(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式Ｉの化合物であって：
0005816618.tif 000033
式中、ｎは炭素の数を示し、ｎは１乃至１８であり、Ｒ１はイソシアナート、イソチオシアナート及びイソセレノシアナートからなる群より選択されることを特徴とする化合物。
【請求項２】
Ｒ１がイソチオシアナートである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｎが８乃至１０である請求項２記載の化合物。
【請求項４】
下記化学式
0005816618.tif 000034
で表される化合物である請求項３記載の化合物。
【請求項５】
グラム陰性細菌のクオラムセンシングを阻害する抗細菌剤製造のための請求項１乃至４のいずれかに記載の化合物の使用において、当該細菌が、アシネトバクター、アクチノバチルス、アグロバクター、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、シアノバクテリア、エンテロバクター、エルウィニア、大腸菌、フランシセラ、ヘリコバクター、ヘモフィルス菌、クレブシエラ菌、レジオネラ菌、モラクセラ、ナイセリア、パスツレラ菌、プロテウス、シュードモナス菌、サルモネラ菌、セラチア菌、赤痢菌、トレポネーマ、ビブリオ、及びエルシニアの一又はそれ以上を含むことを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項５に記載の使用において、アシネトバクター、アクチノバチルス、アグロバクター、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、シアノバクテリア、エンテロバクター、エルウィニア、大腸菌、フランシセラ、ヘリコバクター、ヘモフィルス菌、クレブシエラ菌、レジオネラ菌、モラクセラ、ナイセリア、パスツレラ菌、プロテウス、シュードモナス菌、サルモネラ菌、セラチア菌、赤痢菌、トレポネーマ、ビブリオ、及びエルシニアの一又はそれ以上に起因する植物又は動物の疾患を治療、医療機器、液体を運ぶ及び／又は液体に配置されるあらゆるタイプの構造物、膜、繊維、又は包装材料を処理する、又は、あらゆるタイプのバイオフィルムの形成の防止又は減少させるための使用。
【請求項７】
請求項６に記載の使用において、前記動物が、ヒトではない哺乳類又はヒトを含む哺乳類、魚類、爬虫類、又は鳥類のいずれも含むことを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項６に記載の使用において、前記医療機器が、自然組織上のコーティング、カテーテル、ペースメーカー、コンタクトレンズ、ステント、心臓弁置換又は増強機器、植え込み型自動除細動器、人工心臓補助機器、植え込み型輸液ポンプ、ドレナージ機器、人工関節、骨ピン、スクリュー及びその他の整形外科的機器、歯冠、歯牙充填物、人工歯根、歯の又は整形外科的、歯内器具、外科縫合、クリップ及びステープル若しくは締結具、手術用メッシュ、眼内レンズ、バットレス、ラップバンド、包帯、グラフト、ステント／グラフト、無結節創縫合、シーリング材、接着剤、組織スキャフォールド、柔組織代替若しくは増強インプラントを含むことを特徴とする使用。
【請求項９】
自然組織が歯である請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の伝達の阻害剤、及びその使用方法若しくは製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌密度機能として細菌間の遺伝子発現の化学的調整は、「クオラムセンシング」（ＱＳ）として知られるメカニズムにより調節される。細胞間伝達は、単細胞生物が挙動を調整できるようにし、変化する環境に適応させ、多細胞生物と競争並びに共存させる。ＱＳに制御された挙動の例は、バイオフィルム形成、毒性因子発現、抗生物質産生、及び生物発光誘導を含む。これらのプロセスは、同時に実行されるときにのみ細菌密度に有益である。例えば、海洋細菌Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉによりもたらされる生物発光は、十分な数の細菌が、それらの発光を同期させる場合に限り、この種に寄生する多くの生物に有益である。さまざまなＱＳシグナルシステムが発見されたが、ＱＳに関与するより大きいタンパク質及び小さい分子は、いまだ説明されていない（１−４）。
【０００３】
成人における総微生物菌体数が、少なくとも１０の因数の差で哺乳類細胞の数を上回っていることを考えると特に、細菌内のＱＳの重要性とそれのヒトの健康への影響は重大である。消化管だけで、多大な遺伝的多様性を示す５００−１０００の異なる種を含んでいるが、これらの種の大部分は、いまだインビトロで培養されたことがないので、この菌体数もほとんど明らかになっていない。種内ＱＳ及び種間ＱＳは、細菌数の維持及び病原性細菌のコロニー形成の補助又は防止といった重要なプロセスを調和させて、この片利共生菌体数をかなり増加させることがある（５、６）。
【０００４】
ＱＳは、共有分子構造に応じていくつかのクラスに分類される、自己誘導物質により調節される（図１ａ、２−４）。このクラス内にはアシル側鎖の長さや酸化状態で生じるＱＳシグナルに違いがあるので、７０種を超えるグラム陰性細菌が、Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬｓ）を自己誘導物質として使用する。種を異にするさまざまなＡＨＬｓが、細菌感染において、重要な役割を担うことが示されてきた。重要な例は、グラム陰性細菌、緑膿菌である。この一般的な環境微生物は、日和見性のヒト病原体であり、例えば、一般的な及び致命的な遺伝性疾患である嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者において広く知られており、多くの場合肺防御機能障害により死亡する。緑膿菌の病因及び抗生物質耐性をもたらす大きな要因は、バイオフィルムを形成するその能力にある。これは、細胞の微生物由来の付着群生であり、接合部分に付着あるいは互いに付着して、細胞外ポリママトリクスに生息し、成長、遺伝子発現、及びタンパク質産生に関して浮遊細胞と異なる表現型を示す。バイオフィルムの形成及び特定の構造は、多様なＱＳシステム（７）並びにサイクリックジ−ＧＭＰなどその他の因子により調節されるが、ＱＳの調節遺伝子を一つでも阻害すると、バイオフィルム形成全体を著しく減少に導くことができることが示されてきた。
【０００５】
緑膿菌の主要なＱＳシステムは、３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬの合成及び分泌を介して調節され、３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬは、閾値濃度に達すると転写活性化因子ＬａｓＲに結合する。この相互作用は、フォールディングを修正し、続いて二量化、ＬａｓＲ二量体の標的ＤＮＡへの結合がおこり、その結果遺伝子発現することを示している。３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬが認識することから始まるシグナル伝達事象は、ＱＳ階層の最上位にあるように見えるが、更に、いくつかのその他の小分子が、遺伝子発現（例えば、Ｃ４−ＨＳＬ，ＰＱＳ）の調節において役割を果たすことが見出されてきた（８−１０）。その医学的重要性により、緑膿菌におけるＱＳが広く研究されてきた。この分野におけるある飛躍的な進歩は、その天然リガンド（３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ）に結合するＬａｓＲの結晶構造の決定とともにあると、最近、Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙらにより報告された（１１）。
【０００６】
ＱＳシグナル伝達の阻害は、病原と闘う新しいアプローチとして、ここ数年研究されてきた。このような成果がもたらす強力な阻害剤の数はまだ少ないが、いくつかのグループが、緑膿菌におけるＱＳの重要な阻害を示す化合物を同定した。適当な阻害剤の例を、ＩＣ５０（５０％抑制濃度）の値とともに、図１ｂに示す。
【発明の概要】
【０００７】
背景技術は、細菌伝達の有効な阻害剤、及びその使用方法若しくは製造方法を十分に教示又は示唆していない。
【０００８】
本発明は、少なくともいくつかの実施例では、細菌伝達の共有結合阻害剤、及びその使用方法若しくは製造方法を提供することにより、技術背景のこれらの欠点を克服する。阻害剤は、直接的に又は間接的に選択的に作用して細菌伝達を阻害し、細菌伝達のいかなる段階おいても選択的に作用することがある。
【０００９】
少なくともいくつかの実施形態によると、これらの阻害剤は、抑制化合物（小分子）であり、この抑制化合物は、反応基、好ましくはその標的タンパク質の活性部位内の求核剤と共有結合を形成することができる求電子剤を含み、求電子剤は、他のタンパク質と非特異的に相互作用しない。反応基を求核剤と相互作用させて、その後共有結合を形成することを可能にする方法で、標的タンパク質と相互作用することができる部分に、反応基を結合するのが好ましい。このような阻害剤は、化学式Ａ−Ｂを有するのが好ましく、ここで、Ａは求電子的官能基であり、Ｂは標的タンパク質の天然リガンド又はそれらの部分であり、Ａ官能基が標的タンパク質に共有的に結合して、その後天然リガンドの結合を阻害できる方法で、阻害剤が標的タンパク質と相互作用する。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、天然リガンドが、クオラムセンシングにおいて作用するホモセリンラクトンであるタンパク質に共有的に結合するように設計された一連の求電子的プローブ（阻害剤）が提供される。ホモセリンラクトン類は、グラム陰性細菌のクオラムセンシングのリガンドとして作用することが知られている。クオラムセンシングの細菌の非限定的な例は、アシネトバクター、アクチノバチルス、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、シアノバクテリア、エンテロバクター、エルウィニア、大腸菌、フランシセラ、ヘリコバクター、ヘモフィルス、クレブシエラ、レジオネラ、モラクセラ、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、緑膿菌、サルモネラ菌、セランシア、赤痢菌、トレポネーマ、コレラ菌、及びペスト菌の一又はそれ以上を含む本発明の一又はそれ以上の化合物により選択的に阻害されることがある。
【００１１】
非限定的な例として、タンパク質は、選択的に、緑膿菌用のＬａｓＲ結合ポケットとして機能することがあるが、タンパク質の活性の阻害が、ＱＳで調節された遺伝子発現の特定の阻害及び毒性因子の分泌とバイオフィルム形成を同時に減縮するならば、このタンパク質は、選択的に、天然リガンドがホモセリンラクトンである任意のタンパク質でよい。従って、Ｂは、選択的に任意のホモセリンラクトン部分である。
【００１２】
一つの仮説又は一つの例に制限されることを望むものではないが、これらの化合物が、ＬａｓＲの結合ポケットのＣｙｓ７９に共有的に結合すると考えられる。この非限定的な例に関して、Ｂは、３−オキソ−Ｃ（ｎ＋２）−Ｎ−アシルホモセリンラクトン部分であり、この中で、ｎは少なくとも２であり、選択的に最大１４で、Ａは適切な求電子的官能基である。別段の明記がない限り、全ての分子をＳエナンチオマーと仮定する。
【００１３】
少なくともいくつかの実施形態によると、化学式Ｉの化合物が提供され：
0005816618.tif 000002
式中、ｎは、炭素の数（多くの実施形態では、この範囲は変化することがあるが、選択的にｎは１乃至１８であり；以下に更に詳しく述べるが、用語「ｎ＝ａ−ｂ」は、ｎが、ａ、ａ＋１・・・ｂからなる群より選択される任意の数であることを意味し；本明細書で使用する用語「ｍ」は、提供された数の範囲に類似する意味を与える）を表し、Ｒ１は、任意の適切な反応性求電子官能基である。選択的に、Ｒ１は、チオール基、イソシアナート、イソチオシアナート、イソセレノシアナート、置換又は非置換反応性アミド官能基、ＮＨＣ（＝０）Ｃ＝Ｎ−ＮＨ２、反応性置換環状基、（選択的に少なくとも一の不飽和結合を有する）反応性置換又は非置換複素環基、アルキルスルホナート（アルキルスルホナートは、Ｂ部分と組み合わせてアルキルスルホン酸エステルを形成する）、置換アルケニル、反応性アミノ、及びＲ３からなる基より選択される。本明細書では、用語「環状」は、芳香族及び非芳香族の両方を包含する。
【００１４】
チオール基が存在する場合、ｎは５乃至１２である。本発明の少なくともいくつかの実施形態に従って、チオール基を特徴付ける構造の非限定的な例を構造−Ｄに示した。
【００１５】
イソシアナートは、選択的に置換されている又は非置換である。イソシアナートは、非置換であるのが好ましい。特定の非限定的な例として、（以下の構造−Ｑに示すように）ｎは９である。
【００１６】
イソチオシアナートは、選択的に置換されている又は非置換であり、ここで置換イソチオシアナートは、選択的に構造Ｒ２Ｎ＝Ｃ＝Ｓを有し、Ｒ２は、置換アルキル、置換イソアルキル、置換アルケニル、及び置換イソアルケニルからなる基より選択され、これら各々は、選択的に及び好ましくは、ハロゲン、複素環アミノ、及びアルキルアミノからなる基より選択される部分を有する。置換が、複素環アミノのときは、ピリジル、ピロリル、ピロリジニル、アリールアミノ、イミダリル、及びピペリジニルからなる群より選択されることが好ましい。
【００１７】
少なくともいくつかの実施形態によれば、Ｒ２は、置換エテニル、置換プロペニル、置換ブテニル、及び置換ペンテニルからなる群より選択され、これらの任意の異性体を選択的に含み、これらは上記のように選択的に置換される；Ｒ２は、２−ペンテニルで置換されることが更に好ましく、アルキルアミノ、ピリジル、ピロリル、アリールアミノ、又はイミダゾリルのうちの一で置換されるのが更に好ましく；（以下の構造−Ｙに示すように）ｎは１乃至５がもっとも好ましい。
【００１８】
少なくともいくつかの実施形態によれば、Ｒ２は、置換エチル又はメチルからなる群より選択され、上記のように選択的に置換されるが、アルキルアミノ、ピリジル、ピロリル、アリールアミノ、ピペレジニル、又はイミダゾリルのうちの一で置換されるのが好ましく；ピペリジニルで置換されるのが更に好ましい。ピペリジニルで置換され、（以下の構造−Ｚ１、構造−Ｚ２、及び構造Ｚ−３に示すように）ｎは１乃至５であるのが、もっとも好ましい。
【００１９】
少なくともいくつかの実施形態に従ってハロゲンで置換する場合は、このハロゲンは、臭素又は塩素が好ましい。Ｒ２が、ブロモアルキル又はクロロアルキル、及びｎが７乃至９であるのがもっとも好ましく；ｎが８（構造−３に相当）であるのがもっとも好ましい。イソチオシアナートが非置換である場合は、ｎが８乃至１０（構造ｉｔｃ−１１、ｉｔｃ−１２、及びｉｔｃ−１３に相当）が好ましい。
