(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）カルボン酸エステル基質と；
（ｉｉ）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて配列番号２と整列する炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒であって、
該シグネチャーモチーフが、
（１）配列番号２の１１８−１２０と整列するアミノ酸位置でＲＧＱモチーフ、
（２）配列番号２の１７９−１８３と整列するアミノ酸位置でＧＸＳＱＧモチーフ、および
（３）配列番号２の２９８−２９９と整列するアミノ酸位置でＨＥモチーフ
を含み、該酵素が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する酵素触媒と；
（ｉｉｉ）２よりも小さいｌｏｇ  Ｐ、ここで、ｌｏｇ  Ｐは、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数として定義され、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水と表される、を有する有機溶媒を含み、該酵素触媒のための基質ではない、少なくとも１つの共溶媒と；
を含み、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の２０００ｐｐｍ未満の水濃度を有する調合物である第１の成分を備えるステップと：
（ｂ）水中の過酸素源を含む第２の成分を備えるステップと：
（ｃ）該第１の成分および該第２の成分を混ぜ合わせて、水性反応調合物を形成させるステップと：
を含む、ペルオキシカルボン酸を生成させるための方法であって、
ここで上記共溶媒は、上記酵素触媒のペルヒドロリシス活性を、同じ反応条件下における当該共溶媒の不在下の当該酵素触媒と比べて減少させることなく、上記水性反応調合物に上記カルボン酸エステル基質を可溶化し、それにより、ペルオキシカルボン酸を生成させる、上記方法。
【請求項２】
表面を殺菌するための方法であって、
請求項１に記載の方法のステップ（ｃ）において形成される水性反応調合物を上記表面に適用するステップを含む、上記方法。
【請求項３】
衣料品または繊維製品を処理するための方法であって、
漂白、汚れの除去、臭気軽減、衛生化、殺菌、またはこれらの混ぜ合わせのために、請求項１に記載の方法のステップ（ｃ）において形成される水性反応調合物を該衣料品または繊維製品に適用するステップを含む、上記方法。
【請求項４】
前記水性反応調合物が、噴霧によって前記表面または前記衣料品に適用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の成分が、１：１〜１：１０の質量比で前記第２の成分と組み合わせられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記共溶媒が、２０質量％〜８０質量％の量で前記第１の成分中に存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質が、前記第１の成分中に、その成分の１０質量％〜６０質量％の量で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の成分が、５５質量％のカルボン酸エステル基質、４０質量％の共溶媒、０．３質量％の酵素触媒、および２．５質量％の充填剤を含み、前記第２の成分が、９５質量％の水、１．５質量％の重炭酸ナトリウム、および１質量％の過酸素源を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の成分が、５５．５質量％のトリアセチン、４１質量％のトリプロピレングリコールメチルエーテル、およびサーモトガ・ネアポリタナもしくはサーモトガ・マリティマペルヒドロラーゼ、またはペルヒドロリシス活性を改善する１つまたは複数の点突然変異を有するサーモトガ・ネアポリタナもしくはサーモトガ・マリティマペルヒドロラーゼの変異誘導体を含む０．３質量％の噴霧乾燥酵素粉末、および２．５質量％のヒュームドシリカを含み、前記第２の成分が、９６質量％の水、０．２質量％の過酸化水素安定剤、および３．２質量％の、３０％過酸化水素を含む溶液とを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の成分および前記第２の成分を混ぜ合わせて水性反応調合物を形成する際に、前記カルボン酸エステル基質の初期濃度が１００ｍＭであり、前記過酸素源の初期濃度が１００ｍＭであり、前記酵素触媒の初期濃度が０．１ｍｇ／ｍＬである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の成分および前記第２の成分を混ぜ合わせて水性反応調合物を形成する際に、前記カルボン酸エステル基質の初期濃度が１０ｍＭであり、前記過酸素源の初期濃度が１０ｍＭであり、前記酵素触媒の初期濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬである、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１２】
前記カルボン酸エステル基質がトリアセチンを含み、前記過酸素源が過酸化水素を含み、前記酵素触媒が、配列番号１６および配列番号７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記カルボン酸エステル基質が、１００ｍｇ／ｍＬ未満の水に対する溶解度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、配列番号２の１７９−１８３と整列するアミノ酸位置でＬＸＤモチーフをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素触媒が、配列番号１４および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記共溶媒が、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、１，３−プロパンジオール、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記共溶媒がトリプロピレングリコールメチルエーテルを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペルオキシカルボン酸が、Ｃ3〜Ｃ10ペルオキシカルボン酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペルオキシカルボン酸が、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、ペル乳酸、ペルグリコール酸、ペルメトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、またはこれらのいずれかの組み合わせ
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
酵素触媒が、微生物細胞、透過処理微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製酵素、または精製酵素の形態で備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
酵素触媒が可溶性または不溶性担体の中または上に固定化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
酵素触媒はカタラーゼ活性がない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）（ｉ）カルボン酸エステル基質と；
（ｉｉ）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて配列番号２と整列するＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒であって、
該シグネチャーモチーフが、
（１）配列番号２の１１８−１２０と整列するアミノ酸位置でＲＧＱモチーフ、
（２）配列番号２の１７９−１８３と整列するアミノ酸位置でＧＸＳＱＧモチーフ、および
（３）配列番号２の２９８−２９９と整列するアミノ酸位置でＨＥモチーフ
を含み、該酵素が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する酵素触媒と；
（ｉｉｉ）２よりも小さいｌｏｇ  Ｐ、ここで、ｌｏｇ  Ｐは、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数として定義され、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水と表される、を有する有機溶媒を含み、該酵素触媒のための基質ではない、少なくとも１つの共溶媒と；
を含み、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の２０００ｐｐｍ未満の水濃度を有する調合物である第１の成分を備えることと：
（ｂ）水中の過酸素源を含む第２の成分を備えることと：
を含む、ペルオキシカルボン酸を生成させるための多成分システムであって、
該第１の成分および該第２の成分を混ぜ合わせてペルオキシカルボン酸を含む水性反応調合物を生成させ、ここで上記共溶媒は、上記酵素触媒のペルヒドロリシス活性を、同じ反応条件下における当該共溶媒の不在下の当該酵素触媒と比べて減少させることなく、該水性反応調合物に上記カルボン酸エステル基質を可溶化する、上記システム。
【請求項２４】
前記第１の成分を保存するための第１のコンパートメントと、前記第２の成分を保存するための第２のコンパートメントとをさらに含む、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記第１のコンパートメントからの前記第１の成分の少なくとも一部と、前記第２のコンパートメントからの前記第２の成分の少なくとも一部とを受け、それによって、該第１の成分の少なくとも一部と、該第２の成分の少なくとも一部とを含む混合物の形成を可能にする混合コンパートメントをさらに含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記第１の成分の少なくとも一部が、１：１〜１：１０の質量比で前記第２の成分の少なくとも一部と混和される、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記混合コンパートメントから水性反応調合物を分注するためのノズルをさらに含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記第１のコンパートメントからの前記第１の成分の少なくとも一部と、前記第２のコンパートメントからの該第２の成分の少なくとも一部とを受け、該第１の成分の少なくとも一部を、該第２の成分の少なくとも一部と同時に分注するためのノズルをさらに含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
第１の成分および第２の成分がノズルにより表面に送達され、該表面上で、第１の成分および第２の成分の混合を可能にする、請求項２３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照によってそれぞれその全体が本明細書中に援用される米国仮特許出願第６１／１０２，５０５号、同第６１／１０２，５１２号、同第６１／１０２，５１４号、同第６１／１０２，５２０号、同第６１／１０２，５３１号、および同第６１／１０２，５３９号（それぞれ、２００８年１０月３日に出願）の利益を主張する。
【０００２】
以下は、多成分系を用いる酵素的な過酸の合成およびその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での酵素触媒作用の分野に関する。具体的には、多成分系（すなわち、本明細書の意味では、所望の反応時間の前には別々に貯蔵される少なくとも２つの反応成分を用いるペルオキシカルボン酸の生成を伴う系）を使用し、セファロスポリンアセチルヒドロラーゼ（ＣＡＨ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）を含む炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーに構造的に属すると同定される酵素の過加水分解（ｐｅｒｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）活性を用いてペルオキシカルボン酸を生成し、効果的に送達する方法が提供される。少なくとも１つのペルオキシカルボン酸は、表面の消毒または衛生化、医療機器の殺菌、食品加工装置の殺菌のために有効であり、そして消毒、漂白、脱染、脱臭、および衛生化などのランドリーケア用途において使用するために適切であるように、十分な濃度で生成される。
【背景技術】
【０００３】
過酸組成物は、有効な抗菌剤であることが報告されている。望ましくない微生物の増殖に対して硬い表面、食肉製品、生きた植物組織、および医療用デバイスを清浄化、消毒、および／または衛生化するための方法が説明されている（例えば、特許文献１〜５）。また過酸は、洗濯洗剤用途のための漂白組成物の調製において有用であることも報告されている（特許文献６〜８）。
【０００４】
ペルオキシカルボン酸は、カルボン酸アルキルエステルと、過酸化水素などの過酸化物試薬との化学反応によって調製することができる（非特許文献１を参照）。しかしながら、わずかに塩基性〜酸性のｐＨ（約８〜約４）では、反応は、多くの商業的な消毒および／または漂白用途に適したペルオキシカルボン酸濃度を生じるのに十分に速くは進行しないことが多い。
【０００５】
化学的なペルオキシカルボン酸の生成の不都合を克服する１つの方法は、過加水分解活性を有する酵素触媒を使用することである。特許文献９〜１２には、構造的に炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのメンバー（例えば、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＨ］およびアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）であると分類され、消毒薬および／または漂白剤として使用するのに十分な濃度でカルボン酸エステル（過酸化水素などの適切な過酸素源の存在下）をペルオキシカルボン酸に転化させるために著しい過加水分解活性を特徴とする酵素が開示されている。反応成分が混合されると、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのいくつかのメンバーは、アルコール、ジオール、およびグリセロールのアセチルエステルから、１分間に４０００〜５０００ｐｐｍ、そして５分〜３０分の間に９０００ｐｐｍまでの過酢酸を生じるのに十分な過加水分解活性を有することが実証されている（特許文献１２）。引用される特許出願公報のそれぞれにおいて、ＤｉＣｏｓｉｍｏらによって記載される酵素的な過酸発生系は、過酸溶液が必要とされるまで別々に保持される多数の反応成分の使用に基づき得る。
【０００６】
第１の酵素触媒／基質成分と、水性過酸素源を含む第２の成分とを含む多成分系を用いる場合、２つの成分の混合後に水中に不溶性または部分的に不溶性である１つまたは複数の基質の使用は、ペルオキシカルボン酸生成物を有効に生成および送達する能力を妨害する少なくとも３つの状態を生じ得ることが観察されている：第１に、酵素触媒／基質要素の粘度が高すぎて、過酸素源を含む第２の要素との効率的な混合を可能にできず、ペルオキシカルボン酸の生成速度を低下させ、第２に、酵素触媒／基質要素の粘度が高すぎて、酵素触媒／基質要素および過酸素源の混合物を含む生成物の特定の送達モード（噴霧など）を可能にできず、第３に、水溶液中に過酸素源を含む第２の成分との混合後の酵素／基質成分中の基質の溶解速度が低すぎて、満足できるペルオキシカルボン酸の生成速度を可能にしない。これらの問題は、酵素触媒／基質要素を含む成分に対して特定の比率の水性過酸素源を含む成分の使用が所望される状況でも明白になる。従って、過加水分解活性を有する酵素触媒および基質を、所望の反応時間まで過酸素源から隔てて貯蔵することを伴う多成分系の商業的な使用は、いくつかの用途については依然として実行不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８３，８０７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６８３，７２４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／００２６８４６号明細書
【特許文献６】米国特許第３，９７４，０８２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２９６，１６１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６４，５５４号明細書
【特許文献９】米国特許出願第１１／６３８，６３５号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ」，Ｄａｎｉｅｌ  Ｓｗｅｒｎ編，第１巻，３１３−５１６頁，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
解決すべき問題は、多成分型の発生系を用いる場合に過酸を酵素的に生成する方法を提供することであり、カルボン酸エステル基質と、過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼを含む酵素触媒との配合物を含む少なくとも１つの第１の成分（ここで、カルボン酸エステル基質は、（１）水性マトリックス中に部分的または実質的に不溶性であり、そして／あるいは（２）水性反応マトリックス中への溶解が遅く、そして／あるいは（３）いくつかの商業用途（例えば、異なる粘度および／または溶解度を有する２つの液体成分を混合するように設計された２コンパートメント噴霧ボトルの使用）に対して、容易な混合を促進しない粘度を有する）を特徴とし、そしてさらに、過酸素源を含む水溶液（例えば、過酸化水素の水性配合物）を含む少なくとも１つの第２の成分を特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この問題は、２成分系の第１の成分中の少なくとも１つの共溶媒の使用を取り入れた過酸を酵素的に生成する方法および系を提供することによって解決されており、ここで、前記第１の成分は、カルボン酸エステルと、過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼを含む少なくとも１つの酵素触媒との実質的に非水性の配合物であり、少なくとも１つの共溶媒の添加は、２成分系における送達および混合のために第１の成分の粘度を改善し、第１の成分の体積の所望の調整を可能にして所望の２つの成分の比率で第２の成分と混合できるようにし、そして、水性の第２の成分（すなわち、過酸素源を提供する水性配合物）と混ぜ合わせて水性の過酸配合物を形成する際に第１の成分の溶解度および／または溶解速度を改善する。
【００１１】
約２よりも小さいｌｏｇ  Ｐ（ここで、ｌｏｇ  Ｐは、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数であると定義され、ｌｏｇ  Ｐ＝ｌｏｇ［［溶質］オクタノール／［溶質］水と表される）を有する有機溶媒を含む共溶媒を包含させると上記の状態が解決されることが発見されており、そうでなければ、上記の状態は、消費者、工業、および医療の状況において従来の、あるいは他の点で適切な手段によって送達され得る形態のペルオキシカルボン酸生成物を有効に生成および送達する能力を妨害する。共溶媒は、好ましくは、配合物中で不活性および非反応性であり、そしてカルボン酸エステル基質と混和性であり、ここで、共溶媒は前記酵素触媒のための基質ではない。共溶媒は、好ましくは、酵素的に過加水分解可能なエステル基がない有機アルコールである。本明細書で使用される場合、「アルコール」は、少なくとも１つのヒドロキシル部分を含む分子である。また共溶媒は、好ましくは、多成分系の成分の混合または接触の後、その最終濃度において可溶性である。しかしながら、約２よりも小さいｌｏｇ  Ｐを有する有機溶媒中の生体触媒作用は、多くの場合、酵素活性に悪影響を与えることが報告されている（例えば、酵素要素を不活性化することによる）（例えば、Ｃ．Ｌａａｎｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３０：８１−８７（１９８７年）、ならびにＣｏｗａｎ，Ｄ．Ａ．およびＰｌａｎｔ，Ａ．，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．，第７章  ｉｎ「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｔ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ」，Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｗ．Ｗ．およびＡｄａｍｓ，Ｍ．編，Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，８６−１０７頁（１９９２年）を参照）。従って、アルコールを含む共溶媒の包含によって提供される有益な結果は、予想外に肯定的な成果を表す。本発明の方法および系のこれらのおよび他の利益は以下でより詳細に検討される。
【００１２】
一実施形態では、
（ａ）（ｉ）カルボン酸エステル基質と、
（ｉｉ）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて配列番号２と整列する炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）シグネチャーモチーフ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｍｏｔｉｆ）を有する酵素を含むみ、過加水分解活性を有する酵素触媒であって、
前記シグネチャーモチーフが、
（１）配列番号２の１１８−１２０と整列するアミノ酸位置におけるＲＧＱモチーフ、
（２）配列番号２の１７９−１８３と整列するアミノ酸位置におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および
（３）配列番号２の２９８−２９９と整列するアミノ酸位置におけるＨＥモチーフ
を含み、前記酵素が配列番号２に対して少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む酵素触媒と、
（ｉｉｉ）約２よりも小さいｌｏｇ  Ｐ（ここで、ｌｏｇ  Ｐは、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数であると定義され、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水と表される）を有する有機溶媒を含み、前記酵素触媒のための基質ではない、少なくとも１つの共溶媒媒と
を含み、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の実質的に非水性の混合物である第１の成分を提供するステップと、
（ｂ）水中の過酸素源を含む第２の成分を提供するステップと、
（ｃ）前記第１の成分および前記第２の成分を混ぜ合わせて、水性反応混合物を形成するステップと
を含む、ペルオキシカルボン酸の生成方法が提供されており、前記共溶媒は、酵素触媒の過加水分解活性を実質的に損失することなく、水性反応混合物中にカルボン酸エステル基質を可溶化し、それにより、ペルオキシカルボン酸が生成される。
【００１３】
別の態様では、上記の方法を実施することを含み、さらに、ペルオキシカルボン酸を含む前記水性反応混合物を消毒または漂白のために表面に適用するステップを含む、表面の消毒方法が提供される。
【００１４】
別の態様では、上記の方法を実施することを含み、さらに、漂白、染みの除去、臭気の低減、衛生化、消毒、またはこれらの組み合わせのために、ペルオキシカルボン酸を含む前記水性反応混合物を衣類品に適用するステップを含む、衣類品の処理方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様は、
（ａ）（ｉ）カルボン酸エステル基質と、
（ｉｉ）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて配列番号２と整列するＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、過加水分解活性を有する酵素触媒であって、
前記シグネチャーモチーフが、
（１）配列番号２の１１８−１２０と整列するアミノ酸位置におけるＲＧＱモチーフ、
（２）配列番号２の１７９−１８３と整列するアミノ酸位置におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および
（３）配列番号２の２９８−２９９と整列するアミノ酸位置におけるＨＥモチーフ
を含み、前記酵素が配列番号２に対して少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む酵素触媒と、
（ｉｉｉ）約２よりも小さいｌｏｇ  Ｐ（ここで、ｌｏｇ  Ｐは、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数であると定義され、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水と表される）を有する有機溶媒を含み、前記酵素触媒のための基質ではない、少なくとも１つの共溶媒と
を含み、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の実質的に非水性の混合物である第１の成分を提供することと、
（ｂ）水中の過酸素源を含む第２の成分を提供することと
を含む、ペルオキシカルボン酸を生成するための多成分系であって、
前記第１の成分および前記第２の成分を混ぜ合わせてペルオキシカルボン酸を含む水性反応混合物が生成され、前記共溶媒は、酵素触媒の過加水分解活性を実質的に損失することなく、水性反応混合物中にカルボン酸エステル基質を可溶化する。
【００１６】
本明細書中に記載される第１および第２の成分を分離し、そして混ぜ合わせるための多成分型の包装／送達系の設計は、一般に、個々の反応成分の物理的な形態に依存するであろう。一実施形態では、液体−液体系に適したあらゆる送達系を使用することができる。別の実施形態では、本発明の２成分型の過酸発生系は、本発明の第１の成分を含む第１の容器と、本発明の第２の成分を含む第２の容器とを含む。容器および／またはパッキングシステムの典型的な例をいくつか挙げると、個々のボトル、単一のキット内に一緒に包装された個々のボトル、デュアルチャンバディスペンサーボトル（スクイーズボトル、噴霧ボトルなど）、剛性または非剛性のデュアルチャンバディスペンサーパケット、個々のパケット、および溶解性または分解性のデュアルチャンバディスペンサーパケットがあり得る。（米国特許第４，６７８，１０３号明細書、米国特許第４，５８５，１５０号明細書、米国特許第６，２２３，９４２号明細書、米国特許第５，９５４，２１３号明細書、米国特許第６，７５８，４１１号明細書、米国特許第５，８６２，９４９号明細書、米国特許第５，３９８，８４６号明細書、米国特許第６，９９５，１２５号明細書、および米国特許第６，３９１，８４０号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書および米国特許出願公開第２００２／００３００６３号明細書、ならびにＰＣＴ公報の国際公開第００／６１７１３号パンフレット、国際公開第０２／２２４６７号パンフレット、および国際公開第２００５／０３５７０５号パンフレットを参照）。一実施形態では、送達系は、デュアルコンパートメント噴霧ボトルである。
【００１７】
さらなる実施形態では、酵素触媒は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７３、および配列番号７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列に対する１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加によって誘導されるペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似の酵素を含む。
【００１８】
さらなる実施形態では、ペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似の酵素は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７３、および配列番号７４からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、またさらにより好ましくは少なくとも７０％、またさらにより好ましくは少なくとも８０％、またさらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００１９】
１つの態様では、本発明の方法および多成分系において使用されるカルボン酸エステル基質は：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、場合により、Ｒ６は１つまたは複数のエーテル結合を含み（Ｒ６はＣ２〜Ｃ７である）、
Ｒ５は、場合によりヒドロキシル基によって置換され得るＣ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１つ以下のヒドロキシル基または１つ以下のエステル基を含み、場合により、Ｒ５は、１つまたは複数のエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水中での溶解度を有する１つまたは複数のエステルと、
（ｂ）構造
【化１】
0005656845.tif 000002
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたは複数のグリセリドと、
（ｃ）式
【化２】
0005656845.tif 000003
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステルと、
（ｄ）１つまたは複数のアセチル化単糖、アセチル化二糖、またはアセチル化多糖と、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせと
からなる群から選択される。
【００２０】
一実施形態では、カルボン酸エステル基質は、モノアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、グルコースペンタアセタート、キシローステトラアセタート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−グルカール、プロピレングリコールジアセタート、エチレングリコールジアセタートと、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステルと、これらの混合物からなる群から選択される。別の実施形態では、基質は、プロピレングリコールジアセタート、エチレングリコールジアセタート、およびこれらの混合物からなる群から選択される。さらなる実施形態では、基質は、好ましくは、トリアセチンを含む。
【００２１】
他に指定されない限り、特定の実施形態の開示は、多成分系においてペルオキシカルボン酸を生成するための本発明の方法、表面を消毒するための本発明の方法、本発明の多成分型配合組成物、およびペルオキシカルボン酸を生成するための本発明の発生系に等しく適用される。
【００２２】
さらなる態様では、本発明の方法及び系はランドリーケア用途においても使用され、漂白、脱染、脱臭、および衛生化を含むが、これらに限定されない有益な効果を生じることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】シートＡ〜Ｆは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、５４、６０、６４、６８、７２、７３、および７４を含む、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７のメンバーであると分類されるいくつかの酵素のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（バージョン１．８３）の結果を示す。酵素は全て、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼのためのシグネチャーモチーフを一緒に形成する保存モチーフ（下線）を共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３年）および米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーのメンバーをさらに特徴付けるために使用され得る付加的なモチーフは下線が引かれ、太字で示される（すなわち、ＬＸＤモチーフ）。
【図１Ｂ】シートＡ〜Ｆは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、５４、６０、６４、６８、７２、７３、および７４を含む、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７のメンバーであると分類されるいくつかの酵素のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（バージョン１．８３）の結果を示す。酵素は全て、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼのためのシグネチャーモチーフを一緒に形成する保存モチーフ（下線）を共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３年）および米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーのメンバーをさらに特徴付けるために使用され得る付加的なモチーフは下線が引かれ、太字で示される（すなわち、ＬＸＤモチーフ）。
【図１Ｃ】シートＡ〜Ｆは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、５４、６０、６４、６８、７２、７３、および７４を含む、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７のメンバーであると分類されるいくつかの酵素のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（バージョン１．８３）の結果を示す。酵素は全て、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼのためのシグネチャーモチーフを一緒に形成する保存モチーフ（下線）を共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３年）および米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーのメンバーをさらに特徴付けるために使用され得る付加的なモチーフは下線が引かれ、太字で示される（すなわち、ＬＸＤモチーフ）。
【図１Ｄ】シートＡ〜Ｆは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、５４、６０、６４、６８、７２、７３、および７４を含む、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７のメンバーであると分類されるいくつかの酵素のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（バージョン１．８３）の結果を示す。酵素は全て、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼのためのシグネチャーモチーフを一緒に形成する保存モチーフ（下線）を共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３年）および米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーのメンバーをさらに特徴付けるために使用され得る付加的なモチーフは下線が引かれ、太字で示される（すなわち、ＬＸＤモチーフ）。
