(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）及びイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を含んでなる、ワクチン組成物。
【請求項２】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを更に含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
ｐ６８パータクチン抗原を更に含んでなる、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａが、バクテリン又は細菌抽出物である、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）及びイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）から選択される一つ又は両方の抗原を更に含んでなる、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
当該一つ又は両方の抗原が、ＣＰＩＶ及びＣＡＶ−２である、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
単離されたＢｓｐ２２抗原を更に含んでなる、請求項２ないし６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記組成物が、アジュバント非添加である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
アジュバントを更に含んでなる、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、非呼吸器抗原を含有しない、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、イヌにおけるイヌ呼吸器病原体に対する免疫反応を誘発する、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記イヌ呼吸器病原体が、ＣＩＶ、ＣＲＣｏＶ、ＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓ（Ｍ．ｃｙｎｏｓ）の少なくとも一つである、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
イヌにおけるイヌ呼吸器病原体による感染の治療又は予防のための、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１４】
前記イヌ呼吸器病原体が、ＣＩＶ、ＣＲＣｏＶ、ＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、及びＭ．ｃｙｎｏｓの少なくとも一つである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記組成物が、６ヶ月又はそれより多い期間、前記感染を予防する、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記組成物が、１年の期間、前記感染を予防する、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１７】
イヌにおけるイヌ呼吸器病原体による感染の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１８】
前記組成物が、イヌにおけるイヌ感染性呼吸器病症候群（ＣＩＲＤＣ）を治療又は予防する、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
イヌにおけるＣＩＲＤＣの治療又は予防方法であって、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物を、前記イヌに投与することを含んでなる、方法。
【請求項２０】
前記組成物が、６ヶ月又はそれより多い期間、ＣＩＲＤＣを予防する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、１年の期間、ＣＩＲＤＣを予防する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
イヌにおけるＣＩＲＤＣの治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項２３】
前記ＣＩＶがＰＴＡ−７６９４としてＡＴＣＣに寄託されており、かつ前記ＣＲＣｏＶがＰＴＡ−１１４４４としてＡＴＣＣに寄託されている、請求項１に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に、そして特に免疫原性及びワクチン組成物の分野に関する。これは、イヌ感染性呼吸器病症候群（ＣＩＲＤＣ）を含むイヌの呼吸器病に対して使用するためのような組成物に関する。本発明は、更にイヌにおけるイヌ呼吸器病に対するワクチン接種、治療、又は予防のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌ感染性呼吸器病症候群（ＣＩＲＤＣ）は、リホーミングセンター及び寄宿又は訓練犬舎のような混雑した条件に収容されたイヌに一般的な、非常に伝染性の疾病である。多くのイヌは、軽い咳のみにかかり、そして短時間の後回復する。然しながら、ある場合には、重度の気管支肺炎を発症し得る。
【０００３】
ＣＩＲＤＣの病変形成は、多因子性であると考えられ、いくつかのウイルス及び細菌に関係する。ＣＩＲＤＣの原因病原体であることが知られた感染性病原体は、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）（Ｅｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１０（２）：２１６−２２３，２００３）、イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０（５７４７）：４８２−４８５，２００５）、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）（Ｂｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２６：１４０−１４５，１９６７）、イヌアデノウイルス血清型２（ＣＡＶ−２）（Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．，３：２３８−２４７，１９６２）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓ（Ｃｈａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：３４９１−３４９７，２００４）、及び細菌Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（Ｂｅｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２９：４８−５２，１９７７）を含む。
【０００４】
ＣＲＣｏＶは、非常に伝染性の呼吸器感染を起こし、これは、直接のイヌ−イヌの接触、呼吸器分泌物のエアゾール、及び汚染された環境又はヒトとの接触によって蔓延する。幾つかのイヌは、咳、くしゃみ、及び鼻汁からなる徴候を伴う軽度の疾病を有する。幾つかのイヌは、臨床的徴候を示さない無症状感染を有するが、なお彼らは他のイヌに感染することができるウイルスを排出する。ＣＲＣｏＶに感染した幾つかのイヌは、特に他の呼吸器病原体に同時感染した場合、肺炎に進行する。
【０００５】
ＣＩＶに関して、ウマインフルエンザウイルスは、ウマにおける主要な呼吸器病原体として１９５６年頃から認識されている。ウマインフルエンザウイルスによって起こされる疾病の徴候は、重度であり得、そしてしばしば続いて二次細菌感染がある。ウマインフルエンザウイルスの二つのサブタイプ、即ちサブタイプ−１、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）となる原型、及びサブタイプ−２、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｍｉａｍｉ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）となる原型が認識されている。現時点で、優勢なウイルスのサブタイプは、サブタイプ−２、Ｈ３Ｎ８株である。インフルエンザウイルス、Ｈ３Ｎ８ウマインフルエンザウイルスは、イヌに感染することが可能であり、ある場合には３６％のように高い致死率を伴う。一つの説明は、イヌへのウマインフルエンザウイルスの完全な又は部分的な種間転移が、急性の呼吸器病を伴う新しいイヌ特異的インフルエンザウイルスをもたらすことである（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００６】
ＣＰＩＶによって起こされる疾病は、上部気道において一般的である。単独のＣＰＩＶによって起こされる疾病は、軽度又は無症状であり得るが、他の呼吸器系病原体による同時感染が起こった場合、更に重度となる徴候を伴う。
【０００７】
ＣＡＶ−２は、呼吸器病を起こし、これは、重度な場合、肺炎及び気管支肺炎を含み得る。
【０００８】
Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、呼吸器病の気管気管支炎又は“ケンネルコフ”の一次病原体であると報告されている。これは、イヌを他の呼吸器病原体の影響を受けやすくし、そしてしばしばこれらと同時に存在する。ケンネルコフは、典型的には上部気道の症状であり、そして鼻汁及び咳によって特徴づけられる。今日までに、ノビバック（登録商標）、Ｂｒｏｎｃｈｉ−Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）、Ｂｒｏｎｃｈｉｃｉｎｅ（登録商標）ＣＡｅ、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）Ｂ、Ｕｎｉｖａｃ  ２、Ｒｅｃｏｍｂｉｔｅｋ（登録商標）ＫＣ２、ＮａｒａｍｕｎｅＴＭ−２及びＫｅｎｎｅｌ−ＪｅｃＴＭ２を含む多くのワクチンが、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａによって起こされる気管気管支炎の治療のために使用可能である。然しながら、既存の商業的なワクチンの大多数は、面倒な鼻腔内投与、並びにアジュバントの添加を必要とし、これは、灼熱感及び刺激のような有害な副作用をもたらし得る。Ｖｉｅｒａ  Ｓｃｈｅｉｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｘｕｓ  Ｄｅｃ  ２０００（Ｖｏｌ  ８，Ｎｏ１）。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのｐ６８タンパク質（パータクチン）の使用を含むもののようなサブユニットワクチンが開発されているが、恐らくは不十分な免疫原性、不都合な反応、及び／又は製剤の安定性のために、今日までいずれの商業的なイヌのワクチンにも含まれていない。
【０００９】
ＣＩＲＤＣの病態は、これが肺の損傷に、そしてある場合には気管支肺炎に関係するが、しかし主として上部気道の変化に関係するケンネルコフ（一次病原体：Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）とは区別されることを示す。ケンネルコフは、ＣＩＲＤＣより軽度の症候群であり、そしてＣＩＲＤＣにおいて注目される広い範囲の病態を持たない。ＣＩＲＤＣは、更に重篤度及び死亡率の増加によって識別される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｅｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１０（２）：２１６−２２３，２００３；
【非特許文献２】Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０（５７４７）：４８２−４８５，２００５；
【非特許文献３】Ｂｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２６：１４０−１４５，１９６７；
【非特許文献４】Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．，３：２３８−２４７，１９６２；
【非特許文献５】Ｃｈａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：３４９１−３４９７，２００４；
【非特許文献６】Ｂｅｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２９：４８−５２，１９７７；
【非特許文献７】Ｖｉｅｒａ  Ｓｃｈｅｉｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｘｕｓ  Ｄｅｃ  ２０００（Ｖｏｌ  ８，Ｎｏ１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＣＩＲＤＣは、致命的であることはめったにないが、しかしこれは、救助センターにおけるイヌのリホーミングを遅らせ、訓練犬舎における計画を妨害し、そしてかなりな治療費及び福利的不安をもたらす。ワクチンは、ＣＩＲＤＣに関わる感染性病原体の幾つかに対して使用可能である。然しながら、これらのワクチンの使用にもかかわらず、ＣＩＲＤＣは、恐らくはＣＩＲＤＣに関係する全ての感染性病原体に対して有効なワクチンの欠如のために、なお世界中に蔓延している。
【００１２】
従って、有害な副作用又は混合ワクチン中の他の抗原との干渉を伴わずに、ＣＩＲＤＣを起こす病原体に対する長時間作用型の免疫防御を提供する、イヌへ安全に投与することが可能な免疫原性組成物に対する必要性が残っている。本発明の開示は、これらの及び他の関連する必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は、一般的にＣＩＲＤＣを治療又は予防する抗原を提供する免疫原性組成物に関する。一つの態様において、免疫原性組成物は、イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）及びイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を含んでなる。もう一つの態様において、免疫原性組成物は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを更に含んでなる。もう一つの態様において、免疫原性組成物は、単離されたパータクチン抗原を更に含んでなる。もう一つの態様において、免疫原性組成物は、ｐ６８パータクチン抗原を含んでなる。もう一つの態様において、パータクチン抗原は、組換えタンパク質である。なおもう一つの態様において、パータクチン抗原は、約１μｇないし約３０μｇ間で存在する。もう一つの態様において、前記パータクチン抗原は、尿素中のパータクチン封入体を可溶化し、そして所望によりカラムクロマトグラフィーによって精製することによって調製される。前記パータクチン抗原は、可溶性であり、そして好ましくは実質的に凝集物を含まない。もう一つの態様において、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、バクテリン又は細菌抽出物である。
【００１４】
もう一つの態様において、免疫原性組成物は、ＣＩＶ、ＣＲＣｏＶ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ並びにイヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）及びイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）から選択される一つ又は両方の抗原を含んでなる。もう一つの態様において、前記免疫原組成物は、ｐ６８パータクチン抗原を更に含んでなる。もう一つの態様において、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、バクテリン又は細菌抽出物である。
【００１５】
もう一つの態様は、ＣＩＶ、ＣＲＣｏＶ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及び単離されたパータクチン抗原を含んでなるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ成分、並びにイヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）及びイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）から選択される一つ又は両方の抗原を含んでなる免疫原性組成物を提供する。更なる態様において、免疫原性組成物は、ＣＰＩＶ及びＣＡＶ−２の両方を含んでなる。
