(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリン−３(fibulin-3)タンパク質を有効成分として含む、肺癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物。
【請求項２】
前記フィブリン−３タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
フィブリン−３遺伝子を含むベクターで形質転換して製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養培地を有効成分として含む肺癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物。
【請求項４】
前記肺癌幹細胞が、癌幹細胞マーカーであるＣＤ１３３（prominin-1;AC133）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体;P-glycoprotein1）及びＡＬＤＨ１（Aldehyde dehydrogenase 1）からなる群から選択されるいずれか一つのマーカーによって選別されたものであることを特徴とする、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記フィブリン−３タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項３記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記肺癌幹細胞が、癌幹細胞マーカーであるＣＤ１３３（prominin-1;AC133）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体;P-glycoprotein1）及びＡＬＤＨ１（Aldehyde dehydrogenase 1）からなる群から選択されるいずれか一つのマーカーによって選別されたものであることを特徴とする、請求項３記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリン−３(fibulin-3)タンパク質を製造して、それを有効成分として含む癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物またはフィブリン−３を用いた癌幹細胞の成長抑制方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今まで癌の発生原因は、正常細胞が何らかの外部的原因によって突然変異を起こして発生すると報告されてきた。したがって、現在まで癌の治療のために正常細胞とは異なる癌細胞で特異的に発現するか過剰発現する遺伝子を捜して、その遺伝子を目標とする抗癌剤開発及び治療がなされてきたが、癌が転移した癌患者や癌が再発した患者には上記の治療法だけでは癌細胞を完全に除去することができなかった。このような患者らの研究において、近年、癌細胞内に癌を起こす細胞が別に存在し、この細胞は正常幹細胞の特徴を有していて、このような細胞が癌を発生させると報告され、このような細胞は幹細胞の特徴を有していることから「癌幹細胞」と命名された。癌幹細胞のパラダイムは、腫瘍という多様な潜在的能力(pulprint potency)と自己再生能力(self renewal)を示す特定の細胞群によって起因するというものである（非特許文献１）。癌幹細胞の存在は、急性骨髄性白血病(leukemia)で初めて証明され、最近は乳癌を含む一般固形癌でも癌幹細胞が存在することを証明されることによって、固形癌腫でも幹細胞が存在することが確認されるようになった（非特許文献２、３）。このような腫瘍幹細胞は、今までに開発された抗癌剤に抵抗性を示し、癌細胞中の８０〜９０％は実際に再発能力がないが、残りの１０〜２０％（腫瘍幹細胞）は抗癌剤を投与した時に死なないで残存して再発する。
【０００３】
したがって、癌細胞の再発と転移を避けて癌を完全に除去するためには、癌細胞のみを攻撃する現在の癌治療法が有している限界を越えて、幹細胞の特徴を有する癌幹細胞を標的にして癌幹細胞を除去する抗癌剤の開発が必要である。
【０００４】
現在の抗癌療法は、外科手術と化学療法と放射線療法が主に用いられている。特に、外科手術を除く化学療法及び放射線療法の場合、多様な製剤と放射線などが使用されるがそれらの適用は人体が耐えられる程度の範囲に限定される。これら化学療法及び放射線療法の制限的な適用は、動物試験でいくら優れた効能が見られても臨床ではその効果が相殺されて適用範囲が制限され、効能が制限される短所があるからである。これは抗癌剤耐性を有した癌細胞の出現またはそれぞれの療法の細胞毒性に起因した副作用によるものである。例えば、シスプラチン(cisplatin)は最も効果的な癌治療剤であり、現在臨床で使用されている３０余種の抗癌剤の中で最も有用な薬剤の一つであって、精巣癌、卵巣癌、肺癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌などの癌に薬効があることが知られている（非特許文献４）。しかし、最近はシスプラチン耐性を有した癌が多く報告されていて、現在このような耐性を有した癌細胞が問題視されていて、癌治療後に再発の恐れがあるのでシスプラチンと異なる化学物質との複合療法またはシスプラチンと細胞内発現タンパク質の調節による治療の研究が活発に進行中であるのが実情である（非特許文献５）。また、放射線療法は、適量の放射線を患部に照射することによって人体に発生する各種癌を治療する抗癌療法であり、このような放射線療法は人体の造血機能を低下させて免疫系を抑制し、癌治療の有効性を低める問題点がある。さらには反復的な放射線の照射によって癌細胞が抵抗性を獲得するようになるので、このような放射線療法にも抗癌治療における限界が存在する。
【０００５】
このような癌幹細胞のマーカーとしては、ＣＤ１３３（prominin-1またはＡＣ１３３）及びＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体またはP-glycoprotein 1）などが使用されていて、最近はアセトアルデヒド分解酵素（Aldehyde dehydrogenases 1：ＡＬＤＨ１）が明らかにされた。ＡＬＤＨは、細胞内アルデヒドを酸化させる解毒酵素で、アルキル化剤や酸化ストレスに相当な抵抗性を示すようにする（非特許文献６、７）。また、ＡＬＤＨはレチノール(retinol:ビタミンA)を癌の治療と予防に重要なレチノイド(retinoid)の中で最も活性形態であるレチノイン酸に転換させて細胞の成長及び増殖に影響を与える。ＡＬＤＨは、普通１９個の遺伝子が存在することが知られていて、ＡＬＤＨ１、２、３クラスに区分される。なかでも、ＡＬＤＨ１のみがレチナール(retinal)をレチノイン酸(retinoic acid)に転換させるレチナール脱水素酵素活性を有していて、ＡＬＤＨ１Ａ１とともにＡＬＤＨ１Ａ３(retinaldehyde dehydrogenase 3)が最も効果的な活性を有している（非特許文献８）。したがって、ＡＬＤＨ１の活性は、肺癌細胞株などから癌幹細胞の部分集団(subpopulation)を分離するのに効果的に使用されている（非特許文献９）。
【０００６】
最近、癌再発の原因となる癌幹細胞の生成に重要な役割をすると報告された（非特許文献１０）ウィンド／ベータカテニン(wnt/β-catenin)経路は、進化的に保存された経路で、胚発生の間の細胞成長、形態、細胞の運動性を調節する経路である。この経路は、体細胞幹細胞及びそれらの環境を調節することで腸及び脳などを含む組織の恒常性を維持するのに重要な役割をする。またウィンド(wnt)は、癌で活性化していることがよく知られていて、それによってグリコーゲン生成酵素リン酸化酵素３（Glycogen synthase kinase 3:GSK3)の活性が阻害されてＧＳＫ３の基質であるベータカテニン(β-catenin)が蓄積されるようになる。このような非正常的なウィンド(wnt)経路は、腫瘍の発生及び増殖を誘導する。
【０００７】
フィブリン(fibulin)タンパク質群は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と結合したタンパク質であり細胞間相互作用または細胞と基質の間の相互作用に寄与するタンパク質であって、タイプ１からタイプ６まで６種類が公知である。一部のフィブリンタンパク質は、腫瘍を抑制する新しい遺伝子標的として提案されている。最近、フィブリン−５と相同のフィブリン−３が細胞成長調節及びいくつかの腫瘍に作用することが報告され、フィブリン−５は腫瘍抑制を経て細胞増殖、浸透、血管内皮成長因子と腫瘍血管新生に関連があると報告された（非特許文献１１、１２、１３、１４）。また、フィブリン−３は、細胞成長調節と腫瘍血管新生そしていくつかの腫瘍を減少させると報告された（非特許文献１５）。しかし、腫瘍発生を誘導しまたは持続的にその特徴を維持して抗癌治療に抵抗する癌幹細胞に対するフィブリン−３の影響は、まだ報告されていない。
【０００８】
本発明者らは、非小細胞肺癌細胞であるが、浸透性と電離放射線のような細胞毒性に対して異なる感度を有するＨ４６０及びＡ５４９細胞で、ＡＬＤＨ１活性をマーカーとして使用して癌幹細胞を分離し、分離したＡＬＤＨ１活性または非活性細胞でのフィブリン−３の発現量に差があることを確認した。また、前記分離した細胞でフィブリン−３の発現量が増加すれば、癌幹細胞の特徴を示すベータカテニンならびに浸透関連因子であるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７が減少し、フィブリン−３によって癌幹細胞の成長が減少することを確認した。フィブリン−３が過剰発現した培地で処理しても同じ結果であることを確認した。同時に、フィブリン−３精製用ベクターを構築して、フィブリン−３タンパク質を精製し、精製したフィブリン−３タンパク質が非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞、乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞及び癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞の細胞成長を抑制することを確認して、前記フィブリン−３が癌幹細胞の成長抑制用組成物に効果的に用いることができることを明らかにして本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】B.M. Boman,M.S. Wicha,Cancer stem cells:a step toward the cure, J. Clin. Oncol.2008年,第26巻,p.2795-2799
【非特許文献２】D. Bonnet, J.E. Dick,Human acute myeloid leukemia is organized as hierachy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med,1997年,第3巻,p.730-737
【非特許文献３】M. Al-Hajj, M.F. Clarke,Self-renewal and tumor stem cells. Oncogene,2003年,第23巻,p.7274-7284
【非特許文献４】Teni Boulikas,Oncology Reports,2003年,第10巻,p.1663-1682
【非特許文献５】Tito Fojo,Oncogene,2003年,第22巻,p.7512-7523
【非特許文献６】Blood,1996年,第87巻,p.1097-1103
【非特許文献７】Chem. Biol. Interact.2003年,第143-144巻,p.5-22
【非特許文献８】Biochim. Biophys. Acta,2009年,第1790巻,p.1660-1664
【非特許文献９】Mol. Cancer. Res.,2009年,第7巻,p.330-338
【非特許文献１０】Nature Reviews Cancer,2009年9月,第5巻,p.744-749
【非特許文献１１】J. Biol. Chem.,2002年,第277巻,p.27367-27377
