(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子多型が複数存在する可能性のある遺伝子あるいは検体を対象として、検査対象とする遺伝子型を特異的に検出することを目的とした核酸の測定方法において、蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、蛍光標識オリゴ）が、検査対象以外の遺伝子型にハイブリダイズすることで、当該遺伝子型の遺伝子増幅を抑制するとともに、上記と同一の蛍光標識オリゴを、上記と同一の遺伝子増幅工程において増幅された検査対象の遺伝子型に由来する増幅産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後での蛍光色素の蛍光強度変化から、検査対象の遺伝子型を特異的に検出することを特徴とする核酸の測定方法であって、蛍光標識オリゴが以下の(i)〜(iv)の特徴を有する前記方法。
(i) 検査対象以外の遺伝子型の遺伝子の配列を有する。
(ii) オリゴヌクレオチドの一部または全部がBNA（Bridged Nucleic Acid）で構成される。
(iii) 標的核酸とのハイブリダイゼーションにより、蛍光強度が変化する特性を有する。
(iv) 核酸増幅反応における伸長が発生する温度域において、検査対象以外の遺伝子型を含む標的核酸とは強固に結合しているが、検査対象とする遺伝子型を含む標的核酸とは、その増幅を抑制するほどは強固に結合していないことにより、核酸増幅反応における検査対象以外の遺伝子型の遺伝子増幅が抑制され、検査対象とする遺伝子型の遺伝子が優先的に増幅される。
【請求項２】
蛍光色素にて当該末端部が標識された蛍光標識オリゴであり、当該蛍光標識オリゴが、標的核酸にハイブリダイズしたとき、標的核酸の塩基配列において、当該蛍光標識オリゴの末端部から数えて１〜３塩基の範囲内に（蛍光標識された末端部と塩基対を形成する標的核酸塩基を１とカウント）、Ｇ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在し、標的核酸とのハイブリダイゼーションにより、蛍光強度が減少する特性を有する蛍光標識オリゴを使用することを特徴とする請求項１に記載の核酸の測定方法。
【請求項３】
蛍光色素にて当該末端部が標識された蛍光標識オリゴであり、当該蛍光標識オリゴが、標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該末端部分における塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくも一対以上形成するように塩基配列が設計されており、標的核酸とのハイブリダイゼーションにより、蛍光強度が減少する特性を有する蛍光標識オリゴを使用することを特徴とする請求項１、２の何れかの一項に記載の核酸の測定方法。
【請求項４】
検査対象とする遺伝子型を含む塩基配列とハイブリダイズした際のミスマッチの数が、検査対象以外の遺伝子型を含む塩基配列とハイブリダイズした際のミスマッチの数よりも多い塩基配列を有する蛍光標識オリゴを使用することを特徴とする請求項１〜３の何れかの一項に記載の核酸の測定方法。
【請求項５】
BNAが、2’,4’-BNAcoc、3’-Amino-2’,4’-BNA及び2’,4’-BNANCのうちの少なくとも１種である請求項１〜４の何れか一項に記載の核酸の測定方法。
【請求項６】
蛍光標識オリゴが、さらに、PNA（Peptide Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、TNA（Threose nucleic acid）、GNA（Glycol nucleic acid）のうち少なくとも１種を使用した蛍光標識オリゴである請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸の測定方法。
【請求項７】
遺伝子増幅法が、PCR法、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、Rolling Cycle法、SMAP法、PALSAR法のいずれか1つであることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載の核酸の測定方法。
【請求項８】
検査対象とする遺伝子型が変異型であり、検査対象以外の遺伝子型が野生型である請求項１〜７の何れか一項に記載の核酸の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド、それを用いる核酸の特異的増幅方法、測定方法及びその方法によって得られるデータを解析する方法に関する。詳しくはオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイゼーションさせたまま核酸増幅反応を行うことで、標的核酸の増幅を抑制する特異的増幅方法、蛍光標識オリゴを用いる各種核酸の各種測定方法に関し、蛍光標識オリゴを標的核酸にハイブリダイゼーションさせたときに生ずる、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定するという原理に基づく各種核酸の各種測定方法、それに用いるオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子上の突然変異が、癌の原因の1つとなっている。その為、癌の早期発見法として、PCR法などの遺伝子増幅方法を応用した遺伝子変異検査の重要性が認識されている。
【０００３】
遺伝子変異検査は、癌の早期発見だけでなく、治療方針の決定にも重要である。例として、EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子変異を有する肺がん患者に対する、ゲフィニチブ(チロシンキナーゼ阻害剤)の奏効性判定がある。EGFR遺伝子変異のうち、エクソン１９の欠失変異及びエクソン２１コドン８５８のロイシン→アルギニン変異が見られた症例に対し、奏効率が高いということが知られている。