【００１６】
もう一つの態様において、前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物は、単離されたＢｓｐ２２抗原を更に含んでなる。
【００１７】
もう一つの態様において、前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物は、アジュバントを含まない。もう一つの態様において、前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物は、アジュバントを含んでなる。
【００１８】
もう一つの態様において、前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物は、非呼吸器抗原を含有しない。
【００１９】
なおもう一つの態様において、前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物は、イヌにおけるイヌ呼吸器病原体に対する免疫反応を誘発する。もう一つの態様において、前記イヌ呼吸器病原体は、ＣＩＶ、ＣＲＣｏＶ、ＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓの少なくとも一つである。
【００２０】
本発明のもう一つの態様は、イヌにおけるイヌ呼吸器病原体の感染の治療又は予防のための前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物の使用を提供する。もう一つの態様において、前記イヌ呼吸器病原体は、ＣＩＶ、ＣＲＣｏＶ、ＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、及びＭ．ｃｙｎｏｓの少なくとも一つである。もう一つの態様において、前記組成物は、約６ヶ月又はそれより多い期間、前記感染を予防する。もう一つの態様において、前記組成物は、約１年の期間、前記感染を予防する。もう一つの態様において、本発明は、イヌにおけるイヌ呼吸器病原体の感染の治療及び予防のための医薬の製造における前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物の使用を提供する。
【００２１】
本発明のもう一つの態様は、前記組成物がイヌにおけるイヌ感染性呼吸器病症候群（ＣＩＲＤＣ）を治療又は予防する前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物を提供する。本発明のもう一つの態様は、イヌにおけるＣＩＲＤＣの治療又は予防方法であって、前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物を前記イヌに投与することを含んでなる方法を提供する。もう一つの態様において、前記組成物は、約６ヶ月又はそれより多い期間、ＣＩＲＤＣを予防する。もう一つの態様において、前記組成物は、約１年の期間、ＣＩＲＤＣを予防する。もう一つの態様は、イヌにおけるＣＩＲＤＣの治療又は予防のための医薬の製造における前述の態様のいずれか一つの免疫原性組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＣＲＣｏＶに対する血清中和抗体反応である。イヌを、生理食塩水、水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ）アジュバント添加した（adjuvanted）か、又はＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）アジュバント添加した組成物でワクチン接種した場合の、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）に対する血清中和抗体反応の測定である。
【図２】図２は、チャレンジ後（Post-Challenge）の鼻腔のウイルスの排出である。イヌを、生理食塩水、ＡｌＯＨアジュバント添加したか、又はＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）アジュバント添加した組成物でワクチン接種し、続いてＣＲＣｏＶでチャレンジした場合の、鼻腔経路からのＣＲＣｏＶの排出の測定である。
【図３】図３は、チャレンジ後４日目のＣＲＣｏＶ組織ウイルスに対して陽性の動物のパーセントである。生理食塩水、ＡｌＯＨアジュバント添加したか、又はＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）アジュバント添加した組成物でワクチン接種し、続いてＣＲＣｏＶでチャレンジした場合の、呼吸器組織中のＣＲＣｏＶに対して陽性のイヌの数の評価である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の定義は、本開示に適用される。これらは、本明細書中に参照することにより援用されるそれぞれの個々の参考文献中に含まれるいずれもの矛盾する定義にも優先する。定義されていない用語は、当業者によって普通に使用される意味を有する。更に、文脈によって要求されない限り、単数の用語は複数を含み、そして複数の用語は、単数を含むものである。
【００２４】
“約”又は“概略”は、測定可能な数値に関して使用される場合、示された変数の値及び示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）か、又は示された値の１０パーセント以内である変数のいずれか大きい方の全ての値を指す。“約”が、週の時間間隔に関して使用された場合、“約３週間”は１７ないし２５日であり、そして“約２ないし約４週間”は、１０ないし４０日である。
【００２５】
“アジュバント”は、本明細書中で使用する場合、免疫反応の非特異的刺激剤として役立ついずれもの物質を指す。アジュバントの更なる説明は以下を参照されたい。
【００２６】
用語“動物”は、本明細書中で使用する場合、イヌ呼吸器病症候群に対して感受性である、家畜化された及び野生の両方の哺乳動物を含むいずれもの動物を含む。
【００２７】
“抗体”は、本明細書中で使用する場合、供給源、産生の方法、又は他の特徴に関わらず、抗原結合部位を含んでなるいずれものポリペプチドである。これは、その抗原に対する免疫反応の結果として抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子又はその断片を指す。免疫グロブリンは、“定常”及び“可変”部を有する“軽”及び“重”ペプチド鎖から構成される血清蛋白質であり、そして定常部の組成に基づきクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に分けられる。ある抗原に対して“特異的”である抗体は、抗体の可変部が特異的な抗原を認識し、そしてそれに排他的に結合することを示す。この用語は、制約されるものではないが、以下を含む：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体、単鎖抗体、領域特異的抗体、単一領域抗体、領域欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、及びＣＤＲ移植抗体。抗体は、天然の供給源由来又は組換え供給源由来のインタクトな免疫グロブリンであり得、或いはインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。“抗体”は、抗原結合性タンパク質に転換され得、これは、制約されるものではないが、以下を含む抗体断片を、制約されるものではないが含む：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、Ｆｄ断片、ｄＡｂ断片、二重特異性抗体、ＣＤＲ３ペプチド、制限された（constrained）ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ナノボディー、二価ナノボディー、小型モジュラー免疫医薬品（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）、及びミニボディー、並びに上述の断片のいずれか、及びその化学的又は遺伝子的に操作された対応物、並びに抗原結合機能を保有する他の抗体断片。典型的には、このような断片は、抗原結合領域を含んでなるものである。当業者によって認識されるものであるように、このような分子のいずれもが、その免疫原性を減少するように、その親和性を増加するように、その特異性を変更するように、又は他の目的のために、操作（例えば“生殖（germlined）”）され得る。
【００２８】
“抗原”又は“免疫原”は、本明細書中で使用する場合、対象者に暴露された場合、その抗原に対して特異的である免疫反応を誘発するものである一つ又はそれより多いエピトープ（直線的、立体構造的又は両方）を含有する分子を指す。エピトープは、抗原の特異的部位であり、これは、Ｔ細胞受容体又は特異的抗体に結合し、そして典型的には約３個のアミノ酸残基ないし約２０個のアミノ酸残基を含んでなる。用語抗原は、サブユニット抗原−天然において当該抗原と関連する生物体全体から分離され、そして別個である抗原−並びに死滅、弱毒化又は不活化された細菌、ウイルス、真菌、寄生虫又は他の微生物を指す。用語抗原は、更に抗イディオタイプ抗体又はその断片などの抗体、及び抗原又は抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドのミモトープを指す。用語抗原は、更にＤＮＡ免疫化適用におけるような、ｉｎ  ｖｉｖｏで、抗原又は抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００２９】
“抗原性”は、本明細書中で使用する場合、タンパク質又はポリペプチドの、そのタンパク質又はポリペプチドに対して産生される抗体によって免疫特異的に結合される能力を指す。
【００３０】
用語“Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ”又は“Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ”は、以下を指す：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの生の弱毒化細菌、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの死滅全細胞抽出物（バクテリン）又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの細胞の細菌性抽出物。
【００３１】
“緩衝液”は、別の化学物質の濃度の変化を防止する化学系を意味する。プロトン供与体及び受容体系は、水素イオン濃度（ｐＨ）の顕著な変化を防止する緩衝液として役立つ。緩衝液の更なる例は、弱酸及びその塩（共役塩基）、又は弱塩基及びその塩（共役酸）の混合物を含有する溶液である。
【００３２】
“イヌ”は、本明細書中で使用する場合、イヌと普通に呼ばれるものを含むが、しかしＣａｎｉｄａｅ科の他のメンバーを含む。
【００３３】
用語“細胞株”又は“宿主細胞”は、本明細書中で使用する場合、その中でウイルスが複製し、そして維持され得る原核又は真核細胞を意味する。
【００３４】
用語“培養物”は、本明細書中で使用する場合、他の種又は型の非存在下で増殖する細胞又は微生物の集団を意味する。
【００３５】
“投与（Dose）”は、対象者に与えられるワクチン又は免疫原性組成物を指す。“一回目投与”又は“初回投与”は、０日目に与えられるこのような組成物の投与を指す。“二回目投与”又は“三回目投与”或いは“一年目投与”は、一回目投与の後に与えられるこのような組成物の量を指し、これらは、一回目投与と同じワクチン又は免疫原性組成物であることができるが、しかしそうである必要はない。
【００３６】
“エピトープ”は、抗原の特異的部位であり、これは、Ｔ細胞受容体又は特異的抗体に結合し、そして典型的には、約３個のアミノ酸残基から約２０個のアミノ酸残基を含んでなる。
【００３７】
“賦形剤”は、本明細書中で使用する場合、ワクチン又は免疫原性組成物の、抗原ではない非反応性担体成分を指す。
【００３８】
“断片”は、タンパク質又は遺伝子の切断された部分を指す。“機能的断片”及び“生物学的に活性な断片”は、全長のタンパク質又は遺伝子の生物学的特性を保有する断片を指す。
【００３９】
“相同性”又は“相同性のパーセント”は、最大の配列相同性のパーセントを達成するために、配列を整列させ、そして必要な場合ギャップを導入し、そして更に配列相同性の一部としていずれもの保存的置換を考慮した後の、比較物質の配列（類）中の残基と一致する又は類似である候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセントを指す。
【００４０】
“相同体”又は“種相同体”は、二つ又はそれより多い異なった種中に見出される遺伝子を含み、これは、実質的なポリヌクレオチド配列相同性を保有し、そして同一の、又は類似の、生物学的機能及び／又は特性を保有する。好ましくは、種相同体を表すポリヌクレオチド配列は、実施例によって本明細書中に記載されるような中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして同一の又は類似の生物学的活性及び／又は特性を保有するものである。もう一つの側面において、種相同体を表すポリヌクレオチドは、約６０％より大きい配列相同性、約７０％より大きい配列相同性、約８０％より大きい配列相同性、約９０％より大きい配列相同性、約９５％より大きい配列相同性、約９６％より大きい配列相同性、約９７％より大きい配列相同性、約９８％より大きい配列相同性、又は約９９％より大きい配列相同性を共有するものである。
【００４１】
“同一性”又は“同一性のパーセント”は、最大の配列同一性のパーセントを達成するために、両方の配列を整列させ、そして必要な場合ギャップを導入した後の、そして配列同一性の一部としていずれもの保存的置換を考慮しない、比較物質の配列中の残基と一致する候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸のパーセントを指す。
【００４２】
対象者中の“免疫反応”は、本明細書中で使用する場合、抗原に対する体液性免疫反応、細胞性免疫反応、又は体液性及び細胞性免疫反応の発生を指す。“体液性免疫反応”は、少なくとも部分的に抗体によって仲介されるものを指す。“細胞性免疫反応”は、Ｔリンパ球又は他の白血球細胞或いは両方によって仲介されるものであり、そして活性化されたＴ細胞、白血球細胞、又は両方によって産生されるサイトカイン、ケモカイン及び類似の分子の産生を含む。免疫反応は、当技術分野において既知の標準的な免疫アッセイ及び中和アッセイを使用して決定することができる。
【００４３】
“免疫原性”は、本明細書中で使用する場合、抗原に対して特異的に指向された免疫反応を誘発するタンパク質又はポリペプチドの能力を指す。
【００４４】
“免疫原性組成物”は、例えば、免疫原性組成物中に存在する一つ又はそれより多い抗原に対する受容者の体液性及び細胞性免疫系を刺激するために投与される、タンパク質、ペプチド、全細胞、不活化、サブユニット又は弱毒化ウイルス、又はポリサッカリド、或いはこれらの組合せを含む免疫原を含有する調製物である。“免疫化”は、免疫原性組成物を投与し、そして宿主中の抗原に対する免疫又は免疫原反応を刺激する過程である。好ましい宿主は、イヌのような哺乳動物である。好ましくは、免疫原性組成物は、ワクチンである。
【００４５】
“免疫学的に保護的な量（immunologically protective amount）”は、本明細書中で使用する場合、その不都合な健康上の影響又は合併症を含む疾病の徴候又は症状を予防或いは寛解するために十分である、受容者に免疫原性反応を誘発するために有効な抗原の量である。体液性免疫又は細胞仲介免疫のいずれか、或いは両方を誘発することができる。組成物に対する動物の免疫原性反応は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイにより間接的に、或いは野生型株を用いたチャレンジ後の徴候及び症状をモニターすることにより直接的に評価することができる。組成物又はワクチンによって与えられる保護免疫は、例えば、チャレンジ生物の排出の減少、死亡率、罹患率、体温、並びに対象者の全体的身体状態、健康及び能力のような臨床徴候の減少を測定することによって評価することができる。免疫反応は、制約されるものではないが、細胞性及び／又は体液性免疫の誘発を含み得る。治療的に有効である組成物又はワクチンの量は、使用される特定の生物体、或いは治療又はワクチン接種される動物の状態によって変更することができ、そして獣医師によって決定されることができる。
【００４６】
“鼻腔内”投与は、本明細書中で使用する場合、ワクチン又は他の組成物のような物質の、鼻を経由して又はそれによる対象者の身体への導入を指し、そして主として鼻の粘膜を経由する物質の輸送を含む。
【００４７】
