(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
日本人である被験者から採取されたＤＮＡ含有試料から、ＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査する工程を含む、日本人における網膜色素変性症原因遺伝子変異の検査方法。
【請求項２】
前記ＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査する工程は、一次スクリーニングとして行われる、請求項１に記載の網膜色素変性症原因遺伝子変異の検査方法。
【請求項３】
前記被験者は網膜色素変性症患者である、請求項１又は２に記載の網膜色素変性症原因遺伝子変異の検査方法。
【請求項４】
ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７及び４９５８番目の塩基を含む配列部分を増幅する、日本人においてＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を検出するためのプライマーセット。
【請求項５】
配列番号８の塩基配列を有するプライマー及び配列番号９の塩基配列を有するプライマーの組、又は、配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー及び配列番号９の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーの組を含む、請求項４に記載のプライマーセット。
【請求項６】
ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７及び４９５８番目の塩基を含む配列部分、又は、該配列部分と相補的な塩基配列を有する、日本人においてＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を検出するためのプローブ。
【請求項７】
請求項６に記載のプローブ、及び、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を除くＥＹＳ遺伝子の変異を検出するためのプローブを含む、日本人においてｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を含む複数のＥＹＳ遺伝子の変異を検出するためのマイクロアレイ。
【請求項８】
請求項４に記載のプライマーセット、請求項５に記載のプライマーセット、請求項６に記載のプローブ、及び、請求項７に記載のマイクロアレイの少なくとも１つを含むことを特徴とする、日本人においてＥＹＳ遺伝子の変異を検出するための検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜色素変性原因遺伝子ＥＹＳの新規遺伝子変異であるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を検出するためのプライマーセット、プローブ、マイクロアレイ、及び、これらを備える検出キット、並びに、網膜色素変性症原因遺伝子変異の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜色素変性症（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，ＲＰ）とは、視細胞及び網膜色素上皮の機能を原発性に又はびまん性に障害する進行性の疾患群である。本疾患は、夜盲を初期症状とし、進行すると視野障害及び視力障害につながり、最終的には失明又は重篤な視機能障害に至ることが多い、眼科領域の中で最も重篤な疾患である。本疾患の頻度は、日本では、４０００〜８０００人に１人と言われている。
【０００３】
ＲＰは、遺伝性の疾患である。その遺伝形式には、常染色体優性遺伝（ａｄ），常染色体劣性遺伝（ａｒ），Ｘ連鎖性遺伝の３つがある。日本での各遺伝形式の占める割合は、ａｄが１６．９％、ａｒが２５．２％、Ｘ連鎖性が１．６％と報告されている。また、家系内に他に患者が見られず遺伝形式が明らかでない孤発例も多く、その割合は５６．３％にのぼる。
【０００４】
ＲＰの原因遺伝子として、これまでに、合計４９個の遺伝子が報告されている（表１）。これらの遺伝子に突然変異等が生じ正常に機能しなくなることにより、ＲＰが発症すると考えられる。日本以外の国のＲＰ患者の発症原因のうち、これらの遺伝子で説明できるものは高々６０％と言われている。そのため、さらなるＲＰの原因遺伝子の同定が期待される。
【０００５】
【表１】
0005828499.tif 000002
【０００６】
欧米や英国では、網膜色素変性症の特殊型であるレーバー先天性黒内障（Ｌｅｂｅｒ’ｓ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ａｍａｕｒｏｓｉｓ；ＬＣＡ）の遺伝子治療が、ＬＣＡ患者へ行われており、視機能の改善例が報告されている。こうした治験結果は、網膜色素変性症一般への遺伝子治療の適用可能性を示している。こうした遺伝子治療を有効に行うためには、ＲＰ患者毎に原因遺伝子を特定することが必須である。このためにも、さらなるＲＰ原因遺伝子の同定が期待される。
【０００７】
また、ＲＰ患者の視機能を維持又は改善するためには、比較的発生初期にＲＰの治療に取り掛かることが望ましい。そのため、ＲＰ患者のＲＰ原因遺伝子の変異を簡便に診断する方法が望まれる。さらに、ＲＰの症状が比較的高齢で発症しゆっくりと進行する場合があることを考慮に入れると、ＲＰ原因遺伝子に有害な変異をもつがＲＰ未発症であるＲＰ患者予備軍を発見できる診断法がより好ましい。
【０００８】
