(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）白血球をリンパ球分離培地（ＬＳＭ）に投入し、そして該培地を自動細胞処理及び洗浄システムで洗浄及び遠心分離することにより単核細胞（ＭＮＣ）から汚染細胞を除去し、
（ｂ）該ＭＮＣを密閉された無菌バッグシステム内に一晩保存し、
（ｃ）該ＭＮＣをディスポーザブルな細胞培養システム内でマイトジェン及びシプロフロキサシンで刺激してサイトカインを作製し、
（ｄ）該ＭＳＣから該マイトジェンをろ過により除去し、
(ｅ）該ろ過されたＭＳＣを培地内でインキュベーションし、
（ｆ）該ＭＳＣをろ過することにより該培地から清澄な上澄を得て、
（ｇ）該清澄な上澄から陰イオン交換クロマトグラフィによりＤＮＡを除去することによりクロマトグラフした上澄を得て、そして、
（ｈ）該クロマトグラフした上澄からウイルスを二段の連続した１５ナノメータウイルスろ過で除去し、これにより、ＩＬ−１β、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γのサイトカインを含む一次細胞由来バイオロジックを製造する
工程を含む、一次細胞由来バイオロジックの作製方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）は、さらに、複数のドナーからのＭＮＣから汚染細胞を同時に除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）は、さらに、顆粒球及び赤血球の除去を最適化するために、１５００〜３０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）は、さらに、血小板を１．２ｘ１０１０細胞を下回るレベルまで除去することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）は、さらに、該ＭＮＣをマイトジェン及び８０μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンで刺激することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｈ）は、さらに、少なくとも４Ｌの一次細胞由来バイオロジックを作製することを規定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記マイトジェンは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｄ）は、さらに、ＰＨＡのレベルを＜１５０ｎｇ／ｍＬ以下まで除去することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｄ）は、さらに、接線流モードでろ過することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｅ）は、さらに、２４時間インキュベーションすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程(e)の培地は、８０μｇ／ｍLのシプロフロキサシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）での単核細胞（ＭＮＣ）は、５％以下の顆粒球含量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｆ）は、０．４５μｍフィルタでろ過することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｈ）は、さらに、該クロマトグラフした上澄を紫外線−Ｃ（ＵＶＣ）にかけることにより、該クロマトグラフした上澄から偶発的な物質を一掃する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＵＶＣにかけることは、クロマトグラフした上澄をＵＶＣ放射源に沿って螺旋状に流すことによりＵＶＣを均一に送達することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記一次細胞由来バイオロジックは、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのサイトカインを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション１１９（ｅ）のもと２００８年４月１４日に出願した仮出願第６１／０４４，６７４の優先権の利益を請求し、これを参照のために本明細書に編入する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、大規模な量のバイオロジック（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を作製する方法に関する。特に、本発明は、一次細胞由来バイオロジック作製のスケールアップ方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞からバイオロジックを作製するために使用する技術にはさまざまな方法があり、それは概して所望の産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）を得るためにインキュベーションで細胞を刺激し、そして細胞を洗浄する工程を含む。
【０００４】
例えば、ファブリシアスに対する米国特許第４，３９０，６２３は、ヒト、ウシ又はブタの末梢血単核球細胞から調製した無血清及び無マイトジェンのＴ細胞成長因子（インターロイキン−２）調製物を開示し、それは液体組織培養培地で数回洗浄し、次いで血清及びマイトジェンを補充した組織培養培地内で刺激される。分離した刺激細胞を、再びフレッシュな組織培養培地で洗浄して、実質的にすべての血清及びマイトジェンを除去する。洗浄した細胞を、フレッシュな組織培養培地に懸濁し、インキュベーション条件下でコンディショニングして成長因子を液体へ移す。刺激細胞から分離した組織培養培地は、さらなる細胞刺激のために再利用する。上澄を限外ろ過膜で５０〜１００倍に濃縮する。
【０００５】
ファブリシアスに対する米国特許第４，４０６，８３０は、無血清、無マイトジェンのインターロイキン−１（Ｉｌ−１）（リンパ球活性化因子ＬＡＦとしても知られる）、及び無血清、無マイトジェンのＩｌ−２の作製方法を開示し、それは末梢血単核球（ＰＢＬ）細胞を無血清液体組織培養培地内でインキュベーションしてＰＢＬ細胞表面の残留血清タンパク質を除去し、インキュベーションした細胞をマイトジェンで活性化し、活性化細胞を無菌液で洗浄して細胞からマイトジェンを除去し、そして無血清、無マイトジェンの活性化細胞を液体組織培養培地内でコンディショニングして無血清、無マイトジェンのインターロイキン−１（ＩＬ−１）を産生させ、ＩＬ−１含有液体組織培養培地を新しい血清糖タンパク質と接触させ、そして細胞をＩＬ−１及び新規な血清糖タンパク質の存在下でインキュベーションしてＩＬ−２合成を誘導し、そしてＩＬ−２（Ｔ細胞成長因子）を細胞から組織培養培地の液相へ移すことにより、無血清、無マイトジェンのＩＬ−２を産生させる。
【０００６】
テスラに対する米国特許第５，５０３，８２８は、誘導及び精製を経るαインターフェロンの大規模作製方法を開示する。末梢血白血球から産生させるαインターフェロンサブタイプ混合物の作製は、（ａ）バフィーコートを採集し、そして赤血球を塩化アンモニウムでリンスすることによりヒト末梢血白血球を調製し、（ｂ）アール塩（Ｅａｒｌｅ‘ｓ  Ｓａｌｔｓ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、４．４６ｍｇ／ｍｌのトリシン、ｐＨ７．４、２４μｇ／ｍｌのネオマイシン硫酸塩、ビタミンＢ３及び／又はＣ、炭酸水素ナトリウム及び、０．１〜１．５ｍｇ／ｍｌのヒトアガンマ（ａｇａｍｍａ）血清を含有するイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）を含む誘導培地中に白血球を１〜１０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、（ｃ）プライマーとしての粗又は精製αインターフェロンを、誘導培地に懸濁した白血球に添加し、（ｄ）懸濁液を１００〜３００ｒｐｍで攪拌しながら充分な時間、３６℃でインキュベーションし、（ｅ）５０〜５００ヘマグルチニン単位／ｍｌセンダイウイルスの懸濁液に添加し、（ｆ）懸濁液を１００〜３００ｒｐｍで攪拌しながら充分な時間、３６℃でインキュベーションし、（ｈ）約２，５００ｒｐｍで遠心分離して細胞及び破片を除去し、そして（ｉ）α混合物中の一のαインターフェロンサブタイプを、他のαインターフェロンサブタイプから全く分離することなく、粗αインターフェロンを産物として採取することによる。
【０００７】
モリスに対する米国特許第６，３５０，５８９は、マルチサブタイプの１型インターフェロンの作製方法を開示する。この方法は、（ａ）白血球を培養し、（ｂ）白血球を刺激して粗インターフェロンを産生し、（ｃ）粗インターフェロンを濃縮して、低分子汚染物を除去し、（ｄ）濃縮された粗インターフェロンを作製するための液体体積、（ｅ）実質量の血清アルブミン及び他の汚染物を濃縮粗インターフェロンから除去して、複数のサブタイプを含有する部分精製したインターフェロン混合物を作製し、（ｆ）実質的にすべての残余血清アルブミン及び他の汚染物を部分精製インターフェロン混合物から除去して、約５０％〜約８０％の純度を有するインターフェロン混合物を作製し、（ｇ）約５０％〜約８０％のインターフェロン混合物を精製して少なくとも約９５％の純度を有しかつ約３５重量％以下のＩＦＮα−２及びＩＦＮα−８サブタイプを含有するＩ型インターフェロンの高度に精製された混合物を作製する工程を含む。
【０００８】
タロ−ルに対する米国特許第６，８９６，８７９は、無血清、無マイトジェン及び無抗生物質のサイトカイン混合物の作製方法を開示する。この作製方法では、単核細胞をヒトドナー「バフィーコート」から密度勾配遠心分離法により分離し、そしてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）とともに培養して、ＩＬ−２と他のサイトカインを培養中のドナー白血球細胞からの産生と分泌を強化する。その後、培養上澄を無菌的に収穫し、清澄し、そして商用ウイルス除去処理にかける。次いで、上澄をさらに限外ろ過及び精密ろ過によって約１０倍に濃縮する。この時点で、ヒト血清アルブミン（Ｉｎｊ，ＵＳＰ）を添加し、次いで濃縮物を生理学的ｐＨまで緩衝させ、表示量（ｌａｂｅｌ  ｃｌａｉｍ）当たりの目標濃度（例えば４００ＩＵ／ｍＬ）にもってゆく。次いで、濃縮物を第二の限外ろ過（０．２２ミクロン級のフィルタ）にかけ、無菌血清型バイアルに無菌的に分配し、そのＩＬ−２含量をラベルする。細胞障害性Ｔ−リンパ球株（ＣＴＬＬ−２）による放射化標識チミジンの導入により、産物の力価（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｏｔｅｎｃｙ）を測定する。さらに、最終注射剤を５種のマーカー：ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αについてＥＬＩＳＡで試験する。．
