(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも
（ａ）目的産物をコードするポリヌクレオチド、もしくは目的産物をコードするポリヌクレオチドを組入れるための挿入部位と、
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
を含む発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせであって、
前記少なくとも２種類の発現ベクターは、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチド若しくは挿入部位のいずれかを含むものであり、
前記第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸トランスポーターを含み、前記第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）が葉酸塩、葉酸塩の誘導体もしくは葉酸塩の加工によって得られる産物である基質を加工するものであり、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける、前記発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせ。
【請求項２】
（ａ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸トランスポーターであり、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）が、葉酸塩、葉酸塩の誘導体もしくは葉酸塩の加工によって得られる産物である基質を加工するものである；
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸トランスポーターであり、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）がＤＨＦＲまたはその機能的変異体もしくは誘導体である、あるいは
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸レセプターであり、第二の選択マーカーが、野生型ＤＨＦＲ酵素もしくは宿主細胞によって内因性発現されるＤＨＦＲ酵素よりもＭＴＸ感受性が低いＤＨＦＲ変異体である；
請求項１に記載の発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせ。
【請求項３】
第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が、ヒト葉酸レセプターもしくはその機能的変異体であるまたはそれを含む、または第一の選択マーカーが、配列番号１、２もしくは３または前述の機能的変異体のアミノ酸配列を有するまたは含む葉酸レセプターである、請求項１または２に記載の発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせ。
【請求項４】
少なくとも
（ａ）目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）目的産物をコードするポリヌクレオチド下流の少なくとも１個の終止コドンと、
（ｃ）膜アンカーまたは膜アンカーのシグナルをコードする、終止コドン下流のポリヌクレオチドと、
を含む発現カセットに目的産物をコードするポリヌクレオチドが含まれる、請求項１から３の一項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせ。
【請求項５】
少なくとも
（ａ）目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む宿主細胞であって、
前記第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸トランスポーターであり、前記第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）が葉酸塩、葉酸塩の誘導体もしくは葉酸塩の加工によって得られる産物である基質を加工するものであり、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける、宿主細胞。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の１つ以上の特徴を有する、請求項５に記載の宿主細胞。
（ａ）前記宿主細胞に請求項１から４の少なくとも一項に記載の発現ベクターもしくは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせが導入されている；
（ｂ）前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である；ならびに
（ｃ）前記宿主細胞がＤＨＦＲ＋（プラス）細胞であり、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸レセプターであり、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）が、野生型ＤＨＦＲ酵素もしくは宿主細胞によって内因性発現されるＤＨＦＲ酵素よりもＭＴＸ感受性が低いＤＨＦＲ変異体である
【請求項７】
少なくとも
（ａ）目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
を前記宿主細胞に導入するステップを含む、請求項５または６に記載の宿主細胞を作製するための方法であって、
前記第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸トランスポーターであり、前記第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）が葉酸塩、葉酸塩の誘導体もしくは葉酸塩の加工によって得られる産物である基質を加工するものであり、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける、方法。
【請求項８】
請求項１から４の少なくとも一項に記載の発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせが宿主細胞に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）少なくとも
（ｉ）目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む複数の宿主細胞を提供するステップであって、
前記第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸トランスポーターであり、前記第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）が葉酸塩、葉酸塩の誘導体もしくは葉酸塩の加工によって得られる産物である基質を加工するものであり、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性に少なくとも部分的に依存し、複数の宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）に選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養し、これによって目的産物を発現する宿主細胞を得るステップと、
を含む、目的産物を発現することのできる少なくとも１個の宿主細胞を選抜するための方法。
【請求項１０】
（ｃ）目的産物を発現する少なくとも１個の宿主細胞を選抜するステップ
を追加的に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｂ）の１つ以上の特徴を有する、請求項９または１０に記載の方法。
（ａ）複数の宿主細胞が請求項５もしくは６に記載の宿主細胞を含む
（ｂ）限界濃度の葉酸塩と、葉酸代謝拮抗剤とを含む選抜培地が少なくとも一選抜ステップにおいて用いられる
【請求項１２】
限界濃度の葉酸塩と、葉酸代謝拮抗剤とを含む選抜培地が少なくとも一選抜ステップにおいて用いられ、かつ、選抜培地が５００ｎＭ以下の濃度の葉酸塩を含む、または選抜培地が５００ｎＭ以下の濃度の濃度の葉酸代謝拮抗剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
目的産物を発現させる条件下で、
（ａ）請求項５または６に記載の宿主細胞または
（ｂ）請求項９から１２の少なくとも一項に従って選抜された宿主細胞
を培養するステップを含む、目的産物を生産するためのプロセス。
【請求項１４】
次のステップ、
（ａ）目的産物を前記宿主細胞の培養により得られた培養培地からもしくは前記宿主細胞から単離するステップ、ならびに
（ｂ）単離された目的産物を加工するステップ
のうち少なくとも１つを含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
請求項９から１２の少なくとも一項に記載の方法における、５００ｎＭ以下の濃度の葉酸代謝拮抗剤および５００ｎＭ以下の限界濃度の葉酸塩を含む選抜培地の使用。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的産物を発現する宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞の選抜に適した新規の選抜系に関する。前記選抜系は、選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける、少なくとも２種類の選択マーカー（ｓｍＩおよびｓｍＩＩ）の使用に基づく。本発明は、適切な発現ベクター、宿主細胞および目的産物を高収率で発現する宿主細胞を選抜するための方法を提供する。さらに、本発明は、ポリペプチドを高収率で効率的に生産するための方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
組換えペプチドおよびタンパク質等、目的産物を大量にクローニングし、発現する能力の重要性が高まっている。高レベルのタンパク質を精製する能力は、例えばタンパク質医薬品を生産するためのヒトの医薬およびバイオテクノロジーの分野において、また例えばタンパク質を結晶化してその三次元構造を決定するための基礎研究セッティングにおいて重要である。他の方法では大量に得ることが難しいタンパク質は、宿主細胞において過剰発現させて、次に単離、精製することができる。
【０００３】
組換えタンパク質生産のための発現系の選択は、目的タンパク質の細胞成長特性、発現レベル、細胞内および細胞外発現、翻訳後修飾ならびに生物活性と共に、治療用タンパク質生産における規制問題や経済学的考察等、多くの要因に依存する。哺乳類細胞が細菌または酵母等、他の発現系に優る重要な利点は、適切なタンパク質フォールディング、複雑なＮ−結合型糖鎖付加および標準的なＯ−結合型糖鎖付加ならびに広範囲に及ぶ他の翻訳後修飾を行うその能力である。記載されている利点のため、真核生物、特に哺乳類の細胞は、モノクローナル抗体等、複雑な治療用タンパク質の生産に現時点で最適な発現系である。
【０００４】
高度に発現する宿主細胞（高産生株とも呼ばれる）を得るための最も一般的なアプローチにおける第一のステップとして、目的産物を発現するための適切な発現ベクターが作製される。発現ベクターは、宿主細胞において目的産物をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動し、組換え細胞系を作製するための少なくとも１種類の選択マーカーを提供する。哺乳類発現ベクターの主要なエレメントは、通常、転写活性を強化できる構成的または誘導性プロモーターや、安定的な細胞系の調製および遺伝子増幅のためのコザック配列、翻訳終結コドン、ｍＲＮＡ切断・ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーターおよび選択マーカーを通常含む最適化されたｍＲＮＡプロセシングおよび翻訳シグナルを含み、さらに、細菌におけるベクター増殖のための原核生物の複製開始点および選択マーカーが発現ベクターに提供されてもよい。
【０００５】
近年、開発の焦点は、宿主、特に哺乳類細胞における遺伝子発現のための改良型ベクターの設計に集中してきた。多くのベクターを利用することができるにも関わらず、哺乳類細胞における高収率で強力なポリペプチド／タンパク質産生は、依然として困難なものである。
【０００６】
目的産物を高収率で発現する高産生型細胞系を得るための確立された一手順は、宿主細胞の安定的なトランスフェクションである。しかし、ゲノムへの安定的な組込みは稀にしか起こらず、安定的にトランスフェクトされた細胞の一部のサブセットだけが高産生株である。
【０００７】
選択マーカーおよび選抜系は、目的産物を高収率で発現する宿主細胞を得るための、遺伝子工学、組換えＤＮＡ技術および組換え産物生産において広く用いられている。それぞれの系は、安定的にトランスフェクトされたクローンの作製および同定にも有用である。各選択マーカーおよび選抜系を用いる主要な目的は、選抜培養条件に置くことにより目的組換え産物を高レベルで産生できる細胞の同定を可能にする選択遺伝子を導入することである。例えば、産物発現の収率増加は、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはグルタミン合成酵素（ＧＳ）等の酵素を欠損した細胞系を、これら選択マーカー酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターおよびＤＨＦＲを阻害するメトトレキサート（ＭＴＸ）やＧＳを阻害するメチオニンスルホキサミン（ＭＳＸ）等の薬剤と併せて用いた遺伝子増幅により達成することができる。また、各選択マーカーのさらに高感受性の変異型を野生型細胞と併せて用いることもできる。強力なプロモーターの制御下に置かれた組換え遺伝子と、ＤＨＦＲまたはＧＳ等、選択マーカーをコードする遺伝子とを含む発現ベクターを用いて、先ずそれぞれＤＨＦＲ＋（プラス）またはＧＳ＋（プラス）トランスフェクタントを得て、次にＭＴＸまたはＭＳＸの濃度を徐々に増加させつつトランスフェクタントを培養することにより遺伝子増幅が達成される。このような選択圧を提供する目的は、選択マーカー、したがって目的産物を高収率で発現する細胞を単離することである。
【０００８】
したがって、高ストリンジェンシーの選抜系は、トランスフェクトされた集団から高産生細胞を濃縮するのに重要である。選抜系のストリンジェンシーが高くなるにつれ、選抜プロセス後の低産生株の数は少なくなり、非常に稀少な超高度産生クローンを見出す確率が高くなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、目的産物を高収率で産生する宿主細胞を選抜するためのストリンジェントな選抜系ならびに適切な発現ベクターおよび宿主細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、目的産物を高収率で発現する宿主細胞を選抜するための選抜系に関連し、各産物、特にポリペプチドの産生に関連する。
【００１１】
本発明は、その一実施形態において、少なくとも
（ａ）目的産物をコードするポリヌクレオチド、あるいは目的産物をコードするポリヌクレオチドを組入れるための挿入部位と、
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
を含む発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせであって、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）が葉酸代謝に関与する発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせに関連する。
【００１２】
本発明は、さらに、少なくとも
（ａ）目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞であって、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）が葉酸代謝に関与する、宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞に関する。
【００１３】
さらに、
（ａ）少なくとも
（ｉ）目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む複数の宿主細胞を提供するステップであって、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）が葉酸代謝に関与する、複数の宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）に選択的な培養条件下で前記複数の宿主細胞を培養し、これによって目的産物を発現する宿主細胞を得るステップと、
を含む、目的産物を発現することのできる少なくとも１個の宿主細胞を選抜するための方法が提供される。
【００１４】
限界濃度の葉酸塩と葉酸代謝拮抗剤とを含む、本発明に係る選抜方法において用いることのできる選抜培地もまた提供される。「選抜培地」とは、宿主細胞の選抜に有用な細胞培養培地のことである。
【００１５】
本発明は、また、目的産物の発現がなされる条件下で、本発明に係る宿主細胞または本発明の教示するところに従って選抜された宿主細胞を培養するステップを含む、目的産物を生産するためのプロセスにも関する。
【００１６】
本発明は、また、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）と組み合わせた、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の使用にも関連する。目的産物を発現する真核生物、特に哺乳類の宿主細胞を選抜するために、選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性は、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける。選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）は、好ましくは細胞生存率または細胞増殖に必須の同一または協奏的代謝過程もしくは経路に関与する。好ましくは、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）は葉酸代謝に関与する。
【００１７】
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、両方の選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）が細胞生存率または細胞増殖に必須の同一代謝経路に関与する、２種類の選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）を使用するための本発明の戦略は、非常にストリンジェントな選抜条件をもたらす。このことは、両方の選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）が葉酸塩のメカニズムに関与する好ましい実施形態に基づき本明細書において説明される。葉酸代謝は、細胞生存および細胞成長に不可欠な必須代謝経路である。選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性は他方の選択マーカーの活性に影響し、また両方の選択マーカーが葉酸代謝に関与するため、両方の選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）が十分な量で発現し、したがってレシピエント宿主細胞において高収率で発現する場合、葉酸代謝は選抜培養条件下でただ効果的に機能する。その結果、宿主細胞に対する選択圧は著しく上昇する。
【００１８】
