(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメインおよびＦ１ドメインを含んでなる可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含んでなる、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原であって、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間にフューリン切断部位がなく、前記ポリペプチドが、Ｆ１ドメインのＣ末端側に配置された異種性三量体形成ドメインを更に含んでなる、組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２】
前記Ｆ２ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸２６〜１０５に対応するＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチド部分を少なくとも含んでなる、請求項１に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３】
前記Ｆ１ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸１３７〜５１６に対応するＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチド部分を少なくとも含んでなる、請求項１または２に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項４】
前記Ｆ２ドメインが、配列番号２の参照Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸２６〜１０５に対応するＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドを含んでなり、かつ／または前記Ｆ１ドメインが、アミノ酸１３７〜５１６に対応するＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項５】
前記ＲＳＶ抗原が以下の群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原：
ａ）配列番号６を含んでなるポリペプチド；
ｂ）配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、天然ＲＳＶ株に対応しないアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項６】
シグナルペプチドを更に含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項７】
前記異種性三量体形成ドメインがコイルドコイルドメインを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項８】
前記異種性三量体形成ドメインが、イソロイシンジッパーを含んでなる、請求項７に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項９】
前記ＲＳＶ抗原が、
（ｉ）異種性三量体形成ドメインを含んでなるアミノ酸配列の付加；
（ｉｉ）少なくとも１つのフューリン切断部位の欠失；
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非フューリン切断部位の欠失；
（ｉｖ）ｐｅｐ２７ドメインの１または複数のアミノ酸の欠失；および
（ｖ）前記Ｆタンパク質の細胞外ドメインの疎水性ドメインにおける、親水性アミノ酸による少なくとも１つの置換または付加
を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１０】
前記ＲＳＶ抗原が、ポリペプチドの多量体を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１１】
前記ＲＳＶ抗原が、ポリペプチドの三量体を含んでなる、請求項１０に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原および薬学的に許容される担体または賦形剤を含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記担体または賦形剤が、緩衝剤を含んでなる、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
アジュバントを更に含んでなる、請求項１２または１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、水中油型エマルション、およびミョウバンの少なくとも１つを含んでなる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の感染の低減または防止に用いるための、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ＲＳＶ以外の病原生物の少なくとも１つの更なる抗原を更に含んでなる、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、組換え核酸。
【請求項１９】
前記ＲＳＶ抗原をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、選択された宿主細胞での発現に最適化されたコドンである、請求項１８に記載の組換え核酸。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の核酸を含んでなる、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原を含んでなる、ＲＳＶ感染の処置に用いるための医薬組成物。
【請求項２２】
ＲＳＶ感染の予防的処置に用いるための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原または請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原または請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含んでなる、ＲＳＶ関連疾患の防止または処置に用いるための医薬組成物。
【請求項２５】
Ｆタンパク質の融合前構造において安定化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項２６】
Ｆタンパク質の融合前構造において安定化される可溶性ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドである、請求項１〜１１および２５のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年１２月２４日に提出された米国仮出願第６１／０１６，５２４号および２００８年５月２７日に提出された米国仮出願第６１／０５６，２０６の先の提出日の利益を主張するものであり、これらの開示は参照により本明細書に援用する。
【０００２】
米国特許法施行規則§１．７１（Ｅ）に従う著作権の通知
本特許文書の開示の一部は、著作権保護されるべき財産を含む。著作権者は、特許商標庁の特許のファイルまたは記録に表れる限りにおいては、特許文書または特許開示の複製に異議を有しないが、それ以外は如何なる場合にも、全ての著作権は著作権者が有する。
【０００３】
背景技術
本発明は免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に特異的な免疫反応を引き起こすための組成物および方法に関する。
【０００４】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Respiratory Syncytial Virus; ＲＳＶ）は、６ヶ月未満の幼児および妊娠期間３５週間以下の未熟児における下気道感染症（ＬＲＩ）の世界で最も多い原因である。ＲＳＶ疾患の範囲には、鼻炎および耳炎から肺炎および細気管支炎にわたる幅広い呼吸器系の症状が含まれ、後者の２つの疾患は罹患率および死亡率がかなり高い。ヒトは、知られている唯一のＲＳＶ保有宿主である。ウイルスの混入した鼻汁からのウイルスの拡散は大きな呼吸器系の飛沫を介して起こるため、伝染には、感染した個人または汚染された表面との密接な接触が必要である。ＲＳＶは玩具等の物体上に数時間存在し得るので、特に小児病棟において、ＲＳＶの院内感染率は高い。
【０００５】
全世界での１年間におけるＲＳＶの感染数および死亡数はそれぞれ６４００万件および１６０，０００件と推定されている。米国単独では年間で、ＲＳＶが原因の入院件数は１８，０００〜７５，０００件、死亡件数は９０〜１９００件であると推定される。温暖気候では、毎年冬に流行する細気管支炎および肺炎を含む急性ＬＲＩの原因がＲＳＶであるという詳細な記録がある。米国では、２歳までにほぼ全ての子供がＲＳＶに感染する。その他の点では健康な子供のＲＳＶ関連ＬＲＩの発症率は、生後２年間では３７／１０００人−年（６ヶ月未満の幼児では４５／１０００人−年）、入院のリスクは６／１０００人年（生後６ヶ月までの幼児では／１０００人−年）と計算されている。心肺の疾患を有する子供および早産で生まれた子供は発症がより多く、米国におけるＲＳＶ関連の入院のほぼ半分を占める。ＲＳＶにより引き起こされたより重篤なＬＲＩを経験した子供は、その後の小児喘息の発症率が高い。これらの研究は、重篤なＬＲＩおよびその後遺症を有する患者の看護費用の高い先進国におけるＲＳＶワクチンおよびその使用に対する幅広いニーズを示している。ＲＳＶはまた、高齢者のインフルエンザ様疾病の罹患率の大きな原因として次第に認識されてきている。
【０００６】
健常者集団およびリスク集団において長期間にわたり防御免疫反応を引き起こす安全かつ効果的なＲＳＶワクチンを製造するために種々のアプローチが試みられてきた。しかし、これまで調べられた候補のいずれも、ＲＳＶ感染の防止および／または下気道感染症（ＬＲＩ）等のＲＳＶ疾患の低減もしくは防止を目的とするワクチンとして安全かつ効果的であることは証明されていない。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。より具体的には、三量体融合前構造（ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を安定化するように修飾された組換えＦタンパク質を含む抗原に関する。本発明の組換え抗原は、優れた免疫原性を示し、ＲＳＶ感染および／または疾患に対する防御のための免疫原性組成物（例えばワクチン）の成分として特に好ましく使用される。また、組換え抗原をコードする核酸、抗原を含む免疫原性組成物、並びに抗原を産生および使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】ＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造的特徴を強調した模式図である。
【図１Ｂ】例示的なＲＳＶ融合前Ｆ（ＰｒｅＦ）抗原の模式図である。
【図２】ＰｒｅＦの非対称流フィールドフロー分画（ＡＦＦ−ＭＡＬＳ）分析の代表的結果を示す線グラフである。
【図３】ＰｒｅＦ抗原によるヒト血清の中和阻害を示す棒グラフである。
【図４Ａ】ＰｒｅＦ抗原に応答してマウスで誘発される血清ＩｇＧの力価を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】ＰｒｅＦ抗原に応答してマウスで誘発される血清ＩｇＧの力価を示す棒グラフである。
【図５Ａ】ＰｒｅＦ抗原により誘発されるＲＳＶ特異的な中和抗体の力価を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】ＰｒｅＦ抗原により誘発されるＲＳＶ特異的な中和抗体の力価を示す棒グラフである。
【図６Ａ】マウスにおいて暴露に対してＲＳＶ  ＰｒｅＦ抗原により得られる防御を示すグラフである。
【図６Ｂ】マウスにおいて暴露に対してＲＳＶ  ＰｒｅＦ抗原により得られる防御を示すグラフである。
【図７】免疫化および暴露後のＢＡＬ白血球を評価したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
導入
ＲＳＶ感染を防止するためのワクチンの開発は、宿主の免疫反応がこの疾患の発病に関与していると思われるため、複雑である。１９６０年代の初期の研究により、ホルマリンで不活化したＲＳＶワクチンを接種した子供は、コントロールとなるワクチン未接種対象に比べて、その後ウイルスに暴露した際により重篤な疾患に罹患することが示された。これらの初期の治験では、ワクチン接種を受けた人の８０％が入院し、２人が死亡した。疾患の重篤度が増すことはモデル動物でも確認され、これは不十分な血清−中和抗体レベルと、局所免疫の欠如と、肺好酸球増多症並びにＩＬ−４およびＩＬ−５サイトカインの産生増加を伴う２型ヘルパーＴ細胞様（Ｔｈ２）免疫反応の過剰な誘導との結果であると考えられる。対照的に、ＲＳＶ感染からの防御に成功したワクチンは、ＩＬ−２およびγ−インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を特徴とするＴｈ１優位型（Ｔｈ１  ｂｉａｓｅｄ）の免疫反応を誘導する。
【００１０】
本発明は、これまでワクチンに使用されていたＲＳＶ抗原で遭遇する問題を解決し、抗原の免疫学的特性および製造特性を改善する、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。本発明の組換えＲＳＶ抗原は、可溶性融合（Ｆ）タンパク質ポリペプチドを含むＦタンパク質類似体を含み、これは、Ｆタンパク質の融合前構造、すなわち、宿主細胞膜と融合する前の組み立てられた成熟Ｆタンパク質の構造を安定化するように修飾されている。簡潔で分かり易くするために、これらのＦタンパク質類似体を「ＰｒｅＦ」または「ＰｒｅＦ抗原」と呼ぶこととする。本発明のＰｒｅＦ抗原は、異種性（heterologous）三量体形成ドメインの導入により修飾された可溶性Ｆタンパク質類似体が、免疫原性特性の向上を示し、対象にインビボで投与された時に安全かつ高い防御効果を有するという予期されない発見に基づく。
【００１１】
当該技術分野で広く受け入られている用語および名称を用いてＲＳＶ  Ｆタンパク質の詳細な構造を本明細書に提供し、図１Ａに模式的に示す。例示的ＰｒｅＦ抗原の模式図を図１Ｂに示す。当業者であれば、本明細書の教示に従って任意のＲＳＶ  Ｆタンパク質を融合前構造が安定化するように修飾することができると理解できる。したがって、ＰｒｅＦ抗原の作製を説明する原理を理解し易くするために、ポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１および２に示される例示的Ｆタンパク質を参照して、個々の構造要素を記載する。同様に、適切な場合、ポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３および４に示される例示的Ｇタンパク質を参照して、Ｇタンパク質抗原を記載する。
【００１２】
Ｆタンパク質ポリペプチドの一次アミノ酸配列（図１Ａ）に関して、以下の用語を用いてＰｒｅＦ抗原の構造的特徴を記載する。
【００１３】
Ｆ０という用語は、翻訳された全長Ｆタンパク質前駆体を指す。Ｆ０ポリペプチドは、ｐｅｐ２７と呼ばれる介在ペプチドによって隔てられたＦ２ドメインおよびＦ１ドメインに細区分される。成熟中、Ｆ０ポリペプチドは、Ｆ２とＦ１との間に位置しｐｅｐ２７と隣接する２箇所のフューリン部位でタンパク質切断を受ける。後の議論のために説明すると、Ｆ２ドメインはＦタンパク質のアミノ酸１〜１０９の少なくとも一部または全部を含み、Ｆ１ドメインの可溶性部分はＦタンパク質のアミノ酸１３７〜５２６の少なくとも一部から全部までを含む。前述の通り、これらのアミノ酸位置（および本明細書で指定する以降の全てのアミノ酸位置）は、配列番号２の例示的Ｆタンパク質前駆体ポリペプチド（Ｆ０）を基準にしたものである。
【００１４】
融合前Ｆ（または「ＰｒｅＦ」）抗原は、Ｆタンパク質の融合前構造を安定化する少なくとも１つの修飾を含む可溶性（すなわち膜結合性でない）Ｆタンパク質類似体であり、ＲＳＶ抗原は、Ｆタンパク質の融合前構造の少なくとも１つの免疫優性エピトープを保持している。可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＦ２ドメインおよびＦ１ドメインを含む（しかし、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の膜貫通ドメインは含まない）。例示的実施形態では、Ｆ２ドメインはＦタンパク質のアミノ酸２６〜１０５を含み、Ｆ１ドメインはアミノ酸１３７〜５１６を含む。しかし、安定化されたＰｒｅＦ抗原の３次構造が維持されてさえいれば、これよりも小さな部分を用いてもよい。同様に、更なる構造要素を含むポリペプチド（例えば融合ポリペプチド）も、この更なる要素が３次構造を破壊しないか、安定性、産生、またはプロセシングに悪影響を与えないか、抗原の免疫原性を低下させない限り、例示的Ｆ２およびＦ１ドメインの代わりに用いることができる。Ｆ２およびＦ１ドメインはＮ末端からＣ末端に向かって配置され、成熟した融合前構造へのＦタンパク質類似体の折り畳みおよび組み立て（assembly）が再現されるように設計されている。産生量を高めるために、組換えＰｒｅＦ抗原が発現される宿主細胞中での産生および分泌が増加するように選択された天然Ｆタンパク質シグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチド等の分泌シグナルペプチドがＦ２ドメインに先行してもよい。
【００１５】
ＰｒｅＦ抗原は、１または複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換等の修飾を導入することで（三量体融合前構造で）安定化される。そのような安定化修飾の１つは、異種性の安定化ドメインを含むアミノ酸配列の付加である。例示的な実施形態では、異種性安定化ドメインは、タンパク質多量体形成ドメインである。そのようなタンパク質多量体形成ドメインの特に好ましい一例は、そのようなドメインを有する複数のポリペプチドの三量体形成を促進するイソロイシンジッパードメイン等のコイルドコイルドメインである。例示的なイソロイシンジッパードメインを配列番号１１に示す。通常、異種性安定化ドメインはＦ１ドメインのＣ末端側に位置する。
【００１６】
必要に応じて、ＧＧ配列等の短いアミノ酸リンカー配列を介して多量体形成ドメインはＦ１ドメインに連結される。リンカーは、より長いリンカーであってもよい（例えば、ＧＧ配列を含むアミノ酸配列：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ；配列番号１４等）。ＰｒｅＦ抗原の構造を破壊することなく用いることができる構造的に中立な多くのリンカーが当該技術分野で公知である。
【００１７】
別の安定化修飾としては、天然Ｆ０タンパク質中のＦ２ドメインとＦ１ドメインの間に位置するフューリン認識切断部位の除去がある。第１０５位〜第１０９位および第１３３位〜第１３６位に位置するフューリン認識部位の片方または両方を、フューリン認識部位の１または複数のアミノ酸を欠失または置換して除去することで、プロテアーゼがＰｒｅＦポリペプチドをその構成ドメインに切断できないようにすることができる。必要に応じて、例えばリンカーペプチドを用いて、介在ｐｅｐ２７ペプチドを除去または置換してもよい。更に、または必要に応じて、融合ペプチドに近接する非フューリン切断部位（例えば第１１２位〜第１１３位のメタロプロテイナーゼ部位）を除去または置換してよい。
【００１８】
安定化変異の別の例としては、Ｆタンパク質の疎水性ドメイン中への親水性アミノ酸の付加または置換が挙げられる。通常、疎水性領域中で、ロイシン等の中性残基に対してリジン等の荷電アミノ酸による置換または付加を行う。例えば、Ｆタンパク質細胞外ドメインのＨＲＢコイルドコイルドメイン内の疎水性または中性のアミノ酸に対して親水性アミノ酸の付加または置換を行ってよい。例えば、Ｆタンパク質の第５１２位のロイシンをリジン等の荷電アミノ酸残基で置換してよい。あるいは、またはそれに加えて、Ｆタンパク質のＨＲＡドメイン内の疎水性または中性のアミノ酸に対して、親水性アミノ酸の付加または置換を行ってよい。例えば、リジン等の１または複数の荷電アミノ酸を、ＰｒｅＦ抗原の第１０５位〜第１０６位またはその近く（例えば、アミノ酸１０５と１０６の間等、参照の配列番号２の１０５番目の残基に対応するアミノ酸の後ろ）に挿入してよい。必要に応じて、ＨＲＡドメインおよびＨＲＢドメインの両方において親水性アミノ酸による付加または置換を行ってよい。あるいは、ＰｒｅＦ抗原の全体的な構造に悪影響を与えない限り、１または複数の疎水性残基を欠失させてもよい。
【００１９】
任意のおよび／または全ての安定化修飾を個々に用いるかかつ／または本明細書に開示したその他の安定化修飾のいずれかと組み合わせて用いて、ＰｒｅＦ抗原を作製してよい。例示的な実施形態では、ＰｒｅＦタンパク質は、Ｆ２ドメインおよびＦ１ドメインを含み、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間の介在フューリン切断部位を有さず、Ｆ１ドメインのＣ末端側に配置された異種性の安定化ドメイン（例えば三量体形成ドメイン）を有するポリペプチドを含んでなる。特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、疎水性ＨＲＡおよび／またはＨＲＢドメイン中における１または複数の親水性残基の付加および／または置換をも含む。必要に応じて、ＰｒｅＦ抗原は、メタロプロテイナーゼ部位等の少なくとも１つの非フューリン切断部位への修飾を有する。
【００２０】
ＰｒｅＦ抗原は、必要に応じて、少なくともＲＳＶ  Ｇタンパク質の免疫原性部分を含む更なるポリペプチド要素を含んでもよい。すなわち、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原は、Ｆタンパク質およびＧタンパク質要素の両方を含むキメラタンパク質である。Ｆタンパク質要素は、上記ＰｒｅＦ抗原のいずれであってもよく、Ｇタンパク質要素は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の免疫学的に活性な部分となるように選択される（全長Ｇタンパク質までであるかかつ／または全長Ｇタンパク質を含む）。例示的な実施形態では、Ｇタンパク質ポリペプチドは、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９（ここで、アミノ酸位置は配列番号４で表されるＧタンパク質配列を参照して指定）を含む。当業者であれば、選択された部分がより大きなＧタンパク質断片の優性な免疫学的特徴を維持していれば、Ｇタンパク質のより小さな部分または断片を用いてもよいと理解するであろう。特に、選択された断片は、アミノ酸第１８４位〜第１９８位付近（例えばアミノ酸１８０〜２００）にある免疫学的に優性なエピトープを維持しており、免疫優性エピトープを提示する安定な構造に折り畳まれて組み立てられるのに十分な長さである。選択された断片は、宿主細胞中で組換え産生された時に、キメラタンパク質に関して安定な構造に折り畳まれ、産生、プロセシング、または安定性に干渉しない限り、より長い断片、例えばアミノ酸１２８付近〜アミノ酸２２９付近、全長Ｇタンパク質までを用いてよい。必要に応じて、ＧＧ配列等の短いアミノ酸リンカー配列を介してＧタンパク質要素をＦタンパク質要素に連結する。リンカーは、より長いリンカー（例えばアミノ酸配列：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ：配列番号１４）であってもよい。ＰｒｅＦ抗原の構造を破壊することなく用いることができる構造的に中立な多くのリンカーが当該技術分野で公知である。