【０００４】
しかしながら、検体に含まれる細胞は通常、正常細胞がそのほとんどであり、変異遺伝子が含まれる細胞はわずかである。したがって、通常の遺伝子増幅手法を用いた遺伝子型判別法では、野生型遺伝子が多いため検出感度が低く、臨床検査としては問題があった。
【０００５】
また、骨髄増殖性腫瘍におけるJAK2遺伝子変異（JAK2V617F）は、そのアレル頻度の量的変化を測定することに臨床的意義が大きく、野生型遺伝子中のわずかな頻度の変異遺伝子を検出することは、初期の罹患判定に非常に重要である。
【０００６】
上記の例に示したように、野生型遺伝子を多く含む遺伝子群中において変異型遺伝子を高感度に検出することは、臨床的に非常に重要であり、それを可能にする手法の開発が望まれている。
【０００７】
Nagaiらは、PNA-LNA PCR clampという手法により、EGFR遺伝子に生じる11種類の変異について高感度検出を試みた結果、アレル頻度が0.1%の変異を検出することが可能であった(Nagai et. al., Cancer Research, 65:7276-7282, 2005.：非特許文献１)。しかしながら、この手法においては変異検出用と増幅確認用の2本の蛍光標識オリゴ、およびクランププライマーの3種類のオリゴヌクレオチドを用いる必要があり、他の遺伝子変異へ応用するには設計が煩雑であると考えられる。また、当該既存方法では、多くのオリゴヌクレオチドを利用する必要性があることは、低コスト化が求められる臨床検査において、解決すべき課題であると認識される。
【０００８】
Miyanoらは、PNAを用いたPCR clamp法によるKRAS遺伝子変異の検出を試みた(Miyano et. al., Experimental And Therapeutic Medicine, 4:790-794, 2012.：非特許文献２)。この方法ではクランププライマー1本で増幅反応を行っているが、検出はSYBR Greenで行っているため、シグナルが変異型遺伝子に由来するかは正確に判別が不可能であり、正確性の求められる臨床の現場へは適用が難しいと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nagai et. al., Cancer Research, 65:7276-7282, 2005.
【非特許文献２】Miyano et. al., Experimental And Therapeutic Medicine, 4:790-794, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、野生型遺伝子を多く含む遺伝子群中における変異遺伝子を高感度に、かつ迅速・簡便に検出することができる手法として、蛍光標識オリゴを用いる核酸の特異的増幅法および測定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記の課題を解決するにあたり、変異型遺伝子の特異的増幅法およびそれに続く変異型遺伝子の検出方法について検討を重ねた。その結果、図1の概念図に示した通り、野生型遺伝子の配列を有する、蛍光標識オリゴを野生型遺伝子にハイブリダイゼーションさせて核酸増幅反応を行い、変異型遺伝子を優先的に増幅させた後、変異型遺伝子にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後の蛍光色素の発光の変化量を測定する、即ち1本のオリゴヌクレオチドでクランププライマーと蛍光標識オリゴを兼ねて高感度に変異遺伝子を検出可能であることを発見した。本発明はかかる発見に基づいて完成されたものである。
【００１２】
即ち、本発明は、特定遺伝子配列の特異的増幅法において、上記オリゴヌクレオチドを遺伝子群中の野生型遺伝子にハイブリダイゼーションさせた後に、核酸増幅反応を行った際、その増幅を抑制することによって、変異型遺伝子を特異的に増幅することを特徴とする手法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、蛍光標識オリゴを用いる核酸測定法において、上記オリゴヌクレオチドが特異的に増幅された変異型遺伝子にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、その発光を変化させるオリゴヌクレオチドであり、上記オリゴヌクレオチドを変異型遺伝子にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後の蛍光色素の発光の変化量を測定することを特徴とする核酸の測定法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、蛍光標識オリゴが標的核酸にハイブリダイゼーションした際に、上記蛍光色素が、その発光を減少させるオリゴヌクレオチドであり、かつ、当該オリゴヌクレオチドは、その塩基のうちいずれか１つ以上が人工核酸で構成されていることを特徴とする蛍光標識オリゴ、またそれを用いた核酸測定方法を提供する。
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）遺伝子多型が複数存在する可能性のある遺伝子あるいは検体を対象として、検査対象とする遺伝子型を特異的に検出することを目的とした核酸の測定方法において、蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、蛍光標識オリゴ）が、検査対象以外の遺伝子型にハイブリダイズすることで、当該遺伝子型の遺伝子増幅を抑制するとともに、上記と同一の蛍光標識オリゴを、上記と同一の遺伝子増幅工程において増幅された検査対象の遺伝子型に由来する増幅産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後での蛍光色素の蛍光強度変化から、検査対象の遺伝子型を特異的に検出することを特徴とする核酸の測定方法。
