(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムの濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌含有液状飲食品を調製する工程、
乳酸菌含有液状飲食品に対して、１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理を行う工程、
を含む、免疫賦活活性の低下を抑制して、乳酸菌含有液状飲食品を加熱殺菌する方法。
【請求項２】
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムの濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌含有液状飲食品を調製する工程、
調製した乳酸菌含有液状飲食品に対して、１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理を行う工程、
を含む、加熱殺菌済免疫賦活活性乳酸菌含有液状飲食品を製造する方法。
【請求項３】
乳酸菌含有液状飲食品を調製する工程が、
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムの濃度が０．１質量％以上であり、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌含有液状飲食品を調製する工程、
である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
乳酸菌含有液状飲食品を調製する工程が、
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムの濃度が０．１質量％以上であり、Ｌ−システイン及び／又はその塩の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌含有液状飲食品を調製する工程、
である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｐＨが６．８以上で１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理がなされる乳酸菌分散液に、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、加熱殺菌によって生じる、乳酸菌分散液の免疫賦活活性の低下を抑制する方法であって、
塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程の前、後、又は同時に行われる工程として、次の：
加熱処理する乳酸菌分散液に、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
及び／又は
加熱処理する乳酸菌分散液に、Ｌ−システイン及び／又はその塩を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、方法。
【請求項６】
次のＡ）及びＢ）の条件で行われる加熱処理によって生じる乳酸菌分散液の免疫賦活活性の低下を抑制する方法：
Ａ）加熱処理する乳酸菌分散液のｐＨが６．８以上である、
Ｂ）加熱処理が１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理である、
であって、
加熱処理する乳酸菌分散液に、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む方法であって、
塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程の前、後、又は同時に行われる工程として、次の：
加熱処理する乳酸菌分散液に、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
及び／又は
加熱処理する乳酸菌分散液に、Ｌ−システイン及び／又はその塩を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、方法。
【請求項７】
ｐＨが６．８以上７．２以下である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
免疫賦活活性がインターロイキン−１２産生促進活性である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイ ＭＣＣ１３７５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１３）である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の免疫賦活活性の低下を抑制して乳酸菌含有飲食品を加熱殺菌する方法、及び、加熱処理の際に生じる乳酸菌の免疫賦活活性の低下を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌には様々な特性を有するものが数多く知られ、健康の維持や疾患の予防、治療に有効であることから飲食品、医薬品等に広く利用されている。
例えば、乳酸菌には感染症に対する予防、治療作用が知られており、この作用は乳酸菌による宿主の細胞性免疫の賦活化や、腸管や呼吸器等の粘膜からのＩｇＡの分泌の亢進に基づくことが知られている（非特許文献１）。
また、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌は、宿主の免疫担当細胞からのインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）やインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等のサイトカイン産生を誘導することで、宿主の細胞性免疫を不活化し、インフルエンザ・ウイルス等の感染を防御することが知られている（非特許文献２〜４）。
【０００３】
ＩＬ−１２やＩＦＮ−γは、ナイーブ・ヘルパーＴ細胞をタイプ１ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）へ分化誘導する作用や、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化、マクロファージ等の細胞の貪食作用を亢進する作用を持つサイトカインで、ウイルスや細菌による感染防御作用や宿主の抗腫瘍効果に関わっている。従って、感染症等の疾患に対する効果的な予防、治療方法として強いＩＬ−１２産生誘導能を有する乳酸菌を利用することが有効であると考えられる。
【０００４】
一般に乳酸菌は、食品や医薬品に利用するときは乳酸菌死菌体を用いることがある。乳酸菌は通常、１００℃以下で加熱処理されて乳酸菌死菌体が製造される。
これは、ＩＬ−１２産生促進活性や抗アレルギー活性といった乳酸菌の免疫賦活活性は、高温加熱すると活性が損なわれることが知られているためである。
【０００５】
例えば、特許文献１には、乳酸菌死菌体の調製方法として、ラクトバチルス・デルブルッキイ・サブスピーシーズ・ラクチスＳＢＴ２０８３株死菌体を、９０℃、３０分程度の条件で加熱する方法が開示されている（特許文献１）。
また、例えば、特許文献２には、別の乳酸菌死菌体の調製方法として、ラクトバチルス属の乳酸菌を死滅させる加熱温度として、約６５〜１００℃が開示されている（特許文献２）。
また、例えば、特許文献３には、別の乳酸菌死菌体の調製方法として、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株若しくはその変異株を６０℃以上１００℃未満で１０分以上６０分未満の条件で加熱処理する方法が開示されている（特許文献３）。
【０００６】
一方で、飲食品は、安全性の確保や食品衛生法等の法令遵守の観点から、１００℃以上の高温で加熱殺菌されることが通常である。このような条件で行われる殺菌としては、牛乳や乳飲料等の殺菌やレトルト食品等の殺菌などがある。
【０００７】
例えば、日本国では、食品衛生法(昭和二十二年法律第二百三十三号)に基づいて「食品、添加物等の規格基準」が規定されており、このなかでいわゆるレトルト食品（容器包装詰加圧加熱殺菌食品）の製造基準として、加圧加熱殺菌について、「そのｐＨが４．６を超え，かつ，水分活性が０．９４を超える容器包装詰加圧加熱殺菌食品にあつては，中心部の温度を１２０℃で４分間加熱する方法又はこれと同等以上の効力を有する方法であること。」と要求している。
このように、飲食品においては、安全性の確保や食品衛生法等の法令遵守の観点から、１００℃を超える高温での加圧加熱殺菌、特に１２０℃以上での加圧加熱殺菌が、重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１３２５７９号公報
【特許文献２】特開２０１０−９５４６５号公報
