(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つはホウ素１０同位体である）と多価アミンまたはその塩からなる塩を内封してなるリポソーム。
【請求項２】
ホウ素イオンクラスターが、カルボラン、ドデカボレート、分子式がＢ１０Ｈ１０で表されるイオンクラスター、分子式がＭ（Ｃ２Ｂ９Ｈ１０）２で表わされるサンドイッチ型イオンクラスター（Ｍは遷移元素）（これらは置換基を有していてもよい）から選択される少なくとも１つである請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
ホウ素イオンクラスターが置換基を有していてもよいドデカボレートである請求項２記載のリポソーム。
【請求項４】
多価アミンが脂肪族ポリアミンである請求項１記載のリポソーム。
【請求項５】
脂肪族ポリアミンが、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンから選択される少なくとも１つである請求項４記載のリポソーム。
【請求項６】
請求項１記載のリポソームを含有するホウ素中性子捕捉療法用組成物。
【請求項７】
ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つはホウ素１０同位体である）と多価アミンまたはその塩からなる塩を得る工程と、得られた塩を脂質二重膜からなる粒子の内部に封入する工程を含む請求項１記載のリポソームの製造方法。
【請求項８】
ホウ素中性子捕捉療法用組成物に含有されるホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つはホウ素１０同位体である）の塩を内封してなるリポソームを製造する際におけるホウ素イオンクラスターの塩の構成成分としての多価アミンまたはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法に有用な、ホウ素１０同位体を含むホウ素化合物を内封したリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、放射性アイソトープを利用した新しいがんの治療方法として、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ：Ｂｏｒｏｎ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）が注目されている。ホウ素中性子捕捉療法は、ホウ素１０同位体（１０Ｂ）を含むホウ素化合物を腫瘍細胞に取り込ませ、低エネルギーの中性子（例えば熱中性子）を照射することで、細胞内で起こる核反応により局所的に腫瘍細胞を破壊する治療方法である。ホウ素中性子捕捉療法においては、１０Ｂを含むホウ素化合物を腫瘍に蓄積させることが、治療効果を高める上で重要である。そこで、腫瘍における１０Ｂを含むホウ素化合物の効率的な蓄積を達成すべく、リポソームを利用した１０Ｂを含むホウ素化合物の腫瘍へのデリバリーシステムの研究開発が、本発明者らの研究グループを含む複数の研究グループによって行われている。
【０００３】
リポソームを利用した１０Ｂを含むホウ素化合物の腫瘍へのデリバリーシステムの１つとして、１０Ｂを含むホウ素化合物を内封したリポソームが知られている（例えば特許文献１）。この方法は、例えば効果や安全性が確認されている既存の１０Ｂを含むホウ素化合物をリポソームの内封成分として用いることができるので汎用性に優れると言える。しかしながら、１０Ｂを含むホウ素化合物をリポソームに高濃度に内封することは、いったん内封しても安定して保持されずその後に外部に漏出してしまうといったことから困難であり、また、得られるリポソームの保存安定性に改善の余地があることが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平９−５０１１４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】中村浩之、ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １３０（１２）１６８７−１６９４（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、ホウ素中性子捕捉療法に有用な、１０Ｂを含むホウ素化合物を高濃度に内封した保存安定性に優れるリポソームを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、リポソームに内封する１０Ｂを含むホウ素化合物として多面体構造のホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）の塩を選択する場合、通常、特許文献１にも記載されているように、ナトリウムイオンやカリウムイオンなどのアルカリ金属イオンとの塩やテトラメチルアンモニウムイオンなどのテトラアルキルアンモニウムイオンとの塩が用いられるが、ホウ素イオンクラスターと多価アミンやその塩からなる塩を内封成分とした場合、全く驚くべきことにその塩はリポソームに高濃度に内封されること、また、得られたリポソームは保存安定性に優れることを見出した。
