(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚のｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現量を基に、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する方法であって、
（１）被験対象から得られた角質のサンプルのｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現を定量化する工程、
（２）工程（１）にて測定した遺伝子発現量を用いて、慢性的な紫外線曝露による皮膚損傷の程度の検査を補助する工程
を含む方法。
【請求項２】
慢性的な紫外線曝露による皮膚損傷が日焼け、色素沈着、シワ・タルミ、良性腫瘍、前がん症（日光角化症、悪性黒子）、皮膚がんから選ばれる皮膚損傷である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚のｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線は生物学的観点から、ＵＶＡ（長波長域、４００〜３１５ｎｍ）、ＵＶＢ（中波長域、３１５〜２８０ｎｍ）、ＵＶＣ（短波長域、２８０ｎｍ未満）に分類される。人体への過度の紫外線曝露は、主に眼損傷と皮膚損傷を引き起こす。紫外線曝露による眼損傷の症状として、角膜炎、翼状片、白内障等が知られている。又、紫外線曝露による皮膚損傷の症状として、日焼け、色素沈着、シワ・タルミ、良性腫瘍、前がん症（日光角化症、悪性黒子）、皮膚がん等が知られている。紫外線曝露による皮膚損傷は、太陽光に曝露される皮膚である顔面又は首筋において起こりやすい。近年では、特にオゾン層の破壊進行により、紫外線曝露による皮膚損傷は問題となっている。
【０００３】
紫外線曝露後の反応には、個人差がある。少量の紫外線曝露により皮膚損傷を引き起こすヒトもいれば、比較的紫外線曝露に抵抗力のあるヒトもいる。このような紫外線曝露による皮膚損傷の程度の差は、遺伝や生活環境等の様々な要因が考えられるため、原因を特定することは難しい。しかしながら、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を知ることができれば、どの化粧品を使用して皮膚損傷を予防したら良いか、或いは、どの化粧品を使用して紫外線曝露後の皮膚損傷をケアしたら良いか等が分かる。例えば、紫外線曝露により皮膚損傷を受けやすい肌状態であるという検査結果であれば、予め、日焼け止め化粧品を塗布したり、紫外線曝露後も、念入りに美白やアンチエイジング対応の化粧品を使用したりすることにより、色素沈着やシワ・タルミ等の皮膚損傷を予防・改善することができる。
【０００４】
今までに、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する方法がいくつか発明されている。例えば、アポトーシスを抑制する扁平上皮がん関連抗原ＳＣＣＡ（Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎ）の一種であるＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現を測定し、表皮の紫外線抵抗力を判断する方法（特許文献１、非特許文献１）、皮膚の近赤外吸収スペクトルから、紫外線曝露による損傷の度合いを判定する方法（特許文献２）、紫外線に曝露されることにより変化した角層内のウロカニン酸量をラマン分光法により測定する方法（特許文献３、非特許文献２）、及び、皮膚角層中のアネキシンＩＩ、ブレオマイシン  ハイドロラーゼ、カテプシンＤ、アルギナーゼ−１、ＳＣＣＡ−２からなる群から選ばれる一種又は二種以上のタンパク質の発現量を指標にして、紫外線による皮膚サンバーンに対する抵抗性を評価する方法（特許文献４）等が知られている。しかしながら、実際のヒトの皮膚から有棘層及び顆粒層を含めた表皮細胞を採取する必要がある、複雑な測定機器を使用しなければならない、標的の因子自体がよく分かっていない、一部の皮膚損傷しか検査できない等、容易に紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査することは難しかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２７２３４３号
【特許文献２】ＷＯ２００７／０２６８８４号
【特許文献３】特開２００９−１１５５１３号
【特許文献４】特開２０１０−１５１４８２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｄａ  Ａ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１８，１４７−１５４，２００２．
【非特許文献２】Ｄｅ  Ｆａｂｏ  ＥＣ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８，８４−９８，１９８３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、紫外線曝露によるヒトの皮膚損傷の程度を簡便に検査する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ｓｔｒａｔｉｆｉｎに注目して、紫外線曝露によるヒトの皮膚損傷の程度を簡便に検査する方法について、鋭意検討した。その結果、ｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現を調べることにより、皮膚損傷の程度を検査できることを見出した。又、この遺伝子の発現産物は、テープストリップ等によりヒトの皮膚から容易に、且つ、非侵襲的に採取することができることを見出した。
【０００９】
本発明は、以下に列挙する皮膚検査方法を提供する。
［１］皮膚のｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、皮膚損傷の程度を検査する方法。
［２］前記皮膚損傷が紫外線曝露による皮膚損傷である、［１］に記載の方法。
［３］皮膚のｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現量を基に、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する方法であって、
（１）被験対象から皮膚のサンプルを得る工程、
