(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光供与体及び蛍光受容体を含む信号発生部と前記蛍光供与体及び蛍光受容体を連結するリガンド結合蛋白質を含む感知部を含むＦＲＥＴバイオセンサーを利用したリガンドの検出方法であって、可逆的なアンフォールディングが起こり、リガンドの前記リガンド結合蛋白質への結合に伴うＦＲＥＴ比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度でリガンドを含有する試料と接触させ、前記リガンド結合蛋白質が、ｐＭＡＬｃ２ｘを鋳型として生成したＭＢＰ、大腸菌ＭＧ１６５５から抽出した染色体を鋳型として生成したＧＧＢＰ、ＡＬＢＰ及びＡＲＢＰからなる群より選択される大腸菌由来のリガンド結合蛋白質であり、そして前記臨界温度が、ＭＢＰの場合は５４℃、ＧＧＢＰの場合は５０℃、ＡＬＢＰ及びＡＲＢＰの場合は４９℃であることを特徴とするリガンドの検出方法。
【請求項２】
次の工程を含む、蛍光供与体及び蛍光受容体を含む信号発生部と前記蛍光供与体及び蛍光受容体を連結するリガンド結合蛋白質を含む感知部を含むＦＲＥＴバイオセンサーを利用したリガンド濃度の測定方法であって：
（ａ）可逆的なアンフォールディングが起こり、リガンドの前記リガンド結合蛋白質への結合に伴うＦＲＥＴ比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度で、前記ＦＲＥＴバイオセンサーをリガンドを含有する試料と接触させる工程、及び
（ｂ）前記蛍光供与体と蛍光受容体の発光量比の変化を測定して、リガンドの濃度を測定する工程；
ここで、前記リガンド結合蛋白質が、ｐＭＡＬｃ２ｘを鋳型として生成したＭＢＰ、大腸菌ＭＧ１６５５から抽出した染色体を鋳型として生成したＧＧＢＰ、ＡＬＢＰ及びＡＲＢＰからなる群より選択される大腸菌由来のリガンド結合蛋白質であり、そして前記臨界温度が、ＭＢＰの場合は５４℃、ＧＧＢＰの場合は５０℃、ＡＬＢＰ及びＡＲＢＰの場合は４９℃であるリガンド濃度の測定方法。
【請求項３】
前記リガンドは、糖、アミノ酸、蛋白質、脂質、有機酸、金属または金属イオン、酸化物、水酸化物またはそのコンジュゲート、無機イオン、アミンまたはポリアミン及びビタミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光供与体は、蛍光蛋白質、蛍光顔料、生体発光蛋白質及び量子ドットからなる群から選択され、前記蛍光受容体は、前記蛍光供与体と波長が異なる蛍光蛋白質、蛍光顔料及び量子ドットからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光供与体は、蛍光蛋白質、蛍光顔料、生体発光蛋白質及び量子ドットからなる群から選択され、前記蛍光受容体は、前記蛍光供与体の蛍光強度を減少させる消光剤または金ナノ粒子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光供与体または蛍光受容体は、一つ以上のリンカーを介して、前記リガンド結合蛋白質に連結することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＲＥＴ現象を適用したバイオセンサーを利用したリガンドの検出方法に関し、より具体的にはバイオセンサーを構成するリガンド結合蛋白質が特定の臨界温度（critical temperature）以上で可逆的なアンフォールディング（reversible unfolding）が現れ、このアンフォールディングのレベルがリガンドの濃度により変わる現象を利用して、従来より優秀な効率でリガンド（特に糖）を検出すると共にその濃度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００２年スタンフォード大学のＦｒｏｍｍｅｒは、マルトース測定用ＦＲＥＴバイオセンサーを最初に開発した（Fehr et al., PNAS., 99:9846-9851, 2002）。その後、類似の形態のリボース（Lager et al., FEBS Lett., 553:85, 2003）、グルコース（Fehr et al., J. Biol. Chem., 278:19127-19133, 2003）、スクロース（Ha et al., Appl. Environmicrobiol., 73:7408, 2007）測定用センサー等が持続的に開発されて来た。
【０００３】
しかし、初期に開発された前記バイオセンサーは、非常に低いレベルの検出能力を示したため、より正確な測定手段として用いるためには高感度センサーの開発が求められた（Fehr et al. Current Opinion in Plant Biology, 7:345, 2004）。このような努力の一環として、本発明者等は韓国登録特許１０−０７３９５２９（２００７年７月２９日）と米国登録特許ＵＳ７４３２３５３（２００８年１０月７日）では、バイオセンサーを構成している蛋白質ドメインの間のリンカーペプチドを最適化する方法で、マルトース測定用ＦＲＥＴバイオセンサーの検出能力を増加できると提示した。また、理化学研究所のＭｉｙａｗａｋｉは、蛍光蛋白質を循環置換（circular permutation）させる方法でカルシウム測定用ＦＲＥＴバイオセンサーである「Ｃａｍｅｌｅｏｎ」の検出能力を大きく増加させ（Nagai et al., PNAS., 101:10554, 2004）、ＦｒｏｍｍｅｒはＱＢＰ（glutamine-binding protein）に蛍光蛋白質を挿入融合（in-frame fusion）する方法等でＦＲＥＴバイオセンサーの検出能力を増加させた（Deuschle et al.,Protein Sci., 14:2304, 2006）。しかし、遺伝子操作によるＦＲＥＴバイオセンサーの改良方法は、多くの試行錯誤と少なくない時間を要し、既に技術的な限界に達しているため、より効率的、かつ簡単な改良方式が求められている。
【０００４】
