(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載の塩基配列で表されるＤＮＡを有する、媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスに感染したトマト。
【請求項２】
トマト苗である、請求項１に記載のトマト。
【請求項３】
台木、穂木、及び中間木からなる群から選択される、請求項２に記載のトマト。
【請求項４】
台木と、穂木を接木して得られる苗木である、請求項１又は２に記載のトマト。
【請求項５】
さらに中間木を含む、請求項４に記載のトマト。
【請求項６】
配列番号１記載の塩基配列で表されるＤＮＡを有する、媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させたトマトを製造する方法であって、
台木及び穂木を用いて接ぎ木する工程を含む、方法。
【請求項７】
さらに中間木を用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１記載の塩基配列で表されるＤＮＡを有する、媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させた台木を得る工程を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１記載の塩基配列で表されるＤＮＡを有する、媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させた穂木を得る工程を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１記載の塩基配列で表されるＤＮＡを有する、媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させた中間木を得る工程を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非虫媒性トマト黄化葉巻ウイルスに感染したトマトに関する。また、本発明は、該トマトの製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
トマト黄化葉巻ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｙｅｌｌｏｗ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  ｖｉｒｕｓ；以下「ＴＹＬＣＶ」と表記する場合がある。）は、１９６４年にイスラエルで発見された比較的新しい植物ウイルスの一種である。
日本では、１９９６年にＴＹＬＣＶを病源とするトマト黄化葉巻病が長崎県、愛知県、及び静岡県で同時に発見され、その後、施設トマトの生産地で急速に発生が拡大している。特に、２０００年以降、生食トマト主産地である九州での発生は甚大で、栽培しているトマト全てがＴＹＬＣＶ被害にあう農家も続出している。各県では農家に対し厳重に注意喚起を行い、薬剤散布等によるＴＹＬＣＶ防除を徹底しているが、ＴＹＬＣＶの被害の発生は続いている。
【０００３】
トマト黄化葉巻病の症状は、トマトの葉の黄化から始まり、徐々に葉の縁が下側に巻いて奇形になる。症状が激しくなると、株全体がパーマをかけたようになる。果実には症状が出ないが、栽培初期にトマトがＴＹＬＣＶに感染すると果房２段目程度までしか着果しないため、７〜８割減収し多大な被害となる。
【０００４】
トマト黄化葉巻病は、ＴＹＬＣＶの媒介虫であるタバココナジラミによる伝染により、永続的に蔓延してしまう。
また、植物ウイルス自体に対する、効果的な抗ウイルス薬剤は存在しておらず、これまで一般的な植物ウイルスの防除方法は、ウイルスを伝染する媒介虫への殺虫剤散布、栽培施設へ媒介虫が入るのを物理的に防ぐ防虫ネットや忌避資材の利用、土壌消毒、感染株の抜き取り、栽培管理機具の消毒、障壁作物の利用、及びウイルス抵抗性作物の育種などが中心となっている。
ＴＹＬＣＶの防除方法についても同様であり、ＴＹＬＣＶの媒介虫であるタバココナジラミの防除と感染株の早期抜き取りなどにより、ＴＹＬＣＶの伝染環を断ち切ることが主となっている（非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、タバココナジラミの防除のために、侵入阻止に有効な０．４ｍｍ目合い以下の防虫ネットを使用すると栽培施設内の気温上昇が懸念されるため、現場では実施されにくい現状がある。
また、トマトの大産地である九州などでは栽培期間の違う様々な栽培型のトマトが栽培されており、一年中どこかの地域でトマトが栽培されている状態にある。このため、ＴＹＬＣＶを保毒したタバココナジラミが色々なトマトの栽培型にあわせて野外や施設を移動し、冬の寒さによっても死滅しないため、ＴＹＬＣＶの伝染環が途切れることがなく、ＴＹＬＣＶの防除を困難にしている。
