(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを有し、該対物レンズを介して第１の周波数で強度変調された照明光を標本に照射し、前記標本からの、前記第１の周波数で強度が変化する蛍光を取得する顕微鏡装置であって、
第２の周波数で強度変調され、前記照明光及び前記蛍光の少なくとも一方の波長領域と重複する波長を有するフォーカス光を放射する光源部と、
光を検出して検出信号を出力する光検出部と、
前記フォーカス光を前記対物レンズを介して前記標本に照射するとともに、前記対物レンズの光軸方向に沿った位置であって、前記標本の所定の位置とは異なる位置で反射した前記フォーカス光を前記光検出部に導くフォーカス光学系と、
前記光検出部から出力される前記検出信号から、前記第２の周波数を有する信号を取り出す信号抽出部と、
前記信号抽出部で抽出された前記信号に基づいて、前記対物レンズと前記標本との相対位置関係を変化させることで、前記対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に維持する制御部と、を有する焦点維持装置を有し、
前記第２の周波数は、前記第１の周波数よりも低い周波数であることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第１の周波数は、前記第２の周波数の整数倍でないことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記光源部は、光を放射する光源と、前記第２の周波数の信号を出力する信号発生器と、前記光源から放射された前記光の強度を前記信号発生器から出力される前記信号により強度変調して前記フォーカス光として射出させる強度変調素子と、を有し、
前記信号抽出部は、前記信号発生器から出力される前記信号により前記検出信号から前記第２の周波数を有する信号を抽出する検出機構を有することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記光源部は、前記第２の周波数の信号を出力する信号発生器と、前記信号発生器から出力される前記信号により強度変調されたフォーカス光を出力する光源と、を有し、
前記信号抽出部は、前記信号発生器から出力される前記信号により前記検出信号から前記第２の周波数を有する信号を抽出する検出機構を有することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記光源部は、前記第２の周波数で繰り返されるパルス光を前記フォーカス光として放射する光源と、前記フォーカス光の一部を取り出す光学部材と、前記光学部材で取り出された前記フォーカス光の一部を検出する光検出器と、を有し、
前記信号抽出部は、前記光検出器から出力された前記第２の周波数を有する信号により前記検出信号から前記第２の周波数を有する信号を抽出する検出機構を有することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、焦点維持装置を持つ顕微鏡が市場を拡大しつつある。常に標本に合焦し続ける焦点維持装置は、長時間のタイムラプス観察や試薬投与に伴う観察画像のボケやユレを効果的に除去することができる。焦点維持の手法の一つとして、アクティブ方式がある。この手法は、標本（カバーガラスなど）に照射したフォーカス光（以下「ＡＦ光」と呼ぶ）の反射から、標本のＺ方向の位置（対物レンズの光軸方向位置）を検出する。この際ＡＦ光として顕微鏡本来の照明光・信号光（標本からの光）とは異なる波長の光を用いている（例えば、特許文献１参照）。そして、ＡＦ光検出部において、波長情報を用いてＡＦ光以外の光を除去し，ＡＦ光のみを検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−３２３０９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、波長情報をもとにＡＦ光を検出する手法では、ＡＦ光として用いる光の波長を照明光・信号光の波長として使用できず、顕微鏡観察における波長選択性の自由度が低下してしまうという課題があった。例えば、従来の蛍光顕微鏡では、照明光・信号光（蛍光）ともに可視域にあるため、ＡＦ光として近赤外光を用いることで、波長重複の問題を比較的回避しやすかった。しかし昨今、２光子励起蛍光顕微鏡に代表される非線形光学顕微鏡が注目を浴びている。これらの手法では照明光と信号光の波長関係が実に多種多様であり、ＡＦ光と重複しない波長領域を定めるのは非常に困難である。従って、照明光・信号光の波長選択性に制限を与えないようなＡＦ光検出機構が求められている。
