(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィザノン及びウィザフェリンＡを有効成分とし、両成分を２：１(重量比)の割合で含む抗癌剤。
【請求項２】
注射剤として投与することを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシュワガンダの葉抽出物の構成成分であるウィザノン及びウィザフェリンＡを有効成分として特定の割合で配合した、腫瘍細胞への殺傷能が高く、正常細胞への毒性の少ない抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アシュワガンダ(Ashwagandha,学名Withania   somnifera;ナス科)は、インドの民間医療アーユルヴェーダで最も良く用いられる薬草の一つで、種々の治療効果が知られている。
本発明者らは、従来からアシュワガンダの葉からエタノール抽出物(i-Extract)を精製して、この成分に強い抗腫瘍活性があることを示すと共に、当該エタノール抽出物（i-Extract）から各種のウィザノライド化合物を単離して、生物活性を検討する中で、成分中に含まれるウィザノン（Withanone）に、腫瘍細胞特異的にがん抑制因子ｐ５３を活性化する現象を見出し、生体内での抗腫瘍効果も確認した（特許文献１、２）。当該ウィザノンは、さらに正常細胞の寿命延長、正常細胞の酸化ストレスからの保護作用、紫外線のＤＮＡ損傷及び化学毒性からの保護作用なども報告されている（特許文献２）。
一方、同様に上記エタノール抽出物中に見出されたウィザフェリンA(WithaferinA)も腫瘍細胞殺傷能を示すが、生体内での腫瘍抑制能は見出されず、何より正常細胞に対して強い毒性を有しているという大きな欠点がある。ウィザフェリンＡに対して、ウィザノンを多く含むピーク２１画分と併用することが試みられたことがあるが、正常細胞毒性はかなり減少したものの、完全に毒性を失わせることはできなかった（特許文献１）。
ウィザノンは、正常細胞への毒性がきわめて低いという長所はあるが、生体内での抗腫瘍効果が穏やかなものにとどまり、単独で抗癌剤として用いるためには不十分であった。
したがって、複数のウィザノライド化合物を組み合わせた、正常細胞への毒性はなく、しかも癌細胞に対する細胞増殖抑制効果の高い抗癌剤の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０８２３９２
【特許文献２】特開２００８−１９５７０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、複数のウィザノライド化合物を特定の割合で組み合わせることで、正常細胞への毒性はなく、しかも癌細胞に対する細胞増殖抑制効果の高い抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明では、アシュワガンダ葉由来のエタノール抽出物(i-Extract)に含まれる二つのウィザノライド化合物であるウィザノンとウィザフェリンＡに着目し、両者の配合割合を様々に変化させた組成物を作製し、正常細胞への細胞毒性と共に、癌細胞に対する細胞増殖抑制能を解析することによって、それぞれの成分の相乗効果が現れる配合割合を見出した。
すなわち、in  vitroでは、ウィザノン（下記式１）とウィザフェリンＡ（下記式２）とを重量比で20：1の割合で含んだ組成物の場合において、正常細胞への細胞毒性がなく、しかも、癌細胞に対する細胞増殖抑制能が強力であるという画期的な効果が奏せられることが確認できた。以下、当該組成物を「WiNA-201」という。
＜式１＞ウィザノン：
0005717129.tif 000002
＜式２＞ウィザフェリンＡ：
0005717129.tif 000003
【０００６】
そして、このように両者の配合として、正常細胞に対する毒性がなく、癌細胞に対しては細胞増殖抑制能が強力である最適な数値範囲が存在するという知見が得られたので、本発明者らは、生体内に投与した場合（in  vivo）の最適割合について、両成分の溶解性、半減期を勘案し、体重あたりの最大投与量を決定し、ウィザノンとウィザフェリンＡとを重量比で2：1の割合で含む場合がin  vivoでの最適数値範囲であることを突き止めた。そして、生体内においては、このような重量比2：1の割合で含む組成物（「WiNA-21」）の場合に、正常細胞、組織への毒性はなく、かつ強い腫瘍細胞増殖抑制効果を得ることができ、さらに癌細胞の浸潤性抑制効果と共に、癌細胞の転移抑制作用という優れた抗癌剤機能を実証できた。
これらの知見を得たことで、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、具体的には以下の通りである。
