(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学上許容される担体と、
（ｉ）配列番号１０に記載される配列を有するＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒト(Homo sapiens)における長鎖アイソフォームのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｉｖ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物と
を含んでなる、錐体ジストロフィの治療に用いるための医薬組成物。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡからなる群から選択され、好ましくは前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ベクターが、プラスミド、ウイルス粒子およびファージからなる群から選択される発現ベクターである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞および植物細胞からなる群から選択され、好ましくは宿主細胞が動物細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２００７年６月５日に出願された特許出願ＥＰ０７１０９６５２．３の優先権を主張するものであり、これは引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、神経変性疾患に関し、より詳しくは、神経変性疾患を治療および／または予防するための医薬組成物に関する。
【０００３】
発明の背景
神経変性疾患は、基礎研究と臨床の両側面で長年の挑戦であった。
【０００４】
このような神経変性疾患の一例として、色素性網膜炎（ＲＰ）は、桿体と錐体の光受容体に相当するニューロン集団の一連の変性を特徴とする、遺伝学的に異種の網膜変性である。ＲＰの最初の臨床徴候は夜盲症と周辺視野が狭くなることであり、この視野が徐々に悪くなって「トンネル様」となる。やがて、中心の視野が少なくなり、ほとんどの場合で完全な失明に至る。細胞レベルでは、夜間視野と側方視野に関与する網膜桿体光受容体が徐々に変性する。その後、色覚および高コントラスト視野、視力、細部知覚および通常光視野を担う錐体光受容体も同様に影響を受ける。網膜変性１（ｒｄ１）マウスは色素性網膜炎に関して最も研究されている動物モデルである。これは、桿体特異的ｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットに劣性突然変異を有しており、アポトーシスによって桿体光受容体の死滅に至り(CARTER-DAWSON et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., vol. 17(6), p:489-498, 1978; PORTERA-CAILLIAU et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, vol.91(3), p:974-978, 1994)、その後、おそらくは栄養供給の欠如によって錐体細胞死が起こる(MOHAND-SAID et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, vol.95(14), p:8357-8362, 1998)。
【０００５】
よって、本発明の基礎にある技術的問題は、神経栄養活性を有する新規な化合物を提供することであり、これらの化合物は、現時点では治療法が無い色素性網膜炎などの神経変性疾患の治療に好適である。
【０００６】
ＲｄＣＶＦ遺伝子は、チオレドキシン様６（Ｔｘｎｌ６）またはヌクレオレドキシン様１（Ｎｘｎｌ１）とも呼ばれ、Ｑ８ＶＣ３３  ＵｎｉＰｒｏｔ［６］タンパク質をコードし、このタンパク質は、チオレドキシンスーパーファミリーと限られた類似性を有し、錐体光受容体に対して栄養活性を示す(LEVEILLARD et al, Nat. Genet, vol. 36(7), p:755-759, 2004)。チオレドキシン（ＴＸＮ）は、通常、酸化還元制御、アポトーシスおよびサイトカイン活性の調節などの多面発現活性に関与する可能性のある小さなタンパク質である(HOLMGREN, Annu. Rev. Biochem., vol. 54, p:237-271, 1985; HOLMGREN, J. Biol. Chem., vol.264(24), p:13963-13966, 1989; ARNER and HOLMGREN, Eur. J. Biochem., vol.267(20), p:6102-6109, 2000)。ＴＸＮの保存されている活性部位には、チオールオキシドレダクターゼ活性に関与する２つの異なるシステイン（ＣＸＸＣ）が含まれ(ARNER and HOLMGREN, 2000, 上記; POWIS and MONTFORT, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol, vol.41, p:261-295, 2001)、複数の基質タンパク質においてジスルフィド結合の還元を触媒する(HOLMGREN, J. Biol. Chem., vol.254(18) , p:9113-9119, 1979; HOLMGREN, J. Biol. Chem., vol.254(19), p:9627-9632, 1979)。ＲｄＣＶＦ遺伝子は選択的スプライシングを介し、ＴＲＸ８０との類似性を共有している全長タンパク質とＣ末端転写後末端切断型タンパク質の２つの産物をコードしている。ヒトチオレドキシン−１（Ｔｘｎ）の後者の形態(PEKKARI et al, J. Biol Chem., vol.275(48), p:37474-37480, 2000; PEKKARI et al, Blood, vol.l05(4),: 1598-1605, 2005; LIU et al, Blood, vol.105(4): 1606-1613, 2005)はチオール−レダクターゼ活性は持たないが、末梢単核血液細胞の増殖の制御に関与している(PEKKARI et al, 2000, 上記; PEKKARI et al, FEBS Lett., vol.539(1-3):143-148, 2003)。Ｔｘｎと同様に、ＲｄＣＶＦは、推定チオールオキシドレダクターゼ活性を有する長鎖型（ＲｄＣＶＦ−Ｌ，２１７ａａ，Ｑ８ＶＣ３３）(JEFFERY, Trends Biochem. Sci., vol.24(1:8-11, 1999; JEFFERY, Trends Genet., vol.19(8) :415-417, 2003)と錐体に対して栄養活性を有するが、酸化還元活性は持たない短鎖型（ＲｄＣＶＦ−Ｓ，１０９ａａ，Ｑ９１Ｗ３８）の双方をコードしていることから、二機能性遺伝子のように見える。
【０００７】
発明の概要
本発明は、薬学上許容される担体と、
（ｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒト(Homo sapiens)において短鎖アイソフォーム（short isoform）のアミノ酸配列（配列番号１）、そのオーソログ、誘導体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｉｖ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物とを
含んでなる医薬組成物に関する。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、神経変性疾患を治療および／または予防するための、
（ｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒトにおいてアイソフォームのアミノ酸配列（配列番号１）、そのオーソログ、誘導体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｉｖ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物の使用に関する。
【０００９】
さらに別の実施形態では、本発明は、神経変性疾患を予防および／または治療する方法であって、神経変性疾患を示す、または示すと予測される被験体に、
（ｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒトにおける短鎖アイソフォームのアミノ酸配列（配列番号１）、そのオーソログ、誘導体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｉｖ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物を含んでなる有効量の組成物を提供することを含んでなる方法に関する。
【００１０】
最後に、さらに別の実施形態において、本発明は、神経変性疾患を有する、またはその素因を有すると思われる被験体を試験する方法であって、該被験体由来の生体サンプルにおいてＲｄＣＶＦ２遺伝子および／またはその関連プロモーターにおける突然変異の存在を検出することを含んでなる方法に関する。
