(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第Ｘ因子のネイティブな活性化ペプチドが、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列、ここで３９位および／または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている、からなる第１ポリペプチドと、配列番号４又は配列番号４の１４位の残基に対応するグリシンが、バリン、フェニルアラニンもしくはアラニンによって置換され、そして／または配列番号４の１５位の残基に対応するバリンが、プロリンによって置換されている配列番号４の変異体の７〜１６位の範囲のアミノ酸配列からなる第２ポリペプチドとを含む融合タンパク質によって置換されている、第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体。
【請求項２】
−第Ｘ因子が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有し、
−配列番号１の２３５位の残基に対応するイソロイシンが、アラニン、セリンもしくはロイシンによって置換され、そして／または
−配列番号１の２３６位の残基に対応するバリンが、フェニルアラニンもしくはアラニンによって置換されている、
請求項１記載の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体。
【請求項３】
配列番号１の４１９位の残基に対応する第Ｘ因子のキメラ誘導体のセリンが、アラニンによって置換されている、請求項１〜２のいずれかに記載の第Ｘ因子のキメラ誘導体。
【請求項４】
配列番号１のそれぞれ３８７位および３９１位の残基に対応する第Ｘ因子のキメラ誘導体のアルギニンおよびリジンが、アラニンによって置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載の第Ｘ因子のキメラ誘導体。
【請求項５】
出血型の凝血病態の予防または処置において使用するための請求項１〜４のいずれか１項記載の第Ｘ因子のキメラ誘導体。
【請求項６】
血友病ＡまたはＢの予防または処置において使用するための請求項５記載の第Ｘ因子のキメラ誘導体。
【請求項７】
低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）によってまたは第Ｘａ因子にターゲティングする抗凝固剤によって誘発された出血の予防または処置のための方法において使用するための、請求項１〜４のいずれか１項記載の第Ｘ因子のキメラ誘導体。
【請求項８】
プロテインＣのネイティブな活性化ペプチドが、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列、ここで３９位および／または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている、からなる第１ポリペプチドと、配列番号４又は配列番号４の１４位の残基に対応するグリシンが、バリン、フェニルアラニンもしくはアラニンによって置換され、そして／または配列番号４の１５位の残基に対応するバリンが、プロリンによって置換されている配列番号４の変異体の７〜１６位の範囲のアミノ酸配列からなる第２ポリペプチドとを含む融合タンパク質によって置換されている、プロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体。
【請求項９】
−プロテインＣが、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有し、
−配列番号３の２１２位の残基に対応するロイシンが、アラニンもしくはセリンによって置換され、そして／または
−配列番号３の２１３位の残基に対応するイソロイシンが、フェニルアラニンによって置換され、そして／または
−配列番号３の２１４位の残基に対応するアスパルテートが、グリシンによって置換されている、
請求項８記載のプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体。
【請求項１０】
凝固亢進の関与する病態の予防または処置において使用するための請求項８〜９のいずれか１項記載のプロテインＣのキメラ誘導体。
【請求項１１】
血栓症の予防または処置において使用するための請求項１０記載のプロテインＣのキメラ誘導体。
【請求項１２】
請求項１〜４、８〜９のいずれか１項記載のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体をコードする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、第Ｘ因子の活性化ペプチド、並びにセリンプロテアーゼ誘導体、特にプロテインＣ、第ＩＸ因子および第Ｘ因子の誘導体の半減期および回収率を向上させるためのその使用、並びにプロテインＣ、第ＩＸ因子および第Ｘ因子に関連した疾患、特に血液凝固疾患の予防または処置におけるこれらの誘導体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
血液凝固は、血管の損傷に応答して起こる、主要で複雑な過程である。それは出血を止めそして傷害を受けた血管の修復を開始する血塊の形成からなり、その壁は血小板およびフィブリンを含む血塊によって覆われている。その過程は、損傷のほぼ直後に始まる。
【０００３】
血液凝固の過程には、血小板と呼ばれる細胞性成分、および凝固因子と呼ばれるタンパク質成分という、２種類の成分が関与する。血小板は損傷部位において直ちに血栓を形成し；これは一次止血と呼ばれる。二次止血は同時に起こり：凝固因子または凝血因子と呼ばれる、血漿中のタンパク質が、複雑なカスケードにおいて応答して、血小板の血栓を強化するフィブリン鎖を形成する。
【０００４】
二次止血の凝固カスケードは、内因性経路または接触活性化経路および外因性経路（組織因子経路とも呼ばれる）と呼ばれる、２つの経路に分けられる。前記過程を正しく維持するために、多くの凝固因子だけでなく補因子およびレギュレーターも関与する。
【０００５】
例えば、プロテインＣは、「抗凝固経路」と名付けられた凝血をレギュレーションするための主要な機序の必須因子である。プロテインＣの活性型（活性化プロテインＣ）は、別の補因子（プロテインＳ）と会合すると、トロンビンの大量生成に必須である凝血カスケードの２つの因子である第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を分解する、セリンプロテアーゼである。これらの因子の破壊は、生成されるトロンビンの量を負にレギュレーションし、その結果、抗凝固作用がもたらされる。このタンパク質は、多面的な生物活性、すなわち、抗血栓活性(Taylor et al, 1987; Gruber et al, 1990; Chesebro et al, 1992; Hanson et al, 1993; Arnljots et al, 1994; Sakamoto et al, 1994, Jang et al, 1995, Kurz et al, 1997; Gresele et al, 1998; Mizutani et al, 2000; Bernard et al 2001)だけでなく、抗炎症活性(Emson, 2000)、抗アポトーシス活性(Joyce et al, 2001)および線維素溶解活性促進性(Comp et al, 1981; Rezaie, 2001)も有することが特に知られている。
【０００６】
第ＩＸ因子（本明細書において以後、ＦＩＸと称する）は、血液凝固の１つの必須なセリンプロテアーゼである。このタンパク質の欠損は、血友病Ｂと呼ばれる出血性疾患を引き起こす。血液凝固中に、活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）は、その活性化された補因子である第ＶＩＩＩａ因子（本明細書において以後、ＦＶＩＩＩａと称する）と会合し、その特異的な基質である第Ｘ因子（ＦＸ、本明細書において以後、ＦＸと称する）を、その活性化された誘導体である活性化第Ｘ因子（本明細書において以後、ＦＸａと称する）へと変換する。
【０００７】
第Ｘ因子は、凝血カスケードの別の必須因子である。ＦＸの活性化型（ＦＸａ）は、その補因子（凝血因子Ｖａ）と会合し、プロトロンビンからトロンビンへと活性化することのできる、唯一のセリンプロテアーゼである。さらに、長年、受動的なバイスタンダーであると考えられていた第Ｘ因子は、現在では、その２つの主要なレセプターであるプロテアーゼ活性化レセプター−１（ＰＡＲ−１）およびＰＡＲ−２の活性化を介して多種多様な細胞型に対する直接的なプレーヤーとして提示されている。近年の所見は、ＰＡＲ−２が、凝固と疾病進行との間のインターフェースを調整する重要なメディエーターとして、線維症、組織リモデリングおよび癌などの線維増殖性疾病、並びに第Ｘ因子に向かう地点において重大な役割を果たしていることを示唆する(Borensztajn et al., 2008)。
【０００８】
プロテインＣ、第ＩＸ因子および第Ｘ因子は、肝臓で合成されるそれぞれ６２ｋＤａ、５５ｋＤａおよび５９ｋＤａの糖タンパク質である。血漿中へとそれが分泌される前に、そのポリペプチド鎖は、数回の翻訳後突然変異を受けて、機能的な酵素前駆体となる。
【０００９】
２つのチモーゲンであるプロテインＣおよび第Ｘ因子は、ペプチド鎖の開裂から生じた、アミノ末端軽鎖およびカルボキシ末端重鎖からなる（ここでの軽鎖および重鎖はジスルフィド橋によって接続されている）。チモーゲンの第ＩＸ因子は一本鎖の糖タンパク質である。
【００１０】
大半のセリンプロテアーゼ前駆体と同様に、プロテインＣ、第ＩＸ因子および第Ｘ因子は、触媒活性を欠失したチモーゲンである。その活性化は、その重鎖におけるタンパク質分解による開裂の結果である。プロテインＣにおいては、この開裂は、重鎖のＮ末端において起こり、１２アミノ酸の「活性化」ペプチドが放出される。第Ｘ因子においては、この開裂はチモーゲンのＡｒｇ１９３残基とＩｌｅ１９４残基との間で起こり、これによりまた５２アミノ酸の「活性化」ペプチドが放出される。第ＩＸ因子においては、２回の開裂が起こり、これもまた、前駆分子の内部領域から１１ｋＤａにほぼ等しい分子量の活性化ペプチドが放出される。
【００１１】
血液凝固は、出血または凝血のあらゆるリスクを回避するために十分に制御されていなければならない。従って、血液凝固過程のデレギュレーションにより、出血（出血リスクの増加）および血栓症（凝血リスクの増加）などの深刻な疾患がもたらされる。凝血リスクの増加に因る病態は、静脈または動脈の血栓症、特に内径の大きな血管に影響を及ぼす血栓症、心筋梗塞、血栓性疾病、肺塞栓症、血管形成術もしくは血栓溶解後の冠血管再閉塞、およびまたプロテインＣ遺伝子もしくはトロンボモジュリン遺伝子に影響を及ぼす遺伝子異常を患う患者における凝血異常などの深刻な疾患を含む。血栓症（血管中に不適切に存在する血塊）を防ぐために抗凝固剤がヒトに投与される。これは、素因があるヒトにおける深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞および卒中の一次予防および二次予防において有用である。出血は、血栓塞栓性の合併症の予防および処置における経口抗凝固剤の使用の最も深刻な合併症である。ワーファリンまたはヘパリンを用いて抗凝固剤処置された個体は、出血するかまたは手術を必要とする場合には、典型的には、それぞれビタミンＫまたはプロタミンなどの特異的な解毒剤で処置される。残念なことに、ワーファリン、ヘパリン、ビタミンＫおよびプロタミンの治療活性は、その使用を複雑化させる望ましくない副作用を伴う。これに対し、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）または第Ｘａ因子（ｆＸａ）にターゲティングする新規な経口抗凝固剤の抗凝固作用の拮抗のための特異的かつ効果的な解毒剤は入手できない(概説については、Harenberg, 2008, Bauer, 2008, Khoo et al., 2009を参照されたい)。これらの新規な抗凝固療法が使用される場合には、大量出血が観察される場合もある。従って、出血を制御するために、人工的かつ全身性の迅速で適切な作用が必要である。これは、抗凝固療法の停止、および可能であれば、利用可能な特異的な拮抗剤を使用しての抗凝固作用の拮抗を含む。これらの抗凝固剤に対する特異的な解毒剤が現在必要とされている。
【００１２】
一方で、出血型の病態は、特に、血友病ＡまたはＢ（それぞれ第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の欠損）を含む。これらの深刻な疾病は、処置に簡便に使用される第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対して作られる中和同種抗体である「阻害剤」の存在によって複雑化することが多い。
【００１３】
これらの病態のための処置を改良する必要が現在ある。
【００１４】
処置の第一戦略は、凝血カスケードおよびレギュレーションの欠損ステップを迂回することである。現在の処置を改良するための別の戦略は、使用される化合物、主に、血漿中で容易に中和されるタンパク質の半減期を改良することである。処置を改良するための別のアプローチは、自己増幅系または逆制御を再確立することである。
【００１５】
プロテインＣ欠損症のような凝固亢進疾患のために施される処置は、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、プロテインＣ誘導体などである。血友病のための現在の処置は、血友病ＡおよびＢのためのそれぞれ第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の投与である。
【００１６】
これらの処置は、特に、化合物の半減期が短いために繰り返し注射する必要があるために、高額な費用がかかり、そして、血友病ＡおよびＢの処置のために簡便には使用される第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対して作られる阻害剤すなわち中和同種抗体の開発などが制限される。さらに、血友病Ｂを処置するための組換えタンパク質、特に第ＩＸ因子の投与は、血漿に由来する製品の投与と比較して、低い回収率を示すため障害があることが観察された。
【００１７】
可能性ある解決策が新たな処置戦略として提案された。特に、ＷＯ０３０３５８６１特許出願は、プロテインＣおよび第Ｘ因子のトロンビンによって開裂され得るキメラ誘導体を記載した。
【００１８】
しかしながら、これらの化合物の短い半減期が、血液凝固疾患のためのその使用を制限する。本発明は、この技術的問題を解決するための新たなアプローチを提案する。
【００１９】
発明の要約
本発明は、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列（３９位または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている）を含むポリペプチドＰＰ（第Ｘ因子の活性化ペプチド）に関する。
【００２０】
本発明はまた、セリンプロテアーゼチモーゲン、例えば第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣなどの循環タンパク質の半減期および回収率を向上させるための前記ポリペプチドの使用に関する。
【００２１】
