(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
0005801572.tif 000007
上記式（１）中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基であり、
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基または炭素数１〜４のアルキル基である、
物質である、ＰＰＡＲγ活性化剤。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、水素原子であり、
Ｒ３が、水素原子、メチル基またはエチル基である、請求項１に記載のＰＰＡＲγ活性化剤。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２が、水素原子であり、
Ｒ３が、メチル基である、請求項２に記載のＰＰＡＲγ活性化剤。
【請求項４】
前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への細胞分化促進活性を有し、肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＰＰＡＲγ活性化剤。
【請求項５】
インスリン抵抗性に起因する疾病に対する予防若しくは治療のための請求項１〜４のいずれか１項に記載のＰＰＡＲγ活性化剤。
【請求項６】
糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症またはアルツハイマーの予防または治療に用いられる、請求項５に記載のＰＰＡＲγ活性化剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＰＰＡＲγ活性化剤を有効成分として含有する、インスリン抵抗性に起因する疾病に対する予防剤若しくは治療剤。
【請求項８】
糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症またはアルツハイマーの予防または治療に用いられる、請求項７に記載の予防剤若しくは治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際糖尿病連合（ＩＤＦ）の発表によると、世界の２００７年現在の糖尿病人口は２億４，６００万人であり、２０２５年には３億８，０００万人に増加すると予測されている。糖尿病は、未治療の状態、または血糖値管理が不十分の状態で放置すると、三大合併症である神経障害、網膜症及び腎症に加えて、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、皮膚合併症や下肢合併症など、様々な病気を引き起こすことが知られている。そして、現在、世界中で年間約３８０万人が、糖尿病に起因して命を落としている。
【０００３】
糖尿病の原因の一つに、インスリン抵抗性（グルコース代謝の異常）が挙げられる。インスリン抵抗性とは、インスリンの作用効果が低下している状態であり、場合によっては、血糖を調節しようとして体内のインスリン分泌が過剰になり、高インスリン血症に至る。インスリン抵抗性は、肥満体の人に比較的多く見られる。基礎代謝を上回る栄養分が継続的に細胞に取り込まれると脂肪細胞が肥大化し、これにより、インスリンの働きを向上させる物質（アディポネクチン）の分泌量が減る一方、インスリンの働きを阻害する物質（ＴＮＡ−αや遊離脂肪酸）が多く分泌されるようになる。そのため、インスリンの作用効果が低下していき、やがて糖尿病を疾患しうる。
【０００４】
さらに、インスリン抵抗性は、遺伝的影響、並びに特定の栄養素の欠乏、過剰なカロリー摂取及び運動不足などの環境の影響によって生じるものとされている。インスリン抵抗性は、メタボリックシンドロームの主要な因子の１つであることも分かっている。メタボリックシンドロームとは、空腹時の血糖値が高く、糖尿病、高血圧、異常脂血症、腹部肥満、痛風やアテローム性の動脈硬化などを発症させうる総合的な代謝異常をいう。米国では、約４，７００万人もの人間（成人の約４人に１人）がメタボリックシンドロームに罹患していると報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
インスリン抵抗性を改善する治療薬の成分として、チアゾリジン誘導体が知られている。該治療薬の作用機序について説明すると、該誘導体が受容体であるＰＰＡＲγに結合し、ＰＰＡＲγの活性を向上させる。ＰＰＡＲとは、ステロイド受容体スーパーファミリーに属する核内受容体タンパク質であり、現在までにα，γ，δの三つのサブタイプが報告されている。このうち、ＰＰＡＲαは、肝臓、膵臓、骨格筋に多く発現し、脂肪酸燃焼を調節し、ＰＰＡＲδは、骨格筋をはじめとする各組織に普遍的に存在し、ＰＰＡＲγは、脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしている。活性化されたＰＰＡＲγは、前駆脂肪細胞を肥大化していない正常な脂肪細胞に分化誘導すると同時に、肥大化した脂肪細胞のアポトーシスを誘導する。分化した脂肪細胞は、アディポネクチンを積極的に分泌するため、糖や脂質の代謝が活発になり、血液中からの糖の取り込みが促進され、インスリン抵抗性を改善する。このような脂肪細胞の働きは、糖尿病のみならず、高脂血症の予防や治療に繋がる。しかし、上記治療薬は、肝機能障害、浮腫、心肥大の副作用を引き起こす問題点があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＪＡＭＡ，２８７，ｐ．３５６−３５９，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、チアゾリジン誘導体とは異なる構造を有する、ＰＰＡＲγのアゴニスト活性を向上させる安全性の高い物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、下記式（１）：
【０００９】
【化１】
0005801572.tif 000002
【００１０】
