(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヨツバヒヨドリ（Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ  ｇｌｅｈｎｉ）の葉若しくは花の、水及び／又はエタノール抽出物を有効成分とする保湿剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、免疫賦活効果、美白効果を発揮する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、免疫賦活剤、美白剤、及びこれを含有する皮膚外用剤、機能性経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、皮膚の美観を保つことに対する女性の関心は非常に高く、シワ、シミ、タルミなどは女性の肌に対する悩みの上位に常に位置する。これらの悩みのうち、シワやタルミは、加齢等による真皮線維芽細胞の機能低下や、それに伴うコラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの減少や変性、さらには紫外線等の外来ストレスによる酸化障害などが重要な要因となっている。また、もう一方の大きな悩みである、皮膚の色黒は一部不明な点もあるがホルモンの異常や日光の紫外線の刺激によるメラニン色素の産生が原因であり、その中でも、シミやソバカスはメラニン色素が異常沈着することが、その要因である。
【０００３】
これまでの皮膚外用剤の分野では、上述の皮膚の美観を損なうような諸症状を防止、或いは改善するために、さまざまな細胞賦活剤や抗酸化剤、メラニン産生抑制剤の検索及び配合検討が成されてきた。
【０００４】
例えば、細胞賦活剤としては、ポンカンのエッセンス（特許文献１参照）、ツリガネニンジン属、クサギ及びそれらの抽出物（特許文献２参照）、有機溶媒によるクロレラ抽出物（特許文献３参照）等、抗酸化剤としては、キク科ヘテロテカ属植物抽出物（特許文献４参照）やカユンアンギンの抽出物（特許文献５参照）等、さらにメラニン産生抑制剤としては、ホンダワラの抽出物（特許文献６参照）、ショウガ属植物の抽出物（特許文献７参照）等が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献２】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献３】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献４】特開平１１−１８０８８６号公報
【特許文献５】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献６】特開平１０−３３０２２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などが皮膚外用剤や機能性経口組成物品などの分野に幅広く応用されている。しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿作用、抗老化作用作用、抗酸化作用、免疫賦活作用、美白作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。本発明は、このような有効成分を見出すためになされたものであり、皮膚外用剤や機能性経口組成物などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、アルギナーゼ活性促進剤、肌荒れ防止、改善剤、抗炎症剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、免疫賦活剤、美白剤を見出すために、天然由来の種々の物質について検討を行った。その結果、ヨツバヒヨドリ抽出物に優れた、保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、免疫賦活作用、美白作用を見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ヨツバヒヨドリ抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、免疫賦活剤、美白剤、及びこれを含有する皮膚外用剤、機能性経口組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、優れた効果を有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、免疫賦活剤、美白剤、及びこれを含有する皮膚外用剤、機能性経口組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に用いられるヨツバヒヨドリ（Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ ｇｌｅｈｎｉ）は、キク科ヒヨドリバナ属の植物であり、北海道、本州、四国、サハリン、千島列島に分布する。
【００１０】
本発明におけるヨツバヒヨドリの抽出物には、ヨツバヒヨドリの原体や乾燥物も抽出物に含まれるが、各種溶媒を用いて抽出した抽出物を用いるのが好ましい。抽出には、ヨツバヒヨドリの葉、花、種子、根、茎、芽などのいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、葉、茎、芽を用いるとよい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬するか、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌や抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１１】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。
【００１２】
ヨツバヒヨドリの上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもでき、これらの生理作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理やカラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。ヨツバヒヨドリの前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶解して用いることもできる。
【００１３】
ヨツバヒヨドリ抽出物は、優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、免疫賦活作用、美白作用を有し、ヨツバヒヨドリ抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、免疫賦活剤、美白剤並びにこれらを含有する皮膚外用剤として利用することができる。ヨツバヒヨドリ抽出物を有効成分とする保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、免疫賦活剤、美白剤は、皮膚に外用するだけではなく、毛髪に利用することや経口摂取も可能であり、食品、飲料、あるいは医薬品などの機能性経口組成物にも応用することが可能である。
【００１４】
ヨツバヒヨドリの抽出物を皮膚外用剤や機能性経口組成物に配合する際の配合量は、皮膚外用剤や機能性経口組成物の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して、０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜２０．０質量％である。
【００１５】
ヨツバヒヨドリの抽出物を配合する皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系，カラミンローション等の分散系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填したエアゾール，リップスティック，ファンデーションなどの種々の剤型で提供することもできる。
【００１６】
なお、上記抽出物を配合する皮膚外用剤には、これらの抽出物の他に必要に応じて、通常医薬品，医薬部外品，皮膚化粧料，毛髪用化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分，保湿剤，粉体，色素，乳化剤，可溶化剤，洗浄剤，紫外線吸収剤，増粘剤，薬剤，香料，樹脂，防菌防黴剤，アルコール類等を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤との併用も可能である。
【００１７】
また、ヨツバヒヨドリの抽出物を配合する機能性経口組成物の剤型は任意であるが、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの種々の剤型で提供することもでき、必要に応じて、医薬品・医薬部外品・食品などに配合される、油性成分，保湿剤，粉体，乳化剤，可溶化剤，増粘剤，薬剤，香料，防菌防黴剤，アルコール類，砂糖，練乳，小麦粉，食塩，ブドウ糖，鶏卵，バター，マーガリン，水飴，カルシウム，鉄分，調味料，香辛料、ビタミンＡ及びそれらの誘導体、カロテノイド類、リボフラビン及びその誘導体、ビタミンＢ類及びそれらの塩若しくは誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、コバラミン類、ビタミンＥ及びそれらの誘導体、ビタミンＫ、アデノシン及びその誘導体、フラボノイド類及びタンニン類を配合することもできる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤との併用も可能である。