さらに、最近は殺虫剤耐性のあるタバココナジラミとして、タバココナジラミ−バイオタイプＱ（以下「タバココナジラミＱ」と表記する場合がある。）が蔓延してきており、殺虫剤防除にも限界が見られている。
【０００６】
ＴＹＬＣＶ抵抗性トマトに関連して、Ｔｙ−１、Ｔｙ−２、Ｔｙ−３などの遺伝子がトマト野生種から見つかっているが、トマトがこれらの遺伝子を有している場合、トマト内のウイルス濃度を抑え、病徴を抑制することはできるもののＴＹＬＣＶの感染自体を阻止することまではできない（非特許文献２及び３）。
これらの遺伝子を交配で導入したトマトが既に市場に出ているが、これらの遺伝子の特性上、いずれの場合もトマトは、ＴＹＬＣＶに感染し、トマト体内でウイルスが増殖してしまうことが知られている（非特許文献４）。
このため、これらの遺伝子が導入されたトマトを栽培するにあたり、タバココナジラミの防除を怠ると、ＴＹＬＣＶによる病徴は抑制されても、該トマトは、ＴＹＬＣＶを保毒するため、ＴＹＬＣＶの感染源となり、周囲の感受性のトマト品種にとってはＴＹＬＣＶ感染の大変な危機に曝される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】本多、野菜茶業研究集報 3号、115-122ページ、2006年
【非特許文献２】Henryk Czosnek、Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease、Springer 343−362ページ、2007年
【非特許文献３】斉藤、野菜茶業研究集報 3号、99-102ページ、2006年
【非特許文献４】斉藤ら、園学研 7号別冊1、107ページ、2008年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、上述したような従来の植物ウイルスの防除方法では、ＴＹＬＣＶの蔓延を十分に防除することができず、それぞれの防除方法において、多くの問題点を抱えている。また、従来の防除方法は、ＴＹＬＣＶの伝染環を分断するといった方法ではないため、ＴＹＬＣＶの伝染環を分断できるような新たなＴＹＬＣＶの防除方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、トマト黄化葉巻ウイルスとして、媒介虫により伝染されない新たなウイルスを見出したことにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、ＴＹＬＣＶの防除に用いることのできる非虫媒性トマト黄化葉巻ウイルスに感染したトマトである。また、本発明は、当該トマトの製造方法である。
［１］
媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスに感染したトマト。
［２］
トマト苗である、［１］に記載のトマト。
［３］
台木、穂木、及び中間木からなる群から選択される、［２］に記載のトマト。
［４］
台木と、穂木を接木して得られる苗木である、［１］又は［２］に記載のトマト。
［５］
さらに中間木を含む、［４］に記載のトマト。
［６］
媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させたトマトを製造する方法であって、
台木及び穂木を用いて接ぎ木する工程を含む、方法。
［７］
さらに中間木を用いる、［６］に記載の方法。
［８］
媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させた台木を得る工程を含む、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］
媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させた穂木を得る工程を含む、［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させた中間木を得る工程を含む、［６］〜［９］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、媒介虫によって媒介されないトマト黄化葉巻ウイルスに感染した、新たなトマト、及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１におけるＴＹＬＣＶの検定試験におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す。右のレーンは、分子量マーカーを示し、穂木（中）、感染台木（左）のＴＣ−ＰＣＲの結果を示す。
【図２】実施例２におけるＴＹＬＣＶの検定試験におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す。左のレーンは、分子量マーカーを示し、感染穂木（中）、台木（右）のＴＣ−ＰＣＲの結果を示す。
【図３】実施例３におけるＴＹＬＣＶの検定試験におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す。左のレーンは、分子量マーカーを示し、左から順に、穂木、感染中間木、台木のＴＣ−ＰＣＲの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１４】