本発明はまた、
−第１のポリペプチドＰＰ、および
−配列番号４の７〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド
を含む、融合タンパク質ＦＰに関する。
【００２２】
本発明は、第Ｘ因子またはプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、前記タンパク質のネイティブな活性化ペプチドは融合タンパク質ＦＰによって置換されている。
【００２３】
本発明は、第Ｘ因子またはプロテインＣのトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、前記タンパク質のネイティブな活性化ペプチドは融合タンパク質ＦＰによって置換されている。
【００２４】
本発明はさらに、活性化第Ｘ因子またはプロテインＣまたはその機能保存的変異体および融合タンパク質ＦＰを含む、第Ｘ因子またはプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関する。
【００２５】
本発明は、本発明のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体をコードする核酸分子に関する。
【００２６】
本発明は、出血型の凝血病態の予防または処置において使用するための本発明の第Ｘ因子のキメラ誘導体に関する。
【００２７】
本発明は、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）によってまたは第Ｘａ因子（ｆＸａ）にターゲティングする抗凝固剤によって誘発される出血の予防または処置のための方法において使用するための本発明の第Ｘ因子のキメラ誘導体に関する。
【００２８】
本発明はまた、凝固亢進の関与する病態の予防または処置において使用するための本発明のプロテインＣのキメラ誘導体に関する。
【００２９】
本発明は、本発明のキメラ誘導体を含む血液凝固疾患の予防または処置のための薬学的組成物に関する。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明者らは、第Ｘ因子の種々の構築物を研究することで、第Ｘ因子の活性化ペプチドが、第Ｘ因子のクリアランス過程およびその回収率において始原的な役割を果たしていることを示した。
【００３１】
より具体的には、本発明者らは、この活性化ペプチドのカルボキシ末端の１９アミノ酸が、第Ｘ因子のクリアランス動態において主要な役割を果たしていることを観察した。１９残基のこの配列は、観察された機序に必須である２つのＮ−グリコシル化部位を含む。
【００３２】
定義
「機能保存的変異体」は、類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸を用いてのアミノ酸の置換を含むがそれらに限定されない、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変化させることなく改変されたものである。保存されていると指摘された以外のアミノ酸はタンパク質中において異なり得、よって、類似の機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸の配列の類似率は変化し得、そしてＣｌｕｓｔｅｒ法（類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく）などのアラインメントスキームに従って決定したところ７０％から９９％であり得る。「機能保存的変異体」はまた、比較されるネイティブタンパク質または親タンパク質に対して、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定したところ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、そして同じまたは実質的に類似した特性または機能を有する、ポリペプチドを含む。
【００３３】
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であるか、または約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的に同一）している場合に「実質的に相同」または「実質的に類似」している。好ましくは、類似配列または相同配列は、例えばＧＣＧ(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)パイルアッププログラムまたはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用したアラインメントによって同定される。
【００３４】
本発明による「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」という用語は、別々のポリペプチドを最初はコードしていた２つ以上の遺伝子またはそのフラグメントの連結を通して作製されたタンパク質を指す。この融合遺伝子の翻訳により、元来の各々のポリペプチドに由来する機能特性を有する単一のポリペプチドが得られる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療薬において使用するために組換えＤＮＡ技術によって人工的に作製される。組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子工学操作によって作製されたタンパク質である。これは典型的には、第１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、その後、ライゲーションまたはオーバーラップエクステンションＰＣＲ法を通して第２タンパク質のｃＤＮＡ配列のフレーム内に付加することを含む。その後、そのＤＮＡ配列は、単一タンパク質として細胞によって発現されるだろう。両方の元来のタンパク質の完全配列またはそのいずれかの一部のみを含むように、前記タンパク質を工学操作することもできる。
【００３５】
「回収率」という用語は、計算された理論的または予測された抗原または活性に対する、注入された分子の抗原レベルまたは活性レベルの％で表現した数値を指す。
【００３６】
「循環タンパク質」とは、生体の器官の細胞によって合成され、血流内を輸送されるタンパク質を意味する。循環タンパク質の例は、血液凝固因子、タンパク質ホルモンである。
【００３７】
凝固因子は、一般に、セリンプロテアーゼである。いくつかの例外がある。例えば、第ＶＩＩＩ因子および第Ｖ因子は糖タンパク質であり、そして第ＸＩＩＩ因子はトランスグルタミナーゼである。
【００３８】
タンパク質ホルモンは、血流中に分泌されそして生存動物中において内分泌機能を有するタンパク質のクラスである。
【００３９】
「セリンプロテアーゼチモーゲン」という用語は、当技術分野においてのその一般的な意味を有し、そして活性酵素となるために開裂されることを必要とする、セリンプロテアーゼ酵素の不活性前駆体を指す。本発明によると、対象のセリンプロテアーゼは、循環タンパク質に属するものに限定される。
【００４０】
セリンプロテアーゼは、活性部位におけるアミノ酸の１つがセリンであるいくつかのプロテアーゼを含む。本発明によると、対象のセリンプロテアーゼは、第ＩＸ因子、第Ｘ因子またはプロテインＣ、特に第Ｘ因子およびプロテインＣであり得るがそれらに限定されない。
【００４１】
本発明による「セリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体」という用語は、セリンプロテアーゼチモーゲンまたはそのフラグメントと対象のポリペプチドとの連結によって得られる融合タンパク質である。得られたタンパク質は、前記セリンプロテアーゼの機能特性を示す。
【００４２】
特に、「セリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体」という用語は、活性化セリンプロテアーゼまたはそのフラグメントと対象のポリペプチドとの融合によって得られる融合タンパク質である。
【００４３】
本発明によると、前記のセリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体は、ネイティブなセリンプロテアーゼチモーゲンとは異なるが、少なくとも等価な活性を示す。
【００４４】
「第Ｘ因子」という用語は当技術分野においてその一般的な意味を有し、そして凝固機序に関与する分泌セリンプロテアーゼを指す。第Ｘ因子は、任意の起源に由来し得るが、典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）の第Ｘ因子であり、そしてより具体的にはヒトの第Ｘ因子である。典型的には、ヒト第Ｘ因子のアミノ酸配列は、配列番号１によって提供される（図１）。
【００４５】
第Ｘ因子のアミノ酸残基を位置決定するための種々のナンバリングシステムが存在する：
・第Ｘ因子のｃＤＮＡから推定した配列を参照したナンバリングシステム。
・軽鎖、活性化ペプチドおよび重鎖を含む、分泌タンパク質から推定した配列を参照したナンバリングシステム：１番のアミノ酸残基は、軽鎖のアミノ末端の最初のアミノ酸残基である。このナンバリングシステムを使用する。上流のアミノ酸位置はマイナスとして識別される：プロペプチドのＣ末端アミノ酸は−１番であり、そして翻訳されたタンパク質のＮ末端アミノ酸残基（これはプレペプチドのアミノ末端アミノ酸残基である）は−４０番である。
【００４６】
図１に示したように、第Ｘ因子の配列は、使用するナンバリングシステムに従って、以下に対応する５つの異なる領域に分類される：
・−４０位から−２８位のプレペプチド（またはシグナルペプチド）
・−２７位から−１位のプロペプチド、
・１位から１４２位の軽鎖、
・１４３位から１９４位の活性化ペプチド、
・１９５位から４４８位の重鎖。
【００４７】
「第Ｘ因子」または「ＦＸ」または「成熟ＦＸ」または「チモーゲンＦＸ」という用語は、産生肝細胞による分泌後の、血中循環型の第Ｘ因子を指す。シグナルペプチドはシグナルペプチダーゼによって開裂除去され、そして、成熟Ｎ末端鎖のＮ末端における最初の１１グルタミン酸残基においてγカルボキシル化が起こった後にプロペプチド配列が開裂除去される。さらなるプロセシング工程が、使用するナンバリングシステムによるとＡｒｇ１４２とＳｅｒ１４３との間の開裂によって起こる（図１、配列番号１の１８２〜１８３位）。このプロセシング工程により同時に、Ａｒｇ１４０−Ｌｙｓ１４１−Ａｒｇ１４２のトリペプチドの欠失が起こる（配列番号１の１８０〜１８２位）。得られる分泌された第Ｘ因子チモーゲンは、Ｃｙｓ１３２とＣｙｓ３０２との間のジスルフィド橋を介して共有結合した、１３９アミノ酸のＮ末端軽鎖および３０６アミノ酸のＣ末端重鎖からなる。さらなる翻訳後のプロセシング工程は、Ａｓｐ６３のβ−ヒドロキシル化並びにＮ型およびＯ型グリコシル化を含む。
【００４８】
「活性化第Ｘ因子」または「ＦＸａ」という用語は、凝固活性（例えばトロンビン生成）が必要とされる場合に生成される循環第Ｘ因子の酵素学的に活性な形態を指す。第Ｘ因子を活性化することのできる生理的条件下において、Ｓｅｒ１４３からＡｒｇ１９４までの５２アミノ酸のいわゆる活性化ペプチドが、残りの分子からＡｒｇ１９４における重鎖のカルボキシ末端の開裂によって開裂除去される（図１）。
【００４９】
本発明による「第Ｘ因子」および「活性化第Ｘ因子」という用語は、天然に存在する第Ｘ因子および活性化第Ｘ因子を含むが、その機能保存的変異体およびその改変型も包含する。特に、本発明は、Camire et al, 2000において記載された変異体（γ−カルボキシル化成熟タンパク質のより良好な収率を得るために、ネイティブな第Ｘ因子のプロペプチドが、プロトロンビンのプロペプチドによって置換されている）またはRudolph et al 1997において記載された変異体（プロペプチドの正しい開裂を可能とするために、第Ｘ因子の残基−２に対応するコドン（ＡＣＧ、これは配列番号１の３９位におけるトレオニンに対応する）をＡＧＧ（これはアルギニンに対応する）に変化させ得る）などの、第Ｘ因子の全ての公知の機能保存的変異体（チモーゲンまたは活性化型）を包含する。
【００５０】
「第Ｘ因子の活性化ペプチド」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、そして使用するナンバリングシステムによると第Ｘ因子の１４３〜１９４位の範囲の５２アミノ酸のポリペプチド（配列番号１の１８３〜２３４位）を指す。この用語は、天然に存在する第Ｘ因子活性化ペプチド並びにその保存機能的変異体および改変型を含み得る。本明細書で定義したような活性化ペプチドは、第Ｘ因子のヒト活性化ペプチドに対応するが、しかし任意の起源に由来し得、しかし典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）の第Ｘ因子であり、そしてより具体的にはヒト第Ｘ因子である。第Ｘ因子のヒト活性化ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２によって提供される。
【００５１】
本発明において、第Ｘ因子の活性化ペプチドのカルボキシ末端部分の１９の最後のアミノ酸配列は、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列に対応する、または使用するナンバリングシステム（図１）によると第Ｘ因子の１７６〜１９４位に対応する、対象のポリペプチドに対応する。このポリペプチドはまたＰＡ１７６〜１９４とも呼ばれる。このポリペプチドは、使用するナンバリングシステムによると第Ｘ因子の１８１位および１９１位に対応する、配列番号２の３９位および４９位において２つのグリコシル化部位を含む。
【００５２】
「プロテインＣ」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、そして「抗凝固経路」と呼ばれる凝血をレギュレーションする主要な機序に関与する分泌セリンプロテアーゼを指す。プロテインＣは任意の起源に由来し得るが、しかし典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）のプロテインＣであり、そしてより具体的にはヒトプロテインＣである。典型的には、ヒトプロテインＣのアミノ酸配列は配列番号３によって提供される。
【００５３】
プロテインＣの活性化ペプチドは、配列番号３の配列の２００〜２１１位に見られる１２アミノ酸のポリペプチドである。
【００５４】
「プロテインＣ」または「ＰＣ」または「成熟ＰＣ」または「チモーゲンＰＣ」という用語は、肝産生細胞による分泌後の、血中循環型のプロテインＣを指す。シグナルペプチドがシグナルペプチダーゼによって開裂除去され、成熟Ｎ末端鎖のＮ末端における最初の９グルタミン酸残基においてγカルボキシル化が起こった後に（配列番号３の配列の４３位のアラニンにおいて始まる）プロペプチド配列が開裂除去される。Ｌｙｓ１９８−Ａｒｇ１９９（配列番号３）の２つの欠失によってさらなるプロセシング工程が起こる。得られた分泌プロテインＣチモーゲンは、ジスルフィド橋を介して共有結合した、１５５アミノ酸のＮ末端軽鎖および２６２アミノ酸のＣ末端重鎖からなる。さらなる翻訳後プロセシング工程は、Ａｓｐ１１３（配列番号３）のβ−ヒドロキシル化並びにＮ−型グリコシル化を含む。
【００５５】