以上のような重要性に鑑み、欧米や中国等の多数の施設で、ＲＰ原因遺伝子の変異のスクリーニングが行われきている。しかし、日本では、一部のａｄＲＰ患者について変異解析が行われているのみであり（非特許文献１〜非特許文献３）、ａｒＲＰの原因遺伝子の変異解析は諸外国と比べ後れをとっている（非特許文献４）。そのため、日本人ＲＰ患者の遺伝子治療を行うための又ＲＰ患者予備軍を発見するための基礎となるデータが不足している状況にあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】カワムラ、他、“Ｎｏｖｅｌ  ２３３６−２３３７ｄｅｌＣＴ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＰ１  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、（米国）、エルゼビア、２００４年、第１３７巻、第６号、ｐ．１１３７−１１３９
【非特許文献２】サトウ、他、“Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｇｅｎｅ，  ＰＲＰＦ３１，  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、（米国）、エルゼビア、２００５年、第１４０巻、第３号、ｐ．５３７−５４０
【非特許文献３】ワダ、他、“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＣＹＰ４Ｖ２  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｂｉｅｔｔｉ’ｓ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｃｏｒｎｅｏｒｅｔｉｎａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ”、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、（米国）、エルゼビア、２００５年、第１３９巻、第５号、ｐ．８９４−８９９
【非特許文献４】トダ、他、“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＥＲＴＫ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ、（米国）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ、２００６年、第１２巻、ｐ．４４１−４４４
【非特許文献５】Ａｕｄｏ、他、“ＥＹＳ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｏｄ−ｃｏｎｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ  ｉｎ  Ｆｒａｎｃｅ．”、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ、（米国）、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、２０１０年３月（電子出版）、第３１巻、第５号、ｐ．Ｅ１４０６−Ｅ１４３５
【非特許文献６】Ａｂｄ  Ｅｌ−Ａｚｉｚ、他、“ＥＹＳ，  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐａｃｅｍａｋｅｒ，  ｉｓ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、（米国）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、２００８年、第４０巻、ｐ．１２８５  −  １２８７
【非特許文献７】Ｂａｒｒａｇａｎ、他、“Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ＥＹＳ  ｉｎ  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ、（米国）、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、２０１０年１１月、第３１巻、第１１号、ｐ．Ｅ１７７２−Ｅ１８００
【非特許文献８】Ｃｏｌｌｉｎ、他、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ２  Ｍｂ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｙｅｓ  ｓｈｕｔ／ｓｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｔｈａｔ  Ｉｓ  Ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、（米国）、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年、第８３巻、第５号、ｐ．５９４−６０３
【非特許文献９】Ｌｉｔｔｉｎｋ、他、“Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＹＳ  ｇｅｎｅ  ａｃｃｏｕｎｔ  ｆｏｒ  ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  ５％  ｏｆ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅ  ａ  ｆａｉｒｌｙ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．”、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、（米国）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、２０１０年１０月、第１１７巻、第１０号、ｐ．２０２６−２０３３
【非特許文献１０】Ａｂｄ  Ｅｌ−Ａｚｉｚ、他、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｙｅｓ  ｓｈｕｔ  ｇｅｎｅ（ＥＹＳ）  ｃａｕｓｉｎｇ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、（米国）、Ｃａｄｍｕｓ、２０１０年３月（電子出版）、第５１巻、第８号、ｐ．４２６６−４２７２