【図１Ｅ】シートＡ〜Ｆは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、５４、６０、６４、６８、７２、７３、および７４を含む、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７のメンバーであると分類されるいくつかの酵素のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（バージョン１．８３）の結果を示す。酵素は全て、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼのためのシグネチャーモチーフを一緒に形成する保存モチーフ（下線）を共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３年）および米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーのメンバーをさらに特徴付けるために使用され得る付加的なモチーフは下線が引かれ、太字で示される（すなわち、ＬＸＤモチーフ）。
【図１Ｆ】シートＡ〜Ｆは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、５４、６０、６４、６８、７２、７３、および７４を含む、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７のメンバーであると分類されるいくつかの酵素のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（バージョン１．８３）の結果を示す。酵素は全て、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼのためのシグネチャーモチーフを一緒に形成する保存モチーフ（下線）を共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３年）および米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーのメンバーをさらに特徴付けるために使用され得る付加的なモチーフは下線が引かれ、太字で示される（すなわち、ＬＸＤモチーフ）。
【００２４】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびに欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）規則５．２および４９．５（ａの２）および実施細則の２０８項および付録Ｃの配列表の要件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに対して使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
【００２５】
配列番号１は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ｃａｈ）のコード領域の核酸配列である。
【００２６】
配列番号２は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号３は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種スブチリス株（ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｔｒ．）１６８からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００２８】
配列番号４は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種スブチリス株１６８からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列であり、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列と同一である。
【００２９】
配列番号５は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭからのセファロスポリンアセチルエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３０】
配列番号６は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭからのセファロスポリンアセチルエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号７は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３２】
配列番号８は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号９は、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３４】
配列番号１０は、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１１は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭからのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３６】
配列番号１２は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭからのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１３は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３８】
配列番号１４は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１５は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４０】
配列番号１６は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１７は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４２】
配列番号１８は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１９は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＺＰ＿０１１６８６７４において報告されるような、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。しかしながら、報告される配列は、１５アミノ酸のＮ−末端付加を有すると思われ、他のセファロスポリンＣデアセチラーゼとの配列アライメントと、他のＣＡＨ酵素の観察される長さ（通常は、３１８〜３２５アミノ酸の長さ）に対する報告される長さ（３４０アミノ酸）の比較とに基づいて、これは恐らく誤りである。
【００４４】
配列番号２０は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＺＰ＿０１１６８６７４において報告されるＮ−末端の１５のアミノ酸のない、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号２１は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４６】
配列番号２２は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２３は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４８】
配列番号２４は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２５は、ｐＳＷ１９０にクローン化されたバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２９２３３ＴＭセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ｃａｈ）遺伝子の核酸配列である。
【００５０】
配列番号２６は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３ＴＭセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）の推定アミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２７および２８は、ｐＳＷ１９６の構築のために、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼのコード領域（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ｕ５８６３２）をＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーである。
【００５２】
配列番号２９は、プラスミドｐＳＷ１９６内のサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ遺伝子のコドン最適化型の核酸配列である。
【００５３】
配列番号３０は、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）の核酸配列である。
【００５４】
配列番号３１は、プラスミドｐＫＤ１３の核酸配列である。
【００５５】
配列番号３２および３３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５においてｋａｔＧカタラーゼ遺伝子に対する相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物を発生させるために使用されるプライマーである。この産物は、内在性ｋａｔＧ遺伝子を破壊するために使用した。
【００５６】
配列番号３４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５においてｋａｔＧカタラーゼ遺伝子に対する相同性を有する領域に隣接したカナマイシン耐性遺伝子をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。この産物は、内在性のｋａｔＧ遺伝子を破壊するために使用した。
【００５７】
配列番号３５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のｋａｔＧカタラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【００５８】
配列番号３６は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のＫａｔＧカタラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３７は、プラスミドｐＫＤ４６の核酸配列である。
【００６０】
配列番号３８および３９は、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認するために使用されるプライマーである。
【００６１】
配列番号４０は、プラスミドｐＣＰ２０の核酸配列である。
【００６２】
配列番号４１および４２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５においてｋａｔＥカタラーゼ遺伝子に対する相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物を発生させるために使用されるプライマーである。この産物は、内在性ｋａｔＥ遺伝子を破壊するために使用した。
【００６３】
配列番号４３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５においてｋａｔＥカタラーゼ遺伝子に対する相同性を有する領域に隣接したカナマイシン耐性遺伝子をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。この産物は、内在性ｋａｔＥ遺伝子を破壊するために使用した。
【００６４】
配列番号４４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【００６５】
配列番号４５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のＫａｔＥカタラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号４６および４７は、単一ノックアウト株Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ΔｋａｔＥ、および二重ノックアウト株Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ΔｋａｔＧΔｋａｔＥ（本明細書ではＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８と称される）におけるｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認するために使用されるプライマーである。
【００６７】
配列番号４８は、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３のコドン最適化型の核酸配列である。
【００６８】
配列番号４９は、配列番号２のアミノ酸残基１１８〜２９９を包含する領域のアミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号５０は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００７０】
配列番号５１は、コドン最適化バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼのコード配列の核酸配列である。
【００７１】
配列番号５２は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００７２】
配列番号５３は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型の核酸配列である。
【００７３】
配列番号５４は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号Ｓ４１８５８）からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号５５は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００７５】
配列番号５６は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型の核酸配列である。
【００７６】
配列番号５７は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００７７】
配列番号５８は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００７８】
配列番号５９は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）からのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００７９】
配列番号６０は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００８０】
配列番号６１は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００８１】
配列番号６２は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００８２】
配列番号６３は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）からのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００８３】
配列番号６４は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００８４】
配列番号６５は、サーモトガ種ＲＱ２「ＲＱ２（ａ）」アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００８５】
配列番号６６は、サーモトガ種ＲＱ２「ＲＱ２（ａ）」アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００８６】
配列番号６７は、本明細書において「ＲＱ２（ａ）」と同定されるサーモトガ種ＲＱ２からのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００８７】
配列番号６８は、本明細書において「ＲＱ２（ａ）」と同定されるサーモトガ種ＲＱ２からのアセチルキシランエステラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＣＢ０９２２２）の推定アミノ酸配列である。
【００８８】
配列番号６９は、サーモトガ種ＲＱ２「ＲＱ２（ｂ）」アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００８９】
配列番号７０は、サーモトガ種ＲＱ２「ＲＱ２（ｂ）」アセチルキシランエステラーゼのコード配列のコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００９０】
配列番号７１は、本明細書において「ＲＱ２（ｂ）」と同定されるサーモトガ種ＲＱ２からのアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００９１】
配列番号７２は、本明細書において「ＲＱ２（ｂ）」と同定されるサーモトガ種ＲＱ２からのアセチルキシランエステラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＣＢ０８８６０）の推定アミノ酸配列である。
【００９２】
配列番号７３は、共有の同時出願された同時係属中の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２ＵＳＮＡ（参照によってその全体が本明細書中に援用される）からのサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７におけるＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００９３】
配列番号７４は、共有の同時出願された同時係属中の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２ＵＳＮＡからのサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７におけるＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
多成分その場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）型の過酸消毒薬配合物の特定の用途では、第１の成分（酵素および酵素基質を含む）に対する第２の成分（水性過酸素源を含む）の比率は１：１〜１０：１の範囲内であることが望ましいことがあり、この場合、第２の成分の１０部〜１部（重量による）が第１の成分の１部（重量による）と混合されて、消毒のために有効な濃度で過酸が生成される。
【００９５】
記載される問題は、多成分方法および系（すなわち、本発明との関連では、所望の反応時間の前には別々に貯蔵される少なくとも２つの反応成分を用いたペルオキシカルボン酸の生成を伴う方法および系）において、共溶媒の包含によって、ペルヒドロラーゼの基質が水中の過酸素源と有効に混合されて、例えば表面に、満足に送達され得るという発見によって解決された。本明細書において記載されるように、成分Ｂ対成分Ａの比率が１：１〜１０：１の範囲内になるように、触媒組成物（成分Ａ、本明細書では「第１の」成分とも称される）へ有機溶媒を添加し、そして水性過酸素源（成分Ｂ、本明細書では「第２の」成分とも称される）から同体積の水を除去することによって、消毒に有効な濃度における過酸の生成が可能になる。有機溶媒は、好ましくは、配合物中で不活性および非反応性である。また共溶媒は、好ましくは、酵素基質（例えば、トリアセチン）と完全に混和性である。また共溶媒は、好ましくは、混合後の合わせた成分ＡおよびＢ中で、その最終濃度において可溶性である。本発明に従って、構造的に関連する酵素のＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーを多成分系中で使用して、消毒および／または漂白用途のための濃度の過酸を高効率で発生させることができ、以下に十分に記載されるように、有機溶媒を含む共溶媒は、驚くことに、酵素触媒の過加水分解活性を実質的に損失することなく水性反応配合物中の基質の溶解度を高めるために使用することができる。さらなる態様では、本発明はランドリーケア用途で使用するための方法および多成分系を含み、ここで、衣類品または織物品は、漂白、染みの除去、臭気の低減、衛生化、消毒、またはこれらの組み合わせのために適切な濃度で過酸と接触される。
【００９６】
本発明は、本開示の一部を形成する添付図面、配列表、および実施例に関連して行われる以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解されるであろう。本発明は本明細書中に記載および／または表示される特定の生成物、方法、条件またはパラメータに限定されず、そして本明細書において使用される専門用語は単なる例として特定の実施形態を説明するためのものであって、請求される本発明を限定することは意図されないと理解されるべきである。
【００９７】
本開示において、多数の用語および略語が使用される。他に具体的に記載されない限りは以下の定義が適用される。
【００９８】
本明細書で用いられる場合、本発明の要素または成分に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、要素または成分の事例（すなわち、発生）の数に関して非限定的であることが意図される。従って、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は１つまたは少なくとも１つを含むと解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。
【００９９】
本明細書で用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲において言及される規定の特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。
【０１００】
本明細書で用いられる場合、使用される材料または反応物の量を修正する「約」という用語は、例えば、濃縮物を製造するため、または実際に溶液を使用するために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における故意でない誤差によって、組成物を製造する、または方法を実行するために使用される材料の製造、供給源、または純度の差異によって、および同類のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修正されるかどうかにかかわらず、特許請求の範囲は、その量と同等の量を含む。
【０１０１】
存在する場合、全ての範囲は包括的であり、結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が指定される場合、指定される範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈されるべきである。
【０１０２】
本明細書で用いられる場合、「過酸」という用語は、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ）、ペルオキシカルボン酸、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）、過カルボン酸およびペルオキソ酸（ｐｅｒｏｘｏｉｃ  ａｃｉｄ）と同義である。
【０１０３】
本明細書で用いられる場合、「過酢酸」という用語は「ＰＡＡ」と略され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソ酸、およびＣＡＳ登録番号７９−２１−０の全ての他の同義語と同義である。
【０１０４】
本明細書で用いられる場合、「基質」、「適切な基質」、および「カルボン酸エステル基質」という用語は、具体的には：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、場合により、Ｒ６は、１つまたは複数のエーテル結合を含み（Ｒ６はＣ２〜Ｃ７である）、
Ｒ５は、場合によりヒドロキシル基によって置換され得るＣ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１つ以下のヒドロキシル基または１つ以下のエステル基を含み、場合により、Ｒ５は、１つまたは複数のエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水中での溶解度を有する１つまたは複数のエステル、または
（ｂ）構造
【化３】
0005656845.tif 000004
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたは複数のグリセリド、または
（ｃ）式
【化４】
0005656845.tif 000005
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、または
（ｄ）１つまたは複数のアセチル化単糖、アセチル化二糖、もしくはアセチル化多糖、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
を交換可能に指す。
【０１０５】
前記カルボン酸エステル基質の例としては、モノアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、グルコースペンタアセタート、キシローステトラアセタート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−グルカール、プロピレングリコールジアセタート、エチレングリコールジアセタートか、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルもしくはジエステルか、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１０６】
本明細書で用いられる場合、「モノアセチン」という用語は、グリセロールモノアセタート、グリセリンモノアセタート、およびグリセリルモノアセタートと同義である。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合、「ジアセチン」という用語は、グリセロールジアセタート、グリセリンジアセタート、グリセリルジアセタート、およびＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１０８】
本明細書で用いられる場合、「トリアセチン」という用語は、グリセリントリアセタート、グリセロールトリアセタート、グリセリルトリアセタート、１，２，３−トリアセトキシプロパン、１，２，３−プロパントリオールトリアセタート、およびＣＡＳ登録番号１０２−７６−１の全ての他の同義語と同義である。
【０１０９】
本明細書で用いられる場合、「モノブチリン」という用語は、グリセロールモノブチラート、グリセリンモノブチラート、およびグリセリルモノブチラートと同義である。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合、「ジブチリン」という用語は、グリセロールジブチラートおよびグリセリルジブチラートと同義である。
【０１１１】
本明細書で用いられる場合、「トリブチリン」という用語は、グリセロールトリブチラート、１，２，３−トリブチリルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号６０−０１−５の全ての他の同義語と同義である。
【０１１２】
本明細書で用いられる場合、「モノプロピオニン」という用語は、グリセロールモノプロピオナート、グリセリンモノプロピオナート、およびグリセリルモノプロピオナートと同義である。
【０１１３】
本明細書で用いられる場合、「ジプロピオニン」という用語は、グリセロールジプロピオナートおよびグリセリルジプロピオナートと同義である。
【０１１４】
本明細書で用いられる場合、「トリプロピオニン」という用語は、グリセリルトリプロピオナート、グリセロールトリプロピオナート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号１３９−４５−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１１５】
本明細書で用いられる場合、「酢酸エチル」という用語は、酢酸エーテル、アセトキシエタン、エタン酸エチル、酢酸エチルエステル、エタン酸エチルエステル、エチル酢酸エステル、およびＣＡＳ登録番号１４１−７８−６の全ての他の同義語と同義である。
【０１１６】
本明細書で用いられる場合、「乳酸エチル」という用語は、乳酸エチルエステル、およびＣＡＳ登録番号９７−６４−３の全ての他の同義語と同義である。
【０１１７】
本明細書で用いられる場合、「アセチル化糖」および「アセチル化糖類」という用語は、少なくとも１つのアセチル基を含む単糖、二糖および多糖を指す。例として、グルコースペンタアセタート、キシローステトラアセタート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書で用いられる場合、「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」という用語は、炭素−炭素の単結合、二重結合、または三重結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子によって置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置を意味する。このようなヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であり得る。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。好ましい実施形態では、ヒドロカルビル部分は、炭素−炭素単結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子によって置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置である。
【０１１９】
本明細書で用いられる場合、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールおよびこれらの混合物の「モノエステル」および「ジエステル」という用語は、式ＲＣ（Ｏ）Ｏの少なくとも１つのエステル基を含む前記化合物を指し、ここでＲは、Ｃ１〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分である。一実施形態では、カルボン酸エステル基質は、プロピレングリコールジアセタート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセタート（ＥＤＧＡ）またはこれらの混合物を含む。
【０１２０】
本明細書で用いられる場合、「プロピレングリコールジアセタート」という用語は、１，２−ジアセトキシプロパン、プロピレンジアセタート、１，２−プロパンジオールジアセタート、およびＣＡＳ登録番号６２３−８４−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１２１】
本明細書で用いられる場合、「エチレングリコールジアセタート」という用語は、１，２−ジアセトキシエタン、エチレンジアセタート、グリコールジアセタート、およびＣＡＳ登録番号１１１−５５−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１２２】
本明細書で用いられる場合、「適切な酵素反応混合物」、「その場での過酸の発生に適した成分」、「適切な反応成分」、「適切な水性反応混合物」、および「反応混合物」という用語は、反応物および酵素触媒が接触される材料および水を指す。適切な水性反応混合物の成分が本明細書において提供されており、当業者は本方法に適した成分の変動の範囲を認識する。一実施形態では、適切な酵素反応混合物は、反応成分を混ぜ合わせると、その場で過酸を生成する。従って、反応成分は、反応成分が使用されるまで別々に保持される多成分系として提供され得る。多数の活性成分を分離し、そして混ぜ合わせるための系および手段の設計は当該技術分野において知られており、一般に、個々の反応成分の物理的な形態に依存するであろう。例えば、反応性流体を混合したときに所望の漂白剤が生成されるいくつかの漂白用途において見られるように、多数の活性流体（液体−液体）系は、通常、マルチチャンバーディスペンサーボトルまたは２相系を使用する（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書、米国特許第５，３９８，８４６号明細書、米国特許第５，６２４，６３４号明細書、米国特許第６，３９１，８４０号明細書、欧州特許第０８０７１５６Ｂ１号明細書、米国特許出願公開第２００５／０００８５２６号明細書、およびＰＣＴ公報の国際公開第００／６１７１３号パンフレット）。過酸を発生させるために使用される多成分系のその他の形態には、粉末（例えば、米国特許第５，１１６，５７５号明細書）、多層錠剤（例えば、米国特許第６，２１０，６３９明細書）、多数のコンパートメントを有する水溶性パケット（例えば米国特許第６，９９５，１２５号明細書）、および水を添加すると反応する固体凝集体（例えば、米国特許第６，３１９，８８８号明細書）などの、１つまたは複数の固体成分または固体−液体成分の組み合わせのために設計されたものが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１２３】
多成分系では、活性要素はまず１つまたは複数のそれぞれの成分において互いに分離され、次に混ぜ合わせられて反応配合物を形成する。多成分系は、活性成分が満足に混ざり合わないこと、１つまたは複数の成分の活性の中和もしくは低下、および／または送達の要件に適合しない反応配合物の形成などの問題に直面し得る。例えば、水を含む第２の成分中に不溶性または部分的に不溶性である酵素およびこのような酵素のための基質を含む少なくとも１つの成分を包含する多成分系では、ペルオキシカルボン酸生成物を有効に生成および送達する能力を妨害する少なくとも３つの状態が起こり得る：第１に、酵素／基質要素の粘度が高すぎて、過酸素源を含む第２の要素との効率的な混合を可能にできず、ペルオキシカルボン酸の生成速度を低下させ、第２に、酵素／基質要素の粘度が高すぎて、酵素／基質要素および過酸素源の混合物を含む生成物の特定の送達モード（噴霧など）を可能にできず、第３に、水溶液中に過酸素源を含む第２の成分との混合後の酵素／基質成分中の基質の溶解速度が低すぎて、満足できるペルオキシカルボン酸の生成速度を可能にしない。これらの問題は、酵素／基質要素を含む成分に対して特定の比率の水性過酸素源を含む成分の使用が所望される状況でも明白になる。