【００１１】
詳細な説明
本発明は、ＲｄＣＶＦに対してパラログの遺伝子として新規な遺伝子ＲｄＣＶＦ２が、錐体光受容体および臭覚ニューロンなどのニューロンの生存能を高める該遺伝子によりコードされているタンパク質とともに発見されたことに基づく。
【００１２】
よって、第１の態様において、本発明は、薬学上許容される担体と、
（ｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒトにおける短鎖アイソフォームのアミノ酸配列（配列番号１）、そのオーソログ、誘導体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｉｖ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物と
を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本明細書において「ポリペプチド」とは、錐体光受容体または臭覚ニューロンなどのニューロンの生存能を高めるアミノ酸の分子鎖を意味する。このポリペプチドは、必要であれば、in vitroおよび／またはin vivoにおいて、例えば、グリコシル化、ミリストイル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化により修飾することができ、また、例えば当技術分野で公知の合成または組換え技術によって得ることもできる。
【００１４】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、薬学上許容される担体と、
（ｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒトにおける長鎖アイソフォーム（long isoform）のアミノ酸配列（配列番号１０）、そのオーソログ、誘導体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｉｖ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物を含む。
【００１５】
本明細書において「オーソログ」とは、共通の祖先遺伝子から種分化により進化したヒトにおける配列番号１および配列番号１０のタンパク質とは異なる種のタンパク質を意味する。このようなオーソログの一例としては、ハツカネズミ(Mus musculus)（配列番号２）、ドブネズミ(Rattus norvegicus)（配列番号３）、チンパンジー(Pan troglodytes) (配列番号４）、ウシ(Bos Taurus)（配列番号５）、ニワトリ(Gallus gallus)（配列番号６）、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)（配列番号７）、ミドリフグ(Tetraodon nigroviridis)（配列番号８）およびゼブラフィッシュ(Danio rerio)（配列番号９）のＲｄＣＶＦ２−Ｓに相当するタンパク質が挙げられる。
【００１６】
本明細書において「誘導体」とは、配列番号１、配列番号１０またはそのオーソログと少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、一例としては少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性パーセンテージを有するポリペプチドを意味する。
【００１７】
ヒトにおけるＲｄＣＶＦ２の短鎖型はヒトにおけるＲｄＣＶＦの短鎖型と４０％未満の同一性を有することを述べておかなければならない。
【００１８】
本明細書において「断片」とは、少なくとも２５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、一例としては少なくとも７５または８５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを意味する。
【００１９】
本明細書において、２つのアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」とは、比較する配列の最良のアライメントによって得られた２つの配列間の同一のアミノ酸のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは純粋に統計学的なものであり、これらの２配列間の違いはそのアミノ酸配列にランダムに分散している。本明細書において「最良のアライメント」または「最適なアライメント」とは、決定された同一性パーセンテージ（下記参照）が最も高いアライメントを意味する。２つのアミノ酸配列間の配列比較は通常、最良のアライメントに従って予め整列（アライン）させたこれらの配列を比較することにより明らかとなり、この比較は、類似性のある部分領域を同定および比較するための比較セグメントにおいて明らかになる。比較を行うための最良のアライメントは、手動による他、SMITH および WATERMAN(Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981)により開発されたグローバル・ホモロジー・アルゴリズムの使用によるか、NEDDLEMAN および WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970)により開発された局所ホモロジー・アルゴリズムの使用によるか、PEARSON および LIPMAN(Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988)により開発されたものと類似の方法の使用によるか、アルゴリズム（the Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USAのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ)を用いるコンピューターソフトウエアの使用によるか、ＭＵＳＣＬＥマルチプル・アライメント・アルゴリズム(Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004)の使用によって明らかにすることができる。最良の局所アライメントを得るには、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウエアを、ＢＬＯＳＵＭ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ  ３０マトリックスとともに使用することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適に整列されたこれら２つの配列を比較することにより決定され、これらのアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適アライメントを得るために、参照配列に対しての付加または欠失を含み得る。同一性パーセンテージはこれらの２配列間で同一である位置の数を求め、この数を比較した位置の総数で割り、得られた結果に１００をかけて、これらの２配列間の同一性パーセンテージを得ることで計算される。
【００２０】
「薬学上許容される」とは、生理学上許容され、一般に、ヒトに投与した際に、胃の不快感、めまいなどのアレルギー性または類似の不適当な反応を生じない分子存在および組成物を意味する。好ましくは、本明細書において「薬学上許容される」とは、連邦政府または州政府の規制局によって認可されているか、または米国薬局方、あるいは動物、より詳しくはヒトでの使用に関して一般に認知されている他の薬局方に挙げられていることを意味する。
【００２１】
「担体」とは、それとともに化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。このような製薬担体は、水、ならびに例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む油といった無菌の液体である。好ましくは、水または水溶液、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液が、特に注射用の担体として用いられる。好適な製薬担体は、E.W. Martinにより"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
【００２２】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、好ましくはＤＮＡを意味する。該ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
【００２３】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号１１の配列を含んでなる。
