(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 84に示すVH CDR1、SEQ ID NO: 85に示すVH CDR2、SEQ ID NO: 86に示すVH CDR3;SEQ ID NO: 102に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 103に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 104に示すVL CDR3を含む、ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項２】
SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 83と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択される重鎖可変(VH)ドメインアミノ酸配列、および、
SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 101と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 113と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択される軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列
を含む、ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
以下を含む、CCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分: ATCCアクセッション番号PTA-6981と称されるハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体4.40の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにATCCアクセッション番号PTA-6981と称されるハイブリドーマ細胞から産生されるモノクローナル抗体4.40の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3。
【請求項４】
SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 82と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 116と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖、および
SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 100と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 112と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
以下からなる群より選択される重鎖および軽鎖を抗体が有する、請求項4記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分:
a)SEQ ID NO: 116のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 112のアミノ酸配列を有する軽鎖、および
b)SEQ ID NO: 82のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 100のアミノ酸配列を有する軽鎖。
【請求項６】
重鎖アミノ酸配列がSEQ ID NO: 116であり、かつ軽鎖アミノ酸配列がSEQ ID NO: 112である、請求項5記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項７】
SEQ ID NO: 83の重鎖可変(VH)ドメインアミノ酸配列の1つまたは複数のVH FR1、FR2、FR3、もしくはFR4アミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO: 101およびSEQ ID NO: 113の軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列の1つまたは複数のVL FR1、FR2、FR3、もしくはFR4アミノ酸配列をさらに含む、請求項1記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項８】
重鎖定常ドメインをさらに含む、請求項7記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項９】
軽鎖定常ドメインをさらに含む、請求項8記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項１０】
請求項1記載の抗体または抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項1記載の抗体または抗原結合部分を産生する、単離された細胞株。
【請求項１２】
請求項1記載の抗体または抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１３】
核酸分子に機能的に連結された発現制御配列を任意で含む、請求項12記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
CCR2を介した障害の症状の治療、予防、または軽減を必要としている対象において、CCR2を介した障害の症状を治療、予防、または軽減するための薬学的組成物であって、請求項1記載の抗体または抗原結合部分を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
対象が、炎症性障害、アレルギー性障害、自己免疫障害、移植片拒絶障害、アテローム性動脈硬化症、肥満、HIV感染症、神経因性疼痛、狭窄、再狭窄、多発性硬化症、線維性状態、加齢黄斑変性症、ブドウ膜炎、角膜感染症、および癌からなる群より選択される1種または複数種の状態または障害に苦しんでいる、請求項14記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
線維性状態が肝線維症である、請求項15記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
肝線維症が、C型肝炎ウイルス(HCV)感染、B型肝炎ウイルス(HBV)感染、アルコール性脂肪性肝炎(ASH)、または非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の結果である、請求項16記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許および関連特許出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2008年8月18日に出願された米国特許仮出願第61/189,357号の恩典を主張する。
【０００２】
共同研究契約
本明細書における開示および特許請求の範囲は、特許請求される主題を作成した日またはそれ以前から有効であるPfizer Inc.とAbgenix Inc.との共同研究契約の範囲内で行われた活動の結果として作成された。
【背景技術】
【０００３】
背景
炎症部位への白血球浸潤は、ケモカインとして公知の8〜10kDのタンパク質によって調節されていると考えられている。これらのケモカインは、それらのN末端システイン残基の間隔に応じて、CC、CXC、XC、およびCX3Cと呼ばれる4つの群に分類されている。ケモカインは、走化性の誘発、脱顆粒、脂質メディエーターの合成、およびインテグリン活性化など、白血球に対する一連の炎症誘発作用を媒介することができる(Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991)（非特許文献1）; Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994)（非特許文献2）; Miller, M. D.およびKrangel, M. S., Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992)（非特許文献3）)。
【０００４】
1種のケモカイン、すなわち、CCL2としても公知の単球走化性タンパク質1(MCP-1)は、単球、リンパ球、および樹状細胞に作用して、走化性、顆粒放出、呼吸バースト、およびサイトカイン放出を誘導する。研究によって、MCP-1が、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、肉芽腫症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肥満/糖尿病、神経因性疼痛、癌、および多発性硬化症などの疾患の病理に関係していることが示唆されている(Koch, J. Clin. Invest. 90:772-79 (1992)（非特許文献4）; Hosaka et al., Clin. Exp. Immunol. 97:451-457 (1994)（非特許文献5）; Schwartz et al., Am. J. Cardiol. 71(6):9B-14B (1993)（非特許文献6）; Schimmer et al., J. Immunol. 160:1466-1471 (1998)（非特許文献7）; Flory et al., Lab. Invest. 69:396-404 (1993)（非特許文献8）; Gong et al., J. Exp. Med. 186:131-137 (1997)（非特許文献9）; Salcedo et al. Blood 96(1) 34-40 (2000)（非特許文献10）; Bracke et al., Inflammation & Allergy - Drug Targets 6: 75-79 (2007)（非特許文献11）; Chung Current Drug Targets - Inflammation & Allergy 4: 619-625 (2005)（非特許文献12）)。
【０００５】
CCR2は、MCP-1ならびにCCL8(MCP-2)、CCL7(MCP-3)、およびCCL13(MCP-4)を含む他のケモカインに結合する、7回膜貫通ドメインGタンパク質共役型走化性(chemotactic)受容体である(Charo, I. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2752-2756 (1994)（非特許文献13）; Myers, S. J., et al., J. Biol. Chem. 270:5786-5792 (1995)（非特許文献14）; Gong et al., J. Biol Chem 272:11682-11685 (1997)（非特許文献15）; Garcia-Zepeda et al., J. Immunol. 157:5613-5626 (1996)（非特許文献16）)。CCR2は、CMKBR2およびCKR2としても公知である。CCR2の選択的にスプライシングされた2種の形態であるCCR2AおよびCCR2Bがクローン化されており、これらはC末端が異なる(Wong et al (1997) J. Biol. Chem. 272:1038-1045（非特許文献17）)。シグナル伝達研究において、CCR2AおよびCCR2Bの両方とも、アゴニスト依存性のカルシウム動員およびアデニリルシクラーゼ阻害を媒介する。CCR2は、単球、T細胞、および樹状細胞上で発現され、内皮細胞、単球、および滑膜線維芽細胞によって分泌されるケモカインと相互に作用する。
【０００６】
CCR2の生物学的役割は、CCR2ノックアウトマウスを用いて精査されている(Boring et al., J Clin Invest. 100(10):2552-61 (1997)（非特許文献18）; Boring et al., Nature 394(6696):894-7 (1998)（非特許文献19）; De Paolo et al., J Immunol. 171(7):3560-7 (2003)（非特許文献20）; Gaupp et al., Am J Pathol. 162(1):139-50(2003)（非特許文献21）)。CCR2-/-マウスは、遅延型過敏性応答およびTh1型サイトカイン産生の両方において顕著な欠陥を有し、一般に、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を発症しにくい。免疫応答の調整に加えて、CCR2は、HIVの補助受容体でもある(Connor et al., J. Exp. Med. 185:621-628 (1997)（非特許文献22）; Frade et al., J Clin Invest. 100(3):497-502(1997)（非特許文献23）)。
【０００７】
MCP-1およびその受容体CCR2は望ましくない免疫応答に関与するため、CCR2アンタゴニストは有望な治療物質であり得る。しかしながら、わずかなCCR2アンタゴニストしか説明されていない(Ogilvie et al., Blood 97(7):1920-4 (2001)（非特許文献24）を参照されたい)。したがって、CCR2に結合し、そのリガンドによって媒介されるCCR2シグナル伝達を遮断する、新規な改善された組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991)
【非特許文献２】Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994)
【非特許文献３】Miller, M. D.およびKrangel, M. S., Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992)
【非特許文献４】Koch, J. Clin. Invest. 90:772-79 (1992)
【非特許文献５】Hosaka et al., Clin. Exp. Immunol. 97:451-457 (1994)
【非特許文献６】Schwartz et al., Am. J. Cardiol. 71(6):9B-14B (1993)
【非特許文献７】Schimmer et al., J. Immunol. 160:1466-1471 (1998)
【非特許文献８】Flory et al., Lab. Invest. 69:396-404 (1993)
【非特許文献９】Gong et al., J. Exp. Med. 186:131-137 (1997)
【非特許文献１０】Salcedo et al. Blood 96(1) 34-40 (2000)
【非特許文献１１】Bracke et al., Inflammation & Allergy - Drug Targets 6: 75-79 (2007)
【非特許文献１２】Chung Current Drug Targets - Inflammation & Allergy 4: 619-625 (2005)
【非特許文献１３】Charo, I. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2752-2756 (1994)
【非特許文献１４】Myers, S. J., et al., J. Biol. Chem. 270:5786-5792 (1995)
【非特許文献１５】Gong et al., J. Biol Chem 272:11682-11685 (1997)
【非特許文献１６】Garcia-Zepeda et al., J. Immunol. 157:5613-5626 (1996)
【非特許文献１７】Wong et al (1997) J. Biol. Chem. 272:1038-1045
【非特許文献１８】Boring et al., J Clin Invest. 100(10):2552-61 (1997)
【非特許文献１９】Boring et al., Nature 394(6696):894-7 (1998)
【非特許文献２０】De Paolo et al., J Immunol. 171(7):3560-7 (2003)
【非特許文献２１】Gaupp et al., Am J Pathol. 162(1):139-50(2003)
【非特許文献２２】Connor et al., J. Exp. Med. 185:621-628 (1997)
【非特許文献２３】Frade et al., J Clin Invest. 100(3):497-502(1997)
【非特許文献２４】Ogilvie et al., Blood 97(7):1920-4 (2001)
【発明の概要】
【０００９】
概要
CCR2、特にヒトCCR2に特異的に結合し、CCR2アンタゴニストとして作用することができる単離された抗体またはその抗原結合部分、および該抗体または部分を含む組成物が提供される。CCR2のN末端部分でも第3のループでもないエピトープでCCR2に結合する抗体または抗原結合部分が含まれる。このような抗体は、CCR2の第1の細胞外ループおよび/または第2の細胞外ループに結合し得る。
【００１０】
(i)前記抗CCR2抗体の重鎖および/もしくは軽鎖、その可変ドメイン、もしくはその抗原結合部分、またはそれらをコードする核酸分子;および(ii)薬学的に許容される担体を含む組成物が、提供される。これらの組成物は、治療物質または診断用物質など別の成分をさらに含んでもよい。
【００１１】
診断方法および治療方法もまた、提供される。同様に、炎症性障害および非炎症性障害を治療するための医薬を製造するための抗CCR2抗体およびその一部分も提供される。
【００１２】
核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに核酸分子にコードされるポリペプチドを組換えによって作製する方法が提供される。抗CCR2抗体またはその抗原結合部分を産生する単離された細胞株もまた、提供される。
[請求項1001]
抗体が、
a)ヒトCCR2の第1の細胞外ループ内に含まれるエピトープに結合するか;
b)ヒトCCR2の第2の細胞外ループ内に含まれるエピトープに結合するか;または
c)ヒトCCR2の第1の細胞外ループおよび第2の細胞外ループの両方の内部に含まれるエピトープに結合する、
ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項1002]
以下の特性のうちの少なくとも1つを有する、請求項1001記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分:
a)ヒトCCR5に対する選択性より少なくとも100倍強い、ヒトCCR2に対する選択性を有する;
b)2.0×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトCCR2に結合する;
c)CCR2への結合についてMCP-1および/またはMCP-3と競合する;
d)MCP-1に応答したCa2+動員を低減させる;
e)MCP-1に応答したコラーゲンI mRNA合成を低減させる;
f)MCP-1に応答したヒト単球におけるpERKリン酸化を低減させる;
g)MCP-1に応答したヒト単球の走化性を低下させる;ならびに
h)MCP-1に応答したヒト単球におけるアクチン重合を低減させる。
[請求項1003]
ヒトCCR2の第1の細胞外ループがSEQ ID NO: 128のアミノ酸配列を含み、かつヒトCCR2の第2の細胞外ループがSEQ ID NO: 129のアミノ酸配列を含む、請求項1001記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
[請求項1004]
以下からなる群より選択されるCDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変(VH)ドメインアミノ酸配列を含む、ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分:
a)SEQ ID NO: 12に示すVH CDR1、SEQ ID NO: 13に示すVH CDR2、およびSEQ ID NO: 14に示すVH CDR3;
b)SEQ ID NO: 48に示すVH CDR1、SEQ ID NO: 49に示すVH CDR2、およびSEQ ID NO: 50に示すVH CDR3;
c)SEQ ID NO: 84に示すVH CDR1、SEQ ID NO: 85に示すVH CDR2、およびSEQ ID NO: 86に示すVH CDR3;ならびに
d)SEQ ID NO: 177に示すVH CDR1、SEQ ID NO: 178に示すVH CDR2、およびSEQ ID NO: 179に示すVH CDR3。
[請求項1005]
以下からなる群より選択されるCDR1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列をさらに含む、請求項1004記載の単離されたヒト抗体または抗原結合部分:
a)SEQ ID NO: 30に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 31に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 32に示すVL CDR3;
b)SEQ ID NO: 66に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 67に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 68に示すVL CDR3;
c)SEQ ID NO: 102に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 103に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 104に示すVL CDR3;ならびに
d)SEQ ID NO: 195に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 196に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 197に示すVL CDR3。
[請求項1006]
以下からなる群より選択されるCDR1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を含む、ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合部分:
a)SEQ ID NO: 30に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 31に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 32に示すVL CDR3;
b)SEQ ID NO: 66に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 67に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 68に示すVL CDR3;
c)SEQ ID NO: 102に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 103に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 104に示すVL CDR3;ならびに
d)SEQ ID NO: 195に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 196に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 197に示すVL CDR3。
[請求項1007]
SEQ ID NO: 84に示すVH CDR1、SEQ ID NO: 85に示すVH CDR2、SEQ ID NO: 86に示すVH CDR3;SEQ ID NO: 102に示すVL CDR1、SEQ ID NO: 103に示すVL CDR2、およびSEQ ID NO: 104に示すVL CDR3を含む、請求項1005記載の単離された抗体または抗原結合部分。
[請求項1008]
SEQ ID NO: 202およびSEQ ID NO: 203からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む、ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項1009]
SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 176、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 11、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 47、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 83、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 162と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 158と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 160と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 164と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 11と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 47と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 83と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、およびSEQ ID NO: 176と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択される重鎖可変(VH)ドメインアミノ酸配列を含む、ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項1010]
SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 194、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 29、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 66、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 101、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 113、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 159と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 161と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 163と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 163と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 165と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 29と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 66と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 101と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 113と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、およびSEQ ID NO: 194と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択される軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を含む、CCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[請求項1011]
SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 194、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 29、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 66、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 101、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 113、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 163と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 159と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 161と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 161と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 165と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 29と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 66と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 101と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO: 113と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列、およびSEQ ID NO: 194と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列からなる群より選択される軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列をさらに含む、請求項1008記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
[請求項1012]
以下を含む、CCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分:
a)モノクローナル抗体4.40(ATCCアクセッション番号PTA-6981)、4.22(ATCCアクセッション番号PTA-6980)、4.39、および4.9(ATCCアクセッション番号PTA-6979)からなる群より選択される抗体の重鎖より独立に選択される少なくとも1つの重鎖CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3;または
b)モノクローナル抗体4.40、4.22、4.39、および4.9からなる群より選択される抗体の軽鎖より独立に選択される少なくとも1つの軽鎖CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3;または
c)モノクローナル抗体4.40、4.22、4.39、および4.9からなる群より選択される抗体の重鎖より独立に選択される少なくとも1つの重鎖CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3、ならびにモノクローナル抗体4.40、4.22、4.39、および4.9からなる群より選択される抗体の軽鎖より独立に選択される少なくとも1つの軽鎖CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3。
[請求項1013]
SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 175、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 10、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 46、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 82、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 116、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 162と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 158と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 160と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 160と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 116、およびSEQ ID NO: 164と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 175からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む、ヒトCCR2に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。
[請求項1014]
SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 193、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 28、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 64、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 100、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 112、保存的アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 163と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 159と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 161と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 161と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 112、およびSEQ ID NO: 165と比べて生殖系列アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖をさらに含む、請求項1013記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
[請求項1015]
以下からなる群より選択される重鎖および軽鎖を抗体が有する、請求項1014記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分:
a)SEQ ID NO: 10のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有する軽鎖、
b)SEQ ID NO: 46のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 64のアミノ酸配列を有する軽鎖、
c)SEQ ID NO: 82のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 100のアミノ酸配列を有する軽鎖、
d)SEQ ID NO: 82のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 112のアミノ酸配列を有する軽鎖、
e)SEQ ID NO: 116のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 112のアミノ酸配列を有する軽鎖、ならびに
f)SEQ ID NO: 175のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 193のアミノ酸配列を有する軽鎖。
[請求項1016]
重鎖アミノ酸配列がSEQ ID NO: 116であり、かつ軽鎖アミノ酸配列がSEQ ID NO: 112である、請求項1015記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
[請求項1017]
4.40、4.40 A68G S230P、4.39、4.22、および4.9からなる群より選択される抗体の1つまたは複数のVH FR1、FR2、FR3、もしくはFR4アミノ酸配列、および/またはVL FR1、FR2、FR3、もしくはFR4アミノ酸配列をさらに含む、請求項1005記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
[請求項1018]
重鎖定常ドメインをさらに含む、請求項1017記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
[請求項1019]
軽鎖定常ドメインをさらに含む、請求項1018記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
[請求項1020]
請求項1001記載の抗体または抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[請求項1021]
請求項1001記載の抗体または抗原結合部分を産生する、単離された細胞株。
[請求項1022]
請求項1001記載の抗体または抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
[請求項1023]
