(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、
前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１または３の配列で示され、
前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５、９、１１、７、１３および５の配列のいずれか一つで示され、且つ
前記配列番号１の第１番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンであることを特徴とするヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体または前記抗体の抗原結合性フラグメントＦａｂ。
【請求項２】
下記ａ）〜ｌ）のいずれか一つであり、配列番号１の第１番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである請求項１に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。
ａ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号１５の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０８、を有するＫＳ１０。
ｂ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号９の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０５、を有するＫＳ０３。
ｃ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号１１の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０６、を有するＫＳ０６。
ｄ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号１５の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０８、を有するＫＳ１２。
ｅ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号９の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０５、を有するＫＳ０４。
ｆ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号１１の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０６、を有するＫＳ０７。
ｇ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号５の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０３、を有するＫＳ０２。
ｈ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号７の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０４、を有するＫＳ０８。
ｉ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号１３の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０７、を有するＫＳ１１。
ｊ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号５の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０３、を有するＫＳ０１。
ｋ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号７の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０４、を有するＫＳ０５。
ｌ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号１３の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０７、を有するＫＳ０９。
【請求項３】
重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、
前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２７の第１〜１２０番目、または配列番号２５の第１〜１２０番目に相当し、
前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１の第１〜１０９番目に相当する
ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗原結合性フラグメントＦａｂ。
【請求項４】
定常領域のアミノ酸配列がヒト抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である重鎖、および
定常領域のアミノ酸配列がヒト抗体の軽鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である軽鎖から成る請求項１または２に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。
【請求項５】
前記重鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１７の配列で示され、且つ
前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１９の配列で示される
請求項１、２または４に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。
【請求項６】
前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２１の配列で示され、
前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２３の配列で示され、且つ
前記配列番号２１の第１番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである請求項１、２、４、および５のいずれか一つに記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。
【請求項７】
前記重鎖の可変領域および重鎖の定常領域ＣＨ１から成る重鎖フラグメントと、
前記軽鎖の可変領域および軽鎖の定常領域から成る軽鎖から成り、
前記ＣＨ１のアミノ酸配列はヒト抗体重鎖の定常領域ＣＨ１のアミノ酸配列と同一であり、且つ
前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列はヒト抗体軽鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である請求項１または３に記載の抗原結合性フラグメントＦａｂ。
【請求項８】
前記ＣＨ１のアミノ酸配列は配列表の配列番号３３の配列で示され、且つ
前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１９の配列で示される
請求項１、３または７のいずれかに記載の抗原結合性フラグメントＦａｂ。
【請求項９】
下記ｂ１）〜ｂ３）のいずれか一つである請求項３、７または８のいずれかに記載の抗原結合性フラグメントＦａｂ。
ｂ１）ＫＳ−７Ｆ：前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号２７で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１で示される。
ｂ２）ＫＳ−７Ａ：前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号２５で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１で示される。
ｂ３）ＫＳ−２Ｅ：前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号２５で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２９で示される。
【請求項１０】
抗原結合性フラグメントＡはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、重鎖の可変領
域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントであり、
抗原結合性フラグメントＢはＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、重鎖の可変領域、軽鎖
の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントである
請求項１、２、４、５および６のいずれかに記載の抗体に由来する抗原結合性フラグメントＡ、または
請求項１、３、７、８および９のいずれかに記載のＦａｂに由来する抗原結合性フラグメントＢ。
【請求項１１】
下記Ａ）〜Ｃ）のいずれか一つのタンパク質をコードする遺伝子。
Ａ）請求項１、２、４、５および６のいずれか一つに記載の抗体。
Ｂ）請求項１、３、７、８および９のいずれか一つに記載のＦａｂ。
Ｃ）請求項１０に記載の抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
請求項１、２、４、５および６のいずれか一つに記載の抗体、および配列表の配列番号２または４の配列で示される請求項１０に記載の抗原結合性フラグメントＡ、の重鎖の可変領域のコード配列、
請求項１、２、４、５および６のいずれか一つに記載の抗体、および配列表の配列番号１６、１０、１２、８、１４および６のいずれか一つの配列で示される請求項１０に記載の抗原結合性フラグメントＡ、の軽鎖の可変領域のコード配列、
請求項１、３、７、８および９のいずれか一つに記載のＦａｂ、および配列表の配列番号２、４、２８、および２６のいずれか一つの配列の第１〜３６０番目と同一の請求項１０に記載の抗原結合性フラグメントＢ、の重鎖の可変領域のコード配列、または
請求項１、３、７、８および９のいずれか一つに記載のＦａｂ、および配列表の配列番号１６、１０、１２、８、１４、６、３２、および３０のいずれか一つの配列の第１〜３２７番目に相当する請求項１０に記載の抗原結合性フラグメントＢ、の軽鎖の可変領域のコード配列、
である請求項１１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
