DLD-1およびSW480）においてだけでなく、結腸癌患者からの9/9 FFPEサンプルにおいてもこの「代替の」BTK mRNAの発現を証明した（図19）。
【００７７】
GenBank寄託番号NM_000061として特定される通り、当該BTKの１番目のエキソンは、mRNAの5’UTRに対応することは注目すべきであり、これは2番目のエキソンに位置するBTKタンパク質の１番目のメチオニンアミノ酸をコードするATGトリプレットである。5’UTRは、通常、調節的な機能、例えば、配向性のキャップ依存的またはIRES媒介性のキャップ非依存的翻訳などを行う。従って、異なる１番目のエキソンは、新規な転写物において特定される通り、別のATG（この場合、4番目のエキソンに位置するATG）がBTKタンパク質の翻訳を開始するために用いられなければならず、従って異なるアイソフォームの発現を調節するかどうか、を規定することができる。
【００７８】
当該BTK遺伝子により発現される新規なmRNAの5’UTRに対応する、１番目のエキソンのヌクレオチド配列は、本記載に添付される配列番号１において報告される。
【００７９】
当該新規な転写物によりコードされる、BTKタンパク質の新規なアイソフォームのアミノ酸配列は、本記載に添付される配列番号２において報告される。
【００８０】
上の結果は、化学療法薬に対する腫瘍細胞の耐性を決定する方法だけでなく、腫瘍幹細胞の存在を同定する方法も示唆し、ここにおいて、遺伝子BTKの発現はBTKタンパク質の新規なアイソフォームの存在を確認する工程を含む。
【００８１】
当該BTKタンパク質の新規なアイソフォームの存在は、コントロールされてもよく、例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫化学、または免疫蛍光分析を用いて当該タンパク質の存在を確認し、または、好ましくは、当該代替の１番目のエキソンを持つmRNAであって、そのcDNAが配列番号１により特定されるヌクレオチド配列を示すものの存在を確認する。後者は、PCR分析を用いて、好ましくは、配列番号１に含まれる配列を持つプライマーを用いて、有利に行われてもよい。
【００８２】
この新規な方法は、特に、ヒト患者から得られた腫瘍細胞を分析するために用いられる際に、既知の先行技術について関連した利点を示すことが期待される。
【００８３】
実際、ヒト患者から得られた腫瘍性細胞が、BTKタンパク質をも発現するかもしれない効果的な量のリンパ球を含んでいても良く、従って、腫瘍細胞によって発現されるBTKタンパク質の探索を妨害することが知られている。
【００８４】
しかしながら、リンパ球によって発現されるBTKタンパク質は、分子量77kDaを有するBTKタンパク質の「典型的な」アイソフォームであり、そのためBTKタンパク質の新規なアイソフォームの探索はいかなる妨害もなく、代替の１番目のエキソンを持つBTK mRNAの存在を探す、単純なPCR分析によって行われても良い。
【００８５】
従って、本願発明は上述の先行技術を参照して上述の嘆かわしい問題を解決し、同時に数多くの他の利点を提供し、これは当該治療反応を予測することができる診断方法の発展を可能にすることを含み、そのため診断的な治療的選択だけでなく上のすべての直接的な最高の治療的選択を改良する。
本願の実施態様を以下に記載する。
（１）EphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, RAMP2, RAMP3, CLRN1, MAPK4, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, DAPK1, JAK1, PIM1, TRB3, BTG1, LATS1, LIMK2, MYLK, PAK1, PAK2, CDC2, BTK, PNRC2, NCOA4, NR2C1, TPR, RBBP8, TRPC7, FXYD1, ERN1, PRSS16, RPS3, CCL23, およびSERPINE1からなる群より選択される遺伝子のうち少なくとも一つを機能的にブロックすることのできる化合物の使用であって、上皮腫瘍病態の治療上の処置における化学療法薬に対する耐性を減少することが予定される薬剤の製造のための使用。
（２）（１）に記載の使用であって、前記化合物がRNA干渉機構によって前記遺伝子の１つをサイレンシング可能な低分子干渉RNAのオリゴヌクレオチド分子であるか、または前記分子を発現することができる使用。
（３）（２）に記載の使用であって、前記化合物が前記分子を発現させることができるプラスミドである使用。
（４）（２）に記載の使用であって、前記化合物が前記分子を発現させることができるレトロウイルスベクターである使用。
（５）先行する項のいずれか１項または１項以上に記載の使用であって、前記少なくとも１つの遺伝子が、EphA1, EphA2, EphA8, RAMP3, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, DAPK1, PIM1, BTK, NCOA4およびTPRにより形成される下位群から選択される使用。
（６）（５）に記載の使用であって、前記遺伝子が、そのアルファおよびベータアイソフォームにおいてBTKまたはGSK3である使用。
（７）先行する項のいずれか１項または１項以上に記載の使用であって、前記病態は、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍または胸部腫瘍である使用。
（８）（７）に記載の使用であって、前記腫瘍が、結腸腫瘍であり、前記遺伝子がEphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, CDC2, CHEK1, LATS1, TRB3, JAK1, PIM1, PAK2, BTKからなる群より選択される使用。
