(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質（ＨＢｃ）の発現が欠損しているＢ型肝炎ウイルスゲノムを含む組換え複製欠陥Ｂ型肝炎ウイルスと薬学上許容される担体とを含んでなる、Ｂ型肝炎の治療のための組成物であって、
該ウイルスが、野生型Ｂ型肝炎ウイルスには見られない、少なくとも１つの免疫優性エピトープを含む外来ペプチドをコードする１９５ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含有し、該免疫優性エピトープが配列番号８または配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むものである、組成物。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１４で表されるＮＣＢＩ受託番号Ｖ０１４６０のＨＢＶ  ａｙｗ３ゲノムのＥｃｏＲＩ部位における４番目のヌクレオチドからナンバリングを始めて、ＨＢＶ  ａｙｗ３ゲノムのヌクレオチド残基１９８１〜ヌクレオチド残基２３０８の間に位置する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組成物を含んでなる、Ｂ型肝炎の治療のためのワクチン。
【請求項４】
Ｂ型肝炎ウイルスに持続的に感染している患者の処置を目的とする薬剤の製造のための、請求項１または２に記載の組成物の使用。
【請求項５】
Ｂ型肝炎ウイルスに慢性的に感染している患者の処置を目的とする薬剤の製造のための、請求項１または２に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、持続的感染に関与する組換え複製欠陥ウイルスの発現のためのポリヌクレオチド、および組換え複製欠陥ウイルスを含んでなる組換え複製可能偽ウイルス、ならびに宿主細胞におけるこれらのウイルスの生産に関する。組換え複製欠陥ウイルスおよび複製可能偽ウイルスは、病原体の外来アミノ酸残基などの外来エピトープまたはエピトープを含み得る。複製欠陥ウイルスおよび複製可能偽ウイルスは免疫原性組成物において、また、治療用ワクチンとして特に有用である。本発明はまた、ウイルス感染に対するＴ細胞応答、および外来抗原性エピトープを肝臓に送達し、エピトープ特異的免疫応答を誘発する組換えウイルスに関する。
【０００２】
背景技術
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に対する有効なワクチンは２０年以上利用可能であったが、４億人、すなわち世界の人口の５％を超える人々がＨＢＶに慢性的に感染している。毎年１００万人を超える人がＨＢＶ関連の肝硬変および肝細胞癌から死に至っている(Ganem D., Prince, A.M. (2004) Hepatitis B virus infection-natural history and clinical consequences, N Engl J Med 350:1118-29)。
【０００３】
ＨＢＶは、主として直接の細胞変性性はない。ウイルス抗原に対する免疫応答が、ＨＢＶ感染後の肝臓疾患とウイルスのクリアランスの双方を担っていると考えられている(Ganem et al, 2004)。ウイルス特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４＋  Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞による免疫応答は肝臓の病理とウイルスのクリアランスの双方において重要なエフェクター的役割と調節的役割を果たす。免疫適格成人におけるＨＢＶ急性感染は通常、一過性の自然治癒型(self-limited)の肝臓疾患を生じ、その後、ウイルスはクリアランスされ、ＨＢＶウイルスタンパク質内のいくつかのエピトープに特異的な強いポリクローナルＣＴＬおよびＴｈ−１型応答を特徴とする。
【０００４】
ウイルスを首尾よくクリアランスする急性ウイルス感染患者は、コア、ポリメラーゼおよびエンベロープタンパク質内のいくつかのエピトープに特異的な多重特異的ポリクローナル細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を示す。ウイルス特異的、例えばＨＢＶ特異的なＴｈ細胞もまた活性化される。多重特異的Ｔｈ１様応答は、急性感染後にＨＢＶを首尾よくクリアランスする患者で検出されている(Chisari et al, 1995, Hepatitis B virus immunopathogenesis, Annu Rev Immunol 13:29-60)。
【０００５】
ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答は、慢性的感染を生じる患者では弱いか、または検出不能であり、Ｔ細胞の低応答性または慢性感染における耐性を担う機構は完全には理解されていない。慢性感染患者では、末梢のＣＤ８＋Ｔ細胞応答は検出不能か、または弱く、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は感染をクリアランスする患者よりもはるかに弱い。
【０００６】
機能的エフェクターＴ細胞はまず感染の初期段階に生じるが、慢性感染の過程で、プログラムされた細胞死１（ＰＤ−１）阻害性受容体のアップレギュレーションにより徐々に機能を失う(Chisari et al., 1995)。よって、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を自発的にクリアランスし、中和抗ＨＢ抗体を生成する慢性患者では、血清変換直前の血液でＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答が検出されている。また、慢性Ｂ型肝炎患者からの血液において、ＨＢＶウイルス量の有効な治療的低減がＨＢＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の一時的回復をもたらしたことも示されている。
【０００７】
ＨＢＶ持続的感染中のＴ細胞の低応答性および消耗を担う機構はまだ完全には明らかにされていない(Rehermann B., Nascimbeni M., 2005, Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection, Nat Rev Immunol 5:215-29)。持続的ウイルス感染中に見られるＴ細胞応答の消耗は、病原体のクリアランスに必要なエフェクター機能とＴ細胞の免疫病理を生じる能力の間のバランスを反映している。樹状細胞機能の不全およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の存在もウイルスの持続性に寄与する。さらに、肝臓は特に肝内Ｔ細胞応答を耐性またはアネルギーに偏向する。
【０００８】
特異的ウイルスエピトープに基づく能動的免疫療法および肝炎ワクチン注射は、有効な細胞性免疫応答を誘導する上で有望なアプローチとなる。第Ｉ相臨床試験のこれまでの研究では、ＨＢＶ  ＤＮＡワクチン接種は慢性ＨＢＶ保菌者おいてＴ細胞応答性を特異的に回復させ得ることが示唆されている。しかしながら、このＨＢＶ特異的Ｔ細胞の活性化は一時的なものであると思われ、その後、ＤＮＡ注射をしても徐々に低下した(Mancini-Bourgine M., Fontaine H., Scott-Algara D., Pol S., Brechot C, Michel M.L., 2004, Induction or expansion of T-cell responses by a hepatitis B DNA vaccine administered to chronic HBV carriers, Hepatology 40:874-82)。従って、ＨＢＶ抗原に対するＴ細胞の潜在的耐性を迂回することが免疫療法において最も重要な点であることが分かる。
【０００９】
これを考え合わせると、慢性肝炎、例えばＨＢＶ感染を処置するためには、肝内Ｔ細胞応答を、消耗またはアネルギーの状態からエフェクターＴ細胞が完全に有効な状態へ切り換えなければならないことが示唆される(Bertoletti A., Gehring A.J., 2006, The immune response during hepatitis B virus infection, J Gen Virol 87:1439-49; Rehermann et al, 2005)。
【００１０】
よって、当技術分野において、慢性肝炎感染、例えば、Ｂ型肝炎感染の処置のための新たな療法の必要がある。これらの療法は他のウイルス持続的感染の処置にも一般に有用であるはずである。また、これらの療法は持続的感染に関与するウイルスに感染した細胞に特異的でなければならない。例えば、肝炎ウイルス感染の場合、これらの療法は肝炎ウイルスに感染した細胞、特にヒト肝細胞に特異的でなければならない(Rehermann et al., 2005)。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、当技術分野におけるこれらの要求の充足に寄与するものである。これらの目的を達成するため、本発明は、in vivoにおいてウイルス感染細胞で野生型ウイルスとともに維持され、補足後にウイルス感染細胞内で外来抗原性エピトープを発現することによりウイルスのクリアランスに免疫学的に寄与する、組換え複製欠陥ウイルスを提供する。本発明は、これらの目的を達成するための偽ウイルスを提供する。本発明の組換え欠陥ウイルスは、ウイルス複製に必須のタンパク質の発現が欠損しているゲノムを含んでなる。このようなタンパク質の例としては、構造タンパク質、より詳しくは、キャプシドタンパク質がある。
【００１２】
本発明はまた、肝臓に外来抗原性エピトープを送達するためのベクターとしての肝炎ウイルスの使用に対してモデル化された新規なワクチン戦略を提供する。肝臓細胞によるこれらのエピトープの提示は、次に、有効な（すなわち、消耗していない）Ｔ細胞応答を標的組織、例えば肝臓に誘引し、ウイルスのクリアランスに寄与する。
【００１３】
一つの実施態様において、組換え複製欠陥ウイルスは、in vivoにおいて肝炎ウイルス感染肝細胞で野生型肝炎ウイルスとともに維持され、補足後にウイルス感染細胞内で外来抗原性エピトープを発現することによりウイルスのクリアランスに免疫学的に寄与する肝炎ウイルスである。本発明は、これらの成果を達成するための肝炎偽ウイルスを提供する。
【００１４】
より詳しくは、本発明は、偽ウイルスにおいてＦｌｕポリエピトープなどの外来ペプチドまたはポリペプチドをクローニングおよび発現するためのポリヌクレオチドおよび発現ベクターの設計を含む。一つの実施態様において、これらのポリヌクレオチドおよび発現ベクターは肝炎偽ウイルスにおいてＦｌｕポリエピトープなどの外来ペプチドまたはポリペプチドをクローニングおよび発現するために設計される。これらのポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドおよび発現ベクターが設計され、これらは全て組換え肝炎偽ウイルスの形成を保持している。
【００１５】
一つの実施態様において、本発明は、肝炎ウイルスキャプシドタンパク質（ＨＢｃ）の発現が欠損している肝炎ウイルスゲノムを含んでなる組換え複製欠陥肝炎ウイルスを提供する。このウイルスは、病原体の少なくとも１つの免疫優性エピトープをコードする約１９５ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含有する。このヌクレオチド配列は、ＨＢＶ  ａｙｗ３ゲノムのヌクレオチド残基１９８１〜ヌクレオチド残基２３０８の間に位置する（ＮＣＢＩ受託番号Ｖ０１４６０のＨＢＶゲノムのＥｃｏＲＩ部位からナンバリングを始める）。Ｂ型肝炎は本発明の実施に用いるのに好ましいウイルスである。
【００１６】
本発明の脊組換え複製欠陥ウイルスによりトランスフェクトされた脊椎動物細胞もまた提供される。一つの実施態様において、脊椎動物細胞は肝細胞であり、ウイルスは肝炎ウイルスである。一つの実施態様において、組換えウイルスは、２つの構築物ｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩまたは−ＩＶのうちの１つによるＨｕｈ  ７（１１）またはＨｅｐ  Ｇ２（１２）などの肝細胞系統と野生型キャプシド（ｐＣＭＶ−コアまたはｐＭＡＳ−コア）をコードするプラスミドとの同時トランスフェクションによるか、あるいは１．３コピーのｒＨＢＶゲノムおよびＨＢＶ野生型コアタンパク質用の付加的発現カセットを担持するｐｒＨＢＶ１．３／ＨＢなどのプラスミドを用いたトランスフェクションによって作製することができる。肝細胞はさらに、肝炎偽ウイルスを形成するように組換え複製欠陥肝炎ウイルスを補足するためのＨＢｃをコードするヌクレオチド配列を含んでなることができる。
【００１７】
よって、本発明は、ウイルスのキャプシドタンパク質により補足された組換え複製欠陥ウイルスを含んでなる複製可能偽ウイルスを提供し、この偽ウイルスはin vitroにおいてヒト細胞で複製する。一つの実施態様において、この複製可能偽ウイルスは、ＨＢｃにより補足された組換え複製欠陥肝炎ウイルスを含んでなる肝炎偽ウイルスであり、この偽ウイルスはin vitroにおいてヒト肝細胞で複製する。
【００１８】
さらに、本発明は、偽ウイルスを発現する脊椎動物細胞を提供する。一つの実施態様において、脊椎動物細胞は肝炎偽ウイルスを発現する肝細胞である。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明の感染細胞を、ウイルスのキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現すること、かつ、偽ウイルスを形成するように組換え複製欠陥ウイルスを補足するための条件下で培養することを含む、複製可能偽ウイルスの形成方法を提供し、それは所望により宿主細胞から細胞外間隙に分泌させることができる。一つの実施態様において、この方法は、本発明の感染肝細胞を、ＨＢｃをコードするヌクレオチド配列を発現するため、かつ、肝炎偽ウイルスを形成するように組換え複製欠陥肝炎ウイルスを補足するための条件下で培養することにより複製可能肝炎偽ウイルスを形成するために使用可能であり、それは所望により宿主細胞から細胞外間隙に分泌させることができる。
【００２０】
また、組換え複製欠陥肝炎ウイルスまたはその相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供される。一つの実施態様において、このポリヌクレオチドは組換え複製欠陥肝炎ウイルスまたはその相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
【００２１】
さらにこの組換え複製欠陥ウイルスを含んでなるクローニングおよび／または発現ベクターも提供される。一つの実施態様において、このクローニングおよび／または発現ベクターは組換え複製欠陥肝炎ウイルスを含んでなる。
【００２２】
また、この組換え複製欠陥ウイルスおよび複製可能偽ウイルスによりコードされるポリペプチドも提供される。一つの実施態様において、これらのポリペプチドは、組換え複製欠陥肝炎ウイルスおよび複製可能肝炎偽ウイルスによりコードされている。
【００２３】
さらに、本発明は、本発明のベクターを含んでなる真核生物宿主細胞を提供する。一つの実施態様において、真核生物宿主細胞内のこのベクターは、肝炎偽ウイルスの発現のためにヌクレオチド配列に作動可能なように連結された真核生物プロモーター配列を含んでなる。所望により、このベクターは、外来ポリペプチドとウイルスタンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなることができ、この場合、真核生物宿主細胞はその融合タンパク質を含んでなる偽ウイルスを生産する。一つの実施態様において、この融合タンパク質は肝炎タンパク質を含んでなり、真核生物宿主細胞は融合タンパク質を含んでなる肝炎偽ウイルスを生産する。
【００２４】
より詳しくは、特定の実施態様において、本発明は、ＨＢＶゲノムに由来するベクターに関する。ＨＢＶゲノムは、ＨＢＶキャプシドタンパク質のＮ末端部分内で融合された外来抗原性エピトープを発現し、野生型キャプシドの補足によって感染個体の肝臓で同時に維持される組換えＨＢＶウイルスを生じるように改変されている。ＨＢＶゲノムはさらに、この組換えＨＢＶウイルスに感染した後に、肝細胞の表面で外来エピトープの発現および提示を可能とするように改変することもできる。この外来抗原性エピトープは、ＭＨＣクラス１分子の会合に供される一般病原体に由来し、宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の標的として働き得る。それにより、すでにＨＢＶに感染した肝細胞における組換えＨＢＶベクターにおける複製は、ＨＢＶに感染した肝細胞において外来抗原性エピトープを発現することによりＨＢＶのクリアランスに免疫学的に寄与し得る。
【００２５】
本発明の組換えウイルスベクターの複製を可能とするウイルス感染細胞だけが免疫応答の標的となる。一つの実施態様において、ウイルス感染細胞は、本発明の組換え肝炎ウイルスベクターの複製を可能とする肝炎ウイルス感染肝細胞である。この組換え複製欠陥ウイルスは、脊椎動物の細胞において本発明の複製可能偽ウイルスを介して外来抗原性エピトープ（例えば、ポリエピトープ）を送達し、次いで、強い（ポリ）エピトープ特異的免疫応答を惹起する。一つの実施態様において、組換え複製欠陥ウイルスは組換え複製欠陥肝炎ウイルスであり、脊椎動物細胞は肝細胞である。肝炎ウイルスは細胞溶解機構または非細胞溶解機構によってクリアランスされる。
