(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を標本に照射する励起光照射手段と、
前記標本上における前記励起光の空間強度分布を変調する励起光変調手段と、
変調制御信号に基づいて前記励起光変調手段を制御する励起光変調制御手段と、
前記励起光の照射により生じる前記標本からの発光を検出して検出信号を生成する光検出手段と、
前記変調制御信号及び前記検出信号から前記標本の画像データを生成する画像生成手段と、
前記画像データのナイキスト周波数が前記標本上における前記励起光の空間強度分布のカットオフ周波数よりも大きくなるように、前記変調制御信号を生成する変調制御信号生成手段と、
前記画像データに含まれる前記カットオフ周波数を上回る高周波成分を強調する画像処理手段と、を含む
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の標本観察装置において、
前記励起光照射手段は、前記励起光の少なくとも一部を前記標本上に集光させる集光手段を含み、
前記励起光変調手段は、前記集光手段により集光された前記励起光の集光位置を移動させて、前記標本を走査する走査手段である
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項３】
請求項２に記載の標本観察装置において、
前記変調制御信号生成手段は、前記画像データのナイキスト周波数が前記標本上における前記励起光の空間強度分布のカットオフ周波数の約１．５倍以上になるように、前記変調制御信号を生成する
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載の標本観察装置において、
前記変調制御信号生成手段は、前記画像データのナイキスト周波数が前記標本上における前記励起光の空間強度分布のカットオフ周波数の約４倍以下になるように、前記変調制御信号を生成する
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項５】
請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載の標本観察装置において、
前記励起光の空間強度分布のカットオフ周波数は、前記励起光の波長と前記集光手段の射出側の開口数から算出される回折限界により定まる
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項６】
請求項２乃至請求項５のいずれか１項に記載の標本観察装置において、
前記画像データのナイキスト周波数は、前記走査手段による前記標本上におけるサンプリング間隔により定まる
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項７】
請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の標本観察装置において、さらに、
前記集光手段による集光位置と光学的に共役な位置に開口が形成された共焦点絞りを含む
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項８】
請求項７に記載の標本観察装置において、
前記共焦点絞りの開口径は、レイリー径以下である
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項９】
請求項２乃至請求項８のいずれか１項に記載の標本観察装置において、
前記画像処理手段は、デジタルコンボリューションフィルタを使用して、前記高周波成分を強調する
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の標本観察装置において、
前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記励起光の波長に応じて調整される
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載の標本観察装置において、
前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記発光の波長に応じて調整される
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１２】
請求項９乃至請求項１１のいずれか１項に記載の標本観察装置において、
前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記集光手段の射出側の開口数に応じて調整される
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１３】
請求項９乃至請求項１２のいずれか１項に記載の標本観察装置において、
前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記標本の光学像が前記光検出手段の受光面に投影される倍率に応じて調整される
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１４】
請求項９乃至請求項１３のいずれか１項に記載の標本観察装置において、
前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記画像データのナイキスト周波数に応じて調整される
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１５】
請求項１乃至請求項１４のいずれか１項に記載の標本観察装置において、
前記発光は、前記標本における前記励起光の照射強度に非線形に依存する
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１６】
請求項１５に記載の標本観察装置において、
前記発光は、前記標本から発生する多光子励起蛍光である
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１７】
請求項１５に記載の標本観察装置において、
前記発光は、前記標本から発生する高次高調波である
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１８】
請求項１５に記載の標本観察装置において、
前記励起光は、異なる２つの波長成分を含み、
前記発光は、前記標本からのラマン散乱光に含まれるアンチストークス成分である
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項１９】
請求項１５に記載の標本観察装置において、
前記励起光は、異なる２つ以上の波長成分を含み、
前記発光は、前記標本における４光波混合により生じる
ことを特徴とする標本観察装置。
【請求項２０】
請求項１乃至請求項１９のいずれか１項に記載の標本観察装置において、
前記画像処理手段は、前記画像生成手段による前記画像データの生成に合わせて、前記画像データを実時間処理する
ことを特徴とする標本観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本観察装置に関し、特に、超解像成分が可視化された標本画像を生成する標本観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査顕微鏡は、標本上の一点に集光させた光をガルバノミラーなどの走査手段で移動させて標本を走査することにより標本を観察する顕微鏡であり、現在さまざまな分野で広く用いられている。このような走査顕微鏡は、例えば、特許文献１、特許文献２で開示されている。
【０００３】
