(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において創傷の治療、血管新生、または内皮細胞増殖および／または遊走の促進のための薬剤の製造におけるβＢ２クリスタリンタンパク質またはβＢ２クリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物の使用。
【請求項２】
前記タンパク質は、βＢ２クリスタリンまたはβＢ２クリスタリンのエラスターゼ切断産物の修飾形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記エラスターゼ切断産物は、βＢ２クリスタリンの血管新生断片を含む、請求項１または２の使用。
【請求項４】
前記タンパク質は、ウシもしくはヒツジクリスタリンタンパク質またはウシもしくはヒツジクリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物である、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
創傷の治療に使用する請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記クリスタリンタンパク質は、眼水晶体βＢ２クリスタリンタンパク質または眼水晶体βＢ２クリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物である、請求項１から５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記タンパク質またはタンパク質のエラスターゼ切断産物は、前記対象に局所投与するために局所的に受け入れられる組成物として提供される、請求項１から６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
薬学的に許容できるキャリアと共に、少なくとも１つのβＢ２クリスタリンタンパク質または前記クリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物を含む、対象において創傷を治療し、または血管新生、内皮細胞増殖および／または遊走を促進する医薬組成物。
【請求項９】
前記タンパク質は、βＢ２クリスタリンまたはβＢ２クリスタリンのエラスターゼ切断産物の修飾形態である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記エラスターゼ切断産物は、βＢ２クリスタリンの血管新生断片を含む、請求項８の組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質は、ウシもしくはヒツジクリスタリンタンパク質またはウシもしくはヒツジクリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物である、請求項８から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記対象に局所投与するために局所的に受け入れられる組成である、請求項８から１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記βＢ２クリスタリンは、眼水晶体クリスタリンタンパク質または眼水晶体クリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物である、請求項８から１２のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生および／または創傷治癒を促進するための血管新生クリスタリンタンパク質の使用に関する。本発明はまた、血管新生クリスタリンタンパク質を含む組成物、およびクリスタリンタンパク質を精製する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
クリスタリンは高度に屈折性の水溶性タンパク質であり、代謝酵素およびストレス保護タンパク質と関連がある。クリスタリンは脊椎動物の眼水晶体の主要構成成分であり、タンパク質含量の９０％までを構成することができる。哺乳類中に存在する３つのクラスのクリスタリン（α、β、およびγ）の進化的関係は明白に確立されている。
【０００３】
２つのαクリスタリン遺伝子、αＡおよびαＢ（それぞれ酸性および塩基性）があり、およそ６０％の配列同一性を共有するタンパク質をコードする。αＡおよびαＢクリスタリンは、クリスタリンドメインとα−クリスタリン−ＨＳＰドメインとの２つのドメインを有する。２つのその他のドメイン、すなわちＨＳＰ２０ドメインおよびＩｂｐＡドメインは、α−クリスタリン−ＨＳＰドメインと相同性を有する。αクリスタリンは熱ショックによって誘発でき、小型熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰ）ファミリーのメンバーである。それらは分子シャペロンとして機能し、折り畳まれていないまたは誤って折り畳まれたタンパク質を大きな水溶性低分子量集合体中に保持する。これらの異種性集合体は、その中にαＡおよびαＢサブユニットが３：１の比率で存在する、αクリスタリンの３０〜４０個のサブユニットからなる。
【０００４】
αクリスタリンは全ての動物界に存在するが、全ての生物に必ずしも存在するわけではない。αＢクリスタリンのみがストレス誘導性であることが分かった。αＡクリスタリンの発現は本質的に眼水晶体に限定され、いくつかのその他の組織には微量のみ見いだされる。このため、αＡクリスタリンは本質的に眼水晶体特有のファミリーのメンバーである。αＢクリスタリンはより広く発現され、特に脳、心臓、および筋肉に豊富である（Ｂｌｏｅｍｅｎｄａｌら、２００４年）。
【０００５】
βクリスタリンはβ／γクリスタリンファミリーのメンバーである。βクリスタリンを含む少なくとも５つの異なるタンパク質がある。タンパク質のβ／γクリスタリンファミリーは、４つの非常に良く似た「グリークキー」モチーフに折り畳まれた２ドメインβ構造を含有する。βクリスタリンは、ホモ／ヘテロ二量体またはより高次の複合体を形成する。βクリスタリンオリゴマーの構造は、それらのＮ末端アーム間の相互作用を通じて安定化するようである。βＢ２クリスタリンは、ＸＴＡＬｂｇドメインの重複を含有する。少なくとも５つのγクリスタリンが、ウシおよびラットの水晶体中で同定されている。
【０００６】
α、β、およびγクリスタリンは、脊椎動物眼水晶体の主要タンパク質構成要素であり、αクリスタリンが分子シャペロンならびに構造タンパク質の双方であるのに対し、βおよびγクリスタリンは構造タンパク質である（Ｂｌｏｅｍｅｎｄａｌら、２００４年）。豊富な水溶性クリスタリンなどの水晶体タンパク質は置き換えられないので、生物の生涯にわたって持ちこたえなくははならない。βＢ２クリスタリンは、眼水晶体中におけるクリスタリンの高い溶解性を保つのに必須であることが実証されている。創傷中に起きる生理学的条件の変化に際して、その他の組織中ではその発現は誘発されないように見える。
【０００７】
タンパク質は、より長く隣接している残基の配列に及ぶ顕著な配列類似性が検出できれば、進化的に関連していると見なすことができる。このような相同的なタンパク質は、それに応じて、それぞれ配列同一性が約５０％よりも高いまたは低い、ファミリーおよびスーパーファミリーに分類される。顕著なことにはαクリスタリンとβ／γクリスタリンは、ドメイン構造または配列相同性に関して近い構造的関係にない。
【０００８】
歴史的にクリスタリンは、今やそれぞれの遺伝子配列の分析を通じて識別可能なクラスに対応する、形成されるオリゴマーのサイズによってα、β、およびγクラスに分類されてきた。αクリスタリン凝集体が６００から１８０〜８０ｋＤａの範囲であり、βクリスタリン凝集体が２００〜５０ｋＤａの範囲であるのに対し、γクリスタリンは単量体であってそれらの相対分子量は２０〜２５ｋＤａの範囲である（Ａｊａｚら、１９９７年；Ｈｅｊｔｍａｎｃｉｋら、１９９７年）。βクリスタリンは凝集サイズが最も変化に富み、いくつかの特徴的な集合体クラスを形成する：βＨ（主として１６０〜２００ｋＤａの八量体）、βＬ１（主として７０〜１００ｋＤａの四量体）およびβＬ２（主として４６〜５０ｋＤａの二量体）（Ｈｅｊｔｍａｎｃｉｋら、１９９７年）。
【０００９】
αＡ（酸性）およびαＢ（塩基性）の２種のαクリスタリンについて上の通り述べられているのに対し、７種に達するβクリスタリン、すなわち３種の塩基性Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３と、３種の酸性Ａ２、Ａ３、Ａ４と、βＳと称される７番目の形態とが知られている。同様に数種のγクリスタリン（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、およびＦ）がある。ζ、λ、および熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）ｈｓｐＢ１およびｈｓｐＢ８などのその他のクリスタリンについてもまた知られている。
【００１０】
αＡ、βＢ２、およびβＢ３クリスタリンは、それらの最後から２番目のセリン残基においてリン酸化できる。クリスタリンタンパク質ではその他の多数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）が起きることが知られており、動物の生涯全体を通じてこれらのタンパク質は保持されるため、時が経つにつれて蓄積する。同定されたＰＴＭとしては、メチル化、アセチル化、ホスホリル化、チロシンとトリプトファン残基の酸化、グリコシル化、グルタチオン、Ｓ−メチルシステイン共有結合が挙げられる。水晶体クリスタリン中で起きるＰＴＭタイプのレビューは、Ｈｏｅｈｅｎｗａｒｔｅｒら、（２００６年）によって提供される。
【００１１】
βクリスタリンは、全部ではないとしても大部分の脊椎動物種における豊富な水晶体タンパク質であり、網膜中のβＢ２クリスタリン発現をはじめとして、ヒヨコの眼および眼外の非水晶体組織中で報告されている（Ｈｅａｄら、１９９１年）。さらに水晶体外βクリスタリンの発現が哺乳類で見つかっており、βＢ２クリスタリンはマウスおよびネコ神経網膜および色素網膜中、ならびにネコ虹彩中で発現されることが示されている（Ｄｉｒｋｓら、１９９８年）。水晶体に見られるよりも低いレベルで存在するもの、神経網膜中のβＢ２クリスタリンの出現および蓄積は、この組織の機能的成熟と同時に起きる（Ｈｅａｄら、１９９５年）。βＢ２の発現はまた、ウシ精巣およびラット脳でも報告されている（Ｍａｇａｂｏら、２０００年）。
【００１２】
βＢ２の水晶体外発現は、水晶体中におけるその構造的役割に加えて、それが非水晶体組織中で代謝的役割を果たすかもしれないことを示唆する。可能な代謝機能と一致して、βＢ２はｃＡＭＰ−依存キナーゼ（ＰＫＡ）によってリン酸化される。意外にも、タンパク質の２つの形態がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出され、その１つのみがＰＫＡによってリン酸化される（ＫａｎｔｏｒｏｗおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９７年）。ｃＡＭＰもＰＫＡもなしの同一条件下における組み換えマウスβＢ２およびウシβＢ２のインキュベーションもまた、ホスホリル化をもたらした。この生体外自己ホスホリル化は、Ｍｇ２＋に依存してセリン特異的である。βＢ２Ｃ末端アームの欠失は、自己ホスホリル化活性を無効にしないことが示されており、自己ホスホリル化には、ＰＫＡホスホリル化について同定された最後から２番目のＣ末端セリンとは異なるセリンが関与することが示唆される。
【００１３】
以前の報告は、眼水晶体中のリン酸化βクリスタリンタンパク質を同定してβＢｐと命名した（Ｋｌｅｉｍａｎら、１９９８年）。このタンパク質は後にβＢ２クリスタリンと改名され、新しい皮質細胞中で合成される。水晶体核のβＢ２クリスタリンは、絶対濃度と総可溶性タンパク質画分に対するその比率との双方が、顕著に減少することが示された（ＭｃＦａｌｌ−Ｎｇａｉら、１９８６年）。核可溶性βＢ２クリスタリンの翻訳後変化は、βＢｐ分子の見かけの分子量におけるおよそ３０００ダルトンの段階的減少をもたらして、２３ｋＤａのタンパク質をもたらし、それはβＢ２クリスタリンについて報告された相対分子量と相関する。
【００１４】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４９２０号明細書（国際公開第２００５／００４８９４号パンフレット）は、「保護タンパク質」が関与する、細胞または組織損傷によって特徴づけられる病状の治療について述べている。保護タンパク質は本明細書中で、タンパク質の溶解性および／または安定性を改善する、αＡクリスタリン、αＢクリスタリン、γＤクリスタリン、Ｓｉｃ  Ａ、ｐ２６、および高熱安定性クリスタリンなどの小型分子シャペロンタンパク質であると定義される。Ｐ２６は、外殻鹹水エビの低分子量シャペロンタンパク質である。ＳｉｃＡは小型熱ショックタンパク質ファミリーの別のメンバーであり、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のＩＩＩ型排出系のシャペロンタンパク質である。これらのシャペロンタンパク質は、損傷からその他のタンパク質を保護することにより作用し、立体構造変化および酵素的切断または消化からの分解を最小化することにより機能して、それによって細胞および組織の生存度を高めると述べられている。保護タンパク質の特性としては、創傷治癒の促進が挙げられると述べられている。
【００１５】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６０９号明細書（国際公開第２００４／０９６２７７号パンフレット）は、眼球内血管新生疾患のための予防薬または治療薬の使用に関する。薬剤はクリスタリン阻害物質であると述べられており、βＢ２クリスタリンをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むことができる。特に高レベル酸素への網膜の曝露によって誘導される網膜の脈管構造内または周辺でβＢ２クリスタリンが発現される、動物モデルについて述べられている。高酸素条件はプロピルヒドロキシラーゼ活性がコラーゲン中でヒドロキシプロリンを形成するために重要であり、βＢ２クリスタリン発現の観察はタンパク質の構造的役割と一致する。
【００１６】
あらゆる皮膚の破損は、原因にかかわらず外来性病原体に身体へのアクセスを与え、それは生命に関わるかもしれない重篤な感染症に温床と潜在部位を提供する。急性および非治癒慢性創傷の双方が、治療および健康管理システム双方の観点から、いまだに課題である。したがって集中的で高価な治療を必要とすることが多い、急性および慢性創傷のための改善された治療に対する継続する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
大まかに述べると、本発明は特定の哺乳類のクリスタリンタンパク質が血管新生活性を有して、内皮細胞増殖および／または遊走を促進できるという驚くべき観察に端を発する。したがって１つ以上の形態にある本発明は、それだけに限らないが、創傷治療および創傷治癒促進にまで及ぶ。
【００１８】
より詳しくは、本発明の一態様では、有効量の少なくとも１つの血管新生クリスタリンタンパク質で対象を治療するステップを含む、それを必要とする対象において血管新生を促進する方法が提供される。
【００１９】
本発明の他の態様では、少なくとも１つの血管新生クリスタリンタンパク質によって対象を治療するステップを含む、それを必要とする対象において内皮細胞増殖および／または遊走を促進する方法が提供される。
【００２０】
本発明により具現される方法に従って、あらゆる血管新生クリスタリンタンパク質を使用して、血管新生または内皮細胞増殖および／または遊走を促進できる。少なくともいくつかの形態では、血管新生クリスタリンタンパク質はαＡクリスタリンタンパク質であり、またはαＡクリスタリンまたはβＢ２クリスタリンの血管新生断片である。βＢ２クリスタリンは未変性（例えば未消化）では血管新生活性を有さないが、酵素的部分的消化によって提供されてもよいこのクリスタリンタンパク質のトランケート型は、血管新生を促進する（すなわち血管原性である）ことが意外にも分かった。エラスターゼおよびその他のプロテアーゼなどの酵素は創傷部位に存在し／放出され、したがって未変性βＢ２クリスタリンそれ自体は血管新生または創傷治癒に対する効果を有さないが、未変性タンパク質を投与して、創傷または治療部位で切断してタンパク質のトランケート型活性形態を放出できる。したがって未変性βＢ２クリスタリンは本発明の実施態様において有用性を有する。さらに血管新生および内皮細胞遊走は創傷治癒機序の重要な構成要素であり、血管新生活性があるβＢ２クリスタリンタンパク質はまた、ここで述べられているように創傷治癒および内皮細胞促進においても有用性を有する。
【００２１】
したがって本発明の他の態様では、少なくとも１つのβＢ２クリスタリンタンパク質の有効量を対象に投与するステップを含む、対象において創傷を治療する方法が提供される。
【００２２】
本発明の他の態様では、少なくとも１つのβＢ２クリスタリンタンパク質の有効量を対象に投与するステップを含む、対象において創傷治癒を促進する方法が提供される。
【００２３】
他の態様では、薬学的に許容できるキャリアと共に、少なくとも１つのβＢ２クリスタリンタンパク質を含む、本発明で具現化される方法で使用するための医薬組成物が提供される。
【００２４】
本発明の他の態様では、対象において血管新生を促進するための少なくとも１つのクリスタリンタンパク質の使用が提供される。
【００２５】
本発明の他の態様では、対象において内皮細胞の増殖および／または遊走を促進するための少なくとも１つのクリスタリンタンパク質の使用が提供される。
【００２６】
本発明の他の態様では、対象において創傷を治療し、または創傷治癒を促進するための少なくとも１つのβＢ２クリスタリンタンパク質の使用が提供される。
【００２７】
クリスタリンタンパク質は、標的組織または創傷部位に直接投与できる。皮膚および開放創傷の治療のためには、クリスタリンタンパク質を許容可能なキャリア中で局所的に投与できる。
【００２８】
さらに本発明は、クリスタリンタンパク質を精製する方法にまで及ぶ。したがって本発明の他の態様では、
（ａ）動物死体から得られる眼水晶体の水晶体シースを除去して、眼水晶体の残りの水晶体組織を残すステップと、
（ｂ）水晶体組織からクリスタリンタンパク質を溶媒に溶解させる間、水晶体組織を水性溶媒に入れるステップと、
（ｃ）溶媒からクリスタリンタンパク質を回収するステップと
を含む、少なくとも１つのクリスタリンタンパク質を精製する方法が提供される。
【００２９】
少なくともいくつかの形態では、本方法は、溶媒からクリスタリンタンパク質を回収するのに先だって、溶媒から未溶解の水晶体組織を除去するステップをさらに含む。
【００３０】
精製方法はまた、眼球をスライスして眼球に切り込みを入れ、眼球に圧力をかけて、眼球から切れ目を通じて水晶体を押し出すことにより、水晶体組織を提供するステップも含むことができる。水晶体シースは、常態では水晶体を溶媒に浸漬するのに先だって除去される。溶媒はまた酸性化して、水晶体組織からのクリスタリンタンパク質の溶出を助けることができる。したがって精製方法は、水晶体組織を初期所定間隔で溶媒中に入れた後に、溶媒のｐＨをｐＨ５．０以下に低下させるステップをさらに含むことができる。クリスタリンタンパク質の溶出は、いかなるプロテアーゼも消化酵素も溶媒に添加しなくても起きることができる。すなわちその中に水晶体組織が入れられる溶媒は、このようないかなる酵素も含まないことができる。あらゆる適切なクロマトグラフィー技術を使用して、溶媒からクリスタリンタンパク質を回収できる。溶媒は典型的に水である。
