(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの連通した区画を有するタイプの、走化性に基づく精液試料の生理学的状態の診断および／または精子の選択用のデバイスであって、
ａ．２つの隣接する区画（１ａ、１ｂ）であって、
各区画が、開口部、上部及び下部を含み、
該上部が、該開口部よりも下で、横向きに配置された空気出口ダクト（５）を含み、    該下部が、円錐形の底部端（６）を有する、区画（１ａ、１ｂ）；
ｂ．該２つの区画の間の連結ダクトまたはブリッジ（２）であって、
該下部における各円錐形の底部よりも上で、該２つの区画の間に配置されている、連結ダクトまたはブリッジ（２）；及び
ｃ．該各区画に対する別個の閉鎖手段であって、
該閉鎖手段が突出部を有するプラグ（３）及び弾性リング（４）を含む、閉鎖手段；
を含み、
該閉鎖手段が、該各区画の開口部において閉鎖位置に配置されたときに、該各空気出口よりも下にある該各弾性リングが、空気の排出を可能にする
ことを特徴とする、前記デバイス。
【請求項２】
前記区画が、生体適合性であり、かつ、透明な材料で形成されていることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記区画（１ａ、１ｂ）が、長さが１２ｍｍであり、直径が４ｍｍであり、円錐形の底部端の各々を含み、１３０μｌと等しい容量を有し、ダクトまたはブリッジ（２）が、長さ２ｍｍ、直径２ｍｍで、２０μｌと等しい容量を有することを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
請求項１に記載のデバイスを使用して、走化性に基づいて精液試料の生理学的状態の診断および／または精子の選択をするための手順であって、以下の段階：
ａ）区画の１つ（１ａ）に閉鎖手段を配置する段階；
ｂ）残りの区画（１ｂ）を通して培養液または誘引物質培地を注ぐことにより連結ダクトまたはブリッジ（２）を充填する段階；
ｃ）閉鎖手段を含まない区画（１ｂ）に浮遊液精子を入れ、閉鎖手段を配置する段階；  ｄ）前記区画の１つ（１ａ）の閉鎖手段を取り外し、培養液または誘引物質培地を充填する段階；
ｅ）デバイスをインキュベートする段階；
ｆ）区画（１ａ）の溶液を回収する段階
を含むことを特徴とする、前記手順。
【請求項５】
段階ｆ）後に以下の段階：
ｇ）前記区画（１ａ）にプラグを配置する段階；
ｈ）区画（１ｂ）からプラグを抜く段階；
ｉ）区画（１ｂ）の溶液を回収する段階
を行うことを特徴とする、請求項４に記載の手順。
【請求項６】
誘引物質が、プロゲステロンであることを特徴とする、請求項４に記載の手順。
【請求項７】
精液が、哺乳動物の精液であることを特徴とする、請求項４に記載の手順。
【請求項８】
精液が、哺乳動物以外の動物学群の種から得られた精液であることを特徴とする、請求項４に記載の手順。
【請求項９】
誘引物質培地が、１〜１００ｐＭの濃度のプロゲステロンを含むことを特徴とする、請求項４に記載の手順。
【請求項１０】
インキュベートする段階ｅ）が、３７℃の温度で１０〜３０分間および空気中５％ＣＯ2の環境において行われることを特徴とする、請求項４に記載の手順。
【請求項１１】
精子浮遊液段階ｃ）が、１×１０6〜９．９×１０6移動精子／ｍｌの精子濃度を有することを特徴とする、請求項４に記載の手順。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡易且つ安価なデバイスによって一工程で診断を達成するとともに最良の精子を選択することができる、走化性に基づく精液試料の生理学的状態の診断および／または最良の精子の選択用のデバイスおよびその使用手順に関する。本デバイス、通常の光学顕微鏡、及び実験作業の基礎知識を有する職員のみが必要とされる。
【背景技術】
【０００２】
精子細胞走化性は、精子を誘引濃度勾配に導く細胞輸送機構である。ここ数年、走化性を他の機構によって仲介された細胞集合プロセスから識別する試みが行われてきている。
走化性プロセスは、例えば、ヒト、マウス、ウサギ等の異なる哺乳動物種で確認されてきた。
一方、プロゲステロンは、排卵時の主な卵胞微小環境ステロイドであり、精子誘因物質であることが示されている。
