(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長および分化因子８（ＧＤＦ８）に特異的な拮抗剤であって、拮抗剤が、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない抗ＧＤＦ8抗体または抗原結合タンパク質であり、該抗体または抗原結合タンパク質が重鎖を含み、重鎖が第１、第２、および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
第１の相補性決定領域が、配列番号１９のアミノ酸配列、および配列番号２５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第２の相補性決定領域が、配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第３の相補性決定領域が、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
該抗体または抗原結合タンパク質が軽鎖を含み、軽鎖が第１、第２、および第３の相補性決定領域を含み、
第１の相補性決定領域が、配列番号２２のアミノ酸配列、および配列番号２８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第２の相補性決定領域が、配列番号２３のアミノ酸配列、および配列番号２９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第３の相補性決定領域が、配列番号２４のアミノ酸配列、および配列番号３０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
前記拮抗剤。
【請求項２】
抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み、かつ、
配列番号１６のアミノ酸配列および配列番号１８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の拮抗剤。
【請求項３】
抗体または抗原結合タンパク質が配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項１に記載の拮抗剤。
【請求項４】
抗体または抗原結合タンパク質が配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項１に記載の拮抗剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＧＤＦ８拮抗剤をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
調節配列と作動可能に連結している請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって発現されたＧＤＦ８拮抗剤を単離することとを含む、ＧＤＦ８拮抗剤を生成する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって生成された、単離したＧＤＦ８拮抗剤。
【請求項１１】
成長および分化因子８（ＧＤＦ８）に特異的な抗体または抗原結合タンパク質であって、該抗体または抗原結合タンパク質が、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない抗ＧＤＦ8抗体であり、かつ該抗体または抗原結合タンパク質が重鎖を含み、重鎖が第１、第２、および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
第１の相補性決定領域が、配列番号１９のアミノ酸配列、および配列番号２５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第２の相補性決定領域が、配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第３の相補性決定領域が、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
該抗体または抗原結合タンパク質が軽鎖を含み、軽鎖が第１、第２、および第３の相補性決定領域を含み、
第１の相補性決定領域が、配列番号２２のアミノ酸配列、および配列番号２８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第２の相補性決定領域が、配列番号２３のアミノ酸配列、および配列番号２９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第３の相補性決定領域が、配列番号２４のアミノ酸配列、および配列番号３０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
抗体または抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
（ａ）
（ｉ）試料、
（ｉｉ）ＧＤＦ８と特異的に結合する捕捉試薬、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ８と特異的に結合する検出試薬
を合わせるステップと、
（ｂ）特異的結合が捕捉試薬とＧＤＦ８との間に起こるかどうかを検出するステップと
を含み、特異的結合の検出が試料中のＧＤＦ８の存在を示す、対象からの試料中のＧＤＦ８の存在を検出するためのアッセイであって、
捕捉試薬が請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質であって検出試薬がＲＫ３５であるアッセイか、捕捉試薬がＲＫ３５であって検出試薬が請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質であるアッセイ。
【請求項１５】
（ａ）の合わせるステップの前に試料を酸性緩衝液と合わせることをさらに含む、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
酸性緩衝液のｐＨがｐＨ１．０〜ｐＨ６．０である、請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項１７】
酸性緩衝液のｐＨがｐＨ２．５である、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
捕捉試薬が請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質であって検出試薬がＲＫ３５である請求項１４から１７に記載のアッセイであって、上記請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質がＲＫ２２である、アッセイ。    
【請求項１９】
捕捉試薬がＲＫ３５であって検出試薬が請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質である請求項１４から１７に記載のアッセイであって、上記請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質がＲＫ２２である、アッセイ。
【請求項２０】
（ａ）
（ｉ）試料、
（ｉｉ）ＧＤＦ８と特異的に結合する捕捉試薬、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ８と特異的に結合する検出試薬
を合わせるステップと、
（ｂ）特異的結合が捕捉試薬とＧＤＦ８との間に起こるかどうかを検出するステップと、
（ｃ）ＧＤＦ８のレベルを定量化するステップと
を含み、試料中のＧＤＦ８の存在を示す特異的結合の検出を定量化することができる、対象からの試料中のＧＤＦ８を定量化するためのアッセイであって、
捕捉試薬が請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質であって検出試薬がＲＫ３５であるアッセイか、捕捉試薬がＲＫ３５であって検出試薬が請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質であるアッセイ。
【請求項２１】
（ａ）の合わせるステップの前に試料を酸性緩衝液と合わせることをさらに含む、請求項２０に記載のアッセイ。
【請求項２２】
酸性緩衝液のｐＨがｐＨ１．０〜ｐＨ６．０である、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
酸性緩衝液のｐＨがｐＨ２．５である、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２４】
薬学的に許容できる担体とＧＤＦ８拮抗剤とを含む医薬組成物であって、拮抗剤が、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない請求項１１に記載の抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質である医薬組成物。
【請求項２５】
ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質が、請求項１２に記載の抗体または抗原結合タンパク質である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質が、請求項１３に記載の抗体または抗原結合タンパク質である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ほぼ無毒から無毒である、治療上有効な量の請求項２４から２６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、哺乳動物患者におけるＧＤＦ８関連障害の治療薬。
【請求項２８】
（ａ）対象から得た第１の試料を請求項１に記載の拮抗剤と合わせるステップと、
（ｂ）第１の試料中のＧＤＦ８の存在を検出するステップと、
（ｃ）第１の試料中のＧＤＦ８のレベルを定量化するステップと、
（ｄ）ＧＤＦ８関連障害に罹患していない対象から得た第２の試料を拮抗剤と合わせるステップと、
（ｅ）第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを検出するステップと、
（ｆ）第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを定量化するステップと、
（ｇ）第１および第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを比較するステップと
を含み、第２の試料と比較した第１の試料中のＧＤＦ８のレベルの増加、減少、または類似性を測定する方法。
【請求項２９】
哺乳動物患者においてＧＤＦ８関連障害を治療するための医薬品の調製における医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容できる担体とＧＤＦ８拮抗剤とを含み、ＧＤＦ８拮抗剤が、請求項１に記載の拮抗剤である使用。
【請求項３０】
対象からの試料中のＧＤＦ８の存在を検出する、またはそれを定量化するためのキットであって、ＧＤＦ８と特異的に結合する捕捉試薬およびＧＤＦ８と特異的に結合する検出試薬を含み、該捕捉試薬が請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質であって該検出試薬がＲＫ３５であるか、該捕捉試薬がＲＫ３５であって該検出試薬が請求項１１に記載の抗体または抗原結合タンパク質である、ＧＤＦ８と捕捉および検出試薬との特異的結合の検出が試料中のＧＤＦ８の存在を示すキット。
【請求項３１】
酸性緩衝液をさらに含む、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、ＧＤＦ８活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで阻害するために使用し得る、成長および分化因子−８（ＧＤＦ８）に特異的なエピトープならびにその拮抗剤（たとえば、ペプチド模倣体、抗ＧＤＦ８抗体（たとえば、マウス、ヒトおよびヒト化抗体、その断片など）、組換えポリヌクレオチド、阻害性ポリヌクレオチド等）に関する。本分野は、特に妊娠する可能性がある女性において、生体試料中のＧＤＦ８を検出するための免疫アッセイ方法、ならびにＧＤＦ８関連障害（たとえば、筋肉障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性もしくは誘導性骨障害、脂肪障害、グルコース代謝障害またはインスリン関連障害）を治療、寛解、予防、診断、予後診断、および／または監視する方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオスタチンとしても知られる成長および分化因子−８（ＧＤＦ８）は、分泌タンパク質かつ構造的に関連した成長因子のトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのメンバーは、成長調節および形態形成の特性を保有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、８：１３３〜４６、Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２８：２３５〜７２）。ヒトＧＤＦ８は、ホモ二量体の複合体を形成する３７５個のアミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。プロセッシング中、「潜在性関連ペプチド」（ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＬＡＰ）として知られるアミノ末端のプロペプチドが切断され、ホモ二量体と非共有結合したままで、「小潜在型複合体（ｓｍａｌｌ  ｌａｔｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」と呼ばれる不活性の複合体を形成し得る（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：６４０７〜１５、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：７６４６〜５４、Ｂｒｏｗｎら（１９９９）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３：３５〜４３、Ｔｈｉｅｓら（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１８：２５１〜５９、Ｇｅｎｔｒｙら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：６８５１〜５７、Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３１６：７０１〜０５、Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２：５９７〜６４１）。ＧＡＳＰ−１を含めたフォリスタチンおよびフォリスタチン関連タンパク質などのタンパク質（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２０８：２２２〜２３２、米国特許公開第２００３−０１８０３０６−Ａ１号、米国特許公開第２００３−０１６２７１４−Ａ１号）は、成熟ＧＤＦ８ホモ二量体と結合し、ＧＤＦ８の生物活性を阻害する。
【０００３】
様々な種からの推定されたＧＤＦ８アミノ酸配列のアラインメントは、ＧＤＦ８が高度に保存されていることを実証している（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２４５７〜６１）。ヒト、マウス、ラット、ブタ、およびニワトリのＧＤＦ８の配列は、Ｃ末端領域が１００％同一であり、一方で、ヒヒ、ウシ、およびヒツジのＧＤＦ８は、Ｃ末端がほんの３個のアミノ酸だけ異なる。種にわたる高い度合のＧＤＦ８保存は、ＧＤＦ８が本質的な生理的機能を有することを示唆している。
【０００４】
ＧＤＦ８は、筋芽細胞および衛星細胞の増殖および分化をどちらも阻害することによって筋肉の発生および恒常性の調節に主要な役割を果たすことが示されている（ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、９：６０４〜７、ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１６２：１１３５〜４７）。これは、発生中の骨格筋で初期に発現され、成体の骨格筋、優先的には速収縮型中で発現され続ける。また、ＧＤＦ８は、筋肉に特異的な酵素（たとえばクレアチンキナーゼ）の産生および筋芽細胞の増殖にも示唆されている（ＷＯ００／４３７８１号）。
【０００５】
成体マウスにおけるＧＤＦ８の過剰発現は顕著な筋肉損失をもたらす（Ｚｉｍｍｅｒｓら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６：１４８６〜８８）。同様に、様々な研究により、ＧＤＦ８発現の増加がＨＩＶ誘導性筋消耗に関連していることが示されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５：１４９３８〜４３）。対照的に、ＧＤＦ８ノックアウトトランスジェニックマウスは、骨格筋の顕著な肥厚および過形成ならびに変更された皮質骨構造によって特徴づけられている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ、３８７：８３〜９０、Ｈａｍｒｉｃｋら（２０００）Ｂｏｎｅ、２７：３４３〜４９）。また、ＧＤＦ８遺伝子を不活性化させる天然の突然変異は、動物およびヒトの両方において肥厚および過形成をどちらももたらすことが示されている（ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（１９９７）、上記）。たとえば、畜牛における天然のＧＤＦ８突然変異では、骨格筋量の増加が明らかである（Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４）Ｇｒｏｗｔｈ、３８：５０１〜０７、Ｓｗａｔｌａｎｄら（１９９４）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．、３８：７５２〜５７、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、上記、Ｋａｍｂａｄｕｒら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７：９１０〜１５）。
【０００６】
いくつかのヒトおよび動物の筋肉および骨障害は筋組織の機能障害に関連しており、したがってＧＤＦ８とも関連している可能性がある。たとえば、ＧＤＦ８は、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、筋ジストロフィー（「ＭＤ」、デュシェーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲骨筋型ジストロフィー、および顔面肩甲上腕筋型ジストロフィーが含まれる）、筋萎縮、手根管症候群、臓器萎縮、虚弱、うっ血性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、筋肉減少症、悪液質、ならびに他の疾患および状態によって引き起こされる筋消耗症候群の病因に関与している可能性がある。
【０００７】
また、ＧＤＦ８は、２型糖尿病発生中のグルコース恒常性、耐糖能異常、代謝症候群（すなわち、人を２型糖尿病および／または心疾患の高い危険性にする、一群の健康状態（インスリン抵抗性、腹部肥満、異常脂質血症、高血圧、慢性炎症、血栓形成促進状態などが含まれ得る）の同時発生に関与する症候群（たとえば症候群Ｘ））、インスリン抵抗性（たとえば、熱傷または窒素不均衡などの外傷によって誘導された耐性）、ならびに脂肪組織障害（たとえば、肥満症、異常脂質血症、非アルコール性脂肪肝疾患など）を含めた、数々の他の生理的プロセスおよび関連障害に関与しているとも考えられている（Ｋｉｍら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２８１：９０２〜０６）。現在、これらの障害を治療するための信頼性のあるまたは有効な治療が殆ど存在しない。これらのプロセスの病理学は、ＧＤＦ８を、これらの関連障害の治療における潜在的な標的として示している。
【０００８】
ヒトにおける神経筋障害に加えて、主に高齢者および／または閉経後の女性に影響を与える、骨粗鬆症および骨関節炎などの骨の損失に関連する成長因子関連状態も存在する。そのような代謝性骨疾患および障害には、慢性糖質コルチコイド療法による低骨量、早期性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次副甲状腺機能亢進、栄養障害、および神経性無食欲症が含まれる。これらの状態の現在の治療の多くは、骨吸収を阻害することによって機能するが、骨形成を促進する治療が有用な代替治療であろう。ＧＤＦ８は骨発生および筋発生において役割を果たすため、ＧＤＦ８は、骨変性疾患を治療するための優れた薬理学的標的でもある。
【０００９】
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーの他のメンバーと同様に、ＧＤＦ８は、シグナル配列、Ｎ末端プロペプチドドメイン、および活性分子であると考えられるＣ末端ドメインを含有する、３７６個のアミノ酸前駆体タンパク質として合成される。ＧＤＦ８は、そのプロペプチド（潜在性関連ペプチド、ＬＡＰ）と結合することによって潜在型で分泌され、プロペプチドドメインおよびＣ末端ドメインの間のタンパク質分解性のプロセッシングにより、Ｎ末端プロペプチドおよびＧＤＦ８の成熟型が産生される。未プロセッシングおよび成熟ＧＤＦ８はどちらもジスルフィド結合の二量体を形成し、プロセッシングされたＧＤＦ８二量体がタンパク質の唯一の活性型を表す。血清中および骨格筋内では、ＧＤＦ８は、その活性化、分泌または受容体結合を変調することができるいくつかのタンパク質と結合して見つけることができる。
【００１０】
ＧＤＦ８は、その活性化が受容体のリン酸転移を増強してセリン／スレオニンキナーゼ活性の刺激をもたらす、膜貫通セリン／スレオニンキナーゼヘテロ四量体受容体ファミリーを介してその効果を発揮する。ＧＤＦ８経路は、高親和性受容体ＡｃｔＩＩＲＢとの活性ＧＤＦ８二量体結合を含み、その後、これは低親和性受容体ＡＬＫ４／ＡＬＫ５のリン酸転移を動員して活性化させることが示されている。また、タンパク質Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３が続いて活性化されてＳｍａｄ４と複合体を形成し、その後、核に転移され、これはその後、標的遺伝子の転写を活性化することも示されている。ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００１、９８：９３０６〜９３１１）は、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体が、ＧＤＦ８の影響をｉｎ  ｖｉｖｏで、ＧＤＦ８遺伝子ノックアウトを模倣するマウスにおけるＡｃｔＩＩＲＢのドミナントネガティブ型の発現として媒介できることを実証している。
【００１１】
ＧＤＦ８の影響下で、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞が細胞周期のＧ０／Ｇ１およびＧ２期に蓄積され、その結果、Ｓ期細胞の数が減少することが示されている。また、ＧＤＦ８は、分化マーカーの発現の強力な減少に関連する、筋芽細胞分化の不全も誘導する。また、ＧＤＦ８の発現は、増殖および分化条件のどちらの下でも細胞のアポトーシス率を減少させる（Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０００、２７５：４０２３５〜４０２４３）。
【００１２】
ミオスタチン（ＧＤＦ８）の発現の阻害は、筋肉の肥厚および過形成をどちらももたらす（ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、上記、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、上記）。ミオスタチンは、傷害後の筋肉再生に負の調節を行い、ＧＤＦ８ヌルマウスにおけるミオスタチンの欠如は筋肉再生の加速をもたらす（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら、（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１１８：３５３１〜４１）。ヒト抗ＧＤＦ８抗体（米国公開出願第２００４／０１４２３８２号）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、ＧＤＦ８と結合し、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ８活性を含めたＧＤＦ８活性を阻害することが示されている。たとえば、ミオスタチン中和抗体は、野生型マウス（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３００：９６５〜７１）および筋ジストロフィーのモデルであるｍｄｘマウス（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ、４２０：４１８〜２１、Ｗａｇｎｅｒら（２００２）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５２：８３２〜３６）の骨格筋において、体重、骨格筋量、ならびに筋肉の大きさおよび強度を増加させる。さらに、これらのマウス中のミオスタチン抗体は、やはりＡＬＳの病態中に標的とされる筋肉である横隔膜への損傷を減少させる。筋肉に対するＨＧＦなどの成長因子の作用はミオスタチン発現の阻害が原因であり（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら（２００５）、上記）、したがって、再生および変性のバランスを正の方向にシフトすることを支援し得ると仮定されている。しかし、これらの従来技術の抗体はＧＤＦ８に特異的でなかった、すなわち、これらの抗体は、ＢＭＰ１１などのＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーに対して高い親和性を有する。
【００１３】