【０００８】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）と多価アミンまたはその塩からなる塩を内封してなるリポソームである。
また、請求項２記載のリポソームは、請求項１記載のリポソームにおいて、ホウ素イオンクラスターが、カルボラン、ドデカボレート、分子式がＢ１０Ｈ１０で表されるイオンクラスター、分子式がＭ（Ｃ２Ｂ９Ｈ１０）２で表わされるサンドイッチ型イオンクラスター（Ｍは遷移元素）（これらは置換基を有していてもよい）から選択される少なくとも１つである。
また、請求項３記載のリポソームは、請求項２記載のリポソームにおいて、ホウ素イオンクラスターが置換基を有していてもよいドデカボレートである。
また、請求項４記載のリポソームは、請求項１記載のリポソームにおいて、多価アミンが脂肪族ポリアミンである。
また、請求項５記載のリポソームは、請求項４記載のリポソームにおいて、脂肪族ポリアミンが、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンから選択される少なくとも１つである。
また、本発明は、請求項６記載の通り、請求項１記載のリポソームを含有するホウ素中性子捕捉療法用組成物である。
また、本発明は、請求項７記載の通り、ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）と多価アミンまたはその塩からなる塩を得る工程と、得られた塩を脂質二重膜からなる粒子の内部に封入する工程を含む請求項１記載のリポソームの製造方法である。
また、本発明は、請求項８記載の通り、ホウ素中性子捕捉療法用組成物に含有されるホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）の塩を内封してなるリポソームを製造する際におけるホウ素イオンクラスターの塩の構成成分としての多価アミンまたはその塩の使用である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ホウ素中性子捕捉療法に有用な、１０Ｂを含むホウ素化合物を高濃度に内封した保存安定性に優れるリポソームを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実験例１における、ＢＮＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソームの、脂質に含まれるリンの濃度に対するホウ素濃度の比率を示すグラフである。
【図２】同、ＢＮＨのナトリウム塩を内封してなるリポソームの、脂質に含まれるリンの濃度に対するホウ素濃度の比率を示すグラフである。
【図３】実験例２における、各被験リポソームを腫瘍移植マウスに投与した際の血液、肝臓、腎臓、脾臓、腫瘍のホウ素濃度を示すグラフである。
【図４】同、血液ホウ素濃度に対する腫瘍ホウ素濃度の比率を示すグラフである。
【図５】実験例３における、各被験リポソームを用いて腫瘍移植マウスに中性子照射を行った場合の照射後の腫瘍体積変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）と多価アミンまたはその塩からなる塩を内封してなるリポソームである。
【００１２】
本発明において、ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）は、ホウ素中性子捕捉療法に用いることができる多面体構造のものであればどのようなものであってよい。具体的には、カルボラン、ドデカボレート、分子式がＢ１０Ｈ１０で表されるイオンクラスター、分子式がＭ（Ｃ２Ｂ９Ｈ１０）２で表わされるサンドイッチ型イオンクラスター（Ｍは遷移元素）などの公知のものが挙げられる（必要であれば例えばＯｌｅｊｎｉｃｚａｋ  ＡＢら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３（１）３１１−３１８（２００６）やＭ．Ｅ．Ｅｌ−Ｚａｒｉａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６（５）１５４３−１５５２（２０１０）を参照のこと）。カルボランは分子式がＣ２Ｂ９Ｈ１１で表わされるニド型カルボラン（オルト体、メタ体、パラ体）であってもよいしＣＢ１１Ｈ１２で表わされるクロソ型カルボランであってもよい。ドデカボレート（ＢＨ）は分子式がＢ１２Ｈ１２で表されるイオンクラスターである。