前記抗体の重鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号１８の配列で示され、且つ
前記抗体の軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号２０の配列で示され、
前記ＦａｂのＣＨ１のコード配列は配列表の配列番号３４の配列で示され、且つ
前記Ｆａｂの軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号２０の配列で示される
請求項１１または１２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１４】
前記抗体の重鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号２２の配列で示され、且つ前記抗体の軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号２４の配列で示され、
請求項３、７、８および９のいずれか一つに記載のＦａｂのコード配列は、下記ｃ１）〜ｃ３）のいずれか一つである
請求項１１〜１３のいずれか一つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
ｃ１）ＫＳ−７Ｆ：Ｆａｂの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号２８で示され、且つＦａｂの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号３２で示される。
ｃ２）ＫＳ−７Ａ：Ｆａｂの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号２６で示され、且つＦａｂの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号３２で示される。
ｃ３）ＫＳ−２Ｅ：Ｆａｂの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号２６で示され、且つＦａｂの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号３０で示される。
【請求項１５】
遺伝子材料であって、
請求項１１〜１４のいずれか一つに記載の遺伝子を含む
組み換えベクター、組み換え菌、組み換え細胞株、組み換えウイルス、または発現カセットである遺伝子材料。
【請求項１６】
前記組み換えベクターは、前記Ｆａｂ、抗体、または抗原結合性フラグメントを発現させるための原核生物または真核生物発現ベクターであり、
前記組み換え菌は、前記遺伝子を有する大腸菌であり、
前記組み換え細胞株は、前記遺伝子を組み込んだ哺乳動物細胞株であり、
前記組み換えウイルスは、前記遺伝子を運搬する組み換えアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである
請求項１５に記載の遺伝子材料。
【請求項１７】
前記組み換え細胞株は、ＣＨＯ細胞株、または２９３細胞株およびその亜系統である請求項１６に記載の遺伝子材料。
【請求項１８】
ｄ１）ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気の予防および／または治療のための薬の調整、
ｄ２）ヒト腫瘍壊死因子αを中和するための生成物の調整、または
ｄ３）ヒト腫瘍壊死因子αを定性的もしくは定量的に検出するためのキットの調整
のための、
請求項１、２、４、５および６のいずれか一つに記載の抗体、
請求項１、３、７、８および９のいずれか一つに記載のＦａｂ、
請求項１０に記載の抗原結合性フラグメント、
請求項１１〜１４のいずれか一つに記載の遺伝子、または
請求項１５〜１７のいずれか一つに記載の遺伝子材料、
の使用方法。
【請求項１９】
補助材料および有効成分を含み、
前記有効成分は、
請求項１、２、４、５および６のいずれか一つに記載の抗体、
請求項１、３、７、８および９のいずれか一つに記載のＦａｂ、
請求項１０に記載の抗原結合性フラグメント、
請求項１１〜１４のいずれか一つに記載の遺伝子、および
請求項１５〜１７のいずれか一つに記載の遺伝子材料の少なくとも一つを含み、
前記補助材料は薬学的に許容できる担体または賦形剤である
医薬組成物。
【請求項２０】
前記ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、ヒト腫瘍壊死因子αの増加が原因の病気である請求項１８に記載の使用方法。
【請求項２１】
前記ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、または若年性特発性関節炎である請求項２０に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）抗体およびその抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）およびその使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患の発症および進行は、多くの活性サイトカインの制御のアンバランスが起因となる複雑な過程を経る。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）は多数のサイトカインの中で免疫調節に重要な役割を果たすことが示されている。しかし、その過剰発現は自己免疫疾患などの主要因の１つであることが実証されている。従って腫瘍壊死因子αの活性を抑える生物医薬品の使用は、このような疾病の治療に最も成功した治療の１つになっている。主として承認された適応症は、関節リウマチ、クローン病、プラーク乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎および若年性特発性関節炎を含み、その一方で様々な他の関連疾患について臨床試験が行われている。
【０００３】
現在、ヨーロッパおよび米国市場では、Ｒｅｍｉｃａｄｅのような抗腫瘍壊死因子α抗体薬剤および抗体様Ｆｃ融合タンパク質が入手できる。しかし、Ｒｅｍｉｃａｄｅの生体内での半減期は、およそ９日であり短い。更に、Ｒｅｍｉｃａｄｅは抗原との結合親和力、生物活性および臨床適用があり、配列の１／３がマウス由来配列、および配列の２／３がヒト由来配列からなるキメラ抗体であり、患者の約１０％〜４７％はＲｅｍｉｃａｄｅの投与後に免疫反応が起き、一般に、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の産生をもたらし、抗体の性能および長期適用に影響する。従って、マウス由来率を減少させ、人の病気の治療の際に安全に使用できるように、より高度のヒト化と、マウス由来配列の割合を最大限に減少させた抗腫瘍壊死因子α抗体が要求されている。抗体をヒト化する一般的な過程は、事前に選択したヒト化抗体のフレームワーク領域の中へ、マウス由来抗体の可変領域（ＶH、ＶK）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の部分を組み込む過程である。その合成抗体は、ほぼヒト由来配列からなり、同じ抗原に対して当初のマウス由来抗体の選択性を保持することができる。しかし、その過程は、一般に抗体親和性の減少をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の目的の一つは、ヒト腫瘍壊死因子αに対する親和性が、ヒト−マウスキメラ抗体であるＲｅｍｉｃａｄｅと同等か、またはそれより高い、ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体および前記抗体の抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）を提供することにある。
【０００５】
本発明に係るヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体またはＦａｂは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１または３の配列で示され、前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５、９、１１、７、１３および５の配列のいずれか一つで示され、且つ前記配列番号１の第１番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである。
【０００６】
詳細には、前記抗体は下記ａ）〜ｌ）のいずれか一つから選ばれ、配列番号１の第１番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである。ａ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号１５の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０８を有するＫＳ１０、ｂ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号９の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０５を有するＫＳ０３、ｃ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号１１の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０６を有するＫＳ０６、ｄ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号１５の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０８を有するＫＳ１２、ｅ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号９の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０５を有するＫＳ０４、ｆ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号１１の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０６を有するＫＳ０７、ｇ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号５の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０３を有するＫＳ０２、ｈ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号７の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０４を有するＫＳ０８、ｉ）配列番号３の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０２、および配列番号１３の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０７を有するＫＳ１１、ｊ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号５の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０３を有するＫＳ０１、ｋ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号７の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０４を有するＫＳ０５、ｌ）配列番号１の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域ＳＨ０１、および配列番号１３の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域ＳＨ０７を有するＫＳ０９。
