(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フモニシンの酵素的分解のための添加物を製造するための方法であって、配列番号８および１８に対応する遺伝子の少なくとも１つの核酸配列が準備され、前記の少なくとも１つの核酸配列が原核または真核宿主細胞において発現され、配列番号９および１９に対応する少なくとも１つのこのようにして産生された酵素が植物性原料において使用されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
フモニシンが酸素非依存的に分解されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵素が単離されることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
酵素が保護コーティング内に封入されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
酵素が、カルボキシルエステラーゼ配列番号９および／またはアミノトランスフェラーゼ配列番号１９から選択されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
配列番号９または１９を有する酵素の少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、およびカルボキシルエステラーゼまたはアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素が使用されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
アミノトランスフェラーゼ配列番号１９を使用する場合に、ケトンが補基質として使用されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
カルボキシルエステラーゼ配列番号９を使用する場合に、少なくとも１つの吸着剤が更に使用されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
添加物が、発酵すべき植物性出発物質において又はバイオエタノールの製造のためのマッシュにおいて使用されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
植物性原料および植物性原料を含有する混合物におけるフモニシンの酵素的分解のための添加物であって、配列番号９および１９の少なくとも１つの酵素を含有することを特徴とする添加物。
【請求項１１】
更に、使用される酵素の少なくとも１つ又は幾つかのための少なくとも１つの補基質を含有することを特徴とする、請求項１０記載の添加物。
【請求項１２】
更に、不活性担体を含有することを特徴とする、請求項１０または１１記載の添加物。
【請求項１３】
配列番号９または１９を有する酵素に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、およびカルボキシルエステラーゼまたはアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素が使用されることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項記載の添加物。
【請求項１４】
配列番号９および１９の少なくとも１つの酵素、および／または配列番号９または１９を有する酵素に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、およびカルボキシルエステラーゼまたはアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素が保護コーティングで覆われて使用されることを特徴とする、請求項１０、１１、１２または１３記載の添加物。
【請求項１５】
酵素が、カルボキシルエステラーゼ配列番号９および／またはアミノトランスフェラーゼ配列番号１９から選択されることを特徴とする、請求項１０から１４のいずれか一項記載の添加物。
【請求項１６】
カルボキシルエステラーゼ配列番号９、アミノトランスフェラーゼ配列番号１９、補基質としてのα−ケト酸および不活性担体を含有することを特徴とする、請求項１０から１５のいずれか一項記載の添加物。
【請求項１７】
カルボキシルエステラーゼ配列番号９および少なくとも１つの吸着剤を含有することを特徴とする、請求項１０から１６のいずれか一項記載の添加物。
【請求項１８】
バイオエタノールの製造中にマッシュまたは植物性出発物質と共に酸素非依存的環境において添加物が使用されることを特徴とする、請求項１０から１７のいずれか一項記載の添加物。
【請求項１９】
配列番号８または１８の配列に示される遺伝子の、またはこの遺伝子の発現のための完全組換え宿主生物の、植物性原料におけるフモニシンの分解のための添加物を製造するための使用。
【請求項２０】
カルボキシルエステラーゼおよび少なくとも１つの吸着剤が使用されることを特徴とする、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