【００２１】
必要に応じて、Ｇタンパク質要素は、ＲＳＶ疾患のモデル動物において促進されるウイルス疾患を低減または防止する１または複数のアミノ酸置換を含んでもよい。すなわち、Ｇタンパク質はアミノ酸置換を含んでよく、それにより、一般に認められているモデル動物（例えばＲＳＶのモデルマウス）から選択された対象にＰｒｅＦ−Ｇキメラ抗原を含む免疫原性組成物を投与した時に、非修飾Ｇタンパク質を含むワクチン等のワクチンを接種した対照動物と比べて、ワクチンにより促進されるウイルス疾患（ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）（例えば好酸球増多症、好中球増多症）の症状が対象で低減されるか見られなくなる。ワクチンにより促進されるウイルス疾患の低減および／または防止は、免疫原性組成物をアジュバントなしに投与した時に確認することができる（しかし、例えばＴｈ１を強力に誘導するアジュバントの存在下で抗原を投与した場合には確認されない）。更に、このアミノ酸置換により、ヒト対象に投与された時に、ワクチンにより促進されるウイルス疾患を低減または防止することが可能になる。好適なアミノ酸置換の例としては、アラニンによる第１９１位のアスパラギンの置換が挙げられる（アミノ酸１９１におけるＡｓｎ→Ａｌａ：Ｎ１９１Ａ）。
【００２２】
必要に応じて、上記の任意のＰｒｅＦ抗原は、精製を支援する更なる配列を含んでもよい。一例として、ポリヒスチジンタグが挙げられる。そのようなタグは、所望により最終産物から除去することができる。
【００２３】
ＰｒｅＦ抗原は発現されると、ポリペプチドの多量体を含む成熟タンパク質へと細胞内で折り畳まれ、組み立てられる。好ましくは、ｐｒｅＦ抗原ポリペプチドは、プロセシングを受けた成熟ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前構造に似た三量体に組み立てられる。
【００２４】
本開示のＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）はいずれも、ＲＳＶに対する防御免疫反応を引き起こすための免疫原性組成物に好ましく用いることができる。そのような免疫原性組成物は通常、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、例えば緩衝剤を含む。投与後に生じる免疫反応を強化するために、免疫原性組成物には通常アジュバントも含まれる。ＲＳＶに対する防御免疫反応を引き起こすための免疫原性組成物（例えばワクチン）の場合、組成物は好ましくはＴｈ１免疫反応を主に引き起こすアジュバント（Ｔｈ１優位型のアジュバント）を含む。通常、アジュバントは、組成物を投与する標的群への投与に適するように選択される。したがって、用途に応じて、アジュバントは例えば新生児または高齢者への投与に適するように選択される。
【００２５】
本明細書に記載した免疫原性組成物は、好ましくは、投与またはＲＳＶへの暴露後の病理学的反応（例えばワクチンにより促進されるウイルス疾患）を誘導することなくＲＳＶの感染を低減または防止するためのワクチンとして使用される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物はＰｒｅＦ抗原（例えば配列番号６で示される例示的実施形態）とＧタンパク質要素を含む第２のポリペプチドとを含む。Ｇタンパク質要素は通常、少なくともＧタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９を含む。これよりも小さなＧタンパク質部分を用いることもできるが、そのような断片は少なくともアミノ酸１８４〜１９８の免疫学的に優性なエピトープを含むべきである。あるいは、Ｇタンパク質は、必要に応じて全長Ｇタンパク質やキメラポリペプチド等のより大きなタンパク質の要素として、アミノ酸１２８〜２２９または１３０〜２３０といったより大きなＧタンパク質部分を含んでもよい。
【００２７】
別の実施形態では、免疫原性組成物は、Ｇタンパク質要素（例えば配列番号８および１０で表される例示的実施形態）を含むキメラタンパク質であるＰｒｅＦ抗原を含む。そのようなキメラＰｒｅＦ（またはＰｒｅＦ−Ｇ）抗原のＧタンパク質要素は通常、少なくともＧタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９を含む。上記の通り、Ｇタンパク質のより小さいまたはより大きい断片（例えばアミノ酸１２９〜２２９または１３０〜２３０）も、免疫優性エピトープが維持されており、ＰｒｅＦ−Ｇ抗原の構造に悪影響を与えない限り、用いることができる。
【００２８】
必要に応じて、免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原生物の更なる抗原の少なくとも１つを含んでもよい。例えば、病原生物はＲＳＶ以外のウイルス、例えばパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、麻疹、Ｂ型肝炎、ポリオウイルス、またはインフルエンザウイルスである。あるいは、病原生物は、ジフテリア、破傷風（ｔｅｔａｎｕｓ）、百日咳菌、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）等の細菌であってよい。
【００２９】
ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）のいずれかをコードする組換え核酸も本発明に含まれる。いくつかの実施形態では、この核酸の、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸のポリヌクレオチド配列は、選択された宿主（例えばＣＨＯ細胞、その他の哺乳動物細胞、または昆虫細胞）中での発現に最適化されている。したがって、発現ベクター（真核および原核用の発現ベクターを含む）を含むベクターも本発明に含まれる。同様に、そのような核酸およびベクターを含む宿主細胞も本発明に含まれる。そのような核酸は、対象に投与してＲＳＶ特異的な免疫反応を引き起こすための免疫原性組成物との関連で使用することもできる。
【００３０】
ＰｒｅＦ抗原は、好ましくは、ＲＳＶ感染の防止および／または処置に用いられる。したがって、本発明の別の態様は、ＲＳＶに対する免疫反応を引き起こす方法に関する。この方法は、免疫学的有効量のＰｒｅＦ抗原を含む組成物を対象（例えばヒトまたは動物対象）に投与することを含む。免疫学的有効量の組成物を投与することで、ＰｒｅＦ抗原上に存在するエピトープに特異的な免疫反応が惹起される。そのような免疫反応は、Ｂ細胞反応（例えば中和抗体の産生）および／またはＴ細胞反応（例えばサイトカインの産生）を含む。好ましくは、ＰｒｅＦ抗原により惹起される免疫反応には、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前構造上に存在する構造エピトープの少なくとも１つに特異的な要素が含まれる。ＰｒｅＦ抗原および組成物は、ＲＳＶ接触後にウイルス疾患を促進することなく、対象に投与することができる。好ましくは、本開示のＰｒｅＦ抗原および好適に製剤化された免疫原性組成物は、ＲＳＶ感染を低減もしくは防止しかつ／またはＲＳＶ感染後の病理学的反応を低減もしくは防止するＴｈ１優位型の免疫反応を引き起こす。
【００３１】
免疫原性組成物は、上気道の粘膜にＰｒｅＦ抗原を直接接触させる鼻腔内等の経路を含む種々の経路で投与することができる。あるいは、筋肉内投与等のより一般的な投与経路を用いてもよい。
【００３２】
したがって、ＲＳＶ感染を処置する（例えば、ＲＳＶ感染を予防的に処置するまたは防止する）ための医薬の製造における本開示のＲＳＶ抗原（または核酸）のいずれの使用も想定される。したがって、本開示は、医薬に使用するための本開示の組換えＲＳＶ抗原または免疫原性組成物、およびＲＳＶ関連疾患の防止または処置のためのその使用を提供する。
【００３３】
ＰｒｅＦ抗原に関する更なる詳細およびその使用方法を以下の説明および例中に示す。
【００３４】
用語
本開示の種々の実施形態を概観し易くするために以下に用語を説明する。本開示の文脈中で更なる用語および説明が提供され得る。
【００３５】
特に説明のない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V、Oxford University Press, 1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.)、Encylopaedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers (ed.)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8）に記載されている。
【００３６】
単数形の語は、文脈から明らかに否定されない限り、複数の対象も含む。同様に、「または」、「もしくは」という語は、文脈から明らかに否定されない限り、「および」を含むことが意図される。「複数」という語は２以上を意味する。また、核酸またはポリペプチドに与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値は概数であり、説明のために提供するものであると理解される。更に、抗原等の物質の濃度またはレベルに関する数値的限定も概数であることが意図される。したがって、濃度が少なくとも（例えば）２００ｐｇであると示されている場合、濃度は少なくとも約２００ｐｇであると理解されることが意図される。
【００３７】
本明細書に記載したものと同様なまたは等価な方法および材料を本開示の実施または試験に用いることができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。「含む」は「挙げる」を意味する。「含む」という語およびその活用形は、文脈から否定されない限り、記載された化合物または組成物（例えば核酸、ポリペプチド、抗原）もしくは工程、または化合物もしくは工程の群を包含するが、任意のその他の化合物、組成物、工程、またはその群も排除されないことを示唆すると理解される。本明細書において、「例えば」という語は非限定的な例を指すために使用される。
【００３８】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科、ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）亜科、ニューモウイルス属の病原ウイルスである。ＲＳＶのゲノムはネガティブセンスＲＮＡ分子であり、１１個のタンパク質をコードしている。ＲＮＡゲノムとウイルスＮタンパク質の密接な会合が、ウイルスエンベロープの内側に包まれたヌクレオカプシドを形成する。Ｇ糖タンパク質の抗原性の違いに基づいて２群のヒトＲＳＶ株がＡ群およびＢ群として記述されている。現在までに多くのＲＳＶ株が単離されている。ＧｅｎＢａｎｋおよび／またはＥＭＢＬの受託番号で示されている例示的な株が国際公開第２００８１１４１４９号に記載されている。この文献を、ＰｒｅＦ抗原（キメラＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）の使用およびＰｒｅＦ抗原との併用に適したＲＳＶ  ＦおよびＧタンパク質の核酸配列およびポリペプチド配列を開示する目的で参照により本明細書に援用する。更なるＲＳＶ株が単離される可能性は高く、それらもＲＳＶ属に含まれる。同様に、ＲＳＶ属は、天然（例えば、以前同定されたまたは今後同定される株）から遺伝的浮動により生じるかまたは人工的な合成および／もしくは組換えにより生じた変異体を含む。
【００３９】
「Ｆタンパク質」または「融合タンパク質」または「Ｆタンパク質ポリペプチド」または融合タンパク質ポリペプチド」という用語は、ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。同様に、「Ｇタンパク質」または「Ｇタンパク質ポリペプチド」という用語は、ＲＳＶの付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。多くのＲＳＶ融合および付着タンパク質が報告されており、当業者に知られている。国際公開第２００８１１４１４９号は、本開示の提出日に一般に利用可能なＦおよびＧタンパク質変異体（例えば天然の変異体）の例を記載している。
【００４０】
核酸またはポリペプチド（例えば、ＲＳＶ  ＦもしくはＧタンパク質の核酸もしくはポリペプチドまたはＰｒｅＦの核酸もしくはポリペプチド）に言及する際の「変異体」とは、参照する核酸またはポリペプチドと異なる核酸またはポリペプチドである。通常、変異体と参照する核酸またはポリペプチドの差は、対象に比べて比較的少数である。
【００４１】
ポリペプチドまたはタンパク質の「ドメイン」とは、ポリペプチドまたはタンパク質内の構造的に定義された要素である。例えば、「三量体形成ドメイン」とは、ポリペプチドが三量体へと組み立てられるのを促進するポリペプチド内のアミノ酸配列である。例えば、三量体形成ドメインは、（同じまたは異なるアミノ酸配列を有する更なるポリペプチドの）別の三量体形成ドメインとの会合を介して三量体への組み立てを促進することができる。この用語は、そのようなペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すためにも使用される。
【００４２】
「天然の（ｎａｔｉｖｅまたはｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」という用語は、天然と同じ状態で存在するタンパク質、ポリペプチド、または核酸等の因子を指す。すなわち、この因子は人工的に修飾されていない。本開示の文脈において、例えばＲＳＶの種々の天然株または単離株から得られる、ＲＳＶタンパク質またはポリペプチドの多くの天然の変異体があることが理解されよう。
【００４３】
「ポリペプチド」という用語は、モノマーがアミド結合を介して結合したアミノ酸残基であるポリマーを指す。本明細書において「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を含むことを意図し、糖タンパク質等の修飾された配列を含む。「ポリペプチド」という用語は、天然のタンパク質および組換えまたは合成により作製されたものを含むことが特に意図される。ポリペプチドに関して、「断片」という用語は、ポリペプチドの一部（すなわちサブ配列）を指す。「免疫原性断片」という用語は、全長の参照タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの優性な免疫原性エピトープを維持しているポリペプチドのあらゆる断片を意味する。ポリペプチド内での方向は一般的にＮ末端からＣ末端へと記載され、これは個々のアミノ酸のアミノ部分およびカルボキシ部分の向きにより定義される。ポリペプチドはＮすなわちアミノ末端からＣすなわちカルボキシ末端へと翻訳される。
【００４４】
「シグナルペプチド」とは、新たに合成された分泌タンパク質または膜タンパク質を、例えば小胞体の膜へまたは膜を通して送る、短いアミノ酸配列（例えば約１８〜２５アミノ酸長）である。シグナルペプチドは、全てではないが多くの場合、ポリペプチドのＮ末端に位置し、しばしば、タンパク質が膜を通過した後にシグナルペプチダーゼにより切り離される。シグナル配列は通常、３つの共通する構造的特徴、すなわちＮ末端の極性塩基性領域（ｎ−領域）、疎水性コア、および疎水性Ｃ領域）を含む。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」という用語は、長さが少なくとも１０塩基のポリマー形態のヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾された形態であってよい。この用語は、単鎖および二重鎖のＤＮＡを含む。「単離されたポリヌクレオチド」とは、それが由来する生物の天然ゲノム中で直接隣接する両方のコード配列（片方は５’末端、他方は３’末端）のいずれにも直接隣接しないポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。核酸の５’および３’方向は、個々のヌクレオチド単位の結合性に関連して定義され、デオキシリボース（またはリボース）糖環の炭素位置に従って決定される。ポリヌクレオチド配列の情報（コード）内容は５’から３’方向へと読まれる。
【００４６】
「組換え」核酸は、天然でない配列または隔てられた２個の配列セグメントを人工的に組み合わせることで作製された配列を有する核酸である。この人工的組合せは、化学合成、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人工的操作、例えば遺伝子工学技術により達成され得る。「組換え」タンパク質は、細菌または真核細胞等の宿主細胞に導入された異種性（例えば組換え）核酸によりコードされるタンパク質である。核酸は、導入された核酸によりコードされるタンパク質を発現可能なシグナルを有する発現ベクター上載せて導入してもよく、核酸を宿主細胞染色体中に組み込んでもよい。
【００４７】
核酸、ポリペプチド、または他の細胞成分に関連して、「異種性」という用語は、その要素が天然では本来見られない場所で生じかつ／または要素が別の出所もしくは種を起源とすることを示している。
【００４８】
「精製」（例えば病原体または病原体を含有する組成物に関連して）という用語は、組成物からその存在が望ましくない成分を除去するプロセスを意味する。精製は相対的な用語であり、組成物から望ましくない成分が全て除去される必要はない。ワクチン製造の文脈において、精製は、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排斥クロマトグラフィー、アフィニティー精製、または沈殿等のプロセスを含む。したがって、「精製された」という用語は、完全に純粋であることを要求するものではなく、むしろ、相対的な用語であることが意図される。したがって、例えば、精製された核酸標品とは、その核酸が生産的状況、例えば細胞内または生化学反応用チャンバー内にある場合よりも、特定のタンパク質が濃縮されている標品である。実質的に純粋な核酸またはタンパク質の標品は、所望の核酸が標品の全核酸含有量の少なくとも５０％を占めるように精製され得る。特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸は、標品の全核酸またはタンパク質含有量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％以上を占める。
【００４９】
「単離された」生物学的成分（例えば核酸分子、タンパク質、または細胞小器官）は、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、並びに細胞小器官等の成分が天然に生じる生物の細胞中にあるその他の生物学的成分から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法で精製された核酸およびタンパク質を包含する。この用語はまた、宿主細胞中で組換え発現されることで産生された核酸およびタンパク質並びに化学合成された核酸およびタンパク質を含む。
【００５０】
「抗原」とは、動物中で抗体の産生および／またはＴ細胞反応を刺激できる化合物、組成物、または物質であり、動物中に注入、吸収、またはその他の方法で導入される組成物を包含する。「抗原」という用語は、関連する全ての抗原性エピトープを包含する。「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位を指す。「優性な抗原性エピトープ」または「優性エピトープ」とは、機能的に重要な宿主免疫反応、例えば抗体反応またはＴ細胞反応が生じる相手となるエピトープである。したがって、病原体に対する防御免疫反応に関して、優性な抗原性エピトープは、宿主免疫系に認識された時に、病原体が引き起こす疾患に対する防御を生じさせる抗原性部分である。「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、適切なＭＨＣ分子に結合した時に、（Ｔ細胞受容体を介して）Ｔ細胞が特異的に結合するエピトープを指す。「Ｂ細胞エピトープ」とは、抗体（またはＢ細胞受容体分子）が特異的に結合するエピトープである。
【００５１】
「アジュバント」とは、免疫反応の発生を非特異的に強化する薬剤である。一般的なアジュバントとしては、抗原が吸着した鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液；油中水型および水中油型等のエマルション（および二重エマルション、リバーシブルエマルション等のその変形物）、リポ糖、リポ多糖、免疫賦活性核酸（ＣｐＧオリゴヌクレオチド等）、リポソーム、トール様受容体のアゴニスト（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８、およびＴＬＲ９アゴニスト）、およびそのような成分の種々の組合せが含まれる。
【００５２】
「免疫原性組成物」とは、例えばＲＳＶ等の病原体に特異的な免疫反応を引き起こすことができる、（例えば実験設定下で）ヒトまたは動物対象への投与に適した物質の組成物である。したがって、免疫原性組成物は、１または複数の抗原（例えばポリペプチド抗原）または抗原性エピトープを含む。また、免疫原性組成物は、賦形剤、担体、および／またはアジュバント等の、免疫反応を惹起または強化することができる１または複数の更なる成分を含んでもよい。特定の状況では、免疫原性組成物は、病原体により誘導される症状または状態から対象を防御する免疫反応を引き起こすために投与される。いくつかの場合には、対象が病原体に曝された後の病原体（例えばＲＳＶ）の複製を阻害することで、病原体により生じる症状または疾患が防止（または低減または寛解）される。本開示の文脈において、免疫原性組成物という用語は、ＲＳＶに対する防御免疫反応または緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ）免疫反応を引き起こすために対象または対象群に投与されることが意図される組成物（すなわち、ワクチン組成物またはワクチン）を包含すると理解される。
【００５３】
「免疫反応」とは、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、単球等の免疫系細胞の反応である。免疫反応はＢ細胞反応であってもよく、Ｂ細胞反応は、抗原特異的中和抗体等の特異的抗体を産生する。免疫反応は、ＣＤ４＋反応またはＣＤ８＋反応等のＴ細胞反応であってもよい。いくつかの場合には、反応は特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的反応」）。抗原が病原体に由来する場合、抗原特異的反応は、「病原体特異的反応」である。「防御免疫反応」とは、病原体の有害な機能または活性を阻害するか、病原体の感染を低減するか、病原体の感染による症状（死亡を含む）を低減させる、免疫反応である。防御免疫反応は、例えばプラーク減少アッセイにおけるウイルス複製もしくはプラーク形成の阻害、またはＥＬＩＳＡ中和アッセイ、またはインビボでの病原菌暴露に対する抵抗性を測定することで測定することができる。