【０００７】
本発明の他の目的は、ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗原結合性フラグメントＦａｂを提供することにある。前記Ｆａｂは、重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列表の配列番号２７または配列番号２５の第１〜１２０番目に相当する重鎖、および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１または配列番号２９の第１〜１０９番目に相当する軽鎖、を含む。
【０００８】
本発明で提供する抗体は、定常領域のアミノ酸配列がヒトの重鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である重鎖、および定常領域のアミノ酸配列がヒトの軽鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である軽鎖から成る。
【０００９】
前記抗体の重鎖定常領域は、いずれかのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）またはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）のヒト由来定常領域であっても良く、前記抗体の軽鎖定常領域は、ヒト由来定常領域のいずれかのクラス（κまたはλ）若しくはサブクラス（λ１、λ２、λ３、λ４）又はアロタイプ（κｍ（１）、κｍ（２）、κｍ（３））であっても良い。
【００１０】
前記抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列は詳細には配列表の配列番号１７の配列で示され、且つ前記抗体の軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は詳細には配列表の配列番号１９の配列で示される。
【００１１】
前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２１の配列で示され、前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２３の配列で示される。配列番号２１の第１〜１２０番目のアミノ酸配列は前記重鎖の可変領域に相当し、且つ第１２１〜４５０番目のアミノ酸配列は前記重鎖の定常領域に相当する。配列番号２３の第１〜１０９番目のアミノ酸配列は前記軽鎖の可変領域に相当し、且つ第１１０〜２１４番目のアミノ酸配列は前記軽鎖の定常領域に相当する。前記、配列番号２１の第１番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである。
【００１２】
本発明で提供するＦａｂは、重鎖Ｆｄフラグメントおよび軽鎖から成り、前記重鎖ＦｄフラグメントはＶHとＣＨ１を含み、前記軽鎖はＶKおよび軽鎖定常領域を含み、前記ＣＨ１のアミノ酸配列はヒト抗体重鎖のＣＨ１定常領域のアミノ酸配列と同一であり、且つ、前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列はヒト抗体軽鎖の定常領域と同一である。
【００１３】
前記ＦｄのＦｄフラグメントのＣＨ１は、いずれかのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）またはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）のヒト由来のＣＨ１定常領域であっても良い。前記Ｆａｂの軽鎖定常領域は、いずれかのクラス（κまたはλ）またはサブクラス（λ１、λ２、λ３、λ４）またはアロタイプ（κｍ（１）、κｍ（２）、κｍ（３））のヒト由来の軽鎖定常領域であっても良い。
【００１４】
ＣＨ１のアミノ酸配列は配列表の配列番号３３の配列で示され、前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１９の配列で示される。
【００１５】
本発明の特定の実施形態では、前記Ｆａｂは、下記ｂ１）〜ｂ３）のいずれか一つである。
ｂ１）ＫＳ−７Ｆ：前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２７で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１で示される。
ｂ２）ＫＳ−７Ａ：前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２５で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１で示される。
ｂ３）ＫＳ−２Ｅ：前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２５で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２９で示される。
【００１６】
本発明の更に別の目的は、抗原結合性フラグメントＡまたは抗原結合性フラグメントＢを提供することであり、前記抗原結合性フラグメントＡはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（抗体の可変領域フラグメント）、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントであり、これらは前記抗体に由来し、前記抗原結合性フラグメントＢはＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントであり、これらは前記Ｆａｂに由来する。
【００１７】
前記Ｆ（ａｂ’）２は、軽鎖１対およびＦｄより僅かに大きい重鎖（Ｆｄ’と称される）１対を含む。ペプシンによるＩｇＧ分子の加水分解はＦ（ａｂ’）２フラグメントを産生し、Ｆ（ａｂ’）２は２つのＦａｂを含み、そのため２つの抗原エピトープと結合することができる。Ｆｄ’は約２３５アミノ酸残基を含み、ＶH、ＣＨ１、およびヒンジ領域を含む。Ｆｖは軽鎖の可変領域（ＶＬ）および重鎖の可変領域（ＶH）から成り、それらは非共有結合により会合している。Ｆｖは単一の抗原結合部位を有し、Ｆｖの分子量は完全な抗体分子の約６分の１の分子量である。ＦｖはＳｃＦｖ（単一鎖の抗体）、ＤｓＦｖ（ジスフィルド結合安定化抗体）等を含む。ＳｃＦｖは、１つの適切なオリゴヌクレオチド（リンカー）により結合したＶHおよびＶＬからできる１つのペプチド鎖である。ＤｓＦｖは、軽鎖および重鎖の可変領域の適切な部位にそれぞれ１つのシステインを導入することにより形成された、ジスルフィド結合固定Ｆｖフラグメントである。ＤｓＦｖは、ＳｃＦｖよりも結合能および安定性に優れていることが示されている。
【００１８】
更に、次のタンパク質Ａ）〜Ｃ）のうち、いずれか１つをコードする遺伝子は、特許請求の範囲に含まれる。Ａ）前記抗体、Ｂ）前記Ｆａｂ、Ｃ）抗原結合性フラグメントＡまたはＢ。
【００１９】
抗体および抗原結合性フラグメントＡの両方の重鎖可変領域のコード配列は配列表の配列番号２または４で示される。抗体および抗原結合性フラグメントＡの両方の軽鎖可変領域のコード配列は、配列表の配列番号１６、１０、１２、８、１４および６のうちの１つから選ばれる。Ｆａｂおよび抗原結合性フラグメントＢの両方の重鎖可変領域のコード配列は、配列表の配列番号２、４、２８のいずれかの配列の第１〜３６０番目および配列番号２６の配列の第１〜３６０番目に相当する。Ｆａｂおよび抗原結合性フラグメントＢの両方の軽鎖可変領域のコード配列は配列表の配列番号１６、１０、１２、８、１４、６、３２のいずれかの配列の第１〜３２７番目、および配列番号３０の第１〜３２７番目に相当する。
【００２０】
前記配列において、配列番号６、８、１４、１０、１２および１６は全て３２７ヌクレオチドを有する一方、配列番号２、４は３６０ヌクレオチドを有する。
【００２１】
抗体の重鎖定常領域のコード配列は、配列表の配列番号１８で示され、抗体の軽鎖定常領域のコード配列は、配列表の配列番号２０で示される。
【００２２】
ＦａｂのＣＨ１領域のコード配列は、配列表の配列番号３４で示され、Ｆａｂの軽鎖定常領域のコード配列は配列表の配列番号２０で示される。
【００２３】
本発明の実施態様では、抗体の重鎖のコード配列は詳細には配列表の配列番号２２で示され、抗体の軽鎖のコード配列は配列表の配列番号２４で示される。
【００２４】
前記Ｆａｂのコード配列は以下、ｃ１）〜ｃ３）のいずれか一つである。
ｃ１）ＫＳ−７Ｆ：Ｆａｂの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号２８で示され、且つＦａｂの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号３２で示される。
ｃ２）ＫＳ−７Ａ：Ｆａｂの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号２６で示され、且つＦａｂの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号３２で示される。
ｃ３）ＫＳ−２Ｅ：Ｆａｂの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号２６で示され、且つＦａｂの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号３０で示される。
【００２５】
配列番号２２の第１〜３６０番目および３６０〜１３５０番目の位置のヌクレオチドは前記重鎖の可変領域の配列および重鎖の定常領域の配列にそれぞれ相当する一方、配列番号２４の第１〜３２７番目および第３２８〜６４２番目の位置のヌクレオチドは、前記軽鎖の可変領域の配列および軽鎖の定常領域の配列にそれぞれ相当する。
【００２６】
本発明の別の目的は、次の遺伝子材料を提供することにある。遺伝子材料は、前記遺伝子セットを含む、組み換えベクター、組み換え菌、組み換え細胞株、組み換えウイルス、または発現カセットである。