「活性化プロテインＣ」または「ＰＣａ」という用語は、凝固活性（例えばトロンビン生成）が必要とされる場合に生成される酵素学的に活性な形態の循環プロテインＣを指す。プロテインＣを活性化することのできる生理的条件下において、Ａｓｐ２００からＡｒｇ２１１（配列番号３）の１２アミノ酸のいわゆる活性化ペプチドが、Ａｒｇ２１１（配列番号３）における重鎖のカルボキシ末端の開裂によって残りの分子から開裂除去される。
【００５６】
本発明による「プロテインＣ」または「活性化プロテインＣ」という用語は、天然に存在するプロテインＣおよび活性化プロテインＣを含むが、その機能保存的変異体および改変型も包含する。特に、本発明は、Ａｓｎ３５５および３７１における置換を含むより高い抗凝固活性を有する活性化プロテインＣの誘導体(US Patent 5 453 373)、並びに細胞保護性（抗アポトーシス障害、抗神経変性障害、および卒中に対しては保護性）であるという望ましい特性を有しつつ減少した抗凝固活性を有する活性化プロテインＣの誘導体(例えば WO/2005/007820を参照)などの、プロテインＣの全ての公知の機能保存的変異体（チモーゲンまたは活性化型）を包含する。そのような突然変異体は、例えば、３Ｋ３Ａ−ＡＰＣおよび２２９／２３０−ＡＰＣである。
【００５７】
「フィブリノペプチドＡ」という用語は当技術分野においてその一般的な意味を有し、そしてトロンビンの作用によってフィブリノーゲンのα鎖のＮ末端セグメントから除去された１６アミノ酸残基の小さなペプチドを指す。この用語は、天然に存在するフィブリノペプチドＡ並びにその保存機能的変異体および改変型を含み得る。フィブリノペプチドＡは任意の起源に由来し得るが、しかし典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）のフィブリノペプチドＡであり、そしてより具体的にはヒトフィブリノペプチドＡである。典型的には、ヒトフィブリノペプチドＡのアミノ酸配列は配列番号４によって提供される。
【００５８】
本発明による「フィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体」という用語は、フィブリノペプチドＡまたはそのフラグメントおよびフィブリノペプチドＡのカルボキシ末端部分におけるトロンビンによって開裂され得る部位を含む、ポリペプチドを指す。このような誘導体は、キメラでトロンビンによって開裂され得る第Ｘ因子の誘導体については配列番号５（図３Ａ）または配列番号６（図３Ｂ）によって、およびキメラでトロンビンによって開裂され得るプロテインＣの誘導体については配列番号１３（図４Ａ）または配列番号１４（図４Ｂ）によって定義される。
【００５９】
本発明による「トロンビンによって開裂され得る部位」という用語は、凝固の主要なセリンプロテアーゼであるトロンビンによって認識および開裂され得る短いアミノ酸配列を指す。
【００６０】
グリコシル化は、糖をタンパク質に結合させる酵素的過程である。タンパク質のグリコシル化は、典型的にはＮ結合である。「Ｎ結合」は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の連結を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的連結のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチドのいずれかの存在が、可能性あるグリコシル化部位を作り出す。典型的には、タンパク質にＮ結合したオリゴ糖は、グルコース、マンノースおよび２Ｎ−アセチルグルコサミン分子からなり、これはその後、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコースおよびシアル酸を含む多種多様な異なる単糖を用いて伸長され得る。
【００６１】
従って、「Ｎ−グリコシル化」という用語は、前記に定義した少なくとも１つのアスパラギン残基上でのポリペプチドのＮ−グリコシル化を指す。
【００６２】
その最も広い意味において、「予防する」または「予防」という用語は、疾病または容態を有するとはまだ診断されていない患者において前記疾病または容態が起こることを予防することを指す。
【００６３】
その最も広い意味において、「処置する」または「処置」という用語は、このような用語が適用する疾患もしくは容態の進行、またはこのような疾患もしくは容態の１つ以上の症状を後退、寛解もしくは阻止することを指す。
【００６４】
「患者」という用語は、血液凝固疾患を患うまたは患う恐れのある任意の被験体（好ましくはヒト）を指す。
【００６５】
本発明による「プロテインＣおよび第Ｘ因子に関連した疾患」という用語は、第Ｘ因子またはプロテインＣの関与する任意の病態、特に血液凝固疾患を指す。
【００６６】
本発明による「血液凝固疾患」または「凝血疾患」という用語は、血液凝固機序のデレギュレーションに因る任意の病態を指す。従って、それは血液凝固の過剰および欠如に関与する病態を含む。
【００６７】
血液凝固過剰、すなわち凝固亢進の関与する病態は、静脈または動脈血栓症、心筋梗塞、血栓性疾病、肺塞栓症、冠血管再閉塞、およびプロテインＣの欠損症を含むがそれらに限定されない。
【００６８】
血液凝固の欠如に関与する病態は出血性病態と呼ばれ、そしてこれは特に第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第ＸＩ因子の欠損症を含む。これらの病態は、特に、血友病ＡまたはＢ、および自己免疫疾病または癌などの別の病態に関連した自己抗体の出現から生じる血友病であり得る。
【００６９】
第Ｘ因子の活性化ペプチド由来のポリペプチド
本発明の第１の目的は、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含むポリペプチドＰＰに関し、ここで３９位または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている。
【００７０】
好ましい態様において、３９位および４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている。
【００７１】
１つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の３２〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の３１〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の３０〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２９〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２８〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２７〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２６〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２５〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８０】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２４〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８１】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２３〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８２】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２２〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２１〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８４】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２０〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８５】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１９〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８６】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１８〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８７】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１７〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８８】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１６〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００８９】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１５〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９０】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１４〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９１】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１３〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９２】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１２〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９３】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１１〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９４】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の１０〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９５】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の９〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９６】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の８〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９７】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の７〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９８】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の６〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【００９９】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の５〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１００】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の４〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の３〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２の２〜５２位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
特定の態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。代替的な態様において、前記ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含まない。
【０１０４】
本発明の別の目的は、チモーゲンの半減期、特にセリンプロテアーゼチモーゲンの半減期を向上させるためのポリペプチドＰＰの使用に関する。
【０１０５】
第Ｘ因子の活性化ペプチド由来の融合タンパク質
本発明のさらなる目的は、
−前記したポリペプチドＰＰからなる第１ポリペプチド、および
−配列番号４の７〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド
を含む、融合タンパク質ＦＰに関する。
【０１０６】
本発明のさらなる目的は、
−前記したポリペプチドＰＰからなる第１ポリペプチド、および
−配列番号４の７〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド
を含む、融合タンパク質ＦＰに関し、
ここで、
−配列番号４の１４位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンもしくはアラニンによって置換されている、そして／または
−配列番号４の１５位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されている。
【０１０７】
好ましい態様において、本発明は、第１ポリペプチドのカルボキシ末端領域が、第２ポリペプチドのアミノ末端領域に融合している、前記融合タンパク質に関する。
【０１０８】
特定の態様において、前記の第２ポリペプチドは、配列番号４の７〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
別の特定の態様において、前記の第２ポリペプチドは、配列番号４の６〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
別の特定の態様において、前記の第２ポリペプチドは、配列番号４の５〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
別の特定の態様において、前記の第２ポリペプチドは、配列番号４の４〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
別の特定の態様において、前記の第２ポリペプチドは、配列番号４の３〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
別の特定の態様において、前記の第２ポリペプチドは、配列番号４の２〜１６位の範囲のアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
別の特定の態様において、前記の第２ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
