(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ：
（Ａ）配列番号２０、２２、もしくは２５のアミノ酸配列、又は、配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列を有し、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号２０、２２、もしくは２５のアミノ酸配列、又は配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列が、配列番号２４のアミノ酸配列である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１９もしくは２１の塩基配列、又は配列番号２３の少なくとも１６６位〜１３６８位からなる塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１９もしくは２１の塩基配列、又は配列番号２３の少なくとも１６６位〜１３６８位からなる塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記配列番号２３の少なくとも１６６位〜１３６８位からなる塩基配列が、配列番号２３の塩基配列である、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質：
（Ａ）配列番号２０、２２、もしくは２５のアミノ酸配列、又は配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列を有し、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号２０、２２、もしくは２５のアミノ酸配列、又は配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列が、配列番号２４のアミノ酸配列である、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のタンパク質と、マーカーペプチド、ペプチドタグ、分泌シグナルペプチド、及びこれらの一部から選ばれるペプチドとが結合した融合タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜４、及び請求項８のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９の組換えベクターを含む形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換細胞を培地に培養し、得られる培養物からキシラナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、キシラナーゼの製造方法。
【請求項１２】
前記組換えベクターは、請求項７に記載の融合タンパク質であって、分泌シグナルを含む融合タンパク質を発現することができ、かつ、前記形質転換細胞は前記融合タンパク質を分泌する能力を有し、キシラナーゼ活性を有する組換えタンパク質を培養上清から採取することを特徴とする、請求項１１に記載の組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項５もしくは６に記載のタンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質と、セルラーゼとを、キシランを含むバイオマス資源に反応させて糖を生成させる、糖液の製造方法。
【請求項１４】
前記反応を５０〜７５℃で行うことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の方法で製造された糖液又はその分画物を炭素源として含む培地で、目的物質を産生する微生物を培養し、目的物質を培養物中から採取する、目的物質の製造法。
【請求項１６】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム及びエシェリヒア・コリに属する微生物から選択される細菌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的物質がＬ−アミノ酸である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項５もしくは６に記載のタンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質を、キシランを含むバイオマス資源に反応させる、バイオマス資源の分解方法。
【請求項１９】
前記反応を５０〜７５℃で行うことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシラナーゼ及びそれをコードする遺伝子、並びにそれらの利用に関するものであり、詳しくは、バガス高分解環境であるバガス堆肥に存在する微生物群由来のキシラナーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子、並びにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、グルコースがβ−１,４−グリコシド結合でつながった高分子多糖である。従って、この結合を加水分解すれば、セルロースからグルコースが得られ、グルコースの供給源としてセルロースを有効に利用することができる。しかし、セルロースは難分解性の物質であり、セルロース系バイオマスの活用は実用にまでは至っていない。このセルロースを効率よく加水分解する反応を司るのがセルラーゼである。従って、セルラーゼの特性を改良したり、セルラーゼを効率よく生産することは、セルロース資源の有効活用に関わる技術の根幹をなすものということができ、従来から、微生物由来のセルラーゼ遺伝子の単離が行われている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、セルラーゼ遺伝子をフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）株から単離し、該セルラーゼ遺伝子を宿主微生物に導入し、発現させることによって目的とするセルラーゼを得ることが記載されている。また、特許文献２には、バチルス（Bacillus）属由来の耐熱性アルカリセルラーゼ遺伝子が記載されている。
【０００４】
また、セルロース系バイオマスは、キシランを主とするヘミセルロースやリグニンがセルロース繊維を取り巻いており、これらを除去することがセルラーゼによるセルロースの糖化効率を高めるために重要である。従来のセルロース系バイオマス糖化方法では、希硫酸などの化学物質による前処理により、リグニンやヘミセルロースを除去する試みが行われているが、こういった化学的前処理には、「糖の過分解が起こりやすい」、「ヘミセルロースを構成する糖類を利用することができない」、といった問題点がある。一方で、自然界においては、微生物の生産するマンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどのリグニン分解酵素や、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ペクチナーゼなどのヘミセルロース分解酵素がセルラーゼと共に作用することで、効率良くセルロース系バイオマスが分解されている。
【０００５】
セルロース糖化以外のバイオマスの有効利用方法のひとつとして、家畜糞便と混合・発酵することにより堆肥を作成するコンポスト化が知られている。堆肥では、排泄物中の尿素をはじめ、増殖した微生物菌体や分解された植物タンパク質に由来する窒素源が重要であり、セルロースなどの炭素源は、微生物増殖のエネルギー源などとして利用される。そのため、バイオマスのコンポスト化においては、該バイオマスを高効率で分解する微生物群が集積され、これらの微生物群は、該バイオマスの分解に適した分解酵素を持つことが期待される。
【０００６】
しかし、地球上に存在する微生物は、その99%の割合で、培養困難な難培養性微生物であると言われており、通常の寒天培地を使用する従来のスクリーニング方法では、使用した培地で生育可能なごく一部の微生物種から、目的の酵素や遺伝子をスクリーニングしているにすぎない。そのため、近年では、培養困難な微生物からも有用な酵素を見出すために、環境土壌等のサンプルから直接に全DNAを抽出し、ベクターにクローニングすることでDNAライブラリーを作製し、目的の遺伝子をスクリーニングするメタゲノム手法（メタゲノミクス）によるスクリーニングが行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−５６６６３号公報
【特許文献２】特開２０００−２１００８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、セルロース系バイオマスとして有用なサトウキビバガス等のバイオマス資源の糖化に有用なキシラナーゼ及びその遺伝子、並びにそれらの利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために、サトウキビバガスと牛糞便を混合し、約半年間発酵させたバガス堆肥中から全DNAを抽出し、該DNAのライブラリーを作製し、キシラナーゼ活性をもとにスクリーニングを行い、キシラナーゼ活性を有する組換え体を取得し、キシラナーゼ遺伝子を同定した。さらにこれらのキシラナーゼ遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された形質転換体を用いてキシラナーゼ活性を有する新規組換えタンパク質を製造し、該組換えキシラナーゼを、市販のバイオマス糖化酵素に添加することにより、市販酵素のみによるセルロース糖化率よりも、その糖化率が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ：
（Ａ）配列番号２０、２２、もしくは２５のアミノ酸配列、又は、配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列を有し、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号２０、２２、もしくは２５のアミノ酸配列、又は配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（２）前記配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列が、配列番号２４のアミノ酸配列である、前記ＤＮＡ。
（３）
下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである、前記ＤＮＡ：
（ａ）配列番号１９もしくは２１の塩基配列、又は配列番号２３の少なくとも１６６位〜１３６８位からなる塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１９もしくは２１の塩基配列、又は配列番号２３の少なくとも１６６位〜１３６８位からなる塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ、又は前記相補的な塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記配列番号２３の少なくとも１６６位〜１３６８位からなる塩基配列が、配列番号２３の塩基配列である、前記ＤＮＡ。
（５）下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質：
（Ａ）配列番号２０、２２、もしくは２５のアミノ酸配列、又は配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列を有し、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号２０、２２、もしくは２５のアミノ酸配列、又は配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（６）前記配列番号２４の少なくとも５６位〜４５５位からなるアミノ酸配列が、配列番号２４のアミノ酸配列である、前記タンパク質。
（７）前記タンパク質と、マーカーペプチド、ペプチドタグ、分泌シグナルペプチド、及びこれらの一部から選ばれるペプチドとが結合した融合タンパク質。
（８）前記のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（９）前記ＤＮＡを含む組換えベクター。
（１０）前記組換えベクターを含む形質転換細胞。
（１１）前記形質転換細胞を培地に培養し、得られる培養物からキシラナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、キシラナーゼの製造方法。
（１２）前記組換えベクターは、分泌シグナルを含む前記融合タンパク質を発現することができ、かつ、前記形質転換細胞は前記融合タンパク質を分泌する能力を有し、キシラナーゼ活性を有する組換えタンパク質を培養上清から採取することを特徴とする、前記組換えタンパク質の製造方法。
（１３）前記タンパク質又は融合タンパク質と、セルラーゼとを、キシランを含むバイオマス資源に反応させて糖を生成させる、糖液の製造方法。
（１４）前記反応を５０〜７５℃で行うことを特徴とする、前記糖液の製造方法。
（１５）前記方法で製造された糖液又はその分画物を炭素源として含む培地で、目的物質を産生する微生物を培養し、目的物質を培養物中から採取する、目的物質の製造法。
（１６）前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム及びエシェリヒア・コリに属する微生物から選択される細菌である、前記目的物質の方法。
（１７）前記目的物質がＬ−アミノ酸である、前記目的物質の方法。
（１８）前記タンパク質又は融合タンパク質を、キシランを含むバイオマス資源に反応させる、バイオマス資源の分解方法。
（１９）前記反応を５０〜７５℃で行うことを特徴とする、前記バイオマス資源の分解方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により提供されるバガス堆肥に由来する新規なキシラナーゼは、セルラーゼとの併用により、バガス等のバイオマス資源の分解効率を向上させることができることから、バイオマス資源からの糖生産に有用である。
特に、好ましい形態では、高い最適反応温度及び温度安定性を有しているので、高温での長時間の処理が必要なバガスの糖化には有用である。
また、本発明のＤＮＡは、前記キシラナーゼを製造するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】pH5におけるキシラナーゼによるバガス糖化率を示す図。縦軸は、キシラナーゼ非添加区(NC)に対する各キシラナーゼ添加反応区の相対糖化率を示す。「NC」は50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)、「P」はpPK4を導入したYDK010、「X11-1」はXyn11-1発現株、「X11-2」はXyn11-2発現株、「X11-5」はXyn11-5発現株の培養上清を各々、反応系へ添加したことを示す。「X14」はNS50014（Xyn14）、「X30」はNS50030（Xyn30）をそれぞれ示す（図２も同様）。
【図２】pH7におけるキシラナーゼによるバガス糖化率を示す図。
【図３】新規キシラナーゼ及び市販キシラナーゼの至適反応pHを示す図。縦軸は、最大の生成糖量を示したサンプルを1とした際の各pHでの比活性を示す。
【図４】新規キシラナーゼ及び市販キシラナーゼの至適反応温度を示す図。縦軸は、最大の生成糖量を示したサンプルを1とした際の各反応温度での比活性を示す。
【図５】新規キシラナーゼ及び市販キシラナーゼの短時間（5分間）での温度安定性を示す図。縦軸は、非熱処理酵素液を加えたサンプルの平均値を1とした際の各熱処理温度での比活性を示す。市販酵素Xyn14は35, 50, 70, 80℃で検討を行った。
【図６】新規キシラナーゼ及び市販キシラナーゼの長時間（16時間）での温度安定性を示す図。縦軸は、非熱処理酵素液を加えたサンプルの平均値を1とした際の各熱処理温度での比活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のタンパク質は、キシラナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「キシラナーゼ」ということがある）であり、本発明のＤＮＡは、該タンパク質をコードするＤＮＡ（以下「キシラナーゼ遺伝子」ということがある）である。尚、キシラナーゼは、キシラナーゼそれ自体であってもよく、キシラナーゼに他のペプチドが結合した融合タンパク質であってもよい。また、キシラナーゼ遺伝子は、キシラナーゼ又はキシラナーゼと他のペプチドとの融合タンパク質をコードする構造遺伝子であってもよく、該構造遺伝子にプロモーターやターミネーター等の発現調節配列が結合したものであってもよい。
【００１４】
