(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、ペプチド：
ｉ）アミノ酸配列ＤＴｈｒ−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ又はＤＶａl−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ；
ｉｉ）グリシン若しくはＮ−メチルグリシン残基及び／又は任意の他のスペーサーにより、該配列（ｉ）のＮ末端又はＣ末端に結合したポリ−Ｄ−アルギニンペプチド又はポリアミン；及び
ｉｉｉ）検出可能な標識、又は検出可能な標識と複合体を形成できる置換基。
【請求項２】
検出可能な標識と複合体を形成できる前記置換基が、前記ペプチドのＮ末端に結合した１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸（ＤＯＴＡ）である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記検出可能な標識が、ガドリウニムイオンを含んでもよい造影剤である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
以下の式（Ｉ）から（ＶＩＩＩ）のいずれか１つで表される、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド：
（Ｉ）ＤＯＴＡ−ＤＡｒｇ−Ｎメチルグリシン−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ−Ｎ−メチルグリシン−ポリ−Ｄ−アルギニン［ｒ６］（ポリ−Ｄ−アルギニン［ｒ６］は６個のアルギニン残基を含むポリ−Ｄ−アルギニンを意味する）
（ＩＩ）ＤＯＴＡ−ＤＡｒｇ−Ｎメチルグリシン−ＤＴｈｒ−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ  Ｎメチルグリシン−ポリ−Ｄ−アルギニン［ｒ６］
（ＩＩＩ）ＤＯＴＡ−ＤＡｒｇ−グリシン−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ−グリシン−ポリ−Ｄ−アルギニン［ｒ６］
（ＩＶ）ＤＯＴＡ−ＤＡｒｇ−グリシン−ＤＴｈｒ−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ−グリシン−ポリ−Ｄ−アルギニン［ｒ６］
（Ｖ）ＤＯＴＡ−ポリ−Ｄ−アルギニン［ｒ６］−グリシン−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ−グリシン−ＤＡｒｇ
（ＶＩ）ＤＯＴＡ−ポリ−Ｄ−アルギニン［ｒ６］−グリシン−ＤＴｈｒ−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ−グリシン−ＤＡｒｇ
（ＶＩＩ）ＤＯＴＡ−ＤＡｒｇ−Ｎメチルグリシン−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ−Ｎ−メチルグリシン−ブタンジアミン
（ＶＩＩＩ）ＤＯＴＡ−ＤＡｒｇ−Ｎメチルグリシン−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ−Ｎ−メチルグリシン−ペンタンジアミン。
【請求項５】
ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８〜６０）、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）コート（３５〜４９）、ショウジョウバエＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（４３〜５８）、塩基性ペプチド又はポリアミンから選択される膜透過性キャリアペプチドの添加により適応されていてもよい、生体細胞への進入又は生体関門の通過を促進するために適応された請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドを含有する、α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片に関するシヌクレイン疾患の診断剤。
【請求項７】
α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片に関するシヌクレイン疾患のインビトロ診断を補助する方法であって：
（ａ）被験体由来の組織及び／又は体液（例えば、血液、ＣＳＦ、尿）サンプルと、請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドとを、インビトロで接触させ、該組織サンプル中に存在するα−シヌクレインの凝集体と該ペプチドとを結合させる工程；及び
（ｂ）それによって、該サンプル中のα−シヌクレインの凝集体の存在の有無を検出する工程、
を含み、ここで、α−シヌクレイン凝集体の存在は、該被験体がシヌクレイン疾患に罹患していることを示しており、α−シヌクレイン凝集体が存在しないことは、該被験体が該シヌクレイン疾患に罹患していないことを示している、方法。
【請求項８】
（ｃ）サンプル中のα−シヌクレインの凝集体に結合したペプチド量を定量化する工程、
をさらに含む、請求項７に記載の方法であって、
（ｄ）後に取得した前記同一被験体由来の第二の組織サンプルと、請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドとを、インビトロで接触させ、該第二のサンプル中に存在するα−シヌクレインの凝集体と該ペプチドを結合させる工程；
（ｅ）該第二のサンプル中のα−シヌクレインの凝集体に結合した該ペプチド量を定量化する工程；
（ｆ）工程（ｃ）のサンプル中のα−シヌクレインの量を、工程（ｅ）のサンプル中のα−シヌクレインの量と比較する工程；及び
（ｇ）それによって、該患者の状態が変化したかどうかを決定する工程、
をさらに含んでもよく、ここで、工程（ｃ）のサンプルよりも工程（ｅ）のサンプル中のα−シヌクレインの量の方がより多いことは、該患者の状態が悪化していることを示しており、工程（ｅ）のサンプルよりも工程（ｃ）のサンプル中のα−シヌクレインの量の方がより多いことは、該患者の状態が改善していることを示している、方法。
【請求項９】
前記シヌクレイン疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、又は多系統萎縮症（ＭＳＡ）である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドの標識が放射性標識、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、又は抗原標識を含み、前記サンプル中の可溶性α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの凝集体に結合した前記ペプチドの存在が、オートラジオグラフィー、ポジトロン放出断層撮影法、核磁気共鳴画像法、ガンマカウンター、又はシンチレーションカウンターにより検出されてもよい、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片に関するシヌクレイン疾患の処置が目的で投与された治療剤の有効性についてのインビトロのモニタリング方法であって、該方法が、
（ａ）動物モデル由来のサンプルと、請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドとを、インビトロで接触させ、該サンプル中に存在するα−シヌクレインの凝集体と該ペプチドとを結合させる工程；及び
（ｂ）それによって、該サンプル中のα−シヌクレインの凝集体の存在及び量を検出する工程、
により、該サンプルをα−シヌクレインの凝集体の存在及び量について分析することを含む、方法。
【請求項１２】
α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片に関するシヌクレイン疾患の処置が目的で投与された治療剤の有効性についてのモニタリング方法であって、該方法が、動物モデルの脳をα−シヌクレインの凝集体の存在及び量について画像化することを含み、かつ該動物モデルに投与された請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドと、α−シヌクレインの凝集体との結合を検出することを含む、方法。
【請求項１３】
α−シヌクレイン凝集体の画像化キットであって、該キットが請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチド及び被験体に非手術的な手段により該ペプチドを投与する手段を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−シヌクレイン凝集体を認識して結合できるペプチド、並びに１以上のシヌクレインの異常を伴う神経変性疾患であるシヌクレイン性疾患（シヌクレイン疾患又はシヌクレイン病）の診断及びモニタリングにおける該ペプチドの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、シヌクレイン病の診断及びモニタリングに有用であるペプチド及びそれらの誘導体に関する。シヌクレイン病は、１以上のシヌクレインの異常に関連する疾患であり、いくつかの重要な神経変性状態（例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病（ＡＤ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ））が含まれる。シヌクレインはまた、ヒト癌における様々な腫瘍（例えば、乳房、卵巣）にて、異常に高レベルに発現されている。
【０００３】
シヌクレインは、神経組織にて高レベルに発現されている小さいタンパク質（〜１４ｋＤａ）のファミリーである。３つのファミリー構成メンバー（α−、β−、及びγ−シヌクレイン）が、異なる染色体上に存在する３つの遺伝子の産物である。集まってきた遺伝的及び生化学的証拠は、不溶性のα−シヌクレイン凝集体又は原繊維の蓄積が、いくつかのシヌクレイン病の進行において、重要な工程であることを示唆している。
【０００４】
疾患の発症におけるα−シヌクレインの関与について最初の指摘は、アルツハイマー病（ＡＤ）の脳の精製したアミロイド由来のタンパク質分解断片の１つを単離したことに由来する。このα−シヌクレイン断片は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）不溶性物質の約１０％を示しており、ＡＤアミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣ）と名付けられた。アミノ酸配列決定に使用した酵素の特異性のため、Ｎ末端残基は確実性をもって決定され得なかったが、配列決定により、ＮＡＣは少なくとも３５アミノ酸を含むことが明らかになった。これら３５アミノ酸は、１４０アミノ酸前駆体（ＮＡＣＰ）の残基６１〜９５に相当することが後に示された。ＮＡＣＰは、α−シヌクレインと呼ばれるタンパク質と一致することが見出された。
【０００５】
α−シヌクレイン遺伝子内の３つの異なる突然変異が、ＰＤの稀な遺伝型において発見されたことが示されて、ＰＤとの明らかな遺伝的関係が証明された。突然変異の１つであるα−シヌクレイン（Ａ５３Ｔ）は、あるイタリア及びギリシャの家系にて見出され、Ａｌａ５３がＴｈｒ置換している。他の突然変異であるα−シヌクレイン（Ａ３０Ｐ）は、ドイツに由来する家系に見出されており、Ａｌａ３０がＰｒｏ変化しており、最後の突然変異Ｅ４６Ｋは、家族性パーキンソン病及びＤＬＢに見出された。さらに、ＳＮＣＡの遺伝子量の増加を示唆する、ＳＮＣＡ遺伝子座の遺伝的な重複及び３重複もまた家族性のＰＤのケースで報告されており、これは同時に、野生型α−シヌクレインタンパク質のレベルの増加をもたらし、病原性でもある。ＳＮＣＡの重複は、高齢での発症、遅い進行並びに認知症及び認識低下の欠如を有する孤発性ＰＤに非常に類似している。あるいは、ＳＮＣＡの３重複は結果として、より迅速な進行及び認知症を有する若年発症ＰＤとなる。
【０００６】
