(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受諾番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５５で寄託されたピキア・クドリアブゼビ（Ｐｉｃｈｉａ  Ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）であるアルコール発酵性酵母。
【請求項２】
請求項１記載のアルコール発酵性酵母を使用し、セルロースを原料とするエタノール製造方法。
【請求項３】
請求項２記載のエタノール製造方法において、同時糖化発酵によりエタノールを生成するエタノール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性を有するアルコール発酵性酵母及びこれを用いたエタノール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
木質等のセルロース系の原料からバイオエタノールを製造する際、セルロースからグルコースに糖化する糖化工程において、酵素（セルラーゼ、触媒）コストが高いという問題がある。
セルラーゼはグルコースによる生成物阻害を受けるため、グルコースが２％以上になると、セルロースからグルコースに糖化する反応が進まなくなる。
そこで、次式（１）に示すような、同時糖化発酵（併行複発酵）技術が存在する。この同時糖化発酵技術は、セルロースからグルコースに転換する糖化工程と、酵母によりグルコースからエタノールに転換する発酵工程とを同時に行う技術である。
【０００３】
セルロース（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎ＋水（ｎＨ２Ｏ）
→  グルコース（ｎＣ６Ｈ１２Ｏ６）
→  エタノール（２ｎＣ２Ｈ５ＯＨ）＋二酸化炭素（２ｎＣＯ２）      ・・・式（１）
【０００４】
ここで、一般に、糖化工程の至適温度は６０℃であるが、一般的な発酵工程の至適温度は３０℃であるため、同時糖化発酵は３０℃で行わざるを得ない。この温度では、糖化工程における酵素活性は６０℃の時の約半分になる。
そのため、より高い温度条件下であっても、高い効率でエタノール発酵できる酵母が求められている。
なお、従来の耐熱性を有する酵母として、特許文献１に記載された耐熱性エタノール生産酵母が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０６２５５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、耐熱性を有するアルコール発酵性酵母及びこれを用いたエタノール製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的に沿う第１の発明に係るアルコール発酵性酵母は、ピキア・クドリアブゼビ（Ｐｉｃｈｉａ  Ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５５）である。
【００１１】
前記目的に沿う第２の発明に係るエタノール製造方法は、第１の発明に係るアルコール発酵性酵母を使用する。
【００１２】
第２の発明に係るエタノール製造方法は、セルロースを原料とする。
【００１３】
第２の発明に係るエタノール製造方法において、同時糖化発酵によりエタノールを生成することができる。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１記載のアルコール発酵性酵母においては、一般酵母よりも耐熱性が高いので、高い発酵温度下でエタノールを効率的に生成できる。
【００１５】
また、一般酵母よりもフルフラール耐性が高いので、原料がフルフラールを含有していてもエタノールを効率的に生成することができる。
【００１６】
請求項２及び３記載のエタノール製造方法においては、一般酵母を使用する場合よりも、高い発酵温度下でエタノールを効率的に生成することができる。
【００１７】
請求項２及び３記載のエタノール製造方法においては、セルロースを原料としているので、一般酵母を使用する場合に比べて、エタノールを効率的に生成することができる。
【００１８】
特に、請求項３記載のエタノール製造方法においては、同時糖化発酵により、エタノールを効率的に生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｐ−１０５５株の塩基配列を示す説明図である。