【００２０】
反応性アミド官能基は、選択的にハロカルボキサミドであり、ブロモカルボキサミドとクロロカルボキサミドからなる群より選択されるハロカルボキサミドが好ましく、ここで、アミド官能基の炭素鎖は、１乃至１６炭素の長さ；好ましくはｎが５乃至１６である。ハロカルボキサミドが、ハロアセトアミドであるのが、より好ましく、ハロアセトアミドが、ブロモアセトアミド及びクロロアセトアミドからなる群より選択されるのが更に好ましく、ここで、ｎは５乃至１６（構造ｈａｌ−１１−Ｂｒ、ｈａｌ−１２−Ｂｒ、ｈａｌ−１３−Ｂｒ、ｈａｌ−１１−Ｃｌ、ｈａｌ−１２−Ｃｌ、及びｈａｌ−１３−Ｃｌに相当）が好ましい。
【００２１】
Ｒ１が、ＮＨＣ（＝０）Ｃ＝Ｎ−ＮＨ２の場合は、（例えば、構造−４に示すように）ｎは５乃至１６が好ましい。
【００２２】
反応性置換環状基は、置換アルキレンシクロブチル、アルキレンシクロペンチル、及びアルキレンシクロヘキシルからなる群より選択されるのが好ましく、これらが、アルキレンシクロブチルジオン、アルキレンシクロペンチルジオン、及びアルキレンシクロヘキシルジオンからなる群より選択されるのがより好ましく、これらが、アルキレンシクロブチル−２，４−ジオン、アルキレンシクロペンチル−２，４−ジオン、及びアルキレンシクロヘキシル−２，４−ジオンからなる群より選択されるのがもっとも好ましく；このアルキレン部分は、選択的にメチレン、エチレン、ブテン、又はペンテンであり、メチレンが好ましい。反応性置換環状基が、メチレンシクロペンチル−２，４−ジオンであることがより好ましく、選択的にｎは５乃至１６であるが、（構造−８に示すように）ｎは８乃至１０が更により好ましい。
【００２３】
非置換の場合は、反応性複素環基は、エテニルオキシド、ｎは５乃至１６であるのが好ましく；ｎは８乃至１２がより好ましく；（構造−１２に示すように）ｎは９乃至１１がもっとも好ましい。
【００２４】
置換の場合は、反応性複素環基は、少なくとも一の不飽和炭素結合を有することが好ましく、２−フラニル、及び（選択的に、２−ピロニル又は４−ピロニルである）ピラノニルからなる群より選択される。反応性複素環基が、２−フラニルである場合は、選択的にｎは５乃至１６であり、ｎは８乃至１２が好ましく；（構造−１３に示すように）ｎは９乃至１１がより好ましい。反応性複素環基が、２−ピロニルである場合は、選択的にｎは５乃至１６であり、ｎは８乃至１２が好ましく；（構造−１４に示すように）ｎは９乃至１１がより好ましい。
【００２５】
アルキルスルホナートが、置換及び非置換アルキルスルホナートからなる群より選択され；アルキルスルホナートが、メチルスルホナート、エチルスルホナート、プロピルスルホナート、及びブチルスルホナートからなる群より選択されるものが好ましく；アルキルスルホナートが、プロピルスルホナートで、ｎは１乃至１４であるのがより好ましく、更に好ましくは、ｎは５乃至９であり；アルキルスルホナートが、プロピルスルホナートで、（構造−９に示すように）ｎは６乃至８であるのがもっとも好ましい。置換の場合は、アルキルスルホナートが、ハロアルキルスルホナートであるのが好ましく、ブロモアルキルスルホナート、フルオロアルキルスルホナート、及びクロロアルキルスルホナートからなる群より選択されるものがより好ましく；ブロモメチルスルホナート、クロロメチルスルホナート、及びフルオロメチルスルホナートからなる群より選択されるものがもっとも好ましく、ここで、ｎは１乃至１４が好ましく、ｎは５乃至９がより好ましく；（構造−Ｘに示すように、これは非置換アルキルスルホナートをも示す）ｎは６乃至８がもっとも好ましく；又は代替として、３−ブロモプロピルスルホナート、２−ブロモプロピルスルホナート、３−クロロプロピルスルホナート、及び２−クロロプロピルスルホナートからなる群より選択されるものがもっとも好ましく、ここで、ｎは１乃至１４が好ましく、ｎは５乃至９がより好ましく；（構造−７に示すように）ｎは６乃至８がもっとも好ましい。
【００２６】
置換アルケニルは、置換エテニルからなる群より選択されるものが好ましく、ハロゲンで置換されたものが更に好ましく、臭素で置換されたものがより好ましく；Ｃ＝Ｃ＝ＣＨ２Ｒ５、ここでＲ５は、ハロゲンであり臭素が好ましい。置換アルケニルが、Ｃ＝Ｃ＝ＣＨ２Ｒ５である場合は、Ｒ５は、臭素が好ましく、ｎは１乃至１４が好ましく、ｎは５乃至９がよりこのましく；（下記構造−１０に示すように）ｎは８乃至１０がもっとも好ましい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、反応性アミノは、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり、ここで、アルキル部分が置換されたものが好ましく、ハロゲンで置換されたものがより好ましい。アルキル部分が、メチル、エチル、プロピル、及びブチルからなる群より選択されるものが好ましく；反応性アミノが、ハロゲン置換ジエチルアミノであるのがより好ましい。反応性アミノが、塩素置換ジエチルアミノであるのがもっとも好ましく、ｎは１乃至１４が好ましく、ｎは５乃至９がより好ましく；（構造−１６に示すように）ｎは８乃至１１がもっとも好ましい。
【００２８】
Ｒ３は、選択的に；
0005816618.tif 000003
；  
0005816618.tif 000004
式中、ｍは１乃至６；ｍは１が好ましく；及び
0005816618.tif 000005
からなる群より選択される。
【００２９】
Ｒ３が、
0005816618.tif 000006
の場合は、ｎは選択的に１乃至１４であり、ｎは７乃至１１がより好ましく、（構造−５に示すように）ｎは８乃至１０がもっとも好ましい。
【００３０】
Ｒ３が、
0005816618.tif 000007
の場合は、ｎは３乃至７が好ましく、ｎは４乃至６がより好ましく；（構造−６に示すように）ｎは４乃至６及びｍは１がもっとも好ましい。
【００３１】
Ｒ３が
0005816618.tif 000008
の場合は、（構造−１５に示すように）ｎは９乃至１１が好ましい。
【００３２】
本発明の他の実施形態に従って化学式ＩＩ：
0005816618.tif 000009
の化合物を提供する。ここでＲ１は、選択的に上記の任意の群であり、Ｒ６は、アルキルアミノ、ピリジル、ピロリル、アリールアミノ、イミダゾリル、又はピペリジニル；ｎ１は０乃至８；ｎ２は０乃至８（ｎ１とｎ２は独立的に選択される）であってもよい。典型的な構造を、構造−Ｐ１、構造−Ｐ２、構造−Ｐ３、構造−Ｐ４、及び構造−Ｐ５として示す。
【００３３】
例えば、構造−Ｃに示すように、上記の化合物はいずれも、骨格の炭素鎖中にジスルフィド結合を選択的に具えることがある。
【００３４】
上記化合物の任意の一又はそれ以上が、クオラムセンシングの阻害が要求される本発明のさまざまな実施形態にしたがって、多様な適用で選択的に用いられることがあり、植物又は動物（ここで、動物は選択的に任意の哺乳類、爬虫類、又は魚を含み；動物は哺乳類であることが好ましく、選択的に動物はヒトである）の疾患の治療を含むがこれらに限定されるものではなく、医療機器は、植え込み型の医療機器、並びに体の外側にあり、又は体及び外部環境に連動する医療機器；液体を運ぶ及び／又は液体に配置される任意のタイプの構造；膜、繊維、包装材料、又はいかなるタイプのバイオフィルムの阻止又は縮小するものを含む。
【００３５】
ここで使用するように、用語「バイオフィルム」は、構造の表面に付着する微生物の薄層を意味し、この薄層は微生物が分泌するポリマを有する有機的又は無機的なものである。
【００３６】
医療機器の非限定的な例は、自然組織（歯を含む）へのコーティング、カテーテル、ペースメーカー、コンタクトレンズ、ステント、心臓弁置換若しくは促進装置、植え込み型自動徐細動器、人工心臓補助装置、植え込み型輸液ポンプ、ドレナージ装置、人工関節、骨ピン、スクリュー、及びその他の整形外科に関する装置、歯冠、歯牙充填、人工歯根、その他の歯又は整形外科に関する装置、歯内器具、外科縫合、クリップ及びステープル若しくはその他の締結具、手術用メッシュ、眼内レンズ、バットレス、ラップバンド、包帯、グラフト、ステント／グラフト、無結節創縫合、シーリング材、接着剤、組織スキャフォールド、柔組織代替若しくは増強インプラント（胸、頬、及び臀部のインプラントを含むがこれらに限定されるものではない）などを含む。
【００３７】
本明細書で使用する用語「カテーテル」は、カテーテル、カテーテルライン、ポート、シャント、補給チューブ、気管内チューブ、抹消から中心静脈まで挿入したカテーテル（ＰＩＣＣ）ラインを含むがこれらに限定されるものではない。
【００３８】
液体を運ぶ構造の非限定的な例は、チューブ、ウォーターフィルター、及びその他の浄化装置、このような流体用の容器、液体と接する表面を特徴付ける製造施設（パイプ、チューブ、容器、機械を含むがこれらに限定するものではない）、クリーンルームの表面、ヒトが存在するビル内のいかなるタイプのパイプ、チューブ、容器及び機械などを含む。
【００３９】
液体に配置された構造の非限定的な例は、フィルター、機械、水中構造物、船舶、及び海洋環境に配置された任意の構造（特に海洋環境に没するものに限定するものではない）を含む。
【００４０】
少なくともいくつかの実施態様では、上記いずれかの主張に従って適切な担体中に化合物を含む組成物が提供される。選択的に組成物は、染料、抗菌剤、成長因子、又は抗炎症薬を更に含む。また選択的に、組成物は、更に追加的な賦形剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
本発明は、以下の詳細な説明からより完全に理解及び認識され、以下の図面と併せて解釈される：
【図１】図１は、ａ）構造的に異なるクラスに属する細菌の自己誘導物質の例；ｂ）緑膿菌（Ｉ１−Ｉ５）における合成ＱＳ阻害剤の例を示す。おおよそのＩＣ５０値（異なるレポーターアッセイより）を、化合物の下に表示する。
【図２】図２は、緑膿菌の天然自己誘導物質である、３−オキソ−Ｃ１２−Ｎ−アシルホモセリンラクトン（３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ）の構造と、イソチオシアネート（１）、ブロモアセトアミド（２）、又はクロロアセトアミド（３）に分類される九つの合成類似化合物の非限定的な例の構造を示す。求電子性炭素を反応基ごとにマーク（灰色の円）した。
【図３】図３は、いくつかの阻害化合物の非限定的で典型的な合成図表を示す。ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド）；ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）；ＤＣＭ（ジクロロメタン）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）。
【図４】図４は、ｉｔｃ−１１及びｉｔｃ−１２のＬａｓＲ−ＬＢＤへの共有結合を示しており；ａ）３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬと九つの反応性プローブで表される精製されたＬａｓＲ−ＬＢＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ｂ）３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬで表されるＬａｓＲ−ＬＢＤのデコンボリューション処理された質量スペクトル；ｃ）ｉｔｃ−１１で表されるＬａｓＲ−ＬＢＤのデコンボリューション処理されたＭＳ（質量分析）；ｄ）ｉｔｃ−１２で表されるＬａｓＲ−ＬＢＤのデコンボリューション処理されたＭＳである。差し込み図は、デコンボリューション処理前のスペクトルデータである。
【図５】図５は、リポーター遺伝子分析を示したものである。イソチオシアネート（ａ）及びハロアセトアミド（ｂ）によるＰＡＯ１ＱＳ阻害；イソチオシアネート（ｃ）及びハロアセトアミド（ｄ）による大腸菌（このリポーター株は、３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬを生成しない）中の５０ｎＭの３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬによるＬａｓＲ活性剤の拮抗作用。各点は、３回の実験の平均±ＳＤ（標準偏差）を表したものである。
【図６】図６は、ＰＡＯ−ＪＰ２をベースとするアンタゴニスト（ａとｂ）、アゴニスト（ｃ）、及び半アゴニスト（ｄ）分析である。更に捕捉情報で記載するように、半アゴニスト分析中の曲線は、ｉｔｃ−１２の共有結合モードに起因する場合がある。各点は、３回の実験の平均±ＳＤを表す。
【図７】図７は、野生型緑膿菌株ＰＡＯ１を５０μＭの４−Ｂｒ−ＰＨＬ、ｉｔｃ−１２、又はＤＭＳＯとインキュベーしたときの（ａ）２４時間後のバイオフィルム形成の阻害と、（ｂ）３６時間後のピオシアニン生成を示す。各点は、３回の実験の平均±ＳＤを表す。
【図８】図８は、構造−Ｄの化合物（本明細書では「チオール−１１」ともいう）を含む、チオール含有化合物の合成法を示す。
【図９】図９は、チオール−１１とｉｔｃ−１２双方の緑膿菌の毒性阻害を用量依存的に示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
少なくともいくつかの実施形態では、本発明は、細菌の伝達の共有結合阻害剤、及びその使用方法若しくは製造方法を提供する。記され及び主張された本発明の範囲又は一般概念を損なうことを望むものではなく、以下の記述は、化学式ＩとＩＩの化合物、これらの使用、及びこれらの合成方法に関連するこれらの実施態様に焦点を合わせる。
【００４３】
上記のように、これらの阻害剤は、クオラムセンシングを含む細菌伝達を阻害する。ここで、細菌は緑膿菌を含むが、これに制限されるものではない。一の仮説に限定されることを望むものではなく、少なくともこれらの阻害化合物のいくつかは、ＬａｓＲ又は等価タンパク質を活性化させる、緑膿菌の３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬなどの天然ホモセリンラクトン化合物に十分に類似する構造物を有することが可能であり、これにより３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬの構造のわずかな変化が、親和性の大きな減少をもたらすというこれまでの見解を排除する。これらの阻害剤の化合物は、親自己誘導物質からの偏差がほんのわずかであり、ＬａｓＲの結合ポケット又は等価タンパク質中の残渣に共有結合することができる小さな反応性部分を含むと信じられている。この共有結合プローブは、ＬａｓＲ又は等価タンパク質に結合する天然化合物と効果的に競合すると期待され、結合における結合ポケットのわずかに変化した占有が（占有のわずかな変化が）、標的ＤＮＡに対する転写活性因子の効果的な結合に適した構造変化をもたらす。このタイプのプローブの使用は、ＬａｓＲ若しくは等価タンパク質及び３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬなどの天然リガンド双方の調節及び再利用に重大な影響を与えることもある。
