(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＥＤＴＡと共にシュウ酸を含む混合緩衝液を加えて希釈されたサンプルと、酸化型補因子を還元することによりγ−ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）をコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）へ変換可能な酵素と、ＮＡＤＨへと還元される酸化型補因子であるＮＡＤ＋と、の混合物をインキュベーションする工程、
（ｂ）還元型補因子であるＮＡＤＨの量を測定する工程、および
（ｃ）前記還元型補因子であるＮＡＤＨの測定量と前記サンプル中のＧＨＢの濃度とを関連づける工程、を含み、
前記工程（ａ）の前記酵素がオキシドレダクターゼである、サンプル中のＧＨＢの濃度の決定方法。
【請求項２】
前記酵素がＧＨＢデヒドロゲナーゼ、ＳＳＡレダクターゼ、グルクロン酸レダクターゼ
および／またはアルデヒドレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記還元型補因子の測定波長が１００ｎｍ〜６５０ｎｍである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記還元型補因子の測定波長が３４０ｎｍである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記混合物のインキュベーション温度が２８〜５０℃である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物のインキュベーション温度が３７℃である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベーション時間が１〜６０分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベーション時間が８分である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物のｐＨ値が８〜１２である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐＨ値が１０である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）酸化型補因子を還元することによりＧＨＢをコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）へ変換可能な酵素であるオキシドレダクターゼ、
（ｂ）ＮＡＤＨへと還元される酸化型補因子であるＮＡＤ＋、ならびに
（ｃ）１〜１００ｍＭのシュウ酸、および０．１〜１．５ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液、
を成分として含むＧＨＢサンプル分析用組成物。
【請求項１２】
前記酵素がＧＨＢデヒドロゲナーゼである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記酸化型補因子が０．１〜１０ｍＭのＮＡＤ＋である、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を行うのに適したキット。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
マイクロタイタープレートにおける用途への請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１７】
オートアナライザーにおける用途への請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１８】
前記工程（ａ）の前記酵素が、合成的に製造された遺伝子構築物から得られたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサンプル中のγ−ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）の濃度を決定するための方法および組成物、並びに前記方法を行うのに適したキットに関する。本発明は、さらに、マイクロタイタープレートまたはオートアナライザー（臨床検査室でしばしば使用されるランダムアクセス分析用装置）における用途への前記方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−ヒドロキシ酪酸（４−ヒドロキシブタン酸、Ｃ４Ｈ８Ｏ３、通常、ＧＨＢと略される）は内因性物質であり、また、多くの国において非合法的な治療薬物であって、中枢神経系、つる植物、肉牛、小さな柑橘果実、およびほとんどすべての他の生物に少量見出される自然発生物質である。該物質は現在、米国で規制されており、ジャズファーマシューティカルがキシレム（Ｘｙｒｅｍ）という名称で販売している。
【０００３】
医療機関において、ＧＨＢは一般的な麻酔薬として使用され、不眠症、臨床的鬱病、ナルコレプシー、およびアルコール依存症のような症状の治療ならびに運動能力を改善するため使用されている。
【０００４】
イタリアでは、ＧＨＢは、アルコバー（Ａｌｃｏｖｅｒ）（ＡＴＣＮ０７ＢＢ）という商標名で、急性アルコール離脱用および長期間解毒媒体用としてアルコール依存症治療（３回以上の分配投与で５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日）に使用されている。米国では、ＧＨＢは、キシレムという商標名で、ナルコレプシー患者の脱力発作回数を減らすための用途としての使用が食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可されている。
【０００５】
ＧＨＢがナトリウム塩またはカリウム塩の形態で用いられる場合には、有意量の過剰ナトリウムまたはカリウムが消費されることから、心不全、高血圧、または腎機能低下している者に考慮される。食品とともに摂取される場合には、ＧＨＢナトリウム塩のバイオアベイラビリティーはかなり低下するため、薬を服用する前には食後少なくとも２時間待つよう指示される。その鎮静作用は強力であるため、患者はＧＨＢナトリウム塩を摂取した後、少なくとも６時間は運転や重機を操作するべきではない。
【０００６】
臨床試験におけるキシレムの副作用としては、頭痛、吐き気、咽頭炎、めまい、眠気、嘔吐、尿失禁、精神錯乱、呼吸困難、感覚麻痺、知覚障害、震え、目眩、および視力低下を含む。
【０００７】
また、γ−ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）は、米国や他の国で薬物性昏睡の主要な原因となる違法化学物質である。実際、米国において、ＧＨＢの過剰摂取の数は、現在、ＭＤＭＡ（エクスタシー）の過剰摂取の数を越えている。ＧＨＢは１９６０年代に米国医学会により禁止されたが、血液脳関門を自由に通過し、意識を低下させ、その結果興奮する作用を有し、また、毒性を有することから、多くの人の間で良く知られている。これらの使用は、科学的研究により証明されているわけではなく、死に至る危険性もあるが、睡眠補助薬、抗鬱剤および減量製品としてインターネットで過大に宣伝されている。ＧＨＢは、１９８０年代後半にステロイドが規制されたとき、ステロイドの代替品として最初に始まり、緊急治療室での業務、愛する者を失った者の命に対する喪失感、中毒の家族／友達に対する恐怖感によって生じる多様な医療悪夢へと拡大した。しかし、それは未だ警察官、医療／検視従事者、および親にとって不可解なことである。
【０００８】
非医学的に、中枢神経系（ＣＮＳ）抑制剤としても作用するＧＨＢは、乱用薬物として使用される。それは、リキッドエクスタシーやリキッドエックスを含む多くの俗称を有する。ＧＨＢは、低用量で興奮状態、運動や音楽の楽しさの増加、性欲の増加、および社交性の増加を生じうる。ＧＨＢは、より高用量で吐き気、目眩、眠気、動揺、視覚障害、呼吸困難、記憶喪失、意識不明、および死を誘発する。ＧＨＢの効果は、大量投与した場合またはアルコールと併用した場合、１．５〜３時間以上継続する。
【０００９】