【非特許文献１２】DNA. Cell Biol.,2004年,第23巻,p.367-379
【非特許文献１３】Future Oncology,2005年,第1巻,p.23-35
【非特許文献１４】Cancer Res.,2009年,第69巻,p.6339-6346
【非特許文献１５】Cancer Res.,2006年,第66巻,p.2621-2629
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、癌幹細胞成長抑制活性を有するフィブリン−３タンパク質を提供することである。
【００１１】
また、本発明の目的はフィブリン−３タンパク質の製造方法を提供することである。
【００１２】
また、本発明の目的は、フィブリン−３タンパク質またはフィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株もしくはその培養液を有効成分として含む癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物を提供することである。
【００１３】
さらに、本発明の別の目的は、癌幹細胞を、有効な量の、フィブリン−３タンパク質またはフィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株もしくはその培養液で処理する工程を含む、癌幹細胞の成長抑制方法を提供することである。
【００１４】
さらに、本発明の別の目的は、薬学的に有効な量のフィブリン−３タンパク質を、癌幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、癌幹細胞成長抑制方法を提供することである。
【００１５】
さらに、本発明の別の目的は、薬学的に有効な量の、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液を、癌幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、癌幹細胞成長抑制方法を提供することである。
【００１６】
さらに、本発明の別の目的は、癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造に用いるための、フィブリン−３タンパク質の使用を提供することである。
【００１７】
同時に、本発明の別の目的は、癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造に用いるための、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明は、癌幹細胞成長抑制活性を有するフィブリン−３(fibulin-3)タンパク質を提供する。
【００１９】
また、本発明は、
１）フィブリン−３タンパク質をコードするベクターを構築する工程、
２）工程１）のベクターで細胞を形質転換する工程、及び
３）工程２）の細胞の培養液からフィブリン−３タンパク質を精製する工程
を含む、肺癌成長抑制活性を有するフィブリン−３タンパク質の製造方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、癌幹細胞成長抑制活性を有するフィブリン−３タンパク質を有効成分として含む癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、癌幹細胞を有効な量のフィブリン−３で処理する工程を含む、癌幹細胞の成長抑制方法を提供する。
【００２２】
また、本発明は、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液を有効成分として含む癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物を提供する。
【００２３】
また、本発明は、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液で処理する工程を含む、癌幹細胞の成長抑制方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、薬学的に有効な量のフィブリン−３タンパク質を、癌幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、癌幹細胞成長抑制方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、薬学的に有効な量の、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液を、癌幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、癌幹細胞成長抑制方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は、癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造に用いるための、フィブリン−３タンパク質の使用を提供する。
【００２７】
同時に、本発明は、癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造に用いるための、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液の使用を提供する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のフィブリン−３タンパク質は、非小細胞肺癌細胞からＡＬＤＨ１活性を用いて分離した癌幹細胞において、癌幹細胞の特徴を与えるベータカテニンと浸透関連因子（ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７）を阻害することで、癌幹細胞の細胞成長を抑制することができる。さらに本発明のフィブリン−３タンパク質は、非小細胞肺癌細胞、乳癌細胞及び癌幹細胞の成長を抑制することができ、したがって、癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造用に効果的に用いることができる。
[本発明1001]
癌幹細胞成長抑制活性を有するフィブリン−３タンパク質。
[本発明1002]
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明1001のフィブリン−３タンパク質。
[本発明1003]
前記癌が、肺癌または乳癌であることを特徴とする、本発明1001のフィブリン−３タンパク質。
[本発明1004]
１）フィブリン−３タンパク質をコードするベクターを構築する工程、
２）工程１）のベクターで細胞を形質転換する工程、及び
３）工程２）の細胞の培養液からフィブリン−３タンパク質を精製する工程
を含む、癌幹細胞成長抑制活性を有するフィブリン−３タンパク質の製造方法。
[本発明1005]
前記癌が、肺癌または乳癌であることを特徴とする、本発明1004のフィブリン−３タンパク質の製造方法。
[本発明1006]
フィブリン−３(fibulin-3)タンパク質を有効成分として含む、癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物。
[本発明1007]
前記フィブリン−３タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明1006の薬学的組成物。
[本発明1008]
フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液を有効成分として含む癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物。
[本発明1009]
前記癌幹細胞が、癌幹細胞マーカーであるＣＤ１３３（prominin-1;AC133）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体;P-glycoprotein1）及びＡＬＤＨ１（Aldehyde dehydrogenase 1）からなる群から選択されるいずれか一つのマーカーによって選別されたものであることを特徴とする、本発明1006の薬学的組成物。
[本発明1010]
前記癌が、肺癌または乳癌であることを特徴とする、本発明1006の薬学的組成物。
[本発明1011]
癌幹細胞を、有効量のフィブリン−３タンパク質、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株及びその培養液からなる群から選択されるいずれか一つで処理する工程を含む、癌幹細胞の成長抑制方法。
[本発明1012]
前記癌が、肺癌または乳癌であることを特徴とする、本発明1011の癌幹細胞の成長抑制方法。
[本発明1013]
薬学的に有効な量のフィブリン−３タンパク質を、癌幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、癌幹細胞成長抑制方法。
[本発明1014]
薬学的に有効な量の、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液を、癌幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、癌幹細胞成長抑制方法。
[本発明1015]
前記フィブリン−３タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記癌が、肺癌または乳癌であることを特徴とする、本発明1013の方法。
[本発明1017]
癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造に用いるための、フィブリン−３タンパク質の使用。
[本発明1018]
癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造に用いるための、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液の使用。
[本発明1019]
前記フィブリン−３タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明1017の使用。
[本発明1020]
前記癌が、肺癌または乳癌であることを特徴とする、本発明1017の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】フィブリン−３遺伝子のｃ末端部位にヒスチジンタンパク質塩基配列を付けてタンパク質精製用ベクターを作成したことを示した図である。
【図２】Ａ５４９細胞をＡｌｄｅｆｌｕｏｒ染色後、ＦＡＣＳを用いてＡＬＤＨ１活性細胞及びＡＬＤＨ１非活性細胞を分離した結果を示した図である；  ＡＬ（＋）：ＡＬＤＨ１活性を有する細胞；及び、  ＡＬ（−）：ＡＬＤＨ１活性がない細胞。
【図３】ヒスチジンが付着しているフィブリン−３遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞で過剰発現させて発現有無を逆転写重合酵素反応とウエスタンブロットで確認した結果である；  ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写重合酵素反応；    ウエスタン：ウエスタンブロット；  ｐｃＤＮＡ：対照群で空ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞；及び、  Ｈｉｓ−フィブリン３：ヒスチジンが付着しているフィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞。
【図４】Ａ５４９細胞、Ａ５４９から分離したＡＬＤＨ１活性細胞、Ａ５４９から分離したＡＬＤＨ１非活性細胞をコロニー形成分析を通じて確認した結果である；  Ａ５４９：Ａ５４９細胞のコロニー形成；  ＡＬＤＨ＋：ＡＬＤＨ１活性を有する細胞のコロニー形成；及び、  ＡＬＤＨ−：ＡＬＤＨ１活性がない細胞のコロニー形成。
【図５】Ａ５４９から分離したＡＬＤＨ１活性細胞とＡＬＤＨ１非活性細胞におけるＡＬＤＨ１Ａ１、ベータカテニン、及びフィブリン−３の発現量を、Ａ５４９細胞を対照群にして、逆転写重合酵素反応を通じて確認した結果である；  Ａｌｄｅ（＋）：ＡＬＤＨ１活性細胞；  Ａｌｄｅ（−）：ＡＬＤＨ１非活性細胞；及び、  ＡＬＤＨ１Ａ１：ＡＬＤＨ１。