バイオエタノールの製造におけるマッシュまたは植物性出発物質の酸素非依存的処理のための、請求項１９または２０のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フモニシン（ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ）の酵素的分解のための添加物の製造方法、フモニシンの酵素的分解のための添加物（植物性原料および植物性原料を含有する混合物におけるもの）、および遺伝子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコトキシンは植物農産物上で非常に頻繁に見出され、特に農産物から得られる食物において、更にはそのような食物を摂取する動物およびヒトにおいて、マイコトキシンのタイプによっては重大な経済的損害を与え、そのような損害は極めて多岐にわたる。動物およびヒト栄養、動物育種、食物および飼料加工などの分野でマイコトキシンにより引き起こされる損害を抑制するためにそのようなマイコトキシンを解毒もしくは分解し又は無害にするよう、多数の方法が既に開発されている。
【０００３】
公知マイコトキシンは、多数の構造的に相互関連したマイコトキシン、例えばフモニシンを含み、そのうち、フモニシンＢ１が該グループの最も頻繁に見出される毒素である。しかし、ヒトおよび動物において有害作用を示すことが知られている多数の誘導体および関連分子が存在する。例えば、フモニシンは、酵素セラミドシンターゼと相互作用することによりスフィンゴ脂質代謝を妨げることが公知である。スフィンゴ脂質は細胞膜の成分であるだけでなく、細胞増殖、細胞遊走および細胞結合のような多数の基本細胞過程、炎症過程ならびに細胞内輸送形態におけるシグナルおよびメッセンジャー分子としての重要な役割も果たしている。スフィンゴ脂質代謝のこの阻害により、フモニシンは種々の動物種、そしてヒトにも毒性作用をもたらしている。例えば、フモニシンはげっ歯類において発癌作用を引き起こすことが実証可能であり、疫学的データに基づいて、それはヒトにおける食道癌および神経管欠損に関連づけられている。それは、例えば種々の動物種、例えばブタにおいて、肺水腫により引き起こされる典型的な中毒をもたらすと考えられている。この場合、フモニシンは種々の穀物、特にトウモロコシならびに堅果および植物に対するほぼ遍在的な汚染源となり、ヒトおよび動物の健康に関連したこの強い負の効果は無視できない。
【０００４】
フモニシンの微生物分解はＥＰ−Ａ  １  ８６０  ９５４に既に記載されており、これによると、フモニシンを解毒するための厳密に定められた株から選択される解毒性細菌または酵母を飼料に加えることによりフモニシンおよびフモニシン誘導体を解毒するために微生物が使用される。
【０００５】
フモニシンの生物学的分解のための異化代謝経路ならびにそれを引き起こす遺伝子および酵素も既に記載されている。例えば、ＥＰ  ０  ９８８  ３８３はフモニシン解毒組成物および方法を記載しており、ここで、使用されるフモニシン分解酵素は、とりわけ、トランスジェニック植物において産生され、この場合、フモニシンの解毒は、酵素活性のために分子酸素を要するアミンオキシダーゼを利用して行われる。
【０００６】
さらに、ＷＯ  ２００４／０８５６２４は、特にアミノ化毒素、例えばフモニシンを解毒する酵素的解毒のためのトランスアミナーゼ、デアミナーゼおよびアミノムターゼならびに組成物および方法を記載している。この場合、デアミナーゼ活性を有するポリペプチドが解毒に使用される。
【０００７】
ＷＯ  ００／０４１５８からは、食物または飼料の製造における及び植物性原料の加工におけるフモニシン分解性アミンオキシダーゼの使用が公知となっている。
【０００８】
しかし、従前公知方法は、マイコトキシンを解毒するためには、記載されている異化代謝経路のための分子酸素をそれらが要する点で共通しており、特に必要とされるアミンオキシダーゼは酸素非依存的条件下では機能し得ない。飼料の解毒（例えば、動物の消化管におけるもの）のためのそのような遺伝子および酵素の使用は不可能である。なぜなら、動物の消化管内は実質的に酸素を含有しない環境であり、したがって、公知の遺伝子および酵素は全く活性を示さないからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１  ８６０  ９５４号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０  ９８８  ３８３号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０８５６２４号
