(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度の変化によって誘起される反応の速度を核磁気共鳴測定によって解析するための装置であって、
１）試料溶液に磁場を与えるＮＭＲスペクトル測定用もしくはＭＲＩ測定用のＮＭＲ磁石と、
２）前記ＮＭＲ磁石内のボアに設置され試料溶液が前記磁場を受ける保持部、前記保持部に連設する環状の配管、前記配管内で試料溶液を循環送液させるポンプ、前記試料溶液を前記ＮＭＲ磁石外で温度調節する第一温度調節部、及び前記試料溶液を観察を行いたい反応温度に温度調節する第二温度調節部を備えた試料溶液循環系と、
３）前記保持部外周に配置され試料溶液のＮＭＲ信号を検知する検出コイル、及び前記ＮＭＲ信号を受けＮＭＲスペクトルあるいはＭＲＩイメージ画像に変換する分光計を備えた検出・制御部と、
からなり、
４）前記第二温度調節部を前記ＮＭＲ磁石内に設置し、前記第二温度調節部と前記保持部との距離を短縮したことを特徴とする核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
【請求項２】
前記第一温度調節部及び前記第二温度調節部の内一方が試料溶液を加熱する加熱部で、
他方が試料溶液を冷却する冷却部であること、を特徴とする請求項１に記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
【請求項３】
前記分光計が、前記ポンプの駆動を制御するＯＮ／ＯＦＦ信号を生成し、前記ポンプに送信し、前記ポンプの駆動を制御することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
【請求項４】
ＮＭＲスペクトル測定の場合には、前記保持部、前記検出コイル及び第二温度調節部で核磁気共鳴のプローブを構成するとともに、前記プローブを前記ボアに着脱可能としたことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置において、
前記ポンプを作動させ前記第二温度調節部で温度変化させた試料溶液を前記保持部に送液し、前記ポンプを停止させ、所定時間経過毎に前記保持部内の試料溶液のＮＭＲ測定をし、さらに、前記ポンプの作動、停止、前記試料溶液のＮＭＲ測定のセットを複数回繰り返し、ＮＭＲ信号として得られた等価のＮＭＲスペクトルあるいはＭＲＩイメージ画像を複数積算して反応速度を解析することを特徴とする核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置において、
前記第二温度調節部から前記保持部までの試料溶液の送液時間を１秒以内としたことを特徴とする核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度の変化によって誘起される反応の速度を、ＮＭＲスペクトル測定やＭＲＩ測定等の核磁気共鳴現象を利用した測定（ＮＭＲ測定）によって解析するため方法と、それを可能とする温度可変機能を伴った装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度の変化によって物質の状態や構造が変換することは、水の相転移に代表されるように、非常に広範な物質に備わる性質である。生体を構成するタンパク質も、常温下では固有の立体構造を形成するのに対して、高温下では変性してそれを失う。一部のタンパク質は、加熱によって変性させても、再度冷却すれば巻き戻り、固有の立体構造を取り戻す。
【０００３】
分子の立体構造変化や化学構造の変化を検出する核磁気共鳴を利用したスペクトル測定法（以下、ＮＭＲスペクトル測定という。）は、非常に情報量の多い有用な測定法であり、タンパク質の構造変化についても鋭敏に検出することが出来る。赤坂らは、ＮＭＲスペクトル測定によってタンパク質の巻き戻り過程を観察し、得られたスペクトル（以下、ＮＭＲスペクトル）の変化を解析することにより、タンパク質の構造変化の反応の速度定数を得ることに成功している（非特許文献１、２）。
【０００４】
非特許文献１、２の技術では、ＮＭＲ磁石の検出部に設置されたタンパク質溶液の入った試料管に対して、高温の空気を吹き付けて変性させた後、低温の空気に切り替えて巻き戻りを誘導し、複数のＮＭＲ測定を連続して行う。そして、ＮＭＲスペクトル変化を指数関数変化として解析することにより、速度定数を定量している。非特許文献１、２で得られた速度定数は０．０３ｓ−１〜０．０４ｓ−１程度であった。