【００２７】
組み換えベクターは、抗体、Ｆａｂ、または抗原結合性フラグメントを発現する、原核生物または真核生物発現ベクターである。組み換え菌は、前記遺伝子セットを有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。組み換えの細胞株は、遺伝子組み換え細胞株か融合細胞株であり、遺伝子組み換え細胞株は、本発明のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体、Ｆａｂ、抗原結合性フラグメントをコードする遺伝子をトランスファーした哺乳動物細胞株であっても良く、好ましくは、ＣＨＯ細胞株、または２９３細胞株およびその亜系統である。融合細胞株は本発明の前記ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞である。組み換えウイルスは組み換えアデノウイルスまたは組み換えのアデノ随伴ウイルス等であり、前記遺伝子セットを運搬する。発現カセットは、上流から下流に、プロモーター、プロモーターより転写が開始される抗体またはＦａｂまたは抗原結合性フラグメント、およびターミネーターの３つのフラグメントを含むＤＮＡ分子である。
【００２８】
宿主細胞を、抗体、Ｆａｂ、または抗原結合性フラグメントをコードする遺伝子を含む組み換えベクターにより、トランスフェクトまたはトランスフォームすると、対応するタンパク質が発現され、抗体、Ｆａｂ、抗原結合性フラグメントが得られる。前記宿主細胞は、哺乳動物細胞を含むが、これに限られず、バクテリア、酵母、昆虫細胞等を含む、真核細胞であって良いし、原核細胞であっても良い。大量のタンパク質発現に有用である哺乳動物細胞は多種多様存在し、２９３、ＣＨＯ、ＳＰ２０、ＮＳ０、ＣＯＳ、ＢＨＫ、またはＰｅｒＣ６細胞等である。細胞をトランスフェクトする方法は多様であり、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなどを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
抗体、Ｆａｂ、または抗原結合性フラグメントの好ましい発現方法は以下の通りである。組換え型タンパク質の発現量を増加させるために、安定してトランスフェクトした宿主細胞中の組み換えベクターにより遺伝子増幅を行なう。例えば、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含む組み換えのベクターで安定してトランスフェクトされ、次にメトトレキサート（ＭＴＸ）は、宿主細胞中の組み換えベクターのコピー数を増加させるのに十分な濃度で、細胞培養液へ加えることができる。
【００３０】
コーディング遺伝子配列の組み合わせから成るＦａｂまたはＩｇＧの発現の後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または他の測定により、培地中のタンパク質濃度を決定することができる。Ｆａｂフラグメントについては、プロテインＧを使用して、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。また、ＩｇＧタンパク質はプロテインＡを使用して、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。
【００３１】
更に、抗体、Ｆａｂ、抗原結合性フラグメント、遺伝子、以下の遺伝子材料の使用方法も特許請求の範囲に含む。
ｄ１）ヒト腫瘍壊死因子αに関連した病気の予防および／または治療のための薬の調整、または、
ｄ２）ヒト腫瘍壊死因子αを中和するための生成物の調整、または
ｄ３）ヒト腫瘍壊死因子αを定性的もしくは定量的に検出するためのキットの調整。
【００３２】
ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、ヒト腫瘍壊死因子αの増加により引き起こされる病気であり、前記病気として好ましくは、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、または若年性特発性関節炎である。
【００３３】
本発明の更に別の目的は、補助材料および有効成分を含む医薬組成物を提供することであり、有効成分は、前記の抗体、Ｆａｂ、抗原結合性フラグメント、遺伝子、および遺伝物質の材料のうち少なくとも１つを含み、補助材料は薬学的に許容可能な担体または賦形剤である。医薬組成物の中の有効成分は、前記のＦａｂまたは抗体のいずれか一つであっても良いし、前記の抗原結合性フラグメントのいずれか一つであっても良いし、前記の遺伝子のいずれか一つであっても良いし、前記の遺伝子材料のいずれか一つであっても良い。
【００３４】
更に特許請求の範囲には、ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気の治療での、前記の抗体、Ｆａｂ、抗原結合性フラグメント、遺伝子、遺伝子材料、および医薬組成物の材料のうちいずれか一つの使用も含まれる。
【００３５】
ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、ヒト腫瘍壊死因子αの増加によって引き起こされ、前記病気として好ましくは、自己免疫性ぶどう膜炎、関節リウマチ、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、または若年性特発性関節炎である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、腫瘍壊死因子αの抑制下での、ヒト化Ｆａｂの生物活性のＥＬＩＳＡによる検出結果を示す。
【図２】図２は、腫瘍壊死因子αの中和下におけるＬ９２９細胞毒性試験による、ヒト化Ｆａｂの生物活性の検出結果を示す。
【図３】図３は、異なる種の腫瘍壊死因子α抗原に対するＫＳ１０の結合解析の結果を示す。
【図４】図４は、ＫＳ１０を用いた関節リウマチ試験用ラットの治療に関するスコアを示す。左から順に、正常群、負対照群、モデル群、ＫＳ１０  ５ｍｇ／ｋｇ群、ＫＳ１０  １０ｍｇ／ｋｇ群、ＫＳ１０  ２０ｍｇ／ｋｇの群、を示す。
【図５】図５は、関節リウマチ試験用ラットの関節の滑液／組織中のＩＬ−１βレベルに対するＫＳ１０の影響を示す。左から順に、正常群、負対照群、モデル群、ＫＳ１０  ５ｍｇ／ｋｇ群、ＫＳ１０  １０ｍｇ／ｋｇ群、ＫＳ１０  ２０ｍｇ／ｋｇの群、を示す。
【図６】図６は、関節リウマチ試験用ラットの関節の滑液／組織中のＩＬ−６レベルに対するＫＳ１０の影響を示す。左から順に、正常群、負対照群、モデル群、ＫＳ１０  ５ｍｇ／ｋｇ群、ＫＳ１０  １０ｍｇ／ｋｇ群、ＫＳ１０  ２０ｍｇ／ｋｇの群、を示す。
【実施例】
【００３７】
以下、発明の理解を助けるために実施例を示すが、本発明の範囲がこれらによって制限されるものではない。特に記載していない限り、以下に記載の実験方法はすべて従来の実験的方法である。特に記載していない限り、実施例の中で使用される実験材料はすべて、生化学試薬の一般的な店で購入可能である。以下の実施例の定量試験は３回繰り返して行い、結果は平均値である。
【００３８】
ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲの接合、ＰＣＲによる特定部位の変異誘発、および本発明で述べる突然変異体ライブラリーのスクリーニングを、従来の遺伝子組換え技術および抗原抗体相互作用に基づく免疫学技術によって行い、更に、詳細な実験の手順および手段は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎおよび同様の実験ハンドブックに記載されている。以下の実施例におけるＥＣ５０を、結果のグラフを作成中に、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５に光学濃度（ＯＤ450）の値を入力することにより得た。
【００３９】
実施例１：ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂの発現とその活性の検出
本実施例では、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体の３つのＦａｂ（Ｆａｂは重鎖Ｆｄフラグメントと抗体の軽鎖から成る）、即ちＫＳ−２Ｅ，ＫＳ−７Ａ，およびＫＳ−７Ｆを含む。
【００４０】
手順１．ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７ＡおよびＫＳ−７Ｆの発現ベクターの作成
（１）軽鎖および重鎖の配列の取得
ヒトの腫瘍壊死因子α（Ｒ＆Ｄ社，カタログ番号：２１０−ＴＡ−０５０）の免疫性を付与したマウスから、ハイブリドーマ細胞を得て、モノクローナルスクリーニングを行い、全ＲＮＡを抽出し、テンプレートとして用い、重鎖可変領域のヌクレオチド配列を一般的なプライマーである、Ｐ１：５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＧＣＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ−３’、Ｐ２：５’−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’を用い、ＰＣＲにより増幅し、且つ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、一般的なプライマーＰ３：５’−ＧＡＣＡＴＴＣＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＧＭＣＴＣＣ−３’、Ｐ４：５’−ＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’を用い、ＰＣＲにより増幅した。目的のバンドを含むゲル断片を、回収のために切り取った。抗体の軽鎖および重鎖の増幅産物は夫々、ベクターｐＭＤ１８−Ｔ（ＴａＫａＲａ社、カタログ番号：Ｄ１０１Ｃ）に挿入した。単一のコロニーを別々に選び、抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を確認するためにシークエンシングを行った。
【００４１】
（２）ヒト化Ｆａｂの作成
アミノ酸配列の相同性の比較は、生成物の軽鎖可変領域とヒト化抗体の軽鎖可変領域、および、生成物の重鎖可変領域とヒト化抗体の重鎖可変領域とを比較した。配列相同性は、ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）、およびＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ，ＩＭＧＴ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）で夫々検索した。検索結果に基づいて、軽鎖および重鎖共に相同性の高い配列を有する抗体をヒト化抗体のテンプレートとして選んだ。生成物の重鎖可変領域ＶＨを、より配列の相同性が高いヒト化抗体ＩＧＨＶ３−１５＊０７（登録番号：Ｍ９９４０６）のフレームワーク領域へ接合し、生成物の軽鎖可変領域ＶＫは、より配列の相同性が高いヒト化抗体ＩＧＫＶ６−２１＊０１（登録番号：Ｘ６３３９９）のフレームワーク領域へ接合した。
