(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の反応：
【化１】
0005833222.tif 000025
[式中、Mはアルカリ金属である]
により式II（T3S）を有する甲状腺ホルモンの硫酸化形態を製造する方法であって、以下の工程：
a）ジメチルアセトアミド（DMAC）の存在下、式Iの化合物のクロロスルホン酸（CSA）による硫酸化工程；
b）アルカリ金属無機塩の水溶液中にて塩化して、式IIの化合物を得る工程
を含む、方法。
【請求項２】
無機塩がナトリウム塩である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
CSAおよび式Iの化合物のモル比が4〜10である、請求項１〜２のいずれか記載の方法。
【請求項４】
工程a）において、DMAC中の式Iの化合物の濃度がDMACの0.060〜0.090 mol/Lである、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
工程a）中の硫酸化反応が10℃以下の温度にて行われる、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
工程a）における硫酸化が少なくとも２時間行われる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程b）における塩化がNaHCO3の水溶液中にて行われる、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
さらに、ポリマー吸着固相でのクロマトグラフィーにより、水および有機溶媒の極性逓減混合物で溶出して式IIの化合物を精製する工程c）を含み、適宜工程c）に先行してろ過工程がなされる、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
極性逓減混合物が1.0:0〜0.7:0.3の比における水および極性溶媒の混合物である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
溶出後、溶液が少なくとも式IIの化合物 10g/kgまで濃縮され、5.5〜6.5のpH値となる、請求項８〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
式IIの化合物が有機極性溶媒による処置の後、固体として得られる、請求項８〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
有機極性溶媒がアセトン、エタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルから選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
固体形態における式IIの化合物がさらに微粉化される、請求項１１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
さらに、セルロースまたはその誘導体、カオリン、デンプン、および炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムから選択される無機アルカリ塩からなる群から選択される少なくとも一つの希釈剤とともに、適宜レボチロキシン（T4）と組み合わせて、式IIの化合物の固体および／または微粉化形態を混合する、請求項１１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
希釈剤が微結晶性セルロースであり、式IIの化合物および希釈剤の混合物をさらにジベヘン酸グリセロール、第三リン酸カルシウム、タルク、デンプンおよびその誘導体からなる群から選択される少なくとも一つの流動促進剤、クロスカルメロースまたはその誘導体、クロスポビドン、ポリメチルアクリレート、マルトデキストリン、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも一つの崩壊剤、および適宜ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、コロイド状含水シリカおよびコロイド状二酸化ケイ素からなる群から選択される平滑剤と混合し、次いで混合物の直接圧縮により錠剤に製剤化する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
３’，５  ジヨードサイロニン（T2）をヨウ素化剤で、水性媒体中、脂肪族アミンの存在下にてヨウ素化することにより式Iの試薬を得る、請求項１〜１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
ヨウ素化剤がI2/NaIを含む混合物である、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、甲状腺ホルモンの硫酸化誘導体またはその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺ホルモン トリヨードサイロニン（3,5-ジヨード-O-[3-ヨードフェニル]-L-チロシンまたはT3）は、代謝的に最も有効な甲状腺ホルモンである。チロキシン（T4）のように、これは、糖タンパク質前駆体であるチログロブリンの形態にて、甲状腺により生理学的に製造され、それとともに貯蓄される。平均して、１のチログロブリン分子は３または４のT4残基を含み、多くても１のT3残基を含む。TSH生成は酵素カテプシンD、BおよびLを通して甲状腺ホルモンT3およびT4を放出しながらチログロブリンタンパク質分解を活性化する。しかし、T3生成はこの機序に限定されない：実際、末梢組織において、チロキシンはトリヨードサイロニン（トリヨードサイロニンの80％がチロキシンにより末梢的に生成され、20％が甲状腺内に生成される）に変換される。
【０００３】
T3の重要性は、最も活性な甲状腺ホルモンであるという事実によりそれだけではない。実際、この点、その欠乏により引き起こされる種々の病態が知られている。特に、例えば、胎児性発育期および幼少期の神経組織において、T3欠乏は、大脳および小脳皮質成長、軸索増殖、細胞遊走、髄鞘化、樹状突起分岐およびシナプス生成の減少をもたらす。生命の初期段階におけるT3欠乏の結果として、神経系発育の遅延、次いで認知障害および運動障害が観察され、これはクレチン病といわれる臨床像をもたらすことがある。また成人において、トリヨードサイロニンレベルが減少した場合、脳内血流およびグルコース脳代謝が低くなることが脳PETにより証明されている。これらのデータにより、甲状腺機能低下個体における精神運動欠乏を説明することができる。
【０００４】
神経組織にて観察される効果に加えて、軟骨内骨化がトリヨードサイロニンにより刺激され、従って骨端骨中心の成熟を通して骨が直線的に伸びる、骨組織におけるものも知られている。たとえ、誕生後、骨の直線的成長が必要でなくとも、トリヨードサイロニンは適切な胎児骨成長に不可欠である。
【０００５】
さらに、表皮組織におけるT3効果は実証されており、トリヨードサイロニンがその成熟および肌付属器の（成熟）に関与するだけでなく、その劣化にも関与し、従って細胞再生を促進する。それゆえ、このホルモンの過剰および欠乏はともに、皮膚科学的問題を引き起こしうる。
【０００６】
それゆえ、T3甲状腺ホルモンは当然、上記に加えて、血液組織におけるよく確認された効果を有する多面的なホルモンとして考えられており、エリスロポエチン生成、結果的に造血を増大し；脂肪組織においては、前脂肪細胞の脂肪細胞への成熟を促進し、脂肪酸脂肪分解を増大し、最終的にコレステロール代謝も調整する。
【０００７】
甲状腺機能低下症は自己免疫疾患により頻繁に引き起こされ、むしろ一般的である：実際、イタリア人の有病率は女性で約1.5％、男性で約1％である。より活性な形態、すなわちT3は非常に短い半減期であるため（この理由により通常用いることができない）最適な薬物である合成レボチロキシン（T4）に基づく置換療法を通して主に十分に薬理学的に処置される。
しかし、レボチロキシンによる治療はまた、血漿甲状腺機能正常が蓄えられている間、組織的（tissutal）なものが必ずしもなさないという事実と関連するいくつかの欠点を示す。EP 1560575 Bに記載される甲状腺ホルモン様T3活性に基づき提案可能なものなどの薬理学的な代替研究は、現在の最適な処置に代わる望ましいものであることができる。