さらに、「レビー小体」及び「レビー神経突起」として公知の脳の病変は、ＰＤ及びＤＬＢの患者の脳における主な病的特徴を構成している。これらのレビー小体及びレビー神経突起は、α−シヌクレイン凝集体を含んでいる。さらなる免疫組織化学及び免疫電子顕微鏡による研究は、ＭＳＡに見出されるグリアの細胞質内封入体などの非神経細胞を時には含む、他の神経変性疾患における病理学的病変ともα−シヌクレインが関連していることを示している。したがって、ＰＤ、ＡＤ、ＤＬＢ及びＭＳＡを、本明細書中では、まとめてシヌクレイン病と呼ぶ。
【０００７】
ヒトシヌクレイン疾患において見出されるのと同じ病変が、トランスジェニック動物において生成され得ることが最近報告されている。該トランスジェニック動物は、ヒト野生型又は変異型α−シヌクレインタンパク質を高レベルに発現し、シヌクレイン疾患に関連する多くの病態を徐々に発現する。これらの発見は、シヌクレイン疾患の病態生理学におけるα−シヌクレインタンパク質凝集体の蓄積と関係している。興味深いことに、３つのヒトα−シヌクレイン突然変異は、凝集プロセスを加速させているようである。ヒト野生型α−シヌクレインの完全なアミノ酸配列は、配列番号１として提供される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の要旨
α−シヌクレイン凝集及び毒性に対する小さなペプチド阻害剤が設計され、α−シヌクレイン阻害剤（ＡＳＩ）と名付けられた。これらの短いペプチドは、配列番号１の残基６９〜７２に相当するα−シヌクレインの結合領域の一部を含む。これらのペプチドの不溶性は、合成ペプチドのＮ末端において親水性残基（アルギニン及びグリシンなど）に置換し、Ｃ末端においてグリシン及びアルギニンに置換することによって克服された。これらのペプチドは、α−シヌクレイン単量（遊離）体に結合することが見出されており、初期の可溶性凝集体（又は付加物）及び成熟した凝集体（又は成熟したシヌクレイン原繊維）両方へのα−シヌクレイン単量（遊離）体の集合を阻害することが可能であった。
【０００９】
本発明により、ヒト野生型α−シヌクレインの結合領域のアミノ酸配列（すなわち、配列番号１の残基６１から９５）に相当するアミノ酸配列を含むか、又は本質的に該アミノ酸配列からなるペプチドが提供される。結合領域の配列は、以下に完全に、配列番号２として提供される。
【００１０】
α−シヌクレインの結合領域の配列：
ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ  ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ  ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ  ＡＴＧＦＶ（配列番号２）
【００１１】
好ましくは、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の、２から１２個の連続したアミノ酸残基由来のアミノ酸配列を含むか、又は該アミノ酸配列からなる。具体的には、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の、２、３、４、５、６、７、８、９  １０、１１又は１２個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むか、又は該アミノ酸配列からなってよい。最も好ましくは、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の、最大で７個の連続したアミノ酸残基、最大で６個の連続したアミノ酸残基、最大で５個の連続したアミノ酸残基、最大で４個の連続したアミノ酸残基、最大で３個の連続したアミノ酸、又は最大で２個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含むか、又は該アミノ酸配列からなってよい。
【００１２】
本発明は、天然に生ずるα−シヌクレインの結合領域の配列（配列番号１のアミノ酸残基６１から９５）由来のＡＳＩペプチドが、遊離のα−シヌクレインである「α−シヌクレイン単量体」に対してよりも、α−シヌクレインの初期の可溶性凝集体及び成熟した凝集体の両方に対してより高い親和性にて結合するという驚くべき発見に基づかれている。したがって、α−シヌクレインの結合領域に相当するアミノ酸配列を含むか、又は本質的に該アミノ酸配列からなるペプチドは、α−シヌクレイン（又はＮＡＣなどのその断片）の凝集体を検出するために使用され得る。違うように説明されない限り、α−シヌクレイン凝集体についての全ての以下の言及は、α−シヌクレイン若しくはその断片又は誘導体の、初期の可溶性（低分子量及び／又は高分子量の可溶性オリゴマー）及び成熟した凝集体（任意の他のタンパク質（単数又は複数）と複合体を形成しているα−シヌクレインを含む凝集体を含む）の両方に適用されるものと解釈されるべきである。
【００１３】
α−シヌクレイン凝集体に結合する能力のため、本発明のペプチドは、α−シヌクレインに関する疾患の診断における使用に適している。本発明のペプチドは、シヌクレイン疾患の初期段階に存在するα−シヌクレインの可溶性凝集体（又は付加物）に結合できることから、ペプチドは、このような疾患の初期診断における使用に特に適している。ペプチドは、「野生型」α−シヌクレイン（天然の形態）又は突然変異型、ニトロ化型、リン酸化型、グリコシル化型若しくは欠失型又は任意の他の天然に生ずる改変型の凝集体を検出するのに有用である。
【００１４】
本発明のペプチドはさらに、血液脳関門を通過する輸送を増加させるため、及び／又は生細胞による取り込みを増加させるための置換基を含んでよい。さらに、本発明のペプチドは、造影剤としての使用のために標識されてよい。例えば、付加的な好ましいアミノ末端置換基（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸（ＤＯＴＡ）など）が、ガドリニウムイオンなどの造影剤と複合体を形成するためのリガンドを提供するために導入されてよく、それにより患者のα−シヌクレイン凝集体蓄積物のＭＲＩ画像化が可能となる。
【００１５】
したがって、本発明のペプチドは、初期又は中程度のシヌクレイン疾患の診断において使用するため、及びシヌクレイン疾患の治療をモニタリングするための薬剤として、優れた特性を備えている。したがって、本発明は、以下を提供する：
−  ヒト又は動物体に対して実践される診断方法における使用のための薬剤であって、ここで、該薬剤は配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の２から１２個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドを含むか、又は該アミノ酸配列の誘導体又は類似体を含み、ここで、該薬剤が遊離のα−シヌクレインに対してよりも、α−シヌクレイン凝集体に対してより高い親和性にて結合する、薬剤。
−  以下を含む、ペプチド：
ｉ）アミノ酸配列ＤＴｈｒ−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ又はＤＶａl−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ；
ｉｉ）グリシン若しくはＮ−メチル（ｍｅｔｈｌｙ）グリシン残基及び／又は任意の他のスペーサーにより、該配列（ｉ）のＮ末端又はＣ末端に結合したポリ−Ｄ−アルギニンペプチド；及び
ｉｉｉ）該ペプチドのＮ末端に結合した置換基ＤＯＴＡ。
−  α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片（単数又は複数）に関するシヌクレイン疾患の診断における使用のための本発明の薬剤又はペプチド。
−  α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片（単数又は複数）に関するシヌクレイン疾患の診断方法であって、該方法が、被験体に本発明の薬剤を投与すること、及びそれによってα−シヌクレイン凝集体の存在の有無を検出することを含む方法であって、ここで、α−シヌクレイン凝集体の存在は、該被験体がシヌクレイン疾患に罹患していることを示しており、α−シヌクレイン凝集体が存在しないことは、該被験体が該シヌクレイン疾患に罹患していないことを示している、方法。
−  α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片（単数又は複数）に関するシヌクレイン疾患のモニタリング方法であって、該方法が本発明の薬剤を被験体に投与すること、及び任意のα−シヌクレイン凝集体の量及び／又は大きさを検出することを含む、方法。
−  α−シヌクレイン凝集体の画像化キットであって、該キットが本発明の薬剤及び被験体に該薬剤を投与する手段を含む、キット。
−  患者における、α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片（単数又は複数）に関するシヌクレイン疾患のインビトロ診断方法であって：
（ａ）該患者由来の組織及び／又は体液（例えば、血液、ＣＳＦ、尿）サンプルを、本発明の薬剤を該サンプル中に存在するα−シヌクレインの凝集体と結合させるのに有効な時間及び条件下にて、該薬剤と混合することを含み；かつ
（ｂ）それによって、該サンプル中のα−シヌクレインの凝集体の存在の有無を検出することを含み、ここで、α−シヌクレイン凝集体の存在は、該被験体がシヌクレイン疾患に罹患していることを示しており、α−シヌクレイン凝集体が存在しないことは、該被験体が該シヌクレイン疾患に罹患していないことを示している、方法。
−  α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片（単数又は複数）に関するシヌクレイン疾患の処置が目的で投与された治療剤の有効性についてのインビトロのモニタリング方法であって、該方法が、動物モデル由来のサンプルをα−シヌクレインの凝集体の存在及び量について分析することを含む、方法。
−  α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインの断片（単数又は複数）に関するシヌクレイン疾患の処置が目的で投与された治療剤の有効性についてのモニタリング方法であって、該方法が、動物モデルの脳をα−シヌクレインの凝集体の存在及び量について画像化することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の例示的な造影剤（造影剤１）の構造を示す。造影剤は、３つのドメインを含んでおり、α−シヌクレイン結合ドメインは、剤の中央部分にあるレトロインバーソ配列であり、輸送ドメインはＣ末端のポリアミン又はポリＤ−アルギニンであり、及び造影剤はＮ末端のガドリニウムイオンである。