キシラナーゼ活性とは、ヘミセルロース分子の骨格を作るキシロース糖間のβ−１，４−グリコシド結合を切断することにより、ヘミセルロースを分解する活性を意味する。ヘミセルロースにキシラナーゼを作用させるとその主成分であるキシランが分解され、キシロオリゴ糖及びキシロースが生成する。また、セルロース系バイオマス中のセルロース繊維を取り巻くヘミセルロースがキシラナーゼによって分解されると、セルロースはセルラーゼによって分解されやすくなる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞キシラナーゼ及びそれをコードするＤＮＡ
本発明のキシラナーゼ遺伝子は、バガス堆肥からメタゲノムクローニングによってキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして同定されたものである。これらのキシラナーゼ遺伝子の塩基配列を、配列番号19、21、及び23に示す。これらのキシラナーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号20、22及び24に示す。
【００１６】
本発明のキシラナーゼには、配列番号20、22、又は24のアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。これらのアミノ酸配列をSignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)へ入力し、シグナルペプチド予測を行った。その結果、配列番号24のアミノ酸配列では、55位のアミノ酸残基よりもN末端側の配列がシグナルペプチドであると予測された。そして、実施例に示すように、配列番号24の56位〜455位からなるペプチドと、Sec系又はTat系シグナルペプチドとを連結した融合タンパク質を、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）で発現させたところ、キシラナーゼ活性を示した。したがって、本発明のキシラナーゼには、配列番号24の少なくとも56位〜455位からなるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。また、配列番号20又は22のアミノ酸配列を有するペプチドと、Sec系又はTat系シグナルペプチドとを連結した融合タンパク質も、上記と同様にして発現させたところ、いずれもキシラナーゼ活性を示した。
【００１７】
配列番号22と24のアミノ酸配列は相同性が高く、これらの共通配列を配列番号25に示す。配列番号25の410アミノ酸残基中、336個が共通するアミノ酸残基である。また、配列番号25中、8〜188位では、181アミノ酸中173アミノ酸（95.6%）が同一アミノ酸である。配列番号25のアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のキシラナーゼに含まれる。
【００１８】
本発明のキシラナーゼは、配列番号20、22、もしくは25のアミノ酸配列、又は配列番号24の少なくとも56位〜455位からなるアミノ酸配列を有するタンパク質の保存的バリアント、すなわち、上記アミノ酸配列を有するタンパク質のホモログや人為的な改変体等であってもよい。すなわち、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質であってもよい。また、上記アミノ酸配列に含まれる第１番目のメチオニン（Met）は欠失していてもよい。
【００１９】
「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【００２０】
さらに、上記のような保存的変異を有するキシラナーゼは、配列番号20、22、又は、24のアミノ酸配列もしくは配列番号24の少なくとも56位〜455位からなるアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、キシラナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００２１】
本発明のキシラナーゼは、好ましい形態では下記の性質を有する。
（１）最適反応pH：５．５〜７．５
後述のXyn11-1、Xyn11-2、及びXyn11-5の最適反応pHは、各々７付近、７．０〜７．５付近．５．５〜７．５付近である。
（２）最適反応温度：６５℃〜８０℃
Xyn11-1、Xyn11-2、及びXyn11-5の最適反応温度は、各々６５℃付近、７０℃付近、７５−８０℃付近である。
（３）温度安定性：５０℃で約１６時間安定
Xyn11-1、Xyn11-2、及びXyn11-5は、５０℃で１６時間保持後に８０％以上の活性を維持する。特に、Xyn11-2、及びXyn11-5は、各々６５℃、７０℃で１６時間保持後に約６０％の活性を維持する。
【００２２】
本発明のキシラナーゼは、他のペプチドとの融合タンパク質であってもよい。他のペプチドとしては、マーカーペプチド（マーカータンパク質）、ペプチドタグ、及び分泌シグナルペプチド等が挙げられる。キシラナーゼに連結されるペプチドは一種だけでもよく、２又はそれ以上のペプチドであってもよい。尚、キシラナーゼがシグナルペプチドとの融合タンパク質の場合は、分泌可能な宿主細胞中で発現した後、シグナルペプチドが切断されてキシラナーゼ部分のみが細胞外に分泌され得る。
【００２３】
マーカーペプチドとしては、マーカーとして機能し得るペプチドであれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のFc領域、HRP、GFPなどを具体的に挙げることができる。また、ペプチドタグとしては、特に制限されないが、Mycタグ、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。また、分泌シグナルペプチドとしては、キシラナーゼ遺伝子を発現させる宿主で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、コリネ型細菌を宿主として用いる場合は、コリネ型細菌由来のSec系及びTat系分泌経路の分泌シグナルペプチド（WO01/23591、WO2005/103278参照）が挙げられる。融合タンパク質は、常法により作製することができる。
【００２４】
例えばHisタグは、Ni-NTAとHisタグの親和性を利用したキシラナーゼ活性を有するタンパク質等の精製等や、高濃度のキシラナーゼ活性を有するタンパク質等を含有する培養上清の生産に有用である。
【００２５】
本発明のＤＮＡは、上記のキシラナーゼをコードする。具体的には、配列番号20、22、もしくは、25のアミノ酸配列、又は配列番号24の少なくとも56位〜455位からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。また、これらのアミノ酸配列を有するタンパク質の保存的バリアントをコードするＤＮＡであってもよい。
より具体的には、配列番号19、もしくは21の塩基配列、又は配列番号23の少なくとも166位〜1368位からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。配列番号23の少なくとも166位〜1368位からなる塩基配列としては、配列番号23の塩基配列が挙げられる。本発明のＤＮＡは、これらのものに限定されず、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他の等価のコドンに置換したものであってもよい。
【００２６】
また、本発明のＤＮＡには、配列番号19、もしくは21の塩基配列、又は配列番号23の少なくとも166位〜1368位からなる塩基配列の相補的な塩基配列を有するプローブ、又は前記相補的な塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、例えば、42℃でのハイブリダイゼーション、及び1×SSC、0.1%のSDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理を挙げることができ、65℃でのハイブリダイゼーション、及び0.1×SSC、0.1%のSDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２７】
ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００２８】
本発明のＤＮＡは、本明細書に開示されたＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばサトウキビバガスを種々の動物糞便と混合することにより作製されたバガス堆肥、またはバガス堆肥を施肥した耕作地やバガス堆肥保存場所などの土壌等の全DNAから、PCR又はハイブリダイゼーションなど公知の方法により調製することができる。その他、前記ＤＮＡ情報に基づいて化学合成によっても調製することができる。
【００２９】
また、キシラナーゼ遺伝子には、微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）を含む場合があるが、このような変異を有するキシラナーゼ遺伝子も、本発明のＤＮＡに含まれる。また、前記のキシラナーゼの保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むようにキシラナーゼ遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。また、そのような遺伝子は、公知の突然変異手段、例えば市販の突然変異誘発キットを用いることによっても取得することができる。
【００３０】
キシラナーゼと他のペプチドとの融合タンパク質をコードするＤＮＡは、キシラナーゼをコードするＤＮＡと、他のペプチドをコードするＤＮＡとを連結することによって構築することができる。得られたＤＮＡを発現させることによって、融合タンパク質を製造すすることができる。
【００３１】
＜２＞組換えベクター
本発明の組換えベクターは、キシラナーゼ遺伝子を含む組換えベクターである。キシラナーゼ遺伝子は、キシラナーゼのみをコードするＤＮＡであってもよく、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。組換えベクターは、キシラナーゼ遺伝子を含む限り特に制限されず、任意のベクターにキシラナーゼ遺伝子を挿入することによって構築することができる。
【００３２】
ベクターは、使用する宿主に応じて適宜選択することができる。宿主としては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、及びコリネ型細菌が挙げられる。コリネ型細菌のベクターとしては、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミド、例えば、特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-67679号公報に記載のpAM330；特開昭58-77895号公報に記載のpHM1519；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭５7-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11等を挙げることができる。
エシェリヒア・コリで発現可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等を用いることが出来る。
【００３３】
ベクターとしては、特に制限されないが、キシラナーゼを宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むものが好ましい。そのような発現系としては、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００３４】
また、発現系は、分泌シグナルを含む分泌発現系であってもよい。コリネ型細菌の分泌発現系としては、細胞外でタンパク質がフォールディングされるGeneral secretion pathway (Sec系)（WO01/23591参照）と、細胞内でタンパク質がフォールディングされて分泌されるTwin-arginine translocation pathway (Tat系) （WO2005/103278参照）が挙げられる。
【００３５】
＜３＞形質転換細胞
本発明の形質転換細胞は、本発明のDNA又は組換えベクターを含む。形質転換細胞とは、本発明のDNA又は組換えベクターを宿主細胞に導入することによって得られる細胞を意味し、導入の手法は制限されない。
【００３６】
宿主細胞としては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア・コリ属細菌、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌、ストレプトミセス属細菌等の放線菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等の原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラS2、スポドプテラSf9、カイコ培養細胞等の昆虫細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００３７】
宿主細胞としては、特にエシェリヒア・コリ、コリネ型細菌、および放線菌を含む種々の微生物細胞が挙げられる。エシェリヒア・コリには、一般にクローニングや異種タンパク質の発現によく利用される菌株、例えば、HB101、MC1061、JM109、CJ236、MV1184、及びそれらの誘導体等が含まれる。コリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981))、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点には、これまでにタンパク質の分泌に好適とされてきたカビ、酵母やバチルス属細菌と比べて本来的に菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、目的タンパク質を分泌生産した場合にその精製過程が簡略化、省略化できること、また糖、アンモニアや無機塩等を含む単純な培地で容易に生育するため、培地代や培養方法、培養生産性の点で優れていることが含まれる。
【００３８】
このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００３９】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060，ATCC13869，FERM BP-734
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354
【００４０】
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869よりストレプトマイシン(Sm)耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(WO 02/081694参照)は、その親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高いため、宿主菌として好適である。
【００４１】
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された目的タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、AJ12036の細胞表層タンパク質（PS2）破壊株であるコリネバクテリウム・グルタミカムYDK010株が挙げられる（WO 01/23491参照）。
【００４２】
また、枯草菌、酵母、麹菌、放線菌等のタンパク質分泌能を利用して、キシラナーゼを培地中に生産させてもよい。
【００４３】
組換え発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等、種々のものが挙げられる。コリネ型細菌への導入方法としては、具体的には例えば、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、エレクトロポレーション法(Bio/Technology, 7, 1067-1070)(1989))等を使用することができるが、これらに限定されない。
【００４４】
＜３＞キシラナーゼの製造法
上記のような形質転換細胞を培地に培養し、得られる培養物からキシラナーゼ活性を有するタンパク質を採取することにより、キシラナーゼを製造することができる。
【００４５】
形質転換体を培養するための培地は公知であり、例えば、E. coliの培養にはLB培地などの栄養培地や、M9培地などの最少培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加した培地を用いることができる。形質転換体は宿主に応じて、通常、16〜42℃、好ましくは25〜37℃で5〜168時間、好ましくは8〜72時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌を行ってもよく、通気を行ってもよい。コリネ型細菌を発現宿主として選択する場合は、培地としては、例えばCM2G培地等を用いることができる。また、コリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産における培養条件や、その他Sec系、Tat系のシグナルペプチドを用いたタンパク質の製造法に記載の条件を用いることが出来る（WO01/23591、WO2005/103278参照）。また、キシラナーゼ発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