国際公開第０２／０９０３７３号パンフレット、同第００／０９６４８号パンフレット、および同第９９／６６３３１号パンフレットには、基本的に２つのフィルターで分離された垂直な区画を備える、誘因物質を下の区画に入れ、精子を上の区画に入れる、精子走化性を評価する方法およびデバイスが開示されている。デバイスの二次的な実用性は、誘引物質を含有する区画にしばらくして得られる精子集合に基づく、走化性の評価でなければならない。この方法は、他の細胞集合誘発プロセスから走化性を識別することができない。
国際公開第２００５／０２７６３４号パンフレットには、有効精子を分離する他の方法が提案されている。精子選択は、温度勾配に応じた精子細胞能力、すなわち、冷たい所から温かい所への遊走に基づいて行われる。このデバイスは、各区画の流体用に外部の温度差加温システムを有する。各区画は、１ｍｍの距離で配置された両区画間がわずか２℃の差である温度調整を必要とする。この物理的特徴は、著しくこのデバイスをうまく操作する、追加の温度デバイスによって得られる。濃縮効率は１０％である。
国際公開第２００５／００９２２２号パンフレットには、有効精子のレベルの検出に基づいて、精液試料の生理学的状態のみを診断する方法が提案されている。この発明は、有効精子を援助受精で後に用いられるように回復させることができないので、試料を診断することのみに役立つ、細胞死を伴うプロトコールを提示するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、２つの連通した区画（１ａ、１ｂ）を有するタイプの走化性に基づく精液試料の生理学的状態の診断および／または精子の選択用のデバイスであって、前記区画（１ａ、１ｂ）の連通が、前記区画（１ａ、１ｂ）の底部、且つ下方位置よりも上に位置するダクトまたはブリッジ（２）によって生じ、前記区画（１ａ、１ｂ）の入口に適当な閉鎖手段（３、４）および適当な空気出口ダクト（５）が区画（１ａ、１ｂ）の上端を外部に連通させて配置されている、前記デバイスに関する。前記閉鎖手段（３、４）は、突出部を有するプラグ（３）と好ましくはゴムからなる弾性リング（４）を有し、前記区画（１ａ、１ｂ）、ブリッジ（２）および空気出口ダクト（５）は、生体適合性材料からなる透明本体中に形成される。
本発明は、以下の段階：
ａ）区画の１つ（１ａ）に閉鎖手段（３ａ）を配置する段階；
ｂ）残りの区画（１ｂ）を通して培養液を注ぐことによりブリッジ（２）を充填する段階；
ｃ）閉鎖手段を含まない区画（１ｂ）に精子浮遊液を入れ、閉鎖手段（３ｂ）を配置する段階；
ｄ）前記第１の区画（１ａ）から閉鎖手段（３ａ）を引き抜き、培養液または誘引物質培地を充填する段階；
ｅ）デバイスをインキュベートする段階；
ｆ）区画（１ａ）の溶液を回収する段階
の実施を含む、走化性に基づく精液試料の生理学的状態の診断および／または最適精子の選択のための手順に関する。
前記手順の変形実施態様において、以下の段階：
ｇ）前記区画（１ａ）にプラグを配置する段階；
ｈ）区画（１ｂ）からプラグを抜く段階；及び
ｉ）区画（１ｂ）の溶液を回収する段階
を加えることができる。
本発明の目的をより良く理解するために、実証例の特徴を示す好ましい実施態様で本発明を概略的に図示する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１ａ】図１ａは、本発明のデバイスの平面図を示す図である。
【図１ｂ】図１ｂは、本発明のデバイスの前面図を示す図である。
【図１ｃ】図１ｃは、本発明のデバイスの側面図を示す図である。
【図２】図２は、図１ｃのＡ−Ａ線に沿った断面を示す図である。
【図３】図３は、閉鎖手段を組み込んだ、図１ｃのＡ−Ａ線に沿った断面を示す図である。
【図４】図４は、精子分離で用いられる最適精子濃度（Ｓ）を示すグラフである。値は、走化性による区画１ａで集合した精子のパーセントの平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。*ｐ＜０．０５、***ｐ＜０．００１、６００万Ｓ／ｍｌに対する。