【０００９】
ハッデンに対する米国特許第５，６３２，９８３、５，６９８，１９４、６，９７７，０７２、７，１５３，４９９、７，１８２，９４２は、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αからなる特有のサイトカイン混合物である天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）の作製方法を開示する。複数のＨＩＶ陰性肝炎ウイルス陰性ドナー由来の人血のバフィーコート白血球を採取する。ドナーからの細胞をプールし、フィコールハイペーク（ｆｉｃｏｌｌ  ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に層状にして無リンパ球の好中球及び赤血球を得る。ＮＣＭ産生の好ましい実施態様では、リンパ球を洗浄し、そしてＸ  ｖｉｖｏ−１０培地（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中、刺激剤のマイトジェンが入っているフラスコ（ＭｉｃｒｏＣＥＬＬｅｃｔｏｒ．ＴＭ．Ｔ−２５  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｌａｓｋｓ）へ分配する。刺激剤の固定化処理は、パニング手順、すなわち細胞をフラスコ内で分離するためにさまざまな物質を固定化することについて製造者記載のとおりである。Ｘ  ｖｉｖｏ−１０培地中の細胞を、８０μｇ／ｍｌのシプロフロキサシン（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂ）とともに、３７℃のＣＯ２／エアインキュベータ内で、２４〜４８時間インキュベーションする。インキュベーションに続いて、上澄を流し去って採取する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加して、インターロイキンを安定化させることができる。一般に、ＨＳＡは、０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）で使用する。上澄を４℃〜−７０℃で保存する。プールした上澄を、ＩＬ−２のバイオアッセイ、並びに一以上のインターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１５、ＣＳＦ、ＴＮＦ及びＩＦＮのＥＬＩＳＡでサイトカイン含量を測定することにより特徴づける。無菌性を、チオグリコレートブロス中での培養と、当業者に知られるリムルスライセートアッセイにより測定されるエンドトキシンにより試験する。各上澄を、比較できるように、濃度又は投与量のいずれかでそれぞれ標準化する。特に、各上澄のＩＬ−２当量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）を利用する。ＤＮＡ及びウイルス排除は、もし使用するなら、限外ろ過、エタノ−ル分画、ポリエチレングリコ−ル／ベントナイト沈殿、及び／又は、静脈注射γグロブリン（ＩＧＩＶ  Ｎｅｗｓ  Ｕｐｄａｔｅ  ｂｒｏｃｈｕｒｅ）で使用されている溶媒／界面活性剤処理等の技術を採用する。光化学的不活性化、アルミニウムフタロシアニン又はガンマ照射を使用可能である。この方法は、さらに、以下の本発明で説明する。
【００１０】
バイロジック作製に使用する手動法（ｍａｎｕａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）にはいくつかの制約があり、例えば、作業者の感度、開放系での汚染の可能性、最終産物の一貫しない比率及びおける全タンパク質レベルであり、そのすべてが医薬級産物の作製を不適にする。過去にこれらの問題を扱うため、ろ過、スターチ、手動式での遠心分離及び洗浄のような面倒な手順が行われた。以前の方法は、一貫しないバッチ及び小規模の産物を作製したベンチトップ（ｂｅｎｃｈ  ｔｏｐ）手順であった。
【００１１】
バイオロジック作製で検討を要する別の工程は、ウイルス除去である。患者の安全が最重要であるが、バイオテクノロジープロセスでは組み込まれる（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）細胞を汚染する外因性ウイルスの危険性がある。したがって、存在し又は存在しないかもしれないウイルスを除去するための不活性化及び除去工程が求められる。ＦＤＡ及びＩＣＨガイドラインにしたがって数ｌｏｇの除去／不活性化が要求される。監督官庁は、顕著と認められる最低４ｌｏｇ１０のウイルス不活性化／除去をもたらす製法に含むとともに、未処理バルクの潜在的ウイルスの検査を勧める。その方法は、二（又はそれ以上）の直交性ステップ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｓｔｅｐ）を含み、好ましくは非エンベロープイルスを標的とするものを含むことが提案される。規制ガイドラインは、バリデーション試験が、プロセスのロバスト性をキャラクタライズするために、プロセスが一定範囲の生化学及び生物物理学的特性を示す偶発的ウイルスを除去／不活性化する能力を特徴付けるために行われることを勧める。
【００１２】
一次細胞由来バイオロジック作製にとって、ドナー白血球（サイトカイン産生のための原細胞）は、血液センターによってＰＣＲによるウイルス核酸（ＮＨＣＶ及びＮＨＩＶ）、並びに典型的ウイルス抗原（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）及びヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ））の存在がスクリーニングされる。しかし、他のウイルスであるエプスタインバー（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びヒトパルボウイルスＢ−１９（Ｂ−１９）は、検定を受けたドナー中に依然として存在し得、そして作製に使用されるかもしれない。検出可能レベルのＥＢＶが、最高１００％の健常ドナーに存在し得た（ワリングら、２００３）。無症候の個人のＢ−１９レベルは、１０１２／ｍＬより大であること（ドイル及びコルコラン、２００６）、及び、１０１４／ｍＬと同程度の力価で短時間のウイルス血症感染成績（アンダーソン、１９８５）が報告されている。一次細胞由来バイオロジック製法で使用される広範な細胞洗浄によって、血漿に同伴されるウイルスのほとんどがドナー白血球から本質的に除去され、一次細胞由来バイオロジックバルク中に検出されるすべてのウイルスは、下流の除去／不活性化工程前には感染細胞から放出されたもののみになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
にもかかわらず、産物の安全性を保証するためにロバストな不活性化／除去方法が必要である。
【００１４】
一次細胞由来バイオロジックの手動式作製プロセスは労働集約的であり、容易にスケールアップを受け入れにくく、手動法により扱われる無菌液量に制約される。したがって、手動操作を減じ、そして商業化の実用性を達成するために、製法の進歩が求められる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、白血球をリンパ球分離培地（ＬＳＭ）に投入し、そして該培地を自動細胞処理及び洗浄システムで洗浄及び遠心分離して精製された単核細胞（ＭＮＣ）を得ることによりＭＮＣを精製して汚染細胞を除去し、ＭＮＣを密閉された無菌バッグシステム内に一晩保存し、ＭＮＣの誘導混合物をスケーラブルな細胞培養システム内でマイトジェン及びシプロフロキサシンで刺激し、そしてスケーラブルなディスポーザブル細胞培養装置内でＭＮＣから一次細胞由来バイオロジックを作製し、該誘導混合物から該マイトジェンをろ過により除去し、該誘導混合物をインキュベーションし、該誘導混合物をろ過により清澄して一次細胞由来バイオロジック上澄を得て、一次細胞由来バイオロジック上澄を陰イオン交換クロマトグラフィ及び１５ナノメータウイルスろ過と、紫外線Ｃ（ＵＶＣ）を用いる可能な付加的ウイルス除去にかけてＤＮＡ及び偶発的な物質を一掃することによる、一次細胞由来バイオロジックの作製方法を提供する。
【００１６】
本発明は、また、自動細胞プロセッサに細胞を投入し、細胞を自動で洗浄及び遠心分離し、そして精製された細胞を得ることによる細胞の自動精製方法を提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、スケーラブルな細胞培養システム内で細胞を誘導することによる細胞誘導方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の他の利点は、添付の図面と関連して検討する際に以下の詳細な説明を参照することでよく理解されるとおり、容易に理解できよう。
【００１９】
【図１】フェーズＩＩ臨床試験で使用した一次細胞由来バイオロジックのサイトカインプロファイルの写真である。
【００２０】
【図２】手動法に対する、本発明の商業化スケール一次細胞由来バイオロジックプロセスを含むチャートである。
【００２１】
【図３】バフィーコートを２０分間遠心分離する写真である。
【００２２】
【図４】ＭＮＣを分離する写真である。
【００２３】
【図５】Ａｃ・Ｔ  ｄｉｆｆ２を介して細胞プロセッサで精製されたＭＮＣの細胞集団分析のグラフである。
【００２４】
【図６】ＦＥＰバッグを一晩保存する写真である。
【００２５】
【図７】サイトカインアレイ一次細胞由来バイオロジック（商業化スケールプロセス）の写真である。
【００２６】
【図８】培地／誘導剤と混合され、そしてディスポーザブル細胞培養装置へ移される細胞の写真である。
【００２７】
【図９】インキュベータ内に設置されるディスポーザブル細胞培養装置の写真である。
【００２８】
【図１０】中空ファイバーフィルタを用いた細胞洗浄の写真である。
【００２９】
【図１１】中空ファイバーフィルタを用いた細胞洗浄の写真である。
【００３０】
【図１２】上澄清澄の写真である。
【００３１】
【図１３】特異的ペプチドＤＴＨアッセイのグラフである。
【００３２】
【図１４】ウイルスろ過の写真である。
【００３３】
