(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の以下の化合物、１つまたは複数の以下の化合物の立体異性体、１つまたは複数の以下の化合物の複数の立体異性体の混合物、もしくは該化合物、該立体異性体、および該混合物のいずれかの１つまたは複数の塩を含む組成物。
【化１】
0005715560.tif 000030
（式中、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４はＯ、ＢＨ３およびＳｅから成るグループから選択され；
種々のＹｉ基は同じであっても異なっていてもよく、ｉは１、２，３または４であり；
少なくとも１つのＹｉはＢＨ３またはＳｅであり；
ｎは０または１であり；
Ｒは
【化２】
0005715560.tif 000031
から成るグループから選択され：
Ｒ３とＲ４は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３およびＯＣＨ２ＣＨ３から成るグループから選択され；
Ｒ３とＲ４は同じであっても異なっていてもよく；
Ｗは
【化３】
0005715560.tif 000032
から成るグループから選択され；
Ｒ１とＲ２は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３から成るグループから選択され；
Ｒ１とＲ２は同じであっても異なっていてもよく；かつ
Ｘはメチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、置換ベンジル、メチレンナフチル、および置換メチレンナフチルから成るグループから選択される。）
【請求項２】
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４はＯおよびＢＨ３から成るグループから選択され；種々のＹｉ基は同じであっても異なっていてもよく、ｉは１、２，３または４であり；かつ少なくとも１つのＹｉはＢＨ３である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒが
【化４】
0005715560.tif 000033
から成るグループから選択される請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｗが
【化５】
0005715560.tif 000034
であり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ１はＨまたはＯＣＨ３であり；Ｘはメチルであり；ｎ＝０であり；Ｙ１、Ｙ２およびＹ３のうちの１つだけがＢＨ３である請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ｎ＝０である場合、Ｙ２またはＹ３がＢＨ３であり；ｎ＝１である場合、Ｙ２、Ｙ３またはＹ４がＢＨ３である請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
５’末端に請求項２に記載の組成物を組み込んでいるＲＮＡ分子。
【請求項７】
５’末端に請求項５に記載の組成物を組み込んでいるＲＮＡ分子。
【請求項８】
Ｒが
【化６】
0005715560.tif 000035
から成るグループから選択される請求項７に記載のＲＮＡ分子。
【請求項９】
インビトロで請求項６に記載のＲＮＡ分子を合成する方法であって、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰ、請求項１に記載の組成物、ならびにポリヌクレオチド鋳型を、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼによるポリヌクレオチド鋳型のＲＮＡコピーへの転写を誘導する条件下で反応させることを含み、それによりいくつかのＲＮＡコピーが前記組成物を組込んで請求項６に記載のＲＮＡ分子を製造する方法。
【請求項１０】
タンパク質またはペプチドをインビトロで合成する方法であって、オープンリーディングフレームを有する請求項６に記載のＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子のオープンリーディングフレームを該オープンリーディングフレームによってコード化されたタンパク質またはペプチドへ翻訳するよう誘導する条件下で、無細胞タンパク質合成系で翻訳することを含む方法。
【請求項１１】
培養細胞でタンパク質またはペプチドを合成する方法であって、オープンリーディングフレームを有する請求項６に記載のＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子のオープンリーディングフレームを該オープンリーディングフレームによってコード化されたタンパク質またはペプチドへ翻訳するよう誘導する条件下で、培養細胞で翻訳することを含む方法。
【請求項１２】
前記組成物は、ＲＮＡのタンパク質またはペプチドへの翻訳を全部または部分的に阻害するのに有用な量で、ＲＮＡをタンパク質またはペプチドに翻訳する系へ投与される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記系は生物体の未変性ＲＮＡ翻訳系であり、前記組成物は該生物体へインビボ投与される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４はＯおよびＳｅから成るグループから選択され；種々のＹｉ基は同じであっても異なっていてもよく、ｉは１、２，３または４であり；かつ少なくとも１つのＹｉはＳｅである請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｒが
【化７】
0005715560.tif 000036
から成るグループから選択される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｗが
【化８】
0005715560.tif 000037
であり、Ｒ２はＯＨであり；Ｒ１はＨまたはＯＣＨ３であり；Ｘはメチルであり；ｎ＝０であり；かつＹ１、Ｙ２およびＹ３のうちの１つだけがＳｅである請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ｎ＝０の場合、Ｙ２またはＹ３がＳｅであり；ｎ＝１の場合、Ｙ２、Ｙ３またはＹ４はＳｅである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｒ１はＯＣＨ３であり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＯＨであり；Ｒ４はＯＨであり；ｎは０であり；Ｙ１はＯであり；Ｙ２はＳｅであり；Ｙ３はＯであり；Ｗは
【化９】
0005715560.tif 000038
であり、Ｒは
【化１０】
0005715560.tif 000039
である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
５’末端に請求項１４に記載の組成物を組込んでいるＲＮＡ分子。
【請求項２０】
５’末端に請求項１５に記載の組成物を組込んでいるＲＮＡ分子。
【請求項２１】
Ｒは
【化１１】
0005715560.tif 000040
から成るグループから選択される請求項２０に記載のＲＮＡ分子。
【請求項２２】
インビトロで請求項１９に記載のＲＮＡ分子を合成する方法であって、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰ、請求項１に記載の組成物、ならびにポリヌクレオチド鋳型を、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼによるポリヌクレオチド鋳型のＲＮＡコピーへの転写を誘導する条件下で反応させることを含み、それによりいくつかのＲＮＡコピーが前記組成物を組込んで請求項１９に記載のＲＮＡ分子を製造する方法。
【請求項２３】
タンパク質またはペプチドをインビトロで合成する方法であって、オープンリーディングフレームを有する請求項１９に記載のＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子のオープンリーディングフレームを該オープンリーディングフレームによってコード化されたタンパク質またはペ
プチドへ翻訳するよう誘導する条件下で、無細胞タンパク質合成系で翻訳することを含む方法。
【請求項２４】
培養細胞でタンパク質またはペプチドを合成する方法であって、オープンリーディングフレームを有する請求項１９に記載のＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子のオープンリーディングフレームを該オープンリーディングフレームによってコード化されたタンパク質またはペプチドへ翻訳するよう誘導する条件下で、培養細胞で翻訳することを含む方法。
【請求項２５】
前記組成物は、ＲＮＡのタンパク質またはペプチドへの翻訳を全部または部分的に阻害するのに有用な量で、ＲＮＡをタンパク質またはペプチドに翻訳する系へ投与される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記系は生物体の未変性ＲＮＡ翻訳系であり、前記組成物は該生物体へインビボ投与される、請求項２５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なジヌクレオチドキャップ類似体およびその使用方法、かかる類似体を含むＲＮＡ分子、ＲＮＡ合成におけるかかる類似体の使用方法、ペプチドおよびタンパク質の合成におけるかかる類似体の使用方法、翻訳を阻害するためのかかる類似体の使用方法、および他の使用方法に関する。
【０００２】
本発明の開発は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の米国国立一般医学研究所（ＮＩＧＭＳ）により授与された承認番号Ｒ０１ＧＭ２０８１８の下、米国政府により部分的に資金提供されている。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明の開発は、米国国立科学支援プロジェクト２００８−２０１０により授与された承認番号ＰＢＺ−ＭＮｉＳＷ−０７／Ｉ／２００７の下、ポーランド政府により部分的に資金提供されている。
【背景技術】
【０００４】
リボ核酸（ＲＮＡ）はヌクレオチドの一本鎖の直線状の重合体である。各ヌクレオチド単位は窒素塩基、リボース糖、およびリン酸基を有している。ＲＮＡ分子にはいくつかのタイプがある。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、そのヌクレオチド配列がタンパク質のアミノ酸組成を決定するＲＮＡ分子である。真核生物では、大半のｍＲＮＡの５’末端がブロック、すなわち修飾グアニンヌクレオチドで「キャップ」されている。キャップは２つのヌクレオシド間の５’−５’三リン酸結合およびＲＮＡ重合体鎖より先端側のグアニン環上の７−メチル基を含む。いくつかの他の形式のＲＮＡ、例えば核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）もキャップされている。ＲＮＡのキャップ形成は、ＲＮＡの安定性および翻訳効率を含めて細胞内の分子活性を調節する。
【０００５】
インビトロでキャップ化ＲＮＡ分子を合成する能力は、それによって種々の生物学的用途で適切に機能するＲＮＡ分子の調製を可能にするため、有用である。そのような用途は、研究用途およびポリペプチドの商業的生産の両方を含み、それには例えば特定部位に「非天然」アミノ酸を含む無細胞翻訳系でのポリペプチドの生産または活性または安定のために翻訳後修飾を必要とする培養細胞でのポリペプチドの生産が含まれる。キャップ化ＲＮＡ分子はより安定しており、細胞の翻訳機により容易に結合するため、キャップ化ＲＮＡの翻訳は非キャップ化ＲＮＡの場合よりもかなり長時間進行し、タンパク質がより多く生産される。
【０００６】
インビトロでキャップ化ＲＮＡを製造するための最もよく使用される方法は、４つすべてのリボヌクレオシド三リン酸とｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ7ＧｐｐｐＧとも称される）のようなキャップジヌクレオチドの存在下でバクテリアまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのいずれかでＤＮＡ鋳型を転写することである。ＲＮＡポリメラーゼは、次の鋳型とされるヌクレオシド三リン酸のα−リン酸に対するｍ7ＧｐｐｐＧのＧ
ｕｏ部分の３’−ＯＨによる求核攻撃で転写を開始し、その結果中間体ｍ7ＧｐｐｐＧｐ
Ｎが生じる。競争するＧＴＰ開始生成物ｐｐｐＧｐＮの生成は、転写反応混合物中のｍ7
ＧｐｐｐＧ対ＧＴＰの分子比を５−１０の間に設定することにより抑制される。ｍ7Ｇｐ
ｐｐＧにより生産された５’−キャップ化ｍＲＮＡは、正しい順方向に組み込まれたキャップ類似体を含むもの［ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐ…］と、逆方向の類似体
を含むもの［Ｇ’（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ7ＧｐＮｐ…］との２つの形式のいずれかを
とる可能性がある。後者は細胞翻訳機にキャップ化ｍＲＮＡと認められず、合成ｍＲＮＡ調製の翻訳効率を減少させる。この問題は、ｍ７ＧｕｏのＣ２’位置またはＣ３’位置に
Ｏ−メチルまたはデオキシ修飾をしているキャップ類似体の使用により回避することが可能である。非特許文献１および２を参照されたい。これらのキャップ類似体はもっぱら順方向でＲＮＡ転写物に組み込まれ、したがって、「反逆方向キャップ類似体」（ＡＲＣＡ）と呼ばれる。ウサギ網状赤血球溶解液（ＲＲＬ）翻訳系では、ＡＲＣＡキャップ化ｍＲＮＡは、ｍ7ＧｐｐｐＧでキャップされた転写物よりも２倍高い翻訳効率を有していた（
非特許文献１）。培養哺乳動物細胞では、ＡＲＣＡキャップ化ｍＲＮＡはｍ7ＧｐｐｐＧ
でキャップされたものより２〜２．５倍効率的良く翻訳された。非特許文献３を参照されたい。
【０００７】