一般的に、娯楽で使用される投与量は５００ｍｇ〜３０００ｍｇであり、濃度が１ｇ／ｍｌの場合（いつもとは限らない）、液体の約０．５〜３ｍｌに相当する。レクリエーションドラッグとして使用されるとき、ＧＨＢは純正液体、または標準濃度１ｇ／ｍｌの一般的なＧＨＢ塩水溶液でありうることから、医学用途に合法的に販売されている薬物やキシレムの２倍の強さである。
【００１０】
水および／またはアルコール飲料に溶解したＧＨＢ塩は、ＧＨＢの濃度がわからず、摂取されたＧＨＢの実際の投与量を正確に判断するのが困難となりうることから、きわめて危険である。レクリエーションドラッグとして販売されているＧＨＢは標準化されていないので、違法市場で購入されるＧＨＢ溶液の有効濃度を確認することは不可能である。ＧＨＢナトリウムは１ｍｌの水に１ｇ以上の溶解し、ＧＨＢナトリウム溶液は純粋なＧＨＢ溶液よりも実際に強力でありうる。ＧＨＢカリウム、ＧＨＢカルシウム、およびＧＨＢマグネシウムのような他の塩の形態も報告されているが、前記ナトリウム塩が最も一般的なものである。
【００１１】
化学物質の中には、胃中および血流中に循環している時にＧＨＢに変換されるものがある。ＧＢＬまたはγ−ブチロラクトンはそのようなプロドラッグの一つである。他のプロドラッグとしては１，４−ブタンジオール（１，４−Ｂ）を含む。これらは、前駆体に関する追加的な毒性を有しうる。１，４−ＢおよびＧＢＬは、例えば、ペンキ除去剤やワニス用希釈剤として産業上利用するとき、他のより有害な溶液と混合されうるが、通常、純正液体である。
【００１２】
ＧＨＢは密造され、米国において使用されているＧＨＢのほとんどは、米国内で不法に製造されている。いくつかの他の国において睡眠障害に処方薬として利用されている一方、その使用に伴う危険性により、ＧＨＢは１９９０年にＦＤＡにより（米国内で）禁止された。しかしながら、２００２年７月１７日に、ＧＨＢはナルコレプシーとしばしば併発するカタプレキシーの治療に認可された。
【００１３】
ＧＨＢは４０年以上前に有望な麻酔薬としてフランスで初めて合成されたが、その望ましくない副作用によって米国医学会により禁止された。各国が前記問題を認識し始めており、ＧＨＢの合法的な使用は減少している。ＧＨＢは１９８７年にナルコレプシー／カタプレキシーとして知られている睡眠障害合併症治療用に研究されるオーファンドラッグとして再び使用され始めた。ほぼ同時に、ステロイドユーザーに（深い睡眠状態において）成長ホルモンの体内生産が増大しうると言われていた。しかしながら、過剰摂取者の数が増えたため、１９９０年１１月に店頭に並べられなくなった。不運にも、レクリエーションドラッグおよびレイプドラッグとして認識され、一般に危険なものとなった。ＧＨＢそれ自体の規制が強化された結果、その「アナログ」または体内においてＧＨＢに変換されうる化学的関連物が次第に普及していった。
【００１４】
ＧＨＢの作用は未だ完全には解明されていない。ＧＨＢは、明らかに少なくとも２つの側面の作用を有しており、ＧＡＢＡＢ受容体と同様、最近の特徴付けられた、適切に命名された「ＧＨＢ受容体」を刺激する。ＧＨＢが、仮に実際の神経伝達物質であれば、ＧＡＢＡＢ受容体に対し比較的弱い親和性を有しているので、ＧＨＢ受容体で作用するのに十分な濃度に達しうる。しかしながら、レクリエーションでの使用中、ＧＨＢは基礎レベルに対して脳内できわめて高濃度に達し、ＧＡＢＡＢ受容体にも作用しうる。ＧＡＢＡＢ受容体におけるＧＨＢの作用はおそらくその鎮痛作用に関与しうる。ＧＨＢによるＧＡＢＡＢ受容体の刺激は、ドパミン放出を阻害し、（バクロフェンのような他のＧＡＢＡＢアゴニストのような）天然の鎮静神経ステロイド放出の原因となる。動物では、ＧＨＢの前記鎮静作用はＧＡＢＡＢアンタゴニスト（遮断薬）によりブロックされうる。
【００１５】
ＧＨＢにより誘発された行動的な影響におけるＧＨＢ受容体の関連性は、よく議論されている。信じがたいが、ＧＨＢ作用の高親和性部位と同様に、大脳皮質を含む脳の多くの領域において密に発現されるとき、ＧＨＢ受容体は重要でない。ＧＨＢ受容体における研究は限られている。しかしながら、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸塩の放出の原因となることが解っている。ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシクロトン酸および４−（ｐ−クロロベンジル）−ＧＨＢのようなＧＡＢＡＢ受容体ではなく、ＧＨＢ受容体を選択的に活性化する薬物は、動物の痙攣の原因となり、応答に適するＧＨＢを産出しない。
【００１６】
ＧＨＢ受容体の活性化はＧＨＢの追加的な性質を説明するものではない；ＧＨＢ受容体の選択的なアゴニストであり、ＧＡＢＡＢを活性化しない選択的ＧＡＢＡＢアゴニストおよびＧＨＢアナログを利用した調査では、ＧＨＢ受容体およびＧＡＢＡＢ受容体の両方がドパミン放出に重要であり、結果的に乱用傾向となることが示唆された。前記受容体の両方ではなく、一方のみを活性化する化合物は、急性のドパミン放出を誘起し、またはＧＨＢ自体による典型的な乱用の可能性をもたらすようには思われない。
【００１７】
一般的に、高用量のＧＨＢは、ＧＡＢＡＢ受容体を介して鎮静作用を示し、一方、低用量はＧＨＢ受容体の活性化を介して興奮作用を示す。これは、睡眠剤としてＧＢＨを服用する個体が、ＧＨＢによりもたらされた深い睡眠の数時間後に突然目覚めてしまう際に経験する、いわゆる「リバウンド」効果とも呼ばれる、鎮静とＧＨＢ中毒による典型的な興奮との奇異性の混乱を説明しうる。これは、系中において、ＧＡＢＡＢ受容体機能を刺激するための閾値以下の代謝により、ＧＨＢの濃度は低下し、その後の覚醒状態をもたらすＧＨＢ受容体を刺激するためである。
【００１８】
低用量におけるＧＨＢの脳での鎮静効果は、抑制を抑えることにより高揚感または興奮状態を生み出す。前記用量が増加された場合には、深昏睡に陥る。心拍数も抑えられ、またはゆっくりとなる。神経系における効果はミオクローヌスと呼ばれる筋収縮の痙攣をもたらし、発作のようになる。ＧＨＢの主な鎮静効果と組み合わさると、混乱、記憶喪失、嘔吐、および不規則な呼吸等の他の効果により危険である。ＧＨＢと併用する他の薬物、特にアルコールは、前記鎮静効果を弱め、致命的な結果の可能性を増加しうる。低用量におけるＧＨＢの所望の効果は魅力的に聞こえるが、（誤った）高用量の結果は死でありうる。ＧＨＢの用量反応性はかなり急であり、わずかな用量増加が症状および危険を劇的に増加する原因となることを意味する。様々な効果には、ティースプーン１杯で十分であり、それ以上は過剰投与になる。ＧＨＢを他の化学物質と混合したときに生じる結果に気づくこともまた重要である。例えば、ＧＨＢをアルコールまたは他の抑制剤と混合することは、結果的により死に至りやすくなる。前記効果は４時間続き、突然に消失する。
【００１９】
前記薬物は、さらに最近、アルコールおよび薬物「ロヒプノール」と同様の方法で、デートレイプドラッグとしてメディアで言及されている。ＧＨＢ自体は、石鹸のようなものであり、塩味があるが、溶液に希釈するとほとんど味はなく、したがって、飲料に混ぜたときに気づきにくい。さらに、摂取後のＧＨＢの同定は、体液内に存在する時間が短く困難である。今までのところ、様々な方法：体液または毛髪、および飲料中のγ−ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）のスクリーニング方法が開発されている。
【００２０】
Ｋｉｎｔｚらは、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）／質量分析（ＭＳ）により毛髪中のＧＨＢの検査方法を開示した。該方法は毛髪サンプルを塩化メチレンで洗浄し、次いでＧＨＢ−ｄ６の存在下、ＮａＯＨ（０．０１  Ｎ）中で一晩インキュベーションし、中和し、酸性条件下で酢酸エチルに抽出することにより、洗浄する必要がある（Ｊ．  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．，２００３，Ｊａｎ；４８（１）：１９５−２００）。同様の方法は、Ｓｈｅｎらによっても開発されており（Ｆａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ；２００６  Ｆｅｂ；２２（１）：４８−５１）、毛髪中のＧＨＢをＧＣ／ＭＳ分析している。両方の方法は、ＧＣ／ＭＳ検査方法は時間がかかり、複雑であるという不都合を有しているだけでなく、規則的な成長に対応するものをサンプルとするため、早くとも事象が断定された後、１か月は毛髪を収集しうる。したがって、リアルタイムおよび現場での検査は不可能である。
