(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製に関連する標的核酸を含むことを特徴とする乳頭腫（papilloma）ウイルスの複製を阻害する医薬組成物であって、
核酸を含み、その核酸はオリゴヌクレオチドを含み、そのオリゴヌクレオチドはハイブリッドを形成することのできる条件で、該標的核酸と接触され、
形成されたハイブリッドにより標的核酸の翻訳は阻害され、
該オリゴヌクレオチドは
TAAACGTTCGCATGCTGTCTCCA（配列番号１１）、
TAAAXGTTCGCATGCTGTCTCCAただしＸは5-SH-DC（配列番号１２）及び、TAAACXTTCGCATGCTGTCTCCAただしＸは8-SH-DG（配列番号１３）
のいずれかより選ばれ、
さらに、該オリゴヌクレオチドは金属キレート部を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
金属がランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム及びルテチウムからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
金属がユウロピウムであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
乳頭腫ウイルスの複製を阻害する医薬組成物であって、
TAAACGTTCGCATGCTGTCTCCA（配列番号１１）、
TAAAXGTTCGCATGCTGTCTCCAただしＸは5-SH-DC（配列番号１２）及び、
TAAACXTTCGCATGCTGTCTCCAただしＸは8-SH-DG（配列番号１３）
のいずれかより選ばれるオリゴヌクレオチドを含み、
さらに、該オリゴヌクレオチドは金属キレート部を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
金属がランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム及びルテチウムからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
金属がユウロピウムであることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれをその全体として参照により本明細書に組み込まれている、２００８年５月３０日に出願した先の米国仮出願第６１／０５７，６８５号及び２００７年１１月５日に出願した米国仮出願第６０／９８５，５４８号の恩典を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ウイルスの遺伝子発現及び／又は複製を阻害するための特に修飾したヌクレオチド塩基を含むオリゴヌクレオチド類似体の使用に関する。オリゴヌクレオチドは、高度に選択的な人工ヌクレアーゼ活性を有するランタニドの有機錯体に場合によって結合している。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチドの使用は、現代の療法において極めて重要であり、十分に実証されている（Ｕｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９０、９０、５４３〜５８４頁、Ｃｒｏｏｋｅら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ｍｅｓｍａｅｋａｒら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６〜３７４頁、Ｓｔｅｉｎ、「Ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｅｒｐｌｅｘｅｄ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１、１０８、６４１〜６４４頁）。ＤＮＡ又はＲＮＡ標的に対するアンチセンス・ポリヌクレオチドの特異的結合により、核酸の複製、転写又は翻訳を不活性化し、それにより、癌及びウイルス感染などの疾患をコントロールするためのメカニズムを提供することができる。したがって、標的に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合は、例えば、ウイルスのライフサイクル又は癌細胞の成長を妨げるために、様々な環境における遺伝子発現を変化させるのに用いることができる。
【０００４】
人類を悩ませる多くの重要な感染症は、ウイルスにより引き起こされる。肝炎、免疫不全及び様々な脳炎性疾患を含むこれらの疾患の多くは、しばしば致命的である。他のものは、高度に接触感染性であり、インフルエンザ、麻疹、流行性耳下腺炎及び水痘などの急性不快感並びに呼吸又は胃腸障害をもたらす点で重要である。風疹及びサイトメガロウイルスなどの他のものは、先天性異常を引起こし得る。最後に、ヒト及び動物において癌を引き起こし得る腫瘍ウイルス（ヒト乳頭腫ウイルスを含む）として知られているウイルスが存在する。
【０００５】
ウイルスゲノムは、ＤＮＡ又はＲＮＡからなり得る。複製サイクル中にＤＮＡ相及びＲＮＡ相の両方を用いるウイルスの２群が知られている。ウイルスゲノムＤＮＡは、二重鎖又は単鎖、環状又は直鎖状でもよい。ＤＮＡのサイズは、４．５ｋｂと小さいさいか、又は１．２Ｍｂｐと大きくてよく、遺伝子の数は３から９１１まで変化する。ＤＮＡゲノムは、提案された抗ウイルスの標的としての役割を果たさない。ウイルスエンコードｍＲＮＡｓの代わりに、小分子ＲＮＡｓ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡｓ）並びにウイルス感染に不可欠な宿主因子をエンコードするｍＲＮＡｓをアンチセンス標的として用いることができる。したがって、このアプローチは、ウイルスゲノムの直接的な破壊につながらないが、ウイルスの複製及び／又は遺伝子発現を抑制し、最終的に細胞からのウイルスゲノムの除去につながり得る。さらに、宿主免疫応答の抑制に必須であるタンパク質をエンコードするウイルスｍＲＮＡｓの標的化により、宿主免疫系によるウイルス除去が促進される可能性がある。宿主細胞のアポトーシスの阻害に必須のウイルス遺伝子産物の標的化は、感染細胞の早期の死につながり、ひいてはウイルス感染の除去につながり得るが、潜在ウイルスの維持に必須なウイルス遺伝子産物（ｍＲＮＡｓ又は場合によって小分子ＲＮＡｓ）の標的化は、潜在的に感染した細胞の除去及び感染生物からの潜在ウイルスの除去につながり得る。
【０００６】
レトロウイルスは、ＤＮＡゲノムを有さないが、それらの感染の第１段階で、次に細胞ＤＮＡに組み込まれ、それにより宿主ゲノムの一部（いわゆるプロウイルスＤＮＡ）になる、それらのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡコピーを合成する。このＤＮＡは、しばしば転写的にサイレントであり、これらのプロウイルスを有する細胞は、従来の抗ウイルス薬又はシステムの標的にすることはできない（これは抗ＨＩＶ療法における最大の問題の１つである）。プロウイルスはアンチセンス技術により標的にすることも、除去することもできないが、感染過程の特定のステップについてはそれができる。これらのステップは、逆転写（この段階におけるゲノムＲＮＡは「コア」粒子内のウイルスタンパク質で囲まれている）が起こる前の新たに感染された細胞におけるウイルスゲノムの標的化、ウイルスの侵入を防ぐためのウイルス受容体又は共受容体（ＨＩＶの場合にはケモカイン受容体）の標的化、ウイルスｃＤＮＡ核輸送及び宿主ゲノムにおける組み込みに必須の細胞補因子の標的化（そのような因子の多くはＨＩＶ−１について知られている）、プロウイルスから発現したｍＲＮＡｓの標的化及びそれによるレトロウイルス複製サイクルの抑制、それらの包膜の前のウイルスゲノムＲＮＡｓの標的化及び新たなビリオンの形成の予防を含む。これらの戦略は、発現を阻止できる、複数の調節タンパク質をエンコードするＨＩＶゲノムの阻害に有効である可能性がある。
【０００７】
リボウイルス（ＲＮＡゲノムを有するウイルス）のゲノムは、配列特異性抗ＲＮＡ剤の直接的標的にすることができる。したがって、リボウイルスにより引き起こされる感染は、これらの種類の薬物のみを用いることにより完全に除去することができる。しかし、実際には、ウイルスゲノムはしばしば保護されるので、ゲノムの標的化は複雑になる可能性があるが、そのときでさえも、ウイルスｍＲＮＡｓ及びウイルスに必須な細胞補因子のｍＲＮＡｓは、標的化することができる。
【０００８】
２本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスのゲノムＲＮＡは、常にタンパク質粒子（ウイルスコア）にパッケージングされており、感染細胞の細胞質に決して放出されない。したがって、ｍＲＮＡｓ及び宿主因子のみを抗ＲＮＡ剤の標的にすることができる可能性が最も高い。１本鎖マイナスＲＮＡゲノムを有するウイルスのゲノムは、常にウイルス核タンパク質により保護されているが、固有のコア粒子を形成しない。したがって、ウイルスゲノム並びにそれらの必須のｍＲＮＡｓの両方を標的にすることは可能であると思われる。
【０００９】
１本鎖プラスＲＮＡゲノムを有するウイルスは、ゲノムＲＮＡがｍＲＮＡとして直接用いられ、感染の少なくともいくつかの段階において、裸（保護されていない）形態である、唯一のウイルスである。しかし、複製中は、ゲノム及びその相補鎖は通常、膜構造にパッケージングされている。したがって、感染の初期の段階（複製複合体の形成の前）はＲＮＡ分解剤に対して感受性がより高い可能性がある。ウイルス標的（ゲノム、ｍＲＮＡ又は両方）の性質に加えて、付加的な因子も非常に重要な役割を有する可能性がある。
【００１０】
抗ウイルス剤が１つのＲＮＡ分子を阻害すること（アンチセンス・オリゴヌクレオチド）や１つのＲＮＡ分子を切断すること（これはしばしば抗ウイルスリボザイムに当てはまる）などの単一作用に限られる場合には、標的ＲＮＡの存在量が特に重要である。ウイルスＲＮＡの存在量は、ウイルスの種類及び感染の段階によって著しく異なる。アンチセンス剤は、ウイルスＲＮＡ（ゲノム又はｍＲＮＡｓ）のコピー数が低い段階（一般的にこれは感染の初期段階に相当する）においてより有効であるという仮説が立てられる。
【００１１】
標的の極性は、例えば、これらのウイルスのプラス（ゲノム）鎖の数がマイナス鎖よりしばしば１００倍以上高いという高度に非対称性ＲＮＡ合成を有するポジティブセンス・リボウイルスの阻害に重要である。これは、マイナス鎖を好ましい標的とするものであると思われるが、これらのウイルスのマイナス鎖は、しばしば（おそらく常に）２本鎖ＲＮＡ中間体の形で存在し、膜性複製複合体中に隠されていることが知られている。したがって、提案される抗ウイルス剤がｄｓＲＮＡ複合体にも結合するかどうかを判断することが重要であると思われる（マイナス鎖の特異的分解がＲＮＡｉを用いた実験で報告された）。
【００１２】
感染細胞の内部のウイルス複製の部位は、ウイルスの種類に依存し、核（レトロウイルス、大部分のＤＮＡウイルス及びインフルエンザウイルス）又は細胞質（インフルエンザウイルス、ボルナウイルス及びヌクレオラブドウイルス及びＤＮＡゲノムポックスウイルスを除くすべてのリボウイルス）内で複製を行うことができる。細胞質内で複製するウイルスについては、種々のウイルス特異的構造（しばしば「ウイルスファクトリー」又は「ウイロプラスム」と呼ばれる）が認められる。理論的には、特定の部位（例えば、核、膜複合体及び「ウイルスファクトリー」）の使用は治療薬からのウイルスゲノムを保護することがあり得るが、それにもかかわらず、少なくともＲＮＡｉは核ＲＮＡ分子に対して活性であることが報告された。したがって、特に以下の考慮すべき事項すなわち、すべてのウイルスがそれらの遺伝子を発現するのに遊離のｍＲＮＡｓを用いており、したがって、（１つ又は複数の）ＲＮＡ分解剤により標的にすることができる分子を有すること、及びすべてのプラス鎖ＲＮＡウイルス（ゲノムを容易に標的化することができる唯一のウイルス）が細胞質内で複製することを考慮に入れるならば、ウイルス複製複合体の細胞内局在の重要性は、比較的小さい影響を有する可能性がある。
【００１３】
感染生物の体内のウイルスの複製の部位は、はるかに大きい影響を有する。再び、複製の部位は、ウイルスの種類に依存する。ウイルスの大部分が特定の組織特異性を有し、あるものは上皮細胞を感染させ、あるウイルスは肝細胞を感染させる等である。多くのウイルスは、種々の細胞型を感染させる。感染は、末梢組織（侵入の入口）から始まる可能性があるが、疾患は、他の（１つ又は複数の）細胞型（標的細胞）における複製によって引き起こされる。２つの細胞がかなり異なっている多くのウイルスが存在する（麻疹ウイルス等）が、これらの細胞が同じである多くの例も存在する（インフルエンザウイルス）。
【００１４】
生物の内部の異なる複製部位の帰結は、様々である。ウイルスが上皮組織（腸上皮細胞、気道）において複製する場合、薬物の送達の方法は比較的簡単であり得る。これは、ｓｉＲＮＡｓのような有効であるが、非常に不安定な化合物を用いてこれらの感染をｉｎ  ｖｉｖｏで治療することができることを意味する。ウイルスが上皮以外の組織において複製する場合、少なくともｓｉＲＮＡ技術用の特異的薬物送達システムが必要である。ＨＣＶ感染の場合、治療薬は、理論的には肝臓特異的ナノ粒子又はｓｉＲＮＡ前駆体（ｓｈＲＮＡ）を発現する肝臓特異的ウイルス粒子であってよい。過渡（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）モデルにおいて、ｓｈＲＮＡをエンコードするプラスミドＤＮＡを血流中に直接注射することによっても良好な結果が得られるが、そのような手法を治療に用いることは、送達の特異性が欠如しているため、限定的である可能性が高いと思われる。血液により送達されるのに十分に安定であり、安全で、非毒性である化合物（例えば、短いオリゴヌクレオチドは宿主ＤＮＡ内に組み込まれることはあり得ず、一般的に副作用を引き起こさない）は、これらのウイルスにおいてｓｉＲＮＡ技術と比べて利点を有する可能性がある。
【００１５】
ウイルスがニューロン組織のような特定の組織において複製する場合、他の種類の特異的な送達システムが必要である可能性がある。ウイルスの標的組織がＣＮＳである場合、抗ウイルス剤の大脳内送達のような血液脳関門を越える方法も必要である。
【００１６】
ヒト及び動物に感染するウイルスは、一般的にいくつかの感染戦略のうちの１つを用いる。「ヒット・アンド・ラン」戦略（急性感染）において、ウイルスは宿主に侵入し、急速且つ活発に複製し、宿主免疫反応により最終的に除去される。それに代わる唯一の帰結は、感染宿主の死である。感染時間は一般的に短く（数週間まで）、急性感染時のウイルス量は非常に高い。この戦略は、多くの「古典的」ウイルス（例として、インフルエンザウイルス）により用いられる。
【００１７】
「ヒット・アンド・ハイド」戦略（潜在感染）では、感染は、上のシナリオと同様に開始及び進行するが、完全に除去されずに、ウイルスは生涯にわたる潜在感染を確立する。潜伏中、ウイルスの遺伝子発現は最小限であり、感染性ウイルスは産生されない。しかし、特定の条件下では、ウイルスは再活性化し、新たな疾患を引き起こす（最初のものと類似又は異なっている）。これらの種類のウイルスは、非常に一般的であり、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）などである。多くの場合に、これらのウイルスは、免疫不全患者（ＡＩＤＳ患者など）における重篤又は致命的疾患を引き起こす傾向があるため、深刻な問題となる。
【００１８】
「慢性」又は「持続性」感染は、一般的に短い急性期から始まる。この期は、無症候性であり得、ウイルスの完全な除去で終わり得る。しかし、転帰は、ウイルス及び宿主に依存し、成人におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の９５％までがウイルスの除去で終わる。或いは、ウイルスは、慢性感染を確立する可能性がある（例えば、ＨＣＶ感染の７０％まで及びＨＩＶ感染のおそらく１００％）。慢性感染中、ウイルスの複製は活発なままであり（潜在感染と対照的に）、大量のリオンが産生される可能性がある（ＨＣＶは一般的に１日当たり最大１０１２個の粒子を形成する）。それにもかかわらず、免疫系は感染を除去することができない。５億人までの人がＨＢＶ又はＨＣＶに感染し、約４千万人の人がＨＩＶ−１に感染しているので、慢性ウイルスは、重大な医療上の問題となっている。
【００１９】
異なる種類の感染の除去の要件は、劇的に異なる可能性がある。急性疾患については、治療は、できる限り早期に行わなければならず、たぶんかなり短期であるべきである。この場合には、治療は、明確な目的を有し、ウイルス感染を減速し、免疫系にウイルスを除去する時間を与える（治療による完全なウイルスの阻害は可能でなく、多くの場合に必要でない可能性がある）。用いる薬剤の最小限の有効性はどのようなものであるべきかは明らかでなく、ある場合には複製のわずかな阻害がかなりの保護をもたらす可能性があり、他の場合にはほぼ完全な阻害が必要である可能性がある。
【００２０】
潜在ウイルスについては、重要な問題は、新たな感染が始まる可能性があるリザーバーである潜在感染細胞の除去である。現在のところ、ウイルスの潜伏のメカニズムは十分に理解されておらず、それが、現在の治療が潜在ウイルスを除去できない理由の１つである。理論的には、これらのウイルス及び潜在細胞は、ウイルス補因子（それらが知られている場合）又は必須のウイルス遺伝子産物に対する配列特異的ＲＮＡ分解剤の標的にすることができる。例えば、ＨＳＶの研究において、ウイルスエンコード小分子ＲＮＡは、潜在感染の原因となる主な因子である可能性があり、ウイルス複製の阻害の望ましい標的となり得ることが最近示された。
【００２１】
慢性ウイルスについては、治療は、感染の広がりの予防（例えば、ＨＣＶ患者への肝臓移植の場合）、すべて若しくは多くの細胞における感染を除去すること、又は少なくともウイルスの複製をある種の制御下に維持することを目標としてよい。一般的に、慢性感染の治療は、長い過程であり、現在のところ、ＨＩＶ患者については生涯にわたるものであり、ＨＢＶ及びＨＣＶ患者については何カ月間にもわたるものである。このような事実のため、治療の副作用は、抗ＨＩＶ、抗ＨＣＶ及び抗ＨＢＶ治療に伴う長期の影響に認められるように非常に重要である。
【００２２】
すべての種類の抗ウイルス薬の主な問題の１つは、薬物に対して抵抗性のウイルス突然変異体の出現である。この現象の背後にある一般的な分子的メカニズムは、標的配列の欠失及び標的配列の修飾（点突然変異、小欠失）などである。多くの場合、完全な遺伝子又はその機能が失われることがある（アシクロビルによる抗ＨＳＶ療法はしばしばウイルスＴＫ遺伝子の喪失につながる）。しかし、この耐性のメカニズムは、標的遺伝子がウイルスの生存に必須でない機能をエンコードする場合にのみ可能である。ＲＮＡのコンホメーション等の変化を促進する、失われた機能を補償するようにするための実際の標的外の配列の修飾は、一貫した抗ウイルス治療上の問題となる。他の問題は、多くの重要な病原体が遺伝的に極めて変わりやすいことである。ＨＩＶ−１のゲノム配列の既存の変異は、全ピコナウイルス科におけるものと同程度であり、ＨＣＶ遺伝子型間の相同は、６０％と低いことがあり得る。本質的に、これは、ＨＩＶ−１もＨＣＶも単一病原体でなく、それよりもむしろ、それらは、関連病原体の群に用いられる名称である（一般的に歴史的理由のため）ことを示すものである。この非常に大きい多様性は、これらのウイルスのいずれかに対する有効なワクチンの製造を著しく妨げてきた。さらに、ＨＣＶ、ＨＩＶ並びに他のリボウイルスは、それとして固定したゲノム配列を有さず、それよりも、それらは一種の共通配列を有し（個々のゲノムは一般的にそのために異なっている）、したがって、準種（ｑｕａｓｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）として存在する。１人の患者の中でさえもＨＣＶ  ＲＮＡｓの個々の配列はヌクレオチド位置の１〜３％が互いに異なることが示された。したがって、かなりの配列の変動があらゆる慢性的に感染した患者に既に存在している。
【００２３】
これらの配列の変異は、ウイルスの複製及び組換え事象時に起こる突然変異にしばしば起因する。ウイルス複製時の突然変異は、主として校正機能の欠如に起因して起こるものであって、逆転写酵素（ＨＩＶ−１）もＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＨＣＶ）もウイルス複製時に起こる誤りを訂正することができない（誤り率はサイクル当たり、ヌクレオチド当たり１０−４の変化と推定され、ＨＩＶ及びＨＣＶの場合には、それはゲノム当たり１つの変化を意味する）。これらのウイルスによって大量のゲノムが合成されることと合わせて考えると、ＨＩＶ及びＨＣＶは共に、極めて速やかに突然変異することができる（ＨＣＶはＨＩＶより約１００倍高い突然変異率を有すると報告されている）。本質的に、これは、これらのウイルスが短期間のあらゆる配列特異的治療薬の作用を克服することができることを意味する。抗ＨＩＶ療法は２０年近くにわたり用いられているので、この現象はＨＩＶについて集中的に研究された。結果は、長期の効果を得るために異なる標的特異性を有する阻害剤を併用すべきである（これは現行の強力な多剤併用抗レトロウイルス療法（Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｙ）：ＨＡＡＲＴの原理である）ことを示すものである。しかし、この戦略でさえも新たな薬剤耐性ＨＩＶ変異体の出現を妨げるものでない。
【００２４】
核酸（アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）に基づく療法に対するウイルスの耐性の現象は、ＲＮＡｉシステムについて最も多く研究されている。レトロウイルス（ＨＩＶ）及びリボウイルス（ＨＣＶ、ポリオウイルス）の両方がＲＮＡｉに対して感受性であるが、それらは、ｓｉＲＮＡ標的部位及び／又は周囲の配列に突然変異を導入することによって特異的ｓｉＲＮＡに対する耐性を速やかに発生する。耐性は常に特定の標的配列に関連しており、ＲＮＡｉ自体に対する非感受性に関連しないことも示された。ｓｉＲＮＡは標的との１００％の適合を有するはずである（小分子ＲＮＡは、いくつかの変化に耐えるが、はるかに有効性が低いサイレンサーである）ので、ｓｉＲＮＡｓに対する耐性の発生は明らかにかなり起こりやすい。さらに、遺伝子コードは重複性があるため、核酸配列は、エンコードされるタンパク質の配列に影響を与えずに変化し得る。ウイルスタンパク質もかなりの柔軟性を有する。すなわち、多くのアミノ酸の変化が許容される（これは、抗ＨＩＶ薬耐性に関するデータからも明らかである。変化は、ＲＮＡ配列に対してだけでなく、その二次構造にも影響を与え、それにより、ｓｉＲＮＡによるその認識を阻害し得る。
【００２５】
耐性ウイルスゲノムの出現をどのようにして避ける（又は最小限にする）かの２つの一般的アプローチが存在する。ＨＡＡＲＴ療法と同様に、いくつかのｓｉＲＮＡｓ（又はｓｉＲＮＡｓとリボザイムなどの他の阻害剤との組合せ）を用いてウイルス感染を治療することができる。そのような療法は、単一ｓｉＲＮＡによる治療より有効であり、耐性突然変異体の出現を有意に減少させることが示された。したがって、他の核酸に基づく治療薬に対しても、同様な戦略を強く推奨すべきである。
【００２６】
ｓｉＲＮＡｓは、高度に保存的な配列又は複数の重複機能を有する配列を標的にすることができる。そのような配列は、非常に重要な機能に影響を与えずに容易に変化させることはできない。そのような配列の例は、ＨＩＶ−１ゲノムにおけるプライマー結合領域又はＨＣＶゲノムにおけるＩＲＥＳ要素を含む５’ＵＴＲ領域である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】米国仮出願第６１／０５７，６８５号
【特許文献２】米国仮出願第６０／９８５，５４８号
【特許文献３】米国特許第４，８０６，４６３号
【特許文献４】米国特許第５，５９１，７２０号
【特許文献５】米国特許第５，９５２，４９０号
【特許文献６】国際公開ＷＯ９２０３０５１
【特許文献７】米国特許第５，２６４，４２３号
【特許文献８】米国特許第５，２７６，０１９号
【特許文献９】米国特許第６，３１６，１９０号
【特許文献１０】米国特許第５，２１８，１０３号
【特許文献１１】米国特許第５，６８４，１４８号
【特許文献１２】米国特許第５，４５２，４９６号
【特許文献１３】米国特許第５，２７８，３０２号
【特許文献１４】米国特許第５，６９５，９７９号
【特許文献１５】米国特許第５，７５０，６６６号
【特許文献１６】米国特許第５，６０２，２４４号
【特許文献１７】米国特許公開第２００７０２５９８３０号
【特許文献１８】ＷＯ２００７／１２５１７３
【特許文献１９】米国仮出願第６０／９８５，５５２号
【特許文献２０】米国特許第３，６８７，８０８号
【特許文献２１】米国特許第４，４６９，８６３号
【特許文献２２】米国特許第４，４７６，３０１号
【特許文献２３】米国特許第５，０２３，２４３号
【特許文献２４】米国特許第５，１７７，１９６号
【特許文献２５】米国特許第５，１８８，８９７号
【特許文献２６】米国特許第５，２６４，４２３号
【特許文献２７】米国特許第５，２８６，７１７号
【特許文献２８】米国特許第５，３２１，１３１号
【特許文献２９】米国特許第５，３９９，６７６号
【特許文献３０】米国特許第５，４０５，９３９号
【特許文献３１】米国特許第５，４５３，４９６号
【特許文献３２】米国特許第５，４５５，２３３号
【特許文献３３】米国特許第５，４６６，６７７号
【特許文献３４】米国特許第５，４７６，９２５号
【特許文献３５】米国特許第５，５１９，１２６号
【特許文献３６】米国特許第５，５３６，８２１号
【特許文献３７】米国特許第５，５４１，３０６号
【特許文献３８】米国特許第５，５５０，１１１号
【特許文献３９】米国特許第５，５６３，２５３号
【特許文献４０】米国特許第５，５７１，７９９号
【特許文献４１】米国特許第５，５８７，３６１号
【特許文献４２】米国特許第５，１９４，５９９号
【特許文献４３】米国特許第５，５６５，５５５号
【特許文献４４】米国特許第５，５２７，８９９号
【特許文献４５】米国特許第５，７２１，２１８号
【特許文献４６】米国特許第５，６７２，６９７号
【特許文献４７】米国特許第５，６２５，０５０号
【特許文献４８】米国特許第５，０３４，５０６号
【特許文献４９】米国特許第５，１６６，３１５号
【特許文献５０】米国特許第５，１８５，４４４号
【特許文献５１】米国特許第５，２１４，１３４号
【特許文献５２】米国特許第５，２１６，１４１号
【特許文献５３】米国特許第５，２３５，０３３号
【特許文献５４】米国特許第５，２６４，５６２号
【特許文献５５】米国特許第５，２６４，５６４号
【特許文献５６】米国特許第５，４０５，９３８号
【特許文献５７】米国特許第５，４３４，２５７号
【特許文献５８】米国特許第５，４７０，９６７号
【特許文献５９】米国特許第５，４８９，６７７号
【特許文献６０】米国特許第５，５４１，３０７号
【特許文献６１】米国特許第５，５６１，２２５号
【特許文献６２】米国特許第５，５９６，０８６号
【特許文献６３】米国特許第５，６０２，２４０号
【特許文献６４】米国特許第５，６１０，２８９号
【特許文献６５】米国特許第５，６０８，０４６号
【特許文献６６】米国特許第５，６１８，７０４号
【特許文献６７】米国特許第５，６２３，０７０号
【特許文献６８】米国特許第５，６６３，３１２号
【特許文献６９】米国特許第５，６３３，３６０号
【特許文献７０】米国特許第５，６７７，４３７号
【特許文献７１】米国特許第５，７９２，６０８号
【特許文献７２】米国特許第５，６４６，２６９号
【特許文献７３】米国特許第５，６７７，４３９号
【特許文献７４】米国特許第５，５３９，０８２号
【特許文献７５】米国特許第５，７１４，３３１号
【特許文献７６】米国特許第５，７１９，２６２号
【特許文献７７】米国特許第５，４８９，６７７号
【特許文献７８】米国特許第５，６０２，２４０号
【特許文献７９】米国特許第４，９８１，９５７号
【特許文献８０】米国特許第５，１１８，８００号
【特許文献８１】米国特許第５，３１９，０８０号
【特許文献８２】米国特許第５，３５９，０４４号
【特許文献８３】米国特許第５，３９３，８７８号
【特許文献８４】米国特許第５，４４６，１３７号
【特許文献８５】米国特許第５，４６６，７８６号
【特許文献８６】米国特許第５，５１４，７８５号
【特許文献８７】米国特許第５，５１９，１３４号
