(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接触角が水に対して１５〜９０°の樹脂板又はガラス板である保持板の面に、
細胞密度が５×１０６〜１×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞懸濁液で満たされた、厚さが２〜１００ｍｍ、孔径１８０〜３５００μｍ、平均孔径３５０〜２０００μｍの連通した小孔構造を有し、気孔率が６０〜９５％、圧縮強度が０．０５〜１ＭＰａの生体吸収性高分子材料から成る多孔質体の底面を接触させ、
その後、重力方向から見て前記保持板が前記多孔質体の上側となり、且つ前記保持板の重さが前記多孔質体に加わらない状態で気体中で静止させて細胞を播種する組織再生材料の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質な支持体（多孔質体）に細胞懸濁液を導入し播種する組織再生材料の作製方法、及び組織再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
連通した多孔質構造を有する支持体である多孔質体に細胞が播種された組織再生材料が組織工学分野で使用されている。多孔質体中には、細胞を培養するための小孔が三次元的に連通して中心部まで存在していることが重要である。
【０００３】
実際には、多孔質体の小孔中に細胞、培養液、培養液に細胞が混合された液（以後、「細胞懸濁液」と呼ぶことがある。）を完全に浸透させることが難しく、単に多孔質体に細胞懸濁液を滴下したり、多孔質体を細胞懸濁液中に浸したりしても、細胞懸濁液は多孔質体の中心部まで入らない。
【０００４】
これに対して、特許文献１には、例えば請求項８に記載のように、多孔質体を細胞懸濁液中に沈め、減圧又は真空の下におくことにより多孔質体中に細胞懸濁液を浸透させる方法が提案されている。
【０００５】
特許文献２、３には、多孔質体に水を含ませておき、該水と細胞懸濁液とを同時に入れ替えることで細胞懸濁液を多孔質体中に導入する方法が開示されている。
【０００６】
特許文献４には、多孔質体に形成された孔を比較的大きくして細胞懸濁液を入りやすくするとともに、このように比較的大きな孔であっても細胞懸濁液を多孔質体内に留めるために、細胞懸濁液にコラーゲンやゼラチンなど増粘成分を添加する方法が開示されている。これによれば、多孔質体中に細胞懸濁液を導入して留めておくことができるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００６−５０８７１７号公報
【特許文献２】特開２００７−１８１４５９号公報
【特許文献３】特開２００９−１９５６８２号公報
【特許文献４】特開２００３−０３８６３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の技術では、負圧を利用しても実際には多孔質体全体に細胞懸濁液を浸透させることは難しいため、細胞懸濁液を浸透させる経路をレーザー光等で形成する必要がある。また負圧を利用して圧力を大きく変化させることは細胞にとって必ずしも好ましい状態とはいえない。
【０００９】
特許文献２、３に開示されている技術では、多孔質体全体に細胞を播種することはできるが、細胞懸濁液の一部が流れ出てしまうため導入した細胞の数が正確でなくなるという欠点があった。
【００１０】
特に特許文献１〜３に記載の技術では、多孔質体の小孔が比較的小さく、水を主成分とする細胞懸濁液が十分に多孔質体の中心部まで浸透できないことに問題があった。そこで比較的大きな孔（孔径１８０μｍ〜３５００μｍ、平均孔径３５０μｍ〜２０００μｍ）の小孔構造を有する多孔質体を用いれば細胞懸濁液を中心まで容易に浸透させることができる。しかしながら、このような大きな孔径では細胞懸濁液が容易に多孔質体中を通過してしまい、細胞懸濁液を多孔質体内に留めることが難しくなってしまう。
【００１１】
これに対して特許文献４に記載の技術によれば、細胞懸濁液を多孔質体の中心まで容易に浸透させることができるが、増粘成分が多孔質体中に残るため、新たな培養液の交換が難しくなってしまう問題がある。
【００１２】
そこで本発明は、比較的大きな孔（孔径１８０μｍ〜３５００μｍ、平均孔径３５０μｍ〜２０００μｍ）、即ち、細胞懸濁液を多孔質体内に留めておくことが難しい小孔を有する多孔質体に細胞懸濁液を安定して無駄なく導入し、細胞を播種することが可能な組織再生材料の作製方法を提供することを課題とする。また、組織再生材料を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
以下、本発明について説明する。ここでは分かりやすさのため、図面に付した参照符号を括弧書きで併せて記載するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１４】
