(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、前記電極の電位Ｘを銀・塩化銀電極電位基準でＸ≦−０．６（Ｖ）に制御しながら培養することにより、前記還元経路における還元反応を促進させると共に前記酸化経路における酸化反応を減退させることを特徴とする微生物の代謝経路制御方法。
【請求項２】
ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、前記電極の電位Ｘを銀・塩化銀電極電位基準でＸ≧−０．３（Ｖ）に制御しながら培養することにより、前記還元経路における還元反応を減退させると共に前記酸化経路における酸化反応を促進させることを特徴とする微生物の代謝経路制御方法。
【請求項３】
前記微生物が大腸菌又は加水分解菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の代謝経路制御方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物の代謝経路を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が様々な代謝経路を経て様々な代謝産物を産生し得ることはよく知られている。例えば、大腸菌（E.coli）は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物である。より具体的には、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物である。アセチル補酵素Ａは最終的には酢酸及びエタノールに変換される（図１及び非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】J.Bacteriol(2000), vol182, 3, p620-626
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
大腸菌の代謝経路において、還元経路におけるピルビン酸の乳酸への還元反応を促進させることができれば、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料として有用な乳酸の産生量を増加させることが可能となる。逆に、酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Ａへの酸化反応を促進させることができれば、バイオ燃料として有用なエタノールの産生量を増加させることが可能となる。
【０００５】
また、加水分解菌は、メタン発酵槽内において、水素資化性メタン菌がメタンを産生する際に必要な水素を生育時に産生する機能を有している微生物である。しかし、その一方で、加水分解菌はピルビン酸のアセチル補酵素Ａへの酸化経路を代謝経路として有しており、アセチル補酵素Ａが最終的に変換されて生じる酢酸がメタン発酵槽の酸敗の要因となり得る。そこで、酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Ａへの酸化反応を減退させることができれば、メタン発酵槽の酸敗を引き起こし得る酢酸の産生量を低下させることが可能となり、メタン発酵槽の長期安定化を実現することも可能となる。
【０００６】
このように、微生物のピルビン酸を起点とする代謝経路を制御することで、種々の利点が生み出され得るものと考えられる。
【０００７】
そこで、本発明は、微生物のピルビン酸を起点とする代謝経路を制御する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、本願発明者等が鋭意研究を行った結果、大腸菌を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御することで、乳酸の産生量が増加すると共に酢酸及びエタノールの産生量が減少することを知見した。逆に、電極の電位を酸化電位に制御することで、乳酸の産生量が減少すると共に酢酸及びエタノールの産生量が増加することを知見した。
【０００９】
さらに、本願発明者等は、超好熱性の加水分解菌であるサーモトガ  マリティマ（Thermotoga maritima）を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御することで、通常は殆ど産生されない乳酸が産生されると共に酢酸の産生量が減少することも知見した。
【００１０】
本願発明者等は、これらの知見に基づき、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物全般について、その培養環境に電極を接触させ、電極の電位を制御することで、ピルビン酸を起点とする代謝経路を制御することが可能であることが導き出されることを知見するに至り、さらに種々検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明の微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位Ｘを銀・塩化銀電極電位基準でＸ≦−０．６（Ｖ）に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を促進させると共に酸化経路における酸化反応を減退させるようにしている。
【００１３】
また、本発明の微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位Ｘを銀・塩化銀電極電位基準でＸ≧−０．３（Ｖ）に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を減退させると共に酸化経路における酸化反応を促進させるようにしている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物について、ピルビン酸を起点とする代謝経路を人為的に制御することが可能となる。したがって、この代謝経路からの代謝産物の産生量を増加させたり減少させたりする制御を所望の条件に応じて実施することが可能となる。
【００１５】
例えば、大腸菌を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御することで、還元経路におけるピルビン酸の乳酸への還元反応を促進させて、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料として有用な乳酸の産生量を増加させることが可能となる。逆に、電極の電位を酸化電位に制御することで、酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Ａへの酸化反応を促進させて、バイオ燃料として有用なエタノールの産生量を増加させることが可能となる。
【００１６】
また、加水分解菌を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御することで、酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Ａへの酸化反応を減退させ、還元経路におけるピルビン酸の乳酸への還元反応を促進させることができるので、例えば培養環境をメタン発酵槽とした場合には、メタン発酵槽の酸敗を引き起こし得る酢酸の産生量を低下させることが可能となり、メタン発酵槽の酸敗を防いで長期安定化を実現することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】大腸菌の代謝経路を示す図である。
【図２】サーモトガ  マリティマ（Thermotoga maritima）の代謝経路を示す図である。
【図３】第一の実施形態Ａにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図４】第一の実施形態Ｂにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図５】第一の実施形態Ｃにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図６】第一の実施形態Ｄにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図７】第二の実施形態にかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図８】本発明を実施するための電気培養装置の他の構成の一例を示す断面図である。