“単離された”は、本明細書中で使用する場合、その天然に存在する環境から、単独で、或いは異種宿主細胞、染色体又はベクター（例えば、プラスミド、ファージ、等）中でのいずれかで除去されることを意味する。“単離された細菌”、“単離された嫌気性細菌”、“単離された細菌株”、“単離されたウイルス”、“単離されたウイルス株”等は、その天然に存在する環境から分離された場合のような、細菌又はウイルスが、例えば、培養物中で、他の微生物を実質的に含まない組成物を指す。“単離された”は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドのようないずれもの特別に定義された物質を説明するために使用される場合、物質−ポリペプチド又は核酸のような−が通常見いだされる本来の細胞の環境から分離された物質を指す。従って本明細書中で使用する場合、例示のみとして、本発明のポリヌクレオチドで構築される組換え細胞株は、“単離された”核酸を使用する。別の方法として、特定のタンパク質又は特異的免疫原性断片が、ワクチン或いは他の組成物として特許請求又は使用された場合、これが特定され、分離され、そしてこれが天然に存在することができる状態と比較してある程度精製されたことから、単離されたと考えられるものである。タンパク質又はその特異的免疫原性断片が、抗原を産生する組換え細菌又は真核生物発現ベクター中で産生された場合、これは、単離されたタンパク質又は核酸として存在すると考えられる。例えば、ポリヌクレオチドで構築された組換え細胞株は、“単離された”核酸を使用する。
【００４８】
“薬用薬剤”は、医学的状態の予防、治癒、又は改善、或いは幾つかの生理学的状態又は発生（occurrence）の予防において有用であるいずれもの薬剤を指す。
【００４９】
“モノクローナル抗体”は、本明細書中で使用する場合、全てが特定の抗原上の一つのエピトープを指向する、ハイブリドーマ細胞の単一の株によって産生される抗体を指す。モノクローナル抗体を製造するために使用される抗原は、病原体の単離されたタンパク質又は全病原体として提供され得る。“ハイブリドーマ”は、骨髄腫細胞及び特異的抗体産生細胞の融合によって形成されたハイブリッド細胞からなるクローン細胞株である。一般的に、モノクローナル抗体は、マウス起源のものである。然しながら、モノクローナル抗体は、更にファージディスプレイ技術、又はファージディスプレイと等価な方法、或いは非マウス起源のハイブリッド細胞によって産生された抗原の特定のエピトープに対して製造された抗体のクローン集団を指す。
【００５０】
“経口”又は“経口的”投与は、本明細書中で使用する場合、口を経由する又はそれによる対象者の身体へのワクチン又は他の組成物のような物質の導入を指し、そして嚥下又は口腔粘膜を経由する輸送（例えば、舌下又は頬側吸収）或いは両方を含む。気管内も経口又は経口的投与の手段である。
【００５１】
“口鼻腔”投与は、本明細書中で使用する場合、例えば、一滴又はそれより多い液滴を鼻に入れることによって起こるような、鼻及び口を経由するか又はそれによる対象者の身体への組成物又はワクチンのような物質の導入を指す。口鼻腔投与は、経口及び鼻腔内投与に伴う輸送過程を含む。
【００５２】
“非経口投与”は、本明細書中で使用する場合、消化管を含まない経路を経由するか又はそれによる対象者の身体への組成物又はワクチンのような物質の導入を指す。非経口投与は、皮下、筋肉内、動脈内、及び静脈内投与を含む。本開示の目的のために、非経口投与は、口、鼻、気管、及び肺の粘膜組織を経由する物質の輸送を主として含む投与経路を除外する。
【００５３】
用語“病原体”又は“病原性微生物”は、本明細書中で使用する場合、その宿主動物中に疾病、病気、又は異常状態を誘発又は起こすことが可能である微生物−例えば、ＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２、ＣＲＣｏＶ、ＣＩＶ、又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ−を意味する。
【００５４】
“パータクチン”は、本明細書中で使用する場合、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａの外膜タンパク質を指す。好ましくは、パータクチンは、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａからのものであり、そして最も好ましくは、“ｐ６８”であり、そして遺伝子ｐｒｎＡによってコードされる。パータクチンは、その天然の形態でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａから単離することができるか、又はこれは、組換え的に産生することができる。パータクチンの配列及び例は、米国特許第７，７３６，６５８号中に提供され、その内容は、本明細書中に参考文献として援用される。本明細書中で使用されるパータクチン抗原は、タンパク質の脂質付加された形態を含む。
【００５５】
“医薬的に受容可能”は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、等を伴わずに、妥当な利益−対−危険度比で釣合い、そしてそれらの意図された使用に対して有効である、対象者の組織と接触して使用するために適した物質を指す。
【００５６】
“ポリクローナル抗体”は、本明細書中で使用する場合、特定の病原体又は抗原に対して製造される抗体の混合集団を指す。一般的に、当該集団は、各種の抗体の群を含有し、それぞれの群は、病原体又は抗原の特定のエピトープを指向する。ポリクローナル抗体を製造するために、全病原体、又は単離された抗原が、宿主への接種又は感染によって導入され、これは、病原体又は抗原に対する抗体を製造するように宿主を誘導する。
【００５７】
用語“ポリヌクレオチド”は、本明細書中で使用する場合、鎖状に共有的に結合するヌクレオチドモノマーからなる有機ポリマー分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）は、明確な生物学的機能を持つポリヌクレオチドの例である。
【００５８】
用語“ポリペプチド”は、本明細書中で使用する場合、鎖状に結合する二つ又はそれより多いアミノ酸からなる有機ポリマー分子を意味する。
【００５９】
“感染を予防すること”は、本明細書中で使用する場合、特定された疾病を起こす細菌又はウイルスの複製を予防或いは阻害するか、細菌又はウイルスの伝染を阻害する、細菌又はウイルスがその宿主中に定着することを防止するか、或いは感染によって起こされた疾病の徴候を軽減することを意味する。治療は、細菌又はウイルスの負荷の減少がある場合、治療的であると考えられる。
【００６０】
“保護”、“保護すること”、“保護免疫”、等は、ワクチン又は他の組成物に関して本明細書中で使用する場合、ワクチン又は組成物が、当該ワクチン又は組成物中に使用される抗原（複数可）が由来する生物体によって起こされた疾病の徴候を予防又は減少することを意味する。用語“保護”、“保護すること”等は、ワクチン又は組成物を、対象者中に既に存在している疾病、或いは一つ又はそれより多い疾病の徴候を“治療する”ために使用することができることも意味する。
【００６１】
“呼吸器”投与は、本明細書中で使用する場合、噴霧化（微粒子化）物質の吸入を経由するか又はそれによる対象者の身体へのワクチン又は他の組成物のような物質の導入を指す。呼吸器投与において、一次輸送機構は、微粒子化物質の気管、気管支、及び肺の粘膜を経由する吸収を含み、従って鼻腔内又は経口的投与とは異なる。
【００６２】
用語“特異的結合”、“特異的に結合する”、等は、生理学的又はアッセイ条件下で測定可能であり、そして選択的である、複合体を形成する二つ又はそれより多い分子として定義される。抗体又は他の阻害剤は、適当に選択された条件下で、このような結合が実質的に阻害されず、一方同時に非特異的結合が阻害される場合、タンパク質に“特異的に結合する”と言われる。特異的結合は、高い親和性によって特徴づけられ、そして化合物又はタンパク質に対して選択的である。非特異的結合は、通常低い親和性を有する。例えば、ＩｇＧ抗体における結合は、一般的に、少なくとも約１０−８Ｍ又はそれより高い、或いは少なくとも約１０−９Ｍ又はそれより高い、或いは少なくとも約１０−１０Ｍ又はそれより高い、或いは少なくとも約１０−１１Ｍ又はそれより高い、或いは少なくとも約１０−１２Ｍ又はそれより高いような、少なくとも約１０−７Ｍ又はそれより高い親和性によって特徴づけられる。この用語は、例えば、抗原結合領域が、多数の抗原によって保有されていない特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、この場合、抗原結合部位を保有する抗体は、一般的に他の抗原を結合しないものである。
【００６３】
“特異的免疫原性断片”は、本明細書中で使用する場合、その配列に対して特異的な抗体又はＴ細胞によって認識される配列の一部を指す。
【００６４】
“対象者”は、本明細書中で使用する場合、免疫系を有するいずれもの動物を指し、これは、イヌのような哺乳動物を含む。
【００６５】
“実質的に同一”は、本明細書中で使用する場合、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性の程度を指す。
【００６６】
“サブユニットワクチン”、及び“サブユニット組成物”は、本明細書中で使用する場合、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌のような興味ある病原体からの抗原から誘導されるか或いはそれに相同である、一つ又はそれより多い抗原−しかし必ずしもワクチン又は組成物中の全ての抗原ではない−を含むワクチン又は組成物の種類を指す。このような組成物又はワクチンは、インタクトな病原体細胞又は病原性粒子、或いはこのような細胞又は粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、サブユニットワクチン又はサブユニット組成物は、病原体又はそれらの類似体からの少なくとも部分的に精製された、又は実質的に精製された、免疫原性ポリペプチドから調製することができる。サブユニットワクチン又はサブユニット組成物中の抗原又は複数の抗原を得る方法は、標準的な精製技術、組換え生産、又は化学的合成を含む。従って“サブユニットワクチン”又は“サブユニット組成物”は、規定された抗原性成分又はウイルス、細菌、又は他の免疫原の成分からなるワクチン又は組成物を指す。
【００６７】
“ＴＣＩＤ５０”は、“組織培養感染量（tissue culture infective dose）”を指し、接種された細胞培養物の所定のバッチの５０％を感染するために必要なウイルスの希釈として定義される。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を含む各種の方法をＴＣＩＤ５０を計算するために使用することができ、これは、本明細書を通して使用される。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法の説明に関しては、Ｂ．Ｗ．Ｍａｈｙ  ＆  Ｈ．Ｏ．Ｋａｎｇｒｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  ２５−４６（１９９６）を参照されたい。
【００６８】
“治療剤”は、本明細書中で使用する場合、ウイルス性、細菌性、寄生虫性又は真菌性感染、これらによって起こされる疾病又は状態の治療を補助するいずれもの分子、化合物、ウイルス、又は治療、好ましくは弱毒化された又は死滅ウイルス、或いはサブユニット又は化合物を指す
“治療的有効量”は、本明細書中で使用する場合、抗原又はワクチン或いは組成物を投与される対象者（例えばイヌ）に免疫反応を誘発するものである抗原又はワクチン或いは組成物の、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌のような病原体による感染によって起こされる不都合な健康上の影響又はその合併症を含む疾病の徴候又は症状を予防又は寛解するために十分である量を指す。体液性免疫又は細胞仲介免疫、或いは体液性免疫及び細胞仲介免疫の両方を誘発することができる。抗原、ワクチン、又は組成物に対する動物の免疫原性反応は、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイによって間接的に、又は野生型株を用いたチャレンジ後の徴候及び症状をモニターすることにより直接的に評価することができる。ワクチン又は組成物によって与えられる保護免疫は、チャレンジ生物の排出の減少、並びに／又は死亡率、罹患率、体温、及び対象者の全体的身体状態、健康、及び能力のような臨床徴候の減少を測定することによって評価することができる。治療的に有効であるワクチン又は組成物の量は、使用される特定の免疫原、又は対象者の状態によって変更することができ、そして当業者によって決定されることができる。
【００６９】
“治療する”又は“治療すること”は、本明細書中で使用する場合、このような用語が適用される疾患、状態又は疾病の進行を逆転、軽減、阻害するか、又はそれを予防すること、或いはこのような疾患、状態又は疾病の一つ又はそれより多い徴候を予防することを指す。
【００７０】
“治療”は、本明細書中で使用する場合、すぐ上で定義したような“治療すること”の行為を指す。
【００７１】
“ワクチン”又は“ワクチン組成物”は、本明細書中で使用する場合、改変された生、弱毒化、又は死滅のいずれかのウイルス又は細菌、或いはサブユニットワクチン、或いは前述のもののいずれもの組合せから選択される免疫原性組成物を指す。ワクチンの対象者への投与は、免疫反応をもたらす。ワクチンは、非経口、経口的等を含むいずれもの既知の投与の経路によって対象者に直接導入することができる。この用語は、感染を予防又は軽減する、或いは感染の一つ若しくはそれより多い徴候又は症状を予防或いは軽減する組成物を意味する。病原体に対するワクチン組成物の保護効果は、通常、免疫反応を対象者中に誘発することによって達成される。一般的に言って、感染の発生率の消滅又は減少、徴候又は症状の寛解、又は感染された対象者からの微生物の排除の促進は、ワクチン組成物の保護効果を示す。本発明のワクチン組成物は、イヌ呼吸器病病原体によって起こされた感染に対する保護効果を提供する。
【００７２】
“獣医学的に受容可能な”は、本明細書中で使用する場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、等を伴わずに、妥当な利益−対−危険度比で釣合い、そしてそれらの意図された使用に対して有効である、獣医学的対象者の組織との接触における使用に適した物質を指す。
【００７３】
“獣医学的に受容可能な担体”は、本明細書中で使用する場合、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、そしてこれが投与される獣医学的対象者に対して毒性ではない担体媒体を指す。
【００７４】
抗原、免疫原性組成物、及びワクチン
本開示は、一つ又はそれより多いウイルス及び細菌を含んでなる、免疫原性組成物及びワクチンを提供する。本開示は、一つ又はそれより多いウイルス及び細菌を含んでなる、免疫原性組成物及びワクチン或いはＣＩＲＤＣに対する治療のためのイヌへの投与のために適したサブユニットを提供する。
【００７５】
本明細書中に記載されるイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）は、感染性呼吸器病を持つイヌの気道中に存在するコロナウイルスとして特徴づけられる。ＣＲＣｏＶは、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）ＯＣ４３株及びブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ＨＥＶ）に系統学的に最も密接に関係する；イヌ腸内コロナウイルス（ＣＣｏＶ）は、ＣＲＣｏＶの遠縁にあたるのみである。本発明に使用するために適したＣＲＣｏＶの代表的な例は、ＣＲＣｏＶの４１８２株として特定される株を含む（Ｅｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１２４：７８−８７，２００７）。
【００７６】
本発明によって包含されるインフルエンザウイルス抗原は、制約されるものではないが、サブタイプＨ３赤血球凝集素及びサブタイプＮ８ノイラミニダーゼを有するインフルエンザウイルス、又はより一般的にはＨ３Ｎ８ウイルスと呼ばれる、Ｈ３Ｎ８サブタイプを含む、いずれもの鳥又は哺乳動物からのいずれもの確認されたインフルエンザウイルス株であることができる。インフルエンザは、制約されるものではないが、ブタ、ウマ又はイヌ起源を含む哺乳動物又はトリ起源であることができる。一つの態様において、イヌインフルエンザ抗原が使用される。一つの態様において、ウマインフルエンザ抗原が使用される。一つの態様において、Ｈ３又はＮ８と命名されたサブタイプの糖タンパク質を有する株が使用される。一つの態様において、両方のサブタイプＨ３及びＮ８糖タンパク質を有する株が使用される。
【００７７】