（２）蛍光色素にて当該末端部が標識された蛍光標識オリゴであり、当該蛍光標識オリゴが、標的核酸にハイブリダイズしたとき、標的核酸の塩基配列において、当該蛍光標識オリゴの末端部から数えて１〜３塩基の範囲内に（蛍光標識された末端部と塩基対を形成する標的核酸塩基を１とカウント）、Ｇ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在し、標的核酸とのハイブリダイゼーションにより、蛍光強度が減少する特性を有する蛍光標識オリゴを使用することを特徴とする（１）に記載の核酸の測定方法。
（３）蛍光色素にて当該末端部が標識された蛍光標識オリゴであり、当該蛍光標識オリゴが、標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該末端部分における塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくも一対以上形成するように塩基配列が設計されており、標的核酸とのハイブリダイゼーションにより、蛍光強度が減少する特性を有する蛍光標識オリゴを使用することを特徴とする（１）、（２）の何れかに記載の核酸の測定方法。
（４）検査対象とする遺伝子型を含む塩基配列とハイブリダイズした際のミスマッチの数が、検査対象以外の遺伝子型を含む塩基配列とハイブリダイズした際のミスマッチの数よりも多い塩基配列を有する蛍光標識オリゴを使用することを特徴とする（１）〜（３）の何れか一つに記載の核酸の測定方法。
（５）オリゴヌクレオチドの一部または全部が、核酸の解離温度を上昇させることを特徴とする人工核酸で構成されている蛍光標識オリゴを使用することを特徴とする（１）〜（４）の何れか一つに記載の核酸の測定方法。
（６）核酸の解離温度を上昇させることを特徴とするオリゴヌクレオチドとして、人工核酸である2’,4’-BNAcoc、3’-Amino-2’,4’-BNA、2’,4’-BNANC（BNAは全てBridged Nucleic Acidの略称）、PNA（Peptide Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、TNA（Threose nucleic acid）、GNA（Glycol nucleic acid）のうち少なくとも１種を使用した蛍光標識オリゴを使用することを特徴とする（５）に記載の核酸の測定方法。
（７）遺伝子増幅法が、PCR法、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、Rolling Cycle法、SMAP法、PALSAR法のいずれか1つであることを特徴とする（１）〜（６）の何れか一つに記載の核酸の測定方法。
（８）蛍光色素にて当該末端部が標識された蛍光標識オリゴであり、当該蛍光標識オリゴが、標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該蛍光標識オリゴの末端部から数えて１〜３塩基の範囲内における標的核酸の塩基配列に（蛍光標識された末端部と塩基対を形成する標的核酸塩基を１とカウント）、Ｇ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように塩基配列が設計されていることを特徴とする（１）〜（７）の何れか一つに記載の核酸の測定方法に使用可能な蛍光標識オリゴ。
（９）蛍光色素にて当該末端部が標識された蛍光標識オリゴであり、当該蛍光標識オリゴが、標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該末端部分における塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくも一対以上形成するように塩基配列が設計されていることを特徴とする（１）〜（７）の何れか一つに記載された核酸の測定方法に使用可能な蛍光標識オリゴ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、野生型遺伝子を含む遺伝子群中の変異型遺伝子を高感度・高精度、また迅速・簡便に検出することができる。即ち、本発明によれば変異遺伝子の含有率が0.1%程度でも検出することが可能であり、測定時間は１時間程度で済む。また、用いるオリゴヌクレオチドは１本のみであるため、多種多様に渡る遺伝子変異に対して、適切なオリゴヌクレオチド設計・条件検討が容易であり、汎用性が非常に高い手法である。また、プライマーセット以外に使用するオリゴヌクレオチドの数が１本のみであるため、低コスト化な方法である。更に、検査対象遺伝子のみを特異的に検出することが可能であるため、臨床現場への適用に合致した正確性の高い手法であると認識される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の概念図を示す。
【図２】実施例１のPCR反応液の融解曲線を示す。変異率0%、0.1％、1％、100％の標的核酸を含む溶液の融解曲線をそれぞれA,B,C,D、標的核酸を含まない溶液の融解曲線をEで示す。
【図３】図２の融解曲線の負の一次微分曲線を示す。
【図４】実施例２のPCR反応液の融解曲線の負の一次微分曲線を示す。sample1, 2, 3の標的核酸を含む溶液の融解曲線の負の一次微分曲線をそれぞれA、B、C、標的核酸を含まない溶液の融解曲線の負の一次微分曲線をDで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