本発明は、媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスに感染したトマトである。
トマトに、媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスを感染させることにより、該ウイルスが媒介虫により伝染されず、かつ、好ましくは、トマト内のウイルス濃度を抑えることができるため、該トマトを用いてトマト黄化葉巻ウイルスの新たな防除方法を提供することができる。
【００１５】
本発明の媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルス（非虫媒性ＴＹＬＣＶ）に感染したトマトにおいて、非虫媒性ＴＹＬＣＶは、媒介虫によって伝染されないため、非虫媒性ＴＹＬＣＶを保毒するトマトは、ウイルスの感染源とならないという利点を有する。
また、非虫媒性ＴＹＬＣＶは、トマトが、黄化葉巻耐病性トマトにおいてその利点を有利に発揮するウイルスである。
【００１６】
本発明において、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させるトマトとしては、麗容、りんか４０９（（株）サカタのタネ）、桃太郎はるか、桃太郎ヨ−ク（タキイ種苗（株））などの一般的なトマトでもよいが、秀麗（(株)サカタのタネ)、ＴＹ桃太郎さくら、ＴＹ桃太郎アーク（タキイ種苗（株））などＴＹＬＣＶ耐性遺伝子を持つトマトの方がより好ましい。
【００１７】
本発明において、非虫媒性ＴＹＬＣＶに感染したトマトとして、黄化葉巻耐病性トマトを用いることも好ましい一態様であるが、「黄化葉巻耐病性トマト（耐病性トマト）」とは、ＴＹＬＣＶの感染阻止はできないが、ＴＹＬＣＶによるトマト黄化葉巻病の病徴は抑えることのできる耐性遺伝子を有するトマトを意味する。
耐性遺伝子としては、Ｔｙ−１、Ｔｙ−２、Ｔｙ−３、Ｔｙ−３ａ、Ｔｙ−４、Ｔｙ−５などが挙げられる。
耐病性トマトとしては、耐性遺伝子を自然獲得した野生株のトマトであってもよく、耐性遺伝子を交配により導入したトマトであってもよく、耐性遺伝子を遺伝子組換え技術によって導入したトマトであってもよく、具体的には、ＴＹ桃太郎さくら、ＴＹ桃太郎アーク、秀麗、ＴＹ千恵、ＴＹ千果、ＡＥＧＥＡＮなどが挙げられる。耐病性トマトにおいて、耐性遺伝子はトマトにホモ又はヘテロで導入されている。
【００１８】
耐病性トマトは、ＴＹＬＣＶによるトマト黄化葉巻病の病徴は抑えることのできる耐性遺伝子を有することにより、ＴＹＬＣＶが感染したとしてもトマト黄化葉巻病の病徴は示さないか、又は軽微である。ここで、軽微な症状とは、葉の大きさは変わらないが、葉縁部が少し丸みを帯び、葉色は緑で変わらない状態をいう。一方、重篤な症状とは、葉が小さくなり、葉の表側が裏側に向かって巻くようになり、葉は黄色くなる状態をいう。
耐病性トマトは、ＴＹＬＣＶを保毒するため、ＴＹＬＣＶ保毒トマトとして、媒介虫によって、ＴＹＬＣＶは耐病性トマトから伝染されてしまう。また、耐病性トマトは、トマト黄化葉巻病の病徴は示さないか、又は軽微であるため、ＴＹＬＣＶ感染株の早期抜き取りなどにより、ＴＹＬＣＶの伝染環を断ち切ることもできない。
したがって、ＴＹＬＣＶの防除方法として、耐病性トマトを用いたとしても十分な効果は得られない場合が生じる。ここで、耐病性トマトに対して、非虫媒性ＴＹＬＣＶを予防接種して、非虫媒性ＴＹＬＣＶに感染したトマトとすることにより、ＴＹＬＣＶによる被害を軽減することができるという効果を奏する。
【００１９】
一般的に、耐病性トマトにおいて強毒ＴＹＬＣＶ（ＴＹＬＣＶ感受性トマトにおいて強い病徴を呈するＴＹＬＣＶをいう。）が感染した場合、その病徴は現れない、又は軽微であるものの、強毒ＴＹＬＣＶ自体はトマト体内で増殖し、そこにタバココナジラミなどの媒介虫が飛来すれば、強毒ＴＹＬＣＶが他のトマトへ伝染されてしまう。
つまり、二次的なＴＹＬＣＶ感染被害の汚染源になってしまうという問題があり、これが耐病性トマトの普及を遅らせている。本発明において非虫媒性ＴＹＬＣＶを予め耐病性トマトに接種しておくことにより、非虫媒性ＴＹＬＣＶは、他のトマトへ伝染されない。
また、そのメカニズムは不明であるが、非虫媒性ＴＹＬＣＶを予め耐病性トマトに接種することで、後から強毒ＴＹＬＣＶが媒介昆虫タバココナジラミにより耐病性トマトに伝染されたとしても、その強毒ＴＹＬＣＶがさらに他のトマトへ二次的に虫媒伝染されるのを防ぐことができるという効果を奏する。
【００２０】
本発明において、非虫媒性ＴＹＬＣＶを耐病性トマトに感染させることにより、耐病性トマトの「二次的な感染被害の汚染源になる」という弱点を補完し得、植物ウイルスの防除方法として新たな防除方法を提供し得る新規で、優れたウイルスとトマトの組み合わせを提供できる。
【００２１】