【図２】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ、３０℃、４３℃、４５℃におけるＰ−１０５５株のエタノール発酵を示すグラフである。
【図３】Ｐ−１０５５株の耐熱性を示すグラフである。
【図４】Ｐ−１０５５株の耐エタノール性を示すグラフである。
【図５】Ｐ−１０５５株のフルフラール耐性を示すグラフである。
【図６】Ｐ−１０５５株のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図７】食塩濃度がＰ−１０５５株に与える影響を示すグラフである。
【図８】食塩濃度が各酵母に与える影響を示すグラフである。
【図９】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ、４０℃、４３℃におけるＰ−１０５５株によるエタノール製造結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
続いて、添付した図面を参照しつつ、本発明の実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の一実施の形態に係るアルコール発酵性酵母は、耐熱性を有するピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母である。本実施の形態に係るアルコール発酵性酵母を使用することにより、例えばセルロースを含んだ木質系のバイオマス原料からエタノールを製造できる。
【００２１】
なお、以下、「耐熱性」とは、発酵温度４０〜４３℃の範囲内のいずれの温度においても、８０％以上の収率でエタノール発酵することが可能な酵母の性質をいう。
また、「耐エタノール性」とは、原料の初期エタノール濃度が０．０〜５．０％ｖ／ｖの範囲内のいずれの濃度であっても、７０％以上の収率でエタノール発酵することが可能な酵母の性質をいう。
また、「フルフラール耐性」とは、原料のフルフラール濃度が０．０〜０．２％ｖ／ｖの範囲内のいずれの濃度であっても、２５％以上の収率でエタノール発酵することが可能な酵母の性質をいう。
また、「耐塩性」とは、原料の食塩濃度が０．０〜４．０％ｗ／ｖの範囲内のいずれの濃度であっても、６０％以上の収率でエタノール発酵することが可能な酵母の性質をいう。
なお、前述の耐熱性、フルフラール耐性、耐エタノール性、又は耐塩性を有さないアルコール発酵性酵母を「一般酵母」という場合がある。
以下、本発明を実施例により説明する。
【実施例１】
【００２２】
（新規酵母の分離）
佐賀県にある嬉野温泉の源泉付近の土壌をサンプルとして採取した。サンプルをＹＰＤ寒天培地（酵母抽出物１%、ペプトン２%、グルコース２%含有）に塗沫し、３０℃にて約２日間培養した。
培養シャーレにコロニー形成した各種酵母を、各々ピックアップしてＹＰＤ培地（酵母抽出物２%、ペプトン2%、グルコース１０％含有、ｐＨ６．５〜７．０）にて純粋培養した。
【００２３】
（酵母のスクリーニング）
純粋培養した各酵母の中から、耐熱性を有する酵母をスクリーニングした。
具体的には、培養温度を３０℃、３５℃、４０℃、４３℃、４５℃とした糖液を原料として、それぞれエタノール発酵を行った。その結果、各培養温度について、エタノール発酵性の優れた株を耐熱性株とした。そして、これら耐熱性株の中でも特に耐熱性が高い株を寄託した（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５５）。以下、本明細書中において、この寄託した株を「Ｐ−１０５５株」と呼ぶ。
【００２４】
（Ｐ−１０５５株の同定）
Ｐ−１０５５株からＤＮＡを抽出し、Ｄ２ＬＳＵｒＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物について、ダイレクトシーケンスにより塩基配列を決定した（図１参照）。この塩基配列に基づいて、データベース上で既知の微生物のＤ２ＬＳＵｒＤＮＡ配列とのブラスト（ＢＬＡＳＴ）検索を行い、近縁種と推定される微生物を特定した。その結果、表１に示すように、Ｐ−１０５５株はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属クドリアブゼビ（Ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）種の酵母であることが明らかとなった。
