(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア・コリの野生型アセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）の小サブユニットに下記の群から選択される変異が導入された、細菌のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットであって、バリンによるフィードバック阻害が脱感作された、細菌のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニット：
Ａ）１７位のＬ−アミノ酸をリジン残基で置換すること、
Ｂ）３０位のＬ−アミノ酸をプロリン残基で置換すること。
【請求項２】
請求項１に記載の変異型小サブユニットを含む変異型アセト乳酸合成酵素。
【請求項３】
前記変異型アセト乳酸合成酵素がエシェリヒア・コリの大サブユニットを含む、請求項２に記載の変異型アセト乳酸合成酵素。
【請求項４】
請求項１に記載のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡ及びエシェリヒア・コリのアセト乳酸合成酵素の大サブユニットをコードするＤＮＡを含み、分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産能を有する、腸内細菌科の細菌。
【請求項６】
前記分岐鎖Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから成る群から選択される、請求項５に記載の腸内細菌科の細菌。
【請求項７】
前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が増強される、請求項５又は６に記載の腸内細菌科の細菌。
【請求項８】
前記細菌がエシェリヒア属に属する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の腸内細菌科の細菌。
【請求項９】
前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が、前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子の発現を増大させることによって増強される、請求項７又は８に記載の腸内細菌科の細菌。
【請求項１０】
前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が、
ａ）前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子のコピー数を増大させること、
ｂ）前記遺伝子の発現が高められるように、当該遺伝子の発現調節配列を改変すること、及び
ｃ）それらの組み合わせ
から成る群から選択される方法によって増強される、請求項９に記載の腸内細菌科の細菌。
【請求項１１】
前記コピー数が、前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子の複数コピーを前記細菌の染色体に組込むことによって増大される、請求項１０に記載の腸内細菌科の細菌。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれか１項に記載の細菌を培地中で培養すること、及び培地から分岐鎖Ｌ−アミノ酸を回収することを含む、分岐鎖Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１３】
前記細菌は分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する遺伝子の発現が増強されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分岐鎖Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから成る群から選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、特に分岐鎖Ｌ−アミノ酸の製造方法に関する。さらに詳細には、本発明は、分岐鎖Ｌ−アミノ鎖の生合成に関与する新規のＬ−バリン耐性酵素の使用を開示する。さらに詳細には、本発明は、この合成酵素を含む腸内細菌科の細菌であるエシェリヒア・コリから精製されるＬ−バリン耐性の変異型アセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）、及びこの細菌株を使用した発酵によって、分岐鎖Ｌ−アミノ酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸は、天然源から得られる微生物、又はＬ−アミノ酸の生産性を増強するよう特異的に改変されたそれらの変異体の株を利用した発酵により工業的に製造されてきた。
【０００３】
例えば、組換えＤＮＡによる微生物の形質転換等の、Ｌ−アミノ酸の生産性を特異的に増強する多くの方法が既に記載されている（例えば、米国特許第４，２７８，７６５号を参照のこと）。このような方法は、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増大させること、及び／又は標的酵素を生成されるＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害を脱感作することに基づいている（例えば、特開昭５６−１８５９６号（１９８１）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／１６０４２号、又は米国特許第５，６６１，０１２号及び同第６，０４０，１６０号を参照のこと）。
【０００４】
イソロイシン、ロイシン及びバリンは、分岐した経路を通じて生合成されるが、経路中の３つのステップがそれぞれの最終生成物に共通である。ＡＨＡＳ反応は、これらの３つの生成物に共通の第１の生合成ステップに相当する。この反応は、バリンによる最終生成物阻害の標的となるアイソザイムによって触媒される。このような調節は、細菌におけるこの経路の生理的制御において重要な役割を果たす。この反応は、活性型アセトアルデヒド（ピルビン酸由来）とα−ケト酪酸又はピルビン酸のいずれかとの縮合により、それぞれ、α−アセト−α−ヒドロキシ酪酸（イソロイシンの前駆体）又はα−アセト乳酸（ロイシン及びバリンの前駆体）を産生することを含む。
【０００５】
バリン及びそのケト酸前駆体であるα−ケトイソ吉草酸がエシェリヒア・コリＫ１２の生育を阻害すること、及びイソロイシンがこの阻害に拮抗することが報告されている(Tatum, E.L., Fed. Proc. 8:511(1946))。現在のところ、バリンによる阻害は、主にα−アセト−α−ヒドロキシ酪酸合成の遮断に起因すると一般的に考えられている。エシェリヒ
ア・コリＫ１２の分析によって、この株が３つのＡＨＡＳ（アイソザイムＡＨＡＳ  Ｉ、ＡＨＡＳ  ＩＩ、及びＡＨＡＳ  ＩＩＩと称される）の活性に対する構造遺伝子群を含むことが示されている。ＡＨＡＳ  Ｉ及びＡＨＡＳ  ＩＩＩの両方がバリンによって阻害されるのに対し、ＡＨＡＳ  ＩＩはバリンに耐性がある。しかし、ＡＨＡＳ  ＩＩは通常、エシェリヒア・コリＫ１２細胞では発現していない(Guardiola, J. et al., Mol. Gen. Genet. 156:17-25(1977))。腸内細菌由来の全てのＡＨＡＳアイソザイムは、α2β2構造の大サブユニット及び小サブユニットから構成され、大サブユニットは触媒機能を有しており、また小サブユニットは調節機能を有している。この小サブユニットは、フィードバック阻害因子であるバリンに対する酵素活性の感受性には絶対に必要である。ＡＨＡＳ  Ｉサブユニット及びＡＨＡＳ  ＩＩＩサブユニットそれぞれの特性の研究(Weinstock O. et
al., J. Bacteriol. 174:5560-5566(1992))により、小サブユニットが酵素全体の触媒能を有する構造を特異的に誘導し、遷移状態を安定化させることが示された。
【０００６】
エシェリヒア・コリ由来のＡＨＡＳ  ＩＩＩ調節小サブユニットのバリン結合領域のモデルに基づいて、小サブユニットのカルボキシル末端の切断が行われた。これらの切断によって、切断を受けたＡＨＡＳ  ＩＩＩ酵素におけるバリン感受性の欠失が誘導される(Mendel S. et al., J Mol Biol. 10;325(2):275-84(2003))。
【０００７】
しかし、現在のところ、バリンに対してフィードバック耐性である細菌の変異型アセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）、及び分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産を、対応するＬ−アミノ酸生産株において向上させるためにこのような変異型アセト乳酸合成酵素を使用することについて記載している報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産性が向上した分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産株を開発する目的で、また、これらの株を使用した分岐鎖Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供するために、新規な細菌の変異型アセト乳酸合成酵素を提供する。
【０００９】
本発明は、エシェリヒア・コリ由来の新規の変異型アセト乳酸合成酵素を構築することにより達成された。このエシェリヒア・コリ由来の変異型アセト乳酸合成酵素は、ＩｌｖＮ調節ユニットにおける変異、具体的にはＡｓｎ−１７、Ａｌａ−３０、及び／又はＩｌｅ−４４を有する。この変異型アセト乳酸合成酵素は、この変異型酵素をコードするＤＮＡを分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産株に導入した場合、分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産を向上させることが示された。