【図６】Ａ５４９細胞及びＨ４６０細胞でウエスタンブロットと逆転写重合酵素反応によりベータカテニンの発現量を確認した結果である；  ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写重合酵素反応の結果；及び、  ウエスタン：ウエスタンブロットの結果。
【図７】Ａ５４９細胞及びフィブリン−３が過剰発現したＡ５４９細胞と、Ｈ４６０細胞及びフィブリン−３の発現が抑制されたＨ４６０細胞とで、ベータカテニンおよびフィブリン−３の発現量を確認した結果である；  Ａ５４９：Ａ５４９細胞；  Ａ５４９／Ｖ．Ｃ：コントロールベクターを発現させたＡ５４９細胞対照群；  Ａ５４９／ｐｃＦＢＬＮ３：フィブリン−３過剰発現ベクターを発現させたＡ５４９細胞；  Ｈ４６０：Ｈ４６０細胞；  Ｈ４６０／ｓｉＣｔｌ：ｓｉコントロールベクターを発現させたＨ４６０細胞対照群；  Ｈ４６０／ｓｉＦＢＬＮ３：フィブリン−３発現抑制ベクターを発現させたＨ４６０細胞；  ＦＢＬＮ３：フィブリン−３；  ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写重合酵素反応の結果；及び、  ウエスタン：ウエスタンブロットの結果。
【図８】フィブリン−３過剰発現培地またはフィブリン−３が過剰発現しているＨ４６０細胞培養培地でＡ５４９細胞を処理した後に観察した細胞の顕微鏡写真、及びベータカテニンの発現量の変化をウエスタンブロットで確認した結果である；  Ａ５４９：Ａ５４９細胞；  Ａ５４９／Ｈ４６０Ｍ：Ｈ４６０培養培地で処理したＡ５４９細胞；及び、  Ａ５４９／ＦＢＬＮ３（＋）Ｍ：フィブリン−３タンパク質を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地で処理したＡ５４９細胞。
【図９】フィブリン−３過剰発現培地もしくはフィブリン−３が過剰発現しているＨ４６０細胞培養培地で処理した、またはフィブリン−３過剰発現培地もしくはフィブリン−３が過剰発現しているＨ４６０細胞培養培地とフィブリン−３抗体とで一緒に処理した、Ａ５４９細胞でのベータカテニン、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７の発現量の変化をウエスタンブロットで確認した結果である；  Ａ５４９：Ａ５４９細胞；  Ａ５４９／Ｈ４６０Ｍ：Ｈ４６０培養培地で処理したＡ５４９細胞；  Ａ５４９／ＦＢＬＮ３（＋）Ｍ：フィブリン−３タンパク質を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地で処理したＡ５４９細胞；  Ａ５４９／Ｈ４６０Ｍ＋ＦＢＬＮ３Ａｂ：Ｈ４６０培養培地及びフィブリン−３抗体で処理したＡ５４９細胞；及び、  Ａ５４９／ＦＢＬＮ３（＋）Ｍ＋ＦＢＬＮ３Ａｂ：フィブリン−３タンパク質を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地及びフィブリン−３抗体で処理したＡ５４９細胞。
【図１０Ａ】Ａ５４９細胞を、濃度が異なるフィブリン−３過剰発現培地とフィブリン−３が過剰発現しているＨ４６０細胞培養培地とで処理した後、Ａ５４９細胞のコロニー形成有無を確認したコロニー写真である；  対照群：Ａ５４９細胞の成長培地で処理した対照群；  フィブリン３−％：フィブリン−３を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地とＡ５４９成長培地の混合培地でのフィブリン−３過剰発現培地の比率；及び、  Ｈ４６０−％：Ｈ４６０細胞の培養培地とＡ５４９成長培地の混合培地でのＨ４６０細胞培養培地の比率。
【図１０Ｂ】図１０Ａのコロニー形成結果をコロニーの個数を計数してグラフ化した図である。
【図１１Ａ】Ａ５４９細胞を、５０％の比率で、ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞または２９３Ｔ細胞の培養培地で処理した後、コロニー形成有無を確認したコロニー写真である；  ＣＨＯ−Ｋ１培地：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞の培地；  ２９３Ｔ培地：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた２９３Ｔ細胞の培地。
【図１１Ｂ】図１１Ａのコロニー形成結果をコロニーの個数を計数してグラフ化した図である。
【図１２Ａ】精製されたフィブリン−３タンパク質でＡ５４９細胞を処理した後、コロニー形成有無を確認したコロニー写真である；  ＣＨＯ−Ｋ１  ２４ｈ−１：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理したＡ５４９細胞；  ＣＨＯ−Ｋ１  ２４ｈ−２：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理して、再び２４時間後にもう一度１μｇで処理したＡ５４９細胞；  ２９３Ｔ  ２４ｈ−１：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた２９３Ｔ細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理したＡ５４９細胞；  ２９３Ｔ  ２４ｈ−２：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた２９３Ｔ細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理して、再び２４時間後にもう一度１μｇで処理したＡ５４９細胞；  ｐｃ−ＤＮＡ：対照群。
【図１２Ｂ】図１２Ａのコロニー形成結果をコロニーの個数を計数してグラフ化した図である。
【図１３Ａ】精製されたフィブリン−３タンパク質でＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を処理した後、コロニー形成有無を確認したコロニー写真である；  ＣＨＯ−Ｋ１  ２４ｈ−１：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞；  ＣＨＯ−Ｋ１  ２４ｈ−２：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理して、再び２４時間後にもう一度１μｇで処理したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞；  ２９３Ｔ  ２４ｈ−１：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた２９３Ｔ細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞；  ２９３Ｔ  ２４ｈ−２：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた２９３Ｔ細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理して、また２４時間後もう一度１μｇで処理したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞；  ｐｃ−ＤＮＡ：対照群。
【図１３Ｂ】図１３Ａのコロニー形成結果をコロニーの個数を計数してグラフ化した図である。
【図１４】フィブリン−３過剰発現培地もしくはフィブリン−３が過剰発現しているＨ４６０細胞培養培地で処理した、またはフィブリン−３過剰発現培地もしくはフィブリン−３が過剰発現しているＨ４６０細胞培養培地とフィブリン−３抗体とで一緒に処理したＡＬＤＨ１活性細胞でのベータカテニン、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７の発現量の変化をウエスタンブロットで確認した結果である；  ＡＬＤＨ＋：ＡＬＤＨ１活性細胞；  ＡＬＤＨ＋／ＦＢＬＮ３（＋）Ｍ：フィブリン−３タンパク質を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地で処理したＡＬＤＨ１活性細胞；  ＡＬＤＨ＋／Ｈ４６０Ｍ：Ｈ４６０細胞の培養培地で処理したＡＬＤＨ１活性細胞；  ＡＬＤＨ＋／ＦＢＬＮ３（＋）Ｍ＋ＦＢＬＮ３Ａｂ：フィブリン−３タンパク質を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地及びフィブリン−３抗体で処理したＡＬＤＨ１活性細胞；及び、  ＡＬＤＨ＋／Ｈ４６０Ｍ＋ＦＢＬＮ３Ａｂ：Ｈ４６０細胞の培養培地及びフィブリン−３抗体で処理したＡＬＤＨ１活性細胞。
【図１５Ａ】ＡＬＤＨ１活性細胞を、濃度が異なるフィブリン−３過剰発現培地とフィブリン−３が過剰発現しているＨ４６０細胞培養培地で処理した後、ＡＬＤＨ１活性細胞のコロニー形成有無を確認したコロニー写真である；  ＡＬＤＨ１＋：ＡＬＤＨ１活性細胞；  対照群：ＡＬＤＨ１細胞の成長培地で処理した対照群；  フィブリン３−％：フィブリン−３を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地とＡＬＤＨ１成長培地の混合培地でのフィブリン−３過剰発現培地の比率；及び、  Ｈ４６０−％：Ｈ４６０細胞の培養培地とＡＬＤＨ１成長培地の混合培地でのＨ４６０細胞培養培地の比率。
【図１５Ｂ】図１５Ａのコロニー形成結果をコロニーの個数を計数してグラフ化した図である。
【図１６Ａ】ＡＬＤＨ１活性細胞を、５０％の比率で、ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞または２９３Ｔ細胞の培養培地で処理した後、コロニー形成有無を確認したコロニー写真である；  ＡＬＤＨ＋：ＡＬＤＨ１活性細胞；  ＣＨＯ−Ｋ１培地：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞の培地；  ２９３Ｔ培地：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた２９３Ｔ細胞の培地。
【図１６Ｂ】図１６Ａのコロニー形成結果をコロニーの個数を計数してグラフ化した図である。
【図１７Ａ】精製されたフィブリン−３タンパク質でＡＬＤＨ１活性細胞を処理した後、コロニー形成有無を確認したコロニー写真である；  ＡＬＤＨ＋：ＡＬＤＨ１活性細胞；  ＣＨＯ−Ｋ１  ２４ｈ−１：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＡＬＤＨ１活性細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理したＡＬＤＨ１活性細胞；  ＣＨＯ−Ｋ１  ２４ｈ−２：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させたＡＬＤＨ１活性細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理して、再び２４時間後にもう一度１μｇで処理したＡＬＤＨ１活性細胞；  ２９３Ｔ  ２４ｈ−１：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた２９３Ｔ細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理したＡＬＤＨ１活性細胞；  ２９３Ｔ  ２４ｈ−２：ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた２９３Ｔ細胞から精製したフィブリンタンパク質１μｇで２４時間後に処理して、再び２４時間後にもう一度１μｇで処理したＡＬＤＨ１活性細胞；  ｐｃ−ＤＮＡ：対照群。
【図１７Ｂ】図１７Ａのコロニー形成結果をコロニーの個数を計数してグラフ化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３１】
本発明は、癌幹細胞成長抑制活性を有するフィブリン−３(fibulin-3)タンパク質を提供する。
【００３２】
前記フィブリン−３タンパク質は、下記１）〜３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有することが好ましいがこれに限定されない：