次に、好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。本発明において、DNA、RNA、cDNA、mRNA、rRNA、NTPs、dNTPs、蛍光標識オリゴ、ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション、インターカレーター、プライマー、アニーリング、伸長反応、熱変性反応、核酸融解曲線、PCR、RT-PCR、PNAを用いたPCR法、核酸検出用（遺伝子検出用）デバイス、SNP（スニップ：一塩基置換多型）、等の用語は、現在、分子生物学、遺伝子工学等で一般的に使用されている語と同じ意味である。
【００１８】
本発明において「野生型遺伝子」とは、塩基配列に変異が無く、正常な機能を発揮する遺伝情報が含まれる遺伝子のことである。ここでの遺伝情報とは、rRNA、mRNA等の情報をコードする転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現調節領域も含む。
【００１９】
本発明において「変異型遺伝子」とは、塩基配列に変異をもつ遺伝子である。「変異」とはDNAやRNAの塩基配列上の変化であり、遺伝学上における挿入、欠失、転座なども含まれる。ただしそれによる遺伝子機能の変化は生じていなくてもよい。また対象は転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現調節領域も含まれる。
【００２０】
本発明において「標的核酸」とは、上記した「野生型遺伝子」および「変異型遺伝子」の塩基配列を持つ核酸のことであり、精製の有無、濃度の大小は問わない。
【００２１】
本発明において使用可能な蛍光標識オリゴは、一般的に核酸の測定・検出に用いられるものが便利に使用できるが、蛍光標識オリゴが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、オリゴヌクレオチドに標識した当該蛍光色素が、その発光を変化させるものが好適に用いられる。具体的には、Quenching Probe（Kurata et al., Nucleic Acids Research, Volume 29, Issue 6, e34）、Universal quenching probe（Tani et al.,Anal. Chem., 2009, 81 (14), pp 5678-5685）、Molecular beacons（Tyagi et al., Nature Biotechnology 14, 303 - 308 (1996)）、SimpleProbe (Lyon et al., J Mol Diagn. 2009 Mar;11(2):93-101)などを挙げることができる。
【００２２】
Quenching Probe及びUniversal Quenching Probeとは、蛍光標識オリゴが標的核酸にハイブリダイズした際に、標的核酸のグアニン塩基により蛍光色素が消光する現象を利用した核酸プローブである。Molecular beaconsとは、5’末端を蛍光色素、3’末端をクエンチャー物質で標識しており、ループ構造をとることによりそれらが近接して消光しているオリゴヌクレオチドであり、標的核酸にハイブリダイズした際に蛍光を発する核酸プローブである。Simple probeとは、標的核酸にハイブリダイズした際に、標識された蛍光色素が発光する現象を利用した核酸プローブである。
【００２３】
本発明においてQuenching ProbeやUniversal quenching probeを使用する場合、蛍光色素は、一般にQuenching ProbeやUniversal quenching probeに標識して、核酸の測定・検出に用いられるものが便利に使用できる。具体的には、標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、オリゴヌクレオチドに標識した当該蛍光色素が、その発光を減少させるものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）（FITC）若しくはその誘導体等、Alexa 488、Alexa532、cy3、cy5、EDANS（5-(2'-aminoethyl)amino-1-naphthalene sulfonic acid）｝、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、5-(and 6)-カルボキシローダミン 6G（CR6G）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate）(TMRITC)、ｘ−ローダミン（x-rhodamine）、テキサスレッド(Texas red)、ボディピー(BODIPY)FL(商標名;サーモフィッシャーサイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific)社製、米国)、ボディピー(BODIPY)FL/C3（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific)社製、米国）、ボディピー(BODIPY)FL/C6（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）、ボディピー(BODIPY)5-FAM（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）、ボディピー（BODIPY）TMR（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）、又はその誘導体（例えば、ボディピー（BODIPY）TR（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）、ボディピー（BODIPY）R6G（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）、ボディピー（BODIPY）564（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）、ボディピー（BODIPY）581（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）等を挙げることができる。