【特許文献８８】米国特許第５，５６７，８１１号
【特許文献８９】米国特許第５，５７６，４２７号
【特許文献９０】米国特許第５，５９１，７２２号
【特許文献９１】米国特許第５，５９７，９０９号
【特許文献９２】米国特許第５，６１０，３００号
【特許文献９３】米国特許第５，６２７，０５３号
【特許文献９４】米国特許第５，６３９，８７３号
【特許文献９５】米国特許第５，６４６，２６５号
【特許文献９６】米国特許第５，６５８，８７３号
【特許文献９７】米国特許第５，６７０，６３３号
【特許文献９８】米国特許第５，７９２，７４７号
【特許文献９９】米国特許第５，７００，９２０号
【特許文献１００】ＷＯ９８／３９３５２
【特許文献１０１】ＷＯ９９／１４２２６
【特許文献１０２】米国特許第４，８４５，２０５号
【特許文献１０３】米国特許第５，１３０，３０２号
【特許文献１０４】米国特許第５，１３４，０６６号
【特許文献１０５】米国特許第５，１７５，２７３号
【特許文献１０６】米国特許第５，３６７，０６６号
【特許文献１０７】米国特許第５，４３２，２７２号
【特許文献１０８】米国特許第５，４５７，１８７号
【特許文献１０９】米国特許第５，４５９，２５５号
【特許文献１１０】米国特許第５，４８４，９０８号
【特許文献１１１】米国特許第５，５０２，１７７号
【特許文献１１２】米国特許第５，５２５，７１１号
【特許文献１１３】米国特許第５，５５２，５４０号
【特許文献１１４】米国特許第５，５８７，４６９号
【特許文献１１５】米国特許第５，５９４，１２１号
【特許文献１１６】米国特許第５，５９６，０９１号
【特許文献１１７】米国特許第５，６１４，６１７号
【特許文献１１８】米国特許第５，６４５，９８５号
【特許文献１１９】米国特許第５，８３０，６５３号
【特許文献１２０】米国特許第５，７６３，５８８号
【特許文献１２１】米国特許第６，００５，０９６号
【特許文献１２２】米国特許第５，６８１，９４１号
【特許文献１２３】米国特許第５，７５０，６９２号
【特許文献１２４】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６
【特許文献１２５】米国特許第６，２８７，８６０号
【特許文献１２６】米国特許出願第０９／３３４，１３０号
【特許文献１２７】米国特許第４，８２８，９７９号
【特許文献１２８】米国特許第４，９４８，８８２号
【特許文献１２９】米国特許第５，２１８，１０５号
【特許文献１３０】米国特許第５，５２５，４６５号
【特許文献１３１】米国特許第５，５４１，３１３号
【特許文献１３２】米国特許第５，５４５，７３０号
【特許文献１３３】米国特許第５，５５２，５３８号
【特許文献１３４】米国特許第５，５７８，７１７号
【特許文献１３５】米国特許第５，５８０，７３１号
【特許文献１３６】米国特許第５，５９１，５８４号
【特許文献１３７】米国特許第５，１０９，１２４号
【特許文献１３８】米国特許第５，１１８，８０２号
【特許文献１３９】米国特許第５，１３８，０４５号
【特許文献１４０】米国特許第５，４１４，０７７号
【特許文献１４１】米国特許第５，４８６，６０３号
【特許文献１４２】米国特許第５，５１２，４３９号
【特許文献１４３】米国特許第５，５７８，７１８号
【特許文献１４４】米国特許第４，５８７，０４４号
【特許文献１４５】米国特許第４，６０５，７３５号
【特許文献１４６】米国特許第４，６６７，０２５号
【特許文献１４７】米国特許第４，７６２，７７９号
【特許文献１４８】米国特許第４，７８９，７３７号
【特許文献１４９】米国特許第４，８２４，９４１号
【特許文献１５０】米国特許第４，８３５，２６３号
【特許文献１５１】米国特許第４，８７６，３３５号
【特許文献１５２】米国特許第４，９０４，５８２号
【特許文献１５３】米国特許第４，９５８，０１３号
【特許文献１５４】米国特許第５，０８２，８３０号
【特許文献１５５】米国特許第５，１１２，９６３号
【特許文献１５６】米国特許第５，２１４，１３６号
【特許文献１５７】米国特許第５，２４５，０２２号
【特許文献１５８】米国特許第５，２５４，４６９号
【特許文献１５９】米国特許第５，２５８，５０６号
【特許文献１６０】米国特許第５，２６２，５３６号
【特許文献１６１】米国特許第５，２７２，２５０号
【特許文献１６２】米国特許第５，２９２，８７３号
【特許文献１６３】米国特許第５，３１７，０９８号
【特許文献１６４】米国特許第５，３７１，２４１号
【特許文献１６５】米国特許第５，３９１，７２３号
【特許文献１６６】米国特許第５，４１６，２０３号
【特許文献１６７】米国特許第５，４５１，４６３号
【特許文献１６８】米国特許第５，５１０，４７５号
【特許文献１６９】米国特許第５，５１２，６６７号
【特許文献１７０】米国特許第５，５６５，５５２号
【特許文献１７１】米国特許第５，５６７，８１０号
【特許文献１７２】米国特許第５，５７４，１４２号
【特許文献１７３】米国特許第５，５８５，４８１号
【特許文献１７４】米国特許第５，５８７，３７１号
【特許文献１７５】米国特許第５，５９５，７２６号
【特許文献１７６】米国特許第５，５９７，６９６号
【特許文献１７７】米国特許第５，５９９，９２３号
【特許文献１７８】米国特許第５，５９９，９２８号
【特許文献１７９】米国特許第５，６８８，９４１号
【特許文献１８０】米国特許第５，１０８，９２１号
【特許文献１８１】米国特許第５，３５４，８４４号
【特許文献１８２】米国特許第５，４１６，０１６号
【特許文献１８３】米国特許第５，４５９，１２７号
【特許文献１８４】米国特許第５，５２１，２９１号
【特許文献１８５】米国特許第５，５４３，１５８号
【特許文献１８６】米国特許第５，５４７，９３２号
【特許文献１８７】米国特許第５，５８３，０２０号
【特許文献１８８】米国特許第５，５９１，７２１号
【特許文献１８９】米国特許第４，４２６，３３０号
【特許文献１９０】米国特許第４，５３４，８９９号
【特許文献１９１】米国特許第５，０１３，５５６号
【特許文献１９２】米国特許第５，１０８，９２１号
【特許文献１９３】米国特許第５，２１３，８０４号
【特許文献１９４】米国特許第５，２２７，１７０号
【特許文献１９５】米国特許第５，２６４，２２１号
【特許文献１９６】米国特許第５，３５６，６３３号
【特許文献１９７】米国特許第５，３９５，６１９号
【特許文献１９８】米国特許第５，４１７，９７８号
【特許文献１９９】米国特許第５，４６２，８５４号
【特許文献２００】米国特許第５，４６９，８５４号
【特許文献２０１】米国特許第５，５１２，２９５号
【特許文献２０２】米国特許第５，５２７，５２８号
【特許文献２０３】米国特許第５，５３４，２５９号
【特許文献２０４】米国特許第５，５４３，１５２号
【特許文献２０５】米国特許第５，５５６，９４８号
【特許文献２０６】米国特許第５，５８０，５７５号
【特許文献２０７】米国特許第５，５９５，７５６号
【特許文献２０８】ＷＯ９３／２４５１０
【特許文献２０９】ＷＯ９４／２６７６４
【特許文献２１０】米国特許第５，７７０，７１３号
【特許文献２１１】米国特許出願第０９／３１５，２９８号
【特許文献２１２】米国出願第０９／１０８，６７３号
【特許文献２１３】米国出願第０９／３１５，２９８号
【特許文献２１４】米国出願第１０／０７１，８２２号
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Ｕｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９０、９０、５４３〜５８４頁
【非特許文献２】Ｃｒｏｏｋｅら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）
【非特許文献３】Ｍｅｓｍａｅｋａｒら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６〜３７４頁
【非特許文献４】Ｓｔｅｉｎ、「Ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｅｒｐｌｅｘｅｄ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１、１０８、６４１〜６４４頁
【非特許文献５】Ｚａｍｅｃｎｉｋら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３、４１４３頁〜
【非特許文献６】Ｑｉら（Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｓｈｉ  Ｙａｎ  Ｈｅ  Ｌｉｎ  Ｃｈｕａｎｇ  Ｂｉｎｇ  Ｄｕ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ（２０００）１４、２５３〜２５６頁）
【非特許文献７】Ｆｅｎｎｅｗａｌｄら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．（１９９５）２６、３７〜５４頁
【非特許文献８】Ｇａｏら（（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６４、１１５２１〜１１５２６頁）
【非特許文献９】Ｓｔｅｉｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１、１００４〜１０１２頁
【非特許文献１０】Ｌｅｂｅｄｅｖａら（２００１）Ａｎｎｕｌ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４１、４０３〜４１９頁
【非特許文献１１】Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３、２２７０〜２２７９頁
【非特許文献１２】Ｓｔｅｉｎ  ＣＡ、（２００１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８、６４１〜６４４頁
【非特許文献１３】Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ、（２０００）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３１３、３〜４５頁
【非特許文献１４】Ｍａｒｓｈａｌｌら、（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、６２６５〜６２６９頁
【非特許文献１５】Ｍａｒｓｈａｌｌら、（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９、１５６４〜１５７０頁
【非特許文献１６】Ｉｎｏｕｅら、（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６、１６５１６８頁
【非特許文献１７】Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ、２１５、３２７〜３３０頁
【非特許文献１８】Ｃｈｉａｎｇら、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、１８１６２〜１８１７１頁
【非特許文献１９】Ｍｏｎｉａら、１９９３、Ｊ．Ｎｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、１４５１４頁
【非特許文献２０】Ｙｕら（（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４、１６８５〜１６９２頁
【非特許文献２１】Ａｇｒａｗａｌ（（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４８９、５３〜６８頁）
【非特許文献２２】Ａｇｒａｗａｌ及びＫａｎｄｉｍａｌｌａ（（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ、６、７２〜８１頁）
【非特許文献２３】Ａｇｒａｗａｌ及びＫａｎｄｉｍａｌｌａ、２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ、１、１９７〜２０９頁
【非特許文献２４】Ｋｕｒｒｅｃｋ、２００３、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０、１６２８〜１６４４頁
【非特許文献２５】Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒら（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２９８、９３４〜９４０頁
【非特許文献２６】Ｂａｋｅｒら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１９９４〜２０００頁
【非特許文献２７】Ｋｕｗａｓａｋｉら（２００３）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５１、８１３〜８１９頁
【非特許文献２８】Ｍｏｕ及びＧｒａｙ（２００２）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３０、７４９〜７５８頁）
【非特許文献２９】Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．、８、２１０３〜２１０８頁）
【非特許文献３０】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｔｈｅ  Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ」、増刊１、第１６巻、編集者Ｄ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９７０、２０２〜２２９頁
【非特許文献３１】Ｋｈａｌｙｕｌｌｉｎら、「Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｐｕｒｉｎｅｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９２、２６、２７０〜２８４頁
【非特許文献３２】Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００頁
【非特許文献３３】Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４頁
【非特許文献３４】Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５９〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０
【非特許文献３５】Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３頁
【非特許文献３６】Ｓａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ及びＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３
【非特許文献３７】Ａｕｓｂｅｌら（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４）、６．０．３〜６．４．１０頁
【非特許文献３８】Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭａｎｕａｌＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＮｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）９．４７〜９．５１頁
【非特許文献３９】Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、２１５、４０３〜４１０頁
【非特許文献４０】Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９〜６５６頁
【非特許文献４１】Ｇｕｏら、Ｃｅｌｌ、１９９５、８１、６１１〜６２０頁
【非特許文献４２】Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２〜１５５０７頁
【非特許文献４３】Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６〜８１１頁
【非特許文献４４】Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４〜６９７頁
【非特許文献４５】Ｔａｍｍら、１：Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、８９、６７６〜８６頁、２００８
【非特許文献４６】Ｓａｗａｎｔら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．、１７、９４３〜９頁（２００６）
【非特許文献４７】Ｓａｐｒａら、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．、２、３６９〜８１頁（２００５）
【非特許文献４８】Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ＶＰ．、（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、３５、８１６〜８２０頁（２００７）
【非特許文献４９】Ｓａｗａｎｔら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１７９４３〜９頁（２００６）
【非特許文献５０】Ｂｒａｚｍａ及びＶｉｌｏ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、１７〜２４頁
【非特許文献５１】Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２〜１６頁
【非特許文献５２】Ｍａｄｄｅｎら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、２０００、５、４１５〜４２５頁
【非特許文献５３】Ｐｒａｓｈａｒ及びＷｅｉｓｓｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９９、３０３、２５８〜７２頁
【非特許文献５４】Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、１９７６〜８１頁
【非特許文献５５】Ｊｕｎｇｂｌｕｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、２０、２１００〜１０頁
【非特許文献５６】Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００、８０、１４３〜５７頁
【非特許文献５７】Ｆｕｃｈｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０００、２８６、９１〜９８頁
【非特許文献５８】Ｌａｒｓｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２０００、４１、２０３〜２０８頁
【非特許文献５９】Ｊｕｒｅｃｉｃ及びＢｅｌｍｏｎｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００、３、３１６〜２１頁
【非特許文献６０】Ｃａｒｕｌｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９８、３１、２８６〜９６頁
【非特許文献６１】Ｇｏｉｎｇ及びＧｕｓｔｅｒｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９９、３５、１８９５〜９０４頁
【非特許文献６２】Ｔｏ、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ、２０００、３、２３５〜４１頁
【非特許文献６３】Ｙｅｉｋｉｌｉｓら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２：６１４９−５５．（２００６）
【非特許文献６４】Ａｎｄｒｉａｎａｉｖｏら、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．６：８７７−８３（２００４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、相補的核酸に結合するオリゴヌクレオチドの能力を増加させ、抗ウイルス活性を示す修飾核酸塩基及び場合によってキレート化部分を含む、オリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。
【００３０】
１つの態様において、本発明は、少なくとも１つの核酸塩基がメルカプト修飾互変異性若しくはイオン性塩基（メルカプト核酸塩基）又はヒドロキシ修飾互変異性若しくはイオン性塩基（ヒドロキシ核酸塩基）である、５〜１５０個の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを被検体に投与することを含む、被検体におけるウイルスの複製を阻害する方法を提供する。
【００３１】
他の態様において、本発明は、標的核酸を、オリゴヌクレオチドの標的核酸とのハイブリッド形成を可能にする条件下で５〜１５０個の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む組成物と接触させることを含む、標的核酸の翻訳を阻害する方法であって、ハイブリッド形成オリゴヌクレオチドが標的核酸の翻訳を阻害し、標的核酸がウイルス複製に関連し、オリゴヌクレオチドがメルカプト修飾互変異性若しくはイオン性塩基（メルカプト核酸塩基）及びヒドロキシ修飾互変異性若しくはイオン性塩基（ヒドロキシ核酸塩基）からなる群から選択される少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、標的核酸の翻訳を阻害する方法を企図する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、標的核酸がウイルス複製に関連する、被検体における標的核酸のヌクレオチド配列を予測又は決定することと、少なくとも１つの核酸塩基がメルカプト修飾互変異性若しくはイオン性塩基（メルカプト核酸塩基）又はヒドロキシ修飾互変異性若しくはイオン性塩基（ヒドロキシ核酸塩基）である、５〜１５０個の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む組成物を被検体に投与することとを含み、被検体の生理的条件下で、前記化合物が、被検体におけるそれとハイブリッド形成し、ウイルス複製を阻害するのに十分に標的配列のヌクレオチド配列と相補的である、被検体若しくはウイルス性病原体におけるウイルスゲノムの複製を阻害する方法を提供する。
【００３３】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドが被検体への投与用に製剤化され、少なくとも１つの核酸塩基がメルカプト修飾互変異性若しくはイオン性塩基（メルカプト核酸塩基）又はヒドロキシ修飾互変異性若しくはイオン性塩基（ヒドロキシ核酸塩基）である、５〜１５０個の核酸塩基を含む、被検体におけるウイルス複製を阻害するためのオリゴヌクレオチドの使用を企図する。
【００３４】
関連する態様において、本発明は、標的核酸を、オリゴヌクレオチドの標的核酸とのハイブリッド形成を可能にする条件下でオリゴヌクレオチドを含む組成物と接触させ、ハイブリッド形成オリゴヌクレオチドが標的核酸の翻訳を阻害し、標的核酸がウイルス複製に関連し、オリゴヌクレオチドが、メルカプト修飾互変異性若しくはイオン性塩基（メルカプト核酸塩基）及びヒドロキシ修飾互変異性若しくはイオン性塩基（ヒドロキシ核酸塩基）からなる群から選択される少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、標的核酸の翻訳を阻害するための薬剤の製造におけるオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、標的核酸がウイルス複製に関連する、被検体又はウイルス病原体における標的核酸のヌクレオチド配列を予測又は決定することと、少なくとも１つの核酸塩基がメルカプト修飾互変異性若しくはイオン性塩基（メルカプト核酸塩基）又はヒドロキシ修飾互変異性若しくはイオン性塩基（ヒドロキシ核酸塩基）である、５〜１５０個の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む薬剤を被検体に投与することとを含み、被検体の生理的条件下で、前記化合物が、被検体におけるそれとハイブリッド形成し、ウイルス複製を阻害するのに十分に標的配列のヌクレオチド配列と相補的である、被検体におけるウイルスゲノムの複製を阻害する薬剤の製造におけるオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明の方法若しくは使用に有用なオリゴクレオチド又は化合物は、少なくとも１つのメルカプト核酸塩基を含む。関連実施形態において、メルカプト核酸塩基は、５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン及び８−メルカプトアデニンからなる群から選択される。関連実施形態において、本発明は、少なくとも１つのヒドロキシ核酸塩基を含む。さらなる実施形態において、ヒドロキシ核酸塩基は、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンからなる群から選択される。
【００３７】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、それに結合した有機ヌクレアーゼをさらに含む。１つの実施形態において、有機ヌクレアーゼは、ランタニド金属と錯体を形成したキレート化有機部分を含む。好ましい実施形態において、ランタニド金属は、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム及びルテチウムからなる群から選択される。
【００３８】
さらなる態様において、本明細書で述べるオリゴヌクレオチドは、様々なウイルス株の複製を阻害するのに有用である。１つの実施形態において、ウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。関連実施形態において、ウイルスは、ＤＮＡウイルスである。
【００３９】
さらなる実施形態において、ウイルスは、急速急性ウイルス（ｆａｓｔ  ａｃｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ）である。関連実施形態において、急速急性ウイルスは、アルファウイルスである。
【００４０】
他の実施形態において、ウイルスは、慢性ウイルスである。関連実施形態において、慢性ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスである。
【００４１】
他の実施形態において、ウイルスは、乳頭腫ウイルスである。関連実施形態において、乳頭腫ウイルスは、ウシ乳頭腫ウイルス１及びヒト乳頭腫ウイルスからなる群から選択される。
【００４２】
上記の企図される方法又は使用の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、転写又は調節因子をエンコードするウイルス遺伝子とハイブリッド形成し、ＤＡＮＡゲノムを有するウイルスの複製を阻害する。関連実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ウイルス複製因子とハイブリッド形成し、ＤＮＡゲノムを有するウイルスの複製を阻害する。
【００４３】
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その複製サイクルにおいて逆転写を用いるウイルスとハイブリッド形成する。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、転写又は調節因子をエンコードするウイルス遺伝子とハイブリッド形成して、逆転写を用いることにより複製するウイルスの複製を阻害する。好ましい実施形態において、逆転写を用いるウイルスは、レトロウイルスである。より好ましい実施形態において、レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１である。