現在までに、ＧＤＦ８活性のすべての知られている阻害剤（たとえば、プロペプチド、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ受容体、抗ＧＤＦ８抗体など）は、重要な生物学的機能を有する他の因子（たとえば、ＢＭＰ１１、アクチビンなど）の生物活性も中和する。たとえば、アクチビンおよびＢＭＰ１１は、胚形成中に重要な役割を果たす。アクチビンβＡは重要な性腺成長因子として同定されており、ＢＭＰ１１は中軸骨格のホメオティック変換を担っている。ホモ接合性ＢＭＰ１１ノックアウトマウスは周産期致死であり、ＢＭＰ１１遺伝子の１つの野生型コピーを有するマウスは生存可能であるが骨格欠損を有する。アクチビンおよびＢＭＰ１１は胚形成中に重要な役割を果たすため、ＧＤＦ８および他の因子、たとえばＢＭＰ１１を阻害する拮抗剤は、治療した患者における毒性として、またはたとえば妊娠する可能性がある女性における生殖毒性として提示される場合がある、理論上の安全性リスクをもたらす。したがって、特にヒトにおいて、筋肉量および／または強度および／または骨密度の全体的な増加に貢献するが、たとえばＢＭＰ１１を妨げない、化合物および治療方法の必要性が存在する。言い換えれば、特に妊娠する可能性がある女性において、筋肉量、大きさ、強度などを増加することが望ましいＧＤＦ８関連障害の治療における、ＧＤＦ８活性の特異的阻害の必要性が存在する。
【００１４】
ＧＤＦ−８変調剤を使用する方法が開発されるにつれて、そのような薬剤の個体への投与を監視および最適化する方法を開発する必要性が存在する。具体的には、生体液中のＧＤＦ−８タンパク質レベルを測定する能力が、進行中の臨床治験に重要な意味を持つ。たとえば、循環ＧＤＦ−８レベルは、抗ＧＤＦ−８治療から利点を受け得る病的状態を診断し得るか、または、どの個体が抗ＧＤＦ−８治療に応答する可能性が高いかを予測し得る。さらに、抗ＧＤＦ−８治療中の末梢血中のＧＤＦ−８レベルの変化は、筋肉量および／または機能の後に測定可能な応答の、初期の指標であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
そのような最適化の目的を達成するために、血清および血漿などの生体液中のＧＤＦ−８タンパク質レベルを検出または監視する方法が必要である。たとえば、そのような治療に適した個体を同定するため、治療に対する応答を監視するため、および治療後の進行を追跡するために、ＧＤＦ−８変調剤を用いた治療の前、その間、および治療後にＧＤＦ−８レベルを監視することが望ましい。具体的には、ＧＤＦ−８阻害剤および抗ＧＤＦ−８抗体を含めたＧＤＦ−８変調剤の投与に応答した、内在性ＧＤＦ−８レベルの検出および／または定量化を可能にする方法が必要である。
【００１６】
したがって、本発明の主な目的は、ＧＤＦ８活性を特異的に阻害する化合物および方法、ならびに生体試料中、たとえば、血清および血漿中などのＧＤＦ−８レベルを検出および定量化するための免疫学的アッセイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、少なくとも１つのＧＤＦ８活性（たとえば、ＧＤＦ８がその受容体に結合することまたは他のＧＤＦ８に媒介されるシグナル伝達事象）を特異的に拮抗する、成長および分化因子８（ＧＤＦ８）と特異的に結合する抗体または抗原結合タンパク質の発見に基づいている。また、本発明の抗体はＧＤＦ８に特異的であり、たとえばＢＭＰ１１とは特異的に結合しないため、本発明は、これらの特異的な抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質によって認識されるＧＤＦ８上のエピトープの同定にも基づいている。
【００１８】
ＧＤＦ８に特異的なエピトープを提供することに加えて、本発明は、ＧＤＦ８に特異的な拮抗剤（本明細書中で「特異的ＧＤＦ８拮抗剤」、「ＧＤＦ８拮抗剤」などとも呼ぶ）、たとえば、少なくとも１つのＧＤＦ８活性（たとえばＧＤＦ８に媒介されるシグナル伝達事象（たとえばＧＤＦ８がその受容体（たとえばそのＡＬＫ４／ＡＬＫ５受容体）に結合すること）を特異的に拮抗（たとえば、阻害、低下、および／または中和）し、ＢＭＰ１１活性を顕著に拮抗しない拮抗剤も提供する。また、本発明は、生体試料中のＧＤＦ−８を検出および定量化する方法も提供する。特定の実施形態では、この方法は免疫アッセイを含み、試料は血清および／または血漿である。本発明は、本発明の方法で使用するためのキットをさらに提供する。また、本発明は、ＧＤＦ８関連障害、たとえば、筋肉障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘導性骨障害、脂肪障害、グルコース代謝障害、インスリン関連障害などを治療（寛解、予防、診断、予後診断が含まれる）または監視する方法において、開示した特異的ＧＤＦ８拮抗剤を使用する方法も提供する。
【００１９】
したがって、一態様では、本発明は、ＧＤＦ８の拮抗剤であって、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体のアミノ酸をコードしている単離核酸、ＧＤＦ８に特異的な阻害性ポリヌクレオチド、および抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質のうちの少なくとも１つを含む拮抗剤を提供する。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の拮抗剤であって、拮抗剤が、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体であり、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、および配列番号１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる群から選択される拮抗剤を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のペプチド模倣体であり、かつ環状化されている拮抗剤を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のペプチド模倣体であり、かつジスルフィド結合によって環状化されている拮抗剤を提供する。任意の１つまたは複数の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を有する本明細書中に記載のペプチド模倣体である拮抗剤を提供する。一部の実施形態では、本発明は、免疫原として使用し得るペプチド模倣体である拮抗剤を提供する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の拮抗剤であって、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片であり、抗体または抗原結合タンパク質が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、単鎖抗体、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、ＣＤＲ移植抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、Ｆｄ断片、ｄＡｂ断片が含まれ得る抗体断片、ならびに二重特異性抗体、ＣＤＲ３ペプチド、拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ナノ抗体、二価ナノ抗体、小モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、およびミニ抗体が含まれ得る抗原結合タンパク質からなる群から選択される拮抗剤を提供する。一部の実施形態では、本発明の拮抗剤はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、本発明の拮抗剤はヒト化抗体である。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる、ＧＤＦ８に特異的な抗体、抗原結合タンパク質またはその断片である拮抗剤を提供する。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明の拮抗剤は、第１のＣＤＲが配列番号１９のアミノ酸配列および配列番号２５のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸を含み、第２のＣＤＲが配列番号２０の配列および配列番号２６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸を含み、第３のＣＤＲが配列番号２１のアミノ酸配列および配列番号２７のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸を含む、第１、第２および第３のＣＤＲを含む重鎖を含む、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号１８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明の拮抗剤は、第１のＣＤＲが配列番号２２のアミノ酸配列および配列番号２８のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸を含み、第２のＣＤＲが配列番号２３のアミノ酸配列および配列番号２９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸を含み、第３のＣＤＲが配列番号２４のアミノ酸配列および配列番号３０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸を含む、第１、第２および第３のＣＤＲを含む軽鎖を含む、抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質である。一部の実施形態では、本発明の拮抗剤は、配列番号１６のアミノ酸配列および配列番号１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質である。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明の拮抗剤は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質である。一部の実施形態では、本発明の拮抗剤は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質である。一部の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の本発明のＧＤＦ８拮抗剤を含む、アミノ酸のうちの任意の１つまたは複数をコードしているポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明の拮抗剤は、ＧＤＦ８と特異的に結合し、ｓｉＲＮＡ分子およびアンチセンス分子からなる群から選択される、阻害性ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、本発明は、本発明の拮抗剤をコードしている、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちの任意の１つまたは複数を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、および配列番号１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号３の核酸配列、配列番号５の核酸配列、配列番号７の核酸配列、配列番号９の核酸配列、配列番号１１の核酸配列、およびその断片の核酸配列からなる群から選択される核酸配列から本質的になる、単離したポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明は、調節配列と作動可能に連結している本発明の任意の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうちの任意のものを含むベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうちの任意の１つまたは複数を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明は、ＧＤＦ８拮抗剤を、本発明のポリヌクレオチドのうちの任意の１つまたは複数を含む本明細書中に記載の培養宿主細胞から産生させ、宿主細胞によって発現されたＧＤＦ８拮抗剤を単離する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のＧＤＦ８拮抗剤を産生する方法によって産生させた、単離したＧＤＦ８拮抗剤を提供する。
【００２９】
本発明の別の態様では、本発明は、（ｉ）試料を（ｉｉ）ＧＤＦ８と特異的に結合する捕捉試薬および（ｉｉｉ）ＧＤＦ８と特異的に結合する検出試薬と合わせるステップと、特異的結合が捕捉試薬とＧＤＦ８との間に起こるかどうかを検出するステップとを含み、特異的結合の検出が試料中のＧＤＦ８の存在を示す、対象からの試料中のＧＤＦ８の存在を検出するためのアッセイを提供する。
【００３０】
本発明の一実施形態では、試料中のＧＤＦ８は、試料中に存在するＧＤＦ８結合タンパク質および抗ＧＤＦ８から解離している。一実施形態では、本発明のアッセイは、試料を本明細書中に記載のように捕捉試薬と合わせる前に、試料を酸性緩衝液と合わせることをさらに含む。別の実施形態では、本発明のアッセイの酸性緩衝液は約ｐＨ１．０〜ｐＨ６．０のｐＨを有する。別の実施形態では、酸性緩衝液のｐＨは約ｐＨ２．５である。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、試料が、血清、全血、血漿、生検試料、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、潤滑液および粘液からなる群から選択される、本明細書中に記載のアッセイのうちの任意の１つまたは複数を提供する。別の実施形態では、本発明は、試料が全血、血清または血漿から選択されることを提供する。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、検出ステップが、サンドイッチアッセイおよび競合的結合アッセイのうちの少なくとも１つを含む本明細書中に記載のアッセイのうちの任意の１つまたは複数を提供する。一部の実施形態では、検出ステップはサンドイッチアッセイを含む。一部の実施形態では、検出ステップは、試料と接触した固体光学表面での屈折率の変化検出、発光の変化の検出、色の変化の測定、放射活性の変化の検出、バイオ層干渉法を用いた測定、カンチレバー検出を用いた測定、無標識内因性イメージングを用いた測定、および音波検出を用いた測定のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、本発明の検出ステップは色の変化を測定する。一部の実施形態では、検出ステップは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光アッセイ（ＥＣＬ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）、免疫ブロッティング、免疫沈降、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）からなる群から選択されるアッセイを含む。別の実施形態では、検出ステップはＥＬＩＳＡを含む。
【００３３】
一実施形態では、ＧＤＦ８の存在は、検出可能な標識をさらに含む化合物と、ＧＤＦ８と特異的に結合する検出試薬との特異的結合によって検出される。別の実施形態では、検出可能な標識は、酵素標識、発光標識、タンパク質標識、ビタミン標識、発色標識、放射同位体標識および高電子密度分子標識からなる群から選択される少なくとも１つの標識を含む。別の実施形態では、検出可能な標識はタンパク質標識であり、ビオチンをさらに含む。
【００３４】
一実施形態では、本発明のアッセイは、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片、ＧＤＦ８結合タンパク質およびＧＤＦ８結合ドメインからなる群から選択される捕捉試薬を提供する。別の実施形態では、本発明のアッセイは、捕捉試薬が抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片であり、ＲＫ３５、ＲＫ２２、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２９およびＪＡ１６からなる群から選択されることを提供する。一部の実施形態では、捕捉試薬はＲＫ３５である。一部の実施形態では、捕捉試薬はＲＫ２２である。
【００３５】
本発明のアッセイの一実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片、ＧＤＦ８結合タンパク質およびＧＤＦ８結合ドメインからなる群から選択される検出試薬を提供する。一実施形態では、検出試薬は、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片であり、ＲＫ２２およびＲＫ３５からなる群から選択される。別の実施形態では、本発明のアッセイは、検出試薬がＲＫ３５であることを提供する。別の実施形態では、本発明のアッセイは、検出試薬がＲＫ２２であることを提供する。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、捕捉試薬がＲＫ２２であり、検出試薬がＲＫ３５であるアッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、捕捉試薬がＲＫ３５であり、検出試薬がＲＫ２２であるアッセイを提供する。
【００３７】
本発明の別の態様では、本発明は、（ｉ）試料を（ｉｉ）ＧＤＦ８と特異的に結合する捕捉試薬および（ｉｉｉ）ＧＤＦ８と特異的に結合する検出試薬と合わせるステップと、特異的結合が捕捉試薬とＧＤＦ８との間に起こるかどうかを検出するステップと、試料中のＧＤＦ８のレベルを定量化するステップとを含み、特異的結合の検出が試料中のＧＤＦ８の存在を示し、定量化することができる、対象からの試料中のＧＤＦ８の存在を定量化するアッセイを提供する。本発明の一実施形態では、試料中のＧＤＦ８が、試料中に存在するＧＤＦ８結合タンパク質および抗ＧＤＦ８から解離していることを提供する。一実施形態では、本発明のアッセイは、試料を本明細書中に記載のように捕捉試薬と合わせる前に、試料を酸性緩衝液と合わせることをさらに含む。別の実施形態では、本発明のアッセイの酸性緩衝液は約ｐＨ１．０〜ｐＨ６．０のｐＨを有する。別の実施形態では、酸性緩衝液のｐＨは約ｐＨ２．５である。
【００３８】
本発明の別の態様では、本発明は、対象においてＧＤＦ８関連障害を治療する（寛解および／または予防することが含まれる）ための医薬組成物であって、薬学的に許容できる担体を含み、少なくとも１つのＧＤＦ８拮抗剤が、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体のアミノ酸をコードしている単離核酸、ＧＤＦ８に特異的な阻害性ポリヌクレオチドおよび抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片からなる群から選択される医薬組成物を提供する。
【００３９】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、および配列番号１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、ＧＤＦ８に特異的な結合ドメインのペプチド模倣体を含む。
【００４０】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、配列番号３の核酸配列、配列番号５の核酸配列、配列番号７の核酸配列、配列番号９の核酸配列、配列番号１１の核酸配列およびその断片の核酸配列からなる群から選択される核酸配列から本質的になる、ＧＤＦ８に特異的なアミノ酸をコードしている単離核酸を含む。
【００４１】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片を含む。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体、抗原結合タンパク質またはその断片が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片を提供する。
【００４２】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは結合しない抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質を含み、配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００４３】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、哺乳動物患者において、筋肉障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性もしくは誘導性骨障害、脂肪障害、グルコース代謝障害、およびインスリン関連障害からなる群から選択されるＧＤＦ８関連障害を治療するために使用する。別の実施形態では、ＧＤＦ８関連障害が、筋ジストロフィー、ＡＬＳ、筋萎縮、臓器萎縮、手根管症候群、虚弱、うっ血性閉塞性肺疾患、筋肉減少症、悪液質、筋消耗症候群、肥満症、２型糖尿病、耐糖能異常、代謝症候群、インスリン抵抗性、栄養障害、早期性腺機能不全、アンドロゲン抑制、二次副甲状腺機能亢進、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、低骨量、ビタミンＤ欠乏症、および神経性無食欲症からなる群から選択される、本発明の医薬組成物。
【００４４】
本発明の別の態様は、ほぼ無毒から無毒である、治療上有効な量の、ＧＤＦ８に特異的な拮抗剤を患者に投与することを含む、哺乳動物患者においてＧＤＦ８関連障害を治療する（寛解および／または予防することが含まれる）方法を提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、本発明の拮抗剤が、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体のアミノ酸をコードしている単離核酸、ＧＤＦ８に特異的な阻害性ポリヌクレオチドおよび抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片からなる群から選択されることを提供する。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、本発明の拮抗剤が、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、および配列番号１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体であることを提供する。
【００４６】
一実施形態では、本発明の治療方法は、本発明の拮抗剤が、配列番号３の核酸配列、配列番号５の核酸配列、配列番号７の核酸配列、配列番号９の核酸配列、配列番号１１の核酸配列、およびその断片の核酸配列からなる群から選択される核酸配列から本質的になる、ＧＤＦ８に特異的なアミノ酸をコードしている単離核酸である治療方法を提供する。
【００４７】
本発明の一実施形態では、本発明の拮抗剤が、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片であり、かつ配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む治療方法を提供する。一部の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明の拮抗剤が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片であり、抗体、抗原結合タンパク質またはその断片が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含むことを提供する。一部の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明の拮抗剤が、配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片であることを提供する。
【００４８】
本発明の一実施形態では、本発明の治療方法は、ＧＤＦ８関連障害が、対象における筋肉障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性もしくは誘導性骨障害、脂肪障害、グルコース代謝障害、およびインスリン関連障害からなる群から選択されることを提供する。本発明の一部の実施形態では、本発明の治療方法は、ＧＤＦ８関連障害が、筋ジストロフィー、ＡＬＳ、筋萎縮、臓器萎縮、手根管症候群、虚弱、うっ血性閉塞性肺疾患、筋肉減少症、悪液質、筋消耗症候群、肥満症、２型糖尿病、耐糖能異常、代謝症候群、インスリン抵抗性、栄養障害、早期性腺機能不全、アンドロゲン抑制、二次副甲状腺機能亢進、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、低骨量、ビタミンＤ欠乏症、および神経性無食欲症からなる群から選択されることを提供する。
【００４９】
本発明の別の態様は、対象から第１の試料を得るステップと、第１の試料を本発明の拮抗剤と合わせるステップと、第１の試料中のＧＤＦ８の存在を検出するステップと、第１の試料中のＧＤＦ８のレベルを定量化するステップと、第２の試料をＧＤＦ８関連障害に罹患していない対象から得るステップと、第２の試料を拮抗剤と合わせるステップと、第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを検出するステップと、第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを定量化するステップと、第１および第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを比較するステップとを含み、第１の試料と比較した第２の試料中のＧＤＦ８のレベルの増加、減少、または類似性が、ＧＤＦ８関連障害の重篤度が変化したかどうかを示す、対象がＧＤＦ８関連障害に罹患しているかどうかを診断、予後診断または検出する方法を提供する。
【００５０】
本発明の別の態様は、（ｉ）対象から第１の試料を得るステップと、（ｉｉ）第１の試料を請求項１から１６のいずれか一項に記載の拮抗剤と合わせるステップと、（ｉｉｉ）第１の試料中のＧＤＦ８の存在を検出するステップと、（ｉｖ）第１の試料中のＧＤＦ８のレベルを定量化するステップと、（ｖ）第２の試料をＧＤＦ８関連障害に罹患していない対象から得るステップと、（ｖｉ）第２の試料を拮抗剤と合わせるステップと、（ｖｉｉ）第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを検出するステップと、（ｖｉｉｉ）第２の試料中のＧＤＦ９のレベルを定量化するステップと、（ｉｘ）第１および第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを比較するステップとを含み、第２の試料と比較した第１の試料中のＧＤＦ８のレベルの増加、減少、または類似性が、ＧＤＦ８関連障害の重篤度が変化したかどうかを示す、ＧＤＦ８関連障害の重篤度を監視する方法を提供する。