【００２１】
今まで、血中および尿中におけるＧＨＢの測定方法は、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ、ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ−ＭＳ、またはキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）のようなクロマトグラフィー法にほとんど限られていた。
【００２２】
血中および尿サンプル中のＧＨＢの検出する検査方法は、例えば、Ｋａｎｋａａｎｐaaらにより開発された（Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ．２００７  Ａｕｇ  ６；１７０（２−３）：１３３−８）。この方法もまた、数回の抽出、酸性化および遠心分離工程後、ＧＣ／ＭＳ分析を用いる。同様の方法（いくつかの条件および／または調製工程を伴うＧＣ／ＭＳ方法）はＬｉｕら（Ｆａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ；２００７  Ａｐｒ；２３（２）：１２０−２，１２９）、Ｐａｕｌら（Ｊ  Ａｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００７  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３０（６）：３７５−９）、Ｆｅｒｒａｒａら（Ｊ  Ｆａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ．１９９３  ＪＵＮ；１１（６）：４８３−７）、Ｖｉｌｌａｉｎら（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００３  Ｊｕｌ  １５；７９２（１）：８３−７）、ＭｃＣｕｓｋｅｒら（Ｊ  Ａｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９９  Ｓｅｐｔ；２３（５）：３０１−５）、Ｅｌｉａｎら（Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ．２０００  Ａｐｒ  １０；１０９（３）：１８３−７）、およびＢｌａｎｃｈｅｔら（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００２  Ａｐｒ  ５；７６９（２）：２２１−６）により提供されている。
【００２３】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法はまた、飲料（ｂｅｖｅｒａｇｅ）および／またはドリンク中ＧＨＢの検出に一般的に使用されている（例えば、Ｌｉｕら、Ｆａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ，２００７  Ａｐｒ；２３（２）：１２０−２，１２９）。
【００２４】
ＧＨＢ成分のさらなる検査方法は、ＧＨＢが、酸性溶液中で、水酸化ナトリウム存在下でヒドロキシルアミン塩酸塩と反応するＧＢＬに変換され、ヒドロキサメートを形成する点に特徴を有する、ドリンクおよび尿中のＧＨＢを素早くスクリーニングするカラーテストを含む。ヒドロキサメートは酸性条件において塩化第二鉄と反応したとき、紫色の錯体が形成された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；Ｆａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ，２００６  Ｄｅｃ；２２（６）：４２４−７）。
【００２５】
さらに、間接ＵＶ検出を用いたキャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびエレクトロスプレーイオン化イオントラップ分光分析を用いた確認によって、ヒト尿中のＧＨＢを決定する方法が当該技術分野で知られている（Ｂａｌｄａｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，２００３  Ｍａｒ  ２１；９９０（１）−２：９９−１１０）。該分析は間接ＵＶ吸収検出を用いた液体抽出およびキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）に基づいている。同時に用いられる電解液には、ニコチン酸（４ｍＭ）（間接検出用の化合物）、スペルミン（３ｍＭ）（電気浸透の逆転）、およびヒスチジン（ｐＨ６．２にするために添加される）が含まれる。４０ｃｍの効果的な長さの５０ミクロンＩＤキャピラリー、内部標準としての１−オクタンスルホン酸、２１４ｎｍの溶液検出および２．４ｍＳ／ｃｍの導電性を有する希釈尿を有している場合、ＧＨＢ濃度＝２μｇ／ｍｌが検出されうる。
【００２６】
加えて、ＧＨＢ検出のアッセイに基づく酵素はＢｒａｖｏらにより開発され、サンプル中のＧＨＢ成分はラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のＧＨＢデヒドロゲナーゼを使用する２工程の検査方法において決定される。この方法は少なくとも２つの連続した工程からなり、第１工程は、前記サンプルをＧＨＢオキシドレダクターゼおよび酸化型補因子と接触させ、酸化型補因子の還元を行うものであり、第２工程は第２のオキシドレダクターゼおよび色原体または染料とを前記サンプルおよび前記還元型補因子と接触させ、検出可能な化合物の形態にするものである（Ｂｒａｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ，Ｍａｒ．２００４，Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．２：３７９−８７）。この方法はさらに、ＵＳ  ６，７０３，２１６  Ｂ２で特許されている。
【発明の概要】
【００２７】
最先端ですでに知られているすべての方法は、大規模な装置、および／またはきわめて熟練した職員、および／または実施するのに長時間を要する。資格のない研究者によっても行われうる、新規、簡単、および迅速な方法に対する要望は、大規模な装置を必要とせず、また、緊急の検査に適する、極めて早い方法である。
【００２８】
したがって、本発明は、簡単に行うことができ、大規模で効果な装置を必要としない、マイクロタイタープレートリーダーまたはオートアナライザーのどちらかに利用できるＧＨＢの決定方法を提供することを目的とする。また、本発明の方法を実施するのに適したキットおよび組成物を提供することを目的とする。
【００２９】
前記方法は臨床化学検査器に容易に適用可能であり、標準クロマトグラフィー法と良好な相関を示す利点をさらに有する。また、サンプル中に高レベルまたは低レベルのどちらであってもＧＨＢ決定が可能である。
【００３０】
驚くべきことに、ＧＨＢをコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）に変換しうる酵素および還元される酸化型補因子を含むサンプルをインキュベーションし、前記還元された補因子の量を測定することで、サンプル中のＧＨＢ成分を検出することが可能であることがわかった。前記還元型補因子測定量はサンプル中のＧＨＢ濃度と直接関連しうる。
【００３１】
したがって、本発明は、（ａ）ＥＤＴＡと共にシュウ酸を含む混合緩衝液を加えて希釈されたサンプルと酸化型補因子を還元することによりγ−ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）をコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）へ変換可能な酵素とをインキュベーションする工程、（ｂ）還元型補因子の量を測定する工程、および（ｃ）前記還元型補因子の測定量と前記サンプル中のＧＨＢの濃度とを関連づける工程、を含む、サンプル中のＧＨＢの濃度の決定方法を提供する。