【００４４】
異なる官能基と異なるアルキル鎖長を有するこれらの求電子剤のいくつかの非限定的な例（イソチオシアネート１、ブロモアセトアミド２、クロロアセトアミド３）を図２に示し、天然リガンドと比較した。多くの課題のうちの一つは、求核システインと反応するための十分な反応性はあるが、プローブが結合ポケットに到達する前に望ましくない反応が他の残渣とともに起こるような過度には反応しないプローブを設計することである。
【００４５】
化学式Ｉ及びＩＩの化合物の特定の非限定的な例を以下に示す。
【００４６】
0005816618.tif 000010
0005816618.tif 000011
【００４７】
上記の構造−Ｙ及び構造−Ｚ１乃至Ｚ３について、構造−Ｙのｎ３はｎ−１、構造−Ｚ１及び構造Ｚ−３のｎ３はｎ−３、及び構造−Ｚ２のｎ３はｎ−５のようにｎ３は選択され；ここでは、ｎを上記のように設定する。
0005816618.tif 000012
【００４８】
上記の構造−Ｐ１乃至Ｐ５について、構造−Ｐ１及び構造Ｐ３乃至Ｐ５のｎ４はｎ−５、及び構造−Ｐ２のｎ４はｎ−３のようにｎ４は選択され；ここでは、ｎを上記のように設定する。
【００４９】
0005816618.tif 000013
【００５０】
［実施例］
本発明による組成物及び方法の原理及び作用は、添付の詳細な説明を参照するとより良く理解できるであろう。
【００５１】
本発明の少なくとも一の実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、以下の説明で述べられる又は実施例により例示される細部へのその適用に限定されるものではないものことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、さまざまな方法で実施又は実行することができる。また、本明細書で用いる表現及び専門用語は、説明を目的とするものであり、制限するものと見なすべきではない。
【００５２】
本発明のさまざまな実施形態、利点及び新規な特徴は、以下の実施例を検討する際に、通常の当業者に明らかになるであろうし、これらは、限定されることを意図するものではない。更に、本明細書で上記したように及び以下の特許請求の範囲で主張するように、本発明のさまざまな実施形態及び態様の各々は、以下の実施例で実験的に裏付けがなされる。
【実施例１】
【００５３】
［化学式Ｉのイソチオシアネート化合物及びハロアセトアミド化合物の合成］
この非限定的な実施例は、イソチオシアネートｉｔｃ−１１、１２、１３、ハロアセトアミドｈａｌ−１１、１２、１３−Ｂｒ、及びハロアセトアミドｈａｌ−１１、１２、１３−Ｃｌに関する。この合成の概略図を図３Ａに示す；図３ｂは、化学式Ｉのイソチオシアネート化合物に関する更に詳しい合成を示す（ＤＣＭはジクロロメタン、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、ＤＣＣはＮ，Ｎ’ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジン）；図３ｃは、化学式Ｉのハロアセトアミド化合物についての更に詳しい合成を示す（ＤＣＭはジクロロメタン、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、ＤＣＣはＮ，Ｎ’ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジン、ＴＣＡはトリフルオロ酢酸）。
【００５４】
通常、全ての化学試薬をＡｌｄｒｉｃｈ社又はＡｃｒｏｓ社から購入し、更なる精製をせずに使用した。トリプシンをＰｒｏｍｅｇａ工業（Ｖ５２８０）から購入した。ＴＬＣアルミシートのＦ２５４インジケータ配合のシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ社）上で薄層クロマトグラフィーを行った。フラッシュクロマトグラフィーをＭｅｒｃｋ社４０−６３μｍのシリカゲル上で行った。フラッシュクロマトグラフィーによる化合物の精製についての抽剤比を、容量パーセント（容量／容量）として記録した。ＳＤＳ  ｐａｇｅをＩｎｖｉｔｒｏｎ社（ＮＰ０３４２）より購入したＮｕＰＡＧＥ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ  Ｘｃｅｌｌを用いてＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔ  ｇｅｌ上で行った。Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム１３１４（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて小規模に又はＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に適した予め包装されたカートリッジＮｉ２＋（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ、Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＡＣカートリッジ、７３２−４６１２、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて大規模に発現させた。ＮＭＲ（核磁気共鳴）分析を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＰＸ２００を用いて又は、代替として、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＭＸ５００を用いて実行した。スペクトルを残留溶媒のシグナルで観測した。分析用ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  Ｐｌｕｓ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）上で、Ｌｕｎａ  Ｃ１８、μｍ（１５０×４．６ｍｍ）カラムを用いて、１ｍＬ／分の流速で行った。分取ＨＰＬＣを、定期的にＳａｐｐｈｉｒｅ６００機器（ＥＣＯＭ社）上で、Ｌｕｎａ  Ｃ１８カラム、１０μｍ（２５０×２１．２０ｍ）、２０ｍＬ／分の流速で行った。全ての流出入は、０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を含有する０．１％含水ＴＦＡ（溶媒Ａ）−９０％アセトニトリルの直線的勾配を使用した。化合物を二波長ＵＶ検出（２３０ｎｍ、２６０ｎｍ）により同定した。全てのＭＳをＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）源とともに、ＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行った。スペクトルを陽イオンモードで回収し、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により分析した。バイオアッセイを基準として用いるマイクロタイタープレートをスペクトルＭａｘ  Ｍ２分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて評価した。Ｃｈｈａｂｒａら１及びＧｅｓｋｅら２により記載された方法を変更（４−ブロモフェニル酢酸をＥＤＣ／ＮＨＳ媒介結合を介して、ホモセリンラクトンヒドロブロミドと反応させた）し、化合物３−オキソ−Ｃ１２−ＳＬ及び４−Ｂｒ−ＰＨＬを合成した。
【００５５】
［詳細な合成方法］
0005816618.tif 000014
［９−Ｂｒｏｍａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（４ａ）−］
濃硝酸溶液（１０ｍＬ、２５８ｍｍｏｌ）に９−ブロモノナナール（ｂｒｏｍｏｎｏｎａｎｏｌ）（１ｇｒ、４．４８ｍｍｏｌ）を３０分にわたって、２５乃至３０℃の温度を維持して添加した。この溶液を４時間室温で撹拌し、次いで８０℃に加熱して、更に１時間撹拌した。次いで、反応混合物を室温に冷却して、１００ｍＬの蒸留水で慎重に希釈した。生成物をジエチルエーテル（４×２５ｍＬ）で抽出し、有機相と結合させて硫酸マグネシウム上で乾燥させた。混合物を濾過して、真空で濃縮させ、生成物４ａを定量的に生成させた。１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．３−１．５（ｍ；８Ｈ）、１．５９−１．７１（ｍ；２Ｈ）、１．７８−１．９２（ｍ；２Ｈ）、２．３６（ｔ；Ｊ＝７．４Ｈｚ；２Ｈ）、３．４０（ｔ；Ｊ＝６．８Ｈｚ；２Ｈ）、９．８（ｍ、１Ｈ）
【００５６】
0005816618.tif 000015
［９−アジドノナン酸（５ａ）−］
９−ブロモノナン酸（４ａ）（１．０６２ｇｒ、４．４８ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解させた。次いで、アジ化ナトリウム（９１４ｍｇ、１４ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を６０℃で６時間撹拌した。この溶液を冷却して、５０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、その後１ＭのＨＣｌ（５×５０ｍＬ）、ブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。次いで、混合物を濾過し、真空で濃縮させて、白色固体として９０％の生成物５ａを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．３−１．５（ｍ；８Ｈ）、１．５−１．７（ｍ；４Ｈ）、２．３３（ｔ；Ｊ＝７．４Ｈｚ；２Ｈ）、３．２５（ｔ；Ｊ＝６．８６Ｈｚ；２Ｈ）
【００５７】
0005816618.tif 000016
［１０−アジドデカン酸（５ｂ）−］
１０−ブロモデカン酸（１．１２５ｇｒ、４．４８ｍｍｏｌ）を、生成物５ａについて説明したように反応させて、９１％の生成物５ｂを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２−１．５（ｍ；１０Ｈ）、１．５−１．７（ｍ；４Ｈ）、２．３５（ｔ；Ｊ＝７．４１Ｈｚ；２Ｈ）、３．２４（ｔ；Ｊ＝６．８１Ｈｚ；２Ｈ）
【００５８】
0005816618.tif 000017
［１１−アジドウンデカン酸（５ｃ）−］
アジ化ナトリウム（２．３８ｇｒ、４４．３ｍｍｏｌ）を７．５ｍＬの水に溶解させて、１５ｍＬのジクロロメタンを含む丸底フラスコに添加した。フラスコを０℃に冷却して、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．５ｍＬ、８．９ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。得られた溶液を室温まで温めて、２時間撹拌した。水層をジクロロメタン（３×８ｍＬ）で抽出して、結合有機相を炭酸ナトリウムの飽和溶液で洗浄した。次いで、得られた溶液を１１−アミノウンデカン酸（８９２ｍｇ、４．４３ｍｍｏｌ）と、Ｋ２ＣＯ３（９１５ｍｇ、６．６２ｍｍｏｌ）と、及び１５ｍＬの水及び２２．５ｍＬのエタノール中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１１ｍｇ、０．００４４ｍｍｏｌ）との懸濁液にゆっくりと添加した。混合物を一晩撹拌し、真空で濃縮させた。この溶液を１ＭのＨＣｌ溶液で酸性化して、ジクロロメタン（４×５０ｍＬ）で抽出した。結合させて、硫酸マグネシウムで乾燥させた有機相を濾過し、真空で濃縮させて、９２％の５ｃを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２５−１．４（ｍ；１２Ｈ）、１．５−１．７（ｍ；４Ｈ）、２．３５（ｔ；Ｊ＝７．４３Ｈｚ；２Ｈ）、３．２５（ｔ；Ｊ＝６．８８Ｈｚ；２Ｈ）
【００５９】
［アミンのＢｏｃ保護の一般的方法］
水（９ｍＬ）、ＮａＯＨ（８００ｍｇ、１９．５ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔブタノール（９ｍＬ）、及びＢｏｃ無水物（４．３ｇｒ、１９．５ｍｍｏｌ）を含む丸底フラスコに、所望のアミン（１８．５５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、混合物を室温で１６時間撹拌し、その後、水（２０ｍＬ）及び１ＭのＨＣＬ（１０ｍＬ）で希釈した。得られた溶液を、酢酸エチル（１×６０ｍＬ＋２×２０ｍＬ）で抽出し、ブラインで洗浄して、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。粗混合物を濾過して、真空で濃縮させた。
【００６０】
0005816618.tif 000018
［９−アミノノナン酸（８ａ）−］
９−ブロモデカン酸（２．００５２ｇｒ、８．４６ｍｍｏｌ）を、８０ｍＬの含水水酸化アンモニウム（２５％のＮＨ３）を含む丸底フラスコに添加した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌し、その後、水溶液を減圧下で蒸発させて、定量的収率で白色固体として生成物８ａを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：１．２５−１．４（ｍ；８Ｈ）、１．５−１．７（ｍ；４Ｈ）、２．２３（ｔ；Ｊ＝７．３１  Ｈｚ；２Ｈ）、２．８７（ｔ；Ｊ＝７．４５Ｈｚ；２Ｈ）
【００６１】
0005816618.tif 000019
［１０−アミノデカン酸（８ｂ）−］
１０−ブロモデカン酸（２．５１ｇｒ、１０ｍｍｏｌ）を、８０ｍＬの含水水酸化アンモニウム（２５％のＮＨ３）を含む丸底フラスコに添加した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌し、その後、水溶液を減圧下で蒸発させて、定量的収率で白色固体として生成物８ｂを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：１．２５−１．４（ｍ；１０Ｈ）、１．５−１．７（ｍ；４Ｈ）、２．１５（ｔ；Ｊ＝７．３８Ｈｚ；２Ｈ）、２．８９（ｔ；Ｊ＝７．４８Ｈｚ；２Ｈ）
【００６２】
0005816618.tif 000020
［９−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ノナン酸（９ａ）−］
９−アミノノナン酸（８．４６ｍｍｏｌ）は、上記のようにＢｏｃで保護され、８６％の収率で７．２６ｍｍｏｌの無菌の生成物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２５−１．７（ｍ；２１Ｈ）、２．３０（ｔ；Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．０５（ｔ；Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．５３（ｓ、１Ｈ）