【非特許文献１１】Ｈｕａｎｇ、他、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＥＹＳ  ｉｎ  ａ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．”、ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、（英国）、ＢｉｏＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ、２０１０年８月、第１１巻、ｐ．１２１
【非特許文献１２】Ｂａｎｄａｈ−Ｒｏｚｅｎｆｅｌｄ、“Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｌｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＹＳ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｅ  ａ  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｃａｕｓｅ  ｏｆ  Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．”、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、（米国）、Ｃａｄｍｕｓ、２０１０年４月（電子出版）、第５１巻、第９号、ｐ．４３８７−４３９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、こうした状況を打破するため、発明者は、既知の３１個のａｒＲＰ原因遺伝子を用いて日本人ＲＰ患者及びその家族を対象に大規模スクリーニングを行った。その結果、ａｒＲＰ原因遺伝子の１つＥＹＳ（Ｅｙｅｓ  Ｓｈｕｔ  Ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子において、日本人特異的であると推定される新規遺伝子変異ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡを同定した。
【００１１】
ＥＹＳの変異解析は、これまでに、フランス人、スペイン人、オランダ人、イギリス人、中国人、イスラエル人など様々な人種で報告されている（表２、非特許文献５〜非特許文献１２）。しかし、これらの人種ではその精力的な変異解析にも関わらず、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異は報告されていない。また、非特許文献７によれば、スペイン人ａｒＲＰ患者のうちＥＹＳ遺伝子の複数ある変異のうち一つが原因である割合は高々１６％（１５人／９４人）であるのに対し、今回発見したｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異は、驚くべきことに、ａｄＲＰ以外の日本人ＲＰ患者のうち１２％（１１人／９２人）に共通している。以上から、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異は、日本人ＲＰ患者において突出して頻度の高い、日本人特異的なＥＹＳ遺伝子変異である可能性が極めて高い。
【００１２】
【表２】
0005828499.tif 000003
【００１３】
以上から、ＥＹＳ遺伝子のｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を、ＲＰ患者又は患者候補者において検査することは、臨床的に極めて意義深いと考えられる。特に、ａｄＲＰ以外の日本人ＲＰ患者での占有率が高いことから、ＥＹＳ遺伝子のｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査することは、日本人ＲＰ患者の遺伝子治療を行うための又ＲＰ患者予備軍を発見するためのスクリーニング、特に、一次スクリーニングに相応しいと考えられる。こうした検査やスクリーニングのため、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を患者血液から簡便に検出できる検査キットやｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異とこれまで報告のある変異を組み合わせたマイクロアレイの開発が望まれる。
【００１４】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、ＥＹＳ遺伝子において、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検出するプライマー、プローブ、マイクロアレイ、及びこれらを備える検出キット、並びに、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検出することを含むＲＰ原因遺伝子変異の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る日本人における網膜色素変性症原因遺伝子変異の検査方法は、
日本人である被験者から採取されたＤＮＡ含有試料から、ＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
このとき、前記ＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査する工程は、一次スクリーニングとして行われてもよい。
【００１７】
このとき、前記被験者は網膜色素変性症患者であることが好ましい。
【００１９】
上記目的を達成するため、本発明の第２の観点に係る日本人においてＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を検出するためのプライマーセットは、
ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７及び４９５８番目の塩基を含む配列部分を増幅するために使用できることを特徴とする。
【００２０】
