(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された非ヒト組換え生物。
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有する核酸
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉｖ）前記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
【請求項２】
組換えカイコである、請求項１に記載の組換え生物。
【請求項３】
請求項２に記載の組換えカイコにより作られる絹糸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
優れた強度を有する天然繊維として、クモの糸が注目されている。しかし、クモは、共食いをするため集団飼育には適さず、１匹のクモから得られる糸の量はわずかである。しかも、クモは目的に応じて多種類の糸を使い分けるため、クモ糸の大量生産は困難である。
【０００３】
そこで、遺伝子組み換え技術を用いて、クモ以外の生物に、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を導入し、クモ糸を作らせる試みがなされている。例えば、遺伝子組換えヤギにクモ糸タンパク質を作らせ、ヤギの乳中からクモ糸タンパク質を得る方法が開示されている（特許文献１）。しかし、上記方法による場合、クモ糸タンパク質を抽出、精製し、人工的に紡糸する必要があり、手間やコスト、溶媒による環境への負荷等の点で問題がある。
【０００４】
上記問題を解決するため、カイコに、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を導入し、クモ糸タンパク質を作らせる試みがなされている（特許文献２）。組換えカイコによれば、クモ糸タンパク質が絹糸として吐糸されるため、上記抽出、精製、紡糸等の処理が不要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５０６６４２号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０６８４９５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の組換えカイコにより作られる絹糸の物性は、本来のクモ糸の物性には遠く及ばず、強度が不十分なものであった。
【０００７】
そこで、本発明は、優れた物性を有するタンパク質を作る組換え生物、及びその組換え生物により作られる物性の優れたタンパク質を提供することを目的とする。また、十分に優れた強度を有する絹糸を作る組換えカイコ、及びその組換えカイコにより作られる、十分に優れた強度を有する絹糸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、被組換え生物にナガコガネグモの遺伝子を導入した場合に、得られるタンパク質の物性が優れることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された組換え生物、及び、上記組換え生物により作られるタンパク質に関する。
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有する核酸
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉｖ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
【００１０】
上記特定の核酸を導入することにより、組換え生物が作るタンパク質は、クモタンパク質を多く含むものとなり、その結果、強度などの物性が優れたものとなる。
【００１１】
特に、本発明は、上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された組換えカイコ、及び、上記組換えカイコにより作られる絹糸に関する。上記特定の核酸をカイコに導入することにより、組換えカイコが作る絹糸は、クモタンパク質を多く含むものとなり、その結果、十分な強度を有するものとなる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、優れた物性を有するタンパク質を作る組換え生物、及びその組換え生物により作られる物性の優れたタンパク質を提供することが可能となる。また、十分に優れた強度を有する絹糸を作る組換えカイコ、及びその組換えカイコにより作られる、十分に優れた強度を有する絹糸を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】遺伝子組換え用ベクタープラスミドの構造を示す模式図である。
【図２】クモ遺伝子発現カセットが挿入された位置の右側のカイコゲノム配列を示す図である。
【図３】遺伝子組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示す図である。
【図４】組換えカイコ（Ａ）と非組換えカイコ（Ｂ）の絹糸の走査電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
本発明は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された組換え生物、及び、上記組換え生物により作られるタンパク質に関する。
（ｉ）配列番号１の塩基配列を有する核酸
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、牽引糸タンパク質をコードする核酸
（ｉｖ）上記（ｉ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、牽引糸タンパク質をコードする核酸
【００１６】
特に、本発明は、上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの核酸が導入された組換えカイコ、及び、上記組換えカイコにより作られる絹糸に関する。
【００１７】
配列番号１の塩基配列を有する核酸は、コガネグモ属ナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）において、牽引糸（又は縦糸）タンパク質の主成分であるＭａＳｐ１（大瓶状腺スピドロイン１）タンパク質をコードする核酸であるが、配列番号１の塩基配列を有するものであれば、人工合成により得たものでもよく、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから得たものでもよく、これらのものをＰＣＲで増幅したものや制限酵素で切り出したものでもよい。
【００１８】
配列番号２のアミノ酸配列は、ナガコガネグモのＭａＳｐ１タンパク質が有するアミノ酸配列である。
【００１９】
