(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のものからなる群から選択される、Ｂ．ミクロチに対する抗体の存在を同定するための物質：
（ａ）ペプチドの第一の群を含む複数のペプチド
（ここで、（ｉ）ペプチドの第一の群は、以下の（ａ’）又は（ｂ’）の組み合わせを含み、
（ａ’）配列番号７の配列を有するペプチドと、少なくとも1つの、配列番号５、６、８、９、１０および１１から成る群から選択される配列を有するペプチドとを含む、第一の組み合わせ；
（ｂ’）配列番号７の配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチドと、少なくとも1つの、配列番号５、６、８、９、１０および１１から成る群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するペプチドとを含む、第二の組み合わせであって、各々のペプチドは、Ｂ．ミクロチに対する抗体を検出することができる、前記第二の組み合わせ；および
（ｉｉ）ペプチドの第一の群の各ペプチドは、５０以下のアミノ酸を含む。）；
（ｂ）（ａ）の複数のペプチドを含むキメラタンパク質；及び
（ｃ）第一の部分及び第二の部分を含む融合タンパク質（第一の部分は、（ｂ）のタンパク質であり、第二の部分は、結合メンバーであり、但し、結合メンバーは同種結合パートナーへの特異的結合を有する。）。
【請求項２】
ペプチドの第一の群が、配列番号５で記載される配列を有するペプチド、配列番号６で記載される配列を有するペプチド、配列番号７で記載される配列を有するペプチド、配列番号８で記載される配列を有するペプチド、配列番号９で記載される配列を有するペプチド、配列番号１０で記載される配列を有するペプチド、及び配列番号１１で記載される配列を有するペプチドを含む、請求項１に記載の物質。
【請求項３】
配列番号２の配列をさらに含む、請求項１（ｂ）に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
配列番号４の配列をさらに含む、請求項１（ｃ）に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１（ｂ）に記載のタンパク質である第三の部分をさらに含む、請求項１（ｃ）に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
（ｉ）請求項１に記載の（ａ）の前記複数のペプチド、
（ｉｉ）請求項１に記載の（ｂ）の前記キメラタンパク質又は
（ｉｉｉ）請求項１に記載の（ｃ）の前記融合タンパク質
の少なくとも１つをコードする、単離核酸。
【請求項７】
配列番号１に記載の配列を含む、請求項６に記載の単離核酸。
【請求項８】
配列番号３の配列を含む、請求項６に記載の単離核酸。
【請求項９】
発現調節配列に操作可能に連結される請求項６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１０】
前記発現調節配列がプロモーターである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の発現ベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の物質を含む、固体支持体。
【請求項１３】
ニトロセルロース、ナイロン、プラスチック及び紙からなる群から選択される、請求項１２に記載の固体支持体。
【請求項１４】
請求項１に記載の物質を含む、診断キット。
【請求項１５】
（ａ）物質／抗体複合体を形成するのに十分な時間にわたり、及び十分な条件下で、請求項１に記載の物質と試験試料を接触させ；
（ｂ）該物質／抗体複合体の存在を検出する（該複合体の存在は、該試験試料中でのＢ．ミクロチ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に対する抗体の存在を示す。）、
段階を含む、試験試料中のＢ．ミクロチに対する抗体の存在を検出する方法。
【請求項１６】
前記試験試料が、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液及び尿からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記物質が固体支持体に連結される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）物質／抗体複合体を形成するのに十分な時間にわたり、及び十分な条件下で、請求項１に記載の物質と試験試料を接触させ；
（ｂ）結合抗体にコンジュゲートが結合できるようにするのに十分な時間にわたり、及び十分な条件下で、得られた物質／抗体複合体にコンジュゲートを添加し（該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に連結される抗−抗体を含む。）；
（ｃ）該シグナル生成化合物により生成されるシグナルを検出することによって該試料中に存在し得る抗体の存在を検出する（該シグナルの存在は、該試験試料中でのＢ．ミクロチ抗体の存在を示す。）、
段階を含む、試験試料中のＢ．ミクロチに対する抗体を検出する方法。
【請求項１９】
前記試験試料が血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液及び尿からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
物質が固体支持体に連結される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生生物バベシア・ミクロチ（Ｂ．ミクロチ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ））に対する抗体の存在を同定するための組成物及びこれを診断するアッセイ及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ．ミクロチ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は、バベシア症と呼ばれるマラリア様疾患を引き起こす、感染個体の赤血球細胞に存在するダニ媒介性寄生生物である（Ｈｏｍｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３（３）：４５１−４６９（２０００））。Ｂ．ミクロチは、感染したダニの咬傷によりヒトに伝染し得るが、報告数が急増している（Ｋｒａｕｓｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．６８（４）：４３１−４３６（２００３）；Ｈｅｒｗａｌｄｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ感染している血液供給者から血液又は血液製剤の受容者への輸血によっても伝染し得るので、血液供給に対する潜在的リスクである。（Ｓｅｔｔｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２０：５５４−５５９（２００３））。Ｂ．ミクロチによる感染は、野生動物及び家畜及びヒトの間で世界的に最もよく見られる寄生虫感染症の１つである（Ｈｏｍｅｒら、前出）。米国で、特に北東海岸の州及び中西部の北部で、Ｂ．ミクロチ感染の症例の．Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．５３（２）：１４６−５１（１９９５））。血液供給者の間でのＢ．ミクロチの血清陽性率の推定値は、ウィスコンシンの供給者の０．３％からニューヨークのシェルターアイランドの４．３％である（Ｃａｂｌｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １０（６）：４０５−４１１（２００３））。
【０００３】
Ｂ．ミクロチによる感染は、ライム病との同時感染を含むことが多く（Ｋｒａｕｓｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３４：１１８４−１１９１（２００２））、長期間、未検出のままであることも多い。バベシア症は、特に高齢者及び、免疫系が抑制されている患者において、致死となる可能性がある（Ｋｊｅｍｔｒｕｐら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ３０：１３２３−１３３７（２０００））。バベシア症及び／又はライム病に感染した患者は、筋肉痛、発熱、頭痛及び倦怠感という同じ症状を共有し（Ｈｏｍｅｒら）、従って診断が困難である。キニーネ及びクリンダマイシンなどの抗マラリア薬は、バベシア症の治療において最も有効である（Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔ．Ｄｒｕｇｓ  Ｔｈｅｒ．３４（８６５）：１７−２６（１９９２））。従って、Ｂ．ミクロチ感染の正確な早期診断は重要な意味を持つ。
【０００４】
顕微鏡、ＰＣＲ、間接的免疫蛍光アッセイ、核酸試験及びＥＬＩＳＡに基づく試験は、Ｂ．ミクロチ感染の診断において使用されることが多い。（Ｌｏａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４９：３８５−３８９（２００４））。血液試料の顕微鏡及びＰＣＲ分析により、患者が病院を最初に訪れた際、偽陰性の結果がもたらされ得る。Ｂ．ミクロチに対するヒトからの血清試料のハイスループット試験は、核酸試験に対して適切ではない。Ｂ．ミクロチの免疫原性エピトープの多くはマラリアなどのその他の抗体と交差反応するので（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４２（１１）：１４８８−９６（２００２））、Ｂ．ミクロチの抗体を検出するためのＥＬＩＳＡは、特にＢ．ミクロチに対する抗体が低力価である場合、感度及び特異性が容認できないものであるため、有効ではない可能性がある。従って、Ｂ．ミクロチに対する抗体を検出するために、組成物を開発することが現在も非常に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｏｍｅｒ他、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３（３）、２０００年、ｐ．４５１−４６９
【非特許文献２】Ｓｅｔｔｙ他、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２０、２００３年、ｐ．５５４−５５９
【非特許文献３】Ｋｒａｕｓｅ他、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．６８（４）、２００３年、ｐ．４３１−４３６
【非特許文献４】Ｈｅｒｗａｌｄｔ他、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．５３（２）、１９９５年、ｐ．１４６−５１