【００４４】
関連実施形態において、オリゴヌクレチドは、ウイルス複製に関連する宿主因子とハイブリッド形成し、ウイルス複製を阻害する。さらなる実施形態において、オリゴヌクレチドは、非感染細胞を処理して、これらの細胞におけるウイルス遺伝子発現及び複製を低減させるのに有用である。
【００４５】
本発明の方法において有用なオリゴヌクレチドは、長さが５〜１５０核酸塩基、長さが１０〜１００核酸塩基、長さが１０〜５０核酸塩基、長さが１０〜３０核酸塩基、長さが２０〜３０核酸塩基、又は長さが２１〜２３核酸塩基であることが企図される。５〜１５０核酸塩基のすべての整数長と、５〜１５０核酸塩基の部分的な範囲も本発明の実施のために特に企図される。
【００４６】
修飾オリゴヌクレオチドにおける核酸塩基の１％〜１００％は修飾核酸塩基であることがさらに企図される。１つの実施形態において、核酸塩基の１０％〜９０％が修飾核酸塩基である。関連実施形態において、核酸塩基の２０％〜８０％が修飾核酸塩基である。さらなる実施形態において、核酸塩基の３０％〜７０％、４０％〜６０％又は５０％が修飾核酸塩基である。さらなる実施形態において、核酸塩基の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％が修飾核酸塩基である。
【００４７】
関連実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、３０個まで、４０個まで、５０個まで、１００個まで又はそれ以上の修飾核酸塩基を含み、修飾核酸塩基は、ヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基である。例えば、１５０塩基オリゴヌクレオチドの全体がすべて修飾オリゴヌクレオチドを含んでいてよいことが企図される。
【００４８】
本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ウイルスゲノムの非コーディング領域とハイブリッド形成するか、又はウイルスゲノムのコーディング領域とハイブリッド形成する。関連実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡウイルスのコーディング領域とハイブリッド形成する。
【００４９】
本発明の方法又は使用又は化合物は、１つの態様において、オリゴヌクレオチドが異なる標的配列とハイブリッド形成する、異なる配列を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを被検体に投与することも提供する。本発明は、オリゴヌクレオチドが異なる標的配列とハイブリッド形成する、被検体に投与するための薬剤の製造における異なる配列を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの使用をさらに提供する。１つの実施形態において、２つの異なるオリゴヌクレオチドを被検体に投与する。さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、同じウイルスゲノムにおける異なる標的配列に対して特異的である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、同じ機能単位における標的配列に対して特異的である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、異なる機能単位における標的配列に対して特異的である。
【００５０】
組成物は、本明細書で述べるような医薬担体又は賦形剤をさらに含むことがさらに企図される。
【００５１】
１つの実施形態において、被検体は哺乳動物である。関連実施形態において、被検体はヒトである。
【００５２】
１つの態様において、本発明の方法又は使用又は化合物において使用するための組成物をリポソームに入れて投与する。関連実施形態において、組成物は、ミセル又はナノ粒子などのナノ粒子薬剤中に投与することができる。
【００５３】
オリゴヌクレオチドの標的配列とのハイブリッド形成によって標的核酸の切断が誘発されると企図される。
【００５４】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸との少なくとも７０％の相同性を示す。関連実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸と７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同である。
【００５５】
前述のことに加えて、本発明は、上で具体的に述べた変形形態より多少とも範囲が狭い本発明のすべての実施形態を追加の態様として含む。例えば、本発明の態様を簡潔のために属又は値の範囲に言及することにより記述した場合があるが、属の各メンバー及び範囲内の各値若しくは部分的な範囲は、本発明の態様であるものとされることを理解すべきである。同様に、本発明の各種態様及び特徴を組合わせて、本発明の範囲内にあることが意図される追加の態様を作ることができる。
【００５６】
単数形（冠詞「ａ」又は「ａｎ」の使用を含む）で記述した本発明の態様は、文脈上より狭い解釈が明らかに必要でない限り、１つ又は複数を含む実施形態を含むと理解すべきである。「含む」という用語は、付加的な要素又は特徴が許容されることを意味する。
【００５７】
本出願人（１又は複数人）は本明細書に添付した特許請求の範囲の全範囲を発明したが、本明細書に添付した特許請求の範囲は、それらの範囲内に他者の従来技術の仕事を含まないものとする。特許請求の範囲の範囲内の法定の従来技術が特許局又は他の団体又は個人により本出願人に知らされる場合、本出願人（１又は複数人）は、そのような特許請求の範囲の範囲からそのような法定の従来技術又は法定の従来技術の明らかな変形形態を具体的に除外するためにそのような特許請求の範囲の内容を再定義するように適用特許法の下に補正権を行使する権利を有する。そのような補正された特許請求の範囲により定義された発明の変形形態も本発明の態様であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ｅ２ｍＲＮＡに対して標的化されたアンチセンス修飾オリゴヌクレオチドによって、ＢＰＶオリジン含有プラスミドのＥ２依存的な複製の抑制を示す図である。
【図２】組換えウイルスの複製に対する、修飾５−ＯＨ−ｄＣ塩基を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの効果を示す図である。組換えウイルスの複製の阻害は、ウイルスＬＦ−リポフェクタミンで処理された対照細胞のゲノムＲＮＡから発現されるＲｌｕｃ活性を測定することによってモニターされる。再現可能な実験のうちの１つの結果を図に示す。
【図３】修飾８−オキソ−ｄＧ塩基を有するオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果に対するヌクレアーゼ複合体の相加効果を示す図である。組換えウイルスの複製の阻害は、ウイルスのゲノムＲＮＡから発現されるＲｌｕｃ活性を測定することによってモニターされる。
【図４】ヌクレアーゼ（ＨＭＯ＿９Ｅと命名された化合物）の存在による、ＨＭＯ＿９についての有効用量５０（ＥＣ５０）の減少を実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、ヒト及び動物に対して病原性であるウイルスの複製及び／又は遺伝子発現の抑制のための、有機ヌクレアーゼ錯体に場合によって結合されていてよい、１つ又は複数の修飾塩基を含むオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００６０】
本発明は、ウイルス遺伝子発現及び／又は複製のアンチセンス阻害に用いる特性を有するキレート化部分及びオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。本発明の化合物は、（ａ）天然核酸塩基に対する高い結合効率を有する１つ又は複数の修飾核酸塩基、及び場合によって、（ｂ）１つのキレート化部分を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む。これらの化合物は、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡのホスホジエステル結合を加水分解することができ、アンチセンス療法に有用である。
【００６１】
ウイルス標的
異なる系統群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ）に属し、異なる複製戦略及び異なる標的組織を利用する重要なウイルス性病原体の例及びこれらのウイルスに対する抗ウイルス療法に伴う問題を以下で述べる。
【００６２】
ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされる。身体の免疫系細胞を殺し又は損傷させることにより、ＨＩＶは、感染及び特定の癌と戦う身体の能力を徐々に無効にする。ＨＩＶ／ＡＩＤＳを有する約４２００万人の人々が現在全世界に生存している。２００２年に合計３１０万人がＨＩＶ／ＡＩＤＳに関連する原因により死亡した。抗ＨＩＶ薬物療法の最終的な目標は、ウイルスが繁殖し、免疫系に障害をもたらすことを防止することである。過去１５年にわたるＨＩＶとの戦いに実質的な進歩があったが、依然として医学により治癒は達成されない。今日、医師は、疾患を管理するための３種の薬物クラスの多くの抗レトロウイルス薬を有する。一般的に、２つ又は３つのクラスの薬物がＨＡＡＲＴ（強力な多剤併用抗レトロウイルス療法）として知られている様々な組合せで処方されている。ＨＡＡＲＴ療法は、一般的に２つのヌクレオシド逆転写酵素阻害薬と第３の薬物であるプロテアーゼ阻害薬又は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害薬を含む。臨床試験でＨＡＡＲＴはウイルス負荷を低減させ、薬物耐性の可能性を最小限にする最も有効な手段であることが示された。
【００６３】
ウイルスが耐性を生じなかった他の作用機序により作用するＨＩＶに対して有効な他の抗ウイルス薬の開発が極めて必要である。ヨーロッパでＨＩＶを有すると新たに診断された１０例の患者のうちの１例が市販の既承認薬の少なくとも１つに対して既に耐性のＨＩＶの株に感染していることを示している最近のデータを考慮すると、これは特に重要になりつつある。
【００６４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、米国における最も一般的な慢性血液感染であり、感染患者数はおそらく４００万、全世界では１億５０００万を超えるものと思われる。この一般的なウイルス感染は、肝硬変及び肝臓癌の主な原因であり、現在、米国における肝臓移植の主な理由である。感染からの回復はまれであり、感染患者の約８５％がウイルスの慢性キャリヤーになり、１０〜２０％が肝硬変を発現する。現在のところ全世界で１億７０００万人が慢性キャリヤーであると推定される。米国疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）によれば、慢性Ｃ型肝炎は米国のみにおいて毎年８０００〜１００００例の死亡を引き起こし、約１０００例の肝臓移植につながっている。Ｃ型肝炎について利用可能なワクチンは存在しない。インターフェロン・アルファ又はインターフェロンとリバビリンとの併用による長期療法は、患者の約４０％においてのみ有効であり、重大な副作用を引き起こす。
【００６５】
この科には１００種を超えるヒト感染性ウイルス（ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＰＶｓ）が存在する。ＨＰＶは、良性皮膚いぼ又は乳頭腫を引き起こす。多くのＨＰＶｓは、性的接触により伝染する。性器ＨＰＶ感染は、非常に一般的であり、推定により女性の７５％までが成人期のある時点に１つ又は複数の性的に伝染するＨＰＶ型に感染することが示唆される。「高リスク」の性的に伝染するＨＰＶｓ（ＨＰＶ−１６、−１８及びいくつかの他のもの）の持続的感染は、子宮頚部の癌の発生につながり得る。したがって、ＨＰＶｓは医療上重要である（最大５００００例の癌／年）。２００６／２００７年に、最も流行してる４つのＨＰＶ種に対する有効なワクチンが利用可能になったが、多くのＨＰＶ株及び種はこれらのワクチンによって防がれない。
【００６６】
アルファウイルスは、主に急性感染を引き起こしているウイルスを代表する。この属の１０種以上が既知のヒト病原体である。それらはしばしばまん延するが、それらの医療上の重要性は中等度であるとみなされ、それとして、アルファウイルスに対するヒト用の有効なワクチンは存在しない。レユニオン島（Ｒｅｕｎｉｏｎ  Ｉｓｌａｎｄ）及びインドにおけるチクングニア・ウイルスの劇的な大発生は、この見解を根本的に変えた。レユニオン島のみにおけるチクングニア・ウイルスによってもたらされた全体的な経済的損害は１億ユーロ以上（２３５０００感染例、約２００死亡例）であると推定され、インドにおいてこのウイルスによってもたらされた損害は国家的な災害時の特殊医療体制の規模となっている（推定は６００万感染例程度と高い）。チクングニア・ウイルスは、依然として急速に広がりつつあり、２００７年後期には蚊媒介性大発生がヨーロッパ（イタリア）で最初に検出された。アルファウイルスによって引き起こされた大発生の予測不可能な性質を考慮に入れると、どのようなウイルスが発生し、次の大発生はどこで起こるのかを予測する方法は存在しないので、大規模なワクチン接種は実際的でないと思われる。その代わりとして、多くのアルファウイルスに対して理想的に有効な抗ウイルス療法がより有効であろう。
【００６７】
上に示したウイルスは、ヒト及び家畜に対する既知のウイルス性病原体の一部にすぎないが、すべての種類のウイルスゲノム型（ＤＮＡ、ＲＮＡ、レトロウイルス）、標的組織（上皮、免疫系、肝臓特異性及び広範囲の標的細胞を有するウイルス）及び複製部位（細胞質又は核）、感染の特異性と種類（急性、慢性又は潜在性）を本質的に網羅している。これらのウイルスはまた、細胞死を引き起こす（アルファウイルス、ＨＩＶ）、明らかな細胞損傷を引き起こさない（ＨＣＶ）、又は細胞形質転換を引き起こす（乳頭腫ウイルス）典型的なウイルスを代表している。したがって、これらの代表的なウイルスの研究により得られたデータは、ヒト及び動物に対するすべての既知の種類のウイルス性病原体に拡張することができる。
【００６８】
開発する新規抗ウイルス薬について、次の３つの特徴を組み込むことが極めて望ましいことは明らかである。すなわち、（１）改善された有効性、（２）副作用の低いリスク、及び（３）ウイルスが突然変異により克服することが困難である作用機序。
【００６９】
様々なアンチセンス・アプローチによる特定のウイルスを阻害する試みが行われた。
【００７０】
Ｚａｍｅｃｎｉｋらは、逆転写酵素プライマー部位及びスプライスドナー／アクセプター部位を特異的に標的としたオリゴヌクレオチド（ＯＮｓ）を用いた（Ｚａｍｅｃｎｉｋら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３、４１４３頁〜）（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  ＆  Ｚａｍｅｃｎｉｋ（１９８９）米国特許第４，８０６，４６３号）。
【００７１】
ＩＥ１、ＩＥ２又はＤＮＡポリメラーゼをコードするＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ｍＲＮＡｓを標的とするオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体がＡｎｄｅｒｓｏｎら（１９７７）（米国特許第５，５９１，７２０号）により報告された。
【００７２】
Ｈａｎｅｃａｋら（１９９９）（米国特許第５，９５２，４９０号）は、保存的Ｇカルテット配列及びＨＳＶ−１（単純疱疹ウイルス）などのウイルスの活性を著しく阻害するのに十分な数のフランキングヌクレオチドを有する修飾オリゴヌクレオチドを記載した。
【００７３】
Ｑｉら（Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｓｈｉ  Ｙａｎ  Ｈｅ  Ｌｉｎ  Ｃｈｕａｎｇ  Ｂｉｎｇ  Ｄｕ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ（２０００）１４、２５３〜２５６頁）は、コクサッキーウイルスＢ３におけるアンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド（ＰＳ−ＯＮｓ）の試験を報告した。
【００７４】
国際公開ＷＯ９２０３０５１（Ｒｏｉｚｍａｎ及びＭａｘｗｅｌｌ）は、ＨＳＶウイルスゲノムのバイタル領域に相補的であるメチルホスホネート・アンチセンス・オリゴマー又は抗ウイルス活性を示すそのｍＲＮＡ転写物を記載した。
【００７５】
グアノシン／チミジン又はグアノシンに富むホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチド（ＧＴ−ＰＳ−ＯＮｓ）は、抗ウイルス活性を有することが報告された。試験で「長さがすべて２６又は２７ｎｔの数種のＰＳ含有ＧＴに富むＯＮｓ（Ｂ１０６−１４０、Ｉ１００−１２及びＧ１０６−５７）は３６（Ｂ１０６−９６、Ｂ１０６−９７）又は４５ｎｔからなるＧＴに富むＯＮｓとＨＩＶ−２力価を低下させるのに同様に有効であった（表４）」ことを報告した（Ｆｅｎｎｅｗａｌｄら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．（１９９５）２６、３７〜５４頁）。
【００７６】
Ｃｏｈｅｎら（米国特許第５，２６４，４２３号及び同第５，２７６，０１９号）は、ＨＩＶの複製の阻害、及びより詳細には通常の生細胞の存在下での外来核酸の複製を予防するのに用いることができるＰＳ−ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）類似体を記載した。Ｃｏｈｅｎらは、ウイルス配列に特異的なアンチセンスＰＳ−ＯＤＮｓの抗ウイルス活性を述べている。彼らはまた、１４、１８、２１及び２８ｍｅｒのポリＡ、ポリＴ及びポリＣ  ＰＳ−ＯＤＮ配列の試験を記載し、それらのＰＳ−ＯＤＮｓの抗ウイルス作用を示している。
【００７７】
Ｇａｏら（（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６４、１１５２１〜１１５２６頁）は、７、１５、２１及び２８ヌクレオチドのサイズのポリＡ、ポリＴ及びポリＣ  ＰＳ−ＯＤＮ配列の試験によりＰＳ−ＯＤＮｓによるＨＳＶ−２の複製の阻害を記載している。
【００７８】
Ｓｔｅｉｎ及びＣｈｅｎｇ（Ｓｔｅｉｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１、１００４〜１０１２頁）は、２８ヌクレオチドの非特異的ＯＤＮｓの抗ウイルス活性を考察し、「ＰＳオリゴの抗ＨＩＶ特性は非配列特異的作用により有意に影響される、すなわち、阻害作用は塩基配列に依存しない」と述べている。
【００７９】
レビュー論文において、Ｌｅｂｅｄｅｖａ及びＳｔｅｉｎ（Ｌｅｂｅｄｅｖａら（２００１）Ａｎｎｕｌ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４１、４０３〜４１９頁）は、ＰＳ−ＯＤＮｓの、ウイルスタンパク質を含む、様々な非特異的タンパク質結合活性を報告している。彼らは、「これらの分子は高度に生物学的に活性であり、アンチセンスに関するアーチファクトを見落とすことはしばしば比較的容易である」と述べている。
【００８０】
Ｒｅｉｎら（米国特許第６，３１６，１９０号）は、融合パートナーに結合したＧＴに富むＯＮデコイ及び抗ウイルス化合物として用いることができるＨＩＶヌクレオキャプシドへの結合を報告した。同様に、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３、２２７０〜２２７９頁）は、ＨＩＶのヌクレオキャプシドに特異的に結合するＴＧＴＧＴモチーフを有するＰＯ−ＯＤＮを報告したが、抗ウイルス活性への言及はない。
【００８１】
抗癌剤、抗ウイルス剤として、又は他の疾患を治療するために開発されたアンチセンスＯＤＮｓは、一般的に長さが約２０ヌクレオチドである。レビュー論文（Ｓｔｅｉｎ  ＣＡ、（２００１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８、６４１〜６４４頁）において、「アンチセンス・オリゴヌクレオチドの長さを最適化しなければならない。アンチセンス・オリゴヌクレオチドが長すぎたり、短すぎる場合、特異性の要素が失われる。現在のところ、アンチセンス・オリゴヌクレオチオドの最適長は約１６〜２０ヌクレオチオドであると思われる」ことが確認されている。同様に、他のレビュー論文（Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ、（２０００）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３１３、３〜４５頁）において、「ＲＮＡ及びＲＮＡ二重らせんの形成と比較して、ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドは、ユニット当たり約２．２℃低いＴｍを有する。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効であるために、ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドは一般的に長さが１７〜２０ｍｅｒでなければならない・・・ことを意味する」と述べられている。
【００８２】
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ及び共同研究者ら（Ｍａｒｓｈａｌｌら、（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、６２６５〜６２６９頁）は、１２ｍｅｒのポリシチジン−ＰＳ２−ＯＤＮ及び１４ｍｅｒのＰＳ２−ＯＤＮについてホスホロジチオエートＯＤＮｓ（ＰＳ２−ＯＤＮｓ）の抗ＨＩＶ活性を報告した。他のサイズは抗ＨＩＶ活性について試験しなかった。彼らはまた、１２、１４、２０及び２８ｍｅｒポリシチジン−ＰＳ２−ＯＤＮｓのＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）の阻害を報告した。後に、このグループ（Ｍａｒｓｈａｌｌら、（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９、１５６４〜１５７０頁）は、ＨＩＶ  ＲＴの配列特異的阻害を示す結果を報告した。同じグループは、数件の特許でＰＳ２−ＯＤＮｓに関するデータを公表した。米国特許第５，２１８，１０３号及び同第５，６８４，１４８号においては、ＰＳ２−ＯＤＮの構造及び合成が記載されている。米国特許第５，４５２，４９６号、同第５，２７８，３０２号及び同第５，６９５，９７９号においては、ＨＩＶ  ＲＴの阻害が１５塩基より長くないＰＳ２−ＯＤＮｓについて記載されている。米国特許第５，７５０，６６６号及び同第５，６０２，２４４号においては、ＰＳ２−ＯＤＮｓのアンチセンス活性が記載されている。すべての刊行物は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれている。
【００８３】
例えば、下で引用する参考文献に記載されているように、リボースの２’位において修飾されたオリゴヌクレオチド及びアンチセンス戦略におけるそれらの使用が評価された。
【００８４】
Ｉｎｏｕｅ及び共同研究者ら（Ｉｎｏｕｅら、（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６、１６５１６８頁）は、オリゴ（２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）の合成及び特性を記載している。同じグループ（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ、２１５、３２７〜３３０頁）は、オリゴヌクレオチドがすべての２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む場合、ＲＮＡｓｅ  Ｈ媒介性ｍＲＮＡ切断は起らないことを報告した。混合オリゴヌクレオチド、すなわち、非修飾及び２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドについて、Ｉｎｏｕｅは、ＲＮＡと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドにより形成された核酸複合体の配列特異的ＲＮＡｓｅ  Ｈ加水分解を報告している。
【００８５】
標的ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性切断を支持しない完全に２’−Ｏ−メチル化及びホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドを用いて、活性アンチセンス・オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ  Ｈ依存性メカニズムによりＩＣＡＭ−１発現を阻害したかどうかを判断した（Ｃｈｉａｎｇら、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、１８１６２〜１８１７１頁）。彼らは、これらのアンチセンス・オリゴヌクレオチドは治療薬として有用である可能性があると述べた。
【００８６】
２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ペンチル及び２’−フルオロを含む２’−糖修飾を有するオリゴヌクレオチドをアンチセンス活性について分析した。均一に２’−修飾されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性の評価により、これらの化合物は遺伝子発現を阻害することについて完全に効果がなかったことが明らかになった。化合物が少なくとも５つの２’−デオキシリボヌクレオチド残基の伸長を含んでいた場合、活性は復活した。この最小のデオキシリボヌクレオチド長は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効なＲＮａｓｅ  Ｈ活性化に必要な最小長と完全に相関していた（Ｍｏｎｉａら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、１４５１４頁）。
【００８７】
Ｙｕら（（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４、１６８５〜１６９２頁）は、２’−Ｏ−メチル修飾糖の部分を含むホスホロチオエート、ホスホジエステル又は混合主鎖を有するハイブリッド・アンチセンス・オリゴヌクレオチドはｐ２４  ＥＬＩＳＡ定量により測定される特異的抗ＨＩＶ活性を有することを報告した。
【００８８】
レビュー論文でＡｇｒａｗａｌ（（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４８９、５３〜６８頁）は、最適な活性のために、アンチセンス・オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対する高い安定性又は標的ＲＮＡに対する高い親和性のみの代わりに、様々な特性の組合せを有するべきであることを示唆している。そのような特性としては、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性化などがある。後のレビューにおいて、Ａｇｒａｗａｌ及びＫａｎｄｉｍａｌｌａ（（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ、６、７２〜８１頁）は、２’−Ｏ−メチル修飾を含む混合主鎖オリゴヌクレオチドがＲＮＡｓｅ  Ｈ活性化を含むそれらの改善された特性のために第二世代のアンチセンス・オリゴヌクレオチドのえりすぐりのものになったと述べている。アンチセンス・オリゴは、標的ＲＮＡへの結合に際してＲＮＡｓｅ  Ｈを活性化する能力のような特定の重要な特性を有するべきである（Ａｇｒａｗａｌ及びＫａｎｄｉｍａｌｌａ、２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ、１、１９７〜２０９頁）。ほとんどのアンチセンス・アプローチにおいて、アンチセンス効力を増加させるためにＲＮＡｓｅ  ＨによるＲＮＡ切断を標的にすることが望ましい（Ｋｕｒｒｅｃｋ、２００３、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０、１６２８〜１６４４頁）。