【図２Ａ】図２は、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上にコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるα−シヌクレイン濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から４（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図２Ｂ】図２は、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上にコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるα−シヌクレイン濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から４（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図２Ｃ】図２は、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上にコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるα−シヌクレイン濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から４（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図２Ｄ】図２は、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上にコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるα−シヌクレイン濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から４（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｅは、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上に２００ｐｍｏｌ／ウェルにてコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるペプチド濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から５（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｅは、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上に２００ｐｍｏｌ／ウェルにてコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるペプチド濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から５（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｅは、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上に２００ｐｍｏｌ／ウェルにてコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるペプチド濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から５（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｅは、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上に２００ｐｍｏｌ／ウェルにてコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるペプチド濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から５（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｅは、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上に２００ｐｍｏｌ／ウェルにてコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるペプチド濃度範囲において、本発明のペプチドＯＲ１から５（各々）が、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図４Ａ】図４Ａ及びＢは、ペプチドをマイクロタイタープレート上にコートし、α−シヌクレイン溶液をウェルに添加した場合に、あるα−シヌクレイン濃度範囲において、ペプチドが、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図４Ｂ】図４Ａ及びＢは、ペプチドをマイクロタイタープレート上にコートし、α−シヌクレイン溶液をウェルに添加した場合に、あるα−シヌクレイン濃度範囲において、ペプチドが、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図５】図５は、α−シヌクレインをマイクロタイタープレート上にコートし、ペプチド溶液をウェルに添加した場合に、あるα−シヌクレイン濃度範囲において、本発明のペプチドが、凝集していないそのままのα−シヌクレインよりも、加齢（不溶性凝集体）又はドーパミン処理若しくはニトロ化（可溶性凝集体）のいずれかによって生成した予め形成されたα−シヌクレイン凝集体に対してより効率的に結合することを示している。
【図６】図６のＥＭ顕微鏡写真は、免疫金アッセイシステムを使用した、予め形成されたα−シヌクレインの凝集体（成熟したアミロイド原繊維）に対する本発明のペプチド（ＯＲ５及びＯＲ７）の結合を示している。
【図７】図７は、ペプチドをマイクロタイタープレート上にコートし、Ａβ溶液をウェルに添加した場合に、あるペプチド濃度範囲において、本発明のペプチドが、加齢して凝集している形態又はそのままで凝集していない形態のいずれについても、アルツハイマー病（Ａβ）におけるタンパク質凝集体の主要な成分には結合しないことを示している。同じ結果が、イギリス型痴呆ペプチド（ＡＢｒｉ）などの他のポリペプチド凝集体について得られた（データは示さない）。
【図８】図８は、本発明のペプチドが、ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹＳＹによって効率的に取り込まれることを示している。同じ結果が、ヒト神経芽腫細胞株Ｍ１７について得られた（データは示さない）。
【図９】図９は、細胞からのペプチドＯＲ５の除去を経時的に示している。
【図１０】図１０は、本発明のペプチドが、ヒト神経芽腫細胞株に対して細胞毒性を示さないことを示している。
【図１１】図１１は、α−シヌクレインオリゴマーに対するビオチン化したペプチドＯＲ５の結合を示すドットブロットを示している。
【図１２Ａ】図１２は、死後の脳のレビー小体（ＬＢ）が本発明のペプチドＯＲ５によって標識されることを図示している。
【図１２Ｂ】図１２は、死後の脳のレビー小体（ＬＢ）が本発明のペプチドＯＲ５によって標識されることを図示している。
【図１３Ａ】図１３は、細胞モデルにおいて、ペプチドがα−シヌクレイン凝集体に結合することを示している。
【図１３Ｂ】図１３は、細胞モデルにおいて、ペプチドがα−シヌクレイン凝集体に結合することを示している。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｔ１マップの例を示している。図１４Ｂは、ペプチドＯＲ７をｉｖインジェクションした後の脳のＭＲＩ画像を示している。
【図１４Ｂ】図１４Ａは、Ｔ１マップの例を示している。図１４Ｂは、ペプチドＯＲ７をｉｖインジェクションした後の脳のＭＲＩ画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中で述べる配列の説明
配列番号１は、ヒト野生型α−シヌクレインの全長配列に相当する。配列番号２は、α−シヌクレインの結合領域に相当する。配列番号３から７は、本発明の好ましいペプチド配列に相当する。
【００１８】
本発明の詳細な説明
α−シヌクレイン凝集体
違うように説明されない限り、用語α−シヌクレイン凝集体は、α−シヌクレイン及び任意の断片又はそれらの誘導体の、初期可溶性凝集体（低分子量及び／又は高分子量の付加物又は可溶性オリゴマー）及び成熟した不溶性凝集体（又は成熟したアミロイド原繊維）の両方を包含することが意図されている。凝集体は、α−シヌクレイン単量体の、任意の異常なコンフォメーション又は集合体を含むと考えられており、ユビキチン、ニューロフィラメントタンパク質、及びアルファＢクリスタリンなどの他の成分を含んでもよい。
【００１９】
違うように説明されない限り、用語遊離のα−シヌクレインは、天然のコンフォメーションにおける可溶性α−シヌクレイン単量体を意味することが意図されている。
【００２０】
薬剤
本発明は、α−シヌクレイン、特にα−シヌクレイン凝集体に対して結合する薬剤を提供する。薬剤は、α−シヌクレインの結合領域（配列番号１の残基６１から９５）由来のペプチド配列を含むα−シヌクレイン凝集体結合ドメイン、及び検出可能な標識を含む。薬剤は、血液脳関門を通過するペプチドの輸送及び／又は生細胞によるペプチドの取り込みを促進する輸送ドメインを任意に含んでよい。本発明の薬剤は、α−シヌクレイン凝集体の検出に有用であり、ＰＤ、ＤＬＢ及びＭＳＡを含むシヌクレイン疾患の診断において有用である。
【００２１】
α−シヌクレイン凝集体結合ドメイン
ペプチドは、３から３５個のアミノ酸残基を含む。好ましくは、ペプチド配列は、最大で７個のアミノ酸残基、より好ましくは最大で６個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは最大で５個のアミノ酸残基、及び最も好ましくは最大で３個のアミノ酸残基を含む。
【００２２】
好ましくは、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の、２から１２個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むか、又は該アミノ酸配列からなる。具体的には、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の、２、３、４、５、６、７、８、９  １０、１１又は１２個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むか、又は該アミノ酸配列からなってよい。最も好ましくは、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の、最大で７個の連続したアミノ酸残基、最大で６個の連続したアミノ酸残基、最大で５個の連続したアミノ酸残基、最大で４個の連続したアミノ酸残基、最大で３個の連続したアミノ酸、又は最大で２個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含むか、又は該アミノ酸配列からなってよい。
【００２３】
好ましい実施態様において、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６７から７３に相当する配列由来の２から７個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列（すなわち、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（配列番号３））を含むか、又は該アミノ酸配列からなる。具体的には、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６７から７３に相当する配列由来の２、３、４、５、６又は７個の連続的なアミノ酸残基を含むか、又は該アミノ酸残基からなってよい。最も好ましくは、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６７から７３に相当する配列由来の３個の連続したアミノ酸残基（すなわち、配列番号３の３個の連続したアミノ酸残基）を含むか、又は該アミノ酸残基からなる。特に、ペプチドは、配列番号３の７個全ての連続したアミノ酸のアミノ酸配列、又はテトラペプチドＧｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号４）、ペンタペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（配列番号５）、テトラペプチドＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（配列番号６）、又はトリペプチドＶａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むか、又は本質的に該アミノ酸配列からなってよい。ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の２個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含むか、又は本質的に該アミノ酸配列からなってよい。例えば、ペプチドは、アミノ酸配列ＶＴ又はＴＧ（配列番号１の残基７１から７２又は７２から７３に各々相当する）を含むか、又は本質的に該アミノ酸配列からなってよい。
【００２４】
本発明のペプチド配列の例は、以下の表１の左欄に示され、ペプチド配列が由来するα−シヌクレインの残基もまた同定している。
