(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２０７のＣＤＲＬ１、配列番号２２５のＣＤＲＬ２、配列番号２５７のＣＤＲＬ３、配列番号２９２のＣＤＲＨ１、配列番号３２３のＣＤＲＨ２、配列番号３６１のＣＤＲＨ３を含むか、又は
（ｂ）配列番号２１０のＣＤＲＬ１、配列番号２２１のＣＤＲＬ２、配列番号２６０のＣＤＲＬ３、配列番号２９２のＣＤＲＨ１、配列番号３２０のＣＤＲＨ２、配列番号３６２のＣＤＲＨ３を含むか、又は
（ｃ）配列番号２１３のＣＤＲＬ１、配列番号２３０のＣＤＲＬ２、配列番号２６３のＣＤＲＬ３、配列番号２９３のＣＤＲＨ１、配列番号３２４のＣＤＲＨ２、配列番号３６４のＣＤＲＨ３を含む、ＨＢ−ＥＧＦに特異的に結合する単離された抗体又は該抗体の抗体断片。
【請求項２】
ａ）配列番号１２１のＶＬおよび配列番号１７２のＶＨ、又は
ｂ）配列番号１２４のＶＬおよび配列番号１７５のＶＨ、又は
ｃ）配列番号１２７のＶＬおよび配列番号１７８のＶＨ
を含む、請求項１に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項３】
前記抗体又は抗体断片がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片である請求項１又は２に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項４】
前記抗体断片がＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子である請求項３に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項５】
前記抗体がヒト抗体である請求項３に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項７】
前記抗体又は抗体断片がＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型又はＩｇＧ４型である請求項１又は２に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項８】
前記抗体がＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型である請求項７に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項９】
前記抗体又は抗体断片が標識基に連結されている、請求項１から８の何れかに記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項１０】
前記標識基が放射性同位体、放射性核種、蛍光性基、酵素基、化学発光性基又はビオチニル基である請求項９に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体又は抗体断片がエフェクター基に連結されており、前記エフェクター基が放射性同位体、放射性核種、毒素、治療性基又は化学療法基である請求項１から８の何れかに記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項１２】
前記治療基又は化学療法基がカルケアマイシン、アウリスタチン−ＰＥ、ゲルダナマイシン又はマイタナシンである請求項１１に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項１３】
前記抗体又は抗体断片がＨＢ−ＥＧＦによって媒介されるシグナル伝達を少なくとも部分的に低下させる請求項１から８の一項に記載の単離された抗体又は抗体断片。
【請求項１４】
請求項１から８の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片をコードする核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸分子が調節配列へ作用可能に連結されている請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１４もしくは１５に記載の核酸分子、又は請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１から８の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片をインビトロで作製する方法であって、前記抗体又は抗体断片を分泌する宿主細胞から前記抗体又は抗体断片を調製する工程を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１から８の何れか一項に記載の少なくとも１つの抗体又は抗体断片と、医薬として許容される、担体及び／又は希釈剤及び／又は佐剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
さらなる活性因子をさらに含む請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つのさらなる活性因子が抗新生物剤である請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
抗新生物剤が抗腫瘍抗体であるか、又は抗新生物剤がシスプラチンもしくはアバスチンである請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
抗腫瘍抗体が受容体チロシンキナーゼもしくはＥＧＦＲに対する抗体である請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
過剰増殖性疾患の診断、予防又は治療に用いるための、請求項１９から２３の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記過剰増殖性疾患が癌である請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記過剰増殖性疾患がＨＢ−ＥＧＦ発現を伴うか、又は前記過剰増殖性疾患がかく乱された成長因子受容体の活性化を伴うかもしくは該活性化に付随して起こる請求項２４又は２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記かく乱された成長因子受容体の活性化が、病的に増大した成長因子受容体の活性化である請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記病的に増大した成長因子受容体の活性化が、Ｇタンパク質及び／もしくはＧタンパク質共役型受容体の活性の病的増加を伴うか、又は該病的増加によって引き起こされる請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記癌が、乳癌、胃腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膀胱癌、神経膠腫、悪性黒色腫、癌腫、他のＨＢ−ＥＧＦ発現又は過剰発現癌及び腫瘍転移の形成からなる群から選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記癌腫が上皮又は扁平上皮腫である請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
過剰増殖性疾患の診断、予防又は治療用医薬組成物の製造のための、請求項１から８に記載の少なくとも１つの抗体又は抗体断片の使用。
【請求項３２】
前記過剰増殖性疾患が請求項２５、２６、２９又は３０に記載されている過剰増殖性疾患である請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
請求項１から８に記載の抗体、請求項１４もしくは１５に記載の核酸又は請求項１６に記載のベクターを含むキット。
【請求項３４】
少なくとも１つのさらなる活性因子を含む請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
さらなる活性因子が抗新生物剤である請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
単独療法として、又はさらなる医薬組成物と組み合わせて投与されるべき、請求項２４から３０の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項３７】
さらなる医薬組成物が抗新生物剤を含む請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
抗新生物剤がシスプラチン又はアバスチンである請求項３７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーは、ＨＥＲ１（又はｅｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（又はｅｒｂＢ２）、  ＨＥＲ３（又はｅｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（又はｅｒｂＢ４）と称される４つの異なる受容体チロシンキナーゼを含む。ＨＥＲ１は、一般に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とも称される。ＨＥＲ３を除き、これらの受容体は、ホスホ−アクセプター標的特異的な内在性タンパク質チロシンキナーゼ活性を有する。ＨＥＲファミリーのメンバーは、多くの上皮細胞中で及び多数の異なる腫瘍細胞種中で発現される。例えば、ＨＥＲファミリーの受容体は、上皮起源及び間葉起源の腫瘍細胞中で発現される。さらに、ＨＥＲ受容体チロシンキナーゼは、癌などの疾病と関連する細胞増殖及び血管新生に関与している。例えば、ＥＧＦＲは、乳癌、肝臓癌、腎臓癌、白血病、気管支癌、膵臓癌及び大腸、直腸又は胃癌等の胃腸の癌の中で、しばしば過剰発現され、又は異常に活性化されている。ＥＧＦ受容体の高いレベルも、不良な予後及び治療に対する応答と相関している（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６５：１１８−１２１）。従って、これらのキナーゼからの及びこれらのキナーゼへのシグナル伝達の破壊は、多数の癌及び腫瘍細胞種に対して抗増殖性効果を有しており、従って、治療効果を有している。
【０００２】
受容体チロシンキナーゼの酵素活性は、過剰発現によって、及び／又はリガンド媒介性二量体化によって刺激され得る（Ｈｅｌｄｉｎ，  １９９５，  Ｃｅｌｌ  ８０：２１３−２２３）。受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体の活性化は、受容体上のチロシン残基のリン酸化をもたらし、次いで、これは、細胞内タンパク質などの他の分子のチロシン残基をリン酸化する。（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｃｅｌｌ  ６１：２０３−２１２）。この後に、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）（Ｄｈｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６：３２７９−３２９０）及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）を伴うものなどの細胞内シグナル伝達経路などの活性化が続く。これらの経路の活性化は細胞増殖を増加させ、及びアポトーシスを阻害することが示されているが、ＨＥＲファミリーメンバーによって媒介されるシグナル伝達の、小分子阻害剤又はモノクローナル抗体による阻害は、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを促進することが示されている（Ｐｒｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８：１１−３１）。
【０００３】
ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）は、２２ｋＤａのＯ−グリコシル化されたタンパク質である（Ｈｉｇａｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：６２０５−６２１２）。その成熟形態において、ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦ受容体及びＨＥＲ４に結合し、これらを活性化する（Ｅｌｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＥＭＢＯ  １６：１２６８−１２７８）。ＨＢ−ＥＧＦは、三重膜通過シグナル伝達（ＴＭＰＳ；ｔｒｉｐｌｅ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐａｓｓｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と称されるプロセスを介するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）誘導性細胞増殖の中心的媒介物質である（Ｐｒｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：８８４−８８８，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１：１２０３−１２０８中の概説）。ＨＢ−ＥＧＦは、細胞増殖及び血管新生を促進することが示されている（Ｚｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７３：９１７−９２３；  Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２５：４４１−４４７）。ＨＢ−ＥＧＦは、多数の癌において中心的役割を果たしていることも示されている。すなわち、ＨＢ−ＥＧＦは、卵巣腫瘍の浸潤性の挙動に関連している（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：４７８３−４７９２）。さらに、ＨＢ−ＥＧＦは、卵巣癌細胞株による異種移植腫瘍形成にとって不可欠である。ＨＢ−ＥＧＦ（野生型又は分泌型）の過剰発現は、ＳＫＯＶ３及びＲＭＧ−１細胞中での腫瘍形成を加速させる。しかし、ｓｉＲＮＡを用いた内在性ＨＢ−ＥＧＦのノックダウンは、ＳＫＯＶ３及びＲＭＧ−１細胞による腫瘍形成を消失させ、又は遅延させる。Ｍｉｙａｍｏｔｏ，  ２００４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：５７２０。上記証拠によって示唆されるように、ＨＢ−ＥＧＦ発現又は活性の阻害は、腫瘍形成を阻害し得る。
【０００４】
同様に、ＨＢ−ＥＧＦは、ヒト膀胱癌などの幾つかの癌における不良な予後のマーカーである（Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６２２７−６２３３）。インビトロ研究は、ＨＢ−ＥＧＦ（野生型、可溶性又は切断不能）を発現するように操作されたヒトＥＪ膀胱癌が増殖の増加、足場非依存性増殖並びにＶＥＧＦの産生及び増強された遊走を示すことを示している。これらのＨＢ−ＥＧＦ発現ＥＪ膀胱細胞がヌードマウス中に移植されると、腫瘍形成、血管の大きさ及び密度の増加が腫瘍中に観察された（Ｏｎｇｕｓａｈａ，  ２００４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：５２８３−５２９０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔ他、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６５、１９９２年、ｐｐ．１１８−１２１
【非特許文献２】Ｈｅｌｄｉｎ、Ｃｅｌｌ  ８０、１９９５年、ｐｐ．２１３−２２３
【非特許文献３】Ｕｌｌｒｉｃｈ他、Ｃｅｌｌ  ６１、１９９０、ｐｐ．２０３−２１２
【非特許文献４】Ｄｈｉｌｌｏｎ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６、２００７年、ｐｐ．３２７９−３２９０
【非特許文献５】Ｐｒｅｎｚｅｌ他、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ８、２００１年、ｐｐ．１１−３１
【非特許文献６】Ｈｉｇａｈｉｙａｍａ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７、１９９２年、ｐｐ．６２０５−６２１２
【非特許文献７】Ｅｌｅｎｉｕｓ他、ＥＭＢＯ  １６、１９９７年、ｐｐ．１２６８−１２７８
【非特許文献８】Ｐｒｅｎｚｅｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２、１９９９年、ｐｐ．８８４−８８８
【非特許文献９】Ｆｉｓｃｈｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１、２００３年、ｐｐ．１２０３−１２０８
【非特許文献１０】Ｚｕｓｈｉ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７３、１９９７年、ｐｐ．９１７−９２３
【非特許文献１１】Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈ他、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２５、１９９８年、ｐｐ．４４１−４４７
【非特許文献１２】Ｔａｎａｋａ他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１、２００５年、ｐｐ．４７８３−４７９２
【非特許文献１３】Ｍｉｙａｍｏｔｏ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４、２００４年、ｐｐ．５７２０
【非特許文献１４】Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１、２００１年、ｐｐ．６２２７−６２３３
【非特許文献１５】Ｏｎｇｕｓａｈａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４、２００４年、ｐｐ．５２８３−５２９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書において、ＨＢ−ＥＧＦを結合する単離された抗原結合タンパク質が提供される。これらの抗原結合タンパク質の幾つかは、Ａ）（ｉ）配列番号１８９から２１７から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１８から２３３から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号２３４から２７４から選択されるＣＤＲＬ３；又は（ｉｖ）１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、４以下のアミノ酸の欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる１つ若しくはそれ以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。あるいは、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、Ｂ）（ｉ）配列番号２７５から２９９から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号３００から３３１から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号３３２から３７２から選択されるＣＤＲＨ３；又は（ｉｖ）１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、４以下のアミノ酸の欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる１つ若しくはそれ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み得る。
【０００７】
一実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、上記軽鎖ＣＤＲＬの１つ、２つ又はそれ以上及び上記重鎖ＣＤＲＨの１つ、２つ又はそれ以上を含み得る。一態様において、単離された抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む。別の態様において、上記Ａ）の単離された抗原結合タンパク質は、配列番号１８９から２１７から得られるＣＤＲＬ１；配列番号２１８から２３３から得られるＣＤＲＬ２；配列番号２３４から２７４から得られるＣＤＲＬ３；及び１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、２以下のアミノ酸の欠失又は挿入を含有する上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉ）の何れかのＣＤＲＬからなる群から選択される。さらに、上記Ｂ）の前記重鎖ＣＤＲＨは、配列番号２７５から２９９から得られるＣＤＲＨ１；配列番号３００から３３１から得られるＣＤＲＨ２；配列番号３３２から３７２から得られるＣＤＲＨ３アミノ酸配列；及び１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、２以下のアミノ酸の欠失又は挿入を含有する上記のＣＤＲＨから選択される。さらに、単離された抗原結合タンパク質は、上記Ａ）の１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬ及び上記Ｂ）の１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲＨを含み得る。
【０００８】
別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、以下のもの：配列番号１８９から２１７から得られるＣＤＲＬ１；配列番号２１８から２３３から得られるＣＤＲＬ２；及び配列番号２３４から２７４から得られるＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬを含む。抗原結合タンパク質は、以下の１つ：配列番号２７５から２９９から得られるＣＤＲＨ１；配列番号３００から３３１から得られるＣＤＲＨ２；配列番号３３２から３７２から得られるＣＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨも含み得る。あるいは、単離された抗原結合タンパク質は、上記Ａに列記されている１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬ及び上記Ｂ）の１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲＨを含み得る。特に、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号１８９から２１７のＣＤＲＬ１、配列番号２１８から２３３のＣＤＲＬ２及び配列番号２３４から２７４のＣＤＲＬ３並びに／又は配列番号２７５から２９９のＣＤＲＨ１、配列番号３００から３３１のＣＤＲＨ２及び配列番号３３２から３７２のＣＤＲＨ３を含み得る。
【０００９】
一態様において、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号９４から１４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。別の態様において、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号１４２から１８６から得られるアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００１０】
別の実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、少なくともＩＨＧＥ含有エピトープ及び／又はＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメインを特異的に認識する。
【００１１】
さらに、上述のように、ＨＢ−ＥＧＦを結合する単離された抗原結合タンパク質との結合に関して競合する単離された抗原結合タンパク質が本明細書で提供される。
【００１２】
ＨＢ−ＥＧＦを結合し、並びにＡ）（ｉ）配列番号１８９から２１７と少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１８から２３３と少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２３４から２７４と少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３からなる群から得られる１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）を含む単離された抗原結合タンパク質も本明細書において提供される。あるいは、ＨＢ−ＥＧＦを結合する単離された抗原結合タンパク質は、Ｂ）（ｉ）配列番号２７５から２９９と少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号３００から３３１と少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３３２から３７２と少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）を含む。単離された抗原結合タンパク質は、Ａ）の１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬ及びＢ）の１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲＨも含み得る。
【００１３】
別の実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦを結合し、並びにＡ）（ｉ）配列番号２３４から２７４からなる群から選択されるＣＤＲＬ３；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ３；及び（ｉｉｉ）以下から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列：
Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＰＸ６Ｘ７（配列番号１０４６）、
（Ｘ１は、Ｉ又はＭであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｇ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｉ又はＴであり、
Ｘ４は、Ｈ又はＱであり、
Ｘ５は、Ｆ、Ｌ又はＷであり、
Ｘ６は、Ｃ、Ｉ、Ｈ、Ｌ又はＴであり、
Ｘ７は、Ｓ又はＴである。）
ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＩＴ（配列番号１０４７）、
（Ｘ１は、Ｉ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｆ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｆ、Ｉ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ４は、Ａ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ５は、Ｐ又はＳである。）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｔ（配列番号１０４８）、
（Ｘ１は、Ｌ又はＱであり、
Ｘ２は、Ｋ、Ｎ又はＱであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｈ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｈ、Ｎ又はＹであり、
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ６は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｔ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ７は、Ｐ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ又はＰである。）
ＱＸ１Ｘ２ＤＸ３ＬＰＸ４Ｘ５（配列番号１０４９）、
（Ｘ１は、Ｈ又はＱであり、
Ｘ２は、Ｃ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ又はＬであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｓ又はＴである。）
ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１０５０）、
（Ｘ１は、Ｈ又はＹであり、
Ｘ２は、Ｇ又はＮであり、
Ｘ３は、Ｎ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｓ又はＷであり、
Ｘ５は、Ｐ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ｒ又はＷであり、
Ｘ７は、Ｓ又はＴである。）
又は
Ｘ１ＱＹＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｆ（配列番号１０５１）、
（Ｘ１は、Ｈ又はＱであり、
Ｘ２は、Ｆ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｇ、Ｉ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ又はＴであり、
Ｘ５は、Ｍ、Ｐ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ６は、Ｆ、Ｌ、Ｒ又はＷであり、
Ｘ７は、Ｓ又はＴである。）
から選択される、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
【００１４】
単離された抗原結合タンパク質は、Ｂ）（ｉ）配列番号３３２から３７２からなる群から選択されるＣＤＲＨ３；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３；及び（ｉｉｉ）以下から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＸ１２（配列番号１０６５）、
（Ｘ１は、Ｅ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｄ、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｎ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ｗ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ７は、Ｉ、Ｎ又はＹであり、
Ｘ８は、Ａ又はＹであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｆ又はＧであり、
Ｘ１１は、Ｆ、Ｌ又はＭであり、
Ｘ１２は、Ｖ又はＹである。）
ＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＹＸ１２Ｘ１３Ｘ１４ＤＸ１５（配列番号１０６６）、
（Ｘ１は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２は、Ｋ、Ｌ又はＹであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｇ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｓ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ５は、Ａ又はＧであり、
Ｘ６は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ７は、Ｔ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ９は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１０は、Ｗ又はＹであり、
Ｘ１１は、Ｇ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ１２は、Ｆ又はＹであり、
Ｘ１３は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１４は、Ｍ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１５は、Ｖ又はＹである。）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１０６７）、
（Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２は、Ｇ、Ｈ、Ｗ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｆ、Ｗ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｔ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ７は、Ｇ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｄ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ９は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｅ、Ｎ又はＹであり、
Ｘ１１は、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ１２は、Ｆ又はＩであり、
Ｘ１３は、Ｄ又はＱであり、
Ｘ１４は、Ｃ、Ｈ、Ｖ又はＹである。）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＤＸ１８（配列番号１０６８）、
（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ｉ、Ｖ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ａ、Ｇ、Ｌ又はＮであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｇ、Ｖ又はＷであり、
Ｘ６は、Ａ、Ｎ、Ｒ又はＴであり、
Ｘ７は、Ｇ、Ｎ、Ｐ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｇ、Ｔ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ９は、Ａ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１１は、Ｓ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１２は、Ｇ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１３は、Ｎ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１４は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１５は、Ｄ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１６は、Ａ、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１７は、Ｆ又はＭであり、
Ｘ１８は、Ｉ、Ｖ又はＹである。）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３（配列番号１０６９）、
（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｖ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｖ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ７は、Ｌ、Ｔ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ９は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１０は、Ｄ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１１は、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１２は、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１３は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１４は、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１５は、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１６は、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１７は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１８は、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ１９は、Ｄ、Ｆ、Ｇ又はＹであり、
Ｘ２０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ２１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２２は、Ａ、Ｄ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２３は、Ｉ、Ｌ、Ｖ，Ｙ又はアミノ酸なしである。）
Ｘ１ＹＳＳＧＷＸ２Ｘ３ＹＧＸ４Ｘ５ＤＸ６（配列番号１０７０）、
（Ｘ１は、Ｍ又はＶであり、
Ｘ２は、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ｆ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｖ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｆ又はＭであり、
Ｘ６は、Ｖ又はＹである。）
又は
ＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＦＸ４Ｙ（配列番号１０７１）、
（Ｘ１は、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｎ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｅ、Ｔ又はＷであり、
Ｘ３は、Ｌ、Ｎ、Ｔ又はＶであり、
Ｘ４は、Ｄ又はＥである。）
からなる群から選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）も含む。
【００１５】
別の形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号１８９から２１７から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１；又は（ｉｉｉ）以下から選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列：
Ｘ１ＳＳＱＳＬＸ２Ｘ３ＳＤＧＸ４ＴＹＬＸ５（配列番号１０３５）、
（Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｌ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｈ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｋ又はＮであり、
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ又はＹである。）
ＲＡＳＱＸ１ＩＳＸ２ＹＬＮ（配列番号１０３６）、
（Ｘ１は、Ｒ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ｒ又はＳである。）
ＲＡＳＱＸ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４ＬＸ５（配列番号１０３７）、
（Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ４は、Ｄ、Ｗ又はＹであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｇ又はＮである。）
ＱＡＳＱＤＩＸ１Ｘ２Ｘ３ＬＮ（配列番号１０３８）、
（Ｘ１は、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ｄ又はＮであり、
Ｘ３は、Ｓ又はＹである。）
ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＡ（配列番号１０３９）、
（Ｘ１は、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ｉ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｒ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｓ、Ｎ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｙ又はアミノ酸なしである。）
又は
ＫＳＳＱＸ１Ｘ２ＬＸ３Ｘ４ＳＮＮＫＮＹＬＸ５（配列番号１０４０）、
（Ｘ１は、Ｎ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｉ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｄ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ５は、Ａ又はＶである。）
（ｉｖ）配列番号２１８から２３３からなる群から得られるＣＤＲＬ２；（ｖ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉｖ）のＣＤＲＬ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２；又は（ｖｉ）以下から得られるＣＤＲＬ２アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２ＳＮＸ３Ｘ４Ｓ（配列番号１０４１）、
（Ｘ１は、Ｅ又はＫであり、
Ｘ２は、Ｉ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｒ又はＷであり、
Ｘ４は、Ｄ又はＦである。）
Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＬＱＳ（配列番号１０４２）、
（Ｘ１は、Ａ又はＴであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｅ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｓ又はＴである。）
Ｘ１ＡＳＸ２ＬＱＳ（配列番号１０４３）、
（Ｘ１は、Ａ又はＶであり、
Ｘ２は、Ｓ又はＴである。）
ＤＡＳＸ１ＬＥＴ（配列番号１０４４）、
（Ｘ１は、Ｉ又はＮである。）
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２２３）；又は
ＷＡＳＸ１ＲＥＳ（配列番号１０４５）
（Ｘ１は、Ａ又はＴである。）
から選択されるＣＤＲＬをさらに含み得る。
【００１６】
単離された抗原結合タンパク質は、Ｂ）（ｉ）配列番号２７５から２９９からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１；（ｉｉｉ）以下から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列：
ＧＹＴＸ１ＴＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号１０５２）、
（Ｘ１は、Ｆ又はＬであり、
Ｘ２は、Ｅ、Ｇ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｈ、Ｌ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ５は、Ｉ又はＭであり、
Ｘ６は、Ｈ又はＳである。）
ＧＹＸ１ＦＴＳＹＷＩＧ（配列番号１０５３）、
（Ｘ１は、Ｒ又はＳである。）
ＧＦＴＦＸ１ＳＸ２Ｘ３ＭＨ（配列番号１０５４）、
（Ｘ１は、Ｒ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｈ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｄ又はＧである。）
ＧＦＸ１ＦＳＸ２ＹＸ３ＭＸ４（配列番号１０５５）、
（Ｘ１は、Ｐ又はＴであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ３は、Ａ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｎ又はＳである。）
ＧＸ１ＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＷＸ８（配列番号１０５６）、
（Ｘ１は、Ｄ又はＧであり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｒ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｇ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｄ、Ｇ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ａ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ７は、Ａ又はＹであり、
Ｘ８は、Ｎ又はＳである。）
ＧＦＳＬＳＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号２７９）；又は
ＧＦＳＬＸ１ＴＧＧＶＧＶＧ（配列番号１０５７）、
（Ｘ１は、Ｓ又はＮである。）
（ｉｖ）配列番号３００から３３１からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；（ｖ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉｖ）のＣＤＲＨ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２；又は（ｖｉ）以下から得られるＣＤＲＨ２アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７ＴＸ８Ｘ９Ｘ１０ＱＫＸ１１Ｘ１２（配列番号１０５８）、
（Ｘ１は、Ｓ又はＷであり、
Ｘ２は、Ｆ又はＩであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｎ又はＳであり、
Ｘ４は、Ａ又はＰであり、
Ｘ５は、Ｅ、Ｎ又はＳであり、
Ｘ６は、Ｄ、Ｎ又はＳであり、
Ｘ７は、Ｅ、Ｇ又はＮであり、
Ｘ８は、Ｉ又はＮであり、
Ｘ９は、Ｃ、Ｈ又はＹであり、
Ｘ１０は、Ａ又はＴであり、
Ｘ１１は、Ｆ又はＬであり、
Ｘ１２は、Ｄ又はＧである。）
ＩＩＹＰＸ１ＤＳＤＸ２ＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号１０５９）、
（Ｘ１は、Ｄ又はＧであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｉ又はＴである。）
Ｘ１ＩＸ２Ｘ３ＤＧＳＸ４Ｘ５Ｘ６ＹＸ７ＤＳＶＸ８Ｇ（配列番号１０６０）、
（Ｘ１は、Ｆ又はＶであり、
Ｘ２は、Ｓ又はＷであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｉ、Ｎ又はＴであり、
Ｘ５は、Ｋ又はＱであり、
Ｘ６は、Ｎ、Ｒ又はＹであり、
Ｘ７は、Ａ、Ｔ又はＶであり；
Ｘ８は、Ｋ又はＲである。）
Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０６１）、
（Ｘ１は、Ａ、Ｈ又はＹであり、
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｇ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ５は、Ｓ、Ｔ又はＹであり、
Ｘ６は、Ｉ又はＴである。）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＹＸ１２Ｘ１３ＳＸ１４ＫＳ（配列番号１０６２）、
（Ｘ１は、Ｅ、Ｒ又はＹであり、
Ｘ２は、Ｉ又はＴであり、
Ｘ３は、Ｈ、Ｎ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｃ、Ｈ、Ｓ、Ｔ又はＹであり、
Ｘ５は、Ｓ又はＲであり、
Ｘ６は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ８は、Ｔ又はＷであり、
Ｘ９は、Ｎ又はＹであり、
Ｘ１０は、Ｎ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１１は、Ｄ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１２は、Ａ又はＮであり、
Ｘ１３は、Ｐ又はＶであり、
Ｘ１４は、Ｌ又はＶである。）
Ｘ１ＩＦＳＮＤＥＫＳＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号１０６３）、
（Ｘ１は、Ｈ又はＬである。）
又はＬＩＹＷＮＸ１Ｘ２ＫＲＹＳＰＳＬＸ３Ｓ（配列番号１０６４）、
（Ｘ１は、Ｄ又はＶであり、
Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、
Ｘ３は、Ｋ又はＲである。）
からなる群から得られるＣＤＲＨをさらに含み得る。
【００１７】
さらに別の実施形態において、本明細書に上記されている単離された抗原結合タンパク質は、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列を含み、両配列は互いに共有結合されている。第一のアミノ酸配列は、配列番号２３４から２７４のＣＤＲＬ３、配列番号２１８から２３３のＣＤＲＬ２及び配列番号１８９から２１７のＣＤＲＬ１も含み、並びに第二のアミノ酸配列が配列番号３３２から３７２の前記ＣＤＲＨ３、配列番号３００から３３１のＣＤＲＨ２及び配列番号２７５から２９９のＣＤＲＨ１を含む。
【００１８】
一態様において、前記抗原結合タンパク質はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片であり得る。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子であり得る。一実施形態において、本発明の単離された抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。別の実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。
【００１９】
本明細書に記載されている単離された抗原結合タンパク質は、以下の種類の何れでもあり得る。ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−又はＩｇＧ４−型。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４型である。さらに、抗原結合タンパク質は、標識基に結合され得る。これらの標識基は、例えば、放射性同位体、放射性核種、蛍光性基、酵素基、化学発光性基、ビオチニル基又は所定のポリペプチド基であり得る。
【００２０】
別の実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、例えば、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療性基又は化学療法基などのエフェクター基に結合され得る。化学療法基は、例えば、カリケアマイシン、アウリスタチン−ＰＥ、ゲルダナマイシン、マイタナシン又はこれらの誘導体であり得る。
【００２１】
さらに別の実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、本明細書及び特許請求の範囲に記載されている抗原結合タンパク質とのヒトＨＢ−ＥＧＦへの結合に関して競合する。この競合する抗原結合タンパク質は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片であり得る。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子であり得る。一実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。別の実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。別の実施形態において、この単離された抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型である。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４型である。別の実施形態において、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、標識基に結合され得る。標識基の例は、放射性同位体、放射性核種、蛍光性基、酵素基、化学発光性基、ビオチニル基又は所定のポリペプチド基である。別の実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、例えば、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療性基又は化学療法基などのエフェクター基に結合される。治療基又は化学療法基の例には、例えば、カリケアマイシン、アウリスタチン−ＰＥ、ゲルダナマイシン、マイタナシン又はこれらの誘導体が含まれる。
【００２２】
一態様において、少なくとも部分的にＨＢ−ＥＧＦ媒介性シグナル伝達を低下させる単離された抗原結合タンパク質が提供される。
【００２３】
前述されている単離された抗原結合タンパク質をコードする核酸分子（該核酸分子は、調節配列に作用可能に連結されている。）も本明細書に記載されている。一態様において、上記核酸分子を含むベクターが提供される。別の態様において、上記核酸分子及び／又はベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２４】