【００２６】
本発明の偽ウイルスは強い免疫応答の誘導と、配列特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化状態の増強をもたらし、そのため、この偽ウイルスは治療適用に使用することができる。一つの実施態様において、本発明の偽ウイルスは肝炎偽ウイルスである。
【００２７】
ｐｒＨＢＶ１．３  ＤＮＡは、慢性的にＨＢＶに感染している患者における治療的介入のためのＤＮＡワクチンとして使用可能である。この構築物は３つのＨＢＶエンベロープタンパク質とポリメラーゼとＨＢｘタンパク質を発現する。このベクターは、全身経路によってＤＮＡとして投与される場合には複製しない。ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅ構築物は、外来エピトープを担持する分泌型のＨＢｅＡｇをコードする。それは外来エピトープに特異的なＴ細胞応答を誘導し、これらのエピトープを担持する病原体に対するＤＮＡ感作用のベクターとして使用することができる。
【００２８】
よって、本発明は、本発明の複製欠陥ウイルスを含んでなる組成物、および該組成物を含んでなるワクチンを提供する。本発明のワクチンは、ウイルスに感染した細胞に対してＴ細胞応答を刺激するために、持続的にウイルスに感染している患者に投与することができる。よって、本発明はまた、野生型ウイルスに持続的に感染している患者を処置することを目的とする薬剤の製造のための本発明の組換え複製欠陥ウイルスの使用も意図する。本発明はまた、細胞に本発明の組換え複製欠陥ウイルスを提供することにより、ウイルスに感染した細胞におけるエピトープの発現を標的化するための方法も意図する。
【００２９】
本発明は、本発明の偽ウイルスにより生産されるキメラ抗原性融合タンパク質に対する抗体を提供する。
【００３０】
本発明はまた、本明細書に記載のプラスミドを含んでなるマウス、例えば、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１またはＨｂｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２二重トランスジェニックマウスを提供する。このプラスミドは、トランスジェニック動物を作製するための当技術分野で公知のいずれの方法を用いてマウスの細胞に移入されたものでもよい。一つの実施態様において、動物に筋肉内注射するか、または例えば尾静脈を介して流体力学的に注入する。
【００３１】
一つの実施態様において、動物はｐｒＨＢＶ−１．３、例えばｐｒＨＢＶ−１．３−ＩＩＩまたはｐｒＨＢＶ−１．３−ＩＶを含んでなる。一つの実施態様において、トランスジェニック動物は、ｒＨＢｅ＿ＩＩＩ、ｒＨＢｅ＿ＩＶ、ポリトープＩＩＩまたはポリトープＩＶをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるプラスミドを含んでなる。
【００３２】
一つの実施態様において、トランスジェニック動物のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは本発明の偽ウイルスの感染に応答して増加する。一つの実施態様において、トランスジェニック動物は本発明の偽ウイルスに対するエピトープ特異的Ｔ細胞応答を惹起する。一つの実施態様において、ｒＨＢＶは肝臓細胞で発現され、コードされている外来抗原は免疫認識のためにポリペプチドへと処理される。
【００３３】
本発明は、ウイルスのキャプシドタンパク質により補足された組換え複製欠陥ウイルスを含んでなる組換え複製可能偽ウイルスを提供することによる病原性ウイルスに慢性的に感染した動物にワクチン接種を行う方法を提供する。一つの実施態様において、動物は哺乳類、例えばヒトである。一つの実施態様において、プラスミドは、以下により詳しく記載されるように本発明のプラスミドのいずれかである。
【発明の具体的説明】
【００３４】
ヘパドナウイルスは小型で、エンベロープを有する肝臓指向性ＤＮＡウイルスである。この科の原株はヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。ヘパドナウイルスゲノムは、部分的に二本鎖の弛緩型環状ＤＮＡからなり、広範囲に重複のあるオープンリーディングフレームと調節配列を用いるコンパクトな構成を持っている。ＨＢＶゲノムは互いに重複する種々のシスまたはトランスエレメントにより厳密に組織化されている。
【００３５】
このウイルスゲノムの調査により、それはキャプシドコード領域のＮ末端部分の外来配列片に、肝細胞で維持されるような偽ウイルスを作出するようにさせることができるが、この挿入を受けたタンパク質は自然感染の際に野生型ＨＢＶによりトランスで補足されることが判明した(Gunther S., Piwon N., Jung A., Iwanska A., Schmitz H., Will H., 2000, Enhanced replication contributes to enrichment of hepatitis B virus with a deletion in the core gene, Virology 273:286-99)。よって、組換えＨＢＶは、遺伝子送達のために肝臓指向性を有するターゲティングベクターとして働くと思われた（図１参照）。
【００３６】
従って、本発明は、肝炎ウイルスゲノムに由来するベクターを提供する。この肝炎ウイルスゲノムは、肝炎ウイルスキャプシドタンパク質のＮ末端部分内で融合された外来エピトープを発現するように改変されたものである。結果として得られるウイルスは複製欠陥型である。この組換え複製欠陥型の肝炎ウイルスは肝炎ウイルス感染個体の肝臓で野生型キャプシド補足によってともに維持される。この組換えウイルスに感染すると、肝細胞の表面において外来エピトープの発現および提示が起こる。ＭＨＣ分子とともに提供されたこれらのエピトープは宿主Ｔ細胞免疫応答の標的となる。従って、組換え肝炎ウイルスベクターの複製が可能な肝炎ウイルス感染肝細胞だけが免疫応答の標的となって治癒を受ける。本発明は、例えば、Ｆｌｕなどの一般的な病原体に由来する外来エピトープに対する既存の免疫を利用する。肝炎ウイルスは細胞溶解性機構または非細胞溶解性気候によってクリアランスされる。
【００３７】
患者においてウイルスのクリアランスは、市販のキットを用いて血清中のＨＢＶ  ＤＮＡを測定することによって定量することができる。肝臓におけるクリアランスは生検中のＤＮＡを測定することによって定量することができる。ウイルス複製のマーカーであるＨＢｅＡｇから抗ＨＢｅ抗体への血清変換をウイルスクリアランスのマーカーとして使用することができる。ＨＢｓＡｇの血清からのクリアランスおよび抗ＨＢｓ抗体への血清変換はウイルスの完全なクリアランスを示す。
【００３８】
本発明はまた、本発明の複製欠陥肝炎ウイルスに基づく組換え複製可能肝炎偽ウイルスを提供する。この偽ウイルスは、ＨＢｃにより補足された本発明の組換え複製欠陥肝炎ウイルスを含んでなり、この偽ウイルスはin vitroにおいてヒト肝細胞内で複製する。
【００３９】
より詳しくは、本発明は、肝炎ウイルスキャプシドタンパク質（ＨＢｃ）の発現が欠損している肝炎ウイルスゲノムを含んでなる組換え複製欠陥肝炎ウイルスを提供し、このウイルスは病原体の少なくとも１つの免疫優性エピトープをコードする約１９５ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列はＨＢＶ  ａｙｗ３ゲノムのヌクレオチド残基１９８１〜ヌクレオチド残基２３０８の間に位置する（ＮＣＢＩ受託番号Ｖ０１４６０のＨＢＶゲノムのＥｃｏＲＩ部位の４番目のヌクレオチドからナンバリングを始める）。このウイルスは本明細書において本発明の「組換え複製欠陥肝炎ウイルス」と呼ばれる。
【００４０】
本発明の組換え複製欠陥肝炎ウイルスは、感染細胞において肝炎ウイルス感染細胞によるＨＢｃの発現によって補足される。複製不適格ウイルスのゲノムは、細胞に感染している野生型肝炎ウイルスにより産生されるキャプシド内に完全に封入される。補足されたウイルスは本明細書において「肝炎偽ウイルス」と呼ばれる。
【００４１】
よって、本発明は、偽ウイルスへと組み立て可能であり、宿主細胞内で効率的に生産されるタンパク質の生産のためのポリヌクレオチドおよび発現ベクターを提供する。従って、外来ペプチドの残基を伴う自己組み立て組換え偽ウイルスの作製が可能となる。これは有効な一価、二価および多価免疫原性組成物および治療用ワクチンを提供する。
【００４２】
本発明の複製欠陥肝炎ウイルスおよび肝炎偽ウイルスはＨＢＶに関して詳細に記載されるが、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）（ピコルナウイルス）；Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）（デルタウイルス）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（フラビウイルス）；およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＶ）を含む他の肝炎ウイルスにも適用可能であると理解される。よって、本明細書において「肝炎」とは、Ｂ型肝炎ウイルスおよびその他の肝炎ウイルスを含む。Ｂ型肝炎ウイルスが本発明の実施に用いるのに好ましい。より一般には、本発明は他のウイルスにも適用可能である。
【００４３】
ＨＣＶなどの他の肝臓指向性ウイルス、およびより一般には持続的感染に関与するあらゆるウイルスを用いて本発明を実施する場合、外来エピトープの挿入に適当な部位を特定すべくウイルスゲノムを調べることができる。例えば、ＨＢＶの構造的および非構造的ウイルスタンパク質をコードしている、重複するオープンリーディングフレームのために、エピトープ挿入のために標的化可能な唯一の遺伝子は、ヌクレオキャプシドコード遺伝子である。しかしながら、他のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスはゲノム挿入に対して様々な耐性を有する。さらに、ウイルスが異なれば感染する組織が異なり、それらの組織は、他の非感染組織が傷害されることなく、誘導されたＴ細胞応答によって標的化され、破壊され得る。
【００４４】
「ペプチド」は当技術分野で一般に小アミノ酸分子を意味するものと理解され、「ポリペプチド」は一般にそれより大きなアミノ酸分子を意味するものと理解される。ペプチドとポリペプチドは双方とも本発明の範囲内である。よって、例えば、外来配列はペプチドまたはポリペプチドのいずれかであり得る。これらの用語は本明細書において互換的に用いられる。
【００４５】
一つの態様において、本発明は、外来ペプチドまたはポリペプチドのエピトープ担持部分を含んでなる肝炎偽ウイルスを提供する。本明細書において、外来ペプチドおよびポリペプチドまたはエピトープとは、野生型肝炎ウイルスには見られないペプチドまたはポリペプチドまたはエピトープを意味する。
【００４６】
これらのエピトープは外来ペプチドまたはポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」とは、完全なポリペプチドまたはそのフラグメントが免疫原である場合に、in vivoにおいて体液性または細胞性応答を惹起するタンパク質の部分と定義される。抗体が結合し得るポリペプチドの領域は「抗原決定基」または「抗原性エピトープ」と定義される。抗原性エピトープは、肝炎偽ウイルスにおいて使用した際にもin vivoにおいて体液性または細胞性応答を惹起することができる。よって、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの双方、またはそのいずれか一方を含む肝炎偽ウイルスが本発明に含まれる。免疫原性または抗原性エピトープを含んでなる外来ペプチドまたはポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子に対するエピトープの結合のためには少なくとも８アミノ酸残基の長さであり、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するエピトープの結合のためには少なくとも１２アミノ酸長である（細胞性応答）。Ｂ細胞（体液性応答）エピトープは少なくとも４アミノ酸長である。
【００４７】
いくつかの実施態様において、外来ペプチドまたはポリペプチドは約８〜約１４０のアミノ酸残基、好ましくは約２０〜約１４０のアミノ酸残基、特に約６０〜約１４０のアミノ酸残基を含み得る。ＨＢＶの場合には、約６８までのアミノ酸を含み得る。一つの実施態様において、ＨＢＶの場合、外来ペプチドまたはポリペプチドは６８のアミノ酸を含む。別の実施態様では、約６５のアミノ酸を含む。肝炎偽ウイルスを生成するために、外来ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはＮ末端とＣ末端の双方にフランキング残基を付加することができる。
【００４８】
外来ペプチドまたはポリペプチドはまた、いずれの数の外来タンパク質に由来してもよい。外来ペプチドまたはポリペプチドはいずれの植物、動物、細菌、ウイルスまたは寄生生物のいずれのタンパク質に由来してもよい。
【００４９】
一つの実施態様において、外来ペプチドまたはポリペプチドは病原体のポリペプチドに由来し得る。本明細書において「病原体」とは疾病の特定の原因因子を意味し、例えば、いずれの細菌、ウイルスまたは寄生体も含み得る。
【００５０】
本明細書において「疾病」とは、身体機能、系または器官の妨害、停止または障害を意味する。典型的な疾病としては感染性疾患が含まれる。例えば、外来ペプチドまたはポリペプチドは、ＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩなどのＲＮＡウイルスの免疫原性タンパク質に由来するものであってもよい。具体例としては、デング熱ウイルスの構造タンパク質またはＮＳＩタンパク質；ハンタンウイルスのＧ１、Ｇ２またはＮタンパク質；Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質；フレンドネズミ白血病ウイルスのＥｎｖタンパク質；ＨＴＬＶ−１ウイルスのＥｎｖタンパク質；日本脳炎ウイルスのｐｒｅＭ、Ｅ、ＮＳ１またはＮＳ２Ａタンパク質；ラッサ熱ウイルスのＮまたはＧタンパク質；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスのＧまたはＮＰタンパク質；麻疹ウイルスのＨＡまたはＦタンパク質；パラインフルエンザ３ウイルスのＦまたはＨＮタンパク質；パラインフルエンザＳＶ５ウイルスのＦまたはＨＮタンパク質；狂犬病ウイルスのＧタンパク質；呼吸器合胞体ウイルスのＦまたはＧタンパク質；牛疫のＨＡまたはＦタンパク質；または水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質がある。これらは可能性の一部に過ぎず、網羅的または限定的なリストを表すのではない。
【００５１】
外来ペプチドまたはポリペプチドはまた、ＤＮＡウイルスの免疫原性タンパク質、例えば、サイトメガロウイルスのｇｐ８９；エプスタイン−バーウイルスのｇｐ３４０；ウマヘルペスウイルスのｇｐ１３または１４；１型単純疱疹ウイルスのｇＢ；１型単純疱疹ウイルスのｇＤ；２型単純疱疹ウイルスのｇＤ；または偽狂犬病ウイルスのｇｐ５０に由来するものであってもよい。ここでもまた、これらは可能性の一部に過ぎず、網羅的または限定的なリストを表すのではない。
【００５２】
さらに、外来ペプチドまたはポリペプチドは、連鎖球菌Ａ  Ｍ６抗原などの細菌の免疫原性タンパク質、または腫瘍抗原、例えば、ヒト黒色腫ｐ９７、ラットＮｅｕ癌遺伝子ｐ１８５、ヒト上皮腫瘍ＥＴＡもしくはヒト乳頭腫ウイルス抗原に由来するものであってもよい。ここでもこれらは網羅的または限定的なリストを含むのではない。
【００５３】
本発明の一つの実施態様において、外来ペプチドまたはポリペプチドはヒト免疫不全ウイルスに由来する。次のものは外来ペプチドまたはポリペプチドの設計に使用することができるＨＩＶ−Ｉエピトープである。
【表１】
0005710254.tif 000002
【００５４】
ナンバリングはＨＩＶ−Ｉ  ＷＥＡＵクローン１．６０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ２１１３５）のアミノ酸配列に基づく。ＷＥＡＵ配列は反応性ペプチドの配列と常に同一とは限らず、単にウイルスタンパク質におけるその位置を示す。
【００５５】
外来ペプチドまたはポリペプチドは１つのエピトープまたは互いに連結された複数のエピトープを含み得る。さらに、本発明の肝炎偽ウイルスは、同じ病原体の異なる免疫原性タンパク質に由来するエピトープなど、１以上の起源の複数のエピトープを含み得ると理解される。また、この肝炎偽ウイルスは異なる病原体に由来するエピトープなど、異なる起源に由来する１以上のエピトープを含み得ると理解される。さらに、異なる粒子中に異なるエピトープを有する肝炎偽ウイルスの混合物も本発明により意図される。
【００５６】