核酸分子に機能的に連結された発現制御配列を任意で含む、請求項1022記載の核酸分子を含むベクター。
[請求項1024]
CCR2を介した障害の症状の治療、予防、または軽減を必要としている対象において、CCR2を介した障害の症状を治療、予防、または軽減するための方法であって、請求項1001記載の抗体または抗原結合部分を該対象に投与する段階を含む、方法。
[請求項1025]
対象が、炎症性障害、アレルギー性障害、自己免疫障害、移植片拒絶障害、アテローム性動脈硬化症、肥満、HIV感染症、神経因性疼痛、狭窄、再狭窄、多発性硬化症、線維性状態、加齢黄斑変性症、ブドウ膜炎、角膜感染症、および癌からなる群より選択される1種または複数種の状態または障害に苦しんでいる、請求項1024記載の方法。
[請求項1026]
線維性状態が肝線維症である、請求項1025記載の方法。
[請求項1027]
肝線維症が、C型肝炎ウイルス(HCV)感染、B型肝炎ウイルス(HBV)感染、アルコール性脂肪性肝炎(ASH)、または非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の結果である、請求項1026記載の方法。
[請求項1028]
CCR2を介した障害の症状の治療、予防、または軽減を必要としている対象において、CCR2を介した障害の症状を治療、予防、または軽減するための医薬を製造するための、請求項1001記載の抗体または抗原結合部分の使用。
[請求項1029]
対象が、炎症性障害、アレルギー性障害、自己免疫障害、移植片拒絶障害、アテローム性動脈硬化症、肥満、HIV感染症、神経因性疼痛、狭窄、再狭窄、多発性硬化症、線維性状態、加齢黄斑変性症、ブドウ膜炎、角膜感染症、および癌からなる群より選択される1種または複数種の状態または障害に苦しんでいる、請求項1028記載の使用。
[請求項1030]
線維性状態が肝線維症である、請求項1029記載の使用。
[請求項1031]
肝線維症が、C型肝炎ウイルス(HCV)感染、B型肝炎ウイルス(HBV)感染、アルコール性脂肪性肝炎(ASH)、または非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の結果である、請求項1030記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図1A、1B、および1Cは、FACS解析によって分析した、細胞に対するCCR2抗体の結合を示すグラフである。図1Aは、FACS解析によって分析した、ヒト全血単球に対する、AF-488(ALEXA FLUOR(登録商標)488, Invitrogen)を結合させたCCR2抗体4.40 A68G S230Pの結合を、KLH対照抗体と比較して示すグラフである。
【図１Ｂ】図1Bは、FACS解析によって分析した、ヒトCCR2を発現する300-19細胞に対する、AF-488を結合させたCCR2抗体4.40 A68G S230Pの結合を示すグラフである。
【図１Ｃ】図1Cは、抗ヒトPEを用いて検出した、CCR2をトランスフェクトされた300-19細胞に対する、様々な濃度の4.40 A68G S230P抗体の結合を示すグラフである。
【図２】図2は、飽和結合アッセイ法における、CCR2をトランスフェクトされた300-19細胞に対する4.40 A68G S230P抗体の用量に関連した結合を示す。
【図３】図3は、CCR2リガンドMCP-1に応答したTHP-1細胞の走化性を阻害するが、CCR1/CCR5リガンドMIP-1aに応答したTHP-1細胞の走化性は阻害しない、4.40 A68G S230P抗体の能力を示す。
【図４】図4は、MCP-1に応答した初代ヒト単球の走化性を阻害する、4.40 A68G S230P抗体の能力を示す。
【図５】図5は、CCR1/CCR2キメラを発現させるためのレトロウイルスベクターのプラスミドマップを示す。
【図６】図6Aおよび6Bは、CCR2の第1の細胞外ループおよび第2の細胞外ループならびにCCR1のN末端および第3のループのみからなるキメラ受容体を発現する300-19細胞に対する、4.40 A68G S230P抗体の結合を示す。図6Cは、FACS解析によって測定した、キメラ受容体をトランスフェクトされた300-19細胞に対する4.40 A68G S230Pの飽和結合アッセイ法を示す。
【図７】図7は、(A)300-19対照細胞;(B)完全長CCR2を発現するトランスフェクトされた300-19細胞;(C)フラッグタグ付き(M1)MRRRキメラ[受容体発現を確実にするためにフラッグタグを付けられたCCR2(M)のN末端、およびCCR1(R)のループ領域]を発現する、トランスフェクトされた300-19細胞;(D)フラッグタグ付き(M1)RRRMキメラ[受容体発現を確実にするためにフラッグタグを付けられたCCR1(R)のN末端、第1のループおよび第2のループ、ならびにCCR2(M)の第3のループ]を発現する、トランスフェクトされた300-19細胞;ならびに(E)フラッグタグ付き(M1)RMMRキメラ[受容体発現を確実にするためにフラッグタグを付けられたCCR1(R)のN末端および第3のループ、ならびにCCR2(M)の第1のループおよび第2のループ]を発現する、トランスフェクトされた300-19細胞における、4.40 A68G S230P抗体の飽和結合解析(3時間の飽和曲線)を示す。
【図８】図8は、捕捉ELISAにおいて評価した、CCR2のループ2ペプチド領域またはループ3ペプチド領域のいずれかに対する4.40 A68G S230P抗体の結合を示す。
【図９】図9は、AF-488を結合させた4.40.3 A68G S230P抗体(パネルA)または抗CCR5抗体(パネルB)のいずれかを用いた、組換えCCR5を発現する300-19細胞のFACS免疫染色を示す2つのグラフである。
【図１０】図10は、CCR2をトランスフェクトされた300-19細胞におけるカルシウム動員に基づいて評価したもので、MCP-1によって誘導された活性を4.40 A68G S230P抗体が阻害することを示す。
【図１１】図11は、MCP-3によって誘導されたCCR2をトランスフェクトされた300-19細胞の走化性を、4.40 A68G S230P抗体が阻害することを実証する。
【図１２】図12は、全血中におけるMCP-1に応答したヒト単球アクチン重合を4.40 A68G S230P抗体が阻害することを示す。
【図１３】図13は、全血中におけるMCP-1に応答した雌カニクイザル単球アクチン重合を4.40 A68G S230P抗体が阻害することを示す。
【図１４】図14は、hHSC細胞株L190におけるコラーゲン1 mRNA合成を4.40 A68G S230P抗体が用量依存的に阻害することを示す。
【図１５】図15は、10nM MCP-1のヒト全血におけるpERKリン酸化を4.40 A68G S230P抗体が用量依存的に阻害することを実証する。
【図１６】図16は、ヒトCCR2ノックインマウスにおける血漿中アラニントランスアミナーゼ(ALT)活性および血漿中アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)活性が、ConAの1回の注射から24時間後に4.40 A68G S230P抗体によって低下することを示す。
【図１７】図17A〜17Dは、それぞれ4.22.3抗体、4.40.2抗体、4.39.3抗体、および4.9.2抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と比較した、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の生殖系列アミノ酸配列のアライメントを示す(4.22.3抗体、4.40.2抗体、4.39.3抗体、および4.9.2抗体については、ミスマッチ部分のみ示している)。CDRに下線を引き、ミスマッチのギャップは、パウンド記号(#)によって示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
定義および一般的技術
本明細書において他に規定されない限り、本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、かつ、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において言及する刊行物および他の参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。一般に、本明細書において説明する、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される用語、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり、かつ一般に使用されるものである。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。
【００１５】
方法および技術は、一般に、当技術分野において周知である従来の方法に従って、かつ別段の定めが無い限り、本明細書の全体にわたって引用および考察される様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献において記載されているようにして、実施される。例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992); ならびにHarlowおよび Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野において一般に遂行されているように、または本明細書において説明するようにして、実施する。本明細書において説明する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される用語、ならびにそれらの実験室での手順および技術は、当技術分野において周知であり、かつ一般に使用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬品の調製、調剤、および送達、ならびに患者の治療のために使用される。
【００１６】
以下の用語は、別段の定めが無い限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１７】
「ポリペプチド」という用語は、ネイティブなタンパク質または人工タンパク質、タンパク質断片、およびあるタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体またはポリマーでよい。
【００１８】
「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、または「単離された抗体」という用語は、その起源または由来源のおかげで、(1)ネイティブの状態では付随する天然では結合される成分と結合していないか、(2)同じ種に由来する他のタンパク質を含まないか、(3)異なる種に由来する細胞によって発現されるか、または(4)天然では存在しない、タンパク質、ポリペプチド、または抗体である。したがって、化学合成されるか、または天然において起源とする細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、天然では結合される成分から「単離」されていると考えられる。また、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を用いて単離することにより、タンパク質を、天然では結合される成分を実質的に含まない状態にすることもできる。
【００１９】
単離された抗体の例には、CCR2またはその一部分を用いてアフィニティー精製された抗CCR2抗体、インビトロでハイブリドーマまたは他の細胞株を用いて合成された抗CCR2抗体、およびトランスジェニックマウスに由来するヒト抗CCR2抗体が含まれる。
【００２０】
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約60％〜75％が単一種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋な」、「実質的に均質な」、または「実質的に精製された」状態である。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または多量体でよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、典型的には、約50重量％、約60重量％、約70重量％、約80重量％、もしくは約90重量％、より普通には約95重量％のタンパク質試料を含み、純度が99％を超えてもよい。タンパク質の純度または均質性は、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、続いて、当技術分野において周知の染色剤でゲルを染色した際の単一のポリペプチドバンドを可視化するような、当技術分野において周知のいくつかの手段によって示すことができる。特定の目的のためには、HPLCまたは当技術分野において周知の他の精製手段を用いることによって、より高い分解能を提供することができる。
【００２１】
本明細書において使用される「抗体類似体」という用語は、あるアミノ酸配列の一部分と実質的に同一なセグメントを含み、かつ次の特性のうち少なくとも1つを有する抗体を意味する:(1)適切な結合条件下でのCCR2への特異的結合、(2)CCR2の少なくとも1種の生物活性を阻害する能力。典型的には、抗体類似体は、ネイティブ配列に対して保存的なアミノ酸置換(または挿入もしくは欠失)を含む。類似体は、典型的には、少なくとも20または25のアミノ酸長、少なくとも50、60、70、80、90、100、150、もしくは200、またはそれ以上のアミノ酸長であり、しばしば、抗体の完全長重鎖または完全長軽鎖と同じ長さでもよい。いくつかの場合は、生殖系列のアミノ酸配列からの1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、または17個の置換を有する抗体類似体を含む。
【００２２】
特定の場合において、抗CCR2抗体またはその抗原結合部分に対するアミノ酸置換は、(1)タンパク分解に対する感受性を低下させ、(2)酸化に対する感受性を低下させ、(3)タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変し、(4)グリコシル化部位を付加または除去し、かつ、(5)そのような類似体の他の物理化学的特性または機能特性を付与または変更するが、CCR2への特異的結合は引き続き保持する、置換である。類似体には、通常存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質が含まれ得る。例えば、保存的アミノ酸置換のような単一または複数のアミノ酸置換は、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチド部分に通常存在する配列中に、起こしてよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変えるべきではない。例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在する免疫グロブリン結合ドメインを構成する逆平行βシートを改変するべきでも、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊すべきでもない。一般に、グリシンおよびプロリンは、逆平行βシートにおいて使用されないと考えられる。当技術分野において認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、参照により本明細書に組み入れられるProteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編、W. H. Freeman and Company, New York(1984)); Introduction to Protein Structure(C. BrandenおよびJ. Tooze編、Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));ならびにThornton et al., Nature 354:105 (1991)において説明されている。
【００２３】
本明細書において「抗体」に言及する場合、その抗原結合部分もまた使用され得ることが、通常は理解される。抗原結合部分は、特異的結合について、完全な抗体と競合する。一般には、Fundamental Immunology, 7章(Paul, W.編、第2版、Raven Press, N.Y. (1989)(あらゆる目的のためにその全体が参照により組み入れられる)を参照されたい。抗原結合部分は、組換えDNA技術によって、または完全な抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって得ることができる。いくつかの場合において、抗原結合部分には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、ならびに、ポリペプチドに特異的な抗原結合を与えるのに十分な抗体の一部分を少なくとも含む、相補性決定領域(CDR)断片、単鎖抗体(例えばscFv)、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドが含まれる。
【００２４】
N末端からC末端に向かって、抗体の成熟した軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインはいずれも、FR1領域、CDR1領域、FR2領域、CDR2領域、FR3領域、CDR3領域、およびFR4領域を含む。本明細書において、各ドメインに対するアミノ酸の割付は、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987および1991)); ChothiaおよびLesk, J. Mol .Biol. 196:901-917(1987);またはChothia et al., Nature 342:878-883(1989)の定義に従っている。
【００２５】
本明細書において使用される場合、番号によって言及される抗体は、同じ番号のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体と同じである。例えば、モノクローナル抗体4.40は、ハイブリドーマ4.40またはそのサブクローンから得られるものと同じ抗体である。連続的なサブクローンは、例えば、4.40.1、4.40.2、および4.40.3と呼ばれ、実質的に同じ配列および機能を有する。
【００２６】
本明細書において使用される場合、Fd断片とは、VHドメインおよびCH1ドメインからなる抗体断片を意味し;Fv断片は、ある抗体の短腕のVLドメインおよびVHドメインからなり;dAb断片(Ward et al., Nature 341:544-546(1989))は、VHドメインからなる。
【００２７】
いくつかの場合において、抗体は、VLドメインおよびVHドメインが対となって、単一のポリペプチド鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーを介して一価の分子を形成している、単鎖抗体(例えばscFv)である。(例えば、Bird et al., Science 242:423-426(1988)およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)を参照されたい)。いくつかの場合において、抗体は、ダイアボディ、すなわち、VHドメインおよびVLドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されているが、同じ鎖の上の2つのドメイン間の対形成を可能にさせるには短すぎるリンカーを用い、それによって、別の鎖の相補的ドメインとこれらのドメインとの対形成を余儀なくさせ、2つの抗原結合部位を作り出した、二価の抗体である。(例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)および Poljak R.J. et al., Structure 2:1121-1123(1994)を参照されたい)。いくつかの場合において、本明細書の抗体に由来する1つまたは複数のCDRを、共有結合的にまたは非共有結合的に、ある分子中に組み入れて、CCR2に特異的に結合するイムノアドヘシンにそれを変えてもよい。このような場合において、CDRは、より大型のポリペプチド鎖の一部分として組み入れてもよく、別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結してもよく、または非共有結合的に組み入れてもよい。1つまたは複数の結合部位を有する場合において、これらの結合部位は、互いに同一でもよく、または異ってもよい。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、可変ドメイン配列および定常ドメイン配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。この用語は、ヒト遺伝子に由来するが、例えば、起こり得る免疫原性を減少させる、親和性を高める、望ましくないフォールディングを引き起こす可能性があるシステインを排除する等のために、変更された配列を有する抗体を包含する。この用語は、ヒト細胞では典型的ではないグリコシル化を与え得る、非ヒト細胞において組換えによって作製されたような抗体を包含する。これらの抗体は、本明細書において説明するように、様々な方法で調製することができる。
【００２９】
本明細書において使用される「キメラ抗体」という用語は、2種またはそれ以上の異なる抗体に由来する領域を含む抗体を意味する。1つの場合において、キメラ抗体の1つまたは複数のCDRは、ヒト抗CCR2抗体に由来する。別の場合において、CDRはすべて、ヒト抗CCR2抗体に由来する。別の場合において、複数種のヒト抗CCR2抗体に由来するCDRが、キメラ抗体中で組み合わされる。例えば、キメラ抗体は、第1のヒト抗CCR2抗体の軽鎖に由来するCDR1、第2のヒト抗CCR2抗体の軽鎖に由来するCDR2、および第3のヒト抗CCR2抗体の軽鎖に由来するCDR3を含んでよく、かつ、重鎖に由来するCDRは、1種または複数種の他の抗CCR2抗体に由来してよい。さらに、フレームワーク領域は、1つもしくは複数のCDRの由来元である抗CCR2抗体の内の1つ、または1種もしくは複数種の異なるヒト抗体に由来してよい。
【００３０】
いくつかの場合において、キメラ抗体は、ヒト化抗CCR2抗体である。ヒト化抗CCR2抗体は、1つもしくは複数のヒト抗CCR2抗体の、1つもしくは複数のフレーム領域のアミノ酸配列および/または定常領域の少なくとも一部分に由来するアミノ酸配列、ならびに非ヒト抗CCR2抗体に由来するCDRを含む。
【００３１】
当業者は、本明細書の教示に従って、抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体を容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界の近くに存在する。
【００３２】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書において使用される場合、例えばBIACORE(商標)システム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, SwedenおよびPiscataway, N.J.)を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイムで生体分子特異的な相互作用を解析することを可能にする、光学的現象を意味する。さらに詳しい説明については、Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51 :19-26(1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11 :620-627(1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8:125-131(1995);およびJohnsson B. et al., Anal. Biochem. 198:268-277(1991)を参照されたい。
【００３３】
「KD」という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。解離定数が1mM以下、100nM以下、または10nM以下である場合、抗体は抗原に特異的に結合するとされる。特定の場合において、KDは、1pM〜500pMである。他の場合において、KDは、500pM〜1μMの間、1μM〜100nMの間、または100mM〜10nMの間である。
【００３４】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはT細胞受容体に特異的に結合することができるか、または別の方法である分子と相互作用することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は、一般に、アミノ酸または炭水化物もしくは糖の側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、かつ一般に、特殊な三次元構造特性、ならびに特殊な電荷特性を有する。エピトープは、「直鎖状」または「立体構造的」でよい。直鎖状エピトープにおいて、タンパク質と(抗体のような)相互作用する分子との相互作用が起こる箇所はすべて、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体構造的エピトープにおいて、相互作用が起こる箇所は、互いに離れている、タンパク質上のアミノ酸残基にまたがって存在する。抗原上の所望のエピトープが一旦決定されたら、例えば本明細書において説明する技術を用いて、そのエピトープに対する抗体を作製することができる。あるいは、発見する過程において、抗体の作製および特徴付けにより、望ましいエピトープに関する情報が解明される場合もある。その場合、この情報から、同じエピトープへの結合に関して抗体を競合的にスクリーニングすることができる。これを実現するためのアプローチは、CCR2への結合について互いに競合または交差競合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を発見するために競合研究および交差競合研究を実施することである。交差競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットなプロセスは、国際特許出願WO 03/48731に記載されている。
【００３５】
本明細書において使用される場合、20種の通常のアミノ酸およびそれらの略語は、従来の用法に従う。参照により本明細書に組み入れられるImmunology - A Synthesis(第2版、E.S. GolubおよびD.R.Gren編、Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))を参照されたい。
【００３６】
本明細書において言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも10塩基である、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドいずれかのヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型のポリマー型を意味する。この用語は、一本鎖型および二本鎖型を含む。
【００３７】
本明細書において使用される「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム起源、cDNA起源、もしくは合成起源のポリヌクレオチド、またはその何らかの組合せを意味し、この起源のおかげで、この「単離されたポリヌクレオチド」は、(1)天然には「単離されたポリヌクレオチド」と共に存在するポリヌクレオチドの全部もしくは一部分と結合していないか、(2)天然には結合していないポリヌクレオチドに機能的に連結されているか、または(3)より大型の配列の一部分として、天然には存在しない。
【００３８】
本明細書において使用される「天然のヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書において使用される「修飾されたヌクレオチド」という用語は、修飾された糖基または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書において言及される「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート(phoshoraniladate)、およびホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、開示内容が参照により本明細書に組み入れられるLaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081(1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein編、Oxford University Press, Oxford England(1991));米国特許第5,151,510号; UhlmannおよびPeyman, Chemical Reviews 90:543(1990)を参照されたい。所望の場合は、オリゴヌクレオチドは、検出用の標識を含んでよい。
【００３９】
「機能的に連結された」配列には、対象となる遺伝子に隣接している発現制御配列、およびトランスの位置または対象となる遺伝子を制御する距離で作用する発現制御配列の両方が含まれる。本明細書において使用される「発現制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現およびプロセッシングを実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列;スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなど効率的なRNAプロセッシングシグナル;細胞質内mRNAを安定させる配列;翻訳効率を高める配列(すなわちコザックコンセンサス配列);タンパク質の安定性を高める配列;ならびに、所望の場合には、タンパク質分泌を亢進させる配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセッシングに不可欠であるすべての構成要素を少なくとも含むことが意図され、かつ、その存在が有利である付加的な構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。
【００４０】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。いくつかの場合において、ベクターは、プラスミド、すなわち、付加的なDNAセグメントを連結することができる、環状二本鎖DNA片である。いくつかの場合において、ベクターは、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結することができるウイルスベクターである。いくつかの場合において、ベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製をすることができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物用エピソームベクター)。他の場合において、ベクター(例えば、哺乳動物用非エピソームベクター)は、宿主細胞中に導入された際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれることができ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ばれる。
【００４１】
「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という用語は、本明細書において使用される場合、組換え発現ベクターが導入される細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫も意味することを理解すべきである。いくつかの改変が、変異または環境の影響のいずれかの理由から、後続の世代において生じる場合があるため、このような子孫は、実際は、親細胞と同一でない場合があるが、それでもなお、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００４２】
ヌクレオチド配列に関する「配列同一性パーセント」という用語は、最大限一致するように位置合わせした場合に同じである、2つの配列中の残基を意味する。ヌクレオチドの配列同一性を測定するために使用することができる、当技術分野において公知であるいくつかの様々なアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, Wisconsin中のプログラムである、FASTA、Gap、またはBestfitを用いて比較することができる。例えば、プログラムFASTA2およびFASTA3を含むFASTAは、クエリ配列とサーチ配列が最も良く重複する領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する(参照により本明細書に組み入れられるPearson, Methods Enzymol. 183:63-98(1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219(2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258(1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84(1998))。別段の指定が無い限り、個々のプログラムまたはアルゴリズムに対する初期設定パラメーターを使用する。例えば、ヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み入れられる、初期設定パラメーター(ワードサイズ6およびスコアリングマトリックスに対するNOPAM因子)を用いたFASTAによって、またはGCGバージョン6.1において提供される初期設定パラメーターを用いたGapによって、決定することができる。
【００４３】
ヌクレオチド配列への言及は、別段の指定が無い限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補的配列を有する相補鎖も包含すると理解されるべきである。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「配列同一性パーセント」および「配列相同性パーセント」という用語は同義的に使用される。
【００４５】
「実質的な類似性」または「実質的な配列類似性」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチド挿入物または欠失物を別の核酸(もしくはその相補鎖)と最適に整列させた場合に、前述したようなFASTA、BLAST、またはGapなど任意の周知の配列同一性アルゴリズムによって測定すると、少なくとも約85％、少なくとも約90％、および少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列が同一であることを意味する。
【００４６】
ポリペプチドに対して使用される場合、「実質的な同一性」という用語は、2つのペプチド配列が、プログラムと共に提供される初期設定のギャップウェイトを用いたGAPプログラムまたはBESTFITプログラムなどによって最適に整列させた場合に、少なくとも70％、75％、または80％の配列同一性、少なくとも90％または95％の配列同一性、および少なくとも97％、98％、または99％の配列同一性を有することを意味する。特定の場合において、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学特性(例えば電荷または疎水性)が同様である側鎖R基を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変えないと考えられる。2つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントが上昇するように調整して、置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行うための手段は、当業者には周知である。例えば、Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31(1994)を参照されたい。化学特性が同様である側鎖を有するアミノ酸のグループの例には、1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン;2)脂肪族-ヒドロキシル側鎖:セリンおよびトレオニン;3)アミドを含む側鎖:アスパラギンおよびグルタミン;4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン;5)塩基性側鎖:リシン、アルギニン、およびヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパラギン酸およびグルタミン酸;ならびに7)硫黄を含む側鎖:システインおよびメチオニン、が含まれる。保存的アミノ酸置換のグループは、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタマート-アスパルタート、およびアスパラギン-グルタミンである。
【００４７】
あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み入れられるGonnet et al., Science 256:1443-45(1992)において開示されているPAM250の対数尤度の行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換とは、PAM250の対数尤度の行列において負でない値を有する任意の変化である。
【００４８】
ポリペプチドの配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、および他の改変に割り当てられた類似性の指標を用いて、配列を照合する。例えば、GCGは、「Gap」および「Bestfit」などのプログラムを含み、これらのプログラムによって指定されている初期設定のパラメーターを用いて使用して、異なる生物種に由来する相同ポリペプチドのような近縁のポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の、配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、GCGバージョン6.1(University of Wisconsin, WI)を参照されたい。ポリペプチド配列は、初期設定または推奨のパラメーターを用いてFASTAを使用して比較することもできる。GCGバージョン6.1を参照されたい。FASTA(例えば、FASTA2およびFASTA3)は、クエリ配列とサーチ配列が最も良く重なる領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する(Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98(1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219(2000))。ある配列を様々な生物に由来する多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、プログラムと共に供給される初期設定パラメーターを使用する、コンピュータプログラムBLAST、特にblastpまたはtblastnである。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402(1997)を参照されたい。
