(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を少なくとも含むフェルラ酸含有画分の製造方法であって、
前記フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記の乳酸菌群から選択され、
乳酸菌群：ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブクネリ
前記フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記性質（Ａ）及び（Ｂ）を有するものである、フェルラ酸含有画分の製造方法；
性質（Ａ）：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質、
性質（Ｂ）：フェルラ酸を０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質。
【請求項２】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記乳酸菌群から選択される、請求項１に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法；
乳酸菌群：ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株、ラクトバチルス・ブクネリＮＣＦＢ１６５２株。
【請求項３】
前記培養後の植物素材中からフェルラ酸を精製する工程をさらに含む、請求項１または２に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法。
【請求項４】
植物素材が、野菜、穀物、果物、草類、豆類、芋類、種子、米ぬか、ふすまからなる群から選択される素材に由来するものである、請求項１から３のいずれか１項に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法。
【請求項５】
植物素材が食物繊維分解酵素により酵素処理されたものである、請求項１から４のいずれか１項に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法。
【請求項６】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌及びフェルラ酸を少なくとも含有する、植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品であって、
前記フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記の乳酸菌群から選択され、
乳酸菌群：ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブクネリ
前記フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記性質（Ａ）及び（Ｂ）を有するものである、乳酸菌発酵飲食品；
性質（Ａ）：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質、
性質（Ｂ）：フェルラ酸を０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質。
【請求項７】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記乳酸菌群から選択される、請求項６に記載のフェルラ酸含有画分の乳酸菌発酵飲食品；
乳酸菌群：ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株、ラクトバチルス・ブクネリＮＣＦＢ１６５２株。
【請求項８】
植物素材が、野菜、穀物、果物、草類、豆類、芋類、種子、米ぬか、ふすまからなる群から選択される素材である、請求項６から７のいずれか１項に記載の乳酸菌発酵飲食品。
【請求項９】
下記ステップ：
ステップ（ａ）：フェルラ酸エチルを含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたフェルラ酸を定量するステップ、
ステップ（ｂ）：フェルラ酸を含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたジヒドロフェルラ酸を定量するステップ、
ステップ（ｃ）：検体乳酸菌の下記性質（Ｃ）及び（Ｄ）の有無を評価し、フェルラ酸産生能を判定するステップ、を少なくとも含み、
前記ステップ（ａ）（ｂ）において下記性質、を有する、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法；
性質（Ｃ）：ステップ（ａ）において、フェルラ酸エチルに対して一定割合以上のフェルラ酸を産生する性質、
性質（Ｄ）：ステップ（ｂ）において、フェルラ酸に対して一定割合以上のジヒドロフェルラ酸を産生しない性質。
【請求項１０】
請求項９に記載のスクリーニング方法によってフェルラ酸産生能を有すると判定された乳酸菌であって、
前記フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記の乳酸菌群から選択され、下記性質を有する乳酸菌；
乳酸菌群：ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブクネリ
性質（Ａ）：フェルラ酸エチルを０． ０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質、