外来配列を含むタンパク質は野生型ウイルスに感染した細胞の表面に露出させることができる。結果として露出されたエピトープは、例えば、他の感染性ウイルスなどの病原体に存在する場合、エピトープの優れた配置模倣物となる。このような理由で、ウイルス感染細胞は、本発明の複製欠陥肝炎ウイルスおよび結果として生じる肝炎偽ウイルスを介した、病因因子の保護決定因子などの外来ペプチドまたはポリペプチドの担体としての利用に好適である。
【００５７】
本発明の偽ウイルスのタンパク質をコードする核酸を含む組換え発現ベクターは周知の方法を用いて作製することができる。発現ベクターとしては、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来するものなどの好適な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列と作動可能なように連結された外来ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含む。転写または翻訳調節ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列が別のコードＤＮＡ配列の転写または翻訳を制御するならば、作動可能なように連結されている。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボゾーム結合部位、組織特異的プロモーターおよび転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ならびに転写および翻訳の開始または終結を制御する適当な配列を含む。通常には複製起点によって付与される所望の宿主細胞での複製能、および形質転換体が特定される選択遺伝子を発現ベクターに付加的に組み込んでもよい。
【００５８】
本発明のベクターの作製に用いるための真核生物ベクターとしては、Stratagene (La Jolla, CA)から入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにPharmacia (Piscataway, NJ)から入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。他の好適なベクターも当業者には容易に明らかになろう。
【００５９】
本発明のベクターの作製に用いるためのベクターでは、非組み込み型真核生物ベクターが有用であるだけでなく、組み込み型／形質転換体ベクター（すなわち、真核生物宿主細胞のゲノムにそれらの核酸材料の一部を組み込むベクター）も使用可能である。これらのベクターに典型はレンチウイルスベクターＴｒｉｐｓ、アデノウイルスおよび酵母組み込みベクターである。
【００６０】
好ましい実施態様では、本発明の発現ベクターは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核細胞の培養に関しては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、アンピシリンまたはネオマイシン耐性が挙げられる。
【００６１】
当業者に知られているいずれの強力なプロモーターも、発現の駆動のために使用可能である。好適なプロモーターとしては、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純疱疹チミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、ＨＢＶなどの肝炎ウイルス由来の天然プロモーターであってもよい。
【００６２】
本発明の組換えウイルスのin vivo送達にはウイルス保存株の作出が必要である。肝炎ウイルスの場合、これは野生型肝臓ウイルスキャプシドを発現する肝細胞系統を用いることにより達成することができる。ウイルス保存株の作出方法はGunther S. et al, Virology, 273:286-99 (2000)に記載されている。
【００６３】
偽ウイルスの発現に好適な宿主細胞としては高等真核細胞が挙げられる。例えば、肝炎ウイルスの場合、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＤＶの複製には分化した肝細胞が必要である。植物、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主とともに用いるのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。適当な宿主の代表的例として、限定されるものではないが、酵母細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)Ｓ２およびヨトウガ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３およびBowes黒色腫細胞などの動物細胞；および植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞に適当な培養培地および条件は当技術分野で公知である。
【００６４】
本発明のベクターの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法によって達成することができる。このような方法は、Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)などの多くの標準的な実験手引き書に記載されている。
【００６５】
別の態様において、本発明は、in vitroにおいて好適な培養培地で、本発明の発現ベクターを組み込んだ細胞を培養すること、および培養培地においてこれらの細胞によって生産された偽ウイルスを回収することを含む、偽ウイルスのin vitro生産方法に向けられる。
【００６６】
よって、本発明はまた、偽ウイルスを発現するために本発明のポリヌクレオチドまたはベクターにより感染、形質転換またはトランスフェクトされた組換え真核生物細胞などの細胞に関する。このような細胞を生産するための方法および組換えウイルスの生産においてこれらの細胞を使用する方法は当技術分野で周知である。偽ウイルスは、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンまたはヘパリンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製することができる。
【００６７】
本発明は外来ペプチドまたはポリペプチドの１以上の（ポリ）エピトープを担持する肝炎偽ウイルスに関するが、本発明は肝炎偽ウイルスにおける組み込みのために至適化された（ポリ）エピトープの使用を意図する。（ポリ）エピトープヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、その（ポリ）エピトープの全体的な親水性を高める、およびエピトープの改変されたプロセシングを確保するという点で改変することができる。ポリエピトープ中のエピトープは最良の親水性特性を得るために入れ替えることができる。全般的に疎水性のエピトープと釣り合わせるために親水性スペーサーを付加することもできる。
【００６８】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは単離型であっても精製型であってもよい。「単離」または「精製」とは、本明細書の文脈で純度を定義するために用いる場合、そのタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが天然または内因性起源の他のタンパク質を実質的に含まず、製造工程の他の混入残渣のタンパク質またはポリヌクレオチドは約１重量％未満のみ含む。
【００６９】
本発明の方法の実施において、複製欠陥ウイルスは、ヒトおよびその他の動物に薬剤を投与するために通常用いられる投与様式の１つを用いて宿主に投与される。よって、例えば、複製欠陥ウイルスは、経口経路により、または静脈内もしくは筋肉内注射など非経口的に宿主に投与することができる。脾臓内、肝内、潅流、皮内および粘膜経路などの他の投与様式も使用可能である。好ましくは、本発明の複製欠陥ウイルスは天然のウイルス感染経路に従って投与される。注射のためには、上記の複製欠陥ウイルスは、この目的で便宜に用いられるビヒクル中の溶液、懸濁液またはエマルションの形で調製することができる。
【００７０】
よって、本発明は、本発明の組換え複製欠陥ウイルスを薬学上許容される担体と組み合わせて含んでなる組成物を意図する。本発明はまた、このような組成物を含んでなるワクチンも意図する。本発明のワクチンは、ウイルスに感染した細胞に対するＴ細胞応答を刺激するためにウイルスに持続的に感染している患者に投与することができる。よって、本発明はまた、野生型ウイルスに持続的に感染している患者を処置することを目的とする薬剤の製造のための本発明の組換え複製欠陥ウイルスの使用を意図する。本発明はまた、本発明の組換え複製欠陥ウイルスを細胞に提供することにより、ウイルスに感染した細胞におけるエピトープ発現を標的化するための方法を意図する。
【００７１】
本発明の複製欠陥ウイルスは他の微生物抗原、抗体もしくは有糸分裂促進剤、または他の予防用もしくは治療用物質と組み合わせて使用することができると理解される。例えば、種々の寄生体抗原、抗体もしくは有糸分裂促進剤の混合物、または種々のウイルスもしくは細菌抗原、抗体もしくは有糸分裂促進剤の混合物が本発明の方法において使用可能である。同様に、種々の複製欠陥ウイルスの混合物も同組成物において使用可能である。複製欠陥ウイルスはまた、免疫優性、免疫病理学的、および免疫保護性エピトープに基づくワクチン、または不活性化弱毒もしくはサブユニットワクチンなどの他のワクチン剤と組み合わせることもできる。
【００７２】
本発明の複製欠陥ウイルスは感染細胞においてウイルスをクリアランスするのに十分な濃度を提供するような有効な量で使用する。よって、複製欠陥肝炎ウイルスの量は宿主による吸収、分布およびクリアランスによって異なる。当然のことながら、複製欠陥肝炎ウイルスの有効性は用量に関連する。複製欠陥ウイルスの用量は最低限検出可能な効果をもたらすに十分なものでなければならいが、この用量は好ましくは、非特異的ポリクローナルリンパ球応答を活性化する用量よりも低いものでなければならない。
【００７３】
宿主に投与する本発明の複製欠陥ウイルスの用量は広い限界にわたって可変である。これらのウイルスは治療上有効な最少量で投与することができ、その用量を所望によりその患者が許容する最大用量まで増加させることができる。複製欠陥ウイルスは比較的高い量として投与し、その後、より低い維持量で投与することができるか、あるいはウイルスは均一な用量で投与することもできる。
【００７４】
用量および投与頻度は本発明の方法で用いる複製欠陥ウイルスによって異なる。ヒトへの投与量は約５０ｎｇ／体重Ｋｇ〜約１μｇ／Ｋｇ体重、好ましくは約１００ｎｇ／Ｋｇ体重〜約５００ｎｇ／Ｋｇ体重で可変である。チンパンジーの感染には、２×１０７〜５×１０７ ＨＢＶゲノム当量（約３５〜９０ｐｇ  ＤＮＡに相当）が必要である(Guidotti L. G., et al, Science, 284:825-29 (1999))。これは０．７〜１．８ｐｇ／Ｋｇ体重に相当する。最適量は慣例の用量応答分析技術を用いるか、または疾病の動物モデルに基づく研究からのスケールアップによる、最小限の試験で決定することができる。
【００７５】
本明細書において用量範囲を記載する際に用いる「約」とは、複製欠陥ウイルスが投与される宿主における慢性ウイルス感染のクリアランス（本発明の方法によって処置されていない個体に比べた場合の、in vivoにおける感染性ウイルスの持続の不在もしくは軽減、ならびに／または病原性および臨床的疾患の不在、またはその重篤度の軽減を含む、宿主における病原性の決定因子の不在もしくは軽減を伴う）によって示されるような、数値で示される量と同じ効果を有する量を意味する。
【００７６】
本発明の複製欠陥ウイルスの用量は平均的な大きさの成人に関して特定される。よって、用量は患者の体重の軽い重いで２０〜２５％まで調整することができる。同様に、小児用の用量は周知の用量計算式を用いて調整することができる。
【００７７】
本発明の複製欠陥ウイルスは、ヒトおよび感受性のある非ヒト霊長類およびその他の脊椎動物動物および哺乳類の肝炎感染の処置において、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、服用可能な溶液中の注射液などの形態で療法に使用することができる。
【００７８】
適当な薬学上許容される担体、希釈剤およびアジュバントは、本明細書に記載の複製欠陥ウイルスと組み合わせて、動物における病状の処置に用いるための医薬組成物を作製することができる。本発明の医薬組成物は複製欠陥ウイルスを固体または液体の薬学上許容される無毒な担体とともに含む。このような医薬担体は、石油、動物、植物または合成起源のものを含む水および油などの無菌液体であり得る。好適な液体の例としては、落花生油、大豆油、鉱油およびゴマ油などがある。医薬組成物が静脈内投与される場合は、水が好ましい担体である。特に注射溶液には、生理学的溶液も液体担体として使用可能である。
【００７９】
好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールなどが挙げられる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤および徐放性製剤などの形態を採り得る。好適な医薬担体はE. W. Martinにより"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。これらの医薬組成物は有効治療量の本発明の複製欠陥ウイルスを、宿主への投与に適当な形態を提供するように好適な量の担体とともに含む。
【００８０】
宿主において保護を誘導する本発明の複製欠陥ウイルスの能力は、アジュバントを用いた乳化、リポソームへの封入、好適な担体との組合せまたはこれらの技術の組合せによって増強させることができる。例えば、本発明の複製欠陥ウイルスは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムゲルなどの慣例のアジュバントとともに投与することができる。同様に、複製欠陥ウイルスは脂質膜と結合させたり脂質膜に組み込んだりしてリポソームを形成することができる。この目的で、核酸および他の外来物質を含まない非発熱性脂質を使用することができる。
【００８１】
宿主または患者はウイルスによる感染に感受性のある動物であってよく、好ましくは哺乳類である。より好ましくは、哺乳類はヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびウマからなる群から選択される。特に好ましい実施態様では、哺乳類はヒトである。
【００８２】
本発明の別の態様は、本発明の複製欠陥ウイルスをコードする核酸を担体分子とともにまたは担体分子を伴わずに個体に投与することを含む。当業者は核酸ワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）および核酸ワクチン技術ならびにタンパク質およびポリペプチドに基づく技術の概念、適用および有効性を認識している。核酸に基づく技術は、裸のまたは封入された本発明の複製欠陥ウイルスをコードする核酸を、投与前にコードされているタンパク質を生産する必要なく、直接組織および細胞、特に筋肉細胞またはケラチノサイトに投与することを可能とする。この技術はレシピエント生物の細胞によって取り込まれ、レシピエントの免疫系が応答する複製欠陥ウイルスを生産するように発現されるというこれらの核酸の能力に基づく。このような核酸ワクチン技術としては、限定されるものではないが、本発明の複製欠陥ウイルスをコードする発現ベクターの送達が含まれる。この技術は「ワクチン」と呼ばれるが、これは完全な治癒応答を生じない免疫原性組成物に対しても同様に適用可能である。このような部分的に保護を誘導する組成物および方法も本発明に包含される。
【００８３】
本発明はまた、より大きなまたはより複雑な組成物の一部としての複製欠陥ウイルスの送達も包含する。これらの送達系には本発明の複製欠陥ウイルスをコードする核酸を含むウイルス、ウイルス様粒子または細菌が含まれる。また、本発明の核酸および担体分子とリポソームなどの細胞浸透性化合物との複合体も本発明の範囲内に含まれる。分子ベクター（ＥＰ６９６，１９１、Samain et al.）などのその他の化合物および核酸ワクチンのための送達系も当業者に知られており、例えば、引用することにより本明細書の一部とするＷＯ９３／０６２２３およびＷＯ９０／１１０９２、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号（Vical特許）に例示されており、余分なまたは過度の実験を行わずに製造および使用することができる。
【００８４】
複製周期の間、ＨＢＶプレゲノムＲＮＡはウイルスコアタンパク質およびポリメラーゼタンパク質の翻訳のためのｍＲＮＡ鋳型として働く。それは、２００サブユニット前後のコアタンパク質からなるヌクレオキャプシド中にウイルスポリメラーゼとともに封入されている。ウイルスエンベロープは大（Ｌ）、中（Ｍ）および主として小（Ｓ）ウイルスエンベロープタンパク質とともに稠密に充填されている。エンベロープタンパク質の他、このウイルスは調節タンパク質（Ｘ）をコードし、総てサブゲノムＲＮＡから翻訳される。
【００８５】
ＨＢＶはヒトおよびチンパンジーにのみ感染する。もう１つの動物モデルとして、本発明は、肝臓においてＨＢＶ遺伝子を複製または発現するＨＢＶまたはＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスを提供する。生まれつきの導入遺伝子の発現はこれらの動物におけるｄＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を寛容化する。