【非特許文献５】Ｃａｂｌｅ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １０（６）、２００３年、ｐ．４０５−４１１
【非特許文献６】Ｋｒａｕｓｅ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３４、２００２年、ｐ．１１８４−１１９１
【非特許文献７】Ｋｊｅｍｔｒｕｐ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ３０、２０００年、ｐ．１３２３−１３３７
【非特許文献８】Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔ．Ｄｒｕｇｓ  Ｔｈｅｒ．３４（８６５）、１９９２年、ｐ．１７−２６
【非特許文献９】Ｌｏａ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４９、２００４年、ｐ．３８５−３８９
【非特許文献１０】Ｈｏｕｇｈｔｏｎ他、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４２（１１）、２００２年、ｐ．１４８８−９６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書中で、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）（Ｂ．ミクロチ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ））に対する抗体の存在を同定するために使用され得る作用物質が提供される。この作用物質は、ペプチドの第一の群及びペプチドの任意の第二の群を含む複数のペプチドを含み得る。第一の群の各ペプチドは、ＢＭＮ１−１７−４、ＢＭＮ１−１７−１１、ＢＭＮ１−１７−１２、ＭＮ１０−３、ＭＮ１０−５、ＭＮ１０−６、ＭＮ１０−８又はそれと少なくとも７０％同一である配列からなる群から選択されるペプチド配列を含み得る。第一の群の各ペプチドはまた、配列番号５−１１で記載される各配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列も含み得る。
【０００７】
この作用物質は、第一の群及び場合によっては第二の群からの複数のペプチドを含むキメラタンパク質であり得る。本キメラタンパク質は、配列番号２で記載のとおりの配列を含み得る。この作用物質はまた、第一の部分及び第二の部分を含む融合タンパク質でもあり得、第一の部分は、第一の群からの複数のペプチドを含むキメラタンパク質であり、第二の部分は結合メンバーである。融合タンパク質は、配列番号４で記載されるとおりの配列を含み得る。本融合タンパク質は、第三の部分をさらに含み得、この第三の部分は、複数のペプチドを含むキメラタンパク質を含む。
【０００８】
本明細書中で、複数のペプチド又はこれらのペプチドの１以上をコードする核酸もまた提供される。この複数のペプチドは、ペプチドの第一の群及び任意のペプチドの第二の群を含み得る。第一の群の各ペプチドは、ＢＭＮ１−１７−４、ＢＭＮ１−１７−１１、ＢＭＮ１−１７−１２、ＭＮ１０−３、ＭＮ１０−５、ＭＮ１０−６、ＭＮ１０−８又はそれと少なくとも７０％同一である配列からなる群から選択されるペプチド配列を含み得る。本核酸は、配列番号５−１１で記載されるとおりの配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列を含む第一の群の１以上のペプチドをコードし得る。
【０００９】
核酸はまた、ペプチドの第一の群からの複数のペプチドを同様に含み得るキメラタンパク質もコードし得る。キメラタンパク質をコードする核酸は、配列番号１で記載されるとおりの配列を含み得る。核酸はまた、第一の部分及び第二の部分を含む融合タンパク質もコードし得、ここで、第一の部分は、第一の群からの複数のペプチドを含むキメラタンパク質であり、第二の部分は結合メンバーである。融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号３で記載されるとおりの配列を含み得る。
【００１０】
核酸を含むベクター及び宿主細胞もまた本明細書中で提供される。発現ベクターは、上記の核酸の１以上を含み得、発現又は制御調節配列（例えばプロモーター）に操作可能に連結され得る。
【００１１】
試験試料中でＢ．ミクロチに対する抗体を検出する方法もまた本明細書中に記載される。本方法は、作用物質／抗体複合体を形成させるのに十分な時間にわたり、及び十分な条件下で、上述のような作用物質と試料を接触させ、複合体の存在を検出する（複合体の存在は、試験試料中でのＢ．ミクロチに対する抗体の存在を示す。）ことを含み得る。本方法は、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液及び尿からなる群から選択される試料を使用することを含み得る。さらに、本方法はまた、本明細書中で記載のような作用物質を使用することも含み得るが、この作用物質は固体支持体に連結され、この固体支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、プラスチック及び紙からなる群から選択される。
【００１２】
本発明はまた、試験試料中でＢ．ミクロチに対する抗体を検出する別の方法も包含する。この方法は、作用物質／抗体複合体を形成させるのに十分な時間にわたり、及び十分な条件下で、上記のような作用物質と試験試料を接触させ；結合抗体にコンジュゲートが結合できるようになるために十分な時間にわたり、及び十分な条件下で、得られた作用物質／抗体複合体にコンジュゲートを添加し（コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に連結される抗−抗体を含む。）；シグナル生成化合物により生成されるシグナルを検出することによって試料中に存在し得る抗体の存在を検出する、段階を含む。コンジュゲートは、例えば、抗−ヒトＩｇＧ抗体又は、作用物質−抗ミクロチ複合体に結合することができる化合物を含み得る。シグナル生成化合物は標識であり得る。
【００１３】
本明細書中で、本明細書中の方法で記載されるように、Ｂ．ミクロチ抗体の存在を検出し；抗ミクロチ抗体の量を対照と比較することを含む、対象におけるＢ．ミクロチ感染を診断する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は、Ｂ．ミクロチ感染後のヒト抗体反応の強度及び特異性に基づく、２つの異なるＢ．ミクロチタンパク質からの７種類のペプチド（即ち、ＢＭＮ１−１７−４（配列番号５）、ＢＭＮ１−１７−１１（配列番号６）、ＢＭＮ１−１７−１２（配列番号７）、ＭＮ１０−３（配列番号８）、ＭＮ１０−５（配列番号９）、ＭＮ１０−６（配列番号１０）及びＭＮ１０−８（配列番号１１））を含有する単一のキメラコンストラクト挿入物を示す（配列番号３として開示される全長ヌクレオチド；配列番号４として開示される全長タンパク質コンストラクト）。ボックスにより囲まれるアミノ酸配列はＢ．ミクロチペプチドセグメントである。５’末端から、Ｂａｂ−１配列の配列は、ＢＭＮ１−１７−４と続いてＢＭＮ１−１７−１１のアミノ酸配列をコードし、ＢＭＮ１−１７−１１の最後の５つのアミノ酸（ＧＮＬＮＫ）（配列番号１４）は、ＢＭＮ１−１７−１２の最初の５つのアミノ酸と重複する。Ｂ．ミクロチアミノ酸配列ＭＮ１０−３がＢＭＮ１−１７−１２に続き、ＭＮ１０−５がＭＮ１０−３続く。ＭＮ１０−５の最後の５つのアミノ酸（即ちＴＥＳＧＧ）（配列番号１５）は、ＭＮ１０−６の最初の５つのアミノ酸と重複する。Ｂ．ミクロチアミノ酸配列ＭＮ１０−８がＭＮ１０−６に続く。Ｈｉｓタグ配列は、キメラタンパク質の３’末端に位置する。
【図１Ｂ】図１は、Ｂ．ミクロチ感染後のヒト抗体反応の強度及び特異性に基づく、２つの異なるＢ．ミクロチタンパク質からの７種類のペプチド（即ち、ＢＭＮ１−１７−４（配列番号５）、ＢＭＮ１−１７−１１（配列番号６）、ＢＭＮ１−１７−１２（配列番号７）、ＭＮ１０−３（配列番号８）、ＭＮ１０−５（配列番号９）、ＭＮ１０−６（配列番号１０）及びＭＮ１０−８（配列番号１１））を含有する単一のキメラコンストラクト挿入物を示す（配列番号３として開示される全長ヌクレオチド；配列番号４として開示される全長タンパク質コンストラクト）。ボックスにより囲まれるアミノ酸配列はＢ．ミクロチペプチドセグメントである。５’末端から、Ｂａｂ−１配列の配列は、ＢＭＮ１−１７−４と続いてＢＭＮ１−１７−１１のアミノ酸配列をコードし、ＢＭＮ１−１７−１１の最後の５つのアミノ酸（ＧＮＬＮＫ）（配列番号１４）は、ＢＭＮ１−１７−１２の最初の５つのアミノ酸と重複する。Ｂ．ミクロチアミノ酸配列ＭＮ１０−３がＢＭＮ１−１７−１２に続き、ＭＮ１０−５がＭＮ１０−３続く。ＭＮ１０−５の最後の５つのアミノ酸（即ちＴＥＳＧＧ）（配列番号１５）は、ＭＮ１０−６の最初の５つのアミノ酸と重複する。Ｂ．ミクロチアミノ酸配列ＭＮ１０−８がＭＮ１０−６に続く。Ｈｉｓタグ配列は、キメラタンパク質の３’末端に位置する。
【図２】図２は、免疫ブロットストリップを示す。Ｂ．ミクロチに対する抗体を検出するための試験バンドとして、ＢＭＮ１−１７−４、ＢＭＮ１−１７−１１、ＢＭＮ１−１７−１２、ＭＮ１０−３、ＭＮ１０−５、ＭＮ１０−６及びＭＮ１０−８の７つのペプチド領域を含むＢ．ミクロチ組み換えキメラタンパク質を使用する。３種類の対照バンド、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（（「抗−ｈＩｇＧ」）、ｈＩｇＧ−ｌｏｗ（「ＭｇＧ−Ｌ」）及びｈＩｇＧ−ｈｉｇｎ（「ｈＩｇＧ−Ｈ」）を示す。ストリップ１は、Ｂ．ミクロチに対して非特異的なヒト血漿抗体の陰性対照であり、９９８００と呼ばれ、対照セクションにおいて３つのバンドを示す。ストリップ２は陰性対照であり、このストリップは、Ｂ．ミクロチ組み換えタンパク質を含有しないが、バベシア・ミクロチ抗体を有するヒト試料で調べる。ストリップ３−６は、配列番号５−１１で記載されるアミノ酸配列を含むＢ．ミクロチ組み換えキメラタンパク質に対して特異的な１つの試験バンドを示す４種類の異なるヒト試料である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｂ．ミクロチに対する抗体の存在について試験するために、ある種のペプチドが使用され得ることが分かった。これらのペプチドは、Ｂ．ミクロチに反応するヒト抗体の強度及び特異性に基づき選択される。これらのペプチドは、単独で又は組み合わせて、例えば、診断アッセイの構成要素として、様々な用途がある。
【００１６】
１．定義
本明細書中で使用される術語は、単に特定の実施形態を記載するためのものであり、限定を意図しない。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、文脈内で別段の明らかな指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数形の対象が含まれる。本明細書中での数の範囲の引用に対して、同じ精度で、その間にある各数字が、明らかに企図される。例えば、範囲６−９の場合、６及び９に加えて、７及び８という数が企図され、６．０−７．０の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０という数が明確に企図される。