【特許文献３】特開２００８−２４５５６９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Curr. Issues Mol. Biol.、第１０巻、２００８年、ｐ．３７−５４
【非特許文献２】Clin. Diagn. Lab. Immunol.、第９巻、２００２年、ｐ．１０５−１０８
【非特許文献３】Clin. Exp. Immunol.、第１４６巻、２００６年、ｐ．１０９−１１５
【非特許文献４】Clin. Exp. Immunol.、 第１４３巻、２００５年、ｐ．１０３−１０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、飲食品においては、１００℃を超える高温での加熱殺菌、特に１２０℃以上での加熱殺菌が、重要である。
一方で、乳酸菌による免疫賦活活性は高温で加熱すると失われるために、通常は１００℃以下の加熱処理によって乳酸菌死菌体が製造されている。
しかし、この乳酸死菌体を、飲食品に含有させて、高温で加熱殺菌すると、免疫賦活活性は、低下しあるいは失活してしまう。
そのために、免疫賦活作用を有する乳酸菌を配合した飲食品の加熱殺菌工程では、高温加熱によって十分な加熱殺菌を行うと同時に、乳酸菌免疫賦活活性の失活や低下を抑制することが求められていた。
したがって、本発明の目的は、乳酸菌の免疫賦活活性を低下あるいは失活させることなく、１００℃を超える高温で乳酸菌含有飲食品を加熱殺菌する方法を、提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、乳酸菌の免疫賦活活性を低下あるいは失活させることなく、１００℃を超える高温で加圧加熱殺菌する方法を、探求してきたところ、低いｐＨ条件（酸性条件）とした場合には、１００℃を超える高温での加圧加熱殺菌、さらに１２０℃以上での高温による加圧加熱殺菌を行っても、乳酸菌の免疫賦活活性が、十分に維持されることを独自に見いだした。
この発見は有用であるが、しかし、加圧加熱殺菌の対象となる飲食品では、多くの場合にそのｐＨは中性付近であり、酸性条件ではない。
上記と同じ条件において、中性付近のｐＨ（ｐＨ６．８以上）の乳酸菌溶液（乳酸菌分散液）を、加熱温度１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理をすると、乳酸菌の免疫賦活活性が大きく損なわれてしまった。
【００１２】
そこで、本発明者らは、独自に見いだしたこの課題を解決するために、さらに、中性付近のｐＨにおいても、乳酸菌の免疫賦活活性を低下あるいは失活させることなく、１００℃を超える高温で加圧加熱殺菌する方法を、鋭意研究してきた。
その結果、本発明者らは、中性付近のｐＨ（ｐＨ６．８以上）の乳酸菌溶液（乳酸菌分散液）を、加熱温度１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱殺菌処理をするにあたって、濃度が０．１質量％以上となるように塩化物を添加することによって、加圧加熱殺菌を行っても、乳酸菌の免疫賦活活性が、十分に維持されることを見いだして、本発明に到達した。
本発明において、乳酸菌溶液を乳酸菌分散液ということがある。乳酸菌分散液は、好適な実施の態様において、乳酸菌含有飲食品とすることができる。
【００１３】
したがって、本発明は、以下のＡ）及びＢ）の条件で加熱処理して生じる乳酸菌の免疫賦活活性の低下を抑制する方法であって、
１）加熱処理する乳酸菌溶液に、濃度が０．１質量％以上となるように塩化物が添加されることを含む方法にある：
Ａ）加熱処理する乳酸菌溶液のｐＨが６．８以上であること、
Ｂ）加熱処理が１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理であること。
本発明は、さらに、２ａ）加熱処理する乳酸菌溶液に、濃度が０．１質量％以上となるようにＬ−アスコルビン酸が添加されること、が好ましい。
本発明は、さらに、２ｂ）加熱処理する乳酸菌溶液に、濃度が０．１質量％以上となるようにＬ−システインが添加されること、が好ましい。
本発明は、塩化物が塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択されることが好ましい。
本発明は、免疫賦活活性の低下を抑制する方法が、乳酸菌の免疫賦活活性の残存率１６％以上とする方法であることが好ましい。
本発明は、免疫賦活活性がＩＬ−１２産生促進活性であることが好ましい。
本発明は、乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイ ＭＣＣ１３７５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１３）、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株、およびラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株からなる群から選択されるものであることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、以下のＡ）及びＣ）の条件で加熱処理して生じる乳酸菌の免疫賦活活性の低下を抑制する方法であって、
１）加熱処理する乳酸菌溶液に、濃度が０．１質量％以上となるように塩化物が添加されることを含む方法にある：
Ａ）加熱処理する乳酸菌溶液のｐＨが６．８以上であること、
Ｃ）加熱処理が１１８〜１６０℃でＦ値１４．７〜１２９に相当する加熱処理であること。
【００１５】
さらに、本発明は、次の（１）〜（９）にもある。
（１）
次のＡ）及びＢ）の条件で行われる加熱処理による殺菌によって生じる乳酸菌含有飲食品の免疫賦活活性の低下を抑制する方法：
Ａ）加熱処理する乳酸菌含有飲食品のｐＨが６．８以上である、
Ｂ）加熱処理が１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理である、
であって、
加熱処理する乳酸菌含有飲食品に、塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む方法。
（２）
ｐＨが６．８以上で１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理がなされる乳酸菌含有飲食品に、塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、加熱殺菌によって生じる、乳酸菌含有飲食品の免疫賦活活性の低下を抑制する方法。
（３）
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化物の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌含有飲食品を調製する工程、
乳酸菌含有飲食品に対して、１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理を行う工程、
を含む、免疫賦活活性の低下を抑制して、乳酸菌含有飲食品を加熱殺菌する方法。
（４）
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化物の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌含有飲食品を調製する工程、
調製した乳酸菌含有飲食品に対して、１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理を行う工程、
を含む、加熱殺菌済免疫賦活活性乳酸菌含有飲食品を製造する方法。
（５）
次のＡ）及びＢ）の条件で行われる加熱処理によって生じる乳酸菌分散液の免疫賦活活性の低下を抑制する方法：
Ａ）加熱処理する乳酸菌分散液のｐＨが６．８以上である、
Ｂ）加熱処理が１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理である、
であって、
加熱処理する乳酸菌分散液に、塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む方法。
（６）
ｐＨが６．８以上で１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理がなされる乳酸菌分散液に、塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、加熱殺菌によって生じる、乳酸菌分散液の免疫賦活活性の低下を抑制する方法。
（７）
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化物の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌分散液を調製する工程、
乳酸菌分散液に対して、１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理を行う工程、
を含む、免疫賦活活性の低下を抑制して、乳酸菌分散液を加熱殺菌する方法。
（８）