【００８６】
本発明は、マウス肝臓における遺伝子発現を模倣するためのｒＨＢＶの流体力学的注射はｄＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答の寛容化を回避することを示す。
【００８７】
本発明はまた、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて、外来ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープをコードするＤＮＡベクターによるプライミングがＴ細胞応答を活性化し、これがその後、組換えＨＢＶ（ｒＨＢＶ）の流体力学的注射後のマウスの肝臓に局在することを示す。ｒＨＢＶは野生型ＨＢＶを担持し、かつ、ウイルス周期において同じ機構を共有している肝細胞でだけ複製すると予測されるので、外来ポリエピトープによって惹起された強い免疫応答は、自然ＨＢＶ持続的感染中に存在する消耗したＴ細胞応答を抑え込む。
【００８８】
Ｂ型肝炎慢性感染に対する免疫療法的戦略の開発における重大な問題は、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞がワクチン接種またはその他の免疫調節アプローチを用いて機能的に回復可能であるかどうかということである。また、ワクチンまたはそれ以外の活性化Ｔ細胞が肝臓に侵入し、ＨＢＶ感染細胞をクリアランスするかどうかを評価することも重要である。この段階の研究では、本発明者らは、外来免疫原性エピトープと融合した改変型コアタンパク質を肝臓細胞に送達するための免疫療法ベクターとしてＨＢＶを用いた。この改変型ウイルスの遺伝子発現後、機能的エピトープ特異的Ｔ細胞が肝臓に誘引され、そこでそれらは肝細胞におけるＨＢＶの遺伝子発現を制御することができた。
【００８９】
遺伝子療法に理想的なベクターは、健康な隣接細胞に害を与えずに異常な細胞を標的とすることができる。本発明は、一般的なウイルスに由来する免疫優性エピトープをコードする短い配列の挿入によって分断されたコア遺伝子を有する人工ｒＨＢＶを提供する。この改変型ウイルスは、野生型ウイルスキャプシドがトランスで提供される肝細胞以外では、複製能を持っていなかった。よって、ｒＨＢＶは、健康な肝細胞において維持されるのではなく、慢性的ＨＢＶ複製を有する患者の細胞においてだけ維持されると予想される。自然ＨＢＶ感染が排除されれば、その後のｒＨＢＶ偽ウイルスの命は停止される。
【００９０】
３．２ＫｂのＨＢＶゲノムは極めてコンパクトであり、構造遺伝子の重複オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と種々の調節エレメントを有する。主に空間的な制限のためにこのウイルスを操作することは技術的に難しい。本発明は、ｒＨＢＶ内の外来配列がＨＢＶ  ｍＲＮＡのポリアデニル化シグナルとポリメラーゼリーディングフレームの開始部の間に位置する領域に挿入されたということを示す。この領域に、ウイルス複製に関与している可能性のある明確なシス作用エレメントは見られなかった。しかしながら、リボソーム侵入のための可能性のある内部部位が記載されている。よって、このポリメラーゼの翻訳は、メッセンジャーＲＮＡへのリボソームシャントの機構を備えた確率の低い事象である。ＨＢＶポリメラーゼは、ｐｇＲＮＡにおいてεシグナルを見つけ、ウイルス複製を開始するためにシスで働く。従って、外来挿入の大きさはＨＢＶポリメラーゼの翻訳に適合しなければならない。興味深いことに、本発明者らの研究におけるｒＨＢＶは、Will H et alが劇症肝炎で同定した天然ＨＢＶ変異体（ＤＣ−１４４）と類似する。この変異体は、野生型コアタンパク質で十分補足された場合、野生型ＨＢＶよりも２倍〜４．５倍多い後代ＤＮＡを生産することができた(Gunther S., Piwon N., Jung A., Iwanska A., Schmitz H., Will H., 2000, Enhanced replication contributes to enrichment of hepatitis B virus with a deletion in the core gene, Virology 273:286-99)。さらに、ｒＨＢＶはｐｇＲＮＡのパッケージングに有利な短いウイルスゲノムを有する。従って、ｒＨＢＶは細胞核のｃｃｃＤＮＡプールを支配することができ、野生型ＨＢＶの複製の阻害に至ると予測される。
【００９１】
宿主免疫応答はＨＢＶ感染の種々の転帰を決定する重要な役割を果たしているということを示唆する証拠が増えている。特に、ＨＢＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答はウイルスの制御および免疫媒介疾患において極めて重要であると考えられている。しかしながら、慢性感染の際、これらの応答は一般に狭く、焦点が狭い。慢性患者由来のウイルス特異的Ｔ細胞はすぐに消耗される。Ｔ細胞の機能不全は高レベルの持続的ウイルス抗原のためであるとされている。しかし、慢性患者において、他の病原体に対する免疫応答は健全なままである。よって、本発明者らは、ｒＨＢＶ注射の後にさらに肝臓へ向け直される非ＨＢＶ特異的Ｔ細胞の活性化に基づく新規な治療用アプローチを設計することを考えた。
【００９２】
要するに、本発明は、野生型ウイルスの同時感染によって救済することができ、かつ、ウイルス感染細胞の排除およびその後のウイルスのクリアランスに寄与する外来抗原性エピトープを発現する、欠陥のある複製周期を有するウイルスを設計する新規なアプローチを提供する。本発明のベクターは、一般的な病原体に由来するエピトープの発現により、既存のウイルス特異的Ｔ細胞応答耐性を迂回する。このベクターはウイルス感染細胞でのみ複製する。
【００９３】
特定の実施態様では、本発明は、野生型肝炎ウイルスの同時感染によって救済することができ、かつ、肝炎ウイルス感染細胞の排除およびその後のウイルスのクリアランスに寄与する外来抗原性エピトープを発現する、欠陥のある複製周期を有する肝炎ウイルスを設計する新規なアプローチを提供する。本発明のベクターは、一般的な病原体に由来するエピトープの発現により、既存の肝炎ウイルス特異的Ｔ細胞応答耐性を迂回する。このベクターは肝炎ウイルス感染肝細胞でのみ複製する。
【００９４】
本発明によれば、外来抗原性ポリエピトープは肝炎免疫寛容を打破する、または打破を助けることができる。誘導されたＴ細胞応答は、非細胞溶解性機構により肝炎遺伝子を特異的または非特異的にサイレンシングすることができる。ポリエピトープを担持する組換え肝炎ウイルスは、ヒト肝臓細胞で再構成されたＵＰＡ−ＳＣＩＤマウスの肝細胞における複製に関して試験することができる。
【００９５】
以下のプラスミドを担持する大腸菌株がthe Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 25, rue du Docteur Roux, F- 75724 Paris, Cedex 15, Franceに寄託され、次のような受託番号を割り当てられた。
【表２】
0005710254.tif 000003
【００９６】
値の範囲に関して、文脈がそうではないことを明示していない限り、本発明は、その範囲の上限と下限の間の各中間値を、下限の単位の少なくとも１０分の１まで包含する。さらに、本発明は、記載されている他のいずれの中間値も包含する。また、本発明は、記載されている範囲から特に除外されていない限り、その範囲の上限および下限の一方または両方を含む範囲も包含する。
【００９７】
それ以外の定義がない限り、本明細書で用いられている総ての技術用語および科学用語の意味は、本発明が属する技術分野の熟練者によって共通に理解されているものである。当業者ならばまた、本明細書に記載されているものと類似または等価の方法および材料はいずれも本発明の実施または試験に使用可能であることが分かるであろう。
【００９８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「a」、「or」および「the」は、文脈がそうではないことを明示していない限り、複数形を含むことを述べておかなければならない。よって、例えば、「１つの対象ポリペプチド(a subject polypeptide)」は複数のこのようなポリペプチドを含み、「その薬剤(the agent)」は当業者に知られている１以上の薬剤およびその等価物を含むなどである。
【００９９】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる成分の量、反応条件、純度％、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さなどを表す総ての数値は、特に断りのない限り、「約」という言葉によって修飾される。よって、本明細書および添付の特許請求の範囲で示される数値パラメーターは、本発明の所望の特性によって異なり得る概数である。少なくとも、特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとするものではないが、各数値パラメーターは少なくとも、通常の概数法を適用し、報告されている有意なディジットの数を鑑みて構成すべきである。そうは言っても、具体例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値もその実験的測定の標準偏差に由来する一定の誤差を本質的に含んでいる。
【実施例】
【０１００】
実施例もまた上述の本発明の態様および実施態様を記載および詳説するが、これらの実施例は単に例であり、従って、本発明を何ら限定するものではないと考えるべきである。これらの実施例は、以下の実験が行った総てのまたは唯一の実験であることを表すものではない。用いられている数値（例えば、量および温度）に関しては厳密性を保証すべく努力したが、いくらかの誤差および偏差を見込むべきである。特に断りのない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏度であり、圧力は大気圧付近である。
【０１０１】
実施例１：組換えＨＢＶ（ｒＨＢＶ）複製のin vitroアッセイ
ポリエピトープ配列を１．３コピーのＨＢＶゲノムの、オリジナルキャプシドをコードするフラグメントのＮ末端部分に挿入し、組換えＨＢＶ（ｐｒＨＢＶ−１．３およびその誘導体−ＩＩＩまたは−ＩＶ、図２参照）を作出した。ｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩとＣＭＶプロモーター下でキャプシド遺伝子を発現するプラスミド（ｐＭＡＳコア）の肝臓細胞系統への同時トランスフェクションを行い、in vitroで野生型ＨＢＶ複製を模倣する複製周期を開始させた（サザンブロットアッセイによるｃｃｃＤＮＡゲノムおよび他の中間形態の検出）。結果を図３Ａに示す（分泌されたウイルス粒子における、ＰＣＲによるＨＢＶゲノムの検出）。
【０１０２】
ヒト肝細胞系統Ｈｕｈ７(Nakabayashi H., Taketa K., MIyano K., Yamane T., Sato J., 1982, Growth of human hepatoma cell lines with differentiated functions in chemically defined medium, Cancer Res 42(9):3858-63)をｐＭＡＳ−コアとともにまたは伴わずにｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩで、またはｐＭＡＳ−コア単独で、またはｐＦＣ８０（陽性対照、２つのＨＢＶゲノムをタンデムで含むプラスミド）でトランスフェクトした。上清を採取し、ＰＥＧ  ８０００を用いてウイルス粒子を沈殿させた。残りのプラスミドＤＮＡを除去するためのＤＮアーゼ処理の後、粒子を溶解させ、ＨＢＶゲノムをＰＣＲ増幅した（ＰＣＲプライマーはコア遺伝子のＮ部分上およびＨＢｓコード遺伝子の中間部）。あるいは、これらのプライマーはＨＢＶゲノムのいずれの部分にあってもよく、より詳しくは、Ｓ遺伝子の前にある）。結果を図３Ａに示す。予測されたフラグメントはｐｒＨＢＶ１．３とｐＭＡＳ−コアの同時トランスフェクションの後にのみ検出され、ｐＭＡＳ−コアまたはｐｒＨＢＶ１．３のいずれか単独のトランスフェクション後には検出されなかった。
【０１０３】
また、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）も、ｐｒＨＢＶ１．３とｐＭＡＳ−コアで同時トランスフェクトされた細胞またはｐＦＣ８０でトランスフェクトされた細胞からの上清で検出されたが、ｐＭＡＳコア単独のトランスフェクション後には検出されなかった（図３Ｂ参照）。
【０１０４】
ＬＨＢｓビリオンの救済を評価するため、同時トランスフェクションに関しては２種類の異なる比率（１：１および１：２）とコアは発現しないがＥＧＦＰを発現する対照プラスミドを用いた。ｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩとｐＭＡＳコアプラスミドを肝細胞Ｈｕｈ  ７細胞系統へ同時トランスフェクションした後、トランスフェクト細胞の上清を採取した。大ＨＢＶエンベロープタンパク質（ＬＨＢｓ）を含むウイルス粒子を、捕捉抗体としての大ＨＢＶエンベロープタンパク質に特異的な２種類のモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ  ５ａ９１およびＭｏＡｂ  １８−７）と検出のために標識された抗ＨＢｓ  ＭｏＡｂを用いる特異的ＥＬＩＳＡによって定量した。結果を図３Ｃに示す。この実験は、ＬＨＢｓを含む粒子の有効な分泌には用量依存的にコアの発現が必要とされることを示す。ＬＨＢｓは４２ｎｍのＨＢＶ  Ｄａｎｅ粒子の表面に位置することが知られている。
【０１０５】
実施例２：ｒＨＢＶ感染のin vivoアッセイ
in vitroにおいて生産されたｒＨＢＶビリオンがin vivoにおいて感染性があり得るかどうかを調べるための検討を行う。小動物モデルがないので、ヒト肝臓組織が移植されたＵＰＡトランスジェニックマウスが有用であり得る(Morosan S., et al, 2006, Liver-stage development of Plasmodium falciparum, in a humanized mouse model, J Infect Dis, 193:996-1004)。感染のためには少量の感染性ｒＨＢＶ保存株が必要である。これは、まず、ｒＨＢＶゲノムを構成的に発現する安定なＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）細胞系統を作出し、次に、この細胞系統にＨＢＶコア遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを形質導入することにより得られる。
【０１０６】
実施例３：一連の免疫優性エピトープの作出
ＨＢＶの分子生物学に関する知識に基づくと、ＨＢＶゲノム内に外来配列を収容するスペースはおよそ１９５ヌクレオチドに制限される。このスペースの制限のため、強力な免疫応答を誘導するために組換えＨＢＶゲノムに、外来免疫優性エピトープ（ポリエピトープ）をコードする短い配列が導入される。ポリエピトープに関しては、３つのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと雑多な(promiscuous)ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）とを組み合わせて構成され、これによりいくつかの優勢なＭＨＣクラスＩＩ分子に万能的に適合することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に関しては、臨床的観点から考えて、一般的なヒトウイルス（ＨＩＶ  ｇａｇ、インフルエンザ基質、ＥＢＶ  ＢＭＬ−Ｆ１）に由来する３つの周知のＨＬＡ−Ａ２制限エピトープが選択される。さらに、分子生物学アッセイのための便宜な検出マーカーとして、短いＢ細胞エピトープ（ＦＬＡＧ）を外来配列に導入する（図２および６Ａ〜６Ｄ参照）。ＨＬＡ−Ａ２制限キャプシド由来エピトープ（コア１８〜２７）はキャプシドタンパク質のＮ末端部分に存在する。
【０１０７】
実施例４：in vitroにおけるポリエピトープ発現の評価
ＨＢＶのプレコア−コア領域は、自己組立てを行ってウイルスキャプシドを形成する肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）と分泌ポリペプチドである肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）をコードする。これら２つのタンパク質はフレームコドンのうちの２者で選択的翻訳開始を行うことによって誘導される（図２参照）。１６ＫｄのＨＢｅタンパク質は、第１の開始コドンで開始された前駆タンパク質からのタンパク質分解切断によって誘導される。組換えＨＢＶによるポリエピトープの発現を評価するため、肝細胞腫細胞系統ＨｅｐＧ２をｐｒＨＢＶ１．３−ＩＶでトランスフェクトし、３日後に細胞溶解液を免疫ブロット分析用に採取した。抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体を用いた組換えｒＨＢｅタンパク質の検出を図４に示す。