【００２４】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号１０の配列をコードする配列を含んでなる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、これまでに定義したポリペプチドのコード配列、リーダー配列もしくはプロタンパク質配列などの付加のコード配列、および／またはイントロンもしくは５’および／または３’ＵＴＲ配列などの付加の非コード配列を含むことができる。
【００２６】
本明細書において「ベクター」とは発現ベクターを指し、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態である。
【００２７】
このようなベクターとしては、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび偽性狂犬病などのウイルスＤＮＡが挙げられる。当業者には多数の好適なベクターが知られ、市販されてもいる。例として、以下のベクターが挙げられる。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９(QIAGEN)、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ(STRATAGENE)、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５(PHARMACIA)。真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ(STRATAGENE)、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ(PHARMACIA)。しかしながら、宿主内で複製可能であり、生存能がある限り、他のいずれのベクターを用いてもよい。
【００２８】
ベクター中のポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を命令するのに適当な発現制御配列（プロモーター）と作動可能なように連結されている。このようなプロモーターの代表例としては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉなどの原核生物または真核生物プロモーターが挙げられる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ベクターも含む。このベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列を含んでもよい。
【００２９】
さらに、このベクターは好ましくは、真核細胞の培養に関するジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性、または大腸菌ではテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質をもたらす１以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【００３０】
本明細書において「遺伝学的に操作された宿主細胞」とは、これまでに記載されたポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質導入された、形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主細胞を意味する。
【００３１】
適当な宿主細胞の代表例としては、大腸菌、放線菌(Streptomyces)、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium)などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、Ｓｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯまたはＣＯＳなどの動物細胞、植物細胞などが挙げられる。適当な宿主の選択は、本明細書における教示から、当業者の範囲内であると思われる。
【００３２】
好ましくは、該宿主細胞は動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【００３３】
これまでに記載されているポリヌクレオチドまたはベクターの、宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションなどの当業者に周知の方法によって達成することができる。
【００３４】
本発明の組成物は１以上の添加剤（例えば、安定剤、保存剤）を含んでもよい。一般に、Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker);およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSEL et al, 1994, WILLIAMS & WILKINS)を参照。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、神経変性疾患を治療および／または予防するための
（ｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒトにおける短鎖アイソフォームのアミノ酸配列（配列番号１）、そのオーソログ、誘導体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｉｖ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物の使用を提供する。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、神経変性疾患を治療および／または予防するための、
（ｖ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒトにおける長鎖アイソフォームのアミノ酸配列（配列番号１０）、そのオーソログ、誘導体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｖｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｖｉｉｉ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物の使用を提供する。
【００３７】
一般に、該薬剤は、哺乳類、特にヒトに相当する被験体の治療的または予防的処置のために用いることができる。
【００３８】
本明細書において「神経変性疾患」とは、好ましくはプルキンエ（Purkinje）細胞の変性を含む中枢神経系の変性疾患、光受容体の変性疾患または臭覚ニューロンの変性疾患などのニューロンの変性に関連する疾病を意味する。
【００３９】
中枢神経系の変性疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病／舞踏病が挙げられる。
【００４０】
光受容体の変性疾患の例としては、錐体ジストロフィ（cone dystrophy）（例えば色素性網膜炎）が挙げられる。
【００４１】
臭覚ニューロンの変性疾患の例としては、嗅覚消失症が挙げられる。
【００４２】
該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞はこれまでに記載されている。
【００４３】
好ましい実施形態によれば、該薬剤は、光受容器の変性疾患または臭覚ニューロンの変性疾患を治療および／または予防するために用いることができる。
【００４４】
また、神経変性疾患を示す、または示すと予測される被験体に、
（ｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子のヒトにおける短鎖アイソフォームのアミノ酸配列（配列番号１）、そのオーソログ、誘導体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター；および
（ｉｖ）該ポリペプチドを発現する、遺伝学的に操作された宿主細胞
からなる群から選択される化合物を含んでなる有効量の組成物を提供することを含んでなる、神経変性疾患を予防および／または治療する方法も提供される。
【００４５】
本発明によれば、「有効量」の組成物とは、所望の生体作用を果たす、この場合にはニューロンの生存能を高めるのに十分な量である。この有効用量は、レシピエントの年齢、性別、健康および体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度および望まれる採用の性質によって異なると理解される。以下に示される有効用量の範囲は本発明の限定を意図するものではなく、好ましい用量範囲を表す。しかしながら、この好ましい用量は、当業者に理解され、過度な検討を行わずに決定可能であることから、個々の被験体に対して調整することができる。
【００４６】
該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞はこれまでに記載されている。
【００４７】
また、神経変性疾患を有する、またはその素因を有すると思われる被験体を試験する方法であって、
（ｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子および／またはその関連プロモーターにおける突然変異の存在を検出するため、かつ／または
（ｉｉ）ＲｄＣＶＦ２遺伝子の発現を分析するために
該被験体由来の生体サンプルを分析する工程を含んでなる方法も提供される。
【００４８】
本明細書において「生体サンプル」とは、血液または血清などの被験体に由来する任意のサンプルを意味する。
【００４９】
本明細書において「神経変性疾患」とは、中枢神経系の変性疾患、光受容体の変性疾患または臭覚ニューロンの変性疾患などのニューロンの変性に関連する疾病を意味する。
好ましくは、神経変性疾患は、錐体ジストロフィ（例えば色素性網膜炎）などの光受容体の変性疾患である。
【００５０】
ＲｄＣＶＦ２遺伝子における突然変異を検出するための典型的な技術としては、制限断片長多型、ハイブリダイゼーション技術、ＤＮＡシーケンシング、エキソヌクレアーゼ耐性、マイクロシーケンシング、ｄｄＮＴＰを用いる固相伸張、ｄｄＮＴＰを用いる液相伸張、オリゴヌクレオチドアッセイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションなどの一塩基多型検出法、連結連鎖反応、ミニシーケンシング、ＤＮＡ「チップ」、ＰＣＲまたはモレキュラービーコンを併用する一重または二重標識プローブを用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションなどが挙げられる。
【００５１】
ＲｄＣＶＦ２遺伝子の発現の分析は、転写された核酸または翻訳されたタンパク質の発現を検出するための周知の多様な方法のいずれかを用いて評価することができる。
【００５２】
好ましい実施形態では、ＲｄＣＶＦ２遺伝子の発現は、該遺伝子の、初期ＲＮＡなどの、ｍＲＮＡ転写物またはｍＲＮＡ前駆体の発現を分析することにより評価される。該分析は、被験体由来の生体サンプル中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを調製すること、およびこのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと参照ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって評価することができる。調製されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、限定されるものではないが、サザンまたはノーザン分析、定量的ＰＣＲ(TaqMan)などのポリメラーゼ連鎖反応分析、およびＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ＤＮＡアレイ(AFFYMETRIX)などのプローブアレイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。
【００５３】
有利には、ＲｄＣＶＦ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルの分析は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号で示される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応(BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991)、自己持続的配列複製(GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990)、転写増幅系（ＫＷＯＨ etal.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.86,p:1173-1177,1989）Ｑ−βレプリカーゼ(LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988)、ローリングサイクル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）または他のいずれかの核酸増幅法による核酸増幅の工程の後に、当業者に周知の技術を用いて増幅核酸を検出することを含む。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少数でしか存在しない核酸分子に特に有用である。本明細書において、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域にアニーリングすることができる１対の核酸分子（それぞれプラス鎖とマイナス鎖またはその逆）として定義され、その間に短い領域を含む。一般に、増幅プライマーは約１０〜３０ヌクレオチドの長さであり、約５０〜２００ヌクレオチドの長さの領域に隣接している。適当な条件下で、適当な試薬を用い、このようなプライマーは、プライマーが隣接したヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。
【００５４】
本願により、当業者は、被験体において遺伝子ＲｄＣＶＦ２の配列を簡単に同定することができる。
例として、ヒトにおいてＲｄＣＶＦ２の短鎖アイソフォームをコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号１１の配列を有する。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、ＲｄＣＶＦ２遺伝子の発現は、該遺伝子から翻訳されたタンパク質の発現を分析することにより評価される。該分析は、抗体（例えば、放射性標識、発色団標識、蛍光団標識または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば、基質、またはタンパク質／リガンド対のタンパク質のタンパク質もしくはリガンド（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）との抗体コンジュゲート）、あるいはＲｄＣＶＦ２遺伝子から翻訳されたタンパク質と特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体、単離された抗体超可変ドメインなど）を用いて評価することができる。
【００５６】
該分析は、限定されるものではないが、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット解析および酵素結合免疫吸着検定法（ＲＩＡ）を含む当業者に周知の種々の技術によって評価することができる。
【００５７】
ポリクローナル抗体は、マウス、ウサギまたはヤギなどの好適な動物を、ＲｄＣＶＦ２遺伝子によりコードされているタンパク質またはその断片で免疫することにより作製することができる。免疫された動物の抗体力価は、固定化ポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いるなど、標準的な技術によって経時的にモニタリングすることができる。免疫後の適当な時点、例えば、特定の抗体力価が最高になった際に、抗体生産細胞は動物から得られることができ、KOHLER および MILSTEIN (Nature, vol.256, p:495-497, 1975)により最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(KOZBOR et al, Immunol, vol.4, p: 72, 1983)、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(COLE et al, In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,Inc, p: 77-96, 1985)またはトリオーマ技術などの標準的な技術によってモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するために使用することができる。ハイブリドーマを生産するための技術は周知である（一般に、Current Protocols in Immunology, COLIGAN et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994参照）。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いるなど、ハイブリドーマ培養上清を目的のポリペプチドと結合する抗体に関してスクリーニングすることによって検出される。
【００５８】
本発明の方法は、被験体由来の生体サンプルにおけるＲｄＣＶＦ２遺伝子の発現レベルを対照における該遺伝子の正常な発現レベルと比較することを含むことができる。被験体の生体サンプルにおける該遺伝子の発現レベルが正常な発現レベルと比較して有意に弱ければ、その患者が神経変性疾患を有する、またはそれを発症する素因があることを示す。
【００５９】
ＲｄＣＶＦ２遺伝子の発現の「正常な」レベルは、神経変性疾患に罹患していない、好ましくは色素性網膜炎に罹患していない被験体の生体サンプルにおける該遺伝子の発現レベルである。好ましくは、該正常な発現レベルは、対照サンプル（例えば、神経変性疾患に罹患していない健康な被験体由来のサンプル）で評価され、好ましくは、いくつかの対照サンプルにおける該遺伝子の平均発現レベルである。