〔１〕ウィザノン及びウィザフェリンＡを有効成分とし、両成分を２：１(重量比)の割合で含む抗癌剤。
〔２〕注射剤として投与することを特徴とする、前記〔１〕に記載の抗癌剤。
ウィザノン及びウィザフェリンＡを有効成分とし、両成分を２：１(重量比)の割合で含む抗癌剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のWiNA-201は、in  vitro条件下で、またWiNA-21はin  vivo条件下において、正常細胞に対しては無毒であって、癌細胞特異的に毒性がある。いずれも、それぞれin  vitro条件下、及びin  vivo条件下において顕著な抗腫瘍活性を有すると共に、癌細胞の浸潤能を弱め、抗転移能を有しているので、優れた抗癌剤として期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ウィザノン及びウィザフェリンＡの各種配合割合での腫瘍細胞増殖抑制作用及び正常細胞に対する毒性作用の比較。  ［30時間培養後、ウィザノン及びウィザフェリンＡが20：1の場合（WiNA-201）のみがin  vitro条件下で腫瘍細胞の増殖を抑制し、かつ正常細胞への毒性がないことを示す。］
【図２】ヒト神経膠芽腫細胞(YKG1)の遊走抑制作用。  ［細胞層に引っ掻き傷を作ったYKG1細胞に対する8時間後の周囲の細胞の遊走（＝細胞層の修復）作用を比較した。i-Extract（エタノール抽出液）、ウィザフェリンＡ、ウィザノン、WiNA-201のうち、WiNA-201がin  vitro条件下で最も効果的に遊走を遅らせた。］
【図３】ヒト線維肉腫細胞(HT1080)の浸潤抑制。  ［Boydenチャンバーアッセイでの測定による。ウィザフェリンA、ウィザノンおよび WiNA-201の全てに於いて浸潤能の抑制が観察されたが、WiNA-201がin  vitro条件下で最も強力な作用を示した。］
【図４】ヒト線維肉腫細胞(HT1080)の浸潤抑制。  ［QCMTM細胞浸潤アッセイキットによる。WiNA-201がin  vitro条件下で最も強力な浸潤能抑制作用を示すことが定量的に示された。］
【図５】ヒト線維肉腫細胞(HT1080)とフィブロネクチンとの接着能の抑制。  ［細胞接着アッセイにより測定。ウィザフェリンA、ウィザノンおよびWiNA-201の全てに於いてフィブロネクチンとの細胞接着が抑制されたが、WiNA-201がin  vitro条件下で最も強力な作用を示した。］
【図６】マウスへの静脈注射による毒性試験。  ［WiNA-21などをヌードマウスの尾静脈に注射後のマウスの体重を測定。体重から判断する限り、WiNA-21はマウスに毒性を示さなかった。］
【図７】ヌードマウス腫瘍アッセイでのWiNA-21の強力な抗がん作用。  ［ヌードマウス皮下移植下でのヒト線維肉腫細胞株(HT1080)の増殖を、WiNA-21注射群は比較対照群と比較し強力ながん抑制作用を示した。］
【図８】ヌードマウス腫瘍アッセイでの腫瘍の体積変化。  ［WiNA-21注射群及び比較対照群マウスの4匹それぞれの２か所ずつの腫瘍体積を平均値化し、腫瘍の体積変化を検討した。］
【図９】ヒト線維肉腫細胞に対するin  vivo条件下での浸潤抑制作用。  ［ヌードマウスに静脈注射後8日目のヒト線維肉腫細胞株に対してWiNA-21を腹腔投与した場合とリン酸緩衝液・生理食塩水を用いた場合（コントロール）の5週間後の肺組織へのがん細胞の転移を観察。WiNA-21注射群には腫瘍の転移は殆ど観察されない。］
【図１０】WiNA-21（in  vivo）ならびにWiNA-201（in  vitro）は細胞接着タンパク質NCAM-140を増加させる。  ［Ａ：ヒト神経芽腫細胞株を、ウィザフェリンA、ウィザノンあるいは WiNA-201存在下で48時間培養後、各種NCAMの発現量の確認。Ｂ：HT1080細胞株を用いたin vivo腫瘍形成実験。ヌードマウス皮下で作らせたHT1080細胞の腫瘍中でのWiNA-21を用いた各種NCAM発現量の比較。Ｃ：HT1080細胞培養液中のWiNA-201を用いたNCAM-140とPSA-NCAMの発現量の比較。］
【図１１】WiNA-201によるNCAMの強力な発現誘導とPSA-NCAMの発現抑制。  ［WiNA-201をHT1080細胞培養液に添加しNCAMおよびPSA-NCAMの発現を免疫染色により検討した。WiNA-201投与によってNCAMが上昇したのに対し、PSA-NCAMは減少したことを示す。］