【００４９】
CCR2は、7回膜貫通ドメインタンパク質であり、したがって、6つのループを有する。細胞外のN末端から数えて、ループ1、ループ3、およびループ5は細胞内ループであるのに対し、ループ2、ループ4、およびループ6は細胞外である。CCR2の第1、第2、および第3の細胞外ループは、それぞれ、ループ2、ループ4、およびループ6を指す。
【００５０】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む(comprise)」という単語、または「comprises」もしくは「comprising」などの変形は、記載した整数もしくは整数のグループを包含するが、いかなる他の整数も整数のグループも除外しないことを意味するものと理解される。
【００５１】
ヒト抗CCR2抗体およびその特徴付け
いくつかの場合において、ヒト抗CCR2抗体が提供される。いくつかの場合において、ヒト抗CCR2抗体は、ゲノムがヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物、例えば、げっ歯動物を免疫して、その結果、そのトランスジェニック動物にヒト抗体を産生させることによって作製される。いくつかの場合において、抗CCR2抗体および抗原結合部分には、(i)CCR2の第1の細胞外ループもしくは第2の細胞外ループ、または両方に結合し;(ii)CCR2のN末端もしくは第3の細胞外ループに結合しないか、またはどちらにも結合しないか;または(iii)(i)および(ii)の両方を満たす、抗体または抗原結合部分が含まれるが、それらに限定されるわけではない。別の場合において、SEQ ID NO: 128またはSEQ ID NO: 129のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合するヒト抗CCR2抗体が提供される。別の場合において、ヒト抗CCR2抗体は、SEQ ID NO: 128またはSEQ ID NO: 129に80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。別の場合において、抗CCR2抗体および抗原結合部分には、CCR2の第3の細胞外ループに結合する抗体または抗原結合部分が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５２】
VH遺伝子、Vκ遺伝子、Vλ遺伝子は、配列相同性に基づいてファミリーに分類されている。2つのVH遺伝子、Vκ遺伝子、またはVλ遺伝子は、80％を超える位置で同じヌクレオチド配列を有している場合、同じファミリーに属する。抗CCR2抗体は、ヒトκ軽鎖(Vκ)もしくはヒトλ軽鎖(Vλ)またはそれらに由来するアミノ酸配列を含み得る。λ軽鎖を含むいくつかの場合において、軽鎖可変ドメイン(VL)は、ヒトVλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ4、Vλ5、Vλ6、Vλ7、Vλ8、Vλ9、またはVλ10ファミリー遺伝子を使用する(Williams S.C. et al. J. Mol. Bio. 264:220-232 (1996))。
【００５３】
κ軽鎖を含むいくつかの場合において、軽鎖可変ドメイン(VL)は、ヒトVκI、VκII、VκIII、VκIV、VκV、またはVκVIファミリー遺伝子(Cox J. P. L., et al., Eur. J. Immunol 24:827-836 (1994))、好ましくはVκI、VκII、VκIV、またはVκVIファミリー遺伝子、好ましくはVκIまたはVκVIファミリー遺伝子を使用する。いくつかの場合において、軽鎖生殖系列配列は、非限定的に
0005685535.tif 000002
を含むヒトVκ配列より選択される。特定の場合において、この軽鎖ヒト生殖系列遺伝子は、
0005685535.tif 000003
より選択される。特定の場合において、軽鎖は、ヒトVκI O12、VκII A1、VκIV B3、またはVκVI A26生殖系列遺伝子を使用する。
【００５４】
抗CCR2抗体は、ヒトVH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、またはVH7ファミリー遺伝子を使用する重鎖可変ドメイン(VH)を含み得る。特定の例において、この重鎖ヒト生殖系列遺伝子は、
0005685535.tif 000004
より選択される。特定の場合において、重鎖は、ヒトVHI 1-46またはVH III 3-30遺伝子を使用する。
【００５５】
特定の場合において、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域は、フレームワーク領域またはフレームワーク領域の少なくとも一部分(例えば、FR2およびFR3など2つまたは3つの小領域を含む)を含む。特定の場合において、少なくともFRL1、FRL2、FRL3、またはFRL4は、完全にヒト型である。他の例において、少なくともFRH1、FRH2、FRH3、またはFRH4は、完全にヒト型である。いくつかの場合において、少なくともFRL1、FRL2、FRL3、またはFRL4は、生殖系列配列(例えばヒト生殖系列)であるか、または、特定のフレームワークに対するヒトコンセンサス配列(本明細書において説明する公知のヒトIg配列の供給元から容易に入手可能)を含む。他の例において、少なくともFRH1、FRH2、FRH3、またはFRH4は、生殖系列配列(例えばヒト生殖系列)であるか、または、特定のフレームワークに対するヒトコンセンサス配列を含む。
【００５６】
いくつかの場合において、CCR2抗体のVLは、ヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列と比べて、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入を含む。いくつかの場合において、抗CCR2抗体のVLは、生殖系列アミノ酸配列と比べて、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のアミノ酸置換を含む。いくつかの場合において、これらの置換、欠失、および/または挿入の内の1つまたは複数は、軽鎖のCDR中に存在する。いくつかの場合において、生殖系列に対するアミノ酸置換、欠失、および/または挿入は、抗体4.40、4.9、4.22、4.39、または4.40 A68G S230Pの任意の1つまたは複数のVLにおける、生殖系列と比べての置換、欠失、および/または挿入と同じ1つまたは複数の位置に存在する。例えば、抗CCR2抗体のVLは、抗体4.40のVL中に存在する、生殖系列と比べて1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入を含み得る。いくつかの場合において、アミノ酸変化は、1つまたは複数の同じ位置にあるが、生殖系列と比べて異なる置換、欠失、および/または挿入を伴う。いくつかの場合において、置換は、そのような位置における、参照抗体中のアミノ酸と比べて保存的なアミノ酸置換に相当してよい。例えば、これらの抗体のうち1種中の特定の位置が生殖系列と比べて置換されており、かつそれがグルタミン酸である場合には、その位置をアスパラギン酸で置換することができる。同様に、生殖系列と比較してのアミノ酸置換がセリンである場合、その位置のセリンをトレオニンで保存的に置換することができる。
【００５７】
いくつかの場合において、ヒト抗CCR2抗体の軽鎖は、抗体4.40の可変ドメイン(VL)アミノ酸配列(SEQ ID NO: 101);4.9の可変ドメイン(VL)アミノ酸配列(SEQ ID NO: 29);4.22の可変ドメイン(VL)アミノ酸配列(SEQ ID NO: 65);4.39の可変ドメイン(VL)アミノ酸配列(SEQ ID NO: 194);もしくは4.40 A68G S230Pの可変ドメイン(VL)アミノ酸配列(SEQ ID NO: 113);または1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個までの保存的アミノ酸置換および/または合計3個までの非保存的アミノ酸置換を有する該アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、軽鎖は、抗体4.40、4.9、4.22、4.39、もしくは4.40 A68G S230Pの軽鎖それぞれの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3より独立に選択されるCDR1、CDR2、およびCDR3、または4個未満もしくは3個未満の保存的アミノ酸置換および/もしくは合計3個もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換をそれぞれ有するCDRを含み得る。いくつかの場合において、抗CCR2抗体の軽鎖は、モノクローナル抗体4.40の(SEQ ID NO: 100);4.9の(SEQ ID NO: 28);4.22の(SEQ ID NO: 64);4.39の(SEQ ID NO: 193);または4.40 A68G S230Pの(SEQ ID NO: 112)、軽鎖CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域よりそれぞれ独立に選択される軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。特定の場合において、抗CCR2抗体の軽鎖は、4.40(SEQ ID NO: 101);4.9(SEQ ID NO: 29);4.22(SEQ ID NO: 65);4.39(SEQ ID NO: 194);もしくは4.40 A68G S230P(SEQ ID NO: 113)より選択される抗体のVL領域のアミノ酸配列を含む、抗体の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3;または4個未満もしくは3個未満の保存的アミノ酸置換および/もしくは合計3個もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換をそれぞれ有する該CDRを含む。いくつかの抗体のCDRに関する配列識別子を表8に列挙する。
【００５８】
重鎖に関しては、いくつかの場合において、可変ドメイン(VH)は、ヒトVH 3-30遺伝子配列またはヒトVH 1-46遺伝子配列を使用する。いくつかの場合において、抗CCR2抗体のVH配列は、生殖系列アミノ酸配列と比べて、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入(付加)を含む。いくつかの場合において、重鎖の可変ドメインは、生殖系列アミノ酸配列からの1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、または17個の置換、欠失、および/または挿入を含む。いくつかの場合において、置換は、生殖系列アミノ酸配列と比較しての非保存的置換である。いくつかの場合において、置換、欠失、および/または挿入は、重鎖のCDR中に存在する。いくつかの場合において、アミノ酸置換、欠失、および/または挿入は、抗体4.40、4.22、4.39、または4.9の任意の1つまたは複数のVHにおける、生殖系列からの変異と同じ1つまたは複数の位置で行われる。他の場合において、アミノ酸置換、欠失、および/または挿入は、1つまたは複数の同じ位置にあるが、参照抗体中のものとは異なる置換、欠失、および/または挿入を伴う。いくつかの場合において、抗体は、SEQ ID NO: 202またはSEQ ID NO: 203のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む。
【００５９】
いくつかの場合において、重鎖は、抗体4.40のVHアミノ酸配列(SEQ ID NO: 83);4.22のVHアミノ酸配列(SEQ ID NO: 47);4.9のVHアミノ酸配列(SEQ ID NO: 11);4.39のVHアミノ酸配列(SEQ ID NO: 176);または1個、2個、3個、4個、6個、8個、もしくは10個までの保存的アミノ酸置換および/または合計3個までの非保存的アミノ酸置換を有する該VHアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、重鎖は、前述の抗体のいずれか1つのCDR1の始端からCDR3の末端までのアミノ酸配列を含む。
【００６０】
いくつかの場合において、重鎖は、抗体4.40、4.22、4.39、もしくは4.9の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3;または8個未満、6個未満、4個未満、もしくは3個未満の保存的アミノ酸置換および/もしくは合計3個もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換をそれぞれ有する該CDRを含む。
【００６１】
いくつかの態様において、重鎖CDRは、抗体4.40、抗体4.22、抗体4.39、または抗体4.9のCDRより独立に選択される。別の場合において、重鎖は、4.40(SEQ ID NO: 83);4.22(SEQ ID NO: 47);4.39(SEQ ID NO: 176)、または4.9(SEQ ID NO: 11)より選択される2つまたはそれ以上のVH領域より独立に選択されるCDRを含む。別の場合において、抗体は、上記に開示される軽鎖および上記に開示される重鎖を含む。別の場合において、軽鎖CDRおよび重鎖CDRは、同じ抗体に由来する。
【００６２】
実施され得るアミノ酸置換の1つのタイプは、化学的に反応性であり得る、抗体中の1つもしくは複数のシステインを、非限定的にアラニンまたはセリンなどの別の残基に変更するものである。1つの場合において、非カノニカルなシステインの置換が行われる。この置換は、可変ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域中、または抗体の定常ドメイン中で行うことができる。いくつかの場合において、システインはカノニカルである。
【００６３】
実施され得る別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の任意の潜在的なタンパク質分解部位を変更するものである。このような部位は、可変ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域中、または抗体の定常ドメイン中に存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去により、抗体生成物中の任意の異質性リスクを低減し、したがってその均質性を高めることができる。別のタイプのアミノ酸置換は、潜在的なアミド分解部位を形成するアスパラギン-グリシンの対を、これらの残基の一方または両方を改変することによって除去するものである。いくつかの場合において、アミノ酸置換は、グリコシル化部位を挿入または除去するために使用される。いくつかの場合において、抗CCR2抗体の重鎖のC末端リジンは、タンパク分解性でよく、または遺伝学的に除去されてよい。様々な場合において、抗CCR2抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を任意で含んでよい。
【００６４】
1つの局面において、これらの抗体はハイブリドーマによって産生される。
【００６５】
表1では、例示的な抗体の、重鎖および軽鎖の完全長および可変ドメインを含む一部分をコードする核酸ならびに対応する推測されたアミノ酸配列の配列識別子(SEQ ID NO)を列挙している。
【００６６】
（表１）ヒト抗CCR2抗体
0005685535.tif 000005
【００６７】
また、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、前述のヒト抗CCR2抗体のいくつかの重鎖変異体および/または軽鎖変異体も提供する。変異体に名前を付ける場合、1番目の文字は、天然の抗体鎖のアミノ酸を表す1文字の記号であり、番号は、アミノ酸の位置を指し(1位は、N末端アミノ酸である)、かつ2番目の文字は、変異アミノ酸を表す1文字の記号である。いくつかの場合において、重鎖変異体が提供される。1つのこのような重鎖変異体は、半分の単量体の形成を低減させるためのヒンジ領域安定化変異である(Angal, S. et al. Molecular Immunology 30:105-108 (1993))。4.40抗体重鎖変異体の1つのこのようなヒンジ安定化変異では、SEQ ID NO: 82の230位のセリンがプロリンで置換されている。S230P変異体をコードするDNA配列は、SEQ ID NO: 115の688位から始まるCCAコドンを有する。
【００６８】
また、モノクローナル抗体4.40の変異軽鎖も提供される。A68Gは、SEQ ID NO: 113によって表される4.40軽鎖変異体であり、残基68がグリシン残基である。DNA配列において、A68G 4.40変異体はSEQ ID NO: 109にコードされており、その中の252位から始まるコドンはGGGである。
【００６９】
他の場合において、アミノ酸変異体の組合せを含む抗体を作製することができる。変異体の組合せの例は、4.40抗体において軽鎖置換A68Gおよび重鎖置換S230Pを含む、抗CCR2抗体4.40 A68G S230Pである。4.40の変異重鎖および変異軽鎖のその他の組合せも含まれる。
【００７０】
1つの場合において、抗CCR2抗体は、4.40、4.22、4.39、4.40 A68G S230P、または4.9である。さらに別の場合において、前述のヒト抗CCR2抗体のいずれかの可変ドメインアミノ酸配列に対する配列同一性が80％超、85％超、90％超、95％超、96％超、97％超、98％超、または99％超である可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体が含まれる。
【００７１】
抗CCR2抗体のクラスおよびサブクラス
抗CCR2抗体のクラスおよびサブクラスは、当技術分野において公知である任意の方法によって決定することができる。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、特定のクラスおよびサブクラスの抗体に対して特異的である抗体を用いて決定することができる。このような抗体は、市販されている。クラスおよびサブクラスは、ELISA、またはウェスタンブロット、ならびに他の技術によって決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および/または軽鎖の定常ドメインの全体または一部分を配列決定し、それらのアミノ酸配列を、様々なクラスおよびサブクラスの免疫グロブリンの公知のアミノ酸配列と比較し、かつそれらの抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって、決定することができる。
【００７２】
いくつかの場合において、抗CCR2抗体はモノクローナル抗体である。抗CCR2抗体は、IgG分子、IgM分子、IgE分子、IgA分子、またはIgD分子でよい。1つの場合において、抗CCR2抗体は、例えばサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4に属するIgGである。別の場合において、抗CCR2抗体はIgG4である。さらに別の場合において、抗体は、IgG4イソアロタイプである(Ellison J.およびHood L., PNAS 79:1984-1988 (1982);ならびにBrusco A. et al., Eur J. ImmunogenticsI 25:349-355 (1998))。
【００７３】
CCR2への抗CCR2抗体の結合親和性
いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、高い親和力でCCR2に結合する。
【００７４】
いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、CCR2の第1の細胞外ループ、CCR2の第2の細胞外ループ、または第1の細胞外ループおよび第2の細胞外ループの両方によって形成されるエピトープに、高い親和力で結合する。
【００７５】
関連する場合において、抗CCR2抗体は、SEQ ID NO: 128またはSEQ ID NO: 129に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する。
【００７６】
いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、CCR2の第3の細胞外ループにも、CCR2のN末端ドメインにも、結合しない。
【００７７】
別の場合において、抗CCR2抗体は、SEQ ID NO: 127またはSEQ ID NO: 130に示す配列からなるペプチドに結合しない。別の場合において、抗CCR2抗体は、CCR2の第1の細胞外ループおよび/または第2の細胞外ループに、約2×10-7Mもしくはそれ以下のKD、約2×10-8Mもしくはそれ以下のKD、約2×10-9Mもしくはそれ以下のKD、約1×10-9Mもしくはそれ以下のKD、約9×10-10Mもしくはそれ以下のKD、約8×10-10Mもしくはそれ以下のKD、約7×10-10Mもしくはそれ以下のKD、約6×10-10Mもしくはそれ以下のKD、5×10-10Mもしくはそれ以下のKD、約4×10-10Mもしくはそれ以下のKD、約3×10-10Mもしくはそれ以下のKD、または約2×10-10Mもしくはそれ以下のKDで結合する。特定の場合において、抗体は、CCR2またはCCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループに、4.40、4.9、4.22、4.39、または4.40 A68G S230Pより選択される抗体と実質的に同じKDで結合する。さらに別の場合において、抗体は、CCR2またはCCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループに、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 176、またはSEQ ID NO: 47に示すVH領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む抗体と実質的に同じKDで結合する。さらに別の場合において、抗体は、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 194、もしくはSEQ ID NO: 65に示すVL領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインのCDRを含むか、または、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 176、もしくはSEQ ID NO: 47に示すVH領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインのCDRを含む抗体と実質的に同じKDでCCR2に結合する。
【００７８】
いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、小さい解離速度定数(koff)を有してよい。いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、CCR2またはより好ましくはCCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループに、1.0×10-3s-1もしくはそれ以下のkoff、5.0×10-4s-1もしくはそれ以下のkoff、または2×10-4s-1もしくはそれ以下のkoffで結合し得る。いくつかの場合において、koffは、4.40、4.9、4.22、4.39、および4.40 A68G S230Pより選択される抗体を含む、本明細書において説明する抗体と実質的に同じでよい。いくつかの場合において、抗体は、CCR2またはCCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループに、4.40、4.9、および4.40 A68G S230Pより選択される抗体に由来する重鎖のCDRまたは軽鎖のCDRを含む抗体と実質的に同じkoffで結合し得る。いくつかの場合において、抗体は、CCR2またはCCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループに、(i)SEQ ID NO: 83もしくはSEQ ID NO: 11に示すVH領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、(ii)SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 29に示すVL領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、または(iii)(i)および(ii)の両方を含む抗体と実質的に同じkoffで結合し得る。さらに別の場合において、抗体は、CCR2またはCCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループに、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、またはSEQ ID NO: 29に示すVL領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインのCDR;およびSEQ ID NO: 83またはSEQ ID NO: 11に示すVH領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインのCDRを含む抗体と実質的に同じkoffで結合し得る。
【００７９】
CCR2に対する抗CCR2抗体の結合親和性および解離速度は、当技術分野において公知の方法によって決定することができる。結合親和性は、ELISA、RIA、フローサイトメトリー、BIACORE(商標)のような表面プラズモン共鳴を用いて測定することができる。解離速度は、表面プラズモン共鳴を用いて測定することができる。ある抗体が抗CCR2抗体と実質的に同じKDを有するかどうかは、当技術分野において公知である方法を用いることにより、判定することができる。実施例5では、抗CCR2モノクローナル抗体の親和性定数を決定するための方法を例示する。
【００８０】
抗CCR2抗体によって認識されるCCR2エピトープの同定
CCR2に結合し、かつ次の抗体と競合もしくは交差競合し得るか、かつ/または次の抗体と同じエピトープに結合する、ヒト抗CCR2モノクローナル抗体が提供される:(a)4.40、4.9、4.22、4.39、および4.40 A68G S230Pより選択される抗体;(b)SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 176、もしくはSEQ ID NO: 47に示す可変ドメインのアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む抗体、(c)SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 194、もしくはSEQ ID NO: 65に示す可変ドメインのアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体、または(d)(b)において定義される重鎖可変ドメインと(c)において定義される軽鎖可変ドメインの両方を含む抗体。2つの抗体が、CCR2への結合について互いに相反的に競合する場合、それらは交差競合すると言われる。
【００８１】
ある抗体が、本明細書において提供される抗CCR2抗体と、同じエピトープに結合するか、または結合について競合もしくは交差競合するかどうかは、当技術分野において公知の方法を用いることにより、判定することができる。1つの場合において、本明細書において提供される抗CCR2抗体を飽和条件下でCCR2に結合させ、次いで、試験抗体がCCR2に結合する能力を測定する。試験抗体が、提供される抗CCR2抗体と同時にCCR2に結合することができる場合、その試験抗体は、抗CCR2抗体と異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が、同時にCCR2に結合することができない場合、その試験抗体は、同じエピトープ、重複部分があるエピトープ、または本明細書において提供されるヒト抗CCR2抗体が結合するエピトープの極めて近くにあるエピトープに結合する。試験抗体が参照抗体と交差競合するかどうか判定するために、これらの抗体を逆転させて実験を実施する。すなわち、試験抗体をCCR2に結合させ、次いで、本明細書において提供される抗CCR2抗体がCCR2に結合する能力を測定する。これらの実験は、ELISA、RIA、BIACORE(商標)、またはフローサイトメトリー(FACS)を用いて実施することができる。
【００８２】
抗CCR2抗体によるCCR2活性の阻害
いくつかの場合において、CCR2を介したシグナル伝達を阻害する抗CCR2抗体が提供される。他の場合において、MCP-1、MCP-2、MCP-3、および/またはMCP-4に媒介されるCCR2を介したシグナル伝達を阻害する抗CCR2抗体が提供される。他の場合において、MCP-1、MCP-2、MCP-3、および/またはMCP-4のCCR2への結合を阻害する抗CCR2抗体が提供される。1つの場合において、CCR2はヒトCCR2である。いくつかの場合において、CCR2は、ヒトCCR2A、ヒトCCR2B、または両方である。さらに別の場合において、抗CCR2抗体はヒト抗体である。
【００８３】
抗CCR2抗体のIC50は、ELISA、RIA、または関連するアッセイ法などのリガンド結合アッセイ法、およびCCR2発現細胞の走化性アッセイ法のような細胞ベースのアッセイ法において測定することができる。様々な場合において、抗体またはその抗原結合部分は、ELISAアッセイ法によって測定したところ、5μg/ml以下、1μg/ml以下、0.5μg/ml以下、または0.20μg/ml以下のIC50で、MCP-1とCCR2の間のリガンド結合を阻害する。
【００８４】
別の場合において、MCP-1(CCL2)、MCP-2、MCP-3、および/またはMCP-4などのCCR2リガンドの存在下でCCR2活性化を低減させる抗CCR2抗体が提供される。1つの場合において、抗CCR2抗体は、CCR2リガンドによって誘導される(i)Gタンパク質活性化、(ii)アデニル酸シクラーゼ活性化、(iii)マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)活性化、(iv)細胞質ゾルカルシウム動員、(v)ERKリン酸化、(vi)走化性、または(vii)アクチン重合を阻害し得る。抗CCR2抗体がMCP-1の存在下でCCR2の活性化を防止、阻害、または低減し得るかどうかは、放射性標識GTPで標識された細胞においてGタンパク質のGTP/GDP比を決定することによって、GTPgS取込みを測定することによって、カルシウム発色団を用いて細胞質ゾルカルシウム流入を測定することによって、または細胞中のMAPKのリン酸化状態を測定することによって、判定することができる。CCR2活性化および/またはCCR2へのMCP-1結合を検出するためのアッセイ法は、例えば、Gabrilin et al., Biochem Biophys Res Commun. 327(2): 533-40 (2005)およびJimenez-Sainz et al., Mol Pharmacol. 64(3):773-82 (2003)において説明されている。
【００８５】
1つの場合において、CCR2活性化のレベルは、走化性アッセイ法を用いて判定されるであろう。いくつかの場合において、IC50は、走化性アッセイ法を用いて測定したところ、5μg/ml以下、1μg/ml以下、0.5μg/ml以下、または0.20μg/ml以下である。実施例10では、カルシウム動員をモニターすることにより、抗CCR2抗体によるCCR2阻害を測定する、1つのタイプのアッセイ法を例示する。
【００８６】
別の局面において、細胞を抗体と接触させることにより、その抗体とのインキュベーション後の細胞表面CCR2発現が下方調節される場合がある。いくつかの場合において、インキュベーションは、短期間(例えば4時間)または長期間(例えば24時間)でよい。細胞表面CCR2発現の下方調節は、ウェスタンブロット法、ELISA、またはFACS解析を用いて測定することができる。特定の場合において、細胞を抗体と接触させることにより、ウェスタンブロット法またはELISAによって測定される細胞表面CCR2発現が、少なくとも6％減少、少なくとも10％減少、少なくとも20％減少、少なくとも30％減少、または少なくとも50％減少する場合がある。
【００８７】
別の局面において、抗体は、MCP-1によって誘導されるpERKリン酸化を低減させる。MCP-1によって誘導されるpERKリン酸化の下方調節は、ウェスタンブロット法、ELISA、またはFACS解析を用いて測定することができる。特定の場合において、抗体は、FACS解析によって測定されるMCP-1によって誘導されるpERKリン酸化の少なくとも6％の減少、少なくとも10％の減少、少なくとも20％の減少、少なくとも30％の減少、または少なくとも50％の減少をもたらす。
【００８８】
抗CCR2抗体によるインビボでの走化性の阻害
いくつかの場合によれば、インビボで免疫細胞の走化性を阻害する抗CCR2抗体が提供される。走化性が阻害される免疫細胞には、末梢血単核細胞、THP細胞、単球、記憶Tリンパ球、樹状細胞、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、および養子移入されたCCR2+細胞が含まれる。1つの場合において、抗CCR2抗体は、MCP-1、MCP-2、MCP-3、およびMCP-4の内の1つまたは複数に応答した免疫細胞走化性を阻害する。1つの場合において、ケモカインはMCP-1である。さらに別の場合において、ケモカインはMCP-3である。抗CCR2抗体は、炎症部位または損傷部位への走化性を阻害し得る。
【００８９】
いくつかの場合によれば、線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)(Garcia-Vicuna et al., Arthritis Rheum. 50(12):3866-77 (2004)を参照されたい)、成熟神経幹細胞(Widera et al., Eur J Cell Biol. 83(8):381-7 (2004)を参照されたい)、およびヒト胎児星状細胞(Andjelkovic et al., J Neurosci Res. 70(2):219-31 (2002)を参照されたい)を非限定的に含む非免疫細胞の走化性を阻害する抗CCR2抗体もまた、提供される。
【００９０】
1つの場合において、抗体は、未処置動物における細胞の走化性と比べて、細胞走化性を阻害する。別の場合において、抗CCR2抗体は、少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％、走化性を低減させる。1つの場合において、走化性の阻害は、抗体による処置を動物に始めてから少なくとも1時間目に測定される。別の場合において、走化性の阻害は、抗体による処置を動物に始めてから少なくとも7日目に測定される。別の場合において、抗CCR2抗体は、少なくとも10％〜100％の走化性阻害をもたらす。
【００９１】
種選択性および分子選択性
別の局面において、抗CCR2抗体は、種選択性および分子選択性の両方を示す。いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、ヒトCCR2およびカニクイザルCCR2に結合する。抗CCR2抗体は、その他の非ヒト霊長類種CCR2にも結合し得る。いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、マウスCCR2にもラットCCR2も結合しない。本明細書の教示に従うことにより、当技術分野において周知の方法を用いて抗CCR2抗体に対する種選択性を決定することができる。例えば、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法、またはRIAを用いて、種選択性を決定することができる。1つの場合において、フローサイトメトリーを用いて、種選択性を決定することができる。別の場合において、種特異性は、その種に由来する細胞を用いて、MCP-1の機能的な応答を抗体が阻害する能力を評価することによって、決定することができる。これには、走化性、アクチン重合、カルシウム動員などが含まれ得る。
【００９２】
別の場合において、抗CCR2抗体は、SEQ ID NO: 131に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒトCCR5)に対する選択性に勝る、SEQ ID NO: 126に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒトCCR2B)に対する選択性を有する。別の場合において、抗CCR2抗体は、CCR5に対する選択性に少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍勝る、CCR2に対する選択性を有する。別の場合において、ヒト抗CCR2抗体は、SEQ ID NO: 126に80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【００９３】
別の場合において、抗CCR2抗体は、SEQ ID NO: 131に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒトCCR5)に対する選択性に少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍勝る、SEQ ID NO: 125に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒトCCR2A)に対する選択性を有し得る。別の場合において、ヒト抗CCR2抗体は、SEQ ID NO: 125に80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【００９４】