本発明によって包含されるインフルエンザ抗原は、家畜及び野生の両方のイヌ、ウマ、ブタ、及び家禽から単離することができる。試料採取に選択される動物は、軽度から重度の呼吸器の徴候及び発熱を含んでよい急性及び／又は亜急性臨床症候群を示しているべきである。動物は、更に食欲不振及び嗜眠の徴候を示してもよい。ウイルス単離の方法は、当業者にとって公知であり、以下を含む：哺乳動物又はトリ細胞培養物に接種すること、臨床検体からの鼻又は食道粘膜試料を胚発育卵に接種すること、鼻腔通路又は喉の拭取りによるか、又は脾臓、肺、扁桃腺及び肝臓のような組織を収集すること並びに肺洗浄による収集。ウイルスの細胞変性効果は、細胞培養物中で観察することができる。尿膜腔液又は細胞溶解物を、インフルエンザウイルスの存在に対する仮定的証拠である、ヒト、ニワトリ、七面鳥又はモルモットの赤血球細胞を凝集させるそれらの能力について試験することができる。
【００７８】
本発明において使用するために適したインフルエンザ株の代表的な例は、Ａ／ｃａｎｉｎｅ／Ｉｏｗａ／９Ａ１／Ｂ５／０８／Ｄ１２として特定される株を含み、これは、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約に従いアメリカ培養細胞株統保存機関（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に、２００６年６月２９日にＰＴＡ−７６９４として寄託された。ＣＩＶ抗原の代表的株は、商業的なワクチン、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）ＣＩＶ（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ）中のＣＩＶウイルス株である。本発明は、ウマインフルエンザ株、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／２／Ｍｉａｍｉ／１／６３として特定される株を含んでなるワクチンも包含する。この株は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約に従いアクセッション番号ＶＲ３１７としてＡＴＣＣに寄託された。
【００７９】
本発明において使用するためのインフルエンザウイルスの更なる例は、Ａ／ｃａｎｉｎｅ／Ｉｏｗａ／１３６２８／２００５、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１９９８、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１５／２００２、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｏｈｉｏ／１／２００３、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１／１９９４、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２１３／２００３、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２００３、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／ＮｅｗＹｏｒｋ／１９９９、及びＡ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ／Ａ２／１９９３である。ＣＩＶの他の好ましい株及び／又は分離株は、米国特許第７，９５９，９２９号（特にＪａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ／２００５、Ｍｉａｍｉ／２００５、ＦＬ／２４２／０３及びＦｌｏｒｉｄａ／４３／０４としてその中で特定されている株及びＨＡ配列）、７，３８４，６４２号、７，５７２，６２０号及び７，４６８，１８７号中に開示されているものを含み、全ての配列、特にＨＡ配列、及び株を含むこれらの内容は、その全てが本明細書中に記載されているかのように、本明細書中に参考文献として援用される。更に、本明細書中の使用のために適したＣＩＶ株は、アクセッション番号ＡＤＷ４１７８４を有する、Ｂａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２４（６），１５２４−１５２７（２０１０）中に記載されているＣｏｌｏｒａｄｏ  ＣＩＶ分離株を含む。
【００８０】
本発明によって包含されるイヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）は、ケンネルコフに関連する原因病原体であると知られているウイルスの一つとして特徴付けることができる。ＣＰＩＶ抗原の代表的株は、商業的ワクチン、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ５（Ｐｆｉｚｅｒ）中の弱毒化ＣＰＩウイルス株である。ＣＰＩＶ抗原のもう一つの代表的株は、“ＮＬ−ＣＰＩ−５”（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の名称を有する弱毒化ＣＰＩウイルス株である。
【００８１】
本発明によって包含されるイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）は、ケンネルコフに関連する原因病原体としても知られているウイルスの一つとして特徴付けることができる。ＣＡＶ−２抗原の代表的株は、商業的ワクチン、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ５（Ｐｆｉｚｅｒ）中の弱毒化ＣＡＶ−２ウイルス株である。ＣＡＶ−２抗原の代表的株は、“Ｍａｎｈａｔｔａｎ”株（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）と命名された弱毒化ＣＡＶ−２株である。
【００８２】
本発明に包含されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓ（Ｍ．ｃｙｎｏｓ）は、Ｃｈａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：３４９１−３４９７，２００４中に記載され、そして呼吸器病に普通に伴うマイコプラズマの唯一の種である。Ｍ．ｃｙｎｏｓに対する免疫原性組成物は、本明細書中に参考文献として援用されるＵＳ２００７／００９８７３９中に記載されている。
【００８３】
本発明によって包含されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ成分は、ケンネルコフに関連する細菌性原因病原体として特徴付けることができる。本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、生の弱毒化されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａバクテリン又は細菌抽出物の一つ以上であることができる。更に、当該組成物は、好ましくはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの単離されたサブユニット抗原も含む。
【００８４】
一つの態様において、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、１９８４年１０月１２日に出願された特許出願ＦＲ２５７１６１８中に提供されているようにカラムクロマトグラフィーによって精製された全細胞の超音波処理物として調製される。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのもう一つの代表的例は、細菌抽出物ＢｒｏｎｃｈｉｃｉｎｅＴＭＣＡｅ（Ｐｆｉｚｅｒ）であり、これは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ細胞から抽出された抗原性物質から調製される。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのもう一つの例は、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）中に存在する生の弱毒化Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ株のＢ−Ｃ２及び／又はＩｎｔｒａ−Ｔｒａｃ（登録商標）、Ｂｒｏｎｃｈｉ−Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）、ＮａｒａｍｕｎｅＴＭ、Ｒｅｃｏｍｂｉｔｅｋ（登録商標）、Ｕｎｉｖａｃ、及び／又はＫｅｎｎｅｌ−ＪｅｃＴＭからの生のｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ株である。
【００８５】
更に、サブユニットは、好ましくはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ成分との組合せでも存在する（即ち、補充される）。サブユニットの代表的例は、単離されたパータクチン抗原、好ましくは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのｐ６８抗原、特に組換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ  のｐ６８抗原であり、これは、ｐ６８特異的モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ２−７（米国特許７，７３６，６５８号中に記載、これは、本明細書中に参考文献として援用される）によって認識され、そして一つの好ましい態様において、米国特許７，７３６，６５８号中に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対する相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８６】
組換えｐ６８パータクチン抗原は、好ましくは天然様の構造が加工中に保存又は修復されるように、可溶な形態で調製される。従って、本発明の一つの側面は、凝集物を実質的に含まない（約８０％、９０％、９５％又は更に９９％より少ない）組換えｐ６８を提供する。もう一つの態様において、組換えｐ６８は、尿素、好ましくは尿素の約０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、又は６Ｍ溶液により可溶化される。その後、Ｐ６８抗原は、カラムクロマトグラフィーなどにより精製することができる。このような可溶化法の一つは、Ｓｕｒｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖ．９９（４），ｐｇｓ  ３０３−３１０（２００５）中に記載されている。
【００８７】
本明細書中で使用されるパータクチン抗原は、脂質付加された形態も含む。脂質付加されたタンパク質の産生の例は、参考文献として援用されるＥｒｄｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（１９９３）ｖ．６１（１），ｐ．８１−９０中に提供されている。その中で開示されている方法は、付加された脂質部分を含有する翻訳後修飾されたパータクチンタンパク質を調製するために使用することができる。
【００８８】
更に、もう一つの態様において、免疫原性組成物は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及び単離されたＢｓｐ２２抗原を含んでなる。もう一つの態様において、免疫原性組成物は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、単離されたパータクチン抗原、及び単離されたＢｓｐ２２抗原を含んでなる。Ｂｓｐ２２抗原は、Ｍｅｄｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）７１（２），４９２−５０４中に提供されているように調製することができる。好ましくは、単離されたＢｓｐ２２抗原は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抽出物及び単離されたパータクチン抗原、具体的には組換えｐ６８と組合せて（即ち、それに加えて）存在する。
【００８９】
“Ｂｓｐ２２”は、抗原の脂質付加された形態も含む。脂質付加されたタンパク質の産生の例は、参考文献として援用されるＥｒｄｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（１９９３）ｖ．６１（１），ｐ．８１−９０中に提供されている。その中に開示されている方法は、付加された脂質部分を含有する翻訳後修飾されたＢｓｐ２２タンパク質を調製するために使用することができる。
【００９０】
本発明によって包含されるウイルスは、細胞、細胞株及び宿主細胞中で増殖することができる。前記の細胞、細胞株又は宿主細胞は、例えば、制約されるものではないが、哺乳動物細胞、並びに昆虫及び植物細胞を含む非哺乳動物細胞であることができる。本発明によって包含されるウイルスが増殖することができる細胞、細胞株、及び宿主細胞は、当業者にとって容易に知られ、そして利用可能である。
【００９１】
もう一つの態様において、本明細書中に記載される免疫原性組成物は、非呼吸器抗原を含まない。従って、本発明の一つの態様は、非呼吸器抗原を含まないことを条件とする、本明細書中に記載されるような組成物を提供する。非呼吸器抗原は、対象者に呼吸器病を起こさない。このような非呼吸器抗原の非限定的例は、狂犬病ウイルス、イヌパルボウイルス、イヌ腸内コロナウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、及びＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを含む。
【００９２】
本発明によって包含される細菌は、ブロス（液体）及び寒天（固体；半固体）の両方の培養培地を含む当業者にとって既知の各種の培養培地を使用して培養及び増殖することができる。幾つかの細菌は、更に、哺乳動物細胞又は非哺乳動物細胞中で培養及び増殖することができる。
【００９３】
本発明によって包含されるウイルス及び細菌は、免疫原性組成物又はワクチン中で使用する前に弱毒化又は不活化することができる。弱毒化又は不活化の方法は、当業者にとって周知である。弱毒化の方法は、制約されるものではないが、適した細胞株の細胞培養における一連の継代（ウイルス及び幾つかの細菌）、ブロス培養における一連の継代（細菌）、紫外線照射（ウイルス及び細菌）、及び化学的変異誘発（ウイルス及び細菌）を含む。ウイルス又は細菌の不活化の方法は、制約されるものではないが、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎ）（ＢＰＬ）又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）による処理、或いは当業者にとって既知の他の方法を含む。
【００９４】
ホルマリンによる不活化は、微生物を含有する懸濁液を、３７％ホルムアルデヒドと、０．５％の最終ホルムアルデヒド濃度まで混合することによって行うことができる。微生物−ホルムアルデヒド混合物を、概略２４時間の室温における一定の撹拌によって混合する。次いで不活化された微生物の混合物は、適した細胞株又はブロス培地上の増殖について分析することによって残存する生存生物体について試験される。
【００９５】
幾つかの抗原のために、ＢＥＩによる不活化は、本発明の微生物を含有する懸濁液を、０．１ＭのＢＥＩ（０．１７５ＮのＮａＯＨ中の２−ブロモ−エチルアミン）と、１ｍＭの最終ＢＥＩ濃度まで混合することによって行うことができる。他の抗原のために、最終ＢＥＩ濃度は、２ｍＭである。当業者は、使用する適当な濃度を知るものである。ウイルス−ＢＥＩ混合物を、概略４８時間、室温で一定に撹拌することによって混合し、続いて１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウムを０．１ｍＭの最終濃度まで加える。混合を更に２時間続ける。不活化された微生物を含有する混合物は、適した細胞株又はブロス培地上の増殖について分析することによって残存する生存ウイルスについて試験される。
【００９６】
本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、一つ又はそれより多い獣医学的に受容可能な担体を含むことができる。本明細書中で使用する場合、“獣医学的に受容可能な担体”は、いずれもの、そして全ての溶媒、分散媒体、被覆、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、等を含む。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、等を含むことができる。等張剤は、当業者にとって既知のものの中でも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを含むことができる。安定剤は、当業者にとって既知のものの中でも、アルブミンを含む。保存剤は、当業者にとって既知のものの中でも、マーシオレートを含む。
【００９７】