【００１８】
以下に、ヨツバヒヨドリの抽出物の製造例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤や食品としての処方例、使用試験について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
［抽出方法１］
ヨツバヒヨドリを乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の５０質量％エタノールを加え、室温で撹拌しながら２時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、エタノール抽出物を得た。
【００２０】
［抽出方法２］
ヨツバヒヨドリを乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の精製水を加え、オートクレーブにより２０分間、１２０℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、熱水抽出物を得た。
【００２１】
［抽出方法３］
超臨界抽出装置に乾燥、粉砕したさせたヨツバヒヨドリを投入し、４０℃において１５ＭＰａの気圧下で二酸化炭素の超臨界流体を用いて抽出した。抽出物を回収し、超臨界抽出物を得た。
【００２２】
表１に示すヨツバヒヨドリ抽出物を用いて、保湿作用（保湿作用、アルギナーゼ活性促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用）、抗老化作用（真皮線維芽細胞賦活作用、真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用、表皮角化細胞コラーゲン産生促進作用）、抗酸化作用（ＤＰＰＨラジカル消去作用、ＳＯＤ様活性作用）、免疫賦活作用、美白作用（チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用）の評価を行った。なお各評価結果に記載した*及び**は、ｔ−検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を*で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を**でそれぞれ表したものである。
【００２３】
【表１】
0005656348.tif 000002
【００２４】
［保湿作用の評価］
保湿作用の評価は、表１に示すヨツバヒヨドリ抽出物を試料とし、健常人前腕部を用いて行った。各試料を前腕部３×４ｃｍ2の範囲に２４μＬずつ塗布し、塗布前、塗布１５分後、３０分後、６０分後、及び１２０分後の角質水分量を測定した。角質水分量の測定は、ＳＫＩＣＯＮ−２００（アイ・ビイ・エス株式会社製）を用い、各塗布部位の５点における角質水分量を測定した。塗布部５点の測定値を平均し、塗布前の角質水分量を１とした相対値で表２に示した。また、精製水をネガティブコントロール、一般的な保湿剤であるグリセリン（0.1％水溶液）をポジティブコントロールとして同様に評価を行った。結果は、表２に示したとおりであり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高い保湿作用が認められた。
【００２５】
【表２】
0005656348.tif 000003
【００２６】
［表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用］
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ細胞）を１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５質量％添加したものを用いた。２４時間後１．２ｍＭＣａＣｌ2を含む５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地によって、各濃度に調整した抽出物２を含有するサンプル液に交換しさらに９日間培養した。培地は３日に１回交換した。培養終了後、培養上清を採取し、アルギナーゼ活性促進能の評価を行った。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチンと尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールの吸収（５７０ｎｍ）を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。尿素定量のため、和光純薬社製尿素窒素Ｂ−テストワコーを用いて測定を行い、検量線を作成した。また、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔにて、各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量あたりのアルギナーゼ活性促進能を求めた。サンプルを添加しないブランクの値を１００とした時の相対値により、アルギナーゼ活性促進能を評価した。結果は、表３に示した通りであり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いアルギナーゼ活性促進作用が認められた。
【００２７】
【表３】
0005656348.tif 000004
【００２８】
［ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５重量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表４に示す濃度になるように抽出物６を添加したサンプル培養液に交換し、さらに３日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、プロテオグリカンを用いた間接ＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にてヒアルロン酸産生促進作用の評価を行った。その結果表４に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
【００２９】
【表４】
0005656348.tif 000005
【００３０】
表２，３，４に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物は、保湿作用、アルギナーゼ活性促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用を示すことから、皮膚に対し高い保湿効果を発揮する。
【００３１】
［ヒト真皮線維芽細胞賦活作用］
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表５に示す濃度に調整した抽出物２を含有する培養液に交換し、さらに４８時間培養した。次に４００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。線維芽細胞賦活作用は、抽出物２無添加のブランクにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて評価を行った。その結果表５に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
【００３２】
【表５】
0005656348.tif 000006
【００３３】
［真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表６に示す濃度に調整した抽出物２を含有する培養液に交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲンの定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。評価結果は抽出物２無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて評価した。その結果、表６に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高い真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用が認められた。
【００３４】
【表６】
0005656348.tif 000007
【００３５】
［ヒト表皮角化細胞タイＩＶコラーゲン産生促進作用］