【００６３】
0005816618.tif 000021
［１０−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）デカン酸（９ｂ）−］
１０−アミノデカン酸（５．５７ｍｍｏｌ）は、上記のようにＢｏｃで保護され、７７％の収率で４．２７ｍｍｏｌの無菌の生成物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２５−１．７（ｍ；２３Ｈ）、２．３４（ｔ；Ｊ＝７．３３Ｈｚ、２Ｈ）、３．０７（ｔ；Ｊ＝６．２５Ｈｚ、２Ｈ）、４．５３（ｓ、１Ｈ）
【００６４】
0005816618.tif 000022
［１１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ウンデカン酸（９ｃ）−］
１１−アミノウンデカン酸（１８．５５ｍｍｏｌ）は、上記のようにＢｏｃで保護され、９８％の収率で１７．４ｍｍｏｌの無菌の生成物を得た。１Ｈ−ＮＨＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２５−１．７（ｍ；２５Ｈ）、２．３４（ｔ；Ｊ＝７．３５Ｈｚ、２Ｈ）、３．１（ｔ；Ｊ＝６．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．５２（ｓ、１Ｈ）
【００６５】
［メルドラム酸を用いたホモセリンラクトンの結合に関する一般的な方法］
Ｎ−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（０．２５７ｇｒ、２．１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．４５４ｇｒ、２．２ｍｍｏｌ）、所望のアルキルカルボン酸（２ｍｍｏｌ）、及びメルドラム酸（０．２８８ｇｒ、２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。得られた溶液を一晩攪拌し、それから濾過して反応で形成されたＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル尿素を除去した。濾液を真空で濃縮させた。得られた残渣をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、α−アミノ−γ−ブチロラクトンヒドロブロミド（０．３６４ｇｒ、２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、６０℃で更に４時間攪拌した。得られた溶液を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム、１Ｍ硫酸水素ナトリウム溶液、及びブラインで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して真空で濃縮させた。更に、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００６６】
0005816618.tif 000023
［１１−アジド−３−オキソ−Ｎ−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）ウンデカンアミド（６ａ）］：
生成物５ａを上記のメルドラム酸で反応させ、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、収率６６％で生成物６ａを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２−１．４（ｍ；８Ｈ）、１．５−１．７（ｍ；４Ｈ）、２．１−２．３（ｍ；１Ｈ）、２．５１（ｔ；Ｊ＝７．３；２Ｈ）、２．６−２．７５（ｍ；１Ｈ）、３．２１（ｔ；Ｊ＝６．８５Ｈｚ；２Ｈ）、３．４４（ｓ；２Ｈ）、４．２−４．３（ｍ；１Ｈ）、４．４（ｄｔ；Ｊ１＝９Ｈｚ、Ｊ２＝１．４Ｈｚ；１Ｈ）、４．５−４．６５（ｍ；１Ｈ）、７．７（ｄ；Ｊ＝６．６Ｈｚ；１Ｈ）
【００６７】
0005816618.tif 000024
［１２−アジド−３−オキソ−Ｎ−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）ドデカンアミド（６ｂ）］：
生成物５ｂを、上記のメルドラム酸で反応させ、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、収率３８％で生成物６ｂを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２−１．４（ｍ；１０Ｈ）、１．５−１．７（ｍ；４Ｈ）、２．１−２．３（ｍ；１Ｈ）、２．５０（ｔ；Ｊ＝７．２Ｈｚ；２Ｈ）、２．６−２．７５（ｍ；１Ｈ）、３．２０（ｔ；Ｊ＝６．８５Ｈｚ；２Ｈ）、３．４４（ｓ；２Ｈ）、４．２−４．３（ｍ；１Ｈ）、４．４（ｄｔ；Ｊ１＝９Ｈｚ、Ｊ２＝１．４Ｈｚ；１Ｈ）、４．５−４．７（ｍ；１Ｈ）、７．７５（ｄ；Ｊ＝６．７；１Ｈ）
【００６８】
0005816618.tif 000025
［１３−アジド−３−オキシ−Ｎ−（２−オキシテトラヒドロフラン−３−イル）トリデカンアミド（６ｃ）］：
生成物５ｃを上記のメルドラム酸で反応させ、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、収率６６％で生成物６ｃを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２−１．４（ｍ；１２Ｈ）、１．５−１．７（ｍ；４Ｈ）、２．１−２．３（ｍ；１Ｈ）、２，５２（ｔ；Ｊ＝７．３Ｈｚ；２Ｈ）、２．６−２．８（ｍ；１Ｈ）、３．２４（ｔ；Ｊ＝６．８Ｈｚ；２Ｈ）、３．４６（ｓ；２Ｈ）、４．２−４．３（ｍ；１Ｈ）、４．４．（ｄｔ；Ｊ１＝９Ｈｚ、Ｊ２＝１．４Ｈｚ；１Ｈ）、４．５−４．６５（ｍ；１Ｈ）、７．８５（ｄ；Ｊ＝６．９；１Ｈ）
【００６９】
0005816618.tif 000026
［１１−イソチオシアネート−３−オキソ−Ｎ−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）ウンデカンアミド（７ａ、ｉｔｃ−１１）］：
トルエン（１０ｍＬ）中の６ａの溶液（０．２４ｍｍｏｌ）に、トリフェニルホスフィン（６９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の一部を室温で添加した。溶液を５０℃に加熱して、１時間攪拌した。溶液を室温に冷却した後、二硫化炭素（３０μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。次いで、溶液を５０℃に加熱し戻して、更に２時間攪拌した。粗混合物を真空で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーにより精製して９３％で７ａを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２２−１．３１（ｍ；６Ｈ）、１．３２−１．４（ｍ；２Ｈ）、１．５２−１．５７（ｍ；２Ｈ）、１．６２−１．６８（ｍ；２Ｈ）、２．３−２．３（ｍ；１Ｈ）、２．５２（ｔ；Ｊ＝７．３Ｈｚ；２Ｈ）、２．６６−２．７２（ｍ；１Ｈ）、３．４５（ｓ；２Ｈ）、３．４８（ｔ；Ｊ＝６．８２Ｈｚ；２Ｈ）、４．２２−４．２８（ｍ；１Ｈ）、４．４５（ｔ；Ｊ＝８．９Ｈｚ；１Ｈ）、４．５２−４．６１（ｍ；１Ｈ）、７．７（ｄ；Ｊ＝６．３；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（カーボンサーティーン核磁気共鳴）（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．２、２６．４、２８．５、２８．７、２９．１、２９．５、２９．８、４３．７、４５．０、４８．４、４９．０、６６．０、１２９．３、１６６．６、１７５．１、２０６．４。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］３４１．２、測定値：［Ｍ＋］３４１．０６。
【００７０】
0005816618.tif 000027
［１２−イソチオシアネート−３−オキソ−Ｎ−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）ドデカンアミド（７ｂ、ｉｔｃ−１２）］：
トルエン１０ｍＬ中の６ｂの溶液（０．２４ｍｍｏｌ）に、トリフェニルホスフィン（６９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の一部を室温で添加した。溶液を５０℃に加熱して、１時間攪拌した。溶液を室温に冷却した後、二硫化炭素（３０μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。次いで、溶液を５０℃に加熱し戻して、更に２時間攪拌した。粗混合物を真空で濃縮ささせ、カラムクロマトグラフィーにより精製して６６％で７ｂを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２５−１．３２（ｍ；８Ｈ）、１．３３−１．４１（ｍ；２Ｈ）、１．５３−１．５９（ｍ；２Ｈ）、１．６４−１．７（ｍ；２Ｈ）、２．２−２．２８（ｍ；１Ｈ）、２．５２（ｔ；Ｊ＝７．３Ｈｚ；２Ｈ）、２．７−２．７６（ｍ；１Ｈ）、３．４６（ｓ；２Ｈ）、３．４９（ｔ；Ｊ＝６．８２Ｈｚ；２Ｈ）、４．２４−４．３（ｍ；１Ｈ）、４．４６（ｔ；Ｊ＝８．９Ｈｚ；１Ｈ）、４．５５−４．６１（ｍ；１Ｈ）、７．６（ｄ；Ｊ＝６．３Ｈｚ；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．２、２６．４、２８．６、２８．８、２９．１、２９．７、２９．８、４３．８、４５．０、４８．２、４９．０、６５．９、１２９．３、１６６．４、１７４．９、２０６．５。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］３５５．１、測定値：［Ｍ＋］３５５．０５。
【００７１】
0005816618.tif 000028
［１３−イソチオシアネート−３−オキソ−Ｎ−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）トリデカンアミド（７ｃ、ｉｔｃ−１３）］：
トルエン１０ｍＬ中の６ｃ（０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（６９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の一部を、室温で添加した。溶液を５０℃に加熱して、１時間攪拌した。溶液を室温に冷却した後、二硫化炭素（３０μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。次いで、溶液を５０℃に加熱し戻して、更に２時間攪拌した。粗混合物を真空で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーにより精製して５７％で７ｃを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２２−１．３０（ｍ；１０Ｈ）、１．３４−１．４０（ｍ；２Ｈ）、１．５１−１．５８（ｍ；２Ｈ）、１．６３−１．７（ｍ；２Ｈ）、２．２−２．２８（ｍ；１Ｈ）、２，５１（ｔ；Ｊ＝７．３５Ｈｚ；２Ｈ）、２．６７−２．７３（ｍ；１Ｈ）、３．４５（ｓ；２Ｈ）、３．４８（ｔ；Ｊ＝６．６６Ｈｚ；２Ｈ）、４．２２−４．２８（ｍ；１Ｈ）、４．４５（ｔ；Ｊ＝８．９７Ｈｚ；１Ｈ）、４．５５−４．６１（ｍ；１Ｈ）、７．７（ｄ；Ｊ＝６．３Ｈｚ；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．２、２６．５、２８．７、２８．９、２９．２、２９．５、２９．８、４３．７、４５．０、４８．３、４９．０、６５．９、１２９．３、１６６．５、１７５．０、２０６．５。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］３６７．２、測定値：［Ｍ＋］３６９．０６。
【００７２】
0005816618.tif 000029
［ｔｅｒｔ−ブチル−９，１１−ジオキソ−１１−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イルアミノ）−ウンデシルカルバマート（１０ａ）］：
生成物９ａを上記のメルドラム酸で反応させて、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、３６％で生成物１０ａを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２４−１．３２（ｍ；１０Ｈ）、１．２７（ｓ；９Ｈ）、１．５８−１．７（ｍ；２Ｈ）、２．１０−２．２９（ｂｒ  ｓ；１Ｈ）、２．５２（ｔ；Ｊ＝７．３１；２Ｈ）、２．６２−２．８０（ｂｒ  ｓ；１Ｈ）、３．０７（ｔ；Ｊ＝６．９０Ｈｚ；２Ｈ）、３．４６（ｓ；２Ｈ）、４．２３−４．３４（ｍ；１Ｈ）、４．４６（ｄｔ；Ｊ１＝９．１５、Ｊ２＝０．９；１Ｈ）、４．５４−４．６４（ｍ；１Ｈ）、７．７（ｄ；Ｊ＝４．８１；１Ｈ）
【００７３】
0005816618.tif 000030
［ｔｅｒｔ−ブチル−１０，１２−ジオキソ−１２−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イルアミノ）−ドデシルカルバマート（１０ｂ）］：
生成物９ｂを上記のメルドラム酸で反応させて、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、３２％で生成物１０ｂを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２４−１．３２（ｍ；１２Ｈ）、１．４３（ｓ；９Ｈ）、１．５−１．６２（ｍ；２Ｈ）、２．１０−２．３０（ｂｒ  ｓ；１Ｈ）、２．５２（ｔ；Ｊ＝７．２７Ｈｚ；２Ｈ）、２．６６−２．８２（ｂｒ  ｓ；１Ｈ）、３．０７（ｔ；Ｊ＝６．９１Ｈｚ；２Ｈ）、３．４６（ｓ；２Ｈ）、４．２２−４．３４（ｍ；１Ｈ）、４．４７（ｄｔ；Ｊ１＝９．１５Ｈｚ、Ｊ２＝１．４Ｈｚ；１Ｈ）、４．５４−４．６４（ｍ；１Ｈ）、７．６（ｄ；Ｊ＝４．８４Ｈｚ；１Ｈ）
【００７４】
0005816618.tif 000031
［ｔｅｒｔ−ブチル−１１，１３−ジオキソ−１３−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イルアミノ）−トリデシルカルバマート（１０ｃ）］：