性質（Ｂ）：フェルラ酸を０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を含むことを特徴とするフェルラ酸含有画分の製造方法に関する。また、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌及びフェルラ酸を含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物体内には多様なフェノール性化合物が含まれており、中でもフェルラ酸は広く植物体内に存在し、米ぬかや果物、野菜の皮等に多く含まれていることが知られている。フェルラ酸をはじめとするフェノール性化合物は、フリーラジカルを補足したり、活性酸素を除去したりすることにより、高い抗酸化活性を示すことが報告されている。また、フェルラ酸の機能性については多数の報告があり、抗腫瘍（抗酸化）、糖尿病改善（インスリン分泌促進、血糖値降下）、心血管疾患の改善作用等の他、近年ではアルツハイマー症予防への効果が注目されている。そのため、フェルラ酸の効果的な摂取が、これら疾患の予防・改善につながると考えられている。また、フェルラ酸はその高い抗酸化作用により、食品の酸化防止剤、変色防止剤としても利用されている。
【０００３】
フェルラ酸は、食物中では主に食物繊維（ヘミセルロース）や糖等とエステルの形態で結合しており、そのままの状態では生体内での吸収性が悪い。結合型のフェルラ酸は、腸内細菌等により分解を受けることでその一部が遊離のフェルラ酸となり、腸管より吸収されるとされているが、生成したフェルラ酸は腸内細菌により更に代謝されてしまうことも知られている。そのため、個々人の腸内細菌叢によらず、植物素材から機能性の高いフェルラ酸等を効果的に摂取するためには、事前にフェルラ酸を遊離の形に変換しておくことが重要であると考えられる。
【０００４】
植物体からフェルラ酸を遊離する方法として、物理化学的処理、酵素処理、微生物処理等による方法についての報告がある。物理化学的処理法としては、米ぬかから米サラダ油、脂肪酸を抽出した残渣をアルカリ処理してフェルラ酸を生成する方法（特許文献１）があるが、高温でアルカリ処理し、その後抽出操作が必要となるため、工程が煩雑といった課題がある。リグニンを、水蒸気を含む気体で高温高圧処理することにより、フェルラ酸等の化合物量を増加させる方法（特許文献２）も知られているが、高温高圧処理のための設備が必要となり、汎用性は低い。
【０００５】
酵素を用いる方法としては、米ぬかのエタノール抽出物を酵素処理することにより、フェルラ酸を遊離する方法（特許文献３）が知られているが、エタノール抽出とその後の乾燥工程があり、作業が煩雑でエネルギーコストも高い。フェルラ酸エステラーゼやキシラナーゼ、セルラーゼ活性を有する酵素を用いて、遊離フェルラ酸を高含有する発酵アルコール飲料を製造する方法（特許文献４）も報告があるが、実際の工程を考えると、酵素の添加・反応工程が煩雑となり、酵素のコストの問題もある。
【０００６】
微生物を用いる方法としては、ペニシリウム・クリソゲナムの培養液とシュガービートパルプを反応させることによりフェルラ酸を遊離する方法（特許文献５）や、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する麹菌を使用すること特徴とする高香味穀類蒸留酒に関する特許（特許文献６）があるが、これらの微生物はプロテアーゼ等の他の酵素活性も強いため、植物素材の風味を大きく変えてしまう可能性がある。
【０００７】
また、遊離のフェルラ酸を合成する方法として、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を用いて、オイゲノールからフェルラ酸を産生する方法（特許文献７、８）が知られているが、オイゲノールは、過剰摂取により血尿・痙攣・下痢・吐き気・意識喪失・めまい・動悸等の症状があらわれるほか、皮膚に触れるとアレルギー反応により皮膚炎を起こすことがある。そのため、食品に残存した場合の安全性に課題がある。ベンズアルデヒド誘導体を触媒の存在下、マロン酸または無水酢酸と反応させることによりフェルラ酸を誘導させる方法（特許文献９）も知られているが、１３５℃程度に加熱処理する必要があり、そのための設備が必要となるため汎用性が低い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特公平７−７８０３２
【特許文献２】特許第４３９８８６７
【特許文献３】特開２００６−１６６８３４
【特許文献４】特開２０１０−１４８４８５
【特許文献５】特開２００６−６７８０３
【特許文献６】特開２００４−２３６６３４
【特許文献７】特開平９−１５４５９１
【特許文献８】特開平５−２２７９８０
【特許文献９】特許第３２７１８７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、植物素材及び乳酸菌を用いたフェルラ酸含有画分の製造方法、乳酸菌及びフェルラ酸を含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明者らは、食経験があり、安全に食することができる乳酸菌をターゲットとして、フェルラ酸を植物素材から遊離する乳酸菌を探索した結果、一部の乳酸菌において、フェルラ酸を遊離するフェルラ酸エステラーゼ活性を見出した。ところが、驚くべきことに、そのうちの多くの乳酸菌はフェルラ酸をさらに代謝する活性をもっていた。本発明者らは鋭意検討の結果、フェルラ酸エステラーゼ活性を持ち、且つフェルラ酸代謝活性を持たないか又は一定以下のフェルラ酸代謝活性を持つ乳酸菌を取得することに成功した。このような乳酸菌で植物素材を発酵させることにより、機能性成分であるフェルラ酸を遊離、蓄積することができ、摂食した際のフェルラ酸の吸収性・機能性を高めた飲食品を提供することができる。さらに、本発明は、フェルラ酸を遊離、蓄積する乳酸菌を取得するための方法として、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法を提供する。
【００１１】
すなわち、本発明は下記（１）から（１５）を提供する。
（１）フェルラ酸産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を少なくとも含むことを特徴とする、フェルラ酸含有画分の製造方法。
（２）フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記性質（Ａ）及び（Ｂ）を有するものである、上記（１）に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法；