一実施形態において、前記抗原結合タンパク質を分泌する宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を調製する工程を含む、抗原結合タンパク質を作製する方法が提供される。
【００２５】
さらに別の実施形態において、本発明の上記抗原結合タンパク質の少なくとも１つ及び医薬として許容される担体、希釈剤又は佐剤を含む医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物は、抗新生物剤などのさらなる活性因子を含み得る。抗新生物剤は、例えば、抗腫瘍抗体であり得る。抗腫瘍抗体の例は、例えば、受容体チロシンキナーゼ又はＥＧＦＲに対して誘導された抗体であり得る。
【００２６】
一態様において、医薬組成物は、過剰増殖性疾患の診断、予防又は治療のために使用される。さらなる態様において、過剰増殖性疾患は、ＨＢ−ＥＧＦ発現を伴う。別の態様において、過剰増殖性疾患は、かく乱された（例えば、病的に増大した）成長因子受容体の活性化が伴い又は付随し、前記病的に増大した成長因子受容体の活性化は、Ｇタンパク質及び／又はＧタンパク質共役型受容体の活性の病的増加を伴い、又は病的増加によって引き起こされる。
【００２７】
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、乳癌、胃腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膀胱癌、神経膠腫、悪性黒色腫、他のＢＨ−ＥＧＦ発現又は過剰発現癌及び腫瘍転移の形成などの癌の診断、予防又は治療のために、少なくとも１つの抗原結合タンパク質及び医薬として許容される担体、希釈剤及び／又は佐剤を含む。
【００２８】
別の実施形態において、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、過剰増殖性疾患の診断、予防又は治療のための医薬組成物の製造のために使用される。さらなる実施形態において、過剰増殖性疾患は、ＨＢ−ＥＧＦ発現を伴う。
【００２９】
一実施形態は、本明細書に記載されている単離された抗原結合タンパク質に試料を接触させる工程及び前記試料中のＨＢ−ＥＧＦの存在を測定する工程を含む、ＨＢ−ＥＧＦの発現を伴う症状を診断するための方法を記載する。さらなる実施形態において、前記症状は、ＨＢ−ＥＧＦ発現を伴う過剰増殖性疾患である。
【００３０】
別の態様は、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質の有効量を、ＨＢ−ＥＧＦの発現を伴う症状の予防又は治療を必要としている患者に投与することを含む、患者中のＨＢ−ＥＧＦの発現を伴う症状を予防又は治療する方法を記載する。さらなる態様において、前記症状は、ＨＢ−ＥＧＦ発現を伴う過剰増殖性疾患である。さらに別の態様において、患者は哺乳動物患者である。
【００３１】
一実施形態において、上記抗原結合タンパク質、核酸分子又はベクターを含むキットが提供される。さらなる実施形態において、キットは、少なくとも１つのさらなる活性因子を含み、さらなる活性因子は抗新生物剤である。
【００３２】
本発明のこれらの態様及び他の態様を、本明細書においてさらに詳しく記載する。本発明の態様の各々は、本発明の様々な実施形態を包含することができる。従って、１つの要素又は要素の組み合わせを含む本発明の実施形態の各々が本発明の各態様中に含まれ得ると予想される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、以下の詳細な記載から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｆ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｇ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｈ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｉ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｊ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｋ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｌ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｍ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｎ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｏ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図１Ｐ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ａ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｆ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｇ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｈ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｉ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｊ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｋ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｌ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｍ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｎ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図２Ｏ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に記されている。
【図３Ａ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｆ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｇ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｈ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｉ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｊ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図３Ｋ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ａ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｆ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｇ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｈ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｉ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｊ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｋ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｌ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｍ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｎ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図４Ｏ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のアミノ酸配列を図示する。
【図５Ａ】抗原結合タンパク質の典型的な軽鎖定常領域のアミノ酸配列を図示する。
【図５Ｂ】抗原結合タンパク質の典型的な重鎖定常領域のアミノ酸配列を図示する。
【図６Ａ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図６Ｂ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図６Ｃ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図６Ｄ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図６Ｅ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図６Ｆ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図７Ａ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図７Ｂ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図７Ｃ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図７Ｄ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図７Ｅ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図８Ａ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図８Ｂ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図８Ｃ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図８Ｄ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図８Ｅ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図８Ｆ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図８Ｇ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図８Ｈ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図９Ａ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図９Ｂ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図９Ｃ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図９Ｄ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図９Ｅ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図９Ｆ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するアミノ酸配列を図示する。
【図１０Ａ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変配列のアミノ酸配列の併置を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に示されている。
【図１０Ｂ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変配列のアミノ酸配列の併置を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に示されている。
【図１１Ａ】抗原結合タンパク質の重鎖可変配列のアミノ酸配列の併置を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に示されている。
【図１１Ｂ】抗原結合タンパク質の重鎖可変配列のアミノ酸配列の併置を図示する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、枠内に示されている。
【図１２Ａ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の関連性を示す分岐図を図示する。
【図１２Ｂ】抗原結合タンパク質の軽鎖ＣＤＲＬ３領域の関連性を示す分岐図を図示する。
【図１２Ｃ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の関連性を示す分岐図を図示する。
【図１３Ａ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｆ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｇ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｈ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｉ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｊ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｋ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｌ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｍ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｎ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｏ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｐ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｑ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｒ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｓ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｔ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｕ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１３Ｖ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ａ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｆ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｇ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｈ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｉ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｊ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｋ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｌ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｍ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｎ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｏ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｐ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｑ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｒ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｓ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｔ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｕ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｖ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｗ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｘ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｙ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４Ｚ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４ＡＡ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４ＡＢ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１４ＡＣ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ａ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｆ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｇ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｈ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｉ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｊ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｋ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｌ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１５Ｍ】抗原結合タンパク質の様々な軽鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ａ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｆ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｇ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｈ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｉ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｊ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｋ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１６Ｌ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖のヌクレオチド配列を図示する。
【図１７Ａ】抗原結合タンパク質の軽鎖定常領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１７Ｂ】抗原結合タンパク質の重鎖定常領域のヌクレオチド配列を図示する。
【図１８Ａ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１８Ｂ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１８Ｃ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１８Ｄ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１８Ｅ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１８Ｆ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１９Ａ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１９Ｂ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１９Ｃ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１９Ｄ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１９Ｅ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１９Ｆ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図１９Ｇ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ａ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｂ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｃ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｄ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｅ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｆ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｇ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｈ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｉ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｊ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２０Ｋ】抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ａ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｂ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｃ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｄ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｅ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｆ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｇ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｈ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｉ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｊ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２１Ｋ】抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。
【図２２ａ】本明細書に提供されている異なる抗ＨＢ−ＥＧＦＩｇＧ２抗体調製物がＨＢ−ＥＧＦ誘導性上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンリン酸化を阻害する程度をグラフで図示している。抗体Ｕ２−１からＵ２−６８の調製物に対する結果が提供されている。例示されているように、モノクローナル抗体調製物Ｕ２−１８、Ｕ２−２４、Ｕ２−１９及びＵ２−４２は、ＥＧＦＲチロシンのリン酸化を強く阻害する。
【図２２ｂ】本明細書に提供されている異なる抗ＨＢ−ＥＧＦＩｇＧ４抗体調製物がＨＢ−ＥＧＦ誘導性上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンリン酸化を阻害する程度をグラフで図示している。抗体Ｕ２−２からＵ２−６６の調製物に対する結果が提供されている。例示されているように、モノクローナル抗体調製物Ｕ２−３９、Ｕ２−３４、Ｕ２−４５及びＵ２−６は、ＥＧＦＲチロシンのリン酸化を強く阻害する。
【図２３】抗体がＣＯＳ−７細胞中でリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）誘導性ＥＧＦＲチロシンリン酸化を阻害することを図解する。ＬＰＡは、ＴＭＰＳ経路を活性化するＧＰＣＲリガンドであり、ＨＢ−ＥＧＦの放出をもたらし、その結果、ＥＧＦＲチロシンのリン酸化をもたらす。ＣＯＳ−７細胞を表記抗体で前処理し、ＬＰＡで刺激し、次いで、細胞可溶化液を調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって可溶化液タンパク質を分離した。ブロットの調製後、リン酸化されたＥＧＦＲを検出するために抗ホスホチロシン抗体を使用した。対照として、ＷＢ抗ＥＧＦＲ抗体を用いて、下に示されているように全ＥＧＦＲを検出した。図解されているように、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−２４、Ｕ２−１９及びＵ２−４２は、ＬＰＡ誘導性ＥＧＦＲリン酸化を強く阻害する。
【図２４】本明細書に提供されている様々な抗体による、ＨＢ−ＥＧＦ誘導性ＥＧＦ受容体チロシンリン酸化の用量依存性阻害をグラフで図解する。ＳＣＣ９扁平上皮癌細胞の刺激の前に、候補Ｕ２−３９、Ｕ２−４２及びＵ２−４５抗体調製物の異なる量をＨＢ−ＥＧＦとともに予め温置し、ＥＧＦＲチロシンリン酸化の量を測定した。図示されているように、抗Ｕ２−４２及びＵ２−３９は、最大１１１％の阻害を達成した。抗体に対して測定されたＩＣ５０値は、それぞれ、０．１６７ｎＭ（Ｕ２−３９）、１ｎＭ（Ｕ２−２）及び２ｎＭ（Ｕ２−４５）であった。
【図２５】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物による、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞中でのＴＭＰＳを介したトロンビン誘導性ＥＧＦＲリン酸化の用量依存性阻害をグラフで図解する。トロンビンの存在下でＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を候補Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５抗体調製物とともに温置し、実施例６に記載されている手順を用いて、ＥＧＦＲチロシンリン酸化の量を測定した。図示されているように、抗体Ｕ２−４２及びＵ２−３９は、１００％の阻害を達成した。
【図２６】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物による、ＰＰＣ−１細胞中でのＴＭＰＳを介したＬＰＡ誘導性ＥＧＦＲチロシンリン酸化の用量依存性阻害を図解する。ＰＰＣ−１細胞を候補Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５抗体調製物とともに温置し、実施例４に記載されている手順を用いて、ＬＰＡ刺激後のＥＧＦＲチロシンリン酸化の量を検出した。図示されているように、抗体Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５は、１００％の阻害を達成した。
【図２７】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物がスフィンゴシン−１−リン酸によるＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞遊走の誘導を最大１００％阻害したことを示している。コラーゲンＩによって被覆されたトランスウェル（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，８μｍ孔）を用いて、細胞遊走阻害に関して、候補抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５を検査した。図示されているように、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２は、スフィンゴシン−１−リン酸誘導性ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞遊走を約７０％阻害したのに対して、Ｕ２−３９及びＵ２−４５抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞遊走を約１００％阻害した。従って、本明細書中に提供されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の遊走を強く阻害する。
【図２８】ＭＣＦ−７乳癌細胞のＨＢ−ＥＧＦ誘導性遊走が３つの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物（Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５モノクローナル抗体調製物）によって阻害されることをグラフによって図解する。
【図２９】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物によるＨＥＲ４のＨＢ−ＥＧＦ誘導性チロシンリン酸化の用量依存性阻害を図解する。ＨＥＲ４チロシンリン酸化の刺激及び検出の前に、Ｕ２−４２．１又はＵ２−３９．１抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物をＨＢ−ＥＧＦとともに温置した。図示されているように、ＨＥＲ４チロシンリン酸化の１００％阻害が観察された。ｘ軸上に示されている抗体の量は対数的に減少することに注目されたい。
【図３０Ａ】カニクイザルＨＢ−ＥＧＦを発現するＤＮＡベクターが形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞を用いるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した場合、モノクローナル抗体調製物はカニクイザルから得たＨＢ−ＥＧＦと交叉反応することを示している。図示されているように、空のベクター対照が形質移入されたＨＥＫ−２９３対照細胞に対して、極めて低いＸ平均値（１から２）が観察される。これに対して、ＨＥＫ−２９３細胞がカニクイザルＨＢ−ＥＧＦをコードする発現カセットで形質移入された場合には、２５０又はそれ以上のＸ平均値が観察された。
【図３０Ｂ】マウスＨＢ−ＥＧＦを発現するＤＮＡベクターが形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞を用いるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した場合、モノクローナル抗体Ｕ２−４５調製物はマウスから得たＨＢ−ＥＧＦと交叉反応することを示している。ＨＥＫ−２９３細胞がマウスＨＢ−ＥＧＦをコードする発現カセットで形質移入された場合には、３３．７のＸ平均値が観察された。
【図３０Ｃ】アムフィレグリンとのＨＢ−ＥＧＦ抗体の交叉反応性の程度を示す。
【図３１】ＦＣＡＳ分析によって検出されたように、ＨＢ−ＥＧＦはヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上に発現されていることを示している。
【図３２Ａ】ＨＢ−ＥＧＦはＨＵＶＥＣ細胞の増殖を刺激するのに対して、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物は基礎増殖を約８％から１４％阻害したことを示している。ＨＢ−ＥＧＦは、ＨＵＶＥＣ細胞増殖を約３８％を刺激する。
【図３２Ｂ】しかしながら、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２、Ｕ２−３９又はＵ２−４５を添加すると、基礎細胞増殖は約８％から１４％阻害される。
【図３３Ａ−Ｍ】図３３Ａから３３Ｌは、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体はＨＵＶＥＣ管の退行を加速することを示している。ＨＵＶＥＣ管の形成は、内皮細胞血管新生に対するモデル系である。図３３Ａから３３Ｃは、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体なしに行われた対照アッセイを提供する。図示されているように、ＨＵＶＥＣ細胞は結合して、多くの環状構造、すなわち「管」を形成する。図３３Ｄから３３Ｆは、管の形成に対する抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−３９抗体調製物を添加する効果を図示する。図３３Ｇから３３Ｉは、管形成に対する抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−４２抗体調製物を添加することの効果を図示する。図３３Ｊから３３Ｌは、管の形成に対する抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−４５抗体調製物を添加することの効果を図示する。図示されているように、Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物が存在すると、より少ないＨＵＶＥＣ管が見られ、ネットワークは減少する。図３３Ｍは、本明細書に提供されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物を添加した後におけるＨＵＶＥＣ管形成の定量的評価をグラフで示しており、血管新生を阻害するためのＨＢ−ＥＧＦ抗体の有用性を裏付ける。顕微鏡野当りの管又は閉じた細胞構造の数を、Ｕ２−４２、Ｕ２−３９又はＵ２−４５抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物に関してプロットする。図示されているように、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が存在しない場合には、顕微鏡野当り約１０個のＨＵＶＥＣ管が見られるが、Ｕ２−３９抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物を添加した場合には、顕微鏡野当り約４つのＨＵＶＥＣ管が観察されるに過ぎなかった。Ｕ２−４２抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物の存在下では、約１個のＨＵＶＥＣ管が観察されるに過ぎなかった。Ｕ２−４５抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物が存在する場合には、６つのＨＵＶＥＣ管が観察されるに過ぎなかった。
【図３４Ａ】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体がＯＶＣＡＲ−８卵巣癌細胞のＨＢ−ＥＧＦによって刺激されるコロニー形成を阻害することを示している。図示されているように、ＨＢ−ＥＧＦは、ＯＶＣＡＲ−８細胞を刺激して、ＨＢ−ＥＧＦなしに培養された対照ＯＶＣＡＲ−４８細胞より著しく大きな平均コロニーサイズを形成する。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦの存在下で、抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−３９抗体とともにＯＶＣＡＲ−８細胞を培養すると、平均コロニーサイズは、ＨＢ−ＥＧＦ処理なしの対照細胞に関して観察されたベースラインサイズまで低下した。
【図３４Ｂ】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が軟寒天中でのＢＭ１６０４前立腺癌細胞のＨＢ−ＥＧＦによって刺激されるコロニー形成を阻害することを示している。図示されているように、ＨＢ−ＥＧＦは、ＢＭ１６０４細胞を刺激して、ＨＢ−ＥＧＦなしに培養された対照ＢＭ１６０４細胞より多数のウェル当りコロニーを形成する。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦの存在下で、抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−３９抗体とともにＢＭ１６０４細胞を培養すると、平均コロニーサイズは、ＨＢ−ＥＧＦ処理なしの対照細胞に関して観察されたサイズと同様のサイズまで低下した。抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−４５及びＵ２−４２抗体は、コロニー形成を部分的に阻害したが、このアッセイにおいて、Ｕ２−３９抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体はコロニー形成を完全に阻害した。
【図３４Ｃ】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体がＮＣＩ−Ｈ２２６肺癌細胞のＨＢ−ＥＧＦによって刺激されるコロニー形成を阻害することを示している。図示されているように、ＨＢ−ＥＧＦは、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を刺激して、ＨＢ−ＥＧＦなしに培養された対照ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞より著しく大きな平均コロニーサイズを形成する。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦの存在下で、抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−３９抗体とともにＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を培養すると、平均コロニーサイズは、ＨＢ−ＥＧＦ処理なしの対照細胞に関して観察されたベースラインサイズまで低下した。
【図３４Ｄ】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が、ＨＢ−ＥＧＦの恒常的過剰発現を引き起こさせるために、ＨＢ−ＥＧＦ発現ベクターで形質移入されたＳｋＯＶ−３卵巣癌細胞に由来するＳｋＯＶ−３ＨＢ−ＥＧＦクローン７１細胞の基底コロニー形成を阻害することを図解する。図示されているように、対照ＳｋＯＶ−３ＨＢ−ＥＧＦクローン７１細胞は多数のコロニーを形成した。しかしながら、ＳｋＯＶ−３ＨＢ−ＥＧＦｃｌ．７１細胞を抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−４２又はＵ２−３９抗体の何れかとともに培養すると、コロニーの数が劇的に低下した。
【図３４Ｅ】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が、ＨＢ−ＥＧＦの恒常的過剰発現を引き起こさせるために、ＨＢ−ＥＧＦ発現ベクターで形質移入されたＳｋＯＶ−３卵巣癌細胞に由来するＳｋＯＶ−３ＨＢ−ＥＧＦクローン７４細胞の基底コロニー形成を阻害することを図解する。図示されているように、対照ＳｋＯＶ−３ＨＢ−ＥＧＦクローン７４細胞は多数のコロニーを形成した。しかしながら、ＳｋＯＶ−３ＨＢ−ＥＧＦクローン７４細胞を抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−３９とともに培養すると、コロニーの数が劇的に低下した。
【図３４Ｆ】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が軟寒天中で増殖されたＢｘＰＣ３膵臓腺癌細胞の基底コロニー形成を阻害することを示している。図示されているように、対照ＢｘＰＣ３細胞は多数のコロニーを形成した。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦの存在下で、ＢｘＰＣ３細胞を抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−４２又はＵ２−３９抗体の何れかとともに培養すると、コロニーの数が劇的に低下した。
【図３５】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が軟寒天中で増殖されたＨＢ−ＥＧＦを過剰発現するＥＯ−２７ＨＢ−ＥＧＦクローン５８卵巣癌細胞の基底コロニー形成を阻害することを示している。図示されているように、対照細胞は多数のコロニーを形成した。しかしながら、ＥＦＯ−２７ＨＢ−ＥＧＦｃｌ．５８細胞を抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−４２、Ｕ２−３９又はＵ２−４５抗体の何れかとともに培養すると、コロニーの数が劇的に低下した。さらに、抗ＥＧＦＲ抗体Ｅｒｂｉｔｕｘとの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の併用療法はコロニー形成を完全に阻害した。
【図３６】抗ＨＢ−ＥＧＦがＨＢ−ＥＧＦによって誘導された血管新生をインビボで阻害することを示す。マウスマトリゲルプラグアッセイ中での血管新生ネットワークの形成は、抗体Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５によって、用量依存的に遮断され得る。
【図３７】抗体Ｕ２−４２及びＵ２−３９によるマウス異種移植モデル中の確立されたＢｘＰＣ３腫瘍の成長の阻害を図解する。
【図３８Ａ】抗体Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５によるマウス異種移植モデル中の確立されたＥＦＯ−２７ＨＢ−ＥＧＦクローン５８腫瘍の成長の阻害を図解する。
【図３８Ｂ】抗体Ｕ２−４２及びＵ２−３９による異種移植腫瘍増殖の阻害の効率は、用量依存的であることが示された。
【図３８Ｃ】さらに、抗ＥＧＦＲ抗体Ｅｒｂｉｔｕｘとの併用治療は腫瘍増殖の完全な退行をもたらし、併用療法のための薬剤としての抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の強力な相乗的活性を示している。
【図３９Ａ】免疫組織化学によってヒト組織中のＨＢ−ＥＧＦを検出するためのヒト抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の使用を示している。
【図３９Ｂ】ＥＬＩＳＡによってヒト組織中のＨＢ−ＥＧＦを検出するためのヒト抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の使用を示している。
【図４０Ａ】ＣＬＳ３５４上皮扁平上皮癌細胞（口）のＨＢ−ＥＧＦ誘導性遊走の阻害を示す引っ掻きアッセイを図解する。
【図４０Ｂ】Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２上皮癌細胞（咽頭）のＨＢ−ＥＧＦ誘導性遊走の阻害を示す遊出アッセイを図解する。
【図４１Ａ】ＶＥＧＦによって刺激される内皮細胞の出芽の阻害を示す、球状体を基礎とする細胞血管新生アッセイを図解する。
【図４１Ｂ】ＶＥＧＦによって刺激される内皮細胞の出芽の阻害を示す、球状体を基礎とする細胞血管新生アッセイを図解する。
【図４２】インビボで腫瘍のＣＤ３１染色の阻害を示すヒト腫瘍異種移植試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を図解する。
【図４３Ａ】シスプラチン及びアバスチンとのＵ２−３９の併用治療を示すインビボ卵巣腫瘍異種移植モデルを図解する。
【図４３Ｂ】シスプラチン及びアバスチンとのＵ２−３９の併用治療を示すインビボ卵巣腫瘍異種移植モデルを図解する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書において使用されている節の見出しは、整理を目的とするものに過ぎず、記載されている主題を限定するものと解釈すべきでない。
【００３５】
本明細書中に別段の定義がなければ、本願に関連して使用されている科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段の要請がなければ、単数形は複数を包含し、複数の用語は単数を包含するものとする。
【００３６】
一般に、本明細書中に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学並びにハイブリッド形成に関連して使用される命名法及びこれらの技術は、本分野において周知であり、一般的に使用されている。本願の方法及び技術は、別段の記載がなければ、本分野において周知の慣用法に従って、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的な及びより具体的な参考文献中に論述されているように一般的に実施される。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （２００１）」及び「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９９２）」及び「Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９０）」（これらは、参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。酵素反応及び精製技術は、本分野において一般的に実施されるように又は本明細書に記載されているように、製造業者の仕様に従って実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学並びに医科学及び薬化学に関連して使用されている用語並びにこれらの実験室操作及び技術は、周知のものであり、本分野において一般的に使用されている。化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤化及び送達及び患者の治療のために標準的な技術を使用することができる。
【００３７】
本発明は、本明細書に記載されている特定の方法、プロトコール及び試薬などに限定されるものではなく、従って、変動し得ることを理解すべきである。本明細書中に使用されている用語は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、開示されている範囲を限定することを意図するものではなく、開示されている範囲は、特許請求の範囲によってのみ確定される。
【００３８】
実施例以外に又は別段の記載がなされている場合に、本明細書中に使用されている成分又は反応条件の量を表示する全ての数は、あらゆる事例において、「約」という用語によって修飾されているものと理解すべきである。パーセントと関連して使用される場合、「約」という用語は±１％を意味し得る。
【００３９】
Ａ．総論
ＨＢ−ＥＧＦタンパク質、特に、ヒトＨＢ−ＥＧＦ（ｈＨＢ−ＥＧＦ）タンパク質を結合する抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されているように、１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）がその中に埋め込まれ及び／又は連結されているポリペプチドである。幾つかの抗原結合タンパク質において、ＣＤＲは、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が達成されるようにＣＤＲを配向させる「フレームワーク」領域中に埋め込まれる。一般に、提供される抗原結合タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦとその同族受容体（ＥＧＦ−Ｒ及びＨＥＲ４など）の間の相互作用を妨害し、遮断し、低下させ、又は調節することができる。
【００４０】
本明細書中に記載されているある種の抗原結合タンパク質は抗体であり、又は抗体に由来する。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において、「抗体模倣物」と称される場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。）及びそれぞれ、これらの断片などの（但し、これらに限定されない。）、抗体を基礎とする。様々な構造が、本明細書中の以下にさらに記載されている。
【００４１】
本明細書中に提供される抗原結合タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦ、特にヒトＨＢ−ＥＧＦの幾つかのエピトープに結合することが示された。実施例に示されているように、ＨＢ−ＥＧＦがその同族受容体に結合する能力は低下され又は阻害される。その結果、本明細書中に提供されている抗原結合タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦの活性を阻害することができる。特に、これらのエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、以下の活性の１つ又はそれ以上を有することができる。とりわけ、ＥＧＦ−Ｒ及びＨＥＲ４自己リン酸化の阻害、ＥＧＦ−Ｒ及びＨＥＲ４シグナル伝達経路の誘導、ＥＧＦ−Ｒ及びＨＥＲ４によって誘導される細胞増殖並びにＨＢ−ＥＧＦの結合に際してＥＧＦ−Ｒ及びＨＥＲ４によって誘導される他の生理的効果。
【００４２】
本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質は、様々な用途を有する。抗原結合タンパク質の幾つかは、例えば、ＨＢ−ＥＧＦ、特にｈＨＢ−ＥＧＦの特異的結合アッセイ、アフィニティー精製において、及びこのような受容体を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。さらに、開示されている抗原結合タンパク質は、増殖性疾患などの疾病の診断及び／又は治療のために使用され得る。これらには、癌の様々な種類が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
Ｂ．ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）
ＨＢ−ＥＧＦは、様々な腫瘍細胞によって産生され、自己分泌性腫瘍成長因子として作用する。Ｄａｖｉｓ−Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．３：２８８−２９９；  Ｉｗａｍｏｔｏ  ＆  Ｍｅｋａｄａ，  ２０００，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１１：３３５−３４４。ＨＢ−ＥＧＦは、ＨＢ−ＥＧＦの生物活性を増加させることができるヘパリンに対して強い親和性を有する。ＨＢ−ＥＧＦは、メタロプロテイナーゼによってタンパク分解的に切断されて成長因子の成熟可溶性形態を与える膜貫通タンパク質として産生される。
【００４４】
ＨＢ−ＥＧＦは、可溶性の分泌された形態で培養されたヒトマクロファージの上清から最初に同定された。ヒト細胞に対して、前駆体プロＨＢ−ＥＧＦは、ジフテリア毒素受容体として作用する。上皮細胞、ケラチン生成細胞、単球、メサンギウム細胞、リンパ球様細胞及び骨格筋細胞などの様々な細胞種がＨＢ−ＥＧＦを産生する。ＨＢ−ＥＧＦは、上皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞及び様々なヒト癌細胞に対する強力な有糸分裂促進因子及び化学的遊走因子である。
【００４５】
ＨＢ−ＥＧＦの膜貫通形態は、ＥＧＦ、ヘパリン結合、膜貫通及び細胞質ドメインを含有する２０８アミノ酸の膜貫通前駆体（ｔｍ−ＨＢ−ＥＧＦ）として多くの細胞種によって合成される。細胞外ドメインは、メタロプロテイナーゼの作用を通じて、ＨＢ−ＥＧＦの１２ないし２２ｋＤａ可溶性形態（ｓｏｌ−ＨＢ−ＥＧＦ）として放出され得、これは、異なるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）又はテトラデカノイルホルボール酢酸（ＴＰＡ）などの腫瘍促進因子によって制御される。典型的には、膜貫通ＨＢ−ＥＧＦ前駆体の相当量が細胞表面上で切断されていない状態を保つ。
【００４６】
ｔｍ−ＨＢ−ＥＧＦ及びｓｏｌ−ＨＢ−ＥＧＦは何れも生物学的に活性を有する。ｓｏｌ−及びｔｍ−ＨＢ−ＥＧＦの両方の生物学的機能が、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１）及びＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）によって媒介される。これらの受容体のこれらの種類の活性化は、リガンド誘導体受容体ホモ又はヘテロ二量体化の結果として起こると考えられている。活性化されると、ＥＧＦ受容体は、細胞増殖を増加させ、細胞の運動性を増加させ、アポトーシスを阻害し、及び細胞の形質転換を増加させることが示されている。
【００４７】
ＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達経路は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の刺激に際してトランス活性化され得る。ＧＰＣＲとの相互作用によるヘテロ三量体Ｇタンパク質のリガンド活性化は、膜貫通メタロプロテイナーゼの細胞外活性を誘導する細胞内シグナルをもたらす。ＧＰＣＲ経路を活性化するリガンドには、ＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）、トロンビン、カルバコール、ボンベシン及びエンドセリンが含まれる。このような活性化は、膜貫通成長因子前駆体の細胞外プロセッシング及びＥＧＦＲのエクトドメインと直接又はプロテオグリカンマトリックスを通じて相互作用し、及びチロシンリン酸化を通じてＥＧＦＲのエクトドメインを活性化する成熟因子の放出をもたらす。「Ｐｒｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：８８４−８８８」を参照されたい。従って、ＨＢ−ＥＧＦは、ＧＰＣＲが膜結合型メタロプロテイナーゼ（プロＨＢ−ＥＧＦを切断して、可溶性成長因子を放出し、続いて、可溶性成長因子がＥＧＦ受容体を活性化する。）を活性化する三重膜通過シグナル（ＴＭＰＳ）機構の成分である。ＥＧＦＲのトランス活性化は、心臓肥大（Ｓｈａｈ  ＢＨ，  Ｃａｔｔ  ＫＪ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００３  Ｍａｙ；２４（５）：２３９−２４４に概説されている。）、血管再構築（Ｅｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２００３  Ｄｅｃ；３１（Ｐｔ  ６）：１１９８−２０２中に概説されている。）及び癌（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、上記に概説されている。）などの様々な疾病状態に関連している。