本発明のキメラ誘導体
前記した本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質を、セリンプロテアーゼチモーゲンまたは活性型またはそのフラグメントに融合させて、前記セリンプロテアーゼチモーゲンの半減期および回収率を向上させることができる。
【０１１６】
本発明者らは、第Ｘ因子の活性化ペプチドおよびより具体的にはその１９の最後のアミノ酸を含むそのフラグメントは、第Ｘ因子の長い半減期および注入分子の良好な回収率において主要な役割を果たしていることを示した。本発明者らはまた、第Ｘ因子の活性化ペプチドおよびその１９の最後のアミノ酸を含むそのフラグメントを使用して、循環タンパク質などの他のタンパク質の半減期および回収率を増加させることができることを示した。
【０１１７】
従って、本発明のさらなる目的は、前記した対象のタンパク質およびポリペプチドＰＰを含む、キメラタンパク質に関する。
【０１１８】
前記の対象のタンパク質は、血中で短い半減期を有する酵素または他のタンパク質であり得る。特に、それは循環タンパク質、例えばセリンプロテアーゼまたはタンパク質ホルモンであり得る。
【０１１９】
典型的には、前記の対象タンパク質は、プロテインＣ、第ＶＩＩ因子、活性化第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、インシュリン、エリスロポエチン、可溶性Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンドなどであり得るが、しかしネイティブな第Ｘ因子ではない。
【０１２０】
前記タンパク質を、そのチモーゲン型またはその活性化型で使用することができる。
【０１２１】
特定の態様において、本発明は、ポリペプチドＰＰが、カルボキシ末端、アミノ末端において対象のタンパク質に、または対象のタンパク質のアミノ酸配列中に融合している、前記タンパク質に関する。
【０１２２】
特定の態様において、本発明は、ポリペプチドＰＰが、カルボキシ末端、アミノ末端において対象のタンパク質に、または対象のタンパク質のアミノ酸配列中に融合している前記キメラタンパク質に関する。
【０１２３】
特定の態様において、本発明は、対象のチモーゲンの活性化ペプチドがポリペプチドＰＰによって置換されている、前記キメラタンパク質に関する。
【０１２４】
別の特定の態様において、本発明は、前記ポリペプチドＰＰが、そのネイティブな活性化ペプチドの所在部位において対象の活性化型のタンパク質に融合している、前記キメラタンパク質に関する。
【０１２５】
特定の態様において、本発明は、ポリペプチドＰＰが、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列（３９位または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている）からなる前記キメラタンパク質に関する。
【０１２６】
典型的には、本発明は、前記ポリペプチドＰＰが、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列（３９位または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている）を含み、そして１９アミノ酸、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の最大長を有する、前記キメラタンパク質に関する。
【０１２７】
特定の態様において、本発明は、ポリペプチドＰＰが、第Ｘ因子のネイティブな活性ペプチド（配列番号２）から構成されない前記キメラタンパク質に関する。
【０１２８】
特定の態様において、本発明は、特許出願ＷＯ２００６０１８２０４に記載のタンパク質の１つではない前記キメラタンパク質に関する。
【０１２９】
特定の態様において、本発明は、プロテインＣおよびポリペプチドＰＰを含むキメラタンパク質に関し、ただし、前記ペプチドの配列は、配列番号２のアミノ酸配列から構成されない。
【０１３０】
さらに特定の態様において、本発明は、前記ポリペプチドが、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列からなり、３９位または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されているプロテインＣおよびポリペプチドＰＰを含むキメラタンパク質に関する。
【０１３１】
特定の態様において、本発明は、プロテインＣの活性化ペプチドがポリペプチドＰＰによって置換されているプロテインＣを含むキメラタンパク質に関し、ただし、前記ペプチドの配列は、配列番号２のアミノ酸配列から構成されない。
【０１３２】
さらに特定の態様において、本発明は、プロテインＣの活性化ペプチドが、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列（３９位または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている）からなるポリペプチドＰＰによって置換されているプロテインＣを含むキメラタンパク質に関する。
【０１３３】
特定の態様において、本発明は、活性化プロテインＣおよびポリペプチドＰＰを含むキメラタンパク質に関し、ただし、前記ペプチドの配列は配列番号２のアミノ酸配列から構成されない。
【０１３４】
さらに特定の態様において、本発明は、活性化プロテインＣと、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列（３９位または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている）からなるポリペプチドＰＰとを含む、キメラタンパク質に関する。
【０１３５】
好ましくは、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列（３９位または４９位におけるアスパラギンはＮ−グリコシル化されている）は、活性化プロテインＣの重鎖のＮ末端部分上に融合している。
【０１３６】
本発明は、ポリペプチドＰＰを含むセリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体に関する。
【０１３７】
特に、前記のセリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体は、プロテインＣおよび第Ｘ因子のキメラ誘導体である。特に、ＷＯ０３０３５８６１特許出願またはLouvain-Quintard et al., 2005に記載のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体が、使用および改変される。
【０１３８】
従って、本発明は、前記タンパク質のネイティブな活性化ペプチドが、前記した融合タンパク質ＦＰによって置換されている第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関する。
【０１３９】
本発明によると、本発明はまた、本発明の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体の機能保存的変異体も包含する。
【０１４０】
特定の態様において、本発明はさらに、第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、ネイティブな第Ｘ因子の重鎖の３つの最初の残基に対応するアミノ酸（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、配列番号１の２３５〜２３７位）は、Toso R and al, 2008並びに特許出願ＷＯ０３０３５８６１およびＷＯ０４００５３４７に記載の改変に従って改変されていてもよい。
【０１４１】
特に、本発明は、前記の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、
−配列番号１の２３５位の残基に対応するイソロイシンは、アラニン、セリンまたはロイシンによって置換されていてもよく；
−配列番号１の２３６位の残基に対応するバリンは、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよい。
【０１４２】
別の特定の態様において、本発明はさらに、第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、フィブリノペプチドＡの３つの最後の残基に対応するアミノ酸（Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、配列番号４の１４〜１６位）もまた、Gustafsson D and al, 2004および特許出願ＷＯ０４００５３４７に記載の改変に従って改変されていてもよい。
【０１４３】
特に、本発明は、前記の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、
−配列番号４の１４位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく、
−配列番号４の１５位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されていてもよい。
【０１４４】
本発明によると、前記の改変を使用して、トロンビンによる開裂または活性化第Ｘ因子誘導体の効力を向上させ、そしてこれは本発明のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体の活性を変化させない。
【０１４５】
従って、本発明は、第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、前記タンパク質のネイティブな活性化ペプチドは、
−ポリペプチドＰＰ、および
−配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列によって定義されるフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体
を含む融合タンパク質によって置換されている。
【０１４６】
１つの態様において、前記の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体は、前記ポリペプチドが、第Ｘ因子のネイティブな活性化ペプチド（配列番号２）であることを特徴とする。
【０１４７】
別の態様において、前記の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体は、前記のフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２の群のために選択されたアミノ酸配列によって選択されたアミノ酸配列によって定義されることを特徴付けられる。
【０１４８】
特定の態様において、本発明は、前記の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、
−前記ポリペプチドは、第Ｘ因子のネイティブな活性化ペプチド（配列番号２）であり、そして
−前記フィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体は、アミノ酸配列DFLAEGGGVRIVG（配列番号７）によって定義される。
【０１４９】
本発明はまた、前記タンパク質のネイティブな活性化ペプチドが、融合タンパク質ＦＰによって置換されているプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関する。
【０１５０】
本発明によると、本発明はまた、本発明のプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体の機能保存的変異体も包含する。
【０１５１】
特定の態様において、前記のプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体において、ネイティブなプロテインＣの重鎖の３つの最初の残基に対応するアミノ酸（Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ、配列番号３の２１２〜２１４位）は、特許出願ＷＯ０３０３５８６１に記載の改変に従って改変されていてもよい。
【０１５２】
特に、本発明のプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体において、
−配列番号３の２１２位の残基に対応するロイシンは、アラニンまたはセリンによって置換されていてもよく：
−配列番号３の２１３位の残基に対応するイソロイシンは、フェニルアラニンによって置換されていてもよく；
−配列番号３の２１４位の残基に対応するアスパルテートは、グリシンによって置換されていてもよい。
【０１５３】
別の特定の態様において、本発明はさらに、プロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、フィブリノペプチドＡの３つの最後の残基に対応するアミノ酸（Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、配列番号４の１４〜１６位）は、Gustafsson D and al, 2004および特許出願ＷＯ０４００５３４７に記載の改変に従って改変されていてもよい。
【０１５４】
特に、本発明は、前記の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、
−配列番号４の１４位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく、
−配列番号４の１５位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されていてもよい。
【０１５５】
本発明によると、前記の改変を使用して、トロンビンによる開裂または活性化プロテインＣ誘導体の効力を向上させ、そしてこれは本発明のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体の活性を変化させない。
【０１５６】
本発明はまた、プロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、前記タンパク質のネイティブな活性化ペプチドは、
−ポリペプチドＰＰ、および
−配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列によって定義されるフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体
を含む融合タンパク質によって置換されている。
【０１５７】
１つの態様において、前記ポリペプチドは、第Ｘ因子のネイティブな活性化ペプチド（配列番号２）である。
【０１５８】
別の態様において、前記のフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６の群のために選択されたアミノ酸配列によって選択されたアミノ酸配列によって定義される。
【０１５９】
特定の態様において、本発明は、前記のプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、
−前記ポリペプチドは、第Ｘ因子のネイティブな活性化ペプチド（配列番号２）であり、そして