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表７に示す濃度に調整した抽出物３を含有する培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩＶラーゲンの定量には、タイプＩＶラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α２鎖）及びビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、最後はアビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼに対し３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを添加し反応させた後、６５０ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのＩＶコラーゲン産生量を求めた。評価結果は、抽出物３無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩＶコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて評価した。その結果、表７に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いヒト表皮角化細胞におけるタイプＩＶコラーゲン産生促進作用が認められた。
【００３６】
【表７】
0005656348.tif 000008
【００３７】
表５〜７に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物は、ヒト真皮線維芽細胞賦活作用、真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用、ヒト表皮角化細胞におけるタイプＩＶコラーゲン産生促進作用を示すことから、高い抗老化効果を発揮する。
【００３８】
［ＤＰＰＨラジカル消去作用］
５０重量％エタノールによって表８に示した濃度に調整した抽出物２を含有する溶液１００μＬに、０．２ｍＭ  １，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液１００  μＬを添加し、よく混合した後、室温、暗所にて１０分間静置し、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。抽出物２無添加時の吸光度を（Ａ）、抽出物２添加時の吸光度を（Ｂ）とした時の、ＤＰＰＨラジカル消去率を次式により算出した。その結果、表８に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いＤＰＰＨラジカル消去作用が認められた。
消去率（％）＝｛１  −（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
【００３９】
【表８】
0005656348.tif 000009
【００４０】
[ＳＯＤ様活性の評価（スーパーオキサイドアニオン消去作用）]
０．２５  ｍＭ  ＷＳＴ−１及び  １  ｍＭ  Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅを含むＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液  ７５μＬに、ＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液にて表９に示した濃度に調整した抽出物１を含有する溶液２５μＬを添加した。さらに、Ｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ２５μＬ（０．００７５  Ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７℃にて１５分間反応後、４５０  ｎｍの吸光度を測定した。抽出物１無添加時の吸光度を（Ａ）、抽出物１添加時の吸光度を（Ｂ）とした時、スーパーオキサイドアニオン消去率を次式により算出した。その結果、表９に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いスーパーオキサイドアニオン消去作用が認められた。
消去率（％）＝｛１  −（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
【００４１】
【表９】
0005656348.tif 000010
【００４２】
表８及び表９に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物はＤＰＰＨラジカル消去作用及びスーパーオキサイドアニオン消去作用を示すことから、高い抗酸化効果を発揮する。
【００４３】
［免疫細胞賦活作用（ヒト急性単球白血病細胞株を用いた細胞賦活作用）］
ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を１ウェル当り５．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には1質量％のＦＢＳを添加したＲｐｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）を用いた。24時間後、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）を２０ｎｇ／ｍＬとなるように細胞培養液に添加した。さらに２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地にて各濃度に調整した抽出物３を含有するサンプル培養液に交換し、４８時間培養した。次に生細胞数測定試薬ＳＦ（同仁化学研究所）１／１０量を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を、上清を除いた細胞に添加し、２時間培養した。混合後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。抽出物３無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて細胞賦活作用を算出した。その結果表１０に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高い免疫細胞賦活作用が認められた。
【００４４】
【表１０】
0005656348.tif 000011
【００４５】
［ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用］
正常ヒト表皮メラニン細胞を１ウェル当り３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＭｅｄｉｕｍ  ２５４Ｓを用いた。２４時間後、Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４Ｓによって表１１に示す濃度に調整した抽出物３を含有する培養液に交換し、さらに４８時間培養した。次に１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するリン酸緩衝液７５μＬに交換し、細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に基質となる５０μＬの０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液を加え、３７℃で２時間静置した。基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量は両測定値の差を次式に導入して求めた。
生成されたドーパメラニン量
＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）−２．１６６｝／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量を求めた。評価結果は抽出物３無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量と比較した。表１１に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用が認められた。
【００４６】
【表１１】
0005656348.tif 000012
【００４７】
［Ｂ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表１２に示した濃度に調整した抽出物７含有培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記評価基準を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに５％重量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロールに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５％重量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。これらの肉眼判定結果は判定５及び判定１とし、サンプル判定の指標とした。肉眼判定は下記に示す通り、５段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。その結果、表１２に示したとおりヨツバヒヨドリ抽出物には、高いメラニン産生抑制作用が認められた。
評価基準
判定１：ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白色）
判定２：ポジティブコントロールより僅かに黒い（薄い褐色）
判定３：ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
判定４：ネガティブコントロールより僅かに白い（黒褐色）
判定５：ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒色）
