(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃドメインまたはそのフラグメントに結合された少なくとも１つのケモカイン結合ペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号１５８または配列番号１５９に規定される、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドと、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項３】
炎症、アレルギー、遅延型過敏症、最適でない免疫応答、異常な細胞遊走、自己免疫反応、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、同種移植片拒絶、糖尿病、敗血症、ガン、悪性細胞成長、細菌感染症、ウイルス感染症、関節炎、大腸炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、高血圧、重症筋無力症および再灌流虚血からなる群から選択される状態を処置するためのものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１６８および配列番号１６９からなる群から選択される核酸配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
水溶性ポリマーに結合されている請求項１に記載のポリペプチドを含むコンジュゲート。
【請求項７】
前記水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである、請求項６に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケモカインに結合し得る新規なポリペプチドを開示し、より具体的には、しかし、限定ではないが、ケモカイン依存的プロセス、例えば、自己免疫性、炎症およびガンなどを調節し得るポリペプチドを開示する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、炎症性疾患プロセスに関与する多くの生物学的因子の１つである。ケモカインは、それらの一次構造と、４つの保存されたシステイン残基の存在との両方において関連づけられる小さい、すなわち、約８ｋＤａ〜１４ｋＤａの、ほとんどが塩基性のヘパリン結合タンパク質の一群に属する。
【０００３】
これらのケモカインは、インビトロにおいては白血球サブ集団に対する選択的な化学誘引物質であること、そして、インビボにおいては炎症細胞の蓄積を誘発することが示されている走化性ケモカインである。走化性に加えて、ケモカインは、白血球の脱顆粒［ＢａｇｇｉｏｌｉｎｉおよびＤａｈｉｎｄｅｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１９９４、１５：１２７〜１３３］、接着受容体のアップレギュレーション［ＶａｄｄｉおよびＮｅｗｔｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４、１５３：４７２１〜４７３２］、および、ヒト免疫不全ウイルス複製の抑制［Ｃｏｃｃｈｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２７０：１８１１〜１８１５］を媒介する。
【０００４】
ケモカインは、免疫系からの細胞の動員および活性化において不可欠な役割を果たす。ケモカインはまた、広範囲の様々な影響を、免疫系を越えた多くの異なる細胞タイプにおいて有する；これらには、例えば、中枢神経系の様々な細胞における影響［Ｍａ他、ＰＮＡＳ、１９９８、９５：９４４８〜９４５３］、および、ケモカインが血管形成性または血管新生抑制性のどちらかの影響をもたらす内皮細胞における影響［Ｓｔｒｉｅｔｅｒ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９５、２７０：２７３４８〜２７３５７］が含まれる。特定のケモカインが、血管形成、成長および転移の促進、ならびに、ガンに対する免疫応答の抑制を含めて、多数の影響を腫瘍に対して有し得る一方で、他のケモカインにより、腫瘍媒介の血管形成が阻害され、また、抗腫瘍免疫応答が促進される。
【０００５】
ケモカイン受容体が、炎症および関連状態（例えば、喘息、アテローム性動脈硬化、移植片拒絶、ＡＩＤＳおよび自己免疫状態（例えば、多発性硬化症、関節炎、重症筋無力症、狼瘡）など）の進行におけるそれらの非常に重要な役割のためにますます注目を集めている。
【０００６】
国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００１５５（これは国際公開ＷＯ０３／０７２５９９として公開された）および米国特許第７４８８７１７号は、ケモカインと結合し、かつ、その生物学的機能を調節し得る新規なペプチドおよびペプチド模倣体を開示する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントに結合される少なくとも１つのケモカイン結合ペプチドを含む単離されたポリペプチドが提供される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載されるポリペプチドと、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ケモカインの生物学的影響を調節するための医薬品の製造における本明細書中に記載されるポリペプチドの使用が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ケモカインの生物学的影響を調節する方法であって、治療効果的な量の本明細書中に記載されるポリペプチドをその必要性のある対象に投与し、それにより、ケモカインの生物学的影響を調節することを含む方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、炎症、アレルギー、遅延型過敏症、最適でない免疫応答、異常な細胞遊走、自己免疫反応、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、同種移植片拒絶、糖尿病、敗血症、ガン、悪性細胞成長、細菌感染症、ウイルス感染症、関節炎、大腸炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、高血圧、重症筋無力症および再灌流虚血からなる群から選択される状態を処置するための医薬品の製造における本明細書中に記載されるポリペプチドの使用が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、炎症、アレルギー、遅延型過敏症、最適でない免疫応答、異常な細胞遊走、自己免疫反応、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、同種移植片拒絶、糖尿病、敗血症、ガン、悪性細胞成長、細菌感染症、ウイルス感染症、関節炎、大腸炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、高血圧、重症筋無力症および再灌流虚血からなる群から選択される状態を処置する方法であって、本明細書中に記載されるポリペプチドをその必要性のある対象に投与し、それにより、ケモカインの生物学的影響を調節および／または阻害することを含む方法が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、上記の核酸構築物を含む細胞が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ポリペプチドを作製する方法であって、上記の細胞を培養すること、および、ポリペプチドを単離することを含む方法が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、水溶性ポリマーに結合されている本明細書中に記載されるポリペプチドを含むコンジュゲートが提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドはさらに、リンカーを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーはアミノ酸リンカーである。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｆｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＡのＦｃドメイン、ＩｇＤのＦｃドメイン、ＩｇＥのＦｃドメインおよびＩｇＭのＦｃドメインからなる群から選択される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは、ＦｃドメインまたはそのフラグメントのＮ末端に結合される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは、ＦｃドメインまたはそのフラグメントのＣ末端に結合される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーは４個〜１０個のアミノ酸から構成される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーはヘキサペプチドである。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーは、配列番号１６２に示されるペプチドである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドはさらに、シグナルペプチドを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドはポリペプチドのＮ末端に存在する。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドは下記の式を有する：
Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ
式中、
Ｗはシグナルペプチドである；
Ｘはケモカイン結合ペプチドである；
Ｙはリンカーである；および
ＺはＦｃドメインまたはそのフラグメントである。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは長さが１０アミノ酸〜２０アミノ酸である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは長さが１２アミノ酸〜１３アミノ酸である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは、Ｉ−ＴＡＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される少なくとも１つのケモカインに結合できることによって特徴づけられる。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは、配列番号１〜配列番号１５７からなる群から選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは、ＢＫＴ−Ｐ２（配列番号１０１）およびＢＫＴ−Ｐ４６（配列番号７６）からなる群から選択される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは、配列番号１〜配列番号１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記の配列相同性は少なくとも９５％である。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドはＩＬ−６のシグナルペプチドを含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号１６１を有する。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドは、配列番号１６１に対する少なくとも９０％の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦｃドメインはＩｇＧ１のドメインである。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントはグリコシル化されていない。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは配列番号１６０を有する。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドは、少なくとも１つのケモカインがケモカイン受容体に結合することを阻害できることによって特徴づけられる。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドは、少なくとも１つのケモカインがケモカイン受容体に結合することを強化できることによって特徴づけられる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物は包装材に詰められ、ケモカインの生物学的影響を調節することにおける使用のために包装材の内部または表面において特定される。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物は包装材に詰められ、炎症、アレルギー、遅延型過敏症、最適でない免疫応答、異常な細胞遊走、自己免疫反応、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、同種移植片拒絶、糖尿病、敗血症、ガン、悪性細胞成長、細菌感染症、ウイルス感染症、関節炎、大腸炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、高血圧、重症筋無力症および再灌流虚血からなる群から選択される状態を処置することにおける使用のために包装材の内部または表面において特定される。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、静脈内投与、経口投与、皮下投与、局所投与および／または鼻腔内投与のために配合される。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬品は、静脈内投与、経口投与、皮下投与、局所投与および／または鼻腔内投与のために配合される。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与することは、静脈内投与、経口投与、皮下投与、局所投与および／または鼻腔内投与を含む。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、調節することは、阻害することを含む。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケモカインは、Ｉ−ＴＡＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、生物学的影響は、炎症性影響、細胞遊走、腫瘍成長およびガン転移からなる群から選択される。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドは、炎症、アレルギー、遅延型過敏症、最適でない免疫応答、異常な細胞遊走、自己免疫反応、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、同種移植片拒絶、糖尿病、敗血症、ガン、悪性細胞成長、細菌感染症、ウイルス感染症、関節炎、大腸炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、高血圧、重症筋無力症および再灌流虚血からなる群から選択される状態を処置するためのものである。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１６８および配列番号１６９からなる群から選択される核酸配列を有する。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。
【００５７】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００５９】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ−１Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるポリペプチドをコードするために使用されるベクター、すなわち、配列番号１５８（ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ）をコードするために使用されるベクター（図１Ａ）、および、配列番号１５９（ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ）をコードするために使用されるベクター（図１Ｂ）で、アンピシリン耐性のための遺伝子（Ａｍｐ）およびピューロマイシン耐性のための遺伝子（Ｐｕｒｏ）をさらにコードするベクターのベクターマップである。
【００６０】
【図２】図２は、例示的ポリペプチド（配列番号１５８（レーン１およびレーン２）および配列番号１５９（レーン３〜レーン５））を産生させるために遺伝子操作されたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞プールにおけるＩｇＧ  Ｆｃの発現、ならびに、コントロール（ＩｇＧ  Ｆｃ）の５０ｎｇ（レーン６）、１００ｎｇ（レーン７）、２００ｎｇ（レーン８）および３００ｎｇ（レーン９）を示すウエスタンブロットの画像である。
【００６１】
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、ＩＰ−１０（図３Ａ）、Ｉ−ＴＡＣ（図３Ｂ）およびＭＩＧ（図３Ｃ）によって誘導されるＶＣＡＭ−１へのＴ細胞接着を、ペプチドＢＫＴ−Ｐ２（配列番号１０１）への暴露の前後において剪断流れの関数として示すグラフである（熱不活性化ＳＤＦ−１サイトカインの存在下でのＴ細胞接着がコントロールとして示される）。