１）配列番号１で表されるアミノ酸配列；
２）配列番号１の一部分で表わされるアミノ酸配列；及び
３）配列番号１と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列。
【００３３】
前記癌は、肺癌または乳癌であることが好ましく、前記肺癌は非小細胞肺癌であることがさらに好ましい。
【００３４】
また本発明は、
１）フィブリン−３タンパク質をコードするベクターを構築する工程；
２）工程１）のベクターで細胞を形質転換する工程；及び
３）工程２）の細胞の培養液からフィブリン−３タンパク質を精製する工程を含む、癌幹細胞成長抑制活性を有するフィブリン−３タンパク質の製造方法を提供する。
【００３５】
前記癌は、肺癌または乳癌であることが好ましく、前記肺癌は非小細胞肺癌であることがさらに好ましい。
【００３６】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らはタンパク質精製のためのｃ末端部位にヒスチジンタンパク質が付着したフィブリン−３ベクターを構築し（図１参照）、前記ベクターの発現を確認するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（生命工学研究院、大田）及び２９３Ｔ細胞（漢陽大学校、ソウル）にそれぞれ形質導入して重合酵素連鎖反応及びウエスタンブロットを通じてフィブリン−３タンパク質の過剰発現を確認した（図３参照）。また、前記形質転換した細胞を培養した培地で非小細胞肺癌であるＡ５４９細胞及び癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞を処理した結果、非小細胞肺癌であるＡ５４９細胞及び癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞の細胞成長が共に阻害されることを確認した（図１１及び図１６参照）。同時に、前記形質導入した細胞株を用いてフィブリン−３タンパク質を精製して、精製されたフィブリン−３タンパク質による癌細胞の成長抑制効果を確認した。その結果、非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞、癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞及び乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞で細胞成長抑制効果があることを確認した（図１２、図１７及び図１３参照）。
【００３７】
したがって、フィブリン−３タンパク質を癌細胞及び癌幹細胞の成長抑制に効果的に用いることができる。
【００３８】
また、本発明は、本発明によるフィブリン−３タンパク質を有効成分として含む癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物を提供する。
【００３９】
前記フィブリン−３タンパク質は、下記１）〜３）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない：
１）配列番号１で表されるアミノ酸配列；
２）配列番号１の一部分で表わされるアミノ酸配列；及び
３）配列番号１と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列。
【００４０】
前記癌は、肺癌または乳癌であることが好ましく、前記肺癌は非小細胞肺癌であることがさらに好ましい。
【００４１】
前記癌幹細胞は、癌幹細胞のマーカーであるＣＤ１３３(prominin-1;AC133)、ＣＤ４４(ヒアルロン酸受容体;P-glycoprotein 1)及びＡＬＤＨ１からなる群から選択されるいずれか一つのマーカーによって選別されたものが好ましく、ＡＬＤＨ１によって選別されたものがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００４２】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らは非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞から、ＡＬＤＨ１活性に基づいてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ製品(stem cell)を用いることで、癌幹細胞を区別及び選別した（図２参照）。また、本発明者らは非小細胞肺癌と癌幹細胞の差を確認するために、コロニー形成実験で分離したＡＬＤＨ１活性細胞及びＡＬＤＨ１非活性細胞の成長程度を分析した。その結果、Ａ５４９細胞よりＡＬＤＨ１活性細胞が成長していた一方、ＡＬＤＨ１非活性細胞はＡ５４９細胞対照群より成長できなかったことを確認することによって、ＡＬＤＨ１活性を有する癌幹細胞が非小細胞肺癌成長の原動力であることが分かった（図４参照）。同時に、本発明者らはＡＬＤＨ１活性細胞と非活性細胞でのＡＬＤＨ１、フィブリン−３及びベータカテニンの発現量を確認するため逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）とウエスタンブロットを行なった。その結果、ＡＬＤＨ１非活性細胞と反対にＡＬＤＨ１活性細胞ではＡＬＤＨ１と腫瘍発生及び増殖に重要なベータカテニンの発現量が増加したが、フィブリン−３は発現量が減少することを確認した（図５参照）。したがって、癌細胞成長の原動力である癌幹細胞で癌幹細胞の成長に重要であると知られたベータカテニンは増加しているが、フィブリン−３は減少していることを確認することによって、フィブリン−３を癌幹細胞の抑制に効果的に使用できることが分かった。
【００４３】
さらに、本発明の別の具体的な実施例で、本発明者らはフィブリン−３によるベータカテニンの発現量を確認するため、ベータカテニンの発現量が多いＡ５４９細胞にフィブリン−３過剰発現ベクターを形質導入した。ベータカテニンの発現量が少ないＨ４６０細胞において、フィブリン−３抑制用ｓｉＲＮＡでフィブリン−３の発現を抑制した。その結果、フィブリン−３が過剰発現されたＡ５４９細胞でベータカテニンの発現が減少し、その反対にフィブリン−３が抑制されたＨ４６０細胞ではベータカテニンの発現が増加することが分かった（図６及び７参照）。したがって、過剰発現したフィブリン−３が癌幹細胞の成長に重要なベータカテニンを阻害することを確認し、これを通じてフィブリン−３を癌幹細胞の成長抑制に効果的に用いることができることが分かった。
【００４４】
さらに、本発明の別の具体的な実施例で、本発明者らは非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９でフィブリン−３による腫瘍発生及び増殖に重要なベータカテニンと浸透因子であるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７発現の抑制を確認するために、フィブリン−３を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地と、フィブリン−３の発現が多いＨ４６０細胞の培養培地とでＡ５４９細胞を処理した。その結果、前記培地で処理された細胞は死滅が進行することを顕微鏡で確認し、ベータカテニン、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−７の発現が対照群に比べて減少することを確認した（図８及び９参照）。また、フィブリン−３抗体を用いて前記結果がフィブリン−３によるものであることをもう一度確認した。このような結果を通じて、フィブリン−３がベータカテニン、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−７の発現を直接的に抑制することが分かった。さらに、本発明の別の具体的な実施例で、本発明者らは癌幹細胞でのフィブリン−３によるベータカテニン、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−７の発現を確認するために、フィブリン−３が過剰発現したＡＬＤＨ１活性細胞の培養培地と、フィブリン−３の発現が多いＨ４６０細胞の培養培地とでＡＬＤＨ１活性細胞を処理してウエスタンブロットを行なった。その結果、前記二つの培地で処理した群でベータカテニン、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−７の発現が減少したことを確認した。また、フィブリン−３抗体を用いて前記結果がフィブリン−３によるものであることをもう一度確認した（図１４参照）。このような結果を通じて、フィブリン−３が癌幹細胞でベータカテニン、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−７の発現を直接的に抑制することが分かる。
【００４５】
また、本発明者らはフィブリン−３によって非小細胞肺癌細胞の成長が抑制されるかどうかを確認するために、コロニー形成実験を行なった。その結果、フィブリン−３を過剰発現させたＡ５４９細胞の培養培地、及び、フィブリン−３の発現が多いＨ４６０細胞の培養培地を混合した過剰発現培地の両方で培地濃度依存的にＡ５４９細胞の成長が阻害されることを確認した（図１０参照）。また、本発明者らはフィブリン−３によって癌幹細胞の成長が抑制されるかどうかを確認するためにコロニー形成実験を行ない、その結果、前記フィブリン−３過剰発現培地と混合した両方で培地濃度依存的にＡＬＤＨ１活性細胞の成長が阻害されることを確認した（図１０参照）。また、本発明者らはフィブリン−３タンパク質発現用ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターをタンパク質精製が容易なＣＨＯ−Ｋ１細胞及び２９３Ｔ細胞にそれぞれ過剰発現させた後、４８時間培養した培養培地で、非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞と癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞を処理した。その結果、前記培地で処理された細胞は、対照群に比べて細胞成長が阻害されることを確認した（図１１及び１６参照）。同時に、本発明者らは精製されたフィブリン−３タンパク質による癌細胞及び癌幹細胞の細胞成長が抑制されるかどうかを確認するために、非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞、乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞及び癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞または２９３Ｔ細胞をフィブリン−３タンパク質発現用ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターで形質転換して得たフィブリン−３精製タンパク質で処理した後、コロニー形成実験を行なった。その結果、精製されたフィブリン−３タンパク質が非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞、乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞及び癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞で、細胞成長を抑制することを確認した（図１２、図１３及び図１７参照）。
【００４６】
したがって、癌幹細胞の成長抑制においてフィブリン−３タンパク質が癌幹細胞の細胞成長及び浸透因子を抑制することができるので、フィブリン−３タンパク質を癌幹細胞の成長抑制用薬学的組成物の有効成分として効果的に用いることができる。
【００４７】
治療的に有効な本発明の組成物の量は、多くの要素、例えば投与方法、目的部位、患者の状態などによって変わり得る。したがって、人体に使用時の投与量は安全性及び有効性をともに考慮して適正量に決定しなければならない。動物実験を通じて決定された有効量から人間に使用し得る量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮するこのような事項は、例えば、Hardman and Limbird,eds.,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.(2001年),Pergamon Press;及びE.W. Martin ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.(1990年),Mack Publishing Co.に記述されている。
