(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３菌株（ブダペスト条約に基づく国際寄託である受託番号：ＫＣＴＣ １２１７８ＢＰ）から分離された化学式１または化学式２の環状ペプチド：
【化１】
0005756227.tif 000027
【請求項２】
有効成分として化学式１および／または化学式２の化合物を含む、マイコバクテリア関連疾患の予防または治療のための薬学組成物：
【化２】
0005756227.tif 000028
【請求項３】
前記マイコバクテリア関連疾患が結核である、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項４】
前記結核がＭＤＲ結核またはＸＤＲ結核である、請求項３に記載の薬学組成物。
【請求項５】
薬学組成物における前記組成物が１種以上の抗マイコバクテリア剤をさらに含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の薬学組成物。
【請求項６】
前記抗マイコバクテリア剤は、第１線経口抗結核剤、注射用抗結核剤、フルオロキノロン、第２線経口抗結核剤、その他の抗結核剤、および結核に対する現在臨床試験中の化合物よりなる群から選ばれ、前記第１線経口抗結核剤はイソニアジド、リファンピシン、エタンブトールおよびピラジンアミドを含む群から選ばれ、前記注射用抗結核剤はストレプトマイシン、アミカシン、カプレオマイシンおよびカナマイシンを含む群から選ばれ、前記フルオロキノロンはシプロフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシンおよびモキシフロキサシンを含む群から選ばれ、前記第２線経口抗結核剤はリファブチン、プロチオンアミド、エチオナミド、サイクロセリン、ＰＡＳおよびチオアセタゾンを含む群から選ばれ、前記その他の抗結核剤はリネゾリド、クロファジミン、アモキシリン／クラブラン酸、クラリスロマイシン、およびジアミノジフェニルスルホンの誘導体を含む群から選ばれ、前記結核に対する現在臨床試験中の化合物はベダキリン、ＰＡ−８２４、ダラマニド、ＳＱ−１０９、ステゾリド、リファペンチンおよび臨床前開発中の化合物、特にＡＺＤ５８４７、ＢＴＺ０４３、ＴＢＡ−３５４、ＣＰＺＥＮ−４５、ＳＱ−６４１、ＳＱ−６０９、ＤＣ−１５９ａ、Ｑ２０１、ＴＨＰＰ、クロファジミンのリミノフェナジン類似体およびホウ素含有ＬｅｕＲＳ抑制剤を含む群から選ばれる、請求項４に記載の薬学組成物。
【請求項７】
前記一般化学式１または２の化合物と少なくとも１種の追加の化合物が同時、順次または別途の投与のために調整される、請求項５または６に記載の薬学組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の化学式１または化学式２の抗結核環状ペプチドの製造のためのプロセスにおいて、液体培養培地で好気的条件の下に抗マイコバクテリアペプチドを生産する前記ノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３菌株（ブダペスト条約に基づく国際寄託である受託番号：ＫＣＴＣ １２１７８ＢＰ）の微生物を培養する段階と、菌糸から請求項１に記載の抗結核環状ペプチドを分離する段階とを含む、抗結核環状ペプチドの製造プロセス。
【請求項９】
前記抗結核環状ペプチドを分離する段階が、溶離液としてクロロホルムとメタノールを用いてノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３菌（ブダペスト条約に基づく国際寄託である受託番号：ＫＣＴＣ １２１７８ＢＰ）糸のメタノール抽出物の真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ、Ｖａｃｕｕｍ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行う段階と、溶離液からメタノールを用いてセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０オープンカラムクロマトグラフィーを行う段階と、溶媒としてＨＥＭＷａｔ＋２を用いて高速向流クロマトグラフィー（ＨＳＣＣＣ：Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｃｏｕｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行う段階とを含む、請求項８に記載の抗結核環状ペプチドの製造プロセス。
【請求項１０】
前記抗結核環状ペプチドを分離する段階が、溶媒としてメタノールを用いてノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３菌（ブダペスト条約に基づく国際寄託である受託番号：ＫＣＴＣ １２１７８ＢＰ）糸を抽出する段階と、液体メタノールを作るために前記メタノールの３０％まで水を添加する段階と、ヘキサンを用いて前記メタノール抽出物を脱脂する段階と、液体層を分離し、６５％まで液体メタノールを調整する段階と、クロロホルムを用いて液体層を抽出する段階と、メタノールを用いて前記クロロホルム抽出物を濃縮し、溶解する段階と、溶離液としてメタノールを用いてセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーを行う段階と、逆相ゲル（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｇｅｌ）（ＲＰ−１８）で充填されたカラムを備えた 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行う段階とを含む、請求項８に記載の抗結核環状ペプチドの製造プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１１年４月１８日付で出願された米国仮出願番号ＵＳ６１／４７６，４７３、２０１１年７月２９日付で出願されたＵＳ６１／５１３，４０３、２０１１年１１月３日付で出願されたＵＳ６１／５５５，２５７、および２０１２年３月７日付で出願されたＵＳ６１／６０７，９３４の利益を主張し、それらの内容は参照としてここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、複製／非複製結核菌、および多剤耐性（ＭＤＲ、ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）および広範囲な薬剤耐性（ＸＤＲ、ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）結核を含む多様な薬剤耐性結核菌株（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ）に対抗して高い活性を有する新規な抗マイコバクテリアペプチド（ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）に関する。また、本発明は、結核の予防および／または治療のために、前記抗マイコバクテリアペプチド、その生産プロセス、および本発明の抗マイコバクテリアペプチドを含むそれらの薬学組成物を製造するためのノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３の菌株培養のための発酵プロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
結核菌は、ヒトと他の哺乳動物に結核（ＴＢ）疾病を引き起こす大きくて複雑なバクテリアである。結核は、ヒトの呼吸経路によってヒトに伝播される非常に伝染性の高い疾病である。
ＭＤＲ−ＴＢ保菌者３０万名およびＨＩＶ保菌者のうちの１００万件のケースを含んで２００９年に９４０万件の新しい結核事例があった（非特許文献１：WHO Actions For Life - Towards a world free of tuberculosis; World Health Organization: Geneva, Switzerland, 2006）。ＭＤＲ−ＴＢ（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、多剤耐性結核）は、少なくとも６ヶ月以上、２年間にわたる治療期間が必要である。ＸＤＲ−ＴＢ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の世界的な出現はＭＤＲ Ｍ．結核菌株（ｍｉｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ）の６．６％であると推定される（非特許文献１：WHO Actions For Life - Towards a world free of tuberculosis; World Health Organization: Geneva, Switzerland, 2006）。
【０００４】
本伝染病に対する鋭利な認識にも拘らず、ＭＤＲ−だけでなくＸＤＲ−ＴＢの流行は増加し続ける趨勢にある（非特許文献２：WHO Anti-tuberculosis drug resistance in the world- Report #4. 2008）。ＭＤＲおよびＸＤＲ結核菌株（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ）の急速な出現は、現在の化学療法では治療が難しいか、事実上治療不可能である。これらの菌株は、特にＨＩＶ／ＡＩＤの出現が増加している国家および開発途上国で主要世界保健脅威をもたらす（非特許文献３：Koenig, R. Drug-resistant tuberculosis. In South Africa, XDR TB and HIV prove a deadly combination. Science 2008, 319, 894-897）。
【０００５】
ＬＴＢＩ（ｌａｔｅｎｔ ＴＢ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、潜伏結核感染）に感染した人々の大部分は、症状を起こす原因菌（ｂａｃｉｌｌｉ）を含んでおり、他人を感染させる危険を持っていない。明らかな薬剤または疾病による免疫抑制（ｏｂｖｉｏｕｓ ｄｒｕｇ ｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏ）を除いて、ＬＴＢＩが活性ＴＢ疾患（ａｃｔｉｖｅ ＴＢ ｄｉｓｅａｓｅ）に進行するように触発させることが何であるか殆ど知られていないが、ＴＢが免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）を回避することができれば、それは活性ＴＢ疾患に進行したと見なされる。栄養失調および／または免疫力低下（ｉｍｍｕｎｅ−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）の児童および成人に疾病進行の危険が増加する。２００８年にＴＢで犠牲された１８２万名のうちの５０万名はＨＩＶ感染者であり、ＴＢはＨＩＶ感染者の主な死亡要因となった（非特許文献４：World Health Organization. Global tuberculosis control: a short update to the 2009 report. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 2009）。
したがって、できる限り新しい作用メカニズムを有する新規な抗結核薬物（ａｎｔｉ−ＴＢ ｄｒｕｇｓ）の開発が至急求められる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】WHO Actions For Life - Towards a world free of tuberculosis; World Health Organization: Geneva, Switzerland, 2006
【非特許文献２】WHO Anti-tuberculosis drug resistance in the world- Report #4. 2008
【非特許文献３】Koenig, R. Drug-resistant tuberculosis. In South Africa, XDR TB and HIV prove a deadly combination. Science 2008, 319, 894-897
【非特許文献４】World Health Organization. Global tuberculosis control: a short update to the 2009 report. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、複製／非複製Ｍ．結核（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ／ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および多様な薬剤耐性Ｍ．結核菌株に対抗して作用する新規な抗結核ペプチド（ａｎｔｉ−ＴＢ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を提供することにある。
本発明の他の目的は、抗結核ペプチドの生産プロセスおよび各種マイコバクテリア感染（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の予防および／または治療のための薬学組成物における抗結核ペプチドの用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を達成するために、本発明は、ノノムラエ種ＭＪＭ５１２３菌株（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ． ＭＪＭ５１２３ ｓｔｒａｉｎ）から分離された環状ペプチド（ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を提供する。本発明の好適な実施例において、本発明の環状ペプチドは下記化学式１または化学式２を有することができる。
【０００９】
【化１】
0005756227.tif 000002
【００１０】
また、本発明は、マイコバクテリア菌種（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）関連疾患の予防および／または治療に効果的な薬学組成物を提供する。本発明の好適な実施例において、本発明の薬学的組成物は、ノノムラエ種ＭＪＭ５１２３菌株（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ  ｓｐ．  ＭＪＭ５１２３  ｓｔｒａｉｎ）から分離された新規な抗結核環状ペプチド（ａｎｔｉ−ＴＢ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）と、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）による感染を治療するために薬学的に許容される担体（ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）を含む。本発明者は、ノノムラエ種ＭＪＭ５１２３菌株（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．  ＭＪＭ５１２３ｓｔｒａｉｎ）を２０１２年４月３日に韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）のＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）にブダペスト条約に基づく国際寄託として寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １２１７８ＢＰ）。