このとき、プライマーセットは、配列番号８の塩基配列を有するプライマー及び配列番号９の塩基配列を有するプライマーの組、又は、配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー及び配列番号９の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーの組を含んでいてもよい。
【００２１】
上記目的を達成するため、本発明の第３の観点に係る日本人においてＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を検出するためのプローブは、
ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７及び４９５８番目の塩基を含む配列部分、又は、該配列部分と相補的な塩基配列を有することを特徴とする。
【００２２】
上記目的を達成するため、本発明の第４の観点に係る日本人においてｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を含む複数のＥＹＳ遺伝子の変異を検出するためのマイクロアレイは、
本発明の第３の観点に係るプローブ、及び、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を除くＥＹＳ遺伝子の変異を検出するためのプローブを含むことを特徴とする。
【００２３】
上記目的を達成するため、本発明の第５の観点に係る日本人においてＥＹＳ遺伝子の変異を検出するための検出キットは、
本発明の第２の観点に係るプライマーセット、本発明の第３の観点に係るプローブ、及び、本発明の第４の観点に係るマイクロアレイの少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ＲＰ患者又は患者予備軍のＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査することが可能となる。これにより、ＲＰ患者に対して、その発症原因である遺伝子変異に応じた適切な治療、例えば、遺伝子治療を試みることが可能となる。また、日本人のＲＰ患者内の占有率が高いｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を用いることで、ＲＰ患者におけるＥＹＳ遺伝子変異のスクリーニングを効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＥＹＳタンパク質の一次構造を示す模式図。
【図２】ＥＹＳ遺伝子のイントロンエキソン構造を示す模式図。
【図３】ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の位置を示すシークエンスデータ。
【図４】ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異のｃＤＮＡ配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列（ａ）とその模式図（ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、この発明の実施形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２７】
（ＲＰ原因遺伝子の検査方法）
本実施形態によれば、ＲＰ患者又は患者候補者のＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査するための検査方法が提供される。
【００２８】
ＥＹＳは、ショウジョウバエの複眼形態形成に機能するＳｐａｍ（Ｓｐａｃｅｍａｋｅｒ）と呼ばれる遺伝子のオルソログである。このため、ＥＹＳも視細胞の発生や形態形成に機能していると考えられているが、その生体内での詳細な機能は未だ分かっていない。
【００２９】
ＥＹＳタンパク質は、視細胞特異的に発現し、図１に示すように、Ｎ末にシグナルペプチドと２９個のＥＧＦ−ｌｉｋｅドメイン、Ｃ末に５つのｌａｍｉｎｉｎ  Ａ  Ｇ−ｌｉｋｅ（ＬａｍＧ）ドメインを持つ３１６５アミノ酸からなる非常に大きいタンパク質である。ＥＹＳ遺伝子も、長大であり、図２に示すように、４４個のエキソンからなり眼特異的に発現する既知の遺伝子中最長（ゲノム長２Ｍｂ）の遺伝子と言われている。
【００３０】
本発明で検出するＥＹＳ遺伝子の変異であるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異は、ＥＹＳ遺伝子の第２６エキソン上に存在し、図３に示すように、翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目の塩基と４９５８番目の塩基との間にアデニン（Ａ）が挿入されたものである。なお、本明細書中では、正常人（非ＲＰ発症者）のＥＹＳ遺伝子ｃＤＮＡを基準にゲノム配列中の塩基の位置を示す。また、ＥＹＳ遺伝子には複数の転写物変異体が知られているが、上記ＥＹＳ遺伝子ｃＤＮＡは、４４個のエキソンからなる転写物変異体のｃＤＮＡを指している。ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異では、挿入されたアデニンによってタンパク質への翻訳の際に読み枠のずれ（フレームシフト）が生じるため、本変異を有するＥＹＳ遺伝子から翻訳されるタンパク質（配列番号１４を参照）は、図４に示すように、転写開始メチオニンから数えて１６５３番目に通常とは異なるアミノ酸が付加され、この直後に終端となると推定される。
【００３１】
ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異がどのように生体内で機能するかは明らかではないものの、実施例で後述するように、ａｄＲＰ以外の日本人ＲＰ患者のうち１２％がこの変異を有していた。このため、本変異は、日本人ＲＰ患者の主要なＲＰ発症原因因子の一つであると言える。
【００３２】