【００４６】
培養物からキシラナーゼを採取する方法としては、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。キシラナーゼが分泌生産された場合は、培養物の培養上清をそのまま使用することもできる。
【００４７】
培養上清からキシラナーゼを精製又は単離するには、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等の溶媒沈殿、透析、限外濾過、酸抽出、及び各種クロマトグラフィー、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法が挙げられ、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。また、上記アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体としては、例えば、キシラナーゼに対する抗体を結合させた担体や、キシラナーゼにペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合した担体が挙げられる。また、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法等等も用いることができる。キシラナーゼの精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００４８】
キシラナーゼを細胞内に蓄積させた場合は、形質転換細胞を破砕し、破砕物の遠心上清から上記と同様にしてキシラナーゼを精製又は単離することができる。例えば、形質転換体の培養終了後、遠心により集菌した菌体を菌体破砕用バッファー（20〜100 mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA）に懸濁し、超音波破砕をBranson MODEL-Sonifier 250のマイクロチップを用い、output control 7,duty cycle 50%で約10分間行うことにより菌体を破砕することができる。この破砕処理液を12000rpmで10分間遠心して上清を得ることができる。また、前記遠心後の沈殿について必要に応じて塩酸グアニジウムまたは尿素などで可溶化したのち更に精製することもできる。
【００４９】
得られたキシラナーゼの酵素活性は、キシランを含むバイオマス、例えばバガスを基質とした糖化試験により確認することが出来る。また精製された酵素の活性測定は、特開2007-54050、特許2759209号、Bailey et al. J. Biotech. 23(1992) 257-270記載の方法によって測定することが出来る。
【００５０】
＜４＞糖液の製造方法
キシラナーゼを、キシランを含むバイオマス資源に反応させることにより、バイオマス資源を分解することができる。また、キシラナーゼとセルラーゼをキシランを含むバイオマス資源に反応させて糖を生成させることにより、糖液を得ることができる。本発明のキシラナーゼはヘミセルラーゼの一種であり、本発明のキシラナーゼに加えて、別のキシラナーゼ又はヘミセルラーゼを用いてもよい。
【００５１】
セルラーゼとは、(1→4)-β-グリコシド結合の加水分解に関与する酵素で、非結晶セルロースを分子内部から切断するエンドグルカナーゼ（EC3.2.1.4）、結晶セルロースの末端から分解し、セロビオースを遊離するエキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ）（EC3.2.1.91）、及び、セロビオース及びセロオリゴ糖の末端からグルコースを生成するβ−グルコシダーゼ（EC3.2.1.21）がある。市販のセルラーゼは、前記活性を含むセルラーゼの混合物として販売されており、Aspergillus niger由来、Trichoderma reesei由来の酵素が利用される場合が多い。Novozymes社のCellic Ctec、Celluclast（Novozymes A/S）、Novozyme188（Novozymes A/S）、及びGenencor社のAccelleraseがコストパフォーマンスに優れ代表的な市販糖化酵素である。その他の市販酵素としては、明治製菓（株）のメイセラーゼなどが挙げられる。セルラーゼの活性測定は、Irwin et al. Biotechnol Bioeng. 42 (1993) 1002-1013を参考に測定できる。
【００５２】
ヘミセルラーゼとは、ヘミセルロースに含まれるグリコシド結合の加水分解に関与する酵素の総称である。ヘミセルロースとは、陸上植物細胞の細胞壁を構成する多糖類のうち、セルロースとペクチン以外のものであり、ヘミセルロース成分にはキシランが多く含まれており、ヘミセルラーゼの主成分は、エンド-1,4-β-キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）、及びβ-1,4-キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）等であるが、その他のグルコシド結合加水分解酵素も含まれている。市販のヘミセルラーゼとしては、Novozymes社のCellic Htecが挙げられる。Genencor社や天野エンザイム（株）などからも入手できる。
【００５３】
バイオマス資源とは、植物や藻類が生産する、ヘミセルロース成分を含むセルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスを包含し、そのようなバイオマスには、例えば、バガス、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、大豆粕、大豆オカラ、コーヒー粕、コメ糠等が含まれる。本発明においてはバガスを用いることが望ましい。バガスは、サトウキビを搾汁後、残渣として得られる。
【００５４】
バイオマス資源の分解または糖化のための手法としては、公知の方法を用いることが出来る。例えば用いられるバイオマス資源は、乾燥物でも、また湿潤物でもよいが、処理効率を高めるために予め100-1000μmサイズに粉砕されていることが好ましい。この粉砕はボールミル、振動ミル、カッターミル、ハンマーミル等の機械を用いて行うことが出来る。粉砕したバイオマス資源を水性媒体中に懸濁し、本発明のキシラナーゼとセルラーゼを加え、攪拌しながら加温して、バイオマス資源を分解または糖化することが出来る。キシラナーゼとセルラーゼは、バイオマス資源に同時に加えてもよく、キシラナーゼをバイオ資源に加えて反応させた後にセルラーゼを加えて反応させてもよい。
上記方法において、反応液のpHおよび温度は、キシラナーゼ及びセルラーゼが失活しない範囲であればよいが、本発明のキシラナーゼは、前記のとおり、最適反応温度が高く、温度安定性にも優れているため、最適反応温度又はその付近の温度で反応を行うことが好ましい。例えば、一般的に常圧で反応を行う限り、温度は5-95℃、好ましくは25-80℃、より好ましくは50〜75℃、50〜70℃、50〜65℃、又は50〜55℃、pHは1-11好ましくは4-9の範囲でよい。例えば、セルラーゼとしてNovozymes社のCellic Ctecを用いる場合は、35〜55℃、pH4.5〜6.0の条件が挙げられる。酵素量としては、0.1〜0.5%(w/w TS, total solid)が挙げられる。反応時間は、酵素量等により適宜設定することができる。
本発明のキシラナーゼの酵素量は特に制限されず、予備実験を行う等して適宜設定すればよい。
【００５５】
キシラナーゼとセルラーゼは、バイオマス資源に同時に作用させてもよく、キシラナーゼを作用させた後にセルラーゼを作用させてもよい。また、本発明のキシラナーゼに加えて、別のキシラナーゼ又はヘミセルラーゼを用いてもよい。反応中に、本発明のキシラナーゼ、セルラーゼ及びヘミセルラーゼのいずれか１種又は２種以上を、追添してもよい。
【００５６】
上記のようにしてバイオマス資源を分解すると、主としてグルコースが生成するが、キシロース、マンノース、アラビノース等の糖も生成する。得られた糖液は、用途に応じて、さらに化学反応又は酵素反応によって異性化又は分解させてもよい。
得られた糖液は、用途に応じて、そのまま使用することもできるし、水分を除去して乾燥物として使用することもできる。また、糖液中の成分は適宜分画して使用してもよい。分画物には、粗精製物及び精製物も含まれる。精製物としてはグルコースが挙げられる。
【００５７】
＜５＞目的物質の製造方法
前記方法により得られた糖液又はその分画物は、例えば、発酵法により目的物質の製造における炭素源として用いることができる。目的物質としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールが挙げられる。その他、酢酸、乳酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、核酸が挙げられる。
【００５８】
特にＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンが挙げられる。
【００５９】
また、本発明のＬ−アミノ酸には上記アミノ酸を出発物質として得られるＬ−アミノ酸誘導体も含まれ、GABA、p-ヒドロキシ-D-フェニルグリシン、DOPA、コハク酸、リンゴ酸、ピルビン酸が挙げられる。
【００６０】
核酸としては、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。プリンヌクレオシドには、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどが含まれ、プリンヌクレオチドには、プリンヌクレオシドの５'−燐酸エステル、例えばイノシン酸（イノシン−５'−リン酸。以下「IMP」ともいう）、キサンチル酸（キサントシン−５'−リン酸。以下「XMP」ともいう）、グアニル酸（グアノシン−５'−モノリン酸。以下「GMP」ともいう）、アデニル酸（アデノシン−５'−モノリン酸。以下「AMP」ともいう）などが含まれる。また、本発明の核酸には、上記核酸を出発物質として得られる核酸誘導体も含まれ、Ara-U（ウラシルアラビノシド）、ZVA（Z-バラシクロビル）等が挙げられる。
本発明により製造される目的物質は、１種でもよく、２種又はそれ以上であってもよい。
【００６１】
＜５−１＞目的物質の製造に用いることが出来る微生物
目的物質の製造に用いる微生物は、上記方法で得られる糖、例えばグルコースを資化することができ、目的物質生産能を有し、液体培地で培養したときに培地又は微生物細胞中に目的物質を蓄積させることができる微生物であれば、特に制限されない。蓄積する目的物質の量は、培地から回収できる程度に蓄積できればいずれでもよい。
【００６２】
本発明に用いる微生物又はそれを育種するための親株としては、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物や、コリネ型細菌等を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌が挙げられ、またその他の微生物としては、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属等に属する酵母などが挙げられる。
【００６３】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所  ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America）。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている（http://www.atcc.org/参照）。
【００６４】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００６５】
コリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌に分類される微生物が利用できる。なお、コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在はコリネバクテリウム属細菌として統合された細菌（Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００６６】
このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシェンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００６７】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【００６８】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることができる。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418株は、1989年１月５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００６９】
バチルス属細菌を用いるときは、バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス168 Marburg（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスPY79（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,616,206号）等が挙げられる。
【００７０】
以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸又は核酸生産能を付与する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００７１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ-メチル-Ｎ’-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００７２】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むDNA断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレット第95/34672号参照）。
【００７３】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、国際公開第00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００７４】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００７５】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001-346578号）等が挙げられる。
【００７６】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P. et al. 1987. J. Mol. Biol. 194:59-69; 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００７７】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（国際公開第98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００７８】
このようにＬ−スレオニンによるフィ-ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu-ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００７９】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開第95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許第877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開第99/18228号パンフレット、欧州出願公開第1092776号明細書）が挙げられる。