【００５１】
本発明の別の態様は、（ｉ）対象から第１の試料を得るステップと、（ｉｉ）第１の試料を請求項１から１６のいずれか一項に記載の拮抗剤と合わせるステップと、（ｉｉｉ）第１の試料中のＧＤＦ８の存在を検出するステップと、（ｉｖ）第１の試料中のＧＤＦ８のレベルを定量化するステップと、（ｖ）第２の試料をＧＤＦ８関連障害に罹患していない対象から得るステップと、（ｖｉ）第２の試料を拮抗剤と合わせるステップと、（ｖｉｉ）第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを検出するステップと、（ｖｉｉｉ）第２の試料中のＧＤＦ９のレベルを定量化するステップと、（ｉｘ）第１および第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを比較するステップとを含み、第１の試料と比較した第２の試料中のＧＤＦ８のレベルの増加、減少、または類似性が、対象がＧＤＦ８関連障害を発生する可能性を示す、対象がＧＤＦ８関連障害を発生する可能性を予後診断する方法を提供する。
【００５２】
本発明の別の態様は、（ｉ）対象から第１の試料を得るステップと、（ｉｉ）第１の試料を請求項１から１６のいずれか一項に記載の拮抗剤と合わせるステップと、（ｉｉｉ）第１の試料中のＧＤＦ８の存在を検出するステップと、（ｉｖ）第１の試料中のＧＤＦ８のレベルを定量化するステップと、（ｖ）第２の試料をＧＤＦ８関連障害に罹患していない対象から得るステップと、（ｖｉ）第２の試料を拮抗剤と合わせるステップと、（ｖｉｉ）第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを検出するステップと、（ｖｉｉｉ）第２の試料中のＧＤＦ９のレベルを定量化するステップと、（ｉｘ）第１および第２の試料中のＧＤＦ８のレベルを比較するステップとを含み、第２の試料と比較した第１の試料中のＧＤＦ８のレベルの増加、減少、または類似性が、対象がＧＤＦ８関連障害を発生する可能性を示す、対象がＧＤＦ８関連障害を発生する可能性を予後診断する方法を提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、哺乳動物患者においてＧＤＦ８関連障害を治療する（寛解および／または予防することが含まれる）ための医薬品の調製における医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容できる担体を含み、少なくとも１つのＧＤＦ８拮抗剤が、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体、ＧＤＦ８結合ドメインのペプチド模倣体のアミノ酸をコードしている単離核酸、ＧＤＦ８に特異的な阻害性ポリヌクレオチドおよび抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片からなる群から選択される使用を提供する。
【００５４】
本発明の別の態様は、対象からの試料中のＧＤＦ８の存在を検出するためのキットであって、ＧＤＦ８と特異的に結合する捕捉試薬およびＧＤＦ８と特異的に結合する検出試薬を含み、ＧＤＦ８と捕捉および検出試薬との特異的結合の検出が、試料中のＧＤＦ８の存在を示すキットを提供する。一部の実施形態では、本発明のキットは、酸性緩衝液をさらに含む。
【００５５】
本発明の別の態様は、対象からの試料中のＧＤＦ８を定量化するためのキットであって、ＧＤＦ８と特異的に結合する捕捉試薬およびＧＤＦ８と特異的に結合する検出試薬を含み、ＧＤＦ８と捕捉および検出試薬との特異的結合の検出が、試料中のＧＤＦ８の定量化を可能にするキットを提供する。一部の実施形態では、本発明のキットは、酸性緩衝液をさらに含む。
【００５６】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の抗体であって、抗体が、ＧＤＦ８とは特異的に結合するがＢＭＰ１１とは特異的に結合しない、抗ＧＤＦ８抗体、抗原結合タンパク質またはその断片であり、抗体または抗原結合タンパク質が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多特異性抗体、単鎖抗体、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、ＣＤＲ移植抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、Ｆｄ断片、ｄＡｂ断片が含まれ得る抗体断片、ならびに二重特異性抗体、ＣＤＲ３ペプチド、拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ナノ抗体、二価ナノ抗体、小モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、およびミニ抗体が含まれ得る抗原結合タンパク質からなる群から選択される抗体を提供する。一部の実施形態では、本発明の拮抗剤はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、本発明の拮抗剤はヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は抗ＧＤＦ８抗体である。一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質である。一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質である。
【００５７】
配列の簡単な説明
ＤＮＡおよびアミノ酸配列を配列表に示し、表１とする。
【００５８】
【表１】
0005756291.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１−１】ＧＤＦ８またはＢＭＰ１１に対するハイブリドーマを発現するＲＫ２２およびＲＫ３５（ＧＤＦ８およびＢＭＰ１１のどちらとも結合する対照抗体）からの上清の様々な濃度（ｎｇ／ｍｌ、ｘ軸）の結合（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ、ｙ軸）を実証する図である。
【図１−２】ＧＤＦ８またはＢＭＰ１１に対するハイブリドーマを発現するＲＫ２２およびＲＫ３５（ＧＤＦ８およびＢＭＰ１１のどちらとも結合する対照抗体）からの上清の様々な濃度（ｎｇ／ｍｌ、ｘ軸）の結合（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ、ｙ軸）を実証する図である。
【図２】ＢＩＡｃｏｒｅ２０００システム、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡによって決定したＲＫ２２抗体とＧＤＦ８との間の相互作用の動態速度定数を示す図である。
【図３】ＧＤＦ８および／またはＢＭＰ１１のどちらかと結合するＲＫ２２およびＲＫ３５抗体ならびに他のＲＫ抗体（Ａ〜Ｅ）の非存在下（１０ｍｇ／ｍｌ）、または様々な濃度の存在下において（Ｍ  Ｉｇ、ｘ軸）、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ８で処置したＡ２０４横紋筋肉腫細胞の、ルシフェラーゼ活性（ＬＣＰＳ、ｙ軸）によって測定した、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２−ＴＧＦ−βプロモーターレポーター遺伝子の活性の誘導を示す図である。
【図４】ＲＫ２２またはＭｙｏ−２９の非存在下（ビヒクル）、または１、１０もしくは４０ｍｇ／ｋｇ／週の存在下において、ビヒクルで４週間処置した後のＳＣＩＤマウスから解剖した腓腹筋、四頭筋、および前脛骨筋の筋肉の重量（ｇ、ｙ軸）を示す図である。
【図５】ＧＤＦ８単独、または様々な濃度（［Ｍ］、ｘ軸）のＲＫ２２、非特異的抗体、他のＲＫ抗体（ＤおよびＥ）、ＡｃｔＲＩＩＢと結合するＧＤＦ８を遮断する対照抗体（ＲＫ３５）、対照ＩｇＧ抗体、もしくは可溶性ＡｃｔＲＩＩＢとプレインキュベーションしたＧＤＦ８による、ＡｃｔＲＩＩＢ（ＯＤ４５０、ｙ軸）との結合を示す図である。
【図６】成熟ＧＤＦ８ペプチド全体を表す４８の個別かつ重複を有する１３個の残基のペプチドと共にインキュベーションした２０ｎｇ／ｍｌの対照抗体、ＲＫ２２抗体のエピトープマッピングドットブロットの結果を示す図である。それぞれのドットブロットの下にＧＤＦ８の配列を示し、抗体のＧＤＦ８エピトープに下線を引いた（それぞれのドットブロットに示される）。
【図７】ＲＫ２２可変重鎖ドメイン（ＲＫ２２＿ＶＨ）とＤＰ−７（ＤＰ−７＿ｇｅｒｍｌ＿ＶＨ）およびＤＰ−５（ＤＰ−５＿ｇｅｒｍｌ＿ＶＨ）のヒト生殖系列フレームワーク配列とのアラインメントを示す図である。ヒト化ＲＫ２２可変重鎖ドメイン中で変化しているマウスＲＫ２２可変重鎖ドメインのアミノ酸をアスタリスクで示し、ＲＫ２２のＣＤＲを四角で囲み、下線を引いた。
【図８】ＲＫ２２可変軽鎖ドメインとＤＰＫ２４  ＶＬのヒト生殖系列フレームワーク配列とのアラインメントを示す図である。ヒト化ＲＫ２２可変軽鎖ドメイン中で変化しているマウスＲＫ２２可変軽鎖ドメインのアミノ酸をアスタリスクで示し、ＲＫ２２のＣＤＲを四角で囲み、下線を引いた。
【図９−１】免疫アッセイ様式の比較を示す図である。ＲＫ３５が捕捉試薬であり、ビオチン化ＲＫ２２が検出試薬である。
【図９−２】ＲＫ２２を捕捉として、ビオチン標識したＲＫ３５を検出抗体として示す図である。
【図１０】以前に記載したＥＬＩＳＡアッセイがバックグラウンドを示し、このバックグラウンドはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）効果である可能性が高いことを実証する図である。アッセイのバックグラウンドは、ＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として使用したモノクローナル抗体ＲＫ２２との血清交差反応性が原因であった。ＲＫ３５を捕捉抗体として使用した場合も同じ効果が観察される（データ示さず）。
【図１１】ＲＫ３５抗体をプレート上にコーティングし、市販の試薬ＩＩＲ（免疫グロブリン阻害試薬−Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、ＮＹ）を用いてＥＬＩＳＡのバックグラウンドが低下した、ＧＤＦ−８  ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ＩＩＲを用いた結果は、緩衝液のみを用いたバックグラウンドより勝る。
【図１２】抗体ＲＫ３５がＭＹＯ−０２９の存在下でＧＤＦ−８と結合しないことを示す図である。ＭＹＯ−０２９抗体をＨＢＸアッセイプレート上にコーティングし、ＧＤＦ−８を１２００ｐｇ／ｍｌで、漸増濃度のビオチン標識した検出抗体（ＲＫ２２またはＲＫ３５）と共に加えた。ビオチン標識したＲＫ３５でシグナルは生じなかった。結果は、ＧＤＦ−８との結合おけるＲＫ３５とＭＹＯ−０２９との間の交差反応性を占めす。
【図１３−１】ＭＹＯ−０２９をＥＬＩＳＡアッセイにおいてＧＤＦ−８の阻害剤として使用できることを示す図である。アッセイ緩衝液または１０％のヒト血清に添加した一定濃度のＧＤＦ−８（２５０ｐｇ／ｍｌ）を用いて、漸増濃度のＭＹＯ−０２９をＧＤＦ−８についてＥＬＩＳＡでアッセイした。図１３Ａは、ＲＫ２２を捕捉抗体として使用した場合に、約３０％のシグナルの阻害が存在することを示す。２ＩＲ（「ＩＩＲ」としても知られる）を使用することによるバックグラウンドシグナル（血清）の低下も示す。全シグナルをグラフで示し、％阻害に変換されていない。
【図１３−２】ＭＹＯ−０２９をＥＬＩＳＡアッセイにおいてＧＤＦ−８の阻害剤として使用できることを示す図である。アッセイ緩衝液または１０％のヒト血清に添加した一定濃度のＧＤＦ−８（２５０ｐｇ／ｍｌ）を用いて、漸増濃度のＭＹＯ−０２９をＧＤＦ−８についてＥＬＩＳＡでアッセイした。図１３Ｂは、ＲＫ３５を捕捉抗体として使用した場合に、阻害がほぼ１００％（５〜２０μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９）であることを示す。２ＩＲ（「ＩＩＲ」としても知られる）を使用することによるバックグラウンドシグナル（血清）の低下も示す。全シグナルをグラフで示し、％阻害に変換されていない。
【図１４−１】ＧＤＦ−８を３個の別々の血清試料（血清＃１、＃２、および＃３）で１００％の血清に加えた、「添加回収実験」の結果を示す図である。それぞれの試料を＋／−２０μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９で分析した。２０μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９を加えることで、試験したすべての濃度のＧＤＦ−８でアッセイシグナルが遮断された（図１３Ａ）。結果は、ＧＤＦ−８の添加に伴った、シグナルの直線状の増加を示す。
【図１４−２】ＧＤＦ−８を３個の別々の血清試料（血清＃１、＃２、および＃３）で１００％の血清に加えた、「添加回収実験」の結果を示す図である。図１３Ｂは、血清を加えたがＭＹＯ−０２９を加えなかった添加回収アッセイの結果を示す。
【図１５】正常なマウス、ノックアウト（ＫＯ）マウスおよびヒト血清で作成した検量線の比較を示す図である。ＴＨＳＴ緩衝液単独での曲線の傾きは、血清で作成したものよりもはるかに急であり、血清中の値を定量化するために使用することができない。
【図１６】ＴＨＳＴ緩衝液で作成された観察されたＧＤＦ８値対予測ＧＤＦ８値を実証する図である。
【図１７】約８０℃まで加熱した場合に、ＭＹＯ−０２９を不活性化／ＧＤＦ−８から解離させることができることを示す実験の結果を表す図である。血清試料にＧＤＦ−８または潜在型ＧＤＦ−８＋／−５μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９を添加し、８０℃まで加熱した。結果は、ＭＹＯ−０２９試料を加熱することでＧＤＦ−８を検出する能力が回復することを示し、これは、ＭＹＯ−０２９がＧＤＦ−８から解離し、８０℃まで加熱した際に活性化されたことを示す。また、結果は、ＭＹＯ−０２９を加熱した試料に再度加えた場合に、ＧＤＦ−８シグナルが再度低下することも示す。また、成熟ＧＤＦ−８試料と比較して、潜在型ＧＤＦ−８を添加した試料よりもさらに顕著な、加熱した際の内在性ＧＤＦ−８シグナルの増加も示す。
【図１８】ＧＤＦ−８をヒト血清から枯渇させる前および後の、ＧＤＦ−８のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。正常なヒト血清＋／−２０μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９をＧＤＦ−８について、室温（「ＲＴ」）でおよび８０℃まで加熱した後に分析した。これらの値を、６５℃まで１０分間事前に加熱し、１ｍｇのＭＹＯ−０２９親和性カラムに３回通すことによって最初にＧＤＦ−８を枯渇させた同じ試料と比較した。結果により、ＧＤＦ−８をヒト血清から枯渇させることは、このＥＬＩＳＡにおいてＧＤＦ−８のバックグラウンドレベルを低下させるために有効であることが示される。また、結果は、枯渇させた血清を加熱することでは、正常な血清を加熱した際に観察された最初のシグナルの増加が示されないことも示す。この加熱した／ＧＤＦ−８を枯渇させた（Ｈ／Ｄ）血清は、ＧＤＦ−８検量線の作成に使用することができる。
【図１９】加熱し、ＧＤＦ−８を枯渇させ、その後、漸増濃度の成熟ＧＤＦ−８または潜在型ＧＤＦ−８を添加した血清で作成した検量線のグラフを示す図である。検量線は、室温（ＲＴ）でまたは８０℃まで加熱してアッセイした。潜在型ＧＤＦ−８を添加した血清試料は、成熟ＧＤＦ−８を添加した試料では観察されなかった、加熱後の大きなシグナル増加を示す。
【図２０】異なるプレート上で連続する２日間に実行した２つの検量線の分析を示す図である。既知の濃度の成熟ＧＤＦ−８を有する加熱した／ＧＤＦ−８を枯渇させた血清を用いて、検量線を作成する。それぞれの曲線からのＯＤ値を、成熟ＧＤＦ−８濃度に対してプロットする。非線形回帰曲線のフィッティングは、加熱した／ＧＤＦ−８を枯渇させた血清で作成されたＧＤＦ−８値のより正確な相関である。曲線のフィッティングは、線形回帰曲線よりも良好な相関係数および高い精度範囲を有する。Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈのソフトウェアを用いて、ＧＤＦ−８  ＥＬＩＳＡアッセイで作成されたＯＤ値からＧＤＦ−８濃度を計算した。
【図２１】９個の正常な血清試料中の遊離および全ＧＤＦ−８を測定するためのアッセイの結果を示す図である。結果は＋／−ＭＹＯ−０２９として示す。値はｐｇ／ｍｌのＧＤＦ−８で表し、１００％の血清中のＧＤＦ−８の内在性レベルに対応する。
【図２２】８個の正常な血清試料中の遊離および全ＧＤＦ−８を測定するためのアッセイの結果を示す図である。グラフは、２日の別々の日に実施した２つの別々の実験を表す。実験の２回目の日に、全ＧＤＦ−８は、試料を１０分間加熱することによって（実験の１回目の日に実施した５分間の加熱と比較して）分析した。値の範囲は、遊離ＧＤＦ−８で２２７〜１２４１ｐｇ／ｍｌ、全ＧＤＦ−８で５１４〜４３２９ｐｇ／ｍｌであった。
【図２３】熱変性後にＥＬＩＳＡによってＧＤＦ−８を測定するためのアッセイの結果を示す図である。ヒト血清のアリコートを室温で１時間、＋／−１０μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９でインキュベーションした。次に、試料を、ＥＬＩＳＡ分析の前に勾配熱サイクラーで様々な温度で熱変性した。試験試料中のＧＤＦ−８レベルの定量化は、ＧＤＦ−８を枯渇させたプールしたヒト血清内に添加した既知の濃度の精製した組換えＧＤＦ−８二量体の希釈系列からなる検量線のアッセイ結果からの内挿によって、アフィニティークロマトグラフィーによって行った。ＭＹＯ−０２９の非存在下におけるＧＤＦ−８の最大検出は約６０℃で起こる。ＭＹＯ−０２９の存在は、血清中のＧＤＦ−８の検出を低温で遮蔽するが、６５℃より高い温度では、ＧＤＦ−８の検出は部分的に回復した。
【図２４】ＧＤＦ−８を、ＭＹＯ−０２９の存在下で、低ｐＨで検出できることを示す図である。図２４Ａでは、ＴＨＳＴ緩衝液＋／−１０μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９で希釈したＧＤＦ−８二量体を、中性ｐＨのアッセイ緩衝液（ＴＨＳＴ）、２００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０（ＮａＯＡｃ）、２００ｍＭのリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ３もしくは７（ＰＯ４Ｃｉｔ）、または２００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５（Ｇｌｙ）のいずれかで５倍希釈した。その後、試料を、ＴＨＳＴ緩衝液または非緩衝トリスのどちらかを含有するＥＬＩＳＡウェル（ＲＫ３５抗体でコーティング）に１：１で希釈した。様々なｐＨおよび緩衝能力の溶液を用いてＧＤＦ−８を希釈し、続いてＴＨＳＴまたは非緩衝トリスで希釈することで、約３〜８のｐＨ範囲での分析物捕捉ステップの効率の測定が可能となった。中性ｐＨに近づくアッセイ条件下では、ＭＹＯ−０２９はＧＤＦ−８の検出を低下させた（ＴＨＳＴ／ＴＨＳＴ）。グリシン−ＨＣｌで酸性化し、続いてＴＨＳＴ緩衝液で希釈したＧＤＦ−８は、ＭＹＯ−０２９の結合を防止するために十分に低ｐＨを維持し、ＭＹＯ−０２９の存在下または非存在下でＧＤＦ−８の完全な検出が可能であった（Ｇｌｙ／ＴＨＳＴ）。しかし、グリシンで酸性化したＧＤＦ−８を非緩衝トリスで希釈することで、７を超えるｐＨの分析物捕捉条件がもたらされ、ＭＹＯ−０２９の存在下でＧＤＦ−８の検出が低下した（Ｇｌｙ／非緩衝トリス）。図２４Ｂは、ｐＨ３（左パネル）およびｐＨ７（右パネル）でのＥＬＩＳＡアッセイの模式図を示す。
【図２５】マウス抗体ＲＫ３５が酸性条件下でＧＤＦ−８と結合する一方で、ＭＹＯ−０２９は結合しないことを示す実験の結果を提供する図である。ヒト血清を、＋／−様々な濃度のＲＫ３５またはＭＹＯ−０２９でプレインキュベーションし、ＴＨＳＴ緩衝液（中性ｐＨ）またはグリシン−ＨＣｌ（酸性ｐＨ）で５倍に希釈した。その後、血清を、プレートと結合したＲＫ３５およびＴＨＳＴまたはグリシン−ＨＣｌ緩衝液のどちらかを含有するＥＬＩＳＡウェルに加えた。ＲＫ３５またはＭＹＯ−０２９の非存在下では、複合体の解離および遊離ＧＤＦ−８タンパク質の放出が原因で、中性条件よりも酸性条件下で多くの内在性ＧＤＦ−８が検出された（最初の２つのバーを参照）。最後の６つのバーは、酸性ｐＨで得られたデータを表す。溶液中の漸増量のＲＫ３５が、プレートと結合したＲＫ３５と結合するＧＤＦ−８と結合して競合することができ、酸性条件下でＧＤＦ−８の検出の減少がもたらされた。ＭＹＯ−０２９は、ｐＨ３に近づく溶液中でＧＤＦ−８と結合することができず、溶液中のＧＤＦ−８は、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたＲＫ３５抗体との結合に利用可能なまま残された。
【図２６】ＭＹＯ−０２９濃度を１００μｇ／ｍｌまで増加することでは、酸解離ＥＬＩＳＡプロトコルを用いたＧＤＦ−８の検出が消失しなかったことを示す図である。ヒト血清＋／−１０、４０、または１００μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９を熱または酸解離後にアッセイした。ＧＤＦ−８の濃度は、ＧＤＦ−８を枯渇させたプールしたヒト血清に添加した組換えＧＤＦ−８成熟二量体の検量線からの内挿によって推定した。ＭＹＯ−０２９の非存在下では、血清中のＧＤＦ−８の濃度は、分析物捕捉を中性ｐＨ付近で行った場合に約１ｎｇ／ｍｌまでであると決定された（ＨＳ）。熱解離による血清結合タンパク質の放出後のＧＤＦ−８の検出は、ＭＹＯ−０２９の非存在下では約３ｎｇ／ｍｌまでであった（ＨＳ＋Ｍｙｏ、６３℃、Ａｂなし）。ＭＹＯ−０２９の存在下では、試験した最も低い濃度ででも、熱解離によってＭＹＯ−０２９が存在しない場合と同じレベルの検出を可能にすることはできなかった（ＨＳ＋ＭＹＯ、７３℃）。血清試料の酸処理では、存在するＭＹＯ−０２９の量とは独立して、非常に類似した量のＧＤＦ−８が検出された（ＨＳ＋ＭＹＯ、酸）。
【図２７】分析物捕捉中の酸性条件によりアッセイの特異性が低下しないことを実証する図である。血清の酸性化は、試験したすべての野生型（ＷＴ）動物、カニクイザル（ＮＨＰ−３１）、マウス（ＷＴ  Ｍｍ）、および乳牛（ＷＴウシ）において、より高いシグナル検出をもたらした（白いバー対黒いバー）。中性または酸性ｐＨで測定した、遺伝子操作したＧＤＦ−８ノックアウト（ＫＯ  Ｍｍ）マウスまたは天然に存在するＧＤＦ−８  ＫＯベルジアンブルー牛（ＫＯウシ）のいずれかの血清では、プレートのバックグラウンドを超えるシグナルを生じることができなかった。
【図２８】較正標準の逆算した濃度のその相対誤差に関して、５個のＧＤＦ−８  ＥＬＩＳＡプレートの検量線のフィッティングの３つの異なる方法を対比する図である。５個のＧＤＦ−８  ＥＬＩＳＡプレートからの結果をプロットする。相対誤差とは、（Ｂ−Ｎ）／Ｎ×１００として定義され、式中、Ｂは検量線を用いた標準物質の逆算した濃度であり、Ｎは標準物質の名目濃度である。３つの曲線のフィッティング方法は、１）図３６Ａ−最小二乗（ＬＳ）による光学密度に対する４個のパラメータのロジスティックモデル、２）図３６Ｂ−ＬＳによる光学密度の平方根に対する４個のパラメータのロジスティックモデル、および３）図３６Ｃ−ＬＳによる光学密度の平方根に対する５個のパラメータのロジスティックモデルであった。基準線は−２０および２０である。
【図２９−１】正常およびミオスタチンヌルの動物中の血清ミオスタチンレベルを示す図である。ベルジアンブルー畜牛、正常な畜牛（ｗｔウシ）、ミオスタチンヌルマウス（ｍｓｔｎ  ＫＯマウス）および野生型同腹仔（ｗｔマウス）からの血清を、解離性の酸性条件下（ｐＨ２．５）で測定し、値は、ミオスタチン欠乏血清マトリックス中の組換えヒトミオスタチンの検量線から外挿した。バーは、同型試料（ｎ＝３）の平均＋／−ＳＤを表す。ミオスタチンヌル動物中のミオスタチン濃度は、最も低い較正物質試料の濃度（１４７ｐｇ／ｍｌ）よりも低い。
【図２９−２】漸増濃度の抗ミオスタチン抗体ＭＹＯ−０２９または可溶性ミオスタチン受容体ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを加えた後に、非解離性（ｐＨ８．０、パネルＢ）条件下で、ミオスタチンＥＬＩＳＡで測定した、カニクイザルの血清中のミオスタチンレベルを示す図である。バーは同型試料（ｎ＝３）の平均＋／−ＳＤを表す。破線はＬＬＱを示す。
【図２９−３】漸増濃度の抗ミオスタチン抗体ＭＹＯ−０２９または可溶性ミオスタチン受容体ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを加えた後に、解離性（ｐＨ２．５、パネルＣ）条件下で、ミオスタチンＥＬＩＳＡで測定した、カニクイザルの血清中のミオスタチンレベルを示す図である。バーは同型試料（ｎ＝３）の平均＋／−ＳＤを表す。破線はＬＬＱを示す。
【図３０−１】若年および高齢の男性における、血清ミオスタチンレベル（平均、ＳＤ、中央値ならびに第１および第３の四分位値）の箱ひげ図である。箱中の水平線は平均を表し、箱の下および上の境界は第１および第３の四分位数を表し、垂直バーはＳＤを表す。＊、Ｐ＝０．０３。
【図３０−２】若年男性におけるベースラインミオスタチンレベルと除脂肪体重との相関を示す回帰プロットである。
【図３０−３】高齢男性におけるベースラインミオスタチンレベルと除脂肪体重との相関を示す回帰プロットである。
【図３１−１】段階づけた用量のテストステロンの投与に応答した、若年男性におけるミオスタチンレベルの変化を示す図である（バー図は、ベースライン、ならびに５６および１４０日目の平均＋／−ＳＥＭレベルを示す。図３１Ａは、若年（左パネル）および高齢の男性（右パネル）における、ベースライン、治療５６日目および１４０日目のミオスタチンレベルを示す。データは平均＋／−ＳＥＭである。＊、Ｐ値はベースラインレベルと比較したもの。１４０日目のミオスタチンレベルは、ベースラインレベルと有意に異なっていなかった。
【図３１−２】段階づけた用量のテストステロンの投与に応答した、若年男性におけるミオスタチンレベルの変化を示す図である。図３１Ｂは、若年および高齢の男性における、ベースラインから５６日目までの、血清ミオスタチンレベルのベースラインからの％変化を示す。＊、Ｐ＝０．０３