【００４８】
【表１２】
0005656348.tif 000013
【００４９】
表１１及び表１２に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物はヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用及びメラニン産生抑制作用を示すことから、高い美白効果を発揮する。
【００５０】
続いて、本発明に係るヨツバヒヨドリの抽出物を配合した組成物として、皮膚外用剤と機能性経口組成物の処方例を示す。
【００５１】
［処方例１］乳液
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン                      ４．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）    １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        １．０
（７）グリセリン                                        ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー                          ０．１５
（10）精製水                                          ５３．８５
（11）アルギニン（１質量％水溶液）                    ２０．０
（12）抽出物４                                          ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【００５２】
［処方例２］化粧水
（１）エタノール                                      １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    ０．３
（３）香料                                              ０．１
（４）精製水                                          ７８．３８
（５）クエン酸                                          ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム                                ０．１
（７）グリセリン                                        １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース                        ０．１
（９）抽出物４                                          ５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００５３】
［処方例３］クリーム
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸                                      ２．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）セタノール                                        ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（７）グリセリン                                      １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液）                  １５．０
（10）精製水                                          ３６．７
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １５．０
（12）抽出物１                                          ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（11）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００５４】
［処方例４］美容液
（１）精製水                                          ２７．４５(質量％)
（２）グリセリン                                      １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液)            １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル                      １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル            ３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル）          ２．０
（９）硬化パーム油                                      ２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来）                        １．０
（11）ベヘニルアルコール                                ０．７５
（12）ミツロウ                                          １．０
（13）ホホバ油                                          １．０
（14）１、３−ブチレングリコール                      １０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液）                ２．０
（16）抽出物４                                          ５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（15）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（16）を加え、均一に混合する。
【００５５】
［処方例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー                          ０．５（質量％）
（２）精製水                                          ７８．７
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液）              ０．５
（４）エタノール                                      １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（６）香料                                              ０．１
（７）抽出物１                                        １０．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    ０．１
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００５６】
［処方例６］クレンジング料
（１）スクワラン                                      ７７．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル    １５．０
（３）精製水                                            ３．０
（４）抽出物４                                          ５．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。
【００５７】
［処方例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸                                    １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸                                    １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（４）グリセリン                                      ２０．０