【００２５】
【表１】
0005681489.tif 000002
【００２６】
配列番号１のアミノ酸残基６１から９５に相当する配列由来の連続したアミノ酸残基の配列は、該配列のＮ末端及び／又はＣ末端にて、該配列の当該末端がヒト野生型α−シヌクレインのネイティブの配列に結合されているアミノ酸残基よりもより親水性である１以上のさらなるアミノ酸残基と、結合されてよい。グリシン（Ｇｌｙ）残基は、結合配列と付加的なアミノ酸残基との間のリンカー／スペーサーとして任意に使用されてよい。
【００２７】
本発明のペプチドの誘導体又は類似体もまた、シヌクレインの凝集体への結合に有効である。それゆえ、本発明の第二の局面にしたがうと、本発明の第一の局面にしたがうペプチドの誘導体又は類似体が提供される。
【００２８】
本発明のペプチドの誘導体又は類似体は、Ｎ置換型誘導体を含み得る。置換基は、例えば、ヒドロキシル基又はエチル基であってよいが、より好ましくはメチル基である。したがって、本発明のペプチドの誘導体又は類似体の例としては、ペプチドのＮメチル化型の誘導体が挙げられる。このようなＮメチル化型の誘導体としては、配列のいくつか又は全てがＮメチル化型のアミノ酸残基である誘導体が挙げられる。置換はα位であることが好ましい。
【００２９】
本発明の第一の局面のペプチドの誘導体又は類似体はさらに、ペプチドのＤ−アミノ酸誘導体、ペプチドのペプトイド類似体、又はペプチド−ペプトイドハイブリッドを含んでよい。
【００３０】
ペプチドは多くの手段（生物システムにおけるプロテアーゼ活性など）によって分解に供されてよい。このような分解は、それらのバイオアベイラビリティ、したがって、シヌクレイン凝集体に対する結合能力を制限し得る。生物的状況において増強された安定性を有するペプチド誘導体を設計及び生産し得る十分に確立された技術が幅広く存在している。プロテアーゼを介する分解に対する耐性の増加の結果、このようなペプチド誘導体は、向上したバイオアベイラビリティを有し得る。
【００３１】
好ましくは、本発明の第二の局面のペプチド誘導体又は類似体は、それが由来するペプチドよりもよりプロテアーゼ耐性である。ペプチド誘導体及びそれが由来するペプチドのプロテアーゼ耐性は、周知のタンパク質分解アッセイの手法によって評価され得る。次いで、ペプチド誘導体及びペプチドのプロテアーゼ耐性の相対値が比較され得る。
【００３２】
ペプトイド残基では、側鎖の位置が、α炭素原子から窒素原子へとシフトされている。側鎖の同一性が保存されている一方、３次元空間における配向性が反転されている。これらの化合物は、骨格と側鎖改変の組み合わせと考えることができる。ペプトイド化合物は、本発明のペプチド誘導体／類似体としての使用のためにペプトイド化合物を適切にする２つの特性を有している：
（ｉ）ペプトイド残基では、ＮＨを含む水素結合はありえない。
（ｉｉ）ペプトイドは、酵素的分解に耐性である。
本発明のペプチドのペプトイド誘導体は、選択したペプチドの構造知見から容易に設計され得る。市販のソフトウエアは、十分に確立されたプロトコールにしたがって、ペプトイド誘導体を作製するために使用され得る。
【００３３】
レトロペプトイド（全てのアミノ酸が逆の順番でペプトイド残基により置換されている）は、高親和性結合剤を模倣できることが報告されている。ペプトイド残基を１つ含むペプチド又はペプトイド−ペプチドハイブリッドと比較すると、レトロペプトイドは、リガンドが結合する溝に反対の方向にて結合すると予期される。その結果、ペプトイド残基の側鎖は、本来のペプチドの側鎖と同じ配向性である。
【００３４】
ペプチド−ペプトイドハイブリッドペプチド模倣物もまた、α−シヌクレイン凝集体を検出するために使用され得る。このようなハイブリッドは、１以上のアミノ酸が相当するペプトイド残基によって置換されたペプチドを含む。
【００３５】
本発明の第二の局面の別の実施態様において、配列はＤ−アミノ酸を含む。Ｄ−アミノ酸の配列順序はまた、基になっているα−シヌクレインの配列部分と比較して、反転され得る。例えば、α−シヌクレインの残基６９から７１（ＧＡＶＶ）に基づく配列を有するＤ−アミノ酸ベースのペプチド誘導体は、ＧＡＶＶ又はＶＶＡＧ配列を有し得るであろう。
【００３６】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体及びペプチド類似体は、細胞への進入、又は生体関門（血液脳関門など）の通過を促進するために適応されてよい。シヌクレイン病は脳におけるシヌクレインの病的な活性を一般に伴うことから、脳組織への本発明のペプチド又はペプチド誘導体の進入を促進することは、非常に望ましい。
【００３７】
輸送ドメイン
輸送ドメインはまた、血液脳関門を通過するペプチドの輸送及び／又は生細胞によるペプチドの取り込みを促進する、任意の化合物又は置換基を含んでよいか、又はこれらからなってよい。膜透過性キャリアペプチド（ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８〜６０）、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）コート（３５〜４９）、ショウジョウバエＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（４３〜５８）及びオクタ及びヘキサアルギニンペプチドなどの塩基性ペプチドなど）の助力により、外来性タンパク質を生細胞内に及び血液脳関門を通過させて送達するための方法が開発されている。これらのキャリアペプチドを遺伝学的又は化学的にハイブリダイズさせることによって、様々なオリゴペプチド及びタンパク質の効率的な細胞内送達が達成されてきた。このようなアプローチの有効性は、１２０ｋＤａ程度の分子量を有するＴａｔ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の例によって例示される。この融合タンパク質をマウスで発現させると、生物的に活性のある融合タンパク質が、脳を含む全ての組織に送達される結果となる。したがって、本発明のペプチド又はペプチド誘導体は、このようなキャリアペプチドの組み込みによって、細胞又は組織におけるそれらのバイオアベイラビリティを増加させるために適合され得る。
【００３８】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体及びペプチド類似体の有用性を改善するためにキャリアペプチドを使用するこのアプローチは、非天然アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸又はＮメチル化型アミノ酸）又は非ペプチド性誘導体を含む分子の、組織又は細胞への取り込みを可能にするのに特に適している。
【００３９】
さらに、好ましい輸送ドメインは、グアニジン基を含む。１つの好ましい実施態様において、輸送ドメインはジアミンを含む。ポリアミンは典型的には２、３、４、５、６、７、８又は９個のアミンを含む。ポリアミンは合成されるか、天然に生じ得る。ポリアミンは典型的には、血液脳関門にてポリアミントランスポーターと相互作用できるものである。有用なポリアミンとしては、１，４ブタジアミン、１，５ペンタジアミン、プトレッシン、スペルミジン、１，３−ジアミノプロパン、ノルスペルミジン、スペルミン、シン−ホモスペルミジン、サーマイン(ｔｈｅｒｍｉｎｅ)、サーモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン及びカナバルミンが挙げられる。
【００４０】
別の実施態様において、輸送ドメインはジグアニジンを含んでよい。ポリグアニジンは、３から１０個のグアニジン（例えば、４、５、６又は７個のグアニジン）を含んでよい。
【００４１】
別の実施態様において、輸送ドメインは、例えば、６個のアルギニン残基（ポリアルギニン［ｒ６］）を含むポリアルギニンであってよい。
【００４２】
本発明の薬剤に含まれる輸送シグナルの適切性は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、潜在的な輸送シグナルを含む薬剤の血液脳関門透過性は、マウスなどの実験動物において、各タンパク質について、透過性係数Ｘ表面積（ＰＳ）の積を定量化することによって、決定され得る。典型的には、ＰＳは、静脈ボーラス注射の後に、異なる脳領域における血管内のタンパク質によって占められる残存血漿量（Ｖｐ）について補正した後に、測定される。
【００４３】
輸送シグナルは、α−シヌクレイン凝集体結合ペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれに存在してもよい。
【００４４】
アミン又はグアニジン輸送シグナルは、任意の適切な方法（例えば、化学的な架橋）によってペプチドに付着されてよい。適切な架橋剤は、当該分野で周知である。このような方法の１つが、実施例１に説明されている。
【００４５】
検出可能な標識
本発明のα−シヌクレイン凝集体結合ペプチドは、α−シヌクレイン凝集体の画像化を促進するために標識される。ペプチドは、例えば、Ｃ末端及び／又はＮ末端の検出可能な標識を含んでよい。１つの好ましい実施態様において、検出可能な標識はＮ末端に存在する。検出可能な標識は典型的には、α−シヌクレイン凝集体に結合したときに、ペプチドの検出が可能となるものである。α−シヌクレイン凝集体は、生きた哺乳動物の脳又は死後の脳サンプル中に存在し得る。有用な標識は放射性標識及び造影剤、好ましくはヒトでの使用に適切なものが挙げられる。
【００４６】
適切な放射性標識としては、１８Ｆ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ及び１８８ＲＬが挙げられる。適切な造影剤としては、ガドリニウム（Ｇｄ）、ジスプロシウム及び鉄などの希土類イオンが挙げられる。このような造影剤の他の例としては、粒子などの多くの磁性剤、常磁性剤及び強磁性又は超常磁性剤が挙げられる。
【００４７】
使用されてよい他の標識としては、蛍光標識（フルオレセイン及びローダミンなど）、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放出断層撮影法（「ＰＥＴ」）スキャナーによって検出可能なポジトロン放出同位元素、化学発光剤（ルシフェリンなど)及び酵素マーカー（ペルオキシダーゼ又はホスファターゼなど）が挙げられる。短飛程検出プローブによって検出可能な同位元素などの短飛程放射線放出物もまた、利用され得る。
【００４８】
本発明のペプチドは、標準的な技術を使用して標識されてよい。例えば、ペプチドは、１，３，４，６−テトラクロロ−３α，６α−ジフェニルグリコウリル又はクロラミンＴを使用してヨウ素化されてよい。
【００４９】
キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ及びＮＴＳキレート剤）は、いくつかの常磁性物質（例えば、Ｆｅ＋３、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３）を付着させる（及び毒性を減じる）ために使用され得る。例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸（ＤＯＴＡ）又はジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）などの低分子Ｇｄキレート剤をペプチドに結合させることによって、ペプチドはガドリニウムイオンで標識され得る。したがって、１つの実施態様において、本発明の薬剤は、ペプチドＧｌｙ−Ｘ−ＤＶａｌ−ＤＶａｌ−ＤＡｌａ−Ｇｌｙ（ここで、Ｘは存在しないか又はＤＴｈｒのいずれかである）、輸送シグナル及び低分子量キレート剤（ＤＯＴＡなど）を含んでよい。本発明の１つの実施態様において、検出可能な標識は、顕微鏡（電子顕微鏡、共焦点顕微鏡又は光学顕微鏡など)による検出に適切であるものであってよい。検出可能な標識は、例えば、ビオチン、蛍光化合物（緑色蛍光タンパク質など）、又はペプチドタグ（ｈｉｓタグ、ｍｙｃ又はｆｌａｇなど）であってよい。
【００５０】
画像化方法
検出可能な標識を含む本発明の薬剤は、α−シヌクレイン凝集体の画像化方法において有用である。したがって、本発明は、α−シヌクレイン凝集体の画像化方法を提供し、該方法は、α−シヌクレイン凝集体に対する本発明の薬剤の結合を検出することを含む。
【００５１】