【００４８】
ＨＢ−ＥＧＦタンパク質及びＥＢ−ＥＧＦタンパク質をコードする核酸に対する配列は、当業者が入手可能である。例えば、このようなＨＢ−ＥＧＦ配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／参照）によって提供されるデータベース中に見出すことができる。ＨＢ−ＥＧＦに対する配列の一例は、ＮＣＢＩ受付番号ＮＭ００１９４５及びＮＰ ００１９３６（ｇｉ：４５０３４１３）のアミノ酸配列である。容易に参照するために、以下にこの配列（配列番号１０７２）が挙げられている。
【００４９】
【化１】
0005685442.tif 000002
【００５０】
上に示されているＨＢ−ＥＧＦ配列（配列番号１０７２）は、１９アミノ酸のシグナルペプチド（ＭＫＬＬＰＳＶＶＬＫ  ＬＦＬＡＡＶＬＳＡ、配列番号１０７３）を有する。
【００５１】
可溶性細胞外ドメインは、上記ＨＢ−ＥＧＦ配列のアミノ酸１から１４９からなる。ＨＢ−ＥＧＦ可溶性細胞外ドメインに対するこの配列は、配列番号１０７４として以下に提供されている。
【００５２】
【化２】
0005685442.tif 000003
【００５３】
切断されると、アミノ酸６３から１４９（８７アミノ酸）からなる成熟ＨＢ−ＥＧＦが生成される。成熟ＨＢ−ＥＧＦに対するこの配列は、配列番号１０７５として以下に提供されている。
【００５４】
【化３】
0005685442.tif 000004
【００５５】
ＨＢ−ＥＧＦは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と相互作用し、ＥＧＦＲを活性化する。
ＥＧＦＲは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインからなる１７０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。ＥＧＦＲへの成長因子の結合は、リガンド−受容体複合体の内部取り込み、受容体及び他のタンパク質基質の自己リン酸化をもたらし、最終的には、ＤＮＡ合成及び細胞分裂を引き起こす。外部リガンド結合ドメインは、ＨＢ−ＥＧＦによって刺激されるのみならず、ＥＧＦ、ＴＧＦα及びアムフィレグリン（ＡＲ）によっても刺激される。
【００５６】
ＥＧＦＲの過剰発現には、ＥＧＦ様成長因子の同時発現がしばしば伴い、成長を調節するための自己分泌性経路が腫瘍の進行において大きな役割を果たし得ることを示唆する。現在では、これが、腫瘍細胞が正常な生理的調節を免れ得る機序であると広く信じられている。
【００５７】
Ｃ．ＨＢ−ＥＧＦ受容体抗原結合タンパク質
ＨＢ−ＥＧＦの活性を制御するのに有用な様々な選択的結合剤が提供される。これらの結合剤には、例えば、抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖抗体、ドメイン抗体、免疫接着及び抗原結合領域を有するポリペプチド）を含有し、ＨＢ−ＥＧＦポリペプチド、特に、ヒトＨＢ−ＥＧＦに特異的に結合する抗原結合タンパク質が含まれる。結合剤の幾つかは、例えば、ＨＢ−ＥＧＦがその受容体に結合するのを阻害する上で有用であり、従って、ＨＢ−ＥＧＦによって媒介されるシグナル伝達と関連する１つ又はそれ以上の活性を阻害し、妨害し、又は調節するために使用することができる。
【００５８】
一般に、本明細書に記載されている１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５又は６つ）ＣＤＲを典型的に含む抗原結合タンパク質が提供される。幾つかの事例において、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造並びに（ｂ）ポリペプチド構造中に挿入され、及び／又はポリペプチド構造に結合された１つ又はそれ以上のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態を採り得る。例えば、ポリペプチド構造は、天然に存在する抗体若しくはその断片若しくは変形物のフレームワークであり得若しくはこれらを含むことができ、又は完全に合成的な性質であり得る。様々なポリペプチド構造の例が、以下にさらに記載されている。
【００５９】
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であり、又はモノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において、「抗体模倣物」と称される場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物（「抗体連結物」と称される場合がある。）及びそれぞれ、各々の一部又は断片など（但し、これらに限定されない。）、抗体に由来する。幾つかの事例において、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖ）である。様々な構造が、本明細書中にさらに記載及び定義されている。
【００６０】
本明細書に提供されている抗原結合タンパク質の幾つかは、ヒトＨＢ−ＥＧＦに特異的に結合する。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１０７２のアミノ酸配列を有するヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に特異的に結合する。
【００６１】
抗原結合タンパク質が治療用途のために使用される実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦの１つ又はそれ以上の生物学的活性を阻害し、妨害し、又は調節することができる。この事例において、（例えば、インビトロ競合結合アッセイにおいて結合を測定することによって）抗体の過剰がヒトＨＢ−ＥＧＦの受容体に結合されたヒトＨＢ−ＥＧＦ（又はその逆）の量を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％若しくはそれ以上低下させる場合、抗原結合タンパク質は、ヒトＨＢ−ＥＧＦに特異的に結合し、及び／又はヒトＨＢ−ＥＧＦの受容体へのヒトＨＢ−ＥＧＦの結合を実質的に阻害する。ＨＢ−ＥＧＦは、様々な細胞種中で多くの異なるアッセイにおいて測定することができる多くの異なる生物学的効果を有する。このようなアッセイの例は、本明細書に提供されている。
【００６２】
１．天然に存在する抗体の構造
提供される抗原結合タンパク質の幾つかは、天然に存在する抗体に通例付随する構造を有する。これらの抗体の構造単位は、通例、１つ又はそれ以上の四量体（それぞれ、ポリペプチド鎖の２つの同じ対から構成される。）を含むが、哺乳動物の幾つかの種は単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。典型的な抗体において、各ペア又は対は、１つの完全長「軽」鎖（ある種の実施形態において、約２５ｋＤａ）及び１つの完全長「重」鎖（ある種の実施形態において、約５０から７０ｋＤａ）を含む。それぞれの各免疫グロブリン鎖は、幾つかの「免疫グロブリンドメイン」（それぞれ、概ね９０から１１０個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを呈する。）から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本的単位である。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識のために必要とされる可変ドメインを典型的に含む。カルボキシ末端部分は鎖の他方末端より進化的に保存されており、「定常領域」又は「Ｃ領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般に、κ及びλ軽鎖と分類され、これらの各々は１つ可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含有する。重鎖は、典型的には、μ、δ、γ、α又はε鎖と分類され、これらは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のイソタイプを定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などの（但し、これらに限定されない。）幾つかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む。ヒトにおいて、ＩｇＡ及びＩｇＤイソタイプは４つの重鎖及び４つの軽鎖を含有し、ＩｇＧ及びＩｇＥイソタイプは２つの重鎖及び２つの軽鎖を含有し、並びにＩｇＭイソタイプは５つの重鎖及び５つの軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、エフェクター機能のために必要となり得る１つ又はそれ以上のドメインを典型的に含む。重鎖定常領域ドメインの数は、イソタイプに依存する。ＩｇＧ重鎖は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのイソタイプ及びサブタイプの何れをも有することができる。ある実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦ抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブタイプのものである。
【００６３】
完全長軽鎖及び重鎖において、可変及び定常領域は、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は、さらに約１０個のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｈ．  ７（Ｐａｕｌ，  Ｗ．，  ｅｄ．）  １９８９，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ」（参照により、あらゆる目的のために、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。
【００６４】
典型的なＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体のκ鎖定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
【００６５】
【化４】
0005685442.tif 000005
【００６６】
典型的なＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体のＩｇＧ２重定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
【００６７】
【化５】
0005685442.tif 000006
【００６８】
免疫グロブリン鎖の可変領域は、３つの超可変領域（より頻繁には、「相補性決定領域」又はＣＤＲと称される。）によって連結される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、同じ全体構造を一般に呈する。上記各重鎖／軽鎖対の２つの鎖から得られるＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって併置されて、標的タンパク質（例えば、ＨＢ−ＥＧＦ）上の特異的エピトープに特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端へ、天然に存在する軽鎖及び重鎖可変領域は何れも、典型的には、これらの要素の以下の順序に従う。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。これらの各ドメイン中の位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるために、付番系が考案されている。この付番系は、「Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （１９８７  ａｎｄ  １９９１，  ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）又は「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，  １９８７，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３」に定義されている。
【００６９】
本明細書中に提供されている様々な軽鎖及び重鎖可変領域が、それぞれ、図１Ａから１Ｐ及び図２Ａから２Ｏに図示されている。これらの可変領域の各々は、上の重鎖及び軽鎖定常領域に結合されて、それぞれ、完全な抗体重鎖及び軽鎖を形成し得る。さらに、このようにして生成された重鎖及び軽鎖配列の各々が組み合わされて、完全な抗体構造を形成し得る。
【００７０】
提供される抗体の完全長軽鎖及び重鎖の幾つかの具体例並びにそれらの対応するアミノ酸配列が、それぞれ、図３Ａから３Ｋ及び図４Ａから４Ｏに要約されている。
【００７１】
同じく、図３Ａから３Ｋに列記されている典型的な軽鎖（ＵＬ−１、ＵＬ−２、ＵＬ−３など）の各々は、図４Ａから４Ｏに示されている典型的な重鎖の何れかと組み合わされて、抗体を形成することができる。このような組み合わせの例には、ＵＨ−１からＵＨ−５８の何れかと組み合わされたＵＬ−１、ＵＨ−１からＵＨ−５８の何れかと組み合わされたＵＬ−２、ＵＨ−１からＵＨ−５８の何れかと組み合わされたＵＬ−３などが含まれる。幾つかの事例では、抗体は、それぞれ、図３Ａから３Ｋ及び図４Ａから４Ｏに列記されているものから得られる少なくとも１つの軽鎖及び１つの重鎖を含む。他の例では、抗体は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含有する。一例として、抗体又は免疫学的に機能的な断片は、２つのＵＬ−１軽鎖及び２つのＵＨ−１重鎖又は２つのＵＬ−２軽鎖及び２つのＵＨ−２重鎖又は２つのＵＬ−３軽鎖及び２つのＵＨ−３重鎖並びにそれぞれ、図３Ａから３Ｋ及び図４Ａから４Ｏに列記されている軽鎖の対と重鎖の対の他の類似の組み合わせを含み得る。
【００７２】
提供される他の抗体は、それぞれ、図３Ａから３Ｋ及び図４Ａから４Ｏに示されている重鎖及び軽鎖の組み合わせによって形成された抗体の変形物であり、これらの鎖のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性をそれぞれ有する軽鎖及び／又は重鎖を含む。幾つかの事例において、このような抗体は少なくとも１つの軽鎖及び１つの重鎖を含むのに対して、他の事例において、変形物形態は２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含有する。
【００７３】
２．抗体の可変ドメイン
それぞれ、図１Ａから１Ｐ及び図２Ａから２Ｏに示されているような、Ｕ−ＶＬ１、Ｕ−ＶＬ２、Ｕ−ＶＬ３、Ｕ−ＶＬ４、Ｕ−ＶＬ５、Ｕ−ＶＬ６、Ｕ−ＶＬ７、Ｕ−ＶＬ８、Ｕ−ＶＬ９、Ｕ−ＶＬ１０、Ｕ−ＶＬ１１、Ｕ−ＶＬ１２、Ｕ−ＶＬ１３、Ｕ−ＶＬ１４、Ｕ−ＶＬ１５、Ｕ−ＶＬ１６、Ｕ−ＶＬ１７、Ｕ−ＶＬ１８、Ｕ−ＶＬ１９、Ｕ−ＶＬ２０、Ｕ−ＶＬ２１、Ｕ−ＶＬ２２、Ｕ−ＶＬ２３、Ｕ−ＶＬ２４、Ｕ−ＶＬ２５、Ｕ−ＶＬ２６、Ｕ−ＶＬ２７、Ｕ−ＶＬ２８、Ｕ−ＶＬ２９、Ｕ−ＶＬ３０、Ｕ−ＶＬ３１、Ｕ−ＶＬ３２、Ｕ−ＶＬ３３、Ｕ−ＶＬ３４、Ｕ−ＶＬ３５、Ｕ−ＶＬ３６、Ｕ−ＶＬ３７、Ｕ−ＶＬ３８、Ｕ−ＶＬ３９、Ｕ−ＶＬ４０、Ｕ−ＶＬ４１、Ｕ−ＶＬ４２、Ｕ−ＶＬ４３、Ｕ−ＶＬ４４、Ｕ−ＶＬ４５、Ｕ−ＶＬ４６、Ｕ−ＶＬ４７、Ｕ−ＶＬ４８、Ｕ−ＶＬ４９、Ｕ−ＶＬ５０、Ｕ−ＶＬ５１、Ｕ−ＶＬ５２、Ｕ−ＶＬ５４、Ｕ−ＶＬ５５、Ｕ−ＶＬ５６、Ｕ−ＶＬ５７、Ｕ−ＶＬ５８、Ｕ−ＶＬ５９、Ｕ−ＶＬ６０、Ｕ−ＶＬ６１、Ｕ−ＶＬ６２、Ｕ−ＶＬ６４及びＵ−ＶＬ６５からなる群から選択される抗体軽鎖可変領域並びに／又はＵ−ＶＨ１、Ｕ−ＶＨ２、Ｕ−ＶＨ３、Ｕ−ＶＨ４、Ｕ−ＶＨ５、Ｕ−ＶＨ６、Ｕ−ＶＨ７、Ｕ−ＶＨ８、Ｕ−ＶＨ９、Ｕ−ＶＨ１０、Ｕ−ＶＨ１１、Ｕ−ＶＨ１２、Ｕ−ＶＨ１３、Ｕ−ＶＨ１４、Ｕ−ＶＨ１５、Ｕ−ＶＨ１６、Ｕ−ＶＨ１７、Ｕ−ＶＨ１８、Ｕ−ＶＨ１９、Ｕ−ＶＨ２０、Ｕ−ＶＨ２１、Ｕ−ＶＨ２２、Ｕ−ＶＨ２３、Ｕ−ＶＨ２４、Ｕ−ＶＨ２５、Ｕ−ＶＨ２６、Ｕ−ＶＨ２７、Ｕ−ＶＨ２８、Ｕ−ＶＨ２９、Ｕ−ＶＨ３０、Ｕ−ＶＨ３１、Ｕ−ＶＨ３２、Ｕ−ＶＨ３３、Ｕ−ＶＨ３４、Ｕ−ＶＨ３５、Ｕ−ＶＨ３６、Ｕ−ＶＨ３７、Ｕ−ＶＨ３８、Ｕ−ＶＨ３９、Ｕ−ＶＨ４０、Ｕ−ＶＨ４１、Ｕ−ＶＨ４２、Ｕ−ＶＨ４３、Ｕ−ＶＨ４４、Ｕ−ＶＨ４５、Ｕ−ＶＨ４６、Ｕ−ＶＨ４７、Ｕ−ＶＨ４８、Ｕ−ＶＨ４９、Ｕ−ＶＨ５０、Ｕ−ＶＨ５１、Ｕ−ＶＨ５２、Ｕ−ＶＨ５３、Ｕ−ＶＨ５４、Ｕ−ＶＨ５５、Ｕ−ＶＨ５６、Ｕ−ＶＨ５７及びＵ−ＶＨ５８からなる群から選択される抗体軽鎖可変領域並びにこれらの軽鎖及び重鎖可変領域の免疫学的に機能的な断片、誘導体、変異タンパク質及び変形物を含有する抗原結合タンパク質も提供される。
【００７４】
様々な軽鎖及び重鎖可変領域の配列併置は、それぞれ、図１０Ａ及び１０Ｂ並びに図１１Ａ及び１１Ｂに提供されている。
【００７５】
この種類の抗原結合タンパク質は、式「ＶＨｘ／ＶＬｙ」（「ｘ」は重鎖可変領域の数に対応し、「ｙ」は軽鎖可変領域の数に対応する（一般に、ｘ及びｙは、それぞれ、１又は２である。）。）によって、一般的に表記することができる。
【００７６】
図１Ａから１Ｐに列記されている軽鎖可変領域の各々は、図２Ａから２Ｏに示されている軽鎖可変領域の何れかと組み合わされて、抗原結合タンパク質を形成し得る。このような組み合わせの例には、Ｕ−ＶＨ１、Ｕ−ＶＨ２、Ｕ−ＶＨ３、Ｕ−ＶＨ４、Ｕ−ＶＨ５、Ｕ−ＶＨ６、Ｕ−ＶＨ７、Ｕ−ＶＨ８、Ｕ−ＶＨ９、Ｕ−ＶＨ１０、Ｕ−ＶＨ１１、Ｕ−ＶＨ１２、Ｕ−ＶＨ１３、Ｕ−ＶＨ１４、Ｕ−ＶＨ１５、Ｕ−ＶＨ１６、Ｕ−ＶＨ１７、Ｕ−ＶＨ１８、Ｕ−ＶＨ１９、Ｕ−ＶＨ２０、Ｕ−ＶＨ２１、Ｕ−ＶＨ２２、Ｕ−ＶＨ２３、Ｕ−ＶＨ２４、Ｕ−ＶＨ２５、Ｕ−ＶＨ２６、Ｕ−ＶＨ２７、Ｕ−ＶＨ２８、Ｕ−ＶＨ２９、Ｕ−ＶＨ３０、Ｕ−ＶＨ３１、Ｕ−ＶＨ３２、Ｕ−ＶＨ３３、Ｕ−ＶＨ３４、Ｕ−ＶＨ３５、Ｕ−ＶＨ３６、Ｕ−ＶＨ３７、Ｕ−ＶＨ３８、Ｕ−ＶＨ３９、Ｕ−ＶＨ４０、Ｕ−ＶＨ４１、Ｕ−ＶＨ４２、Ｕ−ＶＨ４３、Ｕ−ＶＨ４４、Ｕ−ＶＨ４５、Ｕ−ＶＨ４６、Ｕ−ＶＨ４７、Ｕ−ＶＨ４８、Ｕ−ＶＨ４９、Ｕ−ＶＨ５０、Ｕ−ＶＨ５１、Ｕ−ＶＨ５２、Ｕ−ＶＨ５３、Ｕ−ＶＨ５４、Ｕ−ＶＨ５５、Ｕ−ＶＨ５６、Ｕ−ＶＨ５７若しくはＵ−ＶＨ５８の何れかと組み合わされたＵ−ＶＬ１又はＵ−ＶＨ１、Ｕ−ＶＨ２、Ｕ−ＶＨ３、Ｕ−ＶＨ４、Ｕ−ＶＨ５、Ｕ−ＶＨ６、Ｕ−ＶＨ７、Ｕ−ＶＨ８、Ｕ−ＶＨ９、Ｕ−ＶＨ１０、Ｕ−ＶＨ１１、Ｕ−ＶＨ１２、Ｕ−ＶＨ１３、Ｕ−ＶＨ１４、Ｕ−ＶＨ１５、Ｕ−ＶＨ１６、Ｕ−ＶＨ１７、Ｕ−ＶＨ１８、Ｕ−ＶＨ１９、Ｕ−ＶＨ２０、Ｕ−ＶＨ２１、Ｕ−ＶＨ２２、Ｕ−ＶＨ２３、Ｕ−ＶＨ２４、Ｕ−ＶＨ２５、Ｕ−ＶＨ２６、Ｕ−ＶＨ２７、Ｕ−ＶＨ２８、Ｕ−ＶＨ２９、Ｕ−ＶＨ３０、Ｕ−ＶＨ３１、Ｕ−ＶＨ３２、Ｕ−ＶＨ３３、Ｕ−ＶＨ３４、Ｕ−ＶＨ３５、Ｕ−ＶＨ３６、Ｕ−ＶＨ３７、Ｕ−ＶＨ３８、Ｕ−ＶＨ３９、Ｕ−ＶＨ４０、Ｕ−ＶＨ４１、Ｕ−ＶＨ４２、Ｕ−ＶＨ４３、Ｕ−ＶＨ４４、Ｕ−ＶＨ４５、Ｕ−ＶＨ４６、Ｕ−ＶＨ４７、Ｕ−ＶＨ４８、Ｕ−ＶＨ４９、Ｕ−ＶＨ５０、Ｕ−ＶＨ５１、Ｕ−ＶＨ５２、Ｕ−ＶＨ５３、Ｕ−ＶＨ５４、Ｕ−ＶＨ５５、Ｕ−ＶＨ５６、Ｕ−ＶＨ５７若しくはＵ−ＶＨ５８何れかと組み合わされたＵ−ＶＬ２などが含まれる。
【００７７】
幾つかの事例において、抗原結合タンパク質は、それぞれ、図１Ａから１Ｐ及び図２Ａから２Ｏに列記されているものから得られる少なくとも１つの重鎖可変領域及び／又は１つの軽鎖可変領域を含む。幾つかの事例において、抗原結合タンパク質は、それぞれ、図１Ａから１Ｐ及び図２Ａから２Ｏに列記されているものから得られる少なくとも２つの異なる重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。このような抗原結合タンパク質の例は、（ａ）１つのＵ−ＶＬ１及び（ｂ）Ｕ−ＶＬ２、Ｕ−ＶＬ３、Ｕ−ＶＬ４、Ｕ−ＶＬ５、Ｕ−ＶＬ６、Ｕ−ＶＬ７、Ｕ−ＶＬ８、Ｕ−ＶＬ９、Ｕ−ＶＬ１０、Ｕ−ＶＬ１１、Ｕ−ＶＬ１２、Ｕ−ＶＬ１３、Ｕ−ＶＬ１４、Ｕ−ＶＬ１５、Ｕ−ＶＬ１６、Ｕ−ＶＬ１７、Ｕ−ＶＬ１８、Ｕ−ＶＬ１９、Ｕ−ＶＬ２０、Ｕ−ＶＬ２１、Ｕ−ＶＬ２２、Ｕ−ＶＬ２３、Ｕ−ＶＬ２４、Ｕ−ＶＬ２５、Ｕ−ＶＬ２６、Ｕ−ＶＬ２７、Ｕ−ＶＬ２８、Ｕ−ＶＬ２９、Ｕ−ＶＬ３０、Ｕ−ＶＬ３１、Ｕ−ＶＬ３２、Ｕ−ＶＬ３３、Ｕ−ＶＬ３４、Ｕ−ＶＬ３５、Ｕ−ＶＬ３６、Ｕ−ＶＬ３７、Ｕ−ＶＬ３８、Ｕ−ＶＬ３９、Ｕ−ＶＬ４０、Ｕ−ＶＬ４１、Ｕ−ＶＬ４２、Ｕ−ＶＬ４３、Ｕ−ＶＬ４４、Ｕ−ＶＬ４５、Ｕ−ＶＬ４６、Ｕ−ＶＬ４７、Ｕ−ＶＬ４８、Ｕ−ＶＬ４９、Ｕ−ＶＬ５０、Ｕ−ＶＬ５１、Ｕ−ＶＬ５２、Ｕ−ＶＬ５４、Ｕ−ＶＬ５５、Ｕ−ＶＬ５６、Ｕ−ＶＬ５７、Ｕ−ＶＬ５８、Ｕ−ＶＬ５９、Ｕ−ＶＬ６０、Ｕ−ＶＬ６１、Ｕ−ＶＬ６２、Ｕ−ＶＬ６４及びＵ−ＶＬ６５の１つを含む。同じく、このような抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＵ−ＶＬ２及び（ｂ）Ｕ−ＶＬ１、Ｕ−ＶＬ３、Ｕ−ＶＬ４、Ｕ−ＶＬ５、Ｕ−ＶＬ６、Ｕ−ＶＬ７、Ｕ−ＶＬ８、Ｕ−ＶＬ９、Ｕ−ＶＬ１０、Ｕ−ＶＬ１１、Ｕ−ＶＬ１２、Ｕ−ＶＬ１３、Ｕ−ＶＬ１４、Ｕ−ＶＬ１５、Ｕ−ＶＬ１６、Ｕ−ＶＬ１７、Ｕ−ＶＬ１８、Ｕ−ＶＬ１９、Ｕ−ＶＬ２０、Ｕ−ＶＬ２１、Ｕ−ＶＬ２２、Ｕ−ＶＬ２３、Ｕ−ＶＬ２４、Ｕ−ＶＬ２５、Ｕ−ＶＬ２６、Ｕ−ＶＬ２７、Ｕ−ＶＬ２８、Ｕ−ＶＬ２９、Ｕ−ＶＬ３０、Ｕ−ＶＬ３１、Ｕ−ＶＬ３２、Ｕ−ＶＬ３３、Ｕ−ＶＬ３４、Ｕ−ＶＬ３５、Ｕ−ＶＬ３６、Ｕ−ＶＬ３７、Ｕ−ＶＬ３８、Ｕ−ＶＬ３９、Ｕ−ＶＬ４０、Ｕ−ＶＬ４１、Ｕ−ＶＬ４２、Ｕ−ＶＬ４３、Ｕ−ＶＬ４４、Ｕ−ＶＬ４５、Ｕ−ＶＬ４６、Ｕ−ＶＬ４７、Ｕ−ＶＬ４８、Ｕ−ＶＬ４９、Ｕ−ＶＬ５０、Ｕ−ＶＬ５１、Ｕ−ＶＬ５２、Ｕ−ＶＬ５４、Ｕ−ＶＬ５５、Ｕ−ＶＬ５６、Ｕ−ＶＬ５７、Ｕ−ＶＬ５８、Ｕ−ＶＬ５９、Ｕ−ＶＬ６０、Ｕ−ＶＬ６１、Ｕ−ＶＬ６２、Ｕ−ＶＬ６４及びＵ−ＶＬ６５の１つを含む。同じく、このような抗原結合タンパク質の別の例は、（ａ）１つのＵ−ＶＬ３並びに（ｂ）Ｕ−ＶＬ１、Ｕ−ＶＬ２、Ｕ−ＶＬ４、Ｕ−ＶＬ５、Ｕ−ＶＬ６、Ｕ−ＶＬ７、Ｕ−ＶＬ８、Ｕ−ＶＬ９、Ｕ−ＶＬ１０、Ｕ−ＶＬ１１、Ｕ−ＶＬ１２、Ｕ−ＶＬ１３、Ｕ−ＶＬ１４、Ｕ−ＶＬ１５、Ｕ−ＶＬ１６、Ｕ−ＶＬ１７、Ｕ−ＶＬ１８、Ｕ−ＶＬ１９、Ｕ−ＶＬ２０、Ｕ−ＶＬ２１、Ｕ−ＶＬ２２、Ｕ−ＶＬ２３、Ｕ−ＶＬ２４、Ｕ−ＶＬ２５、Ｕ−ＶＬ２６、Ｕ−ＶＬ２７、Ｕ−ＶＬ２８、Ｕ−ＶＬ２９、Ｕ−ＶＬ３０、Ｕ−ＶＬ３１、Ｕ−ＶＬ３２、Ｕ−ＶＬ３３、Ｕ−ＶＬ３４、Ｕ−ＶＬ３５、Ｕ−ＶＬ３６、Ｕ−ＶＬ３７、Ｕ−ＶＬ３８、Ｕ−ＶＬ３９、Ｕ−ＶＬ４０、Ｕ−ＶＬ４１、Ｕ−Ｖ｜４２、Ｕ−ＶＬ４３、Ｕ−ＶＬ４４、Ｕ−ＶＬ４５、Ｕ−ＶＬ４６、Ｕ−ＶＬ４７、Ｕ−ＶＬ４８、Ｕ−ＶＬ４９、Ｕ−ＶＬ５０、Ｕ−ＶＬ５１、Ｕ−ＶＬ５２、Ｕ−ＶＬ５４、Ｕ−ＶＬ５５、Ｕ−ＶＬ５６、Ｕ−ＶＬ５７、Ｕ−ＶＬ５８、Ｕ−ＶＬ５９、Ｕ−ＶＬ６０、Ｕ−ＶＬ６１、Ｕ−ＶＬ６２、Ｕ−ＶＬ６４及びＵ−ＶＬ６５などの１つを含む。
【００７８】
このような抗原結合タンパク質のさらに別の例は、（ａ）１つのＵ−ＶＨ１並びに（ｂ）Ｕ−ＶＨ２、Ｕ−ＶＨ３、Ｕ−ＶＨ４、Ｕ−ＶＨ５、Ｕ−ＶＨ６、Ｕ−ＶＨ７、Ｕ−ＶＨ８、Ｕ−ＶＨ９、Ｕ−ＶＨ１０、Ｕ−ＶＨ１１、Ｕ−ＶＨ１２、Ｕ−ＶＨ１３、Ｕ−ＶＨ１４、Ｕ−ＶＨ１５、Ｕ−ＶＨ１６、Ｕ−ＶＨ１７、Ｕ−ＶＨ１８、Ｕ−ＶＨ１９、Ｕ−ＶＨ２０、Ｕ−ＶＨ２１、Ｕ−ＶＨ２２、Ｕ−ＶＨ２３、Ｕ−ＶＨ２４、Ｕ−ＶＨ２５、Ｕ−ＶＨ２６、Ｕ−ＶＨ２７、Ｕ−ＶＨ２８、Ｕ−ＶＨ２９、Ｕ−ＶＨ３０、Ｕ−ＶＨ３１、Ｕ−ＶＨ３２、Ｕ−ＶＨ３３、Ｕ−ＶＨ３４、Ｕ−ＶＨ３５、Ｕ−ＶＨ３６、Ｕ−ＶＨ３７、Ｕ−ＶＨ３８、Ｕ−ＶＨ３９、Ｕ−ＶＨ４０、Ｕ−ＶＨ４１、Ｕ−ＶＨ４２、Ｕ−ＶＨ４３、Ｕ−ＶＨ４４、Ｕ−ＶＨ４５、Ｕ−ＶＨ４６、Ｕ−ＶＨ４７、Ｕ−ＶＨ４８、Ｕ−ＶＨ４９、Ｕ−ＶＨ５０、Ｕ−ＶＨ５１、Ｕ−ＶＨ５２、Ｕ−ＶＨ５３、Ｕ−ＶＨ５４、Ｕ−ＶＨ５５、Ｕ−ＶＨ５６、Ｕ−ＶＨ５７及びＵ−ＶＨ５８の１つを含む。別の例は、（ａ）１つのＵ−ＶＨ２並びに（ｂ）Ｕ−ＶＨ１、Ｕ−ＶＨ３、Ｕ−ＶＨ４、Ｕ−ＶＨ５、Ｕ−ＶＨ６、Ｕ−ＶＨ７、Ｕ−ＶＨ８、Ｕ−ＶＨ９、Ｕ−ＶＨ１０、Ｕ−ＶＨ１１、Ｕ−ＶＨ１２、Ｕ−ＶＨ１３、Ｕ−ＶＨ１４、Ｕ−ＶＨ１５、Ｕ−ＶＨ１６、Ｕ−ＶＨ１７、Ｕ−ＶＨ１８、Ｕ−ＶＨ１９、Ｕ−ＶＨ２０、Ｕ−ＶＨ２１、Ｕ−ＶＨ２２、Ｕ−ＶＨ２３、Ｕ−ＶＨ２４、Ｕ−ＶＨ２５、Ｕ−ＶＨ２６、Ｕ−ＶＨ２７、Ｕ−ＶＨ２８、Ｕ−ＶＨ２９、Ｕ−ＶＨ３０、Ｕ−ＶＨ３１、Ｕ−ＶＨ３２、Ｕ−ＶＨ３３、Ｕ−ＶＨ３４、Ｕ−ＶＨ３５、Ｕ−ＶＨ３６、Ｕ−ＶＨ３７、Ｕ−ＶＨ３８、Ｕ−ＶＨ３９、Ｕ−ＶＨ４０、Ｕ−ＶＨ４１、Ｕ−ＶＨ４２、Ｕ−ＶＨ４３、Ｕ−ＶＨ４４、Ｕ−ＶＨ４５、Ｕ−ＶＨ４６、Ｕ−ＶＨ４７、Ｕ−ＶＨ４８、Ｕ−ＶＨ４９、Ｕ−ＶＨ５０、Ｕ−ＶＨ５１、Ｕ−ＶＨ５２、Ｕ−ＶＨ５３、Ｕ−ＶＨ５４、Ｕ−ＶＨ５５、Ｕ−ＶＨ５６、Ｕ−ＶＨ５７及びＵ−ＶＨ５８の１つを含む。同じく、別の例は、（ａ）１つのＵ−ＶＨ３並びに（ｂ）Ｕ−ＶＨ１、Ｕ−ＶＨ２、Ｕ−ＶＨ４、Ｕ−ＶＨ５、Ｕ−ＶＨ６、Ｕ−ＶＨ７、Ｕ−ＶＨ８、Ｕ−ＶＨ９、Ｕ−ＶＨ１０、Ｕ−ＶＨ１１、Ｕ−ＶＨ１２、Ｕ−ＶＨ１３、Ｕ−ＶＨ１４、Ｕ−ＶＨ１５、Ｕ−ＶＨ１６、Ｕ−ＶＨ１７、Ｕ−ＶＨ１８、Ｕ−ＶＨ１９、Ｕ−ＶＨ２０、Ｕ−ＶＨ２１、Ｕ−ＶＨ２２、Ｕ−ＶＨ２３、Ｕ−ＶＨ２４、Ｕ−ＶＨ２５、Ｕ−ＶＨ２６、Ｕ−ＶＨ２７、Ｕ−ＶＨ２８、Ｕ−ＶＨ２９、Ｕ−ＶＨ３０、Ｕ−ＶＨ３１、Ｕ−ＶＨ３２、Ｕ−ＶＨ３３、Ｕ−ＶＨ３４、Ｕ−ＶＨ３５、Ｕ−ＶＨ３６、Ｕ−ＶＨ３７、Ｕ−ＶＨ３８、Ｕ−ＶＨ３９、Ｕ−ＶＨ４０、Ｕ−ＶＨ４１、Ｕ−ＶＨ４２、Ｕ−ＶＨ４３、Ｕ−ＶＨ４４、Ｕ−ＶＨ４５、Ｕ−ＶＨ４６、Ｕ−ＶＨ４７、Ｕ−ＶＨ４８、Ｕ−ＶＨ４９、Ｕ−ＶＨ５０、Ｕ−ＶＨ５１、Ｕ−ＶＨ５２、Ｕ−ＶＨ５３、Ｕ−ＶＨ５４、Ｕ−ＶＨ５５、Ｕ−ＶＨ５６、Ｕ−ＶＨ５７及びＵ−ＶＨ５８などを含む。
【００７９】
重鎖可変領域の様々な組み合わせは、軽鎖可変領域の様々な組み合わせの何れかと組み合わされ得る。
【００８０】
他の事例では、抗原結合タンパク質は、２つの同一の軽鎖可変領域及び／又は２つの同一の重鎖可変領域を含有する。例として、抗原結合タンパク質は、それぞれ、図１Ａから１Ｐ及び図２Ａから２Ｏに列記されているような軽鎖可変領域の対及び重鎖可変領域の対と組み合わされた２つの軽鎖可変領域及び２つの重鎖可変領域を含む抗体又は免疫学的に機能的な断片であり得る。
【００８１】
提供される幾つかの抗原結合タンパク質は、Ｕ−ＶＬ１、Ｕ−ＶＬ２、Ｕ−ＶＬ３、Ｕ−ＶＬ４、Ｕ−ＶＬ５、Ｕ−ＶＬ６、Ｕ−ＶＬ７、Ｕ−ＶＬ８、Ｕ−ＶＬ９、Ｕ−ＶＬ１０、Ｕ−ＶＬ１１、Ｕ−ＶＬ１２、Ｕ−ＶＬ１３、Ｕ−ＶＬ１４、Ｕ−ＶＬ１５、Ｕ−ＶＬ１６、Ｕ−ＶＬ１７、Ｕ−ＶＬ１８、Ｕ−ＶＬ１９、Ｕ−ＶＬ２０、Ｕ−ＶＬ２１、Ｕ−ＶＬ２２、Ｕ−ＶＬ２３、Ｕ−ＶＬ２４、Ｕ−ＶＬ２５、Ｕ−ＶＬ２６、Ｕ−ＶＬ２７、Ｕ−ＶＬ２８、Ｕ−ＶＬ２９、Ｕ−ＶＬ３０、Ｕ−ＶＬ３１、Ｕ−ＶＬ３２、Ｕ−ＶＬ３３、Ｕ−ＶＬ３４、Ｕ−ＶＬ３５、Ｕ−ＶＬ３６、Ｕ−ＶＬ３７、Ｕ−ＶＬ３８、Ｕ−ＶＬ３９、Ｕ−ＶＬ４０、Ｕ−ＶＬ４１、Ｕ−ＶＬ４２、Ｕ−ＶＬ４３、Ｕ−ＶＬ４４、Ｕ−ＶＬ４５、Ｕ−ＶＬ４６、Ｕ−ＶＬ４７、Ｕ−ＶＬ４８、Ｕ−ＶＬ４９、Ｕ−ＶＬ５０、Ｕ−ＶＬ５１、Ｕ−ＶＬ５２、Ｕ−ＶＬ５４、Ｕ−ＶＬ５５、Ｕ−ＶＬ５６、Ｕ−ＶＬ５７、Ｕ−ＶＬ５８、Ｕ−ＶＬ５９、Ｕ−ＶＬ６０、Ｕ−ＶＬ６１、Ｕ−ＶＬ６２、Ｕ−ＶＬ６４又はＵ−ＶＬ６５から選択される軽鎖可変ドメインの配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸残基においてのみ異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む（それぞれのこのような配列の差は、独立に、１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換である。）。幾つかの抗原結合タンパク質中の軽鎖可変領域は、Ｕ−ＶＬ１、Ｕ−ＶＬ２、Ｕ−ＶＬ３、Ｕ−ＶＬ４、Ｕ−ＶＬ５、Ｕ−ＶＬ６、Ｕ−ＶＬ７、Ｕ−ＶＬ８、Ｕ−ＶＬ９、Ｕ−ＶＬ１０、Ｕ−ＶＬ１１、Ｕ−ＶＬ１２、Ｕ−ＶＬ１３、Ｕ−ＶＬ１４、Ｕ−ＶＬ１５、Ｕ−ＶＬ１６、Ｕ−ＶＬ１７、Ｕ−ＶＬ１８、Ｕ−ＶＬ１９、Ｕ−ＶＬ２０、Ｕ−ＶＬ２１、Ｕ−ＶＬ２２、Ｕ−ＶＬ２３、Ｕ−ＶＬ２４、Ｕ−ＶＬ２５、Ｕ−ＶＬ２６、Ｕ−ＶＬ２７、Ｕ−ＶＬ２８、Ｕ−ＶＬ２９、Ｕ−ＶＬ３０、Ｕ−ＶＬ３１、Ｕ−ＶＬ３２、Ｕ−ＶＬ３３、Ｕ−ＶＬ３４、Ｕ−ＶＬ３５、Ｕ−ＶＬ３６、Ｕ−ＶＬ３７、Ｕ−ＶＬ３８、Ｕ−ＶＬ３９、Ｕ−ＶＬ４０、Ｕ−ＶＬ４１、Ｕ−ＶＬ４２、Ｕ−ＶＬ４３、Ｕ−ＶＬ４４、Ｕ−ＶＬ４５、Ｕ−ＶＬ４６、Ｕ−ＶＬ４７、Ｕ−ＶＬ４８、Ｕ−ＶＬ４９、Ｕ−ＶＬ５０、Ｕ−ＶＬ５１、Ｕ−ＶＬ５２、Ｕ−ＶＬ５４、Ｕ−ＶＬ５５、Ｕ−ＶＬ５６、Ｕ−ＶＬ５７、Ｕ−ＶＬ５８、Ｕ−ＶＬ５９、Ｕ−ＶＬ６０、Ｕ−ＶＬ６１、Ｕ−ＶＬ６２、Ｕ−ＶＬ６４又はＵ−ＶＬ６５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【００８２】
ある抗体は、Ｕ−ＶＨ１、Ｕ−ＶＨ２、Ｕ−ＶＨ３、Ｕ−ＶＨ４、Ｕ−ＶＨ５、Ｕ−ＶＨ６、Ｕ−ＶＨ７、Ｕ−ＶＨ８、Ｕ−ＶＨ９、Ｕ−ＶＨ１０、Ｕ−ＶＨ１１、Ｕ−ＶＨ１２、Ｕ−ＶＨ１３、Ｕ−ＶＨ１４、Ｕ−ＶＨ１５、Ｕ−ＶＨ１６、Ｕ−ＶＨ１７、Ｕ−ＶＨ１８、Ｕ−ＶＨ１９、Ｕ−ＶＨ２０、Ｕ−ＶＨ２１、Ｕ−ＶＨ２２、Ｕ−ＶＨ２３、Ｕ−ＶＨ２４、Ｕ−ＶＨ２５、Ｕ−ＶＨ２６、Ｕ−ＶＨ２７、Ｕ−ＶＨ２８、Ｕ−ＶＨ２９、Ｕ−ＶＨ３０、Ｕ−ＶＨ３１、Ｕ−ＶＨ３２、Ｕ−ＶＨ３３、Ｕ−ＶＨ３４、Ｕ−ＶＨ３５、Ｕ−ＶＨ３６、Ｕ−ＶＨ３７、Ｕ−ＶＨ３８、Ｕ−ＶＨ３９、Ｕ−ＶＨ４０、Ｕ−ＶＨ４１、Ｕ−ＶＨ４２、Ｕ−ＶＨ４３、Ｕ−ＶＨ４４、Ｕ−ＶＨ４５、Ｕ−ＶＨ４６、Ｕ−ＶＨ４７、Ｕ−ＶＨ４８、Ｕ−ＶＨ４９、Ｕ−ＶＨ５０、Ｕ−ＶＨ５１、Ｕ−ＶＨ５２、Ｕ−ＶＨ５３、Ｕ−ＶＨ５４、Ｕ−ＶＨ５５、Ｕ−ＶＨ５６、Ｕ−ＶＨ５７又はＵ−ＶＨ５８から選択される重鎖可変ドメインの配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸残基においてのみ異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む（それぞれのこのような配列の差は、独立に、１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換である。）。幾つかの抗原結合タンパク質中の重鎖可変領域は、Ｕ−ＶＨ１、Ｕ−ＶＨ２、Ｕ−ＶＨ３、Ｕ−ＶＨ４、Ｕ−ＶＨ５、Ｕ−ＶＨ６、Ｕ−ＶＨ７、Ｕ−ＶＨ８、Ｕ−ＶＨ９、Ｕ−ＶＨ１０、Ｕ−ＶＨ１１、Ｕ−ＶＨ１２、Ｕ−ＶＨ１３、Ｕ−ＶＨ１４、Ｕ−ＶＨ１５、Ｕ−ＶＨ１６、Ｕ−ＶＨ１７、Ｕ−ＶＨ１８、Ｕ−ＶＨ１９、Ｕ−ＶＨ２０、Ｕ−ＶＨ２１、Ｕ−ＶＨ２２、Ｕ−ＶＨ２３、Ｕ−ＶＨ２４、Ｕ−ＶＨ２５、Ｕ−ＶＨ２６、Ｕ−ＶＨ２７、Ｕ−ＶＨ２８、Ｕ−ＶＨ２９、Ｕ−ＶＨ３０、Ｕ−ＶＨ３１、Ｕ−ＶＨ３２、Ｕ−ＶＨ３３、Ｕ−ＶＨ３４、Ｕ−ＶＨ３５、Ｕ−ＶＨ３６、Ｕ−ＶＨ３７、Ｕ−ＶＨ３８、Ｕ−ＶＨ３９、Ｕ−ＶＨ４０、Ｕ−ＶＨ４１、Ｕ−ＶＨ４２、Ｕ−ＶＨ４３、Ｕ−ＶＨ４４、Ｕ−ＶＨ４５、Ｕ−ＶＨ４６、Ｕ−ＶＨ４７、Ｕ−ＶＨ４８、Ｕ−ＶＨ４９、Ｕ−ＶＨ５０、Ｕ−ＶＨ５１、Ｕ−ＶＨ５２、Ｕ−ＶＨ５３、Ｕ−ＶＨ５４、Ｕ−ＶＨ５５、Ｕ−ＶＨ５６、Ｕ−ＶＨ５７又はＵ−ＶＨ５８の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【００８３】
さらに別の抗原結合タンパク質、例えば、抗体又は免疫学的に機能的な断片は、直前に記載されているような変形物軽鎖及び変形物重鎖の変形物形態を含む。
【００８４】
３．ＣＤＲ
本明細書に開示されている抗原結合タンパク質は、１つ又はそれ以上のＣＤＲがその中に移植され、挿入され、及び／又は連結されているポリペプチドである。抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを有することができる。従って、抗原結合タンパク質は、例えば、１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）及び／又は１つの軽鎖ＣＤＲ２「ＣＤＲＬ２」）及び／又は１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）を有することができる。幾つかの抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３の両方を含む。具体的なＣＤＲは、図６Ａから６Ｆ及び図７Ａから７Ｅに明記されている。
【００８５】
ある抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）（軽鎖及び重鎖ＦＲアミノ酸配列の例は、それぞれ、図８Ａから８Ｈ及び図９Ａから９Ｆに与えられている。）は、Ｋａｂａｔ他の「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＰＨＳ，  ＮＩＨ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２，  １９９１」によって記載された系を用いて特定され得る。本明細書中に開示されているある種の抗体は、図６Ａから６Ｆ（ＣＤＲＬ）及び図７Ａから７Ｅ（ＣＤＲＨ）中に表されているＣＤＲの１つ又はそれ以上のアミノ酸配列と同一であり、又は実質的な配列同一性を有する１つ又はそれ以上のアミノ酸配列を含む。
【００８６】
天然に存在する抗体内のＣＤＲの構造及び特性は、上に記載されている。要約すれば、伝統的な抗体において、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれている（ＣＤＲは、フレームワークにおいて、抗原結合及び認識のために必要な領域を構成している。）。可変領域は、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１、上記により、フレームワーク領域１から４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と表記される。Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  １９８７、上記も参照）内に、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲを含む。上記参照（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  １９８７，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３も参照）。しかしながら、本明細書において提供されるＣＤＲは、伝統的な抗体構造の抗原結合ドメインを規定するために使用され得るのみならず、本明細書に記載されているような様々な他のポリペプチド構造中に埋め込まれ得る。
【００８７】
一態様において、提供されるＣＤＲは、（ａ）（ｉ）配列番号１８９から２１７からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１８から２３３からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号２３４から２７４からなる群から選択されるＣＤＲＬ３並びに（ｉｖ）１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、５、４、３、２若しくは１以下のアミノ酸の欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択されるＣＤＲＬ；Ｂ）（ｉ）配列番号２７５から２９９からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号３００から３３１からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号３３２から３７２からなる群から選択されるＣＤＲＨ３並びに（ｉｖ）１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、又は５、４、３、２若しくは１以下のアミノ酸の欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）のＣＤＲＬＨ；からなる群から選択されるＣＤＲＨを含む。
【００８８】
さらに別の態様において、図６Ａから６Ｆ及び図７Ａから７Ｅに列記されているＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有するＣＤＲの変形物形態が提供される。
【００８９】
さらに別の態様において、本明細書中に開示されているＣＤＲは、関連するモノクローナル抗体の群に由来するコンセンサス配列を含む。本明細書に記載されている「コンセンサス配列」とは、多数の配列間で共通する保存されたアミノ酸配列及びあるアミノ酸配列内で変動する可変的アミノ酸を有するアミノ酸配列を表す。提供されるＣＤＲコンセンサス配列は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の各々に対応するＣＤＲを含む。
【００９０】
コンセンサス配列は、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のＵ−ＶＬ及びＵ−ＶＨに対応するＣＤＲの標準的な系統発生分析アプローチを用いて決定された。比較用の併置及び系統発生の推定の遂行を容易にするために、まず、このアプローチでは、Ｕ−ＶＬ又はＵ−ＶＨの何れかの可変ドメイン全体に対応するアミノ酸配列をＦＡＳＴＡフォーマットに変換した。この比較に基づいて、それぞれ、各軽鎖及び重鎖可変領域を、系統発生的に関連する群に分割した。すなわち、軽鎖可変領域は６つの群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ（図１２Ａ及び１２Ｂ参照）に分類され、重鎖可変領域は、７つの群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ（図１２Ｃ参照）に分類された。次いで、これらの群の各々の中で、コンセンサス集合物を定義するために、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３領域の各々の比較を使用した。
【００９１】
軽鎖ＣＤＲの群Ａは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【００９２】
ａ．一般式Ｘ１ＳＳＱＳＬＸ２Ｘ３ＳＤＧＸ４ＴＹＬＸ５（配列番号１０３５）のＣＤＲＬ１
（Ｘ１は、Ｋ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｌ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｈ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｋ又はＮであり、
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ又はＹである。）
ｂ．一般式Ｘ１Ｘ２ＳＮＸ３Ｘ４Ｓ（配列番号１０４１）のＣＤＲＬ２
（Ｘ１は、Ｅ又はＫであり、
Ｘ２は、Ｉ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｒ又はＷであり、
Ｘ４は、Ｄ又はＦである。）
ｃ．一般式Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＰＸ６Ｘ７（配列番号１０４６）のＣＤＲＬ３
（Ｘ１は、Ｉ又はＭであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｇ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｉ又はＴであり、
Ｘ４は、Ｈ又はＱであり、
Ｘ５は、Ｆ、Ｌ又はＷであり、
Ｘ６は、Ｃ、Ｉ、Ｈ、Ｌ又はＴであり、
Ｘ７は、Ｓ又はＴである。）
軽鎖ＣＤＲの群Ｂは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【００９３】
ａ．一般式ＲＡＳＱＸ１ＩＳＸ２ＹＬＮ（配列番号１０３６）のＣＤＲＬ１
（Ｘ１は、Ｒ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ｒ又はＳである。）
ｂ．一般式Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＬＱＳ（配列番号１０４２）のＣＤＲＬ２
（Ｘ１は、Ａ又はＴであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｅ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｓ又はＴである。）
ｃ．一般式ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＩＴ（配列番号１０４７）のＣＤＲＬ３
（Ｘ１は、Ｉ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｆ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｆ、Ｉ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ４は、Ａ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ５は、Ｐ又はＳである。）
軽鎖ＣＤＲの群Ｃは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【００９４】
ａ．一般式ＲＡＳＱＸ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４ＬＸ５（配列番号１０３７）のＣＤＲＬ１
（Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ４は、Ｄ、Ｗ又はＹであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｇ又はＮである。）
ｂ．一般式Ｘ１ＡＳＸ２ＬＱＳ（配列番号１０４３）のＣＤＲＬ２
（Ｘ１は、Ａ又はＶであり、
Ｘ２は、Ｓ又はＴである。）
ｃ．一般式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｔ（配列番号１０４８）のＣＤＲＬ３
（Ｘ１は、Ｌ又はＱであり、
Ｘ２は、Ｋ、Ｎ又はＱであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｈ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｈ、Ｎ又はＹであり、
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ６は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｔ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ７は、Ｐ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ又はＰである。）
軽鎖ＣＤＲの群Ｄは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【００９５】
ａ．一般式ＱＡＳＱＤＩＸ１Ｘ２Ｘ３ＩＮ（配列番号１０３８）のＣＤＲＬ１
（Ｘ１は、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ｄ又はＮであり、
Ｘ３は、Ｓ又はＹである。）
ｂ．一般式ＤＡＳＸ１ＬＥＴ（配列番号１０４４）のＣＤＲＬ２
（Ｘ１は、Ｉ又はＮである。）
ｃ．一般式ＱＸ１Ｘ２ＤＸ３ＬＰＸ４Ｘ５（配列番号１０４９）のＣＤＲＬ３
（Ｘ１は、Ｈ又はＱであり、
Ｘ２は、Ｃ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ又はＬであり、Ｘ５は、Ａ、Ｓ又はＴである。）
軽鎖ＣＤＲの群Ｅは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【００９６】
ａ．一般式ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＡ（配列番号１０３９）のＣＤＲＬ１
（Ｘ１は、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ｉ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｒ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｓ、Ｎ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｙ又はアミノ酸なしである。）
ｂ．一般式ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２２３）のＣＤＲＬ２
ｃ．一般式ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１０５０）のＣＤＲＬ３
（Ｘ１は、Ｈ又はＹであり、
Ｘ２は、Ｇ又はＮであり、
Ｘ３は、Ｎ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｓ又はＷであり、
Ｘ５は、Ｐ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ｒ又はＷであり、  
Ｘ７は、Ｓ又はＴである。）
軽鎖ＣＤＲの群Ｆは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【００９７】
ａ．一般式ＫＳＳＱＸ１Ｘ２ＬＸ３Ｘ４ＳＮＮＫＮＹＬＸ５（配列番号１０４０）のＣＤＲＬ１、
（Ｘ１は、Ｎ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｉ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｄ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ５は、Ａ又はＶである。）
ｂ．一般式ＷＡＳＸ１ＲＥＳ（配列番号１０４５）のＣＤＲＬ２、
（Ｘ１は、Ａ又はＴである。）
ｃ．一般式Ｘ１ＱＹＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｆ（配列番号１０５１）のＣＤＲＬ３
（Ｘ１は、Ｈ又はＱであり、
Ｘ２は、Ｆ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｇ、Ｉ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｉ又はＴであり、
Ｘ５は、Ｍ、Ｐ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ６は、Ｆ、Ｌ、Ｒ又はＷであり、
Ｘ７は、Ｓ又はＴである。）
重鎖ＣＤＲの群Ａは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【００９８】
ａ．一般式ＧＹＴＸ１ＴＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号１０５２）のＣＤＲＨ１
（Ｘ１は、Ｆ又はＩであり、
Ｘ２は、Ｅ、Ｇ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｈ、Ｌ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｇ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ５は、Ｉ又はＭであり、
Ｘ６は、Ｈ又はＳである。）
ｂ．一般式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７ＴＸ８Ｘ９Ｘ１０ＱＫＸ１１Ｘ１２（配列番号１０５８）のＣＤＲＨ２
（Ｘ１は、Ｓ又はＷであり、
Ｘ２は、Ｆ又はＩであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｎ又はＳであり、
Ｘ４は、Ａ、Ｐであり、
Ｘ５は、Ｅ、Ｎ又はＳであり、
Ｘ６は、Ｄ、Ｎ又はＳであり、
Ｘ７は、Ｅ、Ｇ又はＮであり、
Ｘ８は、Ｉ又はＮであり、
Ｘ９は、Ｃ、Ｈ又はＹであり、
Ｘ１０は、Ａ又はＴであり、
Ｘ１１は、Ｆ又はＬであり、
Ｘ１２は、Ｄ又はＧである。）
ｃ．一般式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＸ１２（配列番号１０６５）のＣＤＲＨ３
（Ｘ１は、Ｅ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｄ、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｎ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ｗ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ７は、Ｉ、Ｎ又はＹであり、
Ｘ８は、Ａ又はＹであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｆ又はＧであり、
Ｘ１１は、Ｆ、Ｌ又はＭであり、
Ｘ１２は、Ｖ又はＹである。）
重鎖ＣＤＲの群Ｂは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【００９９】
ａ．一般式ＧＹＸ１ＦＴＳＹＷＩＧ（配列番号１０５３）のＣＤＲＨ１、
（Ｘ１は、Ｒ又はＳである。）
ｂ．一般式ＩＩＹＰＸ１ＤＳＤＸ２ＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号１０５９）のＣＤＲＨ２
（Ｘ１は、Ｄ又はＧであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｉ又はＴである。）
ｃ．一般式ＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＹＸ１２Ｘ１３Ｘ１４ＤＸ１５（配列番号１０６６）のＣＤＲＨ３
（Ｘ１は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２は、Ｋ、Ｌ又はＹであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｇ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｓ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ５は、Ａ又はＧであり、
Ｘ６は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ７は、Ｔ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ９は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１０は、Ｗ又はＹであり、
Ｘ１１は、Ｇ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ１２は、Ｆ又はＹであり、
Ｘ１３は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１４は、Ｍ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１５は、Ｖ又はＹである。）
重鎖ＣＤＲの群Ｃは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【０１００】
ａ．一般式ＧＦＴＦＸ１ＳＸ２Ｘ３ＭＨ（配列番号１０５４）のＣＤＲＨ１
（Ｘ１は、Ｒ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｈ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｄ又はＧである。）
ｂ．一般式Ｘ１ＩＸ２Ｘ３ＤＧＳＸ４Ｘ５Ｘ６ＹＸ７ＤＳＶＸ８Ｇ（配列番号１０６０）のＣＤＲＨ２
（Ｘ１は、Ｆ又はＶであり、
Ｘ２は、Ｓ又はＷであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｉ、Ｎ又はＴであり、
Ｘ５は、Ｋ又はＱであり、
Ｘ６は、Ｎ、Ｒ又はＹであり、
Ｘ７は、Ａ、Ｔ又はＶであり、
Ｘ８は、Ｋ又はＲである。）
ｃ．一般式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１０６７）のＣＤＲＨ３
（Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２は、Ｇ、Ｈ、Ｗ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｆ、Ｗ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｔ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ７は、Ｇ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｄ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ９は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｅ、Ｎ又はＹであり、
Ｘ１１は、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ１２は、Ｆ又はＩであり、
Ｘ１３は、Ｄ又はＱであり、
Ｘ１４は、Ｃ、Ｈ、Ｖ又はＹである。）
重鎖ＣＤＲの群Ｄは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【０１０１】
ａ．一般式ＧＦＸ１ＦＳＸ２ＹＸ３ＭＸ４（配列番号１０５５）のＣＤＲＨ１
（Ｘ１は、Ｐ又はＴであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ３は、Ａ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｎ又はＳである。）
ｂ．一般式Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０６１）のＣＤＲＨ２
（Ｘ１は、Ａ、Ｈ又はＹであり、
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ４は、Ｇ、Ｒ又はＳであり、
Ｘ５は、Ｓ、Ｔ又はＹであり、
Ｘ６は、Ｉ又はＴである。）
ｃ．一般式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＸＸ１７ＤＸ１８（配列番号１０６８）のＣＤＲＨ３