一方、温度変化による蛋白質構造の可逆的変化（reversible change）と安全性（thermal stability）維持を観察する研究は、蛋白質の３次元構造が解明されて以来、蛋白質の折り畳み（folding）過程を予測するための研究と共に、多くの研究者の主な関心事になり、大腸菌由来のＰＢＰ（periplasmic-binding protein）は、このような蛋白質構造の熱力学的変化（thermodynamic change）を観察する良いモデルとなって来た。温度によるＡＲＢＰ（arabinose-binding protein）の構造変化をＤＳＣ（differential scanning calorimeter）を利用して観察した報告によれば、アラビノースがない条件では、５３．５℃で可逆的なアンフォールディングが生じ、１ｍＭのアラビノースが存在する場合には、５９℃でアンフォールディングが観察された（Fukuda et al., J. Biol. Chem., 258:13193. 1983）。また、ＧＧＢＰ（glucose/galactose-binding protein）の場合にもグルコースの有無により温度によるアンフォールディング現象が５０℃から６３℃に増加するという報告があり（Piszczek et al., Biochem. J., 381:97, 2004）、ＭＢＰの場合にもマルトースが存在する場合にはｐＨによりアンフォールディングが発生する温度を８〜１５℃まで増加させるという報告があった（Novokhatny et al., Protein Sci., 6:141, 1997）。
【０００５】
そこで、本発明者等は、従来のＦＲＥＴバイオセンサーのリガンド濃度測定能及び検出能を向上させようと鋭意努力した結果、可逆的なアンフォールディング現象が起こる特定臨界温度において融合蛋白質で構成されたバイオセンサーとリガンドを接触させる場合、リガンドを検出して濃度を測定する能力が画期的に改善されることを確認し、本発明を完成することに至った。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、従来のＦＲＥＴバイオセンサーのリガンド検出能及び濃度測定能が改善された新しいリガンドの検出及び濃度測定方法を提供することである。
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明は、蛍光供与体（fluorescence donor）及び蛍光受容体（fluorescence acceptor）を含む信号発生部（signaling domain）と前記蛍光供与体及び蛍光受容体を連結するリガンド結合蛋白質を含む感知部（sensing domain）を含むＦＲＥＴバイオセンサーを利用したリガンドの検出方法であって、可逆的なアンフォールディング現象が起こり、リガンド結合（リガンドが前記リガンド結合蛋白質に結合すること）によるＦＲＥＴ比（ratio）の変化が最も大きい温度区間である臨界温度でリガンドを含有する試料と接触させることを特徴とするリガンドの検出方法を提供する。
【０００８】
さらに本発明は、次の工程を含む、蛍光供与体及び蛍光受容体を含む信号発生部と前記蛍光供与体及び蛍光受容体を連結するリガンド結合蛋白質を含む感知部を含むＦＲＥＴバイオセンサーを利用したリガンド濃度の測定方法を提供する:
（ａ）可逆的なアンフォールディングが起こり、リガンドが前記リガンド結合蛋白質に結合することによるＦＲＥＴ比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度で、前記ＦＲＥＴバイオセンサーを、リガンドを含有する試料と接触させる工程、及び
（ｂ）前記蛍光供与体と蛍光受容体の発光量比の変化を測定してリガンドの濃度を測定する工程。
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】常温（２５℃）と臨界温度でリガンドの有無によるＦＲＥＴバイオセンサーの構造変化とＦＲＥＴ効率の変化、それによる蛍光蛋白質の発光量差を示した模式図である。
【図２】温度によるマルトースＦＲＥＴバイオセンサーのｒａｔｉｏ値とΔｒａｔｉｏの変化を示したグラフである。
【図３】温度によるグルコースＦＲＥＴバイオセンサーのｒａｔｉｏ値とΔｒａｔｉｏの変化を示したグラフである。
【図４】温度によるアロースＦＲＥＴバイオセンサーのｒａｔｉｏ値とΔｒａｔｉｏの変化を示したグラフである
【図５】温度によるアラビノースＦＲＥＴバイオセンサーのｒａｔｉｏ値とΔｒａｔｉｏの変化を示したグラフである。
【図６】２５℃とΔｒａｔｉｏ値が最も大きい臨界温度である５４℃でリガンドの濃度毎に測定したマルトースＦＲＥＴバイオセンサーのタイトレーションカーブであり、上段部のスペクトラムは２５℃と５４℃で各々測定したマルトースＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光スペクトラムである。
【図７】２５℃とΔｒａｔｉｏ値が最も大きい臨界温度である５０℃でリガンドの濃度毎に測定したグルコースＦＲＥＴバイオセンサーのタイトレーションカーブであり、上段部のスペクトラムは２５℃と５０℃で各々測定したグルコースＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光スペクトラムである。
【図８】２５℃とΔｒａｔｉｏ値が最も大きい臨界温度である４９℃でリガンドの濃度毎に測定したアロースＦＲＥＴバイオセンサーのタイトレーションカーブであり、上段部のスペクトラムは２５℃と４９℃で各々測定したアロースＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光スペクトラムである。
【図９】２５℃とΔｒａｔｉｏ値が最も大きい臨界温度である４９℃でリガンドの濃度毎に測定したアラビノースＦＲＥＴバイオセンサーのタイトレーションカーブである。挿入図は２５℃と４９℃で各々測定したアラビノースＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光スペクトラムである。
【図１０】種々の糖類を対象にマルトースＦＲＥＴバイオセンサーの特異性を調べたグラフである。