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化物の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌分散液を調製する工程、
調製した乳酸菌分散液に対して、１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理を行う工程、
を含む、加熱殺菌済免疫賦活活性乳酸菌分散液を製造する方法。
（９）
乳酸菌分散液が、乳酸菌含有飲食品である、（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１６】
さらに本発明は次の（１０）〜（１３）にもある。
（１０）
塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程の前、後、又は同時に行われる工程として、
加熱処理する乳酸菌含有飲食品に、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（１１）
乳酸菌含有飲食品を調製する工程が、
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化物の濃度が０．１質量％以上であり、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌含有飲食品を調製する工程、
である、（３）又は（４）に記載の方法。
（１２）
塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程の前、後、又は同時に行われる工程として、
加熱処理する乳酸菌含有飲食品に、Ｌ−システイン及び／又はその塩を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、（１）、（２）、（１０）のいずれかに記載の方法。
（１３）
乳酸菌含有飲食品を調製する工程が、
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化物の濃度が０．１質量％以上であり、Ｌ−システイン及び／又はその塩の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌含有飲食品を調製する工程、
である、（３）〜（４）、（１１）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
さらに本発明は次の（１４）〜（１７）にもある。
（１４）
塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程の前、後、又は同時に行われる工程として、
加熱処理する乳酸菌分散液に、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、（５）又は（６）に記載の方法。
（１５）
乳酸菌分散液を調製する工程が、
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化物の濃度が０．１質量％以上であり、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌分散液を調製する工程、
である、（７）又は（８）に記載の方法。
（１６）
塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程の前、後、又は同時に行われる工程として、
加熱処理する乳酸菌分散液に、Ｌ−システイン及び／又はその塩を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程、
を含む、（５）、（６）、（１４）のいずれかに記載の方法。
（１７）
乳酸菌分散液を調製する工程が、
乳酸菌を含み、ｐＨが６．８以上であり、塩化物の濃度が０．１質量％以上であり、Ｌ−システイン及び／又はその塩の濃度が０．１質量％以上である、乳酸菌分散液を調製する工程、
である、（７）、（８）、（１５）のいずれかに記載の方法。
【００１８】
さらに本発明は次の（１８）〜（２１）にもある。
（１８）
塩化物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、及び塩化カルシウムからなる群から選択された１以上の塩化物である、（１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）
ｐＨが６．８以上７．２以下である、（１）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）
塩化物を０．１質量％以上の濃度となるように添加する工程が、
塩化物を０．１質量％以上４．０質量％以下の濃度となるように添加する工程である、（１）〜（２）、（５）〜（６）、（９）、（１０）、（１２）、（１４）、（１６）、（１８）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）
塩化物の濃度が０．１質量％以上４．０質量％以下である、（３）〜（４）、（７）〜（９）、（１１）、（１３）、（１５）、（１７）、（１８）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
好ましい実施の態様において、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩は、濃度を０．１質量％以上４．０質量％以下とすることができ、この濃度となるように添加することができる。
好ましい実施の態様において、Ｌ−システイン及び／又はその塩、濃度を０．１質量％以上４．０質量％以下とすることができ、この濃度となるように添加することができる。
好ましい実施の態様において、１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間の加熱処理は、１１８〜１６０℃でＦ値１４．７〜１２９の加熱処理とすることができる。
好ましい実施の態様において、免疫賦活活性の低下の抑制は、乳酸菌の免疫賦活活性の残存率を１６％以上とするものである。
好ましい実施の態様において、免疫賦活活性はＩＬ−１２産生促進活性である。
好ましい実施の態様において、免疫賦活活性の低下が抑制される乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ ＭＣＣ１３７５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１３）、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株、およびラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株からなる群から選択される１以上とすることができる。
【００２０】
上記使用される乳酸菌は、生菌であっても死菌体であってもよい。好ましい実施の態様において、あらかじめ調製した死菌体を使用することができる。また、上述の方法において生菌を使用することもできるので、本発明は、加熱処理によって、免疫賦活活性の低下を抑制しつつ、乳酸菌の生菌から、乳酸菌の死菌体を製造する方法にもある。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、従来は不可能であった、中性付近のｐＨ条件、１００℃を超える加熱処理による殺菌条件において、乳酸菌の免疫賦活活性の低下を抑制することができる。
そこで、本発明によれば、中性付近のｐＨ条件で１００℃を超える加熱処理による殺菌条件において加熱殺菌された加熱殺菌済免疫賦活活性乳酸菌含有飲食品を、得ることができる。従来の技術によれば、添加する乳酸菌の免疫賦活活性が低下又は失活してしまうために、このような飲食品は製造することができなかった。
本発明は、乳酸菌の免疫賦活活性を保護するため添加物として、飲食品によく使用される塩化物、好ましくは塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムを使用できることから、従来の製造工程や手順を大きく変更することなく、きわめて容易に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は加熱温度と加熱後の乳酸菌のＩＬ−１２産生量との関係を示す。
【図２】図２は、塩化物を添加してラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株を加熱処理したときの免疫賦活活性の残存率を示す。
【図３】図３は、塩化物を添加してラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株を加熱処理したときの免疫賦活活性の残存率を示す。
【図４】図４は、塩化物を添加してラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株を加熱処理したときの免疫賦活活性の残存率を示す。
