(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵白加水分解物であって、分子量が１００〜１０，０００の範囲に８０％以上分布する卵白加水分解物を有効成分とする、ＩＬ−１β、ＩＬ−８から選ばれる１種又は２種の炎症性サイトカインの産生抑制剤。
【請求項２】
卵白加水分解物が、中性プロテアーゼ処理により得られることを特徴とする請求項１記載の炎症性サイトカインの産生抑制剤。
【請求項３】
過剰な炎症の抑制又は軽減を必要とするヒトのための、請求項１又は２記載の炎症性サイトカインの産生抑制剤。
【請求項４】
ＩＬ−１β、ＩＬ−８から選ばれる１種又は２種の炎症性サイトカインの産生抑制剤の製造のための、分子量が１００〜１０，０００の範囲に８０％以上分布する卵白加水分解物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は卵白加水分解物を有効成分とする炎症を抑制又は軽減する作用を有する抗炎症剤及び／又は抗炎症用飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症とは異物の侵入や組織の障害といった生体組織にとって好ましくない刺激が発生した時に免疫系が引き起こす局所的な防御反応であり、生体にとっての非自己の排除を助ける。
しかし、一方で自己である生体そのものにも一定の損傷や苦痛を引き起こす性質も持つ。生体の引き起こした炎症が過剰に人体を傷つけている例としてアレルギー疾患、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患等が知られている。これらの疾患に対しては炎症を抑制する必要があり、従来、ステロイド性又は非ステロイド性抗炎症剤が広く用いられている。しかし、これら従来の抗炎症剤には白血球や血小板異常、過敏症、消化管障害などの副作用があるため、使用が制限されることがある（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
近年、炎症の発生の進展に深く関与している種々のサイトカイン及び炎症性酵素が明らかになるに従い、これらサイトカイン及び炎症性酵素の作用をコントロールすることによる薬剤の開発が行なわれつつある。炎症を引き起こす原因因子として関与する炎症性サイトカインとしてはＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８等が、炎症性酵素としてはＣＯＸ−２が知られている。一方、炎症症状を抑制する働きをもつ抗炎症性サイトカインとしてはＩＬ−１０、ＴＧＦ−β等が知られている。このような炎症性サイトカイン、炎症性酵素と抗炎症性サイトカインのバランスが崩れると、自己免疫疾患などの疾患を引き起こすことが知られている（例えば、特許文献２及び３参照。）。
【特許文献１】特開２００８−６９１１１号公報（第２頁）
【特許文献２】特開２００７−２２３９１０号公報（第２頁）
【特許文献３】特開２００８−７５０５号公報（第２頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は炎症性サイトカイン、炎症性酵素、抗炎症性サイトカインに対して作用する抗炎症剤及び／又は抗炎症用飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは種々の物質の炎症性サイトカイン、炎症性酵素、及び抗炎症性サイトカインに対する作用について検討してきたところ、卵白加水分解物に優れた炎症性サイトカイン、炎症性酵素の産生抑制作用、抗炎症サイトカインの産生の低下抑制作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、卵白加水分解物を有効成分とする炎症性サイトカイン及び／又は炎症性酵素の産生抑制、及び／又は抗炎症サイトカインの産生の低下抑制による抗炎症剤及び／又は抗炎症用飲食品を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
卵白加水分解物は上述のように、明らかに炎症の予防・治療効果を有しており、これを抗炎症剤、及び／又は抗炎症用飲食品として摂取することにより、炎症、特に炎症性腸疾患を治療もしくは予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明における抗炎症とは炎症を引き起こす原因因子として関与する炎症性サイトカイン及び／又は炎症性酵素の産生を抑制すること、及び／又は炎症によって産生が抑制される抗炎症性サイトカインの産生の低下を抑制することをいう。
【０００８】
本発明における卵白加水分解物とは、鶏卵卵白をタンパク質加水分解酵素で分解したものである。卵白加水分解物の分子量は、特に限定されるものではないが、分子量が１００〜１０，０００の範囲に８０％以上分布するものが好ましい。分子量が１００以下のものが多い場合は苦味が強くなるという問題がある。また、分子量が１０，０００以上のものが多い場合は加熱凝固し易くなり、抗炎症剤及び／又は抗炎症用飲食品を製造する際に加工上問題となる場合がある。
【０００９】
卵白加水分解物は、種々の加工食品に好ましい物性を付与することが知られているが、このものが炎症性作用を有することは従来知られていなかった。しかし、本発明者らの研究によると、上述のような卵白加水分解物を抗炎症剤及び／又は抗炎症用飲食品として、これを成人１日当たり１〜７０ｇ、好ましくは１〜２０ｇを継続して摂取をつづけるとき、炎症の発症や抑制、治療効果が認められることが見出された。卵白は日常摂取されているものであり、本発明において使用される量では毒性は知られていない。
【００１０】
本発明の抗炎症剤の投与形態は、投与目的、疾患の種類、症状によって異なり、特に限定されないが、剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、液剤等にして直接投与したり、食品や飲水に混ぜて投与することができ、経口的に投与することが望ましい。また、これらの剤型は、従来から知られている通常の方法で製造することができ、製剤上許可されている担体や賦型剤等と混合して成型できる。