【００５４】
「Ｔｈ１」優位型の免疫反応は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の存在を特徴とし、したがって、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌または存在を特徴とする。一方、「Ｔｈ２」優位型の免疫反応は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋ヘルパー細胞が優位であることを特徴とする。
【００５５】
「免疫学的有効量」とは、組成物（通常、免疫原性組成物）または組成物中の抗原に対する免疫反応を対象中で引き起こすために使用される組成物の量である。一般的に、所望される結果は、対象を病原体から防御できるまたは防御に寄与する、抗原（例えば病原体）特異的免疫反応が生じることである。しかし、病原体に対する防御免疫反応を得るためには、免疫原性組成物の複数回投与が必要になることもある。したがって、本開示の文脈において、免疫学的有効量という用語は、前または後の投与と合わせて防御免疫反応の獲得に寄与する分割量を包含する。
【００５６】
「薬学的に許容される」という形容句は、指示対象物が対象（例えばヒトまたは動物対象）への投与に適していることを示す。Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E.  W.  Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)に、免疫原性組成物を含む治療的および／または予防的組成物の薬学的送達に適した組成物および製剤（希釈剤を含む）が記載されている。
【００５７】
免疫反応等の反応に関連して、「調節する」という用語は、反応の開始、大きさ、期間、または特性を変更するまたは変えることを意味する。免疫反応を調節する薬剤は、投与後の免疫反応の開始、大きさ、期間、または特性の少なくとも１つを変更するか、参照薬剤と比較して開始、大きさ、期間、または特性の少なくとも１つを変更する。
【００５８】
「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」という用語は相対的な用語であり、薬剤投与後に反応または状態が定量的に減少した場合または薬剤投与後に反応または状態が参照薬剤と比較して減少した場合、薬剤は反応または状態を低減させているという。同様に、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」という用語は、反応または状態の少なくとも１つの特徴を除去すればよく、薬剤が反応または状態を完全に取り除くことを必ずしも意味しない。したがって、ワクチンにより促進されるウイルス疾患等の病理学的反応等の反応または感染を低減または防止する免疫原性組成物は、そのような感染または反応を完全でなくてもよいが取り除くことができ、例えば、薬剤非存在下における感染または反応の、または参照薬剤と比較して、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約７０％、約８０％、または約９０％の減少（すなわち１０％以下）が測定されればよい。
【００５９】
「対象」とは、生きた多細胞脊椎生物である。本開示の文脈において、対象は、非ヒト動物、例えばマウス、コットンラット、または非ヒト霊長類等の実験対象であり得る。あるいは、対象はヒト対象であってもよい。
【００６０】
ＰｒｅＦ抗原
天然には、ＲＳＶ  Ｆタンパク質はＦ０と呼ばれる長さ５７４アミノ酸の単一ポリペプチド前駆体として発現される。生体内において、Ｆ０は小胞体中でオリゴマーを形成し、２個の保存されたフューリンコンセンサス配列（フューリン切断部位）、ＲＡＲＲ１０９（配列番号１５）およびＲＫＲＲ１３６（配列番号１６）でフューリンプロテアーゼによりタンパク質分解処理され、２個のジスルフィド結合された断片からなるオリゴマーを生成する。これらの断片の小さい方はＦ２と名付けられ、Ｆ０前駆体のＮ末端部分に由来する。当業者には、略語Ｆ０，Ｆ１、およびＦ２が科学文献中で一般的にＦ０、Ｆ１、およびＦ２と呼ばれることが理解できる。大きい方のＣ末端Ｆ１断片は、細胞質側末端２４アミノ酸に隣接する疎水性アミノ酸配列を介して、Ｆタンパク質を膜中にアンカーする。３個のＦ２−Ｆ１二量体が会合して成熟Ｆタンパク質を形成し、準安定な前融合型（ｐｒｅｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）（「融合前」）構造をとり、標的細胞膜との接触が引き金となって構造が変化する。この構造変化により、融合ペプチドとして知られる疎水性配列が露出し、これが宿主細胞膜と会合し、ウイルス膜または感染細胞の膜と標的細胞膜との融合を促進する。
【００６１】
Ｆ１断片は少なくとも２個の７回リピートドメインを含み、これらはＨＲＡおよびＨＲＢと呼ばれ、それぞれ融合ペプチドと膜貫通アンカードメインの近傍にある。融合前構造では、Ｆ２−Ｆ１二量体が球状ヘッドおよびストーク構造を形成しており、ＨＲＡドメインは球状ヘッド中で分割型（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）（伸長型：ｅｘｔｅｎｄｅｄ）構造をし、一方、ＨＲＢドメインは、ヘッド領域から伸びる３本鎖コイルドコイルストークを形成している。融合前構造から融合後構造への遷移中、ＨＲＡドメインは崩壊し、ＨＲＢドメインに近づき、逆平行６ヘリックスバンドルを形成する。融合後の状態では、融合ペプチドおよび膜貫通ドメインが並んで、膜融合を容易にしている。
【００６２】
上記の構造の記述は結晶学的データの分子モデリングに基づいているが、融合前構造と融合後構造の構造的区別は、結晶学に頼らずにモニターすることができる。例えば、技術的教示を目的として参照により本明細書に援用するCalder et al., Virology, 271:122-131 (2000)およびMorton et al., Virology, 311:275-288に実証されているように、電子顕微鏡検査を用いて、融合前構造（または前融合型構造と呼ぶ。）と融合後構造（または融合型構造と呼ぶ。）を区別することができる。また、技術的教示を目的として参照により本明細書に援用するConnolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:17903-17908 (2006)に記載されているように、リポソーム会合アッセイによっても、融合前構造を融合型（融合後）構造から区別することができる。更に、融合前構造および融合型構造は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前形態または融合型形態の一方に存在する構造エピトープを特異的に認識するが他方の形態に存在する構造エピトープは認識しない抗体（例えばモノクローナル抗体）を用いて区別することができる。そのような構造エピトープは、分子表面上の抗原決定基の選択的露出によるものであり得る。あるいは、構造エピトープは、線状ポリペプチド中で非連続なアミノ酸の並置により生じ得る。
【００６３】
本発明のＰｒｅＦ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前構造を安定化して維持するように設計されている。そのため、発現されたタンパク質群中のかなりの部分が前融合型（融合前）構造である（例えば、構造的または熱力学的モデリングから予測されるか、上記に開示した方法の１または複数により評価される）。安定化修飾が、配列番号２の例示的Ｆタンパク質等の天然（または合成）のＦタンパク質に導入され、その結果、ＰｒｅＦ抗原が細胞または細胞外環境（例えば対象に投与した後の生体内）に導入された後も、Ｆタンパク質の融合前構造の主要な免疫原性エピトープが維持される。
【００６４】
最初に、Ｆ０ポリペプチドの膜アンカードメインを置き換えるために、異種性安定化ドメインをコンストラクトのＣ末端に配置してよい。この安定化ドメインは、ＨＲＢの不安定性を補完すると予測され、融合前コンホーマーの安定化を支援する。例示的実施形態では、異種性安定化ドメインは、タンパク質多量体形成ドメインである。そのようなタンパク質多量体形成ドメインの特に好ましい例の１つは三量体形成ドメインである。例示的な三量体形成ドメインは折り畳まれてコイルドコイルを形成し、そのようなコイルドコイルドメインを有する複数のポリペプチドが三量体へと組み立てられるのを促進する。三量体形成ドメインの好ましい例の１つは、イソロイシンジッパーである。例示的イソロイシンジッパードメインとしては、Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993)に記載されている操作された酵母ＧＣＮ４イソロイシン変異体が挙げられる。好適なイソロイシンジッパードメインの１つの配列は配列番号１１で表され、コイルドコイル安定化ドメイン形成能を維持しているこの配列の変異体も同様に好適である。他の安定化コイルドコイル三量体形成ドメインとしては、ＴＲＡＦ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｑ１２９３３［ｇｉ：２３５０３１０３］；アミノ酸２９９〜３４８）；トロンボスポンジン１（受託番号ＰＯ７９９６［ｇｉ：１３５７１７］；アミノ酸２９１〜３１４）；マトリリン−４（受託番号Ｏ９５４６０［ｇｉ：１４５４８１１７］；アミノ酸５９４〜６１８；ＣＭＰ（マトリリン−１）（受託番号ＮＰ＿００２３７０［ｇｉ：４５０５１１１］；アミノ酸４６３〜４９６；ＨＳＦ１（受託番号ＡＡＸ４２２１１［ｇｉ：６１３６２３８６］；アミノ酸１６５〜１９１；およびキュビリン（受託番号ＮＰ＿００１０７２［ｇｉ：４５５７５０３］；アミノ酸１０４〜１３８が含まれる。好適な三量体形成ドメインは、発現されたタンパク質のかなりの部分を三量体に組み立てると予想される。例えば、三量体形成ドメインを有する組換えＰｒｅＦポリペプチドの少なくとも５０％が三量体へと組み立てられる（例えばＡＦＦ−ＭＡＬＳでの評価による）。通常、発現されたポリペプチドの少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も望ましくは少なくとも約７５％以上が三量体として存在する。
【００６５】
ＨＲＢを更に安定化するために、ＰｒｅＦの第５１２位（天然Ｆ０タンパク質に対する位置）のロイシン残基をリジンで置換してよい（配列番号６の例示的ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドのＬ４８２Ｋ）。この置換により、コイルドコイル疎水性残基の周期性が改善される。同様に、第１０５位のアミノ酸の後ろにリジンを付加してもよい。
【００６６】
２番目に、ｐｅｐ２７を除去してよい。融合前状態のＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造モデルの分析から、ｐｅｐ２７はＦ１とＦ２の間に大きな非拘束ループを形成することが示唆されている。このループは融合前状態の安定化に寄与せず、フューリンによる天然タンパク質の切断後に除去される。
【００６７】
３番目に、片方または両方のフューリン切断モチーフを欠失させてよい。このように設計することで、融合ペプチドがＦ２から切断されず、融合前コンホーマーの球状ヘッドからの遊離および近くの膜への接近が防止される。融合ペプチドと膜界面との相互作用は、融合前状態の不安定性における大きな問題であると予測される。融合プロセス中、融合ペプチドと標的膜が相互作用すると、球状ヘッド構造内から融合ペプチドが露出し、融合前状態の不安定性が増大し、融合後コンホーマーへと折り畳まれる。この構造変化により、膜融合プロセスが可能になる。フューリン切断部位の片方または両方を除去すると、融合ペプチドのＮ末端に膜が接近しにくくなり、融合前状態が安定化すると予測される。
【００６８】
必要に応じて、例えば１または複数のアミノ酸を置換することで、少なくとも１つの非フューリン切断部位を除去してもよい。例えば、実験的証拠から、特定のメタロプロテイナーゼによる切断を促進する条件下で、ＰｒｅＦ抗原がアミノ酸１１０〜１１８付近で切断されることが示唆されている（例えば、切断はＰｒｅＦ抗原のアミノ酸１１２と１１３の間；配列番号２の参照Ｆタンパク質ポリペプチドの第１４２位のロイシンと第１４３位のグリシンの間で起こる）。したがって、この領域内の１または複数のアミノ酸の修飾は、ＰｒｅＦ抗原の切断を減少させ得る。例えば、第１１２位のロイシンをイソロイシンまたはトリプトファン等の異なるアミノ酸で置換してよい。あるいは、またはそれに加えて、第１１３位のグリシンをセリンまたはアラニンで置換してもよい。
【００６９】
天然Ｆタンパク質ポリペプチドは、ＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ株またはその変異体（上記に定義した通り）の任意のＦタンパク質から選択してよい。特定の例示的実施形態では、Ｆタンパク質ポリペプチドは配列番号２で表されるＦタンパク質である。本開示を理解し易いように、全てのアミノ酸残基の位置は、株に関係なく、例示的Ｆタンパク質のアミノ酸位置を基準にして記載する（すなわち対応するアミノ酸位置）。簡単に利用可能な周知のアラインメントアルゴリズムを用いて（例えばＢＬＡＳＴを、例えばデフォルトのパラメータで用いて）、選択されたＲＳＶ株のアミノ酸配列を例示的配列のアミノ酸配列とアラインメントさせることで、当業者であれば任意の他のＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ株の相当するアミノ酸位置を容易に決定することができる。種々のＲＳＶ株に由来するＦタンパク質ポリペプチドの多くの更なる例が国際公開第２００８１１４１４９号（ＲＳＶ  ＦおよびＧタンパク質配列の更なる例を提供する目的で参照により本明細書に援用する。）に開示されている。更なる変異体が遺伝的浮遊により生じることがある。また、部位特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発を用いるか、２種以上の既存の変異体の組換えにより、更なる変異体を人工的に作製することもできる。そのような更なる変異体も、本開示のＰｒｅＦ（およびＰｒｅＦ−Ｇ）抗原の文脈において好適である。
【００７０】
Ｆタンパク質のＦ２およびＦ１ドメインを選択する際、当業者であれば、Ｆ２および／またはＦ１ドメインの全体を含めることが厳密に必須ではないことを理解するであろう。通常、Ｆ２ドメインのサブ配列（または断片）を選択する時、構造についての検討が重要である。したがって、Ｆ２ドメインは通常、ポリペプチドの組み立ておよび安定性を促進する、Ｆ２ドメイン中の部分を含む。特定の例示的変異体では、Ｆ２ドメインはアミノ酸２６〜１０５を含む。しかし、（１または複数のアミノ酸の付加または欠失により）長さに軽微な修飾を施した変異体も可能である。
【００７１】
通常、Ｆ１ドメインの少なくともサブ配列（または断片）を選択し、Ｆタンパク質の免疫優性エピトープを含む安定な構造を維持するように設計する。例えば中和抗体により認識されるアミノ酸２６２〜２７５（パリビズマブ中和）および４２３〜４３６（セントコア社（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）製ｃｈ１０１Ｆ  ＭＡｂ）領域中のエピトープを含むＦ１ポリペプチドドメインのサブ配列を選択することが一般的に望ましい。更に、例えばアミノ酸３２８〜３５５領域中のＴ細胞エピトープを含めることが望ましい。Ｆ１サブユニットの単一連続部分（例えばアミノ酸２６２〜４３６にまたがる部分）が最も一般的であるが、エピトープは、安定な構造に組み立てられた非連続因子としてこれらの免疫優性エピトープを含む合成配列中に維持されてもよい。したがって、Ｆ１ドメインポリペプチドは、少なくともＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドのアミノ酸２６２〜４３６付近を含む。本明細書中で提供される非限定的な例として、Ｆ１ドメインは天然Ｆタンパク質ポリペプチドのアミノ酸１３７〜５１６を含む。当業者であれば、実施者の裁量で、更なるより短いサブ配列を用いてもよいと理解するであろう。
【００７２】
Ｆ２またはＦ１ドメインのサブ配列を選択する際（または特定のＰｒｅＦ−Ｇ抗原のＧタンパク質要素に関して後述するように）、構造の検討に加えて、更なる免疫原性エピトープが含まれるかどうかに基づいて配列（例えば変異体、サブ配列等）を選択することが望ましいことがある。例えば、当該技術分野で公知のアンカーモチーフ、またはニューラルネットもしくは多項式の決定等のその他の方法を用いて更なるＴ細胞エピトープを同定することができる。そのような方法については、例えばＲＡＮＫＰＥＰ（ワールドワイドウェブ：mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.htmlで利用可能）；ＰｒｏＰｒｅｄＩ（ワールドワイドウェブ：imtech.res.in/raghava/propredI/index.htmlで利用可能）；Ｂｉｍａｓ（ワールドワイドウェブ：www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.htmlで利用可能）；およびＳＹＦＰＥＩＴＨ（ワールドワイドウェブ：syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htmで利用可能）を参照されたい。例えば、アルゴリズムを用いて、ペプチドの「結合許容限界」を決定し、スコアがＭＨＣまたは抗体と特定のアフィニティーで結合する確率が高いことを示したものを選択する。これらのアルゴリズムは、特定の位置の特定のアミノ酸がＭＨＣ結合に及ぼす影響、特定の位置の特定のアミノ酸が抗体結合に及ぼす影響、またはモチーフを含むペプチド中における特定の置換が結合に及ぼす影響のいずれかに基づく。免疫原性ペプチドの文脈において、「保存された残基」とは、ペプチド中の特定の位置にランダム分布で予想されるよりも有意に高い頻度で現れるものである。アンカー残基は、ＭＨＣ分子との接触点を提供する保存された残基である。そのような予測的方法で同定されたＴ細胞エピトープは、特異的なＭＨＣタンパク質への結合の測定およびＭＨＣタンパク質に提示された時にＴ細胞を刺激する能力によって確認することができる。
【００７３】
好ましくは、ＰｒｅＦ抗原（後述のＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）は、発現系に対応したシグナルペプチド、例えば哺乳動物またはウイルスのシグナルペプチド、例えばＲＳＶ  Ｆ０天然シグナル配列（例えば、配列番号２のアミノ酸１〜２５または配列番号６のアミノ酸１〜２５）を含む。通常、シグナルペプチドは、組換え発現に選択する細胞に適合するように選択される。例えば、シグナルペプチド（例えばバキュロウイルスシグナルペプチドまたはメリチンシグナルペプチドを、昆虫細胞中での発現に置換してもよい。植物発現系が好ましい場合、好適な植物シグナルペプチドは当該技術分野で公知である。多くの例示的シグナルペプチドが当該技術分野で公知であり（例えば、Zhang & Henzel, Protein Sci.,13:2819-2824 (2004)参照。この文献は多くのヒトシグナルペプチドを記載している。）、また、例えば、古細菌、原核生物、および真核生物のシグナル配列を含むＳＰｄｂシグナルペプチドデータベースに掲載されている（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／）。必要に応じて、Ｈｉｓタグ等の更なる配列またはタグを前述の抗原のいずれかに含めて、精製し易くしてもよい。
【００７４】
必要に応じて、ＰｒｅＦ抗原は更なる免疫原性成分を含んでもよい。特定の特に好ましい実施形態では、ＰｒｅＦ抗原はＲＳＶ  Ｇタンパク質抗原成分を含む。ＰｒｅＦおよびＧ要素を有する例示的キメラタンパク質としては、以下のＰｒｅＦ＿Ｖ１（配列番号７および８で表される。）およびＰｒｅＦ＿Ｖ２（配列番号９および１０で表される。）が含まれる。
【００７５】
ＰｒｅＦ−Ｇ抗原では、Ｇタンパク質の抗原性部分（例えばアミノ酸残基１４９〜２２９等の切断型Ｇタンパク質）が構築物のＣ末端に付加されている。通常、Ｇタンパク質要素は可動性リンカー配列を介してＦタンパク質要素に連結されている。例えば例示的なＰｒｅＦ＿Ｖ１の設計中では、Ｇタンパク質は−ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ−リンカー（配列番号１４）によってＰｒｅＦ要素に連結される。ＰｒｅＦ＿Ｖ２の設計中では、リンカーはそれよりも短く、−ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ−リンカー（配列番号１４）の代わりに２個のグリシン（−ＧＧ−）をリンカーとして有する。
【００７６】
Ｇタンパク質ポリペプチドドメインが存在する場合、このドメインは、任意のＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ株から選択されたＧタンパク質の全部または一部を含み得る。特定の例示的実施形態では、Ｇタンパク質は配列番号４で表されるＧタンパク質（またはそれに９５％の同一性）である。好適なＧタンパク質配列の更なる例は、国際公開第２００８１１４１４９号（参照により本明細書に援用する。）に記載されている。
【００７７】
Ｇタンパク質ポリペプチド要素は少なくとも、例えばアミノ酸１８３〜１９７領域中にあるような免疫優性Ｔ細胞エピトープを維持したＧタンパク質のサブ配列（または断片）、例えば天然Ｇタンパク質のアミノ酸１５１〜２２９、１４９〜２２９、または１２８〜２２９を含むＧタンパク質の断片等を含むように選択される。例示的な一実施形態では、Ｇタンパク質ポリペプチドは、天然Ｇタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基１４９〜２２９の全部または一部を含む天然Ｇタンパク質ポリペプチドのサブ配列（または断片）である。当業者であれば、選択された部分がＰｒｅＦ−Ｇ抗原の構造を不安定化せず、ＰｒｅＦ−Ｇ抗原の発現、折り畳み、またはプロセシングを阻害しない限り、より長いまたは短いＧタンパク質部分を使用してもよいことを容易に理解できる。必要に応じてＧタンパク質ドメインは、第１９１位にアミノ酸置換を含み、これは、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンに関連する好酸球増多症を特徴とするワクチンにより促進される疾患の低減および／または防止に関わることが以前に示されている。天然および置換（Ｎ１９１Ａ）Ｇタンパク質の特徴の詳細は、例えば、参照により本明細書に援用する米国特許公開第２００５／００４２２３０号に記載されている。
【００７８】