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様は、細菌のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットであって、エシェリヒア・コリの野生型アセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）の小サブユニットを含み、１７位及び／又は３０位のＬ−アミノ酸を別のＬ−アミノ酸で置換すること、４４位のＬ−アミノ酸より下流のＮ末端部分を数個のＬ−アミノ酸で置換すること、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を含み、バリンによるフィードバック阻害に対して耐性である、細菌のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、前記１７位のＬ−アミノ酸がリジン残基で置換されたことを特徴とする、上記の細菌のアセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）の変異型小サブユニットを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、前記３０位のＬ−アミノ酸がプロリン残基で置換されたことを特徴とする、上記の細菌のアセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）の変異型小サブユニットを提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、前記４４位のＬ−アミノ酸より下流のＮ末端部分がアルギニン及びフェニルアラニンで置換されたことを特徴とする、上記の細菌のアセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）の変異型小サブユニットを提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、前記リジン残基で置換される１７位のＬ−アミノ酸がアスパラギンであることを特徴とする、上記の細菌のアセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）の変異型小サブユニットを提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、前記プロリン残基で置換される３０位のＬ−アミノ酸がアラニンであることを特徴とする、上記の細菌のアセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）の変異型小サブユニットを提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、前記アルギニン及びフェニルアラニンで置換される４４位のＬ−アミノ酸がイソロイシンであることを特徴とする、上記の細菌のアセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ  Ｉ）の変異型小サブユニットを提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、上記の小サブユニットを含む細菌の変異型アセト乳酸合成酵素を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、前記変異型アセト乳酸合成酵素がエシェリヒア・コリの大サブユニットを含む、上記の変異型アセト乳酸合成酵素を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、上記の細菌の変異型アセト乳酸合成酵素であって、前記小サブユニットが１７位、３０位、及び／又は４４位以外の１又は複数の位置において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を含み、かつ当該変異型アセト乳酸合成酵素はバリンによるフィードバック阻害が脱感作されたことを特徴とする、細菌の変異型アセト乳酸合成酵素を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、上記のアセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットをコードするＤＮＡを提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、上記のＤＮＡを含み、かつ分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科の細菌を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、前記分岐鎖Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから成る群から選択されることを特徴とする、上記の細菌を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が増強される、上記の細菌を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、エシェリヒア属に属する上記の細菌を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が、前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子の発現を増大させることによって増強される、上記の細菌を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、前記変異型アセト乳酸合成酵素の活性が、
ａ）前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子のコピー数を増大させること、
ｂ）前記遺伝子の発現が増強されるように、この遺伝子の発現制御配列を改変すること、及び
ｃ）それらの組み合わせ
から成る群から選択される方法によって増強される、上記の細菌を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、前記コピー数が、前記変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子の複数コピーを細菌の染色体へ組込むことによって増大される、上記の細菌を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、分岐鎖Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、前記細菌を培地中で培養すること及び培地から分岐鎖Ｌ−アミノ酸を回収することを含む方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、前記細菌が分岐鎖Ｌ−アミノ酸生合成に関連する遺伝子の発現が増強されている、上記の方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、前記分岐鎖Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから成る群から選択される、上記の方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
さらに、本発明を詳細に説明する。
【００３２】
１．アセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニット及び変異型ｉｌｖＮ遺伝子
「細菌のアセト乳酸合成酵素」という用語は、腸内細菌科の細菌、コリネバクテリア、及びバチルス属に属する細菌等に存在する野生型又は内因生のアセト乳酸合成酵素を意味する。腸内細菌科には、エシェリヒア属、エルビニア属、プロビデンシア属及びセラチア属に属する細菌が包含される。エシェリヒア属が好ましい。
【００３３】
「アセト乳酸合成酵素の活性」という語句は、ピルビン酸及び２−オキソブタノエートからの２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸及びＣＯ2の形成、又はピルビン酸２分子からの２−アセト乳酸及びＣＯ2の形成を触媒する活性を意味する。この活性は、F.C. Stormer及びH.E. Umbarger(Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592(1964))の方法により、細菌抽出物を用いて測定することができる。
【００３４】
アセト乳酸合成酵素Ｉ（ＡＨＡＳ  Ｉ）とも称されるアセトヒドロキシブタノエート合成酵素Ｉは、２つの触媒ドメイン及び２つの調節ドメインを含むヘテロ四量体タンパク質である(Weinstock, O. et al., J. Bacteriol., 174(17), 5560-5566(1992))。大（約６０ｋＤａ）サブユニットが触媒性である一方で、小サブユニットは調節性であると一般的に考えられている。ＡＨＡＳ  Ｉは、ｉｌｖＢ遺伝子及びｉｌｖＮ遺伝子によってコードされる。
【００３５】
エシェリヒア・コリのアセト乳酸合成酵素［ＥＣ４．１．３．１８］の小サブユニットにおいて、１７位のアスパラギン及び／又は３０位のアラニンを任意のアミノ酸で置換すること、好ましくは１７位はリジンで、また３０位はプロリンで置換することにより、バリンによるフィードバック阻害に耐性である変異型タンパク質がもたらされる。また、４４位のＬ−アミノ酸より下流のＮ末端部分を１又は数個のアミノ酸、好ましくはアルギニン及びフェニルアラニン等の２つのアミノ酸で置換することにより、バリンによるフィードバック阻害に耐性である変異型タンパク質がもたらされる。このような変異体の代表的な例はＩｌｖＮ３３（配列番号１１）である。数個のアミノ酸で４４位より下流を置換することができるが、標準的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、及びより好ましくは２個であり得る。１７位、３０位、及び／又は３３位において置換されているか、又は数個のアミノ酸で４４位より下流のＮ末端部分が置換されている野生型アセト乳酸合成酵素の小サブユニットは、「変異型小サブユニット」と称される場合がある。変異型小サブユニットを含むアセト乳酸合成酵素は、「変異型アセト乳酸合成酵素」と称される場合がある。変異型小サブユニットをコードするＤＮＡは、「変異型ｉｌｖＮ遺伝子」と称される場合がある。全く置換されていないアセト乳酸合成酵素の小サブユニットは、「野生型の小サブユニット」と称される場合がある。野生型の小サブユニットを含むアセト乳酸合成酵素は、「野生型のアセト乳酸合成酵素」と称される場合がある。さらに、本発明の変異型小サブユニット及びアセト乳酸合成酵素の大サブユニットをコードするＤＮＡは、「変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子」と称される場合がある。
【００３６】
ｉｌｖＢ遺伝子（同義語−ｂ３６７１）は、アセト乳酸合成酵素の大サブユニットをコ
ードする。ｉｌｖＢ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２の３８４９１１９位〜３８５０８０７位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、ｇｉ：１６１２９１７０）は、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｉｌｖＮ遺伝子とｉｖｂＬ遺伝子との間に位置している。
【００３７】
ｉｌｖＮ遺伝子（同義語−ｂ３６７０）は、アセト乳酸合成酵素の小サブユニットをコードする。ｉｌｖＮ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２の３８４８８２５位〜３８４９１１５位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、ｇｉ：４９１７５９９０）は、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のｕｈｐＡ遺伝子とｉｌｖＢ遺伝子との間に位置している。ｉｌｖＮ遺伝子のヌクレオチド配列及びｉｌｖＮ遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素の小サブユニットのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１及び配列番号２で示される。ｉｌｖＢ遺伝子及びｉｌｖＮ遺伝子はｉｌｖＢＮオペロンを形成する。