特許文献１で述べられているように、走査顕微鏡には、ピンホール径、ＰＭＴの電圧、光源の出力強度や波長、スキャンスピードなど種々の設定項目が存在し、これらの設定によって画質が大きく異なることがある。例えば、蛍光レーザ走査顕微鏡（以降、蛍光ＬＳＭと記す。）では、ピンホール径をエアリーディスク径に対して十分に小さくすると、光学系のカットオフ周波数を超える解像（以降、超解像と記す。）が得られることが知られている。このような技術は、例えば、非特許文献１に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７２２７１１２号明細書
【特許文献２】米国特許第７６４９６８２号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T. Wilsonand C. Sheppard, "Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy", Academic Press, 1984, 第6章6節
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、従来の蛍光ＬＳＭの主要な目的は、超解像成分を得ることではなく、セクショニング効果を得ることにある。また、超解像成分を得るためにピンホール径をエアリーディスク径に対して小さくすると、検出器で検出される蛍光の光量が減少することになる。
【０００７】
このため、従来の蛍光ＬＳＭでは、検出効率の確保を優先して、ピンホール開口径をエアリーディスク径程度に設定するのが通常である。従って、検出器で検出される超解像成分は極めて微弱であり、可視化されない。
【０００８】
なお、以上では、蛍光ＬＳＭについて説明したが、超解像成分が検出される顕微鏡は、蛍光ＬＳＭに限られない。走査顕微鏡では、照明光は標本上の一点に集光し、且つ、その照明光が集光する点は走査手段により移動する。これにより、照明光は、空間的にまたは時間的に変調されるため、走査顕微鏡全般で超解像成分は検出され得る。しかし、従来の蛍光ＬＳＭと同様に、一般的にその超解像成分は極めて微弱であり、可視化されない。
以上のような実情を踏まえて、本発明では、超解像成分が可視化された超解像画像を生成する標本観察装置の技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、励起光を標本に照射する励起光照射手段と、前記標本上における前記励起光の空間強度分布を変調する励起光変調手段と、変調制御信号に基づいて前記励起光変調手段を制御する励起光変調制御手段と、前記励起光の照射により生じる前記標本からの発光を検出して検出信号を生成する光検出手段と、前記変調制御信号及び前記検出信号から前記標本の画像データを生成する画像生成手段と、前記画像データのナイキスト周波数が前記標本上における前記励起光の空間強度分布のカットオフ周波数よりも大きくなるように、前記変調制御信号を生成する変調制御信号生成手段と、前記画像データに含まれる前記カットオフ周波数を上回る高周波成分を強調する画像処理手段と、を含む標本観察装置を提供する。
【００１０】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の標本観察装置において、前記励起光照射手
段は、前記励起光の少なくとも一部を前記標本上に集光させる集光手段を含み、前記励起光変調手段は、前記集光手段により集光された前記励起光の集光位置を移動させて、前記標本を走査する走査手段である標本観察装置を提供する。
【００１１】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の標本観察装置において、前記変調制御信号生成手段は、前記画像データのナイキスト周波数が前記標本上における前記励起光の空間強度分布のカットオフ周波数の約１．５倍以上になるように、前記変調制御信号を生成する標本観察装置を提供する。
【００１２】
本発明の第４の態様は、第２の態様または第３の態様に記載の標本観察装置において、前記変調制御信号生成手段は、前記画像データのナイキスト周波数が前記標本上における前記励起光の空間強度分布のカットオフ周波数の約４倍以下になるように、前記変調制御信号を生成する標本観察装置を提供する。
【００１３】
本発明の第５の態様は、第２の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の標本観察装置において、前記励起光の空間強度分布のカットオフ周波数は、前記励起光の波長と前記集光手段の射出側の開口数から算出される回折限界により定まる標本観察装置を提供する。
【００１４】
本発明の第６の態様は、第２の態様乃至第５の態様のいずれか１つに記載の標本観察装置において、前記画像データのナイキスト周波数は、前記走査手段による前記標本上におけるサンプリング間隔により定まる標本観察装置を提供する。
【００１５】
本発明の第７の態様は、第２の態様乃至第６の態様のいずれか１つに記載の標本観察装置において、さらに、前記集光手段による集光位置と光学的に共役な位置に開口が形成された共焦点絞りを含む標本観察装置を提供する。
【００１６】
本発明の第８の態様は、第７の態様に記載の標本観察装置において、前記共焦点絞りの開口径は、レイリー径以下である標本観察装置を提供する。
【００１７】
本発明の第９の態様は、第２の態様乃至第８の態様のいずれか１つに記載の標本観察装置において、前記画像処理手段は、デジタルコンボリューションフィルタを使用して、前記高周波成分を強調する標本観察装置を提供する。
【００１８】
本発明の第１０の態様は、第９の態様に記載の標本観察装置において、前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記励起光の波長に応じて調整される標本観察装置を提供する。
【００１９】
本発明の第１１の態様は、第９の態様または第１０の態様に記載の標本観察装置において、前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記発光の波長に応じて調整される標本観察装置を提供する。
【００２０】
本発明の第１２の態様は、第９の態様乃至第１１の態様のいずれか１つに記載の標本観察装置において、前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記集光手段の射出側の開口数に応じて調整される標本観察装置を提供する。
【００２１】
本発明の第１３の態様は、第９の態様乃至第１２の態様のいずれか１つに記載の標本観察装置において、前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記標本の光学像が前記光検出手段の受光面に投影される倍率に応じて調整される標本観察装置を提供する。
【００２２】
本発明の第１４の態様は、第９の態様乃至第１３の態様のいずれか１つに記載の標本観察装置において、前記デジタルコンボリューションフィルタの係数は、前記画像データのナイキスト周波数に応じて調整される標本観察装置を提供する。
【００２３】
本発明の第１５の態様は、第１の態様乃至第１４の態様のいずれか１つに記載の標本観察装置において、前記発光は、前記標本における前記励起光の照射強度に非線形に依存する標本観察装置を提供する。
【００２４】
本発明の第１６の態様は、第１５の態様に記載の標本観察装置において、前記発光は、前記標本から発生する多光子励起蛍光である標本観察装置を提供する。
【００２５】
本発明の第１７の態様は、第１５の態様に記載の標本観察装置において、前記発光は、前記標本から発生する高次高調波である標本観察装置を提供する。
【００２６】
本発明の第１８の態様は、第１５の態様に記載の標本観察装置において、前記励起光は、異なる２つの波長成分を含み、前記発光は、前記標本からのラマン散乱光に含まれるアンチストークス成分である標本観察装置を提供する。
【００２７】
本発明の第１９の態様は、第１５の態様に記載の標本観察装置において、前記励起光は、異なる２つ以上の波長成分を含み、前記発光は、前記標本における４光波混合により生じる標本観察装置を提供する。
【００２８】