【特許文献４】国際公開第００／０４１５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、フモニシンを安全に且つ信頼しうる様態で毒物学的に無害な物質に分解し又は解毒することを可能にする、マイコトキシンの酵素的分解のための添加物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの目的を達成するために、配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４に対応する遺伝子の、少なくとも１つの核酸配列を準備し、そのような少なくとも１つの核酸配列を原核または真核宿主細胞内で発現させ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５に対応するこのようにして産生された少なくとも１つの酵素を、必要に応じては補基質と共に、植物性原料において使用する様態で、本発明の方法を行う。配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４に対応する遺伝子の、少なくとも１つの核酸配列を準備することにより、特異的フモニシン分解性またはマイコトキシン分解性遺伝子をクローニングし発現させることが可能であり、ここで、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５に対応する発現酵素を得るための標準的な方法を用いて、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において該発現を行い、ここで、そのような少なくとも１つの酵素は、必要に応じては補基質と共に、処理すべき原料に対して使用される。そのような方法により製造された添加物は、１つの側面においては、フモニシンおよび該分解経路の中間体の分解を触媒するこの方法により産生された特異的酵素で完全に且つ信頼しうる様態で例えばマイコトキシンを原料上で直接的に分解することを可能にし、もう１つの側面においては、例えばアルコールの製造のためのマッシュにおいてバイオエタノールの製造中に直接的にマイコトキシンを分解すること、または食物の製造中でさえも製造工程中に直接的にマイコトキシンを分解し無害にすることを可能にする。
【００１２】
この場合における植物性原料には、穀物または穀物産物、草（イネ科牧草類）、果実または野菜、および食物および飼料の製造のためのこれらの物質を含有する中間産物、例えばサイレージ、果実マッシュなどが含まれる。
【００１３】
この場合における添加物は特に飼料添加物、食物添加物、およびバイオエタノールの製造のための添加物である。
【００１４】
このタイプの方法は更に、酵素セラミドシンターゼとのフモニシンの相互作用により阻害されたスフィンゴ脂質代謝を維持し、同時に、フモニシンを無毒性物質へと生物学的に分解することを可能にする。最後に、技術的な解毒のための応用が達成されるであろう。なぜなら、この方法はより大きな技術的規模に適用可能であり、したがって、本発明の方法によるマイコトキシン非含有産物の安全な且つ信頼しうる製造を可能にするからである。
【００１５】
本発明の方法において使用される核酸配列、ならびに該核酸配列により原核および真核宿主細胞において発現され酸素非依存的環境中で触媒的に作用する酵素を、以下に記載する。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
好ましい更なる発展態様においては、フモニシンを酸素非依存的または嫌気的に分解する様態で、本発明の方法を行う。分子酸素の添加を伴うことなく遺伝子または酵素の核酸配列が安全に且つ信頼しうる様態で分解反応を引き起こして、このようにして産生された添加物が、マイコトキシンが分解される必要がありうるいずれかの酸素非依存的または嫌気的媒体において、例えば、ヒトおよび動物用の食物において、生物エタノールの製造において、そしてまた、遺伝的修飾農作物の生産のために使用可能となるよう、フモニシンを酸素非依存的に分解することにより、本発明の方法を更に発展させることが可能である。
【００１８】
更なる発展態様においては、植物性出発物質における該酵素の使用前に、分子遺伝学的方法、突然変異誘発または分子進化により該酵素を修飾する様態で、本発明の方法を行う。該植物性出発物質における該酵素の使用の前に、分子遺伝学的方法、突然変異誘発または分子進化により該酵素を修飾する様態で該方法を行うことにより、フモニシンの酸素非依存的分解をより一層改良し又は完全にするために、後続の使用目的に適した、より一層安定な形態で、該酵素を製造することが可能である。
【００１９】
本発明の好ましい更なる発展態様においては、該酵素を単離する様態で該方法を行う。この様態で該方法を行うことにより、特にフモニシンは酸素非依存的に完全に分解されるであろう。
【００２０】
本発明のもう１つの好ましい更なる発展態様においては、該酵素を保護コーティング内に封入する様態で該方法を行う。該酵素を保護コーティング内に封入することにより、例えばヒトまたは動物の胃腸管内で該保護コーティングの溶解前に該酵素が作用を開始しないよう、該酵素を、変化することなく、特に分解または損傷することなく、その利用目的部位、例えば特に消化管内に輸送して、胃腸管の酸素非依存的環境における、該マイコトキシンの、より一層選択的で迅速で完全な分解を保証すると同時に、フモニシンを食物と共に摂取した生物にフモニシンがその有害作用を及ぼすことを防ぐことが可能である。
【００２１】