【図１２】WiNA-21（in  vivo）ならびにWiNA-201（in  vitro）によるマトリクスメタロプロテアーゼMMP2の発現抑制。WiNA-201、WiNA-21の投与によるMMP2タンパク質の優位な減少が観察された。  ［Ａ：YKG1細胞株の培養液中にウィザフェリンA、ウィザノンあるいはWiNA-201を添加して培養し、MMP2タンパク質の発現量をウエスタンブロットにより検討。Ｂ：HT1080細胞株の培養液中でのMMP2タンパク質の発現量。Ｃ：ヌードマウス皮下のHT1080由来腫瘍でのMMP2タンパク質の発現量。］
【図１３】WiNA-21ならびにWiNA-201によるシグナル伝達タンパク質のERKの減少。  ［WiNA-201、WiNA-21の投与によるERKの優位な減少が観察された。Ａ：YKG1細胞株の培養液中でのERKの発現量の検討。Ｂ：HT1080細胞株の培養液中でのERKの発現量。Ｃ：ヌードマウス皮下のHT1080由来腫瘍でのERKの発現量。］
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明の「WiNA-21」又は「WiNA-201」の製造方法
アシュワガンダの葉をアルコール（水性アルコール）で抽出、濃縮して得られるアルコール抽出物(i-Extract)を得た後、特許文献１又は２の方法に従って、下記ウィザノン（式１）及びウィザフェリンA（式２）を精製する。粉末状のまま、両者を重量比で2:1又は20:1に配合して投与することもできるが、あらかじめDMSO溶媒にそれぞれ10mg/ml溶解した組成物として用いることが好ましい。本発明の実施例では、WiNA組成物として用いた。
なお、「2:1(重量比)」というとき、四捨五入して2:1となることを意味するから、「2.4〜1.5：1」、すなわち「24：10〜15：10」の場合を包含し、好ましくは22：10〜18：10である。同様に、「20：1(重量比)」という場合も「20.4〜19.5：1」すなわち「204：10〜195：10」の場合を包含し、好ましくは202：10〜198：10である。
＜式１＞ウィザノン
0005717129.tif 000004
＜式２＞ウィザフェリンA
0005717129.tif 000005
【００１１】
２．in  vitroでのWiNA-201の効果と、それを踏まえたin  vivoにおけるウィザノライド化合物の最適配合割合（WiNA-21）
in  vitroでのウィザノライド化合物の投与実験では、ウィザノン（上記式１）とウィザフェリンＡ（上記式２）とを重量比で20：1の割合で含んだ組成物の場合において、正常細胞への細胞毒性がなく、しかも、癌細胞に対する細胞増殖抑制能が強力であるという画期的な効果が奏せられる（WiNA-201）。
このように両者が特定の割合で組み合わされた場合には、正常細胞に対する毒性がなく、癌細胞に対しては細胞増殖抑制能が強力である数値範囲が存在することが明らかとなった。
そこで、実際の抗癌剤として、生体内に投与する場合についても最適配合割合を決定することとした。すなわち、in  vivoにおける投与量は個体の重さに対する量となり、溶解性、半減期など生体内での挙動がin  vitroとは必ずしも一致しないため、投与量を最適化する必要がある。
その際、従来はin  vivoデータ採取の際に経口摂取、局所注射のみであったが、実際の抗癌剤投与形態が血流に投与（静脈注射）することが多いことを踏まえ、本実施例ではマウスの血流への注射を試みた。そのため、尾静脈への注射が可能なマウスの体重(kg)に対する最大投与量を検討したところ、マウスの体重(kg)に対し、ウィザノン-1mg、ウィザフェリンA-0.5mgが最大投与量であることがわかった。ウィザノンとウィザフェリンＡとを重量比で2：1の割合で含む注射剤を製造し、マウス尾静脈へ注射したところ（「WiNA-21」）、投与し続けても体重の変化がなく、正常細胞、組織への毒性が極めて少ないことが判明した。
そして、この「WiNA-21」をヌードマウスに皮下移植した腫瘍細胞に適用したところ、強い腫瘍細胞増殖抑制効果のみならず、癌細胞の浸潤性抑制効果も確認し、癌細胞の転移抑制作用という優れた抗癌剤機能が実証できた。
【００１２】
３．本発明の「WiNA-201」「WiNA-21」の特性
本発明の組成物「WiNA-201」「WiNA-21」には、以下の特性がある。
（１）WiNA-201、WiNA-21はがん細胞特異的に毒性がある。正常細胞に対する毒性はない。（図１，図６）
（２）WiNA-21をマウスに静脈注射しても無害である。
WiNA-21の生体への無毒性は、10日間のマウス尾静脈注射により確認した。（図６）
（３）WiNA-201はin   vitroで抗腫瘍効果を示す。（図１）
（４）WiNA-21はin   vivoで抗腫瘍効果を示す。
WiNA-21の強力な抗癌抑制活性はヌードマウス腫瘍形成アッセイにより確認した。（図７，８）
（５）WiNA-201はがん細胞の浸潤能を弱める。