【００１８】
ａ．対立遺伝子
「対立遺伝子」は、ヌクレオチドの欠失、付加及び／又は置換などの１以上の突然変異の結果改変され得る内在性遺伝子である。
【００１９】
ｂ．抗体
「抗体」は、本明細書中で使用される場合、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及び１本鎖抗体、ダイアボディー、二特異性抗体、二機能性抗体及びその誘導体を含む、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの抗体又はその断片もしくは誘導体を意味し得る。ペプシンなどの酵素により抗体を処理することにより、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２断片が生成され得る。軽鎖は、κ又はλの何れかとして分類される。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体又はその断片／混合物であり得、これらは、所望のエピトープ又はそれら由来の配列に対する十分な結合特異性を示す。抗体はまたキメラ抗体であり得る。抗体は、当技術分野で公知の１以上の化学、ペプチド又はポリペプチド部分の連結により誘導体化され得る。抗体は化学部分と結合され得る。
【００２０】
ｃ．生体試料
「生体試料」又は「試験試料」又は「対照試料」は、本明細書中で使用される場合、全血、血清、血漿、滑液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、腹水、骨髄穿刺液、胸膜滲出液、尿ならびに腫瘍組織又は何らかのその他の生体成分又は何らかの組織培養上清などの体液由来の試料を意味し得る。
【００２１】
ｄ．エピトープタグ
「エピトープタグ」は、融合タンパク質の文脈で使用される場合、タンパク質を同定、単離又は精製するために使用され得る何らかの部分を意味し得る。エピトープタグは、ヒト癌原遺伝子ｃ−ｍｙｃ、ヒトインフルエンザヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）（配列番号１３）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ディゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン又は蛍光色素（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５）であり得る。
【００２２】
ｅ．高ストリンジェンシー（非常に厳しい）条件下でのハイブリッド形成
「高ストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成」は、本明細書中で使用される場合、核酸の複合混合物中などで、第一の核酸配列（例えばプローブ）が第二の核酸配列（例えば標的）とハイブリッド形成する条件を意味し得る。高ストリンジェンシー条件は、配列依存的であり、状況によって異なる。高ストリンジェンシー条件は、規定されるイオン強度ｐＨでの特異的配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低いものが選択され得る。Ｔｍは、平衡状態で標的と相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリッド形成する（規定のイオン強度、ｐＨ及び核濃度下での）温度であり得る（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍで、平衡状態でプローブの５０％が占有される。）。高ストリンジェンシー条件は、ｐＨ７．０から８．３で約０．０１−１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又はその他の塩）など、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低いものであり得、温度は短いプローブ（例えば、約１０−５０ヌクレオチド）の場合は少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドより長いもの）の場合は少なくとも約６０℃である。高ストリンジェンシー条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的又は特異的ハイブリッド形成に対して、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリッド形成の少なくとも２から１０倍であり得る。典型的な高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件には、次のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳ、４２℃で温置又は５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で温置し、６５℃にて０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで洗浄。
【００２３】
ｆ．低ストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成
「低ストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成」は、本明細書中で使用される場合、５０−５５℃での２−５ｘＳＳＣの溶液中での洗浄を意味し得る。低ストリンジェンシー条件はまた、５０−５５℃での２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄又は、２．５ｘデンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ及び０．１ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含有し得る５ｘＳＳＰＥ（０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、５０℃で、それぞれ、４及び１２時間の予備洗浄及びハイブリッド形成も含み得る。
【００２４】
ｇ．中程度のストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成
「中程度のストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成」は、本明細書中で使用される場合、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃又は６５℃、５ｘＳＳＣ、一晩でのハイブリッド形成；次いで、０．１％ＳＤＳを含有する２ｘ、０．５ｘ及び０．２ｘＳＳＣのそれぞれでの６５℃で２０分間の２回の洗浄を意味し得る。ハイブリッド形成技術は、分子生物学の技術分野で周知である。
【００２５】
ｈ．同一配列
「同一」とは、本明細書中で使用される場合、一致する部分が最大となるように並べた場合に同じになる核酸又はアミノ酸の２つの配列を意味し得る。
【００２６】
ｉ．リンカー配列
「リンカー配列」とは、本明細書中で使用される場合、関心のある２つのペプチドを連結するペプチド配列が、酵素切断部位として作用するか又はポリペプチドの単離又は精製において使用され得る物理的及び／又は化学的特性を有することを意味し得る。
【００２７】
ｊ．核酸断片
「核酸断片」は、核酸に関して、本明細書中で使用される場合、全長が意図される組み換えＤＮＡプロトコールでの調製及び使用の容易さにより制限される何らかの長さで、使用され得る。実例となる核酸セグメントは、約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなどの全長で有用であり得る。
【００２８】
ｋ．操作可能に連結
「操作可能に連結される」とは、本明細書中で使用される場合、遺伝子の発現が、それが空間的に連結されるプロモーターの調節下にあることを意味し得る。プロモーターは、その調節下の遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが調節する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知のように、この距離の変化は、プロモーター機能の喪失なく調整され得る。このプロモーターは、Ｔ７、ＴＰ１、ラクターゼ又はメタロチオネインプロモーターを含み得る。
【００２９】
ｌ．ペプチド
「ペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、一緒に共有結合する少なくとも２つのアミノ酸を意味し得る。当業者にとって当然のことながら、アミノ酸配列の表現はまた、１本鎖核酸コード配列及び相補鎖も定義する。
【００３０】
ｍ．特異的結合
「特異的結合」とは、本明細書中で使用される場合、非特異的標的分子（例えば、特異的認識部位を欠く無作為生成分子）よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍又は２０倍の結合選択性のある特異的部位での、結合パートナーの互いに対する（例えば、２つのポリペプチド、ポリペプチド及び核酸分子又は２つの核酸分子）選択的結合を意味し得る。
【００３１】
ｎ．実質的に相補的
本明細書中で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０以上のヌクレオチド又はアミノ酸ヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたる第二の配列相補体に対して、第一の配列が、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であることを意味する。中間の長さは、２００−５００；５００−１，０００などを通じた全ての整数を含む、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３などの引用値の間の何らかの長さを意味し得る。実質的な相補体はまた、２つのヌクレオチド配列が、本明細書中に記載の方法を用いてストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成することも意味し得る。（例えば、下記のような、標準的パラメーターを用いたＢＬＡＳＴ分析）。
【００３２】
ｏ．実質的に同一