好ましい更なる発展態様においては、該酵素が、パーミアーゼ識別番号（ＩＤ  Ｎｏ．）３、カルボキシルエステラーゼ識別番号９、トリカルバリル酸デヒドロゲナーゼ識別番号１１、クエン酸利用タンパク質識別番号１３、アルコールデヒドロゲナーゼ識別番号１７、アミノトランスフェラーゼ識別番号１９および／またはアセト乳酸シンターゼ識別番号２３から選択される様態で、本発明の方法を行う。この様態で該方法を行うことにより、フモニシンは酸素非依存的環境中で円滑かつ完全に分解されうる。この場合、アクセッション番号ＤＳＭ  １６２５４を有する原核生物株に由来する核酸配列番号１の遺伝子クラスターから単離されたＦＵＭ遺伝子クラスター内のオープンリーディングフレームの転写は、以下の表１から明らかなとおり、ＦｕｍＡとＦｕｍＩとの間に位置する二方向性プロモーターにより制御される。該クラスターは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＢおよびＦｕｍＣ）、該基質のサンプリングおよびその輸送に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＡ、ＦｕｍＪ、ＦｕｍＧ）、ならびに該基質の異化に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＤ、ＦｕｍＥ、ＦｕｍＦ、ＦｕｍＨ、ＦｕｍＩ、ＦｕｍＫ）をコードしている。特別な遺伝子および酵素をコードするこれらの核酸配列から、該基質の異化を引き起こしてそれぞれの産生酵素が該基質（すなわち、フモニシン）を完全に異化することを可能にする遺伝子を、本発明の方法の好ましい更なる発展態様に従い選択した。
【００２２】
この場合、例えば、識別番号１を有する核酸配列の遺伝子クラスターから選択されるオープンリーディングフレームを原核または真核宿主細胞において発現させる。アクセッション番号ＤＳＭ  １６２５４を有する細菌株における配列番号１を有する遺伝子クラスターに含まれるオープンリーディングフレームの転写は、添付図面１から明らかなとおり、ｆｕｍＡとｆｕｍＩとの間に位置する二方向性プロモーターにより制御される様態で生じる。該遺伝子は、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＢおよびＦｕｍＣ）、該基質のサンプリングおよびその輸送に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＡ、ＦｕｍＪ、ＦｕｍＧ）、ならびに該基質の異化に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＤ、ＦｕｍＥ、ＦｕｍＦ、ＦｕｍＨ、ＦｕｍＩ、ＦｕｍＫ）をコードしている。
【００２３】
以下の表１においては、フモニシン異化遺伝子クラスターの遺伝子の説明を示す。ここで、Ｏは配向（すなわち、ｆはフォワード、ｒはリバース）を示す。
【００２４】
【表１】
0005833442.tif 000011
【００２５】
好ましくは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５を有する酵素の少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む酵素を使用する様態で本発明の方法を行うことにより、フモニシンのより一層完全な分解が保証され、それにより、フモニシンだけでなく、関連した又は構造的に類似したマイコトキシン（例えば、ＡＡＬ−毒素）も、嫌気的または酸素非依存的環境において、同時に完全に解毒されるであろう。
【００２６】
好ましくは、アミノトランスフェラーゼ識別番号１９を使用する場合に補基質としてα−ケト酸を使用する様態で該方法を行うことにより、特に、フモニシンのアミノ基の分解およびα−ケト酸（例えば、ピルビン酸）の同時利用により、フモニシン分子上のアミノ基をケト基により置換することが可能であり、この場合、この反応の副産物としてアラニンが生成し、これは完全に無害であるため、無害物質へのフモニシンの完全分解が保証される。
【００２７】
好ましい更なる発展態様においては、カルボキシエステラーゼ識別番号９を使用する場合に、特に粘土鉱物から選択される少なくとも１つの吸着剤を更に使用する様態で、本発明の方法を行うことが可能である。カルボキシエステラーゼ識別番号９を使用する場合に、特に粘土鉱物から選択される少なくとも１つの吸着剤を使用することにより、いずれの他の酵素の添加をも伴うことなく、第１の工程において該フモリシン分子から該カルボキシエステラーゼにより２つのトリカルバリル酸側鎖を切断して、いわゆる加水分解フモリシンを生成させることにより、フモニシンを完全に無害にすることが可能である。加水分解フモリシンは実質的には鎖状分子であり、引き続いて例えば粘土鉱物上に吸着されて、１工程酵素分解法においてさえもフモニシンが完全に無害にされうる。
【００２８】
好ましい更なる発展態様においては、このようにして製造された添加物を、発酵すべき植物性出発物質において又はバイオエタノールの製造のためのマッシュにおいて使用する様態で、本発明の方法を行う。本発明の方法により製造された添加物を、発酵すべき植物性出発物質において又はバイオエタノールの製造のためのマッシュにおいて使用することにより、エタノールの製造において生じる共存産物、すなわち、搾りかす、すなわち、乾燥穀物残渣および不溶性成分、または乾燥ビナッセ（可溶性物質を伴う乾燥蒸留穀物−ＤＤＧＳ）を、特に酸素非依存的環境において、フモニシンまたはマイコトキシンから遊離させることが可能である。
【００２９】