（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２は、Ｇ、Ｒ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ｉ、Ｖ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ａ、Ｇ、Ｌ又はＮであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｇ、Ｖ又はＷであり、
Ｘ６は、Ａ、Ｎ、Ｒ又はＴであり、
Ｘ７は、Ｇ、Ｎ、Ｐ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｇ、Ｔ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ９は、Ａ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１１は、Ｓ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１２は、Ｇ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１３は、Ｎ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１４は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１５は、Ｄ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１６は、Ａ、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１７は、Ｆ又はＭであり、
Ｘ１８は、Ｉ、Ｖ又はＹである。）
重鎖ＣＤＲの群Ｅは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【０１０２】
ａ．一般式ＧＸ１ＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＷＸ８（配列番号１０５６）のＣＤＲＨ１
（Ｘ１は、Ｄ又はＧであり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ又はＶであり、
Ｘ３は、Ｒ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｇ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｄ、Ｇ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ａ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ７は、Ａ又はＹであり、
Ｘ８は、Ｎ又はＳである。）
ｂ．一般式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＹＸ１２ＸＩ３ＳＸ１４ＫＳ（配列番号１０６２）のＣＤＲＨ２
（Ｘ１は、Ｅ、Ｒ又はＹであり、
Ｘ２は、Ｉ又はＴであり、
Ｘ３は、Ｈ、Ｎ又はＹであり、
Ｘ４は、Ｃ、Ｈ、Ｓ、Ｔ又はＹであり、
Ｘ５は、Ｓ又はＲであり、
Ｘ６は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ８は、Ｔ又はＷであり、
Ｘ９は、Ｎ又はＹであり、
Ｘ１０は、Ｎ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１１は、Ｄ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１２は、Ａ又はＮであり、
Ｘ１３は、Ｐ又はＶであり、
Ｘ１４は、Ｌ又はＶである。）
ｃ．一般式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３（配列番号１０６９）のＣＤＲＨ３
（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ又はＴであり、
Ｘ２は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｖ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ６は、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｖ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ７は、Ｌ、Ｔ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ８は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ９は、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１０は、Ｄ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１１は、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１２は、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１３は、Ｇ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１４は、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１５は、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１６は、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１７は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ１８は、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ又はＹであり、
Ｘ１９は、Ｄ、Ｆ、Ｇ又はＹであり、
Ｘ２０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｖ又はＹであり、
Ｘ２１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２２は、Ａ、Ｄ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ２３は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｙ又はアミノ酸なしである。）
重鎖ＣＤＲの群Ｆは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【０１０３】
ａ．一般式ＧＦＳＬＳＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号２７９）のＣＤＲＨ１
ｂ．一般式Ｘ１ＩＦＳＮＤＥＫＳＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号１０６３）のＣＤＲＨ２
（Ｘ１は、Ｈ又はＬである。）
ｃ．一般式Ｘ１ＹＳＳＧＷＸ２Ｘ３ＹＧＸ４Ｘ５ＤＸ６（配列番号１０７０）のＣＤＲＨ３
（Ｘ１は、Ｍ又はＶであり、
Ｘ２は、Ｓ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ３は、Ｆ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ４は、Ｖ又はアミノ酸なしであり、
Ｘ５は、Ｆ又はＭであり、
Ｘ６は、Ｖ又はＹである。）
重鎖ＣＤＲの群Ｇは、以下のコンセンサス集合物を含む。
【０１０４】
ａ．一般式ＧＦＳＬＸ１ＴＧＧＶＧＶＧ（配列番号１０５７）のＣＤＲＨ１
（Ｘ１は、Ｓ又はＮである。）
ｂ．一般式ＬＩＹＷＮＸ１Ｘ２ＫＲＹＳＰＳＬＸ３Ｓ（配列番号１０６４）のＣＤＲＨ２
（Ｘ１は、Ｄ又はＶであり、
Ｘ２は、Ｄ又はＥであり、
Ｘ３は、Ｋ又はＲである。）
ｃ．一般式ＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＦＸ４Ｙ（配列番号１０７１）のＣＤＲＨ３
（Ｘ１は、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｎ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｅ、Ｔ又はＷであり、
Ｘ３は、Ｌ、Ｎ、Ｔ又はＶであり、
Ｘ４は、Ｄ又はＥである。）
別のアプローチでは、Ｕ−ＶＬ又はＵ−ＶＨに対応する同じ配列内にＣＤＲを連続して保つことによって、コンセンサス配列を決定し得る。簡潔に述べると、比較用の併置及び系統発生の推定の遂行を容易にするために、このアプローチでは、Ｕ−ＶＬ又はＵ−ＶＨの何れかの可変ドメイン全体に対応するアミノ酸配列をＦＡＳＴＡフォーマットに変換した。次に、Ｕ−ＶＬ又はＵ−ＶＨに対応する同じ配列内にＣＤＲを連続するようになお保ちながら、（例えば、共通の生殖系列フレームワーク遺伝形質を偶然共有する無関係の抗体などの）偶発的現象に起因するアミノ酸位置重み付けバイアスを一切導入することなく、ＣＤＲのみの検査が行われるように、これらの配列のフレームワーク領域を人工のリンカー配列と置換する。次いで、このフォーマットのＵ−ＶＬ又はＵ−ＶＨ配列は、標準的なＣｌｕｔａｌＷ様アルゴリズムを使用するプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０参照）を用いて、配列類似性併置検査に供される。同様に、このプログラムは、分岐長の比較及びグループ分けを介して、配列群の類似性及び相違を構築及び図解するために、ＵＰＧＭＡ（算術平均を用いた重み付けされていないペアグループ法）又は隣接連結法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）（Ｓａｉｔｏｕ  ａｎｄ  Ｎｅｉ，  １９８７，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ４：４０６−４２５参照）の何れかを用いて、配列類似性併置に基づく系統発生図（系統発生樹の図解）を生成する。両方法は、各群内のコンセンサス配列集合物を決定するために類似の結果を与える。
【０１０５】
幾つかの事例において、抗原結合タンパク質は、上記コンセンサス配列の１つを有する少なくとも１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３を含む。幾つかの事例において、抗原結合タンパク質は、上記コンセンサス配列の１つを有する少なくとも１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３を含む。他の事例において、抗原結合タンパク質は、上記コンセンサス配列に係る少なくとも２つのＣＤＲＬ及び／又は上記コンセンサス配列に係る少なくとも２つのＣＤＲＨを含む。一態様において、ＣＤＲＬ及び／又はＣＤＲＨは、異なる群に由来する。他の事例において、抗原結合タンパク質は、同じ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ若しくはＦから得られる少なくとも２つのＣＤＲＬ及び／又は同じ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ若しくはＧから得られる少なくとも２つのＣＤＲＨを含む。他の態様において、抗原結合タンパク質は、同じ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ若しくはＦの同じ群から得られる３つの全てのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３配列及び／又は上記群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ若しくはＧの同じ群から得られる３つの全てのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３配列を含む。
【０１０６】
Ｄ．典型的な抗原結合タンパク質
一態様に従えば、Ａ）（ｉ）配列番号１８９から２１７からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１８から２３３からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号２３４から２７４からなる群から選択されるＣＤＲＬ３及び（ｉｖ）１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、５、４、３、４、２若しくは１つ以下のアミノ酸の欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択される１つ若しくはそれ以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、又はＢ）（ｉ）配列番号２７５から２９９からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号３００から３３１からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号３３２から３７２からなる群から選択されるＣＤＲＨ３並びに（ｉｖ）アミノ酸の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、５、４、３、４、２若しくは１つ以下のアミノ酸の欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群から選択される１つ若しくはそれ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、又は（Ｃ）（Ａ）の１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬ；並びに（Ｄ）（Ｂ）の１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲＨを含む、ＨＢ−ＥＧＦを結合する単離された抗原結合タンパク質が提供される。
【０１０７】
さらに別の実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号１８９−２１７からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１８−２３３からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；及び（ｉｉｉ）ＣＤＲＬ３配列番号２３４−２７４からなる群から選択されるＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬ；（Ｂ）（ｉ）配列番号２７５−２９９からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号３００−３３１からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３３２−３７２からなる群から選択されるＣＤＲＨ３からなる群から選択されるＣＤＲＨ；又は（Ｃ）（Ａ）の１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬ；及び（Ｄ）（Ｂ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＬを含み得る。一実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、（Ａ）配列番号１８９−２１７のＣＤＲＬ１、配列番号２１８−２３３のＣＤＲＬ２及び配列番号２３４−２７４のＣＤＲＬ３並びに（Ｂ）配列番号２７５−２９９のＣＤＲＨ１、配列番号３００−３３１のＣＤＲＨ２及び配列番号３３２−３７２のＣＤＲＨ３を含み得る。
【０１０８】
別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号９４−１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）及び／又は配列番号１４２−１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）を含む。さらなる実施形態において、ＶＬは配列番号９４−１４１からなる群から選択され、及び／又はＶＨは配列番号１４２−１８６からなる群から選択される。
【０１０９】
別の態様において、少なくとも１つのＨＢ−ＥＧＦのＩＨＧＥ含有エピトープ及び／又はＥＧＦ様エピトープを含有するエピトープに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質も提供される。
【０１１０】
さらなる態様において、ＨＢ−ＥＧＦを結合する単離された抗原結合タンパク質が提供され、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号２３４から２７４からなる群から選択されるＣＤＲＬ３；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ３；（ｉｉｉ）以下からなる群から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列：Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＰＸ６Ｘ７（配列番号１０４６）（Ｘ１は、Ｉ及びＭからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｇ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｉ及びＴからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｈ及びＱからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｆ、Ｌ及びＷからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｃ、Ｉ、Ｈ、Ｌ及びＴからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｓ及びＴからなる群から選択される。）；ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＩＴ（配列番号１０４７）（Ｘ１は、Ｉ及びＳからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｆ及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｆ、Ｉ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ａ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｐ及びＳからなる群から選択される。）；Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｔ（配列番号１０４８）（Ｘ１は、Ｌ及びＱからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ｎ及びＱからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｈ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｈ、Ｎ及びＹからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｎ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ６は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｔ、Ｖ及びＹからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｐ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｆ、Ｌ及びＰからなる群から選択される。）；ＱＸ１Ｘ２ＤＸ３ＬＰＸ４Ｘ５（配列番号１０４９）（Ｘ１は、Ｈ及びＱからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｃ及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｆ、Ｉ及びＬからなる群から選択され、Ｘ５は、Ａ、Ｓ及びＴからなる群から選択される。）；ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１０５０）（ＸＸ１は、Ｈ及びＹからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｇ及びＮからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｎ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｓ及びＷからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｐ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｒ及びＷからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｓ及びＴからなる群から選択される。）；並びにＸ１ＱＹＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｆ（配列番号１０５１）（Ｘ１は、Ｈ及びＱからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｆ及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｇ、Ｉ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｆ、Ｉ及びＴからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｍ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｆ、Ｌ、Ｒ及びＷからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｓ及びＴからなる群から選択される。）
からなる群から選択される、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）並びに／又は（Ｂ）（ｉ）配列番号３３２から３７２からなる群から選択されるＣＤＲＨ３；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３；及び（ｉｉｉ）以下からなる群から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＸ１２（配列番号１０６５）（Ｘ１は、Ｅ及びＳからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｄ、Ｎ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｗ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｉ、Ｎ及びＹからなる群から選択され、Ｘ８は、Ａ及びＹからなる群から選択され、Ｘ９は、Ｇ、Ｖ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ａ、Ｆ及びＧからなる群から選択され、Ｘ１１は、Ｆ、Ｌ及びＭからなる群から選択され、Ｘ１２は、Ｖ及びＹからなる群から選択される。）；ＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＹＸ１２Ｘ１３Ｘ１４ＤＸ１５（配列番号１０６６）（Ｘ１は、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ｌ及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｇ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｓ、Ｖ及びＹからなる群から選択され、Ｘ５は、Ａ及びＧからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｔ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ９は、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ｗ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１１は、Ｇ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１２は、Ｆ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１３は、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１４は、Ｍ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１５は、Ｖ及びＹからなる群から選択される。）；Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１０６７）（Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｇ、Ｈ、Ｗ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、Ｗ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｔ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６は、Ａ、Ｄからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｄ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ９は、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ａ、Ｅ、Ｎ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１１は、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１２は、Ｘ１４は、Ｃ、Ｈ、Ｖ及びＹからなる群から選択される。）；Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＤＸ１８（配列番号１０６８）（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｇ、Ｒ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｉ、Ｖ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４は、Ａ、Ｇ、Ｌ及びＮからなる群から選択され、Ｘ５は、Ａ、Ｇ、Ｖ及びＷからなる群から選択され、Ｘ６は、Ａ、Ｎ、Ｒ及びＴからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｇ、Ｎ、Ｐ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｇ、Ｔ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ９は、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１１は、Ｓ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１２は、Ｇ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１３は、Ｎ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１４は、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１５は、Ｄ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１６は、Ａ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１７は、Ｆ及びＭからなる群から選択され、Ｘ１８は、Ｉ、Ｖ及びＹからなる群から選択される。）；Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３（配列番号１０６９）（Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｖ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｖ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｌ、Ｔ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ９は、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ｄ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１１は、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１２は、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１３は、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１４は、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１５は、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｗ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１６は、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１７は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１８は、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１９は、Ｄ、Ｆ、Ｇ及びＹからなる群から選択され、Ｘ２０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｖ及びＹからなる群から選択され、Ｘ２１は、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２２は、Ａ、Ｄ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２３は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択される。）；Ｘ１ＹＳＳＧＷＸ２Ｘ３ＹＧＸ４Ｘ５ＤＸ６（配列番号１０７０）（Ｘ１は、Ｍ及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｆ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｖ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｆ及びＭからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｖ及びＹからなる群から選択される。）及びＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＦＸ４Ｙ（配列番号１０７１）（Ｘ１は、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｎ及びＲからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｅ、Ｔ及びＷからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｌ、Ｎ、Ｔ及びＶからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｄ及びＥからなる群から選択される。）からなる群から選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含む。
【０１１１】
一実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号１８９から２１７からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１；及び（ｉｉｉ）Ｘ１ＳＳＱＳＬＸ２Ｘ３ＳＤＧＸ４ＴＹＬＸ５（配列番号１０３５）（Ｘ１は、Ｋ及びＲからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｌ及びＶからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｈ及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｋ及びＮからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｎ、Ｓ及びＹからなる群から選択される。）；ＲＡＳＱＸ１ＩＳＸ２ＹＩＮ（配列番号１０３６）（Ｘ１は、Ｒ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｒ及びＳからなる群から選択される。）；ＲＡＳＱＸ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４ＬＸ５（配列番号１０３７）（Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、Ｘ５は、Ａ、Ｇ及びＮからなる群から選択される。）；ＱＡＳＱＤＩＸ１Ｘ２Ｘ３ＬＮ（配列番号１０３８）（Ｘ１は、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｄ及びＮからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｓ及びＹからなる群から選択される。）；ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＡ（配列番号１０３９）（Ｘ１は、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｉ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｒ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｓ、Ｎ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択される。）並びにＫＳＳＱＸ１Ｘ２ＬＸ３Ｘ４ＳＮＮＫＮＹＬＸ５（配列番号１０４０）（Ｘ１は、Ｎ及びＳからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｉ及びＶからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｄ及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｎ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、Ｘ５は、Ａ及びＶからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列；又は（ｉｖ）配列番号２１８から２３３からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；（ｖ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉｖ）のＣＤＲＬ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２；又は（ｖｉ）Ｘ１Ｘ２ＳＮＸ３Ｘ４Ｓ（配列番号１０４１）（Ｘ１は、Ｅ及びＫからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｉ及びＶからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｒ及びＷからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｄ及びＦからなる群から選択される。）；Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＬＱＳ（配列番号１０４２）（Ｘ１は、Ａ及びＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｅ及びＶからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｓ及びＴからなる群から選択される。）；Ｘ１ＡＳＸ２ＬＱＳ（配列番号１０４３）（Ｘ１は、Ａ及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｓ及びＴからなる群から選択される。）；ＤＡＳＸ１ＬＥＴ（配列番号１０４４）（Ｘ１は、Ｉ及びＮからなる群から選択される。）；ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２２３）及びＷＡＳＸ１ＲＥＳ（配列番号１０４５）（Ｘ１は、Ａ及びＴからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲｌ２アミノ酸配列；からなる群から選択されるＣＤＲＬ、又はＢ）（ｉ）配列番号２７５から２９９からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１；（ｉｉｉ）ＧＹＴＸ１ＴＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号１０５２）（Ｘ１は、Ｆ及びＬからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｅ、Ｇ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｈ、Ｌ及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｉ及びＭからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｈ及びＳからなる群から選択される。）；ＧＹＸ１ＦＴＳＹＷＩＧ（配列番号１０５３）（Ｘ１は、Ｒ及びＳからなる群から選択される。）；ＧＦＴＦＸ１ＳＸ２Ｘ３ＭＨ（配列番号１０５４）（Ｘ１は、Ｒ及びＳからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｈ及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｄ及びＧからなる群から選択される。）；ＧＦＸ１ＦＳＸ２ＹＸ３ＭＸ４（配列番号１０５５）（Ｘ１は、Ｐ及びＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｎ及びＳからなる群から選択される。）；ＧＸ１ＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＷＸ８（配列番号１０５６）（Ｘ１は、Ｄ及びＧからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｒ、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｙ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６は、Ａ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ７は、Ａ及びＹからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｎ及びＳからなる群から選択される。）；ＧＦＳＬＳＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号２７９）及びＧＦＳＬＸ１ＴＧＧＶＧＶＧ（配列番号１０５７）（Ｘ１は、Ｓ及びＮからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列；（ｉｖ）配列番号３００から３３１からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；（ｖ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失若しくは置換だけ、（ｉｖ）のＣＤＲＨ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２；又は（ｖｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７ＴＸ８Ｘ９Ｘ１０ＱＫＸ１１Ｘ１２（配列番号１０５８）（Ｘ１は、Ｓ及びＷからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｆ及びＩからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｄ、Ｎ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４は、Ａ及びＰからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｅ、Ｎ及びＳからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｄ、Ｎ及びＳからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｅ、Ｇ及びＮからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｉ及びＮからなる群から選択され、Ｘ９は、Ｃ、Ｈ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ａ及びＴからなる群から選択され、Ｘ１１は、Ｆ及びＬからなる群から選択され、Ｘ１２は、Ｄ及びＧからなる群から選択される。）；ＩＩＹＰＸ１ＤＳＤＸ２ＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号１０５９）（Ｘ１は、Ｄ及びＧからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｉ及びＴからなる群から選択される。）；Ｘ１ＩＸ２Ｘ３ＤＧＳＸ４Ｘ５Ｘ６ＹＸ７ＤＳＶＸ８Ｇ（配列番号１０６０）（Ｘ１は、Ｆ及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｓ及びＷからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｄ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｉ、Ｎ及びＴからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｋ及びＱからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｎ、Ｒ及びＹからなる群から選択され、Ｘ７は、Ａ、Ｔ及びＶからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｋ及びＲからなる群から選択される。）；Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０６１）（Ｘ１は、Ａ、Ｈ及びＹからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｇ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｇ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｓ、Ｔ及びＹからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｉ及びＴからなる群から選択される。）；Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＹＸ１２Ｘ１３ＳＸ１４ＫＳ（配列番号１０６２）（Ｘ１は、Ｅ、Ｒ及びＹからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｉ及びＴからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｈ、Ｎ及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｃ、Ｈ、Ｓ、Ｔ及びＹからなる群から選択され、Ｘ５は、Ｓ及びＲからなる群から選択され、Ｘ６は、Ｇ及びＳからなる群から選択され、Ｘ７は、Ｇ、Ｋ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ８は、Ｔ及びＷからなる群から選択され、Ｘ９は、Ｎ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ｎ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１１は、Ｄ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１２は、Ａ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１３は、Ｐ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１４は、Ｌ及びＶからなる群から選択される。）；Ｘ１ＩＦＳＮＤＥＫＳＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号１０６３）（Ｘ１は、Ｈ及びＬからなる群から選択される。）並びにＬＩＹＷＮＸ１Ｘ２ＫＲＹＳＰＳＬＸ３Ｓ（配列番号１０６４）（Ｘ１は、Ｄ及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｄ及びＥからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｋ及びＲからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨをさらに含む。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３配列の少なくとも２つ又は３つ全てが、コンセンサス配列の同じ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ若しくはＦに由来し、並びに／又はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３配列の少なくとも２つ若しくは３つ全てが同じ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ若しくはＧに由来する。他の事例では、異なるコンセンサス配列群由来のＣＤＲが混合され、マッチされる。
【０１１３】
さらに別の実施形態において、上記の単離された抗原結合タンパク質は、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列を含み、これらの両配列は互いに共有結合されている。さらなる実施形態において、単離された抗原結合タンパク質の第一のアミノ酸配列は、配列番号２３４から２７４のＣＤＲＬ３、配列番号２１８から２３３のＣＤＲＬ２及び配列番号１８９から２１７のＣＤＲＬ１を含む。他方、単離された抗原結合タンパク質の第二のアミノ酸配列は、配列番号３３２から３７２のＣＤＲＨ３、配列番号３００から３３１のＣＤＲＨ２及び配列番号２７５から２９９のＣＤＲＨ１を含む。
【０１１４】
一態様において、本明細書に提供されている単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片であり得る。
【０１１５】
別の実施形態において、本明細書に提供されている単離された抗原結合タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子であり得る。
【０１１６】
さらなる実施形態において、本明細書に提供されている単離された抗原結合タンパク質は、ヒト抗体であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型のものであり得る。
【０１１７】
さらに別の態様において、本明細書に提供されている単離された抗原結合タンパク質は、放射性同位体、放射性核種、蛍光性基、酵素基、化学発光性基、ビオチニル基などの標識基又は所定のポリペプチド基又は放射性同位体、放射性核種、毒素、治療基若しくは化学療法基などのエフェクター基に連結され得る。治療又は化学療法基の例は、カルケアマイシン、アウリスタチン−ＰＥ、ゲルダナマイシン、マイタナシン又はこれらの誘導体である。
【０１１８】
さらに別の態様において、本発明は、上記抗原結合タンパク質の何れかと競合する抗原結合タンパク質を含む。
【０１１９】
当業者によって理解されるように、図示されている配列由来の２以上のＣＤＲを有するあらゆる抗原結合タンパク質に関して、図示された配列から独立に選択されるＣＤＲのあらゆる組み合わせが有用である。従って、独立に選択されたＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを有する抗原結合タンパク質を作製することができる。しかしながら、当業者によって理解されるように、特定の実施形態は、非反復的なＣＤＲの組み合わせを一般に使用する。例えば、抗原結合タンパク質は、２つのＣＤＲＨ２領域などを用いて一般に作製されない。
【０１２０】
提供される抗原結合タンパク質の幾つかは、以下により詳しく論述されている。
【０１２１】
１．抗原結合タンパク質及び結合エピトープ
抗原結合タンパク質がＨＢ−ＥＧＦなどのポリペプチドの指定された残基内のエピトープを結合すると称される場合、例えば、意味されるのは、抗原結合タンパク質は指定された残基（例えば、ＨＢ−ＥＧＦの指定されたセグメント）からなるポリペプチドに特異的に結合する。このような抗原結合タンパク質は、通例、ＨＢ−ＥＧＦ内の全ての残基と接触するわけではない。ＨＢ−ＥＧＦ内のあらゆる単一のアミノ酸置換若しくは欠失又はＨＢ−ＥＧＦの細胞外ドメインは、結合親和性に必ずしも著しい影響を与えるわけではない。抗原結合タンパク質のエピトープ特異性は、様々な様式で測定することができる。１つのアプローチは、例えば、抗原の配列を包含し、アミノ酸の少数（例えば、３つのアミノ酸）の増加分が異なる約１５アミノ酸の重複するペプチドの集合物を検査することを含む。ペプチドは、マイクロタイター皿のウェル内に固定化される。固定化は、ペプチドの１つの末端をビオチン化することによって実施することができる。場合によって、同じペプチドの異なる試料は、アミノ及びカルボキシ末端においてビオチン化され、比較のために、別々のウェル中に固定化することができる。これは末端特異的な抗原結合タンパク質を同定するために有用である。場合によって、目的のアミノ酸で終結させることによって、追加のペプチドを含めることができる。このアプローチは、ＨＢ−ＥＧＦの内部断片に対する末端特異的抗原結合タンパク質を同定するのに有用である。抗原結合タンパク質又は免疫学的に機能的な断片は、様々なペプチドの各々への特異的結合に関してスクリーニングされる。エピトープは、抗原結合タンパク質が特異的結合を示す全てのペプチドに共通するアミノ酸のセグメントとともに存在するものと定義される。エピトープを定義するための特異的アプローチに関する詳細は、実施例２３に記載されている。
【０１２２】
実施例２３に示されているように、本明細書に提供される抗原結合タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦの少なくとも１つのＩＨＧＥ含有エピトープ及び／又はＥＧＦ様ドメインを結合することができる。
【０１２３】
２．競合する抗原結合タンパク質
別の態様において、ＨＢ−ＥＧＦへの特異的結合に関して、上記エピトープに結合する例示されている抗体又は機能的断片の１つと競合する抗原結合タンパク質が提供される。このような抗原結合タンパク質は、本明細書に例示されている抗原結合タンパク質又は重複するエピトープの１つと同じエピトープにも結合し得る。例示されている抗原結合タンパク質と同じエピトープと競合し、又は例示されている抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質及び断片は、類似の機能的特性を示すものと予想される。例示される抗原結合タンパク質及び断片は、図１、２、３、４、６及び７に含まれる重鎖及び軽鎖、可変領域ドメイン並びにＣＤＲを有するものなど、上記のものが含まれる。
【０１２４】
３．ヒト抗体及び抗体のヒト化
一実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、ヒト又はヒト化抗体である。ヒト抗体は、マウス又はラットの可変及び／又は定常領域を有する抗体に伴う問題の多くを回避する。このようなマウス又はラット由来のタンパク質の存在は、抗体の迅速な排除をもたらすことができ、又は患者による抗体に対する免疫応答の生成をもたらし得る。マウス又はラット由来の抗体の使用を回避するために、げっ歯類、他の哺乳動物又は動物が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類、他の哺乳動物又は動物中に機能的なヒト抗体遺伝子坐を導入することを通じて、完全ヒト抗体が作製されている。
【０１２５】
完全ヒト抗体を作製するための１つの方法は、ヒト重鎖遺伝子坐及びκ軽鎖遺伝子坐の生殖系列によって構成された最大１０００ｋｂサイズ未満の断片を含有するように改変されたマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統を使用することによる。「Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６」及び「Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  １９９８，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５」を参照されたい。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統は、Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）から入手することができる。
【０１２６】