【図１１】種々の糖類を対象にグルコースＦＲＥＴバイオセンサーの特異性を調べたグラフである。
【図１２】種々の糖類を対象にアロースＦＲＥＴバイオセンサーの特異性を調べたグラフである。
【図１３】種々の糖類を対象にアラビノースＦＲＥＴバイオセンサーの特異性を調べたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。
【００１１】
本明細書において「ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）」とは、互いに異なる発光波長帯の二つの蛍光物質の間から発生する非放射性（non-radiative）エネルギー移転現象で、励起（excitation）状態の蛍光供与体（donor）の励起準位エネルギーが蛍光受容体（acceptor）に伝えられて、蛍光受容体から発光（emission）が観察されたり、蛍光供与体の蛍光減少（quenching）が観察される現象である（Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999）。
【００１２】
本明細書において「蛍光供与体」とは、ＦＲＥＴ現象で供与体として働く蛍光物質を意味し、「蛍光受容体」とは、ＦＲＥＴ現象で受容体として働く蛍光物質を意味する。
【００１３】
本明細書において「リガンド結合蛋白質（リガンド−binding protein）」とは、リガンドの結合によって構造的変化（conformational change）を起こす蛋白質の集合体を意味しており、大腸菌由来の細胞膜間結合蛋白質（periplasmic binding protein，ＰＢＰ）を含む（de Wolf et al., Pharmacol Rev., 52:207, 2000）。
【００１４】
本明細書において「リガンド（ligand）」とはリガンド結合蛋白質に結合して構造的な変化を起こす分子で、糖、アミノ酸、蛋白質、脂質、有機酸、金属または金属イオン、酸化物、水酸化物またはそのコンジュゲート（conjugates）、無機イオン、アミンまたはポリアミン及びビタミンのいずれか一つであるが、これに限定されるのではない。
【００１５】
本明細書において「試料（sample）」とは、関心があるリガンドを含有したり、含有していると推定されて、分析が行われる組成物を意味し、細胞、水、土壌、空気、食品、廃棄物、動植物器官及び動植物組織のいずれか一つ以上から収集されたものであってもよいが、これに限定されるのではない。この時、前記動植物は人体を含む。
【００１６】
本明細書において「臨界温度」とは、ＦＲＥＴバイオセンサーのリガンド結合蛋白質のアンフォールディング（unfolding）が、リガンドの存在の有無によって調節されて、ＦＲＥＴバイオセンサーの検出能及び測定能が向上する温度区間、即ちリガンド結合蛋白質にリガンドの結合の有無によるＦＲＥＴ比の変化が最も大きい温度区間をいう。本発明の実施例３及び４で確認されるようにＰＢＰで構成されたＦＲＥＴバイオセンサーの場合、４９〜５４℃の温度区間が検出能及び測定能が向上する「臨界温度」といえる。
【００１７】
本発明は一観点において、蛍光供与体及び蛍光受容体を含む信号発生部と前記蛍光供与体及び蛍光受容体を連結するリガンド結合蛋白質を含む感知部を含むＦＲＥＴバイオセンサーを利用したリガンドの検出方法であって、可逆的なアンフォールディング現象が起こり、リガンド結合（リガンドが前記リガンド結合蛋白質に結合すること）によるＦＲＥＴ比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度でリガンドを含有する試料と接触させることを特徴とするリガンドの検出方法に関する。
【００１８】
試料中のリガンドの検出は、蛍光供与体及び蛍光受容体の発光量を蛍光分析システム等で測定することによって行われ、蛍光分析システムとしてはフィルター方式及びモノクローム方式の蛍光分光器等を利用することができる。この時、試料中リガンドが存在する場合、前記蛍光供与体と蛍光受容体の発光量変化が感知されるが、これによりリガンドを検出できるようになる。
【００１９】
本発明はまた、他の観点において、次の工程を含む、蛍光供与体及び蛍光受容体を含む信号発生部と前記蛍光供与体及び蛍光受容体を連結するリガンド結合蛋白質を含む感知部を含むＦＲＥＴバイオセンサーを利用したリガンド濃度の測定方法に関する:
（ａ）可逆的なアンフォールディングが起こり、リガンドが前記リガンド結合蛋白質に結合することによるＦＲＥＴ比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度で、前記ＦＲＥＴバイオセンサーをリガンドを含有する試料と接触させる工程、及び
（ｂ）前記蛍光供与体と蛍光受容体の発光量比の変化を測定してリガンドの濃度を測定する工程。
【００２０】
前記蛍光供与体及び蛍光受容体の発光量は、蛍光分析システム等で測定され、リガンドの濃度変化が発生する場合、前記二つの蛍光供与体と蛍光受容体の発光量に変化が発生するが、そこで本発明はリガンドの濃度変化測定のために利用される。
【００２１】
本発明において、ＦＲＥＴバイオセンサーを構成する融合蛋白質は、信号発生部として蛍光供与体及び蛍光受容体を含み、感知部としてリガンド結合蛋白質を含む形態で、前記蛍光供与体と蛍光受容体は、リガンド結合蛋白質の両末端に結合できる。この時、蛍光供与体または蛍光受容体は、一つ以上のリンカーを利用して前記リガンド結合蛋白質に連結できる。
【００２２】
前記リガンド結合蛋白質は、望ましくは本発明の実施例で用いられたＭＢＰ（maltose-binding protein）、ＡＬＢＰ（allose-binding protein）、ＡＲＢＰ及びＧＧＢＰ（galactose/glucose-binding protein）等、大腸菌由来のＰＢＰであることを特徴とするが、リガンドの結合によって構造的変化を起こすリガンド結合蛋白質ならば、これに限定されず本発明による方法及びセンサーで提供できることは明らかである。
【００２３】