【００８０】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Livshits, V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154:123-135)、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００８１】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., 1978. Genetika (in Russian), 14: 947-956)、E. coli VL643及びVL2055 (欧州特許出願公開第1149911号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００８３】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００８４】
エシェリヒア・コリのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号337〜2,799に位置し、GenBank accession No. AAC73113にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号2,801〜3,733に位置し、GenBank accession No. AAC73114にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号3,734〜5,020に位置し、GenBank accession No. AAC73115にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。これら3つの遺伝子は、リーダーペプチドをコードするthrL遺伝子の下流に、thrLABCからなるスレオニンオペロンとしてコードされている。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去することが有効である(国際公開第2005/049808号、国際公開第2003/097839号)。
【００８５】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００８６】
rhtA遺伝子は、ホモセリン及びスレオニンに耐性を与える遺伝子（rht: resistant to threonine/homoserine）として取得されたGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号848,433〜849,320（相補鎖）に位置し、GenBank accession No. AAC73900にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。また、rthAの発現を向上させるrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(Livshits, V. A. et al. 2003. Res Microbiol. 154:123-135、欧州特許出願公開第1013765号)。
【００８７】
エシェリヒア・コリのasd遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号3,571,798〜 3,572,901（相補鎖）に位置し、GenBank accession No. AAC76458にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5: 185-189.参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００８８】
また、エシェリヒア・コリのaspC遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号983,742〜984,932（相補鎖）に位置し、GenBank accession No. AAC74014にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子であり、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００８９】
Ｌ−リジン生産菌
以下、Ｌ−リジン生産菌及びその構築方法を例として示す。
例えば、Ｌ−リジン生産能を有する株としては、Ｌ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、「AEC」と略記することがある。）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産菌として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000-189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。
【００９０】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、または発現調節配列を改変することによって達成できる。
【００９１】
遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えばgapA遺伝子を含むDNA断片を、宿主細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを細菌に導入して形質転換すればよい。
【００９２】
遺伝子のコピー数を高めることは、上述のような遺伝子を細菌のゲノムDNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌のゲノムDNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、ゲノム上に存在するgapA遺伝子の横に、それぞれの遺伝子をタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはintegrationベクターを用いて達成することが出来る。
【００９３】
あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。ゲノム上に遺伝子が転移したことの確認は、遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００９４】
さらに、遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載した方法で、ゲノムDNA上またはプラスミド上の遺伝子の各々のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、各遺伝子の−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけること、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、gapA遺伝子のプロモーター領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev. 1995. 1:105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変により遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することが出来る。
【００９５】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、Ｌ−リジン排出活性を有するタンパク質をコードするybjE遺伝子(WO2005/073390)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gdhA)( Valle F. et al. 1983. Gene 23:199-209)、または、これらの任意の組み合わせの遺伝子の発現レベルが増大していてもよい。カッコ内は、それらの遺伝子の略記号である。
【００９６】
エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型アスパルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。
【００９７】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするDNAとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするDNAが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型DNAはPCRなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００９８】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。同プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００９９】
Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【０１００】
リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい。両遺伝子の発現低下は、WO2006/078039号パンフレットに記載の方法に従って行うことができる。
【０１０１】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Wang, J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54: 9405-9410; Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 594-602; Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272: 8611-8617; Wente, S. R. and Schachman, H. K. 1991. J. Biol. Chem. 266: 20833-20839）。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、又はトランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【０１０２】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. 2002. Bacteriol. 184: 5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【０１０３】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E. coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【０１０４】
pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。
【０１０５】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素の遺伝子発現を増強する手法、酵素活性を低下させる方法は、その他のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする遺伝子についても同様に適用することができる。
【０１０６】
Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌としては、AEC耐性変異株（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）株など：特公昭56-1914号公報、特公昭56-1915号公報、特公昭57-14157号公報、特公昭57-14158号公報、特公昭57-30474号公報、特公昭58-10075号公報、特公昭59-4993号公報、特公昭61-35840号公報、特公昭62-24074号公報、特公昭62-36673号公報、特公平5-11958号公報、特公平7-112437号公報、特公平7-112438号公報参照）；その生育にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号公報、特公昭56-6499号公報参照）；AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号明細書参照）；ＤＬ−α-アミノ-ε-カプロラクタム、α-アミノ-ラウリルラクタム、アスパラギン酸-アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ-ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株；オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号公報、特開昭50-31093号公報、特開昭52-102498号公報、特開昭53-9394号公報、特開昭53-86089号公報、特開昭55-9783号公報、特開昭55-9759号公報、特開昭56-32995号公報、特開昭56-39778号公報、特公昭53-43591号公報、特公昭53-1833号公報）；イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784号公報、特開昭56-8692号公報）；フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号公報、特開昭53-86090号公報）；エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997号明細書）などが挙げられる。
【０１０７】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (国際公開第0127307号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ-２-チエニルアラニン、３-ヒドロキシロイシン、４-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、国際公開第96/06926号に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (欧州特許出願公開第1239041号)が挙げられる。
【０１１０】
コリネ型細菌のＬ−イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【０１１１】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945、ロシア特許第2003677号)、E. coli 80株 (VKPM B-7270、ロシア特許第2119536号)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (欧州特許出願公開第1085087号)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【０１１３】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【０１１４】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(欧州特許出願公開第1016710号)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【０１１５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC＋ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K-12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC＋ (VKPM B-8961) が得られた。
【０１１６】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。
【０１１７】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、欧州特許出願公開第1078989号、欧州特許出願公開第955368号及び欧州特許出願公開第952221号に開示されたものが挙げられる。
【０１１８】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【０１１９】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【０１２０】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【０１２１】
また、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したコリネ型細菌としては、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムL30-2株（特開2006-340603号明細書）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP-4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムL30-2株（特開2006-340603号）