【図３２−１】若年および高齢の男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの変化と全テストステロン濃度の変化との相関を示す回帰プロットである。図３２Ａは、若年男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの％変化および血清全テストステロン濃度の％変化の線形回帰プロットを示す。図３２Ｂは、高齢男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの％変化および血清全テストステロン濃度の％変化の線形回帰プロットを示す。
【図３２−２】若年および高齢の男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの変化と遊離テストステロン濃度の変化との相関を示す回帰プロットである。図３２Ｃは、若年男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの％変化および無血清テストステロン濃度の％変化の線形回帰を示す。図３２Ｄは、高齢男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの％変化および無血清テストステロン濃度の％変化の線形回帰を示す。
【図３２−３】若年および高齢の男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの変化と除脂肪体重の変化との相関を示す回帰プロットである。図３２Ｅは、若年男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの％変化およびベースラインから１４０日目の除脂肪体重の％変化の線形回帰を示す。図３２Ｆは、高齢男性における、ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの％変化およびベースラインから１４０日目の血清除脂肪体重の％変化の線形回帰を示す。
【図３３】月経期若年女性、手術閉経女性、および高齢の女性における、ミオスタチンレベル（平均、ＳＤ、中央値ならびに第１および第３の四分位値）の箱ひげ図である。箱中の水平線は平均を表し、箱の下および上の境界は第１および第３の四分位数を表し、垂直バーはＳＤを表す。３つのグループ中のミオスタチンレベルは統計的に有意でなかった。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、複数形へ言及が含まれる。
【００６１】
本明細書中で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリンまたはその断片をいい、それだけには限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多特異性抗体、単鎖抗体、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、ＣＤＲ移植抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、Ｆｄ断片、およびｄＡｂ断片が含まれる抗体断片、または、抗原結合機能を保持する、前述のものの任意の化学的もしくは遺伝子的に操作された対応物が含まれる。
【００６２】
また、本発明は、本明細書中に記載の抗体とは異なる抗原結合タンパク質も提供し、これには、二重特異性抗体、ＣＤＲ３ペプチド、拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ナノ抗体（米国特許出願第２００８／０１０７６０１号）、二価ナノ抗体、小モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン（ＷＯ０３／０１４１６１号）、ミニ抗体および抗原結合機能を保持する、任意の断片または化学的もしくは遺伝子的に操作された対応物が含まれる。典型的には、そのような断片は抗原結合ドメインを含む。当業者には理解されるように、そのような分子のうちの任意のもの、たとえば、「ヒト化」抗体または抗原結合タンパク質を、その免疫原性を減少させるため、その親和性を増加するため、その特異性を変更するため、または他の目的のために、操作（たとえば「生殖系列化」）し得る。
【００６３】
本発明の抗体は、たとえば、伝統的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９９（１９７５））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリを用いたファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１））によって作製することができる。様々な他の抗体産生技術には、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照されたい。用語「抗原」とは、動物において、抗体もしくはＴ細胞応答、または両方の産生を刺激することができる、化合物、組成物、または免疫原性物質をいい、動物内に注射または吸収される組成物が含まれる。免疫応答は、分子全体、または分子の一部分（たとえば、エピトープまたはハプテン）に対して生じさせ得る。この用語は、個々の巨大分子または抗原性巨大分子の同種もしくは異種の集団をいうために使用し得る。抗原は、特定の液性および／または細胞性免疫の産物と反応する。用語「抗原」には、タンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、核酸、オリゴ糖、多糖類、有機もしくは無機化合物または組成物などを含めた部分を幅広く包含される。用語「抗原」には、すべての関連する抗原性エピトープが含まれる。所定の抗原のエピトープは、当分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａを参照されたい。たとえば、直鎖状エピトープは、たとえば、タンパク質分子の部分に対応する多数のペプチドを固体担体上で同時に合成し、ペプチドを担体に付着させたままでペプチドを抗体と反応させることによって決定し得る。そのような技術は当分野で知られており、たとえば、そのすべてが全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第４，７０８，８７１号、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３９９８〜４００２、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：７０９〜７１５に記載されている。同様に、コンホメーションエピトープは、たとえば、Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴によってなど、アミノ酸の空間コンホメーションを決定することによって容易に同定される。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、上記を参照されたい。さらに、本発明の目的のために、「抗原」には、タンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持している限りは、ネイティブ配列への欠失、付加および置換などの修飾（一般に保存的な性質であるが、非保存的であってもよい）も含まれ得る。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるもの、特定の合成手順によるもの、もしくは遺伝子操作手法によるものなどの計画的、または、抗原を産生��る宿主の突然変異によるものなどの偶発的なものであり得る。さらに、抗原は、任意のウイルス、細菌、寄生生物、原虫、または真菌に由来するか、またはそれから得ることができ、生物全体であることができる。同様に、核酸免疫化の適用におけるものなどの、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも定義に含まれる。合成抗原、たとえば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ、および他の組換えまたは合成誘導した抗原も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：２７７７  ２７８１、Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：３２４２  ３２４９、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７５：４０２  ４０８、Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）１２ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、スイスＧｅｎｅｖａ、１９９８年６月２８日  ７月３日）。
【００６４】
用語「抗原結合ドメイン」、「抗体の活性断片」、または抗原結合タンパク質などとは、抗原の一部または全部と特異的に結合するまたはそれに相補的な領域を含む、抗体または抗原結合タンパク質分子の一部をいう。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分とのみ結合し得る。「エピトープ」、「エピトープの活性断片」、または「抗原決定基」などとは、抗体の抗原結合ドメインとの特異的な相互作用を担っている抗原分子の一部分である。抗原結合ドメインは、１つまたは複数の抗体可変ドメイン（たとえば、ＶＨドメインからなるいわゆるＦｄ抗体断片）によって提供し得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み得る（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【００６５】
「試料」とは、たとえば分析物を検出するために、細胞、組織、臓器、または生物から収集した生体物質である。例示的な生体試料には、血清、血液、血漿、生検試料、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、潤滑液、粘液、ならびに他の臨床的検体および試料が含まれる。
【００６６】
用語「捕捉試薬」とは、生体試料中で検出する標的分子または分析物と結合することができる試薬、たとえば抗体または抗原結合タンパク質をいう。典型的には、捕捉試薬は、たとえばアッセイ表面、たとえば、固体基質または反応器上に固定する。「ＧＤＦ−８捕捉試薬」はＧＤＦ−８と特異的に結合する。
【００６７】
「検出試薬」とは、標的タンパク質、たとえばＧＤＦ−８と特異的に結合するために本発明の免疫アッセイで使用する試薬、たとえば、抗体または抗原結合タンパク質である。検出試薬は、検出可能な標識を含んでいてもよい。検出試薬は、典型的には、捕捉試薬のそれとは明確に異なる結合部位またはエピトープで、標的タンパク質を認識して結合する。検出試薬は検出可能な標識とカップリングしていてよい。「ＧＤＦ−８検出試薬」はＧＤＦ−８と特異的に結合する。
【００６８】
用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、一緒になって抗原結合ドメインを形成する、重鎖からの３個のループおよび軽鎖からの３つからなる、抗体または抗原結合タンパク質分子の超可変領域をいう。
【００６９】
用語「検出すること」とは、最も広い意味で使用され、標的分析物の定性的および定量化的な測定の両方、本明細書中ではＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１などの特定の標的分子の測定が含まれる。本明細書中に記載のアッセイ方法は、生体試料中のＧＤＦ−８もしくはＢＭＰ−１１の存在を同定するために使用することができ、または試料中のＧＤＦ−８もしくはＢＭＰ−１１の量を定量するために使用し得る。
【００７０】
「検出剤」または「検出試薬」は、間接標識を含む検出抗体または抗原結合タンパク質から生じるシグナルを検出するために、本発明の方法で使用し得る。検出剤または試薬とは、ＧＤＦ−８変調剤または複合体の検出を可能にする、タンパク質または小分子である。好ましい実施形態では、検出剤はＧＤＦ−８変調剤と特異的に結合する。検出剤は、検出可能な標識を含んでいてもよい。また、検出剤は、それ自体が、検出可能な標識を含む物質によって検出され得る。また、本明細書中に提供する方法によって検出されたＧＤＦ−８変調剤も、たとえば、他のＧＤＦ−８変調剤を検出する方法で使用し得る。
【００７１】
「ＧＤＦ８活性に関連する障害」、「ＧＤＦ８に関連する障害」、「ＧＤＦ８関連障害」などとは、完全にもしくは部分的に、ＧＤＦ８の調節不全（たとえば、異常に増加もしくは減少したＧＤＦ８の発現および／もしくは活性）によって引き起こされ得る障害、ならびに／または、ＧＤＦ８タンパク質および／もしくは活性を調節および／もしくは監視することによって治療、寛解、予防、予後診断、および／もしくは監視し得る障害をいう。ＧＤＦ８関連障害には、筋肉障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性もしくは誘導性骨障害、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害が含まれる。
【００７２】
用語「有効用量」、「治療上有効な用量」または「有効量」とは、ＧＤＦ−８関連障害に罹患している個体を含めた個体において、臨床的症状を寛解させる、または所望の生物学的結果（たとえば、筋肉量、筋肉強度および／もしくは骨密度の増加）を達成するために十分な、用量またはレベルをいう。そのような量は、たとえば、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ−８の活性を低下させるために十分であろう。治療結果および臨床的症状には、筋肉量の増加、心血管指標の改善またはグルコース代謝調節の改善が含まれ得る。ＧＤＦ−８阻害剤は、たとえば、筋肉量、筋肉強度を増加する、筋肉特異的酵素のレベルを変調するおよび／または筋芽細胞の増殖を刺激することができる。好ましい実施形態では、ＧＤＦ−８阻害剤はＧＤＦ−８関連障害の臨床徴候を低下させる。ＧＤＦ−８変調剤は、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を変調する、脂肪蓄積を減少させる、血清トリグリセリドレベルを減少させる、血清コレステロールレベルを減少させる、グルコース代謝を変調する、骨密度を変調するおよび高血糖症を低下させることができる。また、ＧＤＦ−８阻害剤は、筋肉量を増加させるため、筋肉成長を含めた成長を増加または加速させるためにも、個体に投与し得る。治療上有効な量のＧＤＦ−８阻害剤とは、個体に単一または複数用量で投与した場合に、障害もしくは再発性障害の少なくとも１つの症状を治療、予防、治癒、遅延、重篤度を低下させるもしくは寛解させるため、または、そのような治療が存在しない場合に予測されるよりも対象の生存を延長するために有効な量をいう。
【００７３】
ＧＤＦ−８関連障害に罹患している個体、ＧＤＦ−８関連障害を発生する危険性にある個体、ＧＤＦ−８変調剤を用いて治療を受けている個体、およびＧＤＦ−８変調剤を投与する候補である個体が、本明細書中に提供する方法の候補であり得る。本発明の方法は、有害な免疫応答を検出もしくは予防する、および／またはＧＤＦ−８変調剤を使用することの有効性、生物学的安定性もしくは適合性を評価し得る。
【００７４】
筋肉関連障害または神経筋障害などのＧＤＦ−８関連障害に罹患している、またはそれを発生する危険性にある個体が、本明細書中に提供する方法の候補である。ＧＤＦ−８活性の阻害は、筋肉関連障害を患っているものを含めた個体において筋組織を増加させる。いくつかの障害が筋肉または神経組織の機能障害に関連づけられており、たとえば、それだけには限定されないが、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋萎縮、または虚弱である。筋ジストロフィーには、たとえば、仮性肥大型、顔面肩甲上腕型、および肢帯型ジストロフィーが含まれる。例示的な筋ジストロフィーには、デュシェーヌ型筋ジストロフィー（レイデン−メビウス）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリドレフュス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、脊椎硬直症候群、ウルリッヒ症候群、福山型筋ジストロフィー、ウォーカーワールベルグ症候群、筋肉目脳病、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ランドウジー−デジェリン）、先天性筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー（スタイナート病）、および他の筋緊張症ならびにガウアー病が含まれる。
【００７５】
また、ＧＤＦ−８関連筋肉障害には、心血管病に関連する筋変性も含まれ、または、臓器萎縮、臓器不全、癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、安静臥床、不動、長期的な使用の欠如、または他の疾患もしくは状態などの、別の疾患または状態に続発性のものから選択される障害も、この用語に含まれる。
【００７６】
脂肪組織障害に罹患しているまたはそれを発生する危険性にある個体、たとえば、肥満症、心血管障害（筋肉損失または筋消耗に関連する場合）およびインスリン代謝の障害が候補であり得る。同様に、特に高齢者および／または閉経後の女性の骨粗鬆症、糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、ならびに骨粗鬆症関連骨折を含めた、骨の損失に関連する障害に罹患しているまたはそれを発生する危険性にある個体が、本明細書中で提供する治療方法の候補である。他のＧＤＦ−８関連状態には、代謝性骨疾患ならびに低骨量によって特徴づけられた障害、たとえば、慢性糖質コルチコイド療法、早期性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次副甲状腺機能亢進、栄養障害、および神経性無食欲症によるものなどが含まれる。
【００７７】
心血管障害の例には、冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）、狭心症（急性および不安定狭心症が含まれる）、心臓発作、脳卒中（虚血性脳卒中が含まれる）、高血圧関連心血管病、心不全、鬱血性心不全、冠動脈疾患、高血圧、高脂血症、末梢動脈疾患、ならびに末梢血管疾患が含まれる。インスリン代謝の障害の例には、異常なグルコース恒常性に関連する状態、２型糖尿病、糖尿病前症、耐糖能異常、異常脂質血症、代謝症候群（たとえば症候群Ｘ）、および熱傷または窒素不均衡などの外傷によって誘導されたインスリン抵抗性が含まれる。
【００７８】
用語「ＧＤＦ−８」とは、特定の成長および分化因子−８をいい、「ミオスタチン」とも呼び得る。この用語は、ＧＤＦ−８の完全長の未プロセッシング前駆体形態、ならびに翻訳後切断から生じる成熟およびプロペプチド形態をいう。「不活性」として別段に指定しない限りは、「ＧＤＦ−８タンパク質」は、１つまたは複数のＧＤＦ−８の生物活性を保持する。また、この用語は、本明細書中で記載したように、成熟ＧＤＦ−８に関連する少なくとも１つの生物活性を維持するＧＤＦ−８の任意の断片および変異体もいい、修飾された配列も含まれる。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列を配列番号１に提供する。本発明は、それだけには限定されないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚を含めた、すべての脊椎動物種からのＧＤＦ−８に関する（配列情報には、たとえば、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２４５７〜１２４６１（１９９７）を参照）。
【００７９】
用語「ＧＤＦ−８活性」とは、活性ＧＤＦ−８タンパク質に関連する、１つまたは複数の生理的な成長調節または形態形成の活性をいう。たとえば、活性ＧＤＦ−８は、骨格筋量の負の調節因子である。また、活性ＧＤＦ−８は、筋肉に特異的な酵素（たとえばクレアチンキナーゼ）の産生を変調する、筋芽細胞の増殖を刺激する、および前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を変調することもできる。「ＧＤＦ−８活性」には「ＧＤＦ−８結合活性」が含まれる。たとえば、成熟ＧＤＦ−８は、ＧＤＦ−８のプロペプチド領域、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ−８受容体、アクチビン、フォリスタチン、フォリスタチンドメイン含有タンパク質、ＧＡＳＰ−１、および他のタンパク質と特異的に結合する。抗体もしくは抗原結合タンパク質またはその一部分などのＧＤＦ−８阻害剤は、これらの結合活性のうちの１つまたは複数を低下させ得る。ＧＤＦ−８の生物活性は当業者に周知であり、たとえば、米国特許出願第２００４／０２２３９６６号の実施例５〜６および８〜１２を参照されたい。
【００８０】
「ＧＤＦ−８関連障害」とは、ＧＤＦ−８阻害剤などのＧＤＦ−８モジュレーターを投与することで対象が利点を受ける障害または状態である。ＧＤＦ−８関連障害には、筋肉関連または神経筋の障害または状態などの医学的障害、たとえば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋萎縮、または消耗、萎縮、もしくは虚弱を含めた筋変性が含まれる。筋ジストロフィーには、たとえば、仮性肥大型、顔面肩甲上腕型、および肢帯型筋ジストロフィーが含まれる。例示的な筋ジストロフィーには、デュシェーヌ型筋ジストロフィー（レイデン−メビウス）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリドレフュス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、脊椎硬直症候群、ウルリッヒ症候群、福山型筋ジストロフィー、ウォーカーワールブルグ症候群、筋眼脳病、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ランドウジー−デジェリン）、先天性筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー（スタイナート病）、および他の筋緊張症、ならびにガウアー病が含まれる。
【００８１】
心血管病に関連する筋変性、ありは、臓器萎縮、臓器不全、癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、安静臥床、不動、長期的な使用の欠如、または他の疾患もしくは状態などの、別の疾患または状態に続発性のものも、この用語に含まれる。
【００８２】
また、ＧＤＦ−８関連障害には、脂肪組織障害（たとえば肥満症）、心血管病または障害（筋肉損失または筋消耗に関連する場合）、およびインスリン代謝の障害も含まれる。また、ＧＤＦ−８関連障害には、特に高齢者および／または閉経後の女性の骨粗鬆症、糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、ならびに骨粗鬆症関連骨折を含めた、骨の損失に関連する障害も含まれる。他の状態には、代謝性骨疾患および低骨量によって特徴づけられた障害、たとえば、慢性糖質コルチコイド療法、早期性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次副甲状腺機能亢進、栄養障害、および神経性無食欲症によるものなどが含まれる。
【００８３】
心血管障害の例には、冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）、狭心症（急性狭心症および不安定狭心症が含まれる）、心臓発作、脳卒中（虚血性脳卒中が含まれる）、高血圧関連心血管病、心不全、鬱血性心不全、冠動脈疾患、高血圧、高脂血症、末梢動脈疾患、ならびに末梢血管疾患が含まれる。インスリン代謝の障害の例には、異常なグルコース恒常性に関連する状態、２型糖尿病、糖尿病前症、耐糖能異常、異常脂質血症、代謝症候群（たとえば症候群Ｘ）、および熱傷または窒素不均衡などの外傷によって誘導されたインスリン抵抗性が含まれる。
【００８４】
用語「ＧＤＦ−８潜在型複合体」とは、成熟ＧＤＦ−８ホモ二量体とＧＤＦ−８プロペプチドとの間で形成されたタンパク質の複合体をいう。２個のＧＤＦ−８プロペプチドがホモ二量体中の２個の成熟ＧＤＦ−８の分子と会合して、不活性の四量体複合体を形成すると考えられている。潜在型複合体には、ＧＤＦ−８プロペプチドのうちの１つもしくは複数の代わりに、またはそれに加えて、他のＧＤＦ阻害剤が含まれ得る。
【００８５】
用語「成熟ＧＤＦ−８」とは、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質のカルボキシ末端ドメインから切断されるタンパク質をいう。成熟ＧＤＦ−８は、単量体、ホモ二量体、またはＧＤＦ−８潜在型複合体として存在し得る。条件に応じて、成熟ＧＤＦ−８は、これらの異なる形態の任意またはすべてのものの間で平衡を確立していてもよい。その生物活性形態では、成熟ＧＤＦ−８は「活性ＧＤＦ−８」とも呼ばれる。生物活性のあるＧＤＦ−８はＧＤＦ−８潜在型複合体の形態にはない。また、この用語は、本明細書中に記載したように、成熟ＧＤＦ−８に関連する少なくとも１つの生物活性を維持するＧＤＦ−８の任意の断片および変異体もいい、修飾された配列も含まれる。
【００８６】
用語「ＧＤＦ−８プロペプチド」とは、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質のアミノ末端ドメインから切断されたポリペプチドをいう。ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８上のプロペプチド結合ドメインと結合することができる。ＧＤＦ−８プロペプチドは成熟ＧＤＦ−８ホモ二量体と複合体を形成する。２個のＧＤＦ−８プロペプチドがホモ二量体中の２個の成熟ＧＤＦ−８の分子と会合して、「潜在型複合体」と呼ばれる不活性の四量体複合体を形成すると考えられている。潜在型複合体には、ＧＤＦ−８プロペプチドのうちの１つもしくは複数の代わりに、またはそれに加えて、他のＧＤＦ阻害剤が含まれ得る。
【００８７】