【００３１】
本発明の他の態様では、
（ａ）眼球をスライスして、眼球に少なくとも１つの切り込みを入れるステップと、
（ｂ）眼球に圧力をかけて、眼球から切れ目を通じて水晶体を押し出すステップと、
（ｃ）水晶体からクリスタリンタンパク質を溶媒に溶解させるステップと、
（ｄ）クリスタリンタンパク質を溶媒から精製するステップと
を含む、動物死体眼球の水晶体から１つ以上のクリスタリンタンパク質を精製する方法が提供される。
【００３２】
少なくともいくつかの形態では、切り込みは眼球の強膜と瞳孔の間に入れられる。水晶体除去に先だって眼球を動物死体から分離でき、または水晶体は眼球を死体の中に置いたままで眼球から除去できる。クリスタリンタンパク質は、（例えばＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）クロマトグラフィー分離またはその他の適切な分離技術によって溶媒から精製できる。
【００３３】
本発明に従って使用されるクリスタリンタンパク質は、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギのクリスタリンタンパク質など、無脊椎動物または哺乳類由来であることができる。少なくともいくつかの実施態様では、哺乳類のクリスタリンタンパク質が使用される。クリスタリンタンパク質は、典型的に単量体型である。単量体型は、クリスタリンタンパク質のトランケート型またはプロテアーゼ切断形態からなることができる。
【００３４】
「クリスタリンタンパク質」という用語は、本発明の文脈で、天然クリスタリンタンパク質、ならびにタンパク質の血管新生および／または創傷治癒活性を本質的に保持する、血管新生変異型、トランケート型（例えば断片）、および修飾形態のタンパク質を包含する。特に適切なトランケート型としては、エラスターゼＩまたはキモトリプシンなどの適切なプロテアーゼによるタンパク質の部分的消化によって提供できる、球形ドメインまたは１つ以上（典型的に全て）の「グリークキー」ドメインを含むものが挙げられる。
【００３５】
「創傷治癒の加速または促進」「または血管新生促進」という語句は、ここでの用法では、クリスタリンタンパク質またはタンパク質の血管新生断片の投与によって、創傷治癒過程、血管新生またはその段階を増強することを指す。
【００３６】
「タンパク質」という用語は、それが用いられる文脈が示すか特に断りのない限りここで「ペプチド」と同義的に使用される。
【００３７】
本発明により具現化される方法によって治療される対象は、例えばウシ、ブタ、ヒツジまたはウマ科のメンバー、マウス、ウサギ、モルモット、ネコまたはイヌなどの臨床検査動物、または霊長類またはヒトなどの哺乳類であることができる。
【００３８】
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの活用形は、既述の要素、整数またはステップ、または一群の要素、整数またはステップの包含を暗示するが、あらゆるその他の要素、整数またはステップ、または一群の要素、整数またはステップの排除を暗示しないものと理解される。
【００３９】
本明細書で言及される全ての公報は、その全体を参照によって本明細書に援用する。本明細書に包含されるあらゆる文献、行為、材料、装置、物品などの説明は、本発明に文脈を提供することのみを目的とする。これはこれらの事柄のいずれかまたは全てが先行技術の基礎の一部を形成すること、または本特許出願の優先日に先だってオーストラリアまたは別の場所に存在したような、本発明に関係した分野に一般的な知識であることを認めるものではない。
【００４０】
本発明の特徴と利点は、添付の図面と共に、以下の非限定的実施態様の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ウシ眼球のＭＬＡ００８Ｅ２プロテオグリカン抽出物の内皮細胞遊走結果を示すグラフである。
【図２】ラット大動脈環血管新生アッセイにおける、（Ａ）対照および（Ｂ）ＭＬＡ００８Ｅ２プロテオグリカン抽出物の内皮細胞遊走および増殖に対する効果を示す顕微鏡写真である。
【図３】抽出物ＭＬＡ００８Ｅ２による内皮細胞遊走活性を示すグラフである。
【図４Ａ】１７日間にわたり対照の創傷サイズと比較した治療創傷のサイズを示す写真である。
【図４Ｂ】上記試験期間中の創傷サイズの減少を示すグラフである。
【図５】ウシβＢ２クリスタリンタンパク質のアミノ酸配列である（配列番号１）。
【図６】１ＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００  ＨＲカラム上のウシクリスタリン抽出物（６ｍＬ）の溶出プロフィールである。ジグザグの線は導電率を表す。収集された画分をｘ軸上に示す。αＡおよびＢクリスタリン（画分２０〜２８）、βＨクリスタリン（画分２９〜３３）、βＬ１（画分３４〜４１）、βＬ２（画分４２〜４５）、γＳ（画分４６〜４９）、およびγＢＣ／ＤＥ（画分５０〜５６）。
【図７】１ＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００  ＨＲカラム上のｐＨ５．０に調節されたウシクリスタリン抽出物（２５ｍＬ）の溶出プロフィールである。収集された画分（１８ｍＬ）をｘ軸上に示す。
【図８】ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから溶出されたウシクリスタリン画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。レーン１：ＭＷマーカー、レーン２：画分２１〜３４、レーン３：画分３７〜４７、レーン４：画分５０〜６０、レーン５：画分６１〜７７。
【図９】タンパク質に対する可能な翻訳後修飾を示す、βＢ２アミノ酸配列（配列番号１）である。
【図１０】創傷治癒研究期間中のラットの平均体重増加を示すグラフである。Ａ群：ビヒクル対照リン酸緩衝食塩水。Ｂ群：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １低タンパク質濃度（０．０１ｍｇ／創傷）βＢ２クリスタリン。Ｃ群：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２高タンパク質濃度（０．１ｍｇ／創傷）βＢ２クリスタリン。Ｄ群：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ３（１．０ｍｇ／ｍＬ）αＢクリスタリン。Ｅ群：陽性対照アロエベラゲル（２０ｍｇ／創傷）。
【図１１】創傷治癒経過中の炎症反応を示すグラフである。
【図１２】創傷治癒閉鎖速度の比較を示すグラフである。Ａ群：ビヒクル対照リン酸緩衝食塩水。Ｂ群：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １低タンパク質濃度（０．０１ｍｇ／創傷）βＢ２クリスタリン。Ｃ群：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２高タンパク質濃度（０．１ｍｇ／創傷）βＢ２クリスタリン。Ｄ群：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ３（１．０ｍｇ／ｍＬ）αＢクリスタリン。Ｅ群：陽性対照アロエベラゲル（２０ｍｇ／創傷）。
【図１３】様々なプロテアーゼを熱分解から保護する、ウシクリスタリン画分のシャペロン活性を示すグラフである。
【図１４】ウシクリスタリンタンパク質の血管新生可能性を示すグラフである。サンプル７：ウシβＢ３クリスタリン（ウシクリスタリンを９７〜９９℃で３分間熱変性し、上清を遠心分離によって収集して調製される）。サンプル８：ウシαＡクリスタリン。サンプル９：ウシαＢクリスタリン。サンプル１０：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １ウシβＢ２クリスタリン（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００  ＨＲを使用して、ｐＨ５．３での分画によって調製された、画分４０〜４８）。サンプル１１：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ３ウシαＢクリスタリン（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ上で分画されたウシαクリスタリン抽出物、画分３７〜４７）。サンプル１２：Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２ウシβＢ２クリスタリン（１００ｋＤａ保留Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００  ＨＲでの限外濾過によって調製された、画分４０〜４８）。
【図１５】ウシクリスタリンタンパク質の血管新生可能性を示すグラフである。サンプル１３：ヒツジβＢ２クリスタリン（Ｃ４カラム上でのＲＰ  ＨＰＬＣによって調製された）。サンプル１４：エラスターゼＩで処理されたβＢ２クリスタリン。サンプル１５：ウシβＢ２クリスタリン（Ｃ４カラム上でのＲＰ  ＨＰＬＣによって調製された）。サンプル１６：ヒツジαＡクリスタリン。サンプル１７：ヒツジαＢクリスタリン。サンプル１８：インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ。サンプル１９：トリプトファンジオキシゲナーゼ。サンプル２０：インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼおよびヒツジβＢ２クリスタリン。サンプル２１：トリプトファンジオキシゲナーゼおよびヒツジαＢクリスタリン。
【図１６】ビヒクルのみの対照と比較した、正常な皮膚とエラスターゼＩトランケート型のβＢ２クリスタリンで処置された創傷との間の移行帯中の毛細血管密度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
クリスタリンタンパク質の血管新生活性および／または内皮細胞増殖性または遊走可能性は、ここで述べられている、または当業者によって適切とされているアッセイおよび方法によって評価できる。クリスタリンタンパク質はあらゆる脊椎動物または哺乳類のクリスタリンであることができ、天然クリスタリン、または組み換えまたはその他の合成タンパク質であってもよい。ウシαＡクリスタリンのアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿７７６７１４  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ，ａｌｐｈａ  Ａ［Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ］によって提供される。αＡクリスタリンのアミノ酸配列同一性は例えば種間で高度に保存され、ウシαＡクリスタリンはマウス、ハムスター、およびラットαＡクリスタリンと９８％のアミノ酸配列同一性を有する（ＨａｙおよびＰｅｔｒａｓｈ、１９８７年）。ウシβＢ２クリスタリンのアミノ酸配列は、例えば（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７４８０７  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ，ｂｅｔａ  Ｂ２（ＣＲＹＢＢ２），ｍＲＮＡによって提供される。
【００４３】
天然クリスタリンタンパク質がそれから精製される動物は、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、霊長類、齧歯類またはその他の哺乳類種のメンバーであることができる。少なくともいくつかの形態では、クリスタリンタンパク質は、ウシまたはヒツジクリスタリンタンパク質である。典型的にクリスタリンタンパク質は、眼水晶体から精製される。ヒツジおよびウシ眼水晶体が特に適切である。
【００４４】
組み換えクリスタリンタンパク質は、天然クリスタリンと同一のアミノ酸配列、または天然タンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸の違いを有することができる。アミノ酸の変化は、１つ以上のアミノ酸付加、欠失および／または置換を含むことができる。天然クリスタリンタンパク質配列の修飾をもたらすアミノ酸の反転およびその他の突然変異変化もまた、包含される。さらに組み換えタンパク質は、遺伝コードによってコードされないアミノ酸またはアミノ酸を含むことができる。例えばＬ−アミノ酸でなくＤ−アミノ酸を利用して、生体内におけるタンパク質のエンドペプチダーゼ分解を阻害できる。
【００４５】
アミノ酸の置換は、保存的または非保存的置換であることができる。保存的アミノ酸置換という用語は、アミノ酸残基をクリスタリンタンパク質の血管新生および／または創傷治癒活性に実質的に悪影響を及ぼさない同様の特性を有する別のアミノ酸で置き換えるという、通常受け入れられている意味で理解される。例えば保存的アミノ酸置換は、リジンなどの別の塩基性アミノ酸によるアルギニンなどの塩基性アミノ酸の置換を伴うことができる。同様に例えばシステイン残基をセリンで置換でき、または非極性アミノ酸をアラニンなどの別の非極性アミノ酸で置換してもよい。クリスタリンタンパク質アミノ酸配列中で置換または欠失を受け入れやすいアミノ酸は、近縁関係にあるクリスタリンタンパク質と配列比較して非保存アミノ酸を同定することによって、また通例の試行および十分に当業者の技術範囲内にある実験法によって判定されてもよい。修飾組み換えクリスタリンタンパク質は、宿主細胞中での核酸発現に際して、所望のアミノ酸変化が達成されるように、天然タンパク質をコードする核酸配列中にヌクレオチド変化を導入することで提供できる。
【００４６】
本発明によって具現化される方法で有用な組み換えまたはその他の合成クリスタリンタンパク質は、約６０％以上、そしてより通常では少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上、または１００％の天然クリスタリンとのアミノ酸配列同一性を有し、上に列挙した範囲内の全ての配列相同性およびその範囲は、明示的に包含される。比較目的で最適に位置合わせした際の配列中の各位置でアミノ酸を比較して、アミノ酸配列間の配列同一性を判定する。その位置のアミノ酸が同一であれば、配列はその位置で同一と見なされる。ギャップは、アミノ酸残基が片方の配列中に存在するが他方には存在しないアラインメント中の位置であり、非同一残基がある位置と見なされる。配列のアラインメントは、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年）などのあらゆる適切なプログラムまたはアルゴリズムを使用して実施してもよい。ＧＡＰ挿入ペナルティーが５０でＧＡＰ伸長ペナルティーが３のデフォルト採点マトリックスを使用して、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）の一部であるＧＡＰなどの標準ソフトウェアプログラムを使用して、コンピュータ補助配列アラインメントを好都合に実施できる。
【００４７】
クリスタリンタンパク質はまた、化学的に合成できる。ここで述べられているようなクリスタリンタンパク質を組み込んだ融合タンパク質の提供および使用もまた、本発明に明示的に包含される。融合タンパク質をコードする核酸は、平滑末端化された末端およびオリゴヌクレオチドリンカー、スタッガード末端を提供する消化、および付着末端のライゲーションを必要に応じて用いることで、クリスタリンタンパク質をコードする別個のＤＮＡ断片と、例えばタンパク質の親油性特性を増強するための親油性アミノ酸配列とをつなぎ合わせて提供できる。ここで述べられているような組み換えおよび融合タンパク質を提供する技術は当業者に良く知られており、相互参照によってその内容全体を本明細書に援用する（例えばＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１および２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９８年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、および前述の改訂版と更新もまた参照されたい）。
【００４８】
ここで述べられているような組み換えクリスタリンタンパク質および融合タンパク質の発現のために形質移入できる宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細菌株などの細菌と、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母と、昆虫細胞と、鳥類細胞と、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＨａＲａｓ、ＷＩ３８、ＳＷ４８０、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞などの哺乳類細胞とが挙げられる。宿主細胞は、必要に応じて、当該技術分野で既知のまたはここで述べられているような標準精製技術を使用して、発現された生成物および／または上清を宿主細胞から精製するのに先だって、（典型的に適切な発現ベクター中で）導入された核酸を発現させる条件下で、適切な培地中で培養される。
【００４９】
ここで述べられているようなクリスタリンタンパク質はまた、溶解性、親油性特性、安定性、生物学的半減期を改善し、または例えば引き続く検出のための標識などとして機能する、１つ以上のタンパク様または非タンパク様部分をタンパク質にカップリングしても修飾できる。修飾はまた、構造的修飾をもたらす炭水化物部分の結合または化学反応などの翻訳後または合成後修飾（例えば１つ以上のアミノ酸残基のアルキル化またはアセチル化、または化学結合の形成を伴うその他の変化）に起因することができる。特にクリスタリンタンパク質は、メチル化、ホスホリル化、チロシンおよび／またはトリプトファン残基の酸化、グリコシル化、およびＳ−メチルシステイン共有結合からなる群から選択される、１つ以上の修飾を有することができる。
【００５０】
さらにクリスタリンタンパク質をペグ化またはオルニチニル化して、それが生体内でプロテアーゼによる分解に対して抵抗性がより低くなるようにし、または腎臓を通じた循環からのそれらの排除を阻害してもよい。ペプチドのＰＥＧ化などの方法は当該技術分野で良く知られており、このような全ての修飾は明示的に包含される。
【００５１】
クリスタリンタンパク質は、約１６Ｄａ〜約３２Ｄａの範囲のサイズであることができる。特にαＡクリスタリンタンパク質は、常態では約１６Ｄａ〜約２０Ｄａの範囲のサイズであり、より通常には約１８Ｄａ〜約２０Ｄａの範囲である。本発明によって具現化される１つ以上の方法で用いられるβＢ２クリスタリンタンパク質は、常態では約１５Ｄａ〜約２８Ｄａの範囲、より通常には約２０Ｄａ〜約２５Ｄａの範囲のサイズである。
【００５２】