【０００５】
しかしながら、非特許文献１、２の技術では、さらに１桁速い反応(速度定数０．５ｓ−１程度)の解析は難しいと考えられる。その理由として、吹き付ける空気の切り替え後に、温度が目的の値に到達し安定するまでに１０秒程度かかることが挙げられる。これがデッドタイムとなり、この間に、早い反応の振幅は、おおよそ１／１７０と著しく減衰し、解析が困難となる。
【０００６】
タンパク質の変性、巻き戻りの誘導の方法としては、上記の空気の吹き付け以外に、タンパク質が溶解した試料を循環フロー系の中で送液ポンプの力で循環させ、その中に加熱部と冷却部を挿入し、それぞれ、変性と巻き戻りを誘導することが行われている（非特許文献３）。
【０００７】
非特許文献３の方法では、送液ポンプを常に稼働状態にしているため、加熱部を経て変性したタンパク質試料溶液が冷却部を経て巻き戻り反応を開始し、ＮＭＲ測定の検出コイルに到達した時点での１つのＮＭＲスペクトルのみの観察に留まっており、速度定数は得られていない。
【０００８】
また、タンパク質の巻き戻りを誘導するための冷却部がＮＭＲ磁石の外に存在するため、検出コイルとの距離があり、巻き戻り反応後に検出コイルに到達するまでの時間が１５秒程度となる。したがって、送液ポンプを止めてＮＭＲスペクトル変化を観察できたとしても、速度定数０．５ｓ−１のレベルの反応は解析できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−３１５８２６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】赤坂ら「Construction and performanceof a temperature-jump NMR apparatus」Rev. Sci. Instrum.61, 66-68, 1990
【非特許文献２】赤坂ら「Temperature-jump NMR study ofprotein folding: Ribonuclease A at low pH」J. Biomol. NMR1, 65-70, 1991
【非特許文献３】Alderら「Structuralstudies of a folding intermediate of bovine pancreatic ribonuclease A bycontinuous recycled flow」Biochemistry 27, 2471-2480,1988
【非特許文献４】北川ら「A new titration system of anovel split-type superconducting magnet NMR spectrometer」Rev. Sci. Instrum. 79, 123109, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
非特許文献１〜３に開示の従来技術では、温度変化に伴うタンパク質の構造変化開始後、ＮＭＲスペクトル変化を検出できるまでの間が１０秒程度以上となり、速度定数０．５ｓ−１のレベルの反応の解析が非常に困難である。
【００１２】
そこで、本発明は、温度の変化によって誘起される、温度変化応答性が高い反応の反応速度であってもＮＭＲ測定を用いて解析することができる核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置、より具体的には、試料を含む試料溶液が温度変化開始後に１秒以内にＮＭＲ磁石内の保持部に到達し、その後の待ち時間を合わせたデッドタイムを２秒以下に短縮できる構造にすることにより、速度定数０．５ｓ−１の程度の早い反応の速度定数の定量を、ＮＭＲ測定を用いて行うことができる核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記課題を解決するために、
（１）
温度の変化によって誘起される反応の速度を核磁気共鳴測定によって解析するための装置であって、
１）試料溶液に磁場を与えるＮＭＲスペクトル測定用もしくはＭＲＩ測定用のＮＭＲ磁石と、
２）前記ＮＭＲ磁石内のボアに設置され試料溶液が前記磁場を受ける保持部、前記保持部に連設する環状の配管、前記配管内で試料溶液を循環送液させるポンプ、前記試料溶液を前記ＮＭＲ磁石外で温度調節する第一温度調節部、及び前記試料溶液を観察を行いたい反応温度に温度調節する第二温度調節部を備えた試料溶液循環系と、