【００１１】
以下、本発明について詳細に記述する。
本発明は、マイコバクテリア菌種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、好ましくはノノムラエ種ＭＪＭ５１２３菌株から分離された環状ペプチドを提供する。本発明の好適な実施例において、本発明の環状ペプチドは化学式１または化学式２を有する。好ましくは、本発明の環状ペプチドはノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３菌株から次の手続きによって分離できる。
【００１２】
放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）−新規な抗結核抗生剤（Ａｎｔｉ−ＴＢ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）に対するソース（ｓｏｕｒｃｅ）
放線菌は、非常に多様な２次代謝産物を生産すると知られている、何処にでもある土壌生物である。多様な細菌性感染の治療に用いられる幾つかの抗生剤は、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、セファロスポリン（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ）、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、エリスロマシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファンピン（ｒｉｆａｍｐｉｎ）およびダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含む放線菌に由来する。今日の結核治療に用いられる３種の薬物（リファンピン（ｒｉｆａｍｐｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、サイクロセリン（ｃｙｃｌｏｓｅｒｉｎｅ）は、寒天拡散分析（ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）を用いて放線菌から発見されたが、このようなスクリーン（ｓｃｒｅｅｎｓ）は最初に結核（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を用いて行われたのではない。これは結核（ＴＢ）の伝染性、およびたまに（当時の）致命的な結果に起因した。今、Ｍ．結核抗生剤が種々の抗菌剤に特異的に影響を受けやすい（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）と理解するため、直接このような病原体に対抗して発酵培養液（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈｓ）をスクリーニングすることについての過去の失敗は多くの潜在的に有用な化合物群が検出されない結果をもたらしたと仮定しなければならない。よって、Ｍ．結核の悪性菌株に対抗して直接スクリーニングすることにより、このようなＴＢ薬物発見プログラムを開始した。
【００１３】
ハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
純粋な化合物または抽出物のハイスループットスクリーニングについての技術は、ＩＴＲ（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で確立された。韓国明知大学校におけるＥＣＵＭ（Ｅｘｔｒａｃｔ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｓｅｆｕｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）は、韓国、中国、ネパル、フィリピン、ベトナム、南国大陸および北極圏からの７０００以上の放線菌分離菌（ｉｓｏｌａｔｅｓ）の菌株保存（ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を維持する。より異国的な地域を含ませることは希少で新規な種を分離しようとする試みであった。
各分離菌（ｉｓｏｌａｔｅ）は、最初に３つの相異なる培養培地−Ｇ．Ｓ．Ｓ（富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕｍ））、Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓおよびＧＹＣ（最少培地（ｍｉｎｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ））で２０ｍＬの培養液で発酵され、菌株別に３つの抽出物がＭＡＢＡ（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙ）でテストされ、より優先的に処理された。
【００１４】
ＭＪＭ５１２３の識別
韓国の明知大学校のＥＣＵＭに貯蔵された６万５千以上の抽出物をスクリーニングした後、新規な放線菌種、菌株ＭＪＭ５１２３からの菌糸体（ｍｙｃｅｌｉｕｍ）のメタノール抽出物が強い抗結核活動（ａｎｔｉ−ＴＢ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有することが発見された。菌株ＭＪＭ５１２３は多相分類学的接近法（ｐｏｌｙｐｈａｓｉｃ ｔｏｘｏｎｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ）によってノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）として識別された。
【００１５】
バイオアッセイによる分離（Ｂｉｏａｓｓａｙ−ｇｕｉｄｅｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）
菌株ＭＪＭ５１２３が、真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ、ｖａｃｕｕｍ−ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で初期分画（ｉｎｉｔｉａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）した後、幾つかの高速向流クロマトグラフィー（ＣＣＣ：ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ）段階で選別浄化（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）することに基づくバイオアッセイによる分離手続きのために選択された。
【００１６】
天然物（ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）のバイオ活性原理（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｒｉｖｃｉｐｌｅｓ）に対するバイオアッセイ検索は、複雑な混合物を効率よく分析（分解）することが可能な予備分析技法（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を必要とする[Hostettmann, K.; Marston, A. The search for new drugs from higher plants. Chimia 2007, 61, 322-326; Hostettmann, K.; Marston, A. Plants as a still unexploited source of new drugs. Nat Prod Com 2008, 3, 1307-1315; Hostettmann, K.; Marston, A.; Wolfender, J.-L. Strategy in the search for new lead compounds and drugs from plants. Chimia 2005, 59, 291-294]。この分野における現在の標準方法は、カラム／フラッシュ（ｃｏｌｕｍｎ／ｆｌａｓｈ）、真空および高性能液体クロマトグラフィー（ＣＣ、ＶＬＣ、ＨＰＬＣ）のように、固体固定相（ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）を使用する多様な形態の固体−液体クロマトグラフィーである。ところが、固体固定相（吸着剤）の使用に関連した幾つかの欠点があるが、これはバイオアッセイ誘導分画（ｂｉｏａｓｓａｙ−ｇｕｉｄｅｄ ｆａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）の脈絡からそれらの機能を相当制限する：非可逆的吸収（ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）は、これらの制限の一つであり、広く認識される[Lindblom, T. Irreversible absorption of diphenylamine onto a straight phase and a reverse phase HPLC-column. Symposium on Chemical Problems Connected with the Stability of Explosives, [Proceedings] 1993, 9th, 205-213; Kubo, I. Recent applications of counter-current chromatography to the isolation of bioactive natural products. J Chrom 1991, 538, 187-191; Sadek, P. C.; Carr, P. W.; Bowers, L. D.; Haddad, L. C. A radiochemical study of irreversible adsorption of proteins on reversed-phase chromatographic packing materials. Anal Biochem 1986, 153, 359-371]。したがって、ＬＣ方法は、材料の損失（限られた回復）と頻繁に関連し、さらに重要なことには、分画経路（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）によってバイオ活性の減衰と関連する。これらの制限は向流クロマトグラフィー（ＣＣＣ、ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）では存在しないが、これは分離を達成するために、２つの混ぜられない溶媒間の試料のパーティション（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）に全的に依存する液体−液体技術（ｌｉｑｕｉｄ−ｌｉｑｕｉｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）であって、それは試料物質の完全な回復（ｆｕｌｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を許容し、これにより複雑な天然物混合物の相乗効果を評価しうる可能性を提供するためである。また、それは特定の化合物群の選別分離のための理想的な方法である。このように、分離手続きは主に向流クロマトグラフィー（ＣＣＣ）に基づく。
【００１７】
菌株ＭＪＭ５１２３が、純粋な化合物Ｈ−１４とＨ−１６の２つの高い抗結核活性環状ペプチドの分離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）、構造解明（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ）、おび生物学的プロファイリング（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）のための十分なバイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）を生成するために、ＥＣＵＭで２０Ｌの発酵槽で培養、収穫および抽出された。
【００１８】
バイオ活性成分の構造解明（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）
Ｈ−１４とＨ−１６の完全な構造解明は、最高の品質と最先端の１Ｄ／２ＤＮＭＲ−およびペプチドのＸ線結晶学（Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）によって増加した高解像度ＭＳ基盤構造情報を用いて行われる。定量的ＮＭＲ（ｑＮＭＲ）は、全ての分離段階の同時選択認識および定量決定（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）のために使用された。ＱＮＭＲは、活性分離菌（ａｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ）の純度および／または量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）の決定のためにだけでなく、生物学的に活性であるが、依然として複雑な化合物の混合物／画分（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）をプロファイリングする目的のためにも最適の道具である。Ｈ−１４およびそのアミノ酸残基（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）の全般的な３Ｄ構造はＸ線結晶学（Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）によって決定された。
【００１９】
発酵プロセスの最適化
抗結核ペプチド（ａｎｔｉ−ＴＢ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の生産性向上のために、最適の発酵プロセスと費用効率的な培地（ｍｅｄｉａ）が開発された。主要発酵は６日間６００ｒｐｍの攪拌速度（ａｇｉｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ）と０．３ｖｖｍのエアレーション（ａｅｒａｔｉｏｎ）によって３４℃で行われた。 最終充填された菌糸体容積（ｆｉｎａｌ ｐａｃｋｅｄ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｖｏｌｕｍｅ）はｐＨ８．２０で８０％であり、総糖（ｔｏｔｌａ ｓｕｇａｒ）は１．８％未満であった。発酵プロセスは３７３ｍｇ／ＬのＨ−１４を産出した。