【図９】菌体密度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１０】培養液中のスターチ残存量を示す図である（実施例１）。
【図１１】ガス発生量を示す図である（実施例１）。
【図１２】培養液のｐＨの経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１３】培養液の酢酸濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１４】培養試験における培養液の乳酸濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１５】培養期間中の電流値の測定結果を示す図である（実施例１）。
【図１６】培養液の乳酸濃度を示す図である（実施例２）。
【図１７】培養液の酢酸及びエタノール濃度を示す図である（実施例２）。
【図１８】実施例において使用した電気培養装置の構成を示す断面図である。
【図１９】実施例において使用した電気培養装置の小容器の構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００１９】
本発明の微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を制御しながら培養することにより、微生物のピルビン酸を起点とした代謝を制御するようにしている。
【００２０】
より具体的には、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を制御対象微生物とし、この微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を促進させると共に酸化経路における酸化反応を減退させるようにしている。逆に、電極の電位を酸化電位に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を減退させると共に酸化経路における酸化反応を促進させるようにしている。
【００２１】
本発明を適用する対象となり得る微生物としては、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物であれば特に限定されない。例えば、好適には、大腸菌、加水分解菌が挙げられるが、他にも、ヘテロ乳酸発酵を行う乳酸菌 （例えばLactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactococcus cremoris, L. buchnerii, L. cellobisous, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus helveticus, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc oenos等） や、 ホモ乳酸発酵を行う乳酸菌（Lactobacillus delburueckii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvantus, Lactobacillus plantarum, Sporolactobacillus inulinus, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Pdeiococcus damnosus, Streptococcus acidominimus, Streptococcus agalactiae, Streptococcusequinus, Streptococcus milleri, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis等）、 Bacillus subtilis, Bacillus caldolyticus, Bacillus megaterium, Carnobacterium divergens, Lactosphaera pasteurii, Oenococcus oeni, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae, Clostridium perfringens, Clostridium thermocellum, Salmonella enterica, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Serratia marcescens, Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Geobacillus stearothermophilus, Thermoanaerobacter ethanolicus, Bacillus caldolyticus, Nocardia asteroids, Selenomonas ruminantium, Actinomyces viscosus, Butyrivibrio fibrisolvens, Staphylococcus aureus, Rhizopus oryzae, Acinetobacter calcoaceticus等が挙げられる。
【００２２】
ここで、好適な微生物として例示した大腸菌の代謝経路（図１）に基づいて本発明を説明する。ピルビン酸はグルコースからホスホエノールピルビン酸を経て産生される。このピルビン酸は還元経路を経て乳酸に還元され、酸化経路を経てアセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）に酸化される。アセチル補酵素Ａはアセチルアルデヒドを経てエタノールに変換され、アセチル−Ｐを経て酢酸に変換される。即ち、大腸菌は、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物である。
【００２３】
大腸菌を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御すると、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が促進され、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Ａへの酸化反応が減退する。これにより、乳酸の産生量が増加し、酢酸及びエタノールの産生量が減少する。この場合、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料として有用な乳酸を大腸菌により多く産生させることが可能となる。
【００２４】
これとは逆に、電極の電位を酸化電位に制御すると、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が減退し、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Ａへの酸化反応が促進される。これにより、乳酸の産生量が減少し、酢酸及びエタノールの産生量が増加する。この場合、バイオ燃料として有用なエタノールを大腸菌により多く産生させることが可能となる。
【００２５】
次に、好適な微生物として例示した加水分解菌のうち、超好熱性の加水分解菌であるサーモトガ  マリティマ（Thermotoga maritima、以下、サーモトガと呼ぶこともある）の代謝経路（図２）に基づいて本発明を説明する。ピルビン酸はグルコースからグリセルアルデヒド  ３−ホスフェート及び１，３−ビスホスホグリセリン酸を経て産生される。このピルビン酸は酸化経路を経てアセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）に酸化される。アセチル補酵素Ａは酢酸に変換される。また、通常はピルビン酸からの乳酸の産生が殆ど起こらないが、培養条件等によってはピルビン酸から乳酸が産生され得る。したがって、サーモトガは、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物である。