性質（Ａ）：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質、
性質（Ｂ）：フェルラ酸を０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質。
（３）フェルラ酸産生能を有する乳酸菌がラクトバチルス属の乳酸菌である、上記（１）又（２）に記載の製造方法。
（４）フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記乳酸菌群から選択、上記（３）に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法；
乳酸菌群：ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ブクネリ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・デルブルイッキー。
（５）前記培養後の植物素材中からフェルラ酸を精製する工程をさらに含むことを特徴とする、上記（１）から（４）のいずれか１項に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法。
（６）植物素材が、野菜、穀物、果物、草類、豆類、芋類、種子、米ぬか、ふすま等からなる群から選択される素材に由来するものである、上記（１）から（５）のいずれか１項に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法。
（７）植物素材が食物繊維分解酵素により酵素処理されたものである、上記（１）から（６）のいずれか１項に記載のフェルラ酸含有画分の製造方法。
（８）フェルラ酸産生能を有する乳酸菌及びフェルラ酸を少なくとも含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品。
（９）フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記性質（Ａ）及び（Ｂ）を有するものである、上記（８）に記載の乳酸菌発酵飲食品；
性質（Ａ）：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質、
性質（Ｂ）：フェルラ酸を０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質。
（１０）フェルラ酸産生能を有する乳酸菌がラクトバチルス属の乳酸菌である、上記（８）又は（９）に記載の乳酸菌発酵飲食品。
（１１）フェルラ酸産生能を有する乳酸菌が下記乳酸菌群から選択される乳酸菌である、上記（１０）に記載の乳酸菌発酵飲食品；
乳酸菌群：ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ブクネリ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・デルブルイッキー。
（１２）植物素材が、野菜、穀物、果物、草類、豆類、芋類、種子、米ぬか、ふすま等からなる群から選択される素材である、上記（８）から（１１）のいずれか１項に記載の乳酸菌発酵飲食品。
（１３）下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法；
ステップ（ａ）：フェルラ酸エチルを含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたフェルラ酸を定量するステップ、
ステップ（ｂ）：フェルラ酸を含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたジヒドロフェルラ酸を定量するステップ、
ステップ（ｃ）：検体乳酸菌の下記性質（Ｃ）及び（Ｄ）の有無を評価し、フェルラ酸産生能を判定するステップ；
性質（Ｃ）：ステップ（ａ）において、フェルラ酸エチルに対して一定割合以上のフェルラ酸を産生する性質、
性質（Ｄ）：ステップ（ｂ）において、フェルラ酸に対して一定割合以上のジヒドロフェルラ酸を産生しない性質。
（１４）上記（１３）に記載のスクリーニング方法によってフェルラ酸産生能を有すると判定された乳酸菌であって、下記性質を有する乳酸菌；
性質（Ａ）：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質、
性質（Ｂ）：フェルラ酸を０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法によれば、非常に簡便、効率的、安価な方法で、フェルラ酸含有画分を製造することができる。特に、本発明の製造方法は乳酸菌発酵を利用するため、特別な設備を必要とせず、１０℃から５０℃といったコントロールしやすい温度帯で野菜素材中のフェルラ酸量を増加させることができる。また、原料として植物素材を用いるため、得られるフェルラ酸含有画分は、安全性、栄養価が非常に高く、乳酸菌による発酵のため風味にも優れ、特に飲食品の用途に好適である。フェルラ酸含有画分中の植物由来成分は、フェルラ酸等が生体内で吸収しやすい形態となっているため、摂取した際に高い機能性が期待できるほか、遊離フェルラ酸による保存性の向上、変色防止効果が期待される。
【００１３】
本発明はさらに、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法を提供する。本発明スクリーニング方法によれば、本発明製造方法等に好適に利用できる乳酸菌を効率よくスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地で供試菌株を４８時間培養した後の、培養上清に遊離したフェルラ酸量比を示す。
【図２】フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地で供試菌株を４８時間培養した後の、培養上清に遊離したジヒドロフェルラ酸量比を示す。
【図３】フェルラ酸を０．０５重量％添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地で供試菌株を４８時間培養した後の、培養上清のフェルラ酸（ＦＡ）及びジヒドロフェルラ酸（ＤＨＦＡ）量比を示す。