【０１２４】
酵素が有機溶媒中に直接懸濁される場合か、あるいは混和性の有機／水性の単相溶媒が使用される場合に、有機溶媒が酵素の活性に有害であり得ることは当業者によく知られている。酵素の活性および構造に対する有機溶媒の影響を概説する２つの文献刊行物は、（ａ）上記のＣ．Ｌａａｎｅら、および（ｂ）上記のＤ．Ａ．ＣｏｗａｎおよびＡ．Ｒ．Ｐｌａｎｔである。ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔは、当該技術では、有機相系において細胞内酵素を安定化するために２以下のｌｏｇ  Ｐを有する有機溶媒を使用することに、ほとんどまたは全く価値がないことが通常認識されていると言及しており（８７頁において）、ここで、ｌｏｇ  Ｐは、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数であると定義され、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水と表される。２〜４の間のｌｏｇ  Ｐを有する有機溶媒は、酵素の安定性に応じてケースバイケースで使用することができ、４よりも大きいｌｏｇ  Ｐを有するものは通常有機相系において有用である。
【０１２５】
ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔはさらに、単相の有機−水性溶媒中に溶解した酵素の直接暴露の効果は、溶媒濃度、溶媒／酵素表面基の相互作用、および溶媒／酵素水和殻の相互作用に依存すると言及している（９１頁において）。溶媒が単相を生じるために水相と十分に混和性であるように、溶媒のｌｏｇ  Ｐは十分に低くなければならないので、低ｌｏｇ  Ｐの有機溶媒を含有する単相の有機−水性溶媒は、通常、有機溶媒濃度が低い用途を除いて酵素の安定性に対して負の効果を有する。従って、低いｌｏｇ  Ｐを有する有機溶媒は、伝統的に、役に立たない低濃度以外では酵素の安定性に有害であると考えられる。
【０１２６】
トリアセチンは、エタノール（ｌｏｇ  Ｐ−０．２６）およびイソプロパノール（ｌｏｇ  Ｐ０．１５）（ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔ）と類似して、０．２５のｌｏｇ  Ｐを有することが報告されており（Ｙ．Ｍ．Ｇｕｎｎｉｎｇら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  
Ｃｈｅｍ．４８：３９５−３９９（２０００年））、従って、トリアセチン中での酵素粉末の貯蔵は、ｌｏｇ  Ｐが２よりも小さい付加的な共溶媒（例えば、シクロヘキサノン、ｌｏｇ  Ｐ＝０．９４）（ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔ）、１，２−プロパンジオール、ｌｏｇ  Ｐ＝−１．４１（Ｇｕｎｎｉｎｇら）、１，３−プロパンジオール、ｌｏｇ  Ｐ＝−１．３（Ｓ−Ｊ．Ｋｕｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７３：１４２７−１４３３（１９９６年）、ジエチレングリコールブチルエーテル、ｌｏｇ  Ｐ＝０．５６（Ｎ．Ｆｕｎａｓａｋｉら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８：５７８６−５７９０（１９８４年）、トリエチレングリコール、ｌｏｇ  Ｐ＝−１．７５（Ｌ．Ｂｒａｅｋｅｎら，ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ  ６：１６０６−１６１２（２００５年））の使用がそうであるように、容認できない酵素活性の損失をもたらすことが予想されるであろう。ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔの上記の教示を適用すると、低いｌｏｇ  Ｐ値を有する上記の溶媒は、多成分系の酵素を含有する第１の成分中に、酵素の不活性化（第１の成分と水中に過酸素源を含む第２の成分との混合の前または後に）を伴わずに適切に含有できないことが予想されるであろう。
【０１２７】
しかしながら、驚くことに、約２よりも小さいｌｏｇ  Ｐを有する有機溶媒を含む共溶媒を包含させると、水中での溶解度が不十分な酵素基質の溶解を助ける働きをし、そして／あるいは所望の比率の成分ＡおよびＢの混合を可能にするための成分Ａの希釈剤としての役割を果たし得ることが発見された。言い換えると、共溶媒は、そうでなければ消費者、工業、および医療の状況において従来の（あるいは、他の点で適切な）手段によって送達され得る形態のペルオキシカルボン酸生成物を有効に生成および送達する能力を妨害する状態（例えば、酵素／基質成分の容認できないほど高い粘度、この成分と水中の過酸素源との不十分な混合）を解決することができる。
【０１２８】
本明細書に記載される方法および系において、約２よりも小さいｌｏｇ  Ｐ（ここで、ｌｏｇ  Ｐは、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数であると定義され、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水と表される）を有する有機溶媒を含む共溶媒は、酵素触媒の過加水分解活性を実質的に損失することなく、水性反応配合物中に基質を可溶化し、この共溶媒は、前記酵素触媒のための基質ではない。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、酵素触媒およびカルボン酸エステル基質の配合物を含む第１の成分は、場合により、無機または有機緩衝液、安定剤、防蝕剤、湿潤剤、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、過酸素源は、過酸化水素安定剤を含む。
【０１３０】
本明細書で用いられる場合、「過加水分解」という用語は、過酸を形成するための選択された基質と過酸化物との反応と定義される。通常、無機過酸化物は触媒の存在下で選択された基質と反応されて、過酸を生成する。本明細書で用いられる場合、「化学的な過加水分解」という用語は、基質（すなわち、過酸前駆体）が過酸化水素源と混ぜ合わせられる過加水分解反応を含み、ここで過酸は、酵素触媒を存在させずに形成される。
【０１３１】
本明細書で用いられる場合、「ペルヒドロラーゼ活性」という用語はタンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞重量、または固定化触媒重量あたりの触媒活性を指す。
【０１３２】
本明細書で用いられる場合、「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、特定の温度で１分あたり１μｍｏｌの過酸生成物を生成するために必要とされるペルヒドロラーゼ活性の量と定義される。
【０１３３】
本明細書で用いられる場合、「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は、過加水分解活性を有する酵素を含む触媒を指し、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態であり得る。また酵素触媒は化学修飾されていてもよい（例えば、ペグ化、または架橋試薬との反応による）。またペルヒドロラーゼ触媒は、当業者によく知られた方法を用いて可溶性または不溶性担体に固定化されていてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ、１９９７年が参照される。本明細書に記載されているように、過加水分解活性を有する本発明の酵素は全て、構造的に、酵素の炭水化物エステラーゼファミリー７（「ＣＥ−７」ファミリー）のメンバーである（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ」ｉｎ「Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．ＨｅｎｒｉｓｓａｔおよびＢ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ編，（１９９９年）Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，３−１２頁を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーは、過酸素源と混ぜ合わせたときに、様々なカルボン酸エステル基質から過酸を生成するのに特に有効であることが実証されている（ＰＣＴ公報の国際公開第２００７／０７０６０９号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、米国特許出願公開第２００８／１７６７８３号明細書、および米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照、これらはそれぞれ、参照によってその全体が本明細書中に援用される）。
【０１３４】
ＣＥ−７ファミリーのメンバーとしては、セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）が挙げられる。ＣＥ−７エステラーゼファミリーのメンバーは、保存されたシグネチャーモチーフを共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら、上記）。ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび／または実質的に類似の構造を含むペルヒドロラーゼは、本発明で使用するのに適している。実質的に類似の生体分子を同定するための手段は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、配列アライメントプロトコール、核酸ハイブリダイゼーション、および／または保存シグネチャーモチーフの存在）。１つの態様では、本発明の方法および系における酵素触媒は、本明細書において提供される配列に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、またさらにより好ましくは少なくとも７０％、またさらにより好ましくは少なくとも８０％、またさらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する実質的に類似の酵素を含む。本発明のＣＥ−７炭水化物エステラーゼをコードする核酸分子も本明細書において提供される。さらなる実施形態では、本発明の方法および系において有用なペルヒドロラーゼ触媒は、高度にストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子の１つにハイブリッド形成する核酸分子によってコードされる。
【０１３５】
本明細書で用いられる場合、「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」という用語は、セファロスポリンＣおよび７−アミノセファロスポラン酸などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を指す（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａら，（１９９５年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（６）：２２２４−２２２９）。本明細書において記載されるように、有意な過加水分解活性を有するいくつかのセファロスポリンＣデアセチラーゼが提供される。
【０１３６】
本明細書で用いられる場合、「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２、ＡＸＥ）を指す。本明細書において説明されるように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有するアセチルキシランエステラーゼとして分類されるいくつかの酵素が提供される。
【０１３７】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭ」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託され、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭを有する細菌細胞を指す。バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭは、２−炭素〜８−炭素アシル基を有するグリセロールエステル、特にジアセチンを加水分解することができるエステルヒドロラーゼ（「ジアセチナーゼ」）活性を有すると報告されている（米国特許第４，４４４，８８６号明細書、参照によってその全体が本明細書中に援用される）。本明細書において記載されるように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭから単離されており、配列番号２として提供される。単離した酵素のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＡ０１７２９．１（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａら、上記）によって提供されるセファロスポリンＣデアセチラーゼと１００％のアミノ酸同一性を有する。
【０１３８】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０」という用語は、ＰａｙｎｅおよびＪａｃｋｓｏｎ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８−２２８２（１９９１年））によって報告されるようなバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株を指す。バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０は、スブチリシンおよび中性プロテアーゼをコードする遺伝子において染色体の欠失を有するバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種スブチリス株ＢＲ１５１（ＡＴＣＣ（登録商標）３３６７７ＴＭ）の誘導体である。本明細書において記載されるように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０から単離されており、配列番号４として提供される。単離した酵素のアミノ酸配列は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種スブチリス株１６８で報告されているセファロスポリンＣデアセチラーゼと１００％のアミノ酸同一性を有する（Ｋｕｎｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：２４９−２５６（１９９７年））。
【０１３９】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３ＴＭ」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託され、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３ＴＭを有するバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株を指す。本明細書において記載されるように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３ＴＭから単離および配列決定されており、配列番号２６として提供される。
【０１４０】
本明細書で用いられる場合、「クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭ」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託され、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭを有するクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の株を指す。Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭからのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１２として提供される。
【０１４１】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭ」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託され、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭを有する細菌細胞を指す。バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭは、セファロスポリンアセチルヒドロラーゼ活性を有することが報告されている（米国特許第６，４６５，２３３号明細書）。Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭからのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号５として提供される。
【０１４２】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭ」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託され、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭを有する細菌細胞を指す。バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭは、セファロスポリンアセチルヒドロラーゼ活性を有することが報告されている（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿０７７６２１）。Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭからのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号８として提供される。
【０１４３】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＪ２４９９５７）。バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０として提供される。
【０１４４】
本明細書で用いられる場合、「サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されたサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）の株を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＢ７０８６９）。サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１４として提供される。最近、配列番号１４に由来する変異酵素は改善された過加水分解活性を有することが報告されており、配列番号７３として提供され（「ＩＭＰＲＯＶＥＤ  ＰＥＲＨＹＤＲＯＬＡＳＥＳ  ＦＯＲ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＥＲＡＣＩＤ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ」という表題の、共有の同時出願された同時係属中の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２ＵＳＮＡを参照、参照によってその全体が本明細書中に援用される）、ここで、位置２７７におけるＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【０１４５】
本明細書で用いられる場合、「サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されたサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）の株を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１）。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１６として提供される。最近、配列番号１６に由来する変異酵素は改善された過加水分解活性を有することが報告されており、配列番号７４として提供され（共有の同時出願された同時係属中の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２ＵＳＮＡを参照）、ここで、位置２７７におけるＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【０１４６】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６」という用語は、セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿１７５２６５）。バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号２４として提供される。
【０１４７】
本明細書で用いられる場合、「サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌株を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ｓ４１８５８）。サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号５４として提供される。
【０１４８】
本明細書で用いられる場合、「サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００８１２）。サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推定アミノ酸配列は、配列番号６０として提供される。
【０１４９】
本明細書で用いられる場合、「サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００７０２）。サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推定アミノ酸配列は、配列番号６４として提供される。
【０１５０】
本明細書で用いられる場合、「サーモトガ種ＲＱ２」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００９６９）。サーモトガ種ＲＱ２から２つの異なるアセチルキシランエステラーゼが同定されており、本明細書では「ＲＱ２（ａ）」（配列番号６８として提供される推定アミノ酸配列）および「ＲＱ２（ｂ）」（配列番号７２として提供される推定アミノ酸配列）と称される。
【０１５１】
本明細書で用いられる場合、「単離核酸分子」および「単離核酸断片」は交換可能に使用され、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指すであろう。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成され得る。
【０１５２】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書では、特定のアミノ酸を同定するために以下の略語が使用される。
【０１５３】
【表１】
0005656845.tif 000006
【０１５４】
本明細書で用いられる場合、「実質的に類似の」は、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が１つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、または欠失をもたらすが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の機能特性（すなわち、過加水分解活性）に影響を与えない核酸分子を指す。本明細書で用いられる場合、「実質的に類似の」は、本明細書において報告される配列と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、またさらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する酵素も指し、ここで、得られる酵素は、本発明の機能特性（すなわち、過加水分解活性）を保持する。「実質的に類似の」は、高度にストリンジェントな条件下で本明細書において報告される核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によってコードされる過加水分解活性を有する酵素も指すことができる。従って、本発明は、特定の例示的な配列よりも多くを包含することが理解される。
【０１５５】
例えば、所与の部位で化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらすが、コードされるタンパク質の機能特性に影響を与えない遺伝子の改変が一般的であることは、当該技術分野ではよく知られている。本発明の目的のために、置換は、以下の５つの群：
１．  小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、
２．  極性の負帯電残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
３．  極性の正帯電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
４．  大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、ならびに
５．  大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ
のうちの１の中での交換であると定義される。
【０１５６】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対するコドンは、別のあまり疎水性でない残基（グリシンなど）またはより疎水性の残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換され得る。同様に、１つの負帯電残基による別の残基（アスパラギン酸によるグルタミン酸など）の置換、あるいは１つの正帯電残基による別の残基（リジンによるアルギニンなど）の置換をもたらす変化も、機能的に等価な産物を生じることが予想され得る。多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変更をもたらすヌクレオチドの変化も、タンパク質の活性を変更しないと予想されるであろう。
【０１５７】
提唱される改変のそれぞれは、コードされる産物の生物活性の保持の決定と同様に、当該技術分野において十分にルーチン的な技能の範囲内である。さらに、当業者は、実質的に類似の配列が本発明によって包含されることを認識する。一実施形態では、実質的に類似の配列は、高度にストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃による洗浄）下で本明細書において例示される配列とハイブリッド形成するその能力によって定義される。いくつかの実施形態では、本発明の方法および系は、ストリンジェント条件下で本明細書において報告される核酸分子とハイブリッド形成する単離核酸分子によってコードされるペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含むことができる。好ましい実施形態では、本発明の方法および系は、ストリンジェント条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、および配列番号７１からなる群から選択される核酸配列を有する核酸分子とハイブリッド形成する単離核酸分子によってコードされるペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を用いる。
【０１５８】
本明細書で用いられる場合、核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で第１の分子の一本鎖が他の分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１年）において例示されている。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似した分子（遠縁の生物からの相同配列など）から、高度に類似した分子（近縁の生物から機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、通常、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件セットは、６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより室温で１５分間の洗浄から始まり、次に、２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより４５℃で３０分間の洗浄を繰り返し、そして次に、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返すという一連の洗浄を用いる。より好ましい条件セットはより高温を用い、最終の０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにおける２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に上昇させたことを除いて、洗浄は上記のものと同一である。もう１つの好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件セットは０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃であり、本明細書において例示された配列を用いて２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにより洗浄され、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃で最終洗浄が行われる。
【０１５９】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド形成するために適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記）。１つの態様では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも８００ヌクレオチドの長さである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの因子に従って必要であれば温度および洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
【０１６０】
本明細書で用いられる場合、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間のマッチによって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８年）、「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３年）、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ」（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）、および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１年）において記載される方法を含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ベクターＮＴＩバージョン７．０のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、Ｒｉｃｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６、（６）２７６−２７７頁（２０００年））を用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、アライメントのＣＬＵＳＴＡＬ法（ＣＬＵＳＴＡＬＷ、例えばバージョン１．８３など）（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９年）、Ｈｉｇｇｉｎｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４年）、およびＣｈｅｎｎａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００（２００３年）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを介してＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）をデフォルトパラメータと共に用いて実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アライメントのために適切なパラメータには、ＧＡＰ存在ペナルティー＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳ���＝４、およびＫＴＵＰＬＥ＝１が含まれる。一実施形態では、速いまたは遅いアライメントがデフォルト設定と共に使用されるが、遅いアライメントが好ましい。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（バージョン１．８３）を用いるパラメータを修正して、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５も使用することができる。
【０１６１】
本発明の方法および系の１つの態様では、適切な単離核酸分子（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、本明細書において報告されるアミノ酸配列と少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも３３％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。本発明の適切な核酸分子は上記の相同性を有するだけでなく、通常、約３００〜約３４０のアミノ酸、より好ましくは約３１０〜約３３０のアミノ酸、最も好ましくは約３１８〜約３２５のアミノ酸の長さを有するポリペプチドもコードする。
【０１６２】
本明細書で用いられる場合、「シグネチャーモチーフ」および「診断モチーフ」という用語は、定義される活性を有する酵素のファミリー間で共有される保存構造を指す。シグネチャーモチーフは、定義される基質ファミリーと類似の酵素活性を有する構造的に関連する酵素ファミリーを定義および／または同定するために使用することができる。シグネチャーモチーフは、単一の連続アミノ酸配列であっても、あるいは一緒にシグネチャーモチーフを形成する不連続の保存モチーフの集まりであってもよい。通常、保存モチーフはアミノ酸配列によって表される。本明細書において記載されるように、本発明のペルヒドロラーゼはＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属する。この酵素ファミリーは、ＣＥ−７「シグネチャーモチーフ」の存在によって定義することができる（Ｖｉｎｃｅｎｔら、上記）。
【０１６３】