本発明の非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させたトマトにより、好ましくは、感染させた耐病性トマトを栽培するに際して、媒介虫への殺虫剤散布や物理的進入を防ぐための資材の使用を軽減でき、省力で安心して栽培することが可能になる。また、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させた耐病性トマトを一定量栽培することでその地域のＴＹＬＣＶの蔓延を効果的に抑制することが期待される。さらに、非虫媒性ＴＹＬＣＶが接種されるトマトが耐病性トマトである場合、非虫媒性ＴＹＬＣＶの病徴は出ないか、又は軽微であり、果実収量への影響は少ない。加えて、非虫媒性ＴＹＬＣＶは媒介虫で伝染されないため、他のトマトに伝染してＴＹＬＣＶによる病徴を出すようなことはない。
以上のように、媒介虫で伝染されないＴＹＬＣＶは新規なウイルスであり、また、耐病性トマトにおいて強毒ＴＹＬＣＶの伝染を阻止するような作用もこれまでにはないものである。
【００２２】
本発明において、トマトとしては、トマト植物体から得られる葉、茎、根、花、種、果実、苗、細胞塊、カルス、及びプロトプラストなどが挙げられる。媒介虫で伝染されないＴＹＬＣＶを感染させたトマトは、後述する接木することにより得られるトマトであることが好適な態様であるので、接木するに際に、必要な形態であるトマトであることが好ましい。接木して得られるトマト苗により、媒介虫で伝染されないＴＹＬＣＶを感染させたトマトを増殖させることができる。
【００２３】
接木に用いられるトマトとしては、接木後の形態のトマトであれば特に限定されないが、トマト苗を得ることができるものであり、また、接木苗を得るための、穂木、台木、中間木などが挙げられる。
穂木とは接木苗の上部に当たる部分である。穂木としては、特に限定されないが、果実の収量性が高く、糖度や酸度などの品質も高い品種で、かつＴＹＬＣＶ耐性遺伝子を持つものが好ましい。
台木とは接木苗の土台となる部分で、根の部分に当たる。台木としては、特に限定されないが、穂木と親和性のある品種で、土壌病害などに強く、かつ穂木の収量性や品質を向上するものが望ましい。ＴＹＬＣＶ耐性遺伝子保有の有無は問わない。
中間木とは穂木と台木の間の部分に当たる。中間木としては、特に限定されないが、穂木と台木に親和性のある品種であり、ＴＹＬＣＶ耐性遺伝子保有の有無は問わない。
【００２４】
種子から育てた苗を「自根苗」というのに対して、病気などに強い別の植物や別の品種を台木に接木した苗を「接木苗」という。本発明におけるトマトとしては、自根苗であってもよく、接木苗であってもよいが、本発明においては、非虫媒性ＴＹＬＣＶを接木してトマトに感染させる方法が好適に用いられるため、接木苗であることが好ましい。
【００２５】
接木苗の製造方法としては、従来公知の接木方法を採用することができる。一般に、野菜園芸大事典（清水茂監修 1977 養賢堂 p288）にも記載されているように、接木苗を利用すると、
（１）土壌伝染性の病害を回避して、連作を可能にすることができる、
（２）移植の容易な台木に接木して、植え傷みを軽減することができる、
（３）台木の耐低温性や耐暑性をいかして、早期栽培を行い、あるいは収穫期間の延長を図ることができる、
（４）種類によっては、肥料の節約ができる、といった利点を有する。
本発明においては、トマトに感染させるＴＹＬＣＶが、媒介虫で伝染されないという特徴を有するため、接木法を採用して、非虫媒性ＴＹＬＣＶをトマトに感染させることが好ましい。
本発明においては、接木苗を作成する際に、トマトに非虫媒性ＴＹＬＣＶを同時に感染させようとするもので、これまでこのような接木方法は知られておらず、本発明のような接木方法を用いた非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させたトマトの製造方法は新規なものである。また、接木法を採用することにより、本発明の非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させたトマトを製造することができ、また、該トマトを用いることにより、ＴＹＬＣＶの伝染を防止することができる。
【００２６】
本発明において、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させたトマトを製造する場合、接木法を採用することが好適な態様であるが、接木法として、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させた台木又は穂木を用い、従来の接木方法により台木と穂木を接ぎ木する。
接ぎ木する方法としては、従来公知の、割りつぎ、さしつぎ、呼びつぎ、断根つぎさし、その変形法などにより、台木と穂木を接ぎ木することができる。
また、台木や穂木に加え、中間木を用い、穂木と台木の間に中間木としたサンドイッチ接木法を利用して接ぎ木する方法を採用することもできる。
【００２７】