【００３８】
変異型小サブユニットは、既知の方法を使用して、野生型ｉｌｖＮ遺伝子に変異を導入することによって得られる。ｉｌｖＢＮオペロンは、オペロンのヌクレオチド配列に基づくプライマーを利用したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)を参照のこと）によって得ることができる。他の微生物由来のアセト乳酸合成酵素をコードする遺伝子も同様の方法で得ることができる。
【００３９】
変異型サブユニットを含むアセト乳酸合成酵素の活性が維持される限り、変異型小サブユニットは、１７位、３０位、及び／又は４４位以外の１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を含んでいてもよい。「数個」というアミノ酸の数は、そのタンパク質の三次元構造における位置又はアミノ酸残基の種類によって異なる。これは、アミノ酸にはタンパク質内でその構造及び機能が互いに類似したものがあり、そのようなアミノ酸の置換は、タンパク質の三次元構造又は機能に余り影響を与えないためである。したがって、本発明の変異型アセト乳酸合成酵素は、アセト乳酸合成酵素の全アミノ酸配列に関して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及び特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を有し、かつアセト乳酸合成酵素の活性を維持するものであり得る。あるいは、「数個」というアミノ酸の数は、１個〜３０個、好ましくは１個〜１５個、より好ましくは１個〜５個であり得る。
【００４０】
１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加は、活性が維持されるような保存的変異であるべきである。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００４１】
ｉｌｖＢ遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素の大サブユニットも、１又は複数の位置における１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を含んでいてもよい。
【００４２】
本発明では、「１７位、３０位、及び／又は４４位のＬ−アミノ酸」という語句は、エシェリヒア・コリの野生型アセト乳酸合成酵素の小サブユニットの配列である配列番号２のアミノ酸配列における１７位、３０位、及び／又は４４位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を意味する。エシェリヒア・コリ由来のアセト乳酸合成酵素の小サブユニットにおいて、１７位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、３０位のアミノ酸残基はアラニンであり、４４位のアミノ酸残基はイソロイシンである。アミノ酸残基の位置は変わることがあり得る。例えば、１つのアミノ酸残基がＮ末端部分に挿入される場合、１７位、３０位、及び／又は４４位のアミノ酸残基は１８位、３１位、及び／又は４５位になる。このような場合、元の１７位、３０位、及び／又は４４位のアミノ酸残基は、本発明の１７位、３０位、及び／又は４４位のアミノ酸残基として表示される。
【００４３】
対象となる細菌に由来するアセト乳酸合成酵素の小サブユニットの１７位、３０位、及び／又は４４位のＬ−アミノ酸を決定するために、エシェリヒア・コリ由来のアセト乳酸合成酵素の小サブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）を対象の細菌由来のアセト乳酸合成酵素の小サブユニットのアミノ酸配列とアライメントし、対象の細菌に由来するアセト乳酸合成酵素の小サブユニットにおける１７位、３０位、及び／又は４４位のＬ−アミノ酸を決定することができる。
【００４４】
特定の部位の１又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されるように、部位特異的な変異誘発によりヌクレオチド配列を改変することによって、上記の変異型小サブユニットと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。上記のように改変されたＤＮＡは、従来既知の変異処理によって得られる。このような変異処理としては、変異型ｉｌｖＮ遺伝子を含むＤＮＡを、例えばヒドロキシルアミンによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理すること、並びに、紫外線照射又は既知の変異誘発剤（例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）及び亜硝酸等）により、変異型ｉｌｖＮ遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を処理することが挙げられる。
【００４５】
上記のようなヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加には、例えば、アセト乳酸合成酵素を含む細菌の個体差又は種もしくは属の相違に基づく、自然に生じる突然変異も含まれる（突然変異体又は類縁体）。
【００４６】
変異型小サブユニットと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、変異処理を受けた細胞から、既知のｉｌｖＮ遺伝子配列に相補的な配列又はその一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、大サブユニットとともにアセト乳酸合成酵素活性を有する完全な酵素を形成するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって、得ることができる。
【００４７】
「ストリンジェントな条件」としては、特異的なハイブリッド、例えば少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、及び特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば上記未満の相同性しかないハイブリッドが形成されない条件が挙げられる。ストリンジェントな条件は、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの塩濃度で、１回又はそれ以上、好ましくは２回又は３回洗浄することによって例示される。一般に洗浄時間は、ブロッティングに使用する膜の種類によって異なり、製造業者によって推奨されるものとすることができる。例えば、Ｈｙｂｏｎｄ（商標）のＮ＋ナイロン膜(Amersham)に対して推奨される、ストリンジェントな条件下での洗浄時間は１５分である。好ましくは、洗浄を２、３回行うことができる。プローブ長は、ハイブリダイゼーションの条件に応じて適当に選択することができ、通常は１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。
【００４８】
タンパク質又はＤＮＡの相同性の程度を評価するために、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索及びＣｌｕｓｔａｌＷ等の幾つかの計算法を使用することができる。
【００４９】
ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのプログラムにより利用される発見的検索アルゴリズムである。これらのプログラムは、Karlin、Samuel及びStephen F. Altschulの統計学的方法を使用して、検出結果に有意差を付与する（「一般的スコアリングスキームを使用することによる分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法(Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes)」(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68)、「分子配列における複数の高得点部分に対する適用及び統計(Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences)」(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7)）。ＦＡＳＴＡ検査法は、W.R. Pearsonに記載されている(「ＦＡＳＴＰ及びＦＡＳＴＡによる迅速で高感度な配列比較(Rapid
and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA)」(Methods in Enzymology, 1990 183:63-98)）。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Thompson J.D.、Higgins D.G.及びGibson
T.J.によって記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：配列の重み付け、位置特異的なギャップペナルティ、及び重み付けマトリクスの選択による進歩的な複数の配列アライメントの感度の改善(CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and
weight matrix choice)」(Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680)）。
【００５０】
上記の条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子には、コード領域内に終止コドンを有する遺伝子及び活性部位の変異によって不活性となった遺伝子が包含される。しかし、そのような不都合は、市販の発現ベクターに遺伝子をライゲーションすること、及び発現したタンパク質を含む酵素のアセト乳酸合成酵素活性を調べることにより容易に除去することができる。
【００５１】
２．本発明の細菌