【０００５】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、ＡＦ光の波長が信号光・照明光の波長と重複しても、ＡＦ光のみを検出できる焦点維持装置を有する顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するために、本発明に係る顕微鏡装置は、対物レンズを有し、この対物レンズを介して第１の周波数で強度変調された照明光を標本に照射し、標本からの、第１の周波数で強度が変化する蛍光を取得する顕微鏡装置であって、第２の周波数で強度変調され、照明光及び蛍光の少なくとも一方の波長領域と重複する波長を有するフォーカス光を放射する光源部と、光を検出して検出信号を出力する光検出部と、フォーカス光を対物レンズを介して標本に照射するとともに、対物レンズの光軸方向に沿った位置であって、標本の所定の位置とは異なる位置で反射したフォーカス光を光検出部に導くフォーカス光学系と、光検出部から出力される検出信号から、第２の周波数を有する信号を取り出す信号抽出部と、信号抽出部で抽出された信号に基づいて、対物レンズと標本との相対位置関係を変化させることで、対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に維持する制御部と、を有する焦点維持装置を有し、第２の周波数は、第１の周波数よりも低い周波数であることを特徴とする。
【０００７】
このような顕微鏡装置において、第１の周波数は、第２の周波数の整数倍でないことが好ましい。
【０００８】
また、このような顕微鏡装置において、光源部は、光を放射する光源と、第２の周波数の信号を出力する信号発生器と、光源から放射された光の強度を信号発生器から出力される信号により強度変調してフォーカス光として射出させる強度変調素子と、を有し、信号抽出部は、信号発生器から出力される信号により検出信号から第２の周波数を有する信号を抽出する検出機構を有することが好ましい。
【０００９】
また、このような顕微鏡装置において、光源部は、第２の周波数の信号を出力する信号発生器と、この信号発生器から出力される信号により強度変調されたフォーカス光を出力する光源と、を有し、信号抽出部は、信号発生器から出力される信号により検出信号から第２の周波数を有する信号を抽出する検出機構を有することが好ましい。
【００１０】
また、このような顕微鏡装置において、光源部は、第２の周波数で繰り返されるパルス光をフォーカス光として放射する光源と、このフォーカス光の一部を取り出す光学部材と、この光学部材で取り出されたフォーカス光の一部を検出する光検出器と、を有し、信号抽出部は、光検出器から出力された第２の周波数を有する信号により検出信号から第２の周波数を有する信号を抽出する検出機構を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を以上のように構成すると、ＡＦ光の波長が信号光・照明光の波長と重複しても、ＡＦ光のみを検出できる焦点維持装置を有する顕微鏡装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１の実施形態に係る焦点維持装置の構成を示す説明図である。
【図２】対物レンズによるＡＦ光の結像面と標本面との関係を示す説明図であって、（ａ）は結像面と標本面とが一致している場合を示し、（ｂ）は標本面が結像面より奥側にある場合を示し、（ｃ）は標本面が結像面より手前側にある場合を示す。
【図３】ＡＦ光と照明光及び信号光との関係を示す説明図である。
【図４】第２の実施形態に係る焦点維持装置の構成を示す説明図である。