本発明は更に、フモニシンの酵素的分解のための添加物を提供することを目的とし、それにより、そのようなマイコトキシンを、安全な且つ信頼しうる様態で、酸素非依存的環境において分解または解毒することが可能である。
【００３０】
これらの目的を達成するためには、このタイプの添加物は、それが、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５の、少なくとも１つの酵素、および必要に応じては更に、使用される酵素の少なくとも１つ又は幾つかのための少なくとも１つの補基質、および不活性担体を含有することにより特徴づけられる。
【００３１】
少なくとも１つの酵素または該酵素の発現のための完全組換え宿主生物、および必要に応じては更に、使用される酵素の少なくとも１つ又は幾つかのための少なくとも１つの補基質、および不活性担体を含有するそのような添加物は、フモニシンを選択的に分解し従って解毒する点で優れている。単離された酵素ならびに必要に応じてはその補基質および担体から実質的になる本発明の添加物の使用は、前者が、例えば完全微生物が全く又はほとんど活性でない環境中および条件下、その触媒活性を維持し、同時に、有意により高い特異的活性、および望ましくない副反応を伴わない定められた反応の触媒を可能にするという利点をもたらす。
【００３２】
また、再生可能な微生物の使用により農業用原生産物に対して先行技術において引き起こされる問題は安全に回避され、さらに、単離された酵素を単に含有するに過ぎない添加物は、選択的な且つ制御された活性化（すなわち、例えば、消化管の特定部位におけるもの）のための製剤化特性の向上、および基質の望ましくない消費増加の回避をもたらすであろう。この特異性を更に増強するために、本発明の添加物は、好ましくは、分子遺伝学的方法、突然変異誘発または分子進化により修飾された酵素を使用するよう、更に発展される。
【００３３】
好ましい更なる発展態様においては、識別番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５を有する酵素に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む酵素を使用するよう、該添加物を設計する。識別番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５を有する酵素に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む酵素を使用する場合、好ましくは分解されるべきフモニシン以外の他のマイコトキシンを安全に且つ信頼しうる様態で酸素非依存的に分解することが可能であり、したがって、例えば植物性原生産物上に存在するフモニシンの広範な解毒が可能となる。
【００３４】
本発明の好ましい更なる発展態様に対応する、保護コーティングで覆われた該酵素、修飾酵素および少なくとも９０％同一な酵素を使用する様態で該添加物を設計することにより、該酵素、少なくとも９０％同一な酵素または該修飾酵素は、意図される部位（例えば、胃腸管）におけるその作用が安全に且つ信頼しうる様態で発現されるよう、活性の早期喪失が防がれることが保証されるであろう。
【００３５】
該酵素が、カルボキシルエステラーゼ識別番号９、トリカルバリル酸デヒドロゲナーゼ識別番号１１、クエン酸利用タンパク質識別番号１３、アルコールデヒドロゲナーゼ識別番号１７、アミノトランスフェラーゼ識別番号１９および／またはアセト乳酸シンターゼ識別番号２３から選択される様態で、該添加物を好ましくは更に発展させることにより、適用すべき酵素の量の減少に加えて、該酵素を使用した場合に望ましくない副反応が生じないことが保証されるよう、基質の異化に適した酵素が実質的に適用されるであろう。
【００３６】
本発明の好ましい更なる発展態様においては、該添加物がカルボキシルエステラーゼ識別番号９、アミノトランスフェラーゼ識別番号１９または識別番号２５、補基質としてのα−ケト酸および不活性担体を含有するよう、該添加物を設計する。不活性担体のほかに補基質としてカルボキシルエステラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、α−ケト酸を含有する添加物により、特に、まず、カルボキシルエステラーゼを使用してトリカルバリル酸残基をフモニシンから切断することにより、食物に含まれるフモニシンを加水分解し、ついで、このようにして加水分解されたフモニシンを、アミノトランスフェラーゼおよび補基質としてのα−ケト酸、この場合には好ましくはピルビン酸の作用下、該加水分解フモニシン分子のアミノ基をケト基により置換することにより更に反応させて、例えば哺乳動物には完全に無害であり不変状態で排泄されうる２−ケト−加水分解フモニシン、および同様に例えば生物に対して負の影響を何らもたらしたり及ぼさない副産物としてのアラニンを生成させることが可能である。
【００３７】