本発明の第２０の態様は、第１の態様乃至第１９の態様のいずれか１項に記載の標本観察装置において、前記画像処理手段は、前記画像生成手段による前記画像データの生成に合わせて、前記画像データを実時間処理する標本観察装置を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、超解像成分が可視化された超解像画像を生成する標本観察装置の技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】蛍光ＬＳＭの点像分布関数を例示した図である。
【図２】蛍光ＬＳＭの変調伝達関数を例示した図である。
【図３】点像分布関数の半値全幅と検出効率について、蛍光ＬＳＭと広視野蛍光顕微鏡を比較した図である。
【図４】実施例１に係る蛍光ＬＳＭの構成を例示した図である。
【図５】実施例１に係る蛍光ＬＳＭで実行される超解像画像生成処理のフローを示す図である。
【図６】図５に示されるコンボリューションフィルタの設定処理のフローを示す図である。
【図７】図５に示されるコンボリューションフィルタの設定処理を説明するための図である。
【図８】実施例１に係る蛍光ＬＳＭで強調処理前後の点像分布関数のＦＷＨＭを比較した図である。
【図９】実施例２に係る２光子励起顕微鏡の構成を例示した図である。
【図１０】実施例２に係る２光子励起顕微鏡で実行される超解像画像生成処理のフローを示す図である。
【図１１】実施例２に係る２光子励起顕微鏡の強調処理前後の点像分布関数と強調処理後の目標とする点像分布関数を例示した図である。
【図１２】実施例２に係る２光子励起顕微鏡の強調処理前の変調伝達関数と強調処理後の目標とする変調伝達関数を例示した図である。
【図１３】実施例３に係る第２高調波（ＳＨＧ）顕微鏡の構成を例示した図である。
【図１４】実施例４に係るコヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡の構成を例示した図である。
【図１５】実施例４に係るＣＡＲＳ顕微鏡で実行される超解像画像生成処理のフローを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
まず、本発明の各実施例について説明する前に、蛍光ＬＳＭの結像特性について説明する。
蛍光ＬＳＭの結像式は、式（１）、（２）で表される。
【数１】
0005784393.tif 000002
【００３２】
ここで、PSFLSM、MTFLSMは、それぞれ蛍光ＬＳＭの結像特性を示す点像分布関数（ＰＳＦ：Point Spread Function）、及びそのフーリエ変換である変調伝達関数（ＭＴＦ: Modulation Transfer Function）である。PSFex、MTFexは、それぞれ標本上での励起光スポットの点像分布関数、及びそのフーリエ変換である変調伝達関数であり、励起光が標本面に集光する際の集光特性を示す。PSFem、MTFemは、それぞれ標本面上での検出波長における点像分布関数、及びそのフーリエ変換である変調伝達関数であり、標本面から生じた蛍光が像面（共焦点面）に結像する際の結像特性を示す。PH、~PHは、それぞれ共焦点絞りの透過関数を標本へ投影した関数、それをフーリエ変換した関数である。なお、rは、光軸からの距離であり、標本位置の空間座標を示す。fは、rの空間周波数である。
【００３３】
また、点像分布関数PSFex、PSFem、変調伝達関数MTFex、MTFem、関数PH、~PHは、近似的にそれぞれ式（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）で表される。なお、式（７）、（８）は、共焦点絞りの開口がピンホール形状（円形）である場合に適用される式である。
【数２】
0005784393.tif 000003
【００３４】
ここで、fc,ex、fc,emは、それぞれ標本上における励起波長λexの励起光の空間強度分布のカットオフ周波数（空間周波数の上限）、標本面上における検出波長λemの蛍光の空間強度分布のカットオフ周波数（空間周波数の上限）であり、式（９）、（１０）で表される。NA、dPH、Mobは、それぞれ対物レンズの標本側の開口数、共焦点絞りの開口径、標本面から共焦点絞りまでの投影倍率である。また、Jinc関数、chinesehat関数は、それぞれ式（１１）、（１２）で表される関数である。J1は、第１種Bessel関数である。
【数３】
0005784393.tif 000004
【００３５】
図１は、蛍光ＬＳＭの点像分布関数を例示した図であり、点像分布関数PSFemと共焦点絞りの設定が異なる複数の点像分布関数PSFLSMとを示している。図１の横軸は、点像分布関数PSFemの半値全幅（ＦＷＨＭ：Full Width Half Maximum）で正規化された光軸からの距離r/FWHM_PSFem(r)である。図２は、蛍光ＬＳＭの変調伝達関数を例示した図であり、変調伝達関数MTFemと共焦点絞りの設定が異なる複数の変調伝達関数MTFLSMとを示している。図２の横軸は、カットオフ周波数fc,emで正規化された空間周波数f/fc,emである。なお、図１及び図２では、共焦点絞りの設定として、蛍光が共焦点絞り上に形成するエアリーディスク径に対する共焦点絞りの開口径の比αが０、０．５、１となる場合が例示されている。図３は、点像分布関数の半値全幅と検出効率について、蛍光ＬＳＭと広視野蛍光顕微鏡を比較した図である。横軸は、上述したエアリーディスク径に対する共焦点絞りの開口径の比αであり、縦軸は、広視野蛍光顕微鏡を基準とした蛍光ＬＳＭの点像分布関数の半値全幅または検出効率である。なお、ここで、広視野蛍光顕微鏡とは、標本面を均一に照明する蛍光顕微鏡であり、非共焦点顕微鏡である。
【００３６】
蛍光ＬＳＭの結像特性は、式（１）、（２）に示されるように、蛍光ＬＳＭが励起光、蛍光のそれぞれに対して行う変調に依存している。また、蛍光に対する変調には、光学系による変調のみならず、共焦点絞りよる変調も含まれる。これに対して、広視野蛍光顕微鏡の結像特性は、蛍光に対する光学系による変調により定まる。これは、広視野蛍光顕微鏡では、励起光に対する光学系による変調（励起光の標本面への集光）や蛍光に対する共焦点絞りによる変調は行われないためである。つまり、図１、図２に例示される点像分布関数PSFem、変調伝達関数MTFemは、それぞれ広視野蛍光顕微鏡の点像分布関数、変調伝達関数に相当する。
【００３７】
図１に示されるように、点像分布関数PSFLSMは点像分布関数PSFemに比べて光軸（r/FWHM_PSFem(r)=0）に近い位置により多くの光が分布する特性を有している。また、図２に示されるように、変調伝達関数MTFLSMは変調伝達関数MTFemに比べてより広い空間周波数まで分布している。これらは、蛍光ＬＳＭは広視野蛍光顕微鏡よりも高い結像性能を有し、より高い周波数成分まで検出することができることを示している。また、図１及び図２に示されるように、蛍光ＬＳＭは、比αを小さく設定するほどより高い周波数成分まで検出することができる。
【００３８】
その一方で、図２に示されるように、比αが１の状態の蛍光ＬＳＭでは、広視野蛍光顕微鏡のカットオフ周波数を上回る超解像成分は、極わずかしか伝達されない。また、超解像成分をより効率的に伝達するために比αを小さくすると、図３に示されるように、点像分布関数の半値全幅の減少に対して検出効率が著しく低下する。このため、生成される画像データは標本の画像を非常に暗く表示するものとなってしまう。従って、いずれにしても、検出された超解像成分を画面上で視認することはほとんどできず、超解像成分は可視化されない。
【００３９】
このように、従来の蛍光ＬＳＭは、超解像成分を検出し得るが、超解像成分を可視化するには至っていない。
以下、本発明の各実施例について具体的に説明する。
【実施例１】
【００４０】