【００４２】
ヒト由来重鎖フラグメント（Ｆｄ）および軽鎖の多数の変異サイクルの後、様々な軽鎖および重鎖破片（Ｆｄ）の組み合わせを、ベクターｐＴＬＲ（ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐＥＴ２２ｂ（＋）ｖｅｃｔｏｒ）に挿入した。詳細には、各末端に制限酵素サイトＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを夫々有する軽鎖用の様々なＤＮＡ、および各末端に制限酵素サイトＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを夫々有する重鎖Ｆｄフラグメント用の様々なＤＮＡを準備した。ＤＮＡの２群を、夫々ベクターｐＴＬＲの対応する制限酵素サイト間へ移動、即ち、軽鎖用の様々なＤＮＡを制限酵素サイトＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの間に挿入し、重鎖フラグメント（Ｆｄ）用の様々なＤＮＡを、制限酵素サイトＮｏｔＩおよびＸｈｏＩの間に挿入し、様々なＦａｂ発現ベクター（ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７Ａ、ＫＳ−７Ｆ、を夫々発現する３つのＦａｂ発現ベクターを含む）を作成した。
【００４３】
前記した軽鎖および重鎖フラグメント（Ｆｄ）の様々な組み合わせは、３つのＦａｂ
ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７Ａ、およびＫＳ−７Ｆを含む。ＫＳ−２Ｅの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２５で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号２６で示され、且つ、ＫＳ−２Ｅの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２９で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号３０で示される。ＫＳ−７Ａの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２５で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号２６で示され、且つＫＳ−７Ａの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号３２で示される。ＫＳ−７Ｆの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２７で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号２８で示され、且つＫＳ−７Ｆの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号３２で示される。
【００４４】
前述のｐＴＬＲベクターを得るためのｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター組み換え手順の詳細は、以下の通りである。第１に、ＤＮＡ断片（Ｔ−Ｌ−Ｒ  ＤＮＡ塩基配列に短縮され、配列表の配列番号３５で示される）を、人工的に合成し、それは両末端に制限酵素サイトＳａｌＩおよびＮｏｔＩを有するＴ７プロモーター、ラクトース・オペレーターおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含み、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Νｏｖａｇｅ社製、アメリカ）およびＴ−Ｌ−Ｒ  ＤＮＡ塩基配列を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限酵素の両方で夫々切断し、その後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより結合しトランスフォームし、最後に単一コロニーを従来方法により選び、適切に組み換えベクターを選びシークエンシングを行った。
【００４５】
手順２．ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７ＡおよびＫＳ−７Ｆの原核生物の発現
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｔｏｐ１０に上述の作成したＦａｂ発現ベクター（ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７Ａ、ＫＳ−７Ｆ、を夫々発現する３つのＦａｂ発現ベクターを含む）をトランスフォームし、その後、クロラムフェニコールと共に２−ＹＴプレート（ペプトン１．６％、酵母エキス１％、ＮａＣｌ  ０．５％、および寒天末１．５％）上に蒔いた。翌日、いくつかの単一コロニーを選択するために適切なコロニー密度のプレートを選んだ。各陽性のコロニーから、８つの単一コロニーを選び、９６穴ディープウェルプレートに蒔き、発現用のＩＰＴＧを用いて誘導した。各単一コロニーを、クロラムフェニコールを含む６ｍＬの２−ＹＴ液体培地（ペプトン１．６％、酵母エキス１％、およびＮａＣｌ  ０．５％）入りのチューブに加え、３７℃、１２時間、２５０ｒｐｍで振とうした。細菌懸濁液の０．２μＬを各チューブからピペットで取り、保管のためにクロラムフェニコールを含む２−ＹＴプレート上に移した。５ｍＬの細菌懸濁液を、５００ｍＬのクロラムフェニコール含有２−ＹＴ液体培地に播種し、ＯＤ600が０．６に達するまで、３３℃、３００ｒｍｐで培養した。ＩＰＴＧは３時間の誘導時間で様々なＦａｂの発現を誘導させるために、培地へ最終濃度５０μΜの濃度で加えた。誘導した発現が完了した後に、培地を１０℃、１５分間、５１００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、バクテリアの沈殿を４０ｍＬの予冷したＴＥＳ溶液で完全に再懸濁した。水で２０％まで薄め予冷したＴＥＳ６６ｍＬを、再懸濁したバクテリアの溶液へ再び加え、氷上で４０分間インキュベートし、その後、４℃、１０分、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離の後、Ｆａｂタンパク質（ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７Ａ、またはＫＳ−７Ｆタンパク質）を含むぺリプラズム抽出物である上清を集めた。ぺリプラズム抽出物をＧ−２５（ＧＥ社，１７−００３４−０１）カラムを通して、脱塩した。プロテインＧ（ＧＥ社、１７−０６１８−０４）充填済みカラムを準備し、平衡溶液（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）で平衡にし、タンパク質サンプルをロードした。サンプルのロード後、カラムを平衡溶液で連続して洗い、次に平衡溶液（０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ、ｐＨ２．５）で直接的に溶出した。溶出画分を集め、その収集前に分画収集チューブに１．０Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を、トリス緩衝液と溶出画分が１：９の体積比率となるように添加しておき、溶出画分をｐＨ７．０に迅速に調節した。収集した液体は目的のタンパク質を含む。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質サンプル中のタンパク質濃度を測定した。最後に、タンパク質サンプルをサブパッケージし、−８０℃で保管し、これにより、高純度のＦａｂタンパク質（３つのタンパク質、ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７ＡおよびＫＳ−７Ｆを含む）を得た。
【００４６】
手順３．ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７ＡおよびＫＳ−７Ｆの生物活性の測定
１）ＥＬＩＳＡによる腫瘍壊死因子αへのヒト化Ｆａｂの結合分析
腫瘍壊死因子αに結合するＦａｂを次の手順によりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートを、１ウェルあたり基質として１００ｎｇのヒト由来腫瘍壊死因子α（Ｒ＆Ｄ社，カタログ番号：２１０−ＴＡ−０５０）でコーティングした。Ｆａｂタンパク質（手順２で準備した、３つのタンパク質、ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７ＡおよびＫＳ−７Ｆを含む）４０ｎＭを２倍希釈したものを添加し、インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＣ−Ｋａｐｐａ二次抗体（シグマ社，カタログ番号：Ｋ３５０２）を加え、最後に、ＴＭＢを反応の進行のために加え、２Ｍ硫酸は反応を止めるために入れ、これにより、腫瘍壊死因子α結合Ｆａｂタンパク質を測定した。このようなスクリーニング手順により、高い活性の３つのＦａｂを得た。それはＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７ＦおよびＫＳ−７Ａであり、これらのタンパク質は全体で２つの異なるＶＨ（ＶＨ０１およびＶＨ０２；ＶＨ０１のアミノ酸配列は配列番号２５で示され、ヌクレオチド配列は配列番号２６で示され、ＶＨ０２のアミノ酸配列は配列番号２７で示され、ヌクレオチド配列は配列番号２８で示される）、および２つの異なるＶＫ（ＶＫ０３およびＶＫ０５；ＶＫ０３のアミノ酸配列は配列番号２９で示され、且つそのヌクレオチド配列は配列番号３０で示され、ＶＫ０５のアミノ酸配列は配列番号３１で示され、且つヌクレオチド配列は３２で示される（表１））を含む。
【００４７】
ＥＬＩＳＡによる腫瘍壊死因子αへのヒト化Ｆａｂ結合能の試験結果を図１に示す。その結果が示すように、前記の得られた３つのヒト化Ｆａｂは、ヒト−マウスキメラ抗体であるＲｅｍｉｃａｄｅのＦａｂフラグメントと同様に抗原親和性を示し、その中でＫＳ−７ＡおよびＫＳ−７Ｆは腫瘍壊死因子αへの結合に関するＥＣ５０値において、ヒト−マウスキメラ抗体ＲｅｍｉｃａｄｅのＦａｂフラグメントよりも優れている（表２）。
【００４８】
【表１】
0005767708.tif 000002
【００４９】
【表２】
0005767708.tif 000003
【００５０】
２）Ｌ９２９細胞毒性試験による腫瘍壊死因子α抑制中のヒト化Ｆａｂの生物活性の検出