（２）該サンプルのｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現を定量化する工程、
（３）工程（２）にて測定した遺伝子発現量を用いて、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する工程
を含む方法。
［４］前記遺伝子発現の定量化がポリメラーゼ連鎖反応法により行われる、［３］に記載の皮膚検査方法。
［５］前記皮膚サンプルが被験対象の皮膚から採取した角質である、［３］〜［４］のいずれかに記載の皮膚検査方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、皮膚のｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡの発現量を測定し、その結果から、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査するための方法を提供することが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、皮膚のｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡの発現量を測定し、その結果から、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査するための方法（以下、「皮膚損傷検査法」と言う）を提供する。本発明の皮膚損傷検査法では、被験対象の皮膚から採取したサンプルを用いて、ｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子発現の定量化を行う。その結果を基に、紫外線曝露により皮膚損傷を受けやすい肌状態であるのか否かを評価する。更に、皮膚から採取したサンプルとして角質を用いることにより、非侵襲的な評価が可能になる。
【００１２】
本発明の「ｓｔｒａｔｉｆｉｎ（ＳＦＮ、別名１４−３−３σ）」とは、表皮細胞にて産生されるタンパクの一種であり、表皮細胞における細胞周期の進行を停止させたり、アポトーシスを誘導したりする作用を持つ（Ｂｈａｔｉａ  Ｋ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１２，１６５−１６９，２００３．）。又、最近の知見から、真皮細胞にｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクを曝露させると、コラーゲン分解を亢進することも分かってきた（Ｇｈａｈａｒｙ  Ａ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１２２，１１８８−１１９７，２００４．）。
【００１３】
本発明者は、表皮細胞に紫外線を曝露させたところ、ｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ発現量及びタンパク量が増加することを明らかにした。又、ｓｔｒａｔｉｆｉｎの発現は、非露光部位の上腕内側と比較して露光部位の顔面において亢進していることも明らかにした。これらの結果から、紫外線曝露によりｓｔｒａｔｉｆｉｎが増加し、表皮細胞における細胞周期の進行を停止させるために、表皮の新陳代謝を低下させたり、真皮細胞におけるコラーゲン分解を亢進するために、真皮のコラーゲンを低下させたりすることが考えられた。すなわち、ｓｔｒａｔｉｆｉｎは、紫外線曝露により皮膚損傷を引き起こす主要タンパクの一種であることが推察された。
【００１４】
以上から、被験対象の皮膚からテープストリップ等により採取したｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡ発現量を指標にして、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査することが可能であると考えられた。
【００１５】
本発明の「皮膚損傷」とは、外的及び内的要因により起こる皮膚組織の物理的な損傷を示す。例えば、切り傷、擦り傷、刺し傷、火傷、咬傷、挫傷、日焼け、色素沈着、シワ・タルミ、良性腫瘍、前がん症（日光角化症、悪性黒子）、皮膚がん等が挙げられる。
【００１６】
又、本発明の「紫外線曝露による皮膚損傷」とは、皮膚損傷のうち、紫外線曝露が原因により生じる皮膚損傷を示す。例えば、日焼け、色素沈着、シワ・タルミ、良性腫瘍、前がん症（日光角化症、悪性黒子）、皮膚がん等が挙げられる。
【００１７】
本発明における「遺伝子発現の定量化」とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ発現量を測定することである。又は、遺伝子の発現産物であるタンパク量を測定しても良い。
【００１８】
ｍＲＮＡ発現量の測定には、マイクロアレイ解析や、逆転写反応を行った後にポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を行う方法等を用いることができる。これらの方法は、常法に従って実施すれば良い。各方法について様々なプロトコールが報告されており、当業者であれば公知のプロトコールに従い、又は、公知のプロトコールを適宜修正・変更したプロトコールにより、適切な測定系を構築し、実施することができる。尚、ｍＲＮＡ発現量の測定による遺伝子発現の定量化の詳細については後述する。
【００１９】
一方、タンパク量の測定であれば、例えば、蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウエスタンブロット法、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法やＥＩＡ法等）等を用いることができる。これらの方法についても、常法に従って実施すれば良い。各方法について様々なプロトコールが報告されており、当業者であれば公知のプロトコールに従い、又は、公知のプロトコールを適宜修正・変更したプロトコールにより、適切な測定系を構築し、実施することができる。
【００２０】
本発明に用いる「被験対象の皮膚」であるが、非露光部位の皮膚については、紫外線に曝されにくく、光老化の影響が比較的少ない部位の皮膚、例えば、上腕内側部、前腕内側部、背部、臀部又は大腿内側部等、日常的に衣服に覆われている部位の皮膚が望ましい。又、露光部位の皮膚については、紫外線に曝されやすく、光老化の影響が比較的多い部位の皮膚、例えば、顔面又は首筋等、日常的に衣服から露出している部位の皮膚が望ましい。非露光部位及び露光部位共に、このような試料（組織或いは細胞）の培養物であっても良い。