図４は、本実施例に係る蛍光ＬＳＭの構成を例示した図である。図４に例示される蛍光ＬＳＭ１０は、超解像成分が可視化された超解像画像を生成する標本観察装置である。蛍光ＬＳＭ１０は、励起光２を射出するレーザ光源１１と、励起光２を透過し標本１からの蛍光３を反射するダイクロイックミラー１２と、標本１を走査するガルバノミラー１３と、変調制御信号に基づいてガルバノミラー１３を駆動するガルバノミラー駆動装置１４と、励起光２を標本１に集光させる対物レンズ１５と、レンズ１６と、対物レンズ１５による励起光２の集光位置と光学的に共役な位置にピンホール（開口）が形成された共焦点絞り１７と、レンズ１８と、蛍光３を検出して検出信号を生成するＰＭＴ検出器１９と、変調制御信号と検出信号から標本１の画像データを生成するＰＣ２０と、標本１の画像データを記憶する記憶装置２１と、標本１の画像データを表示するモニタ２２と、を含んでいる。
【００４１】
本実施例に係る蛍光ＬＳＭ１０では、レーザ光源１１から射出された励起光２は、ダイクロイックミラー１２を透過して、ガルバノミラー１３を介して対物レンズ１５に入射する。そして、対物レンズ１５が励起光２を標本１上に集光することで、励起光２が標本１に照射される。即ち、蛍光ＬＳＭ１０では、レーザ光源１１、ダイクロイックミラー１２、ガルバノミラー１３、及び対物レンズ１５は、励起光２を標本１に照射する励起光照射手段であり、対物レンズ１５は、励起光２を標本１上に集光させる集光手段である。なお、集光手段として機能する対物レンズ１５は、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数を高める効果を有している。
【００４２】
また、励起光２の集光位置は、ＰＣ２０からの変調制御信号に基づいて、ガルバノミラー駆動装置１４がガルバノミラー１３を駆動することにより、光軸と直交するＸＹ平面上で移動する。即ち、蛍光ＬＳＭ１０では、ガルバノミラー１３は、標本１上における励起光２の空間強度分布を変調する励起光変調手段であり、対物レンズ１５により集光された励起光２の集光位置を移動させて標本１を走査する走査手段である。また、ガルバノミラー駆動装置１４は、ＰＣ２０からの変調制御信号に基づいて励起光変調手段を制御する励起光変調制御手段である。
【００４３】
励起光２が照射された標本１では、集光位置に存在する蛍光物質が励起されて、標本１における励起光２の照射強度に線形に依存する光量の蛍光３を発光する。蛍光３は、励起光２と同じ経路を反対方向に進行して、ダイクロイックミラー１２に入射する。ダイクロイックミラー１２を反射した蛍光３は、レンズ１６により集光されて共焦点絞り１７に入射する。
【００４４】
共焦点絞り１７では、集光位置以外から生じた蛍光は遮断され、集光位置から生じた蛍光３が開口を通過する。なお、共焦点絞り１７は、その共焦点効果により、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数よりも高い周波数成分の検出に寄与する。
【００４５】
その後、蛍光３は、レンズ１８を介してＰＭＴ検出器１９に入射して検出される。ＰＭＴ検出器１９は、検出した蛍光３の光量に応じた検出信号を生成してＰＣ２０へ送信する。即ち、蛍光ＬＳＭ１０では、ＰＭＴ検出器１９は、励起光２の照射により生じる標本１からの蛍光３を検出して検出信号を生成する光検出手段である。
【００４６】
ＰＣ２０は、生成する画像データのナイキスト周波数が標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数よりも大きくなるように変調制御信号を生成し、且つ、生成した画像データに含まれる標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数を上回る高周波成分を強調する画像処理を行う。即ち、蛍光ＬＳＭ１０では、ＰＣ２０は、標本１の画像データを生成する画像生成手段であるとともに、変調制御信号を生成する変調制御信号生成手段であり、また、画像データの高周波成分を強調する画像処理手段である。なお、ナイキスト周波数とカットオフ周波数の比較は、標本１と像面の間の投影倍率を考慮して行われる。具体的には、ナイキスト周波数とカットオフ周波数の一方を投影倍率で補正することに得られる換算量と他方とを比較する。
【００４７】
図５は、蛍光ＬＳＭ１０で実行される超解像画像生成処理のフローを示す図である。以下、蛍光ＬＳＭ１０による超解像画像の生成方法について、図５を参照しながら、具体的に説明する。
【００４８】
超解像画像生成処理が開始されると、まず、ステップＳ１では、利用者が観察に使用する励起波長λex、蛍光波長（検出波長）λemを選択することで、励起波長λex及び蛍光波長λemがＬＳＭ１０に設定される。例えば、レーザ光源１１がＡｒレーザであり、標本１中の蛍光物質が強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ：Enhanced Green Fluorescence Protein）であれば、ステップＳ１では、励起波長、蛍光波長は、それぞれλex＝４８８ｎｍ、λem＝５０８ｎｍに設定される。
【００４９】
ステップＳ２では、利用者が対物レンズ１５を選択する。例えば、レンズ１６と組み合わせて１００倍の倍率を有し、且つ、開口数が１．４である対物レンズが選択されて、蛍光ＬＳＭ１０にMob＝１００、NA＝１．４が設定される。
【００５０】
ステップＳ３では、標本１上における励起波長λexの励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exと、標本１上における検出波長λemの蛍光３の空間強度分布のカットオフ周波数fc,emとを算出する。ここでは、式（９）、（１０）により、それぞれfc,ex＝５．７μｍ−１、fc,em＝５．５μｍ−１と算出される。
なお、式（９）で示されるように、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exは、励起光２の波長λexと対物レンズ１５の射出側（標本１側）の開口数NAから算出される回折限界により定まる。
【００５１】
ステップＳ４では、蛍光ＬＳＭ１０で生成される画像データのナイキスト周波数を設定する。画像データのナイキスト周波数fNyquistは、超解像成分を記録するために、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exよりも大きくなるように設定する。ここでは、例えば、下式（１３）により算出した画像データのナイキスト周波数fNyquist＝１１．２μｍ−１を設定する。
【数４】
0005784393.tif 000005
【００５２】
これにより、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exの２倍程度までの周波数成分を記録することができる。
なお、ここでは、式（１３）を用いて算出したナイキスト周波数fNyquistを設定したが、画像データのナイキスト周波数fNyquistとカットオフ周波数fc,exとの関係は、この関係に限られない。高い超解像性能を実現するためには、ナイキスト周波数fNyquistは、カットオフ周波数fc,exの約１．５倍以上であることが望ましい。一方で、ナイキスト周波数fNyquistが高すぎると、その周波数を実現するために光量低下やノイズ増大が生じうる。これを避けるためには、ナイキスト周波数fNyquistは、カットオフ周波数fc,exの約４倍以下であることが望ましい。
【００５３】
ステップＳ５では、ガルバノミラー１３による標本１の走査のサンプリング間隔を設定する。サンプリング間隔dpixには、ステップＳ４で設定されたナイキスト周波数fNyquistに応じた値が設定される。これは、画像データのナイキスト周波数fNyquistがガルバノミラー１３による標本１の走査のサンプリング間隔により定まるからである。具体的には、サンプリング間隔dpixは、ナイキスト周波数fNyquistがサンプリング周波数（fpix＝１／dpix）の１／２となるように、下式（１４）により算出された値に設定される。ここでは、サンプリング間隔dpixは０．０４４μｍに設定される。
【数５】
0005784393.tif 000006
【００５４】