【０００８】
しかし、T3Sが関与する限り、主な障害は、大スケール合成における困難性により示されるだろう。実際、これまでT3Sは研究室スケールでのみ製造可能であった。
この点、大過剰の硫化剤、例えば濃硫酸（H2SO4）またはクロロスルホン酸（CSA）を用いたT3からのT3Sの製造が例えばUS2970165およびBiochim. Biophys. Acta, 33, 461 (1959)に記載されており、低温での濃硫酸の直接的な付加により、固体形態にてT3からのT3Sの製造を記載する。
【０００９】
Endocrinology, Vol.117, No.1, 1-7 (1985)およびEndocrinology, Vol.117, No.1, 8-12 (1985)は、冷却下、クロロスルホン酸（CSA）溶液のジメチルホルムアミドへの添加、次いでSephadex LH-20による精製工程による、T3からのT3Sの合成を構想する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、これまで、いずれの先行文献の方法も、主に報告された精製手順が極めて高容量を必要とするため、純粋な形態にて最終生成物のグラム製造までスケールアップすることができなかった。
【００１１】
有利なことに、DMACの存在下、硫化剤としてクロロスルホン酸（CSA）を用いてトリヨードサイロニンから出発する硫酸化反応は高変換率を提示することが分かった。さらに、精製は既知の先行文献の方法にて報告されるものよりも少量で行うことができる。結局、生成物T3Sは、工業スケールにて適用される条件下でも、必要な質および量（何百グラム）についてその臨床用途のために必要なレベルまで精製することができる。
【００１２】
さらに、Chopra et al.（J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194）に記載のRIAなどの血中T3Sレベルを検出する放射性アッセイのみがこれまで記載されているので、例えば非放射性試薬に基づくより安全なイムノアッセイの必要性が存在する。そのような試薬の使用によって、臨床および／または研究構造がこれらの測定を行うことも可能にする。この目的のために、非放射性イムノアッセイが開発され、本発明の一部である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の反応式に従い、式Iの3,5-ジヨード-O-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)-L-チロシンまたはその塩から出発して式IIの3,5-ジヨード-O-[3-ヨード-4-(スルホキシ)フェニル]-L-チロシン（T3S）のモノカチオン塩を製造する方法であって：
【化１】
0005833222.tif 000002
[式中、Mはアルカリ金属、好ましくはNaである]
a）溶媒としてジメチルアセトアミド（DMAC）の存在下、式Iの化合物またはその塩のクロロスルホン酸（CSA）を用いた硫酸化工程；
b）a）で得られた反応混合物をアルカリ金属無機塩、好ましくはモノカチオン性ナトリウム、さらにより好ましくはNaHCO3の水溶液に加えることにより、a）で得られた硫酸化誘導体を塩化して式IIの化合物（T3S）を得る工程
を含む、方法に関する。
【００１４】
特に好ましい態様によれば、式Iの化合物（T3）は、脂肪族アミン（好ましくは直鎖モノアルキル（C1-C4）脂肪族アミンから選択され、中でもエチルアミンが好ましい）の存在下、式IIIの化合物（T2）をヨウ素化剤、好ましくはNaIおよびI2でヨウ素化することにより得る：
【化２】
0005833222.tif 000003
【００１５】
ヨウ素化剤の添加は、水性溶媒、好ましくは水の存在下、好ましくは25℃未満の温度にて行う。好ましくは、ヨウ素化剤は化合物III（T2）に対し0.9〜1.1 mol/molからなるモル比にて存在する。
【００１６】
従って、T3Sの製造方法は、上記条件下、T2のヨウ素化、次いで発明の詳細な説明により記載されているようにジメチルアセトアミド中クロロスルホン酸による硫酸化を用いたT3の製造を含む。
【００１７】
さらに、さらなる態様によれば、本発明はまた、有効成分、T3Sの医薬組成物、好ましくは固体への製剤化を含み、T3Sは好ましくは粉末形態下、希釈剤、次いで流動化剤、平滑剤、好ましくはジベヘン酸グリセロールと混合し、分散剤、好ましくはクロスカルメロースまたはその誘導体を該混合物に加え、篩にかけ、さらに有効成分を含む希釈混合物と混合する。
【００１８】
従って、この認識によれば、該方法は、希釈剤、例えば微結晶性セルロースが１以上のフラクションにて混合される工程、その混合、次いで流動化剤、好ましくはジベヘン酸グリセロール、平滑剤、好ましくはステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸亜鉛、コロイド状含水シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、および好ましくはさらに崩壊剤、好ましくはクロスカルメロースまたはその誘導体を含む混合物の製造；次いでそれらの篩分けおよびさらに有効成分を希釈剤とともに含む混合物との混合を含む。次いで、さらなる賦形剤、安定化剤および希釈剤（例えば炭酸カルシウムなど）を加え、可変時間の間混合することができる。
【００１９】
特に好ましい態様によれば、本発明はさらに、上記製造方法により製造された錠剤であって、T3Sを有効成分として1〜1000μgからなる量にて含み、以下の希釈剤、賦形剤、流動促進剤および滑沢剤：炭酸カルシウム、ジベヘン酸グリセロール、クロスカルメロースナトリウム塩、コロイド状含水シリカ、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロースを含む、錠剤を開示する。単回投与についての好ましい量は、以下の表に与えられる：
【表１】
0005833222.tif 000004
【００２０】
本発明のさらなる態様は非放射性イムノアッセイにより示される。
【００２１】
好ましくは、イムノアッセイはEnzyme Linked Immuno Assay（ELISA）、より好ましくは競合ELISAであり、より好ましくは検出可能部分として蛍光基または酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）またはアビジン誘導検出可能部分（すなわちビオチン）を用いてマルチウェルプレートにて行う。
【００２２】
T3S非放射性検出アッセイのさらなる開発として、試薬はランタニド蛍光免疫測定法について開発されている。新規試薬に基づくT3S定量のための本アッセイ、合成試薬およびキットは本発明のさらなる目的である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Figure 1. パネルa）競合ELISAによるT3S検量線；パネルb）DELFIA検量線。T3Sは33.6、56、93.3、155.5、259、432、720、1200、2000 pg/mLにてアッセイした。
【図２】Figure 2. DTPA-T3Sモノアミド合成の反応式。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の目的は、式Iの3,5-ジヨード-O-[4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル]-L-チロシンまたはその塩化誘導体から出発することによる、式IIの甲状腺ホルモンT3、3,5-ジヨード-O-[3-ヨード-4-(スルホキシ)フェニル]-L-チロシン（T3S）の硫酸化形態のモノカチオン塩としての製造方法：
【化３】
0005833222.tif 000005
[式中、Mはアルカリ金属、好ましくはNaである]
であって、
a）溶媒としてジメチルアセトアミド（DMAC）の存在下、式Iの化合物（T3）のクロロスルホン酸（CSA）を用いた硫酸化工程、
b）a）で得られた硫酸化誘導体を塩化して式IIの化合物を得る工程
を含む、方法である。塩化は一般に、a）で得られた反応混合物をアルカリ金属無機塩、好ましくはナトリウム塩、さらにより好ましくはNa2CO3またはNaHCO3の水溶液に加えることにより得られる。
【００２５】