【００２１】
本発明に用いる被験対象の皮膚から採取した「角質」とは、皮膚の中で最外層に存在する角質層における細胞を示す。皮膚の中で最外層に存在する角質におけるｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現を解析することから、本発明の皮膚損傷検査法は、皮膚をあまり傷つけず、且つ、容易に実施可能なものになる。
【００２２】
皮膚からの角質の採取方法は特に限定されないが、可能な限り、非侵襲的な採取方法を採用することが好ましい。すなわち、角質の採取の際、顆粒層や有棘層等の角質層以外の部分を、可能な限り、傷つけないことが望まれる。非侵襲的な採取方法としては、例えば、粘着性のテープや接着剤等を皮膚へ付着させた後に剥がす方法や、粗面の材料（例えば、不織布等）にて皮膚表面を擦る方法により角質を採取することができる。非常に簡便に実施できる点において、前者の方法は特に好ましい。尚、以降に実施される遺伝子発現の定量化に影響しないものである限り、粘着性のテープや接着剤に用いられる材料（接着成分）は特に限定されない。
【００２３】
本発明の「皮膚損傷検査法」は、好ましくは、以下の一連のステップ（１）〜（３）により実施される。
（１）被験対象の皮膚（非露光部位及び露光部位）から採取した角質を用意するステップ
（２）前記角質から抽出したｍＲＮＡを試料として遺伝子発現の定量化を行い、ｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現量を算出するステップ
（３）ステップ（２）にて算出した発現量を用いて、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査するステップ
【００２４】
ステップ（１）では、被験対象の皮膚から採取した角質を用意する。以下に、角質の採取法、及び、ＲＮＡの抽出法の具体例を示す。
（ａ）顆粒層や有棘層等を傷つけないように、最外層である角質層の一部を剥離する。例えば、粘着性のテープを皮膚へ付着させた後に剥がし（必要に応じて、数回繰り返す）、角質を採取する。
（ｂ）採取した角質を、ＳＬＳ、β−メルカプトエタノール、グアニジンイソチオシアネート等を含む溶解性緩衝液に浸した後、タンパク質分解酵素を加え、反応させる。
（ｃ）反応終了後、例えば、超音波破砕機等の物理的な力により、角質を破砕する。
（ｄ）角質破砕物を含む溶液から、周知の核酸抽出法に準じた方法や市販されたキットを用いた方法により、ＲＮＡを抽出する。例えば、グアニジンイソチオシアネート、フェノール又はクロロホルムを用いたＲＮＡ抽出法、ニッポンジーン社のＩＳＯＧＥＮ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ、或いは、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ社のＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ  Ｋｉｔ等を用いる方法によりＲＮＡを抽出する。
（ｅ）必要に応じて、ＤＮＡ分解酵素を反応させ、ＤＮＡを除去する。
（ｆ）必要に応じて、エタノール沈殿等の核酸濃縮法を用い、ＲＮＡを濃縮する。
【００２５】
ステップ（２）では、採取した角質から抽出したｍＲＮＡを試料として、遺伝子発現の定量化を行う。そして、当該遺伝子発現の定量化により、特定の遺伝子の発現量を算出する。このように、本発明の一態様では、角質中に残存するｍＲＮＡ発現量を指標にした遺伝子発現の定量化を行う。尚、遺伝子発現の定量化では、「遺伝子の発現量」は絶対値又は相対値（比較対象又は標準の発現量との比率や差等）として算出される。
【００２６】
ここで、角質から抽出したｍＲＮＡを用いた遺伝子発現の定量化方法の具体例を、以下に示す。
【００２７】
ＲＴ−ＰＣＲを用いた方法
（ａ）抽出したＲＮＡを鋳型に、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。
（ｂ）ｃＤＮＡを鋳型に、ターゲットとなる遺伝子に対応するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子に対応するＤＮＡ断片を得る。
（ｃ）内部標準となるような遺伝子（β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、ケラチン６Ｂ等）の反応も並行して行う。
（ｄ）得られたＤＮＡ断片の電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド等にて染色してバンドの強度を測定し、その遺伝子の発現量とする。
（ｅ）必要に応じて、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ等の蛍光色素やＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ等の蛍光プローブを用いて定量ＰＣＲ反応を行い、発現量を定量する。
（ｆ）内部標準となる遺伝子の発現量に対する、目的の遺伝子の発現量の比率を算出する。
【００２８】
ステップ（３）では、ステップ（２）にて算出した発現量を用いて、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する。すなわち、ステップ（２）にて算出した発現量を用いて、露光部位／非露光部位のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現比率を計算する。そして、その発現比率が、紫外線曝露による皮膚損傷の程度が関連付けられた複数の区分の中のいずれに該当するのかを調べる。区分設定に関する具体例を以下に示す。
（例）皮膚損傷の程度（低い）：比率＜ａ、（中程度）：ａ≦比率＜ｂ、（高い）：ｂ≦比率
【００２９】
（例）では区分数を３としているが、区分数は特に限定されるものではない。例えば、区分数を２〜１０のいずれかにすることができる。区分数、及び、各区分に関連付けられる基準発現量の値の範囲は、予備実験の結果を基に任意に設定可能である。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を効果的に説明するために、実験例を挙げる。尚、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３１】