３）前記保持部外周に配置され試料溶液のＮＭＲ信号を検知する検出コイル、及び前記ＮＭＲ信号を受けＮＭＲスペクトルあるいはＭＲＩイメージ画像に変換する分光計を備えた検出・制御部と、
からなり、
４）前記第二温度調節部を前記ＮＭＲ磁石内に設置し、前記第二温度調節部と前記保持部との距離を短縮したことを特徴とする核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
（２）
前記第一温度調節部及び前記第二温度調節部の内一方が試料溶液を加熱する加熱部で、
他方が試料溶液を冷却する冷却部であること、を特徴とする（１）に記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
（３）
前記分光計が、前記ポンプの駆動を制御するＯＮ／ＯＦＦ信号を生成し、前記ポンプに送信し、前記ポンプの駆動を制御することを特徴とする（１）又は（２）に記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
（４）
ＮＭＲスペクトル測定の場合には、前記保持部、前記検出コイル及び第二温度調節部で核磁気共鳴のプローブを構成するとともに、前記プローブを前記ボアに着脱可能としたことを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
（５）
（１）〜（４）のいずれかに記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置において、
前記ポンプを作動させ前記第二温度調節部で温度変化させた試料溶液を前記保持部に送液し、前記ポンプを停止させ、所定時間経過毎に前記保持部内の試料溶液のＮＭＲ測定をし、さらに、前記ポンプの作動、停止、前記試料溶液のＮＭＲ測定のセットを複数回繰り返し、ＮＭＲ信号として得られた等価のＮＭＲスペクトルあるいはＭＲＩイメージ画像を複数積算して反応速度を解析することを特徴とする核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
（６）
（１）〜（５）のいずれかに記載の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置において、
前記第二温度調節部から前記保持部までの試料溶液の送液時間を１秒以内としたことを特徴とする核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、上記構成であるので、次の効果を有する。ＮＭＲ磁石内に試料溶液の第二温度調節部（冷却部又は加熱部）を配置しているため、温度変化直後の試料の反応状態を検出することができる。また、ＮＭＲスペクトル測定の場合は、保持部、検出コイル及び第二温度調節部で核磁気共鳴のプローブを構成することで、プローブがボアに容易に着脱可能になる。
【００１５】
また、温度調節装置から保持部まで、試料溶液の送液時間を１秒以内とすることで、反応定数０．５ｓ−１以上の反応定数の定量が可能になる。さらに、試料溶液を送液する配管が環状であり、ポンプの駆動のＯＮ／ＯＦＦを制御することで、保持部内で試料溶液のＮＭＲ測定をすることを繰り返し行うことができ、ＮＭＲ信号を積算することが可能となり、シグナル／ノイズ比が向上し、温度変化によって誘起される反応を精度よく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明である核磁気共鳴を利用した速度解析装置の模式図である。
【図２】図２は、本発明である核磁気共鳴を利用した速度解析装置の他の形態の模式図である。
【図３】図３は、タンパク質の巻き戻り反応に伴うＮＭＲスペクトル変化グラフである。
【図４】ＮＭＲピーク強度（図３で矢印表示した位置）の時間変化を指数関数フィッティングすることにより、０．４７ｓ−１の速度定数を得た結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について、図面を参照しながら詳細に説明する。図１に示すように、本発明である核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１は、ＮＭＲスペクトル測定用であって、（１）ＮＭＲ磁石４と（２）試料溶液循環系２と（３）検出・制御部３とからなる。
【００１８】