【図５】図５は、塩化物及びＬ−アスコルビン酸、又は塩化物及びＬ−システインを添加してラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株を加熱処理したときの免疫賦活活性の残存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。
［加熱処理］
本発明の加熱処理条件は、飲食品、医薬品、飼料等の製造工程において、品質確保するために行われる殺菌工程での加圧加熱処理を想定したものである。
本発明の好適な実施の態様において、乳酸菌の加熱条件は、Ａ）加熱処理する乳酸菌溶液のｐＨが６．８以上であること、及び、Ｂ）加熱処理が１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間に相当する加熱処理がされること、を満たすものでもある。
本発明は、本来、乳酸菌の免疫賦活活性の低下や不活化を生じるような加圧加熱処理において、乳酸菌の免疫賦活活性の低下を抑制することができる。
本発明において、乳酸菌溶液を乳酸菌分散液ということがある。乳酸菌分散液は、好適な実施の態様において、乳酸菌含有飲食品とすることができる。したがって、以下の乳酸菌溶液についての記載は、乳酸菌分散液及び乳酸菌含有飲食品についても、記載したものである。
【００２４】
乳酸菌としては、免疫賦活活性を備えたものであれば、生菌及び死菌体のいずれを使用することもできる。
乳酸菌の生菌を使用した場合には、本発明の加熱条件で、殺菌されて乳酸菌死菌体となるが、この乳酸菌死菌体は免疫賦活活性を維持したものとなる。
本発明において、乳酸菌の免疫賦活活性の低下の抑制には、乳酸菌の免疫賦活活性の維持、乳酸菌の免疫賦活活性の保護が含まれる。
【００２５】
本発明の加熱処理は、例えば、加熱温度を１２１℃としたときは、加熱時間が５〜６０分間であることが好ましく、１０〜３０分間であることがより好ましく、１０〜２０分間であることがさらに好ましい。
同様に、加熱温度を１３０℃としたときは、１０秒間〜２０分間であることが好ましく、３０秒間〜１５分間であることが好ましい。
さらに、加熱温度を１４０℃としたときは、５秒間〜１５分間であることが好ましく、１０秒間〜１０分間であることが好ましい。
さらに、加熱温度を１５１℃としたときは、１〜３０秒間であることが好ましく、１〜１０秒間であることがより好ましく、１〜５秒間であることがさらに好ましい。
さらに、加熱温度を１６０℃としたときは、１〜１０秒間であることが好ましく、１〜５秒間であることがより好ましく、１〜３秒間であることがさらに好ましい。
【００２６】
本発明の加熱処理は、１００℃を超える高温とすることができ、好ましくは、１１８℃以上、さらに好ましくは１２０℃以上、さらに好ましくは１２１℃以上、とすることができる。高温による加熱は、低温による加熱と比較して、より短時間の加熱によって同様の殺菌効果を得ることができるために、飲食品の風味を維持するという点から好ましい。本発明の加熱処理は、温度の上限は、乳酸菌の免疫賦活活性の低下の抑制される限りは、特に制限はないが、例えば、一般に１８０℃以下、あるいは１７０℃以下、あるいは１６０℃以下、あるいは１５０℃以下、あるいは１４０℃以下とすることができる。
本発明の加熱処理は、上述の温度とするために必要な加圧条件で、好適に実施することができる。このような加圧条件の圧力は、例えば、その温度における水の蒸気圧に相当する圧力である。このような加圧条件は、水の入った圧力釜などの圧力容器の中で加熱することで、容易に実現することができる。
【００２７】
［Ｆ値］
Ｆ値とは、一定温度で一定数の細菌を死滅させるのに要する加熱時間を意味するものであって、加圧加熱殺菌（レトルト殺菌）の加圧加熱処理の強度の指標として使用される。
従って、本発明の加熱処理の条件は、加熱温度と加熱時間の組合せに代えて、加熱温度とＦ値の組合せで表すことができる。
本発明のＦ値とは、ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリナム Clostridium botulinum）のＺ値＝１０を使用して下記式で算出される値である。
Ｆ値＝ｔ×１０(T-120.1)/Z＝ｔ×１０(T-120.1)/10
（但し、Ｔ：殺菌温度、ｔ：殺菌時間）
【００２８】
本発明の好適な実施の態様において、加熱処理条件は、Ａ）加熱処理する乳酸菌溶液のｐＨが６．８以上であること、かつ、Ｂ）加熱処理が１１８〜１６０℃で６０分間〜１秒間加熱処理されること、を満たすものである。
本発明の加熱温度と時間をＦ値に換算すると、１２０℃、６０分間ではＦ値４６．６であり、１２１℃、１５分間ではＦ値１４．７であり、１５５℃、２秒間ではＦ値８１．８であり、１６０℃、１秒間ではＦ値１２９である。
従って、本発明の加熱処理条件は、Ａ）加熱処理する乳酸菌溶液のｐＨが６．８以上であること、Ｃ）加熱処理が１１８〜１６０℃でＦ値１４．７〜１２９に相当する加熱処理がされること、と表すことができる。
本発明の加熱条件は、加熱処理が１２０〜１６０℃でＦ値１４．７〜８１．８に相当する加熱処理がさらに好ましい。
なお、加熱処理条件についてＦ値を基準としてみると、１５５℃、２秒間の加熱処理は、１３０℃、約１１分間の加熱処理に相当し、１２１℃、１５分間の加熱処理は、１３０℃、約２分間の加熱処理に相当する。
【００２９】
［乳酸菌］
本発明に使用される乳酸菌は、免疫賦活活性を有する乳酸菌を使用することができる。  免疫賦活活性を有する乳酸菌であれば生菌、死菌に関わらず、特に制限なく使用することができる。
免疫賦活活性を有する乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス属菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等であって免疫賦活活性を有する乳酸菌株が挙げられる。
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＭＣＣ１３７５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１３）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ１４９１７T株、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ５３１０３を使用することが好ましい。
【００３０】
本発明に使用される乳酸菌として生菌を使用する場合には、例えば、その乳酸菌に適した培地で培養した後の培地そのもの、培養後の培地から遠心分離等で集菌した乳酸菌や、集菌した乳酸菌を凍結乾燥した凍結乾燥菌体等を、使用することができる。
本発明で用いる乳酸菌の培養に用いる培地は、当該乳酸菌が生育可能な培地であればよく、天然培地や合成培地、半合成培地などを用いて培養することができる。本発明に用いられる培地としては、ＭＲＳ培地を挙げることができる。
乳酸菌の培養温度は２０℃〜５０℃、培養時間は１時間から９６時間とすることができるが、乳酸菌の種類により適宜変更することができる。
【００３１】
本発明に使用される乳酸菌として死菌体を使用する場合には、その死菌体の製造方法は、乳酸菌の免疫賦活活性を失活しない処理方法であれば特に制限はなく、例えば、乳酸菌の生菌を６０℃〜１００℃、３０分間〜１分間で加熱処理する方法、紫外線照射、化学的処理等により免疫賦活活性を有したまま死滅させる方法等を、使用することができる。もちろん、このような死菌体の製造に使用されている従来の加熱条件は、本発明における加熱条件と比較してごく低温であるので、加圧加熱殺菌食品の製造には、不十分な加熱条件である。
【００３２】
［免疫賦活活性］
免疫賦活活性は、具体的には抗アレルギー活性、抗ウイルス活性、インターロイキン産生促進活性等が含まれる。好適な実施の態様において、免疫賦活活性は、例えば、乳酸菌のＩＬ−１２産生量を測定することにより、その状態を決定することができる。すなわち、免疫賦活活性の失活又は低下の抑制は、例えば、乳酸菌のＩＬ−１２産生量を測定することにより、知ることができる。
【００３３】
［ＩＬ−１２産生量］
本発明では、乳酸菌のＩＬ−１２産生量は、公知の方法によって測定することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫法）によって測定することができる。
【００３４】
［乳酸菌溶液（乳酸菌分散液）］
本発明の方法における乳酸菌溶液とは、乳酸菌を含む溶液であり、乳酸菌が分散された分散液（乳酸菌分散液）ともいう。このような乳酸菌溶液（乳酸菌分散液）としては、乳酸菌を含む医薬、飲食品、又は飼料を製造する上で必要な加熱殺菌工程に供される乳酸菌を含む医薬原料溶液、乳酸菌を含む飲食品原料溶液、又は乳酸菌を含む飼料原料溶液を例示することができる。
【００３５】
本発明の方法には、免疫賦活活性を有する乳酸菌を医薬や飲食品や飼料の原料に添加して、それぞれ乳酸菌を含有する医薬や飲食品や飼料を製造した場合であって、加熱処理による免疫賦活活性の低下が効果的に抑制された乳酸菌を含有する医薬や飲食品や飼料を製造するための方法も含まれる。