接木方法としては大きく３つに分類され、「割りつぎ」「さしつぎ」、「呼びつぎ」、と呼ばれているが、この他にさしつぎ法の変形として「断根つぎさし」がある（蔬菜の栽培技術 藤井健雄編著1981 誠文堂新光社 p21-24、野菜園芸大事典 清水茂監修 1977 養賢堂 p288-290など）。
「割りつぎ」としては、台木の成長点をかきとり、子葉の中間を半分だけ切り下げて、ここに楔（くさび）型に削った接ぎ穂はさむ方法である。
「さしつぎ」としては、台木の成長点をかきとり、胚軸に穴を開けてそこに削った接ぎ穂を差し込む方法である。
「呼びつぎ」としては、台木と接ぎ穂の両方の苗は根をつけたまま、それぞれ胚軸に切れ込みを入れ、両者の切り口を差込み、かみ合わせる方法である。
「断根つぎさし」としては、さしつぎと同様に接木するが、台木は胚軸を切り取り、それを挿し木する方法である。
接木方法としては、以上の４つが基本的な接木法であるが、これらを多少変形した方法を用いることもできる。
変形方法としては、中間木を、穂木と台木の間に挟んで接木する方法である。
さらに穂木、台木、中間木を効率よく増殖する方法として、母木の主枝及び側枝（わき芽）の全てを摘心し、それから大量のシュート（茎葉）を発生させ、これらを挿し木や接木に利用する方法も考案されており（例えば、特開平１１−２７５９５４号公報、特開平８−２８０２４４号公報、特開２００３−１１６３８３を参照。）、これらの方法を用いることができる。
【００２８】
非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させたトマトを、接木により製造するためには、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させた穂木、台木、又は中間木を必要とする。
【００２９】
本発明においては、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させた穂木と、台木を接ぎ木してもよく、穂木と、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させた台木を接ぎ木してもよい。また、穂木と、台木の双方が非虫媒性ＴＹＬＣＶに感染されたものを用いてもよい。
さらに、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させた中間木を用いる接木法においては、感染されていない穂木と、台木を用いることができるが、穂木と台木の一方、あるいは双方が非虫媒性ＴＹＬＣＶで感染されているものを用いることを妨げない。
【００３０】
本発明においては、ＴＹＬＣＶの伝染防止を効率的に行わせるためにも、穂木が耐病性トマトを用いて作成された穂木であることが好ましい。この場合、台木や、
中間木を用いる場合には、台木あるいは中間木が、耐病性トマトを用いて作成された台木や中間木であってもよい。
【００３１】
接木法として、感染台木を栄養繁殖し、穂木は種子を用いて増殖し、接木する方法や、感染穂木を栄養繁殖し、台木は種子を用いて増殖し、接木する方法が挙げられる。穂木は、耐病性トマトであってもよい。
具体的な方法としては、
（１）台木となるトマト又はトマトの台木として利用される植物を増殖する。台木としては、トマト由来する台木に限定されず、トマト穂木を接ぎ木できる台木であれば特に限定されない。台木を増殖する方法は、種子を播くか、植物を栄養繁殖（挿し木、組織培養など）により行う。
（２）穂木となる耐病性トマト品種を増殖する。増殖する方法は、種子を播くか、栄養繁殖して行う。
（３）台木あるいは穂木のいずれか、又は両方に、非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させる。非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させる方法は、非虫媒性ＴＹＬＣＶの感染したトマト苗（非虫媒性ＴＹＬＣＶ株の種火に相当する苗）を接木することによって、非虫媒性ＴＹＬＣＶを目的とする植物に移行させることによって行う。
なお、非虫媒性ＴＹＬＣＶの感染した苗を得る方法は、農家圃場のトマトから腋芽をランダムにサンプリングし、最初にＴＹＬＣＶが感染しているかどうかをＰＣＲなどで検定し、その後、ＴＹＬＣＶに感染していたものを選び、虫媒性試験を行って非虫媒性の株を選抜する。それが最初の非虫媒性ＴＹＬＣＶの種火（遺伝資源）となり、その後、種火を接木接種して、非虫媒性株を増やすことができる。
（４）台木と穂木をいずれかの接木方法（割りつぎ、さしつぎ、呼びつぎ、断根つぎさし、その変形法など）で行う。
【００３２】
栄養繁殖した台木から側枝を切り取る。耐病性トマト品種を種子で増殖した穂木の主枝を切り取る。切り取る側枝と主枝は、その接木面の直径がほぼ同じになるようなものを選ぶと、接木の成功率が高まるため好適である。接木した周辺部分は接木用のホルダー（例えばナスニック（株）社製のスーパーウィズなど）で固定すると、接木の成功率を高めることができる。接木した後に挿し木して完成であるが、接木苗の養生条件は、特に限定されないが、例えば、温度が１０〜２５℃、湿度７０〜１００％、低日照などが挙げられる。