【図４】米ぬか抽出物を供試菌株で４８時間発酵した後の上清に含まれるフェルラ酸量を示す。発酵していない米ぬか抽出物中のフェルラ酸量を１として相対的に表した。
【図５】キシラナーゼ処理したブロッコリー汁素材を供試菌株で４８時間発酵した後の上清に含まれるフェルラ酸量を示す。発酵していないブロッコリー汁素材中のフェルラ酸量を１として相対的に表す。
【図６】キシラナーゼ処理した米ぬか抽出物を供試菌株で４８時間発酵した後の上清に含まれるフェルラ酸量を示す。発酵していない抽出物中のフェルラ酸量を１として相対的に表す。
【図７】ブロッコリー汁を供試菌株で４８時間発酵した後の上清に含まれるフェルラ酸量を示す。発酵していないブロッコリー汁素材中のフェルラ酸量を１として相対的に表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（１）本発明フェルラ酸含有画分の製造方法
本発明フェルラ酸含有画分の製造方法は、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を少なくとも含むことを特徴とする、フェルラ酸含有画分の製造方法である。
【００１６】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌は、植物素材中で遊離のフェルラ酸の産生に好適な条件で培養したときに、フェルラ酸を遊離できる乳酸菌である限りにおいて特に限定されない。具体的には、植物素材よりフェルラ酸を遊離し、且つフェルラ酸を分解しないか又は分解の程度が一定以下であることを指標として選択することができる。このように選択される乳酸菌は、植物等に含まれるフェノール性化合物が有するエステル結合を切断する活性を持ち、多様な機能性が知られているフェルラ酸を植物素材より遊離することができる。
【００１７】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌としては、下記性質（Ａ）及び（Ｂ）を有するものが例示される。
性質（Ａ）：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質。
性質（Ｂ）：フェルラ酸を０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質。
【００１８】
上記性質（Ａ）、（Ｂ）の有無の試験において、フェルラ酸エチル及びフェルラ酸としては、例えば東京化成工業株式会社などの公知のものを用いることができる。培地としては、乳酸菌の生育に好適なものを用いることができ、例えばＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地や脱脂乳培地など通常用いる培地の中から、最も対象の乳酸菌の生育に適した培地を適宜選択して使用できる。乳酸菌の生育に好適な培養条件を採用し、これにより培養４８時間で乳酸菌数が十分に増え、フェルラ酸又はジヒドロフェルラ酸の産生能を適切に評価できる。遊離したフェルラ酸又はジヒドロフェルラ酸の割合は、培養上清を高速液体クロマトグラフィー法に供し、フェルラ酸エチル、フェルラ酸又はジヒドロフェルラ酸のピーク面積を検出することにより算出できる。培地の種類、至適温度等の培養条件、高速液体クロマトグラフィー法の条件等、より具体的には後述の実施例に記載の方法を採用することができる。性質（Ａ）において、「前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質」における「３０％以上」とは、３０％から１００％であればよいが、４０％以上、５０％以上と割合が高い程好ましい。性質（Ｂ）において、「前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質」としては、中でも「前記フェルラ酸の２０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質」がより好ましく、「前記フェルラ酸の１０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質」さらにより好ましく、ジヒドロフェルラ酸を実質的に遊離しないことが最も好ましい。
【００１９】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌の具体例としては、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、オエノコッカス属、に属する乳酸菌が例示される。ラクトバチルス属としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ブクネリ、ラクトバチルス・デルブルイッキー、ラクトバチルス・ガセリ等が例示される。なかでも、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ブクネリ及びラクトバチルス・ガセリが好ましく、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株、ＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株（何れの株も独立行政法人  産業技術総合研究所に受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９、ＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５、ＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３として寄託されている。以下ＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９、ＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５、ＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３とも記載する。）