本発明の好ましい更なる発展態様においては、該添加物がカルボキシルエステラーゼ認識番号９、少なくとも１つの吸着剤、例えば粘土鉱物、および必要に応じては不活性担体を含有するよう、該添加物を更に発展させる。ただ単に１つのカルボキシルエステラーゼ認識番号９および少なくとも１つの吸着剤を使用する場合、トリカルバリル酸残基のみを切断し、このようにして生成された加水分解フモニシンを該吸着剤上に吸着させる様態でも、フモニシンの解毒が達成されうる。カルボキシルエステラーゼの補助によりトリカルバリル酸残基を切断することにより、相当に長鎖の分子が生成され、これは容易に且つ信頼しうる様態で吸着されて、単一酵素の選択された使用のみによる、特に、フモニシンの酸素非依存的分解およびそれに続く吸着による完全な解毒が保証されうる。
【００３８】
それゆえ本発明の更なる発展態様におけるように、添加物はバイオエタノールの製造中に、特にマッシュまたは植物性出発物質と共に酸素非依存的環境において使用され、該添加物を、それに含まれる酵素が、高特異的分解経路によりフモニシンの異化を触媒する細菌に完全に由来するように選択することにより、該添加物が酸素非依存的環境中で技術的に使用されることも可能となるよう、高い特異性、活性および効率でそれを使用することが可能である。
【００３９】
最後に、本発明は、配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４を有する遺伝子配列の発現のための該配列において示される遺伝子の、または該遺伝子配列の発現のための完全組換え宿主生物の、ならびに必要に応じては補基質の、植物性原料の加工または使用におけるフモニシンの分解のための添加物の製造のための使用に関する。この様態で製造された添加物は、特に酸素非依存的環境における、フモニシンの完全な且つ信頼しうる分解を可能にする。
【００４０】
好ましい様態においては、カルボキシルエステラーゼ認識番号９、アミノトランスフェラーゼ識別番号１９もしくは識別番号２５またはα−ケト酸および不活性担体よりなる群から選択される補基質を本発明において使用し、そのような使用は、例えば植物性原料または出発物質におけるフモニシンの全体から無害成分への安全な且つ信頼しうる分解を可能にする。
【００４１】
もう１つの好ましい使用は、カルボキシルエステラーゼ、少なくとも１つの吸着剤、特に粘土鉱物、および必要に応じては不活性担体を使用する点で特徴づけられる。カルボキシルエステラーゼおよび少なくとも１つの吸着剤を使用する場合、単一酵素の単なる使用によりフモニシンを安全に且つ信頼しうる様態で解毒することが可能であり、この場合、該酵素により又は該酵素の補助により該フモニシンからトリカルバリル酸側鎖残基を切断し、ついで、このようにして生成された長鎖加水分解フモニシンを該吸着剤上に吸着させて、安全かつ信頼しうる様態で該毒素を無害にする。
【００４２】
好ましい使用においては、バイオエタノールの製造におけるマッシュまたは植物性出発物質の酸素非依存的または嫌気的処理のために、本発明の添加物を使用する。この場合、該植物性出発物質または原料中に含まれるマイコトキシンを酸素非依存的環境においてバイオエタノールの製造中に安全に且つ信頼しうる様態で無害にすることが可能であり、それにより、ついで、エタノール製造からの残渣、すなわち、搾りかす又は乾燥ビナッセの、フモニシン非含有飼料としての使用が、更なる加工および特に解毒を行うことなく、直接的に又は乾燥およびペレット化後に可能となる。
【００４３】
以下においては、典型的実施形態および図面により、本発明を更に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１はフモニシン−異化遺伝子クラスターを示す。
【図２】図２はフモニシンカルボキシルエステラーゼＦｕｍＤに関するミカエリス−メンテン曲線を例示する。
【図３】図３は加水分解フモニシンＢ１の分解曲線を示す。
【図４】図４はカルボキシルエステラーゼ認識番号９の添加の後のフモニシンＦＢ１から加水分解フモニシンＨＦＢ１への変換を例示する。
【図５】図５はアミノトランスフェラーゼ認識番号１９の添加による加水分解フモニシンＨＦＢ１の分解を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００００】
図１は、アクセッション番号ＤＳＭ  １６２５４を有する微生物株の１５４２０塩基対の部分配列としてのフモニシン−異化遺伝子クラスターを示す。該原核生物株ＤＳＭ  １６２５４のｆｕｍ−遺伝子クラスターにおいては、該オープンリーディングフレームの転写は、ｆｕｍＡとｆｕｍＩとの間に存在する二方向性プロモーターにより制御される。該クラスターは、該遺伝子発現の調節に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＢおよびＦｕｍＣ）、該基質の認識およびその輸送に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＡ、ＦｕｍＪ、ＦｕｍＧ）、ならびに基質の異化に関与するタンパク質（例えば、ＦｕｍＤ、ＦｕｍＥ、ＦｕｍＦ、ＦｕｍＨ、ＦｕｍＩおよびＦｕｍＫ）をコードしている。
【００４５】
実施例
【実施例１】
【００４６】
フモニシンカルボキシルエステラーゼの酵素速度論