【００４８】
本発明の組成物はまた、生物学的製剤に一般的に使用される担体、希釈剤、賦形剤またはふたつ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、組成物の生体内送達に相応しいものなら特別に制限されず、例えば、Merck Index,13th ed., Merck & Co. Inc.に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中から１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法でまたはRemington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA,18th,1990年）に開示されている方法を用いて、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００４９】
本発明の組成物に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含めることができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記タンパク質を０．０００１〜１０重量％で、０．００１〜１重量％を含むことが好ましい。
【００５０】
本発明の組成物は目的とする方法によって、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）または経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日投与量は、０．０００１〜１０ｍｇ／ｍｌであって、好ましくは０．０００１〜５ｍｇ／ｍｌであって、一日１回〜数回に分けて投与することがさらに好ましい。
【００５１】
また、本発明は、癌幹細胞を有効な量のフィブリン−３で処理する工程を含む、癌幹細胞の成長抑制方法を提供する。
【００５２】
また、本発明は、薬学的に有効な量のフィブリン−３タンパク質を、癌幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、癌幹細胞成長抑制方法を提供する。
【００５３】
前記癌は肺癌または乳癌であることが好ましく、前記肺癌は非小細胞肺癌であることがさらに好ましい。
【００５４】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らは癌幹細胞がフィブリン−３によって成長抑制されるかどうかを確認するために、フィブリン−３タンパク質を過剰発現させたＡＬＤＨ１活性細胞の培養培地、及びフィブリン−３タンパク質の発現が多いＨ４６０細胞の培養培地で、Ａ５４９細胞から分離した癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞を処理した後、コロニー形成実験をした。その結果、前記フィブリン−３過剰発現培地の両方で培地濃度依存的にＡＬＤＨ１活性細胞の成長が阻害されることを確認した。同時に、フィブリン−３タンパク質精製用ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターでＣＨＯ−Ｋ１細胞または２９３Ｔ細胞を形質転換して精製したフィブリン−３タンパク質で、非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞、乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞及び癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞を処理した後、コロニー形成実験を行なった結果、精製されたフィブリン−３タンパク質で処理した細胞の成長が阻害されることを確認した。
【００５５】
したがって、本発明のフィブリン−３タンパク質は、癌幹細胞の成長を抑制する方法に効果的に用いることができる。
【００５６】
また、本発明は、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液を有効成分として含む癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物を提供する。
【００５７】
前記癌は肺癌または乳癌であることが好ましく、前記肺癌は非小細胞肺癌であることがさらに好ましい。
【００５８】
また、本発明は、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液で処理する工程を含む、癌幹細胞の成長抑制方法を提供する。
【００５９】
また、本発明は、薬学的に有効な量の、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液を、癌幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、癌幹細胞成長抑制方法を提供する。
【００６０】
前記癌は肺癌または乳癌であることが好ましく、前記肺癌は非小細胞肺癌であることがさらに好ましい。
【００６１】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らはフィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液によって癌幹細胞の成長が抑制されるかどうかを確認するため、フィブリン−３過剰発現ベクターを５×１０５個のＡＬＤＨ１活性細胞で過剰発現させて４８時間培養した培地と５×１０５個のＨ４６０細胞を４８時間培養した培地でＡＬＤＨ１活性細胞を処理してウエスタンブロットを行なった。その結果、前記二つの培地で処理した群で癌幹細胞の成長に関与するベータカテニン、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−７の発現が減少したことを確認した。また、フィブリン−３抗体を用いて前記結果がフィブリン−３によるものであることをもう一度確認した。このような結果を通じて、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液が、癌幹細胞においてベータカテニン、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−７の発現を直接的に抑制することが分かった。
【００６２】
同時に、本発明者らはフィブリン−３によって癌幹細胞の成長が抑制されるかどうかを確認するためにコロニー形成実験を行い、その結果、前記フィブリン−３過剰発現培地と混合した両方で培地濃度依存的にＡＬＤＨ１活性細胞の成長が抑制されることを確認した。また、本発明者らは、タンパク質精製が容易なＣＨＯ−Ｋ１細胞または２９３Ｔ細胞をフィブリン−３タンパク質発現用ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターで形質転換して培養した培養液が、肺癌細胞、乳癌細胞及び癌幹細胞の成長を抑制するかどうか確認するためにコロニー形成実験を行った。その結果、前記培養液によって肺癌細胞、乳癌細胞及び癌幹細胞の成長が抑制されることを確認した。
【００６３】
したがって、癌幹細胞の成長抑制においてフィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液が癌幹細胞の細胞成長及び浸透因子を抑制することを確認し、これを通じてフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液が癌幹細胞の成長抑制用薬学的組成物及び癌幹細胞成長抑制方法に効果的に用いられ得ることが分かる。
【００６４】
また、本発明は、癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造に用いるための、フィブリン−３タンパク質の使用を提供する。
【００６５】
同時に、本発明は、癌幹細胞成長抑制用薬学的組成物の製造に用いるための、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液の使用を提供する。
【００６６】
前記フィブリン−３タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されない。
【００６７】
前記癌は、肺癌または乳癌であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００６８】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らはフィブリン−３タンパク質を精製して、精製されたフィブリン−３タンパク質の癌細胞成長抑制効果を確認した。その結果、非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞、癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞及び乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞で細胞成長抑制効果があることを確認して、フィブリン−３タンパク質を癌細胞及び癌幹細胞の成長抑制に効果的に用いることができることを確認し、フィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液によって癌幹細胞の成長に関与するベータカテニン、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−７の発現を直接的に抑制することを確認した。同時に、フィブリン−３過剰発現培養液によって肺癌細胞、乳癌細胞及び癌幹細胞の成長が抑制されることを確認することによって、癌幹細胞の成長抑制においてフィブリン−３遺伝子を形質転換させて製造したフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液が、癌幹細胞の細胞成長及び浸透因子を抑制することを確認し、これを通じてフィブリン−３過剰発現細胞株またはその培養液が癌幹細胞の成長抑制用薬学的組成物の製造に効果的に用いられることが分かった。
【００６９】
以下、本発明を実施例、実験例及び製造例によって詳しく説明する。
【００７０】
但し、下記の実施例、実験例及び製造例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例、実験例及び製造例によって限定されるのではない。
【実施例】
【００７１】
（発明実施のための形態）
＜実施例１＞フィブリン−３過剰発現ベクターの構築
＜１−１＞フィブリン−３遺伝子過剰発現クローンの構築
本発明者らは、Ａ５４９細胞でフィブリン−３遺伝子を人為的に過剰発現させるために、フィブリン−３遺伝子の過剰発現クローンを構築した。
【００７２】
具体的には、非小細胞肺癌細胞Ｈ４６０(ATCC no. HTB-177)からHigh Pure RNA Isolation Kit（Roche、ドイツ）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche、ドイツ）を用いて全ＲＮＡ  １μｇに対して逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なった。ｃＤＮＡを合成するために、ＰＣＲ条件を５５℃で３０分、及び８５℃で５分間にした。前記ｃＤＮＡを鋳型にして、５'端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列と３'端にＸｈｏＩ制限酵素認識配列を含むように構築された正方向プライマー
0005717920.tif 000002
（配列番号２）及び逆方向プライマー
0005717920.tif 000003