天然クリスタリンタンパク質のＣ末端およびＮ末端延長には、四次構造の安定化およびタンパク質集合体の形成が関与する。したがってこのようなＣ末端およびＮ末端延長を欠いているクリスタリンは、集合体を不十分に形成する。αクリスタリンは大型集合体を形成する。それらは熱ショックドメインを有し、βクリスタリンと同様に凝集形成に関与するＮ末端に延長を有する。クリスタリンタンパク質間の静電相互作用もまた、クリスタリン凝集形成に関与し、ｐＨ５未満におけるヒスチジン残基のイオン化は集合体を破壊できる。典型的に本発明によって具現化される方法で使用されるクリスタリンタンパク質は、単量体型である。クリスタリン単量体は、タンパク質の天然Ｃ末端および／またはＮ末端延長が除去されて、少なくともβＢ２クリスタリンの場合は、球形中央コアまたは「球形ドメインまたはグリークキーモチーフ」を残すように、抽出したクリスタリンタンパク質を（例えばエラスターゼまたはキモトリプシンによる部分的プロテアーゼ消化などにより）部分的に加水分解して調製できる。クリスタリンタンパク質の球形ドメインは、血管新生および／または内皮細胞増殖性または遊走可能性を示す。本発明によって具現化される方法で用いられるαＡクリスタリンの断片は、常態ではクリスタリンおよびタンパク質の熱ショックドメインを含む。
【００５３】
例としてβＢ２クリスタリンのＮ末端をエラスターゼＩによって切断でき（すなわちＡＳＤＨＱＴＱＡ／ＧＫＰＱＰＬＮＰＫＩＩ（配列番号２）、切断点を「／」で示す）、タンパク質のＣ末端についても同様であり（ＲＤＭＱＷＨＱＲＧＡ／ＦＨＰＳＳ（配列番号３））、本発明の１つ以上の実施態様で有用性があるトランケート型のβＢ２クリスタリンがもたらされる。特に使用してもよいトランケート型のβＢ２クリスタリンとしては、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０２５２２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ０２５２２（ＣＲＢＢ２＿Ｂｏｖｉｎ）のアミノ酸１７〜１９１を含むドメイン；ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０２５２２）、およびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０２５２２のアミノ酸２〜２００および１０〜２００からなり、またはそれを含むものが挙げられる。さらに血管新生βＢ２クリスタリンタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０２５２２のアミノ酸１７〜５６（グリークキー１）、５７〜１０１（グリークキー２）、１０７〜１４８（グリークキー３）、および１４９〜１９１（グリークキー４）などのタンパク質の「グリークキー」ドメインの１つ以上（典型的に全て）を含むことができる。
【００５４】
本発明の実施態様で有用な未変性およびトランケート型のクリスタリンタンパク質は、天然クリスタリンタンパク質中のアセチル、メチル、エチル、ホスホリル化、酸化、およびグリコシル化修飾などであるが、これに限定されるものではない翻訳後修飾を受けてもよい。例えば次のβＢ２クリスタリンのアミノ酸（例えばＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０２５２２参照）を次のように修飾できる（ＡＡはアミノ酸位置を示す）：ＡＡ２  Ｎ−アセチルアラニン；ＡＡ４２  Ｎ６−メチル化リジン；ＡＡ６８  Ｎ６−メチル化リジン；ＡＡ７６  Ｎ６−アセチルリジン；ＡＡ１１８ホスホスレオニン；ＡＡ１２１  Ｎ６−アセチルリジンまたはＮ６−メチル化リジン；ＡＡ１１  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ４８  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ６８  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ７６  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ１０１  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ１０８  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ１２０  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ１２１  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ１４０  Ｎ−（Ｇｌｃ）；ＡＡ１６８  Ｎ−（Ｇｌｃ）、およびＡＡ１７２  Ｎ−（Ｇｌｃ）。典型的に未変性（未消化）αＡクリスタリンが、ここで述べられているような本発明の実施態様で使用される。最も通常にはαＡクリスタリンタンパク質は無修飾であり、または少なくともリン酸化されていない（天然タンパク質のアルカリホスファターゼ処理によって達成されてもよい）。アルカリホスファターゼ活性に適切な条件としては、ｐＨが約８．０〜９．８の範囲内にある適切な亜鉛、マグネシウムまたはカルシウム含有緩衝液が挙げられる。
【００５５】
本発明の実施態様で使用するために、濾過およびクロマトグラフィー（例えばＲＰ−ＨＰＬＣ）プロトコルをはじめとするが、これに限定されるものではないあらゆる適切な精製技術によって、クリスタリンタンパク質の部分的加水分解形態を精製できる。
【００５６】
本発明に従って治療してもよい組織部位および創傷としては、急性および慢性創傷、電離放射線への曝露に起因する火傷をはじめとする火傷、薬傷、外科創傷、口腔内創傷、皮膚および筋肉外傷、開放皮膚創傷、糖尿病性足部潰瘍や糖尿病性腎障害足部潰瘍をはじめとする糖尿病性皮膚潰瘍、虚血性腎障害足部潰瘍をはじめとする虚血性組織、静脈鬱血性潰瘍、褥瘡、および低酸素組織が挙げられる。虚血性および低酸素組織の例としては、脳卒中に付随する虚血性心臓組織および低酸素組織が挙げられる。クリスタリンタンパク質投与によって創傷治癒が促進されてもよい条件としては、例えば組織低酸素症や反復性外傷によって、または糖尿病および血管疾患などの全身的原因によって治癒が損なわれまたは妨げられる、創傷治癒遅延の状況が挙げられる。
【００５７】
本発明に従ったクリスタリンタンパク質によって、増殖および／または移動が誘発されてもよい内皮細胞タイプの例としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、およびウシ大動脈内皮細胞が挙げられる。
【００５８】
クリスタリンタンパク質は、単独で、または１つ以上のその他の治療薬と共に同時投与して、このような治療を必要とする対象に投与できる。例えばクリスタリンタンパク質は、血管新生および／または創傷治癒を促進するために従来法で使用される治療薬と合わせて同時投与できる。「同時投与される」とは、同一製剤中での、または同一または異なる経路による２つの異なる製剤中での同時投与、または同一または異なる経路による逐次投与を意味し、そこではクリスタリンタンパク質およびその他の治療薬は、重複する治療濃度域を示す。「逐次」投与とは、一方が他方の後に投与されることを意味する。クリスタリンタンパク質と共に同時投与されてもよいこのようなさらなる薬剤としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来創傷治癒因子、インシュリン成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、抗炎症薬、および抗微生物剤が挙げられる。クリスタリンタンパク質と共に同時投与されてもよい、血管新生および／または創傷治癒を促進するために使用されるその他の治療薬のさらなる例としては、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、スフィンゴシン−１−リン酸（ＳＩＰ）、Ｎ−アシルエタノールアミン、グレープフルーツ抽出物、およびアエシンや緑茶カテキンをはじめとするその他の植物化学物質、メラトニン、血管成長を支援するためのアルギニンおよびその他のアミノ酸が挙げられる。
【００５９】
クリスタリンタンパク質は、一般にタンパク質および薬学的に許容できるキャリアを含む医薬組成物に調合される。適切な医薬組成物としては、内服用または外用のクリーム、ローション、軟膏、およびゲルなどの局所用として許容可能な剤形が挙げられる。局所的に許容可能な組成物は、製剤で含浸された包帯などによって、治療部位に直接塗布できる。クリスタリンタンパク質沈殿物を含むゲルが、特に適切である。ここで述べられているようなゲルおよびその他の医薬組成物はまた、カルシウムイオンおよび／または塩も含んでもよい。組成物中のカルシウムの存在は、創傷治癒を増強できる。
【００６０】
ここで述べられているような医薬組成物にはまた、パラベンやクロロブタノールやソルビン酸などの１つ以上の保存料、コーンスターチまたはゼラチンなどのバインダー、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、ゲル化剤、および典型的にこのような組成物中で使用されるその他の構成要素も組み込める。薬学的に許容できるキャリアとしては、あらゆる適切な従来法で知られている、局所的および生理学的に許容可能な溶媒、分散媒、等張製剤および溶液が挙げられる。薬学的活性物質のためのこのような成分および媒体の使用については、良く知られている。いずれかの従来の媒体または薬剤がクリスタリンタンパク質と不適合である場合を除き、その使用は明示的に包含される。
【００６１】
本発明によって具現化される医薬組成物としては、ヒトまたは獣医学用途のための治療的組成物が挙げられる。典型的に医薬組成物は、組成物を創傷へ直接塗布するのに適したｐＨを有する。一般にｐＨは３．８を超え、通常約４以上である。ここで述べられているようなクリスタリンタンパク質沈殿物ゲルは、沈殿物が所望のｐＨを有するように、タンパク質および生理学的に許容可能な緩衝系を含有する溶液から沈殿できる。あるいは、あらゆる適切なｐＨ調節剤をゲルに添加して、ゲルのｐＨを所望のｐＨに変更できる。
【００６２】
本発明によって具現化される医薬組成物は、一般に組成物の少なくとも約０．００１重量％〜約８０％ｗ／ｗまでのクリスタリンタンパク質を含有する。例えば医薬組成物は約０．０５％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０重量％のクリスタリンタンパク質を含有できる。組成物中のタンパク質量は、提案される投与様式を考慮して適切な有効投薬量が対象に送達されるような量とする。
【００６３】
本発明の実施態様に従って投与されるクリスタリンタンパク質の投薬量は、タンパク質が予防または治療用途で投与されるかどうか、それに対してタンパク質を投与することが意図される疾患または病状、病状の重篤性、対象の性別および年齢、そして対象の体重および総体的な健康をはじめとする関連要素をはじめとするいくつかの要素に左右され、一般に認められた医学原理に従って判定できる。例えば低投薬量を最初に与えて、対象の反応評価に従って各投与時に引き続いて増大できる。同様に投与頻度を同じように判定でき、すなわち各投薬間の対象の応答を連続的にモニタリングして、望ましければ投与頻度を上げ、あるいは投与頻度を下げる。
【００６４】
典型的にクリスタリンタンパク質は、約５０ｍｇ／ｋｇ体重までの、好ましくは約５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重の範囲の投薬量で、本発明によって具現化される方法に従って投与される。局所塗布のためには、クリスタリンタンパク質は、約０．１μｇ〜１００μｇ／ｃｍ−１の範囲の用量で組織または創傷部位に投与される。局所的に投与される用量は、約０．１、０．５、１．０、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇ／ｃｍ−１であることができる。典型的にタンパク質は、治療される組織の１．０〜１０．０μｇ／ｃｍ−１の範囲の投薬量で投与される。
【００６５】
投与経路としては、局所的、呼吸マスク経由、静脈内、経口的、腹腔内、皮下、筋肉内、直腸、局所的、およびインプラントが挙げられるが、これに限定されるものではない。静脈内経路に関して、特に適切な経路は、治療される標的組織に供給する血管内への注射による。クリスタリンタンパク質はまた、例えば胸膜腔または腹膜腔などの腔内へ送達でき、または治療される組織内に直接注射できる。経口投与のためには、クリスタリンタンパク質はカプセル化でき、またはさもなければ胃を通過させて小腸内で放出させるために腸溶性で提供される。あらゆる適切なこのような腸溶性剤形、またはコーティングが利用できる。
【００６６】
さらにクリスタリンタンパク質はまた、血管形成術またはその他の外科処置中に、血管形成術カテーテルなどのカテーテルのステントまたはバルーンの表面、または血管内壁に適用されるその他の手術用具の表面に被覆できる。例えばクリスタリンをこの様にしてゲルまたはあらゆるその他の適切な調合物の形態で血管壁に塗布して、創傷治癒および／または血管新生または治療部位への上皮細胞遊走を促進できる。
【００６７】
本発明によって具現化される組成物で有用な適切な薬学的に許容できるキャリアおよび調合物は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓなどの当業者に良く知られているハンドブックおよび教科書に見られる。
【００６８】
本発明をいくつかの非限定的例に言及して、以下でさらに説明する。
【実施例】
【００６９】
実施例１：内皮細胞遊走および増殖を促進する組織抽出物
１．１  プロテオグリカン単離の標的とされたウシ組織
いくつかのウシ組織をプロテオグリカン単離の標的にした。これらには、皮、関節軟骨、靱帯、骨、筋肉、鼻中隔、腎臓基底膜、眼球、および大動脈が含まれた。
【００７０】
クリスタリンタンパク質を単離するのに使用された最初の手順は、機械的に組織を小片に破壊して、続いて水洗して水溶性タンパク質を除去し、４Ｍグアニジウム塩酸塩（ＨＣｌ）または６Ｍ尿素で抽出することを伴った。次に粗製プロテオグリカン抽出物に、エラスターゼＩによるタンパク質分解を施した。しかしトリプシン、キモトリプシンまたは生物活性を示す適切なサイズのペプチドを放出するあらゆるその他の適切なプロテアーゼもまた使用できる。内皮細胞の増殖および遊走を促進する能力について、消化物を試験した。活性を有するタンパク質またはペプチドを含有する抽出物を、イオン交換、ゲル濾過、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分画し、内皮細胞増殖および遊走アッセイを使用してスクリーニングして活性構成物を同定した。Ｎｉｃｏｓｉａ  Ｒ．ＦおよびＯｔｔｉｎｅｔｔｉ  Ａ．，１９９０年、およびＢｒｏｗｎら，１９９６年によって述べられる手順の変法に基づいて、Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ  ＺｅａｌａｎｄのＰａｕｌ  Ｄａｖｉｓ博士により提供された、血管新生の生体内大動脈環モデルを使用して、促進可能性を有するグリコペプチドを確認した。
【００７１】
１．２  エラスターゼＩによるウシ組織プロテオグリカン抽出物の消化
本研究で使用するために、表１で同定されるプロテオグリカン抽出物を調製した。
【００７２】
【表１】
0005685773.tif 000002
【００７３】
抽出したプロテオグリカンを秤量し、２０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する１ｍＬの１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）タイプＩＥ．Ｃ３．４．２１．３６（１４．３ｍｇ／タンパク質／ｍＬ、６．０単位／ｍｇおよび８５．８単位／ｍＬ、１単位は標準条件下で２５℃で転換される１μｍｏｌの基質（Ｎ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ）に対応する）を使用して、プロテオグリカン抽出物を加水分解した。１単位（１０μＬ）のＰＰＥを添加し、プロテオグリカン抽出物を３７℃で４８時間加水分解した。微量遠心管内で１３２００ｒｐｍ、室温で１分間遠心分離して、固体材料を除去した上清を濾過して滅菌し、内皮細胞増殖および遊走について試験した。
【００７４】
１．３  サンプルＭＬＡ−眼球−００１Ｆの調製
１７．６ｇのみじん切りウシ眼球を２００ｍＬの４ＭグアニジニウムＨＣｌによって室温で２日間抽出し、サンプルＭＬＡ−眼球−００１Ｆを調製した。抽出物をＷｈａｔｍａｎ＃５４１濾紙を通して真空下で濾過した。濾液をｄＨ２Ｏで透析し、使用時まで凍結乾燥した。使用に先だって、１０ｍＭの塩化カルシウムを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液中で凍結乾燥材料を再溶解し、エラスターゼＩで消化した。ＭＬＡ−眼球−００１Ｆ製剤は、表１に示すようにＭＬＡ−００８Ｅ２とコード化した。表１で同定されるその他のプロテオグリカンも同様にして抽出した。
【００７５】
１．４  逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ  Ｃ−１２保護カラム付きＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４μ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０Å（２５０×４．０６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ（Ｕ．Ｓ．Ａ．），Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）上のＲＰ−ＨＰＬＣによって、消化されたプロテオグリカン抽出物の分画を実施した。１ｍＬ／分の流速を使用して、ミリＱ水中の０．１％ＴＦＡでカラムを平衡化した。緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含有する７０％アセトニトリルと３０％ミリＱ水）の勾配を次のように注入した。０分で０％Ｂ、５分で５％Ｂ、１０分で１０％Ｂ、２５分で１５％Ｂ、３０分で２０％Ｂ、３５分で３０％Ｂ、４０分で６０％Ｂ、５０分で２０％Ｂ、５５分で０％Ｂ、および６０分で０％Ｂ。吸光度は２１４ｎｍでモニターした。
【００７６】
１．５  ウシ大動脈内皮細胞の単離および調製
ウシ大動脈を地元の食肉処理場から入手し、両端をクランプした。細動脈を糸で縛った。無菌条件下において２％スクロース溶液で大動脈を洗浄し、汚染血液を除いた。ＰＢＳ緩衝液中のトリプシンを添加して、３０分間インキュベートした。内皮細胞懸濁液と細胞培養液（２０％ウシ胎児血清、２％グルタミン、および抗生物質含有ＤＭＥＭ）とを１：１に混合した。９６０×ｇで１０分間遠心分離して細胞を収集し、次に保存細胞アンプルを培養するのに先立って培地に懸濁した。５回の細胞継代培養後に、細胞を１０％ＤＭＳＯ中で凍結し液体窒素内に保管した。細胞を蘇生させ、７５ｃｍ２培養フラスコ内の培地中で９５％集密まで成長させた。次に使用するために細胞を収集した。
【００７７】
１．６  内皮細胞増殖