請求項１に記載の発明は、接触角が水に対して１５〜９０°の樹脂板又はガラス板である保持板（１）の面に、細胞密度が５×１０６〜１×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞懸濁液（１２）で満たされた、厚さが２〜１００ｍｍ、孔径１８０〜３５００μｍ、平均孔径３５０〜２０００μｍの連通した小孔構造を有し、気孔率が６０〜９５％、圧縮強度が０．０５〜１ＭＰａの生体吸収性高分子材料から成る多孔質体（１１）の底面を接触させ、その後、重力方向から見て保持板が多孔質体の上側となり、且つ保持板の重さが多孔質体に加わらない状態で気体中で静止させて細胞を播種する組織再生材料の作製方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、比較的大きな孔、即ち、細胞懸濁液をその内側に留めておくことが難しいとされている小孔を有する多孔質体に細胞懸濁液を導入でき、該多孔質体に安定して無駄なく細胞を播種することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】組織再生材料の作製方法Ｓ１０の工程を説明する図である。
【図２】組織再生材料の作製方法Ｓ１０の工程を説明する他の図である。
【図３】多孔質体の他の形態例を表す図である。
【図４】組織再生材料の作製方法Ｓ２０の工程を説明する図である。
【図５】組織再生材料の作製方法Ｓ２０の工程を説明する他の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の上記した作用及び利得は、次に説明する発明を実施するための形態から明らかにされる。以下、本発明を図面に示す実施形態に基づき説明する。ただし本発明はこれら実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
図１、図２は１つの実施形態に係る組織再生材料の作製方法Ｓ１０（以下、「作製方法Ｓ１０」と記載することがある。）を説明する図である。図１、図２は作製方法Ｓ１０の工程における場面を表す図である。ここで組織再生材料１０は、細胞が播種された多孔質体１１を意味する。
作製方法Ｓ１０は、載置工程Ｓ１１、細胞懸濁液導入工程Ｓ１２、及び反転工程Ｓ１３を備えている。
【００２３】
載置工程Ｓ１１は、図１（ａ）に示したように、保持板１上に多孔質体１１を載置する工程である。
ここで保持板１は接触角が水に対して１５°〜９０°の樹脂板又はガラス板であることが好ましい。このような保持板１は、従来から細胞を静置培養する容器として用いられている、シャーレ、フラスコ、マルチウェル等に使用されているガラス材料や、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂材料を板状に加工して用いることができる。これらの材料は疎水性が高いことがあるので必要に応じて、多孔質体１１を接触させる面を、コロナ、γ線、アルゴン線等のプラズマ処理等の化学的な方法で極性基を導入し親水性を高め、接触角が水に対して１５°〜９０°となるようにしておくことが好ましい。また、接触させる面にセラミックス皮膜を形成させておいてもよい。接触させる面は平滑であることが好ましいが、高さ数百μｍの溝や筋状突起等が設けられていてもよい。
【００２４】
多孔質体１１は、生体吸収性高分子材料で形成されており、厚さ（保持板１に載置した姿勢で上下方向の大きさ）が２ｍｍ〜１００ｍｍとされ、好ましくは２．１ｍｍ〜７０ｍｍである。多孔質体１１は、孔径１８０μｍ〜３５００μｍ、平均孔径３５０μｍ〜２０００μｍの連通した小孔構造を有し、気孔率が６０％〜９５％とされている。また、多孔質体１１の圧縮強度は０．０５ＭＰａ〜１ＭＰａとなるように構成されている。なお、本発明における多孔質体の孔の孔径とは、１０μｍを下回るような液体のみを通す微小気孔は考慮に入れず、多孔質体全体において１０μｍ以上の気孔の８０％以上が孔径１８０μｍ〜３５００μｍであることを意味している。なお、ここで「気孔率」は、使用された生体吸収性高分子材料の原料塊の重量に対する同体積の多孔質体の重量から算出された値である。
【００２５】
ここで、気孔率が６０％よりも小さいと細胞培養の効率が低くなり、９５％を超えると多孔質体の強度が低下する。従って、気孔率は８０％〜９０％であることがさらに好ましい。また、孔径が１８０μｍより小さいと細胞を自由に通すことが困難となり、多孔質体の内部まで十分に細胞を播種することができない。一方、孔径が３５００μｍよりも大きいと多孔質体の強度が低下してしまう。
また、平均孔径は５４０μｍ〜１２００μｍであることが好ましい。
【００２６】