【図１５】ウイルスろ過の写真である。
【００３４】
【図１６】ディスポーザブル陰イオン交換クロマトグラフィによるウイルス除去の写真である。
【００３５】
【図１７】ＵＶＣによるウイルス不活性化の写真である。
【００３６】
【図１８】ＵＶＣ後の一次細胞由来バイオロジックのウエスタンブロッド分析の写真である。
【００３７】
【図１９】ＵＶＣ前後の一次細胞由来バイオロジックのサイトカインアレイの写真である。
【００３８】
【図２０】凍結準備のできたバルク一次細胞由来バイオロジックの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、広く、一次細胞由来バイオロジック、好ましくはＩＲＸ−２を商業的作製のために大規模量を作るための方法を提供する。この方法は、所望の産物量が大規模に実現可能ないくつかの作製工程を新規に使用する。単核細胞（ＭＮＣ）は、自動細胞処理及び洗浄システムで、白血球をリンパ球分離培地（ＬＳＭ）上に投入し、該培地を遠心分離して精製ＭＮＣを得ることにより精製して汚染細胞を除去する。ＭＮＣは、その後、ＦＥＰリンパ球保存バッグ内に一晩保存される。ＭＮＣの誘導混合物をディスポーザブルな細胞培養装置内でマイトジェン、好ましくはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、及びシプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）で刺激し、そして一次細胞由来バイオロジックをＭＮＣから作製する。該誘導混合物からマイトジェンをろ過及びタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）モードにより除去し、その後、該誘導混合物をインキュベーションする。該誘導混合物をろ過により清澄して一次細胞由来バイオロジック上澄を得る。最後に、該一次細胞由来バイオロジック上澄を、陰イオン交換クロマトグラフィ及び１５ナノメータろ過にかけ、そして適宜の付加的な紫外線−Ｃ（ＵＶＣ）による不活性化により、ＤＮＡ及び偶発的な物質を一掃する。次いで、最終産物をバイアルに入れ、将来の患者への投与のために保存することができる。
【００４０】
本明細書で使用する「一次細胞由来バイオロジック」は、一組のサイトカイン、好ましくは天然及び非組み換え体のサイトカインであり、また、以前はＮＣＭ（天然サイトカイン混合物）として知られている。好ましくは、一次細胞由来バイオロジックは、以下に記載するＩＲＸ−２であり、二つの用語は、本願を通して交換可能に、意図する意味から逸脱せずに使用される。
【００４１】
「ＩＲＸ−２」は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びシプロフロキサシン（ＣＩＰＲＯ）により刺激された精製ヒト白血球（単核細胞）により作製される、白血球に由来する一次細胞由来バイオロジックである。主要活性成分は、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン２（ＩＬ−２）及びγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）である。ＩＲＸ−２は、以前は、米国特許第６，９７７，０７２及び７，１５３，４９９中に定義及び発表した「ＮＣＭ」（天然サイトカイン混合物）とも呼ばれる。詳細には、ＩＲＸ−２は、４−アミノキノロン抗生物質の継続的存在と、マイトジェン（好ましい実施態様ではＰＨＡ）の継続的又は脈動的存在とともに調製される。しかし、他のマイトジェンも使用可能である。本発明の好ましい実施態様によれば、ＩＲＸ−２は６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１５０〜１，８００ｐｃｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１β、６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは３，０００〜１２，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−２、及び２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γを含有する。
【００４２】
ＩＲＸ−２は、また、６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは３００〜２，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−６、６０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは２０，０００〜１８０，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−８、２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度のＴＮＦ−αを含有し得る。組み換え型、天然又はペグ化されたサイトカインもまた使用可能であり、あるいは、ＩＲＸ−２は、組み換え型、天然又はペグ化されたサイトカインの混合物を含み得る。ＩＲＸ−２は、さらに、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ（１００〜１０，０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは５００〜２，０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度にて）及びＧ−ＣＳＦのような他の組み換え型、天然又はペグ化されたサイトカインを含み得る。
【００４３】
活性型になって腫瘍細胞（頭頸部癌細胞）を殺傷するＴ細胞にとって、多数のステップが生起する必要がある。第一に、Ｔ細胞が認識可能な細胞抗原が、Ｔ細胞に提示されねばならない。リンパ節は、この機能を実行する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する。ＡＰＣは、また、樹枝状細胞として識別され、そしてリンパ節のストロマ内に存在する。したがって、第一ステップは、樹状又はＡＰＣ細胞による抗原提示である。第二に、問題抗原に特異的なＴＨ１細胞が発達しなければならない。第三に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、抗原を持つ外来性細胞物質を認識後攻撃するために「ヘルプ」され、続いて、リンパ節から侵襲部位へ移動する。サイトカインのインターロイキン２（ＩＬ−２）及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌するこれらのＴＨ細胞はＴＨ１細胞と呼ばれ、そして、特異的に刺激するＣＴＬ細胞傷害活性及び細胞免疫を伴う。ＴＨ２と呼ばれる別のクラスのＴ細胞は、主としてインターロイキン４（ＩＬ−４）、５（ＩＬ−５）及び１０（ＩＬ−１０）を分泌し、そして抗体産生を促進する。免疫応答の最初に産生される支配的な「クラス」のサイトカイン（例えばＴＨ１又はＴＨ２）は、相反するタイプのサイトカインの産生を抑制することにより、部分的に継続した免疫応答の発達を「導く（ｓｔｅｅｒ）」するよう作用する。したがって、免疫応答は、早期に提示するサイトカインによってＴＨ１（細胞媒介）又はＴＨ２（体液性）方向のいずれかに「向けられる（ｐｏｉｎｔｅｄ）」。したがって、ロバストな抗腫瘍免疫応答の開始のためには、免疫応答の初期フェーズ中に存在するＴＨ１偏向サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）を持つことが重要である。癌免疫療法のゴールは、腫瘍を破壊するために充分な数の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞の産生を刺激することであった。
【００４４】
ＩＲＸ−２は、医薬品基準（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）のもとで正常で健常な血液ドナーから得られた、フィトヘマグルチニン及びシプロフローキサン刺激単核細胞から産生されるサイトカイン産物である。この産物は、頭頸部癌の治療のために、頭頸部癌を排出するリンパ節内に供給するために、皮下に局部的に注射されることが意図される。この産物は、また、すべての他のタイプの癌及び感染症のために使用し得る。
【００４５】
商業的ＩＲＸ−２プロセスでは、ＰＨＡ、シプロフロキサシン及び細胞成分を、遠心分離及び洗浄により除去する。さらに、無細胞上澄は、偶発的な物質（ＤＮＡ，ウイルス）を一掃する処理がされ、その後処方され、フィルタ除菌され、バイアルに詰められる。ＩＲＸ−２において、インターロイキン２（ＩＬ−２）は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１β）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）とともに、主要な活性サイトカイン成分である。これらのサイトカインは、ＴＨ１パスウエイの刺激物質として、細胞免疫を第一に強化する。また、ＩＲＸ−２の分析では、低レベルの他のサイトカイン構成成分の存在が明らかであるが、これらのサイトカインは、産物の潜在能力に重要でないと考えられる。
【００４６】
これらの成分は、さまざまな活動：リンパ球の動員（主にＩＬ−１βによる）、ＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）のようなリンパ球成長レセプターのアップレギュレーション（主にＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γによる）、Ｔ細胞増殖強化（主にＩＬ−１β、ＩＬ−２による）、ＴＨ１機能偏向の維持（主に、ＩＦＮ−γによる）、及び、腫瘍破壊へ導くＴ細胞の十分な活性化のために重要であるマクロファージや樹枝状細胞のような抗原提示細胞により（腫瘍）抗原を処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及び提示（主にＩＦＮ−γによる）により細胞免疫を強化するために作用する。ＩＲＸ−２は、樹枝状細胞の分化及び成熟を促進する。成熟樹枝状細胞は、Ｔ細胞へ効率的に抗原提示することが要求される。ＩＲＸ−２は、また、その上に露出した抗原を有する成熟樹枝状細胞により提示されると特異的になることが可能なナイーブＴ細胞の産生を誘導する。ＴＮＦ−αは、臨床上、本質的に活性な成分とみなされないが、ＩＲＸ−２中のレベルは前述のものと近接し、ＴＮＦ−αの高い不安定性（ｌａｂｉｌｉｔｙ）のために、その含有量が産物の安定性の指標としてモニタ−される。以下の表１は、フェーズＩ及びフェーズＩＩ臨床試験に使用されるｃＧＭＰロットにおけるこれらのサイトカインについての濃度のリストを提供する。