WiNA-201の癌細胞浸潤能抑制効果は、癌細胞の遊走能抑制効果の観察（図２）、Boydenチャンバーを用いた浸潤アッセイ（図３）、QCMTM細胞浸潤アッセイキットによる定量化（図４）により確認した。
（６）WiNA-201、WiNA-21はがん細胞の抗転移能を有する。
WiNA-21の抗転移能は、腫瘍転移アッセイで確認された。（図９）
また、WiNA-201、WiNA-21が、細胞接着タンパク質のNCAM-140の増加作用を示したことはWiNAが抗転移効果誘導に強く関与することを示すものであり、PSA-NCAMの減少効果も、細胞接着の増加と転移の減少を示す。（図１０，１１）
（７）WiNA-201はがん細胞の細胞外マトリクスへの付着を弱める。
WiNA-201の、癌細胞の細胞外マトリクス（フィブロネクチン）への接着能抑制効果を細胞接着アッセイにより確認した。（図５）
（８）WiNA-201はがん細胞の細胞接着タンパク質の発現を増加させる。
WiNA-201、WiNA-21は、細胞接着タンパク質のNCAM-140の増加作用を示す。このことはWiNAが抗転移効果誘導に強く関与することを示すものである。
細胞接着タンパク質NCAMと腫瘍退縮の関連性はすでに知られているが、本実施例８においては、WiNA-201、WiNA-21がNACM-140を増加させていることからみて、NACM-140の増加が腫瘍の縮小を引き起こしたことに強く関連していることが示された。（図１０Ａ，Ｂ、図１１）
また、WiNA-201、WiNA-21には、NCAM-140発現増進剤、阻害剤としての効果が期待できる。
（９）WiNA-201、WiNA-21はがん細胞のメタロプロテアーゼMMP2の発現を減少させる。WiNA-201、WiNA-21は、マトリクスメタロプロテアーゼ（MMP）は、腫瘍に酸素や栄養を供給するための血管新生に関わっているが、とりわけ癌の増殖に最も関わりの深いとされており、阻害剤のターゲットとなっているMMP-2の発現を抑えることが実証された。すなわち、WiNA-201、WiNA-21には、MMP-2発現阻害剤としての効果が期待できる。（図１２）
（１０）WiNA-201、WiNA-21はがん細胞のシグナル伝達タンパク質ERKを減少させる。すなわち、WiNA-201、WiNA-21には、ERK発現阻害剤としての効果が期待できる。（図１３）
【００１３】
４．本発明における「WiNA-21」を有効成分とする抗癌剤
本発明は「WiNA-21」を有効成分とする「抗癌剤」に係るものであるが、本発明において「抗癌剤」というとき、ヒト又は哺乳動物に対して経口若しくは非経口で投与した場合に抗癌活性又は抗腫瘍活性を有する医薬組成物であって、癌の予防又は治療若しくは処置のために用いることができる医薬組成物を指す。
本発明の医薬用組成物の投与方法は特に限定されるものではなく、経口、経鼻、非経口、経肺、経皮、経粘膜などが可能であり、種々の剤形とすることができるが、注射剤による投与が特に適している。例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤などとすることができ、薬剤的に許容できる種々の担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤、ビタミンＣ、抗酸化剤を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の医薬用組成物の投与量は、投与するヒトの年齢、体重、症状によって異なるが、一般的には成人１日用量として１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇを使用し、１日あたりの量を数回に分けて投与することもできる。また、他の抗腫瘍剤や治療法と組み合わせて投与することもできる。
本発明の組成物は、食品又は栄養補助食品の形態とすることも、医薬部外品または化粧品の形態とすることもできる。
また、「WiNA-201」の場合は、患者の血液、リンパ球、樹状細胞などを生体外に取り出し、生体外で他の免疫活性剤、サイトカイン類などと共に投与する場合に有効である。
【実施例】
【００１４】
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。
なお、本願明細書において引用した文献中の記載事項は、本願明細書中の記載として組み入れることとする。また、特に断りがない場合は、公知の方法、例えばMolecular  Cloning  3rd  edition  Sambrook  Jら、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,2001年、細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」（秀潤社、2001年）などの記載に従って実施可能であり、市販の試薬やキット等の指示書に従って実施可能である。