更に、腫瘍壊死因子αの中和における前記の３つのヒト化Ｆａｂ（ＫＳ−２Ｅ、ＫＳ−７ＦおよびＫＳ−７Ａ）の生物活性は、細胞生物学実験であるＬ９２９細胞毒性試験で検証した。この実験では、対数増殖期の１×１０４個のＬ９２９細胞を、９６穴プレートのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）培地中に播種した。２４時間後に、ヒト由来腫瘍壊死因子α（Ｒ＆Ｄ社，カタログ番号：２１０−ＴＡ−０５０）を０．５ｎｇ／ｍＬ、およびアクチノマイシンＤ（Ｆｌｕｋａ）を０．５μｇ／ｍＬ加えた。細胞を４つの群に分け、前記の３つのヒト化Ｆａｂ、および対照の抗体ＲｅｍｉｃａｄｅのＦａｂフラグメントを各群にそれぞれ添加し、細胞を別途２４時間培養した。最後に、細胞の生存率をＣＣＫ８キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ研究所）で分析した。結果を図２に示す。この結果は、前記の３つのヒト化Ｆａｂは、腫瘍壊死因子αを効率的に中和する生物活性を発揮できることを示し、その中で、腫瘍壊死因子αの中和においてＫＳ−７Ａの生物活性は、ヒト−マウスキメラ抗体ＲｅｍｉｃａｄｅのＦａｂフラグメントの生物活性よりも優れていた。図２のデータは、３回行った実験の平均値±標準偏差である。
【００５１】
実施例２：ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂのＣＤＲ３に関する親和性成熟ライブラリーの作成
更に、前記のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂフラグメントの抗原への親和性を増加させるために、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂの発現ベクター内の、重鎖ＶＨ０２  ＣＤＲ３および軽鎖ＶＫ０５  ＣＤＲ３の親和性成熟ライブラリーを別々に作成した。重鎖と軽鎖のＣＤＲ３領域は、抗体の抗原への結合のために最も重要な領域であるので、ＣＤＲ３領域の部位飽和変異誘導を行いスクリーニングすることが、より高い親和性を有する抗体作成につながる可能性がある。重鎖および軽鎖のＣＤＲ３の部位飽和変異誘導ライブラリーの作成のために、部位特異的変異誘導のための一組のプライマーを設計し、ＰＣＲ反応で使用した。ＰＣＲ反応により増幅した反応生成物は、一組のプライマーと同一の縮重比率で共に混在しており、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂの発現ベクターにクローニングした。軽鎖ＣＤＲ３の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成は、以下のように行った。プライマー５シリーズおよび軽鎖下流プライマー６（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧ−３’）を用い、且つ目的部分のＤＮＡ産物を産生するための鋳型として軽鎖のＤＮＡを用い、ＰＣＲを行い、ＤＮＡ産物をＦａｂ発現ベクターにクローニングし、エレクトロトランスファーを行い、軽鎖ＣＤＲ３の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成のために播種した。プライマー５シリーズはＣＤＲ３の変異部位を含み、総じて表３に記載の１９個のプライマーを含む。ＣＤＲ３の重鎖の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成は、以下のように行った。変異プライマー７シリーズおよび重鎖下流プライマー８（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＴＧ−３’）を用い、且つ目的部分のＤＮＡ産物を産生するための鋳型として重鎖のＤＮＡを用い、ＰＣＲを行い、ＤＮＡ産物をＦａｂ発現ベクターにクローニングし、エレクトロトランスファーを行い、重鎖ＣＤＲ３の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成のために播種した。プライマー７シリーズはＣＤＲ３の変異部位を含み、総じて表４に記載の２２個のプライマーを含む。最終的に確立した軽鎖および重鎖の変異ライブラリーより、抗腫瘍壊死因子α（Ｒ＆Ｄ社）への高い結合能を有する抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂを、ＥＬＩＳＡの結果に基づき選択した。高い活性を有する２つの重鎖可変領域、即ち、ＳＨ０１およびＳＨ０２を得るために重鎖変異体をスクリーニングした。また高い活性を有する６つ軽鎖可変領域、即ち、ＳＨ０３、ＳＨ０４、ＳＨ０５、ＳＨ０６、ＳＨ０７およびＳＨ０８を得るために軽鎖変異体をスクリーニングした。
【００５２】
【表３】
0005767708.tif 000004
【００５３】
【表４】
0005767708.tif 000005
【００５４】
実施例３：高親和性のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂの発現と活性評価
この実施例は、それぞれＦＡ０１およびＦＡ０２の名称を持つ２つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂに関する。ＦＡ０１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５で示され（そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号１６で示される）、その軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１９で示され（そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号２０で示される）、その重鎖Ｆｄフラグメントの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１で示され（そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号２で示され）、その重鎖定常領域ＣＨ１のアミノ酸配列は配列表の配列番号３３で示される（そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号３４で示される）。ＦＡ０２の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号９で示され（そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０で示される）、その軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１９で示され（そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号２０で示される）、その重鎖Ｆｄフラグメントの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１で示され（そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号２で示され）、その重鎖定常領域ＣＨ１のアミノ酸配列は配列表の配列番号３３で示される（そのヌクレオチド配列は配列表の配列番号３４で示される）。
【００５５】
手順１．高親和性のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂの作成と発現
２つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂを作成する過程は実施例１と同様である。前記の２つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを、ＦＡ０１に関するｐＦＡ０１Ｆａｂ発現ベクターを得るため、ＦＡ０２に関するｐＦＡ０２Ｆａｂ発現ベクターを得るために、それぞれｐＴＬＲベクターの対応する領域に挿入した。前記の実施例１に記載の手順に従い、高純度のＦＡ０１およびＦＡ０２タンパク質を得た。
【００５６】
手順２．高親和性のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂの生物活性の検出
Ｌ９２９細胞毒性試験によって、前記の２つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のＦａｂ（ＦＡ０１およびＦＡ０２）の生物活性を解析した。手順の詳細は実施例１と同様である。ＯＤ450値の結果を、ＥＣ５０を計算するためにソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄプリズム５に入力した。結果を表５に示す。この結果は、ＦＡ０１およびＦＡ０２の活性がＲｅｍｉｃａｄｅ抗体のＦａｂフラグメントの活性より強力であることを示唆する。
【００５７】
【表５】
0005767708.tif 000006
【００５８】
実施例４：ヒト化腫瘍壊死因子α抗体のＩｇＧ発現およびその活性の検出
手順１．ヒト化腫瘍壊死因子α抗体ＩｇＧに関する組み換え発現ベクターの作成
実施例１および２において得た、２つの重鎖Ｆｄフラグメント（ＳＨ０１とＳＨ０２をそれぞれ含む）および６つの軽鎖（ＳＨ０３、ＳＨ０５、ＳＨ０４、ＳＨ０６、ＳＨ０７およびＳＨ０８をそれぞれ含む）をコードするＤＮＡフラグメントを、表６に示す様に相互に結合し、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）によりＩｇＧ１  Ｆｃ定常領域に関するＤＮＡフラグメントを共に組み立て、組み換えにより発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入した。ＣＨＯ細胞を、作成した組み換え発現プラスミドでトランスフェクションし、完全長ヒト化抗体を発現させた。
【００５９】