【表１】
0005647601.tif 000002
【００４７】
ＩＲＸ−２中の付加的なサイトカイン及びケモカインは、ＥＬＩＳＡで同定されている。これらは、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−８、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。これらのタンパク質レベルは、ＩＬ−６及びＩＬ−８除いて主要な活性成分の濃度よりもかなり低い。それらは、典型的には炎症性反応を伴い、そしてそれらは、多面発現性（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ、すなわち、周囲細胞及びサイトカイン環境に応じて多重メカニズムを有する）である。表２は、これらのサイトカインのリストと、ＩＲＸ−２中のそれらのレベルを表す。
【表２】
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【００４８】
ＥＬＩＳＡに加えて、最も一般的な４２種のサイトカインのＲＡＹＢＩＯヒトサイトカインアレイ（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）は、ＩＲＸ−２産物のサイトカインプロファイル又は「足跡（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）」を提供する。図１は、フェーズＩＩ臨床試験に使用したＩＲＸ−２のサイトカインプロファイルを示す。
【００４９】
ＩＲＸ−２サイトカイン産物は、従来のサイトカイン療法と以下のように対照をなす：（１）薬理学よりもむしろ生理学用量が使用される；（２）産物は腫瘍内又は静脈内よりも外リンパ（ｐｅｒｉｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）に投与される；（３）内因性サイトカインレベルを野生型活性細胞からシミュレートするために、産生は組み換え体技術に基づくよりもむしろ活性化白血球に由来する。
【００５０】
送達モードは、リンパ節活性化の正常な導入出パスウエイを利用する。通常、腫瘍床のような関心領域からのリンパ管ドレン並びに抗原及び疾患に付随する他の因子は、リンパ管内に移動して所属リンパ節（ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｎｏｄｅ）へと移る。所属リンパ節では、抗原提示細胞（ＡＰＣ又は樹枝状細胞）が、これらの疾患関連抗原を確保しかつ処理し、そしてそれらをＴ細胞へ提示する責任を負い、その結果、活性化された抗原特異的Ｔ細胞が増殖する。全身よりむしろこの局在部位に天然の一次細胞由来バイオロジックを提示することによって、Ｔ細胞を直接活性化して増殖させかつＣＴＬ細胞になるとともに、樹枝状細胞機能を促進又は動員する機会が存在する。さらに、より直接の施用によってより低い薬物暴露が可能になり、より低活性のサイトカイン薬物物質は体循環内で消失する。
【００５１】
臨床試験で個々のサイトカイン用量の安全性が評価されており、典型的な用量毒性プロファイルが判明している。対照的に、サイトカイン用量反応曲線は、典型的には釣鐘状である。多くのサイトカインのヒト治療用途が承認され、あるいは、フェーズＩ又はフェーズＩＩ臨床実験で評価されている。試験の際、調査されたサイトカインの用量毒性プロファイルは、他のサイトカインの併用投与により影響していない。過去の使用履歴に基づいて、さまざまなサイトカインの毒性の閾値及びＩＲＸ−２の全工程中にサイトカインが存在する量における推奨又は評価された用量の比較チャートを表３に、適当な安全マージン（ｌｉｋｅｌｙ  ｍａｒｇｉｎ  ｏｆ  ｓａｆｅｔｙ）とともにその桁の順に従って示す。
【表３】
0005647601.tif 000004
【００５２】
これらの安全マージンが与えられると、ＩＲＸ−２中に含まれる個々のサイトカインの用量から顕著な毒物学的影響は生じそうにない。
【００５３】
本明細書で使用する「単核細胞」（ＭＮＣ）は、顆粒を含まない造血系の細胞である。ＭＮＣは、リンパ球、プラズマ細胞、単球及びマクロファージ並びにマスト細胞を含む。
【００５４】
本明細書で使用する「偶発的な物質」は、ウイルス及び毒素であり、そして、たびたび感染性因子であり、これらは細胞株を偶然に汚染する。本発明における偶発的な物質は、不所望の疾患の感染の機会を減じ又は排除するために、患者への投与前に一次細胞由来バイオロジックから除去されることが望ましい。
【００５５】
本発明のプロセスを図２の右欄に詳述する。この製法での各工程は、一次細胞由来バイオロジックの大量作製のためのスケールアップを受け入れ易い。
【００５６】
この製法の第一工程では、プログラム可能な遠心分離装置である細胞プロセッサ（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）の使用によってＭＮＣを精製して一次細胞由来バイオロジックの作製を汚染するすべての細胞を除去する。この装置を以下の実施例で説明する。ＭＮＣをリンパ球分離培地（ＬＳＭ）に投入し、次いでＭＮＣを遠心分離することにより、ＭＮＣがリンパ球及び単球から構成されるように富化される。好ましくは３００ｍＬのＬＳＭを使用する。ドナーらからのＭＮＣを同時に精製し、これは複数のドナーを一度に精製することを意味する。好ましくは１２ドナーからのＭＮＣを同時精製する。ＭＮＣの遠心分離による細胞精製は、顆粒球及び赤血球の除去を最適化するために１５００〜３０００ｒｐｍである。
【００５７】
第一工程は、一般に、細胞を自動細胞プロセッサに投入し、細胞を自動で洗浄及び遠心分離し、そして精製細胞を得ることによる、細胞の自動化精製方法である。すなわち、自動化された方法は、精製を望むすべての細胞のために使用でき、それはＭＮＣに限定されない。重要なことには、自動細胞プロセッサの使用は、細胞プロセッサの仕様を調整することで、精製細胞のスケールアップ又はダウンが可能になる。
【００５８】
そのような精製プロセスは、以前から細胞の後続使用のために細胞を簡単に精製するために使用されている。サイトカインを作製するために使用されておらず、そして、天然のサイトカインを作製するために使用されてはいない。
【００５９】
次いで、密閉された無菌バッグシステムでＭＮＣを一晩保存する。バッグは、好ましくはふっ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）バッグである。このバッグの本発明での使用により、サイトカイン産生が通常の産生レベルを超えて最適化される。これは、サイトカイン産生にとって最適であるバッグ内の豊富なＯ２の環境による。
【００６０】
次の日、ＭＮＣの誘導混合物を、３７℃の５％ＣＯ２中、ＰＨＡで２時間、そしてシプロフロキサシンで２時間刺激する。好ましくは８０μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンを使用する。誘導がスケーラブルな細胞培養装置内で生起し、これにより以前誘導されていたのよりも大量の混合物の誘導が可能になる。スケーラブルな細胞培養装置を用いた誘導により、以前に手動法で誘導されていたよりも大量のサイトカイン産生が可能になる。したがって本発明は、広く、スケーラブルな細胞培養システム内で細胞を誘導することによる細胞誘導方法を提供する。細胞を誘導して、本発明で誘導されたサイトカインのようなすべての細胞産物を作製することができる。この方法は、サイトカイン誘導に限定されず、すべての所望の産物を誘導することができる。
【００６１】
その後、誘導混合物からＰＨＡをろ過により除去する。より詳細には、誘導混合物を滅菌ｓａｌｉｎｅで洗浄し、ＭＮＣを回収し、その後、培養培地内に８０μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンとともに再懸濁する。好ましくはＰＨＡのレベルを＜１５０ｎｇ／ｍＬ以下に減じる。フィルタは、好ましくはＳｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）ＣｅｌｌＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓ（登録商標）という中空ファイバーフィルタであり、そして接線流モード（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｍｏｄｅ）で使用する。その後、インキュベーション混合物を、好ましくは２４時間、インキュベーションする。通常、使用されるべき細胞を得るために細胞洗浄プロセスを使用する。本発明は、洗浄を使用してＰＨＡを除去するが、細胞は、さらなるサイトカインを産生するために培地内に戻される。この工程及び本製法の各工程でのフィルタはスケーラブルであり、すべての適当なフィルタを使用できる。２４時間後、Ｉ型（ＴＨ１）サイトカインで構成される一次細胞由来バイオロジックが作製される。次いで、この誘導混合物を清澄、すなわち収集して、ＭＮＣから一次細胞由来バイオロジック上澄を得る。細胞を０．４５μｍのフィルタを持つフルオロダイン（ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ）膜でろ過する。フィルタは、好ましくはＦＬＵＯＲＯＤＹＮＥ  ＩＩ（商標）（Ｐａｌｌ）であり、フィルタを使用し、実施例でさらに記載する。この自動化工程は、一次細胞由来バイオロジックの以前の手動式遠心分離に比べて利点をもたらす。
【００６２】
本作製方法の最後の工程は、陰イオン交換クロマトグラフィ及び１５ナノメータウイルスろ過にかけることにより一次細胞由来バイオロジック上澄からＤＮＡ及び偶発的な物質を一掃（ｃｌｅａｒｉｎｇ）することである。ＵＶＣにかけることにより、付加的なウイルス不活性化を達成することができる。上記したように、ウイルスやＤＮＡのようなさまざまな偶発的な物質が一掃される。一掃されるウイルスには、限定されるわけでないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、Ａ型肝炎（ＨＡＶ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、シンドビス、レオ及びアデノウイルスを含む。好ましくは陰イオン交換及び１５ナノメータウイルスろ過工程は、４ｌｏｇ１０を超えるウイルスを一掃する。
【００６３】