本発明の細菌は、アセト乳酸合成酵素の変異型小サブユニットをコードするＤＮＡを含む腸内細菌科の分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産菌である。さらに、本発明の細菌は、変異型アセト乳酸合成酵素の活性が増大した腸内細菌科の分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産菌である。具体的には、本発明の細菌は、腸内細菌科の分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産菌であって、本発明の変異型小サブユニットをコードする変異型ｉｌｖＮ遺伝子の当該細菌への導入により、分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産が増大した細菌である。本発明の細菌は、エシェリヒア属に属する分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産菌であって、当該細菌においてアセト乳酸合成酵素、すなわちバリン耐性の変異型アセト乳酸合成酵素の活性を増強することにより、分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産が増大した細菌である。さらに具体的には、本発明の細菌は、当該細菌の染色体上又はプラスミド中に変異型ｉｌｖＮ遺伝子を含んでおり、その遺伝子は過剰発現され、この細菌は分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産能力が高められている。
【００５２】
「分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産能を有する細菌」という語句は、本発明の細菌が培地で培養された場合に、培地中にＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリン等の分岐鎖Ｌ−アミノ酸を蓄積する能力がある細菌を表す。育種によって、分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産能を付与、あるいは増強することができる。本明細書中で使用される「分岐鎖Ｌ−アミノ酸の生産能を有する細菌」という語句は、野生型株又は親株よりも多い量の分岐鎖Ｌ−アミノ酸を生産し、培地に蓄積することができる細菌を示し、好ましくはこの細菌が、０．５ｇ／ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／ｌ以上の分岐鎖Ｌ−アミノ酸を生産し、培地中に蓄積することができることを意味する。例となるＬ−アミノ酸としては、Ｌ−ロイシン、
Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンが挙げられる。
【００５３】
腸内細菌科としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、フォトラブズス属（photorhabdus）、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属、モルガネラ属、及びエルシニア属等に属する細菌が挙げられる。具体的には、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information）データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で使用される分類法によって腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。
【００５４】
「エシェリヒア属に属する細菌」という用語は、この細菌が、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属に分類される細菌を意味する。例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。
【００５５】
「変異型アセト乳酸合成酵素の活性が増強される」という語句は、１細胞当たりの活性が、非改変株、例えば野生型株よりも高いことを意味する。例えば、１細胞当たりの変異型アセト乳酸合成酵素分子の数が増大する場合、及び変異型アセト乳酸合成酵素１分子当たりの比活性が増大する場合等に、活性は増強される。さらに、例えば、比較のために使用することができる例示的な野生型株はエシェリヒア・コリＫ−１２である。変異型アセト乳酸合成酵素の細胞内活性を増強した結果として、培地中の分岐鎖Ｌ−アミノ酸の量が増大する。
【００５６】
変異型アセト乳酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、細菌細胞における変異型アセト乳酸合成酵素の活性を増強することができる。腸内細菌科の細菌又はコリネ型細菌に由来するか、又はそれらの細菌から単離される変異型アセト乳酸合成酵素をコードする任意の遺伝子を使用することができる。これらの中ではエシェリヒア属に属する細菌由来の遺伝子が好ましい。
【００５７】
タンパク質をコードするＤＮＡで細菌を形質転換するということは、例えば従来の方法によって、細菌細胞にＤＮＡを導入して、それにより本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させ、且つその細菌細胞における当該タンパク質の活性を増強することを意味する。
【００５８】
遺伝子発現を増強する方法としては、遺伝子のコピー数を増大させることが挙げられる。エシェリヒア属細菌中で機能できるベクターに遺伝子を導入することによって、遺伝子のコピー数が増大する。このような目的のために、好ましくは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ+、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、又はｐＥＴ２２ｂ等のマルチコピーベクターを使用することができる。相同組換え等により細菌の染色体に遺伝子を多コピー導入することによって、遺伝子発現を高めることもできる。
【００５９】
天然のプロモーターの代わりに強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを位置させることにより、遺伝子発現を高めることもできる。ＲＮＡ合成開始の頻度によって、プロモーターの強度が評価される。プロモーターの強度を評価する方法及び強力なプロモーターの例は、Deuschle, U.、Kammerer, W.、Gentz, R.、Bujard, H.によって記載される(「エシェリヒア・コリにおけるプロモーター：ｉｎ  ｖｉｖｏ強度の階層は、代替構造を示す(Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures)」(EMBO J. 1986, 5, 2987-2994)）。例えば、強力な構成的プロモーターとしてＰRプロモーターが既知である。他の既知の強力なプロモーターは、λファージのＰLプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモータ
ー等である。
【００６０】
リボソームの１６Ｓ  ＲＮＡと相互作用するシャイン−ダルガーノ配列（ＳＤ配列）がｍＲＮＡの開始コドンの上流に位置する場合、天然のＳＤ配列に代えて、より効率的なＳＤ配列を本発明のＤＮＡ中に導入することにより、翻訳を増強することができる(Shine J.及びDalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4, 1342-6)。
【００６１】
強力なプロモーターの使用と複数の遺伝子コピーの使用とを組み合わせてもよい。
【００６２】
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、及びプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に既知の一般的な方法であればよい。これらの方法は、Sambrook, J.及びRussell D.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第３版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))等に記載されている。
【００６３】
本発明の細菌は、もともと分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌に上述のＤＮＡを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、当該ＤＮＡを既に含んでいる細菌に分岐鎖Ｌ−アミノ酸生産能を付与することにより得ることができる。
【００６４】
本発明の親株としては、Ｈ−８１（ＶＫＰＭ  Ｂ−８０６６）、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２８７及びＮＲＲＬ  Ｂ−１２２８８（米国特許第４，３９１，９０７号）、ＶＫＰＭ  Ｂ−４４１１（米国特許第５，６５８，７６６号）、ＶＫＰＭ  Ｂ−７７０７（欧州公開特許第１０１６７１０Ａ２号）等のエシェリヒア属に属するＬ−バリン生産菌が用いられる。また、Ｈ−９０７０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７０４）及びＨ−９０７２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７０６）（米国特許第５７４４３３１号）、ＶＫＰＭ  Ｂ−７３８６及びＶＫＰＭ  Ｂ−７３８８（ロシア特許第２１４０４５０号）、Ｗ１４８５ａｔｐＡ４０１／ｐＭＷｄＡＲ６、Ｗ１４８５ｌｉｐ２／ｐＭＷｄＡＲ６及びＡＪ１２６３１／ｐＭＷｄＡＲ６（欧州特許第０８７２５４７号）等のエシェリヒア属に属するＬ−ロイシン生産菌を用いることができる。また、（ＮＺ１０）ＴＤＨ６／ｐＶＩＣ４０株、ｐＭＷＤ５株(Hashiguchi,
K. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4), 672-679(1999))、又は欧州公開特許第６８５５５５Ａ１号に記載されているＡＪ１２９１９株等のエシェリヒア属に属するＬ−イソロイシン生産菌を使用することもできる。
【００６５】
３．本発明の方法
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養し、分岐鎖Ｌ−アミノ酸を培地中に生成させ、培地から分岐鎖Ｌ−アミノ酸を回収することにより、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリン等の分岐鎖Ｌ−アミノ酸を製造することを含む。
【００６６】
本発明においては、微生物を使用してアミノ酸を製造する従来の発酵方法と同様の方法により、培養並びに培地からの分岐鎖Ｌ−アミノ酸の回収及び精製等を実施することができる。培養に使用される培地は、炭素源、窒素源及びミネラル、また必要に応じて微生物が生育のために必要とする適当量の栄養素を含んでいれば、合成培地又は天然培地のいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース及びスクロース等の様々な炭水化物並びに様々な有機酸を挙げることができる。選択した微生物の同化形態に応じて、エタノール及びグリセロールなどのアルコールを使用してもよい。窒素源としては、アンモニア及び硫酸アンモニウム等の様々なアンモニウム塩、アミン等の他の窒素化合物、ペプトン等の天然窒素源、ダイズ加水分解物並びに消化された発酵性微生物が使用される。ミネラルとしては、リン酸一カリウム（Potassium monophosphate）、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、及び塩化カルシウム等が使用される。必要に応じて、培地に付加的な栄養素を加えてもよい。例えば、微生物が生育にプロリンを必要とする場合