【００１１】
本発明の抗炎症用飲食品では卵白加水分解物と配合する材料は特に限定されるものではなく、他の糖類、食物繊維、脂質、アミノ酸、蛋白質、さらにこれらに必要に応じて、乳酸菌、ビタミン、ミネラルのようなその他の機能性を有する物質を添加することができる。
【００１２】
本発明の抗炎症用飲食品の摂取方法としては、例えば、飲料、クッキー、スナック菓子、乳製品などの種々の食品とすることができるほか、例えば適当な増量剤、賦形剤などを用いて錠剤状、液状、シロップ状、顆粒状などの健康食品、流動食の形態にすることもできる。流動食の場合は、経口、及び経管での摂取が可能である。卵白加水分解物は、様々な食品に添加することが可能であることから容易に摂取することが可能である。
【００１３】
以下、実施例をあげて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００１４】
実施例１
卵白加水分解物の調製
鶏卵卵白液１５ｋｇに中性プロテアーゼ（商品名：プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ  天野エンザイム（株）製）１０ｇを添加し、４５℃において２０時間反応を行った。次に８０℃、３０分の加熱処理を行い酵素を失活させ濾過した。濾液を噴霧乾燥し、卵白加水分解物を１．３ｋｇ得た。得られた卵白加水分解物について、高速液体クロマトグラフィー１０５０システム（ヒューレットパッカード社製）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。分析用カラムには、スーパーデックスペプチド（ファルマシア（株）製）を用い、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を０．５ｍｌ／分の流速で流し、２２０ｎｍで検出した。測定の結果、得られた卵白加水分解物の分子量は２００００〜５０の間にピークが見られ、分子量１００〜１００００以下の画分は９２．２％であった。
【００１５】
試験例
同一の雌豚から生まれた４日齢の子豚１２匹を試験に用いた。
試験期間中、子豚には液体の調製乳を一日３回（午前９時、正午、午後４時）与えた。新しい環境に適応２、３日後、胃にＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）や卵白加水分解物を注入するために、胃にカテーテルを設置した。大腸炎の誘発はＤＳＳの投与によって引き起こした。子豚は無作為に３群（卵白加水分解物投与群、ポジティブコントロール群、ネガティブコントロール群）に分けた。卵白加水分解物投与群にはＤＳＳを体重１ｋｇあたり１．２５ｇを５日間カテーテルから投与した。続いて体重１ｋｇあたり１５０ｍｇの卵白加水分解物を５日間カテーテルから投与した。ポジティブコントロール群にはＤＳＳを体重１ｋｇあたり１．２５ｇを５日間カテーテルから投与した。続いて塩水を５日間カテーテルから投与した。ネガティブコントロール群にはＤＳＳ、卵白加水分解物、生理食塩水は体重１ｋｇあたり１０ｍｌになるように溶解し、一日あたり２回に分けて投与した。ネガティブコントロール群は１０日間生理食塩水を投与した。ＤＳＳ、卵白加水分解物、塩水は予め３７℃に温めて投与した。子豚は２０日に解剖した。空腸、及び結腸は採取され組織分析、ＥＬＩＳＡ、及びｑＲＴ−ＰＣＲに供した。一部の組織は解剖後直ちにホルマリンで固定し、２４時間後に組織は７０％エタノールに移し変えた。残りの組織はすりつぶし、均質化して、上清をＥＬＩＳＡ、及びｑＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００１６】
体重、及び飼料摂取は３群において差は認められなかった。ＤＳＳ投与によって軽度から重度の下痢が起こったが、試験終了時には回復した。
【００１７】
固定した組織は２−３ｍｍの厚さに切り、組織カセットにセットした後、７０％エタノールに浸した。ヘマトキシリン＆エオシンで染色し、薄層にした後にスライドに固定した。
炎症の程度は表１に示す指標に従って評価した。結果を図１〜３に示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
図１よりＩｎｆｌａｍａｔｉｏｎ（炎症）は卵白加水分解物投与によってネガティブコントロールと同等のレベルまで低下した。
【００２０】
図２よりＥｘｔｅｎｔ（炎症の深さ）は蛋白質加水分解酵素を投与することによって低下することが認められた。
【００２１】
図３よりＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（組織の修復）は卵白加水分解物を投与することによって進むことが認められた。
【００２２】
実施例２
炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、及びＩＬ−６について結腸での産生量をＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。分析にはＴｈｅ  Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用し、添付のマニュアルに従って分析した。結果を図４及び５に示す。
【００２３】
図４よりＤＳＳ投与によって上昇する結腸でのＴＮＦ−αの発現量は卵白加水分解物投与によってネガティブコントロールと同等のレベルまで低下した。
【００２４】
図５よりＤＳＳ投与によって上昇する結腸でのＩＬ−６の発現量は卵白加水分解物投与によってネガティブコントロールと同等のレベルまで低下した。
【００２５】
実施例３