【図５】図５は、精子分離に用いられるプロゲステロン濃度を示すグラフである。値は、走化性による区画１ａで集合した精子のパーセントの平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。*ｐ＜０．０１、プロゲステロン１０ｐＭに対する。
【図６】図６は、精子分離に使われたインキュベーション時間を示すグラフである。値は、走化性による区画１ａで集合した精子のパーセントの平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２０分間に対する。
【図７】図７は、上述した、且つ図４〜６にぞれぞれ示される、最大反応を得るための条件（６００万Ｓ／ｍｌ、１０ｐＭプロゲステロン、および２０分間のインキュベーション）で発明者らが設計したデバイスを用いた精子分離を示すグラフである。値は、走化性による区画１ａで集合した精子のパーセントの平均値±ＳＥＭを示す。プロゲステロンを有する区画での走化性による集合した精子の割合は、約１０％である（Δ；ｎ＝５）。**ｐ＜０．０１、対照に対する。  精子分離が走化性によって生じ、他の精子機構（例えば、過反応、化学運動性等）ではないことを証明ために追加の試験を行った。
【図８】図８は、走化性シグナルに関与する酵素（ｍＡＣ）の阻害剤（ｄｄＡｄｏ）で細胞を予め処理したときの走化性による区画１ａで集合した精子のパーセント（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３）を示すグラフである。阻害剤の存在下で、走化性による精子集合は見られない（*ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、プロゲステロン受容体（抗ＰＲ  Ａｂ）に対する抗体“ｃ２６２”で細胞を予め処理したときの走化性による区画１ａで集合した精子のパーセント（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３）を示すグラフである。抗体の存在下で、区画１ａで精子は集合せず（*ｐ＜０.０５）、非特異抗体（抗ＩｇＧ  Ａｂ）は精子集合を阻止しない。
【図１０】図１０は、プロゲステロンの増加する勾配の存在下での集合した精子のパーセントが誘引物質の減少する勾配において見られるのと同様であったが、プロゲステロンの勾配の無いときは（両方の区画１ａと１ｂでホルモンの濃度が等しい）、精子集合が減少する（*ｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の方法による走化性により集合した精子の割合を、ビデオ顕微鏡法および画像コンピュータ解析によって決定した走化性精子のパーセントと比較するグラフである。両方の方法の間で高く且つ顕著な相関が見られる（ｒ＝０．７９４；ｐ＜０．０５；ｎ＝６）。
【図１２】図１２は、誘発された先体反応（ＡＲ）での走化性の割合と本発明の方法での走化性により集合した精子の割合との相関を示すグラフである。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）を示す。（ｒ＝０．９４７；ｐ＜０．０５；ｎ＝５）。  図８〜図１２の結果から、本発明による精子の集合が走化性によって引き起こされていることが確認される。  本発明の１つの適用は、精液試料の生理学的状態の診断および／または最良の精子の選択のための方法を用いている。
【図１３】図１３は、精子分離の前後での有効精子の濃縮率を示すグラフである。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝９）を示し、精子分離前の値は１００％を示し、このことから、有効精子の割合が減少する時間が、走化性による精子分離の後に推定される。基準として定められた精液試料で、本発明による精子分離後に得られた有効精子の割合は、平均２００％増加する（*ｐ＜０．０５、分離前に対する）。本発明を不妊症気味の患者の試料に適用すると（Ｔ：奇形精子症、Ａ−Ｔ：精子無力症−奇形精子症、Ｏ：乏精子症、ＥＳＣＡ：はっきりした原因がない不妊症）、精子分離後、正常な試料で見られるのと同様の有効精子濃縮率を得ることができる。すなわち、精液試料の病状に無関係に、本発明を用いることによって不妊症気味試料の質的改善ができる。