また、前記バイオセンサーの信号発生部で使われる蛍光供与体及び蛍光受容体の構成は、蛍光供与体の発光スペクトラムと蛍光受容体の吸光スペクトラムが互いに重なってＦＲＥＴまたは蛍光減少を誘発できるものであれば、いずれのものでもよく、これに前記蛍光供与体として多様な波長の蛍光蛋白質（fluorescent protein）と蛍光顔料（fluorescent dye）、生体発光蛋白質（bioluminescent protein）及び量子ドット（quantum dot）等が利用でき、前記蛍光受容体として前記蛍光供与体と波長が異なる蛍光蛋白質、蛍光顔料及び量子ドット等が用いられる。または、蛍光受容体として前記蛍光供与体の蛍光強度を減少させる消光剤（quencher）と金ナノ粒子（Au-nano particle）等が用いられる。但し、この中でもＦＲＥＴバイオセンサーを構成する場合、蛍光供与体と蛍光受容体の吸光計数（extinction coefficient）と量子効率（quantum efficiency）、光安全性（photostability）と利用の便宜等を考慮して、蛍光蛋白質であるＥＣＦＰ（enhanced cyan fluorescent protein）とＥＹＦＰ（enhanced yellow fluorescent protein）を用いることが望ましい。
【００２４】
本発明によるリガンドの検出及び濃度測定方法は、蛍光の光学的特性である「ＦＲＥＴ」を利用しており、その原理は図１に示されている。ＦＲＥＴは、一般に蛍光供与体から放出される波長が蛍光受容体の吸光スペクトラムと重なり、光子（photon）が出現せず発生するため、共鳴エネルギー転移と呼ばれ、これは蛍光供与体と蛍光受容体との間の長距離双極子相互作用による結果である。ＦＲＥＴのエネルギー転移効率は、蛍光供与体の発光スペクトラムと蛍光受容体の吸光スペクトラムが重なる範囲と蛍光供与体の量子効率、蛍光供与体と蛍光受容体の転移双極子（transition dipoles）の相対方向（relative orientation）、及び蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離により変わる。従って、ＦＲＥＴのエネルギー転移効率は、蛍光供与体と蛍光受容体の距離と相対方向により異なるが、Ｆｏｒｓｔｅｒの式によると次のように表現される。
【００２５】
［数１］
Ｅ＝Ｒ０６／（Ｒ６＋Ｒ０６）  （１）
前記式（１）において、ＥはＦＲＥＴ効率を示し、Ｒは蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離であり、蛍光物質により差はあるが通常２〜９ｎｍ以内で定義される。また、Ｒ０はＦＲＥＴ効率が５０％になる蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離であり、一般にＦｏｒｓｔｅｒ  ｄｉｓｔａｎｃｅまたはＦｏｒｓｔｅｒ  ｒａｄｉｕｓと呼ばれる。Ｒ０は次の式に表現される。
【００２６】
［数２］
Ｒ０＝０．２１１［ｋ２ｎ−４ＱＤＪ(λ)]１／６ (ｉｎÅ)  （２）
前記式（２）において、ｋ２は方向係数（orientation factor）であり、通常２／３で計算し、蛍光供与体発光と蛍光受容体吸光の相対方向により０〜４の範囲の値を有する。ｎは、媒質の屈折率であり、通常２５℃の水は〜１．３３４であり、ＱＤは、蛍光供与体の量子効率である。Ｊ(λ)は、蛍光供与体の発光と蛍光受容体の吸光スペクトラム上の重複（overlap）程度であり、Ｍ−１ｃｍ−１ｎｍ４の単位値を有する（Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999、Patterson et al., Anal. Biochem. 284:438, 2000、 Patterson et al., J. of Cell Sci. 114:837, 2001）。
【００２７】
そこで、前記説明したＦＲＥＴの原理を利用して、本発明者等は韓国登録特許１０−０７３９５２９号（２００７年７月２９日）と米国登録特許ＵＳ７４３２３５３号（２００８年１０月７日）でＦＲＥＴの蛍光供与体と蛍光受容体として働く蛍光蛋白質であるＥＣＦＰとＥＹＦＰをリガンド結合蛋白質であるＰＢＰの両末端に融合させて、ＦＲＥＴバイオセンサーを構成し、これを利用して各センサーに結合可能なリガンドのアロースとアラビノース、リボース、マルトースを定量的に検出できることを示した。
【００２８】
前記ＦＲＥＴバイオセンサーは、ＥＣＦＰ−ＰＢＰ−ＥＹＦＰが一つのポリペプチドで構成されて巨大な融合蛋白質として発現され、ＰＢＰの概略的な大きさが３×４×６．５ｎｍ（Spurlino et al., J. Biol. Chem., 266:5202, 1991）であることを考慮すると、ＥＣＦＰとＥＹＦＰとの間の距離が、概ね５〜６ｎｍ程度に位置するようになるため、ＦＲＥＴの発生が可能な距離となる。従って、４３６ｎｍでＥＣＦＰを励起させると、ＥＣＦＰの励起準位エネルギーが、ＥＹＦＰに伝えられて、ＥＣＦＰとＥＹＦＰの発光を同時に観察することができる（図１参照）。前記ＦＲＥＴバイオセンサーのリガンド結合部位に糖が結合すると、ＰＢＰの両末端に融合したＥＣＦＰとＥＹＦＰとの距離と相対方向が変わるようになって、その結果ＦＲＥＴ効率の差が生じるため、二つの蛍光蛋白質の発光量比が変わるようになる。従って、二つの蛍光蛋白質の発光量変化を測定することによってリガンドの感知が可能であるが、発光量比の変化は糖濃度に比例するため、定量的な糖濃度の測定が可能になる。
【００２９】
それだけではなく、前記式（２）の計算によると、ＥＣＦＰとＥＹＦＰは概ね５ｎｍ程度のＲ０値を有するため（Patterson et al., Anal. Biochem., 284:438, 2000）、ＥＣＦＰとＥＹＦＰとの間の距離が概ね５〜６ｎｍ程度と仮定すると、距離または相対的方向の小さい変化が、ＦＲＥＴ効率には大きい差を生じさせる。従って、本発明者等はリガンド結合の有無によるＦＲＥＴ効率の差を最大化できると、バイオセンサーの検出能力が大きく向上すると予想した。そこで、本発明では検出能力を最大化するために研究した結果、大腸菌由来のＰＢＰが温度上昇による可逆的なアンフォールディング現象を示し、このような現象はリガンドが存在するとより高い温度でアンフォールディング現象が観察されるとの研究結果に着眼して、従来ＦＲＥＴ原理を利用した方法に比べて、リガンド検出能力が増加したリガンドの検出及び濃度測定方法を提供した。