本明細書中で使用される「実質的に同一」とは、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたり、第一及び第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列が少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であることを意味し得る。中間の長さは、２００−５００；５００−１，０００などを通じた全ての整数を含む、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３などの引用値の間の何らかの長さを意味し得る。実質的に同一とはまた、第一の配列ヌクレオチド又はアミノ酸配列が第二の配列の相補体と実質的に相補的であることも意味し得る。
【００３３】
ｐ．変異体
「変異体」とは、核酸の文脈において本明細書中で使用される場合、実質的に同一であるか又は実質的に相補的である配列を意味し得る。核酸に関する変異体は、１以上の置換、付加、欠失、挿入を含有し得る核酸をさらに意味し得るか又はその断片であり得る。変異体はまた、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成し、作用物質をコードする核酸に特異的に結合することができる核酸でもあり得る。ハイブリッド形成技術は当技術分野で周知であり、中程度のストリンジェンシー条件下で行われ得る。
【００３４】
ペプチドに関する変異体は、１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入においてネイティブペプチドとは異なること又はネイティブペプチド配列と実質的に同一である配列とは異なることをさらに意味し得る。抗原特異的抗血清と反応する変異体の能力は、ネイティブタンパク質に対して、促進されているかもしくは不変であり得るか、又はネイティブペプチドに対して、５０％未満又は２０％未満の低下であり得る。このような変異体は、一般に、作用物質をコードするペプチド配列の１つを修飾し、本明細書中に記載のように抗原特異的抗体又は抗血清との修飾ペプチドの反応性を評価することにより、同定され得る。変異体には、Ｎ末端リーダー配列又は膜貫通ドメインなど１以上の部分が除去されているものが含まれ得る。その他の変異体には、小さな部分（例えば、１−３０アミノ酸又は５−１５アミノ酸）が成熟タンパク質のＮ及び／又Ｃ末端から除去されている変異体が含まれ得る。
【００３５】
ペプチドに関する変異体は保存的置換を含有し得る。「保存的置換」は、ペプチド化学の分野の熟練者がポリペプチドの二次構造及びハイドロパシック特性が実質的に不変であると予想するように、アミノ酸が、同様の特性を有する別のアミノ酸に対して置換されているものである。アミノ酸置換は、一般に、残基の、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づき為され得る。例えば、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ；正電荷アミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ；同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基のあるアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれる。保存的電荷を与え得るアミノ酸のその他の基には、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｉｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；及び（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが含まれる。変異体はまた、非保存的変化も含有する。変異体ペプチドは、５以下のアミノ酸の置換、欠失又は付加によりネイティブ配列とは異なる。変異体はまた、ポリペプチドの、免疫原性、二次構造及びハイドロパシック特性への影響が最小限であるアミノ酸の欠失又は付加によっても修飾され得る。
【００３６】
ｑ．ベクター
「ベクター」とは、本明細書中で使用される場合、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味し得る。ベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスベクターであり得る。ベクターは、エピソームなど、染色体外複製可能であり得る。ベクターは、発現ベクターなど、それが操作可能に連結される核酸の発現を支配可能であり得る。多数の適切なベクター及びプロモーターは、当業者にとって公知であり、市販されている。次のベクターを例として提供する：細菌性：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３  ３、ｐＫＫ２３３  ３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；及び真核性：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００３７】
２．作用物質
Ｂ．ミクロチに対する抗体の存在について試験するために使用され得る作用物質が提供される。本作用物質はペプチドを含み得る。また、本作用物質は、複数のペプチドも含み得る。このペプチドは、合成又は本明細書中に記載の核酸を用いて発現（インビトロ又はインビボ）され得る。
【００３８】
このペプチドは、下記表で記載されるとおりのアミノ酸配列を含み得、ＢＭＮ１−１７−４、ＢＭＮ１−１７−１１、ＢＭＮ１−１７−１２、ＭＮ１０−３、ＭＮ１０−５、ＭＮ１０−６、ＭＮ１０−８及びＢＭＮ−ＭＮ又はその変異体からなる群から選択される。このペプチドは、配列番号２、４、５−１１の何れかに記載されるとおりのアミノ酸配列又はその変異体を含み得る。このペプチドは、赤痢アメーバ（エントアメーバ・ヒストリチカ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）及びプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）などのその他の病原生物から単離されるアミノ酸配列を含み得る。このペプチドは、２０−５０アミノ酸長であり得る。
【００３９】
複数のペプチドは、上述のように、同じペプチドの複数又は異なるペプチドの複数を含み得る。この複数のペプチドは、ペプチドの、第一の群及び任意の第二の群を含み得る。ペプチドの第一の群は、下記表に記載のとおりのアミノ酸配列を含み得、ＢＭＮ１−１７−４、ＢＭＮ１−１７−１１、ＢＭＮ１−１７−１２、ＭＮ１０−３、ＭＮ１０−５、ＭＮ１０−６、ＭＮ１０−８及びＢＭＮ−ＭＮ又はその変異体からなる群から選択される。ペプチドの第一の群は、配列番号２、４、５−１１の何れかに記載のとおりのアミノ酸配列又はその変異体を含み得る。ペプチドの第一の群は、赤痢アメーバ（エントアメーバ・ヒストリチカ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）及びプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）などのその他の病原生物から単離されるアミノ酸配列を含み得る。ペプチドの任意の第二の群は、下記表で記載のとおりのアミノ酸配列を含み得、ＢＭＮ１−１７−４、ＢＭＮ１−１７−１１、ＢＭＮ１−１７−１２、ＭＮ１０−３、ＭＮ１０−５、ＭＮ１０−６、ＭＮ１０−８及びＢＭＮ−ＭＮ又はその変異体からなる群から選択される。ペプチドの第二の群は、配列番号２、４、５−１１の何れかに記載のとおりのアミノ酸配列又はその変異体を含み得る。ペプチドの第二の群は、赤痢アメーバ（エントアメーバ・ヒストリチカ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）及びプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）などのその他の病原生物から単離されるアミノ酸配列を含み得る。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
本作用物質はまた、少なくとも１つのペプチド又は複数のペプチドを含み得るキメラタンパク質も含み得る。キメラポリペプチドはまた、複数のペプチドの１以上を分離するリンカー配列も含み得る。キメラポリペプチドは、結合メンバーも含み得る。結合メンバーはエピトープタグであり得る。
【００４２】
本作用物質はまた、キメラポリペプチド、ペプチド（上述のとおり）、ペプチド変異体又はその複数を含み得る融合タンパク質も含み得る。融合タンパク質はまた、キメラペプチド又はポリペプチドからペプチドを分離するリンカー配列も含み得る。融合タンパク質は、結合メンバーも含み得る。結合メンバーは、上述のようなエピトープタグであり得る。
【００４３】
３．核酸
本明細書中で、本作用物質又はその変異体をコードする核酸もまた提供される。この核酸は、内在性配列などのネイティブ配列を含み得る。この核酸はまた、配列番号１又は３も含み得る。この核酸は、１本鎖（コード又はアンチセンス）又は２本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）又はＲＮＡ分子であり得る。
【００４４】
この核酸は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、ポリヒスチジンシグナルさらなる制限酵素部位、多重クローニング部位、その他のコードセグメントなどのその他のＤＮＡ配列と組み合わせられ得る。核酸はまた、中程度のストリンジェシー条件下でハイブリッド形成し、病原体の核に特異的に結合することも可能であり得る。ハイブリッド形成技術は分子生物学の分野で周知である。その他の核酸との核酸のハイブリッド形成を試験するための適切な中程度のストリンジェシー条件は、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃又は６５℃で一晩、５ｘＳＳＣ中でのハイブリッド形成；次いで、０．１％ＳＤＳを含有する２ｘ、０．５ｘ及び０．２ｘＳＳＣのそれぞれでの６５℃にて２０分間にわたる２回の洗浄を含み得る。
【００４５】
遺伝子コードの縮重、アミノ酸類似性、読み枠の位置などの結果として、本作用物質をコードし得る多くの核酸配列がある。これらの核酸の一部は、何らかのネイティブＢ．ミクロチ遺伝子の核酸配列とのホモロジーが最小限であり得る。本作用物質の核酸は、コドン使用の相違により変化し得る。さらに、本発明の範囲内の本作用物質の核酸配列を含む遺伝子の対立遺伝子。得られたｍＲＮＡ及びタンパク質は、構造又は機能が変化している可能性があるが、必ずしもそうではない。対立遺伝子は、標準的技術を用いて同定され得る（ハイブリッド形成、増幅及び／又はデータベース配列比較など）。
【００４６】
この核酸は、本作用物質を（インビトロ又はインビボ）合成又は発現させるために使用され得る。この核酸は、下記で記載されるように組み換え発現のためにベクターにクローニングされ得る。
【００４７】
４．ベクター
本明細書中で、この核酸を含むベクターもまた提供される。本ベクターは発現ベクターであり得る。このベクターは、配列番号１又は３を含み得る。本ベクターは、配列番号５−１１で記載されるとおりのアミノ酸配列をコードする核酸配列又はその複数を含み得る。