【図１４】図１４は、本発明により、正常（ｎ＝８）且つ不妊症気味患者の精液試料で行われた、精子分離後（“後”）に達成された有効精子の最大および最小濃縮率値の幅を示す（Ｔ：奇形精子症、ｎ＝２９；Ａ−Ｔ：精子無力症−奇形精子症、ｎ＝１５；Ｏ：乏精子症、ｎ＝２；ＥＳＣＡ：はっきりした原因がない不妊症、ｎ＝３）。正常な試料では、少なくとも１００％に濃縮率が全て改善され、分離前と比較すると、分離前の値を６００％まで超えさえする。また、全ての病的な試料は、精子分離前（“前”）に見られる有効精子濃縮を超える有効精子濃縮を達成するが、これらの試料の約３０％において、濃縮レベルは１００％を下回ったこともわかる。この所見により、従来の診断検査では不妊症気味と識別することができない、特にＥＳＣＡタイプの試料での診断に本発明を用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
ここで提案されるデバイス（誘引物質勾配が形成される、空間で分離された２つの区画）は、誘引物質の物理化学的特徴に応じて設計され、ブリッジの長さ（２ｍｍ）およびセットアップシステムのインキュベーション時間（２０分）が、この誘引物質の濃度勾配を形成することができるプロゲステロンの走化性濃度（１０ｐＭ）を用いるように適合されている。
本発明のデバイスは、連通容器の物理的効果により、一方の区画からもう一方の区画への精子の質量流を阻止するので、プロセスは誘引物質の化学作用のみによることが確実である。言い換えると、２つの区画の間に濃度勾配を形成するために、一方の区画に精子が入れられ、もう一方の区画に誘引物質が入れられる、２つの区画の単なる連結は、走化性プロセスの評価を全く保証しない。それ故、これは、区画１ａおよび１ｂの最上部に着座された弾性リング（４）と、弾性リング（４）に着座された一対のプラグ（３）と、１ｂの流体を１ａに押し出すかわりに、プラグを挿入することによって押し出された空気を外部に出させる、弾性リング（４）の上方に位置する一対の開口部（５）とを有する密封閉鎖部を含有する特徴を有するデバイスによって保証される。これらの発明の適合は、デバイス充填順序によって完全になる。
同様に、所定の精液試料データの生理学的状態の診断に加えて、提案されたデバイスを使用する手順または方法により、同様の手順において最良の精子を選択し分離することができる。本発明のデバイスは、区画１ａの内容物または溶液を取り除き、精液試料の生理学的状態を診断することができる。本発明の適用の作用にとって、試料の生理学的状態の診断は、生理学的誘引物質プロゲステロンの存在下で精子が示す走化性反応能力の評価を意味する。従って、プロゲステロンを含有する区画（１ａ）で集合した精子の正味の割合が決定される。前記タイプの分析は、全てのタイプの不妊症気味の試料を評価することができるが、通常の診断分析はＥＳＣＡ−タイプ試料の病状を特定することができないので、本発明は、ＥＳＣＡ−タイプ試料の生理学的状態を評価するのに特に有益である。
【０００６】
本方法は、誘引物質の生産源に向かって移動に方向を合わせる哺乳動物の精子の特徴に基づく。この走化性能力は、また、“可能性”プロセスを完了した、未受精卵を受精させることができる状態の精子のみが発揮し得る。それ故、区画１ａの内容物は、また、未受精卵を受精させることができる精子の選択および／または分離に用いることもでき、このようにして選択された精子は、人工授精技術で用いることができる。
誘引物質濃度勾配を作るために、デバイスは、精子を入れた一方と誘引物質のもう一方の２つの区画からなることが必須である。
しばらくの後、有効精子は、走化性により誘引物質源に向かい、誘引物質を含有する区画（１ａ）内で集合し、すなわち、区画（１ａ）内で、元の精液試料と比較して、有効精子の濃縮が見られる。従って、有効精子の選択と集合が、走化性仲介獲得によって生理学的に行われる。
本発明のデバイスで、元の精液試料よりも優れた６００％までの有効精子の濃縮が得られる。前記濃縮は、薬理学的に誘発された先体反応を行う精子の割合を決定すること、受精能獲得指標として知られる手順を証明した（図１３および図１４）。
