(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを、合計２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上含有するコーヒー焙煎豆又はそのコーヒー焙煎豆の抽出物を有効成分とすることを特徴とする分泌型ＩｇＡ産生誘導剤。
【請求項２】
請求項１に記載の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法であって、
前記コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にすることを特徴とする分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法。
【請求項３】
前記コーヒー焙煎豆の抽出物は、前記コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にした後、該コーヒー焙煎豆から抽出することによって得られることを特徴とする請求項２に記載の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法。
【請求項４】
前記コーヒー焙煎豆の抽出物は、前記コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜７２時間保持した後、該コーヒー焙煎豆から抽出することによって得られることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法。
【請求項５】
前記コーヒー焙煎豆の抽出物は、前記コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜７２時間保持した後、０℃〜−３０℃で保存した該コーヒー焙煎豆から抽出することによって得られることを特徴とする請求項２〜請求項４のいずれか一項に記載の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法。
【請求項６】
前記コーヒー焙煎豆の抽出物は、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンが、合計２３．２ｍｇ／Ｌ以上含有する、又は前記コーヒー焙煎豆の抽出物について、下記の式（１）が成立することを特徴とする請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法。
式（１）：（Ａ／Ｂ）×１０００  ≧２３．９、（Ａは、前記コーヒー焙煎豆の抽出物に含まれる２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンの合計含有量(ｍｇ／Ｌ)であり、Ｂは、前記コーヒー焙煎豆の抽出物に含まれるカフェインの含有量(ｍｇ／ｍｌ)である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤、及び分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の免疫機能の多くは、粘膜が担っている。特に腸管粘膜を含む消化管の粘膜は、外界から侵入してくる細菌、ウイルス、生体に害を与える各種抗原などに対する免疫機能を担う。腸管粘膜における免疫機能として分泌型ＩｇＡによる免疫機能がある。腸管表面には、パイエル板（Ｐａｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈ）が点在している。パイエル板は、分泌型ＩｇＡを放出する。分泌型ＩｇＡが、抗原やウイルスを捕捉して、糞便として体外へ排出することによって生体内へ抗原やウイルスが侵入することを防ぐ。この免疫機能により、様々な感染症、炎症性腸疾患、あるいはアレルギー疾患など様々な疾患を防ぐことができることから、腸管粘膜等の粘膜面には、十分に分泌型ＩｇＡが産生誘導されていることが望ましい。
【０００３】
コーヒー由来の成分の中には、分泌型ＩｇＡの産生誘導作用のあるものが知られている。例えば、特許文献１には、コーヒー焙煎豆から得られたマンノースを主体としたオリゴ糖類を主成分とする分泌型ＩｇＡの産生誘導作用を有する組成物が報告されている。また、特許文献２には、コーヒー抽出物に含有されるアラビノガラクタンを有効成分とする分泌型ＩｇＡの産生誘導作用を有する免疫賦活剤が報告されている。
【０００４】
上記の組成物は、特に体液性・細胞性免疫に関与するＴリンパ球を活性化することによって、結果的に分泌型ＩｇＡの産生誘導が活性化されることになる。また、上記の免疫賦活剤においても、ＩＬ−１２（インターロイキン−１２）の産生またはＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）の産生を増強することによって、結果的に分泌型ＩｇＡの産生誘導が活性化されることになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−０５１５８２号公報
【特許文献２】特開２００９−１４９５２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載のマンノースを主体としたオリゴ糖類を得るためには、コーヒー焙煎豆を、酸加水分解、高温加熱加水分解、酵素加水分解、微生物発酵の中から選ばれる１種または２種以上の方法で処理し、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理、イオン交換膜処理等の方法で分離精製するという煩雑な工程を行う必要がある。さらに、これら工程には種々の設備が必要になるため、設備を揃えるためのコストが非常に高くなる。また、特許文献２に記載の免疫賦活剤を得るためには、コーヒー焙煎豆に、水を添加し加熱する工程、加熱抽出液を回収し、減圧濃縮する工程、減圧濃縮した液体にエタノールを加えて沈殿させる工程など種々の工程を行う必要がある。