ＵＶＣにかけるとき、一次細胞由来バイオロジック上澄をＵＶＣ放射源に沿って螺旋状に流すことにより、ＵＶＣは一次細胞由来バイオロジックへ均一に送達される。好ましくは、波長２５４ｎｍかつ最高１５０Ｊ／ｍ２の線量のＵＶＣが一次細胞由来バイオロジックへ送達される。
【００６４】
作製される特異的一次細胞由来バイオロジックは、好ましくはＩＲＸ−２（以前は、ＮＣＭとして知られる）である。ＩＲＸ−２中に作製するサイトカインは、ＩＬ−１β、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを含む。ＩＬ−２及びＩＬ−１βは、好ましくは１０：１の比に作製される。好ましくは、一バッチで合計４Ｌより大のＩＲＸ−２が作製される。好ましくは、一次細胞由来バイオロジック上澄を濃縮し、そして３００〜１８００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１β、４０００〜８０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２、１０００〜３８００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ、及び１０００〜４３００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ−αへ処方することができる。この誘導混合物は、適宜、積極的にガスが入れられる（ｇａｓｓｅｄ）。
【００６５】
本明細書にあるデ−タは、ＩＲＸ−２製法が以下のプロセス改良：（１）自動細胞プロセッサを用いたＭＮＣ精製、（２）ＶＵＥＬＩＦＥ（登録商標、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ＦＥＰバッグ中でのＭＮＣ保存、（３）スケーラブルな細胞培養装置内での誘導、（４）中空ファイバー（ＨＦ）フィルタシステムを使用した細胞洗浄、及び（５）０．４５μｍフィルタを用いたろ過を介する培養上澄の清澄、（６）陰イオン交換クロマトグラフィろ過によるＤＮＡ除去、（７）二段の連続した１５ナノメータフィルタを用いたウイルス除去、及び（８）付加的なウイルス不活性化はＵＶＣにかける、ことにより達成可能になり、顕著に改善されることを示す。各ユニット操作の評価とその変更は、重要なパラメータは、許容可能な作業範囲内で保持されること及び本製法がその規格に合う産物を提供可能なことを示す。
【００６６】
本商業化方法を、さらにいくつかのバッチを実行することにより評価したが、すべての工程改良は、すべてのサイトカインを以前の手動法で見られるような典型的な比率で作製した。一次細胞由来バイオロジック成分の比較性及び生物学的同等性をＲＡＹＢＩＯヒトサイトイカン抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）及びペプチド結合ワクチンモデルにより確認した。これらのデータに基づいて、本商業化方法は、手動式のＩＲＸ−２製法に匹敵し、そして首尾一貫しかつ再生産可能な産物を作製する。
【００６７】
図２に示すように、以前のＩＲＸ−２製法からの開発と変更が以下の作製工程のそれぞれにおいてなされた。第一に、精製工程において手動式遠心分離から自動細胞プロセッサへの変更があった。ＭＮＣの一晩保存は、ポリプロピレンチューブ内のＭＮＣの一晩保存からＶＵＥＬＩＦＥ（登録商標）ＦＥＰバッグ内のＭＮＣの一晩保存に変更された。細胞洗浄は、手動式遠心分離から中空ファイバー（ＨＦ）フィルタシステムに変更することにより改善された。ディスポーザブルな細胞培養装置（Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ）を使用することにより誘導が改善され、製法のスケーラビリティが達成された。また、手動式遠心分離から０．４５μｍフィルタを用いる単回通過（ｓｉｎｇｌｅ  ｐａｓｓ）ろ過へ変更することにより、培養上澄の収集／清澄が改善された。ＤＮＡ除去は、陰イオン交換クロマトグラフィフィルタを用いるろ過により改善された。ウイルス除去は、二段の連続した１５ナノメータフィルタを用いたろ過により改善された。さらに、ＵＶＣにかけることによりウイルス不活性化を改善できる。
【００６８】
これらの変更のために、ＩＲＸ−２の商業的作製方法は、以前の手動法に比べて改善されている。全体として、自動細胞プロセッサの使用により、作製時間及び労力の減少が、以前の製法でのたくさんのエラーとＩＲＸ−２のバッチ間変動を取り除く。例えば、作業者のエラーは自動化により減少する。体積のスケールアップは、システム設計と自動化により達成される。さらに、密閉されたバッグシステムが使用されるので汚染は避けられ、これは、以前の方法に比べて非常に大きい利点である無菌製法を提供する。ウイルス排除の利点を以下に説明する。
【００６９】
ＩＲＸ−２作製の商業化方法は、専用のウイルス除去工程としての連続したナノろ過（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）１５Ｎフィルタによるウイルス排除を含み、そしてまたディスポーザブルな陰イオン交換クロマトグラフィユニットによるＤＮＡ除去を含む。１５Ｎフィルタは、製造者及びエンドユーザによって行われた試験でヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）及びブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の除去に対して高度に効果的であることが示されている。対照的に、陰イオン交換は、選ばれた目標ウイルスに対して効果的であることが示されている。患者の安全を最良に確保するために、さまざまなモデルウイルスを除去又は不活性化することの可能な二つの直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）の方法を持つことが強く勧められる（ＦＤＡ  Ｐｏｉｎｔｓ  Ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ，１９９３）。
【００７０】
追加のウイルス排除方法をＩＲＸ−２プロセスへ付加するために、本発明に不活性化工程としてＵＶＣ不活性化を加える。以下の実施例で説明するように、試験を、２０〜１５０Ｊ／ｍ２の広範囲のＵＶ線量にわたって行ったが、サイトカインＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッド、サイトカインアレイ又はＣＴＬＬ−２バイオアッセイを用いたサイトカイン含有量に顕著な変化を示さなかった。さらに、ＴＮＦ−αのついての新規なバイオアッセイが開発されたが、これは不安定なサイトカインの生物活性を測定する。ＴＮＦ−α生物活性のある程度の減少が検出されたが、このロスは他の処理工程で典型的に見られるロスに匹敵した。これらの同じＵＶＣ線量（１００Ｊ／ｍ２）にて、４ｌｏｇ１０より大のウイルス不活性化を、モデルウイルスのＰＰＶ及びＢＶＤＶ並びに血液由来ウイルスのＨＡＶで達成した。ＨＩＶは、＜２ｌｏｇ１０のウイルス不活性化へと最小限に不活性化された。このＵＶＣ技術を利用すると、ＩＲＸ−２の多様な実験室バッチが現状のスケールで首尾よく作製され、そして、ＵＶＣ製法のロバストネスを確認するバルク出荷規格をパスした。改良プロセスはロバストであり、そして、Ａ型肝炎及びパルボウイルスＢ１９及びのような非エンベロープイルスやエンベロープウイルス（型肝炎ウイルス）を含む広範囲のウイルス汚染を不活性化する不活性化工程を含むことにより、患者のより良好な保護を提供する。
【００７１】
実施例中のデータは、ＩＲＸ−２サイトカイン収率を減少させることないウイルス排除方法の補足となり得る新規なウイルス不活性化技術、ＵＶＣ照射の進歩を要約する。これらの要件及び原料物質（ｓｏｕｒｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）のヒト白血球に基づいて、試験ウイルスの４ｌｏｇ１０の不活性化が、有益となるべきこの追加手順の望まれる目標である。ＵＶＣ不活性化は、ＩＲＸ−２製法での二種類の既存のウイルス排除方法である陰イオン交換及び１５Ｎろ過と組み合わせたとき、潜在的に、非エンベロープウイルスの総ウイルス不活性化／除去を１２ｌｏｇ１０以上に増大させ得る。
【００７２】
ＩＲＸ−２製法での開発／変更は、以下の作製工程：Ｃｏｂｅ２９９１自動細胞処理遠心分離、リンパ球保存のための無菌バッグの使用、ディスポーザブルな細胞培養装置内での誘導、中空ファイバーろ過を用いた細胞洗浄、陰イオン交換クロマトグラフィを用いたＤＮＡ除去、二段の連続した１５ナノメータろ過を用いたウイルス除去、及び追加のＵＶＣによるウイルス不活性化でなされた。図２は、追加のＵＶＣウイルス不活性化をもつＩＲＸ−２プロセスを説明する。
【００７３】
本発明を以下の実施例を参照することによりさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明の目的だけに提供され、他に特記しない限り限定する意図ではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるとは全く解釈されるべきではなく、むしろ本明細書が提供する教示の結果から自明であるすべての変更を包含すると解釈すべきである。
【実施例】
【００７４】
〔実施例１〕
【００７５】
細胞プロセッサ／ＦＥＰバッグ保存を用いたＭＮＣの精製
【００７６】
ＬＳＭ分画試験（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）
【００７７】
ＩＲＸ−２プロセスのＬＳＭ精製工程の目的は、汚染細胞（顆粒球、赤血球及び血小板）を除去して、リンパ球及び単球からなる単核細胞（ＭＮＣ）に富んだ調製物を得ることである。
【００７８】
顆粒球は、ＰＨＡ誘導（すなわちＰＨＡ結合により）を妨害するとともに、正確な細胞計数を妨害することによりサイトカイン収率を悪化させる原因となり得る。顆粒球の実際のプロセス制限（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｌｉｍｉｔ）はまだ測定されていない。ＩＲ−２の製法開発の初期には、顆粒球除去がＣｏｕｌｔｅｒ  Ａｃ・Ｔ  ｄｉｆｆ２血球計算器で管理され、そのプロセス制限はＮＭＴ５％（Ａｃ・Ｔ  ｄｉｆｆ２の検出限界）に設定された。
【００７９】
以前の製法では、ＭＮＣは、リンパ球分離培地密度勾配（ＬＳＭ、ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ  １０７７（Ｓｉｇｍａ）と等価）上で遠心分離することにより、手動式に精製される。各献体（ｄｏｎａｔｉｏｎ）を別個に精製し、サイトカイン誘導の直前に最高２４の献体をプールする。これは、高純度を生じるが、２４ドナー（作業者一人当たり１２ドナー）を処理するのに二人の作業者が８〜１０時間フルシフトを必要とする手動処理の限界のために、スケールアップに適さない。