【００２６】
サーモトガを含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御すると、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が促進され、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Ａへの酸化反応が減退する。これにより、通常は殆ど乳酸を産生することのないサーモトガが、ピルビン酸を還元して乳酸を産生するようになると共に、酢酸の産生量が減少する。これにより、例えば培養環境をメタン発酵槽とした場合に、メタン発酵槽の酸敗を引き起こし得る酢酸の産生量を低下させることが可能となり、メタン発酵槽の酸敗を防いで長期安定化を実現することが可能となる。
【００２７】
また、ヘテロ乳酸発酵を行う乳酸菌もピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物であり、電極の電位を還元電位とすることで、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が促進され、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Ａへの酸化反応が減退する。逆に、電極の電位を酸化電位とすることで、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が減退し、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Ａへの酸化反応が促進される。ヘテロ乳酸発酵においても、アセチル補酵素Ａを経て酢酸やエタノールが産生される。したがって、大腸菌の場合と同様、電極の電位を還元電位とすることで、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料として有用な乳酸を乳酸菌により多く産生させることが可能となる。逆に、電極の電位を酸化電位とすることで、バイオ燃料として有用なエタノールを乳酸菌により多く産生させることが可能となる。
【００２８】
また、ホモ乳酸発酵を行う乳酸菌においても、培養条件等によっては酢酸等の副産物が微量ではあるが産生され得ることから、本発明における制御対象微生物とすることで、ヘテロ乳酸発酵を行う乳酸菌と同様の効果が奏され得る。また、ホモ乳酸発酵を行う乳酸菌のピルビン酸からの代謝経路がピルビン酸から乳酸への代謝経路に限定される場合であっても、電極の電位を還元電位とすることで、ピルビン酸から乳酸への還元反応を促進して乳酸の産生量を増加させ得る。逆に、電極の電位を酸化電位とすることで、ピルビン酸から乳酸への還元反応を減退して乳酸の産生量を減少させ得る。
【００２９】
ここで、本発明において、電極電位の還元電位への制御は、電極電位を培養環境の酸化還元電位よりも小さくすることで実現される。逆に、電極電位の酸化電位への制御は、電極電位を培養環境の酸化還元電位よりも大きくすることで実現される。
【００３０】
即ち、培養環境の酸化還元電位をＡ（Ｖ）とし、電極電位をＸ（Ｖ）とすると、電極電位Ｘの還元電位への制御は、Ｘ＜Ａとすることで実現される。逆に、電極電位Ｘの酸化電位への制御は、Ｘ＞Ａとすることで実現される。
【００３１】
具体的には、電極電位Ｘの還元電位への制御は、銀・塩化銀電極電位基準で、Ｘ≦−０．６（Ｖ）とすることが好適であり、Ｘ＜−０．６（Ｖ）とすることがより好適であり、Ｘ≦−０．８（Ｖ）とすることがさらに好適である。但し、電極電位Ｘを低くし過ぎると、例えば培養環境において水の電気分解等が生じることにより、投入した電気エネルギーが代謝経路の制御以外にも消費され得るので、Ｘ≧−１．４（Ｖ）とすることが好適であり、Ｘ≧−１．２（Ｖ）とすることがより好適であり、Ｘ≧−１．０（Ｖ）とすることがさらに好適である。
【００３２】
尚、Ｘ≦−０．６（Ｖ）とすることで、加水分解菌を制御対象微生物とした場合に、微生物の増殖開始時間が短縮される効果が得られることが本願発明者等の実験により確認されている。また、Ｘ≦−０．８（Ｖ）とすることで、上記効果に加えて、有機物の分解促進効果及び水素発生量の顕著な増加効果、さらには培養環境のｐＨの中性維持効果が奏され得ることから、加水分解菌を制御対象微生物とした場合には、Ｘ≦−０．６（Ｖ）、特にＸ≦−０．８（Ｖ）とすることが極めて好適であると言える。
【００３３】
次に、電極電位Ｘの酸化電位への制御は、銀・塩化銀電極電位基準で、Ｘ≧−０．３（Ｖ）とすることが好適であり、Ｘ＞−０．３（Ｖ）とすることがより好適であり、Ｘ≧０（Ｖ）とすることがさらに好適である。但し、電極電位Ｘをプラス側に大きくしすぎると、培養環境からの水の電気分解等が生じ、代謝産物の制御以外にも投入した電気エネルギーが消費され得るので、Ｘ≦＋１．４（Ｖ）とすることが好適であり、Ｘ≦＋１．２（Ｖ）とすることがより好適であり、Ｘ≦＋１．０（Ｖ）とすることがさらに好適である。
【００３４】
ここで、培養環境（培養液）には、微生物の代謝を阻害することのない酸化還元物質を添加するようにしてもよい。酸化還元物質を添加することで、培養環境の電位を制御し易くできる。酸化還元物質としては、鉄イオン、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲンなどのビオロゲン誘導体等を用いることができる。尚、酸化還元物質として鉄イオンを用いる場合には、鉄イオンをキレート剤に配位させて、鉄イオンを培養液中で安定に存在させるようにすることが好ましい。キレート剤としては、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチン等、鉄イオンを配位し得る任意のキレート剤を挙げることができる。
【００３５】
また、電極電位を制御する際には、電極（作用電極）を培養環境（例えば培養液）と接触させ、この電極と対を成す電極（対電極）をイオン交換膜を介して培養環境と接触させるようにしてもよい。また、対電極とイオン交換膜は直接接触させてもよいし、電解液を介して間接的に接触させてもよい。イオン交換膜は酸化還元物質を透過させることなく培養液に留めることができるものとすることが好ましい。この場合、培養液全体の電位を制御し易いものとできる。但し、イオン交換膜を設けずとも、作用電極の周辺の電位は制御されるので、本発明の効果は奏され得る。したがって、イオン交換膜の使用は必須ではない。また、イオン交換膜に代えて、透析膜を使用するようにしてもよい。
【００３６】
本発明の微生物の代謝経路制御方法は、例えば、図３〜７に示す電気培養装置により実施される。以下、第一の実施形態を図３〜図６に基づいて説明し、第二の実施形態を図７に基づいて説明する。
【００３７】
＜第一の実施形態＞
第一の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を培養液に投入し、培養液と電解液とをイオン交換膜を介して接触させ、培養液に作用電極と参照電極を接触させ、電解液に対電極を接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、作用電極の電位を３電極方式で制御して、微生物の代謝経路を制御するようにしている。
【００３８】
第一の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法は、例えば図３〜６に示す電気培養装置１により実施される。即ち、図３〜図６に示す電気培養装置１は、イオン交換膜６によって仕切られた二つの槽のうちの一方の槽を培養槽７とし、他方の槽を対電極槽８とし、培養槽７には微生物と酸化還元物質とを含む培養液４が収容されると共に作用電極９と参照電極１１が浸され、対電極槽８には電解液４ａが収容されると共に対電極１０が浸され、作用電極９と対電極１０と参照電極１１は定電位設定装置１２に結線され、定電位設定装置１２により作用電極９の電位を３電極方式で制御するようにしている。