（プロリン栄養要求性）、十分量のプロリンを培地に加えてもよい。
【００６７】
振盪培養及び通気しながらの撹拌培養等の好気条件下で、２０〜４２℃、好ましくは３７〜４０℃の温度で培養を行うことが好ましい。培養物のｐＨは、通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培養物のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、様々な酸、様々な塩基、及び緩衝液を用いて調整することができる。通常、１〜５日間の培養により、液体培地中に標的のＬ−アミノ酸が蓄積する。
【００６８】
培養後、遠心分離又は膜濾過により、液体培地から細胞等の固体を除去し、次いで、イオン交換法、濃縮法及び結晶化法により、標的のＬ−アミノ酸を回収及び精製することができる。
【実施例】
【００６９】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、以下により具体的に説明される。
【００７０】
＜実施例１＞
エシェリヒア・コリのＡＨＡＳ  ＩをコードするｉｌｖＢＮオペロンのクローニング
ｉｌｖＢＮオペロンを、２４３９ｂｐのＰＣＲ産物の一部としてｐＭＩＶ５ＪＳベクターにクローニングした。ｐＭＩＶ５ＪＳベクターの構築は、後述の参考例１において記載する。ＭＧ１６５５の染色体をＰＣＲの鋳型として使用した。合成オリゴヌクレオチドｉｌｖＢＸ６０（配列番号３）及びｉｌｖＢＲ６４（配列番号４）をプライマーとして使用した。プライマーｉｌｖＢＸ６０は５’末端にＸｂａＩ制限部位を含み、プライマーｉｌｖＢＲ６４は５’末端にＳａｌＩ制限部位を含む。ＰＣＲの条件では以下のとおりであった。９４℃で５分間変性；３０サイクルのプロファイル：９４℃で３０秒、５９℃で３０秒、７２℃で２分；最終ステップ：７２℃で７分間。アガロースゲル中で２４４９ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、ＸｂａＩ及びＳａｌＩで処理して、同じ制限酵素(restrictases)で処理したｐＭＩＶ５ＪＳベクターにクローニングした。Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ株をクローニングのための受容株として使用した。Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ株の構築は、参考例２において後述する。得られたプラスミドｐＭＩＶ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮ（図１）は、Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ株のＡＨＡＳ-表現型を補完した。
【００７１】
＜実施例２＞
エシェリヒア・コリのアセト乳酸合成酵素アイソフォームＩのバリン耐性変異体（ＩｌｖＢＮValR）の育種
実施例１に記載されたＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ／ｐＭＩＶ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮ株は、ＡＨＡＳをコードするオペロンを一つだけ含む（ｉｌｖＢＮオペロン）。バリン耐性の自然発生変異体を、１ｇ／ｌのバリンを補充した最小培地プレート上で選抜した。粗抽出物のアセト乳酸合成酵素活性及び酵素のＬ−バリン阻害耐性は、F.C. Stomer及びH.E. Umbargerの方法(Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592(1964))によって測定した。粗抽出物を得るために、細胞を対数増殖期の終期までＭ９最小培地で生育させ、１００ｍＭのＫＣｌを補充した１００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。同じ緩衝液中で細胞を超音波処理することによって、粗細胞抽出物を調製した。ＡＨＡＳ欠損株であるＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨを再度形質転換するために、選抜したバリン耐性変異体から単離されたプラスミドを使用した。結果的に、プラスミドｐＭＩＶ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33が得られ、これによりＡＨＡＳ欠損受容株のバリン耐性生育がもたらされた。このプラスミドは、バリン阻害に耐性のＡＨＡＳ  Ｉをコードするオペロンを含む。１０ｍＭのＬ−バリン存在下で残存するＡＨＡＳ活性を測定した。残存ＡＨＡＳ活性は、Ｌ−バリン存在下における活性（ｎｍｏｌ／分・ｍｇ）×１００（％）／Ｌ−バリン非存在下における活性（ｎｍｏｌ／分・ｍｇ
）で計算される。ＡＨＡＳ活性は、F.C. Stormer及びH.E. Umbarger(Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592(1964))の方法によって測定した。この株に関するＡＨＡＳ活性の測定結果を表１に示す。
【００７２】
＜実施例３＞
バリン耐性のＡＨＡＳ  Ｉをコードする遺伝子のヌクレオチド配列
ｐＭＩＶ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮ３３：ＭＬ７４（配列番号５）、ＬａｔｔＲＳ１（配列番号６）、ｉｌｖｂＳ３１（配列番号７）、ｉｌｖｂＳ３２（配列番号８）、及びｉｌｖｂＳ３３（配列番号９）にクローニングされたｉｌｖＢＮ  ＤＮＡのフラグメントをシークエンシングするために、５つのオリゴヌクレオチドを使用した。このシークエンシングの方法を図２に示す。
【００７３】
得られた配列は、配列表においてｉｌｖＢＮ３３（配列番号１０）として示される。この配列を計算プログラムで比較することにより、小サブユニットをコードする領域における３４ヌクレオチドのダイレクトリピートが明らかになった。この変異遺伝子はｉｌｖＮ３３と名付けられた（図３）。このようなＤＮＡ再編成によって早期に翻訳が終結し、４４位のイソロイシンより下流のＮ末端部分がアルギニン及びフェニルアラニンで置換されて、それにより４５アミノ酸の短縮タンパク質ＩｌｖＮ３３が形成される（配列番号１１）。
【００７４】
＜実施例４＞
ＡＨＡＳ欠損株の染色体へのＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33オペロンの組込みと、その後のｃａｔマーカーの除去
１．ｃａｔ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33遺伝子の染色体への組込み
ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33を細菌の染色体に組込むために、標準的な手法を使用した。ｐＭＩＶ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33をＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ／ｐＭＨ１０細胞に導入した。ｐＭＨ１０（ＫｍR遺伝子、ＭｕトランスポザーゼをコードするＭｕファージＡ及びＢの遺伝子、Ｍｕリプレッサーをコードするｃｔｓ６２遺伝子、及びファージ−λリプレッサー遺伝子ｃＩ８５７を有するｐＡＣＹＣ１７７誘導体）によってコードされるＭｕトランスポザーゼ（欧州特許第１１４９９１１号）は、形質転換の直後に４４℃で２０分間インキュベートすることにより誘導された。
【００７５】
クロラムフェニコール耐性（ＣｍR）のクローンを３０℃で２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上で選抜した。ＬＢにおいてこれらのクローンを培養することにより両プラスミドを除去した後、添加物を入れない最小培地で生育することができるＣｍRＫｍSＡｐSクローンを得た。
【００７６】
結果的に、同定されていない染色体座に組込みカセット(integrated cassette)であるｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33を含む、Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株が得られた。
【００７７】
２．Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株からのクロラムフェニコール耐性マーカーの除去
Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株からクロラムフェニコール耐性マーカーを除去するために、細胞をプラスミドｐＭＷ１１８−ｉｎｔ−ｘｉｓ（ＡｐR）（ＷＯ２００５／０１０１７５号）で形質転換した。１５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で、３０℃でＡｐRクローンを生育させた。数十個のＡｐRクローンを拾い、クロラムフェニコール感受性に
ついて試験した。ＬＢ寒天プレート上で、４２℃でインキュベートすることにより、ＣｍS細胞からプラスミドｐＭＷ１１８−ｉｎｔ−ｘｉｓを除去した。結果的に、同定されていない染色体座に組込みカセットｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33を含む、Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株を得た。１０ｍＭのＬ−バリン存在下での残存ＡＨＡＳ活性を測定した。この株におけるＡＨＡＳ活性の測定結果を表１に示す。
【００７８】
＜実施例５＞
ｉｌｖＢＮValR33オペロンの天然プロモーターの、人工の調節領域による置換
１．ｉｌｖＢＮValR33オペロンの調節領域の改変