選択マーカー（ｓｍＩＩ）の活性が選択マーカー（ｓｍＩ）の活性によってどのように少なくとも部分的に影響を受けるかについても説明する好ましい一実施形態において、選択マーカー（ｓｍＩ）は、葉酸塩を宿主細胞に取り込むトランスポーターポリペプチドである、あるいはそれを含む。選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、選択マーカー（ｓｍＩ）によって取り込まれた葉酸塩または前記移入された葉酸塩から得られたもしくは生じたその後の産物を基質として加工する触媒ポリペプチドである。それぞれの触媒ポリペプチドの好ましい一例はＤＨＦＲである。この実施形態において、葉酸トランスポーター（ｓｍＩ）が十分量の葉酸塩を宿主細胞に取り込む場合、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、より高効率またはより高速の代謝回転速度で作用すると考えられる。理論に制約されることなく、葉酸トランスポーターを第一の選択マーカー（ｓｍＩ）として強力に発現させると、宿主細胞はより多くの葉酸塩を培地からこの細胞へと移入させ、したがって宿主細胞は培地におけるより低濃度の葉酸塩に耐容性を示すと考えられる。葉酸トランスポーター（ｓｍＩ）の強力な発現は、触媒ポリペプチド（ｓｍＩＩ）のための十分な基質（あるいは前記基質の前駆物質）が宿主細胞に移入され、したがって触媒ポリペプチド（ｓｍＩＩ）がこれを利用できるようになる。したがって、触媒ポリペプチド（ｓｍＩＩ）の活性は十分量の葉酸塩が葉酸トランスポーター（ｓｍＩ）によって宿主細胞に移入されることに依存するため、触媒ポリペプチド（ｓｍＩＩ）の活性は、葉酸トランスポーター（ｓｍＩ）の活性の影響を受ける。したがって、宿主細胞が第一の選択マーカー（ｓｍＩ）を強く発現し、その結果葉酸代謝の維持に十分な量の葉酸塩を細胞に移入する場合、培地中の葉酸塩濃度が非常に低い場合であっても、細胞生存率は維持される／増加する。葉酸トランスポーター（ｓｍＩ）活性によって、触媒ポリペプチド（ｓｍＩＩ）の基質可用性が上昇する。選抜培地は、触媒ポリペプチド（ｓｍＩＩ）の阻害剤、例えばその実際の基質の競合物質を含むことができる。触媒ポリペプチド（ｓｍＩＩ）を強力に発現する細胞は、特に高い基質濃度においてより高濃度の前記阻害剤に耐容性を示し、前記濃度は選択マーカー（ｓｍＩ）として用いられる葉酸トランスポーターの活性に少なくとも部分的に依存する。選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）におけるこの活性／機能性の結びつきは、両方の選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）が強力に発現する場合、宿主細胞の生存率および／または成長率が選抜培養条件下で相当に増加するという効果を有する。選抜培養条件下にも関わらず細胞生存および成長に十分な葉酸代謝を維持できる宿主細胞が生存／増殖する。
【００１９】
本発明に係る発現系の独自の設計は、トランスフェクトされた宿主細胞集団から高産生細胞を濃縮させる非常にストリンジェントな選抜系を提供する。本発明に係る選抜系のこの高ストリンジェンシーは、選抜後の集団における低産生株の数を減少させ、非常に稀少な超高度産生クローンを見出す確率を上げる。このことは、選抜を生き残った細胞集団の生産性を高める。実施例は、本発明に係る選抜系により得られた宿主細胞が、目的産物を高収率で産生することを示す。個々の産生株クローンの平均的な生産性もまた上昇する。したがって、本発明に係る選抜系は、より少ないスクリーニング労力で高産生株クローンを見出す確率を上げる。
【００２０】
上述の仮説は、基礎をなすメカニズムの現時点における理解を反映するが、しかし、両者共に葉酸代謝に関与する選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）を用いる場合、観察された選択圧の依存性／増加に対して他の説明も存在し得るため、この仮説に縛られない。さらに、発明を実施するための形態にも概説されている通り、本発明の一般原則は、他の代謝過程または経路ならびに他の選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）にも適用できる。しかし、選択圧を増加させるために、選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、特にそれに依存することが重要である。したがって、当業者であれば、次の記述および添付の特許請求の範囲から、本願の他の目的、特徴、利点および態様が明らかとなるであろう。しかし、次の記述、添付の特許請求の範囲および特定の実施例は、本願の好ましい実施形態を示しているが、単に説明によるものであることを理解するべきである。次の記述を読むことにより、当業者であれば、開示されている発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が容易に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一態様において、少なくとも
（ａ）目的産物をコードするポリヌクレオチド、あるいは目的産物をコードするポリヌクレオチドを組入れるための挿入部位と、
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
を含む発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせであって、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける、発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせが提供される。
【００２２】
導入ポリヌクレオチドによって発現する「選択マーカー」（ｓｍ）は、適切な選抜培養条件下で前記選択マーカーを発現する宿主細胞の選抜を可能にする。選択マーカーは、好ましくは生体分子、特にポリペプチドである。適切な選択マーカーを下に詳述する。
【００２３】
本発明に係る「ベクター」は、少なくとも１種類のポリヌクレオチド断片を運ぶことのできるポリヌクレオチドである。ベクターは、それぞれポリヌクレオチドである核酸断片を宿主細胞に送達する分子キャリアのように機能する。これは、そこに取り込まれたポリヌクレオチドを適切に発現するための調節配列を含む、少なくとも１種類の発現カセットを含むことができる。細胞に導入しようとするポリヌクレオチド（例えば、目的産物または選択マーカーをコードする）は、ベクターの発現カセット（単数または複数）にそこから発現されるように挿入することができる。本発明に係るベクターは、環状または直鎖状（直鎖化）の形状で存在することができ、これはベクター断片も包含する。用語「ベクター」は、外来核酸断片を導入させる人工染色体または同様の各ポリヌクレオチドも含む。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」は、通常、あるデオキシリボースまたはリボースから別のデオキシリボースまたはリボースへと結合したヌクレオチドのポリマーであり、文脈に応じてＤＮＡやＲＮＡを意味する。用語「ポリヌクレオチド」は、いかなるサイズ制限を含むこともなく、修飾を含むポリヌクレオチド、特に修飾ヌクレオチドも包含する。
【００２５】
「導入ポリヌクレオチド」は、例えば、トランスフェクション等、組換え技法の使用により宿主細胞に導入されたポリヌクレオチドを意味する。宿主細胞は、それぞれ導入ポリヌクレオチドと同一の、対応する内因性ポリヌクレオチドを含んでいてもよいし、含まなくてもよい。導入は、例えば、宿主細胞のゲノムに組み込むことのできる適切なベクターをトランスフェクトすることによって達成することができる（安定的なトランスフェクション）。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入させる適切なベクターを下に詳述する。導入ポリヌクレオチドがゲノムに挿入されない場合、導入ポリヌクレオチドは、その後のステージ、例えば細胞が有糸分裂を行うときに失われる可能性がある（一過性トランスフェクション）。適切なベクターは、また、例えばエピゾーム複製により、ゲノムに組み込まれることなく宿主細胞に維持することもできる。しかし、さらに下に詳述されている、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための他の技法もまた、先行技術分野において公知のものである。
【００２６】
「目的産物」は、前記宿主細胞において発現する産物を意味する。目的産物は、例えばポリペプチドまたはＲＮＡ等、ポリヌクレオチドとなることができる。好ましくは、目的産物はポリペプチド、特に免疫グロブリン分子である。具体例を下に記す。
【００２７】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合（単数または複数）によって結合したアミノ酸のポリマーを含む分子を意味する。ポリペプチドは、タンパク質（例えば、５０アミノ酸を超える）およびペプチド（例えば、２〜４９アミノ酸）等、任意の長さのポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意の活性または生物活性のタンパク質および／またはペプチドを含む。適切な例を下に概説する。
【００２８】
「選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける」という特性は、一方の選択マーカーの活性が、他方の選択マーカーの活性、それぞれ機能によって影響を受けるおよび／または少なくともある程度直接的または間接的に依存する（また、必要に応じて逆もまた同様である）ことを特に意味する。この文脈における「活性」は、選択圧に対する抵抗性を提供、促進および／または増加させる選択マーカーの任意の機能または作用を特に説明し、選択マーカーの触媒活性、代謝回転速度、運動反応速度および／または輸送速度を含むがこれらに限定されるものではない。この選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）の依存性／相互作用は、選抜培養条件下で宿主細胞に対する選択圧を相当に増加させることができる。好ましくは、選択マーカー（ｓｍＩ）および選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、細胞生存率または増殖に必須の同一または協奏的代謝過程もしくは経路に関与する。選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）ならびに代謝過程および経路の適切な例を下に詳述する。
【００２９】
続いて、本出願人らは、本発明に係る発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせの実施形態および利点を説明する。必要に応じて、本出願人らは、目的産物を発現する宿主細胞の選抜における前記発現ベクター（単数または複数）の使用と併せて、これらの利点を説明する。
【００３０】
本発明の教示するところによると、選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性は、両方の選択マーカーに選択的な培養条件下で他方の選択マーカーの活性による影響を受け、したがってそれに少なくとも部分的に依存する。この選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）の相互作用のため、宿主細胞に対する選択圧が増加する。その独自の設計のため、トランスフェクトされた宿主細胞集団から高産生細胞を濃縮させる非常にストリンジェントな選抜系が提供される。本発明に係る選抜系のこの高ストリンジェンシーは、選抜後の集団における低産生株の数を減少させ、非常に稀少な超高度産生クローンを見出す確率を上げる。
【００３１】
好ましい一実施形態において、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）は、両者共に好ましくは細胞生存率および／または増殖に必須の同一代謝過程、例えば核酸またはポリペプチドの合成に関与する。したがって、発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせがレシピエント宿主細胞に導入される場合、選抜培養条件と併用した前記選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）の活性／存在は、レシピエント宿主細胞の同一代謝過程に影響／攻撃する。したがって、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）の活性は、前記代謝過程内で互いに影響し、これにより宿主細胞に対する選択圧を高める。選抜培養条件下にも関わらず細胞生存および成長に十分な前記代謝過程を維持できる宿主細胞が、選抜培養条件下で生存／増殖する。前記宿主細胞が両方の選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）、したがって導入された発現ベクター（単数または複数）を高収率で発現する場合、生存／成長は促進される。その結果、目的産物も高収率で発現する宿主細胞が選抜される。
【００３２】
「代謝過程」は、宿主細胞の細胞生存率および／または細胞増殖に必須の過程を特に説明する。代謝過程の例として、核酸合成またはポリペプチド合成が挙げられる。「代謝経路」は、特に代謝過程のサブグループを意味し、細胞内で起こる定義された一連の化学反応を説明する。各経路において、主な化学物質は化学反応によって修飾される。代謝経路の典型例は、ヌクレオチド合成（核酸合成の代謝過程に属する）、特にプリンもしくはピリミジン生合成、またはアミノ酸合成（ポリペプチド合成の代謝過程に属する）である。多くの場合相互依存的、したがって関連してもいる数段階の代謝経路が存在する。したがって、個々の代謝経路、そして同様に代謝過程は多くの場合重複するため、これらの用語はむしろ機能的に理解するべきである。
【００３３】
一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、
（ａ）核酸合成および／またはポリペプチド合成、
（ｂ）ヌクレオチド合成および／またはアミノ酸合成ならびに
（ｃ）葉酸代謝、
から選択された代謝過程または経路に関与する。
【００３４】
言及されている代謝過程／経路は、宿主細胞の細胞生存率の維持および／または宿主細胞の増殖に重要である。したがって、これらは、本発明に係る選抜系の適切な作用点である。したがって、これら代謝経路は、選択マーカー（ｓｍＩ）および選択マーカー（ｓｍＩＩ）としてそれらに関与する適切な選択マーカーならびに前記マーカーを発現する宿主細胞の選抜に適切な選抜条件の選択に非常に適切である。各代謝経路に関与する適切な選択マーカーならびに適切な宿主細胞および適切な選抜条件は、先行技術分野で公知のものであり下に記載されており、したがって本発明と併せて用いることができる。
【００３５】
一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、真核生物の選択マーカーである。「真核生物の選択マーカー」は、それぞれ発現している前記選択マーカーを含む真核生物宿主細胞の選抜を可能にする。前記真核生物の選択マーカーは、代謝選択マーカー、したがって細胞の代謝過程または経路、例えば核酸またはポリペプチド合成に関与するマーカーとなることができる。
【００３６】
さらに、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、増幅可能な選択マーカーとなることができる。増幅可能な選択マーカーは、ベクターを含有する宿主細胞の選抜を可能にし、遺伝子増幅を促進する。それぞれの増幅可能な選択マーカーの例として、ＤＨＦＲやＧＳ等、先行技術分野において公知のものが挙げられる。
【００３７】
第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、触媒ポリペプチドまたはトランスポーターポリペプチドとなることができる。本発明と併せて用いることのできる多くの適切な各選択マーカーが存在し、これを下に詳述する。
【００３８】
一実施形態において、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、
（ａ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）によって宿主細胞に取り込まれた化合物または前記取り込まれた化合物から得られるその後生じる産物である基質および／または
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の活性によって得られる基質またはその前駆物質
を加工する触媒ポリペプチドである。
【００３９】
したがって、選択マーカー（ｓｍＩＩ）として用いられる前記触媒ポリペプチドは、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の活性によって宿主細胞に移入された基質を加工することができる。これは、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の活性によって生成された基質を加工することもできる。例えば第一の選択マーカー（ｓｍＩ）によって宿主細胞に取り込まれた前記化合物は、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）によって加工される実際の基質の前駆物質となることもできる。したがって、触媒ポリペプチド（ｓｍＩＩ）は、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の活性によって宿主細胞に取り込まれた化合物から得られるその後の産物である基質を加工することもできる。選択マーカー（ｓｍＩ）がトランスポーターポリペプチドではなく触媒ポリペプチドである場合、これが適用される。
【００４０】
理論に制約されることなく、この実施形態において、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の活性は、両方のマーカーに選択的な培養条件下で第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の活性に強く依存することが予想される。第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の基質の存在および／または量は、選択マーカー（ｓｍＩ）の適切な発現／活性に少なくともある程度依存する。第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の強い過剰発現は、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の基質のより高い可用性をもたらす。より高い基質可用性は、第二の選択マーカーの活性（例えば、代謝回転速度）を上昇させる。しかし、選択マーカー（ｓｍＩ）が十分な収率で発現しない場合、選択マーカー（ｓｍＩＩ）の基質は生成されない、あるいは生成が少なく、したがってその活性もまた減少する。
【００４１】
一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の基質または基質前駆物質である化合物の培地から宿主細胞への導入／組入れに関与するトランスポーターポリペプチドである。好ましくは、前記化合物は、細胞生存率および／または増殖に必須のものである。第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が十分量の前記化合物を宿主細胞に取り込む場合、この実施形態において、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、より高い効率またはより速い代謝回転速度で作用すると考えられる。理論に制約されることなく、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の強い過剰発現は宿主細胞により多くの前記化合物を培地からこの細胞へと移入させ、したがって宿主細胞に培地におけるより低濃度の前記化合物に対する耐容性を示させることができると考えられる。このことは、宿主細胞における前記化合物、したがって第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の基質（または前記基質の前駆物質）のより高い可用性ももたらす。第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）によって加工される／利用される基質または基質前駆物質を生成する触媒ポリペプチドである場合、同じ原則が適用される。この仮説は、基礎をなすメカニズムの現時点での理解を反映するが、しかし、観察された選択圧の依存性／増加に対する他の説明も存在し得るためこれに縛られない。
【００４２】
両方の選択マーカーが十分量発現し、したがって宿主細胞において高収率で発現する場合、選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性は他方の選択マーカーの活性に影響し、両者は同一または関連する代謝過程もしくは経路、例えばヌクレオチド合成または葉酸代謝を標的とし、したがってこれは選抜培養条件下でより効果的に機能する。これは高度にストリンジェントな選抜条件をもたらす。
【００４３】
一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の上流で作用する。これは例えば、同一または協奏的代謝経路内において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は例えば前記経路の初期で作用することができ、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は選択マーカー（ｓｍＩ）の下流で作用することを意味する。