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統の作製は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された同第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された同第０７／９１９，２９７、１９９２年７月３０日に出願された同第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された同第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された同第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された同第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された同第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された同第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された同第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された同第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国特許公開２００３／００９３８２０号並びに米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号及び同第５，９３９，５９８号並びに日本国特許第３  ０６８１８０Ｂ２、３０６８５０６Ｂ２及び３０６８５０７Ｂ２に論述及び記載されている。１９９６年６月１２日に特許権が付与されて公開された欧州特許ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、１９９４年２月３日に公開された国際特許公開ＷＯ９４／０２６０２、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許公開ＷＯ９６／３４０９６、１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３、２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０も参照されたい。上に引用されている特許、出願及び参考文献の各々の開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
別のアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．などの他社は、「ミニローカス」アプローチを使用した。ミニローカスアプローチでは、外来Ｉｇ遺伝子坐は、Ｉｇ遺伝子坐からの片（各遺伝子）を含めることによって模倣される。従って、動物中に挿入するための構築物中に、１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子、１つ又はそれ以上のＤＨ遺伝子、１つ又はそれ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域及び通常第二の定常領域（好ましくは、γ定常領域）が形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉ他に対する米国特許第５，５４５，８０７号並びにそれぞれＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号及び同第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号及び同第６，０２３，０１０号、Ｂｅｒｎｓ他に対する米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号及び同第５，７８９，２１５号、並びにＣｈｏｉ及びＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号、１９９０年８月２９日に出願されたＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日に出願された０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日に出願された０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日に出願された０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日に出願された０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出願された０８／２０９，７４１号（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。欧州特許０  ５４６  ０７３  Ｂ１、国際特許公開ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２及びＷＯ９８／２４８８４並びに米国特許第５，９８１，１７５号（これらの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）も参照されたい。
【０１２８】
Ｋｉｒｉｎも、ミクロセル融合を通じて、染色体の大きな片又は完全な染色体が導入されたマウスからのヒト抗体の作製を示した。欧州特許出願７７３２８８号及び８４３９６１号（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。さらに、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニローカス（Ｈｕｍａｂ）マウスの交配の結果であるＫＭＴＭマウスが作製された。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨ導入染色体とＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖導入遺伝子を有する（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ４：９１−１０２）。
【０１２９】
ヒト抗体は、インビトロ法によっても得ることができる。適切な例には、ファージディスプレイ（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）、リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
Ｅ．抗体の調製
本明細書に記載されている抗体は、本明細書に記載されているようなＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）技術の使用を通じて調製された。このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子及び抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生を実質的に欠失している。ヒト抗体を産生するために使用される技術は、本明細書に開示されている特許、出願及び参考文献に開示されている。幾つかの実施形態において、マウス及びヒト抗体のトランスジェニック生産は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願０８／７５９，６２０号及び１９９８年６月１１日公開された国際特許公開ＷＯ／２４８９３及び２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているように実施される。「Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６」（この開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【０１３１】
このような技術の使用を通じて、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が作製されている。特に、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統は、目的の抗原（例えば、ＨＢ−ＥＧＦ）で免疫され、過免疫されたマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収し、回収されたリンパ球を骨髄球型細胞株と融合して、不死化ハイブリドーマ細胞株を調製する。目的の抗原に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するために、これらのハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択する。ＨＢ−ＥＧＦ上の機能的に興味深いドメインへの結合に関して、様々な抗体をさらにマッピングするために、ＨＢ−ＥＧＦの断片に対する免疫反応性に対して、上清をスクリーニングすることもできる。抗体は、ＥＧＦＲの他のリガンド又はそのファミリーメンバー、他の関連するヒトケモカイン、ＨＢ−ＥＧＦのラット、マウス及び非ヒト霊長類（カニクイザルなど）オルソログへの結合（オルソログへの結合は、種交叉反応性を測定するため）に関してもスクリーニングされ得る。ＨＢ−ＥＧＦに対して特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株を産生するための方法が本明細書に提供される。さらに、このような細胞株によって産生される抗体の性質決定（このような抗体の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列分析を含む。）が本明細書に提供されている。
【０１３２】
あるいは、ハイブリドーマを作製するために骨髄腫細胞に融合する代わりに、Ｂ細胞は直接アッセイされ得る。例えば、Ｂ細胞は、過免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）マウスから単離し、抗体を分泌する形質細胞へ増殖及び分化させることができる。次いで、ＨＢ−ＥＧＦ免疫原に対する反応性に関して、細胞上清からの抗体をＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。ＨＢ−ＥＧＦ上の機能的に興味深いドメインへの結合に関して、様々な抗体をさらにマッピングするために、ＨＢ−ＥＧＦの断片に対する免疫反応性に対して、上清をスクリーニングすることもできる。抗体は、ＥＧＦ受容体の他のリガンド又はそのファミリーメンバー、他の関連するヒトケモカイン、ＨＢ−ＥＧＦのラット、マウス及び非ヒト霊長類（カニクイザルなど）オルソログへの結合（オルソログへの結合は、種交叉反応性を測定するため）に関してもスクリーニングされ得る。目的の抗体を含有するウェルからのＢ細胞は、個別の又はプールされたウェルからハイブリドーマを作製するための融合又はＥＢＶでの感染又は公知の不死化遺伝子による形質移入及び適切な培地中へのその後の播種などの様々な方法によって不死化され得る。あるいは、次いで、ＨＢ−ＥＧＦ特異的溶血斑アッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を分泌する単一の形質細胞が単離される（Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８）。溶解の標的とされる細胞は、好ましくは、ＨＢ−ＥＧＦ抗原で被覆されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）である。
【０１３３】
上述のように、以下のものを含む（但し、これらに限定されない。）抗体の多数のイソタイプが存在する。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４。生成される抗体は、このようなイソタイプを当初有する必要はなく、むしろ、生成された抗体はあらゆるイソタイプを有することが可能であり、本分野において周知である慣用の分子生物学的技術を用いて、適切な発現ベクター中の分子クローニングされたＶ領域遺伝子又はクローニングされた定常領域遺伝子又はｃＤＮＡを使用し、次いで、本分野において公知の技術を用いて、宿主細胞中で抗体を発現させることによって、抗体のイソタイプを交換できることが理解される。
【０１３４】
一般に、融合されたハイブリドーマによって産生される抗体は、完全ヒトκ鎖を有するヒトＩｇＧ２重鎖又はヒトＩｇＧ４重鎖の何れかであった。抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３などの他のヒトイソタイプでもあり得る。固相及び溶液相技術によって測定された場合に、抗体は、高い親和性を有し、典型的には、約１０−６から約１０−１２Ｍ又はそれ以下のＫＤを有する。ＨＢ−ＥＧＦの活性を阻害するために、少なくとも１０−９ＭのＫＤを有する抗体が好ましい。ＨＢ−ＥＧＦの活性を阻害するために、少なくとも１０−１０ＭのＫＤを有する抗体も好ましい。ＨＢ−ＥＧＦの活性を阻害するために、少なくとも１０−１１ＭのＫＤを有する抗体も好ましい。
【０１３５】
理解されているように、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で発現させることができる。適切な哺乳動物宿主細胞を形質移入するために、特定の抗体をコードする配列を使用することができる。形質移入及びその後の抗体の発現のための適切なベクターを構築する間に、本分野において公知の技術によって、抗体は、あるイソタイプから別のイソタイプへクラスを交換され得る（例えば、ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ２へクラス交換され得る。）。米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号及び同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって例示されるように、例えば、ウイルス中に（又はウイルスベクター中に）ポリヌクレオチドをパッケージし、宿主細胞をウイルス（又はベクター）で形質導入すること、又は本分野において公知の形質移入操作によるなど、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる公知の方法によって、形質移入をすることができる。使用される形質転換操作は、形質転換されるべき宿主に依存する。哺乳動物細胞中に異種のポリヌクレオチドを導入するための方法は本分野において周知であり、デキストランによって媒介される形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによって媒介される形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入及び核内へのＤＮＡの直接的微量注入が含まれる。
【０１３６】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は本分野において周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞及び多数の他の細胞株など（但し、これらに限定されない。）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化された細胞株が含まれる。特に好ましい細胞株は、何れの細胞株が高い発現レベルを有し、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の多量を産生するかの決定を通じて選択される。
【０１３７】
あるいは、これらの抗体は、完全ヒト抗体を産生するように遺伝的に操作された動物から又はバクテリオファージ、酵母、リボソーム若しくはイー・コリ中に作製された抗体ディスプレーライブラリーから調製され得る。例えば、「Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，  Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｓｉｅｇｅｌ，  ２００４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２９０：６９−８０．  Ｇｒｏｖｅｓ  ａｎｄ  Ｏｓｂｏｕｒｎ，  ２００５，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：１２５−１３５  ａｎｄ  Ｊｏｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，  ２００５，  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１２７−１３３」を参照されたい。
【０１３８】
別の態様は、抗体などのＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。本明細書の文脈内で、本明細書において使用される「単離された核酸分子」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成起源のポリヌクレオチド又はこれらの幾つかの組み合わせを意味し、その起源によって、「単離された核酸分子」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然の状態で見出されるポリヌクレオチドの全部若しくは一部を伴わない、（２）天然の状態で連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されており、又は（３）より大きな配列の一部として、天然の状態では存在しない。さらに、本明細書において引用される「核酸分子」という用語は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド又は修飾された若しくは置換された糖基などを有するヌクレオチドなど、ヌクレオチドの何れかの種類の修飾された形態）のポリマー形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態も含む。抗原結合タンパク質又はその一部をコードする典型的な核酸が、以下により詳しく記載されている。
【０１３９】
一実施形態において、核酸分子は、調節配列へ作用可能に連結されている。本明細書において使用される「調節配列」という用語は、連結されているコード配列の発現及びプロセッシングを実施するために必要なポリヌクレオチド配列を表す。このような調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物において、このような調節配列には、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が一般に含まれる。真核生物において、一般に、このような調節配列には、プロモーター及び転写終結配列が含まれる。「調節配列」という用語は、最小限、その存在が発現及びプロセッシングのために不可欠である全ての成分を含むものとし、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合対配列も含み得る。さらに、本明細書において使用される「作用可能に連結された」という用語は、そのように記載されている成分を所期の様式で機能させる関係にある前記成分の位置を表す。さらに、本明細書に提供されているように、コード配列に作用可能に連結された発現調節配列は、コード配列の発現が発現調節配列と適合的な条件下で達成されるように連結される。
【０１４０】
さらなる態様は、本明細書に提供されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターである。核酸分子は、調節配列に作用可能に連結され得る。さらに、ベクターは、複製起点又は選択マーカー遺伝子をさらに含有し得る。使用され得るベクターの例は、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどである。
【０１４１】
Ｆ．基本的な抗体構造を基礎とする抗原結合タンパク質
上述されているように、基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同じ対から構成され、各対は１つの「軽」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０から７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識のために主として必要とされる約１００から１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、二量体化エフェクター機能、循環半減期及び他の機能に必要とされる定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖内において、可変及び定常領域は、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は約１０アミノ酸の「Ｄ」領域も含む。全般に、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）」（参照により、あらゆる目的のために、その全体が組み込まれる。）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。
【０１４２】
従って、完全な状態のＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する。二機能性又は二重特異的抗体を除き、２つの結合部位は同じである。
【０１４３】
鎖の可変領域は全て、３つの超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲとも称される。）によって連結された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を呈する。各対の２つの可変領域から得られるＣＤＲにはフレームワーク領域が併置され、抗原上の特異的なエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖及び重鎖の両者の可変領域は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、「Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）（１９８７  ａｎｄ  １９９１）」又は「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，  １９８７，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３」の定義に従う。
【０１４４】
従って、本明細書に提供される抗体は、式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（ＦＲ１は第一のヒトフレームワーク領域であり、ＣＤＲ１は第一の相補性決定領域であり、ＦＲ２は第二のヒトフレームワーク領域であり、ＣＤＲ２は第二の相補性決定領域であり、ＦＲ３は第三のヒトフレームワーク領域であり、ＣＤＲ３は第三の相補性決定領域であり、及びＦＲ４は第四のヒトフレームワーク領域である。）の少なくとも１つの可変領域ポリペプチド鎖を含み得る。一般に、ＣＤＲ３は、抗体可変領域の最も多様性に富む領域である。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、ＦＲ１領域は、配列番号３７３−３９３及び／又は４５３−４６９のアミノ酸配列の何れの１つをも含み（但し、これらに限定されない。）；ＣＤＲ１領域は、配列番号１８９−２１７及び／又は２７５−２９９のアミノ酸配列の何れの１つをも含み（但し、これらに限定されない。）；ＦＲ２領域は、配列番号３９４−４１４及び／又は４７０−４８１のアミノ酸配列の何れの１つをも含み（但し、これらに限定されない。）；ＣＤＲ２領域は、配列番号２１８−２３３及び／又は３００−３３１のアミノ酸配列の何れの１つをも含み（但し、これらに限定されない。）；ＦＲ３領域は、配列番号４１５−４４０及び／又は４８２−５１１のアミノ酸配列の何れの１つをも含み（但し、これらに限定されない。）；ＣＤＲ３領域は、配列番号２３４−２７４及び／又は３３２−３７２のアミノ酸配列の何れの１つをも含み（但し、これらに限定されない。）；並びに、ＦＲ４領域は、配列番号４４１−４５２及び／又は５１２−５１７のアミノ酸配列の何れの１つをも含む（但し、これらに限定されない。）。従って、幾つかの実施形態において、本明細書に提供されるヒト抗体は、本明細書に提供されるアミノ酸配列の１つ又はそれ以上を有する。
【０１４６】
本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列は２０の慣用アミノ酸に限定されないことを理解すべきである（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅ．Ｓ．  Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ｇｒｅｎ，  Ｅｄｓ．，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  Ｍａｓｓ．  （１９９１））参照（参照により、本明細書に組み込まれる。））。例えば、アミノ酸は、２０の慣用アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α，α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非慣用アミノ酸などの非天然アミノ酸が含まれ得る。提供される抗体のための適切な成分でもあり得る非慣用アミノ酸には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン又はＮ−メチルアルギニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。
【０１４７】
さらに、配列番号１から５１７及び１０３５から１０７１に示されているアミノ酸配列中の僅かな変動が包含されるものとして想定されるが、但し、アミノ酸配列中の変動は、配列番号１から５１７及び１０３５から１０７１に示されている配列の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％及び最も好ましくは９９％を維持する。配列番号１から５１７及び１０３５から１０７１に示されているアミノ酸配列中の好ましい変動、すなわち、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換は、機能的ドメインの境界付近で起こる。構造的及び機能的ドメインは、公の又は独自の配列データベースとヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を比較することによって同定することができる。公知の構造及び／又は機能の他の抗体中に生じる配列モチーフ又は予想タンパク質立体構造を同定するために、コンピュータ化された比較法を使用することができる。公知の三次元構造に折り畳むタンパク質配列を同定するための方法が公知である。例えば、「Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４；  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｅｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４））；  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｃ．  Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｔｏｏｚｅ，  ｅｄｓ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９１））；  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５」（全て、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。従って、当業者は、構造及び機能的ドメインを確定するために使用され得る配列モチーフ及び構造的な立体構造を認識することができる。
【０１４８】
配列番号１から５１７及び１０３５から１０７１に示されているアミノ酸配列中の特に好ましい変動は、タンパク質分解若しくは酸化に対する低下した感受性をもたらし、グリコシル化のパターンを変化させ又は結合親和性を変化させ、又は抗体の他の物理化学的若しくは機能的特性を付与若しくは修飾する変動である。特に、保存的なアミノ酸置換が想定される。保存的置換とは、側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。好ましいアミノ酸ファミリーは、以下のものである。酸性ファミリー＝アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性ファミリー＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性ファミリー＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン：及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは、脂肪族ヒドロキシファミリー＝セリン及びスレオニン；アミド含有ファミリー＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族ファミリー＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族ファミリー＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。例えば、ロイシンのイソロイシン又はバリンとの、アスパラギン酸のグルタミン酸との、スレオニンのセリンとの隔離された置換又はあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の置換は、特に、その置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まなければ、生じた抗体の結合又は特性に対して大きな影響を与えないと予測するのが合理的である。しかしながら、他の全ての可能なアミノ酸置換も包含される。アミノ酸の変化が機能的な抗体（すなわち、ＨＢ−ＥＧＦに結合し、及びＨＢ−ＥＧＦの機能を低下させ、中和し、又は実質的に阻害する抗体）をもたらすかどうかは、ＨＢ−ＥＧＦへの結合に関するＥＬＩＳＡ若しくはＦＡＣＳ又はインビトロ若しくはインビボ機能的アッセイにおいて、生じた抗体の特異的活性をアッセイすることによって容易に測定することができる。
【０１４９】
ＨＢ−ＥＧＦによって媒介されるシグナル伝達の低下、中和又は実質的阻害は、ＨＢ−ＥＧＦのその受容体（例えば、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ４）への結合に影響を与える（例えば、減少又は阻害する）ことによって引き起こされ得る。
【０１５０】
本明細書において使用される「抗体」又は「抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト化抗体（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３Ｚ３２３−３２９；  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ，  １９９２，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．２．５９３−５９６）、キメラ抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：６８５１−６８５５）、少なくとも２つの抗体から形成される多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）又はこれらの抗体断片を意味する。「抗体断片」という用語は、上記抗体のあらゆる一部、好ましくは、上記抗体の抗原結合又は可変領域の少なくとも１つを含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：６４４４−６４４８）、一本鎖抗体分子（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，  ＥＤＳ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９９４），  ２６９−３１５）及びＨＢ−ＥＧＦへの結合の所望される能力を示す限りその他の断片が含まれる。
【０１５１】
さらに、本明細書において使用される「抗体」又は「抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体」という用語は、抗体の改変されたサブドメイン又は天然に存在する抗体変形物を含有する抗体様分子を含み得る。これらの抗体様分子は、ラクダ科動物などの天然源から（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７４，  ２７７−３０２）又はヒト、ラクダ科動物又は他の種（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１：４８４−９０）からのライブラリーのインビトロディスプレイを通じて得られるＶＨのみ又はＶＬのみのドメインなど単一ドメイン抗体であり得る。
【０１５２】
「Ｆｖ断片」は、完全な抗原認識部位及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、強固に非共有会合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画するのはこの立体配置においてである。総合して、６つのＣＤＲが抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有するが、通常、完全な結合部位より低い親和性で結合する。「Ｆａｂ断片」は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。「Ｆａｂ断片」は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又はそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２から３個の残基が付加されている点で、「Ｆａｂ’断片」と異なる。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、その間にヒンジシステインを有する「Ｆａｂ’断片」の対として当初産生される。パパイン又はペプシン消化など、このような抗体断片を調製する方法が、当業者に公知である。
【０１５３】
本明細書に提供される抗体は、補体（ＣＤＣ）を固定し、又は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）（特に、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４又は分子生物学によって若しくはヒトＩｇＧ１産生マウスから新たに作製されたヒト若しくは哺乳動物起源の別のサブタイプからクラススイッチされたＩｇＧ１変形物）を活性化し得る。他の方法も使用し得る。本明細書に提供されている抗体は、標識基又はエフェクター基、例えば、毒素、化学療法剤、レポーター分子又は造影剤に時々連結され得る。
【０１５４】
Ｇ．ＨＢ−ＥＧＦ結合タンパク質のさらなる種類
別の態様において、本明細書に提供されるＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、抗体様結合活性を有する（すなわち、ＨＢ−ＥＧＦに結合する）足場タンパク質である。
【０１５５】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「足場タンパク質」という用語は、複数の挿入、欠失又は置換などの修飾に対するその折り畳みの高い許容度を有するポリペプチド性フレームワークを意味する。この固有の立体構造上の安定性によって、タンパク質の所定の領域内での誘導されたランダム化及び劇的な変化が可能となる。従って、タンパク質はある種の新しい特性を獲得するが、その総体的な構造的完全性及び元の物理化学的挙動は保存されたままである。この新たに採用された特性の多くは、所定の標的分子に対する結合特異性を含むが、全てが含むわけではない。
【０１５６】
現在、様々な程度まで旧来の抗体の結合原理を模倣する広範な足場タンパク質が使用されている（Ｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５１４−２２）。本発明に従って使用することができる足場タンパク質の例は、異なる群に細分することができる。抗体関連足場は、サイズが天然より小さく、構造がより単純な抗体又はこのように改変された抗体の誘導体として定義される。この群には、例えば、いわゆるナノボディが含まれる（Ｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５；  ２３  （１０）；  ５１４−５２２に概説されている。）、ドメイン抗体（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４８４−４８９）又はサメ抗原反応性タンパク質（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００３；  ２１；  ４８４−４８９）が含まれる。足場タンパク質の第二の群は、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２７０：２５４１１−２５４１７）、ヒトトランスフェリン（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２７４：２４０６６−２４０７４）又はシステイン−結び目構造動力（ｃｙｓｔｅｉｎ−ｋｎｏｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｔｉｖｅｓ）（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２：７９７−８０６）のような、単一ループペプチドの挿入又は無作為化を許容する堅固なタンパク質の折り畳みである。抗体と同様に、堅固な保存されたフレームワーク上に複数の超可変ループの原理を共有するタンパク質の代表例は、ヒトＣＴＬＡ−４（Ｈｕｆｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４７５：２２５−２３１）、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１）、Ｃ型レクチン様ドメイン又はリポカリン（Ｓｋｅｒｒａ，  ２００１，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２５７−２７５）である。タンパク質の堅固な二次構造内に部分的に又は完全に配置されたアミノ酸残基を通じて達成された結合特異性を有する足場は、例えば、アンキリン反復タンパク質（Ｂｉｎｚ，  ２００３，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４８９−５０３）、プロテインＡのＺドメイン（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：６０１−６０８）又はγ−クリスタリン（Ｆｉｅｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｕｄｏｌｐｈ，  ２００１、国際特許公開ＷＯ  ０１／０４１４４）である。足場タンパク質及びペプチド並びにこれらの応用が、「Ｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：５１４−５２２；  Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１２５７−１２６８）及びＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１１２６１１３６」に概説されている。
【０１５７】
足場タンパク質の改変は、修飾に対するその折り畳みの高い許容度を有するポリペプチド性フレームワークの構造的フレームワーク上に又は構造的フレームワーク中に親和性機能を移植又は組み込むことと認めることができる。親和性機能は、本発明に従うタンパク質結合親和性を意味する。足場は、結合特異性を付与するアミノ酸配列から構造的に分離され得る。一般に、このような人工的なアフィニティー試薬の開発に適すると思われるタンパク質は、合理的な、又は最も一般的には、本分野において公知である技術を用いて、インビトロで提示された人工の足場ライブラリー中の結合剤に対する抗原、例えば、ＨＢ−ＥＧＦ（精製されたタンパク質又は細胞表面上に提示されたタンパク質のいずれか）に対するパニングなどのコンビナトリアルタンパク質工学技術によって取得され得る。（Ｓｋｅｒｒａ，  ２０００，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．Ｊｕｌ−Ａｕｇ；  １３（４）：１６７−８７；  Ｂｉｎｚ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  ２００５，  Ａｕｇ；１６（４）：４５９−６９）。さらに、抗体様結合活性を有する足場タンパク質は、アクセプターポリペプチドを含有する足場ドメイン上にドナーポリペプチドの結合特異性を付与するために、ドナーポリペプチドの結合ドメインを移植され得る足場ドメインを含有するアクセプターポリペプチド（例えば、前述のタンパク質の１つ）に由来し得る。前記挿入された結合ドメインは、例えば、抗体、特に、ＨＢ−ＥＧＦ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ又はそれ以上であり得る。好ましくは、ＣＤＲは、ＣＤＲ３である。例えば、当業者に周知の組換え法の様々な形態によるポリペプチド合成、コードされるアミノ酸の核酸合成など、当業者に公知の様々な方法によっても、挿入を達成することができる。
【０１５８】
Ｈ．ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質連結物
別の実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質、例えば、本明細書に提供されている抗体は、標識基に連結される。このような標識された抗原結合タンパク質は、診断用途に特に適している。本明細書において使用される「標識基」という用語は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸又は標識されたアビジン（例えば、光学的又は比色分析法によって検出することができる蛍光マーカー又は酵素活性に結合されたストラプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分を表す。抗体等のポリペプチド及び糖タンパク質を標識するための様々な方法が本分野において公知であり、使用され得る。適切な標識基の例には、以下のもの、放射性同位体若しくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５１、１３１Ｉ）、蛍光性基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチン基又は二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープが含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、立体的な妨害の可能性を低下させるために、標識基は様々な長さのスペーサーアームによって付着されることが望ましい場合があり得る。
【０１５９】
あるいは、本明細書に提供されるＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質（抗体など）は、エフェクター基に連結され得る。このようなエフェクター修飾された抗原結合タンパク質は、治療用途に特に適している。本明細書において使用される「エフェクター基」という用語は、放射性同位体若しくは放射性核種、毒素、治療用基又は本分野において公知の他のエフェクター基などの細胞毒性基を表す。適切なエフェクター基の例は、放射性同位体若しくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、カリケアマイシン、アウリスタチンなどのドラスタチン類縁体及びゲルダナマイシン及びマイタンシン誘導体（ＤＭ１を含む。）などの化学療法剤である。ある観点で、立体的な妨害の可能性を低下させるために、エフェクター基は様々な長さのスペーサーアームによって付着されることが望ましい場合があり得る。
【０１６０】
同じく、本明細書に記載されているように、極めて有用なＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に提供されている抗体調製物）の多くは、例えば、以下の配列を有するタンパク質の残基１０６から１４９を含むＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメイン内のエピトープを認識する。
【０１６１】
ＰＣＬＲＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰＳＣＩＣＨＰＧＹ  ＨＧＥＲＣＨＧＬＳＬＰ（配列番号１０７６）。幾つかの実施形態において、本明細書に提供される抗原結合タンパク質によって認識される上皮成長因子エピトープは、アミノ酸配列ＩＨＧＥを含む。従って、ＨＢ−ＥＧＦのＩＨＧＥ含有エピトープ及び／又はＥＧＦ様ドメイン（例えば、配列番号１０７６）に結合し、認識する抗体調製物が提供される。
【０１６２】
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、患者の試料中のＨＢ−ＥＧＦの検出において有用であり、従って、本明細書に記載されているような病状に対する診断薬として有用である。さらに、（以下に示されているように）ＨＢ−ＥＧＦ及び／又はＥＧＦ受容体活性を著しく阻害するその能力を基礎として、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦ発現及び／又はＨＢ−ＥＧＦ活性から生じる症候及び症状を治療する上で治療効果を有する。特定の実施形態において、本明細書中の抗原結合タンパク質及び方法は、ＨＢ−ＥＧＦ関連疾患、ＨＥＲ４関連疾患又はＥＧＦ受容体関連病状、例えば、癌性症状から生じる症候の治療に関する。さらなる実施形態は、望ましくない血管新生、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌及び膵臓癌などの新生物疾患を治療するために、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質及び方法を使用することを含む。
【０１６３】
Ｉ．ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質をコードする核酸
抗体の一方若しくは両方の鎖又はその断片、誘導体、変異タンパク質若しくは変形物をコードする核酸、重鎖可変領域又はＣＤＲのみをコードするポリヌクレオチド、ハイブリッド形成プローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ＰＣＲプライマー若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、変異し、又は増幅するための配列決定プライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸及び前記の相補的配列など、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質又はその一部をコードする核酸も提供される。核酸は、あらゆる長さであり得る。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００ヌクレオチド長若しくはそれ以上であり得、及び／又は１つ若しくはそれ以上の追加の配列、例えば、制御配列を含むことができ、及び／又は、より大きな核酸（例えばベクター）の一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチド並びにこれらの人工変形物（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。図１５Ａから１５Ｖは、抗原結合タンパク質の様々な軽鎖に対するヌクレオチド配列を図示する。図１６Ａから１６ＡＣは、抗原結合タンパク質の様々な重鎖に対するヌクレオチド配列を図示する。図１３Ａから１３Ｍは、抗原結合タンパク質の様々な軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。図１４Ａから１４Ｌは、抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図示する。図１８Ａから１８Ｆは、抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。図１９Ａから１９Ｇは、抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。図２０Ａから２０Ｋは、抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。図２１Ａから２１Ｋは、抗原結合タンパク質の重鎖可変領域の様々なＦＲ領域に対するヌクレオチド配列を図示する。図１７Ａは、抗原結合タンパク質の軽鎖定常領域のヌクレオチド配列を図示する。最後に、図１７Ｂは、抗原結合タンパク質の重鎖定常領域のヌクレオチド配列を図示する。
【０１６４】
ある種の抗原結合タンパク質又はその一部（例えば、完全長抗体、重若しくは軽鎖可変ドメイン又はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２若しくはＣＤＲＬ３）をコードする核酸は、ＨＢ−ＥＧＦ又はその免疫原性断片で免疫化されたマウスのＢ細胞から単離され得る。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの慣用の操作によって単離され得る。ファージディスプレイは、抗体及び他の抗原結合タンパク質の誘導体を調製し得る公知の技術の別の例である。１つのアプローチにおいて、目的の抗原結合タンパク質の成分であるポリペプチドは、あらゆる適切な組換え発現系の中で発現され、発現されたポリペプチドを集合させて、抗原結合タンパク質分子を形成させる。
【０１６５】
さらに、ある態様は、特定のハイブリッド形成条件下で他の核酸（例えば、図１３から２１に図示されているヌクレオチド配列を含む核酸）にハイブリッド形成する核酸を提供する。核酸をハイブリッド形成させる方法は、本分野において周知である。例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−６．３．６」を参照されたい。本明細書に定義されているように、中度に厳格なハイブリッド形成条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する事前洗浄溶液、約５０％ホルムアミドのハイブリッド形成緩衝液、６×ＳＳＣ及び５５℃のハイブリッド形成温度（又は、４２℃のハイブリッド形成温度を有する他の類似のハイブリッド形成溶液（約５０％ホルムアミドを含有するものなど））及び０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での６０℃の洗浄条件を使用する。厳格なハイブリッド形成条件は、４５℃の６×ＳＳＣ中でハイブリッドを形成させた後、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で１又はそれ以上の洗浄を行う。さらに、当業者は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が通例互いにハイブリッド形成された状態を保つように、ハイブリッド形成の厳格性を増加又は減少させるために、ハイブリッド形成条件及び／又は洗浄条件を操作することができる。ハイブリッド形成条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータ及び適切な条件を考案するための指針は、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  上記）及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５，  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４）」に記載されており、例えば、核酸の長さ及び／又は塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。
【０１６６】
変化は、核酸中への変異によって導入することが可能であり、これにより、核酸がコードするポリペプチド（例えば、抗体又は抗体誘導物）のアミノ酸配列の変化がもたらされる。変異は、本分野において公知のあらゆる技術を用いて導入することができる。一実施形態において、１つ又はそれ以上の特定のアミノ酸残基は、例えば、部位指定突然変異導入プロトコールを用いて変化される。別の実施形態において、１つ又はそれ以上の無作為に選択された残基は、例えば、無作為突然変異導入プロトコールを用いて変化される。どのようにして作製されたとしても、変異体ポリペプチドを発現させ、所望の特性に関してスクリーニングすることが可能である。
【０１６７】
変異は、核酸がコードするポリペプチドの生物活性を著しく変化させずに核酸中に導入することができる。例えば、ヌクレオチド置換を作製することができ、非必須アミノ酸残基にアミノ酸置換がもたらされる。あるいは、核酸がコードするポリペプチドの生物活性を選択的に変化させる核酸中に、１つ又はそれ以上の変異を導入することができる。例えば、変異は、生物活性を定量的に又は定性的に変化させることができる。定量的な変化の例には、活性を増加し、低下し、又は除去することが含まれる。定性的な変化の例には、抗体の抗原結合特異性を変化させることが含まれる。
【０１６８】
別の態様は、核酸配列の検出のためのプライマー又はハイブリッド形成プローブとして使用するのに適した核酸分子を提供する。核酸分子は、完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用することができる断片又はポリペプチドの活性部分（例えば、ＨＢ−ＥＧＦ結合部分）をコードする断片を含むことができる。
【０１６９】
ある核酸の配列を基礎とするプローブは、当該核酸又は類似の核酸、例えば、ポリペプチドをコードする転写物を検出するために使用することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素又は酵素補因子を含むことができる。このようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を同定するために使用することができる。
【０１７０】