α−シヌクレイン凝集体の存在の有無は、任意の適切な画像化技術を使用して脳においてインビボで検出されてよい。このような実施態様において、方法は、被験体への本発明の薬剤の投与をさらに含んでよい。被験体は典型的には、哺乳動物、好ましくはヒトである。被験体は実験動物であってよく、特に、シヌクレイン疾患の実験動物モデルであってよい。例えばＰＤの動物モデルは当該分野で公知であり、トランスジェニックマウス及びトランスジェニックショウジョウバエを含む。
【００５２】
適切な画像化技術としては、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ガンマシンチグラフィー、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、機能的核磁気共鳴画像法（ＦＭＲＩ）、脳磁図（ＭＥＧ）及び単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。ＭＲＩ（３０μｍ）によって提供される空間分解能及びシグナル対ノイズ比が、α−シヌクレイン凝集体蓄積物を検出するのに適切であることから、ＭＲＩは好ましい方法である。
【００５３】
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、生きている被験体の内部的特徴を可視化するためにＮＭＲを使用しており、予後、診断、処置、及び手術に有用である。ＭＲＩは、明らかな利益として、放射活性のあるトレーサー化合物なしで使用され得る。いくつかのＭＲＩ技術は、公表された欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０  ５０２  ８１４にまとめられている。一般に、異なる環境における水プロトンの緩和時間定数Ｔ１及びＴ２に関する差異が、画像を作成するときに使用される。しかし、これらの差異は、はっきりとした高分解能画像を提供するのには不十分であり得る。これらの緩和（ｒｅｌａｔｉｏｎ）時間定数の差異は、造影剤によって増強される。
【００５４】
α−シヌクレイン凝集体の存在の有無はまた、例えば、α−シヌクレイン凝集体の形成及び蓄積を阻害する薬剤を同定するために設計された実験にて、インビトロにおいて検出されてもよい。本発明の薬剤は、実験動物の脳切片又はヒト被験体の死後の脳切片におけるα−シヌクレイン凝集体を検出するためにもまた使用されてよい。このような実施態様において、画像化方法は、顕微鏡法（電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法又は光学顕微鏡法など）であってよい。
【００５５】
本発明の薬剤は、シヌクレイン病の診断方法において使用されてよい。１つの好ましい実施態様において、本発明の薬剤は、ＰＤ、ＤＬＢ及びＭＳＡの診断に有用である。軽度又は中程度の段階のシヌクレイン病の診断は、複雑な精神医学プロファイルに依存するために、現在では困難である。ＭＲＩ造影剤としての本発明の標識した薬剤の使用は、疾患の初期段階において決定的な診断が下されることを可能にし、脳の広範囲の破壊が起こる前に、保護的な治療が開始され得る。α−シヌクレイン凝集体の蓄積を脳から取り除く目的で多くの治療が試行されているが、本発明の造影剤を使用する画像法（特にＭＲＩ）は、治療の有効性の追跡方法を提供するであろう。
【００５６】
１つの実施態様において、本発明は、被験体におけるシヌクレイン疾患の診断方法を提供し、該方法は、α−シヌクレイン凝集体の存在の有無を決定することを含み、ここで、α−シヌクレイン凝集体の存在は、被験体がシヌクレイン疾患に罹患していることを示している。α−シヌクレイン凝集体が存在しないことは、被験体がシヌクレイン疾患に罹患していないことを示している。
【００５７】
被験体から得られた画像は、診断に至るか又は診断を確定するために、シヌクレイン疾患に罹患していないコントロールの被験体から得られた画像及び／又はシヌクレイン病に罹患していることが既知の他の被験体から得られた画像と比較されてよい。
【００５８】
本発明のシヌクレイン疾患の診断方法は、典型的には、検出可能に標識された本発明の薬剤を被験体に投与すること、α−シヌクレイン凝集体に結合した任意の該薬剤を検出するために該被験体の脳を画像化すること、及びα−シヌクレイン凝集体の存在の有無を決定することを含む。本発明の薬剤は、任意のα−シヌクレイン凝集体に結合するのに十分な量にて診断が必要な被験体に投与され、ＭＲＩなどの画像化技術によって検出される。
【００５９】
本発明は、被験体中のシヌクレイン疾患の状態のモニタリング方法もまた提供する。すなわち、該方法は、疾患の進行を決定するために使用され得る。例えば、方法は、被験体の脳におけるα−シヌクレイン凝集体蓄積物の増大をモニタリングするために使用されてよい。方法は、治療の有効性をモニタリングするため及び／又はシヌクレイン疾患の新しい処置効果を評価するためにも使用されてよい。被験体は、被験体内の疾患の進行をモニタリングするために、定期的に（例えば、毎月、６ヵ月毎、又は毎年）試験されてよい。
【００６０】
したがって、さらなる実施態様において、本発明は、被験体におけるシヌクレイン疾患のモニタリング方法を提供し、該方法は、α−シヌクレイン凝集体に対する本発明の薬剤の結合を検出することによって、被験体の脳におけるα−シヌクレイン凝集体の存在の有無を決定することを含む。画像は典型的には、より初期の時点で同じ被験体から得られた１以上の画像と比較される。
【００６１】
被験体の脳に存在するα−シヌクレイン凝集体の数及び／又は大きさは、シヌクレイン疾患の進行と関連している。α−シヌクレイン凝集体の数及び／又は大きさの増加は、疾患の進行を示している。反対に、α−シヌクレイン凝集体の数又は大きさの減少は、疾患の軽減を示している。α−シヌクレイン凝集体の数及び／又は大きさに変化が観察されない場合には、疾患は定常状態である。モニタリング方法がシヌクレイン疾患のための処置効果を決定する場合には、α−シヌクレイン凝集体の数又は大きさの定常状態での維持又は減少は、典型的には処置が成功していることを示している。α−シヌクレイン凝集体のレベルは、シヌクレイン疾患状態を決定するために、基準と比較されてよい。
【００６２】
診断方法に使用するための薬剤の処方及び投与
任意の薬剤の処方は、薬剤の性質及び診断されるべき状態などの因子に依存するであろう。任意のこのような薬剤は、様々な剤形にて投与又は送達されてよい。非手術又は手術的な手段によって投与又は送達されてよい。非手術的な投与手段としては、例えば、経口投与（例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性若しくは油性懸濁剤、分散性の粉末剤又は顆粒剤として）、局所投与、経皮投与又は点滴若しくは吸入技術による投与が挙げられる。手術的な投与手段としては、例えば、非経口投与、皮下投与、静脈投与、筋肉内投与、又は肋骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌｌｙ）投与が挙げられる。薬剤は、坐薬として投与又は送達されてもよい。医師は、各特定の患者のために、必要とされる投与又は送達経路を決定することができるであろう。
【００６３】
薬剤は、典型的には脳に供給する血管又は脳自体の中への注射によって、α−シヌクレイン凝集体の蓄積部位（例えば、レビー小体）に直接投与されてよい。
【００６４】
典型的には、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とともに処方される。本発明は、本発明の薬剤及び薬学的に有効な希釈剤又はキャリアを含む薬学組成物を提供する。
【００６５】
薬学的キャリア又は希釈剤は、例えば、等張液であってよい。例えば、固形経口形態としては、活性化合物と一緒に、希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ又はポテトスターチ）；潤滑剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはカルシウム、及び／又はポリエチレングリコール）；結合剤（例えば、スターチ、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン）；分散剤（例えば、スターチ、アルギン酸、アルギン酸塩又はデンプングリコール酸ナトリウム）；発泡混合物；染料；甘味剤；湿潤剤（レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸）；及び、一般に、薬学的処方に使用される非毒性かつ薬理学的に不活性な物質を含んでよい。このような薬学調製物は、例えば、混合、顆粒化、錠剤化、糖コーティング又はフィルムコーティングプロセスの手段による、公知の様式にて製造されてよい。
【００６６】
経口投与のための液体分散物は、シロップ、乳剤及び懸濁剤であってよい。シロップは、キャリアとして例えば、サッカロース又はサッカロースとグリセリン及び／又はマンニトール及び／又はソルビトールを含んでよい。
【００６７】
懸濁剤及び乳剤は、キャリアとして例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを含んでよい。筋肉内注射のための懸濁剤又は溶液は、活性化合物と一緒に、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、滅菌水、オリーブオイル、オレイン酸エチル、グリコール（例えば、プロピレングリコール））、及び所望であれば、適切な量の塩酸リドカインを含んでよい。
【００６８】
静脈又は点滴のための溶液は、キャリアとして例えば滅菌水を含んでよく、それらは好ましくは滅菌等張食塩水の形態であってよい。
【００６９】
用量は、様々なパラメーターにしたがって、特に使用される物質、処置されるべき患者の年齢、体重及び状態、投与経路、及び用いられる診断方法にしたがって決定されてよい。これについてもまた、医師は、任意の特定の患者のために必要とされる投与経路及び投薬量を決定できるであろう。
【００７０】
キット
本発明は、本発明の診断及びモニタリング方法を行うためのキットもまた提供する。キットは、本発明の造影剤及び被験体に造影剤を投与するための手段を含んでよい。薬剤の投与手段は、滅菌シリンジを含むか又は該シリンジからなってよい。シヌクレイン疾患をモニタリング又は診断するためのキットの使用説明書もまた含まれてよい。
【００７１】
以下の実施例は、本発明を例示している。
【実施例１】
【００７２】
実施例１：
検出可能な標識を取り込んでいるレトロインバースペプチドの合成及び精製
アミロイド配列に最適化されたＦｍｏｃ／ｔＢｕ方法論を使用して、ペプチド合成を行った（Ｅｌ−Ａｇｎａｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）ＢＢＲＣ，Ｖｏｌ．２７３：ｐｐ１００３−０７）。ＨＡＴＵ（２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル  ウロニウム  ヘキサフルオロホスファート）を、ＰＥＧ−ＰＳ樹脂上のＦｍｏｃで保護したアミノ酸のためのカップリング剤として使用し、α−シヌクレイン結合配列について２重カップリングを合成の間に行った。実験システムにおけるペプチドの検出を促進するために、α−シヌクレイン結合配列のＣ末端に、ε−ビオチン−Ｌｙｓタグを組み込んだ。生細胞への送達及び血液脳関門（ＢＢＢ）透過を助けるために膜透過性キャリアとして、ペプチドのＣ末端又はＮ末端に、ポリＤ−アルギニン［ｒ６］又はポリアミンを組み込んだ。ＨＡＴＵを使用する２重カップリングによって、［１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸］（ＤＯＴＡ）をＮ末端にカップルさせた。ＭＲＩ造影剤であるガドリニウム（Ｇｄ）と複合体を形成させるために、ＤＯＴＡを組み込む。改変ペプチドを放出して脱保護し、次いで逆相ＨＰＬＣを使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｉｘ製の分取Ｃ４カラムにて精製した。精製度を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計によって確認した（データは示さない）。最後に、３倍モル過剰のＧｄ三塩化物とともに水中で一晩インキュベーションして、ＤＯＴＡ−ペプチドのＧｄ塩を調製し、ｐＨを７．０に調製した。