培養哺乳動物細胞へ導入された合成ｍＲＮＡから生産されるタンパク質の量は、ｍＲＮＡの自然な分解により制限される。ｍＲＮＡ分解の１つのインビボ経路はｍＲＮＡキャップが外れることから始まる。この取り外しは、調節サブユニット（Ｄｃｐ１）と触媒サブユニット（Ｄｃｐ２）を含むヘテロダイマーのピロホスファターゼにより触媒される。触媒サブユニットは、三リン酸架橋のαリン酸基とβリン酸基の間を開裂させる。
【０００８】
非特許文献３は、メチレン基がαリン酸基とβリン酸基の間のＯ原子を交換するキャップ類似体ｍ27,3’-OＧｐｐCH2ｐＧについて記載している。この類似体でキャップされた
ｍＲＮＡは、インビトロでの組換えヒトＤｃｐ２による加水分解に対して強い。培養細胞に導入されると、類似体ｍ27,3’-OＧｐｐCH2ｐＧでキャップされたｍＲＮＡは、ｍ27,3
’-OＧｐｐｐＧでキャップされたｍＲＮＡより安定していたが、ｍ27,3’-OＧｐｐCH2ｐ
ＧでキャップされたｍＲＮＡは全体の翻訳効率が３’−ＯＧｐｐＣＨ２ｐＧより低かった。これは恐らくｍ27,3’-OＧｐｐCH2ｐＧがｍ27,3’-OＧｐｐｐＧよりｅＩＦ４Ｅに対し
て低い結合親和性を有するためである。真核生物の翻訳開始因子ｅｌＦ４Ｅは、キャップ化ｍＲＮＡを翻訳のためにリボソームの所に連れて来ることに関与する。
【０００９】
非特許文献４は、三リン酸鎖の中の３つの非架橋Ｏ原子のうちの一つがＳ原子と置換された３つのＡＲＣＡの合成について記載した。これらのホスホロチオエート類似体（Ｓ−ＡＲＣＡと呼ばれる）の各々は、純粋なジアステレオマーを製造すべくクロマトグラフィで分離することが可能なジアステレオマーの混合物として合成された。ｅＩＦ４Ｅに対するホスホロチオエートキャップ類似体の結合親和性は、ｍ7ＧｐｐｐＧと等しいか、いく
つかの場合ではｍ7ＧｐｐｐＧよりも大きかった。
【００１０】
非特許文献５は、βリン酸で修飾されたＳ−ＡＲＣＡでキャップされたｍＲＮＡが、インビトロでの組換えヒトＤｃｐ２による加水分解に強いことを示した。さらに、１つのβ
Ｓ−ＡＲＣＡジアステレオマーでキャップされたｍＲＮＡは、哺乳動物細胞へ導入された時、対応するＡＲＣＡキャップ化ｍＲＮＡのジアステレオマーよりも長い半減期を有し、また細胞中でより大きな翻訳効率を有していた。これらのうちの１番目の特性は、おそらくＤｃｐ２での加水分解に対するβ  Ｓ−ＡＲＣＡの耐性に起因し、２番目の特性は、おそらくｅＩＦ４Ｅに対するβ−Ｓ−ＡＲＣＡのより高い結合性に起因している。
【００１１】
合成ｍＲＮＡキャップ類似体の別の使用方法は、ｅＩＦ４Ｅへの結合に関し、キャップ化ｍＲＮＡとの競合によるキャップ依存的翻訳を阻害することである。非特許文献６および７を参照されたい。
【００１２】
キャップ類似体の翻訳阻害能力は、潜在的な治療上の重要性を有する。多くの種類の癌細胞はｅＩＦ４Ｅを過剰発現しており、これは腫瘍形成と転移を促進するタンパク質の発現の増大に結びつく場合がある。非特許文献８を参照されたい。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または特異的ｅＩＦ４ＥサプレッサーによるｅＩＦ４Ｅ発現の減少は、腫瘍成長と腫瘍形成を阻害し得る。非特許文献９および１０を参照されたい。さらに、ｅｌＦ４Ｅの翻訳活性は、競争する翻訳に不十分なキャップ類似体で細胞を飽和させ
ることにより抑制することが可能である。
【００１３】
いくつかの合成キャップ類似体はｅＩＦ４Ｅ活性の特異的阻害剤であり、したがって、腫瘍形成および転移の治療、臓器移植における免疫抑制、および他の病状の治療の薬物として有用である可能性がある。しかしながら、これらのキャップ類似体の利用可能性については、一部には細胞内の状態でキャップ類似体が不安定性であるという理由により、これまでインビボで実証されたことはなかった。
非特許文献４はそのγ−Ｓ−ＡＲＣＡが無細胞系での強い翻訳阻害剤であることを実証したが、これはｅＩＦ４Ｅに対するその結合親和性が高いためであると推測される。γ−修飾類似体は、この種の化合物の分解の原因であるスカベンジャーピロホスファターゼであるヒトＤｃｐＳ酵素による加水分解に強い。
【００１４】
他の改変が、キャップ化ｍＲＮＡを酵素による分解から保護するよう支援し得る。１例はボラノホスフェート修飾であり、ここでは非架橋Ｏ原子の一つがボラン基（ＢＨ3-）と置換される（ＢＨ3-類似体と称されることもある）。別の例はホスホロセレノエート修飾であり、非架橋Ｏ原子の一つがセレン原子と置換される（Ｓｅ類似体と称されることもある）。ホスホロチオエート、ボラノホスフェートおよびホスホロセレノエートはいずれも非架橋酸素原子を置換し、いくつかの化学的および生化学的特性を共有する。しかしながら、これらの基は違いも有する。例えば、Ｐ−Ｘ結合距離が異なり（ＸはＳ、ＳｅまたはＢＨ3は表わす）、Ｘ基のファンデルワールス半径が異なり、かつ種々の二価および他の
金属陽イオンに対するＸ基の親和性が異なる。これらの異なる化学的性質により、かかる基を備えたキャップ類似体の生物活性（キャップ結合タンパク質との相互作用および酵素分解に対する感度を含む）が変化する。
【００１５】
ボラノホスフェートモノヌクレオチドおよびボラノホスフェートポリリン酸ジヌクレオチドは非特許文献１１で検討されている。
ボラノホスフェートポリリンジヌクレオシド類似体は特許文献１に記載されており、Ｐ２Ｙ受容体により調節される疾患（例えば２型糖尿病および癌）に対する該類似体の使用方法についても記載されている。
【００１６】
ボラノホスフェートヌクレオチド類似体は、結合角、ｐＫa値およびＰ−ジアステレオ
異性が類似しているため、ホスホロチオエート類似体との類似点を有している。しかしながら、場合によっては、ボラノホスフェートヌクレオチド類似体が、そのホスホロチオエート相当物より酵素加水分解に対して１０倍強いこともある。ボラノホスフェートヌクレオチド類似体はホスホロチオエートよりも脂溶性であるため、それらが細胞膜を通過し、かつ細胞内翻訳機に到達するのを支援し得る。ボラノホスフェート類似体はホウ素中性子捕獲療法（ＢＮＣＴ）にも使用され得る。非特許文献１２および１３を参照されたい。
【００１７】
α位置で修飾したヌクレオシドジホスフェートおよびトリホスフェートのホスホロセレノエート類似体が非特許文献１４−１７に記載されている。しかしながら、本願発明者らの
知る限りでは、α位置以外の任意の位置で修飾したヌクレオシドポリリン酸類似体についての以前の報告もなければ、任意の位置で修飾したジヌクレオシドポリリン酸についての報告もない。
【００１８】
ホスホロセレノエートヌクレオチド類似体は、結合角、ｐＫa値、Ｐ−ジアステレオ異
性、および酵素分解に対する耐性が類似しているため、ホスホロチオエートおよびボラノホスフェートと類似している。ホスホロセレノエート、セレンを多波長異常分散（ＭＡＤ）法に使用することが可能であるため、核酸結晶学に非常に有用であり得る。非特許文献１６−１９を参照されたい。
【００１９】
特許文献２および３に記載されている反逆方向キャップｍＲＮＡ類似体についての本願発明者らの研究も参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０２８７２７１号
【特許文献２】米国特許第７，０７４，５９６号
【特許文献３】国際特許出願第２００８／１５７６８８号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】J. Stepinski et al., Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogues 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG," RNA, vol. 7, pp. 1486-1495 (2001)
【非特許文献２】J. Jemielity et al., Novel 'anti-reverse' cap analogues with superior translational properties,・RNA, vol. 9, pp. 1108-1122 (2003)
【非特許文献３】E. Grudzien et al, "Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs," J. Biol. Chem., vol. 281, pp. 1857-1867 (2006)
【非特許文献４】J. Kowalska et al., "Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containing phosphorothioate substitutions that bind tightly to eIF4E and are resistant to the decapping pyrophosphatase DcpS," RNA, vol. 14, pp. 1119-1131 (2008)
【非特許文献５】E. Grudzien et al., " Phosphorothioate cap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency in mammalian cells," RNA, vol. 13, pp. 1745-1755 (2007)
【非特許文献６】A. Cai et al., "Quantitative assessment of mRNA cap analogues as inhibitors of in vitro translation," Biochemistry, vol. 38, pp. 8538-8547 (1999)
【非特許文献７】E. Grudzien et al., "Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translational efficiency," RNA, vol. 10, pp. 1479-1487 (2004)
【非特許文献８】A. De Benedetti et al, "eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases," Oncogene, vol. 23, pp. 3189-3199 (2004)
【非特許文献９】J. R. Graff et al., "Therapeutic suppression of translation initiation factor eIF4E expression reduces tumor growth without toxicity," J. Clin. Investigation, vol. 117, pp. 2638-2648 (2007)
【非特許文献１０】T. Herbert, "Rapid induction of apoptosis by peptides that bind initiation factor eIF4E,"Curr. Biol., vol. 10, pp. 793-796 (2000)
【非特許文献１１】P. Li et al., "Nucleoside and oligonucleoside boranophosphates: chemistry and properties," Chem. Rev., vol. 107, pp. 4746-4796 (2007)
【非特許文献１２】B.R. Shaw et al., "CityplaceReading, Writing and Modulating Genetic Information with Boranophosphate Mimics of Nucleotides, DNA and RNA," Ann. N.Y. Acad. Sci., vol. 1201, pp23-29 (2003)
【非特許文献１３】J. Summers et al., "Boranophosphates as Mimics of Natural Phosphodiesters in DNA", Current Medicinal Chemistry, vol. 8, pp 1147-1155 (2001
【非特許文献１４】K. Misiura et al., "Synthesis of nucleoside α-thiotriphosphates via an oxathiaphospholane approach," Org. Lett., vol. 7, pp 2217-2220 (2005)
【非特許文献１５】P. Li et al., "Synthesis of α-P-modified nucleoside diphosphates with ethylenediamine," J. Am. Chem. Soc., vol. 127, pp. 16782-16783 (2005)
【非特許文献１６】N. Carrasco et al., Enzymatic synthesis of phosphoroselenoate DNA using thymidine 5‘-(α-P- seleno)triphosphate and DNA polymerase for x-ray crystallography via MAD,"J. Am. Chem. Soc., vol. 126, pp. 448-449 (2004)
【非特許文献１７】N.  Carrasco et al., Efficient enzymatic synthesis of phosphoroselenoate RNA by using adenosine 5’-(α-P-seleno)triphosphate, Angew. Chem. Int. Ed., vol. 45, pp. 94-97 (2006)
【非特許文献１８】J. Wilds et al., Selenium-assisted nucleic acid crystallography: use of phosphoroselenoates for MAD phasing of a DNA structure,"J. Am. Chem. Soc., vol. 124, pp 14910-14916 (2002)
【非特許文献１９】P.S. Pallan et al., Selenium modification of nucleic acids: preparation of phosphoroselenoate derivatives for crystallographic phasing of nucleic acid structures,"Nat. Protoc., vol. 2, pp. 640-646 (2007).