本発明の目的に関し、T3Sは、トリヨードサイロニンの硫酸化形態またはそのモノカチオン塩（式II化合物）のいずれかを含む、式IIの化合物を意味する。
工程a）は、溶液を激しく攪拌しながら、冷却下、DMAC中、T3の懸濁液にCSAを加えることにより行う。
温度は約10℃未満、より好ましくは-10℃〜8℃、より好ましくは-8℃〜6℃、さらにより好ましくは-5℃〜5℃の値に保つ。
CSAの懸濁液への添加は、ゆっくりと、好ましくは用いる試薬の量に応じて30〜60分の間、好ましくは不活性雰囲気下、例えば窒素またはアルゴン雰囲気下行う。
【００２６】
好ましい態様によれば、CSAおよびT3のモル比は4より大きく、好ましくは4.5〜10、さらにより好ましくは7〜9からなる。さらにより好ましくは、CSAの7.5〜8.5 mol／T3のmolからなる。T3のmol／DMACのLとして表されるDMAC中のT3の濃度は0.06〜0.15 mol/L、より好ましくは0.12〜0.14 mol/Lからなる。CSAおよび溶媒の比は、CSAの0.35〜1.28 mol／DMACのL、好ましくは約0.8〜1.15 mol/L、さらにより好ましくはCSAの約0.96〜1.1 mol／DMACのLであってもよい。
CSAを添加後、混合物を4-5時間よりも長くない時間、一般に冷却せずに反応させ、温度を室温（20-25℃）に到達させる。
85％よりも多く、好ましくは90％よりも多く、さらにより好ましくは95％よりも多いT3がT3Sに変換される場合に、規定の条件下、硫酸化は一般に完了する。
【００２７】
特に好ましい態様によれば、該方法の工程a）は、CSAの約8モル／T3のモルの好ましい比で約-5℃〜約5℃からなる温度にて30-40分間にてT3の0.12-0.14モル／DMACのLの濃度にてDMAC中CSAのT3溶液への添加を予測する。添加の最後に、一般に冷却を停止し、温度を室温（約15〜25℃からなる）まで4〜5時間、好ましくは2〜3時間以下にて上昇させる。
次いで、存在するクロロスルホン酸を中和する量にて硫酸化混合物を塩化工程b）により無機アルカリ塩、好ましくはモノカチオンの水溶液（ここに、Naが特に好ましいカチオンである）に加える。
塩化は、好ましくは、炭酸ナトリウム（Na2CO3）または炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）の水溶液で、前の工程にて用いられるクロロスルホン酸の量の機能量および得られた溶液のpHを中和するのに少なくとも十分な量にて行う。一般に、Na2CO3を用いる場合、約1.5モル／CSAモルの量は十分である。この態様によれば、Na2CO3溶液濃度は約0.7モル／溶液Lである。そのような条件下、クエンチ後の溶液pH 6.5〜7.5が得られる。
【００２８】
この態様によれば、得られたT3S化合物の対応するモノカチオン塩は式II（ここに、Mは好ましくはNaである）を有する。
工程b）による反応混合物の添加は、30℃未満の温度に保ちながら可変時間にて行われ、典型的には1時間〜3時間からなる。
上記工程b）によるモノカチオン塩として溶液中にて得られる式IIのT3S化合物は、さらなる工程c）に従い、クロマトグラフィーより精製される。クロマトグラフィーに先だって、副生成物として形成される無機塩の一部を軽減する目的で、b）にて得られる反応混合物の沈殿および／またはろ過を、例えば重量または真空下、予めおよび適宜行う。
クロマトグラフィー（c）はポリマータイプの吸着性樹脂上にて行う。好ましくは、そのような樹脂は大網様芳香族ポリマーマトリクスにより構成される。好ましい樹脂の例は、XADTM AmberlitesTMであり、さらにより好ましくはAmberliteTM XADTM 1600である。
【００２９】
よく知られているように、使用前に、樹脂は当分野にて知られる手順、例えば水、アセトンなどで洗浄することにより活性化する（一般参照として、Rohm and Haas「Laboratory Column Procedures and Testing of Amberlite and Duolite Polymeric Adsorbents」セクション「Preparation of Resins」を参照）。本発明の方法によれば、樹脂は、好ましくは、次の溶出のために選択される溶媒で活性化する（すなわちアセトンまたは水／アセトン混合物）。
T3Sは、好ましくは、高極性を有する混合物から出発して、減少勾配の極性にて溶媒の溶出混合物により樹脂から溶出する。
好ましい態様によれば、該溶出混合物はまず水であり、次いで適切な反比における適切な極性有機溶媒による連続希釈である。
好ましい溶出混合物は、1:0〜0.7:0.3からなる比の水／アセトニトリルおよび水／アセトンで示される。好ましくは、溶出混合物は、1:0〜0.85:0.15からなる比の水およびアセトンの混合物で示され、カラムからの溶出速度は一般に、0.9〜1.1倍のカラム容積／時からなる。
【００３０】
カラムから溶出した、最終生成物を95％、より好ましくは96％、98％、99％より高い純度で含むフラクション（当分野にてよく知られている分析法、例えばUV検出で測定し、HPLC分析で分析する）を集めて一緒にし、溶媒の留去、すなわち真空下での凍結乾燥または他の既知の方法により有効成分を単離することができる。
しかし、好ましい態様によれば、溶出したフラクションは、例えば約10 g／溶媒kgの濃度まで真空下、部分的に留去することにより濃縮する。
【００３１】
この濃度にて、希釈強無機酸溶液、好ましくは硫酸および塩酸から選択される一つの酸、特に好ましくは塩酸を加えることにより6.5未満、好ましくは5.5〜6.5の値に溶液のpHを調整し、0.9〜1.1 Nからなる濃度にて希釈された形態にて利用する。
溶液をさらに約10-15回濃縮し、T3Sは、例えば凍結乾燥、スプレードライにより固体として単離するか、または好ましくは極性タイプの有機溶媒で好ましくは処理し、固体形態にて単離し、次いで適宜さらに微粉化することができる。
従って、この好ましい態様によれば、式II化合物は、アセトン、アセトニトリルおよびC1-C4アルコールからなる群から選択される溶媒で処理することにより固体形態にて単離する。しかし、芳香族アルカン、エーテル、塩素化溶媒、エステル、ジメチルホルムアミド、ニトロメタン、ジメチルスルホキシド、2-メトキシエタノールまたはその混合物から選択される他の溶媒を用いてもよく、固体形態にて塩を得ることができ、単離可能である。
【００３２】
従って、詳細には、クロマトグラフィーし、フラクションを含むT3Sを約10 g／溶液 kgの濃度まで濃縮し、6.5未満、好ましくは5.5〜6.5からなる値までpH調整し、170〜500 gからなる式II化合物／懸濁液またはゲル kgの濃度までさらに溶媒を留去し、濃縮溶液を有機溶媒で処理する。好ましくは、該溶媒は、アセトン、例えばエタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの低級アルコール、およびアセトニトリルから選択される極性有機溶媒であり、特に好ましくはアセトンである。
アセトンの濃T3S溶液への添加を20〜25℃の温度にて行い、モノカチオンT3S塩の固体形態を完全に析出させるために、好ましくは0〜25℃の温度にて１〜３時間攪拌しながら混合物を放置する。
溶媒の懸濁液への添加は、既知の割合に従い行い、アセトンを用いる場合、アセトン1-11 g／T3S gの量にて20〜25℃の温度にて加える。
【００３３】
従って、式IIのモノカチオン誘導体またはより好ましくはそのナトリウム塩は、例えばろ過により、固相から液相の分離後、固体形態にて95％、より好ましくは96％、98％、または＞99％より高いHPLC純度で得られる。
従って、全体的にみると、本発明の方法により、最終生成物（T3S）を高収率（総収率：≧60％）かつ高純度（HPLC＞99％）で単離することが可能となる。
実際に、従来法より有利なことに、DMACの存在下、硫酸化混合物a）中に副生成物の量が10％未満、一般には7％未満である。
次いで、硫酸化反応における高変換率および続く塩化により、産業上利用可能なクロマトグラフィー工程による純粋な形態および限られた容積にて生成物を得ることができる。
T3Sは、効率的に他の副生成物から分離され、何百グラムで製造した場合であっても高純度（＞99％）であり、そのため、可能な臨床実践におけるこのトリヨードサイロニン誘導体の使用を可能とする。
臨床用製剤を製造するために、固体形態および99％までの純度のT3Sは、例えば窒素圧下、好ましくはさらに微粉化されて、粒径を減少する。