【０１０８】
組換えウイルスにより担持されているポリエピトープの発現はまた、Ｈｕｈ７細胞をｐｒＨＢＶ１．３でトランスフェクトした後の、抗ＦＬＡＧ  ＭｏＡｂを用いた免疫蛍光アッセイにおいても検出された（図５パネルＢ参照）。ＨＢｓＡｇの発現はまた、抗ＨＢｓ  ＭｏＡｂを用い、Ｈｕｈ７細胞でも検出された（図５パネルＡ）。細胞内ＨＢｓＡｇの局在は細胞質に均一に分散していたが、タグ付きの組換えＨＢｃ抗原は、やや分極のある核周辺領域に局在していた。
【０１０９】
実施例５：in vivoにおけるポリエピトープ発現の評価
組換えウイルスにより担持されているポリエピトープの発現はまた、マウスにｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩ  ＤＮＡの流体力学的注射を行った後にも評価した(Yang P.L., et al, 2002, Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection, Proc Natl Acad Sci, U.S.A, 99:13825-30; Pajot A., et al., 2004, A mouse model of human adaptive immune functions: HLA- A2.1/HLA-DR1-transgenic H-2 class I/class II-knockout mice, Eur J Immunol, 34(11):3060-9)。
【０１１０】
ｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩ  ＤＮＡの注射３日後、肝臓を採取し、肝臓切片に対して組織化学的分析を行った。検出のために抗ＨＢｓ  ＭｏＡｂを用い、肝臓細胞でＨＢｓＡｇ発現が見られた（図６Ａ、６Ｃ）。抗ＦＬＡＧ  ＭｏＡｂを用い、外来エピトープを担持する組換えＨＢｅＡｇが検出された（図６Ｂ、６Ｄ）。対照マウスにはＰＢＳの流体力学的注射を施した。
【０１１１】
実施例６：in vivoにおけるポリエピトープに対するＴ細胞応答の評価
外来ポリエピトープに対するＴ細胞応答を評価するため、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるポリエピトープを有するプラスミド（ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅ）を、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲＢ１＊０１トランスジェニックマウス(Pajot et al, 2004)における筋肉内ＤＮＡ感作（２回の注射）により試験した。外来エピトープに対する特異的Ｔ細胞応答を、マウスに２回目の注射を行ってから１週間後に増殖アッセイおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープＰＡＤＲＥはＩＦＮ−γ−分泌細胞を活性化し（図７、左のパネル）、免疫マウス由来のリンパ球の増殖を誘導することができた（図７、右のパネル）。
【０１１２】
ポリエピトープ中に存在するＣＤ８エピトープの中で最も認識頻度が高いのはＦｌｕ基質由来エピトープであった（応答性マウス６は匹中４匹）。ＥＢＶおよびコア由来エピトープに対するＴ細胞応答は１匹のマウスでのみ見られた。Ｆｌｕ由来エピトープに対する免疫優性応答は、おそらくＨＬＡ−Ａ２分子への固定をめぐるペプチド間の競合の結果であろう。このことを第２の実験で確認したところ、Ｆｌｕ由来エピトープに対してＴ細胞応答を有する免疫マウスは１０匹中８匹であり、ＨＢｃ  １８−２７由来ＨＬＡ−Ａ２エピトープに対してＴ細胞応答を有する免疫マウスは１０匹中３匹であった（図８、左のパネル）。しかしながらやはり、Ｇａｇ由来エピトープおよびＥＢＶ由来エピトープ活性化Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ前にin vitroにおいて脾細胞を対応するペプチドで刺激してから１週間後に検出可能であった。
【０１１３】
また、Ｆｌｕ基質エピトープに対するＴ細胞応答も、ＤＮＡ感作マウス（ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅを２回注射）由来の脾細胞において、Ｆｌｕエピトープを担持するＨＬＡ−Ａ２四量体を用いて定量した。Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞は脾臓由来ＣＤ８＋Ｔ細胞の１０％前後に相当する（図８、右のパネル）。
【０１１４】
組換えウイルスにより発現されたポリエピトープに対する免疫応答も、ｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩをＨＬＡ−Ａ２／−ＤＲＢ  １＊０１トランスジェニックマウスに１回流体力学的注射した後に評価した。流体力学的注射から１６日後に採取した脾細胞に対してＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。Ｆｌｕ基質エピトープに特異的なＴ細胞が５匹中４匹のマウスで検出された（図９）。この実験では、対照として２匹のマウスに筋肉内注射によりｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩを感作させた（マウス６および７）。組換えＨＢＶの静脈内注射は筋肉内注射よりも免疫原性が低い。これは注射経路と寛容原性器官であることが知られている肝臓における抗原発現に関連するものであり得る。
【０１１５】
実施例７：in vivoにおけるポリエピトープに対するＴ細胞応答とＦｌｕ特異的Ｔ細胞の局在性の評価
ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲＢ１＊０１マウス群(Pajot et al, 2004)の筋肉内にプラスミドｐＣＭＶ−ｒＨＢｅを感作させ、外来エピトープに特異的なＴ細胞応答をプライミングした。プライミング１５日後、マウスにｐｒＨＢＶ１．３またはｐＣＭＶ−βＧａｌ（対照プラスミド）のいずれかの流体力学的経路による注射、またはｐＣＭＶ−ｒＨＢｅの筋肉内注射を行った。図１０Ａは免疫タイムラインのグラフを示す。
【０１１６】
肝臓浸潤リンパ球を調製し、ＦＡＣＳ分析のために抗ＣＤ８、抗ＣＤ３抗体、およびＦｌｕ四量体で染色した。非免疫対照マウスを対照として用いた。ＣＤ８  Ｔ細胞の定量は抗ＣＤ８、抗ＣＤ３抗体で染色した後に行った。ＣＤ３＋、ＣＤ８−細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞とみなした。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤肝臓の数は、ｐＣＭＶ−βＧａｌ受容マウス（図１０Ｂ、パネルＢ２、７．３１％）および非注射マウス（図１０ＢパネルＢ１、５．１１％）に比べ、ｐｒＨＢＶ１．３受容マウス（図１０ＢパネルＢ３、３７．４％）ではるかに多いことを示した。非免疫マウス、または体力学的注射によるｐＣＭＶ−βＧａｌ受容マウス、またはｐｒＨＢＶ１．３受容マウスに関する下のパネルにＦｌｕ特異的Ｔ細胞染色が示されている。ｐｒＨＢＶ１．３受容マウスでは、Ｔ細胞の１７％がＦｌｕ特異的である。これらの細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞の４２％に相当する。脾臓由来リンパ球で比較分析を行った。
【０１１７】
Ｔ細胞およびＦｌｕ特異的Ｔ細胞は脾臓および肝臓に局在した。結果を図１０Ｃに示す。ｐＣＭＶ−βＧａｌまたはｐＣＭＶ−ｒＨＢｅ受容マウスに比べ、ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射後にはＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤肝臓の％の著しい増加（それより低いが脾臓でも）が示された。これに対し、脾臓または肝臓におけるＣＤ４  Ｔ細胞のパーセンテージは３つのマウス群で匹敵するものである。肝臓では、主要なリンパ球集団は、四量体染色により検出されたように、Ｆｌｕ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる。これらの実験は、ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射後には、Ｆｌｕ特異的Ｔリンパ球が脾臓から肝臓へ再局在することを示す。
【０１１８】
実施例８：外来ポリエピトープを担持するｒＨＢＶゲノムの構築
ＨＢＶ  ａｙｗ３遺伝子型バックグラウンド（受託番号ＶＯ１４６０、ＧｅｎＢａｎｋ）においてｐｒＨＢＶ１．３を構築した。本発明は、全長ポリメラーゼ遺伝子およびＨＢＶゲノムの総ての下流ウイルスエレメントを担持するプラスミドｐＣＭＶ−Ｐｏｌを提供する。ポリメラーゼ遺伝子の開始コドンに隣接する配列をＫｏｚａｋのルールと一致するように5'CCGAACATGGAG（配列番号１）と改変した。さらに、外来ポリエピトープをコードする１８０ヌクレオチドのフラグメントを導入するために、ＡＴＧ開始コドンの前に２つの制限酵素部位（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＰｓｔ  Ｉ）が配置され（Genscript Corp., Piscataway, NJにより合成）、その結果、ｐＣＭＶ−Ｆ−Ｐｏｌと呼ばれる新たなプラスミドが得られた。この包埋された外来配列（Ｆ）は残りのＨＢＶコアフラグメントと同じリーディングフレームを共有する（図１１Ａ〜１１Ｄ）。
【０１１９】
１．３コピーのｒＨＢＶゲノムを作製するため、ＨＢＶゲノムのｎｔ１０７５〜ｎｔ１９８１にわたるＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、Ｎｒｕ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩでの消化により、親プラスミドのＣＭＶプロモーターに取って代わらせた。ｐＣＭＶ−ｒＨＢｃはＣＭＶプロモーターにより駆動される組換え外来抗原（ｒＨＢｃ）をコードする。ｐＭＡＳ−ＣはＣＭＶプロモーター下にＨＢＶコア遺伝子を含んでなる。プラスミドｐｒＨＢＶ１．３ＨＢｃはＨＢＶコアタンパク質の付加的発現カセットを有する。要するに、ＳＶ４０初期プロモーター配列（ｐＣＤＮＡ３由来、Invitrogen）をＰＣＲ増幅し、ｐｒＨＢＶ１．３のｒＨＢＶゲノムの下流に挿入した（ｆ１起点により分離）。さらに、このＨＢＶコア遺伝子をＢＧＨポリＡプロセシング部位とともにＳＶ４０初期プロモーター下にサブクローニングした（図１１Ｄ）。プラスミドはＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製カラム(Endofree Plasmid Kit（商標）; Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。
【０１２０】
ＰＣＲ増幅は、QIAamp DNA Blood Kit（商標） (Qiagen)を用い、マウスの血清からウイルスＤＮＡを抽出することによって行った。抽出されたＤＮＡを、残留するｐｒＨＢＶ１．３  ＤＮＡ夾雑プラスミドを線状化するためにＰｖｕ  ＩＩ消化で処理した。電気泳動後、ゲルの２．５〜３．５ｋｂの領域にわたるＤＮＡバンドを、特異的プライマー（３０４２Ｆ、5’GTGGAGCCCTCAGGCTCAGGG（配列番号２）；４５９Ｒ、5’GGACAAACGGGCAACATACC（配列番号３））を用いて、ＰＣＲ増幅用の鋳型として精製した。
【０１２１】
ｒＨＢＶは、除去して、一連の免疫優性Ｔ細胞エピトープをコードするインフレームの１９０ｂｐの外来配列と置換するＨＢＶコア遺伝子内の３２５ｂｐのフラグメントを除き、野生型ＨＢＶゲノム（図１１Ａ、１１Ｂ）とそのほとんどの特徴を共有するように構築した（図１１Ｃ）。欠失の結果としてポリメラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームは１３５ｂｐ前に移動し、ｐｏｌ  ＯＲＦのＡＴＧはＨＢＶプレゲノムＲＮＡの５’ＣＡＰに著しく接近する（図１１Ａ、１１Ｂ）。このポリメラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始シグナルは、翻訳のためのリボソーム侵入を容易にするためにＫｏｚａｋのルールに従って至適化した。
【０１２２】
外来ポリエピトープは３つの免疫優性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと雑多な(promiscuous)ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）とを組み合わせて操作し、これにより優勢なＭＨＣクラスＩＩ分子のほとんどと万能的に調和することができる。臨床的観点から考えて、in vivoにおいて強力な免疫応答を惹起するために、一般的なヒトウイルス（ＨＩＶ  ｇａｇ、インフルエンザ基質、ＥＢＶ  ＢＭＬ−Ｆ１）に由来する３つの周知のＨＬＡ−Ａ２制限エピトープが選択された。この構築においては、コア遺伝子のアミノ末端部分に存在する周知のＨＢｃ１８−２７  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープを保存した。さらに、便宜な検出マーカーとして外来配列のＮ末端部分に短いＢ細胞エピトープ（ＦＬＡＧ）を導入した（図１１Ｃ）。ＨＢＶのコア遺伝子はプレコア／ＨＢｅＡｇとコアタンパク質の２種類のタンパク質をコードし、これらは２つの異なるメッセンジャーＲＮＡ種へ翻訳される。この２種類のタンパク質の翻訳には２つのインフレーム開始コドンが用いられる。コアタンパク質はヌクレオキャプシドの主成分であり、ＨＢｃＡｇを担持する。ＨＢｅＡｇは、コアＯＲＦの最初のＡＴＧで開始される前駆体タンパク質の翻訳後修飾により産生される分泌型タンパク質である。従って、外来ポリエピトープが末端切断型ＨＢｅ／キャプシドタンパク質とインフレームで融合されたｒＨＢｃと呼ばれるキメラ抗原性タンパク質が生じ得る（図１１Ｃ）。
【０１２３】
ｐｒＨＢＶ１．３／ＨＢｃは２つの発現カセット（一方はｒＨＢＶゲノム発現のためのもので、もう一方はキャプシドタンパク質の発現のためのものである）を持つプラスミドである（図１１Ｄ）。プラスミドｐｒＨＢＶ１．３は１．３コピーのｒＨＢＶゲノムのみを有する。両プラスミドともin vitroおよびin vivoにおける複製アッセイに用いた。ｐＣＭＶｒＨＢｃでは、ｒＨＢｃの発現はＣＭＶ初期遺伝子プロモーターにより駆動される。ｍＲＮＡのポリアデニル化シグナルはＨＢＶ配列により提供される（図１１Ｄ）。中でもこのプラスミドをマウスの免疫に使用した。
【０１２４】
実施例９：ポリエピトープを担持する組換えタンパク質の発現
キメラｒＨＢｃタンパク質の発現をまず細胞培養系で検討した。ヒト肝細胞腫細胞系統ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ  ７を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入し、一時的トランスフェクションアッセイに用いた。ＰＥＩトランスフェクション４日後に細胞培養上清を採取し、ｒＨＢＶウイルスＤＮＡの調製に用いた。
【０１２５】
ＤＮＡトランスフェクション３日後に、公開されている方法を用いてＨｅｐＧ２細胞に対して免疫蛍光実験を行った。要するに、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞または組織切片を４℃で一晩、抗Ｆｌａｇ  ｍＡｂ（１０８４；１：１００；Sigma-Aldrich）または抗ＨＢｓ  ｍＡｂ（３Ｅ７；１：１００；Dako, Glostrup, Denmark）とともにインキュベートした。よく洗浄した後、結合した一次抗体をＡｌｅｘａ  ４８８標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ(Molecular Probes, Carlsbad, CA)で検出した。
【０１２６】
新しく調製し、液体窒素中で予冷したイソペンタン中で凍結させ、クリオモールド(cryomold)中のＯＣＴ化合物に包埋したマウス肝臓に対して組織学的染色を行った。５μ厚のクリオスタット切片をスーパーフロスト・プラス(superfrost plus)スライドにマウントし、−８０℃で保存した。染色前にスライドを氷冷アセトン中で５〜１０分間固定した。肝臓切片をヘマトキシリンとエオジンで染色するか、またはＦＩＴＣ標識抗ＨＢｓ抗体（１：５０；ａｂ３２９１４、Abeam, Cambridge, MA）で免疫染色した。ＰＢＳＴおよびＰＢＳでよく洗浄した後、肝臓切片を、ＤＡＰＩを含有する退色防止剤とともにマウントした。
【０１２７】
ｐｒＨＢＶ１．３プラスミドを肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞系統に一時的トランスフェクトした後、細胞溶解液において、予測されたサイズ（１５ｋＤ）の組換えタンパク質が、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットにより検出された（図１２Ａ）。また、ｒＨＢｃタンパク質が、ＨｅｐＧ２トランスフェクト細胞の細胞質における抗Ｆｌａｇ抗体を用いた抗体染色および免疫蛍光によって検出された（図１２Ｂ、下のパネル）。ｒＨＢＶでトランスフェクトされた細胞におけるＨＢＶエンベロープタンパク質の発現は、このエンベロープの主要抗原決定基であるＨＢｓＡｇに対する抗体を用いて検出された（図１２Ｂ、上のパネル）。興味深いことに、細胞内ＨＢｓＡｇの標識は細胞質に均一に分散していたが、ｒＨＢｅは、分極のある核周辺領域に局在していた。さらに、ＨＢＶ大エンベロープタンパク質（Ｌ）を担持するＨＢｓＡｇ粒子も、ｐｒＨＢＶ１．３トランスフェクション後の細胞培養上清におけるＥＬＩＳＡにより検出された（以下および図１２Ｄ参照）。