【００６０】
以下、アミノ酸配列、核酸配列および実施例を参照して本発明をさらに詳細に記載する。しかしながら、これらの実施例の詳細により、本発明は何ら限定されるものではない。むしろ、本発明は、本明細書の実施例には明示されていない詳細を含むいずれの実施形態にも関するが、これらは特に労力無く、当業者に見出される。
【実施例】
【００６１】
１）ＲｄＣＶＦに対してパラログの遺伝子であるＲｄＣＶＦ２の同定
マウスＲｄＣＶＦ遺伝子は第８染色体に位置し、３つのエキソンを含み、それぞれＲｄＣＶＦ−Ｌ（長鎖(long)）とＲｄＣＶＦ−Ｓ（短鎖(short)）に相当する２つの異なるスプライス変異体に転写される。
【００６２】
両ＲｄＣＶＦスプライス変異体の構造は図１のパネルａに記載されている。ＲｄＣＶＦ−Ｌ  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１４５５９８、マウス第８染色体、マイナス鎖、７０’０３３’７６３〜７０’０２７’７１７）は、３４８、６８７および１７５１ｂｐの３つのエキソン（１〜３）からなる。ＲｄＣＶＦ−Ｓ  ｍＲＮＡ（ＢＣ０１７１５３、７０’０３３’７８５〜７０’０３２’６１５）は、１つのエキソン（１１７２ｂｐ）からなる。コード領域および非コード領域はそれぞれ濃いグレーと薄いグレーで示されている。第一のコーディングエキソンの末端にある停止コドンの周囲のゲノム領域および１２の他の脊椎動物ゲノムにおける対応するオーソログ配列がアラインされている。黒三角は第一のＲｄＣＶＦ−Ｌコーディングエキソンの末端を示す。保存されている停止コドンは赤で示される。下には、コード領域（ＣＤＳ）と末端非翻訳領域（ＵＴＲ）の長さが示されている。
【００６３】
ＲｄＣＶＦ−Ｌスプライス変異体は３つのエキソンからなり、この変異体は、最後の１０９のアミノ酸が「キャップ(cap)」と呼ばれるタンパク質をコードしている。
【００６４】
ＲｄＣＶＦ−Ｓスプライス変異体は、そのコード配列が１つのコドンが延長された長鎖型の第一のエキソンと同じである１つのエキソン、その後に停止コドン（ＴＧＡ）、最後に３’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる。
【００６５】
結果として、ＲｄＣＶＦ−Ｌの「キャップ」（すなわち、最後の１０９のアミノ酸）はＲｄＣＶＦ−Ｓを欠いている。
【００６６】
データベースでのｂｌａｓｔ検索により、ＲｄＣＶＦ２と呼ばれるパラログ遺伝子の同定が可能であった。
【００６７】
両ＲｄＣＶＦ２スプライス変異体の構造は、図１のパネルｂに記載されている。ＲｄＣＶＦ２−Ｌ  ｍＲＮＡ（ＡＫ０１５８４７、マウス第１３染色体、プラス鎖、５０’２０２’６３０〜５０’２０６’７９７）は、６０３ｂｐと５６４ｂｐの２つのエキソン（１〜２）からなる。ＲｄＣＶＦ２−Ｓ  ｍＲＮＡ（ＢＣ０１６１９９、５０’２０２’６６７〜５０’２０５’５７１）は、１つのエキソン（２９０４ｂｐ）からなる。コード領域および非コード領域はそれぞれ濃いグレーと薄いグレーで示されている。第一のコーディングエキソンの末端にある停止コドンの周囲のゲノム領域および１２の他の脊椎動物ゲノムにおける対応するオーソログ配列がアラインされている。黒三角は第一のＲｄＣＶＦ２−Ｌコーディングエキソンの末端を示す。保存されている停止コドンは赤で示される。下には、コード領域（ＣＤＳ）と末端非翻訳領域（ＵＴＲ）の長さが示されている。
【００６８】
この分析により第１３染色体においてＲｄＣＶＦ２遺伝子の位置を特定し、ＲｄＣＶＦとＲｄＣＶＦ２の配列と遺伝子構造が双方の間で極めて類似していることを証明することができる。実際、ＲｄＣＶＦ２はまた、それぞれＲｄＣＶＦ２−ＬおよびＲｄＣＶＦ２−Ｓと呼ばれるチオレドキシン様タンパク質（１５６ａａ、配列番号１２）および短鎖型（１０１ａａ、配列番号２）の双方をコードすることが明らかである。
【００６９】
最後に、この配列分析は、ＲｄＣＶＦとＲｄＣＶＦ２の間の相同性の程度が、長鎖アイソフォームでは５８．０％、短鎖アイソフォームでは５３．５％であることを明らかにした。
【００７０】
２）進化におけるＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２の遺伝子構造の保存
錐体の生存能は、ＲｄＣＶＦ−Ｓ型の生産、ひいては、そのアイソフォームを得るのに必要な第一のエキソンの末端における停止コドンの存在に関連する。
【００７１】
その停止コドンの保存性をさらに評価するため、ＵＣＳＣゲノムブラウザＢＬＡＴ(HINRICHS et al, Nucleic Acids Res., vol.34 (Database issue):D590-598, 2006; KENT, Genome Res., vol.12(4):656-664, 2002)セーバーを用いて、得られる総ての脊椎動物ゲノムに対してマウスＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２遺伝子をマッピングし、対応するゲノム配列を抽出した。
【００７２】
結果は、１３の脊椎動物に両遺伝子座が見られたことを示した。これらの生物は、トラフグ(Takifugu rubripes)とミドリフグ(Tetraodon nigroviridis)を除いた総てが両遺伝子を示し、これらではＲｄＣＶＦが同じ染色体の場所で倍加し（ＲｄＣＶＦ  ａおよびｂ）、この遺伝子座の第一のコーディングエキソンにさらにイントロンが挿入されていた。注目すべきは、この第一のエキソンの末端にある停止コドンは大多数のものにおいて厳密に保存されていることである（図１パネルａおよびｂ）。
【００７３】
最後に、この知見は、ニワトリ(Gallus gallus)およびゼブラフィッシュ(Brachydanio rerio)ＲｄＣＶＦ；ミドリフグ(Tetraodon nigroviridis)およびトラフグ(Takifugu rubripes)ＲｄＣＶＦｂを除いたほとんどの脊椎動物にＲｄＣＶＦ短鎖アイソフォームが存在する可能性があることを意味する。
【００７４】
３）ＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２タンパク質配列の分析
候補ＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２オーソログタンパク質を同定するため、ＵｎｉＰｒｏｔ(WU et al, Nucleic Acids Res., vol.34(Database issue), p :D187-191, 2006)およびＥＭＢＬ(COCHRANE et al, Nucleic Acids Res., vol.34(Database issue):D10-15, 2006)公開配列データベースにて、ＢＬＡＳＴプログラム(ALTSCHUL et al, J. Mol. Biol, vol.215(3):403-410, 1990 ; ALTSCHUL et al, Nucleic Acids Res., vol.25(17):3389-3402, 1997)を用い、ホモロジー検索を行った。
【００７５】
両ＲｄＣＶＦ遺伝子の長鎖アイソフォームを表すＲｄＣＶＦ（−Ｌ／２−Ｌ）に対してオーソログのタンパク質は、タンパク質またはゲノムデータベース検索に従い、脊椎動物（ドブネズミ(Rattus norvegicus)、ヒト(Homo sapiens)、チンパンジー(Pan troglodytes)、ウシ(Bos taurus)、イヌ(Canis familiaris)、ニワトリ(Gallus gallus)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)、ミドリフグ(Tetraodon nigroviridis)、ゼブラフィッシュ(Brachydanio rerio)において同定または推定した。
【００７６】
次に、ＴＢＡ(BLANCHETTE et al, Genome Res., vol.14(4):708-715, 2004)およびＰｉｐｅＡｌｉｇｎ(PLEWNIAK et al, Nucleic Acids Res., vol.31(13):3829-3832, 2003)プログラムをデフォルトパラメーターとともに用い、ゲノム配列およびタンパク質配列それぞれのマルチプルアライメントを作製した。タンパク質アライメントには、場合により、タンパク質の二次構造の保存と合わせて手動調整を含んだ。
【００７７】