生成物９ｃを上記のメルドラム酸で反応させて、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、５９％で生成物１０ｃを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．２２−１．３２（ｍ；１４Ｈ）、１．４３（ｓ；９Ｈ）、１．５３−１．６２（ｍ；２Ｈ）、２．１０−２．３０（ｂｒ  ｓ；１Ｈ）、２．５１（ｔ；Ｊ＝７．２７Ｈｚ；２Ｈ）、２．６６−２．８（ｂｒ；１Ｈ）、３．０８（ｔ；Ｊ＝６．９１Ｈｚ；２Ｈ）、３．４５（ｓ；２Ｈ）、４．２２−４．３３（ｍ；１Ｈ）、４．４６（ｄｔ；Ｊ１＝９．１６Ｈｚ、Ｊ２＝０．５６Ｈｚ；１Ｈ）、４．５４−４．６４（ｍ；１Ｈ）、７．７（ｄ；Ｊ＝４．９３；１Ｈ）
【００７５】
［生成物１１ａ−ｇの一般的手法］：
化合物１０ａ−ｃ（０．７０５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン４ｍＬに溶解させる。トリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を一部分添加して、得られた溶液を室温で２０分間撹拌し、その後Ｂｏｃ部分を完全に除去した（ＮＭＲによって確認した）。溶媒を蒸発させて、ジクロロメタン（５ｍＬ）を得られた残渣に添加した。トリエチルアミンを添加することによってｐＨを７までに調整して、ピリジン（６２μＬ、０．７８５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、氷浴上で０℃に冷却して、ジクロロメタン（４．５ｍＬ）中のブロモアセチルブロミド溶液（６４μＬ、０．７４ｍｍｏｌ）（生成物１１ｄ−ｇ用に塩化クロロアセチルを使用した）を５分間にわたり液滴で添加した。反応混合物を、１時間氷上に置いたままにし、その後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１００ｍＬ）で希釈してクロロホルム（３×３０ｍＬ）で抽出した。結合した有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して真空で濃縮させた。最終生成物（１１ａ−ｇ）をＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）で精製した。
【００７６】
［１１ａ（ｈａｌ−１１−Ｂｒ）−］１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：
１．２２−１．３２（ｂｒ；８Ｈ）、１．５１（ｔ；Ｊ＝６．８１Ｈｚ；２Ｈ）、１．５６（ｔ；Ｊ＝６．７８Ｈｚ；２Ｈ）、２．１８−２．２８（ｍ；１Ｈ）、２．５１（ｔ；Ｊ＝７．２５  Ｈｚ；２Ｈ）、２．７−２．７６（ｍ；１Ｈ）、３．２５（ｑ；Ｊ＝６．７１Ｈｚ；２Ｈ）、３．４５（ｓ；２Ｈ）、３．８６（ｓ；２Ｈ）、４．２２−４．２９（ｍ；１Ｈ）、４．４６（ｔ；Ｊ＝８．９３Ｈｚ；１Ｈ）、４．５５−４．６１（ｍ；１Ｈ）、６．４９（ｂｒ、１Ｈ）、７．６７（ｂｒ；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．２０、２６．５６、２８．７４、２８．８５、２９．０４、２９．１６、２９．３４、２９．８６、４０．２０、４３．８１、４８．１４、４９．０８、６５．９１、１６５．３８、１６６．３９、１７４．７８、２０６．５１。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］４１９．３、測定値：［Ｍ＋］４１９．０４。
【００７７】
［１１ｂ（ｈａｌ−１２−Ｂｒ）−］１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：
１．２３−１．３１（ｂｒ；１０Ｈ）、１．５１（ｔ；Ｊ＝７．１３Ｈｚ；２Ｈ）、１．５５（ｔ；Ｊ＝７．３１Ｈｚ；２Ｈ）、２．１８−２．２８（ｍ；１Ｈ）、２．５１（ｔ；Ｊ＝７．３３Ｈｚ；２Ｈ）、２．６９−２．７５（ｍ；１Ｈ）、３．２５（ｑ；Ｊ＝６．７５Ｈｚ；２Ｈ）、３．４５（ｓ；２Ｈ）、３．８６（ｓ；２Ｈ）、４．２３−４．２９（ｍ；１Ｈ）、４．４５（ｄｔ、Ｊ１＝９．０８Ｈｚ、Ｊ２＝１．４４Ｈｚ；１Ｈ）、４．５５−４．６１（ｍ；１Ｈ）、６．５４（ｂｒ、１Ｈ）、７．７３（ｄ；Ｊ＝６．４７Ｈｚ；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．２４，２６．６７、２８．８３、２９．０２、２９．１３、２９．３９、２９．７０、４０．２１、４３．７７、４８．３０、４９．０４、６５．９３、１６５．３９、１６６．４８、１７４．９２、２０６．４７。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］４３３．３、測定値：［Ｍ＋］４３５．０３。
【００７８】
［１１ｃ（ｈａｌ−１３−Ｂｒ）−］１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：
１．２２−１．３２（ｂｒ；１２Ｈ）、１．５２（ｔ；Ｊ＝７．０２Ｈｚ；２Ｈ）、１．５７（ｔ；Ｊ＝７．０３Ｈｚ；２Ｈ）、２．１８−２．２８（ｍ；１Ｈ）、２．５２（ｔ；Ｊ＝７．３４Ｈｚ；２Ｈ）、２．７１−２．７８（ｍ、１Ｈ）、３．２７（ｑ；Ｊ＝６．７５Ｈｚ：２Ｈ）、３．４６（ｓ；２Ｈ）、３．８７（ｓ；２Ｈ）、４．２３−４．３０（ｍ；１Ｈ）、４．４７（ｄｔ、Ｊ１＝９．０７Ｈｚ、Ｊ２＝１．２７Ｈｚ；１Ｈ）、４．５５−４．６１（ｍ；１Ｈ）、６．５１（ｂｒ、１Ｈ）、７．７０（ｄ；Ｊ＝５．７６Ｈｚ；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．２９、２６．７３、２８．８８、２９．１１、２９．２１、２９．３０、２９．４０、２９．８２、４０．２６、４３．８７、４８．１２、４９．０６、６５．８９、１６５．３０、１６６．３９、１７４．７９、２０６．５４。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］４４７．１、測定値：［Ｍ＋］４４７．１７。
【００７９】
［１１ｄ（ｈａｌ−１１−Ｃｌ）−］１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：
１．２５−１．３３（ｂｒ；１０Ｈ）、１．５−１．５９（ｂｒ；４Ｈ）、２．１９−２．２９（ｍ；１Ｈ）、２．５２（ｔ；Ｊ＝７．２９Ｈｚ；２Ｈ）、２．７０−２．７６（ｍ、１Ｈ）、３．２８（ｑ；Ｊ＝６．７５Ｈｚ：２Ｈ）、３．４６（ｓ；２Ｈ）、４．０４（ｓ；２Ｈ）、４．２４−４．３０（ｍ；１Ｈ）、４．４７（ｔ、Ｊ１＝９．００Ｈｚ；１Ｈ）、４．５６−４．６２（ｍ；１Ｈ）、６．６１（ｂｒ、１Ｈ）、７．７２（ｂｒ；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．１７、２６．５９、２８．７２、２８．８４、２９．０３、２９．１９、２９．６９、３９．８０、４２．６７、４３．６９、４８．２５、４９．０２、６５．８８、１６５．８３、１６６．４２、１７４．８５、２０６．３７。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］３７５．８、測定値：［Ｍ＋］３７５．０７。
【００８０】
［１１ｅ（ｈａｌ−１２−Ｃｌ）−］１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：
１．２２−１．３０（ｂｒ；１２Ｈ）、１．４８−１．５８（ｂｒ；４Ｈ）、２．１７−２．２７（ｍ；１Ｈ）、２．５０（ｔ；Ｊ＝７．３５Ｈｚ；２Ｈ）、２．６８−２．７５（ｍ、１Ｈ）、３．２６（ｑ；Ｊ＝６．７８Ｈｚ：２Ｈ）、３．４４（ｓ；２Ｈ）、４．０２（ｓ；２Ｈ）、４．２２−４．２９（ｍ；１Ｈ）、４．４５（ｄｔ、Ｊ１＝９．０６Ｈｚ、Ｊ２＝１．３０Ｈｚ；１Ｈ）、４．５４−４．６１（ｍ；１Ｈ）、６．５８（ｂｒ、１Ｈ）、７．７１（ｄ；Ｊ＝６．２０Ｈｚ；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．２５、２６．７１、２８．８６、２９．０８、２９．１９、２９．７０、３９．８５、４２．６７、４３．７８、４８．２２、４８．９９、６５．８７、１６５．７７、１６６．４０、１７４．８５、２０６．４６。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］３８８．９、測定値：［Ｍ＋］３８９．１。
【００８１】
［１１ｇ（ｈａｌ−１３−Ｃｌ）−］１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：
１．２２−１．３０（ｂｒ；１２Ｈ）、１．４８−１．５８（ｂｒ；４Ｈ）、２．１７−２．２７（ｍ；１Ｈ）、２．５０（ｔ；Ｊ＝７．３５Ｈｚ；２Ｈ）、２．６８−２．７５（ｍ；１Ｈ）、３．２６（ｑ；Ｊ＝６．７８Ｈｚ：２Ｈ）、３．４４（ｓ；２Ｈ）、４．０２（ｓ；２Ｈ）、４．２２−４．２９（ｍ；１Ｈ）、４．４５（ｄｔ、Ｊ１＝９．０６、Ｊ２＝１．３０；１Ｈ）、４．５４−４．６１（ｍ；１Ｈ）、６．５８（ｂｒ、１Ｈ）、７．７１（ｄ；Ｊ＝６．２０；１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２３．２５、２６．７１、２８．８６、２９．０８、２９．１９、２９．７０、３９．８５、４２．６７、４３．７８、４８．２２、４８．９９、６５．８７、１６５．７７、１６６．４０、１７４．８５、２０６．４６。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋］４０２．９、測定値：［Ｍ＋］４０３．０８。
【００８２】
図３Ｄは、（上記）化合物７ａの１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示す。
【００８３】
図３Ｅは、（上記）化合物７ｂの１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示す。
【００８４】
図３Ｆは、（上記）化合物７ｃの１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示す。
【００８５】
図３Ｇは、（上記）化合物７ｃの１３Ｃ−ＤＥＰＴ−ＮＭＲ及び２Ｄ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲ分析結果を示す。
【００８６】
これらの結果は、上記化合物の分析から得られたデータのいくつかを非限定的な例として示したにすぎない。
【実施例２】
【００８７】
［実施例１の化合物による細菌伝達の阻害］
［材料と方法］
［化学合成］
イソチオシアネートｉｔｃ−１１、１２、１３、ハロアセトアミドｈａｌ−１１、１２、１３−Ｂｒ及びハロアセトアミドｈａｌ−１１、１２、１３−Ｃｌの合成を上記のように行った。
【００８８】
［質量分析］
全てのＭＳ分析を、ＥＳＩ源を具えるＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ質量分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）上で実行した。陽イオンモードでスペクトルを回収して、Ｘｃａｌｉｂｕｒ及びＰｒｏｍａｓｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により分析した。ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）の分析に関して、０．１％の含水ギ酸（溶媒Ａ）及び０．１％のギ酸（溶媒Ｂ）を含有するＣＨ３ＣＮの移動相の直線的な傾きを用いて、流速０．５ｍＬ／分の５μｍ（１５０×４．６ｍｍ）カラムであるＬｕｎａ  Ｃ１８を具えるＳｕｒｖｅｙｏｒ  Ｐｌｕｓ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。
【００８９】
［ＬａｓＲ−ＬＢＤの発現］
全長ＬａｓＲの発現が、天然リガンドである３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬの有無にかかわらず、ほとんど不溶性であるタンパク質を生じさせることは、以前から知られていた（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｕｒａｇｌｉａ，Ｅ．，Ｂａｚｚｏ，Ｒ．＆  Ｃａｒｆｉ，Ａ．。その自己誘導物質に結合した毒性調節遺伝子ＬａｓＲの構造由来のヒト病原緑膿菌クオラムセンシングへの分子的洞察。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，１３５９２−６００（２００７））。従って、発現は、短縮型で、Ｈｉｓ６で標識されたＬａｓＲ構造体、ＬａｓＲ−ＬＢＤ（リガンド結合ドメイン）をコードするｐＥＴＭ−１１ベクターを用いて形質転換された株を使用して行われ、これは残基Ｍｅｔ−１からＬｙｓ−１７３に及んだ。プラスミドを大腸菌ＢＬ２１株に導入して、細胞を１ｍＬの栄養分豊富なＬＢ培地中で１時間インキュベートした。次いで、細胞をカナマイシン（５０マイクログラム／ｍＬ）を含有する、ＬＢ寒天培地上で培養した。発現用に、単一のコロニーを選択して、カナマイシンを含有する栄養豊富なＬＢ培地５ｍＬに導入し、一晩培養した。タンパク質を、上記の通り、天然３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ又はさまざまな阻害剤の存在下で発現させ、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーで精製し（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｕｒａｇｌｉａ，Ｅ．，Ｂａｚｚｏ，Ｒ．＆  Ｃａｒｆｉ，Ａ．。その自己誘導物質に結合した毒性調節遺伝子ＬａｓＲの構造由来のヒト病原緑膿菌クオラムセンシングへの分子的洞察。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２、１３５９２−６００（２００７））、大量発現条件を用いてＬＢ培地１リットルあたり７０ｍｇまでの精製タンパク質を生成し、少量発現条件を用いて５０ｍＬのＬＢ培地から０．５未満乃至１ｍｇの精製タンパク質を生成した。精製プロセスをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により観察して、精製タンパク質の分子量を質量分析法により確定した。
【００９０】
［大量発現］
カナマイシン（５０マイクログラム／ｍＬ）、１０乃至１００マイクロＭの３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ又は阻害剤７ａ−ｃ若しくは１１ａ−ｇを含有する栄養豊富なＬＢ培地１リットルあたりつき、一晩培養した細胞培養物１ｍＬを接種した。細胞を、光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．４になるまで培養し、その後、０．２ｍＭのイソプロピル１−チオ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより２１℃で発現が誘導されたら、追加的にリガンド／阻害剤を培地に添加した。ＯＤ６００ｎｍが１．４に達した（だいたい６−８時間）ら、細胞は、１分間あたり６０００ｒｐｍで遠心分離し、５ｍＭのイミダゾール、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有するｐＨ８の溶解バッファで洗浄し、再懸濁した。細胞は、７０％の振幅で２分間超音波処理を２回繰り返した。溶解物を、１分間あたり１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄みをＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【００９１】