【００３９】
このように、３電極方式で作用電極９の電位を制御することで、作用電極９の電位を厳密に設定電位に制御することができる。詳細には、定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２により、作用電極９と参照電極１１との間の電位差を測定し、この電位差が設定電位に達するように作用電極９と対電極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。尚、３電極方式による電位制御については、例えば、電気化学測定法（上）、技報動出版株式会社、第１版１５刷、２００４年６月発行の６〜９ページにその詳細が記載されている。但し、作用電極９と対電極１０の極間電圧のみで作用電極９の電位を制御できる場合には、３電極方式とせずともよい。
【００４０】
また、図３〜図６に示す電気培養装置１では、培養槽７内の培養液４の液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガスを培養槽７の外（電気培養装置１の外）へ導くガス排出管１５ａを備え、このガス排出管１５ａをバルブ１５ｂにより開閉可能としたガス回収手段１５により、培養槽７内のガスを回収するようにしている。但し、ガスの回収方法は、この方法に限定されない。例えば、ガス回収手段１５を備えることなく、培養槽７の上部に開口部を設けて合成ゴム等（例えばシリコーンゴム）の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺してヘッドスペースからガスを回収するようにしてもよい。合成ゴム等の弾性材料は、注射針を引き抜くと孔が塞がる。したがって、ガスの回収を行わないときには、注射針を引き抜いておいても、培養槽７からガスが漏れ出すことがない。このようにしてガスを回収することで、ガスや揮発物を産生する微生物、例えば水素を産生する加水分解菌を対象として代謝経路制御を行った場合に発生する水素を漏れなく回収することができる。そして、加水分解菌を対象として代謝経路制御を行った場合に奏され得る水素発生量の顕著な増加効果により、ヘッドスペースに多量に滞留し得る水素ガスを漏れなく回収することが可能となる。また、代謝産物がエタノールや酢酸等のように揮発性物質の場合には、ヘッドスペースに滞留する揮発分を回収することも可能となる。
【００４１】
さらに、図３〜図６に示す電気培養装置１では、培養槽７内の培養液４の液面よりも下部に、培養槽７内の培養液４を培養槽７の外に導く培養液排出管１６ａを備え、この培養液排出管１６ａをバルブ１６ｂにより開閉可能とした培養液採取手段１６により、培養槽７内から培養液４を採取するようにしている。但し、培養液４の採取方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養液採取手段１６を備えることなく、培養槽７に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺して培養液４を採取するようにしてもよい。または両端が開口された管の一端の注射器に接続し、他端を培養液４に浸けて、管を介して培養液４を採取するようにしてもよい。このようにして培養液４を回収することで、培養液４に含まれる微生物２の代謝産物を回収することができる。
【００４２】
また、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６とは別に、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽７の外部から培養液４に物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、培養液４に栄養源、中和剤、物質生産に必要な物質等を必要に応じて添加することができる。勿論、微生物２をこの導入管から供給することもできる。また、嫌気条件とするためのガス（窒素ガス等）を供給することもできる。但し、培養液４に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６を培養液４に物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液４に物質を添加・供給するようにしてもよい。
【００４３】
以下、図３に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ａとして説明し、図４に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｂとして説明し、図５に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｃとして説明し、図６に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｄとして説明する。
【００４４】
（第一の実施形態Ａ）
図３に示す電気培養装置１は、密閉構造の容器２０を培養槽７とし、容器２０に収容可能な密閉構造の小容器２１を対電極槽８とし、小容器２１は少なくとも一部にイオン交換膜６を備えると共にガス（対電極１０から発生するガス）を容器２０の外に排出するガス排出管２２を備えるものとしている。また、対電極１０と定電位設定装置１２を結線する配線は、ガス排出管２２の中を通過させている。尚、図３に示す電気培養装置１では、対電極１０と定電位設定装置１２を結線する配線は、ガス排出管２２の中を通過させているが、必ずしもこの構成には限定されず、配線をガス排出管２２を通さずに定電位設定装置１２と結線するようにしてもよい。
【００４５】
培養槽７としての密閉構造の容器２０は、対電極槽８としての密閉構造の小容器２１を収容可能な大きさの容器であり、形状は特に限定されない。容器の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過性の膜材をヒートシール等により袋状に形成した容器を培養槽７として用いるようにしてもよい。
【００４６】
対電極槽８としての密閉構造の小容器２１は、培養槽７としての容器２０に収容可能な大きさの容器であり、少なくとも一部にイオン交換膜６を備えるものとしている。ここで、小容器２１はその全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としてもよいが、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成したり、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分は容器２０と同様の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えばガス不透過性の膜材により構成してもよい。
【００４７】
このように、容器２０に小容器２１を収容することで、容器２０に収容されている培養液４に小容器２１が浸され、小容器２１の少なくとも一部に備えられているイオン交換膜６は培養液４と接触する。換言すれば、培養液４はイオン交換膜６を介して電解液４ａと接触する。
【００４８】
ここで、第一の実施形態Ａでは、小容器２１を密閉構造とすることが好ましい。この場合、小容器２１において発生するガスを容器２０の外に排出するガス排出管を備えるようにすることで、対電極１０から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく回収することができる。但し、小容器２１は必ずしも密閉構造とせずともよい。
【００４９】
また、培養槽７（容器２０）は、密閉構造とすることが好ましい。この場合には、培養槽７を嫌気条件に制御し易い。さらに、微生物がガスを産生する場合には、培養槽７を密閉構造とし、且つ上述のガス回収手段１５等を備えることが好ましい。この場合には、微生物が産生するガスを容器２０の外に漏れ出させることなく、ガスによる容器２０内の圧力上昇を防ぎながらその全量を回収し易いものとできる。但し、培養槽７を密閉構造とすることは必須条件ではない。即ち、微生物がガスを産生して培養液４の液面からガスが発生することによって、培養液４の液面への遊離酸素の接触が抑制され、培養槽７の嫌気条件が維持され得るような場合には、培養槽７を密閉構造とせずとも構わない。