これにより、変調制御信号生成手段であるＰＣ２０では、式（１４）で算出されたサンプリング間隔dpixで標本１を走査する変調制御信号が生成される。
【００５５】
ステップＳ６では、共焦点絞り１７のピンホール径dPHを設定する。ピンホール径dPHは、超解像成分、つまり、標本上における励起光の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exを上回る周波数成分を高いコントラストで記録するために、レイリー径以下に設定することが望ましい。
【００５６】
具体的には、下式（１５）により、標本１上での蛍光スポットのエアリーディスク径demを算出する。ここでは、エアリーディスク径demは、０．４４μｍと算出される。そして、算出されたエアリーディスク径demを用いて、下式（１６）により、ピンホール径dPHを算出する。式（１６）において、比αに１以下の値を用いることで、ピンホール径dPHをレイリー径以下とすることができる。ここでは、例えば、比α＝０．５とする。
【数６】
0005784393.tif 000007
【００５７】
なお、比αの値が大きくなるほど、後述するコンボリューションフィルタによる強調処理による超解像周波数領域（超解像成分）の増強度を大きくする必要がある。このため、比αの値が大きすぎると、超解像画像中のノイズが目立ちやすくなってしまう。一方、比αの値が小さくなるほど、検出効率が低下し生成される画像データのＳ／Ｎ比も低下する。このため、比αの値が小さすぎる場合にも、超解像画像中のノイズが目立ちやすくなってしまう。従って、比αは、これらを勘案して最適な値に設定することが望ましい。
【００５８】
ステップＳ７では、ＰＣ２０での高周波成分の強調に用いられるデジタルコンボリューションフィルタCFを設定する。コンボリューションフィルタについては、図６、図７を参照しながら説明する。図６は、図５に示されるコンボリューションフィルタの設定処理（ステップＳ７）のフローを示す図である。図７は、図５に示されるコンボリューションフィルタの設定処理を説明するための図である。
【００５９】
まず、ステップＳ８で、式（１）により、蛍光ＬＳＭで実際に得られる点像分布関数PSFLSMを算出する（図７の破線を参照）。図７に例示されるように、実際に得られる点像分布関数PSFLSMは、広視野蛍光顕微鏡に相当する点像分布関数PSFemに比べて、高い結像性能を示している。
【００６０】
ステップＳ９では、コンボリューションフィルタCFによる強調処理後に得られる、目標とする点像分布関数PSFDSTを設定する（図７の一点鎖線を参照）。目標とする点像分布関数PSFDSTは、例えば、そのカットオフ周波数fDSTが下式（１７）を満たすような、仮想的な点像分布関数を設定する。
【数７】
0005784393.tif 000008
【００６１】
なお、カットオフ周波数fDSTが大きくなるほど、コンボリューションフィルタCFを用いた強調処理による超解像周波数領域（超解像成分）の増強度を大きくする必要がある。このため、カットオフ周波数fDSTが大きすぎると、超解像画像中のノイズが目立ちやすくなってしまう。従って、カットオフ周波数fDSTは、この点を勘案して最適な値に設定することが望ましい。
【００６２】
次に、ステップＳ１０では、コンボリューションフィルタCFのサイズNcを設定する。ここでは、例えば、Nc＝７とする。なお、コンボリューションフィルタCFのサイズNcが大きくなると、計算コスト（計算時間や使用メモリ容量など）も大きくなる。従って、サイズNcは、超解像画像の超解像性と計算コストとを勘案して、最適なサイズを設定することが望ましい。
【００６３】
最後に、ステップＳ１１では、コンボリューションフィルタCFの係数を設定する。コンボリューションフィルタCFの係数は、下式(１８)を満たすように、最小二乗法を用いた数値計算により算出して設定する。
【数８】
0005784393.tif 000009
【００６４】
以下は、比α＝０．５の場合のコンボリューションフィルタCFの係数の算出結果の一例である。
【数９】
0005784393.tif 000010
【００６５】
このようにして算出されたコンボリューションフィルタCFを用いて画像データに対して強調処理（コンボリューション演算）を行うことで、図７に例示されるように、目標とする点像分布関数PSFDSTに近似した点像分布関数PSFrを有する超解像画像の画像データを得ることができる（図７の実線を参照）。なお、算出されるコンボリューションフィルタCFの係数は、比αにより、つまり、ピンホール径の設定により異なる。
【００６６】
図８は本実施例に係る蛍光ＬＳＭ１０で強調処理前後の点像分布関数PSFLSMとPSFrのＦＷＨＭを比較した図である。横軸は、上述したエアリーディスク径に対する共焦点絞りの開口径の比αであり、縦軸は、広視野蛍光顕微鏡を基準とした点像分布関数の半値全幅の比である。本実施例に係る蛍光ＬＳＭ１０で強調処理後に得られる点像分布関数PSFLSMのＦＷＨＭは、比α＜１．２において、広視野蛍光顕微鏡の点像分布関数のＦＷＨＭに対して、０．５倍から０．８倍程度となる。つまり、本実施例に係る蛍光ＬＳＭ１０は、比α＜１．２において、広視野蛍光顕微鏡に対して、１．６倍から２倍程度の超解像性を有している。従って、蛍光ＬＳＭ１０は、比αを過度に小さくして検出効率を低下させることなく、高い超解像性を実現することができる。
【００６７】
また、コンボリューションフィルタCFの係数は、励起光２の波長や蛍光３の波長に応じて調整してもよい。また、コンボリューションフィルタCFの係数は、対物レンズ１５の射出側の開口数に応じて調整してもよい。また、コンボリューションフィルタCFの係数は、標本１の光学像が共焦点絞り１７に投影される倍率に応じて調整されてもよい。さらに、コンボリューションフィルタCFの係数は、画像データのナイキスト周波数fNyquistに応じて調整されてもよい。これにより、コンボリューションフィルタCFの係数を、蛍光ＬＳＭ１０の励起光２の波長、蛍光３の波長、開口数、倍率、ナイキスト周波数に最適化することができる。
【００６８】
また、コンボリューションフィルタCFは、画像処理の分野で広く使用されているＬｏＧ（Laplacian of Gaussian）タイプのフィルタであってもよい。これにより、超解像画像のノイズを効果的に抑制することができる。また、本実施例で例示されるように、対物レンズ１５の開口数が０．５を超えるような場合には、計算精度を向上させるために、ベクトル回折理論を採用して点像分布関数を算出してもよい。
【００６９】
コンボリューションフィルタCFの設定を含む各種設定が完了すると、図５に示されるように、ステップＳ１２では、蛍光ＬＳＭ１０による画像取得処理が行われる。このとき、ガルバノミラー１３による標本１の走査は、ステップＳ５で設定されたサンプリング間隔dpixで行われる。これにより、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exよりも大きい超解像成分を含む画像データがＰＣ２０で生成される。
【００７０】
ステップＳ１３では、ＰＣ２０が、生成された画像データに対して、ステップＳ７で設定したコンボリューションフィルタCFを使用したコンボリューション演算により強調処理を行う。これにより、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exよりも大きい超解像成分が強調された超解像画像の画像データがＰＣ２０で生成される。
【００７１】
ステップＳ１３で生成された超解像画像の画像データは、ステップＳ１４でモニタ２２に表示される。ステップＳ１５では、画像取得を継続するか否かが判断されて、継続する場合には、ステップＳ１２に戻って同様の処理を繰り返す。これにより、モニタ２２に超解像画像が動画表示される。
【００７２】
画像取得が終了すると、ステップＳ１６で生成した超解像画像の画像データを記憶装置２１に記憶して、その後、処理を終了する。
【００７３】