【００１５】
（実施例１）２種類のウィザノライドの配合割合の検討
２種類のウィザノライドとしてウィザノンとウィザフェリンＡを選択し、in  vitroにおける両者の最適な組み合わせを検討した。
本発明者らは、以前にウィザノンとウィザフェリンAとの１：１の比率での組み合わせ(WiNA-11)を検討していたが、正常細胞に対する毒性があり、抗癌剤の有効成分としては適さないことをすでに確認していた（図示せず）。
そこで、ヒト骨肉腫細胞（U20S株）及び正常細胞（TIG-1株）の培養液（3×105個／0.2ml）に対し、ウィザノン5.0μg/ml、ウィザフェリンA0.250μg/ml(WiNA-201[20：1])、ウィザノン2.0μg/ml、ウィザフェリンA0.4μg/ml(WiNA-102 [10：2])、ウィザノン5.0μg/ml、ウィザフェリンA0.250μg/ml(WiNA-201[20：1])を添加し、さらに30時間培養後の写真を示す（図１）。コントロールとしては、2μlのDMSOを添加した。
ウィザノンとウィザフェリンAの20：1の組み合わせ(WiNA-201)は、がん細胞を殺傷するが、正常細胞には無害である。一方、ウィザノンとウィザフェリンAの10：2の組み合わせ(WiNA-102)およびウィザノンとウィザフェリンAの10：3の組み合わせ(WiNA-103)は正常細胞に対し、毒性をもつ。
以上の結果から、in  vitroにおけるウィザノンとウィザフェリンＡの最適な配合割合が20：1であると確定した。当該「WiNA-201」は正常細胞への毒性のない高い抗癌活性を有する優れた抗癌剤としての効果が期待されるので、以下の実施例で、「WiNA-201」の抗癌剤としての効果について詳細に検討する。
【００１６】
（実施例２）ヒト神経膠芽腫細胞の浸潤抑制
WiNA-201のヒト神経膠芽腫細胞株の浸潤抑制能を確認するために、「創傷治癒アッセイ」で細胞遊走能を観察した。ヒト神経膠芽腫細胞(YKG1)細胞を6穴の培養皿で培養し、細胞が100％コンフルエントに近付いた時点で細胞層に均一な傷を付けた(20ゲージ注射針)。
i-Extract、ウィザフェリンＡ、ウィザノン及びWiNA-201をそれぞれ培養液中に2μg/ml、0.25μg/ml、5μg/ml、5μg/ml＋0.25μg/mlずつ添加し、８時間後の細胞の動きを位相差顕微鏡で観察した。コントロールとウィザノライド類添加細胞の動きを継時的に写真に収めた。なお、コントロール（比較対照群）としては2μlのDMSOを添加したものを用いている。コントロールでは８時間ほどで周囲の細胞が傷部分に遊走したが培養液にi-Extract、ウィザノンもしくはWiNA-201を処理した細胞では、傷への遊走(＝細胞層の修復)が遅れた。このうち、WiNA-201が最も効果的に遊走を遅らせた（図２）。
【００１７】
（実施例３）ヒト線維肉腫細胞の浸潤抑制
（３−１）Boydenチャンバーを用いた浸潤アッセイ
WiNA-201によるヒト線維肉腫細胞株HT1080の浸潤能の抑制効果を、Boydenチャンバーを用いた浸潤アッセイ(Corning  Inc.,Corning,NY)により検討した。
Boydenチャンバーの仕組みは以下の通りである。培養皿を上層と下層のポリカーボネートのフィルター膜で隔てる。この膜には8μmの穴が開いており、マトリゲル(50μl  of  5mg/ml)を加えて37℃で2時間放置、ゲル化させる。1×106個の細胞を100μlの無血清培養液に浮遊させて、ゲル化したマトリゲルの上層に注ぐ。培養皿の下層には、細胞接着基質としてフィブロネクチン(5μg/ml)を含む培養液(600μl)で満たされている。この状態でチャンバーを37℃で24時間放置する。浸潤能を有する細胞はマトリゲルを分解してフィルター膜を通過、上層から下層に移動する。培養終了後、フィルター膜の上層に残っている細胞は綿棒で取り除く。下層に浸潤した細胞は、培養液をメタノール・アセトン(1：1)と交換して固定、クリスタルバイオレットで染色する。染色した細胞は乾燥させて、培養皿から取り外し、顕微鏡下で写真に収める。
【００１８】
上記のように調製したヒト線維肉腫細胞株(HT1080)上層のゲル化マトリゲル上に、コントロールのDMSO、ウィザフェリンＡ、ウィザノンおよびWiNA-201をそれぞれ2μl、0.25μg/ml、5μg/ml、5μg/ml＋0.25μg/mlずつ添加し、37℃で24時間培養後、メンブレンより下に浸潤した細胞をメタノール・アセトン(1：1)で固定した後、クリスタルバイオレットで染色し、乾燥して写真撮影した。ウィザフェリンA、ウィザノンおよびWiNA-201の全てに於いて浸潤能の抑制が観察されたが、WiNA-201が最も強力な作用を示した。（図３）