上記圧縮強度について、圧縮強度が０．０５ＭＰａよりも小さいと多孔質体が、細胞懸濁液を加えた時の表面張力や、細胞の培養時に細胞懸濁液から受ける細胞の伸展応力で収縮してしまう。一方、１ＭＰａを超える多孔質体を作製することは技術的に難しい。なお、ここで「圧縮強度」とは直径１０ｍｍ×高さ２ｍｍの円柱状の試験体をクロスヘッドスピード１ｍｍ／分で圧縮させた際の圧縮破壊強度を意味する。
【００２７】
多孔質体の厚さについては、多孔質体の中心部まで細胞懸濁液を十分に浸透させることが目的であるため、厚さが２ｍｍ未満のものを用いる必要性は少ない。一方、１００ｍｍを超えると細胞を導入したり、長期間培養したりすることが難しくなる。
【００２８】
このような多孔質体の形状は、図１、図２に示したように立方体を基本とし、その他半円型やドーム型が好ましいが、後述するように反転工程Ｓ１３を経て、重力方向から見て上記した保持板１が上側となり且つ保持板１の重さが多孔質体に加わらない状態で気体中で静止させ細胞を播種することが可能であれば特に限定されない。例えば図３に示したように円板状であってもよい。
そのときの多孔質体の底面積（保持板１に接する面の面積）は、厚さに対して十分な大きさの面積を有する形状であることが好ましい。具体的には、多孔質体の体積１ｃｍ３〜５００００ｃｍ３の範囲において、底面積が０．５ｃｍ２〜２００ｃｍ２であることが好ましい。０．５ｃｍ２未満又は２００ｃｍ２を超えると保持板に吊り下げた状態で播種することが難しくなる。なお、多孔質体には、生体吸収性高分子材料内に粉末状のリン酸カルシウム、例えばハイドロキシアパタイトやβ三リン酸カルシウムを分散させてもよい。
【００２９】
多孔質体を構成する材料は、生体吸収性高分子材料であり、一定期間体内でその形態を維持できれば特に限定することなく用いることができる。例えば、従来から用いられているポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、乳酸−ε−カプロラクトン共重合体、ポリアミノ酸、ポリオルソエステル及びそれらの共重合体中から選択される少なくとも一種を例示することができる。その中でもポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体が、米国食品医薬庁（ＦＤＡ）から人体に無害な高分子として承認されていること及びその実績の面から最も好ましい。生体吸収性高分子材料の重量平均分子量は５０００〜２００００００であることが好ましく、より好ましくは１００００〜５０００００である。
【００３０】
多孔質体の作製方法は特に限定されないが、例えば、有機溶媒に生体吸収性高分子材料が溶解された溶液にその有機溶媒には溶解せず且つ生体吸収性高分子材料を溶解しない液で溶解する粒径が１００μｍ〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結する。その後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５μｍ〜５０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製する。そして、この多孔質生体吸収性高分子をミル等で粉砕してから粒子状物質を生体吸収性高分子を溶解しない液で溶解して取り除いた後、篩にかけて１００μｍ〜３０００μｍの平均粒径の生体吸収性顆粒状多孔質物質とし、これらの生体吸収性顆粒状多孔質物質を所定形状の容器内に入れて加圧し加熱する作製方法を挙げることができる。
【００３１】
引き続き、作製方法Ｓ１０について説明する。載置工程Ｓ１１により保持板１の面に多孔質体１１が載置された姿勢となり、次に細胞懸濁液導入工程Ｓ１２で、図１（ｂ）に示したように多孔質体１１に細胞懸濁液１２が、例えば滴下や注入等の方法によって導入される。これにより、図２（ａ）に示したように、細胞懸濁液１２が多孔質体１１内に浸透するとともに、多孔質体１１が細胞懸濁液１２により全体が満たされた状態となる。このとき、多孔質体１１の体積に対して細胞懸濁液１２の量が多すぎると、後述の反転工程Ｓ１３が行い難くなったり、培養の効率が低下したりする傾向があるため、多孔質体１１全体を浸し且つ多孔質体１１から過剰に漏れ出ない量の細胞懸濁液を導入することが好ましい。
【００３２】
導入される細胞懸濁液は、細胞密度が５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ〜１×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌとされている。また、培養される細胞は種々の細胞が自由に使用可能である。例えば、表皮細胞、ケラチン生成細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞、神経膠細胞、星状膠細胞、上皮細胞、乳房表皮細胞、鳥細胞、内皮細胞、間葉細胞、真皮線維芽細胞、間皮細胞、造骨細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、靭帯線維芽細胞、腱線維芽細胞及び軟骨細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、歯胚細胞、歯根膜細胞、歯髄細胞、体性幹細胞、又はＥＳ細胞等を用いることができる。