【００５０】
本実施形態において使用できる作用電極９は、特に限定されるものではなく、その表面にて酸化反応または還元反応が生じ得る電極、例えば炭素電極や白金電極等を適宜用いることができる。また、対電極１０としては、作用電極９における酸化反応または還元反応を補完する反応が生じ得る電極、例えば炭素電極や白金電極等を適宜用いることができる。
【００５１】
（第一の実施形態Ｂ）
図４に示す電気培養装置１は、上方が開放されている容器２３をイオン交換膜６で仕切ることにより開放された二つの槽が形成され、培養槽７としての一方の槽の上方開放部がガス不透過膜またはガス不透過部材２４により塞がれているものとしている。つまり、図４に示す電気培養装置１は、イオン交換膜６による培養槽７と対電極槽８の仕切り構成以外は、実質的には図３と同一の構成であり、図３に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が奏され得る。
【００５２】
尚、図４に示す電気培養装置１において、対電極槽８は、開放したままでもよいが、培養槽７と同様に密閉構造とし、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外に排出するガス排出管を備えるようにしてもよい。このように構成することで、対電極１０から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく回収することができる。
【００５３】
また、図４に示す電気培養装置１において、培養槽７のヘッドスペースと対電極槽８のヘッドスペースは連通させてもよいし、隔壁等により仕切って連通させないようにしてもよい。
【００５４】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００５５】
図４に示す電気培養装置１において、ガス不透過膜またはガス不透過部材２４としては、各種分野で一般に用いられているものを適宜用いることができる。例えば、ガス不透過部材としては、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過膜としては、例えばイオン交換膜６を用いることもできるがこれに限定されるものではない。
【００５６】
尚、本実施形態において使用できる容器２３の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００５７】
（第一の実施形態Ｃ）
図５に示す電気培養装置１は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２５ａと２５ｂがイオン交換膜６を介して開口部で連結されてＵ字型の容器２５が形成され、一方の容器２５ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２５ｂを開放して対電極槽８としている。この場合、培養液４と電解液４ａがイオン交換膜６を介して接触すると共に、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間と対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間とが容器２５自体のＵ字型構造によって隔てて配置される。つまり、図５に示す電気培養装置１は、容器２５の形状以外の構成については、実質的には図４と同一の構成である。したがって、図４（さらには図３）に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が奏され得る。
【００５８】
ここで、第一の実施形態Ｃにおける電気培養装置１の他方の容器２５ｂの開放とは、例えば他方の容器２５ｂの端部を完全に開放した場合は勿論のこと、図５に示すように、一方の容器２５ａと同様に密閉構造としつつ、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外の排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備えることで、対電極槽８から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく容易に回収することが可能となる。
【００５９】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００６０】
尚、本実施形態において使用できる容器２５の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００６１】
（第一の実施形態Ｄ）
図６に示す電気培養装置１は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２６ａと２６ｂがイオン交換膜６を介して開口部で連結されてＨ字型の容器２６が形成され、一方の容器２６ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２６ｂを開放して対電極槽８としている。この場合にも、培養液４と電解液４ａがイオン交換膜６を介して接触すると共に、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間と対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間とが容器２６自体のＨ字型構造によって隔てて配置される。つまり、図６に示す電気培養装置１は、容器２５の形状以外の構成については、実質的には図４と同一の構成である。したがって、図４（さらには図３）に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が奏され得る。
【００６２】
ここで、第一の実施形態Ｄにおける電気培養装置１の他方の容器２６ｂの開放とは、例えば他方の容器２６ｂの上部等を完全に開放した場合は勿論のこと、図６に示すように、一方の容器２５ａと同様に密閉構造としつつ、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外の排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備えることで、対電極槽８から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく容易に回収することが可能となる。
【００６３】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００６４】
尚、本実施形態において使用できる容器２６の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００６５】
＜第二の実施形態＞
第二の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を培養液に投入し、培養液に作用電極と参照電極を接触させ、培養液と対電極とをイオン交換膜を介して接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、作用電極の電位を３電極方式で制御して、微生物の代謝経路を制御するようにしている。つまり、第一の実施形態における微生物の代謝経路制御方法とは、電解液を用いることなく対電極を直接イオン交換膜に接触させている点のみが異なっている。
【００６６】
しかしながら、第一の実施形態のように電解液４ａを用いずとも、作用電極９と対電極１０との間でイオン交換膜６を介してイオン電流は流れるので、第二の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法によれば、第一の実施形態と同様に作用電極９の電位を制御して、同様の効果を得ることが可能である。
【００６７】