炎症に関連するサイトカイン、酵素、及び抗炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現量をｑＰＣＲ］を用いて評価した。炎症性サイトカインはＩＬ−１β、及びＩＬ−８、炎症性酵素はＣＯＸ−２、抗炎症性サイトカインはＩＬ−１０、ＴＧＦ−βを評価した。ｍＲＮＡはまずＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔで抽出した。２０ｍｇの組織をＲＬＴバッファーと共に均質化し１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を回収した。等量の７０％エタノールを加え、ピペッティングし、７００μｌを２ｍｌ回収チューブの付いたＲＮｅａｓｙスピンカラムに移した。チューブは１００００ｒｐｍで１５秒遠心し、カラムに回収された液は廃棄した。ＲＷ１バッファー７００μｌをＲＮｅａｓｙスピンカラムに加え、１００００ｒｐｍ、１５秒遠心し、スピンカラム膜を洗浄した。カラムに回収された液は廃棄した。ＲＰＥバッファー５００μｌをＲＮｅａｓｙスピンカラムに加え、１００００ｒｐｍ、２分遠心しスピンカラム膜を洗浄した。再度、ＲＰＥバッファー５００μｌをＲＮｅａｓｙスピンカラムに加え、１００００ｒｐｍ、２分遠心しスピンカラム膜を洗浄した。ＲＮｅａｓｙスピンカラムを新しい回収チューブに移しＲＮａｓｅフリー水を５０μｌ加え、１００００ｒｐｍ、１分間遠心し、ＲＮＡを溶出させた。ＲＮＡはｃＤＮＡ合成するまで−８０℃で保管した。
【００２６】
抽出されたＲＮＡから残存しているゲノムＤＮＡを取り除くため、ｇＤＮＡ  Ｗｉｐｅｏｕｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（７Ｘ）と混合し、４２℃、２分間インキュベートした。その後直ちに氷冷した。Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ１μｌ、Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（５Ｘ）４μｌ、ＲＴ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ１μｌを氷上で混合し逆転写マスターミックスを調製した。ゲノムＤＮＡを取り除いたＲＮＡ１４μｌは逆転写マスターミックスに加えられ４２℃、１５分間インキュベートした。その後直ちに９５℃、３分間Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ逆転者酵素を失活させた。調製されたｃＤＮＡはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲをするまで−２０℃で保管した。
【００２７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのサンプル調整にはＱＩＡＧＥＮ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔを使用した。添付マニュアルに従ってサンプルを調整し、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ検出システムで実施した。結果を図６〜１０に示す。
【００２８】
図６よりＤＳＳ投与によって上昇する結腸での炎症性サイトカインＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現量は卵白加水分解物投与によって上昇を抑制した。
【００２９】
図７よりＤＳＳ投与によって上昇する結腸での炎症性サイトカインＩＬ−８のｍＲＮＡ発現量は卵白加水分解物投与によって上昇を抑制した。
【００３０】
図８よりＤＳＳ投与によって上昇する結腸での炎症性酵素ＣＯＸ−２のｍＲＮＡ発現量は卵白加水分解物投与によって上昇を抑制した。
【００３１】
図９よりＤＳＳ投与によって低下する結腸での抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現量は卵白加水分解物投与によって低下を抑制した。
【００３２】
図１０よりＤＳＳ投与によって低下する結腸での抗炎症性サイトカインＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現量は卵白加水分解物投与によって低下を抑制した。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明で得られた卵白加水分解物を有効成分とする抗炎症剤はＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）を投与して誘発させた炎症の豚への投与試験で、炎症性サイトカイン及び／又は炎症性酵素の産生を抑制及び／又は抗炎症性サイトカインの低下を抑制し、各種飲食品、医薬品等に利用して、炎症を抑制又は軽減することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】各群での炎症の程度を比較した図である。
【図２】各群での炎症の深さを比較した図である。
【図３】各群での組織の修復を比較した図である。
【図４】各群での結腸におけるＴＮＦ−αの発現量を比較した図である。
【図５】各群での結腸におけるＩＬ−６の発現量を比較した図である。
【図６】各群での結腸における炎症性サイトカインＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現量を比較した図である。
【図７】各群での結腸における炎症性サイトカインＩＬ−８のｍＲＮＡ発現量を比較した図である。
【図８】各群での結腸における炎症性酵素ＣＯＸ−２のｍＲＮＡ発現量を比較した図である。
【図９】各群での結腸における抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現量を比較した図である。
【図１０】各群での結腸における抗炎症性サイトカインＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現量を比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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