【００２５】
【表１】
0005813369.tif 000002
【００２６】
（菌学的性質）
Ｐ−１０５５株は、以下の菌学的性質を有する。
１．細胞形状      ：球状
２．コロニー形状  ：白色（光沢無）、皺状
３．増殖形式      ：多極出芽
４．最適生育温度  ：３０℃
５．最適生育ｐＨ  ：４．０
６．凝集性        ：なし
７．資化性        ：表２参照
【００２７】
【表２】
0005813369.tif 000003
【実施例２】
【００２８】
（耐熱性試験）
発酵温度３０℃、４３℃、４５℃にて、２４時間バッチ発酵試験をそれぞれ実施し、Ｐ−１０５５株を用いてエタノールが生成されるか否かについて調べた。試験条件は以下の通りである。
＜試験条件＞
１．振とう数：１２０ｒｐｍ（振幅１０ｍｍ）
２．発酵時間：２４時間
３．原料：ＹＰＤ培地
【００２９】
結果を図２（Ａ）〜（Ｃ）に示す。各図中、横軸は経過時間（ｈ）を示している。また、左縦軸はエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、右縦軸は、酵母濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を示している。
各図から明らかなように、各発酵温度において時間が経過するに伴って、糖（グルコース）が消費されると共にエタノールが生成された。特に、発酵温度が４３℃及び４５℃であっても、エタノールが生成されたことから、Ｐ−１０５５株は、高温下でのエタノール発酵能力を有している。
【００３０】
（エタノール発酵の温度依存性試験）
発酵温度３０℃、３５℃、４０℃、４３℃、４５℃にて、２４時間バッチ発酵試験をそれぞれ実施し、エタノール発酵の温度依存性について調べた。試験条件は以下の通りである。
＜試験条件＞
１．振とう数：１２０ｒｐｍ（振幅１０ｍｍ）
２．発酵時間：２４時間
３．原料：ＹＰＤ培地
【００３１】
結果を図３に示す。図中、横軸は温度（℃）を示している。縦軸はエタノール発酵収率（％）を示している。
Ｐ−１０５５株、一般酵母Ａ（Ｐ−１０５５株とは異なるピキア属の酵母）及び一般酵母Ｂ（サッカロマイセス・セルビジエ）は、共に発酵温度４０〜４５℃の温度範囲で、エタノール発酵収率が低下する。
しかし、Ｐ−１０５５株は、一般酵母Ａ（Ｐ−１０５５株とは異なるピキア属の酵母）及び一般酵母Ｂ（サッカロマイセス・セルビジエ）よりもエタノール発酵収率の低下率が抑えられている。
【００３２】
（耐エタノール性試験）
一般に、エタノール濃度が高くなると、エタノール発酵収率が低下する。そこで、Ｐ−１０５５株について、エタノール濃度とエタノール発酵収率との関係について調べた。
発酵前のエタノール濃度（初期エタノール濃度）を変更して、それぞれ２４時間バッチ発酵試験を実施した。試験条件は以下の通りである。
＜試験条件＞
１．振とう数：１２０ｒｐｍ（振幅１０ｍｍ）
２．発酵時間：２４時間
３．原料：ＹＰＤ培地
４．発酵温度：３０℃
【００３３】
結果を図４に示す。図中、横軸は初期エタノール濃度（％ｖ／ｖ）を示している。縦軸はエタノール発酵収率（％）を示している。
Ｐ−１０５５株については、初期エタノールの濃度が高くなっても、一般酵母Ｂ（サッカロマイセス・セルビジエ）よりもエタノール発酵収率の低下率が抑えられている。詳細には、Ｐ−１０５５株は、原料の初期エタノール濃度が０．０〜５．０％ｖ／ｖの範囲内のいずれの濃度であっても、７０％以上の収率でエタノール発酵することが可能であり、耐エタノール性を有している。
【００３４】
（フルフラール耐性試験）
フルフラールは、糖の過分解物質であり、セルロースを熱処理した際に発生する。フルフラールは、発酵阻害物質である。そこで、Ｐ−１０５５株について、フルフラール濃度とエタノール発酵収率との関係について調べた。
フルフラール濃度を変更して、それぞれ２４時間バッチ発酵試験を実施した。試験条件は以下の通りである。
＜試験条件＞
１．振とう数：１２０ｒｐｍ（振幅１０ｍｍ）
２．発酵時間：２４時間
３．原料：ＹＰＤ培地
４．発酵温度：３０℃
【００３５】
結果を図５に示す。図中、横軸はフルフラール濃度（％ｖ／ｖ）を示している。縦軸はエタノール発酵収率（％）を示している。