【００３２】
本発明は、さらに（ａ）ＧＨＢをコハク酸セミアルデヒドへ変換可能な酵素、および（ｂ）酸化型補因子を成分として含むＧＨＢサンプル分析用組成物を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、本発明の方法を行うのに適したキットを提供する。
【００３４】
本発明は、また、マイクロタイタープレートまたはオートアナライザー（電解質、酵素、乱用薬物、治療薬物、腫瘍マーカー、ホルモン、心臓マーカーのような臨床化学パラメータの臨床検査にしばしば使用されるランダムアクセス分析）を用いる本発明の方法の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１はサンプル（例えば、血清、尿、飲料）中のＧＨＢ濃度の決定原理を示す。
【図２】図２はＧＨＢ−ＤＨの動態に関するマイクロプレート分析を示す。
【図３】図３はオートアナライザー（臨床化学分析）に用いられた２つのアッセイフォーマットを示す。
【図４】図４はコーンＴ３０分析器で行われた２つの試薬による分析を示す。
【図５】図５は臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）におけるＧＨＢ検量線を示す。
【図６】図６は尿サンプル用の前記方法の精度を実証するための、臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）においての一連のアッセイ（添加回収率実験）の結果を示す。
【図７】図７は血清サンプル用の前記方法の精度を実証するための、臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分）において行われる一連のアッセイ（添加回収率実験）の結果を示す。
【図８】図８は、本発明の酵素法の精度を実証するための、臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）またはイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）法のいずれかで行われる一連のアッセイの結果を示す。
【図９】図９は臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）において行われる一連のアッセイの結果を示す。
【図１０Ａ】図１０は本発明の酵素法（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）でそれぞれ測定された１０人の健常ドナーの血清および尿中のＧＨＢの内因性レベルをそれぞれ示す。
【図１０Ｂ】図１０は本発明の酵素法（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）でそれぞれ測定された１０人の健常ドナーの血清および尿中のＧＨＢの内因性レベルをそれぞれ示す。
【図１１】図１１は中毒患者（ｎ＝９）から採取した尿サンプル中のＧＨＢの内因性レベルと、ＧＨＢ濃度を示す健常ドナー（ｎ＝１０）から採取した尿サンプル中のＧＨＢの内因性レベルとの比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の前記方法において、前記サンプルは任意の体液、およびアルコール含有飲料を含む任意の飲料または任意の食用エキスから採取されうる。前記サンプルが体液から採取される場合、限定されないが、前記サンプルは、血液、血清、血漿、リンパ液、細胞もしくは組織誘導抽出物、骨髄液、唾液、眼球液、精液、脳抽出物、髄液、関節液、胸腺液、腹水または精製物質、および羊水からなる群から選択されることが好ましく、血液、血清または血漿、およびスポット尿であることが最も好ましい。可能な血漿サンプルはＥＤＴＡ、クエン酸塩、およびヘパリン血漿を含む。前記サンプルが飲料または飲料様製品から採取される場合、前記サンプルは、制限されないが、ビール、ワイン、蒸留酒のようなアルコール含有飲料およびカクテルやアルコポップのようなアルコール含有混合飲料、レモンソーダ、炭酸ミネラルウォーター、コカコーラ（登録商標）、ジンジャーエール（登録商標）、ビターレモン（登録商標）、トニックウォーター（登録商標）またはスプライト（登録商標）、フルーツジュースのような炭酸またはソーダ飲料のようなノンアルコール飲料からなる群から選択されることが好ましい。本発明の趣旨において、バターミルク、ミルク、ヨーグルト飲料、ヨーグルト、およびクリームのような飲料様食品から前記サンプルを採取することも可能である。さらに可能なサンプルは、紅茶、紅茶含有製品、ココア、およびココア含有製品のほか、コーヒー、コーヒー代替品、および他のコーヒー含有製品である。
【００３７】
本発明の趣旨において、ＧＨＢはＧＨＢ由来のものまたはそのアナログでありうる。さらに、「ＧＨＢ」との語は、限定されないが、「γ−ヒドロキシ酪酸」、「γ−ヒドロキシ酪酸エステル」、「４−ヒドロキシ酪酸」、「オキシ酪酸」、「γ−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（ｇａｍｍａ−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅ）」、「γ−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（ｇａｍｍａ−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｂｕｔｙｒａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）」、「γ−ヒドロキシ酪酸分解生成物」、「γ−ヒドロキシ酪酸モノナトリウム塩」、「４−ヒドロキシブタン酸」、「４−ヒドロキシブタン酸エステル」、「４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム」、「４−ヒドロキシ酪酸モノナトリウム塩」、「４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩」、「ナトリウム  γ−オキシ酪酸」などの語を含み、同じ意味で用いられうる。さらに、以下の語および商品名により表される物質が含まれる：「４ＨＢ」、「４−０３−００−００７７４  （バイルシュタインハンドブック参照）」、「４−ＯＨＢ」、「５０２−８５−２」、「５２３５２−２７−９」、「５９１−８１−１」、「ＡＩＤＳ−１５６０１２」、「ＡＩＤＳ  １５６０１２」、「ＢＲＮ  １７２０５８２」、「Ｃ００９８９」、「ＣＨＥＢＩ：３０８３０」、「ＤＥＡ  Ｎｏ．２１００」、「ＥＢ  ２７」、「Ｇａｍ−ＯＨ」、「γ−ＯＨ」、「ＬＭＦＡ０１０５０００６」、「ＮＳＣ８４２２３」、「ソムサナイト（Ｓｏｍｓａｎｉｔｅ）」、「ＷＹ  ３４７８」、「ＷＹ−３４７８」、「ナトリウム  オキシベート（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｘｙｂａｔｅ）」など。さらに、本発明の方法によって検出可能な、ＧＨＢに構造的に関連したＧＨＢアナログ、それらの塩および同位体が含まれ、同一またはきわめて類似の薬剤効果を示し、この際、本発明の請求項１に記載の酵素の基質として使用されうる。前記ＧＢＨ塩は、前述したＧＨＢまたはこれらのアナログ、およびＧＢＨに変換しうる前駆物質または前駆体（例えば、エーテルまたはアミド）、並びに、非限定のＧＨＢに構造的に関連する「γ−ブチロラクトン」、「１，４−ブタンオール」、その他の化合物を含有するＧＨＢ前駆体等であり、同一または同様の薬剤効果を（直接的にまたは代謝の後に）示し、また、本発明により提供される方法により直接的にまたは段階的に検出されうる。「ＧＢＬ」、「γ−ブチロラクトン」、「４−ヒドロキシ酪酸ラクトン」、「１，４−ブタノリド」、「４−ブチロラクトン」等の語は同じ意味で用いられ、「ジヒドロ−２（３Ｈ）−フラノン」を意味する。「前駆体」との語は、ＧＨＢを化学的に、または体内で代謝後に生成しうる化合物に関する。
【００３８】