これらの中でも、FITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、ボディピー（BODIPY） FL/C3（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）、ボディピー（BODIPY） FL/C6（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）等を好適なものとして、また、FITC、TMR、6-joe、ボディピー（BODIPY） FL/C3（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製、米国）、ボディピー（BODIPY） FL/C6（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製）、パシフィックブルー（商標名；サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社製）、アトー（ATTO）465（商標名；アトーテック（ATTO-TEC）社製）、アトー（ATTO）655（商標名；アトーテック（ATTO-TEC）社製）をより好適なものとして挙げることができる。
【００２４】
本発明においてQuenching ProbeやUniversal quenching probeを使用する場合、オリゴヌクレオチドに標識した蛍光色素の発光を効率的に変化させるため、標的核酸の塩基配列において、当該蛍光標識オリゴの末端部から数えて１〜３塩基の範囲内に（蛍光標識された末端部と塩基対を形成する標的核酸塩基を１とカウント）、Ｇ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在することが望ましく、より好ましくは末端がＧであるように設計するほうがよい。また、蛍光色素にて当該末端部が標識された蛍光標識オリゴにおいて、当該蛍光標識オリゴが標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該蛍光標識オリゴの当該末端部分における塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくも一対以上形成するように塩基配列が設計されるとよい。
【００２５】
本発明において、一方の遺伝子型のみの増幅抑制をするには、伸長が発生する温度域（PCRにおいては一般的には72℃付近で伸長させる）において、蛍光標識オリゴが、増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸とは強固に結合しているが、増幅抑制しない遺伝子型を含む標的核酸とは、その増幅を抑制するほどは強固に結合していない状況を担保する必要性がある。野生型遺伝子と変異型遺伝子で塩基配列の差異が大きい場合は、天然由来のDNAのみで構成された蛍光標識オリゴを用いても、蛍光標識オリゴと増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸との解離温度を伸長が発生する温度以上とし、かつ蛍光標識オリゴと増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸との解離温度と、蛍光標識オリゴと増幅抑制しない遺伝子型を含む標的核酸との解離温度との差を十分に確保することが可能であり、上記した状況（伸長する温度域において、蛍光標識オリゴが、増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸とはしっかりと結合しているが、増幅抑制しない遺伝子型を含む標的核酸とは結合していない状況）を担保することが可能であるが、野生型遺伝子と変異型遺伝子で塩基配列の差異が非常に少ない場合（例えば1塩基のみが変異している場合）、伸長する温度域において、上記と同様の状況を作るのは困難である。この場合、蛍光標識オリゴの長さを短くすることで、蛍光標識オリゴと野生型遺伝子との結合温度と、蛍光標識オリゴと変異型遺伝子との結合温度との差を十分に確保することが可能であるが、蛍光標識オリゴの長さが短くしたことにより、蛍光標識オリゴの解離温度が低下し、伸長が発生する温度域（PCRにおいては一般的には72℃付近で伸長させる）において、当該蛍光標識オリゴを、増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸と強固に結合させることが困難となることから、一方の遺伝子型を優先的に増幅させることが困難となる。このような場合は、蛍光標識オリゴを構成する塩基として、解離温度を上昇させる特徴のある2’,4’-BNAcoc、3’-Amino-2’,4’-BNA、2’,4’-BNANC（BNAは全てBridged Nucleic Acidの略称）、PNA（Peptide Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、TNA（Threose nucleic acid）、GNA（Glycol nucleic acid）等の人工核酸を好適に利用することが可能である。本人工核酸を用いることで、野生型遺伝子と変異型遺伝子で塩基配列の差異が非常に少なく、蛍光標識オリゴを短くせざるを得ない状況においても、伸長する温度域において、蛍光標識オリゴが、増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸とはしっかりと結合しているが、増幅抑制しない遺伝子型を含む標的核酸とは結合していない状況を容易に実現することが可能となる。人工核酸を挿入する箇所については、人工核酸と天然DNAの混合体であるキメラオリゴであっても良いし、全て人工核酸で構成されていてもよく、特には制限されないが、野生型遺伝子と変異型遺伝子で異なる塩基配列部分について人工核酸を挿入することが望ましい実施の形態として挙げることができる。