【００４８】
本発現ベクターはまた、本作用物質の発現に影響を与え及び／又は促進することができる１以上の調節配列も含み得る。原核生物における発現で適切である調節配列には、例えば、プロモーター配列、オペレーター配列及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞での発現に対する調節配列には、プロモーター、エンハンサー及び転写終結配列（即ちポリアデニル化シグナル）が含まれ得る。
【００４９】
本発現ベクターにはまた、例えば、シグナル配列又は増幅可能遺伝子をコードする核酸配列などのその他の配列も含まれ得る。シグナル配列は、そのタンパク質を発現する細胞からの、シグナル配列に融合されるポリペプチドの分泌を支配し得る。この発現ベクターにおいて、シグナル配列をコードする核酸は、ポリペプチドコード配列の読み枠を保存するように、ポリペプチドコード配列に連結され得る。選択された宿主細胞における栄養要求性欠損を補完する遺伝子をベクターに含有させることにより、このベクターで形質転換される宿主細胞の選択が可能になり得る。
【００５０】
５．作用物質の宿主細胞／発現
本明細書中で、このベクターを含む宿主細胞もまた提供される。ベクターの増殖及び／又は発現に対して、多岐にわたる宿主細胞が利用可能である。例としては、ウイルス（ファージ、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、原核細胞（Ｅ．コリ及びバチルス、シュードモナス及びその他の細菌の株など）、酵母又はその他の真菌細胞（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）及びＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。）、昆虫細胞、植物細胞ならびに、高等真核細胞（ヒト胚腎臓細胞及びその他の哺乳動物細胞など）が挙げられる。
【００５１】
何らかの従来法によって作用物質を発現するベクターを宿主細胞に導入し得るが、この方法は、使用されるベクター−宿主系に依存して変化し得る。一般に、ベクターを担うウイルス（例えばファージ）による、形質転換又は感染（「遺伝子移入」とも呼ばれる。）によって、宿主細胞にベクターを導入し得る。宿主細胞が原核細胞（又は細胞壁を有するその他の細胞）である場合、好都合な形質転換法には、Ｃｏｈｅｎら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２１１０−１４により記載されるカルシウム処理法が含まれ得る。原核細胞が宿主細胞として使用され、ベクターがファージミドベクターである場合、ベクターは、遺伝子移入により宿主細胞に導入され得る。
【００５２】
例えば、Ｈｉｎｎｅｎ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１９２９−３３により教示されるように、ポリエチレングリコールを用いて酵母細胞を形質転換し得る。哺乳動物細胞は、好都合に、Ｇｒａｈａｍら（１９７８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：５４６及びＧｏｒｍａｎ、ら（１９９０）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．、２：３−１０により記載のリン酸カルシウム沈殿法を用いて形質転換される。しかし、核注入、エレクトロポレーション、原形質融合及びその他の手段などの、宿主細胞にＤＮＡを導入するためのその他の公知の方法もまた、本発明での使用に対して許容可能である。
【００５３】
形質転換宿主細胞からの作用物質の発現は、細胞増殖及び発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、発現されたポリペプチドを細胞溶解物から回収するか、又はそのポリペプチドが分泌される場合、培地から回収することを必要とし得る。特に、培地は、使用される宿主細胞にとって適切な栄養素及び増殖因子を含有し得る。栄養素及び増殖因子は、多くの場合周知であるか又は当業者により容易に経験（実験）的に判断され得る。哺乳動物宿主細胞に対する適切な培養条件は、例えば、Ｍａｍｍａｒｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９８４）及びＢａｒｎｅｓ及びＳａｔｏ（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：６４９で記載されている。
【００５４】
さらに、この培養条件により、転写、翻訳及び細胞区画間のタンパク質輸送が可能となり得る。これらのプロセスに影響を与え得る因子は周知であり、これには、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡコピー数；ＤＮＡを安定化させる因子；培地中に存在する、栄養素、栄養補助剤及び転写誘発因子又はリプレッサー；培養の、温度、ｐＨ及び浸透圧；及び細胞密度が含まれる。特定のベクター−宿主細胞系での発現を促進するためのこれらの因子の調整は、当技術分野の技術レベルの範囲内である。インビトロ哺乳動物細胞培養の生産性を最大化するための原理及び実践的技術は、例えば、Ｍａｍｍａｒｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂｕｔｌｅｒ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９１）で見出され得る。
【００５５】
作用物質の発現において、タンパク質の大規模又は小規模産生のための多くの周知の技術の何れかを使用し得る。これらには、振盪フラスコ、流動層バイオリアクター、ローラーボトル培養系及び撹拌槽バイオリアクター系の使用が含まれ得る。回分培養で、流加培養で又は連続形式で、細胞培養を行い得る。
【００５６】
本作用物質の回収のための方法は周知であり、使用される発現系に依存して変化する。シグナル配列を含む作用物質は、培地又はぺリプラズムから回収され得る。本作用物質はまた、細胞内で発現され、細胞溶解物から回収され得る。
【００５７】
発現された作用物質は、宿主細胞又は培地の１以上の成分からポリペプチドを分離することができる何らかの方法によって、培地又は細胞培養物から精製され得る。ポリペプチドの意図される使用を妨害する宿主細胞及び／又は培地成分から、作用物質を分離し得る。第一段階として、細胞残屑を除去するために、培地又は細胞溶解物を遠心するか又はろ過し得る。次に、通常、上清を所望の体積に濃縮もしくは希釈するか又はさらなる精製のために調製物を適切な状態にするために適切な緩衝液に透析し得る。
【００５８】
次に、周知の技術を用いて作用物質をさらに精製し得る。選択される技術は、作用物質の特性に依存して変化する。例えば、作用物質の結合メンバーの同種結合パートナーを含有するアフィニティーカラムを用いて作用物質を精製し得る。例えば、アフィニティーカラムでの分別によって、緑色蛍光タンパク質、ヘマグルチニン又はＦＬＡＧエピトープタグと融合された又はヘキサヒスチジン（配列番号１３）もしくは類似の金属アフィニティータグと融合された作用物質を精製し得る。
【００５９】
６．Ｂ．ミクロチに対する抗体を検出する方法
本明細書中で、試験試料中で抗ミクロチ抗体を検出するための方法が提供される。本方法は、試験試料と作用物質を接触させ、抗ミクロチ抗体の量を測定して、対照試料と比較することを含み得る。
【００６０】
作用物質は固体支持体上に固定化され得る。また、作用物質をブロッキング剤に接触させ得る。さらに、抗ミクロチ抗体を含み得る対照試料又は試験試料に本作用物質を接触させ得る。本作用物質は、抗Ｂ．ミクロチ抗体と抗原−抗体複合体を形成し得るが、これを検出試薬と接触させ得る。検出試薬は、検出可能な標識を含み得る。検出方法は、検出系に含まれ得る。
【００６１】
ａ．Ｂ．ミクロチ抗体を同定するためのアッセイの成分
（１）固体支持体
Ｂ．ミクロチ抗体の存在を同定するために、診断アッセイにおいて固体支持体が使用され得る。固体支持体は、本作用物質が連結され得る当業者にとって公知の何らかの物質であり得る。使用され得る固体支持体の例は、マイクロタイタープレート中の試験ウェル、ニトロセルロース、ナイロン、ビーズ又はディスク（ガラス、グラスファイバー、ラテックス、プラスチック又は紙材料製であり得る。）、ゲル（例えば、ポリペプチドが流され、次いで乾燥させられるゲル）又はストリップ、ディスク又はシート（ニトロセルロース、ナイロン、プラスチック又は紙製であり得る。）である。支持層は、プラスチック、厚紙製などであり得、例えば、ニトロセルロースストリップ又はディスクは、感圧プラスチックフィルム上に積層され得る。ストリップディスク又はシートは、さらにオンボード対照又は試験バンド、スポット又はドットの場所に対して使用される何らかの不連続領域に対して、場合によっては、その他の試料とそれが差別化され得るように、試料を標識化するために使用される識別領域を含む（例えば、名称、番号、英数字番号、バーコード又はその他の適切な手段）。
【００６２】
本作用物質は、当業者にとって公知の何らかの技術を用いて、固体支持体上に結合又は固定化され得る（例えば、ウエスタンブロット技術、当業者にとって周知である方法を用いて）。さらに、１以上の対照もまた、固体支持体上に固定化され得る。「結合」又は「固定化」という用語は、交換可能に使用される場合、吸着などの非共有結合及び共有結合（組み換えタンパク質と固体支持体上の官能基との間の直接連結であり得るか又は架橋剤によりなされる連結であり得る。）の両方を指し得る。ストリップ、ディスク又はシートへの吸着は、適切な時間にわたり、ストリップ、ディスク又はシートと、適切な緩衝液中の組み換えポリペプチドのそれぞれ及び何らかの対照の溶液を接触させることによって達成され得る。この接触時間は、温度に依存して様々であるが、約１時間から約２４時間の間である。
【００６３】
本作用物質は、前述のストリップ、ディスク又はシート上に固定化され得る。本作用物質は、ストリップ、ディスク又はシート上の個々の平行するバンド、スポット又はドットとして並べられ得る（これらのそれぞれは、「試験」バンド（ｂａｎｄ）、スポット（ｓｐｏｔ）又はドット（ｄｏｔ）、まとめて「試験」バンド（ｂａｎｄｓ）、スポット（ｓｐｏｔｓ）又はドット（ｄｏｔｓ）と呼ばれ得る。）。本作用物質は、（Ｂｉｏ−Ｄｏｔ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ（ＡＪＱ３０００  Ａｉｒ  Ｊｅｔ  Ｑｕａｎｔｉ又はＲＲ４２００−Ｄｉｐ  Ｔａｎｋなど）から得入手可能なものなどの噴射装置を用いて）組み換えタンパク質を前述のストリップ、ディスク又はシート上に噴射することによるなどの自動化技術、又は前述のストリップ、ディスク又はシート上に組み換えタンパク質をピペットで添加することによるなどの手動技術など、当技術分野で公知の通常の技術を用いて、前述のストリップ、ディスク又はシート上に固定化され得る。シートを使用する場合、組み換えタンパク質全てをシート上に固定化したら、アッセイで使用するためのストリップになるように、当技術分野で公知の通常の技術を用いて、このシートを切ることができる。ストリップ、ディスク又はシート上の本作用物質（及び場合によっては何らかの対照）の位置は重要ではない。さらに、このストリップ、ディスク又はシートは、糊付け、積層などの当技術分野で公知の通常の技術を用いて、支持層にさらに固定化され得る。