、ラクトバチルス・ファーメンタムＪＣＭ１１７３株（独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設にて番号ＪＣＭ１１７３として入手可能である。以下ＪＣＭ１１７３とも記載する。）、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株（独立行政法人  産業技術総合研究所に受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１として寄託されている。以下ＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１とも記載する。）、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２株（独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設にて番号ＪＣＭ１１１２として入手可能である。以下ＪＣＭ１１１２とも記載する。）、ラクトバチルス・ブクネリＮＣＦＢ１６５２株（ＢＣＣＭ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｅｌｇｉｕｍにて番号ＬＭＧ１２０００として寄託されている。以下ＮＣＦＢ１６５２とも記載する。）及びラクトバチルス・ガセリＪＣＭ５８１３株（独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設にて番号ＪＣＭ５８１３として入手可能である。以下ＪＣＭ５８１３とも記載する。）がより好ましく、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株及びＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株が最も好ましい。
【００２０】
植物素材とは、結合型、エステル型のフェルラ酸が少量でも含まれるものであれば特に限定されないが、野菜、穀物、果物、草類、豆類、芋類、種子、米ぬか、ふすま等の素材に由来するものが挙げられる。植物素材とは、上記に例示された植物素材等そのものであってもよいが、植物素材を適宜加工等して得られるものであってもよい。加工方法としては、ミキサー等による粉砕等が例示されるが、特に限定されるものではない。乳酸菌が生育するための十分な水分があることが好ましいが、植物素材を調整後に水分を添加などして調整することもできる。
【００２１】
より効率的に植物素材からフェルラ酸を遊離するため、食物繊維分解酵素により植物素材を事前に酵素処理してもよい。使用する酵素としては、キシラナーゼ、セルラーゼ等が例示されるが特に限定されるものではない。例えば、野菜汁に上記酵素を添加し、上記酵素の至適温度で数時間から２日程度酵素反応させて得られる植物素材を用いることにより、より効率的にフェルラ酸を遊離することができる。
【００２２】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する方法は、植物素材中で乳酸菌が生育し、植物素材からフェルラ酸を遊離できる条件である限り特に限定されない。例えば、植物素材に乳酸菌培養物を０．５から１０％程度添加し、乳酸菌が生育可能な温度範囲で1日から７日発酵させることにより培養できるが、これに限定されない。
【００２３】
本発明フェルラ酸含有画分の製造方法によって得られるフェルラ酸含有画分は、植物素材中で乳酸菌を培養して得られる培養物そのものであってもよいが、培養物に添加物等を添加し、又は不純物を除去する等して得られるものであってもよい。また、培養物からフェルラ酸を分画、精製する等して、フェルラ酸濃度がより高いフェルラ酸含有画分とすることもできる。
【００２４】
（２）本発明乳酸菌発酵飲食品
本発明乳酸菌発酵飲食品は、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌、フェルラ酸を少なくとも含有する、植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品である。
【００２５】
フェルラ酸産生能を有する乳酸菌としては、植物素材中で遊離のフェルラ酸の産生に好適な条件で培養したときに、フェルラ酸を遊離できる乳酸菌である限りにおいて特に限定されず、具体的には上記（１）本発明フェルラ酸含有画分製造方法で説明したものを用いることができる。
【００２６】
植物素材としては、上記（１）本発明フェルラ酸含有画分製造方法で説明したものを用いることができる。例えば、野菜汁、果汁等を用いた場合、風味、栄養価が優れた乳酸菌発酵飲料を提供することができる。
【００２７】
本発明乳酸菌発酵飲食品中のフェルラ酸濃度は、植物素材中にどの程度含まれているかによるが、本発明の乳酸菌により、素材中のフェルラ酸量を増加させることができる。
【００２８】
本発明乳酸菌発酵飲食品の製造方法は特に限定されないが、本発明フェルラ酸含有画分の製造方法により製造することができる。
（３）本発明スクリーニング方法
本発明スクリーニング方法は、下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法である；
ステップ（ａ）：フェルラ酸エチルを含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたフェルラ酸を定量するステップ、
ステップ（ｂ）：フェルラ酸を含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたジヒドロフェルラ酸を定量するステップ、
ステップ（ｃ）：検体乳酸菌の下記性質（Ｃ）及び（Ｄ）の有無を評価し、フェルラ酸産生能を判定するステップ；
性質（Ｃ）：ステップ（ａ）において、フェルラ酸エチルに対して一定割合以上のフェルラ酸を産生する性質、
性質（Ｄ）：ステップ（ｂ）において、フェルラ酸に対して一定割合以上のジヒドロフェルラ酸を産生しない性質。
【００２９】
本発明スクリーニング方法によれば、フェルラ酸産生能に優れた乳酸菌をスクリーニングすることができる。