【発明の概要】
【００２２】
本願発明者らは新規なクラスのジヌクレオチドキャップ類似体を発見した。この新規なジヌクレオチドキャップ類似体は、ボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基により種々のリン酸塩位置で修飾される。新規な類似体は、キャップ化ｍＲＮＡの調製の際の試薬として広範な有用性を有する。新規な類似体はインビトロおよびインビボで安定性が増加している。新規な類似体はキャップ依存性翻訳の阻害剤として使用可能である。任意選択で、ボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基は２’−Ｏまたは３’−Ｏ−アルキル基、好ましくはメチル基を有し、ＢＨ3−ＡＲＣＡまたはＳｅ−ＡＲＣＡ
と呼ばれる類似体を生産する。ＡＲＣＡはα−、β−、またはγ−ボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基で修飾されてもよい。
【００２３】
修飾の種類および位置の選択により、ｍＲＮＡの合成、プロセシング、核−細胞質輸出、翻訳および分解の間にキャップを認識するタンパク質の活性が調節される。
表１は、化学的、生物物理学的、生化学的、および分子生物学的方法により合成および特徴付けされたか、将来合成および特徴付けられる、いくつかのＢＨ3類似体およびＳｅ
類似体を列挙している。ｍＲＮＡキャップに特に有利な化合物にはβ−ＢＨ3−ＡＲＣＡ
およびβ−Ｓｅ−ＡＲＣＡが含まれる。翻訳阻害剤として特に有利な化合物にはβ−およびγ−ＢＨ3類似体およびＳｅ類似体が含まれる。
【００２４】
【表１】
0005715560.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】５’，５’−三リン酸架橋のα位置にボラノホスフェート基を備えたキャップ類似体の合成。
【図２】５’，５’−三リン酸架橋のβ位置にボラノホスフェート基を備えたキャップ類似体の合成。
【図３】ｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇ（方法ＩＩ）の合成。
【図４】ｍ27,2 ’-OＧｐｐBH3ｐＧの合成。
【図５】ｍ27,2 ’-OＧｐｐSeｐＧの合成。
【図６】ｍ7ＧｐSeｐｐＧの合成。
【図７】ＡｐｐｐＧ（非機能キャップ類似体）、ｍ7ＧｐｐｐＧ、ｍ27,3’-OＧｐｐｐＧ、ボラノホスフェートキャップ類似体ｍ7ＧｐｐBH3ｐＧ（ジアステレオマー１：１混合物）およびｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7ＧでキャップされたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡの相対的インビトロ翻訳効率。
【図８】ボラノホスフェートキャップ類似体によるインビトロルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳阻害。
【図９】翻訳開始前に６０分間ウサギ網状赤血球溶解液でインキュベートしたボラノホスフェートキャップ類似体によるインビトロルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳阻害。
【図１０】ＡｐｐｐＧ、ｍ7ＧｐｐｐＧ、ｍ27,3’-OＧｐｐｐＧおよびホスホロセレノエートキャップ類似体ｍ27,2’-OＧｐｐSeｐＧ（Ｄ１）および（Ｄ２）でキャップされたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡのインビトロ翻訳効率。
【図１１】ホスホロセレノエートキャップ類似体によるインビトロルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳阻害。
【図１２】翻訳開始前に６０分間ウサギ網状赤血球溶解液でインキュベートしたホスホロセレノエートキャップ類似体によるインビトロルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳阻害。
【図１３】種々の類似体で５’キャップしたＡ31ポリＡテイルを備えたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡの相対的インビトロ翻訳効率。
【図１４】ヌクレオポレーション後の、種々の類似体でキャップされ６０塩基のポリ（Ａ）テイルを有する培養ＨｅＬａ細胞中のルシフェラーゼｍＲＮＡの安定性の測定値。
【図１５】ヌクレオポレーション後の、種々の類似体でキャップされ６０ヌクレオチドのポリ（Ａ）テイルを有する培養ＨｅＬａ細胞中のルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳効率。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
キャップ類似体の合成および単離
ボラノホスフェートおよびホスホロセレノエートキャップ類似体の化学合成は、他の類似体に対して報告された合成スキームを改変したものとした。M. Kadokura et al., "Efficient synthesis of -methyl-capped guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions," Tetrahedron Lett., vol. 38, pp. 8359-8362 (1997)、J. Stepinski
et al. (2001); M. Kalek et al., "Enzymatically stable 5′ mRNA cap analogs," Bioorg. Med. Chem., vol. 14, pp. 3223-3230 (2006);、およびJ. Kowalska et al. (2008)参照。
【００２７】
モノヌクレオチドは反応性のイミダゾリド誘導体に変換され、その後、これは過剰のＺｎＣｌ2の存在下でＤＭＦ中の別のモノヌクレオチドに結合される。ＺｎＣｌ2は、有機溶媒での反応物の溶解度を大きく増強し、イミダゾリド誘導体の加水分解を阻害し、反応速度を加速する。ＭｎＣｌ2、ＣｄＣｌ2またはＭｇＣｌ2等の他の金属塩化物もピロリン酸
結合の形成を媒介するために使用可能であるがが、ＺｎＣｌ2ほど一般に効率的ではない
。M. Kadokura et al., "Efficient synthesis of -methyl-capped guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions," Tetrahedron Lett., vol. 38, pp. 8359-8362 (1997を参照されたい。
【００２８】
リン酸−ボラノホスフェート結合およびリン酸−ホスホロセレノエート結合を含むキャップ類似体の合成には一般に同様の合成スキームを使用したが、ボラノホスフェート類似体の場合、結合媒介物質としてＺｎＣｌ2ではなくＭｇＣｌ2を使用すると最良の結果が得
られた。ＺｎＣｌ2の存在下でもカップリング反応は生じたが、ＺｎＣｌ2により生じる酸性条件下でのＰ−ＢＨ3結合の開裂に関する重大な副反応が伴った。
【００２９】
図１は、α位置で修飾された類似体の合成を示している。本願発明者らは、最初に中間体グアノシン５’−ボラノホスフェートの合成方法を開発した。グアノシン５’（Ｈ−ホスホネート）を、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）でシリル化した。得られた中間体であるビス（トリメチルシリル）亜リン酸を、分離せずＢＨ3・Ｓ
Ｍｅ2複合体で処理することによりボロン化した。イオン交換クロマトグラフィによりそ
の後脱シリル化および精製し、約３０％の収率で所望のグアノシン５’−ボラノホスフェートを得た。キャップ類似体ｍ7ＧｐｐｐBH3Ｇ、またはそのＡＲＣＡ相当物であるｍ27,2
’-OＧｐｐｐBH 3Ｇを得るために、グアノシン５’−ボラノホスフェートを、過剰Ｍｇ
Ｃｌ2の存在下で９：１ＤＭＦ／水混合物中で、ｍ7ＧＤＰまたはｍ27,2 ’-OＧＤＰのイ
ミダゾリド誘導体とそれぞれ結合させた。いずれの場合も、２つのＰ−ジアステレオマーの混合物が得られ、その後これは逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣにより分離された。逆相ＨＰＬＣカラムからのそれらの溶出順序に従って、ジアステレオマーにはＤ１およびＤ２と名付けた。
【００３０】
図２は、β位置で修飾された類似体の合成を示している。ボラノホスフェートトリエチルアンモニウム塩を、V. Nahum et al., "Boranophosphate salts as an excellent mimic of phosphate salts: preparation, characterization, and properties," Eur. J. Inorg. Chem., vol. 20, pp. 4124-4131 (2004)の手順の改変により得た。元の手順では、
トリス（トリメチルシリル）亜リン酸を、ＢＨ3・ＳＭｅ2複合体でボロン化した。次に適切な塩基（例えばアンモニア、トリブチルアミン等）の存在下でメタノール中で脱シリル化し、蒸発乾燥させ、対応する塩（アンモニウム、トリブチルアンモニウム等）としてボラノホスフェートを得た。しかしながら、生成物にはホスホン酸塩（２０％以下）が混在した。この混在は、おそらく完全に無水でない反応条件下（ビス化合物は後にボロン化を受けなかった）でトリス（トリメチルシリル）亜リン酸がビス（トリメチルシリル）亜リン酸へ部分加水分解した結果であると考えられた。本願発明者らは、反応液に過剰のシリル化試薬（ＢＳＡ）を加えることにより、ビス（トリメチルシリル）亜リン酸の形成が阻害され、この問題を克服した。このようにして得られたボラノホスフェートトリエチルアンモニウム塩を、過剰量のグアノシン一リン酸イミダゾリド誘導体と結合させ、対称的なジグアノシン５’,５’’−（２−ボラノトリホスフェート）を生じた（ＧｐｐBH3ｐＧ、図２）