用語「ＧＤＦ−８変調剤」には、ＧＤＦ−８の活性、発現、プロセッシング、もしくは分泌を変調することができる任意の薬剤、またはその薬学的に許容できる誘導体が含まれる。ＧＤＦ−８変調剤は、１つまたは複数のＧＤＦ−８活性を増加または減少させる。「ＧＤＦ−８阻害剤」を含めたＧＤＦ−８モジュレーターは、たとえば、脂肪細胞障害、グルコース代謝関連障害、または骨障害を治療するために使用し得る。ＧＤＦ−８変調剤の生物学的誘導体がこの用語によって包含される。特定の実施形態では、ＧＤＦ−８変調剤または阻害剤は、ＧＤＦ−８と、それだけには限定されないが、受容体（たとえばＡｃｔＲＩＩＢ）、フォリスタチンドメイン含有タンパク質（たとえば、フォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＧＡＳＰ−１、ＧＡＳＰ−２）、またはＧＤＦ−８プロペプチドなどのＧＤＦ−８タンパク質ならびにその突然変異体および誘導体を含めた、その生理的結合パートナーのうちの１つまたは複数との結合に影響を与える。ＧＤＦ−８変調剤には、たとえば、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体（ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２、ＪＡ−１６、およびその断片や誘導体が含まれる）、ＧＤＦ−８受容体と特異的に結合する抗体（たとえば、米国特許第６，６５６，４７５号、米国特許公開第２００４／００７７０５３−Ａ１号を参照）、修飾された可溶性受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質などの受容体融合タンパク質が含まれる）、ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１と特異的に結合する他のタンパク質（ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１プロペプチド、ＧＤＦ−８プロペプチドの突然変異体および誘導体、フォリスタチン、フォリスタチンドメイン含有タンパク質、これらのタンパク質のＦｃ融合物など）、ＧＤＦ−８受容体と結合するタンパク質およびこれらのタンパク質のＦｃ融合物、ならびに模倣体が含まれる。非タンパク質阻害剤（核酸など）も、用語ＧＤＦ−８阻害剤によって包含される。ＧＤＦ−８阻害剤には、ＧＤＦ−８を特異的に阻害する、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、リボザイム、抗センスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡが含まれる）および他の小分子が含まれる。
【００８８】
用語「個体」とは、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、または魚を含めた任意の脊椎動物をいう。用語「哺乳動物」には、ヒト、非ヒト霊長類、サル、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、畜牛などを含めた、雄または雌の、そのように分類される任意の動物が含まれる。非哺乳動物の例には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、魚（サケ、ナマズ、バス、ゼブラフィッシュ、およびマスなど）、ならびにカエルが含まれる。個体は、ヒト、または、たとえば、飼い馴らした、原料用（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）、家畜化した（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、動物園の、スポーツ用、競技用、もしくはペットの動物から選択し得る。
【００８９】
用語「阻害する」および「阻害性」とは、同じ阻害剤が存在しない場合のＧＤＦ−８の活性と比較した、ＧＤＦ−８阻害剤によるＧＤＦ−８の１つまたは複数の活性の低下をいう。活性の低下は、好ましくは少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くである。特定の実施形態では、ＧＤＦ−８の活性は、本明細書中に開示する阻害剤のうちの１つまたは複数に影響を受けた場合に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも約６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％、より好ましくは少なくとも９５％〜１００％低下する。用語「中和する」および「中和すること」とは、１つまたは複数のＧＤＦ−８活性の少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の低下をいう。ＧＤＦ−８活性の阻害は、たとえば、Ｔｈｉｅｓら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１８：２５１〜２５９（２００１）に記載のようにｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター遺伝子アッセイで、または以下の実施例中に例示するようにＡｃｔＲＩＩＢ受容体アッセイで測定することができる。
【００９０】
用語「単離した」とは、その天然の環境から実質的に分離された分子をいう。たとえば、単離したタンパク質とは、それが由来する細胞または組織源から実質的に分離されているものである。
【００９１】
また、標識は、酵素、たとえば、ペルオキシダーゼ（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼなどの基質を変換する酵素であってもよい。ペルオキシダーゼは、可溶性基質（たとえば、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノ−ジ［３−エチル−ベンズチアゾリン］スルホネート（ＡＢＴＳ）、ルミノール、ポリフェノール、アクリジンエステル、およびルシフェリン）と共にインキュベーションした際に、分光器で検出することができる基質の発色性または発光性の変化をもたらす。典型的には、基質との一定のインキュベーション期間後、反応を反応停止させ（たとえば酸性化によって）、光学密度（吸光度）または発光を測定することによって結果を定量化する。吸光度の結果を発色反応の線形範囲内のＯＤ値と比較することができ、発光性免疫アッセイは相対光単位（ＲＬＵ）で測定する。
【００９２】
また、標識は、ビオチン、ハプテン、またはエピトープタグ（たとえば、ヒスチジン、ＨＡ（赤血球凝集素ペプチド）、マルトース結合タンパク質、ＡｖｉＴａｇ（登録商標）、もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）であってもよく、これは、ＧＤＦ８変調剤または検出剤と会合した標識と相互作用する、標識した検出剤を加えることによって検出することができる。ビオチンで標識した（「ビオチン標識した」）検出剤は、アビジン−酵素のコンジュゲート、たとえばアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼとのその相互作用によって、アビジン−酵素のコンジュゲートおよび適切な発色性または発光基質と逐次的にインキュベーションした後に検出し得る。ユーロピウムも標識である。
【００９３】
本明細書中で使用する用語「ペプチド模倣体」とは、ホルモン、サイトカイン、酵素基質、ウイルスまたは他の生体分子上の活性決定要因を生物学的に模倣するペプチドをいい、天然リガンドの生理活性を拮抗、刺激、または他の様式で変調し得る。ペプチド模倣体は、好ましくは、ペプチドと同様の二次構造を有しており、さらなる構造的特徴を任意選択で有している化合物として定義され、その作用機構はネイティブペプチドの作用機構と大部分が類似または同一であるが、その活性（たとえば、拮抗剤または阻害剤として）は、ネイティブペプチド、特に受容体または酵素と比較して改変されている場合がある。さらに、これらはネイティブペプチドの効果（作用剤）を模倣することができる。本明細書全体にわたって、用語「ペプチド模倣体」とは、その構造的特性のおかげで、機能的ＧＤＦ８または非機能的ＧＤＦ８のどちらかの生物学的機能を模倣することができる分子をいう。本発明では、ＧＤＦ８の結合／二量体化ドメインを含むＧＤＦ８の断片が、ＧＤＦ８に対するドミナントネガティブとして機能すると提案されている。ＧＤＦ８の結合／二量体化ドメインのペプチド模倣体自体は、複数モル濃度の過剰で存在することができ、野生型ＧＤＦ８との「競合に勝って」野生型分子とヘテロ二量体を形成し、したがって、ＧＤＦ８の生物学的機能のドミナントネガティブとして作用することができる。その点で、ＧＤＦ８の機能が破壊され、したがって筋肉成長の阻害が緩和される。そのような成長促進ＧＤＦ８模倣体の活性のｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的アッセイの一例は、有効量の本発明の少なくとも１つの成長促進模倣体を投与することによる、正常なマウスまたは他の試験動物における骨格筋量の増強である。
【００９４】
用語「精製した」とは、その天然の環境中で分子に付随している他の物質を実質的に含まない分子をいう。たとえば、精製したタンパク質は、それが由来する細胞または組織からの細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離したタンパク質が治療組成物として投与するために十分に純粋である、または少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは少なくとも８０％〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは、９０〜９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物をいう。
【００９５】
本明細書中で使用する用語「ｓｉＲＮＡ」とは、標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用することができる低分子干渉ＲＮＡ分子をいう。ｓｉＲＮＡは、１９〜２５個のヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡであることができる。ｓｉＲＮＡは、ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅ  ＩＩＩ関連ヌクレアーゼによる、より長いｄｓＲＮＡ分子の分解によって内在的に産生させることができる。また、ｓｉＲＮＡは、細胞内に外因的に、または発現構築体の転写によって、導入することもできる。形成された後、ｓｉＲＮＡは、タンパク質構成成分とアセンブルして、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体となる。ＡＴＰによって生じるｓｉＲＮＡの巻き戻しがＲＩＳＣを活性化し、立ち代ってこれがワトソン−クリックの塩基対合によって相補的ｍＲＮＡ転写物を標的とし、それによりｍＲＮＡが切断および破壊される。ｍＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ鎖によって結合される領域の中央付近で起こる。この配列特異的なｍＲＮＡ分解が遺伝子サイレンシングをもたらす。
【００９６】
少なくとも２つの方法を用いてｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを達成することができる。第１に、ｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、細胞内に一過的に導入して遺伝子発現を抑制させることができる。ｓｉＲＮＡは、短い混合オリゴヌクレオチドの二重鎖であり、たとえば、対称的なジヌクレオチド３’オーバーハングを有する１９個のＲＮＡヌクレオチドが含まれ得る。合成の２１ｂｐのｓｉＲＮＡ二重鎖（たとえば、１９個のＲＮＡ塩基、次いでＵＵまたはｄＴｄＴの３’オーバーハング）を用いて、配列特異的遺伝子サイレンシングを哺乳動物細胞中で達成することができる。これらのｓｉＲＮＡは、多くのタンパク質の翻訳の非特異的な抑圧をもたらし得る、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性化なしに、哺乳動物細胞において標的遺伝子の翻訳を特異的に抑制することができる。
【００９７】
第２に、ｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでベクターから発現させることができる。この手法は、ｓｉＲＮＡを細胞またはトランスジェニック動物中で安定して発現させるために使用することができる。ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）転写単位からのｓｉＲＮＡ転写を駆動するように操作する。Ｐｏｌ  ＩＩＩ転写単位は、ヘアピンｓｉＲＮＡへの２ｂｐのオーバーハング（たとえばＵＵ）の付加をもたらす、短いＡＴに富んだ転写終結部位を配置し、これは、ｓｉＲＮＡ機能に役立つ特長であるため、ヘアピンｓｉＲＮＡ発現に適している。また、Ｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターは、ｓｉＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスを作製するためにも使用することができる。
【００９８】
また、ｓｉＲＮＡは、組織に特異的な様式で発現させることもできる。この手法下では、最初に、長いｄｓＲＮＡを、プロモーター（ＣＭＶ（ｐｏｌ  ＩＩ）など）から、選択した細胞系またはトランスジェニックマウスの核中で発現させる。長いｄｓＲＮＡは、核内で（たとえばダイサーによって）ｓｉＲＮＡへとプロセッシングされる。ｓｉＲＮＡは核から出て行き、遺伝子に特異的なサイレンシングを媒介する。同様の手法を、組織に特異的な（ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターと併せて用いて、組織に特異的なノックダウンマウスを作製することができる。
【００９９】
用語「小分子」とは、巨大分子ではない化合物をいう。たとえば、Ｋａｒｐ、（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ、１６：２６９〜８５、Ｖｅｒｋｍａｎ、（２００４）ＡＪＰ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８６：４６５〜７４を参照されたい。したがって、小分子は、しばしば１０００ダルトン未満の化合物であるとみなされる（たとえば、ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｎ．Ｒｏｓｅ編、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１４（１９９５）。たとえば、Ｄａｖｉｓら（（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２：５９８１〜８６）は、フォレート、メトトレキサート、および神経ペプチドを示すために語句小分子を使用している一方で、ＨａｌｐｉｎおよびＨａｒｂｕｒｙ（（２００４）ＰＬｏｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２：１０２２〜３０）は、小分子遺伝子産物、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチドを示すためにこの語句を使用している。天然小分子の例には、コレステロール、神経伝達物質、およびｓｉＲＮＡが含まれ、合成小分子には、数々の市販の小分子データベース、たとえば、ＦＣＤ（Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓデータベース）、ＳＭＩＤ（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎデータベース）、ＣｈＥＢＩ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、およびＣＳＤ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌデータベース）に記載されている様々な化合物が含まれる（たとえば、Ａｌｆａｒａｎｏら（２００５）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｄａｔａｂａｓｅ、第３３号：Ｄ４１６〜２４を参照）。
【０１００】
用語「特異的結合」、「特異的に結合する」などとは、２つ以上の分子が、生理的条件下またはアッセイ条件下で測定可能であり、選択的な複合体を形成することを意味する。抗体もしくは抗原結合タンパク質または他の阻害剤は、適切に選択された条件下で、そのような結合は実質的に阻害されないが、同時に非特異的結合が阻害される場合に、タンパク質と「特異的に結合する」と言われる。特異的結合は高親和性によって特徴づけられており、化合物またはタンパク質に対して選択的である。非特異的結合は通常は低い親和性を有する。たとえば、ＩｇＧ抗体の結合は、一般に、少なくとも約１０−７Ｍ以上、たとえば、少なくとも約１０−８Ｍ以上、または少なくとも約１０−９Ｍ以上、または少なくとも約１０−１０以上、または少なくとも約１０−１１Ｍ以上、または少なくとも約１０−１２Ｍ以上の親和性によって特徴づけられている。また、用語は、たとえば、抗原結合ドメインが、数多くの抗原によって保有されない特定のエピトープに特異的な場合にも適用され、その場合は、抗原結合ドメインを保有する抗体または抗原結合タンパク質は、一般に、他の抗原と結合しない。
【０１０１】
特定の方法は、特異的結合に高い親和性を必要とする一方で、表面プラズモン共鳴アッセイなどの他の方法では、より低い安定性の複合体およびより低い親和性の相互作用が検出され得る。必要な場合は、結合条件を変動することによって、特異的結合に実質的に影響を与えずに非特異的結合を低下させることができる。そのような条件は当分野で知られており、当業者がルーチン技術を使用して適切な条件を選択することができる。条件は、通常、結合パートナーの濃度、溶液のイオン強度、温度、結合に許容する時間、非関連分子（たとえば、血清アルブミン、乳カゼイン）の濃度等に関連して定義される。例示的な結合条件は、以下の実施例に記載されている。
【０１０２】
用語「特異的ＧＤＦ８拮抗剤」または「特異的ＧＤＦ８阻害剤」には、ＧＤＦ８の活性、発現、プロセッシング、または分泌を阻害、低下および／または中和することができるが、他のタンパク質、たとえばＴＧＦ−βスーパーファミリー、たとえばＢＭＰ１１の活性、発現、プロセッシング、または分泌を顕著に阻害、低下および／または中和しない、任意の薬剤が含まれる。そのような阻害剤には、ＧＤＦ８活性を特異的に阻害する、巨大分子および小分子、たとえば、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、抗センスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、および他の小分子が含まれる。そのような阻害剤は、ＧＤＦ８の生物活性を特異的に「拮抗する」（たとえば、「阻害」、「減少」、「低下」または「中和」する）と言われる。ＧＤＦ−８阻害剤は、活性ＧＤＦ−８タンパク質に関連する生理的、成長調節、または形態形成の活性などの、ＧＤＦ−８の少なくとも１つの生物学的活性を、阻害または中和または低下させる。たとえば、ＧＤＦ−８は骨格筋成長の負の調節因子である。ＧＤＦ−８阻害剤は、筋肉量を増加させる、筋肉強度を増加させる、筋肉特異的酵素のレベルを変調する、筋芽細胞の増殖を刺激する、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を変調する、脂肪蓄積を減少させる、血清トリグリセリドレベルを減少させる、血清コレステロールレベルを減少させる、グルコース代謝を変調する、および／または高血糖症を低下させることができる。
【０１０３】
用語「治療」とは、本明細書中で用語「治療方法」と互換性があるように使用し、治療処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／予防的（ｐｒｏｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段のどちらもいう。また、用語治療は、障害を寛解、治療または予防できるとも定義される。治療を必要としているものには、既に特定の医学的障害に罹患している個体、および最終的に障害に罹患し得るもの（すなわち、予防的手段を必要とするもの）が含まれ得る。
【０１０４】
本発明の実施では、別段に指定しない限りは、当分野の技術範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学慣用技術を用いる。そのような技術は文献中に完全に記載されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、Ｗｕ編）、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ、（１９８７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．）、ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ  ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編（１９８６）を参照されたい。
【０１０５】
ＧＤＦ８に特異的なエピトープおよびその拮抗剤
特異的ＧＤＦ８抗体およびヒトＧＤＦ８の重複を有する１３個のアミノ酸のペプチドを用いたエピトープマッピングにより、ＧＤＦ８の特異的拮抗を標的とし得る、ＧＤＦ８に特異的な候補エピトープが明らかとなった（実施例４．２）。この手法に基づいて、ＧＤＦ８に特異的な５個の独立したエピトープを同定した。本発明は、これらのエピトープ（そのペプチド模倣体が含まれる）、エピトープをコードしているポリヌクレオチド、それに対する阻害性ポリヌクレオチド、およびＧＤＦ８活性に対する特異的拮抗剤としてそれに関連する抗体を提供する。
【０１０６】
ＧＤＦ８に特異的なエピトープおよびそのペプチド模倣体
本発明は、ＧＤＦ８に特異的であると生物学的に特徴づけられていてもよく、したがって本明細書中でＧＤＦ８に特異的なエピトープと呼ばれる、エピトープに相同的な新規の単離および精製したポリペプチドを提供する。これらのＧＤＦ８特異的エピトープのペプチド模倣体を、ＧＤＦ８拮抗剤として、すなわち、ＧＤＦ８活性、たとえば、ＧＤＦ８がその受容体に結合することを拮抗するために使用し得ることが、本発明の一部である。
【０１０７】
たとえば、本発明は、ＧＤＦ８に特異的な５個の結合ドメイン（ＧＤＦ８のＡＬＫ４／ＡＬＫ４受容体結合部位が含まれ得る）をコードしており、本明細書中で「ＧＥ１」、「ＧＥ２」、「ＧＥ３」、「ＧＥ４」、および「ＧＥ５」と命名する、ＧＤＦ８受容体拮抗剤／ペプチド模倣体としても機能し得る、精製および単離したポリヌクレオチドを提供する。本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてもよく、完全にまたは部分的に合成であってもよい。本明細書中に記載するヌクレオチド配列への言及には、内容により他のものが必要とされる場合以外は、指定した配列を有するＤＮＡ分子または遺伝的均等物（たとえば相補的配列）、およびＴがＵで置換されている指定した配列を有するＲＮＡ分子が包含される。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列ならびに化学合成ＤＮＡ配列が含まれる。
【０１０８】
ヒトｃＤＮＡと指定されるヒトＧＥ１、ＧＥ２、ＧＥ３、ＧＥ４、およびＧＥ５をコードしているｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号３、５、７、９、および１１として記載する。また、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号３、５、７、９、および１１として記載したヌクレオチド配列もしくはその補体を有するおよび／もしくはそれから本質的になるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびに／または、それぞれＧＥ１、ＧＥ２、ＧＥ３、ＧＥ４、もしくはＧＥ５の実質的な生物活性を保持するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドには、少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、配列番号３、５、７、９、および１１として記載したヌクレオチド配列の連続した一部分も含まれる。
【０１０９】
ヒトＧＥ１、ＧＥ２、ＧＥ３、ＧＥ４、ＧＥ５、およびそれに対する模倣ポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、６、８、１０および１２として記載されている。また、本発明のポリペプチドには、少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む、配列番号４、６、８、１０および１２として記載した配列のうちの任意のものの連続した一部分を有するおよび／またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドも含まれる。また、本発明のポリペプチドには、Ｌ−アミノ酸のうちの１つまたは複数がその対応するＤ−アミノ酸で置き換えられている、その連続した一部分を含めた配列番号４、６、８、１０および１２として記載した配列のうちの任意のものも含まれる。また、本発明のポリペプチドには、配列番号４、６、８、１０および１２の活性断片、すなわち、完全長のヒトＧＥ１、ＧＥ２、ＧＥ３、ＧＥ４、またはＧＥ５の実質的な生物活性を保持する、配列番号４、６、８、１０および１２として記載した配列のうちの任意のものの任意の連続した一部分、すなわち、ＧＤＦ８に特異的な結合ドメインおよび／またはそれに対する模倣ペプチドがＧＤＦ８活性の特異的拮抗剤であり得る、配列番号４、６、８、１０および１２の任意の断片も含まれる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を用いてアセチル化および／またはアミドブロッキングし得る。また、本発明のポリヌクレオチドには、上述のこれらポリヌクレオチドに加えて、配列番号４、６、８、１０および１２として記載したアミノ酸配列ならびにその連続した一部分のうちの任意のものをコードしており、遺伝暗号の周知の縮重のみが原因で上述のヒト由来のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドも含まれる。
【０１１０】
また、本発明は、ＧＤＦ８に特異的なエピトープに対する環状模倣ペプチドをコードしている精製および単離したポリヌクレオチド、たとえば、ＧＥ１、ＧＥ２、ＧＥ３、ＧＥ４、およびＧＥ５も提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列ならびに化学合成ＤＮＡ配列が含まれる。当業者は、本発明には、ＧＤＦ８に特異的な他の結合ドメインに基づいた環状模倣ペプチドなどの、他の環状分子も含まれることを理解されよう。さらに、本発明の環状模倣ペプチドは、周知の方法を用いてアセチル化および／またはアミドブロッキングされていてもよい。