（配列番号３）のプライマー対を用いて９４℃で５分間前変性させた後、９４℃で１分間変性、５６℃で１分間アニール、７２℃で１分３０秒間伸長を行う条件を３０回繰り返した後、７２℃で５分間後伸長を行なった。このような条件でＰＣＲを遂行することにより、１，４８２ｂｐのフィブリン−３遺伝子を得た。前記で得たＰＣＲ産物及びｐｃＤＮＡ３．１（invitrogen，米国）ベクターをそれぞれ制限酵素で処理した後、混合してリガーゼで連結させてフィブリン−３過剰発現用ｐｃＤＮＡ３．１／フィブリン−３ベクターを構築した。
【００７３】
＜１−２＞フィブリン−３タンパク質精製用ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターの構築
本発明者らは、タンパク質精製をするためにｃ末端部位にヒスチジンタンパク質が付着したフィブリン−３クローンを構築した。
【００７４】
具体的には、前記＜実施例１−１＞の過剰発現用フィブリン−３クローンのＤＮＡ０．１μｇを鋳型にして、ヒスチジンタンパク質がフィブリン−３の後方で発現するようにプライマーを構築してＰＣＲを行なった。５'端にＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列と３'端にＸｈｏＩ制限酵素認識配列とともにヒスチジン(his)タンパク質塩基配列を付着させて構築された正方向プライマー
0005717920.tif 000004
（配列番号１４）及び逆方向プライマー
0005717920.tif 000005
（配列番号１５）のプライマー対を用いて９４℃で５分間前変性させた後、９４℃で１分間変性、６０℃で１分間アニール、７２℃で１分３０秒間伸長を遂行する条件を３０回繰り返した後、７２℃で５分間後伸長を行うことによりＰＣＲを実施し、ｈｉｓタンパク質塩基配列が付着したフィブリン−３遺伝子を得た。前記で得たＰＣＲ産物及びｐｃＤＮＡ３．１（invitrogen、米国）ベクターをそれぞれ制限酵素で処理した後、混合してリガーゼで連結させてｈｉｓタンパク質が付着したフィブリン−３タンパク質精製用ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを構築した（図１）。
【００７５】
＜実施例２＞フィブリン−３タンパク質過剰発現培地の製造及び精製
＜２−１＞フィブリン−３遺伝子過剰発現培地の製造
本発明者らは前記＜実施例１−１＞のフィブリン−３過剰発現ベクターによりフィブリン−３を過剰発現させた細胞を培養した培地を製造した。
【００７６】
具体的には、リポフェクタミン２０００を用いてペニシリン−ストレプトマイシン（Hyclone）が添加されていない培地で５×１０５細胞／ｍｌのＡ５４９細胞に前記＜実施例１−１＞のフィブリン−３過剰発現ベクター２μｇを形質導入した。４〜６時間反応させた後、１００ユニット／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加した培地に入れ替えて４８時間培養し、その培地を得た。
【００７７】
＜２−２＞精製用フィブリン−３タンパク質過剰発現培地の製造
本発明者らは前記＜実施例１−２＞の精製用フィブリン−３タンパク質ベクター(his-fibulin-3)で形質転換した細胞を培養した培地を製造した。
【００７８】
具体的には、タンパク質の精製が容易な細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞（生命工学研究院、大田）及び２９３Ｔ細胞（漢陽大学校、ソウル）をそれぞれ６０ｍｍのプレートにそれぞれ細胞５×１０５個を播種した後、リポフェクタミン２０００を用いてペニシリン−ストレプトマイシン(penicillin-streptomycin solution,Hyclone)が添加されていないＤＭＥＭ：Ｆ１２（Gibco）培地及びＤＭＥＭ(Hyclone)培地でｈｉｓ−フィブリン−３ベクター４μｇを形質導入した。１２時間反応させた後、１００ユニット／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加した培地に入れ替えて４８時間培養し、それぞれその培地を得た。
【００７９】
＜２−３＞ｈｉｓ−フィブリン−３タンパク質の精製
本発明者らは前記＜実施例２−２＞のフィブリン−３タンパク質精製用培地でｈｉｓ−フィブリン−３タンパク質を精製した。
【００８０】
具体的には、ｈｉｓ−フィブリン−３タンパク質の精製のためにＣＨＯ−Ｋ１細胞と２９３Ｔ細胞にｈｉｓ−フィブリン−３ベクターを過剰発現させた後、タンパク質溶解溶液を入れてピペッティングし、４℃で１５〜２０分反応させ、１３０００ＲＰＭの４℃遠心分離機でペレットと上清を分離した。前記の上清に、ＰＢＳ溶液で２回洗浄したｈｉｓビーズ（Qiagen）を入れて４℃で２時間ビーズとｈｉｓ−フィブリン−３タンパク質を結合させる。その後、４℃、３０００ＲＰＭで遠心分離後、ビーズのみ収集し、ＰＢＳ溶液で３回洗浄する。ビーズからＰＢＳ溶液を完全に除去し、溶出液（２５０ｍＭイミダゾール）を入れて常温で５分反応させた後、遠心分離機を用いてｈｉｓ−フィブリン−３タンパク質を精製し、使用のために新しいチューブに移した。ブラッドフォード方法でタンパク質定量キット(Bio-rad)を用いて５９５ｎｍ波長でタンパク質量を測定して４℃で保管した。
【００８１】
＜実施例３＞Ａ５４９細胞からのＡＬＤＨ１活性細胞と非活性細胞の分離
本発明者らは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）活性に基づいたステムセル社のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ製品を用いて非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞から癌幹細胞を区別及び選別した。
【００８２】
具体的には、乾燥したＡＬＤＥＦＬＵＯＲ試薬を２５μｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を入れて１分間常温で反応させ、試薬を赤橙色から明淡黄色になるように活性化した。活性化した試薬に２Ｍの塩酸を２５μｌ入れて１５分間常温で反応させた後、３６０μｌのＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイバッファーを入れて冷蔵保管してＡＬＤＥＦＬＵＯＲ基質を作った。以後、１×１０６個のＡ５４９細胞を遠心分離して上清を分離した。上清は捨ててＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイバッファー１ｍｌを混ぜる。空のチューブを二本準備して前記の細胞とＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイバッファーが混じった試料をそれぞれ５００μｌ入れて、一方のチューブには活性化したＡＬＤＥＦＬＵＯＲ基質を５μｌ入れて、他方のチューブの対照群にはＤＥＡＢ（ジエチルアミノベンズアルデヒド）溶液を５μｌ入れて混合した。二本のチューブを３７℃で反応させた後、遠心分離機を用いて上清を除去して、細胞に５００μｌのＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイバッファーを入れて４℃で２４時間反応させた。負電荷を有するＡＬＤＨ基質であるＢＡＡＡは受動的な拡散を通じて生きている細胞内に浸透すると、細胞内のＡＬＤＨによってＢＡＡ−に転換しながら蛍光を発光するので、ＦＡＣＳソーター（BD bioscience、米国）で蛍光を発光する細胞を活性細胞として、蛍光がない細胞を非活性細胞として識別した（図２）。
【００８３】
＜実験例１＞ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターによるフィブリン−３タンパク質過剰発現確認
本発明者らは、タンパク質精製用ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターによってフィブリン−３タンパク質が過剰発現されるかどうか確認するために前記ベクターを過剰発現させた後、重合酵素連鎖反応及びウエスタンブロットを行なった。
【００８４】
具体的には、タンパク質精製が容易な細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞（生命工学研究院、大田）と２９３Ｔ細胞（漢陽大学校、ソウル）を６０ｍｍのプレートにそれぞれ細胞５×１０５個を分注した後、リポフェクタミン２０００を用いてペニシリン−ストレプトマイシン(Hyclone)が添加されていない培地でｈｉｓ−フィブリン−３ベクター４μｇを形質導入した。１２時間後、１００ユニット／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加した培地に入れ替えて４８時間培養し、ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を集めてフィブリン遺伝子の発現を確認した。まず、ＲＮＡを抽出するために各細胞をトリゾール１ｍｌと５分間混合した後、２００μｌのクロロホルム試薬を入れて再び５分間混合し、４℃の遠心分離機で１０分間遠心分離して２００μｌの上清を得、新しいチューブに移した。前記で得られた上清に５００μｌのイソプロパノールを混合し、常温で１０分間反応させて４℃で遠心分離して上清を除去した後、沈殿物を７５％のエチルアルコールが入ったＤＥＰＣ溶液で洗浄し、再び遠心分離して上清を除去する。遠心分離して得られた沈殿物をＤＥＰＣ溶液で溶解してＲＮＡを得、これを定量した後、Ｉｎｔｒｏｎ社のオリゴｄＴ  ｃＤＮＡキットを用いてＲＮＡ１μｇを増幅器（Takara、日本）において４５℃で１時間、９５℃で５分、ｃＤＮＡを合成した。以後、下記＜表１＞のプライマーおよびＩ−ｔａｑ重合酵素(Intron)を用いて９４℃で５分前変性、９４℃で３０秒変性；５６℃で３０秒アニール；７２℃で３０秒伸長工程を３０回繰り返し、７２℃で１０分間後伸長した後、得られた生成物を１％アガロースゲルにローディングして確認した。
【００８５】
また、ｈｉｓ−フィブリン−３タンパク質発現を確認するためにベクターが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を集めて、各細胞に溶解溶液をそれぞれ５０μｌずつ入れて４℃で３０分間反応させた後、４℃で遠心分離機を用いて遠心分離して上清を得、その次にタンパク質定量キット(sigma)を用いてそれぞれのタンパク質４０μｇずつをＳＤＳ−ゲルにローディングした。ＳＤＳ−ゲルにローディングしたタンパク質をニトロセルロース膜に移動させた後、ＢＳＡバッファーと３０分間常温で反応させて他の抗体が結合できないようにした後、一次抗体である抗ベータカテニン抗体(santa cruz)と抗ベータアクチン抗体(sigma)を１：１０００で希釈したＰＢＳ緩衝液で４時間反応させた後、再び二次抗体である抗マウス(cell signaling)を１：１００００に希釈したＰＢＳ緩衝液で１時間反応させた。その後、ＰＢＳでニトロセルロース膜を５回洗浄後、検出溶液でフィルムに感光させた。
【００８６】
その結果、ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞でフィブリン−３タンパク質が過剰発現することを確認した（図３）。
【００８７】
＜実験例２＞ＡＬＤＨ１活性細胞及びＡＬＤＨ１非活性細胞の特徴確認
＜２−１＞ＡＬＤＨ１活性細胞及びＡＬＤＨ１非活性細胞の成長確認
本発明者らは、Ａ５４９細胞とそれから分離したＡＬＤＨ１活性細胞及びＡＬＤＨ１非活性細胞の成長程度を比較するために、Ａ５４９細胞、それから分離したＡＬＤＨ１活性細胞及びＡＬＤＨ１非活性細胞でコロニー形成の分析を行なった。
【００８８】
具体的には、Ａ５４９細胞、分離したＡＬＤＨ１活性細胞及びＡＬＤＨ１非活性細胞を１×１０３細胞／ｍｌで分注して、３５ｍｍプレートに播種して３７℃二酸化炭素インキュベーターで８日間培養した。コロニーを形成した細胞を０．５％クリスタルバイオレット試薬で１０分間染色した後、数回ＰＢＳで洗浄して顕微鏡で観察した。
【００８９】
その結果、Ａ５４９細胞よりそれから分離したＡＬＤＨ１活性細胞の方がより成長する一方、ＡＬＤＨ１非活性細胞はほとんど成長しないことを確認した（図４）。
【００９０】
＜２−２＞ＡＬＤＨ１活性細胞及びＡＬＤＨ１非活性細胞でのＡＬＤＨ１、フィブリン−３及びベータカテニンの発現確認
本発明者らは、Ａ５４９細胞を対照群にして、それから分離したＡＬＤＨ１活性細胞及び非活性細胞でのフィブリン−３及びベータカテニンの発現量を確認した。