【００７３】
以下のペプチドが作製された：
（ＯＲ１）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ｒＧｔｖｖａＧＫ（ビオチン）−ｒｒｒｒｒｒ
（ＯＲ２）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ｒＧｖｖａＧＫ（ビオチン）−ｒｒｒｒｒｒ
（ＯＲ３）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ｒｒｒｒｒｒＧｔｖｖａＧＫ（ビオチン）−ｒ
（ＯＲ４）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ｒｒｒｒｒｒＧｖｖａＧＫ（ビオチン）−ｒ
（ＯＲ５）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ｒ−Ｓａｒ−ｖｖａ−Ｓａｒ−Ｋ（ビオチン）−ｒｒｒｒｒｒ
（ＯＲ６）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ｒ−Ｓａｒ−ｖｖａ−Ｓａｒ−Ｋ（ビオチン）−ブタジアミン
（ＯＲ７）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ｒ−Ｓａｒ−ｖｖａ−Ｓａｒ−Ｋ（ビオチン）−ペンタジアミン
【００７４】
α−シヌクレイン結合配列に下線を施している。小文字は、Ｄ−配置のアミノ酸を示している（すなわち、これはα−シヌクレインの結合領域のレトロインバース配列である)。したがって、例えば、ＯＲ１のＧｔｖｖａＧは、野生型α−シヌクレインの配列ＧＡＶＶＴＧ（配列番号１の残基６８から７３）に相当する。ペプチドＯＲ５、６及び７においては、Ｇｌｙの代わりにサルコシン（Ｓａｒ）を組み込む。サルコシンは、Ｎ−メチルグリシンであり、タンパク質分解耐性、溶解性及び血液脳関門（ＢＢＢ）透過性を付加する。
【００７５】
α−シヌクレインの調製：
リコンビナントヒトα−シヌクレインをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現させて、我々が先に説明したようにＦＰＬＣにて精製した（Ｅｌ−Ａｇｎａｆ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。α−シヌクレインタンパク質の精製度を、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によって確認した。
【００７６】
α−シヌクレインアミロイド原繊維の調製：
リコンビナントα−シヌクレインを、標準的なリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に５０μＭにて溶解し、エッペンドルフサーモミキサー中にて継続的に混合しながら（１０００ｒｐｍ）３７℃にて７日間までインキュベートした。アミロイド原繊維の形成を、Ｔｈ−Ｔ結合アッセイによりモニタリングし、電子顕微鏡によっても確認した（データは示さない）。
【００７７】
α−シヌクレインの可溶性凝集体を、ニトロ化によるか又はドーパミン処理によって生成した。ニトロ化は以下のように行う：０．７ｍｇ／ｍｌの凍結乾燥した（ｌｙｐｈｏｌｉｓｅｄ）α−シヌクレインを７００μｌの水に溶解する。５０μｌ分量の１％テトラニトロメタンのエタノール液を、５００μｌの１ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液に添加して、１％ＴＮＭのエタノール液によるα−シヌクレインのニトロ化を誘導した。反応混合物を室温にて１０分間激しく攪拌した。同じ条件下にて、別の５０μｌ分量の１％ＴＮＭ溶液を添加して、手順を繰り返した。１０分後、最終濃度２Ｍにて尿素を添加して、未反応のＴＮＭを完全に除去するために、ｐＨ７．８の適切な緩衝液を４回交換することで、このタンパク質混合物を透析した。α−シヌクレインのニトロ化を、ニトロ化α−シヌクレインに対する特定のモノクローナル抗体を使用して、免疫ブロット法により確認した（データは示さない）。
【００７８】
以下のようにして、ドーパミン処理を行う：ドーパミン及びα−シヌクレインを、１：１の比率で水中で混合し（典型的には、５０μＭ  α−シヌクレイン：５０μＭドーパミン）、次いでエッペンドルフサーモミキサー中にて継続的に混合しながら（１４００ｒｐｍ）３７℃にて８日間までインキュベートした。α−シヌクレインオリゴマーの形成を、ウエスタンブロッティング及び特定のオリゴマー−ＥＬＩＳＡアッセイにより確認し、一方でα−シヌクレイン原繊維の形成を、Ｔｈ−Ｔ結合アッセイによりモニタリングし、ＥＭにて確認した（データは示さない）。
【実施例２】
【００７９】
実施例２：コートしたα−シヌクレイン凝集体に対するペプチドの結合
ＥＬＩＳＡアッセイ
様々な濃度のそのまま又は凝集したα−シヌクレイン溶液（２０〜２００ｐｍｏｌ／ウェル）を、マイクロタイタープレート上にコートして、３７℃にて一晩乾燥させた。それゆえ、凝集したα−シヌクレインをマイクロタイタープレートに固定させた。凝集したα−シヌクレインは、図に示したように、加齢、ドーパミン処理又はニトロ化のいずれかによって生成された。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄して、ブロッキング緩衝液（２．５％ゼラチン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）でブロッキングしたあとに、ビオチン化ペプチド（ＰＢＳ中で２００ｐｍｏｌ／ウェル）又はＢＳＡタンパク質（ネガティブコントロール）を添加して、１．５時間室温（ＲＴ）にてインキュベートした。
【００８０】
α−シヌクレインに対するペプチドの結合を酵素と結合したアビジンを使用して定量化した。簡単に言うと、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後に、ブロッキング緩衝液中に１：５，０００に希釈したエキストラアビジンペルオキシダーゼを、１００μｌ／ウェル添加した。次いで、プレートを３回ＰＢＳＴで洗浄した後に、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を添加した。プレートを１５分間ＲＴにて放置して発色させた。１００μｌ／ウェルの０．５Ｍ硫酸を添加して反応を停止させて、プレートを４５０ｎｍにて分光光度計で読み取った。コートしたＢＳＡタンパク質に対する非常に低い結合が全てのペプチドについて観察された一方で、コートしたα−シヌクレインに対しては全てのペプチドが濃度依存的な結合を示した（図２）。ペプチドＯＲ１及び２は、コートしたそのまま及び凝集したα−シヌクレインの両方に対して、高い結合を示し（図２Ａ、Ｂ）、一方で、同じ条件下において、ペプチドＯＲ３及び４は、凝集したα−シヌクレインに対してより特異的な結合を示した（図２Ｃ、Ｄ）。
【００８１】
固定濃度のα−シヌクレインに対する結合におけるペプチド濃度の効果を、コートしたマイクロタイタープレートにて、１００又は２００ｐｍｏｌ／ウェルのα−シヌクレインにて上記のようにして試験した。ペプチドＯＲ１及び２は、１００ｐｍｏｌ／ウェルのα−シヌクレインにて、そのままのα−シヌクレインよりも凝集したα−シヌクレインに対してより強い結合を示した（図３Ａ、Ｂ）。両ペプチドについて検出された最も低い結合濃度は、１０ｐｍｏｌ／ウェルであった。ペプチドＯＲ３から５は、２００ｐｍｏｌ／ウェルのα−シヌクレインにて、凝集したα−シヌクレインに対して高度に特異的な結合を示した（図３Ｃ、Ｄ、Ｅ）。全ての３つのペプチドについて検出された最も低い結合濃度は、１０ｐｍｏｌ／ウェルであった。コートしたそのまま又は加齢型のα−シヌクレインに対するペプチド６及び７の結合特性もまた試験した。凝集したα−シヌクレインを５００ｐｍｏｌ／ウェルにてコートした場合に、ペプチド６及び７について結合を検出した（データは示さない）。
【００８２】
ペプチドＯＲ５は、全ての形態の凝集したα−シヌクレインに対して非常に特異的な結合を示し、ドーパミン処理したα−シヌクレインに対して特に高い特異性を示した（図５）。ドーパミン処理したα−シヌクレインについて検出された最も低い結合濃度は１０ｐｍｏｌ／ウェルであった。ドーパミン処理又はニトロ化したα−シヌクレインは、シヌクレイン疾患の初期段階に存在する可溶性凝集体（又は付加物）の生理的な近似物である。したがって、このデータは、本発明のペプチドがこのような疾患の初期における検出及び診断に適切な特性を有していることを確証している。
【００８３】
コントロール実験では、神経変性疾患におけるアミロイド原繊維形成に関連する他のタンパク質、特にアルツハイマー病におけるタンパク質凝集体の主要な成分（Ａβ）、イギリス型痴呆ペプチド（ＡＢｒｉ）を、様々な濃度にてマイクロタイタープレートをコートした。本発明のペプチドは、Ａβ（図７）又はＡＢｒｉ（データは示さない）について親和性を有さないことが示された。
【００８４】
免疫金アッセイ
銅グリッドを５０μＭの凝集したα−シヌクレイン５０μｌに１時間配置して、次いで、５０μｌのＰＢＳで２分間洗浄した後に、５０μｌのブロッキング緩衝液（Ｖｅｃｔｏｒ）を１時間３０分配置した。グリッドをＰＢＳで５回洗浄し（各５分）、次いで、０．１μｇ／ｍｌのペプチド５（ブロッキング緩衝液中）又はブロッキング緩衝液のみ（ネガティブコントロール）のいずれかに１時間３０分間、室温にて浸した。次いでグリッドをＰＢＳで５回洗浄し（各５分）、ブロッキング緩衝液中にて５０μｌのストレプトアビジン−金標識（１：５０）に３０分間室温にて浸した。グリッドを再びＰＢＳで５回洗浄し（各５分）、５０μｌの酢酸ウラニル（蒸留水中で２％）中に１分間室温にて浸した後に、透過型電子顕微鏡にて観察した。結果は、ペプチドＯＲ５及びＯＲ７がα−シヌクレイン凝集体を起こしているものに結合することを示している（図６）。ネガティブコントロールのグリッドについては金シグナルが観察されなかったことから、ストレプトアビジン−金標識には、非特異的な結合が存在しないことが示唆された。
【実施例３】
【００８５】
実施例３：遊離のα−シヌクレイン凝集体に対するコートしたペプチドの結合
ペプチド（１００ｐｍｏｌ／ウェル）をマイクロタイタープレート上にコートして、３７℃にて一晩乾燥させた。それゆえ、ペプチドをマイクロタイタープレートに固定させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄して、ブロッキング緩衝液（２．５％ゼラチン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）でブロッキングしたあとに、そのまま若しくは凝集したα−シヌクレイン溶液（加齢によって生じた）、又はＢＳＡタンパク質（ネガティブコントロール）を様々な濃度（０．００１〜２００ｐｍｏｌ／ウェル）添加して、１．５時間室温（ＲＴ）にてインキュベートした。
【００８６】
ペプチドに対するα−シヌクレインの結合を酵素と結合したα−シヌクレインに対する特異的な抗体を使用して定量化した。簡単に言うと、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後に、ポリクローナルウサギα−シヌクレイン抗体ＦＬ−１４０を１：１０００（ＰＢＳ中）にて添加した。次いで、プレートを３回ＰＢＳＴで洗浄した後に、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を添加した。プレートを１５分間ＲＴにて放置して発色させた。１００μｌ／ウェルの０．５Ｍ硫酸を添加して反応を停止させて、プレートを４５０ｎｍにて分光光度計で読み取った。
【００８７】
ペプチドＯＲ４（図４Ａ）及び５（図４Ｂ）は、そのままのα−シヌクレインよりも凝集したα−シヌクレインをより多く捕獲した。これらの結果は、本発明のペプチドが、単量体α−シヌクレインよりもα−シヌクレイン原繊維に対してより特異的であることを確証している。
【実施例４】
【００８８】
実施例４：本発明のペプチドが生きた神経細胞に進入するための能力