第二の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法は、例えば図７に示す電気培養装置により実施される。図７に示す電気培養装置１は、イオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造の容器５内に作用電極９と参照電極１１が配置され、容器５の外側に対電極１０が配置され、容器５に培養液４が収容されると共に作用電極９と参照電極１１が培養液４に浸され、容器４のイオン交換膜６は容器５に培養液４が収容されたときに少なくともその一部がイオン交換膜６と接触しうる位置に備えられ、イオン交換膜６の培養液４の接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極１０が接触して配置されているものとしている。図７に示す電気培養装置１では、容器５の培養液４の液面よりも下部に開口部５ａが設けられ、開口部５ａがイオン交換膜６で塞がれ、容器５の外側のイオン交換膜６の表面の少なくとも一部に対電極１０が接触して配置されているものとしている。つまり、図７に示す電気培養装置１では、容器５全体が培養槽７として機能することとなる。
【００６８】
したがって、図７に示す電気培養装置１によれば、容器５を密閉構造としているので、容器５からガスが漏洩することがない。また、第一の実施形態と同様、容器５内を嫌気条件に制御し易い利点もある。
【００６９】
尚、図７に示す電気培養装置１では、第一の実施形態と同様に、ガス回収手段１５、培養液採取手段１６を備えるようにしているが、上記の通り、ガス回収方法、培養液採取方法は、これらの手段を利用したものには限定されない。また、第一の実施形態と同様、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。
【００７０】
以下、図７に示す電気培養装置１の詳細について説明する。但し、以下に説明する以外の構成については、第一の実施形態と実質的に同一であり、説明は省略する。
【００７１】
容器５は、イオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造としている。容器５の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。尚、図７では、密閉構造の容器５の培養液４の液面よりも下部に設けられた開口部５ａをイオン交換膜６により塞ぐようにしているが、容器５の形態や構造は特に限定されない。例えば容器５全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としてもよいし、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成してもよいし、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分はガラス等の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えば培養液４と培養液４中の成分の双方を透過させることがない膜材により構成してもよい。要は、容器５に収容される培養液４が容器５の少なくとも一部を構成するイオン交換膜６と接触しうる構造の容器とすればよい。
【００７２】
対電極１０は、イオン交換膜６の培養液４との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に接触させるようにしている。本実施形態において、対電極１０は板状の炭素電極としているが、対電極１０の形状と材質はこれに限定されるものではなく、要は、イオン交換膜６との接触が可能な形状であり、且つ作用電極９における酸化反応に対して電子の授受を補完する還元反応を進行させることが可能な材質、つまり、作用電極９において還元反応が生じる際に酸化反応を進行させることが可能な材質の電極とすればよい。また、本実施形態では、対電極１０の面積をイオン交換膜６の面積よりも大きなものとしてイオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うようにし、イオン交換膜６と対電極１０とを接触させるようにしているが、イオン交換膜６の培養液４との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極１０を接触させれば、イオン交換膜６を介して培養液４から対電極１０にイオンが伝達するので、必ずしもイオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うようにしてイオン交換膜６と対電極１０とを接触させずともよい。但し、イオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うことで、対電極１０をイオン交換膜６の保護材としても機能させることができると共に、培養液４からのイオンの伝達面が増大する結果として、培養液４の電位制御性を高めることができる利点があり、好適である。イオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆う方法としては、例えば、容器５の開口部５ａの周囲に接着剤を塗布して対電極１０を接着することにより、開口部５ａを塞ぐイオン交換膜６全体と対電極１０とを接触させるようにしてもよいし、容器５の開口部５ａの周囲に接着剤を塗布して対電極１０の表面の少なくとも一部に塗布形成されたイオン交換膜６を接着することにより、開口部５ａをイオン交換膜６で塞ぎつつ、開口部５ａを塞ぐイオン交換膜６全体と対電極１０とを接触させるようにしてもよい。イオン交換膜６を塗布形成するための薬剤としては、例えばナフィオン分散液が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、対電極１０の表面にナフィオン分散液を塗布し、ナフィオン分散液が乾燥する前にイオン交換膜６を貼り付けるようにしてもよい。この場合には、イオン交換膜６の対電極１０の表面への接着性と接触性とを十分なものとすることができる。
【００７３】
ここで、対電極１０は多孔質体とすることが好適である。この場合には、イオン交換膜６と対電極１０との接触面で発生したガスを接触面とは反対側の面に通過させやすくなる。尚、対電極１０を多孔質体とし、ナフィオン分散液を用いてイオン交換膜６を貼り付けることで、ナフィオン分散液の多孔質体の孔への侵入によりイオン交換膜６と対電極１０との接触面積を増大させて電気化学反応をより進行させやすくすることができ、好適である。
【００７４】
また、培養槽７として機能する容器５は、第一の実施形態と同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。また、容器５の外側の対電極１０をガス不透過部材等で覆って密封構造とし、対電極１０から発生するガスを回収するためのガス回収手段を設けてもよい。このように構成することで、対電極１０から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく回収することができる。
【００７５】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、図８に示すように、培養液４と電解質４ａをイオン交換膜６ではなく、イオンや微生物を一切透過させることのない不透過部材４０で隔て、あるいは培養槽７と対電極槽８を別の容器で形成し、塩橋４１（寒天等にＫＣｌ等の飽和電解質溶液を入れたもの）を介して培養液４と電解質４ａを接触（液絡）させるようにしてもよい。この場合にも、塩橋４１によってイオン電流の流れが許容され、上述の実施形態と同様の効果が得られる。
【実施例】
【００７６】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００７７】
＜実験装置＞
（１）実施例１において使用した電気培養装置
実施例１では、図６に示す電気培養装置を用いて実験を行った。２５０ｍＬ容の２つのガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ製）のうちの一方を培養槽７とし、他方を対電極槽２６ｂとし、下部開口部において陽イオン交換膜（ナフィオンＫ、デュポン製）１０６を介して２つのバイアル瓶を接続し、Ｈ字型の容器２６とした。培養槽７には蓋をし、蓋の上面にはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極を通した際の密閉製を確保した。