【００６２】
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ−４Ｃは、ＩＰ−１０（図４Ａ）、Ｉ−ＴＡＣ（図４Ｂ）およびＭＩＧ（図４Ｃ）によって誘導されるＶＣＡＭ−１へのＴ細胞接着を、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ（配列番号１５８）（本発明のいくつかの実施形態によるポリペプチド）への暴露の前後において剪断流れの関数として示すグラフである（熱不活性化ＳＤＦ−１サイトカインの存在下でのＴ細胞接着がコントロール（ｄｅｎ）として示される）。
【００６３】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、コントロールマウスと、配列番号１５９を有する例示的ポリペプチド（ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ）により処置されるマウスとにおいて、ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）についての平均臨床スコアを、急性疾患を誘導するためのＰＬＰ（プロテオリピドタンパク質）による免疫化後の時間の関数として示すグラフ（図５Ａ）、および、ＥＡＥについての平均累積臨床スコアを示すグラフ（図５Ｂ）である。
【００６４】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、コントロールマウスと、例示的ポリペプチド（これは配列番号１５９（ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ）または配列番号１５８（ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ）を有する）により処置されるマウスとにおいて、ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）についての平均臨床スコアを、急性疾患を誘導するためのＰＬＰ（プロテオリピドタンパク質）による免疫化後の時間の関数として示すグラフ（図６Ａ）、および、ＥＡＥについての平均累積臨床スコアを示すグラフ（図６Ｂ）である。
【００６５】
【図７】図７は、コントロールマウスと、例示的ポリペプチド（これは配列番号１５８（ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ）または配列番号１５９（ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ）を有する）により処置されるマウスとにおいて、ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）についての平均臨床スコアを、慢性疾患を誘導するためのＭＯＧペプチドによる免疫化後の時間の関数として示すグラフである。
【００６６】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ−８Ｂは、健康なマウス（陰性コントロール）、関節炎マウス（陽性コントロール）、および、配列番号１５８を有する例示的ポリペプチド（ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ）により処置される関節炎マウスの膝関節腔における好中球のレベル（図８Ａ）および単球のレベル（図８Ｂ）を示すグラフである。
【００６７】
【図９】図９は、配列番号１５９を有する例示的ポリペプチド（ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ）および配列番号１５８を有する例示的ポリペプチド（ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ）による遅延型過敏症の阻害を示すグラフである（デキサメタゾン（Ｄｅｘ．）による阻害が比較のために示される）。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、ケモカインに結合し得る新規なポリペプチドを開示し、より具体的には、しかし、限定ではないが、ケモカイン依存的プロセス、例えば、自己免疫性、炎症およびガンなどを調節し得るポリペプチドを開示する。
【００６９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施または実行される。
【００７０】
本明細書中上記の背景の節において述べられるように、様々なケモカインに結合し、かつ、それらの生物学的機能を調節し得るペプチドおよび構造的類縁化合物（ペプチド模倣物）が（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００１５５（これは国際公開ＷＯ０３／０７２５９９として公開された）および米国特許第７４８８７１７号において）記載されている。そのようなペプチドの例が配列番号１〜配列番号１５７に示される。ケモカインの機能を調節することができるために、そのようなペプチドは様々な治療的適用を有する。しかしながら、そのようなペプチドの治療的利益が典型的には、例えば、ペプチドのインビボにおける短い半減期によって制限される。
【００７１】
改善された特性を有するケモカイン結合ペプチドを作製しようとしているとき、本発明者らはケモカイン結合ペプチドをＦｃドメインフラグメントに結合させた。
【００７２】
下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明を実施に移しているとき、ケモカイン結合ペプチドと、Ｆｃドメインフラグメントとを含むポリペプチドが驚くべきことに、改善されたケモカイン結合能を示すことが見出された。このようなポリペプチドは、長い循環寿命と同様に、免疫に関連した疾患および障害（例えば、多発性硬化症、関節炎および遅延型過敏症など）を処置するためのインビボでの改善された効力を示すことがさらに見出された。
【００７３】
次に図面および表を参照すると、図１Ａおよび図１Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による、本明細書中ではＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ（配列番号１５８）およびＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ（配列番号１５９）として示される例示的なポリペプチドを発現させるために使用される例示的なＤＮＡ構築物を例示する。図２は、ウエスタンブロットによって検出されるような、細胞培養における上記の例示的ポリペプチドの発現を示す。
【００７４】
「ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ」および「ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ」は、本発明の所有者らによって所有される商標である。ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣは、米国仮特許出願第６１／２１３４９３号において「ＩＬ６シグナルペプチド−ＢＫＴ−Ｐ２−スペーサー−ＦＣ」、「Ｐ２−Ｆｃ」、「ＢＫＴ−Ｆｃ−２」、「ＢＫＴ−Ｆｃ−Ｐ２」、「ＩＬ６−Ｐ２−Ｆｃ」、「ＩＬ６−Ｐ２−Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ」および「ＩＬ６−ＢｉｏＰｅｐ１−Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ」としてもまた示されるポリペプチドを示す。ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣは、米国仮特許出願第６１／２１３４９３号において「ＩＬ６シグナルペプチド−ＢＫＴ−Ｐ４６−スペーサー−ＦＣ」、「ＢＫＴ−Ｆｃ−４６」、「ＢＫＴ−ＦＣ−４６」、「Ｐ４６−ＦＣ」、「ＩＬ６−Ｐ４６−Ｆｃ」、「ＩＬ６−Ｐ４６−Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ」および「ＩＬ６−ＢｉｏＰｅｐ２−Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ」としてもまた示されるポリペプチドを示す。
【００７５】
表３は、様々なケモカインに対する上記の例示的ポリペプチドの結合についての解離定数を示す。
【００７６】
図４Ａ〜図４Ｃは、いくつかのケモカインの生物学的活性（Ｔ細胞接着の誘導）の例示的ポリペプチド（配列番号１５８）による阻害を示す。比較のために、図３Ａ〜図３Ｃは、このポリペプチドが基づくケモカイン結合ペプチド（配列番号１０１）による同じ活性の阻害を示す。表４は、例示的ポリペプチド（配列番号１５８および配列番号１５９）、および、それらが基づくケモカイン結合ペプチド（それぞれ、配列番号１０１および配列番号７６）の、様々なケモカインの活性を阻害する能力をまとめる。
【００７７】
図５Ａ、図５Ｂ、図６および図７は、マウスにおけるＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）の進行に対する、本発明のいくつかの実施形態による例示的ポリペプチドの効力を示す。図８Ａおよび図８Ｂは、マウスにおける関節炎に対する例示的ポリペプチドの効力を示す。図９は、遅延型過敏症に対する例示的ポリペプチドの効力を示す。
【００７８】
表５は、本発明の実施形態によるポリペプチドに含まれ得るケモカイン結合ペプチドを示す。
【００７９】
したがって、本明細書中に示される実験結果は、本発明の実施形態によるポリペプチドがケモカインに結合し得ること（例えば、表３を参照のこと）、対応するケモカイン結合ペプチドよりも一層強力な、ケモカイン活性の調節剤であること（例えば、表４、ならびに、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａおよび図４Ｂを参照のこと）、そして、様々な状態を処置するために治療効果的であること（例えば、図５Ａ〜図９を参照のこと）を示す。
【００８０】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、抗体（例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体）のＦｃドメインまたはＦｃドメインのフラグメントに結合される少なくとも１つのケモカイン結合ペプチドを含む単離されたポリペプチドが提供される。Ｆｃドメインまたはそのフラグメントに結合されるペプチドを含む分子が、本明細書中では「ポリペプチド」として示されることがある。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ただ１つだけのケモカイン結合ペプチドを含む。
【００８２】
代替において、ポリペプチドは、２つ以上のケモカイン結合ペプチド（例えば、２個、３個、４個または５個のケモカイン結合ペプチド）を含む。これらのケモカイン結合ペプチドは互いに同じであってもよく、または、互いに異なっていてもよい。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、用語「ケモカイン結合ペプチド」は、少なくとも１つのケモカインに溶液中で結合できることによって特徴づけられる任意のペプチド（例えば、アミノ酸残基が２０個までのペプチド）を示す。例示的なケモカインには、ＣＣＬ１（この場合、ＣＣＬはケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンドの略である）、ＭＣＰ−１（これはまた、この分野ではＣＣＬ２として示される）、ＭＩＰ−１（ＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−１βを含む）、ＲＡＮＴＥＳ（これはまた、この分野ではＣＣＬ５として示される）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、エオタキシン（これはまた、この分野ではＣＣＬ１１として示される）、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１（この場合、ＣＸＣＬはケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンドの略である）、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、インターロイキン−８（これはまた、この分野ではＣＸＣＬ８として示される）、ＭＩＧ（これはまた、この分野ではＣＸＣＬ９として示される）、ＩＰ−１０（これはまた、この分野ではＣＸＣＬ１０として示される）、Ｉ−ＴＡＣ（これはまた、この分野ではＣＸＣＬ１１として示される）、ＳＤＦ−１（これはまた、この分野ではＣＸＣＬ１２として示される）、ＢＣＡ−１（これはまた、この分野ではＣＸＣＬ１３として示される）、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２およびＣＸ３ＣＬ１が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態によれば、ペプチドは、Ｉ−ＴＡＣ（インターフェロン誘導性のＴ細胞α化学誘引物質）、ＩＰ−１０（１０ｋＤａのインターフェロン−γ誘導のタンパク質）、ＭＩＧ（ガンマーインターフェロンによって誘導されるモノカイン）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）、エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）からなる群から選択される少なくとも１つのケモカインに結合する。
【００８４】
ケモカインに対する結合を、この技術分野において知られているいずれかの好適な技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）に従って求めることができる。場合により、結合は、ケモカインに対するペプチドの結合についての解離定数（Ｋｄ）が１０−４Ｍ未満（場合により１０−５Ｍ未満、場合により１０−６Ｍ未満）であるような結合である。解離定数を求めるための好適な技術が当業者には知られている。
【００８５】
本発明の実施形態に従って使用され得るケモカイン結合ペプチドが、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００１５５（これは国際公開ＷＯ０３／０７２５９９として公開された）および米国特許第７４８８７１７号に記載される。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ケモカイン結合ペプチドは長さにおいて５個〜５０個のアミノ酸であり、場合により長さにおいて５個〜４０個のアミノ酸であり、場合により長さにおいて５個〜３０個のアミノ酸であり、場合により長さにおいて７個〜２０個のアミノ酸であり、場合により長さにおいて９個〜２０個のアミノ酸であり、場合により長さにおいて１０個〜２０個のアミノ酸である。例示的な実施形態によれば、ケモカイン結合ペプチドは長さにおいて約１２個のアミノ酸である。
【００８７】
場合により、ケモカイン結合ペプチドは、配列番号１〜配列番号１５７からなる群から選択される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ケモカイン結合ペプチドは、少なくとも２つのヒスチジン残基の存在および全体的な正電荷（例えば、正荷電のアミノ酸が数において負荷電のアミノ酸を上回る）によって特徴づけられ、この場合、ペプチドは、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸から主に構成される（例えば、ペプチドの少なくとも４０％が、場合により少なくとも５０％が上記アミノ酸からなる）。
【００８９】
上記特徴を有するペプチドの例には、限定されないが、ＳＩＦＡＨＱＴＰＴＨＫＮ（配列番号１００）、ＳＩＰＳＨＳＩＨＳＡＫＡ（配列番号１０１）、ＳＡＩＳＤＨＲＡＨＲＳＨ（配列番号９６）、ＳＡＧＨＩＨＥＡＨＲＰＬ（配列番号９５）、ＡＣＨＡＳＬＫＨＲＣ（配列番号４４）、ＡＨＳＬＫＳＩＴＮＨＧＬ（配列番号４６）、ＥＳＤＬＴＨＡＬＨＷＬＧ（配列番号５４）、ＨＳＡＣＨＡＳＬＫＨＲＣ（配列番号６９）、ＷＳＡＨＩＶＰＹＳＨＫＰ（配列番号１４３）、ＹＡＴＱＨＮＷＲＬＫＨＥ（配列番号１４５）、ＣＡＨＬＳＰＨＫＣ（配列番号１）、ＧＶＨＫＨＦＹＳＲＷＬＧ（配列番号６１）、ＨＰＴＴＰＩＨＭＰＮＦ（配列番号６６）、ＳＶＱＴＲＰＬＦＨＳＨＦ（配列番号１１３）およびＶＨＴＳＬＬＱＫＨＰＬＰ（配列番号１３３）が含まれる。ＳＩＰＳＨＳＩＨＳＡＫＡ（配列番号１０１）が本明細書中では「ＢＫＴ−Ｐ２」として示されており、例示的なケモカイン結合ペプチドである。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ケモカイン結合ペプチドは、少なくとも２つの隣接するヒスチジン残基の存在および全体的な正電荷（例えば、正荷電のアミノ酸が数において負荷電のアミノ酸を上回る）によって特徴づけられ、この場合、ペプチドは、Ｈ、Ｐ、Ｔ、Ｌ、Ｒ、ＷおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸から主に構成される（例えば、ペプチドの少なくとも４０％が、場合により少なくとも５０％が上記アミノ酸からなる）。
【００９１】
上記特徴を有するペプチドの例には、限定されないが、ＧＤＦＮＳＧＨＨＴＴＴＲ（配列番号５９）、ＨＨＦＨＬＰＫＬＲＰＰＶ（配列番号６４）、ＨＨＴＷＤＴＲＩＷＱＡＦ（配列番号６５）、ＬＤＹＰＩＰＱＴＶＬＨＨ（配列番号７６）、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＰ（配列番号７９）、ＴＲＬＶＰＳＲＹＹＨＨＰ（配列番号１２５）、ＣＨＨＮＬＳＷＥＣ（配列番号７）およびＳＦＷＨＨＨＳＰＲＳＰＬ（配列番号９９）が含まれる。ＬＤＹＰＩＰＱＴＶＬＨＨ（配列番号７６）が本明細書中では「ＢＫＴ−Ｐ４６」として示されており、例示的なケモカイン結合ペプチドである。