【００１９】
（３−２）QCMTM細胞浸潤アッセイキットによる定量化
WiNA-201によるHT1080細胞株の浸潤能抑制効果は更に、QCMTM細胞浸潤アッセイキット(Milipore社のQCMTM キット)を用い、蛍光測定により定量化した。なお、細胞は6穴培養皿で48時間培養後、実験に使用した。
Boydenチャンバー同様、このキットも培養皿の上層と下層を細胞外マトリクス層で隔てられており、上層に注いだ細胞が浸潤能を持てば、細胞外マトリクスを分解して下層に移動する。細胞外マトリクス層を温めた無血清培養液300μlで15分から30分濡らしておく。その後膜を破ることなく培養液を250μlほど取り除き、細胞(250μl,1×106cells/ml)を加える。下層には10％胎児ウシ血清を含む培養液で満たされている。培養液中に、コントロールのDMSO、ウィザフェリンＡ、ウィザノン及びWiNA-201をそれぞれ2μl、0.25μg/ml、5μg/ml、5μg/ml＋0.25μg/mlずつ添加し、この状態で37℃、24時間培養した後、上層の培養液を取り除く。浸潤チャンバーインサートを取り外し、温めた細胞剥離液(225μl)に漬けて37℃で30分間放置する。遊離させた細胞はその後NP40細胞溶解液で溶解し、核酸染色液(CyQuant  GRRダイ,Molecular  Probes)で染色した(室温で15分)。染色した細胞の細胞数はプレートリーダー(480/520nmフィルター)で計測した。（図４）
その結果、ウィザフェリンA、ウィザノンおよびWiNA-201の全てに於いて浸潤能の抑制が観察されたが、WiNA-201が最も強力な抑制作用を示した。
【００２０】
（実施例４）細胞接着アッセイ
この実験では、ヒト線維肉腫細胞(HT1080)の細胞外マトリクス構成因子(フィブロネクチン)への接着能へのWiNA-201の抑制効果を検討する。
HT1080株は6穴培養皿で48時間培養後、実験に使用した。96穴培養皿をフィブロネクチンで室温2時間コーティングして、0.5％ BSA/PBSで30分間ブロッキングしたものを使用した。細胞数を5×105cells/mlになるように、無血清培養液に浮遊させてから、100μlの細胞を上記セッティングに乗せて、ウィザフェリンＡ、ウィザノン及びWiNA-201をそれぞれ0.25μg/ml、5μg/ml、5μg/ml+0.25μg/mlずつ37℃で45分間培養した。その後培養液を注意深く取り除き、培養皿をPBSで3回洗浄、底に接着した細胞数を計測した。細胞数の計測には、MTT比色分析アッセイを行った。培養液に、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)(0.5mg/ml)を添加して4時間放置、その後100・lのDMSOで置換すると結晶化したフォルムアザンが溶解して赤紫色になる。550nmの吸光度をプレートリーダー(Wallac)で計測下結果を図５に示す。
ウィザフェリンA、ウィザノンおよびWiNA-201の全てに於いてフィブロネクチンとの細胞接着が抑制されたが、WiNA-201が最も強力な作用を示した。
【００２１】
（実施例５）WiNA-21注射による毒性試験
マウスの尾静脈への注射を行うため、ウィザノン及びウィザフェリンの尾静脈注射が可能なマウスの体重(kg)に対する最大投与量を検討した結果、マウスの体重(kg)に対し、ウィザノン-1mg、ウィザフェリンA-0.5mgが最大投与量であることがわかった。
WiNA-21(ウィザノン-1mg/kg体重+ウィザフェリンA-0.5mg/kg体重)をヌードマウスに尾静脈に注射した。毎回200μlを、１日間隔で10日間投与した。比較のために、コントロール(PBS)、ウィザフェリンＡ（0.5mg/kg体重）及びウィザノン（1mg/kg体重）も200μlずつ同様に投与した。マウスの体重は3日おきに計測した。餌の摂食と行動は毎日記録した(図６)。
その結果、ウィザフェリンＡを投与したマウスは食欲も減退し体重が減少するという明らかな毒性を示したが、WiNA-21はウィザノンと同様に順調な体重増加が見られ、マウスに毒性を示さなかった。
【００２２】
（実施例６）ヌードマウス腫瘍形成アッセイ
この実験では、WiNA-21によるヌードマウス皮下移植下でのヒト線維肉腫細胞株(HT1080)の増殖抑制効果を、WiNA-21注射群とコントロール群とで比較検討した。
