(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒｓ８１０３１４２またはｒｓ１２９７９８６０のＳＮＰを検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の工程
（Ａ）被検核酸を、配列番号４のフォワードプライマーと配列番号７のリバースプライマーからなるプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅して調製し、得られた被検核酸と配列番号１のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（Ｂ）被検核酸を、配列番号６のフォワードプライマーと配列番号９のリバースプライマーからなるプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅して調製し、得られた被検核酸と配列番号３のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【請求項２】
ｒｓ８１０３１４２またはｒｓ１２９７９８６０のＳＮＰを検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の工程
（Ａ）被検核酸を、配列番号４のフォワードプライマーと配列番号７のリバースプライマーからなるプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅して調製し、得られた被検核酸と配列番号１のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（Ｂ）被検核酸を、配列番号６のフォワードプライマーと配列番号９のリバースプライマーからなるプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅して調製し、得られた被検核酸と配列番号３のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、前記プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴う蛍光強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【請求項３】
配列番号１のプローブまたは配列番号３のプローブが検出可能な標識物質により標識化されたものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
検出可能な標識物質が蛍光色素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
末端のシトシンが標識化された、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸増幅法によりｒｓ８１０３１４２またはｒｓ１２９７９８６０のＳＮＰが含まれる領域を増幅するためのプライマー対であって、下記（１）または（２）で構成されるプライマー対。
（１）配列番号４のフォワードプライマーと配列番号７のリバースプライマーからなるプライマー対
（２）配列番号６のフォワードプライマーと配列番号９のリバースプライマーからなるプライマー対
【請求項８】
核酸増幅法を利用してｒｓ８１０３１４２またはｒｓ１２９７９８６０のＳＮＰを検出するためのプライマー対およびプローブの組合せであって、下記（１）または（２）で構成される組合せ。
（１）配列番号４のフォワードプライマーと配列番号７のリバースプライマーからなるプライマー対、および、配列番号１のプローブ
（２）配列番号６のフォワードプライマーと配列番号９のリバースプライマーからなるプライマー対、および、配列番号３のプローブ
【請求項９】
請求項１から６のいずれかに記載の方法に用いるための変異検出キットであって、請求項７に記載のプライマー対を含む変異検出キット。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれかに記載の方法に用いるための変異検出キットであって、請求項
項８に記載のプライマー対およびプローブの組合せを含む変異検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型慢性肝炎の治療率に関与する一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）を検出するためのプローブ、ならびに、該プローブを用いたＳＮＰの検出方法およびＳＮＰを検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ；ＨＣＶ）は感染者の７０〜８０％が慢性肝炎に移行すると言われている。さらに、慢性肝炎から肝硬変や肺がんへと移行する例も多数報告されている。
【０００３】
Ｃ型肝炎の代表的な治療法としてペグインターフェロン＋リバビリン（ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ）併用療法がある。しかし、この治療法の効果には個人差があることが知られてきた。
【０００４】
ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ治療効果に個人差が生じる理由として、ＩＬ２８Ｂ遺伝子周辺のＳＮＰが関係あることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２、特許文献１）。
【０００５】
特許文献１にはＳＮＰ検査の実施例が記載されている。特許文献１ではシークエンス法やＤｉｇｉＴａｇ２法という方法を用いている。シークエンス法は一般的に検体となるヒト遺伝子を核酸増幅し、その増幅産物の配列を同定するという方法で行う。しかし、この方法では核酸増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる誤診が発生するという懸念がある。また、検査開始から結果判明までに数時間から１日の期間が必要である。
【０００６】
ＤｉｇｉＴａｇ２法は２本のプローブを用いて検出する方法である。プローブを用いる方法は核酸増幅と検出を同じ閉鎖系で行えばコンタミネーションを防ぐことができる。しかしＤｉｇｉＴａｇ２法や蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用した方法では、検出には２本以上のプローブが必要であり、コストがかかるという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−４１５２６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｅ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６１，３９９−４０１，２００９
【非特許文献２】Ｔａｎａｋａ  Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４１，１１０５−１１０９，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記従来のＣ型肝炎治療に関するＳＮＰ検査における問題点を解決しようとするものであり、その目的は該ＳＮＰ検査を迅速、正確、かつ安価に行うための方法及び試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、Ｃ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰおよびその周辺の塩基配列に特異的に結合する１本の核酸プローブを用いることにより従来技術よりも正確に該ＳＮＰを検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１１】
［項１］
Ｃ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰを検出するためのプローブであって、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列を有するプローブ。
［項２］
検出可能な標識物質により標識化された、項１に記載のプローブ。
［項３］
検出可能な標識物質が蛍光色素である、項２に記載のプローブ。