（９）先行する項のいずれか１項または１項以上に記載の使用であって、前記化学療法薬が、代謝拮抗物質またはトポイソメラーゼIのインヒビター、トポイソメラーゼIIのインヒビター、白金配位化合物およびアルキル化剤により形成される群より選択されるいずれか一つのDNA損傷剤である使用。
（１０）（９）に記載の使用であって、前記化学療法薬が5-フルオロウラシルに基づく使用。
（１１）（９）に記載の使用であって、前記化学療法薬が、オキサリプラチンまたは、5-フルオロウラシルとオキサリプラチンとの組合せに基づく使用。
（１２）先行する項のいずれか１項または１項以上に記載の使用であって、前記化合物が当該遺伝子BTKのインヒビターである使用。
（１３）（１２）に記載の使用であって、前記インヒビターがLFM-A13である使用。
（１４）先行する項のいずれか１項または１項以上に記載の使用であって、前記化合物がそのアルファおよびベータアイソフォームにおいて当該遺伝子GSK3のインヒビターである使用。
（１５）EphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, RAMP2, RAMP3, CLRN1, MAPK4, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, DAPK1, JAK1, PIM1, TRB3, BTG1, LATS1, LIMK2, MYLK, PAK1, PAK2, CDC2, BTK, PNRC2, NCOA4, NR2C1, TPR, RBBP8, TRPC7, FXYD1, ERN1, PRSS16, RPS3, CCL23およびSERPINE1からなる群より選択される遺伝子のうち少なくとも１つを機能的にブロックすることができる化合物および薬学的に許容される媒体からなる医薬組成物。
（１６）EphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, RAMP2, RAMP3, CLRN1, MAPK4, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, DAPK1, JAK1, PIM1, TRB3, BTG1, LATS1, LIMK2, MYLK, PAK1, PAK2, CDC2, BTK, PNRC2, NCOA4, NR2C1, TPR, RBBP8, TRPC7, FXYD1, ERN1, PRSS16, RPS3, CCL23およびSERPINE1からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を機能的にブロックすることができる化合物および腫瘍病態の治療のための化学療法薬を含む医薬キット。
（１７）（１６）に記載のキットであって、前記化学療法薬が、代謝拮抗物質または、トポイソメラーゼIのインヒビター、トポイソメラーゼIIのインヒビター、白金配位化合物およびアルキル化剤により形成される群から選択されるいずれか１つのDNA損傷剤であるキット。
（１８）（１７）に記載のキットであって、前記化学療法薬が5-フルオロウラシルまたはオキサリプラチンまたはそれらの組合せに基づくキット。
（１９）EphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, RAMP2, RAMP3, CLRN1, MAPK4, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, DAPK1, JAK1, PIM1, TRB3, BTG1, LATS1, LIMK2, MYLK, PAK1, PAK2, CDC2, BTK, PNRC2, NCOA4, NR2C1, TPR, RBBP8, TRPC7, FXYD1, ERN1, PRSS16, RPS3, CCL23およびSERPINE1からなる群より選択される１つまたは１つ以上の遺伝子の発現を測定する工程を含む、化学療法薬に対する腫瘍細胞の耐性を決定する方法。
（２０）（１９）に記載の方法であって、前記腫瘍細胞は上皮型であり、前記遺伝子はGSK3である方法。
（２１）（１９）に記載の方法であって、前記遺伝子がBTKである方法。
（２２）（２１）に記載の方法であって、前記遺伝子BTKの発現の測定が65から68kDaの間の分子量を有するBTKタンパク質アイソフォームの存在を確認する工程を含む方法。
（２３）（２２）に記載の方法であって、前記BTKタンパク質のアイソフォームが配列番号２において定義されるアミノ酸配列を有する方法。
（２４）（２２）に記載の方法であって、前記BTKタンパク質のアイソフォームが配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有し、配列番号２において特定されるアミノ酸のうち１個または２、３個のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含む方法。
（２５）（２１）に記載の方法であって、前記遺伝子BTKの発現の測定が、cDNAが配列番号１において定義されるヌクレオチド配列を含む5’-UTRを有するmRNAの存在を確認する工程を含む方法。
（２６）（２５）に記載の方法であって、前記mRNAの存在を確認する前記工程がそのcDNAのPCR分析を含み、配列番号１に含まれる配列を有する少なくとも１つのプライマーを用いる方法。
（２７）（２１）から（２６）のうちいずれか１項に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が上皮型である方法。
（２８）（２１）から（２６）のうちいずれか１項に記載の方法であって、前期腫瘍細胞が白血病型である方法。