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中のウシ大動脈内皮細胞をウェルあたり０．８×１０４個含有する無菌の９６ウェルプレートを調製して、２４、４８または７２時間インキュベートした。サンプルは３つの異なる濃度（無希釈、１０−２、および１０−４）で、三連で調製した。試験抽出物を添加する前に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２時間付着させた。所望時間経過後、プレートを凍結し細胞を溶解して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＣｙＱｕａｎｔ細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を使用して、製造業者の説明書に従って細胞数を読み取った。
【００７８】
１．７  内皮細胞遊走
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ血管新生細胞遊走アッセイ２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用した。遊走プレートは必要になるまで−１８℃に保った。簡単に述べると、ＤＭＥＭおよびＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）中でウシ大動脈内皮細胞を２×１０５細胞／ｍＬに調製した。２５０μＬの容積の細胞懸濁液（５×１０４細胞）を上のチャンバーに入れた。即座に、サンプル注入口を使用して底の各ウェルに７５０μＬを入れた。１ｍＬのＤＭＥＭ含有ＨＥＰＥＳに糖タンパク質抽出物を添加して、サンプルを調製した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で、２２±１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、上のチャンバーから培養液を注意深く取り出した。４μｇ／ｍＬのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中のカルセインＡＭを０．５ｍＬ／ウェル含有する第２のＦａｌｃｏｎ（商標）非ＴＣ処理２４ウェルプレートに挿入物を移し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。さらなる操作なしに励起／放射波長４８５／５３８ｎｍで、最低読み取りを使用して、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ蛍光性プレートリーダー内で、侵入された細胞の蛍光を読み取った。
【００７９】
細胞を遊走後にカルセインＡＭで標識した。ＤＭＳＯに１ｍｇ／ｍＬを溶解して、カルセインＡＭ原液を調製した。原液５０μＬを１２．５ｍＬのＨＢＳＳに添加した。
【００８０】
１．８  ラット大動脈環血管新生アッセイ
ラット大動脈を切除して付着する脂肪および結合組織を取り去った後、およそ３ｍｍ幅の環に切断した。マルチウェル培養プレートのウェルの底にフィブリノーゲンを入れ、トロンビン作用によってゲル化させた。次に大動脈環を各ゲル上に重ねて、その上にフィブリンのさらなる層をのせた。抗生物質を添加したＭＣＤＢ１３１培地（Ｓｉｇｍａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）中で、フィブリノーゲンを調製した。次にフィブリンの二重層に、試験抽出物を含有するＭＣＤＢ１３１培地を重ね合わせた。対照ウェルはＨＢＳＳを含有した。陰性対照としてフマギリン（２０μｇ／ｍＬ）を三連でアッセイした。
【００８１】
ゲルを３％ＣＯ２／９７％空気の雰囲気中３７℃でインキュベートした。倒立顕微鏡を使用して環を調べ、それらの外辺部からの微小血管の成長を観察した。２日間毎にこれらのデジタル画像を撮影し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ）を使用して、環サイズに対する微小血管の成長程度を判定し、次に各ウェルについて微小血管の成長速度を判定した。各試験抽出物を三連でアッセイし、平均成長速度を計算した。
【００８２】
２．結果および考察
プロテオグリカン抽出物を調製して、エラスターゼＩで加水分解した。粗製抽出物は、最初に内皮細胞遊走または増殖を促進する能力について試験した。活性を示した抽出物を、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分画した。分離されたペプチドを再試験して、活性の原因であるペプチドを同定した。
【００８３】
結果は、大部分のサンプルが、事実上血管新生促進効果を有さないことを示した。しかし抽出物ＭＬＡ００８Ｅ２による測定可能な血管新生促進が観察された。濃度１２５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを陽性対照として使用した。アッセイ中に使用したＦａｌｃｏｎプレートを、バックグラウンド蛍光について試験した。この値は、最終読み取りから差し引かれた（すなわち結果−プレート空試験）。各ウェルについて９回の読み取りを実行し、平均して、高低の値をプロットした。結果を表２および図１にそれぞれ示す。ＭＬＡ００８Ｅ２による血管新生促進を示す大動脈環アッセイの例を図２に示す。
【００８４】
【表２】
0005685773.tif 000003
【００８５】
ＭＬＡ００８Ｅ２の内皮細胞遊走性についてもまた試験した。簡単に述べると、無菌条件下で、総容積７５０μＬの無血清ＤＭＥＭ中の１０μＬおよび５０μＬの抽出物の２つの異なる用量を使用して、プロテオグリカン抽出物ＭＬＡ００８Ｅ２を三連で試験した。結果を図３に示すが、これは遊走が用量依存様式で増大することを示し、抽出物中の内皮細胞遊走促進作用因子の存在が示唆される。
【００８６】
さらなる研究は、続いて血管新生を調節する能力を有するペプチド／タンパク質源としての抽出物ＭＬＡ００８Ｅ２に着目する。
【００８７】
実施例２：ＲＰ−ＨＰＬＣまたはゲル濾過によるＭＬＡ００８Ｅ２の分画
実施例１．４で述べられているように、ＭＬＡ００８Ｅ２の最初の分画は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ  Ｃ−１２保護カラム付き分析Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４μ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０Å（２５０×４．０６ｍｍ）カラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣ分離を伴った。このカラムは、１０ｋＤａよりも小さいペプチドを結合するようにデザインされている。画分をプールして、内皮細胞遊走性（無血清培地中の５×１０４細胞／ウェルを５％ＣＯ２中３７℃で２２±１時間遊走させた）および増殖活性について試験した。増殖アッセイでは、細胞空試験が増殖バックグラウンドレベルを提供した。１０％ＦＢＳが陽性細胞増殖対照を提供した。１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中でウェルあたり１×１０４細胞の初期播種密度を使用して、細胞増殖を７２時間にわたり試験した。分子プローブＣｙＱｕａｎｔキットを使用して、製造業者の説明書に従って細胞数を定量化した。
【００８８】
内皮細胞遊走を促進する可能性を有するとして、いくつかの画分が同定された。具体的には、画分１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、および３１〜３５（合計４０の画分）が、バックグラウンド遊走レベル（細胞および培地）と比較して、ウシ内皮細胞の遊走を促進する作用因子を含有するようであった。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によって、最初のグループ分けから、代表的なペプチドプロフィールを含有するようであった単一画分を選択した（画分１２、１３、１７、２２、２４、２６、３１、および３３）。内皮細胞遊走活性について、個々の画分を再試験した。画分１２および３３は内皮細胞遊走を増強する能力を有するようであった（発光が強いほど、遊走した細胞数がより多いことを示す）。画分１２および３３は、ＴＳＫ２５００カラム上でゲル濾過を使用してさらに分画した。
【００８９】
複数ペプチドが画分１２中に存在し、１つの主要ピークが画分３３中に存在した。画分３３中の未知の作用因子を分析した。簡単に述べると、ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析および蛍光分光分析、プロトンおよび１３Ｃ  ＮＭＲおよびＩＲによって化合物を分析した。画分３３の分析結果は、主要構成物がトリプトファンであったことを暗示した。内皮細胞遊走を促進する能力についてトリプトファンを試験したところ、意外にも細胞の遊走を促進できるようであった。理論に制限されるものではないが、内皮細胞と関連付けられている細胞遊走は、トリプトファンジオキシゲナーゼおよびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの双方によって誘発されるトリプトファンの分解に起因すると考えられる。これらの酵素はどちらも超酸化物を使用し、インドール環の切断を触媒してＮ−ホルミルキヌレニンを生じ、それらは酸素ラジカルを除去するので抗炎症性である。したがってトリプトファン分解は、血管新生の促進と、創傷中に存在する炎症細胞（例えば好中球）により誘発される炎症性損傷の低下の双方をもたらす。
【００９０】
２．１  ゲル濾過によるＭＬＡ００８Ｅ２画分１２の分画
画分１２をＴＳＫ２５００ゲル濾過カラム上でさらに分画した。カラムをリン酸緩衝食塩水で平衡化し、１００μＬのサンプルを流速１ｍＬ／分でカラムに注入した。溶出プロフィールを２８０ｎｍおよび２１４ｎｍでモニターした。６０分間にわたって１ｍＬの画分を収集した。内皮細胞遊走を促進する能力について、得られた画分を再試験した。結果は決定的でなかった。したがってこれらのペプチド間の相乗作用が最初の観察を引き起こしたかもしれず、または効果をもたらすのにより高濃度のペプチドが必要であったと想定された。ＭＬＡ００８Ｅ２  ＲＰ−ＨＰＬＣ画分を１％ＦＢＳ不在下で再試験した（無血清ＤＭＥＭ中の２×１０５個の細胞を３７℃、５％ＣＯ２中で２２±１時間遊走させた）。
【００９１】
２．２  血管新生アッセイ
実施例１．８で述べられているようなラット大動脈環アッセイ（生体外血管新生）と、ラット背部皮弁アッセイ（創傷治癒アッセイ）とを使用して、いくつかのＭＬＡ００８Ｅ２画分の追加的分析を実施した。これらのアッセイ結果を表３に示す。
【００９２】
【表３】
0005685773.tif 000004
【００９３】
分析されたサンプルの最初のバッチは、画分ＭＬＡ００８Ｅ２＃３３（トリプトファンを含有する画分に相当する）中にいくらかの促進が存在することを示唆した。分析されたさらなるサンプルのバッチは、いくぶん類似した促進が抽出物ＭＬＡ００８Ｅ２  ３−１５中に存在することを示した。最初のバッチのＭＬＡ００８Ｅ２＃３３とさらなるバッチのＭＬＡ００８Ｅ２  １６−２９との間に類似したレベルの促進が、観察された。
【００９４】
Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ  ＺｅａｌａｎｄのＰａｕｌ  Ｄａｖｉｓ博士によって提供されるラット背面皮弁アッセイもまた用いて、血管新生を評価した（Ｍｅｌｌｉｎら、１９９２年参照）。簡潔には、２５〜２６週齢（平均２５．３週齢）の６匹のオスＬｅｗｉｓラットの背骨に沿って、肩甲骨間の背部表面に２つの直径８ｍｍの皮膚全厚にわたる創傷を形成した。第１の創傷は頭蓋よりおよそ６．０ｃｍ遠位であり、第２の創傷は同一線に沿ってさらに２ｃｍ遠位であった。創傷形成に先だってケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ体重）の注射（ｉ．ｐ．）で動物を麻酔した。回復後、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重でＴｅｍｇｉｓｉｃを皮下注射した。
【００９５】
各動物に４用量（各２５μＬ用量）の試験抽出物ＭＬＡ００８Ｅ２  ３−１５を投与したが、これは１、３、５、７、および９日目に片方の創傷に局所的に塗布されるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１μｇ／ｍＬ）中のＭＬＡ−ＫＤＪ  ００７に相当する。ペプチド溶液は濾過滅菌した。いくらかの物質がフィルター上に保持された。他方の創傷には２５μＬのＰＢＳのみを塗布したので、各動物はそれ自身の対照創傷を有した。キャノンＥＯＳ  ３０００Ｎカメラ（Ｆ２．８マクロレンズ）およびフジＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ４００ＮＰＨフィルムを使用して、各追加処置に先だって各創傷を撮影した。各撮影のプリントはデジタル記録して、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６３ソフトウェアを使用してこれらの画像から各創傷面積を計算した。これを１７日目まで継続した。処置創傷と対照創傷の平均面積を各時点で計算し、対照創傷に対する処置創傷の平均サイズを計算した。結果を下の表４、および図４Ａと４Ｂに示す。
【００９６】
【表４】
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【００９７】
上から示されるように、創傷治癒速度は試験創傷において、同一期間の対照創傷と比較して７〜９日目の間に劇的に加速された。さらに対照創傷よりも早く完全な創傷閉鎖が達成された。より早い閉鎖速度は、創傷治癒カスケードに沿ったいくつかの点で創傷治癒過程が促進され、より早い創傷閉鎖につながったことを示唆する。
【００９８】
２．３  ＭＬＡ００８Ｅ２から誘導される促進特性がある化合物の分析
活性を有する抽出物中に存在するペプチド／タンパク質の分子量をゲル濾過によって推定した。ＴＳＫ２５００ゲル濾過カラムをリン酸緩衝食塩水で平衡化し、１００μＬのサンプルを流速１ｍＬ／分でカラムに注入した。溶出プロフィールを２１４ｎｍでモニターした。６０分間にわたって１ｍＬの画分を収集した。既知の相対分子量のタンパク質、ペプチド、およびアミノ酸を同一条件下で試験してカラムを較正した。結果を表５に示す。
【００９９】
【表５】
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【０１００】
促進可能性がある画分ＭＬＡ００８Ｅ２  ３−１５およびＭＬＡ００８Ｅ２  １９−２９の双方の中の分子量約２７ｋＤａのタンパク質は、このタンパク質が観察された血管新生促進の原因であるかもしれないことを示唆する。引き続いてＮ末端配列分析を行って、このタンパク質を同定した。
【０１０１】
２．４  Ｎ末端配列分析
２７ｋＤａタンパク質のサンプルを得るために抽出物に分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、２７ｋＤａタンパク質をＮ末端配列分析のために切り取った。Ｎ末端はブロックされていることが分かった。Ｎ末端ブロッキングを克服するために、２７ｋＤａタンパク質のさらなるサンプルを調製して、３７℃で一晩トリプシンで消化した。得られたペプチドをＣ１８  Ｖｙａｄａｃカラム（Ｖｙａｄａｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｈｅｒｐｅｒｉａ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）に装入し、０〜１００％Ｂ（６０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ）の１時間の勾配からピークを収集した。これらのペプチドのＮ末端を引き続いて配列決定した。
【０１０２】
２．５  βＢ２クリスタリンの同定
同定されたメジャーおよびマイナー配列を下に示す。
【０１０３】
【表６】
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【０１０４】
配列ＬＹＥＮＰＮ（配列番号４）を使用し、ＮＣＢＩタンパク質データベースツール「Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ，ｎｅａｒｌｙ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｃｈｅｓ」を使用して検索を実施した。この６個のアミノ酸コードは、最初の２つのアミノ酸（残基１および２）の多義性のために用いられた。１回目の検索からはいくつかのβクリスタリンタンパク質およびダイニンタンパク質との相同性がもたらされた。哺乳類種に限定した２回目の検索からは、哺乳類のβＢ３およびβＢ２クリスタリン、ならびにダイニンとの相同性がもたらされた。
【０１０５】
クリスタリンおよびダイニンタンパク質のさらなる分析からは、目的の抽出物の未知タンパク質がβＢ２クリスタリンであることが実証された。ウシ眼球から抽出されたままではそのＮ末端はアセチル化されており、したがってブロックされており、配列ＬＹＥＮＰＮ（配列番号４）に先行する２つのアミノ酸はＩＴであった。またＮ末端からＩ（リジンＫ）のトリプシン切断部位が配列中に存在し、配列決定されたペプチドを放出できるようにする（図５参照）（配列番号１）。さらにダイニンは非常に大きなタンパク質（４７４６１０Ｄａ）であり、一致する配列に先立つ配列はＮＶであった。この配列に先立つトリプシン切断部位はなかった。完全配列ＩＴＬＹＥＮＰＮ（配列番号５）もまた使用してＮＣＢＩデータベースを検索し、βＢ２クリスタリンとしてのアイデンティティを確認した。ウシβＢ２クリスタリンアミノ酸配列を図５（配列番号１）に記載する。
【０１０６】
実施例３：ウシ眼球からのβＢ２クリスタリンの精製および創傷治癒活性のアセスメント
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００ＨＲ上でのゲル濾過クロマトグラフィー、およびいくつかの公称分画分子量膜を使用した限外濾過が関与する、２つの異なるアプローチを使用して、βＢ２クリスタリンを部分的に精製した。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ上でのイオン交換クロマトグラフィーによって、αＢクリスタリンを精製した。
【０１０７】
３．１  ウシ眼水晶体クリスタリンの抽出