【００３４】
特に好ましくは、気候室内での加速安定性試験に提出する場合に少なくとも一ヶ月間安定である、25μmより小さい粒径（25μm未満のサイズの粒子の少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％）である。
それゆえ、本発明の好ましい態様によれば、該方法は、純粋な形態での固体T3Sの微粉化を含み、上記定義されるサイズの粒子、および経口投与用固体製剤を製造するためのその使用を与える。
この態様によれば、微粉化後、T3Sは、粉末混合物中の適切な添加成分と一緒に製剤化され、適宜顆粒形態または微粒形態下、好ましくは粉末混合物の直接圧縮を通して得られる錠剤または丸剤として製剤化される。
固体形態またはより好ましくは錠剤へのT3S製剤化により、微粉化された有効成分（または好ましくはレボチロキシンと組み合わされた場合の成分）に、まず必要な最終希釈剤の量の一部、好ましくは30、40または好ましくは少なくとも50％の希釈剤を加え、これらを混合して混合物a）を与える。
好ましい希釈剤はセルロースまたはその誘導体、例えば微結晶性セルロースである。他の適切な希釈剤は、カオリン（caolin）、デンプン、または炭酸マグネシウムもしくは炭酸カルシウムなどのアルカリ無機塩である。特に好ましくは、炭酸カルシウム、より好ましくは微結晶性セルロースと結合する。
【００３５】
次いで、混合物a）は、さらなる成分、一般に流動促進剤、平滑剤および分散剤（disaggregating agent）を含む混合物b）と混合し、篩にかけ、次いで有効成分を含む混合物a）と混合する。
崩壊剤のうち、特に好ましくは、クロスカルメロースまたはその誘導体である。この目的のために使用可能な他の薬剤は、クロスポビドン、ポリメタクリレート、マルトデキストリン、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウムである。
流動促進剤のうち、特に好ましくは、ジベヘン酸グリセロールである。他の使用可能な流動促進剤は、第三リン酸カルシウム、タルク、デンプンまたはその誘導体である。
【００３６】
滑沢剤のうち、特に好ましくは、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸亜鉛、コロイド状含水シリカ、コロイド状二酸化ケイ素である。さらなる賦形剤、安定化剤および希釈剤（例えば炭酸カルシウムなど）を連続的に加え、可変時間混合してもよい。次いで、最終混合物を量り分け、錠剤を好ましくは直接圧縮により製造する。
T3Sは唯一の有効成分として1〜1000μg、より好ましくは2.5〜500μg、さらにより好ましくは5〜250μgの量にて、または他の有効成分、好ましくはT4（レボチロキシン）と組み合わせて固体投与形態にて存在する。この態様によれば、T4は1〜800μgまたは5〜400μg、より好ましくは10〜200μgの量にて存在する。そして、有効成分としてT3およびT4をともに含む錠剤の製造方法において、これらは混合物a）中の好ましい希釈剤、およびさらに予め順に混合した他の成分と、上記のように混合する。
【００３７】
それゆえ、好ましい態様によれば、本発明は、以下の添加成分と一緒に1〜1000μgの量にて、有効成分としてT3Sを含む、上記方法により製造した錠剤を開示する：
−セルロースまたはその誘導体から選択される、希釈剤であり、好ましくは全希釈剤の35％まで（w/w）の第二希釈剤（好ましくは炭酸カルシウム）と組み合わされる；
−ジベヘン酸グリセロール（最も好ましい）、タルク、シリカ誘導体（そのうち三ケイ酸マグネシウム）、アミド、第三リン酸カルシウムから選択される、流動促進剤であり、これは通常1〜10％、最も好ましくは4〜6％（w/w）の量にて組成物中に存在する；
−デンプン、クロスカルメロースナトリウムおよびクロスポビドンから選択される、崩壊剤。好ましくは0.5〜10％、さらにより好ましくは1〜5％、最も好ましくは2〜4％（w/w）の範囲の量のクロスカルメロースナトリウム塩である；
−ステアリン酸マグネシウム、コロイド状含水シリカおよびタルクから選択される、滑沢剤であり、より好ましくは0.1〜7％の総量範囲のステアリン酸マグネシウムおよびコロイド状シリカ、さらにより好ましくは前者0.1〜2％および後者0.5〜5％（w/w）である。
【００３８】
賦形剤として特に好ましくは、以下の好ましい量による以下の成分である：炭酸カルシウム、ジベヘン酸グリセロール、クロスカルメロースナトリウム塩、コロイド状含水シリカ、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース：
【表２】
0005833222.tif 000006
【００３９】
より好ましい態様にて、組成物は2.5〜500μgのT3Sまたはより好ましくは5〜250μgのT3Sを含む。
T4もまた存在する組合せ組成物について、T3Sは、好ましくは2.5〜500μgの量、およびT4は1〜800μgにて存在するか、またはさらにより好ましくはT3S: 5〜250μgおよびT4: 5-400μg、またはT3S: 10-100μgおよびT4 10-200μgである。
当業者は代替の組成形態、錠剤重量および／または治療プロトコルにより調節を予測することができるが、上記量は単一投与形態、好ましくは１日単回投与のための好ましくは約110 mgの錠剤を意味するものである。
好ましい態様による錠剤は、有効成分の最適溶出速度（以下の表を参照）および最適安定性（少なくとも24ヶ月）を示す。
【００４０】
ICHガイドラインによる条件にて測定した以下の特性：
【表３】
0005833222.tif 000007
本発明の方法において、T3（式Iの化合物）を含むすべての試薬は市販されている。
【００４１】
しかし、特に好ましい態様によれば、T3は式IIIの化合物（3,5-ジヨード-サイロニン, LevoditiまたはT2）を脂肪族アミン（好ましくはモノアルキル（C1-C4）直鎖脂肪族アミンから選択され、好ましくはエチルアミンである）の存在下、ヨウ素化剤、好ましくはNaIおよびI2でヨウ素化することにより製造する：
【化４】
0005833222.tif 000008
T2は好ましくは上記のように製造する。
【００４２】
ヨウ素化剤の添加は、水性溶媒、好ましくは水の存在下、好ましくは25℃未満の温度にて行う。
好ましいヨウ素化剤は0.9〜1.1 mol/molの化合物III（T2）からなるモル比にて存在する。
ヨウ素化後、T3をナトリウム塩として、好ましくはろ過により、単離し、次いで水中への再懸濁および酸、好ましくは酢酸または硫酸による酸性化により酸形態に変換する。
酸形態を、好ましくはろ過により、単離し、また水中に再懸濁して塩を除去し、ろ過する。
【００４３】
湿固体としてのT3をN,N-ジメチルアセトアミド中に懸濁し、懸濁液を無水化し、硫酸化反応を行う。
好ましい具現によれば、CSAとT3のモル比は4より大きく、好ましくは4.5〜10であり、さらにより好ましくは7〜9である。さらにより好ましくはCSA 7.5〜8.5 mol／T3 molである。DMAC中のT3濃度はT3 mol／DMAC Lとして示され、0.10〜0.15 mol/L、より好ましくは0.12〜0.14 mol/Lである。CSAと溶媒の比は、CSA 0.58〜1.28 mol／DMAC L、好ましくは0.89〜1.15 mol/L、さらにより好ましくはCSA 0.96〜1.09 mol／DMAC Lであってもよい。
【００４４】
CSAの添加後、混合物を4〜5時間以下の間反応させ、一般に冷却せずに温度を室温まで上昇させる。
硫酸化は一般に、85％、好ましくは90％、さらにより好ましくは95％より多いT3がT3Sに変換された場合に、記載の条件下にて完了する。
特に好ましい態様によれば、本方法の工程a）はCSAをT3 0.12-0.14 mol／DMAC Lの濃度のDMAC中のT3溶液に、CSA約8 mole／T3 moleの好ましい比で、約-5℃〜約10℃の温度にて30-40分間添加することが予見される。添加終了時に、一般に冷却を停止し、温度を室温（約15〜25℃）まで、4-5時間以下、好ましくは2-3時間以下で上昇させる。
次いで、硫酸化混合物を、塩化工程b）により、存在するクロロスルホン酸を中和する量にて無機アルカリ塩の水溶液、好ましくはジカチオン性（ここで、Naが特に好ましいカチオンである）に添加する。