【００３０】
即ち、本発明の一実施例では温度変化によるＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光分析を介して、４５〜６５℃の温度範囲でリガンドの有無によるバイオセンサーの蛍光比が大きく変わることを確認し、より詳しくは４９℃〜５４℃の温度範囲でセンサーの検出能力である△ｒａｔｉｏ値が増加することを確認して「臨界温度」区間が存在することを確認した（図２〜図５）。また、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者なら、本発明の臨界温度が結合蛋白質の種類による安全性レベル及び反応液の造成により多様な範囲で変化する可能性があることを理解できる。即ち、低温性または好熱性微生物由来のリガンド結合蛋白質またはこれの基質特異性を改良した結合蛋白質を利用したバイオセンサーは、本発明の臨界温度範囲（４９℃〜５４℃）より高いか低い温度範囲で、より向上した検出能力を有することもある。特に、蛋白質の構造的堅固性（rigidity）に影響を及ぼす物質、即ち、酸（acid）、塩基（base）、還元剤（reducing agent）、変成剤（denaturant，chaotropic agent）、安定剤（stabilizer）、界面活性剤（surfactant）、乳化剤（emulsifier）、または不活性化剤（detergent）の有無によって臨界温度範囲を調節可能であることは、本発明で期待する通常の知識範囲に属する。
本発明の他の実施形態では、ＦＲＥＴバイオセンサーの検出能力が、２５℃で測定した場合より臨界温度において最小２．５倍から最大１２倍程度増加することを確認し（図６〜図９）、各センサーの基質に対する特異性も、米国登録特許ＵＳ７４３２３５３号で提示した結果より向上することを確認することができた（図１２、図１３）。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
《実施例１：ＦＲＥＴバイオセンサーの製造》
１−１：ＦＲＥＴバイオセンサーのための融合蛋白質製造のための発現ベクターの構築
まず次の式（Ｉ）で表される蛋白質を含有するバイオセンサーを提供するために次のように発現ベクターを構築した：
【化１】
0005710595.tif 000002
ここで、リガンド結合蛋白質であるＰＢＰは、ＡＬＢＰ、ＡＲＢＰ、ＭＢＰ及びＧＧＢＰからなる群から選択され、Ｌ１及びＬ２は各々ＦＰ１のＣ−末端とＰＢＰのＮ−末端との間、ＰＢＰのＣ−末端とＦＰ２のＮ−末端との間を連結する２個のアミノ酸で構成されたリンカーペプチドであり、ＦＰ１とＦＰ２は、ＦＲＥＴの蛍光供与体と蛍光受容体で、各々ＥＣＦＰとＥＹＦＰで構成される。
【００３２】
本発明で用いられたアロースとアラビノース、マルトースを定量的に測定できるＦＲＥＴバイオセンサーは、本発明の出願人によって先出願された韓国登録特許１０−０７３９５２９号及び米国登録特許ＵＳ７４３２３５３号で提示されたセンサーと同じであり、詳細には、次の方法によって構築した。
まず、マルトースを定量的に測定するためのマルトースバイオセンサーであるＣＭＹ−ＢＩＩの発現ベクターは次の方法によって構築した。
【００３３】
配列番号１：５’−ｇａｔｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇ−３'
配列番号２：５'−ｇａｔｃａａｇｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃ−３'
配列番号３：５'−ｇａｔｃａｔａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇ−３'
配列番号４：５'−ｔｔｔａｃｃｔｔｃｔｔｃｇａｔｔｔｔｃａｔｔｃｇｃｇａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃ−３'
配列番号５：５'−ａｔｇａａａａｔｃｇａａｇａａｇｇｔａａａｃ−３'
配列番号６：５'−ｇａｔｃｇｇａｔｃｃｃｇａｇｃｔｃｇａａｔｔａｇｔｃｔｇ−３'
【００３４】
まず、ＥＹＦＰの遺伝子は、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を鋳型として、各々ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ切断塩基配列が導入された配列番号１と２のプライマーをもちいてＰＣＲを行った。増幅されたＥＹＦＰ遺伝子は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断した後、発現ベクターであるｐＥＴ−２１a（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の制限酵素認知部位に挿入して、ＥＹＦＰのＣ末端に６×Ｈｉｓ−ｔａｇが発現できるベクターであるｐＥＹＦＰ−ＩＩＩを構成した。ＥＣＦＰ遺伝子は、ｐＥＣＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を鋳型として、ＮｄｅＩの制限酵素切断塩基配列が導入された配列番号３と、ＭＢＰのＮ末端塩基配列が重なるように作製した配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。同様にＭＢＰの遺伝子は、ｐＭＡＬｃ２ｘ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を鋳型として、配列番号５と、ＢａｍＨＩ制限酵素切断塩基配列が導入された配列番号６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このように増幅された各々のＥＣＦＰとＭＢＰの遺伝子は互いに重なるように作製されたプライマーによって、重複伸長重合酵素連鎖反応（overlap-extension PCR）が可能であるため、配列番号３と配列番号６のプライマーを利用して、反応液に同量のＥＣＦＰとＭＢＰ遺伝子を添加した後、ＰＣＲを行ってＥＣＦＰ−ＭＢＰ形態の合成遺伝子を得ることができた。前記増幅された合成遺伝子は、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、ＭＢＰ−ＥＹＦＰの発現ベクターであるｐＥＹＦＰ−ＩＩＩの制限酵素認知部位にクローニングする方法で発現ベクターであるｐＥＣＭＹ−ＢＩＩベクターを構築し、前記方法で構成されたマルトース測定用ＦＲＥＴバイオセンサーをＣＭＹ−ＢＩＩと命名した。