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ又はＭ１７神経芽腫細胞を１５ｍｌの培地中でフラスコでコンフルエントにまで増殖させた後、各懸濁物をペトリ皿に分注して、カバースリップ上で翌日まで細胞を増殖させた（〜５ｘ１０３／プレート）。次いで５０μＭの異なるペプチドとともに、細胞を増殖培地中で培養した（総量＝２ｍｌ）。ペプチドＯＲ１と同一であるがポリＤ−アルギニン［ｒ６］を欠いているペプチドを、コントロールとして含んだ。各々のペプチドとともに１５分インキュベーションした後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した。２ｍｌの固定液（ＰＢＳ中で４％パラホルムアルデヒド）を細胞に添加して、次いで３０分間室温にてインキュベートした。固定緩衝液を除去して、２ｍｌの透過緩衝液（ＰＢＳ中で０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）を３０分間室温にて細胞に添加して、次いで除去した。２ｍｌのブロッキング緩衝液を添加して、１時間ＲＴにて放置し、次いで除去した後に、ブロッキング緩衝液中の１：１００  ＦＩＴＣ［アビジン標識したフルオレセイン］（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を添加した。細胞を１時間インキュベートして、次いでＰＢＳ  ０．０５％ｔｗｅｅｎで２回洗浄した。カバースリップを除去して、マウント剤（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を１滴添加して、細胞を有している表面をスライドガラス上に下向きに配置した。次いで細胞を共焦点顕微鏡下で可視化した。
【００８９】
蛍光標識した本発明のペプチドを、生きた全てのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の蛍光シグナルとして観察し（図８）、細胞全体に分布していることが分かったが、一方で、コントロールペプチドで処理した細胞は、いずれの生細胞においても蛍光シグナルを示さなかった。ペプチド１から５は、３０分インキュベーションした後に、生細胞中に蛍光シグナルとして観察され、ペプチド６及び７は、各々２時間及び４時間インキュベーションした後に、生細胞中に観察された。同様の結果が、Ｍ１７細胞について得られた（データは示さない）。したがって、本発明のペプチドは、細胞膜を通過して、生きた神経細胞に進入する能力を有している。
【実施例５】
【００９０】
実施例５：細胞によるペプチドの除去
ペプチドが細胞に進入した後に、細胞がペプチドを除去する能力を試験した。細胞をペプチドとともに３０分間３７℃にてインキュベートし、ペプチドを取り込ませた。次いで細胞培地をペプチドを含まない新鮮な培地に置換して、２４時間までインキュベートした。細胞はペプチドを５分程度で除去し、１時間までには細胞はペプチドを完全に除去した（図９）。興味深いことに、４時間後に細胞は再びペプチドのいくらかの取り込みを示し、２４時間までに再び除去した。
【実施例６】
【００９１】
実施例６：本発明のペプチドの細胞毒性の評価
ヒト神経芽腫細胞株Ｍ１７に対するペプチドの細胞毒性を、標準的なＭＴＴアッセイを使用して評価した。Ｍｏｓｍａｎｎにより最初に説明された（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８３；６５（１−２）：ｐ５５−６３）、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム  ブロミド］アッセイは、生きた細胞由来のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素が、淡黄色のＭＴＴのテトラゾリウム環を切断して、ほとんど細胞膜を透過できない紺青色のホルマザン結晶を形成させるという能力に基づいており、その結果、健康な細胞では結晶が蓄積することになる。界面活性剤の添加による細胞の可溶化により、可溶性である結晶が開放される。生存細胞の数は、生成されるホルマザン産物のレベルと正比例している。次いで分光光度計の簡易比色アッセイによって、色を定量化できる。
【００９２】
図１０に示すように、ペプチドＯＲ１から４のいずれも、１〜５０μＭのペプチドにて４８時間まで処理した後に、Ｍ１７細胞に対して任意の有意な細胞毒性を示さなかった。同様の結果が、ペプチドＯＲ５から７について得られ、（データは示さない）、全てのペプチドについて、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株にて得られた。
【実施例７】
【００９３】
実施例７：ドットブロッティングによるα−シヌクレインアミロイドオリゴマーに対するビオチン化ペプチドの結合の確認
オリゴマー化しているα−シヌクレインに対するペプチドの結合も、ドットブロッティングを使用して試験した。単量体α−シヌクレイン（そのままのα−シヌクレイン溶液）及びオリゴマー化しているα−シヌクレイン（ドーパミン処理したα−シヌクレイン）を、ニトロセルロース膜上にスポットした。サンプルを室温にて２時間乾燥させた後に、膜をブロックして、次いで抗α−シヌクレインＭＡｂ２１１又はビオチン化したペプチドを膜に添加して、１．５時間室温にてインキュベートした。ゆるやかに洗浄した後、エキストラアビジンペルオキシダーゼ又は抗マウス−ペルオキシダーゼにて膜を適切に処理した。２１１とペプチドの結合を、ＥＣＬ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した。図１１に示すように、ビオチン化したペプチドは、オリゴマー化しているα−シヌクレインに特異的に結合するが、単量体形態のα−シヌクレインには結合しない。
【実施例８】
【００９４】
実施例８：脳における天然のα−シヌクレイン凝集体に対するペプチドの結合調査
ＥＬＩＳＡ
α−シヌクレイン原繊維に特異的な抗体（抗ＦＩＬＡ（Ｐｏｕｌ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａａｒｈｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋより寄贈））を使用して、本発明者は、ヒト脳溶解物中の天然のα−シヌクレイン凝集体を定量化するためのＥＬＩＳＡを開発した。コントロール、ＡＤ及びＤＬＢ患者由来の大脳皮質前部の死後の凍結脳サンプルを、弱い界面活性剤及びプロテアーゼ阻害剤カクテルからなる溶解緩衝液中にてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離して、上清を回収した。サンプル中の総タンパク質濃度を測定して、次いで、ＥＬＩＳＡで解析する前に３ｍｇ／ｍｌに調製した。脳サンプルを、一晩３７℃にてインキュベーションしてマイクロタイタープレート上にコートさせて、洗浄後にブロッキングして、抗ＦＩＬＡをウェルに添加して２時間インキュベートした。脳サンプル中のα−シヌクレイン凝集体に対する抗ＦＩＬＡの結合を、ＨＲＰ標識した抗ラビット抗体にて定量化した。コントロールの脳サンプルの測定値と比較して、抗ＦＩＬＡは、ほとんどのＤＬＢサンプルと、非常にわずかなＡＤサンプルにのみ、強いシグナルを与えた。
【００９５】
このＥＬＩＳＡ法を使用して試験した本発明のペプチドは、ヒトＤＬＢ脳における天然のα−シヌクレイン凝集体に対して結合することを示すであろう。
【００９６】
免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｏｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
ペプチドの結合について、ホルマリン固定した死後のＰＤ及びＤＬＢ脳の５ｍｍワックス切片、又は凍結させたばかりの脳のクライオスタット切片を使用して調べた。コントロールとして、最初に抗α−シヌクレイン抗体（ＭＡｂ２１１又はＦＬ−１４０）にて切片を免疫染色し、次いで、試験するペプチド及びペルオキシダーゼ−アビジンとともにインキュベートした連続切片と、顕微鏡下で比較して、死後の脳におけるレビー小体（ＬＢ）がペプチドで標識されるかどうかを決定した。
【００９７】
脳切片を水に浸して、スライド上に配置して、次いでキシレン中にて５分間インキュベートした。キシレンを交換して、スライドをさらに５分間インキュベートしてから、３％過酸化水素のメタノール液にて室温で３０分間インキュベーションすることによって、内在性ペルオキシダーゼ活性をクエンチさせた。次いでスライドを、１００％エタノール５分、１００％エタノール５分、９０％エタノール５分、７０％エタノール５分、ギ酸５分、７０％エタノール５分、蒸留水（３回交換）５分、ＰＢＳ５分にて洗浄した。スライドをブロッキング緩衝液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）中で９０分間３７℃にてインキュベートして、ＰＢＳで５分間洗浄した。抗α−シヌクレイン抗体ＦＬ−１４０をブロッキング緩衝液に添加して、一晩４℃にてインキュベートしてから、ＰＢＳ（５分以上３回交換）で洗浄した。ヤギ抗ラビットＦＩＴＣ（ブロッキング緩衝液中で１：１００）を添加して、１時間３７℃にてインキュベートしてから、ＰＢＳ（５分以上３回交換）で洗浄した。次いでスライドを蛍光顕微鏡下で観察するためにマウントしたところ、Ｆｌ−１４０はＬＢに対する特異的な染色を示した（図１２Ａ参照）。
【００９８】
次いで、凍結させたばかりの死後のＰＤ脳の５ｍｍクライオスタット切片に対するペプチドの結合を評価した。スライドをブロッキング緩衝液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）中でインキュベートして、ＰＢＳで洗浄した。ペプチドＯＲ５（０．０５ｍｇ／ｍｌ）をブロッキング緩衝液に添加して、一晩４℃にてインキュベートしてから、ＰＢＳで洗浄した。次いでアビジン−ＦＩＴＣ（ブロッキング緩衝液中で１：１００）を添加して、１時間３７℃にてインキュベートしてから、ＰＢＳで洗浄した。次いでスライドをマウントして、蛍光顕微鏡下で観察した。図１２Ｂに示すように、ペプチドＯＲ５はＬＢに対して特異的な染色を示した。この結果から、ＯＲ５がＰＤの死後の脳切片中のＬＢに特異的に結合することが示された。
【実施例９】
【００９９】
実施例９：細胞モデルにおけるα−シヌクレイン凝集体に対するビオチン化したＯＲ化合物の結合についての調査
この実施例は、Ｄｒ．Ｋｏｓｔａｓ  Ｖｅｋｒｅｌｌｉｓ（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ａｔｈｅｎｓ）から頂いた、誘導可能なＴＥＴ−ｏｆｆで制御されているＳＨ−ＳＹ５Ｙシステムを利用している。これら形質導入した細胞は、可溶性及び不溶性のα−シヌクレインの凝集体を両方とも生産することを示している。α−シヌクレイン凝集体に対するＯＲ化合物の結合について、この細胞モデルにおいて調べた。
【０１００】
Ａ５３Ｔを発現している細胞を、ドキシサイクリンを含まない培地中のカバースリップ上で増殖させて、レチノイン酸を１０μＭにて添加して７日間分化させた。６日目に、レチノイン酸を含む培地にて１μＭのＭＧ１３２で２４時間細胞を処置した。ビオチン化したＯＲ５、６及び７を培地に５μＭにて、各々１、２及び４時間３７℃にて添加した。
【０１０１】
次いで細胞用培地を、ペプチドを含まない新鮮な培地に交換して、α−シヌクレイン凝集体に結合していないペプチドを細胞が除去するように、さらに１５分間インキュベートした。細胞を固定して、次いで０．２％ＴｒｉｔｏｎＸのＰＢＳ液にて１５分間ＲＴにて処置し、ＰＢＳで洗浄した後に、ブロッキング緩衝液である０．５％ＢＳＡを添加した。
【０１０２】
細胞を抗α−シヌクレイン抗体（ＭＡｂ２１１又はＦＬ−１４０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））及びストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。抗マウスＴＲＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）又は抗ラビットＴＲＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）で必要に応じて染色した後に、α−シヌクレイン凝集体を検出した。
【０１０３】