【００８９】
多くの試験でアンチセンス・オリゴヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メトキシエチル修飾の使用を述べている。例は、Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒら（（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２９８、９３４〜９４０頁）に記載されているギャップ２’修飾オリゴヌクレオチド・アンチセンスを用いた試験である。他の例は、ＲＮａｓｅ  Ｈ独立２’−Ｏ−メトキシエチル・アンチセンスを用いた翻訳開始複合体の形成の阻害を示している（Ｂａｋｅｒら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１９９４〜２０００頁）。
【００９０】
Ｋｕｗａｓａｋｉら（２００３）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５１、８１３〜８１９頁は、ヌクレオシド上に２’−Ｏ−メチル基及びヌクレオチド間結合上に硫黄基を含む、高度にヌクレアーゼ抵抗性の二量体ヘアピングアノシン四重らせんのデザイン、及び培養細胞におけるその抗ＨＩＶ−１活性を記載している。
【００９１】
Ｍｏｕ及びＧｒａｙ（２００２）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３０、７４９〜７５８頁）は、一般的なホスホロチオエート−ＤＮＡオリゴマーと比較して、２’−Ｏ−メチル修飾の追加により非特異的タンパク質結合特性が減少することを示している。３６ｍｅｒオリゴヌクレオチドのｇ５ｐのタンパク質結合親和性は、ｄＡ３６＜ｒＡ３６＜２’−Ｏ−ＭｅＡ３６＜Ｓ−ｒＡ３６＜＜Ｓ−２’−Ｏ−Ｍｅ−Ａ３６＜Ｓ−ｄＡ３６（ここでｄ＝デオキシ、ｒ＝リボ、２’−Ｏ−Ｍｅ＝２’−Ｏ−メチル、Ｓ＝ホスホロチオエート）の順序で増加した。この順序は、これらのオリゴマー修飾へのヒト血清アルブミン、ガンマグロブリン及びフィブリノーゲンなどの血漿タンパク質の非特異的結合についてＫａｎｄｉｍａｌｌａら（（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．、８、２１０３〜２１０８頁）に報告されたＳ−ＲＮＡ＜＜Ｓ−２’−Ｏ−ＭｅＲＮＡ＜Ｓ−ＤＮＡの順序と一致していた。
【００９２】
標的核酸に特異的に結合し、切断するようにデザインされた、小干渉性ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）、それらの前駆体及び類似体並びにリボザイムを含む、オリゴヌクレオチドと類似しているが、異なる作用機序を有する、物質の使用に関するさらなる知識が当技術分野に存在する。
【００９３】
本発明に用いられることが企図される標的ウイルスは、急性感染を引き起こすプラス鎖ＲＮＡウイルス（セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ＳＦＶ、アルファウイルス属、トガウイルス科など）、慢性感染を引き起こすプラス鎖ＲＮＡウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ、ヘパシウイルス属、フラビウイルス科など）、急性感染並びに長期持続性慢性疾患（ヒト免疫不全ウイルス１型、ＨＩＶ−１、レンチウイルス属、レトロウイルス科など）を引き起こすレトロウイルス並びにＤＮＡゲノムを有するウイルス（ウシ乳頭腫ウイルス１型、ＢＰＶ−１、パピローマウイルス科など）を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
本開示は、これらのウイルスを感染させた、それらのゲノムをトランスフェクトした、又はそれらの遺伝子発現単位を含む、細胞培養物への修飾オリゴヌクレオチドの単回投与により、それらの遺伝子発現及び（ＲＮＡウイルス及び乳頭腫ウイルスの場合）複製の特異的抑制がもたらされることを示している。これらの効果は、オリゴヌクレオチド阻害剤の量に比例し、化合物における修飾塩基の存在により増大し、有機ヌクレアーゼ錯体の存在によりさらに増大する。
【００９５】
本開示はまた、修飾塩基をヒドロキシ核酸塩基からメルカプト核酸塩基に変更する場合、抗ウイルス効果が増大し、阻害剤の有効濃度が低くなることを示している。
【００９６】
オリゴヌクレオチド
本発明に関連して、「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー若しくはポリマー又はその擬似体、キメラ、類似体及び相同体を意味する。この用語は、天然核酸塩基、糖及び共有結合性ヌクレオシド内（主鎖）結合並びに例えば、標的核酸とハイブリッド形成又は相補的オリゴヌクレオチドと相互作用するとき、天然オリゴヌクレオチドと同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、高い細胞取り込み、標的核酸に対する高い親和性及びヌクレアーゼの存在下での高い安定性のような望ましい特性があるため、天然形よりしばしば好ましい。
【００９７】
本発明の化合物の生物学的対応物（例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）に対する結合の有効性は、両性イオン性又はイオン性互変異性体を有する修飾核酸塩基又は他の類似体の組み込みにより達成される。本発明の化合物は、両性イオン又はイオン性互変異性体を有する修飾核酸塩基又は他の類似体を有する、少なくとも１つの核酸塩基を有する。好ましい実施形態において、修飾核酸塩基は、５−ヒドロキシシトシン及び８−ヒドロキシグアニンから選択されるヒドロキシ核酸塩基又は５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン及び８−メルカプトアデニンから選択されるメルカプト核酸塩基である。米国特許公開第２００７０２５９８３０号及びＷＯ２００７／１２５１７３に示されているように、ヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基と標的核酸の核酸塩基とのより安定な水素結合が起こり得る。したがって、それらは、相補的核酸鎖に対してより有効に結合するとみなすことができる。
【００９８】
修飾核酸塩基における酸性互変異性基は、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ等などの他の酸性基であってよい。
【００９９】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５−ヒドロキシウラシル陰イオンの１つ又は複数の互変異性形を含む。他の実施形態において、本発明の化合物は、ヒドロキシ塩基５−ヒドロキシシトシンを含む。他の実施形態において、ヒドロキシ塩基は、８−ヒドロキシアデニン及びその陰イオンの互変異性形である。本発明の他の実施形態は、８−ヒドロキシグアニン及びその陰イオンの互変異性形により修飾された本発明の化合物を提供する。これらの核酸塩基の互変異性形は、ＷＯ２００７／１２５１７３にさらに詳細に記載されている。
【０１００】
本明細書で企図されるさらなる修飾核酸塩基としては、メルカプト修飾核酸塩基などがある。メルカプト修飾ピリミジン及びプリンの合成は、当技術分野で知られている（例えば、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｔｈｅ  Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ」、増刊１、第１６巻、編集者Ｄ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９７０、２０２〜２２９頁及びＫｈａｌｙｕｌｌｉｎら、「Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｐｕｒｉｎｅｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９２、２６、２７０〜２８４頁を参照）。企図されたメルカプト核酸塩基としては、５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン及び８−メルカプトアデニンなどがある。
【０１０１】
修飾核酸塩基は、全体として参照により本明細書に組み込まれている、共同所有及び同時係属出願番号＿（整理番号２８１１３／４３４３５Ａ）及び米国仮出願第６０／９８５，５５２号においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸のハイブリッド形成及びｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングも企図されている。
【０１０２】
本明細書で用いているように、ヒドロキシ核酸塩基のそれぞれは、対向核酸塩基に安定に水素結合しているとき、核酸塩基と相補的とみなされる。したがって、場合によって、５−ヒドロキシウラシルはアデニンと相補的であり、５−ヒドロキシシトシンはグアニンと相補的であり、８−ヒドロキシアデニンはウラシル及び／又はチミンと相補的であり、８−ヒドロキシグアニンはシトシンと相補的である。ヒドロキシ核酸塩基と標的核酸の核酸塩基との他の安定な水素結合は起こり得る。したがって、ヒドロキシ核酸塩基は、安定な水素結合が起こる標的核酸の核酸塩基と相補的とみなされる。
【０１０３】
本発明の所定の化合物におけるヒドロキシ核酸塩基及び／又はメルカプト核酸塩基の数は、化合物のオリゴヌクレオチド部分の核酸塩基の総数の少なくとも１％から１００％までである。本発明の化合物に複数のヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基が存在する場合、ヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基は、同じ又は異なって（異なる塩基及び／又は修飾の種類のいずれかの組合せ）いてよい。本明細書で述べるオリゴヌクレオチドにおける核酸塩基の１０％〜９０％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％又は５０％が修飾核酸塩基であると予測される。核酸塩基の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％が修飾核酸塩基であると企図される。
【０１０４】
本発明による化合物は、好ましくは約５〜約１５０核酸塩基（すなわち、約５〜約１５０個の結合ヌクレオシド）を含む。当業者は、本発明が長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、及び１５０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【０１０５】
１つの好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが１０〜１００核酸塩基である。当業者は、これが長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【０１０６】
他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが１０〜５０核酸塩基である。当業者は、これが長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【０１０７】
他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが２０〜３０核酸塩基である。当業者は、これが長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【０１０８】
特に好ましい化合物は、約１０〜約５０核酸塩基のオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは約２０〜約３０核酸塩基を含むものであり、抗ウイルス薬として実例試験で用いた化合物は、２１又は２３核酸塩基から構成されていた。
【０１０９】
上述のように、オリゴヌクレオチドは、１００％修飾核酸塩基を含んでいてよい。したがって、オリゴヌクレオチドの長さによって、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、又は１５０修飾核酸塩基を含んでいてよく、修飾塩基は、メルカプト核酸塩基又はヒドロキシ核酸塩基である。
【０１１０】
本発明の化合物は、キレート化部分を場合によってさらに含む。キレート化部分は、金属リガンドとして機能する。それらは、金属イオンを安定的にキレート化する。特定の金属−リガンド錯体は、ホスホジエステル結合を切断するのに有効であることが示された。キレート化部分をアンチセンス活性を示す能力のあるオリゴヌクレオチドに組み込んだ状態では、標的核酸の１つ又は複数のホスホジエステル結合を分解又は切断する能力がそれにあるため、標的核酸を阻害するオリゴヌクレオチドの効力は増加する。したがって、本発明の化合物は、金属イオンをキレート化することができるキレート化部分をさらに含む。金属イオンは、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム及びルテチウムからなる群から選択される。１つの態様において、好ましいイオンは、ユウロピウム又はランタンのイオンである。金属のイオンは、＋１、＋２、＋３、＋４又は＋５などの安定なイオンであってよい。好ましいイオンは、Ｌａ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｈｏ（ＩＩＩ）及びＣｅ（ＩＶ）である。
【０１１１】
企図されるキレート化部分としては、下記のような式により表されるものが挙げられる。
【化１】
0005710977.tif 000002
【０１１２】
ここでＲは、オリゴヌクレオチドの残部である。
【０１１３】
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜８アルカン、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アシルＣ１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール及びＣ１〜８アルキルヘテロアリールから選択される。
【０１１４】
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール、Ｃ１〜８アルキルヘテロアリール及びアシルＣ１〜８アルカンから独立に選択される。また、
【０１１５】
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜８アルカン、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アシルＣ１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール及びＣ１〜８アルキルヘテロアリールからなる群から独立に選択される。
【０１１６】
「アルキル」という用語は、示される炭素原子数を含む直鎖及び分枝炭化水素基、一般的にメチル、エチル並びに直鎖及び分枝プロピル及びブチル基を含む。炭化水素基は、１６個までの炭素原子を含んでいてよい。「アルキル」という用語は、「架橋アルキル」、例えば、Ｃ６〜Ｃ１６二環式又は多環式炭化水素基、例えば、ノルボルニル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル及びデカヒドロナフチルを含む。「アルキル」という用語はまた、例えば、１つ又は複数のハロゲン原子、１つ又は複数のヒドロキシル基、或いは１つ又は複数のチオール基で場合によって置換されているアルキル基を含む。「シクロアルキル」という用語は、環状Ｃ３〜Ｃ８炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル及びシクロペンチルと定義される。「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも１つのヘテロ原子が環状構造に存在することを除いて、シクロアルキルと同様に定義される。適切なヘテロ原子は、Ｎ、Ｓ及びＯなどである。
【０１１７】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、それぞれ炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合を含むことを除いて、「アルキル」と同様に定義される。「シクロアルケニル」は、炭素−炭素二重結合が環に存在することを除いて、シクロアルキルと同様に定義される。
【０１１８】
「アルキレン」という用語は、置換基を有するアルキル基を意味する。例えば、「Ｃ１〜３アルキレンアリール」という用語は、１〜３個の炭素原子を含み、アリール基で置換されたアルキル基を意味する。
【０１１９】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、本明細書においてフッ素、臭素、塩素及びヨウ素を含むと定義する。
【０１２０】
単独又は組み合わされた「アリール」という用語は、本明細書において単環式又は多環式芳香族基、好ましくは単環式又は二環式芳香族基、例えば、フェニル又はナフチルと定義する。特に示さない限り、「アリール」基は、非置換であるか、又は、例えば、１つ又は複数の、また特に１つから３つのハロ、アルキル、ヒドロキシ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル及びアルキルスルホニルで置換されていてよい。具体例としてのアリール基としては、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２−メチルフェニル、４−メトキシフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−ニトロフェニルなどがある。「アリールＣ１〜３アルキル」及び「ヘテロアリールＣ１〜３アルキル」という用語は、Ｃ１〜３アルキル置換基を有するアリール又はヘテロアリール基と定義される。
【０１２１】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書において１つ又は２つの芳香環を含み、芳香環に少なくとも１つの窒素、酸素又は硫黄原子を含み、非置換であるか、又は、例えば、ハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル及びアルキルスルホニルのような１つ又は複数の、また特に１つから３つの置換基で置換され得る、単環式又は二環式環系と定義する。ヘテロアリール基の例としては、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、イソキノニル、インドリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、イミジゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル及びチアジアゾリルなどがある。
【０１２２】
「Ｈｅｔ」という用語は、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含む単環式、二環式及び三環式基と定義される。「Ｈｅｔ」基は、環に結合したオキソ基（＝Ｏ）も含み得る。Ｈｅｔ基の非限定的な例としては、１，３−ジオキソラニル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、モルホリニル、チオホリニル、ピペリジニル、１，４−ジチアニル及び１，４−ジオキサンなどがある。
【０１２３】
「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨと定義される。
【０１２４】
「アルコキシ」という用語は、Ｒがアルキルである、−ＯＲと定義される。
【０１２５】
「アルコキシアルキル」という用語は、水素がアルコキシ基により置換された、アルキル基と定義される。「（アルキルチオ）アルキル」という用語は、酸素原子でなく硫黄原子が存在することを除いて、アルコキシアルキルと同様に定義される。
【０１２６】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、アルキル基に付加したヒドロキシ基と定義される。
【０１２７】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ２と定義され、「アルキルアミノ」という用語は、少なくとも１つのＲがアルキルであり、第２のＲがアルキル又は水素である、−ＮＲ２と定義される。
【０１２８】
「アシルアミノ」という用語は、Ｒがアルキル又はアリールである、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎ−と定義される。
【０１２９】
「アルキルチオ」という用語は、Ｒがアルキルである、−ＳＲと定義される。
【０１３０】
「アルキルスルフィニル」という用語は、Ｒがアルキルである、ＲＳＯ２−と定義される。
【０１３１】
「アルキルスルホニル」という用語は、Ｒがアルキルである、ＲＳＯ３−と定義される。
【０１３２】
「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２と定義される。
【０１３３】
「トリフルオロメチル」という用語は、−ＣＦ３と定義される。
【０１３４】
「トリフルオロメトキシ」という用語は、−ＯＣＦ３と定義される。
【０１３５】
「シアノ」という用語は、−ＣＮと定義される。
【０１３６】
金属イオンと錯体を形成したキレート化部分を含む本発明の化合物の計算ヌクレアーゼ有効性は、天然ヌクレアーゼと比較して、修飾核酸塩基の数の性質によって最大１０３〜１０９倍増加し、有効濃度の対応する低下と同時に化合物の高い特異性を維持することを可能にする。
【０１３７】
本発明の化合物の他の修飾も企図される。オリゴヌクレオチドは本発明の化合物の好ましい形であるが、本発明は、オリゴヌクレオチド類似体及び擬似体を含むが、これらに限定されない他のファミリーの化合物を含む。
【０１３８】
本発明の組成物及び方法における使用が企図されるさらなるアンチセンス化合物は、修飾主鎖（例えば、リン原子を含む又は含まない）又は非天然ヌクレオシド間結合、オリゴヌクレオシド、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、或いは１つ又は複数の短鎖へテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間結合により形成された主鎖を有する、リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド主鎖（例えば、モルホリノ結合；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のもの）を含むオリゴヌクレオチド、逆極性を有するオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合（すなわち主鎖）が場合によって新規な基で置換されているオリゴヌクレオチド擬似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’位に次の１つを含むが、それらに限定されない１つ又は複数の置換糖部分を有するオリゴヌクレオチド：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る）、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖部分を形成しているロックト核酸（ＬＮＡｓ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含むが、これらに限定されない合成及び天然核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリミド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧクランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐｓ）などである。修飾核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドン、キレート化部分、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基を含む（これらに限定されないが）、第一級若しくは第二級ヒドロキシル基に化学的に結合したオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。上述の修飾は、ＷＯ２００７／１２５１７３にさらに記載されている。
【０１３９】
一般的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、ヒルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素などがある。本発明の状況において、薬力学的特性を向上させる基は、取り込みを改善する、分解に対する抵抗性を増大させ、且つ／又は標的核酸との配列特異的ハイブリッド形成を強くする基などである。
【０１４０】
修飾ヌクレオシド間結合（主鎖）
企図される、本発明で有用なアンチセンス化合物の特定の例は、修飾主鎖又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドなどである。本明細書で定義したように、修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドとしては、主鎖にリン原子を保持するもの及び主鎖にリン原子を有さないものなどがある。本明細書の目的のために、また当技術分野で時として言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドとみなすことができる。
【０１４１】
企図される、リン原子をその中に含有する修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル並びに３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、並びに１つ又は複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’又は２’−２’結合である、逆極性を有するものなどがある。企図される、逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合における単一３’−３’結合、すなわち無塩基（核酸塩基が欠失しているか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）であってよい単一逆ヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩及び遊離酸形も含まれる。
【０１４２】
上のリンを含む結合の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号及び同第５，６２５，０５０号を含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
企図される、リン原子をその中に含有しない修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、或いは１つ若しくは複数の短鎖へテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成された）を有するもの、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、リボアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネート及びスルホンアミド主鎖、アミド主鎖並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有するその他のものを含む。