別の態様は、ポリペプチド又はその一部（例えば、１つ若しくはそれ以上のＣＤＲ又は１つ若しくはそれ以上の可変領域ドメインを含有する断片）をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム性哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で核酸を含むことができる。組換え発現ベクターは、発現されるべき核酸配列に作用可能に連結されている、発現のために使用されるべき宿主細胞を基礎として選択された１つ又はそれ以上の制御配列を含む。制御配列には、宿主細胞の多くの種類でヌクレオチド配列の恒常的発現を誘導するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーター及びサイトメガロウイスルプロモーター）、ある種の宿主細胞中のみでヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば、組織特異的な制御配列。Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６  Ｔｒｅｎｄｓ  ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７参照（参照により、これらの全体が本明細書に組み込まれる。））及び特定の処理又は条件に応答してヌクレオチド配列の誘導性発現を誘導するもの（例えば、哺乳動物細胞中でのメタロチオニンプロモーター並びに原核系及び真核系の両方でのｔｅｔ−応答性及び／又はストレプトマイシン応答性プロモーター（下記参照））が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存し得ることが当業者によって理解される。発現ベクターは、宿主細胞中に導入することができ、これにより、本明細書に記載されている核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド（融合タンパク質又はペプチドを含む。）を産生することができる。
【０１７１】
別の態様は、組換え発現ベクターがその中に導入される宿主細胞を提供する。宿主細胞は、あらゆる原核細胞（例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は真核細胞（例えば、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であり得る。ベクターＤＮＡは、慣用の形質転換又は形質移入技術を介して、原核又は真核細胞中に導入することができる。哺乳動物細胞の安定的形質移入のために、使用される発現ベクター及び形質移入技術に応じて、細胞の少数のみが外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定及び選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子とともに、宿主細胞中に一般に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。導入された核酸で安定的に形質移入された細胞は、とりわけ、薬物選択の方法（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するのに対して、他の細胞は死滅する。）によって同定することができる。
【０１７２】
Ｊ．診断及び治療目的のためのＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質の使用
１．適応症
本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、過剰な細胞増殖、望ましくない細胞遊走及び／又は異常な血管新生を伴うものなど、多数の疾病及び疾患を検出又は治療するために使用することができる。例えば、これらのＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、癌細胞中でのＨＢ−ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ４チロシンリン酸化を阻害することができる（図２２から２９）。このような阻害は、細胞増殖及び遊走並びに血管新生を誘導するシグナル伝達現象のカスケードを妨害することができる。さらに、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲのトランス活性化を妨害することができる。さらに、これらの抗原結合タンパク質は、基底ＨＵＶＥＣ細胞増殖（図３２Ｂ）、内皮細胞管形成（図３３）及びインビボでのマトリゲルプラグアッセイにおけるＨＢ−ＥＧＦ誘導性血管形成（図３６）を阻害する。これらの結果は、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質がインビトロ及びインイボで血管新生を阻害することを示唆する。さらに、これらの抗原結合タンパク質は、足場非依存性細胞増殖（図３４及び図３５）及びマウス中での異種移植腫瘍増殖（図３７及び図３８）も阻害する。重要なことに、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ２３１癌細胞の遊走も阻害する（図２７及び２７参照）。従って、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、転移性癌の伝播及び発達と関連する細胞増殖、血管新生及び細胞遊走を調節するシグナル伝達現象など、腫瘍及び他の癌性症状の発達における幾つかの工程を攻撃する。このような多面的介入は、癌が発達するプロセスを調節及び阻害するのに高度に有益である。さらに、進行のあらゆる段階にある癌（例えば、原発性、転移性及び再発性の癌）を治療することができる。
【０１７３】
進行の様々な段階にある癌を検出及び治療する上でのＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質の使用に加えて、これらの抗原結合タンパク質は、癌の多数の異なる種類を検出するためにも有用であり得る。例えば、ＨＢ−ＥＧＦは、正常な乳房及び膵臓組織中では、極めて低いレベルで発現される。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦは、約５５％の膵臓癌細胞及び乳癌細胞の約７０％において、高いレベルで発現される。さらに、実施例に記載されているように、ＨＢ−ＥＧＦ発現は、様々な癌細胞株中で検出され、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質が様々な癌の種類の検出のために使用することができることを示唆する。
【０１７４】
例えば、特許請求の範囲に記載されている抗原結合タンパク質によって検出又は治療され得る癌には、固形哺乳動物腫瘍及び血液の悪性腫瘍が含まれる。固形哺乳動物腫瘍には、例えば、胚細胞性腫瘍、軟部組織肉腫、原発性脳腫瘍、神経芽細胞腫、腎芽腫及び癌腫、特に、扁平上皮癌及び上皮癌などの小児癌が含まれる。固形哺乳動物腫瘍には、例えば、起源不明の腫瘍、成人における原発性脳癌、下垂体、唇、口腔、上咽頭、咽頭、上顎洞、篩骨洞、唾液腺、甲状腺（副甲状腺及び癌様体を含む。）、食道、胃、膵臓、小腸、大腸、直腸、肛門管、肝臓、胆嚢、肝臓外胆管、ファーター膨大部、癌様体、胃−腸−肝臓系の内分泌腫瘍、褐色細胞腫及び傍神経節腫、副腎、肺、胸膜、縦隔、胸腺、骨及び軟部組織の腫瘍、唇、まぶた、外耳、顔の他の明記されていない部分、頭皮及び首、体幹、上肢及び肩、下肢及び臀部、外陰部、陰茎、陰嚢、乳癌の皮膚腫瘍、外陰部、膣、子宮頚部、子宮体部、卵巣、卵管の婦人科学的腫瘍、妊娠性及び絨毛性腫瘍、陰茎、前立腺、精巣、腎臓、腎盂及び尿管、膀胱、尿道、まぶた、結膜、ぶどう膜、網膜、眼窩及び涙腺の眼科的腫瘍などの成体の癌も含まれ得る。血液の悪性腫瘍には、小児、例えば、白血病、リンパ腫、急性及び慢性白血病（ＡＭＬ、ＡＮＬＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＭＤＳ）、ホジキン病、Ｂ細胞、Ｔ細胞、巨大細胞、濾胞性、リンパ球及び皮膚起源の無痛性／低悪性度、侵襲性／高悪性度リンパ腫、形質細胞新生物並びにＡＩＤＳを伴う癌が含まれる。
【０１７５】
さらに、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、例えば、腺腫、腺管絨毛腺腫、絨毛腺腫、血管繊維腫、異型増殖性粘液性新生物、ブレンナー腫瘍、癌様体、海綿状血管腫、細胞性平滑筋腫、絨毛膜血管腫、先天性中胚葉腎腫、粘液性嚢胞腺腫、漿液性嚢胞腺腫、類皮腫、類繊維腫、繊維腺腫、繊維腫、繊維莢膜細胞腫、濾胞性腺腫、神経節腫、巨細胞腫、顆粒細胞腫、顆粒膜細胞腫、血管腫、乳管内乳頭腫、膵島腫瘍、平滑筋腫、脂肪腫、黄体腫、髄膜腫、黒子、骨髄脂肪腫、粘液腫、神経線維腫、母斑、骨軟骨腫、褐色細胞腫、ポリープ症、シュワン細胞腫、漿液性嚢胞腺癌、卵巣甲状腺腫、滑膜軟骨腫症、良性胸腺腫を含む、癌性症状又は新生物疾患を検出又は治療するためにも使用され得る。
【０１７６】
本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦタンパク質を用いて検出又は治療することができる癌の種類のさらなる例は、例えば、米国癌協会（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）から又は「Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｉｎｃ．」から見出され得る。
【０１７７】
従って、本明細書中に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、癌、癌性症状、腫瘍増殖、癌細胞の転移、血管新生プロセス及び／又は新生物疾患を治療及び／又は予防するために使用することができる。従って、これらの抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されているヒト及び／又はモノクローナルＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質調製物の１つを含む組成物又はこれらの組み合わせの有効量を対象に投与することを含む、対象中の癌を治療又は予防する方法を提供する。
【０１７８】
固形腫瘍疾患の高い割合は、しばしば、腫瘍血管新生、成長因子（すなわち、ＶＥＧＦ）及び他の因子（すなわち、ＨＢ−ＥＧＦ）によって媒介される腫瘍組織中の（異常な）血管の過剰増殖によって特徴付けられる。ＨＢ−ＥＧＦ特異的抗原結合タンパク質を通じてＨＢ−ＥＧＦを標的とすることにより、新たな血管の形成が妨げられ、従って、既存の腫瘍の増殖及び新たな腫瘍の発達（すなわち、転移）が制限され得る。
【０１７９】
有糸分裂促進性及び浸潤促進性リガンドとしてのその役割の他に、幾つかの研究は、癌内の血管新生プロセスの重要な調節物質としてのＨＢ−ＥＧＦの像を実証した。実施例に例証されているように、インビボでの血管新生の制御におけるＨＢ−ＥＧＦの機能が示された。従って、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、血管新生を伴う又は血管新生によって引き起こされる疾病（例えば、癌性又は非癌性疾患）を治療するために使用することができる。
【０１８０】
例えば、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、血管新生（例えば、腫瘍血管新生）における血管の発達及び機能における基本的なプロセスである平滑筋細胞（ＳＭＣ）及び内皮細胞間の連絡を妨害し得る。
【０１８１】
さらに、これらの抗原結合タンパク質は、強力な内皮性有糸分裂促進因子としてその後に作用するＳＭＣ由来のＶＥＧＦのＨＢ−ＥＧＦ誘導性発現及び放出を少なくとも部分的に阻害する。同様に、ＶＥＧＦは、内皮細胞中でのＨＢ−ＥＧＦ産生を増加させ、従って、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質を投与することによって破壊され得るこれら２つの重要なリガンドからなる血管新生促進性フィードバックループを構成する。最近、ＶＥＧＦの他に、アンギオポエチン１及び２（Ａｎｇ−１及び２）などのさらなる重要な血管新生促進成分及びこれらの受容体であるＴＩＥ−２並びに強力な平滑筋細胞であるＧＰＣＲ刺激性アンギオテンシンＩＩ（ＡＴＩＩ）を同定した。興味深いことに、ＨＢ−ＥＧＦは、ＡＴＩＩによって誘導されるＥＧＦＲトランス活性化並びに内皮細胞中でのＶＥＧＦ及びＡｎｇ−２の下流上方制御の重要な媒介物質である。インビボにおいて、ＡＴＩＩは、ＨＢ−ＥＧＦ依存性の様式で血管新生を誘導し、ＶＥＧＦの血管新生活性を増強した。これらの知見は、ＶＥＧＦと平行して、ＨＢ−ＥＧＦは、Ａｎｇ２を介したさらなる血管新生経路を活性化することができることを裏付ける。従って、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質の有効量の投与を用いて、哺乳動物中の異常な血管新生又は癌を治療し得る。
【０１８２】
癌における血管新生プロセスの重要な制御物質としてのその役割の他に、活性化された血管新生経路及び側副血流の必要性を伴う様々な非癌適応症は、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質療法に対する疾病分野の候補である。
【０１８３】
免疫系によって媒介される「炎症性反応」（例えば、移植片対宿主病、移植拒絶、再狭窄）、代謝性疾患（例えば、糖尿病）又は慢性低酸素症状などの慢性炎症性疾患（例えば、腎炎、ＣＯＰＤ、炎症性腸疾患）は、しばしば、過剰及び／又は新血管新生（例えば、慢性潰瘍）によって特徴付けられる。記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、血管新生のための不可欠なプロセス（炎症性細胞によって産生された又は低酸素状態によって上方制御されたＨＢ−ＥＧＦにより誘導された内皮細胞による血管平滑筋細胞の動員）を少なくとも部分的に阻害し得、従って、過剰な／病的な新血管新生の介入的療法に対する魅力的な経路となる。
【０１８４】
肥満対象において、肥満における血管疾患のより高い発生率に寄与する蓄積された脂肪に由来するＨＢ−ＥＧＦの増加したレベルは、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質によって中和することができる。従って、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質を用いた治療的介入は、脂肪血管軸を分断する上で抗脂肪サイトカインとして直接作用する。
【０１８５】
繊維芽細胞において、ＨＢ−ＥＧＦは、上皮成長因子受容体の活性化を介して、エラスチンｍＲＮＡを著しく下方制御する。この効果は、肺繊維症の発達における介入の経路を提供する。
【０１８６】
さらに、ＨＢ−ＥＧＦは、炎症性疾患の発病に関与するケラチン生成細胞の有糸分裂促進物質である。さらに、ＨＢ−ＥＧＦの発現及びＥＧＦＲとの共存は、乾癬の初期発病において重要な役割を果たしている可能性があり、これは、特許請求の範囲に記載されている抗原結合タンパク質を用いた皮膚の炎症性疾患の治療に、特に、乾癬の初期治療において、治療の途を開く可能性を秘めている。
【０１８７】
増殖性硝子体網膜症の発達には、ＰＶＲ網膜中でのＨＢ−ＥＧＦの著しい上方制御が伴うので、記載されている抗原結合タンパク質を用いたＨＢ−ＥＧＦの標的化は、ＰＶＲを有する患者に対する治療の選択肢にもなり得る。さらに、繊維増殖性組織中でのＨＢ−ＥＧＦの発現及び神経膠細胞増殖、化学遊走及びＶＥＧＦ分泌に対するその刺激効果は、ＨＢ−ＥＧＦがＰＶＲの間の神経膠細胞応答を媒介する因子であり得ることを示唆する。これらの原理は、加齢性及び非加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、ぶどう膜炎（ｒｕｂｅｏｔｉｃ）緑内障、間質性ケラチン症、未熟児の網膜症及び角膜移植不全などのさらなる血管新生依存性の眼疾患に対しても適用することができる。
【０１８８】
アドレナリン作動性受容体及びアンギオテンシン受容体などのＧＰＣＲは、血管収縮性及び成長促進能のために、高血圧の発病に関連している。ＨＢ−ＥＧＦはこれらの経路の重要な媒介物質であるので、中和性抗原結合タンパク質は、心肥大及びうっ血性心不全、腎不全又は脳卒中などの高血圧性疾患における標的化された介入に適している。
【０１８９】
平滑筋細胞（ＳＭＣ）に対する強力な有糸分裂促進物質及び化学誘引物質であるＨＢ−ＥＧＦは、内膜肥厚を有する冠動脈のアテローム性動脈硬化斑の中に検出され、ＳＭＣ及びマクロファージによって産生される。さらに、アテローム性動脈硬化症の既知の原因因子である残遺リポタンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦによって媒介されたＥＧＦＲトランス活性化を介したＳＭＣ増殖を誘導することが示された。従って、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、重要な平滑筋細胞機能を遮断することによって、アテローム性動脈硬化症状を標的とする選択的及び効率的因子である。さらに、平滑筋細胞の増殖によって特徴付けられる経皮的な冠動脈への介入後の再狭窄も、ＨＢ−ＥＧＦ機能の特異的な中和によって予防され得る。
【０１９０】
従って、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、異常な血管新生、平滑筋腫（子宮繊維症）、良性平滑筋細胞腫瘍、糸球体硬化症（メサンギウム細胞の過剰増殖）、平滑筋細胞過形成、アテローム性硬化症（血管平滑筋細胞の過剰増殖）、虹彩；血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、糖尿病性失明、黄斑変性、リウマチ性関節炎、心肥大、乾癬などの非悪性増殖性疾患を含む様々な疾病を治療するために使用することができる。
【０１９１】
さらなる態様において、これらのＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、妨害された、例えば、病的に増強された成長因子受容体活性化が伴い又は付随する疾患を治療するために使用することができる。
【０１９２】
別の態様において、この増強された成長因子受容体活性化は、Ｇタンパク質及び／又はＧタンパク質共役型受容体の活性の病的増加を伴い、又はこれによって引き起こされ得る。妨害された、例えば、病的に増強された成長因子受容体活性化が伴い又は付随し、並びにＧタンパク質及び／又はＧタンパク質共役型受容体の活性の病的増加を伴い又はこれによって引き起こされ得る疾患は、Ｇタンパク質共役型受容体を介した成長因子受容体のトランス活性化が起こる点で、成長因子受容体活性化の増強された活性によって特徴付けられる他の疾患から識別され得ることに注目すべきである。
【０１９３】
２．診断方法
本明細書中に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合分子は、検査試料を抗原結合分子と接触させること、及び抗体が試料中のプロＨＢ−ＥＧＦ又はＨＢ−ＥＧＦ分子を発現する細胞に結合するかどうかを検出することを含む、検査試料中の癌細胞を検出する方法において使用され得る。結合が起こる程度は、対照試料の使用によって評価することができる。検査試料及び対照試料は、例えば、血液、血清、腹水、胸水、脳脊髄液、組織、細胞、尿、リンパ、唾液、乳又は他の試料であり得る。このような対照試料は、液体又は組織又は細胞種の非癌性試料であり得る。幾つかの実施形態において、対照試料は、検査試料として同じ対象から得られた非癌性試料である。「対象」又は「患者」は、症状、疾患又は疾病の治療又は検出を必要としている哺乳動物、好ましくはヒトを表す。
【０１９４】
検査試料の成分への抗体の結合は、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質に結合され又は選択的に結合され得る、レポーター分子、画像化剤又は標識を検出することによって検出することができる。これらのＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、１つ又はそれ以上のレポーター分子、標識又は画像化剤を有することができる。レポーター分子は、アッセイを用いて検出され得るあらゆる部分として定義される。抗体に連結されるレポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射線標識、ハプテン、蛍光性標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色された粒子又はリガンド（ビオチンなど）が含まれる。レポーター分子は、検出可能なシグナルを与えることができる。例えば、検出可能なシグナルは、蛍光、リン光、化学発光、電気化学発光、電気化学、色の変化又は酵素的シグナルであり得る。本明細書に提供されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、図３９に示されている組織試料の成長因子又は免疫組織化学的分析のＥＬＩＳＡを基礎とする検出のための捕捉抗体として使用することができる。
【０１９５】
幾つかの実施形態において、レポーター分子は、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質に共有結合されている。別の実施形態において、レポーター分子は、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質に共有結合され得る。記載されている抗原結合タンパク質へのレポーター分子のこのような選択的結合は、標識が共有結合された二次抗体によって達成することが可能であり、二次抗体は、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＢ抗原結合タンパク質に選択的に結合する。
【０１９６】
３．治療方法：医薬製剤、投与の経路
癌の治療又は癌を治療することには、疾病に通例伴われる少なくとも１つの症候を緩和又は軽減することが含まれるものとする。治療には、付随する症候の２以上を緩和又は軽減することも含まれる。治療は、癌を治癒させ得る。例えば、治療は、癌細胞を実質的に除去し、及び／又は癌性腫瘍の増殖を停止させ得る。あるいは、治療は、癌の進行を遅らせ得る。
【０１９７】
当業者が利用可能な方法を用いて、様々な癌又は癌細胞に対する抗癌活性を評価することができる。抗癌活性は、例えば、癌の増殖を妨げる本明細書に記載されている抗原結合タンパク質の調製物のＬＤ１００又はＥＤ５０を同定することによって測定することができる。一実施形態において、抗癌活性は、標準的な用量応答方法を用いて測定されたときに癌細胞の５０％又は１００％を死滅させる抗体の量である。
【０１９８】
本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、単独で、又は抗体、化学療法薬又は放射線療法と組み合わせて投与することができる。本発明の医薬組成物は、単独療法として、又は別の医薬組成物と組み合わせて、好ましくは別の抗新生物剤、特に、シスプラチン又はアバスチンを含む別の医薬組成物と組み合わせて投与され得る。例えば、記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、抗腫瘍抗体（例えば、キメラ、ヒト化又はヒト抗腫瘍抗体）とともに、ＶＥＧＦに特異的に結合して腫瘍血管新生をさらに阻害する抗体とともに、又はＨＥＲ２、ＨＥＲ４又はＥＧＦＲなどの受容体チロシンキナーゼに特異的に結合し、従って、腫瘍細胞増殖をさらに阻害する抗体とともに同時投与され得る。図３８において、検査した両治療用抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体に対して、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の相乗効果が示され得る。さらに、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、他の抗腫瘍剤とともに同時投与され得る。本明細書に提供される抗体とともに同時投与することができる抗腫瘍剤の具体例には、例えば、ゲフェチニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ペメトレキセド、ベバシスマブ、セツキシマブ、イマチニブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、エルロチニブ、ボルテゾミブなどが含まれる。癌又は腫瘍細胞増殖を阻害することができる他のあらゆる抗癌剤又は薬物は、本明細書中に記載されている及び特許権が請求されている組成物中でも使用することができる。例えば、特許権が請求されている組成物には、キャペシタビン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素、ブサルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミスラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコフォルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホル−アミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド、シスプラチン、アバスチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの化学療法剤が含まれ得る。一般に、「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １５ｔｈ  Ｅｄ．１９８７，  ｐｐ．１２０６−１２２８，  Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｒａｈｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．」を参照されたい。記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質とともに使用される場合、このような化学療法剤は、個別に（例えば、５−ＦＵ及び抗体）、順次に（例えば、ある期間に５−ＦＵ及び抗体、続いてＭＴＸ及び抗体）又は１つ若しくはそれ以上の他のこのような化学療法剤と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ及び抗体又は５−ＦＵ、放射線療法及び抗体）使用され得る。
【０１９９】
ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質調製物のＬＤ１００又はＥＤ５０をインビボ又はインビトロで測定することを含む、本明細書に開示されているアミノ酸配列を有する抗体を用いて癌を治療するための治療的有効用量を評価する方法も提供される。このような方法によって、癌細胞の増殖又は転移を約１０％から１００％又は約２０％から１００％又は約２５％から１００％又は約３０％から１００％又は約４０％から１００％又は約５０％から１００％阻害するために、容量当りの必要とされる抗原結合タンパク質のおよその量を計算することが可能となる。幾つかの実施形態において、癌細胞の増殖又は転移の１００％未満の阻害が観察される。例えば、癌細胞の増殖及び／又は転移は、約９０％、８０％、７０％、６０％又は５０％阻害される。パーセント阻害は、例えば、腫瘍細胞が導入された本分野で利用可能なＳＣＩＤ若しくはｎｕ／ｎｕマウスに抗原結合タンパク質調製物を投与することによって、及び／又は培養された癌細胞を用いる標準的な方法によって測定することが可能である（図３８Ｂ参照）。幾つかの方法が、実施例に記載されている。
【０２００】
例えば、癌及び／又は異常な血管新生などの疾病に対する治療として有用である本明細書に記載のＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質の無菌医薬製剤も含まれる。このような製剤は、ＨＢ−ＥＧＦの受容体（例えば、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ４）へのＨＢ−ＥＧＦの結合を阻害することにより、例えば、血清、細胞若しくは組織ＨＢ−ＥＧＦが異常に上昇している病的状態又はその受容体（例えば、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ４）が異常に活発である病的状態を有効に治療する。本明細書に例示されているように、ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦを強力に中和し、及びＨＢ−ＥＧＦ受容体と関連するシグナル伝達現象を調節するために十分な親和性を有する。
【０２０１】
本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、好ましくは、ヒト化された抗原結合タンパク質である。これらのヒト化された抗原結合タンパク質の投与は、有害な副作用の確率を低下させる。さらに、これらの抗原結合タンパク質は、例えば、正常なヒト産物として認識され、これにより、免疫系応答のリスクを最小化するので、インビボにおいて安定である。さらに、これらの抗原結合タンパク質は、タンパク分解による破壊を受ける傾向がなく、その循環半減期を向上させる。従って、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ調製物は、ヒト内部への投与が比較的頻繁でないように、優れたインビボ半減期を有する。このような延長された作用期間は、皮下又は筋肉内注射などの別の非経口経路による、より低頻度で、より便利な投薬スケジュールを可能にし得る。
【０２０２】
例えば、抗体の凍結乾燥及び再構成の前又は後に、無菌のろ過膜を通過させるろ過によって、無菌製剤を作製することができる。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、通常、凍結乾燥された形態で又は溶液中に保存される。治療用抗体組成物は、無菌のアクセス孔を有する容器、例えば、皮下注射針が貫通し得る栓など、製剤の回収を可能とするアダプターを有する静脈内溶液袋又は又は容器の中に一般に配置される。
【０２０３】
ＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質の投与経路は、公知の方法に従う（例えば、静脈内、皮下、皮内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、くも膜下腔内、膀胱内、空洞内、吸入、病変内経路による注射又は注入又は以下に記載されているような徐放系による。）。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗原抗原結合タンパク質は、注入によって又は大量瞬時注射によって連続的に投与される。
【０２０４】
本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質は、医薬として許容される担体との混合物中に調製することができる。この治療用組成物は、静脈内投与され、又は好ましくは液体若しくは粉末エアロゾル（凍結乾燥されている。）として、鼻若しくは肺を通じて投与することができる。また、組成物は、所望に応じて、非経口投与又は皮下投与され得る。全身投与される場合、治療用組成物は、無菌で、発熱物質が存在しないようにすべきであり、生理的に許容されるｐＨ値、等張性及び安定性がどのようなものかを考慮しながら、非経口的に許容される溶液中に入れるべきである。これらの条件は、当業者に公知である。簡潔に述べると、本明細書に記載されている化合物の投薬製剤は、生理的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と所望される純度を有する化合物を混合することによって、保存又は投与のために調製される。このような材料は、使用される投薬量及び濃度で服用者に対して無毒であり、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、リン酸、クエン酸、酢酸及び他の有機酸の塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；ポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリジノンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニンなどのアミノ酸；セルロース若しくはその誘導体、グルコース、マンノース又はデキストリンなどの単糖、二糖及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン及び／又はＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ若しくはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２０５】
注射用の無菌組成物は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２０ｔｈ  ｅｄ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （２００３））」に記載されている旧来の医薬慣行に従って製剤化することができる。例えば、水又はゴマ、落花生若しくは綿実油のような天然に存在する植物油又はオレイン酸エチルなどのような合成脂肪ビヒクルなどのビヒクル中に活性化合物を溶解又は懸濁することが望ましい場合があり得る。緩衝液、防腐剤、抗酸化剤などは、受け入れられた医薬慣行に従って取り込ませることができる。
【０２０６】
徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体親水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは成形品、フィルム又は微小カプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，  １９８２，  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５によって記載されているようなポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許５８，４８１）、Ｌグルタミン酸とγエチルＬ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、ＬＵＰＲＯＮ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドから構成される注射可能な小球体）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれる。
【０２０７】
エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日超にわたる分子の放出を可能にするのに対して、ある種のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。封入されたタンパク質が長期間体内に残存すると、３７℃で水分に曝露される結果、封入されたタンパク質は変性又は凝集し得、その結果、生物活性が失われ、免疫原性が変化し得る。関与する機序に応じて、タンパク質を安定化させるために合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機序がジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適切な添加物を使用し、及び特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化が達成され得る。
【０２０８】
持続放出される組成物は、懸濁液中に結晶を維持することができる適切な製剤中に懸濁された抗原結合タンパク質の結晶の調製物も含む。これらの調製物は、皮下又は腹腔内に注射されると、持続的な放出効果をもたらし得る。他の組成物は、リポソームに捕捉された抗体を含む。このような抗体を含有するリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される。米国特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；  Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４；欧州特許５２，３２２；欧州特許３６，６７６；欧州特許８８，０４６；欧州特許１４３，９４９号；欧州特許１４２，６４１号；日本国特許出願８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号及び米国特許第４，５４４，５４５号；並びに欧州特許第１０２，３２４号を参照されたい。
【０２０９】
ある患者に対する抗原結合タンパク質製剤の投薬量は、疾病の重度及び種類、体重、性別、食事、投与の時間及び経路、他の医薬並びに他の関連する臨床的要因など、薬物の作用を修飾することが知られた様々な要因を考慮に入れて、担当医によって決定される。治療的有効投薬量は、インビトロ又はインビボ法によって決定され得る。
【０２１０】
治療的に使用されるべき本明細書に記載されている抗原結合タンパク質の有効量は、例えば、治療の目的、投与の経路及び患者の症状に依存する。従って、治療者は投薬量を滴定し、最適な治療効果を得るために、必要に応じて投与の経路を改変することが好ましい。典型的な一日投薬量は、上記要因に応じて、約０．００１ｍｇ／ｋｇから最大１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲とし得る。典型的には、医療従事者は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、治療用抗原結合タンパク質を投与する。この治療の進行は、慣用のアッセイによって又は本明細書に記載されているように容易にモニターされる。
【０２１１】
本明細書中の組成物及び方法に従う治療的部分の投与は、適切な担体、賦形剤及び改善された転移、送達、許容性などを与えるために製剤中に取り込まれる他の因子とともに投与されることが理解される。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、蝋、油、脂肪、脂肪（陽イオン性又は陰イオン性）含有小胞（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭなど）、ＤＮＡ連結物、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンｃａｒｂｏｗａｘ（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル及びｃａｒｂｏｗａｘを含有する半固体混合物が含まれる。製剤中の活性成分が製剤によって不活化されず、及び製剤が投与経路と生理的に適合され、及び投与経路を許容する限り、前記混合物の何れもが、本明細書に記載されているＨＢ−ＥＧＦ抗原結合タンパク質を含む治療及び療法において適切であり得る。Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ，”  ２０００，  Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３２：２１０−２１８；  Ｗａｎｇ，“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，”  ２０００，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．２０３：１−６０；  Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ  “Ｌｉｐｉｄｓ，  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ，”  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９：９６７−９７８；  Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”  ＰＤＡ  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１及び薬化学者に周知の製剤、賦形剤及び担体に関連する追加情報に関するこれらの中の引用文献を参照されたい。
【０２１２】
実施された実験及び得られた結果を含む以下の実施例は、例示のために提供されているものに過ぎず、本明細書中の教示を限定するものと解釈すべきではない。
【０２１３】
実施例
（実施例１）
免疫原の作製
ｐｃＤＮＡ３−ＶＳＶ−ＨＢ−ＥＧＦ発現構築物（Ｐｒｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、上記）からＥＧＦ様ドメイン（アミノ酸１から１４９）を含むＨＢ−ＥＧＦを増幅し、カルボキシル末端にインフレームの６Ｈｉｓタグを与える発現ベクター中にクローニングした（ｐｃＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−ｈｉｓ，  ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｃ末端ｍｙｃ（ＨＩＳ）６タグを有するＨＢ−ＥＧＦ免疫原をＨＥｋ２９３細胞中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びヘパリンセファロース（Ｓｉｇｍａ）上での二段階精製によって精製した。
【０２１４】
免疫原のＨＢ−ＥＧＦ部分は、以下の配列（配列番号１０７７）を有していた。
【０２１５】
１  ＭＫＬＬＰＳＶＶＬＫ  ＬＦＬＡＡＶＬＳＡＬ  ＶＴＧＥＳＬＥＲＬＲ  ＲＧＬＡＡＧＴＳＮＰ
４１  ＤＰＰＴＶＳＴＤＱＬ  ＬＰＬＧＧＧＲＤＲＫ  ＶＲＤＬＱＥＡＤＬＤ  ＬＬＲＶＴＬＳＳＫＰ
８１  ＱＡＬＡＴＰＮＫＥＥ  ＨＧＫＲＫＫＫＧＫＧ  ＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲ  ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥ
１２１  ＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰ  ＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧ  ＥＲＣＨＧＬＳＬＰ
（実施例２）
Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅマウスの免疫化及び観察された力価
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統：ＸＭＧ２（ヒトＩｇＧ２産生）及びＸＭ３Ｃ−１（ヒトＩｇＧ４産生）、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を順次免疫化することによって、ＨＢ−ＥＧＦに対するモノクローナル抗体を開発した。
【０２１６】
１．免疫化
全ての注射に対して、足蹠を介してＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物を免疫化した。各注射の総容量は、５０μＬ／マウス、２５μＬ／足蹠であった。コホート１（ＸＭＧ２マウス１０匹）及びコホート２（ＸＭ３Ｃ−１、１０匹）の両方に関して、最初の免疫化は、１：１（ｖ／ｖ）でＴＩＴＥＲＭＡＸＧＯＬＤ（Ｒ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｏａｋｖｉｌｌｅ，  ＯＮ）と混合されたＨＢ−ＥＧＦタンパク質１０μｇ／マウスを用いて行った。その後、発熱物質を含まないＤ−ＰＢＳ中のａｌｕｍゲル１００μｇ（Ｓｉｇｍａ，  Ｏａｋｖｉｌｌｅ，  ＯＮ）とともに１：１（ｖ／ｖ）混合されたＨＢ−ＥＧＦタンパク質１０μｇを用いて、４回の強化免疫を行った。５回目の強化免疫は、１：１（ｖ／ｖ）でＴＩＴＥＲＭＡＸＧＯＬＤ（Ｒ）と混合されたＨＢ−ＥＧＦタンパク質１０μｇからなった。６回目及び７回目の注射は、ａｌｕｍゲル１００μｇと１：１ｖ／ｖ混合されたＨＢ−ＥＧＦタンパク質１０μｇからなった。最終強化免疫は、アジュバントなしに、無発熱物質ＤＰＢＳ中のＨＢ−ＥＧＦタンパク質１０μｇを用いて行った。このプロトコールのために、０、４、８、１４、１８、２１、２５及び２８日目にＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスを免疫化し、３２日目に融合を行った。４回目の強化免疫から１６日後、６回目の強化免疫から２３日後に、後眼窩採血手法を通じて、２回の採血を行った。
【０２１７】
２．力価による採集用動物の選択
免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスから得た血清中の抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔に述べれば、抗原コーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６ＮａＨＣＯ３（ＭＷ８４）８．４ｇ／Ｌ）中において、４℃で一晩、Ｃｏｓｔａｒ  Ｌａｂｃｏａｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ  （Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ａｃｔｏｎ，  ＭＡ）上に、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質（２μｇ／ｍＬ）をコートした。翌日、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）でプレートを１回洗浄した。次いで、２００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサール）を用いてプレートをブロックし、室温で１時間温置した。１時間のブロッキングの後、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、洗浄緩衝液でプレートを１回洗浄した。１：１００の当初希釈から２つ組みで１：３希釈して、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中に、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質によって免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス又は非免疫化ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物から得た血清を滴定した。最後のウェルは、ブランクとして残した。これらのプレートを室温で２時間温置し、次いで、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＣＡＬＴＡＧ、カタログ番号Ｈ１０５０７）連結抗体を、ブロッキング緩衝液中に１：２０００の最終濃度で添加し、室温で１時間温置した。Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ発色性基質（ＢｉｏＦｘＢＳＴＰ−０１００−０１）を添加して１０から２０分間又は陰性対照ウェルが発色を示し始めるまで、プレートを展開した。次いで、停止溶液（１００ｍＬＨ２Ｏ／瓶を用いて再構成されたＴＭＢ（ＢｉｏＦｘＢＳＴＰ−０１００−０１）用の６５０ｎＭ停止試薬）の添加によって、ＥＬＩＳＡを停止させた。６５０ｎｍでの光学密度から各ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物の特異的力価を測定し、下表１に示す。力価の値は、バックグラウンドの２倍のＯＤ読み取りを有する血清の最大希釈の逆数である。従って、数字が大きいほど、ＨＢ−ＥＧＦに対する液性免疫応答は大きかった。
【０２１８】
【表１】
0005685442.tif 000007
【０２１９】
（実施例３）
ハイブリドーマの作製及び結合物質に対する一次スクリーニング
免疫化されたマウスを屠殺し、各コホートからリンパ節を採集し、プールした。組織から細胞を放出させるために、ＤＭＥＭ中で磨り潰すことによってリンパ細胞を解離させ、ＤＭＥＭ中に細胞を懸濁した。細胞を計数し、細胞を穏やかに、但し、完全に再懸濁するために、リンパ球１億当り０．９ｍＬＤＭＥＭを細胞沈降物に添加した。細胞１億当りＣＤ９０＋磁気ビーズ１００μＬを用いて、４℃で１５分間、磁気ビーズとともに細胞を温置することによって細胞を標識した。最大１０８の陽性細胞（又は最大２×１０９の全細胞）を含有する磁気標識された細胞懸濁物をＬＳ＋カラム上に搭載し、ＤＥＭＥを用いてカラムを洗浄した。ＣＤ９０陰性画分（これらの細胞の多くは、Ｂ細胞であると予想された。）として、全流出液を収集した。
【０２２０】
上から得られた洗浄された濃縮Ｂ細胞及びＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ１５８０（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９７９，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２３：１５４８−１５５０）から購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を１：１の比で混合することによって融合を行った。８００ｇで細胞混合物を穏やかに遠心した。上清の完全な除去後に、最長２分間、プロナーゼ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５３７０２；ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬ）の２から４ｍＬで、細胞沈降物を処理した。次いで、酵素活性を停止させるために、ＦＢＳ３から５ｍＬを添加し、電気細胞融合溶液ＥＣＦＳ（０．３Ｍスクロース、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ７９０３、０．１ｍＭ酢酸マグネシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ２５４５、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ４７０５）を用いて、４０ｍＬの総容積になるように懸濁液を調整した。遠心後に上清を除去し、ＥＣＦＳ４０ｍＬ中に細胞を再懸濁した。この洗浄工程を反復し、２×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように、ＥＣＦＳ中に細胞を再び再懸濁した。
【０２２１】
融合作製装置モデルＥＣＭ２００１、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡを用いて、電気細胞融合を行った。使用した融合チャンバーのサイズは２．０ｍＬであり、以下の装置設定を使用した。アラインメント条件：電圧：５０Ｖ、時間：５０秒；膜破壊：電圧：３０００Ｖ、時間：３０μ秒；融合後の保持時間：３秒。
【０２２２】
電気細胞融合の後、無菌条件下で、細胞懸濁液を融合チャンバーから注意深く除去し、ハイブリドーマ培地（Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＯＰＩ（オキサロアセタート、ピルバート、ウシインシュリン）（全てＳｉｇｍａから）及びＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））が補充されたＤＭＥＭ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））の同じ容量を含有する無菌チューブ中に移した。３７℃で１５から３０分間、細胞を温置し、次いで、４００ｇで５分間遠心した。ハイブリドーマ選択培地（０．５×ＨＡが補充されたハイブリドーマ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９６６６））の少量中に細胞を穏やかに再懸濁し、合計５×１０６Ｂ細胞／９６ウェルプレート及び２００μＬ／ウェルの最終播種に基づいて、さらなるハイブリドーマ選択培地を用いて容量を適切に調整した。細胞を穏やかに混合し、ピペット操作で９６ウェルプレート中に移し、増殖させた。７日目又は１０日目に、培地の半分を除去し、ハイブリドーマ選択培地を細胞に再び加えた。
【０２２３】
培養の１４日後、ＥＬＩＳＡによって、ＨＢ−ＥＧＦ特異的モノクローナル抗体に関して、コホート＃１及びコホート＃２から得られたハイブリドーマ上清をスクリーニングした。一次スクリーニングにおいて、コーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６、ＮａＨＣＯ３８．４ｇ／Ｌ）中のＨＢ−ＥＧＦタンパク質（２μｇ／ｍＬ）の５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１２−５６５−１３６）をコートし、次いで、４℃で一晩温置した。温置後、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、プレートを１回洗浄した。２００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサール）を添加し、プレートを室温で１時間温置した。温置後、洗浄緩衝液でプレートを１回洗浄した。ハイブリドーマ上清の分取試料並びに陽性及び陰性対照（５０μＬ／ウェル）を添加し、プレートを室温で２時間温置した。全体を通じて使用した陽性対照は、関連するＨＢ−ＥＧＦタンパク質で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅから得た血清であり、陰性対照はＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスのＫＬＨ免疫化された関連の系統から得た血清であった。温置後、洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄した。検出抗体ヤギ抗ｈｕＩｇＧＦｃ−ＨＲＰ（ＣａｌｔａｇＩｎｃ．，カタログ番号Ｈ１０５０７、使用した濃度は１：２０００希釈であった。）の１００μＬ／ウェルを添加し、室温で１時間、プレートを温置した。温置後、洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸＬａｂ．カタログ番号ＴＭＳＫ−０１００−０１）の１００μＬ／ウェルを添加した。次いで、プレートを約１０分間（陰性対照ウェルが僅かに発色し始めるまで）発色させた。次いで、５０μＬ／ウェルの停止溶液（ＴＭＢ停止溶液（ＢｉｏＦＸＬａｂ．カタログ番号ＳＴＰＲ−０１００−０１）を添加し、４５０ｎｍの波長で、ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置上でプレートを読み取った。
【０２２４】
一次スクリーニングに基づく陽性ハイブリドーマ細胞増殖ウェルからの古い培養上清を除去し、ＨＢ−ＥＧＦ陽性ハイブリドーマ細胞を新鮮なハイブリドーマ培地とともに懸濁し、２４ウェルプレートに移した。２日間培養した後、これらの上清は直ちに二次確認スクリーニングを行える状態であった。二次確認スクリーニングでは、抗体調製物がその組成物中においてＨＢ−ＥＧＦ特異的であり、完全にヒトであることを示すために、検出用抗体の２つの組：ヒトγ鎖検出用のヤギ抗ｈｕＩｇＧＦｃ−ＨＲＰ（ＣａｌｔａｇＩｎｃ．，カタログ番号Ｈ１０５０７、使用した濃度は１：２０００希釈であった。）及びヒトκ軽鎖検出用のヤギ抗ｈＩｇκ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２０６０−０５）を用いるＥＬＩＳＡ（上述）によって、一次スクリーニング中での陽性をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ手法の２つの組は、２つの異なる検出抗体が別々に使用されたことを除き、上記記述は同一であった。
【０２２５】
二次確認スクリーニングと平行して、ｍｙｃ（ｈｉｓ）６タグに応答する抗体を除外するために、カウンターＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。ＨＢ−ＥＧＦｍｙｃ（ｈｉｓ）６タンパク質を用いたコーティングの代わりに、無関係のｍｙｃ（ｈｉｓ）６タグタンパク質（ＭＬ−ｍｙｃ（ｈｉｓ）６タンパク質）で被覆されたことを除き、ＥＬＩＳＡ手法は、上の記述と同一であった。
【０２２６】