塩化は、好ましくは、用いたクロロスルホン酸の量と相当量、少なくとも得られた溶液のpHを中和するのに十分な量のNa2CO3またはNaHCO3の水溶液で行う。一般に、Na2CO3を用いる場合、少なくとも塩1.5モル／CSAモルの量が十分である。特に好ましい態様によれば、無機アルカリ金属塩がNa2CO3である場合、その最終濃度は少なくとも0.7 mol／溶液 Lである。そのような条件下、反応停止後、6.5〜7.5の溶液pHが得られる。
【００４５】
この態様によれば、得られたT3S化合物の対応モノカチオン塩は式IIである（ここに、Mは好ましくはNaである）。
工程b）による反応混合物の添加は、30℃未満の温度を維持しながら、可変時間、典型的には1 h〜3hの間行う。
式IIのT3S化合物は、上記のように工程b）およびc）によるモノカチオン塩として溶液にて得られる。
本発明の方法は、初めて出願人の最善の知識により、少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、98％または＞99％の臨床用純度にてT3またはT2からのT3Sの製造を記載する。
【００４６】
さらなる態様によれば、本発明はまた、比色分析、蛍光検出または化学発光検出に基づく非放射性T3Sイムノアッセイにも関する。
好ましいイムノアッセイはEnzyme Linked Immuno Assay（ELISA）、より好ましくは競合ELISA（ここに、T3Sの漸増量を、固相結合抗T3S抗体（例えばChopra et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194に開示される多クローン性）への結合について、蛍光基もしくは酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）などの検出可能部分または適宜検出可能部分に連結してもよいアビジン結合誘導体（すなわちビオチン）とコンジュゲートする固定量のT3Sと競合させる）である。
【化５】
0005833222.tif 000009
式A’
【００４７】
非放射性アッセイに有用なT3S誘導体は一般に、一般式A：
【化６】
0005833222.tif 000010
式A
[式中、Rは以下：
a）蛍光基、または西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼからなる群から選択される酵素からなる群から選択される、検出可能部分、
c）適宜検出可能部分に連結してもよいアビジン結合誘導体、
d）ランタニドキレート剤
からなる群から選択される]
に含まれる。
【００４８】
Rがランタニドキレート剤である場合、T3S誘導体は好ましくは式IVの化合物である。
アッセイを好ましくはマルチウェルプレート中にて行う。好ましくは、検出可能部分は蛍光基もしくは酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）またはアビジン結合誘導体（すなわちビオチン）である。後者の態様によれば、検出は好ましくは、アルカリ性ホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素、好ましくはHRPを含むアビジン誘導体、好ましくはストレプトアビジンで行い、具体的な基質を着色、蛍光または化学発光生成物に変換する。シグナル発生のための技術としての種々の検出発光と組み合わせた、ビオチン-アビジン相互作用の使用により、RIA試験（すなわちChopra et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194を参照）に匹敵するシグナル増幅および感度の増大を可能にするが、放射性を必要とせず、先行技術に対して明らかな利点を可能にする。
【００４９】
ELISAアッセイ、ビオチン誘導体などのT3S誘導体、それらの合成および該試薬を含むT3S定量用キットは本発明のさらなる目的を示す。
別の態様として、非放射性T3SイムノアッセイはHemmila I et al. Anal Biochem. 1984 Mar;137(2): 335-43に記載のランタニド蛍光免疫測定法と称する蛍光技術について開発され、これにより1-1000 pg/ml T3Sの感度が得られる。T3S検出について開発された本アッセイ、合成試薬、および該試薬を含むT3S定量用キットは本発明のさらなる目的を示す。
【００５０】
従って、式IVのDTPA-T3Sモノアミド（3,5-ジヨード-N-[[(カルボキシメチル)[2-[(カルボキシメチル)[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル]アミノ]エチル]アミノ]アセチル]-O-[3-ヨード-4-(スルホキシ)フェニル]-L-チロシン)は、好ましい態様によりキレート化合物を意味する：
【化７】
0005833222.tif 000011
式IV
【００５１】
他の分子は、ランタニドイオンの錯体化に適したもののうち種々のキレート部分、例えばニトリロ三酢酸（NTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-ビス(2-ヒドロキシフェニル酢酸)（EDDHA）、エチレンジアミンジコハク酸（EDDS）、プロパンジアミン四酢酸（PDTA）、ジエチレントリアミン四酢酸（DTTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）および類似の分子とT3Sとのコンジュゲートを通して当分野における専門家により設計および合成することができる。キレート剤およびT3Sのコンジュゲートは、実施例部分に例示されているような直接アミド結合形成、あるいは(S)-1-p-イソチオシアナートベンジルジエチレントリアミン五酢酸（DTPAイソチオシアナート - Invitrogen cat. I24221）または類似の生成物などの市販製品であってもよい二官能性キレート剤を用いる方法などの当分野における専門家に知られた種々の方法により得ることができる。
【００５２】
キレート標識として用いられる適切なランタニド金属は、サマリウム、テルビウム、ジスプロシウムおよびユーロピウムからなる群にて選択される。
特に好ましくは、ユーロピウムキレート3,5-ジヨード-N-[[(カルボキシメチル)[2-[(カルボキシメチル)[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル]アミノ]エチル]アミノ]アセチル]-O-[3-ヨード-4-(スルホキシ)フェニル]-L-チロシン（式V）である
【化８】
0005833222.tif 000012
式V
【００５３】
その合成の反応式はFigure 2に示される。方法は以下のとおりに概述することができる：DTPA二無水物は適切な有機溶媒に溶解するおよそ等モル量の水を加えることにより部分的に加水分解した後、適切な有機または無機塩基の存在下にて主にDTPA一無水物からなる生成物をT3Sと反応させる。溶媒留去後、油性残基を水で希釈する。得られた沈殿物を集め、水で洗浄し、水／アセトン混合物に溶解する。この粗反応生成物を水／アセトンの混合物または勾配で発展させたAmberlite XAD1600または同様の樹脂のカラムで精製する。フラクションを含む生成物を集め、溶媒を留去して乾燥し、所望のDTPA-T3Sモノアミドを得る。
等量のランタニド塩をモノアミド水溶液に加え、pHを適切な塩基（例えばNaOH）で7に調節することにより既知の手順に従いランタニド錯体を得る。場合により、ランタニド・キレート生成物を樹脂カラム（例えばAmberlite XAD1600）に吸着させ、水／溶媒混合物で溶出することにより脱塩することができる。
【００５４】
またこの場合、先行技術アッセイに対し明らかな利点を示す放射性同位体の使用を避けながら、既知のRIA試験（Chopra et al., ibidem参照）と同等の感受性を得る。
上記教示から、当業者は本発明になお含まれるELISAの代替フォーマットを構想することができる。例えば、標的ホルモンT3Sは、プレートおよび抗体に共有結合し、適宜トレーサー酵素に連結しまたはトレーサー酵素に連結した抗体と組み合わせて用いて、未知のサンプルにおけるT3Sレベルを競争的に測定するために用いることができる。さらなる態様によれば、トレーサーは、当業者に知られている手順に従い検出可能な酵素（例えばアルカリ性ホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）に直接結合した抗原自体（T3S）であり、すぐに使えるコンジュゲーション・キットにても入手可能である。