分子式がＭ（Ｃ２Ｂ９Ｈ１０）２で表わされるサンドイッチ型イオンクラスターを構成する遷移元素ＭはＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏなどであってよい。なお、これらのホウ素イオンクラスターはチオール基、水酸基、アミノ基などの置換基を有していてもよい。置換基を有するドデカボレート、例えば、チオール基を有するドデカボレート（ＢＳＨ）は分子式がＢ１２Ｈ１１ＳＨで表される２価の負電荷を有するイオンクラスター、水酸基を有するドデカボレート（ＢＯＨ）は分子式がＢ１２Ｈ１１ＯＨで表される２価の負電荷を有するイオンクラスター、アミノ基を有するドデカボレート（ＢＮＨ）は分子式がＢ１２Ｈ１１ＮＨ３＋で表される１価の負電荷を有するイオンクラスターであり、いずれもホウ素中性子捕捉療法に有用な１０Ｂを含むホウ素化合物として知られている（下記の構造式を参照のこと）。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
本発明において、多価アミンは、分子内に１〜３級のアミノ基を２つ以上有する化合物を意味する。具体的には、分子内のアミノ基が炭素数２〜６のアルキレン基を介して結合した脂肪族ポリアミン、例えばプトレスシン、スペルミジン、スペルミンの他、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、１，３−プロパンジアミン、１，６−ヘキサメチレンジアミンなどが挙げられる。多価アミンはデンドリマー構造を有するものであってもよい。多価アミンの塩としては、無機酸塩（塩酸、硝酸、硫酸などの無機酸との塩）や有機酸塩（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸などの有機酸との塩）が挙げられる。
【００１５】
ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）と多価アミンまたはその塩からなる塩は、例えば、ホウ素イオンクラスターのナトリウムイオンやカリウムイオンなどのアルカリ金属イオンとの塩の水溶液と、多価アミンまたはその無機酸塩や有機酸塩の水溶液を混合することで、水溶液の形態で得ることができる。また、得られた水溶液を凍結乾燥することで粉末の形態で得てもよい。ホウ素イオンクラスターと多価アミンまたはその塩の混合比率は、例えば前者が１当量に対して後者をモル数×分子内アミノ基数で０．８〜４．５当量が望ましい。
【００１６】
ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）と多価アミンまたはその塩からなる塩を内封してなるリポソームは、脂質二重膜からなる粒子の内部に１０Ｂを含むホウ素化合物を封入するための一般的な方法で製造することができる（必要であれば例えば特許文献１やＫ．Ｍａｒｕｙａｍａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９８（２００４）１９５−２０７を参照のこと）。脂質二重膜の構成成分として用いる脂質は、公知の脂質であってよく、例えば、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質の他、１〜３級のアミノ基や４級アンモニウム基を導入したカチオン性脂質、ポリアルキレングリコールを導入した脂質、腫瘍に対する親和性を有するリガンドを結合した脂質が挙げられる。これらの脂質は単独で用いてもよく、複数種類を混合して用いてもよい。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンなど）、ホスファチジルエタノールアミン（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなど）、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質などの天然または合成のリン脂質が挙げられる。グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドが挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドが挙げられる。カチオン性脂質としては、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基やモノアシルオキシアルキル−ジアルキルアンモニウム基やジアシルオキシアルキル−モノアルキルアンモニウム基などの４級アンモニウム基を導入した脂質が挙げられる。ポリアルキレングリコールを導入した脂質としては、例えば、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールを導入した脂質が挙げられる。腫瘍に対する親和性を有するリガンドを結合した脂質におけるリガンドとしては、例えば、トランスフェリンやがん特異的抗原に対する抗体が挙げられる。また、リポソームの構成成分として、例えば、膜安定化剤としてのコレステロール類や、抗酸化剤としてのトコフェロール類などを添加してもよい。