【００９２】
場合により、ケモカイン結合ペプチドは、配列番号１〜配列番号１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列（例えば、配列番号７６および配列番号１０１）に対する少なくとも７０％の配列相同性、少なくとも８０％の配列相同性、少なくとも９０％の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する。場合により、配列相同性は少なくとも９５％である。場合により、配列相同性は１００％である。
【００９３】
相同性を、初期設定されているパラメーターを使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して求めることができる。相同性はまた、欠失変化体、挿入変化体または置換変化体を、そのアミノ酸置換およびその生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを含めて示すことがある。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、「Ｆｃドメイン」は、抗体の重鎖の領域で、重鎖の少なくとも２つの定常ドメイン（例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（これらの用語はこの技術分野で定義されるように））を典型的には含む領域を示す。Ｆｃドメインは、例えば、パパインによる抗体の消化によってダイマーの形態で得ることができる。Ｆｃドメインポリペプチドのダイマーは、ジスルフィド結合によってつながれる場合、抗体の「テール」領域を形成する。この技術分野では知られているように、抗体のいくつかのクラスのＦｃドメインはマルチマーの形態であり得る。したがって、Ｆｃドメインは場合によりモノマー状であり、場合によりダイマー状であり、場合によりマルチマー状である。場合により、本明細書中に記載されるポリペプチドは、ダイマーの形態、すなわち、Ｆｃダイマーを含むポリペプチド、または、マルチマーの形態、すなわち、Ｆｃマルチマーを含むポリペプチドである。
【００９５】
Ｆｃドメインは、天然型Ｆｃドメイン（すなわち、抗体において自然界で見出されるドメイン）の修飾された形態、例えば、天然型Ｆｃドメインに対する少なくとも９０％の相同性、場合により少なくとも９５％の相同性、場合により少なくとも９８％の相同性を有するポリペプチドを包含し得る。修飾されたＦｃドメインが、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９７／３４６３１および同ＷＯ９６／３２４７８に記載される。
【００９６】
場合により、天然型Ｆｃは、構造的特徴または生物学的活性をもたらす部位の中で、本発明の実施形態のために要求されない部位を除くように修飾される。そのような部位の例には、ジスルフィド結合形成、選択された宿主細胞の不適合性、選択された宿主細胞における発現時のＮ末端不均一性、グリコシル化、補体との相互作用、Ｆｃ受容体（新生児型Ｆｃ受容体以外）への結合および／または抗体依存性細胞傷害性に影響を及ぼすか、または、それらに関与する残基が含まれる。
【００９７】
本発明の実施形態によるポリペプチドはまた、Ｆｃドメインのフラグメントを含むことができる。場合により、フラグメントは、本明細書中上記で定義されるようなＦｃドメインの少なくとも２０％、場合により少なくとも５０％、場合により少なくとも８０％を含む。
【００９８】
Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは場合により、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）のための結合部位を含む。
【００９９】
下記の実施例の節において例示されるように、本発明の実施形態によるポリペプチドは血液循環における比較的長い寿命を示し、著しいレベルのポリペプチドが投与後少なくとも１１日において血液中に留まっていた。
【０１００】
１つの実施形態によれば、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントをケモカイン結合ペプチドに結合することにより、インビボでの半減期がケモカイン結合ペプチド自体よりも長いポリペプチドがもたらされる。これは、（ＦｃＲｎへの結合によるＦｃのサルベージのためであるかもしれない）Ｆｃドメインの長い血清半減期のためであるかもしれず、および／または、ポリペプチドのサイズがケモカイン結合ペプチドとの比較においてより大きく、これにより、糸球体ろ過による血流からのクリアランスが低下するためであるかもしれない。別の実施形態によれば、得られたポリペプチドは、ケモカイン結合ペプチドそれ自体と比較した場合、低下した免疫原性を有する。
【０１０１】
必要に応じた随意的な実施形態によれば、ＦｃドメインまたはそのフラグメントはヒトＦｃドメイン（例えば、ヒト抗体に由来するもの）またはそのフラグメントである。
【０１０２】
例示的な実施形態によれば、Ｆｃドメイン（またはそのフラグメント）はＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）のＦｃドメイン（またはそのフラグメント）である。場合により、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントはグリコシル化されていない。
【０１０３】
例示的な実施形態によれば、Ｆｃフラグメントは配列番号１６０を有し、これは、Ｎ２９７Ａ変異を有するヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントに対応する。
【０１０４】
場合により、Ｆｃドメイン（またはそのフラグメント）のＮ末端がケモカイン結合ペプチドに（直接的または間接的に）結合させられる。Ｎ末端は場合により、例えば、２つ以上のケモカイン結合ペプチドを含む配列に結合させられることによって、２つ以上のケモカイン結合ペプチドに結合させられる。
【０１０５】
代替において、または、加えて、Ｆｃドメイン（またはそのフラグメント）のＣ末端が、ケモカイン結合ペプチドに直接に、または、リンカー（例えば、アミノ酸リンカー）を介して結合させられる。Ｃ末端は場合により、２つ以上のケモカイン結合ペプチドに結合させられる。
【０１０６】
本明細書中に記載されるケモカイン結合ペプチドおよびＦｃドメインまたはＦｃフラグメントに加えて、本明細書中に記載されるポリペプチドはさらに、１つまたは複数のさらなるペプチド配列を含むことができる。そのような配列は場合により、望ましい生物学的活性または構造的特徴を提供するように、例えば、ポリペプチドの治療効力を改善するか、または、ポリペプチドの産生を容易にする活性または特徴を提供するように選択することができる。
【０１０７】
したがって、例えば、ポリペプチドは場合により、ポリペプチドの輸送を行わせることができるように選択される少なくとも１つのシグナルペプチドを含む。
【０１０８】
場合により、シグナルペプチドは、ポリペプチドを発現する細胞（例えば、哺乳動物細胞）からのポリペプチドの分泌を促進させることができようにように選択される。
【０１０９】
場合により、（植物のトランスフェクションによって産生されるポリペプチドのための）液胞シグナルペプチドが含まれる。
【０１１０】
例示的な実施形態において、ポリペプチドは、ＩＬ−６（インターロイキン−６）のシグナルペプチド（例えば、配列番号１６１）、または、ＩＬ−６のシグナルペプチドに対する少なくとも９０％の相同性（場合により少なくとも９５％の相同性）を示すアミノ酸配列を有するシグナルペプチドを含む。
【０１１１】
上記のさらなるペプチド配列（例えば、シグナルペプチド）は、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、または、ポリペプチドの中央（例えば、ＦｃドメインまたはＦｃフラグメントと、ケモカイン結合ペプチドとの間、あるいは、２つのケモカイン結合ペプチドの間）に存在させることができる。
【０１１２】
したがって、本明細書中に記載されるＦｃドメインまたはＦｃフラグメント、ケモカイン結合ペプチド（１つまたは複数）および（存在するならば）任意のさらなるペプチド（１つまたは複数）は、任意の順序でポリペプチドの内部において互いに結合させることができる。
【０１１３】
ＦｃドメインまたはＦｃフラグメント、ケモカイン結合ペプチド（１つまたは複数）および（存在するならば）任意のさらなるペプチド（１つまたは複数）は独立して、直接に、または、リンカー（例えば、アミノ酸リンカー）を介して互いに結合させられる。
【０１１４】
しかしながら、いくつかのシグナルペプチドの活性は、ポリペプチド内の特定の場所（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端）に置かれることに依存する。したがって、いくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドはポリペプチドにおいて特定の場所に置かれる。
【０１１５】
例示的な実施形態によれば、シグナルペプチド（例えば、ＩＬ−６のシグナルペプチド）はポリペプチドのＮ末端に存在する。シグナルペプチドをＮ末端に有するポリペプチドの例には、下記の式のポリペプチドが含まれる：
Ｗ−Ｘ−Ｚ、Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ、Ｗ−Ｙ−Ｘ−Ｚ、Ｗ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｚ、Ｗ−Ｚ−Ｘ、Ｗ−Ｚ−Ｙ−Ｘ、Ｗ−Ｙ−Ｚ−ＸおよびＷ−Ｙ−Ｚ−Ｙ−Ｘ、
上記式において、Ｗはシグナルペプチドであり、Ｘはケモカイン結合ペプチドであり、Ｙはリンカー（例えば、アミノ酸リンカー）であり、ＺはＦｃドメインまたはＦｃフラグメントである。例示的な実施形態によれば、ポリペプチドは上記式のＷ−Ｘ−Ｙ−Ｚを有する。
【０１１６】
リンカー（これはまた、「スペーサー」として示される）は場合により、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドまたは４個以上のアミノ酸を含むアミノ酸リンカーである。そのようなリンカーは、ポリペプチドが、融合タンパク質として容易に産生され得るただ１つだけの連続したポリペプチド鎖を含むことを可能にするという点で好都合である。リンカーは典型的には、ケモカイン結合ペプチドがその標的ケモカインに結合することを当該リンカーが妨害しないように選択される。場合により、リンカーは、４個〜１０個のアミノ酸から構成されるペプチド（例えば、ヘキサペプチド）である。例示的な実施形態によれば、リンカーは、配列番号１６２に示されるペプチドである。２つ以上のリンカーを含む実施形態において、リンカーは同じであり得るか、または、互いに異なり得る。
【０１１７】
本発明の好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、（例えば、ポリペプチドにおけるケモカイン結合ペプチドがケモカインと相互作用することを介して）少なくとも１つのケモカインに結合することができる。ポリペプチドがケモカインに結合することは多くの場合、ケモカイン（例えば、Ｉ−ＴＡＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、エオタキシンおよび／またはＲＡＮＴＥＳ）がケモカイン受容体に結合する能力に影響を与える。
【０１１８】
したがって、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのケモカインがケモカイン受容体に結合することを阻害できることによって特徴づけられる。場合により、結合の阻害は、ポリペプチドの存在下における（受容体へのケモカインの結合についての）解離定数がポリペプチドの非存在下における解離定数よりも少なくとも１０％大きくなる、場合により少なくとも１００％大きくなるようなものである。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのケモカインがケモカイン受容体に結合することを強化できることによって特徴づけられる。場合により、結合の強化は、ポリペプチドの存在下における（受容体へのケモカインの結合についての）解離定数がポリペプチドの非存在下における解離定数よりも少なくとも１０％低くなる、場合により少なくとも５０％低くなるようなものである。
【０１２０】
本発明の実施形態によるポリペプチドは場合により、少なくとも１つのケモカインがケモカイン受容体に結合することを阻害することができ、かつ、同様にまた、少なくとも１つのケモカインがケモカイン受容体に結合することを強化することができる。
【０１２１】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」には、天然のペプチド（例えば、分解産物または合成的に合成されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてポリペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ポリペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはポリペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ’末端修飾、Ｃ’末端修飾、ポリペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される。
【０１２２】
ポリペプチド内のポリペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ポリペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【０１２３】
これらの修飾は、ポリペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【０１２４】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（ＴＩＣ）、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【０１２５】
天然に存在する本明細書中に記載されるペプチドおよびポリペプチド（例えば、Ｆｃドメイン配列、シグナルペプチド）のアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質におけるポリペプチドのアミノ酸配列、あるいは、保存的置換または非保存的置換のどちらかを含むそのようなアミノ酸配列のどちらであってもよい。
【０１２６】
用語「保存的置換」は、本明細書中で使用される場合、ペプチドにおける生来的配列に存在するアミノ酸が、類似する立体的特性を有する天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸あるいはペプチド模倣体により置き換えられることを示す。置き換えられることになる生来的アミノ酸の側鎖が極性または疎水性のどちらかである場合、保存的置換は、（置き換えられたアミノ酸の側鎖と同じ立体的特性を有することに加えて）同様に極性または疎水性である天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸またはペプチド模倣成分によるものでなければならない。
【０１２７】
天然に存在するアミノ酸は典型的にはそれらの特性に従ってグループ分けされるので、本発明によれば、荷電アミノ酸を立体的に類似する非荷電アミノ酸によって置き換えることは保存的置換であると見なされるということを念頭に置いて、天然に存在するアミノ酸による保存的置換は容易に決定することができる。
【０１２８】
保存的置換を天然に存在しないアミノ酸によって生じさせるために、この技術分野では広く知られているアミノ酸アナログ（合成アミノ酸）を使用することもまた可能である。天然に存在するアミノ酸のペプチド模倣体が、当業者に知られている文献において十分に記載される。
【０１２９】
保存的置換を行うとき、代用されるアミノ酸は、元のアミノ酸と同じまたは類似する官能基を側鎖に有しなければならない。
【０１３０】
表現「非保存的置換」は、本明細書中で使用される場合、親配列に存在するアミノ酸が、異なる電気化学的特性および／または立体的特性を有する別の天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸によって置き換えられることを示す。したがって、代用されるアミノ酸の側鎖は、置換されようとする生来的アミノ酸の側鎖よりも著しく大きく（または小さく）することができ、かつ／または、置換されようとするアミノ酸とは著しく異なる電子的特性を有する官能基を有することができる。このタイプの非保存的置換の例には、アラニンに代わるフェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシンへの置換、グリシンに代わるイソロイシンへの置換、あるいは、アスパラギン酸に代わる−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ２）５ＣＯＯＨ］−ＣＯ−への置換が含まれる。本発明の範囲内に含まれるそのような非保存的置換は、天然型ペプチド（例えば、Ｆｃドメイン配列、シグナルペプチド）の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを依然として構成する非保存的置換である。
【０１３１】
従って、本明細書において使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【０１３２】