−前記のフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体は、アミノ酸配列DFLAEGGGVRLID（配列番号１５）によって定義される。
【０１６０】
本発明のさらなる目的は、ポリペプチドＰＰが、ネイティブなプロテインＣの活性化ペプチドのアミノ末端部分に融合しているプロテインＣのキメラ誘導体に関する。
【０１６１】
本発明のさらなる目的は、活性化されたセリンプロテアーゼまたはその機能保存的変異体およびポリペプチドＰＰを含むことを特徴とする、前記のセリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体に関する。
【０１６２】
特に、本発明は、活性化されたセリンプロテアーゼまたはその機能保存的変異体および融合タンパク質ＦＰを含むことを特徴とする、前記の対象のセリンプロテアーゼのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関する。
【０１６３】
特定の態様において、本発明は、活性化第Ｘ因子またはその機能保存的変異体および融合タンパク質ＦＰを含む、第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関する。
【０１６４】
好ましい態様において、本発明は、活性化第Ｘ因子またはその機能保存的変異体および融合タンパク質ＦＰを含む、第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、融合タンパク質ＦＰのカルボキシ末端部分は、活性化第Ｘ因子の重鎖のアミノ末端部分に融合している。
【０１６５】
本発明によると、いくつかのアミノ酸を置換、欠失または付加することによって、本発明の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体の活性を向上させることができる。特に、フィブリノペプチドＡの３つの最後のアミノ酸に対応するアミノ酸（配列番号４のアミノ酸配列の１４〜１６位）および活性化第Ｘ因子の重鎖の３つの最初のアミノ酸（配列番号１のアミノ酸配列の２３５〜２３７位）を前記に詳述したように改変させ得る。
【０１６６】
特に、本発明は、前記の本発明の第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、
−配列番号１の２３５位の残基に対応するイソロイシンは、アラニン、セリンまたはロイシンによって置換されていてもよく、
−配列番号１の２３６位の残基に対応するバリンは、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく、
−配列番号４の１４位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく、
−配列番号４の１５位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されていてもよい。
【０１６７】
本発明によると、前記の改変を使用して、トロンビンによる開裂または活性化第Ｘ因子誘導体の効力を向上させ、そしてこれは本発明のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体の活性を変化させない。
【０１６８】
特定の態様において、本発明は、活性化プロテインＣまたはその機能保存的変異体および融合タンパク質ＦＰを含む、プロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関する。
【０１６９】
好ましい態様において、本発明は、活性化プロテインＣまたはその機能保存的変異体および融合タンパク質ＦＰを含む、プロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体に関し、融合タンパク質ＦＰのカルボキシ末端部分は、活性化プロテインＣの重鎖のアミノ末端部分に融合している。
【０１７０】
本発明によると、いくつかのアミノ酸を置換、欠失または付加することによって、本発明のプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体を向上させることができる。特に、活性化プロテインＣの重鎖の３つの最初のアミノ酸に対応するアミノ酸（配列番号３の２１２〜２１４位）を前記に詳述したように改変させ得る。
【０１７１】
特に、本発明のプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体において、
−配列番号３の２１２位の残基に対応するロイシンは、アラニンまたはセリンによって置換されていてもよく；
−配列番号３の２１３位の残基に対応するイソロイシンは、フェニルアラニンによって置換されていてもよく；
−配列番号３の２１４位の残基に対応するアスパルテートは、グリシンによって置換されていてもよく；
−配列番号４の１４位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく；
−配列番号４の１５位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されていてもよい。
【０１７２】
本発明によると、前記の改変を使用して、トロンビンによる開裂または活性化プロテインＣ誘導体の効力を向上させ、そしてこれは本発明のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体の活性を変化させない。
【０１７３】
核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明のさらなる目的は、本発明に記載のポリペプチドおよびキメラ誘導体をコードする核酸分子に関する。
【０１７４】
１つの態様において、本発明は、前記した第Ｘ因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体をコードする核酸分子に関する。
【０１７５】
別の態様において、本発明は、前記したプロテインＣのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体をコードする核酸分子に関する。
【０１７６】
「コード配列」すなわちＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質もしくは酵素などの発現産物を「コードする」配列は、発現された場合に、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の生成をもたらすヌクレオチド配列、すなわち、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。タンパク質のコード配列は、開始コドン（通常ＡＴＧ）および終止コドンを含み得る。
【０１７７】
これらの核酸分子を、当業者に周知の従来の方法によって、特にネイティブなタンパク質をコードする遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。
【０１７８】
典型的には、前記核酸は、適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターに含まれ得る、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
【０１７９】
よって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸分子が転写（特にプロモーター、エンハンサー、および場合により終結因子）および場合により翻訳を制御するための適切なエレメントを伴うベクターおよび発現カセット、並びにまた、本発明による核酸分子が挿入された組換えベクターに関する。これらの組換えベクターは、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。
【０１８０】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、これによりＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができ、よって宿主を形質転換し、そして導入配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進することのできる、ビヒクルを意味する。
【０１８１】
本発明のポリペプチドまたはキメラ誘導体をコードする遺伝子を挿入および発現することができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７(Miyaji H et al. 1990)、ｐＡＧＥ１０３(Mizukami T et al. 1987)、ｐＨＳＧ２７４(Brady G et al. 1984)、ｐＫＣＲ(O'Hare K et al. 1981)、ｐＳＧ１βｄ２−４(Miyaji H et al. 1990)などが挙げられる。
【０１８２】
プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミドが挙げられる。
【０１８３】
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術によって、例えばパッケージング細胞のトランスフェクションによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、例えば、WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056およびWO 94/19478に見出し得る。
【０１８４】
動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー(Mizukami T. et al. 1987)、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー(Kuwana Y et al. 1987)、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター(Mason JO et al. 1985)およびエンハンサー(Gillies SD et al. 1983)などが挙げられる。
【０１８５】
本発明はまた、in vivoまたはex vivoにおいて遺伝子療法において使用することのできる、本発明の核酸分子を含む遺伝子送達系も含む。これは、例えば、遺伝子療法において慣用的に使用されるウイルス導入ベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス由来のものなどを含む。これはまた、本発明の核酸分子および非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクルを含む、遺伝子送達系も含む。非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクルの例としては、リポソームおよびポリマー、例えばポリエチレンイミン、シクロデキストリン、ヒスチジン／リジン（ＨＫ）ポリマーなどが挙げられる。
【０１８６】
本発明の主題はまた、本発明による少なくとも１つの核酸分子で遺伝子的に形質転換された原核または真核宿主細胞である。
【０１８７】
「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味し、これにより、宿主細胞は導入された遺伝子または配列を発現して、導入遺伝子または配列によってコードされる所望の物質、典型的にはタンパク質または酵素を産生する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取りそして発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【０１８８】
好ましくは、本発明によるポリペプチドおよびキメラ誘導体、特にプロテインＣおよび第Ｘ因子誘導体を発現および産生するために、真核細胞、特に哺乳動物細胞、より具体的にはヒト細胞を選択する。
【０１８９】
典型的には、ＣＨＯ、ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、ＰＥＲ．Ｃ６またはＨＥＫ２９３などの細胞株が、誘導体の正しい翻訳後修飾をプロセシングするその能力のために使用され得る。
【０１９０】
本発明はまた、本発明の発現カセットを含む少なくとも１つの導入遺伝子を収容した、トランスジェニック動物、特にトランスジェニック非ヒト哺乳動物を包含する。前記のトランスジェニック動物を、例えばBrink et al., 2000によってすでに記載されているように、本発明のキメラタンパク質を産生するために使用することができる。
【０１９１】
本発明による発現ベクターの構築、宿主細胞の形質転換、およびトランスジェニック動物の産生を、従来の分子生物学技術を使用して行なうことができる。本発明のキメラ誘導体、特にプロテインＣまたは第Ｘ因子誘導体は、例えば、本発明に従って遺伝子的に形質転換された細胞を培養し、そして前記細胞によって発現される誘導体を培養液から回収することによって得ることができる。その後、それらを必要であれば、当業者にはそれ自体公知である従来の手順によって、例えば分画沈降法、特に硫酸アンモニウム沈降法、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィーなどによって精製し得る。
【０１９２】
特に、組換えタンパク質を調製および精製するための従来の方法を、本発明によるタンパク質の産生のために使用し得る。例えば、本発明によるプロテインＣ誘導体を産生するために、US patent 4 992 373またはUS patent 4 981 952に記載のような方法を使用し得る。
【０１９３】
治療法および使用
本発明の第３の目的は、プロテインＣおよび第Ｘ因子に関連した疾患、特に血液凝固疾患の予防または処置において使用するための本発明によるキメラ誘導体に関する。
【０１９４】
１つの態様において、本発明は、凝血促進剤としての本発明の第Ｘ因子のキメラ誘導体に関する。
【０１９５】
特定の態様において、本発明は、特に第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第ＸＩ因子欠損症の後に続いて起こる、出血型の凝血病態の予防または処置において使用するための、第Ｘ因子のキメラ誘導体に関する。
【０１９６】
これらの病態は、特に、血友病ＡまたはＢであり得、これらは、阻害剤（処置に従来使用される第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対して作られる中和性の同種抗体）の存在によって複雑化されていてもいなくてもよく；それらは、別の病態（自己免疫疾病、癌、リンパ球増殖性症候群、突発性疾患など）に関連した自己抗体の出現から生じる後天性の血友病でもよい。
【０１９７】
特定の態様において、本発明は、血友病ＡまたはＢの予防または処置において使用するための第Ｘ因子のキメラ誘導体に関する。
【０１９８】
別の態様において、本発明は、血友病Ｂの予防または処置において使用するための第ＩＸ因子のキメラ誘導体に関する。
【０１９９】
別の態様において、本発明は、線維症、組織リモデリングおよび癌などの線維増殖性疾病の予防または処置において使用するための第Ｘ因子のキメラ誘導体に関する。
【０２００】