【０００７】
したがって、特許文献１や特許文献２に記載の技術では、免疫賦活作用を有する組成物や免疫賦活剤を簡便に製造することは困難であり、また設備を揃えるためにコストがかかるため、安価に製造することは困難であるという問題がある。
【０００８】
本発明は、上記問題を解決するためになされたものであり、簡便で安価に製造することが可能な分泌型ＩｇＡ産生誘導剤、及び分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤は、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを、合計２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上含有するコーヒー焙煎豆又はそのコーヒー焙煎豆の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１０】
本発明の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤は、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを、合計２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上含有するコーヒー焙煎豆又はそのコーヒー焙煎豆の抽出物を有効成分とすることによって、分泌型ＩｇＡの産生量を高くする効果を奏する。分泌型ＩｇＡは、例えば腸管表面に点在しているパイエル板から放出され、分泌型ＩｇＡ産生量の向上は、腸管粘膜における免疫機能の向上につながる。
【００１１】
さらに、コーヒー焙煎豆又はそのコーヒー焙煎豆の抽出物は、食用に供される天然由来の物であるため、本発明の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤は、長期的に連続して使用しても人体への安全性が高く、副作用の心配をする必要がなく使用することができる。
【００１２】
本発明の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤は、飲食品や医薬品として経口摂取することができる。飲食品としては、例えば、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品、ドリンク剤などであってもよい。飲食品として用いられる場合には、例えば、顆粒、飴、ゼリー、飲料等の形態で用いることができる。また、医薬品として用いられる場合には、製剤形態については特に限定されるものではなく、例えば、液剤、錠剤、散剤、シロップ剤等の形態で用いることができる。
【００１３】
また、本発明の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤は、ヒト以外の、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、猿等の哺乳動物に対しても適用することができる。
コーヒー豆は、常法に従って焙煎することができる。例えば、熱風式ドラム焙煎機を用い、熱風温度４００−５００℃で２０分間程度行うなどの焙煎方法がある。
【００１４】
焙煎されるコーヒー豆は、適宜選択して使用できる。単一の種類のコーヒー豆や、複数の種類のコーヒー豆をブレンドしたコーヒー豆であってもよい。
コーヒー焙煎豆の抽出物は、従来公知のコーヒー焙煎豆の抽出方法を適宜選択して行うことによって得ることができる。抽出方法としては、例えば、ドリップ式抽出法、浸漬抽出法、サイフォン式抽出法、エスプレッソ式抽出法等が挙げられる。
【００１５】
本発明の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法は、前記コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にすることを特徴とする。
本発明の製造方法で製造した分泌型ＩｇＡ産生誘導剤は、上記と同様の効果を奏する。
【００１６】
本発明の製造方法が、分泌型ＩｇＡの産生量を高くする効果を奏することができる理由は、次のように推測される。
コーヒー焙煎豆は、焙煎過程で発生した大量の炭酸ガスを焙煎豆内部に保持している。また、焙煎過程では、コーヒー豆に含まれる炭水化物などから、メイラード反応によって香気成分が生じる。香気成分には、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンが含まれる。なお、その他の香気成分としては、例えばアセトアルデヒド、ギ酸メチル、プロピオンアルデヒド、アセトン、２−メチルフラン、２−ブタノン、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、フルフラール、酢酸フルフリルなども含まれる。焙煎過程で生じた香気成分を含む炭酸ガスは、焙煎直後から不可逆的な散逸を続ける。さらに、コーヒー焙煎豆中に保持された炭酸ガスは、保持する環境の温度が高いほど、散逸速度は速い。コーヒー焙煎豆を焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にすることによって、焙煎直後から始まる２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを含む香気成分の散逸が大きく抑制できる。したがって、コーヒー焙煎豆には、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンが、合計２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上含有するので、本発明の製造方法によれば分泌型ＩｇＡの産生量を高くする効果を奏することができる。
【００１７】
焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にするには、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下に冷却すると好ましい。
焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にするには、特殊な冷却機器は必要なく、通常使用される冷却機器で冷却し保持することができる。冷却機器としては、例えば、空冷ファン、ブラストフリーザー、トンネルフリーザー、スパイラルフリーザー等が挙げられる。
【００１８】
本発明の製造方法で有効成分として使用されるコーヒー焙煎豆の抽出物は、コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にした後、該コーヒー焙煎豆から抽出することによって得られると好ましい。
【００１９】
コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にした場合には、コーヒー焙煎豆からの２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを含む香気成分の散逸を防ぐことができる。したがって、このコーヒー焙煎豆には、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンが、合計２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上含有するので、本発明の製造方法によれば分泌型ＩｇＡの産生量を高くする効果を奏することができる。
【００２０】
また、コーヒー焙煎豆の抽出物は、コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜７２時間保持した後、該コーヒー焙煎豆から抽出することによって得られると好ましい。より好ましくは、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜４８時間保持した後、該コーヒー焙煎豆から抽出することによって得られると好ましい。さらに好ましくは、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、ただちに該コーヒー焙煎豆から抽出することによって得られると好ましい。
【００２１】
コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜７２時間保持した場合においても、上記と同様にコーヒー焙煎豆からの２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを含む香気成分の散逸を防ぐことができる。したがって、このコーヒー焙煎豆には、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンが、合計２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上含有するので、本発明の製造方法によれば分泌型ＩｇＡの産生量を高くする効果を奏することができる。
【００２２】
焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜７２時間保持するには、特殊な冷却機器は必要なく、通常使用される冷却機器で冷却し保持することができる。冷却機器としては、例えば、空冷ファン、ブラストフリーザー、トンネルフリーザー、スパイラルフリーザー等が挙げられる。
【００２３】
また、コーヒー焙煎豆の抽出物は、前記コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜７２時間保持した後、０℃〜−３０℃で保存した該コーヒー焙煎豆から抽出することによって得られると好ましい。
【００２４】
コーヒー焙煎豆を、焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜７２時間保持した後、０℃〜−３０℃で保存した場合においても、上記と同様にコーヒー焙煎豆からの２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを含む香気成分の散逸を防ぐことができる。したがって、このコーヒー焙煎豆には、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンが、合計２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上含有するので、本発明の製造方法によれば分泌型ＩｇＡの産生量を高くする効果を奏することができる。
【００２５】
焙煎直後から１５分以内の間に２８℃以下にし、２８℃〜−３０℃の温度で０〜７２時間保持し、０℃〜−３０℃で保存するには、特殊な冷却機器は必要なく、通常使用される冷却機器で冷却し保持することができる。冷却機器としては、例えば、空冷ファン、ブラストフリーザー、トンネルフリーザー、スパイラルフリーザー等が挙げられる。
【００２６】
前記コーヒー焙煎豆の抽出物には、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンが、合計２３．２ｍｇ／Ｌ以上含有する、又は前記コーヒー焙煎豆の抽出物については、下記の式（１）が成立すると好ましい。
式（１）：（Ａ／Ｂ）×１０００  ≧２３．９、（Ａは、前記コーヒー焙煎豆の抽出物に含まれる２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンの合計含有量(ｍｇ／Ｌ)であり、Ｂは、前記コーヒー焙煎豆の抽出物に含まれるカフェインの含有量(ｍｇ／ｍｌ)である。）