【００３３】
次に、反転工程Ｓ１３により、図２（ａ）で示した状態から、保持板１が上、細胞懸濁液１２が含まれた多孔質体１１が下となるように反転させ、図２（ｂ）に示したような姿勢とする。即ち、重力方向から見て保持板１が多孔質体１１の上側となり、且つ保持板１の重さが多孔質体１１に加わらない状態で気体中で静止させる。この状態で静止を維持し、導入された細胞を多孔質体１１の孔の内壁に接着させて播種が完了し、組織再生材料１０とされる。多孔質体に細胞を接着させるために気体中で静止させる時間は、多孔質体の材質や細胞の種類により異なるが、一般的には２０分〜３００分である。
【００３４】
以上のような作製方法Ｓ１０によれば、多孔質体１１が比較的大きな孔を有するので、細胞懸濁液を多孔質体１１の内部にまで適切に浸透させることができる。そして、最終的に細胞懸濁液を上記のように重力方向から見て保持板１が多孔質体１１の上側となり、且つ保持板１の重さが多孔質体１１に加わらない状態で気体中に静止させることにより、多孔質体１１から細胞懸濁液１２が漏れないように保持することができる。そして細胞懸濁液１２を安定して無駄なく導入し細胞を多孔質体中に播種することが可能となる。以後、細胞が播種された多孔質体である組織再生材料１０は、従来の方法によって細胞培養を行うことができる。
【００３５】
また、このような製作方法を実現するために上記に示したような、細胞懸濁液が播種された多孔質体が用いられることが好ましい。これにより、上記効果を奏することが可能な組織再生材料とすることが可能となる。
【００３６】
図４、図５は他の実施形態に係る組織再生材料の作製方法Ｓ２０（以下、「作製方法Ｓ２０」と記載することがある。）を説明する図である。図４、図５は作製方法Ｓ２０の工程における場面を表す図である。なお本実施形態のうち、上記した１つの実施形態で説明したものと共通する部分については同じ符号を付して説明を省略する。
【００３７】
作製方法Ｓ２０は、仮載置工程Ｓ２１、細胞懸濁液導入工程Ｓ２２、挟持工程Ｓ２３、及び保持工程Ｓ２４を備えている。
【００３８】
仮載置工程Ｓ２１は、撥水性が高い板状部材である仮載置板２に多孔質体１１を載置する工程である。仮載置板２は接触角が水に対して９０°より大きい樹脂板又はガラス板であることが好ましい。
【００３９】
細胞懸濁液導入工程Ｓ２２は、上記した細胞懸濁液導入工程Ｓ１２と同様、多孔質体１１に細胞懸濁液１２が導入される。これにより、図４（ｂ）に示したように、細胞懸濁液１２が浸透して多孔質体１１全体に満たされた状態となる。
【００４０】
挟持工程Ｓ２３は、図５（ａ）に示したように、細胞懸濁液で満たされた多孔質体１１を仮載置板２との間に挟むように保持板１の面に多孔質体１１を接触させる工程である。
【００４１】
保持工程Ｓ２４は、図５（ｂ）に示したように、多孔質体１１を接触させた保持板１を引き上げ、多孔質体１１を保持板１側に保持させ、仮載置板２から離脱させる工程である。これにより、多孔質体１１は上記１つの実施形態と同様に、重力方向から見て保持板１が多孔質体１１の上側となり、且つ保持板１の重さが多孔質体１１に加わらない状態で気体中で静止させる。この状態で静止を維持し、導入された細胞を多孔質体１１の内壁に接着させて播種が完了し、組織再生材料１０とされる。
ここで仮載置板２は撥水性のある板、保持板１は親水性のある板により構成されているので、細胞懸濁液で満たされた多孔質体の上記したような保持、離脱が適切に行われる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
＜移植細胞の準備＞
移植細胞Ａ：ヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞
ヒト腸骨骨髄液から採取した細胞を１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地で懸濁した後、有核細胞数１×１０５ｃｅｌｌ／１０ｃｍ直径培養皿へ播種した。３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測し、５０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００４４】
移植細胞Ｂ：ヒト顎骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞
ヒト顎骨骨髄液から採取した細胞を１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地で懸濁した後、有核細胞数１×１０５ｃｅｌｌ／１０ｃｍ直径培養皿へ播種した。３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に1回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測し、５０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００４５】
移植細胞Ｃ：ヒト耳介軟骨から採取した軟骨細胞
ヒト耳介軟骨をメスで細かく切りわけ、コラゲナーゼで３７℃３０分間処理した細胞懸抱濁液を１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地で懸濁した後、有核細胞数１×１０５ｃｅｌｌ／１０ｃｍ直径培養皿へ播種した。３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、非接着成分（細胞＋組織片）を除いた。以後３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＡＴ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測し、５０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００４６】
＜多孔質体の準備＞
多孔質体Ａ：ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロック
分子量２５００００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径５００μｍ前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型することによって、平均孔径５４０μｍ、気孔率９０％、圧縮強度０．２ＭＰａ、直径９ｍｍで厚さ３ｍｍの生体吸収性合成高分子からなるブロック状の多孔質体を作製した。
【００４７】
多孔質体Ｂ：ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロック
分子量２５００００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径１０μｍのハイドロキシアパタイト粉を分散させ、粒径５００μｍ前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型することによって、平均孔径５４０μｍ、気孔率９０％、圧縮強度０．２ＭＰａ、直径１３ｍｍで厚さ５ｍｍの生体吸収性合成高分子＋リン酸カルシウム材料からなるブロック状の多孔質体を作製した。
【００４８】
＜実施例１＞
多孔質体Ａの円盤状の底面をガラス板（大きさ１００ｍｍ×１００ｍｍ×２ｍｍ、水に対する接触角２８°）の上面に接触させ載置した。軟骨分化用培養液（αＭＥＭ、グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ、１０−７Ｍデキサメサゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、６．２５μｇ／ｍｌのインスリン、６．２５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍｌのセレン酸、５．３３μｇ／ｍｌのリノレイン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）に２×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌの密度で懸濁させた０．１９ｍｌの移植細胞Ａを多孔質体Ａに滴下して導入した。ガラス板を反転させ逆さまにした状態で３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２条件下で３０分間材料に細胞を接着させることで多孔質体Ａに細胞を播種して組織再生材料を得た。
その後、軟骨分化用培養液で満たした５０ｍｌ遠沈管に入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して軟骨組織再生用細胞移植体を作製することができた。
【００４９】
＜実施例２＞