［項４］
末端のシトシンが標識化された、項２または３に記載のプローブ。
［項５］
Ｃ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰを検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
［項６］
項５に記載の方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、前記プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴う蛍光強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
［項７］
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、項５または６に記載の方法。
［項８］
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、項７に記載の方法。
［項９］
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、項７または８に記載の方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号４〜６のいずれかで示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号７〜９のいずれかで示されるオリゴヌクレオチド
［項１０］
核酸増幅法によりＣ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰを増幅するためのプライマー対であって、下記（１）〜（３）のいずれかで構成されるプライマー対。
（１）配列番号４および配列番号７のそれぞれに示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対
（２）配列番号５および配列番号８のそれぞれに示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対
（３）配列番号６および配列番号９のそれぞれに示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対
［項１１］
項５に記載のＣ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰを検出する方法に用いるための変異検出キットであって、項１〜４のいずれかに記載のプローブを含む変異検出キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｃ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰ検査を迅速、正確かつ簡便に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【図３】実施例３の結果を示す図である。
【図４】実施例４の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態の一つは、Ｃ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰを検出するためのプローブであって、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列を有するプローブである。
【００１５】
本発明の「Ｃ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰ」とは、Ｃ型肝炎の治療，特にインターフェロン療法、中でもＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ併用療法の治療効果を予測できるＳＮＰであって、より具体的には、ｒｓ８１０３１４２、ｒｓ８０９９９１７ｒｓ１２９７９８６０で示される三つのＳＮＰである。
【００１６】
この三つのＳＮＰはいずれもＩＬ２８Ｂ遺伝子またはその周辺に存在する。ｒｓ８１０３１４２およびその周辺の塩基配列は配列番号１０で示される。ｒｓ８１０３１４２は配列番号１０の３８９番目の塩基にあたり、配列番号１０ではｙ（Ｔ／Ｃ）で示される。ｒｓ８０９９９１７およびその周辺の塩基配列は配列番号１１で示される。ｒｓ８０９９９１７は配列番号１１の３０１番目の塩基にあたり、配列番号１１ではｋ（Ｔ／Ｇ）で示される。ｒｓ１２９７９８６０及びその周辺の塩基配列は配列番号１２で示される。ｒｓ１２９７９８６０は配列番号１２の３０１番目の塩基にあたり、配列番号１２ではｙ（Ｃ／Ｔ）で示される。なお、上記ＳＮＰを表す番号（ｒｓ番号）や、配列表に記載の配列は、ＮＣＢＩのデータベース（Ｂｕｌｉｄ  ３５）に掲載されているヒトの遺伝子配列情報を参照している。
【００１７】
本発明のプローブは、各被検核酸に対して１本ずつ特異的に結合するように設計されており、融解曲線分析に適している。
特許文献１に開示されている方法は、検出に２本以上のプローブを要し本発明とは全く異なる原理で被検核酸を検出する方法であるから、該方法に用いられているプローブを本発明に直接転用することは出来ないし、参考にすることも出来ない。
【００１８】
配列番号１で示される本発明のプローブは、ｒｓ８１０３１４２を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、なおかつｒｓ８１０３１４２がマイナーアリルであるチミンの場合にアンチセンス鎖と完全な相補鎖となるように設計されていて、アンチセンス鎖におけるＳＮＰを確認できる。
【００１９】
配列番号２で示される本発明のプローブは、ｒｓ８０９９９１７を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、なおかつｒｓ８０９９９１７がマイナーアリルであるグアニンの場合にアンチセンス鎖と完全な相補鎖となるように設計されていて、アンチセンス鎖におけるＳＮＰを確認できる。
【００２０】
配列番号３で示される本発明のプローブは、ｒｓ１２９７９８６０を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、なおかつｒｓ１２９７９８６０がメジャーアリルであるグアニンの場合にアンチセンス鎖と完全な相補鎖となるように設計されていて、アンチセンス鎖におけるＳＮＰを確認できる。
【００２１】
本発明のプローブは、配列番号１から３のいずれかに示される核酸配列が好ましいが、ｒｓ８１０３１４２、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ１２９７９８６０のいずれかのＳＮＰを含む１０塩基以上３０塩基以下の核酸配列またはこれに相補的な核酸配列であれば、特に限定されない。
【００２２】
本発明のプローブは、標識物質で標識化された標識化プローブであってもよい。好ましくは、蛍光色素によって標識された核酸プローブ、さらに好ましくは、末端が蛍光色素によって標識された核酸プローブを使用できる。
【００２３】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されたプローブであることが好ましい。前記標識物質は、制限されないが、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例として、例えば、前記蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００２４】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００２５】
本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００２６】
本発明のプローブは、前述のように、Ｃ型肝炎治療に関するＳＮＰの検出に使用することができる。この変異の検出方法は、何ら制限されず、被検核酸と前記プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。
【００２７】
本発明の実施形態の一つは、Ｃ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰを検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含むことを特徴とする方法である。