【００４４】
好ましい一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、トランスポーターポリペプチドである、あるいはそれを含む。「トランスポーターポリペプチド」は、特に、ある区画から別の区画への、特に培地から宿主細胞への化合物の伝達を媒介するポリペプチドである。適切なトランスポーターポリペプチドの例として、レセプターポリペプチド、チャネルおよびキャリアが挙げられる。
【００４５】
トランスポーターポリペプチドとして、前記選択マーカー（ｓｍＩ）は、好ましくは、宿主細胞の細胞生存率または増殖に関与するおよび／または必須の化合物を宿主細胞に移入する。したがって、細胞生存率または増殖は、前記化合物の宿主細胞への移入に少なくとも部分的に依存する。トランスポーターポリペプチド（ｓｍＩ）と組み合わせて用いられる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、例えば移入された化合物またはその後生じるその産物を利用するため、好ましくは、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）のトランスポーター活性に依存する／影響を受ける代謝経路または過程に関与する酵素である。この実施形態において、前記第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の活性、特に代謝回転速度は、前記化合物を宿主細胞に移入するトランスポーターポリペプチド（ｓｍＩ）の活性に少なくとも部分的に依存する。この実施形態と併せて、トランスポーターポリペプチド（ｓｍＩ）によって宿主細胞に移入される前記化合物を限界濃度で含む選抜培地を用いることができる。
【００４６】
「限界濃度」は、選抜培地における宿主細胞に選択圧を与える前記化合物の濃度を意味する。したがって、前記化合物は、選抜培地中に豊富には含まれず、これにより宿主細胞に選択圧を与える。したがって、選抜培地は、例えば、トランスポーターポリペプチド（ｓｍＩ）によって細胞に取り込まれる／輸送される前記化合物が除かれていてもよいし、それぞれ少量の前記化合物を含んでいてもよい。
【００４７】
したがって、培地中の前記化合物の濃度が非常に低いとしても、宿主細胞が第一の選択マーカー（ｓｍＩ）を過剰発現し、したがって十分量の前記化合物を細胞に移入して関連する代謝経路を維持する場合、細胞生存率が維持される／増加する。トランスポーターポリペプチド（ｓｍＩ）の発現、したがってその活性が上昇する場合、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の基質可用性は増加する。第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）が触媒ポリペプチドである場合、選抜培地は、前記第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の阻害剤、例えば第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の実際の基質の競合物質を含むことができる。第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）を強く過剰発現する細胞は、特に高い基質濃度（これは選択マーカー（ｓｍＩ）の活性に少なくとも部分的に依存する）においてより高濃度の前記阻害剤に耐容性を示す。このことは、両方の選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）が強く発現する場合、宿主細胞の生存率が選抜条件下で相当に増加するという効果を有する。その結果、目的産物の発現率が上昇する。したがって、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）の活性／機能性の結びつきは、高度に、また超高度に発現する細胞クローンの選抜を可能にする非常にストリンジェントな選抜条件をもたらす。第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の基質の産生／生成に関与する酵素である場合、同じ原則が適用される（上述を参照）。
【００４８】
好ましい一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、葉酸代謝に関与する。本発明に係る葉酸塩は、例えば、酸化型葉酸塩（すなわち、葉酸）もしくは還元型葉酸塩またはそれらの誘導体となることができる。一般に、葉酸塩は、宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞へと取り込まれることができる限り、本発明の範囲内において有用である。酸化型葉酸塩すなわち葉酸と、還元型葉酸塩またはテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）として知られる葉酸の還元型誘導体は、真核生物、特に哺乳類細胞におけるプリン、チミジル酸および特定のアミノ酸の生合成の必須補助因子および／または補酵素であるＢ−９ビタミンのグループである。ＴＨＦ補助因子は、ＤＮＡ複製、したがって細胞増殖に特に不可欠である。特に、ＴＨＦ補助因子は、ＤＮＡのＣｐＧアイランドメチル化等、プリン、チミジル酸およびアミノ酸の新規生合成ならびにメチル基代謝に関与する一連の相互接続した代謝経路において、一炭素単位の供与体として機能する。特に、１０−ホルミル−ＴＨＦ（１０−ＣＨＯ−ＴＨＦ）等、ＴＨＦ補助因子は、プリンの新規生合成に関与する２種類の主要な新規ホルミルトランスフェラーゼ反応における一炭素単位に寄与する。酸化型葉酸塩の好ましい一例として、葉酸が挙げられる。還元型葉酸塩の好ましい具体例として、５−メチル−テトラヒドロ葉酸、５−ホルミル−テトラヒドロｆｏｌｉｃ、１０−ホルミル−テトラヒドロ葉酸および５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸が挙げられる。
【００４９】
それ自身の葉酸塩を合成する多くの原核生物、植物および菌類とは対照的に、哺乳類および他の真核生物種はＴＨＦ補助因子の生合成を欠き、したがって、通常は培地である外来のソースからそれを得なければならない。哺乳類細胞において、３種の独立した輸送系が、葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤の取り込みを媒介することが現在知られている。
【００５０】
ａ）還元型葉酸塩補助因子の主要な細胞輸送系は、還元型葉酸塩キャリア（ＲＦＣ）である。ＲＦＣ（溶質キャリアファミリー１９メンバー１；ＳＬＣ１９Ａ１としても知られている）は、非常に高い細胞内レベルで蓄積することが知られているアデニンヌクレオチドならびにチアミン一リン酸およびチアミンピロリン酸等、有機リン酸を交換することにより還元型葉酸塩の上り坂輸送を媒介する双方向性促進性キャリアとして機能する、遍在的に発現する約８５ｋＤａの膜糖タンパク質である。ＲＦＣは、ロイコボリン（５−ホルミル−ＴＨＦ；Ｋｔ＝１μＭ）等、ＴＨＦ補助因子に対して高い親和性を示す一方、酸化型葉酸塩である葉酸に対しては非常に低い輸送親和性（Ｋｔ＝２００〜４００μＭ）しか持たない。
【００５１】
ｂ）葉酸塩取り込みの別のルートは、近年クローニングされたプロトン共役葉酸トランスポーター（ＰＣＦＴ；ＳＬＣ４６Ａとしても知られている）である。ＰＣＦＴは、ＲＦＣとは独立的に発現すると考えられ、酸性ｐＨ（５．５）で至適に機能し、酸化型（例えば葉酸）とＴＨＦ補助因子（すなわち還元型葉酸塩）の両方、そしてＭＴＸ等、様々な親水性葉酸代謝拮抗剤の流入を媒介する。酸性ｐＨ（５．５）で葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤の至適な輸送を示すが、生理的ｐＨ（７．４）ではそれを示さないＰＣＦＴは、上部小腸における葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤双方の吸収に重要な役割を有する。
【００５２】
ｃ）第三の輸送ルートは葉酸レセプター（ＦＲ）に関与する。ＦＲは、３種の異なる遺伝子、ＦＲα、ＦＲβおよびＦＲγにコードされる高親和性の葉酸塩結合糖タンパク質である。ＦＲαは、成体葉酸塩結合タンパク質またはＦＤＰとして、葉酸レセプター１またはＦＯＬＲ（マウスにおけるｆｏｌｂｐ１）として、そして卵巣癌関連抗原またはＭＯｖ１８としても知られている。ＦＲβは、ＦＯＬＲ２（胎児）およびＦＢＰ／ＰＬ−１（胎盤）としても知られている。ＦＲγは、ＦＯＬＲ３およびＦＲ−Ｇとしても知られている（Ｍ．Ｄ．ＳａｌａｚａｒおよびＭ．Ｒａｔｎａｍ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．２００７  ２６（１）、１４１〜５２頁によって概説されている）。十分に特徴付けられている成熟ＦＲは、約７０〜８０％のアミノ酸同一性を有する相同タンパク質であり、２２９〜２３６アミノ酸および２〜３個のＮ−糖鎖付加部位を含む。ＦＲαおよびＦＲβは、膜結合型、特にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の細胞表面糖タンパク質であり、一方、ＦＲγはＧＰＩアンカーを欠く分泌タンパク質である。ＦＲαおよびＦＲβは、葉酸（Ｋｄ＝０．１〜１ｎＭ）、５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ；ロメトレキソール；Ｋｉ＝０．４〜１．３ｎＭ、基質として［３Ｈ］葉酸を用いる）およびＢＧＣ９４５（これは、還元型葉酸塩キャリア経由ではなくＦＲα経由単独で特異的に輸送される、シクロペンタ［ｇ］キナゾリンベースのチミジル酸合成酵素阻害剤である）（Ｋｄ＝１ｎＭ）に対して高い親和性を示すが、ＭＴＸ（Ｋｄ＞１００ｎＭ）に対しては非常に低い親和性を示す。葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤のＦＲ依存性の取り込みは、レセプターを介したエンドサイトーシスの古典的なメカニズムを経由して進行する。
【００５３】
一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、少なくとも１種類の葉酸塩を培地から宿主細胞に移入するトランスポーターポリペプチドである。一般に、葉酸塩は、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）によって宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞に取り込まれることができる限り、本発明の範囲内において有用である。
【００５４】
一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、還元型葉酸塩キャリア（ＲＦＣ）またはその機能的変異体もしくは断片である、あるいはそれを含む。ＲＦＣは、５−メチル−ＴＨＦおよび５−ホルミル−ＴＨＦ等、還元型葉酸塩を細胞に取り込むための主要なトランスポーターとして機能する、遍在的に発現する膜糖タンパク質である。しかし、ＲＦＣは、酸化型葉酸塩である葉酸に対して非常に低い親和性を示す。したがって、ＲＦＣの発現を欠いた、あるいはゲノム上のＲＦＣ遺伝子座が欠失した細胞は、５−ホルミル−ＴＨＦ等の還元型葉酸塩が徐々に成長培地から取り除かれる条件下で、選択マーカー遺伝子ＲＦＣ（（ｓｍＩ）としての）トランスフェクションのレシピエントとなることができ、これによって細胞にこの葉酸トランスポーターをより高レベルで発現させることができる。
【００５５】
実施例の節でも詳細に説明するが、好ましい一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、葉酸トランスポーターポリペプチドである、あるいはそれを含み、好ましくは機能的葉酸レセプターである。葉酸レセプターまたはその機能的変異体もしくは断片の使用は、ＲＦＣ選抜系の使用に優る多くの利点を有する。標的ノックアウトまたは機能欠失型突然変異によって内因性ＦＲ遺伝子座がノックアウトまたは不活性化された細胞を用いる必要はない。さらに、ＲＦＣは、葉酸に対して低い輸送親和性を有し、したがってこの酸化型葉酸塩は培地において選抜に用いることができない。しかし、葉酸は、葉酸レセプターによって加工することができる。さらに、葉酸塩−レセプターに基づく選抜系は一方向性の葉酸塩取り込み系であり、ＲＦＣは葉酸塩の等しく強力な移入および排出を示す双方向性の葉酸トランスポーターである。したがって、葉酸レセプターの使用は多くの重要な利点を有する。しかし、これは選択マーカーとしてのＲＦＣと組み合わせて用いることもできる。
【００５６】
各葉酸レセプターは、本発明に係る発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせによる目的産物の産生を目的として、真核生物細胞に導入することができる。葉酸レセプターを第一の選択マーカー（ｓｍＩ）としてコードするポリヌクレオチドと共に、目的産物（ポリペプチド等）をコードするポリヌクレオチドおよび第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドを導入した後、細胞を限界濃度の葉酸塩を含む選抜培地で培養する。培地中の葉酸塩濃度が低い程、適用される選抜条件はよりストリンジェントになる。好ましくは、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸レセプターである、あるいはそれを含む場合、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、葉酸塩および／または葉酸塩から得られるその後の産物のいずれかである基質を加工する触媒ポリペプチドである。したがって、導入された葉酸レセプターを過剰発現する細胞は、十分量の葉酸塩を取り込んで、細胞成長、ＤＮＡ複製、したがって細胞増殖を維持することができる。この効果は、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の活性が、この場合は葉酸レセプターのトランスポーター活性である第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の活性に依存する／影響を受けるという実態のためにさらに増強される（上述を参照）。これは、導入された選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）を強く過剰発現する、したがって目的産物を過剰発現するこれらの細胞のみが生き残るという効果を有する。このアプローチは、例えこれが可能な実施形態を構成するとしても、事前に内因性葉酸レセプター（ＦＲ）遺伝子が欠失されていない、選択された実施形態に依存することを必要とする。
【００５７】
本発明に従って使用された発現ベクターによって真核生物宿主細胞に導入された葉酸レセプターは、本発明の範囲内において機能的である限り、すなわち用いられている真核生物細胞と適合する限り、いかなる生物種に由来することもできる。好ましくは、哺乳類生物種に由来する、例えば齧歯類、あるいは多くの場合好ましくはヒト葉酸レセプターに由来する葉酸レセプターが用いられる。
【００５８】
一般に、葉酸トランスポーター、特に真核生物宿主細胞に導入されて選択マーカーとして用いられる葉酸レセプターは、宿主細胞の内因性葉酸レセプターと相同であっても、異種であってもよい。相同である場合、それは宿主細胞と同じ生物種に由来し、例えば、宿主細胞の内因性葉酸レセプターと同一であってよい。異種である場合、それは宿主細胞とは別の生物種に由来し、したがって宿主細胞の内因性葉酸レセプターとは異なっていてよい。通常、導入された葉酸トランスポーター、好ましくは選択マーカーとして用いられるレセプターは、宿主細胞に対して異種となるであろう。例えば、齧歯類宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞の選択マーカーとして、ヒト由来の葉酸レセプターを用いることができる。
【００５９】
一実施形態において、葉酸レセプターは、機能的膜結合型葉酸レセプターである。前記レセプターは、葉酸塩またはその誘導体を真核生物細胞に一方向性で移入または取り込むことのできる機能的膜結合型レセプターとなることができる。上に概説されている通り、膜結合型葉酸レセプターはいかなる生物種に由来してもよい。
【００６０】
第一の選択マーカー（ｓｍＩ）として用いられる機能的膜結合型葉酸レセプターは、葉酸レセプターα、葉酸レセプターβ、葉酸レセプターγ、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を有するまたは含む葉酸レセプターおよび前述の機能的変異体からなる群から選択されてよい。好ましくは、これはヒトｆｏｌｉｃレセプターαまたはその機能的変異体である。
【００６１】
機能的変異体は、生理的様態において機能的、すなわち宿主細胞（特に真核生物、好ましくは哺乳類宿主細胞）による葉酸塩の取り込みが可能で、細胞の葉酸代謝により細胞の生存率に寄与する葉酸レセプターの誘導体を含む。例えば、葉酸レセプターの変異型は、１または複数のアミノ酸置換、欠失および／または付加等、１または複数のアミノ酸突然変異（単数または複数）を含むことができる。各葉酸レセプターを含む融合タンパク質もまた、前記用語「変異体」によって包含される。
【００６２】
好ましくは、葉酸レセプターは、ヒト葉酸レセプターα、ヒト葉酸レセプターβまたはそれらの機能的変異体である。最も好ましくは、次のアミノ酸配列（配列番号１、一文字表記、Ｎ末端からＣ末端の方向で示す）を有するまたは含むヒト葉酸レセプターαである。
【化１】
0005801207.tif 000002
【００６３】
別の好ましい一実施形態は、次のアミノ酸配列（配列番号２、一文字表記、Ｎ末端からＣ末端の方向で示す）を有するまたは含むヒト葉酸レセプターβに関する。
【化２】
0005801207.tif 000003
【００６４】
代替法において、天然では膜結合型ではない葉酸レセプターが、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）として用いられる。このような非膜結合型レセプターは、膜結合型となるよう改変することができる。例えば、膜アンカーが提供されてもよいし、および／または前記葉酸レセプターが、非膜結合型葉酸レセプターと別のポリペプチドの膜貫通領域とを含む融合タンパク質として発現されてもよい。同様に、当業者であれば容易に利用できる他の変異体を用いることができる。この点において好ましい具体例は、可溶性葉酸レセプターγ、好ましくはヒト可溶性葉酸レセプターγに基づくであろう。その最も好ましい一実施形態において、ヒト可溶性葉酸レセプターγは、次のアミノ酸配列（配列番号３、一文字表記、Ｎ末端からＣ末端の方向で示す）を有する／含むであろう。
【化３】
0005801207.tif 000004
【００６５】
前記レセプターは、変異していてもよいし、さもなければ遺伝子改変、誘導体化または修飾がなされて、本発明の文脈内における葉酸塩取り込みが可能な機能的膜結合型葉酸レセプターを生成してもよい。
【００６６】
上述から明らかとなったように、選択マーカー（単数または複数）（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）は、核酸合成および／または葉酸代謝に関与する触媒ポリペプチドとなることができる、あるいはそれを含むことができる。一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、核酸合成に関与するおよび／または必須の化合物を宿主細胞に組入れるトランスポーターである、あるいはそれを含み、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、核酸合成、例えばヌクレオチド生成に関与する触媒ポリペプチドである。好ましくは、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、触媒ポリペプチド、好ましくは核酸合成、特に葉酸代謝に関与する酵素である。これは、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸塩を宿主細胞に輸送する、例えば葉酸レセプターである場合、特に有用である。
【００６７】