【００８０】
本発明の改良方法では、ＬＳＭ精製が、密閉された無菌バッグシステムとプログラム可能な遠心分離装置の細胞プロセッサを用いて行われる。この商業化方法により、白血球を１２ドナー連合で処理できる。これにより、一人の作業者が一シフトあたり最高３６のドナーを処理可能になる。
【００８１】
この商業化方法では、バッグを無菌的に充填し、白血球をプールする。この白血球バッグを無菌的にハーネス（ｈａｒｎｅｓｓ）に取り付ける。白血球を単一のバッグ内にプールし、そのバッグを熱でシールする。バッグを細胞プロセッサ及びバルブ内に据え、そして、色分けされた細管（ｔｕｂｉｎｇ）を整列（ａｌｉｇｎｅｄ）させる。白血球に負荷がかかり、遠心分離される。バフィーコートが調製され、濃縮され、そして、回収される。第二のバッグを細胞プロセッサ内に据える。バフィーコートが２０ｍＬ／分にてＬＳＭ上に層状にされ、そして２０分間、遠心分離される（図３）。ＭＮＣは、図４に示す第三のバッグ内に分離する。細胞をｓａｌｉｎｅでプログラムされた洗浄サイクルで洗浄し、無血清培養培地に再懸濁する。
【００８２】
結果：
【００８３】
ＭＮＣのＬＳＭ精製に細胞プロセッサを使用することの実用性を検討するために、このプロセスの初期の開発は、細胞プロセッサによるＭＮＣ精製及び分画中の発現細胞の無菌的回収を含んだ。これらの分画を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｃ・Ｔ  ｄｉｆｆ２分析器で分析したが、精製ＭＮＣに本質的に顆粒球が無いことが示された。
【表４】
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【００８４】
図５及び表４は、細胞プロセッサから採集された分画の相対的な細胞分布を示す。これは、細胞プロセッサから要求純度（≦５％顆粒球）を満たす最高１００ｍＬのＭＮＣを４ｘ１０９細胞にもなる全収率で回収する潜在能力を示す。これは一人の作業者によって精製できる細胞の１０倍の増大に等しい。ほとんどのＭＮＣを含有する分画（分画３〜６）を無菌的に採集し、プールし、標準的洗浄法で洗浄し、ＦＥＰバッグ内で一晩、保存した。
【００８５】
ＩＲＸ−２作製のために、ＭＮＣを使用して、適当なサイトカインレベルのＩＬ−１β、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを有するＩＲ−Ｘバッチを作製した。
【００８６】
ＭＮＣ保存試験
【００８７】
以前の製法では、精製ＭＮＣを、ポリプロピレン遠心チューブ内に一晩保存する。細胞プロセッサを用いて、１回運転当たり作製される大量のＭＮＣのために、２００ｍＬポリプロピレンチューブ中の４０ｍＬの各ドナーＭＮＣ（約５ｘ１０８）を保存する代替手段が実用化された。高収率の細胞に適応するために（ＦＥＰ）バッグを使用して、ＭＮＣを一晩（３７℃、５％Ｃ０２）保存した。ＦＥＰバッグ保存バッグは、樹枝状細胞の増大、ヒトリンパ球の保存及びＬＡＫ細胞の産生のために利用されてきたが、高いガス透過性及び低い結合特性の理由からリンパ球保存に適する。細胞を保存するために、ＦＥＰバッグ内の濃度を、ポリプロピレンチュ−ブ内の濃度と等価になるまで調整した。ＭＮＣ生存度及び細胞濃度を、ＧＵＡＶＡ  ＶＩＡＣＯＵＮＴ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてモニタ−した。
【００８８】
図６は、保存プロセスを示す。ＭＮＣをバッグから無菌的に取り出し、ＦＥＰバッグへ無菌的に移す。このＦＥＰバッグを一晩保存する。
【００８９】
結果：
【００９０】
精製されたＭＮＣについて、細胞濃度と生存度を対比することにより、一晩の保存処理を評価した。Ｄａｙ１（ＦＥＰバッグへの希釈時）及びＤａｙ２（ＰＨＡ誘導前）に、試料をＧｕａｖａ（登録商標）Ｖｉａｃｏｕｎｔ（登録商標）により評価した。表５に見られるとおり、ＭＮＣは、一晩保存の間、細胞濃度にロスを示さず、高い生存度（９５％）を保持し、これは保存方法の適性を説明している。
【表５】
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【００９１】
細胞タイプのキャラクタリゼーション及び分布試験
【００９２】
細胞プロセッサで作製したＭＮＣを充分に評価するために、精製ＭＮＣ中のさまざまな細胞集団を検査して新規方法対手動式のＬＳＭ精製の比較可能性を調べた。細胞集団を定量化するために、細胞判別（ＣＤ）マーカーを用いて蛍光標識セルソーター（ＦＡＣＳ）によりＭＮＣを分析した。
【００９３】
結果：
【００９４】
表６に、手動式ＬＳＭ精製法により調製されるのと、自動細胞プロセッサ法により調製されるのとの両方について、細胞集団分布に関するデ−タを示す。
【００９５】
元来の方法については、ＦＡＣＳ分析をＤａｙ２のプールしたＭＮＣをＰＨＡ誘導の直前に行った。商業化方法では、細胞集団をサンプリングし、Ｄａｙ１（一晩保存前）とＤａｙ２（一晩保存後）の両方で試験した。
【表６】
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【００９６】
表１０にあるデータにより、手動法に対する商業化方法の同等性が確認される。得られたＭＮＣ調製物は、入手可能な文献（Ｂｒｕｔｅｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｉｖｉｅｒｅら、１９７７）で予測された現在の規格の≦５％を下回る顆粒球含量をもって作製された。このデ−タは、細胞プロセッサによって生成したＭＮＣは、標準法と細胞分布及び純度が等価であったことを示している。
【００９７】
インキュベーション（Ｄａｙ２）後の商業化方法での単球濃度（ＣＤ１４＋／ＣＤ４５＋）は、以前の手動法と比べて一貫して低く現れることが観測された。新しく調製したＭＮＣ（Ｄａｙ１）の検査から、単球マーカー（ＣＤ１４＋）が１８％から１２％へ若干降下することが明らかになった。
【００９８】
細胞集団の若干の相違を、細胞プロセッサで精製した、作製直後と一晩インキュベーション前のＭＮＣの細胞集団を測定することによりさらに調査した。
【００９９】
表１０は、細胞プロセッサから直ぐにサンプリングした単核細胞は、以前の製法で見られたものと同等に見えることを示す。これらのデ−タから、細胞がサンプリングされ分析される時間が集団プロファイルに大きく影響することが明らかである。新規な製法では、一晩保存後にサンプリングした細胞は、単球のＣＤ１４＋ＣＤ４５＋マーカーが若干低めのシフトを有する。このＣＤ１４＋ＣＤ４５＋集団の変化は、異種ドナーリンパ球を用いた単球の活性化に起因し、これは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）と呼ばれる。文献（ジョルダン及びリッター、２００２）によれば、この反応はＴ細胞を刺激して、ＩＲＸ−２製法の一次産物であるＴＨ１サイトカイン（すなわちＩＬ−１β、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ）を産生する。これらが産物中に望まれるので、プールを一晩保持することはＩＲＸ−２作製に対して負の影響を示さない。
【０１００】
２〜３Ｌバッチ試験
【０１０１】
この試験の目的は、細胞プロセッサで精製ＭＮＣを利用するいくつかの２〜３ＬのＩＲＸ−２開発バッチを作製することであった。同日に行ったいくつかの運転からの精製ＭＮＣ細胞調製物をプールして、１０スタック（ｓｔａｃｋ）細胞培養装置を作製するために充分な細胞を作製した。
【０１０２】
結果：  
【０１０３】
商業化方法からのサイトカイン作製の等価性を、多数のＥＬＩＳＡアッセイ及びＣＴＬＬ−２バイオアッセイにより確認した。さまざまなサイトカインの最終産物範囲を、サイトカインを正規化することによりＩＬ−２の目標濃度７０００ｐｇ／ｍＬと推算した。表７に示されるように、作製したバルク産物を配合して、すべてのサイトカインアッセイをパスし、フェーズＩ及びＩＩ臨床産物に匹敵する。
【表７】
0005647601.tif 000008
【０１０４】
改良方法における主要な相違は、複数のドナー由来の精製ＭＮＣ（単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞）を、マイトジェン誘導に先立って一晩一緒にインキュベーションすることである。この方法から新規なサイトカイン種、特にＴＨ２サイトカイン（すなわち、ＩＬ−３、ＩＬ−４及びＩＬ−５）を産生しないことを確認するため、そして細胞プロセッサで生成したＭＮＣからのサイトカイン作製の同等性を証明するために、ＩＲＸ−２改良方法を４２種のヒトサイトカイン、ケモカイン及び成長因子を検出するサイトカインアレイ（Ａｒｒａｙ３、ＲＡＹＢＩＯヒトサイトカイン抗体（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））によって分析した。細胞プロセッサで生成したＭＮＣからＩＲＸ−２におけるこれらの最も共通するサイトカインのアレイ分析（ファンら、２００１）は、ＩＲＸ−２商業化産物プロファイル又は「フットプリント」は、サイトカイン組成が現在の産物と同等であり、そして、図７に示すように、新規なサイトカイン（すなわち２型サイトカイン）を誘導しないことを確認した。
【０１０５】
〔実施例２〕
【０１０６】
中空フィルタシステムを使用した細胞洗浄
【０１０７】
自動ＭＮＣ洗浄法を開発したが、これは誘導したＭＮＣからプロセスケミカルフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、マイトジェンを手動式遠心分離による洗浄と同等レベルまで効率的に除去するとともに、細胞生存度及びＩＲＸ−２サイトカイン作製能力を維持する。
【０１０８】
ＩＲＸ−２製法の第二工程では、マイトジェン、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びシプロフロキサシンを添加することにより、プールしたＭＮＣを誘導して、生物学的活性なサイトカインを作製する。ＰＨＡと協力して、シプロフロキサシンは、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを含むＩ型サイトカインの細胞誘導転写を刺激する。図８は、培地／誘導剤と混合され、そしてディスポーザブル細胞培養装置へ移される細胞を示す。図９は、インキュベータ内に設置されたディスポーザブル細胞培養装置を示す。誘導後、誘導混合物、培養培地及び細胞を無菌的に収穫し、そして細胞を遠心分離により回収する。細胞培養装置を無菌ｓａｌｉｎｅで３回洗浄し、約２０％の細胞を、ＣＦ表面に付着したままの約８０％の細胞を持つ、抱き合わせた洗浄液から回収する。その後、回収した細胞を、８０μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンを有する新規なＸ−Ｖｉｖｏ１０培養培地に再懸濁し、そして細胞培養装置へ戻す。サイトカイン生成は、無マイトジェンのバルクＩＲＸ−２を作製する追加の２４時間の間に生起する。