多孔質体Ｂの円盤状の底面をプラズマ処理ポリスチレン板（大きさ５０ｍｍ×５０ｍｍ×２ｍｍ、水に対する接触角７１°）の上面に接触させ載置した。骨分化用培養液（αＭＥＭ、グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ、１０％のＦＢＳ、１０−７Ｍデキサメサゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｍＭのβグリセロリン酸）に５×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌの密度で懸濁させた０．６７ｍｌの移植細胞Ｂを多孔質体Ｂに滴下して導入した。プラズマ処理ポリスチレン板を反転させ逆さまにした状態で３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２条件下で１００分間材料に細胞を接着させることで多孔質体Ｂに細胞を播種し組織再生材料を得た。
その後、骨分化用培養液で満たした５０ｍｌ遠沈管に入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら２週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製することができた。
【００５０】
＜実施例３＞
多孔質体Ｂの円盤状の底面をプラズマ処理アクリル板（大きさ５０ｍｍ×５０ｍｍ×２ｍｍ、水に対する接触角５８°）の上面に接触させ載置した。軟骨分化用培養液（αＭＥＭ、グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ、１０−７Ｍデキサメサゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、６．２５μｇ／ｍｌのインスリン、６．２５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍｌのセレン酸、５．３３μｇ／ｍｌのリノレイン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）に２×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌの密度で懸濁させた０．６７ｍｌの移植細胞Ｃを多孔質体Ｂに滴下して導入した。プラズマ処理アクリル板を反転させ逆さまにした状態で３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２条件下で３０分間材料に細胞を接着させることで多孔質体Ｂに細胞を播種し組織再生材料を得た。
その後、軟骨分化用培養液で満たした５０ｍｌ遠沈管に入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して軟骨組織再生用細胞移植体を作製することができた。
【００５１】
＜実施例４＞
多孔質体Ａを、撥水処理されたガラス板（大きさ５０ｍｍ×５０ｍｍ×２ｍｍ、水に対する接触角１１４°）の上に置いた。骨分化用培養液（αＭＥＭ、グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ、１０％のＦＢＳ、１０−７Ｍデキサメサゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｍＭのβグリセロリン酸）に５×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌの密度で懸濁させた０．１９ｍｌの移植細胞Ｂを多孔質体Ａに滴下し導入した。多孔質体Ａが置かれたガラス板の上からプラズマ処理ポリスチレン板（大きさ５０ｍｍ×５０ｍｍ×２ｍｍ、水に対する接触角７１°）を静かに下ろして多孔質体Ａを軽く挟むようにしてプラズマ処理ポリスチレン板面に接触させた。接触させたプラズマ処理ポリスチレン板をゆっくりと引き上げ、多孔質体Ａをプラズマ処理ポリスチレン板側に保持させガラス板から離脱させた。多孔質体Ａは重力方向から見てプラズマ処理ポリスチレン板が上側となり、且つプラズマ処理ポリスチレン板の重さが多孔質体Ａに加わらない状態で気体中で静止させ、逆さまにした状態で３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２条件下で１００分間材料に細胞を接着させることで多孔質体Ａに細胞を播種し組織再生材料を得た。
その後、骨分化用培養液で満たした５０ｍｌ遠沈管に入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら２週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製することができた。
【符号の説明】
【００５２】
１    保持板
２    仮載置板
１０  組織再生材料
１１  多孔質体
１２  細胞懸濁液
【図１】
0005816073.tif 000002
【図２】
0005816073.tif 000003
【図３】
0005816073.tif 000004
【図４】
0005816073.tif 000005
【図５】
0005816073.tif 000006