【０１２８】
実施例１０：ｒＨＢＶ粒子の救済とトランスキャプシド封入による複製
ｒＨＢＶはコア遺伝子の破壊による欠陥型ＨＢＶウイルスである。しかしながら、それは、感染肝細胞においてトランス生産された野生型ＨＢＶキャプシドの助けで、肝細胞において複製し、維持される。本発明は、ｒＨＢＶゲノムとキャプシドタンパク質の双方をコードするｐｒＨＢＶ１．３／ＨＢｃプラスミドのトランスフェクション後に、例えばＨｕｈ−７肝細胞系統からの細胞培養上清中に複製型のｒＨＢＶウイルスＤＮＡを提供するが、ｐｒＨＢＶ１．３のトランスフェクション後にはそのようなウイルスＤＮＡは提供しない。
【０１２９】
ｒＨＢＶビリオンに関連するウイルスＤＮＡをＨｅｐＧ２−またはＨｕｈ  ７トランスフェクト細胞の細胞培養上清から抽出した。要するに、培地中のウイルス粒子を、一晩氷上で１０％ＰＥＧ  ８０００とともにインキュベートすることにより沈殿させた。１１，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、ペレットをバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁させ、さらに、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下、ＤＮアーゼＩ(Invitrogen, Carlsbad, CA)で処理した。プロテイナーゼＫ消化（１ｍｇ／ｍｌ）の後、ウイルスＤＮＡを、担体としてエタノールおよびグリコーゲンを用いて沈殿させた。サザンブロットアッセイは、ＨＢＶゲノムに特異的な３２Ｐ標識プローブを用い、当技術分野で公知の方法によって行った。
【０１３０】
ＤＮＡ抽出およびサザンブロットアッセイにおけるＨＢＶ特異的プローブハイブリダイゼーションの後、ウイルスＤＮＡはその典型的な弛緩型の環状（ＲＣ）と二本鎖直鎖（ＤＳＬ）型の双方で検出されたが（図１３Ａ）、これらは正常なパッケージングとｒＨＢＶヌクレオキャプシドの成熟を示す。さらに、コア救済型ｒＨＢＶは野生型ＨＢＶよりも効率的なウイルス周期を示した。ｐｗｔＨＢＶで同時トランスフェクトした際、ｒＨＢＶの複製中間体は、野生型の複製型よりも有意に高いレベルで発現したが、これは野生型キャプシドタンパク質の存在下でのｒＨＢＶビリオンの救済、パッケージングおよび成熟を示す（図１３Ｃ）。
【０１３１】
流体力学的注射技術(Liu F., 1999, Gene Therapy)を用いて、マウス肝臓へｒＨＢＶゲノムを導入した。尾静脈からｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射を行って４日後に、それぞれ抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＢｓ抗体を用いた肝臓切片の免疫蛍光染色により、マウス肝臓で組換え抗原性タンパク質（ｒＨＢｃ）とＨＢＶエンベロープタンパク質の双方が検出された（図１２Ｃ）。これらの実験を考え合わせると、ＨＢＶエンベロープタンパク質と、ポリエピトープを担持するｒＨＢｃタンパク質は、１．３コピーのｒＨＢＶゲノムを担持するプラスミドのin vitroまたはin vivoトランスフェクション後に発現される。
【０１３２】
さらに、組換えｒＨＢＶビリオンは、流体力学的注射によりｐｒＨＢＶ１．３とｐＭＡＳ−Ｃの双方を受容したマウスの血清において、注射４日後に特異的ＰＣＲ増幅を用いて検出された。これに対し、ｐＭＡＳ−Ｃの不在下では、ｐｒＨＢＶ１．３単独注射またβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミド（ｐＣＭＶ−βＧａｌ）の同時注射を行ってもウイルスＤＮＡは検出されなかった（図１３Ｄ）。従って、ｒＨＢＶゲノムは、複製型のウイルスＤＮＡを含むウイルス粒子を完成するようにin vitroおよびin vivoで生成するキャプシドタンパク質によってトランスで補足され得る。
【０１３３】
大エンベロープタンパク質（Ｌ）は、感染個体の血清中に存在する４２ｎｍＨＢＶ完全ウイルス粒子の表面および繊維状ウイルス粒子下に局在することが知られている。完全なウイルス粒子がｒＨＢＶゲノムから生じ得ることを証明するため、ｐｒＨＢＶ１．３と、コアタンパク質をコードするプラスミド（ｐＭＡＳ−Ｃ）の同時トランスフェクション実験をＨｕｈ−７細胞系統で行った。コアコードプラスミドとの同時トランスフェクションの結果、対照としてのｐｒＨＢＶ１．３単独のトランスフェクションまたはｐＩＲＥＳ−ＧＦＰとの同時トランスフェクションの場合に比べ、細胞培養上清中のＬタンパク質担持粒子の生産が増加した。Ｌタンパク質生産の増加は、Ｌタンパク質のアミノ末端部分を認識する２つの異なるモノクローナル抗体を用いた特異的ＥＬＩＳＡで示されるように用量依存的であった（図１３Ｂ）。
【０１３４】
実施例１１：ポリエピトープ特異的Ｔ細胞応答の活性化
ＩＦＮ−γ生産脾細胞は、当技術分野で知られているように、ペプチドで刺激した後にex vivo  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって定量した。要するに、９６ウェルニトロセルロースＨＡプレート(Millipore, Bedford, MA)を、４℃で一晩、ＩＦＮ−γに対する捕捉抗体（５５１２１６；BD Pharmingen, San Diego, CA）とともにインキュベートすることによりコーティングした。新しく単離した脾細胞（１０／ウェル）を、補足α−ＭＥＭ培地中１μｇ／ｍｌの濃度の個々のペプチドとともに２４時間インキュベートした。二次ビオチンコンジュゲート抗体（５５４４１０；BD Pharmingen, San Diego, CA）とアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン(Roche, Basel, Switzerland)によりスポットを現像した。Ｚｅｉｓｓ  Ｅｌｉｓｐｏｔ自動カウンターを用い、スポットを計数した。応答は、３反復のウェル中のスポット形成細胞（ＳＦＣ）数の中央値が培地のみを含む対照ウェルの場合の少なくとも２倍である場合に陽性とみなした。
【０１３５】
増殖アッセイについては、脾細胞（１０細胞／ウェル）を、補足ＨＬ１血清不含培地(Biowhitaker, Walkersville, Maryland)中で３日間、２０μｇ／ｍｌのペプチドとともにインキュベートした(Pajot et al, 2004)。細胞をウェル当たり１μＣｉの（３Ｈ）−チミジンで最終１６時間刺激した。組み込まれた放射活性をマイクロβカウンターで測定した。
【０１３６】
外来ポリエピトープに対するＴ細胞応答を評価するため、ｒＨＢｃをコードするＤＮＡプラスミド（ｐＣＭＶ−ｒＨＢｃ、実施例１に記載のとおり）を用い、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウス(Pajot et al., 2004)に感作させた。筋肉内注射２週間後、ex vivo  ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて検出したところ、１０匹中９匹のマウスがエピトープ特異的Ｔ細胞応答を惹起したと判定された（図１４Ａ）。
【０１３７】
３つの外来ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうちＦｌｕ基質由来エピトープが明らかに最も高い頻度で認識され、最も強力である（応答性マウスは１０匹のうち９匹）。Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞応答は、このタンパク質のＮ末端部分に存在する、十分記載されているキャプシド由来ＨＢｃ１８−２７  ＨＬＡ−Ａ２エピトープに対する応答をも支配した。Ｆｌｕ由来エピトープに対する免疫優性応答はおそらくＨＬＡ−Ａ２分子への固定をめぐるペプチド間の競合の結果であろう。しかしながらやはり、ＧａｇおよびＥＢＶ特異的Ｔ細胞は、個々のペプチドによるin vitro脾細胞の刺激１週間後に検出可能であった。また、Ｆｌｕ基質エピトープに対するＴ細胞応答を、ＤＮＡ免疫マウス由来の脾細胞を標識するためのＦｌｕペプチドを担持するＨＬＡ−Ａ２五量体(Prolmmune, Oxford, UK)を用いて定量した。よって、Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞は脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞の１０％前後に相当する（図１４Ｂ、右のパネル）。
【０１３８】
ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅ注射を受容したマウスはまた、Ｉ  ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（図１４Ａ）と、ＰＡＤＲＥペプチドによる脾細胞の刺激の際の６匹のうち５匹の免疫マウスで見られた特異的増殖（図１４Ｃ）の双方によって示されたように、ＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープＰＡＤＲＥに対するＴヘルパー応答を生じさせた。
【０１３９】
実施例１２：肝臓に対するポリエピトープ特異的Ｔ細胞応答の再標的化
マウスに心室経路で２０ｍｌのＰＢＳを潅流させた。肝臓を１００μｍのセルストレーナー(cell strainer)（１００μｍナイロン、BD, Franklin Lakes, NJ)にてシリンジプランジャーで粉砕した。細胞ペレットを４０％のＰｕｒｃｅｌｌ(Sigma, St. Louis, MO)１５ｍｌに再懸濁させ、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して肝細胞塊を除去した。ペレット中の肝内リンパ球を、マウス脾細胞の分離の場合と同様に、フィコール勾配遠心分離でさらに精製した。新しく単離したリンパ球をＰｅｒＣＰ標識抗ＣＤ３、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体、またはＦｌｕペプチドとコンジュゲートしたＰＥ標識ＨＬＡクラスＩ四量体により染色した。
【０１４０】
ＦＡＣＳ分析については、対象集団にゲートを設けた少なくとも１００００事象を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラム(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)を用い、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーターにて分析した。ｒＨＢＶは肝臓中、ならびにＨＢＶ感染および複製マウスモデルの不在下で野生型ＨＢＶウイルスとともに維持されることを証明するため、本発明はＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるｒＨＢＶに基づく能動免疫療法プロトコールを提供する（図１５Ａ）。
【０１４１】
末梢においてポリエピトープ特異的Ｔ細胞応答をプライミングするため、０日目にプラスミドｐＣＭＶ−ｒＨＢｃの筋肉内注射によりＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１マウスを免疫した。２週間後、肝細胞感染を迂回し、肝臓におけるＨＢＶ複製を模倣するために、ｐｒＨＢＶ１．３を流体力学的経路により注射した(Yang P., Althage L.A., Chung J., Chisari F.V., 2002, Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection, Proc Natl Acad Sci, U.S.A. 99:13825-30)。よって、ｒＨＢＶが肝臓細胞において発現可能であり、コードされている外来抗原はペプチドへとプロセシングされ、in situで提供され、次に、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対する肝内標的となる。ｐＣＭＶ−βＧａｌを流体力学的注射の対照プラスミドとして用いた。
【０１４２】
プライミングおよびｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射の後、マウスは強い肝内Ｔ細胞応答を惹起し、多数のＣＤ８＋Ｔリンパ球が肝臓に浸潤する。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、３、４および７日目に採取した肝臓浸潤リンパ球のＦＡＣＳ分析によって検出されるように、マウス肝臓に蓄積した。７日目に肝臓浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ｐＣＭＶ−βＧａｌ受容マウス（７．３１％）および非免疫マウス（５．１１％）に比べて、ｐｒＨＢＶ１．３受容マウスでは全リンパ球の３７．４％までを占めた（図１５Ｂ）。ｐｒＨＢＶ１．３を受容したマウスにおいて、全肝臓浸潤リンパ球の４２％に相当する１７％のＴ細胞がＦｌｕ特異的であった。これに比べて、筋肉内注射によりプライミングされたＦｌｕ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は０．３６％のみが、ｐＣＭＶ−βＧａｌの流体力学的注射７日目の肝臓に存在した。
【０１４３】
図１５Ｃおよび１５Ｄは、流体力学的注射によりｐｒＨＢＶ１．３もしくはｐＣＭＶ−βＧａｌのいずれかを受容した、またはｐＣＭＶ−ｒＨＢｃの筋肉内注射を２回受容した４群のプライミングマウスからの肝臓および脾臓におけるＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞の相対的分布を示す。ｐＣＭＶ−βＧａｌ受容マウスおよびｐＣＭＶ−ｒＨＢｃのみを受容したマウスに比べ、ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射後のマウスの肝臓で、そしてそれより程度は低いが脾臓でＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの著しい増加が見られた。
【０１４４】
目立ったことでは、ｐｒＨＢＶ１．３受容マウスの肝臓でＦｌｕ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの大きな増加が見られた。免疫後、Ｆｌｕ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、脾臓リンパ球のパーセンテージに比べ、極めて高いパーセンテージの肝臓リンパ球を含んでいた（ｐ＝０．０００２）。これに対し、脾臓および肝臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは、３群のマウスで有意には異なっていなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が存在する場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞貯蔵庫は肝臓では相対的に減少するが、脾臓では減少しない。これらの実験は、Ｆｌｕ特異的末梢ＣＤ８＋Ｔリンパ球の大多数は、ｒＨＢＶに基づく能動免疫の後に肝臓に再局在することを示す。
【０１４５】
免疫後に誘導される全リンパ球のパーセンテージの増加は、肝臓および脾臓の双方で統計学的有意に達した。図１５Ｃに示されるように、ｐＣＭＶｒＨＢｅプライミングおよびその後にｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射を施したマウスの肝臓に見られたＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージは、ｐＣＭ  ＶｒＨＢｅプライミングおよびその後にｐＣＭＶβＧａｌの流体力学的注射を施したマウスの肝臓におけるより有意に高く（ｐ＝０．０００１）、筋肉内経路によってｐＣＭＶｒＨＢｅを２回注射したマウスよりも有意に高かった（ｐ＝０．０００９）。
【０１４６】
ｐＣＭＶｒＨＢｅプライミングおよびその後にｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射を施したマウスの脾臓に見られたＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージの同様の増加も、ｐＣＭＶｒＨＢｅプライミングおよびその後にｐＣＭＶβＧａｌの流体力学的注射を施したマウスの脾臓におけるより有意に高く（ｐ＝０．００１１）、筋肉内経路によってｐＣＭＶｒＨＢｅを２回注射したマウスよりも有意に高かった（ｐ＝０．０１１４）。
【０１４７】
実施例１３：ポリエピトープ特異的Ｔ細胞により媒介される肝臓におけるＨＢＶ遺伝子発現の非細胞溶解性制御