上記式（１）中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基であり、
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基または炭素数１〜４のアルキル基である、
物質である、ＰＰＡＲγ活性化剤である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、チアゾリジン誘導体とは異なる構造を有する、ＰＰＡＲγのアゴニスト活性を向上させる安全性の高い物質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＰＰＡＲγ活性化能の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜本発明の第１＞
本発明の第１は、下記式（１）：
【００１４】
【化２】
0005801572.tif 000003
【００１５】
上記式（１）中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基であり、
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基または炭素数１〜４のアルキル基である、
物質である、ＰＰＡＲγ活性化剤である。
【００１６】
（Ｒ１およびＲ２）
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基である。ここで、炭素数１〜４のアルキル基としては、直鎖状、分枝状、環状のいずれであってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基などが挙げられる。中でも、ＰＰＡＲγ活性を高くするという観点で、ブチル基、プロピル基、エチル基、メチル基が好ましく、より好ましくは、エチル基またはメチル基である。また、炭素数１〜４のアシル基としては、直鎖状、分枝状、環状のいずれであってもよく、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基等が挙げられる。中でも、ＰＰＡＲγ活性を高くするという観点で、ブチリル基、プロピオニル基またはアセチル基が好ましい。
【００１７】
Ｒ１およびＲ２としては、ＰＰＡＲγ活性を高くするという観点で、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、ブチル基、プロピル基、エチル基、メチル基である。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、水素原子の組み合せ；水素原子、メチル基の組み合せ；メチル基、メチル基の組み合せ；メチル基、プロピル基の組み合せである。特に好ましくは、Ｒ１およびＲ２いずれとも、水素原子の組み合わせである。
【００１８】
（Ｒ３）
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基または炭素数１〜４のアルキル基である。ここで、炭素数１〜４のアルキル基の具体例は、（Ｒ１およびＲ２）で述べた通りである。中でも、Ｒ３は、ＰＰＡＲγ活性を高くするという観点で、水素原子、メチル基またはエチル基が好ましく、特に好ましくは、メチル基である。
【００１９】
以上より、Ｒ１〜Ｒ３の好ましい組み合わせは、ＰＰＡＲγ活性を高くするという観点で、好ましくは、Ｒ１およびＲ２が、水素原子であり、Ｒ３が、水素原子、メチル基またはエチル基である組み合せであり；さらに好ましくは、Ｒ１およびＲ２が、水素原子であり、Ｒ３が、メチル基である組み合せである。
【００２０】
なお、上記式（１）で示される物質がＰＰＡＲγ活性を示すメカニズムは以下の通りと推測される。ただし、本発明の技術的範囲が、かかるメカニズムによって制限されないのは言うまでもない。すなわち、上記式（１）で示される物質が、ＰＰＡＲγのアゴニスト（作動薬）となって作用し、ＰＰＡＲγが核内受容体転写因子であるレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子のプロモーター領域にあるＰＰＡＲ応答配列（ＰＰＲＥ）にリガンド依存的に結合し、標的遺伝子の転写を促進させることにある。
【００２１】
なお、前記式（１）で示される物質は、様々な立体異性体が考えられるが、特に好ましくは、以下（２）の構造を有する。
【００２２】
【化３】
0005801572.tif 000004
【００２３】
ここで、２’、３’、４’が、それぞれ独立して、逆の立体配置もありうる。
【００２４】
前記式（１）で示される物質を準備する方法としては、従来公知の知見を参照し、あるいは組み合わせることによって、合成することができる。あるいは、市販品を購入することによって準備してもよい。市販品としては、シグマ社が型番Ｄ５０１１で市販している、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンがある。
【００２５】
ここで、前記式（１）で示される物質を準備するための合成方法について説明すると、アデノシンの無水ジメチルホルムアミド溶液に、２，２−ジメトキシプロパン及び無水ｐ−トルエンスルホン酸を加え撹拌し、２’，３’−イソプロピリデンアデノシン（化合物１）を得；ついで、化合物１の無水ピリジン溶液に、ｐ−トルエンスルホニルクロリドを加え撹拌し、２’，３’−イソプロピリデンー５’−（ｐ−トルエンスルホニル）アデノシン（化合物２）を得；ついで、ナトリウムチオメトキシドのジメチルホルムアミド−メタノール溶液に化合物２を加え撹拌し、２’，３’−イソプロピリデンー５’−メチルチオアデノシン（化合物３）を得；最後に、化合物３のテトラヒドロフラン溶液に、０．１Ｎの塩酸を加えることにより、５’−メチルチオアデノシンを合成することができる。（例えば、特表２００７−５３１７２４  Ｐ２３−２６に記載の方法を参照し、本明細書に参考として引用される）。
【００２６】