本発明のデバイスは、誘引物質勾配を有する２つの区画の配置と、例えば１〜１００ｐＭプロゲステロン値の低濃度で効果的な誘引物質に適合した寸法を組み合わせるので、能力を有する、最良の精子の選択の高い効率が得られる。
好ましい実施態様において、デバイスは、プロゲステロンの特徴（拡散能力および濃度勾配形成能力、および低濃度での有効性）に適合した特定の寸法があり得る。例えば、２つの区画の間の連結ブリッジのサイズは、直径約２ｍｍ、長さ約２ｍｍであるのがよい。
【０００７】
連結容器システムデバイスであるので、区画の一方に液体を配置するときに、容積の高さが等しくなるまでブリッジを通して流体がもう一方の区画に通る傾向がある。この現象は、誘引物質勾配形成を破壊し、従って、機械的に、すなわち、非生理学的に、精子を誘引物質含有区画に向かって運ぶので、望ましくない。
後者の問題を防止するために、デバイスに密封閉鎖システムが設けられる。必要により、２つのデバイス区画は円錐形の底部を有してもよく、２つの区画の間に挿入されたブリッジコネクタが前記円錐の上方にある。円錐形の底部によって、単に重力によりチューブの下方に、動かないあるいは少ない動きの精子を静かに移すことができ、より速い走化性精子によって、精子がブリッジおよびもう一方の区画へ引き込まれることを防止する。
本発明のデバイスは、このような小さなシステムでの流体の移動を防ぎ、且つ外部汚染を防ぐために必要な密封状態を与える。
まとめると、本明細書で提案するデバイスは、基本的な実験知識を有する職員により１時間未満で行うことができる、わずか１工程で、簡単、低コスト、且つ高効率な方法で、診断して最良の精子を選択することができる。
提案されるデバイスの適用に関連して、所定の精液試料の生理学的状態の診断のための使用が提供され、同時に受精率を向上させるために後に用いられる最良の精子が獲得される。
提案された方法検査テストは、高価な機器および非常に訓練された職員を必要とする、精子による非常に複雑な遊走反応を求める方法を用いて行われていたことが留意されなければならない。
【０００８】
図１〜図３では、生体適合性材料のデバイスは、好ましくはアクリルで製造され、デバイスの効率的な使用のために必然的に透明であり、好ましくは長さ１２ｍｍ、直径４ｍｍ（１３０μｌと等しい容量）の２つの円筒形垂直区画“１ａ”および“１ｂ”からなり、２つの区画は、長さ２ｍｍ、直径２ｍｍ（２０μｌと等しい容量）のチューブまたはブリッジ“２”によって連結されている。
区画の一方、例えば“１ｂ”には、精子を含有する懸濁液が入れられ、“１ａ”には、誘引物質が入れられる。ブリッジ２に沿って、増大する誘引物質濃度勾配が形成され、誘引物質区画１ａ内で集合する、走化性による精子の選択を可能にする。
好ましい実施態様において、本デバイスの寸法は、誘引物質としてプロゲステロンを使用するように、且つ各区画内に入れる容積を最小にするように適合されている。誘引物質が、低濃度、例えばピコモルのオーダーの濃度で効果的ないかなる化学誘因物質でもよいことは当業者に明らかである。
デバイスの設計は、その使用を誘引物質としてプロゲステロンを使うことができるが、いかなる他の既知の誘引物質も本発明の精神を変えることなく用いることができることは当業者はわかっている。
連通する容器システムであるので、重要な態様は、区画“１ａ”および“１ｂ”を充填または空にしつつ、ブリッジ２を通る流体流れを阻止することである。この望ましくない作用は、誘引物質勾配を壊すことがあるので、デバイス機能動作原理を損ない、あるいは区画の内容物をもう一方の区画に機械的に運んでしまい、これもまた、デバイスの効率を著しく減じる。
【０００９】
前記不都合を防止するために、区画を密封閉鎖するための方法が提供されるので、本デバイスの適合と具体的な閉鎖順序とが組み合わせられる。
各区画、“１ａ”または“１ｂ”において、前記閉鎖手段は、密封閉鎖が生じる弾性ゴムリング“４”に着座した、突出部を有するプラグ“３”を備えている。さらに、区画“１ａ”または“１ｂ”を密封閉鎖するために、プラグ“３”を配置しつつ区画内に含有する空気の一定の流出を可能にする、各区画“１ａ”および“１ｂ”の最上部の開口部“５”が、プラグ“３”とゴムリング“４”の間に設けられる。