このため、本実施形態の検査方法では、被験者から採取したＤＮＡ含有試料から、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査する工程を含む。この変異の有無の検査工程は、具体的には、試料に含まれるＤＮＡから、ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目と４９５８番目との塩基の間にアデニンが挿入されているか否かを調べることによって行われる。日本人ＲＰ患者において占有率の高い変異を検査する工程を含むことによって、本実施形態の検査方法では、既知のＥＹＳ遺伝子の変異のみを用いる検査方法と比較して高い確率で、日本人ＲＰ患者のＲＰ原因変異を特定することが可能となる。このため、本検査方法を用いることで、日本人ＲＰ患者又はＲＰ予備軍患者のスクリーニングを効率よく行うことが可能となる。
【００３３】
また、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査する工程を、一次スクリーニングとして行ってもよい。このとき、一次スクリーニングで検査されるＥＹＳ遺伝子の変異は、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異のみであることが好ましい。また、これまでのところ、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異と同程度の頻度で表れるＥＹＳ遺伝子変異は知られていないが、このような変異が発見された場合、それらの変異を一次スクリーニングで、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異とともに検査するものとしてもよい。そして、必要であれば、二次以降のスクリーニングで、一次スクリーニングで検査しなかったＥＹＳ遺伝子の変異を検査する。このように、被験体の人種集団で出現頻度の高い変異のみを一次スクリーニングに用いることによって、検査に係る手間を減らしつつスクリーニングによって原因遺伝子変異を特定できる割合を維持できる。これにより、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査する工程を、一次スクリーニングとして行う場合、そうでない場合に比べて、さらに効率よく、日本人ＲＰ患者又はＲＰ予備軍患者のスクリーニングを行うことができる。
【００３４】
変異の有無を検査することは、当業者に既知の種々の方法を用いて行うことができる。具体的には、ダイレクトシーケンス法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ（Ｐｏｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法、  ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＩＩｓ型制限酵素を利用したＳＮＰ特異的な標識方法、磁気蛍光ビーズを使った変異部位における遺伝子型の決定法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＲＣＡ法、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、変性剤濃度勾配ゲル法、ＤＮＡアレイ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション法など種々の方法が知られている。
【００３５】
被験者としては、ＲＰ患者の他に、ＲＰ予備軍と疑われる患者、家族内にＲＰ患者がいる健常者（非ＲＰ発症者）あるいは胎児、及び、定期健診を受ける人々などが考えられる。また、ＥＹＳ遺伝子の変異を検出するためのＤＮＡ含有試料として、被験者から得られた任意の生体試料を用いることができる。生体試料の例として、被検者から得られた、血液、その他の体液、皮膚、口腔粘膜、その他の組織もしくは細胞等、またはこれらから単離もしくは精製されたゲノムＤＮＡが挙げられる。ゲノムＤＮＡの抽出及び精製法は周知である。例えば、ヒトから採取した血液等の生体試料から、フェノール法等を用いてゲノムＤＮＡを精製する。その際、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ等の市販のゲノムＤＮＡ抽出キットや装置を用いることができる。
【００３６】
被験者が、ＲＰ患者である場合、本実施形態のＲＰ原因遺伝子変異の検査方法で得られた結果は、ＲＰ患者の治療に役立てることができる。例えば、本検査方法によって、ＲＰ患者がｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を有していることが判明した場合、この変異がＲＰ患者のＲＰ発症原因であると推定できる。こうした情報は、ＲＰ患者に対する遺伝子治療などの際に有効な判断材料となると期待される。
【００３７】
また、被験者が、ＲＰであると診断されていない人である場合、本実施形態のＲＰ原因遺伝子変異の検査方法で得られた結果は、当該被験者の網膜色素変性症への遺伝的感受性の検査に用いることができる。例えば、本検査方法によって、被験者がｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を有していることが判明した場合、被験者が網膜色素変性症を発症する可能性があると判断することができる。こうした情報は、ＲＰ症状の早期発見につながるものであり、ＲＰ患者予備軍（診断が確定した後ではＲＰ患者）の治療をＲＰ発生初期から始めることができるため、良好な予後が期待できる。
【００３８】
（プライマー、プローブ、及び、マイクロアレイ）
本実施形態の係る、プライマー、プローブ、及び、マイクロアレイは、ＥＹＳ遺伝子のｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を検出する。
【００３９】
本実施形態に係るプライマーは、ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目と４９５８番目との塩基の間にアデニンが挿入されているか否かを、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法などの既知の方法で検出するために用いることができるプライマーであればどのようなものでも構わない。