【００２０】
また、本発明は、本発明の化学式１および／または化学式２の化合物を活性成分として含むマイコバクテリア種関連疾患の予防および／または治療に効果的な薬学的組成物を提供する。好適な実施例において、マイコバクリア種関連疾患は結核である。本発明の別の好適な実施例において、結核はＭＤＲ結核またはＸＤＲ結核である。
本発明の薬学的組成物は、ノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３菌株から分離された本発明の新規な抗結核ペプチドを含む。好ましくは、本発明の薬学的組成物は薬学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）および希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）をさらに含むことができる。
【００２１】
本発明の一実施例において、本発明の環状ペプチドは、結核治療剤として単独で、或いは別の抗マイコバクテリア剤（ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ）の１種または少なくとも２種の混合組成物と組み合わせて処置される。本発明の好適な実施例において、前記抗マイコバクテリア剤としては、イソニアジド（ｉｓｏｎｉａｚｉｄ）、リファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）、エタンブトール（ｅｔｈａｍｂｕｔｏｌ）およびピラジンアミド（ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｄｅ）などの第１線経口抗結核剤（ａ １ｓｔ ｌｉｎｅ ｏｒａｌ ａｎｔｉｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｇｅｎｔ）；ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、アミカシン（ａｍｉｋａｃｉｎ）、カプレオマイシン（ｃａｐｒｅｏｍｙｃｉｎ）およびカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）などの注射用抗結核剤（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ａｎｔｉ−ＴＢ ａｇｅｎｔ）；シプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、オフロキサシン（ｏｆｌｏｘａｃｉｎ）およびモキシフロキサシン（ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ）などのフルオロキノロン（ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）；リファブチン（ｒｉｆａｂｕｔｉｎ）、プロチオンアミド（ｐｒｏｔｉｏｎａｍｉｄｅ）、エチオナミド（ｅｔｈｉｏｎａｍｉｄｅ）、サイクロセリン（ｃｙｃｌｏｓｅｒｉｎｅ）、ＰＡＳおよびチオアセタゾン（ｔｈｉｏａｃｅｔａｚｏｎｅ）などの第２線経口抗結核剤（ａ ２ｎｄ ｌｉｎｅ ｏｒａｌ ａｎｉｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｇｅｎｔ）；リネゾリド（ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、クロファジミン（ｃｌｏｆｚｉｍｉｎｅ）、アモキシリン／クラブラン酸（ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ／ｃｌａｖｕｌａｎａｔｅ）、およびジアミノジフェニルスルホンの誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｄｉａｎｏｍｉｄｉｐｈｅｎｙｌｓｕｌｐｈｏｎｅ）などのその他の抗結核剤；ベダキリン（Ｂｅｄａｑｕｉｌｉｎｅ）、ＰＡ−８２４、ダラマニド（Ｄａｌａｍａｎｉｄ）、ＳＱ−１０９、ステゾリド（Ｓｕｔｅｚｏｌｉｄ）、リファペンチン（ｒｉｆａｐｅｎｔｉｎｅ）などの結核に対する現在臨床試験中の化合物および臨床前開発（ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中の化合物、特にＡＺＤ５８４７、ＢＴＺ０４３、ＴＢＡ−３５４、ＣＰＺＥＮ−４５、ＳＱ−６４１、ＳＱ−６０９、ＤＣ−１５９ａ、Ｑ２０１、ＴＨＰＰ、クロファジミン（ｃｌｏｆａｚｉｍｉｎｅ）のリミノフェナジン類似体（ｒｉｍｉｎｏｐｈｅｎａｚｉｎｅ ａｎａｌｏｇｓ）およびホウ素含有ＬｅｕＲＳ抑制剤などの化合物を使用することができるが、常にそれに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の抗結核環状ペプチド（ａｎｔｉ−ＴＢ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、経口投与のために、例えば、粉末、顆粒、錠剤、丸薬、カプセル、溶液、懸濁液、エマルジョンおよびシロップに製剤化できる。担体、賦形剤および希釈剤はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、デキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）、エリトリトール（ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）、マルチトール（ｍａｌｔｉｔｏｌ）、澱粉（ｓｔａｒｃｈ）、アラビアゴム（ａｃａｓｉａ ｇｕｍ）、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ケイ酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、微結晶性セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、水（ｗａｔｅｒ）、ヒドロキシ安息香酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、ヒドロキシ安息香酸プロピル（ｐｒｏｐｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、タルク（ｔａｌｃ）、ステアリン酸マグネシウム（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）および鉱油（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）によって例示される。
【００２３】
経口投与のための固形製剤（ｓｏｌｉｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）には錠剤、丸薬、粉末、顆粒およびカプセルがある。このような固形製剤は、例えば澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどの少なくとも１種の適切な賦形剤と混合して製造できる。簡単な賦形剤を除いて、例えばステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ）が使用できる。
経口投与のための液状製剤は懸濁液、溶液、エマルジョンおよびシロップであり、前記言及された製剤は水や流動パラフィンなどのように一般に用いられる単純希釈剤に加えて、湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、甘味剤（ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ）、芳香剤（ａｒｏｍａｔｉｃｓ）、保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）などの多様な賦形剤を含むことができる。
【００２４】
本発明の新規な抗結核ペプチドは、静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）のために製剤化できる。静脈（ＩＶ）内の使用のために、本発明の化合物の水溶性形態は一般に用いられるいずれの静脈流体内でも溶解でき、注入によって投与できる。静脈用製剤は担体、賦形剤、またはカルシウム、ヒト血清アルブミン、クエン酸、酢酸、塩化カルシウム、炭酸およびその他の塩を制限なく含む安定剤を含むこともできる。静脈用流体は、制限なく、生理食塩水またはリンガー液を含むこともできる。また、本発明の抗結核ペプチドは注射器、カニューレ（ｃａｎｎｕｌａｅ）、カテーテル（ｃａｔｈｅｔｅｒｓ）および線（ｌｉｎｅｓ）に配置されてもよい。
【００２５】
非経口投与のための製剤は、水性または非水性等張性滅菌注射溶液または懸濁液の形でありうる。これらの溶液または懸濁液は経口投与のための製剤に使用するために言及された担体の少なくとも１種を有する滅菌粉末または顆粒から製造できる。本発明の新規な抗結核ペプチドは、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウムおよび／または多様なバッファで溶解できる。
筋肉内投与、非経口投与または静脈内投与の準備のために、抗結核ペプチドの殺菌製剤または前記化合物の適切な水溶性塩の形態、例えば塩酸塩（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｓａｌｔ）が注射用水（ＷＦＩ、Ｗａｔｅｒ−ｆｏｒ−Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、生理食塩水或いは５％ブドウ糖などの薬学的希釈剤に溶解して投与できる。
【００２６】
また、ペプチドの適切な不溶性形態は、水性塩基または薬学的に許容される油性塩基（ｏｉｌ ｂａｓｅ）、例えば、オレイン酸エチルなどの長鎖脂肪酸のエステル（ｅｓｔｅｒ ｏｆ ａ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）である塩基で懸濁液として製造、投与されてもよい。注射可能なデポー型（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｄｅｐｏｔ ｆｏｒｍｓ）はポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーで抗結核ペプチドのマイクロカプセル化マトリクスを形成することにより作られる。薬物に対するポリマーの比率と採用された特定のポリマーの性質に依存し、薬物放出速度が制御できる。生分解性ポリマーはポリオルトエステル（ｐｏｌｙ−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒｓ）とポリ無水物（ｐｏｌｙ−ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）を含む。また、デポー注射製剤（ｄｅｐｏｔ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）は身体組織と両立可能な互換できるマイクロエマルジョンに薬物をエントラップ（ｅｎｔｒａｐ）することにより製造できる。
【００２７】
目または耳に適用するために、本発明のペプチドは軟膏、クリーム、ローション、ペイントまたは粉末のように疎水性または親水性塩基に製剤化できる。
直腸投与に適用するために、本発明のペプチドはココアバター、ワックスまたはその他のグリセリド等の既存の担体と混合される坐薬として製剤化できる。
また、本発明の抗結核ペプチドは、測定された定量吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ ｉｎｈａｌｅｒｓ）および噴霧器（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒｓ）などの吸入器に使用することもできる。
【００２８】
また、本発明は、本発明の化学式１または化学式２の抗結核環状ペプチドを製造するためのプロセスを提供する。本発明のプロセスは、次の段階を含むことができる：液体培養培地で好気的条件の下に抗マイコバクテリアペプチドを生産するノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３菌株の微生物を培養する段階、および発酵された菌糸体から本発明の抗結核環状ペプチドを分離する段階。
本発明の一実施例において、前記抗結核環状ペプチドを分離するための段階は、次の段階を含むことができる：溶離液としてメタノールとクロロホルムを用いてノノムラエ種ＭＪＭ５１２３菌糸体のメタノール抽出物の真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）を行う段階、溶離液としてメタノールを用いてセファデックスＬＨ−２０オーブンカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ ｏｐｅｎ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行う段階、および溶媒としてＨＥＭＷａｔ＋２を用いて高速向流クロマトグラフィー（ＨＳＣＣＣ：Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行う段階。
【００２９】
本発明の別の実施例において、前記抗結核環状ペプチドを分離するための段階は、次の段階を含むことができる：溶媒としてメタノールを用いてノノムラエ種ＭＪＭ５１２３菌糸体を抽出する段階、液体メタノールを作るためにメタノール抽出液の３０％まで水を添加する段階、ヘキサンを用いてメタノール抽出物を脱脂する段階、液体層を分離し、６５％まで液体メタノールを調整する段階、クロロホルムを用いて前記液体層を抽出する段階、メタノールを用いて前記クロロホルム抽出物を濃縮および溶解する段階、溶離液としてメタノールを用いてセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーを行う段階、および逆相ゲル（ＲＰ−１８）で充填されたカラムを備えたＨＰＬＣを行う段階。
【発明の効果】
【００３０】
新規な抗結核環状ペプチドは、結核に対する治療剤として効果的に使用できるように、単一薬剤耐性結核菌株、ＭＤＲ（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）およびＸＤＲ−ＴＢ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む複製／非複製Ｍ．結核に対抗して強い活性、および哺乳動物細胞に対しては非常に低い細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】微生物抽出物ライブラリー構築（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）のためのプロセスを示す。
【図２】本ペプチドの抽出プロセスの概要を示す。