特に、前記式（１）中、Ｒ１およびＲ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基である物質；は、例えば、食品（貴醸酒、清酒）などに含まれる成分であるので、それを抽出して、適宜精製をすることによって、準備してもよい。言い換えれば、前記式（１）で示される物質は、食品（貴醸酒、清酒）などに含まれる成分であり、ＰＰＡＲγ活性化剤として使用する際に、安全性が高いと言える（参考文献：日本醸造協会雑誌  Vol.71, No.6, Page.469-475、日本醸造協会雑誌  Vol.70, No.8, Page.585-587 (1975)、参考文献：生化学辞典、第３版、東京化学同人  Ｐ１４０２）。
【００２７】
この安全性の高いＰＰＡＲγ活性化剤は、前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への細胞分化促進活性を有し、肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するため、本発明の第２で後述もするが、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症、アルツハイマーなどの予防または治療に用いることができる。
【００２８】
＜本発明の第２＞
本発明の第２は、本発明の第１のＰＰＡＲγ活性化剤を有効成分として含有する、医薬品である。本発明の第２の医薬品としては、インスリン抵抗性に起因する疾病に対する予防剤若しくは治療剤であれば特に制限させることはなく、例えば、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症、アルツハイマー（特開２００８−２８５４３８号公報参照）などに対する予防剤または治療剤などが挙げられる。
【００２９】
本発明の第２の医薬品としては、前記本発明の第１のＰＰＡＲγ活性化剤を単体で、または製薬上許容される担体と配合した、または製薬上許容される溶剤に溶解もしくは懸濁した組成物として、治療の施行前または施行中、または施行後に、経口的または非経口的に患者に投与される。
【００３０】
本剤を経口投与用とする場合には、前記本発明の第１のＰＰＡＲγ活性化剤を単体で、または適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルロースカルシウム、カルボシキメチルセルロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤または希釈剤等と適宜混合して、錠剤、粉剤、乳剤、懸濁剤、液剤、散剤（粉末）、丸剤、および顆粒剤等の固形製剤にすることができる。また、硬質または軟質のゼラチンカプセル等を用いてカプセル剤としてもよい。これらの固形製剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート、メタアクリレートコポリマー等の被覆用基剤（コーティング剤）を用いて腸溶性被覆（腸溶性コーティング）を施してもよい。さらに、前記本発明の第１のＰＰＡＲγ活性化剤を、精製水、生理食塩水等の一般的に用いられる不活性希釈剤に溶解して、必要に応じて、この溶液に浸潤剤、乳化剤、分散助剤、界面活性剤、甘味料、フレーバー、芳香物質等を適宜添加することにより、シロップ剤、エリキシル剤等の液状製剤とすることもできる。
【００３１】
また、非経口投与用とする場合には、前記本発明の第１のＰＰＡＲγ活性化剤を精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理的食塩水、リンガー溶液（リンゲル液）、ロック溶液等の生理的塩類溶液、エタノール、グリセリン及び慣用される界面活性剤等と適当に組み合わせた滅菌された水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソームまたはエマルジョンとして、好ましくは注射用滅菌水溶液として、静脈内、皮下、筋肉内等に投与される。この際、液状製剤は、生理学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨを有することが好ましい。また、ローション剤、懸濁剤、乳剤等の液状製剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏等の半固形製剤、散剤、粉剤（粉状）もしくは用時溶解（液状）して塗布するための顆粒剤等の固形製剤として、または貼付剤などの外用剤として、標的部位およびその周辺部位に経皮的に投与してもよい。さらに、ペレットによる埋め込み、または坐薬用基剤を用いた坐薬として投与されることも可能である。上述したうち、好ましい製剤や投与形態等は、担当の医師によって選択される。前記医薬品のローション剤、クリーム剤及び軟膏などの半固形製剤は、前記医薬品を、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤及び懸濁化剤などよりなる群から選択される一種以上と適宜混和することにより得られる。
【００３２】
本発明の第２の医薬品に含まれる、本発明の第１のＰＰＡＲγ活性化剤の濃度は、投与形態、疾病の種類や重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、一般的には、医薬品の原料の全質量に対して０．０１〜８０質量％、好ましくは０．１〜６０質量％である。特に、本発明の製剤が経口投与される場合には、医薬品の原料の全質量に対して０．００１〜１００質量％、好ましくは０．０１〜１００質量％であり、非経口投与される場合には、医薬品の原料の全質量に対して０．０１〜８０質量％、好ましくは０．１〜６０質量％であることが好ましい。
【００３３】
本発明の第２の医薬品に含まれる、本発明の第１のＰＰＡＲγ活性化剤の用量は、患者の年齢、体重及び症状、目的とする投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって異なり、正確な量は医師により決定されるものであるが、通常、経口、非経口投与ともに、ＰＰＡＲγ活性化剤の投与量換算で、毎回０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量の範囲である。より好ましくは、ＰＰＡＲγ活性化剤の投与量換算で、毎回０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量の範囲である。