新鮮なウシ眼球を食肉処理場から得て即座に処理した。眼水晶体を得るために、メスを使用して強膜と瞳孔の間に２〜３ｃｍの切り込みを入れた。瞳孔の上を親指で押して、水晶体を眼球から取り出した。このアプローチを使用して、望ましくない付着組織が最小限の無傷の水晶体を回収した。あるいは、角膜の中心を通る切り込みを入れることで、水晶体を眼球から除去した。この切り込みは水晶体内に達して水晶体シースを切り開き、角膜の直径に及んだ。これは眼球を両側から穏やかに圧搾することで、水晶体シースおよびその他の物質を含まない水晶体を眼球から除去できるようにした。水晶体シースの除去は、可溶性クリスタリンタンパク質を蒸留水で単に撹拌または混合して抽出する際に、３０分以内に可溶化させるために必須であった。さもなければ水晶体からのクリスタリンの抽出には、１０容積（ｗ／ｖ）の蒸留水、または１ｍＭ  ＤＴＴおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）のどちらかの中で、一晩４℃で撹拌することが必要であった。水晶体はこの間に緩慢に溶解した。不溶性膜結合タンパク質は、５００００ｒｐｍで３０分の超遠心によって高度に可溶性のクリスタリンから分離された。水溶性水晶体クリスタリンを含有する上清は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００  ＨＲを含有する１Ｌカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに分画された。ゲル濾過はいくつかの異なる条件を使用して実施した。カラムは、蒸留水中で、または１ｍＭ  ＤＴＴおよび１５０  ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）の抽出緩衝液を使用して作動させた。流速は１ｍＬ／分であり１８ｍＬの画分が収集された。慣例的に２５ｍＬの４５ｍｇ／ｍＬ眼水晶体抽出物をカラムに装入した。タンパク質溶出をモニターするインライン導電率モニタリング付きの２１４ｎｍおよび２８０ｎｍに設定したＱｕａｄＴｅｃ検出器を使用して、ＢＩＯＲＡＤ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃクロマトグラフィーシステムを使用して、カラムを４℃で作動させた。
【０１０８】
３．２  クリスタリンタンパク質の精製
ウシクリスタリン抽出物の典型的な溶出プロフィールを図６に示す。溶出を１ｍＬ／分で実施し、タンパク質は２１４ｎｍ（三角形）および２８０ｎｍでモニターした。抽出物は、不溶性物質を除去する超遠心の後、典型的に約４５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有した。様々な哺乳類のクリスタリンタンパク質の分離に起因するピークは、相対分子量およびイムノブロット分析によって、そして溶出プロフィールとクリスタリンタンパク質に関する文献で以前述べられているプロフィールとを比較することで、溶出プロフィール中で識別された。溶出ピークは、以前ＨｅｒｂｒｉｎｋおよびＢｌｏｅｍｅｎｄａｌ（１９７４年）によって、ゲル濾過クロマトグラフィーの下で分離することが示された、画分α、βＨ、βＬ１、βＬ２、γＳ、およびγＢＣ／ＤＥを表すと同定された。それぞれの画分の相対タンパク質濃度を表６に概説した。
【０１０９】
【表７】
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【０１１０】
ゲル濾過カラムから得られた、全てのクリスタリンタンパク質を含有する６つの画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって分析した。
【０１１１】
クリスタリンβＢ２は、全てのβ画分（βＨ、βＬ１、およびβＬ２）中に存在した。βＨ画分からのβＢ２クリスタリンの回収を、ｐＨシフトを通じて試みた。ｐＨを６．８から５．３に低下させてβＢ２クリスタリン表面のヒスチジン残基をイオン化させた。これはβＨクリスタリン凝集の解離、および４６〜４８ｋＤａのβＢ２クリスタリン二量体の形成をもたらすことが示唆されており、それらはゲル濾過によって分離することができる。溶出プロフィールを図７に示す。溶出は１ｍｌ／分で実施され、タンパク質は２１４ｎｍ（三角形）および２８０ｎｍであった。
【０１１２】
画分４２中の最大吸光度でβＢ２二量体を溶出した。このタンパク質を含有する画分をプールして、透析し凍結乾燥した。βＨ画分はαクリスタリンを含有するようであり、それはｐＨ５．３でのゲル濾過を使用して、二量体βＢ２クリスタリンから容易に分離された。酢酸を使用してｐＨを調節したところ、沈殿物は形成されなかった。この画分をプールしてβＢ２クリスタリンを含有することを確認し、下で製剤「Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １」と称する。
【０１１３】
氷酢酸を使用して抽出物のｐＨを８．６から５．０に調節し、粗製ウシクリスタリン抽出物を同様に分画したところ、白色沈殿物が形成し遠心分離によって除去された。ペレットを０．１Ｍホウ酸塩緩衝液にｐＨ９．０で溶解した。ウエスタンブロット分析からは、αクリスタリンが、ｐＨ５．０で形成されたタンパク質沈殿物中に存在することが示唆された。βＢ２クリスタリンの存在は検出できなかった。
【０１１４】
３．３  ウシβＢ２クリスタリン精製のための限外濾過
上の所見に基づいて、βＢ２クリスタリン精製のための限外濾過分離技術を考案した。スケールアップに対応できる方法でウシクリスタリンを分画するために、一連の限外濾過膜を評価した。βＢ２クリスタリンの精製は、βＢ２クリスタリンとその他のクリスタリンタンパク質との分子間相互作用を利用する方法を使用して実施した。
【０１１５】
全ての水溶性クリスタリンを含有するウシクリスタリン抽出物は、水晶体組織から蒸留水で抽出して最初に調製され、抽出物はｐＨ約６．８を有し、最初は４℃で７０ｐｓｉの圧力セル内で３００ｋＤａの公称分画分子量膜（ＮＭＷＣＯ）を使用した、蒸留水中での分画がそれに続いた。膜上に形成したゲルは、主にαクリスタリンおよびβクリスタリンから構成された。ゲルを収集し、一部を水に溶解してゲル濾過クロマトグラフィーによって分析し、残りのゲル材料をペトリ皿内に４℃で保存した。γクリスタリンはこのゲルには存在しないようであった。
【０１１６】
上で概説したのと同一条件下で１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して、３００ｋＤａの濾液のさらなる分画を実施した。濃縮水は有意水準のβＢ２クリスタリン（２３１６６Ｄａ）およびβＡ３クリスタリン（２５１３１Ｄａ）を含有するようであり、それをＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００ＨＲカラム上でのゲル濾過によってさらに精製した。ゲル濾過は、蒸留水で中性ｐＨに平衡化されたカラムに２５ｍＬの抽出物を装入して達成された。流速は１ｍＬ／分で、１８ｍＬの画分を収集し、それをＢＩＯＲＡＤ  ＱｕａｄＴｅｃ検出器を使用して２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでタンパク質含量についてモニターした。βクリスタリン画分をダイアフィルター処理し、次に凍結乾燥して製剤「Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２」と称される第２のサンプルを生成し、創傷治癒分析について試験した。存在するタンパク質の大部分はβＢ２クリスタリンであった。βＢ２クリスタリンとβＡ３クリスタリンの間に少量の二量体があるβＢ２クリスタリンの二量体は、画分４２におけるピークで溶出することが観察され、それはこのカラムを使用して溶出されたウシクリスタリン抽出物のβＬ２画分に相当した。
【０１１７】
１００ｋＤａ濾液のさらなる分画は、５０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して達成された。５０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜の使用によって、二量体および三量体βクリスタリンから単量体γクリスタリンの分離ができたことは明らかであった。３０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用してγクリスタリンのさらなる濃縮を達成し、５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して低分子量ペプチドの収集もまた実施した。ウシクリスタリン抽出物の分画については下のスキーム１で概説した。高分子量αクリスタリンは、基本的に、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して、本質的にβクリスタリンから分離された。βクリスタリンが１００ｋＤａおよび５０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して分画されたのに対し、γクリスタリンはそれぞれ３０ｋＤａおよび５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して分離され濃縮された。全ての分画ステップは、上述のように４℃で７０ｐｓｉの圧力セルを使用して実施された。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を実施して、これらの様々な画分中に存在するタンパク質プロフィールを観察した。
【０１１８】
３００ｋＤａの濃縮水は、主にαＡクリスタリンおよびＢクリスタリン、およびβクリスタリンを含有した。この膜を使用して濃縮された高分子量非クリスタリンタンパク質もまた観察されたが、そのアイデンティティは未知である。３００ｋＤａ濾液、１００ｋＤａ濃縮水、および５０ｋＤａ濃縮水は、主にβクリスタリンを含有した。５０ｋＤａ濾液、３０ｋＤａ濃縮水、３０ｋＤａ濾液、および５ｋＤａ濃縮水は、様々なサイズのγクリスタリンタンパク質を含有した。
【０１１９】
画分中に存在したγクリスタリンは、５０ｋＤａよりも低い分子量を有する。αクリスタリンタンパク質は、主に３００ｋＤａ濃縮水中に存在した。βクリスタリンは、３００ｋＤａと５０ｋＤａの間の画分に位置した。
【化１】
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【０１２０】
３．４  ウシαＢクリスタリンの精製
αＢクリスタリンを単離するために、変性条件下でＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを使用して、粗製ウシクリスタリン抽出物を分画した。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを含有するカラム（３×３３ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ−２６カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗイオン交換樹脂を含有する）を５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６Ｍ尿素、０．０１％ＤＴＴで平衡化した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６Ｍ尿素、０．０１％ＤＴＴを使用して勾配溶出を実施し、３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６Ｍ尿素、０．０１％ＤＴＴ、１Ｍ  ＮａＣｌを使用して溶出を完了した。ＢＩＯＲＡＤ  ＱｕａｄＴｅｃ検出器を使用して、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでタンパク質吸光度をモニターした。６ｍＬの画分を収集した。５０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬウシクリスタリンを流速１ｍＬ／分で装入した。
【０１２１】
カラムからの対称的ピーク下の画分をプールして、１２，０００Ｄａの公称分画分子量膜を使用して、蒸留水を少なくとも３回取り替えて、４℃で２日間にわたり透析し、尿素を除去した。サンプルを凍結乾燥し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を使用して分析した（図８）。ウエスタンブロットおよびＭＳ分析によって、画分３７〜４７はウシαＢクリスタリンを含有することが示された。精製されたαＢクリスタリンを下で「Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ３」と称する。
【０１２２】
３．５  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ製剤の分析
ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を実施して、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２、およびＷｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ３製剤中のβＢ２クリスタリンおよびαＢクリスタリンの濃縮度を評価した。αＡクリスタリン、αＢクリスタリン、およびβＢ２クリスタリンの存在を知るためのアッセイでは、これらの各抗原に対してそれぞれ特異的な一次抗体を利用した。３つの製剤は、αＡクリスタリンを含まないようであった。Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １およびＷｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２がβＢ２クリスタリンを含有したのに対し、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ３はαＢクリスタリンを含有した。
【０１２３】
Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ製剤（１〜３）の質量分光光度計（ＭＳ）分析もまた行った。上述したように、クリスタリンタンパク質は翻訳後修飾できる。翻訳後修飾の詳細な一覧表は、Ｈｏｅｈｅｎｗａｒｔｅｒら、２００６年によるレビュー論文にある。
【０１２４】
βＢ２クリスタリン（２３１６８  Ｄａ）はＷｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １中に観察された。ＭＳ結果から、約２２６６４Ｄａの質量を有する別のタンパク質が存在するようである。Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２製剤のＭＳ分析では、２つのタンパク質、すなわちβＢ２クリスタリン（２３１６７  Ｄａ）およびβＡ３クリスタリン（２５０６１  Ｄａ）が検出された。ウシβＢ２クリスタリンについて同定されたいくつかの翻訳後の修飾のために、このタンパク質の質量範囲はかなり様々になり得る。２３０９５のピークがアセチルアラニンの喪失の結果かもしれないのに対して、２３３３５のピークは図９に示されるような完全修飾形態かもしれない（配列番号９）。
【０１２５】
Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ３製剤のＭＳ分析からの最も近い一致はαＢクリスタリンであり、これはまたウエスタンブロット分析によっても検出された。
【０１２６】
３．６  創傷治癒アッセイ
３０匹のオスＬｅｗｉｓラットを以下の表７に概略を説明するように、６匹ずつの５群に分けた。ラットは年齢および体重を一致させた。研究全体を通じて、ラットに齧歯類飼料と水を自由摂取させた。
【０１２７】
【表８】
0005685773.tif 000010
【０１２８】
試験開始前に動物を２日間秤量し、体重を最小から最大にグループ分けした。次に群平均が可能な限り同様になるように、５×５ラテン方格を使用して体重に基づいて動物を無作為に群に割り当てた。
【０１２９】
ラットは手術後に１匹ずつ収容した。摂食量は測定しなかった。１日量約４ｍｌのゼリーを１日目から投与して、水分補給を助けた。
【０１３０】
創傷形成のおよそ３０分前に、各動物の頸基部にＴｅｍｇｅｓｉｃを皮下注射した（０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重）。酸素中３％のハロタンを使用して各動物を麻酔した。ひとたびペダル反射が消失したら、電気バリカンを使用して頭蓋基部から後肢領域にかけて動物を剪毛した。７０％エタノール中の０．５％クロルヘキシジンを使用して、各ラットの皮膚を消毒した。各動物で頭蓋基部から股関節上部までの距離を測定し、脊髄軸に沿って頭蓋基部の６ｃｍ下に黒色フェルトペンで創傷位置を標識した。
【０１３１】
無菌技術を使用して、この位置に無菌の１２ｍｍ生検パンチを使用して全厚の切り込みを入れた。あらゆる出血は綿棒を使用して除去した。パンチが乾燥しており、残骸（例えば皮膚、毛）が創傷に入らないように注意を払った。各創傷は皮膚表面に直角に形成し、生検パンチが皮膚のみを切断し、筋肉組織のより深い層に突き抜けないことを確実にするよう注意を払った。Ｆ２．８マクロレンズ付きキャノンデジタルＥＯＳ  ２０Ｄカメラを使用して各創傷を撮影した後、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｍａｎ  ＣＰ  １００ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、サンプルのアリコートをＡ、Ｂ、Ｄ、およびＥ群のラットの創傷に塗布した。生検パンチの内側を無菌食塩水に浸した綿棒で拭って、あらゆる組織液および／または残骸を除去した。次にパンチを次の動物で使用する前に７０％エタノールに浸した。
【０１３２】
各動物の全身状態を創傷形成後５日間にわたり注意深くモニターした。必要ならば動物に追加的なＴｅｍｇｅｓｉｃを術後に投与した。２から７日目は動物に紙タオルを与えた。創傷が乾燥した場合にのみ、紙タオルからかんな屑に変更した。
【０１３３】
１、３、５、７、および９日目に、全ての動物に対照または試験薬剤を合計５回局所塗布した。１日目以降の投与および撮影のためには、動物を麻酔せずに拘束した。
【０１３４】
研究終了時創傷が治癒したら、ＣＯ２吸入と頸椎脱臼によって動物を安楽死させた。隣接する皮膚、筋膜、および筋肉組織を含めた創傷部位全体を切除して、組織学的および免疫組織化学的検査のためにホルマリン中で固定した。ホルマリンに入れて２４時間以内に、創傷をパラフィン蝋に包埋して３μｍ厚さの切片を切り出し、ポリ−Ｌ−リジン被覆スライドガラスに付着させて脱蝋し、組織学的検査のためにヘマトキシリン、エオジン、およびヴァン・ギーソン染色液で染色した。その他の切片は、免疫組織化学的検査のために使用した。
【０１３５】
体重を１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３日目に測定し、各動物について元の体重（１日目）からの偏差を計算した。同日に、Ｆ２．８マクロレンズ付きキャノンデジタルＥｏｓ  ２０Ｄを使用して写真を撮影した。写真をダウンロードし、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．６３３ｕソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ）を使用して、創傷面積を測定した。レーザースペックル画像もまた、空間写真と同時に撮影した。動物を１日おきに、創傷閉鎖速度の写真記録を行った際に、秤量した。
【０１３６】
視覚的観察から、各創傷の発赤および腫脹を個々に評点した。これらは次のような０〜３の尺度で評点した。
０＝発赤または腫脹なし
１＝軽微な発赤／腫脹
２＝顕著な発赤／腫脹
３＝大規模な発赤／腫脹
【０１３７】
記述統計を評価した。予備ｔ検定は、異常値が結果に顕著に影響を及ぼすかどうかを調べた。収集した全てのデータ点について、主要分析を実施した。予備分析は、ｔ検定を使用して対照創傷のみに対して行った。一変量ＡＮＯＶＡを使用して、処置と対照との差異および処置からのサンプルを評価した。別のＡＮＯＶＡは、処置サンプルのみを使用して用量反応があったかどうかを評価した。正規性仮説はスチューデント化残渣上でｑ−ｑプロットを使用して試験され、分散の不均一性はＬｅｖｅｎｅの検定を使用して試験された。Ｍａｃ  ＯＳＸのためのＳＰＳＳ  １１を仮説検定および統計学的分析のために使用した。