本明細書で用いられる場合、「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝暗号の性質を指す。従って、本発明は、本発明の微生物ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をコードするあらゆる核酸分子に関する。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。従って、宿主細胞における発現の改善のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１６４】
本明細書で用いられる場合、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域を指すような「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変更することなく、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための遺伝子または核酸分子のコード領域におけるコドンの変更を指す。
【０１６５】
本明細書で用いられる場合、「合成遺伝子」は、当業者に知られている手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成要素から組み立てることができる。これらの構成要素は連結およびアニールされて遺伝子セグメントを形成し、これは次に酵素的に組み立てられて遺伝子全体を構築する。ＤＮＡ配列に関する場合の「化学的に合成される」は、ヌクレオチド成分がインビトロで組み立てられることを意味する。十分に確立された手順を用いて手作業でのＤＮＡの化学合成が達成されてもよいし、あるいは多数の市販の機械の１つを用いて自動化学合成が実施されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて、遺伝子を最適な遺伝子発現に合わせて作り、宿主細胞のコドンバイアスを反映することができる。当業者は、コドン使用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合に、遺伝子発現が成功する可能性を認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能な宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１６６】
本明細書で用いられる場合、「遺伝子」は特定のタンパク質を発現する核酸分子を指し、コード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）の制御配列が含まれる。「天然遺伝子」は、その独自の制御配列を有する天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない制御およびコード配列を含む、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同じ源に由来するが天然に見出されるものとは異なった形で配列された制御配列およびコード配列を含むことができる。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、通常は宿主生物中に見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物中に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム内に導入された遺伝子である。
【０１６７】
本明細書で用いられる場合、「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。
【０１６８】
本明細書で用いられる場合、「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよいし、あるいは天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよいし、あるいはさらに合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる発生段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に応答して遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者によって理解される。ほとんどの時点で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【０１６９】
本明細書で用いられる場合、「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列（通常は、真核生物に限定される）と、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる制御シグナルをコードする他の配列とが含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸経路（通常は、真核生物に限定される）の付加に影響を与えることを特徴とする。
【０１７０】
本明細書で用いられる場合、「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一の核酸分子における核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響することができる場合、そのコード配列と作動可能に連結されており、すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写調節下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結され得る。
【０１７１】
本明細書で用いられる場合、「発現」という用語は、本明細書に記載される核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。また発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともできる。
【０１７２】
本明細書で用いられる場合、「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸分子の転移を指す。本発明において、宿主細胞のゲノムは、染色体遺伝子および染色体外（例えば、プラスミド）遺伝子を含む。形質転換された核酸分子を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【０１７３】
本明細書で用いられる場合、「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、任意の源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（直鎖または環状）であってもよく、ここで、多数のヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入することができる独特の構成に結合または組換えられている。「形質転換カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の発現の強化を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【０１７４】
本明細書で用いられる場合、「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．８３、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６７３−４６８０（１９９４年）、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議，１１１−２０．編：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ．４．０５が含まれ得るがこれらに限定されない。本出願に関連して、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に元々ロードされた、ソフトウェア製造業者により設定された任意の値のセットまたはパラメータセットを意味するであろう。
【０１７５】
本明細書で用いられる場合、「生物学的汚染物質」という用語は、１つまたは複数の不要なおよび／または病原性の生物学的実体を指し、微生物、胞子、ウィルス、プリオン、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。本方法は、生存可能な生物学的汚染物質の存在を低減および／または除去するために有用である有効な濃度の少なくとも１つの過カルボン酸を生成する。好ましい実施形態では、生物学的汚染物質は、生存可能な病原微生物である。
【０１７６】
本明細書で用いられる場合、「消毒する」という用語は、生物学的汚染物質を破壊する、または生物学的汚染物質の増殖を予防する過程を指す。本明細書で用いられる場合、「消毒薬」という用語は、生物学的汚染物質の破壊、中和、または増殖の阻害によって消毒する薬剤を指す。本明細書で用いられる場合、「消毒」という用語は、消毒の作用または過程を指す。通常、消毒薬は無生物体または表面を処理するために使用される。本明細書で用いられる場合、「防腐剤」という用語は、疾患を保有する生物学的汚染物質（微生物など）の増殖を阻害する化学物質を指す。本発明の方法および系の１つの態様では、生物学的汚染物質は病原微生物である。
【０１７７】
本明細書で用いられる場合、「衛生」という用語は、通常、健康に有害であり得る物質を除去、防止、または調節することによる、健康の回復または予防を意味する、またはこれらに関する。本明細書で用いられる場合、「衛生化する」という用語は、衛生にすることを意味する。本明細書で用いられる場合、「サニタイザー」という用語は、衛生化する薬剤を指す。本明細書で用いられる場合、「衛生化」という用語は、衛生化の作用または過程を指す。
【０１７８】
本明細書で用いられる場合、「抗ウィルス剤（ｖｉｒｕｃｉｄｅ）」という用語は、ウィルスを阻害または破壊する薬剤を指し、「抗ウィルス薬（ｖｉｒｉｃｉｄｅ）」と同義である。ウィルスを阻害または破壊する能力を示す薬剤は、「抗ウィルス」活性を有すると説明される。過酸は、抗ウィルス活性を有することができる。本発明と共に使用するのに適し得る当該技術分野で既知の典型的な代替の抗ウィルス剤としては、例えば、アルコール、エーテル、クロロホルム、ホルムアルデヒド、フェノール、ベータプロピオラクトン、ヨウ素、塩素、水銀塩、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、エチレングリコール、第４級アンモニウム化合物、酵素、および洗剤が挙げられる。
【０１７９】
本明細書で用いられる場合、「殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）」という用語は、微生物を不活性化または破壊する化学物質（通常は広範囲）を指す。微生物を不活性化または破壊する能力を示す化学物質は、「殺生物（ｂｉｏｃｉｄａｌ）」活性を有すると説明される。過酸は、殺生物活性を有することができる。本発明における使用に適し得る当該技術分野で既知の典型的な代替の殺生物剤としては、例えば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌラート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール（ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ）、銅塩、有機硫黄化合物、および第４級アンモニウム塩が挙げられる。
【０１８０】
本明細書で用いられる場合、「最小殺生物濃度」という語句は、特定の接触時間に、標的微生物の生存可能な集団において所望の致死的で不可逆的な低減を生じ得る殺生物剤の最小濃度を指す。有効性は、処理後の生存可能な微生物の減少のｌｏｇ１０によって測定することができる。１つの態様では、標的とされる生存可能な微生物の処理後の減少は、少なくとも３−ｌｏｇの減少、より好ましくは少なくとも４−ｌｏｇの減少、最も好ましくは少なくとも５−ｌｏｇの減少である。別の態様では、最小殺生物濃度は、生存可能な微生物細胞の少なくとも６−ｌｏｇの減少である。
【０１８１】
本明細書で用いられる場合、「有益な薬剤」という用語は、有用な利点または好ましい効果を促進または増強するものを指す。一実施形態では、消毒、衛生化、漂白、染みの除去、脱臭／臭気の低減、およびこれらの任意の組み合わせなどの所望の利益を達成するためにペルオキシカルボン酸を含む組成物などの有益な薬剤を衣類品または織物品に適用させる方法および系が提供される。
【０１８２】
本明細書で用いられる場合、「過酸素源」および「過酸素の源」という用語は、水溶液中にある場合に約１ｍＭ以上の濃度の過酸化水素を提供することができる化合物を指し、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））、過ホウ酸塩、および過炭酸塩が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において記載されるように、水性反応配合物中の過酸素化合物によって提供される過酸化水素の濃度は、反応成分を混ぜ合わせたときに最初は少なくとも１ｍＭ以上である。一実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも１０ｍＭである。別の実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも１００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも２００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度は、５００ｍＭ以上である。さらに別の実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度は、１０００ｍＭ以上である。水性反応配合物中の酵素基質、例えばトリグリセリドに対する過酸化水素のモル比（Ｈ２Ｏ２：基質）は約０．００２〜２０でよく、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５でよい。
【０１８３】
本発明で開示される方法および系のいくつかの実施形態では、酵素触媒は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属する構造を有するペルヒドロラーゼを含む。他の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的に、セファロスポリンＣデアセチラーゼとして分類される。他の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的に、アセチルキシランエステラーゼとして分類される。「酵素触媒」、「過加水分解活性を有する酵素触媒」、および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は本明細書において交換可能に使用される。
【０１８４】
本発明の方法および系のいくつかの実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２と整列するＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記ＣＥ−７シグネチャーモチーフは：
ｉ）配列番号２のアミノ酸位置１１８−１２０におけるＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置１７９−１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９８−２９９におけるＨＥモチーフ
を含み、また前記酵素は、配列番号２に対して少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む。
【０１８５】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、シグネチャーモチーフは、さらに、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２に整列されるときにアミノ酸残基２６７−２６９におけるＬＸＤモチーフであると定義される第４の保存モチーフを含む。
【０１８６】
本発明の方法および系の付加的な実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７３、および配列番号７４からなる群から選択されるペルヒドロラーゼ活性を有する酵素、あるいは前記アミノ酸配列に対する１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加によって誘導されるペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似の酵素を含むことができる。
【０１８７】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、ペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似の酵素は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７３、および配列番号７４からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、またさらにより好ましくは少なくとも７０％、またさらにより好ましくは少なくとも８０％、またさらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【０１８８】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、および配列番号７１からなる群から選択される核酸配列とハイブリッド形成する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【０１８９】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号１４および配列番号７３（すなわち、野生型サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）およびアミノ酸残基２７７におけるアミノ酸置換を有するサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）変異体）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【０１９０】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号１６および配列番号７４（すなわち、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）およびアミノ酸残基２７７におけるアミノ酸置換を有するサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【０１９１】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号４９として定義される連続シグネチャーモチーフと少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３６％のアミノ酸同一性を有する酵素を含み、上記の保存モチーフ（すなわち、ＲＧＱ、ＧＸＳＱＧ、およびＨＥ、場合により、ＬＸＤ）は保存されている。
【０１９２】
本発明で開示される方法および系に関して、適切なカルボン酸エステル基質は、以下の式：
［Ｘ］ｍＲ５
によって提供されるエステルを含み、式中、
Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、場合により、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合にＲ６は１つまたは複数のエーテル結合を含み、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換され得るＣ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１つ以下のヒドロキシル基または１つ以下のエステル基を含み、場合により、Ｒ５は１つまたは複数のエーテル結合を含み、
ｍ＝１からＲ５中の炭素原子の数までであり、
前記エステルは、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水中での溶解度を有する。
【０１９３】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、適切な基質は、式：
【化５】
0005656845.tif 000007
のエステルも含み、式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２＝Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎＨまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨおよびｎ＝１〜１０である。
【０１９４】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、適切なカルボン酸エステル基質は、式：
【化６】
0005656845.tif 000008
のグリセリドを含み、式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である。
【０１９５】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、Ｒ６は場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換され得るＣ１〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分であり、場合により、１つまたは複数のエーテル結合を含む。さらに好ましい実施形態では、Ｒ６は場合によりヒドロキシル基によって置換され得るＣ２〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分であり、そして／あるいは場合により１つまたは複数のエーテル結合を含む。
【０１９６】
開示される方法および系のその他の実施形態では、適切なカルボン酸エステル基質は、アセチル化単糖、二糖、および多糖からなる群から選択されるアセチル化糖類も含む。好ましい実施形態では、アセチル化糖類は、アセチル化単糖、二糖、および多糖を含む。他の実施形態では、アセチル化糖類は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランの断片、アセチル化キシロース（キシローステトラアセタートなど）、アセチル化グルコース（グルコースペンタアセタートなど）、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。好ましい実施形態では、アセチル化糖類は、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。従って、アセチル化炭水化物は、本発明の方法および系を用いて（すなわち、過酸素源の存在下で）過カルボン酸を発生させるために適切な基質であり得る。
【０１９７】
本発明の方法および系の付加的な実施形態では、カルボン酸エステル基質は、モノアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、グルコースペンタアセタート、キシローステトラアセタート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−グルカール、プロピレングリコールジアセタート、エチレングリコールジアセタートと、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステルと、これらの混合物であり得る。本発明の方法および系の好ましい実施形態では、基質はトリアセチンを含む。
【０１９８】
好ましくは、本発明の方法および系において使用される基質は、約１００ｍｇ／ｍＬ未満の水中での溶解度を有する。本発明の方法および系のいくつかの実施形態では、水性反応混合物中の基質の重量パーセントは、水中での基質の溶解限界を上回る。
【０１９９】
本発明で開示される方法および系のその他の実施形態では、基質は、酢酸エチル、乳酸メチル、乳酸エチル、グリコール酸メチル、グリコール酸エチル、メトキシ酢酸メチル、メトキシ酢酸エチル、３−ヒドロキシ酪酸メチル、３−ヒドロキシ酪酸エチル、２−アセチルクエン酸トリエチル、グルコースペンタアセタート、グルコノラクトン、グリセリド（モノ、ジ、およびトリグリセリド）、例えば、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン（グリセリルジプロピオナート）、トリプロピオニン（１，２，３−トリプロピオニルグリセロール）、モノブチリン、ジブチリン（グリセリルジブチラート）、トリブチリン（１，２，３−トリブチリルグリセロール）、アセチル化糖類、およびこれらの混合物であり得る。
【０２００】
本発明の方法および系のさらに好ましい態様では、カルボン酸エステル基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群から選択される。さらに別の態様では、カルボン酸エステル基質は、ジアセチン、トリアセチン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群から選択される。好ましい態様では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびこれらの混合物からなる群から選択されるグリセリドである。
【０２０１】
多成分型の発生系における共溶媒の使用
本発明で開示される方法および系において使用するための共溶媒は、約２よりも小さいｌｏｇ  Ｐを有する有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、共溶媒は、好ましくは、アルコールである。共溶媒は、好ましくは、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロルジノン（ｐｙｒｒｏｌｄｉｎｏｎｅ）、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、１，３−プロパンジオール、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。本発明の方法および系のいくつかの実施形態では、共溶媒は、トリプロピレングリコールメチルエーテルを含む。
【０２０２】
多成分系においてペルオキシカルボン酸を生成するための本発明の方法では、多成分系は、共溶媒を含む触媒組成物を含む第１の成分と、過酸素源および水を含む第２の成分とを含むことができる。第２の成分は、過酸化水素の貯蔵寿命を延ばすために、任意的な安定剤を含んでもよい。第１の成分と第２の成分とを混ぜ合わせる前に、触媒、基質、および共溶媒を混ぜ合わせて第１の成分を形成することができる。同様に、表面を消毒するための開示される方法に関して、触媒組成物および過酸素源を混ぜ合わせるステップは、触媒組成物および共溶媒を含む第１の成分と、過酸素源および水を含む第２の成分と混ぜ合わせることを含むことができる。
【０２０３】
多成分系が、共溶媒を含む触媒組成物を含む第１の成分と、過酸素源および水を含む第２の成分とを含む、本発明の方法および系の実施形態では、第１の成分は、約１：１〜約１：１０の重量による比率で、第２の成分と混ぜ合わせることができる。一実施形態では、第１の成分は、約１：９の重量による比率で第２の成分と混ぜ合わせられる。
【０２０４】
上記のような第１および第２の成分の１：１〜１：１０の混合物の範囲で、第１の成分中の酵素基質（「活性化剤」）の濃度、および第１の成分に対する第２の成分の比率も、第１の成分および第２の成分の最終混合物中で基質が可溶性であるように選択される。例えば、水中のトリアセチンの溶解度は７１．７ｇ／Ｌであると報告されており（Ｓｅｅｌｉｇ，Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｂｅｒｉｃｈｔｅ；２４：３４６６（１８９１年））、１，２−プロパンジオールジアセタートの溶解度は、１０部の水中に１部であると報告されており（Ｗｕｒｔｚ，Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ；５５：４４３（１８５９年）、Ｊｕｓｔｕｓ  Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎａｌｅｎ  ｄｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ；１０５：２０６（１８５８年））、そして水中のトリブチリンの溶解度は、０．０１５％（体積／体積）であると報告されている（Ｌｏｓｋｉｔ，Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｅｒ  Ｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｓｔｏｅｃｈｉｏｍｅｔｒｉｅ  ｕｎｄ  Ｖｅｒｗａｎｄｔｓｃｈａｆｔｓｌｅｈｒｅ；１３４：１３７（１９２８年））。本発明の酵素基質に対する広範囲の溶解度を考慮すると（酵素基質は以下に記載される）、本発明の第１の成分に添加される共溶媒は、所望の比率の第１の成分および第２の成分の混合を可能にするための第１の成分中の希釈剤としてのその機能に加えて、水中での溶解度が低い酵素基質の溶解を助ける働きをすることができる。本発明の一実施形態では、基質は、少なくとも２５％（重量／重量）の濃度において、結果として得られる第１の成分および第２の成分の配合物中に可溶性である。本発明の第２の実施形態では、基質は、少なくとも１０％（重量／重量）の濃度において、結果として得られる第１の成分および第２の成分の配合物中に可溶性である。本発明の第３の実施形態では、基質は、少なくとも５％（重量／重量）の濃度において、結果として得られる第１の成分および第２の成分の配合物中に可溶性である。本発明の第４の実施形態では、基質は、少なくとも２％（重量／重量）の濃度において、結果として得られる第１の成分および第２の成分の配合物中に可溶性である。
【０２０５】
一実施形態では、共溶媒は、約２０重量％〜約８０重量％の量で第１の成分中に存在し得る。基質は、約１０重量％〜約６０重量％の量で第１の成分中に存在し得る。いくつかの実施形態では、第１の成分は、約５５重量％の基質、約４０重量％の共溶媒、約０．３重量％の酵素触媒、および約２．５重量％の充填剤を含み、第２の成分は、約９５重量％の水、約１．５重量％の重炭酸ナトリウム、および約１重量％の過酸素源を含むことができる。他の例では、第１の成分は、約５５．５重量％のトリアセチン、約４１重量％のトリプロピレングリコールメチルエーテル、約０．９％の重炭酸ナトリウム、約０．３重量％の噴霧乾燥酵素粉末（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）もしくはサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ、またはサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）もしくはサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）の過加水分解活性を改善する１つまたは複数の点突然変異を有する変異誘導体のペルヒドロラーゼを含む）、および約２．５重量％のヒュームドシリカを含み、第２の成分は、約９６重量％の水、約０．２重量％の過酸化水素安定剤（例えば、（１−ヒドロキシエチリデン）ビスホスホン酸））、および約３．２重量％の、３０％の過酸化水素を含む溶液を含むことができる。
【０２０６】
本発明の方法および系に関して、カルボン酸エステル基質は、酵素触媒による過加水分解の際に所望の濃度の過酸を生じるのに十分な濃度で使用され得る。カルボン酸エステルは反応配合物中に完全に可溶性でなくてもよいが、好ましくは、ペルヒドロラーゼ触媒によってエステルが対応する過酸へ転化できるようにするために十分な溶解度を有する。カルボン酸エステルは、反応配合物の約０．０００５重量％〜約４０重量％の濃度、好ましくは水性反応配合物の０．１重量％〜２０重量％の濃度、より好ましくは水性反応配合物の０．５重量％〜１０重量％の濃度で、水性反応配合物中に存在する。カルボン酸エステルの重量％は、カルボン酸エステルの溶解限界よりも大きいこともある。添加されるカルボン酸エステルの全てがすぐに水性反応配合物中に溶解しなければいけないわけではなく、全ての反応成分の初期混合の後、付加的な連続または不連続の混合は任意的である。
【０２０７】
本発明の方法および系において、過酸素源としては、過酸化水素、過酸化水素付加物（尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド）など）、過ホウ酸塩および過炭酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。水性反応配合物中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３重量％〜約５０重量％、好ましくは０．０３３重量％〜約４０重量％、より好ましくは０．３３重量％〜約３０重量％の範囲であり得る。
【０２０８】
本発明の方法および系の反応配合物は、約５ｍＭ〜約２５０ｍＭの基質、約５ｍＭ〜約２５０ｍＭの過酸素源、および約０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２．０ｍｇ／ｍＬの酵素触媒を含むことができる。このような例では、基質はトリアセチンを含み、過酸素源は過酸化水素を含み、そして酵素触媒は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）またはサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）のペルヒドロラーゼを含むことができる。別の実施形態では、酵素触媒は、配列番号７３または配列番号７４により定義され、アミノ酸残基位置２７７において野生型システインがアラニン、バリン、セリン、またはスレオニンによって置換されたサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）またはサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）の変異体を含むことができる。
【０２０９】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過処理された全細胞、および部分精製全細胞抽出物など）は、カタラーゼ活性を有することが報告されている（ＥＣ  １．１１．１．６）。カタラーゼは、過酸化水素の酸素および水への転化を触媒する。本発明で開示される方法および系の１つの態様では、過加水分解触媒にはカタラーゼ活性がない。別の態様では、反応配合物にカタラーゼ阻害剤が添加される。カタラーゼ阻害剤の例としては、ナトリウムアジドおよび硫酸ヒドロキシルアミンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調整することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、通常、０．１ｍＭ〜約１Ｍ、好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。１つの態様では、ナトリウムアジドの濃度は通常約２０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であり、硫酸ヒドロキシルアミンの濃度は通常約０．５ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭである。
【０２１０】