【００６４】
必要に応じて、固体支持体への本作用物質（及び場合によっては何らかの対照）の共有結合は、最初に、支持体及び組み換えポリペプチドにおけるヒドロキシル又はアミノ基などの官能基の両方と反応する二官能性試薬と固体支持体を反応させることにより達成される。例えば、ベンゾキノンを用いて、又はポリペプチド上のアミン及び活性水素と支持体上のアルデヒド基の縮合により、適切なポリマーコーティングを有する支持体にポリペプチドを結合させ得る。
【００６５】
（２）ブロッキング試薬
本作用物質（及び場合によっては何らかの対照）を支持体上に固定化したら、支持体上で本作用物質の残りの結合部位をブロッキング処理し得る。当業者にとって公知の何らかの適切なブロッキング試薬を使用し得る。例えば、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）ＰＢＳ中のカゼイン溶液、Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ならびにその他のブロッキング試薬が使用され得る。その後に乾燥させるゲルを含む支持体を使用する場合、支持体をブロッキング処理する必要がない場合がある。ブロッキング処理を完了した後、ＰＢＳなどにより支持体を洗浄し、（風乾などにより）適切な時間にわたり乾燥させ得る。乾燥時間は温度に依存して変動するが、約３０分から約２４時間の間である。
【００６６】
次いで、固定化された作用物質（及び場合によっては１以上の対照）を試験試料と温置する。この温置前に、ＰＢＳなどの適切な希釈剤で試験試料を希釈し得る。この温置中、何らかの抗体が試験試料中に存在する場合、これらの抗体は、固体支持体上の組み換えポリペプチドの１以上に結合する。一般に、温置時間は、試験試料内でのＢ．ミクロチ抗体の存在の検出を可能にするのに十分である時間である。温置時間は、約１５分から約６時間の間であり得る。好ましくは、温置時間は、約１時間から約４時間の間であり得る。
【００６７】
（３）試験試料
固体支持体上の本作用物質を試験試料と接触させ得る。この試験試料は、Ｂ．ミクロチに対する抗体を含有し得る。この試験試料は、ヒト、家畜哺乳動物、例えばイヌ、ネコ及びハムスターなど、又は野生の哺乳動物を含む哺乳動物から単離され得る。この試験試料は、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、尿又はその他の適切な試料であり得る。試験試料は、緩衝液中で連続希釈され得る。例えば、試験試料の連続希釈には、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２及び１：１０２４の比率が含まれ得る。
【００６８】
（４）対照試料
固体支持体上の作用物質を対照試料と接触させ得る。この対照試料は、Ｂ．ミクロチに対する抗体を含有することにより陽性対照であり得る。この対照試料は、Ｂ．ミクロチに対する抗体を欠くことにより、陰性対照であり得る。例えば、陰性対照試料は、トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）に対する抗体又は指定されたＣｈａｎｇａｓ  ＳＤＢを含有し得る。Ｔ．クルジ抗体は、ＪＬ８、ＴＣＲ２７、ＪＬ７、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＴＣＮＡ、ＴｃＬｏ１．２、ＴＳ、ＴｃＤ、ＦｃａＢＰ、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、ＦＬ−１６０、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＴｃＰ２βＮ−Ｃ２９、ＳＡ８５−１．１、ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０及びＴｃＦからなる群から選択される組み換えポリペプチドに対して反応性を有し得る。陰性対照はまた、Ｂ．ミクロチに対するペプチドに結合しない抗体も含み得る。本作用物質と接触させる対照試料は、ヒト、家畜動物、例えば、イヌ、ネコ及びハムスターなど、又は野生動物を含む哺乳動物から単離され得る。哺乳動物からの対照試料は、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、尿又はその他の適切な試料であり得る。対照試料は、Ｂ．ミクロチに対して非特異的な、ヒト血漿タンパク質又は免疫グロブリンであり得る。対照試料は、緩衝液中で連続希釈され得る。例えば、対照試料の連続希釈は、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２及び１：１０２４の比率であり得る。
【００６９】
（５）検出試薬
本作用物質をブロッキング処理した後、本作用物質を接触させ、検出試薬を用いて検出し得る。ＰＢＳ又はトリス緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するトリス緩衝液など）などの適切な緩衝液で固体支持体を洗浄することによって、未結合試験試料を除去し得る。固体支持体に検出可能試薬を添加し得る。適切な検出可能試薬は、固定化された作用物質−抗体複合体（及び場合によっては何らかの固定化対照）に結合し、当業者にとって公知の様々な手段の何れかにより検出され得る何らかの化合物である。検出可能試薬は、検出可能な標識に結合される、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン、レクチン又は遊離抗原）などの結合試薬を含有し得る。検出可能標識への結合試薬の結合は、当業者にとって公知の標準方法を用いて達成され得る。一般的な結合試薬は、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）及びＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）などの多くの市販業者から、様々な検出可能標識に結合されたものを購入することができる。
【００７０】
検出試薬は、結合抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（及び場合によっては１以上の対照）を検出するために十分な時間にわたり、固定化されたポリペプチド−抗体複合体（及び場合によっては１以上の対照）とともに温置され得る。適切な温置時間は、一般に、製造者の説明書から、又はある時間にわたり起こる結合のレベルをアッセイすることにより、決定され得る。次に、未結合検出試薬を除去し、検出可能標識を用いて結合検出試薬を検出する。検出可能な標識を検出するために使用される方法は、アッセイで使用される検出可能標識の性質に依存する。例えば、放射性標識の場合、シンチレーションカウント又はオートラジオグラフィー法を使用し得る。化学発光又は蛍光標識の場合、分光学的方法を使用し得る。酵素標識は、通常、基質を添加し（通常、特定の時間にわたり）、次いで反応産物の分光学的又はその他の分析により検出され得る。
【００７１】
（６）検出標識
検出試薬は、検出標識を含み得る。検出可能標識は、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ及び３３Ｐなど）、酵素免疫アッセイのために使用される酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ルシフェラーゼなど）、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、ルミナール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛被覆セレン化カドミウム）、温度標識（ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｒｉｃ  ｌａｂｅｌ）又は免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識に対する導入、標識手段及び標識の検出は、Ｐｏｌａｋ及びＶａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）及びＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）（これは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎにより刊行されたハンドブック兼カタログである。）で見出される。
【００７２】
検出可能標識は、放射性、比色又は蛍光イメージング又はその他の視覚的手段により測定され得る。例えば、検出標識は、蛍光画像装置により相対光単位で測定され得る。
【００７３】
ｂ．検出系
（１）Ｂ．ミクロチ抗体の検出に対する一般的方法
本明細書中に記載される検出法は、試験又は対照試料中でのＢ．ミクロチに対する抗体の存在を判定するために、様々な周知の検出系により実行される。一般に、この検出系は、試験試料中でのＢ．ミクロチ抗体の有無を判定するための、作用物質に結合する検出標識から生成されるシグナルと所定値との間での、蛍光又はその他の比較手段を含み得る。所定値は、対照試料から測定されたシグナルに対する試験試料から測定されたシグナルの比率であり得る。一般に、Ｂ．ミクロチ抗体を含有しない対照試料から測定された平均シグナルを３標準偏差上回るシグナルを生成する試験試料は、Ｂ．ミクロチ抗体及びＢ．ミクロチ感染について陽性であると見なされ得る。
【００７４】
あるいは、検出可能標識の数値を測定するために、密度計などの装置を使用し得る。所定値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｐ．１０６−１０７（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎら、１９８５）の方法を使用して、Ｒｅｃｅｉｖｅ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅ（「ＲＯＣ」）を用いて決定され得る。所定値は、蛍光画像装置又は上述のようなその他の手段による、相対光単位に基づき得る。簡潔に述べると、所定値は、診断試験結果に対するそれぞれの可能な値に相当する真陽性比率（即ち感度）及び偽陽性比率（即ち１００％特異性）のペアのプロットから決定され得る。左上角に最も近いプロットにおける所定値（即ち、最大領域を囲む値）は、最も正確な所定値であり、この方法により決定される所定値よりも高いシグナルを生成する試料は陽性と見なされ得る。あるいは、所定値は、偽陽性比率を最小限にするために、プロットに沿って左に移動させ得る。
【００７５】
（２）免疫ブロット
検出法は、抗ミクロチ抗体を検出するために、免疫ブロット検出系において使用され得る。免疫ブロットにおいて、本作用物質を固定化するために固体支持体が使用され得る。