本明細書の教示に従い、当技術分野において周知の方法を用いて、CCR2に対する抗CCR2抗体の選択性を決定することができる。例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法、もしくはRIA、および/または走化性、カルシウム動員、もしくはアクチン重合などの機能アッセイ法を用いて、選択性を決定することができる。
【００９５】
抗体および抗体産生細胞株を作製する方法
免疫化
いくつかの場合において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座の一部または全部をそのゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物をCCR2抗原で免疫することによって作製される。1つの場合において、非ヒト動物は、XENOMOUSE(商標)動物である。(Amgen Fremont, Inc.(以前はAbgenix, Inc.), Fremont, CA)。
【００９６】
XENOMOUSE(商標)マウスは、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座の大型断片を含み、かつマウス抗体産生に欠陥のある、操作されたマウス系統である。例えば、Green et al., Nature Genetics 7:13-21(1994)、ならびに米国特許第5,916,771号、同第5,939,598号、同第5,985,615号、同第5,998,209号、同第6,075,181号、同第6,091,001号、同第6,114,598号、同第6,130,364号、同第6,162,963号、および同第 6,150,584号を参照されたい。また、WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560、およびWO 00/037504も参照されたい。
【００９７】
別の局面において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物をCCR2抗原で免疫することによって、非ヒト非マウス動物から抗CCR2抗体を作製するための方法が提供される。このような動物は、上記の文献において記載されている方法を用いて作製することができる。これらの文献において開示されている方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,994,619号に記載されているように改良することができる。米国特許第5,994,619号では、ブタおよび雌ウシに由来する、新規に培養された内部細胞塊(CICM)細胞および細胞株、ならびに異種DNAが挿入されたトランスジェニックCICM細胞を作製するための方法を記載している。CICMトランスジェニック細胞は、クローン化されたトランスジェニックな胚、胎児、および子孫を作製するために使用され得る。特許第‘619号はまた、異種DNAを子孫に伝播することができるトランスジェニック動物を作製する方法も記載している。好ましい場合において、非ヒト動物は、哺乳動物、特にラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。
【００９８】
XENOMOUSE(商標)マウスは、完全なヒト抗体の成熟したヒトレパートリーを産生し、かつ抗原特異的なヒト抗体を産生する。いくつかの場合において、XENOMOUSE(商標)マウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の生殖系列配置の断片を導入することにより、ヒト抗体V遺伝子レパートリーの約80％を含む。他の場合において、XENOMOUSE(商標)マウスは、ヒトλ軽鎖遺伝子座のほぼすべてをさらに含む。開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156(1997)、GreenおよびJakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495(1998)、ならびにWO 98/24893を参照されたい。
【００９９】
別の場合において、これらの抗体は、改変された胚性幹(ES)細胞から直接、遺伝的に改変されたマウスを直ちに作製するためのVELOCIMOUSE(商標)技術(Regeneron Pharmaceuticals, Tarrytown, NY.)を用いて作製される(Poueymirou W.T., et al., Nature Biotechnology 25:91-99 (2007))。
【０１００】
いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン「ミニ遺伝子座(minilocus)」を有する動物である。ミニ遺伝子座のアプローチにおいて、外因性Igの遺伝子座は、Ig遺伝子座に由来する個々の遺伝子を含めることによって模倣される。したがって、1つまたは複数のVH遺伝子、1つまたは複数のDH遺伝子、1つまたは複数のJH遺伝子、μ定常ドメイン、および第2の定常ドメイン(好ましくはγ定常ドメイン)を、動物に挿入するための構築物に形成する。このアプローチは、とりわけて、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、同第5,789,650号、同第5,814,318号、同第5,591,669号、同第5,612,205号、同第5,721,367号、同第5,789,215号、および同第5,643,763号に記載されている。
【０１０１】
別の局面において、ヒト化抗CCR2抗体を作製するための方法が提供される。いくつかの場合において、抗体産生を可能にする条件下で、本明細書において説明するCCR2抗原で非ヒト動物を免疫する。抗体産生細胞をこれらの動物から単離し、かつ関心対象の抗CCR2抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を単離する。これらの核酸を、当業者に公知の技術を用いて、かつ下記にさらに説明するようにして続いて操作して、非ヒト配列の量を減らす。すなわち、抗体をヒト化して、ヒトにおける免疫応答を減少させる。
【０１０２】
いくつかの場合において、CCR2抗原は、単離および/または精製されたCCR2である。1つの場合において、CCR2抗原はヒトCCR2である。いくつかの場合において、CCR2抗原はCCR2の断片である。いくつかの場合において、CCR2断片は、CCR2の細胞外ループ、N末端ドメイン、またはC末端である。特定の場合において、CCR2断片は、CCR2の第1の細胞外ループまたは第2の細胞外ループを含む。他の場合において、CCR2断片は、SEQ ID NO: 128またはSEQ ID NO: 129に示すアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
他の場合において、CCR2断片は、CCR2の第3の細胞外ループにもN末端ドメインも含まない。
【０１０４】
他の場合において、CCR2断片は、SEQ ID NO: 127に示すアミノ酸配列もSEQ ID NO: 130に示すアミノ酸配列も含まない。いくつかの場合において、CCR2断片は、CCR2の少なくとも1つのエピトープを含む。他の場合において、CCR2抗原は、その表面でCCR2またその免疫原性断片を発現または過剰発現する細胞である。いくつかの場合において、CCR2抗原はCCR2融合タンパク質である。いくつかの場合において、CCR2は、合成ペプチド免疫原である。
【０１０５】
動物の免疫化は、当技術分野において公知である任意の方法によって実施することができる。例えば、HarlowおよびLane, Antibodies:A Laboratory Manual, New York:Cold Spring Harbor Press, 1990を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、およびウマなどの非ヒト動物を免疫するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、前記のHarlowおよびLane、ならびに米国特許第5,994,619号を参照されたい。1つの場合において、CCR2抗原は、免疫応答を促進するためのアジュバントと共に投与される。例示的なアジュバントには、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバント、RIBI(ムラミルジペプチド)、またはISCOM(免疫賦活複合体)が含まれる。このようなアジュバントは、局所的な保管場所中にポリペプチドを隔離することによって急速な分散からポリペプチドを保護し得るか、または、マクロファージおよび免疫系の他の構成要素に対して走化性である因子を宿主が分泌するように刺激する物質を含み得る。ポリペプチドが投与される場合、免疫スケジュールは、数週間に渡って実施されるポリペプチドの2回またはそれ以上の投与を含む。実施例1は、XENOMOUSE(商標)マウスにおいて抗CCR2モノクローナル抗体を作製するための方法を例示する。
【０１０６】
抗体および抗体産生細胞株の作製
CCR2抗原で動物を免疫した後、抗体および/または抗体産生細胞をその動物から得ることができる。いくつかの場合において、抗CCR2抗体を含む血清は、その動物から血液採取するか、またはその動物を屠殺することによって得られる。血清を動物から得たまま使用してもよく、血清から免疫グロブリン画分を得てもよく、または血清から抗CCR2抗体を精製してもよい。
【０１０７】
いくつかの場合において、抗体産生不死化細胞株は、免疫化動物から単離した細胞から調製される。免疫後、動物を屠殺し、かつ末梢血、リンパ節、および/または脾臓B細胞を当技術分野において公知である任意の手段によって不死化する。細胞を不死化する方法には、癌遺伝子をそれらにトランスフェクトする方法、腫瘍ウイルスにそれらを感染させ、かつ不死化細胞を選択する条件下でそれらを培養する方法、発癌性または変異誘発性の化合物にそれらを供する方法、不死化細胞、例えば骨髄腫細胞とそれらを融合する方法、および腫瘍抑制遺伝子を不活性化する方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、前記のHarlowおよびLaneを参照されたい。骨髄腫細胞との融合が使用される場合、骨髄腫細胞は、好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない(非分泌性細胞株)。不死化細胞は、CCR2、その一部分、またはCCR2発現細胞を用いてスクリーニングする。1つの場合において、CCR2部分は、(i)CCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループを含むか;(ii)SEQ ID NO: 128および/もしくはSEQ ID NO: 129に示すアミノ酸配列を含むか;(iii)CCR2の第3の細胞外ループおよび/もしくはN末端ドメインを含まないか;(iv)SEQ ID NO: 127および/もしくはSEQ ID NO: 130に示すアミノ酸配列を含まないか;または(v)それらの組合せである。1つの場合において、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫測定法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ法を用いて実施する。ELISAスクリーニングの例は、参照により本明細書に組み入れられるWO 00/37504において提供される。
【０１０８】
下記にさらに考察するように、抗CCR2抗体産生細胞、例えばハイブリドーマを選択し、クローン化し、かつ、活発な増殖、高レベルの抗体産生、および望ましい抗体特性を含む望ましい特性に関してさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、同系の動物において、免疫系を欠いた動物、例えばヌードマウスにおいてインビボで、または細胞培養においてインビトロで増殖させることができる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、かつ増殖させる方法は、当業者には周知である。
【０１０９】
1つの局面において、免疫される動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、脾臓B細胞は、その非ヒト動物と同じ種に由来する骨髄腫細胞株と融合される。例示的な場合において、免疫される動物はXENOMOUSE(商標)マウスであり、骨髄腫細胞株は、非分泌性マウス骨髄腫である。1つの場合において、骨髄腫細胞株は、P3-X63-Ag8.653(American Type Culture Collection)である。例えば、実施例1を参照されたい。
【０１１０】
CCR2の第1の細胞外ループおよび/または第2の細胞外ループを対象とする抗体を同定するための不死化された抗体産生細胞のスクリーニングは、その細胞によって産生される抗体が、CCR2の第1の細胞外ループまたは第2の細胞外ループのアミノ酸配列を含むペプチドに結合するかどうかを試験することによって実現することができる。あるいは、または組み合わせて、その細胞によって産生される抗体が、CCR2の第1の細胞外ループおよび/または第2の細胞外ループの配列を除いては別のケモカイン受容体の配列を主として有するがキメラケモカイン受容体に結合するかを試験してもよい。抗CCR2抗体のエピトープをマッピングするためのキメラの使用を例示する実施例8を参照されたい。補完的な場合において、その細胞によって産生されCCR2に結合することが公知である抗体が、CCR2の配列を主に有するがCCR2の野生型の第1の細胞外ループおよび/または第2の細胞外ループを欠く、例えば、別のサイトカイン受容体に由来する第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループを有するか、またはこれらの細胞外ループの一方もしくは両方に変異を含む、キメラケモカイン受容体に結合するかを試験してよい。
【０１１１】
別の局面において、ヒト抗CCR2抗体を産生する細胞および細胞株(ハイブリドーマを含む)が提供される。1つの場合において、細胞、細胞株、またはハイブリドーマによって産生されるヒト抗CCR2抗体は、CCR2のアンタゴニストである。さらに別の場合において、ヒト抗CCR2抗体は、(i)CCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループに結合するか;(ii)SEQ ID NO: 128および/もしくはSEQ ID NO: 129に示すアミノ酸配列に結合するか;(iii)CCR2の第3の細胞外ループおよび/もしくはN末端ドメインに結合しないか;(iv)SEQ ID NO: 127および/もしくはSEQ ID NO: 130に示すアミノ酸配列に結合しないか;または(v)それらの組合せである。別の場合において、細胞、細胞株、またはハイブリドーマによって産生されるヒト抗CCR2抗体は、高い親和力で第3の細胞外ループに結合しないか、高い親和力でCCR2のN末端ドメインに結合しないか;または高い親和力でいずれにも結合しない。
【０１１２】
さらに別の局面において、トランスジェニック動物をCCR2で免疫し、初代細胞、例えば、脾臓細胞または末梢血細胞を、免疫したトランスジェニック動物から単離し、かつ所望の抗原に特異的な抗体を産生する個々の細胞を同定する。例えば、個々の各細胞に由来するポリアデニル化mRNAを単離し、かつ、可変領域配列にアニールするセンスプライマー、例えば、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子のFR1領域の大半または全体を認識する縮重プライマー、ならびに定常領域配列または結合(J)領域配列にアニールするアンチセンスプライマーを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)を実施する。次いで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのcDNAを、任意の適切な宿主細胞、例えば骨髄腫細胞にクローニングし、重鎖定常ドメインおよびκまたはλの定常ドメインなどそれぞれの免疫グロブリン定常領域を有するキメラ抗体として発現させる。参照により本明細書に組み入れられるBabcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996を参照されたい。次いで、本明細書において説明するようにして抗CCR2抗体を同定および単離することができる。
【０１１３】
別の局面において、ファージディスプレイ技術を用いて、CCR2に対する親和性が様々である抗体レパートリーを含むライブラリーを提供することができる。初代B細胞をDNA供給源として直接使用することができる。例えば脾臓に由来するB細胞から得られたcDNAの混合物は、発現ライブラリー、例えば大腸菌(E.coli)にトランスフェクトされるファージディスプレイライブラリーを作製するのに使用される。結果として生じる細胞を、CCR2に対する免疫反応性に関して試験する。このようなライブラリーから高親和性のヒト抗体を同定するための技術は、参照により組み入れられるGriffiths et al., EMBO J. 13:3245-3260(1994); Nissim et al., 同書、pp. 692-698、およびGriffiths et al., 同書、12:725-734によって説明されている。最終的に、抗原に対して所望の大きさの結合親和力を生じるライブラリー由来のクローンを同定し、かつそのような結合を担う産生物をコードするDNAを回収し、標準的な組換え発現のために操作する。ファージディスプレイライブラリーは、前もって操作されたヌクレオチド配列を用いて構築し、かつ同様の様式でスクリーニングすることもできる。一般に、重鎖および軽鎖をコードするcDNAは、ファージライブラリーにおいて作製するために、独立に供給されるか、またはFv類似体を形成するように連結される。
【０１１４】
次いで、CCR2に対する親和性が最も高い抗体についてファージライブラリーをスクリーニングし、適切なクローンから遺伝物質を回収する。さらにスクリーニングを繰り返すことにより、単離した元の抗体の親和性を高めることができる。
【０１１５】
核酸、ベクター、宿主細胞、および抗体を作製する組換法
核酸
抗CCR2抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子もまた、包含される。いくつかの場合において、異なる核酸分子が、抗CCR2免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。他の場合において、同じ核酸分子が、抗CCR2免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。1つの場合において、核酸は、CCR2抗体またはその抗原結合部分をコードする。
【０１１６】
いくつかの場合において、軽鎖(VL)の可変ドメインをコードする核酸分子は、ヒトVκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、またはVκ6遺伝子ファミリーセグメント、およびJκ1、Jκ2、Jκ4、またはJκ5遺伝子セグメントを含み、生殖系列からの変異を含むまたは含まない。
【０１１７】
いくつかの場合において、軽鎖をコードする核酸分子は、生殖系列アミノ酸配列からの1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の置換を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの場合において、核酸分子は、生殖系列のVκ配列およびJκ配列と比べて、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の保存的アミノ酸置換、および/または1個、2個、もしくは3個の非保存的置換を含むVLアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。置換は、CDR、フレームワーク領域、または定常ドメイン中に存在してよい。
【０１１８】
いくつかの場合において、核酸分子は、抗体4.40、4.9、4.22、4.39、または4.40 A68G S230Pの内の1つのVL中に存在する変異と同一である、生殖系列配列と比較しての1つまたは複数の変異体を含むVLアミノ酸配列をコードする。いくつかの場合において、核酸は、本明細書において提供されるCCR2抗体における生殖系列からの変異と同じ1つまたは複数の位置に変異を含むが、提供される抗体における置換と比べて、異なる置換、いくつかの場合においては保存的置換を含むVLアミノ酸配列をコードする。
【０１１９】
いくつかの場合において、核酸分子は、抗体4.40、4.9、4.22、4.39、または4.40 A68G S230Pの内の1つのVL中に存在する、生殖系列配列と比べて少なくとも3つのアミノ酸置換をコードする。
【０１２０】
いくつかの場合において、核酸分子は、モノクローナル抗体4.40のVLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 101)、4.9のVLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 29)、4.22のVLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 65)、4.39のVLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 194)、もしくは4.40 A68G S230PのVLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 113)、またはその変異体もしくは一部分をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合において、核酸は、前述の抗体の内の1つの軽鎖CDRを含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの場合において、前記一部分は、CDR1〜CDR3を含む連続した部分である。
【０１２１】
いくつかの場合において、核酸分子は、抗体4.40、4.9、4.22、4.39、もしくは4.40 A68G S230PのVL領域のいずれか1つのVLアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 194、もしくはSEQ ID NO: 65のいずれか1つのVL領域のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％同一であるVLアミノ酸配列をコードする。核酸分子には、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 29、またはSEQ ID NO: 65中に存在するVL領域をコードする核酸が含まれる。
【０１２２】
別の場合において、核酸は、4.40、4.9、4.22、4.39、もしくは4.40 A68G S230Pより選択される抗体の完全長軽鎖、またはSEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 193、もしくはSEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を含む軽鎖、または本明細書において開示するもののような変異を含む該軽鎖配列をコードする。
【０１２３】
さらに別の場合において、核酸分子は、ヒト3-30もしくは1-46 VH遺伝子配列またはそれらに由来する配列を含む重鎖(VH)の可変ドメインをコードする。様々な場合において、核酸分子は、ヒト3-30 VH遺伝子配列、ヒトD1-7遺伝子配列およびヒトJH3B遺伝子配列;ヒト1-46 VH遺伝子配列、ヒトD1-7遺伝子配列およびヒトJH3B遺伝子配列;またはこれらのヒト遺伝子に由来する配列を使用する。
【０１２４】
いくつかの場合において、核酸分子は、ヒトV遺伝子、ヒトD遺伝子、またはヒトJ遺伝子の生殖系列アミノ酸配列と比べて1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、または18個の変異を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの場合において、該変異はVH領域中にある。いくつかの場合において、該変異はCDR中にある。
【０１２５】
いくつかの場合において、核酸分子は、モノクローナル抗体4.40、4.22、4.39、または4.9のVH中に存在するアミノ酸変異と同一である、生殖系列配列と比較しての1つまたは複数のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの場合において、核酸は、前述のモノクローナル抗体の内の1つ中に存在する少なくとも3つのアミノ酸変異と同一である、生殖系列配列と比較しての少なくとも3つのアミノ酸変異をコードする。
【０１２６】
いくつかの場合において、核酸分子は、4.40(SEQ ID NO: 83)、4.22(SEQ ID NO: 47)、4.39(SEQ ID NO: 176)、もしくは4.9(SEQ ID NO: 11)より選択されるモノクローナル抗体のVHアミノ酸配列の少なくとも一部分、その変異体、または保存的アミノ酸変異および/もしくは合計3個もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換を有する該配列をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な場合において、この配列は、1つまたは複数のCDR、CDR3領域、3つのCDRすべて、CDR1〜CDR3を含む連続的な部分、またはシグナル配列を含むもしくは含まないVH領域全体をコードする。
【０１２７】
いくつかの場合において、核酸分子は、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 175、もしくはSEQ ID NO: 116の内の1つのアミノ酸配列、またはシグナル配列を有する該配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい場合において、核酸分子は、SEQ ID NO: 73もしくはSEQ ID NO: 115のヌクレオチド配列、またはシグナル配列を有する該配列の少なくとも一部分を含む。いくつかの場合において、前記一部分は、VH領域(シグナル配列を含むまたは含まない)、CDR3領域、3つのCDRすべて、またはCDR1〜CDR3を含む連続的な領域をコードする。
【０１２８】
いくつかの場合において、核酸分子は、抗体4.40、4.9、4.22、4.39、もしくは4.40 A68G S230PのVH領域のいずれか1つのVHアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 176、もしくはSEQ ID NO: 11のいずれか1つのVH領域のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、または99％同一であるVHアミノ酸配列をコードする。また、4.40のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 83)、4.22のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 47)、4.39のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 176)もしくは4.9のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 11)もしくはそれらのVH領域をコードする核酸、またはSEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 2のヌクレオチド配列を有するか、もしくはそのVH領域をコードする核酸も含まれる。
【０１２９】
別の場合において、核酸は、4.40、4.22、4.9、4.39、もしくは4.40 A68G S230Pより選択される抗体の完全長重鎖、またはSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 175、もしくはSEQ ID NO: 116のアミノ酸配列を有し、シグナル配列を含むもしくは含まない重鎖、または本明細書において考察する変異体の内の1つのような変異を含む重鎖をコードする。さらに、核酸は、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 166、もしくはSEQ ID NO: 115のヌクレオチド配列、または本明細書において考察する変異体の内の1つのような変異を含む重鎖をコードする核酸分子を含んでよい。
【０１３０】
抗CCR2抗体の重鎖もしくは軽鎖またはそれらの一部分をコードする核酸分子は、このような抗体を産生する任意の供給源から単離することができる。様々な場合において、核酸分子は、CCR2で免疫された動物から単離されたB細胞から、または抗CCR2抗体を発現するそのようなB細胞に由来する不死化細胞から単離される。抗体をコードするmRNAを単離する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al.を参照されたい。mRNAを使用して、抗体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)またはcDNAクローニングにおいて使用するためのcDNAを作製することができる。1つの場合において、核酸分子は、非ヒトトランスジェニック動物に由来しヒト免疫グロブリンを産生する細胞を融合相手の一方として有するハイブリドーマから単離される。他の場合において、ヒト免疫グロブリンを産生する細胞は、XENOMOUSE(商標)動物から単離される。別の場合において、ヒト免疫グロブリンを産生する細胞は、本明細書において説明するように、非ヒト非マウストランスジェニック動物に由来する。別の場合において、核酸は、非ヒト非トランスジェニック動物から単離される。非ヒト非トランスジェニック動物から単離された核酸分子は、例えば、ヒト化抗体のために使用され得る。
【０１３１】
いくつかの場合において、抗CCR2抗体の重鎖をコードする核酸は、任意の供給源に由来する重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、VHドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。同様に、抗CCR2抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、任意の供給源に由来する軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、VLドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１３２】
さらなる局面において、重鎖(VH)および/または軽鎖(VL)の可変ドメインをコードする核酸分子は、完全長抗体遺伝子に「変換」される。1つの場合において、VHドメインまたはVLドメインをコードしている核酸分子は、VHセグメントがベクター内部でCHセグメントに機能的に連結され、かつ/またはVLセグメントがベクターの内部でCLセグメントに機能的に連結されるように、重鎖定常(CH)ドメインまたは軽鎖定常(CL)ドメインをそれぞれ既にコードしている発現ベクター中に挿入することによって、完全長抗体遺伝子に変換される。別の場合において、VHドメインおよび/またはVLドメインをコードしている核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を用いて、CHドメインおよび/またはCLドメインをコードしている核酸分子に、VHドメインおよび/またはVLドメインをコードしている核酸分子を連結、例えばライゲーションすることによって、完全長抗体遺伝子に変換される。ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常ドメイン遺伝子のヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、NIH Publ. No. 91-3242, 1991を参照されたい。次いで、完全長の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子を、それらを導入しておいた細胞から発現させ、抗CCR2抗体を単離することができる。
【０１３３】
核酸分子は、大量の抗CCR2抗体を組換えによって発現させるために使用され得る。核酸分子はまた、下記にさらに説明するように、キメラ抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、変異抗体、および抗体派生物を作製するのにも使用され得る。核酸分子が非ヒト非トランスジェニック動物に由来する場合は、同様に本明細書において説明するように、これらの核酸分子を抗体ヒト化のために使用することができる。
【０１３４】
いくつかの場合において、定常領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、生殖系列ヒト定常領域配列と比べて1つまたは複数の変異を含む、完全長重鎖または完全長軽鎖をコードする核酸が提供される。例えば、核酸は、グリコシル化部位を付加もしくは除去することによって、または抗体の安定性もしくは半減期を改善する置換をコードすることによって、抗体の特性を改善するアミノ酸置換をコードし得る。この核酸はまた、例えば、特定の発現ベクター中への核酸のクローニングを容易にするために、制限酵素部位を付加または除去するための「サイレント」変異も含んでよい。
【０１３５】
ベクター
抗CCR2抗体またはその抗原結合部分の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターが提供される。また、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片、およびそれらのプローブをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。
【０１３６】
いくつかの場合において、本明細書において説明するようにして得た、軽鎖および/または重鎖の一部分または完全長をコードしているDNAを、それらの遺伝子が転写制御配列および翻訳制御配列など必要な発現制御配列に機能的に連結されるように発現ベクターに挿入することによって、抗CCR2抗体または抗原結合部分を発現させる。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、YAC、およびEBV由来のエピソームなどが含まれる。場合によっては、抗体遺伝子は、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する所期の機能を果たすように、ベクター中に連結される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターまたは同じ発現ベクター中に挿入することができる。抗体遺伝子は、標準的な方法(例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端のライゲーション)によって発現ベクター中に挿入される。
【０１３７】
簡便なベクターは、機能的に完全なヒトCH免疫グロブリン配列またはヒトCL免疫グロブリン配列をコードし、本明細書において説明するように、任意のVH配列またはVL配列を挿入し発現させることができるように操作した適切な制限部位を有するものである。このようなベクターにおいて、スプライシングは通常、挿入されたJ領域中のスプライス供与部位と、ヒトCドメインの前にあるスプライス受容部位との間で起こり、かつ、ヒトCHエキソン内に存在するスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にあるネイティブな染色体部位で起こる。組み換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドもコードし得る。シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、免疫グロブリンではないタンパク質に由来するシグナルペプチド)でよい。
【０１３８】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当業者には理解されると考えられる。哺乳動物宿主細胞において発現させるための好ましい調節配列には、プロモーターおよび/またはエンハンサーなど、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスLTR由来のもの、(CMVプロモーター/エンハンサーのような)サイトメガロウイルス(CMV)由来のもの、(SV40プロモーター/エンハンサーのような)シミアンウイルス40(SV40)由来のもの、アデノウイルス由来のもの(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、ポリオーマ由来のプロモーターおよび哺乳動物の強力なプロモーター、例えば、ネイティブな免疫グロブリンプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。ウイルスの調節エレメントおよびそれらの配列のさらに詳しい説明については、例えば、米国特許第5,168,062号、米国特許第4,510,245号、および米国特許第4,968,615号を参照されたい。プロモーターおよびベクターに関する説明を含む、植物において抗体を発現させるための方法、ならびに植物の形質転換は、当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,517,529号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現させる方法もまた、当技術分野において周知である。
【０１３９】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)および選択マーカー遺伝子など付加的な配列を有し得る。選択マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が容易になる(例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号、および同第5,179,017号を参照されたい)。例えば、選択マーカー遺伝子は、典型的には、G418、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターを導入された宿主細胞に与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、(メトトレキサートによる選択/増幅と共にdhfr-宿主細胞において使用するための)ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、(G418選択用の)neo遺伝子、およびグルタミン酸合成酵素(GS)遺伝子が含まれる。
【０１４０】
非ハイブリドーマ宿主細胞および組換えによってタンパク質を作製する方法