実験例１  ヒトケラチノサイトにおける、紫外線曝露によるｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現変化
培養細胞を用いて、紫外線曝露によるｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子発現の定量化を行った。すなわち、６ｃｍシャーレにヒトケラチノサイトを播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。コンフルエントな状態になったところで、３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを曝露し、更に６時間培養した。その後、細胞よりＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡの抽出を行い、細胞から抽出した総ＲＮＡを基に、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。同時に、内部標準として、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
【００３２】
ｓｔｒａｔｉｆｉｎ用のプライマーセット
ＡＧＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＡ（配列番号１）
ＡＴＣＴＣＧＴＡＧＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＡＡＡＡＧ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ（配列番号３）
ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ（配列番号４）
【００３３】
その結果を表１に示す。図示の通り、ヒトケラチノサイトにＵＶＢを曝露すると、ｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現量は増加した。
【００３４】
【表１】
0005653684.tif 000002
【００３５】
実験例２  ヒトケラチノサイトにおける、紫外線曝露によるｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクの変化
培養細胞を用いて、紫外線曝露によるｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクの定量化を行った。すなわち、６ｃｍシャーレにヒトケラチノサイトを播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。コンフルエントな状態になったところで、３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを曝露し、更に２４時間培養した。その後、細胞よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総タンパクの抽出を行った。ｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパク量の測定は、細胞から抽出した総タンパクを基にしてウエスタンブロット法により行った。すなわち、２ｍｇ／ｍｌの総タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、トランスファーメンブレンであるＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にブロッティングした。次に、ａｎｔｉ−ｓｔｒａｔｉｆｉｎ抗体（Ａｎｔｉ−１４−３−３σ、ｃｌｏｎｅ  ＣＳ１１２−２Ａ８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と室温にて１時間反応させた後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｌｕｓ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）と室温にて１時間反応させた。その後、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）と室温にて反応させ、発光パターンを撮影した。撮影後、３０ｋＤ付近に現れたバンドを定量化した。
【００３６】
その結果を表２に示す。図示の通り、ヒトケラチノサイトにＵＶＢを曝露すると、ｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパク量は増加した。
【００３７】
【表２】
0005653684.tif 000003
【００３８】
実験例３  皮膚のｓｔｒａｔｉｆｉｎタンパクをコードする遺伝子の発現量の測定、及び、紫外線に対する防御への意識アンケート
１．角質に含まれるＲＮＡの抽出
男性被験者２９名（２６〜５９歳）の非露光部位である上腕内側、及び、露光部位である顔面の皮膚に、半径１ｃｍの円状のテープ（３Ｍ、Ｂｌｅｎｄｅｒｍ社）を１枚貼付し、十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質を含むテープを得た。この操作を４回繰り返し、同一部位から４枚のテープストリップサンプルを得た。得られた角質に含まれるＲＮＡを、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ  Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて抽出した。すなわち、角質の付着したテープ４枚を、テープごとＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加し、５６℃にてインキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて分散させた後、６４％エタノールを加えて攪拌してテープを取り除き、角質抽出液を得た。付属のＦｉｌｔｅｒ  ＣａｒｔｒｉｄｇｅにＲＮＡを吸着させた後、溶出液にてＲＮＡを溶出した。得られた溶出液にＤＮａｓｅＩを加え、残存しているＤＮＡを完全に除去した後、エタノールを用いてＲＮＡを沈殿させてＲＮＡを濃縮した。得られたＲＮＡのペレットを必要量の水に溶解し、角質に含まれる残存ＲＮＡを得た。
【００３９】
２．角質に含まれるＲＮＡのＰＣＲ解析