【０１４４】
上のオリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号及び同第５，６７７，４３９号を含むがこれらに限定されない。
【０１４５】
修飾糖及びヌクレオシド間結合擬似体
他の予測されるオリゴヌクレオチド擬似体において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合（すなわち、主鎖）の両方が新規な基で置換されている。核酸塩基単位は、適切な標的核酸とのハイブリッド形成が維持される。そのような化合物において、優れたハイブリッド形成特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド擬似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖を含むアミドで置換されている。核酸塩基は、保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号及び同第５，７１９，２６２号を含むがこれらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示はＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００頁に見出すことができる。
【０１４６】
本発明の特定の実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシド、並びに特に上に記載した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ主鎖として知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（天然ホスホジエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−と表される）、並びに上に記載した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖である。上に記載した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。
【０１４７】
修飾糖
修飾オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の置換糖部分も含んでいてよい。企図されるオリゴヌクレオチドは、２’位に次の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってよい）。特に好ましいものはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ｎ及びｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に次の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル若しくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、並びに同様な特性を有する他の置換基。企図される修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４頁）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。企図される、さらなる修飾は、下文の実施例で述べる２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び下文の実施例でも述べる２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥ）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１４８】
他の企図される修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置であってよい。好ましい２’アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様な修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位においても行うことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬似体も有していてよい。そのような修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号及び同第５，７００，９２０号を含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
糖のさらなる好ましい修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖部分を形成しているロックト核酸（ＬＮＡｓ）を含む。連結は、好ましくは２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ｎは１又は２である。ＬＮＡｓ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
【０１５０】
天然及び修飾核酸塩基
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当技術分野でしばしば単に「塩基」と呼ばれている）の修飾又は置換を含んでいてもよい。本明細書で用いているように、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノ−アデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧクランプなどである。修飾核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンを含んでいてもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５９〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３頁に開示されているもの、並びにＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ及びＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３に開示されているものなどである。
【０１５１】
上記の修飾核酸塩基並びに他の修飾核酸塩基の特定のものの調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第３，６８７，８０８号並びに同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号及び同第５，６８１，９４１号を含むが、これらに限定されず、米国特許第５，７５０，６９２号も参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５２】
結合体
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させる１つ又は複数の部分又は結合体をオリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。これらの部分又は結合体は、第一級又は第二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した結合体基などであり得る。本発明の結合体基は、キレート化部分、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基などである。
【０１５３】
一般的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素などがある。本発明の状況における薬力学的特性を向上させる基は、取り込みを改善する、分解に対する抵抗性を増大させ、且つ／又は標的核酸との配列特異的ハイブリッド形成を強くする基などである。本発明の状況における薬物動態特性を向上させる基は、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝又は排泄を改善する基などである。代表的な結合体基は、全開示が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６及び米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。
【０１５４】
結合体部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール若しくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗菌薬又は抗生物質と結合させることもできる。オリゴヌクレオチド−薬物結合体及びそれらの調製は、全体として参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第０９／３３４，１３０号に記載されている。
【０１５５】
そのようなオリゴヌクレオチド結合体の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号及び同第５，６８８，９４１号を含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
アンチセンス阻害
本発明の化合物の標的核酸とのハイブリッド形成は、一般的に「アンチセンス」と呼ばれる。そのようなハイブリッド形成は、標的核酸の翻訳の阻害をもたらし得るものであり、本明細書では「アンチセンス阻害」と呼ぶ。そのようなアンチセンス阻害は、一般的に、少なくとも１本の鎖若しくはセグメントが開裂し、分解し、又は別の仕方で機能しなくするような、オリゴヌクレオチド鎖若しくはセグメントの水素結合に基づくハイブリッド形成に基づいている。この点に関して、そのようなアンチセンス阻害のために特定の核酸分子及びそれらの機能を標的にすることが現在のところ好ましい。
【０１５７】
阻害すべきＤＮＡの機能は、複製及び転写などである。複製及び転写は、例えば、内因性細胞鋳型、ベクター、プラスミド構成体又は他のものによるものであってよい。妨害すべきＲＮＡの機能は、タンパク質の翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡ合成の部位から遠い細胞内の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ又は複数のＲＮＡ種を生成するためのＲＮＡのスプライシング、及び関与する可能性があるＲＮＡに関係する又はＲＮＡにより促進される触媒活性又は複合体形成などの機能を含み得る。本発明の状況において、「調節」及び「発現の調節」は、遺伝子をエンコードする核酸分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの量又はレベルの増加（刺激）又は減少（阻害）を意味する。阻害は、発現の調節のしばしば好ましい形であり、ｍＲＮＡがしばしば好ましい標的核酸である。
【０１５８】
本発明の状況において、「ハイブリッド形成」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対合を意味する。本発明において、対合の好ましいメカニズムは、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソン・クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であってよい水素結合に関係する。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成により対になる相補的核酸塩基である。ハイブリッド形成は、様々な状況下で起こり得る。
【０１５９】
標的核酸への化合物の結合が標的核酸の正常な機能を妨害して活性の喪失をもたらし、特異的結合が望ましい条件下、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ又は治療的処置の場合の生理的条件下、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にアッセイを実施する条件下で非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な相補性の程度が存在する場合に、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリッド形成できる。
【０１６０】
本発明において、「緊縮ハイブリッド形成条件」又は「緊縮条件」という語句は、本発明の化合物がその標的配列とハイブリッド形成するが、最小限の数の他の配列とハイブリッド形成する条件を意味する。緊縮条件は、配列依存的であり、異なる状況で異なり、本発明の状況において、オリゴマー化合物が標的配列とハイブリッド形成する「緊縮条件」は、オリゴマー化合物の性質及び組成並びにそれらが検討されるアッセイによって決定される。１つの具体例としての条件の組は次の通りである。５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、２０ｍＭＮａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８中４２℃でのハイブリッド形成；及び１ＸＳＳＣで５５℃で３０分間洗浄。同等のハイブリッド形成条件を計算するための式及び／又は所望のレベルの緊縮性を達成するための他の条件の選択は、よく知られている。同等の緊縮性の条件は、Ａｕｓｂｅｌら（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４）、６．０．３〜６．４．１０頁に記載されているように温度及び緩衝液又は塩濃度の変形形態により達成することができることは当技術分野で理解されている。ハイブリッド形成条件の修正は、プローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対合の長さ及びパーセントに基づいて経験的に決定又は精密に計算することができる。ハイブリッド形成条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、９．４７〜９．５１頁に記載されているように計算することができる。
【０１６１】
「相補的」は、本明細書で用いているように、オリゴマー化合物の２つの核酸塩基間の正確な対合の能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）の特定の位置における核酸塩基が標的核酸の特定の位置における核酸塩基と水素結合することができ、前記標的核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子である場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的位置であるとみなされる。各分子における十分な数の相補的位置が互いに水素結合することができる核酸塩基によって占有されている場合、オリゴヌクレオチドとさらなるＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子は互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリッド形成可能」及び「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に安定且つ特異的な結合が起こるような十分な数の核酸塩基にわたる十分な程度の正確な対合又は相補性を示すのに用いる用語である。
【０１６２】
特異的にハイブリッド形成するためにアンチセンス化合物の配列がその標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが当技術分野で理解されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在又は隣接セグメントがハイブリッド形成事象に関与しないように１つ又は複数のセグメントにわたってハイブリッド形成していてよい（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分が標的核酸内の標的領域との少なくとも７０％の配列相補性を含むことが好ましく、より好ましくはそれらが、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域との少なくとも８５％又は９０％の配列相補性を含み、また少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相補性を含み得る。例えば、化合物の２０個の核酸塩基のうちの１８個が標的領域と相補的であり、したがって特異的にハイブリッド形成する本発明の化合物は、９０％の相補性を示すこととなる。この例において、残りの非相補的核酸塩基は、密集しているか、又は相補的核酸塩基の間に散在していてよく、互いに又は相補的核酸塩基に隣接している必要はない。したがって、標的核酸との完全な相補性の２つの領域が両側に隣接している４個の非相補的核酸塩基を有する長さが１８個の核酸塩基である化合物は、標的核酸との７７．８％の総相補性を有し、したがって、本発明の範囲内に入ることとなる。標的核酸の領域を含む化合物の相補性のパーセントは、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本局所アライメント検索ツール（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、２１５、４０３〜４１０頁；Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９〜６５６頁）を用いてルーチンに求めることができる。ヒドロキシ核酸塩基及び／又は合成類似体（他の合成核酸塩基など）を有する本発明の化合物については、相補性は、標的核酸の個々の核酸塩基に対する合成類似体の特異性によって評価することができる。
【０１６３】
アンチセンス化合物の好ましい形は１本鎖アンチセンス・オリゴヌクレオチドであるが、多くの種において２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子のような２本鎖構造の導入は、遺伝子又はその関連遺伝子産物の機能の強く、特異的なアンチセンス媒介性の低減を引き起こすことが示された。この現象は、植物及び動物の両方において起こり、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシングとの進化上の関連性を有すると考えられている。
【０１６４】
ｄｓＲＮＡが動物における遺伝子サイレンシングをもたらし得るという最初の証拠は、１９９５年に線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおける研究から出現した（Ｇｕｏら、Ｃｅｌｌ、１９９５、８１、６１１〜６２０頁）。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙらは、ｄｓＲＮＡの主要な干渉効果は転写後であることを示した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２〜１５５０７頁）。２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への曝露に起因するＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおいて定義された転写後アンチセンスメカニズムは、それ以来ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれている。この用語は、内因性標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的低下につながるｄｓＲＮＡの導入に伴うアンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングを意味するように一般化された（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６〜８１１頁）。最近、それは、実際には、ＲＮＡｉの強力なインデューサーであるｄｓＲＮＡｓのアンチセンス極性の１本鎖ＲＮＡオリゴマーであることが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４〜６９７頁）。
本発明の化合物の使用
本明細書で述べる化合物は、ＤＮＡゲノム、ＲＮＡゲノムを有するウイルス及び逆転写を用いるウイルスを含む、ウイルスのような病原体の遺伝子発現及び増殖を制限するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで用いる。したがって、化合物は、疾患状態になりやすい、又は疾患状態にある生物に投与することができる。生物に投与するとき、化合物は、様々な病原体による感染を処置するために用いることができる。本明細書で用いているように、「処置する」は、被検体の健康状態、病状及び疾患に対して所望の結果をもたらすのに十分な用量／量での必要とする被検体への、又は診断目的のための本発明のオリゴヌクレオチドの投与を意味する。所望の結果は、投与の受容者における主観的又は客観的改善を含んでいてよい。「処置（治療）」は、予防処置又は治療処置又は診断処置を意味する。診断又は処置の「対象」は、哺乳類又は霊長類を含む、ヒト又は非ヒト動物である。「治療上有効な量」は、健康に対する意図される有益な効果をもたらす有効な組成物の量を意味する。
【０１６５】
化合物は、特定のＢ細胞、ヘルパー細胞、サプレッサー細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの特定のＴ細胞などの免疫系細胞の機能を調節するために用いることができる。本発明の化合物を用いる免疫機能の調節は、ウイルス性病原体により引き起こされる慢性疾患のような様々な疾患の治療に有用であり得る。
【０１６６】
化合物のオリゴヌクレオチドのその標的配列に対する結合に関係するメカニズムのいずれかによりタンパク質の転写及び／又は発現を妨げることができる化合物を選択することができる。これらのメカニズムは、プロセシングの妨害、核膜を通しての輸送の阻害、エンドヌクレアーゼによる開裂、レプリカーゼ複合体の形成などを含むが、これらに限定されない。
【０１６７】
本明細書で述べる化合物は、感染性疾患の治療に用いることができる。標的核酸配列は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ等の病原性ウイルスの遺伝子、並びにこれらのウイルスに対する、或いは疾患発現及び／又は進行に関与する宿主因子をエンコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０１６８】
癌の治療において、標的核酸配列は、腫瘍遺伝子又は腫瘍形成特性を有するウイルスに関連するＤＮＡ若しくはＲＮＡ、腫瘍サプレッサー遺伝子、及び関連遺伝子であってよい。さらに、本発明の化合物は、薬物耐性に関連する遺伝子及びそれらの遺伝子産物を標的とすることもできる。
【０１６９】
標的を定める過程は、所望の効果、例えば、発現の調節が生じるように、アンチセンス相互作用が起こる標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント又は部位の決定も通常含む。本発明の状況において、「領域」は、少なくとも１つの識別できる構造、機能又は特性を有する標的核酸の部分を意味する。標的核酸の領域内にセグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さい部分又は小部分を意味する。「部位」は、本発明で用いているように、標的核酸内の位置を意味する。
【０１７０】
本明細書で述べる組成物は、同じウイルスゲノム内の２つの異なる領域又はセグメントとハイブリッド形成するために併用することがさらに企図される。標的を選択するために、考慮事項は、ウイルス増殖に重要であるウイルスゲノムの領域における標的の局在化などである（標的は必須の領域でなければならない）。可能な場合、好ましい標的は、ウイルスの異なる株及び遺伝子型間に保存されている領域にあるべきである（しばしばこれは配列の機能の意義も示している）。タンパク質の高度に保存されたドメインをエンコードする領域は良好な標的であり、重複機能要素（シス活性要素と重複したコーディング配列）を含む領域も良好な標的である。
【０１７１】
標的部位は、望ましいヌクレオチド含量及び／又は修飾核酸塩基の組成を有するオリゴヌクレオチド阻害剤の構築を可能にするヌクレオチド組成を有するべきであり、好ましくは標的は強い二次構造要素を含まないことがさらに企図される。さらに、標的の配列は、必須の宿主遺伝子、特に宿主ｍＲＮＡｓの配列と重複すべきでない。さらに、修飾核酸塩基の位置は、宿主配列と一致すべきでない。Ｃ又はＧヌクレオチドのクラスター（３つ又はそれ以上）は、避けるべきである。実験でコーディング領域内の標的部位は非コーディング領域におけるものよりよいこと、またＲＮＡウイルスの場合、プラス鎖はマイナス鎖よりよい標的であることが示された。核酸の破壊（例えば、ＲＮＡｓｅ又はＤＮＡｓｅ複合体による）の特有のメカニズムのため、翻訳開始配列を修飾オリゴヌクレオチドの標的にすることは必要でない。これは、ＲＮＡ分解を開始することができず、翻訳の開始コドンを含む領域を標的とする場合に最も（又はもっぱら）有効である、モルホリノ・オリゴヌクレオチドの場合と対照的である。そのような制約は、ここで述べる修飾オリゴヌクレオチドについては存在しない。
【０１７２】
２つ又はそれ以上の部位を標的とするために、各部位は、上で述べた基準のいくつかを満たさなければならない。標的の配列は、オリゴヌクレオチドの集合を避けるために異なっており、互いに相補的でないものであるべきであり、標的は、１つ及び同じ機能単位、例えば、同じ酵素と、又は異なる単位と異なる配列を示すことができる。ほとんどの場合、耐性突然変異体の発生の可能性を最小限にするために、第２の選択肢が好ましい。本明細書で用いているように、「機能単位」という用語は、ウイルスの複製又は遺伝子発現の機能を有するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、例えば、各種複製因子、転写因子等を意味する。同じ機能単位に結合するオリゴヌクレオチドは、例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質内の同じポリペプチド又はポリヌクレオチド機能単位における異なる標的配列に結合する。異なる機能単位に結合する本発明により企図されるオリゴヌクレオチドは、ウイルス複製又は遺伝子発現の異なる機能を有するポリペプチド又はポリヌクレオチド、例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔ及びＲｅｖ遺伝子又はタンパク質に結合する。当業者は、ウイルス複製又は遺伝子発現に関連する機能単位の意味を容易に理解することができる。
【０１７３】
翻訳開始コドンは、一般的に５’ＡＵＧ（転写ｍＲＮＡ分子における；対応するＤＮＡ分子における５’ＡＴＧ）であり、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれている。少数の遺伝子がＲＮＡ配列５’ＧＵＧ、５’ＵＵＧ又は５’ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’ＡＵＡ、５’ＡＣＧ及び５’ＣＵＧは、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能することが示された。したがって、「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」という用語は、各場合におけるイニシエーターアミノ酸は一般的にメチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物において）であるが、多くのコドン配列を含むことができる。真核生物及び原核生物遺伝子は、いずれか１つが、特定の細胞型若しくは組織において、又は特定の条件の組のもとで翻訳開始に優先的に用いられる可能性がある、２つ又はそれ以上の代替開始コドンを有する可能性があることも当技術分野で知られている。本発明の状況において、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列（単数又は複数）にかかわらず、インターロイキン１８をエンコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためにｉｎ  ｖｉｖｏで用いられるコドン又は（複数の）コドンを意味する。遺伝子の翻訳終止コドン（又は「停止コドン」は、３つの配列、すなわち、５’ＵＡＡ、５’ＵＡＧ及び５’ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５’ＴＡＡ、５’ＴＡＧ及び５’ＴＧＡである）の１つを有する可能性があることも当技術分野で知られている。