この化合物を次にヨウ化メチルのＤＭＳＯ溶液で処理し、グアノシンのＮ７位置にメチル基を導入した。この反応は、モノメチル化キャップ類似体とジメチル化キャップ類似体（ｍ7ＧｐｐBH3ｐＧとｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇ）の混合物を生じさせた。これらの生成物の
比は反応条件の調節により制御することが可能である。約４倍の過剰量のヨウ化メチルの存在下で、主生成物（約７０％収率）としてｍ7ＧｐｐBH3ｐＧが形成された。約８倍〜１０倍の過剰量のヨウ化メチルでは、ｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇが優勢な生成物（約５０％）で
あった。しかしながら、後者の生成物に至る好ましい経路は、７−メチルグアノシンイミダゾリド誘導体とのボラノホスフェートの結合であり、これにより１つの工程からなる合成で本願発明者らは３４％の収率で生成物を分離した。図３を参照されたい。
【００３１】
β−ＢＨ3−ＡＲＣＡ（ｍ27,2 ’-OＧｐｐBH3ｐＧ）の合成に有用な中間体７，２’−
Ｏ−ジメチルグアノシン  ５’−（２−ボラノジホスフェート）（ｍ27,2 ’-OＧＤＰβ
ＢＨ3）を得る最初の試みは、うまくいかなかった。本願発明者らは、ＭｇＣｌ2の存在下で、ｍ27,2 ’-OＧＭＰ−Ｉｍと過剰のボラノホスフェートトリエチルアンモニウム塩を
結合させた。結合生成物のＭＳ  ＥＳＩ（−）分析は、所望の生成物が形成されたことを示したが、十分な量でそれを分離することは不可能であった。化合物は水溶液中で比較的速い加水分解を受け、イオン交換クロマトグラフィによる分離が実際不可能になる場合が
ある。したがって、本願発明者らは、ＭｇＣｌ2の存在下でｍ27,2 ’-OＧＭＰ−Ｉｍを過剰量のボラノホスフェートと反応させてｍ27,2 ’-OＧＤＰβＢＨ3を生成し、これを単離することなくＧＭＰ−Ｉｍと結合させることによるｍ27,2 ’-OＧｐｐBH3ｐＧの代替合成を開発した。図４を参照されたい。
【００３２】
図５は、ｍ27,2 ’-OＧｐｐSeｐＧの合成について描いている。セレノホスフェート（
ＰＳｅＯ3-3）は、R. Glass et al., "Selenophosphate," Meth. Enzymol., vol. 252, pp. 309-315 (1995)に記載の方法の改変により調製した。トリメチルシリル亜リン酸塩を
セレンのピリジン溶液で処理し、トリメチルシリルセレノホスフェートを与え、その後、これをトリエチルアミンの存在下でメタノールで脱シリル化し、セレノホスフェートトリエチルアンモニウム塩を与える。この化合物を７のイミダゾリド誘導体と結び付けられた、７，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン  ５’−モノホスフェート（ｍ27,2 ’-OＧＭＰ−
Ｉｍ）と結合させ、７，（２’−Ｏ−ジメチルグアノシン  ５’−Ｏ−（２−セレノジホスフェート）（ｍ27,2 ’-OＧＤＰβＳｅ）を与えた。無水ＺｎＣｌ2を用いてカップリング反応を媒介し、ＺｎＣｌ2はＤＭＦ中の試薬の溶解度を劇的に増加させ、反応速度も加
速させた。反応は非常に速く、本質的に１００％のｍ27,2 ’-OＧＭＰ−Ｉｍからｍ27,2 ’-OＧＤＰβＳｅへの変換が１５分後に逆相ＨＰＬＣにより観察された。ｍ27,2 ’-OＧ
ＤＰβＳｅは酸性水溶液では不安定であり（ｍ27,2 ’-OＧＭＰに加水分解される）、中
性または塩基性溶液でのみ適度に安定した。したがって、ｍ27,2 ’-OＧＤＰβＳｅの精
製中にｐＨを７以上に維持するよう注意し、これにより生成物がイオン交換クロマトグラフィ後に８０％の収率で分離されることが可能となった。その後、過剰ＺｎＣｌ2の存在
下でＧＭＰのイミダゾリド誘導体とｍ27,2 ’-OＧＤＰβＳｅを結合させた。逆相ＨＰＬ
Ｃにより２つのｍ27,2 ’-OＧｐｐSeｐＧジアステレオマーに対応する２つのピークが観
察され、これらを溶出順序に従ってＤ１およびＤ２と名付けた。しかしながら、カップリングは遅く進行し、約２日でｍ27,2 ’-OＧＤＰβＳｅの完全な消失が見られた。反応時
間を延長させるとｍ27,2 ’-OＧＤＰβＳｅからｍ27,2 ’-OＧＭＰへの部分加水分解が適度な反応収率でのみ（ＨＰＬＣで４０％変換、２５％を分離）生じた。イオン交換クロマトグラフィによる分離後のｍ27,2 ’-OＧｐｐSeｐＧのジアステレオマー混合物を逆相Ｈ
ＰＬＣで純粋なジアステレオマーに分解することに成功した。生成物を質量分析、1Ｈ  
ＮＭＲおよび31Ｐ  ＮＭＲにより特徴付け、構造および均質性を確認した。ｍ27,2 ’-O
ＧｐｐSeｐＧのＤ１およびＤ２異性体は水溶液で安定しており、大幅な加水分解も酸化も受けず、−２０℃で水分から保護された状態で少なくとも３か月間固体として保存することが可能である。
【００３３】
他のＢＨ3−およびＳｅ−類似体も図１−６に描かれたものとおおむね類似の反応によ
り生産されたか、生産されるだろう。
【００３４】
実施例１。キャップ類似体の分離および特徴付けのための一般手順。
中間体ヌクレオチドを、トリエチルアンモニウム重炭酸塩（ＴＥＡＢ）の脱イオン水溶液の直線濃度勾配でＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム（ＨＣＯ3-形式）でイオン交換クロマトグラフィにより分離した。エタノールを追加して減圧下で蒸発した後、中間体をトリエチルアンモニウム塩として分離した。最終生産物（キャップ類似体）を、半調製逆相ＨＰＬＣによりさらに分離し、真空凍結乾燥を繰り返した後、アンモニウム塩として分離した。分析ＨＰＬＣを、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．９）で０％−２５％メタノールの直線濃度勾配でＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−Ｔ  逆相カラム（４．６×２５０ｍｍおよび流量１．３ｍｌ／分）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２００シリーズの装置で行なった。化合物の溶出をＵＶ−Ｖｉｓ検出器（２６０ｎｍ）と蛍光検出器（２８０ｎｍの励起および３３７ｎｍの放出）で検知した。半調製ＨＰＬＣを、Ｗａｔｅｒｓ６００Ｅ  Ｍｕｌｔｉｓｏｌｖｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ装置およびＷａｔｅｒｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＲＰ  Ａｍｉｄｅ
Ｃ１６逆相カラム（２１．２ｍｍ×２５０ｍｍおよび流量５．０ｍｌ／分）上で、メタノールの０．０５Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．９）の直線濃度勾配で行い、２６０ｎｍでＵＶ検出した。1Ｈ  ＮＭＲおよび31Ｐ  ＮＭＲスペクトルを、それぞれ３９
９．９４ＭＨｚおよび１６１．９０ＭＨｚでＶａｒｉａｎ    ＵＮＩＴＹプラス分光計にて２５℃で記録した。1Ｈ  ＮＭＲ化学シフトを内部標準としてのナトリウム３−トリメ
チルシリル−［２，２，３，３−Ｄ４］−プロピオナートのＤ2Ｏ溶液と比較して決定し
た。31Ｐ  ＮＭＲ化学シフトを外部標準としての２０％リン酸のＤ2Ｏ溶液と比較して決
定した。エレクトロスプレイ陰イオンモードにおける質量スペクトル［（ＥＳＩ  ＭＳ（−））をＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＱＴｏＦ  １  ＭＳ分光計で記録した。溶媒および他の試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、別段の記載のない限りそれ以上の処理は行なわずに使用した。アセトニトリルとアセトンをＰ2Ｏ5で蒸留し、使用に先立って４Å分子篩いにかけて保存した。ＧＭＰおよびＧＤＰはＤｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ８イオン交換樹脂でトリエチルアンモニウム塩に変換した。ｍ27,2 ’-OＧＭＰおよびｍ27,2 ’-OＧＤＰをJ. Jemielity et al.(2003)に以前に記載されたように調製した。
【００３５】
実施例２。ヌクレオチドイミダゾリド誘導体の合成のための一般手順。
ＧＭＰ−Ｉｍ、ｍ27,2 ’-OＧＭＰ−Ｉｍ、ＧＤＰ−Ｉｍ、およびｍ27,2 ’-OＧＤＰ−Ｉｍを、T. Mukaiyama et al., "Phosphorylation by oxidation-reduction condensation. Preparation of active phosphorylating reagents," M. Bull. Chem. Soc. Jpn., vol. 44, p. 2284 (1971)に記載されているように調製した。ヌクレオチド（１当量、ＴＥ
Ａ塩）、イミダゾール（８当量）および２，２’−ジチオジピリジン（３当量）をＤＭＦ（約２．５ｍｌ／１００ｍｇのヌクレオチド）で混合した。トリエチルアミン（２当量）およびトリフェニルフォスフィン（３当量）を加え、混合物を６〜８時間撹拌した。生成物を、無水ＮａＣｌＯ4（１つの負電荷当たり１当量）の乾燥アセトン溶液（ＤＭＦ１ｍ