抗CCR2抗体をコードする核酸分子、およびこれらの核酸分子を含むベクターを用いて、適切な哺乳動物、植物、細菌、昆虫、または酵母の宿主細胞をトランスフェクションすることができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法によって実施することができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中に導入するための方法は当技術分野において周知であり、デキストランを介したトランスフェクション、リン酸カルシウム共沈法、ポリブレンを介したトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、および核中へのDNAの直接的なマイクロインジェクションが含まれる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞中に導入することもできる。細胞を形質転換させる方法は、当技術分野において周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,399,216号、同第4,912,040号、同第4,740,461号、および同第4,959,455号を参照されたい。植物細胞を形質転換する方法は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を介した形質転換、微粒子銃による形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換を含めて、当技術分野において周知である。細菌細胞、昆虫細胞、および酵母細胞を形質転換させる方法もまた、当技術分野において周知である。
【０１４１】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野において周知であり、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多数の不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけて、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞、NSO細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、仔ハムスター腎臓(BHK)細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHep G2)、A549細胞、およびいくつかの他の細胞株が含まれる。どの細胞株が高い発現レベルを有するかを判定することによって、特に好ましい細胞株を選択する。使用され得る他の細胞株は、Sf9細胞またはSf21細胞などの昆虫細胞株である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現、または宿主細胞を増殖させる場である培地中への抗体の分泌を可能にさせるのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより、抗体は作製される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から回収することができる。植物宿主細胞には、例えば、タバコ(Nicotiana)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが含まれる。細菌宿主細胞には、大腸菌種およびストレプトミセス(Streptomyces)種が含まれる。酵母宿主細胞には、シゾサッカロミケス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)が含まれる。
【０１４２】
さらに、産生細胞株からの抗体の発現は、いくつかの公知の技術を用いて亢進させることができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系(GS系)は、特定の条件下で発現を亢進させるための一般的なアプローチである。GS系は、欧州特許第216846号、同第256055号、同第323997号、および同第338841号において、全体的にまたは部分的に考察されている。
【０１４３】
様々な細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現される抗体のグリコシル化は互いに異なる可能性がある。しかしながら、本明細書において提供される核酸分子によってコードされるか、または本明細書において提供されるアミノ酸配列を含む抗体はすべて、抗体のグリコシル化に関わらず、本開示の一部分である。
【０１４４】
トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物
抗CCR2抗体はまた、関心対象の免疫グロブリンの重鎖配列および軽鎖配列に対してトランスジェニックな哺乳動物または植物を作製し、かつそれらから回収可能な形態で抗体を産生させることによって、トランスジェニック的に作製することもできる。哺乳動物におけるトランスジェニック的作製に関連して述べると、抗CCR2抗体は、ヤギ、雌ウシ、または他の哺乳動物の乳汁において産生させ、かつそれから回収することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,827,690号、同第5,756,687号、同第5,750,172号、および同第5,741,957号を参照されたい。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物は、本明細書において説明するように、CCR2またはその免疫原性部分で免疫される。植物において抗体を作製するための方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,046,037号および同第5,959,177号に記載されている。
【０１４５】
いくつかの場合において、非ヒトトランスジェニック動物または非ヒトトランスジェニック植物は、抗CCR2抗体をコードする1つまたは複数の核酸分子を標準的なトランスジェニック技術によって動物または植物に導入することにより、作製される。前記Hoganおよび米国特許第6,417,429号を参照されたい。トランスジェニック動物を作製するために使用されるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞もしくは体細胞、または受精卵でよい。非ヒトトランスジェニック生物は、キメラのヘテロ接合体、非キメラのヘテロ接合体、および非キメラのホモ接合体でよい。例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 第2版, Cold Spring Harbor Press(1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics:A Practical Approach, Oxford University Press(2000);およびPinkert, Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook, Academic Press(1999)を参照されたい。いくつかの場合において、非ヒトトランスジェニック動物は、関心対象の重鎖および/または軽鎖をコードするターゲティング構築物による、標的を定められた破壊および置換を受ける。1つの場合において、トランスジェニック動物は、CCR2に特異的に結合し、かつ好ましくは、(i)CCR2の第1の細胞外ループおよび/もしくは第2の細胞外ループに結合するか;(ii)CCR2のN末端もしくは第3の細胞外ループ、または両方に結合しないか;または(iii)両方を満たす重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、かつ発現する。1つの場合において、トランスジェニック動物は、ヒトCCR2に特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、かつ発現する。いくつかの場合において、トランスジェニック動物は、単鎖抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体などの修飾抗体をコードする核酸分子を含む。抗CCR2抗体は、任意のトランスジェニック動物において作製することができる。1つの場合において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。非ヒトトランスジェニック動物は、血液、乳汁、尿、唾液、涙、粘液、および他の体液中で、コードされた前記ポリペプチドを発現する。
【０１４６】
ファージディスプレイライブラリー
抗CCR2抗体またはその抗原結合部分を作製するための方法であって、ヒト抗体のライブラリーをファージ上で合成する段階、CCR2またはその一部分を用いてそのライブラリーをスクリーニングする段階、CCR2に結合するファージを単離する段階、およびそのファージから抗体を獲得する段階を含む方法が提供される。例として、ファージディスプレイ技術で使用するための抗体ライブラリーを調製するための1つの方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物をCCR2またはその抗原性部分で免疫して免疫応答を生じさせる段階、免疫した動物から抗体産生細胞を採取する段階、採取した細胞から抗体の重鎖および軽鎖をコードするRNAを単離する段階、そのRNAを逆転写してcDNAを作製する段階、プライマーを用いてそのcDNAを増幅させる段階、ならびに抗体がファージ上で発現されるようにそのcDNAをファージディスプレイベクター中に挿入する段階を含む。組換え抗CCR2抗体はこのようにして得ることができる。
【０１４７】
組換え抗CCR2ヒト抗体は、組換え抗体コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。このライブラリーは、B細胞から単離されたmRNAから調製されたヒトVL cDNAおよびVH cDNAを用いて作製された、scFvファージディスプレイライブラリーでよい。このようなライブラリーを調製およびスクリーニングするための方法は、当技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するためのキットが市販されている(例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27-9400-01およびStratagene SurfZAP(商標)ファージディスプレイキット、カタログ番号240612)。また、抗体ディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする際に使用することができる他の方法および試薬もある(例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,223,409号;PCT公開番号WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372(1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85(1992); Huse et al., Science 246:1275-1281(1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734(1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896(1992); Clackson et al., Nature 352:624-628(1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580(1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377(1991); Hoogenboom et al., Nuc.Acid Res. 19:4133-4137(1991);およびBarbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982(1991)を参照されたい)。
【０１４８】
1つの場合において、所望の特性を有するヒト抗CCR2抗体を単離および作製するために、本明細書において説明するヒト抗CCR2抗体を最初に使用して、参照により本明細書に組み入れられるPCT公開番号WO 93/06213において説明されているエピトープインプリンティング法により、CCR2に対して同様の結合活性を有するヒト重鎖配列およびヒト軽鎖配列を選択する。この方法において使用される抗体ライブラリーは、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開番号WO 92/01047、McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990);およびGriffiths et al., EMBO J. 12:725-734(1993)において説明されているように調製およびスクリーニングしたscFvライブラリーでよい。scFv抗体ライブラリーは、ヒトCCR2を抗原として用いてスクリーニングすることができる。
【０１４９】
最初のヒトVLドメインおよびヒトVHドメインを選択した後、「混合およびマッチング」実験を実施し、最初に選択したVLセグメントおよびVHセグメントの様々なペアをCCR2結合についてスクリーニングして、好ましいVL/VHペアの組合せを選択する。さらに、抗体の質をさらに改善するために、天然の免疫応答の間に抗体の親和性成熟を司るインビボの体細胞変異プロセスに類似したプロセスで、好ましくはVHおよび/またはVLのCDR3領域内で、好ましいVL/VHペアのVLセグメントおよびVHセグメントをランダムに変異させてもよい。このインビトロの親和性成熟は、それぞれVH CDR3またはVL CDR3に相補的なPCRプライマーを用いてVHドメインおよびVLドメインを増幅させることによって達成することができる。これらのプライマーには、結果として生じるPCR生成物がVHおよび/またはVLのCDR3領域中にランダムな変異が導入されたVHセグメントおよびVLセグメントをコードするように、特定の位置に4種のヌクレオチド塩基のランダムな混合物を「添加(spike)」した。これらのランダムに変異させたVHセグメントおよびVLセグメントは、CCR2への結合について再スクリーニングすることができる。
【０１５０】
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーから抗CCR2抗体をスクリーニングおよび単離した後、選択された抗体をコードしている核酸をディスプレイパッケージから(例えばファージゲノムから)回収し、かつ標準的な組換えDNA技術によって他の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。所望の場合は、本明細書において説明するように、核酸をさらに操作して他の抗体形態を作り出すことができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離した組換えヒト抗体を発現させるために、本明細書において説明するように、抗体をコードするDNAを組換え発現ベクター中にクローニングし、かつ哺乳動物宿主細胞中に導入する。
【０１５１】
クラススイッチ
別の局面は、ある抗CCR2抗体のクラスまたはサブクラスを別のクラスまたはサブクラスに変換するための方法を提供する。いくつかの場合において、CLまたはCHをコードする配列を含まない、VLまたはVHをコードする核酸分子は、当技術分野において周知の方法を用いて単離される。次いで、その核酸分子は、所望の免疫グロブリンクラスまたはサブクラスに由来するCLまたはCHをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結される。これは、本明細書において説明するように、CL鎖またはCH鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成することができる。例えば、元はIgMであった抗CCR2抗体をIgGにクラススイッチすることができる。さらに、クラススイッチを用いて、1つのIgGサブクラスを別のサブクラス、例えばIgG1またはIgG2からIgG4に変換することもできる。所望のアイソタイプを含む抗体を作製するための別の方法は、抗CCR2抗体の重鎖をコードする核酸および抗CCR2抗体の軽鎖をコードする核酸を単離する段階、VH領域をコードする配列を単離する段階、所望のアイソタイプの重鎖定常ドメインをコードする配列にそのVH配列を連結する段階、細胞中で軽鎖遺伝子および重鎖構築物を発現させる段階、ならびに所望のアイソタイプを有する抗CCR2抗体を収集する段階を含む。
【０１５２】
脱免疫化抗体
別の局面において、例えばPCT公開番号WO98/52976およびWO00/34317(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている技術を用いて抗体を脱免疫化して、その免疫原性を減少させてもよい。
【０１５３】
変異抗体
別の局面において、核酸分子、ベクター、および宿主細胞は、変異抗CCR2抗体を作製するのに使用され得る。例えば抗体の結合特性を改変するために、これらの抗体の重鎖および/または軽鎖の可変ドメインを変異させてよい。例えば、1つまたは複数のCDRに変異を起こさせて、CCR2に対する抗体のKDを増加もしくは減少させるか、koffを増加もしくは減少させるか、または抗体の結合特異性を改変することができる。部位特異的変異誘発の技術は当技術分野において周知である。例えば、前記のSambrook et al.およびAusubel et al.を参照されたい。別の場合において、モノクローナル抗体4.40、4.9、4.22、4.39、または4.40 A68G S230P中の生殖系列と比べて異なっていることが公知であるアミノ酸残基に1つまたは複数の変異を起こさせる。これらの変異は、可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域中、または定常ドメイン中に起こしてよい。1つの場合において、これらの変異は可変ドメイン中に起こされる。いくつかの場合において、1つまたは複数の変異は、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 194、またはSEQ ID NO: 113より選択されるアミノ酸配列の可変ドメインのCDRまたはフレームワーク領域中の、生殖系列と比べて変化していることが公知であるアミノ酸残基に起こされる。
【０１５４】
別の局面において、結果として生じるフレームワーク領域が対応する生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように、フレームワーク領域を変異させる。フレームワーク領域または定常ドメイン中に変異を起こさせて、抗CCR2抗体の半減期を延長させることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるPCT公開番号WO 00/09560を参照されたい。また、抗体の免疫原性を改変または低減するため、別の分子に共有結合もしくは非共有結合するための部位を提供するため、1つもしくは複数のグリコシル化部位を付加もしくは除去するため、または補体結合、FcR結合、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)などの特性を改変するために、フレームワーク領域または定常ドメイン中に変異を起こすこともできる。1つの抗体は、可変ドメインの1つもしくは複数の任意のCDRもしくはフレームワーク領域中、または定常ドメイン中に変異を有し得る。
【０１５５】
いくつかの態様において、変異抗CCR2抗体のVHドメインまたはVLドメインのいずれかには、変異前の抗CCR2抗体と比べて、1個〜8個(間の任意の数を含む)のアミノ酸変異がある。上記のもののいずれかにおいて、これらの変異は、1つまたは複数のCDR中に存在してよい。さらに、変異のいずれかは、保存的アミノ酸置換でよい。いくつかの場合において、定常ドメイン中に5個、4個、3個、2個、または1個以下のアミノ酸変化がある。
【０１５６】
修飾抗体
別の局面において、別のポリペプチドに連結された抗CCR2抗体の全体または一部分を含む、融合抗体またはイムノアドヘシンが作製され得る。1つの場合において、抗CCR2抗体の可変ドメインのみがそのポリペプチドに連結される。さらに別の場合において、抗CCR2抗体のVHドメインは第1のポリペプチドに連結され、一方、抗CCR2抗体のVLドメインは、VHドメインおよびVLドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成できるような様式で第1のポリペプチドと結合する第2のポリペプチドに連結される。さらに別の場合において、VHドメインは、VHドメインおよびVLドメインが互いに相互作用できるように、リンカーによってVLドメインから離されている(下記の単鎖抗体を参照されたい)。次いで、VH-リンカー-VL抗体は、関心対象のポリペプチドに連結される。融合抗体は、CCR2を発現する細胞または組織にポリペプチドを方向付けるために有用である。ポリペプチドは、毒素、ケモカイン、もしくは他の調節タンパク質などの治療物質でよく、または、容易に可視化できる酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼのような診断用物質でもよい。さらに、2個(またはそれ以上)の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体も作り出すことができる。これは、単一のポリペプチド鎖上で二価もしくは多価の抗体を作り出したい場合、または二重特異性抗体を作り出したい場合に有用である。
【０１５７】
単鎖抗体(scFv)を作り出すために、VHおよびVLをコードしているDNA断片を、柔軟なリンカーをコードしている別の断片、例えばアミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードしている別の断片に機能的に連結し、その結果、VH配列およびVL配列が、柔軟なリンカーによって結合されたVLドメインおよびVHドメインを有する連続的な単鎖タンパク質として発現され得るようにする。例えば、Bird et al., Science 242:423-426(1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990)を参照されたい。単鎖抗体は、1つのVHおよびVLのみが使用される場合は一価であり得、2つのVHおよびVLが使用される場合は二価であり得、または2つより多いVHおよびVLが使用される場合は多価であり得る。CCR2および別の分子に特異的に結合する二重特異性抗体または多価抗体を作製することができる。
【０１５８】
別の局面において、抗CCR2抗体をコードする核酸分子を用いて他の修飾抗体を調製することができる。例えば、「κ抗体(Kappa body)」(Ill et al., Protein Eng. 10:949-57(1997))、「ミニ抗体」(Martin et al., EMBO J. 13:5303-9(1994))、「ダイアボティ」(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90: 6444-6448(1993))、または「ジャヌシン(Janusin)」(Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659(1991)およびTraunecker et al., Int. J. Cancer(補遺)7:51-52(1992))は、本明細書の教示に従って標準的な分子生物学的技術を用いて調製することができる。
【０１５９】
二重特異性の抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含む様々な方法によって、作製することができる。例えば、SongsivilaiおよびLachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990)、Kostelny et al., J.Immunol. 148:1547-1553(1992)を参照されたい。さらに、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」または「ジャヌシン(Janusin)」として形成され得る。いくつかの場合において、二重特異性抗体は、CCR2の2つの異なるエピトープに結合する。いくつかの場合において、二重特異性抗体は、モノクローナル抗体4.40、4.9、または4.40 A68G S230Pに由来する第1の重鎖および第1の軽鎖、ならびに付加的な抗体重鎖および抗体軽鎖を有する。いくつかの場合において、付加的な軽鎖および重鎖もまた、上記に特定したモノクローナル抗体の内の1つに由来するが、第1の重鎖および軽鎖とは異なる。
【０１６０】
いくつかの場合において、本明細書において説明する修飾抗体は、本明細書において提供するヒト抗CCR2モノクローナル抗体に由来する1つまたは複数の可変ドメインまたはCDRを用いて調製される。
【０１６１】
誘導体化抗体および標識抗体
抗CCR2抗体または抗原結合部分は、誘導体化するか、または別の分子(例えば、別のペプチドもしくはタンパク質)に連結することができる。一般に、誘導体化または標識化によってCCR2結合が悪影響を受けないように、抗体またはその一部分を誘導体化する。したがって、抗体および抗体部分は、本明細書において説明するヒト抗CCR2抗体の完全な形態および修飾された形態の両方を含むことが意図される。例えば、抗体または抗体部分は、別の抗体(例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ)、検出物質、細胞障害性物質、薬学的物質、および/または、抗体もしくは抗体部分と別の分子(ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど)との結合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなど1種または複数種の他の分子単位に、(化学的結合、遺伝的融合、非共有結合、または別の方法によって)機能的に連結することができる。
【０１６２】
誘導体化抗体の1つのタイプは、(例えば二重特異性抗体を作り出すために、同じタイプまたは別のタイプの)2つまたはそれ以上の抗体を架橋結合させることによって作製される。適切な架橋剤には、ヘテロ2価性で、2種の極めて反応性の高い基が適切なスペーサーによって離されているもの(例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、またはホモ2価性のもの(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)が含まれる。このようなリンカーは、Pierce Chemical Company, Rockford, Ilから入手可能である。
【０１６３】
別のタイプの誘導体化抗体は、標識抗体である。抗体または抗原結合部分を誘導体化することができる有用な検出物質には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、5-ジメチルアミン-1-ナプタレンスルホニル(napthalenesulfonyl)クロリド、およびランタニド蛍光体などを含む蛍光性化合物が含まれる。抗体はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼなど、検出に有用である酵素で標識することもできる。検出可能な酵素で抗体が標識されている場合、抗体は、酵素が使用して識別可能な反応生成物を生成する付加的な反応物を添加することによって検出される。例えば、作用物質西洋ワサビペルオキシダーゼが存在している場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加することにより、検出可能な有色の反応生成物が生じる。抗体は、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を間接的に測定することによって検出することもできる。抗体は、二次レポーターによって認識される前もって決定したポリペプチドエピトープ(例えばロイシンジッパーの対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)で標識することもできる。いくつかの場合において、標識は、潜在的な立体障害を低減させるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
【０１６４】
抗CCR2抗体はまた、放射性標識アミノ酸で標識することもできる。放射性標識物質は、診断目的および治療目的の両方のために使用され得る。例えば、放射性標識物質は、X線または他の診断技術によってCCR2発現腫瘍を検出するために使用され得る。さらに、放射性標識物質は、癌細胞または腫瘍に対する毒素として治療のために使用することもできる。ポリペプチド用の標識の例には、非限定的に、次の放射性同位体または放射性核種が含まれる―3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、および131I。
【０１６５】
抗CCR2抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)、メチル基もしくはエチル基、または炭水化物基などの化学基で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改善するために、例えば、血清半減期を延長するため、または組織結合を増大させるために有用である。
【０１６６】
いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、画像処理すると検出可能である常磁性、放射性、または蛍光原性のイオンまたは部分で標識され得る。
【０１６７】
いくつかの場合において、常磁性のイオンは、クロミウム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)、またはエルビウム(III)である。他の場合において、放射性イオンは、ヨウ素123、テクネチウム99、インジウム111、レニウム188、レニウム186、銅67、ヨウ素131、イットリウム90、ヨウ素125、アスタチン211、およびガリウム67である。他の場合において、抗CCR2抗体は、ランタン(III)、金(III)、鉛(II)、およびビスマス(III)などのX線造影剤で標識される。
【０１６８】
薬学的組成物およびキット
アンタゴニスト特性を有するヒト抗CCR2抗体を含む組成物が提供される。このような組成物は、肝線維症、腎臓線維症、肺線維症、乾癬;炎症性障害、アレルギー性障害、自己免疫疾患、移植片拒絶障害、アテローム性動脈硬化症、肥満、HIV感染症、神経因性疼痛、虚血に関連する炎症、狭窄および再狭窄、癌、敗血症、強皮症、ならびに糖尿病を非限定的に含む、CCR2が役割を有する状態を治療するために有用である。いくつかの場合において、治療は、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)によって媒介される肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、および/またはアルコール性脂肪性肝炎(ASH)の治療である。いくつかの場合において、対象は、炎症応答部位である組織のような組織中への白血球浸潤の低減を必要としている。いくつかの場合において、治療の対象はヒトである。他の場合において、対象は、動物対象である。炎症の低減または白血球浸潤の低減を必要としている組織の例には、結合組織、軟骨、肝臓、肺、腎臓、神経組織(脳、脊髄、および末梢神経組織を含む)、心臓、血管、食道、胃、小腸、大腸、結腸、前立腺、膵臓、尿路、卵巣、乳房、子宮、精巣、陰茎、骨、筋肉、甲状腺、副腎、下垂体、脂肪組織、骨髄、血液、胸腺、脾臓、リンパ節、皮膚、眼、耳、または鼻が含まれるが、それらに限定されるわけではない。1つの場合において、組織は、粘膜表面を有する組織である。
【０１６９】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合性である、任意およびすべての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容される担体のいくつかの例は、例に過ぎないが、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、およびエタノールなど、ならびにそれらの組合せである。多くの場合において、等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいと考えられる。薬学的に許容される物質のさらなる例は、湿潤剤、または、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝剤など少量の補助物質であり、これらは抗体の貯蔵寿命または有効性を向上させる。
【０１７０】
組成物は、様々な形態、例えば、液状の溶液剤(例えば、注射用の溶液剤および注入用の溶液剤)、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、および坐剤など、液体剤形、半固体剤形、および固体剤形であってよい。形態は、意図される投与様式および治療的用途に依存する。典型的な組成物は、ヒトの受動免疫化用に使用されるものに類似した組成物のような注射用溶液剤または注入用溶液剤の形態である。好ましい投与様式は、非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉)である。1つの場合において、抗体は、静脈内注入または静脈注射によって投与される。さらに別の場合において、抗体は、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【０１７１】
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で、無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液剤、マイクロエマルジョン、分散系、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則構造体として調剤することができる。無菌の注射液剤は、適切な溶媒中の必要とされる量の抗CCR2抗体を、必要に応じて、上記に列挙した成分の内の1つまたはそれらの組合せと混合し、続いてろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、基本となる分散媒体および上記に列挙したもののうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって調製される。無菌注射液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末を、予め滅菌ろ過したその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液剤の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散系の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、実現することができる。
【０１７２】
抗体は、当技術分野において公知の様々な方法によって投与してよいが、多くの治療的用途の場合、好ましい投与経路/様式は、皮下注入、筋肉内注入、または静脈内注入である。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望の結果に応じて異なると考えられる。他の投与様式には、腹腔内、気管支内、経粘膜、脊髄内、滑液包内、大動脈内、鼻腔内、眼、耳、局所および頬側、ならびに腫瘍内が含まれる。
【０１７３】
特定の場合において、抗体組成物の活性化合物は、埋め込み剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、急速な放出から抗体を保護すると考えられる担体と共に調製してよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許権を与えられており、または、一般に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)を参照されたい。
【０１７４】
付加的な活性化合物も、組成物中に混合することができる。特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体は、1種または複数種の付加的な治療物質、診断用物質、または予防物質と同時調剤されるか、かつ/または同時投与される。治療物質には、非限定的に、様々な優れた特異性を有する抗CCR2抗体、他の標的、光感受性物質、アンドロゲン、エストロゲン、非ステロイド系抗炎症薬、血圧降下薬、鎮痛剤、抗うつ薬、抗生物質、抗癌剤、麻酔薬、制吐薬、抗感染症薬、避妊薬、抗糖尿病薬、ステロイド、抗アレルギー薬、化学療法剤、抗片頭痛薬、禁煙用の薬剤、抗ウイルス剤、免疫抑制薬、血栓溶解剤、コレステロール低下剤、および抗肥満剤に結合する抗体が含まれる。
【０１７５】
また、治療物質には、CCR2を阻害するペプチド類似体、MCP-1、MCP-2、MCP-3、またはMCP-4に結合し、CCR2へのそれらの結合を妨害する抗体または他の分子、およびCCR2発現を阻害する作用物質も含まれる。1つの場合において、CCR2発現を阻害する付加的な作用物質は、ヘアピンRNAまたはsiRNAなど、CCR2 mRNAにハイブリダイズすることができるアンチセンス核酸を含む。RNA干渉によって遺伝子機能を阻害することができる配列特異的核酸は、当技術分野において周知である。このような併用療法が必要とする阻害性抗CCR2抗体ならびに同時投与される作用物質の投薬量は少なく、したがって、様々な単独療法に付随する毒性または合併症の可能性を回避し得る。
【０１７６】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される治療物質は、抗微生物剤である。抗微生物剤には、抗生物質(例えば抗菌剤)、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗原生動物剤が含まれる。抗微生物剤の非限定的な例は、スルホンアミド、トリメトプリムスルファメトキサゾール、キノロン、ペニシリン、およびセファロスポリンである。