【００３５】
また、アロース測定用バイオセンサーであるＣａｌｓＢＹ−ＱＶの発現ベクターを構築するためのＥＣＦＰ遺伝子の増幅は、塩基配列３及び７のプライマーを用いており、ＡＬＢＰ遺伝子は大腸菌ＭＧ１６５５から抽出した染色体遺伝子（chromosomal DNA）を鋳型として、配列番号８と９のプライマーを用いて増幅した。
配列番号７：５'−ｇａｃａｇｃａｔａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｃａｔｔａｃｔｔｇｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃ−３'
配列番号８：５'−ａｔｇｇｃｃｇｃｃｇａａｔａｔｇｃｔｇｔ−３'
配列番号９：５'−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃｇａｔｔｇａｇｔｇａｃｃａｇｇａｔｔ−３'
【００３６】
増幅されたＥＣＦＰ及びＡＬＢＰの遺伝子は、配列番号３と９のプライマーを利用してＥＣＦＰ−ＡＬＢＰの合成遺伝子に増幅した。前記ＥＣＦＰ−ＡＬＢＰ遺伝子は、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素認知部位を利用して、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ発現ベクターからＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子を取り除いて挿入する方法で、アロース測定用バイオセンサーの発現のためのｐＥＣａｌｓＢＹ−ＱＶベクターを構築した。
【００３７】
同様に、アラビノース測定用バイオセンサーであるＣａｒａＦＹ−ＰＲの発現ベクターを構築するためのＥＣＦＰ遺伝子の増幅は、塩基配列３と１０のプライマーを用いており、ＡＲＢＰの遺伝子は、大腸菌ＭＧ１６５５から抽出した染色体遺伝子を鋳型として、配列番号１１と１２のプライマーを用いて増幅した。
配列番号１０：５'−ｃｃｇａｇｃｔｔｃａｇｇｔｔｃｔｃｃａｔｃｃｔａｇｇｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃ−３'
配列番号１１：５'−ａｔｇｇａｇａａｃｃｔｇａａｇｃｔｃｇ−３'
配列番号１２：５'−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃｇａｃｔｔａｃｃｇｃｃｔａａａｃｃｔｔ−３'
【００３８】
増幅されたＥＣＦＰとＡＲＢＰの遺伝子は、配列番号３と１２のプライマーを利用してＥＣＦＰ−ＡＲＢＰの合成遺伝子で増幅し、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ発現ベクターのＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子位置に挿入する方法でｐＥＣａｒａＦＹ−ＰＲを構築した。
また、本発明で用いられたグルコース測定用バイオセンサーであるＣｍｇｌＢＹ−ＳＳの発現ベクターは下の方法で構築した。
配列番号１３：５'−ｃａｃｃａａｔｇｃｇａｇｔａｔｃａｇｃｃａｔｃｇａａｇａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃ−３'
配列番号１４：５'−ａｔｇｇｃｔｇａｔａｃｔｃｇｃａｔｔｇｇｔｇ−３'
配列番号１５：５'−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｃｔｇａａｔｔｃａｇｃ−３'
【００３９】
まず、ＥＣＦＰ遺伝子はｐＥＣＦＰベクターを鋳型として、配列番号３と、ＧＧＢＰのＮ末端塩基配列が重なるように作製した配列番号１３の逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行った。同様に、ＧＧＢＰの遺伝子は、大腸菌ＭＧ１６５５から抽出した染色体遺伝子を鋳型として、配列番号１４と、ＢａｍＨＩ制限酵素切断塩基配列が導入された配列番号１５の逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行った。前記増幅したＥＣＦＰとＧＧＢＰ遺伝子を反応液に共に添加した後、配列番号３と配列番号１５のプライマーでＰＣＲを行ってＥＣＦＰ−ＧＧＢＰの合成遺伝子が得られた。前記増幅されたＥＣＦＰ−ＧＧＢＰ合成遺伝子は、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、前記ｐＥＣＭＹＢ−ＩＩのＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素認知部位を利用してＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子を取り除いて挿入する方法でｐＥＣｍｇｌＢＹ−ＳＳベクターを構築し、前記方法で構成されたグルコース測定用ＦＲＥＴバイオセンサーをＣｍｇｌＢＹ−ＳＳと命名した。
【００４０】
１−２：ＦＲＥＴバイオセンサーの製造、純粋分離