フモニシンカルボキシルエステラーゼをコードするｆｕｍＤ遺伝子（配列番号８）を、標準的な方法を用いて、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてクローニングし発現させた。該ｈｉｓタグ付き酵素をアフィニティークロマトグラフィーにより上清培養溶液から回収し精製した。該酵素濃度を決定し、１リットル当たり５０μｇから２５ｍｇ  ＦＢ１までの範囲の７つの異なる基質濃度および０．３３ｎｇ／ｍｌの酵素濃度で該酵素−速度論的パラメーターを決定した。該反応を、０．１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミンを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）中で緩衝化し、３０℃でインキュベートした。サンプルを０、３０、６０、１２０および２４０分間のインキュベーションの後に採取し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。フモニシンＢ１（ＦＢ１）および加水分解フモニシンＢ１を、該精製参照物質および完全に１３Ｃ標識された内部−ＦＢ１標準での校正に基づいて定量した。
【００４７】
図２は、フモニシンカルボキシルエステラーゼＦｕｍＤによるフモニシンＢ１（ＦＢ１）の加水分解に関するミカエリス−メンテン曲線を例示し、これは、Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）中、０．３３ｎｇ／ｍｌの酵素濃度で決定されたものであり、初期酵素速度が該基質濃度に対してプロットされている。該ミカエリス−メンテン曲線は、より高い基質濃度における低下を示している。なぜなら、該酵素速度は、該産物、すなわち、加水分解ＦＢ１の生成に基づいて計算されたからである。加水分解ＦＢ１は、保有されたただ１つのトリカルバリル酸側鎖と切断された側鎖とを有する部分加水分解ＦＢ１を経由して、ＦＢ１から２段階反応で生成されるため、該最終産物の生成は高い基質濃度においては遅くなったのである。該ミカエリス−メンテン定数ＫＭは０．９０μｍｏｌ／ｌと算出され、これは６５０ｐｐｂと同等であり、該変換速度は毎秒９００であった。
【００４８】
フモニシンは妥当な濃度範囲において該カルボキシルエステラーゼで迅速かつ完全に加水分解されうるという結果が、図２から認められる。
【実施例２】
【００４９】
ＨＦＢ１（加水分解フモニシンＢ１）アミノトランスフェラーゼの触媒活性
配列番号１８および２４を、標準的な方法を用いてクローニングし、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させた。該細菌細胞を集め、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファーに再懸濁させ、超音波作用下で細胞溶解した。加水分解フモニシンを加え、該サンプルを２５℃でインキュベートした。サンプルを幾つかの時間間隔で採取し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。加水分解ＦＢ１濃度の減少は観察されなかった。補基質、例えばα−ケト酸、例えばピルビン酸、またはオキサルアセタートを該反応に加えた場合、図３に示すとおり、該加水分解フモニシンから２−ケト−ＨＦＢ１への完全な分解を観察することが可能であった。この基質は哺乳動物に対して完全に無害である。
【実施例３】
【００５０】
腸環境中の酵素活性
消化管におけるＦＵＭ−カルボキシルエステラーゼの酵素活性を調べるために、新たに屠畜されたブタの腸を使用し、酸素排除状態で研究所に輸送し、嫌気性無菌ベンチにおいて検査した。十二指腸および空腸の長さ約１０ｃｍの断片を確保し、切り出した。濃縮水溶液中の約１０ｐｐｍの最終濃度に希釈されたフモニシンＢ１を針により注射し、腸内容物と混合した。この後、水溶液中の５μｇのフモニシンカルボキシルエステラーゼ、または陰性対照における同じ体積の水を、それぞれ、注射し、混合した。該腸断片を３９℃でインキュベートした。サンプルを針の補助により採取し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。２時間後の最初のサンプル採取の時点で、フモニシンＢ１は十二指腸および空腸において既に完全に加水分解されていたことが示された。
【実施例４】
【００５１】
フモニシンカルボキシルエステラーゼの活性の温度範囲の決定
フモニシンカルボキシルエステラーゼが活性である温度範囲を決定するために、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ７．０）中の１．６ｎｇ／ｍｌ  ＦＵＭ−カルボキシルエステラーゼを０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび１０ｐｐｍ  フモニシンＢ１と共に種々の温度でインキュベートした。該酵素に最適な温度は３０℃であることが示された。４０℃、そして５０℃においてさえも、酵素活性が尚も明らかに決定された。したがって、ＦＵＭ−カルボキシルエステラーゼは、消化管において又は食物および飼料の製造におけるプロセス工程（これは高温で生じる）の経過において一般的な温度条件下の適用に適している。
【実施例５】
【００５２】
フモニシンカルボキシルエステラーゼの活性のｐＨ範囲の決定