【０１７７】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される治療物質、およびケモカインアンタゴニスト、CCR2アンタゴニスト、MCP-1アンタゴニスト、またはCCR5アンタゴニスト。CCR2アンタゴニストまたはMCP-1アンタゴニストには、非限定的に、次のものが含まれる:MCP-1を対象とする抗体(米国特許第7,202,343号、US2005/0025768、US2006/0039913、US2006/0246069、およびUS2004/004/0047860);テトラヒドロピラニルシクロペンチルベンジルアミド化合物(US2006/0116421);ヘテラリールピペルジン(heterrarylpperdine)化合物(US2005/0250781);ピペリジニルシクロペンチルアリールベンジルアミド化合物(US2006/0173013);環状アミン化合物(米国特許第6,140,349号および米国特許第6,476,054号);シクロペンチル化合物(US2002/0049222および米国特許第6,545,023号);テトラヒドロピラニルシクロペンチルテトラヒドルピリドピプリジン(tetrahydorpyridopypridine)化合物(US2004/0167156、米国特許第6,812,234号および米国特許第7,230,008号);アミノシクロペンチル縮合ヘテロトリシクリックアミド化合物(US2007/0004714);ピペリジニル-α-アミノアミド化合物(US2005/0250814);置換ピラゾール化合物(WO06/88813);テトラヒドロピラニルシクロペンチル複素環式アミド化合物(US2006/0178363);7員および8員の複素環式シクロペンチルベンジルアミド化合物(US2006/0183731);ベンゾキサジニル-アミドシクロペンチル-複素環式化合物(US2006/0069088);3-アミノシクロペンタンカルボキサミド化合物(US2007/0149532);窒素含有複素環式化合物(US2007/0155713);トリアゾリルフェニルベンゼンスルオンアミド(bensenesulonamide)化合物(WO08/10934);置換ピロリンド(pyrrolinde)誘導体(US2004/0186140);置換ベンズアミド誘導体および置換フェニルカルバマート誘導体(米国特許第7,087,604号);置換シクロアルキルアミン化合物(US2005/0054626);置換ビシクロアルキルアミン化合物(US2005/0227960);ピロリジノンおよびピロリジン-チオン化合物(US2003/0149081、米国特許第6,727,275号および米国特許第6,936,633号);メルカプトイミダゾール化合物(US2007/0244138);置換ジピペリジン化合物(US2007/0197590);フェニルアミノで置換された四級塩化合物(US2006/0293379);二環式で架橋された窒素複素環(US2006/0074121);3-アミノシクロペンタンカルボキサミド化合物(US2006/0020133);3-(4-ヘテロアリールシクロヘキシルアミノ)シクロペンタンカルボキサミド化合物(US2005/0267146);トリアゾロ化合物(米国特許第6,492,364号);ヘテロアリールスルホンアミド化合物(US2006/0173019);アリールスルホンアミド(米国特許第6,939,885号);ビス-アリールスルホンアミド(米国特許第7,227,035号およびUS2004/0167113);置換ベンズアミド化合物(米国特許第6,821,964号);置換ジアゼパム化合物(US2007/0249589);トリアザスピロ[5.5]ウンデカン誘導体(US2005/267114);置換ピペリジンカルボキサミド化合物(US2003/0114443およびUS6,562,978);ベンゾアゼピン誘導体(US2004/0235822および米国特許第7,262,185号)。
【０１７８】
選択された場合において、CCR2抗体と同時調剤または同時投与されるケモカインアンタゴニストはSELZENTRY(商標)(マラビロク(Maraviroc))であり、これは、化学的には4,4-ジフルオロ-N-{(1S)-3-[エキソ-3-(3-イソプロピル-5-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-4-イル)-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタ-8-イル]-1-フェニルプロピル}シクロヘキサンカルボキサミド:
0005685535.tif 000006
と記載される。
【０１７９】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される治療物質は、CB-1受容体アンタゴニストである。本明細書において使用される場合、「CB-1受容体」という用語は、Gタンパク質共役型カンナビノイド1受容体である。「アンタゴニスト」という用語は、完全なアンタゴニストおよび部分的なアンタゴニストの両方、ならびにインバースアゴニストを含む。CB-1受容体アンタゴニストは、CB-1受容体に対して選択的であり得る。「CB-1受容体選択的」とは、その化合物が、カンナビノイド2受容体(CB-2)に拮抗する能力をほとんどまたは全く持たないことを意味する。CB-1アンタゴニストのCB-1受容体に対する選択性は、CB-2受容体に対する選択性と比較して、少なくとも約10倍であり得る。例えば、CB-1受容体に拮抗するための阻害濃度(IC50)は、CB-2受容体に拮抗するための阻害濃度(IC50)の約10分の1またはそれ以下である。適切なCB-1受容体アンタゴニストには、米国特許第5,462,960号;同第5,596,106号;同第5,624,941号;同第5,747,524号;同第6,017,919号;同第6,028,084号;同第6,432,984号;同第6,476,060号;同第6,479,479号;同第6,518,264号;および同第6,566,356号;米国特許公報第2003/0114495号;同第2004/0077650号;同第2004/0092520号;同第2004/0122074号;同第2004/0157838号;同第2004/0157839号;同第2004/0214837号;同第2004/0214838号;同第2004/0214855号;同第2004/0214856号;同第2004/0058820号;同第2004/0235926号;同第2004/0259887号;同第2005/0080087号;同第2005/0026983号;および同第2005/0101592号;PCT特許公報WO 03/075660; WO 02/076949; WO 01/029007; WO 04/048317; WO 04/058145; WO 04/029204; WO 04/012671; WO 03/087037; WO 03/086288; WO 03/082191; WO 03/082190; WO 03/063781; WO 04/012671; WO 04/013120; WO 05/020988; WO 05/039550; WO 05/044785; WO 05/044822;およびWO 05/049615;2004年12月6日に出願されたPCT特許出願PCT/IB2004/004050;2004年12月6日に出願されたPCT/IB2004/004017; 2004年12月6日に出願されたPCT/IB2004/004023;および2004年12月6日に出願されたPCT/IB2004/004019;ならびに2003年11月21日に出願された米国特許仮出願第60/523937号;2003年12月6日に出願された同第60/529908号;2003年12月6日に出願された同第60/529909号;2003年12月6日に出願された同第60/529910号;2003年12月6日に出願された同第60/530012号;および2004年4月21日に出願された同第60/564648号において開示されている化合物が含まれる。上記の特許および特許出願はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。これらの方法で使用するために好ましいCB-1受容体アンタゴニストには次の物が含まれる:リモナバント(商品名Acomplia(商標)としても公知であるSR141716A)は、Sanofi-Synthelabo社から入手可能であるか、または米国特許第5,624,941号に記載されているようにして調製することができる;N-(ピペリジン-1-イル)-1-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-ヨードフェニル)-4-メチル-1H-ピラゾール-3-カルボキサミド(AM251)は、Tocris(商標), Ellisville, MOから入手可能である;米国特許第6,645,985号に記載されているようにして調製することができる[5-(4-ブロモフェニル)-1-(2,4-ジクロロ-フェニル)-4-エチル-N-(1-ピペリジニル)-1H-ピラゾール-3-カルボキサミド](SR147778);PCT特許公報WO 03/075660に記載されているようにして調製することができる、N-(ピペリジン-1-イル)-4,5-ジフェニル-1-メチルイミダゾール-2-カルボキサミド、N-(ピペリジン-1-イル)-4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-クロロフェニル)-1-メチルイミダゾール-2-カルボキサミド、N-(ピペリジン-1-イル)-4,5-ジ-(4-メチルフェニル)-1-メチルイ���ダゾール-2-カルボキサミド、N-シクロヘキシル-4,5-ジ-(4-メチルフェニル)-1-メチルイミダゾール-2-カルボキサミド、N-(シクロヘキシル)-4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-クロロフェニル)-1-メチルイミダゾール-2-カルボキサミド、およびN-(フェニル)-4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-クロロフェニル)-1-メチルイミダゾール-2-カルボキサミド;米国特許公報第2004/0092520号に記載されているようにして調製することができる、1-[9-(4-クロロ-フェニル)-8-(2-クロロ-フェニル)-9H-プリン-6-イル]-4-エチルアミノ-ピペリジン-4-カルボン酸)の塩酸塩、メシル酸塩、およびベシル酸塩;米国特許公報第2004/0157839号に記載されているようにして調製することができる、1-[7-(2-クロロ-フェニル)-8-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-ピラゾロ[1,5-a][1,3,5]トリアジン-4-イル]-3-エチルアミノ-アゼチジン-3-カルボン酸アミドおよび1-[7-(2-クロロ-フェニル)-8-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-ピラゾロ[1,5-a][1,3,5]トリアジン-4-イル]-3-メチルアミノ-アゼチジン-3-カルボン酸アミド;米国特許公報第2004/0214855号に記載されているようにして調製することができる、3-(4-クロロ-フェニル)-2-(2-クロロ-フェニル)-6-(2,2-ジフルオロ-プロピル)-2,4,5,6-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-7-オン、2-(2-クロロ-フェニル)-3-(4-エチル-フェニル)-5-(2,2,2-トリフルオロ-エチル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピロロ[3,4-c]ピラゾール-6-オン、および2-(2-クロロ-フェニル)-3-(4-イソプロピル-フェニル)-5-(2,2,2-トリフルオロ-エチル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピロロ[3,4-c]ピラゾール-6-オン;米国特許公報第2005/0101592号に記載されているようにして調製することができる、3-(4-クロロ-フェニル)-2-(2-クロロ-フェニル)-7-(2,2-ジフルオロ-プロピル)-6,7-ジヒドロ-2H,5H-4-オキサ-1,2,7-トリアザ-アズレン-8-オン;米国特許公報第2004/0214838号に記載されているようにして調製することができる、2-(2-クロロ-フェニル)-6-(2,2,2-トリフルオロ-エチル)-3-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-2,6-ジヒドロ-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-7-オン;PCT特許公報WO 02/076949に記載されているようにして調製することができる、(S)-4-クロロ-N-{[3-(4-クロロ-フェニル)-4-フェニル-4,5-ジヒドロ-ピラゾール-1-イル]-メチルアミノ-メチレン}-ベンゼンスルホンアミド(SLV-319)および(S)-N-{[3-(4-クロロ-フェニル)-4-フェニル-4,5-ジヒドロ-ピラゾール-1-イル]-メチルアミノ-メチレン}-4-トリフルオロメチル-ベンゼンスルホンアミド(SLV-326);米国特許第6,432,984号に記載されているようにして調製することができる、N-ピペリジノ-5-(4-ブロモフェニル)-1-(2,4-ジクロロフェニル)-4-エチルピラゾール-3-カルボキサミド;米国特許第6,518,264号に記載されているようにして調製することができる、1-[ビス-(4-クロロ-フェニル)-メチル]-3-[(3,5-ジフルオロ-フェニル)-メタンスルホニル-メチレン]-アゼチジン;PCT特許公報WO 04/048317に記載されているようにして調製することができる、2-(5-(トリフルオロメチル)ピリジン-2-イルオキシ)-N-(4-(4-クロロフェニル)-3-(3-シアノフェニル)ブタン-2-イル)-2-メチルプロパンアミド;米国特許第5,747,524号に記載されているようにして調製することができる、4-{[6-メトキシ-2-(4-メトキシフェニル)-1-ベンゾフラン-3-イル]カルボニル}ベンゾニトリル(LY-320135);WO 04/013120に記載されているようにして調製することができる、1-[2-(2,4-ジクロロフェニル)-2-(4-フルオロフェニル)-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-スルホニル]-ピペリジン);���らびにWO 04/012671に記載されているようにして調製することができる、[3-アミノ-5-(4-クロロフェニル)-6-(2,4-ジクロロフェニル)-フロ[2,3-b]ピリジン-2-イル]-フェニル-メタノン。
【０１８０】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される治療物質は、血管新生因子である。血管新生因子には、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、アンジオゲニン、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ、腫瘍壊死因子、アンギオポエチン、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、肝細胞増殖因子、およびプロリフェリンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８１】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される治療物質は、血栓溶解物質である。血栓溶解物質には、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、α2-プラスミン阻害因子の阻害物質、およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害因子-1の阻害物質、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、スピロノラクトン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、インターロイキン1β変換酵素の阻害物質、ならびに抗トロンビンIIIなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８２】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される治療物質は、抗肥満物質である。抗肥満物質には、アポB/MTP阻害剤、11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ-1阻害剤、ペプチドYY3-36またはその類似体、MCR-4アゴニスト、CCK-Aアゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤、交感神経作動薬、β3アドレナリン作動性受容体アゴニスト、ドーパミンアゴニスト、メラニン細胞刺激ホルモン受容体類似体、5-HT2c受容体アゴニスト、メラニン濃縮ホルモンアンタゴニスト、レプチン、レプチン類似体、レプチン受容体アゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤、ボンベシンアゴニスト、神経ペプチドY受容体アンタゴニスト、サイロミメティック物質、デヒドロエピアンドロステロンまたはその類似体、糖質コルチコイド受容体アンタゴニスト、オレキシン受容体アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト、繊毛様神経栄養因子、ヒトアグーチ関連タンパク質アンタゴニスト、グレリン受容体アンタゴニスト、ヒスタミン3受容体アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、およびニューロメジンU受容体アゴニストが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８３】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される治療物質は、血管損傷部位への好中球および/または単核細胞の動員および/または接着を阻害する作用物質である。このような治療物質は、例えば、細胞接着、走化性、および/またはホーミングを媒介する細胞表面分子の活性(例えば、結合活性、シグナル伝達活性)を阻害することができる。例えば、細胞接着分子(例えば、インテグリン(例えば、β1インテグリン、β2インテグリン、β3インテグリン、β4インテグリン、β5インテグリン、β6インテグリン、β7インテグリン、β8インテグリン)、セレクチン(例えば、E-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチン)、カドヘリン(例えば、E-カドヘリン、P-カドヘリン、N-カドヘリン)、および免疫グロブリンスーパーファミリー接着分子(例えば、LFA-2、LFA-3、CD44))のアンタゴニスト、ならびにサイトカイン受容体のアンタゴニスト(例えば、ケモカイン受容体機能のアンタゴニスト)が、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与され得る。さらに、細胞接着分子またはサイトカインもしくはケモカインのリガンドに結合し、好中球および/または単核細胞上で発現される受容体へのリガンドの結合を阻害する作用物質もまた、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与され得る。
【０１８４】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される治療物質は、心臓治療物質である。心臓障害を治療すると意図される例示的な治療物質には、増殖因子、血管新生物質、カルシウムチャネル遮断薬、血圧降下薬、強心薬、アテローム産生抑制物質、抗凝血薬、β遮断薬、抗不整脈薬、強心配糖体、抗炎症物質、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および原虫感染症を抑制する作用物質、ならびに抗悪性腫瘍薬が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８５】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される心臓治療物質は、カルシウムチャネル遮断薬である。カルシウムチャネル遮断薬には、ニフェジピン、ニカルジピン、およびニモジピンなどのジヒドロピリジン;ジリタゼム(dilitazem)のようなベンゾチアゼピン;ベラパミルのようなフェニルアルキルアミン;ベプリジルのようなジアリールアミノプロピルアミンエーテル;ならびにミベフラジルのようなベンズイミドール置換テトラリンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８６】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される心臓治療物質は、血圧降下薬である。血圧降下薬には、ヒドロクロロチアジド、フロセミド、スピロノラクトン、トリアムテレン、およびアミロリドなどのチアジドを含む利尿剤;クロニジン、グアナベンズ、グアンファシン、メチルドパ、トリメタファン、レセルピン、グアネチジン、グアナドレル、フェントラミン、フェノキシベンズアミン、プラゾシン、テラゾシン、ドキサゾシン、プロパノロール、メトプロロール、ナドロール、アテノロール、チモロール、ベタキソロール、カルテオロール、ピンドロール、アセブトロール、ラベタロールを含む抗アドレナリン作動薬;ヒドラリジン(hydralizine)、ミノキシジル、ジアゾキシド、ニトロプルシドを含む血管拡張薬;およびカプトプリル、ベナゼプリル、エナラプリル、エナラプリラト、ホシノプリル、リシノプリル、キナプリル、ラミプリルを含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤;ロサルタンのようなアンギオテンシン受容体アンタゴニスト;ならびにニフェジン、アムロジピン、フェロジピンXL、イサジピン(isadipine)、ニカルジピン、ベンゾチアゼピン(例えばジルチアゼム)、およびフェニルアルキルアミン(例えばベラパミル)を含むカルシウムチャネルアンタゴニストが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８７】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される心臓治療物質は、抗凝血薬である。抗凝血薬には、ヘパリン、ワルファリン、ヒルジン、マダニ抗凝固ペプチド、低分子量ヘパリン、例えば、エノキサパリン、ダルテパリン、およびアルデパリン、チクロピジン、ダナパロイド、アルガトロバン、アブシキシマブ、およびチロフィバンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８８】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される心臓治療物質は、抗不整脈薬である。抗不整脈薬には、ナトリウムチャネル遮断薬(例えば、リドカイン、プロカインアミド、エンカイニド、およびフレカイニドなど)、βアドレナリン遮断薬(例えばプロプラノロール)、活動電位持続時間の延長物質(prolonger)(例えばアミオダロン)、ならびにカルシウムチャネル遮断薬(例えば、ベラパミル(verpamil)、ジルチアゼム、および塩化ニッケルなど)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。心抑制薬(例えばリドカイン)、強心剤(例えば、イソプロテレノール、ドーパミン、ノルエピネフリンなど)、および複数の心臓用薬剤の組合せ(例えば、心房細動を治療するためのジゴキシン/キニジン)の送達もまた、関心対象である。
【０１８９】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される心臓治療物質は、うっ血性心不全を治療するための作用物質である。うっ血性心不全を治療するための作用物質には、強心配糖体、強心薬、細胞外ループ利尿薬、チアジド利尿薬、カリウムイオン排泄抑制(sparing)利尿薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシン受容体アンタゴニスト、ニトロ血管拡張薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、直接血管拡張薬、α1-アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、および交感神経作動薬が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１９０】
いくつかの特定の場合において、阻害性抗CCR2抗体と同時調剤および/または同時投与される心臓治療物質は、心筋症を治療するのに適した作用物質、例えば、非限定的に、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびフェニレフリンである。
【０１９１】
また、一定量の抗ウイルス剤と組み合わせて一定量の抗体を含む、哺乳動物においてウイルス感染、特にHIV感染を抑制するための組成物も含まれ、その際、抗CCR2抗体の量および抗ウイルス剤の量が合わさって、ウイルス複製、新しい細胞のウイルス感染、またはウイルス負荷を阻害する際に有効である。ヌクレオシド類似体(例えば、AZT、3TC、およびddl)、プロテアーゼ阻害剤、およびケモカイン受容体アンタゴニストを含む多くの抗ウイルス剤が現在、当技術分野において公知であり、これらはHIV感染を阻害することができるが、ウイルス感染症は阻害することができない。
【０１９２】
別の局面において、抗CCR2抗体またはその断片は、抗炎症薬物または抗炎症分子など他の治療物質と、関節炎、アテローム性動脈硬化症、または多発性硬化症などの炎症性障害を有する患者に同時投与され得る。1つの局面において、哺乳動物における炎症性障害を治療するための方法であって、治療的有効量の化合物を抗炎症物質と組み合わせて該哺乳動物に投与する段階を含む方法が提供される。抗炎症物質には、サリチル酸誘導体(アスピリン)、パラ-アミノフェノール誘導体(アセトアミノフェン)、インドールおよびインデン酢酸(インドメタシン)、ヘテロアリール酢酸(ケトロラク)、アリールプロピオン酸(イブプロフェン)、アントラニル酸(メフェナム酸)、エノール酸(オキシカム)、およびアルカノン(ナブメトン)など任意の公知の非ステロイド性抗炎症薬、ならびにコルチコステロイド(corticosteriod)および相対的な糖質コルチコイド(代謝)活性および鉱質コルチコイド(電解質調節)活性に関して生物学的に活性な合成類似体を含む任意の公知のステロイド性抗炎症薬が含まれるが、それらに限定されるわけではない。別の場合において、抗CCR2抗体は、アスピリン(Bayer、Bufferin)、イブプロフェン(Motrin、Advil)、ナプロキセンナトリウム(Aleve)、ケトプロフェン(Orudis KT)、インドメタシン(Indocin)、エトドラク(Lodine)、ジクロフェナクナトリウム(Voltaren)、ロフェコキシブ(Vioxx)、セレコキシブ(Celebrex)、ナブメトン(Relafen)などの非ステロイド系抗炎症薬と組み合わせて、またはプレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルチカゾン、もしくはトリアムシノロンなどのステロイドと組み合わせて、投与される。
【０１９３】
さらに、炎症の治療で使用される他の薬物には、あらゆるヒスタミン受容体アンタゴニストおよびブラジキニン受容体アンタゴニスト、ロイコトリエン受容体アンタゴニストおよびプロスタグランジン受容体アンタゴニスト、ならびに血小板活性化因子受容体アンタゴニストなどのアンタゴニストが含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに別の場合において、抗体または併用療法は、放射線療法、化学療法、光線力学的療法、外科手術、または他の免疫療法治療、すなわち免疫系を標的とする療法と共に施される。さらに別の場合において、抗体は、別の抗体と共に投与される。例えば、抗CCR2抗体は、抗体または炎症を抑制することが公知である他の作用物質、例えば、α-4インテグリン(US2004/0009169)またはIL-8受容体(US2004/0037830)を阻害する抗体または作用物質と共に投与され得る。抗CCR2抗体と同時投与され得るその他の抗体は、米国特許第6,6965,50号;同第6,406,865号;同第6,352,832号;および同第6,084,075号において説明されており、これらの文献の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９４】
これらの組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の抗体または抗原結合部分を含んでよい。「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量および期間において有効な量を意味する。抗体または抗体の一部分の治療的有効量は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに抗体または抗体の一部分が個体において所望の応答を誘発する能力などの因子に応じて変動し得る。治療的有効量はまた、抗体または抗体の一部分の任意の毒性作用または有害作用を、治療的に有益な作用が上回っている量でもある。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を達成するのに必要な投薬量および期間で有効な量を意味する。典型的には、予防的用量は疾患より前または疾患の初期段階に対象において使用されるため、予防的有効量は、治療的有効量より少量でよい。
【０１９５】
投与計画は、最適な所望の応答(例えば、治療的応答または予防的応答)を提供するように調整することができる。例えば、単回ボーラスを投与することができ、いくつかに分割した用量を時間をかけて投与することができ、または、治療状況の緊急性によって必要とされるのに応じて、比例的に用量を減量もしくは増量することができる。単位剤形の非経口組成物を調剤することは、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、治療しようとする哺乳動物対象に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように算出された所定の量の活性化合物を含む。単位剤形の仕様は、(a)抗CCR2抗体またはその一部分の独特な特徴および達成すべき個々の治療効果または予防効果、ならびに(b)個体の感受性の治療のためにこのような抗体を配合する当技術分野につきものの制約に基づいて必然的に決められ、かつそれらに直接的に依存している。
【０１９６】
抗体または抗体の一部分の治療的有効量または予防的有効量の例示的な非限定的範囲は、0.025mg/kg〜50mg/kg、0.1mg/kg〜50mg/kg、0.1mg/kg〜25mg/kg、0.1mg/kg〜10mg/kg、または0.1mg/kg〜3mg/kgである。1つの場合において、抗体は、約5.0〜約6.5の範囲のpHを有し、かつ約1mg/ml〜約200mg/mlの抗体、約1ミリモル濃度〜約100ミリモル濃度のヒスチジン緩衝液、約0.01mg/ml〜約10mg/mlのポリソルベート80またはポリソルベート20、限定されるわけではないがトレハロースもしくはスクロースより選択される約100ミリモル濃度〜約400ミリモル濃度の非還元糖、約0.01ミリモル濃度〜約1.0ミリモル濃度のEDTA二ナトリウム二水和物を含み、かつ、キレート剤に加えて、薬学的に許容される抗酸化剤を任意で含む、無菌水性液剤としての製剤中で投与される。適切な抗酸化剤には、メチオニン、チオ硫酸ナトリウム、タラーゼ、および白金が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば、組成物は、1mM〜約100mMの範囲の濃度、および特に約27mMである濃度でメチオニンを含んでよい。いくつかの場合において、製剤は、20mMクエン酸ナトリウム、pH5.5、140mM NaCl、および0.2mg/mlポリソルベート80からなる緩衝液中の5mg/mlの抗体を含む。投薬量の値は、軽減すべき状態のタイプおよび重症度に応じて変動し得ることに留意すべきである。任意の具体的な対象に対して、個別の必要および組成物の投与を管理または監督する人物の専門的判断に従って経時的に個々の投与計画を調整すべきであること、ならびに本明細書において示す投薬量範囲は、例示にすぎず、かつ特許請求の範囲の組成物の範囲も実践も制限しないと意図されることが、さらに理解されるべきである。
【０１９７】
別の局面は、抗CCR2抗体もしくは抗原結合部分、またはそのような抗体もしくは抗原結合断片を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体または組成物に加えて、診断用物質または治療物質を含み得る。キットはまた、診断方法または治療方法において使用するための取扱い説明書、ならびに、限定されるわけではないが、氷、ドライアイス、STYROFOAM(商標)、発泡体、プラスチック、セロファン、シュリンクラップ、バブルラップ、段ボール、およびスターチピーナッツ(starch peanut)などの包装材料も含んでよい。1つの場合において、キットは、抗体またはそれを含む組成物、および本明細書において説明する方法において使用できる診断用物質を含む。さらに別の場合において、キットは、抗体またはそれを含む組成物、および本明細書において説明する方法において使用できる1種または複数種の治療物質を含む。
【０１９８】
一定量の化学療法剤と組み合わせて一定量の抗体を含む、哺乳動物において癌を抑制するための組成物およびキットであって、化合物、塩、溶媒和物、またはプロドラッグの量および化学療法剤の量が合わさって、異常な細胞増殖を阻害する際に有効である組成物およびキットが提供される。現在、多くの化学療法剤が当技術分野において公知である。いくつかの場合において、化学療法剤は、有糸分裂阻害物質、アルキル化剤、抗代謝産物、インターカレートする抗生物質、ケモカイン阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生体応答調節物質、抗ホルモン、例えば、抗アンドロゲン、および抗血管新生剤からなる群より選択される。
【０１９９】
使用する診断方法
別の局面において、診断方法が提供される。抗CCR2抗体は、インビトロまたはインビボで生物試料中のCCR2を検出するのに使用され得る。1つの場合において、それを必要とする対象においてCCR2発現細胞の存在または位置を診断するための方法であって、対象に抗体を注射する段階、抗体がどこに結合したか位置確認することによって対象におけるCCR2発現を測定する段階、対象における発現を、正常な参照対象の発現または標準と比較する段階、およびそれらの細胞の存在または位置を診断する段階を含む方法が提供される。抗CCR2抗体はまた、炎症および/または単球のような免疫細胞の組織中への浸潤のマーカーとしても使用され得る。
【０２００】
抗CCR2抗体は、非限定的にELISA、RIA、フローサイトメトリー、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット、または免疫沈降法を含む、従来のイムノアッセイ法において使用され得る。抗CCR2抗体は、ヒトからCCR2を検出するのに使用され得る。別の場合において、抗CCR2抗体は、カニクイザルまたはアカゲザルからCCR2を検出するのに使用され得る。別の場合において、抗CCR2抗体は、マウスおよびラットなどのげっ歯動物からCCR2を検出するのに使用され得る。
【０２０１】
また、生物試料を抗CCR2抗体と接触させる段階、および結合された抗体を検出する段階を含む、生物試料中のCCR2を検出するための方法も提供される。1つの場合において、抗CCR2抗体は、検出可能な標識で直接標識される。別の場合において、抗CCR2抗体(第1の抗体)は標識されず、その抗CCR2抗体に結合できる二次抗体または他の分子が標識される。当業者に周知のように、特定の種およびクラスの第1の抗体に特異的に結合することができる二次抗体が選択される。例えば、抗CCR2抗体がヒトIgGである場合は、二次抗体は抗ヒトIgGであり得る。抗体に結合できる他の分子には、非限定的に、プロテインAおよびプロテインGが含まれ、いずれも、例えばPierce Chemical Co.から市販されている。
【０２０２】
抗体または二次抗体に対する適切な標識は、前記に開示されており、様々な酵素、補欠分子団、蛍光性材料、発光性材料、および放射性材料が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ;適切な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれ;適切な蛍光性材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれ;発光性材料の例には、ルミノールが含まれ;適切な放射性材料の例には、125I、131I、35S、または3Hが含まれる。
【０２０３】
他の場合において、CCR2は、検出可能な物質で標識されたCCR2標準物質および非標識抗CCR2抗体を使用する競合イムノアッセイ法により、生物試料中で分析され得る。このアッセイ法では、生物試料、標識されたCCR2標準物質、および抗CCR2抗体を混合し、かつ、非標識抗体に結合された標識CCR2標準物質の量を測定する。生物試料中のCCR2の量は、抗CCR2抗体に結合された標識CCR2標準物質の量に反比例する。
【０２０４】
上記に開示したイムノアッセイ法は、いくつかの目的のために使用することができる。例えば、抗CCR2抗体は、培養細胞中のCCR2を検出するのに使用することができる。1つの場合において、抗CCR2抗体は、様々な化合物で処理された細胞の表面のCCR2量を測定するのに使用される。この方法は、CCR2タンパク質レベルを調節する化合物を同定するのに使用され得る。この方法によれば、1つの細胞試料を試験化合物で一定期間処理し、同時に別の試料を未処理のままにする。CCR2の全発現を測定する場合、細胞を溶解し、かつ本明細書において説明するイムノアッセイ法の内の1つを用いてCCR2の全発現を測定する。処理細胞および未処理細胞におけるCCR2の全発現を比較して、試験化合物の影響を判定する。
【０２０５】
CCR2の全発現を測定するための好ましいイムノアッセイ法は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学である。細胞表面のCCR2発現を測定する場合、細胞を溶解せず、本明細書において説明するイムノアッセイ法の内の1つを用いてCCR2の細胞表面レベルを測定する。CCR2の細胞表面レベルを測定するための好ましいイムノアッセイ法は、ビオチンまたは125Iなど検出可能な標識で細胞表面タンパク質を標識する段階、抗CCR2抗体を用いてCCR2を免疫沈降させる段階、および次いで、標識されたCCR2を検出する段階を含む。
【０２０６】
CCR2の局在化、例えば細胞表面レベルを測定するための別のイムノアッセイ法は、免疫組織化学を使用することによる。CCR2の細胞表面レベルを検出するためのイムノアッセイ法は、フルオレセインまたはフィコエリトリンなど適切な蛍光体で標識された抗CCR2抗体を結合する段階、およびフローサイトメトリーを用いて一次抗体を検出する段階を含む。別の場合において、抗CCR2抗体は標識されず、かつその抗CCR2抗体に結合できる二次抗体または他の分子が標識される。ELISA、RIA、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、免疫組織化学、内在性膜タンパク質の細胞表面標識、および免疫沈降法などの方法が、当技術分野において周知である。例えば、前記のHarlowおよびLaneを参照されたい。さらに、イムノアッセイ法は、CCR2の活性化または阻害のいずれかについて多数の化合物を試験するために、ハイスループットなスクリーニング用にスケールアップすることもできる。