例えば、天然株の対応する配列の選択に関して、Ａ２またはＬｏｎｇと命名された一般的な研究室用単離株または任意のその他の天然株もしくは単離株（前述の国際公開第２００８１１４１４９号に開示）を含むＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ株に対してドメインの１または複数の配列が対応し得る。そのような天然のおよび単離された変異体に加え、前述の配列に対する配列類似性を有する操作された変異体もＰｒｅＦ（ＰｒｅＦ−Ｇを含む。）抗原に関連して用いることができる。ＰｒｅＦ抗原ポリペプチド（および後述するポリヌクレオチド配列）の類似性は、ポリペプチド（および一般にヌクレオチド配列）に関して、配列間の類似性（配列同一性とも呼ばれる）の点から表現できることが当業者には理解されよう。配列同一性はしばしば、同一性（または類似性）のパーセンテージの点から測定され、このパーセンテージが高いほど、２つの配列の一次構造が似ていることになる。一般的に、２個のアミノ酸（またはポリヌクレオチド）配列の一次構造が似ているほど、折り畳みおよび組み立て後の高次構造は近くなる。ＰｒｅＦポリペプチド（およびポリヌクレオチド）配列の変異体は通常、１または少数のアミノ酸の欠失、付加、または置換を含むが、それでも、それらのアミノ酸および一般的にそれらのポリヌクレオチド配列の非常に多くの部分が共通している。更に重要なことは、変異体が、本明細書に開示する参照配列の構造的特性、したがって構造特性を維持していることである。
【００７９】
配列同一性を決定する方法は当該技術分野で周知であり、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドおよび（例えば後述する）それらをコードする核酸にも適用可能である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970；Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881, 1988；およびPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988に記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994に、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察が記載されている。配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと一緒に使用するためのＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., Ｊ. Mol. Biol. 215:403, 1990）が、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ、メリーランド州ベセスダ）を含む複数の供給元からおよびインターネット上で利用可能である。このプログラムを用いて配列同一性をどのように決定するかについての説明はインターネット上のＮＣＢＩのウェブサイトから利用可能である。
【００８０】
いくつかの場合では、ＰｒｅＦ抗原は、それが由来する天然株のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸修飾を有する（例えば、前述の安定化修飾に加えて）。そのような差は、１または複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換であってよい。変異体は通常、約１％、２％、５％、１０％、１５％、または２０％未満のアミノ酸残基で異なる。例えば、変異体ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇを含む。）ポリペプチド配列は、配列番号６、８、および／または１０の例示的ＰｒｅＦ抗原ポリペプチド配列と比較して、１個、２個、または５個まで、約１０個まで、約１５個まで、約５０個まで、または約１００個までの異なるアミノ酸を含んでよい。したがって、ＲＳＶ  ＦまたはＧタンパク質、またはＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）に関する変異体は、通常、参照タンパク質、例えば配列番号２、４、６、８および／または１０で示される参照配列または本明細書に開示する例示的ＰｒｅＦ抗原のいずれかと、少なくとも８０％または８５％、より一般的には少なくとも約９０％以上、例えば９５％、更には９８％または９９％の配列同一性を有する。本開示の構成として含まれる更なる変異体としては、国際公開第２００８１１４１４９号に開示されている天然変異体から選択されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列の全部または一部を含むＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）が挙げられる。更なる変異体が遺伝的変動で生じることがある。また、部位特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発、あるいは２種以上の既存の変異体の組換えにより、更なる変異体を人工的に作製することもできる。そのような更なる変異体も、本明細書に開示するＰｒｅＦ（およびＰｒｅＦ−Ｇ）抗原の文脈において好適である。例えば、修飾は、得られるＰｒｅＦ抗原の構造または免疫原性エピトープを変更しない１または複数のアミノ酸（例えば２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、約１０アミノ酸まで、またはそれ以上）の置換であってよい。
【００８１】
あるいは、またはそれに加えて、修飾は、１もしくは複数のアミノ酸の欠失および／または１もしくは複数のアミノ酸の付加を含んでよい。実際、所望であれば、ポリペプチドドメインの１または複数は、如何なる単一の株にも相当せず、複数の株からのサブ配列要素またはＲＳＶウイルスポリペプチドの複数の株のアラインメントから推測されるコンセンサス配列からのサブ配列要素を含む、合成ポリペプチドであってもよい。特定の実施形態では、ポリペプチドドメインの１または複数が、その後のプロセシングまたは精製を容易にするタグを構成するアミノ酸配列の付加によって修飾されている。そのようなタグは、抗原タグもしくはエピトープタグ、酵素タグまたはポリヒスチジンタグであってよい。通常、タグは、タンパク質の一端または他方の端、例えば抗原または融合タンパク質のＣ末端またはＮ末端に位置する。
【００８２】
ＰＲＥＦ抗原をコードする核酸
本開示の別の態様は、上記のＰｒｅＦ抗原をコードする組換え核酸に関する。特定の実施形態では、組換え核酸は、選択された原核または真核の宿主細胞中での発現に最適化されたコドンである。例えば、配列番号５および１２は、ＰｒｅＦ抗原をコードする配列を説明する２つの異なる非限定的な例であり、これらは、哺乳動物、例えばＣＨＯ細胞中での発現に最適化されたコドンである。複製および発現を容易にするために、核酸を原核または真核用の発現ベクター等のベクターに組み込んでよい。組換えＰｒｅＦ抗原をコードする核酸を含む宿主細胞も本発明に含まれる。好ましい宿主細胞としては、大腸菌等の原核（すなわち細菌）宿主細胞、および真菌（例えば酵母）細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ、ＶＥＲＯ、およびＨＥＫ２９３細胞）を含む多くの真核宿主細胞が含まれる。
【００８３】
複製および発現を容易にするために、核酸を原核または真核用の発現ベクター等のベクターに組み込んでよい。本明細書に開示する核酸は種々のベクター（例えば、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；ファージＤＮＡとプラスミドとの組合せに由来するベクターおよびワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、その他多数のウイルスを含むウイルスＤＮＡを含む。）のいずれに含まれてもよいが、最も一般的なベクターは、ポリペプチド発現産物を作製するのに適した発現ベクターであろう。発現ベクター中で、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は通常、ｍＲＮＡ合成へと進ませるための適切な転写調節配列（プロモーター、および必要に応じて、１または複数のエンハンサー）に近接しかつその方向に配置される。すなわち、目的のポリヌクレオチド配列は適切な転写調節配列に作動可能に連結されている。そのようなプロモーターの例としては、ＣＭＶの最初期プロモーター、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーター、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージＴ７およびラムダＰＬプロモーター、および原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子発現を調節することが知られているその他のプロモーターが含まれる。発現ベクターは通常、転写開始のためのリボソーム結合部位および転写終結因子も含む。ベクターは、必要に応じて、発現を増幅するための適切な配列を含む。更に、発現ベクターは必要に応じて１または複数の選択可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞をセレクションするための表現型形質、例えば真核細胞培養用にジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシンに対する耐性等、あるいは大腸菌中におけるカナマイシン、テトラサイクリン、またはアンピシリンに対する耐性等を付与する。
【００８４】
発現ベクターはまた、例えば翻訳効率を向上させるために、更なる発現因子を含んでもよい。これらのシグナルとしては、例えばＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれ得る。いくつかの場合には、例えば、翻訳開始コドンおよび関連する配列因子を目的のポリヌクレオチド配列と同時に適切な発現ベクター中に挿入する（例えば天然のスタートコドン）。そのような場合では、それ以外の翻訳調節シグナルは不要である。しかし、ポリペプチドをコードする配列またはその一部のみを挿入する場合には、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸が翻訳されるように、ＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルを付与する。開始コドンは、目的のポリヌクレオチド配列が確実に翻訳されるように、正確な読み枠で配置される。外来性の転写因子および開始コドンは、天然および合成の両方を含む種々の起源のものであってよい。所望であれば、使用する細胞系に適したエンハンサーを含めることで発現効率を更に高めてもよい（Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62；Bitter et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544）。
【００８５】
いくつかの場合には、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸（ベクター等）は、宿主細胞に導入された時にＰｒｅＦをコードする核酸の発現を増加および／または最適化するように選択された１または複数の更なる配列因子を含む。例えば、特定の実施形態では、ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸は、ヒトヘルペスウイルス５イントロン配列等のイントロン配列を含む（例えば配列番号１３参照）。イントロンは、組換えコンストラクト中に適切に配置された場合に同種および異種性の核酸の発現を増大させることが繰り返し示されている。別のクラスの発現促進配列としては、マトリックス結合領域（またはＭＡＲ）等のエピジェネティックな因子またはＳＴＡＲ因子（例えば、Otte et al., Biotechnol. Prog. 23:801-807, 2007に開示されているＳＴＡＲ因子等）等の同様なエピジェネティック因子が含まれる。理論により限定されるものではないが、ＭＡＲは、核マトリックスへの標的ＤＮＡ配列のアンカー（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）を仲介し、ヘテロクロマチンコアから外側に伸びたクロマチンループドメインを作り出すと考えられる。ＭＡＲは明らかなコンセンサス配列または認識可能な配列を有していないが、これらの最も共通する特徴は、全体的にＡ／Ｔ含量が高く、Ｃ塩基が一方の鎖に多く存在することであると思われる。これらの領域は、鎖の分離を起こしやすくする可能性のある屈曲した二次構造を形成するようであり、鎖分離の核形成点として作用し得るコア巻戻し因子（ＣＵＥ）を含んでもよい。複数の単純なＡＴリッチ配列モチーフがＭＡＲ配列と関連付けられている：例えばＡボックス、Ｔボックス、ＤＮＡ巻戻しモチーフ、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）、および脊椎動物またはショジョウバエのトポイソメラーゼＩＩコンセンサス部位。例示的なＭＡＲ配列は、公開されている米国特許出願第２００７０１７８４６９号および国際公開第０２／０７４９６９号（参照により本明細書に援用する）に記載されている。ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸の発現を高めるために使用できる更なるＭＡＲ配列としては、Girod et al., Nature Methods, 4:747-753, 2007に記載されている鶏リゾチームＭＡＲ、ＭＡＲｐ１−４２、ＭＡＲｐ１−６、ＭＡＲｐ１−６８、およびＭＡＲｐｘ−２９が含まれる（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡ４２３３０６、ＤＩ１０７０３０、ＤＩ１０６１９６、ＤＩ１０７５６１、およびＤＩ１０６５１２に開示されている）。当業者であれば、ＭＡＲ１−９で報告されているような中程度の増加を起こすＭＡＲを選択することで発現を更に調節することができると理解するであろう。所望であれば、例えばＭＡＲ−Ｆｉｎｄｅｒ（futuresoft.org/MarFinderにてウェブ上で利用可能）、ＳＭＡＲＴｅｓｔ（genomatix.deにてウェブ上で利用可能）、またはＳＭＡＲＳｃａｎＩ（Levitsky et al., Bioinformatics 15:582-592, 1999）等のソフトウェアを用いて配列データベースを検索することで、ＰｒｅＦ抗原の発現を増加させるための代替的なＭＡＲ配列を同定してもよい。特定の実施形態では、ＭＡＲは、ＰｒｅＦ抗原をコードする配列と同じ核酸（例えばベクター）に載せて宿主細胞に導入（例えばトランスフェクト）される。別の実施形態では、ＭＡＲは別の核酸上で（例えばトランスで）導入され、必要に応じ���、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列と共組換えされてよい。
【００８６】
当業者が組換えＰｒｅＦ抗原核酸を作製する指針となるのに十分な例示的手順は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (およびSupplements to 2003)；およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999に記載されている。
【００８７】
ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドをコードする例示的核酸は配列番号５、７、９、１２、および１３で表される。例えば国際公開第２００８１１４１４９号に記載されているような公知の発見されている（またはこれから発見される）ＲＳＶ株のいずれかから選択された類似するＦおよびＧタンパク質ポリペプチド配列を構築することで、更なる変異体を作製することができる。当業者は、例示的変異体と配列同一性を有する更なる配列変異体を作製することができる。核酸変異体は通常、１％、２％、５％、１０％、１５％、または２０％未満のアミノ酸残基が異なるポリペプチドをコードする。すなわち、コードされるポリペプチドは、少なくとも８０％または８５％、より一般的には少なくとも約９０％以上、例えば９５％、更には９８％または９９％の配列同一性を有する。当業者には、遺伝暗号の縮重のために、ＰｒｅＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列自体の配列同一性が低くなり得ることが容易に理解されよう。いくつかの場合には、ＰｒｅＦ抗原は、それが由来する天然株のアミノ酸配列と比較して、１または複数のアミノ酸修飾を有する（例えば、前述の安定化修飾に加えて）。そのような差は、それぞれ、１または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の付加、欠失、または置換であってよい。変異体は通常、約１％、２％、５％、１０％、１５％、または２０％未満のヌクレオチド残基が異なる。例えば、変異体ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇを含む。）核酸は、配列番号５、７、９、１２、および／または１３の例示的ＰｒｅＦ抗原核酸と比べて、１個または２個、または５個まで、約１０個まで、約１５個まで、約５０個まで、または約１００個までの異なるヌクレオチドを含んでよい。したがって、ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはＲＳＶ  Ｇタンパク質またはＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）の核酸の文脈における変異体は通常、参照配列、例えば配列番号１、３、５、７、９、１２、もしくは１３に示す参照配列または本明細書に開示するその他の例示的ＰｒｅＦ抗原核酸のいずれかと、少なくとも８０％または８５％、より一般的には少なくとも約９０％以上、例えば９５％、更には９８％または９９％の配列同一性を有する。本開示の構成として含まれる更なる変異体としては、国際公開第２００８１１４１４９号に開示されている天然変異体から選択されたヌクレオチド配列の全部または一部を含むＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）が挙げられる。更なる変異体が遺伝的変動により生じることがある。また、部位特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発、あるいは２種以上の既存の変異体の組換えにより、更なる変異体を人工的に作製することもできる。そのような更なる変異体も本明細書に開示するＰｒｅＦ（およびＰｒｅＦ−Ｇ）抗原の文脈において好適である。
【００８８】
既に記載した変異体核酸に加えて、配列番号１、３、５、７、９、１２、および１３で表される例示的核酸の１または複数とハイブリダイズする核酸も、ＰｒｅＦ抗原をコードするために使用することができる。当業者であれば、前述した％配列同一性の測定値に加えて、２つの核酸間の配列類似性を示す別の指標がハイブリダイズできるかどうかであることを理解するであろう。２つの核酸の配列が似ているほど、それらの核酸がハイブリダイズする条件は、よりストリンジェントになる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、配列に依存し、種々の環境パラメータ下で異なる。したがって、特定の程度のストリンジェンシーとなるハイブリダイゼーション条件は、選択するハイブリダイゼーション方法の性質およびハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変わる。洗浄回数もストリンジェンシーに影響を与えるが、一般的に、ハイブリダイゼーション温度とハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特にＮａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおいて具体的な配列の融解温度（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（所定のイオン強度およびｐＨ下にて）標的配列の５０％が完全一致プローブとハイブリダイズする温度である。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993、およびAusubel et al.  Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999に記載されている。
【００８９】
本開示において、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間のミスマッチが２５％未満の場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、より正確に定義するために特定のレベルのストリンジェンシーに分けてもよい。例えば、本明細書において、「適度なストリンジェンシー」条件とは、２５％超の配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、１５％超のミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」条件とは、１０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「非常に高いストリンジェンシー」条件とは、６％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。一方、「低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸としては、それよりはるかに配列同一性が低い核酸、または核酸中の短いサブ配列に対してのみ配列同一性を有する核酸が含まれる。したがって、本開示に包含される核酸の種々の変異体は配列番号１、３、５、７、９、および／または１２の少なくとも１つとほぼその全長でハイブリダイズすることができることが理解されよう。
【００９０】
ＲＳＶ抗原性ポリペプチドの産生方法
本開示のＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原および適当であればＧ抗原も含む。）は、組換えタンパク質を発現および精製するための十分に確立された方法を用いて産生される。当業者の指針となるのに十分な手順が以下の参考文献に見出せる：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 200；およびAusubel et al.  Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 999。更なる具体的な詳細を以下に記載する。
【００９１】