【００３６】
そして、本発明における乳酸菌溶液（乳酸菌分散液）は、当該溶液のｐＨが６．８以上の場合において、加熱処理による免疫賦活活性の低下が効果的に抑制されるものである。
換言すれば、製造工程中、ｐＨが６．８以上の環境で加熱殺菌処理工程が実施される医薬や飲食品や飼料において、当該医薬、飲食品又は飼料の原料に乳酸菌を添加した乳酸菌を含む医薬原料溶液、飲食品原料溶液、又は飼料原料溶液を、本発明の方法を参酌して製造することによって、乳酸菌に基づく免疫賦活活性が十分に享受された医薬や飲食品や飼料が提供される。
【００３７】
なお、ｐＨが６．８以上の乳酸菌溶液とは、乳酸菌を含むｐＨが６．８以上の医薬原料溶液、乳酸菌を含むｐＨが６．８以上の飲食品原料溶液、又は乳酸菌を含むｐＨが６．８以上の飼料原料溶液を例示することができる。
なかでも、乳酸菌を含むｐＨが６．８以上の飲食品原料溶液としては、当該飲食品として、ｐＨが６．８以上の清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、アイスクリームやアイスシャーベット、かき氷等の冷菓、加工乳等の乳製品、ソース、たれ等の調味料、スープ等をそれぞれ例示することができる。
【００３８】
乳酸菌分散液（乳酸菌溶液）は、医薬原料溶液、飲食品原料溶液、又は飼料原料溶液であってもよいが、液体又は流動体の飲食品に、乳酸菌が分散されたものであってもよい。すなわち、好適な実施の態様において、乳酸菌分散液は、乳酸菌含有飲食品とすることができる。したがって、本発明は、加圧加熱処理による殺菌によって生じる乳酸菌分散液の免疫賦活活性の低下を抑制する方法にもある。また、本発明は、加圧加熱殺菌によって生じる、乳酸菌含有飲食品組成物の免疫賦活活性の低下を抑制する方法にもある。また、本発明は、免疫賦活活性の低下を抑制して、乳酸菌含有飲食品組成物を加圧加熱殺菌する方法にもある。また、本発明は、加圧加熱殺菌済免疫賦活活性乳酸菌含有飲食品を製造する方法にもある。
【００３９】
［塩化物］
本発明の好ましい実施の態様において、加熱処理する乳酸菌溶液に塩化物を濃度が０．１質量％以上となるように添加することができる。
本発明で使用される塩化物としては、溶液（分散液）のなかに塩化物イオンを生じさせるものを使用することができる。このような塩化物として、例えば、アルカリ金属塩化物、及びアルカリ土類金属塩化物等を例示することができる。アルカリ金属塩化物としては、好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウムを使用することができる。アルカリ土類金属塩化物としては、好ましくは、塩化マグネシウム、塩化カルシウムを使用することができる。好適な実施の態様において、塩化物は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムからなる群から選択された１以上の塩化物を、使用することができる。好適な実施の態様において、塩化物は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムを使用することができる。
塩化物は、乳酸菌溶液に固体のまま添加してもよく、水に溶解して塩化物水溶液を調製してから添加してもよい。
乳酸菌溶液中の塩化物の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは０．２質量％以上、さらに好ましくは０．３質量％以上、さらに好ましくは０．４質量％以上、さらに好ましくは０．５質量％以上、さらに好ましくは０．６質量％以上、さらに好ましくは０．７質量％以上、さらに好ましくは０．８質量％以上、さらに好ましくは０．９質量％以上、さらに好ましくは１．０質量％以上、さらに好ましくは１．５質量％以上、さらに好ましくは２．０質量％以上とすることができる。
乳酸菌溶液中の塩化物の濃度は、例えば、１０質量％以下、あるいは７．０質量％以下、あるいは５．０質量％以下、あるいは４．０質量％以下、あるいは３．０質量％以下とすることができる。
【００４０】
［Ｌ−アスコルビン酸］
本発明の好ましい実施の態様において、１）加熱処理する乳酸菌溶液に、濃度が０．１質量％以上となるように塩化物を添加する工程、に加えて、２）加熱処理する乳酸菌溶液に、濃度が０．１質量％以上となるようにＬ−アスコルビン酸を添加する工程、を含むものとすることができる。
溶液中のＬ−アスコルビン酸濃度を０．１質量％以上に調整することにより、高温加熱の際、塩化物との相乗効果により、乳酸菌の免疫賦活活性の低下を一層抑制することができる。
乳酸菌溶液中のＬ−アスコルビン酸の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは０．２質量％以上、さらに好ましくは０．３質量％以上、さらに好ましくは０．４質量％以上、さらに好ましくは０．５質量％以上、さらに好ましくは０．６質量％以上、さらに好ましくは０．７質量％以上、さらに好ましくは０．８質量％以上、さらに好ましくは０．９質量％以上、さらに好ましくは１．０質量％以上、さらに好ましくは１．５質量％以上、さらに好ましくは２．０質量％以上とすることができる。
乳酸菌溶液中のＬ−アスコルビン酸の濃度は、例えば、１０質量％以下、あるいは７．０質量％以下、あるいは５．０質量％以下、あるいは４．０質量％以下、あるいは３．０質量％以下とすることができる。
Ｌ−アスコルビン酸としては、Ｌ−アスコルビン酸結晶やＬ−アスコルビン酸ナトリウムなどの塩を使用することができる。
Ｌ−アスコルビン酸は、粉末で添加してもよく、水に溶解して水溶液で添加してもよい。
また、Ｌ−アスコルビン酸等の添加は、前記１）塩化物を添加する工程の前であってもよく、前記１）塩化物を添加する工程の後であってもよい。
【００４１】
［Ｌ−システイン］
本発明の好ましい実施の態様において、１）加熱処理する乳酸菌溶液に、濃度が０．１質量％以上となるように塩化物を添加する工程、に加えて、３）加熱処理する乳酸菌溶液に、濃度が０．１質量％以上となるようにＬ−システインを添加する工程、を含むものとすることができる。
乳酸菌溶液中のＬ−システイン濃度を０．１質量％以上に調整することにより、高温加熱処理の際、塩化物との相乗効果により、乳酸菌の免疫賦活活性の低下を一層抑制することができる。
乳酸菌溶液中のＬ−システインの濃度は、好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは０．２質量％以上、さらに好ましくは０．３質量％以上、さらに好ましくは０．４質量％以上、さらに好ましくは０．５質量％以上、さらに好ましくは０．６質量％以上、さらに好ましくは０．７質量％以上、さらに好ましくは０．８質量％以上、さらに好ましくは０．９質量％以上、さらに好ましくは１．０質量％以上、さらに好ましくは１．５質量％以上、さらに好ましくは２．０質量％以上とすることができる。
乳酸菌溶液中のＬ−システインの濃度は、例えば、１０質量％以下、あるいは７．０質量％以下、あるいは５．０質量％以下、あるいは４．０質量％以下、あるいは３．０質量％以下とすることができる。
Ｌ−システインとしては、Ｌ−システイン粉末やＬ−システイン水和物、あるいはＬ−システインの塩を使用することができる。
Ｌ−システインは、粉末で添加してもよく、水に溶解して水溶液で添加してもよい。
また、Ｌ−システインの添加は、前記１）塩化物を添加する工程の前であってもよく、前記１）塩化物を添加する工程の後であってもよい。
【００４２】
本発明の好ましい実施の態様において、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩と、Ｌ−システイン及び／又はその塩を、同時に添加して、使用することもできる。Ｌ−アスコルビン酸及び／又はその塩を添加する工程と、Ｌ−システイン及び／又はその塩の添加する工程とは、いずれを先に行ってもよく、それぞれ、塩化物を添加する工程の前であってもよく、後であってもよい。
【００４３】
［免疫賦活活性の低下抑制］
本発明において、乳酸菌の免疫賦活活性の低下の抑制は、乳酸菌の免疫賦活活性の残存率で表すことができる。
本発明において、乳酸菌の免疫賦活活性の低下の抑制は、乳酸菌の免疫賦活活性の残存率が１６％以上であるものが好ましい。
さらには、乳酸菌の免疫賦活活性の低下の抑制は、乳酸菌の免疫賦活活性の残存率が１８％以上であるものがより好ましく、２０％以上であることがより好ましく、２４％以上であることがさらに好ましい。
【００４４】