【図３】２８℃で２週間ＩＳＰ３培地で成長したノノムラエ種の走査電子顕微鏡写真を示す。
【図４】ノノムラエ種ＭＪＭ５１２３の全体細胞加水分解分析の結果を示す。
【図５】ノノムラエ種ＭＪＭ５１２３の極性脂質プロファイルを示す。プレートは全体脂質を検出するためのリンモリブデン酸（ｍｏｌｙｂｄａｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）（ａ）、アミノ脂質を検出するためのニンヒドリン（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）（ｂ）、リン脂質を検出するためのモリブデンブルー（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｂｌｕｅ）（ｃ）、およびグルコ脂質を検出するためのα−ナフトールスルホン酸（α−ｎａｐｈｔｈｏｌｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）（ｄ）が撒布された。
【図６】ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｘによるデータの多重整列後に構築され、ＮＣＢＩデータベースから利用可能な１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンスに基づく系統発生分析を示す［Thompson, J. D.; Gibson, T. J.; Plewniak, F.; Jeanmougin, F.; Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 1997, 25, 4876-4882］。
【図７】主要発酵において抗結核化合物の活性とバイオマスのグラフを示す（ＤＣＷ；乾燥細胞重量（ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ）、ＰＭＶ；充填菌糸体容積、活性（ｐａｃｋｅｄ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｖｏｌｕｍｅ、ａｃｔｉｖｉｔｙ）；ペーパーディスク拡散分析（ｐａｐｅｒ ｄｉｓｋ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）によってスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５に対抗する成長抑制ゾーン。
【図８】遅い蒸発方法を用いて成長したＨ−１４の結晶を示す。最も長い寸法は約０．５ｍｍであった。
【図９】Ｈ−１４の３Ｄ構造を示す。
【図１０】０．８３の解像度で選択された残留物、トリプトファン（Ｗ１０）、フェニル粗任（Ｆ１２）、トレオニン（Ｔ５）、およびイソロイシン（Ｉ３）の電子密度図を示す。
【図１１】本発明の環状Ｈ−１４ペプチドの構造的配列を示す。
【図１２】本発明の環状Ｈ−１６ペプチドの構造的配列を示す。
【図１３】図１５および図１６における特別なアミノ酸残基を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の実用的で好適な実施様態が次の実施例に示されているように例示される。
ところが、当業者は本発明の開示を考慮することにより本発明の思想と範囲内で修正および改善を加え得ることが理解できるであろう。
【００３３】
実施例１：ハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）のための微生物抽出物ライブラリーの製造
約７，０００の放線菌分離菌は、高山地域、熱帯地域、極地方、砂漠、火山などの独特な気候条件および生態系を有する地域から収集された土壌試料から分離され、韓国明知大学校のＥＣＵＭ（Ｅｘｔｒａｃｔ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｓｅｆｕｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）によって維持されている。９種の相異なる抽出物が、各抗結核候補をスクリーニングするために各分離菌から製造された。第一、それぞれの分離菌はＧ．Ｓ．Ｓ、Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓおよびＧＹＣの３０ｍＬで培養された。菌糸体および培養液が遠心分離によって分離された後、前記菌糸体はメタノールで抽出され、前記培養上清液はそれぞれ酢酸エチルと水で分割された。最後に、３種の培地で培養された各微生物分離菌から９つの有機および水溶性抽出物が真空蒸発によって濃縮乾燥し、−７０℃で急速冷凍機に保存された（図１、図２および表１）。
【００３４】
【表１】
0005756227.tif 000003
【００３５】
実施例２：大規模のスクリーニング
ＥＣＵＭの各放線菌分離菌は、最初３つの相異なる培養培地、すなわちＧ．Ｓ．Ｓ（富栄養培地）、Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓおよびＧＹＣ（最少培地）で２０ｍＬの培養液で発酵された。前記菌糸体はメタノールで抽出され、培養上清液は酢酸エチルで抽出されたが、これは水で分割されて分離菌当たり９個の抽出物を生成した。１００μＬの分取量（ａｌｉｑｕｏｔ）が９６ウェルプレートで乾燥し、明知大学校からＵＩＣへ発送されたが、１００μＬのＤＭＳＯで可溶性とし、試験培養液で１：１００に希釈した。〜６３，０００抽出物のＨＴＳは、マイクロアラマーブルー分析（ＭＡＢＡ、ｍｉｃｒｏ Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙ）の蛍光測定値によって決定される７Ｈ１２培地で結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）＝９０％抑制（Ｃソースとしてのパルミチン酸）で３４９抽出物（０．５５％）を産出した。次いで、初期ヒット（ｈｉｔｓ）の９０はＥＣＵＭで１リットルの規模で再発酵され、その後、抽出物当たり６個の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を産出するために、前記抽出物が、メタノール−水濃度勾配２０〜１００％（ＭｅＯＨ−ｗａｔｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ２０〜１００％）の後にクロロホルム（ＣＨＣｌ３）１００％で固体相反転シリカゲル抽出（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）でＵＩＣから分画された。画分は次の項目で生物学的にプロファイリングされた：１）哺乳類細胞毒性（ベロ細胞ＩＣ５０）、２）非複製結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対抗する活性（ＬＯＲＡ）、３）リファンピン、イソニアジド（ＩＮＨ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、カナマイシン（ＫＭ）、カプレオマイシン（ＣＡＰ）、シクロセリン（ＣＳ）（また、単にこのような放線菌由来抗生剤のみを見つけるのではないことを明らかにするために）またはモキシフロキサシン（ＭＯＸ）に耐性を有する結核菌株（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ）に対抗する活性、４）スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対抗する活性。これらの結果に基づいて、２０個の放線菌株は追加調査のために優先順位が与えられた。
【００３６】
実施例３：ＭＪＭ５１２３の識別
形態学的および培養特性の決定
ＭＪＭ５１２３は、韓国の漢拏山から収集された土壌試料から分離された。前記菌株の属（ｇｅｎｕｓ）は細胞壁構成要素の特性形態と化学的分析によって識別された。形態学的および培養特性を決定するために、前記菌株を酵母エキス麦芽エキス寒天（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｔ ａｇａｒ）（ＩＳＰ２）、オートミール寒天（ＩＳＰ３）、無機塩澱粉寒天（ＩＳＰ４）、グリセロールアスパラギン寒天（ＩＳＰ５）のように国際ストレプトミセスプロジェクト（ＩＳＰ；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）培地を用いて２８℃で２週間成長させた［Shirling, E. B. and D. Gottlieb, Methods for characterization of Streptomyces species. Int J Syst Evol Microbiol. 1966 16(Pt 3): 313-330］。前記コロニー色相（ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｌｏｒｓ）が色相ハモニー説明書［Jacobson, E., W. C. Grauville, et al., Color Harmony Manual. 1958. Chicago, Container Corporation of America］を用いて決定された。胞子（ｓｐｏｒｅｓ）と菌糸体は電子顕微鏡（日立、Ｓ−３５００Ｎ、日本）をスキャンして観察された（図３）。
【００３７】
【表２】
0005756227.tif 000004
【００３８】
気中菌糸体（ａｅｒｉａｌ ｍｙｃｅｌｉｕｍ）の成長および胞子形成は、＋＋、優秀；＋、普通；±、不良；−、成長なしまたは胞子形成なしとしてスコアリングされる。
【００３９】
前記菌株は、ＩＳＰ２培地でよく成長し、他の培地で普通の成長を示した。栄養菌糸体（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ）および気中菌糸体の色相は拡散性色素のないベージュ色であった。白色胞子はオートミール培地（ＩＳＰ３）でのみ形成され、走査電子顕微鏡は気中菌糸体上にシワの寄った胞子の螺旋状鎖を示した。
【００４０】
メラノイド色素に対してテストするために、ペプトン酵母エキス鉄寒天（ｐｅｐｔｏｎｅ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｉｒｏｎ ａｇａｒ）（ＩＳＰ６）とチロシン寒天（ＩＳＰ７、チロシンを有し、或いはチロシンなし）が使用された。成長のための温度範囲、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）耐性およびｐＨの範囲がＩＳＰ３培地で決定され、抗生剤耐性試験は２８℃で２週間ＩＳＰ２培地を用いて行われた。
【００４１】
【表３】
0005756227.tif 000005
【００４２】
特性は（＋＋）、ポジティブ；（＋）、普通；（−）、ネガティブとしてスコアリングされる。
【００４３】
ＭＪＭ５１２３はメラニンを生産することなく栄養供給源としてチロシンを吸収し、前記菌株はｐＨ５．０〜９．０、０〜３．０％のＮａＣｌで成長することができ、２０℃〜３７℃で良い成長を示した。ＭＪＭ５１２３はアプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）およびチオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）に対しては脆弱であったが、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）に対しては耐性を有する。
【００４４】
【表４】
0005756227.tif 000006
【００４５】
特性は（＋）ポジティブ；（−）ネガティブとしてスコアリングされる。
【００４６】
ＩＳＰ９寒天培地が唯一の炭素ソースとして炭水化物の利用を試験する基礎培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）として使用された。炭水化物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＲ１０）の原液（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１０％Ｗ／Ｖ）は濾過によって滅菌され、１．０％の最終濃度でＩＳＰ９培地をオートクレーブするために添加された。ＭＪＭ５１２３はヘキソース、ペントース、アルコール糖および二糖類を使用した（表５）。
【００４７】
【表５】
0005756227.tif 000007
【００４８】
特性は（＋＋）ポジティブ；（＋）普通；（−）ネガティブとしてスコアリングされる。
【００４９】
化学分類学的特性の決定
細胞壁構成要素の化学分類学的特性について、凍結乾燥した菌糸体が２８℃で７日間回転振動機上のＴＳＢ培地（ＴＳＢ、ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）で成長させて製造された。グリシンとジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ）の立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓ）がＴＬＣによって決定された［Becker, B.; Lechevalier, M. P.; Gordon, R. E.; Lechevalier, H.A. Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates. Appl Microbiol 1964, 12, 421-423］。ドライセル（ｄｒｙ  ｃｅｌｌｓ）５ｍｇを１ｍＬの６Ｎ塩酸と共に小さいアンプル内にシールした。アンプルは１００℃のオーブンで一晩保管された。空冷した加水分解物がＷａｔｔｍａｎ１番の濾紙で濾過された。濾過液は濃縮乾燥し、蒸留水０．３ｍＬに溶解した。前記溶液の２μＬをＴＬＣプレート上に滴下し（Ｍｅｒｃｋ、ＴＬＣセルロースＦガラスプレート番号１０５，７１８）、メタノール：蒸留水：６Ｎ塩酸：ピリジン（８０：２６：４：１０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）の溶媒系で４時間成長させた。空気乾燥の後、０．２％のニンヒドリン溶液（アセトン）で噴霧し、１００℃で３分間加熱してスポットを現した。０．１ＭＤ、Ｌ−ＤＡＰ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ｄ−１３７７）１μｍと０．１Ｍグリシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、番号５００４６）１μＬが定格標準（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）として使用された。グリシンとＤ，Ｌ−ＤＡＰスポットは灰色−緑色で視覚化された。
【００５０】