核酸合成過程において、第一の酵素、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＲＴＦ）はプリンのイミダゾール環形成に関与し、一方、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＡＩＣＡＲＴＦ）の媒介するさらに下流の反応はプリン中間体、イノシン５’−一リン酸（ＩＭＰ）を生じる。後者は、調節されたＡＭＰおよびＧＭＰ生合成に重要な前駆物質として機能する。さらに、５，１０−メチレン−ＴＨＦ（５，１０−ＣＨ２−ＴＨＦ）は、チミジル酸合成酵素（ＴＳ）に不可欠な補助因子として機能する、別の重要なＴＨＦ補酵素である。ＴＳは、５，１０−メチレン−ＴＨＦ（５，１０−ＣＨ２−ＴＨＦ）を用いてｄＵＭＰからチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）の生成を触媒し、これによってジヒドロ葉酸を生じる。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）は、ジヒドロ葉酸（ＤＨＦ）からテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）へのＮＡＤＰ依存性の還元を触媒する。次にＴＨＦは、それぞれプリンおよびチミジル酸の新規生合成に用いられる、１０−ホルミル−ＴＨＦおよび５，１０−メチレン−ＴＨＦに相互変換される。この反応は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）によって触媒される。したがって、ＤＨＦは、５，１０−メチレン−ＴＨＦ依存性の反応におけるｄＵＭＰからｄＴＭＰへの変換を触媒するチミジル酸合成酵素（ＴＳ）の触媒活性の副産物である。したがって、ＤＨＦＲは、ＤＮＡ複製に必要なプリンおよびピリミジンヌクレオチドの生合成に必須のＴＨＦ補助因子の再利用に不可欠である。
【００６８】
記載されているある程度葉酸塩依存性の酵素は、ＤＮＡ複製に必須のプリンおよびチミンヌクレオチド新規生合成の主要なメディエーターであり、同一代謝過程、すなわち核酸合成に関与するため、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）として適切である。
【００６９】
一実施形態において、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、葉酸塩、葉酸塩の誘導体および／またはＤＨＦもしくはＴＨＦ等の葉酸塩の加工によって得られる産物または前述の機能的変異体もしくは誘導体である基質を加工する。各基質は核酸の生成に重要である。好ましくは、前記第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、またはＴＳおよびＳＨＭＴ等、ＤＨＦＲ下流で作用する／それぞれＤＨＦＲと併用される酵素である、あるいはそれらを含む。この実施形態は、選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸トランスポーターである場合、特に適切となる。
【００７０】
本発明と併せて用いることのできる数種類の適切なＤＨＦＲ酵素、したがってその遺伝子は、先行技術分野において公知のものである。ＤＨＦＲは、野生型ＤＨＦＲまたはその機能的変異体もしくは誘導体となることができる。用語「変異体」または「誘導体」は、各ＤＨＦＲ酵素のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸配列の交換（例えば、欠失、置換または付加）を有するＤＨＦＲ酵素、ＤＨＦＲ酵素またはその機能的断片を含む融合タンパク質ならびに追加的な構造および／または機能を提供するよう改変されたＤＨＦＲ酵素と共に、ＤＨＦＲ酵素の少なくとも一機能を維持する前述の機能的断片を含む。例えば、ＤＨＦＲ酵素は、例えば野生型ＤＨＦＲ酵素および／または発現するのであれば宿主細胞によって内因性発現するＤＨＦＲ酵素よりも、ＭＴＸ等、葉酸代謝拮抗剤に対する感受性が高いまたは低い選択マーカー（ｓｍＩＩ）として用いることができる。ＤＨＦＲ酵素は、本発明の範囲内で機能的、すなわち用いられている宿主細胞に適合する限りいかなる生物種に由来してもよい。例えば、ＭＴＸに対し重大な抵抗性を有する変異型マウスＤＨＦＲは、トランスフェクタント細胞における高レベルＭＴＸ抵抗性の獲得を顕著に増強する優性の選択マーカーとして広く用いられている。好ましくは、ＤＨＦＲ酵素は、ＤＨＦＲ＋（プラス）宿主細胞で内因性発現するＤＨＦＲ酵素よりも、ＭＴＸ等、ＤＨＦＲ阻害剤に対する感受性の低い選択マーカーとして用いられる。
【００７１】
一実施形態において、イントロンまたはその断片は、ＤＨＦＲ遺伝子のオープンリーディングフレームの３’末端に配置される。この構成は、コンストラクトの発現／増幅率に有利な効果を有する。ＤＨＦＲ発現カセットに用いられるイントロンは、ＤＨＦＲ遺伝子のより小さい非機能的変異体をもたらす（Ｇｒｉｌｌａｒｉら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８７、５９〜６５）。その結果、ＤＨＦＲ遺伝子の発現レベルは低下し、したがって選抜系のストリンジェンシーをさらに増加させることができる。したがって、宿主細胞は、ＤＨＦＲ酵素をコードする導入ポリヌクレオチドを含むことができ、前記ポリヌクレオチドは、ＤＨＦＲコード配列の３’に位置するイントロンを含む。ＤＨＦＲ遺伝子の発現レベルを低減させるためにイントロンを利用する代替的な方法は、欧州特許第０７２４６３９号明細書に記載されており、これを用いることもできる。
【００７２】
好ましい一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、葉酸レセプターであり、第二の選択マーカーは、野生型ＤＨＦＲ酵素および／または宿主細胞によって内因性発現されるＤＨＦＲ酵素よりもＭＴＸ感受性が低いＤＨＦＲ変異体である。前記ＤＨＦＲ変異体は、好ましくは上述の通りイントロンも含む。各マーカーの組み合わせは、ＤＨＦＲ＋（プラス）細胞との組み合わせが特に好ましい。
【００７３】
本明細書に記載されている発現ベクターおよび／または少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせの様々な実施形態を用いて、本発明の教示するところを行うことができる。目的産物をコードするポリヌクレオチドまたは各ポリヌクレオチドを組入れるための挿入部位、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドならびに追加的な選択マーカー等、必要に応じたさらに別のベクターエレメントは、同一のまたは別個の発現ベクター上に配置することができる。
【００７４】
例えば、少なくとも上述の全確定的エレメント、すなわち目的産物をコードするポリヌクレオチド（または各ポリヌクレオチドを組入れるための挿入部位）、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いることは、宿主細胞への導入には１種類の発現ベクターだけが必要とされるという利点を有する。さらに、特に安定的な発現系統を確立する場合、全エレメントがゲノム中に一体に組み込まれるため、全エレメントが宿主細胞によって等しく発現、あるいは少なくとも同様の比率で発現する確率がより高くなる。
【００７５】
しかし、トランスフェクションのために、各ポリヌクレオチドが異なる発現ベクターに配置されている少なくとも２または３種類の発現ベクターの組み合わせを用いることもでき、これは本発明の範囲内である。次に、前記発現ベクターの組み合わせが、宿主細胞にトランスフェクトされる。少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせを用いる場合、好ましくは目的産物をコードする少なくとも１種類のポリヌクレオチド（または目的ポリヌクレオチドを導入するための挿入部位）と、選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）のうち少なくとも一方とが同一発現ベクター上に配置されているセッティングが用いられる。安定的な発現細胞系を確立するために発現ベクターの組み合わせが用いられる場合、これは特に、選択マーカー（（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）の発現と、目的産物の発現との緊密な結びつきを確実にするためのものである。他方の選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）は、前記発現ベクターの組み合わせとは別個の発現ベクターに配置することができる。したがって他方の選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）を含む前記別個の発現ベクターは、目的産物をコードする追加的なポリヌクレオチドを含むことができる。各セッティングは、例えば免疫グロブリン分子の発現に用いることができる。しかし、全ポリヌクレオチド（目的産物、（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）をコードする）が別個に配置され、したがって個々の発現ベクターに配置されることもまた、本発明の教示の範囲内である。
【００７６】
一実施形態において、本発明に係る発現ベクターは、目的産物をコードするポリヌクレオチドを挿入するための、その時点ではまだ目的産物をコードするポリヌクレオチドを含んでいない挿入部位を含む。それぞれの「空の」発現ベクターは、所望の目的産物をコードするポリヌクレオチドの挿入に用いられ、これによって、目的産物を発現するために宿主細胞に取り込まれ得る直ちに利用できる発現ベクターを得ることができる。適切なクローニング方法を用いることによって、例えば目的産物をコードするポリヌクレオチドを挿入するための制限酵素を用いることによって、取り込みを達成することができる。この目的のため、例えば発現ベクターは、例えば全読み枠で用いることのできる多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができる。挿入部位の一例としての各多重クローニング部位は、発現カセット内に配置されてよい。所望の目的産物をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって発現ベクターを目的の用途に容易に適用することができるため、それぞれの「空の」発現ベクターは、異なる目的産物を発現するための有用なツールを提供する。
【００７７】
発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせは、さらに別のベクターエレメントを追加的に含むことができる。例えば、さらに別の目的産物をコードする少なくとも１種類の追加的ポリヌクレオチドが提供されてよい。この実施形態は、免疫グロブリン分子の発現に特に適している。有用となり得るさらに別の一般的なベクターエレメントは先行技術分野において公知のものであり、これは複製起点や、さらに別の選択マーカー、異なる宿主細胞における発現またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のためのプロモーターを含むがこれらに限定されるものではない。
【００７８】
本発明に係る発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせは、免疫グロブリン分子重鎖の少なくとも機能的断片をコードする少なくとも１種類のポリヌクレオチドと、免疫グロブリン分子軽鎖の少なくとも機能的断片をコードする少なくとも１種類のポリヌクレオチドとを含むことができる。少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせが用いられる場合、前記ポリヌクレオチドは、同一または異なる発現ベクター上に配置することができる。一方の発現ベクターが、少なくとも第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドならびに少なくとも免疫グロブリン分子軽鎖の少なくとも機能的断片をコードするポリヌクレオチドおよび／または前記免疫グロブリン分子重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、前記組み合わせの他方の発現ベクターが、少なくとも第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドならびに少なくとも前記免疫グロブリン分子軽鎖の少なくとも機能的断片をコードするポリヌクレオチドおよび／または前記免疫グロブリン分子重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせの使用もまた、本発明の範囲内である。各セッティングは実施例にも記載されている。宿主細胞において前記ポリヌクレオチドが発現することによって、機能的免疫グロブリン分子が得られる。後述するように、免疫グロブリン分子重鎖の少なくとも機能的断片をコードするポリヌクレオチドおよび免疫グロブリン分子軽鎖の少なくとも機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、同一発現カセットまたは異なる発現カセットに含まれてよい。
【００７９】
本発明に係る発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせは、１または複数種の追加的選択マーカー（単数または複数）をコードする、１または複数種のさらに別のポリヌクレオチド（単数または複数）を追加的に含むことができる。前記追加的マーカー（単数または複数）は、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）と同一または協奏的代謝過程もしくは経路に関与することができる。しかし、これは、異なる代謝経路に関与していてもよい。本発明は、その一実施形態において、１または複数の異なる選抜系（単数または複数）（例えば、ｎｅｏ／Ｇ４１８等、抗生物質抵抗性の選抜系）と共に本発明の系を利用する同時選抜は、性能をさらに改善するために適用することができる。真核生物宿主細胞の選抜を可能にするさらに別の真核生物選択マーカーに加えて、原核生物選択マーカーを用いることもできる。「原核生物選択マーカー」は、適切な選抜条件下で原核生物宿主細胞における選抜を可能にする選択マーカーである。それぞれの原核生物選択マーカーの例として、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンおよび／またはクロラムフェニコール等、抗生物質に対する抵抗性を付与するマーカーが挙げられる。
【００８０】
目的産物を発現するために用いられるベクターは、通常、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写休止または終結シグナル等、転写を駆動するのに適切な転写調節エレメントを発現カセットのエレメントとして含む。所望の産物がタンパク質である場合、好ましくは、例えばリボソームの受け入れに適切な５’キャップ構造ををもたらす５’非翻訳領域や、翻訳プロセスを終結させるための終止コドン等、適切な翻訳調節エレメントがベクターに含まれる。特に、選択マーカー遺伝子として機能するポリヌクレオチドおよび目的産物をコードするポリヌクレオチドは、適切なプロモーター内に存在する転写エレメントの制御下で転写されてよい。その結果生じる選択マーカー遺伝子の転写産物および目的産物の転写産物は、相当レベルのタンパク質発現（すなわち、翻訳）および適切な翻訳終結を容易にする機能的翻訳エレメントを有する。取り込まれたポリヌクレオチドの発現を適切に駆動できる機能的発現単位は、本明細書において「発現カセット」とも言う。目的産物をコードするポリヌクレオチド（単数または複数）ならびに選択マーカーｓｍ（Ｉ）および（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは発現カセットに含まれる。数例の実施形態が適切であり、例えば、前記ポリヌクレオチド（単数または複数）のそれぞれが異なる発現カセットに含まれてよい。しかし、１個の発現カセット内に各ポリヌクレオチドのうち少なくとも２種類が含まれることもまた、本発明の範囲内である。
【００８１】
したがって、本発明に係る発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせは、少なくとも１個のプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーエレメントを発現カセットのエレメントとして含むことができる。これら２種の調節エレメント間の物理的境界は常に明らかというわけではないが、用語「プロモーター」は通常、そこにＲＮＡポリメラーゼおよび／または任意の関連因子が結合し、そこから転写が開始される核酸分子上の部位を意味する。エンハンサーは、時間的および空間的にプロモーター活性を増強させる。多くのプロモーターは、広範囲の細胞型において転写活性を有する。プロモーターは、構成的に機能するプロモーターと、誘導または抑制解除によって調節されるプロモーターの２クラスに分類することができる。両者は、本発明の教示するところとの併用に適切である。哺乳類細胞におけるタンパク質の高レベル産生に用いられるプロモーターは、強力で、好ましくは広範囲の細胞型において活性を有するべきである。
【００８２】
多くの細胞型で発現を駆動する強力な構成的プロモーターは、アデノウイルス主要後期（major late）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期（immediate early）プロモーター、ＳＶ４０およびラウス肉腫ウイルスプロモーターならびにマウス３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ＥＦ１ａを含むがこれらに限定されるものではない。プロモーターおよび／またはエンハンサーがＣＭＶおよび／またはＳＶ４０のいずれかから得られる場合、本発明の発現ベクターから良好な結果が得られる。転写プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＢＲＯＡＤ３プロモーター、マウスｒｏｓａ２６プロモーター、ｐＣＥＦＬプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択されてよい。
【００８３】
好ましい一実施形態は、目的産物をコードするポリヌクレオチド、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドが別個の転写プロモーターの制御下に置かれた、本発明に係る発現ベクターに関する。一般に、宿主細胞、特に真核生物宿主細胞における必須ポリヌクレオチドの発現、特に転写を促進できるプロモーターが適切である。ポリヌクレオチドからの発現を駆動する別個の転写プロモーターは同一でもよいし、異なっていてもよい。
【００８４】
一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するためのものより強いプロモーターおよび／またはエンハンサーが、目的産物をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するために用いられる。この構成は、目的産物が選択マーカーよりも多量の転写産物を生成するという効果がある。個々の細胞が異種産物を産生する能力は無限ではなく、したがって目的産物に集中するべきであるため、目的産物の生成が選択マーカーの生成より優勢であることが有利である。さらに、選抜プロセスは発現細胞系確立の初期段階だけで行われ、その後細胞は目的産物を一定に産生する。したがって、細胞の資源を目的産物の発現／生成に集中させると有利である。さらに、目的ポリペプチドのものより強度の低いプロモーターを選択マーカー（単数または複数）（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）を発現するために用いると、選択圧をさらに上昇させる。
【００８５】
一実施形態において、目的産物をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターはＳＶ４０プロモーターである。ＣＭＶプロモーターは、哺乳類における発現に利用できる最も強力なプロモーターの一つであることが知られており、非常に良好な発現率をもたらす。これは、ＳＶ４０プロモーターよりも有意に多くの転写産物を生じると考えられている。
【００８６】
さらに別の一実施形態において、目的産物をコードするポリヌクレオチド、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドは、同一転写プロモーターの制御下に置かれる。適切なプロモーターは上に記載されている。この実施形態において、前記転写プロモーターの制御下にある各発現カセットから、１本の長い転写産物が得られる。一実施形態において、少なくとも１個のＩＲＥＳエレメントが、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドの間に機能的に配置される。その結果、前記転写産物から別個の翻訳産物が確実に得られる。
【００８７】