【図５】第３の実施形態に係る焦点維持装置の構成を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［第１の実施形態］
以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、本実施形態に係る焦点維持装置の構成について説明する。この焦点維持装置１０は、ＬＥＤ等の光源２１を有する光源部２０からのＡＦ光を、フォーカス光学系３０を用いて顕微鏡装置６０の対物レンズ６１に導き、この対物レンズ６１を介して標本面Ｏに照射し、その反射光を４分割フォトダイオード４０（円状の領域が４分割され、各領域にＰＤ（フォトダイオード）が配置された光検出素子であって、以下、「ＱＰＤ４０」と呼ぶ）等で構成される光検出部で検出することで、対物レンズ６１に対する標本面ＯのＺ軸方向位置を検出するものである。
【００１４】
この焦点維持装置１０のフォーカス光学系３０は、光源２１側から順に、光源２１から放射されたＡＦ光を略平行光束に変換するコリメートレンズ３１、略平行光束の略半分を遮光するマスク３２、入射するＡＦ光の略半分を透過し、残りを反射させる第１ハーフミラー３３、後述する機能を有するオフセットレンズ３４、及び、顕微鏡装置６０を構成する対物レンズ６１の像側に配置され、光源２１から放射されたＡＦ光を対物レンズ６１に導くとともに、標本面Ｏで反射されたＡＦ光を焦点維持装置１０に導く第２ハーフミラー３５を有している。
【００１５】
また、この焦点維持装置１０のフォーカス光学系３０は、標本面ＯからのＡＦ光（反射光）が第１ハーフミラー３３で反射する方向に、結像レンズ３６を有している。なお、ＱＰＤ４０は、結像レンズ３６の焦点面上に配置されている。また、この焦点維持装置１０の光源部２０は、ＡＦ光の強度を変調する強度変調素子である音響光学素子２２（以下、「ＡＯＭ２２」と呼ぶ）、所定の周波数ｆｍで振動する信号を出力する信号発生器であるファンクションジェネレータ２３（以下、「ＦＧ２３」と呼ぶ）、及び、このＦＧ２３からの信号に応じてＡＯＭ２２の作動を制御するドライバ２４を有し、また、この焦点維持装置１０は、後述するように、ＦＧ２３からの信号に応じてＱＰＤ４０で取得された信号から所定の信号を取り出す信号抽出部を構成する検出機構であるロックインアンプ４１、及び、このロックインアンプ４１により取り出された信号に基づいて顕微鏡装置６０の合焦の制御を行う制御部５０を有している。このように、本第１の実施形態では、光源２１及びＡＯＭ２２によりＡＦ光を放射する光源部２０を構成している。
【００１６】
このような構成の焦点維持装置１０において、光源２１から射出したＡＦ光は、コリメートレンズ３１により略平行光束に変換された後、マスク３２によりビームプロファイルが半月状になり、ＡＯＭ２２に入射する。ＡＯＭ２２はＦＧ２３とドライバ２４によって周波数ｆｍでオン−オフを繰り返すよう制御されており、このＡＯＭ２２を透過して射出するＡＦ光に変調周波数ｆｍで強度変調が施される。このＡＦ光の略半分は第１ハーフミラー３３を透過し、オフセットレンズ３４により曲率変化を受け、さらに第２ハーフミラー３５により、照明光と合波され、対物レンズ６１に導かれる。そして、対物レンズ６１によって集光されたＡＦ光は、標本面Ｏで反射し、再び対物レンズ６１を通過する。その後、第２ハーフミラー３５で反射し、オフセットレンズ３４を通過し、第１ハーフミラー３３により反射されて結像レンズ３６によりＱＰＤ４０上に集光される。
【００１７】
なお、オフセットレンズ３４は、対物レンズ６１の焦点面に対してＡＦ光の結像位置をＺ軸方向にずらす機能を有している。すなわち、光源２１から放射されてコリメートレンズ３１により略平行光束になったＡＦ光がオフセットレンズ３４を通過した後も略平行光である場合は、対物レンズ６１により結像するＡＦ光の位置は対物レンズ６１の焦点面に略一致する。一方、オフセットレンズ３４を射出したＡＦ光が発散光である場合は、ＡＦ光の結像位置は対物レンズ６１の焦点面より奥側に移動し、オフセットレンズ３４を射出したＡＦ光が収束光である場合は、ＡＦ光の結像位置は対物レンズ６１の焦点面より手前側に移動する。このように、対物レンズ６１の焦点面に対してＡＦ光の結像位置を光軸方向にずらす（オフセットする）ことにより、対物レンズ６１の焦点は標本内の所望の位置に合焦させながら、対物レンズ６１の焦点面とは異なる位置（例えば、標本を覆うプレートガラスと標本との境界面（上述の「標本面Ｏ」）でＡＦ光を反射させて焦点の維持を行うことができる。