【０１７４】
「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’又は３’）の約２５〜約５０の連続したヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。同様に、「停止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’又は３’）の約２５〜約５０の連続したヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。したがって、「開始コドン領域」（又は「翻訳開始コドン領域」）及び「停止コドン領域」（又は「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物が効果的に標的にすることができるすべての領域である。
【０１７５】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが当技術分野で知られている読み取り枠（ＯＲＦ）又は「コーディング領域」は、効果的に標的にすることができる領域でもある。本発明の状況において、好ましい領域は、遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）の翻訳開始又は終止コドンを含む遺伝子内領域である。
【０１７６】
他の標的領域は、当技術分野で翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分を意味することが知られ、したがってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、及び当技術分野で翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分を意味することが知られ、したがってｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’端との間のヌクレオチド（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結されたＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体並びにキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むとみなされる。５’キャップ領域を標的とすることもまた好ましい。
【０１７７】
一部の真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは、それが翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られている１つ又は複数の領域を含む。残りの（またしたがって翻訳される）領域は、「エキソン」として知られており、一緒にスプライスされて、連続ｍＲＮＡ配列を形成する。標的スプライス部位、すなわち、イントロン−エキソン連結部又はエキソン−イントロン連結部も、異常なスプライシングが疾患に関連づけられる、或いは特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関連づけられる状況においては特に有用であり得る。再配列又は欠失に起因する異常な融合連結も好ましい標的部位である。異なる遺伝子源からの２つ（又はそれ以上）のｍＲＮＡｓのスプライシングの過程を経て産生されるｍＲＮＡ転写物は、「融合転写物」として知られている。イントロンは、例えば、ＤＮＡ又は前ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物を用いて効果的に標的にすることができることも知られている。
【０１７８】
代替のＲＮＡ転写物は、ＤＮＡの同じゲノム領域から産生させることができる。これらの代替転写物は、一般的に「変異体」として知られている。より具体的には、「前ｍＲＮＡ変異体」は、同じゲノムＤＮＡから産生される他の転写物とそれらの開始又は停止位置が異なる同じゲノムＤＮＡから産生され、イントロン及びエキソン配列を含む転写物である。
【０１７９】
スプライシング時の１つ又は複数のエキソン又はイントロン領域或いはその一部の切除により、前ｍＲＮＡ変異体はより小さい「ｍＲＮＡ変異体」を生ずる。したがって、ｍＲＮＡ変異体は、処理された前ｍＲＮＡ変異体であり、各特有の前ｍＲＮＡ変異体は、スプライシングの結果として特有のｍＲＮＡ変異体を常に生じなければならない。これらのｍＲＮＡ変異体は、「選択的スプライス変異体」としても知られている。前ｍＲＮＡ変異体のスプライシングが起らない場合、前ｍＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同じである。
【０１８０】
変異体は、転写を開始又は停止するための選択的シグナルを用いることによって産生させることができ、前ｍＲＮＡｓ及びｍＲＮＡｓは、複数の開始コドン又は停止コドンを有することができる。選択的開始コドンを使用する前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡが起源である変異体は、当該前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られている。選択的停止コドンを使用する転写物は、当該前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「選択的停止変異体」として知られている。選択的停止変異体の１つの特定のタイプは、複数の転写物が転写装置による「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替選択により産生され、それにより、特有のポリＡ部位で終結する転写物を産生する、「ポリＡ変異体」である。本発明の状況において、本明細書で述べる変異体のタイプも好ましい標的核酸である。
【０１８１】
さらに、ＤＮＡゲノムウイルス並びにＲＮＡゲノムを有するウイルスの大多数が新たなゲノム鎖の合成の開始のために用いられるそれらのゲノムのフラグメントを含む。それらのセグメントは、複製起点と呼ばれており、構造、数（ゲノム当たりのコピー）によって、また作用様式によって変化し得る。ＲＮＡウイルスについては、複製起点は、一般的にＲＮＡ分子の両末端の配列を含む。複製起点の配列は、複製の開始に関与し、多くの場合に、複製過程を行う（後者の場合にそれらは「レプリカーゼ複合体の成分」又は「ウイルス・レプリカーゼ」と呼ばれている）、起点認識因子と呼ばれているウイルス・エンコードタンパク質によって一般的に認識される。ウイルス・レプリカーゼは、ウイルス・エンコードタンパク質により（ＨＳＶの場合と同様に）、宿主及びウイルスサブユニットからほぼ完全になっているか、又は主として宿主細胞にエンコードされ得る。
【０１８２】
ウイルス配列のいくつかのセグメントは、ウイルス、宿主又はウイルス及び宿主エンコード因子により認識される。そのようなセグメントは、複製起点、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、パッケージング配列等であり、それらは、一般的に「シス作用要素」と呼ばれている。これらのシグナルと相互作用する、ウイルス、宿主又はウイルス−宿主タンパク質複合体は、「トランス作用因子」と呼ばれている。シス作用配列は、それらの機能に必要な特定の一次及び／又は二次構造を有していてよく、これらの要素は、ウイルスゲノムの種々の位置（コーディング配列に含まれる）に配置することができる。シス作用要素は、互いに、並びに対応するトランス作用因子をエンコードするコーディング配列と重複してよい。
【０１８３】
多くのＤＮＡ及びほぼすべてのＲＮＡウイルスは、それらのゲノムの１本の鎖（「プラス鎖」と定義される）においてのみ読み枠を含む。１本鎖ゲノムを有するＲＮＡウイルスの場合において、ゲノムは、コーディングｍＲＮＡ配列（プラス鎖ＲＮＡウイルス）により、又はヌクレオキャプシドタンパク質中にパッケージされた当鎖に相補的なＲＮＡ（マイナス鎖ＲＮＡウイルス）により表すことができる。細胞内での複製時に、これらのウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスではマイナスＲＮＡ及びマイナス鎖ＲＮＡウイルスではプラスＲＮＡである「アンチゲノム」と定義される反対の極性を有するＲＮＡを合成する。この鎖は、ゲノムＲＮＡを含む（プラス鎖ウイルス）又は含まない（マイナス鎖ＲＮＡウイルス）二重らせんを形成することができる。プラス及びマイナス鎖間の二重らせんは、「複製形」又は「複製中間体」と定義され、プラス鎖ＲＮＡウイルスにより感染された細胞内では、それはレプリカーゼタンパク質及び細胞膜に結合している。
【０１８４】
好ましいアンチセンス化合物がハイブリッド形成する標的核酸上の位置は、下文で「好ましい標的セグメント」と呼ばれる。本明細書で用いるように、「好ましい標的セグメント」という用語は、活性アンチセンス化合物が標的とする標的領域の少なくとも５個の核酸塩基部分と定義される。理論により束縛されることは望まないが、現在のところ、これらの標的セグメントは、ハイブリッド形成のためにアクセスできる標的核酸の一部であると考えられている。
【０１８５】
特定の好ましい標的セグメントの特定の配列を本明細書に示すが、当業者は、これらが本発明の範囲内の個々の実施形態を説明し、述べるのに役立つと認識するであろう。さらなる好ましい標的セグメントは、当業者により同定される可能性がある。
【０１８６】
例示的な好ましい標的セグメントの中から選択される少なくとも５個の連続する核酸塩基の伸長を含む長さが５〜１５０核酸塩基の標的セグメントは、標的とするにも適切であると考えられる。
【０１８７】
標的セグメントは、例示的な好ましい標的セグメントの１つの５’末端からの少なくとも５個の連続する核酸塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含んでいてよい（残りの核酸塩基は、標的セグメントの５’末端のすぐ上流から始まり、ＤＮＡ又はＲＮＡが約５個〜約１５０個の核酸塩基を含むまで続く同じＤＮＡ又はＲＮＡの連続する伸長である）。同様に好ましい標的セグメントは、例示的な好ましい標的セグメントの１つの３’末端からの少なくとも５個の連続する核酸塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列により表される（残りの核酸塩基は、標的セグメントの３’末端のすぐ上流から始まり、ＤＮＡ又はＲＮＡが約５個〜約１５０個の核酸塩基を含むまで続く同じＤＮＡ又はＲＮＡの連続する伸長である）。本明細書で説明した好ましい標的セグメントの知識を有する当業者は、過度の実験なしに、さらなる好ましい標的セグメントを同定することができるであろう。
【０１８８】
１つ又は複数の標的領域、セグメント又は部位が同定されたならば、所望の効果を示すのに十分に標的と相補的であり、すなわち、十分によく、且つ十分な特異性でハイブリッド形成し、標的領域、セグメント又は部位の配列における核酸塩基と相補的である少なくとも１つのヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基を組み込み、本明細書で述べたようなキレート化部分をさらに組み込んだ、アンチセンス化合物を合成する。次いで、アンチセンス化合物をイオンと接触させて、化合物とイオンとの錯体形成を行わせる。この得られた化合物は、アンチセンス療法メカニズムに用いることができる。
【０１８９】
修飾オリゴヌクレオチドの抗ウイルス作用の評価のためのアッセイ
アルファウイルスは、急性感染を引き起こすＲＮＡウイルスの例である。蚊、鳥及び各種動物はすべて、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に感染し得る。ＳＦＶのゲノムは、長さが約１１．５ｋｂのプラス鎖ＲＮＡである。これは、２つの大きい読み取り枠（ＯＲＦｓ）（１つは５’領域にあり、もう１つは３’領域にある）を含む（図１）。第１のＯＲＦは、非構造タンパク質、すなわち、ＲＮＡ複製システムのウイルスサブユニットをエンコードする。第２のＯＲＦは、ビリオンタンパク質をエンコードし、ＲＮＡ複製それ自体には必要でない。すべての既知のアルファウイルスのゲノムは、同様に組織化される。ＳＦＶは、感染細胞の細胞質内で複製する。複製過程は、エンドソーム及びリソソーム由来の細胞膜上で起こる。一般的に、哺乳動物細胞における感染は、細胞ＲＮＡ及びタンパク質合成のほぼ完全な遮断につながり、感染の１２〜２４時間後に感染細胞の死をもたらす。したがって、ＳＦＶは、一般的に高度に細胞傷害性であり、急速（ｒａｐｉｄ）ウイルスである。
【０１９０】
ＳＦＶタンパク質の発現は、構造又は非構造領域に挿入されたマーカー遺伝子（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｒｌｕｃ）を有するＳＦＶゲノムの使用によりモニターすることができ、感染細胞におけるマーカーの発現レベルは、感染細胞におけるウイルスＲＮＡｓ（マーカーが非構造領域に挿入されている場合にはゲノムＲＮＡｓであり、マーカーが構造領域に挿入されている場合にはサブゲノムＲＮＡｓである）のコピー数に比例する（Ｋｉｉｖｅｒら、２００８）。したがって、ＥｎｄｕＲｅｎ又は他の適切な基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることによるＲｌｕｃのモニタリングにより、感染細胞におけるウイルス複製（ウイルスＲＮＡｓ及びタンパク質の蓄積）に関する十分な情報が提供される。
【０１９１】
Ｃ型肝炎ウイルスは、慢性感染を引き起こすＲＮＡウイルスの例である。ＨＣＶは、フラビウイルス科の非細胞変性性メンバーである。これは、長さが約９．６ｋｂのプラスセンスＲＮＡゲノムを有する。ＨＣＶゲノムは、５’キャップを欠いているが、その代わりに、５’−ＵＴＲ内の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有する。ＨＣＶゲノムは、タンパク質分解により１０の個別タンパク質：４つの構造タンパク質と６つの非構造タンパク質に開裂する、単一ポリタンパク質をエンコードする。これらの非構造タンパク質のうちの５つは、ＨＣＶゲノムの複製に必要である。複製は、感染細胞の細胞質内で起こり、ウイルスタンパク質及びＲＮＡが細胞因子とともに複製複合体におけるゲノムの足場としての役割を果たす「膜性ウエブ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｗｅｂ）」を形成する。ＨＣＶ複製は、非対称性である（プラス鎖がより多い）。ＨＣＶビリオンは、ＥＲ膜上で組み立てられ、分泌経路を経て細胞から出る。ＨＣＶは、宿主細胞代謝の全体的な遮断や細胞死を引き起こさず、その代わり、細胞の抗ウイルスメカニズムの高度に特異的な遮断を引き起こす。
【０１９２】
ＨＣＶの複製は、高度に感受性の細胞株に基づく一時的発現システム及びルシフェラーゼマーカー遺伝子を含むＨＣＶ１ｂレプリコン（レプリコン欠乏ゲノムを陰性対照として用いる）を含む代用レプリコンモデルを用いてモニターすることができる。
【０１９３】
ＨＣＶ感染の初期段階は、細胞培養で再現することは困難である。限られたＨＣＶ変異体のみが培養細胞を感染させることができる（遺伝子型２のＪＦＨ１及びＪＦＨ１に基づくいくつかの組換え体）が、医学的に最も重要な１ｂ遺伝子型については、これまでにそれは報告されていない。しかし、ＳＦＶの非細胞傷害性突然変異体のレプリカーゼ部分（Ｔａｍｍら、１：Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、８９、６７６〜８６頁、２００８）と挿入されたＲｌｕｃリポーター及びＳＦＶのサブゲノム・プロモーターの制御下でクローンしたＨＣＶレプリカーゼ領域のフラグメントを含むハイブリッドウイルスを用いることにより、ＨＣＶ  １ｂの感染の初期段階をモデル化することはできる。これらのハイブリッドゲノムは、ＳＦＶ構造タンパク質を含む粒子と同様にウイルスにパッケージングし、抗ＨＣＶ及び／又は抗ＳＦＶ化合物を投与したｈｕｈ７細胞の感染に用いることができる。
【０１９４】
病原性レトロウイルスの例としてのＨＩＶ−１。ＨＩＶ−１は、レトロウイルス科、レトロウイルス属に属している。ＨＩＶ−１のゲノム構成は、単純レトロウイルスのゲノム構成より複雑である。ＨＩＶのゲノムＲＮＡは、長さが約９ｋｂであり、いくつかの遺伝子を有する。これらの遺伝子の一部は、ゲノムサイズＲＮＡから直接発現し、他の遺伝子は十分に調節された選択的スプライシングにより発現する。ＨＩＶの遺伝子発現は、ウイルス及び宿主因子により調節される。最もよく知られているウイルス・レギュレーターは、Ｔａｔ（転写アクチベーター）及びＲｅｖ（スプライシング及び核輸出のレギュレーター）である。これらのタンパク質は、スプライスＲＮＡ転写物から発現し、それらの発現は、その後の転写を活性化し（Ｔａｔ活性）、スプライシングパターンを変化させる（Ｒｅｖ活性）。
【０１９５】
ＨＩＶプロモーターのＴａｔ媒介性活性化は、抗ウイルス化合物の評価に用いることができるモデルシステムである。ＨＩＶプロウイルスが宿主ゲノムに組み込まれるとき、活性化には、ＨＩＶエンコードＴａｔタンパク質とウイルスｍＲＮＡにおけるＴａｒ要素との相互作用を必要とする。Ｔａｔタンパク質がなければ、ＨＩＶプロモーターからの転写は非常に不活性であり、Ｔａｔが含まれることによってプロモーターが３００倍活性化される。結果として、Ｔａｔ及びＴａｒ要素が存在しない場合、活性ＨＩＶ遺伝子の発現は起こり得ない。分析用システムは、Ｔａｒ含有ＨＩＶプロモーターのＴａｔ活性化に基づいており、ＨＩＶプロモーターの制御下でクローンされたルシフェラーゼマーカー遺伝子（ＬＴＲ）を含み、この構成体は、安定Ｊｕｒｋａｔ細胞株を構築するのに用いられた。これらの細胞において、ルシフェラーゼマーカーの発現は、非常に低い基礎レベルで起こる。発現は、トランスフェクションによりこれらのリポーター細胞に送達された、ＢクードウイルスＨＡＮ−２のＴａｔ遺伝子を用いることにより活性化することができる。この過程は、抗ウイルスオリゴヌクレオチドにより抑制することができる。
【０１９６】
ＤＮＡゲノムを有するウイルスの例としての乳頭腫ウイルス。乳頭腫ウイルスは、環状２本鎖ＤＮＡゲノムを有する小非包膜ウイルスの群である。乳頭腫ウイルスの複製サイクルは、上皮組織の発達と厳密に相関し、ウイルスは成熟上皮細胞においてのみ成熟する。終末段階に発達していない細胞において、乳頭腫ウイルスゲノムは、細胞染色体外プラスミド当たり高コピー（５０〜４００コピー）として複製する。乳頭腫ウイルスのＤＮＡゲノムは、長さが約８ｋｂｐであり、１０〜１２タンパク質をエンコードし、感染細胞の核内で複製する。複製は、２つのウイルス・エンコードタンパク質Ｅ１及びＥ２に依存する。Ｅ２は、ウイルス遺伝子発現の調節にも関与する。
【０１９７】
乳頭腫ウイルスの複製に対する修飾オリゴヌクレオチドの影響は、遺伝子発現のＥ２媒介性活性化をモニターすることによって分析することができる。リポーター遺伝子（ホタル・ルシフェラーゼ、Ｌｕｃ）をＥ２活性化プロモーターの制御下でクローンした。このリポーター・プラスミドとＥ２エンコーディング・プラスミドの共トランスフェクションにより、活性化効果（及び抗ウイルスオリゴヌクレオチドによるその調節）を測定することができる。
【０１９８】
細胞におけるＢＰＶ複製の分析は、抗ウイルス化合物の効果の分析のための他のモデルである。ウイルスのコピー数は、定量的ＰＣＲ又はサザンブロットにより分析することができる。
【０１９９】
製剤
本発明の化合物は、取込み、分布及び／又は吸収の助けとするために、例えば、リポソーム、担体、希釈剤、受容体標的分子、経口、直腸、局所又は他の製剤として、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合、封入、複合体化又は別の方法で結合させることもできる。そのような取込み、分布及び／又は吸収補助製剤の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，１０８，９２１号、同第５，３５４，８４４号、同第５，４１６，０１６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５２１，２９１号、同第５，５４３，１５８号、同第５，５４７，９３２号、同第５，５８３，０２０号、同第５，５９１，７２１号、同第４，４２６，３３０号、同第４，５３４，８９９号、同第５，０１３，５５６号、同第５，１０８，９２１号、同第５，２１３，８０４号、同第５，２２７，１７０号、同第５，２６４，２２１号、同第５，３５６，６３３号、同第５，３９５，６１９号、同第５，４１６，０１６号、同第５，４１７，９７８号、同第５，４６２，８５４号、同第５，４６９，８５４号、同第５，５１２，２９５号、同第５，５２７，５２８号、同第５，５３４，２５９号、同第５，５４３，１５２号、同第５，５５６，９４８号、同第５，５８０，５７５号、及び同第５，５９５，７５６号を含むが、これらに限定されない。
【０２００】
本発明のアンチセンス化合物は、製薬上許容される塩、エステル、又はそのようなエステルの塩、或いはヒトを含む動物への投与後に生物学的に活性な代謝物又はその残留物を（直接又は間接的に）供給することができる他の化合物を含む。したがって、例えば、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグ及び製薬上許容される塩、そのようなプロドラッグの製薬上許容される塩、並びに他の生物学的同等物も対象とする。
【０２０１】
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素若しくは他の化学物質及び／又は条件の作用により体内又はその細胞内で活性形（すなわち、薬物）に変換される不活性形として調製される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ形は、１９９３年１２月９日に公開されたＧｏｓｓｅｌｉｎらへのＷＯ９３／２４５１０又はＩｍｂａｃｈらへのＷＯ９４／２６７６４及び米国特許第５，７７０，７１３号に開示されている方法によりＳＡＴＥ（（Ｓアセチル−２−チオエチル）リン酸）誘導体として調製される。
【０２０２】
「製薬上許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学上及び製薬上許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、その望ましくない毒性学的作用を与えない塩を意味する。オリゴヌクレオチドについては、製薬上許容される塩の好ましい例及びそれらの使用は、全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。
【０２０３】
本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物及び製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所又は全身投与が望ましいかどうか、及び治療する部位に依存する多くの方法で投与することができる。投与は、局所（眼並びに膣及び直腸送達を含む粘膜に対する）、肺、例えば、噴霧器によるものを含む、散剤又はエアゾール剤の吸入又は吸送による；気管内、鼻内、表皮及び経皮、経口又は非経口であってよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹膜内又は筋肉内注射若しくは注入、或いは頭蓋内例えば硬膜下腔内又は脳室内投与を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。局所投与用の医薬組成物及び製剤は、経皮貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び散剤などであってよい。従来の医薬担体、水性、粉末状若しくは油性基剤、粘稠化剤などが必要又は望ましい可能性がある。被覆コンドーム、手袋なども有用である可能性がある。
【０２０４】
好都合には単位剤形であってよい、本発明の医薬製剤は、製薬産業でよく知られている従来の技術により調製することができる。そのような技術は、有効成分を医薬担体（単数又は複数）又は賦形剤（単数又は複数）と結合した状態にする段階を含む。一般的に、製剤は、有効成分を液体担体若しくは微細な固体担体又は両方と均一且つ緊密に結合した状態にし、次に、必要な場合、生成物を成形することにより調製する。
【０２０５】
本発明の組成物は、それらに限定されないが、水性、非水性又は混合媒体中懸濁剤などの多くの可能な剤形のいずれかに製剤化することができる。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどの懸濁剤の粘度を増加させる物質をさらに含んでいてよい。懸濁剤は、安定化剤も含んでいてよい。
【０２０６】
本発明に有用な医薬組成物は、液剤、乳剤、泡剤及びリポソーム、ミセル又はナノ粒子含有製剤を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物及び製剤は、１つ又は複数の浸透促進剤、担体、賦形剤、希釈剤又は他の活性若しくは不活性成分を含んでいてよい。
【０２０７】
乳剤は、一般的に１つの液体が通常直径が０．１μｍを超える液滴の形で他の液体中に分散した不均一系である。乳剤は、分散相及び水相、油相中に溶液として又はそれ自体独立した相として存在していてよい活性薬に加えて、さらなる成分を含んでいてよい。マイクロエマルジョンは、本発明の一実施形態として含まれる。乳剤及びそれらの使用は、当技術分野でよく知られており、全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。
【０２０８】
本発明に有用な製剤として、リポソーム製剤が挙げられる。本発明で用いているように、「リポソーム」という用語は、球状の二重層又は複数の二重層で配置した両親媒性脂質からなる小胞を意味する。リポソームは、送達される組成物を含む、親油性物質及び水性の内側から形成された膜を有する単層又は多層小胞である。陽イオンリポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている正に荷電したリポソームである。ｐＨ感受性であるか、又は負に荷電したリポソームは、それとの複合体ではなく、ＤＮＡを捕捉すると考えられている。陽イオン及び非陽イオン性リポソームの両方は、ＤＮＡを細胞に送達するのに用いられており、本発明の化合物を送達するのに用いることができる。
【０２０９】
リポソームは、本明細書で用いているように、リポソーム中に取り込まれたとき、そのような特殊化脂質を欠くリポソームと比べて循環中寿命の延長をもたらす１つ又は複数の特殊化脂質を含むリポソームを意味する用語である、「立体的に安定化された」リポソームも含む。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、１つ又は複数の糖脂質を含むか、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ又は複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。リポソーム及びそれらの使用は、全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。本明細書で述べる組成物を含むリポソームは、リポソームが組織内に又は細胞膜を越えて導かれるように、細胞浸透性ペプチドと複合体化又は別の方法で結合させることもできる。細胞浸透性ペプチドは、ＨＩＶ  ｔａｔペプチド、抗体又はその結合性フラグメント、ビオチン、及び当技術分野で知られている他の組成物（Ｓａｗａｎｔら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．、１７、９４３〜９頁（２００６）；Ｓａｐｒａら、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．、２、３６９〜８１頁（２００５））などである。