ＰｒｅＦ抗原をコードする組換え核酸を、選択するベクターおよび宿主細胞に応じて、エレクトロポレーション、リポソームを介したトランスフェクション（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００またはＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）等の市販のリポソームトランスフェクション試薬を用いる。）、リン酸カルシウム沈殿、感染、トランスフェクション等の種々の周知の手法のいずれかにより宿主細胞に導入する。ＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）をコードする例示的核酸を配列番号５、７、９、１２、および１３に示す。当業者であれば、配列番号５、７、９、１２、および１３は説明のためのものであり、限定することを意図していないことを理解するであろう。例えば、配列番号５、７、および９と同じタンパク質をコードする（例えば配列番号６、８、および１０で示される。）が、遺伝暗号の縮重の分だけ（例えば配列番号１２に示されるように代替的なコドン最適化により）異なるポリヌクレオチド配列を、配列番号５、７、および９の例示的配列の代わりに容易に使用することができる。同様に、配列番号１３に示すような、内部に配置されたイントロン等の（またはプロモーター、エンハンサー、イントロン、またはその他の同様な因子の付加により）発現促進因子を含むポリヌクレオチド配列を用いてもよい。当業者は、このような修飾の組合せも同様に好適であることが理解されよう。同様に、任意のＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ株から選択された相同配列および／または前述したようにかなりの配列同一性を有するその他の配列も、ＰｒｅＦ抗原の発現に用いることができる。実際、既に開示した変異体核酸のいずれも好適に宿主細胞に導入してＰｒｅＦ抗原（ＰｒｅＦ−Ｇ抗原を含む。）および適当であればＧポリペプチドを産生するために使用することができる。
【００９２】
したがって、組換えＰｒｅＦ抗原をコードする核酸を含む宿主細胞も本発明に含まれる。好ましい宿主細胞としては、大腸菌等の原核（例えば細菌）宿主細胞および真菌（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス等の酵母）細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３細胞等）を含む多くの真核宿主細胞が含まれる。組換えＰｒｅＦ抗原核酸は、例えば発現ベクター等のベクターを介して、宿主細胞に導入（例えば形質導入、形質転換、またはトランスフェクト）される。前述した通り、ベクターは最も一般的にはプラスミドであるが、そのようなベクターも、例えばウイルス粒子、ファージ等であってよい。適切な発現宿主の例としては、大腸菌、ストレプトミセス属、サルモネラ・チフィリウム等の細菌細胞；サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、アカパンカビ等の真菌細胞；ショウジョウバエ、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）等の昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、またはボーズメラノーマ等の哺乳動物細胞；藻類細胞を含む植物細胞等が含まれる。
【００９３】
宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体のセレクション、または挿入されたポリヌクレオチド配列の増幅に適するように改変された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は通常、発現用に選択された宿主細胞で既に使用されている条件であり、当業者には明らかであろう。そのような条件は、例えばFreshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New Yorkを含む本明細書で引用した参考文献およびその中で引用されている参考文献中に記載されている。本発明の核酸に対応する発現産物は、植物、酵母、真菌、細菌等の非動物細胞中でも産生させることができる。細胞培養に関する詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ、およびＡｕｓｕｂｅｌの他に、Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY；Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLに見出せる。
【００９４】
細菌系では、発現される産物の用途に応じて複数の発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の作製に大量のポリペプチドまたはその断片が必要な場合、精製が容易な融合タンパク質を高レベルで発現させるベクターを使用することが好ましい。そのようなベクターとしては、限定されるものではないが、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（ストラタジーン社製）等の多機能大腸菌クローニング・発現ベクター；ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509）；ｐＥＴベクター（ウィスコンシン州マディソンのノバジェン社製）等が含まれる。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴでは、目的のコード配列、例えば前述した本発明のポリヌクレオチドを、アミノ末端翻訳開始メチオニンおよびその後ろのベータ−ガラクトシダーゼの７残基に対する配列とインフレームでベクター中にライゲートすることで、酵素活性ベータガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生させることができる。ｐＥＴベクターでは、アミノ末端メチオニンがヒスチジンタグとインフレームでライゲートされる。
【００９５】
同様に、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母では、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨ等の構成型または誘導型のプロモーターを含む複数のベクターを、所望の発現産物の産生に用いることができる。概説としては、Ｂｅｒｇｅｒ、Ａｕｓｕｂｅｌ、および例えばGrant et al. (1987; Methods in Enzymology 153:516-544)を参照されたい。哺乳動物宿主細胞では、プラスミドおよびウイルスの両方に基づく系を含む複数の発現系が使用可能である。
【００９６】
宿主細胞は、必要に応じて、挿入配列の発現を調節する能力または発現されたタンパク質を所望の通りにプロセシングする能力で選択される。そのようなタンパク質修飾としては、グリコシル化（並びに、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化）が含まれるが、これらの限定されるものではない。宿主細胞に関して、必要に応じて、例えば、前駆体の形態を切断（例えばフューリンプロテアーゼによる）してタンパク質に成熟形態を形成させる翻訳後プロセシングが行われる。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等の種々の宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特有の細胞機構および特徴的機序を有し、導入する外来タンパク質が正しく修飾およびプロセシングされるようにこれらを選択することができる。
【００９７】
本開示の組換えＰｒｅＦ抗原を長期間にわたって高収率で産生するために、安定な発現系が通常使用される。例えば、ＰｒｅＦ抗原ポリペプチドを安定して発現する細胞系を、ウイルスの複製起点または内在性の発現因子および選択可能なマーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞に導入する。ベクターを導入し、細胞を濃縮培地中で１〜２日成長させた後、選択培地に移す。選択可能なマーカーの目的は、セレクションへの耐性を付与することであり、それが存在することで、導入された配列を発現することに成功した細胞の成長および回収が可能になる。例えば、耐性を有する安定に形質転換された細胞の群またはコロニーは、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。ＰｒｅＦ抗原をコードする核酸で形質転換された宿主細胞は、必要に応じて、コードされたタンパク質の発現および細胞培養液からの回収に適した条件下で培養される。
【００９８】
好適な宿主細胞系に形質導入し、宿主細胞を適当な細胞密度まで成長させた後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば温度変化、または化学的誘導）で誘導し、細胞を更に培養する。必要に応じて、培地に、プロテイナーゼによる発現タンパク質の分解を低減する成分および／または添加剤を含める。例えば、ＰｒｅＦ抗原を産生するための細胞培養に用いられる培地は、細胞または細胞外（例えばマトリックス）プロテイナーゼによる望ましくない切断を低減または排除するために、キレート化剤または小分子阻害剤等のプロテアーゼ阻害剤（例えばＡＺ１１５５７２７２、ＡＳ１１１７９３等）を含んでもよい。
【００９９】
その後、分泌されたポリペプチド産物を培養培地から回収する。すなわち、細胞を遠心分離により回収し、物理的または化学的な手段で破壊することで、粗抽出物が得られ、その後、これを精製する。タンパク質の発現に使用される真核または微生物細胞は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用、または当業者に公知のその他の方法を含む任意の従来の方法で破壊してよい。
【０１００】
発現されたＰｒｅＦ抗原は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、ろ過、限外ろ過、遠心分離、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば本明細書に記載したタグシステムのいずれかを使用）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む当該技術分野で公知の複数の方法のいずれを用いて組換え細胞培養液から回収および精製してよい。所望により、成熟タンパク質の立体構造を完成させるために、タンパク質を再度折り畳む工程を用いてもよい。最後に、最終精製工程に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてもよい。上記で言及したものに加えて、種々の精製方法が当該技術分野で公知であり、例えば以下に記載されているものが含まれる：Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.；Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY；Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.；Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY；Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY；およびWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ。
【０１０１】
特定の例では、核酸は、大腸菌等の原核細胞での導入および発現に適したベクターを介して細胞に導入される。例えば、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸は、ｐＥＴシリーズの発現ベクター（例えばｐＥＴ９ｂおよびｐＥＴ２ｄ）等の種々の市販されているまたは独占権下にあるベクターのいずれかに導入してよい。コード配列の発現はＩＰＴＧで誘導可能であり、高レベルのタンパク質発現が得られる。ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、ファージＴ７プロモーター下で転写される。熱で誘導可能なラムダｐＬプロモーターを含むｐＵＲＶ２２等の代わりのベクターも好適である。
【０１０２】
発現ベクターは、（例えばエレクトロポレーションにより）好適な細菌宿主に導入される。大腸菌の多くの好適な株が利用可能であり、当業者に選択可能である（例えば、Ｒｏｓｅｔｔａ株およびＢＬ２１（ＤＥ３）株が、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターの発現に好ましいことが証明されている。
【０１０３】
より一般的には、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチドは真核細胞（例えば昆虫または哺乳動物の細胞）での導入および発現に適した発現ベクター中に組み込まれる。好ましくは、そのような核酸は、選択されたベクター／宿主細胞中での発現に最適化されたコドンである（例えば配列番号５、７、９、および１２に記載の配列は、ＣＨＯ細胞中での発現に最適化されたコドンである）。例示的な一実施形態では、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、ロンザ・バイオロジカルズ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）社により開発されたｐＥＥ１４ベクター等のベクターに導入される。このポリペプチドは、最初期ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター等の構成的プロモーター下で発現される。ポリペプチドを発現する安定なトランスフェクト細胞のセレクションは、トランスフェクト細胞がグルタミン源非存在下で成長する能力に基づいて行われる。ｐＥＥ１４ベクターはＧＳ酵素（グルタミン合成酵素）を発現するため、ｐＥＥ１４の組込みに成功した細胞は、外部からのグルタミンがなくても成長することができる。セレクションされた細胞は、クローニングにより増やすことができ、所望のＰｒｅＦポリペプチドの発現について特徴解析することができる。
【０１０４】
別の例では、ＰｒｅＦ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞に導入される。昆虫細胞に感染することができる組換えバキュロウイルスは、ＢＤバイオサイエンス社のＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄシステム等の市販のベクター、キット、および／またはシステムを用いて作製することができる。簡潔に説明すると、抗原をコードするポリヌクレオチド配列を、ｐＡｃＳＧ２転移ベクターに挿入する。その後、宿主細胞ＳＦ９（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））を、ｐＡｃＳＧ２−キメラプラスミドと、バキュロウイルスであるオートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＡｃＮＰＶ）の線状化したゲノムＤＮＡを含むＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄとで共トランスフェクトする。トランスフェクション後、ｐＡＣＳＧ２プラスミドとバキュロウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、組換えウイルスが生成する。１つの例では、ＰｒｅＦ抗原は、ポリヘドリンプロモーター（ｐＨ）の調整制御下で発現される。ベーシック（Ｂａ）プロモーター、ｐ１０プロモーター等のその他のプロモーターを用いて同様な転移ベクターを作製してよい。同様に、Ｓｆ９と密接に関連するＳＦ２１および鱗翅目ヤガ科のガの幼虫（ｃａｂｂａｇｅ  ｌｏｏｐｅｒ）であるイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）に由来するハイファイブ細胞系等の代替的な昆虫細胞を用いてもよい。
【０１０５】
トランスフェクションおよび（選択されたプロモーターおよび／またはエンハンサーまたはその他の調節因子に応じた）発現誘導の後、発現されたポリペプチドを回収（例えば精製または濃縮）し、抗原活性を有する融合前構造に確実に折り畳まれるように再生する。
【０１０６】
免疫原性組成物および方法
上記のＰｒｅＦ抗原（例えば配列番号６、８、および１０で例示されるもの）のいずれか、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む免疫原性組成物も提供する。
【０１０７】
特定の実施形態、典型的には、ＰｒｅＦ抗原がＧタンパク質要素を含まない実施形態（例えば配列番号６）では、免疫原性組成物は、単離されて組換えおよび／または精製されたＧタンパク質を含み得る。多くの好適なＧタンパク質が当該技術分野で報告されており、それには、全長組換えＧタンパク質、並びにＧタンパク質の一部（例えば、アミノ酸１２８〜２２９または１３０〜２３０）と融合相手（例えばチオレドキシン）または発現および／もしくは精製を容易にするシグナルおよび／もしくはリーダー配列とで構成されるキメラタンパク質が含まれる。ＰｒｅＦ抗原との混合物中に使用するための例示的Ｇタンパク質は、それぞれを参照により本明細書に援用する国際公開第２００８１１４１４９号、米国特許第５，１４９，６５０号、同第６，１１３，９１１号、米国出願公開第２００８０３００３８２号、および米国特許第７，３６８，５３７号に見出せる。キメラＰｒｅＦ−Ｇタンパク質に関して示すように、ＰｒｅＦ（Ｇを含まない。）およびＧを含む混合物に関して、アミノ酸１４９〜２２９の部分または１２８付近〜２２９付近の部分等のより小さなＧタンパク質断片を好ましく使用することができる。前述した通り、例えばアミノ酸１８３〜１９７領域内に含まれる免疫優性エピトープが存在することが重要である。あるいは、そのような組成物中に全長Ｇタンパク質を用いてもよい。
【０１０８】
薬学的に許容される担体および賦形剤は周知であり、当業者により選択可能である。例えば、担体または賦形剤は、好ましくは緩衝剤を含んでもよい。必要に応じて、担体または賦形剤は、溶解性および／または安定性を安定化する少なくとも１つの成分も含む。可溶化／安定化剤の例としては、界面活性剤、例えばローレル（ｌａｕｒｅｌ）サルコシンおよび／またはＴｗｅｅｎが含まれる。別の可溶化／安定化剤としては、アルギニンおよびガラス形成ポリオール（スクロース、トレハロース等）が含まれる。多くの薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容される賦形剤が当該技術分野で公知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975)に記載されている。
【０１０９】
したがって、選択された投与経路で対象に送達されるのに適した製剤を製造するために、当業者は好適な賦形剤および担体を選択することができる。
【０１１０】
好適な賦形剤としては、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｌ−プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、トリメチルアミンオキシド、ＫＣｌ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、およびその他の二価カチオン関連塩、ジチオスレイトール、ジチオエリトロール、およびβ−メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定されるものではない。その他の賦形剤としては、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、トリトンＸ−００、ＮＰ−４０、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、両性洗浄剤３−０８、両性洗浄剤３−０、両性洗浄剤３−２、両性洗浄剤３−４、両性洗浄剤３−６、ＣＨＡＰＳ，デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含む。）が挙げられる。
【０１１１】
必要に応じて、免疫原性組成物はアジュバントを含んでもよい。ＲＳＶに対する防御免疫反応を引き起こす目的で対象に投与するのに適した免疫原性組成物に関して、アジュバントは、Ｔｈ１優位型の免疫反応を引き起こすように選択される。
【０１１２】
アジュバントは通常、組成物を投与する対象または対象群中のＴｈ１優位型の免疫反応を高めるように選択される。例えば、免疫原性組成物が、ＲＳＶ感染症に罹りやすい（またはそのリスクが高い）特定の年齢群の対象に投与される場合、アジュバントは、その対象または対象群中で安全かつ効果的であるように選択される。したがって、高齢対象（例えば６５歳を超える対象）に投与するためのＲＳＶ  ＰｒｅＦ抗原を含む免疫原性組成物を製剤化する場合、アジュバントは、高齢対象中で安全かつ効果的であるように選択される。同様に、ＲＳＶ  ＰｒｅＦ抗原を含む免疫原性組成物を新生児または幼児対象中に投与する場合（例えば生後２歳までの対象）、アジュバントは、新生児および幼児中で安全かつ効果的であるように選択される。
【０１１３】
更に、アジュバントは通常、免疫原性組成物が投与される投与経路を介して投与された時にＴｈ１型免疫反応を高めるように選択される。例えば、経鼻投与用にＰｒｅＦ抗原を含む免疫原性組成物を製剤化する場合、好ましいＴｈ１優位型のアジュバントはプロテオソームおよびプロトリンである。一方、免疫原性組成物を筋肉内投与用に製剤化する場合、３Ｄ−ＭＰＬ、スクアレン（例えばＱＳ２１）、リポソーム、および／または油と水のエマルションの１または複数を含むアジュバントを選択することが好ましい。
【０１１４】
ＰｒｅＦ抗原と組み合わせて用いるのに適したアジュバントの１つは非毒性細菌リポ多糖誘導体である。好適なリピドＡの非毒性誘導体の例としては、モノホスホリルリピドＡ、より具体的には３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。３Ｄ−ＭＰＬは、グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズＮ．Ａ．社からＭＰＬの名称で販売されており、本明細書中ではＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと呼んでいる。例えば、米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，８７７，６１１号、同第４，８６６，０３４号、および同第４，９１２，０９４号を参照されたい。３Ｄ−ＭＰＬは、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）表現型を示すＣＤ４＋Ｔ細胞反応を主に促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、英国特許公開第２２２０２１１（Ａ）号に開示されている方法に従って作製することができる。化学的には、３Ｄ−ＭＰＬは３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡと３、４、５、または６アシル化鎖の混合物である。本発明の組成物中では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用してよい。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍのフィルターで滅菌ろ過することができる粒子サイズである。そのような標品は、国際公開第９４／２１２９２号に記載されている。