以上より、蛍光標識オリゴを構成する塩基は、野生型遺伝子と変異型遺伝子との塩基配列の違いに応じて天然核酸および人工核酸またはその組合せ等により最適化することが肝要であり、本発明において、その核酸の種類は、特に制限はされない。
【００２６】
本発明において「クランププライマー」とは、増幅抑制しない遺伝子型を含む標的核酸との解離温度よりも、増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸に対する解離温度のほうが高いオリゴヌクレオチドであり、蛍光標識オリゴと同一のものを示す。本実施形態においては、当該クランププライマーと増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸との水素結合（塩基対の数）の数は、当該クランププライマーと増幅抑制しない遺伝子型との水素結合（塩基対の数）の数よりも多いことを特徴とする。クランププライマーの長さは、10〜25塩基であり、Tm値が70〜100℃であることが望ましい。増幅反応溶液におけるクランププライマーの濃度は、10〜500nMであることが望ましく、より好ましくは20〜200nM程度である。
【００２７】
本発明において「蛍光標識オリゴ」とは、標的核酸にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドであり、クランププライマーと同一のものを示す。本実施形態においては、当該蛍光標識オリゴは、増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸との水素結合（塩基対の数）の数＞増幅抑制しない遺伝子型を含む標的核酸との水素結合（塩基対の数）の数となるよう設計された配列を有する。すなわち、検査対象とする遺伝子型を含む塩基配列とハイブリダイズした際のミスマッチの数が、検査対象以外の遺伝子型を含む塩基配列とハイブリダイズした際のミスマッチの数よりも多い塩基配列を有する蛍光標識オリゴを使用する。また、当該蛍光標識オリゴは、標的核酸とのハイブリダイゼーション前後において、標識された蛍光色素の発光の変化量を測定し、標的核酸の検出を行うことを特徴とする。更に、蛍光標識オリゴは、当該オリゴと増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸と結合した際の解離温度と、当該オリゴと増幅抑制しない遺伝子型を含む標的核酸と結合した際の解離温度との間に差があり、当該解離温度の差を測定することで、増幅抑制する遺伝子型を含む標的核酸と増幅抑制しない遺伝子型を含む標的核酸とを区別できる機能を有する。解離温度の差を測定するための好適な方法としては、温度変化させながら蛍光標識オリゴの蛍光変化を測定することで解離温度を認識することができる融解曲線解析を挙げることができる。
【００２８】
本発明において「核酸増幅法」とは、増幅用プライマーを用いて標的配列を含む検出領域を増幅する方法であり、その形式は特に問わない。例えば、PCR法でもよいし、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、Rolling Cycle法、SMAP法、PALSAR法のいずれであってもよい。
【００２９】
前記の「増幅用プライマー」とは、核酸増幅法で検出領域を増幅するために用いられる核酸である。増幅用プライマーの濃度は、増幅が発生する範囲で最適な濃度を検討すればよいが、一般的には100nM〜1.5μMの濃度が設定されるケースが多い。また、クランププライマーして機能する蛍光標識オリゴと同じ側にハイブリダイゼーションする増幅用プライマーの濃度は、反対側の濃度より高いほうが望ましく、好適には反対側の濃度よりも1.5〜10倍程度に設定される場合が多い。
増幅用プライマーの塩基数は、10〜40塩基が望ましく、より好ましくは15〜35塩基程度である。増幅用プライマーの配列は、標的配列を含む検出領域を核酸増幅法にて増幅可能であれば特に問わないが、Tm値は50〜70℃が好ましい。
【００３０】
本発明の測定原理は前記のごとくであるが、各種の核酸測定法に適用できる。以下にその例を示す。
【００３１】
野生型遺伝子の標的配列に相補的であるクランププライマーおよび蛍光標識オリゴとして機能するQuenching Probeと、増幅用プライマーと、標的遺伝子群を含むDNAとを、遺伝子増幅用の反応溶液に混合させる。これにより、Quenching Probeは野生型遺伝子に優先的にハイブリダイゼーションし、増幅用プライマーは野生型・変異型遺伝子に同じ効率でハイブリダイゼーションする。
【００３２】
続いて、遺伝子増幅反応により増幅用プライマーの伸長を行う。野生型遺伝子の検出領域は、Quenching Probeがハイブリダイゼーションしているため伸長が抑制され、変異型遺伝子の標的配列が含まれる検出領域が優先的に増幅される。
【００３３】
伸長反応終了後、Quenching Probe、増幅用プライマーを、それぞれに相補的な遺伝子配列に再びハイブリダイゼーションさせる。PCR反応の場合は95℃前後で熱変性を行う必要があるが、LAMP法、ICAN法などは一定温度で反応を行うことが可能である。遺伝子増幅反応のサイクルを繰り返すことで、変異型遺伝子の検出領域を選択的に増幅させることが可能である。サイクル数は30〜55サイクル程度が望ましい。
【００３４】