【００９１】
具体的には、Ａ５４９細胞及びそれから分離したＡＬＤＨ１活性細胞及び非活性細胞からＲＮＡを抽出するために、まず、各細胞をトリゾール１ｍｌと５分間混合した後、２００μｌのクロロホルム試薬を入れて再び５分間混合し、４℃の遠心分離機で１０分間遠心分離して２００μｌの上清を得、新しいチューブに移した。前記得られた上清に、５００μｌのイソプロパノールを混合し、常温で１０分間反応させて４℃で遠心分離して上清を除去し、沈殿物を７５％エチルアルコールが入ったＤＥＰＣ溶液で洗浄後、再び遠心分離機を用いて上清を除去した。遠心分離して得られた沈殿物をＤＥＰＣ溶液で溶解してＲＮＡを得、これを定量した後、Intron社のオリゴｄＴ  ｃＤＮＡキットを用いてＲＮＡ１μｇを増幅器（Takara、日本）において４５℃で１時間、９５℃で５分間、ｃＤＮＡを合成した。以後、下記＜表１＞のプライマーおよびＩ−ｔａｑ重合酵素(Intron)を用いて９４℃で５分前変性、９４℃で３０秒変性；５６℃で３０秒アニール；７２℃で３０秒伸長工程を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間、後伸長した後に得られた生成物を１％アガロースゲルにローディングして確認した。
【００９２】
【表１】
0005717920.tif 000006
【００９３】
その結果、ＡＬＤＨ１とベータカテニンはＡＬＤＨ１活性細胞で非活性細胞より発現量が多いことを確認し、反対にフィブリン−３は非活性細胞で活性細胞より発現量が多いことを確認した（図５）。
【００９４】
＜実験例３＞フィブリン−３によるベータカテニン発現抑制効果の確認
＜３−１＞非小細胞肺癌細胞でベータカテニンの発現確認
本発明者らは、非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞とＨ４６０細胞でのベータカテニンの核酸及びタンパク質発現量を確認した。
【００９５】
具体的には、Ａ５４９細胞とＨ４６０細胞からＲＮＡを抽出するために、まず、各細胞をトリゾール１ｍｌと５分間混合した後、２００μｌのクロロホルム試薬を入れて再び５分間混合し、４℃の遠心分離機で１０分間遠心分離して２００μｌの上清を得、新しいチューブに移した。５００μｌのイソプロパノールを混合し、常温で１０分間反応させて４℃で遠心分離して上清を除去した後、沈殿物を７５％エチルアルコールが入ったＤＥＰＣ溶液で洗浄し、再び遠心分離して上清を除去した。遠心分離して得られた沈殿物をＤＥＰＣ溶液に溶解してＲＮＡを得、これを定量した。抽出したＲＮＡ各１μｇをｃＤＮＡ Synthesis Kit(Intron Biotechnology、Gyungki-do、韓国)を用いる逆転写重合酵素連鎖反応(RT-PCR)に供してｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型に前記＜表１＞のベータカテニンプライマーおよびＩ−ｔａｑ重合酵素(Intron)を用いて９４℃で５分前変性、９４℃で３０秒変性；５６℃で３０秒アニール；７２℃で３０秒伸長工程を３０回繰り返してＰＣＲを行なった後、７２℃で１０分間、後伸長した後に得られた生成物を１％アガロースゲルにローディングした後、結果を確認した。
【００９６】
ウエスタンブロットは、まず、各細胞に溶解溶液を各々５０μｌずつ入れて４℃で３０分間反応させた後、４℃の遠心分離機を用いて遠心分離して、上清を得、その次にタンパク質定量キット(sigma)を用いてそれぞれのタンパク質４０μｇずつをＳＤＳ−ゲルにローディングした。ＳＤＳ−ゲルにローディングしたタンパク質をニトロセルロース膜に移動させた後、ＢＳＡバッファーと３０分間常温で反応させて他の抗体が結合できないようにした後、一次抗体である抗ベータカテニン抗体(santa cruz)と抗ベータアクチン抗体(sigma)を１：１０００で希釈したＰＢＳ緩衝液で４時間反応させた後、再び二次抗体である抗マウス(cell signaling)を１：１００００に希釈したＰＢＳ緩衝液で１時間反応させた。その後、ＰＢＳでニトロセルロース膜を５回洗浄した後、検出溶液でフィルムに感光させた。
【００９７】
その結果、ベータカテニンの核酸及びタンパク質の発現がＨ４６０細胞よりＡ５４９細胞でより多いことを確認した（図６）。
【００９８】
＜３−２＞非小細胞肺癌細胞でのフィブリン−３によるベータカテニン発現抑制効果
本発明者らは、非小細胞肺癌細胞でフィブリン−３がベータカテニンの核酸及びタンパク質の発現量に影響を与えるのかどうか確認した。
【００９９】
具体的には、ベータカテニン発現が多いＡ５４９細胞に前記＜実施例１−１＞で構築されたフィブリン−３遺伝子過剰発現クローンを形質導入した。また、ベータカテニンの発現が少ないＨ４６０細胞でフィブリン−３の発現を抑制するためにフィブリン−３遺伝子に対するそれぞれ２５マー(mer)の正方向プライマー
0005717920.tif 000007
（配列番号１２）と逆方向プライマー
0005717920.tif 000008
（配列番号１３）であるフィブリン−3stealth-ＲＮＡｉをInvitrogen社に注文した。前記ｓｉＲＮＡの細胞内導入は、Ｈ４６０細胞２×１０５個当たりのＲＮＡｉ１００ｎＭずつによりリポフェクタミンＲＮＡｉ  ＭＡＸ(invitrogen)を用いて実施し、Scrambled Stealth(商標)ＲＮＡ分子(molecule)を導入した細胞（陰性対照群；siControl）は、Scrambled Stealth(商標)ＲＮＡ分子１００ｎＭによりリポフェクタミンＲＮＡｉ  ＭＡＸ(invitrogen)を用いてペニシリン−ストレプトマイシンが添加されない培地で細胞に形質導入した。形質導入をして４〜６時間後、１００ユニット／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを添加した培地に入れ替えて７２時間培養した。前記細胞を＜実験例２−１＞の方法でフィブリン−３プライマーを用いた重合酵素連鎖反応とフィブリン−３抗体（ab14926,Abcam，英国）を用いたウエスタンブロットを行ない、ベータカテニンプライマーを用いた重合酵素連鎖反応とベータカテニン抗体を用いたウエスタンブロットを行なった。
【０１００】
その結果、Ａ５４９細胞ではフィブリン−３遺伝子過剰発現クローンによってフィブリン−３が過剰発現され、Ｈ４６０細胞ではフィブリン−３ｓｉＲＮＡによってフィブリン−３が阻害されたことを確認した。フィブリン−３が過剰発現されたＡ５４９細胞ではベータカテニンの発現が減少して、フィブリン−３の発現が阻害されたＨ４６０細胞ではベータカテニンの発現が増加することを確認した（図７）。
【０１０１】
したがって、非小細胞肺癌細胞株でフィブリン−３によってベータカテニンの発現が阻害されることを確認した。
【０１０２】
＜実験例４＞癌細胞でのフィブリン−３タンパク質の効果の確認
＜４−１＞非小細胞肺癌細胞でのフィブリン−３のベータカテニン発現抑制効果の確認
本発明者らは、非小細胞肺癌細胞株であるＡ５４９細胞でのフィブリン−３によるベータカテニン発現の抑制効果を確認した。
【０１０３】
具体的には、＜実施例２−１＞で製造したフィブリン−３過剰発現培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地、及びＨ４６０細胞培養培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地を調製し、該培地でそれぞれ２×１０５細胞／ｍｌのＡ５４９細胞を処理した。その後、顕微鏡で細胞の状態を確認し、前記＜実験例３−１＞のウエスタンブロット方法でベータカテニンのタンパク質発現量を確認した。
【０１０４】
その結果、Ｈ４６０細胞培養培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地、及びフィブリン−３過剰発現培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地それぞれで処理した細胞すべてで、非処理Ａ５４９細胞に比べてベータカテニンの発現が抑制されることを確認した（図８）。
【０１０５】
＜４−２＞非小細胞肺癌細胞でのフィブリン−３のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７発現の抑制の確認
本発明者らは、肺癌細胞株であるＡ５４９細胞でのフィブリン−３によるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７発現の抑制効果を確認した。
【０１０６】
具体的には、＜実施例２−１＞で製造したフィブリン−３過剰発現培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地、及びフィブリン−３の発現がＡ５４９細胞に比べて多いＨ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地を調製し、該培地でそれぞれ２×１０５細胞／ｍｌのＡ５４９細胞を処理した。４８時間後、抗ＭＭＰ−２(cell signaling)および抗ＭＭＰ−７(R&D system)抗体を１：１０００の比率で用いて前記＜実験例３−１＞のウエスタンブロット方法でタンパク質発現を確認した。また、フィブリン−３の直接的な作用であることを確認するために、前記二つの培地にフィブリン−３抗体の５００：１希釈物を加えてフィブリン−３の活性を阻害した後、Ａ５４９細胞を処理し、４８時間後、抗ＭＭＰ−２抗体、抗ＭＭＰ−７抗体、および抗ベータカテニン抗体を用いたウエスタンブロットでそれぞれの培地でタンパク質発現を確認した。
【０１０７】
その結果、ベータカテニンタンパク質と同様に、Ａ５４９細胞対照群に比べて、Ｈ４６０細胞培養培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地、及びフィブリン−３過剰発現培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地で処理した細胞で、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−７タンパク質が減少することを確認した。しかし、前記培地にフィブリン−３抗体の５００：１希釈物を加えてＡ５４９細胞を処理したウエスタンブロット結果では、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、およびベータカテニンのタンパク質発現が対照群に比べて差がないことを確認し、これを通じてＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７及びベータカテニン発現の抑制効果がフィブリン−３タンパク質によるものであることを確認した（図９）。
【０１０８】
＜４−３＞フィブリン−３の非小細胞肺癌細胞成長抑制効果の確認
本発明者らは、フィブリン−３による、非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞の成長抑制効果を確認した。
【０１０９】
具体的には、＜実施例２−１＞で製造したフィブリン−３過剰発現培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地、及びフィブリン−３の発現がＡ５４９細胞に比べて多いＨ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地とＡ５４９細胞培地を１：４の比率で混合した培地で、Ａ５４９細胞を処理した。まず、Ａ５４９細胞１×１０３個を３５ｍｍのプレートに播種して２４時間後、フィブリン−３を過剰発現した培地とＡ５４９細胞培地を１：１の比率（５０％）で混合した培地、フィブリン−３過剰発現培地とＡ５４９細胞培地を５：４の比率（８０％）で混合した培地、及び、フィブリン−３過剰発現培地（１００％）でそれぞれ処理した。また、Ｈ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地とＡ５４９細胞培地を１：１の比率（５０％）で混合した培地、Ｈ４６０細胞培養培地とＡ５４９細胞培地を５：４の比率（８０％）で混合した培地、及びＨ４６０細胞培養培地（１００％）でそれぞれ処理した。前記組み合わせの培地で処理した後、３７℃の二酸化炭素インキュベーターで８日間培養し、クリスタルバイオレット０．５％試薬で１０分間染色をしてＰＢＳで数回洗浄して確認した。