本発明の趣旨において、５μＭ（〜０．５ｍｇ／Ｌ）〜１０００００μＭ（〜１０ｇ／Ｌ）、好ましくは２５〜５００００μＭ、より好ましくは５０〜２００００μＭのレベルで決定されうる。尿サンプルを検査する場合において、治療レベルの検査および１００μＭの切り捨てが、内因性並びに／または治療レベルおよびに毒性を示しうる陽性レベルとの間を区別するために好ましく使用される場合には、測定されうるＧＨＢ濃度は、好ましくは０〜２０００μＭ、より好ましくは２０〜５００μＭ、さらに好ましくは３０〜１５０μＭ、最も好ましくは１００μＭである。血漿または血清サンプルを検査する場合には、測定されうるＧＨＢの濃度は、好ましくは０〜１０００μＭ、より好ましくは１０〜５００μＭ、さらに好ましくは２０〜１００μＭであり、５０μＭの切り捨てが、内因性並びに／または治療レベルおよび毒性を示しうる陽性レベルとの間を区別するために好ましく使用されている。直接分析において過度に高い濃度のサンプルは当業者公知の手段により希釈されうる。
【００３９】
本発明の方法に使用される酵素は、ＧＨＢをコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）に変換し、酸化型補酵素を還元できる任意の酵素でありうる。そのような酵素の例としては、オキシドレダクターゼが挙げられる。本発明において「オキシドレダクターゼ」との語は、１つの分子（還元剤であり、水素受容体または電子供与体とも呼ばれる）からもう１つ（酸化剤であり、水素供与体または電子受容体とも呼ばれる）への電子移動を触媒しうる任意の酵素を含む。特に、好ましいオキシドレダクターゼは、デヒドロゲナーゼおよびレダクターゼを含み、ＧＨＢデヒドロゲナーゼ（ＧＨＢ−ＤＨ）、ＳＳＡ−レダクターゼ、グルクロン酸レダクターゼ、およびアルデヒドレダクターゼが最も好ましい。１以上の酵素の混合物は、前記したように、本発明の前記方法においても使用されうる。
【００４０】
本発明の方法に適した酵素は、天然由来のものまたは組み換えたもののいずれかでありうるが、好ましくは合成的に製造された遺伝子構築物（プラスミド）である。本発明において、前記組み換え酵素の調製は、当該技術分野において公知の、任意の方法が使用されうる。これらの方法は、限定されるものではないが、天然の出発原料に基づく化合物の合成および全合成システムによる調製を含む。
【００４１】
本発明において、前記酵素の二つの異なる製造方法が好ましい。以下、本発明において好ましい方法が、単離に始まり、クローニング、ＧＨＢ−ＤＨの配列決定（遺伝子構築物の調製）という、酵素ＧＨＢ−ＤＨを製造方法を例として概説される：ＧＨＢ−ＤＨの単離、クローニング、および配列決定は、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、および／またはボルデテラ・パラペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）から行われる。ＧＨＢ−ＤＨの上流および下流のプライマーは、前記遺伝子を増幅するために使用されうる。ＧＨＢ−ＤＨは、その後、組み換え標識Ｈｉｓ融合タンパク質として生産され、Ｈｉｓ結合電磁ビーズまたはスーパーフローカラムを使用して精製される。コードされた遺伝子配列はｐＱＥ−３０ＵＡベクター中にクローン化され、組み換えＧＨＢ−ＤＨは、図に示されるように、発現し精製されうる。
【００４２】
１．大腸菌における発現
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、および／またはボルデテラ・パラペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）からの構築物が、出発原料として使用される。この方法によると、ＧＨＢ−ＤＨ発現の最適化は３種類可能である：（１）大腸菌株（Ｍ１５、ＢＬ−２１およびＸＬ１−ブルーＭＲＦ’）、（２）インダクタ濃度（ＩＰＴＧ）、および（３）インダクション用のインキュベーション温度（１８℃〜３７℃）。ラルストニア・ユートロファ、シュードモナス・プチダおよび／またはボルデテラ・パラペルツッシスからの配列を含むｐＱＥ−３０ＵＡベクターの構築物は、例えば、ｌａｃ  リプレッサーヘルパープラスミドｐＲＥＰ４を利用し、および利用しないで、ＸＬ１−ブルー中で形質転換される。正確な組み換えタンパクの発現は、抗Ｈｉｓ標識抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより確認される。同時に、小スケールのＩＭＡＣは、ＸＬ１−ブルー発現からＧＨＢ−ＤＨ凝集体の可溶化が行われる。その後、前記プラスミドは、選択された発現株のセットに再形質転換（ｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍ）される。
【００４３】
２．ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現
標的組み換えタンパクに対するα係数分泌シグナルを含むベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａが、成長培地に付与される。目的の遺伝子の複数の複製物は、単一細胞中に統合されうる。多くの複製物は、ゼオシン濃度の増加により選択されうる。天然構築物からの前記ＧＨＢ−ＤＨ配列（上記参照）は、Ｈｉｓ標識でラベルされていないベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａ  Ａ中に再クローン化される。ピキア・パストリスにおける形質転換は化学的方法で行われ、ゼオシン耐性により選択される。
【００４４】
本発明における補因子は、酵素にしっかりと結合され、これが触媒活性に必要とされる非タンパク化学物質として理解されうる。それらは「ヘルパー」分子およびイオンとしてそれぞれ理解され、それぞれ生化学的変換を補助する。本発明において酸化型補因子は、本発明の方法において還元能を有する任意の補因子である。
【００４５】
本発明の方法において使用される補因子は、限定されないが、ニコチンアミド補因子、フラビン補因子、キノン補因子およびオキソ酸を含み、この際、ニコチンアミド補因子は、限定されないが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ニコチンアミド１、Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチドリン酸を含む。フラビン補因子はフラビン基またはその活性部分を含む補因子を含む。本発明においてフラビン補因子の例は、限定されないが、リボフラビン、イソアロキサジン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である。本発明において、キノン補因子は、キノン基を含む補因子として理解されうる。キノン補因子の例は、限定されないが、ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）である。オキソ酸の例は、限定されないが、α−ケトグルタル酸である。本発明の方法において使用されうる補因子のアナログもまた、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４６】
特に好ましい補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）である。
【００４７】
本発明において、ＮＡＤ＋は２つのリボース環からなり、一方はその１’位の炭素原子にアデニンが結合され、もう一方はこの位置にニコチンアミドが結合される。これらの２つの糖ヘテロ環部位は５’位の炭素を介して２つのリン酸基の架橋により共に結合している。ＮＡＤ（Ｐ）＋において、前記アデニンに結合しているリボース環は、２’位にさらにリン酸基を有している。前記補因子のアナログは、限定されないが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）は、例えば、３−アセチルピリジン−ＮＡＤＨ、３−アセチルピリジン  ＮＡＤＰＨ、３−ピリジンアルデヒド−ＮＡＤＨ、３−ピリジンアルデヒド−ＮＡＰＤＨ、チオニコチンアミド−ＮＡＤＨおよびチオニコチンアミド−ＮＡＤＰＨであり、本発明の方法においても使用されうる。さらに、１以上の補因子およびそれらのアナログの混合物は、それぞれ、前記されているように、本発明の方法において使用されうる。