（１）ＮＭＲ磁石４は、試料溶液に磁場を与える、従来からＮＭＲスペクトル測定に用いられているものを採用することができる。例えば、ＮＭＲ磁石４は、横置きスプリットタイプで中心部のスプリットギャップにアクセスしやすい比較的大きな空間を生じる超伝導磁石（特許文献１、非特許文献４）を用いることができる。必ずしも横置きでなくてよい。また、医療用ＭＲＩ測定に用いられているＮＭＲ磁石でもよい。
【００１９】
（２）試料溶液循環系２は、ＮＭＲ磁石４内のボアに設置され試料溶液がＮＭＲ磁石４から磁場を受ける場所である保持部２ｅと、保持部２ｅに連設する環状の配管２ａと、配管２ａ内で試料溶液を循環送液させるポンプ２ｂと、試料溶液をＮＭＲ磁石４外で加熱する加熱部２ｃ（第一温度調節部）と、試料溶液をＮＭＲ磁石４内で冷却する冷却部２ｄ（第二温度調節部）からなる。保持部２ｅはＮＭＲスペクトルを取得する場合には従来のＮＭＲスペクトル測定用の試験管を採用することができる。なお、ＭＲＩ測定でＭＲＩイメージ画像を取得する場合には、人工心臓など試験管と同等のものを採用することができる。
【００２０】
冷却部２ｄをＮＭＲ磁石４内のボアに設置することにより、検出コイル３ａとの距離を短縮でき、デッドタイムの短縮を実現することができる。加熱部２ｃ、冷却部２ｄは、ヒートポンプなどによる熱交換器などが例示できる。
【００２１】
具体的には、加熱部２ｃでは配管２ａに熱媒体を直接或いは間接的に接触させて加熱することなどが挙げられる。また、ＮＭＲ磁石４内の第二温度調節部である冷却部２ｄでは、配管２ａに直接又は間接的に接触させるため、冷媒をＮＭＲ磁石４外に設置された冷凍機、冷却器（図示せず）から別途管を介して循環するなどの方法が例示できる。
【００２２】
ポンプ２ｂは接点信号等によって、ＯＮ／ＯＦＦの制御ができることが望ましい。また、送液能力は、例えば内径０．５ｍｍの配管２ａに対して１０ｍＬ／ｍｉｎ以上の速度での送液できることが望ましい。
【００２３】
従って、ポンプ２ｂ、試料溶液循環送液用の配管２ａについては、高速液体クロマトグラフィーで用いられるポンプ、ポリエチレンエチレンケトン（ＰＥＥＫ）などの化学的に安定かつ１００℃程度の耐熱性がある材質のチューブが望ましい（特許文献１、非特許文献４）。
【００２４】
また、配管２ａがそのような可撓性素材であれば、容易にプローブ５をボアに出し入れすることができる。なお、図１では、配管２ａはＮＭＲ磁石４を上下に貫通して配置されているが、保持部２ｅ後の配管２ａもＮＭＲ磁石４の下側からポンプ２ｂに接続してもよい。
【００２５】
（３）検出・制御部３は、保持部２ｅの外周に配置され、試料溶液の核磁気共鳴信号であるＮＭＲ信号を検知する検出コイル３ａと、分光計３ｂからなる。分光計３ｂは、検出コイル３ａを通して試料溶液にラジオ波３ｃを照射し、検出コイル３ａを通してＮＭＲ信号３ｄを受ける。ＮＭＲスペクトル測定する場合には、ＮＭＲ信号３ｄをフーリエ変換することによりＮＭＲスペクトルを得る。ＭＲＩ測定する場合には、ＮＭＲ信号３ｄをＭＲＩイメージ画像に変換する。また、ポンプ２ｂの駆動を制御するＯＮ／ＯＦＦ信号３ｅを生成、送信する。
【００２６】
従って、分光計３ｂは、ポンプ２ｂの駆動のＯＮ／ＯＦＦ、ラジオ波３ｃの照射、ＮＭＲ信号３ｄの検出のタイミングを制御し、またこれを繰り返すことにより、反応の速度定数解析のための複数の等価のＮＭＲ信号３ｄの取得と複数のＮＭＲスペクトル（或いはＭＲＩイメージ画像）の積算によるシグナル／ノイズ比向上を実現する。なお、ポンプ２ｂのＯＮ／ＯＦＦ制御は、分光計と分離してタイマーなどで制御してもよい。
【００２７】
そして、ＮＭＲスペクトル測定用の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１において、保持部２ｅと検出コイル３ａと冷却部２ｄで、核磁気共鳴のプローブ５を構成する。ＮＭＲ磁石４の内部空間（ボア）にプローブ５は着脱できる。
【００２８】
以下、図１の試料溶液循環系２の場合における試料溶液の温度制御、送液制御、検出コイル３ａにおける検出方法について説明する。
【００２９】
加熱部２ｃは、例えば、２０Ｌ以上の水を張った金属製の容器に、市販のサーモスタット付きの投げ込み式ヒーターを入れて、容器内の水を加熱することで、試料溶液を加熱する。冷却部２ｄは、例えば、ＮＭＲ磁石４内の検出コイル３ａ近傍に設置した容器に、ＮＭＲ磁石４外に設置した市販の冷却水循環装置を用い、低温の水もしくは不凍液をシリコンチューブ等によって循環させる（図示省略）。
【００３０】