手順の詳細は以下に述べる通りである。（１）軽鎖に関するＤＮＡフラグメントを組換えによって、真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に直接挿入した。以下のプライマー、５’−ＴＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣ−３’（下線部は制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩ）、５’−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ−３’（下線部は制限酵素部位ＸｈｏＩ）を設計し、ＰＣＲ増幅反応で使用した。増幅産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒ０１０４Ｌ、ＮＥＢ社製）およびＸｈｏＩ（Ｒ０１４６Ｌ、ＮＥＢ社製）を用いてダブルダイジェストし、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、同じ酵素を用いダブルダイジェストしたｐｃＤＮＡ３．１（＋）の大きいフラグメントをライゲーションした。（２）重鎖用ＤＮＡ断片は、オーバーラップ伸長ＰＣＲによりＩｇＧ１  Ｆｃ定常領域用のＤＮＡ断片と共に組み立て、且つ組換えによってｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入する必要がある。以下のプライマー、５’−ＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧ−３’（下線部は制限酵素部位ＫｐｎＩ）、５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴ  ＡＧＣＧＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣ−３’；５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴ  ＡＧＣＧＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣ−３’；５’−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧ−３’（下線部は制限酵素部位ＸｈｏＩ）を設計し、ＰＣＲ増幅反応で使用した。集めたＰＣＲ産物を、制限酵素ＫｐｎＩ（Ｒ０１４２Ｌ、ＮＥＢ社製）およびＸｈｏＩ（Ｒ０１４６Ｌ、ＮＥＢ社製）でダブルダイジェストし、同じ制限酵素でダブルダイジェストした発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）に組み換えにより挿入し、適切な組み換え体を得るために切断解析およびシークエンシングにより確認した。
【００６０】
表７の１８個の抗体用の発現ベクターを、前記の手順に従い準備した。
ＫＳ０１（Ｇｌｕ）、ＫＳ０３（Ｇｌｕ）、ＫＳ０５（Ｇｌｕ）、ＫＳ０６（Ｇｌｕ）、ＫＳ０９（Ｇｌｕ）およびＫＳ１０（Ｇｌｕ）の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列はすべて、配列表の配列番号２（ヌクレオチド配列の第１〜３番目はＧＡＧである）で示され、且つ配列番号１（第１番目のアミノ酸はＧｌｕである）に示される重鎖の可変領域をコードする。ＫＳ０１（Ｇｌｎ）、ＫＳ０３（Ｇｌｎ）、ＫＳ０５（Ｇｌｎ）、ＫＳ０６（Ｇｌｎ）、ＫＳ０９（Ｇｌｎ）およびＫＳ１０（Ｇｌｎ）の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列はすべて、ヌクレオチド配列の第１〜３番目をＣＡＧに置換した配列表の配列番号２で示され、且つ配列番号１で示される重鎖可変領域（第１番目のアミノ酸はＧｌｎである）をコードする。ＫＳ０２、ＫＳ０４、ＫＳ０７、ＫＳ０８、ＫＳ１１およびＫＳ１２の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列はすべて、配列表の配列番号４で示され、配列番号３のように示される重鎖可変領域をコードし、ＫＳ０１（Ｇｌｕ），ＫＳ０１（Ｇｌｎ）およびＫＳ０２の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列の全ては配列表の配列番号６で示され、且つ配列番号５に示される軽鎖可変領域をコードする。ＫＳ０３（Ｇｌｕ）、ＫＳ０３（Ｇｌｎ）およびＫＳ０４の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列はすべて、配列表の配列番号１０で示され、配列番号９で示される軽鎖可変領域をコードする。ＫＳ０５（Ｇｌｕ）、ＫＳ０５（Ｇｌｎ）およびＫＳ０８の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列はすべて、配列表の配列番号８に示され、配列番号７に示されるような軽鎖可変領域をコードする。ＫＳ０６（Ｇｌｕ）、ＫＳ０６（Ｇｌｎ）およびＫＳ０７の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列はすべて、配列表の配列番号１２に示され、配列番号１１に示される軽鎖可変領域をコードする。ＫＳ０９（Ｇｌｕ）、ＫＳ０９（Ｇｌｎ）およびＫＳ１１の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列はすべて、配列表の配列番号１４に示され、配列番号１３に示される軽鎖可変領域をコードする。ＫＳ１０（Ｇｌｕ）、ＫＳ１０（Ｇｌｎ）およびＫＳ１２の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列はすべて、配列表の配列番号１６に示され、配列番号１５に示される軽鎖可変領域をコードする。１８個の抗体の重鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列は配列表の配列番号１８で示され、配列番号１７で示される重鎖定常領域をコードする。１８個の抗体の軽鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列は配列表の配列番号２０で示され、配列番号１９で示される軽鎖定常領域をコードする。
【００６１】
手順２．完全長ヒト化抗腫瘍壊死因子αＩｇＧ抗体の発現と精製
手順１で得た軽鎖組み換えプラスミドおよび重鎖組み換えプラスミドを、完全長ヒト化抗体を発現させるためにＣＨＯ細胞に同時導入した。表６に示されるような組み合わせに対応するプラスミドを、従来方法によりＣＨＯ細胞にそれぞれ安定的に同時導入した後、１２個の対応する完全長組み換え抗体が細胞培養の上清に分泌された。上清を対応する完全長ＩｇＧ抗体を得るために精製した。精製の手順の詳細は以下の通りである。
【００６２】
１）クロマトグラフィーの充填材
Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ社製）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ社製）
【００６３】
２）緩衝液
アフィニティー平衡化緩衝液（ＰＢＳ）：０．２Ｍリン酸水素ナトリウム：８２．５ｍＬ／Ｌ；０．２Ｍナトリウム二水素ナトリウム：１７．５ｍＬ／Ｌ；２Ｍ塩化ナトリウム：７５ｍＬ／Ｌ；に超純水を加えて、完全にかき混ぜてよく混合し、１Ｍ水酸化ナトリウムまたは１Ｍ塩化水素を用いてｐＨを７．１〜７．３に調整した。
アフィニティー溶出緩衝液：ＮａＣｌ  ２．９２２ｇ／Ｌ、無水酢酸ナトリウム  ０．４９ｇ／Ｌ、氷酢酸  ２．９ｍＬ／Ｌ添加、ｐＨ３．４〜３．６。
アフィニティー再生緩衝液：５．８ｍＬ／Ｌ氷酢酸、ｐＨ３．０。
アフィニティー定置洗浄（ＣＩＰ）緩衝液：１Ｍ水酸化ナトリウム１００ｍＬ／Ｌ。
ゲル濾過クロマトグラフィー溶液（ＰＢＳ）：０．２Ｍリン酸水素ナトリウム：８２．５ｍＬ／Ｌ；０．２Ｍリン酸二水素ナトリウム：１７．５ｍＬ／Ｌ；２Ｍ塩化ナトリウム：７５ｍＬ／Ｌ；超純水を加え、完全にかき混ぜよく混合し、１Ｍ水酸化ナトリウムまたは１Ｍ塩化水素を用いて、ｐＨを６．８に調整した。
【００６４】
３）サンプルの準備（清澄濾過）
遠心分離：サンプルは、１０〜１５分、５０００〜６０００ｒｐｍで遠心分離した。
ろ過：遠心分離の後、サンプルの上清はＨ７（０．４５＋０．２μｍ）フィルターでろ過した。
【００６５】
４）アフィニティー・クロマトグラフィー
ＡＫＴＡ精製システム（ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）およびアフィニティー・クロマトグラフィー・カラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  ｏｒ  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ）を設置する。カラム体積の２倍体積量の超純水で洗浄する。基線が安定するまでカラム体積の５倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄し、サンプルを注入する。サンプルの注入後、カラム体積の５〜１０倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄する。その後、カラムをアフィニティー溶出緩衝液で、１カラム体積量で連続して溶出し、２８０ｎｍのメジャー吸光度ピーク（ｍａｊｏｒ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｐｅａｋ）に対応する画分を集めた。そのカラムはカラム体積の３倍体積量のアフィニティー再生緩衝液で溶出した。アフィニティー平衡化緩衝液で中性のｐＨになるように洗浄した。カラム体積の５倍体積量のＭａｂｓｅｌｅｃｔ  ＣＩＰ緩衝液もしくはＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ＣＩＰ緩衝液を用い、定置洗浄を行う。基線が安定するまで、カラム体積の３倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄する。基線が安定するまで、カラム体積の３倍体積量の超純水で洗浄する。カラム体積の３倍体積量の２０％エタノールで洗浄し、アフィニティー・クロマトグラフィー・カラムを保管する。
【００６６】
５）ゲル濾過クロマトグラフィー
ＡＫＴＡ精製システムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過クロマトグラフィーカラムを設置する。５ｍＬ／分に流量を調整して、１カラム体積量の超純粋で洗浄し、カラム体積の２倍体積量のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム・クロマトグラフィー平衡化液で洗浄する。２．５ｍＬ／分に流量を調整して、アフィニティー・クロマトグラフィー・ピークに対応する画分を集め、ｐＨ値を調整し、カラム上に直接注入した。サンプル注入の後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム・クロマトグラフィー平衡化液で溶出し、目的の２８０ｎｍピークを集めた。引き続き１カラム体積量で洗浄した。クロマトグラフィーカラムは０．０１Ｍ水酸化ナトリウムで保管した。
【００６７】
手順３．ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体ＩｇＧの活性の検出
手順２で得た１２個のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体ＩｇＧを、Ｌ９２９細胞毒性試験（操作の詳細は実施例１に述べた通り）により腫瘍壊死因子αの中和の生物活性を試験し、その結果のＯＤ450値を得て、ＥＣ５０を計算するためにソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄプリズム５に入力した。腫瘍壊死因子αの活性を抑制するための１２個のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体ＩｇＧのＥＣ５０値を表７に示した。その結果は、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体の生物活性はかなり増加し、ＫＳ１０は最も高い生物活性があることを示す。従って、更なる抗体活性の詳細な調査は、主としてＫＳ１０に関して行った。