アジュバントは、代謝可能であることができ、植物油ベースのアジュバントのような、標的種によって代謝されることが可能な成分からなるアジュバントを指す。代謝可能なアジュバントは、代謝可能な油であることができる。代謝可能な油は、典型的に植物及び動物中に存在する脂肪及び油であり、そして通常大部分はトリグリセリド又は天然の脂肪としても知られるトリアシルグリセロールの混合物からなる。これらの非極性の、水不溶性の物質は、グリセロールの脂肪酸トリエステルである。トリアシルグリセロールは、その三つの脂肪酸残基又は側鎖の同一性及び配置によって異なる。
【００９８】
アジュバントは、代謝不可能であることもでき、乳液が投与される動物の対象者の身体によって代謝することができない成分からなるアジュバントを指す。本発明の組成物中で使用するために適した代謝不可能な油は、アルカン、アルケン、アルキン、並びにその対応する酸及びアルコール、そのエーテル及びエステル、並びにそれらの混合物を含む。好ましくは、油の個々の化合物は、軽質炭化水素化合物であり、即ち、このような成分は、６ないし３０個の炭素原子を有する。油は、合成的に調製するか又は石油製品から精製することができる。本明細書中に記載される組成物中で使用するために好ましい代謝不可能な油は、鉱油、例えば、パラフィン油、及びシクロパラフィンを含む。用語“鉱油”は、ペトロラタムから蒸留技術によって得られる液体炭化水素の混合物である、代謝不可能なアジュバントの油を指す。この用語は、“液化パラフィン”、“液体ペトロラタム”及び“白色鉱油”と同義である。この用語は、“軽質鉱油”、即ち同様にペトロラタムの蒸留によって得られるが、しかし白色鉱油より僅かに低い比重を有する油を含むことも意図する。鉱油は、各種の商業的供給源、例えばＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，  ＰＡ），ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得ることができる。軽質鉱油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）の名称で商業的に入手可能である。
【００９９】
アジュバントは、制約されるものではないが、当業者にとって既知の多くの他のアジュバントの中で、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）アジュバント系（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｒａｌｓｔｏｎ，ＮＥ）、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油乳液、例えばフロイントの完全及び不完全アジュバントのような油中水乳液、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ；Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）又は他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉからの熱不安定性エンテロトキシン（組換え又はその他）、コレラ毒素、ムラミルジペプチド、スクアレン／プルロニックブロックコポリマー／界面活性剤（ＳＰ−ｏｉｌ）、スルホリポベータ−シクロデキストリン（ＳＬ−ＣＤ）、免疫調節物質（immumodulator）を含有するリポソーム（例えば、ＣｐＧ又はポリＩ：Ｃ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ  （Ｑｕｉｌ  Ａ／ホスファチジルコリン（phosphotidyl choline））、ＣｐＧ／ＤＥＡＥ−デキストラン／鉱油（ＴＸＯ）、ＣｐＧ、トリテルペノイド（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ又は他の精製又は部分的に精製されたサポニン調製物）、ステロール（例えば、コレステロール）、免疫調節剤（例えば、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム−ＤＤＡ）、ポリマー（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）のようなポリアクリル酸）、及びＴｈ２刺激物質（例えば、Ｂａｙ  Ｒ１００５（登録商標）のような糖脂質）、並びにこれらの組合せを含む。
【０１００】
使用することができる各種の組合せの非限定的例は、トリテルペノイド＋ステロール（例えば、ＱＡＣとしても知られる、Ｑｕｉｌ  Ａ／コレステロール）、トリテルペノイド＋ステロール、免疫調節剤、及びポリマー（例えば、ＱＣＤＣとしても知られる、Ｑｕｉｌ  Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））、並びにトリテルペノイド＋ステロール、免疫調節剤、ポリマー、及びＴｈ２刺激物質（例えば、ＱＣＤＣＲとしても知られる、Ｑｕｉｌ  Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、及びＢａｙ  Ｒ１００５（登録商標））を含む。
【０１０１】
本発明の文脈において有用なアジュバント及び添加剤の量並びに濃度は、当業者によって容易に決定することができる。一つの態様において、本発明は、約２０μｇから約２０００μｇまでのアジュバントを含んでなる免疫原性組成物及びワクチンを意図する。もう一つの態様において、アジュバントは、約１００μｇから約１５００μｇまで、又は約２５０μｇから約１０００μｇまで、或いは約３５０μｇから約７５０μｇまでの量で含まれる。もう一つの態様において、アジュバントは、約５００μｇ／２ｍｌの免疫原性組成物又はワクチンの投与の量で含まれる。
【０１０２】
免疫原性組成物及びワクチンは、抗生物質も含むことができる。このような抗生物質は、制約されるものではないが、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、及びテトラサイクリンのクラスからのものを含む。一つの態様において、本発明は、約１μｇ／ｍｌから約６０μｇ／ｍｌまでの抗生物質を含んでなる免疫原性組成物及びワクチンを意図する。もう一つの態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、約５μｇ／ｍｌから約５５μｇ／ｍｌまでの抗生物質、又は約１０μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌまでの抗生物質、又は約１５μｇ／ｍｌから約４５μｇ／ｍｌまでの抗生物質、又は約２０μｇ／ｍｌから約４０μｇ／ｍｌまでの抗生物質、又は約２５μｇ／ｍｌから約３５μｇ／ｍｌまでの抗生物質を含んでなる。なおもう一つの態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、約３０μｇ／ｍｌより少ない抗生物質を含んでなる。
【０１０３】
本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、ウイルス又は細菌、或いはウイルス又は細菌のタンパク質をコードする一つ若しくはそれより多いポリヌクレオチド分子を含むことができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、免疫原性組成物又はワクチン中で使用することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、他の薬剤の非存在で投与することができ、或いはこれは、細胞の取込みを容易にする薬剤（例えばリポソーム又はカチオン性脂質）と一緒に投与することができる。免疫原性組成物及びワクチン中の全ポリヌクレオチドは、一般的に約０．１μｇ／ｍｌないし約５．０ｍｇ／ｍｌの間であるものである。もう一つの態様において、免疫原性組成物及びワクチン中の全ポリヌクレオチドは、約１μｇ／ｍｌないし約４．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０μｇ／ｍｌないし約３．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌないし約２．０ｍｇ／ｍｌであることができる。核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を使用するワクチン及びワクチン接種法は、当技術、例えば米国特許第５，７０３，０５５号、米国特許第５，５８０，８５９号、及び５，５８９，４６６号において十分に説明され、これらの全ては、本明細書中に参考文献として援用される。
【０１０４】
先に記載したウイルス及び細菌に加えて、本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、他の更なる抗原を含むことができる。抗原は、微生物の不活化された全体又は部分的調製物の形態、又は遺伝子操作技術又は化学的合成によって得られる抗原性分子の形態であることができる。本発明によって使用するために適当な他の抗原は、制約されるものではないが、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルスのような病原性ウイルス、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｈａｒｄｊｏｂｏｖｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ亜種ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓを含むＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、及びＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓのような病原性細菌由来のものを含む。抗原は、Ｃａｎｄｉｄａのような病原性真菌、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．のような原虫、又はＴａｅｎｉａ、Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、及びＰａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｓｐｐ．のような蠕虫由来であることもできる。
【０１０５】
投与の形態、投与量、経路
本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、ＣＩＲＤＣに対する有効な免疫反応を誘発するために動物に投与することができる。従って、本発明は、治療的有効量の本明細書中に記載される免疫原性組成物又はワクチンを動物に投与することによる、有効な免疫反応を刺激する方法を提供する。
【０１０６】
本明細書中に記載される免疫原性組成物及びワクチンは、動物の対象者にＣＩＲＤＣに対するワクチン接種をするために動物に投与することができる。免疫原性組成物及びワクチンは、動物のＣＩＲＤＣを予防又は治療するために動物に投与することができる。従って、本明細書中には、治療的有効量の本明細書中に記載される免疫原性組成物又はワクチンを動物に投与することを含んでなる、ＣＩＲＤＣに対して動物にワクチン接種し、そしてＣＩＲＤＣを予防又は治療する方法が記載される。
【０１０７】
本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、投与の経路によって各種の形態で製造することができる。例えば、免疫原性組成物及びワクチンは、注射使用のために適した滅菌水溶液又は懸濁液の形態で製造するか、或いは冷凍乾燥技術を使用して凍結乾燥された形態に製造することができる。凍結乾燥された免疫原性組成物及びワクチンは、典型的には約４℃で維持され、そして安定化した溶液、例えば、アジュバントを伴って又は伴わずに、生理食塩水又はＨＥＰＥＳ中で再構成することができる。免疫原性組成物及びワクチンは、懸濁液又は乳液の形態で製造することもできる。
【０１０８】
本発明の免疫原性組成物及びワクチンは、治療的有効量の一つ又はそれより多い上記の微生物を含む。精製されたウイルス及び／又は細菌を、免疫原性組成物及びワクチン中に直接使用することができ、或いは更に弱毒化、又は不活化することができる。典型的には、免疫原性組成物又はワクチンは、約１×１０２ないし約１×１０１２個の間のウイルス又は細菌粒子、又は約１×１０３ないし約１×１０１１個の間の粒子、又は約１×１０４ないし約１×１０１０個の間の粒子、又は約１×１０５ないし約１×１０９個の間の粒子、又は約１×１０６ないし約１×１０８個の間の粒子を含有する。保護効果を提供するために有効な免疫原性組成物又はワクチン中の微生物の正確な量は、当業者によって決定されることができる。
【０１０９】
パータクチン抗原は、約１μｇないし約３００μｇの間で存在する。更に特に、前記パータクチンは、約５μｇないし約２０μｇの間、更になお特に、約７μｇないし約１５μｇの間、そしてなお更に特に、約５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、又は２０μｇで存在する。
【０１１０】
免疫原性組成物及びワクチンは、一般的に約０．５ｍｌないし約５ｍｌの間の体積で獣医学的に受容可能な担体を含んでなる。もう一つの態様において、担体の体積は、約１ｍｌないし約４ｍｌの間、又は約２ｍｌないし約３ｍｌの間である。もう一つの態様において、担体の体積は、約１ｍｌ、又は約２ｍｌ、又は約５ｍｌである。免疫原性組成物及びワクチンにおける使用のために適した獣医学的に受容可能な担体は、本明細書中に先に記載したもののいずれかであることができる。
【０１１１】
当業者は、ウイルス又は細菌を投与前に弱毒化又は不活化する必要があるか否かを容易に決定することができる。本発明のもう一つの態様において、ウイルス又は細菌は、更なる弱毒化を行わずに動物に直接投与することができる。治療的に有効である微生物の量は、使用される特定の微生物、動物の状態及び／又は感染の程度によって変化することができ、そして当業者によって決定されることができる。
【０１１２】
本発明の方法によれば、一回の投与を動物に投与することができ、或いは、二回又はそれより多い接種を約２から約１０週間までの間隔で行うことができる。追加免疫投与計画を必要とすることがあり、そして投与計画は、最適な免疫化を与えるために調節することができる。当業者は、最適な投与計画を容易に決定することができる。
【０１１３】
免疫原性組成物及びワクチンは、血流、筋肉、内部器官中に、又は皮膚の下に直接投与することができる。非経口投与のために適した手段は、静脈内、動脈内、筋肉内、及び皮下投与を含む。非経口投与のために適したデバイスは、有針（マイクロニードルを含む）注射器及び無針注射器を含む。
【０１１４】
非経口製剤は、典型的には、塩、炭水化物、タンパク質、及び緩衝剤（好ましくは約３から約９まで、又は約４から約８まで、又は約５から約７．５まで、又は約６から約７．５まで、又は約７から約７．５までのｐＨ）のような賦形剤を含有することができる水溶液であるが、しかし幾つかの適用のために、それらは、滅菌非水性溶液として、或いは滅菌パイロジェンフリーの水又は生理食塩水のような適したビヒクルと共に使用される乾燥した形態として、より適切に製剤化することができる。
【０１１５】
例えば凍結乾燥による、滅菌条件下の非経口製剤の調製は、当業者にとって周知の標準的な製薬技術を使用して容易に達成することができる。
【０１１６】
非経口溶液の調製において使用される物質の溶解性は、緩衝液、塩、界面活性剤、リポソーム、シクロデキストリン、等を含む溶解性向上剤の組込みのような当業者にとって既知の適当な製剤化技術の使用によって増加することができる。
【０１１７】
非経口投与のための組成物は、即時又は改変放出であるように製剤化することができる。改変放出製剤は、遅延、継続、パルス、制御、標的化及びプログラム放出を含む。従って、免疫原性組成物及びワクチンは、固体、半固体、又は免疫原性組成物及びワクチンの改変放出を提供するインプラントのデポーとしての投与のための揺変性液体として製剤化することができる。
【０１１８】
免疫原性組成物又はワクチンの投与の他の手段は、マイクロニードル又は無針（例えば、ＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔＴＭ、ＢｉｏｊｅｃｔＴＭ、等）注射による送達を含む。
【０１１９】
皮下又は筋肉内注射が使用される場合、等張製剤が好ましい。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含むことができる。特定の場合において、リン酸緩衝生理食塩水のような等張溶液が使用される。製剤は、ゼラチン及びアルブミンのような安定剤を更に包含することができる。幾つかの態様において、血管収縮剤を製剤に加える。本発明による医薬調製物は、一般的に滅菌及びパイロジェンフリーで提供される。然しながら、医薬的に受容可能な担体の処方は、いずれものイヌワクチン、ポリペプチド（抗原）サブユニット免疫原性組成物及びワクチン、組換えウイルスベクターワクチン、及びＤＮＡワクチンについて、米国農務省、或いはカナダ若しくはメキシコ、又は欧州国家のいずれか一つのような外国の同等な政府機関によって公表された規則において認可された医薬的担体であることは当業者にとって周知である。従って、免疫原性組成物又はワクチンの商業的産生のための医薬的に受容可能な担体は、米国又は外国の適当な政府機関によってすでに認可された、又は認可されるものである担体である。免疫原性組成物及びワクチンは、更に医薬的に受容可能であるアジュバントと混合することができる。免疫原性組成物及びワクチンのある種の製剤において、免疫原性組成物又はワクチンは、他のイヌ病原体によって起こされる広い範囲の疾病に対してイヌを保護することができる多価産物を製造するために、他のイヌ免疫原性組成物又はワクチンと混合される。