ｌ当たり約８ｍｌ）を用いて反応液から沈殿させた。４℃での冷却後、沈殿物をろ過し、冷却した乾燥アセトンで繰り返し洗浄し、Ｐ4Ｏ10で真空乾燥させた。収率は８０％−１
００％であった。
【００３６】
実施例３。グアノシン５’−（Ｈ−ホスホネート）。
この調製はM. Yoshikawa et al., "Studies of phosphorylation. IV. The phosphorylation of nucleosides with phosphorus trihalide," Bull. Chem. Soc. Jpn., vol. 43,
pp. 456-461 (1970)に従った。２’，３’−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデングアノシン（１
．３ｇ、４．０ミリモル）を１９．５ｍｌのトリメチルホスフェートに懸濁し、氷上で０℃に冷却した。ＰＣｌ3（１．０６ｍｌ、１２．１ミリモル）を加え、混合物を１時間０
℃で撹拌した。反応液を水（８０ｍｌ）で希釈し、固体ＮａＨＣＯ3でｐＨ約１．５に調
節し、１時間７０℃に加熱した。溶液を室温まで冷却し、ＮａＨＣＯ3でｐＨ約６に調節
し、８０ｍｌの水で希釈し、ＴＥＡＢの０−０．９Ｍ勾配でＤＥＡＥセファデックス上でクロマトグラフィにかけた。０．６−０．６５Ｍ  ＴＥＡＢで溶出し、約３．０ミリモルの生成物を含む分画を収集し、蒸発させ、Ｐ2Ｏ5で真空デシケータ中で乾燥させた。これにより１．３４ｇのグアノシン５’−（Ｈ−ホスホネート）トリエチルアンモニウム塩（収率７５％）を生成した。
【００３７】
【化１】
0005715560.tif 000003
【００３８】
実施例４。グアノシン５’−Ｏ−ボラノホスフェートトリエチルアンモニウム塩。
グアノシン５’−（Ｈ−ホスホネート）（１．０３ｇ、２．３ミリモル）を丸底フラスコに入れ、３０ｍｌの乾燥アセトニトリルに懸濁した。フラスコをゴム隔壁で密閉し、３０分間アルゴンで洗浄した。Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（１１．３ｍｌ、４６ミリモル）を注射器を通じて注入し、透明溶液が得られるまで混合物を激しく攪拌し、次にさらに３０分間撹拌した。その後、溶液を氷浴で冷却し、２Ｍ  ＢＨ3・ＳＭｅ2複合体  ＴＨＦ溶液（５．７ｍｌ、１１．５ミリモル）を加えた。５分後、フラスコを氷浴から除去し、３０分間攪拌を続けた。溶液を減圧下で油状残留物になるまで蒸発させ、氷浴に再び置き、６０ｍｌのメタノールおよび３ｍｌの２Ｍアンモニア  エタノール溶液で処理し、２時間室温で攪拌した。溶液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、１００ｍｌの水に溶解し、２０ｍｌのジエチルエーテルで一度抽出した。エーテルを減圧下で水層から除去した。生成物をＴＥＡＢの０−０．９Ｍ勾配でＤＥＡＥセファデックスで分離した。生成物の１３，２００の光学濃度ユニットを含む分画を蒸発させ、水に溶解し、凍結乾燥させ、４１０ｍｇのグアノシン５’−Ｏ−ボラノホスフェートトリエチルアンモニウム塩（３２％）を生成した。
【００３９】
【化２】
0005715560.tif 000004
【００４０】
実施例５。ｍ7ＧｐｐｐBH3Ｇの合成。
ＧＭＰＢＨ3（５０ｍｇ、０．０８９ミリモル、ＴＥＡ塩）およびｍ7ＧＤＰ−Ｉｍ（１００ｍｇ、０．１８ミリモル、ナトリウム塩）の２．５ｍｌＤＭＦ／Ｈ2Ｏ（９：１）混
合物に、無水ＭｇＣｌ2（１１０ｍｇ、１．１６ミリモル）を部分に分けて加え、試薬が
すべて溶解するまで混合物を激しく振動させた。溶液を３日間室温で攪拌し、ＥＤＴＡ（４３０ｍｇ、１．１６ミリモル）を２５ｍｌの水に入れた溶液を加えることにより反応を停止し、固体ＮａＨＣＯ3を加えてｐＨを約６に調節した。固体ＮａＨＣＯ3を加えてｐＨを約６に調節した。生成物を０−１．２Ｍ勾配のＴＥＡＢでＤＥＡＥセファデックスで分離した。ｍ7ＧｐｐｐBH3Ｇのジアステレオマー混合物を得た（６８５光学濃度ユニット）。ジアステレオマーは半調製ＨＰＬＣと凍結乾燥を３回行なって分離した。ＨＰＬＣ分離後の収率は１３．４ｍｇのｍ7ＧｐｐｐBH3Ｇ（Ｄ１）および７．３ｍｇのｍ7ＧｐｐｐBH3Ｇ（Ｄ２）（それぞれ１８％および９．８％）であった。
【００４１】
【化３】
0005715560.tif 000005
【００４２】
実施例６。ｍ27,2 ’-OＧｐｐｐBH3Ｇ。
ＧＭＰＢＨ3（３０ｍｇ、０．０５３ミリモル、ＴＥＡ塩）およびｍ27,2 ’-OＧＤＰ−Ｉｍ（６０ｍｇ、０．１１ミリモル、ナトリウム塩）の１．５ｍｌのＤＭＦ／Ｈ2Ｏ（９
：１）混合物に、無水ＭｇＣｌ2（８０ｍｇ、０．８５ミリモル）を部分に分けて加え、
試薬がすべて溶解するまで混合物を激しく振動させた。溶液を４日間室温で攪拌し、ＥＤＴＡ（３２０ｍｇ、０．８５ミリモル）を２５ｍｌの水に入れた溶液を加えることにより反応を停止し、固体ＮａＨＣＯ3を加えてｐＨを約６に調節した。生成物を０−１．２Ｍ
勾配のＴＥＡＢでＤＥＡＥセファデックスで分離した。ｍ27,2 ’-OＧｐｐｐBH3Ｇのジアステレオマー混合物を得た（５２０の光学濃度ユニット）。ジアステレオマーは半調製ＨＰＬＣと凍結乾燥を３回行なって分離した。ＨＰＬＣ分離後の収率は６．１ｍｇのｍ27,2
’-OＧｐｐｐBH3Ｇ（Ｄ１）および３．７ｍｇのｍ27,2 ’-OＧｐｐｐBH3Ｇ（Ｄ２）（それぞれ１３．４％および８．０％）であった。
【００４３】
【化４】
0005715560.tif 000006
【００４４】
実施例７。ボラノホスフェートトリエチルアンモニウム塩。
この塩はV. Nahum et al., "Boranophosphate Salts as an Excellent Mimic of Phosphate Salts: Preparation, Characterization, and Properties," J. Inorg. Chem. vol.
20, pp. 4124-4131 (2004)の手順の改変により調製した。トリス（トリメチルシリル）
亜リン酸塩（６００μｌ、１．８ミリモル）を５ｍｌの乾燥アセトニトリルを含む丸底フラスコに加えた。フラスコをゴム隔壁で密閉し、アルゴンで３０分間洗浄した。Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（１．５ｍｌ、５．４ミリモル）を注射器を通じて注入した。３０分後、溶液を氷浴で冷却し、２Ｍ  ＢＨ3・ＳＭｅ2複合体  ＴＨＦ溶液（１．３５ｍｌ）を加えた。５分後、フラスコを氷浴から除去し、３０分間攪拌を続けた。その後、溶液を油状残留物になるまで蒸発させ、氷浴に再び置き、２０ｍｌのメタノールおよび０．５ｍｌのトリエチルアミンで処理し、２時間室温で攪拌した。溶液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、残留物をＰ2Ｏ5で乾燥させた。［ＨＮ（ＣＨ2ＣＨ3）3］2ＨＰＯ3
ＢＨ3の収率は５３０ｍｇ（１７．８ミリモル）（９７％、アセトアミドが混入）であっ
た。このボラノホスフェート  トリエチルアンモニウム塩を４℃で保存し、この形式でさらなる反応に使用した。
【００４５】
【化５】
0005715560.tif 000007
【００４６】
実施例８。ＧｐｐBH3ｐＧ。
ＧＭＰのイミダゾリド誘導体（ＧＭＰ−Ｉｍ）（２００ｍｇ、０．４６ミリモル、ナトリウム塩）および以前に得られたボラノホスフェートトリエチルアンモニウム塩（７０ｍｇ、０．２３ミリモル）を４ｍｌのＤＭＦに懸濁し、無水ＭｇＣｌ2（３８０ｍｇ、４ミ
リモル）を部分に分けて加えた。１時間後、ＥＤＴＡ（１．４８ｍｇ、４ミリモル）を４０ｍｌの水に入れた溶液を加えて反応を停止し、固体ＮａＨＣＯ3を加えてｐＨを約６に
調節した。生成物をＴＥＡＢの０−１．２Ｍ勾配でＤＥＡＥセファデックスで分離した。
蒸発後、１６５ｍｇのＧｐｐBH3ｐＧ  トリエチルアンモニウム塩（２６０ｎｍで４，０
００の光学濃度ユニット）を得た（収率６５％）。
【００４７】
【化６】
0005715560.tif 000008
【００４８】
実施例９。ｍ7ＧｐｐBH3ｐＧ。
ＧｐｐBH3ｐＧ（３５ｍｇ、ＴＥＡ塩）を１．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、２０μｌの
ヨウ化メチルを加えた。４時間後、１５ｍｌの水を加えて反応を停止し、固体ＮａＨＣＯ3を加えてｐＨを約７に調節した。生成物を０−１．２Ｍ勾配のＴＥＡＢでＤＥＡＥセフ
ァデックスで分離した。ｍ7ＧｐｐBH3ｐＧ（５５０光学濃度ユニット）のジアステレオマー混合物を収集し、溶媒を蒸発させた。その後、生成物を少量の水に溶解させ、Ｄｏｗｅｘ樹脂上でナトリウム塩に変換した。ジアステレオマーを、半調製ＨＰＬＣおよび凍結乾燥を３回行なって分離した。ＨＰＬＣ分離後の収率は、ＮＨ4+塩（それぞれ３７．２％および３５．６％）として１０．２ｍｇのｍ7ＧｐｐBH3ｐＧ（Ｄ１）および９．８ｍｇのｍ7ＧｐｐBH3ｐＧ（Ｄ２）であった。
【００４９】
【化７】
0005715560.tif 000009
【００５０】
実施例１０。ｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇ（方法Ｉ）。
ＧｐｐBH3ｐＧ（５０ｍｇ、８００の光学濃度ユニット、ＴＥＡ塩）を１．０ｍｌのＤ
ＭＳＯに溶解させ、３０μｌのヨウ化メチルを加えた。２時間後、３０μｌのヨウ化メチルをさらに加えた。２時間後、１５ｍｌの水を加えて反応を停止し、固体のＮａＨＣＯ3
でｐＨを約７に調節した。生成物を０−１．２Ｍ勾配のＴＥＡＢでＤＥＡＥセファデックスで分離した。ｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇ（２００光学ユニット密度）を収集し、蒸発させ、