ｉｌｖＢＮValR33オペロンの調節領域の改変すなわちｉｌｖＢＮオペロンの天然のプロモーター領域のＰLプロモーターによる置換は、「Ｒｅｄ駆動型組込み(Red-driven integration)」と呼ばれるDatsenko及びWanner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって初めて開発された方法によって達成された。この手法に従い、ＰＣＲプライマーであるｉｌｖＢ−ａｔｔＲ１（配列番号１２）及びｉｌｖＢ−ＰＬＳＤ（配列番号１３）を構築した。オリゴヌクレオチドｉｌｖＢ−ａｔｔＲ１（配列番号１２）は、ｉｌｖＢ遺伝子の上流に位置する領域及びＢＷ２５１１３ｃａｔ−ＰL−ｙｄｄＧの染色体ＤＮＡに存在する抗生物質耐性を付与する遺伝子に隣接する領域と相同性を有する。オリゴヌクレオチドｉｌｖＢ−ＰＬＳＤ（配列番号１３）は、ｉｌｖＢ領域及びＢＷ２５１１３ｃａｔ−ＰL−ｙｄｄＧの染色体に存在するＰLプロモーターの下流に位置する領域の両者と相同性を有する。ＢＷ２５１１３ｃａｔ−ＰL−ｙｄｄＧの取得については既に詳細に記載されている（欧州公開特許第１４４９９１８Ａ１号、ロシア特許第２２２２５９６号）。ＢＷ２５１１３ｃａｔ−ＰL−ｙｄｄＧ株の染色体ＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲの条件は以下のとおりであった。９５℃で３分間変性；最初の２サイクルのプロファイル：９５℃で１分、３４℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の３０サイクルのプロファイル：９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終ステップ：７２℃で５分間。その結果、ＰＣＲ産物が得られ（配列番号１４）、アガロースゲル中で精製し、温度感受性の複製起点を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むエシェリヒア・コリＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株のエレクトロポレーションに使用した。プラスミドｐＫＤ４６(Datsenko及びWanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45)は、アラビノース誘導性のＰaraBプロモーター制御下にあるλ  Ｒｅｄ相同組換え系の遺伝子（γ、β、エキソ遺伝子）を含み、ファージλ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４５９）の２１５４塩基（３１０８８〜３３２４１）のＤＮＡフラグメントを含む。プラスミドｐＫＤ４６は、ＰＣＲ産物をＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株の染色体に組込むのに必要である。
【００７９】
エレクトロコンピテント細胞を以下のように調製した。エシェリヒア・コリＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株をアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）含有ＬＢ培地において３０℃で一晩生育させ、この培養物をアンピシリン及びＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含有するＳＯＢ培地(Sambrook et al.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第２版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))５ｍｌで１００倍に希釈した。細胞を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させ、それから１００倍に濃縮し、氷冷した脱イオンＨ2Ｏで３回洗浄することによりエレクトロコンピテントな状態とした。細胞７０μｌ及びＰＣＲ産物約１００ｎｇを使用して、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、細胞をＳＯＣ培地(Sambrook et al.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第２版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))１ｍｌで３７℃で２．５時間インキュベートし、Ｌ寒天上にプレーティングし、３７℃で生育させ、ＣｍR組換え体を選抜した。次いで、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、４２℃で、Ｃｍを含む
Ｌ寒天上での継代を２回行い、得られたコロニーについてアンピシリンに対する感受性を試験した。
【００８０】
２．ｉｌｖＢＮ調節領域の改変の確認
Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮValR33クローンが得られたが、これには、Ｃｍ耐性遺伝子で標識された、ファージλＰLプロモーターの制御下でフィードバック耐性のＡＨＡＳ  Ｉをコードする変異型のｉｌｖＢＮValR33オペロンを有するｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮValR33のカセットが含まれる。天然のｉｌｖＢＮ調節領域の、Ｃｍ耐性遺伝子で標識されたＰLプロモーターによる置換をＰＣＲによって確認した。ファージＭｕの右側接着部位に特異的なプライマーＭＲ７４（配列番号１５）及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子Ｃｍ−ｔｅｓｔ２に特異的なプライマー（配列番号１６）を、確認のためのＰＣＲで使用した。ＰＣＲでの確認の条件は以下のとおりであった。９４℃で３分間変性；３０サイクルのプロファイル：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分；最終ステップ：７２℃で７分間。Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33細胞を鋳型として使用して得られたＰＣＲ産物は、５８６塩基の長さであった（配列番号１７）。Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮValR33細胞を鋳型として使用して得られたＰＣＲ産物は、８７９塩基長であった（配列番号１８）。１０ｍＭのＬ−バリン存在下での、Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮValR33株における残存ＡＨＡＳ活性を測定した。この株におけるＡＨＡＳ活性の測定結果を表１に示す。
【００８１】
【表１】
0005813907.tif 000002
【００８２】
＜実施例６＞
バリン耐性のＡＨＡＳ  Ｉを有するエシェリヒア・コリの株によるＬ−バリンの生産
エシェリヒア・コリＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株及びＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮValR33の両者を、Ｌ寒天プレート上で３７℃で１８時間生育させた。その後、プレート表面の約０．５ｃｍ2からの細胞を発酵培地（２ｍｌ）に導入し、３２℃で７２時間、通気をしながら試験管で培養した。栄養要求性のＡＨＡＳ欠損株Ｂ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨに対しては、発酵培地にそれぞれ１
００μｇ／ｍｌのイソロイシン及びバリンをさらに補充した。蓄積したＬ−バリンをＴＬＣにより測定した。結果を表２に示す。
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース            ６０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4      １８．０
ＫＨ2ＰＯ4 ３Ｈ2Ｏ   ２．０
ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ    １．０
ＣａＣＯ3            ２５．０
チアミン              ０．０２
豆濃（Mameno）        ４．０
【００８３】
【表２】
0005813907.tif 000003
【００８４】
表２に示されるように、バリン耐性ＡＨＡＳ  Ｉの発現によってバリンの生成がもたらされる。ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33オペロンは転写減衰及び環状ＡＭＰによって制御される。エシェリヒア・コリＢ７ΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭΔｉｌｖＩＨ  ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ＰivbL−ｉｌｖＢＮValR33株における、ｉｌｖＢＮValR33オペロンの天然の調節領域（リーダーペプチドをコードする遺伝子（ｉｖｂＬ）の除去を含む）のファージλのＰLプロモーターによる置換によって、Ｌ−バリンの生産が１．５倍に増加した。
【００８５】
＜実施例７＞
ｉｌｖＢＮの発現が改変された、ＡＨＡＳ  Ｉがバリン耐性である、新規エシェリヒア・コリ変異体
Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＧＭ株において、実施例５で記載されたものと同様の方法により、ｉｌｖＢＮオペロンの天然の調節領域をファージλＰLプロモーターで置換した（参考例２のセクション５を参照のこと）。この株はＡＨＡＳ  Ｉのみを有する。得られたＢ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＧＭ  ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮ株はバリン感受性であった。この株から、ＡＨＡＳ  Ｉの新規のバリン耐性自然発生変異体が得られた。１ｇ／ｌのバリンでより良好に生育した株の特徴付けを行った（表３）。
【００８６】
【表３】
0005813907.tif 000004
【００８７】
バリン耐性の変異体であって、イソロイシンにも耐性であるものが得られた。野生型の比活性よりも高い比活性を有する変異体が得られた。表４に示されるように、バリン耐性のＡＨＡＳ  Ｉの発現によって、バリンの生成がもたらされた。発酵培地は６％のグルコースを含んでいた。２つの最良の変異体、ｉｌｖＢＮ  ＶａｌＲ１及びｉｌｖＢＮ  ＶａｌＲ４に対する変異型オペロンのヌクレオチド配列を決定した。ＩｌｖＢＮ  ＶａｌＲ１は、ＩｌｖＮにおいて１つの点変異（Ａ３０Ｐ  Ａｌａ−Ｐｒｏ（３０位のＡｌａがＰｒｏで置換、対応するコドンｇｃｃがｃｃｃで置換された））を含み、またＩｌｖＢＮ  ＶａｌＲ４も、ＩｌｖＮにおいて１つの点変異（Ｎ１７Ｋ  Ａｓｎ−Ｌｙｓ（１７位のＡｓｎがＬｙｓで置換、対応するコドンａａｃがａａｇで置換された））を含むことが明らかになった。いずれにせよ、このような置換は稀であった。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
＜実施例８＞
バリン耐性のＡＨＡＳ  Ｉを有するエシェリヒア・コリの株によるＬ−ロイシンの生産
ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮ  ＶａｌＲ４カセットをＬ−ロイシン生産性のエシェリヒア・コリ５７株に導入した（ロシア特許第２１４０４５０号、ＶＫＰＭ  Ｂ−７３８６）。この目的のため、エシェリヒア・コリ５７株に、ドナー株であるＢ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＧＭ  ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮＶａｌＲ４上で生育させたＰ１virを感染させた。クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を補充したＬ寒天プレート上で形質導入株を選抜した。前記５７株は、アクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−７３８６で、１９９７年５月１９日にロシア国立産業微生物保存機関(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)（ＶＫＰＭ）(Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)に寄託された。
【００９０】
エシェリヒア・コリ５７株及びエシェリヒア・コリ５７ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮＶａｌＲ４株の両方を、実施例６に示すように培養した。蓄積したＬ−ロイシンをＴＬＣによって測定した。結果を表５に示す。
【００９１】
【表５】
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【００９２】
表５に示されるように、５７ｃａｔ−ＰL−ｉｌｖＢＮＶａｌＲ４株はより多量のＬ−ロイシンを生産した。
【００９３】
＜参考例１＞
プラスミドｐＭＩＶ５ＪＳの構築
ＰＭＩＶ−５ＪＳを以下のスキームに従って構築した。最初に、Ｍｕ由来の組込みカセットをｐＭＷ１１９の誘導体であるプラスミドｐＭＷ１にｉｎ  ｖｉｖｏで組込むことによって、プラスミドｐＭ１２を構築した（図４）。互いに相補的な２つのターミネーターオリゴヌクレオチド配列を合成した（配列番号１９及び配列番号２０）。順方向（配列番号１９）及び逆方向（配列番号２０）にこれらの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって、ターミネーターｔｈｒＬを得た。ターミネーターｔｈｒＬはＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＰｓｔＩ部位により両側を挟まれている。次いで、合成ターミネーター配列Ｔｅｒ（ｔｈｒ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化したｐＭ１２に挿入することによって、プラスミドｐＭ１２−ｔｅｒ（ｔｈｒ）を構築した（図５）。
【００９４】
ｉｎｔＪＳ組込みカセットを以下のように構築した（図６）。
ａ）上流のプライマー（配列番号２１）（ＢｇｌＩＩに関する部位を下線で示す）及びリン酸化した下流のプライマー（配列番号２２）を用いたＰＣＲ増幅によって、０．１２ｋｂｐのＬａｔｔＬフラグメントを得た。鋳型として、プラスミドｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−ｔｅｔ−ａｔｔＲ−ｔｅｒ＿ｒｒｎＢを使用した（ＷＯ２００５／０１０１７５号）。
ｂ）リン酸化した上流のプライマー（配列番号２３）及び下流のプライマー（配列番号２４）（ＰｓｔＩに関する部位を下線で示す）を用いたＰＣＲ増幅によって、１．０３ｋｂｐのＣｍRフラグメントを得た。鋳型として、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を使用した。
ｃ）上流のプライマー（配列番号２５）（ＰｓｔＩに関する部位を下線で示す）及び下
流のプライマー（配列番号２６）（ＳａｃＩに関する部位を下線で示す）を用いたＰＣＲ増幅によって、０．１６ｋｂｐのＬａｔｔＲフラグメントを得た。鋳型として、プラスミドｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−ｔｅｔ−ａｔｔＲ−ｔｅｒ＿ｒｒｎＢを使用した。
ｄ）ＬａｔｔＬフラグメント及びＣｍRフラグメントをライゲーションして、得られた１．１５ｋｂｐのＬａｔｔＬ−ＣｍRフラグメントを精製した
ｅ）ＬａｔｔＬ−ＣｍRフラグメント及びＬａｔｔＲフラグメントをＰｓｔＩで消化し、ライゲーションして、得られた１．３１ｋｂｐのＬａｔｔＬ−ＣｍR−ＬａｔｔＲフラグメントを精製した。
ｆ）２つの合成されたオリゴヌクレオチド（配列番号２７で示される配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２７に相補的な配列を有する別のオリゴヌクレオチド）をアニーリングすることによって、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含む７０ｂｐの二本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。
ｇ）ＬａｔｔＬ−ＣｍR−ＬａｔｔＲフラグメント及びＭＣＳフラグメントをＳａｃＩで消化し、ライゲーションして、得られた１．３８ｋｂｐのＬａｔｔＬ−ＣｍR−ＬａｔｔＲ−ＭＣＳのカセットを精製した。
【００９５】
最後のステップとして、ＬａｔｔＬ−ＣｍR−ＬａｔｔＲ−ＭＣＳフラグメントをＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＭ１２−ｔｅｒ（ｔｈｒ）にクローニングすることにより、プラスミドｐＭＩＶ−５ＪＳを得た（図７）。
【００９６】
＜参考例２＞
不活性化したアセト乳酸合成酵素遺伝子を有する株の構築
１．ｉｌｖＢＮオペロンの欠失
「Ｒｅｄ−駆動型組込み（Red-driven integration）」と呼ばれる、Datsenko及びWanner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって初めて開発された方法により、ｉｌｖＢＮオペロンを欠失させた。この手順に従って、ｉｌｖＢＮオペロンに隣接する領域及び鋳型プラスミド中のクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子の両者と相同性を持つＰＣＲプライマーｉｌｖＢＮ１（配列番号２８）及びｉｌｖＢＮ２（配列番号２９）を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型として、プラスミドｐＭＷ−ａｔｔＬ−Ｃｍ−ａｔｔＲ（ＷＯ０５／０１０１７５号）を使用した。ＰＣＲの条件は以下のとおりであった。９５℃で３分間の変性ステップ；最初の２サイクルのプロファイル：９５℃で１分、３４℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の３０サイクルのプロファイル：９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終ステップ：７２℃で５分間。
【００９７】
得られた１７１３ｂｐのＰＣＲ産物をアガロースゲル中で精製し、これを温度感受性の複製起点を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のエレクトロポレーションに使用した。ｐＫＤ４６プラスミド(Datsenko及びWanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45)は、ファージλ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４５９）の２１５４塩基（３１０８８〜３３２４１）のＤＮＡフラグメントを含み、アラビノース誘導性のＰaraBプロモーター制御下にλＲｅｄ相同組換え系の遺伝子（γ、β、エキソ遺伝子）を含む。ｐＫＤ４６プラスミドは、ＰＣＲ産物をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体に組込むために必要である。
【００９８】
エレクトロコンピテント細胞は以下のように調製した。アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地において３０℃で一晩生育させたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の培養物を、アンピシリン及びＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含有するＳＯＢ培地(Sambrook et al.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第２版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))５ｍｌで１００倍に希釈した。培養物を、通気しながら３０℃でＯＤ600が約０．６になるまで生育させ、それから１００倍に濃縮し
、氷冷した脱イオンＨ2Ｏで３回洗浄することによりエレクトロコンピテントな状態にした。細胞７０μｌ及びＰＣＲ産物約１００ｎｇを使用して、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、細胞をＳＯＣ培地(Sambrook et al.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第２版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))１ｍｌで３７℃で２．５時間インキュベートし、Ｌ寒天上にプレーティングして、３７℃で生育させ、ＣｍR組換え体を選抜した。次いで、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、４２℃で、Ｃｍを含むＬ寒天上での継代を２回行い、得られたコロニーについてアンピシリンに対する感受性を試験した。このように、不活性化したｉｌｖＢＮオペロンを有する変異株ＭＧ１６５５ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔを構築した。
【００９９】
２．ＰＣＲによるｉｌｖＢＮオペロンの欠失の確認
ｉｌｖＢＮオペロンを欠失し、Ｃｍ耐性遺伝子で標識された変異体を、ＰＣＲにより確認した。遺伝子座に特異的なプライマーｉｌｖＢＮＣ５（配列番号３０）及びｉｌｖＢＮＣ６（配列番号３１）を、確認のためのＰＣＲに使用した。ＰＣＲでの確認の条件は以下のとおりであった。９４℃で３分間の変性ステップ；３０サイクルのプロファイル：９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分；最終ステップ：７２℃で７分間。ｉｌｖＢＮ+である親株ＭＧ１６５５由来の染色体ＤＮＡを鋳型として使用した反応で得られたＰＣＲ産物は、２２７５塩基の長さであった。変異株ＭＧ１６５５ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔ株由来の染色体ＤＮＡを鋳型として使用した反応で得られたＰＣＲ産物は、１９９５塩基の長さであった（図８）。
【０１００】
３．ｉｌｖＩＨオペロンの欠失