少量発現を、従前の手順に従い、５０ｍＬ容量で行った。細胞は、溶解バッファ（５ｍＭのイミダゾール、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．２％（容量／容量）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．７５μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ−Ｉ、０．０５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのｐＨ８のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び０．０１％（容量／容量）のタンパク質阻害剤混合物）を添加する化学的溶解によって生成され、３７℃で６０分間インキュベートされた。細胞の破片を、１分間あたり４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して除去した。上澄みを、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【００９２】
［緑膿菌野生型（ＰＡ０１）株のＱＳ阻害試験］
発光系ｌｕｘＣＤＡＢＥ（Ｄｕａｎ，Ｋ．＆  Ｓｕｒｅｔｔｅ，Ｍ．Ｇ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ緑膿菌ＰＡ０１のＬａｓ及びＲｈ１クオラムセンシングシステムの調節遺伝子。Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８９，４８２７−３６（２００７））に結合したＬａｓＩレポータを含有するプラスミドｐＫＤ２０１を内包する緑膿菌野生型ＰＡ０１株を、トリメトプリムを３００マイクログラム／ｍｌ含有するＬＢ培地で一晩インキュベートした。９６ウェルのブラックマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）を阻害剤の望ましい濃度（成長阻害が観察される１ｍＭ超まで）で処理し、最終吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．０１５に達するまで細菌を添加した。次いで、このプレートを３７℃で１２時間インキュベートした。その間に、発光測定を１０分間隔で行なった。それから相対的な発光を、追加した阻害剤の濃度に対してプロットした；ＩＣ５０値をＧｒａｆｉｔ６．０（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて計算した。
【００９３】
［緑膿菌ＰＡＯ−ＪＰ２ＱＳアゴニスト／アンタゴニスト分析］
ｌｕｘＣＤＡＢＥ発光系（上記を参照されたい）に結合するＬａｓＩレポータ含有のプラスミドｐＫＤ２０１を内包するｌａｓＩ／ｒｈｌＩ欠損株であるＰＡＯ−ＪＰ２を、トリメトプリムを３００マイクログラム／ｍｌ含有するＬＢ培地で一晩インキュベートした。９６ウェルのブラックマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）を、ＰＡ０１阻害試験用に上記のように準備した。それから相対的な発光を、追加された阻害剤の濃度に対してプロットした；ＩＣ５０値をＧｒａｆｉｔ６．０（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて計算した。アンタゴニスト実験では、最終濃度５０ｎＭの３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬを使用した。
【００９４】
［大腸菌ＤＨ５−アルファＬａｓＲアゴニスト／アンタゴニスト分析］
ＬａｓＲ発現ベクター、ｐＪＮ１０５Ｌ及びプラスミド媒介ＰｌａｓＩ−ｌａｃＺ融合（ｐＳＣＩＩ）を内包する大腸菌ＤＨ５α（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｌｅｑｕｅｔｔｅ，Ｙ．＆  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｐ．精製ＱｓｃＲの活性、緑膿菌オーファンクオラムセンシング転写因子。Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９，６０２−９（２００６））を用いて、β−ガラクトシダーゼの発現レベルを測定することにより、クオラムセンシング阻害を定量化した。アンピシリン１００マイクログラム／ｍＬ及びゲンタマイシン１５マイクログラム／ｍＬ含有するＬＢ培地で、細菌を一晩インキュベートした。新鮮培地を用いて容量１：１０の比率で培養物を希釈し、更にＯＤ６００ｎｍが０．３に達するまでインキュベートした。９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）を望ましい濃度の阻害剤で準備して、最終吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．３に達するまで細菌を添加した。発現は、Ｌ−（＋）−アラビノース（４ｍｇ／ｍＬ）のエディションにて誘導され、プレートを３７℃で４時間インキュベートした（０．４５−０．５のＯＤ６００ｎｍ）。次いで、Ｍｉｌｌｅｒ検定方法４６により培養物をβ−ガラクトシダーゼ活性測定した：２００ｍＬ分量を清潔な９６ウェルのマイクロタイタープレートに移してＯＤ６００ｎｍを記録した。次いで、各ウェルの１００ｍＬを、２００ｍＬのＺ−バッファ、１０ｍＬのクロロホルム、及び５ｍＬの０．１％のＳＤＳ（重量／容量）を含むポリプロピレンベースの９６ウェルのマイクロタイタープレートに添加した。ウェルを、ピペット操作してよくすすぎ、その後クロロホルムを定着させた。水性上層の１００ｍＬを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移し、２０ｍＬのオルト−ニトフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＨ７のリン酸バッファ中の４ｍｇ／ｍＬのＯＮＰＧ）を添加した。プレートを２８℃で３５分間インキュベートした。１Ｍの炭酸ナトリウム溶液を添加して反応を停止させ、二つの波長（５５０ｎｍ、４２９ｎｍ）における吸収を記録した。Ｍｉｌｌｅｒユニットを、標準方法（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｈ．分子遺伝学における実験、３５２−３５５（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９７２）を用いて計算した。アンタゴニスト実験では、最終濃度５０ｎＭの３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬを使用した。
【００９５】
［ＬａｓＲ−ＬＢＤ及びＬａｓＲ−ＬＢＤ−ｉｔｃ−１１／１２−のトリプシン消化］
ＬａｓＲ質量比１：１００の酵素中で、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ工業）を、０．１％のＳＤＳ、３ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及び１０％のアセトニトリル含有の５０ｍＭのＴｒｉｓバッファ（ｐＨ＝８）に溶解させた。ＬａｓＲを所望の量を添加し、溶液を３７℃で２時間インキュベートした。混合物を−２０℃で保管して、トリプシンを失活させた。サンプルをＬＣ−ＭＳにより分析して、所望のピークは、以下のように配列ごとにＭＳ２を受けた。
0005816618.tif 000032
【００９６】
［ＱＳ阻害剤との相互作用の構造分析及びモデリング］
タンパク質−リガンドの画像をＰｙＭＯＬで処理した。ＬａｓＲ−ＬＢＤ−ＱＳＩの相互作用のモデリングでは、水素原子をＬａｓＲに添加して、ｐＨ７．４をシミュレーションした。マイクロモデルバージョン９．０（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  ＬＬＣ  ｓｏｆｔｗａｒｅ社）に実装されるメルク分子力場（ＭＭＦＦ−Ｓ）を用いて、最初にタンパク質の骨格を、次にＡＨＬ構造を硬化させて、これらの水素とタンパク質の側鎖の位置を、エネルギーを最小化（５０００最急降下ステップ）させることにより最適化した。
【００９７】
［結果］
化学式Ｉ（特に、例えば、図２で示すような化学式Ｉのハロアセトアミド化合物）の化合物のいくつかの非限定的な例とともにＬａｓＲを発現する細菌をインキュベートしたところ、可溶性ＬａｓＲ−ＬＢＤを得ることができた（図４ａ）。重要なことには、ハロアセトアミドの大部分が存在する場合は、ＬａｓＲが過剰発現して、可溶性ＬａｓＲ−ＬＢＤがほんの少量の発生したのに対し、プローブ又は３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬがない場合には、可溶性ＬａｓＲ−ＬＢＤが観察されなかった。同様に、細胞を４−Ｂｒ−ＰＨＬでインキュベートしたときは、Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙらの以前の結果（上記参照）を裏付けるように、可溶性ＬａｓＲは全く観察されなかった（データは示さず）。
【００９８】
ＬＣ−ＭＳ測定は、計算された質量が、測定された質量と一致（それぞれ２２，７７０Ｄａ  対２２，７７０Ｄａ及び２２，７８４Ｄａ対２２，７８３Ｄａ）して、精製ＬａｓＲ−ＬＢＤ（分子量２２，４３０Ｄａ、図４ｂ）が、ｉｔｃ−１１（分子量３４０Ｄａ）及びｉｔｃ−１２（分子量ｉｔｃ−１２  ３５４Ｄａ）に従って共有結合的に修正され得ることを明らかにした（図４ｃ、ｄ）。重要なことは、化学式Ｉの典型的な化合物が過剰に使用されたとしても（０．５乃至３．５マイクロ−ＭのＬａｓＲ−ＬＢＤの発現を導く、細菌成長培養における１０乃至１００マイクロ−Ｍ）、共有結合している化合物の一のユニットしか観察することができなかったことであり、このことは、使用される濃度において、反応が十分に特異的であることを示している。任意のハロアセトアミドでインキュベートした細胞からＬａｓＲ−ＬＢＤを精製しても、このような共有結合的修飾は、観察されなかった。これらの結果より、一の仮説に限定されることを望むものではないが、それらの阻害効果が、その他の強力な非共有結合阻害剤（例えば、誤ったフォールディングや沈殿が続く、結合初期ＬａｓＲ）に類似の方法で媒介されることを意味する共有結合反応が、ハロアセトアミドとＬａｓＲの間で行われるか、若しくは生成物を観察することはできないもののタンパク質の不溶性により共有結合反応を生じさせることができる。
【００９９】
［化学式Ｉの共有結合抑制化合物のＬａｓＲ結合ポケットにおけるＣｙｓ７９との特異的な反応］
ＬａｓＲ−ＬＢＤを、３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ又はｉｔｃ−１２（若しくはｉｔｃ−１１）の存在下で発現させ、続いてタンパク質の精製とトリプシンの消化をした。システイン含有のフラグメント（７２−ＶＤＰＴＶＳＨＣＴＱＳＶＬＰＩＦＷＥＰＳＩＹＱＴＲ−９６）を、単一のピーク（２９０３．４Ｄａ）としてＬＣ−ＭＳによって確認したと同時に、増加した保持時間とともに修飾されたペプチドとｉｔｃ−１２（又はｉｔｃ−１１）に対応する質量増加も確認した（データ示さず）。修飾された又は修飾されないＬａｓＲ−ＬＢＤ上のタンデムＭＳ／ＭＳ測定は正しくＣｙｓ７９が、共有結合プローブと反応したことを裏付けた（データは示さず）。
【０１００】
更に、二点突然変異（Ｃｙｓ→Ａｌａ又はＣｙｓ→Ｓｅｒ）を、天然タンパク質に導入し、その結合ポケット中の反応チオール部分を欠いてもまだＬａｓＲ−ＬＢＤが共有結合的に修飾されるかを検査した。予想通りに、ｉｔｃ−１２でインキュベーされた細菌中でＬａｓＲ−ＬＢＤのＣｙｓ７９Ａｌａ突然変異体が過剰発現すると、共有結合修飾は検出されなかった（データ示さず）。しかし、可溶性タンパク質を得た。このことは、突然変異体ＬａｓＲが、正しいフォールディングを誘導する基質として、イソチオシアネートを認識することができることを示している。同様に、共有修飾が観察されないにもかかわらず、ｉｔｃ−１２の存在下でＣｙｓ７９Ｓｅｒ突然変体は、可溶性タンパク質を発現させる。
【０１０１】
特に、天然ＬａｓＲ−ＬＢＤが、ｉｔｃ−１１とｉｔｃ−１２の存在下で発現したときは、共有結合標識は大抵不完全に見え、可溶性の、標識されないＬａｓＲ−ＬＢＤをかなりの量（２５乃至４０％、状況に応じて）もたらした。これは、イソチオシアネート用の代替の結合モードが、反応を防止するためにＣｙｓ７９から十分遠く配置された反応性炭素原子に存在することを示している。
【０１０２】
［ＬａｓＲ−イソチオシアネートの相互作用のコンピュータ分析］
上記実験データを補足するべく、コンピュータ構造分析及びＬａｓＲへのイソチオシアネートの結合をシミュレーションするドッキング計算を行った。ドッキング手法を確認する対照群として、天然３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬリガンドをその結合部位から取り除き、首尾よく再度ドッキングした。すなわち、結晶構造中のリガンドに対応する構造は、全ての非水素原子が平均二乗偏差＜０．２Åで、出力ポーズの相当上位に位置していた。次いで、三つのイソチオシアネート化合物をＬａｓＲ−結合部位へドッキングした。一リガンドごとの最も高いポーズが、剛体と考えられているタンパク質との関係において、詳細な配座解析に提示された。この分析により、最長のイソチオシアネート、すなわちｉｔｃ−１３を、タンパク質を伴う極性頭部基の相互作用を崩壊させずに、結合部位で適合させることはできないことが明らかなった。それに対し、より短い化合物、すなわちｉｔｃ−１１及びｉｔｃ−１２は、全ての有益なタンパク質を伴う極性相互作用を維持しながら、適合され得る。興味深いことに、エネルギーを最小化した配座異性体は、二つのグループに分けられたｉｔｃ−１１及びｉｔｃ−１２の双方で観察され、それらのイシチオシアネート基の配向においてのみ大幅に異なるものである（図５）。他の配向が、この反応にとって不十分であるのに対し、ある配向は、Ｃｙｓ７９の硫黄原子による求核攻撃にとって理想的な事前構築を提示する。ｉｔｃ−１２では、個体群のおおよそ６６％が、反応に適した配座を選ぶのに対し、ｉｔｃ−１１では、配座異性体の個体群は均等に分割（５０／５０）された。ｉｔｃ化合物へのＣｙｓ７９側鎖の再度の配向により、求核攻撃を強化し；ＬａｓＲの結晶構造は、この回転異性体が容認されるのを示唆する。