乳酸菌の免疫賦活活性の残存率とは、「従来通りに１００℃の温度で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量」（１００℃で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量）と、「塩化物を添加することなく１００℃より高い温度で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量」（１００℃より高い温度で加熱処理したコントロールの乳酸菌のＩＬ−１２産生量）と、「本発明にしたがって塩化物を添加して１００℃より高い温度で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量」（本発明によって１００℃より高い温度で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量）とを、測定して、以下の式によって求めて百分率で表したものである。
【００４５】
＜乳酸菌の免疫賦活活性の残存率（％）＞  ＝  ［＜本発明によって１００℃より高い温度で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量（ｐｇ／ｍｌ）＞  −  ＜１００℃より高い温度で加熱処理したコントロールの乳酸菌のＩＬ−１２産生量（ｐｇ／ｍｌ）＞］  ／  ［＜１００℃で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量（ｐｇ／ｍｌ）＞  −  ＜１００℃より高い温度で加熱処理したコントロールの乳酸菌のＩＬ−１２産生量（ｐｇ／ｍｌ）＞］  ×１００（％）
【００４６】
このように、本発明によって加熱処理した乳酸菌の免疫賦活活性の残存率とは、本発明にしたがうことなく１００℃より高い温度で加熱処理したために失われたＩＬ−１２産生量を分母として、本発明にしたがって１００℃より高い温度で加熱処理したために維持された（失われなかった）ＩＬ−１２産生量を分子として、得られた値を、百分率で示した数値である。したがって、本発明において、乳酸菌の免疫賦活活性の残存率とは、上記式によって求められる、ＩＬ−１２産生促進活性の残存率である。
なお、以下の実施例では、実施例として、本発明にしたがって塩化物を添加する等を行って、１００℃より高い温度で加熱処理した（加圧加熱処理した）試料を示し、コントロールとして、本発明にしたがうことなく、塩化物を添加する等を行うことなく、１００℃より高い温度で加熱処理した（加圧加熱処理した）試料を示す。
【実施例】
【００４７】
［試験例１］
本試験では、加熱処理における乳酸菌の免疫賦活活性の低下と加熱温度との関係について検討した。
免疫賦活活性を有する乳酸菌として、ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株を使用した。
【００４８】
［方法］
ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株をＭＲＳ（ｄｅ Ｍａｎ Ｒｏｇａｓａ Ｓｈａｒｐｅ）培地（Ｄｉｆｃｏ製）で２４時間培養した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、さらに蒸留水で２回洗浄した後に蒸留水で懸濁し、凍結乾燥したものを試料とした。
乳酸菌を溶解する溶媒として、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を使用した。
初めにラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の凍結乾燥試料を乳酸菌濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解して乳酸菌溶液を調製した。乳酸菌溶液２ｍｌをガラス試験管に分注し、オートクレーブ（TOMY社製）を用いて９０℃、１００℃、１１０℃、１２１℃の温度でそれぞれ１５分間の加熱処理をして乳酸菌死菌体試料を調製した。
乳酸菌のＩＬ−１２産生量を測定するために、６週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー）を入手し、７〜９週齢時に解剖し脾臓を採取した。
採取した脾臓から脾細胞を採取し、赤血球溶血液（０．１４４Ｍ塩化アンモニウム、１７ｍＭトリスアミノメタン、ｐＨ７．６５）にて３分間処理し、赤血球を除去したものを調製した。調製した脾細胞を、ＲＰＭ１１６４０（ＳＩＧＭＡ製）に１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ製）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えた培地で、２．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁し、乳酸菌死菌体試料を終濃度５μｇ／ｍｌになるように添加し、９６穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ製）にて３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。２日後に培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ製）。
測定結果を図１に示した。
【００４９】
［結果］
図１において、＊はｔ検定によってコントロールと比較したときの危険率５％以下の統計学的有意差を示す。コントロールは９０℃、１５分の条件で加熱処理した乳酸菌死菌体のＩＬ−１２産生量である。１１０℃、１５分及び１２１℃、１５分の加熱条件で処理した試料のＩＬ−１２産生量は、９０℃、１５分で加熱処理した試料の活性を基準として有意に減少した。
加熱条件を９０℃、１５分とした試料は２１８．３ｐｇ／ｍｌ、及び、加熱条件を１００℃、１５分とした試料は１９４．４ｐｇ／ｍｌと高いＩＬ−１２産生促進活性を有していた。
一方、１１０℃、１５分で加熱処理した試料では１４１．７ｐｇ／ｍｌとなり、ＩＬ−１２産生量の有意な減少は見られたものの、９０℃、１５分の試料と比較して約６５％の活性を有していた。
しかしながら、１２１℃、１５分の条件で加熱処理した試料は、ＩＬ−１２産生量が１０．６ｐｇ／ｍｌとなり、９０℃、１５分の試料と比較して約５％と大きく減少した。
【００５０】
図１の１１０℃及び１２１℃のＩＬ−１２産生量から近似直線を作成したところ、Ｙ＝−１１．９１８Ｘ＋１４５２．７となった。
図１からわかるように、ＩＬ−１２産生量は、１２０℃付近（例えば、１１８℃）では、非常に低いものとなっている。
図１において、１１８℃の温度での加熱では、近似直線の計算から、免疫賦活活性の残存率が１６％となっていた。そこで、免疫賦活活性の残存率が１６％を超えるかどうかに注目して評価を行った。
【００５１】
［試験例２］
本試験では、加熱処理における乳酸菌の免疫賦活活性の低下とｐＨとの関係について検討した。
［試験方法］
［方法］
乳酸菌として試験例１で調製したラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の凍結乾燥試料を使用した。
乳酸菌の溶媒として、１０ｍＭクエン酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ４．３の溶媒を調製した。また、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．８の溶媒を調製した。
初めにラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の凍結乾燥試料を乳酸菌濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように、ｐＨ調製された２種類の溶媒に溶解して乳酸菌溶液を調製した。
続いて、乳酸菌溶液２ｍｌをガラス試験管に分注し、１２１℃、１５分の加熱処理をして乳酸菌死菌体を調製した。
乳酸菌のＩＬ−１２産生量の測定は、試験例１と同様の方法で行った。
測定結果を表１に示した。
【００５２】
【表１】
0005801084.tif 000002
【００５３】
［結果］
表１から、溶媒がｐＨ４．３のときは１２１℃、１５分の加熱処理によっても、乳酸菌死菌体のＩＬ−１２産生量は６８１ｐｇ／ｍｌとなり、免疫賦活活性が維持された。
一方、溶媒がｐＨ６．８のときは同様の加熱処理によって乳酸菌死菌体のＩＬ−１２産生量が３０ｐｇ／ｍｌとなり、免疫賦活活性がほとんど失われた。
本結果から、乳酸菌溶液の加熱処理による免疫賦活活性の低下は、溶媒のｐＨが６．８以上のときに乳酸菌のＩＬ−１２産生促進活性が大きく減少することが明らかになった。
【００５４】
［試験例３］
試験例３では、本発明に使用する乳酸菌のＩＬ−１２産生量を確認した。
本試験では、乳酸菌としてラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株、及び、ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株を用いた。
溶媒として１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を使用した。
【００５５】
［試験方法］
ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株を、ＭＲＳ（ｄｅ Ｍａｎ Ｒｏｇａｓａ Ｓｈａｒｐｅ）培地（Ｄｉｆｃｏ）で２４時間培養した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、さらに蒸留水で２回洗浄した後に蒸留水で懸濁し、凍結乾燥して試料とした。
ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株及びラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株についても同様の方法で各試料を調製した。
【００５６】
はじめに、ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の凍結乾燥物を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に投入し、乳酸菌濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁した。この乳酸菌の懸濁液をそれぞれ１００℃、１５分の条件で加熱処理した。
同様の方法で、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株又はラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株を使用して調製した試料を調整した。
そして、加熱処理後の試料について、試験例１と同様の方法でＩＬ−１２産生量を測定した。ＩＬ−１２産生量は３回測定して平均値を求めた。
乳酸菌溶液を１００℃、１５分で加熱する加熱条件は、一般的な乳酸菌死菌体を調製する際の加熱条件としたものである。
【００５７】
［結果］
結果を、表２に示す。
Ｌ．パラカゼイＭＣＣ１３７５株は４２４．６ｐｇ／ｍｌ、Ｌ．プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株は３３６．３ｐｇ／ｍｌ、Ｌ．ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株は２４７．４ｐｇ／ｍｌとなり、それぞれが高い免疫賦活活性を有していることが明らかになった。
【００５８】
【表２】
0005801084.tif 000003
【００５９】
［試験例４］
試験例４では、本発明の方法によって、１００℃を超える加熱処理（加圧加熱処理）による乳酸菌の免疫賦活活性の低下が抑制されることを確認した。
本試験では、乳酸菌としてラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株、及び、ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株を用いた。
溶媒として１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を使用した。
さらに添加物として、塩化ナトリウム（ナカライテクス工業製）、塩化カリウム（ナカライテクス工業製）、Ｌ−アスコルビン酸結晶（和光純薬工業製）、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（関東化学工業製）及び緑茶由来カテキン混合物（和光純薬工業製）を使用した。
【００６０】
［試験方法］
ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株を、ＭＲＳ（ｄｅ Ｍａｎ Ｒｏｇａｓａ Ｓｈａｒｐｅ）培地（Ｄｉｆｃｏ）で２４時間培養した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、さらに蒸留水で２回洗浄した後に蒸留水で懸濁し、凍結乾燥して試料とした。
ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株及びラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株についても同様の方法で各試料を調製した。
続いて、ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株を、塩化物を添加して塩濃度を調整した溶媒に懸濁した。調製した溶媒を表３に示す。
１００℃、１５分の加熱条件で加熱処理した試料（Ｎｏ．１）を調製した。乳酸菌溶液を１００℃、１５分で加熱する加熱条件は一般的な乳酸菌死菌体を調製する際の加熱条件としたものである。
なお、ＭＣＣ１３７５菌株、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株及びラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株は、溶液のｐＨ６．８で、１００℃、１５分間の加熱処理では、加熱処理後にＩＬ−１２産生量が減少しないことを確認している。
また、緩衝液を塩類を添加せずに用いた試料をコントロールとして調製した（Ｎｏ．２）。
そして、１０ｍＭリン酸緩衝液に塩化ナトリウム又は塩化カリウムを０．１〜２．０質量％の範囲で添加した試料を調製した（Ｎｏ．３〜１０）。さらに、リン酸緩衝液をカテキン濃度０．１質量％に調製したものを対照試料１とした（Ｎｏ．１１）。
【００６１】
はじめに、ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の凍結乾燥物を、表１のＮｏ．１〜１１に示した溶液に投入し、乳酸菌濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁した。この乳酸菌の懸濁液をそれぞれ１２１℃、１５分の条件で加熱処理した。
同様の方法で、ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株に代えてラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株又はラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株を使用して調製した試料を調整した。
但し、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株又はラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株を使用した試験では、添加物を添加しない試料（Ｎｏ．１、２）、塩化物濃度を０．１質量％又は０．９質量％とした試料（Ｎｏ．３、５、７、９）のみ実施した。
ＩＬ−１２産生量の測定方法は、試験例１と同様の方法で実施した。
これらの実験条件を、次の表３にまとめて示す。
【００６２】
【表３】
0005801084.tif 000004
【００６３】
［結果］
各乳酸菌のＩＬ−１２産生量の測定結果を図２〜４に示した。
図２はラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の乳酸菌の免疫賦活活性の残存率（ＩＬ−１２産生促進活性の残存率）を示す。図２において、横軸は各試料を示し、縦軸は乳酸菌の免疫賦活活性の残存率（ＩＬ−１２産生促進活性の残存率）（％）を示す。
なお、本試験のＭＣＣ１３７５株では、＜１２１℃で加熱処理したコントロールの乳酸菌のＩＬ−１２産生量＞は、＜１００℃で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量＞から、９４．５％が失われたものであった。つまり、ＭＣＣ１３７５株では、本発明にしたがうことなく１２１℃で加熱処理した場合には、ＩＬ−１２産生量の９４．５％が失われてしまった。
【００６４】
同様に、図３はラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T株の乳酸菌の免疫賦活活性の残存率（ＩＬ−１２産生促進活性の残存率）を示す。
なお、本試験のＡＴＣＣ１４９１７T株では、＜１２１℃で加熱処理したコントロールの乳酸菌のＩＬ−１２産生量＞は、＜１００℃で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量＞から、８０．９％が失われたものであった。つまり、ＡＴＣＣ１４９１７T株では、本発明にしたがうことなく１２１℃で加熱処理した場合には、ＩＬ−１２産生量の８０．９％が失われてしまった。
【００６５】
さらに、図４はラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ５３１０３株の乳酸菌の免疫賦活活性の残存率（ＩＬ−１２産生促進活性の残存率）を示す。
なお、本試験のＡＴＣＣ５３１０３株では、＜１２１℃で加熱処理したコントロールの乳酸菌のＩＬ−１２産生量＞は、＜１００℃で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量＞から、９３．８％が失われたものであった。つまり、ＡＴＣＣ５３１０３株では、本発明にしたがうことなく１２１℃で加熱処理した場合には、ＩＬ−１２産生量の９３．８％が失われてしまった。
【００６６】