本発明の方法および系のその他の実施形態では、酵素触媒には有意なカタラーゼ活性がないか、あるいはカタラーゼ活性を低減または除去するように操作されている。宿主細胞におけるカタラーゼ活性は、よく知られた技術（トランスポゾン変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的化変異誘発、およびランダム変異誘発を含むがこれらに限定されない）を用いてカタラーゼ活性の原因である遺伝子の発現を破壊することによって、下方制御または除去することができる。本発明の方法および系のいくつかの実施形態では、内在性カタラーゼ活性をコードする遺伝子は、下方制御または破壊（すなわち、「ノックアウト」）される。本明細書で用いられる場合、「破壊された」遺伝子は、改変された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性および／または機能がもう存在しない遺伝子である。遺伝子を破壊するための手段は当該技術分野においてよく知られており、対応するタンパク質の活性および／または機能が存在しなくなる限り、遺伝子への挿入、欠失または突然変異を含むことができるがこれらに限定されない。さらに好ましい実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧ（配列番号３５）およびｋａｔＥ（配列番号４４）からなる群から選択される破壊されたカタラーゼ遺伝子を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生宿主である。他の実施形態では、産生宿主は、ｋａｔｇ１およびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方における下方制御および／または破壊を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。ｋａｔＧおよびｋａｔＥの二重ノックアウトを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が本明細書で提供される（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＫＬＰ１８）。
【０２１１】
本明細書において記載されるカタラーゼ陰性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＫＬＰ１８は、発酵槽条件下での増殖により決定されるように、カタラーゼ陰性株ＵＭ２（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＃７１５６，イェール大学，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ  ＣＴ）と比較して、ペルヒドロラーゼ酵素の大規模（１０−Ｌ以上）産生のために優れた宿主であることが実証されている。ＫＬＰ１８およびＵＭ２は両方ともカタラーゼ陰性株であるが、ＵＭ２は多数の栄養要求体を有することが知られており、従って、酵母抽出物およびペプトンで強化された培地を必要とする。発酵のために強化された培地を用いる場合でも、ＵＭ２は、不十分に、そして限られた最大細胞密度（ＯＤ）までしか増殖しなかった。対照的に、ＫＬＰ１８は特別な栄養要求を有さず、ミネラル培地のみにおいて、あるいは付加的な酵母抽出物を含む培地において高い細胞密度まで増殖した。
【０２１２】
本発明の方法および系の水性反応配合物中の触媒の濃度は触媒の特定の触媒活性に依存し、所望の反応速度を得るように選択される。過加水分解反応における触媒の重量は、通常、全反応体積の０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１０ｍｇ〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。また触媒は、当業者によく知られた方法を用いて可溶性または不溶性担体に固定化されてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ、１９９７年が参照される。固定化触媒の使用は、その後の反応における触媒の回収および再利用を可能にする。酵素触媒は、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製もしくは精製酵素、またはこれらの混合物の形態であり得る。
【０２１３】
本発明の方法および系の１つの態様では、過カルボン酸エステルの化学的な過加水分解と酵素的な過加水分解との組み合わせによって発生される酸の濃度は、所望のｐＨにおいて漂白、衛生化または消毒のために有効な濃度の過酸を提供するのに十分である。別の態様では、本発明の方法および系は、所望の有効な濃度の過酸を生成するための酵素および酵素基質の組み合わせを提供し、ここで、添加される酵素が存在しないと、著しくより低い濃度の過酸が生成される。場合によっては、無機過酸化物と酵素基質との直接的な化学反応によって酵素基質の実質的に化学的な過加水分解が起こり得るが、所望の用途において有効な濃度の過酸を提供するために十分な濃度の過酸は発生しないことがあり、全過酸濃度の著しい増大は、反応配合物への適切なペルヒドロラーゼ触媒の添加によって達成される。
【０２１４】
本発明の系および方法に関連して、少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解によって発生される過酸（例えば、過酢酸）の濃度は、過加水分解反応を開始させてから１０分以内、好ましくは５分以内、最も好ましくは１分以内に、少なくとも約２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍの過酸、より好ましくは少なくとも３００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍの過酸、最も好ましくは少なくとも２０００ｐｐｍの過酸であり得る。過酸を含む生成配合物は、場合により、水または主に水で構成される溶液で希釈され、所望のより低い濃度の過酸を含む配合物を生成することができる。本発明の方法および系の１つの態様では、所望の濃度の過酸を生成するために必要とされる反応時間は、約２時間以内、好ましくは約３０分以内、より好ましくは約１０分以内、さらにより好ましくは約５分以内、最も好ましくは約１分以内である。表面を消毒するための本発明の方法のその他の態様では、生物学的汚染物質で汚染された硬い表面または無生物体を含む表面は、前記反応成分を混ぜ合わせてから約１分〜約１６８時間以内に、または約１分〜約４８時間以内に、または前記反応成分を混ぜ合わせてから約１分〜２時間以内に、または本明細書中のこのようなあらゆる時間間隔で、本明細書において記載される方法に従って形成される過酸と接触される。
【０２１５】
反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を調節するように選択される。反応の温度は、反応配合物の凝固点（約０℃）のすぐ上の温度から約９５℃まで、好ましくは約５℃〜約７５℃の範囲でよく、反応温度のより好ましい範囲は約５℃〜約５５℃である。
【０２１６】
過酸を含有する最終反応配合物のｐＨは、約２〜約９、好ましくは約３〜約８、より好ましくは約５〜約８、さらにより好ましくは約６〜約８、またさらにより好ましくは約６．５〜約７．５である。別の実施形態では、反応配合物のｐＨは酸性（ｐＨ＜７）である。反応および最終的な反応配合物のｐＨは、場合により、適切な緩衝液（重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、またはマレイン酸を含むが、これらに限定されない）の添加によって調節することができる。使用される場合の緩衝液の濃度は、通常、０．１ｍＭ〜１．０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。
【０２１７】
本発明の方法および系の別の態様では、酵素的過加水分解生成物は、望ましい機能性を提供する付加的な成分を含有し得る。さらなる態様では、本発明の方法および系は、衣類品の処理のためのランドリーケア用途において使用される。付加的な成分の例としては、緩衝液、洗剤ビルダー（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｂｕｉｌｄｅｒ）、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、防蝕剤（ベンゾトリアゾールなど）、酵素安定剤、および過酸化水素安定剤（金属イオンキレート化剤など）が挙げられるが、これらに限定されない。付加的な成分の多くは洗剤産業においてよく知られている（参照によって本明細書に援用される米国特許第５，９３２，５３２号明細書に記載されるものなど）。乳化剤の例としては、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。増粘剤の例としては、ＬＡＰＯＮＩＴＥ（登録商標）ＲＤ、コーンスターチ、ＰＶＰ、ＣＡＲＢＯＷＡＸ（登録商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、ＣＡＢＯＳＩＬ（登録商標）、ポリソルベート２０、ＰＶＡ、およびレシチンが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝系の例としては、リン酸ナトリウム一塩基性／リン酸ナトリウム二塩基性、スルファミン酸／トリエタノールアミン、クエン酸／トリエタノールアミン、酒石酸／トリエタノールアミン、コハク酸／トリエタノールアミン、および酢酸／トリエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤の例としては、（ａ）エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドのブロックコポリマー、エトキシル化またはプロポキシル化線状および分枝状第１級および第２級アルコール、ならびに脂肪族ホスフィンオキシドなどの非イオン性界面活性剤、（ｂ）第４級アンモニウム化合物、特に、３つのＣ１〜Ｃ２アルキル基に結合した窒素原子にＣ８〜Ｃ２０アルキル基がさらに結合した第４級アンモニウム化合物などのカチオン性界面活性剤、（ｃ）アルカンカルボン酸（例えば、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸）、アルキルホスホナート、アルカンスルホナート（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム「ＳＤＳ」）、または線状もしくは分枝状アルキルベンゼンスルホネート、アルケンスルホナートなどのアニオン性界面活性剤、ならびに（ｄ）アミノカルボン酸、アミノジカルボン酸、アルキルベタイン、およびこれらの混合物などの両性および両性イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。付加的な成分は、香料、染料、過酸化水素安定剤（例えば、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）２０１０、Ｓｏｌｕｔｉａ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート剤）、ＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（ＣＡＳ＃２８０９−２１−４）、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５２０、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５３１、酵素活性の安定剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、および洗剤ビルダーを含むことができる。
【０２１８】
表面を消毒する本発明の方法の別の態様では、酵素的過加水分解生成物は、消毒すべき表面と接触させる前に、前もって混合されて、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させることができる。表面を消毒する本発明の方法の別の態様では、酵素的過加水分解生成物は、消毒すべき表面（硬い表面または無生物体など）と接触させる前に、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために前もって混合されず、その代わりに、所望の濃度の過カルボン酸を発生させるための反応配合物の成分が、消毒、衛生化、漂白、脱染、脱臭すべき（またはこれらの任意の組み合わせ）表面と接触されて、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。いくつかの実施形態では、反応配合物の成分は、その場所で結合または混合される。いくつかの実施形態では、反応成分は、その場所に送達または適用され、その後に混合または結合されて、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。
【０２１９】
表面を消毒する、または衣類品もしくは織物品に利益（染みの除去、臭気の低減、漂白、衛生化、および／または消毒）をもたらす本発明の方法のあらゆる実施形態において、水性反応配合物は、噴霧、注入、散布、拭取、または任意の他の適切な技術（その多数の他の例は当業者の間で認識されるであろう）によって表面に適用することができる。
【０２２０】
ペルヒドロラーゼ触媒を用いたその場での過酸の生成
セファロスポリンＣデアセチラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１、系統名セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ、ＣＡＨ）は、セファロスポリンＣ、７−アミノセファロスポラン酸、および７−（チオフェン−２−アセトアミド）セファロスポラン酸などのセファロスポリンに結合したアセチルエステルを加水分解する能力を有する酵素である（Ａｂｂｏｔｔ，Ｂ．ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（３）：４１３−４１９（１９７５年））。ＣＡＨは、炭水化物エステラーゼファミリー７と呼ばれる構造的に関連する酵素のより大きいファミリーに属する（ＣＥ−７、Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ」  ｉｎ  「Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．  Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．  ＨｅｎｒｉｓｓａｔおよびＢ．  Ｓｖｅｎｓｓｏｎ編（１９９９年）Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，３−１２頁を参照）。
【０２２１】
ＣＥ−７ファミリーは、ＣＡＨおよびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）の両方を含む。ＣＥ−７ファミリーのメンバーは共通の構造モチーフを共有し、通常、アセチル化キシロオリゴ糖およびセファロスポリンＣの両方に対してエステル加水分解活性を示すという点で非常に珍しく、このことから、ＣＥ−７ファミリーは、様々な小さい基質に対して多機能性のデアセチラーゼ活性を有する単一のタンパク質の種類を表すことが示唆される（Ｖｉｎｃｅｎｔら、上記）。Ｖｉｎｃｅｎｔらは、このファミリーのメンバー間の構造的な類似性について記載し、ＣＥ−７ファミリーの特徴を有するシグネチャー配列モチーフを定義する（「ＣＥ−７シグネチャーモチーフ」）。
【０２２２】
ＣＥ−７ファミリーのメンバーは、植物、真菌（例えば、セファロスポリジウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ））、酵母（例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ））、および細菌（サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ノルカルディア・ラクタムデュランス（ｎｏｒｃａｒｄｉａ  ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）、およびバチルス属の種々のメンバーなど）において見出される（Ｐｏｌｉｔｉｎｏら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（１２）：４８０７−４８１１（１９９７年）、Ｓａｋａｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５：５３−５７（１９９８年）、Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．およびＷｉｅｇｅｌ，Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：５４３６−５４４１（１９９７年）、Ｃａｒｄｏｚａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４（３）：４０６−４１２（２０００年）、Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａら，ｓｕｐｒａ，Ａｂｂｏｔｔ，Ｂ．およびＦｕｋｕｄａ，Ｄ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（３）：４１３−４１９（１９７５年）、Ｖｉｎｃｅｎｔら，上記、Ｔａｋａｍｉら，ＮＡＲ，２８（２１）：４３１７−４３３１（２０００年）、Ｒｅｙら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，５（１０）：ａｒｔｉｃｌｅ  ７７（２００４年）、Ｄｅｇｒａｓｓｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１４６：１５８５−１５９１（２０００年）、米国特許第６，６４５，２３３号明細書、米国特許第５，２８１，５２５号明細書、米国特許第５，３３８，６７６号明細書、および国際公開第９９／０３９８４号パンフレット）。配列番号２に対して有意な相同性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーのメンバーの非包括的な一覧は、表１に提供される。
【０２２３】
【表２】
0005656845.tif 000009
【０２２４】
【表３】
0005656845.tif 000010
【０２２５】
【表４】
0005656845.tif 000011
【０２２６】
【表５】
0005656845.tif 000012
【０２２７】
本発明の方法および系において使用するためのペルヒドロラーゼは、好ましくは、全てＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーのメンバーである。酵素触媒は、配列番号１４によって定義されるサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼを含むことができる。本発明の方法および系のその他の実施形態では、酵素触媒は、配列番号１６によって定義されるサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを含むことができる。Ｖｉｎｃｅｎｔら（上記）によって記載されるように、ファミリーのメンバーは、このファミリーの特徴を示す共通のシグネチャーモチーフを共有する。本発明のペルヒドロラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントは、メンバーが全てＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属することを説明する（図１のシートＡ〜Ｆ）。ＣＥ−７ペルヒドロラーゼのいくつかの間の全体的なアミノ酸同一性パーセントの比較は表２において提供される。
【０２２８】
【表６】
0005656845.tif 000013
【０２２９】
全体的なアミノ酸同一性パーセントに関して変動が観察される（すなわち、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭペルヒドロラーゼ、配列番号１２は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭペルヒドロラーゼ、配列番号２と５７％のアミノ酸同一性しか共有しないが、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ペルヒドロラーゼ（配列番号２４）は、配列番号２と３３％の同一性しか共有しない）が、本発明のペルヒドロラーゼ酵素のそれぞれは、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを共有する。従って、本発明のペルヒドロラーゼ触媒は構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属すると分類される酵素である。本発明のペルヒドロラーゼ酵素のそれぞれは、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含む。
【０２３０】
本発明の方法および系の一実施形態では、適切な過加水分解酵素は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフの存在によって同定することができる（Ｖｉｎｃｅｎｔら、上記）。好ましい実施形態では、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むペルヒドロラーゼは、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭペルヒドロラーゼ（配列番号２、相対的なアミノ酸位置の番号付けのために使用される参照配列）に対して、ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントを用いて同定される。配列番号２のアミノ酸残基の番号付けにより、ＣＥ−７シグネチャーモチーフは、ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０、ｂ）Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３、およびｃ）Ｈｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９と定義される３つの保存モチーフを含む。従って、本発明の系および方法において使用される酵素触媒は、配列番号２に対して、Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０、Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３、およびＨｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９と定義される３つの配列モチーフを含み得る。それぞれのシグネチャーモチーフのアライメントは表３に提供される。通常、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、またはスレオニンである。触媒トライアッド（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）に属する３つのアミノ酸残基のうちの２つは太字である。一実施形態では、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、およびスレオニンからなる群から選択される。
【０２３１】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー内の保存モチーフのさらなる分析は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼをさらに定義するために使用され得る付加的なモチーフ（配列番号２のアミノ酸位置２６７−２６９のＬＸＤ）の存在を示す。本発明の方法および系のさらなる実施形態では、上記で定義されたシグネチャーモチーフは、参照配列番号２に対してＬｅｕ２６７−Ｘａａ２６８−Ａｓｐ２６９と定義される第４の保存モチーフを含むことができる。アミノ酸残基位置２６８のＸａａは、通常、イソロイシン、バリン、またはメチオニンである。第４のモチーフは、触媒トライアッドの第３のメンバーであるアスパラギン酸残基を含む（Ｓｅｒ１８１−Ａｓｐ２６９−Ｈｉｓ２９８）。
【０２３２】
多数のよく知られているグローバルなアライメントアルゴリズムを用いて、２つ以上のアミノ酸配列（ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を表す）を整列させ、本発明のシグネチャーモチーフの存在を決定することができる（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷまたはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０年））。整列された配列は、参照配列（配列番号２）と比較される。一実施形態では、参照アミノ酸配列（本明細書で使用される場合、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからのＣＡＨ配列（配列番号２））を用いるＣＬＵＳＴＡＬアライメント（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、例えばバージョン１．８３））を使用して、ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを同定する。保存アミノ酸残基の相対的な番号付けは、整列された配列内の小さい挿入または欠失（通常、５アミノ酸以下）を考慮に入れるために、参照アミノ酸配列の残基の番号付けに基づく。
【０２３３】
本明細書において例示されるペルヒドロラーゼ間での全体的な同一性パーセントの比較によって、配列番号２に対してわずか３３％の同一性しか有さない酵素（シグネチャーモチーフを保持しながら）は有意なペルヒドロラーゼ活性を示し、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼと分類されることが示される。本発明の方法および系のいくつかの実施形態では、本発明のペルヒドロラーゼは、本発明のシグネチャーモチーフと、配列番号２に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも４２％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性とを含む酵素を含む。
【０２３４】
上記のシグネチャーモチーフで構成されるＣＥ−７酵素の例は、表３に提供される。
【０２３５】
【表７】
0005656845.tif 000014
【０２３６】
あるいは、Ｖｉｎｃｅｎｔら（上記）によって同定された３つの保存モチーフ（ＲＧＱ、ＧＸＳＱＧ、およびＨＥ、配列番号２のアミノ酸残基１１８−２９９、任意的な第４のモチーフ、ＬＸＤも下線が引かれる）を含む連続シグネチャーモチーフ（配列番号４９）は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼを同定するための連続シグネチャーモチーフとしても用いることができる（図１のパネルＡ〜Ｆ）。従って、ペルヒドロラーゼ活性を有することが予想される適切な酵素は、配列番号４９に対して少なくとも３０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも３６％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、またさらにより好ましくは少なくとも７０％、またさらにより好ましくは少なくとも８０％、またさらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性も有すると同定され得る（ＣＥ−７炭水化物エステラーゼにおいて見出される４つの保存モチーフは下線が引かれる）。
ＲＧＱＱＳＳＥＤＴＳＩＳＬＨＧＨＡＬＧＷＭＴＫＧＩＬＤＫＤＴＹＹＹＲＧＶＹＬＤＡＶＲＡＬＥＶＩＳＳＦＤＥＶＤＥＴＲＩＧＶＴＧＧＳＱＧＧＧＬＴＩＡＡＡＡＬＳＤＩＰＫＡＡＶＡＤＹＰＹＬＳＮＦＥＲＡＩＤＶＡＬＥＱＰＹＬＥＩＮＳＦＦＲＲＮＧＳＰＥＴＥＶＱＡＭＫＴＬＳＹＦＤＩＭＮＬＡＤＲＶＫＶＰＶＬＭＳＩＧＬＩＤＫＶＴＰＰＳＴＶＦＡＡＹＮＨＬＥＴＥＫＥＬＫＶＹＲＹＦＧＨＥ（配列番号４９）．
【０２３７】
ペルヒドロラーゼ活性を有するいくつかのＣＥ−７エステラーゼにする連続シグネチャー配列を用いた比較は表４に提供される。デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＰを使用した。
【０２３８】
【表８】
0005656845.tif 000015
【０２３９】
あるいは、本発明の方法および系において使用するための１つまたは複数のペルヒドロラーゼの完全長に対するアミノ酸同一性パーセントも使用され得る。従って、ペルヒドロラーゼ活性を有する適切な酵素は、配列番号２と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、またさらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する。本発明の方法および系のさらなる実施形態では、適切なペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７３、および配列番号７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、配列番号７３または配列番号７４のいずれかの位置２７７におけるアミノ酸残基は、アラニン、バリン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択される。好ましい実施形態では、配列番号１４または配列番号１６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するペルヒドロラーゼ活性を有する適切な酵素が使用され得る。さらに好ましい実施形態では、ペルヒドロラーゼ活性を有する適切な酵素は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号７３、および配列番号７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０２４０】
本発明の方法および系において使用するための過加水分解活性を有する適切な炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）酵素は、本発明のペルヒドロラーゼ酵素（配列番号１４または１６など）の１つに対する１つまたは複数の欠失、置換、および／または挿入を有する酵素を含んでいてもよい。表２に示されるように、ペルヒドロラーゼ活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼは、わずか３１％の全体的なアミノ酸同一性しか共有しない。構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属すると分類されるペルヒドロラーゼ活性を有する付加的な酵素は、酵素が保存シグネチャーモチーフを保持する限り、それよりさらに低い同一性パーセントを有してもよい。従って、保存シグネチャーモチーフ（表３を参照）が酵素内のその相対位置において見出される限り、欠失、置換、および／または挿入の数は変動し得る。
【０２４１】
さらに、対応する核酸配列内で見出される構造的な類似性に従って適切な酵素を同定することは、十分に当該技術分野の技能の範囲内である。ハイブリダイゼーション技術を用いて、類似の遺伝子配列を同定することができる。従って、本発明の適切なペルヒドロラーゼ触媒は、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、および配列番号７１からなる群から選択される核酸配列を有する核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０２４２】
最近、これらが由来する対応の野生型酵素に対して過加水分解活性が強化されたいくつかの変異ＣＥ−７酵素が同定された（参照によって本明細書に援用される、代理人整理番号ＣＬ４３９ＵＳＮＡを有する共有の同時出願された同時係属中の米国特許出願を参照）。具体的には、過加水分解活性が強化されたいくつかの変異体を生じるためにサーモトガ属からのいくつかの野生型ＣＥ−７酵素を改変した。変異体の配列は配列番号７３および７４として提供されており、ここで、配列番号７３または配列番号７４のいずれかの位置２７７におけるアミノ酸残基は、アラニン、バリン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択される。
【０２４３】
多成分型の酵素的過酸発生系
本発明の方法および系は、炭水化物エステラーゼファミリー７に属する酵素のペルヒドロラーゼ活性を用いて水性反応条件下で工業的に有用な有効濃度の過酸をその場で生成する際に使用することができる。いくつかの実施形態では、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、構造的および機能的にセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）と分類される。他の実施形態では、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、構造的および機能的にアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ）と分類される。
【０２４４】
本発明の方法および系に従って生成される過酸は非常に反応性であり、変数（温度およびｐＨを含むが、これらに限定されない）に依存して、長時間にわたって濃度が低下し得る。従って、特に液体配合物については種々の反応成分を別々に保持することが望ましい場合がある。１つの態様では、過酸化水素源は、基質またはペルヒドロラーゼ触媒のいずれか、好ましくは両方から隔てられる。これは、多数のコンパートメントを有するディスペンサーの使用を含むがこれに限定されない様々な技術を用いて（米国特許第４，５８５，１５０号明細書など）、ペルヒドロラーゼ触媒と、無機過酸化物および本発明の基質とを使用時に物理的に混ぜ合わせて水性の酵素的過加水分解反応を開始させることによって達成することができる。ペルヒドロラーゼ触媒は、場合により、反応チャンバの本体内に固定化されていてもよいし、あるいは処理の標的とされる表面および／または物体と接触させる前に、過酸を含む反応生成物から分離（ろ過など）されてもよい。ペルヒドロラーゼ触媒は液体マトリックス中に存在してもよいし、あるいは固体形態（粉末または錠剤など）であってもよいし、あるいは固体マトリックス内に埋め込まれてもよく、これはその後、基質と混合されて酵素的な過加水分解反応を開始させる。さらなる態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は溶解性または多孔質のポーチ内に含有されてもよく、これは水性基質マトリックスに添加されて、酵素的過加水分解を開始させる。付加的なさらなる態様では、酵素触媒を含む粉末はカルボン酸エステル基質（トリアセチンなど）中に懸濁され、使用時に、水中の過酸素源と混合される。いくつかの実施形態では、固定比率の二液型スプレー（Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ１００、Ｔａｋｅ  ５  Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｇｕｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＯＲ）または可変比率の二液型スプレー（Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ２００、Ｔａｋｅ；５  Ｃｏｒｐ．）などの２つのコンパートメントの噴霧ボトルが用いられる（参照によって本明細書に援用される米国特許第５，１５２，４６１号明細書および米国特許第５，５３２，１５７号明細書）。別の実施形態では、壊すことのできるシールで隔てられた２つの別々のコンパートメントを含有する単一のボトルが用いられる。いくつかの実施形態では、２つの別々のコンパートメントの体積比は、１：１、または５：１、または１０：１である。多成分型の送達系の例は、共有の同時出願された同時係属中の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４４００ＵＳＮＡ（参照によってその全体が本明細書に援用される）においても見出すことができる。