Ｄｏｗｅｘ樹脂でナトリウム塩に変換した。最後に、生成物をエタノールで沈降させ、Ｐ2Ｏ5で乾燥させた。その収率は２２ｍｇのｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇ（ナトリウム塩）（５４
％）であった。
【００５１】
【化８】
0005715560.tif 000010
【００５２】
実施例１１。ｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇ（方法ＩＩ）。
ｍ7ＧＭＰ（ｍ7ＧＭＰ−Ｉｍ）（２２５ｍｇ、０．５ミリモル、ナトリウム塩）のイミダゾリド誘導体およびボラノホスフェートトリエチルアンモニウム塩（７５ｍｇ、０．２５ミリモル、ナトリウム塩）を４ｍｌのＤＭＦに懸濁させ、無水ＭｇＣｌ2（３８０ｍｇ
、４つミリモル）を部分に分けて加えた。１時間後、ＥＤＴＡ（１．４８ｍｇ、４ミリモル）を４０ｍｌの水に入れたものを加えることにより反応を停止し、固体ＮａＨＣＯ3を
加えてｐＨを約６に調節した。生成物を０−１．２Ｍ勾配のＴＥＡＢでＤＥＡＥセファデックスで分離した。溶媒の蒸発後、生成物を少量の水に溶解させ、Ｄｏｗｅｘ樹脂上でナトリウム塩に変換した。エタノールによる沈澱およびＰ2Ｏ5での乾燥後、１５０ｍｇのｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇナトリウム塩が得られた（収率３４％）。（スペクトルのデータは上
記の方法Ｉの記載で与えられる。）
実施例１２。ｍ27,2 ’-OＧｐｐBH3ｐＧ。
【００５３】
ｍ27,2 ’-OＧＭＰ−Ｉｍ（１５ｍｇ、０．０３ミリモル、ナトリウム塩）およびボラ
ノホスフェートトリエチルアンモニウム塩（３０ｍｇ、０．１ミリモル）の０．５ｍｌＤＭＦの懸濁液に、無水ＭｇＣｌ2（４０ｍｇ、０．４ミリモル）を部分に分けて加え、試
薬が溶けるまで混合物を振動させた（１−２分）。その後、ＧＭＰ−Ｉｍ（４０ｍｇ、０．０９ミリモル）およびＭｇＣｌ2（４０ｍｇ）を反応液に加えた。ＥＤＴＡ（０．８ミ
リモル）を１０ｍｌの水に入れたものを加えることにより５時間後に反応を停止し、固体ＮａＨＣＯ3を加えてｐＨを約６に調節した。生成物を半調製ＨＰＬＣおよび凍結乾燥を
３回行なって分離した。収率は、ＮＨ4+塩（それぞれ１８％および１７％）として５．１ｍｇのｍ27,2 ’-OＧｐｐBH3ｐＧ（Ｄ１）および４．８ｍｇのｍ27,2 ’-OＧｐｐBH3ｐＧ（Ｄ２）であった。
【００５４】
【化９】
0005715560.tif 000011
【００５５】
実施例１３。セレノホスフェートトリエチルアンモニウム塩。
セレン（１６０ｍｇ、２ミリモル）のピリジン（１ｍｌ）懸濁液を、注射器を通じて、隔壁で密封し、かつアルゴンで洗浄したトリス（トリメチルシリル亜リン酸塩（６００μｌ、１．８ミリモル）の乾燥ＣＨ3ＣＮ（２０ｍｌ）に部分に分けて天下した。生じた溶
液室温に３０分間保持し、次に、乾燥するまで蒸発させた。その後、トリエチルアミン（５００μｌ、３．６ミリモル）のＭｅＯＨ（２０ｍｌ）溶液を加え、混合物を２時間室温で撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をメタノールで２回再度蒸発させた。油状の黄色残留物として得られた生成物をさらに処理することなく以下の反応に使用した。
【００５６】
実施例１４。７，２′−Ｏ−ジメチルグアノシン５’−Ｏ−（２−セレノジホスフェート）（ｍ27,2 ’-OＧＤＰβＳｅ）
７，２′−Ｏ−ジメチルグアノシン５’−Ｏ−ホスフェートイミダゾリド（２５０ｍｇ、０．４３ミリモル）およびセレノホスフェートトリエチルアンモニウム塩（６００μｌの（Ｍｅ3ＳｉＯ）3Ｐ）の５ｍｌ  ＤＭＦ懸濁液に、無水ＺｎＣｌ2（５９０ｍｇ、４．
３０ミリモル）を加え、試薬がすべて溶解するまで混合物を激しく振動させた（３分間）。得られた溶液を室温で２０分間攪拌させ、反応物を二ナトリウムＥＤＴＡ（１．６ｇ、４．３０ミリモル）および８００ｍｇのＮａＨＣＯ3を３００ｍｌの水に入れたものを加
えることにより停止した。必要に応じて固体ＮａＨＣＯ3を加えてｐＨを約７に調節した
。生成物を０−１．０Ｍ勾配のＴＥＡＢでＤＥＡＥセファデックスで分離した。収率はＴＥＡ塩として２５４ｍｇ（０．３５ミリモル）のｍ27,2 ’-OＧＤＰβＳｅ（８１％）で
あった。ESI MS(-) m/z:553.85（Ｃ12Ｈ18Ｎ5Ｏ10Ｐ280Ｓｅの計算値:５３３．９７）。
【００５７】
実施例１５。ｍ27,2’-OＧＰＰseｐＧ。ｍ27,2’-OＧＤＰβＳｅ（２５０ｍｇ、０．３５ミリモル）およびＧＭＰ−Ｉｍ（２５０ｍｇ、０．５０ミリモル）を、５ｍｌのＤＭＦに懸濁し、無水ＺｎＣｌ2（４８０ｍｇ、３．５ミリモル）を加えた。生じた溶液を２日
間室温で維持した。二ナトリウムＥＤＴＡ（１．３ｇ、３．５ミリモル）を１００ｍｌの水に入れたものを加えることにより反応を停止し、固体ＮａＨＣＯ3で中和した。生成物
を０−１．２Ｍ勾配のＴＥＡＢでＤＥＡＥセファデックスで分離した。最後に、ジアステレオマーを半調製ＨＰＬＣと凍結乾燥を３回行なって分離した。収率は、ＮＨ4+塩（それぞれ１３％および１１％）として４０ｍｇ（０．０４５ミリモル）のｍ27,2’-OＧｐｐSeｐＧ（Ｄ１）および３５ｍｇ（０．０４０ミリモル）のｍ27,2’-OＧｐｐSeｐＧ（Ｄ２）
であった。
【００５８】
【化１０】
0005715560.tif 000012
【００５９】
実施例１６。７−メチルグアノシン５’−Ｏ−（Ｈ−ホスホネート）。ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に溶解させたグアノシン５’−Ｏ−（Ｈ−ホスホネート）（２６０ｍｇ、０．６５ミリモル）にヨウ化メチル（３２２μｌ、５．２ミリモル）を添加し、溶液を３時間ストッパー付フラスコ中で攪拌した。反応は２００ｍｌの水で希釈することにより停止し、反応混合物をエーテルで３回抽出した。残りのエーテルを減圧下で水層から除去し、生成物をＴＥＡＢの０−０．７Ｍ勾配でＤＥＡＥセファデックスにより分離した。蒸発後およびＰ2Ｏ5での乾燥後、２００ｍｇ（０．４３ミリモル）の生成物がトリエチルアンモニウム塩（６６％）として得られた。ＥＳＩ  ＭＳ（−）ｍ／ｚ：３６０．０６（Ｃ11Ｈ15Ｎ5
Ｏ7Ｐ1、３６０．０７）。
【００６０】
実施例１７。７−メチルグアノシン  ５’−Ｏ−ホスホロセレノエート（ｍ7ＧＭＰＳ
ｅ,トリエチルアンモニウム塩）。７−メチルグアノシン  ５’−（Ｈ−ホスホネート）
（２００ｍｇ、０．４３ミリモル）を丸底フラスコに入れ、２０ｍｌの乾燥アセトニトリル中に懸濁させた。フラスコをゴム隔壁で密封し、アルゴンで３０分間洗浄した。その後、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（１１．３ｍｌ、４６ミリモル）を注射器を通じて注入した。透明溶液が得られるまで混合物を激しく攪拌し、次にさらに３０分間撹拌した。その後、セレン（４０ｍｇ、０．５ミリモル）のピリジン（０．５ｍｌ）溶液を加え、次にさらに３０分間続けて攪拌した。溶液を減圧下で蒸発させて油状残留物とし、トリエチルアミン（６０μｌ、０．４３ミリモル）のメタノール（４０ｍｌ）溶液を加え、得られた混合物を２時間撹拌した。溶液を蒸発させ、生成物を１００ｍｌの水に溶解し、ペーパーフィルターでろ過した。生成物はＴＥＡＢの０−０．９Ｍ勾配のＤＥＡＥセファデックスで分離した。蒸発および真空凍結乾燥後の分画は９３ｍｇの７−メチルグアノシン  ５’−Ｏ−ホスホロセレノエート  トリエチルアンモニウム塩（４５％）を生成した。ＥＳＩ  ＭＳ（−）ｍ／ｚ：４３９．９７（Ｃ11Ｈ15Ｎ5Ｏ7Ｐ80Ｓｅの計算値４３９．９８）。
【００６１】
実施例１８。ｍ7ＧｐSeｐｐＧ。ｍ7ＧＭＰＳｅ（１０ｍｇ、０．０２１ミリモル）およびＧＤＰ−Ｉｍ（１５ｍｇ、０．０２７ミリモル）のＤＭＦ（０．８ｍｌ）懸濁液に、無水ＺｎＣｌ2（３０ｍｇ、０．２２ミリモル）を加えた。反応を２日間室温で維持し、９
０ｍｇの二ナトリウムＥＤＴＡを１０ｍｌの水に入れたものを加えることにより停止し、
固体ＮａＨＣＯ3で中和した。ジアステレオマーは逆相ＨＰＬＣにより分離された。収率
は、ＮＨ4+塩として２ｍｇのｍ7ＧｐSeｐｐＧ（Ｄ１）および２．５ｍｇのｍ7ＧｐSeｐｐＧ（Ｄ２）（それぞれ１０％および１３％）であった。ＥＳＩ  ＭＳ（−）ｍ／ｚ：４６５．０２（Ｃ21Ｈ28Ｎ20Ｏ17Ｐ380Ｓｅの計算値８６５．００）
実施例１９。ｅＩＦ４Ｅに対する結合親和性の測定。
【００６２】
蛍光滴定測定をＬＳ−５０ＢまたはＬＳ−５５分光蛍光計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）で、２０．０±０．２℃、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴで、ＫＣｌの添加によりイオン強度を１５０ｍＭに調節して行った。種々のキャップ類似体の溶液を、濃度を増大させて、１μｌアリコートで１．４ｍｌの０．１または０．２μＭのタンパク質溶液に加えた。蛍光強度を２．２ｎｍの帯域幅の２８０ｎｍまたは２９５ｎｍの励起光と、４ｎｍの帯域幅で３３７ｎｍの検出光および２９０ｎｍのカットフィルターで測定した。データはサンプル稀釈および内部フィルタ効果について補正した。平衡結合定数（Ｋas）を、他に特記のない限りA. Nied
毆iecka et al., "Biophysical studies of eIF4E cap-binding protein: recognition of mRNA 5'cap structure and synthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1 proteins," J.