図２において、ＭＣＣ１３７５株の乳酸菌の免疫賦活活性の残存率（ＩＬ−１２産生促進活性の残存率）は、塩化ナトリウムを添加した試料では２０．２〜６５．８％となった。
また、塩化カリウムを添加した試料では残存率が１６．６〜６８％となった。
一方、緑茶カテキン混合物を添加した試料では残存率が４．１％となった。
【００６７】
図３において、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７T 株の残存率は、塩化ナトリウムを添加した試料で４０．４〜４９．３％となり、塩化カリウムを添加した試料では残存率が４１．７〜５４．０％となった。
【００６８】
図４において、ＡＴＣＣ５３１０３株の残存率は、塩化ナトリウムを添加した試料で２４．７〜９７．４％となり、塩化カリウムを添加した試料では１８．９％となった。
これらの結果より、免疫賦活活性の残存率はいずれも１６％以上であった。
【００６９】
［試験例５］
本試験は、乳酸菌溶液に塩化物を添加することに加えて、Ｌ−アスコルビン酸を添加することにより、１００℃より高い温度での加熱処理（加圧加熱処理）から乳酸菌の免疫賦活活性を顕著に保護することを明らかにすることを目的とした。
また、本試験は、乳酸菌溶液に塩化物を添加することに加えて、Ｌ−システインを添加することにより、１００℃より高い温度での加熱処理（加圧加熱処理）から乳酸菌の免疫賦活活性を顕著に保護することを明らかにすることを目的とした。
【００７０】
［試験方法］
初めに、試験例１で使用したラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５の凍結乾燥品を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁し、懸濁液中の乳酸菌濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。そして、１００℃又は１２１℃、１５分間の加熱処理を行った。調製した乳酸菌死菌体試料のＩＬ−１２産生促進活性（ＩＬ−１２誘導能）を、実施例１と同様の方法によって測定した。
【００７１】
［結果］
図５はＭＣＣ１３７５株の免疫賦活活性の残存率（ＩＬ−１２産生促進活性の残存率）を示す。
なお、乳酸菌溶液を１００℃、１５分で加熱する加熱条件は一般的な乳酸菌死菌体を調製する際の加熱条件としたものである。
図中の数値とバーは、３回行った試験の平均値と標準偏差を示す。
また、図中の＊はｔ検定によってコントロールと比較したときの危険率５％以下の統計学的有意差を示す。
なお、本試験のＭＣＣ１３７５株では、＜１２１℃加熱処理したコントロールの乳酸菌のＩＬ−１２産生量＞は、＜１００℃で加熱処理した乳酸菌のＩＬ−１２産生量＞から、９８．５％が失われたものであった。つまり、ＭＣＣ１３７５株では、本発明にしたがうことなく１２１℃で加熱処理した場合には、ＩＬ−１２産生量の９８．５％が失われてしまった。
【００７２】
図５において、ＭＣＣ１３７５株の免疫賦活活性の残存率は、塩化ナトリウム０．１質量％及びＬ−システイン濃度０．１質量％とした試料では４１．７％となり、塩化ナトリウム０．１質量％及びアスコルビン酸０．１質量％とした試料では５２．１％となった。
これらの結果より、免疫賦活活性の残存率はいずれも１６％以上であった。
すなわち、ｐＨ６．８以上の乳酸菌溶液中に塩化ナトリウムとＬ−システインを組み合わせて添加することにより、加圧加熱処理によって減少する乳酸菌の免疫賦活活性の低下が効果的に抑制されることが明らかになった。
同様に、ｐＨ６．８以上の乳酸菌溶液中に塩化ナトリウムとＬ−アスコルビン酸を組み合わせて添加することにより、加圧加熱処理によって減少する乳酸菌の免疫賦活活性の低下が効果的に抑制されることが明らかになった。
【００７３】
［参考例１］
［乳酸菌含有飲料］
試験例１で調製したラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の凍結乾燥物を、乳酸菌濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１０００ｍｌに溶解した。
続いて、乳酸菌溶液に、塩化ナトリウム１．０ｇを添加して溶液の塩濃度を０．１質量％に調整した。
そして、塩濃度を調整した乳酸菌溶液をオートクレーブ（TOMY社製）にて１２１℃、１５分で殺菌して乳酸菌含有飲料を調製した。このときのＦ値は１４．７である。
これとは別に、殺菌前の乳酸菌溶液をオートクレーブにて１００℃で１５分間加熱処理した対照試料を調製した。
調製した乳酸菌含有飲料について、試験例１に記載のＩＬ−１２産生量の測定方法で測定したところ、対照試料に対してＩＬ−１２産生量が２５％残存していた。
【００７４】
［参考例２］
［乳酸菌含有飲料２］
試験例１で調製したラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の凍結乾燥物を、乳酸菌濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１０００ｍｌに溶解した。
続いて、乳酸菌溶液に、塩化ナトリウム１．０ｇを添加して溶液の塩濃度を０．１質量％に調整した。さらに、乳酸菌溶液にＬ−アスコルビン酸ナトリウム１．０ｇを添加して溶液のＬ−アスコルビン酸濃度を０．１質量％に調製した。
塩濃度及びＬ−アスコルビン酸濃度を調整した乳酸菌溶液をオートクレーブ（TOMY社製）にて１２１℃、１５分で殺菌して乳酸菌含有飲料を調製した。このときのＦ値は１４．７であった。
調製した乳酸菌含有飲料について、試験例１に記載のＩＬ−１２産生量の測定方法で測定したところ、参考例１の対照試料に対してＩＬ−１２産生量が５２％残存していた。
【００７５】
［参考例３］
［乳酸菌含有飲料３］
試験例１で調製したラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株の凍結乾燥物を、乳酸菌濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１０００ｍｌに溶解した。
続いて、乳酸菌溶液に、塩化ナトリウム１．０ｇを添加して溶液の塩濃度を０．１質量％に調整した。さらに、乳酸菌溶液にＬ−システイン塩酸塩一水和物１．０ｇを添加して溶液のＬ−システイン濃度を０．１質量％に調製した。
塩濃度及びＬ−システイン濃度を調整した乳酸菌溶液をオートクレーブ（TOMY社製）にて１２１℃、１５分で殺菌して乳酸菌含有飲料を調製した。このときのＦ値は１４．７である。
調製した乳酸菌含有飲料について、試験例１に記載のＩＬ−１２産生量の測定方法で測定したところ、参考例１の対照試料に対してＩＬ−１２産生量が４２％残存していた。
【００７６】
［参考例４］
［液状栄養組成物］
難消化性デキストリン（松谷化学工業社製）１８７ｇ、塩化ナトリウム（日本食塩製造社製）１４．３ｇ、及びミネラル混合物１７６．４ｇを７０℃の温湯９．５ｋｇに溶解し、原料溶液を調製した。原料溶液にラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１３７５株１９６．３５ｍｌ（菌体重量２１．４ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、高圧均質機（ＡＰＶ社製）を使用して全圧５０ＭＰａ、２段目５ＭＰａの圧力で均質した。均質して得られた溶液に、デキストリン（松谷化学工業社製）３７２３ｇ、スクラロース（三栄源エフ・エフ・アイ社製）０．２６ｇ及びビタミン混合物８．７ｇを添加した後、全体の液量を１４．３ｋｇに調整した。調整後の溶液を、殺菌機（森永乳業社製）を用いて１５５℃、２秒間加熱処理し、滅菌された液状栄養組成物を得た。このときのＦ値は８１．８であった。
【００７７】
滅菌処理後の液状栄養組成物の液温を４℃として、遠心分離機ＳＣＲ２０Ｂ（日立製）で１０，０００Ｇ、３０分の条件で遠心分離して沈殿した菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で２回洗浄した後に凍結乾燥処理を行い、乾燥重量を測定し、滅菌後試料とした。
一方、滅菌処理前の栄養組成物の液を、滅菌処理後の試料と同様の方法で遠心分離し、洗浄し、凍結乾燥処理して、滅菌前試料とした。
滅菌前試料及び滅菌後試料を、試験例１と同様の方法でＩＬ−１２産生量を測定した。
滅菌後試料のＩＬ−１２産生量は滅菌前試料のＩＬ−１２産生量の１１６％であり、乳酸菌免疫賦活活性の低下がみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によれば、乳酸菌によるＩＬ−１２の産生量が効果的に維持されることから、本発明の方法によれば、衛生面、安全面に優れ、かつ、高い免疫賦活活性を有する飲食品、医薬品、飼料等を製造することができる。本発明は産業上有用な発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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