下記の表１〜表２には、天然に存在するアミノ酸のすべて（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表２）が示される。
【０１３３】
0005784010.tif 000002
0005784010.tif 000003
0005784010.tif 000004
0005784010.tif 000005
【０１３４】
組換え技術が好ましくは、本発明のポリペプチドを作製するために使用される。これは、これらの技術は、比較的長いポリペプチド（例えば、２０アミノ酸よりも長いもの）およびその比較的多い量を作製するためにより良く適しているからである。そのような組換え技術が、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４）、Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９）、Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）（Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４）、Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）（ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３０７〜３１１）、Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）（ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：１６７１〜１６８０）、Ｂｒｏｇｌｉ他（１９８４）（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３）、Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５）、および、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁）によって記載される。
【０１３５】
本発明のポリペプチドを、組換え技術を使用して製造するために、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが核酸発現ベクターに連結される。この場合、核酸発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞における本発明のポリペプチドの構成的転写、組織特異的転写または誘導可能な転写を行わせるために好適なシス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下に含む。
【０１３６】
ケモカイン結合ペプチドを発現させるために使用することができる単離されたポリヌクレオチドの例が、配列番号１６３および配列番号１６４に示される。Ｆｃフラグメントを発現させるために使用することができる単離されたポリヌクレオチド配列の一例が、配列番号１６５に示される通りである。ＩＬ−６のシグナルペプチドを発現させるために使用することができる単離されたポリヌクレオチドの一例が、配列番号１６６に示される。リンカーを発現させるために使用することができる単離されたポリヌクレオチドの一例が、配列番号１６７に示される。
【０１３７】
本発明のいくつかの実施形態によるポリペプチドを発現させるために使用することができる例示的なポリヌクレオチド配列が、配列番号１６８および配列番号１６９に示される。
【０１３８】
表現「単離されたポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で単離および提供される一本鎖または二本鎖の核酸配列を示す。
【０１３９】
本明細書中で使用される表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を示す。そのような配列は続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【０１４０】
本明細書中で使用される表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（染色体から単離される）配列を示し、従って、ゲノムポリヌクレオチド配列は染色体の隣接した一部分を表す。
【０１４１】
本明細書中で使用される表現「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも一部分が相補的であり、かつ、少なくとも一部分がゲノムである配列を示す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために要求されるいくつかのエキソン配列、ならびに、エキソン配列の間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、他の遺伝子のものを含めて、任意の供給源のものが可能であり、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列はさらに、シス作用の発現調節エレメントを含むことができる。
【０１４２】
述べたように、本発明の実施形態のポリヌクレオチドはさらに、ポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチド（上述のようなもの）をコードするシグナル配列を含むことができる。
【０１４３】
発現および分泌の後、シグナルペプチドは典型的には、成熟タンパク質をもたらす前駆体タンパク質から除かれる。
【０１４４】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本明細書下記の実施例１において記載されるようなＰＣＲ技術、あるいは、２つの異なるＤＮＡ配列の連結のために当該技術分野において知られている何らかの他の方法または手法を使用して調製することができる。例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２）を参照のこと。
【０１４５】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のポリヌクレオチド配列は、組換えポリペプチドの発現を可能にするために発現ベクター（すなわち、核酸構築物）に挿入される。本発明の実施形態の発現ベクターは、このベクターを原核生物または真核生物または好ましくは両方における複製および組込みのために好適にするさらなる配列（例えば、シャトルベクター）を含む。典型的なクローニング用ベクターは、転写開始配列および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、ならびに、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含有する。
【０１４６】
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列（ＴＡＴＡボックスおよび上流側のプロモーター要素）を含有する。ＴＡＴＡボックス（これは転写開始部位の２５塩基対〜３０塩基対上流側に位置する）は、ＲＮＡポリメラーゼに、ＲＮＡ合成を開始させることに関与していると考えられる。それ以外の上流側のプロモーター要素は、転写が開始される速度を決定する。
【０１４７】
エンハンサー要素は、転写を、連結された相同的プロモーターまたは異種プロモーターから１０００倍まで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたとき、活性がある。ウイルスに由来する多くのエンハンサー要素は広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性がある。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞タイプについて好適である。本発明のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶなど）からの長末端反復に由来するものが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１４８】
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、その天然の環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離で異種の転写開始部位から配置される。しかしながら、当該分野で既知のように、この距離におけるある程度の変動が、プロモーター機能の喪失を伴うことなく受け入れられ得る。
【０１４９】
既に述べられた要素に加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または、組換えＤＮＡを有する細胞の特定を容易にするために意図された他の特殊化された要素を含有することができる。例えば、数多くの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外の複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。このようなウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドにおいて運ばれる遺伝子によるか、または、宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子によるかのいずれかで提供される限り、エピソームとして複製する。
【０１５０】
ベクターは真核生物のレプリコンを含んでも、含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まないならば、エピソーム増幅ができない。その代わり、組換えＤＮＡは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、その細胞において、プロモーターが所望の核酸の発現を行わせる。
【０１５１】
本発明の発現ベクターはさらに、例えば、１つのｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）など）、および、プロモーターキメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列を含むことができる。
【０１５２】
哺乳動物発現ベクターの例には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．ｌ（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能であるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能であるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能であるｐＴＲＥＳ、ならびに、それらの誘導体が含まれる。
【０１５３】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節要素を含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または、真核生物細胞での発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。
【０１５４】
ウイルスは、多くの場合において宿主の防御機構を回避するように進化してきた非常に特殊化された感染性因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプに感染し、特定の細胞タイプにおいて増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的化し、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。従って、本発明によって使用されるベクターのタイプは、形質転換された細胞タイプに依存する。
【０１５５】
組換えウイルスベクターは、側方感染のような利点を提供するので、本発明の実施形態のポリペプチドの発現のために有用でありうる。側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有のものであり、出芽し、周りの細胞に感染する多くの子孫ビリオンを１個の感染細胞が産生するプロセスである。その結果は、最初のウイルス粒子によってそのほとんどが最初に感染していなかった広い面積が急速に感染することである。これは、感染性因子が娘核種を介してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。横方向に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。この特徴は、所望する目的が、指定された遺伝子を局在化した多数の標的化された細胞のみに導入することであるならば、有用であり得る。
【０１５６】
様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、本発明のポリペプチドを発現させるための宿主−発現システムとして使用することができる。これらには、微生物、例えば、ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（これには、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰおよびＢＬ２１＊のＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられるが、これらに限定されない）、および、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母など；ポリペプチドコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）が感染させられるか、または、ポリペプチドコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換される植物細胞システムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
様々な方法を、本発明の発現ベクターを宿主発現系の細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）；および、Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４〜５１２、１９８６］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的トランスフェクションまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選択法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１５８】
ウイルス感染による核酸の導入では、より高いトランスフェクション効率をウイルスの感染性のために得ることができるので、他の方法（例えば、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなど）を上回る利点がいくつかもたらされる。
【０１５９】
本発明のポリペプチドの核酸配列は特定の宿主細胞の発現のために最適化することができる。そのような配列改変の例には、目的とする種において典型的に見出されるＧ／Ｃ含有量により近づけるための変化させたＧ／Ｃ含有量、および、コドン最適化として一般に示される、種において典型的に見出されないコドンの除去が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
語句「コドン最適化」は、目的とする種におけるコドン使用頻度に近づける、構造遺伝子またはそのフラグメントにおける使用のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択をいう。したがって、最適化された遺伝子または核酸配列は、生来的遺伝子または天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列が、選択された種における統計学的に好まれるコドンまたは統計学的に好都合であるコドンを利用するために改変されている遺伝子を示す。ヌクレオチド配列は典型的にはＤＮＡレベルで調べられ、この種における発現のために最適化されたコード領域が、何らかの好適な手法を使用して、例えば、Ｓａｒｄａｎａ他（１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１５：６７７〜６８１）に記載されるように決定される。この方法では、コドン使用頻度の標準偏差、すなわち、コドン使用頻度の偏りの尺度を、高発現の選択された種の遺伝子の各コドンに対する生来的遺伝子の各コドンの使用頻度の二乗比例偏差を最初に見出し、その後、平均二乗偏差を計算することによって計算することができる。使用される式が、１ＳＤＣＵ＝ｎ＝１Ｎ［Ｘｎ−Ｙｎ］／Ｙｎ］２／Ｎであり、この式において、Ｘｎは高発現の遺伝子におけるコドンｎの使用の頻度を示し、Ｙｎは、目的とする遺伝子におけるコドンｎの使用の頻度を示し、Ｎは、目的とする遺伝子におけるコドンの総数を示す。
【０１６１】
核酸配列を特定の細胞タイプのための好ましいコドン使用頻度に従って最適化することの１つの方法が、コドン最適化表、例えば、日本のＮＩＡＳ（独立行政法人農業生物資源研究所）ＤＮＡバンクからコドン使用頻度データベース（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）においてオンラインで提供されるコドン最適化表などの、何らかの余分な統計学的計算を行うことを伴わない直接的な使用に基づく。このコドン使用頻度データベースは、いくつかの異なる種についてのコドン使用頻度表を含有しており、それぞれのコドン使用頻度表が、Ｇｅｎｂａｎｋに存在するデータに基づいて統計学的に決定されている。
【０１６２】