本発明の製造方法で有効成分として使用されるコーヒー焙煎豆の抽出物に、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンが、合計２３．２ｍｇ／Ｌ以上含有する場合、又は、式（１）が成立する場合、分泌型ＩｇＡの産生量を高くするのに十分な量の２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを含有することになる。したがって、本発明の製造方法によれば分泌型ＩｇＡの産生量を高くする効果を奏することができる。
【００２７】
抽出物は、コーヒー焙煎豆によって抽出率に差が生じ成分濃度が変化する。成分濃度の変化に対応するため、式（１）では、コーヒー抽出物中のカフェイン含有量に対する、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンの合計含有量の割合を算出している。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】常温保持時間とピラジン類合計含有量との関係を示すグラフである。
【図２】種々温度で７２時間保持した場合の保持温度とピラジン類合計含有量との関係を示すグラフである。
【図３】コーヒー焙煎豆を常温で７２時間保持後、種々温度で５日間保存した場合の保存温度とピラジン類合計含有量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
次に、本発明の実施形態について一例を挙げて説明する。但し、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
１．分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法
（分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１）
（１）焙煎：コーヒー豆（ブラジルサントスＮｏ．２）を、家庭用焙煎機ｉ‐ＲＯＡＳＴ（Ｈｅａｒｔｈｗａｒｅ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ製）を使用して色差計ＮＤ１００１ＤＰ（日本電色工業社製）による色調のＬ値が２２になるまで焙煎した。
（２）保存：焙煎後、１５分以内の間に２８℃以下にし、アルミパウチに入れて密閉し、０℃に冷却し５日間保存した。
（３）抽出：５日間保存したコーヒー焙煎豆は、直ちにボンマックコーヒーカッターＢＭ６５０（ラッキーコーヒーマシーン社製）を使用して挽き豆にした。その後、挽き豆と熱湯の比率が１：１０の比率になるように混合して混合液を調製し２分間静置した。静置後に、混合液を数回攪拌し、カリタ式ペーパードリッパーを用いてろ過し、ろ過液を回収し、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１とした。
（分泌型ＩｇＡ産生誘導剤２）
（１）焙煎は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行った。
（２）保持：焙煎後、１５分以内の間に２８℃以下にし、４８時間常温保持した。なお、常温とは２８℃のことである（以下同様）。
（３）保存、（４）抽出は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行い、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤２を得た。
（分泌型ＩｇＡ産生誘導剤３）
（１）焙煎は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行った。
（２）保持：焙煎後、１５分以内の間に２８℃以下にし、７２時間常温保持した。
（３）保存、（４）抽出は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行い、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤３を得た。
（比較例１）
（１）焙煎は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行った。
（２）保持：焙煎後、１５分以内の間に２８℃以下にし、９６時間常温保持した。
（３）保存、（４）抽出は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行い、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤を得た。
（比較例２）
（１）焙煎は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行った。
（２）保持：焙煎後、１５分以内の間に２８℃以下にし、１６８時間常温保持した。
（３）保存、（４）抽出は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行い、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤を得た。
（比較例３）
（１）焙煎は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行った。
（２）保持：焙煎後、１５分以内の間に２８℃以下にし、３３６時間常温保持した。
（３）保存、（４）抽出は、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１と同様に行い、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤を得た。
２．分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の評価
（１）分泌型ＩｇＡ産生誘導剤のカフェイン含有量に対する２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン合計含有量の割合の評価