発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせは、適切な転写終結部位を発現カセットのエレメントとして含むことができる。上流のプロモーターから第二の転写ユニットを通しての連続転写は、下流のプロモーターの機能を阻害し得るため、これはプロモーター閉塞（promoter occlusion）または転写干渉として知られている現象である。この現象は、原核生物と真核生物の両方において説明されてきた。転写終結シグナルを２個の転写ユニット間に適切に配置することによって、プロモーター閉塞を防ぐことができる。転写終結部位は十分に特徴付けられており、その発現ベクターへの取り込みは、遺伝子発現において複数の有益な効果を有することが示された。
【００８８】
好ましくは、用いられる宿主細胞は、真核生物、特に哺乳類の宿主細胞である。多くの真核生物新生ｍＲＮＡは、その３’末端に、一次転写産物の切断および共役ポリアデニル化反応に関与する複雑なプロセスにおいて付加されたポリＡテールを有する。ポリＡテールは、ｍＲＮＡ安定性および伝達可能性において有利である。したがって、本発明に係るベクターの発現カセットは通常、ポリアデニル化部位を含む。ウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）、マウスβ−グロビン、ＳＶ４０初期転写ユニットおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に由来するポリＡシグナル等、哺乳類発現ベクターに用いることのできる数種類の効率的なポリＡシグナルが存在する。一方、合成ポリアデニル化部位も知られている（例えば、Ｌｅｖｉｔｔら、１９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３、（７）：１０１９〜１０２５に基づく、ＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩ−ｎｅｏ発現ベクターを参照）。ポリアデニル化部位は、ＳＶ４０後期および初期ポリＡ部位（例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、１９８１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８５４〜８６４に記載されているｐＳＶ２−ＤＨＦＲプラスミドを参照）等、ＳＶ４０ポリＡ部位、合成ポリＡ部位（例えば、Ｌｅｖｉｔｔら、１９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３、（７）：１０１９〜１０２５に基づく、ＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩ−ｎｅｏ発現ベクターを参照）およびｂｇｈポリＡ部位（ウシ成長ホルモン）からなる群から選択されてよい。
【００８９】
さらに、目的産物をコードするポリヌクレオチド、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットは、少なくとも１個のイントロンを含むことができる。この実施形態は、真核生物、特に哺乳類宿主細胞が発現に用いられる場合、特に適切である。高等真核生物に由来する多くの遺伝子は、ＲＮＡプロセシングにおいて取り除かれるイントロンを含む。トランスジェニック系において、各コンストラクトは、イントロンを欠く同一コンストラクトよりも効率的に発現する。通常、イントロンは、オープンリーディングフレームの５’末端に配置されるが、３’末端に配置されてもよい。したがって、イントロンは、発現率が増加するように発現カセット（単数または複数）に含まれてよい。前記イントロンは、プロモーターおよびまたはプロモーター／エンハンサーエレメント（単数または複数）と、発現しようとするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの５’末端との間に配置されてよい。数種類の適切なイントロンは、本発明と併せて用いることのできる本技術水準において公知のものである。
【００９０】
一実施形態において、目的産物を発現するための発現カセットに用いられるイントロンは、ＳＩＳまたはＲＫイントロン等、合成イントロンである。ＲＫイントロンは、好ましくは目的遺伝子のＡＴＧ開始コドンの前に配置される強力な合成イントロンである。ＲＫイントロンは、ＣＭＶプロモーターのイントロンドナースプライス部位およびマウスＩｇＧの重鎖可変領域のアクセプタースプライス部位からなる（例えば、Ｅａｔｏｎら、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５、８３４３〜８３４７、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ  Ｊ．２（８）、１３７３〜１３７８を参照；これはｐＲＫ−５ベクター（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）から得られる）。
【００９１】
本発明に係る発現ベクターまたはベクターの組み合わせは、環状の形状で宿主細胞にトランスフェクトすることができる。スーパーコイル状のベクター分子は、通常、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの活性によって核内で直鎖状分子に変換される。しかし、トランスフェクション前の発現ベクターの直鎖化は、多くの場合、安定的なトランスフェクション効率を改善する。これは、トランスフェクション前に発現ベクターが直鎖化されれば、直鎖化ポイントが制御できるためでもある。したがって、本発明の一実施形態において、発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせは、トランスフェクション前にベクター（単数または複数）の直鎖化に用いることのできる少なくとも１個の所定の制限酵素部位を含む。前記制限酵素部位は、ベクターがどの位置で開環／直鎖化されるか決定し、したがって発現カセットの順序／配置を決定するため、コンストラクトが真核生物、特に哺乳類細胞のゲノムに組み込まれる場合、前記直鎖化用制限酵素部位の合理的な配置が有利である。例えば、数種類の異なる産物／ポリペプチドの発現のためのツールとして企図される標準的な発現ベクターとしてベクターが用いられる場合、低い切断頻度の複数の酵素認識部位を含む直鎖化用制限酵素部位を提供することが有利である。ベクターの適切な直鎖化のために酵素切断が１回のみ行われることを確実にするため、直鎖化のために選択される制限酵素は、好ましくは目的産物、選択マーカーまたは他のベクター骨格配列の発現カセット内で切断するべきではない。低い切断頻度の複数の制限酵素認識部位を含む直鎖化用制限酵素部位を提供することによって、ユーザーは、提供された選択肢から直鎖化に適切な制限酵素を選択して、目的産物をコードするポリヌクレオチド内の制限を確実に回避することができる。しかし、上に概説されている通り、追加的な制限酵素部位に変異導入されてもよいし、あるいは部分制限酵素消化が行われてもよい。一実施形態において、直鎖化によって、真核生物の増幅可能な選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが目的産物をコードするポリヌクレオチドの５’に位置するように、直鎖化部位が配置される。この構成は遺伝子増幅に有利である。原核生物選択マーカーが追加的に用いられる場合、前記マーカーをコードするポリヌクレオチドは、目的産物をコードするポリヌクレオチドの３’に配置される。この構成は、原核生物選択マーカー遺伝子が３’にあり、したがって直鎖化されたベクター核酸の「哺乳類」部分の「外側」にあるという効果を有する。原核生物配列は哺乳類細胞におけるメチル化増加または他のサイレンシング効果をもたらす可能性があるため、原核生物遺伝子が真核生物、特に哺乳類における発現には恐らく有利ではないことからこの構成が有利である。
【００９２】
発現ベクターは、本発明に係る選抜方法と先行技術分野において公知の他の選抜系とを組み合わせる、追加的なエレメントを含むことができる。先行技術分野において公知の確立された一選抜方法は、フローサイトメトリー、特に蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の使用に基づく。フローサイトメトリーを用いた選抜方法は、多数の細胞を迅速にスクリーニングできるという利点を有する。高産生細胞クローンの同定に特に有用な一選抜方法において、目的産物、例えば抗体の一部は、膜結合型融合ポリペプチドとして発現する。その結果、産物の一部は、細胞表面上に融合ポリペプチドとして提示される。産生された融合ポリペプチドの量は全体の発現率と相関するため、宿主細胞は、細胞表面上に提示されている融合ポリペプチド量に基づきフローサイトメトリーによって選抜することができる。これは、高産生宿主細胞の迅速な選抜を可能にする。本発明に係る選抜系は、フローサイトメトリーの使用に基づく各選抜方法と有利に組み合わせ得ることが判明した。ＦＡＣＳを用いた効率的な選抜を行うため、目的産物を発現するために好ましくは特別な発現カセットが用いられる。したがって、一実施形態において、本発明に係る発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせは、発現した目的産物の一部が膜貫通アンカーを含むように設計された目的産物をコードするポリヌクレオチドを発現するための発現カセットを含む。この結果を達成するためにいくつかの選択肢が存在する。
【００９３】
一実施形態において、前記発現カセットは、少なくとも
（ａ）目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）目的産物をコードするポリヌクレオチド下流の少なくとも１個の終止コドンと、
（ｃ）膜アンカーおよび／または膜アンカーのシグナルをコードする、終止コドン下流のさらに別のポリヌクレオチドと、
を含む。
【００９４】
発現カセットのこの設計は、翻訳の読み過ごしプロセス（終止コドンが「リーキー」である）によって、目的産物の一部が、膜アンカーを含む融合ポリペプチドとして生成されるという効果を有する。その結果、この融合ポリペプチドが細胞表面上に提示され、高レベルの膜アンカー型融合ポリペプチドを提示する細胞を、フローサイトメトリー、好ましくはＦＡＣＳによって選抜することができる。その結果、高発現率の宿主細胞が選抜される。この終止コドンに基づく技術の詳細および好ましい実施形態は、ＷＯ２００５／０７３３７５およびＰＣＴ／ＥＰ２００９／００６２４６に記載されている。これは、本開示に参照されている。
【００９５】
代替的な一実施形態において、前記発現カセットは、少なくとも
（ａ）目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）５’スプライスドナー部位および３’スプライスアクセプター部位を含み、インフレーム翻訳終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含むイントロンと、
（ｃ）膜アンカーおよび／または膜アンカーのシグナルをコードする、前記イントロン下流のポリヌクレオチドと、
を含む。
【００９６】
発現カセットのこの設計は、転写および転写産物プロセシングによって、発現カセットから少なくとも２種類の異なる成熟ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ＰＯＩ）および（ｍＲＮＡ−ＰＯＩ−ＡＮＣＨＯＲ）が得られるという効果を有する。ｍＲＮＡ−ＰＯＩの翻訳は、目的産物を生じる。ｍＲＮＡ−ＰＯＩ−ＡＮＣＨＯＲの翻訳は、目的産物と膜アンカーとを含む融合ポリペプチドを生じる。その結果、この融合ポリペプチドも同様に細胞表面上に提示され、高レベルの膜アンカー型融合ポリペプチドを提示する細胞を、フローサイトメトリー、好ましくはＦＡＣＳによって選抜することができる。その結果、高発現率の宿主細胞が選抜される。このイントロンに基づく技術の詳細および好ましい実施形態は、ＷＯ２００７／１３１７７４に記載されている。これは、本開示に参照されている。
【００９７】
抗体の目的産物としての発現に特に有用な好ましい一実施形態において、膜アンカーは免疫グロブリン膜貫通アンカーである。他の適切な膜アンカーおよび免疫グロブリン膜貫通アンカーの好ましい実施形態は、ＷＯ２００７／１３１７７４、ＷＯ２００５／０７３３７５およびＰＣＴ／ＥＰ２００９／００６２４６に記載されている。
【００９８】
少なくとも
（ａ）目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む宿主細胞であって、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカー活性によって少なくとも部分的に影響を受ける宿主細胞もまた提供される。
【００９９】
一実施形態において、宿主細胞は、上および特許請求の範囲に詳述されている発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせを含む。本出願人らは、上述の開示を参照する。
【０１００】
さらに、宿主細胞は、次の特性のうち少なくとも一特性を有することができる。
【０１０１】
宿主細胞は、好ましくは真核生物宿主細胞である。前記真核生物細胞は、好ましくは、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞および菌類細胞からなる群から選択される。菌類細胞および植物細胞は、葉酸塩に対して原栄養となることができる（すなわち、このような細胞は、その細胞生存、すなわち細胞成長および増殖に必要な自分自身の葉酸塩を自律的に合成できる）。本発明は、特に、葉酸塩に対して栄養要求性である、あるいは葉酸塩に対して栄養要求性となり得るこのような菌類および植物細胞を包含する。この状態は、例えば遺伝子操作による、すなわち細胞が現時点でその細胞生存に必要な十分量の葉酸塩を合成できなくなることによるものである。例えば、このような菌類または植物細胞が、葉酸塩を例えば適切な代謝経路を経て内因性生合成する能力は、例えば適切な標的遺伝子の遺伝子破壊もしくは遺伝子サイレンシングまたは主要酵素の阻害等によって不活性化することができる。好ましくは、宿主細胞は哺乳類細胞である。前記哺乳類細胞は、好ましくは齧歯類細胞、ヒト細胞およびサル細胞からなる群から選択される。特に好ましくは、好ましくはＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、マウス３Ｔ３線維芽細胞およびＳＰ２／０細胞からなる群から選択された齧歯類細胞である。最も特に好ましくは、齧歯類細胞はＣＨＯ細胞である。好ましくはＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＰｅｒＣ６細胞およびＨｅＬａ細胞からなる群から選択されたヒト細胞も好ましい。さらに好ましくは、好ましくはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７細胞およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択されたサル細胞である。
【０１０２】
宿主細胞と、取り込まれた選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）とは適合性となるが、これは宿主細胞と、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）の選択された組み合わせが、選抜培養条件下で各マーカーを発現する宿主細胞の選抜を可能にすることを意味する。選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）の発現は、選抜培養条件下における選抜上の利点を提供する。したがって、好ましくは、選抜培養条件下における選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）による選抜に対して感受性の宿主細胞が選択される。例えば、特定の酵素が選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）として用いられる場合、宿主細胞は各酵素を内因性発現することができない、あるいは選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）をコードする異種ポリヌクレオチドの十分な発現なしでは、選抜培養条件下で細胞を適切に機能／成長させるには十分ではない量または十分ではない活性の前記酵素を少なくとも発現できる。したがって、宿主細胞が、導入された選択マーカー、したがって目的産物をコードするポリヌクレオチドを、選抜培養条件を生き残るのに十分な収率で発現する場合、その宿主細胞だけが十分な比率で生き残る／増殖することができる。適切な宿主細胞の選択／設計は、選択された選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）に依存する。適切な宿主細胞は、先行技術分野において公知のものである、あるいは例えば遺伝子工学（例えば、突然変異誘発、遺伝子ノックアウト、遺伝子サイレンシング等）により適切な細胞系を開発することによって作製することができる。これらの原則は先行技術分野においてよく知られており、したがって本明細書で詳細に説明する必要はない。
【０１０３】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を欠く宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）（例えば、標的ゲノム欠失による、ＤＨＦＲ−宿主細胞とも言う）は、ヌクレオチドを含まない培地においてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカー遺伝子としてトランスフェクションするためのレシピエントとして用いることができる。しかし、適切な選抜培養条件が用いられるのであれば、ＤＨＦＲ選抜を行う際にＤＨＦＲを内因性発現する宿主細胞（ＤＨＦＲ＋（プラス）宿主細胞）を用いてもよい。この場合、好ましくは、ＤＨＦＲ＋（プラス）宿主細胞によって発現される内因性ＤＨＦＲ酵素よりもＭＴＸ感受性が低いＤＨＦＲ酵素が、選択マーカー（ｓｍＩＩ）として用いられる。異種ポリヌクレオチド、例えばＤＨＦＲ遺伝子を例えば第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）として含む本発明に係る発現ベクターでトランスフェクションした後、細胞をＤＨＦＲ阻害剤濃度の漸増に付すことができる。一例として、強力なＤＨＦＲ阻害剤（Ｋｄ＝１ｐＭ）であるＭＴＸ等、葉酸代謝拮抗剤が挙げられる。培地中にＭＴＸ等、葉酸代謝拮抗剤が存在すると、細胞は生き残るためにより高レベルのＤＨＦＲを産生する。これを達成するため、複数ラウンドの選抜により、選択マーカーＤＨＦＲは顕著な遺伝子増幅を頻繁に行う。先行技術は、十分な遺伝子増幅、したがって目的産物の生成増加を達成するために、より高濃度の葉酸代謝拮抗剤／ＭＴＸを用いなければならない。葉酸代謝拮抗剤は毒性があり宿主細胞を変化させる可能性があるため、これは不利である。同一または協奏的代謝経路（好ましくは葉酸代謝）に関与する２種類の選択マーカー（ｓｍＩおよびｓｍＩＩ）を組み合わせる本発明の新規アプローチは、低レベルの阻害剤（例えばＭＴＸ）ですでに選抜ストリンジェンシーが相当に増加するという利点を有する。したがって、本発明の教示するところにより、先行技術のアプローチと比べてより少量の阻害剤、したがって毒性の薬剤が、非常にストリンジェントな選抜条件の提供に必要とされる。
【０１０４】
選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）ならびにそれらの組み合わせの適切な例が上に詳述されている。本出願人らは、上述の開示を参照する。
【０１０５】
目的産物をコードするポリヌクレオチド、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドは、前記宿主細胞に安定的に導入することができる。安定的な導入、それぞれトランスフェクションは、特に大規模発現細胞系の確立、したがって目的産物の工業生産に有利である。
【０１０６】
目的産物をコードするポリヌクレオチド、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドは、前記宿主細胞に含まれる同一または別個の発現ベクター上に配置することができる。これら実施形態に関する詳細は上に説明されている。本出願人らは、上述の開示を参照する。
【０１０７】