【０２１０】
ミセル及びナノ粒子などのさらなるナノ粒子医薬担体は、本明細書で述べる組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでの送達用として企図される。そのようなナノ医薬品を合成し、投与する技術は、当技術分野で知られており、例えば、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ＶＰ．、（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２００８年３月３１日）、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ＶＰ．、（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、３５、８１６〜８２０頁（２００７）及びＳａｗａｎｔら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．、１７、９４３〜９頁（２００６））に記載されている。
【０２１１】
本発明の医薬製剤及び組成物は、界面活性剤も含んでいてよい。医薬品、製剤及び乳剤における界面活性剤の使用は、当技術分野でよく知られている。界面活性剤及びそれらの使用は、全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。
【０２１２】
１つの実施形態において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率のよい送達をもたらすための様々な浸透促進剤を用いる。細胞膜を通しての非親油性薬物の拡散を促進することに加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の浸透性も向上させる。浸透促進剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤及び非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属すると分類することができる。浸透促進剤及びそれらの使用は、全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。
【０２１３】
当業者は、製剤は、それらの意図する使用、すなわち、投与経路に応じて常法により設計されることを認識するであろう。
【０２１４】
局所投与用の好ましい製剤としては、本発明の化合物が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤などの局所送達剤との混合物の形であるものが挙げられる。好ましい脂質及びリポソームとしては、天然（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。
【０２１５】
局所又は他の投与のために、本発明の化合物は、リポソーム内に封入することができ、又はそれとの、特に、陽イオン性リポソームとの複合体を形成していてよい。或いは、化合物は、脂質との、特に、陽イオン性脂質との複合体を形成させることができる。好ましい脂肪酸及びエステル、製薬上許容されるその塩、並びにそれらの使用は、全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。局所製剤は、全体として参照により本明細書に組み込まれている、１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願第０９／３１５，２９８号に詳細に記載されている。
【０２１６】
経口投与用の組成物及び製剤としては、散剤又は顆粒剤、ミクロ粒子、ナノ粒子、水中又は非水媒体中懸濁剤又は液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤又は小錠剤などが挙げられる。粘稠化剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。好ましい経口製剤は、本発明の化合物を１つ又は複数の浸透促進剤、界面活性剤及びキレート化剤とともに投与するものである。好ましい界面活性剤は、脂肪酸及び／又はそのエステル若しくは塩、胆汁酸及び／又はその塩などである。好ましい胆汁酸／塩及び脂肪酸並びにそれらの使用は、全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩も好ましい。特に好ましい組合せは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルなどである。本発明の化合物は、噴霧乾燥粒子を含む顆粒状で経口送達することができ、或いはミクロ又はナノ粒子を形成するために錯体形成させることができる。錯体化剤及びそれらの使用は、全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。経口製剤及びそれらの調製は、それぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれている、米国出願第０９／１０８，６７３号、米国出願第０９／３１５，２９８号及び米国出願第１０／０７１，８２２号に詳細に記載されている。
【０２１７】
非経口、硬膜下腔内又は脳室内投与用の組成物及び製剤は、緩衝剤、希釈剤、並びに浸透促進剤、担体化合物及び他の製薬上許容される担体又は賦形剤に限定されないが、これらなどの他の適切な添加剤も含んでいてよい滅菌済み水溶液を含んでいてよい。
【０２１８】
本発明の特定の実施形態は、本発明の１つ又は複数の化合物及び非アンチセンス・メカニズムにより機能する１つ又は複数の化学療法薬を含む医薬組成物を提供する。そのような化学療法薬の例は、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロ尿素、ベスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、デカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、窒素マスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベステロール（ＤＥＳ）などの癌化学療法薬を含むが、これらに限定されない。本発明の化合物とともに用いる場合、そのような化学療法薬は、個別に（例えば、５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、逐次的に（例えば、ある期間５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチドの後にＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド）、１つ又は複数の他のそのような化学療法薬と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド又は５−ＦＵ、放射線療法及びオリゴヌクレオチド）用いることができる。非ステロイド抗炎症薬及びコルチコステロイドを含むが、これらに限定されない抗炎症薬、並びにリビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルを含むが、これらに限定されない抗ウイルス薬も本発明の組成物と組み合わせることもできる。アンチセンス化合物と他の非アンチセンス薬物の組合せも本発明の範囲内にある。２つ又はそれ以上の組合せの化合物を一緒又は逐次的に用いることができる。
【０２１９】
他の関連実施形態において、本発明の組成物は、第１の核酸標的を標的とする１つ又は複数のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、及び第２の核酸標的を標的とする１つ又は複数のさらなるアンチセンス化合物を含んでいてよい。或いは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的とする２つ又はそれ以上のアンチセンス化合物を含んでいてよい。アンチセンス化合物の多数の例が当技術分野で知られている。２つ又はそれ以上の組合せの化合物を一緒又は逐次的に用いることができる。
【０２２０】
投与
治療用組成物の製剤及びそれらの後の投与は、当業者の技術の範囲内にあると考えられており、例えば、用量反応、毒性及び薬物動態試験により決定される。投与は、治療する疾患状態の重症度及び反応性に依存し、治療の過程は、数日から数カ月、又は治癒がもたらされるまで、若しくは疾患状態の軽減が達成されるまで続く。投与は、慢性疾患状態又は軽減するが、治癒は達成できない状態については無期限に続く可能性がある。最適な投与計画は、患者の体内の薬物の蓄積の測定から計算することができる。当業者は、最適な用量、投与方法及び反復率を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力によって異なり、一般的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの動物モデルにおいて有効であることが認められたＥＣ５０ｓに基づいて推定することができる。一般的に、用量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日に、１週間に、１カ月に、若しくは１年に１又は複数回、或いは２〜２０年ごとに１回投与することができる。当業者は、体液又は組織中の薬物の実測滞在時間及び濃度に基づいて投与の反復率を容易に推定することができる。成功を収めた治療の後に、患者は、オリゴヌクレオチドを体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で１日１又は複数回から２０年ごとに１回投与する、維持療法を疾患状態の再発を予防するために受けることが望ましい可能性がある。
【０２２１】
キット及び診断ツール
本発明の化合物は、診断、治療、予防のために、並びに研究用試薬及びキットとして利用することができる。さらに、高い特異性で遺伝子発現を阻害することができる、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、個々の遺伝子の機能を解釈するために、又は生物学的経路の様々なメンバーの機能を区別するためにしばしば当業者によって用いられている。
【０２２２】
キット及び診断に用いるために、本発明の化合物は、単独で、又は他の化合物若しくは治療薬と組み合わせて、細胞及び組織内で発現した遺伝子の相補体の一部又は全体の発現パターンを解明するための各種及び／又はコンビナトリアル分析におけるツールとして用いることができる。
【０２２３】
１つの非限定的な例として、１つ又は複数のアンチセンス化合物で処理した細胞又は組織内の発現パターンをアンチセンス化合物で処理しなかった対照細胞又は組織と比較し、それらは、例えば、検討する遺伝子の疾患関連性、シグナリング経路、細胞局在化、発現レベル、サイズ、構造又は機能に関連するので、発生したパターンを遺伝子発現の差別的レベルについて分析する。これらの分析は、刺激又は非刺激細胞において、発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在下又は非存在下で行うことができる。
【０２２４】
当技術分野で知られている遺伝子発現分析の方法の例としては、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイ（Ｂｒａｚｍａ及びＶｉｌｏ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、１７〜２４頁；Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２〜１６頁）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ））（Ｍａｄｄｅｎら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、２０００、５、４１５〜４２５頁）、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡｓの制限酵素増幅）（Ｐｒａｓｈａｒ及びＷｅｉｓｓｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９９、３０３、２５８〜７２頁）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、１９７６〜８１頁）、タンパク質アレイ及びプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２〜１６頁；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、２０、２１００〜１０頁）、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２〜１６頁；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００、８０、１４３〜５７頁）、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリンティング（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０００、２８６、９１〜９８頁）；Ｌａｒｓｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２０００、４１、２０３〜２０８頁）、サブトラクティブクローニング、差別的ディスプレイ（ＤＤ）（Ｊｕｒｅｃｉｃ及びＢｅｌｍｏｎｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００、３、３１６〜２１頁）、比較ゲノムハイブリッド形成（Ｃａｒｕｌｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９８、３１、２８６〜９６頁）、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成）技術（Ｇｏｉｎｇ及びＧｕｓｔｅｒｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９９、３５、１８９５〜９０４頁）及び質量分析法（Ｔｏ、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ、２０００、３、２３５〜４１頁）などが挙げられる。
【０２２５】
アンチセンスの特異性及び感度も当業者によって治療上の使用のために活用された。アンチセンス化合物は、ヒトを含む動物における疾患状態の治療における治療薬構成成分として用いられている。リボザイムを含むアンチセンス・オリゴヌクレオチド薬は、ヒトに安全且つ効果的に投与され、多くの臨床試験が現在行われている。したがって、アンチセンス化合物は、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療のための投与計画において有用であるように設定することができる有用な治療モダリティであり得る。
【０２２６】
療法については、標的核酸の発現を調節することにより治療することができる疾患又は障害を有すると疑われる被検体、好ましくはヒトは、本発明によるアンチセンス化合物を投与することにより治療される。例えば、１つの非限定的な実施形態において、上記方法は、治療を必要とする被検体に治療上有効な量のアンチセンス化合物を投与するステップを含む。本発明の化合物は、有効な量の化合物を適切な製薬上許容される希釈剤又は担体に加えることにより、医薬組成物に用いることができる。本発明の化合物及び方法の使用は、予防的にも有用である可能性がある。例えば、組成物は、これらの細胞におけるウイルス遺伝子の発現及び複製を低減させるために非感染細胞を処理するのに有用である。
【０２２７】
本開示のさらなる態様及び詳細は、限定するのではなく、例示することを意図する以下の実施例から明らかであろう。
【実施例１】
【０２２８】
セムリキ森林熱ウイルスを阻害するための修飾オリゴヌクレオチドの使用
ウイルス遺伝子複製に対する修飾オリゴヌクレオチドの効果を決定するために、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、アルファウイルス属Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科由来の急速（急性）プラス鎖ＲＮＡウイルスに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを作製し、ウイルスゲノム複製の阻害を測定した。
【０２２９】
オリゴヌクレオチド及びＳＦＶウイルスゲノム内の標的のリストを表１に並べる。
【０２３０】
【表１】
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【０２３１】
ＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓）細胞を３５ｍｍ径のディッシュでコンフルエントになるまで増殖させ、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、メタルヌクレアーゼ（Ｅｕ）を伴う又は伴わない、修飾オリゴヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは、感染の瞬間又は感染前に行われた。細胞は、３０ピコモルのオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされ（生体ヌクレアーゼを伴う又は伴わない、無関係なオリゴヌクレオチドを対照として使用した）、感染多重度（ｍｏｉ）０．０５でレポーターウイルスＳＦＶ４−ｓｔＲＬｕｃ（ＳＦＶゲノムの構造領域に挿入されたウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを有する自己複製ＳＦＶベクター）で感染させた。ｍｏｉ、トランスフェクション試薬の量、及びトランスフェクションと感染との時間間隔などのいくつかの条件を様々な実験で変更した。ＥｎｄｕＲｅｎ生細胞基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｒ−Ｌｕｃ活性を検出し、測定は大部分の実験で感染の１．５、２、３、４、５、及び８時間後に行われた（遅い時間点も同様にいくつかの実験で使用した）。この実験の結果を表２に示す。
【０２３２】
【表２】
0005710977.tif 000004
【０２３３】
ＳＦＶ複製の阻害に対する３つの標的の比較は、オリゴヌクレオチドＡ８（センス型オリゴ、標的はアンチセンスＲＮＡである）はウイルス複製に効果がないが、Ａ６オリゴヌクレオチド（アンチセンス、標的はＳＦＶの５’ＵＴＲである）は、中程度の効果を有し、及びＡ７オリゴヌクレオチド（アンチセンス、標的はｎｓＰ４のコーディング領域である）は、生体ヌクレアーゼ（Ｅｕ）と複合したとき、３．４倍に増幅される有為な阻害効果を有することを示した。
【実施例２】
【０２３４】
Ｃ型肝炎ウイルスを阻害するための修飾オリゴヌクレオチドの使用
ウイルス遺伝子複製に対する修飾オリゴヌクレオチドの効果を決定するために、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、ヘパシウイルス属Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科由来の緩徐（慢性）プラス鎖ＲＮＡウイルスを作製し、ウイルスゲノム複製の阻害を測定した。
【０２３５】
オリゴヌクレオチド及びＨＣＶウイルスゲノム内の標的のリストを表３に示す。
【０２３６】
【表３】
0005710977.tif 000005
【０２３７】
ＨＣＶ複製及びこのプロセスに対する阻害剤の効果の解析は、Ｌｕｃマーカー遺伝子を含むＨＣＶレプリコンを用いて行い、ＲＮＡ転写物としてＬｕｎｅｔ細胞に送達された。ウイルスの生来の３’ＵＴＲを有するＨＣＶ  ＩＲＥＳ及びＨＣＶ非構造領域（ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ）の調節下にあるＬｕｃマーカーを有する、非選択マーカーを含むＨＣＶレプリコン（遺伝子型１ｂ）をこのアッセイに使用した。対応する構築物由来のｃＤＮＡはインビトロで転写され、修飾オリゴヌクレオチド化合物とともに、エレクトロポレーションによってｈｕｈ７／Ｌｕｎｅｔ細胞にトランスフェクトされた。ＨＣＶは一時的な複製を開始し、この場合、ルシフェラーゼの発現はＨＣＶゲノムのコピー数に比例する。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクション後の４〜９６時間である４時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間で測定された（また、いくつかの実験では、追加の時間点を用いた）。実験中に数回、細胞培養物を取り出し、ｌｕｃ発現レベルを試料中の全タンパク質に対して標準化した。
【０２３８】
ルシフェラーゼの発現は、ＨＣＶゲノムのコピー数に比例し、上記で設定した時間点で測定された。ヌクレアーゼ複合体とともに又は伴わない、修飾ヌクレオチドに基づく阻害剤（１００ピコモル）は、ウイルスＲＮＡとともに添加された（同時エレクトロポレーション）。実験の結果を表４に示す。
【０２３９】
【表４】
0005710977.tif 000006
【０２４０】
これらの結果は、修飾オリゴヌクレオチドの使用によるＨＣＶ複製の阻害が、８−オキソ−ｄＧ；又は５−ＯＨ−ｄＣのいずれかを有するオリゴヌクレオチドを用いて観察されたことを示す。生体ヌクレアーゼと複合化した修飾オリゴヌクレオチドは、抗ウイルス活性に寄与し、ヌクレアーゼ複合体を欠損しているオリゴよりも１０倍低い濃度で抗ウイルス効果を示した。
【実施例３】
【０２４１】
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のＴａｔ活性化遺伝子発現を阻害するための修飾オリゴヌクレオチドの使用
ウイルス遺伝子複製に対する修飾オリゴヌクレオチドの効果を決定するために、ＨＩＶ−１、レンチウイルス属Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを作製し、ウイルスゲノム複製の阻害を測定した。
【０２４２】
オリゴヌクレオチド及びＨＩＶウイルスゲノム内の標的のリストを表５に示す。
【０２４３】
【表５】
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【０２４４】
ＨＩＶプロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物を有するＪｕｒｋａｔ細胞株をこれらの実験のために用いた。発現の活性化因子（Ｔａｔを発現するプラスミド、５ｎｇ）は、オリゴヌクレオチド阻害剤（１００ピコモル）とともに細胞に送達された。阻害剤の効果（単数又は複数）は、測定されたルシフェラーゼ活性のレベル（感染の２４時間後）の比較によって計算された。実験の結果を表６に示す。
【０２４５】
【表６】
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【０２４６】
ＨＩＶ−Ｔａｔ配列は、修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドにとって有効な標的である。阻害効果は、オリゴヌクレオチドが修飾塩基を含む場合にのみ検出され、ＲＮＡヌクレアーゼ活性の存在によってさらに増加した。
【実施例４】
【０２４７】
Ｅ２によって活性化された遺伝子発現及び１型ウシパピローマウイルスの複製を阻害するためのＳ−修飾オリゴヌクレオチドの使用
従来の結果は、ヒドロキシ又はメルカプト修飾のいずれかを含む修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドが遺伝子複製のアンチセンス阻害においてより効果的であることを示している（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００７／１２５１７３を参照されたい）。ウイルス遺伝子複製に対するこれらの修飾オリゴヌクレオチドの効果を決定するために、種々の修飾オリゴヌクレオチドが、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）Ｅ２癌遺伝子の複製を阻害するそれらの能力について評価された。
【０２４８】
非修飾オリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡの使用による潜在的な標的についてのプレスクリーニングに基づいて、ＢＰＶＩのＥ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの５’領域に位置される配列５’ＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＧＡＡＣＧＴＴＴＡ３’（配列番号１０）を修飾オリゴヌクレオチドに基づく阻害剤の標的として選択した。３つの阻害剤は、これらの配列に対して構築され、３つの化合物はすべて、ＷＯ２００７／１２５１７３に記載されるように、それらの５’端でユウロピウムを有するヌクレアーゼ複合体を含んだ。
【０２４９】
ＢＰＶ１＿Ｅｕ：５’ＴＡＡＡＣＧＴＴＣＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡ３’（配列番号１１）
【０２５０】
ＢＰＶ２＿Ｅｕ：５’ＴＡＡＡＸＧＴＴＣＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡ３’、ここで、Ｘ＝５−ＳＨ−ｄＣである（配列番号１２）
【０２５１】
ＢＰＶ３＿ＥＵ：５’ＴＡＡＡＣＸＴＴＣＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡ３’、ここで、Ｘ＝８−ＳＨ−ｄＧである（配列番号１３）
【０２５２】
ＣＨＯ細胞株におけるルシフェラーゼ発現のＥ２を媒介した活性の試験。ＣＨＯ細胞は、Ｅ２−トランス遺伝子を発現せず、したがって、Ｅ２を発現するプラスミドとの同時トランスフェクションは、Ｅ２遺伝子に対するオリゴヌクレオチド活性を解析するために必要であった。Ｅ２の過剰発現を避けるために、有意ではあるが、なおも動的な活性化に必要とされるＥ２を発現するプラスミドの量を確定した。ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）のＥ２に依存しない発現を結果の標準化のために使用した。前述の用量応答解析に基づいて、１ｎｇのＥ２を発現するプラスミドをアッセイのために選択した。１ｎｇのＥ２発現プラスミドのトランスフェクションは、マーカー発現の４〜５倍の活性化を引き起こし（マーカー発現の４〜５倍の減少はＥ２を媒介にした活性化の完全な欠落に対応する）、その濃度で、Ｅ２発現レベルにおける小さな変化は、マーカー発現の全活性化の有為な変化をもたらした。
【０２５３】
１００ピコモルの修飾オリゴヌクレオチド阻害剤は１ｎｇのＥ２を発現するプラスミド及びレポータープラスミドとともにＣＨＯ細胞に送達され、Ｅ２に依存したルシフェラーゼ発現の阻害が観察された。ＢＰＶ１＿ＥＵは、レポーター発現の１．６倍の減少を引き起こしたが、ＢＰＶ２＿ＥＵ及びＢＰＶ３＿ＥＵは、Ｅ２によって活性化された遺伝子発現のおよそ２倍の減少を引き起こした。以前に計算された較正曲線に基づいて、Ｒｌｕｃ比に対するＬｕｃの１．６倍の減少は、Ｅ２発現の２倍の減少に対応し、ＲＬｕｃ比に対するＬｕｃの２倍の減少は、Ｅ２発現の３．５倍の減少に対応する。
【０２５４】