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、上記のように流体力学的注射７日後における肝臓浸潤物の主要集団である。肝臓浸潤物のさらなる分析は、ｐｒＨＢＶ１．３注射４日後に採取した肝臓切片の組織化学的分析によって行った（図１６Ａ）。炎症細胞の顕著な浸潤が肝臓で見られ、主として様々な大きさのクラスターに集中していたが、このことはそれらが急速に起こり、炎症病巣を形成することを示唆する。事前のプライミング無しでｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射を施したマウスから採取した肝臓切片では細胞クラスターはほとんど見られなかったので、これらの浸潤物の存在は末梢Ｔ細胞応答のプライミングに依存していた。ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅプライミングおよびその後にｐＣＭＶ−βＧａｌの流体力学的注射を施したマウスではクラスター化した浸潤物はほとんどまたは全く無かった（図１６Ａ）。
【０１４８】
Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞は、in vivo拡大中の活性化またはエフェクター記憶Ｔ細胞に相当するＣＤ４４＋、ＣＤ６２ＬｌｏｗおよびＣＤ６９ｈｉｇｈとしてさらに表現型分類された（図１６Ｂ）。Ｆｌｕペプチドによるex vivo刺激の際、新しく肝臓から単離されたこれらの細胞は主としてＩＮＦγを生産したが、ＴＮＦαも生じた（胞内染色により検出）（図１６Ｃ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の５８％前後が、細胞脱顆粒のマーカーである、ＣＤ１０７ａでの表面染色陽性であった（図１６Ｃ）。考え合わせるとこれらのデータは、肝臓浸潤細胞は主として機能的ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞であったことを示す。
【０１４９】
肝臓におけるＨＢＶ遺伝子の発現は、抗原認識後のＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞による非溶解性の制御を受け得ることが分かっているので、本発明者らはマウスの肝臓および血清におけるｒＨＢＶ発現(the expression of rHBV expression)をモニタリングした。ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射４日後に、ＨＢｓＡｇの肝内発現を、ｐｒＨＢＶ１．３単独受容マウス（図１６Ｄ、右のパネル）と比べたところ、ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅプライミング受容マウスでは検出不能であった（図１６Ｄ、左のパネル）。よって、ｐｒＨＢＶ１．３注射の前にＴ細胞がプライミングされたマウスの血清では、ＨＢｓＡｇの１００倍の減少が見られた（図１６Ｅ）。これに対し、末梢プライミングされたＴ細胞が存在しない場合、マウスはｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射後に強いＨＢｓＡｇ発現を示した。ＨｂｓＡｇ発現は肝臓切片の免疫蛍光染色（図１６Ｄ、右のパネル）と、市販の検出キット(Monolisa HBsAg ULTRA, Bio-Rad)を用いた血清におけるＨｂｓＡｇ測定（図１６Ｅ、左のパネル）によって証明された。考え合わせるとこれらの実験は、ポリエピトープにより活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるｒＨＢＶ遺伝子発現の迅速な非細胞溶解性制御を示す。
【０１５０】
これらの浸潤Ｔ細胞は仮説として肝臓傷害の一因である可能性がある。しかしながら、ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射４日後、対照としてのｐＣＭＶ−βｇａｌ受容マウスに比べ、流体力学的注射によるｐｒＨＢＶ１．３受容マウスの血清には傷害マーカーＡＬＴの有意な増加は見られなかった（図１６Ｆ）。流体力学的注射４日後に、平均血清アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、ｒＨＢＶに基づく免疫を施した１１匹のマウスで９４．１８±３０．３３ｍＵ／ｍｌであった。これに対し、ｐＣＭＶ−ｒＨＢｃプライミングおよびその後にｐＣＭＶ−βＧａｌの流体力学的注射を施したマウスでは血清ＡＴＬレベルは正常を維持したが（平均＝３８．００±５．３５）、コンカナバリンＡ誘導急性肝炎(Zhu R., et al, 2007, The Pro-Th1 cytokine IL-12 enhances IL-4 production by invariant NKT cells: relevance for T cell-mediated hepatitis, J. Immunol, 178:5435-42)を有するマウスの血清では顕著な増加が見られた（図１６Ｆ）。従って、末梢生起されたＴ細胞応答が存在する場合、ｒＨＢＶの発現は、大きな肝臓傷害を引き起こすことなく、肝臓のＴ細胞応答を急速に誘引したことが示唆される。
【０１５１】
実施例１４：ＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスにおける能動的免疫療法
本発明はさらに、肝臓においてＨＢＶエンベロープタンパク質を発現し、血清中にＨＢｓＡｇを分泌するトランスジェニックマウス系統を用い、本発明の偽ウイルスの器官特異的ウイルスの標的化および発現を証明する。この系統は予めＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスと戻し交配され、ネズミＭＨＣクラスＩ分子を欠いている。本研究に用いたＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１（ＨＬＡ−Ａ０２．０１／ＤＲ１−トランスジェニック、Ｈ−２クラスＩ／クラスＩＩ  ＫＯ）およびＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスはパスツール研究所の動物施設で育成されたものである(Pajot et al., 2004)。
【０１５２】
ＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２二重トランスジェニック系統（Ｈ−２クラスＩ  ＫＯ）はＨＬＡ−Ａ２のバックグラウンドを備えており、導入遺伝子の発現後、マウス肝臓でＨＢｓＡｇを産生する。筋肉内ＤＮＡ感作は、１００μｇのプラスミドＤＮＡを再生中の（すなわち、心臓毒処理した）脛側前側筋肉に注射することによって行った。流体力学的注射については、１２〜１５週齢前後の雌マウスを用いた。要するに、マウス体重の８＆に相当する量のＰＢＳ中、２５μｇのプラスミドＤＮＡを尾静脈から注射した。全量を５秒以内に送り込んだ。示された時間にマウスから採血し、特異的ＥＬＩＳＡにより血清をＨＢｓＡｇに関してアッセイした。マウスを含む総ての実験は欧州ガイドラインに従って行った。
【０１５３】
プライミングおよび流体力学的注射の後、マウスから毎週採血し、血清中のＨＢｓＡｇ濃度をモニタリングした。血清中のＨＢｓＡｇの低下はプライミング２週間後に初めて見られ、その後、ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射１〜２週間後に総ての供試マウスで２回目の急低下が見られた（図１７Ｂ）。プライミング後の低下は、循環から肝臓へのポリペプチド特異的Ｔ細胞の流入に相当する。このＨＢｓＡの低下は、供試マウスの何匹かの開始レベルに対して９０％までに達した（図１７Ｂ）。これに対し、対照としてのｐＣＭＶ−βＧａｌ受容マウスでは、流体力学的注射後に有意なＨＢｓＡｇ低下は見られなかった（図１７Ｃ）。
【０１５４】
ＨＢｓＡｇのクリアランスは完全ではなく、抗原レベルは２か月の追跡調査中に基本レベルの２５％前後で変動した。しかしながら、感作８週間後のｐＣＭＶ−βＧａｌ対照動物と比較すると、ＨｂｓＡｇのクリアランスは強く、持続的であった（ｐ＜０．０００１）。
【０１５５】
本発明者らはこれまでに、肝臓のＨＢＶ  ｍＲＮＡが、ＨＢｓＡｇ特異的ワクチンにより活性化されたＴ細胞によって分泌されたＩＮＦ−γによるダウンレギュレーションを受け得ることを示した(Mancini-Bourgine et al., 2004)。また、ＨｂｓＡｇに関してトランスジェニックなＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２バックグラウンドを有するマウスは、ｒＨＢＶに基づく能動免疫に対する抗ウイルス応答を示す。
【０１５６】
本発明の方法によって証明されるＨＢｓＡｇのクリアランスは、Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞の肝臓への非ＨＢＶポリエピトープ特異的流入と、ＨＢｓＡｇ発現肝細胞に対するＩＮＦγ分泌Ｔ細胞のバイスタンダー効果に関連している可能性がある。これは、これらの機能的エフェクターＴ細胞がｒＨＢＶ発現を制御するだけでなく、図１６Ｅに示されるように、肝臓におけるｕＨＢＶ導入遺伝子の発現を示すことを示唆する。
【０１５７】
要約すると、本願は、当技術分野で長年感じられていた必要性を満たす、持続的ウイルス感染の処置を目的とする能動免疫の使用のための新規で有効、かつ実現可能な戦略を提供する。
【０１５８】
本願を通じ、「ｒＨＢｅ」および「ｒＨＢｃ」の用語は、違いなく、改変型ｐｒｅＣＣオープンリーディングフレームの翻訳産物を意味する。
【０１５９】
参照文献
以下の文献を明細書で引用する。以下に記載した各文献および前記の文献は、その全体を参照により根拠とし、明細書で引用する。
【表３】
0005710254.tif 000004
0005710254.tif 000005
【０１６０】
【表４】
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0005710254.tif 000007
0005710254.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含めた本特許もしくは特許出願公報のコピーは、請求し、必要な手数料を支払えば特許庁から提供される。
【図１】外来エピトープを含む本発明の偽ウイルスを形成するようにＨＢｃを発現するプラスミドにより補足されるｒＨＢＶと呼ばれる組換えベクターの概略図であり、これは偽ウイルスに感染した肝細胞に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を刺激することができる。
【図２】ポリトープ（ポリエピトープ）を含むｐｒＨＢＶ−１．３−ＩＶと呼ばれる構築物ならびにポリトープＩＶと呼ばれる構築物を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｃは、ｐｒＨＢＶ  １．３−ＩＩＩとキャプシド発現プラスミド（ＰＭＡＳコア）で同時トランスフェクトされたヒト肝細胞系統からのｒＨＢＶ  ＤＮＡの救済を示す。図３Ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡがＰＣＲ増幅された。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｃは、ｐｒＨＢＶ  １．３−ＩＩＩとキャプシド発現プラスミド（ＰＭＡＳコア）で同時トランスフェクトされたヒト肝細胞系統からのｒＨＢＶ  ＤＮＡの救済を示す。図３Ｂ：その細胞上清中に粒子を含むＨＢｓＡｇの生産を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｃは、ｐｒＨＢＶ  １．３−ＩＩＩとキャプシド発現プラスミド（ＰＭＡＳコア）で同時トランスフェクトされたヒト肝細胞系統からのｒＨＢＶ  ＤＮＡの救済を示す。図３Ｃ：ＬＨＢビリオンの救済を示す。これは図１２Ｄにも示される。
【図４】図４は、ＨｅｐＧ２細胞系統（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）に一時的トランスフェクションした後の、組換え抗原ｒＨＢｅのウエスタンブロットによる検出を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞系統に一時的トランスフェクションした後の、組換え抗原ｒＨＢｅの抗体を用いた免疫蛍光染色による検出を示す。これは図１２Ｂにも示される。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、ｐｒＨＢＶ１．３−ＩＩＩをマウス（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）に流体力学的注射した後の、肝臓切片における外来組換え抗原の免疫染色を示す。これは図１２Ｃにも示される。
【図７】ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（左のパネル）および増殖アッセイ（右のパネル；図１４Ｃにも示される）により検出された、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１  ＴｇマウスのｒＨＢＶゲノム中のポリエピトープに対する細胞応答を示す。
【図８】ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅ−ＩＶを感作させたＨＬＡ−Ａ２／ＤＲＢ１  Ｔｇマウスの免疫応答を示す。左のパネルはインフルエンザ基質タンパク質に由来するエピトープに対する免疫優性応答を示す。これは図１４Ａにも示される。右のパネルは、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲＢ１非免疫（右上）または免疫マウス（右下）での、脾臓細胞における、Ｆｌｕエピトープを担持するＨＬＡ−Ａ２四量体で標識されたＦｌｕ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出を示す。これは図１４Ｂにも示される。
【図９】マウスの尾静脈からのｐｒＨＢＶ−１．３ＩＩＩの流体力学的注射後のＴ細胞応答を示す（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、in vivoにおけるポリエピトープに対するＴ細胞応答およびｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射後のマウス肝臓肝臓におけるＦｌｕ特異的Ｔ細胞の局在を示す。これは図１５Ａ〜１５Ｄにも示される。図１０Ａ：免疫タイムライン；ｐｒＨＢＶ１．３（ドットの四角）、ｐＣＭＶ−βＧａｌ（対照プラスミド、白い四角）、ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅ（グレーの四角）。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃは、in vivoにおけるポリエピトープに対するＴ細胞応答およびｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射後のマウス肝臓肝臓におけるＦｌｕ特異的Ｔ細胞の局在を示す。これは図１５Ａ〜１５Ｄにも示される。図１０Ｂ：肝臓浸潤リンパ球の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析；非注射マウス（パネルＢ１）、ｐＣＭＶ−βＧａｌ受容マウス（パネルＢ２）、ｐｒＨＢＶ１．３受容マウス（パネルＢ３）；下のパネルは各処理のＦｌｕ特異的Ｔ細胞染色を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、in vivoにおけるポリエピトープに対するＴ細胞応答およびｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射後のマウス肝臓肝臓におけるＦｌｕ特異的Ｔ細胞の局在を示す。これは図１５Ａ〜１５Ｄにも示される。図１０Ｃ：脾臓（上のパネル）および肝臓（下のパネル）におけるＴ細胞およびＦｌｕ特異的Ｔ細胞の局在；ｐｒＨＢＶ１．３流体力学的注射受容マウス（ドットのバー）、ｐＣＭＶ−βＧａｌ受容マウス（白いバー）、ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅ受容マウス（グレーのバー）。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄ：ｒＨＢＶ構築物およびプラスミドの概略図。図１１Ａ：ＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ＨＢＶ／ｐｇＲＮＡ）が細い青い線で表され、キャッピング部位（ｃａｐ）、キャプシド形成（ε）シグナルおよびポリアデニル化（Ａｎ）シグナルが示されている。コアのＡＵＧコドンとポリメラーゼ（ｐｏｌ）オープンリーディングフレームの間の距離は４０６ヌクレオチド（ｎｔ）である。図１１Ｂ：ｒＨＢＶプレゲノムＲＮＡが示され、外来抗原性ポリエピトープをコードする短いＤＮＡ配列（青）がコアオープンリーディングフレーム内にインフレームで挿入され、キメラタンパク質（ｒＨＢｃ）の発現が可能となっている。図１１Ｃ：ｒＨＢｃコードドメインの概略図は、それぞれＨＢｅ抗原の発現およびコアタンパク質に対する２つのインフレームＡＴＧコドンを示す。