【００３４】
＜本発明の第３＞
本発明の第３は、下記式（１）：
【００３５】
【化４】
0005801572.tif 000005
【００３６】
上記式（１）中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアシル基であり、
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基または炭素数１〜４のアルキル基である、
物質を含む、食品である。
【００３７】
本発明の第３において、「食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が経口摂取可能な形態のものであれば特に制限はなく、その形態も液状物（溶液、懸濁液、乳濁液など）、半液体状物、粉末、または固体成形物のいずれのものであってもよい。このため食品は、例えば飲料の形態であってもよく、また、サプリメントのような栄養補助食品の錠剤形態であってもよい。
【００３８】
食品として具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、ようかん、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、牛乳、乳清飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、プリン、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品などの水産加工品；畜肉ハム・ソーセージなどの畜産加工品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品；栄養食品などが挙げられる。
【００３９】
また、通常の食品原料として使用されているもの、すなわち、デキストリン、セルロース、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料及び保存剤よりなる群から選択される１種以上を適宜配合してもよい。
【００４０】
本発明の第３の食品は、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症に罹患しているか、または罹患していることが疑われる者、あるいは糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症への罹患のリスクが高い者に対して好適に使用することができる。ここで、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症への罹患のリスクが高い者としては、例えば、体組成や食生活をはじめとする各種の指標を考慮して、または、健康診断等の診断・診察から、当該リスクが高いと判断された者や、そのようなリスクが高いと本人または周囲の者から認識されるに至った者が含まれる。
【００４１】
本発明において「食品」には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、栄養機能食品、または、病者用食品のような分類のものも包含される。さらに「食品」という用語は、ヒト以外の哺乳動物を対象として使用される場合には、飼料を含む意味で用いられうる。ここでいう特定保健用食品とは、体の生理学的機能などに影響を与える保健機能成分を含む食品で、血圧、血中のコレステロールなどを正常に保つことを助けたり、おなかの調子を整えるのに役立つなどの特定の保健の用途に資する旨を表示するものをいう。このような食品は、食品が疾病リスクを低減する可能性があること表示した食品、すなわち、疾病リスク低減表示を付した食品であってもよい。ここで、疾病リスク低減表示とは、疾病リスクを低減する可能性のある食品の表示であって、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会（コーデックス委員会）の定める規格に基づいて、またはその規格を参考にして、定められた表示または認められた表示でありうる。
【００４２】
本発明の他の形態によれば、前記式（１）で示される物質を有効量含有する食品であって、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症を予防および／または改善する機能を有し、その機能表示が付された食品が提供される。ここで食品に付される機能表示は、例えば、製品の本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかに付することができる。
【００４３】
本発明の第３の食品の製造にあたっては、通常の食品の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品添加剤、安定剤などを適宜添加することができる。食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術を参照して実施することができる。
【００４４】
本発明の第３の食品に含まれる、前記式（１）で示される物質の含有量は、各食品の組成などによって様々であるため特に限定されることはないが、前記食品の全質量に対して０．０００１〜５０質量％であることが好ましく、０．０００１〜１０質量％であることがより好ましい。上記した範囲内の場合、食事療法などの効果が有意に向上しうる。
【００４５】
上記、本発明の第１〜第３で述べたように、上記式（１）で示される物質が、ＰＰＡＲγ活性を示し、インスリン抵抗性を改善する治療薬の成分として用いられることによって、つまり、本発明の第２の医薬品または本発明の第３の食品として用いられることによって、以下の機構を有する。すなわち、上記式（１）で示される物質がペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）に結合し、核内受容体転写因子であるレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子のプロモーター領域にあるＰＰＡＲ応答配列（ＰＰＲＥ）にリガンド依存的に結合し、標的遺伝子の転写を促進させ、前駆脂肪細胞を肥大化していない正常な脂肪細胞（成熟脂肪細胞（小型脂肪細胞））に分化促進する。また、肥大化した脂肪細胞（肥大化脂肪細胞）のアポトーシスを誘導する。分化した脂肪細胞は、アディポネクチンを積極的に分泌するため、糖や脂質の代謝が活発になり、血液中からの糖の取り込みが促進され、インスリン抵抗性を改善する。