一実施形態において、用いられる宿主細胞の細胞生存率または増殖率は、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）によって宿主細胞に取り込まれる化合物（例えば、葉酸塩等）の取り込みに依存し得る。上に概説されている通り、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、化合物を前記宿主に移入できるトランスポーターポリペプチドをコードすることができる。上に詳述されている一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、少なくとも１種類の葉酸塩を宿主細胞に移入し、これは好ましくは上述の通り葉酸レセプターである。この実施形態は、ＤＨＦＲを第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）として用いる場合、特に上首尾となる。好ましい一実施形態において、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は葉酸レセプターであり、第二の選択マーカーは野生型ＤＨＦＲ酵素よりもＭＴＸ感受性が低いＤＨＦＲ変異体である。各マーカーの組み合わせは、ＤＨＦＲ＋（プラス）細胞との組み合わせが特に好ましい。この場合、好ましくは、ＤＨＦＲ＋（プラス）宿主細胞によって発現される内因性ＤＨＦＲ酵素よりもＭＴＸ感受性が低いＤＨＦＲ酵素が、選択マーカー（ｓｍＩＩ）として用いられる。詳細は上および下に記載されている。
【０１０８】
一実施形態において、宿主細胞は、少なくとも１種類の内因性機能的膜結合型葉酸レセプターの完全な活性を欠いている。各細胞系は、選抜／スクリーニングプロセスによって、あるいは例えばノックアウト細胞系を作製するための遺伝子工学技法によって得ることができる。したがって、例えば少なくとも１種類の内因性機能的膜結合型葉酸レセプターを含む内因性一方向性機能的葉酸塩輸送系が完全な活性を欠いている、すなわち減衰されている宿主細胞もまた提供される。このような減衰は、例えば、当該内因性葉酸塩輸送系、例えば内因性機能的膜結合型葉酸レセプターの任意の種類の突然変異誘発、例えば点突然変異や遺伝子破壊等によって提供されてよい。減衰は、部分的でも完全でもよい。後者の場合、本発明に係る真核生物細胞は、内因性機能的一方向性機能的葉酸塩輸送系、例えば内因性機能的膜結合型葉酸レセプターを含まない。
【０１０９】
一実施形態において、本発明に係る宿主細胞は、例えば上述の発現ベクターによって前記宿主細胞に導入された異種機能的膜結合型葉酸レセプターに加えて、少なくとも１種類の内因性機能的一方向性機能的葉酸塩輸送系、特に１または複数種の内因性機能的膜結合型葉酸レセプター（単数または複数）を含む。このような内因性一方向性機能的葉酸塩輸送系が存在していても、すなわちこのような内因性の系が維持されていても本明細書に記載されている選抜系を利用できることは、本発明の利点である。これは、内因性の系が維持され、したがって機能的である場合、続く非選抜条件下における目的産物の生成のための各宿主細胞の使用がより容易に行えるからである。
【０１１０】
したがって、さらに好ましい一実施形態は、好ましくは少なくとも１種類の内因性機能的膜結合型葉酸レセプターを含む、少なくとも１種類の内因性一方向性機能的葉酸塩輸送系を含む本発明の宿主細胞に関する。その好ましい一実施形態において、内因性機能的膜結合型葉酸レセプターは、葉酸レセプターαおよび葉酸レセプターβからなる群から選択される。
【０１１１】
さらに適切な組み合わせは、ＭＴＸ等、ＤＨＦＲ阻害剤に対する感受性が、ＤＨＦＲ＋（プラス）宿主細胞において内因性発現するＤＨＦＲ酵素よりも低い、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）としての変異型ＤＨＦＲと組み合わせた、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）としての葉酸レセプターの選択である。前記宿主細胞は、上に概説されている通り、ＲＦＣ＋（プラス）となることもできる。
【０１１２】
前記宿主細胞に、少なくとも
（ａ）目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
を導入するステップを含む、上述の宿主細胞を作製するための方法であって、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける方法もまた提供される。
【０１１３】
ポリヌクレオチドおよび発現ベクターを哺乳類宿主細胞等の真核生物を含む宿主細胞に導入するための、先行技術分野において公知の数種類の適切な方法が存在する。各方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃およびポリマーによる遺伝子導入を含むがこれらに限定されるものではない。従来のランダムな組込みに基づく方法に加えて、組換えによるアプローチもまた、目的産物をコードするポリヌクレオチド、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞ゲノムへの伝達に用いることができる。このような組換え方法は、Ｃｒｅ、ＦｌｐまたはΦＣ３１等、導入遺伝子の直接的な挿入を媒介することのできる部位特異的リコンビナーゼの使用を含むことができる（例えば、Ｏｕｍａｒｄら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）５０：９３〜１０８を参照）。あるいは、相同組換えのメカニズムが前記ポリヌクレオチドの挿入に用いられてもよい（Ｓｏｒｒｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２３（２００５）４３１〜４６９に概説）。組換えに基づく遺伝子挿入は、宿主細胞に伝達／導入される異種核酸に含まれるべきエレメントの数を最低限に抑える。例えば、残りのエレメント（例えば、目的産物をコードするポリヌクレオチド、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードするポリヌクレオチドおよび／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチド）だけが宿主細胞に伝達／トランスフェクトされる必要があるように、プロモーターおよびポリＡ部位（外因性または内因性）が前もって提供されている挿入遺伝子座が用いられてよい。本発明に係る適切な発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせと共に、適切な宿主細胞の実施形態が上に詳述されている。本出願人らは、上述の開示を参照する。
【０１１４】
適切な選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）をコードするポリヌクレオチドならびにそれらの組み合わせが上に詳述されている。本出願人らは、上述の開示を参照する。一実施形態において、本発明に係る発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせが宿主細胞に導入される。発現ベクターおよび発現ベクターの組み合わせは、上および特許請求の範囲に詳述されている。
【０１１５】
（ａ）少なくとも
（ｉ）目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む、複数の宿主細胞を提供するステップであって、
選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受けるステップと、
（ｂ）選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）に選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養、したがって目的産物を発現する宿主細胞を得るステップと、
を含む、目的産物を発現することのできる少なくとも１個の宿主細胞を選抜するための方法もまた提供される。
【０１１６】
本明細書における用語「選抜する」または「選抜」は、選択マーカーおよび選抜培養条件を用いて、本発明に係るベクターまたはベクターの組み合わせを取り込んだ宿主細胞を選抜、したがってそれを得るプロセスを特に意味する。その結果、トランスフェクトが成功した宿主細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の集団から単離および／または濃縮することができる。
【０１１７】
本発明に係るベクターまたはベクターの組み合わせの取り込みが成功しなかった宿主細胞は、好ましくは死滅する、あるいは本発明に係るベクターまたはベクターの組み合わせの取り込みが成功した宿主細胞と比べて選抜培養条件下における成長が損なわれる。選抜において、本発明に係るベクターまたはベクターの組み合わせの取り込みが成功した宿主細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の集団からプールとして濃縮することができる。また、個々の宿主細胞は、選抜（例えば、クローン選抜による）の際に、トランスフェクトされた宿主細胞の集団から単離することができる。トランスフェクトが成功した宿主細胞を得るための選抜手順（例えば、ＦＡＣＳ選別または限界希釈による）の適切な実施形態は、先行技術分野においてよく知られており、したがって詳細な説明の必要はない。
【０１１８】
特に選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）ならびにそれらの組み合わせの選択に関して適切な宿主細胞および特定の実施形態は、上に詳述されている。本出願人らは、上述の開示を参照する。
【０１１９】
宿主細胞に選択圧をかけるため、用いられている宿主細胞、したがって選択された選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）に応じて、培養条件が適応される。例えば、選抜培地は、選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）として選択された触媒ポリペプチドの適切な阻害剤を含むことができる。例えば、ＤＨＦＲが選択マーカー（ｓｍＩＩ）として用いられる場合、ＭＴＸ等、葉酸代謝拮抗剤は、ＤＨＦＲの活性を阻害するために用いることができる。培地中の用いられている前記阻害剤濃度（徐々に増加させてもよい）に応じて、選抜条件のストリンジェンシーが上昇する。さらに、選択圧を維持するため、培地は、選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）の活性を迂回させる十分量の代謝産物を含むべきではない。例えば、ＤＨＦＲが選択マーカー（ｓｍＩＩ）として用いられる場合、選抜培地が関連ヌクレオチドを含まないことが有利である。一般に、前記選抜戦略に干渉する代謝産物が制御、例えば回避される。
【０１２０】
さらに、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）がトランスポーターポリペプチドである場合、選抜培地は、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）によって移入される、細胞成長に必須の限界濃度の前記化合物を含むべきであり、例えば、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）が葉酸塩を宿主細胞に輸送する場合、これは葉酸塩である。このような選抜条件の選択の原則は、本技術水準において公知のものであり、実験的に決定してもよく、したがって詳細な説明の必要はない。急速成長する浮遊細胞に特に適した葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤の適切な濃度もまた本明細書に記載されている。
【０１２１】
選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）のための選抜条件は、同時に適用することができる。最適の条件が用いられる場合、これは選択圧を上昇させ、選抜ステップを一段階割愛することでより迅速な選抜手順を可能にする。このことは、適切な細胞系を得るための時間を短縮させる。例えば、選択マーカーの組み合わせである葉酸レセプター／ＤＨＦＲのため、より少量の葉酸塩を含み、ＤＨＦＲの阻害剤を含む成長培地を用いることができる。適切な阻害剤は、例えばＭＴＸ等、葉酸代謝拮抗剤である。
【０１２２】
（ｓｍＩ）と（ｓｍＩＩ）に加えてさらに別の選択マーカーが用いられる場合、選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）のための選抜条件の適用前（例えば、前選抜ステップ）またはそれと同時に、前記選択マーカーのための選抜条件を適用することができる。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）が追加的選択マーカーとして用いられる場合、本発明に係る発現ベクターまたは少なくとも２種類の発現ベクターの組み合わせを取り込んだ細胞を選抜するため、細胞は、第一に、例えばＧ４１８を含む培地で培養することができる。この第一の培地は、選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）のうち少なくとも一方に対してすでに選択的であってよい。その後、選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）のための選抜条件が適用される。この手順は、選択マーカー（ｓｍＩ）および／または（ｓｍＩＩ）のうち一方が増幅可能な選択マーカーである場合、特に有用である。
【０１２３】
上に概説されている通り、好ましくは（ｓｍＩ）は葉酸トランスポーター、特に葉酸レセプターであり、したがって本発明の一実施形態は細胞培養培地中の葉酸塩の限定的な可用性に基づく。この系は、広範に適用、特に細胞生存が葉酸塩の取り込みに依存する真核生物細胞に適用できるであろう。この実施形態は、加速度的な選抜、スクリーニングおよび宿主細胞、特に真核生物、例えば好ましくは高レベルの組換え産物を安定的に過剰発現する哺乳類細胞クローンの確立に用いることができる。さらにまた、他の公知の選抜系とは対照的に、例えば、内因性遺伝子（単数または複数）の変異導入またはノックアウトによって提供される改変された細胞が絶対に必要という訳ではない（実行可能な場合もあるが）。例えばＦＲαのＦＡに対する親和性（ＫＤ＝０．１ｎＭ）は、例えばＲＦＣのロイコボリンに対する親和性（Ｋｔ＝１μＭ）よりも高いことが示され、ＦＲαは葉酸を一方向性経路により細胞に輸送するため、本発明は、特に成長培地からの段階的な葉酸塩（例えば、葉酸）の除去による、ＦＲαその他の葉酸レセプターの顕著に改善された優性の代謝選択マーカーとしての使用を提供する。この葉酸塩に基づく選抜は、培養哺乳類細胞における標的タンパク質の加速度的で安定的な高レベル過剰発現によく適した優れた戦略である。
【０１２４】
好ましくは共通または協奏的代謝過程もしくは経路に関与する、２からのある程度の数の相互依存的な選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）を使用するための本発明の戦略は、一代謝経路を標的とする選抜条件の相加的／相乗的効果のため、非常に高いストリンジェンシーが得られるという利点を有する。したがって、選抜を生き残った細胞集団の生産性は著しく増加する。実施例は、選抜方法の手順後に得られた宿主細胞が目的産物を高収率で産生することを示した。また、個々の宿主細胞の平均的な生産性も増加する。したがって、より少ないスクリーニング労力で高産生株クローンを見出す確率が改善される。したがって、本発明に係る選抜系は、先行技術分野で用いられる選抜系より優れている。特に、ＤＨＦＲ酵素と併用した葉酸レセプターの選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）としての使用の好ましい組み合わせのため、各選択マーカー単独での使用と比べてより高い生産性を有する宿主細胞が得られる。したがって、選抜条件のより高いストリンジェンシーのために、選抜手順が最適化される。
【０１２５】
最適の細胞培養条件が用いられる場合、選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）のための選抜を一選抜ステップで行うことができるため、本発明に係る選抜方法は、先行技術分野で公知の従来の選抜戦略より迅速でより効率的に行うこともできる。
【０１２６】
前記方法は、
（ｃ）目的産物を所望の収率で発現する少なくとも１個の宿主細胞を選抜するステップ
を追加的に含むことができる。
【０１２７】
本発明のストリンジェントなスクリーニング／選抜手順の結果得られた細胞は、一般に、元々の細胞集団における非選抜細胞から単離、濃縮することができる。細胞は、個々の細胞として単離、培養することができる。しかし、濃縮された集団を用いてもよい。得られた宿主細胞は、必要に応じて追加的な定性および定量解析のための１または複数の追加ラウンドの選抜に用いることもできるし、あるいは例えばタンパク質生産のための細胞系開発に用いることもできる。一実施形態において、上述の通り選抜された産生宿主細胞の濃縮された集団は、目的ポリペプチドを優れた収率で産生するための集団として直接用いられる。
【０１２８】
好ましくは、目的産物を安定的に発現する宿主細胞が選抜される。安定的なトランスフェクション／発現の利点は、上に詳述されている。本出願人らは、上述の開示を参照する。
【０１２９】
選抜方法の最も好ましい一実施形態において、複数の宿主細胞は、本発明に係る、すなわち本明細書に開示されている宿主細胞を含む。本出願人らは、特に適切な選択マーカー（ｓｍＩ）および（ｓｍＩＩ）ならびにそれらの組み合わせに関する上の詳細な開示を参照する。
【０１３０】
特に宿主細胞および発現ベクター、それぞれの発現ベクターの組み合わせに関するさらに好ましい実施形態は、上に詳述されている。本出願人らは上述の開示を参照する。
【０１３１】
好ましくは、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、葉酸塩を宿主細胞に輸送することのできるトランスポーター／レセプターである。本発明に係る選抜系のこの実施形態は、トランスフェクション前の内因性葉酸レセプターα、βまたはγ遺伝子のゲノム欠失または減衰を必要とせず、したがってある程度の内因性葉酸レセプターの遺伝子発現が行われている場合であっても、どのレシピエント細胞にも適用することができる（上述を参照）。この重要な利点は、葉酸レセプターαのトランスフェクションに続き、成長培地における急激で重度の葉酸塩（例えば葉酸）欠乏に細胞を付すことができるという事実に基づく。その結果、顕著な量の葉酸レセプターα選択マーカーを発現するトランスフェクタント細胞だけがＤＮＡ複製および細胞増殖の維持に十分な葉酸塩を輸送することができる。これは、内因性葉酸レセプターα遺伝子の顕著な発現上昇が全くなくても起こる。さらに、本発明に係る選抜系のこの実施形態は、内因性ＲＦＣの発現増加等、葉酸塩取り込みの代替ルートの発現増加による選択圧の軽減のために、選抜ストリンジェンシーの低下を被ることはない。この重要な利点は、葉酸レセプターαが葉酸に対して優れた親和性（Ｋｄ＝０．１ｎＭ）を有する一方、ＲＦＣは葉酸に対して非常に低い親和性（Ｋｍ＝０．２〜０．４ｍＭ）を示すという事実によるものである。
【０１３２】
（ｓｍＩＩ）が、ＤＨＦＲまたは核酸合成経路もしくは特に葉酸代謝における別の酵素である場合、選抜培地は、選抜条件を提供するために各酵素の阻害剤、例えばＭＴＸ等、葉酸代謝拮抗剤を追加的に含む。
【０１３３】
少なくとも一選抜ステップにおいて用いられる選抜培地は、１または数種類の葉酸塩を含むことができる。選抜培地中に限界濃度で含まれている葉酸塩は、宿主細胞に取り込まれ、宿主細胞によって加工されることができる。宿主細胞によって加工されない葉酸塩、特に葉酸塩の誘導体は選択圧に寄与せず、したがって限界濃度に寄与しないであろう。選抜培地は、次の特性、
（ａ）好ましくは約５００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下または最大約２，５ｎＭの濃度である、限界濃度の葉酸塩、好ましくは葉酸を含むこと、および／または
（ｂ）約５００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、好ましくは約５０ｎＭ以下の濃度の葉酸を含むこと、および／または
（ｃ）ＤＨＦＲ阻害剤を含むこと、および／または
（ｄ）葉酸代謝拮抗剤を含むこと、および／または
（ｅ）約５００ｎＭ以下、約３５０ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１５０ｎＭ以下の濃度の葉酸代謝拮抗剤を含むこと、および／または
（ｆ）葉酸代謝拮抗剤としてＭＴＸを含むこと、および／または
（ｇ）約３５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、好ましくは約１５０ｎＭ以下の濃度のＭＴＸを含むこと、および／または
（ｈ）最大１００ｎＭ、好ましくは最大５０ｎＭの濃度の葉酸、そして葉酸代謝拮抗剤の最大２０倍の等モル濃度の葉酸を含むこと
のうち１または複数を有することができる。