Balb/cヌードマウス(4週齢雌)を業者から購入(日本クレア)し、動物施設で1週間慣れさせた。ヒト線維肉腫細胞株(HT1080)3×106個を0.2ml培養液に浮遊させ、下腹部の皮下に注射した(一匹当たり二か所)。小さい腫瘍が現れた後（8日後）、腫瘍マウスをランダムに4匹ずつグループに分けた。コントロール群にはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を投与する。試験群にはWiNA-21(ウィザノン-1mg/kg体重＋ウィザフェリンA-0.5mg/kg体重)を尾静脈注射で１日おきに5回投与した。腫瘍の増殖と動物の健康は毎日モニターした。
その結果、コントロール群では、湿潤性の巨大な腫瘍を形成するものが多かったが、WiNA-21注射群では腫瘍がほとんど消失したマウスもあり、他のマウスの腫瘍も増大する速度は遅いことが観察された（図７）。なお、図７では、図に示した日に写真を撮影した。
同時に、WiNA-21注射群と比較対照群におけるヌードマウス移植腫瘍をノギスで測定し、皮下の腫瘍の体積をV＝(長さ×幅×厚さ)/2として計算した。4匹のマウスの平均値をプロットした（図８）。
以上の結果は、WiNA-21の強力ながん抑制作用を示すものである。
【００２３】
（実施例７）腫瘍転移アッセイ
この実験では、WiNA-21によるin  vivoでのヒト線維肉腫細胞株(HT1080)の転移抑制効果を、転移アッセイにより検討する。
転移アッセイでは、ヒト線維肉腫細胞株（HT1080）を3×105個、0.2mlの培養液に浮遊させて、尾静脈注射した。8日後、８匹のマウスをランダムに2グループに分ける。上記実施例６と同様に、コントロール群にはリン酸緩衝生理食塩水を投与、試験群にはWiNA-21を１日おきに5回投与した(尾静脈注射)。マウスは5週間後に安楽死させて、肺組織への癌細胞の転移を観察した。（図９）
WiNA-21注射群では、腫瘍の転移は殆ど観察されないか、あるとしてもごく小さなものだった。
【００２４】
（実施例８）WiNA-201及びWiNA-21による神経細胞接着因子（NCAM）の誘導効果
（８−１）Westernブロッティングの操作条件
本実施例、及び以下の各実施例で用いる免疫ブロッティング（Westernブロッティング）は以下の条件下で行った。
細胞溶解にはRIPAバッファーを用いた。タンパク質量をBCA法で計測して、20mgのタンパク質をSDS-PAGEで分離し、イモビロン-Pメンブレン(Millipore)にセミドライトランスファー機器で転写した。免疫ブロッティングに用いた抗体は以下の通り。NCAM抗体(AbCys  SA)、MMP2抗体(Santa  Cruz)、リン酸化ERK抗体、リン酸化p38抗体(Cell  Signalling)、およびactin抗体(Chemicon  International)。2次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ結合ウサギIgG抗体を用い、発色にはECLキットを用いた(GE  Healthcare)。
【００２５】
（８−２）神経細胞接着因子（NCAN）のin  vitro誘導
ヒト神経芽腫細胞株（IMR32株）を、ウィザフェリンＡ、ウィザノン及びWiNA-201をそれぞれ0.25μg/ml、5μg/ml、5μg/ml+0.25μg/mlの存在下37℃で48時間培養した。ウィザノンとWiNA-201は細胞接着タンパク質のNCAM-140を強力に誘導した。ウィザノンがNCAM-180を誘導したのに対して、 WiNA-201は専らNCAM-140を誘導した。NCAM-120の合成には影響がなかった。（図１０Ａ）。
細胞接着タンパク質のNCAM-140の増加はWiNAが抗転移効果誘導に強く関与することを示している。
【００２６】
（８−３）HT1080細胞株により形成された腫瘍（in  vivo）でのNCAM誘導実験
前記実施例６と同様の操作により、ヌードマウス皮下でHT1080細胞の腫瘍を作らせた。ウィザフェリンA、ウィザノン及びWiNA-21を注射した腫瘍内での18日後のNCAMの発現を上記（８−１）の免疫ブロッティング法により観察した。WiNA-21を注射した腫瘍は、NCAM-140のタンパク質レベルがコントロール群よりも高かった。同様の結果はウィザフェリンAでも得られた。その一方でNCAM-120は、ウィザノンおよびWiNA-21を注射した腫瘍で減少していた。結論として、WiNA-21はin   vivoで腫瘍の縮小を引き起こし、細胞接着タンパク質のNCAM-140を増加させる。（図１０Ｂ）。
細胞接着タンパク質NCAMによる細胞接着と腫瘍退縮の関連性はすでに知られているが、本実施例８においては、WiNA-201、WiNA-21が、NACM-140を増加させたことで腫瘍の縮小を引き起こしたことが示唆される。
【００２７】
（８−４）HT1080細胞培養液中でのNCAM誘導実験