最も好ましいコドンまたは最も好都合であるコドンを特定の種においてそれぞれのアミノ酸について決定するために上記の表を使用することによって、目的とするタンパク質をコードする天然に存在するヌクレオチド配列をその特定の種のためにコドン最適化することができる。これが、低い統計学的出現率を特定の種のゲノムにおいて有し得るコドンを、アミノ酸に関して、統計学的により好都合である対応するコドンにより置き換えることによって達成される。しかしながら、１つ以上のあまり好都合でないコドンを、存在する制限部位を欠失するために、または、新しい制限部位を潜在的に有用な接合部（シグナルペプチドカセットまたは終結カセットを加えるための５’末端および３’末端、正しい全長配列を作製するためにセグメントを切断し、一緒にスプライスするために使用されるかもしれない内部部位）において作るために、または、ｍＲＮＡの安定性もしくは発現に負の影響を及ぼし得るヌクレオチド配列を排除するために選択することができる。
【０１６３】
天然に存在するコードヌクレオチド配列は既に、何らかの改変に先立って、特定の種における統計学的に好都合であるコドンに対応するいくつかのコドンを含有する場合がある。したがって、生来的ヌクレオチド配列のコドン最適化では、どのコドンが、生来的ヌクレオチド配列において、特定の種に関して統計学的に好都合でないかを決定すること、および、これらのコドンをその特定の種のコドン使用頻度表に従って改変して、コドン最適化された派生物を作製することを含むことができる。改変されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質が、対応する天然に存在する遺伝子または生来的遺伝子によってコードされるタンパク質よりも高いレベルで産生されるならば、改変されたヌクレオチド配列は、特定の種のコドン使用頻度について完全または部分的に最適化され得る。コドン使用頻度を変更することによる合成遺伝子の構築が、例えば、ＰＣＴ特許出願公開９３／０７２７８号に記載される。
【０１６４】
したがって、本発明は、本明細書中上記の核酸配列、そのフラグメント、それとのハイブリダイゼーションが可能な配列、その相同的配列、そのオルソロガス配列、異なるコドン使用頻度を有する類似したポリペプチドをコードする配列、変異（例えば、天然に存在するか、または、人為的に誘導されたかのどちらであっても、ランダムまたは標的化された様式のどちらであっても、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換など）によって特徴づけられる変化した配列を包含する。
【０１６５】
宿主細胞系とは無関係であるが、（ポリペプチドをコードする）挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現ポリペプチドの安定性、産生、精製、収量または活性を最適化するために操作された配列を含むことができることが理解される。
【０１６６】
形質転換された細胞が、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えポリペプチドを産生するために培養される任意の培地を示す。そのような培地には典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵用バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。培養を、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量において行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【０１６７】
産生のために使用されるベクターおよび宿主の系に依存して、得られる本発明のポリペプチドは組換え細胞内に留まり得るか、または、発酵培地に分泌され得るか、または、２つの細胞膜の間の空間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細胞膜周辺腔など）に分泌され得るか、または、細胞膜もしくはウイルス膜の外側表面に保持され得るかのいずれかである。
【０１６８】
培養での所定期間の後、組換えポリペプチドの回収が行われる。
【０１６９】
本明細書中で使用されるとき、語句「組換えポリペプチドを回収する」は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。
【０１７０】
したがって、本発明のポリペプチドは、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化など（これらに限定されない）を使用して精製することができる。
【０１７１】
本発明の実施形態のポリペプチドはアフィニティークロマトグラフィーによって都合良く精製することができる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの好適性は、キメラ体において使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプに依存する。プロテインＡを、ヒトのγ１重鎖、γ２重鎖またはγ４重鎖に基づくキメラ分子を精製するために使用することができる［Ｌｉｎｄｍａｒｋ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６２：１〜１３（１９８３）］。プロテインＧが、好ましくは、すべてのマウスイソタイプについて、また、ヒトγ３について使用される［Ｇｕｓｓ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５：１５６７〜１５７５（１９８６）］。アフィニティーリガンドが結合される固体担体は、ほとんどの場合アガロースであるが、他の固体担体もまた利用可能である。機械的に安定な固体担体（例えば、制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど）は、アガロースを用いて達成され得るよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。キメラ分子をプロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティーカラムに結合するための条件は、Ｆｃドメインの特徴、すなわち、その種およびイソタイプによって完全に決定される。一般には、適切なリガンドが選ばれるとき、効率的な結合が未調整の培養液から直接に生じる。本発明のこの態様の結合したポリペプチドは、酸性ｐＨ（約３．０以上）において、または、穏和なカオトロピック塩を含有する中性ｐＨ緩衝液で、そのどちらでも効率よく溶出することができる。このアフィニティークロマトグラフィー工程により、９５％を超える純度のポリペプチド調製物を得ることができる。
【０１７２】
当該技術分野で知られている他の方法を、本発明の実施形態のポリペプチドを精製するために、プロテインＡまたはプロテインＧでのアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧでのアフィニティークロマトグラフィーに加えて使用することができる。例えば、ポリペプチドはイオウ親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）ゲルクロマトグラフィー［Ｈｕｔｃｈｅｎｓ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５９：２１７〜２２６（１９８６）］および固定化金属キレートクロマトグラフィー［Ａｌ−Ｍａｓｈｉｋｈｉ他、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、７１：１７５６〜１７６３（１９８８）］において抗体と同様に挙動することが期待される。
【０１７３】
回収を容易にするために、発現したコード配列は、本発明のポリペプチドと、融合された切断可能な成分（例えば、ヒスチジン）とをコードするように操作することができる。そのような融合タンパク質は、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、切断可能な成分に対して特異的なカラムでの固定化によって容易に単離され得るように設計することができる。
【０１７４】
切断部位が、ポリペプチドと、切断可能な成分との間で操作される場合、ポリペプチドは、融合タンパク質をこの部位において特異的に切断する適切な酵素または薬剤による処理によってクロマトグラフィーカラムから遊離させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９：６５〜７０（１９８８）；および、Ｇａｒｄｅｌｌａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５８５４〜１５８５９（１９９０）を参照のこと］。
【０１７５】
本発明のポリペプチドは好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。
【０１７６】
本明細書中で使用されるとき、語句「実質的に純粋な」は、本明細書中に記載される適用におけるポリペプチドの効果的な使用を可能にする純度を示す。
【０１７７】
宿主細胞において合成可能であることに加えて、本発明のポリペプチドはまた、インビトロ発現システムを使用して合成することができる。これらの方法が当該技術分野では広く知られており、そのようなシステムの構成成分が市販されている。
【０１７８】
ポリペプチドはそのまま使用することができ、または、さらに修飾することができる。
【０１７９】
例えば、ポリペプチドは、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）をポリペプチドに結合することによって修飾することができる。水溶性ポリマーのそのような結合は、ポリペプチドの生物学的活性を、例えば、ポリペプチドの溶解性を増大させることによって、ポリペプチドの毒性を低下させることによって、ポリペプチドの循環半減期を（例えば、糸球体ろ過を低下させることにより）延ばすことによって、および／または、ポリペプチドをタンパク質分解的分解から保護することによって改善することができる。
【０１８０】
したがって、本発明の必要に応じた随意的な実施形態によれば、本明細書中に記載されるポリペプチドは水溶性ポリマーに結合させられる。ポリエチレングリコールが好適な水溶性ポリマーである。薬学的投与のために意図されるポリペプチドへの結合のために好適な（例えば、非毒性の）さらなる水溶性ポリマーが当業者には明らかである。
【０１８１】
水溶性ポリマーは、（直接に、または、リンカーを介して）ポリペプチドのどのような部分にでも結合させることができる。場合により、水溶性ポリマーは、ケモカイン結合ペプチド以外のポリペプチドの部分に、そのケモカイン結合活性を妨害しないように結合させられる。
【０１８２】
本明細書中に記載されるように、また、下記の実施例の節において例示されるように、本明細書中に記載されるポリペプチドは、ケモカインの活性を調節することに効果的であり、このことは数多くの好都合な治療的適用を有し得る。したがって、ケモカイン活性を調節し、かつ／または、様々な医学的状態を処置するための新規かつ効率的な方法が本明細書中に提供される。
【０１８３】
それによれば、本発明の実施形態の１つの局面において、ケモカイン（例えば、Ｉ−ＴＡＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、エオタキシンおよび／またはＲＡＮＴＥＳ）の生物学的影響を調節する方法であって、治療効果的な量の本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される修飾型または非修飾型のポリペプチド）をその必要性のある対象に投与することを含む方法が提供される。
【０１８４】
本明細書中で使用される場合、用語「方法」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これらには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の分野の当業者に知られているか、または、そのような当業者によって、既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発されるかのどちらであってもそのような様式、手段、技術および手順（これらに限定されない）が含まれる。
【０１８５】
下記の実施例の節において明らかにされるように、本明細書中に記載されるポリペプチドは、様々な医学的状態を処置するためのものであり得る。そのような状態を処置することが、本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される修飾型または非修飾型のポリペプチド）をその必要性のある対象に投与することを含む方法によって行われる。本発明の実施形態に従って処置することができる状態の例には、限定されないが、炎症、アレルギー、遅延型過敏症、最適でない免疫応答、異常な細胞遊走、自己免疫反応、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、同種移植片拒絶、糖尿病、敗血症、ガン、悪性細胞成長、細菌感染症、ウイルス感染症、関節炎、大腸炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、高血圧、重症筋無力症および再灌流虚血が含まれる。
【０１８６】
場合により、投与は、静脈内投与、経口投与、皮下投与、局所投与および／または鼻腔内投与を含む。
【０１８７】
本明細書中に記載されるポリペプチドのＦｃドメインまたはＦｃフラグメントは、ケモカイン結合ペプチドそれ自体の半減期と比較した場合、循環におけるポリペプチドのより長い半減期をもたらし得ることが理解される。このより長い半減期のために、ポリペプチドの治療効果的なレベルを、より少ない頻度の投与によりインビボで維持することができる。
【０１８８】
したがって、いくつかの実施形態によれば、投与が、１週間あたりせいぜい１回、場合により１ヶ月あたりせいぜい２回、場合により１ヶ月あたりせいぜい１回、場合により２ヶ月あたりせいぜい１回、場合により３ヶ月あたりせいぜい１回、場合により６ヶ月あたりせいぜい１回行われる。
【０１８９】
代わりの実施形態において、ただ１回だけの投与が、所望される治療効果を達成するために十分である。
【０１９０】
同様に、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ケモカイン（例えば、Ｉ−ＴＡＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、エオタキシンおよび／またはＲＡＮＴＥＳ）の生物学的影響を調節する（例えば、本明細書中に記載されるように、阻害および／または強化する）ための医薬品の製造における、本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される修飾型または非修飾型のポリペプチド）の使用が提供される。
【０１９１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、炎症、アレルギー、遅延型過敏症、最適でない免疫応答、異常な細胞遊走、自己免疫反応、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、同時移植片拒絶、糖尿病、敗血症、ガン、悪性細胞成長、細菌感染症、ウイルス感染症、関節炎、大腸炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、高血圧、重症筋無力症および再灌流虚血からなる群から選択される状態を処置するための医薬品の製造における、本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される修飾型または非修飾型のポリペプチド）の使用が提供される。
【０１９２】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１９３】
処置されるべき対象はヒトまたは非ヒト動物であり得る。好ましくは、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【０１９４】
本明細書中に記載されるようなポリペプチドを利用する処置は単独で施すことができ、または、特定の疾患を処置することにおいて有用であることが知られている他の薬剤と一緒に施すことができる。本明細書中に記載される医薬品または医薬組成物は場合によりさらに、１つまたは複数のそのような薬剤を含むことができる。
【０１９５】
場合により、本明細書中に記載される医薬品は、静脈内投与、経口投与、皮下投与、局所投与および／または鼻腔内投与のために配合される。
【０１９６】
本明細書中に記載される本発明の実施形態に従って調節することができるケモカインの生物学的影響の例には、限定されないが、炎症性影響、細胞遊走、腫瘍成長およびガン転移が含まれる。
【０１９７】
本明細書中に記載される本発明のいずれかの局面において、生物学的影響を調節することは、生物学的影響を阻害または強化することを含むことができる。例示的な実施形態において、調節することは、阻害することを含む。場合により、少なくとも１つのケモカインの生物学的影響が阻害され、かつ、別のケモカインの生物学邸影響が強化される。
【０１９８】
本明細書中に記載される方法および使用のいずれかにおいて、ポリペプチドはそれ自体で使用することができ、または、好ましいことではあるが、医薬的に許容されるキャリアをさらに含む医薬組成物の一部として使用することができる。
【０１９９】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載されるようなポリペプチドと、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【０２００】