（５）非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染した台木又は穂木から、それぞれ穂木又は台木に非虫媒性ＴＹＬＣＶが移行しワクチン感染接木苗が完成する。
【００３３】
また、接木法として、感染中間木を種子繁殖した穂木と台木の間に挟み、接木する方法が挙げられる。
具体的には、
（１）台木と耐病性トマト品種に由来する穂木を、種子を播くか栄養繁殖して、それぞれ増殖する。
（２）非虫媒性ＴＹＬＣＶの感染したトマトを中間木として栄養繁殖して増やす。
（３）台木、穂木、中間木の茎を接木に適するように適当な大きさに切る。
（４）台木と穂木の間に非虫媒性ＴＹＬＣＶの感染した中間木を挟んで接木する。
（５）中間木から非虫媒性ＴＹＬＣＶが穂木と台木に移行し、ワクチン感染接木苗が完成する。
【００３４】
本発明は、トマトに感染させたウイルスとして、トマト黄化葉巻ウイルスであって、媒介虫により伝染されないウイルスを用いる。
本発明において、「トマト黄化葉巻ウイルス」(ＴＹＬＣＶ)とは、ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）ベゴモウイルス属（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）に分類され、環状１本鎖ＤＮＡを１分節ゲノムとして有し、ウイルス粒子は直径約２０ｎｍの球体が２つ結合した双球状であるウイルスを意味する。
ＴＹＬＣＶは、中近東、北中米、東南アジア、東アジア（日本・中国）などで主に発生している。日本で発生しているＴＹＬＣＶは、主に２系統存在し、長崎で発見された分離株をはじめ九州、関東などで発生しているＴＹＬＣＶイスラエル系統と、東海、関東で発生しているイスラエルマイルド系統がある。
【００３５】
本発明において「媒介虫」とは、ある植物体から、別の植物体へ、植物ウイルスを伝染させることのできる昆虫を意味する。ここで、植物ウイルスを「伝染」するとは、植物体においてウイルス症状として現れなくても、ウイルスが植物体に感染していることが遺伝子分析等で確認できる場合を含む。
トマト黄化葉巻ウイルスを媒介する媒介虫としては、タバココナジラミが挙げられる。
【００３６】
日本ではいくつかの型のタバココナジラミが見つかっているが、タバココナジラミ−バイオタイプＢ（以前は、シルバーリーフコナジラミと呼ばれていた。以下「タバココナジラミＢ」と表記する場合がある。）とタバココナジラミＱの２型が主に広く生息している。
これまでの報告では、タバココナジラミＢとタバココナジラミＱではＴＹＬＣＶを伝染する虫媒性に差はないとされている（北村ら、関西病虫研報51巻、81〜83ページ、2009年）。なお、タバココナジラミＢに比べ、タバココナジラミＱのほうが殺虫剤耐性が高い。
【００３７】
ＴＹＬＣＶは、タバココナジラミによって伝染される。ＴＹＬＣＶに感染したトマトの接木によって伝染するが、経卵伝染、接触伝染、種子伝染、土壌伝染及び感染葉磨砕汁液の機械的接種などでは感染しない。
したがって、トマトにおけるＴＹＬＣＶの伝染は、実際の栽培施設において、タバココナジラミなどの媒介虫による伝染が問題となり、媒介虫の虫媒性を制御することができれば、新たなトマト黄化葉巻病の防除方法を提供することができるものであり、本発明によって見出された媒介虫により伝染されないトマト黄化葉巻ウイルスによって、新たな防除方法が提供される。
【００３８】
本発明において、「媒介虫により伝染されない（非虫媒性）」とは、被検用トマトを育苗し、育苗期間中においてＴＹＬＣＶが伝染されていないことを意味する。具体的には、以下のようにして非虫媒性であることを確認することができる。トマト黄化葉巻ウイルスを保有していないタバココナジラミを用いて、ＴＹＬＣＶ感染トマトに吸汁させ、吸汁させたタバココナジラミを回収する。ＴＹＬＣＶ感受性でありトマト黄化葉巻ウイルスを保有していない新たなトマトを別の隔離ケースに用意し、該タバココナジラミ放飼し、吸汁させる。その後、タバココナジラミを回収し、被検用トマトを育苗して、育苗期間中においてＴＹＬＣＶが伝染されていないことを確認する。
【００３９】
本発明における非虫媒性ＴＹＬＣＶは、媒介虫を用いて、吸汁させ、伝染性を試験し、媒介虫による伝染性のないウイルスをスクリーニングすることにより得ることのできるウイルスである。
非虫媒性ウイルスは、好ましくは、配列番号１記載の塩基配列で表されるＤＮＡを有するウイルスである。
【００４０】