【０１３８】
創傷の結果として、ラットには即時の体重低下があった（図１０）。これは３日目に最も明白であった。その後、全てのラットは着実な増大を示した。創傷がＰＢＳキャリアで処置されたラットは最大低下を示した。それらは３日目に開始体重の７．０％を失った。しかしそれらは着実に回復して、その他の４群のいずれよりも早い速度で、体重が増加した。１１日目までにはこれらのラットの平均重量は開始体重に戻り、研究の終わりまでにはそれらは試験開始時よりもおよそ５．０％重かった。処置された４群は全て、最初にほぼ同一の体重減少を示した（５．４％〜５．７％）。次にそれらは元の体重に戻った。より低用量の試験抽出物を塗布されたものは（Ｂ群、毎回０．０１ｍｇの塗布；Ｃ群、毎回０．１ｍｇの塗布）、ほぼ同一の増加速度を示した。Ｂ群は１４日目までにそれらの創傷前体重に戻り、Ｃ群は１５日目までに復帰した。したがってそれらの復帰速度は未処置対照よりも遅かった。最高用量を塗布されたラット（Ｄ群、毎回１．０ｍｇの塗布）は、わずかにより速い速度で体重が増加したようであった。それらは１２日目までに開始体重に戻った。
【０１３９】
創傷をアロエベラで処置することは、αＢクリスタリン抽出物と同様の効果を有するようであった。これらのラットの平均体重は、１２日目までには開始体重に戻り、研究の終わりまでには開始時よりも平均して４．３％重かった。
【０１４０】
処置結果としての創傷の炎症性反応を評点し、結果を図１１に要約する。
【０１４１】
各研究日に、各創傷に炎症性スコアを割り当てた。創傷形成に続き、全群によって即時の顕著な炎症反応があったことが注目される。増加が最小だったのはキャリアのみを与えられた対照群であった。βＢ２クリスタリン抽出物を与えられた群は、いくらかより大きい初期反応を示した。αＢクリスタリンを与えられた群、そしてまたアロエベラを塗布された群による反応もまた、反応増大を示した。しかし３日目以降、全ての群が残る研究期間にわたり炎症の着実な低下を示した。例外は炎症スコアが５日目に最高値に達した後、低下したキャリア対照群であった。結果はクリスタリン抽出物およびアロエベラが、より迅速に抗炎症反応を生じたことを示唆する。アロエベラで処置された創傷は、最も迅速な炎症低下を示すようであった。対照的に、用量レベルにかかわらず、炎症性スコア低下に対するクリスタリン抽出物の効果はわずかであった。異なる処置群の創傷面積を表８および図１２に示す。
【０１４２】
【表９】
0005685773.tif 000011
【０１４３】
Ａ群（対照−ＰＢＳ処置）中の創傷治癒速度は、予期されたとおりであった。７〜１１日目が最速相であった治癒パターンもまた予期されたとおりであった。
【０１４４】
最低用量のβＢ２クリスタリン（投与あたり０．０１ｍｇ）で処置された創傷（Ｂ群）は、最初の７日間にわたり参照群よりもわずかにより早い治癒速度を示した。７日目以降は、群の治癒速度は対照群と非常に良く似ていた。妥当なことに、この群の試験抽出物の用量レベルは非常に低かった。
【０１４５】
Ｃ群中のラット（投与あたり０．１ｍｇのβＢ２クリスタリンを与えた）の平均治癒速度は、最初の９日間にわたり対照群（Ａ群）よりも高かった。その後、２群の速度はほぼ同一であった。この群では最初の１１日間の閉鎖速度が、より低い用量（Ｂ群）を与えられた群よりもわずかにより早いことは注目に値し、可能な用量反応が示唆された。
【０１４６】
しかしＤ群（αＢクリスタリン）が塗布された場合は、治癒速度はかなり低下し、この群の治癒速度はキャリアのみを与えられた群よりも低かった。すなわち１ｋｇあたり１ｍｇの用量は、治癒速度を阻害した。３日目には創傷は、緩衝食塩水のみを与えられたラットの創傷よりも８．８％大きかった。それらは７日目には７．７％大きく、１１日目には２８．７％大きかった。創傷がほぼ治癒した最後の数日間になってはじめて、Ｄ群は対照群と同様の治癒速度を有した。この結果は、高濃度のαＢクリスタリンが治癒にとって拮抗性であるかもしれないことを示唆する。
【０１４７】
アロエベラゲル（Ｅ群）で処置された創傷は、食塩水（Ａ群）で処置されたものとほぼ同一の治癒速度を示した。これは実験期間全体に当てはまった。したがって陽性対照の効果は明白でなかった。このアロエベラゲル効果の欠如について、明らかな理由はない。
【０１４８】
２３日目の創傷治癒完了時に、創傷あたり２０ｍｇで試験された陽性対照アロエベラゲルを含めて、試験されたサンプルのいずれでも創傷閉鎖の明らかな促進はなかった。この理由は、治療的範囲から外れた投薬量に関係するかもしれない。しかし研究５日目には統計学的に有意な効果があり、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １（Ｂ群：βＢ２クリスタリン低用量、ｐ＝０．０４５）、およびＷｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２（Ｃ群：βＢ２クリスタリン高用量、ｐ＝０．００８）では創傷面積が有意により小さかった。これは創傷治癒の促進が、治癒カスケードの初期段階で観察されたことを示唆する。５日目にはまた、βＢ２クリスタリン（Ｃ群）とαＢクリスタリン（Ｄ群）の間に統計学的有意差があった（ｐ＝０．０１２）。５日目には濃度効果が明白なようであり、より低濃度のβＢ２クリスタリン（Ｂ群）の平均創傷面積が１２２．７±１４．７ｍｍであったのに対し、より高濃度（Ｃ群）の平均創傷面積は１１２．７±１０ｍｍであった。したがって未変性のβＢ２クリスタリン投与から、いくらかの創傷治癒活性が明らかであった。
【０１４９】
βＢ２クリスタリンのホスホリル化状態の分析を、３１ＰＮＭＲを使用して実施した。ピークは検出されず、タンパク質がリン酸化されていないことが示唆された。これは蛍光性ホスホタンパク質染色を使用して確認され（データ示さず）、βＢ２クリスタリンが、５日目前後の創傷治癒カスケード初期段階で創傷治癒において生物活性を有し、それは血管新生を促進するその能力に起因する可能性が高いことがさらに示唆された。
【０１５０】
βＢ２クリスタリンはより高いタンパク質濃度では、二量体およびより高次の集合体を形成するので、このアッセイでは低濃度のＷｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １を使用した。Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２はより高濃度のβＢ２クリスタリンを含有したので、この抽出物中に存在する別のタンパク質βＡ３クリスタリンと共に二量体を形成するかもしれない。βＢ２クリスタリンの活性は予期されたよりも低く、５日目にその他の処置と比較して創傷面積のわずかな減少があったのみである。βＢ２含有製剤で最初に観察された劇的な創傷治癒効果の欠如が観察されたのは、タンパク質のＣ末端およびＮ末端を切断することで単量体型タンパク質を発生させる、エラスターゼＩによるβＢ２クリスタリン処置の欠如に起因するようであった。
【０１５１】
実施例４：調製されたウシクリスタリン画分の分析
クリスタリンタンパク質の機能特性を調査するために、研究を行った。実施例３で述べたようにして、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００ＨＲ上でゲル濾過クロマトグラフィーを使用してウシクリスタリンタンパク質の分画を実施した。この技術を使用して、αクリスタリンならびにβＨ、βＬ、およびβＬ２、γＳおよびγＢＣ／ＤＥとして同定された画分を分離した。次に生物学的活性を評価するために、画分を以下の研究で使用した。
【０１５２】
４．１  クリスタリンのプロテアーゼ阻害活性
エラスターゼＩ活性を阻害する能力について、ウシクリスタリン画分を試験した。簡単に述べると、粗製ウシクリスタリン抽出物およびαＡ／Ｂクリスタリン画分で、わずかなエラスターゼ阻害が観察された。βクリスタリン画分（全てβＢ２クリスタリンを含有するβＨ、Ｌ１およびＬ２）中には、活性は検出されなかった。γＳクリスタリンは、その他の画分と比べてかなりのエラスターゼ阻害活性を有することが示された。これらの結果も先と同様にαおよびβクリスタリンの間の違いを実証し、クリスタリンタンパク質のプロテアーゼ阻害活性が、βＢ２クリスタリンとは異なってシャペロン活性もまた有することが示されている、γＳクリスタリンおよびαＡおよびＢクリスタリンに、限定されることを示唆する。
【０１５３】
４．２  シャペロン活性
プロテアーゼエラスターゼＩ、トリプシン、およびキモトリプシンを熱変性から保護する能力について、ウシクリスタリン画分を試験した。簡単に述べると、クリスタリン画分の存在または不在下において、沸騰水浴内で３０秒間プロテアーゼを加熱した。結果を図１３に示す。
【０１５４】
対照は加熱前のプロテアーゼ活性を実証し、熱変性対照（ＨＤ）は水浴内での加熱後に残ったプロテアーゼ活性を実証した。エラスターゼＩをＷｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ３と混合した際にはシャペロン活性が観察されたが、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １またはＷｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２製剤との混合では観察されなかった。サンプルをトリプシンまたはキモトリプシンで処理した場合は、事実上シャペロン活性は観察されなかった。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗによって単離されたαＢクリスタリンおよびαＡクリスタリンは、どちらもエラスターゼＩを熱不活性化から保護できた。αＢクリスタリンは、エラスターゼＩを熱変性から保護する上で最も活性が高いようであった。βクリスタリン含有画分のいずれにおいても活性は観察されず、βクリスタリンが分子シャペロンとして機能せず、熱媒介変性からエラスターゼＩを保護できないことが実証された。βＢ３クリスタリンとは対照的に、βＢ２クリスタリンは熱処理に対して不安定であることが分かった。
【０１５５】
４．３  血管新生の促進
４つの別々の試験を実施して、クリスタリン製剤の血管新生効果を判定した。各サンプルを三連でアッセイした。陽性対照（ＶＥＧＦ）およびＰＢＳを含有するビヒクル対照もまた、三連でアッセイした。（平均からの）標準偏差百分率を評価して、ばらつきが２０％を超えることが分かった場合は異常値を除去した。予備統計的有意性を独立スチューデントｔ検定によってα＜０．０５で評価した。平均＋／−標準誤差のグラフ表示を判定した。
【０１５６】
第１の研究は、実施例３．２で述べられているようなゲル濾過分析によって調製されたウシ画分の血管新生可能性を調査した。この実施例で述べられているように、α画分はαＡおよびαＢクリスタリンを含有し、βＨ画分は全てのβクリスタリンを含有し、βＬ１画分はβクリスタリンの細分画および高含量のβＢ２クリスタリンおよびβＢ３クリスタリンを含有し、βＬ２画分はβＢ２クリスタリンおよびβＡ３クリスタリンのみを含有した。
【０１５７】
第２の研究は、精製されたクリスタリンタンパク質の血管新生可能性を調査した。簡単に述べると、βＢ３クリスタリンが加熱によって調製されて（９７〜９９℃で３分間、上清を遠心分離によって収集）、本質的に均質であった。αＡクリスタリンおよびαＢクリスタリンのサンプルは上述のようにイオン交換クロマトグラフィーによって調製され、これもまた本質的に均質であった。Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  １〜３製剤もまた、本研究で試験した。
【０１５８】
第３の研究は、ヒツジクリスタリンタンパク質の血管新生可能性をそれらのウシ同等物と比較して調査した。実施例５で下述するようにＣ４カラムを使用してＲＰ  ＨＰＬＣによって、ウシおよびヒツジクリスタリンタンパク質の双方を精製して本質的に均質にした。均質性はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。未変性（すなわち未消化）βＢ２クリスタリンとエラスターゼＩ消化βＢ２クリスタリンとで血管新生可能性を比較して、βＢ２クリスタリンに対するエラスターゼＩ処置の効果もまた調査した。エラスターゼＩ処置によってクリスタリンタンパク質のＮ末端およびＣ末端延長が放出され、単量体である球形タンパク質が残った。
【０１５９】
最後の研究では、ヒツジβＢ２クリスタリンを単独でまたはインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）と組み合わせて試験し、ヒツジαＢクリスタリンを単独でまたはトリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）と組み合わせて試験した。
【０１６０】
簡単に述べると、各研究において１匹のＬｅｗｉｓラットを安楽死させ、その大動脈を１０ｍＬのＭＣＢＤ−１３１培地を含有する１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移して氷上で保存した。１０ｍＬの氷冷ＭＣＤＢ−１３１を含有する９２×１７ｍｍペトリ皿に大動脈を移した後に、オリンパスＳＺ−６０解剖顕微鏡の下で外側脂肪組織を除去した。これは光ファイバー光源を用いて行った。次に大動脈をサイズおよそ２ｍｍの連続環に切断した。微小ハサミとピンセットを用いて、個々の環の外側から結合組織を除去した。清浄な環を別個のペトリ皿内で無菌のＭＣＤＢ−１３１培地内に保存した。環を９７％空気／３％ＣＯ２雰囲気内３７℃で一晩予備インキュベートした。
【０１６１】
ゲルサンドイッチを調製するために、７５ｍｇのフィブリノーゲンを２５ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地に添加して、ロッカーローラー上で５分間穏やかに振盪した。３ｍｌのＭＣＤＢ−１３１／フィブリノーゲン溶液を１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブに入れて、１０μＬのトロンビンをそれに続け、直ちに混合した。このフィブリノーゲン−トロンビン溶液の０．４ｍＬ容積を２４ウェルプレート上の各ウェルに、一度に６ウェルずつ添加した。次に大動脈環を固化中のゲルにのせ、穏やかにゲル内に押し込んで４５分間置いた。次に各環が０．４ｍＬのゲルで覆われるように、これらのステップを繰り返した。ゲルを放置して室温で固化させた。５ｍＬのＭＣＤＢ−１３１中で試験サンプルを１００μｇ／ｍＬに希釈し、１．５ｍＬの各サンプルを３つの適切なウェルのそれぞれに入れた。次にプレートを恒温器（３７℃、９７％空気／３％ＣＯ２）に入れた。
【０１６２】
倒立顕微鏡を使用して、ウェル内の汚染徴候（真菌成長または培地の黄変）について培養プレートを毎日検査した。それらの外辺部からの微小血管の成長についてもまた観察した。ＯＬＹＭＰＵＳ  ＣＫ−１２顕微鏡に装着したＰｉｘｅｒａ  ＰＶＣ−１００Ｃデジタルカメラを使用して、各ウェルのデジタル写真を接種後７日後に撮影し、マッキントッシュコンピュータに保存した。低倍率視野（すなわち２０×、６４０×４８０ピクセルＰＩＣＴ）で十分であった。ＰＩＣＴは、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ内での視覚化および測定のためにグレースケールに変換できる。グレースケール画像はＪ  １．３２  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅプログラムで開くことができる。
【０１６３】
微小血管成長速度判定を判定する際は、ＮＩＨ  ｉｍａｇｅソフトウェア中のシェイプツールを使用して環の周囲を描画し、各環周囲の微小血管成長が占める面積および各大動脈環の面積を測定した。この測定を繰り返し、２回目は毛細管周囲を描画した。典型的に、内的および外的毛細血管成長、および内面および外面大動脈環面積の４つの測定を行った。次に各ウェルについて微小血管成長面積と大動脈環面積との比率を計算し、三連の各サンプルについて平均値および標準偏差（ＳＤ）を判定した。
【０１６４】
個々の各ウェルのデジタル撮影に続いて、各ウェルを摘出して１０％ホルマリン中で固定した。ホルマリン中で２４時間以内に、各環を除去してパラフィンに包埋した。３μｍ厚さの切片を切り出してポリ−Ｌ−リジン被覆スライドガラスに付着させ、脱蝋してプロテアーゼＸＩＶ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水中の０．５ｍｇ／ｍＬ）で３７℃で１０分予備消化した。いくつかの抗体は加工によって損なわれた免疫反応性を「埋め合わせる」ために、ホルマリン固定パラフィン包埋組織および細胞学的製剤のＨｅａｔ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ（ＨＩＥＲ）を必要とした。クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用した場合に、改善された免疫染色結果が得られた。ＨＩＥＲ中には組織スライドをクエン酸緩衝液に浸し、ホットプレートまたはその他の適切な熱源により沸騰させた（＞９５℃）。
【０１６５】
ＨＩＥＲ処置は次のステップからなった。固定され包埋された組織切片をＨｉｓｔｏＧｒｉｐ（商標）（Ｚｙｍｅｄ（登録商標）カタログ番号００−８０５０）シランまたはポリ−Ｌ−リジンを使用して、スライドガラスに付着させた。固定化切片をキシレン中で脱パラフィンして段階的アルコール中で再水和し、続けて、脱イオン水中、次にＰＢＳ中で洗浄した。内在性ペルオキシダーゼを０．５％過酸化水素で１０分間ブロックし、続けて、ＰＢＳ中でのさらに洗浄した。スライドをスライドラックに入れて、５００ｍＬのクエン酸緩衝液の使用液を含有するＩＬガラスビーカー（Ｐｙｒｅｘ）中に沈めた。ビーカーをホットプレートにのせて沸騰するまで溶液を加熱し、１５分間沸騰させた。加熱後、スライドを収容するビーカーをホットプレートから除去して２５分間放冷した。次にスライドをＰＢＳで洗浄し、必要ならばアビジン／ビオチンブロックを実施した。免疫染色に先だって、一般タンパク質をブロックするステップもまた実施した。
【０１６６】
次にＩｎｎｏｇｅｎｅｘ  ＩＨＣキットを使用して製造業者（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｉｎｃ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）の説明書に従って、上のように調製されたスライドを一次抗体と共にインキュベートし、二次抗体と共にインキュベートし、洗浄して、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと共にインキュベートし、洗浄して、ＤＡＢ色素源と共にインキュベートし、洗浄して、マイアーのヘマトキシリンで対比染色し、洗浄してマウントした。
【０１６７】
スライドは、ビメンチンについては１：２０希釈およびＣＤ−３１については１１：１０希釈でそれぞれ使用される一次抗体によって特異的に染色された。染色によって、内皮細胞と全ての遊走細胞との比率が計算できるようになった。
【０１６８】
４．４  結果と考察