糖類分析がＬｅｃｈｅｖａｌｉｅｒのやや修正された方法で行われた。ドライセル５０ｍｇを、１Ｎ硫酸２．０ｍＬを有する密封アンプルで２時間沸かした。冷却した加水分解物を５０ｍＬの円錐型遠心チューブに移し、ｐＨを飽和水酸化バリウムによって５．４に調整した。遠心分離の後、上清液は０．３ｍＬまで濃縮し、不溶粒子は遠心分離によって除去した。溶液１μＬをプレート（Ｍｅｒｃｋ、ＴＬＣセルロースＦガラスプレート番号１０５７１８）ＴＬＣ上にロードした。キシロース、アラビノース、ガラクトースを含む第１糖類（Ｓｉｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＲ１０）標準と、ラムノース、リボース、マンノース、ブドウ糖を含む第２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＲ１０）糖類標準をｎ−ブタノール：蒸留水：ピリジン：トルエン（１０：６：６：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶媒系で１％濃度でそれぞれ４時間適用した。アニリンフタル酸溶液（水飽和ブタノール１００ｍＬに溶解した、３．２５ｇのフタル酸水素アニリン塩（ＴＣＩ−ＧＲ、Ｎｏ．Ｐ０２８４））を噴霧した後、ＴＬＣプレートを１００℃で４分間加熱した。グリシンとＤ，Ｌ−ＤＡＰはＭＪＭ５１２３のペプチドグリカンの構成成分であり、主要糖は全体細胞加水分解物におけるキシロース、ガラクトース、マンノース、ブドウ糖であった（図４）。
【００５１】
極性脂質とメナキノンがＭｉｎｎｉｋｉｎ ｅｔ ａｌ．などの方法によって抽出された［Minnikin, D. E.; O'Donnella, A. G.; Goodfellowb, M.; Aldersonb, G.; Athalyeb, M.; Schaala, A.; Parlett, J. H. An integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones and polar lipids. J Microbiol Methods 1984, 2, 233-241]。メタノール：蒸留水（１００：１０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）２ｍＬと石油エーテル２ｍＬをドライセル５０ｍｇに添加し、１５分間混合した。上部層は新しいガラス瓶に移した。石油エーテル１ｍＬを下部層に添加して混合した。組み合わせられた上部層は常温で窒素ガスの下で蒸発し、残留物がメナキノンの分析に使用された。極性脂質が下部層から抽出された。下部層は５分間沸騰水の容器内で加熱した。３７℃に冷却した後、クロロホルム：メタノール：水（９０：１００：３０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液２．３ｍＬを添加して６０分間混合した。遠心分離の後に上清液を新しいチューブに移した。クロロホルム：メタノール：水（５０：１００：４０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液０．７５ｍＬを５分間混合して下部層が抽出され、上清液は前記チューブと組み合わせられた。この段階をもう１回繰り返し行った。収集された上清液はクロロホルム１．３ｍＬと０．３％塩化ナトリウム溶液１．３ｍＬと共に完全に混合された。遠心分離して分割した後、上部層は捨て、下部層は室温で窒素ガスの下に乾燥させた。極性脂質抽出物をクロロホルム：メタノール（２：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）６０μＬに溶解させ、溶液１０μＬをＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ、ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレート番号１０５７２９）上に滴下し、クロロホルム：メタノール：蒸留水（６５：２５：４、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いる２次元ＴＬＣ方法で識別し、現像溶剤（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ）としてクロロホルム：メタノール：蒸留水（４０：７．５：６：２、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いた。極性脂質は４つの試薬、エタノール内の５％リンモリブデン酸溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４８６９）、水飽和Ｎ−ブタノール内の０．２％ニンヒドリン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ４８７６）、α−ナフトール硫酸およびモリブデンブルー（Ｓｉｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ１９４２）をもって噴霧することにより視覚化された。
【００５２】
極性脂質分析の結果より、ＭＪＭ５１２３の極性脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ；ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＧ；ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ホスファチジルモノメチルエタノールアミン（ＰＭＥ；ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ；ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｍａｎｎｏｓｉｄｅ）、未知のリン脂質（ＰＬ；ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）および未知の極性脂質（Ｌ）から構成されることが解明された（図５）。
【００５３】
細胞脂肪酸（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）は気体クロマトグラフィーと結合した微生物識別システム（ＭＩＤＩ；Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ｖｅｒｓｉｏｎ４．５）を用いて分析され、ＡＣＴＩＮ６データベースで識別された。主要細胞脂肪酸はｉｓｏ−Ｃ１６：０（２５．５％）であり、各種の他の脂肪酸も検出された（表６）。
【００５４】
【表６】
0005756227.tif 000008
【００５５】
値は全体細胞脂肪酸の比率である。１．０％以下の極少量は表示されない。
【００５６】
系統発生分析
１６Ｓ ｒＤＮＡが２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’、配列番号１）と１４９２ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’、配列番号２）のプライマー対を持つＭＪＭ５１２３ゲノムＤＮＡから増幅された。増幅されたＤＮＡはＡＢＩ ３７３０ＸＬ毛細管ＤＮＡシーケンサー上に上述のプライマーを用いてシーケンスされた（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）。コンピュータを用いた１６Ｓ ｒＤＮＡの比較はhttp://www.ncbi-nlm-nih.govで利用可能なＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用いて行われた。
系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）がＭＥＧＡ４．０ソフトウェアを用いて近隣結合法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）によって構成された。系統樹のための分岐支持（ｂｒａｎｃｈ ｓｕｐｐｏｒｔ）が１０００個のブートストラプト（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）複製によって生成された。
【００５７】
ＢＬＡＳＴ検索によれば、１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンスは、ノノムラエ・ルブラ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｒｕｂｒａ）ＤＳＭ ４３７６８Ｔ、ノノムラエ・ロゼオラ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｒｏｓｅｏｌａ）ＤＳＭ ４３７６７Ｔと９８％の類似性を示し、ノノムラエ・ディエチアエ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｄｉｅｔｚｉａｅ）ＤＳＭ ４４３２０Ｔと９７％の類似性を示した。系統発生分析によってＭＪＭ５１２３がノノムラエファミリーに属したが、密接な関連のある菌株から相異なる下位系統分岐（ｓｕｂｃｌａｄｅ）に位置している。
ソフトウェアパッケージＭＥＧＡ、ｖｅｒｓｉｏｎ４．０を用いて近隣結合方法によって、距離が得られ（Ｋｉｍｕｒａ−２モデルによって距離オプションを用いて）、クラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）が行われた。１０００個の複製に基づくブートストラプト値は分岐点で百分率にて記載される。バーはヌクレオチド当たり０．００２置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を示す（図６）。
【００５８】
密接に関連した菌株とのＤＮＡ連関性
密接に関連した菌株とのＤＮＡ−ＤＮＡの連関性がマイクロプレートハイブリッド化方法を用いて蛍光分析によって評価された。ＤＮＡ−ＤＮＡの連関性値はＭＪＭ５１２３が別のゲノム種を示したことを表示する３４％〜６５％であった（表７）。
【００５９】
【表７】
0005756227.tif 000009
【００６０】
本発明者は２０１２年４月３日にノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）ＭＪＭ５１２３を韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）のＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １２１７８ＢＰ）。
【００６１】
実施例４：発酵プロセスの最適化
抗結核ペプチドの生産性を改善するために、最適の発酵プロセスと費用効率的な培地が開発された。菌株ＭＪＭ５１２３は、多様な炭素および窒素供給源、例えばブドウ糖、フルクトース、マルトース、ガラクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、大豆油、澱粉、デキストリン、アミノ酸、酵母エキス、膵臓消化カゼイン、牛肉エキス、ペプトン、麦芽エキス、オートミール、大豆粉、酵素分解された大豆粉、綿実粕、コーンスティープリカー、無機塩類などを用いることができる。ＭＪＭ５１２３は広範囲の温度とｐＨ（２０〜４０℃、ｐＨ５．０〜９．０）で成長した。ところが、接種前に初期培地ｐＨを〜７．２に調整することが有利である。発酵温度を３４℃に維持したとき、最も効率的な成長と力価（ｔｉｔｅｒ）が達成された。各段階に対する３段階発酵手続きおよび培地が、費用効率的な生産および後続処理の容易性のために、次のとおり開発された。
【００６２】
【表８】
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【００６３】
【表９】
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【００６４】
【表１０】
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【００６５】
機械的で再生産可能な処理のために、冷凍栄養菌糸体（ＦＶＭ：ｆｒｏｚｅｎ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｙｃｅｌｉａ）が次のとおり製造された；２８℃で７日間ＩＳＰ３培地で成長した単一菌糸を、ＳＣ培養液７０ｍＬを含む５００ｍＬのバッフルフラスコに接種し、３日間２００ｒｐｍの振動速度にて３４℃で培養した。全体培養液は５０％グリセロールと完全に混合し、栄養菌糸体−グリセロール混合物を使用するまで−８０℃で保管した。
【００６６】
前記冷凍栄養菌糸体（ＦＶＭ）は１０％ｖ／ｖで前記活性化培養の開始に使用された。活性化段階は５４時間２００ｒｐｍの振動速度にて３４℃で行われた。この活性化段階を介して、充填された菌糸体容積（ＰＭＶ）は１５％であり、ｐＨは７．５８であった。前記幼若活性栄養培養液が１０％ ｖ／ｖで種培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）のために使用された。２番目の種培養は６０時間２００ｒｐｍの振動速度にて３４℃で行われた。前記ＰＭＶとｐＨはそれぞれ４３％、７．４８であった。前記種培養は１０％ｖ／ｖで主発酵培地に移された。主発酵は１４４時間３４℃で攪拌速度（ａｇｉｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ）６００ｒｐｍ、通気（ａｅｒａｔｉｏｎ）０．３ｖｖｍで行われた。最終ＰＭＶはｐＨ８．２０で８０％であり、総糖は１．８％未満であった。発酵過程は３７３ｍｇ／ＬのＨ−１４を産出した（図７）。
【００６７】
実施例５：ノノムラエ種ＭＪＭ５１２３菌株からの新規な抗結核ペプチドＨ−１４とＨ−１６の分離
分離例１：
２０個の優先順位化された放線菌株の一つである菌株ＭＪＭ５１２３が大規模発酵され、その有効な画分（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）が後述の方法によって実施例１で分離された。