フモニシンカルボキシルエステラーゼが活性であるｐＨ範囲を決定するために、テオレル−ステンハーゲン（Ｔｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎ）バッファーを使用した。このバッファーは、シトラート、ホスファートおよびボラートの組合せにより、同じ緩衝能で１０ｐＨ単位の範囲にわたって調節されうる。ＦＵＭ−カルボキシルエステラーゼを、３．３ｎｇ／ｍｌの濃度で、このバッファー中、種々のｐＨ値および２５℃で、１０ｐｐｍ  フモニシンＢ１と共にインキュベートした。ｐＨ８．０において最高活性が示されたが、ｐＨ５からｐＨ１０までの全範囲において活性を決定することが可能であった。この広範なｐＨ範囲内のこの活性は、飼料添加物としての又は食物および飼料加工の経過中の該酵素の技術的適用を可能にしている。
【実施例６】
【００５３】
子ブタでの給餌試験
該試験は、それぞれ動物１０頭を収容する１２個の部屋を有する試験用畜舎において行った。該畜舎はスラット化床、平鍋容器およびコンピュータ制御給餌システムを備えていた。該部屋の壁に沿ってオートマットが配置されていた。毎日、畜舎の気候が自動的に記録され、温度は子ブタの飼育のための標準的な推奨に従い設定された。
【００５４】
この試験のために、１２０頭の性別混合の離乳したブタ（齢：約４週、平均設定体重：８．２１ｋｇ）を使用した。各子ブタをイヤマークで標識し、個々に体重測定した。１２０頭の子ブタを１２個の部屋に無作為に分配した。全ての子ブタはＡｕｓｔｒｉａｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＯＨＹＢ（＝（ラージホワイト×ランドレース）×ピエトレイン）に由来するものであった。
【００５５】
離乳直後に、該子ブタに幼動物飼料を２日間与え、この順応期間の後、試験飼料への切り替えを行った。給餌は以下の２段階で行った：離乳段階第１〜１４日、飼育段階第１５〜４２日。該試験試料をスポットミックス（ｓｐｏｔｍｉｘ）給餌装置により個々に部屋ごとに混合し、子ブタの数、体重増加および飼料消費に応じて、１日２回、乾燥形態で分配した。水に任意に摂取可能であった。それらの１２個の部屋を、それぞれ３重複の４つの異なる適用群に分け、前記飼料における以下の混合物を与えた。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
陽性対照においては、該動物のほぼ半数で呼吸障害が観察され、更には１例の脱落が生じた。全ての他の群は見掛け上健康であった。
【００５８】
【表３】
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【実施例７】
【００５９】
バイオエタノールマッシュにおけるフモニシンの酵素的分解
バイオエタノールの製造のためのトウモロコシマッシュのサンプルを採取し、攪拌下で３０〜６５℃でインキュベートし、攪拌（分単位の攪拌時間）下のマッシュ１立方メートル当たり７７０単位のカルボキシルエステラーゼ認識番号９の添加の後でフモニシンＢ１の分解を調べた。サンプルを、採取後に煮沸することにより不活性化し、ついで分析のために遠心分離し、該上清のアリコートを蒸発させた。残渣を、Ｃ１３標識内部フモニシン標準を含有する２００μｌのサンプルバッファー中に取り、１．５分間振とうし、遠心分離し、ついでＬＣ−ＭＳ−分析に付した。図４に示すとおり、フモニシンＦＢ１は加水分解フモニシンＨＦＢ１へと完全に変換されるという結果が、これから認められる。アミノトランスフェラーゼ識別番号１９の添加の後、図５に示すとおり、該加水分解フモニシンＨＦＢ１は無害成分へと完全に分解される。
【実施例８】
【００６０】
コーントルティージャマッシュおよびコーンフレークマッシュにおけるフモニシンおよびその誘導体の分解
コーントルティージャおよびコーンフレークの製造のためのトウモロコシ（コーン）マッシュサンプル（ひき割りトウモロコシ粉）において、フモニシン分解酵素の活性を調べた。フモニシンで汚染されたトウモロコシ（約１ｐｐｍ）をトウモロコシ粉に粉砕し、水と混合し、煮沸した。トルティージャの製造のために、約５０〜６０℃に冷却されたトウモロコシマッシュをアルカリ性溶液中のプロテイナーゼの混合物で補足した。ｐＨが９未満、好ましくは８未満に低下していた３０〜１８０分後、カルボキシルエステラーゼとアミノトランスフェラーゼ（それぞれ５００〜１０００Ｕ／ｍ３）との混合物を加え、更に３０〜６０分間インキュベートした。コーンフレークの製造に関しては、粉砕されたトウモロコシおよびオオムギ麦芽のトウモロコシマッシュを圧力容器内で約１時間煮沸し、６０℃（好ましくは５０℃）に冷却後、カルボキシルエステラーゼとアミノトランスフェラーゼ（それぞれ５００〜１０００Ｕ／ｍ３）との酵素混合物を加え、更に３０〜６０分間インキュベートした。ついでサンプルをこの混合物から採取し、実施例７と同様にしてＦＢ１およびＨＦＢ１残渣に関して検査した。該サンプルの全てにおいてＨＦＢ１レベルは８０ｐｐｂ未満であり、ＦＢ１から生成したＨＦＢ１は連続的に反応し続けているようであった。ＦＢ１に関する測定値を以下の表に示す。
【００６１】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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