【０１１５】
３Ｄ−ＭＰＬ等のリポ多糖は、ヒト１回投与量の免疫原性組成物当たり１〜５０μｇの量で使用してよい。そのような３Ｄ−ＭＰＬは、約２５μｇ、例えば２０〜３０μｇ、好ましくは２１〜２９μｇ、２２〜２８μｇ、２３〜２７μｇ、２４〜２６μｇ、または２５μｇのレベルで使用してよい。別の実施形態では、ヒト投与量の免疫原性組成物は、３Ｄ−ＭＰＬを約１０μｇ、例えば５〜１５μｇ、好ましくは６〜１４μｇ、例えば７〜１３μｇ、８〜１２μｇ、９〜１１μｇ、または１０μｇのレベルで含む。別の実施形態では、ヒト投与量の免疫原性組成物は、３Ｄ−ＭＰＬを約５μｇ、例えば１〜９μｇ、２〜８μｇ、好ましくは３〜７μｇ、または４〜μｇ、または５μｇのレベルで含む。
【０１１６】
別の実施形態では、リポ多糖は、米国特許第６，００５，０９９号および欧州特許第０  ７２９  ４７３（Ｂ１）号に記載されているようなβ（１−６）グルコサミン二糖であってよい。当業者であれば、これらの参考文献の教示に基づいて、３Ｄ−ＭＰＬ等の種々のリポ多糖を容易に作製することができるが、これらの参考文献のそれぞれを参照により本明細書に援用する。前述の免疫賦活薬（ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬの構造に似た構造をしている。）に加えて、上記ＭＰＬの構造のサブ部分であるアシル化された単糖および二糖の誘導体も好適なアジュバントである。別の実施形態では、アジュバントはリピドＡの合成誘導体であり、これらのいくつかはＴＬＲ−４アゴニストであると言われており、限定されるものではないが、ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸二水素）、（国際公開第９５／１４０２６号）；ＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ、９Ｒ）−３−−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール、１，１０−ビス（リン酸二水素）（国際公開第９９／６４３０１号および同第００／０４６２号）；およびＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール、１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサノアート）（国際公開第０１／４６１２７号）が含まれる。
【０１１７】
使用することのできるその他のＴＬＲ４リガンドとしては、アルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）、例えば国際公開第９８／５０３９９号または米国特許第６，３０３，３４７号（ＡＧＰの製造プロセスも開示している。）に開示されているもの、好ましくはＲＣ５２７またはＲＣ５２９、または米国特許第６，７６４，８４０号に開示されているようなＡＧＰの薬学的に許容される塩が挙げられる。ＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであるものも、ＴＬＲ４アンタゴニストであるものもある。どちらもアジュバントとして有用であると考えられる。
【０１１８】
ＴＬＲ−４を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるその他の好適なＴＬＲ−４リガンド（Sabroe et al, JI 2003 p1630-5）としては、例えば、グラム陰性菌由来のリポ多糖およびその誘導体またはその断片、特に、ＬＰＳの非毒性誘導体（３Ｄ−ＭＰＬ等）が挙げられる。その他の好適なＴＬＲアゴニストとしては、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５、または９０；サーファクタントタンパク質Ａ、ヒアルロン酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノーゲンペプチドおよびｂ−デフェンシン−２、およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）が挙げられる。一実施形態では、ＴＬＲアゴニストはＨＳＰ６０、７０、または９０である。その他の好適なＴＬＲ−４リガンドとしては、国際公開第２００３／０１１２２３号および同第２００３／０９９１９５号に記載されているもの、例えば国際公開第２００３／０１１２２３号の４〜５頁または国際公開第２００３／０９９１９号の３〜４頁に開示されている化合物Ｉ、化合物ＩＩ、および化合物ＩＩＩ、特に、国際公開第２００３／０１１２２３号にＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０、およびＥＲ８０４７６４として開示されている化合物が挙げられる。例えば、好適なＴＬＲ−４リガンドの１つはＥＲ８０４０５７である。
【０１１９】
これら以外のＴＬＲアゴニストもアジュバントとして有用である。「ＴＬＲアゴニスト」という用語は、直接リガンドとしてまたは内性もしくは外性のリガンドを生成して間接的に、ＴＬＲシグナル経路を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできる薬剤を指す。そのような天然または合成のＴＬＲアゴニストを、代替的または追加的なアジュバントとして用いてもよい。アジュバント受容体としてのＴＬＲの役割についての簡潔な概要はKaisho & Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589:1-13, 2002に記載されている。これらの潜在的なアジュバントとしては、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のアゴニストが含まれるが、これら限定されるものではない。したがって、一実施形態では、アジュバントおよび免疫原性組成物は更に、ＴＬＲ−１アゴニスト、ＴＬＲ−２アゴニスト、ＴＬＲ−３アゴニスト、ＴＬＲ−４アゴニスト、ＴＬＲ−５アゴニスト、ＴＬＲ−６アゴニスト、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−８アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、またはその組合せからなる群から選択されるアジュバントを含む。
【０１２０】
本発明の一実施形態では、ＴＬＲ−１を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる。好ましくは、ＴＬＲ−１を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、トリアシル化リポペプチド（ＬＰ）；フェノール可溶性モジュリン；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＬＰ；Ｓ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ、細菌リポタンパク質のアセチル化アミノ末端を模倣した三塩酸塩（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）ＬＰ、およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来のＯｓｐＡ  ＬＰから選択される。
【０１２１】
別の実施形態では、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる。好ましくは、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、リポタンパク質、ペプチドグリカン、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、または梅毒トレポネーマ（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）に由来する細菌リポペプチド；スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）等の種に由来するペプチドグリカン；リポタイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリア・ポリンズ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｐｏｒｉｎｓ）、細菌線毛、エルシナ（Ｙｅｒｓｉｎａ）ビルレンス因子、ＣＭＶビリオン、麻疹赤血球凝集素、および酵母由来のザイモサンの１または複数である。
【０１２２】
別の実施形態では、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる。好ましくは、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはウイルス感染に関連する分子核酸パターンであるポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリＩＣ）である。
【０１２３】
別の実施形態では、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる。好ましくは、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、細菌のフラジェリンである。
【０１２４】
別の実施形態では、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる。好ましくは、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、マイコバクテリアのリポタンパク質、ジアセチル化ＬＰ、およびフェノール可溶性モジュリンである。更なるＴＬＲ６アゴニストは国際公開第２００３／０４３５７２号に記載されている。
【０１２５】
別の実施形態では、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる。好ましくは、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ロキソリビン、Ｎ７位およびＣ８位におけるグアノシン類似体、またはイミダゾキノリン化合物、またはその誘導体である。一実施形態では、ＴＬＲアゴニストはイミキモドである。更なるＴＬＲ７アゴニストは国際公開第２００２／０８５９０５号に記載されている。
【０１２６】
別の実施形態では、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる。好ましくは、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子、例えばレジキモド（Ｒ８４８）である。レジキモドはＴＬＲ−７にも認識される。使用することができるその他のＴＬＲ−８アゴニストとしては、国際公開第２００４／０７１４５９号に記載のものが含まれる。
【０１２７】
別の実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストが用いられる。一実施態様では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストはＨＳＰ９０である。あるいは、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達反応を生じさせることのできるＴＬＲアゴニストは、細菌またはウイルスのＤＮＡ、非メチル化ＣｐＧヌクレオチドを含むＤＮＡ、特にＣｐＧモチーフとして知られる配列構成を含むＤＮＡである。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは主にＴｈ１反応を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば国際公開第９６／０２５５５号、同第９９／３３４８８号、米国特許第６，００８，２００号、および同第５，８５６，４６２号に記載されている。好ましくは、ＣｐＧヌクレオチドはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本発明の免疫原性組成物中で使用するのに適したオリゴヌクレオチドはＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、必要に応じて、少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個以上のヌクレオチドで隔てられた、２個以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含む。ＣｐＧモチーフは、シトシンヌクレオチドにグアニンヌクレオチドが続いたものである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは通常、デオキシヌクレオチドである。特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチド中の内部ヌクレオチドはホスホロジチオエートまたは好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル結合およびその他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲に含まれる。複数種類のヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドの作製方法は米国特許第５，６６６，１５３号、同第５，２７８，３０２号、および国際公開第９５／２６２０４号に記載されている。
【０１２８】
ＰｒｅＦ抗原を含む免疫原性組成物中で例えば単独でまたは３Ｄ−ＭＰＬもしくはその他の本明細書に記載のアジュバントと組み合わせて用いることのできるその他のアジュバントとして、ＱＳ２１等のサポニンが挙げられる。
【０１２９】
サポニンは、Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)に教示されている。サポニンは植物界および海洋動物界に広く分布するステロイドまたはトリテルペングリコシドである。サポニンは、振盪により水中でコロイド溶液を形成することおよびコレステロールを沈殿させることが知られている。サポニンは、細胞膜の近くにあると、膜中にポア様構造を形成して膜を破裂させる。赤血球の溶血がこの現象の例であり、これは全てではないが特定のサポニンの特性である。
【０１３０】
サポニンは、全身投与用のワクチン中におけるアジュバントとして知られている。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血の活性は当該技術分野で広く研究されてきた（前述のLacaille-Dubois and Wagner）。例えば、クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ；南アメリカの木、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来する）およびその画分が米国特許第５，０５７，５４０号および“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55；および欧州特許第０  ３６２  ２７９（Ｂ１）号に記載されている。クイルＡ画分を含む免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる微粒子構造は溶血性であり、ワクチンの製造に使用されてきた（Ｍｏｒｅｉｎ，  Ｂ．に付与された欧州特許第０  １０９  ９４２（Ｂ１）号；国際公開第９６／１１７１１号；同第９６／３３７３９号）。溶血性のサポニンであるＱＳ２１およびＱＳ１７（ＨＰＬＣ精製されたクイルＡ画分）は強力な全身用アジュバントであることが報告されており、その製造方法は、参照により本明細書に援用する米国特許第５，０５７，５４０号および欧州特許第０  ３６２  ２７９（Ｂ１）号に開示されている。全身用ワクチン接種の研究に用いられてきたその他のサポニンとしては、カスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）、サポナリア等のその他の植物種に由来するものが含まれる（Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992）。
【０１３１】
ＱＳ２１は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来するＨｐｃｌ精製された非毒性画分である。ＱＳ２１の製造方法は米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。ＱＳ２１を含む非反応源性アジュバント製剤が国際公開第９６／３３７３９に記載されている。前述の参考文献を参照により本願に援用する。ＱＳ２１等の前記免疫学的活性サポニンは、ヒト１回投与量の免疫原性組成物当たり１〜５０μｇの量で用いてよい。好ましくは、ＱＳ２１は約２５μｇ、例えば２０〜３０μｇ、好ましくは２１〜２９μｇ、２２〜２８μｇ、２３〜２７μｇ、２４〜２６μｇ、または２５μｇのレベルで用いられる。別の実施形態では、ヒト投与量の免疫原性組成物は、ＱＳ２１を約１０μｇ、例えば５〜１５μｇ、好ましくは６〜１４μｇ、例えば７〜１３μｇ、８〜１２μｇ、９〜１１μｇ、または１０μｇのレベルで含む。別の実施形態では、ヒト投与量の免疫原性組成物は、ＱＳ２１を５μｇ、例えば１〜９μｇ、２〜８μｇ、好ましくは３〜７μｇ、４〜６μｇ、または５μｇのレベルで含む。ＱＳ２１およびコレステロールを含むそのような製剤は、抗原と一緒に製剤化された時に、Ｔｈ１刺激性アジュバントとして機能することが示されている。したがって、例えば、ＰｒｅＦポリペプチドを、ＱＳ２１とコレステロールの組合せを含むアジュバントと一緒に免疫原性組成物中で好ましく使用することができる。
【０１３２】
必要に応じて、アジュバントは、アルミニウム塩やカルシウム塩、特に水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等の鉱物塩も含んでよい。例えば、３Ｄ−ＭＰＬをアルミニウム塩（例えば水酸化アルミニウムまたは「ミョウバン」）と一緒に含むアジュバントは、ヒト対象に投与するためのＰｒｅＦ抗原を含む免疫原性組成物に製剤化するのに適している。
【０１３３】
ＰｒｅＦ抗原を用いた製剤中での使用に適したＴｈ１優位型のアジュバントの別のクラスとしては、ＯＭＰを主成分とする免疫賦活組成物が含まれる。ＯＭＰを主成分とする免疫賦活組成物は、例えば鼻腔内投与用の粘膜アジュバントとして特に好ましい。ＯＭＰを主成分とする免疫賦活組成物は、限定されるものではないが例えばナイセリア種（例えばLowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988；Lowell et al., Science 240:800, 1988；Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 1984；Lowell, in "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997；米国特許第５，７２６，２９２号；同第４，７０７，５４３号参照）等のグラム陰性菌に由来する外膜タンパク質（ＯＭＰ。いくつかのポリンを含む。）標品の属であり、細菌抗原またはウイルス抗原等の免疫原用の組成物中で、または担体として、有用である。ＯＭＰを主成分とする免疫賦活組成物の一部は「プロテオソーム」と呼ばれることもあり、これは疎水性であり、ヒトで使用するのに安全である。プロテオソームは自発的に組み立てられて約２０〜約８００ｎｍの小胞または小胞様ＯＭＰクラスターを形成し得、タンパク質抗原（Ａｇ）、特に疎水性部分を有する抗原を非共有結合的に組み込むか、配位するか、またはそれと（例えば静電的または疎水的に）会合もしくは協調することが可能である。１または複数のＯＭＰの多分子膜状構造または溶融した球様のＯＭＰ組成物を含む小胞形態または小胞様形態の外膜タンパク質成分を生じさせる任意の作製方法が、プロテオソームの定義に含まれる。プロテオソームは、例えば当該技術分野で報告されているように作製してよい（例えば米国特許第５，７２６，２９２号または同第５，９８５，２８４号参照）。プロテオソームは、ＯＭＰポリンの作製に用いられる細菌（例えばナイセリア種）を起源とする内性のリポ多糖またはリポオリゴ糖（それぞれＬＰＳまたはＬＯＳ）を含んでもよく、これらは通常、全ＯＭＰ標品の２％未満である。
【０１３４】
プロテオソームは、ナイセリア・メニギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）から化学的に抽出された外膜タンパク質（ＯＭＰ）から主に構成され（主にポリンＡおよびＢ並びにクラス４ＯＭＰ）、界面活性剤により溶液中に維持されている（Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206）。プロテオソームは、例えばダイアフィルトレーションまたは従来の透析プロセスにより、本明細書に開示するＰｒｅＦポリペプチドを初めとするウイルス源に由来する精製または組換えタンパク質等の種々の抗原と一緒に製剤化することができる。界面活性剤を徐々に除去することで、直径が１００〜２００ｎｍの疎水性微粒子複合体を形成することができる（Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206）。
【０１３５】
本明細書において「プロテオソーム：ＬＰＳまたはプロトリン」とは、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（免疫賦活組成物として機能し得る。）を得るために少なくとも１種類のリポ多糖を例えば外部から添加するなどして混合したプロテオソーム標品を指す。したがって、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物は、（１）ナイセリア・メニンギチジス等のグラム陰性菌から調製したプロテオソームの外膜タンパク質標品（例えばプロジュバント（Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ））および（２）１または複数のリポ糖標品、を含む、プロトリンの基本的成分の２つを含んでよい。リポオリゴ糖は、内性（例えばＯＭＰプロテオソーム標品に天然で含まれる。）であってもよく、外的に調製された（例えば、ＯＭＰ標品とは異なる培養物または微生物から調製された）リポオリゴ糖由来のＯＭＰ標品と混合または組み合せてもよく、それらの組合せであってもよい。そのような外部から添加されるＬＰＳは、ＯＭＰ標品を作製したのと同じグラム陰性菌に由来してもよく、異なるグラム陰性菌に由来してもよい。また、プロトリンは、必要に応じて脂質、糖脂質、糖タンパク質、小分子等、およびその組合せを含んでもよいと理解されるべきである。プロトリンは、例えば米国特許出願公開第２００３／００４４４２５号に記載されているように調製することができる。
【０１３６】