【００４８】
本発明の方法において、ＮＡＤ＋は０．００１〜１０００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ、最も好ましくは２ｍＭの濃度での濃度で使用される。
【００４９】
本発明の方法において、前記補因子ＮＡＤ（Ｐ）＋は電子受容体として使用され、したがって、ＮＡＤ（Ｐ）＋はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元される。本発明の方法は、様々な異なる方法、例えばマイクロタイタープレートまたはオートアナライザーにおいて一般的に行われうる。これに関連して、前記マイクロタイター（またはマイクロプレート）は小さな試験管として使用される小さな管状「ウェル」を有するフラットプレートである。マイクロプレートのそれぞれのウェルは、通常、数μＬ〜数百μＬの液体を保持する。マイクロプレートは人間の手によってではなく、ロボットにより扱われうる。ロボットは、これらのプレートに液体サンプルを吸引もしくは分配する液体ハンドラーであり、または装置間でそれらを移動させる「プレート運送屋」でありうる。前記プレートのウェルに置き換える行為は、後に特別なマイクロタイタープレートリーダーにより検知される。好ましくは、強力なランプはマイクロタイターウェルを経て光を送り、マイクロプレートウェルに含まれる反応生成物に吸収または放出された光は、検知器により定量化される。本発明において適当な検知モードの例は、吸光度、蛍光強度、発光、時間分解蛍光および蛍光偏光であり、特に吸光度が好ましい。
【００５０】
本発明において、オートアナライザーは、特別な流体操作およびフロー法を使用する自動分析器である。本発明において、利用可能な自動分析器の例は、セグメントフローアナライザー、フローインジェクションアナライザーまたは透析装置モジュールを有するオートアナライザーである。本発明において、具体的なオートアナライザーは、限定されないが、エアロセット（Ａｅｒｏｓｅｔ）、アルション  ３００（Ａｌｃｙｏｎ  ３００）、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）社製のＣ８０００／１６０００およびＣｉ  ８２００／１６２００、シンクロンＣｘ５（Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｘ５）、シンクロンＣｘ４（Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｘ４）シンクロンＣｘ７（Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｘ７）、シンクロンＬｘ２０（Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｌｘ２０）およびベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）社製のＵｎｉＣｅｌｌ  ＤｘＣ８００、サーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）社製のコーン（Ｋｏｎｅ）Ｔ２０、Ｔ２０  ＸＴ、Ｔ３０およびＴ６０、オリンパス社製のリプライアナライザー（Ｒｅｐｌｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）、ＡＵ  ４００，ＡＵ  ６００、ＡＵ  ８００、ＡＵ  ６４０およびＡＵ  ２７００／５４００、オルト社製のビトロスフュージョン５．１（Ｖｉｔｒｏｓ  Ｆｕｓｉｏｎ  ５．１）およびビトロス３４０（Ｖｉｔｒｏｓ  ３４０）、ロシュ社製のコバスミラ（Ｃｏｂａｓ  Ｍｉｒａ）、ヒタチ７０４（Ｈｉｔａｃｈｉ  ７０４）、ヒタチ７１７（Ｈｉｔａｃｈｉ  ７１７）、ヒタチ９１１（Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１１）、ヒタチ９０２（Ｈｉｔａｃｈｉ  ９０２）、ヒタチ９１２（Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１２）、ヒタチ９１７（Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７）、コバスインテグラ４００／７００／８００（Ｃｏｂａｓ  Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００／７００／８００）、モジュラーＰ８００（Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐ  ８００）、コバスＣ５０１（Ｃｏｂａｓ  Ｃ５０１）、コバスＣ１１１（Ｃｏｂａｓ  Ｃ１１１）、モジュラーＤ２４００（Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄ２４００）、コバスＢＩＯ（Ｃｏｂａｓ  ＢＩＯ）、コバスファラ（Ｃｏｂａｓ  ＦＡＲＡ）およびコバス６０００（Ｃｏｂａｓ  ６０００）、シーメンズ（バイエル）社製のアドヴィア１２００（Ａｄｖｉａ  １２００）、アドヴィア１６５０（Ａｄｖｉａ  １６５０）、アドヴィア１８００（Ａｄｖｉａ  １８００）およびアドヴィア２４００（Ａｄｖｉａ  ２４００）、シーメンズ（ダデ）社製のディメンションＲｘＬ（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ＲｘＬ）、ディメンションＸｐａｎｄプラス（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｘｐａｎｄ  ｐｌｕｓ）、ディメンションヴィスタ３０００Ｔ（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｖｉｓｔａ  ３０００Ｔ）およびディメンションヴィスタ１５００（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｖｉｓｔａ  １５００）、エービーエックス（ＡＢＸ）社製のペントラ６０（Ｐｅｎｔｒａ  ６０）およびペントラ１２０（Ｐｅｎｔｒａ  １２０）、イーライテック（ＥＬＩＴｅｃｈ）社製のセレクトラＥ／ＸＬ（Ｓｅｌｅｃｔｒａ  Ｅ／ＸＬ）、ランドックス（Ｒａｎｄｏｘ）社製のＲＸデイトナ（ＲＸ  Ｄａｙｔｏｎａ）およびＲＸイモラ（ＲＸ  Ｉｍｏｌａ）、テクニコン（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ）社製のＲＡ５００、ＲＡ１０００およびＲＡ  ＸＴでありうる。本発明においてオートアナライザーは「臨床化学分析器」とも呼ば���る。
【００５１】
サンプル中のＧＨＢ濃度の決定のため、還元型補因子の量を測定しなければならない。還元型補因子の量を測定しうる検知モードは、吸光度、蛍光強度、発光、時間分解蛍光、および蛍光偏光であり、特に吸光度が好ましい。前記サンプルの吸光度は好ましくは分光光度計を用いて測定される。本発明において分光光度計は色またはより特別な波長の光における強度を測定しうる光度計（光強度を測定する装置）である。本発明において多くの種類の分光光度計が用いられる。これらを分類するために利用されるもっとも重要な特徴は、作用する波長、利用できる測定技術、スペクトルの取得方法、測定のために設計された強度変化の源である。分光光度計の他の重要な特徴はスペクトルバンド幅および線形範囲を含む。通常、２つの異なる種の分光光度計（シングルビームおよびダブルビーム分光光度計）が本発明において使用されうる。ダブルビーム分光光度計は二つの異なる光路における光の強度の比率を測定し、前記シングルビーム分光光度計は絶対光度を測定する。比率の測定は簡易、かつ、一般的により安定であるが、シングルビーム装置は、例えば、より大きなダイナミックレンジを有しうる等の利点がある。
【００５２】
本発明の方法によって処理された前記サンプルの光学密度は１〜１０００ｎｍ、好ましくは１００〜６５０ｎｍ、より好ましくは２８０〜４５０ｎｍ、最も好ましくは３４０ｎｍで測定されうる。
【００５３】