【００１７】
なお、本発明のリポソームに、ホウ素イオンクラスターと多価アミンまたはその塩からなる塩に加えて、抗癌剤をはじめとする各種の薬理成分などを内封してもよい。
【００１８】
本発明のリポソームは、ホウ素イオンクラスター（但し分子中のホウ素原子の少なくとも１つは１０Ｂである）と多価アミンまたはその塩からなる塩を高濃度に内封してなる、粒子径が例えば１０ｎｍ〜１０００ｎｍのものであり（粒子径は２０ｎｍ〜２００ｎｍが望ましい）、そのホウ素濃度は５０００ｐｐｍ以上に達する。また、本発明のリポソームは、保存安定性に優れるものである。従って、本発明のリポソームを用いれば、少ない投与量で効果的なホウ素中性子捕捉療法によるがんの治療が可能となる。本発明のリポソームは、例えば所定量を生理食塩水や注射用蒸留水に分散させた組成物として製剤化され、静脈から投与することができる。なお、本発明のリポソームを含有する組成物には、自体公知のｐＨ調節剤や防腐剤などを添加してもよい。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００２０】
実施例１：ＢＳＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソーム
Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９８（２００４）１９５−２０７に記載の方法を参考に、内封されるＢＳＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩の濃度が１２５ｍＭとなるように以下の工程で製造した。
（１）  ９０．１ｍｇ（０．６２ミリモル）のスペルミジンをサンプル管にとり、１ＮのＨＣｌを１．８６ｍＬ（スペルミジン１当量に対して１ＮのＨＣｌを３当量）加え、ｐＨが５付近のスペルミジン塩酸塩の水溶液を得た。
（２）  一方、１３０．２ｍｇ（０．６２ミリモル）のメルカプトウンデカハイドロドデカボレートの２ナトリウム塩（Ｎａ２Ｂ１２Ｈ１１ＳＨ、１０Ｂ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ＞９９％）をサンプル管にとり、３．１４ｍＬのミリＱ水を加えて、その水溶液を得た。
（３）  上記のスペルミジン塩酸塩の水溶液とＮａ２Ｂ１２Ｈ１１ＳＨの水溶液を混ぜ合わせることで、スペルミジン塩酸塩をカウンターカチオンに持つＢＳＨの塩の水溶液を得た。
（４）  次に、５０ｍＬのナスフラスコに、１５８ｍｇ（０．２ミリモル）のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、７７．３ｍｇ（０．２ミリモル）のコレステロール、６３．８ｍｇ（０．０２２ミリモル）の分子量２０００のポリエチレングリコールを導入したジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのナトリウム塩（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ−２０ＣＮ：市販品）をとり、５ｍＬのクロロホルムを加えて完全に溶かした後に、５ｍＬのイソプロピルエーテルを加えた。
（５）  （４）で得た５ｍＬのナスフラスコ中の混合溶液に、（３）で得たスペルミジン塩酸塩ＢＳＨ水溶液を加えて、２層溶液を得た。
（６）  （５）で得た２層溶液に超音波を３分間あてることで、Ｗ／Ｏ型エマルションを得、エバポレータで有機溶媒を除去することによって、脂質二重膜のリポソームを得た（ＲＥＶ法）。
（７）  （６）で得たリポソームを、エクストルーダーを用いて１００ｎｍのメンブレンフィルタ−を通すことによって、その粒子径を１００ｎｍにした。
（８）  （７）で得たリポソームを超遠心機（日立工機社製：ｈｉｍａｃ  ｃｐ  ８０  ｗｘ、以下同じ）によって５００００ｒｐｍで１時間、遠心分離することを２度繰り返すことによって、約１ｍＬのペレット状のスペルミジン塩酸塩ＢＳＨを内封してなるリポソームを得た。
以上の工程で得たペレット状のリポソームに０．５ｍＬの生理食塩水を加え、スペルミジン塩酸塩ＢＳＨを内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させたホウ素中性子捕捉療法用組成物を得た。得られた組成物のホウ素濃度を誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ：ＨＯＲＩＢＡ社製、以下同じ）で測定したところ、１３０００ｐｐｍというこれまでにない高い濃度であった。
【００２１】
実施例２：ＢＮＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソーム
実施例１における１３０．２ｍｇ（０．６２ミリモル）のメルカプトウンデカハイドロドデカボレートの２ナトリウム塩のかわりに、１０６．１ｍｇ（０．６２ミリモル）のアミノウンデカハイドロドデカボレートのナトリウム塩（ＮａＢ１２Ｈ１１ＮＨ３、１０Ｂ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ＞９９％：Ｗ．Ｒ．Ｈｅｒｔｌｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，８６，３６６１−３６６８（１９６４）に記載の方法に従って合成）を用いること以外は実施例１と同様にして、約１ｍＬのペレット状のスペルミジン塩酸塩ＢＮＨを内封してなるリポソームを得た。得られたペレット状のリポソームに０．５ｍＬの生理食塩水を加え、スペルミジン塩酸塩ＢＮＨを内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させたホウ素中性子捕捉療法用組成物を得た。得られた組成物のホウ素濃度をＩＣＰ−ＡＥＳで測定したところ、１３０００ｐｐｍというこれまでにない高い濃度であった。
【００２２】
比較例１：ＢＳＨの２ナトリウム塩を内封してなるリポソーム
実施例１におけるスペルミジン塩酸塩をカウンターカチオンに持つＢＳＨの塩の水溶液のかわりに、１３０．２ｍｇ（０．６２ミリモル）のメルカプトウンデカハイドロドデカボレートの２ナトリウム塩に５ｍＬのミリＱ水を加えて得た水溶液を用いること以外は実施例１と同様にして、約１ｍＬのペレット状のＢＳＨの２ナトリウム塩を内封してなるリポソームを得た。得られたペレット状のリポソームに０．５ｍＬの生理食塩水を加え、ＢＳＨの２ナトリウム塩を内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させたホウ素中性子捕捉療法用組成物を得た。得られた組成物のホウ素濃度をＩＣＰ−ＡＥＳで測定したところ、３５００ｐｐｍであり実施例１で得られた組成物のホウ素濃度の１／３以下であった。
【００２３】
比較例２：ＢＮＨのナトリウム塩を内封してなるリポソーム
比較例１における１３０．２ｍｇ（０．６２ミリモル）のメルカプトウンデカハイドロドデカボレートの２ナトリウム塩のかわりに、１０６．１ｍｇ（０．６２ミリモル）のアミノウンデカハイドロドデカボレートのナトリウム塩を用いること以外は比較例１と同様にして、約１ｍＬのペレット状のＢＮＨのナトリウム塩を内封してなるリポソームを得た。得られたペレット状のリポソームに０．５ｍＬの生理食塩水を加え、ＢＮＨのナトリウム塩を内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させたホウ素中性子捕捉療法用組成物を得た。得られた組成物のホウ素濃度をＩＣＰ−ＡＥＳで測定したところ、４０００ｐｐｍであり実施例２で得られた組成物のホウ素濃度の１／３以下であった。
【００２４】
実験例１：ホウ素薬剤のリポソーム内封率とその時間変化の評価
実施例２で得たＢＮＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させた組成物と、比較例２で得たＢＮＨのナトリウム塩を内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させた組成物について、脂質に含まれるリンの濃度に対するホウ素濃度の比率（Ｂ／Ｐ）をＩＣＰ−ＡＥＳを用いて調べることで、ホウ素薬剤のリポソーム内封率を評価した。また、組成物を得た日の１日後、３日後、７日後、１４日後に、再度、超遠心機によって５００００ｒｐｍで１時間、遠心分離することによってペレット状のリポソームを得、得られたペレット状のリポソームを０．５ｍＬの生理食塩水に分散させた組成物についてＢ／Ｐを調べ、ホウ素薬剤のリポソーム内封率の時間変化を評価した。
実施例２で得た組成物の評価結果を図１に、比較例２で得た組成物の評価結果を図２にそれぞれ示す。図１と図２から明らかなように、実施例２で得た組成物のリポソーム内封率は、比較例２で得た組成物のリポソーム内封率よりも全評価期間を通して高く（前者のＢ／Ｐは約３であるのに対して後者のＢ／Ｐは約２）、ＢＮＨをスペルミジン塩酸塩と塩を形成させることによってリポソーム内封率が向上することがわかった。
【００２５】
実験例２：ホウ素薬剤内封リポソームを腫瘍移植マウスに投与した際の体内ホウ素濃度の時間変化の評価