【０２４５】
本発明で開示されるペルオキシカルボン酸を生成するための系は、酵素触媒（酵素粉末など）、カルボン酸エステル基質（実質的に水を含まない）、および共溶媒を含む第１の成分と、過酸素源および水を含む第２の成分とを含むことができる。第１の成分中の過剰な水の存在は、貯蔵の不安定性を引き起こし得る。従って、「実質的に水を含まない」という語句は、第１の成分中に存在する場合に酵素の貯蔵安定性に悪影響を与えない、カルボン酸エステル基質／酵素／共溶媒を含む成分中の水の濃度を指すであろう。一実施形態では、「実質的に水を含まない」は、カルボン酸エステル基質含有成分中、２０００ｐｐｍ未満、好ましくは１０００ｐｐｍ未満、より好ましくは５００ｐｐｍ未満、さらにより好ましくは２５０ｐｐｍ未満の水を意味し得る。このような実施形態では、系は、第１の成分を貯蔵するための第１の器／容器と、第２の成分を貯蔵するための第２の器／容器とをさらにを含んでもよい。本明細書で用いられる場合、「容器」という用語は、一般的に、本発明の材料を保持および／または輸送するために適切な器、コンパートメント、ボトル、パケット、およびその他のパッキングシステムを説明するために使用され得る。本発明の系は、第１の容器からの第１の成分の少なくとも一部と、第２の容器からの第２の成分の少なくとも一部とを受け入れ、それによって、第１の成分の少なくとも一部と、第２の成分の少なくとも一部とを含む配合物の形成を可能にするための混合コンパートメントを含んでもよい。このような例では、系は、混合コンパートメントから配合物を分配するためのノズルをさらに含んでもよい。
【０２４６】
本発明の系のその他の実施形態では、第１および第２の器を含む系は、第１の器からの第１の成分の少なくとも一部と、第２の器からの第２の成分の少なくとも一部とを受け入れ、第１の成分の少なくとも一部を第２の成分の少なくとも一部と同時に分配するためのためのノズルをさらに含むことができる。本明細書で用いられる場合、「同時に」は、第１の成分の少なくとも一部が分配される時間の少なくとも一部の間に、第２の成分の少なくとも一部も分配されることを意味する。従って、第１の成分の一部が１秒の全期間で分配される場合、第１の成分の分配後に１秒間、および第１の成分の分配中に０．１秒間、第２の成分を分配することは第１の成分の分配と同時であったと考えられるであろう。
【０２４７】
過酸および過酸化水素の濃度の決定方法
本発明の方法において、反応物および生成物を分析するために様々な分析方法を使用することができ、これには、滴定、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、Ｕ．Ｋａｒｓｔら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９（１７）：３６２３−３６２７（１９９７年））によって記載される分析手順、ならびに本発明の実施例において記載されるような２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾタゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈａｚｏｌｉｎｅ））−６−スルホナート（ＡＢＴＳ）アッセイ（Ｓ．Ｍｉｎｎｉｎｇら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７８：２９３−２９８（１９９９年）および国際公開第２００４／０５８９６１Ａ１号パンフレット）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４８】
過酸の最小殺生物濃度の決定
Ｊ．Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎら（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０：６３−７３（２００２年））によって記載される方法は、過酸、または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物濃度（ＭＢＣ）を決定するために使用することができる。アッセイ法は、ＸＴＴの還元阻害に基づいており、ここで、ＸＴＴ（（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩）は、４９０ｎｍまたは４５０ｎｍで測定される光学濃度（ＯＤ）の変化によって微生物の呼吸活性を示す酸化還元色素である。しかしながら、消毒薬および防腐剤の活性を試験するために利用可能な様々なその他の方法が存在し、生存可能なプレートのカウント、直接的な顕微鏡のカウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、バイオルミネセンスなどが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｍｏｕｒ  Ｓ．「Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ」，第５版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ，２００１年を参照）。
【０２４９】
酵素的に調製された過酸組成物の使用
本発明の方法に従って生成した、酵素触媒により発生されたペルオキシカルボン酸は、様々な硬い表面／無生物体の用途において生物学的汚染物質の濃度を低減するために使用することができ、例えば、医療機器（例えば、内視鏡）、織物（例えば、衣類、カーペット）、食品の調理用の表面、食品貯蔵および食品包装装置、食品の包装に使用される材料、鶏の孵化場および成育施設、動物の囲い、ならびに微生物および／または抗ウィルス活性を有する使用済みプロセス水の汚染除去のために使用することができる。酵素により発生されたペルオキシカルボン酸は、プリオン（例えば、特定のプロテアーゼ）を不活性化して、さらに殺生物活性を提供するように設計された配合物中で使用することができる。好ましい態様では、本発明のペルオキシカルボン酸組成物は、特に、加圧滅菌することができない医療機器および食品包装装置のための消毒剤として有用である。ペルオキシカルボン酸含有配合物は、ＧＲＡＳまたは食品グレード成分（酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝液）を用いて調製することができるので、酵素により発生されたペルオキシカルボン酸は、動物の屠殺体、食肉、果物および野菜の汚染除去のため、または加工食品の汚染除去のためにも使用することができる。酵素により発生されたペルオキシカルボン酸は、その最終形態が粉末、液体、ゲル、フィルム、固体またはエアロゾルである製品に組み込むことができる。酵素により発生されたペルオキシカルボン酸は、有効な汚染除去をそれでも提供する濃度まで希釈されてもよい。
【０２５０】
有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物は、表面または物体と、本発明の方法によって生成された生成物とを接触させることによって、生物学的汚染物質で汚染された（汚染された疑いがある）表面および／または無生物体を消毒するために使用することができる。本明細書で用いられる場合、「接触させる」は、清浄化および消毒するのに十分な時間、有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含む消毒組成物と、生物学的汚染物質で汚染された疑いがある表面または無生物体とを接触した状態に置くことを指す。接触には、噴霧、処理、浸漬、フラッシング、注入（上または中に）、混合、混ぜ合わせ、ペインティング、コーティング、適用、添加が含まれ、そして、有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含むペルオキシカルボン酸溶液もしくは組成物、または有効な濃度のペルオキシカルボン酸を形成する溶液もしくは組成物と、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染された疑いがある表面または無生物体との、その他の方法による連通も含まれる。消毒薬組成物は、清浄化および消毒の両方を提供するために清浄化組成物と併用されてもよい。あるいは、単一の組成物で清浄化および消毒の両方を提供するために、配合物中に清浄化剤（例えば、界面活性剤または洗剤）が組み込まれてもよい。
【０２５１】
有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物は、少なくとも１つの付加的な抗菌剤、プリオン分解プロテアーゼの組み合わせ、抗ウィルス剤、殺胞子剤、または殺生物剤を含有することもできる。これらの薬剤と、特許請求される発明によって生成されるペルオキシカルボン酸との組み合わせは生物学的汚染物質で汚染された（汚染された疑いがある）表面および／または物体を清浄化および消毒するために使用される場合に、増大したおよび／または相乗的な効果を提供することができる。適切な抗菌剤には、所望の程度の微生物防護を提供するの十分な量の、カルボン酸エステル（例えば、ｐ−ヒドロキシアルキルベンゾアートおよびアルキルシンナマート）、スルホン酸（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸）、ヨウ素化合物または活性ハロゲン化合物（例えば、元素ハロゲン、ハロゲン酸化物（例えば、ＮａＯＣｌ、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、ＣｌＯ２）、ヨウ素、ハロゲン間化合物（ｉｎｔｅｒｈａｌｉｄｅ）（例えば、一塩化ヨウ素、二塩化ヨウ素、三塩化ヨウ素、四塩化ヨウ素、塩化臭素、一臭化ヨウ素、または二臭化ヨウ素）、ポリハロゲン化物、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、次亜臭素酸塩、次亜臭素酸、クロロ−およびブロモ−ヒダントイン、二酸化塩素、および亜塩素酸ナトリウム）、有機過酸化物（過酸化ベンゾイル、過酸化アルキルベンゾイル、オゾン一重項酸素発生剤、およびこれらの混合物を含む）、フェノール誘導体（ｏ−フェニルフェノール、ｏ−ベンジル−ｐ−クロロフェノール、ｔｅｒｔ−アミルフェノールおよびＣ１〜Ｃ６アルキルヒドロキシベンゾアートなど）、第４級アンモニウム化合物（塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウムおよびこれらの混合物など）、ならびにこのような抗菌剤の混合物が含まれる。有効な量の抗菌剤には、約０．００１重量％〜約６０重量％の抗菌剤、約０．０１重量％〜約１５重量％の抗菌剤、または約０．０８重量％〜約２．５重量％の抗菌剤が含まれる。
【０２５２】
一つの態様では、本発明の方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、ある場所の上におよび／またはある場所で適用される場合に、生存可能な生物学的汚染物質（生存可能な微生物集団）の濃度を低減するために使用することができる。本明細書で用いられる場合、「場所」は、消毒または漂白に適した標的表面の一部または全てを含む。標的表面には、潜在的に生物学的汚染物質で汚染され得る全ての表面が含まれる。非限定的な例としては、食品または飲料産業において見られる装置の表面（タンク、コンベヤー、床、ドレーン、冷凍庫、装置の表面、壁、バルブ、ベルト、パイプ、ドレーン、ジョイント、割れ目、これらの組み合わせなど）、建物の表面（壁、床、および窓など）、非食品産業関連のパイプおよびドレーン（水処理施設、プールおよび温泉場、ならびに発酵タンクを含む）、病院または動物病院の表面（壁、床、ベッド、装置（内視鏡など）、病院／動物病院または他のヘルスケア環境で着用される衣類（衣類、手術着（ｓｃｒｕｂ）、靴を含む）、および他の病院または動物病院の表面など）、レストランの表面、浴室の表面、トイレ、衣服および靴、家禽、ウシ、乳牛、ヤギ、ウマおよびブタなど家畜のための納屋または畜舎の表面、家禽またはエビのための孵化場、ならびに医薬品または生物医薬品の表面（例えば、医薬品または生物医薬品の製造装置、医薬品または生物医薬品の成分、医薬品または生物医薬品の賦形剤）が挙げられる。付加的な硬い表面には、牛肉、鶏肉、豚肉、野菜、果物、シーフード、そしてこれらの組み合わせなどの食品も含まれる。場所は、感染した（ｉｎｆｅｃｔｅｄ）リネンまたはその他の織物などの吸水材料を含むこともできる。また場所は、収穫された植物または植物製品（種子、球茎、塊茎、果実、および野菜を含む）、生育中の植物、特に作物用に生育中の植物（穀草類、葉野菜およびサラダ用作物、根菜、豆類、ベリー状の果実、柑橘果実および硬い果物を含む）も含む。
【０２５３】
硬い表面材料の非限定的な例は、金属（例えば、鋼、ステンレス鋼、クロム、チタン、鉄、銅、真鍮、アルミニウム、およびこれらの合金）、鉱物（例えばコンクリート）、ポリマーおよびプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン）、アクリロニトリルブタジエンなどのポリオレフィン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、およびナイロンなどのポリアミド）である。付加的な表面としては、レンガ、タイル、セラミック、磁器、木、ビニール、リノリウム、およびカーペットが挙げられる。
【０２５４】
本発明の方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、漂白、脱染、衛生化、消毒、および脱臭を含むがこれらに限定されない利益を織物に提供するために使用されてもよい。本発明の方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、織物の予洗処理剤、洗濯洗剤、染み抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびすすぎ（ｒｉｎｓｉｎｇ）剤を含むが、これらに限定されないあらゆるランドリーケア製品において使用することができる。
【０２５５】
組換え微生物の発現
本発明の方法および系に関して、本明細書において記載される配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞において、特に微生物宿主の細胞において産生され得る。遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリーにおいて見出すことができ、広範な温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌はどれも適切に本発明の核酸分子の発現の宿主となり得ると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外、または細胞内および細胞外の両方の組み合わせにおいて発現され得るが、ここで、細胞外発現によって、発酵産物からの所望のタンパク質の回収は、細胞内発現によって産生されるタンパク質の回収方法よりも容易になる。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを発生させるために使用される細胞原料に対して不変なままであり、機能性遺伝子は構わずに発現されるであろう。宿主株の例としては、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピキア属、ファフィア属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ヤロウィア属、クルイベロミセス属、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ザイモモナス属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム属、クロマチウム属、フラボバクテリウム属、サイトファーガ属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリア属、マイコバクテリウム属、ディノコッカス属、エシェリキア属、エルウィニア属、パンテア属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロコッカス属、メチロサイナス属、メチロミクロビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、シネココッカス属、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、およびミキソコッカス属などの細菌、真菌または酵母種が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細菌宿主株には、クルイベロミセス属、エシェリキア属、バチルス属、およびシュードモナス属が含まれる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０２５６】
大規模の微生物の増殖および機能性遺伝子の発現は、様々な単純または複合炭水化物、有機酸、およびアルコール、またはメタンなどの飽和炭化水素、または二酸化炭素（光合成または化学独立栄養宿主の場合）、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または任意のきわめて微量の栄養素（小さい無機イオンを含む）の形態および量を使用し得る。増殖速度の制御は、特定の制御分子を培養物に添加するか否かによって影響され得るが、これらは通常栄養物またはエネルギー源とは考えられない。
【０２５７】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは当該技術分野でよく知られている。通常、ベクターまたはカセットは、関連の遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体の組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の調節を包含する遺伝子の５’領域と、転写の終結を調節するＤＮＡ断片の３’領域とを含む。両方の調節領域が形質転換宿主細胞に相同および／または産生宿主に天然の遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、このような調節領域はそのような由来でなくてもよい。
【０２５８】
所望の宿主細胞において本発明のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の発現を駆動するために有用な開始調節領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。事実上、これらの遺伝子を駆動することができるあらゆるプロモーターが本発明に適しており、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピキア属における発現に有用）、ならびにｌａｃ、ａｒａＢ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）、ならびにバチルス属における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび種々のファージプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５９】
終結調節領域も、好ましい宿主細胞に天然の種々の遺伝子に由来し得る。一実施形態では、終結調節領域の包含は任意である。別の実施形態では、キメラ遺伝子は、好ましい宿主細胞に由来する終結調節領域を含む。
【０２６０】
工業的な産生
本発明の方法および系に従って本発明のペルヒドロラーゼ触媒を産生するために様々な培養方法を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模の産生は、バッチおよび連続培養方法の両方によって生成することができる。
【０２６１】
古典的なバッチ培養法は閉鎖系であり、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養過程中に人工的な変更を受けない。従って、培養過程の初めに、培地は所望の生物（単数または複数）を播種し、増殖または代謝活動はこの系にさらに何も添加することなく生じ得る。しかしながら、通常は、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してバッチ式であり、多くの場合、ｐＨおよび酸素濃度などの因子を調節する試みがなされる。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成物は、培養が終了する時間まで絶えず変化する。バッチ培養において、細胞は、静的な誘導期を通って高増殖の対数期へ、そして最後に増殖速度が減少または停止される定常期まで緩和する。未処理の場合、定常期の細胞は最終的には死滅するであろう。いくつかの系では、対数期の細胞は、多くの場合、最終産物または中間体の産生の大部分に関与する。その他の系では、定常期または対数期後の産生を得ることができる。
【０２６２】
標準的なバッチ系におけるバリエーションは流加系である。流加培養過程も本発明において適切であり、培養が進行するにつれて基質が徐々に添加されることを除いて典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化産物の抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、そして培地中に限られた量の基質を有するのが望ましい場合に有用である。流加系における実際の基質の濃度の測定は困難であり、ｐＨ、溶解酸素および排ガス（ＣＯ２など）の分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）、およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７−２３４（１９９２年）において見出すことができる。
【０２６３】
所望のペルヒドロラーゼ触媒の商業的な産生は、連続培養を用いて達成することもできる。連続培養は開放系であり、定義される培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に、等量の条件培地が処理のために除去される。一般に、連続培養は、主に細胞が対数増殖期にあるときに、細胞を一定の高い液相密度に維持する。あるいは、連続培養は固定化細胞を用いて実施することもでき、ここで、炭素および栄養物は連続的に添加され、価値のある産物、副産物または老廃物は細胞塊から連続的に除去される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料で構成される様々な固体担体を用いて実施することができる。
【０２６４】
連続または半連続培養によって、細胞の増殖または最終産物の濃度に影響を与える１つの因子または多数の因子の調節が可能になる。例えば、１つの方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限栄養物が固定比率で維持され、すべての他のパラメータは調節可能にされるであろう。その他の系では、増殖に影響を与える多数の因子を連続的に変更することができ、培地の濁度によって測定される細胞濃度が一定に保持される。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとするので、培地が抜き取られたことによる細胞の損失は、培養中、細胞増殖速度に対してバランスがとられなければならない。連続培養過程のための栄養物および成長因子の調節方法、ならび産物の形成速度を最大にするための技術は、工業微生物学の技術分野においてよく知られており、Ｂｒｏｃｋ（上記）によって様々な方法が詳述されている。
【０２６５】
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなければならない。適切な基質としては、単糖（グルコースおよびフルクトースなど）、二糖（ラクトースまたはスクロースなど）、多糖（デンプンまたはセルロースなど）、またはこれらの混合物、および再生可能な原料（チーズホエー浸透液、コーンスティープリカー、甜菜の糖蜜、および大麦の麦芽など）からの未精製混合物が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、炭素基質は、二酸化炭素、メタンまたはメタノールなどの１炭素基質であってもよい（例えば、宿主細胞がメチロトローフ微生物である場合）。同様に、種々のカンジダ種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝するであろう（Ｓｕｌｔｅｒら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３：４８５−４８９（１９９０年））。従って、本発明において用いられる炭素源は様々な種類の炭素含有基質を包含することができ、生物の選択によってのみ制限されると考えられる。
【０２６６】
バッチ発酵、流加発酵、または連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者に知られている方法のいずれかによって達成され得る。例えば、酵素触媒が細胞内で産生される場合、細胞ペーストは遠心分離または膜ろ過によって培地から分離され、場合により水または所望のｐＨの水性緩衝液で洗浄され、次に、所望のｐＨの水性緩衝液中の細胞ペーストの懸濁液はホモジナイズされて、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出物を生じる。細胞抽出物は、場合により、セライトまたはシリカなどの適切なろ過助剤を通してろ過され、酵素触媒溶液から不要なタンパク質を沈殿させるための加熱処理工程の前に細胞片が除去されてもよい。次に、所望の酵素触媒を含有する溶液は、膜ろ過または遠心分離によって、沈殿した細胞片およびタンパク質から分離されてもよく、得られた部分精製酵素触媒溶液は、付加的な膜ろ過によって濃縮され、次に場合により、適切なキャリア（例えば、マルトデキストリン、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合物）と混合され、噴霧乾燥されて所望の酵素触媒を含む固体粉末を生じる。
【０２６７】
本出願人らは、特に、引用される全ての参考文献の内容全体を本開示に援用する。さらに、量、濃度、またはその他の値もしくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または上限の好ましい値および下限の好ましい値の一覧のいずれかで与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲の上限または好ましい値と任意の範囲の下限または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が列挙される場合、他に記載されない限り、その範囲は、その両端点ならびに範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。範囲を定義する場合、本発明の範囲は、列挙される特定の値に限定することは意図されない。
【実施例】
【０２６８】
一般的な方法
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために提供される。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を示し、従って、その実施のために好ましいモードを構成すると考えられることは、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変化が成され、そしてそれでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができると認識すべきである。
【０２６９】
全ての試薬および材料は、他に指定されない限り、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）またはＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０２７０】
本明細書における以下の略語は、以下のように、測定、技術、特性、または化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分の１を意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」は重力を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ｄｄＨ２Ｏ」は蒸留および脱イオン水を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ（登録商標）」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「Ｕ」はペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「ｒｐｍ」は１分間の回転数を意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。
【０２７１】
実施例１
ｋａｔＧカタラーゼ破壊Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築
配列番号３２および配列番号３３と同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で分間１、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子のコード領域（ｋａｎ、配列番号３０）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号３１）から増幅して、配列番号３４と同定されるＰＣＲ産物を生じた。ｋａｔＧ核酸配列は配列番号３５として提供され、対応するアミノ酸配列は配列番号３６である。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６ＴＭ）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号３７）で形質転換し（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ，２０００年，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５）、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３０℃で２４時間選択した。エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）によって、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を５０〜５００ｎｇのＰＣＲ産物で形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＫＤ４６プラスミドをキュアリングした。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システム（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて数個のコロニーからゲノムＤＮＡを単離し、配列番号３８および配列番号３９と同定されるプライマーを用いてＰＣＲによりチェックして、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認した。いくつかのｋａｔＧ破壊株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号４０）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を切除するために使用し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドをキュアリングした。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１およびＭＧ１６５５ＫａｔＧ２と命名した。
【０２７２】
実施例２
ｋａｔＥカタラーゼ破壊Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築
配列番号４１および配列番号４２と同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子（配列番号３０）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号３１）から増幅して、配列番号４３と同定されるＰＣＲ産物を生じた。ｋａｔＥ核酸配列は配列番号４４として提供され、対応するアミノ酸配列は配列番号４５である。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６ＴＭ）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号３７）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３０℃で２４時間選択した。エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）によって、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を５０〜５００ｎｇのＰＣＲ産物で形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＫＤ４６プラスミドをキュアリングした。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システムを用いてゲノムＤＮＡを数個のコロニーから単離し、配列番号４６および配列番号４７と同定されるプライマーを用いてＰＣＲによりチェックして、ｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認した。いくつかのｋａｔＥ破壊株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号４０）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を切除するために使用し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドをキュアリングした。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＥ１およびＭＧ１６５５ＫａｔＥ２と命名した。
【０２７３】
実施例３
ｋａｔＧカタラーゼおよびｋａｔＥカタラーゼ破壊Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＫＬＰ１８）の構築
配列番号４１および配列番号４２と同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子（配列番号３０）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号３１）から増幅して、配列番号４３と同定されるＰＣＲ産物を生じた。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号３７）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３０℃で２４時間選択した。エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）によって、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１／ｐＫＤ４６を５０〜５００ｎｇのＰＣＲ産物で形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＫＤ４６プラスミドをキュアリングした。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システムを用いてゲノムＤＮＡを数個のコロニーから単離し、配列番号４６および配列番号４７と同定されるプライマーを用いてＰＣＲによりチェックして、ｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認した。いくつかのｋａｔＥ破壊株（ΔｋａｔＥ）を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号４０）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を切除するために使用し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドをキュアリングした。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１およびＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ２３と命名した。ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８と称される。