本発明の方法を実施する場合、特に制限されないが、ｐＨ、バッファー、イオン強度、１以上の塩の存否および濃度、変化および補因子の存否および濃度、任意の試薬、温度、持続時間（インキュベーション時間）、および反応容積を含む１以上のパラメータが個々に選択されうる。前記パラメータは所望の結果を得るために適宜組み合わせて選択されうる。
【００５４】
前記反応混合物のｐＨは、ｐＨ２〜ｐＨ１３、好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１２から選択され、最も好ましくはｐＨ１０である。本発明の方法に適したｐＨを得るために、好ましくは分析試薬中にバッファーが含まれる。使用可能なバッファーは酢酸塩、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）、フタル酸塩、ホウ酸塩、トリクロロ酢酸塩、スルホサリチル酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール、３，３−ジメチルグルタル酸、３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、マロン酸、１，３−ビストリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパン（ビス−ＴＲＩＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−マレイン酸（トリス−マレイン酸エステル）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−マロン酸（トリス−マロン酸塩）、３−Ｎ−（トリスヒドロキシメチル）メチルアミノ−２−ヒドロキシプロパンヒドロキシプロパン硫酸（ＴＡＰＳＯ）、２−（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，４−ピペラジンビス（エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、４−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、硫酸塩、アミノ酸（例えば、グリシン）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、イミダゾール、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、トリス−ＨＣｌおよび当業者に公知の他の物を含む。最も好ましくはＡＭＰＤバッファーである。
【００５５】
本発明の方法によると、前記サンプルのインキュベーションは、０℃〜１００℃、好ましくは１８℃〜７０℃、より好ましくは２８℃〜５０℃、さらに好ましくは３５℃〜４０℃、最も好ましくは３７℃の温度で行われる。
【００５６】
本発明の方法によると、前記サンプルのインキュベーション時間は、１秒〜数日、好ましくは１０秒〜２４時間、より好ましくは３０秒〜５時間、さらに好ましくは１分〜６０分であり、３分〜１２分もまた好ましく、５分〜８分が最も好ましい。
【００５７】
本発明の方法において使用される前記酵素の濃度は、リットル毎のユニットとして０．１〜１００００μｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１０００μｇ／ｍＬの範囲から選択され、より好ましくは１０〜１００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３０〜８０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは６０μｇ／ｍＬでありうる。
【００５８】
本発明の方法によると、前記反応容積は１μＬ〜１００ｍＬ、好ましくは５０μＬ〜１０ｍＬ、より好ましくは１００μＬ〜１ｍＬから選択され、最も好ましくは２５０μＬでありうる。
【００５９】
本発明の技術的範囲において、追加の反応剤が前記方法に含まれうる。そのような反応剤は、本発明の方法により、ＧＨＢの前駆体を検知可能な化合物に変換できる反応剤を含みうる。エステルをＧＨＢに変換するには、エステラーゼが添加されていてもよく、ＧＨＢエステル、ＧＢＬのような内部エステル等が、ＧＨＢに変換されうる。アミラーゼは、アミド化形態のＧＨＢをＧＨＢに上記と同様に変換するために添加されうる。
【００６０】
本発明の方法において、任意に含まれる物質は、限定されないが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン、カラギーナン、カゼイン、アルブミン、メチルセルロース、保護されていないポリエチレングリコール、末端保護されたポリエチレングリコール、多糖類（例えば、スクロース）、他の天然および合成高分子材料、並びにこれらの組み合わせ等の高分子試薬；単糖類（例えば、グルコース）およびグリセロール等の非高分子試薬を含む群から選択されうる。また、試薬は安定化剤およびバイオサイドを含んでいてもよい。
【００６１】
さらに、本発明の方法において、その他の任意の成分として、例えば、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質、マルトース、グルコース、スクロース、トレハロース、グリセロールなどのような糖類、ポリエチレングリコールおよび当該技術分野において公知の化合物のような高分子化合物、例えば、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウムおよび当該技術分野において公知の金属のような金属イオンが含まれていてもよい。任意成分として金属イオンが使用される場合、これらの金属イオンは酵素活性剤および／または安定化剤として働きうる。さらなる任意成分はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化合物である。好ましくは、前記糖類は０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１５〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。タンパク質は、０．００１〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１５〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜２％（ｗ／ｖ）の濃度の溶液で使用される。金属イオンは、０．００１〜１０００ｍＭ、好ましくは０．１〜１００ｍＭ、最も好ましくは０．１５〜８０ｍＭの金属イオン濃度の溶液で使用される。ＥＤＴＡは、０．００１〜５０ｍＭ、好ましくは０．０１〜２ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜１．５ｍＭ、最も好ましくは０．８ｍＭの濃度の溶液で使用される。
【００６２】
また、上述工程に追加の工程が行われうる。前記追加の工程は、限定されないが、例えば、シングル検査の実施に応じて行われるサンプル除タンパク質または加熱のような特別な処置；形質転換細菌培地の強力な溶解性、天然および変性状態におけるＮｉ２＋充填カラムによる発現タンパクの溶出、並びに／または前記溶出タンパク質へのプロテイナーゼ阻害剤および／もしくは防腐剤（例えば、ＮａＮ３）の添加によって、−発現融合タンパク質の完全性およびタンパク質のコンタミネーションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、または形成した封入体を溶解して、リフォールドする評価方法により評価されうる−酵素精製の再現性の最適化；ＧＨＢ−ＤＨ非存在下でＮＡＤ＋を含むサンプルのプレインキュベート、サンプルの希釈、ＥＤＴＡと混合された乳酸脱水素酵素（例えば、シュウ酸）を含む糖分解酵素阻害剤の添加、またはサンプルを加熱不活化により、サンプル中のＧＢＨ依存性酵素または非酵素的なＮＡＤＨの形成の最小化；亜硝酸および亜硝酸ナトリウム塩のようなヘモグロビン抑制剤の添加；トリス−ＨＣｌ、ＣＡＰＳ，ＣＡＰＳＯ、および／またはＡＭＰのようなアルカリのｐＨにするために好適なバッファーの添加からなる群から選択されうる。本発明において、上述されたすべての追加的な工程は、本発明の方法に単独でまたは適宜組み合わせて実施されうる。
【００６３】