【０１２２】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5,908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【０１２３】
パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【０１２４】
また、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417が付与され、2004年2月26日に上記の産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【０１２５】
さらに、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【０１２６】
さらにコリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、メカノセンシティブチャンネル（mechanosensitive channel）をコードするyggB遺伝子を増幅する方法（国際公開WO2006/070944号）、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である。yggB遺伝子は、GenBank Accession No. NC_003450で登録されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 13032株のゲノム配列上の塩基番号1,337,692〜1,336,091（相補鎖）に位置し、NCgl1221とも呼ばれるGenBank accession No. NP_600492にて登録されている膜タンパク質をコードする遺伝子である。
【０１２７】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【０１２８】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(国際公開03/044191号)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473号及び2003/0157667、国際公開03/044192号)。
【０１２９】
コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したコリネバクテリウム・グルタミカBPS-13株 (FERM BP-1777, K77 (FERM BP-2062) 及び K78 (FERM BP-2063)（欧州特許公開公報331145号、特開平 02-303495号）、チロシン要求性株（特開平05-049489）等を使用することができる。
【０１３０】
また、フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、Ｌ−トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB, mtrや、Ｌ−チロシンの取り込み遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくＬ−フェニルアラニンを生産する菌株を取得することができる（EP1484410）。
【０１３１】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473及び2003/0157667)。
【０１３２】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ(aroG)、３-デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５-エノール酸ピルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（chorismate mutase/prephenate dehydrogenase (CM/PDH) ）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ、３-デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５-エノール酸ピルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (国際公開94/08031号)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【０１３３】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(国際公開2005/103275号)。
【０１３４】
コリネ型細菌としてはサルフアグアニジンに耐性株であるコリネバクテリウム・グルタミクムAJ12118（FERM BP-478  特許01681002号）、トリプトファンオペロンが導入されたコリネ型細菌（特開昭63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開01994749号公報）を用いることができる。
【０１３５】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (欧州特許公開公報1,172,433号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (欧州特許公開公報1,239,041号)が挙げられる。
【０１３７】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【０１３８】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315号)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2,001,112,869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (欧州特許公開公報1,170,358号)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(欧州特許公開公報1,170,361号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【０１４０】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(国際公開96/06926号)を親株として用いることができる。
【０１４１】
コリネ型細菌のＬ−バリン生産菌としては、例えば、Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる。Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、ilvBNCオペロンによりコードされる酵素、すなわちilvBNによりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼやivlCによりコードされるイソメロリダクターゼ(国際公開00/50624号)が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン及び/又はＬ−イソロイシン及び/又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーションを解除することが望ましい。
【０１４２】
Ｌ−バリン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する、少なくとも１種の酵素の活性を低下あるいは欠損させることにより行ってもよい。例えば、Ｌ−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやD-パントセナート合成に関与する酵素の活性を低下させることが考えられる（国際公開00/50624号）。
【０１４３】
Ｌ−バリン生産能を付与する別の方法として、アミノ酸アナログなどへの耐性を付与する方法も挙げられる。
例えば、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニン要求性，ならびにＤ-リボ-ス，プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し，かつＬ−バリン生産能を有する変異株（FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034） や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314) 、更には酢酸を唯一の炭素源とする培地でＬ−バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ(フルオロピルビン酸等)に感受性を有する変異株（FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号）が挙げられる。
【０１４４】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６-ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【０１４５】
コリネ型細菌のＬ−イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【０１４６】
Ｌ−メチオニン生産菌
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−スレオニン要求株、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられるが、これらに限定されない(特開2000-139471号)。さらに、メチオニンリプレッサーを欠損した株や、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ-シンテースなどのＬ−メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開2000-139471号)。
【０１４７】
次に、微生物に核酸生産能を付与する方法と核酸生産菌について例示する。
核酸生産能を有する細菌微生物は、上記のような細菌微生物に、例えば、プリンヌクレオシド要求性、又はさらにプリンアナログ等の薬剤に対する耐性を付与することにより、取得することが出来る（特公昭３８−２３０９９、特公昭５４−１７０３３、特公昭５５−４５１９９、特公昭５７−１４１６０、特公昭５７−４１９１５、特公昭５９−４２８９５参照）。例えば、栄養要求性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）、またはＥＭＳ(エタンメタンスルフォネート)等の通常の変異処理に用いられている変異剤による処理によって取得することが出来る。
【０１４８】
プリンヌクレオシドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスKMBS16株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするpurR遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするpurA遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスtrpC2株（168 Marburg）の誘導体である（特開2004-242610、US2004166575A1）。また、バチルス・ズブチリス菌株AJ3772（FERM P-2555）（特開昭62-014794）等を使用することもできる。
【０１４９】
グアノシン生産能を有するバチルス属細菌としては、ＩＭＰ脱水素酵素の活性が上昇したバチルス属細菌（特開平3-58787）、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込まれているベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌（特公平4-28357）等が挙げられる。
【０１５０】
またプリンヌクレオチドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５'−グアニル酸（グアノシン−５'−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる（特公昭５６−１２４３８号公報）。
【０１５１】
また、キサンチル酸生産菌は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammmoniagenes）を中心とするコリネ型細菌の育種に用いたられる方法を使用して構築することができる。例えば、PRPP amidotransferaseを強化株（特開平8-168383）、脂肪族アミノ酸耐性株（特開平4-262790）、デヒドロプロリン耐性株（韓国特許公開公報2003-56490）を取得することによって、キサンチル酸生産菌を構築することができる。
【０１５２】
また、プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌を育種する方法として、以下の方法が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関与する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細胞内での活性を上昇させる方法が挙げられる。該酵素の細胞内での活性は、バチルス属細菌の非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌よりも上昇させることが好ましい。「活性が上昇する」とは、例えば、細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。例えば、前記酵素の遺伝子の発現量を上昇させることにより活性を上昇させることができる。前記プリン生合成に関与する酵素としては、たとえばホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ（PRPP synthetase  [EC:2.7.6.1]）などが挙げられる
【０１５３】
ペントースリン酸系に取り込まれたグルコースなどの糖源が代謝により生成したカタボライトの一部は、リブロース−５−リン酸を経由して、リボース−５−リン酸となる。生合成されたリボース−５−リン酸より、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成の不可欠な前駆物質であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）が生成される。具体的には、リボース−５−リン酸は、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼによりＰＲＰＰに転換される。したがって、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇するように改変することにより、バチルス属細菌にプリン系物質生産能を付与又は増強することができる。
【０１５４】
「ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇する」とは、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性は例えば、Switzer等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11）、Roth等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17）により、測定することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇したバチルス属細菌は、例えば、特開2004-242610号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。
【０１５５】
一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成に不可欠な前駆物質であるPRPPが生成されると、その一部は、プリン生合成に関与する酵素群によりプリンヌクレオチド、プリンヌクレオシドへと変換される。そのような酵素群をコードする遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのプリンオペロン、具体的にはpurEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purDオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87）（現在では、purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002。GenBank Accession No.NC_000964）、およびエシェリヒア・コリのpurレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。