【０２７４】
実施例４
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受入番号ＡＡＢ７０８６９）において報告されるようなサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子のコード領域を、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に対して最適化されたコドン（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて合成した。その後、配列番号２７および配列番号２８と同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、遺伝子のコード領域を増幅した。得られた核酸産物（配列番号２９）をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）にサブクローニングして、ＳＷ１９６と同定されるプラスミドを生じた。プラスミドｐＳＷ１９６を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８を形質転換し、株ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６を生じた。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６を、ＬＢ培地中、３７℃で振とうさせながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで増殖させ、この時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるまで添加し、インキュベーションを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、全可溶性タンパク質の２０〜４０％でペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０２７５】
実施例５
ペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８形質転換体の発酵
酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１０．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．０ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（１．０ｇ／Ｌ）およびクエン酸第二鉄アンモニウム（０．１０ｇ／Ｌ）を含有する０．５Ｌの種培地を２Ｌの振とうフラスコに入れることによって、発酵槽の種培養物を調製した。培地のｐＨを６．８に調整し、培地をフラスコ中で滅菌した。殺菌後の添加は、グルコース（５０重量％、１０．０ｍＬ）および１ｍＬのアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）保存液を含んだ。種培地に、２
０％のグリセロール中のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６の培養物を１ｍＬ播種し、３５℃および３００ｒｐｍで培養した。ＫＨ２ＰＯ４（３．５０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（２．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ  １５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２二水和物（１０ｇ／Ｌ）、およびＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含有する３５℃の８Ｌの培地を含む１４Ｌの発酵槽（Ｂｒａｕｎ）に、約１〜２のＯＤ５５０において、種培養物を移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）およびＮａＭｏＯ４二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有した。殺菌後の添加は、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ、８０．０ｇ）およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）保存液（１６．００ｍＬ）を含んだ。グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ）を流加のために使用した。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌまで低下したときにグルコースの供給を開始し、０．３１ｇ供給／分から始まり、毎時それぞれ０．３６、０．４２、０．４９、０．５７、０．６６、０．７７、０．９０、１．０４、１．２１、１．４１、１．６３ｇ／分まで徐々に増大させ、その後速度を一定に保持した。培地中のグルコース濃度を監視し、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えたら、供給速度を低下または一時的に停止した。ＯＤ５５０＝５６とＯＤ５５０＝８０との間で、種々の株に対する１６ｍＬのＩＰＴＧ（０．５Ｍ）の添加によって誘導を開始した。溶存酸素（ＤＯ）濃度を空気飽和の２５％に調節した。ＤＯは、初めはインペラーの撹拌速度（４００〜１４００ｒｐｍ）によって、その後通気速度（２〜１０ｓｌｐｍ）によって調節した。ｐＨを６．８に調節した。ｐＨ調節のためにＮＨ４ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）およびＨ２ＳＯ４（２０％ｗ／ｖ）を使用した。ヘッドの圧力は０．５バールであった。ＩＰＴＧ添加の１６時間後に、細胞を遠心分離によって収集した。
【０２７６】
実施例６
噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼの調製
実施例５で記載したように調製されたサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）細胞ペーストを、ｐＨ７．４の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中に２００ｇ湿細胞重量／Ｌの最終濃度で懸濁させた。１２，０００ｐｓｉ（〜８２．７４ＭＰａ）の入口圧力で操作されるＡＰＶ１０００ホモジナイザーによって単一バスで、懸濁液中の細胞を溶解させた。得られたライセートを６５℃で約３０分間加熱処理し、ホモジネートを室温まで冷却し、得られた固体を遠心分離で除去した。０．１ミクロンのフィルタを用いて遠心分離からの上澄みをろ過し、３０Ｋ  ＮＭＷＣＯフィルタを用いて、得られたろ液（ペルヒドロラーゼを含有する）を３４ｍｇタンパク質／ｍＬの最終タンパク質濃度まで濃縮した。重量によりタンパク質の濃度の約３倍の濃度になるまで、マルトデキストリンをタンパク質溶液に添加し、２２５℃の入口温度および７６℃の乾燥器出口温度を用いて、得られた溶液を噴霧乾燥させた。得られた粉末中のタンパク質濃度は２０．３重量％であり、乾燥固体含量は９３．２重量％であった。
【０２７７】
実施例７
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼによる過酢酸生成に対する添加溶媒の効果
９０．０ｇの脱イオン水と、０．３５０ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈａｇｕｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と、水中３０重量％の過酸化水素３．２０ｇとの第１の混合物を、５０％の水酸化ナトリウム水でｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で１００．０ｇに調整した。５５．７６ｇのトリアセチンと、４．２０ｇの重炭酸ナトリウムと、２．５０ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５ヒュームドシリカ（Ｃａｂｏｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と、０．２７０ｇの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例６）と、トリプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＴＰＭ、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、ジプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）、プロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）、ジエチレングリコールブチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＢ）、ジプロピレングリコール（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＧ）、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロルジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、および１，３−プロパンジオールからなる群から選択される３７．４３ｇの１つの有機溶媒との第２の混合物を調製した。第２の混合物の１．０ｇのアリコートを急速に攪拌しながら（溶解していない固体を懸濁させるため）取り出し、これに、水中の過酸化水素およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬの第１の混合物（ｐＨ７．２）９．００ｍＬを２５℃で攪拌しながら添加して混合し、得られた混合物は、２５５ｍＭのトリアセチン、２５４ｍＭの過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。各溶媒に対する対照反応も行い、タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した。
【０２７８】
Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施した。反応混合物のアリコート（０．０４０ｍＬ）を所定の時間に取り出し、水中５ｍＭのリン酸０．９６０ｍＬと混合し、希釈サンプルのｐＨをｐＨ４未満に調整すると反応は直ちに終了した。得られた溶液を、１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルターユニット（３０，０００公称分画分子量（ＮＭＷＬ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ、カタログ＃ＵＦＣ３ＬＫＴ００）を用いてろ過した。得られたろ液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含有する１．５ｍＬのスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ、＃５１８２−０７１５）に移し、次に、アセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリル−スルフィド）０．１００ｍＬを添加し、バイアルにフタを閉め、内容物を手短に混合した後、光のない状態で、約２５℃で１０分間のインキュベーションを行った。次に、各バイアルに、０．４００ｍＬのアセトニトリルおよび０．１００ｍＬのトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、４０ｍＭ）のアセトニトリル溶液を添加し、バイアルに再度フタを閉め、得られた溶液を混合し、光のない状態で、約２５℃で３０分間インキュベートした。次に、各バイアルに、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ、ＨＰＬＣ外部標準）を添加し、以下に記載されるように、得られた溶液をＨＰＬＣにより分析した。
【０２７９】
ＨＰＬＣ方法：
Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ）（カタログ＃５６９４２２−Ｕ）ｗ／プレカラムＳｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃５９５９０−Ｕ）、１０マイクロリットルの注入体積、１．０ｍＬ／分および周囲温度におけるＣＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃２７０７１７）および脱イオン水による勾配法：
【０２８０】
【表９】
0005656845.tif 000016
【０２８１】
０．５分、１分、２分、５分および１０分間に上記反応で生成された過酢酸濃度は、以下の表５に記載される。
【０２８２】
【表１０】
0005656845.tif 000017
【０２８３】
トリアセチンおよび有機溶媒の混合物中での噴霧乾燥酵素の安定性を実証するために、トリアセチンと、重炭酸ナトリウムと、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）と、噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例６）と、上記のトリプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＴＰＭ）または１，２−プロパンジオールのいずれかとの混合物を、周囲温度で２４時間貯蔵し、次に、これらの混合物のそれぞれ１．０ｇのアリコートを急速に攪拌しながら（溶解していない固体を懸濁させるため）取り出し、２５℃で攪拌しながら、水（ｐＨ７．２）中の過酸化水素およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬの新たに調製した（上記のように）混合物９．０ｍＬと混合し、得られた混合物は、２５５ｍＭのトリアセチンと、２５４ｍＭの過酸化水素と、０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼとを含有した。各溶媒に対する対照反応も行い、タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した。Ｋａｒｓｔらによって記載される方法に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施した（表６）。
【０２８４】
【表１１】
0005656845.tif 000018
【０２８５】
実施例８
添加溶媒の存在または不在下におけるサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼによる過酢酸生成の比較
４０．０ｇの脱イオン水と、０．１５７５ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と、水中３０重量％の過酸化水素１．４４ｇとの第１の混合物を、５０％の水酸化ナトリウム水でｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で４６．８７ｇに調整した。２．７８ｇのトリアセチンと、０．２１０ｇの重炭酸ナトリウムと、０．１２５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）と、０．０１３５ｇの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例６）との第２の混合物を調製し、水中の過酸化水素およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬの第１の混合物（ｐＨ７．２）を２５℃で攪拌しながら第２の混合物に添加し、得られた混合物は、２５５ｍＭのトリアセチン、２５４ｍＭの過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施した。対照反応も行い、ペルヒドロラーゼを添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した。
【０２８６】
プロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）またはジプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）のいずれか１．８７２ｇを、反応混合物中の同量の水の代わりに用いて上記の反応を繰り返した。４０．０ｇの脱イオン水と、０．１７５ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬと、水中３０重量％の過酸化水素１．６０ｇとの第１の混合物を、５０％の水酸化ナトリウム水でｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で５０．０ｇに調整した。２．７８ｇのトリアセチンと、プロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）またはジプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）のいずれか１．８７２ｇと、０．２１０ｇの重炭酸ナトリウムと、０．１２５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）と、０．０１３５ｇの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例６）との第２の混合物を調製し、水中の過酸化水素およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬの第１の混合物（ｐＨ７．２）４５．０ｇを２５℃で攪拌しながら第２の混合物に添加し、得られた混合物（ｐＨ６．５）は、２５５ｍＭのトリアセチン、２５４ｍＭの過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。対照反応も行い、抽出タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した。０．５分、１分、２分、５分および１０分間に上記の３つの反応で生成された過酢酸濃度は、以下の表７に記載される。
【０２８７】
【表１２】
0005656845.tif 000019
【０２８８】
実施例９
攪拌反応と比較して２コンパートメント噴霧ボトルを用いたその場での過酸発生のための溶媒の使用
２０００ｐｐｍのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有する０．２０Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液１００ｇと、２８０ｇの脱イオン水と、水中３０重量％の過酸化水素５．２０ｇとの第１の混合物を、５０％の水酸化ナトリウム水でｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で４００ｇに調整した。８３．４ｇのトリアセチンと、３．７５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）と、０．７５０ｇの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例６）と、プロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）、トリプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＴＰＭ）、ジエチレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＭ）、プロピレングリコールｎ−ブチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＮＢ）、プロピレングリコールｎ−プロピルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰｎＰ）、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセタート（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭＡ）、ジプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、および１，２−プロパンジオールから選択される単一の溶媒６２．１ｇとを含有する第２の混合物を別個に調製した。２５℃における第１の反応では、反応の最初の３０〜６０秒間、１．０ｇの第１の混合物を９．０ｇの第２の混合物と共に攪拌し（６．５〜６．０の反応ｐＨ）、サンプルを抜き出して、過酢酸の生成について分析し、得られた反応混合物は、２５５ｍＭのトリアセチン、１０３ｍＭの過酸化水素および１００μｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。Ｋａｒｓｔら（上記））によって記載される方法に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定（以下の表８）を実施した。対照反応も行い、ペルヒドロラーゼを添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した。
【０２８９】
上記のように調製した第１の混合物および第２の混合物を、２コンパートメント噴霧ボトル（Ｃｕｓｔｏｍ  Ｄｕａｌ−Ｌｉｑｕｉｄ  Ｖａｒｉａｂｌｅ−Ｒａｔｉｏ  Ｓｐｒａｙｅｒ，Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ  ２００、Ｔａｋｅ５（Ｒｏｇｕｅ  Ｒｉｖｅｒ、ＯＲ）により製造）の２つのコンパートメントの１つにそれぞれ別々に入れ、ボトルをセットアップして、９重量部の第１の混合物と、１重量部の第２の混合物との混合物を噴霧した。２つの混合物を１２．５ｃｍ直径の結晶皿に噴霧し、得られた反応混合物（６．５〜６．０の反応ｐＨ）は、２５５ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭの過酸化水素および０．１００ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。噴霧した反応混合物を所定の時間に採取し、Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って、過酢酸について分析した（以下の表８）。
【０２９０】
【表１３】
0005656845.tif 000020
【０２９１】
【表１４】
0005656845.tif 000021
【０２９２】
実施例１０
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを酵素触媒として用いたペルオキシカルボン酸の生成
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現は、前の実施例１〜４に記載された方法に従って達成される。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを発現する細菌の形質転換体の発酵は、前の実施例５に従って実施され、噴霧乾燥サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼの調製は、実施例６で記載された方法を用いて達成される。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのクローニング、発現、および調製のための技術に関する付加的な情報は、米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書（参照によって本明細書中に援用される）において入手可能である。
【０２９３】
添加溶媒の存在および不在下におけるサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼによる過酢酸生成の比較を行う。４０．０ｇの脱イオン水と、０．１５７５ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と、水中３０重量％の過酸化水素１．４４ｇとの第１の混合物を、５０％の水酸化ナトリウム水でｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で４６．８７ｇに調整する。２．７８ｇのトリアセチンと、０．２１０ｇの重炭酸ナトリウムと、０．１２５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）と、０．０１３５ｇの噴霧乾燥サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼとの第２の混合物を調製し、水中の過酸化水素およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬの第１の混合物（ｐＨ７．２）を２５℃で攪拌しながら第２の混合物に添加し、得られた混合物は、２５５ｍＭのトリアセチン、２５４ｍＭの過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有する。Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施する。対照反応も行い、ペルヒドロラーゼを添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定する。
【０２９４】
プロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）またはジプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）のいずれか１．８７２ｇを、反応混合物中の同量の水の代わりに用いて、上記の反応を繰り返す。４０．０ｇの脱イオン水と、０．１７５ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬと、水中３０重量％の過酸化水素１．６０ｇとの第１の混合物を５０％の水酸化ナトリウム水でｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で５０．０ｇに調整する。２．７８ｇのトリアセチンと、プロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）またはジプロピレングリコールモノメチルエーテル（ｄｏｗａｎｏｌ（登録商標）ＤＰＭ）のいずれか１．８７２ｇと、０．２１０ｇの重炭酸ナトリウムと、０．１２５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）と、０．０１３５ｇの噴霧乾燥サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼとの第２の混合物を調製し、水中の過酸化水素およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ第１の混合物（ｐＨ７．２）４５．０ｇを２５℃で攪拌しながら第２の混合物に添加し、得られた混合物（ｐＨ６．５）は、２５５ｍＭのトリアセチン、２５４ｍＭの過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。対照反応も行い、添加抽出タンパク質を添加しないで過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定する。０．５分、１分、２分、５分および１０分分間に上記３つの反応で生成された過酢酸濃度を測定して記録する。
【０２９５】
実施例１１
攪拌反応と比較して、２コンパートメント噴霧装置を用い、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ用いたその場での過酸発生のための溶媒の使用
２０００ｐｐｍのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有する０．２０Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液１００ｇと、２８０ｇの脱イオン水と、水中３０重量％の過酸化水素５．２０ｇとの第１の混合物を５０％の水酸化ナトリウム水でｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で４００ｇに調整する。８３．４ｇのトリアセチンと、３．７５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）と、０．７５０ｇの噴霧乾燥サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ（実施例１０）と、プロピレングリコールメチルエーテル（ｄｏｗａｎｏｌ（登録商標）ＰＭ）、トリプロピレングリコールメチルエーテル（ｄｏｗａｎｏｌ（登録商標）ＴＰＭ）、ジエチレングリコールメチルエーテル（ｄｏｗａｎｏｌ（登録商標）ＤＭ）、プロピレングリコールｎ−ブチルエーテル（ｄｏｗａｎｏｌ（登録商標）ＰＮＢ）、プロピレングリコールｎ−プロピルエーテル（ｄｏｗａｎｏｌ（登録商標）ＰｎＰ）、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセタート（ｄｏｗａｎｏｌ（登録商標）ＰＭＡ）、ジプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、および１，２−プロパンジオールから選択される単一の溶媒６２．１ｇとを含有する第２の混合物を別個に調製する。２５℃における第１の反応では、反応の最初の３０〜６０秒間、１．０ｇの第１の混合物を９．０ｇの第２の混合物と共に攪拌し（６．５〜６．０の反応ｐＨ）、サンプルを抜き出して、過酢酸の生成について分析し、得られた反応混合物は、２５５ｍＭのトリアセチン、１０３ｍＭの過酸化水素および１００μｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有する。Ｋａｒｓｔらによって記載される方法（上記）に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施する。対照反応も行い、ペルヒドロラーゼを添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定する。
【０２９６】
上記のように調製した第１の混合物および第２の混合物を、２コンパートメント噴霧ボトル（Ｃｕｓｔｏｍ  Ｄｕａｌ−Ｌｉｑｕｉｄ  Ｖａｒｉａｂｌｅ−Ｒａｔｉｏ  Ｓｐｒａｙｅｒ，Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ  ２００、Ｔａｋｅ５（Ｒｏｇｕｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＯＲ）により製造）の２つのコンパートメントの１つにそれぞれ別々に入れ、ボトルをセットアップして、９重量部の第１の混合物と、１重量部の第２の混合物との混合物を噴霧する。２つの混合物を１２．５ｃｍ直径の結晶皿に噴霧し、得られた反応混合物（６．５〜６．０の反応ｐＨ）は、２５５ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭの過酸化水素および０．１００ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有する。噴霧した反応混合物を所定の時間に採取し、Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って、過酢酸について分析する。
【０２９７】
実施例１２
例示的な２成分系
２成分その場型の過酸消毒薬配合物の一例は、以下に記載される。
【０２９８】
【表１５】
0005656845.tif 000022
【０２９９】
上記の２成分その場型の過酸消毒薬配合物について、成分Ａは成分ＡおよびＢの合わせ
た重量の約２．６重量％を構成し、成分Ａに対する成分Ｂの重量比は約３８：１である。２成分その場型の過酸消毒薬配合物のための特定の用途では、成分Ａに対する成分Ｂの比率が１：１〜１０：１の範囲内にあるのが望ましいこともあり、この場合、１０部〜１部（重量による）の成分Ｂが１部（重量による）の成分Ａと混合されて、消毒に有効な濃度の過酸を生成する。例えば、第１の用途では、固定比率の二液型スプレー（Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ１００、Ｔａｋｅ５）または可変比率の二液型スプレー（Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ２００、Ｔａｋｅ５）などの２コンパートメント噴霧ボトルが用いられ、ここでは、成分Ａに対する成分Ｂの最大比率１０：１が用いられる。第２の用途では、壊すことのできるシールで隔てられた２つの別々のコンパートメントを含有する単一のボトルが用いられ、ここでは、２つの別々のコンパートメントの体積比は、１：１、または５：１または１０：１である。これらの用途のそれぞれにおいて、２成分型配合物は、成分Ｂに対する成分Ａの所望の比率で混合されて、所望の反応物の濃度および生成物の最終濃度を提供することができない。
【０３００】
実施例１３
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭペルヒドロラーゼを用いるプロピレングリコールジアセタートまたはエチレングリコールジアセタートの過加水分解
バチルス・スブチリスからの野生型ペルヒドロラーゼを発現する形質転換体（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４）のホモジネートを、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含有する０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、細胞ペースト（２０重量％の湿細胞重量）の懸濁液から調製した。粗ホモジネートを遠心分離して細胞片を除去し、清澄化細胞抽出物を生じ、これを６５℃で３０分間加熱処理した。得られた混合物を遠心分離し、加熱処理した上澄みを３０ＫのＭＷＣＯ（分子量カットオフ）膜において３２ｍｇ／ｍＬの全溶解固体の濃度まで濃縮し、清澄化、加熱処理した細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ペルヒドロラーゼが少なくとも８５〜９０％純粋であることが示された。次に、この濃縮物に、固体１グラムあたり２．０６グラムのＮａＨ２ＰＯ４および１．１７グラムのＮａ２ＨＰＯ４を添加し、約３：１であるリン酸緩衝液対加熱処理細胞抽出タンパク質の比率（ｗｔ／ｗｔ）を生じた。この溶液を脱イオン水により３０重量％に希釈し、次に、Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−２９０実験室用噴霧乾燥器を用いて噴霧乾燥し（１８０℃の入口温度、７０℃の出口温度）、得られた噴霧乾燥粉末は、２５．５重量％のタンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ）を含有し、９４．３重量％の乾燥固体であった。