Ｃ型肝炎の治療率に関与すると言われるＳＮＰを検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【００２８】
本発明のＳＮＰ検出方法によれば、配列番号１〜３のいずれかのプローブを使用することでそれぞれｒｓ８１０３１４２、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ１２９７９８６０のＳＮＰを検出できる。
【００２９】
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００３０】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前記試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、変異検出の精度を向上できることから、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物があげられる。これらの増幅産物を、本発明における被検核酸としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜３００塩基である。
【００３１】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、白血球細胞等の血球試料、全血試料、口腔拭い液、咽頭拭い液等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３２】
本発明の方法で用いる融解曲線分析について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００３３】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。
前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。標識化プローブにおける標識物質は、例えば、前述のとおりである。
好ましい標識物質は、蛍光色素である。標識物質に蛍光色素を用いた場合、上記方法において、前記プローブに付加した蛍光色素のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行い、この工程における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定することができる。
【００３４】
前述のように、被検核酸が、鋳型核酸から核酸増幅法により増幅させた増幅産物である場合、前記工程（１）は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から核酸を増幅する工程を含んでも良い。言い換えれば、前記工程（１）における被検核酸は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物であっても良い。
【００３５】
前記プライマー対としては、ＩＬ２８Ｂ遺伝子および／またはＩＬ２８Ｂ遺伝子周辺領域の本発明のプローブがハイブリダイズ可能な領域が特異的に増幅されるものであれば、特に制限されない。前記増幅領域は、例えば、前記プローブがハイブリダイズする領域のみでもよいし、前記ハイブリダイズ領域を含む領域であってもよい。
【００３６】
具体的には、例えば、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーが例示できる。
（Ｆ）塩基配列が配列番号４〜６のいずれかで示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号７〜９のいずれかで示されるオリゴヌクレオチド
【００３７】
前記核酸増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００３８】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００３９】
本発明プローブが含まれる反応系でＩＬ２８Ｂ遺伝子および／またはＩＬ２８Ｂ遺伝子周辺領域を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＩＬ２８Ｂ遺伝子および／またはＩＬ２８Ｂ遺伝子周辺領域またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＩＬ２８Ｂ遺伝子および／またはＩＬ２８Ｂ遺伝子周辺領域と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００４０】
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’→  ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＩＬ２８Ｂ遺伝子および／またはＩＬ２８Ｂ遺伝子周辺領域と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００４１】
他方、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’→  ３’エキソヌクレアーゼ活性は持たず、３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００４２】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製、商標）を用いることが好ましい。
【００４３】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績製、登録商標）」、「ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、商標）」、「ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。
【００４４】
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００４５】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：  ４０ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ          塩化マグネシウム
１５ｍＭ          ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ：  ２μｇ／μｌ      活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：  １．５ｍＭ        ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔  ３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ：  ２０％            トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：  １μｇ／μｌ      キャリアーＤＮＡ
【００４６】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８  ａｔ  ２５℃），  １０ｍＭ  ＫＣｌ，  ６ｍＭ  硫酸アンモニウム，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．００１％  ＢＳＡ，５  μｇ  トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００４７】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成速度とは単位時間当たりのＤＮＡの合成数をいう。ＤＮＡ合成速度は、市販品であれば該市販品の説明書等に記載されている値、説明書等に記載がない場合は文献等に記載されている値を指すものとする。これらの方法で特定できない場合は、以下の方法で求めることができる。
【００４８】