本発明は、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）によってまたは第Ｘａ因子（ｆＸａ）にターゲティングする抗凝固剤によって誘発された出血の予防または処置のための方法において使用するための本発明の第Ｘ因子のキメラ誘導体に関する。
【０２０１】
第Ｘａ因子にターゲティングする抗凝固剤は周知である（概説についてはHarenberg, 2008, Bauer, 2008, Khoo et al., 2009を参照されたい）。第Ｘａ因子にターゲティングする抗凝固剤の例は、リバロキサバンおよびベトリキサバンである。
【０２０２】
好ましい態様において、配列番号１の４１９位の残基に対応する前記の第Ｘ因子のキメラ誘導体のセリンは、アラニンによって置換されている。
【０２０３】
別の態様において、配列番号１の３８７位、３９１位および４１９位の残基にそれぞれ対応する前記の第Ｘ因子のキメラ誘導体のアルギニン、リジンおよびセリンは、アラニンによって置換されている。
【０２０４】
本発明の第Ｘ因子のこれらのキメラ誘導体は、それらが第Ｘａ因子阻害剤に直接的にまたは間接的にのいずれかで結合するように改変されている。
【０２０５】
構造的には、これらの誘導体は、全く凝血促進活性を与えないかまたは減少した凝血促進活性を与えるかのいずれかとなるように改変されており、そして後者の態様のためにはプロトロンビナーゼ複合体へと会合しない。
【０２０６】
別の態様において、本発明は、抗血栓剤、抗炎症剤、抗神経変性剤および抗アポトーシス剤としてのプロテインＣのキメラ誘導体に関する。
【０２０７】
特定の態様において、本発明は、凝固亢進に関与する病態の予防または処置において使用するためのプロテインＣのキメラ誘導体に関する。
【０２０８】
このような病態としては、静脈または動脈の血栓症、特に内径の大きな血管に影響を及ぼす血栓症、心筋梗塞、血栓性疾病、肺塞栓症、血管形成術もしくは血栓溶解後の冠血管再閉塞、卒中、およびまたＰＣ遺伝子もしくはトロンボモジュリン遺伝子に影響を及ぼす遺伝子異常を患う患者における凝血異常が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２０９】
特定の態様において、本発明は、血友病ＡまたはＢの予防または処置において使用するためのプロテインＣのキメラ誘導体に関する。
【０２１０】
別の態様において、本発明は、呼吸器疾病および炎症疾病の予防または処置において使用するためのプロテインＣのキメラ誘導体に関する。
【０２１１】
好ましくは、前記キメラ誘導体は、治療有効量で投与される。
【０２１２】
「治療有効量」とは、任意の医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比でプロテインＣおよび第Ｘ因子に関連した疾患を処置または予防するのに十分な本発明のキメラ誘導体の量を意味する。
【０２１３】
本発明の化合物および組成物の１日の総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の患者についての具体的な治療有効投与量レベルは、処置する疾患および疾患の重症度；使用する具体的な化合物の活性；使用する具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；使用する具体的な化合物の投与時刻、投与経路、排泄速度；処置持続期間；使用する具体的なポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野において周知である同様な因子を含む、多種多様な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルから化合物の用量を開始し、そして次第に所望の効果が達成されるまで用量を増加させることは当該技術の範囲内である。しかしながら、製品の１日投与量を、１日あたり１人の成人あたり０．０１〜１，０００mgの広い範囲で変化させることができる。好ましくは、前記組成物は、処置しようとする患者に対して症候による用量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、１日当たり０．０００２mg/kg（体重）から約２０mg/kg（体重）、特に１日あたり約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）の用量レベルで供給される。
【０２１４】
薬学的組成物
本発明のさらなる目的は、プロテインＣおよび第Ｘ因子に関連した疾患、特に血液凝固疾患の予防または処置のための本発明のキメラ誘導体を含む薬学的組成物に関する。
【０２１５】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、哺乳動物、特にヒトに適宜、投与された場合に、有害な、アレルギー性のまたは他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、あらゆる種類の無毒性固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤化補助剤を指す。
【０２１６】
１つの態様において、本発明は、前記に詳述した出血型の凝血病態、線維増殖性病態の処置のための、第Ｘ因子のキメラ誘導体を含む薬学的組成物に関する。
【０２１７】
別の態様において、本発明は、前記に詳述したような凝固亢進、炎症疾病または呼吸器疾病の関与する病態の予防または処置のための、プロテインＣのキメラ誘導体を含む薬学的組成物に関する。
【０２１８】
セリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体を、薬学的に許容される賦形剤、および場合により生分解性ポリマーなどの持続放出マトリックスと合わせて、治療組成物を形成し得る。
【０２１９】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与のための本発明の薬学的組成物において、活性成分を単独でまたは別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、および経口懸濁剤または液剤、舌下および頬側投与剤形、エアゾール、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、クモ膜下腔内、および鼻腔内投与剤形および直腸投与剤形を含む。
【０２２０】
好ましくは、薬学的組成物は、注入することのできる製剤に対して薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）、または乾燥、特に凍結乾燥した組成物（これに場合に応じて、滅菌水または生理食塩水を添加すると、注射用液剤の再構成を可能とする）であり得る。
【０２２１】
注射用途に適した薬学的剤形は、無菌の水性の液剤または分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌の注射用液剤または分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、そして容易にシリンジが扱える程度に流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下において安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して防御されていなければならない。
【０２２２】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む液剤を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。また、分散剤を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中および油中においても調製することができる。通常の保存および使用の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含む。
【０２２３】
本発明のセリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体を、中和形態または塩形態の組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成）を含み、これは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのこのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基と共に形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのこのような有機塩基から誘導することもできる。
【０２２４】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの種々の抗細菌剤および抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を使用することによってもたらすことができる。
【０２２５】
無菌注射溶液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙した他の成分のいくつかと共に含有し、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散剤は、種々の滅菌された活性成分を、基本の分散媒体および上記に列挙したものの中の必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に含有することによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これにより活性成分の粉末と、以前に滅菌ろ過したその溶液からの任意の追加の所望の成分とが得られる。
【０２２６】
製剤化されると、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、そして治療有効であるような量で投与される。製剤は、多種多様な剤形、例えば前記した種類の注射溶液などで容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
【０２２７】
水性液剤での非経口投与のために、例えば、溶液は必要であれば適切に緩衝化すべきであり、そして十分な食塩水またはグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張とすべきである。これらの特定の水性液剤は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に適している。これに関連して、使用することのできる無菌水性媒体は、本発明の開示を鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１用量を、１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、そして１０００mlの皮下注入用液体に添加、または提案された注射部位に注入のいずれかを行ない得る。処置する被験体の状態に応じて、用量の幾分の変更が必然的になされるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験体に対する適切な用量を決定する。
【０２２８】
本発明のセリンプロテアーゼチモーゲンのキメラ誘導体は、１用量あたり約０．０００１〜１．０mg、または約０．００１〜０．１mg、または約０．１〜１．０、またはさらには約１０mgなどを含むように、治療混合物内に製剤化され得る。また、複数の用量を投与してもよい。
【０２２９】
静脈内注射または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の化合物の他に、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、錠剤または経口投与用の他の固体；リポソーム製剤；持続放出カプセル剤；および現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】第Ｘ因子チモーゲンのアミノ酸配列の種々の部分の模式図：プレペプチド（またはシグナルペプチド）は、−４０位から−１８位のアミノ酸配列によって定義され、そしてプロペプチドは、−１７位から−１位のアミノ酸配列によって定義される。軽鎖は、１位から１４２位のアミノ酸の配列に対応し、重鎖は１９５位から４４８位のアミノ酸の配列に対応する。活性化ペプチド（１４３位から１９４位）をボックスで囲み、そして対象のＮ−グリコシル化部位は＊によってタグを付ける。使用したナンバリングシステムは、配列と同じ行の上に記載され、そして他の参照システムは、グレイで配列の下の行に記載されている。
【図２Ａ】第Ｘ因子のトロンビンによって開裂され得る誘導体のためのフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体の模式図：Ａ．前記のフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体は、フィブリノペプチドＡのアミノ酸配列を含み、ここで１４位または１５位のアミノ酸は図に従って改変させることができる。カルボキシ末端部分において、３つのさらなるアミノ酸を付加して、フィブリノペプチドＡ（または誘導体）の最後の３アミノ酸を含む６アミノ酸のトロンビンによって開裂され得る部位を形成する。
【図２Ｂ】第Ｘ因子のトロンビンによって開裂され得る誘導体のためのフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体の模式図：Ｂ．本発明の好ましい形式において、フィブリノペプチドＡの僅か１０の最後のアミノ酸を使用して、これを３アミノ酸のペプチドと融合させて、トロンビンによって開裂され得る部位を形成する。
【図３Ａ】プロテインＣのトロンビンによって開裂され得る誘導体のためのフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体の模式図：Ａ．前記のフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体は、フィブリノペプチドＡのアミノ酸配列を含み、そして３アミノ酸をカルボキシ末端部分に付加して、フィブリノペプチドＡ（または誘導体）の３つの最後のアミノ酸を含む６アミノ酸のトロンビンによって開裂され得る部位を形成する。
【図３Ｂ】プロテインＣのトロンビンによって開裂され得る誘導体のためのフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体の模式図：Ｂ．本発明の好ましい形式において、フィブリノペプチドＡの僅か１０の最後のアミノ酸を使用して、これを３アミノ酸のペプチドと融合して、トロンビンによって開裂され得る部位を形成する。
【図４】ＦＸ変異体構築物の模式図：７つの組換え第Ｘ因子（ＦＸ）タンパク質が存在する。タンパク質ドメインは以下の通りである：グレイは軽鎖、白は活性化ペプチド（ＡＰ）、黒は第Ｘ因子の触媒ドメイン。活性化ペプチドは、種々の変異体の間の差異の部位である。ＦｐＡは、配列番号７によって定義されるフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体に対応し、ａｐは、ＦＸ活性化ペプチドのカルボキシ末端の１７６〜１９４残基に対応し、そして黒い線はＦＸ活性化ペプチド中の突然変異Ｎ１８１ＡおよびＮ１９１Ａの部位を示す。