活性と選択性指数（ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）をモニタリングするために、ＭＡＢＡ、ＬＯＲＡおよびベロ細胞毒性を用いて生物学的特性化と併用して、菌株Ｅ５１２３の大規模菌糸体メタノール抽出物が化学的分画プロセス（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を経た。活性成分の分画および分離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）はクロマトグラフィー分離の３つの段階を関連させた。２０％での水／メタノール濃度勾配段階を用いて、逆相シリカゲル（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ）上に、前記抽出物（１２８．７ｇ）の真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）は７個の化学的に異なる画分ＶＣ−１〜７を産出した。それぞれ１００％メタノールと１００％エタノールで溶出した画分ＶＣ−６とＶＣ−７に対して、ＭＩＣ＜０．７６、０．７４μｇ／ｍＬが観察された。ＶＣ−６およびＶＣ−７は、再結合し（８．４７ｇ）、溶離液としての１００％エタノールによってセファデックスＬＨ−２０オーブンカラム上に８１個の画分にさらに分離され、Ｓ−１からＳ−１１まで１１個の再結合した画分のパネルを産出した（ＴＬＣによって）。副画分（ｓｕｂｆａｃｔｉｏｎｓ）Ｓ−２とＳ−３に対して、ＭＩＣは＜０．２１μｇ／ｍＬであった。Ｓ−３（３７４ｍｇ）は、ＧＵＥＳＳ方法によって最も適した溶媒系として選択されたＨＥＭＷａｔ＋２で高速向流クロマトグラフィー（ＨＳＣＣＣ）によって１１０個の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分離された［Kubo, I. Recent applications of counter-current chromatography to the isolation of bioactive natural products. J Chrom 1991, 538, 187-191］。これらの画分はＨ’−１からＨ’−１１まで１１個の画分のパネルに再結合した。副画分Ｈ−４、Ｈ−６、Ｈ−８およびＨ−９に対して、ＭＩＣは＜０．３９１μｇ／ｍＬであった。Ｓ−２（１７７ｍｇ）がＨＥＭＷａｔ＋２でＨＳＣＣＣによって１４０個の画分にさらに分離され、Ｈ−１からＨ−２６まで２６個の画分のパネルに再結合した。Ｈ−３、Ｈ−５、Ｈ−７、Ｈ−９〜Ｈ−２３に対して、ＭＩＣは＜０．５μｇ／ｍＬであった。活性ペプチド画分のうち、Ｈ−１４とＨ−１６（８ｍｇ、収率＝０．４ｍｇ／Ｌ）が、ｑＨＮＭＲ分析によれば最も純粋であったので、構造的解明（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ）のために選択された。１ＨＮＭＲスペクトルの類似性に応じて、Ｈ−１１はＨ−１５、Ｈ’−６はＨ’−８とそれぞれ再結合した後、Ｈ−１４（約８０％純度）１８９ｍｇが得られた（収率＝９．４５ｍｇ／Ｌ）、活性ペプチドの全量は約３６９ｍｇであり、収率は１８ｍｇ／Ｌである。
【００６８】
分離例２：
ＭＪＭ５１２３の発酵によって生成された抗結核化合物は、主に細胞内部で維持された。抗結核化合物は菌糸ケーキ（ｍｙｃｅｌｉａｌ ｃａｋｅ）から抽出された。上述したように、後者は全体発酵液の濾過によって発酵過程から収穫された。菌糸ケーキの抽出はメタノールを用いることが最も効果的であったが、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルムなどのその他の有機溶媒を用いてもよい。未加工の抗結核活性化合物は適量で抽出物の蒸発および溶媒−溶媒分割（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｓｏｌｖｅｎｔ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）を含むルーチンプロセスによって抽出溶液から回復された。
【００６９】
メタノール抽出物は３７℃の真空で濃縮され、７０％メタノールを得るために、前記濃縮された溶液に脱イオン水が添加された。水混合物はｎ−ヘキサンと脱イオン水の１容量（ｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ）で希釈された脱脂溶液に分割することにより脱脂された。これは１容量のクロロホルムで抽出され、抗結核活性化合物を含むクロロホルム層は脱イオン水で振盪洗浄された。前記クロロホルム層を乾燥させ、１００％メタノールに溶解させ、１００％メタノールと平衡をなすセファデックスTMＬＨ−２０に適用された黄色固体を産出した。抗結核活性化合物は１００％メタノールの溶離により立体排除クロマトグラフィーでプールされた（ｐｏｏｌｅｄ）。強力な抗結核活性を示すＨ−１４とＨ−１６は、移動相（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）として、２０μＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で緩衝された３５％水性アセトニトリル溶液と逆相Ｃ−１８カラムを用いる高性能液体クロマトグラフィーで完全に精製された。精製された画分はアセトニトリルを除去するために気化し、クロロホルムで抽出された。最後に、クロロホルム層は乾燥濃縮され、高い水準に精製されたＨ−１４とＨ−１６は構造決定および体外抗結核活性を含む追加研究対象であった。
【００７０】
実施例６：抗結核環状ペプチドＨ−１４の構造解明
Ｈ−１４は菌糸体のＭｅＯＨ抽出によって得られたノノムラエ種ＭＪＭ５１２３の代謝産物である。Ｈ−１４に対する分子式は高解像度質量分析（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）と１Ｈ、１３Ｃ ＮＭＲによって決定されたようにＣ８３Ｈ１３４Ｏ１７Ｎ１４である。
Ｈ−１４は光活性淡黄色粉末（ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｙｅｌｌｏｗ ｐｏｗｄｅｒ）として分離された。高解像度質量スペクトルは１６００．０１８９ｍ／ｚで陽イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋を示し、１６２１．９９８２ｍ／ｚで陽イオンピーク［Ｍ＋Ｎａ］＋を示し、１５９９．０１１１の正確な質量を示す。ＩＲスペクトルはマルチプルアミド部分（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｍｉｄｅ ｍｏｉｔｉｅｓ）（１６３２．１６ｃｍ−１）の存在を暗示する。ＵＶスペクトルは、Ｈ−１４が２１１ｎｍ（＝５４２０９Ｍ−１Ｍｃｍ−１，４８、２５℃、メタノールで）、２１９ｎｍ（＝５５２６６Ｍ−１ｃｍ−１、４８、２５℃、メタノールで）、２６３ｎｍ（＝７９２５Ｍ−１ｃｍ−１、４８、２５℃、メタノールで）、２８１ｎｍ（＝６４６５Ｍ−１ｃｍ−１、４８、２５℃、メタノールで）、および２９１ｎｍ（＝５８３９Ｍ−１ｃｍ−１、４８、２５℃、メタノールで）における吸収帯域であり、芳香族残基を有するペプチドであることを示唆した。ＣＤスペクトルは、Ｈ−１４が２２０ｎｍ（２５℃、アセトニトリルで）でモル楕円率（ｍｏｌａｒ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）が１９１８５３０ｄｅｇｃｍ２ｍｏｌ−１であり、１９６ｎｍ（２５℃、アセトニトリルで）で６１６０９４ｄｅｇｃｍ２ｍｏｌ−１であり、Ｈ−１４は逆平行−βシート構造（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ β−ｓｈｅｅｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）であるペプチドであることを示唆する。
【００７１】
この分子が相対的に大きいサイズを持つにも拘わらず、ＮＭＲスペクトルは許容可能な信号分散を示し、よって構造情報の価値のあるソースとなった。メタノール−ｄ３における１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、交換の際に完全に重水素化されたメタノールで消える９．２０ｐｐｍ〜７．７２ｐｐｍの８つの交換可能なプロトン信号をディスプレーした。また、信号が一つのフェニル基と他の芳香族系に対しては芳香族領域コードで現れ、ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔｓ）が２０個の脂肪族メチル基に対応する０．７３〜１．３３ｐｐｍで発見された。ペプチドの場合に対しては、驚くべきことに、２．１６、２．３１、３．１４、３．２３、３．２６、３．３３および３．８２ｐｐｍで７個のシングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）が現れ、２．３１ｐｐｍにおけるシングレットが２つのメチル基に対して統合することにより、これは８Ｎ−メチルおよび／またはメトキシ基を示す。アミド陽性領域でダブレットを持つ信号、および５．４〜０．７ｐｐｍの完全な範囲をカバーする信号の分布は、前記調査された化合物が本当にペプチドであることを明確に示した。
【００７２】
ペプチドとして前記化合物の分類（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を支持する追加分光証拠は、１３個のカルボニル炭素に該当する、１７０．９２〜１７５．１４ｐｐｍの範囲内にある総１２個の（アミド−）カルボニル信号を示す１３Ｃ ＮＭＲスペクトルから派生した。ＤＥＰＴ１３５およびＨＳＱＣ実験を用いることにより、３４個のメチン、３つのメチレンおよび２８個のメチル信号が識別された。これらの信号は１５５．２３、１４２．６８、１４０．０４、１１８．３６および１１２．４７ｐｐｍで５つの第四級炭素信号と共に、Ｈ−１４に存在する総８３個の炭素を示した。
【００７３】
特に、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣおよび半選択的な（ｓｅｍｉ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）ＨＭＢＣ実験に基づく、Ｈ−１４の２Ｄ ＮＭＲスペクトルの広範囲な分析の結果として、１５個の離散、１Ｈ、１Ｈスピンシステム：Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ、Ｖａｌ１、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｖａｌ２、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｖａｌ３、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ ａ、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ ｂ、Ｌ−Ｖａｌ４、Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ ａ、Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ ｂおよびＬ−Ｖａｌ５の説明が行われた。１Ｈと１３Ｃに対する詳細な割り当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）が表１１に与えられた。ターミナルメチル基の１３Ｃと１Ｈ信号は非常に混雑な地域内に存在する。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは１９．１０ｐｐｍ〜２０．０４ｐｐｍまで０．９４ｐｐｍウィンドウ内に１４炭素を示す１４炭素信号をディスプレーし、１Ｈ ＮＭＲスペクトルは０．８５ｐｐｍ〜１．０９ｐｐｍまで０．１４ｐｐｍウィンドウ内に４７プロトンを示す１７プロトン信号をディスプレーした。ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ実験の解像度は、これらの信号に対する連結性を確立するのに十分高くないため、半選択（ｓｅｍｉ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）ＨＭＢＣ実験を導入したが、これはホモ核プロトンカップリング変調（ｈｏｍｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｏｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を抑制することにより、間接的１３Ｃ次元で高解像度を得る。直接的なＨ−Ｃ連結性は半選択ＨＭＢＣ実験で抽出された１３Ｃ−１Ｈ単一結合相関（ｓｉｎｇｌｅ ｂｏｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ）を用いて構築された。これらの相関はＦ２方向に沿って１２６Ｈｚの周囲にカップリング定数（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ）として観察された。メチル基は半選択（ｓｅｍｉ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）ＨＭＢＣ実験で抽出されたメチルプロトン信号と一般にβ−炭素信号、およびメチル炭素信号と一般にβ−プロトン信号間の前記１Ｈ、１３Ｃ長距離相関（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ）を用いてそれぞれそれらのスピンシステムに連結された。
【００７４】
Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−ＴｒｐとＲ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅユニット内の連結性はＨＭＢＣ実験で抽出された１Ｈ、１３Ｃ長距離相関を用いて確立された。このようなＨＭＢＣ相関がＮ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈ４／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｃβ、Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ Ｈ２’／Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ Ｃβ、およびＲ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ Ｈ５’／Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ Ｃβについて観察された。
また、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐのメトキシ基の位置はＨＭＢＣ相関を分析して決定された。ＨＭＢＣ相関がＮ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈ１２／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｃ１０、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈ８／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｃ６、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈ７／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｃ１１、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈ９／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｃ１１について観察された。
【００７５】