【００１８】
また、図２（ａ）に示すように、オフセットレンズ３４で指定した位置に標本面Ｏがある時は、結像レンズ３６に入射する光は略平行光である（図２において、光軸方向をＺ軸方向とし、この光軸に直交する面内で互いに直交する方向の一方をＸ軸方向とし、他方をＹ軸方向とする）。これは焦点ズレがない状態を表し、ＱＰＤ４０の中心に光が結像している。一方、図２（ｂ），（ｃ）に示すように、焦点ズレが生じると、ＱＰＤ４０上での光強度分布が変化する。例えば、図２（ｂ）のように、標本面Ｏが対物レンズ６１から離れると、結像レンズ３６に入射する光が収束光になる。そのため、ＱＰＤ４０よりも手前で結像し、このＱＰＤ４０上では左にずれる。また、図２（ｃ）のように、標本面Ｏが対物レンズ６１に近づくと、結像レンズ３６に入射する光が発散光になる。そのため、ＱＰＤ４０よりも奥で結像し、このＱＰＤ４０上では右にずれる。このように、ナイフエッジ法（半月集光）により焦点ズレをＱＰＤ４０上での位置ズレとして検出し、図２（ａ）の状態を保持するように制御部５０でフィードバック制御する（例えば、ＱＰＤ４０の検出結果に応じて標本が載置されたステージを対物レンズ６１の光軸に沿って移動させる）ことで焦点維持を達成できる。
【００１９】
このとき、ＱＰＤ４０を構成する各ＰＤで検出される光には、図３に示すように焦点維持に必要なＡＦ光の他に、照明光と信号光も混入している。そのため、入射した光の強度和に応じた電気信号が各ＰＤから出力される。このようなＱＰＤ４０からの出力はロックインアンプ４１に送られる。ロックインアンプ４１は取り出したい信号（この場合はＡＦ光）の周波数と位相情報によって、雑音（この場合は信号光及び照明光）を除去するデバイスである。ＱＰＤ４０からの出力信号と、ＦＧ２３から出力されＡＦ光をＡＯＭ２２で強度変調したものと同じ、周波数ｆｍの参照信号の積を取ることで、ＱＰＤ４０から出力される信号のうち、周波数ｆｍを持つ信号（すなわち、ＡＦ光）のみが直流成分に変換される。この大きさはＡＦ光と参照信号の位相差に依存する。そして、このロックインアンプ４１に内蔵されているローパスフィルタ(以下「ＬＰＦ」と呼ぶ)により、直流成分のみを検出することで、ＡＦ光のみを検出することができる。雑音（信号光，照明光）は周波数ｆｍの成分を持たないため、直流成分に変換されることはなく、ＬＰＦを通過できないからである。このように、ロックインアンプ４１は、ＱＰＤ４０からの出力信号のうち、ＦＧ２３から得られる参照信号と同じ周波数ｆｍを有する信号のみを同期検波する。従って、波長が重複していても、ＡＦ光を照明光・信号光から分離検波することができる。上述のように、ロックインアンプ４１によって検出された信号（ＡＦ光）が標本面Ｏの焦点位置情報を有しており、この信号を用いて制御部５０によりフィードバック処理を行い、ステージがズレを補正するように光軸に沿って移動することで焦点維持を達成することができる。
【００２０】
ここで、雑音の１／ｆゆらぎ特性を考慮すると、ＡＦ光を変調する周波数ｆｍは、高い値にするほどロックインアンプ４１で取り出される信号のノイズを減らすことができ、たとえば、この周波数ｆｍを１００ＫＨｚ以上とすることが望ましい。また、変調されたＡＦ光は、正弦波の形状よりも矩形波の形状の方が感度を高くすることができる。
【００２１】
また、顕微鏡装置６０において、照明光を変調するときは、照明光を変調する周波数とＡＦ光を変調する周波数ｆｍとを異なる値にしなければならない。１／ｆゆらぎ特性を鑑みて、ＡＦの感度よりも顕微鏡本体の感度を向上させるには、照明光を変調する周波数に対して、ＡＦ光を変調する周波数ｆｍを低くする方が良い。これにより、照明光に変調歪による高調波成分が発生したとしても、それはＡＦ光検出には影響しない。また、この時、ＡＦ光に変調歪による高調波成分が発生し、その成分が照明光の変調周波数と一致若しくは近似してしまうと、ＡＦ光が顕微鏡本体の検出感度を低下させてしまう。そのため、照明光を変調する周波数は、ＡＦ光を変調する周波数ｆｍの整数倍にしないことが望ましい。