実施例１−１で構築したｐＥＣａｌｓＢＹ−ＱＶ、ｐＥＣａｒａＦＹ−ＰＲ、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ及びｐＥＣｍｇｌＢＹ−ＳＳが、各々ＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換された大腸菌を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加されたＬＢ培地（１％ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ）に接種して、３７℃で１２時間震盪培養した。
【００４１】
前記培養させた大腸菌は、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加された１ＬのＬＢ培地に１％になるよう接種して、３７℃で約２時間程度培養させ、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍでの吸光度が０．５に到達した時点に、ＩＰＴＧ（isopropyl β-d-thiogalactopyranoside）を０．５ｍＭになるよう添加して、２５℃で２４時間蛋白質の発現を誘導した。
【００４２】
培養を終えた菌株は、６０００ｒｐｍの速度で遠心分離機（Ｓｕｐｒａ２２Ｋ，Ｈａｎｉｌ，Ｋｏｒｅａ）を利用して回収し、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させ超音波粉砕機で細胞膜を破壊させた。さらに、溶解した菌株は高速遠心分離機で１５０００ｒｐｍで沈殿物を取り除き、上層液だけを０.２μｍフィルターでろ過して、以後の精製過程に用いた。
【００４３】
蛋白質の精製は、ＦＲＥＴバイオセンサーのＣ−末端に発現した６×Ｈｉｓ−ｔａｇを利用してＦＰＬＣ（fast-performance liquid chromatography）に連結した親和性クロマトグラフィーカラムＨｉｓＴｒａｐ（商品名）ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して、一次ろ過を行い、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＴｒａｐ（商品名）Ｑ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して、二次精製を行った。精製を終えたＦＲＥＴセンサーは、２０％グリセロールが含まれたＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮して、−７０℃で保管し、下記実施例で用いた。
【００４４】
《実施例２：ＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光分析方法》
ＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光は、各センサー蛋白質を０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に０．５μＭの濃度で同一に調節した条件で、蛍光分析システムのＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｍｕｌｇｒａｖｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて測定し、４３６ｎｍで励起させて発生する発光スペクトラムを４５０ｎｍから６００ｎｍまでスキャンして確認した。また、ＦＲＥＴ効率を示す指標としては、４８０ｎｍでのＥＣＦＰ発光とＦＲＥＴによって発生するＥＹＦＰの５３０ｎｍでの発光量（emission intensity）の比を下記の式（３）に代入した値であるＦＲＥＴ  ｒａｔｉｏと定義した。
［数３］
ｒａｔｉｏ＝（５３０ｎｍ／４８０ｎｍ）  （３）
ｒａｔｉｏ：ＥＹＦＰとＥＣＦＰの発光量比
５３０ｎｍ：ＦＲＥＴによって測定されるＥＹＦＰの発光量
４８０ｎｍ：励起光を４３６ｎｍにした時測定されるＥＣＦＰの発光量
また、ＦＲＥＴバイオセンサーの検出能力を定義する△ｒａｔｉｏは下記の式（４）により決めた。
［数４］
△ｒａｔｉｏ＝ｒａｔｉｏｍａｘ−ｒａｔｉｏｍｉｎ  （４）
△ｒａｔｉｏ：リガンドの有無によるｒａｔｉｏの最大差
ｒａｔｉｏｍａｘ：リガンドが存在する条件で測定されるｒａｔｉｏの比
ｒａｔｉｏｍｉｎ：リガンドがない条件で測定されるｒａｔｉｏの比
【００４５】
ＦＲＥＴバイオセンサーのリガンドに対するタイトレーションカーブは、リガンドの濃度を１ｎＭ〜１０ｍＭまで増加させながら測定したｒａｔｉｏ変化をＳｉｇｍａｐｌｏｔ  １０．０（Ｓｙｓｔａｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）のＨｉｌｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ、４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ方式を適用して、Ｓ字形態の曲線（Sigmoidal curve）で表現し、各センサーに対するリガンドの解離常数（dissociation constant）のＫｄは、Ｓ字状の曲線において△ｒａｔｉｏが１／２値を示すリガンドの濃度と定めた。また、各センサーを利用して、定量的に測定可能なリガンドの濃度範囲は、△ｒａｔｉｏ値が１０％から９０％飽和された範囲以内のリガンド濃度と定義した。
【００４６】
《実施例３：ＦＲＥＴバイオセンサーの温度変化による蛍光分析》
温度変化によるＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光分析は、各センサーを０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に０．５μＭの濃度に調節して、リガンドがない条件と飽和濃度の１ｍＭのリガンドが添加された条件でのＦＲＥＴ  ｒａｔｉｏを測定して、比較分析した。ＦＲＥＴバイオセンサー０．５ｍＬに添加するリガンドの体積は、センサーの過度な希釈を防止するために全体積の１／１００に該当する５μＬに制限した。温度変化は、１０〜６５℃区間まで５℃間隔で測定し、ｒａｔｉｏの変化が著しい区間である４５〜６０℃間では１℃間隔で温度を変化させながら測定した。全ての実験群は水分蒸発を防止するために栓が閉じられた蛍光キューベット（cuvette）に入っている状態で実験を行い、キューベットは温度調節装置が連結したペルチエ素子（peltier device）に位置させた状態で目標温度に到達してから３分経過後、蛍光を測定した。