検出マーカーとして用いられるＢ細胞エピトープ（ＦＬＡＧ）；それぞれＨＩＶ  Ｇａｇ、インフルエンザ基質およびＥＢＶ  ＢＭＬＦ−１タンパク質に由来する３つのＨＬＡ−Ａ２制限ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ；ならびに万能ＣＤ４−Ｔ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含んでなるポリエピトープ。これらのポリエピトープ配列をコア遺伝子のアミノ末端部分内にインフレームで挿入した。図１１Ｄ：プラスミドの概略図を示す。ｐＣＭＶｒＨＢｃプラスミドは、ＣＭＶ初期遺伝子プロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）の制御下でｒＨＢｃならびにｒＨＢＶゲノムの発現を可能とする。ｐｒＨＢＶ１．３プラスミドは１．３コピーのｒＨＢＶゲノムを担持する。ｐｒＨＢＶ１．３／ＨＢｃプラスミドは、１．３コピーのｒＨＢＶゲノム、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター（Ｐ−ＳＶ４０）の制御下で野生型ＨＢＶコア遺伝子を発現させるためのカセットを担持し、１以上のウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ  ｐＡ）を用いる。ポリエピトープをコードする配列が挿入されている位置を矢印で示す。ヌクレオチドの位置はＨＢＶのＤ遺伝子型ａｙｗサブタイプの配列に従って示されている。０番はＥｃｏＲ１部位に相当し、１９８１番はＨＢＶゲノムにおけるｍＲＮＡに対するポリアデニル化シグナルの３’末端に相当する。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄ：ｒＨＢＶおよびキメラ抗原性タンパク質の発現を示す。図１２Ａ：ＨｅｐＧ２細胞系統（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）をｐＦＬＡＧ−ＰＣＮＡまたはｐｒＨＢＶ１．３プラスミドでトランスフェクトした後に得られた細胞溶解液のウエスタンブロット解析。Ｆｌａｇと融合された増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（レーン１；対照）とｒＨＢｃ（レーン２）の分子量は分子量マーカー（キロダルトン（ＫＤａ））に従って評価する。図１２Ｂ：ｐｒＨＢＶ１．３プラスミドでトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の、抗ＨＢｓ（上のパネル）または抗ＦＬＡＧ抗体（下のパネル）を用いた免疫蛍光染色。ＤＡＰＩ染色核は青色である。図１２Ｃ：ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射４日後のマウス（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）から採取した肝臓切片に対する抗体標識（抗ＨＢｓ、左のパネルおよび抗ＦＬＡＧ、右のパネル）および免疫蛍光染色。図１２Ｄ：ＨＢＶ−Ｌタンパク質を含むＨＢｓＡｇ粒子の、サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量。ＰｒｅＳ１特異的モノクローナル抗体（５ａ９１および１８−７）を捕捉抗体として用い、２種類の異なる比率のｐｒＨＢＶ１．３（ｒＨＢＶ）およびｐＭＡＳ−Ｃ（コア）プラスミドで、または対照プラスミドｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ）でトランスフェクトされたＨｕｈ−７細胞の培養上清中のＬタンパク質を検出した。結果はＥＬＩＳＡによる４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）として表す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄ：野生型コアタンパク質によるキャプシド形成ｒＨＢＶゲノムを示す。図１３Ａ：２種類の異なる濃度のｐｒＨＢＶ１．３（レーン１、３）またはｐｒＨＢＶ１．３／ＨＢｃプラスミド（レーン２、４）でトランスフェクトされたＨｕｈ  ７細胞の細胞培養上清におけるＨＢＶ特異的プローブを用いたサザンブロットアッセイにより検出されたウイルスＤＮＡ。対照として、ＨｅｐＡＤ３８細胞系統から野生型ＨＢＶ  ＤＮＡを抽出した（レーン５）。弛緩環状（ＲＣ）、二本鎖直鎖（ＤＳＬ）および一本鎖（ＳＳ）ＨＢＶ  ＤＮＡに相当するバンドが示されている。Ｍ：分子量マーカー（Ｋｂ）。ＨＢｃ＋は、トランスフェクション実験に用いたベクターによるキャプシドタンパク質の発現を示す。図１３Ｂ：ｐｒＨＢＶ１．３（白い柱）またはｐｒＨＢＶ１．３／ＨＢｃ（グレーの柱）のいずれかでトランスフェクトされたＨｕｈ  ７細胞の培養培地（３〜５日）でのＨｂｓＡｇ（左）およびＬＨＢｓＡｇ（右）の産生を比較するＥＬＩＳＡアッセイ。ＨＢｓＡｇ（ｎｇ／ｍｌ）はＭｏｎｏｌｉｓａ検出キット(Bio-Rad, Hercules, CA)によって定量した。ＬＨＢｓＡｇの産生は４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）として表した。図１３Ｃ：ｐａｙｗ  １．２およびｐｒＨＢＶ  １．３での同時トランスフェクション３日後のＨｕｈ  ７細胞中のウイルスＤＮＡのサザンブロットアッセイ。各濃度をブロットの下の表に示す。図１３Ｄ：ｐｒＨＢＶ１．３をｐＭＡＳ−Ｃ（レーン１〜３）またはｐＣＭＶ−ｂＧａｌ（レーン４〜６）のいずれかとともに流体力学的注射して４日後のＣ５７／ＢＬ６マウスの血清におけるＰＣＲによるウイルスＤＮＡの検出。ｐＦＣ８０プラスミドを陽性対照として用いた（レーン７）。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃ：ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅを注射したマウスにおけるポリエピトープ特異的Ｔ細胞応答を示す。図１４Ａ：ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅの１回の筋肉内注射から１５日後に採取した１０個体のＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスからの脾細胞に対して行ったＥＬＩｓｐｏｔアッセイ。各バーは、各マウス個体の脾細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の数を表す。ex vivoで脾細胞の刺激に用いたペプチドはＨＩＶ  ｇａｇ（ＨＩＶ−Ｇ）、インフルエンザ基質（ＦＩｕ−Ｍ）、ＥＢＶ−ＢＭＬＦ１（ＥＢＶ−Ｂ）、ＨＢＶキャプシド（ＨＢｃ／１８−２７）およびＨＢＶエンベロープ（ＨＢｓ  ５）タンパク質に由来する。ＰＡＤＲＥは雑多な(promiscuous)ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドである。図１４Ｂ：ｐＣＭＶ−ｒＨＢｅの１回の筋肉内注射から１５日後に採取した非免疫マウス（左のパネル）および代表的なＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウス（右のパネル）由来Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。脾臓細胞を、ＡＰＣで標識された抗ＣＤ８抗体、およびＦｌｕペプチドを担持するＨＬＡ−Ａ２五量体で染色した。Ｆｌｕ特異的Ｔ細胞は脾臓由来ＣＤ８  Ｔ細胞の１０％前後に相当する（赤い丸）。図１４Ｃ：ＰＡＤＲＥペプチドでin vitro刺激された後のｐＣＭＶ−ｒＨＢｃ−免疫ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウス由来脾細胞の増殖応答。応答は増殖指数として表す。点線は刺激指数の平均値に相当する。ＳＩ＞２であれば陽性とみなされる。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｄは、ｒＨＢＶの流体力学的注射後の、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスの肝臓および脾臓におけるＴ細胞応答を示す。図１５Ａ：能動免疫プロトコールは、０日目（Ｄ０）にｐＣＭＶ−ｒＨＢｃの筋肉内注射によりＴ細胞応答をプライミングすることを含む。１５日目（Ｄ１５）に、マウスに流体力学的経路によって、ｐｒＨＢＶ１．３または対照ｐＣＭＶ−βＧａｌプラスミドのいずれかを注射した。２２日目（Ｄ２２）に、脾臓および肝臓由来のリンパ球をＦＡＣＳ分析用に採取した。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｄは、ｒＨＢＶの流体力学的注射後の、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスの肝臓および脾臓におけるＴ細胞応答を示す。図１５Ｂ：抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰと抗ＣＤ８−ＡＰＣ抗体（上のパネル）、およびＰＥ標識Ｆｌｕ特異的四量体とＡＰＣ標識抗ＣＤ８（下のパネル）で染色した肝内リンパ球のＦＡＣＳ分析。リンパ球は非免疫マウス（Ｂ１、左のパネル）、ｐＣＭＶｒＨＢｃプライミング／ｐＣＭＶβＧａｌ流体力学的注射受容マウス（Ｂ２、真ん中のパネル）およびｐＣＭＶｒＨＢｃプライミング／ｐｒＨＢＶ１．３流体力学的注射受容マウス（Ｂ３、右のパネル）から調製した。脾細胞のＣＤ８＋（丸）およびＣＤ４＋（四角）Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜Ｄは、ｒＨＢＶの流体力学的注射後の、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスの肝臓および脾臓におけるＴ細胞応答を示す。図１５Ｃ：３群のマウスに由来する肝内リンパ球の分析。第１の群はｐＣＭＶｒＨＢｃプライミング／ｐＣＭＶβＧａｌ流体力学的注射を受け（白いバー、ｎ＝５）、第２の群はｐＣＭＶｒＨＢｃプライミング／ｐｒＨＢＶ１．３流体力学的注射を受け（ドットのバー、ｎ＝６）、第３の群は筋肉内経路により２回目のｐＣＭＶｒＨＢｃ注射を受けた（グレーのバー、ｎ＝３）。結果は、全リンパ球集団におけるＣＤ８＋、ＣＤ４＋およびＦｌｕ特異的Ｔ細胞の平均±ＳＥＭパーセンテージとして表す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜Ｄは、ｒＨＢＶの流体力学的注射後の、ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスの肝臓および脾臓におけるＴ細胞応答を示す。図１５Ｄ：図１５Ｃに記載のマウス由来の脾臓内リンパ球の分析。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜Ｆは、肝臓浸潤リンパ球の分析を示す。図１６Ａ：流体力学的注射４日後に採取した肝臓切片の組織学的分析。ｐＣＭＶｒＨＢｃプライミング／ｐＣＭＶβＧａｌ流体力学的注射を受けた代表的なＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１マウス（左のパネル、１００倍）、およびｐＣＭＶｒＨＢｃプライミング／ｐｒＨＢＶ１．３流体力学的注射を受けた代表的なマウス（真ん中のパネル、１００倍）からの肝臓切片のヘマトキシリン／エオジン染色。右のパネルは真ん中のパネルの領域を２００倍で示す。炎症病巣の細胞クラスターを枠内に示す。矢印は変性を受けている細胞を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜Ｆは、肝臓浸潤リンパ球の分析を示す。図１６Ｂ：ｐＣＭＶｒＨＢｃプライミング／ｐｒＨＢＶ１．３流体力学的注射後の代表的なマウスから採取した肝内リンパ球表現型。Ｆｌｕ五量体標識後のＦｌｕ＋またはＦｌｕ陰性細胞の分析のためＣＤ８＋Ｔ細胞をゲートで制御した（左のパネル）。五量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞（真ん中のパネル）および五量体陰性ＣＤ８  Ｔ細胞（右のパネル）に対してＣＤ６９＋およびＣＤ６２Ｌ＋細胞の定量を行った。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜Ｆは、肝臓浸潤リンパ球の分析を示す。図１６Ｃ：ＣＤ３＋  ＣＤ８＋肝内Ｔ細胞の機能特性。ポリエピトープ由来ペプチド（３つの混合物）によるex vivo刺激の後（下のパネル）または刺激無し（上のパネル）で、細胞を表面マーカーＣＤ１０７、細胞内ＩＮＦγおよびＴＮＦαに関して分析した。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜Ｆは、肝臓浸潤リンパ球の分析を示す。図１６Ｄ：ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射前にｐＣＭＶｒＨＢｃ筋肉内注射でプライミングされたか（左のパネル）またはプライミングされていない（右のパネル）マウスからの、ｐｒＨＢＶ１．３流体力学的注射４日後に採取された肝臓切片に対するＨＢｓＡｇの免疫染色。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜Ｆは、肝臓浸潤リンパ球の分析を示す。図１６Ｅ：ｐｒＨＢＶ１．３の流体力学的注射前における、プライミング有り（白い）またはプライミング無し（グレーの柱）の、図１６Ｄのマウスの血清中のＨＢｓＡｇの平均レベル（ｎｇ／ｍｌ）。
【図１６Ｆ】図１６Ａ〜Ｆは、肝臓浸潤リンパ球の分析を示す。図１６Ｆ：ｐＣＭＶ−ｒＨＢｃプライミング／ｐｒＨＢＶ１．３流体力学的注射後のマウス（グレーの柱、ｎ＝１１）およびｐＣＭＶ−ｒＨＢｃプライミング／ｐＣＭＶ−βＧａｌ流体力学的注射を行ったマウス（白い柱、ｎ＝４）の血清中のトランスアミナーゼの平均レベル（ＡＬＴ  ｍＵ／ｍｌ）。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）注射をＡＬＴ増加の陽性対照として用いた。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｃは、ＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＨＢｓＡｇ発現の制御を示す。図１７Ａ：ＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおける能動免疫のプロトコール。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｃは、ＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＨＢｓＡｇ発現の制御を示す。図１７Ｂ：０週間目（ＷＯ）にｐＣＭＶ−ｒＨＢｃの筋肉内注射によるプライミングと２週間（Ｗ２）後のｐｒＨＢＶ１．３流体力学的注射の後の、個々のＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの血清におけるＨＢｓＡｇの低下。マウスを毎日採血し、市販のＥＬＩＳＡを用いてＨＢｓＡｇ（ｎｇ／ｍｌ）を定量した。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜Ｃは、ＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＨＢｓＡｇ発現の制御を示す。図１７Ｃ：ｐｒＨＢＶ１．３（黒いバー）またはｐＣＭＶ−βＧａｌ（白いバー）受容マウスの血清において、ＨＢｓＡｇのパーセンテージは８週間にわたって低下する。０週目のＨＢｓＡｇ濃度を１００％とし、結果を平均±ＳＥＭで表す。
【図１８】ｐｒＨＢＶ−１．３−ＩＩＩの配列（配列番号４）（ポリエピトープ（ポリトープ）配列に網掛け（配列番号５））を示す。
【図１９】ｒＨＢｅ＿ＩＩＩ＿の配列（配列番号６）（組換えタンパク質；ポリエピトープ（ポリトープ）配列に網掛け（配列番号７））を示す。
【図２０】ポリトープＩＩＩの配列（配列番号８）（小文字のアミノ酸はフランキング残基である）を示す。
【図２１】ポリトープＩＶの配列（配列番号９）（小文字のアミノ酸はフランキング残基である）を示す。
【図２２】ｐｒＨＢＶ−１．３−ＩＶの配列（配列番号１０）（ポリエピトープ（ポリトープ）配列に網掛け（配列番号１１））を示す。
【図２３】ｒＨＢｅ＿ＩＶ＿の配列（配列番号１２）（組換えタンパク質；ポリエピトープ（ポリトープ）配列に網掛け（配列番号１３））を示す。
【図２４】ＮＣＢＩ受託番号：Ｖ０１４６０Ｂ型肝炎ウイルス（ａｙｗ株）ゲノム、ＤＮＡ配列（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｖ０１４６０  Ｊ０２２０３  ＶＥＲＳＩＯＮ  Ｖ０１４６０．１  ＧＬ６２２７６，ＶＲＬ  ２８−ＪＡＮ−２００３）（配列番号１４）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図６】
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【図１２】
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【図１７Ｂ】
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