ＤＮＡ合成速度の測定法
ＤＮＡポリメラーゼの反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），８ｍＭ塩化マグネシウム、７．５ｍＭ ジチオスレイトール、１００ μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＣｉ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液（５０ｍＭ 水酸化ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ フィコール、０．０５％ ブロモフェノールブルー）を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求める。
【００４９】
次に、本発明の変異検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、以下の説明によって何ら制限されることはない。
【００５０】
まず、例えば全血からゲノムＤＮＡを単離する。単離は、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを用いて行うことができる。
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、標識化プローブとして、例えば、ＱＰｒｏｂｅを添加する。
【００５１】
前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述する増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、前記工程（２）とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
【００５２】
前記プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００５３】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５４】
ＰＣＲのプライマーの配列は、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅できるものであれば特に制限されず、前述のように、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜４０ｍｅｒ）に設定できる。
【００５５】
本発明の検出方法に使用するプライマーセットとしては、例えば、前述の本発明のプライマーセットがあげられる。なお、本発明のプライマーセットの用途は、本発明の検出方法には制限されず、また、本発明の検出方法に使用するプライマーセットも、本発明のプライマーセットには限定されない。
【００５６】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００５７】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００５８】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００５９】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜１μｍｏｌ／Ｌである。
【００６０】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６１】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００６２】
目的の塩基部位における遺伝子型（野生型、変異型など）の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００６３】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６４】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【実施例】
【００６５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６６】
〔実施例１：精製したヒトゲノムからのｒｓ８１０３１４２の検出〕
（１）試料の調製
既にｒｓ８１０３１４２がメジャーホモ（Ｔ／Ｔ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＭ）、ｒｓ８１０３１４２がヘテロ（Ｔ／Ｃ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＨ）、そしてｒｓ８１０３１４２がマイナーホモ（Ｃ／Ｃ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下Ｈｍ）を試料とし、陰性コントロール（ＮＣ）として１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりｒｓ８１０３１４２を検出した。核酸増幅および融解曲線分析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００６７】
試薬
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号４）  ３００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号７）  １５００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）  ３００ｎＭ
×１０緩衝液  １．３μｌ
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ
ＢＳＡ  １．３μｇ
ＤＭＳＯ  ０．９８μＬ
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製）  ０．４Ｕ
試料  ４μｌ
【００６８】
核酸増幅および融解曲線分析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００６９】
結果
図１は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。ＨＭは５７〜５８℃にピークが現れており、Ｈｍは６７℃付近でピークが現れている。そしてＨＨはその両方の温度でピークが現れている。本実施例で用いた配列番号１のプローブは末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識されている。このプローブは相補的な配列の核酸と結合している間は蛍光が消光しており、逆にプローブが単独で遊離している間は蛍光が発光しているという特徴を有する。配列番号１のプローブはマイナーホモのｒｓ８１０３１４２を含む核酸と最も強く結合し、メジャーホモのｒｓ８１０３１４２を含む核酸とは一塩基のミスマッチが生じているため、より弱く結合する。従って、図１の５７〜５８℃でのピークは被検核酸中のｒｓ８１０３１４２がメジャーアリルであることを示しており、６７℃付近のピークは被検核酸中のｒｓ８１０３１４２がマイナーアリルであることを示している。そしてその両方のピークを発した被検核酸はメジャーアリルとマイナーアリルの両方を有するヘテロであることを示している。
以上より、本発明プローブを用いることでｒｓ８１０３１４２のアリルを容易に識別できることが示された。
【００７０】
〔実施例２：精製したヒトゲノムからのｒｓ８０９９９１７の検出〕
（１）試料の調製
既にｒｓ８０９９９１７がメジャーホモ（Ｔ／Ｔ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＭ）、ｒｓ８０９９９１７がヘテロ（Ｔ／Ｇ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＨ）、そしてｒｓ８０９９９１７がマイナーホモ（Ｇ／Ｇ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下Ｈｍ）を試料とし、陰性コントロール（ＮＣ）として１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりｒｓ８０９９９１７を検出した。核酸増幅および融解曲線分析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７１】