HT1080細胞培養液を用いて、前記（８−２）と同様の培養を行った。HT1080細胞培養液においてはWiNA-201によるNCAM-140の増加が最も強く観察された。一方で発達中の神経細胞によく見られる長鎖のポリシアル酸（PSA）をもったPSA-NCAMは減少していた。（図１０Ｃ）。
ここで、PSA-NCAMの減少は、細胞接着の増加と転移の減少を示すものである。
【００２８】
（実施例９）免疫染色法を用いた腫瘍細胞内のNCAM発現誘導の観察
本実施例では、免疫染色法を用いて、WiNA-201の腫瘍細胞内でのNCAMの発現誘導を観察する。具体的には以下の条件下で行った。
HT1080細胞株を12穴の培養皿に沈めたカバースリップ上で培養して接着させる。その際の培養条件は、上記実施例１と同様であり、培養液中にはウィザフェリンＡ、ウィザノン及びWiNA-201をそれぞれ0.25μg/ml、5μg/ml、5μg/ml+0.25μg/mlずつ添加されている。
48時間培養後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄、冷やしたメタノール・アセトン(1:1)で5分から10分間固定する。固定した細胞をPBSで洗浄後、0.2％のTriton  X-100/PBSで10分間漬けて、細胞膜に穴を空ける。2％ウシ血清アルブミン/PBSでブロッキングして、NCAM抗体(Santa  Cruz  Biotechnology)あるいはPSA  NCAM抗体(Cell  signaling)で反応させる。二次抗体として、Alexa488結合ヤギ抗ウサギIgG抗体を用いる(Molecular  probes)。0.2％  Triton  X-100/PBSで2、3回洗浄後、マウンティング液で封入する。観察にはCarl  Zeissの蛍光顕微鏡を用いた。
WiNA-201を培養液に添加した細胞および比較対照群のNCAMおよびPSA-NCAMの発現を免疫染色で検討した。WiNA-201投与によってNCAMが上昇したのに対して、PSA-NCAMは減少した。（図１１）
【００２９】
（実施例１０）マトリクスメタロプロテアーゼMMP2の発現抑制
本実施例では、ヒト神経芽腫細胞株（IMR32株）及びヒト線維肉腫細胞株（HT1080）を用いて、血管新生を促進する因子として知られているマトリクスメタロプロテアーゼMMPのうち、腫瘍の増殖に最も関わりの深いとされるMMP-2発現に対するWiNA-201の抑制効果を、前記実施例（８−１）に記載したウエスタンブロッティング法により検討した。
YKG1およびHT1080細胞株を培養し（培養条件は実施例１と同様。）、培養液中にウィザフェリンA、ウィザノンあるいはWiNA-201を添加して、48時間培養後のMMP2タンパク質の発現を検討した。WiNA-201を添加したYKG1およびHT1080細胞株のいずれにおいてもMMP2タンパク質の優位な減少が観察された。（図１２Ａ，Ｂ）
一方、実施例６と同様の操作でヌードマウス皮下で増殖させたHT1080細胞株においては、WiNA-21の投与により、in  vitroにおけるWiNA-201を添加した場合と同様、MMP2の減少を顕著に引き起こした（図１２Ｃ）。
【００３０】
（実施例１１）細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の発現抑制
ERKは、非常に多くのシグナル伝達経路に係わっているシグナル伝達分子であり、細胞の分化や増殖などを制御していると考えら、癌細胞のシグナル伝達にも関わっていることが知られている。本実施例では、YKG1株およびHT1080細胞株を用いて、ERK発現に対するWiNA-201の抑制効果を、実施例１０と同様に行った。
その結果、YKG1およびHT1080細胞株の培養液中にWiNA-201を添加すると、ERKタンパク質の減少が観察された。しかしながら同様の実験をウィザフェリンAあるいはウィザノンで行ってもERKの発現には変化がなかった（図１３Ａ，Ｂ）。同様の結果は、WiNA-21を投与したヌードマウス皮下のHT1080由来腫瘍でも観察された（図１３Ｃ）。
【図１】
0005717129.tif 000006
【図２】
0005717129.tif 000007
【図３】
0005717129.tif 000008
【図４】
0005717129.tif 000009
【図５】
0005717129.tif 000010
【図６】
0005717129.tif 000011
【図７】
0005717129.tif 000012
【図８】
0005717129.tif 000013
【図９】
0005717129.tif 000014
【図１０】
0005717129.tif 000015
【図１１】
0005717129.tif 000016
【図１２】
0005717129.tif 000017
【図１３】
0005717129.tif 000018