セクション１に記載されたｉｌｖＢＮオペロンの欠失と同様の方法で、ｉｌｖＩＨオペロンを欠失させた。この手順に従って、ｉｌｖＩＨオペロンに隣接する領域及び鋳型プラスミド中のクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子の両者と相同性を有するＰＣＲプライマーｉｌｖＩＨ１（配列番号３２）及びｉｌｖＩＨ２（配列番号３３）を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型として、プラスミドｐＭＷ−ａｔｔＬ−Ｃｍ−ａｔｔＲ（ＰＣＴ国際公開ＷＯ０５／０１０１７５号）を使用した。ＰＣＲの条件は以下のとおりであった。９５℃で３分間の変性ステップ；最初の２サイクルのプロファイル：９５℃で１分、３４℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の３０サイクルのプロファイル：９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終ステップ：７２℃で５分間。
【０１０１】
１７１３ｂｐのＰＣＲ産物をアガロースゲル中で精製し、これをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６株のエレクトロポレーションに使用した。エレクトロポレーション後にクロラムフェニコール耐性の組換え体を選抜し、遺伝子座に特異的なプライマーｉｌｖＩＨＣ３（配列番号３４）及びｉｌｖＩＨＣ４（配列番号３５）を用いたＰＣＲによって確認した。ＰＣＲでの確認の条件は以下のとおりである。９４℃で３分間の変性ステップ；３０サイクルのプロファイル：９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分２０秒；最終ステップ：７２℃で７分間。ＩｌｖＩＨ+である親株ＭＧ１６５５Ｂ７ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔ由来の染色体ＤＮＡを鋳型として使用した反応で得られたＰＣＲ産物は、２４９１塩基の長さであった。変異株ＭＧ１６５５Ｂ７ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔ  ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ株由来の染色体ＤＮＡを鋳型として使用した反応で得られたＰＣＲ産物は、１８２３塩基の長さであった。その結果、ＭＧ１６５５ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ株が得られた。
【０１０２】
４．ｉｌｖＧＭオペロンの欠失
セクション１に記載されたｉｌｖＢＮオペロンの欠失と同様の方法で、ｉｌｖＧＭオペロンを欠失させた。この手法に従って、ｉｌｖＧＭオペロンに隣接する領域及び鋳型プラスミド中のクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子の両者と相同性を有するＰＣＲプライマーｉｌｖＧＭ１（配列番号３６）及びｉｌｖＧＭ２（配列番号３７）を構築した。Ｐ
ＣＲ反応の鋳型として、プラスミドｐＭＷ−ａｔｔＬ−Ｃｍ−ａｔｔＲ（ＰＣＴ国際公開ＷＯ０５／０１０１７５号）を使用した。ＰＣＲの条件は以下のとおりであった。９５℃で３分間の変性ステップ；最初の２サイクルのプロファイル：９５℃で１分、３４℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の３０サイクルのプロファイル：９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終ステップ：７２℃で５分間。
【０１０３】
１７１３ｂｐのＰＣＲ産物をアガロースゲル中で精製し、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６株のエレクトロポレーションに使用した。エレクトロポレーション後にクロラムフェニコール耐性の組換え体を選抜し、遺伝子座に特異的なプライマーｉｌｖＧＭＣ３（配列番号３８）及びｉｌｖＧＭＣ４（配列番号３９）によるＰＣＲによって確認した。ＰＣＲでの確認の条件は以下のとおりであった。９４℃で３分間の変性ステップ；３０サイクルのプロファイル：９４℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で１分３０秒；最終ステップ：７２℃で７分間。親株ＭＧ１６５５由来の染色体ＤＮＡを鋳型として使用した反応で得られたＰＣＲ産物は、２２０９塩基の長さであった。変異株ＭＧ１６５５ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株由来の染色体ＤＮＡを鋳型として使用した反応で得られたＰＣＲ産物は、１９４１塩基の長さであった。結果的に、ＭＧ１６５５ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株が得られた。
【０１０４】
５．全てのアセト乳酸合成酵素遺伝子が不活性化した株の構築（ΔｉｌｖＢＮ、ΔｉｌｖＩＨ及びΔｉｌｖＧＭの各欠失の組み合わせ）
Ｐ１形質導入によって、野生型のエシェリヒア・コリＫ１２株（ＶＫＰＭ  Ｂ−７）において、ｉｌｖＩＨ遺伝子（ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ）を欠失させた(Sambrook et al.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第２版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))。セクション３に記載されたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ株をドナー株として使用し、ＣｍＲ形質導入株を選抜した。結果的に、Ｂ７ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ株が得られた。Ｂ７ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔからクロラムフェニコール耐性マーカーを除去するために、プラスミドｐＭＷ１１８−ｉｎｔ−ｘｉｓ（ＡｐR）で細胞を形質転換した（ＷＯ２００５／０１０１７５号）。ＡｐRクローンを、３０℃で１５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で生育させた。数十個のＡｐRクローンを拾い、クロラムフェニコール感受性について試験した。ＬＢ寒天プレート上で、４２℃でインキュベートすることにより、プラスミドｐＭＷ１１８−ｉｎｔ−ｘｉｓをＣｍS細胞から除去した。結果的に、Ｂ７ΔｉｌｖＩＨ株が得られた。
【０１０５】
Ｐ１形質導入によって、エシェリヒア・コリＢ７ΔｉｌｖＩＨ株において、ｉｌｖＢＮ遺伝子（ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔ）を欠失させた。セクション１に記載されたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔ株をドナー株として使用し、ＣｍＲ形質導入株を選抜した。結果的に、Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔ株が得られた。Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔからクロラムフェニコール耐性マーカーを上記のように除去した。結果的に、Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＢＮ株が得られた。
【０１０６】
Ｐ１形質導入によって、エシェリヒア・コリＢ７ΔｉｌｖＩＨ株において、ｉｌｖＧＭ遺伝子（ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ）を欠失させた。セクション４に記載されたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株をドナー株として使用し、ＣｍＲ形質導入株を選抜した。結果的に、Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株が得られた。Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔからクロラムフェニコール耐性マーカーを上記のように除去した。結果的に、Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＧＭ株が得られた。Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＧＭ株は原栄養性であったので、ｉｌｖＧＭ遺伝子の欠失によって、イソロイシン−バリンオペロンの末端部の遺伝子(distal genes)の発現は妨げられないことがわかった。
【０１０７】
Ｐ１形質導入によって、エシェリヒア・コリＢ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＢＮ株において、ｉｌｖＧＭ遺伝子（ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ）を欠失させた。セクション４に記載されたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株をドナー株として使用し、ＣｍＲ形質導入株を選抜した。結果的に、Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株が得られた。Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔからクロラムフェニコール耐性マーカーを上記のように除去した。結果的に、Ｂ７ΔｉｌｖＩＨΔｉｌｖＢＮΔｉｌｖＧＭ株が得られた。
【０１０８】
本発明を、その好ましい実施形態を参照して詳細に記載してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更や同等物の利用が可能であることは、当業者にとって明らかであろう。本明細書中の全ての引用文献は、参照により本願の一部として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】プラスミドｐＭＩＶ−ＰivbL−ｉｌｖＢＮの構築を示す図である。
【図２】ｉｌｖＢＮ３３オペロンをシークエンシングする方策を示す図である。
【図３】ｉｌｖＮ及びｉｌｖＮ３３のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ヌクレオチド配列は小文字で示され、アミノ酸は大文字で示される。ｉｌｖＮ３３における３４ｂｐのダイレクトリピートは太字で示され、矢印が付されている。
【図４】プラスミドｐＭ１２の構築を示す図である。
【図５】プラスミドｐＭ１２−ｔｅｒ（ｔｈｒ）の構築を示す図である。
【図６】ｉｎｔＪＳの組込みカセットの構築を示す図である。
【図７】プラスミドｐＭＩＶ−５ＪＳの構築を示す図である。
【図８】不活性化したｉｌｖＢＮ遺伝子を有する染色体ＤＮＡフラグメントの構築を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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