【０１０３】
［緑膿菌中のＱＳを阻害する反応性プローブ］
共有結合プローブの活性を、いくつかのレポータ株、すなわち、発光ＰＡ０１−ｌｕｘＡＢＣＤＥ野生型株及びＰＡ０１  ｌａｓＩ−ｒｈｌＩの二つの突然変異体（ＰＡＯ−ＪＰ−ｌｕｘＡＢＣＤＥ）、並びに大腸菌β−ガラクトシダーゼ−ＬａｓＲ−ベースのレポータ株を用いて評価した。プローブのいくつかが、ＰＡＯ−ＪＰ２−及び大腸菌株とともに行なった分析中で、アゴニスト及びアンタゴニスト活性の双方を示した（図６ｃ、ｄ）のに対し、いくつかのイソチオシアネート及びブロモアセトアミドは、野生型株中の発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ）を強く阻害した（図６ａ、ｂ）。このデータを、既知の強力なＱＳ阻害剤と報告されるそれらと比較するために、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ及び共同研究者により、最も活性のある緑膿菌ＱＳアンタゴニストの一つとして同定された（Ｇｅｓｋｅ，Ｇ．Ｄ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｍａｔｔｍａｎｎ，Ｍ．Ｅ．＆  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｈ．Ｅ．合成リガンドでの細菌のクオラムセンシングの調節：多重種におけるＮ−アシル化ホモセリンラクトン統計的評価とそれらの活性のメカニズムに対する洞察。Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ１２９，１３６１３−２５（２００７））対照群のアンタゴニストである、２−（４−ブロモフェニル）−Ｎ−（２−オキソ−テトラヒドロフラン−３−イル）−アセトアミド（４−Ｂｒ−ＰＨＬ）を合成した。
【０１０４】
大腸菌ベースのＬａｓＲアンタゴニスト試験（図６ｃ、ｄ）において、Ｇａｓｋｅらにより報告された（３．９マイクロ−Ｍ；上記参照されたい）ものと似ている、４−Ｂｒ−ＰＨＬ（４．８±０．５マイクロＭ）のＩＣ５０を得た。これらの分析でスクリーニングされた九つのプローブは、クロロアセトアミド、最適なアンタゴニストと思われる（ＩＣ５０：１．１±０．１マイクロ−Ｍ）ｈａｌ−１２−Ｃｌ、続いてｈａｌ−１１−Ｃｌ並びにｈａｌ−１１−Ｂｒ（ＩＣ５０：それぞれ３．１±０．１マイクロＭ及び２６．８±１．３マイクロ−Ｍ）、及び三つのイソチオシアネート、ｉｔｃ−１１−１３（ＩＣ５０：それぞれ３９．１±９．４、２９．８±０．５、１９．２±３．９マイクロ−Ｍ）であった。驚くべきことに、より短い類似物が、強力な阻害剤として機能するのに対し、ブロモアセトアミドのうちの一つ（すなわち、ｈａｌ−１３−Ｂｒ）は、この分析中でより高い濃度において、ＬａｓＲ活性を非常に強めることを示した；一の仮説に限定されることを望むものではないが、ｈａｌ−１３Ｂｒの効果は、この分析に特異的であり、別の状況ではこの分子は、阻害性であると考えられている。
【０１０５】
野生型ＰＡ０１レポータ株に依存する阻害分析では、試験された類似物によって全く異なる挙動を観察した。発光の最も強力な阻害剤は、ｉｔｃ−１３及びｈａｌ−１２−Ｂｒであり、続いてｉｔｃ−１２、ｉｔｃ−１１、及びＡ−Ｂｒ−ＰＨＬ（図６ａ、ｂ；ＩＣ５０ｓ：ｉｔｃ−１３：４５．２±０．７マイクロ−Ｍ、ｈａｌ−１２−Ｂｒ：１００±７マイクロ−Ｍ、ｉｔｃ−１２、１１３±１９マイクロ−Ｍ；ｉｔｃ−１１：最大３００マイクロ−Ｍ）と思われる。驚くべきことに、４−Ｂｒ−ＰＨＬは、野生型ＰＡ０１レポータ株中では、大腸菌レポータよりはるかに弱いＬａｓＲ拮抗作用（ＩＣ５０：最大２５０マイクロ−Ｍ）を示した。
【０１０６】
大腸菌レポータ株に依存する試験に加え、３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ（すなわち、株ＰＡＯ−ＪＰ２）を生成しないＰＡ０１変異体を用いて実験を行い、さまざまな阻害剤が、特異的な３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬアンタゴニスト活性を示したか否かを確認した（図７ａ、ｂ）。検討された九つのプローブのうちの、ｉｔｃ−１３（ＩＣ５０：３０±７マイクロ−Ｍ）、ｈａｌ−１２−Ｃｌ（７０±２７マイクロ−Ｍ）、ｈａｌ−１２−Ｂｒ（８５±１マイクロ−Ｍ）、ｉｔｃ−１２（１３４±６マイクロ−Ｍ）、及び４−Ｂｒ−ＰＨＬ（最大２００マイクロ−Ｍ）は、かなりの拮抗作用を示した。活性阻害のモードが、非共有結合であるときは、Ｃｙｓ７９と反応することができない、アジド同配体類似物であるｉｔｃ−１２（アジド−Ｃ１２）を用いてに実験を行った。この類似物の阻害活性は、ｉｔｃ−１２の阻害活性よりもかなり低く（データは示さず）、非共有的に標識された生成物を、アジド−Ｃ１２の存在下で発現された精製ＬａｓＲ−ＬＢＤのＭＳ測定において観察した。
【０１０７】
天然自己誘導物質と比べて著しくレベルは低下するものの、阻害剤のいくつか（特に、イソチオシアネート）がＰＡＯ−ＪＰ２ベースのレポータを用いるアゴニズムを示したので（図７ｃ）、共有結合ＱＳ阻害剤の阻害効果が、部分アゴニズムに起因するかどうかてもにつ検討した。このプローブは、全ての分析において一貫して強い活性を示したので、次の実験では、ｉｔｃ−１２を使用した。他の阻害剤と比べて、ｉｔｃ−１２は、可溶性ＬａｓＲ−ＬＢＤをより多量に発現誘導するように見えた。近年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌと共同研究者は、それらの阻害剤のいくつかが、特徴的な部分アゴニズムパターンを示したことを明らかにした２７。私どものデータも、部分アゴニズムパターンを提示し（図７ｄ）、ｉｔｃ−１２が高濃度であっても、これらの他の阻害剤とｉｔｃ−１２により誘発された効果の顕著な相違に注目した。ただ一つの仮説に限定されるのを望むものではなく、反応性ｉｔｃ−１２プローブの共有結合モードによって観察された相違を説明することができる。
【０１０８】
［ＱＳで調節された活性を阻害するイソチオシアネートベースのプローブ］
この反応性プローブが、バイオフィルム形成やピオシアニン生成といったＱＳで調節された活性を阻害するかを評価するべく、野生型緑膿菌ＰＡ０１株を、ｉｔｃ−１２及び４−Ｂｒ−ＰＨＬの存在下（両方５０マイクロ−Ｍ）で、又はコントロールとしてＤＭＳＯ存在下でインキュベートした。マイクロタイタープレート中２４時間でバイオフィルム形成の分析、バイアル中３６時間でピオシアニン生成の測定をした。図８ａ、ｂに示すように、両活性は、イソチアネート存在下で、並びにＱＳ阻害剤として知られる４−Ｂｒ−ＰＨＬ存在下で著しく阻害された。いずれの表現型の完全阻害は、めったに見られず、これは、ＱＳ関連のメカニズムによる調節が部分的なものであることを示している。しかし、バイオフィルム形成が、部分的な減縮であっても、ＱＳの崩壊の影響を受ける総バイオフィルムの質量だけでなく、その構造、多孔性の度合い、及びその柔軟性及び堅牢性の程度のように細菌が宿主反応を受けやすい状態にするのに十分である。
【０１０９】
［考察］
本発明の少なくともいくつかの実施形態による一連の化合物を、緑膿菌のＱＳの調節遺伝子、ＬａｓＲを標的にすること、及びＱＳがこのタンパク質の共有結合を介して阻害され得るかどうかを試験することもできる。イソチオシアネートベースのプローブが、ＬａｓＲ結合ポケットに見られるＣｙｓ７９に共有的に及び選択的に結合したと結論付けられた。更に、いくつかのよく特徴付けられたレポータ株を用いることで、遺伝子発現に関連する緑膿菌のクオラムセンシングにおける九つの合成阻害剤の影響を評価することができる。レポータアッセイ間で測定した活性に相違が認められたが、ＱＳの強力な阻害は、イソチオシアネート類似体で観察した。
【０１１０】
不明瞭な効果は、強力な活性を示すブロモアセトアミドを有する、ハロアセトアミドに見られた。しかし、ハロアセトアミドとＬａｓＲのあらゆる非共有結合的な相互作用を観察した。これらの結果から、非共有結合反応は、ハロアセトアミドとＬａｓＲ間で起こり、これは、それらの阻害効果が、他の強力な阻害剤に類似する方法、すなわち、結合新生ＬａｓＲで媒介されること、タンパク質の誤ったフォールディング及び沈降が続くことを意味した。４−Ｂｒ−ＰＨＬと比較すると、イソチオシアネートは、全体的に同様の活性を示した。この活性は、大腸菌レポータ株を用いた分析においてｉｔｃ−１２及びｉｔｃ−１３で測定した低いマイクロモルＩＣ５０値を有する。おそらく最も顕著なのは、ＰＡＯ−ＪＰ２ベースのアンタゴニスト分析におけるｉｔｃ−１３及び４−Ｂｒ−ＰＨＬ間の活性における大きな相違である。しかし、膜組成、発現の二次調節、競合するリガンド等の相違が、観察された阻害に大きな影響を及ぼすので、さまざまな株及びレポータアッセイを用いて得られたさまざまな化合物のＩＣ５０値の比較は、問題があることに留意すべきである。従って、所定の化合物による特異的なＱＳシステムの阻害の範囲に関して絶対的な結論を出すことは困難である。しかし、レポータアッセイで十分な及び特異的な阻害、並びに野生型株で表現型阻害を示す化合物は、更なるＱＳ阻害及び機構研究の優れた候補と見なすことができる。イソチオシアネート類は、全ての分析で低い濃度において大きなＱＳ阻害を示した。このように、化合物のうちの一つ、更に詳しくはｉｔｃ−１２の作用の有効性及びモードを研究することを決定した。野生型ＰＡ０１株を用いた分析では、ｉｔｃ−１２が、ＱＳで制御された毒性因子発現、並びにバイオフィルム形成を著しく阻害することを示した。
【０１１１】
新規な抗生物質に対する菌耐性が増大するため、細菌毒性の阻害が、実現可能な新たな治療標的として提案されてきた。このような戦略は、細菌の成長を標的とする薬剤と対照的に、毒性を標的とする薬物への耐性を含むことなく望ましい結果をもたらす。更に、ＬａｓＲを標的とする共有結合性プローブ（又は別の細菌におけるその相同体、並びにＱＳ分子の他のクラスの構造的に特徴付けられるレポータ）を、分子ツールとして用い、細菌のクオラムセンシングの活性化及び失活のメカニズムへの新規の洞察を提供する。
【実施例３】
【０１１２】
［化合物を含有するジスルフィド結合の合成］
この非限定的な実施例は、本発明の少なくともいくつかの実施態様によるジスルフィド結合を含有する化合物の合成に関し、構造−Ｃの化合物を含む。一般的な合成は、上記実施例１のとおりである。合成手順の非限定的な特定の実施例を以下に示す。
【０１１３】
［１０−メルカプトデカン酸］
チオ尿素（２８２ｍｇ，３．５４ｍｍｏｌ、１．５等量）と１０−ブロモデカン酸（６４１ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の混合物をＥｔＯＨ（５ｍＬ）中で２０時間還流させた。溶媒を真空で取り除いて、７．５ＭのＮａＯＨ（水溶液）（５ｍＬ、１．４ｇ、３．５４ｍｍｏｌ、１．５等量）を添加した。この混合物をさらに１６時間９０℃で、窒素下で撹拌した。次いで、氷浴上で冷却し、２ＭのＨ２ＳＯ４を撹拌しながらゆっくり添加した。有機生成物をＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＰｒＯＨ＝９９：１）を介して原油を精製し、白色固体としてチオール中間体を得た（３９８ｍｇ、８１％の収率：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）δ１．２９−１．４０（ｍ、１０Ｈ）、１．５３−１．６６（ｍ、４Ｈ）、２．３４（ｔ、７．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｑ、７．４Ｈｚ、２Ｈ）。
【０１１４】
［１０，１０’−ジスルファンジイルビス（デカン酸）］
１０−メルカプトデカン酸（１２２ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を、ＮａＯＨ（２４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）と４ｍＬのＨ２Ｏ：ＤＭＦ（１：１）中のＫＩ（２９．８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。Ｉ２（７５．８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を黄色が持続するまで添加し、次いで溶液が完全に脱色するまでＮａ２ＳＯ３を添加した。得られた懸濁液をＨＣｌ（１Ｎ）で酸性化して、水相をＣＨＣｌ３（４×２０ｍＬ）で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させて溶媒を真空で蒸発させた。定量的収率で、白色固体の中間体ジスルフィド化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１３、４００ＭＨｚ）δ１．２５−１．４０（ｍ、１０Ｈ）、１．５５−１．７０（ｍ、４Ｈ）、２．３３（ｔ、６．４Ｈｚ、２Ｈ）２．６６（ｔ、７．４Ｈｚ、２Ｈ）。
【０１１５】
［１２，１２’−ジスルファンジイルビス（３−オキソ−Ｎ−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）ドデカンアミド］
Ｎ−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（７７ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１３６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、ジカルボン酸（１２１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、及びメルドラム酸（８５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を６ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。得られた溶液を一晩攪拌して、次いで濾過して、反応で形成されるＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル尿素を除去した。ろ液を真空で濃縮させた。得られた残渣をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させて、α−アミノ−γ−ブチロラクトンヒドロブロミド（１０９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、更に６０℃で４時間攪拌した。得られた溶液を酢酸エチル３０ｍＬで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、１Ｍの硫酸水素ナトリウム溶液、ブラインで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して真空で濃縮させた。更に、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（収率３３％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋Ｈ＋］６５７．３２、測定値：［Ｍ＋Ｈ＋］６５７．２２。