【００４０】
一例として、ダイレクトシークエンス法を用いる場合について説明する。ダイレクトシークエンス法は、標的遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用い、患者又は被験者から単離したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等によって、変異が生じる塩基配列部分を含む塩基配列を増幅し、この増幅した塩基配列をサイクルシークエンス法等のＤＮＡシークエンス法によって決定する方法である。
【００４１】
例えば、ＥＹＳ遺伝子にハイブリダイズするプライマー、例えば、配列番号８及び９のプライマーセットを用い、患者又は被験者から単離したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによって、ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目と４９５８番目との塩基の間を含む塩基配列を増幅し、この増幅した塩基配列をサイクルシークエンス法によって決定することができる。この決定した塩基配列から、ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目と４９５８番目との塩基の間にアデニンが挿入されているか否かを判定することができる。アデニンの挿入が認められた場合、当該患者又は被験者のＥＹＳ遺伝子は、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異であると判定できる。
【００４２】
本実施形態に係るプローブは、ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目と４９５８番目との塩基の間にアデニンが挿入されているか否かを、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法などの既知の方法で検出するために用いることができるプローブであればどのようなものでも構わない。
【００４３】
一例として、Ｉｎｖａｄｅｒ法を用いる場合について説明する。アレルプローブは、検出すべき変異部位に隣接する領域（ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目と４９５８番目との塩基のどちらか一方）にハイブリダイズするように設計される。アレルプローブの５’側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アレルプローブは変異部位の３’側にハイブリダイズし、変異部位の上でフラップに連結する構造を有する。一方インベーダープローブは、変異部位の５’側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって３’末端が変異部位（ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目と４９５８番目との塩基の間に挿入されるアデニン）に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける変異部位に相当する位置の塩基は任意でよい。つまり、変異部位を挟んでインベーダープローブとアレルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列は設計されている。
【００４４】
変異部位がアレルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアレルプローブの両者が変異部位にハイブリダイズすると、アレルプローブの変異部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）した構造が形成される。ｃｌｅａｖａｓｅは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアレルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも変異部位の塩基がアレルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、変異部位におけるインベーダープローブとアレルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってｃｌｅａｖａｓｅによるフラップの切断が起こらない。
【００４５】
ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。ＦＲＥＴプローブは５’末端側に自己相補配列を有し、３’末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。ＦＲＥＴプローブの３’末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップが  ＦＲＥＴプローブにハイブリダイズすると、ＦＲＥＴプローブの自己相補配列の５’末端部分にフラップの３’末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。ｃｌｅａｖａｓｅは侵入構造を認識して切断する。ＦＲＥＴプローブの  ｃｌｅａｖａｓｅによって切断される部分を挟んで、レポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、ＦＲＥＴプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。結果として、蛍光シグナルが観察された場合、ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目と４９５８番目との塩基の間にアデニンが挿入されていると判定できる。このようにアデニンの挿入が認められた場合、当該患者又は被験者のＥＹＳ遺伝子は、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異であると判定できる。