いくつかの実施形態において、組成物は包装材に詰められ、本明細書中に記載されるように、ケモカイン（例えば、Ｉ−ＴＡＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、エオタキシンおよび／またはＲＡＮＴＥＳ）の生物学的影響を調節することにおける使用のために包装材の内部または表面において印刷により特定される。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、組成物は包装材に詰められ、炎症、アレルギー、遅延型過敏症、最適でない免疫応答、異常な細胞遊走、自己免疫反応、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、同種移植片拒絶、糖尿病、敗血症、ガン、悪性細胞成長、細菌感染症、ウイルス感染症、関節炎、大腸炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、高血圧、重症筋無力症および再灌流虚血からなる群から選択される状態を処置することにおける使用のために包装材の内部または表面において印刷により特定される。
【０２０２】
本明細書中に記載されるポリペプチドは、そのままで、または、その医薬的に許容される塩としてそのどちらでも、本発明の様々な局面において投与することができ、または、そうでない場合には利用することができる。
【０２０３】
表現「医薬的に許容される塩」は、親化合物の溶解度特性を改変するために、および／または、親化合物による生物に対する何らかの著しい刺激を軽減するために典型的には使用され、一方で、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない、親化合物の荷電化学種およびその対イオンを示す。医薬的に許容される塩の限定されない一例がカルボキシレートアニオンおよびカチオン（例えば、アンモニウム、ナトリウムおよびカリウムなど、これらに限定されない）である。
【０２０４】
好適な投与経路には、例えば、吸入経路、経口経路、口内経路、直腸経路、経粘膜経路、経皮経路、皮内経路、経鼻経路、腸管経路および／または腸管外経路；筋肉内注射経路、皮下注射経路および／または髄膜内注射経路；髄空内注入経路、直接心室内注入経路、静脈内注射経路、腹腔内注射経路、鼻腔内注射経路および／または眼内注射経路；ならびに／あるいは、対象の組織領域に直接注入する経路が含まれ得る。必要に応じた随意的な実施形態において、静脈内経路、経口経路、皮下経路、局所経路および／または鼻腔内経路が使用される。
【０２０５】
皮膚の疾患および障害（例えば、乾癬、皮膚アレルギー、皮膚過敏症）については、局所投与が場合により、例えば、局所投与のために配合されるクリーム、ローション、ゲルまたは粉末剤を使用して使用される。
【０２０６】
本明細書に記載される方法、組成物および使用は治療有効量のポリペプチドを利用する。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２０７】
本発明の方法および使用において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０２０８】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０２０９】
投与は、本明細書中に記載されるように、単回投与または複数回投与であることができる。
【０２１０】
本明細書に記載される一つ以上のポリペプチドを含む医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０２１１】
本発明の実施形態に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容されるキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０２１２】
注射の場合、有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。
【０２１３】
経口投与の場合、化合物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容されるキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのようなキャリアは、本発明の化合物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０２１４】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０２１５】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０２１６】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０２１７】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０２１８】
本明細書中に記載される調製物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０２１９】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０２２０】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０２２１】
本発明の実施形態による調製物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０２２２】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０２２３】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、ガラスまたはプラスチックホイル（例えば、ブリスターパック）を含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。
【０２２４】
本明細書中に記載されるポリペプチドはケモカインに結合することができ、したがって、少なくともいくつかのケモカインの構造に対して相補的な構造を有する。ケモカイン受容体もまた、ケモカインに対して相補的な構造を有するので、本明細書中に記載される少なくともいくつかのポリペプチドの構造がケモカイン受容体の構造との著しい類似を有することが予想される。したがって、ポリペプチドをケモカイン受容体の代用物としていくつかの適用において使用することができる（例えば、ケモカイン受容体に結合し得る抗体を作製するとき）。
【０２２５】
したがって、本発明の実施形態の別の局面において、ケモカイン受容体の少なくとも一部分を認識することができる抗体が提供される。抗体は場合により、本明細書中に記載されるポリペプチドに対する抗体を、抗体を生じさせるための標準的な技術を使用して生じさせることによって作製される。
【０２２６】
本明細書中に同様にまた提供されるものが、自己抗体を生じさせるための、本明細書中に記載されるポリペプチドを含むワクチンである。ワクチンは、ポリペプチドに対して対象において抗体を生じさせるように設計される。この場合、抗体はさらに、対象において少なくとも１つのケモカイン受容体の少なくとも一部分を認識し、この部分に結合する。ワクチンは場合により、アジュバントおよびキャリアなど（これらに限定されない）を含めて、当業者によって容易に選択され得る任意の好適なワクチンキャリアを含む。
【０２２７】
免疫原性組成物またはワクチン組成物を調製するための一般的な方法が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．；最新版）に記載される。免疫原性を増大させるために、本発明のポリペプチドは、ビーズ（例えば、ラテックスビーズまたは金ビーズなど）およびＩＳＣＯＭなどに吸着またはコンジュゲート化することができる。免疫原性組成物はアジュバントを含むことができ、この場合、アジュバントは、免疫原性成分の免疫刺激特性を高めるために免疫原またはワクチン配合物に加えることができる物質である。リポソームもまた、アジュバントであると見なされる（Ｇｒｅｇｉｒｕａｄｅｓ，Ｇ．他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）。ポリペプチド免疫原の有効性を増大させ得るアジュバントまたは薬剤の例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルションおよび水中油型エマルションが含まれる。好ましいタイプのアジュバントが、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）ならびに様々なＭＤＰ誘導体およびＭＤＰ配合物であり、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−（β−１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＧＭＤＰ）（Ｈｏｒｎｕｎｇ，ＲＬ他、Ｔｈｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９５、２：７〜１４）またはＩＳＡＦ−１（０．４ｍｇのトレオニル−ムラミルジペプチドを伴うリン酸塩緩衝化溶液における５％スクアレン、２．５％プルロニックＬ１２１、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０；Ｋｗａｋ，ＬＷ他（１９９２）、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｏｌ．、３２７：１２０９〜１２３８）である。他の有用なアジュバントが、コレラトキシン、細菌エンドトキシン、脂質Ｘ、細菌プロピオノバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）または百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の生物全体または細胞成分分画物、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニンおよびサポニン誘導体（例えば、ＱＳ２１（Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｃ．他（１９９１）、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、３０３：２０７〜２１０）、これは現在、臨床において使用されている（Ｈｅｌｌｉｎｇ，Ｆ他（１９９５）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５５：２７８３〜２７８８；Ｄａｖｉｓ，ＴＡ他（１９９７）、Ｂｌｏｏｄ、９０：５０９））、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロック型コポリマーまたは他の合成アジュバントであり、あるいは、それらに基づく。数多くのアジュバントが様々な供給源から市販されている：例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）またはフロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（水中油型）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウム）、または、ＡｍｐｈｉｇｅｎおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの混合物。アルミニウムがヒト使用のために承認されている。
【０２２８】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２２９】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２３０】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２３１】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０２３２】
用語「任意選択的」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０２３３】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０２３４】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２３５】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての数とを含むことが意味される。
【０２３６】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２３７】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２３８】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２３９】
材料および方法
材料：
増幅緩衝液（×１０）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た；
デキストランＴ−５００をＰｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ  Ａ／Ｓ（デンマーク）から得た；
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から得た；
ＥＣＬ溶液をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た；
ＥｃｏＲＩをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから得た；
エンハンサー溶液（×１０）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た；
エオタキシン（ヒト）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、米国）から得た；
ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）２９３培地をＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た；
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から得た；
フィコール１０７７をＳｉｇｍａから得た；
フロイント完全アジュバントをＳｉｇｍａまたはＤｉｆｃｏから得た；
ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６をＲｏｃｈｅから得た；
ＩＰ−１０（ヒト）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから得た；
ＩＬ−８（ヒト）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから得た；
Ｉ−ＴＡＣ（ヒト）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから得た；
ＭＣＰ−１（ヒト）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから得た；
メチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）をＳｉｇｍａから得た；
ＭＩＧ（ヒト）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから得た； 
ＮｏｔＩをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから得た；
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＢｉｓＴｒｉｓゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た；
ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ベクターをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得た；
プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズをＡｍｅｒｓｈａｍから得た；
ＲＡＮＴＥＳ（ヒト）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから得た；
ＲＰＭＩ培地をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から得た；
ＳＤＦ−１α（ヒト）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから得た；
Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た；および
ＶＣＡＭ−１（ヒト）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。
【０２４０】
すべてのケモカインを供給者の推奨法に従って調製した。
【０２４１】
ＩＬ６−ＢＫＴペプチドのＤＮＡフラグメントを得るための２工程ＰＣＲ：
最初のＰＣＲ工程において、ＩＬ６のシグナルペプチドのＤＮＡ配列（配列番号１６６）を、それぞれのＢＫＴペプチドの最初の９アミノ酸に対応するＤＮＡ配列に加えた。このＰＣＲ反応の生成物を、ＢＫＴペプチドの残り３アミノ酸に対応するＤＮＡ配列、スペーサー配列（配列番号１６７）および３’末端でのＢｓｔＢＩ制限部位を加えるためのテンプレートとして第２のＰＣＲ工程で使用した。
【０２４２】