α−シヌクレイン凝集体の形成を、蛍光顕微鏡を使用して分化させた細胞にて調べた。どちらの抗α−シヌクレイン抗体も、小さなα−シヌクレイン凝集体が分散した染色を示しており、核周辺領域にはほとんど凝集体が形成されていなかった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。しかし、未分化細胞では、α−シヌクレインは、細胞質全体に拡散的に分散していた（データは示さない）。細胞内のα−シヌクレイン凝集体に対するビオチン化したＯＲ化合物の染色についても調べた。この結果から、細胞内に形成されたα−シヌクレイン凝集体に、ペプチドＯＲ５、６及び７が結合することが示される（図１３Ａ及び１３Ｂ）。興味深いことに、α−シヌクレインの凝集体は、α−シヌクレイン抗体及びビオチン化したＯＲ化合物にて共染色した。ネガティブコントロールの細胞では、シグナルは検出されなかった（データは示さない）ことから、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ又はα−シヌクレイン凝集体に対する抗マウスＴＲＩＴＣ及び抗ラビットＴＲＩＴＣの非特異的な結合は存在しないことが示された。細胞における抗α−シヌクレイン抗体とビオチン化したＯＲ化合物の共局在は、同じα−シヌクレインの凝集体に結合することを示している。
【実施例１０】
【０１０４】
実施例１０：正常マウスにおけるリード化合物の血液脳関門（ＢＢＢ）透過性及び薬物動態の顕微鏡的調査
１００μｇ／１００μｌのペプチドＯＲ６及び５０μｇ／２００μｌのペプチド５又はＰＢＳ溶液（各群についてｎ＝２）を、正常マウスに静脈注射した。ＯＲ６を注射した動物を５、１５、３０及び６０分後に犠牲にし、一方でＯＲ５を注射したマウスを５、１０、１５、２０及び３０分後に犠牲にした。全脳、腎臓及び肝臓を取り除いた。組織を１０％ホルムアルデヒドのリン酸緩衝液（ＰＢ）にて一晩室温（ＲＴ）にて固定して、翌日３０％ショ糖のＰＢ液に移して、もう一晩４℃にてインキュベートした。次いで、クライオスタットを使用して、脳を７０ｍｍ凍結切片に切断した。脳スライスをＰＢＳで洗浄してから、３％過酸化水素（５０％エタノール中）にて３０分間ＲＴにてインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、エキストラアビジンペルオキシダーゼ（０．３％ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ中にて１：５００）とともに切片をインキュベートし、１時間ＲＴにてインキュベートしてから、ＰＢＳ（５分以上２回交換）、最後の洗浄はＰＢにて洗浄した。ＤＡＢ（３，３’ジアミノベンジジン四塩酸塩）を１５分間適用した後に、ＰＢにて５分間３回洗浄した。切片をゼラチンコートしたスライド上に配置させて、一晩乾燥させるために放置した。翌日、スライドを水中で３分間水和化させて、次いで、５０％エタノール、７０％エタノール、９５％エタノール、１００％エタノール（２ｘ）及びキシレン（２ｘ）のそれぞれにて５分間脱水させた。次いで顕微鏡下で観察するために、スライドをＤＰＸ−キシレンでマウントした。
【０１０５】
ペプチドＯＲ５
免疫組織化学データから得られた薬物動態の結果は、マウスがＯＲ５を注射した５分後に、弱く拡散した染色パターンを、視床、中脳及び小脳にわたって観察したことを示唆している。注射１０分後には、染色は海馬、橋及び視床にも拡大していた。このときに、小脳の染色は、小脳の周辺部に局在していた。注射１５分後には、ＯＲ５染色は、中脳及び橋、並びに視床を含む脳幹に出現した。これらの領域の染色は、注射後３０分まで維持していた。さらに、この時点で、小脳の染色は、内部を含む小脳全領域にわたって広がっていた。
【０１０６】
ペプチドＯＲ６及びＯＲ７
ペプチドＯＲ６の薬物動態の結果は、ペプチドがＢＢＢを通過して、注射５分後には中脳を極めて強く染色することを示唆している。注射５分後及び１５分後の両方にて、弱いが特異的な染色を、視床下部、視床及び小脳周辺部においても観察した。小脳におけるペプチドの６染色は、注射３０分後にピークに達し、ペプチド５について観察した小脳の染色パターンと同様に、小脳内部及び周辺部にわたって全てを染色している。注射３０分後には、視床及び中脳の染色はより強くなり、海馬においても染色を観察した。注射３０分後に見られる海馬及び中脳の染色を、注射１時間後にて維持しており、視床下部においてさらなる染色を観察した。しかし、小脳の染色はこの時点で次第に薄れ始め、これは、この領域からのペプチド６の除去におそらく起因しているのであろう。同じ結果がペプチドＯＲ７について得られた。
【０１０７】
結論
３つのペプチド全てがＢＢＢを通過し、時間の経過のあいだに、脳の様々な領域に局在しているようである。ペプチドＯＲ５の染色を、視床、中脳、脳幹及び海馬において観察した一方で、ＯＲ６及び７は、視床、中脳及び海馬においてより強い染色を提示しているうえに、視床下部を選択的に染色した。一方で、３つのペプチドは、時間にて同じ小脳染色パターンを示したが、注射１時間後に、より薄い染色が観察されることから示唆されるように、ペプチド６は小脳から除去されてきている可能性もあった。先行実験もまた、ペプチドＯＲ５が、１時間後に小脳から除去されてきている可能性を示唆している。ＯＲ６及び７とともに見られるより強い染色は、マウスにより高用量のペプチドを注射したことに起因し得る。
【実施例１１】
【０１０８】
実施例１１：リード化合物の血液脳関門（ＢＢＢ）透過性についてのＭＲＩ調査
ＭＲＩ画像化において使用される常磁性の造影剤であるガドリニウム（Ｇｄ）を、リード化合物のＮ末端に結合させる。Ｇｄは、Ｔ１、Ｔ２及びＴ２＊を短縮させる。この結果、Ｔ１強調画像の強度が上昇し、Ｔ２／Ｔ２＊強調画像の強度が減少することになる。
【０１０９】
化合物がＧｄに結合していることを確認するために、水を含むチューブを、水に溶解した特定の化合物（８２．２μＭにて）溶液を含むチューブと比較した。例えば、ペプチドＯＲ７は、化合物中のＧｄ含有量の結果、Ｔ１強調画像のシグナルを増加させる。同じ結果が、ペプチドＯＲ５及びＯＲ６について得られた。
【０１１０】
次いで、ペプチドＯＲ５、６及び７を、ＢＢＢ透過性及び脳における生体内分布を調べるために、ＭＲＩを使用して、正常Ｃ５７ＢＬ６コントロールマウス及びウィスター系ラットにて試験した。
【０１１１】
ボーラス追跡（Ｔ２／Ｔ２＊）
カテーテルを介して静脈注射したＧｄを、Ｇｄのボーラスが最初に脳を通過する間に、ＭＲＩによってシグナル減少として可視化できる。Ｇｄが脳組織に漏れ出していれば、第２のシグナル増加が予期される。ボーラス追跡実験のためにげっ歯類に与えた正常なＧｄ用量は、０．２ｍｍｏｌ  Ｇｄ／ｋｇである。しかし、全ての実験を、低Ｇｄ濃度（すなわち、０．２ｍｍｏｌ  Ｇｄ／ｋｇ未満）にて行った。
【０１１２】
Ｔ１マッピング
Ｔ１マップを、静脈注射の前後に作成した。マップ中のＴ１値を比較することによって、脳全体の造影化合物の分布及びある領域中のＧｄの存在を評価することが可能である。Ｔ１マップの記録時間は４０分であった。図１４ＡはＴ１マップの例を示している。Ｔ１値は異なる灰色の値で表している。実験のために、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ社の高磁場ＭＲＩシステム、Ｐｈａｒｍａｓｃａｎ７０／１６及びＢｉｏＳｐｅｃ９４／２０ＵＳＲ（各々７Ｔ及び９．４Ｔの磁場を有する）という、２つのシステムを使用した。Ｏ２：Ｎ２が１：２の気体混合物とともに投与して、吸入麻酔薬イソフルランにて動物を麻酔した。
【０１１３】
データの後処理を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｐａｒａ  Ｖｉｓｉｏｎ  ４．０画像ソフトウエア、自作のＭａｔｌａｂルーチン及びＡｍｉｒａ  ４．０（Ｍｅｒｃｕｒｙ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）にて行った。
【０１１４】
ペプチドＯＲ７
インビボにおけるＭＲＩ画像のために、正常ラットに２ｍｇのＯＲ７を０．１ｍｌのＰＢＳ液にて静脈注射して、０．００１２ｍｍｏｌのＧｄ（通常使用されるＧｄ濃度よりも４０倍以上低い）を与えた。
【０１１５】
化合物のボーラス注射後、おそらく低容量及び／又は低濃度のため最初の通過が観察されなかったが、ＯＲ７がＢＢＢを通過したことを示すシグナルの増加を検出した。図１４Ｂは、グラフの右に示した目的領域（全脳）を表し、同時のプロファイルはより小さな領域についても見られた。
【０１１６】
ボーラス追跡実験のために、単一のスライス様式のみが可能であることから、脳の特定の位置を選択した。これは、他の領域で起きていることについての空間的な情報を制限した。このボーラス後に、複数スライス解剖学画像（Ｔ２強調）を、より局所的なＧｄの漏出を検出するために行った。これらの画像から、Ｇｄスポットは（より低い強度のために）見られなかった。
【０１１７】
ボーラス追跡データは、ラットへの高投薬量（０．００１２ｍｍｏｌＧｄ及び２ｍｇペプチド）を含む注射の後の脳におけるＯＲ７の滞留を明らかに示唆している。
【０１１８】
ペプチドＯＲ６
この実験において、ボーラス追跡ではなくＴ１マッピングを行った。注射の前にＴ１を測定して、マウスを磁石から移した。次いでマウスに、０．１５ｍｌ生理食塩水に溶解したＯＲ６溶液（０．１８μｍｏｌのＧｄを含む０．３ｍｇ）を注射し、長距離カテーテルを使用せずに静脈に直接ゆっくりと溶液を注入した（このためには、より少量が必要とされる）。マウスを磁石に戻して、再びＴ１を測定した。
【０１１９】
以下に示す表において、平均Ｔ１値は、尾状核被殻（ＣＰｕ）、海馬（Ｈｉｐｐｏ）、及び深部中脳路核（Ｄｅｅｐ  Ｍｅｓｅｎｃｈｅｐｈａｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ）（ＤｐＭｅ）の、脳の３領域に存在している。尾状核被殻は脳前部の大きな領域であるため分割しており、海馬は脳室の隣に位置する重要な領域である。
【０１２０】
表２において、試験したマウスについてのＴ１値を提示する。Ｂ＝注射前、Ａ＝注射１５分後（記録時間は４０分）、及びＡ３ｄ＝注射後３日目。
【０１２１】
ＯＲ６溶液を注射した後に全ての領域においてＴ１値が有意に減少し、３日後には、シグナルは正常に回復した。
【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
ペプチドＯＲ５
２匹のマウスに、０．１６５μｍｏｌ及び０．１２４μｍｏｌのＧｄを各々含む０．４ｍｇ／ｍｌのＯＲ５溶液を、０．２０ｍｌ及び０．１５ｍｌ注射した。１番目のマウスにおいて、注射後に最初の通過と、その後のシグナルの増加がみられ、これはＯＲ５を注射したときＯＲ５がＢＢＢを通過したことを意味している。
【０１２４】
２番目のマウスも評価して、ＯＲ６について行ったようにＴ１マップを作成した。
【０１２５】
表３は、２番目のマウスについてのＴ１値を提示している。（Ｂ＝注射前、Ａ＝注射１５分後（記録時間は４０分））。注射後、３つの分割領域においてＴ１値がわずかに減少しており、これはＧｄがこれらの領域に滞留していることを示唆している。シグナルの減少は非常に小さく、これは少量のＧｄが投与されたということと一致している。
【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
ＯＲ５について、より低い濃度にて実験を繰り返した。０．５ｍｇ／ｍｌのＯＲ５を含む溶液を、３番目のマウスに０．３０ｍｌ（０．１５０ｍｇのＯＲ５及び０．０６１８μｍｏｌのＧｄ）を注射し、４番目のマウスに０．１ｍｌ溶液（０．０５０ｍｇのペプチド５及び０．０２０６μｍｏｌのＧｄ）を注射した。結果を表４に示す。マウス４について、２つの連続したＴ１マップを注射後に記録して、Ｔ１値の時間変化についてみた。２番目のマップ（Ａ２）の記録は、注射５５分後に開始した。
【０１２８】
【表４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ｅ】
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【図５】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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