【０２０７】
抗CCR2抗体はまた、組織中または組織由来の細胞中のCCR2レベルを測定するために使用することもできる。いくつかの場合において、この組織は罹病組織である。いくつかの場合において、この組織は組織生検材料である。この方法のいくつかの場合において、組織またはその生検材料は、患者から摘出される。次いで、組織または生検材料は、上記の方法によって、例えば、CCR2の全発現、CCR2の細胞表面レベル、またはCCR2の局在化を測定するためのイムノアッセイ法において使用される。このような方法を用いて、ある組織が高レベルのCCR2を発現するかどうかを判定することができ、このことは、その組織が抗CCR2抗体を用いた治療の標的であることを示し得る。
【０２０８】
これらの抗体はまた、CCR2を発現する組織および器官を特定するためにインビボで使用することもできる。いくつかの場合において、抗CCR2抗体は、CCR2を発現する細胞を特定するために使用される。
【０２０９】
この方法は、検出可能に標識された抗CCR2抗体またはそれらを含む組成物を、そのような診断検査を必要とする患者に投与する段階、およびその患者を画像解析に供して、CCR2を発現する組織の位置を決定する段階を含む。画像解析は、医薬分野において周知であり、X線解析、磁気共鳴画像法(MRI)、またはコンピュータ断層撮影法(CT)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。抗体は、インビボ画像処理に適した任意の薬剤、例えば、X線解析用に使用され得るバリウムのような造影剤、またはMRIもしくはCT用に使用され得るガドリニウムキレートのような磁性造影剤で標識することができる。他の標識物質には、99Tcのような放射性同位体が含まれるが、これに限定されるわけではない。別の場合において、抗CCR2抗体は標識されず、検出可能であり抗CCR2抗体に結合できる二次抗体または他の分子を投与することによって画像化される。別の場合において、生検材料は、関心対象の組織がCCR2を発現するかどうかを判定するために、患者から採取される。
【０２１０】
いくつかの場合において、検出可能に標識された抗CCR2は、蛍光体を含む。特定の場合において、蛍光体は、近赤外蛍光色素、ジニトロフェニル、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタアルデヒドおよびフルオレサミン、TEXAS RED(商標)、RHODAMINE GREEN(商標)、OREGON GREEN(商標)、CASCADE BLUE(商標)、フィコエリトリン、CY3(商標)、CY5(商標)、CY2(商標)、CY7(商標)、クマリン、インフラレッド40、MR 200、IRD 40、ALEXA FLUOR(商標)、テトラメチルローダミン、PACIFIC BLUE(商標)、SYBR(商標)、およびBODIPY(商標)からなる群より選択される。別の場合において、蛍光体は、次の化合物の内の1つ(括弧内にそれらの最大発光波長(単位nm)を示す)を含む:CY2(商標)(506)、GFP(赤方偏移(Red Shifted))(507)、YO-PRO(登録商標)-1(509)、YOYO(登録商標)-1(509)、Calcein(517)、FITC(518)、FLUORX(登録商標)(519)、ALEXA(登録商標)(520)、Rhodamine 110(520)、5-FAM(522)、OREGON GREEN(登録商標)500(522)、OREGON GREEN(登録商標)488(524)、RIBOGREEN(登録商標)(525)、RHODAMINE GREEN(登録商標)(527)、Rhodamine 123(529)、MAGNESIUM GREEN(登録商標)(531)、CALCIUM GREEN(登録商標)(533)、TO-PRO(登録商標)-1(533)、TOTO(登録商標)-1(533)、JOE(548)、BODIPY(登録商標)530/550(550)、Dil(565)、BODIPY(登録商標)(568)、BODIPY(登録商標)558/568(568)、BODIPY(登録商標)564/570(570)、CY3(登録商標)(570)、ALEXA(登録商標)546(570)、TRITC(572)、MAGNESIUM ORANGE(登録商標)(575)、Phycoerythrin R&B(575)、Rhodamine Phalloidin(575)、CALCIUM ORANGE(登録商標)(576)、Pyronin Y(580)、Rhodamine B(580)、TAMRA(582)、RHODAMINE RED(登録商標)(590)、CY3.5(登録商標)(596)、ROX(608)、CALCIUM CRIMSON(商標)(615)、ALEXA(登録商標)594(615)、TEXAS RED(商標)(615)、Nile Red(628)、YO-PRO(登録商標)-3(631)、YOYO(登録商標)-3(631)、R-phycocyanin(642)、C-Phycocyanin(648)、TO-PRO(登録商標)-3(660)、TOTO(登録商標)-3(660)、DiD DilC(5)(665)、CY5(商標)(670)、チアジカルボシアニン(Thiadicarbocyanine)(671)、およびCy5.5(商標)(694)。
【０２１１】
使用する治療方法
別の局面において、それを必要とする患者に抗CCR2抗体を投与することによって、CCR2活性を阻害するための方法が提供される。本明細書において説明するタイプの抗体のうちいずれかを治療的に使用することができる。様々な場合において、抗CCR2抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。いくつかの場合において、抗体またはその抗原結合部分は、CCR2の第1の細胞外ループおよび/または第2の細胞外ループに結合する。この抗体またはその抗原結合部分は、好ましくは、CCR2の第3の細胞外ループにもN末端ドメインにも結合しない。
【０２１２】
さらに別の場合において、CCR2はヒトであり、患者はヒト患者である。あるいは、患者は、抗CCR2抗体が交差反応するCCR2を発現する哺乳動物でもよい。抗体は、獣医学的目的のために、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応するCCR2を発現する非ヒト哺乳動物に投与することができる。このような動物モデルは、抗体の治療的有効性を評価するために有用な場合がある。
【０２１３】
1つの局面において、治療的有効量の抗CCR2抗体を対象に投与することによって、対象においてCCR2を介した障害を治療するか、治療を助けるか、予防するか、または予防を助けるための方法が提供される。本明細書において使用される場合、「CCR2を介した障害」という用語は、その障害を患っている対象における高レベルのCCR2発現またはCCR2活性の存在が、その障害の病態生理の原因またはその障害の悪化をもたらす要因のいずれかであると示されているか、または推測される、疾患および他の障害を含むと意図される。このような障害は、例えば、その障害を患っている対象の罹患細胞または罹患組織中の細胞表面のCCR2レベルの上昇によって、または障害の病理の一因となるかもしくは障害の悪化をもたらす、好塩基球、単球、もしくはリンパ球などの細胞型におけるCCR2を介した活性の増大によって、または炎症部位におけるMCP-1のようなCCR2リガンドのレベルの上昇によって証明され得る。CCR2発現の増大は、例えば、抗CCR2抗体を用いて検出することができる。CCR2活性の増大は、G-タンパク質活性化の増大、F-アクチン重合、またはCCR2を発現する細胞の走化性、例えば、MCP-1もしくは他のCCR2リガンドに応答した走化性の増大に基づいて検出することができる。
【０２１４】
1つの局面において、CCR2を介した障害は、線維化を特徴とする。本明細書において使用される場合、「線維化」という用語は、組織損傷に応答した線維性材料(例えば細胞外基質)の過剰な沈着および代謝を特徴とする病理学的状態を意味する。多くの場合において、線維化は、線維芽細胞または星状細胞の活性化および増殖、ならびにコラーゲン蓄積を招く、慢性的または過剰な組織傷害が原因でおかしくなってしまった正常な修復プロセス(例えば創傷治癒)に相当する。線維化状態には、心臓疾患のような血管疾患、脳疾患、および末梢血管疾患、ならびに眼、皮膚、腎臓、肺、消化管、および肝臓などの主要な組織および器官系に関連している線維増殖性障害が含まれる(Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004); Bataller, RおよびBrenner, D., J. Clin. Invest. 115:209-218 (2005))。他の原因は、化学療法薬、放射線によって誘発された線維化、ならびに損傷および熱傷である。線維化状態は広範な種類(group)の病理を網羅するものの、これらの状態の内の大半について、線維性組織の蓄積をもたらす一般的メカニズムは多くの共通要素を有すると考えられている。しばしば、状態は、炎症細胞の流入に応答して開始され、浸潤細胞(例えば、マクロファージ、T細胞)と組織内の常在細胞(例えば、星状細胞、筋線維芽細胞、またはクッパー細胞)の間の、それに続くサイトカインシグナル伝達経路によって永続化される。例えば、MCP-1は、肺のいくつかの疾患において役割を果たすことが示されており(Rose CE Jr, Sung SS, Fu SM. Microcirculation 10:273-288 (2003))、かつ、CCR2欠損マウスは肺線維症が発症しないように保護される(Moore BB, et al. Protection from Pulmonary Fibrosis in the Absence of CCR2 Signaling. J. Immunol. 167: 4368-4377 (2001))ことから、肺におけるこの受容体の重要な役割が示唆される。同様に、周皮細胞は、強皮症の発症に関与している主要な線維形成性細胞型であり、PDGF 受容体型チロシンキナーゼ阻害剤(RTKI) は、周皮細胞の増殖を減速させ、この進行性疾患の患者における皮膚病変を抑制することが示されている。腎臓では、白血球浸潤が、慢性腎臓疾患において尿細管間質性の炎症および線維化を媒介する上で主要な役割を果たしている。Vielhauerおよび同僚は、閉塞性腎症のマウスモデルにおいて、蓄積するマクロファージおよびCD3+リンパ球上のCCR2およびCCR5の発現が、組織損傷部位における進行性線維化と相互に関係していることを確かめた(Vielhauer V, et al. J. Am. Soc. Nephrol. 12:1173-1187 (2001))。
【０２１５】
本明細書において使用される場合、「線維化」という用語はまた、「線維芽細胞蓄積およびコラーゲン沈着」の同意語としても使用される。線維芽細胞は結合組織細胞であり、身体全体の結合組織中に分散している。線維芽細胞は、I型コラーゲンおよび/またはIII型コラーゲンを含む軟質の細胞外基質を分泌する。組織への損傷に応答して、近くの線維芽細胞または星状細胞は、創傷中に遊走し、増殖し、大量のコラーゲン性細胞外基質を産生する。コラーゲンは、グリシンおよびプロリンに富んだ繊維性タンパク質であり、細胞外基質および結合組織、軟骨、ならびに骨の主成分である。コラーゲン分子は、α鎖と呼ばれる三本鎖らせん構造体であり、ロープ状のらせん体中で互いに巻き付いている。コラーゲンは、いくつかの形態または型で存在する;これらの内で、最も一般的なI型は、皮膚、腱、および骨中に存在し;III型は、皮膚、血管、および内臓中に存在する。例示的な線維化状態には、次のものが含まれるが、それらに限定されるわけではない:線維化を伴う肺疾患、例えば、特発性肺線維症、放射線によって誘発される線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシンによって誘発される肺線維症、慢性喘息、ケイ肺症、アスベストによって誘発される肺線維症、急性肺傷害および急性呼吸困難(細菌性肺炎によって誘発されるもの、外傷によって誘発されるもの、ウイルス性肺炎によって誘発されるもの、人工呼吸器によって誘発されるもの、非肺炎性敗血症(non-pulmonary sepsis)によって誘発されるもの、および吸引によって誘発されるものを含む);損傷/線維化(腎線維症)を伴う慢性腎症、例えば、狼瘡、糖尿病、強皮症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、同種移植片、ループス、およびアルポート;消化管線維症、例えば、強皮症、および放射線によって誘発される消化管線維症;肝線維症、例えば、肝硬変、アルコールによって誘発される肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変、感染症またはウイルスによって誘発される肝線維症(例えば慢性HCV感染症)、および自己免疫性肝炎;頭頸部線維症、例えば、放射線によって誘発されるもの;角膜瘢痕化、例えば、LASIX(商標)、角膜移植、および線維柱帯切除術;肥厚性の瘢痕化およびケロイド、例えば、熱傷によって誘発されたものおよび外科手術によるもの;ならびに他の線維性疾患、例えば、サルコイドーシス、強皮症、脊髄損傷/線維化、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、およびペーロニー病。
【０２１６】
1つの局面において、CCR2を介した障害は、病理学的炎症を特徴とする。本明細書において使用される場合、「病理学的炎症」という用語は、非限定的に、喘息、アテローム性動脈硬化症、AIDS認知症、糖尿病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、移植拒絶、移植片対宿主病、多発性硬化症(特に、それ以上の脱髄を抑制するため)、腫瘍、腫瘍転移、腎炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、心筋虚血、および慢性前立腺炎、肥満、代謝症候群を含む障害に関連した不適切かつ/または慢性の炎症を意味する。このような炎症は、浸潤する白血球を含む炎症細胞の応答の高まりを特徴とする。時間とともに、このような病理学的炎症はしばしば、不適切な炎症の領域にある組織の損傷をもたらす。したがって、CCR2に結合し阻害する抗体またはその抗原結合部分の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、病理学的炎症を有する対象を治療する方法が提供される。
【０２１７】
また、抗体またはその抗原結合断片を用いて、MCP-1、MCP-2、MCP-3、およびMCP-4を含むケモカインの結合によるCCR2の活性化が示唆されている障害を治療することもできる。
【０２１８】
拮抗性の抗CCR2抗体またはその抗原結合断片(例えば、4.40および/もしくは4.9またはそれらの抗原結合断片)を用いて、アレルギー性呼吸器疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、間質性肺疾患(ILD)(例えば、特発性肺線維症、または関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、もしくは皮膚筋炎に関連したILD)、慢性閉塞性肺疾患、アナフィラキシーまたは過敏性応答、薬物アレルギー(例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対するもの)、刺虫アレルギー、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、脊椎関節症、強皮症、乾癬、ならびに炎症性皮膚疾患、例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、じんま疹、血管炎(例えば、壊死性血管炎、皮膚血管炎、および過敏性血管炎)を含む、炎症性またはアレルギー性の疾患および状態を治療することができる。
【０２１９】
拮抗性の抗CCR2抗体またはその抗原結合断片(例えば、4.40および/もしくは4.9またはそれらの抗原結合断片)を用いて、自己免疫疾患を治療することができる。自己免疫障害の例には、アジソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多腺性内分泌障害、紫斑病、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギラン・バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼疾患が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２２０】
特定の場合において、拮抗性抗CCR2抗体で治療される自己免疫疾患は、関節リウマチ(RA)である。TH1障害であるRAは、一般的なヒト自己免疫疾患であり、コーカサス人の有病率は約1％であり(Harris, B. J. et al., 1997, Textbook of Rheumatology 898-932)、現在250万人のアメリカ人が罹患している。RAは、関節軟骨の進行的破壊をもたらす、滑膜関節の慢性炎症ならびに活性化されたT細胞、マクロファージ、およびプラズマ細胞による浸潤を特徴とする。これは、関節疾患の最も重症な形態である。
【０２２１】
さらに別の局面において、拮抗性抗CCR2抗体で治療される自己免疫疾患は、多発性硬化症(MS)である。MSもまたTH1障害であり、最も一般的な中枢神経系(CNS)脱髄性疾患であり、北米での罹患者は350,000名(0.1％)であり、全世界の罹患者は110万人である。一般に、MSは、抗原(Ag)提示細胞(APC)上で発現されるMHCクラスII分子と結合した特異的なミエリンポリペプチドを認識する炎症誘発性CD4 T(Th1)細胞および単球によってある程度媒介される、自己免疫疾患であるとみなされている。
【０２２２】
拮抗性の抗CCR2抗体またはその抗原結合断片(例えば、4.40および/もしくは4.9またはそれらの抗原結合断片)を用いて、ヒトI型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病(IDDM)、すなわち、ランゲルハンスの膵島中のβ細胞の自己免疫性破壊を特徴とする疾患を治療することができる。β細胞の枯渇により、血液中のグルコースのレベルを調節できなくなる。ヒトでは、長期の前駆症状期間が、糖尿病の発症に先行する。この期間中に、膵臓β細胞の機能が徐々に失われる。疾患の発症は、インスリン、グルタミン酸脱炭素酵素、およびチロシンホスファターゼIA2(IA2)に対する自己抗体の存在によって示唆される。
【０２２３】
また、拮抗性の抗CCR2抗体またはその抗原結合断片(例えば、4.40および/もしくは4.9またはそれらの抗原結合断片)を用いて、神経因性疼痛を治療することもできる。CCR2を欠損したマウスは、軽減された神経因性疼痛を有することが示されている(Abbadie et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(13): 7947-52 (2003))。本明細書において使用される場合、「神経因性疼痛」という用語は、神経損傷に起因する疼痛を意味する。神経因性疼痛は、小さな皮膚神経または筋肉もしくは結合組織中の小さな神経に関わる急性組織損傷によって引き起こされる疼痛である侵害受容性疼痛とは区別される。侵害受容性メカニズムを伴う疼痛は、Myers, Regional Anesthesia 20:173-184 (1995)において説明されているように、通常、持続期間が組織修復期間に限定されており、一般に、入手可能な鎮痛薬またはオピオイドによって緩和される。神経因性疼痛は、典型的には、長期にわたるかまたは慢性であり、しばしば、初期の急性組織損傷後数日目または数ヶ月目に発生する。神経因性疼痛は、持続的な自発痛ならびに異痛、すなわち、通常は痛くない刺激に対する疼痛応答を伴い得る。また、神経因性疼痛は、通常は取るに足らない針のひと刺しのような疼痛刺激に対する目立った応答が認められる痛覚過敏も特徴とし得る。
【０２２４】
拮抗性抗CCR2抗体は、末梢神経、後根神経節、脊髄、脳幹、視床、または脳皮質の障害に起因する神経因性疼痛を緩和するにあたって有用である。この方法は、疼痛の病因に関わらず、神経因性疼痛を緩和するにあたって有用である。例えば、ある方法を用いて、神経腫;神経圧迫;神経挫滅、神経伸展、または不完全な神経切断;モノニューロパシーまたは多発性ニューロパシーなどの末梢神経障害に起因する神経因性疼痛を緩和することができる。また、ある方法を用いて、後根神経節圧迫;脊髄の炎症;挫傷、腫瘍、もしくは脊髄の半側切断;脳幹、視床もしくは脳皮質の腫瘍;または脳幹、視床、もしくは脳皮質への外傷などの障害に起因する神経因性疼痛を緩和することもできる。
【０２２５】
また、拮抗性の抗CCR2抗体またはその抗原結合断片(例えば、4.40および/もしくは4.9またはそれらの機能的断片)を用いて、アテローム性動脈硬化症を治療することもできる。アテローム斑は、数十年に渡って発達し、炎症細胞浸潤、平滑筋細胞増殖、細胞外基質の蓄積、線維性被膜の形成、および血管新生を伴う。(Bayes-Genis et al. Circ. Res. 86:125-130 (2000))。走化性は、アテローム性動脈硬化症の初期の発症に関与している。細胞集団は、血管壁の内側部分に向かって遊走し、新生内膜を生じ、アテローム斑の形成を招く。例えば、単球走化性は、損傷された動脈壁におけるアテローム性動脈硬化症の発症初期に発現される単球走化性タンパク質1(MCP-1)によって誘導される。(Furukawa et al. Circ. Res. 84:306-314 (1999); Han et al. J. Lipid Res. 40:1053 (1999))。CCR2+/+マウス由来ではなくCCR2-/-マウス由来の骨髄を、食餌誘発性アテローム性動脈硬化症の影響を受けやすいマウス系統であるApoE3-Leidenマウスに移植すると、アテローム発生が低減したことから、CCR2を介したMCP-1シグナル伝達がアテローム性動脈硬化症の一因であることが示唆される(Guo et al. (2003) Arterioscler Thromb Vasc Biol. ;23(3):447-53)。したがって、CCR2アンタゴニスト抗体、ならびに特に、CCR2の第1の細胞外ループおよび/または第2の細胞外ループに結合するアンタゴニスト抗体を対象に投与して、アテローム性動脈硬化症の発病率を低下させるか、アテローム性動脈硬化症を治療するか、またはアテローム性動脈硬化症の治療を助けることができる。
【０２２６】
また、拮抗性の抗CCR2抗体またはその抗原結合断片(例えば、4.40および/もしくは4.9またはそれらの抗原結合断片)を用いて、肥満を治療することもできる。肥満では、脂肪組織が多数の単球を含むことが実証されている。これらの単球は、脂肪沈着または代謝症候群と一般に呼ばれる肥満に一般に関連した様々な続発症の発症のいずれかの一因となり得る。代謝症候群には、糖尿病発症のような変化が含まれる。
【０２２７】
また、拮抗性の抗CCR2抗体またはその抗原結合断片(例えば、4.40および/もしくは4.9またはそれらの抗原結合断片)を用いて、血管系、特に動脈、例えば冠動脈の狭窄または再狭窄、例えば、血管インターベンション(例えば、外科的、治療的、もしくは機械的なインターベンション)、ならびに新生内膜過形成に起因する狭窄または再狭窄を治療することもできる。例えば、典型的には血管管腔の開口部の狭小化をもたらす再狭窄は、血管損傷に起因し得る。血管損傷には、血管移植処置、バルーンを用いて実施される血管形成術を含む血管形成術、粥腫切除術、レーザーもしくは他の適切な方法(例えば、経皮経管的冠動脈形成術(PTCA))、ステント留置(例えば、機械的もしくは生物学的な血管内ステント留置)、血管バイパス処置、またはそれらの組合せ、ならびに、狭窄した血管または閉塞した血管を治療するために使用される他の処置によってもたらされるものが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０２２８】
また、拮抗性の抗CCR2抗体またはその抗原結合断片(例えば、4.40および/もしくは4.9またはそれらの抗原結合断片)を用いて、同種移植片拒絶または移植片対宿主病を含む移植片拒絶(例えば移植時のもの)および臓器移植に関連した動脈硬化症を治療することもできる。
【０２２９】
CCR2のアンタゴニストである抗体またはその抗原結合断片は、HIV感染症の治療薬として使用され得る。HIV-1およびHIV-2は、ヒトの後天性免疫不全症候群(AIDS)の病原体である。AIDSは、HIV感染個体におけるCD4+ Tリンパ球の枯渇をいくらかもたらす。HIV-1は主としてTリンパ球、単球/マクロファージ、樹状細胞、および中枢神経系においてはミクログリアに感染する。これらの細胞はすべて、HIV-1およびHIV-2の受容体として役立つCD4糖タンパク質を発現する。標的細胞へのHIVの効率的な侵入は、ウイルスの外側エンベロープ糖タンパク質gp120のアミノ末端CD4ドメインへの結合に依存する。
【０２３０】
さらに、CCR2は、HIV-1の補助受容体の役割を果たすことも示されている(Frade et al. (1997) J Clin Invest.;100(3):497-502)。ウイルス結合後、HIV-1エンベロープ糖タンパク質は、ウイルスと宿主細胞膜の融合を媒介して、侵入プロセスを完了させる。感染細胞表面で発現されるHIV-1エンベロープ糖タンパク質によって指示される膜融合により、細胞と細胞が融合して、シンシチウムを生じる。
【０２３１】
CCR2のアンタゴニストである抗体およびその抗原結合断片は、加齢黄斑変性症(AMD)、ブドウ膜炎、および角膜感染症を含む、様々な眼科学的状態の治療用の治療薬として使用され得る。
【０２３２】
加齢黄斑変性症(AMD)
CCR2は、加齢黄斑変性症患者、ならびに網膜色素線条症患者、強度近視患者、眼ヒストプラスマ症患者で観察される脈絡膜新生血管(CNV)発達の際のマクロファージ動員において役割を果たしていることが示されている(Tsutsumi, C. et al. Journal of Leukocyte Biology 74:25-32, 2003)。
【０２３３】
ブドウ膜炎
CCR2の一塩基多型とそのリガンド(MCP-1)の関連が、急性特発性前部ブドウ膜炎(Yeo, TK, et al. Cytokine 35:29-35 2006)および特発性免疫介在性後区ブドウ膜炎(Ahad, MA, et al. Mol Vis 13:388-396 2007)の患者において実証されている。
【０２３４】
角膜感染症(細菌性):
CCL2は、角膜感染症の間の多形核好中球(PMN)動員の調節において役割を果たしていることが示されている(Xue, M. L, et al. Immunology and Cell Biology 85:525-531 2007)。PMNは、角膜において細菌を排除し、創傷治癒を促進するために不可欠であるが、これらの細胞の残存が、慢性炎症性疾患をもたらす場合がある。
【０２３５】
CCR2のアンタゴニストである抗体およびその抗原結合断片は、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫、ホジキン病、ならびに前立腺、膀胱、乳房、子宮頸、結腸、肺、肝臓、または胃の固形腫瘍および癌といった癌腫を含む、様々な固形腫瘍および癌の治療用の治療薬として使用され得る。
【０２３６】
前立腺癌
MCP-1は、前立腺癌の増殖および浸潤のためのパラクリン因子およびオートクリン因子として作用することが示されており(Lu, Y. et al. The Prostate 66:1311-1318, 2006)、CCR2発現は、前立腺癌進行と相関があることが示されている(Lu, Y. et al. Journal of cellular biochemistry 101:676-685, 2007)。中和性抗MCP-1抗体の全身送達は、マウスにおいて前立腺癌の腫瘍退縮を誘導することが示されている(Loberg, R. D., Cancer Res 67:9417-9424 2007)。
【０２３７】
乳癌
腫瘍関連マクロファージは、腫瘍の免疫監視および発達において決定的に重要な役割を果たすと考えられており、リンパ球の活性化および動員は、MCP-1を含むケモカインによって調節されている。乳癌におけるCCR2多形性に関して有意な関連が実証されている(Zafiropoulos, A., N. et al. Journal of medical genetics 41:e59 2009)。CCL2/CCR2経路はまた、腫瘍進行、血管新生、および脈管血管新生を促進する骨髄性サプレッサー細胞を、乳癌、卵巣癌、および胃癌を含む癌に動員する際に中心的な役割を果たすことも示されている(Huang, B., et al. Cancer letters 252:86-92, 2007).。
【０２３８】
黒色腫
また、MCP-1機能を妨害することにより、マウスの悪性黒色腫において腫瘍関連マクロファージの動員が阻害され、腫瘍の血管新生および増殖が妨げられることも示されている(Koga, M. et al. Biochemical and biophysical research communications 365:279-284, 2008)。
【０２３９】
肝臓癌
CCR2の妨害により、マトリックスメタロプロテイナーゼ2の主要供給源であり、肝臓腫瘍形成の間の新血管新生(neovavascularization)を促進する肝臓星状細胞のトラフィッキングが低減することが示されている(Yang, X. et al. International journal of cancer 118:335-345, 2006)。
【０２４０】
子宮頸癌
CCR2は、扁平上皮内病変から子宮頸部新生物を発達する際に腫瘍血管新生をもたらすマクロファージ動員において役割を果たすことが示されている(Coelho, A., et al. Gynecologic oncology 96:760-764, 2005; .Coelho, A., et al. Gynecologic and obstetric investigation 64:208-212, 2007)。
【０２４１】
卵巣癌
CCL2/CCR2経路はまた、腫瘍進行、血管新生、および脈管血管新生(vasculoangiogenesis)を促進する骨髄性サプレッサー細胞を、乳癌、卵巣癌、および胃癌を含む癌に動員する際に中心的な役割を果たすことも示されている(Huang, B., et al. Cancer letters 252:86-92, 2007)。
【０２４２】
抗体は、1回または複数回投与され得る。抗体は、毎日4回〜6ヶ月またはそれ以上の期間毎に1回、投与され得る。投与する段階は、毎日3回、毎日2回、毎日1回、2日毎に1回、3日毎に1回、毎週1回、2週間毎に1回、毎月1回、2ヶ月毎に1回、3ヶ月毎に1回、および6ヶ月毎に1回などのスケジュールに従ってよい。抗体はまた、ミニポンプを介して継続的に投与してもよい。抗体は、粘膜経路、頬側経路、鼻腔内経路、吸入経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、非経口経路、腫瘍内経路、または局所的経路を介して投与され得る。抗体は、局所的または全身的に投与され得る。
【０２４３】
抗体は、1回、少なくとも2回、または少なくとも、状態が治療、軽減、もしくは治癒されるまでの期間、投与され得る。抗体は、一般に、本明細書において説明するように薬学的組成物の一部分として投与される。抗体の投薬量は、一般に、0.1mg/kg〜100mg/kg、0.5mg/kg〜50mg/kg、1mg/kg〜20mg/kg、または1mg/kg〜10mg/kgの範囲である。抗体の血清濃度は、当技術分野において公知である任意の方法によって測定することができる。
【０２４４】
以下の実施例は例証のために過ぎず、範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２４５】
実施例1
抗CCR2抗体を産生するハイブリドーマの作製
ヒトIgG2抗体およびヒトIgG4抗体を産生する8〜10週齢のXENOMOUSE(商標)マウスを、後肢の足蹠において、CCR2B(Genbank MN000648、SEQ ID NO: 204)をトランスフェクトした300-19細胞(TITERMAX(商標)Gold Adjuvant、Sigma、カタログ番号T2684、ロット番号K1599に溶かした107個の細胞/投与/マウス;体積比50/50で調製)で免疫した。3〜8週間の期間に渡って、リン酸アルミニウムゲルアジュバント(Aluminium Phosphate Gel Adjuvant)(カタログ番号1452-250、バッチ番号8937、HCI Biosector(5ul/マウス/追加免疫))およびqCpG(IMMUNEASY(商標)マウスアジュバント(Mouse Adjuvant))(カタログ番号303101;ロット番号11551249; Qiagen(15ul/マウス/追加免疫))に溶かしたブースター注射液をマウスに5〜9回注射した。融合の4日前に、PBSに溶かした最後の注射液をマウスに注射した。免疫したマウスに由来する脾臓およびリンパ節のリンパ球を採取し、非分泌性骨髄腫P3-X63-Ag8.653細胞株と融合させた。これらの融合細胞を、以前に説明されているように(GalfreおよびMilstein, Methods Enzymol. 73:3-46 (1981))、HAT選択に供した。CCR2に特異的なヒト抗体を分泌するハイブリドーマすべてのパネルを回収した。FACS解析によって評価して、いくつかの抗体がCCR2に結合することを確認した。さらなる研究のためにハイブリドーマを選択した。一部を表6に挙げる。
【０２４６】
表2に示すハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に従って、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209に寄託した。ハイブリドーマに以下のアクセッション番号を割り当てた。
【０２４７】
（表２）
0005685535.tif 000007
【０２４８】
実施例2
抗CCR2抗体の配列決定
作製した抗体の構造を解析するために、抗CCR2モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに由来する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む断片をコードする核酸をクローニングした。CCR2抗体の軽鎖および軽鎖をクローニングし、配列を確認した。例えば、4.40.2抗体の場合は次のようにした:
RNEASY(商標)MINI KIT(Qiagen)を用いてポリ(A)+mRNAを単離し、かつオリゴ(dT)プライミングを使用するADVANTAGE RT-for-PCRキット(BD Biosciences)を用いて、mRNAからcDNAを合成した。表3に列挙するプライマーを用いて、クローン4.40.2のオリゴ(dT)プライミングしたcDNAを増幅した。増幅は、PFUULTRA HIGH-FIDELITYポリメラーゼ(Stratagene)およびPTC-200 DNA Engine(MJ Research)を用いて、次のサイクルで実行した:95℃で2分間;25×(95℃で20秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間);72℃で10分間。重鎖および軽鎖の発現ベクター中にPCRアンプリコンをクローニングした。次いで、標準プロトコールを用いて、MAX EFFICIENCY DH5α化学的コンピテント細胞(Invitrogen)にベクターをトランスフォームした。Grills 16th BDTv3.1/dGTP化学(Applied Biosystems Inc)および3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc)を用いてクローンの配列を確認した。抗体のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列から、各抗体鎖の遺伝子使用を確認した。MACVECTOR(商標)ソフトウェアプログラムおよびGENEWORKS(商標)ソフトウェアプログラム(Oxford Molecular Group, Campbell, CA, USA)を用いて、「V 塩基配列ディレクトリ」(MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK; Tomlinson, et al., J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995))に対するアライメントを実施した。
【０２４９】
（表３）4.40.2を増幅するために設計された可変ドメインプライマー(5'側から3'側)
0005685535.tif 000008
【０２５０】
表4では、選択されたハイブリドーマ抗体クローンの遺伝子利用を示す。
【０２５１】
（表４）重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の利用
0005685535.tif 000009
【０２５２】
IgG4マウスにおいてハイブリドーマクローンを作製し、これらの配列を得た後で、比較用のIgG1型、IgG2型、およびIgG4型の発現ベクター中に可変ドメインをクローニングした。
【０２５３】
実施例3
抗CCR2抗体の変異誘発
軽鎖可変領域における生殖系列配列への復帰変異
以下のように部位特異的変異によって、CCR2 4.40.2軽鎖の68位のアラニン残基を生殖系列残基であるグリシンに復帰変異させた。表5のプライマーを用いて、アミノ酸残基68に対するコドン中の点変異を変更した。部位特異的変異誘発は、以下のサイクル改良を含む標準プロトコールに従い、QUIKCHANGE(商標) II Site-Directed Mutagenesisキット(Stratagene)を用いて実施した:96℃で2分間;16×(96℃で50秒間、68℃で10秒間);68℃で10分間。変異誘発されたベクターをXL1-Blueスーパーコンピテント細胞中にトランスフォームした。変異誘発が成功したが確認するために、Grills 16th BDTv3.1/dGTP chemistry(Applied Biosystems Inc.)および3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc.)を用いてクローンの配列を決定した。
【０２５４】
（表５）変異誘発プライマー(5'側から3'側)
0005685535.tif 000010
*変更されたヌクレオチドは太字で下線を引いている。
【０２５５】
結果として生じる抗体を4.40 A68G(SEQ ID NO: 112)と名付けた。これは、軽鎖可変領域の68位にグリシンを有する。
【０２５６】
ヒンジ安定化変異を有するIgG4重鎖定常領域の作製