【００５５】
さらなる態様によれば、本発明は血中T3S投与および投薬のためのキットを含み、該キットは、好ましくは上記錠剤形態である、上記非放射性アッセイによるT3S免疫検出用投薬キットならびにT3SまたはT3SおよびT4組成物の多くの日用量（すなわち毎週、隔週、毎月または隔月の必要性）を有する投与／治療キットを含む。
T3S非放射性免疫検出用投薬キットは、第一の好ましい態様によれば、好ましくはコンジュゲートがT3S-ビオチンであり、アビジン誘導体検出可能部分がすなわちストレプトアビジンである、ポリクローナル抗体、アビジン結合T3S誘導体を含んでもよい。より好ましくは、アビジン誘導体はストレプトアビジンであり、検出可能部分は、好ましくはHRPである、酵素化学発光部分（アルカリ性ホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を含む。
【００５６】
ランタニド蛍光イムノアッセイ由来態様によれば、キットは、ランタニド金属キレート錯体T3S誘導体などの具体的にそのような検出のために開発された試薬を抗体とともに含んでもよく、金属はサマリウム、テルビウム、ジスプロシウムおよびユーロピウムからなる群から選択される。特に好ましくは、ユーロピウムキレート3,5-ジヨード-N-[[(カルボキシメチル)[2-[(カルボキシメチル)[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル]アミノ]エチル]アミノ]アセチル]-O-[3-ヨード-4-(スルホキシ)フェニル]-L-チロシン（式V化合物）である。
【００５７】
キットはまた、検量線の調製のためのT3S標準を含んでもよい。標準は、正確な濃度の溶液として、または適切な溶媒における可溶化のために予め希釈し、準備してもよい。キットはまた、希釈剤、染料分子、緩衝液、保存剤、抗T3S抗体、使用説明書からなる群から選択される他の試薬を含んでもよい。
【００５８】
本発明は、説明のみである以下の実施例により記載されており、これは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例1.  DMAC中のT3Sの製造
すべての原料の量をT3 100 gに対して示す。
3,5-ジヨード-O-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)-L-チロシン（100 g; 0.154 mol）を窒素雰囲気下DMAC（2.0 L）に懸濁させ、固体析出を避けるために激しく攪拌した。-5℃まで冷却した後、-5÷5℃の温度を保ちながら、CSA（142.2 g; 1.229 mol）を40分かけて滴加した。添加の終わりに、冷却を止め、反応混合物を約4時間攪拌下に放置した。反応混合物を重炭酸ナトリウムの攪拌水溶液（335.5 g; 水中3.994 mol, 4.5 L）に1.5時間かけて滴加した。添加の終わりに、時間が経つにつれてこのように得られた溶液から無機塩の混合物として結晶固体の沈殿が観察された。そのような固体をろ別した後、得られた溶液を、極性を減少させながら水／アセトン混合物で溶出することによりAmberliteTM XADTM1600で精製し、溶出液をフラクションに集めた。適当な純度レベルを有する生成物を含むフラクションを減圧下、10 g/kgの濃度まで溶媒留去した。該懸濁液のpHをHCl 1Nで6.2に調節した。懸濁液をさらに約1:3の固体および残留水の比まで濃縮した。そのような残渣を冷却下アセトンで 2時間処理した後、ろ別し、アセトンで洗浄した。生成物を減圧下40℃にて乾燥した。T3S 74 gを白色固体として得た。無水塩基の収率：62％。
【００６０】
実施例2.  T2（Levoditi）からのT3Sの製造
反応式を以下に示す：
【化９】
0005833222.tif 000013
すべての原料の量をLevoditi 1 kgに対して示す。
ヨウ素（およそ0.48 kg, 源: SQM）、NaI（およそ0.65 kg, 源: Ajay - SQM）および水を反応器中18-22℃で充填し、完全な溶解まで攪拌した。得られたヨウ素化混合物を、使用まで室温にて攪拌下維持した。
Chalmers, J. R. et al. A. J. Chem. Soc. 1949, 3424-3433）に記載の方法によりL-チロシンから得られたLevoditi、NaI（およそ0.32 kg）および水を別の反応容器に充填し、70％モノエチルアミンを加えた。
ヨウ素化混合物を反応混合物に加えた。
得られた懸濁液を少なくとも6時間18-22℃にて攪拌した後、0℃まで1時間かけて冷却し、3-4時間攪拌し、ろ過した。ケーキを水で洗浄した。
湿固体を水に懸濁し、酢酸を混合物に加え攪拌した。懸濁液をろ過し、ケーキを水で洗浄した。
湿固体を攪拌した水に再懸濁させ、ろ過し、水で洗浄した。
次いでケーキをDMAC（およそ12.15 kg）に懸濁させ、懸濁液を減圧下蒸溜し無水化した。
懸濁液を5-10℃まで冷却し、窒素雰囲気下、CSA（およそ1.54 kg）をゆっくり加え、温度を15℃以下に維持した。
溶液を18-22℃まで1時間加熱し、もう1時間維持した後、30℃の温度を維持しながら、予め調製した水（およそ29.02 kg）中のNa2CO3（およそ2.27 kg）溶液を含む反応器に加えた。
溶液を、95:5から開始して70:30まで極性を減少させながら、水（87.5 L）および水／アセトン混合物（125 L）の溶出によりAmberlite XAD 1600（12.5 L）のカラムで精製した。高HPLC純度のフラクションを集め、所望の成分に達するまで減圧蒸留した（およそ0.04 kg T3S／懸濁液 L）。
懸濁液を40℃まで冷却し、エタノール（およそ5.22 kg）を加え、溶液を得た。
混合物を0℃まで2時間かけて冷却し、析出させ、もう1時間攪拌した後、ろ過した。ケーキをエタノール／水混合物で室温にて洗浄した。
湿固体をおよそ40℃にて減圧乾燥した。
純粋T3-硫酸ナトリウム塩（HPLC面積％＞99％）0.98 kgを白色固体として得た。
T2からの総収率（無水物ベース）：68.5％。
【００６１】
実施例3.  T3S錠剤の製造
有効成分を、異なる量のレボチロキシンとも組み合わせて、50％の含量の微結晶性セルロースと１５分間予め混合した。
この予め混合した混合物に、残り50％の微結晶性セルロースと一緒に、次の成分をこの順番で加え：ジベヘン酸グリセロール、コロイド状含水シリカ、クロスカルメロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよび炭酸カルシウム（0.6 mmのきれいな軽／メッシュシーブを通して先に篩にかける）、さらに20分間混合した。
混合物中の有効成分の分布の均一性を混合物の６箇所からのサンプリングにより確認した；有効成分（または複数の有効成分）は、レボチロキシンとの製剤化の場合にも、混合物中にて均一に分布することが示された。
次いで粉末混合物を、丸平パンチを供えた回転錠剤プレスを用いて圧縮し、錠剤をもろさ、崩壊時間および有効成分分布についての試験に提出した。
混合および圧縮工程にて行われるテキストの結果により、25〜200μgからなるT3S用量について、双方の再現性を確認した。さらに、そのように得られた錠剤が公式の欧州薬局方（VI版）により提供された要件に合うパラメータを有することが示された。
錠剤組成
【表４】
0005833222.tif 000014
上記のように製造した錠剤を甲状腺切除個体における臨床試験第I相に用い、甲状腺ホルモン置換療法（US 2011/0245342を参照）として用いることができることが示された。
実際、T3Sは吸収される（胃腸壁を横断して）ことが示され、経口投与後の血中にて見つかり、用量関連様にて臨床的に活性なT3に変換された。血中T3レベルは単回用量投与後48時間でもまだ検出可能であった。
【００６２】
実施例4.  化学発光検出を用いたイムノアッセイによるT3Sの定量化
T3Sビオチン誘導体の合成