【００６８】
【表６】
0005767708.tif 000007
【００６９】
【表７】
0005767708.tif 000008
【００７０】
実施例５：ＫＳ１０（Ｇｌｕ）のヒト腫瘍壊死因子αへの結合の動態評価
ヒト腫瘍壊死因子α（Ｒ＆Ｄ社，２１０−ＴＡ−０５０）およびＮＨＳ−ＬＣＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ−ｆｉｓｈｅｒ社製，カタログ番号：２１３３８）をモル比で１：３の比率で一様に混合し、１時間室温で保持した。その後、残りのＮＨＳ−ＬＣＬＣビオチンは、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ社製、カタログ番号：１７−０８５１−０１）によって取り除いた。得られた最終結合産物は５０μｇ／ｍＬのビオチン−ヒト腫瘍壊死因子αであった。
【００７１】
ＫＳ１０のヒト腫瘍壊死因子αへの結合動態パラメータはＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）ｉｎ  ｔｈｅ  Ｏｃｔｅｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍによって決定した。試験の手順を機器の取り扱い説明書に従い設定した。５０μｇ／ｍＬビオチン−ヒト腫瘍壊死因子αをローディング（Ｌｏａｄｉｎｇ）することによりＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎバイオセンサー（ＳＡ）に結合させた。その抗体濃度の適切な範囲を以下の通り、６０００ｎＭ、２０００ｎＭ、６６６．７ｎＭ、２２２．２ｎＭ、７４．１ｎＭおよび２４．７ｎＭのパイロット試験により決定した。Ｒｅｍｉｃａｄｅはポジティブコントロールとして使用し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）はブランクのコントロールとして使用した。その結果（表８）は、ＫＳ１０のＫＤ値はＲｅｍｉｃａｄｅのＫＤ値よりも小さいことを示し、それはＫＳ１０のヒト腫瘍壊死因子αへの親和性がヒト−マウスキメラ抗体Ｒｅｍｉｃａｄｅの親和性よりも高いことを示唆する。
【００７２】
更に、チンパンジー腫瘍壊死因子α（配列番号３６で示されるアミノ酸配列および配列番号３７で示されるヌクレオチド配列）、アカゲザル腫瘍壊死因子α（配列番号３８で示されるアミノ酸配列および配列番号３９で示されるヌクレオチド配列）、マウス腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦ−α）（ＰＲＯＳＰＥＣ製、カタログ番号：ＣＹＴ−２５２）、およびヒトＴＮＦβ（ＰＲＯＳＰＥＣ製、カタログ番号：ＣＹＴ−２２４）へのＫＳ１０の結合親和性を決定した。Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システムの親和性評価基準に従い、抗原の抗体への結合に起因する光波の変位距離は、２つの物質間の親和性を間接的に反映し、光波の変位距離が長いと、親和性は高い。その結果（図３）は、ＫＳ１０がヒト腫瘍壊死因子αにかなり強力に結合すること、チンパンジーの腫瘍壊死因子αにも大いに結合すること、アカゲザルの腫瘍壊死因子αに弱く結合すること、マウス腫瘍壊死因子αおよびヒト腫瘍壊死因子βにほとんど結合しないことを示す。従って、本発明において抗体はヒト化の後に特異的結合能を有することを確認した。
【００７３】
【表８】
0005767708.tif 000009
【００７４】
実施例６：ヒト腫瘍壊死因子αを誘発した関節リウマチモデルラットへのＫＳ１０（Ｇｌｕ）の影響
ＳＰＦグレード、半分が雄で半分が雌、体重１４０〜１８０ｇ、７２匹の４〜６週齢Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌ  ｌｉｃｅｎｓｅ：ＳＣＸＫ（Ｓｉｃｈｕａｎ）２００８−２４）を使用した。ラットを１週間慣らし、無作為に１群１２匹で６群、即ち、正常群、負対照群、モデル対照群、ＫＳ１０  ５ｍｇ／ｋｇ群、ＫＳ１０  １０ｍｇ／ｋｇ群およびＫＳ１０  ２０ｍｇ／ｋｇ群に分けた。試験の初めに、正常群を除く各群のラットに１０％抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。モデリングの前に、ラットに３つの異なる量のＫＳ１０（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈注入し、負対照群およびモデル対照群のラットには等量の食塩水を尾静脈注入した。１５分後に、０．５ｍｇ／ｍＬのヒト腫瘍壊死因子α（Ｒ＆Ｄ社，カタログ番号：２１０−ＴＡ−０５０）（１％ＢＳＡで溶かし、６０μＬ／ラットの量を注入した）を１ｍＬの注射器で、３つのＫＳ１０投与群およびモデル対照群に急性関節炎（１つの足首のモデリング）を引き起こすために、ラットの左足首の関節腔に注入し、等量の１％ＢＳＡを負対照群ラットの左足首の関節腔に注入した。注入の成功は、関節腔の両側のくぼみの漸次腫脹によって示された。正常群ラットには前記の注入は行わなかった。
【００７５】
モデルは１８時間後に確立され、各群中のラットの左足首関節の腫脹度を以下のように０〜４の変調段階基準（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）でそれぞれ採点した。０：発赤と腫脹なし、１：足首関節のみ発赤および／または腫脹、２：足首関節の発赤と腫脹および足底の腫脹、３：足首関節および足底の発赤と腫脹、４：足首関節、足底および足の表面の発赤および腫脹（Ｒ  Ο  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ  Ｆｅｌｄｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｒ  Ν  Ｍａｉｎｉ，“Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５；８９（２０）：９７８４−９７８８  を参照）。モデルを確立した２０時間後に、滑膜関節液を抜いた。関節周辺の柔組織を分離し、均質化し、遠心し−７０℃で凍結した。ＩＬ−ｌβおよびＩＬ−６のレベルはラットＥＬＡＳＡキット（ＩＬ−ｌβ  Ｒ＆Ｄ社製，カタログ番号：ＲＬＢ００；ＩＬ−６  Ｒ＆Ｄ社製，カタログ番号：Ｒ６０００Ｂ）を用いて決定した。
【００７６】
スコア（図４）は、ＫＳ１０の３つの投与量で、ヒト腫瘍壊死因子αが誘発するラットの関節の発赤および腫脹を、大いに緩和することができ、ヒト腫瘍壊死因子αが誘発する関節リウマチの進行に大いに拮抗できることを示す。サイトカイン評価では、ＫＳ１０の３つの投与量で、滑液および関節周辺の柔組織でＩＬ−ｌβ（図５）およびＩＬ−６（図６）のレベルを大いに下げることが示され、このことは、ＫＳ１０がヒト腫瘍壊死因子αによって誘発されるＩＬ−ｌβおよびＩＬ−６の増加レベルを完全にブロックすることができ、ＫＳ１０のヒト腫瘍壊死因子αに対する活性の証拠となることを示す。
【００７７】
実施例７：ヒト腫瘍壊死因子αを誘発したぶどう膜炎モデルラットへのＫＳ１０（Ｇｌｕ）処理効果
４０匹の健康なＬｅｗｉｓラットを、正常群、モデル群、負対照群、ＫＳ１０群に分けた。ラットに、１０％抱水クロラール（０．３５ｍＬ／ｋｇ１回投与）を腹腔内に注入した。ラットに麻酔をかけた後、モデル群および負対照群のそれぞれのラットに、毛様体筋の平らな部分を通してガラス体に生理食塩水１０μＬを注入し（３０  Ｇ１／２針を使用）、４ｍｇ／ｍＬのＫＳ１０溶解液（ＰＢＳで作成した）を１０μＬ、ＫＳ１０群のラットそれぞれに同様に注入した。３０分後、１０μＬのヒト腫瘍壊死因子α（約０．５ｍｇ／ｍＬ）をモデル群およびＫＳ１０群の各ラットの静脈内に注入し、１０μＬの１％ＢＳＡを負対照群の各ラットの静脈内に注入した。最初の投与によりモデルが形成されてから２４時間および４８時間後に、ラットを麻酔し、細隙灯の下観察し、それぞれ採点した。採点基準は、文献（Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  ＬＮ，Ｆｅｒｒｅｌｌ  ＪＢ，Ｓｍｉｔｈ  ＭＧ，ＭｃＧａｈａｎ  ＭＣ，“Ｌｉｐｉｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｖｅｉｔｉｓ”Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，１９９１  Ｊｕｌ；３２（８）：２３９３−９）および改訂版を参照したものであり、虹彩の充血０〜２（０：充血なし、１：少し充血、２：重度の充血）、縮瞳０〜１（０：正常な瞳孔、１：縮瞳）、前房滲出０〜２（０：前房滲出なし、１：少し前房滲出；２：重度の前房滲出）、暗瞳孔（ｃａｌｉｇｏ  ｐｕｐｉｌｌａｅ）または虹彩後癒着０〜２（０：癒着なし、１：一方の部位で癒着、２：両方の部位で癒着）である。
【００７８】
採点結果を表９に示す。これはＫＳ１０が、眼内の透明度を増加させ、虹彩充血、繊維素性滲出および暗瞳孔（ｃａｌｉｇｏ  ｐｕｐｉｌｌａｅ）または虹彩後癒着を抑えることを示すぶどう膜炎評価基準のスコアを、著しく低下できることを示す。従って、ＫＳ１０がヒト腫瘍壊死因子αにより誘発されるぶどう膜炎への重大な拮抗作用を発揮することが示された。
【００７９】
【表９】
0005767708.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、ヒト化抗体（マウス由来抗体の可変領域（ＶＨ、ＶＫ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト化抗体のフレームワーク領域へ直接接合した）の従来方法では抗体の親和性が低下するという欠陥を、ＣＤＲグラフト化抗体の変異生成により、効果的に克服し、最終的に最初の抗体（ｉｎｉｔｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）に類似する抗体を得た。本発明で提供するＦａｂとＩｇＧ抗体は、ヒト化の程度（最大で９５％超）がかなり高く、ヒト−マウスキメラ抗体であるＲｅｍｉｃａｄｅと同様か又はそれより高い親和性および生物活性を有すること、ヒト腫瘍壊死因子αの中和効果により優れ、腫瘍壊死因子αに関連する疾病の治療により効果的であることを実験的に立証した。前記疾病として好ましくは、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、または若年性特発性関節炎である。
【図１】
0005767708.tif 000011
【図２】
0005767708.tif 000012
【図３】
0005767708.tif 000013
【図４】
0005767708.tif 000014
【図５】
0005767708.tif 000015
【図６】
0005767708.tif 000016
【配列表】
0005767708000001.app