【００３０】
ステップ（ａ）から（ｃ）において、検体乳酸菌とはフェルラ酸産生能の有無の判定対象となる乳酸菌である。ステップ（ａ）及び（ｂ）における培養条件は乳酸菌が好適に生育できる限りにおいて特に限定されず、例えば検体乳酸菌の生育に好適な培地にて至適温度で、乳酸菌数が十分に達する適当な時間（例えば１２から４８時間程度）培養することが例示される。含有するフェルラ酸エチル、フェルラ酸の培地中の濃度も特に限定されないが、例えば０．０１から１重量％、好ましくは０．０５重量％程度が例示される。フェルラ酸、ジヒドロフェルラ酸の定量方法は、例えば高速液体クロマトグラフィー法を採用することができ、例えば上記（１）本発明フェルラ酸含有画分の製造方法で説明した方法を採用することができる。性質（Ｃ）及び（Ｄ）における一定割合とは、所望のフェルラ酸産生能に応じて適宜設定することができ、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％等と設定することができる。
【００３１】
このようにして所望のフェルラ酸産生能を有する乳酸菌をスクリーニングすることができ、例えば下記性質を有する乳酸菌を、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌として得ることができる。
性質（Ａ）：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸として遊離する性質、
性質（Ｂ）：フェルラ酸を０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸の３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離しない性質。
【００３２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例
に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
（フェルラ酸遊離活性を持つ菌株の選抜試験）
試験には表１に示した菌株を使用し、ＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ）にて３７℃（ラクトコッカス・ラクティス及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンスは３０℃）で１６時間培養した。０．０５％フェルラ酸エチル（東京化成工業株式会社）を添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地に菌液を３％接種し、３７℃（ラクトコッカス・ラクティス及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンスは３０℃）にて４８時間培養した。培養上清を分画分子量３ｋＤａのＵＦフィルターに通し、通過液を高速液体クロマトグラフィーにて分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  １２００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを用い、カラムはＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８，Ｓ−５μｍ，１２ｎｍ  （４．６  ｍｍ  ＩＤ×２５０ｍｍ：  ＹＭＣ）  を用いた。溶媒はＡ液：０．０５％  ＴＦＡ  ｉｎ  ５％アセトニトリル、Ｂ液：０．０５％  ＴＦＡ  ｉｎ  ９５％アセトニトリルを用い、Ｂ液の量が、０→３分は２５％、８分までに３０％、９分までに１００％、９→１４分は１００％、１５分までに２５％、１５→２０分は２５％のグラジエントで行った。溶媒流量は１ｍｌ／分、インジェクション量は１０μｌとし、フェルラ酸の検出は３２０ｎｍで、フェルラ酸の代謝産物であるジヒドロフェルラ酸の検出は２１０ｎｍで行った。同定は保持時間で行い、そのピーク面積値から濃度を算出した。
【００３４】
図１に示す通り、供試した４０株のうち１１株が、添加したフェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸に変換した。特にラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株、ＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンスＪＣＭ６９８５株、ラクトバチルス・ガセリＪＣＭ５８１３株の５株はフェルラ酸エチルの８０％以上をフェルラ酸に変換した。それ以外では、ラクトバチルス・ファーメンタムＪＣＭ１１７３株、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２株、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株、ラクトバチルス・ブクネリＮＣＦＢ１６５２株、ラクトバチルス・ガセリＪＣＭ１１３０株、ＪＣＭ１０３１株が３０％以上のフェルラ酸を生成した。一方で、供試した１４株はフェルラ酸エチルを代謝したが、フェルラ酸を蓄積せず、フェルラ酸が更に代謝されたジヒドロフェルラ酸を主に生成した（図２）。また、供試した１４株はフェルラ酸エチルをほとんど代謝しなかった。特に、フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸に変換すると評価された上記１１株の内、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株、ＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２株、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株及びラクトバチルス・ブクネリＮＣＦＢ１６５２株の６株はジヒドロフェルラ酸を実質的に生成せず、ラクトバチルス・ファーメンタムＪＣＭ１１７３株及びラクトバチルス・ガセリＪＣＭ５８１３株は少量のジヒドロフェルラ酸しか生成しなかった。したがって、これら菌株は特にフェルラ酸産生能が高いことが明らかになった。以上のように、一部の乳酸菌において、フェルラ酸エステルからフェルラ酸を遊離し、蓄積する活性があることが見出された。