【０１１１】
ＧＤＦ８に特異的な抗体
本開示は、ＧＤＦ８と特異的に相互作用する新規抗体を提供する（たとえば、抗体または抗原結合タンパク質断片）。そのような抗体の非限定的な例示的な実施形態をＲＫ２２と呼ぶ。本発明の抗体は独特かつ有益な特徴を有する。第１に、これらの抗体は、高い親和性で成熟ＧＤＦ８と結合することができる（実施例２）。第２に、開示した抗体は、ＧＤＦ８と特異的に相互作用する、すなわち、本発明の抗体は、ＴＧＦ−βサブファミリー、たとえばＢＭＰ１１の他のメンバーと高い親和性では結合しない（実施例２）。第３に、本発明の抗体は、実証するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ８活性を阻害する（実施例３）。第４に、開示した抗体は、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ８活性を阻害し得る（実施例３）。
【０１１２】
一実施形態では、本明細書中で開示した抗体は、ＧＤＦ８と特異的に相互作用することができる、すなわち、抗体は、他のタンパク質、たとえばＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するもの、たとえば、ＢＭＰ１１、アクチビン、ミュラー管阻害物質、グリア由来神経栄養因子、またはＧＤＦ８以外の成長および分化因子と大規模に反応しないことが企図される。本発明の非限定的な一実施形態では、本発明の特異的ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質は、それがＢＭＰ１１と結合するよりも５〜１０倍高い優先度でＧＤＦ８と結合する。本発明の非限定的な実施形態では、本発明の特異的抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質は、それがＢＭＰ１１と結合するよりも１０〜１００倍高い優先度でＧＤＦ８と結合する。本発明の非限定的な一実施形態では、目的の特異的抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質は、それがＢＭＰ１１と結合するよりも１００〜１０００倍高い優先度でＧＤＦ８と結合する。別の実施形態では、本発明の特異的抗ＧＤＦ８抗体または抗原結合タンパク質は、本明細書中に開示したもの（たとえば、配列番号４、６、８、１０および１２として記載したアミノ酸配列またはその活性断片を有するおよび／またはそれから本質的になる、ＧＤＦ８に特異的なエピトープ）を含めた、ＧＤＦ８に特異的なエピトープと結合する。本発明の一実施形態では、企図される抗体は、成熟ＧＤＦ８の予測されたＡＬＫ４／ＡＬＫ５結合部位、たとえば、配列番号４、６または８として記載したアミノ酸配列を有するＧＤＦ８エピトープと特異的に相互作用する。
【０１１３】
当業者は、本発明の抗体を、様々な種に由来するＧＤＦ８タンパク質、たとえば本明細書中に記載のものを検出、測定、および阻害するために使用し得ることを理解されよう。％同一性は、標準のアラインメントアルゴリズム、たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜１０）に記載されているＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４４〜５３）のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓら（（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１〜１７）のアルゴリズムなどによって決定する。一般に、本発明の抗体および抗体または抗原結合タンパク質断片は、実質的なＧＤＦ８の生物活性を保持し、配列番号１として記載したＧＤＦ８の成熟型の、少なくとも１００、８０、６０、４０、２０、または１５個の連続したアミノ酸の任意の配列と、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより高い同一性であるアミノ酸配列を含む、任意のタンパク質と共に使用することができる。
【０１１４】
免疫グロブリンとしても知られるインタクト抗体は、典型的には、四量体のグリコシル化タンパク質は、それぞれ約２５ｋＤａの２本の軽（Ｌ）鎖、およびそれぞれ約５０ｋＤａの２本の重（Ｈ）鎖からなる。λおよびκと呼ばれる２種類の軽鎖が抗体中に存在する。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、５つの主要なクラス、すなわち、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てられ、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類し得る。それぞれの軽鎖は、Ｎ末端の可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）からなる。それぞれの重鎖は、Ｎ末端のＶドメイン（ＶＨ）、３または４個のＣドメイン（ＣＨ）、およびヒンジ領域からなる。ＶＨに最も近位のＣＨドメインをＣＨ１と呼ぶ。ＶＨおよびＶＬドメインは、フレームワーク領域と命名される比較的保存されている配列の４つの領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）からなり、これらは、超可変配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）の３つの領域の足場を形成する。ＣＤＲは、抗体または抗原結合タンパク質の、抗原との特異的な相互作用を担っている残基のほとんどを含有する。ＣＤＲはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素はＨ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれ、軽鎖上のＣＤＲ構成要素はＬ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれる。ＣＤＲ３は、抗体または抗原結合タンパク質の結合部位内の分子多様性の最大の供給源である。たとえば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基の短いもの、または２６個のアミノ酸より長いものであることができる。様々な免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元立体配置が当分野で周知である。抗体構造の総説には、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗら編、１９８８を参照されたい。当業者は、それぞれのサブユニット構造、たとえば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、および／またはＦＲ構造が活性断片を含むことを理解されよう。たとえば、活性断片は、抗原と結合するＶＨ、ＶＬ、もしくはＣＤＲサブユニットの一部分、すなわち、抗原結合断片、または、Ｆｃ受容体および／もしくは補体と結合するおよび／もしくはそれを活性化するＣＨサブユニットの一部分からなり得る。
【０１１５】
本明細書中で使用する用語「抗体または抗原結合タンパク質断片」に包含される結合断片の非限定的な例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ジスルフィド橋によってヒンジ領域で連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）１個のＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、ならびに（ｖｉ）単離したＣＤＲが含まれる。さらに、Ｆｖ断片、ＶＬおよびＶＨの２個のドメインは別々の遺伝子によってコードされているが、これらは合成リンカーによって組換えにより結合されて、ＶＬおよびＶＨドメインが対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖を生じ得る（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）。最も一般的に使用されるリンカーは、１５個の残基の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドであるが、他のリンカーも当分野で知られている。また、単鎖抗体は、用語「抗体もしくは抗原結合タンパク質」または抗体の「抗原結合断片」内に包含されることも意図する。
【０１１６】
これらの抗体は、当業者に知られている慣用技術を用いて得て、断片は、インタクト抗体と同様に有用性についてスクリーニングする。抗体の多様性は、可変ドメインをコードしている複数の生殖系列遺伝子および様々な体性事象によって生じる。体性事象には、多様性を有する可変遺伝子セグメント（Ｄ）と連結（Ｊ）遺伝子セグメントとの組換えによる完全なＶＨドメインの作製、および可変と連結遺伝子セグメントとの組換えによる完全なＶＬドメインの作製が含まれる。組換えプロセス自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部でアミノ酸の損失または付加がもたらされる。これらの多様性の機構は、抗原に曝露する前に発生中のＢ細胞中で起こる。抗原刺激後に、Ｂ細胞中の発現された抗体遺伝子が体細胞突然変異を受ける。生殖系列遺伝子セグメントの推定数、これらのセグメントのランダム組換え、およびランダムＶＨ−ＶＬ対合に基づいて、１．６×１０７個までの異なる抗体が生じ得る（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版（１９９３）、Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。抗体の多様性に寄与する他のプロセス（体細胞突然変異など）を考慮した場合、１×１０１０個以上の異なる抗体が作製され得ると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ、第２版（１９９５）、Ｊｏｎｉｏら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。抗体の多様性の発生に関与するプロセスが多く存在するため、同じ抗原特異性を有する独立して誘導したモノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有する可能性は低い。
【０１１７】
したがって、本発明は、ＧＤＦ８と特異的に相互作用する新規抗体、すなわち特異的ＧＤＦ８抗体を提供する。本発明の抗体または抗原結合タンパク質断片、たとえば、ＣＤＲを含有する構造は、一般に、抗体もしくは抗原結合タンパク質の重鎖もしくは軽鎖の配列またはその活性断片であり、ＣＤＲは、天然に存在するＶＨおよびＶＬのＣＤＲに対応する位置に配置される。免疫グロブリン可変ドメイン、たとえばＣＤＲの構造および位置は、周知の番号付けスキーム、たとえば、Ｋａｂａｔの番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けスキーム、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの組合せ（ＡｂＭ）などを用いて定義し得る（たとえば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国社会福祉省（１９９１）、Ｋａｂａｔら編、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、２７３：９２７〜９４８を参照）。
【０１１８】
したがって、本発明は、新規ＣＤＲをさらに提供する。本発明のＣＤＲを保有するための構造は、一般に、ポリペプチド、たとえば、抗体もしくは抗原結合タンパク質の重鎖もしくは軽鎖の配列またはその実質的な一部分であり、ＣＤＲは、天然に存在するＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲに対応する位置に配置される。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、たとえば、Ｋａｂａｔら、上記およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、上記に記載されているように決定し得る。
【０１１９】
本発明のポリペプチドと特異的に相互作用することができる抗体または抗原結合タンパク質分子は、当業者に周知の方法によって産生し得る。たとえば、モノクローナル抗体は、既知の方法に従ったハイブリドーマの作製によって産生することができる。その後、この様式で形成したハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＢｉａｃｏｒｅ分析などの標準方法を用いてスクリーニングして、ＧＤＦ８と特異的に相互作用する（たとえばＧＤＦ８と結合する）ならびに／または、少なくとも１つのＧＤＦ８活性（たとえば、ＧＤＦ８がその受容体もしくは他の下流のＧＤＦ８シグナル伝達事象に結合すること）を拮抗する（たとえば、阻害、低下、および／もしくは中和する）抗体を産生する、１つまたは複数のハイブリドーマを同定する。
【０１２０】
組換えＧＤＦ８、天然に存在するＧＤＦ８、およびＧＤＦ８の抗原ペプチド断片を免疫原として使用し得る。抗原ペプチド断片は、少なくとも６個の連続したアミノ酸を含み、それに対して産生させた抗体がＧＤＦ８と特異的免疫複合体を形成するようなエピトープが包含される。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸残基を含む。さらに、ＧＤＦ８の抗原ペプチド断片は、ＧＤＦ８に特異的なエピトープ（たとえば、配列番号４、６、８、１０、１２として記載したアミノ酸配列を有するおよび／もしくはそれから本質的になるペプチド、または活性断片転移）を含むことが好ましい。
【０１２１】
本発明の一実施形態では、完全長ＧＤＦ８ポリペプチドを免疫原として使用し得るか、または、ポリペプチドの抗原ペプチド断片を使用し得る。たとえば、免疫原は、ＧＤＦ８特異的エピトープ（たとえば、ＧＤＦ８に特異的なエピトープ、および／または、それに向けられた特異的抗ＧＤＦ８抗体および／または模倣ペプチドのエピトープが、ＧＤＦ８シグナル伝達の特異的拮抗剤（たとえば、配列番号４、６、８、１０、１２のアミノ酸配列のうちの１つもしくは複数、およびその活性断片））および／または関連するペプチドもしくは環状ペプチドであり得る。本発明のポリペプチドの抗原ペプチドは、少なくとも４個の連続したアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産生させた抗体がポリペプチドと特異的免疫複合体を形成するようなエピトープが包含される。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも６個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも９個のアミノ酸残基を含む。
【０１２２】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（たとえば抗体ファージディスプレイライブラリ）を本発明のポリペプチドでスクリーニングすることで、ポリペプチドと結合する免疫グロブリンライブラリのメンバーを単離することによって、同定および単離し得る。ファージディスプレイライブラリを作製およびスクリーニングための技術および市販のキットは、当業者に周知である。さらに、抗体または抗原結合タンパク質ディスプレイライブラリの作製およびスクリーニングに使用するために、特に受け入れられる方法および試薬の例は、文献中に見つけることができる。
【０１２３】
ポリクローナル血清および抗体は、適切な対象を、ＧＤＦ８、その変異体、および／またはその一部分、たとえば、本発明の特異的ＧＤＦ８エピトープで免疫化することによって産生し得る。免疫化した対象内の抗体価は、ＥＬＩＳＡなどを用いた標準技術によって、または固定したＧＤＦ８もしくは他のマーカータンパク質（たとえばＦＬＡＧ）を用いることによって、経時的に監視し得る。所望する場合は、本発明のポリペプチドに向けられた抗体分子を対象または培養培地から単離し、タンパク質Ａクロマトグラフィーなどの周知の技術によってさらに精製して、ＩｇＧ画分を得てもよい。
【０１２４】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む、本発明のポリペプチドに対するキメラ、ヒト化、および単鎖抗体を、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて産生し得る。また、ヒト化抗体は、内在性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子を発現することができないが、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いても産生し得る。
【０１２５】
本発明の抗体または抗原結合タンパク質分子（断片が含まれる）（たとえば、ＧＤＦ８と特異的に相互作用する抗体または抗原結合タンパク質分子）には、それだけには限定されないが、モノクローナルＲＫ２２抗体、その変異体（たとえばヒト化変異体）およびその断片が含まれる。また、ＧＤＦ８と特異的に相互作用する本発明の抗体または抗原結合タンパク質分子は特異的ＧＤＦ８拮抗剤であってもよく、したがって、これらの抗体または抗原結合タンパク質分子は、ＧＤＦ８関連障害、たとえば、骨、筋肉、脂肪およびグルコース代謝に関連する病状の予防または治療に有用であり得る。
【０１２６】
したがって、また、本発明は、少なくとも１つのＧＤＦ８活性を拮抗し得る特異的ＧＤＦ８抗体の領域をコードしている、精製および単離したポリヌクレオチド、たとえば、ＲＫ２２およびその変異体も提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノム、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡ配列が含まれる。上述のように、本発明の抗体または抗原結合タンパク質の領域をコードしているポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてよく、全体的または部分的に合成であってよい。本明細書中に記載するヌクレオチド配列への言及には、内容により他のものが必要とされる場合以外は、指定した配列を有するＤＮＡ分子またはゲノム均等物（たとえば相補的配列）、およびＴがＵで置換されている指定した配列を有するＲＮＡ分子が包含される。
【０１２７】
本発明のヌクレオチド配列には、マウスＲＫ２２の軽鎖可変ドメインをコードしているもの、たとえば、配列番号１５として記載したヌクレオチド配列が含まれる。また、本発明のヌクレオチド配列には、マウスＲＫ２２の重鎖可変ドメインをコードしているもの、たとえば、配列番号１３として記載したヌクレオチド配列も含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドには、実質的に配列番号１３および１５として記載した核酸配列やその補体を有するおよび／もしくはそれから本質的になるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびに／または、ＲＫ２２の可変ドメインの実質的な生物活性（すなわち活性断片）を保持するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドには、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、配列番号１３および１５として記載した配列の連続した一部分も含まれる。
【０１２８】
マウスＲＫ２２の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１６として記載されている。マウスＲＫ２２の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１４として記載されている。ヒト化可変重鎖および軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７および１８に記載されている。マウスＲＫ２２の重鎖内に含有されるＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号１９〜２１および２５〜２７として記載されている。マウスＲＫ２２の軽鎖内に含有されるＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号２２〜２４および２８〜３０として記載されている。また、本発明のポリペプチドには、少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む、実質的に配列番号１４、１６、１７、１８、および１９〜３０として記載した配列のうちの任意のものの連続した一部分も含まれる。本発明の好ましいポリペプチドには、配列番号１４、１６、１７、１８、および１９〜３０としての活性断片、すなわち、本発明の抗体または抗原結合タンパク質の実質的な生物活性を保持している、配列番号１４、１６、１７、１８、および１９〜３０として記載した任意の配列の任意の連続した一部分が含まれる。また、上述のポリヌクレオチドに加えて、本発明には、実質的に配列番号１４、１６、１７、１８、および１９〜３０として記載したアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド、またはその連続した一部分、ならびに、遺伝暗号の周知の縮重のみが原因で上述の抗体または抗原結合タンパク質のポリヌクレオチドと異なるものも含まれる。
【０１２９】
上述のように、ＣＤＲは、抗原との特異的な相互作用を担っている残基のほとんどを含有し、ＶＨおよびＶＬドメイン、すなわち、それぞれ重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン内に含有される。したがって、抗体が、本発明の抗体または抗原結合タンパク質の少なくとも１つのＣＤＲ、たとえば、配列番号１９〜３０として記載したアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ、またはその活性のある抗体もしくは抗原結合タンパク質断片を含む限りは、これは本発明の抗体である、すなわち、ＧＤＦ８と特異的に相互作用する（たとえばＧＤＦ８と結合する）および／またはＧＤＦ８活性を特異的に拮抗する抗体である。したがって、本発明の一実施形態には、配列番号１９〜３０として記載したアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはその活性断片のアミノ酸配列を含む、１つまたは複数のＣＤＲを含有する抗体が含まれる。したがって、当業者は、本発明の抗体には、ＶＬ鎖のＣＤＲが、配列番号２２〜２４および２８〜３０として記載したものの１つもしくは複数のＣＤＲであり、および／またはＶＨ鎖のＣＤＲが、配列番号１９〜２１および２５〜２７として記載したものの１つもしくは複数のＣＤＲである、抗体または抗原結合タンパク質が含まれることを理解されよう。
【０１３０】
抗原結合断片は、ＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖ断片であり得る。したがって、ＲＫ２２のＦｖ断片は、断片がＧＤＦ８と特異的に相互作用する限りは、本発明の抗体を構成し得る。当業者は、ＲＫ２２のＦｖ断片を含有する任意の抗体または抗原結合タンパク質断片も本発明の抗体であり得ることを理解されよう。さらに、配列番号１９〜３０として記載したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含有する、任意のＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片も、本発明の抗体または抗原結合タンパク質であり得る。
【０１３１】
本発明の特定の実施形態は、ＲＫ２２のＦｖ断片のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。本発明の抗体の断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、およびｄＡｂ断片は、抗体、たとえばＲＫ２２の、当分野で周知の方法に従った切断によって生成し得る。たとえば、免疫学的に活性のあるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、抗体を酵素、たとえば、それぞれパパインおよびペプシンで処理することによって作製し得る。
【０１３２】
さらなる実施形態は、本明細書中に開示した抗体のＶＨドメイン（たとえばＲＫ２２のＶＨドメイン（配列番号１４および１７として記載）ならびに本明細書中に開示した抗体のＶＬドメイン（たとえばＲＫ２２のＶＬドメイン（配列番号１６および１８として記載のうちの任意のものの、１つまたは複数のＣＤＲ（たとえば、配列番号１９〜２１および２５〜２７として記載した１つまたは複数のＣＤＲ）を含む。一実施形態は、ＲＫ２２のＶＨドメインのＨ３断片（配列番号２１として記載を含む。
【０１３３】
便宜上、ＶＨおよびＶＬドメイン内のそれぞれのＣＤＲのおおよその位置を表２に示す。
【０１３４】
【表２】
0005756291.tif 000003
【０１３５】
本明細書中に開示する抗体は、抗体もしくは抗原結合タンパク質の定常ドメインまたはその一部をさらに含み得る。たとえば、本発明のＶＬドメインは、そのＣ末端で、抗体または抗原結合タンパク質の軽鎖定常ドメイン、たとえば、ヒトＣκまたはＣλ鎖、好ましくはＣλ鎖に付着していてよい。同様に、ＶＨドメインに基づく特異的抗原結合断片は、そのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにアイソタイプサブクラスのうちの任意のもの、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の、すべてまたは一部に付着していてよい。例示的な実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１λの重鎖および軽鎖のＣ末端断片を含む。遺伝暗号の縮重が原因で、配列の簡単な説明１に記載されているＤＮＡ配列は、目的のアミノ酸配列、ペプチド、および抗体をコードしている核酸の単なる代表であり、したがって限定的であると解釈されるべきでないことを理解されたい。
【０１３６】