【００７６】
免疫ブロットは、２つの個別の対照試料（即ち、第一の対照及び第二の対照）を使用し得、これらは、固体支持体上に固定化され得る。免疫ブロットは、３つの個別の別個の対照試料（即ち、第一の対照、第二の対照及び第三の対照）を使用し得る。複数の対照試料が存在する場合、対照は互いに同一であり得るか又は互いに異なり得る。対照試料の２つが同一であり得る（例えば第一の対照及び第二の対照など）。対照試料の２つが同一である場合、これらの対照試料のうち１つの濃度（第一の対照もしくは第二の対照の何れか又は３つの対照が存在する場合、第一の対照もしくは第三の対照又は第二の対照もしくは第三の対照のレベル）はその他の対照よりも高い（又は大きい）ことがある。本対照試料は、その他の対照よりも高濃度であり得、これは、「高濃度対照」と呼ばれ得る。高濃度対照よりも低濃度でストリップ、ディスク又はシート上に固定化された対照は、「低濃度対照」と呼ばれ得る。高濃度対照に対する低濃度対照の濃度比は、約１：２から約１：１０、好ましくは、約１：５から約１：６であり得る。例えば、第一の対照は低濃度対照であり得、第二の対照は高濃度対照であり得る。あるいは、第一の対照は高濃度対照であり得、第二の対照は低濃度対照であり得る。別の例として、３つの対照検出系は、低濃度対照及び高濃度対照ならびに第三の対照を含み得る（例えば試料添加を確認するために使用され得る。）。低濃度対照及び高濃度対照はヒト血漿（高濃度対照に対する低濃度対照の比が約１：２から約１：１０である。）であり得、第三の対照は、ＳＤＢ  Ｃｈａｇａｓ又はヒト血漿であり得る。
【００７７】
フロースルー方式において、試験試料を含有する溶液に、固体支持体上に固定化された作用物質を浸漬し得る。あるいは、希釈剤とともに反応トレイ中に固体支持体を置き、次いで試験試料を反応トレイに添加し得る。本明細書中で既に記載の同じ時間及び技術を用いて、十分な時間にわたり、試験試料及び作用物質を温置する。本明細書中で既に記載の技術を用いて、未結合試験試料を除去し得る。この方式において、試験試料内の抗ミクロチ抗体は、試験試料が膜を通過するとき、固定化された作用物質（及び少なくとも１つの対照）に結合し得る。少なくとも１つの検出試薬（検出可能標識を含有する本明細書中で既に記載の検出試薬など）を添加し得る。少なくとも１つの検出試薬は、検出試薬を含有する溶液がストリップを流れるときに形成される作用物質−抗体複合体のそれぞれに結合し得る。試験試料中のＢ．ミクロチ抗体の有無を調べるために、カットオフを使用して、又は下記で詳細に考察されるように１以上の対照により生成される１以上のシグナルの強度を比較することによって、結合した検出試薬の検出を上述のように行い得る。
【００７８】
上述のような低濃度対照及び高濃度対照がフロースルー方式で使用され得る場合、本作用物質に対する試験バンド（又はスポット又はドット）のそれぞれにおいて、検出可能標識からのシグナルの存在を同定することによって、試験試料中のＢ．ミクロチ抗体の有無が判定され得る。本作用物質に対する試験バンドにおいてシグナルが同定される場合、０から４＋のスケールを用いて、低濃度対照バンド（又はスポット又はドット）及び高濃度対照バンド（又はスポット又はドット）からのシグナルの強度と、この検出されるシグナルの強度を比較する。バンドが見られない場合、読み取りは０である。低濃度対照バンド及び高濃度対照バンドの強度は、それぞれ１＋（低濃度対照）及び３＋（高濃度対照）として定義され得る。低濃度対照の強度に匹敵する強度の試験バンドは、１＋と評価される。低濃度対照と高濃度対照バンドとの間の強度のバンドは２＋と評価される。高濃度対照の強度に匹敵する強度のバンドは、３＋と評価される。高濃度対照の強度よりも高いバンド強度は４＋と評価される。低濃度対照の強度よりも強度が弱い微弱なバンドは、＋／−と評価される（表２参照）。米国特許出願第１１／５８３，２０３（参照により完全に組み込まれる。）の図２に記載の典型的アルゴリズムを示されるように、免疫ブロットアッセイは、試験試料が抗Ｂ．ミクロチ抗体に対して陽性であるか又は陰性であるかの視覚的指標を提供し得る。
【００７９】
【表２】
0005676263.tif 000003
【００８０】
（３）競合アッセイ
本検出方法は、Ｂ．ミクロチに特異的な抗体を用いて試験試料を同定するために、競合検出系において使用され得る。本作用物質は、上述のように、固体支持体上に固定化され得る。次に、固定化された作用物質は、本作用物質に結合し、試験試料中の抗Ｂ．ミクロチ抗体と競合することが知られている、検出可能標識される競合抗体と接触させられ得る。固定化された作用物質を試験試料とも接触させる。抗体の両セットが固定化された作用物質に対して競合しているので、検出可能に標識される抗体からのシグナルは、Ｂ．ミクロチに特異的な抗体を含有する試験試料中で、より低くなり得る。
【００８１】
言うまでもなく、本明細書中の代表的方式の何れか及び本発明による何らかのアッセイ又はキットが、例えば米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号で記載のような、及び例えば、以下に限定されないが、ＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭ及びＱｕａｎｔｕｍ  ＩＩプラットフォームならびにその他のプラットフォームを含む、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）により市販されているような、自動又は半自動システム（微小粒子を含む固相があるものを含む。）での使用に対して適応させられ得るか又は最適化され得ることは当然である。
【００８２】
さらに、本発明のアッセイ及びキットは、場合によっては、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴＴＭ）電気化学的免疫アッセイシステムを含む、ポイントオブケアアッセイ系に対して適応させられ得るか又は最適化され得る。免疫センサー及び使い捨て試験装置でそれらを製造し操作する方法は、例えば米国特許第５，０６３，０８１号及び米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号、同第２００４００１８５７７号、同第２００５００５４０７８号及び同第２００６０１６０１６４号（上記のものに関するそれらの教示のために本明細書中で参照により組み込まれる。）で記載されている。
【００８３】
７．診断キット
本発明はまた、Ｂ．ミクロチに対する抗体について試料をアッセイするための試験キットも提供する。本発明による試験キットには、本発明による１以上の免疫アッセイを実施するために有用な本作用物質などの１以上の試薬が含まれる。試験キットには、通常、１以上の個別の組成物として又は場合によっては、試薬の適合性が許す場合、混合物として試薬を保持する１以上の容器での包装が含まれる。この試験キットにはまた、緩衝液、希釈剤、標準物質及び／又は試料処理、洗浄又はアッセイの何らかのその他の段階を行うのに有用な何らかのその他の材料など、使用者の立場から所望され得るその他の材料も含まれる。
【００８４】
ある一定の実施形態において、試験キットにはヒト化モノクローナル抗体が含まれ、このヒト化モノクローナル抗体は本作用物質に特異的である。この成分は、本発明による免疫アッセイにおける陽性対照として使用され得る。必要に応じて、この成分は、試験試料中で検出されるシグナルが比較され得る標準曲線の作成を容易にするために複数濃度で試験キットに含まれ得る。あるいは、キット中で提供される単一ヒト化モノクローナル抗体溶液の希釈液を調製することによって、標準曲線を作成し得る。
【００８５】
本発明によるキットには、固相及び固体支持体に固定された作用物質が含まれ得る。サンドイッチ免疫アッセイを行うためにキットを使用し得、キットには、標識された検出抗体が含まれる。標識化される検出抗体は、抗ヒトＩｇＧ標識化抗体であり得る。本キットは検出可能標識をさらに含み得る。
【００８６】
ある実施形態において、試験キットには、アクリジニウム−９−カルボキサミドなどの少なくとも１つの直接的標識が含まれ得る。本発明による試験キットにはまた、少なくとも１つの間接的標識も含まれ得る。使用される標識が一般に検出可能なシグナルを生成させる指標試薬を必要とする場合、本試験キットには、１以上の適切な指標試薬が含まれ得る。
【００８７】
本キットには固相が含まれ得る。本発明による試験キットには、本発明の免疫アッセイの１以上を行うための説明書が含まれ得る。本発明のキットに含まれる説明書は、包装材料に固定され得るか又は添付文書として含まれ得る。説明書は、典型的には、書かれているか又は印刷物であるが、一方でこれらはそのようには限定されない。このような説明書を保管し、エンドユーザーにそれらを伝えることができる何らかの媒体が本発明により企図される。このような媒体には、以下に限定されないが、電子記憶装置媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ  ＲＯＭ）などが含まれる。本明細書中で使用される場合、「説明書」という用語は、説明を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
【実施例１】
【００８８】
ペプチド被覆微小粒子
次の結果から、バベシア血清反応性が、微小粒子に結合されたバベシア抗原を用いてバベシア感染対象の血清から測定され得ることが示される。ペプチド−被覆微小粒子を作製するために、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ＲＬら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、２００２；４２：１４８８−９６（この内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載のものなど、当技術分野で周知の方法に従い、Ｆｍｏｃ（即ち、９−フルオレニルメチルカルバメート）化学を用いて、バベシア抗原ＭＮ−１０−８（配列番号１１）及びＢＭＮ１−１７−４（配列番号５）を合成した。組み合わせられたＭＮ−１０−８及びＢＭＮ１−１７−４抗原、ＢＭＮ−ＭＮ（配列番号１２）からなるペプチドを同様に作製した。米国公開第２００４００２３８６５号（この内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載のものなど、当技術分野で周知の方法に従い、バベシア抗原を微小粒子上に固定化した。
【００８９】
バベシアペプチド−被覆微小粒子（０．０５％固体）をブロッキング処理し、次いで既知のＢ．ミクロチに感染している対象からの５種類の異なる血清試料の１つ又はヒト血漿陰性対照（ＮＣ）と温置した。陰性対照は、４つ組試験で行った。温置後、微小粒子を洗浄した。次に、洗浄し、次いで生物発光を惹起することができる基質と温置される、生体発光酵素に結合されたマウス−抗−ヒトＩｇＧ２５ｎｇ／ｍＬを添加し、洗浄し、生物発光を惹起することができる基質と温置した。次に、生体発光画像装置を用いて、相対光単位（ＲＬＵ）で発光量を測定した。４つの陰性対照の平均ＲＬＵ値により各バベシア−感染試料に対するＲＬＵ測定を割ることによって、陽性対陰性対照（Ｐ／Ｎ）比を測定した。表３で結果を示す。