なお、２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンを以下ピラジン類と称する。
（１−１）分泌型ＩｇＡ産生誘導剤のピラジン類の合計含有量の測定
ピラジン類含有量をＧＣ−ＭＳ（Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、ガスクロマトグラフ質量分析）によって以下の（ｉ）、（ｉｉ）の手順で測定した。
【００３０】
（ｉ）ＧＣ−ＭＳ分析用サンプルの調製
分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１を、適宜希釈した後、アセトニトリルを用いて活性化させた固相カラム（Ｖａｌｉａｎ製、ＢＯＮＤＥＬＵＴ  ＪＲ−Ｃ１８）に対して２ｍＬ注入し、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤中に含まれるピラジン類を吸着させた。その後、アセトニトリルを用いて、２ｍｌ×２回溶出を行った。溶出画分は限外濾過フィルター（ＤＩＳＭＩＣ１３ＪＰ、孔径０．２５μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）にてろ過し、ろ液を分析用サンプルとして使用した。
【００３１】
分泌型ＩｇＡ産生誘導剤２、３、及び比較例１〜比較例３の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤についても、上記と同様に分析用サンプルを調製した。
（ｉｉ）ＧＣ−ＭＳ分析条件
ＧＣ−ＭＳ分析条件は以下に示す通りである。
【００３２】
測定機器：ＧＣ（７８９０Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）），ＭＳ（７０００Ｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）），カラム（ＶＦ−ＷＡＸ  ０．２５ｍｍ×６０ｍ（Ｖａｒｉａｎ製）），注入口温度：２５０℃，昇温条件：５０℃で５分保持、２５０℃まで８℃／ｍｉｎで昇温後、１０分保持，イオン源温度：２３０℃，キャリアーガス：ヘリウム，スキャンモード：イオン化電圧  ７０ｅＶ，スプリットレス
（１−２）分泌型ＩｇＡ産生誘導剤のカフェイン含有量の測定
カフェイン含有量をＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析によって以下の（ｉ）、（ｉｉ）の手順で測定した。ＨＰＬＣ分析用サンプルは、２．（１）の記載と同様の方法で調製した。
【００３３】
（ｉ）ＨＰＬＣ分析条件
ＨＰＬＣ分析条件は以下に示す通りである。
測定機器：ＵＶ−ＶＩＳ検出器：ＳＰＤ−１０Ａｖｐ（（株）島津製作所），カラムオーブン：ＣＴＯ−１０Ａｖｐ（（株）島津製作所），ポンプ：ＬＣ−１０ＡＴｖｐ（（株）島津製作所），カラム：Ｓｈｉｍｐａｃｋ ＯＤＳ−ＦＣ  内径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ（（株）島津製作所），サンプル注入量：２０μＬ，流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ−ＶＩＳ検出器設定波長：２７０ｎｍ，カラムオーブン設定温度：４０℃，溶出溶媒：溶離液Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．６）），溶離液Ｂ（アセトニトリル）
（ｉｉ）ＨＰＬＣ分析結果
上記（ｉ）に記載の条件下、溶解液Ａ，Ｂを用いて、下記に示す濃度勾配条件によってアセトニトリル濃度勾配をつけて、カフェインを溶出させた。
（濃度勾配条件）
時間          溶離液Ａ    溶離液Ｂ
０．００分      ９３％        ７％
６．００分      ９３％        ７％
２０．００分      ８０％      ２０％
２０．０１分      ５０％      ５０％
２５．００分      ５０％      ５０％
２５．０１分      ９３％        ７％
３５．００分      ９３％        ７％
（１−３）測定結果
上記（１−１）で測定したピラジン類合計含有量、及び上記（１−２）で測定したカフェイン含有量は、表１に示す通りであった。また、式（１）のパラメータを算出した。
【００３４】
式（１）：（Ａ／Ｂ）×１０００（Ａは、コーヒー焙煎豆の抽出物に含まれる２−メチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジンの合計含有量(ｍｇ／Ｌ)であり、Ｂは、コーヒー焙煎豆の抽出物に含まれるカフェインの含有量(ｍｇ／ｍｌ)である。）
その結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
0005828771.tif 000002
【００３６】
表１に示すように、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３においては、ピラジン類合計含有量は２３．２ｍｇ／Ｌ以上であり、式（１）を用いて算出された値は２３．９以上であることが示された。
【００３７】
なお、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３、及び比較例１〜３の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤は、コーヒー焙煎豆によって抽出率に差が生じ成分濃度が変化することがある。この場合でも、式（１）を用いれば、成分濃度が変化しても、コーヒー焙煎豆の抽出物に含まれるピラジン類合計含有量を適切に評価することができる。
（２）分泌型ＩｇＡ産生誘導作用試験