【００４６】
なお、本発明の範囲は、上記した実施態様に限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変更を加えることができる。
【実施例】
【００４７】
本発明について、下記の実施例によりさらに詳細に説明するが、当該実施例はあくまで例示にすぎず、本発明は以下に限定されることはない。
【００４８】
＜実施例１＞
１．１
５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ；シグマ社  型番Ｄ５０１１）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１０００μｇ/ｍＬになるように、溶解させた。
【００４９】
１．２  ＣＯＳ−１細胞の形質転換および被検試料の添加
ＣＯＳ−１細胞をトリプシン処理により回収し、１０００ｒｐｍ、４℃で、３分間遠心分離した後、上清を除去した。得られた細胞を、２ｍｌの培地（ＤＭＥＭ培地）に分散して、６０ｍｍ培養シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で播いた後、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、２４時間、培養した。
【００５０】
形質転換には、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ  社）を使用した。即ち、１．５ｍｌのチューブに、Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＣ  １５０μｌ、ｐＭ−ｈＰＰＡＲγ−ＧＡＬ４  １μｇ、ｐＵＡＳｇ−ｔｋ−Ｌｕｃ  １μｇ、ｐＳＥＡＰ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ  １μｇ、及び最後にＥｎｈａｎｃｅｒ  ２４μｌを入れ、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）で１秒間攪拌した。２５℃で３分間放置した後、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅを２５μｌ加え、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）で１０秒間攪拌した後、２５℃で７分間放置した。この間に、６０ｍｍ培養シャーレの培地（ＤＭＥＭ培地）を除去し、新しく培地（ＤＭＥＭ培地）を４ｍｌ入れて培地交換をした。７分後、１．５ｍｌのチューブに培地を１ｍｌ加え、２回、ピペッティングにより懸濁して６０ｍｍ培養シャーレに全量を滴下し、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、１６時間、培養した。
【００５１】
形質転換した細胞をトリプシン処理により回収し、１０００ｒｐｍ、４℃で、３分間、遠心分離した後、上清を除去した。得られた細胞を、１０ｍｌの培地（ＤＭＥＭ培地）に懸濁して９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ）に１２５μｌ／ｗｅｌｌ播き、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、１〜２時間、培養した。その後、１．２で調製した被検試料を最終濃度２５０μｇ/ｍＬとなるように添加し、穏やかに攪拌して、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、２４時間培養した。
【００５２】
１．３  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性測定
１．２における、被検試料添加から２４時間後、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅから培地を２５μｌ／ｗｅｌｌ回収し、９６ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅに移した。その後、残りの１００μｌ／ｗｅｌｌに、３７℃にて融解したルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性測定用溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、暗所にて３５分間反応させた後、それぞれのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光強度（下記式中の、「被検試料のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発光強度」）を測定した。なお、上記方法において、比較対照として、被検試料を添加する代わりにＤＭＳＯを添加する以外は、同様の実験を行った（下記式中の、「ＤＭＳＯのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発光強度」）。また、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性測定用溶液は、下記に従って調製された。
【００５３】
１．４  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＥＡＰ）活性の測定