IgG4 L309アロタイプ(Brusco A. et al., Eur J. ImmunogenticsI 25:349-355 (1998))に関連して、生殖系列からのヒンジ領域安定化変異、すなわちアミノ酸230位におけるセリンからプロリンへの変異を有する(Angal, S. et al. Molecular Immunology 30:105-108 (1993))IgG4発現ベクター由来pCON-G4(pro)(Lonza, Basel, Switzerland)から、IgG4重鎖定常領域を単離した。
【０２５７】
pCON-G4(pro)ベクターのG4 CH1エキソンの11番目のヌクレオチド残基中に、PCR変異誘発によってサイレント変異(Lys、AAG→AAA)を導入して、以下の増幅プライマーを用いたサブクローニングを容易にするためにApaI認識部位を除去した。
G4_フォワード
0005685535.tif 000011
(ハイブリダイズする塩基を大文字で示す(CH1の11番目残基の変異を太文字で示す);ハイブリダイズしない塩基を小文字で示す。)
G4_リバース:
0005685535.tif 000012
(ハイブリダイズする塩基を大文字で示す。XbaI部位を含むハイブリダイズしない塩基を小文字で示す。)
【０２５８】
増幅は、Expand Hi-Fi Polymerase(Roche)およびPTC-200 DNA ENGINE(商標)(MJ Research)を用いて、次の熱サイクルで実行した:95℃で3分間;22×(95℃で20秒間、58℃で30秒間、72℃で2分10秒間);72℃で10分間。
【０２５９】
pCON-G4(pro)ベクターのG4 CH1エキソンのヌクレオチド残基209の位置に、PCR変異誘発によって別のサイレント変異(Thr、ACC→ACA)を導入して、以下のプライマーを用いて発現ベクター中に可変領域をサブクローニングするための酵素の使用を容易にするためにBstEII部位を除去した。
0005685535.tif 000013
【０２６０】
増幅は、QUIKCHANGE(商標)Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)およびPTC-200 DNA Engine(MJ Research)を用いて、次の熱サイクルで実行した:96℃で1分間;14×(96℃で50秒間、68℃で15分48秒間);72℃で10分間。
【０２６１】
次いで、S230Pと呼んでいるヒンジ領域変異および2つのサイレント変異を含む得られたIgG4定常領域を、DHFR抗体発現ベクターのApaI/XbaI部位中にApaI/XbaI断片としてサブクローニングした。次いで、G4 S230P定常領域を含む発現ベクター中に4.40.2抗体の重鎖可変領域をクローニングして、完全長重鎖構築物を得た。軽鎖可変領域のA68G生殖系列置換および重鎖ヒンジ領域のS230P置換を有する4.40由来抗体を4.40 A68G S230Pと名付けた。これは、SEQ ID NO: 112の軽鎖アミノ配列およびSEQ ID NO: 116の重鎖アミノ酸配列を有する。
【０２６２】
発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する上清を採取し、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、組換え免疫グロブリンを単離した。次いで、SDS-PAGE、光散乱、および分光光度法によってこれらのタンパク質を特徴付けた。
【０２６３】
実施例4
インビトロでの結合
図1は、全血中のヒト単球(図1A)、CCR2をトランスフェクトされた300-19細胞(図1B)に対する、AF-488を結合させた抗体4.40 A68G S230Pのインビトロでの結合、および抗ヒトPEを用いて検出した、CCR2をトランスフェクトされた300-19細胞に対する様々な濃度の4.40 A68G S230P抗体の結合(図1C)を示す。手短に言えば、2％の熱失活させたウシ胎児血清および0.002％アジ化ナトリウムを含むダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水を用いて、体積100ul中の細胞100万個を試験抗体で染色した。15分後、検出用二次抗体を添加した。30分後、細胞を緩衝液中で洗浄し、500ul中に再懸濁し、FACS CALIBURを用いて染色を評価した。チューブ1個当たり合計10,000個の事象を評価した。染色規模の指標として、各抗体濃度に関して平均チャネル蛍光強度を評価した。
【０２６４】
実施例5
抗CCR2モノクローナル抗体の親和性定数(KD)の決定
CCR2に対する抗体のKDを評価するために、CCR2を発現する300-19細胞への抗体結合を、3時間のアッセイ法においてFACSによって評価した。手短に言えば、2％の熱失活させたウシ胎児血清、0.002％アジ化ナトリウム、および0.005mg/mlサイトカラシン(Cytochalasin)-B(Sigma 6762)を含むダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水である緩衝液を用いて、体積100ul中の細胞100万個を試験抗体で染色した。15分後、検出用二次抗体、すなわち、R-フィコエリトリンを結合させたロバ抗ヒトIgG H+LのAffini-pure F(ab')断片(Jackson 709-116-149)を添加した。室温で3時間、チューブを穏やかに振盪した。緩衝液中で2回洗浄した後、細胞を緩衝液500ul中に再懸濁し、FACS CALIBUR(商標)を用いて評価した。チューブ1個当たり合計10,000個の事象を評価した。染色規模の指標として、各抗体濃度に関して平均チャネル蛍光強度を評価した。これらの結合試験により、4.40 A68G S230P抗体が、トランスフェクトされた細胞上のヒトCCR2に0.085ug/mL(0.58nM)のKDで結合することが実証された(図2)。CCR2の第1細胞外ループおよび第2の細胞外ループを有するCCR2/CCR5キメラ受容体を発現する細胞において飽和結合を評価した場合(実施例7を参照されたい)、図6Cに示すように、同様の濃度曲線およびKD(KD=0.023ug/mL(0.16nM))が得られた。
【０２６５】
実施例6
MCP-1によって誘導される走化性の阻害
ヒト抗CCR2抗体を、CCR2リガンドであるMCP-1(CCL2)に応答したTHP-1単球(ATCC番号TIB202)の走化性を阻害する能力について、評価した。走化性は、以前に説明されているようにして(Gladue RP et al., J Biol Chem 278:40473-40480 (2003)を参照されたい)、NeuroProbe, Inc. (Gaithersburg, MD) から購入した96ウェル走化性チャンバーを用いて行った。手短に言えば、0.1％BSAを含むRPMI 1640培地(Roswell Park Memorial Institute)中にCCL2を希釈し、次いで、チャンバーの底側ウェルに添加した。5μmの細孔付きフィルター(Neuroprobe)をチャンバーの上側ウェルと下側ウェルの間に置いた。次いで、様々な濃度の試験抗体の存在または不在下で、THP-1細胞をチャンバー上部に添加した(8×105個)。この装置を5％CO2加湿インキュベーター中、37℃で3時間、インキュベートした。インキュベーション期間後、上側チャンバーから非遊走細胞を除去し、フィルター上面を拭いた。次いで、2mMの冷EDTAを上側ウェルに添加し、走化性チャンバーを4℃で20分間、インキュベートした。次いで、EDTAを除去し、96ウェルマイクロタイタープレートを800×gで10分間遠心分離した。次いで、フィルターを除去し、培地を廃棄し、0.2％ FDAをプレートに添加した。次いで、黄色い色が生じるまで、プレートを37℃で1.5時間インキュベートした。マイクロタイタープレートリーダーを用いて490nmでの色の強度を読み取ることにより、遊走細胞の数を定量した。表6に示すように、THP1走化性を様々な程度に阻害するいくつかの抗体が同定された。
【０２６６】
（表６）MCP-1によって誘導されるTHP-1走化性の阻害
0005685535.tif 000014
【０２６７】
同様に、図3に示すように、抗体4.40 A68G S230Pは、CCR1/CCR5リガンドMIP-1に応答したTHP-1単球の走化性を阻害しなかったが、MCP-1(IC50 = 0.148 ug/ml)に応答したTHP-1単球の走化性を阻害した。
【０２６８】
初代単球走化性
ヘパリンを添加したヒト全血をACCUSPIN HISTOPAQUE 1077チューブ(Sigma; St. Louis, MO)中に層状に積み重ね、遠心沈殿させた。単核細胞画分を採取し、PBSで3回洗浄し、赤血球(RBC)を水で溶解し、これらの細胞を、0.1％ BSA(Sigma)および10mM HEPES(Gibco)を含むRPMI (Gibco; Grand Isle, NY)に4×106個/mlとなるように再懸濁した。抗体希釈物またはKLH対照を0.25nM MCP-1(Peprotech; Rocky Hill, NJ)に添加し、48ウェルBoydenチャンバー(Neuroprobe; Gaithersburg, MD)の底に30ulを入れた;陰性対照は、培地のみであった。5umのPVP無しフィルター(Neuroprobe)をこの上に置き、チャンバーを密閉した。単離した単核細胞を抗体希釈物またはKLH対照と共に室温で30分間インキュベートした。次いで、50ulを上側ウェルに添加した。このチャンバーを5％CO2加湿インキュベーター中、37℃で90分間、インキュベートした。インキュベーション後、これらの細胞を上側ウェルから吸引して取り出し、フィルターの上面を拭き、風乾させ、DIFF-QUIK(商標)(Dade-Behring; Newark, DE)で染色し、6つの区域中の遊走細胞数を計数した。単離された初代ヒト単球の、MCP-1に応答した走化性の、抗体4.40 A68G S230Pによる阻害を、図4に示す。
【０２６９】
さらに、4.40抗体を用いて例示するように、CCR1/CCR5リガンドMIP-1aの場合はTHP-1細胞の阻害は観察されなかった(図3)。
【０２７０】
実施例7
CCR2/CCR1キメラ構築
MCP-1によって誘導される走化性を阻害する抗体をCCR2キメラに対する結合に関して試験して、それらのエピトープをマッピングした。CCR2の細胞外ループ(第1、第2、および/または第3)およびN末端置換物とCCR1の一部分とからなる様々な受容体キメラ(M=CCR2、R=CCR1)を発現する300-19細胞への抗体の結合を評価することによって、これを遂行した。
【０２７１】
キメラ受容体MRRRの構築
MRRRキメラ受容体(CCR2(M)のN末端、CCR1(R)の第1、第2、および第3の細胞外ループ)を、Stratagene社製のQUIKCHANGE(登録商標)部位特異的変異誘発キットおよび発現ベクターpcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, CA)中にクローニングされた野生型ヒトCCR1中の最初のApaL制限酵素部位を以下のプライマーを用いてBamHI部位に変異させるための以下の変異誘発プライマーを用いて構築した。
センスプライマー40A:
0005685535.tif 000015
アンチセンスプライマー40B:
0005685535.tif 000016
【０２７２】
pCMV-1由来の発現ベクター(Pharmacia; Piscataway, NJ)中にクローニングされたFLAGタグ付きMMRRキメラ(CCR2のN末端および第1の細胞外ループ、CCR1の第2および第3の細胞外ループ)を含むキメラ受容体は、J. David Gladstone InstitutesのIsrael Charoによって提供された。MMRRキメラの構築(著者らは「2211」と呼んでいる)は、Monteclaro F. S. et al. (Methods in Enzymology 228:70-84 (1997))において説明されている。以下の変異誘発プライマーを用いて、キメラ中の最初のApaL部位をBamH1部位に変異させた:
センスプライマー41A:
0005685535.tif 000017
アンチセンスプライマー41B:
0005685535.tif 000018
【０２７３】
結果として生じる各変異クローンをNdeIおよびBamHIで切断した。CCR1/pcDNA3 BamHI変異体に由来するベクターを含む断片および変異MMRR/pCMV1プラスミド由来のCCR2 N末端のみを含む632塩基対のNdeI/BamHI断片をゲル単離し、一つに連結して、MRRR/pcDNA3キメラを得た。
【０２７４】
以下の変異誘発プライマーを用いて、MRRRキメラ中のBamHI部位をApaL部位に逆変異させた:
センスプライマー41C:
0005685535.tif 000019
アンチセンスプライマー41D:
0005685535.tif 000020
【０２７５】
ベクターのFLAGタグ領域に相同なセンスプライマー66C(SEQ ID NO: 138)およびCCR1の3'末端に相同であり、かつHindIII部位を含むアンチセンスプライマー66D(SEQ ID NO: 139)を用いて、完全体のMRRR断片をPCR増幅した。
センスプライマー66C
0005685535.tif 000021
アンチセンスプライマー66D
0005685535.tif 000022
【０２７６】
次いで、レトロウイルス構築物に由来するpMIG(Van Parijs, L. et al., Immunity 11:281-188 (1999))(図5)のPflMI部位およびHindIII部位中にこの断片をサブクローニングして、FLAGタグとそれに続くSal1部位の後にあり、配列内リボソーム進入部位-高感度緑色蛍光タンパク質部位(IRESEGFP)を除去しておいた挿入遺伝子(マウス/ヒトキメラ)を置換した。
【０２７７】
キメラ受容体RRRMおよびRMMRの構築
RRRM(CCR1のN末端、第1の細胞外ループおよび第2の細胞外ループ、ならびにCCR2の第3の細胞外ループ)キメラ受容体およびRMMR(CCR1のN末端および第3の細胞外ループ、ならびにCCR2の第2の細胞外ループおよび第3の細胞外ループ)キメラ受容体を、2段階PCR法を用いて作製した。
【０２７８】
RRRMキメラの場合、以下のプライマーを用いて、ヒト野生型CCR2の第3のループを最初にPCR増幅した。
センスキメラプライマー89A:
0005685535.tif 000023
アンチセンスプライマー81B:
0005685535.tif 000024
野生型ヒトCCR2を、鋳型としてのレトロウイルス由来発現ベクターpMIG中にクローニングした。以下のプライマーを用いて、N末端領域から第2の細胞外ループまでをPCR増幅し:
センスプライマー89C:
0005685535.tif 000025
アンチセンスキメラプライマー89B:
0005685535.tif 000026
野生型CCR1を、鋳型としての発現ベクターpcDNA3中にクローニングした。
【０２７９】
これらの断片をゲル精製し、混合し、5'末端プライマーおよび3'末端プライマー:89C(SEQ ID NO: 142)および81B(SEQ ID NO: 141)を用いて一緒にPCR増幅した。レトロウイルスベクターの、すなわち、N末端FLAGタグを含みかつIRESEGFPを除去されたpMIGのSalI/HindII部位に、得られた断片を連結した。
【０２８０】
キメラ受容体RMMRの構築
鋳型としての発現ベクターpcDNA3中にクローニングされた野生型CCR1および以下のプライマーを用いて、CCR1の第3の細胞外ループから細胞質尾部までをPCR増幅した。
センスキメラプライマー85A:
0005685535.tif 000027
アンチセンスプライマー78D:
0005685535.tif 000028
これは、野生型CCR1/pcDNA3プラスミド中の挿入物の3'側のベクター領域にハイブリダイズする。
【０２８１】
J. David Gladstone InstitutesのIsrael Charoから入手した鋳型としてのFLAGタグ付きRMMM/pcDNA3プラスミドを用いて、CCR1のN末端ならびにCCR2の第1の細胞外ループおよび第2の細胞外ループを含む領域を含む第2の断片をPCR増幅した。RMMMキメラ構築物の構築(著者らは「2111」と呼んでいる)は、Monteclaro, F. S. et al. (Methods in Enzymology 228:70-84 (1997))において説明されている。使用したプライマーは、FLAGタグにハイブリダイズするセンスプライマー66C(SEQ ID NO: 138)およびアンチセンスキメラプライマー85B:
0005685535.tif 000029
であった。これら2種の断片をゲル精製し、混合し、5'末端プライマーおよび3'末端プライマー:66C(SEQ ID NO: 138)および78D(SEQ ID NO: 144)を用いて一緒にPCR増幅した。この最終断片をPflMIおよびHindIIIで消化し、N末端FLAGタグを含みかつIRESEGFPを除去されたpMIGレトロウイルスベクターに連結した。
【０２８２】
キメラ発現
各キメラ構築物からレトロウイルスを作製し、300-19細胞に形質導入するのに使用した。抗FLAGエピトープ抗体M1(Sigma; St. Louis, MO、カタログ番号F3040)を用いたFACS解析により、発現を判定した。
【０２８３】
実施例8
エピトープマッピング
CCR2/CCR1キメラ受容体への抗体の結合をFACS解析によって評価した。受容体はすべて、N末端にFLAGタグを付け、また、受容体発現を確認できるように抗FLAG抗体M1で染色した。図6Aおよび6Bは、M1抗体を用いたN末端上のFLAGのFACS染色(図 6A)を4.40の染色(図6B)と比べて示す。図6Cは、RMMRキメラをトランスフェクトされた300-19細胞における4.40 A68G S230P抗体の飽和結合曲線を示す。CCR2をトランスフェクトされていない300-19細胞に対する4.40 A68G S230P抗体の飽和結合は、10ug/mLまでの濃度で結合を示さなかったのに対し(図7A)、完全なヒトCCR2をトランスフェクトされた300-19細胞は、0.01ug/mLを上回る濃度で、用量依存的な結合を示した(図7B)。さらに、CCR1の3つのループ領域と共にCCR2のN末端のみを発現するキメラ受容体(MRRR)(図7C)またはCCR1のN末端ならびに第1のループ領域および第2のループ領域と共にCCR2の第3の細胞外ループを発現するキメラ受容体(RRRM)に対する4.40 A68G S230P抗体の飽和結合は、10ug/mLまでの濃度で有意な結合はまったく示さなかった(図7D)。それに反して、CCR1のN末端および第3のループ領域ならびにCCR2の第1のループ領域および第2のループ領域を発現するキメラ受容体(RMMR)に対する4.40 A68G S230P抗体の飽和結合は、0.001ug/mLを上回る濃度で、有意な用量依存的結合を示した(図7E)。M1抗体(Sigma F3040番)を用いたN末端上のFLAG染色を評価することによって、これらの受容体トランスフェクタントすべてにおける受容体発現を確認した。
【０２８４】
（表７）エピトープマッピング
0005685535.tif 000030
*複合体=野生型に結合するが、キメラに結合しない。
【０２８５】
ペプチドELISA
さらに、CCR2の第1のループおよび/または第2のループに対するエピトープ結合もまた、ペプチドELISAによって評価した。Reacti-Bind NEUTRAVIDIN(商標)Coated, High Binding Capacity ELISAプレート(Pierce; Rockford, IL)をPBS/0.05％ Tween20で3回洗浄し、次いで、6ug/mlのビオチン標識CCR2ループ2ペプチド(SEQ ID NO: 129)またはループ3ペプチド(SEQ ID NO: 130)(AnaSpec; San Jose, CA)を100ul/ウェルで用いてコーティングした。プレートを、1時間インキュベートし、次いで3回洗浄した。次いで、PBS/0.1％ BSA/0.05％ Tween20中で希釈したCCR2アンタゴニスト抗体4.40.3 A68G S230Pまたは他の一次抗体を段階希釈の様式でプレートに添加し、他の対照と同じように、1時間インキュベートした。このプレートを3回洗浄し、100ul/ウェルのHRPマウス抗ヒトIgG4二次抗体(Zymed; So. San Francisco, CA)をすべてのウェルに希釈率1:5000で添加し、1時間インキュベートした。このプレートを3回洗浄し、TMB基質をすべてのウェルに添加し、約30分間インキュベートした。2M H2SO4を用いて発色反応を停止し、プレートリーダーを用いて450nMでの吸光度表示値を測定した(図8)。受容体の第2の細胞外ループペプチドに結合するが、第3のループに結合しない、抗体4.9および4.40を含む抗体を同定した。
【０２８６】
実施例9
結合選択性
図9に示すように、密接に関連したケモカイン受容体CCR5への結合が無いこと、およびCCR5/CCR1リガンドMIP-1aによって誘導される走化性の阻害が無いこと(図3)に基づいて、ヒトCCR2に対する4.40 A68G S230P抗体の選択性を確認した。抗CCR5抗体(Pharmingen, カタログ番号555992)は、CCR5を発現する細胞に結合したのに対し(図9b)、CCR2抗体4.40.3 A68G S230Pは、これらの同じ細胞に対して結合を示さなかった(図9a)。これらの研究のために、CCR5を発現するように操作された300.19細胞を、CCR2選択的抗体4.40 A68G S230PまたはCCR5選択的抗体のいずれかと共に30分間インキュベートした。次いで、FACS緩衝液(0.02％アジ化ナトリウム、2％熱失活ウシ胎児血清のPBS溶液)中で細胞を洗浄し、標準的な方法によってフローサイトメーターを用いて、細胞表面発現を解析した。
【０２８７】
実施例10
カルシウム動員
抗体4.40がCCR2に対して機能的アンタゴニストとして作用し、かつ、顕著なアゴニスト特性を全く有さないかどうか判定するために、以前に説明されているようにして(Gladue RP et al., J Biol Chem 278:40473-40480 (2003))、CCR2をトランスフェクトされた300-19細胞のカルシウム動員に対する4.40.3の影響を試験した。ヒトCCR2をトランスフェクトされた300-19細胞を遠心沈殿し、10mM Hepes(Gibco)および4.0mM CaCl2(Sigma; St. Louis, MO))を含むPTI緩衝液(HBSS(Gibco, Grand Island, NY)に2×106細胞/mlで再懸濁した。これらの細胞に、1ml当たり2ulのindo-1 AM(Molecular Probes; Eugene, OR)を添加し(最終濃度2uM)、37℃で25分間インキュベートした。次いで、これらの細胞をPTI緩衝液で2回洗浄し、1×107個/mlで懸濁させた。いくつかの濃度の抗体または適切な対照をこれらの細胞に添加し、室温で30分間インキュベートした。1mm四角キュベット(Sarstedt; Germany)に、予め温めた PTI緩衝液1.8mlを細胞懸濁液200ulと共に添加した。これらの細胞を励起させ、Photon Technology Corporation International(PTI; Lawrenceville, NJ)社製の機器を用いて蛍光を測定した。機械を一時停止し、100nM MCP-1(Peprotech; Rocky Hill, NJ)20ulを添加した。反応後、以下の試薬をこの順番で添加して、全カルシウムを放出させ、キレート化させた:18％ Triton X-100(20ul);3M Tris pH 8.5(20ul);0.5M EGTA pH 8.5(20ul)(すべてSigma社製)。抗体4.40は、MCP-1が用量応答的にカルシウム動員を誘導する能力を阻害した(図10)。4.40 A68G S230P抗体を用いた場合も同様の結果が得られた。
【０２８８】
実施例11
CCL2およびCCL7に向かう走化性の阻害
4.40 A68G S230P抗体による走化性の阻害がMCP-1に特異的であるか、またはそれが他のCCR2リガンドにも当てはまるかを判定するために、図3に示すように、MCP-1(CCL2)に向かうTHP-1細胞の走化性を、CCL3(MIP-1a)に向かう走化性と比較した。さらに、CCR2をトランスフェクトされた300-19細胞が、抗体4.40 A68G S230Pの存在下で別のCCR2リガンドであるCCL7(MCP-3)へ向かって遊走することも、実施例6で説明したのと同様の走化性アッセイ法を用いて評価した。4.40 A68G S230P抗体は、公知のCCR2リガンドであるCCL2(図3)およびCCL7(図11)の両方に向かう走化性を阻害したが、CCR1/CCR5リガンドであるCCL3(MIP-1a)に向かう走化性は妨害しないことを図3は示している。
【０２８９】
実施例12
単球におけるアクチン重合
ヒト全血アクチン重合
また、図12に示すように、ヒト全血におけるアクチン重合を阻害する能力についても、モノクローナル抗体4.40 A68G S230Pを試験した。EDTAバキュティナチューブ(VWR; Boston, MA)中に血液を採取し、次いで、抗体希釈物またはKLH対照と共に室温で30分間インキュベートした。緩衝液対照または100nM MCP-1(Peprotech; Rocky Hill, NJ)10μlを48ウェルCorningプレート(VWR)に添加した。次いで、穏やかに混ぜながら血液100μlを添加し、40秒間インキュベートした後、停止/溶解試薬(10％のFACS溶解溶液(Becton Dickinson; San Jose, CA)、20％の16％パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences; Ft. Washington, PA)、および70％のH2O)0.8mlを用いて反応を停止させた。このプレートを室温で10分間インキュベートし、遠心沈殿し、細胞を96ウェル丸底ポリプロピレンプレートに移し、PBSで2回洗浄した。ウェル1つ当たり100μlのPBSを添加した。次いで、染色試薬(10％の10X HBSS中5mg/mlリゾホスホチジルコリン(Sigma)、80％の16％パラホルムアルデヒド、および10％の6.6uM NBDファラシジン(Molecular Probes; Eugene, OR))50μlを添加した。室温で1時間、これらの細胞を暗所で染色した。インキュベーション後、2％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan UT)を含むPBSで細胞を2回洗浄し、単球にゲートをかけたFACSCAN(Becton Dickinson)を用いて蛍光を定量した。図12に示すように、抗体4.40 A68G S230Pは、0.168ug/mlのIC50でアクチン重合を阻害した。
【０２９０】
カニクイザル全血アクチン重合
EDTAバキュティナチューブ(VWR; Boston, MA)中に血液を採取し、次いで、抗体希釈物またはアイソタイプ対照と共に室温で30分間インキュベートした。この期間中に、10ulの100nM MCP-1(Peprotech; Rocky Hill, NJ; 最終濃度10nM)または緩衝液対照(Ca+2もMg+2も含まず、0.2％BSA(Sigma; St. Louis, MO)を含むHBSS(Gibco; Grand Island, NY))を48ウェルCorningプレート(VWR)に添加した。次いで、血液100ulを穏やかに混ぜながら添加し、40秒間インキュベートした。停止/溶解試薬(10％のFACS溶解溶液(Becton Dickinson; San Jose, CA)、20％の16％パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences; Ft. Washington, PA)、および70％のH2O)0.8mlを用いて反応を停止させた。このプレートを10分間インキュベートし、遠心沈殿し、PBSで2回洗浄した。次いで、室温で1時間、暗所で、染色試薬(10％の10X HBSS中5mg/mlリゾホスホチジルコリン(lysophosphotidylcholine)(Sigma)、80％の16％パラホルムアルデヒド、および10％の6.6uM NBDファラシジン(Molecular Probes; Eugene, OR))でこれらの細胞を染色した。インキュベーション後、2％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan UT)を含むPBSで細胞を2回洗浄し、活性化された単球にゲートをかけたFACSCAN(Becton Dickinson)を用いて蛍光を定量した。図13に示すように、抗体4.40 A68G S230Pは、0.49ug/mlのIC50で、カニクイザルにおける全血アクチン重合を阻害した。
【０２９１】
実施例13
コラーゲンI mRNA定量アッセイ法
5％ CO2加湿インキュベーター中、37℃で、10％不活性化FBS、100U/mlペニシリン/100ug/mlストレプトマイシンおよび2mM L-Gln(Invitrogen)を添加したDME培地を入れたフラスコ中でヒト肝臓星状細胞株LI-90(JCRB Cellbank, Japan)を増殖させた。20,000細胞/ウェルの濃度で96ウェル組織培養プレート中で3日間細胞を増殖させ、37℃で48時間、1000nMのMCP-1(PeproTech)および様々な濃度の4.40 A68G S230Pで処理した。培地を除去し、QUANTIGENE(商標)Expression Kit(Panomics)と共に供給される溶解緩衝液100ulを添加することによって細胞を溶解した。製造業者の取扱い説明書に従って、分岐DNAアッセイ法を実施した。手短に言えば、ハイブリダイゼーション緩衝液および50fmol/ulのCol1A1/GAPDHプローブセットを入れた96ウェルマイクロタイタープレーに、全RNAの試料を載せた。46℃で60分間インキュベートすることによって、アルカリホスファターゼ分子を含む分岐DNA分子に、捕捉されたmRNAをハイブリダイズさせた。化学発光基質と共に46℃で30分間さらにインキュベーションした後、ルミノメーター(ARVOsx, Perkin Elmer; Massachusetts, USA)を用いて発光を定量した。GAPDHに対するCol1A1の発光の比率を計算し、このデータをPrism 4.0 ソフトウェアを用いて解析して、IC50値を決定した(GraphPad)。図14に示すように、4.40 A68G S230Pは、MCP-1によって誘導されるLI90細胞におけるコラーゲンIAI mRNA合成を0.89μg/mL(6.2nM)のIC50値で阻害した。
【０２９２】
実施例14
pERKリン酸化
ヒト全血を健常志願者から新しく単離した。FACS解析により、MCP-1添加後6分目のCD14+単球において、細胞外シグナル調節キナーゼ(pERK)の高レベルのリン酸化が示された。4.40 A68G S230Pは、全血においてMCP-1によって誘導されるpERKリン酸化を用量依存的に阻害した(図15)。MCP-1によるエクスビボでの刺激後の単球におけるpERKリン酸化は、メカニズムバイオマーカーとして利用され、したがって、PK/PDおよびトランスレーショナル薬理学を促進し得る。この全血アッセイ法において4.40 A68G S230P抗体に関して得られるIC50値およびIC90値は、それぞれ0.44μg/mL(2.9nM)および0.89μg/ml(6.1nM)であった。
【０２９３】
実施例15
マウス急性肝炎モデル
また、4.40 A68G S230P抗体の有効性を、急性肝炎マウスConAモデルを用いて検査した。4.40 A68G S230P抗体はげっ歯動物CCR2を認識しないため、マウスCCR2をヒトCCR2で置換したトランスジェニックマウスをこの研究のために使用した。これらの動物に、生理食塩水に溶かした0.1mg/kg、0.3mg/kg、または1.0mg/kgのmAbを1回腹腔内注射した。別の群にIgG4アイソタイプ対照抗体を投与した。30分後、パイロジェンフリー生理食塩水に溶かした15mg/kg ConAをこれらの動物に尾静脈内注射(0.1mL)した。対照群にはConAを含まない生理食塩水を与えた。24時間後、血液試料を得、血漿肝臓酵素を解析した。図16に示すように、対照抗体群ではALTおよびASTが著しく増加しており、値は25,000U/Lに近かった。それに反して、0.5mg/kgおよび1.0mg/kgの4.40 A68G S230Pで処置したマウスは、血漿肝臓酵素のそれぞれ約50％および約80％の有意な減少を示した。
【０２９４】
実施例17
動物疾患モデルにおける治療的効果
炎症
4.40抗体および4.9抗体を含むヒト抗CCR2抗体またはその抗原結合断片の治療的効果を、炎症のインビボ哺乳動物モデルを用いて試験する。MCP-1のようなケモカインおよび哺乳動物CCR2に反応性の抗体またはその断片、例えば4.40抗体を適切な動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、またはアカゲザルに皮内注射した際の白血球浸潤をモニターする(例えば、Van Damme, J. et al., J. Exp. Med. 176:59-65 (1992); Zachariae, C. O. C. et al., J. Exp. Med. 171:2177-2182 (1990); Jose, P. J. et al., J. Exp. Med.179: 881-887 (1994)を参照されたい)。皮膚生検材料の白血球(例えば、好酸球および顆粒球)浸潤を組織学的に評価する。拮抗性の抗CCR2抗体は、対照動物と比べて白血球浸潤を減少させることが予想される。
【０２９５】
多発性硬化症
4.40抗体および4.9抗体を含む抗体またはその断片の治療的効果を、多発性硬化症のインビボ哺乳動物モデルを用いて試験する。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、中枢神経系(CNS)のT細胞媒介性炎症性疾患であり、多発性硬化症(MS)の動物モデルとして役立つ(Steinman L, Neuron 24:511-514 (1999)を参照されたい)。脳炎誘発性MOG35-55ペプチドによる免疫後(p.i.)0日目および7日目に、70μgの結核菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(Difco)を含む不完全フロイントアジュバント(IFA; Difco, Detroit, MI)中に乳化させた合計600μgの脳炎誘発性MOG35-55を皮下(s.c.)注射(2カ所、背側測腹部)することによって、C57/J129マウスおよび/またはC57BL/6マウスを活性EAEに対して感作させる。免疫後0日目および2日目に、尾静脈を介して、各マウスに百日咳毒素(PTX; List Biological Laboratories, Campbell, CA)500ngも静脈内(i.v.)投与する。また、一部の動物には、投薬量を段階的に増やした拮抗性抗CCR2抗体、例えば4.40抗体も与える。動物の臨床徴候を毎日評価し、次の尺度に従って評価する:グレード0、異常無し;グレード1、尾部の動きが弱い;グレード2、尾部がだらんとしており、後肢の動きが弱い;グレード3、後肢の不全対麻痺;グレード4、四肢麻痺;およびグレード5、瀕死または死亡。
【０２９６】
さらに、視神経、大脳、小脳、および脊髄から得てグルタルアルデヒド/オスミウム固定した組織試料において光学顕微鏡調査を実施した。組織試料を脱水し、エポキシ樹脂中に包埋し、それから1μm切片を切り出し、トルイジンブルーで染色する。以前に説明されていたようにして(Cannella et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:10100-10105 (1998))、炎症、脱髄、ウォラー変性(WD)、および再有髄化を0〜5の尺度で採点する。拮抗性抗CCR2抗体で処置したマウスは、対照動物よりも少ない臨床的異常、炎症、脱髄、およびWDの徴候を示すことが予想される。このような低減は、投薬量に依存的に起こることがさらに予想される。
【０２９７】
神経因性疼痛
4.40抗体および4.9抗体を含む抗体またはその断片の治療的効果を、神経因性疼痛のインビボ哺乳動物モデルを用いて試験する。C57BLマウスを2つの群に分ける。実験群には、4.40抗体のような拮抗性抗CCR2抗体を尾静脈注射によって毎日投与するのに対し、第2群にはこの抗体を投与しない。これら2つの群を、処置開始後、次のアッセイ法において定期的に試験する:
ロータロッド。最初に、10rpmの速度で3分間、ロータロッド上でマウスを訓練する。試験の場合、この速度を10rpmで60秒間に設定し、続いて600rpmに加速する。加速開始後、マウスが落ちるまでにかかる時間を記録する。
ホットプレート。45℃に温度設定したホットプレート装置にマウスを2分間慣れさせる。続いて、マウスをホットプレート上に載せ、温度を逐次的にそれぞれ52.5℃および55.5℃に(カットオフ値は30秒に設定)、次いで、58.5℃に(カットオフ値は20秒に設定)変更する。マウスが足を舐めるか、または飛び上がる時間を記録する。
ホルマリン試験。試験前の4日間、毎日2時間、マウスを試験プラットホームに順化させる。試験当日、試験プラットホームにマウスを1時間載せ、続いて、左足の足底表面に2％ホルマリン10μlを投与する。注射された足をマウスが舐めるか、または持ち上げて過ごす時間を、50分の間、5分間隔で、2分間の期間に渡って記録する。
熱刺激および機械的刺激。放射熱刺激に対して足を引っ込めるまでの潜伏時間を測定することによって、熱感受性を評価する(Hargreaves et al., Pain 32:77-88 (1988))。上下パラダイム(up-and-down paradigm)を用いて、較正されたフォンフレイフィラメントを用いて機械的感受性を測定する(Chaplan et al., J. Neurosci. Methods 53, 55-63 (1994))。
神経損傷。ケタミン(50mg/kg、i.m.)およびメデトミジン(1mg/kg、i.m.)の混合物でマウスに麻酔をかける。寛骨のすぐ下に、坐骨神経に平行な切開部を作る。神経を露出させ、任意の付着組織を神経から除去する。坐骨神経の直径3分の1〜2分の1の周囲を6-0絹縫合糸でしっかりと結紮する。筋肉を縫合糸で閉じ、傷口を創傷クリップで閉じる。機械的刺激に対するマウスの応答を、神経損傷前および神経損傷後15日まで試験する。
【０２９８】
拮抗性抗CCR2抗体で処置したマウスは、対照動物と比べて少ない神経因性疼痛徴候を示すことが予想される。
【０２９９】
（表８）CDR配列(Seyuences)(SEQ ID NO:)
0005685535.tif 000031
【図１Ａ】
0005685535.tif 000032
【図１Ｂ】
0005685535.tif 000033
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
0005685535.tif 000039
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
0005685535.tif 000053
【図１７Ｃ】
0005685535.tif 000054
【図１７Ｄ】
0005685535.tif 000055
【配列表】
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