【０１５６】
したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与又は増強することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。
【０１５７】
プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。
【０１５８】
プリンオペロンの発現量を増大させる第２の方法として、プリンオペロン固有のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することや、固有のプロモーターの-35、-10領域をコンセンサス配列に置換することが挙げられる。
【０１５９】
例えば、バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）では、プリンオペロンの-35配列はコンセンサス配列（TTGACA）であるが、-10配列はTAAGATであり、コンセンサス配列TATAATとは異なっている（Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287）。したがって、-10配列（TAAGAT）をコンセンサス配列にすること、あるいはコンセンサス配列に近づけ、TATAAT、またはTATGAT、もしくはTAAAATとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。
【０１６０】
プリンオペロンの発現量を増大させる第３の方法として、プリンオペロンのリプレッサーの発現量を低下させる方法も挙げられる（USP6,284,495号）。「プリンオペロンのリプレッサーの発現」とは、プリンオペロン遺伝子の転写、及び転写産物の翻訳の両方を含む。また、「発現量を低下させる」とは、発現量が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における発現量よりも低いこと、及び、発現が実質的に消失していることを含む。
【０１６１】
プリンペオペロンのリプレッサー（プリンリプレッサー）の発現量を低下させるためには、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射またはＮＴＧもしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、プリンリプレッサーの発現量が低下した変異株を選択する方法を採用することができる。
【０１６２】
また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202）により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺伝子（purR；GenBank Accession NC_000964（コード領域は塩基番号54439〜55293）を、正常に機能しない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ということがある）で置換することによって得ることができる。
【０１６３】
さらに、プリン系物質の細胞内への取り込みを弱化することによっても、プリン系物質生産能を強化することができる。例えば、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。
【０１６４】
さらに、プリンヌクレオシドを製造する場合には、プリンヌクレオシド生産能を増強させるためにプリン系物質を分解する酵素の活性を低下させてもよい。このような酵素として、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。
【０１６５】
PRPPから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドに変換される。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。
【０１６６】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の低下は、具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子とpupG遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明のバチルス属細菌は、上記のようなdeoD遺伝子とpupG遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。deoD遺伝子、pupG遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子（deoD;GenBank Accession No. NC_000964(コード領域は2134672-2135370), pupG;GenBank Accession No. NC_000964(コード領域は2445610-2446422)が利用できる。
【０１６７】
また、プリン系物質生産能を増強させるために、サクシニル−AMPシンターゼの活性を低下させてもよい。サクシニル−AMPシンターゼをコードする遺伝子としては、purA遺伝子が挙げられる。purA遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_000964（コード領域は相補鎖の塩基番号4153460-4155749）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。
【０１６８】
さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素の活性を低下させてもよい。ＩＭＰ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、guaB遺伝子が挙げられる。guaB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No.NC_000964(コード領域は15913-17376)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。
【０１６９】
また、プリン系物質生産能を増強させる方法として、プリン系物質を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を増幅することが考えられる。このような遺伝子が増幅された細菌としては、例えば、rhtA遺伝子を増幅したバチルス属細菌が挙げられる（特開2003-219876）。
【０１７０】
遺伝子組換えにより、上記のＬ−アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、保存的バリアント、すなわちコードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。保存的バリアント等については、前記のキシラナーゼ及びそれをコードする遺伝子について記載したのと同様である。
【０１７１】
＜５−２＞目的物質の製造における微生物の培養
本発明の方法により製造された糖液又はその分画物（以下、併せて「糖」と記載することがある。）を炭素源として、目的物質生産能を有する微生物を培養し、培地又は微生物細胞から目的物質を採取する。
炭素源として上記糖を用いること以外は、通常の発酵法と同様の方法を用いることができる。
【０１７２】
本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができ、本発明により得られる糖は、初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよいし、これらの両方に含まれていてもよい。
【０１７３】
流加培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また連続培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加するとともに容器から培地（通常、流加する培地と等量）を抜き取る方法をいう。また、初発培地とは、流加培養または連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地（培養開始時の培地）のことを意味し、流加培地とは流加培養または連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地を意味する。また、回分培養（batch培養）とは、一回毎に新たな培地を用意し、そこへ株を植えて収穫まで培地を加えない方法を意味する。
【０１７４】
糖は、目的物質を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の糖濃度としては、好ましくは0.05w/v%〜50w/v%程度、より好ましくは0.1w/v%〜40w/v%程度、特に好ましくは0.2w/v%〜20w/v%程度培地に含有させる。本発明の方法により製造される糖は、単独で用いることも出来るし、他の方法で得られたグルコース、あるいは、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、本発明の方法により得られる糖と他の炭素源は任意の比率で混合することが可能である。他の炭素源として好ましいのは、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物や、他のバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。
【０１７５】
使用する培地は、炭素源として本発明の方法により得られる糖を用いる以外は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等の無機アンモニウム塩または硝酸塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用できる。培地中にこれらの窒素源が１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と異なるものを使用してもよい。
【０１７６】
培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１７７】
また、培地には、上記成分の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【０１７８】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−リジン生産菌は、後述のようにＬ−リジン生合成経路が強化されており、Ｌ−リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、硫黄濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１７９】
なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、及び必要に応じてその他の成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【０１８０】
培養は好気的条件下で1〜7日間実施するのがよく、培養温度は20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃、特に好ましくは33〜42℃で培養することが好ましい。培養は通気培養が好ましく、酸素濃度は、飽和濃度に対して5〜50%に、望ましくは10%程度に調節して行うことが好ましい。また、培養中のpHは5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。
【０１８１】
上記のような条件下で、好ましくは10時間〜120時間程度培養することにより、培養液中に著量の目的物質が蓄積される。
【０１８２】
また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のpHが6.5〜9.0、培養終了時の培地のpHが7.2〜9.0となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも2g/L以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）。
【０１８３】
また、Ｌ−グルタミン酸発酵においては、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、pH5.0〜4.0、好ましくはpH4.5〜4.0、さらに好ましくはpH4.3〜4.0、特に好ましくはpH4.0を挙げることができる。（欧州特許出願公開第1078989号明細書）
【０１８４】
培養液からの目的物質の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内に目的物質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、目的物質を回収することができる。目的物質がアミノ酸又は核酸の場合は、回収される目的物質は、フリー体であっても、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩であってもよい。
【０１８５】
また、本発明において採取される目的物質は、目的物質以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取された目的物質の純度は、50%以上、好ましくは85%以上、特に好ましくは95%以上である  （US5,431,933, JP1214636B,
US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878）。
【実施例】
【０１８６】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。
【０１８７】
〔実施例１〕メタゲノムクローニングによるキシラナーゼ遺伝子の単離
（１）DNAの単離
種子島の畜産農家が作製したサトウキビバガスを主体とした堆肥を採集した。このバガス堆肥は、サトウキビバガスと牛糞便を混合し、数ヶ月間発酵させたものである。堆肥は屋外のコンクリート床で適宜作製されており、発酵期間が異なるいくつかのバガス堆肥があった。発酵期間の異なるいくつかのバガス堆肥における、バガスの分解状況を目視で観察したところ、発酵期間約６ヶ月のバガス堆肥では、目視ではバガス片が確認できないほどバガスの分解が進んでいたことから、このバガス堆肥をメタゲノムライブラリー構築のための遺伝子源として採取した。
【０１８８】
グラム陰性菌としてE. coli W3110株、グラム陽性菌としてラクトバチルス・ムリヌス（Lactobacillus murinus）ラット盲腸由来分離株、酵母としてサッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）CBS1513株、糸状菌としてアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）JCM2261株の菌体及びバガス堆肥を用いて、DNA抽出方法の検討を行った。DNA抽出方法としては、Blood & Cell culture DNA Midi kit (QIAGEN)、又は、UltraClean Mega Soil DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories。UltraCleanは同社の商標）を用いた方法、及び凍結融解法を検討した。
前記キットを用いたDNA抽出は、各々のキットに添付されたプロトコールに従って行った。但し、UltraClean Mega Soil DNA Isolation Kitを用いた場合は、ビーズ破砕処理前に500μlの100mg/ml塩化リゾチーム溶液（ナカライテスク株式会社）及び220μlの3mg/ml
N-アセチルムラミダーゼ（Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 (Sigma-Aldrich Co.)）溶液を添加し、37℃で30分間の溶菌前処理を行った以外は、プロトコールに従ってDNA抽出を行った。また、プロトコールには、溶菌操作時に激しく攪拌する手法とゆっくり震盪する手法が記載されていたため、どちらの手法も検討した。
【０１８９】