１．２における、被検試料添加から２４時間後、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅから回収した培地２５μｌ／ｗｅｌｌに、１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μｌ／ｗｅｌｌを添加した。セロハンテープで蓋をした後、穏やかに攪拌し、６５℃で３０分間、放置した。その後、４℃に冷却し、２５℃に戻してから、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ９０μｌ／ｗｅｌｌを添加して、穏やかに攪拌した。２５℃で５分間放置し、ＭＵＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １０μｌ／ｗｅｌｌを添加して、穏やかに攪拌した。暗所にて２５℃で６０分間反応させた後、４−ｍｅｔｈｙｌ  ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅに基づくＳＥＡＰの蛍光強度（Ｅｘ＝３６０ｎｍ、Ｅｍ＝４６０ｎｍ）（下記式中の、「被検試料のＳＥＡＰ蛍光強度」）を測定した。なお、上記方法において、比較対照として、被検試料を添加する代わりにＤＭＳＯを添加する以外は、同様の実験を行った（下記式中の、「ＤＭＳＯのＳＥＡＰ蛍光強度」）。また、１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ及びＭＵＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、１．５に従って調製された。
【００５４】
１．５  試薬の調製法
１．３で使用されるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性測定用溶液は、以下のようにして調製した。すなわち、６０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．８）、１６ｍＭ  （ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ（塩基性ＭｇＣＯ３）、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ  Ｘ−１００（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．５ｍＭ  Ｄ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ（ナカライテスク）、１．５ｍＭ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＩＧＭＡ）、０．５ｍＭ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ（ＳＩＧＭＡ）、及び０．１ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏ  ｅｔｈａｎｏｌを超純水で調製し、１０ｍｌ程度ずつ分注して使用直前まで−２０℃に保存した。
【００５５】
また、１．４で使用される１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒは、以下のようにして調製した。すなわち、使用直前に、５×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  ＢｕｆｆｅｒをＨ２Ｏで希釈した。ここで、５×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒは、ＮａＣｌ  ４．３８ｇ、Ｔｒｉｓ  ２．４２ｇを９０ｍｌの超純水で溶解することによって調製した。１２Ｎ  ＨＣｌを加えてｐＨ７．２に調整し、使用直前まで４℃で保存した。
【００５６】
また、１．４で使用されるＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒは、以下のようにして調製した。すなわち、Ｌ−ｈｏｍｏａｒｇｉｎｉｎｅ  ０．９ｇ、ＭｇＣｌ２０．０４ｇを超純水１５８ｍｌに溶解し、ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ４２ｍｌを加えた。１２Ｎ  ＨＣｌを加えてｐＨ９．８に調整し、使用直前まで４℃で保存した。
【００５７】
また、１．４で使用されるＭＵＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、以下のようにして調製した。すなわち、１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．７μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ７μｌ／ｗｅｌｌ、１０×ＭＵＰ  ０．３μｌ／ｗｅｌｌを混ぜた。１０×ＭＵＰ、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＭＵＰ）２．５６ｍｇを超純水１０００μｌで溶解し、使用直前まで−２０℃にて保存した。
【００５８】
１．６  ＰＰＡＲγ活性化能の評価
１．３で測定されたＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光強度、および１．４で測定されたＳＥＡＰの蛍光強度から、下記数式１に従いＰＰＡＲγ活性化能を算出した。結果、９３７３であった。ＰＰＡＲγ活性化能の結果を図１に示す。
【００５９】
【数１】
0005801572.tif 000006
【００６０】
＜実施例２＞
最終濃度を１２５μｇ/ｍＬとなるように添加した以外は、実施例１と同様に実験を行い、ＰＰＡＲγ活性化能を算出した。結果、６０８０であった。ＰＰＡＲγ活性化能の結果を図１に示す。
【００６１】
＜実施例３＞
最終濃度を６３μｇ/ｍＬとなるように添加した以外は、実施例１と同様に実験を行い、ＰＰＡＲγ活性化能を算出した。結果、３３４８であった。ＰＰＡＲγ活性化能の結果を図１に示す。
【図１】
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