Ｅ２のｍＲＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチド阻害剤を用いたＢＰＶ複製の抑制。ＢＰＶ複製は、ＢＰＶ−１最小複製起源を含むプラスミド、及びＥ１とＥ２タンパク質についての発現プラスミドを用いて同時にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において測定された。サザンブロッティングを用いて、トランスフェクトされた細胞における組換えウイルス起源のコピー数を解析した。このアッセイでは、ヌクレアーゼ複合体を伴う３つの抗Ｅ２修飾オリゴヌクレオチド（ＢＰＶ１＿ＥＵ、ＢＰＶ２＿ＥＵ及びＢＰＶ３＿ＥＵ）をすべて解析した。結果は、１００ピコモルのＢＰＶ１＿ＥＵは、トランスフェクションの７２時間後、複製のわずかな阻害を引き起こしたことを示す。同量のＢＰＶ２＿ＥＵは、感染の４８時間と７２時間後の両方で検出され得る阻害の増大を引き起こした。同量のＢＰＶ３＿ＥＵは、複製をほとんど抑制しないことを示した。結果を図１に示す。
【０２５５】
これらの結果は、ヌクレアーゼ複合体を伴うアンチセンス修飾オリゴヌクレオチドがＥ２によって活性化された遺伝子発現及びパピローマウイルスのＥ２に依存した複製を抑制できることを示す。同じ部位に対して標的化された非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、アンチセンス修飾オリゴヌクレオチドはより効果的な阻害剤であった。５−ＳＨ−ｄＣ残基を有するアンチセンス修飾オリゴヌクレオチドは、８−ＳＨ−ｄＧ残基を有するアンチセンス修飾オリゴヌクレオチドよりもＰＶ複製の効果的な阻害剤であった。対照的に、Ｅ２によって活性化された転写を抑制する能力において、別々に修飾された阻害剤の間に相違は観察されなかった。
【実施例５】
【０２５６】
メルカプト核酸塩基の使用は抗ウイルス効率を上昇させ、阻害に必要とされる修飾オリゴヌクレオチドの濃度を減少させる
修飾されたヒドロキシ塩基を有するオリゴヌクレオチドが一時的な発現モデルにおいてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製を減少させるという証拠を実施例２に記載した。メルカプト核酸塩基を有するオリゴが同じ増大した抗ウイルス効果を有するかどうかを決定するために、１００ピコモルのオリゴヌクレオチドＢ４＿Ｎ（２つの５−ＯＨ−ｄＣ塩基を含む）又は１００ピコモルの薬物Ｂ６−Ｎ（２つの８−オキソ−ｄＧ塩基を含む）（表７）の阻害効果が前述される複製アッセイにおいて測定される。
【０２５７】
結果は、メルカプト−オリゴヌクレオチドがＨＣＶ複製の減少を引き起こしたことを示す。Ｂ４−Ｎの５−ＯＨ−ｄＣ塩基（複数）がＢ６−Ｎの５−ＳＨ−ｄＣ塩基及び８−オキソ−ｄＧ塩基で置換されたことを除いて（表７）同様な実験を、同じヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて繰り返した場合、Ｂ４Ｓ−Ｎ及びＢ６Ｓ−Ｎによって引き起こされる阻害効果は４０ピコモルの量で検出可能であり、メルカプト塩基を有するヒドロキシ塩基の置換が、一時的なシステムにおいてＨＣＶ複製の阻害を達成するために必要とされる阻害剤の量をおよそ２．５倍まで減少させたことを示す。
【０２５８】
【表７】
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【０２５９】
オリゴヌクレオチドＢ４Ｓ−Ｎ及びＢ６Ｓ−Ｎが、挿入されたマーカーを含む非細胞毒性ＳＦＶ変異体のレプリカーゼ部分と、それぞれの標的部位を含むＨＣＶ断片（ＮＳ５Ａ−５Ｂ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用される場合、ハイブリッドウイルス複製の強力な阻害は、たった３０ピコモルの阻害剤を用いた場合に観察された。ハイブリッドウイルス複製の全減少は、Ｂ６Ｓ−Ｎでは１．５倍であり、Ｂ４Ｓ−Ｎでは３．４倍であった。
【０２６０】
これらの結果は、ヒドロキシ塩基の代わりにメルカプト塩基を使用することにより、抗ウイルス効率が増加し、ＨＣＶの一時的な複製の阻害に必要な修飾オリゴヌクレオチドの活性濃度が減少することを示す。効果の増大は、標的へのこのような修飾オリゴヌクレオチドの結合の増大、膜（ウイルスが複製する場所）へのこのような修飾オリゴヌクレオチドの親和性の増加、これらの修飾オリゴヌクレオチドそれ自体若しくはトランスフェクション試薬と組み合わせた修飾オリゴヌクレオチドの細胞膜を通過する能力の増大、細胞環境内及び／若しくは細胞外のこれらの修飾を有するオリゴヌクレオチドの安定性の増大、又はこれらのメカニズムのいずれかの組み合わせに起因していてもよい。
【実施例６】
【０２６１】
修飾８−オキソ−ｄＣ核酸塩基の数の増加がウイルス複製を阻害するのに必要とされる阻害剤の量を減少させる
修飾オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性における修飾の位置、及び修飾核酸塩基の数／存在の効果を決定するために、様々な数の修飾８’又は５’ヒドロキシ核酸塩基を有する構築物を作製し、抗ウイルス阻害アッセイに使用した。
【０２６２】
オリゴヌクレオチド当たりの修飾塩基数の増加の効果は、増加している数の修飾８−オキソ−ｄＧ残基を含む修飾オリゴヌクレオチドによるＨＣＶ複製の阻害の実施例によって示される。阻害剤の配列は、ＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ５Ｂの領域に対するアンチセンスであり、配列：５’ＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＧＧＧＧＣＡＧ３’（配列番号１６）を有し、ここで、０、１、５、１０又は１３個のＧ残基は８−オキソ−ｄＧ残基で置換された。これらの５つの化合物は、挿入されたマーカーを有する非細胞毒性ＳＦＶ変異体の複製部分と、それぞれの標的部位を有するＨＣＶ断片（ＮＳ５ＡＢ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用された。ハイブリッドウイルス粒子による感染の２４時間前に細胞を修飾オリゴヌクレオチドによって処理し、１００万個のｈｕｈ７細胞当たり３０ピコモルの阻害剤を使用した。組換えウイルスゲノムのコピー数に対応するＲＬｕｃ活性を感染の２４時間後に測定した。結果を表８に示す。
【０２６３】
【表８】
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【０２６４】
高量で使用されたＨＭＯ＿１は、最初の３つの修飾オリゴヌクレオチドと類似した阻害を示した。これらの結果は、オリゴ阻害剤における８’−オキソ−ｄＧ塩基の数の増加が１００万個の処理細胞当たり３０ピコモルで検出された抗ウイルス効果の増加をもたらすことを示す。
【０２６５】
増加している数の修飾５−ＯＨ−ｄＣ残基を含む修飾オリゴヌクレオチドを用いたＨＣＶ複製の阻害は、ＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ４Ｂの領域に対する阻害剤アンチセンスを用いて行い、配列：５’ＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＧＣ３’（配列番号２１）を有し、ここで、０、１、５、１０又は１２個のＣ残基は５’−ＯＨ−ｄＣ残基で置換された。これらの５つの化合物は、上述される挿入されたマーカーを有する非細胞毒性ＳＦＶ変異体のレプリカーゼ部分と、それぞれの標的部位を有するＨＣＶ断片（ＮＳ３−４Ｂ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用された。結果を表９及び図２に示す。
【０２６６】
【表９】
0005710977.tif 000011
【０２６７】
これらの結果は、単一の５−ＯＨ−ｄＣ塩基を有するオリゴヌクレオチドと比較して、５個の５−ＯＨ−ｄＣ塩基を有するオリゴヌクレオチドは阻害効果を２．５倍に増加させ、１０個の５−ＯＨ−ｄＣ塩基を有するオリゴヌクレオチドは単一の塩基置換体と比較して、阻害を９倍を超えて増加させたことを示した。
【実施例７】
【０２６８】
ヌクレアーゼ複合体が高量の修飾８−オキソ−ｄＧ、５−オキソ−ｄＣ又は６−ＯＨ−ｄＵ塩基を有するオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効率を増加させる
オリゴヌクレオチド当たり高数の修飾塩基を含む修飾オリゴヌクレオチドにおけるヌクレアーゼ複合体の存在の効果を評価するために、０、５又は１０個の修飾５−ＯＨ−ｄＣ残基を含む修飾オリゴヌクレオチドによるＨＣＶ複製の阻害を解析した。
【０２６９】
阻害剤の配列は、ＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ４Ｂの領域に対するアンチセンスであり、配列：５’ＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＧＣ３’（配列番号２１）を有し、ここで、０、５又は１０個のＣ残基は５’−ＯＨ−ｄＣ残基で置換された；オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ複合体を有するか又は有しなかった。これらの６つの化合物は、挿入されたマーカーを有する非細胞毒性ＳＦＶ変異体のレプリカーゼ部分と、それぞれの標的部位を含むＨＣＶ断片（ＮＳ３−４Ｂ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用された。ハイブリッドウイルス粒子による感染の２４時間前に細胞を修飾オリゴヌクレオチドにより処理し、１００万個のｈｕｈ７細胞当たり３０ピコモルのこれらの阻害剤を使用した。感染の２４時間後に測定した、組換えウイルスゲノムのコピー数に対応するＲＬｕｃ活性を表１０に示す。
【０２７０】
【表１０】
0005710977.tif 000012
【０２７１】
これらの結果は、ヌクレアーゼ複合体の添加が５個又は１０個の５−ＯＨ−ｄＣ塩基を含むオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を増加させたことを示す。阻害の増大は、ヌクレアーゼを伴わない阻害剤の効率に依存する；化合物それ自体がより活性になれば、より多くの相加効果がヌクレアーゼによって与えられる。
【０２７２】
同じ原理が、５個又は１０個の修飾８−オキソ−ｄＧ残基を有するオリゴヌクレオチド、及び９個の６−ＯＨ−ｄＵ残基を有するオリゴヌクレオチドについて示される。
【０２７３】
さらなるアッセイでは、ヌクレアーゼ複合体を伴う又は伴わない、５個又は１０個のＧ残基が８’−オキソ−ｄＧ残基で置換された配列：５’ＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＧＧＧＧＣＡＧ３’（配列番号１６）を有するＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ５Ｂの領域に対する阻害剤アンチセンスを試験した。これらの６つの化合物は、挿入されたマーカーを有する非毒性ＳＦＶ変異体のレプリカーゼ部分と、それぞれの標的部位を有するＨＣＶ断片（ＮＳ５ＡＢ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用された。細胞は、ハイブリッドウイルス粒子による感染の２４時間前に修飾オリゴヌクレオチドにより処理され、１００万個のｈｕｈ７細胞当たり３０ピコモルのこれらの阻害剤を使用した。感染の２４時間後に測定した、組換えウイルスゲノムのコピー数に対応するＲＬｕｃ活性を図３に示す。
【０２７４】
これらの結果は、ヌクレアーゼ複合体の添加が、５個又は１０個の８−オキソ−ｄＧ残基を有するオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を増加させ、これにより、その結果は、任意数の任意のヒドロキシ修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドにまで論理的に拡張することができることを示す。
【０２７５】
上記の実験は、６−ＯＨ−ｄＣ残基で置換された９個のＴ残基を有するオリゴヌクレオチドを用いて繰り返されてもよい。これらの置換基を有するオリゴは、８−オキソ−ｄＧ残基を有するオリゴと同様の阻害活性を有することが予想される。
【実施例８】
【０２７６】
ヌクレアーゼ複合体が高含量のヒドロキシ修飾核酸塩基を有する修飾ヌクレオチドの有効濃度を減少させる
化合物の有効濃度５０に対する、オリゴヌクレオチド当たり高数の修飾塩基数を含むオリゴヌクレオチドにおけるヌクレアーゼ複合体の効果を決定するために、ヌクレアーゼ複合体を伴う又は伴わない、１０個の５−ＯＨ−ｄＣ残基を含む修飾オリゴヌクレオチドによるＨＣＶ複製の阻害を調べた。
【０２７７】
ＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ４Ｂの領域に対する阻害剤アンチセンスであり、１０個のＣ残基が５’−ＯＨ−ｄＣ残基で置換された配列：５’ＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＧＣ３’（配列番号２１）を有する阻害剤アンチセンスは、阻害アッセイに使用された。また、ヌクレアーゼ複合体を伴う又は伴わないオリゴヌクレオチドを調べた。連続希釈したこれらの化合物は、挿入されたマーカーを有する非細胞毒性ＳＦＶ変異体のレプリカーゼ部分と、それぞれの標的部位を有するＨＣＶ断片（ＮＳ３−４Ｂ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用された。細胞は、ハイブリッドウイルス粒子による感染の２４時間前に修飾オリゴヌクレオチドにより処理され、１００万個のｈｕｈ７細胞当たり３０、１５、７．５、３．７５又は１．８７５ピコモルのこれらの阻害剤を使用した。感染の２４時間後に測定した、組換えウイルスゲノムのコピー数に対応するＲＬｕｃ活性を表１１及び図４に与える。
【０２７８】
【表１１】
0005710977.tif 000013
【０２７９】
２倍希釈した抗ウイルスオリゴヌクレオチドを用いて細胞を処理し、それらの抗ウイルス効率は、対応する標的部位を含む組換えウイルス複製の減少によって解析された（図４）。組換えウイルス複製の阻害は、ウイルスのゲノムＲＮＡから発現されるＲＬｕｃ活性を測定することによってモニターされた。
【０２８０】
これらの結果は、ヌクレアーゼ複合体の添加が１０個の修飾塩基を有する阻害性オリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を増加させ、ウイルス複製の５０％の減少を到達するために必要とされる阻害量をおよそ１０ピコモルから１．８７５ピコモル未満に減少させることを示す。同じ原理は、任意の修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基の任意の組み合わせを有するオリゴヌクレオチドについて当てはまることが予想される。
【０２８１】
ＨＣＶ複製の阻害に対する、オリゴヌクレオチド当たりの複数の６−ＯＨ−ｄＵ塩基を有するオリゴヌクレオチドの効果を決定するために、９個の６−ＯＨ−ｄＵ残基を含むオリゴヌクレオチドが、上述される阻害アッセイに使用される。ＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ３の領域に対する阻害剤アンチセンスであって、０又は９個のＴ残基が６’−ＯＨ−ｄＴ残基で置換されている配列：５’ＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＧＴＣ３’（配列番号２６）を有する阻害剤アンチセンス（表１２）。これらの２つの化合物は、前述されるように、挿入されたマーカーを有する非細胞毒性ＳＦＶ変異体のレプリカーゼ部分と、それぞれの標的部位を有するＨＣＶ断片（ＮＳ３−４Ｂ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用される。
【０２８２】
【表１２】
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【実施例９】
【０２８３】
同位置に複数のヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果の比較
抗ウイルスアンチセンスオリゴの阻害活性に対するメルカプト核酸塩基の効果を決定するために、オリゴヌクレオチド当たり複数の５−ＳＨ−ｄＣ又は８−ＳＨ−ｄＧ塩基を有するオリゴヌクレオチドを、対応する位置にヒドロキシ核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドと比較する。７個の５−ＳＨ−ｄＣ残基又は５個の８−ＳＨ−ｄＧ残基を含む修飾オリゴヌクレオチドによってＨＣＶ複製を測定する阻害アッセイを行う。阻害剤はＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ３の領域に対するアンチセンスであり、配列：５’ＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＧＴＣ３’（配列番号２６）を含み、０個の修飾残基、７個の５−ＳＨ−ｄＣ塩基若しくは５−ＯＨ−ｄＣ残基（すべてのＣ残基を置換する）、又は５個の８−ＳＨ−ｄＧ若しくは８−オキソ−ｄＧ残基（すべてのＧ残基を置換する）を有する。これらの５つの化合物（表１３）は、上述されるように、挿されたマーカーを有する非細胞毒性ＳＦＶ変異体のレプリカーゼ部分と、それぞれの標的部位を有するＨＣＶ断片（ＮＳ３−４Ｂ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用される。
【０２８４】
【表１３】
0005710977.tif 000015
【０２８５】
多置換されたオリゴヌクレオチドの強力な抗ウイルス効果が予想され、おそらくは、ヒドロキシ核酸塩基が使用される場合よりもメルカプト核酸塩基が存在する場合の抗ウイルス活性を改善した。
【実施例１０】
【０２８６】
複数のメルカプト核酸塩基及びヒドロキシ核酸塩基の組み合わせの使用が抗ウイルス効率を増加させる
オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性における複数のメルカプト核酸塩基及びヒドロキシ核酸塩基の効果を決定するために、１つのオリゴヌクレオチドにおけるメルカプト及びヒドロキシ修飾核酸塩基の組み合わせの使用を評価する。これは、５個の５−ＳＨ−ｄＣ及び２個の５−ＯＨ−ｄＣ残基、又は２個の５−ＳＨ−ｄＣ及び５個の５−ＯＨ−ｄＣ残基を含む修飾オリゴヌクレオチドによってＨＣＶ複製を阻害する実施例によって例証される。ＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ３の領域に対する阻害剤アンチセンスであって、０個の修飾残基を有するか、５個の５−ＳＨ−ｄＣ残基及び２個の５−ＯＨ−ｄＣ残基を有するか、又は２個の５−ＳＨ−ｄＣ残基及び５個の５−ＯＨ−ｄＣ残基有する（このようにしてすべてのＣ残基を置換する）配列：５’ＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＧＴＣ３’（配列番号２６）を有する阻害剤アンチセンスを使用した。これらの３つの化合物、並びにＨＭＯ＿１３及びＨＭＯ＿１４（表１４）は、上述されるように、挿入されたマーカーを有する非細胞毒性ＳＦＶ変異体のレプリカーゼ部分と、それぞれの標的部位を有するＨＣＶ断片（ＮＳ３−４Ｂ領域）を含むハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用された。
【０２８７】
【表１４】
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【０２８８】
追加のアッセイは、ＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ３の領域に対する修飾オリゴヌクレオチド阻害剤アンチセンスであって、７個の５−ＳＨ−ｄＣ及び５個の８−ＳＨ−ｄＧ残基、７個の５−ＯＨ−ｄＣ及び５個の５−オキソ−ｄＧ残基又は９個の６−ＯＨ−ｄＵ及び７個の５−ＯＨ−ｄＣ残基を含む配列：５’ＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＧＴＣ３’を有する修飾オリゴヌクレオチド阻害剤アンチセンスを用いて行われる（表１５）。このようにして、すべてのＣ残基及びＧ残基を修飾ヌクレオチドで置換するか又はすべてのＴ及びＣヌクレオチドを置換しているオリゴヌクレオチドを用いる。これらの４つの化合物、並びにＨＭＯ＿１３、ＨＭＯ＿１４、ＨＭＯ＿１５及びＨＭＯ＿１６（前述される）は、上述されるハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用される。
【０２８９】
【表１５】
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【０２９０】
強力な抗ウイルス効果が企図され、おそらくは、ヒドロキシ核酸塩基を有するオリゴよりもメルカプト核酸塩基を発現するオリゴにおいてより良好である。前述の結果は、いずれかのタイプの修飾（メルカプト／ヒドロキシ及び／又は異なる核酸塩基）を組み合わせることができ、これは抗ウイルス効果の増大をもたらすことを示唆する。任意の数の可能な組み合わせが意図される。
【実施例１１】
【０２９１】
ヌクレアーゼ複合体は任意の修飾核酸塩基及び任意のそれらの組み合わせによりオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効率を増加する
修飾オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ複合体の添加は、修飾オリゴヌクレオチドの遺伝子不活性化を増加させることが示されている（ＷＯ２００７／１２５１７３）。修飾オリゴヌクレオチドに複合化されたヌクレアーゼの効果を決定するために、ＨＣＶ１ｂ遺伝子型のＮＳ３の領域に対する阻害剤アンチセンスであって、配列：５’ＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＧＴＣ３’（配列番号２６）を有する阻害剤アンチセンスを評価する。オリゴヌクレオチドＨＭＯ＿１１（修飾なし）、ＨＭＯ＿１２、ＨＭＯ＿１３、ＨＭＯ＿１４、ＨＭＯ＿１５、ＨＭＯ＿１６、ＨＭＯ＿１７、ＨＭＯ＿１８、ＨＭＯ＿１９、ＨＭＯ＿２０及びＨＭＯ＿２１（表１６）は、ヌクレアーゼ複合体を伴う又は伴わないで、ハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用される。
【０２９２】
【表１６】
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【０２９３】
任意の高活性化合物は、任意の組み合わせ及び数の修飾核酸塩基を有する高活性アンチセンス・オリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ複合体の相加効果により、ヌクレアーゼの存在によってさらに活性化され得る。
【実施例１２】
【０２９４】
様々な修飾オリゴヌクレオチドの組み合わせの使用がこのような処置の抗ウイルス効果を増加させる
ｈｕｈ７細胞は、同じ部位（試料は前述される化合物ＨＭＯ＿１１からＨＭＯ＿２１から選択される）又は異なる標的部位に標的化された別々に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いて処理される：１つの化合物は化合物ＨＭＯ＿１１からＨＭＯ＿２１のリストから選択され、及び別の化合物はリストＨＭＯ＿８からＨＭＯ＿１０から選択される。化合物のいずれもヌクレアーゼ基を含まないか、化合物のいずれか又は化合物の両方がヌクレアーゼ基を含む、オリゴヌクレオチドの組み合わせについて試験する。処理に使用されるオリゴヌクレオチドの量は以下の通りである：各々１５ピコモル（合わせて３０ピコモル）又は化合物の各々について有効用量５０に対応する量。
【０２９５】
化合物の組み合わせは、上述されるアッセイにおける場合のように、ハイブリッドウイルスの複製を阻害するために使用される。異なる部位に標的化されたオリゴヌクレオチドの使用は、同じ部位に標的化された別々に修飾されたオリゴヌクレオチドの使用よりも効果的であり、修飾オリゴヌクレオチドを用いた処置の阻害効果はいくつかの異なるオリゴヌクレオチドの使用によって増加することが予想される。また、（当該技術分野において報告されているｓｉＲＮＡ処置の類推による）修飾オリゴヌクレオチドを用いた処置は、標的領域において変異を担持するウイルスゲノムの出現を減少させ、したがって抗ウイルス処置への抵抗性を減少させることになる。
【実施例１３】
【０２９６】
修飾オリゴヌクレオチドが安定にトランスフェクトされた細胞株におけるＨＣＶの複製を阻害する
ＨＣＶ感染のインビトロモデルにおける修飾オリゴヌクレオチドの効果を決定するために、ＨＣＶ持続感染は、抗生物質耐性マーカー及びウミシイタケ・ルシフェラーゼレポーター遺伝子のルシフェラーゼを担持するＨＣＶレプリコンを用いてｈｕｈ７細胞をトランスフェクトすることによってモデル化される。ＨＣＶ複製は、レポータータンパク質の発現レベルを解析することによってモニターされる。細胞は、修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチド（必要に応じて複数回）で処理され、それらの効率は、処置後の選択された時間点でルシフェラーゼ活性を測定することによってモニターされる。
【０２９７】
アッセイは、前述の実施例に記載されるオリゴヌクレオチド組成物を用いて上記で設定したものと類似している。アッセイは、メルカプト核酸塩基、ヒドロキシ核酸塩基を有するオリゴヌクレオチド、キレート剤及び金属イオンを用いてヌクレアーゼと複合化された組成物を用いて行われる。また、化合物は、慢性感染症（すなわち、ＨＣＶによって引き起こされる最も重大な疾患状態である患者のＨＣＶの慢性感染症に関連している）を確認しているウイルスに対する効果を有することが予想される。
【実施例１４】
【０２９８】
修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドは一時的にトランスフェクトされたマウスにおけるＨＣＶトランス遺伝子の発現を抑制する
ＨＣＶはげっ歯類においては複製しないが、このウイルスにとっては良好な小動物モデルがない。インビトロ条件における修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドの効率を明らかにするために、流体衝撃法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｍｅｔｈｏｄ）によりトランスフェクトされたマウスをモデルとして使用した。不安定化ウミシイタケ・ルシフェラーゼレポーターのコーディング領域、及びアンチセンス修飾オリゴヌクレオチドに対する標的部位（単数又は複数）を含むＨＣＶ領域（単数又は複数）を含むｍＲＮＡを転写する発現構築物を構築する。発現ユニットを含むＤＮＡプラスミドは、流体衝撃法（Ｙｅｉｋｉｌｉｓら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２：６１４９−５５．（２００６）；Ａｎｄｒｉａｎａｉｖｏら、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．６：８７７−８３（２００４））を用いることによって対象マウスの肝臓に送達され、ＨＣＶ配列を含むｍＲＮＡの発現は、肝臓組織におけるレポーター活性の測定によって定量される。
【０２９９】
発現構築物におけるＨＣＶ特異的領域に対する修飾抗ウイルスオリゴヌクレオチドアンチセンスは、発現構築物との同時トランスフェクション、又は発現構築物の送達前、送達とともに及び／若しくは送達後に化合物の繰り返される送達のいずれかを用いてマウスの肝臓に送達される。実施例３〜１１に記載される化合物、並びに実施例１２に記載されるそれら組み合わせをアッセイに使用する。
【０３００】
修飾オリゴヌクレオチドは、インビボにおいて効果的な抗ウイルス活性を示し、及びウイルスのトランス遺伝子の複製を阻害することが予想される。
【０３０１】
また、修飾オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において周知である適切な動物モデルを用いて、他の治療に関連するウイルスに対して測定される。
【０３０２】
上記の例示的な実施例に記載される本発明の多数の修飾及び変更は、当業者に想到されることが予想される。結果として、添付された特許請求の範囲に見られるこのような制限のみが本発明に配されるべきである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【配列表】
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