二次確認及びカウンターＥＬＩＳＡスクリーニング後に、４９個の完全ヒトＩｇＧ／κＨＢ−ＥＧＦ特異的モノクローナル抗体がコホート１及び２から同定された。
【０２２７】
（実施例４）
機能的アッセイでの大規模化及び抗体の検査
本実施例は、ＨＢ−ＥＧＦに対して親和性を有する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の同定を記載する。
【０２２８】
１．ＨＢ−ＥＧＦ発現細胞株に結合された、ハイブリドーマによって産生された抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のＦＡＣＳによる検出
細胞株上でのＨＢ−ＥＧＦ発現をＦＡＣＳ分析によって測定した。この分析を実施するために、ＰＢＳ中の１０ｍＭＥＤＴＡを用いて、２×１０５の選択されたＨＢ−ＥＧＦ発現細胞を採集し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ、０．４％アジ化物）中に再懸濁し、９６ウェルの丸底プレート上に播種した。上清を除去するための１０００ｒｐｍでの３分間の遠心後、ハイブリドーマに由来する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体希釈（１００μＬ／ウェル）中に細胞を再懸濁し、４℃で４５分間温置した。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に１：１００希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）ロバ抗ヒト−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに再懸濁した。４℃、暗所で３０分間、細胞懸濁物を温置し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析した（ＦＡＣＳ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０２２９】
これらのアッセイの結果は、下表２及び３に提供されており、各ＦＡＣＳアッセイに対する蛍光の平均値を与える。表３及び４に示されているように、ＨＢ−ＥＧＦを発現しないＣＨＯ対照細胞中には、実質的にＨＢ−ＥＧＦ発現は検出されなかった。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦがＣＨＯ細胞中で組換え的に過剰発現されている場合には、幾つかのモノクローナル抗体調製物がＨＢ−ＥＧＦ発現細胞への著しい結合を示す。ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＳＣＣ−９及びＣＯＳ−７細胞への結合は、幾分変動し得るが、あるＨＢ−ＥＧＦ発現細胞の種類に結合した抗体調製物は別のＨＢ−ＥＧＦ−発現細胞種に通例結合した。表２に示されているように、例えば、Ｕ２−２４、Ｕ２−５、Ｕ２−１９、Ｕ２−２１、Ｕ２−１５及びＵ２−４２抗体調製物などの幾つかの抗体調製物が、ＨＢ−ＥＧＦ発現ＣＨＯ細胞への強い結合を示した。同様に、抗体調製物Ｕ２−３９、Ｕ２−２６、Ｕ２−４４、Ｕ２−４５及びＵ２−４８も、ＨＢ−ＥＧＦ発現ＣＨＯ細胞に良好な結合を示した。
【０２３０】
【表２】
0005685442.tif 000008
【０２３１】
【表３】
0005685442.tif 000009
【０２３２】
２．ＨＢ−ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲチロシンリン酸化の阻害
何れの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物がＨＢ−ＥＧＦ誘導性上皮成長因子受容体チロシンのリン酸化を阻害するかを同定するために、以下のプロトコールを使用した。このような実験は、抗体をさらに性質決定し、何れのハイブリドーマ細胞株がＨＢ−ＥＧＦ活性を阻害し、その後、クローニング及び増殖させるべき抗体を産生するかを同定するのに役立つ。
【０２３３】
培地１００μＬ中、９６ウェルプレート上に、ＳＳＣ９ヒト扁平上皮癌細胞４００００個を播種した。無血清培地６０μＬ中に細胞を２４時間飢餓状態にした。黒いＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートを、４℃で一晩、抗ＥＧＦＲ抗体１００μＬ（２μｇ／ｍＬ）でコートした。洗浄せずに、コーティング溶液をブロッキング溶液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ）３００μＬと置換し、室温で２時間、温置させた。ＩｇＧ２対照（Ｓｉｇｍａ）又は抗ＨＢ−ＥＧＦハイブリドーマ由来抗体１０μｇ／ｍＬを２０ｎｇ／ｍＬＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）に添加し、３７℃で３０分間予め温置した（容量：４０μＬ）。３７℃で３分間、培地のみで又は抗体／リガンド溶液で細胞を処理した。培地を除去し、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０ｍＭＮａＦ及び２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を基礎とする溶解緩衝液１００μＬを用いて、細胞を氷上で溶解した。ブロッキングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄した。細胞可溶化液８０μＬを洗浄されたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに直接移し、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩温置した。ＰＢＳ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを６回洗浄し、次いで、希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋５ｍＭＥＤＴＡ）中に１：４０００希釈された４Ｇ１０−ビオチン１００μＬ（ＵＢＩ）を各ウェルに添加し、室温で２時間温置した。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを６回洗浄し、室温で３０分間、希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋５ｍＭＥＤＴＡ）中に１：２００００希釈されたＡＰ連結されたストレプトアビジン１００μＬ（ＵＢＩ）を各ウェルに添加した。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを６回洗浄し、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質１００μＬを各ウェルに添加した。室温で暗所にて、最大３時間、プレートを温置し、３０、９０及び１８０分に、発生する蛍光をモニターした（励起：４３０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）。
【０２３４】
ＨＢ−ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲチロシンリン酸化の％阻害は、ハイブリドーマ由来の各抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物によるＩｇＧ２−対照（Ｓｉｇｍａ）を用いて観察されたリン酸化の量の低下によって計算された。
【０２３５】
様々な抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物に対する結果が、図２３Ａ及び２３Ｂに提供されている。図示されているように、モノクローナル抗体調製物Ｕ２−１８、Ｕ２−２４、Ｕ２−１９、Ｕ２−４２、Ｕ２−３９、Ｕ２−３４、Ｕ２−４５及びＵ２−６は、ＥＧＦＲチロシンリン酸化を強く阻害する。
【０２３６】
３．抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物はＬＰＡ誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害する
ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達経路は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の刺激に際して活性化され得る。ＧＰＣＲとの相互作用によるヘテロ三量体Ｇタンパク質のリガンド活性化は、膜貫通メタロプロテイナーゼの細胞外活性を誘導する細胞内シグナルをもたらす。ＧＰＣＲ経路を活性化し得るリガンドは、ＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）、トロンビン、カルバコール、ボンベシン及びエンドセリンが含まれる。このような活性化は、膜貫通成長因子前駆体の細胞外プロセッシング及びＥＧＦＲの外部ドメインと直接又はプロテオグリカンマトリックスを通じて相互作用し、リン酸化を通じてＥＧＦＲの外部ドメインを活性化する成熟した因子の放出をもたらす。「Ｐｒｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：８８４−８８８」を参照されたい。
【０２３７】
本明細書に提供されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物がＣＯＳ−７細胞中のＧＰＣＲリガンドＬＰＡによって誘導されたＥＧＦＲチロシンリン酸化を阻害できるかどうかを確かめるために、以下の手法を用いて、本明細書に提供されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物を検査した。
【０２３８】
２ｍＬ培地中、６ウェルプレート上に、ＣＯＳ−７細胞２５０，０００個を播種し、一晩培養した。無血清培地１ｍＬ中に細胞を２４時間飢餓状態にした。抗体との事前温置（３７℃、１時間）後に、１０μＭＬＰＡ（３７℃、３分）で細胞を刺激し、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０ｍＭＮａＦ及び２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を基礎とする溶解緩衝液４００μＬを用いて、氷上で溶解した。低温室中で４時間のＥＧＦＲの免疫沈降（可溶化液３４０μＬ、ＨＮＴＧ３４０μＬ、Ｐｒｏｔ．  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ３０μＬ、αＥＧＦＲ１．５μＬ（１０８．１、Ｐｒｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、上記））後に、ＨＮＴＧ緩衝液５００μＬで沈殿物を３回洗浄し、７．５％ＳＤＳＰＡＧＥ上に走行させた。ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）上への転写後、ホスホチロシン残基を認識する抗体（一次抗体４Ｇ１０（１：２０００、Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；二次抗マウス抗体１：１００００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ブロットをプローブで探査した。剥離後にヒツジ抗ＥＧＦＲ（Ｕｐｓｔａｔｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で再度ブロットを実施することによって、受容体の等しい量が各レーン中で沈殿したことが示された。
【０２３９】
図２４は、何れの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物がＬＰＡ誘導性ＥＧＦＲチロシンリン酸化を阻害するかを示すウェスタンブロットを提供する。図２４に示されているように、Ｕ２−１９及びＵ２−４２抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物は、ＬＰＡ誘導性ＥＧＦＲリン酸化を強く阻害した。Ｕ２−２４抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物は、幾分弱く、ＬＰＡ誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害した。
【０２４０】
（実施例５）
モノクローナル抗体を作製するためのハイブリドーマのクローニング
前実施例中に記載されている実験から観察された試験結果に基づいて、４９の当初単離株のうち、限界希釈及びモノクローナル抗体のさらなる性質決定によって、４３個のハイブリドーマ細胞株をクローニングのために選択した。クローニングのために選択された株は、ＦＡＣＳ分析によって示されたように、ＨＢ−ＥＧＦ発現細胞株に結合し、ＥＧＦ受容体チロシンリン酸化のＨＢ−ＥＧＦ刺激を阻害した。幾つかのハイブリドーマに関して、全ての一次スクリーニングアッセイを実施するのに十分な抗体が作製されなかった。ハイブリドーマのこの一部も、ハイブリドーマクローニングに進んだ。
【０２４１】
（実施例６）
ＥＧＦＲのＧＰＣＲ誘導性チロシンリン酸化の抗体関連阻害のさらなる性質決定
本実施例は、本明細書に提供される幾つかの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物がＧＰＣＲ誘導性ＥＧＦ受容体チロシンリン酸化の用量依存性阻害を呈することを示すさらなるデータを提供する。
【０２４２】
これらの抗体調製物の異なる濃度及び以下の手法を用いて、候補抗体調製物Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５による阻害を調べた。
【０２４３】
培地１ｍＬ中、１２ウェルプレート上に、細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＰＰＣ１）１５０，０００個を播種した。無血清培地５００μＬ中に細胞を２４時間飢餓状態にした。黒いＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートを、４℃で一晩、抗ＥＧＦＲ抗体１００μＬ（２μｇ／ｍＬ）でコートした。洗浄せずに、コーティング溶液をブロッキング溶液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ）３００μＬと置換し、室温で２時間、温置させた。３７℃で３０分間、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体１０μｇ／ｍＬとともに、細胞を事前温置し、次いで、３７℃で３分間、ＧＰＣＲリガンドであるＬＰＡ（１０μＭ、ＰＰＣ１細胞）又はトロンビン（１Ｕ／ｍＬ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞）で処理した。培地を除去し、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０ｍＭＮａＦ及び２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を基礎とする溶解緩衝液２００μＬを用いて、細胞を氷上で溶解した。ブロッキングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄した。細胞可溶化液を洗浄されたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに直接移し、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩温置した。
【０２４４】
ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを６回洗浄し、次いで、希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋５ｍＭＥＤＴＡ）中に１：４０００希釈された４Ｇ１０−ビオチン１００μＬ（ＵＢＩ）を各ウェルに添加し、室温で２時間温置した。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを６回洗浄し、室温で３０分間、希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋５ｍＭＥＤＴＡ）中に１：２００００希釈されたＡＰ連結されたストレプトアビジン１００μＬ（ＵＢＩ）を各ウェルに添加した。ＰＢＳ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを６回洗浄し、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質１００μＬを各ウェルに添加した。室温で暗所にて３時間、プレートを温置し、３０、９０及び１８０分に、発生する蛍光をモニターした（励起：４３０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）。
【０２４５】
図２６に示されているように、ＬＰＡ誘導性ＥＧＦＲチロシンリン酸化の阻害は、用量依存性であった。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の量が増加するにつれて、ＥＧＦＲチロシンリン酸化のより大きな阻害が観察された。
【０２４６】
図２５は、候補抗体調製物Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５はＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞中のトロンビン誘導性ＥＧＦＲリン酸化も効果的に阻害することを示す。用量依存性阻害が観察される。すなわち、より多くの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が添加されると阻害が増加した。図２６は、本明細書に提供される抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物によるＰＰＣ−１細胞中でのＬＰＡ誘導性ＥＧＦＲチロシンリン酸化の阻害が用量依存的であることを示す。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の量が増加するにつれて、図示されているように、ＥＧＦＲチロシンリン酸化のより大きな阻害が検出された。
【０２４７】
（実施例７）
ヒト抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によるＧＰＣＲ誘導性ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞遊走の阻害
本明細書に提供されている抗体がＧＰＣＲリガンドであるスフィンゴシン−１−リン酸によって誘導される細胞遊走を遮断するかどうかを調べるために、遊出実験を行った。
【０２４８】
血清飢餓状態にされたヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、３７℃で４５分間、細胞懸濁物に対する表記抗体とともに予め温置した。その後、細胞懸濁物（５０，０００細胞）５００ｍＬをコラーゲン１で被覆されたトランスウェル（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，８μｍ孔径）の最上チャンバー中に配置した。７５０ｍＬ培地（ＭＥＭ、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン、０．１％ＢＳＡ）のみ又はＧＰＣＲリガンドであるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を含有する培地を下部チャンバー中で使用した。３７℃で８時間の遊走後、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、統計学的評価のために、細胞の核を計数した。
【０２４９】
候補抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５を用いたこれらのＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞遊走アッセイに対する結果が、図２７に示されている。図示されているように、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞遊走を約７０％阻害した。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４５は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞遊走を約１００％阻害した。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−３９は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞遊走を約１００％阻害した。従って、これらの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体がＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞遊走を阻害する能力は多大である。
【０２５０】
（実施例８）
ヒト抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によるＭＣＦ−７細胞のＨＢ−ＥＧＦ誘導性遊走の阻害
本明細書に提供されている抗体が、抗体がなければＨＢ−ＥＧＦによって直接誘導される細胞遊走を遮断するかどうかを調べるために、遊出実験を行った。これらの試験の結果は、抗転移性癌の薬剤として開発するために、何れの抗体調製物を使用し得るかを明らかにする。
【０２５１】
血清飢餓状態にされたヒト乳癌ＭＣＦ７細胞の細胞懸濁物５００ｍＬ（５０，０００細胞）を、コラーゲン１で被覆されたトランスウェル（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、８μｍ孔径）の上部チャンバー中に配置した。１０μｇ／ｍＬＨＢ−ＥＧＦ抗体の存在下又は不存在下で、培地（ＭＥＭ、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン、０．１％ＢＳＡ）のみ又は２０ｎｇ／ｍＬＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を含有する培地７５０ｍＬを下部チャンバー中に配置した。３７℃で８時間の温置及び遊走後、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、統計学的評価のために、細胞の核を計数した。
【０２５２】
候補抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５を用いたこれらの遊走アッセイに対する結果が、図２８に示されている。図示されているように、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２は、ＭＣＦ−７細胞遊走を約５５％阻害した。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４５は、ＭＣＦ−７細胞遊走を約９３％阻害した。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−３９は、ＭＣＦ−７細胞遊走を約９８％阻害した。従って、これらの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体がＭＣＦ−７細胞遊走を阻害する能力は多大である。
【０２５３】
（実施例９）
上位１０個の抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の特徴
ＧＰＣＲ誘導性三重膜通過シグナル（ＴＭＰＳ）実験における上位１０個のハイブリドーマ由来抗体調製物に対する結果の要約が、下記表４に提供されている。ＴＭＰＳ実験は、ＳＣＣ９細胞中でのＬＰＡ刺激、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞中でのトロンビン刺激、ＳｋＯＶ−８細胞のＬＰＡ刺激及びＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のスフィンゴシン−１−リン酸遊走を含んだ。提供されているデータは、抗体が存在しないときの同じアッセイと比較された、アッセイ中で抗体調製物を使用したときに観察されたＴＭＰＳトランス活性化シグナルの％阻害を表す。各実験の上位３つの抗体は、太字で強調表示されている。
【０２５４】
【表４】
0005685442.tif 000010
【０２５５】
（実施例１０）
ヒト抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によるＨＢ−ＥＧＦ誘導性ＨＥＲ４チロシンリン酸化の阻害
本実施例は、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物がＨＥＲ４のＨＢ−ＥＧＦ誘導性チロシンリン酸化を阻害することを示す。ＨＥＲ４チロシンリン酸化に対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の効果を評価するために、以下の手法を使用した。
【０２５６】
１２５，０００細胞のＴ４７Ｄヒト乳癌細胞を、培地５００μＬ中、２４ウェルプレート上に播種した。無血清培地２００μＬ中で２４時間、細胞を飢餓状態にした。ＨＥＲ４チロシンリン酸化の検出のために、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥｒｂＢ４  ＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔを使用した。室温で一晩、マウス抗ヒトＥｒｂＢ４抗体１００μＬ（捕捉抗体１μｇ／ｍＬ）で透明なＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートを被覆した。被覆されたＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、ブロッキング溶液３００μＬ（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ）によって洗浄溶液を交換し、室温で２時間温置した。３７℃で３０分間、抗ＨＢ−ＥＧＦＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）の５倍濃度を加えた無血清培地５０μＬを５倍濃度のＨＢ−ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）とともに温置し、次いで、各ウェルに（２つ組みで）添加した。培地を除去し、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０ｍＭＮａＦ及び２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を基礎とする溶解緩衝液２００μＬを用いて、細胞を氷上で溶解した。ブロッキングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。細胞溶解液を洗浄されたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに直接移し、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩温置した。ＰＢＳ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを６回洗浄し、次いで、希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋５ｍＭＥＤＴＡ）中に希釈された抗ホスホチロシン−ＨＲＰ１００μＬ（検出抗体６００ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、室温で２時間温置した。ＰＢＳ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを６回洗浄し、室温で２０分間、テトラメチルベンジジン１００μＬ（ＴＭＢ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を各ウェルに添加した。１ＭＨ２ＳＯ４５０μＬの添加によって反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓプレートリーダー）。
【０２５７】
結果は、図２９に示されている。図示されているように、Ｕ２−４２．１又はＵ２−３９．１抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物の増加する濃度は、ＨＢ−ＥＧＦ誘導性ＨＥＲ４リン酸化の増加した阻害をもたらした。
【０２５８】
（実施例１１）
モノクローナル抗体の交叉反応性
本実施例は、カニクイザルＨＢ−ＥＧＦ、マウスＨＢ−ＥＧＦ及び関連するＥＧＦ様成長因子アムフィレグリンに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物の交叉反応性を示すさらなるデータを提供する。ＨＢ−ＥＧＦのサル及びマウス形態のクローニングに続いて、ＨＥＫ２９３細胞中に各発現構築物を形質移入し、ＦＡＣＳ実験中でこれらのタンパク質を結合する能力に関して、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を検査した。ＥＬＩＳＡフォーマットアッセイによって、アムフィレグリンの交叉反応性を検査した。
【０２５９】
１．カニクイザルＨＢ−ＥＧＦのクリーニング
本研究では、カニクイザルＨＢ−ＥＧＦプラスミドを調製した。カニクイザルＨＢ−ＥＧＦの配列に基づくプライマーを用いて、カニクイザル腎臓ｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってカニクイザルＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡをクローニングした。
【０２６０】
カニクイザルＨＢ−ＥＧＦの増幅のために使用したプライマーは、以下のとおりであった。
【０２６１】
フォワードプライマー：５’−ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＣＧ−３’（配列番号１０７８）
リバースプライマー：５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  Ｃ  −３’（配列番号１０７９）
Ｈｐａ１及びＸｈｏ１を用いてＰＣＲ産物を消化し、Ｈｉｎｄ３で消化されたｐＣＤＮＡ３．１中に連結した。精製後、ＤＨ５α細菌細胞中にカニクイザルＨＢ−ＥＧＦプラスミドを形質転換し、アンピシリン選択下で複製した。次いで、単一の形質転換されたコロニーを用いて、アンピシリン選択培地中でプラスミドを高度に発現させた。市販のＤＮＡ精製キットを用いて精製した後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にカニクイザルＨＢ−ＥＧＦプラスミドを一過性に形質移入した。
【０２６２】
２．マウスＨＢ−ＥＧＦのクローニング
本研究では、マウスＨＢ−ＥＧＦプラスミドを調製した。マウスＨＢ−ＥＧＦの配列に基づくプライマーを用いて、マウス肺ｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってマウスＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡをクローニングした。
【０２６３】
マウスＨＢ−ＥＧＦの増幅のために使用したプライマーは、以下のとおりであった。
【０２６４】
フォワードプライマー：５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  Ｇ−３’（配列番号１０８０）
リバースプライマー：５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＧＣＣ−３’（配列番号１０８１）
ＥｃｏＲ１及びＸｈｏ１を用いてＰＣＲ産物及びｐＣＤＮＡ３．１ベクターＤＮＡを消化し、連結した。精製後、Ｄｈ５α細菌細胞中にマウスＨＢ−ＥＧＦプラスミドを形質転換し、アンピシリン選択下で複製した。次いで、単一の形質転換されたコロニーを用いて、アンピシリン選択培地中でプラスミドを高度に発現させた。市販のＤＮＡ精製キットを用いて精製した後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にマウスＨＢ−ＥＧＦプラスミドを一過性に形質移入した。
【０２６５】
３．カニクイザル及びマウスＨＢ−ＥＧＦの形質移入及び発現
本明細書に記載されている抗体の交叉反応性をスクリーニングするために、リン酸カルシウム法を用いてカニクイザル又はマウスＨＥ−ＥＧＦプラスミドの何れかでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性に形質移入し、その後、ＦＡＣＳ分析によって分析した。
【０２６６】
従って、形質移入の３０時間前に、１５ｃｍ細胞培養プレート上で１６ｍＬ中に、３×１０６ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、７％ＣＯ２及び３７℃で温置した。ｄｄＨ２Ｏ７２０μＬ中のカニクイザル若しくはマウスＨＢ−ＥＧＦＤＮＡのＤＮＡ３２μｇ又は空のベクターを２．５ＭＣａＣｌ２及び２×ＢＢＳ（ｐＨ６．９６）と混合し、室温で１０分間温置した。温置後、細胞上に溶液を滴加し、３％ＣＯ２及び３７℃で８時間温置した。培地を浸漬した後、７％ＣＯ２及び３７℃で２４時間、新鮮な増殖培地とともに細胞を温置した。
【０２６７】
４．抗体の交叉反応性に関してスクリーニングするために、ＦＡＣＳ分析を行った
従って、ＰＢＳ中の１０ｍＭＥＤＴＡを用いて、２×１０５の形質移入された細胞を採集し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ、０．４％アジ化物）中に再懸濁し、９６ウェルの丸底プレート上に播種した。上清を除去するための１０００ｒｐｍでの３分間の遠心後、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体希釈（１００μＬ／ウェル）中に細胞を再懸濁し、４℃で４５分間温置した。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に１：１００希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）ロバ抗ヒト−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに再懸濁した。４℃、暗所で３０分間、細胞懸濁物を温置し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析した（ＦＡＣＳ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０２６８】
図３０Ａは、３つのｍＡｂ調製物がカニクイザルから得たプロＨＢ−ＥＧＦと交叉反応することを示す。
【０２６９】
図３０Ｂは、ＦＡＣＳ分析によって検出されたように、Ｕ２−４５ｍＡｂ調製物はマウスＨＢ−ＥＧＦと交叉反応することを示す。さらなる検査は、抗体Ｕ２−４６及びＵ２−５１もマウスＨＢ−ＥＧＦを検出していることを示した。しかしながら、抗体Ｕ２−４５．１は、ＥＧＦＲのマウスＨＢ−ＥＧＦ誘導性チロシンリン酸化を極めて弱く（５から１０％）中和するに過ぎなかった。
【０２７０】
５．アムフィレギュリン交叉反応性ＥＬＩＳＡアッセイに対するプロトコール
アムフィレギュリン（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  濃度ＰＢＳ中１ｎｇ／ｍＬ，  １０ｎｇ／ｍＬ，  １００ｎｇ／ｍＬ）の異なる濃度を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）中にて、４℃で一晩被覆した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；１５０μＬ／ウェル）でプレートを洗浄した後（６回）、室温で４時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ、１００μＬ／ウェル）とともにプレートを温置した。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。一次抗体として、抗体希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）中の５μｇ／ｍＬの精製ヒト抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を使用し、室温で９０分間温置した。洗浄緩衝液でプレートを６回洗浄し、二次抗ヒト−ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）抗体を添加し（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭＥＤＴＡ中の１：１００００）、室温で６０分間温置した。
【０２７１】
洗浄緩衝液でプレートを６回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を室温で１５分間添加した。２５０ｍＭＨＣｌの１００μＬを添加することによって、青色の発色を停止させた後、プレート読み取り装置（Ｔｈｅｒｍｏ  ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２７２】
図３０Ｃは、ＥＬＩＳＡ形式のアッセイによって測定したところ、抗体Ｕ２−４５はアムフィレギュリンに結合し、抗体Ｕ２−４６は弱く結合することを示す。Ｕ２−４５ｍＡｂは、アムフィレギュリンを結合するが、アムフィレギュリンに対するＵ２−４５．１のＫＤは（ＨＢ−ＥＧＦに対する０．０４３ｎＭと比較して）８ｎＭに過ぎなかった。また、Ｕ２−４５．１ｍＡｂは、ＡＲに対して非中和であった。
【０２７３】
（実施例１２）
抗ＨＢ−ＥＧＦＭａｂＵ２−４２．２、Ｕ２−３９．１、Ｕ２−４５．３、Ｕ２−２６．２及びＵ２−３４．１に対するＫｄ値の速度論的排除アッセイ分析
ＫｉｎＥｘＡ技術を用いて、ヒトＨＢ−ＥＧＦへのｍＡｂＵ２−４２．２、Ｕ２−３９．１、Ｕ２−４５．３及びＵ２−２６．２及びＵ２−３４．１の結合のＫＤを測定した。この目的のために、ＫｉｎＥｘＡ３０００装置を使用した。全てのｍＡｂ滴定に関して、４℃で一晩、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０中のＨＢ−ＥＧＦ（約２９μｇ）とアズラクトンビーズ５０ｍｇ結合した。ビーズへのＨＢ−ＥＧＦの連結後、ビーズを遠心し、ブロッキング緩衝液（１ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．３、１０ｍｇ／ｍＬＢＳＡ）を用いて１回洗浄し、再び遠心し、次いで、ビーズの表面上に存在する残存する反応性アズラクトン基を全て遮断するために、約２３℃で１から２時間、ブロッキング緩衝液中で温置した。ブロッキングの後、標準的なＫｉｎＥｘＡビーズ容器にビーズを移し、装置上に配置した。
【０２７４】
ＭＡｂＵ２−４２．２：ＫＤを測定するために、二重曲線分析を行った。ＫＤ調節された滴定のために、ＨＢ−ＥＧＦの漸増濃度を用いて、３７ｐＭの名目ｍＡｂ結合部位濃度を含有する１２の溶液を滴定し、ｍＡｂ調節された滴定曲線中で、１１１０ｐＭ結合部位を滴定した。各溶液は、１０ｍＬ（ＫＤ調節）又は２ｍＬ（ｍＡｂ調節）の合計容量を有し、約２３℃で、３０から３６時間（ＫＤ調節）又は６時間（ｍＡｂ調節）平衡化させた。滴定用の溶液は全て、容積測定用ガラス製品を用いて調製し、ＨＢ−ＥＧＦ濃度は１０．５ｎＭから２０５ｆＭまで変動した。これらの溶液の分析のために使用される装置法は、ガラス毛細管中にビーズを充填し、３つ組みで、１０分間（２．５ｍＬ、ＫＤ調節）又は１分（０．２５ｍＬ、ｍＡｂ調節）、０．２５ｍＬ／分でビーズカラムを通して、平衡化された溶液を流すビーズ充填工程からなった。続いて、ビーズ上に捕捉された遊離のｍＡｂ結合部位を標識するために、０．５ｍＬ／分で２分間、ビーズパックを通して、３．４ｎＭ（ＫＤ調節）又は１．１ｎＭ（ｍＡｂ調節）の蛍光標識されたｃｙ−５ヤギ抗ヒト（Ｆｃ特異的）ポリクローナル抗体を流した。ビーズパックからの蛍光発光を６７０ｎｍで、６２０ｎｍの励起を用いて測定した。
【０２７５】
添付のＫｉｎＥｘＡソフトウェアパッケージ（バージョン１．０．３）を用いて標準的に実施して、得られた蛍光測定を％遊離ｍＡｂ結合部位対総抗原濃度へ転換した。ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用いて、ドリフト補正因子を含めて、１：１平衡等温式に二重滴定曲線をフィッティングした。
【０２７６】
データに最適に合致するＫＤの値は５３ｐＭであり、それぞれ、３４ｐＭ及び８１ｐＭで９５％低及び高信頼限界を有していた。
【０２７７】
ＭＡｂＵ２−３９．１：ＫＤを測定するために、ＫＤ調節された滴定曲線を実施した。ＨＢ−ＥＧＦの漸増濃度を用いて、５５ｐＭの名目ｍＡｂ結合部位濃度を含有する１２の溶液を滴定した。各溶液は、１０ｍＬの合計容量を有し、約２３℃で、３０から３６時間平衡化させた。滴定用の溶液は全て、容積測定用ガラス製品を用いて調製し、ＨＢ−ＥＧＦ濃度は１０．５ｎＭから２０５ｆＭまで変動した。これらの溶液の分析のために使用される装置法は、ガラス毛細管中にビーズを充填し、３つ組みで、１０分間（２．５ｍＬ）、０．２５ｍＬ／分でビーズカラムを通して、平衡化された溶液を流すビーズ充填工程からなった。続いて、ビーズ上に捕捉された遊離のｍＡｂ結合部位を標識するために、０．５ｍＬ／分で２分間、ビーズパックを通して、３．４ｎＭの蛍光標識されたｃｙ−５ヤギ抗ヒト（Ｆｃ特異的）ポリクローナル抗体を流した。ビーズパックからの蛍光発光を６７０ｎｍで、６２０ｎｍの励起を用いて測定した。添付のＫｉｎＥｘＡソフトウェアパッケージ（バージョン１．０．３）を用いて、得られた蛍光測定を％遊離ｍＡｂ結合部位対総抗原濃度へ転換した。ビーズパックへのリガンド非特異的結合のために、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用いて、リガンド非特異的結合を含めた項を有する１：１平衡等温式に滴定曲線をフィッティングした。
【０２７８】
データに最適に合致するＫＤの値は７．８ｐＭであり、それぞれ、５．６ｐＭ及び１１ｐＭで９５％低及び高信頼限界を有していた。
【０２７９】
ＭＡｂＵ２−４５．３：ＫＤを測定するために、二重曲線分析を実施した。ＫＤ調節滴定のために、ＨＢ−ＥＧＦの漸増濃度を用いて、４０ｐＭの名目ｍＡｂ結合部位濃度を含有する１２の溶液を滴定し、ｍＡｂ調節された滴定曲線中で、１０６０ｐＭ結合を滴定した。各溶液は、１０ｍＬ（ＫＤ調節）又は２ｍＬ（ｍＡｂ調節）の合計容量を有し、約２３℃で、３０から３６時間（ＫＤ調節）又は６時間（ｍＡｂ調節）平衡化させた。滴定用の溶液は全て、容積測定用ガラス製品を用いて調製し、ＨＢ−ＥＧＦ濃度は５．２５ｎＭから１０２ｆＭまで変動した。これらの溶液の分析のために使用される装置法は、ガラス毛細管中にビーズを充填し、３つ組みで、１０分間（２．５ｍＬ、ＫＤ調節）又は１分間（０．２５ｍＬ、ｍＡｂ調節）、０．２５ｍＬ／分でビーズカラムを通して、平衡化された溶液を流すビーズ充填工程からなった。続いて、ビーズ上に捕捉された遊離のｍＡｂ結合部位を標識するために、０．５ｍＬ／分で２分間、ビーズパックを通して、３．４ｎＭ（ＫＤ調節）又は１．１ｎＭ（ｍＡｂ調節）の蛍光標識されたｃｙ−５ヤギ抗ヒト（Ｆｃ特異的）ポリクローナル抗体を流した。ビーズパックからの蛍光発光を６７０ｎｍで、６２０ｎｍの励起を用いて測定した。添付のＫｉｎＥｘＡソフトウェアパッケージ（バージョン１．０．３）を用いて標準的に実施して、得られた蛍光測定を％遊離ｍＡｂ結合部位対総抗原濃度へ転換した。ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用いて、ドリフト補正因子を含めた１：１平衡等温式に二重滴定曲線をフィッティングした。
【０２８０】
データに最適に合致するＫＤの値は４３ｐＭであり、それぞれ、２７ｐＭ及び６５ｐＭで９５％低及び高信頼限界を有していた。
【０２８１】
ＭＡｂＵ２−２６．２：ＫＤを測定するために、二重曲線分析を行った。ＫＤ調節された滴定のために、ＨＢ−ＥＧＦの漸増濃度を用いて、４１ｐＭの名目ｍＡｂ結合部位濃度を含有する１２の溶液を滴定し、ｍＡｂ調節された滴定曲線中で、１０６０ｐＭ結合部位を滴定した。各溶液は、１０ｍＬ（ＫＤ調節）又は２ｍＬ（ｍＡｂ調節）の合計容量を有し、約２３℃で、３０から３６時間（ＫＤ調節）又は６時間（ｍＡｂ調節）平衡化させた。滴定用の溶液は全て、容積測定用ガラス製品を用いて調製し、ＨＢ−ＥＧＦ濃度は２．６３ｎＭから５１．４ｆＭ（ＫＤ調節）まで及び５．２６ｎＭから１０３ｆＭまで（ｍＡｂ調節）変動した。これらの溶液の分析のために使用される装置法は、ガラス毛細管中にビーズを充填し、３つ組みで、１０分間（２．５ｍＬ、ＫＤ調節）又は１分（０．２５ｍＬ、ｍＡｂ調節）、０．２５ｍＬ／分でビーズカラムを通して、平衡化された溶液を流すビーズ充填工程からなった。続いて、ビーズ上に捕捉された遊離のｍＡｂ結合部位を標識するために、０．５ｍＬ／分で２分間、ビーズパックを通して、３．４ｎＭ（ＫＤ調節）又は１．１ｎＭ（ｍＡｂ調節）の蛍光標識されたｃｙ−５ヤギ抗ヒト（Ｆｃ特異的）ポリクローナル抗体を流した。ビーズパックからの蛍光発光を６７０ｎｍで、６２０ｎｍの励起を用いて測定した。添付のＫｉｎＥｘＡソフトウェアパッケージ（バージョン１．０．３）を用いて標準的に実施して、得られた蛍光測定を％遊離ｍＡｂ結合部位対総抗原濃度へ転換した。ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用いて、ドリフト補正因子を含めた１：１平衡等温式に二重滴定曲線をフィッティングした。
【０２８２】
データに最適に合致するＫＤの値は６１ｐＭであり、それぞれ、３７ｐＭ及び１００ｐＭで９５％低及び高信頼限界を有していた。
【０２８３】
ＭＡｂＵ２−３４．１：ＫＤを測定するために、ＫＤ調節された滴定曲線を実施した。ＨＢ−ＥＧＦの漸増濃度を用いて、４０ｐＭの名目ｍＡｂ結合部位濃度を含有する１２の溶液を滴定した。各溶液は、１０ｍＬの合計容量を有し、約２３℃で、３０から３６時間平衡化させた。滴定用の溶液は全て、容積測定用ガラス製品を用いて調製し、ＨＢ−ＥＧＦ濃度は５．２６ｎＭから１０３ｆＭまで変動した。これらの溶液の分析のために使用される装置法は、ガラス毛細管中にビーズを充填し、３つ組みで、１０分間（２．５ｍＬ）、０．２５ｍＬ／分でビーズカラムを通して、平衡化された溶液を流すビーズ充填工程からなった。続いて、ビーズ上に捕捉された遊離のｍＡｂ結合部位を標識するために、０．５ｍＬ／分で２分間、ビーズパックを通して、５．１ｎＭの蛍光標識されたｃｙ−５ヤギ抗ヒト（Ｆｃ特異的）ポリクローナル抗体を流した。ビーズパックからの蛍光発光を６７０ｎｍで、６２０ｎｍの励起を用いて測定した。添付のＫｉｎＥｘＡソフトウェアパッケージ（バージョン１．０．３）を用いて標準的に実施して、得られた蛍光測定を％遊離ｍＡｂ結合部位対総抗原濃度へ転換した。ビーズパックへのリガンド非特異的結合のために、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用いて、リガンド非特異的結合を含めた項を有する１：１平衡等温式に滴定曲線をフィッティングした。
【０２８４】
データに最適に合致するＫＤの値は５９ｐＭであり、それぞれ、３２ｐＭ及び８７ｐＭで９５％低及び高信頼限界を有していた。
【０２８５】
（実施例１３）
抗体親和性スキャッチャード分析の測定
間接的ＦＡＣＳスキャッチャード分析によって、本明細書に提供されている抗体の親和性測定を行った。この分析を実施するために、ＰＢＳ中の１０ｍＭＥＤＴＡを用いて、目的の２×１０５細胞を採集し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ、０．４％アジ化物）中に再懸濁し、９６ウェル丸底プレート上に播種した。上清を除去するために、１０００ｒｐｍで３分間遠心した後、２０μｇ／ｍＬから開始し、１：２希釈工程で希釈された抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体希釈（１００μＬ／ウェル）中に細胞を再懸濁した。細胞懸濁物を４℃で４５分間温置し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に１：１００希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）ロバ抗ヒト−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに再懸濁した。４℃、暗所で３０分間、細胞懸濁物を温置し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析した（ＦＡＣＳ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０２８６】
ＦＡＣＳスキャッチャード分析に従って、各測定のために蛍光平均を計算した。ＨＢ−ＥＧＦ抗体なしの細胞のバックグラウンド蛍光を各蛍光平均から差し引いた。ｘ値＝蛍光平均及びｙ値＝蛍光平均／ｍＡｂの濃度（ｎＭ）を有するスキャッチャードプロットを作製した。線形式の１／ｍの絶対値としてＫＤを得た。
【０２８７】
【表５】
0005685442.tif 000011
【０２８８】
（実施例１４）
アムフィレギュリンへの抗ＨＢ−ＥＧＦＭａｂＵ２４５．３結合に対するＫｄ値の速度論的排除アッセイ分析
ＫＤを求めるために、ＫＤ調節された滴定曲線を実施した。４．４ｎＭの名目ｍＡｂ結合部位濃度を含有する１２の溶液をアムフィレギュリンの漸増濃度で滴定した。各溶液は１０ｍＬの合計容量を有し、約２３℃で３０から３６時間平衡化させた。容積測定用ガラス製品を用いて、滴定用の全ての溶液を調製し、アムフィレギュリン濃度を１．２３μＭから２４ｐＭまで変動させた。これらの溶液の分析のために使用される装置法は、ガラス毛細管中にビーズを充填し、３つ組みで、１分間（０．２５ｍＬ）、０．２５ｍＬ／分でビーズカラムを通して、平衡化された溶液を流すビーズ充填工程からなった。続いて、ビーズ上に捕捉された遊離のｍＡｂ結合部位を標識するために、０．５ｍＬ／分で２分間、ビーズパックを通して、６８４ｐＭの蛍光標識されたｃｙ−５ヤギ抗ヒト（Ｆｃ特異的）ポリクローナル抗体を流した。ビーズパックからの蛍光発光を６７０ｎｍで、６２０ｎｍの励起を用いて測定した。
【０２８９】
添付のＫｉｎＥｘＡソフトウェアパッケージ（バージョン１．０．３）を用いて標準的に実施して、得られた蛍光測定を％遊離ｍＡｂ結合部位対総抗原濃度へ転換した。ビーズパックへのリガンド非特異的結合のために、各濃度で収集された３つのうち１つの反復試料のみを分析することができ（最も高い３つの２倍アムフィレギュリン濃度は分析から除外される。）、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用いて、１：１平衡等温式にフィッティングした。
【０２９０】
データに最適に合致するＫＤの値は５．０ｎＭであり、それぞれ、３．１ｎＭ及び７．７ｎＭで９５％低及び高信頼限界を有していた。
【０２９１】
（実施例１５）
上位の抗体調製物に対する選択基準
上位の抗体調製物を同定するために、以下の基準を使用した。ＴＭＰＳを阻害する強度、抗体がＥＧＦ受容体及びＨＥＲ４のチロシンリン酸化を阻害する程度を観察することによって測定されたＨＢ−ＥＧＦを直接阻害する強度、ＨＢ−ＥＧＦに対する抗体の親和性、他の分子に対する抗体の交叉反応性及びエピトープの特徴。
【０２９２】
（実施例１６）
抗Ｈｂ−Ｅｇｆ抗体はＨｕｖｅｃ細胞増殖及び管形成のＨＢ−ＥＧＦ刺激を阻害する
本実施例は、ＨＢ−ＥＧＦがヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖を刺激するのに対して、本明細書に提供されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は基底ＨＵＶＥＣ細胞増殖を阻害することを示す。また、本実施例によって示されているように、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、新血管新生に対するインビトロモデルであるＨＵＶＥＣ管形成を阻害する。ＨＵＶＥＣ増殖及び／又は血管新生を阻害する抗体調製物は、癌を治療するために有用であるのみならず、望ましくない血管新生（例えば、糖尿病性網膜症）を伴う非癌性症状を治療するためにも有用である。
【０２９３】
１．手順：フローサイトメトリーによるＨＵＶＥＣ細胞上でのＨＢ−ＥＧＦ発現の測定
ＦＡＣＳ分析によって、ヒト内皮細胞上のＨＢ−ＥＧＦ発現を測定した。従って、ＰＢＳ中の１０ｍＭＥＤＴＡを用いて目的の２×１０５細胞を採集し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ、０．４％アジ化物）中に再懸濁し、９６ウェル丸底プレート上に播種した。１０００ｒｐｍで３分間遠心した後、上清を除去し、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体希釈物（１００μＬ／ウェル、１０μｇ／ｍＬ抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体）中に細胞を再懸濁し、４℃で４５分間温置した。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に１：１００希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）抗ヒト−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに再懸濁した。４℃、暗所で３０分間、細胞懸濁物を温置し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析した（ＦＡＣＳ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０２９４】
ＨＵＶＥＣ増殖に対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の効果を検査するために、ＥＧＭ−２、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ゲンタマイシン−アムホテリシン並びにｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ及びＩＧＦ−１（Ｃａｍｂｒｅｘ）を含有する２％ＦＣＳを加えた培地を含有する４８ウェルの各々に、約５０００個のＨＵＶＥＣ細胞を播種した。３７℃で一晩、細胞を温置した後、０．５％ＦＣＳを含有するＰＢＳを用いて、細胞を２回洗浄した。次いで、成長因子を補充しないＥＧＭ−２、０．５％ＦＣＳ中で、細胞を８時間飢餓状態にした。ＨＢ−ＥＧＦ又は抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物を、５００μＬの飢餓培地中に添加した。
【０２９５】
次いで、さらに６０時間細胞を培養し、トリプシン処理し、計数した。
【０２９６】