加熱部２ｃでの試料溶液の温度は、タンパク質の変性温度以上である８０℃とし、冷却部２ｄの温度は保持部２ｅ内において観察を行いたい反応温度（但し、タンパク質の変性温度以下）に従って設定する。例えば、保持部２ｅ内での試料溶液の反応温度を４０℃とする場合、内径０．５ｍｍの配管２ａで１０ｍＬ／ｍｉｎの送液速度とすると、冷却部２ｄの温度設定が２６℃であれば、８０℃に加温された試料溶液がポンプ２ｂによって保持部２ｅ送液された時点でちょうど４０℃となる。
【００３１】
また、保持部２ｅ内での反応温度を２０℃とする場合は、冷却部２ｄの温度を１２℃に設定すると、同様の効果が得られる。保持部２ｅ内の目標温度と設定温度の一致は、ポンプ２ｂの送液停止平衡時とポンプ２ｂ作動直後の水のシグナル位置の一致により判断する。この際、磁場補正のためのＮＭＲロックを外すことにより、水のシグナル位置は温度変化に対して鋭敏に反応する。
【００３２】
加熱部２ｃには、１回のポンプ２ｂの作動によって移動する試料溶液（例えば０．５ｍＬ程度）を超える容量のタンパク質溶液を変性状態で保っておくことが必要である。配管２ａを束ねるなどして加熱部２ｃに入れる場合、内径０．５ｍｍのチューブであれば２ｍ５０ｃｍでこの量となる。
【００３３】
一方で、加熱部２ｃの出口から、保持部２ｅまで含む容量は、１回のポンプ２ｂ作動によって移動する容量以下である必要がある。これにより、試料溶液、例えば変性・巻き戻りの反応過程のタンパク質溶液で保持部２ｅを満たすことができる。保持部を０．１８ｍＬとすると、０．３２ｍＬ以下、上記のチューブで１ｍ６０ｃｍ以下となる。
【００３４】
また、冷却部２ｄの中の試料溶液が通過する領域として、上記のチューブで２０ｃｍ（０．０４ｍＬ）程度とれば、効率的に冷却できる。冷却部２ｄの出口から、保持部２ｅまでの距離は短いほど良いが、上記のチューブで２０ｃｍ以下（０．０４ｍＬ）にすることが望ましい。
【００３５】
この結果、冷却開始となる冷却部２ｄの入り口から、保持部２ｅの中心位置までの流路容量は０．１７ｍＬ以内となる。送液を１０ｍＬ／ｍｉｎで行えば、冷却部２ｄの入り口から保持部２ｅまで１秒以内で到達する。
【００３６】
このようにしてなる核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１は、特許文献１の循環フロー系を改変し、温度の変化によって誘起される反応の速度定数を定量するための装置を構成する。
【００３７】
先ず、ポンプ２ｂのＯＮ／ＯＦＦを分光計３ｂからＯＮ／ＯＦＦ信号３ｅで制御可能にし、ＮＭＲ測定中は試料溶液の循環を止めることによって、核磁気共鳴スペクトルの時間変化の解析が可能なシステムとなる。
【００３８】
次に、冷却部２ｄをＮＭＲ磁石４の中まで組み入れ、試料溶液が保持部２ｅに到達した時点で直ちに目的の温度に達するように温度を調整することにより、デッドタイムの２秒以下への短縮を実現する。
【００３９】
このシステムにおいて、加熱、冷却、ＮＭＲ測定を繰り返し、得られた等価の核磁気共鳴スペクトルを積算することによって、シグナル／ノイズ比が向上できる。上記のシステムにより、０．５ｓ−１程度以上精度の高い速度定数の定量が可能となる。
【００４０】
ＮＭＲスペクトル測定のための超伝導磁石部は、超伝導コイルを浸す液体ヘリウム槽をＮＭＲ磁石４内に保持しており、中心部の狭い空間（ボア）にＮＭＲ信号３ｄ検出のためのプローブ５を差し込み、プローブ５中に、検出コイル３ａや保持部２ｅの温度調節のための電熱ヒーターやガスフロー系を設置している（図示省略）。
【００４１】
これに加えて、試料溶液循環系２を組み入れ、さらにそのための冷却部２ｄを組み込むことは、これまでに行われていない。
【００４２】
特に、ほとんどの市販のＮＭＲ測定用のプローブ５においては、検出コイル３ａの中に外から脱着可能な電熱ヒーターが設置されており、そこにさらに冷却部２ｄを配置する発想はなかった。
【００４３】
図２の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１１では、ＮＭＲスペクトル測定用であって、図１における核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１の加熱部２ｃと冷却部２ｄの位置を交換し、第一温度調節部を冷却部２ｄとし第二温度調節部を加熱部２ｃとした試料溶液循環系１２である。試料溶液、温度調節の方法、測定目的に応じて、核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１と核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１１を使い分ける。