デバイスの他の詳細は、遊走精子が移動する勾配が生じる、ブリッジ連結部の下に位置する、各区画底部の円錐終端部“６”である。この適合は、重力によって、区画の底部に動かないまたは少ない動きの精子を静かに移すことを可能にするので、これらの精子が移動精子によってブリッジに引き込まれることが阻止される。
本デバイスの使用方法に関連して、操作を以下に記載する。
精漿の移動精子の分離（Ｓ）をパーコール法によって行う。約２ｍｌの容積の精液を用い、１ｍｌパーコール勾配に沈降させる（ＨＡＭ−Ｆ１０で、下層：５００μｌパーコール９５％、上層：５００μｌパーコール４７．５％）。１８００ｒｐｍで２０分で遠心分離した後、細胞ペレットを回収し、ＨＡＭ−Ｆ１０培地と、１０００ｒｐｍで７分間遠心分離で２回洗浄する。最後に、回収したペレットを１ｍｌのＨＡＭ-Ｆ１０培地中に浮遊させ、細胞計数チャンバ内で細胞数を数え、８００万Ｓ／ｍｌ濃度を得るために、容積を調整する。Ｓ能力は、空気中５％ＣＯ2雰囲気下に、３７℃で４時間、１％ヒト精液アルブミン（ＨＳＡ）で補足したＨＡＭ−Ｆ１０培地中で増大する。
【００１０】
受精能獲得時間が終わったときに、６００万移動Ｓ／ｍｌを得るためにＳ濃度を調整し、２つのデバイスを前の断面図（図１−３）に記載したように準備し、一方は負の対照として誘引物質を含まず、もう一方は誘引物質としてのプロゲステロンを有する。
デバイス対照を準備するために、図１〜３に記載したデバイスが以下のように進行する：１）培養液（ＨＡＭ−Ｆ１０／１％ＨＳＡ）を入れる場合に、区画1aにプラグを入れ、２）両方の区画を連結しているブリッジが培養液で満たされ、３）Ｓ浮遊液を区画１ｂ（１３０μlの６００万Ｓ／ｍｌの溶液）に入れ、この区画をプラグで閉じ、４）区画１ａのプラグを抜き、培養液（１３０μl）で満たす。
誘引物質で準備されたデバイスについては、培養液を培養液で希釈された１０ｐＭプロゲステロン液に置き換える以外はデバイス対照のように、図１〜３に記載したように他のデバイスを準備する。両方のデバイスが準備されると（“対照”および“誘引物質”）、これらを空気中５％ＣＯ2雰囲気下に３７℃で２０分間インキュベートする。
離れたデバイスを用いて最良の精子を回復させるために、培養液または誘引物質を含有する区画溶液（１ａ）が取り出される。両方のデバイス（対照と誘引物質）の区画１ａから取り出された精子浮遊液について、細胞数を細胞計数チャンバ内で数える。その後、これらの２つの区画の各々に見られるＳのパーセントの差を求め、誘引物質含有区画に移動するＳの正味のパーセントを評価することができる（“Δ”）。
デバイス設計段階が終わると、次に、その使用の実験条件を定め、その後に方法確認において進行させるために、一連の実験を進行させる。
【００１１】
最適精子分離を得る最善の実験条件は（培養液および誘引物質を有する区画で集合するＳの比率間の差“Δ”として評価した）、１）約６００万個Ｓ／ｍｌの濃度を有する浮遊液（図４）、２）約１〜１００ｐＭプロゲステロンの濃度（図５）、および３）約２０分のデバイスインキュベーション（図６）であった。
その後、診断のための方法確認（Ｓの化学戦術的応答に基づく）を３つの方法で：１）化学戦術的シグナリングに関与するｍＡＣ酵素を阻害する化学戦術的応答の阻止によって、２）精子細胞膜に位置するプロゲステロン受容体を遮断する化学戦術的反応の阻止によって、３）減少するプロゲステロン勾配と比較し且つプロゲステロン勾配がないことにさらすことによって、４）ビデオ顕微鏡検査による走化性の決定と比較することによって、および５）誘発先体反応レベル（ＡＲ）と比較することによって行った。プロゲステロンに対する精子走化性仲介分離は、プロゲステロンの方へ著しく移動する精子分集団の観察を可能にした（９±０.４％；p＜０．０１；図７“Δ”）。このような細胞集団は、ビデオ顕微鏡検査によって評価された化学戦術的精子（r＝０．７９、p＜０．０１；図１１）および誘発ＡＲ（r＝０．９４、p＜０．０５；図１２）のパーセントと相関した。増加するプロゲステロン勾配による集合した精子の比率は、減少するプロゲステロン勾配によって観察されたものと同様であり、精子集合はプロゲステロン勾配がない場合には観察されなかった（p＜０．００１；図１０）。走化性による精子集合は、細胞プロセスに関与する酵素の阻止によって、また、プロゲステロン受容体活性を遮断することによって阻止された（p＜０．０５；図８および図９）。