【００３５】
【表１】
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【実施例２】
【００３６】
（フェルラ酸代謝活性を持たない菌株の評価）
実施例１で評価した菌株のうち、フェルラ酸遊離活性を示した５株と、コントロールとしてジヒドロフェルラ酸を生成した５株を試験に用いた。ＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養した菌液を、０．０５％フェルラ酸を添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地に３％接種し、３７℃にて４８時間培養した。培養上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにてフェルラ酸、ジヒドロフェルラ酸を定量した。
【００３７】
図３に示す通り、実施例１でジヒロドフェルラ酸のみを産生していたＪＣＭ１１３１株、ＪＣＭ１１３２株、ＪＣＭ１１８５株、ＪＣＭ１１２６株、ＪＣＭ２０１０株は、添加したフェルラ酸をほぼ全てジヒドロフェルラ酸に変換した。一方、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株、ラクトバチルス・ガセリＪＣＭ５８１３株、ラクトバチルス・ファーメンタムＪＣＭ１１７３株ではフェルラ酸をほとんど代謝・分解せず、ジヒドロフェルラ酸も産生しなかった。以上の方法により、フェルラ酸代謝活性を持たないか、当該活性が低い菌株を評価することができた。
【実施例３】
【００３８】
（選抜した株による植物素材の発酵試験）
実施例１，２で選抜されたフェルラ酸遊離活性を持ち、かつフェルラ酸代謝活性のない乳酸菌について、植物素材を発酵させた際のフェルラ酸遊離能を調べた。植物素材として、まずフェルラ酸含量が多いとされる米ぬかを使用した。新鮮な米ぬかを１０倍量の水に懸濁し、９０℃で１時間煮出した後、ろ紙でろ過した。ろ液  １ＬにＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ  ５５ｇを溶解し、滅菌後、米ぬか抽出物として発酵試験に用いた。供試菌株はＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養し、米ぬか抽出物に３％接種して、３７℃にて４８時間発酵した。培養上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにてフェルラ酸を定量した。
【００３９】
図４に示す通り、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株でフェルラ酸量が１．５倍以上増加したほか、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株で１．２倍フェルラ酸が増加した。一方で、フェルラ酸代謝活性のあるラクトバチルス・ガセリＪＣＭ１１３１株ではフェルラ酸が０．３倍に減少した。以上の結果から、フェルラ酸遊離活性を持ち、かつフェルラ酸代謝活性のない乳酸菌を用いることで、植物素材中の遊離フェルラ酸量を増加させることが可能となった。
【実施例４】
【００４０】
（食物繊維分解酵素との併用効果１）
食物繊維分解酵素との併用効果を調べるため、ブロッコリー濃縮物をキシラナーゼ処理したものを原料として発酵した際のフェルラ酸遊離能を調べた。市販のブロッコリー混濁濃縮汁１００ｇを１Ｌの水に懸濁し、９５℃で５分間加熱した。５０℃まで冷却後、５ｇのキシラナーゼ（ＳＩＧＭＡ）を添加し、５０℃で２０時間処理した。この酵素処理液１ＬにＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ  ５５ｇを添加して溶解後、滅菌したものをブロッコリー汁素材として発酵試験に用いた。供試菌株はＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養し、ブロッコリー汁素材に３％接種して、３７℃にて４８時間発酵した。培養上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにてフェルラ酸を定量した。
【００４１】
図５に示す通り、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５が１．５倍増加したほか、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２株で１．４倍、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株で１．３倍、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株で１．２倍に増加した。一方で、フェルラ酸代謝活性のあるラクトバチルス・ガセリＪＣＭ１１３１株ではフェルラ酸が０．２倍に減少した。以上の結果から、食物繊維分解酵素との併用においても、遊離のフェルラ酸量を増加することができることが示された。
【実施例５】
【００４２】
（食物繊維分解酵素との併用効果２）
食物繊維分解酵素との併用効果を調べるため、米ぬかをキシラナーゼ処理したものを原料として発酵した際のフェルラ酸遊離能を調べた。新鮮な米ぬか１００ｇを１Ｌの５０ｍＭ  ＭＥＳバッファーに懸濁し、９５℃で５分間加熱した。５０℃まで冷却後、５ｇのキシラナーゼ（ＳＩＧＭＡ）を添加し、５０℃で２０時間処理した。この酵素処理液１ＬにＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ  ５５ｇを溶解し、滅菌後、酵素分解米ぬか抽出物として発酵試験に用いた。供試菌株はＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養し、酵素処理米ぬか抽出物に３％接種して、３７℃にて４８時間発酵した。但し、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンスについては培養・発酵を３０℃で行った。培養上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにてフェルラ酸を定量した。