【０１３４】
葉酸塩、特に葉酸の好ましい濃度は、
（ａ）約５００ｎＭ〜１００ｐＭ、
（ｂ）約２５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは約２５０ｎＭ〜２，５ｎＭまたは約２５０ｎＭ〜５もしくは１０ｎＭ、
（ｃ）約１５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは約１５０ｎＭ〜２，５ｎＭまたは約１５０ｎＭ〜５もしくは１０ｎＭ、
（ｄ）約１００ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜２，５ｎＭまたは約１００ｎＭ〜５もしくは１０ｎＭ、
（ｅ）約７５ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは約７５ｎＭ〜２，５ｎＭまたは約７５ｎＭ〜５もしくは１０ｎＭ、
（ｆ）約５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは約５０ｎＭ〜２，５ｎＭまたは約５０ｎＭ〜５もしくは１０ｎＭ、
（ｇ）約５０ｎＭ〜１２．５ｎＭおよび
（ｈ）約２５ｎＭ〜２．５ｎＭまたは約２５ｎＭ〜５ｎＭ
から選択される。
【０１３５】
葉酸代謝拮抗剤、特にＭＴＸの好ましい濃度は、
（ａ）約５００ｎＭ〜５ｎＭ、
（ｂ）約３５０ｎＭ〜５ｎＭ、
（ｃ）約２００ｎＭ〜５ｎＭ、
（ｄ）約１００ｎＭ〜１０ｎＭ、
（ｅ）約５０ｎＭ〜１０ｎＭおよび
（ｆ）約５０ｎＭ
から選択される。
【０１３６】
上述の葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤の好ましい濃度および濃度範囲は、互いに組み合わせることができる。一実施形態において、約１２，５ｎＭ〜５０ｎＭの葉酸塩濃度は、１０ｎＭ〜１００ｎＭの葉酸代謝拮抗剤濃度と組み合わせて用いられる。説明してきたように、好ましくは葉酸が葉酸塩として、ＭＴＸが葉酸代謝拮抗剤として用いられる。
【０１３７】
さらに、用いられる葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤濃度が互いに影響することも見出された。したがって、葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤の絶対濃度に加えて、その比率もまた、適切な選抜条件を提供するための要因となることができる。葉酸代謝拮抗剤（好ましくはＭＴＸ）の濃度は、葉酸塩（好ましくは葉酸）濃度の最大約２０倍となることができる。葉酸代謝拮抗剤（好ましくはＭＴＸ）濃度は、葉酸塩（好ましくは葉酸）濃度の約１０倍となることができる。好ましくは、選抜培地は、１：１０から１０：１の濃度比率、好ましくは１：５から５：１の濃度比率で葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤を含む。ほぼ等モル濃度の葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤が用いられる場合、非常に良い結果が得られる。実施例によって示されている通り、これらの比率は、高産生宿主細胞を得るのに非常に適切な選抜培養条件を提供する。本発明は、本発明の方法による宿主細胞の選抜に適した各選抜培地も提供するため、上述の選抜培地もまた本発明の個々の要素を構成する。
【０１３８】
上述の濃度は、商業生産用の細胞系に好ましい表現型である急速成長する浮遊細胞に特に適している。しかし、異なる細胞系は、異なる葉酸消費特性を有する可能性がある。さらに、限界濃度は、用いられる葉酸塩、それぞれの葉酸代謝拮抗剤に依存して変化する。したがって、限界濃度の葉酸塩（特に葉酸）および葉酸代謝拮抗剤（特にＭＴＸ）ならびに適切な葉酸対ＭＴＸの比率は、選択された宿主細胞および葉酸塩、それぞれの葉酸代謝拮抗剤に依存して異なる可能性がある。しかし、適切な濃度は、当業者であれば容易に実験的に決定することができる。
【０１３９】
一実施形態において、宿主細胞は、トランスフェクションおよび／または選抜前に、葉酸塩を含まない培地または限界濃度の葉酸塩を含む培地で前培養される。葉酸塩の適切な限界濃度は上に説明されている。好ましくは、宿主細胞を前培養するための前記培地は、５０ｎＭ以下の濃度の葉酸塩、特に葉酸を含む。
【０１４０】
上に概説されている通り、本発明に係る選抜方法は、先行技術分野で公知のフローサイトメトリーに基づく選抜方法と組み合わせることができる。したがって、一実施形態において、目的産物を高収率で発現する宿主細胞を選抜するため、本発明の方法に従って宿主細胞が選抜された後に、フローサイトメトリーに関する選抜ステップが行われる。この目的のため、好ましくは目的産物の少なくとも一部は、宿主細胞の細胞表面上に提示される膜アンカー型融合ポリペプチドとして発現する。提示された融合ポリペプチドの量に基づき、目的産物を高収率で発現する宿主細胞は、フローサイトメトリーを用いて、好ましくはＦＡＣＳを用いて選抜することができる。
【０１４１】
したがって、好ましい一実施形態において、目的ポリヌクレオチドは、
ａ）少なくとも
ａａ）目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
ｂｂ）目的産物をコードするポリヌクレオチド下流の少なくとも１個の終止コドンと、
ｃｃ）膜アンカーおよび／または膜アンカーのシグナルをコードする、終止コドン下流のポリヌクレオチドと、
を含む発現カセット
または
ｂ）少なくとも
ａａ）目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
ｂｂ）５’スプライスドナー部位および３’スプライスアクセプター部位を含み、インフレーム翻訳終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含むイントロンと、
ｃｃ）膜アンカーおよび／または膜アンカーのシグナルをコードする、前記イントロン下流のポリヌクレオチドと、
を含む発現カセット
から発現する。
【０１４２】
これら発現カセットの設計に関する詳細は、上に記述されてきた。これは、各開示を参照する。選抜のため、目的産物の少なくとも一部が、膜アンカーを含む融合ポリペプチドとして発現し、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上に提示され、細胞表面上に提示された融合ポリペプチドの量に基づいて少なくとも１個の宿主細胞が選抜されるように、宿主細胞は目的産物を発現するよう培養される。上述の通り、宿主細胞は、好ましくはフローサイトメトリー、特にＦＡＣＳを用いて選抜される。実施例に示されている通り、本発明に係る選抜方法とそれぞれフローサイトメトリーに基づく選抜アプローチとの組み合わせは非常に有利であり、非常に優れた発現率を有する宿主細胞が同定される。
【０１４３】
一実施形態において、本発明は、限界濃度の葉酸塩と、葉酸代謝拮抗剤とを含む選抜培地も提供する。上に概説した通り、選抜培地に限界濃度で含まれている葉酸塩は、宿主細胞に取り込まれ、宿主細胞によって加工されることができる。宿主細胞によって加工されない葉酸塩、特に葉酸塩の誘導体は、選択圧に寄与せず、したがって限界濃度に寄与しない。前記選抜培地は、好ましくは、特に培地に含まれる葉酸塩および葉酸代謝拮抗剤の濃度ならびに好ましい実施形態に関する、本発明に記載の選抜方法と併せて用いられる選抜培地のための上述の特性のうち１または複数を有する。その利点も上に詳述されている。これは、この場合にも適用される上述の開示を参照する。前記選抜培地は、本発明の選抜系と併せて用いることができる。
【０１４４】
本発明に係る宿主細胞および／または目的産物を発現させる条件下で本発明の教示するところに従って選抜された宿主細胞を培養するステップを含む、目的産物を生産するためのプロセスも提供される。
【０１４５】
目的産物、特にポリペプチドを生産するために本発明に係る宿主細胞を用いることは、目的産物を非常に高収率で生産できるという利点がある。発現に適した宿主細胞を選抜するための本発明に係る選抜方法を行う場合、これは特に有利である。したがって、本発明は、目的ポリペプチドを生産するための改良法を提供する。適切な宿主細胞は上に説明されている。本出願人らは、上述の開示を参照する。
【０１４６】
発現した目的産物は、宿主細胞を破砕することによって得ることができる。ポリペプチドは、発現、例えば培地に分泌されて、そこから得ることもできる。また、各方法の組み合わせも可能である。その結果、産物、特にポリペプチドが産生され、高収率で効率的に得る／単離することができる。目的産物を所望の品質で生産するため、得られた産物は、例えば精製および／または修飾ステップ等、さらに別の加工段階に付すこともできる。一実施形態において、前記宿主細胞は無血清条件下で培養される。
【０１４７】
目的産物を生産するための方法は、次のステップ
−  目的産物を前記細胞培養培地からおよび／または前記宿主細胞から単離するステップおよび／または
−  単離された目的産物を加工するステップ
のうち少なくとも一方を含むことができる。
【０１４８】
本発明に従って産生された目的産物、例えばポリペプチドは、本技術分野で公知の方法によって回収、さらに精製、単離および／または修飾することができる。例えば、産物は、遠心分離、ろ過、限外ろ過、抽出または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって栄養培地から回収することができる。精製は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよび分子ふるい）、電気泳動の手順（例えば、調製的等電点電気泳動）、溶解度分画（differential solubility）（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出を含むがこれらに限定されない本技術分野で公知の様々な手順によって行うことができる。
【０１４９】
目的産物は、前記ポリヌクレオチドにコードされた遺伝情報の転写、翻訳または発現に関する任意の他の事象によって産生できる任意の生物学的産物となることができる。この点において、産物は発現した産物となるであろう。目的産物は、ポリペプチドおよび核酸、特にＲＮＡからなる群から選択されてよい。産物は、医薬的もしくは治療的に有効な化合物、あるいはアッセイ等で利用されるリサーチツールとなることができる。特に好ましい一実施形態において、産物は、ポリペプチド、好ましくは医薬的もしくは治療的に有効なポリペプチド、あるいは診断もしくは他のアッセイ等で利用されるリサーチツールである。したがってポリペプチドは、任意の特定のタンパク質またはタンパク質のグループに限定されず、むしろ本明細書に記載されている方法による選抜および／または発現が望ましい任意のサイズ、機能または起源の任意のタンパク質となることができる。したがって、数種類の異なる目的ポリペプチドが発現／産生されてよい。ポリペプチドという用語は、ペプチド結合（単数または複数）によって結合したアミノ酸のポリマーを含む分子を意味する。ポリペプチドは、タンパク質（例えば、５０アミノ酸を超える）およびペプチド（例えば、２〜４９アミノ酸）等、任意の長さのポリペプチドを含む。ポリペプチドは、例えば酵素タンパク質またはペプチド（例えばプロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ）、レセプタータンパク質またはペプチド、トランスポータータンパク質またはペプチド、殺菌性および／またはエンドトキシン結合タンパク質、構造タンパク質またはペプチド、免疫ポリペプチド、毒素、抗生物質、ホルモン、成長因子、ワクチンその他等の生物活性ポリペプチドを含む、任意の活性または生物活性のタンパク質および／またはペプチドを含む。前記ポリペプチドは、ペプチドホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、サイトカイン、免疫グロブリン、特に抗体もしくは機能的抗体断片またはそれらの変異体からなる群から選択されてよい。最も好ましい一実施形態において、ポリペプチドは、免疫グロブリン分子もしくは抗体またはそれらの機能的変異体、例えばキメラまたは部分もしくは完全ヒト化抗体である。このような抗体は、診断用抗体または医薬的もしくは治療的に有効な抗体となることができる。
【０１５０】
上および特許請求の範囲に規定されている通り、本発明に係る方法によって得られた産物もまた提供される。前記産物は、好ましくはポリペプチド、特に免疫グロブリン分子またはそれらの機能的断片である。
【０１５１】
本発明のさらに別の態様は、目的産物を発現できる宿主細胞を選抜するための、第一の選択マーカー（ｓｍＩ）とは異なる第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）と組み合わせた第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の使用に関連し、選択マーカー（ｓｍＩ）または（ｓｍＩＩ）の活性は、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける。
【０１５２】
第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、次の特性、
（ａ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／または第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、
（ａａ）核酸合成および／もしくはポリペプチド合成と、
（ａｂ）ヌクレオチド合成および／もしくはアミノ酸合成と、
（ａｃ）葉酸代謝と、
から選択された代謝過程または経路に関与する、ならびに／または
（ｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／もしくは第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、触媒ポリペプチドまたはトランスポーターポリペプチドである、ならびに／または
（ｃ）第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、
（ｃａ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）によって宿主細胞へと移入された化合物または前記取り込まれた化合物から得られるその後の産物である基質、および／もしくは
（ｃｂ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）の活性によって生成された基質またはその前駆物質
を加工する触媒ポリペプチドである、ならびに／または
（ｄ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）の上流で作用する、ならびに／または
（ｅ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、細胞生存および／または増殖に関与するおよび／もしくは必須の化合物を宿主細胞に移入するトランスポーターポリペプチドである、あるいはそれを含む、ならびに／または
（ｆ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、少なくとも１種類の葉酸塩を宿主細胞に輸送する／取り込む、ならびに／または
（ｇ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、機能的膜結合型葉酸レセプターである、あるいはそれを含む、ならびに／または
（ｈ）第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、葉酸塩および／もしくは葉酸塩から得られたその後の産物のいずれかである基質を加工する触媒ポリペプチドである、ならびに／または
（ｉ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、次の特性
（ｉａ）葉酸レセプターは、葉酸レセプターα、葉酸レセプターβ、葉酸レセプターγおよび前述の機能的変異体からなる群から選択される、および／もしくは
（ｉｂ）葉酸レセプターは、ヒト葉酸レセプターまたはその機能的変異体である、および／もしくは
（ｉｃ）葉酸レセプターは、ヒト葉酸レセプターαまたはその機能的変異体である、および／もしくは
（ｉｄ）葉酸レセプターは、配列番号１、２もしくは３または前述の機能的変異体のアミノ酸配列を有するまたは含む葉酸レセプターである
のうち、１または複数を有する葉酸レセプターである、あるいはそれを含む機能的膜結合型葉酸レセプターである、ならびに／または
（ｊ）選択マーカー（単数または複数）（ｓｍＩ）および／もしくは（ｓｍＩＩ）は、核酸合成および／もしくは葉酸代謝に関与する触媒ポリペプチド、好ましくはＤＨＦＲまたはその機能的変異体もしくは断片である、あるいはそれを含む、ならびに／または
（ｋ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）は、核酸合成に関与するおよび／もしくは必須の化合物を宿主細胞に組入れるトランスポーターポリペプチドである、あるいはそれを含み、第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、核酸合成に関与する触媒ポリペプチドである、ならびに／または
（ｌ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／もしくは第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、真核生物の選択マーカーである、ならびに／または
（ｍ）第一の選択マーカー（ｓｍＩ）および／もしくは第二の選択マーカー（ｓｍＩＩ）は、増幅可能な選択マーカーである
のうち、少なくとも一特性を有することができる。
【０１５３】
これらの実施形態の詳細、組み合わせおよび利点は、上に説明されている。本出願人らは、上述の開示を参照する。特に好ましくは、葉酸レセプター等、葉酸トランスポーターとＤＨＦＲまたはその機能的変異体もしくは誘導体との組み合わせである。
【０１５４】
本明細書に記されている文章および文書の内容全体は、参照によって本明細書に援用されており、したがって本開示の一部を構成する。
【０１５５】
次の実施例は、その範囲を決して限定することなく本発明の説明に用いられる。特に、実施例は本発明の好ましい実施形態に関する。
【実施例】
【０１５６】
一般に、試薬等の適切な材料は、当業者によく知られており、市販されており、メーカーの取扱説明書に従って用いることができる。実施例は記載の取扱説明書に従って行われる。
【実施例１】
【０１５７】
１．実施例１−選抜
ＣＨＯ細胞における同時トランスフェクション実験は、同一目的タンパク質（モノクローナル抗体）の同一発現カセットを有するが、選択マーカーの異なる組み合わせのベクターを用いて行われる。この実験は、細胞培養培地におけるＭＴＸと限定的な葉酸濃度を組み合わせた選抜によって、目的産物、この場合は免疫グロブリン分子を高度に過剰発現する細胞集団が作製されること、またこれら集団の生産性が、ＤＨＦＲまたは葉酸レセプターα（ＦｏｌＲ）を代謝選択マーカーとして単独で用いる戦略と比べてより高いことを示す。
【０１５８】
１．１．材料と方法
１．１．１．ベクター構築
ベクターＩは、ＤＨＦＲ（ｄｈｆｒ＋（プラス）細胞系の変異型）発現カセットを含む。真核生物細胞、特にＣＨＯ細胞における発現に適した前記プラスミドベクター（ベクターＩ）は、次のエレメントを有する。
（ｉ）ＩｇＧ１型の分泌性組換えヒト抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードする発現カセットを含む発現カセット。組換え抗体の発現は、ＣＭＶプロモーターおよび標準的な（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルの制御下に置かれる。
（ｉｉ）ＤＨＦＲ（ＭＴＸに対してより低い感受性を有する変異型）をコードするポリヌクレオチドを選択マーカー遺伝子（ｓｍＩＩ）として含む別個の発現カセット。ＤＨＦＲの発現は、ＳＶ４０プロモーターおよび標準的な（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルの制御下に置かれる。
【０１５９】
プラスミドベクター（ベクターＩＩ）は、ＤＨＦＲの代わりにヒト葉酸レセプターαを第一の選択マーカー（ｓｍＩ）として含む。したがって、両方のベクターは、Ｇ４１８耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含むが、異なる追加的マーカー、すなわちＤＨＦＲまたはヒト葉酸レセプターαのいずれかを含む。ベクターＩおよびベクターＩＩは、次の主要なエレメントを含む。
【０１６０】
【表１】
0005801207.tif 000005
【０１６１】