図２（パネルａ）は、ＲｄＣＶＦ、ＲｄＣＶＦ２、トリパレドキシン（ＴＲＹＸ）、ヌクレオレドキシン（ＮＸＮ）およびチオレドキシン（ＴＸＮ）の配列アライメントを示す。各タンパク質配列の名称、生物および受託番号（括弧内）を示す（左）。同一（黒地に白の文字）、小さい（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ；緑地に白の文字）、疎水性（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；黄色地に黒の文字）、極性（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ；青の文字）および電荷を有する（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ；赤地に白の文字）、保存された残基を、保存閾値８５％に従って示す。コンセンサス配列はマルチプルアライメントの下に示され、ｓ、ｈ、ｐおよびｃはそれぞれ小さい、疎水性、極性および電荷を有する残基に相当する。クリチディア・ファシキュラータ(Crithidia fasciculata)トリパレドキシンＩ構造（１ＥＷＸ）の二次構造（βシートおよびαヘリックス）をコンセンサス配列の下に示す。青の破線の四角は、３つのＲｄＣＶＦ（２）特異的挿入を示す。緑の破線の四角は、ＲｄＣＶＦ（２）−Ｓには存在しない「キャップ」領域を示す。ヒトチオレドキシン切断産物（ＴＲＸ８０）の位置が示されている（赤の三角）。パネルｂは、クリチディア・ファシキュラータＴＲＹＸ−Ｉ（１ＥＷＸ）（左）、マウスＲｄＣＶＦ−Ｌ（中央）およびマウスＲｄＣＶＦ２−Ｌ（右）モデルの構造を示す。ＲｄＣＶＦ（２）−Ｌにおいて保存されているＴＲＹＸ−Ｉ主鎖の領域が赤で示されている。「キャップ」領域および３つの特異的挿入がそれぞれ緑および青で示されている。推定触媒部位（Ｃ４４ＸＸＣ４７）は、黄色でスペースを埋めるように示されている。
【００７８】
ＴＸＮスーパーファミリー間の系統発生的分析によりＲｄＣＶＦタンパク質とＲｄＣＶＦ２タンパク質はＴＲＹＸメンバーおよびＮＸＮメンバーと近縁であることが確認された(MICOSSI et al, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., vol.58(Pt 1):21-28, 2002; KRUMME et al, Biochemistry, vol.42(50): 14720-14728, 2003; ALPHEY et al, J. Biol Chem., vol.274(36):25613-25622, 1999; EKLUND et al, Proteins, vol.11(1):13-28, 1991; KUROOKA et al, Genomics, vol.39(3):331-339, 1997; LAUGHNER et al, Plant Physiol, vol.118(3):987-996, 1998)。クリチディア・ファシキュラータトリパレドキシンＩ（Ｏ９６４３８、ＴＲＹＸ−Ｉ）(ALPHEY et al, 1999,前掲)などの遠縁ホモログでさえ、マウスＲｄＣＶＦ（−Ｌ／２−Ｌ）タンパク質と４２．５％および４５．４％の配列類似性を示す。マルチプルアライメントにおける３つの挿入（１、２および３と呼ぶ）はこれらの系統発生的タンパク質ファミリーの識別を可能とする（図２パネルａ）。
【００７９】
挿入３（残基８７〜１１０）は、保存モチーフＷＬＡＬＰ［Ｗ１０８（Ｌ，Ｖ）（Ａ，Ｆ）（Ｌ，Ｖ，Ｉ）Ｐ１１２］を含み、これによりＴＲＹＸファミリー［ＴＲＹＸ，ＮＸＮ，ＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２］とＴＸＮスーパーファミリーを明確に識別することができる。
【００８０】
挿入２（６３〜７２）と挿入３の２つの付加的残基（９６〜９７）により、ＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２タンパク質と残りのＴＲＹＸファミリーを識別することができる。
【００８１】
最後に、挿入１（１６〜２１）は、ＲｄＣＶＦと、ＲｄＣＶＦ２を含む他の総てのＴＸＮスーパーファミリーメンバーを明確に分ける。チオレドキシン活性部位Ｃ４４ＸＸＣ４７はＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２脊椎動物タンパク質の、それぞれ４４．４％（４／９）および７２．７％（８／１１）でしか保存されていないことを述べておかなければならない。
【００８２】
４）ＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２の構造モデリング
ＲｄＣＶＦの、ＴＲＹＸタンパク質とのこの高い配列類似性は、本発明者らに、クリチディア・ファシキュラータＴＲＹＸ−Ｉ結晶構造（ＰＤＢ受託番号：１ＥＷＸ、１．７Å解像構造(ALPHEY et al, 1999,前掲)を鋳型として用い、ＲｄＣＶＦ（−Ｌ／２−Ｌ／−Ｓ／２−Ｓ）構造モデルを構築させた。ヒトＴＸＮおよびＴＲＸ８０モデル(PEKKARI et al, 2000,前掲)との類似性により、ＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ）構造モデルは、全体的な同じ折りたたみを維持するものと推測された。それぞれ最初の１５５および１４７の残基を用いたマウスＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２（Ｓ型およびＬ型の双方）の構造モデルを、Ｂｕｉｌｄｅｒホモロジーモデリングパッケージ(KOEHL and DELARUE, J. Mol. Biol, vol.239(2):249-275, 1994; KOEHL and DELARUE, Nat. Struct. Biol, vol.2(2):163-170, 1995; KOEHL and DELARUE, Curr. Opin. Struct. Biol, vol.6(2):222-226, 1996)を用いて構築した。最終的なモデルを、ＥＮＣＡＤ(LEVITT et al, Computer Physics Comm., vol.91:215-231, 1995)を用いたエネルギー最小化によりさらに精密化した。各モデルに対し、１０００ステップの共役勾配最小化を適用した。Ｅ１４６（１ＥＷＸ）→Ｐ１４６（ＲｄＣＶＦ−Ｌ）突然変異により、鋳型構造におけるこの部分的主鎖コンフォメーションはプロリンに一致させるために適用される。自己無撞着平均場アプローチを用い、Builderサンプルを同時に、５つの挿入／欠失部とＥ→Ｐ突然変異領域におけるループのコンフォメーションおよび側鎖のコンフォメーション。ＰｙＭＯＬ(www.pymol.org)を用い、最終的な構造とした。
【００８３】
図２（パネルｂ）は、ＴＲＹＸ−Ｉ（１ＥＷＸ）およびＲｄＣＶＦ（−Ｌ／２−Ｌ）の構造を示す。
【００８４】
図２は、マルチプルアライメントの下（パネルａ）およびＴＲＹＸ−Ｉ三次元構造（パネルｂ）中に１ＥＷＸ二次構造（β−シートおよびα−ヘリックス）を示す。
【００８５】
この構造のモデル化は、挿入１、２および３がそれぞれ、β１．１−β１．２シートの大きさの増大、α２ヘリックスにおける１つのターンの延長、ならびにＴＲＹＸ特異的αｓｕｐ−βｓｕｐおよびα３延長を含むより大きな構造領域に相当する。ＲｄＣＶＦタンパク質の挿入３に属す２つの残基（９６〜９７）はストランドβｓｕｐの前のより大きな拘束ループに相当し、これらのタンパク質をＴＲＹＸメンバーから識別することが可能となる。ＲｄＣＶＦにおいて、３つの挿入が同時に存在する折りたたまれたタンパク質上の位置が、推定触媒部位（Ｃ４４ＸＸＣ４７）とは反対側にある（（図２パネルｂ）ことは大変価値あることである。
【００８６】
最後に、ＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ）タンパク質には存在しないＣ末端領域（以下、「キャップ」と呼び、図２のパネルｂに緑で示されている）は、触媒部位と相対的に位置決定されている。ＴＸＮタンパク質の「キャップ」領域は、循環酵素であるチオレドキシンレダクターゼ［７、１３］と相互作用し、それが存在しないと、ＴＲＸ８０およびＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ）のチオレドキシン活性を損なう可能性がある［４、１３］。
【００８７】
これらの構造モデルの著しい特徴は、３つの挿入部の残基が明らかに空間的に近接していることである。この一致は、ＲｄＣＶＦ（−Ｌ／２−Ｌ）における可能性のある新規な相互作用部位を示す。予測されたように、ＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ）の精密化モデルの主鎖コンフォメーションは、非「キャップ」領域と「キャップ」領域との境界の側鎖に微細な改変が見られるものの、長鎖型のその対応物と同じである。「キャップ」が存在しないことでＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ）表面に主要な疎水性パッチが現れることを強調しなければならない。結果として、ＲｄＣＶＦタンパク質の、この接近可能な表面領域の疎水性部分は長鎖型の２３９４Å２から短鎖型の３１５７Å２に増える。
【００８８】
４）ＲｄＣＶＦ−Ｓ、ＲｄＣＶＦ２−ＳおよびＲｄＣＶＦ２−Ｌは網膜で桿体依存的に発現する
８、１５および３５日齢の野生型（Ｃ５７ＢＬ／６＠Ｎ）およびｒｄ１突然変異型（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ＠Ｎ）マウスの神経網膜から、また、臭覚上皮（Ｂａｌｂ／ｃ）から、セシウム勾配(CHIRGWIN et al, Biochemistry, vol.18(24):5294-5299, 1979)により全ＲＮＡを精製した。