【００４６】
本実施形態に係るマイクロアレイは、ＥＹＳ遺伝子のｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異及び既知のＥＹＳ遺伝子変異を検出する。そのため、本マイクロアレイは、ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７及び４９５８番目の塩基を含む配列部分、又は、該配列部分と相補的な塩基配列を有するプローブと、既知のＥＹＳ遺伝子変異を検出するためのプローブとを含む。
【００４７】
このＤＮＡマイクロアレイを用いて、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、多数の変異部位について同時に解析するには、ＤＮＡアレイは有用である。
【００４８】
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。
【００４９】
オリゴヌクレオチドは、検出すべき遺伝子変異を含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。更に、一般にＤＮＡアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチプローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチプローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。
【００５０】
本マイクロアレイを用いることで、既知のＥＹＳ遺伝子変異と共に日本人ＲＰ患者において占有率の高いｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異についてスクリーニングを行うことができるため、本マイクロアレイでは、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の他のＥＹＳ遺伝子変異を基に作成られたマイクロアレイと比較して高い確率で、日本人ＲＰ患者のＲＰ原因変異を特定することが可能となる。このため、本検査方法を用いることで、日本人ＲＰ患者又はＲＰ予備軍患者のスクリーニングを効率よく行うことが可能となる。
【００５１】
（検出キット）
次に、本実施形態に係る検出キットについて説明する。
【００５２】
本検出キットは、本実施形態に係るプライマー、プローブ、及び、マイクロアレイの少なくとも１つを備える。また、本検出キットは、好ましくは、上述した遺伝子変異検出を実施するために必要な各種反応成分、例えば、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用及び／又は検出用試薬などを、さらに含む。これにより、本検出キットでは、上述したような種々の方法のいずれかによって、被験者のＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検出可能である。
【００５３】
また、本プライマーと本プローブとを備える検出キットでは、例えば、被験者から採取した試料中のＥＹＳ遺伝子ＤＮＡを、本プライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した後、本プローブを用いたＩｎｖａｄｅｒ法によって検査することが可能となる。これにより、僅かな試料を用いる場合でも、正確にＥＹＳ遺伝子の変異を検知できる。
【００５４】
また、本プライマーと本マイクロアレイとを備える検出キットでは、例えば、被験者から採取した試料中のＥＹＳ遺伝子ＤＮＡを、本プライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した後、本マイクロアレイを用いたマイクロアレイ法によって検査することが可能となる。これにより、僅かな試料を用いる場合でも、正確にＥＹＳ遺伝子の変異を検知できる。
【００５５】
また、本検出キットは、説明書を含んでもよい。説明書には、上述した、ＲＰ患者又は患者候補者のＥＹＳ遺伝子におけるｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異の有無を検査するための検査方法を行うための指示が記載されていることが好ましい。これにより、使用者は、説明書を参照しながら、本検出キットを用いることで、ＲＰ患者又は患者候補者におけるＲＰ原因遺伝子変異のスクリーニングを効率良く行うことができる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
（ＥＹＳ遺伝子の変異解析）
【００５７】
ＲＰ患者は、日本においては、約１６０００−３２０００と概算され、少数の患者を発見し、検体を収集することは極めて困難である。そこで、ＲＰ症例が集まりやすい４基幹施設（浜松医科大学眼科、神戸理化学研究所、名古屋大学医学部眼科、千葉大学医学部眼科）の協力により、倫理規定に基づき遺伝子検査について十分な説明を行いインフォームドコンセントが得られた「発端者の両親が正常の患者（即ち、優性以外の遺伝形式）」という条件に適合した検体を９２人収集した。こうした条件で検体を収集したのは、現在は一般に家系が小さく（発端者に同胞がおらず）、家系情報が揃わない（祖父母などの情報がない）ため、正確な遺伝形式を判断することが難しいためである。このため、今回得られた検体のＲＰの遺伝形式は、常染色体劣性とＸ連鎖性と孤発例とを含む。
【００５８】
また、視覚障害のない日本人９６名を、正常人コントロールとした。
【００５９】