【図５】プロテインＣ変異体構築物の模式図：３つの組換えプロテインＣタンパク質が存在する。タンパク質ドメインは以下の通りである：グレイは軽鎖、白は活性化ペプチド（ＡＰ）、黒はプロテインＣの触媒ドメイン。ＦｐＡは配列番号７によって定義されるフィブリノペプチドＡのトロンビンによって開裂され得る誘導体に対応し、ＰＰはＦＸ活性化ペプチドのカルボキシ末端の１７６〜１９４残基に対応する。
【図６】血漿からのｗｔ−ＦＸの二相性クリアランス：マウスに、精製ｗｔ−ＦＸ（１０μg／マウス）を静脈内注射した。指定した時点において血液試料を採取した。血漿中の残留ｗｔ−ＦＸ抗原の量をＥＬＩＳＡ（「実験手順」を参照）で定量した。注射後の時間と注射から２分後に存在する量に対する血漿中の残留抗原の比率をプロットする。これらのデータから導かれた薬物動態パラメーターを表Ｉに要約する。データは、各時点について３匹のマウスの平均値±標準偏差を示す。
【図７】血漿からのＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡの単相性クリアランス：マウスに、精製ＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡ（１０μg／マウス）を静脈内注射した。指定した時点において血液試料を採取した。血漿中の残留ＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡ抗原の量をＥＬＩＳＡ（「実験手順」を参照）で定量した。注射後の時間と注射から２分後に存在する量に対する血漿中の残留抗原の比率をプロットする。これらのデータから導かれた薬物動態パラメーターを表Ｉに要約する。データは、各時点について３匹のマウスの平均値±標準偏差を示す。
【図８】血漿からのＦＸ／ＡＰ−ＦｐＡの二相性クリアランス：マウスに、精製ＦＸ／ＡＰ−ＦｐＡ（１０μg／マウス）を静脈内注射した。指定した時点において血液試料を採取した。血漿中の残留ＦＸ／ＡＰ−ＦｐＡ抗原の量をＥＬＩＳＡ（「実験手順」を参照）で定量した。注射後の時間と注射から２分後に存在する量に対して血漿中の残留抗原の比率をプロットする。これらのデータから導かれた薬物動態パラメーターを表Ｉに要約する。データは、各時点について３匹のマウスの平均値±標準偏差を示す。
【図９】血漿からのＦＸ／ＡＰ１７６−１９４の二相性クリアランス：マウスに、精製ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４（１０μg／マウス）を静脈内注射した。指定した時点において血液試料を採取した。血漿中の残留ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４抗原の量をＥＬＩＳＡ（「実験手順」を参照）で定量した。注射後の時間と注射から２分後に存在する量に対する血漿中の残留抗原の比率をプロットする。これらのデータから導かれた薬物動態パラメーターを表Ｉに要約する。データは、各時点について３匹のマウスの平均値±標準偏差を示す。
【図１０】血漿からのＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ−Ｎ１９１Ａの単相性クリアランス：マウスに、精製ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ−Ｎ１９１Ａ（１０μg／マウス）を静脈内注射した。指定した時点において血液試料を採取した。血漿中の残留ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ−Ｎ１９１Ａ抗原の量をＥＬＩＳＡ（「実験手順」を参照）で定量した。注射後の時間と注射から２分後に存在する量に対して血漿中の残留抗原の比率をプロットする。これらのデータから導かれた薬物動態パラメーターを表Ｉに要約する。データは、各時点について３匹のマウスの平均値±標準偏差を示す。
【図１１】血漿からのＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａの二相性クリアランス：マウスに、精製ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ（１０μg／マウス）を静脈内注射した。指定した時点において血液試料を採取した。血漿中の残留ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ抗原の量をＥＬＩＳＡ（「実験手順」を参照）で定量した。注射後の時間と注射から２分後に存在する量に対して血漿中の残留抗原の比率をプロットする。これらのデータから導かれた薬物動態パラメーターを表Ｉに要約する。データは、各時点について３匹のマウスの平均値±標準偏差を示す。
【図１２】血漿からのＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１９１Ａの単相性クリアランス：マウスに、精製ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１９１Ａ（１０μg／マウス）を静脈内注射した。指定した時点において血液試料を採取した。血漿中の残留ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１９１Ａ抗原の量をＥＬＩＳＡ（「実験手順」を参照）で定量した。注射後の時間と注射から２分後に存在する量に対して血漿中の残留抗原の比率をプロットする。これらのデータから導かれた薬物動態パラメーターを表Ｉに要約する。データは、各時点について３匹のマウスの平均値±標準偏差を示す。
【０２３１】
実施例
材料および方法
材料
ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）は、ＡＴＣＣ(Rockville, USA)からであった。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡプロテアーゼ非含有）をPAA Laboratories (Les Mureaux, France)から購入した。ダルベッコ改変イーグル／Ｆ１２培地、ペニシリン／ストレプトマイシン、ファンギゾン（アムホテリシンＢデオキシコール酸塩）をInvitrogen (Cergy Pontoise, France)から入手した。ベンズアミジンおよびフッ化フェニルスルホニル（ＰＭＳＦ）はCalbiochem (Meudon, France)からであった。メトトレキセート、ビタミンＫ１、ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）をSigma (Saint Quentin Fallavier, France)から購入した。Ｎ−ａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド−ジヒドロクロライド（Ｎ−ａ−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡ）製品名Ｓ−２７６５はChromogenix (Molndal, Sweden)からであった。Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ウシ脳から）、およびＬ−α−ホスファチジルコリン（卵黄から）はAvanti Polarlipids (Albaster, USA)からであった。ＱＡＥセファデックスＡ−５０、ＨｉＴｒａｐＴＭ Ｑカラム、ヘパリンＨｉＴｒａｐカラムをGE Healthcare (Orsay, France)から入手した。抗プロテインＣアフィニティマトリックスをRoche Diagnostics (Meylan, France)から購入した。
【０２３２】
組換えＦＸ誘導体の構築
ヒト第Ｘ因子ｃＤＮＡを含む哺乳動物発現プラスミドｐＫＧ５(Christophe, et al., 2001)、ヒトインシュリンｃＤＮＡを含むプラスミド、およびヒトプロテインＣ ｃＤＮＡを含むプラスミドを、標準的なＰＣＲ突然変異誘発のための鋳型として使用して、それぞれ全長ヒト第Ｘ因子、全長ヒトインシュリン、およびＣ末端ＨＰＣ−４タグ（残基EDQVDPRLIDGK、配列番号２７）を有する全長ヒトタンパク質をコードするｃＤＮＡを生成した。発現ベクターｐＮＵＴにクローニングされた突然変異した全長ｃＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ＤＮＡシークエンサーで製造業者の説明書に従ってＡＢＩ ＰＲＩＳＭダイターミネーターサイクルシークエンシング反応キットｖ３．１(Applied Biosystems Applera, Courtaboeuf, France)を使用してＤＮＡ配列解析によって確認した。ＦＸ構築物を標準的なＰＣＲ突然変異誘発（プライマーについては表Ｉ参照）のための鋳型として使用し、ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４、ＦＸ／ｄｅｌＰＡ−ＦｐＡ、ＦＸ／ＡＰ−ＦｐＡ、ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ、ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１９１Ａ、およびＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ−Ｎ１９１Ａと命名された活性化ペプチドにおいて部分的な欠失および特定の突然変異を有する第Ｘ因子変異体をコードするｃＤＮＡを生成した（図４）。インシュリン構築物を標準的なＰＣＲ突然変異誘発のための鋳型として使用して、配列番号２の３３〜５２位の範囲のアミノ酸配列（第Ｘ因子の活性化ペプチド）を含むポリペプチドＰＰを含むインシュリン変異体をコードするｃＤＮＡを生成した。同様に、プロテインＣ構築物を鋳型として使用して、プロテインＣ変異体をコードするｃＤＮＡを生成した（図５）。ｐＮＵＴ発現ベクターにクローニングされた構築物の全体をシークエンスした。
【０２３３】
【表１】
0005833448.tif 000002
【０２３４】
組換え誘導体を発現する細胞株の獲得
ｐＮＵＴ構築物を、業者によって明記されたようにjetＰＥＩ試薬(Qbiogen, Ozyme, France)を使用してベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）にトランスフェクションした。１００μMの濃度のメトトレキセート（Sigma）を含む培地を用いてトランスフェクションした細胞を選択した後、単一のクローンを採取し、そして選択培地中で増殖させて、安定な細胞株を得た。第Ｘ因子抗原の産生を、Dako (Dakopatts, Glostrup, Denmark)から入手したセイヨウワサビペルオキシダーゼでコンジュゲーションしたおよびしていない第Ｘ因子に対するポリクローナル抗体を使用して酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。Kordia (Leiden, The Netherlands)からの精製ヒト血漿由来の第Ｘ因子（ｐｄ−ＦＸ）を参照として使用した。インシュリンの産生を、DakoからのヒトインシュリンＥＬＩＳＡキットによってアッセイした。プロテインＣの産生を、コーティングのためのアフィニティ精製されたマウスモノクローナル抗体(Roche, Meylan, France)およびDakoから入手したセイヨウワサビペルオキシダーゼでコンジュゲーションしたタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いてtwo-site ＥＬＩＳＡによってアッセイした。第Ｘ因子、インシュリンおよびプロテインＣを産生する細胞株を選択した。
【０２３５】
組換え第Ｘ因子、インシュリンおよびプロテインＣ誘導体の産生および精製
組換えの第Ｘ因子、インシュリンおよびプロテインＣ誘導体並びに野生型の第Ｘ因子、インシュリンおよびプロテインＣを産生する安定な細胞株を、タンパク質産生のために、３００cm２フラスコ中の、１０％ＦＣＳ、５０μMメトトレキセート、１００U/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン、および５μg/mlビタミンＫ１（インシュリンについては含まない）の補充されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で維持した。対象のタンパク質を含む培地を４８時間毎に収集した。ベンズアミジンおよびＰＭＳＦをそれぞれ１０mMおよび２mMの最終濃度となるまで加え、そして培地を遠心分離にかけ（６０００ｇ）、セルロースアセテート膜（０．４５μm）上を通過させて、細胞片を排除し、そして使用するまで−２０℃で保存した。馴化培地を３７℃で解凍した。ＥＤＴＡを５mMの最終濃度となるまで加えた。培地を希釈水およびトリス（ｐＨ７．４）中で希釈し、最終のトリスおよびＮａＣｌ濃度をそれぞれ２５mMおよび６０mMとした。その後、混合物を３０分間室温でＱＡＥセファデックスＡ−５０ビーズと共に撹拌して、０．２５％（ｗｔ／ｖ）の最終濃度を達成した。ビーズを洗浄し、その後、５０mMトリス（ｐＨ７．４）、５００mM ＮａＣｌおよび１０mMベンズアミジンを用いて溶出した。溶出画分（ＥＬＩＳＡ）に含まれる組換えタンパク質を直ちに１０mMベンズアミジンを含む２５mMトリス（ｐＨ７．４）および１００mM ＮａＣｌに対して透析し、そして使用するまで−２０℃で保存した。濃縮したタンパク質を３７℃で解凍した。カルシウムを５mMの最終濃度となるまで加えた。組換えタンパク質の精製を、業者の説明に従って、ＨＰＣ−４アガロース(Roche, Meylan, France)を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって実施した。チモーゲンとして使用する１時間前に、第Ｘ因子誘導体を、１mMのＰＭＳＦと共にインキュベーションして、組換えタンパク質の産生または精製中に生じ得る全ての微量の活性化第Ｘ因子を中和した。同じ処理をプロテインＣ誘導体にも適用した。対照実験は、トリス−ＨＣｌ緩衝液中で３０分後に、ＰＭＳＦが完全に加水分解され、そして他の反応に干渉しないであろうことを示した。タンパク質の純度を、還元（１００mMジチオトレイトール、最終濃度）および非還元条件下における組換えタンパク質の１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析、その後の、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いての染色により評価した。第Ｘ因子、インシュリンおよびプロテインＣの同定は、精製組換えタンパク質を還元し、そして１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードした後に行なわれた。分離したタンパク質を、イモビロン膜に転写し、そしてセイヨウワサビペルオキシダーゼでコンジュゲートした第Ｘ因子、インシュリンおよびプロテインＣに対するポリクローナル抗体(Dakopatts, Glostrup, Denmark)を使用してブロッティングした。精製した誘導体をアリコート化し、そして使用するまで−８０℃で保存した。アリコートの濃度は、２８０nmにおけるその吸光度によって推定され、第Ｘ因子、インシュリンおよびプロテインＣの吸光係数（Ｅ２８０nm、０．１％）は１．１６、１．０５および１．４５であると考える。