Ｎ−メチル基の位置はＨＭＢＣ相関を分析して決定された。（ｉ、ｉ）ＨＮＭｅ、Ｃαおよび／または（ｉ、ｉ−１）ＨＮＭｅ、ＣＣ＝０ＨＭＢＣ相関がＮ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ Ｈ６（７）／Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ Ｃα、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ Ｈ７／Ｖａｌ１ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ Ｈ７／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｐ−Ｉｌｅ Ｃα、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ Ｈ５／Ｌ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ Ｈ５／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ Ｃα、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ Ｈ７／Ｌ−Ｖａｌ２ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ Ｈ７／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ Ｃα、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｈ６／Ｌ−Ｖａｌ３ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ Ｈ６／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ Ｃα、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈ１３／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈ１３／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｃαについて観察された。
【００７６】
それぞれのアミノ酸残基の大部分は、以後、Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−ＶａｌおよびＮ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕユニットを除いて、１Ｈ、１３Ｃ−長距離相関によって順次連結された。各アミノ酸残基に対してＨα、ＣＣ＝０の間に２つの相関、（ｉ、ｉ）Ｈα、ＣＣ＝０および（ｉ、ｉ−１）Ｈα、ＣＣ＝０が観察された。これは一緒にペプチド結合連結性を決定する。これに対し、Ｈβ、ＣＣ＝０の間に只一つの相関が観察される。これは前記残留物のカルボニル基を決定する。ＨＭＢＣ実験が１７０．９１ｐｐｍ〜１７５．１４ｐｐｍの４．２３ｐｐｍウィンドウに提供される１３１３Ｃ信号で前記混雑したカルボニル領域を解決することができないので、さらに半選択ＨＭＢＣ実験が採用された。Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ Ｈα／Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ Ｈβ／Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｖａｌ１ Ｈα／Ｖａｌ１ ＣＣ＝０、Ｖａｌ１ Ｈβ／Ｖａｌ１ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌ−Ｉｌｅ Ｈα／Ｖａｌ１ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｔｈｒ Ｈα／Ｌ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｔｈｒ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｔｈｒ Ｈβ／Ｌ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ Ｈα／Ｌ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ２ Ｈα／Ｌ−Ｖａｌ２ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ２  Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ２ Ｈβ／Ｌ−Ｖａｌ２ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ Ｈα／Ｌ−Ｖａｌ２ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｌｅｕ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ３ Ｈα／Ｌ−Ｖａｌ３ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ３ Ｈβ／Ｌ−Ｖａｌ３ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ―Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ Ｈα／Ｌ−Ｖａｌ３ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ４ Ｈα／Ｌ−Ｖａｌ４ Ｈ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ４ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｌ−Ｔｒｐ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ４ Ｈβ／Ｌ−Ｖａｌ４ ＣＣ＝０、Ｒ−β―ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ Ｈα／Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ ＣＣ＝０、Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ Ｈα／Ｌ−Ｖａｌ４ ＣＣ＝０、Ｒ−β―ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ Ｈβ／Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ５ Ｈα／Ｌ−Ｖａｌ５ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ５ Ｈα／Ｒ−β−ＯＨ−Ｌ−Ｐｈｅ ＣＣ＝０、Ｌ−Ｖａｌ５ Ｈβ／Ｌ−Ｖａｌ５ ＣＣ＝０について関係が観察された。ＮＭｅ２−ＶａｌとＮＭｅ−Ｌ−Ｌｅｕからカルボニル基の１３Ｃ信号は１７３．２９ｐｐｍでオーバーラッピングし、カルボニル基とのＶａｌ１ ＨαとＬ−Ｖａｌ３ Ｈαの連結性が未定のままで残し��このようにＨ−１４に対する２つの可能な構造を残した。
【００７７】
また、Ｌ−Ｔｈｒ ＨβとＬ−Ｖａｌ５ ＣＣ＝０間のＨＭＢＣ相関が観察され、Ｈ−１４がＣ末端カルボニル基とＬ−ＴＨＲ残基の側鎖との間で環化された環状デプシペプチド（ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ）であることを示唆する。
高解像度質量スペクトル分析によって決定された１５９９．０１１１の分子量と共に、このデータは分子式Ｃ８３Ｈ１３４Ｎ１４Ｏ１７と一致する。
ところが、Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−ＶａｌとＬ−Ｖａｌ１間の連結性は、ｍ／ｚ３５４．３２で断片イオン（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎ）［Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ＋Ｌ−Ｖａｌ１＋Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ］＋を示すＨ−１４のダンデム質量スペクトル（ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）の分析によって確認された。
【００７８】
分子のシーケンスを確立することに役立つ次の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）がタンデム質量スペクトルで検出された：ｍ／ｚ（ｒｅｌ．ｉｎｔ．）１６００．２３［Ｍ＋Ｈ］＋（８）、１２４６．９５［Ｍ−Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ−Ｌ−Ｖａｌ１−Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ＋２Ｈ］＋（４８）、９９０．８６［Ｍ−Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ−Ｌ−Ｖａｌ１−Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｖａｌ５＋２Ｈ］＋（７）、８００．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋（５０）、６１０．４１［Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ＋Ｌ−Ｖａｌ１＋Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ＋Ｌ−Ｔｈｒ＋Ｌ−Ｖａｌ５］＋（３６）、３５４．３２［Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ＋Ｌ−Ｖａｌ１＋Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ］＋（８７）。
【００７９】
【表１１】
0005756227.tif 000013
【００８０】
【表１２】
0005756227.tif 000014
【００８１】
【表１３】
0005756227.tif 000015
【００８２】
ａオーバーラッピングのため、前記信号の多重性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）は不確実である。
ｂメタノール−ｄ３で１Ｈ ＮＭＲ実験から得られたデータ
【００８３】
ＭＪＭ５１２３（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）から分離され、精製されたＨ−１４の構造は、化学式１で表される。図１１は環状Ｈ−１４ペプチドの構造的配列を示す。
【００８４】
【化２】
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【００８５】
結晶化および構造決定
５７日にわたる遅い蒸発方法を用いてＭｅＯＨ：ＭｅＣＮ：水＝（１：１：０．５）からＨ−１４の針状の結晶が得られた。結晶サイズは約０．１×０．１５×０．５ｍｍであった。Ｘ線データはＢｒｕｋｅｒ Ｄ８ディスカバーＸ線システム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｘ−ｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ）上から室温で収集され、結晶（ｃｒｙｓｔａｌ）はＸ線を０．８３に回折させた。前記結晶はユニットセル媒介変数、ａ＝７１．６４、ｂ＝１１．４３、ｃ＝１２．７０を有する斜方晶系空間（ｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃ ｓｐａｃｅ）Ｐ２（１）２（１）２に属した。非対称ユニットに一つの分子がある（図８および表１２）。
【００８６】
【表１４】
0005756227.tif 000017
【００８７】
相（ｐｈａｓｅ）の問題はＳｈｅｌｘＤソフトウェアを用いて原子の任意の分布で始める反復二重空間直接方法（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｄｕａｌ−ｓｐａｃｅ ｄｉｒｅｃｔ ｍｅｔｈｏｄｓ）によって解決された。ＳｈｅｌｘＤから生成された初期モデルはＨ−１４の２次元構造によって修正され、水分子がグラフィックプログラムＷｉｎＣｏｏｔで生成された初期電子密度図（ｉｎｉｔｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐ）によって案内されて添加された。最後に、精製プログラムＳｈｅｌｘＬまたはＲｅｆｍａｃでＲ因子を０．１７２３減らすことにより、精製されたモデルを得た。図９に示すように、Ｈ−１４の全体構造はツイストヘアピンなどの逆並列構造（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）と類似する。主鎖のＣ＝０とＮ−Ｈ基間の５つのＨ−結合が全体構造を安定化する。また、取り囲む水分子がＨ−結合形成に参与する。Ｘ−ｒａｙ構造およびＭａｒｆｅｙ方法の結果より（図示されていないデータ）、Ｈ−１４が全てのＬ−アミノ酸またはそれらの類似体（ａｎａｌｏｇｓ）から構成されたと結論付けた。ＮＭＲ分析によって示唆された非標準アミノ酸はいずれも、電子密度図を用いて各原子の位置を検査することにより確認された（図９および図１０）。
【００８８】
実施例７：抗結核環状ペプチドＨ−１６の構造解明
Ｈ−１６はノノムラエ菌糸体のメタノール抽出物から得たノノムラエ種（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．）Ｍ５１２３の別の代謝産物である。Ｈ−１６に対する分子式は１Ｈ、１３ＣＮＭＲおよび高解像度質量データによって決定されたようにＣ８３Ｈ１３４Ｏ１６Ｎ１４である。
【００８９】