ＩＬ６−Ｆｃ  ｐＩＲＥＳｐｕｒｏのＤＮＡが、最初のＰＣＲ工程における３つすべてのＰＣＲ反応のためのＤＮＡテンプレートとして役立った。３つすべてのＰＣＲ反応を、同じフォワードプライマー（Ｔ７プライマー；配列番号１７０）を使用して行った。ユニバーサルＴ７プライマーを使用することにより、サブクローニングのために後で使用されたＮｈｅＩを含めて、５’末端におけるマルチクローニング部位を含有したＰＣＲ産物が得られた。リバースプライマーはそれぞれのペプチドについて特異的であった；配列番号１７１がＢＫＴ−Ｐ２のために使用され、配列番号１７２がＢＫＴ−Ｐ４６のために使用された。
【０２４３】
ＰＣＲ反応条件は下記の通りであった：２０ｎｇのＤＮＡテンプレート；５μｌの増幅（×１０）緩衝液；０．２ｍＭの各デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）；０．５ｍＭのＭｇＳＯ４；５μｌのエンハンサー溶液（×１０）；０．２μＭの各プライマー；２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ；水を加えて、５０μｌの総反応体積にした。
【０２４４】
増幅を、９４℃で３分間の最初の変性工程、続いて、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３０サイクル、その後、７２℃で１０分間により行った。
【０２４５】
ＰＣＲ増幅が終了したとき、５μｌのそれぞれの反応混合物を、臭化エチジウムにより染色され、ＵＶ光により可視化される２％アガロースゲルで分析した。
【０２４６】
上記手順によって得られるＰＣＲ産物を第２のＰＣＲ工程のためのテンプレートとして使用した。上記Ｔ７プライマーを３つすべての反応においてフォワードプライマーとして使用し、一方、リバースプライマーはそれぞれのペプチドについて特異的であった；配列番号１７３がＢＫＴ−Ｐ２のために使用され、配列番号１７４がＢＫＴ−Ｐ４６のために使用された。それぞれのリバースプライマーが、所望されるペプチドのアミノ酸１０〜１２と、ヘキサペプチドスペーサー配列（配列番号１６２）とをコードし、ＢｓｔＢ１制限部位を含んだ。
【０２４７】
ＰＣＲ反応条件は下記の通りであった：０．５μｌのＤＮＡテンプレート；５μｌの増幅（×１０）緩衝液；０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ；０．５μＭのＭｇＳＯ４；５μｌのエンハンサー溶液（×１０）；０．２μＭの各プライマー；２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ；水を加えて、５０μｌの総反応体積にした。
【０２４８】
増幅およびＰＣＲ産物の分析を、最初のＰＣＲ工程について上記で記載されるように行った。ＰＣＲ産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ（商標））を使用してゲルから抽出した。
【０２４９】
ＩＬ６−ＢＫＴペプチドのＤＮＡフラグメントのＦｃ配列への連結：
抽出されたＩＬ６−ＢＫＴペプチドＤＮＡ産物をＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩにより消化し、上記で詳述されるようにアガロースゲルから精製し、同じ酵素により事前に消化されたＦｃ  Ｎ２９７Ａ  ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３に連結した。配列番号１５８および配列番号１５９をコードするためのベクターのマップが図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示される。連結混合物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。アンピシリン抵抗性の形質転換体をスクリーニングし、陽性クローンをコロニーＰＣＲによってさらに分析した。
【０２５０】
ＤＮＡをアンピシリン抵抗性コロニーから抽出し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩの制限酵素による３７℃での２時間の消化に供した。反応液をアガロースゲルで分離した。陽性コロニーは、５１２３ｂｐおよび８６８ｂｐの２つのバンドを生じさせることが予想された。陽性コロニーをＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２５１】
ウエスタンブロット：
細胞サンプルからの培地を集め、遠心分離した（１０００回転／分、７分）。１ｍｌの細胞除去培地を５０μｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズと室温で４５分間インキュベーションした。インキュベーション時間が終了したとき、タンパク質を、１００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）および１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含有する５０μｌのサンプル緩衝液によりビーズから溶出した。サンプルを３分間煮沸し、その後、２５μｌのサンプルを１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＢｉｓＴｒｉｓゲルに負荷した。タンパク質をニトロセルトースメンブランに転写し、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０が補充されたＰＢＳ）における１０％低脂肪ミルクによりブロッキング処理した。その後、メンブランを、ブロッキング溶液における１：４００００の濃度でのヒト抗ＩｇＧ  Ｆｃフラグメント抗体により、その後で、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲート化されたヤギ抗ヒト抗体により１時間、室温でブロッティングした。ＥＣＬ溶液とのインキュベーションの後、メンブランをフィルムに感光させた。
【０２５２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：
カルボキシメチルデキストランにより被覆されるチャンバーにおいて、ペプチドまたはポリペプチドを、典型的にはリシン残基またはＮ末端のアミノ基を介してチャンバーに共有結合により結合させた。ケモカインを増大する濃度で注入してチャンバーに通した。
【０２５３】
表面から反射される光における変化が、結合したタンパク質の量に比例しており、検出器によって検出される。
【０２５４】
ケモカインの種々の濃度で結合するタンパク質の量をプロットすることにより、解離係数の計算が可能であった。
【０２５５】
新鮮血からのＴ細胞の精製：
５０ｍｌの血液を、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液生理的食塩水）におけるデキストランＴ−５００の溶液（６％ｗ／ｖ）の１０ｍｌおよび７ｍｌのクエン酸塩緩衝液（５００ｍｌのＰＢＳにおける２５グラムのクエン酸塩、８グラムのクエン酸）に加えた。この溶液を２５℃で３０分間インキュベーションした。１０ｍｌのフィコール１０７７をチューブの底に加えた。その後、チューブを、（遠心分離機のブレーキモードをオフにして）２０００回転／分で３０分間、１８℃で遠心分離した。相間部を集め、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含む８ｍｌのＰＢＳにより２回洗浄し、その後、１４００回転／分における５分間の１８℃での遠心分離を行った。細胞を１０８個／ｍｌ未満の濃度で、５％のＦＣＳを含むＰＢＳに再懸濁した。２ｍｌの細胞溶液を、ＰＢＳ−５％ＦＣＳに事前に浸されたポリ（メタクリル酸メチル）ナイロンウールカラムに加え、その後、２５℃で４５分間インキュベーションした。それぞれのカラムを８ｍｌのＰＢＳ−５％ＦＣＳにより洗浄し、細胞（Ｔ細胞および赤血球）をＰＢＳにおける５ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の５０ｍｌによって溶出した。赤色ペレットを、（ブレーキをオンにした）１４００回転／分における５分間の４℃での遠心分離によって得た。
【０２５６】
赤血球の溶解を行うために、赤色ペレットを５ｍｌの溶解緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、×０．１ＰＢＳ）に４分間再懸濁し、その後、ＥＤＴＡを含むＰＢＳの５０ｍｌを直ちに加えた。１４００回転／分における５分間の４℃での遠心分離の後、ペレットを再び５０ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡにより洗浄し、同じ条件のもとで再び遠心分離した。白色ペレットが得られた。これを、１０％のＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ培地に、３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞を３７℃で２時間インキュベーションし、その後、非接着性細胞を集めた。細胞は、３７℃での一晩のインキュベーションの後、実験で使用できる状態であった。
【０２５７】
インビトロＴ細胞接着アッセイ：
１０μｇ／ｍｌのヒトＶＣＡＭ−１および２μｇ／ｍｌのケモカイン（無傷のＭＩＧ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１（間質細胞由来因子−１）、ＢＣＡ−１（Ｂリンパ球化学誘引物質−１）、ＩＬ−８（インターロイキン−８）またはエオタキシン、あるいは、コントロールとしての熱不活化ＳＤＦ−１を、２０ｍＭ重炭酸塩により緩衝化されたＰＢＳ（ｐＨ８．５）に溶解し、ポリスチレンプレートにおいて４℃で一晩インキュベーションした。代替では、１０μｇ／ｍｌのケモカインを使用し、プレートを室温で３０分間インキュベーションした。その後、プレートを３回洗浄し、ＰＢＳにおける２０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンと３７℃で２時間インキュベーションすることによってブロッキング処理した。
【０２５８】
その後、プレートを平行壁フローチャンバーの下部壁として組み立て、倒立顕微鏡のステージに取り付けた。１０μｇ／ｍｌの試験されているペプチドを、３７℃で１０分間、基質被覆チャンバー壁に定着させ、その後、洗浄した。Ｔ細胞を、本明細書中上記で記載されるように新鮮血から精製し（５×１０６個／ｍｌ、９８％を越える純度）、結合緩衝液に懸濁し、チャンバーの中に灌流させ、３７℃で１分間、基質被覆チャンバー壁に定着させた。流れを開始し、５秒毎に２倍〜２．５倍の増分で増大させ、これにより、壁面における制御された剪断ストレスを生じさせた。細胞を倒立型位相差Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）の２０倍対物レンズで可視化し、ＡＧ−６７３０  Ｓ−ＶＨＳビデオレコーダー（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ）に接続されたロング・インテグレーションＬＩＳ−７００ＣＣＤビデオカメラ（Ａｐｐｌｉｔｅｃｈ；イスラエル）により写真撮影した。高まった剪断力による剥離に耐える接着性細胞の数を、ビデオテープに録画された細胞画像の分析によってそれぞれの時間間隔の後で求め、最初に定着した細胞のパーセントとして表した。すべての接着実験を多数の試験領域で少なくとも３回行った。
【０２５９】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）：
ＥＡＥをメスのＳＪＬマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導した。マウスを１００μｇのＰＬＰ１３９−１５１ペプチドまたは２５０μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドによりわき腹の皮下にそれぞれ免疫化した（０日目）。ＰＬＰペプチドおよびＭＯＧペプチドを、８００μｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を含有する等体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に乳化した。マウスにはまた、３００ｎｇの百日咳トキシンを０日目および２日目に腹腔内注射した。
【０２６０】
マウスに、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣまたはＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ（５０μｇ／マウス）を免疫化後９日目に静脈内注射した。いくつかの実験では、マウスを、疾患のピーク時に、すなわち、疾患誘導後１４日で処置した。このとき、マウスに、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣまたはＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣを静脈内注射した。
【０２６１】
脊髄組織サンプルを疾患誘導後３０日で集め、４％パラホルムアルデヒドにおいて固定処理し、脱水し、パラフィンに包埋した。脊髄切片を６μｍで切断し、免疫細胞の浸潤を評価するためのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いた染色、ならびに、脱髄領域に印を付けるためのルクソールファストブルーを用いた染色による組織学的分析のために処理した。
【０２６２】
血液サンプルを免疫化後３０日目に集め、血清をサイトカイン分析のために取り出した。サイトカインのレベルを製造者の説明書に従ってマウスＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット（ＢＤサイトメトリービーズアッセイ（ＣＢＡ））によって評価した。
【０２６３】
ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドおよびＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドの影響を、動物対象におけるＥＡＥの臨床スコアをモニターすることによって求めた。ＥＡＥについての臨床スコアを下記の判定基準に従って決定した：０−疾患なし；１−低下した尾の緊張；２−後肢衰弱または部分的麻痺；３−完全な後肢麻痺；４−前肢および後肢の麻痺；５−瀕死状態。累積スコアを、実験終了時に、すべての結果を実験群におけるすべての動物について合計することによって計算した。
【０２６４】
すべてのＥＡＥ実験のために、群あたり１０匹〜１２匹のマウスが存在した。
【０２６５】
実施例１
ポリペプチドの調製
ＢＫＴ−Ｐ２ペプチド（配列番号１０１）およびＢＫＴ−Ｐ４６ペプチド（配列番号７６）（これらは本明細書中では「ＢＫＴペプチド」として示される）を、分泌型非グリコシル化ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ）のＮ’末端に融合されるＢＫＴペプチドを有するポリペプチドを調製するための基礎として使用した。
【０２６６】
ＤＮＡクローニングを可能にするために、ＢＫＴ−Ｐ２およびＢＫＴ−Ｐ４６のペプチド配列をＤＮＡ配列に逆翻訳した。それぞれのＢＫＴペプチド配列を、哺乳動物システムにおけるタンパク質分泌を可能にするためにヒトＩＬ６シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合した。この手順を、本明細書中上記に記載されるような２工程ＰＣＲによって行った。その後、ＰＣＲによって得られるＩＬ６−ＢＫＴペプチドのＤＮＡフラグメントを消化し、本明細書中上記に記載される手順を使用して、非グリコシル化Ｆｃ配列（これは点変異Ｎ２９７Ａを含有する）に読み枠を合わせて連結して、ＩＬ６−Ｐ２−Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ（配列番号１６８）およびＩＬ６−Ｐ４６−Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ（配列番号１６９）と称されるフラグメントを得た。
【０２６７】
その後、ＩＬ６−ＢＫＴペプチド−ＦｃのＤＮＡ構築物を、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬を使用してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。それぞれの構築物を６ウエルプレートの２つのウエルに移した。１つのウエルをウエスタンブロット（ＷＢ）分析のために割り当て、第２のウエルを、安定なプールを確立するために割り当てた。細胞をウエルあたり５０００００細胞の濃度で６ウエルプレートに置床した。翌日、細胞を６μｌのＦｕＧＥＮＥおよび２μｇのＤＮＡにより（３：１の比率で）トランスフェクションした。
【０２６８】
ＷＢ分析のために割り当てられるウエルにおいて、培地を無血清培地により２４時間後に取り替え、培地を４８時間後に集めた。一過性トランスフェクションによる細胞を、抗Ｆｃ抗体を使用するウエスタンブロット分析によって分析した。細胞は、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ（配列番号１５８）およびＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣ（配列番号１５９）と称される所望のポリペプチドを発現することが見出された（データは示されず）。
【０２６９】
他方のウエルにおいて、培地を、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）により２４時間後に取り替え、４８時間後、細胞をトリプシン処理し、安定なクローンを得るための選抜培地（１０％のＦＣＳおよび５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ）を含有するＴ７５フラスコに移した。
【０２７０】