凍結融解法は以下の方法で行った。菌体またはサンプルのTEバッファー（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0）懸濁液に塩化リゾチーム（ナカライテスク）及びドデシル硫酸ナトリウムをそれぞれ終濃度5mg/ml及び50mg/mlとなるように添加して37℃で1時間反応させた後、反応液の入ったプラスチックチューブを-80℃フリーザーであらかじめ冷却しておいたエタノールに浸して-80℃フリーザー中に30分間置き、その後65℃に設定したウォーターバスに30分間浸すことによる凍結融解を3回繰り返した。凍結融解後、プロテアーゼK（QIAGEN）を終濃度1mg/mlとなるように添加し、60℃で1時間反応させた。その後、反応液と等量のTE飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）を添加し、30分間ゆっくりと混合した後に、遠心（6000×g、20分）して上清を回収する操作を3回繰り返した。続いて、回収した上清と等量のクロロホルム・イソアミルアルコール（24:1）を添加し、20分間ゆっくりと混合した後に、遠心（6000×g、20分）して上清を回収した。回収した上清に終濃度0.3Mとなるように酢酸ナトリウム（ナカライテスク）溶液を添加し、上清の2.5倍量のあらかじめ冷却したエタノールを添加してゆっくり混合した後に、遠心（9400×g、30分）上清を除去して、DNA沈殿物を回収した。回収したDNAにあらかじめ冷却しておいた70%エタノールを添加し、よく混合した後に、遠心（9400×g、30分）して上清を除去して、DNA沈殿物を洗浄した。沈殿物を室温で風乾後にTE溶液に溶解させた。抽出した全DNA溶液をパルスフィールドゲル電気泳動に供し、泳動終了後に20kbp近辺のDNA断片を含むゲルを切り出した。パルスフィールドゲル電気泳動には、CHEF-DR III System （Bio-Rad Laboratories, Inc.）を使用し、1%アガロースゲル（Lonza Rockland, Inc.、Seakem GTG agarose）を用い、0.5×TBEバッファー中で、バッファー温度14℃、Angle 120°、Switch time 1-30秒、Voltage 6V/cmの条件で電気泳動を行った。
【０１９０】
Blood & Cell culture DNA Midi kitによるDNA抽出は、他の手法と比較してDNA抽出効率が低かった。また、凍結融解法ではグラム陰性菌が他の微生物と比較して著しくDNA抽出効率が高く、サンプルに存在する微生物のDNAを偏りなく抽出することが困難であると判断した。UltraClean Mega Soil DNA Isolation Kitを使用した場合には、微生物種によるDNA抽出効果のばらつきは比較的小さく、グラム陰性菌を除く他の微生物種及びバガス堆肥からのDNA抽出効率は凍結融解法とほぼ同等であった。また、バガス堆肥からのDNA抽出において、溶菌操作時に激しく攪拌した場合には、抽出したDNAが断片化し、好ましいサイズのDNA断片（20-40kbp）が得られなかったが、ゆっくり震盪した場合には、抽出したDNAに断片化は認められず、好ましいサイズのDNA断片が得られたため、この方法をDNA抽出法として用いることとした。メタゲノムライブラリー構築のため、バガス堆肥10g からUltraClean Mega Soil DNA Isolation Kitを用い、前述の方法でDNAを抽出することにより、8mlのDNA抽出液を得た。DNA抽出液に0.32ml 5M NaCl溶液及び16.6ml エタノールを添加してエタノール沈殿を行い、風乾後に0.2mlの10mM TEバッファー（pH8.0）に再溶解することでDNAの濃縮を行い、-20℃で保存した。
【０１９１】
（２）DNAの精製及びDNAライブラリーの構築
バガスコンポストから抽出したDNA溶液中に混入していると推測される酵素反応阻害物質の影響を検討するため、16s rRNA遺伝子のコンセンサス配列プライマーセット（JCM 27f [配列番号28]、及びJCM 1492R [配列番号29]）を用いたPCR反応（96℃ 10秒、[96℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 2分]を30サイクル、72℃ 5分30秒）を行った。PCR反応にはExTaq DNAポリメラーゼ（TAKARA）を用い、H2O 22.9μl、 10×バッファー 3μl、 dNTPs 2.4μl、 ExTaq DNA ポリメラーゼ 0.2μl、 20pmol/μlの各プライマー 0.5μl、 鋳型DNA溶液 0.5μl、 総量30 μlとなる反応液組成でPCR反応を行った。PCR反応の結果、16S rRNA遺伝子のPCR産物は得られなかったことから、混入している酵素反応阻害物質がライブラリー構築にも影響することが懸念された。そこでDNAライブラリー構築の操作における種々の酵素反応阻害物質を除去することを目的として、DNAの電気泳動と泳動後ゲルからのDNA回収を行った。バガス堆肥から単離した全DNA溶液をパルスフィールドゲル電気泳動に供し、泳動終了後に20kbp近辺のDNA断片を含むゲルを切り出した。パルスフィールドゲル電気泳動には、CHEF-DR III System （Bio-Rad Laboratories, Inc.）を使用し、1% アガロースゲル（Lonza Rockland, Inc.、Seakem GTG agarose）を用い、0.5×TBEバッファー中で、バッファー温度14℃、Angle 120°、Switch time 1-30秒、Voltage 6V/cmの条件で電気移動を行った。
【０１９２】
切り出したゲル片を、20ml 0.25×TBEバッファーを満たした透析チューブ（フナコシ株式会社、スペクトラ／ポア CE 透析用チューブ）に入れ、0.25×TBEバッファーを満たしたミニゲル電気泳動槽中で電圧をかけることで、ゲルから透析膜内の0.25×TBEバッファー中にDNA断片を回収した。DNA断片を含む0.25×TBEバッファーを回収し、20ml フェノール・クロロホルム溶液［TE飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝25:24:1］を添加し30分間ゆっくり浸透した後、遠心（9400×g、20分）して上清を回収した。回収した上清に20ml クロロホルム溶液［クロロホルム：イソアミルアルコール＝24:1］を添加して、30分間ゆっくり浸透した後、遠心（9400×g、20分）して、再度上清を回収した。回収した上清に1.9ml 3M酢酸ナトリウムと15.2mlのイソプロパノールを添加してアルコール沈殿を行い、DNA断片を回収した。回収したDNAを鋳型として、前記と同様の方法により16s rRNA遺伝子のPCRを行った結果、増幅産物が得られ、酵素反応阻害物質の除去を確認した。回収したDNAを鋳型として、CopyControl Fosmid Library Production Kit（EPICENTRE Biotechnologies。CopyControlは同社の商標）を用い、キットに付属のプロトコールに従って、回収したDNA断片のバガス堆肥DNAライブラリーを構築し、終濃度20%グリセロール溶液として-80℃で保存した。
【０１９３】
（３）発現スクリーニング
キシランの分解活性を指標に目的遺伝子のスクリーニングを行った。上記のバガス堆肥DNAライブラリーを有するE. coliを、12.5μg/mlのクロラムフェニコールを添加したLB寒天培地（tryptone 10.0 g/L、Bacto-yeast extract 5.0 g/L、NaCl 10.0g /L、寒天20g/L）（以下、「LBcm寒天培地」と記載する）に塗布し、37℃で一晩培養した後、出現したコロニーをナイロンメンブレン（Amersham、Hybribond-N+ membrane）を使って、0.6%キシラン(Sigma-Aldrich Co.)含有のLBcm寒天培地にコピーし、37℃で一晩培養した。コロニーが出現したことを確認した後、寒天培地に300μlの10倍希釈したInduction solution（CopyControlTM Fosmid Library Production Kitに含まれる）を添加し、再度37℃で１週間培養を行いながら、寒天培地上のキシラン分解によるハロー形成の有無を観察し、ハロー形成を確認できたコロニーから順次釣菌を行った。釣菌したE. coliクローンは純化後に、0.6%キシラン含有のLBcm寒天培地におけるハロー形成を確認した。
【０１９４】
（４）キシラナーゼ遺伝子の特定
キシラン分解活性を発揮するバガス堆肥フォスミドを有するE. coli株から、QIAGEN Plasmid Kit （QIAGEN GmbH）を用いてフォスミドベクターを抽出した。抽出したフォスミドベクターを、BamHI、HindIII、KpnI、SalI、又は、Sau3AI（タカラバイオ株式会社）により、それぞれの酵素に付属のプロトコールに従って消化した後に、消化断片をpUC18ベクター（タカラバイオ株式会社）にサブクローニングし、0.6%キシラン及び100μg/mlアンピシリンを含有するLB寒天培地で、キシラン分解を示すE. coliクローンをスクリーニングした。キシラン分解を示すクローンからプラスミドを調製し、全塩基配列決定をタカラバイオ株式会社に委託した。決定した全塩基配列情報から、Genetyx version 6.1.2（GENETYX CORPORATION）によりオープンリーディングフレーム(ORF)を見出し、アミノ酸配列に翻訳した後に、タンパク質データベースによる相同性検索を行うことにより、キシラナーゼをコードすると推定される８種類の塩基配列（配列番号19、21、及び23を含む）を決定した。これらの翻訳アミノ酸配列と一致する既知アミノ酸配列は存在せず、新規のキシラナーゼ遺伝子配列であると考えられた。これら翻訳アミノ酸配列間の相同性、及びこれらのアミノ酸配列と既知配列との相同性（％）を表１に示す。
【表１】
0005790022.tif 000002
【０１９５】
キシラナーゼをコードすると推定される８種類の塩基配列をXyn10-1、Xyn10-2、Xyn11-1（配列番号19）、Xyn11-2（配列番号21）、Xyn11-3、Xyn11-4、Xyn11-5（配列番号23）、Xyn11-6と命名した。Xyn11-1、Xyn11-2、及びXyn11-5のキシラナーゼを発現するクローンE. coli JM109/Xyn11-1、E. coli JM109/Xyn11-2、及びE. coli JM109/Xyn11-5は、各々AJ110764、AJ110765、及びAJ110769と命名された。AJ110764及びAJ110765は平成22年1月29日に、AJ110769は平成22年3月11日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、各々受託番号FERM P-21897、FERM P-21898、及びFERM P-21939が付与され、2011年1月25日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、各々FERM BP-11325、FERM BP-11326、及びFERM BP-11327の受託番号が付与されている。
【０１９６】
（５）キシラナーゼ遺伝子の大腸菌TAクローニング
上記のように決定したキシラナーゼ遺伝子配列に基づき、当該ORFのDNA領域を増幅するDNAプライマーを作製し、サブクローンDNAの希釈液をテンプレートとしてKOD-plus-ver.2（TOYOBO CO., LTD.）の標準プロトコールに従ってPCRを行った。Xyn11-1（配列番号19）、Xyn11-2（配列番号21）、及びXyn11-5（配列番号23）のDNA領域を増幅するDNAプライマーを配列番号1〜6に記載する。PCR産物はアガロースゲル電気泳動を行い、予想される分子量のバンドを切り出し、QIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN GmbH） の標準プロトコールに従って精製した。TaKaRa Ex Taq（タカラバイオ株式会社）を用い、精製したPCR産物にdA付加し、pGEM-T Easy vector（Promega Corporation）の標準プロトコールに従い、T4ライゲースによるライゲーションを行った。ライゲーション反応は4℃で16時間とした。得られたライゲーション混液5μLを用い、Competent high JM109（TOYOBO CO., LTD.）を常法に従い形質転換した。得られた形質転換体を純化し、0.6%キシランと50μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天培地上でのハロー形成を検討したところ、Xyn11-3及びXyn11-6を除く6つのORFをクローニングした形質転換体でハロー形成を確認した。Xyn11-3及びXyn11-6を見出したサブクローンDNA断片には、他のキシラナーゼをコードすると予想されるORFも存在しているため、サブクローンが示すハロー形成はXyn11-3及びXyn11-6ではなくこれらの別のORFによるものと考えられた。そのため、Xyn11-3及びXyn11-6は大腸菌では発現または機能できない遺伝子と考えられた。
【０１９７】
（６）Corynebacterium glutamicumによる発現系構築
上記の各キシラナーゼ遺伝子を発現させるための宿主としては、C. glutamicumを選択した。C. glutamicumのタンパク質分泌系の特徴として、もともと分泌しているタンパク質がほとんど無く、発現させた異種タンパク質が高純度で培地中に蓄積する点が挙げられる。タンパク質分泌経路は、細胞外でタンパク質がフォールディングされるGeneral secretion pathway (Sec系)（WO01/23591参照）と、細胞内でタンパク質がフォールディングされて分泌されるTwin-arginine translocation pathway (Tat系) （WO2005/103278参照）が知られ、目的遺伝子によってどちらの系が上手く働くかは異なるため、両方の分泌系を構築した。
【０１９８】
各キシラナーゼのアミノ酸配列をSignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)へ入力し、シグナルペプチド予測を行った。すると、Xyn11-5(配列番号24)のN末端アミノ酸残基から55番目と56番目のアミノ酸残基の間で切断されることが予想されたため、56番目のアミノ酸残基以降をコリネ型細菌での発現ベクターにあるSec系およびTat系シグナルペプチドに連結させるように、各々のDNA断片を連結した。Xyn11-1(配列番号20)、Xyn11-2(配列番号22)はシグナル配列が予想されなかったため、1番目のアミノ酸残基以降をSec系およびTat系シグナルペプチドに連結させた。他のキシラナーゼでは、Xyn10-1、Xyn10-2、Xyn11-4及びXyn11-6でXyn11-5と同様にシグナル配列が予測されたため、切断部位以降の配列をSec系およびTat系シグナルペプチドに連結させた。
【０１９９】
Sec系の発現宿主としては、C. glutamicum YDK010株を用いた。当該株はC. glutamicum変異株であるYSr株の細胞表層タンパク質（PS2）をコードする遺伝子の破壊株である（国際公開パンフレットWO01/23591記載）。一方、Tat系の発現宿主としては、C. glutamicum
WDK010株を用いた。当該株はC. glutamicum 2256株（ATCC 13869）由来の細胞表層タンパク質（PS2）遺伝子破壊株である。
【０２００】
WDK010は以下の工程で構築された。
WO02/081694記載のC. glutamicum（Brevibacterium lactofermentum）AJ12036株からゲノムDNAを抽出した。AJ12036株は、C. glutamicum 2256株から、もともと存在するプラスミドpAM330を脱落させた株である。このAJ12036株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーYSrpsL5（5'-AGGTCAGTGGCGAGTTTCTT-3'）（配列番号26）とプライマーYSrpsL3（5'-GGTAGGTAGCGCCACCAACA-3'）（配列番号27）を用いてPCR増幅を行い、PS2をコードする遺伝子の一部を含む1 kbpの断片を得た。PCRの条件は以下の通りである。
【０２０１】
Pyrobest DNA ポリメラーゼ (TAKARA) を使用。
H2O 37.8 μl, PCR バッファー5 μl, dNTPs 4 μl, Pyrobest DNA ポリメラーゼ 0.2 μl, 10 μMの各プライマー1 μl, 100 ng/μl DNA (鋳型) 1 μl, 総量50 μl
＜PCR 反応条件＞
Cycle 1 (x1)    98℃; 5 分間
Cycle 2 (x30)   98℃; 10 秒間, 57℃; 0.5 分間, 72℃; 1 分間
【０２０２】
このDNA断片とC. glutamicum ATCC13869株を用いて、WO02/081694の実施例9に記載されている方法と同様にして遺伝子置換株を作製した。得られた遺伝子置換株が100 mg/Lストレプトマイシンを含むCM2G寒天培地で生育する事を確認した。更にこの遺伝子置換株を用いて、WO02/081694の実施例9に記載されている方法と同様にして細胞表層タンパク質（PS2）遺伝子完全破壊株を作成し、本菌株をWDK010株と命名した。
【０２０３】