【００７８】
培養期間中に培養槽７から発生したガスは、ガス回収手段１５に接続したアルミニウム製サンプリングバッグ（ジーエルサイエンス製、商品名：アルミニウムバッグ、１Ｌ）に回収した。
【００７９】
対電極槽８には、電解液４ａを収容すると共に対電極１０を収容して電解液４ａに浸した。対電極槽８も蓋をし、蓋の上面にはシリコーンゴム栓を設けて、シリコーンゴム栓にガス排出管２２を貫通させた。そして、対電極１０と電位制御装置１２を結線するための配線をガス排出管２２に通した。ガス排出管２２は両端が開口されており、一端を対電極槽８の内部に、他端を対電極槽８の外側に配置するようにした。
【００８０】
作用電極９は、培養槽７に収容して培養液４に浸し、作用電極９から電位制御装置１２への配線はシリコーンゴム栓を通して培養槽７の外側に引き出した。参照電極１１（銀・塩化銀電極（RE-1B, ＢＡＳ株式会社））は培養槽７の外側からシリコーンゴム栓に差し込んで、培養液４と接触させた。作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを３電極式の定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２に結線して、作用電極９の電位を厳密に制御可能とした。培養中は攪拌子により培養液４を攪拌した。
【００８１】
作用電極９は炭素電極（サイズ：7.5 cm ×2.5 cm）とした。対電極１０は炭素電極（サイズ：6.5 cm×1.2 cm）とした。
【００８２】
（２）実施例２において使用した電気培養装置
実施例２では、図１８に示す電気培養装置を用いて実験を行った。培養槽７としての容器２０は２５０ｍＬ容のガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ製）とした。培養液４は容器２０の八分目程度まで入れた。容器２０には蓋３０をした。蓋３０の上面３０ａにはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極、管を通した際の容器２０の密閉性を確保した。また、シリコーンゴム栓を設けることにより注射針の突き刺しを可能とし、且つ注射針の差し込みにより生じた孔が注射針を抜いた際に塞がるようにした。
【００８３】
対電極槽８としての小容器２１は、イオン交換膜６を成型して袋状（以下、袋２１と呼ぶ）とした。実験で用いた小容器２１の形態を図１９に示す。具体的には、イオン交換膜（ナフィオンＫ、デュポン製）をヒートシーラーで熱圧着により加工して上部が開口した袋状の容器２１とし、袋２１の内部には電解液４ａを収容すると共に対電極１０を収容して電解液４ａに浸した。そして、対電極１０と定電位設定装置１２を結線するための配線３１をガス排出管２２に通した。ガス排出管２２は両端が開口されており、一端を小容器２１の内部に、他端を容器２０の外側に配置するようにして、小容器２１内で発生するガスが容器２０の外側に排出されるようにした。袋状の小容器２１の上部の開口部は、シリコン接着剤３２で塞いだ。
【００８４】
小容器２１と作用電極９とを培養液４に浸漬し、小容器２１のガス排出管２２と作用電極４の配線は蓋３０に設けたシリコーンゴム栓に通して容器２０の外側に引き出した。銀・塩化銀参照電極１１（RE-1B, ＢＡＳ株式会社）は容器２０の外側からシリコーンゴム栓に通して差し込むことにより培養液４と接触させた。培養液採取管１６は容器２０の外側からシリコーンゴム栓に通して差し込むことによりその一端を培養液４と接触させた。作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを３電極式の定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２に結線して、作用電極９の電位を厳密に制御可能とした。培養液採取管１６の他端は注射器と接続して培養液４を採取可能とした。培養中は攪拌子３４により培養液４を攪拌した。
【００８５】
作用電極９は炭素電極（サイズ：7.5 cm ×2.5 cm）とした。対電極１０は炭素電極（サイズ：6.5 cm×1.2 cm）とした。
【００８６】
＜分析方法＞
【００８７】
菌体密度は、測定値（ＯＤ６６０）から計算した。
【００８８】
培養液４のスターチ濃度は、フェノール／硫酸法により測定した。
【００８９】
図１８に示す電気培養装置１のサンプリングバッグに回収されたガスの量を水上置換法を用いて分析し、ガスの組成をガスクロマトグラフィー（ＶＡＲＩＡＮ、ＣＲ４９００）で分析して、これらの分析結果を基に、ＣＯ２ガス量とＨ２ガス量を計算した。
【００９０】
培養液４の乳酸濃度及び酢酸濃度は、イオンクロマトグラフィー（ICS-2000、DIONEX製）にて測定した。
【００９１】
エタノール濃度は、液体クロマトグラフィー（LachromeElite, Hitachi）にて測定した。
【００９２】
（実施例１）
ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物として、超好熱性の加水分解菌であるサーモトガ  マリティマ ＤＳＭ３１０９（Thermotoga maritima DSM3109、以下、サーモトガと呼ぶ）を用いて、培養試験を実施した。
【００９３】
以下の組成の培地（JSCC237, Thermotoga medium）を培養液４とし、初期菌体密度を３．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにサーモトガをこの培養液４に添加して、これを培養槽７に２５０ｍＬ収容した。
［培地組成］
スターチ              ：１．０ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                        ：０．５ｇ
ＮａＣｌ              ：２０ｇ
ＮｉＣｌ２・Ｈ２Ｏ      ：０．００２ｇ
イーストエクストラクト：０．５ｇ
人工海水              ：２５０ｍＬ
微量元素溶液  ：１０ｍＬ
ｐＨ６．５
[微量元素溶液の組成（Ｌ−１）]
ニトリロ三酢酸        1.5g
MgSO4・7H2O            3g
MnSO4・2H2O            0.5g
NaCl                  1.0g
FeSO4・7H2O            0.1g
CoSO4・7H2O            0.18g
CaCl2・2H2O            0.1g
ZnSO4・7H2O            0.18g
CuSO4・5H2O            0.01g
H3BO3                  0.01g
Na2MoO4・2H2O      0.01g
NiCl2・6H2O            0.025g
Na2SeO3・5H2O            0.8mg
Na2WO4            0.8mg
KAl(SO4)2・12H2O      4mg
水                     1L
[人工海水]
MgSO4・7H2O            7g
MgCl2・6H2O            5.5g
NaCl                  27.7g
CaCl2・2H2O            2.25g
KCl                  0.65g
NaBr                  0.1g
H3BO3                  30mg
SrCl2・6H2O            15mg
クエン酸            10mg
KI                  0.05mg
水                  1L
【００９４】
電解液４ａは、ＮａＣｌ溶液（30ｇ／Ｌ）とした。
【００９５】
培養温度（培養液温度）は８０℃とした。
【００９６】
酸化還元物質として、アントラキノン  ２，６−ジスルホン酸（ＡＱＤＳ）を０．２ｍＭとなるように培養液４に添加した。
【００９７】
作用電極９の設定電位は、銀・塩化銀電極電位基準で、−０．８Ｖ、−０．６Ｖ、−０．３Ｖ、０Ｖ、＋０．３Ｖとして培養試験を実施した。