非虫媒性ウイルスから単離される配列番号１の塩基配列を含む核酸をも提供する。該核酸の塩基配列は、本発明の目的に反しない範囲において、１又は数個の塩基が欠失、付加、及び／又は置換された塩基配列であってもよく、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡであることが好ましい。ただし、該核酸がＲＮＡである場合には、配列番号１中のＴ（配列表においては、ｔと記載され、チミンを表す。）はＵ（ウラシルを表す。）である。また、配列番号１記載の塩基配列中には、ＡＴＧＣＵ以外にも、それぞれＡＴＧＣＵと等価な塩基を含んでいてもよく、等価な塩基として、ＡＴＧＣＵの塩基部分が置換又は修飾された塩基を含んでいてもよい。また、核酸中の糖部分が、リボース又はデオキシリボースと等価であれば、置換又は修飾されていてもよい。
また、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を含む核酸も提供する。該核酸の塩基配列は、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列であるが、本発明の目的に反しない範囲において、１又は数個の塩基が欠失、付加、及び／又は置換された塩基配列であってもよく、配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡであることが好ましい。
なお、配列番号１記載の塩基配列は、分離株１７Ｇの全塩基配列に相当する。
【００４１】
本発明の非虫媒性ＴＹＬＣＶに感染させたトマトからは、ＴＹＬＣＶが媒介虫により伝染されず、また、他のＴＹＬＣＶに対してもさらなる感染を防止し得るので、トマトにおける黄化葉巻病ウイルスの防除をすることができる。
ＴＹＬＣＶを防除するために、予め、非虫媒性ＴＹＬＣＶをトマトに感染させた非虫媒性ＴＹＬＣＶに感染させた耐病性トマトであることにより、ＴＹＬＣＶによるトマト黄化葉巻病の発生をより有効に防除することができる。
【００４２】
非虫媒性ＴＹＬＣＶの維持方法は、接木又は挿木増殖による。非虫媒性ＴＹＬＣＶのトマトへの接種時期は、トマトのどの成長段階でも接木接種できるが、望ましくは、接木及びその後の非虫媒性ＴＹＬＣＶの感染を効率よく行うためには、本葉２〜６枚ころがよい。
【００４３】
非虫媒性ＴＹＬＣＶを感染させたトマトとしては、わき芽を利用することができ、わき芽の大きさが本葉２枚以上の状態であれば、十分にウイルスを有していることを確認している。本発明においては、トマトとしてわき芽であってもよい。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００４５】
＜ＴＹＬＣＶの検定＞
簡易ＤＮＡ抽出法として、チューブキャプチャ（以下「ＴＣ」と表記する。）法によりＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により、ＴＹＬＣＶが植物に感染しているか否かを検定した。ＴＣ−ＰＣＲ法は、具体的には以下のように行った。
まず、ＴＹＬＣＶ感染葉を１００ｍｇ〜１ｇ用意し、５〜２０倍容量の抽出緩衝液（０．０５Ｍ 炭酸緩衝液、０．０１Ｍ 燐酸緩衝液、又は０．０１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液）中で磨砕した。磨砕粗汁液１．５ｍＬをマイクロチューブに入れ、４℃〜室温の温度下で３０分〜１晩静置した。その後、マイクロチューブ内の粗汁液を捨て、ＴＥ緩衝液（０．０１Ｍ ＴＲＩＳ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）又は０．０１Ｍ 燐酸緩衝液等でリンスした後、滅菌水を入れ、ＴＹＬＣＶのＤＮＡ抽出液を得た。
このＤＮＡ抽出液を１μＬとり、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｏＴａｑRＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘの方法に従い、ＰＣＲを行った。ＰＣＲではＴＹＬＣＶの分離株間で比較的安定な領域に合わせたプライマーである
ＴＹＰＲＢ２Ｆ；5'CCCTCTGGAATGAAGGAACA  （配列番号２）
ＴＹＣ−Ｒ；5' TTGAAAAATTGGRCTCTCAA  （配列番号３）
を用いて、９５℃５０秒・５６℃５０秒・７２℃４５秒のサイクルを３５サイクル行い、目的領域を増幅した。ＰＣＲ後、目的のＤＮＡは１．２％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００４６】
＜非虫媒性ＴＹＬＣＶ＞
熊本県において分離したＴＹＬＣＶを、ウイルスフリーのＴＹＬＣＶ感受性トマト品種（ハウス桃太郎（タキイ種苗社）に感染させ、次いで、タバココナジラミＢ（千葉県内で入手）を用いて、吸汁させ、他のトマトへの伝染性を試験して、媒介虫による伝染性のないウイルスをスクリーニングすることにより非虫媒性ＴＹＬＣＶ（１７Ｇ）を得た。