前述したように種々のアジュバントの組合せをＰｒｅＦ抗原と一緒に組成物中で用いてもよい。例えば、既に述べたように、ＱＳ２１を３Ｄ−ＭＰＬと一緒に製剤化してもよい。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比率は通常、ほぼ１：１０〜１０：１、例えば１：５〜５：１、しばしば実質的に１：１である。通常、この３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１の比率は、２．５：１〜１：１である。別の組合せのアジュバント製剤は、３Ｄ−ＭＰＬおよびアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムを含む。組み合わせて製剤化した時に、この組合せは抗原特異的なＴｈ１免疫反応を高めることができる。
【０１３７】
いくつかの場合には、アジュバント製剤は、水中油型エマルションまたはカルシウム塩もしくはアルミニウム塩等の鉱物塩、例えばリン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、もしくは水酸化アルミニウムを含む。
【０１３８】
水中油型エマルションの一例としては、スクアレン等の代謝可能な油と、アルファ−トコフェロールを初めとするトコフェロール等のトコールと、ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０等の界面活性物質とを水性担体中に含むものが含まれ、これは更なる免疫賦活薬は含まず、特に、非毒性リピドＡ誘導体（３Ｄ−ＭＰＬ等）またはサポニン（ＱＳ２１等）は含まない。水性担体は、例えばリン酸緩衝生理食塩水であってよい。更に、水中油型エマルションは、スパン８５および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含んでよい。
【０１３９】
本発明の別の実施形態では、抗原または抗原組成物と、水中油型エマルションおよび必要に応じて１または複数の更なる免疫賦活薬を含むアジュバント組成物とを含むワクチン組成物が提供され、前記水中油型エマルションは０．５〜１０ｍｇの代謝可能な油（好ましくはスクアレン）、０．５〜１１ｍｇのトコール（好ましくはトコフェロール、例えばアルファ−トコフェロール）、および０．４〜４ｍｇの乳化剤を含む。
【０１４０】
特定の一実施形態では、アジュバント製剤は、水中油型エマルション等のエマルションの形態で調製された３Ｄ−ＭＰＬを含む。いくつかの場合には、国際公開第９４／２１２９２号に開示されているように、エマルションは直径０．２μｍ未満の小粒子サイズを有する。例えば、３Ｄ−ＭＰＬの粒子は、（欧州特許第０  ６８９  ４５４号に記載されているように）０．２２ミクロンのメンブレンで滅菌ろ過することができるほど小さくてよい。あるいは、３Ｄ−ＭＰＬは、リポソーマル製剤の形態で調製してもよい。必要に応じて、３Ｄ−ＭＰＬ（またはその誘導体）を含むアジュバントは、更なる免疫賦活成分も含んでよい。
【０１４１】
例えば、ＰｒｅＦポリペプチド抗原を含有する免疫原性組成物を幼児に投与するために製剤化する場合、アジュバントの用量は、幼児対象中で効果的かつ比較的非反応源性であるように決定される。一般的に、幼児用製剤中におけるアジュバントの用量は、成人（例えば６５歳以上の成人）に投与するために設計された製剤で使用されるよりも少ない。例えば、３Ｄ−ＭＰＬの量は、通常、１回投与量当たり１〜２００μｇ、例えば１０〜１００μｇ、または１０〜５０μｇの範囲内である。幼児への投与量は通常、この範囲の下端であり、例えば約１〜約５０μｇ、例えば約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇから、約２５μｇ、または約５０μｇまでである。通常、製剤中にＱＳ２１を用いる場合の投与量の範囲もほぼ同じである（かつ前述した比率に従う）。成人および高齢者の群のための製剤は通常、幼児用の製剤中に一般的に含まれるよりも多くのアジュバント成分を含む。水中油型エマルションを用いた特定の製剤では、そのようなエマルションは更なる成分、例えばコレステロール、スクアレン、アルファトコフェロール、および／または界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０またはスパン８５等を含んでもよい。例示的な製剤中では、そのような成分は以下の量で存在し得る：約１〜５０ｍｇのコレステロール、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のアルファトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０。一般的に、アルファトコフェロールに対するスクアレンの比率は１未満であり、この比率はエマルションをより安定にする。いくつかの場合には、製剤は安定化剤を含んでもよい。例えば３Ｄ−ＭＰＬとの組合せ等でミョウバンが存在する場合、ミョウバンの量は通常、１回投与量当たり約１００μｇ〜１ｍｇ、例えば約１００μｇ、約２００μｇ〜約７５０μｇ、例えば約５００μｇである。
【０１４２】
免疫原性組成物は通常、免疫防御的量（またはその分割投与の量）の抗原を含み、常法により調製することができる。ヒト対象投与用のものを初めとする免疫原性組成物の調製一般については、Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61  Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995およびNew Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に記載されている。リポソーム中への封入は、例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎに付与された米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。巨大分子へのタンパク質の結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、例えばＬｉｋｈｉｔｅに付与された米国特許第４，３７２，９４５号およびＡｒｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１４３】
通常、免疫原性組成物の各投与量に含まれるタンパク質の量は、典型的な対象中で大きな副作用を伴わずに免疫防御反応を誘導する量が選択される。この文脈における免疫防御とは、感染に対する完全な防御を必ずしも意味せず、症状または疾患、特にウイルスに関連する重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、用いる具体的な免疫原に応じて変わり得る。一般的に、ヒト１回投与量に含まれるタンパク質は、１〜１０００μｇ、例えば約１〜約１００μｇ、例えば約１〜約５０μｇ、例えば約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、または約５０μｇであると予測される。免疫原性組成物中で用いられる量は、対象群（例えば幼児または高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の最適量は、対象中における抗体価およびその他の反応の観察を含む標準的な実験により確認することができる。初回接種の約４週間後に対象に追加免疫を行ってもよい。
【０１４４】
選択したアジュバントに関わらず、最終製剤中の濃度は標的群中で安全かつ効果的であるように計算されることに留意すべきである。例えば、ヒト中でＲＳＶに対する免疫反応を引き起こすための免疫原性組成物は、幼児（例えば、初回投与時に生後１年以内の幼児、例えば０〜６ヶ月の幼児）に好ましく投与される。ＲＳＶに対する免疫反応を引き起こすための免疫原性組成物は、高齢のヒトにも（例えば、単独で、またはＣＯＰＤに関連するその他の病原体の抗原と組み合わせて）好ましく投与される。これらの異なる用途においてアジュバントの選択は異なってもよく、各状況で最適なアジュバントおよび濃度は当業者により経験的に決定可能であることが理解されよう。
【０１４５】
特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶの感染を低減または防止するワクチンである。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶ感染後の病理学的反応を低減または防止するワクチンである。必要に応じて、ＰｒｅＦ抗原を含む免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原生物の少なくとも１つの更なる抗原と一緒に製剤化される。例えば、病原生物は、気道の病原体（例えば、呼吸系の感染症を引き起こすウイルスまたは細菌）であってよい。特定の場合には、免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性ウイルス、例えばインフルエンザまたはパラインフルエンザ等の気道の感染症を引き起こすウイルスに由来する抗原を含む。別の実施形態では、更なる抗原は、投与を容易にするか、複数の感染性生物から対象を防御するのに必要な接種回数が少なくなるように選択される。例えば、抗原は、とりわけ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳菌、インフルエンザ菌、ポリオウイルス、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、または肺炎球菌の任意の１または複数に由来してよい。
【０１４６】
したがって、ＲＳＶへの暴露またはＲＳＶによる感染を（後から治療的にまたは前もって予防的に）処置するための医薬の製造におけるＰｒｅＦ抗原またはそれをコードする核酸の使用も本発明に含まれる。同様に、対象中でＲＳＶに対する免疫反応を引き起こす方法も本発明に含まれる。そのような方法は、ＰｒｅＦ抗原を含む組成物をヒト対象等の対象に免疫学的有効量投与することを含む。一般的に、組成物は、Ｔｈ１優位型の免疫反応を引き起こすアジュバントを含む。組成物は、ＲＳＶ接触後にウイルス疾患を促進することなくＲＳＶに特異的な免疫反応を引き起こすように製剤化される。すなわち、組成物は、ＲＳＶの感染を低減もしくは防止しかつ／またはＲＳＶ感染後の病理学的反応を低減もしくは防止するＴｈ１優位型の免疫反応が得られるように製剤化される。組成物は種々の異なる経路で投与することができるが、最も一般的には、免疫原性組成物は筋肉内または鼻腔内の投与経路で送達される。
【０１４７】
免疫原性組成物は通常、免疫防御的量（またはその分割投与の量）の抗原を含み、常法により調製することができる。ヒト対象投与用のものを含む免疫原性組成物の調製一般については、Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61, Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995およびNew Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に記載されている。リポソーム中への封入は、例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎに付与された米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。巨大分子へのタンパク質の結合は、例えばＬｉｋｈｉｔｅに付与された米国特許第４，３７２，９４５号およびＡｒｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１４８】
通常、免疫原性組成物の各投与量に含まれるタンパク質の量は、典型的な対象中において大きな副作用を伴わずに免疫防御反応を誘導する量が選択される。この文脈における免疫防御とは、感染に対する完全な防御を必ずしも意味せず、症状または疾患、特にウイルスに関連する重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、用いる具体的な免疫原に応じて変わり得る。一般的に、ヒト１回投与量に含まれるタンパク質は、１  １０００μｇ、例えば約１〜約１００μｇ、例えば約１〜約５０μｇ、例えば約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、または約５０μｇであると予測される。免疫原性組成物中で用いられる量は、対象群（例えば幼児または高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の最適量は、対象中における抗体価およびその他の反応の観察を含む標準的な実験により確認することができる。初回接種の約４〜１２週間後に対象に追加免疫を行ってもよい。例えば、ＰｒｅＦ抗原を含む免疫原性組成物を幼児対象に投与する場合、初期接種およびその後の接種は、この期間に投与されるその他のワクチンと同時に投与されてもよい。
【実施例】
【０１４９】
以下の実施例は、特定の具体的な構成および／または実施形態を説明するために提供するものである。これらの実施例は、記載されているその具体的な構成または実施形態に本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１５０】
実施例１：例示的ＰｒｅＦ抗原
融合前構造のタンパク質を安定化するために、天然ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べてＰｒｅＦ抗原を修飾した。これは、Ｆの融合前構造に対して生じる免疫反応が、膜融合における結合、構造シフト、および／またはその他の出来事を防止する抗体を選択的に含むことで防御反応の効果を増大させるという予測に基づいている。
【０１５１】
図１ＡおよびＢは、ＲＳＶ  Ｆ０および例示的ＰｒｅＦ組換え抗原の特徴を模式的に示す図である。図１Ａは、ＲＳＶ  Ｆ０タンパク質を示す。Ｆ０は、５７４アミノ酸からなるタンパク質前駆体である。Ｆ０タンパク質前駆体は、翻訳後にタンパク質分解によるプロセシングを受け、グリコシル化される。後からシグナルペプチダーゼで除去されるシグナルペプチドにより、翻訳されたＦ０タンパク質前駆体は小胞体（ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ：ＲＥ）へと向かう。ＲＥ中の新生ペプチドは次いで、複数の部位（三角で示す）でＮグリコシル化される。Ｆ０がフューリンにより切断されることでＦ２ペプチドドメインおよびＦ１ペプチドドメインが生じ、これらは一緒に折り畳まれ、組み立てられ、Ｆ２−Ｆ１ヘテロダイマーの三量体（すなわち、３個のＦ２−Ｆ１）を形成する。Ｆタンパク質は、天然の状態では、Ｃ末端領域の膜貫通ヘリックスにより膜にアンカーされている。Ｆ０ポリペプチドの更なる特徴としては、１５個のシステイン残基、４個の特徴的な中和エピトープ、２個のコイルドコイル領域、および脂質化モチーフが含まれる。図１Ｂは、例示的ＰｒｅＦ抗原の特徴を示している。ＰｒｅＦ抗原を構築するために、Ｆ０ポリペプチドを修飾してＦタンパク質の融合前構造を安定化し、これにより、ＲＳＶウイルスが宿主細胞に結合および融合する前に提示するＦタンパク質の主要な免疫原性エピトープを維持した。Ｆ０ポリペプチドに対する以下の安定化変異をＰｒｅＦ抗原に導入した。第１に、安定化コイルドコイルドメインをＦ０ポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端に配置し、Ｆ０の膜アンカードメインと置き換えた。第２に、ｐｅｐ２７ペプチド（天然タンパク質中ではＦ２とＦ１ドメインの間に位置する）を除去した。第３に、フューリンモチーフを両方とも除去した。代替的な実施形態（ＰｒｅＦ＿Ｖ１およびＰｒｅＦ＿Ｖ２と呼ぶ。）では、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の免疫学的活性部分（例えばアミノ酸１４９〜２２９）をＣ末端ドメインに付加した。
【０１５２】
実施例２：ＣＨＯ細胞によるＰｒｅＦ組換えタンパク質の産生およびＣＨＯ細胞からの精製
ＰｒｅＦ抗原産生のために、例示的ＰｒｅＦ抗原をコードする組換えポリヌクレオチド配列を宿主ＣＨＯ細胞に導入した。導入されたポリヌクレオチド配列を含む一時的にトランスフェクトした宿主細胞または増殖した安定集団を、所望の目的に適うスケールでの生育に適した培地および条件下で成長させた。（例えばFreshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New Yorkおよびその中の引用文献に一般に記載されているように）。通常、細胞は、振盪フラスコ中の無血清培地中で３７℃、５％  ＣＯ２で生育して２〜３日間隔で継代培養するか、バイオリアクター中でｐＯ２を２０％に維持して２９℃で生育する。
【０１５３】
組換えＰｒｅＦ抗原を回収するために、細胞培養液を遠心分離し、細胞培養液上清をその後の使用時まで８０℃で保存した。更なる分析のために、２リットルに分けた細胞培養液上清を純水で２倍希釈し、ＮａＯＨを用いてｐＨを９．５に調整した。この上清をＱセファロースＦＦイオン交換カラム（６０ｍｌ、１１．３ｃｍ）上に１４ｍｌ／ｍｉｎの速度でロードし、２０ｍＭのピペラジン（ｐＨ９．５）で平衡化した。カラムを開始バッファーで洗浄した後、０〜０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを用いて２０カラム体積分の溶出を行った（画分サイズ１０ｍｌ）。画分を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上での銀染色およびウェスタンブロットを用いて分析した。次いで、ＰｒｅＦタンパク質を多く含む画分をプールし、更なるプロセスに供した。
【０１５４】
Ｑステップでプールした溶出分（約１３０ｍｌ）を、ミリポア社のベンチスケールのＴＦＦシステムとＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＰＥＳ  Ｂｉｏｍａｘ１００（ＭＷＣＯ  １０，０００Ｄａ）膜カセットを用いて１０ｍＭ  リン酸塩（ｐＨ７．０）へとバッファー交換した。得られた材料は、ｐＨが７．０、伝導率が１．８ｍＳ／ｃｍであった。このサンプル１００ｍｌを、１０ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化した１０ｍｌのヒドロキシアパタイトタイプＩＩ（ＨＡ  ＴＩＩ）ゲル（ＸＫ１６、高さ＝５ｃｍ）に５ｍｌ／分でロードした。カラムを開始バッファーで洗浄した後、１０〜２００ｍＭのＰＯ４（Ｎａ）（ｐＨ７．０）のグラジエントを用いて２０カラム体積分の溶出を行った。再度、画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥで銀染色およびクーマシーブルーを用いて分析し、陽性画分をプールした。
【０１５５】
アフィニティークロマトグラフィー後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮ユニット（１０，０００Ｄａ、ＭＷＣＯ）を用いて、プールした画分を濃縮し、バッファーをＤＰＢＳ（ｐＨ約７．４）に交換した。最終産物は約１３ｍｌであった。ローリー法で評価したタンパク質濃度は１９５μｇ／ｍｌであった。純度は９５％超であった。この精製ＰｒｅＦ抗原標品を滅菌ろ過し、−２０℃で使用時まで保存した。
【０１５６】
実施例３：ＣＨＯ細胞で産生されたＰｒｅＦ組換えタンパク質の特徴解析
ＣＨＯ細胞で産生されたＰｒｅＦ組換えタンパク質を、非対称流フィールドフロー分画（ＡＦＦ−ＭＡＬＳ）で特徴解析し、ＲＳＶ  ＦおよびＲＳＶ  Ｇタンパク質要素を含むキメラ抗原と比較した。ＡＦＦ−ＭＡＬＳは、マトリックス相互作用を最小にした液流中でタンパク質種をその分子サイズに従って分離し、多角度光散乱による更なる分析で正確な分子量を決定することができる。図２Ａは、最終ＰＢＳバッファー中で、精製ＦＧ材料の６５％超が高分子量オリゴマー（１０００〜１０００００ＫＤａ）として見られ、３％が単量体形態のままであることを示している。
【０１５７】
図２Ｂは、ＰＢＳバッファー中で７３％までの精製ＰｒｅＦタンパク質が三量体形態に折り畳まれていることを示している。材料の１０％が１０００〜２００００ＫＤａのオリゴマーとして見られる。これらの結果は、ＣＨＯ細胞中で発現された組換えＰｒｅＦタンパク質が天然状態で予測されるように三量体に折り畳まれていることを示している。
【０１５８】
また、精製ＰｒｅＦタンパク質をグルタルアルデヒドを用いて架橋した。これには、リン酸バッファー溶液中におけるタンパク質の可溶性の性質を確認するためおよびＦＧタンパク質とのインビボ比較評価（後述の実施例７参照）のための凝集体を作製するための２つの目的がある。グルタルアルデヒド架橋は、タンパク質の四次構造の評価に適していることが知られており、（Biochemistry, 36:10230-10239 (1997); Eur. J. Biochem., 271:4284-4292 (2004)）に記載されている。
【０１５９】
タンパク質を１％、２％、および５％のグルタルアルデヒド架橋剤と共に４℃で４時間インキュベートし、ＮａＢＨ４を添加して反応をブロックした。カラムを用いてＰＢＳバッファーで脱塩し、余分なグルタルアルデヒドを除去した。得られたタンパク質を２８０ｎｍにおける吸光度で定量し、変性還元条件のＳＤＳ  ＰＡＧＥで評価した。精製組換えＰｒｅＦの大部分はＰＢＳ溶液中で三量体として移動することが確認された。三量体タンパク質の大部分を高分子量凝集体に変換するためにはインキュベーション温度を２３℃に上げる必要があることがＳＤＳ  ＰＡＧＥで確認された。
【０１６０】
実施例４：ＰｒｅＦ抗原によるインビトロ中和阻害
志願者から得られたヒト血清を、ＲＳＶ  Ａに対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングし、各血清サンプルについて予め確認したＲＳＶ中和能の力価に基づいて適切に希釈し、中和阻害（ＮＩ）アッセイに使用した。簡潔に説明すると、血清を、５０％１９９−Ｈ培地、０．５％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、および５０μｇ／ｍｌのゲナマイシン（ｇｅｎａｍｙｃｉｎ）（全てインビトロジェン社製）を含むＤＭＥＭ中の濃度が２５μｇ／ｍｌの阻害剤タンパク質（ＰｒｅＦまたは米国特許第５，１９４，５９５号に開示されているＲｉｘＦＧと名付けられたキメラＦＧに本質的に対応するコントロールタンパク質）と混合し、回転式撹拌機（ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｗｈｅｅｌ）を用いて３７℃で１．５〜２時間インキュベートした。丸底９６ウェルプレート中で、２０μｌの血清の段階希釈物およびタンパク質を、力価を調整したＲＳＶ  Ａと混合して、各血清サンプルについて阻害範囲を最適化した。得られた混合物を３３℃、５％  ＣＯ２下で２０分間インキュベートしてｐＨを維持した。
【０１６１】