【０１０９】
洗浄プロセスの効率性を評価し、そしてプロセス不純物の最小限の残余を確かめるために、最終バルク産物の残留ＰＨＡをＥＬＩＳＡにより試験する。最終産物の残留ＰＨＡの規格は、ＰＨＡ  ＥＬＩＳＡアッセイの検出限界の＜１５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１１０】
改良方法では、細胞洗浄及びＰＨＡ除去は、図１０及び１１に示す接線流モードの中空ファイバーろ過を用いて達成される。サイトカイン作製に加えて等価性を説明するために使用する重要な出力パラメータ（ｏｕｔｐｕｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は、ＰＨＡ除去率及び生存細胞回収率である。
【０１１１】
結果：
【０１１２】
これらのＰＨＡの低い残留レベルをより正確に測定するために、より感度の高い新規なＰＨＡ  ＥＬＩＳＡが開発され、そして証明された。表８は、遠心分離を用いて処理されたＩＲＸ−２臨床ロット（フェーズＩ及びＩＩ臨床作製で使用）のＰＨＡ含有量を、中空ファイバーろ過法により洗浄を行った６ロットのものと対比する。新規な方法では、マイトジェンがＰＨＡの規格限界を下回るレベルまで除去されている。
【表８】
0005647601.tif 000009
【０１１３】
表９は、二つの異なるバッチからＨＦ洗浄方法を用いた洗浄細胞の％細胞回収率を示す。以下に見られるように、二時間のインキュベーション後にセルファクトリー（ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ）から回収した誘導混合物（「ＣＳ含量」と表示）は、細胞培養装置内で最初に誘導した出発細胞の少数分の一を含有する（１２％）。これらのデ−タから、中空ファイバー洗浄法後は、トリパンブルー色素排除試験法により測定した、細胞が適当な生存度と最小のロスをもって、充分なアッセイ変動性内で回収されたことが確認される。
【表９】
0005647601.tif 000010
【０１１４】
新規な方法の細胞洗浄により作製されたサイトカインの分析を、典型的なＩＲＸ−２サイトカインを示す表１０に表す。
【表１０】
0005647601.tif 000011
【０１１５】
これらの予備デ−タから、中空ファイバー（ＨＦ）ろ過システムは、骨が折れかつ時間のかかる手動式遠心分離に代わって、ＩＲＸ−２作製に適したＰＨＡ除去、細胞回収及びサイトカイン作製をもって、細胞洗浄に使用できることが確認された。
【０１１６】
〔実施例３〕
【０１１７】
ＩＲＸ−２培養上澄の収集／清澄
【０１１８】
０．４５ミクロンろ過の上澄清澄方法を開発したが、これは培養上澄から細胞を効率的に除去し、そしてＩＲＸ−２サイトカインの収率を極端に減少させることなく手動式遠心分離と同等である。重要なＩＲＸ−２サイトカインの無除去はほとんどないことが示される。上澄清澄を図１２に示す。
【０１１９】
結果：  
【０１２０】
現在のＩＲＸ−２プロセスの間、誘導されたサイトカインを含有する培養上澄を、遠心分離を用いて清澄した（すなわち細胞除去）。このプロセスを合理化及びスケールアップするために、０．４５ミクロンろ過膜フィルタの細胞除去及び上澄清澄を評価した。同じＰＶＤＦ膜材料を、ＩＲＸ−２プロセスの他のステージ（陰イオン交換プレフィルタ及び最終産物無菌級フィルタ）で使用し、そして、最小のタンパク質結合のものを選択した。データ評価は、ＩＲＸ−２培養上澄をフルオロダイン膜でろ過したときに最小のサイトカイン除去を示す（表１１）。フィルタは、所望するＩＲＸ−２バッチスケールにしたがって（バッチ体積対フィルタ面積比と一定のデルタＰを用いて）スケールアップ又はダウンされる。
【表１１】
0005647601.tif 000012
【０１２１】
〔実施例４〕
【０１２２】
実行可能バッチ（ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｂａｔｃｈｅｓ）
【０１２３】
この試験の目的は、現在の規模（２〜３Ｌ）でＩＲＸ−２プロセスのすべての新規な方法と組み合わせていくつかのバッチを作製することである。この試験により、ＩＲＸ−２を作製するためのこれらの自動化された「スケーラブル」な方法が、手動式のＩＲＸ−２プロセスと等価であることが確認される。
【０１２４】
結果：  
【０１２５】
本願に述べたすべての改良プロセスを利用して三つの実用可能バッチを作製した。完全な改良方法を利用したＩＲＸ−２製品のサイトカイン分析を表１２に示す。これらのバッチを、目標とするＩＬ−２濃度の７０００ｐｇ／ｍＬに正規化し、手動法により作製した２の臨床ロットと対比した。これらのバッチの分析は、新規な製法が、典型的なサイトカインレンジのＩＲＸ−２を作製したことを示した。
【表１２】
0005647601.tif 000013
【０１２６】
また、中空ファイバー洗浄法によるＰＨＡ除去は、＜１５０ｎｇ／ｍＬ（表１３）のＱＣ開放（ｒｅｌｅａｓｅ）規格を満足するＰＨＡレベルを持った許容可能産物を提供し、そして、安全な用量（１６７ｎｇ／ｋｇ）よりかなり低いレベル、又は毒性レベル（８３３，０００ｎｇ／ｋｇ）より４桁低い典型的な用量の５０ｎｇ／ｋｇを提供することが確認された。これは、明らかに残留プロセスマイトジェンの低レベルが安全な産物を表していることを証明する。
【表１３】
0005647601.tif 000014
【０１２７】
分析的試験に加えて、改良方法により作製したＩＲＸ−２は、また、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルのペプチド結合ワクチンモデルにおいて同等のパフォーマンスを示した。ＩＲＸ−２は、細胞傷害性Ｔ細胞の産生、又は遅延型過敏反応（ＤＴＨ、ナイラー及びヘッデン、２００３）により測定されるマウスのＴ細胞応答を禁止（ｉｌｌｉｃｉｔ）することが示されている。手動法及び商業化方法の両方で作られたＩＲＸ−２のサンプルは両方とも、抗原にＰＳＭＡペプチド結合ＫＬＨを使用したマウスの遅延型過敏反応（ＤＴＨ）を誘導した（表１４及び図１３）。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルの等価な生物学的パフォーマンスを確認し、そして、改良方法により作製されるＩＲＸ−２の同等性を支持するデータを提供する。
【表１４】
0005647601.tif 000015
【０１２８】
プロトコ−ル：マウスをＰＳＭＡ−ＫＬＨ結合ワクチン及び標準方法又は改良方法により調製したＩＲＸ−２で免疫した。マウスは、ＩＲＸ−２単独での９回の追加注入を受け、そして１４日及び２８日目に追加免疫した。ペプチドに対するＤＴＨ応答を、追加免疫９日後の足蹠腫脹の増大として計測した。
【０１２９】
結論
【０１３０】
ここに示すデータは、ＩＲＸ−２プロセスは、提案したプロセス改良：（１）自動細胞プロセッサを用いたＭＮＣ精製、（２）ＭＮＣのＦＥＰバッグ中での保存、（３）中空ファイバー（ＨＦ）フィルタシステムを用いた細胞洗浄、（４）ディスポーザブルな細胞培養装置内でのサイトカイン誘導及び産生、並びに（５）ＰＶＤＦ  ０．４５μｍフィルタを用いたろ過による培養上澄の清澄により顕著に改善されることを示す。各ユニット操作とその変更の評価は、重要なパラメータは、許容可能な作業範囲内に維持されることと、本製法がその規格に合う産物を提供可能であることを示す。さらに、本製法をすべてプロセス改善したいくつかのバッチを実施することにより評価したが、それらは、現在の製法で以前に見られたように、すべてのＩＲＸ−２を典型的な比率で作製した。一次細胞由来バイオロジック成分の同等性と生物学的同等性を、ＲＡＹＢＩＯヒトサイトカイン抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）及びペプチド結合ワクチンモデルで確認した。これらのデータに基づくと、改良方法は、現在のＩＲＸ−２製法と同等であり、そして、一貫性と再現性のある産物を作製する。変更の要約を以下に表２１にさらに見ることができる。
【０１３１】
〔実施例５〕
【０１３２】
ウイルス排除
【０１３３】
上記したように、ＩＲＸ−２作製の以前の方法は、ウイルス専用除去工程（図１４及び１５に示す）のような二段の１５Ｎフィルタを連続に用いるナノろ過によるウイルス排除を含み、また、（ＭＱ）ディスポーザブル陰イオン交換クロマトグラフィユニット（図１６に示す）によるＤＮＡ除去を含む。
【０１３４】
ＵＶＣ処理
【０１３５】
ＵＶＣシステム（新規な螺旋流水力混合（ｓｐｉｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ）付き反応器、図１７に示す）は、これらの限界を克服し、そして用途をバイオテクノロジー産物への使用を目標とするために設計された（シュミットら、２００５、シュミット及びカウリング、２００７）。ＵＶＣを用いた試験は、顕著なタンパク質損傷を招くことなくウイルスを不活性化する新規な反応器でのＵＶＣ処理の有効性を実証している（ワンら、２００４）。ウイルス及びモック固定化（ｍｏｃｋ  ｓｐｉｋｅｄ）α１プロティナーゼインヒビター（Ａｌｐｈａ１  ＰＩ）溶液をさまざまなＵＶＣ線量で試験した。ウイルス試料の残留感染力をアッセイし、そしてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）で増幅した。また、モック固定化試料のタンパク質保全性をアッセイした。Ａｌｐｈａ１  ＰＩ（血漿タンパク質）を、生物学的活性の減少によりＵＶ誘導ダメージを容易に検出できるＵＶ−吸収アミノ酸に基づき目標タンパク質として選択した。一本鎖又は二本鎖、長鎖又は短鎖のＲＮＡ又はＤＮＡゲノムを持ったエンベロープ及び非エンベロープウイルスを含む多様性パネル（ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐａｎｅｌ）のウイルスを試験した。Ａｌｐｈａ１−ＰＩのＵＶＣ処理は、ＳＶ４０、ＰＰＶ、ＨＡＶ、シンドビス、レオ及びアデノウイルスの４ｌｏｇ１０を超える不活性化を生じ、これは、すべての試験ウイルスが、核酸のタイプやエンベロープの存在にかかわらず不活性化されることを実証した。
【０１３６】