【実施例４】
【０１１６】
［チオール含有の化合物の合成］
この非限定的な実施例は、構造−Ｄ（本明細書では「チオール−１１」ともいう）の化合物などのチオール含有化合物の化合物に関する。
【０１１７】
一般的な合成は、上記の実施例１に示したとおりである。合成手順を図８に示す。実施例３の最終化合物（例えば、構造−Ｃ）に始まる、合成手順の非限定的な特定な実施例を以下に示す。
【０１１８】
［１２−メルカプト−３−オキソ−Ｎ−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）ドデカンアミド］
１２−メルカプト−３−オキソ−Ｎ−（２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）ドデカンアミド（２９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の二量体を０．５ｍＬのＴＨＦに溶解させ、水中（０．５ｍＬ）のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素化で一晩攪拌し、５ｍＬの水で希釈してＥｔ２Ｏ（２×５ｍＬ）で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて濾過して濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の化合物を、白色固体として生じさせた（収率７０％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値：［Ｍ＋Ｈ＋］３３０．１７、測定値：［Ｍ＋Ｈ＋］３３０．０６。
【０１１９】
同様の手順で、続いて、炭素鎖が一炭素短い及び一炭素長い分子を生成したが、これは、出発物質が１０−ブロモデカン酸（実施例３に記載されている）ではなく、それぞれ９−ブロモデカン酸若しくは１１−ブロモデカン酸であるだけの違いである、
【実施例５】
【０１２０】
［チオール−１１及びｉｔｃ−１２による細菌伝達の阻害］
実施例４のチオール-１１化合物を、ＰＡＯ−ｌｕｘＣＤＡＢＥ中のｌａｓＩ発現の阻害を検査する上記のシステムにおいて、化学式Ｉの化合物（上に示した）であるｉｔｃ−１２で検査した。図９に示すように、チオール−１１及びｉｔｃ−１２の両方が、緑膿菌の毒性を用量依存的に阻害し、これによって、これらの化合物の特異性を示した。
【実施例６】
【０１２１】
［抗バイオフィルム組成物用の化合物の使用］
少なくともいくつかの実施形態では、本発明の少なくともいくつかの実施形態による化合物を、選択的にバイオフィルム形成を阻害又は減少させるための抗バイオフィルム組成物において使用した。
【０１２２】
このような組成物は、適切な担体中に本発明の少なくともいくつかの実施形態による化合物を選択的に含むことがある。この開示の組成物は、例えば、染料、抗菌剤、成長因子、抗炎症薬（閉鎖的なリストを提供することを望むものではない）などの更なる成分を選択的に含む。この開示にて用いられた用語「抗菌剤」は、抗生物質、防腐剤、消毒剤、及びこれらの組み合わせを含む。実施形態では、抗菌剤は、トリクロサンなどの防腐剤でもよい。
【０１２３】
この組成物で用いられることがある抗生物質のクラスは、ミノサイクリンなどのテトラサイクリン；リファピンなどのリファマイシン；エリスロマイシンなどのマクロライド；ナフシリンなどのペニシリン；セファゾリンなどのセファロスポリン；イミペネム及びアズトレオナムなどのβラクタム；ゲンタマイシン及びトブラマイシン．ＲＴＭ．などのアミノグリコシド；クロラムフェニコール；スルファメトキサゾールなどのスルホンアミド；バンコマイシンなどのグリコペプチド；シプロフロキサシンなどのキノロン；フシジン酸；トリメトプリム；メトロニダゾール；クリンダマイシン；ムピロシン；アムホテリシンＢなどのポリエン；フルコナゾールなどのアゾール；及びスルバクタムなどのβラクタム阻害剤を含む。
【０１２４】
その他の実施形態では、イオンフラノンの銀塩などの銀塩を、抗菌性を出すために添加する場合がある。
【０１２５】
この組成物で利用されることがある防腐剤及び消毒剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ヘキサロロフェン；クロルヘキシジン及びシクロヘキサジエン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｄｉｎｅ）などのカチオンピグアニド；ポビドンヨードなどのヨウ素及びヨ−ドフォア；ＰＣＭＸ（すなわち、ｐ−クロロ−ｍ−キシレノール）及びトリクロサン（すなわち、２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシ−ジフェニルエーテル）などのハロ置換フェノール化合物；ニトロフラントイン及びニトロフラゾンなどのフラン医薬製剤；メテナミン；グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドなどのアルデヒド；及びアルコールを含む。いくつかの実施形態では、抗菌剤の少なくとも一つは、トリクロサンなどの防腐剤でよい。
【０１２６】
本開示の抗菌組成物は、安定剤、増粘剤、顔料などのさまざまな選択的な成分を含む。選択的な成分を、抗菌組成物の総重量の最大約１０％の量で含む場合がある。
【実施例７】
【０１２７】
［医療機器用の化合物の使用］
少なくともいくつかの実施形態では、本発明の少なくともいくつかの実施形態による化合物を、選択的に用いてバイオフィルム形成阻害用の医療機器を扱う。医療機器は、選択的に吸収性物質、非吸収性物質、及びそれらの組み合わせから形成されることがある。医療機器を形成するのに利用される適切な吸収性物質は、トリメチレンカーボネート、カプロラクトン、ジオキサノン、グリコール酸、乳酸、グリコリド、ラクチド、これらのホモポリマ、及びこれらの組み合わせを含み、化合物は、選択的にこの物質へ吸収され、又はこの物質とともに形成される。医療機器を形成するのに利用する適切な非吸収性物質は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン及びポリプロピレンのコポリマ、及びポリエチレン及びポリプロピレンのブレンドポリオレフィンを含み、化合物を、選択的にこの機器にコーティングする。もちろん任意の他の適切なポリマも医療機器用に選択して利用してもよい。
【０１２８】
本発明の化合物を医療機器のコーティングに適用する場合に、コーティングでの使用に適した任意のポリマを本開示にしたがって利用してもよい。ポリマは、生体吸収性又は生体非吸収性であってもよい。少なくともいくつかの実施形態では、生体吸収性フィルム形成ポリマを、本開示の装置及び／又はコーティングに利用してもよい。コーティングに利用されるフィルム形成ポリマは、当業者にとって公知であり、例えば、グリコリド、ラクチド、グリコール酸、乳酸、カプロラクトン、トリメチレンカーボレート、ジオキサノン、ジオキセパノンなど、ホモポリマ、コポリマ、及びこれらの組み合わせなどモノマから得られるそれらの結合を含む。
【０１２９】
［参考文献］
１．  Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｂ．＆  Ｓｐｅｒａｎｄｉｏ，Ｖ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７３，３１９７−２０９（２００５）  
２．  Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｈａｒｄｉｅ，Ｋ．Ｒ．＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：ｓｏｒｒｙ，ｃａｎ’ｔ  ｔａｌｋ  ｎｏｗ  −  ｇｏｎｅ  ｔｏ  ｌｕｎｃｈ！  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５，２１６−２２  （２００２）  
３．  Ｔａｇａ，Ｍ．Ｅ．＆  Ｂａｓｓｌｅｒ，Ｂ．Ｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １００，１４５４９−１４５５４（２００３）  
４．  Ｌｙｏｎ，Ｇ．Ｊ．＆  Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｍｏｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，１００７−１０２１（２００３）  
５．  Ｋｅｌｌｙ，Ｄ．，Ｃｏｎｗａｙ，Ｓ．＆  Ａｍｉｎｏｖ，Ｒ．Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｇｕｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６，３２６−３３（２００５）  
６．Ａｕｇｅｒ，Ｓ．，Ｋｒｉｎ，Ｅ．，Ａｙｍｅｒｉｃｈ，Ｓ．＆  Ｇｏｈａｒ，Ｍ．Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ２  ａｆｆｅｃｔｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２、９３７−４１（２００６）
７．  Ｓｔｏｏｄｌｅｙ，Ｐ．，Ｓａｕｅｒ，Ｋ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．Ｇ．＆  Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ａｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５６，１８７−２０９（２００２）
８．  Ｌａｔｉｆｉ，Ａ．，Ｆｏｇｌｉｎｏ，Ｍ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．＆  Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，Ａ．Ａ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｑｕｏｒｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｌｉｎｋｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ＬａｓＲ  ａｎｄ  ＲｈＩＲ  （ＶｓｍＲ）ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ−ｐｈａｓｅ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＲｐｏＳ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２１，１１３７−４６（１９９６）  
９．Ｐｅｓｃｉ，Ｅ．Ｃ．，Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｅｅｄ，Ｐ．Ｃ．＆  Ｉｇｌｅｗｓｋｉ，Ｂ．Ｈ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｓ  ａｎｄ  ｒｈｌ  ｑｕｏｒｕｍ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９，３１２７−３２  （１９９７）
１０．Ｌｅｑｕｅｔｔｅ，Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｌｅｄｇｈａｍ，Ｆ．，Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，Ａ．＆  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｐ．Ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＱｓｃＲ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｑｕｏｒｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｉｔ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８，３３６５−７０（２００６）
１１．Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ，ＭＪ．，Ｍｕｒａｇｌｉａ，Ｅ．，Ｂａｚｚｏ，Ｒ．＆  Ｃａｒｆｉ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｑｕｏｒｕｍ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＬａｓＲ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｉｔｓ  ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，１３５９２−６００（２００７）  
【０１３０】
別の実施態様の文脈で、明確にするために記載された発明のさまざまな機能が、単一の実施形態で組み合わせて提供される提供されることが理解されるであろう。反対に、簡潔するために単一の実施形態の文脈で記載される本発明のさまざまな機能も個別に、又は任意の適切なサブコンビネーションで提供されることがある。また、本発明は、本明細書に特に示され、記載されているものに限定されるものではないことは、当業者によって理解されるであろう。むしろ、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定義されている。
【図１】
0005816618.tif 000035
【図２】
0005816618.tif 000036
【図３Ａ】
0005816618.tif 000037
【図３Ｂ】
0005816618.tif 000038
【図３Ｃ】
0005816618.tif 000039
【図３Ｄ】
0005816618.tif 000040
【図３Ｅ】
0005816618.tif 000041
【図３Ｆ】
0005816618.tif 000042
【図３Ｇ】
0005816618.tif 000043
【図４】
0005816618.tif 000044
【図５】
0005816618.tif 000045
【図６】
0005816618.tif 000046
【図７】
0005816618.tif 000047
【図８】
0005816618.tif 000048
【図９】
0005816618.tif 000049