本発明の特定の実施形態は、ＲＫ２２のＦｖ断片のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。さらなる実施形態は、これらのＶＨおよびＶＬドメインのうちの任意のものの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一実施形態は、ＲＫ２２のＶＨドメインのＨ３断片を含む。特定の実施形態では、本発明のＶＨおよびＶＬドメインは生殖系列化である、すなわち、これらのドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト生殖系列遺伝子産物のコンセンサスアミノ酸配列と一致するように、慣用の分子生物学技術を用いて変化されている。これは、ヒト化または生殖系列化抗体としても知られる。他の実施形態では、フレームワーク配列は生殖系列とは相違したままである。ヒト化抗体は、内在性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子を発現することができないが、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて産生し得る。
【０１３７】
本発明のさらなる態様は、抗体のＧＤＦ８に特異的な抗原結合ドメインを得る方法を提供する。当業者は、本発明の抗体が、表２に記載のようにＶＨおよびＶＬドメインの特異的配列に限定されず、抗原結合能力を保持するこれらの配列の変異体も含まれることを理解されよう。そのような変異体は、提供した配列から当分野で知られている技術を用いて誘導し得る。アミノ酸の置換、欠失、または付加は、ＦＲまたはＣＤＲ中に行うことができる。フレームワーク領域内の変化は、通常は抗体の安定性を改善し、免疫原性を低下させるために設計されているが、ＣＤＲ内の変化は、通常、その標的に対する抗体の親和性を増加させるために設計されている。そのような親和性を増加させる変化は、典型的には、ＣＤＲ変更し、抗体を試験することによって経験的に決定される。そのような変更は、たとえば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載の方法に従って行うことができる。
【０１３８】
したがって、本発明の抗体もしくは抗原結合タンパク質（またはその断片）には、ＧＤＦ８と特異的に相互作用するもの、ならびに重鎖および軽鎖の定常ドメイン中に突然変異を有するものも含まれる。定常ドメインの特定の断片を突然変異または不活性化させることが望ましい場合もある。たとえば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）および／または補体との結合が低下した抗体を産生するために、重鎖定常ドメイン中の突然変異が望ましい場合がある。そのような突然変異は当分野で周知である。また、当業者は、ＣＬおよびＣＨサブユニットのどの活性断片が必要であるかの決定は、本発明の抗体を適用する応用に依存することを理解されよう。たとえば、互いに対するその共有結合に関与する、ＣＬおよびＣＨサブユニットの活性断片が、インタクト抗体の作製に重要である。
【０１３９】
本明細書中に記載したＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを作製する方法は、本明細書中で開示したＶＨドメインのアミノ酸配列中に１つまたは複数のアミノ酸を付加、欠失、置換または挿入するステップと、それによりもたらされるＶＨドメインを１つまたは複数のＶＬドメインと任意選択で組み合わせ、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組合せもしくは複数の組合せを、ＧＤＦ８との特異的な相互作用について試験するステップと、そのような抗原結合ドメインの、１つまたは複数のＧＤＦ８関連活性を変調する能力を（好ましくは）試験するステップとを含む。ＶＬドメインは、実質的に本明細書中に記載のものであるアミノ酸配列を有し得る。本明細書中に開示したＶＬドメインの１つまたは複数の配列変異体を１つまたは複数のＶＨドメインと組み合わせる、類似の方法も用い得る。
【０１４０】
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ８と特異的に相互作用する抗原結合断片を調製する方法を提供する。この方法は、後に置き換えられるＣＤＲ、たとえばＣＤＲ３、またはＣＤＲ、たとえばＣＤＲ３コード領域を欠くＶＨドメインのどちらかが含まれる、ＶＨドメインをコードしている核酸の開始レパートリーを提供することと、ドナー核酸がレパートリー中のＣＤＲ、たとえばＣＤＲ３領域内に挿入されて、ＶＨドメインをコードしている核酸の生成物レパートリーがもたらされるように、レパートリーを本発明のドナーＣＤＲをコードしているドナー核酸（たとえば、配列番号１４、１６、１７、１８の活性断片を含むＣＤＲをコードしているドナー核酸と組み合わせることと、生成物レパートリーの核酸を発現させることと、ＧＤＦ８に特異的な抗原結合断片を選択することと、特異的抗原結合断片またはそれをコードしている核酸を回収することとを含む。ここでも、本発明のＶＬ  ＣＤＲ（たとえばＬ３）を、後に置き換えられるＣＤＲが含まれるまたはＣＤＲコード領域を欠く、ＶＬドメインをコードしている核酸のレパートリーと組み合わせる、類似の方法を用い得る。
【０１４１】
本発明のＣＤＲ（たとえばＣＤＲ３）のコード配列は、ＣＤＲ（たとえばＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリー内に、組換えＤＮＡ技術を用いて導入し得る。たとえば、Ｍａｒｋｓら（（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜８３）は、可変ドメイン領域の５’末端またはその付近に向けられたコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと併せて使用して、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する、抗体または抗原結合タンパク質の可変ドメインのレパートリーを生成する方法を記載している。レパートリーは特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせ得る。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ３由来の配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャフリングしてもよく、シャフリングした完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族ＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、本発明の特異的抗原結合断片が提供される。その後、適切な抗原結合断片を選択することができるように、レパートリーをＷＯ９２／０１０４７号のファージディスプレイ系などの適切な宿主中で表示させ得る。
【０１４２】
類似のシャフリングまたはコンビナトリアル技術は、β−ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術を記載しているが、この手法を抗体の産生に使用し得ると観察している、Ｓｔｅｍｍｅｒ（（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９〜９１）によっても開示されている。さらなる代替方法は、１つまたは複数の選択したＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を用いて可変ドメイン全体内に突然変異を生じさせ、本発明のＣＤＲ由来の配列を保有する新規ＶＨまたはＶＬドメインを産生することである。そのような技術は、誤りがちＰＣＲを使用することによってＧｒａｍら（（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３５７６〜８０）に記載されている。新規抗体またはその断片を産生するために使用し得る別の方法は、突然変異誘発をＶＨまたはＶＬのＣＤＲの遺伝子に向けることである。そのような技術は、Ｂａｒｂａｓら（（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：３８０９〜１３）およびＳｃｈｉｅｒら（（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：５５１〜６７）に開示されている。
【０１４３】
同様に、１つ、２つ、または３つすべてのＣＤＲをＶＨまたはＶＬドメインのレパートリー内に移植してもよく、その後、これらをＧＤＦ８に特異的な特異的結合パートナーまたは結合断片についてスクリーニングすることができる。免疫グロブリン可変ドメインの実質的な一部分が、少なくともＣＤＲ、および任意選択で、本明細書中に記載した抗体断片からのその介在フレームワーク領域を含む。また、この一部分には、ＦＲ１およびＦＲ４の一方または両方の少なくとも約５０％も含まれ、５０％は、ＦＲ１のＣ末端の５０％およびＦＲ４のＮ末端の５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端の追加の残基は、通常は天然に存在する可変ドメインに付随していないものであり得る。たとえば、組換えＤＮＡ技術によって作製した本発明の特異的抗体または抗原結合タンパク質断片の構築は、クローニングまたは他の操作ステップを容易にするために導入されたリンカーによってコードされているＮまたはＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作ステップには、本発明の可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（たとえば、二重特異性抗体の産生において）または以下にさらに詳述するタンパク質標識を含めたさらなるタンパク質配列と結合するための、リンカーの導入が含まれる。
【０１４４】
実施例中に例示する実施形態は、ＶＨおよびＶＬドメインの「一致する」対を含むが、本発明には、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のどちらか、特にＶＨドメインに由来する単一の可変ドメイン、たとえばｄＡｂ断片を含有する結合断片も包含される。単鎖特異的結合ドメインのどちらかである場合は、これらのドメインを用いて、ＧＤＦ８と結合することができる２個のドメインの特異的抗原結合ドメインを形成することができる相補的ドメインについてスクリーニングし得る。これは、たとえばＷＯ９２／０１０４７号に開示されている、いわゆる階層的二重コンビナトリアル手法を用いたファージディスプレイスクリーニング方法によって達成し得る。この技術では、ＨまたはＬ鎖の一方のクローンを含有する個々のコロニーを用いて、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードしているクローンの完全ライブラリを感染させ、生じる二本鎖の特異的抗原結合ドメインを、その参考文献中に記載されているものなどのファージディスプレイ技術に従って選択する。この技術はＭａｒｋｓら、上記にも開示されている。
【０１４５】
抗体は、放射性核種、薬物、巨大分子、または他の薬剤を用いた化学的方法によってコンジュゲートさせることができ、本発明の１つまたは複数のＣＤＲを含む融合タンパク質として作製し得る。
【０１４６】
抗体または抗原結合タンパク質の融合タンパク質はＶＨ−ＶＬ対を含有し、これらの鎖のうちの一方（通常はＶＨ）および別のタンパク質は、単一のポリペプチド鎖として合成する。これらの種類の生成物は、一般に追加の機能的要素（たとえば、小分子の活性部分またはコンジュゲートもしくは融合した巨大分子の主要な分子構造的特徴）を有するという点で抗体とは異なる。
【０１４７】
概要を上述したアミノ酸配列の変化に加えて、抗体は、グリコシル化、ｐｅｇ化、またはアルブミンもしくは非タンパク質ポリマーと連結させることができる。たとえば、本明細書中で開示した抗体は、様々な非タンパク質ポリマー、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの１つと連結させ得る。抗体は、たとえば、ポリマーとの共有結合によってその循環半減期を増加させるために、化学修飾し得る。例示的なポリマーおよびそれらをペプチドに付着させる方法は、当分野で知られている。
【０１４８】
他の実施形態では、抗体または抗原結合タンパク質は、変更されたグリコシル化パターンを有するように（すなわち、元のまたはネイティブグリコシル化パターンと比較して）修飾し得る。本明細書中で使用する「変更された」とは、１つもしくは複数の炭水化物部分が欠失している、および／または１つもしくは複数のグリコシル化部位が元の抗体に付加されていることを意味する。本明細書中で開示した抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、グリコシル化部位のコンセンサス配列が含有されるように変更するための周知の方法によって達成する。抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドを抗体のアミノ酸残基に化学的または酵素的カップリングさせることによる。抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に、当分野で知られているように達成し得る。
【０１４９】
また、本発明の抗体は、１３１Ｉまたは９９Ｔｃなどの検出可能または機能的な標識でタグ付けしてもよく、これは、当分野で知られている慣用の化学を用いて本発明の抗体に付着させ得る。また、標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素標識も含まれる。標識には、特異的な同族の検出可能な部分、たとえば標識したアビジンとの結合によって検出し得る、ビオチンなどの化学部分がさらに含まれる。
【０１５０】
ＣＤＲ配列が本明細書中に開示した抗体のＣＤＲ配列とわずかにしか異ならない抗体が、本発明の範囲内に包含される。わずかな差異には、軽微なアミノ酸変化、たとえば、ＣＤＲの配列中の任意の５個のアミノ酸のうちの１個または２個の置換が含まれる。典型的には、アミノ酸は、同様の電荷、疎水性、または立体化学的特徴を有する、関連するアミノ酸によって置換される。そのような置換は、当業者の通常の技術範囲内にある。構造のフレームワーク領域（ＦＲ）は、抗体の結合特性に有害な影響を与えずに、ＣＤＲよりも実質的に改変することができる。ＦＲへの変化には、それだけには限定されないが、非ヒト由来のフレームワークのヒト化または抗原接触もしくは結合部位の安定化に重要な特定のフレームワーク残基の操作、たとえば、定常ドメインのクラスもしくはサブクラスの変化、Ｆｃ受容体結合などのエフェクター機能を変更し得る特異的アミノ酸残基の変化（たとえば、Ｌｕｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：２６５７〜６２、Ｍｏｒｇａｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６：３１９〜２４）、または定常ドメインが由来する種の変化が含まれる。抗体は、重鎖のＣＨ２ドメイン中に、エフェクター機能、たとえば、Ｆｃ受容体結合および補体の活性化を低下または変更する突然変異を有し得る。たとえば、抗体は、米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号に記載されているものなどの突然変異を有し得る。また、抗体は、たとえばＡｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：１０５〜０８に開示されているように、ＩｇＧ４のヒンジ領域中の突然変異などの、免疫グロブリンの２本の重鎖間のジスルフィド結合を安定化する突然変異も有し得る。
【０１５１】
また、本発明のポリペプチドおよび抗体には、開示したポリペプチドおよび抗体と構造的に異なるタンパク質、たとえば、開示したポリペプチドおよび抗体から変更された配列を有するが、実質的に同じ生化学的特性を有するもの、たとえば、機能的に重要でないアミノ酸の変化のみを有するものも包含される。そのような分子には、天然に存在する対立遺伝子変異体および変更、置換、置換え、挿入、または欠失を含有する計画的に操作した変異体が含まれる。そのような変更、置換、置換え、挿入、または欠失のための技術は、当業者に周知である。
【０１５２】
さらに、本発明の抗体は、抗原による刺激に応答して、動物の内在性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて産生し得る。たとえばＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２号を参照されたい。非ヒト宿主中の重鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖をコードしている内在性遺伝子は無能力にされており、ヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードしている活性座位が宿主のゲノム内に挿入されている。ヒト遺伝子は、たとえば必須のヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を用いて取り込ませる。その後、改変の完全な補体よりも少ないものを含有する中間のトランスジェニック動物を交雑育種することによって、すべての所望の改変を提供する動物を子孫として得る。そのような非ヒト動物の一実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５号およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているように、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）と呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、目的の免疫原で免疫化した後に動物から直接、たとえばポリクローナル抗体の調製物として、あるいは、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなどの動物に由来する不死化Ｂ細胞から得ることができる。さらに、ヒト可変ドメインを有する免疫グロブリンをコードしている遺伝子を回収および発現させて抗体を直接得ることができるか、または、さらに改変して抗体の類似体、たとえば単鎖Ｆｖ分子などと得ることができる。
【０１５３】
したがって、本明細書中で使用する用語、抗体または抗原結合タンパク質には、インタクト抗体、抗体の断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｄ、ｄＡｂおよびｓｃＦｖ断片、インタクト抗体ならびにその定常および／または可変ドメインのどちらかが突然変異した断片（たとえば、キメラ、部分的にヒト化、または完全ヒト化抗体を産生するため、また、所望の特色、たとえば、増強したＧＤＦ８結合および／または低下したＦｃＲ結合を有する抗体を産生するための突然変異）が含まれる。したがって、抗体または抗原結合タンパク質がＧＤＦ８と特異的に相互作用する限りは、これらの抗体または抗原結合タンパク質は本発明の範囲内に含まれる。
【０１５４】
また、他のタンパク質結合分子も、ＧＤＦ８の活性を変調するために用い得る。そのような抗原結合分子には、小モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ（商標））の薬物（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ）が含まれる。ＳＭＩＰとは、抗原、対抗受容体などの同族構造の結合ドメイン、１個または０個のシステイン残基を有するヒンジ領域ポリペプチド、ならびに免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる単鎖ポリペプチドである。ＳＭＩＰならびにその使用および応用は、たとえば、すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、米国公開特許出願第２００３／０１１８５９２号、第２００３／０１３３９３９号、第２００４／００５８４４５号、第２００５／０１３６０４９号、第２００５／０１７５６１４号、第２００５／０１８０９７０号、第２００５／０１８６２１６号、第２００５／０２０２０１２号、第２００５／０２０２０２３号、第２００５／０２０２０２８号、第２００５／０２０２５３４号、および第２００５／０２３８６４６号、ならびにその関連特許ファミリーのメンバーに開示されている。
【０１５５】
本発明の抗体または抗原結合タンパク質の結合能力は、以下の方法によって測定し得る：以下の実施例に記載のＢｉａｃｏｒｅ分析、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｘ線結晶構造解析、配列解析および突然変異誘発のスキャン、ならびに当分野で周知の他の方法。本発明の抗体または抗原結合タンパク質が１つまたは複数のＧＤＦ８関連活性を阻害、低下、および／または中和する能力は、以下の非限定的な方法のリストによって測定し得る：ＧＤＦ８依存性細胞系の増殖を測定するアッセイ、ＧＤＦ８媒介ポリペプチドの発現を測定するアッセイ、下流のシグナル伝達分子の活性を測定するアッセイ、関連する動物モデルにおいて本発明の抗体または抗原結合タンパク質が筋肉障害を予防する効率を試験するアッセイ、以下の実施例に記載のアッセイ、および当分野で周知の他のアッセイ。
【０１５６】
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ８と特異的に相互作用することができる、および／または１つもしくは複数のＧＤＦ８活性を特異的に拮抗することができる抗体を選択する方法を提供する。この方法は、複数の抗体をＧＤＦ８で収縮させることと、ＧＤＦ８と結合する第２の複数の抗体を選択することと、第２の複数の抗体がＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーと結合する能力を試験することと、第２の複数の抗体から、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーとより低い親和性で結合する第３の複数の抗体を選択することとを含む。
【０１５７】
別の実施形態では、この方法は、第３の複数の抗体が少なくとも１つのＧＤＦ８活性を拮抗する（たとえば、ＧＤＦ８がＧＤＦ８受容体と結合することを予防する）能力を試験するステップと、１つまたは複数のＧＤＦ８活性を拮抗する（たとえば、ＧＤＦ８がその受容体に結合することを予防する）ことができる抗体を選択するステップとをさらに含む。
【０１５８】
また、本発明の抗ＧＤＦ８抗体は、上清中、細胞溶解物中、または細胞表面上のＧＤＦ８を単離、精製、および／または検出するためにも有用である。本発明中に開示した抗体は、臨床的試験手順の一部としてＧＤＦ８タンパク質レベルを監視するために、診断的に使用することができる。さらに、本発明の抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ８関連障害の中和および／または阻害を必要とする治療、たとえば、筋肉関連の病状の治療に使用することができる。また、本発明は、新規の単離および精製したポリヌクレオチドならびにヒトＧＤＦ８に向けられている新規抗体に関連するポリペプチドも提供する。本発明の遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、およびポリペプチドには、それだけには限定されないが、ＧＤＦ８に対するマウスおよびヒト化抗体、たとえばＲＫ２２、ならびにその変異体が含まれる。
【０１５９】
拮抗剤である組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチド
上述のように、本発明は、特異的ＧＤＦ８拮抗剤として、ＧＤＦ８に特異的なエピトープをコードしている単離および精製した核酸、またはそれに対するペプチド模倣体もしくは抗体をさらに提供する。本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてよく、全体的または部分的に合成であってよい。本明細書中に記載するヌクレオチド配列への言及には、指定した配列を有するＤＮＡ分子またはゲノム均等物、および内容により他のものが必要とされる場合以外はＴがＵで置換されている指定した配列を有するＲＮＡ分子を含む。
【０１６０】
本発明の単離したポリヌクレオチド、たとえば、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５は、開示したポリヌクレオチドをコードしているものと同一またはそれに類似の配列を有する核酸を同定および単離するための、ハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用し得る。非限定的な例として、このような様式で抗体または抗原結合タンパク質のポリヌクレオチドを使用して単離したポリヌクレオチドを使用して、たとえば、ＧＤＦ８に対する特異的抗体を産生し得る、またはそのような抗体を発現する細胞を同定し得る。核酸を同定および単離するハイブリダイゼーション方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションが含まれ、当業者に周知である。
【０１６１】
ハイブリダイゼーション反応は、様々なストリンジェンシーの条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには、任意の２個の核酸分子が互いにハイブリダイズする際の困難性が含まれる。好ましくは、それぞれのハイブリダイズするポリヌクレオチドは、低いストリンジェンシーの条件下、より好ましくはストリンジェントな条件、最も好ましくは高いストリンジェンシーの条件下で、その対応するポリヌクレオチドとハイブリダイズする。ストリンジェンシー条件の例を以下の表３に示す。高いストリンジェンシーの条件とは、少なくともたとえば条件Ａ〜Ｆと同等にストリンジェントなものであり、ストリンジェントな条件とは、少なくともたとえば条件Ｇ〜Ｌと同等にストリンジェントなものであり、低いストリンジェンシーの条件とは、少なくともたとえば条件Ｍ〜Ｒと同等にストリンジェントなものである。
【０１６２】
【表３−１】
0005756291.tif 000004
【０１６３】
【表３−２】
0005756291.tif 000005
【０１６４】
ＴＢ＊−ＴＲ＊：長さが５０個未満の塩基対であることが期待されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低いはずであり、Ｔｍは以下の方程式に従って決定する。長さが１８個未満の塩基対のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。長さが１８〜４９個の塩基対のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｎａ＋）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、Ｎａ＋は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣのＮａ＋＝０．１６５Ｍ）。