【００８９】
Superscript Choice System (INVITROGEN)を用い、５μｇの全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡはランダムプライミングにより作製し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡに対してノーマライズした。第一鎖ｃＤＮＡ（０．２μｌ）を、２μＭの特異的プライマーを用いて３回増幅した。ＲｄＣＶＦ２−Ｓに対してはプライマー５’−ＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１３）および５’−ＣＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＣ−３’（配列番号１４）を用い、ＲｄＣＶＦ２−Ｌに対してはプライマー５’−ＣＣＧＴＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号１５）および５’−ＣＴＧＡＣＡＣＴＣＣＡＡＴＣＧＴＡＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＧＣ−３’（配列番号１６）を用いた。ロドプシンに対してはライトサイクラー(Roche, Basel, Switzerland)にて、プライマー５’−ＡＡＧＣＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号１７）および５’−ＴＣＡＴＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴ−３’（配列番号１８）を用いた。
【００９０】
ノーザンブロット法分析では、２μｇのポリＡ  ｍＲＮＡを用い、その膜を、標準的な方法を用い、ＲｄＣＶＦ２遺伝子のエキソン１に相当するプローブとハイブリダイズさせた。
【００９１】
ＤＮＡ混入が無いことは、逆転写酵素を除くことにより確認した。結果は、最低の発現と比較して何倍違うかで示した。
【００９２】
図３のパネルａは、ＲｄＣＶＦ２の短鎖アイソフォーム（ＲｄＣＶＦ２−Ｓ、１７６ｐｂ断片）と長鎖アイソフォーム（ＲｄＣＶＦ２−Ｌ、１７０ｐｂ断片）に関する、生後３５日の野生型およびｒｄ１マウスでのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【００９３】
図３のパネルｂは、脳、精巣、正常網膜（ｗｔ）、変性網膜（ｒｄ１）、および胚発生１２．５日（ＥＤ１２．５）の全マウス胚におけるＲｄＣＶＦ２転写物の発現を示す。
【００９４】
これらの結果により、ＲｄＣＶＦ２−Ｓおよび−Ｌは野生型マウス網膜で発現することが確認された（図３パネルａ）。興味深いことに、ＲｄＣＶＦ２−Ｓおよび−Ｌの発現は、桿体光受容体変性後のｒｄ１マウスの網膜には存在しない。これらの結果はまた、網膜での、最も可能性が高くは、その発現が変性網膜（ｒｄ１）には見られないことから桿体光受容器による発現の他、脳および精巣においてもＲｄＣＶＦ２の弱い発現が見られることも示す。さらに、これらの結果は、短鎖アイソフォーム（ＲｄＣＶＦ２−Ｓ）および長鎖アイソフォーム（ＲｄＣＶＦ２−Ｌ）に相当する２つのメッセンジャーＲＮＡの発現が臭覚上皮でも検出されることを示した。最後に、胚発生１２．５日の全マウス胚では、発現が検出されなかった。
【００９５】
網膜および臭覚上皮におけるＲｄＣＶＦ２−Ｓおよび−Ｌ  ｍＲＮＡの発現は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ネズミアンチセンスリボプローブとのin situハイブリダイゼーションにより分析した。
【００９６】
マウスＲｄＣＶＦ２−ＳおよびＲｄＣＶＦ２−Ｌは、以下のプライマー：ＲｄＣＶＦ２−Ｓに対してはプライマー５’−ＧＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧ−３’（配列番号１９）および５’−ＧＴＣＡＴＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２０）；ＲｄＣＶＦ２−Ｌに対してはプライマー５’−ＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号２１）および５’−ＡＡＴＴＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣ−３’（配列番号２２）を用い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＰＧＥＭイージーベクター(PROMEGA)にクローニングした。ＳＰ６またはＴ７プロモーターから生成し、ジゴキシゲニン−ＵＴＰ(ROCHE)で標識したセンスおよびアンチセンスＲｄＣＶＦ２  ｍＲＮＡプローブを製造業者の説明書に従って作製した。
【００９７】
室温で解凍および乾燥させた後、網膜および臭覚上皮切片を氷上、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間、後固定し、室温で１０分間、ＰＢＳ中で洗浄した。網膜切片を、ＳＰ６またはＴ７プロモーターから生成し、ジゴキシゲニン−ＵＴＰで標識したセンスおよびアンチセンスＲｄＣＶＦ２  ｍＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。in situハイブリダイゼーションおよびジゴキシゲニン標識プローブ検出をこれまでに記載されているように行った(ROGER et al., Dev. Biol., vol.298(2):527-539, 2006)。染色の特異性は、センスプローブとのハイブリダイゼーションシグナルが無いことで示された。
【００９８】
図３のパネルｃは、野生型およびｒｄ１マウス網膜の切片上でのジゴキシゲニン標識ＲｄＣＶＦ２−ＳおよびＬリボプローブ（ＡＳ：アンチセンス、Ｓ：センス）とのin situハイブリダイゼーションの結果を示す。原倍率：４０倍。
【００９９】
これらの結果は、ＲｄＣＶＦ２−Ｓおよび−Ｌの転写物が光受容体層で検出されたことを示す。センス対照プローブでは染色は見られず、ＲｄＣＶＦ２−ＳおよびＬプローブの特異性を裏付けた。最後に、桿体変性後のｒｄ１網膜において発現は検出されなかった（結果は示されていない）。さらに、これらの結果は、臭覚上皮における標識細胞の局在が、基底細胞、未熟ニューロンおよび成熟ニューロンがＲｄＣＶＦ２  ｍＲＮＡを強く発現すること、および支持細胞の細胞質の頂端部分にはＲｄＣＶＦ２  ｍＲＮＡの発現は見られなかったことを示した。発生期（Ｅ１２．５）にも、特に鼻発生に限って、ＲｄＣＶＦ２  ｍＲＮＡの小さな発現が見られたことを述べておかなければならない。
【０１００】
最後に、桿体変性過程でＲｄＣＶＦ２−ＳおよびＲｄＣＶＦ２−Ｌの発現を分析した。
【０１０１】
図３のパネルｄは、生後８日、１５日および３１日（ＰＮ８、ＰＮ１５およびＰＮ３５）の野生型（ｗｔ）およびｒｄ１マウスにおけるＲｄＣＶＦ２アイソフォームおよびロドプシン転写物の双方の発現タイムコースを示す。
【０１０２】
これらの結果により、桿体欠損の発生前の生後８日（ＰＮ８）に、ＲｄＣＶＦ２−Ｓは、桿体光色素遺伝子ロドプシンと同様に、野生型およびｒｄ１網膜で同等のレベルで発現する。ＰＮ１５〜ＰＮ３５で、桿体の変性（ロドプシン発現の低下によって測定）はＲｄＣＶＦ２−Ｓ発現の低下と相関している。結論として、これらの結果は、ＲｄＣＶＦ２−Ｓが桿体依存的に発現することを示す。同じ結果がＲｄＣＶＦ２−Ｌでも見られた（データは示されていない）。
【０１０３】
５）ＲｄＣＶＦ２  ｍＲＮＡは網膜および臭覚上皮で発現するだけでなく、他の組織でも発現する
ＲｄＣＶＦアイソフォームおよびＲｄＣＶＦ２アイソフォーム（ＬおよびＳ）の双方に関連するマウスｍＲＮＡおよびＥＳＴ配列を用い、各メッセンジャーの組織特異性を評価した。結果を下表に示す。
【０１０４】
【表１】
0005671678.tif 000002
0005671678.tif 000003
【０１０５】
これまでに報告されているように(LEVEILLARD et al., 2004,前掲)、結果は、ＲｄＣＶＦ−ＬおよびＲｄＣＶＦ−Ｓ  ｍＲＮＡは、眼および網膜にそれぞれ２０／２３および４／４系列が見られたことから、これらの組織で特異的に発現することが確認された。これらの結果は、マウスＲｄＣＶＦ２−Ｌ  ｍＲＮＡは網膜で優先的に発現する（１０／２４）だけでなく、腫瘍（２）、精巣（２）、幹細胞（２）、羊膜（１）、胎盤（１）、卵管（１）、胎児（１）、胸腺（１）および乳腺（１）などの他の組織種にも存在することを示す。これらの結果により、精巣および脳で見られるＲｄＣＶＦ２の発現が確認された（図４パネルｂ）。最後に、ＥＳＴおよびＣＶＦ２−Ｓに相当するｍＲＮＡ配列はもっぱら網膜で発現する（３／４）。
【０１０６】
６）ＲｄＣＶＦ２錐体生存効果
遺伝子の組成、配列の保存性および桿体依存的発現に関するＲｄＣＶＦ遺伝子座とＲｄＣＶＦ２遺伝子座の間の強い類似性から、本発明者らは、ＲｄＣＶＦ２タンパク質が、ＲｄＣＶＦ−Ｓに関してこれまでに報告されているように(LEVEILLARD et al, 2004,前掲)、錐体の生存能も増進することができる可能性があるとの仮説に至った。