【０１２０】
本明細書中に記載される免疫原性組成物は、イヌ呼吸器病原体からの感染を予防することができるか、又はイヌにおけるＣＩＲＤＣを約３ヶ月又はそれより長い期間予防することができる。当該組成物は、前記イヌ呼吸器病原体からの感染を予防することができるか、又は前記イヌにおけるＣＩＲＤＣを約６ヶ月又はそれより長い期間予防することができる。当該組成物は、前記イヌ呼吸器病原体からの感染を予防することができるか、又は前記イヌにおけるＣＩＲＤＣを約１年の期間予防することができる。
【０１２１】
検出及び診断方法
動物において誘発された免疫反応の程度及び特質は、各種の技術を使用することによって評価することができる。例えば、血清を接種された動物から収集し、そして免疫原に対して特異的な抗体の存在又は非存在を試験することができる。細胞性免疫反応の誘発を示すリンパ系組織中の反応性細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の検出は、Ｔ細胞増殖のようなアッセイによって達成することができる。関連する技術は、当技術分野において十分に記載されている。
【０１２２】
キット
免疫原性組成物又はワクチンを、更なる組成物又は化合物と組合せて−例えば、特定の疾病又は状態を治療する目的のために−投与することが好ましいことであり得る限り、免疫原性組成物又はワクチンを、都合よく組成物の投与又は同時投与のために適したキットの形態に含めるか、又は組合せることができることは本発明の範囲内である。
【０１２３】
従って、本発明によって包含されるキットは、少なくともその一つが本発明による免疫原性組成物又はワクチンである一つ又はそれより多い別個の医薬組成物、及びコンテナー、別々のビン、又は別々のホイル包装のような前記組成物を別個に保持する手段を含んでなることができる。このようなキットの例は、シリンジ及び針、等である。本発明のキットは、例えば、経口及び非経口のための、別個の組成物の異なった投与間隔の投与のための、又は別個の組成物を互いに力価測定するための、異なった剤形の投与に特に適している。本発明によって包含される組成物を投与するものを援助するために、キットは典型的には投与のための説明書を含んでなる。
【０１２４】
本発明によって包含されるもう一つのキットは、感染された動物の検出のために有用な一つ又はそれより多い試薬を含んでなることができる。キットは、全微生物、ポリペプチド、エピトープ又はポリヌクレオチド配列の存在について試料を分析するための試薬を含むことができる。ウイルス、細菌、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の存在は、抗体、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、及び当業者にとって既知の他の検出方法を使用して決定することができる。
【０１２５】
本発明によって包含されるもう一つのキットは、特定のエピトープに対する抗体の検出のための試薬を提供することができる。このような試薬は、抗体の存在について試料を分析するために有用であり、そして当業者にとって容易に知られ、そして使用可能である。抗体の存在は、当業者にとって既知の標準的な検出方法を使用して決定することができる。
【０１２６】
ある態様において、キットは、当該キットが感染された動物の検出のために有用であることを表示する印刷された説明書、又はラベルの組合せを含むことができる。
【０１２７】
抗体
抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又は組換え型のいずれかであることができる。抗体は、免疫原又はその一部に対して調製することができる。例えば、免疫原のアミノ酸配列に基づいて、又はクローニング技術によって組換え的に調製された合成ペプチド、或いは天然の遺伝子産物及び／又はその一部を単離し、そして免疫原として使用することができる。免疫原は、当業者にとって周知の標準的な抗体産生技術によって抗体を産生するために使用することができる。抗体の断片も、当業者にとって既知の方法によって抗体から調製することができ、そしてＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片を含む。
【０１２８】
抗体の産生において、所望の抗体に対するスクリーニングは、当技術分野において既知の免疫学の標準的な方法によって達成することができる。一般的に、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法が免疫アッセイの好ましい種類である。両方のアッセイは、当業者にとって周知である。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方をこのアッセイにおいて使用することができる。抗体は、当技術分野において周知のように、固体支持基質と結合するか、検出可能な部分とコンジュゲートするか、或いは結合及びコンジュゲートの両方をすることができる。抗体の固体支持基質との結合も、当技術分野において周知である。本発明において使用することを意図する検出可能な部分は、制約されるものではないが、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、１４Ｃ、及びヨウ素化のような蛍光、金属、酵素及び放射性マーカーを含むことができる。
【０１２９】
本発明は、以下の実施例によって更に例示されるが、しかし決してそれに限定されない。
【実施例】
【０１３０】
実施例１．ＣＲＣｏＶを含有するワクチンの評価
良好な一般的健康状態の６０匹の生後８ないし９週のビーグル犬を研究に使用した。全ての動物は、到着時に、そして再び研究の−２又は−１日目に身体検査を受けた。動物は到着からの一般的健康状態について、研究の−８日目から研究の３９日目まで一日一回観察した。耳内温度を、ワクチン接種に先立ち研究の−１日目に収集し始めた。血清学のための血液試料（概略５ｍＬ）を、それぞれのワクチン接種に先立ち研究の０日目及び２１日目にＳＳＴ試験管中に収集した。
【０１３１】
ＣＲＣｏＶワクチン株は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約に従いＰＴＡ−１１４４４としてＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣｏＶ．６６９株に由来した。ＣＩＶワクチン株は、ＰＴＡ−７６９４としてＡＴＣＣに寄託されたものに由来した。ＣＰＩＶ及びＣＡＶ−２分離株は、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）ワクチン株（Ｐｆｉｚｅｒ）中のワクチンを製剤化するために使用された種ウイルスに由来した。抗原は、ウイルスの最高の継代で調製した（マスター種ウイルス＋５（Master Seed Virus+5））。ワクチン組成物は、Ｑｕｉｌ  Ａ（２０ｕｇ）、コレステロール（２０ｕｇ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ；１０ｕｇ）、及びカーボポール（登録商標）（ポリアクリル酸；０．０５容量／容量％）からなるアジュバントを含有していた。ＣＲｏＶ抗原を、投与当たり１．３の相対抗原単位（ＲＡＵ）を目標として処方した。実験用ワクチンを無菌性について試験した。
【０１３２】
異種のＣＲＣｏＶ分離株（“Ｍａｘ”株；継代１）を、チャレンジ物質として使用した。ウイルス原料物質（stock material）を増殖させ、そしてＨＲＴ１８Ｇ細胞上で力価測定し、そして１０７．１ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価を有することを決定した。このチャレンジ物質を試験し、そして無菌性について満足であり、そしてマイコプラズマ又はイヌ／ネコ外来性病原体を含まないことを確認した。
【０１３３】
１匹の動物に２１日目にワクチン接種した；全ての残りの動物に研究の２２日目にワクチン接種した。動物に、適当なワクチン又はプラセボで、表１に示す研究設計によって皮下的にワクチン接種した。最初のワクチン接種は、右肩部（研究の０日目）に投与し、そして二回目のワクチン接種は、左肩部（研究の２２日目）に投与した。
【０１３４】
【表１】
0005833144.tif 000002
【０１３５】
最初のワクチン接種後、動物を、ワクチン接種注射後の膨潤について毎日観察した（研究の１日目から８日目まで）。二回目のワクチン接種後、動物を、ワクチン接種注射後の膨潤について２９日目まで毎日観察した。観察を、注射部位の膨潤／疼痛を有した動物について、先に記載した日数を超えて、膨潤／疼痛が消散するまで週二回続けた。耳内温度をそれぞれのワクチン接種後一週間毎日収集した。
【０１３６】
血清学のための血液試料（概略８ｍＬ）を、研究の４２日目にチャレンジに先立ちＳＳＴ試験管に収集した。耳内温度を、研究の４０、４１、及び４２日目のチャレンジ前に収集した。二つの種類の中咽頭拭取り検体（ウイルス単離のためのＶＴＭ［ウイルス輸送培地（Virus Transport Medium）］、及び細菌単離のためのアミーズ（Amies））を、研究の４２日目のチャレンジに先立ちそれぞれのイヌから収集した。動物を、基線値を決定するために、呼吸器病の臨床的徴候についてチャレンジ前の研究の４０、４１、及び４２日目に一日一回観察した。
【０１３７】
研究の４２日目に、全ての動物を、１０６／ｍＬ／イヌの目標チャレンジ投与量のＣＲＣｏＶチャレンジウイルスで鼻腔内的（ＩＮ）にチャレンジした。全ての動物を、チャレンジ投与に先立ち、Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）の静脈内注射によって鎮静させた。鎮静後、それぞれの動物は、針のないシリンジを使用して鼻腔当たり概略０．５ｍＬで与えられる１．０ｍＬのチャレンジウイルスを受けた。チャレンジ投与後、鎮静をＡｎｔｉｓｅｄａｎ（登録商標）の筋肉内注射によって無効にした。
【０１３８】
耳内温度、臨床観察、及び中咽頭の拭取り検体を、チャレンジ後、研究の４２から５６日目まで、毎日収集した。血清学のための血液試料（概略５ｍＬ）を、研究の４６日目及び研究の５６日目（剖検に先立ち）に収集した。
【０１３９】
剖検において、完全な肺及び気管を無菌的に取出し、そして滅菌覆布上に置き、そして肺葉を、肺の病変（硬化）について全体的に評価した。それぞれの肺葉を肺の硬化のパーセントで採点した。一組の肺は、瀉血が不十分であり、評価しなかった。気管を横切断し、管腔を全体的病態について評価し、そしていずれもの所見を記録した。
【０１４０】
肺を採点した後、右下肺葉を、細菌学的分析及びウイルス単離のために、概略３０．０ｍＬの培地を流すことによって洗浄した。一対の組織試料を、気管及び鼻腔から、一つはウイルス単離のために、そして二つ目は組織病理学のために収集した。右上肺葉を、細菌学の試料採取のための一つを含む三つの試料に分割した。血清学のための血液を所定の研究日に収集した。
【０１４１】
結果。  全ての動物を、ＩＦＡ試験によって、ＣＲＣｏＶに対する抗体に対して陰性である（ＩＦＡ力価＜４０）ことを、研究の０日目の前に確認した。ＣＲＣｏＶウイルス単離のために評価した中咽頭拭取り検体は、全ての動物が研究の０日目のワクチン接種に先立ちＣＲＣｏＶを持たないことを確認した。プラセボでワクチン接種した対照は、研究の４２日目までＣＲＣｏＶの血清陰性のままであった。この群は研究の４２日目のウイルス単離によって、ＣＲＣｏＶを持たないことが確認され、施設中の外来性ＣＲＣｏＶの欠如が示された。全てのイヌが、研究の４２日目にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを持たないことを確認した。
【０１４２】
ＥＬＩＳＡアッセイを、基準抗原に指定したＣＲＣｏＶの特定のバッチに対する相対的抗原単位（ＲＡＵ）として、ワクチン中のＣＲＣｏＶ抗原濃度を測定するために使用した。ＣＲＣｏＶ抗原は、０．５ＲＡＵ／投与であると決定した。
【０１４３】
ワクチン接種後に、プラセボでワクチン接種した群を含むワクチン接種したイヌの大多数は、注射部位に注射部膨潤を発生した。一価ワクチン接種した群について、ワクチン接種の大多数において、膨潤の大きさは一般的に小さかった（最長寸法で２ｃｍ又はそれより小さい）。これらの膨潤は、大多数のイヌについて２週間内に消散した。いずれものワクチン接種したイヌにおいて、ワクチンに関連する疼痛又は全身性反応はなかった。臨床的発熱（≧３９．５℃）は、一匹のイヌを除き、観察されなかったが、そのイヌの上昇した温度はワクチン接種に関係なかった（温度は二回目のワクチン接種に先立ち収集した）。これらの所見は、一価ワクチンが、アジュバント添加した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチンについて予測された範囲内の注射部膨潤のみを起こすことを示す。
【０１４４】
血清中和力価を表にし、そして群間で比較した。全ての一価ワクチン接種したイヌ（１００％）は、二回目のワクチン接種後３週間でＳＮ力価（ＧＭＴ３７１）を発生し、活性な免疫化を示した。プラセボでワクチン接種したイヌ（ＧＭＴ４７１）と比較して、強力なチャレンジ後（既往性）の血清中和反応を、５６日目に組合せワクチン接種したイヌ（ＧＭＴ６，９１５）において測定した。これらの結果は、統計的に有意に異なり、そしてＣＲＣｏＶワクチンの抗原が、ＣＲＣｏＶ感染に対するイヌの免疫反応を有効に刺激し、そして抗原刺激したことを示す。
【０１４５】
チャレンジ後、全てのプラセボでワクチン接種した動物は（１００％）、チャレンジ後１日目ないし６日目の間の少なくとも１日で、その中咽頭分泌物中にウイルスを排出し、ＣＲＣｏＶ感染の誘発を示す。一価ワクチンは、プラセボ（３．３日）と比較した場合、中咽頭排出のある平均日数を有意に（ｐ＝０．０２３７）減少し（２．１日）、ＣＲＣｏＶ感染を減少することにおけるワクチンの有効性を示す。
【０１４６】
全てのプラセボでワクチン接種したイヌ（１００％）は、チャレンジ後４日目に、その気管、鼻腔、及び肺おけるウイルス単離に対して陽性と検定され、呼吸器官のＣＲＣｏＶ感染を示した。チャレンジ後１４日目にいずれもの器官から単離されたウイルスはなく、イヌインフルエンザと同様な典型的な呼吸器ウイルス感染を示唆した。対照的に、一価ワクチンは、ワクチン接種したイヌの肺（ｐ値＜０．０００１）及び気管（ｐ値＜０．０２３７）のそれぞれ９０％及び５０％における感染を防止した。これは、一価ワクチンがこれらの重要な器官におけるウイルス感染を防止する十分な免疫を誘発したことを示す。ワクチン接種及び対照間の鼻腔感染の速度に有意な差はなかった。
【０１４７】
ＣＲＣｏＶチャレンジは、実験条件下で軽度の臨床的徴候のみを起こした。涙及び鼻汁並びに結膜炎が処置群のイヌ全体で報告された。チャレンジ後の期間中に臨床的発熱（≧３９．５℃）を報告された５匹の動物−プラセボ群に２匹、一価ワクチン群に１匹、そして組合せワクチン群に２匹−がいた。
【０１４８】
肺、気管、及び鼻の鼻甲介の全体的評価を、チャレンジ後の４及び１４日目に行った。２匹のイヌ−Ｔ０５の１匹、Ｔ０１の１匹−が、低いレベルの肺の硬化を有し、２匹のイヌ−Ｔ０１の１匹、Ｔ０３の１匹−が、鼻の鼻甲介の壊死の病巣領域を有したことを除き、報告された顕著な全体的病変はなかった。
【０１４９】
組織病理学において、肺、気管、及び鼻腔組織を調べ、そして採点した。観察された変化の程度により、得点（０から４）を割当てた。チャレンジに起因する変化は、鼻の鼻甲介において最も著しく、次いで気管、そして最後に肺であった。これは、その一次影響を上部気道（鼻の鼻甲介及び気管）に、その後の、そしてより少ない影響を下部気道（肺）に有する呼吸器チャレンジウイルスと一致する。これは、ＣＲＣｏＶ感染が呼吸器官の組織病変を起こしたことを証明する。
【０１５０】
従来の研究は、チャレンジ後４日目の気管の線毛損傷が、ＣＲＣｏＶ感染の特徴的な病理学的帰結であることを示している。データは、プラセボでワクチン接種したもの（３０％の正常なイヌ）と比較した場合、一価ワクチンが６０％の動物の気管の線毛損傷を防止することを示したが、減少は、有意ではなかった（Ｐ＝０．１５３８）。肺及び肺洗浄液に対して行った診断的細菌学は、全ての動物が、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓに対して陰性であることを確認した。肺、肺洗浄液、又は両方は、４匹の動物においてのみＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．に対して陽性であった。この所見は、病変がウイルス感染に特異的であり、そしてそれからもたらされたことを示唆する。