Ｐ−１０５５株については、フルフラール濃度が高くなっても、一般酵母Ｂ（サッカロマイセス・セルビジエ）よりもエタノール発酵収率の低下率が抑えられている。詳細には、Ｐ−１０５５株は、原料のフルフラール濃度が０．０〜０．２％ｖ／ｖの範囲内のいずれの濃度であっても、２５％以上の収率でエタノール発酵することが可能であり、フルフラール耐性を有している。
【００３６】
（ｐＨ依存性試験）
原料のｐＨを変更して、それぞれ２４時間バッチ発酵試験を実施し、ｐＨに対する依存性について、一般酵母Ｂ（サッカロマイセス・セルビジエ）と比較した。試験条件は以下の通りである。
＜試験条件＞
１．振とう数：１２０ｒｐｍ（振幅１０ｍｍ）
２．発酵時間：２４時間
３．原料：ＹＰＤ培地
４．発酵温度：３０℃
【００３７】
結果を図６に示す。図中、横軸は発酵前の原料のｐＨ（初期ｐＨ）を示している。縦軸はエタノール発酵収率（％）を示している。
Ｐ−１０５５株については、初期ｐＨが３〜９の範囲で、一般酵母Ｂよりもエタノール発酵収率が高い。従って、Ｐ−１０５５株は、一般酵母ＢよりもｐＨに対する依存性が低い。
【００３８】
（耐塩性試験［１］）
原料の食塩濃度を変更して、それぞれ２４時間バッチ発酵試験を実施し、耐塩性について調べた。試験条件は以下の通りである。
＜試験条件＞
１．振とう数：１２０ｒｐｍ（振幅１０ｍｍ）
２．発酵時間：２４時間
３．原料：ＹＰＤ培地
４．発酵温度：３０℃
【００３９】
結果を図７に示す。図中、横軸は原料の食塩濃度（％ｗ／ｖ）を示している。縦軸はエタノール濃度（％）及びエタノール発酵収率（％）を示している。
Ｐ−１０５５株については、原料の食塩濃度が０．０〜４．０％ｗ／ｖの範囲内のいずれの濃度であっても、エタノール濃度が３８ｇ／Ｌ以上、エタノール発酵収率が６０％以上である。従って、Ｐ−１０５５株は、耐塩性を有している。
【００４０】
（耐塩性試験［２］）
Ｐ−１０５５株の耐塩性について、一般酵母Ａ（Ｐ−１０５５株とは異なるピキア属の酵母）及び一般酵母Ｂ（サッカロマイセス・セルビジエ）との比較を行った。
原料の食塩濃度を４．０％ｗ／ｖとし、２４時間バッチ発酵試験を実施した。試験条件は以下の通りである。
＜試験条件＞
１．振とう数：１２０ｒｐｍ（振幅１０ｍｍ）
２．発酵時間：２４時間
３．原料：ＹＰＤ培地
４．発酵温度：３０℃
【００４１】
結果を図８に示す。図中、縦軸はエタノール濃度（％）及びエタノール発酵収率（％）を示している。
本試験においては、Ｐ−１０５５株は、一般酵母Ａ、Ｂよりもエタノール濃度及びエタノール発酵収率がともに高かった。
従って、Ｐ−１０５５株により、例えば海水や、高い塩分を含む生ごみを使用してエタノール発酵できる。
【実施例３】
【００４２】
（エタノール製造試験）
発酵温度４０℃及び４３℃にて、繰り返し回分によるエタノール発酵を行った。試験条件は、以下の通りである。
＜試験条件＞
１．発酵温度：４０℃、４３℃
２．攪拌速度：１２０ｒｐｍ
３．発酵時間：２４時間
４．原料：ＹＰＤ培地
【００４３】
結果を図９（Ａ）及び図９（Ｂ）にそれぞれ示す。各図中、横軸は発酵回数を示している。左縦軸はエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、右縦軸は酵母濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を示している。
各図から明らかなように、各発酵温度にて、複数回エタノール発酵を行うことができた。また、各発酵温度について、エタノール発酵収率は８０％以上であった。
従って、Ｐ−１０５５株は、発酵温度４０〜４３℃の範囲内のいずれの温度においても、８０％以上の収率でエタノール発酵することが可能であり、耐熱性を有している。
このように、Ｐ−１０５５株は耐熱性を有していることから、Ｐ−１０５５株を使用して、同時糖化発酵によりエタノールを生成できる。
【００４４】
なお、本発明は、前述の実施の形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲での変更は可能である。
【図１】
0005813369.tif 000004
【図２】
0005813369.tif 000005
【図３】
0005813369.tif 000006
【図４】
0005813369.tif 000007
【図５】
0005813369.tif 000008
【図６】
0005813369.tif 000009
【図７】
0005813369.tif 000010
【図８】
0005813369.tif 000011
【図９】
0005813369.tif 000012