以上、本実施例に係る蛍光ＬＳＭ１０によれば、超解像成分が可視化された超解像画像を生成することができる。具体的には、蛍光ＬＳＭ１０では、従来は可視化されていなかった超解像成分を強調処理することにより、超解像成分を可視化することができる。また、強調処理が行われるため、図８に示されるように、共焦点絞り１７のピンホール径（開口径）をレイリー径程度に広げても高い超解像性を発揮することができる。このため、蛍光ＬＳＭ１０では、高い光の利用効率と超解像性能を両立することができる。また、既知の光学系の特性から超解像画像の生成に適したピンホール径（開口径）やサンプリング間隔を算出することができるため、蛍光ＬＳＭ１０では、事前に画像を取得して設定を調整するなどの作業が不要であり、開口径やサンプリング間隔の設定を自動化することができる。さらに、強調処理が簡単な行列のコンボリューション演算であるため、強調処理を短時間で行うことができる。即ち、ＰＣ２０は、画像データの生成に合わせて強調処理を実時間処理することが可能であり、蛍光ＬＳＭ１０では、画像取得後、超解像画像をほぼリアルタイムでモニタ２２に表示することができる。
なお、式（１）から分かるように、標本面上での検出波長における点像分布関数PSFemとピンホールの透過関数PHのコンボリューションの範囲外に分布する励起光はＬＳＭの結像に寄与しない。従って、励起光が必ずしも全て１点に集光する必要性は無い。
【実施例２】
【００７４】
図９は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡の構成を例示した図である。図９に例示される２光子励起顕微鏡３０は、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０と同様に、超解像成分が可視化された超解像画像を生成する標本観察装置である。２光子励起顕微鏡３０は、励起光２である超短パルスレーザ光を射出する超短パルスレーザ光源３１と、標本１を走査するガルバノミラー３２と、変調制御信号に基づいてガルバノミラー３２を駆動するガルバノミラー駆動装置３３と、励起光２を透過し標本１からの２光子蛍光４を反射するダイクロイックミラー３４と、励起光２を標本１に集光させる対物レンズ３５と、標本１から生じる２光子蛍光４（多光子励起蛍光）を検出して検出信号を生成するＰＭＴ検出器３６と、変調制御信号と検出信号から標本１の画像データを生成するＰＣ３７と、標本１の画像データを記憶する記憶装置３８と、標本１の画像データを表示するモニタ３９と、を含んでいる。
【００７５】
２光子励起顕微鏡３０は、蛍光ＬＳＭ１０と異なり、２光子励起により共焦点効果を生じさせることができる。このため、蛍光（２光子蛍光４）をＰＭＴ検出器３６へ導く構成が蛍光ＬＳＭ１０と異なっており、その結果、結像式も蛍光ＬＳＭ１０と異なっている。具体的には、２光子励起顕微鏡３０の結像式は式（２０）、（２１）で表される。
【数１０】
0005784393.tif 000011
【００７６】
ここで、PSF2p、MTF2pは、それぞれ２光子励起顕微鏡３０の結像特性を示す点像分布関数、変調伝達関数である。PSFex、MTFexは、それぞれ標本１上での励起光スポットの点像分布関数及びそのフーリエ変換である変調伝達関数であり、励起光が標本面に集光する際の集光特性を示す。rは、光軸からの距離であり、標本位置の空間座標を示す。fは、rの空間周波数である。なお、PSFex、MTFexは、上述した式（３）、（５）により表される。
【００７７】
式（２０）、（２１）に示されるように、２光子励起顕微鏡３０の結像特性は、励起光が標本面に集光する際の集光特性である点像分布関数PSFex、変調伝達関数MTFexに依存するが、検出波長（蛍光波長）における点像分布関数PSFem、変調伝達関数MTFemには依存しない点が、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０の結像特性と異なっている。
【００７８】
２光子励起顕微鏡３０は、ＰＣ３７が生成する画像データのナイキスト周波数が標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数よりも大きくなるように変調制御信号を生成し、且つ、生成した画像データに含まれる標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数を上回る高周波成分を強調する画像処理を行う点については、蛍光ＬＳＭ１０と同様である。即ち、２光子励起顕微鏡３０でも、蛍光ＬＳＭ１０と同様に、ＰＣ３７は、標本１の画像データを生成する画像生成手段であるとともに、変調制御信号を生成する変調制御信号生成手段であり、また、高周波成分を強調する画像処理手段である。なお、ナイキスト周波数とカットオフ周波数の比較は、実施例１と同様に、標本１と像面の間の投影倍率を考慮して行われる。具体的には、ナイキスト周波数とカットオフ周波数の一方を投影倍率で補正することに得られる換算量と他方とを比較する。
【００７９】
図１０は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡で実行される超解像画像生成処理のフローを示す図である。以下、２光子励起顕微鏡３０による超解像画像の生成方法について、図１０を参照しながら、具体的に説明する。
【００８０】
超解像画像生成処理が開始されると、まず、ステップＳ２１では、利用者が観察に使用する励起波長λexを選択することで、励起波長λexが２光子励起顕微鏡３０に設定される。例えば、超短パルスレーザ光源３１がチタンサファイアレーザ（Ti:Sapphire Laser）であり、ステップＳ２１では、励起波長は、λex＝９００ｎｍに設定される。
【００８１】
ステップＳ２２では、利用者が対物レンズ３５を選択する。例えば、２５倍の倍率を有し、且つ、開口数が１．０５である対物レンズが選択されて、２光子励起顕微鏡３０にMob＝２５、NA＝１．０５が設定される。
【００８２】
ステップＳ２３では、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exを算出する。ここでは、式（９）により、fc,ex＝２．３μｍ−１と算出される。
【００８３】
ステップＳ２４では、２光子励起顕微鏡３０で生成される画像データのナイキスト周波数を設定する。画像データのナイキスト周波数fNyquistは、超解像成分を記録するために、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exよりも大きくなるように設定する。ここでは、例えば、下式（２２）により算出した画像データのナイキスト周波数fNyquist＝４．６μｍ−１を設定する。
【数１１】
0005784393.tif 000012
【００８４】
これにより、標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数fc,exの２倍程度までの周波数成分を記録することができる。
なお、ナイキスト周波数fNyquistは、実施例１と同様の理由により、カットオフ周波数fc,exの約１．５倍以上であり、且つ、約４倍以下であることが望ましい。従って、画像データのナイキスト周波数fNyquistとカットオフ周波数fc,exとの関係は、式（２２）の関係に限られない。
【００８５】
ステップＳ２５では、ステップＳ２４で設定されたナイキスト周波数fNyquistに応じて、ガルバノミラー３２による標本１の走査のサンプリング間隔を設定する。具体的には、サンプリング間隔dpixは、ナイキスト周波数fNyquistがサンプリング周波数（fpix＝１／dpix）の１／２となるように、上述した式（１４）により算出された値に設定される。ここでは、サンプリング間隔dpixは０．１１μｍに設定される。
【００８６】