精子分離の後に得られた精子集団において、誘導先体反応レベル値の増加のパーセントを算出することによって、１００％とみなされる、分離前の精子試料において得られた値と比較して最良の精子を選択する方法確認を行った。結果は、精子分離後の有効精子の濃縮レベルが６００％までに達し得ることを示した（図１３および図１４）。
まとめると、本デバイスと手順にユニークな特徴を与える、用いられた誘引物質、密封閉鎖、および正確な充填と空にする順序の明確さに対する寸法の適合を含むデバイス設計によって、診断効率および最良の精子の選択または分離の実質的な改善が得られた。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕２つの連通した区画（１ａ、１ｂ）を有するタイプの、走化性に基づく精液試料の生理学的状態の診断および／または精子の選択用のデバイスであって、
前記区画（１ａ、１ｂ）の入口に適当な閉鎖手段（３、４）および区画（１ａ、１ｂ）の上端を外部に連通させる適当な空気出口ダクト（５）が配置されていることにより、前記区画（１ａ、１ｂ）の連通が、前記区画（１ａ、１ｂ）の底部、且つ下方位置よりも上に位置するダクトまたはブリッジ（２）を通じて生じることを特徴とする、前記デバイス。
〔２〕前記閉鎖手段（３、４）が、突出部を有するプラグ（３）と、好ましくはゴムからなる弾性リング（４）からなることを特徴とする、前記〔１〕に記載のデバイス。
〔３〕前記区画（１ａ、１ｂ）、ブリッジ（２）および空気出口ダクト（５）が、生体適合性材料の透明本体に形成されることを特徴とする、前記〔１〕に記載のデバイス。
〔４〕区画（１ａ、１ｂ）の下端部が、円錐形底部（６）を有することを特徴とする、前記〔１〕に記載のデバイス。
〔５〕前記区画（１ａ、１ｂ）が、長さ１２ｍｍ、直径４ｍｍの円錐形の底端部を有し、１３０μｌと等しい容量を有し、ダクトまたはブリッジ（２）が、長さ２ｍｍ、直径２ｍｍで、２０μｌと等しい容量を有することを特徴とする、前記〔１〕に記載のデバイス。
〔６〕デバイスの効率的な使用のために、好ましくは、アクリルで、生体適合性材料で、必然的に透明な材料で製造されていることを特徴とする、前記〔１〕に記載のデバイス。
〔７〕走化性に基づいて精液試料の生理学的状態の診断および／または精子の選択のための手順であって、以下の段階：
ａ）区画の１つ（１ａ）に閉鎖手段（３ａ）を配置する段階；
ｂ）残りの区画（１ｂ）を通して培養液または誘引物質培地を注ぐことによりブリッジ（２）を充填する段階；
ｃ）閉鎖手段を含まない区画（１ｂ）に浮遊液精子を入れ、閉鎖手段（３ｂ）を配置する段階；
ｄ）前記第１の区画（１ａ）の閉鎖手段（３ａ）を取り外し、培養液または誘引物質培地を充填する段階；
ｅ）デバイスをインキュベートする段階；
ｆ）区画（１ａ）の溶液を回収する段階
を含むことを特徴とする、前記手順。
〔８〕段階ｆ）後に以下の段階：
ｇ）前記区画（１ａ）にプラグを配置する段階；
ｈ）区画（１ｂ）からプラグを抜く段階；
ｉ）区画（１ｂ）の溶液を回収する段階
を行うことを特徴とする、前記〔７〕に記載の手順。
〔９〕誘引物質が、プロゲステロンであることを特徴とする、前記〔７〕に記載の手順。
〔１０〕精液が、哺乳動物の精液であることを特徴とする、前記〔７〕に記載の手順。
〔１１〕精液が、他の動物学群の種から得られた精液であることを特徴とする、前記〔７〕に記載の手順。
〔１２〕誘引物質培地が、１〜１００ｐＭの濃度のプロゲステロンを含むことを特徴とする、前記〔７〕に記載の手順。
〔１３〕インキュベートする段階ｅ）が、３７℃の温度で１０〜３０分間および空気中５％ＣＯ2の環境において行われることを特徴とする、前記〔７〕に記載の手順。
〔１４〕精子浮遊液段階ｃ）が、１×１０6〜９．９×１０6移動精子／ｍｌの精子濃度を有することを特徴とする、前記〔７〕に記載の手順。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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