検体として選ばれた患者及びコントロールから最大２０ｍｌの血液を真空採血管（ベノジェクトＩＩ真空採血管  ＶＰ−Ｈ０５０Ｋ、ＴＥＲＵＭＯ、日本）を用いて採取した。検体は連結可能匿名化した。各検体の血液２ｍｌよりゲノムＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いて抽出した。また、採取した血液のうち５ｍｌは、Ｂリンパ芽球様細胞株の樹立のために用いた。具体的には、患者の末梢血５ｍｌからＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、独国）を用いてリンパ球を抽出し、ＥＢウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）に感染させる。その後、活発に増殖するＢリンパ芽球様細胞が得られるまで培養と継代を続けた。Ｂリンパ芽球様細胞株の樹立のさらなる詳細については、文献（Ｂａｒｄ、他、“Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．”、Ｎａｔｕｒｅ、（英国）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｐｕ、１９８１年１月、第２８９巻、第５７９５号、ｐ．３００−３０１、及び、カツキ、他、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ．”、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、（米国）、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１９７５年２月、第１５巻、第２号、ｐ．２０３−２１０）に記載されている。こうして樹立したＢリンパ芽球様細胞株は、上記のように抽出したＤＮＡが足りなかった場合に必要量の高分子量ＤＮＡを調整するために用いた。残りの血液はフリーザーに冷凍保存した。
【００６０】
抽出した各ＤＮＡサンプルにおいて、ＥＹＳ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。新規変異が発見されたＥＹＳ遺伝子のエキソン２６及びその近傍のイントロンの増幅に用いたプライマーセット（配列番号２と３、４と５、６と７、８と９、１０と１１、１２と１３の組み合わせ）を表３に示す。反応溶液（１０μＬ）には６ｎｇのＤＮＡ、０．３ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍｍｏｌ／Ｌの各デオキシヌクレオシド三リン酸  （ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、１．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、０．２ＵのＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２、ＴＯＹＯＢＯ）を含み、それぞれのＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を用いた。  増幅プロトコルは初期変性が９４℃、２分；３５ｃｙｃｌｅｓで変性が９８℃、１０秒、アニーリングが６０℃で３０秒、伸展が６８℃で１分、そして最終伸展を６８℃で５分とした。ＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ  （登録商標）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）、又は、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ、米国）を用いた酵素処理により精製した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いてシーケンス反応を行い、ＡＢＩ３１００シーケンサーにて塩基配列を解析した。こうして得られた検体の塩基配列を、コントロール群の塩基配列と比較した。その結果、配列番号１に示すような、ＥＹＳ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンから下流４９５７番目の塩基と４９５８番目の塩基との間にアデニンが挿入されたｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異を発見した。ＲＰ患者中の頻度を調べると、９２人の患者中１１人が本変異を有していることが明らかとなった。
【００６１】
【表３】
0005828499.tif 000004
【００６２】
本変異についてコントロールにおける存否およびその頻度を評価した。その結果、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異は、日本人正常コントロール９６名では同定されなかった。また、同定した変異体の塩基配列（配列番号１）からタンパク質のアミノ酸配列を推定したところ、図４に示すように、フレームシフトが生じ、本変異を有するＥＹＳ遺伝子から翻訳されるタンパク質（配列番号１４）は、転写開始メチオニンから数えて１６５３番目に通常とは異なるアミノ酸が付加され、この直後に終端となることが判明した。この予想アミノ酸配列は機能領域の５０％を欠くため、生体内では正常に機能しないものと推定される。以上より、本変異が、ＲＰの原因変異であると結論された。
【００６３】
非特許文献７によれば、スペイン人ａｒＲＰ患者のうちＥＹＳ遺伝子の複数ある変異のうち一つが原因である割合は高々１６％（１５人／９４人）であることから、日本人のＲＰ患者のＥＹＳ遺伝子スクリーニングにおいても、同様の傾向が見られるものと発明者は予測していた。しかし、驚くべきことに、日本人のＲＰ患者の１２％（１１人／９２人）に共通する変異が存在することが明らかとなった。ＥＹＳの変異解析は、これまでに、フランス人、スペイン人、オランダ人、イギリス人、中国人、イスラエル人など様々な人種で報告されている（表２、非特許文献５〜非特許文献１２）。しかし、これらの人種ではその精力的な変異解析にも関わらず、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異は報告されていない。以上から、ｃ．４９５７＿４９５８ＩｎｓＡ変異は、日本人ＲＰ患者において突出して頻度の高い、日本人特異的な遺伝子変異である可能性が極めて高い。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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