上腕内側及び顔面の皮膚の角質より、上記実験例３の１．の方法にて残存ＲＮＡを得た。各ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたＲＴ−ＰＣＲ反応に供し、ｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現量を定量した。ｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現量は、β−アクチン  ｍＲＮＡの発現量にて規格化（ノーマライズ）した。尚、ｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ発現の測定に使用したプライマーは、上記実験例１と同様のものである。β−アクチン  ｍＲＮＡのプライマーは、次の通りである。
【００４０】
β−アクチン用のプライマーセット
ＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ（配列番号５）
ＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号６）
【００４１】
定量化はΔΔＣｔ法にて行い、ｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現比率を、基準となるｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ発現量に対する上腕内側及び顔面のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ発現量の比率として算出した。基準となるｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ発現量は、ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｒ１２３４２１８−Ｐ）から、上記実験例３の２．の方法にてｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ発現量を算出したものを用いた。
上腕内側のΔΔＣｔ＝（上腕内側のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡのＣｔ値―上腕内側のβ−アクチン  ｍＲＮＡのＣｔ値）―（基準となるｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡのＣｔ値―基準となるβ−アクチン  ｍＲＮＡのＣｔ値）
顔面のΔΔＣｔ＝（顔面のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡのＣｔ値―顔面のβ−アクチン  ｍＲＮＡのＣｔ値）―（基準となるｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡのＣｔ値―基準となるβ−アクチン  ｍＲＮＡのＣｔ値）
遺伝子発現比率＝２−ΔΔＣｔ
【００４２】
その結果を表３に示す。図示の通り、ｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ及びβ−アクチン  ｍＲＮＡ共に、上腕内側及び顔面から検出可能であった。すなわち、ｓｔｒａｔｉｆｉｎの遺伝子発現産物は、テープストリップ等によりヒトの皮膚から容易に、且つ、非侵襲的に採取することができることが分かった。又、非露光部位である上腕内側と比較して、露光部位である顔面はｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡ発現比率が高かった。すなわち、紫外線曝露により、ｓｔｒａｔｉｆｉｎの発現が亢進することが分かった。
【００４３】
【表３】
0005653684.tif 000004
【００４４】
３．紫外線に対する防御への意識アンケート
上記実験例３の１．及び２．と同じ男性被験者のうち、顔面／上腕内側のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現比率が高い８名及び低い８名に、紫外線に対する防御への意識アンケートを行った。すなわち、「屋外で行動する時、日焼け止め化粧品を塗るか？」の質問に対しては、「必ず塗る」、「時々塗る」、「ほとんど塗らない」の３つの解答を選択させた。又、「日焼け止め化粧品をこまめに塗り直すか？」の質問に対しては、「こまめに塗り直す」、「ほとんど塗り直さない」の２つの解答を選択させた。
【００４５】
その結果を表４及び５に示す。「屋外で行動する時、日焼け止め化粧品を塗るか？」の質問に対しての解答である「必ず塗る」は○、「時々塗る」は△、「ほとんど塗らない」は×で示した。又、「日焼け止め化粧品をこまめに塗り直すか？」の質問に対しての解答である「こまめに塗り直す」は○、「ほとんど塗り直さない」は×で示した。
【００４６】
【表４】
0005653684.tif 000005
【００４７】
【表５】
0005653684.tif 000006
【００４８】
表４及び５から、顔面／上腕内側のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現比率が高い群は、紫外線に対する防御への意識が低いと推測された。言い換えると、比較的、紫外線に曝露される環境下にあるため、顔面／上腕内側のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現比率が高く、皮膚損傷が大きいと考えられた。一方、顔面／上腕内側のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現比率が低い群は、紫外線に対する防御への意識が高いと推測された。言い換えると、比較的、紫外線に曝露される環境下にないため、顔面／上腕内側のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現比率が低く、皮膚損傷が小さいと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の皮膚損傷検査法によれば、皮膚のｓｔｒａｔｉｆｉｎ  ｍＲＮＡの発現量を指標にして、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査することができる。この手法では、試料を得る際の痛み等を伴わず、非侵襲的に皮膚のサンプルを得ることができる。又、皮膚損傷の程度を検査することで、化粧品の使用方法を提示することが可能になり、皮膚損傷を予防・改善することができる。
【配列表】
0005653684000001.app