【０３０１】
プロピレングリコールジアセタート（ＰＧＤＡ）またはエチレングリコールジアセタート（ＥＧＤＡ）と、過酸化水素（１００ｍＭ）と、噴霧乾燥Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭ野生型ペルヒドロラーゼを発現する）からの加熱処理した抽出タンパク質（上記のように調製）１２３μｇ／ｍＬとを含有する５０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ７．２）中、２３℃で反応（１０ｍＬの全体積）を行った。それぞれの反応条件に対する対照反応を行い、加熱処理した抽出タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した。１、５、および３０分で反応を採取し、Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔら（上記））を用いて、サンプルを過酢酸について分析し、反応混合物のアリコート（０．０４０ｍＬ）を取り出し、水中５ｍＭのリン酸０．９６０ｍＬと混合し、希釈サンプルのｐＨをｐＨ４未満に調整すると反応は直ちに終了した。得られた溶液を、１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルターユニット（３０，０００公称分画分子量（ＮＭＷＬ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ＃ＵＦＣ３ＬＫＴ００）を用いてろ過した。得られたろ液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含有する１．５ｍＬのスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ、＃５１８２−０７１５）に移し、次に、アセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリル−スルフィド）０．１００ｍＬを添加し、バイアルにフタを閉め、内容物を手短に混合した後、光のない状態で、約２５℃で１０分間のインキュベーションを行った。次に、各バイアルに、０．４００ｍＬのアセトニトリルおよび０．１００ｍＬのトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、４０ｍＭ）のアセトニトリル溶液を添加し、バイアルに再度フタを閉め、得られた溶液を混合し、光のない状態で、約２５℃で３０分間インキュベートした。次に、各バイアルに、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ、ＨＰＬＣ外部標準）を添加し、得られた溶液をＨＰＬＣにより分析した。１分、５分および３０分間に生成された過酢酸濃度は、表９に記載される。
【０３０２】
【表１６】
0005656845.tif 000023
【０３０３】
実施例１４
Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）およびＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型および変異体ペルヒドロラーゼを用いるプロピレングリコールジアセタートまたはエチレングリコールジアセタートの過加水分解
ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含有する０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペースト（２０重量％湿細胞重量）の懸濁液を、１６，０００ｐｓｉ（〜１１０ＭＰａ）の作動圧力を有するＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓに２回通すことによって、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓ）、およびサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔ）を発現する形質転換体の細胞抽出物を、それぞれ抽出した。溶解細胞を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離して、清澄化細胞抽出物を生じ、これを全可溶性タンパク質についてアッセイした（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ）。上澄みを７５℃で２０分間加熱した後、氷浴中で２分間失活させた。１１，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって、沈殿したタンパク質を除去し、得られた加熱処理した抽出タンパク質の上澄みのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＣＥ−７酵素は調製物中の全タンパク質の約８５〜９０％を構成することが示された。加熱処理された抽出タンパク質の上澄みをドライアイス中で凍結し、使用まで−８０℃で貯蔵した。
【０３０４】
第１の反応セット（１０ｍＬの全体積）は、プロピレングリコールジアセタート（ＰＧＤＡ）またはエチレングリコールジアセタート（ＥＧＤＡ）（１００ｍＭ）と、過酸化水素（１００ｍＭ）と、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）の１つからの加熱処理した抽出タンパク質（上記のように調製）２５μｇ／ｍＬとを含有する１０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）中、２０℃で実行した。それぞれの反応に対する対照反応を行い、抽出タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した。１、５、および３０分で反応を採取し、Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔら（上記））およびＨＰＬＣ分析法（上記）を用いてサンプルを過酢酸について分析した。１分、５分および３０分間で生成された過酢酸濃度は表１０に記載される。
【０３０５】
【表１７】
0005656845.tif 000024
【０３０６】
第２の反応セット（１０ｍＬの全体積）は、プロピレングリコールジアセタート（ＰＧＤＡ）またはエチレングリコールジアセタート（ＥＧＤＡ）（２ｍＭ）と、過酸化水素（１０ｍＭ）と、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）の１つからの加熱処理した抽出タンパク質（上記のように調製）１０μｇ／ｍＬとを有する１０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）中、２０℃で実行した。それぞれの反応に対する対照反応を行い、抽出タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した。５分で反応を採取し、Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔら（上記））およびＨＰＬＣ分析法（上記）を用いてサンプルを過酢酸について分析した。５分間で生成された過酢酸濃度は表１１に記載される。
【０３０７】
【表１８】
0005656845.tif 000025
【０３０８】
実施例１５
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８におけるサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の発現
共有の同時出願された同時係属中の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２ＵＳＮＡに記載されるようなアセチルキシランエステラーゼ突然変異を含むプラスミドは、アミノ酸残基位置２７７にＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒを置き換えることによって、野生型サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（配列番号１４）から調製した（配列番号７３）。プラスミドを用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８を形質転換した（実施例３）。形質転換体をＬＢ−アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレート上に蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールが補充された２．５ｍＬのＬＢ培地を用いて細胞をプレートから収集し、得られた細胞懸濁液の１．０ｍＬのアリコートを−８０℃で凍結させた。１ｍＬの解凍した細胞懸濁液を、ＫＨ２ＰＯ４（５．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（１．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ  １５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２二水和物（０．１ｇ／Ｌ）、およびＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含有する０．７Ｌの培地と共に、１ＬのＡＰＰＬＩＫＯＮ（登録商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）およびＮａＭｏＯ４二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有した。殺菌後の添加は、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ、６．５ｇ）およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）保存液（２．８ｍＬ）を含んだ。グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ）は、流加にも使用した。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ以下に低下した４０分後に開始し、０．０３ｇ供給／分から始まり、毎時それぞれ０．０４、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１２、および０．１４ｇ／分まで徐々に増大させ、その後速度を一定にした。培地中のグルコース濃度を監視し、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えたら、供給速度を低下または一時的に停止した。ＯＤ５５０＝５０で、０．８ｍＬのＩＰＴＧ（０．０５Ｍ）の添加によって誘導を開始した。初めは攪拌（４００〜１０００ｒｐｍ）によって、その後は通気（０．５〜２ｓｌｐｍ）によって溶存酸素（ＤＯ）濃度を空気飽和の２５％に調節した。温度を３７℃に調節し、ｐＨを６．８に調節し、ｐＨ調節のためにＮＨ４ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）およびＨ２ＳＯ４（２０％ｗ／ｖ）を使用した。ＩＰＴＧ添加の２０時間後に、遠心分離（５，０００×ｇで１５分）によって細胞を収集した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型ペルヒドロラーゼ）の細胞培養物を、実施例２に記載さ��るように増殖させた。
【０３０９】
実施例１６
半精製した野生型Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼまたはＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）変異体アセチルキシランエステラーゼを含有する細胞ライセートの調製
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型ペルヒドロラーゼ）の細胞培養物を、実施例５に記載されるように増殖させた。得られた細胞ペーストを、１．０ｍＭのＤＴＴを補充した５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁させた（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞をＦｒｅｎｃｈ圧力セルに２回通し、９５％よりも多い細胞溶解を保証した。溶解細胞を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄みを７５℃で２０分間加熱した後、氷浴中で２分間失活させた。１１，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって、沈殿したタンパク質を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＣＥ−７酵素は、加熱処理抽出物の上澄み中の全タンパク質の約８５〜９０％を構成することが示された。
【０３１０】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｖ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｖ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ａ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ａ変異体ペルヒドロラーゼ）、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）の細胞培養物を、実施例１５に記載されるように、それぞれ増殖させた。得られた細胞ペーストを、１．０ｍＭのＤＴＴが補充された５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁させた（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞をＦｒｅｎｃｈ圧力セルに２回通し、９５％よりも多い細胞溶解を保証した。溶解細胞を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄みを７５℃で２０分間加熱した後、氷浴中で２分間失活させた。１１，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって、沈殿したタンパク質を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＣＥ−７酵素は、加熱処理抽出物の上澄み中の全タンパク質の約８５〜９０％を構成することが示された。
【０３１１】
実施例１７
Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシラン野生型エステラーゼおよびＣ２７７エステラーゼ変異体の比活性および過加水分解／加水分解比
反応（４０ｍＬの全体積）は、トリアセチン（１００ｍＭ）と、過酸化水素（１００ｍＭ）と、以下のアセチルキシランエステラーゼ変異体：Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓからの０．０１０ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質）、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ）からの０．０１０ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ａ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ａからの０．０１２５ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質）、およびＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｖ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｖからの０．０１２５ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質）（実施例１６に記載されるように調製）のうちの１つとを含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中、２５℃で実行した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の３０秒間だけ反応を攪拌した。
【０３１２】
反応は、直前で記載したものと同一条件下で、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型アセチルキシランエステラーゼを発現する（実施例１））から単離した０．０５０ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質を用いても実行し、ここで、加熱処理した抽出物の上澄みは、実施例１６の手順に従って調製した。
【０３１３】
上記の反応混合物のそれぞれから、各反応の最初の１分後、その後２分毎に１５分間、２つのサンプルを同時に抜き出した。ここで、２つのサンプルの１つは過酢酸について分析し、第２のサンプルは、トリアセチンの酵素的な加水分解と、その後のメチル−ｐ−トリルスルフィド（ＭＴＳ、以下を参照）との反応によるサンプル中の過酢酸の酢酸への転化との両方から生成される全酢酸について分析した。
【０３１４】
Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法の変形を用いて、反応混合物中の過酢酸の生成速度の測定を実施した。反応混合物のサンプル（０．０４０ｍＬ）を所定の時間に取り出し、すぐに水中５ｍＭのリン酸０．９６０ｍＬと混合し、希釈サンプルのｐＨをｐＨ４未満に調整することによって反応を終了させた。得られた溶液を、１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルターユニット（３０，０００公称分画分子量（ＮＭＷＬ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ、カタログ＃ＵＦＣ３ＬＫＴ００）を用いてろ過した。得られたろ液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含有する１．５ｍＬのスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ、＃５１８２−０７１５）に移し、次に、アセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリルスルフィド）０．１００ｍＬを添加し、バイアルにフタを閉め、内容物を手短に混合した後、光のない状態で、約２５℃で１０分間インキュベーションを行った。次にバイアルに、０．４００ｍＬのアセトニトリルおよび０．１００ｍＬのトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、４０ｍＭ）のアセトニトリル溶液を添加し、得られた溶液を混合し、光のない状態で、約２５℃で３０分間インキュベートした。次にバイアルに、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ、ＨＰＬＣ外部標準）を添加し、ＨＰＬＣによって、得られた溶液をＭＴＳＯ（メチル−ｐ−トリルスルフィド）について分析し、化学量論的な酸化生成物が、ＭＴＳと過酢酸との反応によって生成された。抽出タンパク質またはトリアセチンを添加させずに対照反応を行い、過酢酸の生成速度を背景のＭＴＳ酸化に対して補正するために、過酸化水素によるアッセイ混合物中のＭＴＳの酸化の速度を決定した。ＨＰＬＣ法：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８プレカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃５９５９０−Ｕ）を備えたＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ）（カタログ＃５６９４２２−Ｕ）、１０マイクロリットルの注入体積、１．０ｍＬ／分および周囲温度におけるＣＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃２７０７１７）および脱イオン水による勾配法（表４）。
【０３１５】
【表１９】
0005656845.tif 000026
【０３１６】
反応においてペルヒドロラーゼに触媒される酢酸の生成速度の決定のために、反応混合物のサンプル（０．９００ｍＬ）を所定の時間に取り出し、すぐに、０．０４０ｍＬの０．７５ＭのＨ３ＰＯ４を含有する１．５ｍＬの微量遠心管に添加し、得られた溶液を手短に混合して、ｐＨ３．０〜４．０で反応を終了させた。次に、５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ（７．２）中の１０ｍｇ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ３５１５）の溶液０．０２０ｍＬを管に添加し、得られた溶液を混合し、周囲温度で１５分間反応させ、未反応の過酸化水素を不均化させて水および酸素にした。次に、０．０４０ｍＬの０．７５ＭのＨ３ＰＯ４を管に添加し、得られた溶液を混合し、１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルターユニット（３０，０００公称分画分子量（ＮＭＷＬ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、カタログ＃ＵＦＣ３ＬＫＴ００）を用いてろ過した。得られたろ液のアリコート（０．１００ｍＬ）をアセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリルスルフィド）０．１５０ｍＬと混合し、得られた溶液を、光のない状態で、約２５℃で１０分間インキュベートした。フレームイオン化検出器（ＦＩＤ）およびＤＢ−ＦＦＡＰカラム（長さ：１５ｍ、ＩＤ：０．５３０ｍｍ、膜厚：１．００μｍ）を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ）を用いて、トリアセチンの酵素的加水分解と、ＭＴＳとの反応による過酢酸の酢酸への転化との両方によって生成されるサンプル中の酢酸の濃度を決定した。それぞれの速度決定に対して新たな注入ポートライナーを用いて（全部で８個のサンプル分析）、時間と共にリン酸が注入ポートライナーに蓄積するのを回避した。
【０３１７】
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体は、トリアセチンの過加水分解に対して、野生型エステラーゼよりも著しく高い比活性を有した（表１３）。Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の過加水分解／加水分解比は、ＰＡＡの生成速度（過加水分解速度）をトリアセチンの酢酸への加水分解速度（加水分解速度）で割ることによって決定した（ＰＡＡおよび酢酸の両方からのアッセイ法において全酢酸生成速度から計算し、過酢酸生成速度に対して補正した）。Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体のＰ／Ｈ比は、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型アセチルキシランエステラーゼのＰ／Ｈ比とほぼ同等であるか、あるいはそれよりも大きかった（表１３）。
【０３１８】
【表２０】
0005656845.tif 000027
【０３１９】
実施例１８
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８におけるサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の発現
共有の同時出願された同時係属中の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２ＵＳＮＡに記載されるようなアセチルキシランエステラーゼ突然変異を含むプラスミドは、アミノ酸残基位置２７７にＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒを置き換えることによって、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（配列番号１６）から調製した（配列番号７４）。プラスミドを用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８を形質転換した（実施例３）。形質転換体を、ＬＢ培地中３７℃で振とうさせながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで増殖させ、この時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベーションを２〜３時間続けた。遠心分離によって細胞を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、全可溶性タンパク質の２０〜４０％におけるアセチルキシランエステラーゼの発現を確認した。
【０３２０】
実施例１９
半精製したＴ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体を含有する細胞ライセートの調製
実施例１５に記載されるものと同様の発酵プロトコールを用いて、細胞培養物（実施例１６で記載したように調製した）を１Ｌのスケール（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）で増殖させた。５，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって細胞を収集し、次に、１．０ｍＭのＤＴＴを補充した５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞をＦｒｅｎｃｈ圧力セルに２回通し、９５％よりも多い細胞溶解を保証した。溶解細胞を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄みを７５℃で２０分間加熱した後、氷浴中で２分間失活させた。１１，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって、沈殿したタンパク質を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＣＥ−７酵素は、調製物中の全タンパク質の約８５〜９０％を構成することが示された。
【０３２１】
実施例２０
Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシラン野生型エステラーゼおよびＣ２７７エステラーゼ変異体の比活性および過加水分解／加水分解比
反応（４０ｍＬの全体積）は、トリアセチン（１００ｍＭ）と、過酸化水素（１００ｍＭ）と、以下のアセチルキシランエステラーゼ変異体：Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓからの０．０１０ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質）、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔからの０．０１０ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質）、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ａ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ａからの０．０１２５ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質）、およびＴ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｖ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｖからの０．０１２５ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質）（実施例１９に記載されるように調製）のうちの１つとを含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中、２５℃で実行した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の３０秒間だけ反応を攪拌した。
【０３２２】
反応は、直前で記載したものと同一条件下で、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型アセチルキシランエステラーゼを発現する）から単離した０．０５０ｍｇ／ｍＬの加熱処理した全抽出タンパク質を用いても実行し、ここで、加熱処理した抽出物の上澄みは、実施例１９の手順に従って調製した。
【０３２３】
上記の反応混合物のそれぞれから、各反応の最初の１分後、その後は２分毎に１５分間、２つのサンプルを同時に抜き出した。ここで、２つのサンプルの１つは、Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法の変形を用いて過酢酸について分析し、第２のサンプルは、トリアセチンの酵素的加水分解と、その後のメチル−ｐ−トリルスルフィド（ＭＴＳ）との反応によるサンプル中の過酢酸の酢酸への転化との両方から生成される全酢酸について分析した。
【０３２４】
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体は、トリアセチンの過加水分解に対して、野生型エステラーゼよりも著しく高い比活性を有した（表１４）。Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の過加水分解／加水分解比は、ＰＡＡの生成速度（過加水分解速度）をトリアセチンの酢酸への加水分解速度（加水分解速度）で割ることによって決定した（ＰＡＡおよび酢酸の両方からのアッセイ法において全酢酸生成速度から計算し、過酢酸生成速度に対して補正した）。Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体のＰ／Ｈ比は、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型アセチルキシランエステラーゼのＰ／Ｈ比とほぼ同等であるか、あるいはそれよりも大きかった（表１４）。
【０３２５】
【表２１】
0005656845.tif 000028
【０３２６】
実施例２１
ペルヒドロラーゼを用いる過酢酸の生成
トリアセチン（２ｍＭ）、過酸化水素（１０ｍＭ）、および０．１μｇ／ｍＬ〜２．０μｇ／ｍＬの加熱処理した細胞抽出タンパク質（上記のように調製、加熱処理は８５℃で２０分間実施した）を含有する反応（１００ｍＬの全体積）を、１０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）中、２０℃で実行した。Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施した。１分、５分、２０分、４０分および６０分で生成した過酢酸濃度は、表１５に記載される。
【０３２７】
【表２２】
0005656845.tif 000029
【０３２８】
実施例２２
ペルヒドロラーゼを用いる過酢酸の生成
トリアセチン（２０ｍＭ）、過酸化水素（１０ｍＭ）、および０．１μｇ／ｍＬ〜２．０μｇ／ｍＬの加熱処理した細胞抽出タンパク質（上記のように調製、加熱処理は８５℃で２０分間実施した）を含有する反応（１００ｍＬの全体積）を、１０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）中、２０℃で実行した。Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施した。１分、５分、２０分、４０分および６０分で生成した過酢酸濃度は、表１６に記載される。
【０３２９】
【表２３】
0005656845.tif 000030
【０３３０】
実施例２３
ペルヒドロラーゼを用いる過酢酸の生成
トリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ）、および１０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの加熱処理したＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）またはＴ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型またはＣ２７７変異体ペルヒドロラーゼ（上記のように調製した、加熱処理した細胞抽出タンパク質として、加熱処理は７５℃で２０分間実施した）を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中、反応（４０ｍＬの全体積）を２５℃で実行した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の３０秒間だけ反応を攪拌した。Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施した。１分、５分、および３０分で生成した過酢酸濃度は、表１７に記載される。
【０３３１】
【表２４】
0005656845.tif 000031
【０３３２】
実施例２４
ペルヒドロラーゼを用いる過酢酸の生成
トリアセチン（１００ｍＭまたは１５０ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ、２５０ｍＭまたは４２０ｍＭ）、および加熱処理したＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）またはＴ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型、Ｃ２７７ＳまたはＣ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼを含有する重炭酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、初期ｐＨ６．０）中、反応（１０ｍＬの全体積）を２５℃で実行した。４２０ｍＭの過酸化水素を用いて実行した反応は、さらに、５００ｐｐｍのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬを含有した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の３０秒間だけ反応を攪拌した。Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って、反応混合物中の過酢酸の濃度の決定を実施した。１分、５分、および３０分で生成した過酢酸濃度は、表１８に記載される。
【０３３３】
【表２５】
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【図１Ａ】
0005656845.tif 000033
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
0005656845.tif 000035
【図１Ｄ】
0005656845.tif 000036
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【配列表】
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