本発明はまた、上述の方法の実施に適したキットに関する。本発明の方法の実施に適したキットは、少なくともＧＨＢをコハク酸のセミアルデヒド（ＳＳＡ）変換できる酵素および酸化型補因子を含む。前記キットはまた、限定されないが、全て上記で詳細に記載された、バッファー物質、ＧＨＢ前駆体を検出可能な形態に変換できる追加の試薬、前記分析能力を改善するための物質、タンパク質、糖類、高分子化合物、金属イオン、およびキレート化合物を含んでいてもよい。
【００６４】
本発明はまた、少なくともＧＨＢをコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）に変換できる酵素および酸化型補因子を含む、ＧＨＢのサンプルの分析に適した組成物に関する。前記組成物に含まれる酵素は、好ましくはオキシドレダクターゼであり、より好ましくはデヒドロゲナーゼであり、最も好ましくはＧＨＢデヒドロゲナーゼ（ＧＨＢ−ＤＨ）である。また、詳細に上述されているような化合物および試薬が前記組成物に追加的に含まれていてもよい。前記組成物に含まれる酸化型補因子は、好ましくはＮＡＤ＋である。
【００６５】
本発明はまた、マイクロタイタープレートまたはオートアナライザーにおける用途への前記方法の使用に関する。
【００６６】
図のリスト
本発明は、限定されないが、さらに以下の図によって説明される。図は典型的な特徴を表すものであり、例示目的のみのものであることが理解される。
【００６７】
図１はサンプル（例えば、血清、尿、飲料）中のＧＨＢ濃度の決定原理を示す。該分析において、オキシドレダクターゼ（ＧＨＢデヒドロゲナーゼ、ＧＨＢ−ＤＨ；ＥＣ  １．１．１．６１）は、ＮＡＤ＋を補因子として用いて、ＧＨＢをコハク酸セミアルデヒドへ酸化する。薬物（ＧＨＢ）濃度と酵素活性とは直接に関連している。該反応は前記酵素を添加することにより開始され、ＧＨＢ−ＤＨ活性は３４０ｎｍでＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの変換能を測定することで分光学的に決定される。
【００６８】
図２はＧＨＢ−ＤＨの動態に関するマイクロプレート分析を示す。ＧＨＢ濃度の作用の反応容積に対する添加されたＧＨＢ濃度との関係におけるＧＨＢ−ＤＨ活性をマイクロプレート分析において５分間測定した。該分析において用いられたＧＨＢ濃度を右側に示す（ｍＭで表す）。
【００６９】
図３はオートアナライザー（臨床化学分析）に用いられた２つのアッセイフォーマットを示す。２つのフォーマットは、コーンＴ３０分析器で行われた１つの試薬による分析を記載する。該試薬をオートアナライザーに設置する前に、緩衝液、阻害剤、補因子、および酵素を含む試薬混合物を、図に示されるＲａ、Ｒｂ、およびＲｃ、またはＲａ’およびＲｂ’を混合して調製しなければならない。その後、該試薬を前記サンプルまたは較正器と接触させ、指示された時間オートアナライザー内でインキュベートし、その後測定した。略称：ＯｘＡ（シュウ酸）；Ｃａｌ（較正器）。
【００７０】
図４はコーンＴ３０分析器で行われた２つの試薬による分析を示す。試薬混合物Ｒ１をオートアナライザーに設置する前に、緩衝液および阻害剤を含む試薬Ｒ１ａ、並びに補因子を含む試薬Ｒ１ｂを、図に示されるようにＲ１ａおよびＲｂを混合して調製しなければならない。そして、前記試薬Ｒ１ａ：Ｒ１ｂを、ＧＨＢ−ＤＨを含む試薬Ｒ２を加える前に前記サンプルまたは較正器と２分間接触させる。最終反応混合物インキュベートし、オートアナライザーでさらに６分間測定した。略称：ＯｘＡ（シュウ酸）；Ｃａｌ（較正器）；Ｃｏｎ  Ｌ（〜１５０μＭ  ＧＨＢを含む尿コントロール）；Ｃｏｎ  Ｈ（〜８００μＭ  ＧＨＢを含む尿コントロール）。
【００７１】
図５は臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）におけるＧＨＢ検量線を示す。ΔＯＤはインキュベーション時間２〜８分の３４０ｎｍにおける光学密度の差である。
【００７２】
図６は尿サンプル用の前記方法の精度を実証するための、臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）においての一連のアッセイ（添加回収率実験）の結果を示す。この実験において、健常ドナー（ｎ＝５）の尿は、ＧＨＢに対して０、１００、５００、および１０００μＭで添加された。パーセント（％）添加回収率は、添加サンプル中の予測ＧＨＢ濃度（Ｅ）に対する実測ＧＨＢ濃度（Ｏ）の％値（Ｏ／Ｅ）として計算された。
【００７３】
図７は血清サンプル用の前記方法の精度を実証するための、臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分）において行われる一連のアッセイ（添加回収率実験）の結果を示す。この実験において、健常ドナー（ｎ＝６）からの血清は、ＧＨＢに対して０、１５０、および８００μＭで添加された。パーセント（％）添加回収率は、添加サンプル中の予測ＧＨＢ濃度（Ｅ）に対する実測ＧＨＢ濃度（Ｏ）の％値（Ｏ／Ｅ）として計算された。
【００７４】
図８は、本発明の酵素法の精度を実証するための、臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）またはイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）法のいずれかで行われる一連のアッセイの結果を示す。中毒患者（それぞれ、ｎ＝３）から採取したＧＨＢ陽性血清および尿サンプルが、２つの試薬による手順を使用する酵素法において分析され、測定結果を、イオンクロマトグラフィーに基づく確立した参照方法で得られた結果と比較した（Ｊｏｒｄｉら：ヒト血清および尿中のギ酸、グリコール酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸を、その他の内因性有機酸とともに決定する方法、２００３年、スイス、バーゼルおよびムッテンツの産業科および化学科の工業高校における卒業研究；Ｊｏｒｄｉら：イオンクロマトグラフィーを用いたＧＨＢ決定、２００３年、スイス、バーゼルの国際ＴＤＭ学会会議でのポスター）。
【００７５】
図９は臨床化学分析器（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）において行われる一連のアッセイの結果を示す。中毒患者（ｎ＝９）から採取したＧＨＢの陽性尿サンプルの濃度は、本発明の酵素法により決定され、図８において規定されたＩＣ参照法に関連付けられた。初期濃度が２０００μＭより大きな尿サンプル（〜２００ｍｇ／Ｌ）は０．９％ＮａＣｌ溶液で５〜１００倍に希釈され、再分析された。測定されたＧＨＢ濃度はｍｇ／Ｌで示される。
【００７６】
図１０は本発明の酵素法（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）でそれぞれ測定された１０人の健常ドナーの血清および尿中のＧＨＢの内因性レベルをそれぞれ示す。
【００７７】
図１１は中毒患者（ｎ＝９）から採取した尿サンプル中のＧＨＢの内因性レベルと、ＧＨＢ濃度を示す健常ドナー（ｎ＝１０）から採取した尿サンプル中のＧＨＢの内因性レベルとの比較を示す。すべてのサンプルは本発明の酵素法（コーン  Ｔ３０、サーモ社製；２つの試薬によるアッセイフォーマット；インキュベーション総合時間は８分である）で測定された。測定されたＧＨＢ濃度はμＭで与えられる。２０００μＭより高い初期濃度の患者のサンプルは０．９％ＮａＣｌ溶液で５〜１００倍に希釈し、再分析した。
【図１】
0005711216.tif 000002
【図２】
0005711216.tif 000003
【図３】
0005711216.tif 000004
【図４】
0005711216.tif 000005
【図５】
0005711216.tif 000006
【図６】
0005711216.tif 000007
【図７】
0005711216.tif 000008
【図８】
0005711216.tif 000009
【図９】
0005711216.tif 000010
【図１０Ａ】
0005711216.tif 000011
【図１０Ｂ】
0005711216.tif 000012
【図１１】
0005711216.tif 000013