Ｈ−１６は淡黄色非晶質粉末として得られた。高解像度質量スペクトルは１５８４．０２２７ｍ／ｚで陽イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］＋を示し、１６０６．００３５ｍ／ｚで陽イオンピーク［Ｍ＋Ｎａ］＋を示すが、１５８３．０１４９の正確な質量を示す。高解像度質量スペクトルおよび１３Ｃ ＮＭＲデータは分子式Ｃ８３Ｈ１３４Ｎ１４Ｏ１６と一致した。１Ｈ ＮＭＲデータもＨ−１６がペプチドであることを示した。詳細な１Ｈおよび１３Ｃ割り当てが表１３で与えられる。Ｈ−１６のＮＭＲ分光識別はＨ−１４の分光識別と類似に行われた。この過程でアミノ酸残基のスピンシステムは、さらにＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣスペクトルを含む、２Ｄ ＮＭＲスペクトルの解析によって識別された。それぞれのアミノ酸残基が明確にＨＭＢＣおよび半選択ＨＭＢＣ相関によって順次リンクされた。このような相関関係はＮ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ Ｈα／Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ Ｈβ／Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｖａｌ１ Ｈα／Ｖａｌ１ ＣＣ＝０、Ｖａｌ１ Ｈα／Ｎ，Ｎ−Ｍｅ２−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｖａｌ１ Ｈβ／Ｖａｌ１ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅ Ｈα／Ｖａｌ１ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅ ＣＣ＝０、Ｔｈｒ Ｈα／Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｔｈｒ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅ ＣＣ＝０、Ｔｈｒ Ｈβ／Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｈｒ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｈｒ Ｈα／Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｈｒ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｖａｌ２ Ｈα／Ｖａｌ２ＣＣ＝０、Ｖａｌ２ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｔｈｒ ＣＣ＝０、Ｖａｌ２ Ｈβ／Ｖａｌ２ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ Ｈα／Ｖａｌ２ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ ＣＣ＝０、Ｖａｌ３ Ｈα／Ｖａｌ３ ＣＣ＝０、Ｖａｌ３ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ ＣＣ＝０、Ｖａｌ３ Ｈβ／Ｖａｌ３ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｖａｌ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｖａｌ Ｈα／Ｖａｌ３ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−Ｖａｌ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｔｒｐ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｔｒｐ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｔｒｐ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−Ｖａｌ ＣＣ＝０、Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｔｒｐ Ｈβ／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｔｒｐ ＣＣ＝０、Ｖａｌ４ Ｈα／Ｖａｌ４ ＣＣ＝０、Ｖａｌ４ Ｈα／Ｎ−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−Ｔｒｐ ＣＣ＝０、Ｖａｌ４ Ｈβ／Ｖａｌ４ ＣＣ＝０、Ｐｈｅ Ｈα／Ｐｈｅ ＣＣ＝０、Ｐｈｅ Ｈα／Ｖａｌ４ ＣＣ＝０、Ｐｈｅ Ｈβ／Ｐｈｅ ＣＣ＝０、Ｖａｌ５ Ｈα／Ｖａｌ５ ＣＣ＝０、Ｖａｌ５ Ｈα／Ｐｈｅ ＣＣ＝０、Ｖａｌ５ Ｈβ／Ｖａｌ５ ＣＣ＝０について観察された。
【００９０】
【表１５】
0005756227.tif 000018
【００９１】
【表１６】
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【００９２】
ＭＪＭ５１２３から分離および精製されたＨ−１６の構造は化学式２で表される。
図１２は環状Ｈ−１４ペプチドの構造的配列を示す。
【００９３】
【化３】
0005756227.tif 000020
【００９４】
実験例１：好気性条件の下で結核に対抗するＨ−１４とＨ−１６のＭＩＣおよびＭＢＣ
結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対抗してＨ−１４とＨ−１６の抑制活性はマイクロアラマーブルー分析を用いて測定した［Collins, L. and S.G. Franzblau, Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother, 1997. 41(5): p. 1004-9; Hurdle, J.G., et al., A microbiological assessment of novel nitrofuranylamides as anti-tuberculosis agents. J Antimicrob Chemother, 2008. 62(5): p. 1037-45］。参照菌株Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖを用いて好気性条件の下で測定したＨ−１４とＨ−１６に対するＭＩＣ（９０％に成長を抑制するのに必要な最小抑制濃度）とＭＢＣ９９（有機体の９９％を死なせる最小濃度）値を表１４で示す。
各化合物のＭＢＣ９９がそのＭＩＣより約２倍高く、よって、Ｈ−１４とＨ−１６は殺菌的なものと分類されるべきである。
【００９５】
【表１７】
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【００９６】
結核菌は、細胞から細胞へ遺伝情報を交換しないクローン有機体（ｃｌｏｎａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）である。ヒトと共同進化の過程中に、多くの別個の血統（ｌｉｎｅａｇｅｓ）、または系統群（ｃｌａｄｅｓ）が生成されてき、地球の多くの部分で目立つ［Filliol, I., et al., Global phylogeny of Mycobacterium tuberculosis based on single nucleotide polymorphism (SNP) analysis: insights into tuberculosis evolution, phylogenetic accuracy of other DNA fingerprinting systems, and recommendations for a minimal standard SNP set. J Bacteriol, 2006. 188(2): p. 759-72; Gagneux, S. and P.M. Small, Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development. Lancet Infect Dis, 2007. 7(5): p. 328-37］。
表１５は、参照としてＨ３７Ｒｖ実験室菌株と共に、地理／遺伝的多様性を代表する６種のマイコバクテリア結核菌株に対抗するＨ−１４とＨ−１６のＭＩＣ値を提供する。この６種の菌株に対抗するＨ−１４とＨ−１６のＭＩＣは野生型Ｈ３７Ｒｖに対抗するＭＩＣと比較でき、それが広く効能を持つことを示唆する。
【００９７】
【表１８】
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【００９８】
実験例２：低酸素の下でＭ．結核菌に対抗するＨ−１４とＨ−１６のＭＢＣ
低酸素の下で非複製Ｍ．結核菌に対抗するＨ−１４とＨ−１６の殺菌活性は、低酸素回復分析（ＬＯＲＡ：ｌｏｗ ｏｘｙｇｅｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｓｓａｙ）を用いて決定された。複製されていない条件の下で１０日間培養した後、結核菌の生存能力９９％減少に影響した濃度はＨ−１４とＨ−１６の両方とも約１．５μＭであった。この低いＭＢＣはＨ−１４とＨ−１６が非複製パーシスタ（ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｐｅｒｓｉｓｔｏｒｓ）の部分母集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を抑制することにより、結核治療期間を減らすことが可能な潜在性を持つことを示唆する。
【００９９】
実験例３：Ｈ−１４とＨ−１６抗菌選択性
Ｈ−１４とＨ−１６の選択性は、大腸菌、グラム陰性菌、黄色ブドウ球菌、グラム陽性菌、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、酵母、および６種のマイコバクテリア種（表１６）に対抗してそれらをスクリーニングすることにより決定された。その化合物のいずれも大腸菌、黄色ブドウ球菌、およびＣ・アルビカンスに対する抗菌活性を示さなかった。２つの化合物はＭＩＣ ０．４μＭ以下でＭ．Ｋａｎｓａｓｉｉに対抗し、ＭＩＣ １．０μＭ以下でＭ．ａｖｉｕｍに対抗し、ＭＩＣ ２．０μＭ以下でＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅおよびＭ．ｍａｒｉｕｍに対抗し、ＭＩＣ ４．０μＭ以下でＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに対抗する活性であるが、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓに対抗しては相当少なく活性化された。それらの結果はＨ−１４とＨ−１６が選択的抗マイコバクテリア化合物であることを示唆する。
【０１００】
【表１９】
0005756227.tif 000023
【０１０１】
実験例４：哺乳動物細胞に対抗するタンパク結合および毒性
タンパク結合（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）は、化合物の薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）に影響を与え、究極的に活性非結合化合物の量を減少させることにより、その効率性に影響を及ぼすおそれがある。Ｍ．結核に対抗するＨ−１４およびＨ−１６のＭＩＣは、表１７に示すように、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下に追加補充タンパク質（０．４％ ＢＳＡ）なしで決定された。１０％ＦＢＳまたは４％ＢＳＡの存在下でＭＩＣが２倍（２−ｆｏｌｄ）増加し、タンパク結合が自分の効能に悪影響を与えないことを示唆する。
【０１０２】
【表２０】
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【０１０３】
哺乳類細胞に対抗するＨ−１４およびＨ−１６の細胞毒性をベロ細胞、アフリカ緑色猿の腎臓細胞株に対してテストして評価した（表１８）。細胞毒性は最高試験濃度（３２μＭ）ですら２つの化合物について発見されなかった。
【０１０４】
【表２１】
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【０１０５】
実験例５：実験室で生成されたモノ薬剤耐性（ｍｏｎｏ−ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）Ｍ．結核菌株のパネルに対抗するＨ−１４とＨ−１６のＭＩＣ
Ｈ−１４とＨ−１６がリファンピン（ＲＭＰ）、イソニアジド（ＩＮＨ）、モキシフロキサシン（Ｍｏｘ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、カナマイシン（ＫＭ）、サイクロセリン（ＣＳ）またはカプレオマイシン（ＣＡＰ）にそれぞれ耐性があるＨ３７Ｒｖ−ｉｓｏｇｅｎｉｃ Ｍ．結核菌株のパネルに対してテストされた（表１９）。２つの化合物はいずれもモノ薬剤耐性結核菌の菌株に対抗してそれらの活性水準を維持し、現在抗結核薬物と交差耐性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）がないことを示唆し、よって、薬物敏感および薬剤耐性結核菌感染に対抗する利用に同等に適する新しい行動モード（ｎｏｖｅｌ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ）を示唆する。
【０１０６】
【表２２】
0005756227.tif 000026
【０１０７】
結論的に、Ｈ−１４およびＨ−１６はいずれも、現在の第１線抗結核薬剤と比較すべき生体外抗結核活性プロファイルを有し、ＭＢＣ １００−ｆｏｌｄで生体外哺乳動物細胞毒性を有しない。複製するマイコバクテリア結核に対抗するＭＩＣは、Ｈ１４、Ｈ１６、リファンピンおよびイソニアジドに対してそれぞれ０．１６μＭ、０．１６μＭ、０．０９μＭおよび０．４７μＭである。Ｈ−１４とＨ−１６の選択インデックス（ベロセル（ＶＥＲＯ ｃｅｌｌ）ＩＣ５０／Ｍ結核ＭＩＣ）は全て６２０より大きい。活性レベルは地球の系統群を代表する臨床的分離菌に対してだけでなく、環状ペプチド、カプレオマイシンに対抗し、リファンピン、イソニアジド、ストレプトマイシン、カナマイシン、サイクロセリンに耐性を有するＭ．結核の同種菌株に対抗するように維持される。複製Ｍ．結核菌に対抗するＭＢＣは、強い殺菌剤であることを示すＨ−１４およびＨ−１６に対してそれぞれ０．３４μＭ、０．１９μＭである。化合物はいずれも。ＬＯＲＡにおいて略１．５μＭでｌｏｇ１０だけ非複製Ｍ．結核菌の生存能力を減少させ、Ｍ．結核パーシスタの部分母集団を抑制することにより、ＴＢ治療期間を短縮することが可能な潜在性を示唆する。対照的に、３１μＭで黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．アルビカン（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対抗する活性が観察されておらず、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に対抗する活性はさらに低かった。これは両ペプチドともの抗結核活性が非常に選択的であることを意味する。さらに、これはこれらのペプチドが代替バクテリア（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）に対抗してスクリーニングすることによりもともと検出されなかったことを示唆する。４％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳの存在下でＭＩＣｓが只２倍だけ増加するので、タンパク結合はそれらの効能に悪影響を及ぼしてはならない。
【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１３】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005756227.tif 000041
【配列表】
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