（５）水酸化ナトリウム                                  ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン                １．０
（７）精製水                                          ３１．５
（８）抽出物５                                          ６．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００５８】
［処方例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン                                      １０．２(質量％)
（２）セタノール                                        ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル      ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル                  １．０
（５）プロピレングリコール                            １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（７）精製水                                          ６５．４
（８）酸化チタン                                        １．０
（９）ベンガラ                                          ０．１
（10）黄酸化鉄                                          ０．４
（11）香料                                              ０．１
（12）抽出物２                                          ５．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００５９】
［処方例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン                              ２．０(質量％)
（２）スクワラン                                        ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル                      ５．０
（４）セタノール                                        １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル              １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        ０．７
（７）１、３−ブチレングリコール                        ８．０
（８）キサンタンガム                                    ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（10）精製水                                          ５３．４
（11）酸化チタン                                        ９．０
（12）タルク                                            ７．４
（13）ベンガラ                                          ０．５
（14）黄酸化鉄                                          １．１
（15）黒酸化鉄                                          ０．１
（16）香料                                              ０．１
（17）抽出物４                                          ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００６０】
［処方例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン                                  ３０．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス                      ２．０
（３）ワセリン                                          ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル                    ５．０
（５）塩化ナトリウム                                    １．３
（６）塩化カリウム                                      ０．１
（７）プロピレングリコール                              ３．０
（８）１、３−ブチレングリコール                        ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（10）抽出物５                                          ５．０
（11）精製水                                          ４３．４
（12）香料                                              ０．１
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（10）を（11）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００６１】
［処方例１１］パック
（１）精製水                                          ５８．９(質量％)
（２）ポリビニルアルコール                            １２．０
（３）エタノール                                      １７．０
（４）グリセリン                                        ５．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）      ２．０
（６）抽出物１                                          ５．０
（７）香料                                              ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００６２】
［処方例１２］入浴剤
（１）香料                                              ０．３(質量％)
（２）抽出物４                                          ５．０
（３）炭酸水素ナトリウム                              ４６．０
（４）硫酸ナトリウム                                  ４８．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００６３】
［処方例１３］飲料
（１）抽出物４                                          ８．０(質量％)
（２）エリスリトール                                    １．０
（３）クエン酸                                          ０．１
（４）ステビア                                          ０．０１
（５）精製水                                          ９０．８９
製法：（１）〜（５）を均一に混合する。
【００６４】
［処方例１４］錠剤
（１）抽出物４                                          ０．３０（質量部）
（２）還元麦芽糖水飴                                    ０．５３
（３）トウモロコシデンプン                              ０．１５
（４）グリセリン脂肪酸エステル                          ０．０２
製法：（１）〜（３）を篩過して混合し、さらに（４）を添加して混合した。打錠機にて打錠を行い、全量３００ｍｇの錠剤を得た。