【００９０】
【表３】
0005676263.tif 000004
【００９１】
２．５μｇ／Ｌの濃度のバベシア抗原ＭＮ−１０−８、ＢＭＮ１−１７−４及びＢＭＮ−ＭＮで被覆された微小粒子をまた、次のようにＥＩＡ中のバベシア感染血清に対する血清反応性について試験した。この微小粒子をブロッキング処理し、洗浄し、次いで５種類のバベシア感染血清試料（２つ組試験での各試料）、陰性対照（９９８００）又はマラリア感染血清（ＳＤＢ）のうち１つとともに温置した。次に、微小粒子を洗浄した後、製造者のプロトコールに従い、ＨＣＶ  ＥＩＡ２．０（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からの試薬を用いて、血清反応性を測定した。結果を表４で示す。
【００９２】
【表４】
0005676263.tif 000005
【００９３】
これらの結果から、対象からの血清中のバベシア抗体に対する血清反応性を測定するために、バベシア抗原で被覆された微小粒子を使用することができることが示される。
【実施例２】
【００９４】
血清反応抗体を検出するためのキメラタンパク質
次に、それらの比較的強い血清反応性及び特異性により選択された７種類のバベシアペプチドを含む合成キメラ組み換えタンパク質（「キメラタンパク質」）を説明する。次の選択基準を使用した：平均ＯＤ４５０≧０．１、マラリア感染血清に対する平均ＯＤ４５０、バベシア感染血清に対しておよそ≦６０％及び陰性対照に対する平均ＯＤ４５０、バベシア感染血清に対しておよそ≦６０％。それぞれ５’−及び３’−末端にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位とともにこのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「キメラ配列」、図１）を設計した。発現ベクターｐＫＲＲ８２６（非融合産物を生成するｐＬに基づくベクター）において同じ部位にクローニングするために、これらの部位を使用し、同様に、ｐＪＯ２００へのクローニングのために使用することができた（ＣＫＳ−融合産物を生成するベクター）。このＤＮＡ配列は、その他の内部ＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩ部位を含有しない。
【００９５】
発現コンストラクトを作製するために、ベクターシャインダルガノ配列の開始から下流の最適な距離（一般に１２から１４塩基）に開始コドンが位置するように、キメラ配列のすぐ上流に開始コドンをインフレームで挿入した。キメラ配列は、Ｅ．コリでの発現に対して可能な限りコドン−最適化した。稀少コドンは使用しなかった。Ｈｅｎａｕｔ及びＤａｎｃｈｉｎ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｖｏｌ．２、Ｃｈ．１１４：２０４７−２０６６、１９９６、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ＦＣ編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．からのＥ．コリコドン使用表をコドン選択のために使用した。結果として望ましくないリボソーム負荷が起こり、キメラタンパク質の発現が低下し得る、潜在的なＳｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏコンセンサス配列（即ち、５’ＵＡＡＧＡＧ）についてセンス鎖を調べた。あらゆる強力なコンセンサスマッチを代替コドンに変更した。最も保存された４塩基コア配列（ＡＧＧＡ）との完全な合致はなかった。いくつかの部位が７つの位置のうち５つで合致し、両方ではない場合、少なくとも１つのミスマッチがより保存性が高い位置にあった。
【００９６】
結果として短縮型産物が発現され得る潜在的転写終結部位（即ち、ＧＣリッチステムの前の２塩基上流内にＣがあり、その後にすぐ下流にＴリッチストレッチが続く、センス鎖における軽度のステムループ構造）についてもキメラ配列を調べた。全く見付からなかった。
【００９７】
代替コドン使用を通じて、特にパリンドロームが、発現コンストラクトを組み立てることにおいて使用しようとする合成オリゴヌクレオチドの末端又はその付近に存在する場合、大きな影響を与えるパリンドロームを破壊した。代替コドン使用を通じて、組み立て中の正しくないプライミングの可能性を低下させるために、コンストラクト内の不要な配列に対してキメラ配列の合成オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端の間の相補性が最小限になるようにした。クローニング前に、キメラ配列の伸長／ＰＣＲアセンブリを促進するために、隣接するオリゴヌクレオチドが２０塩基末端重複を含有した。酸に不安定なペプチド対Ａｓｐ−Ｐｒｏの存在についてもキメラ配列を調べた。全く見付からなかった。
【００９８】
フレキシブルスペーサーとして機能させるために、キメラタンパク質のペプチドセグメント間にＡｌａ及び／又はＧｌｙからなるジペプチドを挿入した。ペプチドが正常に重複する隣接配列由来であった場合又はこのタイプのスペーサーが既に存在した場合は、これを行わなかった。
【００９９】
停止コドンは、翻訳停止のためのキメラＯＲＦの末端に位置し、キメラ配列の最後尾の後及び停止コドンの前に、Ｈｉｓタグペプチド配列を付加した。キメラ配列発現コンストラクトからこのキメラタンパク質を首尾よく発現させ、次いで、精製し、血清学的同定において使用した。キメラ配列及びキメラタンパク質の略図を図１で示す。
【実施例３】
【０１００】
キメラタンパク質に対する血清反応性
次の結果から、実施例２のキメラタンパク質がバベシア感染対象からの血清に対して血清反応性を示すことが明らかとなる。ストリップ試験により、下記のように測定した場合の結果を図２で示す。
【０１０１】
ヒトＩｇＧ−高濃度（２５μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ−低濃度（２．５μｇ／ｍＬ）及びヤギ抗ヒトＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）ならびにキメラタンパク質（１００μｇ／ｍＬ）の対照溶液を用いて、免疫ストリップを調製した。具体的に、ｐＨ７、５０ｍＭナトリウム３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホネート緩衝液中で各タンパク質を溶解した。Ｂｉｏ−Ｄｏｔ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）からの、マイクロプロセッサー制御ＸＹＺ３０５０分配装置を用いて、図２で示される相対位置で並行線で、ニトロセルロース膜シート（０．４５ミクロン、２ｘ３インチ；Ｗｈａｔｍａｎ  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）上に各タンパク質試料１００μＬを噴射し、室温（ＲＴ）にて１時間、温置した。噴射溶液の濃度は上述のとおりであった。温置後、１００ｍＬリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で膜を洗浄し、ＲＴで３０分間、ＰＢＳ中５％脱脂粉乳でブロッキング処理し、１００ｍＬ  ＰＢＳ中で５分間洗浄し、風乾した。最後の段階として、この膜シートに感圧プラスチックフィルムを積層し、３ｍｍ幅のストリップになるように切った。
【０１０２】
次のように、上記免疫ストリップを介して、陰性対照及び５検体のバベシア感染標本の両方を試験した。陰性対照（９９８００、図２）は、Ｂ型肝炎表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）に対する及びＢ型肝炎ウイルスのコアタンパク質（「ＨＢｃｏｒｅ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」））、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）及びヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（「ＨＴＬＶ」）に対する抗体についてのアッセイで試験した場合に陰性となったカルシウム再沈着正常ヒト血漿であった。バベシア感染が確認されたドナーから採血した血液から、バベシア抗体陽性標本（試料１−５、図２）を分離した。
【０１０３】
粒状物質を除去するために試験前に、１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中で、以前に凍結した血清又は血漿試料を微量遠心し（１４，０００ｒｐｍ、５分）；未凍結試料は遠心しなかった。希釈剤３ｍＬ及び免疫ストリップを免疫ブロット反応トレイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の各底に入れ、ＲＴで５分間温置した。各温置段階中、振盪器上で底部の内容物を穏やかに混合した。希釈剤中にストリップを含有する各ウェルに５０μＬ試料を添加し、ＲＴで２時間温置し、次いで吸引し、ＴＮＴ緩衝液中ですすぎ（ｐＨ８．０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０）、ＲＴにて５ｍＬ  ＴＮＴ緩衝液で３回洗浄した。次に、０．２μｇ／ｍＬアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ｈＩｇＧ溶液３ｍＬを各底部に添加し、ＲＴにて１時間温置した。ウェルを吸引し、ＲＴにて５分間、５ｍＬ  ＴＮＴ緩衝液でストリップを３回洗浄した。この次に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（「ＢＣＩＰ／ＮＢＴ」；２０ｍＬの蒸留水中錠剤１錠；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の基質溶液２ｍＬを各ウェルに添加し、発色のためにＲＴにて１０分間、周囲温度で温置した。この後、吸引し、発色を停止させるために蒸留水で３回洗浄した。続いて、ストリップを底部から除去し、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍを介して読み取るために風乾させた。総アッセイ時間は約４時間であった。
【０１０４】
図２から、陰性対照がキメラタンパク質に対して反応を示さなかった一方で、試料２−５は、キメラタンパク質に対して血清反応性を示したことが示される。それゆえに、バベシアに感染した対象の血液中の抗体の存在を測定するために、キメラタンパク質を使用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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