Mol. Biol., vol. 312, pp. 615-635 (2002)に記載されているように、キャップ類似体
濃度に対する蛍光強度の理論的依存性を実験データにフィットすることにより決定した。タンパク質の濃度を平衡方程式中の自由パラメータとし、「活性」タンパク質の量を決定した。最終Ｋasを３〜１０の独立した滴定の加重平均として計算し、加重の標準偏差の平方の逆数として得た。非線形最小二乗数値回帰分析をＯＲＧＩＮ６．０（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、アメリカ合衆国）を使用して行なった。
【００６３】
実施例２０。ＤｃｐＳに対する感度の分析。
ヒトＤｃｐＳをL. Cohen et al, "Nematode m7GpppG and m32,2,7GpppG decapping: activities in Ascaris embryos and characterization of C. elegans scavenger DcpS," RNA, vol. 10, pp. 1609-1624 (2004)に記載されているように大腸菌で発現した。５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、および２０％  グリセリンを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）の１５μＭ  タンパク質溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。酵素反応を、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および６０
ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む５００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）で
中で３０℃にて実行した。選択されたキャップ類似体の４０μＭ溶液を５．０μｌのＤｃｐＳで１２０分間処理した。１０、３０、６０および１２０分目に１００μｌのサンプルを反応混合物から収集し、２分間９０℃でインキュベートして不活性化した。サンプルを、分析逆相ＨＰＬＣによるさらなる処理なしで、０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．０）０−５０％、１５分間にわたるメタノールの直線濃度勾配で分析した。
【００６４】
実施例２１。ＢＨ3およびＳｅ類似体でキャップされたｍＲＮＡの合成。方法Ｉ（ｍ7ＧｐｐBH3ｐＧ（Ｄ１／Ｄ２混合物）およびｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇに対する類似体）。インビトロ転写ためのＤＮＡ鋳型を、プラスミドＳＰ６ｐ−５’ＵＴＲβ−グロビン−ルシフェラーゼからＰＣＲにより合成した。かかる鋳型は、ＳＰ６プロモータと、それに続くウサギβ−グロビンｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ配列と、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡの全コード領域とを含んでいた。通常のインビトロ転写反応混合物（５０μｌ）は、ＳＰ６転写緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、カタログ番号ＥＰ０１３１）、２ｍＭの各ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ、０．１ｍＭ  ＧＴＰおよび１ｍＭ  ジヌクレオチドキャップ類似体を含んでいた。反応混合物を３７℃で５分間インキュベートしてから、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を最終濃度が２Ｕ／μｌになるよう添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＧＴＰを１ｍＭの最終濃度となるように加え、反応をさらに９０分間続けた。その後、反応混合物を、鋳型ＤＮＡ  １μｇ当たり１ＵのＤＮａｓｅ  ＲＱ１（ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で転写緩衝液中で３７℃、２０分間処
理した。ＲＮＡ転写物をＤＥＰＣ処理セファデックスＧ−５０スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で精製した。転写物が完全なものであるか否かは、非変性１％アガロースゲルでの電気泳動により確認した。濃度は分光測光法で決定した。転写物を使用するまで−８０℃で保存した。
【００６５】
実施例２１。ＢＨ3およびＳｅ類似体でキャップされたｍＲＮＡの合成。方法ＩＩ（類
似体ｍ27,2 ’-OＧｐｐBH3ｐＧ（Ｄ１）、ｍ27,2 ’-OＧｐｐBH3ｐＧ（Ｄ２）、ｍ27,2 
’-OＧｐｐｐBH3Ｇ（Ｄ１）、ｍ27,2 ’-OＧｐｐｐBH3Ｇ（Ｄ２）、ｍ27,2 ’-OＧｐｐSeｐＧ（Ｄ１）およびｍ27,2 ’-OＧｐｐSeｐＧ（Ｄ２）、ｍ7ＧｐｐBH3ｐＧ（Ｄ１）、ｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇ、ｍ27,2 ’-OＧｐｐsｐＧ（Ｄ１）、およびｍ27,2 ’-OＧｐｐsｐＧ（Ｄ２））キャップ化されたポリアデニル化ルシフェラーゼｍＲＮＡを、ＳＰ６プロモータと、ウサギβ−グロビンｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ配列と、ホタルルシフェラーゼの全コード領域と、３１アデノシン残基とを含むｄｓＤＮＡ鋳型からのＰＣＲによりインビトロで合成した。一般的な転写反応混合物（４０μｌ）はＳＰ６転写緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、０．７μｇのＤＮＡ鋳型、１Ｕ／μｌ  ＲｉｂｏＬｏｃｋリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、０．５ｍＭの各ＡＴＰ、ＣＰＴ、およびＵＴＰ、０．１ｍＭ  ＧＴＰ、および０．５ｍＭ  ジヌクレオチドキャップ類似体を含んでいた。反応混合物を３７℃で５分間インキュベートしてから、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を最終濃度が１Ｕ／μｌになるよう添加し、続けて３７℃で３０分間インキュベートした。反応混合物を方法ＩでのようにＤＮａｓｅで処理した。ＲＮＡ転写物をＮｕｃＡｗａｙスピンカラム（Ａｍｂｉｏｎ）で精製した。方法Ｉでのように転写物と定量が完全なものであるか否かを確認した。
【００６６】
実施例２２。インビトロシステムでのキャップ化ｍＲＮＡの翻訳効率。
ミクロコッカスヌクレアーゼで処理したウサギ網状赤血球溶解液系（Ｆｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解液系、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、インビトロ翻訳に使用した。翻訳反応を、１０μｌに６０分間、３０℃で行った。通常の反応混合物は４０％の網状赤血球溶解液と、２０種類の「標準」アミノ酸（各々０．０１ｍＭ）と、ＭｇＣｌ2（１．２ｍＭ）と、
酢酸カリウム（１７０ｍＭ）と、ｍＲＮＡ（各転写物に対して５つの異なる濃度、０．２５から４μｇ／ｍｌまでの範囲に及ぶ）とを含んでいた。ルシフェラーゼ活性をルミノメータ（Ｇｌｏｍａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で測定した。線形回帰を使用してデータポイントをフィットさせ（ルシフェラーゼ活性対ｍＲＮＡ転写物の濃度）、翻訳効率はこのラインの傾きとして定義した。テストｍＲＮＡの相対的翻訳効率を、ｍ7ＧｐｐｐＧでキャッ
プ化したルシフェラーゼｍＲＮＡのそれと比較し、後者を１．０と定義した。
【００６７】
実施例２３。ＢＨ3類似体によるインビトロでのキャップ依存的翻訳の阻害。インビト
ロ翻訳反応を、キャップ依存的翻訳に好ましい状況下で１２．５μｌ、６０分間、３０℃にて行なった。ある場合には、反応混合物を６０分間３０℃でインキュベートしてからジヌクレオチドキャップ類似体（阻害剤）およびｍ7,3’-OＧｐｐｐＧキャップ化ルシフェ
ラーゼｍＲＮＡを加え、翻訳を開始した。他の場合には、生物学的安定性を分析するために、キャップ類似体を翻訳混合物中で６０分間、３０℃インキュベートしてからルシフェラーゼｍＲＮＡを加え、翻訳を開始した。通常の反応混合物は５６％の網状赤血球溶解液と、２０種類の「標準」アミノ酸（各々０．０１ｍＭ）と、ＭｇＣｌ2（１．２ｍＭ）と
、酢酸カリウム（１７０ｍＭ）と、ＲｉｂｏＬｏｃｋリボヌクレアーゼ阻害剤（０．３２Ｕ／μｌ）と、キャップ類似体溶液（合計の反応体積の１／１０）と、ｍ27,3’-OＧｐｐｐＧ−キャップ化ルシフェラーゼＲＮＡとを含んでいた。転写物はポリアデニル化されていなかったが、代わりに５９塩基の３’−ＵＴＲを有していた。反応は０．１２−１００μＭの範囲のキャップ類似体濃度で行なった。ルシフェラーゼ活性をルミノメータで測定した。測定から本願発明者らは、５０％阻害を生じさせるキャップ類似体の濃度として定義されるＩＣ５０値を計算した。プログラムＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ
）を、方程式ｑLUC＝Ｚ／＋（１＋Ｉ／ＩＣ50）＋Ｎとの曲線適合に使用した。式中、ｑLUCはキャップ類似体の存在下で合成されたルシフェラーゼ活性であり、Ｚはキャップ類似体がない状態で合成されたルシフェラーゼ活性であり、Ｎはキャップと独立した様式で合成されたルシフェラーゼ活性であり、Ｉはキャップ類似体の濃度である。データを表２に示す。
【００６８】
【表２】
0005715560.tif 000013
【００６９】
実施例２４。ＢＨ3類似体およびＳｅ類似体の生物物理学的および生化学的特徴付けの
結果。
種々のキャップ類似体の真核生物ｅＩＦ４Ｅに対する結合親和性を蛍光消光により決定
した。この生物物理学試験により、翻訳時のキャップ類似体の効能を予測することが可能である。未修飾キャップ類似体（ｍ7ＧｐｐｐＧ）よりもｅＩＦ４Ｅに対して高い類似性
を有するキャップ類似は、翻訳機に一層よく認識され、翻訳効率がより高くなると予想される。翻訳を阻害するのに自由なキャップジヌクレオチドが使用される場合、未修飾ｍＲＮＡにより効果的に競争するとも予想される。概略についてはE. Grudzien-Nogalska et al., 鉄ynthesis of anti-reverse cap analogs (ARCAs) and their applications in mRNA translation and stability,・Methods Enzymol., vol. 431, pp. 203-227 (2007)を
参照されたい。結果は、試験されたすべてのＢＨ3類似体およびＳｅ類似体の結合定数が
、その未修飾相当物の結合常数と類似するかそれより高いことを示した。表２および３を参照されたい。
【００７０】
【表３】
0005715560.tif 000014
【００７１】
実施例２５。ＢＨ3類似体およびＳｅ類似体でキャップされたｍＲＮＡの翻訳効率。
翻訳効率をインビトロ翻訳により決定した。新規な類似体でキャップされたｍＲＮＡは、未修飾の親化合物でキャップされたｍＲＮＡより一般に高い翻訳効率を有することが分かった（表４および５）。正しい方向でｍＲＮＡが組み込まれた類似体でのみ（ＢＨ3−
ＡＲＣＡ、Ｓｅ−ＡＲＣＡおよびｍ7ＧｐｐBH3ｐｍ7Ｇ）、特に高い翻訳効率が観察され
た。
【００７２】
【表４】
0005715560.tif 000015
【００７３】
【表５】
0005715560.tif 000016
【００７４】
実施例２６。ＤｃｐＳによる分解に対する新規な類似体の感受性も決定された。
予想外に、すべてのβ−ＢＨ3類似体がＤｃｐＳ（表２）による加水分解に耐性である
ことが判明した。J. Kowalskaら（２００８）は、対応するβ−ホスホロチオエートキャ
ップ類似体がすべてＤｃｐＳに弱いことを示しため、この結果は、三リン酸塩架橋の同じ位置に異なるリン酸修飾があると生化学的結果が異なり得ることを示している。Ｓｅ類似体については、対照的に、γ位置で修飾したものだけが、ＤｃｐＳに耐性であった（表３）。
【００７５】
実施例２７。インビトロのキャップ依存的翻訳の阻害剤としてのＢＨ3類似体。
２つのタイプの実験を実行した。実験の一方のセット（条件Ａ）では、キャップ類似体をルシフェラーゼｍＲＮＡと一緒に翻訳システムに加えた。実験の他方のセット（条件Ｂ）では、ｍＲＮＡの添加前にキャップ類似体を６０分間の翻訳系でインキュベートした。いずれのタイプの実験でも、ＢＨ3類似体およびＳｅ類似体は、翻訳（表２および３）の
強い阻害剤であることが分かった。さらに、ｍ7ＧｐｐｐＧとは対照的に、これらの類似
体のうちのいくつかのインキュベーションはそれ自信の阻害作用を損なわず、これはおそらくピロホスファターゼ攻撃に対する抵抗を反映している。翻訳系ではＤｃｐＳによる加
水分解への耐性と類似体の安定性との間に相関があった。
【００７６】
実施例２８。翻訳効率の測定および培養ＨｅＬａ細胞の中でのｍＲＮＡの減少
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ（Ａｍａｘａバイオシステムズ社）を使用し、製造業者の推奨プロトコルに従い、ＨｅＬａ細胞へＲＮＡを導入した。１μｇのＲＮＡを、プログラムＴ−０２４を使用してＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（Ｖ）で１０6個の細胞に導
入した。
【００７７】
ルシフェラーゼ合成を測定するために、細胞をいくつかのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに分け、３７℃の湯浴に入れて振動させる。タンパク質を抽出するため、２×１０5個の