ウシクリスタリン凝集体の血管新生効果を調査する第１の研究では、いずれのサンプルも血管新生を促進しなかった。妥当なことに、ＶＥＧＦは３０μｇ／ｍｌではいかなる血管新生促進も生じることなく、実際にはそれは統計学的に有意ではなかったが１５．０８％阻害性であった。これはいくぶん意外であり、そのため第２の研究ではより高濃度のＶＥＧＦを使用した。しかし対照ウェル内の微小血管成長レベル（９．６４０±０．２６３ＳＥＭ）は予期されたようであったので、実験条件は満足できるものであったと考えられる。
【０１６９】
試験されたクリスタリン凝集体の６個のサンプルは、例えばホスホリル化およびアセチル化およびプロテアーゼ分解生成物をはじめとする翻訳後修飾などのクリスタリンタンパク質の全ての異なる形態を含有した。αクリスタリンが高分子量クラスター（６００〜８００ｋＤａ）であったのに対し、βクリスタリンはサイズが２００〜４０ｋＤａにわたる四量体、三量体、および二量体であることが分かった。サイズは、分画で使用されたＳｅｐｈａｒｃｙｌ  ３００  ＨＲカラムの較正、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって、および文献で報告されている既知のサイズ範囲から求められた。γクリスタリンは、サイズ範囲が２０〜３０ｋＤａの単量体であった。
【０１７０】
ウシクリスタリンタンパク質の効果に着目する第２の研究、および結果を表９に示す。
【０１７１】
【表１０】
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【０１７２】
上のように、βＢ２クリスタリンは２００μｇ／ｍＬの濃度で微小血管成長に２１．８３％の増大を促した。αＡクリスタリンの２００μｇ／ｍＬ溶液もまた、８．２６％促進性であることが分かった。その他のいずれの試験サンプルも微小血管成長に対して、血管新生効果を示さなかった。５０μｇ／ｍＬのＶＥＧＦはわずかな促進を生じたが、これは統計学的に有意でなかった。対照ウェル内の成長（９．８９４±１．０７６ＳＥＭ）は、先と同様に実験条件が満足できるものであったことを示唆した。
【０１７３】
第３の研究はヒツジクリスタリンタンパク質の血管新生活性を対応するウシクリスタリンタンパク質と比較し、結果は表１０に示される。
【０１７４】
【表１１】
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【０１７５】
ウシおよびヒツジαＡクリスタリンのどちらも血管原性であることが示された。ヒツジαＡクリスタリンは、ウシαＡクリスタリンよりも高活性であった。しかし後者はヒツジαＡクリスタリンの半分の濃度で試験された。したがって活性の差は、投薬量効果に起因するかもしれない。興味深いことに、未変性のウシおよびヒツジβＢ２クリスタリンが血管原性でなかったのに対し、エラスターゼＩ処理ヒツジβＢ２クリスタリンは血管新生を促進した。この結果は、単量体形態のトランケート型（すなわちＮ末端およびＣ末端部分を欠く）のタンパク質が、血管新生促進に関してより高活性であることを示唆する。ヒツジαＢクリスタリンはこの研究では血管原性でなかった。
【０１７６】
第４の研究は、トリプトファン加水分解酵素ＩＤＯおよびＴＤＯと組み合わせた、クリスタリンタンパク質の効果に着目し、結果は表１１に示される。
【０１７７】
【表１２】
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【０１７８】
ＩＤＯおよびＴＤＯ双方はどちらも促進性であり、ＩＤＯはＴＤＯよりも高活性であった。これらの研究結果を図１４および図１５に図示する。
【０１７９】
要約すれば、精製されたクリスタリンを使用するとより高い活性が明らかであり、クリスタリンが結合して高分子量集合体になると、その生物学的効果がいくぶん低下するかもしれないことが示唆される。１０８％活性のウシαＡクリスタリンおよび１２１％活性のＷｏｕｎｄ  Ｈｅａｌ  ２、ウシβＢ２クリスタリンの２つのサンプルは、血管新生を促進する能力を実証した。ＶＥＧＦは５０ｎｇ／ｍＬで１０７％活性を有した。これは統計学的に有意でなく、このモデル系では血管新生の促進においてβＢ２クリスタリンタンパク質がＶＥＧＦよりも高活性であることが示唆された。
【０１８０】
これらの研究は、ラット大動脈環血管新生アッセイにおいてクリスタリン凝集体が低い生物学的活性を有することを実証した。しかし集合体をさらに精製すると、βＢ２クリスタリンおよびヒツジβＢ２クリスタリンのエラスターゼＩ切断産物、およびウシおよびヒツジαＡクリスタリンの双方が、微小血管成長に好ましい効果を有することが実証された。
【０１８１】
実施例５：ヒツジβＢ２クリスタリンの調製
所望のタンパク質を精製する単純で効率的な工程を使用して、ヒツジβＢ２クリスタリンの精製を実施した。改善された方法は、ゲル濾過クロマトグラフィーの実施を不要にする。
【０１８２】
ヒツジ眼球を採取して上の実施例３．１で述べられているようにして水晶体を除去した。蒸留水を使用して水晶体を抽出した。４℃で３０分間混合した後に、水晶体の外層が溶解した。水晶体抽出物を遠心分離して、氷酢酸でｐＨを４．５に調節した。ｐＨ調節中に沈殿は形成されなかった。分取用Ｃ４  ＨＰＬＣカラムへの装入に先だって、０．４５ミクロンフィルターを通して抽出物を濾過した。ヒツジβＢ２クリスタリンを含有する単一ピークが回収された。プロトコルの修正を使用して、ヒツジβＢ２クリスタリンを単離するのに要する溶出時間が成功裏に短縮された。２回の分取操作から１００ｍｇの精製ヒツジβＢ２が単離された。ヒツジ水晶体からのβＢ２クリスタリンの収率は、分取用ＨＰＬＣカラムに装入されたタンパク質の８％であった。これは水晶体の湿潤重量の２．７％に一致する。ヒツジ水晶体は３４％のタンパク質を含有した。
【０１８３】
５．１  ヒツジ眼水晶体クリスタリンの抽出
ヒツジ眼球を地元の食肉処理場から入手し、即座に処理した（１時間以内）。メスを使用して、眼球の様々な位置に１〜２ｃｍの切り込みを入れた。回収した６個の水晶体を２００ｍＬの蒸留水で洗浄し、残留する水晶体シースを除去した。水を２００ｍＬの新鮮な蒸留水に入れ換えて、２０容積中４℃で３０分間撹拌した。この時間後、固い水晶体核は原形を保ち処理からはずされた。水晶体外層は溶解して、濁った白色溶液が得られ、これを１０℃、３００００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、または１０℃において５０００ｒｐｍで３０分間により清澄化した。ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して水溶性水晶体クリスタリンを含有する上清をさらに分画し、ヒツジ眼球からのβＢ２クリスタリンの可能な収率を判定した。
【０１８４】
５．２  分取ＲＰ−ＨＰＬＣ
分取ＲＰ−ＨＰＬＣプロトコルは分析法から適応させた。簡単に述べると、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４  ３００Ａ  １０ｕｍ  ２５０×２１．２、カタログ番号００Ｇ−４１６８−Ｐ０、およびＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄカートリッジＣ４−３００Ａ  １５×２１．２  Ｊｕｐｉｔｅｒ（シリアル番号３８８３３−１）を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣによってヒツジβＢ２クリスタリンを単離した。カラムはｄＨ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡおよび０．１％ＴＦＡ含有１０％アセトニトリルによって流速２５ｍＬ／分で、平衡化した。緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ含有１００％アセトニトリル）の勾配は次のように注入した。０分で１０％Ｂ、１０分で３０％Ｂ、７０分４０％Ｂ、９０分６０％Ｂ、９５分９８％Ｂ、および１００分１０％。吸光度は２８０、２１４、２３５、３３０、および４５０ｎｍでモニターした。４３秒毎に１８ｍＬの画分を収集した。装入容積は５０ｍＬ（９．５７ｍｇ／ｍＬ）であった。
【０１８５】
以下の修正勾配条件下で、処理時間が短縮された。０分で１０％Ｂ、１０分で３０％Ｂ、１５分で３１％Ｂ、２０分で４０％、２５分で６０％Ｂ、３０分で９８％Ｂ、および３２分で１０％。吸光度を２８０、２１４、２３５、３３０、および４５０ｎｍでモニターした。この場合もまた流速は２５ｍＬ／分であり、１８ｍＬの画分を収集した。装入容積は８０ｍＬ（９．５７ｍｇ／ｍＬ）であって。
【０１８６】
５．３  ウシβＢ２クリスタリンの単離
ヒツジβＢ２クリスタリンを含有するピークは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４  ３００Ａカラムを使用したＲＰ−ＨＰＬＣ分取プロトコルにより、その他の水溶性クリスタリンタンパク質から容易に分離された。実施例５．２で述べられている短縮プロトコルを使用して、ヒツジβＢ２クリスタリンを精製した。
【０１８７】
ヒツジβＢ２クリスタリンを含有するピークが再度分離された。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって単一バンドが観察され、非還元性条件下でヒツジβＢ２二量体の存在が観察された。ヒツジβＢ２クリスタリンのＭＳ／ＭＳ分析は、対応するウシβＢ２クリスタリンタンパク質との配列相同性を有する単一タンパク質を明らかにした。双方の操作からヒツジβＢ２クリスタリンを含有する画分１８および１９をプールして、真空下で濃縮しアセトニトリルを除去して、次に凍結乾燥して白色の綿毛状タンパク質粉末を生成した。１００ｍｇのタンパク質が得られた。ＨＰＬＣ操作は３２分以内に完了した。
【０１８８】
５．４  ヒツジβＢ２クリスタリンの収率
合計６個のヒツジ水晶体を収集した（４．６９ｇ）。これを２００ｍＬの水で抽出し、次にこの抽出物の１５２ｍＬを遠心分離した（４５ｍＬは処理しなかった、２２．５％）。遠心分離後、１３０ｍＬを実施例５．２で述べられているように分取用ＨＰＬＣカラムに装入した。１００ｍｇの精製タンパク質を得た。様々なヒツジ眼球組織重量およびβＢ２の収率は、表１２および表１３に示すように判定された。
【０１８９】
【表１３】
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【０１９０】
【表１４】
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【０１９１】
カラムからの収量は、ヒツジβＢ２クリスタリンがカラムに装入されたタンパク質のおよそ８％を構成することを実証した。全ての抽出物が処理されたなら、さらに２２ｍｇのヒツジβＢ２クリスタリンが得られたことが予期できる。
【０１９２】
５．５  ヒツジβＢ２クリスタリンとウシβＢ２クリスタリンとの配列相同性の比較
ウシβＢ２クリスタリンのアミノ酸配列に対応するヒツジβＢ２クリスタリンについて、いくつかのペプチドが同定され配列決定された。精製されたヒツジβＢ２クリスタリンをトリプシン加水分解し、生じた断片のＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＬＴＱ−ＦＴＭＳを使用して得られた配列を使用してタンパク質データベースを検索した。得られた唯一の肯定的結果は、対応するウシタンパク質、βＢ２クリスタリンであった。相同性領域は、Ｐｒｏｆｏｕｎｄおよび配列アラインメントツールを使用して同定した。配列中にオーバーレイが得られなかった６つの領域があった。カバレッジは５１．９％であった。しかしこれらの結果は、単離されたヒツジタンパク質が、ウシタンパク質とかなりの配列類似性を有するヒツジβＢ２クリスタリンであることを確かに確認した。
【０１９３】
実施例６：ヒツジβＢ２クリスタリン創傷治癒製剤
６．１  ヒツジβＢ２クリスタリンの調製
本質的に実施例５．１で述べられているようにして、ヒツジ眼球を収集して即座に処理した。簡単に述べると、メスを使用して角膜を横切って２〜３ｃｍの切り込みを入れた。ブレードを除去しながら眼球の両側をつまんで水晶体を眼球から押し出し、１分あたり約１２個の眼球が処理できた。水晶体を４℃において２０容積（ｗ／ｖ）の蒸留水中で一晩撹拌した。水晶体はこの時間内に緩慢に溶解した。濁った白色溶液が得られ、それをセライト（セライト５４５  ３４９６７−００２５、Ａｃｒｏｓ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を通して濾過した。酢酸を使用して水溶性水晶体クリスタリンを含有する上清のｐＨを３．５に調節し、実施例５．２で述べられているようにＲＰ−ＨＰＬＣを使用してβＢ２クリスタリンを精製した。
【０１９４】
６．２  βＢ２クリスタリンタンパク質酸性沈殿ゲル
酸性条件下において塩溶液の存在下で自然発生的に沈殿するタンパク質の能力を利用して、ヒツジβＢ２クリスタリンのタンパク質ゲル沈殿物を調製した。
【０１９５】
透明なβＢ２クリスタリン酸性ゲルを以下のようにして調製した。実施例６．１で述べられているような分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された未変性ヒツジβＢ２クリスタリンを８５ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬで蒸留水に溶解した。タンパク質が完全に溶解した後に、ｐＨ約１．４〜１．７の透明な酸性ゲルの形成が明らかであった。エラスターゼＩトランケート型のＲＰ−ＨＰＬＣ精製ヒツジβＢ２クリスタリンをその最大溶解度（２０ｍｇ／ｍＬ）で溶解すると、それは自然発生的に透明ゲルを形成できなかった。簡単に述べるとヒツジβＢ２クリスタリンのエラスターゼＩトランケート型は、実施例６．１．で述べられているようなＲＰ−ＨＰＬＣによって調製された。トランケート型は、１：１００の酵素対基質比のエラスターゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号２２８０（５．０５μ／ｍｇおよび２７．２ｍｇ／ｍＬ）バッチ番号３８Ａ１０１７４）を使用して、精製されたβＢ２クリスタリンを消化して調製された。βＢ２クリスタリンの部分的加水分解は、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、１０〜５０ｍｇ／ｍＬの精製βＢ２クリスタリンと０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬのエラスターゼとを１〜８時間混合して達成された。反応が完了したらトランケート型βＢ２クリスタリンをＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。未修飾形態の滞留時間は、約１５分間からトランケート型の１０分間にシフトして、タンパク質の修飾が示唆された。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析もまたタンパク質の相対分子量のシフトを実証した。１０分で溶出したタンパク質ピークを収集して、溶媒を真空下で除去した。次にタンパク質溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥トランケート型タンパク質を有機ゲルと５ｍｇ／ｇゲルで混合し、ラットの創傷に毎日創傷あたり３００μＬで塗布した。あるいは、凍結乾燥タンパク質を蒸留水に１０〜２０ｍｇ／ｍＬで溶解し濾過滅菌して、塩溶液に予浸したガーゼを覆うのに使用した。タンパク質被覆ガーゼを風乾させた。最終滅菌は、包装後に酸化エチレンガスまたはγ照射を使用して達成できた。生成物は創傷への塗布に先だってＰＢＳ水和を必要とする。
【０１９６】
６．３  カルシウム塩を用いて調合されたβＢ２クリスタリンタンパク質沈殿物ゲル
カルシウムは、ケラチノサイトの増殖および分化調節因子として重要な役割を果たし、制御因子として皮膚の創傷治癒を助ける。実験モデルはまた、カルシウムの管理が創傷管理も改善することを提案し（Ｌａｎｓｄｏｗｎ、２００２年）、アルギン酸カルシウム包帯が、正常な創傷治癒のいくつかの細胞的機構を改善することが示されている（Ｄｏｙｌｅら、１９９６年）。油性水酸化カルシウム懸濁液はまた、非外科的歯周治療後に口腔創傷に局所的に塗布すると、歯周創傷治癒を改善することが示されている（Ｋａｓａｊら、２００６年）。さらにβクリスタリンは、規定の化学量論比と中程度の親和性で二価のカルシウムイオンと結合することが報告されている（Ｓｈａｒｍａら、１９８９年）。最近の研究（ＪｏｂｂｙおよびＳｈａｒｍａ、２００７年）では、βＢ２クリスタリンはカルシウムイオンと特異的に結合することが示されている。
【０１９７】
創傷への塗布により適したより高いｐＨのβＢ２クリスタリンゲルを提供するために、未変性βＢ２クリスタリンをカルシウム塩と共に調合して、最終ｐＨ約４．０〜５．０のタンパク質沈殿ゲルを得た。簡単に述べると、実施例６．１で述べられているように調製された０．５ｇの精製未変性ヒツジβＢ２クリスタリンを５ｍＬの蒸留水に溶解した。これはｐＨが約１．５の透明ゲル様混合物をもたらした。これを１０ｍＭ（最終）Ｃａ（ＯＨ２）および１００ｍＭ（最終）ＣａＣｌ２と混合して、タンパク質の沈殿を得た。次に溶液を遠心分離して、ペレットと上清を分離した。ペレット（０．１１ｇ）を３ｍＬの蒸留水に溶解して、４℃で保存した。上清は依然として最初のタンパク質含量の７５％を含有したので、それを凍結乾燥して重量０．４３ｇの綿毛状の白色粉末を得た。この凍結乾燥粉末をペレット溶液と混合し、ｐＨ４．０のｐＨ値を有するゲル様生成物を得た。ゲルの最終濃度は１００ｍｇ／ｍＬであった。このゲルを下の実施例８で述べる、遅延創傷治癒モデルで使用した。
【０１９８】
６．４  トランケート型βＢ２クリスタリン（有機ゲル）配合物
ミリスチン酸イソプロピルおよびステアリン酸マグネシウムを含有する無水有機ゲル（ＩＮＣＩ  Ｍａｇｎａｔｅ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）と、実施例６．２で述べられているように調製されたＲＰ−ＨＰＬＣ精製ヒツジエラスターゼＩトランケート型βＢ２クリスタリンとを５ｍｇ／ｍＬの濃度で混合した。凍結乾燥タンパク質を有機ゲル中に均等に混合して、滑らかなペーストを形成した。このペーストを下の実施例７で述べる５日間創傷治癒研究において使用した。
【０１９９】
実施例７：ラットにおける５日間創傷治癒研究
各群６匹ずつの５つの処置群に割り当てた３０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用して、創傷治癒研究を実施した。処置群は次のとおりであった。
Ａ群−ビヒクル対照（有機ゲル）
Ｂ群−エラスターゼＩ処理ヒツジβＢ２クリスタリン（トランケート型）（有機ゲル中５ｍｇ／ｇ）
Ｃ群−ヒツジαＡクリスタリン（有機ゲル中２．６ｍｇ／ｇ）
Ｄ群−ウシインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）（有機ゲル中１０ｍｇ／ｇ）
Ｅ群−陽性対照（グレープフルーツ果皮抽出物）（有機ゲル中１ｍｇ／ｇ）
【０２００】
全てのクロマトグラフィー手順は、インライン導電率モニタリングと共に、２１４および２８０ｎｍに設定したＱｕａｄＴｅｃ検出器付きＢＩＯＲＡＤ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃシステムを使用して、４℃で実施した。
【０２０１】