次いで、血清−阻害剤−ウイルス混合物を、予めＶｅｒｏ細胞を植菌した平底９６ウェルプレートにプレーティングし、３３℃で２時間インキュベートした後、培地１６０μｌを添加した。ＮＩ力価検出のための免疫蛍光アッセイまで、プレートを３３℃、５％ＣＯ２で更に５〜６日間インキュベートした。１％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１時間固定した後、プレートを２％ミルク／ＰＢＳおよびブロックバッファーでブロッキングした。ヤギ抗ＲＳＶ抗体（バイオデザイン・インターネーション社（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ）製、１：４００）を、リンスせずに各ウェルに添加し、室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（シグマ社製、１：４００）を含むブロッキングバッファーをウェルに添加した。プレートを再度ＲＴで２時間インキュベートし、上記のように２回洗浄した後、判定した。１以上の蛍光シンシチウムが検出されたウェルを陽性とした。スピアマン−カーバー（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ：ＳＫ）法で５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を計算し、ＮＩの百分率を以下のように計算した：［（０μｇ／ｍｌ阻害剤の中和力価−２５μｇ／ｍｌ阻害剤の中和力価）／０μｇ／ｍｌ阻害剤の中和力価］×１００。図３に示す例示的な結果は、試験したドナー２１人中１６人におけるＮＩでＰｒｅＦがＦＧよりも優れていることを示している。
【０１６２】
実施例５：ＰｒｅＦ抗原は免疫原性
ＰｒｅＦ抗原の抗原性を決定するために、ｐｒｅＦ（６．５、３．１、０．６３、０．１３，および０．０２５μｇ／ｍｌ）並びにヒト投与量の１／２０の３Ｄ  ＭＰＬおよびＱＳ２１を含むＴｈ１アジュバント（「ＡＳ０１Ｅ」）、またはｐｒｅＦ（１、０．２、および０．０４μｇ／ｍｌ）並びにヒト投与量の１／１０の３Ｄ  ＭＰＬおよびミョウバンを含むＴｈ１アジュバント（「ＡＳ０４Ｃ」）を用いて、２週間間隔でＩＭで２回マウスを免疫化し、３週間後に血清を回収した。
【０１６３】
プールした血清サンプルについて、標準的な手順に従ったＥＬＩＳＡにより、抗原特異的ＩｇＧ抗体価を決定した。簡潔に説明すると、精製した不活化ＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ  Ｂ、および相同なｐｒｅＦタンパク質で９６ウェルプレートをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。血清サンプルを、初期濃度１：５０でブロッキングバッファー中に段階希釈し、同時に精製マウスＩｇＧオンタリオのシグマ社製）を開始濃度２００ｎｇ／ｍｌで段階希釈し、室温で２ｈインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（オンタリオのシグマ社製）を用いて、結合した抗体を検出した。３，３Ａ，５，５Ａ−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ＢＤ  Ｏｐｔ  ＥＩＡ（商標）；オンタリオのＢＤバイオサイエンス社製）をＨＲＰの基質として用いた。５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して反応を停止させた。モレキュラー・デバイス・マイクロプレート・リーダー（米国のモレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製）を用いて、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで検出した。
【０１６４】
図４Ａおよび４Ｂに詳細を示す代表的な結果は、ｐｒｅＦ抗原での免疫化後にＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの両方に対して強力な力価が惹起されることを示している。
【０１６５】
実施例６：ＰｒｅＦは中和抗体を引き起こす
上記実施例５中で記載したように免疫化したマウスの血清サンプル中の中和抗体の有無および量を調べた。免疫化した動物からプールした血清を、９６ウェルプレート中で、ＲＳＶ培地中に開始希釈率１：８で段階希釈した（２０μｌ／ウェル）。コントロールのウェルには、ＲＳＶ培地のみ、または１：５０のヤギ抗ＲＳＶ抗体（バイオデザイン・インターナショナル社（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）製）を含めた。５００〜１０００感染量の代表的ＲＳＶ  ＡまたはＢ株をウェルに添加し、プレートを３３℃、５％  ＣＯ２で２０分間インキュベートした後、この混合物を、１×１０５細胞／ｍＬのＶｅｒｏ細胞を予め植菌した９６ウェル平底プレートに移した。細胞を、５％  ＣＯ２、３３℃で約２時間インキュベートし、再度栄養を与え、その後、同じ温度で５〜６日間インキュベートした。上清を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて、付着した細胞を１時間固定し、その後、ヤギ抗ＲＳＶ一次抗体および抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いた間接免疫螢光法（ＩＦＡ）による検出を行った。
【０１６６】
図５Ａおよび５Ｂに示す代表的結果はそれぞれ、ｐｒｅＦで免疫化された動物の血清中に、両方のＲＳＶ株に対するかなりの中和抗体が検出されることを示している。
【０１６７】
実施例７：ＰｒｅＦはＲＳＶ暴露に対する防御を提供する
前述のようにマウスを２週間間隔でＩＭで２回免疫化し、２回目の注入から３週間後にＲＳＶ  Ａに暴露させた。ＲＳＶに対する防御を、暴露後に肺に存在するウイルスを測定することで評価した。簡潔に説明すると、免疫化した動物の肺を安楽死後に無菌的に取り出し、１５ｍｌチューブ中で、１０ｍｌ／肺の２倍体積のＲＳＶ培地中で洗浄した。次いで、肺を計量し、自動ポッターホモジナイザー（オンタリオ、ネピアンのフィッシャー社（Ｆｉｓｈｅｒ）製）を用いて個々にＲＳＶ培地中でホモジナイズし、２６５５×ｇ、４℃で２分間遠心分離した。上清中に存在するウイルスを、９６ウェルプレート中に予め植菌したＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）単層上での段階希釈（１：１０から開始して８個複製）して力価を測定し、６日間インキュベートした。１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で固定した後、ヤギ抗ＲＳＶ一次抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ二次抗体を用いた間接的ＩＦＡによってＲＳＶを検出した。
【０１６８】
図６ＡおよびＢに示す代表的結果は、アジュバント存在下で与えられた０．０４μｇ以上の投与量で、ＲＳＶに対する強力な防御が惹起されることを示している。
【０１６９】
実施例８：ＰｒｅＦは暴露後に肺好酸球の動員を誘導しない
ＰｒｅＦ抗原が免疫化およびその後の暴露後に悪化する疾患を引き起こす可能性を評価するために、マウス群（５マウス／群）をそれぞれ（ａ）１０μｇのグルタルアルデヒド処理したｐｒｅＦ、（ｂ）１０μｇのｐｒｅＦ、または（ｃ）アジュバントを含まない１０μｇのＦＧ、で２回免疫化した。追加免疫から３週間後にマウスをＲＳＶ  Ａに暴露させ、暴露して４日後に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。ＢＡＬのろ液中に含まれるマウス１頭当たりの全白血球を計数し、また、マクロファージ／単球、好中球、好酸球、およびリンパ球の細胞形態に基づく示差計測（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）（３００細胞）も行った。
【０１７０】
各動物について、全細胞数に好酸球の示差百分率（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）をかけた。群当たりの幾何平均を信頼限界９５％で示す。図７に示す代表的な結果は、ｐｒｅＦによる免疫化および投与後に好酸球が肺に動員されないことを示している。更に、これらの結果は、意図的に凝集させた形態のｐｒｅＦ（グルタルアルデヒド処理）またはＦＧ抗原（天然で凝集されている。）と比べて、ｐｒｅＦ抗原の可溶性が好酸球に優先的な性質のものでないことを示唆している。
【０１７１】
配列表
配列番号１
ＲＳＶ参照融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
株Ａ２ GenBank 受託番号 U50362
atggagttgctaatcctcaaagcaaatgcaattaccacaatcctcactgcagtcacatttgttttgcttctggtcaaaacatcactgaagaattttatcaatcaacatgcagtgcagtagcaaaggctatcttagtgctctgagaactggttggtataccagtgttataactatagattaagtaatatcaaggaaaataagtgtaatggaacagatgctaaggtaaaattgataaacaagaattagataaatataaaaatgctgtaacagaattgcagttgctcatgcaaagcacccagcaacaaacaatcgagccagaagagaactaccaaggtttatgaattatacactcaaaatgccaaaaaaaccaatgtaacattaagcaagaaaaggaaaagaagatttcttggtttttgttaggtgttggatctgcaatcgccagtggcgttgctgtatctaaggtcctgcacctgaaggggaagtgaacaagatcaaaagtgctctactatccacaaacaaggctgtagtcagttatcaaatggagttagtgtcttaaccagcaaagtgttagacctcaaaaactatatagaaaacaattgttacctattgtgaacaagcaaagctgcagcatatcaaatatagcaactgtatagagttccaacaaaagaacaacagactactagagattaccagggaatttagtgttaagcaggtgtaactacacctgtaagcacttacatgttaactaatagtgaattattgtcattatcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaagttaatgtccaacaatgttcaaatgttagacagcaaagttactctatcatgtccataataaaagaggaagtcttagcatatgtgtacaattaccactatatggtgttatagatacaccctgttggaaactacacacatccccctatgtacaaccaacacaaaagaagggtccaacatctgtttaacaagaactgacagaggtggtactgtgacaatgcaggatcagtatctttcttcccacaagctgaaacatgtaaagtcaatcaaatcgagtattttgtgacacaatgaacagtttaacattaccaagtgaagtaaactctgcaatgttgacatattcaaccccaaatatgattgtaaaattatgacttcaaaaacgatgtaagcagctccgttatcacatctctaggagccattgtgtcatgctatggcaaaacaaatgtacagcatccaataaaaatcgtggaatcataaagacattttctaacgggtgcgatatgtatcaaataaaggggtggacactgtgtctgtaggtaacacattatattatgtaaaaagcaagaaggtaaaagtctctatgtaaaaggtgaaccaataataaatttctatgacccttagtattcccctctgatgaatttgatgcatcaatatctcaagtcaacgagaagattaacagagcctagcatttattcgtaaatccgatgaattattacataatgtaaatgctggtaatccaccataaatatcatgataactactataattatagtgattatagtaatattgttatcttaattgctgttggactgctcttatactgtaaggccagaagcacaccagtcacactaagaaagatcaactgagtggtataaataatattgcatttagtaactaa
配列番号２
ＲＳＶ参照Ｆタンパク質前駆体Ｆ０のアミノ酸配列
株Ａ２ GenBank 受託番号 AAB86664
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIATVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTINIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
配列番号３
ＲＳＶ参照Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列 
株Long
Atgtccaaaaacaaggaccaacgcaccgctaagacactagaaaagacctgggacactctcaatcatttattattcatatcatcgggcttatataagttaaatcttaaatctatagcacaaatcacattatccattctggcaatgataatctcaacttcacttataattacagccatcatattcatagcctcggcaaaccacaaagtcacactaacaactgcaatcatacaagatgcaacaagccagatcaagaacacaaccccaacatacctcactcaggatcctcagcttggaatcagcttctccaatctgtctgaaattacatcacaaaccaccaccatactagcttcaacaacaccaggagtcaagtcaaacctgcaacccacaacagtcaagactaaaaacacaacaacaacccaaacacaacccagcaagcccactacaaaacaacgccaaaacaaaccaccaaacaaacccaataatgattttcacttcgaagtgtttaactttgtaccctgcagcatatgcagcaacaatccaacctgctgggctatctgcaaaagaataccaaacaaaaaaccaggaaagaaaaccaccaccaagcctacaaaaaaaccaaccttcaagacaaccaaaaaagatctcaaacctcaaaccactaaaccaaaggaagtacccaccaccaagcccacagaagagccaaccatcaacaccaccaaaacaaacatcacaactacactgctcaccaacaacaccacaggaaatccaaaactcacaagtcaaatggaaaccttccactcaacctcctccgaaggcaatctaagcccttctcaagtctccacaacatccgagcacccatcacaaccctcatctccacccaacacaacacgccagtag
配列番号４
ＲＳＶ参照Ｇタンパク質のアミノ酸配列
MSKNKDQRTAKTLEKTWDTLNHLLFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIFIASANHKVTLTTAIIQDATSQIKNTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLKPQTTKPKEVPTTKPTEEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNTTRQ
配列番号５ 
ＣＨＯに最適化されたＰｒｅＦ類似体のヌクレオチド配列
aagcttgccaccatggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggcctgataatctaga
配列番号６
ＰｒｅＦ類似体のアミノ酸配列
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA
配列番号７ 
ＣＨＯに最適化されたＰｒｅＦ＿Ｖ１をコードするヌクレオチド配列
aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaactccgagctgctctccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggctggcggctctggcggcagcggcggctccaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcctaccaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaaccaccaagcaccaccaccatcaccactgataatcta
配列番号８ 
ＣＨＯのＰｒｅＦ＿Ｖ１ペプチド
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGSGGSGGSKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTK
配列番号９ 
ＣＨＯのＰｒｅＦ＿Ｖ２
aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaactccgagctgctctccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggctggcggcaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcctaccaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaaccaccaagcaccaccaccatcaccactgataatcta
配列番号１０ 
ＣＨＯのＰｒｅＦ＿Ｖ２ペプチド
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTK
配列番号１１
例示的コイルドコイル（イソロイシンジッパー）
EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA
配列番号１２
ＰｒｅＦ抗原ポリヌクレオチドＣＨＯ２
atggagctgcccatcctgaagaccaacgccatcaccaccatcctcgccgccgtgaccctgtgcttcgccagcagccagaacatcacggaggagttctaccagagcacgtgcagcgccgtgagcaagggctacctgagcgcgctgcgcacgggctggtacacgagcgtgatcacgatcgagctgagcaacatcaaggagaacaagtgcaacggcacggacgcgaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgcggtgacggagctgcagctgctgatgcagagcacgccggcgacgaacaacaagttcctcggcttcctgctgggcgtgggcagcgcgatcgcgagcggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagtccgcgctgctgagcacgaacaaggcggtcgtgagcctgagcaacggcgtgagcgtgctgacgagcaaggtgctcgacctgaagaactacatcgacaagcagctgctgccgatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccgcctgctggagatcacgcgggagttctccgtgaacgcaggcgtgacgacgcccgtgtctacgtacatgctgacgaacagcgagctgctcagcctgatcaacgacatgccgatcacgaacgaccagaagaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcgccagcagagctacagcatcatgagcatcatcaaggaggaggtgctggcatacgtggtgcagctgccgctgtacggcgtcatcgacacgccctgctggaagctgcacacgagcccgctgtgcacgaccaacacgaaggagggcagcaacatctgcctgacgcggacggaccggggctggtactgcgacaacgcgggcagcgtgagcttcttcccgctcgcggagacgtgcaaggtgcagagcaaccgcgtcttctgcgacacgatgaacagcctgacgctgccgagcgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaacccgaagtacgactgcaagatcatgacgagcaagaccgatgtcagcagcagcgtgatcacgagcctcggcgcgatcgtgagctgctacggcaagacgaagtgcacggcgagcaacaagaaccgcggcatcatcaagacgttcagcaacggctgcgactatgtgagcaacaagggcgtggacactgtgagcgtcggcaacacgctgtactacgtgaacaagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagccgatcatcaacttctacgacccgctcgtgttcccgagcgacgagttcgacgcgagcatcagccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggcgttcatccgcaagagcgacgagaagctgcacaacgtggaggacaagatcgaggagatcctgagcaagatctaccacatcgagaacgagatcgcgcgcatcaagaagctgatcggcgaggcgcatcatcaccatcaccattga
配列番号１３
イントロンを有するＰｒｅＦ抗原ポリヌクレオチド
atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtacgtgtcgggacttgtgttcccctttttttaataaaaagttatatctttaatgttatatacatatttcctgtatgtgatccatgtgcttatgactttgtttatcatgtgtttaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggccggaggtcaccaccaccatcaccactga
配列番号１４
合成リンカー配列
GGSGGSGGS
配列番号１５
フューリン切断部位
RARR
配列番号１６
フューリン切断部位
RKRR
【図１Ａ】
0005711972.tif 000002
【図１Ｂ】
0005711972.tif 000003
【図２】
0005711972.tif 000004
【図３】
0005711972.tif 000005
【図４Ａ】
0005711972.tif 000006
【図４Ｂ】
0005711972.tif 000007
【図５Ａ】
0005711972.tif 000008
【図５Ｂ】
0005711972.tif 000009
【図６Ａ】
0005711972.tif 000010
【図６Ｂ】
0005711972.tif 000011
【図７】
0005711972.tif 000012
【配列表】
0005711972000001.xml