【００２２】
このように、本実施形態に係る焦点維持装置１０は、ＬＥＤ等からなる光源２１から放射されるＡＦ光をＡＯＭ２２で所定の周波数ｆｍで強度変調することにより、このＡＦ光を顕微鏡装置６０における照明光若しくは信号光（蛍光）が同一の波長であっても、上記ロックインアンプ４１より、所定の周波数ｆｍを有するＡＦ光の信号だけを取り出すことができるので、顕微鏡装置６０において、信号光・照明光の波長選択に制限がなくなる。
【００２３】
なお、光源２１は、ＬＥＤに限定されず、ＬＤ（レーザーダイオード）を用いることもできる。また、強度変調素子は、音響光学素子（ＡＯＭ）２２の代わりに光チョッパや電気光学素子を用いることもできる。また、４分割フォトダイオード（ＱＰＤ）４０の代わりに、ＰＤアレイを用いることもできる。
【００２４】
［第２の実施形態］
第１の実施形態では、ＬＥＤ等の光源２１から放射されたＡＦ光を、ＡＯＭ２２で強度変調させる光源部２０の構成について説明したが、図４に示すように、光源２１として半導体レーザーを用い、ドライバ２４により半導体レーザーへの注入電流を変調周波数ｆｍで直接変調することで、この光源２１から放射されるＡＦ光を強度変調するように光源部２０を構成することができる。このような構成によると、第１の実施形態で示したＡＯＭ２２のような変調素子を使用しなくても変調されたＡＦ光を用いることができる。なお、図４においては、第１の実施形態と同一の構成要素については同一の符合を付し、詳細な説明は省略する（以下も同様である）。
【００２５】
また、半導体レーザーである光源２１の変調周波数を高くすると、周波数チャープが発生してＡＦ光の波長が変化し、標本の観察に影響を及ぼす可能性があるため、周波数チャープの発生しない変調周波数ｆｍとすることが望ましい。
【００２６】
［第３の実施形態］
第１及び第２の実施形態では、ＡＦ光を変調するために、光源部２０にファンクションジェネレータ（ＦＧ）２３を設けていたが、図５に示すように、光源２１としてパルスレーザーを用いると、このＦＧ２３も不要となる。パルスレーザーは、所定の繰り返し周波数のパルス光を放射するものであり、この繰り返し周波数を上述の所定の周波数ｆｍとすることにより、ロックインアンプ４１でこの周波数ｆｍを有するＡＦ光を検出することができる。なお、ロックインアンプ４１に入力する参照信号は、ＡＦ光の光路上にこのＡＦ光の一部を反射し、残りの一部を透過する光学部材２５を配置し、その反射光を光検出器であるフォトダイオード（ＰＤ）２６で検出して所定の周波数を有する信号として出力することで、取得することができる。この光学部材２５は、ガラスのようにＡＦ光の一部（数％程度）を反射することができる部材であれば良い。
【００２７】
なお、この第３の実施形態の場合、照明光の光源にもパルスレーザーを用いている場合には、照明光のパルスの繰り返し周波数とＡＦ光のパルスの繰り返し周波数とが一致しないようにする必要がある。また、標本の励起観察をする場合には、ＡＦ光の強度が、標本で蛍光を発生しない程度にする（励起しない強度にする）必要がある。
【００２８】
以上に説明した第１〜第３の実施形態において、焦点ずれを検出する方法としてナイフエッジ法（半月集光）を例として示したが、本発明がこの方法に限定されることはない。また、オフセットレンズ３４の有無も、本発明を限定するものではない。
【符号の説明】
【００２９】
１０  焦点維持装置    ２０  光源部    ２１  光源
２２  ＡＯＭ（強度変調素子）
２３  ファンクションジェネレータ（信号発生器）
２５  光学素子    ２６  フォトダイオード（光検出器）
３０  フォーカス光学系    ４０  ＱＰＤ（光検出部）
４１  ロックインアンプ（検出機構）    ５０  制御部
６０  顕微鏡装置    ６１  対物レンズ
【図１】
0005831782.tif 000002
【図２】
0005831782.tif 000003
【図３】
0005831782.tif 000004
【図４】
0005831782.tif 000005
【図５】
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