分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３、及び比較例１〜３の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤について、分泌型ＩｇＡ産生誘導作用を試験した。試験方法は次のとおりとした。
（ｉ）試験用サンプルの調製
生後６週令のＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウス雄性を１週間固形飼料(日本クレア製  ＣＥ−２)で予備飼育した後、平均体重が均等になるように群分けした。各々の群のＩＣＲマウスに対して、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１を、ゾンデを用いて胃内に強制的に注入する強制経口投与を行った。投与量は、ヒトにおいてコーヒーカップ４杯分の摂取量に相当する、６００ｍｌ／日とした。飼料および水は自由摂取とした。排泄から２４時間以内の糞便を採取した後、予備凍結を経て、凍結乾燥を行った。乾燥糞便に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｇ／ｍｌ濃度となるように加え、ホモジナイザーにより均質化した。その後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分、５℃）し上清を試験用サンプルＡとした。なお、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤２、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤３、及び比較例１〜比較例３の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤を用いた場合も、上記と同様に試験用サンプルを調製し、それぞれを、サンプルＢ，サンプルＣ，サンプルＤ，サンプルＥ，サンプルＦとした。
（ｉｉ）分泌型ＩｇＡ濃度の測定
分泌型ＩｇＡ濃度の測定は、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製）を用い、そのプロトコールに従って行った。
【００３８】
プロトコールに従った測定方法について次に説明する。
ヤギ抗マウスＩｇＡ抗体を１次抗体として、各ウェルに注入した後、一晩コーティング処理を行った。翌日、各ウェルを、０．０５%ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ,０．１４Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）（洗浄液Ａ）で５回洗浄し、各ウェルに１％ＢＳＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、２５℃で３０分間ブロッキングした。適当な濃度に希釈した試験用サンプルＡ〜ＦとマウスＩｇＡ抗体の標準品を、１％ＢＳＡ，０．０５%ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ,０．１４Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈した。各ウェルを５回洗浄液Ａで洗浄後、サンプルＡ〜サンプルＦのそれぞれと、マウスＩｇＡ抗体の標準品とを加えて２５℃で１時間保持した。その後、各ウェルを洗浄液Ａで５回洗浄後、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）標識したヤギ抗マウスＩｇＡ抗体を各ウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。各ウェルを５回洗浄後、ＯＰＤ（ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ：オルト−フェニレンジアミン）発色液（ナカライテスク製）を加えアルミホイルで遮光しながら２５℃で３０分間反応させた。その後０．１８Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を１００μｌ加えて反応を停止し、反応液の４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。なお、コントロール群として、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤を投与しないＩＣＲマウス糞便中の分泌型ＩｇＡ濃度（ｍｇ／ｇ  糞便）も上記の記載と同様に測定した。
（ｉｉｉ）ＩＣＲマウス糞便中の分泌型ＩｇＡ濃度（ｍｇ／ｇ  糞便）の測定結果
上記（ｉｉ）に記載の測定方法によって、試験開始時（０週間）から４週間の期間、１週間ごとにサンプルＡ〜サンプルＦのＩＣＲマウス糞便中の分泌型ＩｇＡ濃度（ｍｇ／ｇ  糞便）を測定した。その結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
0005828771.tif 000003
【００４０】
表２に示すように、サンプルＡ、サンプルＢは、試験開始２週間後、マウスの糞便中の分泌型ＩｇＡ濃度がコントロール群に対して有意に増加することが明らかとなった。サンプルＣは、試験開始から４週間後、分泌型ＩｇＡがコントロール群に対して有意な増加が認められた。一方、サンプルＤ〜サンプルＦは、コントロール群に対して分泌型ＩｇＡの有意な増加は認められなかった。
【００４１】
したがって、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３を使用することよって、分泌型ＩｇＡ濃度を向上させることができることが明らかとなった。
また、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３の製造方法における、「（１）焙煎」、「（２）保持」、「（３）保存」、「（４）抽出」工程には、従来使用されているコーヒー焙煎豆の保存、保持設備や抽出設備を使用しているので、上記の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３を製造するには、特殊な設備は必要なく簡便で安価に製造することができる。