メスのＢａｌｂ／ｃマウスの右足太ももにＣＴ２６細胞を皮下移植し（濃度：２×１０７個／ｍＬ，５０μＬ）、１週間後に腫瘍体積（長径×長径×短径／２）が約１００ｍｍ３〜１５０ｍｍ３であることを確認した後、被験リポソームを２００μＬ静脈投与した。被験リポソームは、実施例１で得たＢＳＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソーム（ＢＮＤ−Ｓ）を体重１ｋｇあたりのホウ素投与量で１５ｍｇ（１５ｍｇ［Ｂ］／ｋｇ）、３０ｍｇ［Ｂ］／ｋｇ、１００ｍｇ［Ｂ］／ｋｇ、実施例２で得たＢＮＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソーム（ＢＮＤ−Ｎ）を１５ｍｇ［Ｂ］／ｋｇ、３０ｍｇ［Ｂ］／ｋｇ、１００ｍｇ［Ｂ］／ｋｇとした。時間経過ごとのホウ素の体内分布を調べるために、各被験リポソームを投与してから２４時間後、３６時間後、４８時間後、７２時間後にマウスを解剖し（ｎ＝５）、血液を採取するとともに、肝臓、腎臓、脾臓、腫瘍を摘出した。採取した血液と摘出した臓器および腫瘍に濃硝酸を加えて８０℃に加熱して溶かし、５００ｎｍのフィルターに通した後、ＩＣＰ−ＡＥＳでホウ素濃度を測定し、それぞれのホウ素濃度の時間変化を評価した。
各被験リポソームについての血液、肝臓、腎臓、脾臓、腫瘍の評価結果をそれぞれ図３に示す。また、血液ホウ素濃度に対する腫瘍ホウ素濃度の比率（Ｔ／Ｂ）を図４に示す。図３と図４から明らかなように、ＢＮＤ−ＳとＢＮＤ−Ｎはともに血液中の貯留性に優れ、腫瘍に高濃度に集積することがわかった。ＢＮＤ−ＳとＢＮＤ−Ｎをそれぞれ１００ｍｇ［Ｂ］／ｋｇ投与した場合、３６時間後の腫瘍ホウ素濃度はそれぞれ２００ｐｐｍと２４０ｐｐｍであり、いずれもこれまで報告されている腫瘍に対する集積濃度よりも遥かに高い集積濃度であった。この結果は、ＢＳＨやＢＮＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩が血液中を循環している際にリポソームから漏出することなく、効率良く腫瘍にデリバリーされたことを示唆するものであった。なお、いずれの被験リポソームを投与した場合においてもマウスに急性毒性の症状は認められなかった。
【００２６】
実験例３：ホウ素薬剤内封リポソームを用いた腫瘍移植マウスに対する中性子照射の抗腫瘍効果の評価
実験例２と同様にして腫瘍移植マウスに各被験リポソームを２００μＬ静脈投与した。３６時間後に中性子照射（中性子照射線量：１．３〜２．２×１０１２ｎ／ｃｍ２、γ線量：６．７〜８．８×１０−１Ｇｙ）を５０分間行い、照射後の腫瘍体積変化を測定し、各被験リポソームの抗腫瘍効果を評価した（ｎ＝６）。
結果を図５に示す（図中、Ｈｏｔ  ｃｏｎｔｒｏｌは被験リポソームを投与せずに中性子照射を行った群を意味し、Ｃｏｌｄ  ｃｏｎｔｒｏｌは被験リポソームを投与して中性子照射を行わなかった群を意味する）。図５から明らかなように、いずれの被験リポソームを投与した場合においても、照射後４〜５日目あたりから腫瘍体積の顕著な減少がみられ、約２週間後には腫瘍がほぼ消滅した。
【００２７】
実験例４：ホウ素薬剤内封リポソームの保存安定性の評価
実施例１で得たＢＳＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させた組成物と、比較例１で得たＢＳＨの２ナトリウム塩を内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させた組成物を、４℃で冷蔵保存したところ、前者は１ヶ月経過後も性状変化が認められなかったのに対し、後者は１ヶ月経過後にリポソームの分解による白濁化が認められた。実施例２で得たＢＮＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させた組成物と、比較例２で得たＢＮＨのナトリウム塩を内封してなるリポソームを生理食塩水に分散させた組成物も、同様の結果であったことから、ＢＳＨやＢＮＨをスペルミジン塩酸塩と塩を形成させることは、リポソームを構成する脂質二重膜の安定化に寄与することが推察された。
【００２８】
実施例３：ＢＳＨとスペルミン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソーム
実施例１と同様にして得た。その特性は程度の違いはあるが実施例１で得たＢＳＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソームと同様であった。
【００２９】
実施例４：ＢＳＨとプトレスシン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソーム
実施例１と同様にして得た。その特性は程度の違いはあるが実施例１で得たＢＳＨとスペルミジン塩酸塩からなる塩を内封してなるリポソームと同様であった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法に有用な、１０Ｂを含むホウ素化合物を高濃度に内封した保存安定性に優れるリポソームを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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