この試験で、最小のゲノムを持つウイルスは、ＵＶＣ処理に対して最も感応的であることが判明し、そして、≧２．０ｋｂのＰＣＲ増幅の検出は、ウイルス感染力と相関した。ウイルス不活性化を顕著に達成した線量は、クエンチャーの不在下でも＞９０％のタンパク質活性の復元をもたらした。ウイルス不活性化の反応論は、比較的線形であり、そして、ウイルスの小さな耐性分画（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）も生き残らなかった。さらに、ＰＰＶは、ＰＣＲ及び感染力アッセイの両方によりＵＶ照射試験のＢ１９の適当なモデルであることを示した。ＵＶＣ処理のプロセス開発の要約を以下の表２２にさらにリストする。
【０１３７】
ＵＶｉｖａｔｅｃ（登録商標）ＵＶＣシステム
【０１３８】
ＵＶＣ反応器では、照射線源に沿った新規な水力螺旋流が流体流内の高度に効率的な混合を誘導し、ＵＶＣ照射の高線量を溶液へ均等かつ均質に送達でき、こうして照射チャンバー内の所望の滞在時間がきわめて短く、そしてＵＶＣ処理が制御可能である（ワンら、２００４、シュミットら、２００５、シュミット及びカウリング、２００７）。同心ＵＶＣ源（２５４ｎｍ）を持った石英管の周りに螺旋状に巻かれる円筒状のポリ（テトラフルオロエチレンン）管が、反応器の照射チャンバーを形成する（図３８）。流体流はランプに沿って螺旋状に移動するとき、高度に効率的な混合を提供し、ＵＶ光に対してウイルス露出を最適化し、全体積の均質かつ制御可能な照射を可能にする二次循環流（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｌｏｗｓ、Ｄｅａｎ渦）が生成する。
【０１３９】
ＵＶＣの殺ウイルス活性を最適化し、そしてタンパク質損傷を最小化するために、ＵＶＣシステムは波長２５４ｎｍのＵＶＣ照射を利用する。この波長はウイルスの核酸成分を特異的標的とするのに選択された。図３９は、ウイルスがこの波長でいかに不活性化さるとともに、タンパク質が比較的影響されないことを実証する（シュミットら、２００７）。
【０１４０】
さらに、ウイルスを不活性化するのに必要な線量は、血漿産物に使用されるＵＶ照射で以前に記載された１０００〜２０００Ｊ／ｍ２より１０倍低い（チンら、１９９５、チンら、１９９７、カイレット−ファウケットら、２００４、スガワラら、２００１）。
【０１４１】
ＵＶＣ線量は、典型的には、ＵＶフルエンシー（ｆｌｕｅｎｃｙ）の単位で記載され、そして、（１）ランプにより放射される平均放射照度、（２）照射チャンバー内の滞在時間、及び（３）試験溶液の光学密度（Ｗｓ／ｃｍ２＝Ｊ／ｃｍ２）に依存する（ワンら、２００４、リら、２００５）。ＵＶＣ処理に先立ち、溶液のＡ２５４を測定してタンパク質溶液により生成される干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を決定し、そして、Ａ２５４に基づいて必要な線量を達成するための必要な流速を計算する。
【０１４２】
ウイルス排除試験
【０１４３】
ＩＲＸ−２商業化方法は、最高１１ｌｏｇ１０の偶発性ウイルス汚染を除去又は不活性化することが示されている、効果確認済みの二種類のウイルス排除方法を含む（すなわち、陰イオン交換クロマトグラフィ及び１５ｎｍろ過）。第三の方法であるＵＶウイルス不活性化（ＵＶＣ）のＩＲＸ−２プロセスへの用途を評価した。ＵＶＣ技術に関して以前に刊行されたデータ（ワンら、２００４、シュミットら２００５、シュミット及びカウリング、２００７）と一致して、偶発的な非エンベロープウイルスを殺傷することが知られている最高１５０Ｊ／ｍ２の線量は、ＩＲＸ−２サイトカインの最小の不活性化を示す。
【０１４４】
１００Ｊ／ｍ２の線量は、ＰＰＶ及びＨＡＶを含むいくつかの目標ウイルスに対して４ｌｏｇｓ不活性化することが示され（ワンら、２００４、シュミットら、２００５、シュミット及びカウリング、２００７）、そしてＩＲＸ−２サイトカインに対しては最小の影響を持つことが示された。したがって、それがＩＲＸ−２のための目標線量として選択された。
【０１４５】
この試験のために使用したウイルスの選定は、出発材料の性質及び起源並びに作製に用いた原料（すなわち、ヒト白血球に由来するバイオテク産物（ｂｉｏｔｅｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｔ））に基づいた。使用した各ウイルスは、原材料（この場合、ヒト血液）を汚染し得る関連ウイルス、又は予測される汚染種について認識されたモデルである。さらに、モデルウイルスを（無血清又は低タンパク質培地内で）高力価株（ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ  ｓｔｏｃｋ）を生育及び創製する能力と、敏感かつ信頼性のあるアッセイでのそれらの検出し易さで選択した。この試験に使用したウイルスは、ＨＩＶ−１、ＢＶＤＶ、ＨＡＶ及びＰＰＶであった。使用したウイルスは、ＵＶＣシステムのウイルスを排除する能力を充分に試験するために、広い範囲の物理化学的特性を示す。＜１００Ｊ／ｍ２の範囲の低線量のＵＶＣがより大きなエンベロープウイルスに対して効果的であることは予期しなかった。したがって、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ、大きなエンベロープウイルスの典型的な代用物）は、この予備試験では試験しなかった。
【０１４６】
ＩＲＸ−２中でのＵＶＣのウイルス排除能力を、二つのウイルス排除試験で確認した。ＩＲＸ−２試料（約５０ｍｌ）をモデル及び血液由来ウイルスでスパイク（ｓｐｉｋｅ）し、そして４０〜１５０Ｊ／ｍ２にわたるＵＶＣ線量に曝露した。表１５は、１００Ｊ／ｍ２での結果を示し、そして実証したＵＶＣ技術は、４ｌｏｇ１０のウイルス不活性化を提供することができる。
【表１５】
0005647601.tif 000016
【０１４７】
スケールダウンしたプロセス条件のもとで、ＵＶＣは、試験した３種類のウイルス（ＰＰＶ、ＨＡＶ及びＢＶＤＶ）の４ｌｏｇｓ１０を超えるウイルス排除を実証した。７ｌｏｇｓを超えたＰＰＶがＵＶＣで不活性化された。ＰＰＶ（Ｂ−１９のモデル）は最小ウイルスの一つであり、また他の方法（溶媒／洗浄剤、ｐＨ又は熱）では最も不活性化しにくいウイルスである（チンら、１９９５）。最近の研究により、ＵＶＣ不活性化の間のパラレル比較においてＰＰＶがＢ−１９の適当なモデルである適性が確認されている（ワンら、２００４）。ヒトパルボウイルスＢ−１９は、ヒト血漿中＞１０１２ＩＵ／ｍＬに達し得、そして血液由来製品の潜在的ハザードである（トレイ及びコーコラン、２００６）。ＨＩＶ−１は、おそらくその大きなゲノムサイズ（８０〜１１０ｎｍ）のために、ＵＶＣでは不活性化の効率が若干低い（１．９ｌｏｇｓ）が、これは潜在的にＵＶＣを用いた不活性化をより困難にする（ワンら、２００４）が、しかしＩＲＸ−２に付加される場合は、１０ｌｏｇｓ１０を超えるウイルス排除に増大する。
【０１４８】
この試験は、ＩＲＸ−２プロセスのためのＵＶＣ工程の有効性を証明する。さらに、ＵＶＣは、ＰＰＶ、ＨＡＶ及びＢＶＤＶの４ｌｏｇｓを超える除去を実証し、したがって、ＩＲＸ−２製法における付加的なウイルス排除工程を提供する。ＵＶＣの付加では、データが、累積的評価プロセス（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ）をとおした全排除（ｔｏｔａｌ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）は、ＨＩＶ−１について≧１０．５ｌｏｇｓ、ＨＡＶについて≧１１．２、ＢＶＤＶについて≧１１．３、そしてＰＰＶについて１８．９ｌｏｇｓを示したことを表している。
【０１４９】
２〜３ＬバッチＵＶＣ
【０１５０】
ＵＶＣシステムを充分に評価するため、新規な製法を用いて４つのバッチを調製したが、これらは、ＵＶＣを用いたプロセスを含むすべての一体化してプロセス変更を含む。
【表１６】
0005647601.tif 000017
【０１５１】
結果：  
【０１５２】
現状の規模（２〜３．５Ｌ）で作製した実験室スケールバッチのＵＶＣ処理は、ＴＮＦ−α生物活性の若干の検出可能なロスを示し、ＴＮＦ−α生物活性の回収率は９３％であり、そしてＥＬＩＳＡによれば９２％であり、したがって小規模試験での当初の発見、すなわちＩＲＸ−２は、これらの条件のもとではＵＶＣ照射に影響されないことを確認した。ＥＬＩＳＡ又はバイオアッセイ（ＣＴＬＬ−２）によるすべての他のサイトカインは、非エンベロープウイルスのＨＡＶ及びＰＰＶを効率的に不活性化する１００Ｊ／ｍ２の線量にてＩＲＸ−２サイトカインのきわめて良好な回収率を示した。
【０１５３】
ＵＶＣ処理したＩＲＸ−２に由来するＩＲＸ−２に関する最も一般的なサイトカイン（ハンら、２００１）のアレイ分析（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によれば、ＩＲＸ−２産物はＵＶＣ処理前後のサイトカイン組成において同等のようであることが明らかになった（図１９）。
【０１５４】
結論
【０１５５】
ここに示すデータは、ＩＲＸ−２プロセスが提案されたＵＶＣ不活性化処理の付加により顕著に改善され、そしてウイルス不活性化法として有効であることを示す。不活性化工程の付加は、規制基準（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）を満足し、そして現状のＩＲＸ−２プロセスにおいて、ロバストなウイルス不活性化／除去法を加える。このユニット操作及びその変更の評価は、重要なパラメータが許容可能な作業範囲内に維持されること及び、この製法がその規格を満たす産物を提供し得ることを示す。ＵＶＣ不活性化後、ＩＲＸ−２バルク産物を凍結し（図２０に示す）、そして患者への配布のために用意することができる。
【０１５６】
本願をとおして、米国特許をはじめとするさまざまな刊行物を、著者及び年度、並びに番号による特許を参照する。刊行物の詳細な書誌情報（Ｆｕｌｌ  ｃｉｔａｔｉｏｎｓ）を以下にリストする。これらの刊行物及び特許の全体の開示を、本発明が関係する現在の技術をより充分に記載するために、本願に参照として編入する。
【０１５７】
本発明を実例で説明してきたが、使用した用語は、限定よりもむしろ説明する単語の本質の中にあると意図されることを理解するべきである。
【０１５８】
明らかに、本発明の多くの改変と変更が上記教示に徴して可能である。したがって、添付の請求の範囲の範囲内で本発明を特に記載しない限り実施できると理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005647601.tif 000033
【図１７】
0005647601.tif 000034
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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