【００４７】
その結果、図２乃至図５に示したように、前記実施例１−２で精製したＦＲＥＴバイオセンサーのリガンドの有無によるＦＲＥＴ  ｒａｔｉｏの変化が最も大きい臨界温度は、マルトースセンサーは５４℃（図２）、グルコースセンサーは５０℃（図３）、アロースとアラビノースセンサーは４９℃（図４、図５）で若干の差があり、臨界温度±１℃ではＦＲＥＴ  ｒａｔｉｏの変化が大きくなく、安定した結果を示すことが確認された。
【００４８】
また、前記臨界温度でのリガンドに対する各ＦＲＥＴバイオセンサーのタイトレーションカーブを分析した結果、図６乃至９に示したように、マルトースセンサーは１．２２（図６）、グルコースセンサーは１．６（図７）、アロースセンサーは−０．６２（図８）、アラビノースセンサーは０．７２（図９）の△ｒａｔｉｏ値を示すことが確認された。
【００４９】
前記測定された各ＦＲＥＴバイオセンサーの△ｒａｔｉｏ値を既に２５℃で測定した数値と比較すると、マルトースセンサーは７倍（図６）、グルコースセンサーは１２倍（図７）、アロースセンサーは３倍（図８）、アラビノースセンサーは２．５倍（図９）以上△ｒａｔｉｏ値が増加した数値となり、この結果は特定臨界温度で多様な種類のＦＲＥＴバイオセンサーの検出能力が大きく改善されるという本出願人の主張を直接的に確認する結果である。
前記結果は下記の表１にまとめられた。
【００５０】
【表１】
0005710595.tif 000003
【００５１】
一方、各ＦＲＥＴバイオセンサーで測定可能なリガンドの濃度範囲は、生理的（physiological）に有意な濃度範囲と確認され、例えば、血糖濃度を測定するのに重要な血液のグルコースの濃度は７０〜２００ｍｇ／ｄＬであり、これは概ね４００〜１１００μＭに該当する。従って、グルコースセンサーを利用して、血糖濃度を測定する場合には、血液をセンサー体積の１／１００となるよう添加するため、４〜１１μＭの濃度範囲に該当するように、前記濃度範囲はグルコースセンサーのＫｄ値が９.２±０.５μＭであるため、最も正確に測定できる濃度区間となる。
【００５２】
《実施例４：ＦＲＥＴバイオセンサーのリガンドに対する特異性分析》
ＦＲＥＴバイオセンサーの多様なリガンドに対する特異性分析は、１９種の単糖類と多糖類、及び糖アルコール等種々の糖類を対象に測定した。
測定方法は、精製されたＦＲＥＴバイオセンサーを０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）に０．５μＭの濃度に調節して、各リガンドの濃度を１００μＭと１ｍＭ、１０ｍＭ等になるよう添加して、キューベットを囲むペルチエ素子が前記実施例３で求めた臨界温度に到達した時から３分経過後に蛍光を測定した。
その結果、図１０及び１２に示したように、マルトースとアロース測定用ＦＲＥＴバイオセンサーは、他の種類の糖とは特異的な結合をしないと確認された。また、２５℃で測定した、本発明出願人によって先出願された米国登録特許ＵＳ７４３２３５３号の結果と比較して見ると、アロースＦＲＥＴバイオセンサーは、高濃度のリボースに対する特異性が減少することが確認できた。
【００５３】
一方、アラビノースとグルコースＦＲＥＴセンサーは、既存の研究結果と同様にガラクトースに非常に親和力が高いことが確認され（Vyas et al., J. Biol. Chem. 266, 5226-5237, 1991、 Fehr et al., J. Biol. Chem. 278, 19127-19133, 2003）、特にグルコースセンサーの場合には、ガラクトース以外にも高濃度で存在する多数の糖類と低いレベルの親和力があると確認された（図１１）。しかし、血液に存在する糖類はグルコースを除いて微量に存在するため、グルコースセンサーを血糖測定用に用いても、その他糖類による誤差が大きくないものと判断され、最近の研究によると、ガラクトースに対する親和力が大きく減少したＧＧＢＰが報告されたため（Sakaguchi-Mikami et al., Biotechnol. Lett. 30:1453-1460, 2008）、グルコース測定用ＦＲＥＴバイオセンサーの特異性を改善できる余地も十分にある。
【産業上の利用の可能性】
【００５４】
以上、説明したように本発明による方法は、バイオセンサーを構成しているリガンド結合蛋白質が、特定の臨界温度以上で可逆的なアンフォールディングが起こり、このアンフォールディングのレベルがリガンド濃度により変わる現象に基づく技術として、前記臨界温度で蛍光を測定する方法でＦＲＥＴバイオセンサーの検出能力を画期的に増加でき、リガンド結合蛋白質と蛍光蛋白質を利用した全ての種類のＦＲＥＴバイオセンサーに幅広く適用できるため、活用範囲が広範囲である。
【００５５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
0005710595.tif 000004
【図２】
0005710595.tif 000005
【図３】
0005710595.tif 000006
【図４】
0005710595.tif 000007
【図５】
0005710595.tif 000008
【図６】
0005710595.tif 000009
【図７】
0005710595.tif 000010
【図８】
0005710595.tif 000011
【図９】
0005710595.tif 000012
【図１０】
0005710595.tif 000013
【図１１】
0005710595.tif 000014
【図１２】
0005710595.tif 000015
【図１３】
0005710595.tif 000016
【配列表】
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