ピューロマイシン選抜を生き延びた細胞集団（安定なクローン）を増殖させ、細胞集団の培地を、所望されるポリペプチドの発現を確認するために、本明細書中上記に記載されるようにウエスタンブロットによって分析した。
【０２７１】
図２に示されるように、所望されるＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドおよびＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドが、試験された細胞培養物のすべてにおいて発現された。
【０２７２】
加えて、上記プールからの上清を、Ｆｃフラグメントに対するＥＬＩＳＡによって試験した。結果は、試験された培養物のすべてにおける所望されるＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドまたはＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドの発現を示した（データは示されず）。
【０２７３】
細胞の正体を確認するために、ゲノムＰＣＲを行った。結果は、正しい配列が細胞ゲノムに組み込まれたことを示した（データは示されず）。
【０２７４】
所望されるポリペプチドを発現するそれぞれのプールのいくつかのアリコートを液体窒素において凍結保存した。数日後、細胞生存性を確認するために、それぞれのストックからの１つのアンプルを解凍した。
【０２７５】
その後、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチド（配列番号１５８）およびＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチド（配列番号１５９）を、懸濁状態で成長させられる哺乳動物培養で産生させた。トランスフェクション細胞のＴ１７５フラスコの１つを、選抜用抗生物質（５μｇ／ｍｌのピューロマイシン）を含有する１０％血清補充培地で維持し、３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベーションした。トリプシン処理後、細胞を、４ｍＭのグルタミンおよび選抜用抗生物質（１μｇ／ｍｌのピューロマイシン）が補充される無血清培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）２９３培地）に移し、３７℃で５％ＣＯ２においてフラスコでさらにインキュベーションした。３日後、細胞を、１２５回転／分の撹拌速度による３７℃での振とうフラスコに移した。細胞密度が２．０〜３．５×１０６細胞／ｍｌに達したとき、培養体積を、２つのスピナーフラスコにおいて４リットルに至るまで連続的に希釈することによって増大させた。２００ｍｌの培養物を含有する１つの振とうフラスコを予備として保った。
【０２７６】
４日の産生期の後、２つのスピナーフラスコの培養液は、９１％の生存性で３．７×１０６細胞／ｍｌに、９２％の生存性で４．０×１０６細胞／ｍｌにそれぞれ達した。２つのスピナーフラスコからの培地および振とうフラスコからの２００ｍｌを遠心分離（５０００回転／分、１５分）によって集めた。合計で３．５リットルを採取し、０．２２μｍのフィルターでろ過し、−８０℃で保った（２つの１．５ｍｌサンプルを取った）。ポリペプチド（配列番号１５８または配列番号１５９）をプロテインＡカラムでさらに精製した。
【０２７７】
実施例２
ケモカインに対するポリペプチドの親和性
実施例１に記載されるポリペプチドのケモカインに対する親和性を、材料および方法の節に記載されるように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって求めた。結果が下記の表３にまとめられる。
【０２７８】
表３に示されるように、ポリペプチドが、感知できる程度に、Ｉ−ＴＡＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳのケモカインのそれぞれに結合した。
0005784010.tif 000006
【０２７９】
実施例３
ポリペプチドのインビトロ活性
本明細書中上記で記載されるインビトロ接着アッセイを使用して、ＶＣＡＭ−１へのＴ細胞の接着に対する、ケモカイン結合ペプチドのＢＫＴ−Ｐ２（配列番号１０１）およびＢＫＴ−Ｐ４６（配列番号７６）の影響を、上記ケモカイン結合ペプチド配列の一方を含む実施例１に記載されるポリペプチドの影響と比較した。ＶＣＡＭ−１へのＴ細胞の接着を阻害する上記のペプチドおよびポリペプチドの能力が下記の表４にまとめられる。
0005784010.tif 000007
【０２８０】
表４、ならびに、図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃに示されるように、ペプチドＢＫＴ−Ｐ２は、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよびエオタキシンによって誘導されるＴ細胞接着を阻害したが、ＭＩＧによって誘導される接着は阻害しなかった。
【０２８１】
表４、ならびに、図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃに示されるように、ポリペプチドＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣは、ＭＩＧによって誘導されるＴ細胞接着を、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよびエオタキシンによって誘導される接着と同様に阻害した。
【０２８２】
表４においてさらに示されるように、ペプチドＢＫＴ−Ｐ４６は、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳによって誘導されるＴ細胞接着を阻害したが、エオタキシンによって誘導される接着は阻害せず、これに対して、ポリペプチドＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣは、エオタキシンによって誘導されるＴ細胞接着を、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳによるのと同様に阻害した。
【０２８３】
上記結果は、ポリペプチドが、ケモカイン活性を調節する対応するケモカイン結合ペプチドの能力と比較された場合、ケモカイン活性を調節する高まった能力を有することを示している。これは、ペプチドと比較してポリペプチドの長くなった寿命および高まった安定性の結果であるかもしれず、ならびに／または、それらの三次的立体配座における変化のためであるかもしれない。
【０２８４】
実施例４
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対するポリペプチドのインビボ影響
実施例１に記載されるＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドおよびＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドの脳炎症に対する影響を、材料および方法の節に記載されるようなインビボでの実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルを使用して試験し、スコア化した。
【０２８５】
図５Ａおよび図５Ｂに示されるように、ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドはＰＬＰ誘導ＥＡＥの平均臨床スコアおよび累積臨床スコアを（５５日目までの）実験継続期間にわたってかなり低下させた。
【０２８６】
実験の３７日目において、１３匹中６匹のコントロールマウスが、少なくとも２のＥＡＥ臨床スコアを有し、これに対して、ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドを受けた１０匹すべてのマウスが０のＥＡＥ臨床スコアを有した。
【０２８７】
加えて、図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドおよびＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドの両方がＰＬＰ誘導ＥＡＥの平均臨床スコアおよび累積臨床スコアを（３３日目までの）実験継続期間にわたって低下させた。
【０２８８】
実験の２７日目において、１０匹中８匹のコントロールマウスが、少なくとも２のＥＡＥ臨床スコアを有し、これに対して、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドを受けた１０匹中９匹のマウス、および、ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドを受けた１０匹中８匹のマウスが、０のＥＡＥ臨床スコアを有した。
【０２８９】
同様に、図７に示されるように、ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドおよびＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドの両方がＭＯＧ誘導ＥＡＥの平均臨床スコアを（５５日目までの）実験継続期間にわたって低下させた。
【０２９０】
これらの結果は、本ポリペプチドが、マウスの脳における炎症性応答、例えば、ＥＡＥ（多発性硬化症のモデル）の炎症性応答などを阻害することに効果的であることを示している。
【０２９１】
実施例５
関節炎に対するポリペプチドのインビボ影響
実施例１に記載されるＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドの関節炎に対する影響を、インビボでのマウス誘導関節炎モデルを使用して試験した。アッセイを、Ｃｏｅｌｈｏ他［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、２００８、５８：２３２９〜２３３７］、Ｇｒｅｓｐａｎ他［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、２００８、５８：２０３０〜２０４０］およびＬｅｍｏｓ他［ＰＮＡＳ、２００９、１０６：５９５４〜５９５９］に記載されるように行った。
【０２９２】
０日目に、マウスを、生理的食塩水と、等体積のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）とのエマルションの１００μｌにおける５００μｇのメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）により尾の基部において皮内に免疫化した。１１日目に、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドを２ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。２４時間後、抗原攻撃をマウスにおいて行った。それぞれのマウスが、（１０μｌの殺菌された生理的食塩水における）１０μｇのｍＢＳＡの注射を左膝関節において受けた。ポリペプチド投与後４８時間で、マウスを殺し、膝関節腔をＰＢＳにより洗浄し、組織中の白血球の数を、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して白血球を計数することによって求めた。
【０２９３】
図８Ａおよび図８Ｂに示されるように、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドは、関節炎の膝関節腔における好中球の数および単球の数をかなり減少させた。
【０２９４】
これらの結果は、本ポリペプチドが、炎症性応答、例えば、関節リウマチの炎症性応答などを阻害することに効果的であることを示している。
【０２９５】
実施例６
遅延型過敏症（ＤＴＨ）に対するポリペプチドのインビボ影響
実施例１に記載されるＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドおよびＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドの免疫応答に対する影響を、インビボでの遅延型過敏症マウスモデルを使用してさらに試験した。
【０２９６】
マウス（８週齢〜１０週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス）を、０日目に、生理的食塩水と、等体積のフロイント完全アジュバントとのエマルションの１００μｌにおける５００μｇのメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）により尾の基部において皮内に免疫化した。１２日後、抗原攻撃をマウスにおいて行った。それぞれのマウスが、Ｃｏｅｌｈｏ他［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、２００８、５８：２３２９〜２３３７］およびＨｅａｌｙ他［Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００６、１７７：１８８６〜１８９３］に記載されるように、（１０μｌの殺菌された生理的食塩水における）１０μｇのｍＢＳＡの注射を左膝関節において受けた。一部のマウスにおいて、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣ（５０μｇ／マウス）を攻撃の２４時間前に静脈内注射した。ＰＢＳの擬似免疫化により攻撃されたナイーブマウスがコントロールマウスとして役立った。抗原攻撃後２４時間でマウスを殺した。
【０２９７】
図９に示されるように、上記ポリペプチドの両方が遅延型過敏症を阻害し、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣがＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣよりも強力であった。
【０２９８】
これらの結果は、本ポリペプチドが、遅延型過敏症の炎症性応答を阻害することに効果的であることを示している。
【０２９９】
実施例７
ポリペプチドの薬物動態学
マウスにおけるポリペプチドの薬物動態学を、５０μｇ／マウスのＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチド（配列番号１５９）またはＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチド（配列番号１５８）が静脈内注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて求めた。
【０３００】
マウスを、注射後２時間、２４時間、５日および１１日で採血し、血清を取り出した。血清中のポリペプチドのレベルを、ヒト総ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（ＩＣＬ）を製造者の説明書に従って使用して調べた。
【０３０１】
ポリペプチドが、注射後１１日においてさえ、血液中に検出された。
【０３０２】
これらの結果は、本ポリペプチドがインビボにおける相当の安定性を有することを示している。
【０３０３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３０４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０３０５】
0005784010.tif 000008
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【配列表フリーテキスト】
【０３０６】
配列番号１〜１５７は、合成ペプチドの配列である。
配列番号１５８は、ＢＫＴ−Ｐ２−ＦＣポリペプチドの配列である。
配列番号１５９は、ＢＫＴ−Ｐ４６−ＦＣポリペプチドの配列である。
配列番号１６０は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  （Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ）の配列である。
配列番号１６１は、ＩＬ６シグナルペプチドの配列である。
配列番号１６２は、ヘキサペプチドスペーサーの配列である。
配列番号１６３は、ＢＫＴ−Ｐ２ペプチドのＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１６４は、ＢＫＴ−Ｐ４６ペプチドのＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１６５は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  （Ｆｃ  Ｎ２９７Ａ）のＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１６６は、ＩＬ６シグナルペプチドのＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１６７は、スペーサーのＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１６８は、ＩＬ６−Ｐ２−Ｆｃ  Ｎ２９７ＡのＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１６９は、ＩＬ６−Ｐ４６−Ｆｃ  Ｎ２９７ＡのＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１７０〜１７４は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図９】
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【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【配列表】
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