簡潔に、T3Sビオチン誘導体を以下のように合成した：N-ヒドロキシスクシンイミジル d-ビオチン-15-アミド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデシレートA（50 mg; 0.0849 mmol）をDMAC（2 mL）に可溶化し、反応混合物を0℃にて連続的に攪拌しながら、これにDIPEA（14.5 uL; 0.0866 mmol）を加えた。次いで、T3S（68.4 mg; 0.0908 mmol、Mol & Visser, Endocrinology 1985, 117:1-7に記載されているように製造した）を加え、数分後、懸濁物を放置して室温まで上昇させ、透明な溶液を得た。2時間攪拌した後、同温にて終夜保った。DMACを減圧下留去し（10 mbar; 40℃）、無色油状物を得た。そのように得られた粗生成物をH2Oに溶解し、分取用（Semi-preparative）HPLCにより精製した。生成物を含むフラクションを集め、濃縮し、最後に凍結乾燥してT3S-ビオチンを白色固体として得た（59.6 mg; 0.0495 mmol）。収率58％。
多クローン性抗T3S抗血清をChopra et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194に記載のようにウサギにて得た。
アッセイは、白色96ウェルプレートにてT3Sの量を増大させて抗体結合についてビオチンでコンジュゲートした一定量のT3Sと競合させた競合ELISAに基づいた。シグナル向上のための技術として発光と組み合わせたビオチン-アビジン相互作用の使用によりシグナル増幅が可能となり、Chopra et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194に記載されたRIA試験に相当する感受性を可能にした。
T3Sの標準溶液を以下の濃度にて調製した：希釈緩衝液中1000, 200, 40, 8, 1.6 pg/mL: PBS, 0.05％ Tween, 0.3％ BSA。
トレーサー溶液（T3S-ビオチン, 180.6μM）を上記希釈緩衝液中にて調製した。抗体溶液：T3Sウサギ抗血清を希釈緩衝液にて1:50000に希釈プラス8 mM ANS（1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート）, 1.2 mg/mLサリチル酸ナトリウム。
リン酸緩衝液pH 7.8に希釈した2μg/mL抗ウサギIgG 100μL／ウェルで4℃にて96ウェル白色プレートを終夜コーティングした。同時に、ビオチン標識T3Sの標準溶液を、表Aに記載されるように、希釈抗血清およびT3S-ビオチン溶液で集めた。集めたサンプルを室温にて暗闇の中、終夜インキュベーションした。
後日、プレートを洗浄緩衝液（PBS中0.05％ Tween 20）で４回洗浄した後、室温にて１時間ブロッキング緩衝液（洗浄緩衝液中2％ BSA）にてインキュベーションした。
その後、プレートを洗浄緩衝液で４回すすぎ、100μL／ウェルの混合サンプルを三回に分けて加え、プレートを室温にて３時間インキュベーションした。
次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回すすぎ、ストレプトアビジンポリ-HRP（RASA中10 ng/mL, 100μL/ウェル）で室温にて１時間インキュベーションした。
さらに６回洗浄した後、プレートをスーパーシグナルELISAフェムト最大感受性基質（100μL/ウェル）で暗闇の中5分間インキュベーションし、放射光をカウント／秒（CPS）として発光プレートリーダーで読み取った。
表A：検量線作成
【表５】
0005833222.tif 000015
検量線を1.6〜1000 pg/mLの範囲で試験項目の５つの濃度を用いて緩衝液にて作成した。曲線をFig. 1, パネルa)に示す。
【００６３】
実施例5.  ランタニド蛍光イムノアッセイによるT3Sの定量
式V化合物の製造：
[[3,5-ジヨード-N-[[(カルボキシメチル)[2-[(カルボキシメチル)[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル]アミノ]エチル]アミノ]アセチル]-O-[3-ヨード-4-(スルホキシ)フェニル]-L-チロシネート(6-)]ユーロペート(3-)]三ナトリウム（式V）
【化１０】
0005833222.tif 000016
Eu-DTPA-T3Sモノアミドの合成
3,5-ジヨード-N-[[(カルボキシメチル)[2-[(カルボキシメチル)[2-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル]アミノ]エチル]アミノ]アセチル]-O-[3-ヨード-4-(スルホキシ)フェニル]-L-チロシン（DTPA-T3Sモノアミド）の合成の反応式はFigure 2に示す。
H2O（0.282 ml; 15.64 mmol）のDMAC（43 mL）溶液をN,N-ビス[2-(2,6-ジオキシルエノールオレンジ-4-モルホリニル)エチル]グリシンA（4.27 g; 11.94 mmol）のDMAC（85 mL）懸濁液に室温にて添加した。添加の終わりに、混合物を80℃まで加熱した。4.5時間後、反応混合物を25℃まで冷却し、T3S/1（3 g; 3.98 mmol）およびDIPEA（2.71 mL; 15.92 mmol）のDMAC（85 mL）溶液を20分かけて添加した。DMACを減圧留去した（10 mbar; 40℃）。油状残渣をH2O（200 mL）で希釈し、黄色みがかった固体の析出物を得、これをろ過し、H2Oで洗浄し、乾燥した。そのように得られた粗製物をアセトン／H2O 20:80（v/v）に溶解し、溶液（pH = 2,97）をAmberlite（登録商標）XAD-1600樹脂カラム（200 mL; 直径6 cm）に充填し、アセトン／H2O勾配で溶出した。同様の組成を有する生成物を含むフラクションを集め、溶媒留去し、リガンドDTPA-T3Sを固体として得た（1.27 g; 1.15 mmol）。収率26％。
塩化ユーロピウム６水和物（0.17 g, 0.46 mmol）をリガンドDTPA-T3S（0.51 g; 0.46 mmol）のH2O（50 mL）溶液に少しずつ20℃（pH 2.93）にて加え；各添加後、溶解が完了するまで懸濁液を攪拌した。錯体化が完了するとすぐに、pHを0.1 N NaOHで7に調節し、溶液をAmberlite（登録商標）XAD-1600樹脂（100 mL; 直径3 cm）のカラムから水／アセトンで溶出することにより脱塩した。所望の生成物を含み、塩を含まないフラクションを集め、溶媒留去し、式IVの化合物（0.37 g, 0.28 mmol）を黄色固体として得た。収率：61％。
イムノアッセイ法をHemmila I et al. Anal Biochem. 1984 Mar;137(2): 335-43に従い、設計した。用いた溶液は、以下の点を除き、実施例4に記載したとおりであった：DELFIA（登録商標）Wash（Perkin Elmer）を上記洗浄緩衝液の代わりに用いた。トレーサー・ストック溶液はユーロピウム100μMを含み、これを+4℃にて保存し、光から保護した。使用直前に、アッセイ緩衝液中、1:300000に希釈し、440 pg/mLの最終濃度を得た。
アッセイはDELFIA（登録商標）黄色プレート（Perkin Elmer）にて行った。
混合サンプルで３時間のインキュベーション後、式V希釈化合物溶液をすべてのウェルに加えた（50μL／ウェル）。次いで、プレートをプラスチック粘着シートで封印し、37℃にて１時間攪拌下インキュベーションした。
３回洗浄した後、プレートを吸収紙上でタップして乾燥し、Delfia増強溶液（Perkin Elmer）を加えた（200μL）。25℃にて１時間後、「ユーロピウム」製造業者プロトコルによりVictor3装置にてプレートを読み取った。
30〜2000 pg/mLの範囲にて９つの濃度の試験項目を用いて、検量線を作成した。曲線はFig. 1, パネルb)に示す。
【００６４】
実施例6.  HRP-T3Sモノアミドの合成
活性化HRPを含む市販キット（例えばHOOKTMHRP PLUS標識キット-G-バイオサイエンス）を直接用いてコンジュゲートを製造した。1-2 mgのT3Sを供給された炭酸緩衝液1 mLに溶解した後、この溶液を凍結乾燥活性化HRPを含むバイアルに分け、活性化酵素を再構成するために繰り返しピペッティングすることにより穏やかに混合した。室温にて約１時間後、20μLの供給シアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）溶液を加えた後、室温にて約15分間反応させた。最後に、50μLのクエンチ緩衝液を加えた後、15分間穏やかに回転または振盪しながらインキュベーションした。最終コンジュゲートを脱塩し、透析またはカラム脱塩によりPBS中にて緩衝液交換した。