３．コーヒー焙煎豆に含まれるピラジン類合計含有量の測定
（１）分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３、及び比較例１〜３の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法で抽出時に使用したコーヒー焙煎豆それぞれに含まれるピラジン類合計含有量を測定した。測定方法は、次に示す通りである。
（ｉ）測定方法
コーヒー焙煎豆の挽き豆と、熱湯との比率が１：１０の比率になるように混合して混合液を調製し、１００ｍＬ三角フラスコに入れた。混合液の入った１００ｍＬ三角フラスコに冷却管を装着させ、８０℃の湯浴中に浸漬して、還流抽出を３０分間行った。還流抽出後、十分に水冷し、抽出物をペーパーろ過し、抽出液を得た。抽出液を適宜希釈した後、アセトニトリルを用いて活性化させた固相カラム（Ｖａｌｉａｎ製、ＢＯＮＤＥＬＵＴ  ＪＲ−Ｃ１８）に対して２ｍＬ注入し、ピラジン類を吸着させた。その後、アセトニトリルを用いて、２ｍｌ×２回溶出を行った。溶出画分は限外濾過フィルター（ＤＩＳＭＩＣ１３ＪＰ、孔径０．２５μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）にてろ過し、ろ液を測定用サンプルとした。測定は、上記２．（１−１）に記載と同様に行った。その結果を表３及び図１に示す。
（ｉｉ）測定結果
【００４２】
【表３】
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【００４３】
表３に示すように、分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３の製造方法で抽出時に使用したコーヒー焙煎豆に含まれるピラジン類の合計含有量は、２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上であり、比較例１〜３の分泌型ＩｇＡ産生誘導剤の製造方法で抽出時に使用したコーヒー焙煎豆と比較して高くなることが明らかとなった。さらに、図１のグラフから、常温保持時間が４８時間を越えると、ピラジン類の合計含有量の減少度合いが増加し、４８〜９６時間付近でピラジン類の合計含有量が急激に変化することが示された。
【００４４】
したがって、分泌型ＩｇＡ産生誘導効果を奏することが可能な分泌型ＩｇＡ産生誘導剤１〜３の製造方法において、抽出時に使用されたコーヒー焙煎豆には、ピラジン類合計含有量が２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上含まれることが示された。
（２）上記１．に記載の焙煎後の保持温度を、０℃、４℃、１０℃、２０℃、２８℃、３２℃、３７℃の温度で７２時間保持した場合に、抽出時に使用されたコーヒー焙煎豆に含まれるピラジン類合計含有量を測定した。測定は、上記３．（ｉ）に記載のとおりに行った。測定結果を表４及び図２に示す。
【００４５】
【表４】
0005828771.tif 000005
【００４６】
表４に示すように、保持温度を０、４、１０、２８℃とした場合のコーヒー焙煎豆に含まれるピラジン類の合計含有量は、２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上であり、保持温度が、３２、３７℃の場合と比較して高くなることが明らかとなった。また、図２に示すように、保持温度が２８℃を超えるとピラジン類の合計含有量は顕著に減少することが示された。保持温度が０℃〜２８℃の場合は、ピラジン類の合計含有量は顕著に減少することはなかった。なお、０℃以下においても、ピラジン類の合計量は２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上になることは明らかである。
（３）上記１．に記載の常温で７２時間保持後、保存温度を、−３０℃、−１０℃、０℃、４℃、１０℃、２８℃で５日間保存した場合の抽出時に使用されたコーヒー焙煎豆に含まれるピラジン類合計量を測定した。測定は、上記３．（ｉ）に記載のとおりに行った。
【００４７】
測定結果を表５及び図３に示す。
【００４８】
【表５】
0005828771.tif 000006
【００４９】
表５に示すように、常温で７２時間保持後、保存温度が−３０、−１０、０℃とした場合のコーヒー焙煎豆に含まれるピラジン類の合計含有量は、２２５．０ｍｇ／ｋｇ以上であり、保存温度が、４、１０、２８℃の場合と比較して高くなることが明らかとなった。また、図３に示すように、保存温度が０℃を超えるとピラジン類の合計含有量は顕著に減少することが示された。保存温度が−３０℃〜０℃の場合は、ピラジン類の合計含有量は顕著に減少することはなかった。
【００５０】
上記（２）、（３）に示したように、コーヒー焙煎豆について、保持温度が、０℃〜２８℃、保存温度が、−３０℃〜０℃の範囲にした場合には、十分に分泌型ＩｇＡ産生誘導効果を奏することが可能なコーヒー焙煎豆を得ることができる。
【００５１】
上記温度範囲で、コーヒー焙煎豆を保持、保存する場合には、従来使用している冷凍機を使用することができるので、特別な設備を揃える必要はなく、その分コストを抑えることができる。
【００５２】
尚、本発明は前記実施の形態になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施しうることはいうまでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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