【０１０７】
ＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ／２−Ｌ）アイソフォームを発現プラスミドｐｃＤＮＡ３にクローニングし、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、ＣＯＳトランスフェクト細胞からの細胞馴化培地を採取し、ニワトリ胚由来の錐体富化一次細胞培養系（錐体６０〜８０％）とともにインキュベートした(FINTZ et al, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., vol.44(2):818-825 2003)。
【０１０８】
インキュベーション７日後（これらの有糸分裂後の細胞が退化する期間）、培養細胞の生存能はＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ(MOLECULAR PROBES)とこれまでに記載されているような［４］細胞計数プラットフォームを用いてスコアリングした。３回の独立したアッセイに相当する生存能を、陰性対照として用いたｐｃＤＮＡ３に対する倍数として表す。
【０１０９】
図４は、空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）と比較した際のＲｄＣＶＦ−ＳおよびＲｄＣＶＦ２−Ｓの救済活性を示す。統計分析（チューキー検定）は、これらの結果が統計学的に有意であることを示す（ｐ＜０．００１）。
【０１１０】
これらの結果は、ＲｄＣＶＦ−Ｓの存在下での生細胞数が対照（ｐｃＤＮＡ３）の２倍であることを示す。ＲｄＣＶＦ２−Ｓでは、著しくはないが、統計学的有意な錐体生存能の増加（１．６倍）が見られる。これらの知見により、ＲｄＣＶＦ２−ＳもＲｄＣＶＦ−Ｓと同様に(LEVEILLARD et al., 2004,前掲)、錐体生存因子であることが確認される。重要なこととしては、ＲｄＣＶＦ−ＳとＲｄＣＶＦ２−Ｓの双方がＣＯＳ−１細胞に同時にトランスフェクトされた際には錐体に対する相乗的栄養効果は見られず、両因子により同じ経路が用いられていることが指摘される（データは示されていない）。
【０１１１】
７）ＲｄＣＶＦ２のＯＳＮ生存効果
ＲｄＣＶＦ２は臭覚ニューロンでも発現することから、臭覚感覚ニューロン（ＯＳＮ）の培養物に対するＲｄＣＶＦ２の生存活性を分析した。
【０１１２】
成体マウスを断頭により犠牲にした。鼻腔から鼻中隔の後部を切り離し、すぐに、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン(EUROBIO; GIBCO)および１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(EUROBIO)を含有する氷冷ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に入れた。この中隔の軟骨を取り除き、臭覚粘膜を２．４ユニット／ｍｌのディスパーゼＩＩ溶液(ROCHE)中、３７℃で３０分間インキュベートした。臭覚上皮を、解剖顕微鏡下で注意深く、下にある基底膜から分離し、約２０回、穏やかに粉砕して細胞を分離した。得られた細胞懸濁液を５０ｍｌコニカル管に移し、カルシウムとマグネシウムを除いたＨＢＳＳ４０ｍｌを加えることでディスパーゼを失活させた。この細胞懸濁液を７００ｒｐｍで５分、遠心分離した。上清を吸引し、細胞を含むペレットを、インスリン（１０μｇ／ｍｌ、SIGMA）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ、SIGMA）、セレン（１０μｇ／ｍｌ、SIGMA）、ウシ胎児血清（５％）、アスコルビン酸（２００μＭ）を含有するＤＭＥＭからなる媒体に再懸濁させた。細胞を、５μｇ／ｃｍ２のヒトコラーゲンＩＶ(SIGMA)でコーティングした１２ｍｍの無菌カバーガラス上に細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。
【０１１３】
これまでに記載されているＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ／２−Ｌ）アイソフォームをコードする発現ベクターをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、ＣＯＳトランスフェクト細胞から細胞馴化培地を採取し、ＯＳＮ培養物とともにインキュベートした。培養４日後、細胞を固定し、チューブリンＩＩＩで標識し、計数した。
【０１１４】
図５に示されている結果により、ＯＳＮ細胞の生存能は、対照に比べ、ＲｄＣＶＦ２−Ｓアイソフォームの存在下でより重要であったことが確認された。ＲｄＣＶＦ２−Ｌでは、保護作用が見られた。
【０１１５】
８）ＲｄＣＶＦ２のプルキンエ細胞生存効果
生後１〜３日のマウスを断頭した後、脳を切除し、５ｍｇ／ｍｌのグルコースを含有する冷却したＧｅｙの平衡塩溶液に入れ、髄膜を取り除いた。小脳の側矢状方向切片（３５０または２５０μｍ厚）をＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーで切り取り、孔径０．４μｍの３０ｍｍ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥカルチャーインサート(MILLICELL; MILLIPORE, Bedford, MA)メンブラン上に移した。切片は、３５℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気下、培地１ｍｌを含む６穴プレートまたは培地３ｍｌを含む１０ｃｍ培養皿で培養維持した。培地はイーグルの塩(INVITROGEN)、２５％ＨＢＳＳ(INVITROGEN)、２５％ウマ血清(INVITROGEN)、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）および５ｍｇ／ｍｌグルコースを含む５０％基本培地からなった(Stoppini et al, J. Nenrosci. Methods., vol.37(2), p: 173-82, 1991)。
【０１１６】
これまでに記載されているＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ／２−Ｌ）アイソフォームをコードする発現ベクターをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、ＣＯＳトランスフェクト細胞からの細胞馴化培地を採取し、プルキニエ細胞培養物とともにインキュベートした。培養４日後、細胞を固定し、計数した。
【０１１７】
９）ＲｄＣＶＦ２の皮質ニューロン生存効果
生後１日のマウスで、マウス皮質一次培養物の血清不含調製を行った。髄膜を取り除いた後、２価の陽イオンを加えないリン酸緩衝生理食塩水グルコース溶液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７．９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３３ｍＭグルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中で皮質全体を機械的に剥離し、２％Ｂ２７添加物(GIBCO)、０．５ｍＭグルタミンおよび２５μＭグルタミン酸塩を含有するNeurobasal-medium(GIBCO-INVITROGEN)に再懸濁させた。その後、細胞をポリオルニチンをコーティングしたカバーガラス上で培養し、ニューロンが極めて富化された培養物を作製した。
【０１１８】
これまでに記載されているＲｄＣＶＦ（−Ｓ／２−Ｓ／２−Ｌ）アイソフォームをコードする発現ベクターをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、ＣＯＳトランスフェクト細胞からの細胞馴化培地を採取し、皮質ニューロン培養物とともにインキュベートした。培養４日後、細胞を固定し、計数した。
【０１１９】
最後に、これらに結果より、錐体の生存、より一般にはニューロンの生存のための新規な栄養因子が同定されたことが確認された。この因子は神経保護および酸化ストレスに対する応答に重要な可能性のある二機能性タンパク質の新規なファミリーを定義する。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】ＲｄＣＶＦ遺伝子およびＲｄＣＶＦ２遺伝子の構造保存を示す。
【図２】マウスＲｄＣＶＦおよびＲｄＣＶＦ２タンパク質とチオレドキシンスーパーファミリーメンバーとの配列および構造類似性を示す。
【図３】網膜におけるＲｄＣＶＦ２発現の検証を示す。
【図４】ＲｄＣＶＦ−ＳおよびＲｄＣＶＦ２−Ｓの存在下での錐体生存能アッセイを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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