【０２３６】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの野生型の雄マウス(Janvier, Le Genest-St-Isle, France)を、本研究全体を通じて使用し、そしてこれは８〜９週令であった。飼育および実験は、フランスの規則および欧州共同体の実験ガイドラインによって推奨された通りに行なわれた。２４匹のマウスを各々のクリアランスの調査のために使用した。
【０２３７】
マウスにおける第Ｘ因子誘導体のクリアランス、回収率および体内分布
麻酔をかけていないマウスを拘束装置に入れ、そしてその尾を４０℃の水浴に３分間浸した。その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で５０μg/mlに希釈した第Ｘ因子誘導体２００μlをマウスの尾静脈に注入した。種々の時点において（注入から２、６、１０、および３０分後、並びに１、２、４および８時間後）、マウスにペントバルビタールナトリウム（６０mg/kg；Ceva Sante Animale, Libourne, France)の腹腔内注入によって麻酔をかけ、そして血液を後眼窩静脈叢から、クエン酸三ナトリウムを含むプラスチックチューブに回収した（９容量の血液に対して１容量の０．１３８Ｍのクエン酸三ナトリウム）。３匹のマウスを各時点において使用し、そして各マウスを１回だけ出血させた。血小板の少ない血漿を得るために、血液試料を１０００ｇで２０分間室温で遠心分離にかけた。血漿中の第Ｘ因子誘導体の濃度を、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中でコーティングしたＨＰＣ−４（Roche）と呼ばれるマウスモノクローナル抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたポリクローナル抗体の抗ヒト第Ｘ因子（Dako）を使用するイムノソルベントアッセイを用いて測定した。ＨＰＣ４のタグの付いた組換え精製および定量した野生型第Ｘ因子（前記参照）を参照として使用した。結果を、注入した組換えヒト第Ｘ因子の比率として表した。体内分布実験および回収率の決定のために、高度に精製された組換えＦＸ変異体を、記載の通りに(Fracker and Speck, BBRC 1978)、Iodo Gen(Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA)を使用してＮａ１２５Ｉ(Perkin-Elmer, Courtaboeuf, France)を用いて標識した。比放射能は、ＦＸ変異体の２〜１０×１０４cpm/μgまで変動した。最終調製物中における遊離ヨウ素は、２０％トリクロロ酢酸を用いての沈降によって決定したところ５％未満であった。回収率は、注入された量に対する注入から５分後の血漿中に存在するＦＸの比率を示す。
【０２３８】
マウスにおけるプロテインＣおよびインシュリンの変異体のクリアランス
各々のプロテインＣおよびインシュリンの変異体について、８周令の２４匹の雄のＷＴマウスを使用する。１匹のマウスあたり、ＰＢＳ中に希釈した１０μgの精製組換えタンパク質を尾静脈を介して注入する。注入後の種々の時点において、マウスをトリブロモエタノール（６０mg/kg（体重））を用いて麻酔し、そして後眼窩静脈からヒルジン(Diagnostica Stago, Asnieres, France)（１００ＵＩ、最終濃度）にサンプリングによって血液を回収する。１時点につき３匹のマウスを使用し、そして各マウスは１回だけ出血させる。血漿を調製し、そしてＥＬＩＳＡによってまたは残留活性によって注入された残留抗原濃度について分析する。
【０２３９】
データ分析
クリアランス曲線は、時間の関数としての注入された量に対する、マウス血漿中の残留第Ｘ因子、プロテインＣおよびインシュリン誘導体抗原の量（注入された濃度の％）を指す。データを、以下のいずれかにあてはめた。
・単一指数関数式：
Ｃｐ＝Ａｅ−αｔ                  式１
・または、双指数関数式：
Ｃｐ＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔ      式２
【０２４０】
パラメーターＡ、α、Ｂおよびβを、KaleidaGraphソフトウェア (KaleidaGraph version 4.02. for Mac OS X, Synergy Software, Reading, USA)を使用して決定した。Ｃｐは、注入された量に対する、血漿中の残留第Ｘ因子誘導体の量を指す。これらのパラメーターは、平均滞留時間（ＭＲＴ）を計算するために必要とされる。
・二相性クリアランス過程において：
ＭＲＴ＝（Ａ／α２＋Ｂ／β２）／（Ａ／α＋Ｂ／β）    式３
・単相性クリアランス機序において：
ＭＲＴ＝（Ａ／α２）／（Ａ／α）                      式４
【０２４１】
さらに、αおよびβを使用して、Ｔ１／２α＝ｌｎ ２／α、およびＴ１／２β＝ｌｎ ２／βを使用して、それぞれ初期相および消失相の半減期を計算した。
【０２４２】
トロンビン生成アッセイ
トロンビン生成を、分注機の具備されたFluoroscan Ascent蛍光光度計(Thermolabsystems OY, Helsink, Finland)でHemker 等(Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, et al. Pathophysiol Haemost Thromb 2003; 33:4-15)によって記載された方法に従って測定した。簡潔に言うと、食塩水（対照）または指定した濃度の抗凝固剤のフォンダパリニクス(Arixtra（登録商標）, GlaxoSmithKline, Brentford, UK)および種々の濃度の組換え第Ｘ因子誘導体の補充された８０μlの血漿を、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中に分注した。ＴＦ（組換えの脂質化されたヒト組織因子、Innovin（登録商標）、Dade Behringから入手）およびリン脂質（ＰＬ）小胞を含む２０μlの混合物を血漿試料に加えて、最終濃度１pMのＴＦおよび４μMのＰＬ小胞を得た。Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）およびＬ−α−ホスファチジルコリン（ＰＣ）(Avanti Polarlipids, Albaster, Alabama, USA)から調製し、１００nmの公称直径（ＰＣ：ＰＳ、３：１）のＰＬ小胞を、膜押出法(Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., and Papahadjopoulos, D. (1979) Biochim Biophys Acta 557(1), 9-23)によって合成した。リン脂質の濃度をホスフェート分析によって決定した。最後に、蛍光発生基質およびＣａＣｌ２を含む２０μlの出発試薬の添加によって、トロンビンの生成をトリガーした。蛍光発生基質Ｉ−１１４０（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）はBachem AG (Bubendorf, Switzerland)からであった。凝固血漿中におけるトロンビン生成の動態を、６０分間３７℃で較正自動化トロンボグラムを使用してモニタリングし、そしてThrombinoscope（登録商標）ソフトウェア(Thrombinoscope B.V., Maastricht, the Netherlands)を使用して分析した。３つのウェルが各実験のために必要とされ、２つのウェルは血漿試料のトロンビン生成を測定するためのものであり、１つのウェルは検量のためであった。全ての実験は三重に行なわれ、そして平均値が報告された。内因性トロンビン生成能（ＥＴＰ）、すなわち曲線下面積、トロンビン生成ピークおよびトロンビン検出のためのラグタイムを決定した。
【０２４３】
結果
組換え野生型第Ｘ因子の二相性クリアランス
血漿からの第Ｘ因子のクリアランスを調査するために、マウスに、組換え野生型第Ｘ因子を静脈内注入した。注入後の指定した時点において、マウスを出血させ、そして血漿を第Ｘ因子抗原について分析した。注入後の時間の関数としての抗原値のグラフ表示は、野生型第Ｘ因子が、それぞれ４３分および３０５分という急速な半減期および遅い半減期によって特徴付けられる二相性クリアランスで血液から消失したことを示した（図６）。さらに、ＭＲＴは、３８０分間であると計算された（表ＩＩ）。
【０２４４】
【表２】
0005833448.tif 000003
【０２４５】
組換えＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡの単相性クリアランス
第Ｘ因子のクリアランスの動態における活性化ペプチドの役割を決定するために、活性化ペプチドを欠失した第Ｘ因子変異体を設計し、産生しそして精製した。ＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡと呼ばれるこの変異体は、第Ｘ因子活性化ペプチドをもはや有さず、しかしその代わりにフィブリノペプチドＡのカルボキシ末端に対応する１０残基を有する。フィブリノペプチドＡ残基の配列は、ＦＸ活性化ペプチドに存在する対応する残基とは異なる。野生型第Ｘ因子とは対照的に、マウスへの注入後に、ＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡは、見掛け上４０分間の半減期を有する単相性のクリアランスパターンを示した（図７）。さらに、ＭＲＴは、野生型第Ｘ因子と比較して、切断短縮された分子では６倍減少した（表ＩＩ）。結論として、これらのデータは、第Ｘ因子の活性化ペプチドが、血漿中における第Ｘ因子のクリアランス速度に重大な役割を有することを示唆する。
【０２４６】
組換えＦＸ／ＡＰ−ＦＰＡの二相性クリアランス
ＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡのクリアランスパターンおよび薬物動態パラメーターに対して観察される効果は、フィブリノペプチドＡ残基の存在に起因するのではなく、第Ｘ因子活性化ペプチドの欠失に起因することを実証するために、ＦＸ／ＡＰ−ＦｐＡを設計し、産生し、精製し、そして特徴付けた。この第Ｘ因子変異体は、カルボキシ末端においてフィブリノペプチドＡの１０残基に結合された、第Ｘ因子活性化ペプチドの５２残基を含む。精製された変異体を、尾静脈への注入によってマウスに投与した。野生型第Ｘ因子に類似したクリアランスパターンが観察された（図８）。表ＩＩにおいて要約したように、この変異体および野生型ＦＸについて類似した薬物動態パラメーターが得られた。従って、以前に観察された急速なＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡクリアランス速度（前記参照）は、ＦＩＸ配列の存在から独立していたが、ＦＸ活性化ペプチドの５２残基の非存在に起因していた。
【０２４７】
組換えＦＸ／ＡＰ１７６−１９４の二相性クリアランス
第Ｘ因子のクリアランスに寄与する活性化ペプチドの残基を同定することに関心があった。この目的を達成するために、第Ｘ因子活性化ペプチドのカルボキシ末端の僅か１９残基を有するＦＸ／ＡＰ１７６−１９４と呼ばれる第Ｘ因子変異体を構築した。精製した変異体を、尾静脈への注入によってマウスに投与した。マウスを種々の時点で出血させ、そして血漿を第Ｘ因子抗原について分析した。これらの実験は、ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４が、野生型第Ｘ因子と類似した様式で血漿から消失したことを明らかとした（図９）。実際に、類似の薬物動態パラメーターを実験データから計算することができた（表ＩＩ）。これらのデータは、第Ｘ因子活性化ペプチドのカルボキシ末端内の残基が、第Ｘ因子のクリアランス速度において重大な役割を果たしていることを実証する。
【０２４８】
ＦＸの血液循環からのクリアランスにおける活性化ペプチドのＮ−グリコシル化の関与
第Ｘ因子のカルボキシ末端は、２つのＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ１８１および１９１）を含んでいるので、第Ｘ因子の循環寿命におけるこれらの翻訳後修飾の可能性ある役割を、一方または両方のＮ−グリコシル化部位において突然変異したＦＸ／ＡＰ１７６−１９４を使用して研究した。ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ、ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１９１ＡおよびＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ−Ｎ１９１Ａと呼ばれる２つの単一突然変異体および１つの二重突然変異体を産生し、精製し、そしてそのクリアランスを研究した。二重突然変異体のＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ−Ｎ１９１Ａは、野生型第Ｘ因子よりも急速に循環からクリアランスされ、そして興味深いことに、第Ｘ因子の活性化ペプチドを全く含まない第Ｘ因子変異体であるＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡと類似したクリアランスパターンでクリアランスされた（図１０）。表ＩＩに示したように、ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａ−Ｎ１９１ＡおよびＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡについて類似した薬物動態パラメーターが得られた。これらのデータは、活性化ペプチド中の１８１位および１９１位におけるＮ−グリコシル化が、第Ｘ因子の生存において重大な役割を果たしていることを実証する。変異体ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａについて、野生型第Ｘ因子と同じような二相性クリアランスが観察された（図１１）。しかしながら、循環からのその消失は、表ＩＩに示したように野生型ＦＸよりも速かった。変異体ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１９１Ａについては、ＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦｐＡと同じような単相性クリアランスが観察された（図１２）。これに対し、その消失はＦＸ／ｄｅｌＡＰ−ＦＡよりも長かったが、ＦＸ／ＡＰ１７６−１９４−Ｎ１８１Ａと比較して類似したＭＲＴであった。これらのデータは、１８１位におけるＮ−グリコシル化が、第Ｘ因子のクリアランスの単相性パターンに関与し、一方、１９１位におけるＮ−グリコシル化は、二相性パターンに関与していることを示す。さらに、両方のＮ−グリコシル化が、第Ｘ因子の薬物動態パラメーターにおいて重要な役割を果たしている。
【０２４９】
参考文献
本願の全体を通じて、種々の参考文献が、本発明が属する当技術分野の最先端技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５０】
【表３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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