（２９）EphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, RAMP2, RAMP3, CLRN1, MAPK4, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, DAPK1, JAK1, PIM1, TRB3, BTG1, LATS1, LIMK2, MYLK, PAK1, PAK2, CDC2, BTK, PNRC2, NCOA4, NR2C1, TPR, RBBP8, TRPC7, FXYD1, ERN1, PRSS16, RPS3, CCL23およびSERPINE1からなる群より選択される１つまたは１つ以上の遺伝子の発現を測定する工程を含む、腫瘍幹細胞の存在を同定するための方法。
（３０）（２９）に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が上皮型であり、前記遺伝子がGSK3である方法。
（３１）（２９）に記載の方法であって、前記遺伝子がBTKである方法。
（３２）（３１）に記載の方法であって、前記遺伝子BTKの発現の測定が、65から68kDaの間の分子量を有するBTKタンパク質アイソフォームの存在を確認する工程を含む方法。
（３３）（３２）に記載の方法であって、前記BTKタンパク質のアイソフォームが配列番号２において定義されるアミノ酸配列を有する方法。
（３４）（３２）に記載の方法であって、前記BTKタンパク質のアイソフォームが配列番号２において記載されるアミノ酸配列を有し、配列番号２において特定されるアミノ酸のうち１個または２、３個のアミノ酸の置換、欠失、および付加を含む方法。
（３５）（３１）に記載の方法であって、前記遺伝子BTKの発現の測定が、cDNAが配列番号１において定義されるヌクレオチド配列を含む、5’UTRを有するmRNAの存在を確認する工程を含む方法。
（３６）（３５）に記載の方法であって、前記mRNAの存在を確認する工程が、そのcDNAのPCR分析を含み、少なくとも配列番号１に含まれる配列を有するプライマーを用いる方法。
（３７）（３１）から（３６）のうちいずれか１項に記載の方法であって、前記腫瘍細胞は上皮型である方法。
（３８）（３１）から（３６）のうちいずれか１項に記載の方法であって、前記腫瘍細胞は白血球型である方法。
（３９）細胞の5’-フルオロウラシル(5-FU)に対する感受性を回復するための方法であって：
治療上効果的な量の低分子干渉RNAを発現する薬剤に当該細胞を接触させ、当該低分子干渉RNAは細胞の5-FUに対する感受性を調節することが知られている、少なくとも１つの遺伝子のmRNAの翻訳を抑制し；
治療上効果的な量の少なくとも5-FUに当該細胞を接触させることを含む方法。
（４０）（３９）に記載の方法であって、少なくとも１つの遺伝子が、EphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, CDC2, CHEK1, LATS1, TRB3, JAK1, PIM1, PAK2, BTKからなる群より選択される方法。
（４１）（４０）に記載の方法であって、少なくとも１つの遺伝子が、EphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, RAMP2, RAMP3, CLRN1, MAPK4, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, DAPK1, JAK1, PIM1, TRB3, BTG1, LATS1, LIMK2, MYLK, PAK1, PAK2, CDC2, BTK, PNRC2, NCOA4, NR2C1, TPR, RBBP8, TRPC7, FXYD1, ERN1, PRSS16, RPS3, CCL23およびSERPINE1からなる群より選択される方法。
（４２）（４１）に記載の方法であって、当該細胞が当該薬剤に接触させた後、２４〜７２時間少なくとも5-FUに接触させられる方法。
（４３）必要としている哺乳類における結腸癌を治療するための方法であって、EphA1, EphA2, EphA8, EphB2, CSF1R, VEGFR2, RAMP2, RAMP3, CLRN1, MAPK4, PIK3C2A, PIK3CG, GSK3alpha, GSK3beta, IRAK3, DAPK1, JAK1, PIM1, TRB3, BTG1, LATS1, LIMK2, MYLK, PAK1, PAK2, CDC2, BTK, PNRC2, NCOA4, NR2C1, TPR, RBBP8, TRPC7, FXYD1, ERN1, PRSS16, RPS3, CCL23および SERPINE1からなる群より選択され少なくとも１つの遺伝子を機能的にブロックする、治療上効果的な量の化合物を当該哺乳類に送達することと、治療上効果的な量の少なくとも5-FUを当該哺乳類に送達することとを含む方法。
（４４）少なくとも（１）に記載の使用に従う化合物を投与することを含む、癌の治療方法。
（４５）（３６）に記載の方法であって、当該癌は結腸癌である方法。
（４６）配列番号２において定義されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（４７）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号２において特定されるアミノ酸のうち１個または２、３個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含む方法。
（４８）配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を有する、PCR分析における使用のためのプライマー。
（４９）配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を有する少なくとも一つのプライマーを含む、PCR分析のためのキット。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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