【０１５１】
要約すれば、Ｔ０３−Ｔ０６の全てのＣＲＣｏＶでワクチン接種したイヌ（１００％）は、二回目のワクチン接種後３週間で血清中和力価を発生し、活性な免疫化を示した。一価ワクチンは、ワクチン接種したものに免疫反応を誘発し、これは、中咽頭分泌物及び呼吸器官中のウイルス排出を減少させた。これは、プラセボでワクチン接種した対照と比較して、ワクチン接種したものにおける気管の線毛損傷も減少させた。組織病理学試験は、一価ワクチンが、プラセボでワクチン接種した動物（３０％）と比較した場合、６０％の動物における気管の線毛損傷を防止することを示した。
【０１５２】
実施例２．イヌにおける二価のＣＲＣｏＶ／ＣＩＶワクチンの効力試験
良好な一般的健康状態の６０匹の生後７ないし８週のビーグル犬を、研究に使用した。全ての動物は、研究の−９日目の到着時に身体検査を受けた。研究の−７日目に外された１匹のイヌを除き、全ての動物は、研究の−２日目に二回目の身体検査を受け、そして研究に適しているとみなされた。
【０１５３】
動物を、到着時からの一般的健康状態について、研究の−７日目ないし研究の３９日目まで一日一回観察した。血清学のための血液試料（概略６ｍＬ）を、血清分離試験管（ＳＳＴ）中に研究の０及び２１日目に、それぞれのワクチン接種に先立ち収集した。二組の鼻腔拭取り検体−ＣＲＣｏＶのための一つ及びＣＩＶウイルス単離のための一つ−を、それぞれのイヌからワクチン接種に先立ち０日目に、ＣＲＣｏＶ及びＣＩＶが存在しないことを確認するために収集した。耳内温度を、ワクチン接種に先立ち基線を確立するために−１及び０日目にワクチン接種に先立ち収集し、そして記録した。耳内温度を、２１日目の二回目のワクチン接種に先立ち収集した。動物を、研究の０及び２１日目にワクチン接種に先立ち、肩の部分で触診して、既存の病変が注射部位領域に存在しないことを確認した。
【０１５４】
Ｔ０４の一匹のイヌを、呼吸困難のため研究の−７日目に研究から外した。Ｔ０５の一匹のイヌを、呼吸困難のため研究の０日目にワクチン接種に先立ち研究から外した。更に、二匹の動物を、研究の行為に関係ない状態のため、参加後、研究から外した。Ｔ０６の一匹のイヌを、呼吸困難のために研究の２１日目の二回目のワクチン接種を受ける前に研究から外した。Ｔ０２の一匹のイヌを、未解決の角結膜炎及び瞬膜腺脱出（ｐｒｏｌａｐｓｅｄ  ｎｉｃｔｉｔａｎｓ）のために、研究の２１日目の二回目のワクチン接種を受ける前に研究から外した。
【０１５５】
二つの二価ワクチン、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）で５容量／容量％でアジュバント添加した不活化ＣＲＣｏＶ／不活化ＣＩＶワクチン、及びＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＴＭで５容量／容量％でアジュバント添加した不活化ＣＲＣｏＶ／不活化ＣＩＶワクチンを調製した（表２）。ＣＲＣｏＶワクチン株は、ＰＴＡ−１１４４４としてＡＴＣＣに寄託されたものに由来した。ＣＩＶワクチン株は、ＰＴＡ−７６９４としてＡＴＣＣに寄託されたものに由来した。ワクチンを製造するために使用した両方の抗原原体は、免疫原性の要求に合致するようにウイルス及び細胞の最大継代において産生された。ＣＲＣｏＶ抗原は、１．５５ＲＡＵ／投与を目標として製剤化した。ＣＩＶ抗原は、６４０ＨＡ単位／投与を目標として製剤化した。
【０１５６】
【表２】
0005833144.tif 000003
【０１５７】
異種ＣＲＣｏＶ分離株（“Ｍａｘ”株；継代１）を、チャレンジ物質として使用した。ウイルス原料物質を増殖させ、そしてＨＲＴ１８Ｇ細胞上で力価測定し、そして１０７．１ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価を有することを決定した。このチャレンジ物質を試験し、そして無菌性試験について満足であり、マイコプラズマ及びイヌ／ネコ外来性病原体を含まないことを確認した。
【０１５８】
動物に、適当なワクチン又はプラセボで、０及び２１日目にワクチン接種した（表２）。一回目のワクチン接種を、右肩部に０日目に投与し、そして二回目のワクチン接種を左肩部に２１日目に投与した。
【０１５９】
動物を、一回目のワクチン接種後の注射部膨潤／疼痛について研究の０から８日目まで毎日、そしてその後、研究の１２、１５、１９、２１、２２、及び２６日目に観察した。研究の８日目、１８匹の動物の膨潤の観察は不注意で記録されなかった。研究の２１日目、右肩（一回目投与のワクチン接種）の観察に対する余分な観察が、幾匹かの動物に対して記録された。
【０１６０】
研究の２１日目のワクチン接種後、動物を、ワクチン接種後の注射部膨潤／疼痛について研究の２１から２９日まで毎日、そしてその後、研究の３３、３６、及び４０日目に観察した。二回目のワクチン接種から生じた全ての膨潤は、研究の４０日目に消散した。耳内温度を、ワクチン接種の０から７及び２１から２８日目に、それぞれのワクチン接種の概略３時間後に収集した。
【０１６１】
血清学のための血液試料（概略６ｍＬ）を、ＳＳＴ試験管に研究の４２日目にチャレンジに先だち収集した。またチャレンジに先立ち、研究の４０、４１、及び４２日目に、基線値を確立するために、耳内温度を収集した。二種類の鼻腔の拭取り検体（ＣＲＣｏＶウイルス単離のためのＶＴＭ；細菌単離のためのアミーズ）を、研究の４２日目のチャレンジに先立ちそれぞれのイヌから収集した。動物を、基線値を確立するために、呼吸器病の臨床的徴候についてチャレンジ前の研究の４０、４１、及び４２日目に一日一回観察した。
【０１６２】
全ての処置群からの６匹のイヌのそれぞれの群に、１９ｍＬのチャレンジ物質をプレキシガラスの部屋の中で概略３０分間エアゾール投与することによってチャレンジウイルスを投与した。室内に噴霧化するチャレンジウイルスの体積は、６匹より少ないイヌを同時にチャレンジする場合、比例的に調節した。チャレンジ投与後に収集したＣＲＣｏＶチャレンジ試料に対して行ったウイルス力価測定は、室内にエアゾール化された生のチャレンジウイルスの量が、１０５．１ＴＣＩＤ５０／ｍＬを含有していたことを確認した。チャレンジ後、耳内温度、臨床観察、及びウイルス単離のための鼻腔拭取り検体（滅菌ダクロン綿棒、Ｐｕｒｉｔａｎ  ２５−８０６−１ＰＤ）（ＶＴＭ試験管）を、研究の４２から５６日目までイヌから毎日収集した。血清学のための血液試料（概略６ｍＬ）を、研究の４６日目及び研究の５６日目に剖検に先だって収集した。
【０１６３】
剖検において、完全な肺及び気管を無菌的に取出し、そして滅菌覆布上に置いた。肺葉を、肺の病変（硬化）について全体的に評価した。それぞれの肺葉を、肺の硬化のパーセントで採点した。２匹の動物からの肺の組は、不十分な瀉血を有し、評価及び採点できなかった。気管を横切断し、管腔を全体的病態について評価し、そしていずれもの所見を記録した。肺を採点した後、それぞれの右下肺葉を、診断的細菌学的分析及びウイルス単離のために、概略３０．０ｍＬのＶＴＭ（抗生物質を含まない）を流すことによって洗浄した。
【０１６４】
肺を採点した後、組織試料を、気管、及び鼻腔から収集し、そして全部の左中肺葉を、組織病理学のために収集した。組織試料を、気管、鼻腔、及び右上肺葉から、ウイルス単離及び細菌学のために収集した。
【０１６５】
血清学のための血液を所定の研究日に収集した。
【０１６６】
鼻腔拭取り検体（チャコールを含まないアミーズ輸送培地）を、それぞれのイヌから研究の４２日目（チャレンジに先立ち）に、診断的細菌学のために収集した。これらの拭取り検体を、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓの存在について試験した。
【０１６７】
結果。  ５９匹のビーグルの子イヌを、ＩＦＡ試験によって、ＣＲＣｏＶに対する抗体に対して陰性（ＩＦＡ力価＜４０）であることを、研究の０日目にワクチン接種に先立ち確認した。血清試料も血清中和によって試験し、そしてＣＲＣｏＶに対する抗体に対して陰性（ＳＮ力価＜２０）であることを確認した。ＣＲＣｏＶウイルス単離について評価した鼻腔拭取り検体は、全ての動物が、研究の０日目のワクチン接種に先立ち、ＣＲＣｏＶウイルスを持たないことを確認した。研究の０日目のＣＩＶウイルス及び抗体試験は、動物がＣＩＶウイルス及びＣＩＶのＨＡＩ抗体を持たない（ＨＡＩ力価＜８）ことを確認した。これらの二つの基準に基づき、動物が、感受性であり、そして従ってＣＲＣｏＶ及びＣＩＶワクチンの効力及び安全性の評価のために適していることを確認した。生理食塩水でワクチン接種した対照は、研究の４２日までＣＲＣｏＶ血清陰性のままであった。全てのイヌは、研究の４２日目のウイルス単離によってＣＲＣｏＶを持たないことが確認され、施設内の外来性ＣＲＣｏＶ暴露の欠如を示した。全てのイヌが、研究の４２日目（チャレンジ前）に、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを持たないことを確認した。
【０１６８】
イヌに、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）又はＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＴＭのいずれかでアジュバント添加した不活化ＣＲＣｏＶ及び不活化ＣＩＶ抗原を含有する二つの製剤でワクチン接種した。ワクチン中のＣＲＣｏＶ抗原の効力は、ＣＲＣｏＶ特異的血清中和モノクローナル抗体４１．１．１を使用する二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。指定された基準抗原に対して測定して、効力は、１．１４ＲＡＵ／投与と決定された。モルモットのＣＩＶのＨＡＩ力価は、９５５であった。（合格判定基準はＨＡＩ力価≧１６１であった）。
【０１６９】
Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）製剤を受けた１９匹の動物（Ｔ０５及びＴ０６）のうち１０匹は、一回目のワクチン接種後、測定可能な注射部膨潤を発生した。ワクチン接種の直後に大多数のイヌにおいて引掻き行動の報告があった。接触に対する疼痛は、２匹のイヌでのみ報告された。１匹のイヌを除き、この群の膨潤は、翌日までに全て消散した。二回目のワクチン接種後、注射部膨潤の大きさ及び頻度の数値の僅かな増加があったが、しかしそれらは、アジュバント添加したワクチンに対する典型的な反応として、全て予測された範囲内であった。臨床的発熱の欠如（≦３９．５℃）によって確認されるように、いずれものワクチン接種したイヌにおいて全身性反応の報告はなかった。これらの所見は、このワクチン製剤が、この年齢の群のイヌに投与するために安全であり、そして安全特性は、アジュバント添加したワクチンについて予測される範囲内であることを示す。
【０１７０】
ＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＴＭ製剤を受けた大多数のイヌ（Ｔ０３及びＴ０４）は、それぞれのワクチン接種後、注射部膨潤を発生した。膨潤は、一回目のワクチン接種後三日目に現れ、大多数の膨潤は、研究の１９日目までに消散した。類似の反応は、二回目のワクチン接種後に見られ、この場合、大多数の膨潤は、研究の３６日目までに消散した。注射部膨潤は、一般的に小さい大きさであり、そして典型的なミョウバンアジュバントの反応であった。疼痛及び発熱の報告はなく、ワクチンに対する全身性反応の欠如を確認した。これらの所見は、このワクチン製剤が、この年齢の群のイヌに投与するために安全であり、そして安全特性が、アジュバント添加したワクチンについて予測される範囲内であることを示す。
【０１７１】
血清中和の力価を表にし、そして群間で比較した（図１）。両方のワクチン製剤は、一回目の投与後の全てのワクチン接種したイヌに血清中和抗体（ＳＮ）反応を誘発し、活性な免疫化を示した（図１）。幾何平均ＳＮ反応（ＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＴＭについてのＧＭＴ＝５５２；Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）についてのＧＭＴ＝２０３０）は、二回目のワクチン接種後に増加し、二回目のワクチン接種の追加免疫効果を示した。両方のワクチン製剤は、チャレンジ後、強い既往性のＳＮ反応をもたらし（研究の５６日目における、研究に残ったイヌについて、ＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＴＭについてのＧＭＴ＝１０，７２５；Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）についてのＧＭＴ＝１１，５８４）、有効な免疫記憶反応を示した。ＣＲＣｏＶに対する抗体反応が、ＣＩＶ抗原の存在下で達成され、二価ワクチンにおける抗原間の干渉の欠如を示したことに注目することは重要である。
【０１７２】
研究に残った５６匹のイヌを、研究の４２日目にエアゾール投与によってチャレンジした。チャレンジ後の鼻腔のウイルス単離は、全ての生理食塩水でワクチン接種したイヌ（１００％）は、チャレンジ後の１ないし６日目の間の少なくとも三日間、チャレンジウイルスを排出したことを示し、平均日数４．５日の排出を伴うＣＲＣｏＶによるイヌの感染を示した（図２）。二つのワクチン製剤は、ウイルス排出を、ＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＴＭ及びＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）に対して、それぞれ２．６日（ｐ＜０．０００１）及び３．４日（ｐ＝０．００４２）に有意に減少させた。これらの所見は、ワクチンが、ウイルス感染の減少をもたらす効力を誘発したことを示す。
【０１７３】
組織のウイルス単離のデータは、生理食塩水でワクチン接種した群のイヌの９０−１００％が、その鼻腔、気管、及び肺組織においてチャレンジ後の研究の４日目においてウイルスについて陽性であったことを示し、呼吸器官の感染を示した（図３）。対照的に、両方のワクチンは、肺（ｐ＜０．０００１）及び鼻腔（ｐ＜０．００２）におけるウイルス単離について陽性の動物のパーセントを有意に減少させた。両方のワクチンは、気管におけるウイルス単離を減少させたが（ウイルスはＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＴＭ群について７０％から、そしてＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）群について４４％から単離された）、生理食塩水の対照と比較した場合、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）製剤のみがウイルス単離の有意な減少をもたらした（ｐ＝０．００８９）。チャレンジ後の１４日目に、いずれもの動物からウイルスの単離はなく、ＣＲＣｏＶ感染が、イヌインフルエンザと類似の筋書きで、迅速に呼吸器組織に入り、そして離脱することを示した。ウイルス単離のデータは、両方のワクチン製剤が、イヌのウイルス感染を有意に減少させることを示す。
【０１７４】
ＣＲＣｏＶチャレンジは、実験条件下で軽度の呼吸器の臨床徴候のみを起こした。涙及び鼻汁が全部の処置群のイヌで報告された。
【０１７５】
研究の４１日目（チャレンジの１日前）の生理食塩水対照群の１匹の動物を除き、全ての動物は、チャレンジに先立ち正常な体温を有していた。チャレンジ後、臨床的発熱を持つと報告された２匹のイヌが生理食塩水対照群にいた。両方のイヌは、誘発後の２日目（研究の４４日目）に３９．６℃の体温を有していた。それらのイヌの１匹は、チャレンジ後の４日目に再び発熱（４０℃）を示した。このイヌは、同時に胃腸炎の治療を受けていた。これは、このウイルスが以前に実験条件下で発熱を起こすことが示されていなかったため、このイヌのＣＲＣｏＶチャレンジ後の発熱反応を説明するかもしれない。いずれものワクチン接種したイヌにおいて臨床的発熱の報告はなかった。
【０１７６】
肺、気管、及び鼻腔の鼻甲介の全体的剖検評価を、チャレンジ後の４及び１４日目に行った。Ｔ０５からの２匹のイヌ、Ｔ０１からの２匹のイヌ、及びＴ０２からの１匹のイヌの肺の硬化を除き、顕著な全体的病変の報告はなかった。これらの病変の原因は不明であったが、しかし病変は一貫せず、そしてＣＲＣｏＶが肺の硬化を起こすことは示されていないため、ＣＲＣｏＶによるとは考えられない。組織の診断的細菌学の試験は、いずれもの他の病原体の関与を示唆しなかった。
【０１７７】
肺、気管、及び鼻腔組織の切片を試験し、そして採点した。観察された変化の程度により、得点（０から４）を割当てた。従来行われた研究は、チャレンジ後４日目の気管上皮における線毛損傷が、ＣＲＣｏＶ感染に伴う特徴的病理学的影響であることを示している（Ｐｒｉｅｓｔｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）。組織病理学データは、生理食塩水でワクチン接種したイヌの７０％が、チャレンジ後４日目に、ある程度の気管の線毛上皮の損傷を経験したことを明らかにした。対照的に、両方のワクチンは、影響されたイヌの数を、ＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＴＭについて４０％（ｐ＝０．１１８４）、そしてＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）について０％（ｐ＝０．０００３）に減少させた。これは、ワクチンが、気管の粘膜網様体の損傷に対して保護するか、又はそれを減少させる効力を誘発したことを示し、これは感染したイヌにおける重要な生得的防御機構である。