ステップＳ２６では、ＰＣ３７での高周波強調処理に用いられるコンボリューションフィルタCFの設定を設定する。具体的な設定手順は、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０と同様である。ただし、２光子励起顕微鏡３０では、下式（２３）、（２４）で表される点像分布関数PSFDST、変調伝達関数MTFDSTを目標として設定し、下式（２５）を満たすようにコンボリューションフィルタCFを算出して設定する点が、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０と異なっている。即ち、２光子励起顕微鏡３０では、目標とする点像分布関数PSFDSTには、２光子蛍光像とカットオフ周波数が等しい広視野蛍光像の点像分布関数を設定する。
【数１２】
0005784393.tif 000013
【００８７】
なお、図１１は、２光子励起顕微鏡３０の強調処理前の点像分布関数PSF2pと強調処理後の目標とする点像分布関数PSFDSTを比較した図であり、点像分布関数PSF2p、PSFDSTは、それぞれ点線、破線で示されている。また、図１２は、２光子励起顕微鏡３０の強調処理前の変調伝達関数MTF2pと強調処理後の目標とする変調伝達関数MTFDSTを比較した図であり、変調伝達関数MTF2p、MTFDSTは、それぞれ点線、破線で示されている。
【００８８】
以下は、コンボリューションフィルタCFの係数の算出結果の一例である。
【数１３】
0005784393.tif 000014
【００８９】
このようにして算出されたコンボリューションフィルタCFを用いて画像データに対して強調処理を行うことで、図１１に例示されるように、目標とする点像分布関数PSFDSTに近似した点像分布関数PSFrを有する超解像画像の画像データを得ることができる（図１１の実線を参照）。
【００９０】
コンボリューションフィルタCFの設定を含む各種設定が完了すると、２光子励起顕微鏡３０による画像取得処理が行われ（ステップＳ２７）、取得された画像データに対するコンボリューションフィルタCFを使用した強調処理が行われ（ステップＳ２８）、コンボリューション処理により生成された超解像画像がモニタに表示される（ステップＳ２９）。そして、画像取得が終了するまでこれらの処理（ステップＳ２７からステップＳ２９）が繰り返し行われる（ステップＳ３０）ことで、超解像画像の動画表示が行われる。画像取得が終了すると、超解像画像の画像データを記憶装置２１に記憶して、処理を終了する（ステップＳ３１）。
【００９１】
以上、本実施例に係る２光子励起顕微鏡３０によっても、超解像成分が可視化された超解像画像を生成することが可能であり、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０と同様の効果を得ることができる。
【００９２】
なお、実施例２では、標本観察装置として２光子励起顕微鏡３０を例示したが、その他の多光子励起顕微鏡についても、図１０に例示したフローと同様の超解像画像生成処理により超解像画像を生成することができる。
【実施例３】
【００９３】
図１３は、本実施例に係る第２高調波（ＳＨＧ：Second Harmonic Generation）顕微鏡の構成を例示した図である。図１３に例示されるＳＨＧ顕微鏡４０は、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０と同様に、超解像成分が可視化された超解像画像を生成する標本観察装置である。ＳＨＧ顕微鏡４０は、励起光２である超短パルスレーザ光を射出する超短パルスレーザ光源４１と、標本１を走査するガルバノミラー４２と、変調制御信号に基づいてガルバノミラー４２を駆動するガルバノミラー駆動装置４３と、励起光２を標本１に集光させる対物レンズ４４と、標本１から発生するＳＨＧ光５を集光するレンズ４５と、標本１を透過した励起光２を遮断するバリアフィルタ４６と、標本１から発生するＳＨＧ光５（高次高調波）を検出して検出信号を生成するＰＭＴ検出器４７と、変調制御信号と検出信号から標本１の画像データを生成するＰＣ４８と、標本１の画像データを記憶する記憶装置４９と、標本１の画像データを表示するモニタ５０と、を含んでいる。なお、ＳＨＧ顕微鏡４０で検出するＳＨＧ光５は、蛍光と異なりコヒーレント光であるため、ＰＭＴ検出器４７は透過光路上に配置される。
【００９４】
ＳＨＧ顕微鏡４０は、ＰＣ４８が生成する画像データのナイキスト周波数が標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数よりも大きくなるように変調制御信号を生成し、且つ、生成した画像データに含まれる標本１上における励起光２の空間強度分布のカットオフ周波数を上回る高周波成分を強調する画像処理を行う点については、蛍光ＬＳＭ１０や２光子励起顕微鏡３０と同様である。即ち、ＳＨＧ顕微鏡４０においても、ＰＣ４８は、標本１の画像データを生成する画像生成手段であるとともに、変調制御信号を生成する変調制御信号生成手段であり、また、高周波成分を強調する画像処理手段である。なお、ナイキスト周波数とカットオフ周波数の比較は、実施例１と同様に、標本１と像面の間の投影倍率を考慮して行われる。具体的には、ナイキスト周波数とカットオフ周波数の一方を投影倍率で補正することに得られる換算量と他方とを比較する。
【００９５】
ＳＨＧ顕微鏡４０で実行される超解像画像生成処理のフローは、実施例２に係る２光子励起顕微鏡３０と同様であるので、詳細な説明は省略する。
以上、本実施例に係るＳＨＧ顕微鏡４０によっても、超解像成分が可視化された超解像画像を生成することが可能であり、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０や実施例２に係る２光子励起顕微鏡３０と同様の効果を得ることができる。
【００９６】
なお、実施例３では、標本観察装置としてＳＨＧ顕微鏡４０を例示したが、例えば、第３高調波（ＴＨＧ：Third Harmonic Generation）顕微鏡などの他の高次高調波顕微鏡についても、同様の超解像画像生成処理により超解像画像を生成することができる。
【実施例４】
【００９７】
図１４は、本実施例に係るコヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ：coherent anti-Stokes Raman scattering）顕微鏡の構成を例示した図である。図１４に例示されるＣＡＲＳ顕微鏡６０は、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０と同様に、超解像成分が可視化された超解像画像を生成する標本観察装置である。ＣＡＲＳ顕微鏡６０は、励起光であるｐｕｍｐ光６を射出するｐｕｍｐ光レーザ光源６１と、ｐｕｍｐ光６とは異なる波長の励起光であるＳｔｏｋｅｓ光７を射出するＳｔｏｋｅｓ光レーザ光源６２と、ミラー６３と、ｐｕｍｐ光６を透過しＳｔｏｋｅｓ光７を反射するダイクロイックミラー６４と、標本１を走査するガルバノミラー６５と、変調制御信号に基づいてガルバノミラー６５を駆動するガルバノミラー駆動装置６６と、異なる２つの波長成分を含む励起光（ｐｕｍｐ光６、Ｓｔｏｋｅｓ光７）を標本１に集光させる対物レンズ６７と、標本１からのラマン散乱光に含まれるアンチストークス成分であるＣＡＲＳ光８を集光するレンズ６８と、標本１を透過した励起光を遮断するバリアフィルタ６９と、ＣＡＲＳ光８を検出して検出信号を生成するＰＭＴ検出器７０と、変調制御信号と検出信号から標本１の画像データを生成するＰＣ７１と、標本１の画像データを記憶する記憶装置７２と、標本１の画像データを表示するモニタ７３と、を含んでいる。なお、ＣＡＲＳ顕微鏡６０で検出するＣＡＲＳ光８は、蛍光と異なりコヒーレント光であるため、ＰＭＴ検出器７０は透過光路上に配置される。
【００９８】
ＣＡＲＳ顕微鏡６０は、ｐｕｍｐ光６の２光子とＳｔｏｋｅｓ光７の１光子による３光子励起によりＣＡＲＳ光８を生じさせる。具体的には、ＣＡＲＳ顕微鏡６０の結像式は式（２７）、（２８）で表される。
【数１４】
0005784393.tif 000015
【００９９】