【実施例１】
【００４４】
次に、図１に示す核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１を用いて、試料溶液として、ウシ膵臓ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＡ（ＥＣ３．１．２７．５、Ｓｉｇｍａ社Ｒ５５００）を０．３ｍＭの濃度で、２０ｍＭ重水素化酢酸（ｐＨ３．１：ｐＨメータの表示）を含む９９．９％重水に溶解したタンパク質溶液を使用して、タンパク質の温度依存的立体構造変化の反応速度定数を解析した結果について説明する。なお、本発明である核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置は、タンパク質の立体構造変化の反応を測定することに限らず、ＮＭＲ測定できる化学反応の反応速度解析に使用できることは勿論である。
【００４５】
当該試験では、図１の構成の核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１において、配管２ａを内径０．５ｍｍＰＥＥＫチューブとした。また加熱部２ｃを８０℃、冷却部２ｄを２６℃、別途ガスフローによってＮＭＲ磁石４内でプローブ５を構成する検出コイル３ａ部分を４０℃に温度調節した。そして、ポンプ２ｂを３．５秒間作動させて送液を行い、その停止後、１．２秒間の待ち時間を置き、その後２．０秒おきに７回のＮＭＲ測定を行って、ＮＭＲ信号３ｄとしてそれぞれ取得した（図３）。
【００４６】
３．５秒の送液時間において、最初の１秒程度は圧力が上がらず送液がほとんどされない不感時間であるが、その後の２．５秒間は平均で１２ｍＬ／ｍｉｎの速度で流れ、５６０μＬを移送した。
【００４７】
実施例１で採用した試料溶液循環系２の冷却部２ｄの入り口から保持部２ｅの中心部までの流路容積は１６５μＬで、冷却部２ｄで冷却が開始されてから検出コイル３ａへ送液されるまでの到達時間は約０．８秒であった。そして、ポンプ停止後からＮＭＲ測定前の待ち時間である１．２秒を到達時間に加えた２．０秒が、核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置１でのデッドタイムとなる。
【００４８】
このデットタイムであれば、０．５ｓ−１の速度定数の反応でも、１／３以上の振幅が残存していることになり、反応速度の解析は十分可能である。なお、前記所定時間、ポンプ停止中の測定回数は、反応速度、種類により適宜変更されるのは勿論である。
【００４９】
そして、ポンプ２ｂの作動、停止、試料溶液のＮＭＲ測定のセットを複数回繰り返しポンプ２ｂ停止後からの時間の異なる７つの核磁気共鳴スペクトルを複数取得し、時間毎にそれぞれ積算し、シグナル／ノイズ比を高めた。
【００５０】
図３に、１回に７つの異なる時間でＮＭＲ測定して得られるＮＭＲスペクトルについて、４４８回のセットを取得し、時間ごとに積算したスペクトルを表示した。最初のＮＭＲスペクトルの測定時点を０とし、２秒間隔で合計７つのＮＭＲスペクトルについて、重ねて表示した。
【００５１】
また、図３の囲み部分を右に拡大して表示した。矢印の位置は、図４に表示の指数関数フィッティングに用いたピーク位置を示す。
【００５２】
図３から、変性したタンパク質由来のピークが減少する一方、巻き戻ったタンパク質由来のピークが増加することが観察できる。
【００５３】
ピーク強度の変化を指数関数フィッティングし、ほぼ０．５ｓ−１の反応速度定数（０．４７ｓ−１の）を得た（図４）。おそらく、３割程度大きい反応速度定数でも十分解析可能であると考えられる。
【符号の説明】
【００５４】
１    核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置
２    試料溶液循環系
２ａ  配管
２ｂ  ポンプ
２ｃ  加熱部
２ｄ  冷却部
２ｅ  保持部
３    検出・制御部
３ａ  検出コイル  
３ｂ  分光計
３ｃ  ラジオ波
３ｄ  ＮＭＲ信号
３ｅ  ＯＮ／ＯＦＦ信号
４    ＮＭＲ磁石
５    プローブ
１１  核磁気共鳴を利用した反応速度解析装置
１２  試料溶液循環系
【図１】
0005831872.tif 000002
【図２】
0005831872.tif 000003
【図３】
0005831872.tif 000004
【図４】
0005831872.tif 000005