【０１７８】
研究における他の呼吸器病原体の潜在的関与を評価するために、動物を、チャレンジに先立ち（鼻腔拭取り）、そしてチャレンジ後に（肺組織／洗浄液）、診断的細菌学のために試験した。得られた結果は、動物が殆ど他の呼吸器病原体を持たず、チャレンジ後に測定された臨床的結果が、ＣＲＣｏＶ感染に特異的に起因したことを示した。
【０１７９】
要約すれば、全てのＣＲＣｏＶ−ＣＩＶでワクチン接種したイヌ（１００％）は、二回目のワクチン接種の３週間後にＣＲＣｏＶ血清中和抗体の力価を発生し、活性な免疫化と、それに続く強力なチャレンジ後の既往性反応を示し、良好な免疫系の刺激を示した。二つのワクチン製剤は、ウイルスの排出を有意に減少させた。両方のワクチン製剤は、肺（ｐ＜０．０００１）及び鼻腔（ｐ＜０．００２）におけるウイルス単離について陽性の動物のパーセントを、有意に減少させた。両方のワクチンは、気管におけるウイルスの単離を減少させた、にも関わらず、生理食塩水対照と比較した場合、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）製剤のみが、ウイルス単離の有意な減少をもたらした（ｐ０．００８９）。両方のワクチンは、気管の線毛上皮に影響を受けたイヌの数も減少させた。これらのワクチン中のＣＲＣｏＶ抗原の効力は、ＣＩＶ抗原の存在下で達成され、ＣＩＶ画分によるＣＲＣｏＶに対する干渉の欠如を示した。
【０１８０】
実施例３．イヌにおけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを含有するワクチンの安全性及び効力
五つの処置群に分割した五十（５０）匹のイヌを、研究のために選択した。動物を、−４日目の身体検査に基づいて研究のために適合するかを決定した。
【０１８１】
血清学のための血液試料（概略８ｍＬ）を、全ての動物から研究の−２、２１及び２８日目にそれぞれのワクチン接種に先立ちＳＳＴ試験管に収集した。−２日目に収集した血清試料を、動物がＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを持たないことを確認するために使用した。鼻腔拭取り検体を０日目のワクチン接種に先立ち収集し、そしてＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの存在について試験した。耳内温度を、−４日目に開始して収集して、ワクチン接種に先立ち基線を確立した。
【０１８２】
動物に、表４に示した研究設計により、０、２１、及び２８日目に適当なワクチンでワクチン接種した。ワクチンを、それぞれのイヌに一回目のワクチン接種を右肩部に、そして二回目のワクチン接種を左肩部に皮下投与した。
【０１８３】
【表３】
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【０１８４】
全ての動物を、ワクチン接種の０、２１、及び２８日目に、ワクチン接種後の注射部位の反応について観察した。それらを、ワクチン接種後の注射部反応について１ないし７、及び２２−３５日目に毎日観察した。耳内温度を、０ないし７、及び２１ないし３５日目に収集した。
【０１８５】
血清学のための血液試料（概略６ｍＬ）を、チャレンジに１日先立つ５５日目に収集した。耳内温度を、チャレンジに先立ち５４、５５、及び５６日目に収集した。鼻腔拭取り検体を、チャレンジに１日先立ち５５日目に収集し、そしてＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの存在について試験した。動物を、一日二回（午前及び午後）５４及び５５日目に、そして５６日目の午前に、それぞれ概略３０分のセッション、呼吸器病の臨床的徴候について基線値を確立するために観察した。
【０１８６】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのチャレンジ株を、１０９ＣＦＵ／４ｍＬ／イヌの目標チャレンジ投与量を調製するために使用した。５６日目に、全ての処理群からのイヌを、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより、プレキシガラス室内のエアゾール投与によって、チャレンジされるそれぞれの檻に対して合計３０分間鼻腔内的にチャレンジした。同じ檻の５匹のイヌ（それぞれの処置群から１匹）を一度にチャレンジした。
【０１８７】
耳内温度を、チャレンジ後一日一回、５６から７７日目まで記録した。臨床的観察を、一日二回（午前及び午後）、それぞれのセッション当たり、それぞれの部屋において概略３０分間、５６日目から、そして７６日目まで、そして７７日目に一回（午前）行った。簡単には、咳、鼻汁、くしゃみ、涙、悪心、及び鬱状態を、次の採点系を使用して観察した：非存在（０）、軽度（１）、中等度（２）、及び重度（３）。鼻腔拭取り検体を、５９、６２、６６、６９、７４、７６及び７７日目に収集して、チャレンジ生物の排出を決定した。
【０１８８】
血清学のための血液試料（概略６ｍＬ）を、７７日目に収集した。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの単離のための鼻腔拭取り検体を綿棒及び輸送培地を使用して収集した。
【０１８９】
Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する凝集抗体を、微小凝集試験（Micro Agglutination Test）（ＭＡＴ）によって決定した。０、２８、５５、及び７７日目の処置群Ｔ０４及びＴ０５からの血清試料を、ＣＲＣｏＶ抗体について、血清中和及びＩＦＡによって、そしてＣＩＶについてＨＡＩによって力価測定した。鼻腔拭取り検体からのＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの単離を、標準的な方法によって行った。それぞれの試料を、細菌の存在又は非存在について定性的に試験した。
【０１９０】
結果。  五十（５０）匹の健康な概略生後８週間のビーグルの子イヌが、０日目にＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ生物体を含まないことを、鼻腔拭取り検体の培養物単離によって確認した。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ凝集抗体についてＭＡＴによって評価した血清試料は、全ての子イヌが、−２日目に≦８のＭＡＴ力価で感受性であることを確認した。
【０１９１】
この研究で評価した全ての実験のワクチンは、一回目のワクチン接種後、軽度から無の注射部膨潤を生じた。注射部膨潤は、ワクチン接種したものの大多数において、研究の０日目に限られた。軽度から無の注射部膨潤は、二回目のワクチン接種後にも報告された。注射部位膨潤は、それが起こった場合、二回目のワクチン接種後、１ないし３日の間に消散した。引掻き行為は、５種混合の群（Ｔ０４）において主として報告された。ワクチン接種後の臨床的発熱の報告はなかった。生理食塩水の群において注射部膨潤の報告はなかった。データは、ワクチンの安全性を確認した。
【０１９２】
チャレンジ接種前及び後に行われたコロニーの計数は、イヌ当たり平均１．４５×１０８ＣＦＵのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａが、室内でエアゾール化されたことを確認した。チャレンジ接種は、全ての生理食塩水の対照のイヌ（Ｔ０２）において咳を誘発し、咳を観察した平均パーセントは４３．５％で、１２．２日咳をした。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原を含まない４種ウイルスのみ（ＣＲＣｏＶ／ＣＩＶ／ＣＰＩＶ／ＣＡＶ２）でワクチン接種した処置群Ｔ０５は、生理食塩水の対照と同様の咳を発生し、咳を観察した平均パーセントは４３．４％で、１２．２日咳をした。これらの所見は、チャレンジが試験ワクチンを評価するために十分であり、そして一貫していることを示した。
【０１９３】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチンでワクチン接種した処置群Ｔ０１のイヌは、対照群（１２．２日咳をした）と比較した場合、チャレンジに対して有意に保護された（３．６日咳をした、ｐ＜０．０００１）。同じワクチンは、３週間間隔の投与計画で与えた場合、Ｔ０３のイヌも有意に保護した（５．８日咳をした、ｐ＝０．０００４）。これらの二つの群（Ｔ０１対Ｔ０３）の咳の得点の減少は、有意には異ならず（ｐ値＝０．１８８３）、３又は４週間間隔で与えたワクチンについての保護のレベルは同様であることを示唆した。
【０１９４】
アジュバント非添加（ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）５種混合ワクチンを受けたＴ０４のイヌは、生理食塩水の対照（１２．２日咳をした）と比較した場合、及び４種ウイルス（ＣＲＣｏＶ／ＣＩＶ／ＣＰＩＶ／ＣＡＶ２）混合を受けたＴ０５（１２．１日咳をした、ｐ＝０．００１９）と比較した場合、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａチャレンジに対して有意に（ｐ＝０．００１６）保護し（６．６日咳をした）、アジュバントを欠く混合ワクチンにおけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ画分の効力を示した。
【０１９５】
５種混合ワクチン中のウイルス画分の血清学的評価は、ＣＩＶ及びＣＲＣｏＶの二つの画分のみについて可能であり、ここでイヌは研究の−２日目に血清学的陰性であると確認された。研究の５６日目における４種ワクチン群（Ｔ０４）におけるＣＩＶのＨＡＩ反応は、５種ワクチン群（Ｔ０５）のそれと数字的に同様であり、そしてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ画分によるＣＩＶ抗原に対する干渉の欠如を示した。研究の５６日目のＣＲＣｏＶのＳＮ反応は、４種ワクチン群（Ｔ０４）において、５種ワクチン群（Ｔ０５）より数字的に高く、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａによるＣＲＣｏＶ画分に対する干渉の可能性を示した。然しながら、これらの所見は、これらのワクチンはアジュバント添加されず、そして処方は最適化されず、そしてＣＲＣｏＶチャレンジは効力を試験するために行われなかったため、決定的ではない。
【０１９６】
一価のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチンが、安全で、そして有効であることを確認した。ワクチンを２１又は２８日の間隔で投与した場合の一価ワクチンの効力は証明された。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ画分は、５種アジュバント非添加混合ワクチン中で投与した場合、有効であることも示された。
【０１９７】
実施例４．多価血清学研究
生後概略８週間の、そして良好な一般的健康状態の４０匹のイヌを、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａについて微小凝集試験（ＭＡＴ）によって、そしてイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）について間接蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）によって予備スクリーニングした。血清中和（ＳＮ）を、更に抗体レベルを評価するために使用した。０日目に、全てのイヌは、ＭＡＴによって決定された（≦１６）ように、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する抗体について陰性であり、そしてＩＦＡによって決定された（＜４０）ように、ＣＲＣｏＶに対する抗体について陰性であった。全てのイヌは、更に一回目のワクチン接種（０日目）に先立つ鼻腔拭取り検体単離試験によって決定されたように、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びＣＲＣｏＶを持っていなかった。
【０１９８】
イヌを、それぞれ８匹のイヌの五つの処置群に分割し、そして表１に示す研究設計によりワクチン接種した。ワクチンを、それぞれのイヌに、一回目のワクチン接種を右肩部に、そして二回目のワクチン接種を左肩部に投与した。
【０１９９】
【表４】
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【０２００】
二回目のワクチン接種後、合併症のために、Ｔ０４及びＴ０５群を研究から外した。残りの群（Ｔ０１、Ｔ０２、及びＴ０３）のイヌを、ワクチン接種後の反応について毎日観察し、そしてそれぞれのワクチン接種後７日間体温（耳内温度）をモニターした。血液試料を、０、２１、４２及び５６日目にイヌから収集して、抗体反応を測定した。
【０２０１】
０、２１、４２及び５６日目からの血清試料を、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する凝集抗体についてＭＡＴアッセイによって試験した。同じ日の血清試料を、更にＣＲＣｏＶ抗体について血清中和によって、ＣＩＶについてＨＡＩによって、そしてＣＡＶ−２及びＣＰＩ抗体について血清中和によって力価測定した。幾何平均の抗体力価を、それぞれの処置群について得た。
【０２０２】
Ｔ０２及びＴ０３群の試験ワクチンは、二回目の投与後、全ての（１００％）のワクチン接種したイヌに抗体反応を誘発し、ウイルス抗原に対する活性な免疫化を示した。抗体反応は、大多数のワクチン接種したイヌにおいて二回目のワクチン接種後に増加し、二回目のワクチン接種の追加免疫効果を示した。ウイルス画分の中での抗体反応が、多数のウイルス及び細菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）抗原の存在下で達成され、免疫学的干渉の欠如を示したことを注記することは重要である。ＭＡＴ血清学は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａに対する保護に相関していないが、しかしむしろ適した実験動物を登録するための価値あるスクリーニングの道具である。結論として、ワクチン接種したイヌの免疫学的反応に基づけば、ウイルス抗原の効力は、５種多価ワクチンにおいて予測される。
【０２０３】
実施例５．免疫研究の期間
この研究の目的は、イヌにおける多価呼吸器混合ワクチンの免疫の期間を証明することである。ワクチンは、パータクチン、Ｂｓｐ２２、又は両方のいずれかの組換え抗原で補充された次の抗原性成分を含有する：改変生ＣＡＶ−２、改変生ＣＰＩＶ、不活化ＣＩＶ、不活化ＣＲＣｏＶ及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抽出物。
【０２０４】
全ての動物は、良好な一般的健康状態であり、そして当該ワクチンが、それに対して保護するように設計されているいずれもの病原体に対するいずれものワクチン接種を受けていない。イヌを、多数の組の処置群に分割する。それぞれの組は、二つの処置群、プラセボワクチンを受ける対照群、及び試験ワクチンを受けるワクチン接種群からなる。動物を、概略２−４週間離して、二回ワクチン接種する。それらを、それぞれのワクチン接種後、注射部位反応について観察する。
【０２０５】
ワクチン接種の概略３−１２ヶ月後、二つの処置群（ワクチン接種及び対照）のそれぞれの組を、ワクチンがそれに対して保護するように設計された病原体の一つでチャレンジする。臨床観察を、チャレンジまで及びそのあとに行う。チャレンジ病原体の単離のための鼻腔拭取り検体を、チャレンジ後の期間に収集する。それぞれの動物からの血液を、血清を得るために収集し、これを、その後の解析的分析に使用する。呼吸器病の臨床的徴候、チャレンジ後の病原体排出、及び血清学的反応を、ワクチンの効力を判定するための基準として使用する。
【０２０６】
全ての前述の参考文献は、全てが本明細書中に記載されているかのように、本明細書中に参考文献として援用される。
【０２０７】
このように本発明の詳細な各種の態様が記載されてきたが、付属の特許請求の範囲によって定義される本発明が、その多くの明白な変更が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく可能であるため、上記の説明中に記載された特定の詳細に制約されるものではないことは理解されることである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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