【００４３】
図６に示す通り、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株ではフェルラ酸量が約１０倍と著しく増加しており、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２株でも５倍以上に増加していた。また、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株、ＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株、ラクトバチルス・ガセリＪＣＭ５８１３株及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンスＪＣＭ６９８５株でも４．２〜２．４倍フェルラ酸が増加した。なお、各培養物中のフェルラ酸含量は、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株は1.9mg/L、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２株は1.0mg/L、ラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株は0.8mg/L、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株は0.7mg/L、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株は0.5mg/Lであった。以上の結果から、食物繊維分解酵素と併用することにより、遊離のフェルラ酸量を著しく増加することができることが示された。このようにして得られた発酵物は、通常の野菜素材よりも遊離フェルラ酸含量が高く、摂取した際の高い機能性が期待できる。
【実施例６】
【００４４】
（野菜素材を用いた発酵試験）
次に、野菜素材を使用した場合の発酵性とフェルラ酸含量の変化を調べた。植物素材としてブロッコリー濃縮物を使用し、選抜された乳酸菌を用いて発酵させた際のフェルラ酸遊離能を調べた。市販のブロッコリー混濁濃縮汁１００ｇを１Ｌの水に懸濁し、９５℃で３０分間殺菌したものをブロッコリー汁素材として発酵試験に用いた。供試菌株はＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養し、ブロッコリー汁素材に３％接種して、３７℃にて４８時間発酵した。但し、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンスについては培養・発酵を３０℃で行った。培養上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにてフェルラ酸を定量した。
【００４５】
図７に示す通り、ラクトバチルス・ガセリＪＣＭ５８１３株でフェルラ酸量が２倍増加したほか、ラクトバチルス・ファーメンタムＪＣＭ１１７３株で１．６倍、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１８８３株、ＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５株及びラクトバチルス・アシドフィルスＦＥＲＭ−Ｐ１４１６１株で１．５倍増加した。また、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２株で１．４倍、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンスＪＣＭ６９８５株及びラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−Ｐ２１０７９株で１．３倍フェルラ酸が増加した。以上の結果から、植物素材としてブロッコリー汁素材を発酵させた場合にも、遊離フェルラ酸量を増加できることが示された。
【実施例７】
【００４６】
（野菜発酵飲料の試作）
選択された乳酸菌を用いて、実際に野菜を発酵した際の発酵性と風味への影響を調べた。市販のキャロット混濁濃縮汁、ブロッコリー混濁濃縮汁、ケール混濁濃縮汁を水で還元し、９５℃で１５分加熱殺菌した。乳酸菌として実施例５でフェルラ酸遊離能が最も高かったラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５を用い、０．５％の酵母エキスを含む１２％還元脱脂乳で３７℃、１６時間培養した後、野菜汁に３％接種して３７℃で１６時間発酵した。
【００４７】
表２に示すように、選択された乳酸菌は様々な野菜汁中でも成育し、適度な酸度の上昇、ｐＨの低下が見られた。風味についても酸味が強すぎず、非常に良好であった。以上の結果から、このようにして選択された乳酸菌によって、野菜の良好な発酵が可能であることが確認された。
【００４８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を含むことを特徴とするフェルラ酸含有画分の製造方法、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌及びフェルラ酸を含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品、フェルラ酸産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法等に関する。本発明は食品分野、医薬分野等に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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