ウシＩＤＯは上述されているようにしてウシ心臓組織から調製した（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９７８年）。カチオン交換ＳＰ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を以下の条件で使用した。樹脂を１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．４）を使用して平衡化した。次に１０ｍＬのウシ心臓抽出物（２５ｇの凍結心臓を１２５ｍＬの１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．４）で抽出して調製された）をカラムに装入した。カラムを２００ｍＬの平衡緩衝液で洗浄し、続いて、２００ｍＬ容積の平衡緩衝液中の０〜１ＭのＮａＣｌからの勾配溶出を行った。６ｍＬの画分を収集して、ＩＤＯ活性について試験した。活性を含有する画分をプールして透析し（１０〜１２ｋＤａのＮＭＷＣＯ）、次に凍結乾燥した。凍結乾燥タンパク質をウシＩＤＯまたはウシ心臓酵素と称する。凍結乾燥タンパク質粉末を１０ｍｇ／ｍＬで有機ゲルと混合した。
【０２０２】
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）を使用して平衡化して作動されるＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００ＨＲ上でのゲル濾過クロマトグラフィーと、ＲＰ−ＨＰＬＣとの組み合わせを使用して、実施例６．１で概説した標準プロトコルを使用してヒツジαＡクリスタリンを調製した。装入材料はＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００ＨＲカラムからのαＡおよびαＢ画分であった。精製ヒツジαＡクリスタリンは、ＭＳ分析およびＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって確認した。
【０２０３】
陽性対照（グレープフルーツ果皮抽出物）は、ラット大動脈環アッセイ（血管形成モデル系）によって判定された血流を促進するその能力のために選択された。大動脈環モデルによる判定で類似した活性様式がある化合物間において、比較を行った。
【０２０４】
使用した動物創傷モデルは、本質的に実施例３．６で述べられているようであった。簡単に述べると、創傷形成のおよそ３０分前に、各動物の鼠径窩にＴｅｍｇｅｓｉｃを皮下注射した（０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重）。酸素中の３％ハロタンを使用して動物を麻酔し、ひとたびペダル反射が消失したら、電気バリカンを使用して頭蓋基部から後肢領域にかけて各動物を剪毛した。７０％エタノール中の０．５％クロルヘキシジンを使用して、皮膚を消毒した。各動物で頭蓋基部から股関節上部までの距離を測定し、脊髄軸に沿って頭蓋基部から６ｃｍ下に創傷位置を黒色フェルトペンで標識した。無菌技術を使用して、無菌の１２ｍｍ生検パンチを使用して、穏やかな旋回で全厚の切り込みを入れた。パンチは乾燥しており、残骸（例えば皮膚、毛）が創傷に入らないように注意を払った。各創傷は皮膚表面に直角に形成し、生検パンチは皮膚のみを切断し、筋肉組織のより深い層に突き抜けなかった。Ｆ２．８マクロレンズ付きキャノンデジタルＥＯＳ  ２０Ｄカメラを使用して創傷を撮影した後、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｍａｎ  ＣＰ  １００ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、対照または試験βＢ２クリスタリン（１００μｌアリコート）を創傷に塗布した。生検パンチの内側を無菌食塩水に浸した綿棒で拭って、あらゆる組織液および／または残骸を除去した。次にパンチを次の動物で使用する前に７０％エタノールに浸した。創傷形成後、毎日各動物の状態を注意深くモニターした。ラットには毎日、新しい紙タオルを床材として与えた。全ての動物は１、２、および３日目に、対照または試験化合物を合計３回局所塗布された。毎日各創傷を撮影した。
【０２０５】
研究終了時、ＣＯ２吸入と頸椎脱臼によって動物を安楽死させた。隣接する皮膚、筋膜、および筋肉組織を含めた創傷部位全体を切除して、それぞれ長手方向に二分した。各群の動物１、２、および３からの左側部分を４％緩衝ホルマリン中で２４時間固定してから、７０％エタノールに移した。動物１、２、および３からの右側部分は、さらなるタンパク質分析のために凍結保存した。各群の動物４、５、および６からの左右双方の部分は、４％緩衝液ホルマリン中で固定した。創傷面積の分析および創傷の組織学的分析を行った。
【０２０６】
創傷を毎日撮影し、ＮＩＨ  ｉｍａｇｅを使用して画像を分析し創傷面積を計算した。記述統計を評価した。予備ｔ検定は、異常値が結果に顕著に影響を及ぼすかどうかを調べた。収集した全てのデータ点について、主要分析を実施した。予備分析は、ｔ検定を使用して対照創傷のみに対して行った。一変量ＡＮＯＶＡを使用して、処置と対照との差異および処置からのサンプルを評価した。別のＡＮＯＶＡは、処置サンプルのみを使用して用量反応があったかどうかを評価した。正規性仮説はスチューデント化残渣上でｑ−ｑプロットを使用して試験され、分散の不均一性はＬｅｖｅｎｅの検定を使用して試験された。Ｍａｃ  ＯＳＸのためのＳＰＳＳ  １１を仮説検定および統計学的分析のために使用した。
【０２０７】
隣接する皮膚、筋膜、および筋肉組織を含めた創傷部位全体を切除して、組織学的検査のためにホルマリン中で固定した。ホルマリンに入れて２４時間以内に、創傷をパラフィン蝋に包埋して３μｍ厚さの切片を切り出し、ポリ−Ｌ−リジン被覆スライドガラスに付着させて脱蝋し、組織学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
【０２０８】
ヘマトキシリンおよびエオジン染色されたスライドを低倍率でデジタル撮影した（２．５×対象）。切片はかなり大きかったために、各組織切片全体を記録するのに６〜１２枚の写真が必要であった。連続する写真間に十分な重なりを含めて、後日、写真を重ね合わせて合成画像が形成できるようにした。各切片は解剖学的に類似しており、血清凝塊、好中球残骸、および散在する細菌コロニーで覆われた潰瘍性創傷側面にある、毛が生えた細長い２本の皮膚からなった。この血清細胞性外皮のより深くには線維血管性肉芽組織の層があり、それは典型的に、表在性の細胞密度の高い緻密層と、不定性に毛細血管網を含有するより深いより疎性の層とに重層化されていた。いずれの場合も、潰瘍は皮下筋肉層に貫通していた。傷の異なる部分を炎症細胞および血管数について分析した。
【０２０９】
トランケート型のβＢ２クリスタリンは、５日間創傷治癒研究全体にわたり、有機ゲルビヒクルの陰性対照およびグレープフルーツ陽性対照と比較して、最大治癒反応を有することが分かった。５日目のトランケート型のヒツジβＢ２クリスタリンの創傷面積は、表１４に示すように８３．７±３．４と比較して６９．９±４．４であった。
【０２１０】
【表１５】
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【０２１１】
図１７に示されるように、正常皮膚と創傷の間の帯域である移行帯内の毛細血管密度の分析は、エラスターゼＩトランケート型のβＢ２クリスタリンについて、ビヒクルのみの対照と比較して、血管密度の統計学的に有意な増大を実証した。
【０２１２】
全処置群において、創傷外部では毛細血管格付け１が観察された。しかしエラスターゼＩトランケート型βＢ２クリスタリン処置群では、ビヒクル対照の表面細胞での５．５および深部細胞での３．３（合計８．８、Ａ群）とそれぞれ比較して、表面細胞では格付け６．２、深部細胞では４．０（合計１０．２、Ｂ群）が得られた。αＡクリスタリン（Ｃ群）およびインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（Ｄ群）を使用した他の２つの処置は、それぞれ９．２および８．５の総毛細血管数を有した。
【０２１３】
５日目に行われた組織学的分析は、創傷移行帯の炎症細胞プロフィール（すなわちマクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、および形質細胞）が、全ての試験物質について同様であったことを明らかにした。リンパ球数は、全ての試験化合物とビヒクル対照との間で統計学的に有意に異なり（ｐ＜０．０１）、ビヒクルのみの対照と比較して試験製剤中で細菌負荷のレベルがより高かったことが示唆された。これが対照と比較して、試験群のより高い好中球含量をもたらしたかもしれない。
【０２１４】
実施例８：遅延創傷治癒研究
８．１  虚血性創傷治癒動物モデル
Ｃｈｅｎら（１９９９年）によって以前述べられているモデルに基づく虚血性遅延治癒モデルを使用した。動物の背部中央の切除創傷の両側に２つの切開創傷（双茎皮弁）を作ることで、虚血を引き起こした。より詳しくは、週齢および体重を一致させたオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを筋肉内ケタミン塩酸塩（１００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した。それぞれの背部の毛を刈り込んで、１０×４ｃｍの透明長方形テンプレートを使用して、背中の試験領域の輪郭を描いた。無菌条件下で、無菌１２ｍｍ生検パンチを使用して、穏やかな旋回で全厚の切り込みを入れた。あらゆる出血は綿棒を使用して除去した。パンチが乾燥しており、残骸（例えば皮膚、毛）が創傷に入らないように注意を払った。各創傷は皮膚表面に直角に形成した。虚血性群では切除創傷を上のように形成した。さらにメスを使用して、切除創傷の両側、長手方向に、創傷の上下端から１ｃｍずつ伸びる（長さ約３ｃｍ）全厚の切り込みを２本入れた。これらの創傷は、切除創傷の両側から約１．５ｃｍ側方に位置した。ひとたび止血が達成されたら、創傷皮弁を持ち上げて、外科用ハサミを使用して、膜および創傷床の底にあるあらゆる血管を切断した。切開は３本の結節縫合（４−０  Ｎｏｖａｆｉｌ、モノフィラメントポリブテステル、非吸収性縫合糸、Ｔｙｃｏ、カタログ番号４４０２−３３）を使用して、長さに沿って等距離点で閉鎖した。止血が再度達成されたら、創傷を撮影した。撮影後、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｍａｎ  ＣＰ１００  ＆  ＣＰ１０００ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、試験サンプル（１００μｌの未変性ヒツジβＢ２クリスタリンおよび１００μｌのＭｅｄｉｆｉｌｌ  ＩＩ（商標）（実施例８．２参照））を塗布した。生検パンチの内側を無菌食塩水に浸した綿棒で拭って、あらゆる組織液および／または残骸を除去した。パンチを次の動物で使用する前に７０％エタノールに浸した。創傷形成後、各動物の病状を厳密にモニターした。創傷形成の２および３日目には、各動物に新しいタオルを床材として与えた。通常は研究の５から７日目の間に、創傷が乾燥し、かんな屑によって悪影響を受けなくなった場合にのみ、紙タオルからかんな屑に変更した。対照群は切除創傷のみからなった。創傷閉鎖速度を３１日間にわたり測定した。
【０２１５】
結果は、２１日間の研究期間全体にわたり、対照と比べて創傷閉鎖速度の著しい低下を明らかに実証し、したがってこの遅延創傷治癒モデルの妥当性が確認された。スチューデントｔ検定を使用した統計学的分析は、１日目以降、試験全体を通じて常に創傷閉鎖の遅延がｐ：α＜０．０５で有意であったことを示した。
【０２１６】
虚血性と正常な創傷の間の創傷閉鎖の遅延は、研究の初期１３日目まではおよそ４日間であった。この時点で、虚血性創傷は対照動物の創傷のおよそ２倍の大きさであった。１５日目までには、正常な創傷動物では元の創傷面積のおよそ１０％の百分率であった。虚血性創傷はこの閉鎖レベルには２７日目まで達せず、遅延がさらに８日間伸びたことが示唆された。この結果は、組織虚血が創傷閉鎖に顕著な遅延を引き起こすことを示唆した。創傷の毛づくろいは、全ての処置群で明らかであった。毛づくろいもまた、治癒速度を低下させることができる創傷感染の可能性を増大させるかもしれない。
【０２１７】
８．２  比較研究
実施例８．１で述べられている虚血性遅延創傷治癒ラットモデルを使用して、創傷治癒に特効性のある、三重らせん分子形態のタイプＩウシコラーゲンを含有する創傷治癒コラーゲンゲルである、市販のＭｅｄｉｆｉｌｌ  ＩＩ（商標）タイプＩウシコラーゲン（ＢｉｏＣｏｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）と比較して、未変性βＢ２クリスタリンの創傷治癒上の利点を評価した。コラーゲン原線維の改善された表面積／密度は、創面に接触するコラーゲンのレベルを増大させる。
【０２１８】
未変性βＢ２クリスタリンタンパク質は、未修飾形態が未変性βＢ２クリスタリンタンパク質を高濃度に含有するゲルを形成する能力のために、実施例６．２で述べられているＲＰ−ＨＰＬＣ精製エラスターゼＩトランケート型に優先して選ばれた。ヒト慢性創傷は、血管新生促進性トランケート型タンパク質形成につながる、未変性βＢ２クリスタリンを加水分解する能力を有する（ヒト好中球エラスターゼをはじめとする）高レベルのプロテアーゼを示す。
【０２１９】
簡単に述べると、上の実施例６．２で述べられるようなタンパク質沈殿ゲルに調合された未変性ヒツジβＢ２クリスタリンタンパク質、または（陽性対照として）Ｍｅｄｉｆｉｌｌ  ＩＩ（登録商標）コラーゲンゲルを１、３、５、７、および９日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの虚血性創傷に塗布した。結果は元の創傷面積の平均百分率として表される。対照群は未処置虚血性創傷がある動物からなった。３群は全て各１０匹のラットを含んだ（Ｎ＝１０）。
【０２２０】
研究の最初の５日間では、βＢ２クリスタリンタンパク質ゲル処置群における治癒速度の低レベルの改善が実証されたが、これは統計学的に有意でなかった。７日目までには、３処置の全てが同様の創傷面積を有した。７日目から３１日目の研究の終わりまでは、Ｍｅｄｉｆｉｌｌ（商標）ゲル処置群が対照虚血性創傷と本質的に同一の経路をたどり、それが創傷の治癒速度に真の利点も不利益もないことが示唆された。未変性βＢ２クリスタリンゲルは、９〜２７日目にかけて対照虚血性創傷と比較して閉鎖速度を低下させるようであったが、これもまた有意ではなかった。２７日目には未変性βＢ２クリスタリンゲル群の動物の１匹がその創傷を損傷し、過度の毛繕いに伴って、創傷が感染して創傷面積がはるかにより大きくなった。この動物は２７日目に処分することが決定された。その結果、この処置群の平均結果は、２９日目に急激に低下した。これは創傷面積平均に対する、単一動物からの劇的な影響であった。この動物におけるの感染の存在は、治癒にさらなる遅延を引き起こすこともあり得たので、この動物の実験からの除去は正当化され、この動物は異常値であると見なされた。虚血性対照群と比較して、Ｍｅｄｉｆｉｌｌ  ＩＩ（商標）ゲルおよび未変性βＢ２クリスタリンゲル処置群の結果に有意差はなかった。この研究から導かれた結論は、Ｍｅｄｉｆｉｌｌ  ＩＩ（商標）ゲルおよび未変性βＢ２クリスタリンゲルのどちらも虚血性創傷治癒において、同様のレベルの利点を提供するということである。
【０２２１】
元の創傷面積の平均百分率が、未処置対照と比較して、実験経過全体を通じて同様であったことから、Ｍｅｄｉｆｉｌｌ（商標）ゲルからはわずかな利点しか得られないようであった。しかし対照的に、未変性βＢ２クリスタリンゲルは、処置の最初の５日間にわたって虚血性対照創傷に優るいくらかの利点を示した。試験の残りの期間中、試験の３１日目まで、対照虚血性創傷と比較してさらなる利点は観察されなかった。３１日目にはβＢ２クリスタリンタンパク質の元の創傷面積の平均百分率は、虚血性対照創傷よりも小さかった。妥当なことに、βＢ２クリスタリンを加水分解するプロテアーゼは、最初の７２時間以内に起きる創傷治癒の炎症段階に存在するため、未変性タンパク質からのトランケート型のβＢ２クリスタリンの生成は、このモデルにおいては創傷治癒のより初期の段階に限定されたかもしれない。ヒトの非治癒創傷は長期の炎症期を有して高レベルのプロテアーゼを示すので、未修飾形態のβＢ２クリスタリンの投与は、これらの状況下でより大きな利点を有するかもしれない。
【０２２２】
実施例９：創傷包帯用ガーゼの調製
以下のようにして布帛材料ガーゼまたはモスリンをＲＰ−ＨＰＬＣ精製未変性またはエラスターゼＩ処理ヒツジβＢ２クリスタリンで被覆した。
【０２２３】
布帛材料を塩溶液（２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）であるが、上述のようにカルシウム塩をはじめとするいくつかの異なる塩が使用できる）に入れた。布帛を塩溶液から取り出して、本質的に過剰な水を含まなくなるまで濾紙で吸い取った。２層の濾紙の間で吸い取って、材料からはいかなる追加的な水も除去できなくなった。次に布帛を精製βＢ２クリスタリンの酸性溶液（１０〜５０ｍｇ／ｍＬ）に入れた。
【０２２４】
１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）中で、βＢ２クリスタリンのトランケート型を調製した。ｐＨ値は２．０〜５．０の範囲であることができる。試験したβＢ２クリスタリンタンパク質濃度は、布帛を効果的に覆うことが分かった。電子顕微鏡で示されるように、βＢ２クリスタリンは約１０秒以内に白色タンパク質沈殿物で布帛表面を覆う。未修飾形態のβＢ２クリスタリンもまた同一条件下で、あらかじめ浸漬した布帛の表面を覆う能力を実証した。
【０２２５】
βＢ２クリスタリンで絆創膏またはその他の材料が被覆できる能力は、有効量のタンパク質を創傷部位に送達するのを助けるかもしれない。未変性およびエラスターゼＩ処理トランケート型βＢ２クリスタリンは、どちらも布帛材料ガーゼおよびムスリンを被覆することが分かった。塩濃度、タンパク質濃度、および布帛、ガーゼまたはその他の適切な基材がβＢ２クリスタリンタンパク質溶液と接する時間を変更することで、被覆レベルを制御してもよい。次に被覆材料を後の使用のために乾燥し、滅菌してもよい（例えばγ照射）。スポンジ材料もまた、上のプロトコルを使用してヒツジβＢ２クリスタリンタンパク質で被覆したが、スポンジをβＢ２クリスタリンタンパク質溶液に入れる前に、圧搾して過剰な液体を除去した。このタイプの創傷包帯は、高レベルの浸出液を生じる創傷で使用するのに適するかもしれない。
【０２２６】
いくつかの実施態様に言及して本発明について述べられているが、多数の変形および／または修正が可能であることが当業者には理解されるであろう。このような全ての変形および／または修正は、明示的に包含される。したがって本実施態様は、全ての点で例示的であり限定的でないと見なされる。
【０２２７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005685773.tif 000029
【図１３】
0005685773.tif 000030
【図１４】
0005685773.tif 000031
【図１５】
0005685773.tif 000032
【図１６】
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【図８】
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