カイコに導入する核酸は、牽引糸タンパク質をコードするものであれば、配列番号１の塩基配列を有する核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸（ｉｉｉ）であってもよい。上記配列同一性は９０％以上であればよいが、９５％以上であることが好ましく、９８％以上であることがより好ましい。
【００２０】
また、カイコに導入する核酸は、牽引糸タンパク質をコードするものであれば、配列番号１の塩基配列を有する核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｉｖ）であってもよい。ここで、核酸の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。また、「ハイブリダイズ」とは、上記相補鎖間で起こる相補的結合、又は一本鎖核酸分子間の塩基対相互作用の形成を意味する。
【００２１】
上記「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。
【００２２】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【００２３】
本明細書において、「組換え生物」とは、遺伝子組換えにより外来遺伝子が染色体に導入され、形質転換された生物を示す。形質転換される対象となる被組換え生物としては、特に制限はなく、昆虫、動物、植物、微生物等を用いることができるが、昆虫を用いることが好ましい。好適な昆虫としては、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（てんさん）（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（さくさん）（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）等が挙げられる。なかでも、カイコガ科に属するカイコ、クワコ等が好適に用いられ、特に、カイコを用いることが好ましい。
【００２４】
本明細書において、「カイコ」とは、カイコガ属カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）をいう。カイコは、実験用の品種であっても、実用商品化された実用品種であってもよい。また、「組換えカイコ」とは、遺伝子組換えにより外来遺伝子がカイコ染色体に導入され、形質転換されたカイコを示す。本実施形態において、遺伝子組み換えはトランスポゾンを用いる方法により行うが、外来遺伝子をカイコに導入できる方法であれば制限はなく、エレクトロポレーション等の他の方法によって遺伝子組み換えを行ってもよい。
【００２５】
本明細書において、「絹糸」とは、カイコ、クワコ、天蚕、柞蚕等により吐糸される繊維であり、繭を構成し、フィブロインタンパク質を主成分とするものである。フィブロインタンパク質は、大小２つのサブユニット（Ｈ鎖及びＬ鎖）からなる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
（クモ遺伝子）
配列番号１の塩基配列を有する核酸を含むベクターを利用し、上記核酸の両端にマッチするプライマーを設計し、ＰＣＲ法によりクモ遺伝子を取得した。プライマーには、次の遺伝子操作をするために、あらかじめ適当な制限酵素サイトを設けた。具体的には、フォワードプライマーとしてＭａＳｐ１ＦＷ（５’−ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣ−３’）（配列番号３）を用い、リバースプライマーとしてＭａＳｐ１ＲＶ（５’−ＧＡＣＡＡＴＣＣＧＴＡＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧ−３’）（配列番号４）を用いた。
【００２８】
（カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列）
カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列は、同遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ２２６６８８）に基づいて設計したプライマーを用い、通常のカイコゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法により取得した。具体的には、フォワードプライマーとして制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含むＰｆｉｂＨ５’（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’）（配列番号５）を用い、リバースプライマーとしてＳｐｅＩサイトを含むＰｆｉｂＨ３’（５’−ＴＧＣＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴ−３’）（配列番号６）を用いた。
【００２９】
（カイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列）
カイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列は、同遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＦ２２６６８８）に基づいて設計したプライマーを用い、通常のカイコゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法により取得した。具体的には、フォワードプライマーとして、ＮｈｅＩサイトを含むＬＢＳ−ＦＷ（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧ−３’）（配列番号７）を用い、リバースプライマーとして、ＢａｍＨＩサイトを含むＬＢＳ−ＲＶ（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＣ−３’）（配列番号８）を用いた。
【００３０】
（遺伝子組換用ベクタープラスミドの作製）
上記カイコフィブロインＨ鎖プロモーター配列（ＦＰ）、クモ遺伝子配列（ＭＡＳＰ）及びカイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列（ＦＣ）を順に連結し、クモ遺伝子発現カセットとした。このクモ遺伝子発現カセットを、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含むベクタープラスミドに導入し、遺伝子組換え用ベクタープラスミドとした。図１は、遺伝子組換え用ベクタープラスミドの構造を示す模式図である。図１中の記号は以下のものを意味する。
【００３１】
ＦＰ：カイコフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター配列
ＭＡＳＰ：クモ遺伝子配列
ＦＣ：カイコフィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分配列
ＭＫ：マーカー遺伝子配列
Ｌ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＬハンド
Ｒ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＲハンド
【００３２】
（組み換えカイコの作製）
上記遺伝子組換用ベクタープラスミドを、大腸菌で増殖させ、「ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ」（（株）キアゲン社製）を用い、キットに添付したマニュアルに従って精製した。トランスポゼースタンパク質遺伝子を含むヘルパープラスミドも上記の方法で精製した。精製した上記のプラスミドＤＮＡをＴＥバッファーで溶解し、遺伝子組換え用ベクタープラスミドＤＮＡとヘルパープラスミドＤＮＡを１対１の比で混和し、エタノール沈殿を行った。最後に、この混和ＤＮＡを４００ｎｇ／ｕｌの濃度になるように、５ｍＭのＫＣｌを含むｐＨ７のリン酸バッファーで調製した。これを産後３〜６時間のカイコ卵に顕微鏡の下で注射した。
【００３３】
注射した卵をＧ０世代とし、Ｇ０世代が成長したガはＧ０ガと呼び、Ｇ０ガを親として産まれる卵はＧ１卵とする。Ｇ０ガを未注射のガと交尾させ、Ｇ１卵を採取し、催青期のＧ１卵について、蛍光顕微鏡の下で蛍光の発する個体（ポジティブ卵）をスクリーニングした。１匹の親ガ（Ｇ０ガ）が産む卵集団を１集団とし、１粒以上のポジティブ卵が検出された集団の数を、「ポジティブＧ１数」として計上した。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0005691052.tif 000002
【００３５】
（インバースＰＣＲによるクモ遺伝子の挿入及びその位置の確認）
カイコのゲノムＤＮＡは、公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照）で抽出した。ゲノムＤＮＡは制限酵素ＨａｅＩＩＩにより切断した後、セルフライゲーションされた。これをテンプレートとし、ｐｉｇｇｙＢａｃの左右ハンドにそれぞれマッチする２ぺアのプライマーを用い、挿入位置のカイコゲノム配列を含む断片を送付し、配列を同定した。具体的には、レフトハンドフォワードプライマーとしてＢａｃＬＦ（５’−ＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＴＴＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号９）を用い、レフトハンドリバースプライマーとしてＢａｃＬＲ（５’−ＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＧＣ−３’）（配列番号１０）を用い、ライトハンドフォワードプライマーとして（５’−ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣＡＣＡＴＧ−３’）（配列番号１１）を用い、ライトハンドリバースプライマーとして（５’−ＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣ−３’）（配列番号１２）を用いた。図２は、クモ遺伝子発現カセットが挿入された位置の右側のカイコゲノム配列（配列番号１３）を示す。
【００３６】
（絹糸のタンパク質分析）
遺伝子組み換えカイコが作製した繭を切取り、１ｍｇの繭片に対して５０μｌの６０％ＬｉＳＣＮを加えて振動させ、室温下で２時間静置し、タンパク質を可溶化した。その後、１５０００ｒｐｍで遠心して不溶部分を除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、上層の溶液中のクモ糸タンパク質とカイコのフィブロインとを分離した。図３は、遺伝子組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示す図である。図３中、ＦＨはカイコフィブロインＨ鎖を意味し、ＭＡＳＰはクモ糸タンパク質を意味する。また、図３のレーン１にはＨＭＷ分子量マーカーを流し、レーン２には組換えカイコが作製した絹糸のタンパク質を含む上記上層の溶液を流し、レーン３にはレーン２の５倍のタンパク質を含む溶液を流した。分離結果から、絹糸タンパク質中のクモ糸タンパク質の含有率を計算したところ、２２．５％と、従来の組換えカイコにおける上記含有率よりも顕著に高い数値を示した。
【００３７】
（絹糸の走査電子顕微鏡観察による繊度推算）
組換えカイコが作製した繭を４０℃の温水に１分間漬け、毛羽を除き、丁寧に糸を採取し、２０℃、６５％ＲＨの条件で一昼夜馴致したものをサンプルとした。得られたサンプルについて、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）Ｓ−２３８０Ｎ（日立製作所製）を用い、１０ｋＶ電圧で観察及び撮影を行った。これをもとに、糸の直径と断面積を推算し、その断面積をもとに糸の強度を計算した。コントロールとして、遺伝子組み換えを行っていないカイコ（非組換えカイコ）の繭についても同様の処理を行った。図４は、組換えカイコ（Ａ）と非組換えカイコ（Ｂ）の絹糸の走査電子顕微鏡写真である。
【００３８】
（絹糸の物性解析）
組換えカイコが作製した繭を４０℃の温水に１分間漬け、毛羽を除き、丁寧に糸を採取し、２０℃、６５％ＲＨの条件で一昼夜馴致したものをサンプルとした。得られたサンプルについて、「ＡＵＴＯＧＲＡＰＨ  ＡＧＳ−Ｊ」（島津製作所製）を用いて、２０℃、６５％ＲＨの標準条件下で引っ張り試験を行った。コントロールとして、遺伝子組換えを行っていないカイコ（非組換えカイコ）が作製した絹糸についても、同様に引っ張り試験を行った。その結果、コントロール（非組換えカイコ）の絹糸の強度が３９７．０ＭＰａ（３．４９ｇ／ｄ）であったのに対して、組換えカイコが作製した絹糸の強度は４８９．２ＭＰａ（４．２７ｇ／ｄ）と、２２．３５％も増強していた。
【００３９】
一方、特許文献２に記載のオニグモ等の遺伝子を用いた従来の組換えカイコにおいては、コントロールの絹糸の強度３．７８ｇ／ｄに対して、組換えカイコの絹糸の強度は３．９３ｇ／ｄと、３．９６％しか増強していない（特許文献２の第２９頁表３参照）。
【００４０】
以上のことから、本発明の特定の核酸を用いた場合には、従来のオニグモ等の遺伝子を用いた場合よりも、組換えカイコが作製する絹糸の強度が高まることが明らかとなった。表２に、本発明の絹糸と特許文献２の絹糸との物性比較を示す。
【００４１】
【表２】
0005691052.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の組換え生物により作られるタンパク質は、優れた物性を有する天然素材として有用である。特に、本発明の組換えカイコにより作られる絹糸は、十分に優れた強度を有する天然素材であるため、手術縫合糸などの医療用品をはじめ、航空機材、衣料品、化粧品など、さまざまな用途に好適に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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