【０１１０】
その結果、フィブリン−３過剰発現培地またはＨ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地の混合の比率が高い培地で処理したＡ５４９細胞の成長が、Ａ５４９細胞対照群に比べて阻害されることを確認した（図１０）。
【０１１１】
同時に、本発明者らは＜実施例２−２＞のタンパク質精製用ｈｉｓ−フィブリン−３ベクターで形質転換して得たｈｉｓ−フィブリン−３過剰発現培地でＡ５４９細胞を処理して、細胞成長抑制効果をコロニー形成実験で確認した。
【０１１２】
具体的には、＜実施例２−２＞でＣＨＯ−Ｋ１細胞または２９３Ｔ細胞をそれぞれ用いて調製したｈｉｓ−フィブリン−３過剰発現培地を１：１の比率で混合して、１×１０３個のＡ５４９細胞を処理した後、３７℃の二酸化炭素インキュベーターで７日間培養した。その後、クリスタルバイオレット０．５％試薬で１０分間染色をしてＰＢＳで数回洗浄して確認した。その結果、ｈｉｓ−フィブリン−３過剰発現培地で処理したＡ５４９細胞は、対照群に比べて細胞成長が阻害されることを確認した（図１１）。
【０１１３】
＜４−４＞精製したフィブリン−３タンパク質の癌細胞成長抑制効果の確認
本発明者らは、精製されたフィブリン−３タンパク質による癌細胞成長抑制効果を確認した。
【０１１４】
具体的には、１×１０３個の非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞及び乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を３５ｍｍのプレートに播種して２４時間後、＜実施例２−３＞のｈｉｓ−フィブリン−３精製タンパク質それぞれ１μｇで肺癌細胞及び乳癌細胞を一度または二度（一度処理したところに再び２４時間後もう一度処理）処理した。その後、細胞を３７℃のインキュベーターで７日間培養した後、クリスタルバイオレット０．５％試薬で１０分間染色した後、ＰＢＳで数回洗浄した。
【０１１５】
その結果、肺癌細胞であるＡ５４９細胞及び乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の両方で細胞成長が抑制されることを確認した（図１２及び図１３）。
【０１１６】
＜実験例５＞癌幹細胞でのフィブリン−３の効果の確認
＜５−１＞癌幹細胞でのフィブリン−３によるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、およびベータカテニン発現抑制効果の確認
本発明者らは、癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞でのフィブリン−３によるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７及びベータカテニン発現の抑制効果を確認した。
【０１１７】
具体的には、＜実施例２−１＞で製造したフィブリン−３過剰発現培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を１：４の比率で混合した培地、及びフィブリン−３の発現がＡ５４９細胞に比べて多いＨ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を１：４の比率で混合した培地を調製して、該培地でそれぞれ２×１０５細胞／ｍｌのＡＬＤＨ１活性細胞を処理した。４８時間後、ＭＭＰ−２(cell signaling)、ＭＭＰ−７(R&D system)、ベータカテニン(santa cruz)抗体を用いて前記＜実験例２−１＞のウエスタンブロット方法でタンパク質発現を確認した。また、フィブリン−３の直接的な作用であることを確認するため、前記で混合した二つの培地にフィブリン−３抗体の５００：１希釈物を加えてＡＬＤＨ１活性細胞を処理した４８時間後、ＭＭＰ−２抗体、ＭＭＰ−７抗体、およびベータカテニン抗体を用いたウエスタンブロットでタンパク質発現を確認した。
【０１１８】
その結果、ベータカテニンタンパク質と同様に、ＡＬＤＨ１活性細胞対照群に比べて、Ｈ４６０細胞培養培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を１：４の比率で混合した培地、及びフィブリン−３過剰発現培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を１：４の比率で混合した培地で処理した細胞において、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７及びベータカテニンのタンパク質発現が減少することを確認した。また前記培地にフィブリン−３抗体の５００：１希釈物を加えてＡＬＤＨ１活性細胞を処理したウエスタンブロット結果で、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７及びベータカテニンのタンパク質発現が対照群に比べて差がないことを確認し、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７及びベータカテニン発現の抑制効果がフィブリン−３タンパク質によるものであることを確認した（図１４）。
【０１１９】
＜５−２＞フィブリン−３の癌幹細胞成長抑制効果の確認
本発明者らは、フィブリン−３による、癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞の成長抑制効果を確認した。
【０１２０】
具体的には、＜実施例２−１＞で製造したフィブリン−３過剰発現培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を１：４の比率で混合した培地、及びフィブリン−３の発現がＡ５４９細胞に比べて多いＨ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を１：４の比率で混合した培地でＡＬＤＨ１活性細胞を処理した。まず、ＡＬＤＨ１活性細胞１×１０３個を３５ｍｍのプレートに播種して２４時間後、フィブリン−３を過剰発現した培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を１：１の比率（５０％）で混合した培地、フィブリン−３過剰発現培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を５：４の比率（８０％）で混合した培地、及びフィブリン−３過剰発現培地（１００％）でそれぞれ処理した。また、Ｈ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を１：１の比率（５０％）で混合した培地、Ｈ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地とＡＬＤＨ１活性細胞培地を５：４の比率（８０％）で混合した培地、及びＨ４６０細胞５×１０５個を４８時間培養したＨ４６０細胞培養培地（１００％）でそれぞれ処理した。前記培地で処理後、３７℃の二酸化炭素インキュベーターで８日間培養し、クリスタルバイオレット０．５％試薬で１０分間染色後、ＰＢＳで数回洗浄して確認した。
【０１２１】
その結果、ＡＬＤＨ１活性細胞対照群より、フィブリン−３過剰発現培地、またはＨ４６０細胞培養培地の比率が高い培地で処理したＡＬＤＨ１活性細胞でその成長が阻害されることを確認した（図１５）。
【０１２２】
同時に、本発明者らは＜実施例２−２＞で製造したｈｉｓ−フィブリン−３過剰発現培地による、癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞の成長抑制効果を確認した。
【０１２３】
具体的には、＜実施例２−２＞でＣＨＯ−Ｋ１細胞または２９３Ｔ細胞をそれぞれ用いて調製したｈｉｓ−フィブリン−３過剰発現培地を１：１の比率で混合して、１×１０３個のＡＬＤＨ１活性細胞を処理した後、３７℃の二酸化炭素インキュベーターで７日間培養し、クリスタルバイオレット０．５％試薬で１０分間染色をしてＰＢＳで数回洗浄してコロニー形成実験をした。
【０１２４】
その結果、ｈｉｓ−フィブリン−３過剰発現培地で処理したＡＬＤＨ１活性細胞が、対照群に比べて細胞成長が阻害されることを確認した（図１６）。
【０１２５】
＜５−３＞精製したフィブリン−３タンパク質の癌幹細胞成長抑制効果の確認
本発明者らは、精製されたフィブリン−３タンパク質による癌幹細胞成長抑制効果を確認した。
【０１２６】
具体的には、１×１０３個の癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞を３５ｍｍのプレートに播種して２４時間後、＜実施例２−３＞のｈｉｓ−フィブリン−３精製タンパク質それぞれ１μｇでＡＬＤＨ１活性細胞を一度または二度（一度処理したところに再び２４時間後にもう一度処理）処理した。その後、細胞を３７℃のインキュベーターで７日間培養した後、クリスタルバイオレット０．５％試薬で１０分間染色した後、ＰＢＳで数回洗浄した。
【０１２７】
その結果、癌幹細胞であるＡＬＤＨ１活性細胞の細胞成長が抑制されることを確認した（図１７）。
【０１２８】
＜製造例１＞薬学的製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
フィブリン−３タンパク質                       ２ｇ
乳糖                                            １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【０１２９】
＜１−２＞錠剤の製造
フィブリン−３タンパク質                      １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                               １００ｍｇ
乳糖                                            １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【０１３０】
＜１−３＞カプセル剤の製造
フィブリン−３タンパク質                      １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                               １００ｍｇ
乳糖                                            １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【０１３１】
＜１−４＞丸薬の製造
フィブリン−３タンパク質                         １ｇ
乳糖                                          １．５ｇ
グリセリン                                        １ｇ
キシリトール                                  ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸当たり４ｇになるように製造した。
【０１３２】
＜１−５＞顆粒の製造
フィブリン−３タンパク質                       １５０ｍｇ
大豆抽出物                                       ５０ｍｇ
ブドウ糖                                        ２００ｍｇ
澱粉                                            ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エチルアルコール１００ｍｇを添加して６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、分包に充填した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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