発現プラスミドの構築はApp. Env. Micro., 2003, 69, 358-366に記載されている方法に従った。Sec系については、App. Env. Micro., 2003, 69, 358-366記載のプラスミドpPSPTG1を鋳型として、CspBプロモーターおよびシグナルペプチド（SlpAシグナル, Corynebacterium ammoniagenes由来）をコードする領域をPCR増幅するためのDNAプライマー（配列番号7、8）を設計した。Tat系については、Appl Microbiol Biotechnol., 2008, 78:67-74 記載のプラスミドpPTPPGを鋳型として、CspBプロモーターおよびシグナルペプチド（TorAシグナル, Escherichia coli由来）をコードする領域をPCR増幅するプライマー（配列番号7、9）を設計した。なお、Sec系での発現系、Tat系での発現系ともに、その増幅DNA断片でのプロモーター配列の上流にBamHIサイトを付与した。
【０２０４】
各キシラナーゼ遺伝子のDNA断片については、前述の当該TAクローンより抽出したプラスミドを鋳型としてXyn11-1（配列番号19）、Xyn11-2（配列番号21）は1番目のアミノ酸残基、Xyn11-5（配列番号23）は56番目のアミノ酸残基から、ストップコドンの1つ前のアミノ酸残基までを増幅するプライマー（配列番号10〜18）を用いたPCRによって取得した。その際、Sec系及びTat系のシグナル配列と相同性を持つ20塩基をプライマーの5'末端に付与し、また、各ストップコドンの下流にXbaIサイトを付与するようにプライマーを設計した。他のキシラナーゼ遺伝子に関しても、シグナル配列が予測されなかったXyn11-3に関しては一番目のアミノ酸、予測されたXyn10-1、Xyn10-2、Xyn11-4及びXyn11-6に関しては切断部位以下のアミノ酸から、ストップコドンの一つ前のアミノ酸までを増幅するプライマーを設計した。
【０２０５】
各キシラナーゼ遺伝子のDNA断片については、前述の当該TAクローンより抽出したプラスミドを鋳型としてXyn11-1（配列番号19）、Xyn11-2（配列番号21）は1番目のアミノ酸残基、Xyn11-5（配列番号23）は56番目のアミノ酸残基から、ストップコドンの1つ前のアミノ酸残基までを増幅するプライマー（配列番号10〜18）を用いたPCRによって取得した。その際、Sec系及びTat系のシグナル配列と相同性を持つ20塩基をプライマーの5'末端に付与し、また、各ストップコドンの下流にXbaIサイトを付与するようにプライマーを設計した。
【０２０６】
PCRは、KOD-plus-ver.2（TOYOBO CO., LTD.）の標準プロトコールに従い行った。プロモーターおよびシグナルペプチドのPCR産物は、AMpure（ベックマン・コールター株式会社）の標準プロトコールに従って精製した。PCR産物はアガロースゲル電気泳動を行い、予想される分子量のバンドを切り出し、QIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN GmbH） の標準プロトコールに従って精製した。
次に、プロモーター及びシグナルペプチドのPCR産物と取得キシラナーゼ遺伝子のPCR産物を1:1（体積比）で混合したものを鋳型とし、プロモーター配列に対応するプライマー（配列番号7）およびストップコドンに対応するプライマー（配列番号16[Xyn11-1（配列番号19）に対応], 配列番号17[Xyn11-2（配列番号21）に対応], 配列番号18[Xyn11-5（配列番号23）に対応]など）を用いたクロスオーバーPCRを行った。これにより、プロモーター、シグナル配列、及びキシラナーゼをコードするDNA断片が増幅された。
【０２０７】
このクロスオーバーPCR産物を制限酵素BamHIおよびXbaIにて消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする分子量のDNAバンドを切り出し、QIAEX II Gel Extraction
Kit（QIAGEN GmbH） の標準プロトコールに従って精製した。これらのDNA断片を、特開平9-322774（EP0841395）記載のCorynebacterium-E. coliシャトルベクターであるpPK4のBamHI-XbaI部位に挿入してSec系及びTat系の取得キシラナーゼ分泌発現プラスミドを得た。これらのプラスミドを、Sec系はYDK010株へ、また、Tat系はWDK010株へエレクトロポレーション法により導入し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地（酵母エキストラクト10g、トリプトン10g、グルコース５g、NaCl ５g、寒天 15g、水で1LにしてｐＨ7.2に調整）で生育した菌株を選択した。
【０２０８】
選択した菌株をCM2G液体培地（酵母エキストラクト10g、トリプトン10g、グルコース５g、NaCl ５g、水で1LにしてｐＨ7.2に調整）に植菌し、30℃で一晩前培養した。MMTG液体培地（グルコース 120g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン 0.15g、炭酸カルシウム 50g、水で１ＬにしてｐＨ7.0に調整）に25mg/lのカナマイシンを添加し、大型試験管に4mlを張り込んで前培養液を5%(v/v)の割合で接種し、30℃で72時間培養した。
培養終了後の培養上清をキシラン含有アガロースプレートに滴下し、ハローを形成することでキシラン分解活性を確認したところ、（５）に記載した大腸菌クローンで活性が確認できなかったXyn11-3及びXyn11-6では、コリネ型細菌発現系でも活性が確認できなかった。また、大腸菌クローンでは活性が確認できたXyn10-2でも、コリネ型細菌発現系での活性が確認できなかった。活性を確認したXyn11-1（配列番号19）、Xyn11-2（配列番号21）、Xyn11-5（配列番号23）、Xyn10-1、及びXyn11-4は、同培養上清をSDS-PAGEに供し、予想される分子量の位置にタンパク質の発現があることを確認した。酵素活性やタンパク質発現量より、Xyn11-1はTat系、Xyn11-2、Xyn11-5、Xyn10-1、及びXyn11-4はSec系を選択した。
【０２０９】
〔実施例２〕キシラナーゼによるバガスの糖化
各キシラナーゼのサトウキビバガスの糖化を助ける働きを評価するため、以下のバガス糖化能向上効果試験を行った。
バガスは種子島より入手し、更にバガス粉砕は、以下の条件で行った。
【０２１０】
乾燥：天日乾燥
粉砕委託先：(株)奈良機械製作所
粉砕機：奈良式自由粉砕機Ｍ−４型
粉砕条件：回転速度=5500/min, スクリーン：ダイヤスクリーン0.9mm
篩がけ：目開き0.15mmと0.355mmの篩を用い、0.15-0.355mmのバガスを回収し、試験に用いた。
【０２１１】
実施例１に記載した方法で調製したC. glutamicum培養上清を、10ｋDaカットアウトの限外ろ過膜Vivaspin 20（Sartorium Stedim Biotech GmbH）を用いて10倍濃縮し、50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)に置換した。ポジティブコントロールとして、 Novozymes biomass kit（Novozymes A/S社）に含まれるキシラナーゼ製剤 NS50030（Xyn30）及びNS50014（Xyn14）を、一方、ネガティブコントロールとして、50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)、及びpPK4を導入したYDK010の培養上清を、それぞれ評価に用いた。なお、サンプルはN=3で評価を行った。
【０２１２】
各サンプルのタンパク質量をProtein Assay CBB Solution（ナカライテスク社）の標準プロトコールに従って定量した。また、ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) を用い、SDS-PAGEの画像において目的バンドが総タンパク質に占める割合を算出し、酵素濃度の算出に用いた。セルラーゼミックスとして、0.143g/ml Celluclast（Novozymes A/S社）、及び0.033g/ml Novozyme188（Novozymes A/S社）、抗生物質として5mg/ml Geneticineを50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)に溶解させ調製した。
【０２１３】
ブチルゴム栓付きガラスバイアルに、0.1g乾燥バガスと4mlの50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)もしくは 50mMリン酸バッファー(pH8.0)を添加し、121℃で20分オートクレーブ滅菌したものに、φ0.22のPESフィルターMILLEX GP（Millipore）を用いて滅菌した0.5ml のセルラーゼミックス液、及び、0.5mlの試験サンプルを添加し、50℃でゆっくり振とうしながら４日間糖化反応を行った。酵素量は5mLの反応系あたり65mg〜150mgとなるよう調製した。反応終了後に、反応液の遠心（14000rpm、10min)上清を回収し、バイオテックアナライザーAS310(サクラエスアイ株式会社)によってグルコース濃度を測定した。全ての試験区にバガスを入れない反応系をおき、そのグルコース量をブランクとして差し引いた値をバガス由来の遊離グルコース量とし、バガス含有グルコース量に対する遊離グルコース量の割合を糖化率として求めた。なお、50mMリン酸バッファー(pH8.0)を添加した場合、サンプルの最終pHは7付近となるため、pH7.0条件下でのバガス糖化試験とした。
【０２１４】
キシラナーゼ非添加区（50mM酢酸ナトリウムバッファー（図中「NC」と記載））での糖化反応の結果、産生したグルコース濃度を基準にした。そして、この時の糖化率を１とした場合の各サンプルの糖化率の相対比を算出し、それらを平均化したものを、図１（pH5）及び図２（pH7）に示す。なお、NS50014（Xyn14）（図中「X14」と記載）添加とNS50030（Xyn30）（図中「X30」と記載）添加の場合は３回分の試験データの平均であるため、N=9であり、Xyn11-1、Xyn11-2、Xyn11-5（各々図中「X11-1」、「X11-2」、「X11-5」と記載）の添加では２回分の試験データの平均であるため、N=6である。また、標準偏差をエラーバーで示した。
その結果、pH7の条件では、本発明のキシラナーゼの添加はいずれも市販のキシラナーゼ添加よりも高い糖化率を示し、セルラーゼの糖化反応を助ける効果が明瞭であった。また、pH5の条件においては、pH7の場合よりも小さいものの、その糖化を促進する傾向にあることが判明した。他のキシラナーゼ（Xyn10-1、及びXyn11-4）に関しても同様の試験を行ったが、いずれも市販のキシラナーゼと有意な差は認められなかった。
【０２１５】
〔実施例３〕キシラナーゼの酵素学的特性評価
各キシラナーゼの酵素学的特性を評価するため、以下の試験を行った。
（１）最適反応pH
樺材由来のキシラン（Xylan from Birchwood、Sigma社)とクエン酸-リン酸バッファー（pH 3.5-8.0、pH0.5刻み）により、1%(w/v)基質溶液を作製し、オートクレーブ処理によりキシランを溶液中でよく分散させた。
【０２１６】
酵素液としては、実施例１に記載した方法で調製したC. glutamicum培養上清を、10ｋDaカットアウトの限外ろ過膜Vivaspin 20（Sartorium Stedim Biotech GmbH）を用いて10倍濃縮し、50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)に置換したものを用いた。
【０２１７】
酵素反応はBerrinらの方法（Protein Expression and Purification, 19, 179-187, 2000）に従い、1% 基質溶液180μLと酵素液20μLをマイクロプレート内で混合し、サーマルサイクラーを用いて50℃で5分間反応させた。なお、各pHにつき1酵素あたりN=3で反応を行った。反応後の溶液を50μL取り、1% DNS溶液100μLと混合し、95℃で5分間反応させた。なお、1% DNS溶液とは、1%ジニトロサリチル酸、0.05%亜硫酸ナトリウム、1%水酸化ナトリウム、20%酒石酸ナトリウムカリウムで構成される溶液を指し、このDNS溶液は還元糖量測定において一般的に用いられる。
【０２１８】
反応液の吸光度（540nm）を測定し、キシロース溶液で作成した検量線より、生成されたキシロオリゴ糖量を算出した。事前の検証により、酵素液に含まれる糖は検出されなかったが、基質液には特に酸性域において酸加水分解産物と思われる還元糖が検出された。そこで、すべてのpHの基質に対し、酵素液の代わりに蒸留水を加えたブランクを作成し、基質液由来のバックグラウンドの糖を差し引いた値を生成糖量とした。最大の生成糖量を示したサンプルを1とした際の各pHでの生成糖量を比活性として求めた。
【０２１９】
至適反応pHのグラフを図３に示した。各新規キシラナーゼは、いずれも似た至適pHパターンを示し、至適pHは7.0付近であった。一方、市販キシラナーゼXyn14 (Novozymes社, NS50014)は至適pHが6.5付近であった。
【０２２０】
（２）最適反応温度
Xylan from Birchwood (Sigma社)とクエン酸−リン酸バッファー(pH 7.0)を用いて、1%(w/v)基質溶液を作成し、オートクレーブ処理によりキシランを溶液中でよく分散させた。酵素液は前項に記載した方法で調製した。酵素反応は前項に記載した方法に準じて、1% 基質溶液90μLと適宜蒸留水で希釈した酵素液10 μLをマイクロプレート内で混合し、サーマルサイクラーを用いて35〜85℃(5℃刻み)で5分間反応させた。なお、各温度につき1酵素あたりN=3(コントロールとした市販酵素Xyn14のみN=2)で反応を行った。反応後の溶液を50 μL取り、DNS溶液100μLと混合し、95℃で5分間の呈色反応をさせ、反応液の吸光度(540nm)を測定した。すべての温度サンプルに対し、酵素液の代わりに蒸留水を加えたブランクを作成し、基質液由来のバックグラウンドの値を差し引いた値を生成糖量とした。最大の生成糖量を示したサンプルを1とした際の各温度での生成糖量を比活性として示した。
至適反応温度のグラフを図４に示した。Xyn11-1は65℃、Xyn11-2及び市販酵素Xyn14は70℃、Xyn11-5は75℃にて最も高い活性を示した。
【０２２１】
（３）短時間での温度安定性
前項に記載した方法で調製した酵素液をクエン酸−リン酸バッファー(pH 7.0)で希釈し、pHが7であることを確認した。酵素液を50〜75℃(5℃刻み)で10分間反応させたものを熱処理酵素とした。1% 基質溶液90μL(pH7.0)と、熱処理酵素液又は非熱処理酵素液10 μLをマイクロプレート内で混合し、サーマルサイクラーを用いて50 ℃で5分間反応させた。なお、各熱処理温度につき1酵素あたりN=3で反応を行った。反応後の溶液を50 μL取り、DNS溶液100μLと混合し、95℃で5分間の呈色反応をさせ、反応液の吸光度(540nm)を測定した。すべての温度サンプルに対し、酵素液の代わりに希釈に用いたバッファーを加えたブランクを作成し、基質液由来のバックグラウンドの値を差し引いた値を生成糖量とした。非熱処理酵素液を加えたサンプルの平均値を1とした際の各熱処理温度での生成糖量を比活性として示した。市販酵素Xyn14は35, 50, 70, 80℃で検討を行った。
短時間での温度安定性のグラフを図５に示した。新規酵素Xyn11-2と市販酵素Xyn14はほぼ同様の活性プロファイルを示した。一方、Xyn11-5は高温にて処理しても比較的高い活性を保持し、75℃で10分間処理しても78％の活性を保持した。
【０２２２】
（４）長時間での温度安定性
バガスの糖化反応は50℃で4日間かけて行う長時間反応であるため、より長い時間の熱処理に対する温度安定性を検討した。前項に記載した方法において、酵素液の熱処理時間を10分間から16時間に延長し、その他の条件は前項と同様にして試験を行った。比熱処理酵素液を加えたサンプルの平均値を1とした際の各熱処理温度での生成糖量を比活性として示した。
【０２２３】
長時間での温度安定性を図６に示した。50℃にて16時間処理しても新規酵素は86−97％の活性を保持したのに対し、市販酵素は69%まで活性が低下した。特にXyn11-5は高温にて処理しても比較的高い活性を保持し、70℃で16時間処理しても61％の活性を保持した。50℃の16時間処理において新規キシラナーゼが市販酵素Xyn14よりも活性を高く保持したことは、実施例２に示したバガス糖化能向上効果の結果を支持する。バガスを糖化する工程は長時間反応であるため、新規酵素の温度安定性が長時間にわたり高く維持されることは産業上有効な性質である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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