ここで、PSFCARS、MTFCARSは、それぞれＣＡＲＳ起顕微鏡６０の結像特性を示す点像分布関数、及びそのフーリエ変換である変調伝達関数である。PSFpump、MTFpumpは、それぞれ標本１上でのｐｕｍｐ光スポットの点像分布関数、及びそのフーリエ変換である変調伝達関数であり、ｐｕｍｐ光が標本面に集光する際の集光特性を示す。PSFStokes、MTFStokesは、それぞれ標本１上でのＳｔｏｋｅｓ光スポットの点像分布関数、及びそのフーリエ変換である変調伝達関数であり、Ｓｔｏｋｅｓ光が標本面に集光する際の集光特性を示す。rは、光軸からの距離であり、標本位置の空間座標を示す。fは、rの空間周波数である。
【０１００】
従って、取得されるＣＡＲＳ顕微鏡画像の空間強度分布のカットオフ周波数fCARSは、ｐｕｍｐ光６の波長λpumpをとし、Ｓｔｏｋｅｓ光７の波長λStokesをとすると、下式（２９）により表される。
【数１５】
0005784393.tif 000016
【０１０１】
ここで、ｐｕｍｐ光６のカットオフ周波数fpump、Ｓｔｏｋｅｓ光７のカットオフ周波数fStokesは、それぞれ式（３０）、（３１）で表される。
【数１６】
0005784393.tif 000017
【０１０２】
ＣＡＲＳ顕微鏡６０は、ＰＣ７１が生成する画像データのナイキスト周波数が標本１上におけるｐｕｍｐ光およびＳｔｏｋｅｓ光の空間強度分布のカットオフ周波数よりも大きくなるように変調制御信号を生成し、且つ、生成した画像データに含まれる標本１上におけるｐｕｍｐ光およびＳｔｏｋｅｓ光スポットの空間強度分布のカットオフ周波数を上回る高周波成分を強調する画像処理を行う点については、蛍光ＬＳＭ１０と同様である。即ち、ＣＡＲＳ顕微鏡６０でも、蛍光ＬＳＭ１０と同様に、ＰＣ７１は、標本１の画像データを生成する画像生成手段であるとともに、変調制御信号を生成する変調制御信号生成手段であり、また、高周波成分を強調する画像処理手段である。なお、ナイキスト周波数とカットオフ周波数の比較は、実施例１と同様に、標本１と像面の間の投影倍率を考慮して行われる。具体的には、ナイキスト周波数とカットオフ周波数の一方を投影倍率で補正することに得られる換算量と他方とを比較する。
【０１０３】
図１５は、本実施例に係るＣＡＲＳ顕微鏡で実行される超解像画像生成処理のフローを示す図である。以下、ＣＡＲＳ顕微鏡６０による超解像画像の生成方法について、図１５を参照しながら、具体的に説明する。
【０１０４】
超解像画像生成処理が開始されると、まず、ステップＳ４１では、利用者が観察に使用するｐｕｍｐ光６の波長λpump、Ｓｔｏｋｅｓ光７の波長λStokesを選択することで、ｐｕｍｐ光６の波長λpump、Ｓｔｏｋｅｓ光７の波長λStokesがＣＡＲＳ顕微鏡６０に設定される。例えば、ＣＡＲＳ顕微鏡６０で脂質を観察する場合であれば、ステップＳ４１では、ｐｕｍｐ光６の波長、Ｓｔｏｋｅｓ光７の波長は、それぞれ、λpump＝７１１ｎｍ、λStokes＝８３９ｎｍに設定される。
【０１０５】
ステップＳ４２では、利用者が対物レンズ６７を選択する。例えば、６０倍の倍率を有し、且つ、開口数が１．２である対物レンズが選択されて、ＣＡＲＳ顕微鏡６０にMob＝６０、NA＝１．２が設定される。
【０１０６】
ステップＳ４３では、標本１上における励起光の空間強度分布のカットオフ周波数fCARSを算出する。ここでは、式（２９）により、fCARS＝９．６μｍ−１と算出される。
なお、式（２９）から式（３１）で示されるように、標本１上における励起光の空間強度分布のカットオフ周波数fCARSは、励起光（ｐｕｍｐ光６、Ｓｔｏｋｅｓ光７）の波長λpump、λStokesと対物レンズ６７の射出側（標本１側）の開口数NAから算出される回折限界により定まる。
【０１０７】
ステップＳ４４では、ＣＡＲＳ顕微鏡６０で生成される画像データのナイキスト周波数を設定する。画像データのナイキスト周波数fNyquistは、超解像成分を記録するために、標本１上におけるｐｕｍｐ光およびＳｔｏｋｅｓ光の空間強度分布のカットオフ周波数よりも大きくなるように設定する。ここでは、例えば、下式（３２）により算出した画像データのナイキスト周波数fNyquist＝９．６μｍ−１を設定する。
【数１７】
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【０１０８】
ステップＳ４５では、ステップＳ４４で設定されたナイキスト周波数fNyquistに応じて、ガルバノミラー６５による標本１の走査のサンプリング間隔を設定する。具体的には、サンプリング間隔dpixは、ナイキスト周波数fNyquistがサンプリング周波数（fpix＝１／dpix）の１／２となるように、上述した式（１４）により算出された値に設定される。ここでは、サンプリング間隔dpixは０．０５２μｍに設定される。
【０１０９】
ステップＳ４６では、ＰＣ７１での高周波強調処理に用いられるコンボリューションフィルタCFの設定を設定する。具体的な設定手順は、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０と同様である。ただし、ＣＡＲＳ顕微鏡６０では、コンボリューションフィルタCFによる強調処理後に得られる目標とする点像分布関数PSFDSTとして、例えば、そのカットオフ周波数fDSTが下式（３３）を満たすような、仮想的な点像分布関数を設定する。
【数１８】
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【０１１０】
コンボリューションフィルタCFの設定を含む各種設定が完了すると、ＣＡＲＳ顕微鏡６０による画像取得処理が行われ（ステップＳ４７）、取得された画像データに対するコンボリューションフィルタCFを使用した強調処理が行われ（ステップＳ４８）、コンボリューション処理により生成された超解像画像がモニタに表示される（ステップＳ４９）。そして、画像取得が終了するまでこれらの処理（ステップＳ４７からステップＳ４９）が繰り返し行われることで、超解像画像の動画表示が行われる（ステップＳ５０）。画像取得が終了すると、超解像画像の画像データを記憶装置７２に記憶して（ステップＳ５１）、処理を終了する。
【０１１１】
以上、本実施例に係るＣＡＲＳ顕微鏡６０によっても、超解像成分が可視化された超解像画像を生成することが可能であり、実施例１に係る蛍光ＬＳＭ１０、実施例２に係る２光子励起顕微鏡３０、実施例３に係るＳＨＧ顕微鏡４０と同様の効果を得ることができる。
【０１１２】
なお、実施例４では、標本観察装置としてＣＡＲＳ顕微鏡６０を例示したが、例えば、異なる２つの波長成分を含む励起光で標本を励起して、標本における４光波混合により生じる発光を検出して標本を観察する顕微鏡についても、同様の超解像画像生成処理により超解像画像を生成することができる。
【符号の説明】
【０１１３】
１・・・標本
２・・・励起光
３・・・蛍光
４・・・２光子蛍光
５・・・ＳＨＧ光
６・・・ｐｕｍｐ光
７・・・Ｓｔｏｋｅｓ光
８・・・ＣＡＲＳ光
１０・・・蛍光ＬＳＭ
１１・・・レーザ光源
１２、３４、６４・・・ダイクロイックミラー
１３、３２、４２、６５・・・ガルバノミラー
１４、３３、４３、６６・・・ガルバノミラー駆動装置
１５、３５、４４、６７・・・対物レンズ
１６、１８、４５、６８・・・レンズ
１７・・・共焦点絞り
１９、３６、４７、７０・・・ＰＭＴ検出器
２０、３７、４８、７１・・・ＰＣ
２１、３８、４９、７２・・・記憶装置
２２、３９、５０、７３・・・モニタ
３０・・・２光子励起顕微鏡
３１、４１・・・超短パルスレーザ光源
４０・・・ＳＨＧ顕微鏡
４６、６９・・・バリアフィルタ
６０・・・ＣＡＲＳ顕微鏡
６１・・・ｐｕｍｐ光レーザ光源
６２・・・Ｓｔｏｋｅｓ光レーザ光源
６３・・・ミラー
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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