細胞を２００μｌのルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に溶解した。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を製造業者の推奨プロトコルにより測定した。
【００７８】
ｍＲＮＡの安定性を測定するために、細胞を３５ｍｍの細胞培養皿に分配し、３７℃で５％のＣＯ2高湿度に配置した。細胞を種々の時間に採集し、ＰＢＳで２回洗った。細胞
質ＲＮＡを抽出するために、２×１０5細胞を、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｍ
ｇＣｌ2、０．５％（ｖ／ｖ）のイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ、シグマ社）および１ｍＭ  
ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の１７５μｌに溶解した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｍｉｎｉキットでさらに精製し、リアルタイムＰＣＲで分析した。５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００μＭ  各ｄＮＴＰ、２．５μＭ  
ランダム壁サマー、０．２ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤および０．８ユニットのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む２０μｍの反応混合物で、４００ｎｇのＲＮＡに対して逆転写を行なった。反応混合物を２５℃で１０分間、４８℃で３０分間、および９５℃で５分間インキュベートした。定量的リアルタイムＰＣＲを、Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒツール（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて、各ｍＲＮＡに対して設計された特定のプライマーに対して行なった。ルシフェラーゼｍＲＮＡのレベルを、５’端部から２２６−３９８の塩基を増幅するよう設計されたプライマーを使用してＰＣＲにより決定した。マウスＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルを、同じ方法により（コントロールとして）、マウスＧＡＰＤＨに特異的なプライマーを使用して決定した。増幅および検出は、５μｌの転写反応混合物（５０ｎｇのｃＤＮＡ）、１２．５μｌのＩＱ  ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘおよび０．３ｍＭのプライマー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含む２５μｌの反応混合物で、ｉＣｙｃｌｅｒ  ＩＱリアルタイムＰＣＲ検出系で行なった。インキュベーションはポリメラーゼ活性が３分、９５℃であり、その後に４０サイクル、すなわち９５℃で１５秒および６０℃で１分のそれぞれが続く。ルシフェラーゼｍＲＮＡのレベルを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システムに対するユーザー会第２番に記載されているような絶対標準曲線法を使用して計算した。その後、ルシフェラーゼｍＲＮＡを、細胞抽出物から精製した全細胞ＲＮＡの指標である各サンプル中のマウスＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定レベルとの比較により正規化した。各時点で残っているルシフェラーゼｍＲＮＡをゼロ時間に存在するＲＮＡのパーセントに対して変換し、ｔ1/2を決定すべく、ｌｏｇ10（［ＲＮＡ］）対時間をプロットした。結果を図１４に
示す。
【００７９】
ルシフェラーゼ合成速度をゼロ時間の細胞中のルシフェラーゼｍＲＮＡの濃度に正規化することにより、種々のルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳効率を決定した。結果を図１５に示す。
【００８０】
さらなる実施例
本発明の範囲内の組成物および方法の例には以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８１】
１つまたは複数の以下の化合物、１つまたは複数の以下の化合物の立体異性体、１つまたは複数の以下の化合物の複数の立体異性体の混合物、もしくは該化合物、該立体異性体、および該混合物のいずれかの１つまたは複数の塩を含む組成物。
【００８２】
【化１１】
0005715560.tif 000017
【００８３】
（式中、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3およびＹ4はＯ、ＢＨ3およびＳｅから成るグループから選択され；
種々のＹi基は同じであっても異なっていてもよく、ｉは１、２，３または４であり；
少なくとも１つのＹiはＢＨ3またはＳｅであり；
ｎは０または１であり；
Ｒは
【００８４】
【化１２】
0005715560.tif 000018
【００８５】
から成るグループから選択され：
Ｒ3とＲ4は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3から成るグループから選択され；
Ｒ3とＲ4は同じであっても異なっていてもよく；
Ｗは
【００８６】
【化１３】
0005715560.tif 000019
【００８７】
から成るグループから選択され；
Ｒ1とＲ2は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ3またはＯＣＨ2ＣＨ3から成るグループから選択され；
Ｒ1とＲ2は同じであっても異なっていてもよく；かつ
Ｘはメチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、置換ベンジル、メチレンナフチル、および置換メチレンナフチルから成るグループから選択される。）
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3およびＹ4はＯおよびＢＨ3から成るグループから選択され；種々のＹi基は同じであっても異なっていてもよく、ｉは１、２，３または４であり；かつ少なくとも１つのＹiはＢＨ3である上記組成物。
【００８８】
Ｒが
【００８９】
【化１４】
0005715560.tif 000020
【００９０】
から成るグループから選択される上記組成物。
Ｒ3はＯＨ、Ｒ4はＯＨであり
Ｒが
【００９１】
【化１５】
0005715560.tif 000021
【００９２】
から成るグループから選択されると、Ｒ1およびＲ2はいずれもＯＨでない上記組成物。
Ｗが
【００９３】
【化１６】
0005715560.tif 000022
【００９４】
であり；Ｒ2はＯＨであり；Ｒ1はＨまたはＯＣＨ3であり；Ｘはメチルであり；ｎ＝０で
あり；Ｙ1、Ｙ2およびＹ3のうちの１つだけがＢＨ3である上記組成物。
ｎ＝０である場合、Ｙ2またはＹ3がＢＨ3であり；ｎ＝１である場合、Ｙ2、Ｙ3または
Ｙ4がＢＨ3である；上記組成物。
【００９５】
５’末端に上記組成物を組み込んでいるＲＮＡ分子。
Ｒが
【００９６】
【化１７】
0005715560.tif 000023
【００９７】
から成るグループから選択される上記組成物。
インビトロまたはインビボで上記ＲＮＡ分子を合成する方法であって、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰ、上記組成物、ならびにポリヌクレオチド鋳型を、ＲＡＮポリメラーゼの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼによるポリヌクレオチド鋳型のＲＮＡコピーへの転写を誘導する条件下で反応させることを含み、それによりいくつかのＲＮＡコピーが前記組成物を組込んで上記ＲＮＡ分子を製造する方法。
【００９８】
タンパク質またはペプチドをインビトロで合成する方法であって、オープンリーディングフレームを有する上記ＲＮＡ分子を、該オープンリーディングフレームによってコード化されたタンパク質またはペプチドへ翻訳するよう誘導する条件下で、無細胞タンパク質合成系で翻訳することを含む方法。
【００９９】
インビボまたは培養細胞でタンパク質またはペプチドを合成する方法であって、オープンリーディングフレームを有する上記ＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子のオープンリーディングフレームを該オープンリーディングフレームによってコード化されたタンパク質またはペプチドへ翻訳するよう誘導する条件下で、インビボまたは培養細胞で翻訳することを含む方法。
【０１００】
ＲＮＡのタンパク質またはペプチドへの翻訳を全部または部分的に阻害するのに有用な量で、ＲＮＡをタンパク質またはペプチドに翻訳する系へ上記組成物を投与することを含む方法。
【０１０１】
前記系は生物体の未変性ＲＮＡ翻訳系であり、前記方法は該生物体へ組成物をインビボ投与することを含む上記方法。
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3およびＹ4はＯおよびＳｅから成るグループから選択され；種々のＹi基
は同じであっても異なっていてもよく、ｉは１、２，３または４であり；かつ少なくとも１つのＹiはＳｅである上記組成物。
【０１０２】
Ｒが
【０１０３】
【化１８】
0005715560.tif 000024
【０１０４】
から成るグループから選択される上記ＲＮＡ分子。
Ｒ3はＯＨ、Ｒ4はＯＨであり
Ｒが
【０１０５】
【化１９】
0005715560.tif 000025
【０１０６】
から成るグループから選択されると、Ｒ1およびＲ2はいずれもＯＨでない上記組成物。
Ｗが
【０１０７】
【化２０】
0005715560.tif 000026
【０１０８】
であり、Ｒ2はＯＨであり；Ｒ1はＨまたはＯＣＨ3であり；Ｘはメチルであり；ｎ＝０で
あり；かつＹ1、Ｙ2およびＹ3のうちの１つだけがＳｅである上記組成物。
ｎ＝０の場合、Ｙ2またはＹ3がＳｅであり；ｎ＝１の場合、Ｙ2、Ｙ3またはＹ4はＳｅ
である上記組成物。
【０１０９】
Ｒ1はＯＣＨ3であり；Ｒ2はＯＨであり；Ｒ3はＯＨであり；Ｒ4はＯＨであり；ｎは０
であり；Ｙ1はＯであり；Ｙ2はＳｅであり；Ｙ3はＯであり；Ｗは
【０１１０】
【化２１】
0005715560.tif 000027
【０１１１】
であり、Ｒは
【０１１２】
【化２２】
0005715560.tif 000028
【０１１３】
である上記組成物。
５’末端に上記組成物を組込んでいるＲＮＡ分子。
Ｒは
【０１１４】
【化２３】
0005715560.tif 000029
【０１１５】
から成るグループから選択される上記ＲＮＡ分子。
インビトロまたはインビボで上記ＲＮＡ分子を合成する方法であって、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰ、上記組成物、ならびにポリヌクレオチド鋳型を、ＲＡＮポリメラーゼの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼによるポリヌクレオチド鋳型のＲＮＡコピーへの転写を誘導する条件下で反応させることを含み、それによりいくつかのＲＮＡコピーが前記組成物を組込んで上記ＲＮＡ分子を製造する方法。
【０１１６】
タンパク質またはペプチドをインビトロで合成する方法であって、オープンリーディングフレームを有する上記ＲＮＡ分子を、オープンリーディングフレームによってコード化されたタンパク質またはペプチドへ翻訳するよう誘導する条件下で、無細胞タンパク質合
成系で翻訳することを含む方法。
【０１１７】
インビボまたは培養細胞でタンパク質またはペプチドを合成する方法であって、オープンリーディングフレームを有する上記ＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子のオーブンリーディングフレームを該オープンリーディングフレームによってコード化されたタンパク質またはペプチドへ翻訳するよう誘導する条件下で、インビボまたは培養細胞で翻訳することを含む方法。
【０１１８】
ＲＮＡのタンパク質またはペプチドへの翻訳を全部または部分的に阻害するのに有用な量で、ＲＮＡをタンパク質またはペプチドに翻訳する系へ上記組成物を投与することを含む方法。
【０１１９】
前記系は生物体の未変性ＲＮＡ翻訳系であり、前記方法は該生物体へ組成物をインビボ投与することを含む上記方法。
本明細書に引用されたすべての文献の全開示を本明細書に援用する。両立しない矛盾がある場合は、この明細書が効力を持つものとする。
【図１】
0005715560.tif 000041
【図２】
0005715560.tif 000042
【図３】
0005715560.tif 000043
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005715560.tif 000047
【図８】
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【図９】
0005715560.tif 000049
【図１０】
0005715560.tif 000050
【図１１】
0005715560.tif 000051
【図１２】
0005715560.tif 000052
【図１３】
0005715560.tif 000053
【図１４】
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【図１５】
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