ＨＵＶＥＣ管形成に対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の効果を検査するために、成長因子低減マトリゲル（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２００μＬを４８ウェル上に播種した。４８ウェル当りＨＵＶＥＣ培地２５０μＬを添加した（ＥＢＭ−２＋ヒドロコルチゾン＋アスコルビン酸ゲンタマイシン−アムフォテリシン＋０．２５％ＦＣＳ，Ｃａｍｂｒｅｘから入手）。２０分間の事前温置後、培地５０μＬ＋ＨＢ−ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＵ２−４２、Ｕ２−３９若しくはＵ２−４５抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（１０μｇ／ｍＬ）を含有する０．２５％ＦＣＳ中に２０，０００個のＨＵＶＥＣ細胞を添加した。培養ウェルの代表的な領域の光学顕微鏡写真を得ることによって、管形成をモニターした。定量的分析のために、ＨＵＶＥＣ管の閉鎖領域を計数した。
【０２９７】
２．結果
図３０中のＦＡＣＳ分析によって示されているように、ＨＵＶＥＣ上にＨＢ−ＥＧＦが発現される。細胞増殖検査の結果が、図３２ＡからＢに提供されている。図３２Ａに示されているように、ＨＢ−ＥＧＦは、ＨＵＶＥＣ細胞増殖を約３８％刺激する。しかしながら、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２、Ｕ２−３９又はＵ２−４５を添加すると、細胞増殖のこのような刺激は、約８％から１４％阻害される（図３１Ｂ）。このアッセイにおいて、Ｕ２−３９抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物が、阻害の最も高いレベルを与えた。
【０２９８】
管形成検査の結果が、図３３ＡからＭに提供されている。図３４ＡからＣに示されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体なしの対照アッセイは、ＨＵＶＥＣ細胞が集合して環状構造又は「管」を形成することを示している。しかしながら、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物Ｕ２−４２、Ｕ２−３９又はＵ２−４５を添加すると、このような管形成が阻害される。観察される管の数の要約が、図３３Ｍに提供されている。図３３Ｍに示されているように、Ｕ２−４２抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物が管退行の最高の加速を与え、次いで、Ｕ２−３９抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物が高い加速を与えた。
【０２９９】
（実施例１７）
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体はＨＢ−ＥＧＦによって刺激されるコロニー形成及び基底コロニー形成を阻害する
本明細書中に提供されている抗体が足場非依存性細胞増殖を阻害する能力を調べるために、軟寒天アッセイを実施した。軟寒天コロニー形成アッセイは、形質転換された細胞のみが軟寒天中で増殖することができるので、このような形質転換された細胞を検査するための標準的なインビトロアッセイである。
【０３００】
このアッセイを実施するために、ＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、１０ｎｇ／ｍＬのＨＢ−ＥＧＦ及び２０μｇ／ｍＬの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又は陰性対照としてのＩｇＧ２（ＳＩＧＭＡ）とともに、ＯＶＣＡＲ−８、ＢＭ−１６４０及びＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を温置し、０．２％Ｄｉｆｃｏノーブル寒天中に再懸濁した。９６ウェルプレート中に、４つ組みで、０．４％寒天下層上に、細胞懸濁物を播種し、ＩＭＤＭ培地を重層した。コロニーを約１４日間形成させ、次いで、ＭＴＴ４０μＬ（Ｓｉｇｍａ、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）で４時間染色した。ＨＴＳＢｏｎｉｔ（ＬｅｍｎａＴｅｃ）コロニー形成ソフトウェアによって、ＨＢ−ＥＧＦの刺激及び抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の阻害効果を定量した。
【０３０１】
別のアッセイにおいて、ＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、２０μｇ／ｍＬの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又は陰性対照としてのＩｇＧ２（ＳＩＧＭＡ）とともに、（ＳｋＯＶ−３クローン７１又は７４、図３４Ｄ及びＥに応じて）７５０又は１０００個の細胞を３７℃で３０分間、予め温置し、０．４％Ｄｉｆｃｏノーブル寒天（又はクローン７４に対しては０．２％）中に再懸濁した。９６ウェルプレート中に、４つ組みで、０．７５％寒天下層（クローン７４に関しては０．４％）上に、細胞懸濁物を播種し、ＩＭＤＭ培地を重層した。類似のアッセイにおいて、２０％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中の２０μｇ／ｍＬの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又は陰性対照としての２０μｇ／ｍＬのＩｇＧ２（ＳＩＧＭＡ）とともに、３７℃で３０分間、２０００Ｂ×ＰＣ−３細胞（図３４Ｆ）を事前温置した。０．４％Ｄｉｆｃｏノーブル寒天中に細胞を再懸濁し、９６ウェルプレート中に、４つ組みで、０．７５％寒天下層上に、細胞懸濁物を播種した。ウェルにＩＭＤＭ培地を重層した。両層は、２０％ＦＣＳを含有した。
【０３０２】
約１４日間、コロニーを形成させ、次いで、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）４０μＬで４時間染色した。結果が図３４ＡからＦに示されており、ＨＢ−ＥＧＦがコロニー形成を刺激すること（図３４ＡからＣ）、及び抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によって基底コロニー形成（図３４ＤからＦ）が著しく低下されることを示す。図示されているように、例えば、図３４Ａでは、ＨＢ−ＥＧＦがＯＶＣＡＲ−８細胞を刺激して、ＨＢ−ＥＧＦなしに培養された対照ＯＶＣＥＲ−８細胞より著しく大きな平均コロニーサイズを形成する。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦの存在下で、ＯＶＣＡＲ−８細胞を抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−３９抗体とともに培養すると、ＨＢ−ＥＧＦ処理なしの対照細胞に対して観察されたサイズと同様のサイズまで平均コロニーサイズが低下した（図３４Ａ）。（前立腺癌組織から得られた）ＢＭ１６０４細胞に対して、同様の結果が観察された（図３４Ｂ参照）。抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−４５及びＵ２−４２抗体も、ＢＭ１６０４コロニー形成を阻害した。
【０３０３】
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、ＮＣＩ−Ｈ２２６肺癌細胞のＨＢ−ＥＧＦによって刺激されたコロニー形成も阻害する（図３４Ｃ）。図３６Ｃに示されているように、ＨＢ−ＥＧＦの存在下で、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−３９抗体とともに培養すると、平均コロニーサイズは、ＨＢ−ＥＧＦ処理なしの対照細胞に対して観察されたサイズと同様のサイズまで低下した。
【０３０４】
コロニーの数及びコロニーサイズは、本発明の抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体での処理によって低下する（図３４ＤからＦ）。従って、図３４Ｄは、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が（プロＨＢ−ＥＧＦ発現構築物で安定的に形質移入されたＳｋＯＶ−３卵巣癌細胞から得られる）ＳｋＯＶ−３ＨＢ−ＥＧＦクローン７１細胞によって形成された基底コロニーの数を低下させることを示している。図示されているように、ＨＢ−ＥＧＦを過剰発現する対照ＳｋＯＶ−３細胞は、多数のコロニーを形成した。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦの存在下で、抗ＨＢ−ＥＧＦＵ２−４２又はＵ２−３９抗体とともに、ＳｋＯＶ−３ＨＢ−ＥＧＦｃｌ．７１細胞を培養すると、コロニーの数は劇的に低下した。同様に、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、卵巣癌組織に由来するＳｋＯＶ−３（クローン７４）細胞及び膵臓腺癌組織に由来するＢｘＰＣ３細胞のコロニー形成を阻害する（図３４ＥからＦ）。
【０３０５】
これらのデータは、極めて多様な癌細胞種によるコロニー形成及び腫瘍が、本明細書に提供されているＵ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５抗体調製物などの本発明の抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によって阻害され得ることを示唆する。
【０３０６】
（実施例１８）
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体はインビボで腫瘍増殖を阻害する
図３７は、ＳＣＩＤマウスを用いた異種移植実験において形成された膵臓のＢｘＰＣ３腫瘍の平均容積を図示している。図示されているように、ビヒクル対照と比較した場合に、確立された腫瘍増殖は、抗体調製物Ｕ２−４２及び／又はＵ２−３９の存在下において著しく阻害される。図３８Ａにおいて、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体Ｕ２−４２、Ｕ２−３９及びＵ２−４５は、ＥＦＯ−２７ＨＢ−ＥＧＦクローン５８細胞の確立された増殖をインビボで阻害することが示されている。腫瘍増殖阻害の効果は用量依存的であることが示され得、２５ｍｇ／ｋｇが高度に有効な処理であったのに対して、１又は５ｍｇ／ｋｇなど、より用量が低いほど効率性は低くなった（図３８Ｂ）。
【０３０７】
（実施例１９）
抗ｅｇｆｒ抗体であるＥｒｂｉｔｕｘを用いた併用療法における抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体
図３５は、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を用いたＥＦＯ−２７ＨＢ−ＥＧＦｃｌ．５８細胞の単一薬剤阻害が中度から強度であることを示している。しかしながら、抗ＨＢ−ＥＧＦ及び抗ＥＧＦＲ抗体の用量調節された組み合わせにおいて、コロニー形成の阻害は極めて効果的である。さらに、インビボ異種移植片増殖は、抗ＨＢ−ＥＧＦ及び抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせによって強く阻害され、卵巣癌腫瘍増殖の完全な退行がもたらされる（図３８Ｃ）。
【０３０８】
（実施例２０）
様々な癌細胞種上でのＨＢ−ＥＧＦ発現
ヒト細胞株上でのＨＢ−ＥＧＦ発現をＦＡＣＳ分析によって測定した。この分析を実施するために、ＰＢＳ中の１０ｍＭＥＤＴＡを用いて、２×１０５細胞を採集し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ、０．４％アジ化物）中に再懸濁し、９６ウェルの丸底プレート上に移した。上清を除去するための１０００ｒｐｍでの３分間の遠心後、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体希釈（１００μＬ／ウェル）中に細胞を再懸濁し、４℃で４５分間温置した。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に１：１００希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）ロバ抗ヒト−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに再懸濁した。４℃、暗所で３０分間、細胞懸濁物を温置し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析した（ＦＡＣＳ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０３０９】
これらのアッセイの結果は、下表６に示されている。
【０３１０】
【表６】
0005685442.tif 000012
【０３１１】
（実施例２１）
免疫組織化学及びＥＬＩＳＡによる組織及び体液中のＨＢ−ＥＧＦを検出するための抗ＨＢ−ＥＧＦ
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体Ｕ２−４２及びＵ２−３９がヒトの固定された試料中に発現されたＨＢ−ＥＧＦを染色する能力に関して、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体Ｕ２−４２及びＵ２−３９を検査した。図３９Ａに示されているように、両抗体は、ヒト腎臓尿細管細胞の顕著な膜及び細胞質染色を示すのに対して、対照は一切の染色を示さない。患者組織試料中でのＨＢ−ＥＧＦの免疫組織化学的検出に加えて、ＨＢ−ＥＧＦは様々な体液中に成長因子として放出される。コーティング試薬としてのヒト抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体に基づいて、４０ｐｇ／ｍＬを下回るレベルまで、液体試料中のＨＢ−ＥＧＦを検出するＥＬＩＳＡが確立された（図３９Ｂ）。
【０３１２】
（実施例２２）
抗体の正準クラス
最後の実施例に記載されているように、上位抗体をコードする遺伝子の配列決定を行った。抗体を正準クラスに割り当てるために、この配列データを使用した。
【０３１３】
Ｃｈｏｔｉａ他は、各免疫グロブリン鎖の超可変領域に対する「正準クラス」に関して抗体構造を記載した（Ｃｈｏｔｈｉａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １９６（４）：９０１−１７）。様々な免疫グロブリンのアミノ酸配列とそれらの抗原結合部位の三次元構造間の関係を決定するために、様々な免疫グロブリンのＦａｂ及びＶＬ断片の原子構造を分析した。Ｃｈｏｔｉａ他は、免疫グロブリンの充填を通じて、水素結合又は稀なφ、ψ若しくはω立体構造を採る能力が超可変領域の主鎖立体構造に関して主に必要とされる残基は比較的少ないことを発見した。これらの残基は、超可変領域内又は保存されたα−シートフレームワーク中の部位に存在することが見出された。未知の構造を有する免疫グロブリンの配列を調べることによって、Ｃｈｏｔｈｉａ他は、多くの免疫グロブリンが公知の構造の１つとサイズが類似する超可変領域を有し、観察された立体構造に必要とされる部位に同一の残基をさらに含有することを示す。
【０３１４】
彼らの発見は、これらの超可変領域が公知の構造中の超可変領域に近い立体構造を有することを示唆した。超可変領域の５つに関して、立体構造のレパートリーは、比較的少数の別個の構造的クラスに限定されるように見受けられた。超可変領域のこれらの一般的に存在する主鎖立体構造は、「正準構造」と名付けられた。Ｃｈｏｔｉａ他１９８９；  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８３及び他者（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５）によるさらなる研究によって、抗体の６つの超可変領域のうち少なくとも５つに対して、主鎖立体構造の小さなレパートリーが存在することを確認した。
【０３１５】
各抗体調製物の相補性決定領域（ＣＤＲ）の正準クラスを決定するために、それらを分析した。知られているとおり、正準クラスは、抗体軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の他、抗体重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２に対してのみ割り当てられている。下表は、分析の結果を要約する。正準クラスのデータは、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３（Ｈ１−Ｈ２−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３）（「ＨＣＤＲ」は重鎖ＣＤＲを表し、「ＬＣＤＲ」は軽鎖ＣＤＲを表す。）の形態である。従って、例えば、１−３−２−１−１の正準クラスは、正準クラス１に属するＨＣＤＲ１、正準クラス３に属するＨＣＤＲ２、正準クラス２に属するＬＣＤＲ１、正準クラス１に属するＬＣＤＲ２及び正準クラス１に属するＬＣＤＲ３を有する抗体を表す。
【０３１６】
抗体中のアミノ酸が各正準クラスに対して定義されたアミノ酸と合致する特定の正準クラスへの割り当てが為された。各正準クラスに対して定義されたアミノ酸は、例えば、上に参照されているＣｈｏｔｉａ他による論説中に見出すことができる。表７及び表８は、ＨＢ−ＥＧＦ抗体の各々に対する正準クラスの割り当てを報告する。合致する正準クラスが存在しなかった場合には、文字ｓと数字（「ｓ１８」など（ＣＤＲのサイズが１８であることを意味する。））で正準クラスの割り当てをマークする。
【０３１７】
【表７】
0005685442.tif 000013
0005685442.tif 000014
【０３１８】
【表８】
0005685442.tif 000015
0005685442.tif 000016
【０３１９】
表９は、クラス当りの抗体の数の分析である。左列中に表記された特定の正準クラスを有する抗体の数が、右列に示されている。
【０３２０】
最も一般的に見られた構造は、１−３−２−１−１である。合計４０ｍＡｂのうち８つが、この組み合わせを有していた。
【０３２１】
【表９】
0005685442.tif 000017
【０３２２】
（実施例２３）
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のエピトープマッピング
本実施例は、抗体調製物によって認識されるエピトープのマッピングを記載する。
【０３２３】
検査された抗体：ＨＢ−ＥＧＦの活性を中和することができる、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ由来の５つのヒトモノクローナル抗体調製物、Ｕ２−３９、Ｕ２−４２、Ｕ２−４５、Ｕ２−２６及びＵ２−１９を分析した。これらのモノクローナル抗体調製物のうち４つが、ヒトＨＢ−ＥＧＦに対して特異的であることが示されたのに対して、抗体調製物Ｕ２−４５はマウスＨＢ−ＥＧＦ及びヒトアムフィレギュリンとの幾らかの交叉反応性を示した。これらの中和抗体調製物の全ては、ＭＣＡＢビン７及び８にマッピングされる（以下参照）。
【０３２４】
１．エピトープマッピング
ＰＣＲ増幅によって、ＨｅＬａｍＲＮＡからヒトＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡを単離し、Ｉｇκシグナルペプチド配列を用いて、ｍｙｃ−Ｈｉｓ融合タンパク質として、ｐＳｅｃＴＡｇベクター中に成熟ＨＢ−ＥＧＦ配列をクローニングした。成熟ＨＢ−ＥＧＦポリペプチドを２９３Ｔ細胞中に発現させ、培地中に分泌した。
【０３２５】
部位指定突然変異導入によって、ＨＢ−ＥＧＦのジフテリア毒素結合部位及びＥＧＦ受容体結合部位を変異させた。
【０３２６】
ＥＧＦ様ドメインの第三のジスルフィド結合を喪失するＨＢ−ＥＧＦ（Ｌｏｕｋｉａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ１９５：８１−８６）の短い形態もクローニングした。
【０３２７】
配列番号１０８２を有するＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメイン（ＤＰＣＬＲＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧＥＲＣＨＧＬＳＬＰ）をｐＳｅｃＴａｇ中にクローニングし、Ｍｙｃ−Ｈｉｓ融合タンパク質として発現及び分泌された。
【０３２８】
２．結果
Ｕ２−３９、Ｕ２−４２、Ｕ２−４５、Ｕ２−２６及びＵ２−１９抗体調製物の全てが不連続なエピトープを認識する。抗体の何れもが、ＨＢ−ＥＧＦの短縮形態を認識しない。
【０３２９】
５つの抗体調製物全てに対する結合部位がＥＧＦ様ドメイン内にあり、これは以下の配列：ＤＰＣＬＲＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧＥＲ  ＣＨＧＬＳＬＰ（配列番号１０８２）を有する成熟タンパク質の残基４４から８６を含んでいた。Ｕ２−３９、Ｕ２−４２、Ｕ２−４５、Ｕ２−２６及びＵ２−１９抗体調製物の全ての結合のために、ＥＧＦ様ドメイン中の第三のジスルフィド結合が必要とされる。
【０３３０】
３．部位指定突然変異導入による抗体結合部位の構造−機能分析
ヒトプロＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメイン内の１から４つの残基をマウスプロＨＢ−ＥＧＦ中に本来見出される対応するアミノ酸残基と置換することによって、１２の独立した変異をＨＢ−ＥＧＦ中に作製した。
【０３３１】
本抗体調製物の多くが種選択的であることに鑑みて、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質と異なる種由来の関連するタンパク質との間の公知の差において、ＨＢ−ＥＧＦエピトープを同定するための部位指定突然変異導入を行った。特に、ヒト及びマウスＨＢ−ＥＧＦ間のアミノ酸の差は、以下のとおりである。Ｋ１２２Ｒ、Ｖ１２４Ｌ、Ｋ１２５Ｑ、Ｉ１３３Ｋ及びＨ１３５Ｌ。
【０３３２】
エピトープマッピングのためのＨＢ−ＥＧＦ変異体ポリペプチド配列の完全なリストが、表１０に提供されている。所望の変異体タンパク質をコードする変異体ＨＢ−ＥＧＦ核酸を２９３Ｔ細胞中で一過性に発現し、モノクローナル抗体結合をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０３３３】
従って、これらの変異を用いて、ＨＢ−ＥＧＦ変異体ポリペプチドを作製し、本抗体調製物がＨＢ−ＥＧＦ変異体ポリペプチドになお結合するかどうかを確認するために、このような変異体ポリペプチドを検査した。本抗体調製物がＨＢ−ＥＧＦ変異体ポリペプチドに結合しなければ、変異を受けたアミノ酸は抗体結合のために重要な可能性があり、従って、エピトープの重要な一部を形成した。
【０３３４】
表１１は、得られた結合の結果を要約し、「あり」は表記変異に関わらず、結合が起こったことを示し、「なし」は表記変異によって結合が実質的に失われたことを示し、「低下」は変異が存在したときに、低下した結合が起こったことを示す。
【０３３５】
【表１０】
0005685442.tif 000018
【０３３６】
【表１１】
0005685442.tif 000019
【０３３７】
これらの結合研究は、Ｕ２−４２及びＵ２−３９抗体調製物がジフテリア毒素結合ドメインを認識し、Ｆ１１５、Ｌ１２７及びＥ１４１がジフテリア毒素の結合にとって重要であることを示唆する。
【０３３８】
さらに、Ｆ１１５Ｙ又はＥ１４１Ｈ変異がＨＢ−ＥＧＦ中に存在する場合、Ｕ２−４２抗体調製物に関して、結合が実質的に消失する。従って、Ｐｈｅ−１１５及びＧｌｕ−１４１はＵ２−４２抗体の結合にとって重要である。Ｐｈｅ−１１５が変異を受けたときに、Ｕ２−４５抗体調製物による結合が低下するので、この抗体調製物もＰｈｅ−１１５を必要とするようである。
【０３３９】
Ｐｈｅ−１１５及びＬｅｕ−１２７残基の変異の何れもが抗体結合を実質的に消失させるので、Ｕ２−３９抗体調製物はＨＢ−ＥＧＦを結合するためにＰｈｅ−１５及びＬｅｕ−１２７を必要とする。
【０３４０】
Ｕ２−１９、Ｕ２−２６及びＵ２−４５抗体調製物は、残基１１７から１２０（ＩＨＧＥ）間の保存された領域を結合する。表１１に示されているように、これらの残基の少なくとも１つが抗体調製物Ｕ２−１９及びＵ２−２６の結合にとって不可欠であるので、抗体調製物Ｕ２−１９及びＵ２−２６はＩｌｅ−１３３及び／又はＨｉｓ−１３５のエピトープも認識する。
【０３４１】
その結合特性に基づいて、表１２中に列記されている関係「ビン」の中に抗体を配置した。
【０３４２】
ビニングは、抗原への結合に関する抗体の競合に基づいて、抗体をグループ分けする方法である（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：９１−９８参照）。
【０３４３】
ビンの割り当ては、検査されている抗体の全てに対して観察された結合パターンがどのように異なるかに依存する。従って、ビンは、他の手段によって決定されたエピトープと必ずしも相関するものではなく、単にエピトープを大まかに定義するために使用することができる。
【０３４４】
【表１２】
0005685442.tif 000020
【０３４５】
一般に、Ｕ２−４５抗体調製物のエピトープマッピングは、ビン７抗体調製物がマウスＨＢ−ＥＧＦ及びヒトアムフィレギュリンと相互作用することを示す。
【０３４６】
Ｆ１１５からＡｌａ又はＴｙｒへの変異は、Ｕ２−４５抗体の結合親和性に影響を及ぼす。しかしながら、Ｕ２−４５抗体結合は、他の幾つかのビン７抗体調製物に影響を及ぼしたＩ１３３及びＨ１３５の変異によって影響を受けなかった。ＩＨＧＥヒトＨＢ−ＥＧＦ配列をマウスＨＢ−ＥＧＦ及びヒトアフィレギュリン中に存在するＬＨＤＧＶに変化させると、全てのビン７抗体調製物が結合できなかった。従って、ＩＨＧＥ残基（１１７から１２０）は、ビン７抗体調製物に対するエピトープを形成する可能性がある。
【０３４７】
ＥＧＦＲへのＨＢ−ＥＧＦ変異体の結合を伴うさらなる部位指定突然変異導入研究は、ＥＧＦ受容体へのＨＢ−ＥＧＦの最適な結合のためにＡｓｐ−１０６及びＰｒｏ−１０７を含む残基の何れもが必要であることを示唆する。さらに、ＥＧＦ受容体へのＨＢ−ＥＧＦの結合のために必要とされるＬｅｕ−１４８は、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体調製物の何れの結合にも関与していないように見受けられた。
【０３４８】
（実施例２４）
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の中心的要素の配列
本実施例は、図１から２１中の抗体調製物の配列を提供する。
【０３４９】
（実施例２５Ａ）
引っ掻きアッセイ−ＣＬＳ３５４上皮扁平上皮癌細胞（口）のＨＢ−ＥＧＦ誘導性遊走の阻害
本発明の抗体がなければＨＢ−ＥＧＦによって直接誘導される細胞の遊走を、本発明の抗体が遮断するかどうかを調べるために、引っ掻き実験を行った。
【０３５０】
１２ウェルプレート上、１ｍＬ中の培地（１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ培地）中に、１×１０６のＣＬＳ３５４細胞を播種し、一晩血清飢餓状態にした（０．５％ＦＣＳを加えた培地）。細胞が集密な層に達した後、無菌のプラスチックチップを用いて、ウェルの真ん中を引っ掻いた。ＰＢＳで細胞を洗浄し、１０μｇ／ｍＬのＵ２−３９、ｅｒｂｉｔｕｘ又はヒトＩｇＧの存在下又は不存在下において、単独で、又は２０ｎｇ／ｍＬのＨＢ−ＥＧＦを含有するで、引っ掻かれたＣＬＳ３５４細胞を処理した。３７℃で１２時間の温置後、実験を停止した。培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃で氷冷した１００％メタノールを用いて固定し、クレゾール−バイオレットで染色し、洗浄し、一晩乾燥させた。文献に記載するために、写真を撮影した。
【０３５１】
図４０Ａは、ＨＢ−ＥＧＦ処理が引っ掻きの閉鎖を刺激すること、及び本発明の抗体Ｕ２−３９が引っ掻き内へのＣＬＳ３５４上皮扁平上皮癌細胞のＨＢ−ＥＧＦ媒介性遊走を阻害することを示している。
【０３５２】
（実施例２５Ｂ）
遊出アッセイ−デトロイト５６２上皮癌細胞（咽頭）のＨＢ−ＥＧＦ誘導性遊走の阻害
本発明の抗体がなければＨＢ−ＥＧＦによって直接誘導される細胞遊走を、本発明の抗体が遮断するかどうかを調べるために、遊出実験を行った。
【０３５３】
血清飢餓状態にされたヒト上皮癌細胞の細胞懸濁液５００ｍＬ（５０，０００細胞）を、フィブロネクチンによって被覆されたトランスウェルの上部チャンバー（ＢＤＦａｌｃｏｎ、８μｍ孔径）中に配置した。１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ、Ｕ２−３９又はＥｒｂｉｔｕｘ抗体の存在下又は不存在下の培地７５０ｍＬ（非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）及びラクトアルブミン加水分解物（０．１％）、９０％；ウシ胎児血清１０％、ペニシリン−ストレプトマイシン、０．１％ＢＳＡ）を加えた、単独の又は２０ｎｇ／ｍＬＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するイーグルのＢＳＳ中の最小必須培地（Ｅａｇｌｅ））の分取試料を、３７℃で３０分の事前温置後に、下部チャンバー中に配置した。３７℃で６時間の温置及び遊走後、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、評価のために、トランスウェルの写真を撮影した。
【０３５４】
結果は、ＨＢ−ＥＧＦ抗体Ｕ２−３９が、Ｅｒｂｉｔｕｘ処理によるＨＢ−ＥＧＦ媒介性細胞遊走の阻害と同等に、ＨＢ−ＥＧＦ誘導性デトロイト５６２上皮癌細胞遊走を効果的に阻害することを示す。
【０３５５】
（実施例２６）
球状体を基礎とする細胞血管新生アッセイ−ＶＥＧＦによって刺激された上皮細胞出芽の阻害
本発明の抗体がコラーゲンマトリックス中でのＶＥＧＦ誘導性内皮細胞（ＥＣ）の出芽を阻害することができるかどうかを調べるために、球状体を基礎とする細胞血管新生アッセイを行った。球状体を一晩凝集させるために、プラスチック皿の上での懸滴中に、５００細胞で、一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種した。コラーゲン溶液０．９ｍＬ（２ｍｇ／ｍＬ）中に５０ＥＣの球状体を播種し、重合させるために、２４ウェルプレートの各ウェル中にピペット操作で添加した。重合前のコラーゲン溶液（異なる濃度）中に、本発明の抗体Ｕ２−３９を直接混合し、重合されたゲルの上部に１０倍濃縮された作業希釈液１００μＬをピペット操作で添加することによって、成長因子ＶＥＧＦ−Ａ（２５ｎｇ／ｍＬ）を３０分後に添加した。３７℃で２４時間、プレートを温置し、４％パラホルムアルデヒドを添加することによって固定した。倒立顕微鏡及びデジタル画像化ソフトウェアＡｎａｌｙｓｉｓ３．２を用いて、球状体当りの累積出芽長を測定する画像解析システムによって、ＥＣ球状体の出芽強度を定量した。
【０３５６】
図４１Ａは、データ点当りの無作為に選択された１０個の球状体の累積的出芽長の平均を図示する。図４１Ｂは、Ｕ２−３９によるデータ点当りの無作為に選択された１０個の球状体の累積的出芽長の相対的阻害を示す。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０３を用いて、ＩＣ５０曲線のフィッティング及びＩＣ５０値の計算を行った。
【０３５７】
実施例２６の結果は、コラーゲンマトリックスを用いる球状体を基礎とするアッセイにおいて、本発明の抗体Ｕ２−３９が用量依存的様式でＶＥＧＦ−Ａによって刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞の出芽を阻害することを示す。ＨＵＶＥＣの出芽は、５．２×１０−８ＭのＩＣ５０値で阻害された。
【０３５８】
（実施例２７）
ヒト腫瘍異種移植試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析−インビボでの腫瘍のＣＤ３１染色の阻害
インビボでの血管新生の阻害に対する本発明の抗体Ｕ２−３９の効力を調べるために、免疫組織化学分析によって、Ｕ２−３９又はＥｒｂｉｔｕｘで処理されたヒト腫瘍異種移植片を分析した。
【０３５９】
ＨＢ−ＥＧＦを過剰発現させるために、ヒト卵巣腺腫細胞株ＥＦＯ２７を遺伝的に操作し、ＳＣＩＤマウス中での異種移植研究のためにクローンＥＦＯ２７−ＣＩ５８を選択した。７週齢の雌のＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスの左脇腹中に、ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）１００μＬ中の３×１０６ＥＦＯ２７−ＣＩ５８細胞を皮下注射した。２５０ｍｍ３の平均腫瘍容積の腫瘍を有するマウスを、１０匹の動物を含むグループへ無作為に振り分けた。２５ｍｇ／ｋｇのＵ２−３９又は２５ｍｇ／ｋｇのＥｒｂｉｔｕｘ又は対照ビヒクルＰＢＳの毎週投薬により動物の腹腔内を３週間処理した。２８日後、マウスを屠殺し、原発性腫瘍組織を集め、腫瘍の半分を液体窒素中に瞬間凍結し、−８０℃で保存した。
【０３６０】
ガラスチャンバースライド上に調製された腫瘍の５から８μｍ切片を、４℃で１０分間、１００％アセトン中に固定し、完全に乾燥させた。非特異的結合部位を遮断するために、固定された腫瘍切片を有するスライドを、アビジンＤブロック（１５分）、ビオチンブロック（１５分）及び１．２５％ＢＳＡ溶液（１時間）で処理した。各処理工程の間に、スライドをＰＢＳで２回洗浄した。腫瘍脈管構造の免疫組織化学的検査のために、古典的な内皮細胞マーカーＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１（血小板内皮細胞接着分子−１；Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）の別称でも知られる。）の発現を、（１．２５％ＢＳＡ溶液中に希釈され、湿気を与えたチャンバー中にて、室温で２時間温置された）２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３１抗体でのスライドの処理によって分析した。ビオチン化されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（室温で３０分）及びＡｌｅｘａ５４６ストレプトアビジン（暗所で１５分）を適用することによって、検出を行った。各処理工程の間に、ＰＢＳ洗浄工程を行った。暗所で、ＤＡＰＩを加えたＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ戴置培地とともに切片を戴置し、文献に記載するために写真を撮影し（蛍光顕微鏡）、４℃で保存した。
【０３６１】
図４２は、Ｅｒｂｉｔｕｘ処理された又は対照処理された腫瘍異種移植片と比べて、Ｕ２−３９で処理されたヒト腫瘍異種移植片が低下した内皮細胞マーカー染色（ＣＤ３１染色）を示すことを示している。この結果は、本発明の抗体のインビボでの抗血管新生効力を示す。
【０３６２】
（実施例２８）
インビボ卵巣癌異種移植モデル−シスプラチン及びアバスチンとのＵ２−３９の組み合わせ治療
単独療法として、又はシスプラチン若しくはアバスチンと組み合わせて投与された本発明の抗体の抗腫瘍効率を評価するために、卵巣癌異種移植研究を行った。
【０３６３】
ＨＢ−ＥＧＦを過剰発現するように、ヒト卵巣腺癌細胞株ＥＦＯ２７を遺伝子操作した。ＳＣＩＤマウス中での異種移植研究のためにクローンＥＦＯ２７−ＣＩ５８を選択した。
７週齢の雌のＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスの左脇腹中に、ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）１００μＬ中の３×１０６ＥＦＯ２７−ＣＩ５８細胞を皮下注射した。７５と１７５ｍｍ３の間の平均腫瘍容積の腫瘍を有するマウスを、１０匹の動物を含むグループへ無作為に振り分けた。２５ｍｇ／ｋｇのＵ２−３９、２５ｍｇ／ｋｇアバスチン又は５ｍｇ／ｋｇのシスプラチン又は対照ビヒクルＰＢＳの毎週投薬により動物の腹腔内を処理した。アバスチンとのＵ２−３９の組み合わせはそれぞれ１２．５ｍｇ／ｋｇで与えられ、シスプラチンとのＵ２−３９の組み合わせは５ｍｇ／ｋｇシスプラチンとともに２５ｍｇ／ｋｇ抗体で与えられた。原発性腫瘍サイズを週３回測定した。カリパスでの測定後、Ｗ２×Ｌ／２（Ｌ＝長さ及びＷ＝腫瘍の垂直幅）に従って、腫瘍のサイズを計算した。５００ｍｍ３に進行するための時間を確定するために、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ対数ランク法を使用した（統計学的理由のために、「事象」として定義した。）。
【０３６４】
図４３Ａは、シスプラチンとのＵ２−３９の組み合わせが、シスプラチン単独を用いた治療より、投与期間中により強い腫瘍低下をもたらした。さらに、Ｕ２−３９とシスプラチンの組み合わせは、Ｕ２−３９単独療法と比べて、５００ｍｍ３まで中央値腫瘍サイズが進行する時間を遅延させた。
【０３６５】
図４３Ｂの結果は、単独療法としてアバスチンを用いた治療と比べて、５００ｍｍ３まで腫瘍容積が進行するまでの時間を著しく遅延させたことを示している。
【０３６６】
本明細書に参照又は掲載されている全ての特許及び公報は、本発明が属する分野の当業者の技術水準を示唆するものであり、このような参照されている各特許又は公報は、参照によってその全体が個別に組み込まれている場合又はその全体が本明細書に記載されている場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６７】
出願人は、引用されているこのような特許又は公報から得られる全てのデータ及び情報を本明細書中に物理的に組み込む権利を留保する。
【０３６８】
本明細書に記載されている具体的な方法及び組成物は、好ましい実施形態の代表例であり、典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書を検討することにより、他の目的、態様及び実施形態が当業者に想到され、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含される。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示されている本発明に対して、置換及び修飾を施し得ることが当業者に自明である。本明細書中に例示的に記載されている本発明は、本明細書中に必須であると具体的に開示されていないあらゆる要素又は限定なしに適切に実施され得る。本明細書に例示的に記載されている方法及び過程は、工程の異なる順序で適切に実施することができ、本明細書又は特許請求の範囲に示されている工程の順序に必ずしも限定されるものではない。本明細書及び特許請求の範囲に使用されている単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上複数表記を含まないことが明らかでなければ、複数表記を含む。従って、例えば、「１つの抗体」という表記は、このような抗体の複数（例えば、複数抗体の溶液又は一連の抗体調製物）を含む。いかなる場合においても、特許は、本明細書に具体的に開示されている具体的な実施例又は実施形態又は方法に限定されると解釈してはならない。いかなる場合においても、出願人による応答書面において、米国特許商標庁の審査官又は他の職員若しくは被用者によって為された陳述が明確に且つ限定又は留保なしに明示的に採用された場合を除き、特許はこのような陳述によって一切限定されるものではない。
【０３６９】
使用されている用語及び表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用されており、このような用語及び表現の使用において、示されている及び記載されている特徴又はその一部の均等物を排除することを意図するものではなく、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲内で様々な修飾が可能であることが認識される。従って、好ましい実施形態及び場合によって存在する特徴によって、本発明を具体的に開示してきたが、本明細書に開示されている概念の修飾及び改変が当業者によって想到され得、このような修飾及び改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に属するものと考えられる。
【０３７０】
本発明は、広範に及び包括的に本明細書に記載されている。包括的な開示に属するより狭い種及び亜族のグループの各々も本発明の一部を形成する。これは、取り出された構成要素が本明細書中に明示されているかどうかと関わらず、属から何れかの主題を除去する但し書き又は否定的限定を有する本発明の包括的記載を含む。
【図１Ａ】
0005685442.tif 000021
【図１Ｂ】
0005685442.tif 000022
【図１Ｃ】
0005685442.tif 000023
【図１Ｄ】
0005685442.tif 000024
【図１Ｅ】
0005685442.tif 000025
【図１Ｆ】
0005685442.tif 000026
【図１Ｇ】
0005685442.tif 000027
【図１Ｈ】
0005685442.tif 000028
【図１Ｉ】
0005685442.tif 000029
【図１Ｊ】
0005685442.tif 000030
【図１Ｋ】
0005685442.tif 000031
【図１Ｌ】
0005685442.tif 000032
【図１Ｍ】
0005685442.tif 000033
【図１Ｎ】
0005685442.tif 000034
【図１Ｏ】
0005685442.tif 000035
【図１Ｐ】
0005685442.tif 000036
【図２Ａ】
0005685442.tif 000037
【図２Ｂ】
0005685442.tif 000038
【図２Ｃ】
0005685442.tif 000039
【図２Ｄ】
0005685442.tif 000040
【図２Ｅ】
0005685442.tif 000041
【図２Ｆ】
0005685442.tif 000042
【図２Ｇ】
0005685442.tif 000043
【図２Ｈ】
0005685442.tif 000044
【図２Ｉ】
0005685442.tif 000045
【図２Ｊ】
0005685442.tif 000046
【図２Ｋ】
0005685442.tif 000047
【図２Ｌ】
0005685442.tif 000048
【図２Ｍ】
0005685442.tif 000049
【図２Ｎ】
0005685442.tif 000050
【図２Ｏ】
0005685442.tif 000051
【図３Ａ】
0005685442.tif 000052
【図３Ｂ】
0005685442.tif 000053
【図３Ｃ】
0005685442.tif 000054
【図３Ｄ】
0005685442.tif 000055
【図３Ｅ】
0005685442.tif 000056
【図３Ｆ】
0005685442.tif 000057
【図３Ｇ】
0005685442.tif 000058
【図３Ｈ】
0005685442.tif 000059
【図３Ｉ】
0005685442.tif 000060
【図３Ｊ】
0005685442.tif 000061
【図３Ｋ】
0005685442.tif 000062
【図４Ａ】
0005685442.tif 000063
【図４Ｂ】
0005685442.tif 000064
【図４Ｃ】
0005685442.tif 000065
【図４Ｄ】
0005685442.tif 000066
【図４Ｅ】
0005685442.tif 000067
【図４Ｆ】
0005685442.tif 000068
【図４Ｇ】
0005685442.tif 000069
【図４Ｈ】
0005685442.tif 000070
【図４Ｉ】
0005685442.tif 000071
【図４Ｊ】
0005685442.tif 000072
【図４Ｋ】
0005685442.tif 000073
【図４Ｌ】
0005685442.tif 000074
【図４Ｍ】
0005685442.tif 000075
【図４Ｎ】
0005685442.tif 000076
【図４Ｏ】
0005685442.tif 000077
【図５Ａ】
0005685442.tif 000078
【図５Ｂ】
0005685442.tif 000079
【図６Ａ】
0005685442.tif 000080
【図６Ｂ】
0005685442.tif 000081
【図６Ｃ】
0005685442.tif 000082
【図６Ｄ】
0005685442.tif 000083
【図６Ｅ】
0005685442.tif 000084
【図６Ｆ】
0005685442.tif 000085
【図７Ａ】
0005685442.tif 000086
【図７Ｂ】
0005685442.tif 000087
【図７Ｃ】
0005685442.tif 000088
【図７Ｄ】
0005685442.tif 000089
【図７Ｅ】
0005685442.tif 000090
【図８Ａ】
0005685442.tif 000091
【図８Ｂ】
0005685442.tif 000092
【図８Ｃ】
0005685442.tif 000093
【図８Ｄ】
0005685442.tif 000094
【図８Ｅ】
0005685442.tif 000095
【図８Ｆ】
0005685442.tif 000096
【図８Ｇ】
0005685442.tif 000097
【図８Ｈ】
0005685442.tif 000098
【図９Ａ】
0005685442.tif 000099
【図９Ｂ】
0005685442.tif 000100
【図９Ｃ】
0005685442.tif 000101
【図９Ｄ】
0005685442.tif 000102
【図９Ｅ】
0005685442.tif 000103
【図９Ｆ】
0005685442.tif 000104
【図１０Ａ】
0005685442.tif 000105
【図１０Ｂ】
0005685442.tif 000106
【図１１Ａ】
0005685442.tif 000107
【図１１Ｂ】
0005685442.tif 000108
【図１２Ａ】
0005685442.tif 000109
【図１２Ｂ】
0005685442.tif 000110
【図１２Ｃ】
0005685442.tif 000111
【図１３Ａ】
0005685442.tif 000112
【図１３Ｂ】
0005685442.tif 000113
【図１３Ｃ】
0005685442.tif 000114
【図１３Ｄ】
0005685442.tif 000115
【図１３Ｅ】
0005685442.tif 000116
【図１３Ｆ】
0005685442.tif 000117
【図１３Ｇ】
0005685442.tif 000118
【図１３Ｈ】
0005685442.tif 000119
【図１３Ｉ】
0005685442.tif 000120
【図１３Ｊ】
0005685442.tif 000121
【図１３Ｋ】
0005685442.tif 000122
【図１３Ｌ】
0005685442.tif 000123
【図１３Ｍ】
0005685442.tif 000124
【図１３Ｎ】
0005685442.tif 000125
【図１３Ｏ】
0005685442.tif 000126
【図１３Ｐ】
0005685442.tif 000127
【図１３Ｑ】
0005685442.tif 000128
【図１３Ｒ】
0005685442.tif 000129
【図１３Ｓ】
0005685442.tif 000130
【図１３Ｔ】
0005685442.tif 000131
【図１３Ｕ】
0005685442.tif 000132
【図１３Ｖ】
0005685442.tif 000133
【図１４Ａ】
0005685442.tif 000134
【図１４ＡＡ】
0005685442.tif 000135
【図１４ＡＢ】
0005685442.tif 000136
【図１４ＡＣ】
0005685442.tif 000137
【図１４Ｂ】
0005685442.tif 000138
【図１４Ｃ】
0005685442.tif 000139
【図１４Ｄ】
0005685442.tif 000140
【図１４Ｅ】
0005685442.tif 000141
【図１４Ｆ】
0005685442.tif 000142
【図１４Ｇ】
0005685442.tif 000143
【図１４Ｈ】
0005685442.tif 000144
【図１４Ｉ】
0005685442.tif 000145
【図１４Ｊ】
0005685442.tif 000146
【図１４Ｋ】
0005685442.tif 000147
【図１４Ｌ】
0005685442.tif 000148
【図１４Ｍ】
0005685442.tif 000149
【図１４Ｎ】
0005685442.tif 000150
【図１４Ｏ】
0005685442.tif 000151
【図１４Ｐ】
0005685442.tif 000152
【図１４Ｑ】
0005685442.tif 000153
【図１４Ｒ】
0005685442.tif 000154
【図１４Ｓ】
0005685442.tif 000155
【図１４Ｔ】
0005685442.tif 000156
【図１４Ｕ】
0005685442.tif 000157
【図１４Ｖ】
0005685442.tif 000158
【図１４Ｗ】
0005685442.tif 000159
【図１４Ｘ】
0005685442.tif 000160
【図１４Ｙ】
0005685442.tif 000161
【図１４Ｚ】
0005685442.tif 000162
【図１５Ａ】
0005685442.tif 000163
【図１５Ｂ】
0005685442.tif 000164
【図１５Ｃ】
0005685442.tif 000165
【図１５Ｄ】
0005685442.tif 000166
【図１５Ｅ】
0005685442.tif 000167
【図１５Ｆ】
0005685442.tif 000168
【図１５Ｇ】
0005685442.tif 000169
【図１５Ｈ】
0005685442.tif 000170
【図１５Ｉ】
0005685442.tif 000171
【図１５Ｊ】
0005685442.tif 000172
【図１５Ｋ】
0005685442.tif 000173
【図１５Ｌ】
0005685442.tif 000174
【図１５Ｍ】
0005685442.tif 000175
【図１６Ａ】
0005685442.tif 000176
【図１６Ｂ】
0005685442.tif 000177
【図１６Ｃ】
0005685442.tif 000178
【図１６Ｄ】
0005685442.tif 000179
【図１６Ｅ】
0005685442.tif 000180
【図１６Ｆ】
0005685442.tif 000181
【図１６Ｇ】
0005685442.tif 000182
【図１６Ｈ】
0005685442.tif 000183
【図１６Ｉ】
0005685442.tif 000184
【図１６Ｊ】
0005685442.tif 000185
【図１６Ｋ】
0005685442.tif 000186
【図１６Ｌ】
0005685442.tif 000187
【図１７Ａ】
0005685442.tif 000188
【図１７Ｂ】
0005685442.tif 000189
【図１８Ａ】
0005685442.tif 000190
【図１８Ｂ】
0005685442.tif 000191
【図１８Ｃ】
0005685442.tif 000192
【図１８Ｄ】
0005685442.tif 000193
【図１８Ｅ】
0005685442.tif 000194
【図１８Ｆ】
0005685442.tif 000195
【図１９Ａ】
0005685442.tif 000196
【図１９Ｂ】
0005685442.tif 000197
【図１９Ｃ】
0005685442.tif 000198
【図１９Ｄ】
0005685442.tif 000199
【図１９Ｅ】
0005685442.tif 000200
【図１９Ｆ】
0005685442.tif 000201
【図１９Ｇ】
0005685442.tif 000202
【図２０Ａ】
0005685442.tif 000203
【図２０Ｂ】
0005685442.tif 000204
【図２０Ｃ】
0005685442.tif 000205
【図２０Ｄ】
0005685442.tif 000206
【図２０Ｅ】
0005685442.tif 000207
【図２０Ｆ】
0005685442.tif 000208
【図２０Ｇ】
0005685442.tif 000209
【図２０Ｈ】
0005685442.tif 000210
【図２０Ｉ】
0005685442.tif 000211
【図２０Ｊ】
0005685442.tif 000212
【図２０Ｋ】
0005685442.tif 000213
【図２１Ａ】
0005685442.tif 000214
【図２１Ｂ】
0005685442.tif 000215
【図２１Ｃ】
0005685442.tif 000216
【図２１Ｄ】
0005685442.tif 000217
【図２１Ｅ】
0005685442.tif 000218
【図２１Ｆ】
0005685442.tif 000219
【図２１Ｇ】
0005685442.tif 000220
【図２１Ｈ】
0005685442.tif 000221
【図２１Ｉ】
0005685442.tif 000222
【図２１Ｊ】
0005685442.tif 000223
【図２１Ｋ】
0005685442.tif 000224
【図２２ａ】
0005685442.tif 000225
【図２２ｂ】
0005685442.tif 000226
【図２３】
0005685442.tif 000227
【図２４】
0005685442.tif 000228
【図２５】
0005685442.tif 000229
【図２６】
0005685442.tif 000230
【図２７】
0005685442.tif 000231
【図２８】
0005685442.tif 000232
【図２９】
0005685442.tif 000233
【図３０Ａ】
0005685442.tif 000234
【図３０Ｂ】
0005685442.tif 000235
【図３０Ｃ】
0005685442.tif 000236
【図３１】
0005685442.tif 000237
【図３２Ａ】
0005685442.tif 000238
【図３２Ｂ】
0005685442.tif 000239
【図３３Ａ−Ｍ】
0005685442.tif 000240
【図３４Ａ】
0005685442.tif 000241
【図３４Ｂ】
0005685442.tif 000242
【図３４Ｃ】
0005685442.tif 000243
【図３４Ｄ】
0005685442.tif 000244
【図３４Ｅ】
0005685442.tif 000245
【図３４Ｆ】
0005685442.tif 000246
【図３５】
0005685442.tif 000247
【図３６】
0005685442.tif 000248
【図３７】
0005685442.tif 000249
【図３８Ａ】
0005685442.tif 000250
【図３８Ｂ】
0005685442.tif 000251
【図３８Ｃ】
0005685442.tif 000252
【図３９Ａ】
0005685442.tif 000253
【図３９Ｂ】
0005685442.tif 000254
【図４０Ａ】
0005685442.tif 000255
【図４０Ｂ】
0005685442.tif 000256
【図４１Ａ】
0005685442.tif 000257
【図４１Ｂ】
0005685442.tif 000258
【図４２】
0005685442.tif 000259
【図４３Ａ】
0005685442.tif 000260
【図４３Ｂ】
0005685442.tif 000261
【配列表】
0005685442000001.app