上記の遺伝子増幅法によって増幅された、変異遺伝子の検出領域の検出を行う。検出は、蛍光色素で3’あるいは5’末端を標識されたQuenching Probeによって行う。変異型遺伝子とは1塩基ミスマッチではあるが、増幅が優先的に行われた変異型遺伝子にハイブリダイゼーションする。次いで、蛍光色素の発光強度の温度依存性を測定する。具体的には、溶液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度について蛍光色素の発光強度を測定する。
【００３５】
蛍光色素の発光強度を温度に対してプロットしたものを融解曲線と呼ぶ。融解曲線を温度で微分することで、極値を示す温度としてQuenching Probeと変異型遺伝子、及びQuenching Probeと正常型遺伝子のTm値を求めることが可能である。このような融解曲線解析は、当業者に周知の市販のプログラムを用いて容易に行うことができる。
【００３６】
上記Quenching Probeを含む反応溶液中の蛍光色素の発光は、低温では蛍光色素の近傍にある標的配列中のグアニンによる消光現象により抑制される。温度をQuenching Probeと変異型遺伝子のTm付近まで上げると、Quenching Probeが解離し、消光の程度が弱まり蛍光強度は増加する。従って、融解曲線解析を行うことで、変異型遺伝子を容易に検出することが可能である。
【００３７】
また、標的核酸の塩基配列において、Quenching Probeに標識されている蛍光物質に対して消光作用をするグアニン塩基を持つヌクレオチドが変異している場合、いずれの温度においても蛍光の低下が生じないため、融解曲線解析において変異を特定することができる。
【００３８】
次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の単なる例示であって、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００３９】
[実施例1] JAK2遺伝子変異の高感度検出(PCR産物を標的としたモデル系)
PCR反応の鋳型として、ヒトJAK2遺伝子配列の一部のPCR産物(363bp)が、野生型遺伝子：変異型遺伝子の比率が、0：100、90:10、99：1、99.5：0.5、99.9：0.1、100：0となるよう、トータル10000 copies/μlとして調製した。各反応溶液はいずれも、鋳型DNA 1μl(10000copies)、DNAポリメラーゼとしてKOD plus DNA polymerase（東洋紡（株）社）、4種のdNTP（いずれも0.2 mM）、フォワードプライマー（配列番号1、最終濃度1.0μM）、リバースプライマー（配列番号2、最終濃度0.2 μM）、硫酸化マグネシウム溶液（最終濃度1 mM）、所定量のKOD plus polymerase、及び3’ 末端をカルボキシローダミン6G(CR6G)標識したQuenching Probe（配列番号3、最終濃度0.05 μM）を含む。なお、当該Quenching Probeは、クランププライマーおよび標的核酸検出用の蛍光標識オリゴとして機能する。各PCR反応溶液は、滅菌水で15μlにメスアップして調製した。
下記配列において、前に＋がある塩基は2’,4’-BNANC, それ以外はDNAで構成されている。
配列番号1: ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAA(29塩基)
配列番号2: CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA(30塩基)
配列番号3: +C+AC+A+G+A+C+A+C+AT+A+C+T+C+C(16塩基)−CR6G
【００４０】
上記反応溶液をリアルタイムPCR装置(Rotor-Gene(Qiagen社))を用いて以下のPCR反応に供した。
(1)熱変性工程：95℃、300秒間
(2)熱変性工程：95℃、10秒間
(3)アニーリング工程：60℃、30秒間
(4)伸長工程：68℃、20秒間
(5)昇温工程：50〜99℃
(1)の熱変性工程の後、工程(2)~(4)を50サイクル繰り返した。(5)の昇温工程において蛍光強度を測定し、図２に示す融解曲線を得た。図中、変異率0%、0.1％、1％、100％の標的核酸を含む溶液の融解曲線をそれぞれA,B,C,D、標的核酸を含まない溶液の融解曲線をEで示す。また、これらの融解曲線の負の一次微分曲線を図３に示す。
【００４１】
実験の結果、本発明のQuenching Probeを用いて融解曲線分析を行うことにより、図３のB,C,Dで示される融解曲線の負の一次微分曲線において、上記Quenching Probeと標的核酸との複合体の融解温度にて極小を示すピークが得られた一方、A,Eで示される融解曲線の負の一次微分曲線においてはピークが検出されなかった。
このことより、上記Quenching Probeを用いることで、JAK2遺伝子群において変異が0.1%でも含まれていれば、それを明確に検出できることが明らかとなった。
【００４２】
[実施例2] JAK2遺伝子変異の高感度検出(実サンプル)
PCRの鋳型DNAとして、骨髄増殖性腫瘍患者の血液からゲノムDNAを抽出して用いた。なお、DNA抽出はQIAamp DNA Mini Kit(Qiagen社)を用いて行った。各反応溶液はいずれも、PPD mix(東洋紡社)、PPD mixに溶解したフォワードプライマー(配列番号1、最終濃度1.2μM)、リバースプライマー(配列番号4、最終濃度0.2μM)及び3’ 末端をカルボキシローダミン6G(CR6G)標識したQuenching Probe（配列番号5、最終濃度0.12μM）の混合溶液を2.4μl、KOD mix(東洋紡社)を3.6μl、ゲノムDNA30ngを含む溶液および滅菌水を6μl、計12μlとなるよう調製した。なお、当該Quenching Probeは、[実施例1]と同様、クランププライマーおよび標的核酸検出用の蛍光標識オリゴとして機能する。