試薬
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号５）  ５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号８）  ２５００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号２、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）  ２５０ｎＭ
×１０緩衝液  １．３μｌ
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ
ＢＳＡ  １．３μｇ
ＤＭＳＯ  ０．９８μＬ
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製）  ０．４Ｕ
試料  ４μｌ
【００７２】
核酸増幅および融解曲線分析
実施例１と同じ。
【００７３】
結果
図２は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。ＨＭは５４℃付近にピークが現れており、Ｈｍは６１℃付近でピークが現れている。そしてＨＨはその両方の温度でピークが現れている。本実施例で用いた配列番号２のプローブは末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識されている。このプローブは相補的な配列の核酸と結合している間は蛍光が消光しており、逆にプローブが単独で遊離している間は蛍光が発光しているという特徴を有する。配列番号２のプローブはマイナーホモのｒｓ８０９９９１７を含む核酸と最も強く結合し、メジャーホモのｒｓ８１０３１４２を含む核酸とは一塩基のミスマッチが生じているため、より弱く結合する。従って、図２の５４℃付近でのピークは被検核酸中のｒｓ８０９９９１７がメジャーアリルであることを示しており、６１℃付近のピークは被検核酸中のｒｓ８０９９９１７がマイナーアリルであることを示している。そしてその両方のピークを発した被検核酸はメジャーアリルとマイナーアリルの両方を有するヘテロであることを示している。
以上より、本発明プローブを用いることでｒｓ８０９９９１７のアリルを容易に識別できることが示された。
【００７４】
〔実施例３：精製したヒトゲノムからのｒｓ１２９７９８６０の検出〕
（１）試料の調製
既にｒｓ１２９７９８６０がメジャーホモ（Ｃ／Ｃ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＭ）、ｒｓ１２９７９８６０がヘテロ（Ｃ／Ｔ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＨ）、そしてｒｓ１２９７９８６０がマイナーホモ（Ｔ／Ｔ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下Ｈｍ）を試料とし、陰性コントロール（ＮＣ）として１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりｒｓ１２９７９８６０を検出した。核酸増幅および融解曲線分析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７５】
試薬
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号６）  ３００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号９）  １５００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）  ３００ｎＭ
×１０緩衝液  １．３μｌ
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ
ＢＳＡ  １．３μｇ
ＤＭＳＯ  ０．９８μＬ
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製）  ０．４Ｕ
試料  ４μｌ
【００７６】
核酸増幅および融解曲線分析
実施例１と同じ。
【００７７】
結果
図３は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。ＨＭは６２℃付近にピークが現れており、Ｈｍは４８℃付近でピークが現れている。そしてＨＨはその両方の温度でピークが現れている。本実施例で用いた配列番号３のプローブは末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識されている。このプローブは相補的な配列の核酸と結合している間は蛍光が消光しており、逆にプローブが単独で遊離している間は蛍光が発光しているという特徴を有する。配列番号３のプローブはメジャーホモのｒｓ１２９７９８６０を含む核酸と最も強く結合し、マイナーホモのｒｓ１２９７９８６０を含む核酸とは一塩基のミスマッチが生じているため、より弱く結合する。従って、図３の４８℃付近でのピークは被検核酸中のｒｓ１２９７９８６０がマイナーアリルであることを示しており、６２℃付近のピークは被検核酸中のｒｓ１２９７９８６０がメジャーアリルであることを示している。そしてその両方のピークを発した被検核酸はメジャーアリルとマイナーアリルの両方を有するヘテロであることを示している。
以上より、本発明プローブを用いることでｒｓ１２９７９８６０のアリルを容易に識別できることが示された。
【００７８】
〔実施例４：全血希釈液からのｒｓ８０９９９１７の検出〕
（１）試料の調製
全血１０μｌに１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を９０μｌ加えて、希釈倍率１０倍の全血希釈液を調製した。この全血希釈液を試料とした。検出系は１０μｌであり、試料は１μｌを供するため、検出系での全血の終濃度は１％となる。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記全血希釈液に下記試薬を添加して、下記条件によりｒｓ８０９９９１７を検出した。核酸増幅および融解曲線分析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７９】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号５）  ５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号８）  ２５００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号２、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）  ２５０ｎＭ
×１０緩衝液  １μｌ
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ
ＢＳＡ  １μｇ
ＤＭＳＯ  ０．７５μＬ
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製）  ０．３Ｕ
試料  １μｌ
【００８０】
核酸増幅および融解曲線分析
実施例１と同じ。
【００８１】
結果
図５は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。図５から明らかなように、本発明プローブを用いることによって全血の希釈液からでもｒｓ８０９９９１７を検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明をＣ型肝炎治療に関するＳＮＰ検査およびＣ型肝炎治療に関するＳＮＰ検査試薬開発に適用することで、迅速、確実かつ簡便な慢性骨髄増殖性疾患関連遺伝子の変異検出を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0005831093.tif 000004
【図４】
0005831093.tif 000005
【配列表】
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