T3S-HRPコンジュゲートの適当な希釈を行い、実施例4に記載のように一段階ELISAにてトレーサーとして用い、ストレプトアビジン-HRPインキュベーション工程を省略した。
【化１１】
0005833222.tif 000017
【００６５】
比較例：DMF中でのT3S合成および溶出試験
【化１２】
0005833222.tif 000018
上記反応式に従い、反応をDMF中で行った。
簡潔に：T3（40 mg）をアンモニア性エタノール中に溶解した。
この溶液を窒素流下、留去した。
残渣に、クロロスルホン酸（99％クロロスルホン酸2.5 mLおよびN,N-DMF 8 mlを混合することにより得た）の熱溶液2 mlを加えた。次に、混合物を攪拌しながら室温にし、反応を終夜継続した。
混合物を水（5 mL）で希釈した後、Sephadex LH-20カラム（5 mL）で溶出し、フラクションAを得た。溶出を0.1 N HCl（5 mL）で続け、フラクションBを得た。
これらのフラクションをカラムに再充填し、0.1 N HCl（およそ4 mL）、水および無水エタノールの連続溶出により精製した。
しかし、５組の異なる水および無水エタノール量を精製に用いた。これらの５つの条件により得られるT3S収率および純度をTable Bに概述した。
【００６６】
表B：精製試験
【表６】
0005833222.tif 000019
表Bは、合成を上記条件下にて行い、DMFを溶媒として用いた場合、高変換を達成することができたが、総収率はかなり低いことを示す。
さらなる態様によれば、本発明は、以下の態様を開示する：
項１：以下の反応：
【化１３】
0005833222.tif 000020
[式中、Mはアルカリ金属であり、好ましくはNaである]
により式II（T3S）を有する甲状腺ホルモンの硫酸化形態を製造する方法であって、以下の工程：
a）ジメチルアセトアミド（DMAC）の存在下、式Iの化合物のクロロスルホン酸（CSA）による硫酸化工程；
b）アルカリ金属無機塩の水溶液中にて塩化して、式IIの化合物を得る工程
を含む、方法。
項２：無機塩がナトリウム塩である、項１記載の方法。
項３：CSAおよび式Iの化合物のモル比が4〜10、好ましくは7〜9である、項１〜２のいずれか記載の方法。
項４：工程a）において、DMAC中の式Iの化合物の濃度がDMACの0.060〜0.090 mol/Lである、項１〜３のいずれか記載の方法。
項５：工程a）中の硫酸化反応が10℃以下、好ましくは-10℃〜8℃の温度にて行われる、項１〜４のいずれか記載の方法。
項６：工程a）における硫酸化が少なくとも２時間行われる、項５記載の方法。
項７：工程b）における塩化がNaHCO3の水溶液中にて行われる、項１〜６のいずれか記載の方法。
項８：さらに、ポリマー吸着固相でのクロマトグラフィーにより、水および有機溶媒の極性逓減混合物で溶出して式IIの化合物を精製する工程c）を含み、適宜工程c）に先行してろ過工程がなされる、項１〜７のいずれか記載の方法。
項９：極性逓減混合物が1.0:0〜0.7:0.3の比における水および極性溶媒の混合物である、項８記載の方法。
項１０：溶出後、溶液が少なくとも式IIの化合物 10g/kgまで濃縮され、5.5〜6.5のpH値となる、項８〜９のいずれか記載の方法。
項１１：式IIの化合物が有機極性溶媒による処置の後、固体として得られる、項８〜１０のいずれか記載の方法。
項１２：極性有機溶媒がアセトン、エタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルから選択される、項１１記載の方法。
項１３：固体形態における式IIの化合物がさらに微粉化される、項１１〜１２のいずれか記載の方法。
項１４：さらに、セルロースまたはその誘導体、カオリン、デンプン、および炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムから選択される無機アルカリ塩からなる群から選択される少なくとも一つの希釈剤とともに、適宜レボチロキシン（T4）と組み合わせて、式IIの化合物の固体および／または微粉化形態を混合する、項１１〜１３のいずれか記載の方法。
項１５：希釈剤が微結晶性セルロースであり、式IIの化合物および希釈剤の混合物をさらにジベヘン酸グリセロール、第三リン酸カルシウム、タルク、デンプンおよびその誘導体からなる群から選択される少なくとも一つの流動促進剤、クロスカルメロースまたはその誘導体、クロスポビドン、ポリメチルアクリレート、マルトデキストリン、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも一つの崩壊剤、および適宜ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、コロイド状含水シリカおよびコロイド状二酸化ケイ素からなる群から選択される平滑剤と混合し、次いで混合物の直接圧縮により錠剤に製剤化する、項１４記載の方法。
項１６：３’，５  ジヨードサイロニン（T2）をヨウ素化剤、好ましくはI2/NaIを含む混合物で、水性媒体中、脂肪族アミンの存在下にてヨウ素化することにより式Iの試薬を得る、項１〜１５のいずれか記載の方法。
項１７：T3Sを有効成分として1〜1000μgの量にて含み、適宜T4と組み合わせて、以下の成分：炭酸カルシウム、ジベヘン酸グリセロール、クロスカルメロースナトリウム塩、コロイド状含水シリカ、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロースと一緒に含む、医薬組成物。
項１８：T3Sが2.5〜500μg、より好ましくは5〜250μgの量である、項１７記載の組成物。
項１９：T3SおよびT4を有効成分として含み、T3Sが2.5〜500μgおよびT4が1〜800μg、T3Sが5〜250μgおよびT4が5〜400μg、T3Sが10〜100μgおよびT4が10〜200μgの量である、項１７〜１８のいずれか記載の組成物。
項２０：非放射性T3Sコンジュゲートを含む、T3S検出および定量のための非放射性イムノアッセイ。
項２１：非放射性T3Sコンジュゲートが式A：
【化１４】
0005833222.tif 000021
[式中、Rは：
a）蛍光基からなる群から選択される検出可能部分、
b）西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼからなる群から選択される酵素、
c）適宜検出可能部分に連結したアビジン結合誘導体、
d）ランタニドキレート剤
からなる群から選択される]
を有する、項２０記載の非放射性イムノアッセイ。
項２２：非放射性コンジュゲートが式A'のT3S-ビオチンまたはT3S-HRPである、項２１記載のイムノアッセイ。
【化１５】
0005833222.tif 000022
式A'
項２３：イムノアッセイが競合ELISAである、項２０〜２２記載のイムノアッセイ。
項２４：ランタニド蛍光検出系を含む、項２１記載のイムノアッセイ。
項２５：式Aの非放射性T3Sコンジュゲートが式IVの化合物であり、ランタニドキレート剤である、項２４記載のイムノアッセイ。
【化１６】
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式IV
項２６：キレートランタニド金属がサマリウム、テルビウム、ジスプロシウムおよびユーロピウムからなる群から選択される、項２１，２３〜２５のいずれか記載のイムノアッセイ。
項２７：式Vのユーロピウムキレートを含む、項２６記載のイムノアッセイ。
【化１７】
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項２８：項２１〜２７のいずれかに規定される式Aの非放射性T3Sコンジュゲートを含む容器、ならびにT3S検量線作成のための試薬および適宜希釈剤、染料分子、緩衝液、保存剤、抗T3S抗体、使用説明書からなる群から選択される試薬またはその組合せを含む容器を含む、キット。
【図１】
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【図２】
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