下記配列において、前に＋がある塩基は2’,4’-BNANC, それ以外はDNAで構成されている。
配列番号4：CACCTAGCTGTGATCCTGAA(20塩基)
配列番号5：+C+AC+AG+A+C+AC+AT+AC+TC+C(16塩基)−CR6G
【００４３】
上記反応溶液を遺伝子解析装置(GENECUBE, 東洋紡社製)を用いて以下のPCR反応に供した。
(1)熱変性工程：95℃、30秒間
(2)熱変性工程：95℃、2秒間
(3)アニーリング工程：60℃、3秒間
(4)伸長工程：68℃、5秒間
(5)昇温工程：40〜99℃
(1)の熱反応工程の後、工程(2)〜(4)を55サイクル繰り返した。(5)の昇温工程において蛍光強度を測定し、融解曲線を得た。融解曲線の負の一次微分曲線を図４に示す。図中、sample1, 2, 3の標的核酸を含む溶液の融解曲線の負の一次微分曲線をそれぞれA、B、C、標的核酸を含まない溶液の融解曲線の負の一次微分曲線をDで示す。
【００４４】
実験の結果、本発明のQuenching Probeを用いて融解曲線分析を行うことにより、図４のAで示される融解曲線の負の一次微分曲線において、上記Quenching Probeと正常型遺伝子との複合体の融解温度にて極小を示すピークが得られた一方、Bで示される融解曲線の負の一次微分曲線においては、Quenching Probeと正常型、変異型両方の複合体の融解温度にて極小を示すピークが得られCで示される融解曲線の負の一次微分曲線においては、Quenching Probeと変異型の複合体の融解温度にて極小を示すピークが得られた。またDで示される融解曲線の負の一次微分曲線においては、ピークが検出されなかった。
【００４５】
本手法、次世代シーケンサーでの判別結果、および半定量的解析で見積もられた変異率を表1に示す。変異率が0.1%以下と考えられる2つのサンプル(A, B)において、次世代シーケンサーと同じ判別結果が得られた。このことより、上記Quenching Probeを用いることで、JAK2遺伝子の0.1%でも変異が見られれば、ゲノムDNA中から変異を検出可能であると考えられる。
【表１】
0005813263.tif 000002
【００４６】
[実施例３] 異なる人工核酸を用いた検討(実サンプル)
異なる人工核酸を用いた場合の本法の有効性を確認する目的で、2’,4’-BNANC、PNA、LNA、天然DNAにて構成されたQuenching Probeを用いて実験を行った。具体的には、本実施例で用意したQuenching Probeは、[実施例１]の配列番号３における+で示した塩基を、2’,4’-BNANC、PNA、LNA、天然DNAとして、合計４本合成した。Quenching Probeを同一とした。なお、当該Quenching Probeは、[実施例1]、[実施例2]と同様、クランププライマーおよび標的核酸検出用の蛍光標識オリゴとして機能する。
【００４７】
実験の結果を表-2に示す。
蛍光標識オリゴを用いた場合に検出可能であった変異遺伝子割合は、2’,4’-BNANCと天然核酸（DNA）で構成されたQuenching Probe＞LNAと天然核酸で構成されたQuenching Probe＞PNAと天然核酸で構成されたQuenching Probe＞全て天然核酸（DNA）で構成されたQuenching Probeの順で低かった。このことから、本実施例の標的核酸のように配列の違いが僅かである場合（具体的には1塩基変異の場合）は、人工核酸の使用が好ましいことが示唆された。また、変異遺伝子の検出限界は、人工核酸種によっても異なり、検討した人工核酸において2’,4’-BNANCが最も機能性が高いことが示唆された。
【表２】
0005813263.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、遺伝子変異の検出に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
＜配列番号１＞
配列番号１は、実施例１で用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、実施例１で用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、実施例１で用いたQuenching Probeの塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、実施例２で用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、実施例２で用いたQuenching Probeの塩基配列を示す。
【要約】
【課題】野生型遺伝子を多く含む遺伝子群中における変異遺伝子を高感度に、かつ迅速・簡便に検出することができる手法を提供すること。
【解決手段】遺伝子多型が複数存在する可能性のある遺伝子あるいは検体を対象として、検査対象とする遺伝子型を特異的に検出することを目的とした核酸の測定方法において、蛍光色素で標識されたオリゴが、検査対象以外の遺伝子型にハイブリダイズすることで、当該遺伝子型の遺伝子増幅を抑制するとともに、上記と同一の蛍光標識オリゴを、上記と同一の遺伝子増幅工程において増幅された検査対象の遺伝子型に由来する増幅産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後での蛍光色素の蛍光強度変化から、検査対象の遺伝子型を特異的に検出することを特徴とする核酸の測定方法。前記方法に使用可能な蛍光標識オリゴヌクレオチドも提供される。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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