１．１．２．ＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよび選抜
細胞培養、トランスフェクションおよびスクリーニングは、従来の培地中で浮遊成長しているＣＨＯ細胞を用いてシェイカーフラスコで行われる。宿主細胞における細胞内葉酸貯蔵を低減させるため、そして前培養培地から選抜培地への葉酸の同時移動を防ぐため、細胞は、トランスフェクションおよび選抜の前に、葉酸を含まない培地または葉酸含有量を低下させた培地（例えば、５０ｎＭ）へと継代される。
【０１６２】
エレクトロポレーションによって、ベクターＩとベクターＩＩを細胞に同時トランスフェクトする。Ｇ４１８および１０ｎＭ葉酸を含む選抜培地を細胞に添加することによって、細胞生存率に応じてトランスフェクションの２４〜４８時間後に第一の選抜ステップを開始する。細胞が８０％を超える生存率に回復し次第、１００ｎＭ  ＭＴＸおよび１０ｎＭ葉酸を含むがＧ４１８を含まない培地に細胞を継代することによって、第二の選抜ステップが行われる。よりストリンジェントな条件下では細胞が回復しない場合、葉酸濃度を２０ｎＭ、続いて１００ｎＭに増加させてよい。依然として増殖はしていないが生存率の上昇が観察できるプールは、１１．３μＭ葉酸を含むがＭＴＸを含まない培地に細胞を移す。この移動の後、増殖を開始した同時トランスフェクト細胞集団は、さらなる解析のため増殖させる。
【０１６３】
１．１．３．プールの生産性の決定
第一および最終選抜ステップの後、１１．３μＭ葉酸を含み、Ｇ４１８およびＭＴＸを含まない培地において過成長したシェイカーフラスコのバッチ培養物から、選抜された細胞集団の生産性を解析する。
【０１６４】
バッチ培養物をシェイカーフラスコ１２５において５０ｍｌの作業容量で播種し、シェイカーキャビネット（加湿なし）内で１５０ｒｐｍ、１０％ＣＯ２で培養する。細胞の生存率は、アッセイ開始時に＞９０％でなければならない。播種細胞密度は、ほぼ２×１０５ｃ／ｍｌである。力価決定は１３日目に行われる。細胞培養物上清における抗体価は、培養開始１３日後にプロテインＡ  ＨＰＬＣによって決定される。
【０１６５】
１．２．結果
ＤＨＦＲおよびＦｏｌＲを選択マーカーとして用いる選抜戦略の有効性を示すため、ＤＨＦＲ（ベクターＩ）やＦｏｌＲ（ベクターＩＩ）と共に同一モノクローナル抗体をコードするベクターの同時トランスフェクションが行われる。両方のベクターは、Ｇ４１８耐性遺伝子も含む（上述を参照）。
【０１６６】
１．２．１．第一の選抜ステップ
先ず、Ｇ４１８を添加し、葉酸濃度を１０ｎＭに低減させることによって、トランスフェクトされた細胞集団が選抜される。この最初の前選抜ステップは、第二の選抜ステップにおいてよりストリンジェントな選抜条件が適用される前に非トランスフェクト細胞を死滅させるのに有用であり、同時に細胞に自身の細胞内葉酸蓄積を消費させる。トランスフェクトされた全細胞集団はこれらの第一の選抜条件下で回復し、通常、材料と方法に記載されている通り生産性が評価される。Ｇ４１８および１０ｎＭ葉酸含有培地において選抜されたトランスフェクトされた細胞は、シェイカーフラスコバッチ培養において解析される。培養１３日目に、培地のサンプルを採取し、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって抗体含有量を解析する。表１は、各事例において得られた生産性の結果をまとめたものである。
【０１６７】
【表２】
0005801207.tif 000006
【０１６８】
全細胞集団が抗体を産生する。ＤＨＦＲベクター（ベクターＩ）と組み合わせたＦｏｌＲベクター（ベクターＩＩ）でトランスフェクトした細胞は、選抜に対して従来の先行技術方法（例えば、ＤＨＦＲ単独）よりも高度な平均生産性で応答する。培地における限定的な葉酸含有量は、ＦｏｌＲを過剰発現する細胞の成長を促進させる。
【０１６９】
１．２．２．第二の選抜ステップ
選抜ストリンジェンシーを上げるために、次のステップは、Ｇ４１８を除去するためのものであるが、１００ｎＭ  ＭＴＸを培地に添加して葉酸濃度を１０ｎＭに維持するためのものである。これらの条件下で、トランスフェクトされた全集団における細胞の生存率は劇的に低下し、低レベルを維持する。さらに、通常、細胞成長は検出されない。葉酸含有量を先ず２０ｎＭに、続いて１００ｎＭに増加させることによって選択圧を低下させてよい。生産性評価のために選抜された集団の成長を促進させるため、回復した生細胞を、ＭＴＸを含まないが１１．３μＭ葉酸を含む培地に移すことができる。すでに二重トランスフェクションから部分的に回復した１プールは別個に１００ｎＭ葉酸を含む培地で維持し、それに対し各ベクターの組み合わせによる他のプールは細胞密度を増やすよう組み合わせ、これによって生存確率を上げる。速い成長で応答する二重トランスフェクトされた細胞をさらに増殖させ、生産性を解析する。表２は結果を示す。
【０１７０】
【表３】
0005801207.tif 000007
【０１７１】
Ｇ４１８および１０ｎＭ葉酸によって選抜された細胞集団は、１００ｎＭ  ＭＴＸおよび段階的に増加させた濃度の葉酸を添加することによってさらに選抜する。最終的に、ＭＴＸを含まず１１．３μＭ葉酸を含む培地に細胞を移し、シェイカーフラスコバッチ培養において回復した集団を解析する。培養１３日目に培地のサンプルを採取し、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって抗体含有量を解析する。
【０１７２】
この選抜プロセスを経た後、二重トランスフェクトされた細胞集団の生産性は驚くほど高い。第一の選抜ステップと比べて、プール１の場合、抗体価はほぼ２０倍増加して１ｇ／Ｌを超え、プール２〜５を組み合わせた場合１０倍増加する。また、例えば、Ｇ４１８と組み合わせたＤＨＦＲ単独を選択マーカーとして用いたさらにより強力に最適化された選抜手順と比較すると、本発明に係るベクターの組み合わせを用いた二重選抜後に観察された生産性はさらに高い。ＤＨＦＲ／Ｇ４１８の組み合わせを同一抗体のために用いた以前の実験は、相当低いプール力価をもたらす。
【０１７３】
したがって、ＤＨＦＲおよびＦｏｌＲを選択マーカーとして用いた組み合わせ選抜は、目的タンパク質を高度に過剰発現する細胞をもたらす。この組み合わせは、本技術水準の選抜系（例えば、ＤＨＦＲ／Ｇ４１８）より優れてもいる。
【実施例２】
【０１７４】
２．実施例２：選抜条件の最適化
２．１．トランスフェクション、選抜およびクローン特性評価
２．１．１．トランスフェクションおよび選抜
選抜条件の最適化のため、二連続選抜ステップにおいて葉酸およびＭＴＸ濃度の追加的な組み合わせを試験する。先ず、０．８ｇ／Ｌ  Ｇ４１８を含む培地において、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１１．３μＭ（参照）の葉酸濃度を、２．５ｎＭ、５ｎＭもしくは１０ｎＭ  ＭＴＸまたはＭＴＸなしと組み合わせる。第二の選抜ステップにおいてこれらの条件下で回復した細胞集団を、Ｇ４１８を含まず第一の選抜ステップと同じ葉酸濃度を含むが１０倍高いＭＴＸ濃度の培地に移す。ＤＨＦＲ選抜標準プロトコールに従って、参照細胞を５００ｎＭ  ＭＴＸを含む培地に移す。
【０１７５】
２．１．２．クローニングおよびクローン特性評価
１ウェル当たり０．５細胞の密度で９６ウェルプレートに細胞を播種することにより限界希釈法によってクローニングを行う。その後、生産性スクリーニングのために先ず２４ウェルプレートで、続いてシェイカーフラスコで細胞を増殖させる。
【０１７６】
異なる型式を用いたバッチおよびフェドバッチ実験においてクローンの生産性を解析する。細胞を振盪式２４ウェルプレートに播種することによって、２４ウェルプレートのバッチアッセイにおいて最初のスクリーニングを行う。細胞培養物上清における抗体価は、培養開始１０日後に定量的プロテインＡ−ＨＰＬＣによって決定する。その後、バッチおよびフェドバッチモードのシェイカーフラスコモデルにおいて、最も高度に産生するクローンを解析する。１１．３μＭ葉酸を含む培地におけるバッチ培養物を１００ｍＬまたは５０ｍＬの作業容量でシェイカーフラスコ（５００ｍＬまたは２５０ｍＬ容量）に播種し、シェイカーキャビネット（加湿なし）内で１５０ｒｐｍ、３６．５℃、１０％ＣＯ２で培養する。アッセイ開始時の細胞の生存率は＞９０％である。播種細胞密度は、２×１０５ｃ／ｍＬである。抗体価、細胞数および生存率は、画定された培養時点において決定することができる。同一条件を用いるが、４×１０５ｃ／ｍＬの出発細胞密度であり、生細胞密度が７×１０６ｃ／ｍＬを超えたら栄養の定期的な添加を開始するフェドバッチ実験を行う。クローンの安定性は、シェイカーフラスコのバッチモデルを用いてほぼ２週間毎に生産性を測定しつつ、細胞を最大１９週間の期間にわたって培養することによって評価する。
【０１７７】
２．２．結果
２．２．１．第一の選抜ステップ
トランスフェクトされた細胞は、第一の選抜ステップにおいて２．５ｎＭから１０ｎＭのＭＴＸ濃度と組み合わせた１２．５ｎＭから５０ｎＭの範囲の葉酸濃度で選抜される。参照として、１１．３μＭ葉酸（ＦＡ）も試験される。第一の選抜ステップの後に得られた生産性を表３にまとめる。
【０１７８】
【表４】
0005801207.tif 000008
【０１７９】
１０ｎＭ  ＭＴＸによる選抜の後に最も高い生産性が得られることが判明した。ベクターＩおよびベクターＩＩで同時トランスフェクトした細胞は、驚くほど大量の産物（最大８８７ｍｇ／Ｌ）を産生する。これは、ＤＨＦＲ単独（ｄｈｆｒ単独参照）でトランスフェクトした細胞の生産性を大きく超える。
【０１８０】
２．２．２．第二の選抜ステップ
Ｇ４１８を含まない培地に細胞を移し、第一の選抜ステップの葉酸濃度は維持しつつＭＴＸ濃度を１０倍に増加させることによって、回復した集団に第二の選抜ステップが適用される。これらの条件下で回復した細胞集団の生産性を解析する。結果を表４にまとめる。
【０１８１】
【表５】
0005801207.tif 000009
【０１８２】
驚くべきことに、適切な選抜条件下で、ベクターＩおよびベクターＩＩ、したがって本発明に係る組み合わせでトランスフェクトした細胞は、ベクターＩ単独でトランスフェクトした細胞と比べてより高い生産性（最大１．５ｇ／Ｌ）を有することが判明した。このことは、ＤＨＦＲとＦｏｌＲの選択マーカーとしての組み合わせが、非常に高い選抜ストリンジェンシーを提供することを示す。したがって、本発明は、先行技術を上回る非常に重大な改善を提供する。
【０１８３】
２．２．３．クローン生産性の比較
選抜の後、同時トランスフェクトしたプールから、限界希釈クローニングによってクローンを作製する。２４ウェルプレートのスクリーニングにおいて同定された最も高度に産生するクローンをシェイカーフラスコでさらに増殖させる。過成長したシェイカーフラスコバッチアッセイにおいて生産性を解析し、以前の実験の個々のベクターから得られた上位クローンの結果と比較する。
【０１８４】
【表６】
0005801207.tif 000010
【０１８５】
ｄｈｆｒおよびｆｏｌＲを選択マーカーとして含むベクターを同時トランスフェクトすることによって、またトランスフェクトした細胞を限定的な葉酸濃度とＭＴＸの下で選抜することによって、最も高度に産生するクローンを得る。
【０１８６】
２．２．４．クローン生産安定性の解析
ｄｈｆｒ／ｆｏｌＲで同時トランスフェクトして選抜した上位１０クローンのクローン生産安定性は、バイアルの解凍から１９週間の期間にわたって測定し、最初の生産性評価は解凍５週間後に行う。５０ｎＭ葉酸および５０ｎＭ  ＭＴＸの選抜条件下で細胞を培養する。生産性アッセイは、１１．３μＭ葉酸を含む培地で行う。
【０１８７】
【表７】
0005801207.tif 000011
【０１８８】
解析した１０クローンのうち８クローンは１９週間の期間にわたって高度な生産安定性を示し、全１０クローンは１２週間にわたって十分な安定性を示す。
【実施例３】
【０１８９】
３．実施例３−組み合わせベクターおよびＦＡＣＳ選別を用いた選抜
３．１．ベクター構築
ＦＡＣＳ選別を用いたさらなる選抜をも可能にする、選択マーカーＤＨＦＲおよびＦｏｌＲを一骨格に含むベクターＩＩＩを作製する。前記ベクターＩＩＩは、「リーキー」終止コドンおよび免疫グロブリン膜貫通アンカーを含む、抗体重鎖を発現するための発現カセットを含む。本明細書において上に概説されている通り、発現カセットのこの設計により、抗体の一部が宿主細胞の細胞表面に繋留された融合タンパク質として生成されるという効果（翻訳読み過ごしプロセスのため）が得られる。ベクターＩＩＩは、次の主要なエレメントを含む。
【０１９０】
【表８】
0005801207.tif 000012
【０１９１】
このＤＨＦＲ／ＦｏｌＲ−ＦＡＣＳベクター（ベクターＩＩＩ）を、ｎｅｏ遺伝子を第二の選択マーカーとして含むＤＨＦＲ−ＦＡＣＳ参照ベクター（ベクターＩＶ）と比較する。ベクターＩＶは、次の主要なエレメントを含む。
【０１９２】
【表９】
0005801207.tif 000013
【０１９３】
さらに、２種類の発現ベクターおよびＦＡＣＳ選別を用いた同時トランスフェクション実験のため、ＤＨＦＲを含まないがｎｅｏ遺伝子およびｈｕＦｏｌＲを含むベクターＶを作製する。ベクターＶは、次の主要なエレメントを含む。
【０１９４】
【表１０】
0005801207.tif 000014
【０１９５】
３．２．選抜、クローニングおよびクローン特性評価
組み合わせベクターＩＩＩでトランスフェクトした細胞を、１２．５ｎＭ葉酸および５ｎＭ  ＭＴＸを含む培地において選抜する。参照ベクターでトランスフェクトした細胞を、１２．５ｎＭ葉酸、５ｎＭ  ＭＴＸおよび０．８ｇ／Ｌ  Ｇ４１８を含む培地において選抜する。ＦＡＣＳ濃縮サイクル後の第二の選抜ステップにおいて、ＭＴＸ濃度を５０ｎＭに増加させる一方、葉酸濃度は一定に維持し、Ｇ４１８を除去する。シェイカーフラスコバッチ培養において、回復した細胞集団（プール）を生産性に対してスクリーニングする。
【０１９６】
細胞のＦＡＣＳ解析、濃縮およびクローニング
細胞の標識：トランスフェクトされたプール当たり２×１０Ｅ７細胞を遠心分離し、５ｍＬの冷却したＰＢＳで洗浄し、１ｍＬの冷ＰＢＳで再懸濁する。適量のＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体（サプライヤー）を細胞に添加し、氷上で３０分間、暗所でインキュベートする。その後、細胞を室温で５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、ろ過し、解析、選別およびクローニングのためＦＡＣＳチューブに分注する。Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（ＡＣＤＵ）を備えるＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエアを用いて細胞選別を行う。４８８ｎｍに調整した低出力空冷式固体レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ（登録商標）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）固体）を用いて、二次抗体と結合したフルオレセイン染色試薬を励起する。相対的なＦＩＴＣ蛍光強度は、５３０／３０ＢＰフィルターを通してＥ検出器で測定する。最もＦＩＴＣ蛍光の高い細胞の５パーセントをゲート制御して細胞塊か単一細胞のいずれかとして９６ウェルプレートに選別する。
【０１９７】
ＦＡＣＳ濃縮プールからの限界希釈か、濃縮または未濃縮プールからのＦＡＣＳクローニングのいずれかによってクローンを作製する。
【０１９８】
抗体作製およびクローン安定性の決定
異なる型式を用いたバッチおよびフェドバッチ実験においてクローンの生産性を解析する。振盪式２４ウェルプレートに細胞を播種することによって、２４ウェルプレートバッチアッセイにおいて最初のスクリーニングを行う。細胞培養物上清における抗体価は、培養開始１０日後に定量的プロテインＡ−ＨＰＬＣによって決定する。次に、バッチおよびフェドバッチモードのシェイカーフラスコモデルにおいて最も高度に産生するクローンを解析する。１１．３μＭ葉酸を含む培地におけるバッチ培養物を、シェイカーフラスコ（５００ｍＬまたは２５０ｍＬ容量）に１００ｍＬまたは５０ｍＬ作業容量で播種し、シェイカーキャビネット（加湿なし）内で１５０ｒｐｍ、３６．５℃、１０％ＣＯ２で培養する。細胞の生存率は、アッセイ開始時には＞９０％となるべきである。播種細胞密度は、２×１０５ｃ／ｍＬである。抗体価、細胞数および生存率は、画定された培養時点において決定することができる。フェドバッチ実験は、同一条件を用いるが、４×１０５ｃ／ｍＬの出発細胞密度で、生細胞密度が７×１０６ｃ／ｍＬを超えたら栄養の定期的な添加を開始して行う。シェイカーフラスコバッチモデルを用いてほぼ２週間毎に生産性を測定しつつ、１９週間までの期間にわたり細胞を培養することによって、クローン安定性を評価する。
【０１９９】
３．３．結果
ＤＨＦＲ／ＦｏｌＲ組み合わせベクター（ベクターＩＩＩ）でトランスフェクトした５つの細胞集団、参照ベクター（ベクターＩＶ）でトランスフェクトした３つの細胞集団を、上述の通り作製、選抜する。シェイカーフラスコバッチ培養における回復した細胞プールの生産性を表５にまとめる。
【０２００】
【表１１】
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【０２０１】
ＤＨＦＲ／ＦｏｌＲ組み合わせベクター（ベクターＩＩＩ）の使用は、一選抜ステップに付された後すでに驚くほど優れた生産性をもたらす。
【０２０２】
ＦＡＣＳ濃縮サイクルおよび１０倍高いＭＴＸ濃度を用いた第二の選抜ステップに付すことによって、プールをさらに処理する。組み合わせベクターは同時トランスフェクションアプローチに匹敵するほど良く機能して、これにより同様に非常に高いプール生産性が得られる（表８を参照）。
【０２０３】
【表１２】
0005801207.tif 000016
【０２０４】
ＦＡＣＳ濃縮プールを限界希釈することによってクローンを作製し、一次スクリーニングのために２４ウェルプレートで増殖させる。最良の産生株をシェイカーフラスコでさらに増殖させる。シェイカーフラスコバッチ培養において生産性を解析し、ｄｈｆｒ参照ベクターを用いたＦＡＣＳクローニングによる以前の実験から得られた上位クローンの結果と比較する。
【０２０５】
シェイカーフラスコバッチモデルにおける組み合わせベクターＩＩＩでトランスフェクトしたクローンの生産性は、ＤＨＦＲ遺伝子のみを含む参照ベクターＩＶでトランスフェクトしたクローンと比べて有意により高い（表９を参照）。
【０２０６】
【表１３】
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【０２０７】
凍結保存したバイアルを解凍し、シェイカーフラスコバッチモデルにおける生産性をモニターすることによって、ベクターＩＩＩでトランスフェクトしたクローンのクローン生産安定性をさらに解析する。解凍後５週目から解凍後１９週目において生産性をモニターし、凍結保存前の生産性と比較する。選抜条件下でクローンを培養し、一方で高い葉酸含有量（１１．３μＭ）の培地においてシェイカーフラスコバッチ培養を行う。
【０２０８】
【表１４】
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【０２０９】
解析した１２クローンのうち１クローンだけが、１９週間の期間にわたって２５％を超える生産性減少を示し、他の全クローンは高い生産安定性を示す。
【実施例４】
【０２１０】
ＩＶ．実施例４−トランスフェクトされたＣＨＯ細胞によるポリペプチドの大量生産
ポリペプチドの大量生産は、例えばウエーブ（wave）、ガラス製またはステンレススチール製バイオリアクターにおいて行うことができる。この目的のため、通常単一の凍結バイアル、例えばＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ由来のバイアルから開始して細胞を増殖させる。細胞を解凍し、数ステップを経て増殖させる。異なる規模のバイオリアクターに適量の細胞を接種する。バイオリアクターに栄養液および添加剤を添加することによって、細胞密度を増加させてよい。細胞を高い生存率で長時間維持する。大量生産において、リアクター内に１リットル当たり数百ミリグラムから１リットル当たり最大数グラムの範囲の産物濃度が達成される。標準的なクロマトグラフィー手順によって精製を行うことができ、これはアフィニティー、イオン交換、疎水性相互作用または分子ふるいクロマトグラフィーステップを含むことができる。バイオリアクターのサイズは、最終的なスケールで最大数千リットル容量となることができる（例えば、Ｆ．Ｗｕｒｍ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２２、１１、２００４、１３９３〜１３９８も参照）。
【配列表】
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