１７Ｇの全長ＤＮＡ配列をアグロバクテリウム用バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００（ＣＡＭＢＩＡ社）に挿入し、プラスミド（ｐＣＡＭ１７Ｇ１）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成２２年１１月２日に受領され、受領番号ＦＥＲＭ−ＡＰ２２０３７が付与され、２０１０年１２月３日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０３７が付与されている。該プラスミドは、植物体にアグロインフィルタレーション法で感染させ、ウイルスが発現し、非虫媒性が保たれていることを確認している。また、該プラスミド及び１７Ｇ株は、本出願人によって保存維持されており、日本国特許法施行規則２７条の３の規定に準ずる分譲は本出願人が保証する。
寄託されたプラスミドに挿入された塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列である。
【００４７】
＜実施例１＞
（ワクチン感染台木を栄養繁殖し、穂木はＴＹＬＣＶ耐性品種を種子で増殖し接木する方法）
ワクチン感染台木となる品種（ブロック、（株）サカタのタネ）を播種し、温度１５〜３０℃で本葉１０葉期まで生育させた。第９本葉と第１０本葉の間の主枝を切断し、その後、側枝（わき芽）が３〜５ｃｍに成長したもの(台木)に、１７Ｇの感染したトマトの茎（穂木）を接木する。接木方法は、穂木と台木のそれぞれの切断面の直径がほぼ同じ大きさになるような部位を選んで斜めに、好ましくは３０〜４５°の斜度で、切断し、接木部の周辺部分には接木用のホルダー（ナスニック社製のスーパーウィズ）で固定した。接木後は育苗トンネル内をビニールで覆い、温度１５〜２５℃、湿度９５〜１００％に３日間保持し、その後２日間かけてビニールを徐々に開け、接木を完遂した。接木１ケ月後に、台木品種であるブロックの側枝に１７Ｇが移行していることをＴＣ−ＰＣＲで確認し、順次その側枝を切り取り、挿し木し、育苗トンネル内をビニールで覆い、温度１５〜２５℃、湿度９５〜１００％に２日間保持し、その後３日間かけてビニールを徐々に開いて湿度を低めていき、挿し木苗を順次活着させ、台木として用いた。
穂木はＴＹＬＣＶ耐性品種（秀麗、（株）サカタのタネ））を播種し、本葉が３〜４葉期の草丈５〜１０ｃｍなるまで、温度１０〜２５℃で生育させた。
接木は、穂木と台木のそれぞれの切断面の直径がほぼ同じ大きさになるような部位を選んで斜めに切断し、穂木（秀麗）を台木（ブロック）に接木した。接木部の周辺部分には接木用のホルダー（ナスニック社製のスーパーウィズ）で固定した。次いで、育苗トンネル内をビニールで覆い、温度１５〜２５℃、湿度９５〜１００％に３日間保持し、２日間かけてビニールを徐々に開いていき、接木を完遂した。
接木苗におけるＴＹＬＣＶの移行を確認するため、穂木の葉からＴＣ−ＰＣＲ法により分析を行った。結果を図１に示す。
ＴＹＬＣＶのＤＮＡのバンドが確認できたことから、接木苗において、ＴＹＬＣＶは、感染台木から、穂木に移行していることが確認された。
【００４８】
＜実施例２＞
（ワクチン感染したＴＹＬＣＶ耐性穂木を栄養繁殖し、台木は種子で増殖し接木する方法）
穂木となる品種（秀麗、（株）サカタのタネ）を播種し、実施例１の台木でワクチン感染台木を得た方法で、ワクチン感染したＴＹＬＣＶ耐性穂木苗を得た。
台木は種子（ブロック、（株）サカタのタネ）を播種し、実施例１の穂木を得た方法で、台木苗を得た。
接木は実施例１と同様な方法で行った。
接木苗おけるＴＹＬＣＶの移行を確認するため、台木の葉からＴＣ−ＰＣＲ法により分析を行った。結果を図２に示す。
ＴＹＬＣＶのＤＮＡのバンドが確認できたことから、接木苗において、ＴＹＬＣＶは、感染穂木から、台木に移行していることが確認された。
【００４９】
＜実施例３＞
（ワクチン感染中間木を種子繁殖した穂木と台木の間に挟み、接木する方法）
中間木となるトマトの種子(品種ハウス桃太郎、タキイ種苗(株))を播種し、実施例１の台木と同様に、ワクチン感染中間木の苗を得た。その中間木苗を本葉１０葉期まで生育させ、第９本葉と第１０本葉の間の主枝を切断し、側枝が３〜５ｃｍになったら、本接木に使用する穂木と台木の切断面の直径とほぼ同じになる部分を幅１〜２ｃｍに輪切りして穂木と台木の間に挟んで使用した。
穂木（秀麗、（株）サカタのタネ）及び台木（ブロック、（株）サカタのタネ）はそれぞれ種子を播種し、本葉４葉期まで温度１５〜３０℃で生育させ、穂木及び台木はそれぞれ子葉と第一本葉の間で切り取り、穂木は切断部の上部を、台木は切断部の下部を利用し、その間に中間木を挟んで３者を接木した。接木方法は、実施例１の接木方法と同様であるが、接木用ホルダー（ナスニック社製のスーパーウィズ）を２個使用し、それぞれ穂木と中間木、中間木と台木を固定するために使用した。
接木苗おけるＴＹＬＣＶの移行を確認するため、穂木及び台木の葉からＴＣ−ＰＣＲ法により分析を行った。結果を図３に示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号１は、分離株１７Ｇの全塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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