【００９８】
また、コントロールとして、培養液４にＮａ２ＳとＬ−システインを０．５ｇ／Ｌ添加して通電無しで培養試験を実施した。このときの培養液４の酸化還元電位は約−０．４５Ｖであったことから、本実施例では、設定電位を−０．８Ｖ、−０．６Ｖとした場合には作用電極９の電位が還元電位に制御されていることになり、設定電位を−０．３Ｖ、０Ｖ、＋０．３Ｖとした場合には作用電極９の電位が酸化電位に制御されていることになる。
【００９９】
培養槽７を窒素パージし、培養槽７を嫌気条件としてから培養試験を開始した。
【０１００】
菌体密度の経時変化を図９に示す。設定電位を−０．３Ｖ、−０．６Ｖ、−０．８Ｖにすることで、最終菌体密度をコントロールと同程度にできると共に、−０．６Ｖ、−０．８Ｖとすることで、増殖開始までの時間がコントロールよりも短縮される傾向が見られた。
【０１０１】
培養試験終了後のスターチの残存量を図１０に示す。設定電位を−０．８Ｖとすることで、コントロールよりもスターチ濃度が減少している傾向が見られた。このことから、設定電位を−０．８Ｖとすることで、スターチの分解量が増加していることが明らかとなった。
【０１０２】
ガス発生量の測定結果を図１１に示す。二酸化炭素発生量については条件による違いが殆ど見られなかったものの、設定電位を−０．８Ｖとすることで、コントロールよりも水素発生量が顕著に増加することが明らかとなった。
【０１０３】
培養液４のｐＨの経時変化を図１２に示す。設定電位を−０．８Ｖとすることで、培養液４のｐＨを７付近に維持できることが明らかとなった。
【０１０４】
培養液４の酢酸濃度の経時変化を図１３に示す。設定電位を−０．６Ｖ、−０．８Ｖとすることで、コントロールよりも酢酸濃度が低下する傾向が見られた。
【０１０５】
培養液４の乳酸濃度の経時変化を図１４に示す。コントロールでは全培養期間に亘って乳酸が検出されなかったが、設定電位を−０．６Ｖ、−０．８Ｖとすることで、乳酸が検出されるようになることが確認された。
【０１０６】
培養期間中における電流値の測定結果を図１５に示す。通電開始時点で設定した電位環境に調整するために電流が流れ、それ以後、サーモトガの増殖が定常期に入るまでは電流はほぼ一定値を示した。このことから、増殖の過程で、酸化還元物質として添加したＡＱＤＳとサーモトガとの間で電子授受は生じていないものと考えられた。したがって、本発明の効果は、ＡＱＤＳ等の酸化還元物質と微生物との間における電子授受に依存するものではないことが明らかとなった。また、設定電位を−０．８Ｖとした場合には、培養後期においてより多くの還元電流が流れていることが確認されたことから、この還元電流の増加が、水素発生量の増加と何らかの相関を有している可能性が示唆された。
【０１０７】
以上の結果から、作用電極９の設定電位を還元電位（−０．６Ｖ、−０．８Ｖ）とすることで、サーモトガの酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Ａへの酸化反応を減退させて酢酸産生量を減少させることができると共に、還元経路におけるピルビン酸の乳酸への還元反応を促進させて、乳酸の産生が可能になることが示された。また、増殖開始までの時間が短縮される効果が得られることも明らかとなった。
【０１０８】
さらに、作用電極９の設定電位を−０．８Ｖとすることで、有機物の分解促進効果、水素発生量の顕著な増加効果、ｐＨの中性維持効果が得られることがわかった。即ち、有機物の分解効率を高めて、水素発生量を顕著に増加させながらも、培養液４のｐＨを酸性シフトさせることなく中性領域に維持できる極めて優れた効果が奏されることが明らかとなった。
【０１０９】
尚、設定電位を−０．８Ｖとすることで、水素発生量が顕著に増加したこと、及びｐＨが中性に維持されたことから、設定電位を−０．８Ｖとすることで、還元力が水素として系外に放出された可能性が示唆された。
【０１１０】
（実施例２）
ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Ａに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物として、大腸菌を用いて培養試験を実施した。
【０１１１】
以下の組成の培養液４に、大腸菌（E.coli JM109）を初期菌体密度を8×106  ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加して、これを培養槽７に200ｍＬ収容した。
[培養液の組成（Ｌ−１）]
・グルコース：  ５．０ｇ
・ＫＨ２ＰＯ４：  ４．２ｇ
・ＮＨ４Ｃｌ：  ０．６ｇ
・ＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏ：  ０．０８ｇ
・カザミノ酸：  ５．０ｇ
・微量元素溶液：  １ｍＬ
[微量元素溶液の組成（Ｌ−１）]
・ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：  ０．２ｇ
・ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ：  １．０ｇ
・ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ：  ０．０３４ｇ
・ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：  ０．０１５ｇ
・Ｎａ２ＳｅＯ４：  ０．５ｇ
【０１１２】
培養温度（培養液温度）は３０℃とした。
【０１１３】
酸化還元物質として、アントラキノン  ２，６−ジスルホン酸（ＡＱＤＳ）を０．２ｍＭとなるように培養液４に添加した。
【０１１４】
培養液４のｐＨは７．０とした。
【０１１５】
作用電極９の設定電位は、銀・塩化銀電極電位基準で、−１．０Ｖ、−０．８Ｖ、−０．６Ｖ、−０．３Ｖ、０Ｖとして培養試験を実施した。
【０１１６】
尚、本実施例では、設定電位を−１．０Ｖ、−０．８Ｖ、−０．６Ｖとした場合には作用電極９の電位が還元電位に制御されていることになり、設定電位を−０．３Ｖ、０Ｖとした場合には作用電極９の電位が酸化電位に制御されていることになる。
【０１１７】
培養槽７を窒素パージし、培養槽７を嫌気条件としてから培養試験を開始した。
【０１１８】
培養試験終了後の培養液４の乳酸濃度の測定結果を図１６に示す。設定電位を−１．０Ｖ、−０．８Ｖ、−０．６Ｖとすることで、乳酸濃度が高くなる傾向が見られ、逆に設定電位を−０．３Ｖ、０Ｖとすることで、乳酸濃度が低くなる傾向が見られた。
【０１１９】
培養試験終了後の培養液４の酢酸及びエタノール濃度の測定結果を図１７に示す。エタノール濃度については、設定電位を−１．０Ｖ、−０．８Ｖ、−０．６Ｖとすることで、低くなる傾向が見られ、設定電位を−０．３Ｖ、０Ｖとすることで高くなる傾向が見られた。特に、設定電位を０Ｖとすることでエタノール濃度が高くなる傾向が顕著であった。酢酸濃度については、設定電位を−０．８Ｖとすることで低くなる傾向が見られ、０Ｖとすることで高くなる傾向が見られた。その他の設定電位については酢酸濃度の大きな差が見られなかった。
【０１２０】
以上の結果から、電極の電位を還元電位とすることで、エタノール産生量を減少させると共に乳酸産生量を増加させることができ、逆に、電極の電位を酸化電位とすることで、エタノール産生量を増加させると共に乳酸産生量を減少させることができることが明らかとなった。
【０１２１】
また、酢酸についても、還元電位である−０．８Ｖで濃度が低くなり、酸化電位である０Ｖで濃度が高くなったことから、還元電位において産生量が減少し、酸化電位において産生量が増加する傾向にあることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１８】
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【図１９】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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