【０１６５】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のさらなる例は、本明細書中に参考として組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第９章および第１１章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２．１０節および第６．３節〜第６．４節、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）に提供されている。
【０１６６】
本発明の単離したポリヌクレオチドは、開示したポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体をコードしている配列を有するＤＮＡを同定および単離するための、ハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用し得る。対立遺伝子変異体とは、開示したポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドと同一またはそれと有意な類似性を有するポリペプチドをコードしている、開示したポリヌクレオチドの天然に存在する代替形である。好ましくは、対立遺伝子変異体は、開示したポリヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性）を有する。
【０１６７】
また、本発明の単離したポリヌクレオチドは、開示したポリヌクレオチドに相同的なポリペプチドをコードしている配列を有するＤＮＡを同定および単離するための、ハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとしても使用し得る。これらの相同体は、開示したポリペプチドおよびポリヌクレオチドとは異なる種から、または同じ種内から単離したが、開示したポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して有意な配列類似性を有する、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。好ましくは、ポリヌクレオチド相同体は、開示したポリヌクレオチドと少なくとも５０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有する一方で、ポリペプチド相同体は、開示した抗体／ポリペプチドと少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも４５％の同一性、最も好ましくは少なくとも６０％の同一性）を有する。好ましくは、開示したポリヌクレオチドおよびポリペプチドの相同体は、哺乳動物種から単離したものである。
【０１６８】
また、本発明の単離したポリヌクレオチドは、本発明のＧＤＦ８に特異的なエピトープまたは抗体を発現する細胞および組織、ならびにそれらが発現される条件を同定するための、ハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとしても使用し得る。
【０１６９】
さらに、本発明の単離したポリヌクレオチドは、細胞または生物において、本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現変更（すなわち、増強、低下、または改変）するために使用し得る。これらの「対応する遺伝子」とは、転写されて本発明のポリヌクレオチドが由来するｍＲＮＡを生じる、本発明のゲノムＤＮＡ配列である。
【０１７０】
細胞または生物における、本発明に関連する配列の変更された発現は、アンチセンスポリヌクレオチド、本発明の遺伝子から転写されたｍＲＮＡと結合および／またはそれを切断するリボザイム、遺伝子の調節領域を標的とする三重鎖形成オリゴヌクレオチド、ならびに標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を引き起こす低分子干渉ＲＮＡなどの、様々な阻害性ポリヌクレオチドの使用によって達成し得る（たとえば、Ｇａｌｄｅｒｉｓｉら（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１８１：２５１〜５７、Ｓｉｏｕｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、１：５７５〜８８、ＫｎａｕｅｒｔおよびＧｌａｚｅｒ（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１０：２２４３〜５１、Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４２８〜２９）。そのような阻害性ポリヌクレオチドは、本発明の拮抗剤であるとみなされる。当業者は、本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、（本発明の拮抗抗体ではなく）上記に提供するようにＧＤＦ８に特異的なエピトープに向けられているべきであることを理解されよう。
【０１７１】
本発明によって包含される阻害性三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、高い特異性および親和性で二重鎖ＤＮＡの主溝中に結合する（ＫｎａｕｅｒｔおよびＧｌａｚｅｒ、上記）。本発明の遺伝子の発現は、遺伝子の調節領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列）に相補的なＴＦＯを標的化させて、遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することによって、阻害することができる。
【０１７２】
本発明の一実施形態では、本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である（たとえば、Ｇａｌｄｅｒｉｓｉら（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１８１：２５１〜５７、Ｓｉｏｕｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、１：５７５〜８８を参照）。これらのｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を引き起こす短い二重鎖のＲＮＡ分子である。この分解は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（たとえば、Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４２８〜２９）。ＲＮＡｉは最初に下等生物で同定され、哺乳動物細胞に有効に応用されており、最近では、Ｆａｓ  ｍＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡ分子で治療したマウスにおいて劇症肝炎を予防することが示されている（Ｓｏｎｇら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、９：３４７〜５１）。さらに、くも膜下腔内に送達したｓｉＲＮＡは、最近、ラットにおいて２つのモデル（作用剤誘導性疼痛モデルおよび神経因性疼痛モデル）で疼痛応答を遮断することが報告されている（Ｄｏｒｎら（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２（５）：ｅ４９）。
【０１７３】
本発明のｓｉＲＮＡ分子の二重鎖構造は、重合したＲＮＡの１つまたは複数の鎖を含み得る、すなわち、二重鎖構造は、ヘアピンループを含む１本の自己相補的ＲＮＡ鎖または２本の相補鎖によって形成され得る。標的配列と比較して挿入、欠失、および単一の点突然変異を有するｓｉＲＮＡ配列も、標的配列の発現の阻害に有効であることが見出されている（Ｆｉｒｅら、米国特許第６，５０６，５５９号）。したがって、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、本発明のＧＤＦ８に特異的な標的エピトープに対応するｍＲＮＡの少なくとも一部分と実質的な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことが好ましい。たとえば、本発明のｓｉＲＮＡ分子の二重鎖領域は、ＧＤＦ８に特異的な標的エピトープに対応するｍＲＮＡの少なくとも一部分と９０％を超える配列同一性、好ましくは１００％の配列同一性を有し得る。あるいは、実質的な配列同一性は、ｓｉＲＮＡ分子の二重鎖領域の少なくとも１つの鎖が、少なくとも、たとえば、上記表３の条件Ｇ〜Ｌとして定義したストリンジェントな条件下で、ＧＤＦ８に特異的な標的エピトープの少なくとも一部分とハイブリダイズする能力として定義し得る。本発明の好ましいが非限定的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、高いストリンジェンシーの条件、たとえば、少なくともたとえば上記表３の条件Ａ〜Ｆと同等にストリンジェントな条件下で、ＧＤＦ８に特異的な標的エピトープの少なくとも一部分とハイブリダイズする。実質的に同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０、１５、１９、２１、２３、２５、５０、１００、２００、３００、４００、または５００個のヌクレオチドであってよく、好ましくは１９〜２７個のヌクレオチドであり、最も好ましくは１９または２１個のヌクレオチドである（Ｆｉｒｅら、上記を参照）。
【０１７４】
本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、当分野で周知の基準に基づいて（たとえばＥｌｂａｓｈｉｒら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．、２０：６８７７〜８８）および／または周知のアルゴリズムを用いることによって（たとえば、公的に利用可能なアルゴリズム）設計し得る。たとえば、本発明の阻害性ポリヌクレオチドの標的化部分（たとえばｓｉＲＮＡ分子の二重鎖領域）は、好ましくは、ＡＡ（最も好ましい）、ＴＡ、ＧＡ、またはＣＡから開始されるべきである。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、ＧＣ比が４５〜５５％である配列を含むべきである。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、３個の同じヌクレオチドを連続して含有すべきではない。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、７個の混合Ｇ／Ｃを連続して含有すべきではない。これらの基準、または他の既知の基準（たとえばＲｅｙｎｏｌｄｓら（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２：３２６〜３０）に基づいて、ＧＤＦ８に特異的なエピトープを標的とする本発明のｓｉＲＮＡ分子が当業者によって設計され得る。たとえば、一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列、配列番号７のヌクレオチド配列、配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号１１のヌクレオチド配列、およびその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するおよび／またはそれから本質的になり得る。本実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３のヌクレオチド配列の補体、配列番号５のヌクレオチド配列の補体、配列番号７のヌクレオチド配列の補体、配列番号９のヌクレオチド配列の補体、配列番号１１のヌクレオチド配列の補体、およびその断片の補体をさらに含む。
【０１７５】
たとえば、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、２本の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を一緒にアニーリングさせることによって（Ｆｉｒｅら、上記）、または、それ自体が折り畳まれて必須の二本鎖部分を生じる単一のヘアピンＲＮＡ分子の使用によって作製し得る（Ｙｕら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：６０４７〜５２）。ｓｉＲＮＡ分子は、化学合成であるか（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４〜９８）、または一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成され得る（Ｙｕら、上記）。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、本発明に関連するポリヌクレオチドを、そのプロモーターに対してセンスおよび／またはアンチセンスの配向で含む、以下に記載の発現ベクターを用いて、生物学的に、一過的（Ｙｕら、上記、Ｓｕｉら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：５５１５〜２０）または安定的（Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１４４３〜４８）に生成することができる。組換えＲＮＡポリメラーゼをｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写に使用してもよく、または、改変した細胞の内在性ＲＮＡポリメラーゼがｉｎ  ｖｉｖｏの転写を媒介し得る。最近では、初代ヒト細胞における標的ｍＲＮＡのレベルの効率的かつ配列特異的な様式の低下が、ｓｉＲＮＡ分子へとさらにプロセッシングされるヘアピンＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターを用いて実証された（Ａｒｔｓら（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１３：２３２５〜３２）。
【０１７６】
本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、当分野で周知の手順を含めた化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。化学合成ポリヌクレオチドのヌクレオシド結合は、ヌクレアーゼ媒介分解に抵抗する、一部の生物において二重鎖ＲＮＡによって生じる全体的パニック応答を回避する、および／またはその配列特異性を増加するその能力を増強するために修飾し得る。そのような結合の修飾には、それだけには限定されないが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）結合が含まれる（Ｇａｌｄｅｒｉｓｉら、上記、Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２４３：２０９〜１４、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、８：１１５７〜７９）。
【０１７７】
上述のように、本発明に関連する単離したポリヌクレオチド、またはその連続した一部分は、センスまたはアンチセンスの配向で発現制御配列と作動可能に連結している、および／または、本発明の阻害性ポリヌクレオチド（たとえばｓｉＲＮＡ分子）を組換え発現させるための発現ベクター内にライゲーションさせ得る。
【０１７８】
また、本発明は、上述の本発明少なくとも１つの核酸を含む、プラスミド、ベクター、転写物または発現カセットの形態の構築体も提供する。
【０１７９】
本発明の単離したポリヌクレオチドは、本発明の特異的エピトープ（たとえばペプチド模倣体として）または抗体を組換え産生するための発現制御配列と作動可能に連結していてもよい。さらに、当業者は、本発明のポリヌクレオチドをコードしている抗体または抗原結合タンパク質は、様々な抗体アイソタイプの定常ドメインをコードしている周知のヌクレオチド配列と作動可能に連結していてもよいことを理解されたい。たとえば、本発明の軽鎖可変ドメインをコードしている本発明のポリヌクレオチド（たとえば配列番号１５として記載したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、連結したヌクレオチドの発現により、ＧＤＦ８と特異的に相互作用するおよび／またはそれを特異的に拮抗する可変ドメインを有する完全なκまたはλ軽鎖がもたらされるように、κ軽鎖もしくはλ軽鎖のどちらかの定常ドメイン（またはその誘導体）をコードしているヌクレオチド配列と作動可能に連結していてもよい。同様に、本発明の重鎖可変ドメインをコードしている本発明のポリヌクレオチド（たとえば配列番号１３として記載したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、重鎖アイソタイプ（またはその誘導体）、たとえば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＡの定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列と作動可能に連結していてもよい。組換えタンパク質を発現させるための一般的な方法は当分野で周知である。そのような組換えタンパク質は、ＧＤＦ８に関連する障害の治療に使用するために、可溶型で発現させ得る。本発明の組換え発現ベクターは、付加配列、宿主細胞中でベクターの複製を調節する配列（たとえば複製起点）、ヒスチジンなどのタグ配列、および選択マーカー遺伝子を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。たとえば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いてｄｈｆｒ宿主細胞で使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【０１８０】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じて他の配列を含めた、適切な調節配列を含有する適切なベクターは、選択または構築し得る。ベクターは、必要に応じて、プラスミドまたはウイルス、たとえば、ファージ、もしくはファージミドであり得る。さらなる詳細には、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照されたい。たとえば、核酸構築体の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析において、核酸を操作するための、多くの知られている技術およびプロトコルが、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２に詳述されている。
【０１８１】
また、本発明は、上述の１つまたは複数の構築体、たとえば、本明細書中に提供する、ＧＤＦ８に特異的な任意のエピトープをコードしている組換え核酸、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３）、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、または特異的抗原結合断片を含む宿主細胞も提供し、本発明の一態様を形成する。
【０１８２】
また、本発明には、タンパク質を、コードしている核酸から、宿主細胞内で発現させることによって、ペプチドを生成する方法も含まれる。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成し得る。
【０１８３】
いくつかの細胞系が、本発明のポリペプチドおよび抗体の組換え発現に適した宿主細胞である。哺乳動物宿主細胞系には、それだけには限定されないが、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、ジャーカット細胞ならびに一次組織および初代外植片のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物に由来する細胞株が含まれる。また、そのような宿主細胞は、ゲノムＤＮＡからなる本発明のポリヌクレオチドのスプライシングも可能にする。
【０１８４】
あるいは、酵母などの下等真核生物または原核生物中で本発明のポリペプチドおよび抗体を組換えによって産生させることも可能であり得る。潜在的に適切な酵母株には、それだけには限定されないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）株が含まれる。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が含まれる。本発明のポリペプチドを酵母または細菌中で作製する場合は、機能的なタンパク質を得るために、たとえば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によってそれらを修飾することが必要であり得る。そのような共有結合は、周知の化学または酵素方法を用いて達成し得る。
【０１８５】
また、本発明のポリペプチドおよび抗体は、バキュロウイルスベクターなどの１つまたは複数の昆虫発現ベクター中で本発明の単離したポリヌクレオチドを適切な制御配列と作動可能に連結させ、昆虫細胞発現系を用いて、組換えによっても産生させ得る。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系の材料および方法は、キットの形態で市販されている（たとえばＭＡＸＢＡＣ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）。
【０１８６】
適切な宿主細胞中での組換え発現後、本発明のポリペプチドおよび抗体は、培地または細胞抽出物から、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの既知の精製プロセスを用いて精製し得る。また、精製には、本発明のポリペプチドおよび抗体と結合することが知られている薬剤を用いたアフィニティークロマトグラフィーも含まれ得る。また、これらの精製プロセスは、本発明のポリペプチドおよび抗体を天然源から精製するためにも使用し得る。
【０１８７】
あるいは、本発明のポリペプチドおよび抗体は、精製を容易にする形態で、組換えによって発現させ得る。たとえば、ポリペプチドは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）などの、タンパク質との融合体として発現させ得る。そのような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、それぞれＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。また、本発明のポリペプチドおよび抗体は、小さなエピトープでタグ付けし、続いて、エピトープに対する特異的抗体または抗原結合タンパク質を用いて同定または精製することもできる。好ましいエピトープは、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（コネチカット州Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ）から市販されているＦＬＡＧエピトープである。
【０１８８】
また、本発明のポリペプチドおよび抗体は、知られている慣用の化学合成によっても産生し得る。本発明のポリペプチドおよび抗体を化学合成する方法は当業者に周知である。そのような化学合成のポリペプチドおよび抗体は、天然の精製したポリペプチドおよび抗体と共通した生物学的特性を保有している場合があり、したがって、天然のポリペプチドおよび抗体の生物活性のあるまたは免疫学的な置換体として用い得る。
【０１８９】
本発明のさらなる態様は、本明細書中に開示した核酸、ポリペプチド、ベクター、または抗体およびその断片を含む宿主細胞を提供する。さらなる態様は、本発明の核酸を宿主細胞内に導入することを含む方法を提供する。導入には任意の利用可能な技術を用い得る。真核細胞では、適切な技術には、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介形質移入およびレトロウイルスまたは別のウイルス、たとえばワクシニアもしくは昆虫細胞ではバキュロウイルスを用いた形質導入が含まれる。細菌細胞では、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔およびバクテリオファージを用いた感染が含まれ得る。
【０１９０】
核酸の導入に続いて、たとえば、宿主細胞を遺伝子発現に適した条件下で培養することによって、核酸からのタンパク質産生が引き起こされるまたは可能となり得る。そのような条件は当分野で周知である。
【０１９１】
本発明による、阻害性ポリヌクレオチド、ＧＤＦ８に特異的なエピトープ（たとえば、ペプチド模倣体および／もしくは免疫原として）、特異的抗体もしくは抗原結合タンパク質断片、ＶＨドメイン、および／またはＶＬドメイン、ならびにコードしている核酸分子およびベクターは、たとえば、その天然の環境から実質的に純粋もしくは均一な形態で単離および精製されて、または、核酸の場合は、必要な機能を有するポリペプチドをコードしている配列以外の、由来する核酸もしくは遺伝子を含まないもしくは実質的に含まずに、提供し得る。
【０１９２】
生体試料中のＧＤＦ８を検出および定量化する方法
本発明は、生体試料中のＧＤＦ−８を検出および定量化する方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、血清、血液、および血漿中の遊離および全ＧＤＦ−８の両方を検出および定量化するための免疫アッセイを含む。一例では、免疫アッセイは、抗ＧＤＦ−８治療のバイオマーカーとして有用なデータを提供する。具体的には、開示した免疫アッセイは、抗ＧＤＦ−８治療前のベースラインでの臨床成績の予測的／予後的マーカーとして、抗ＧＤＦ−８治療への曝露のマーカーとして、抗ＧＤＦ−８薬の有効性または応答のマーカーとして、およびＧＤＦ−８が特定の病状または生物学的プロセスに関与していることの診断的マーカーとして、有用であり得る。
【０１９３】
特に、この方法は、ＧＤＦ−８関連疾患または障害に罹患しているまたはそれを発生する危険性にある哺乳動物において、ＧＤＦ−８関連疾患または障害を検出、診断、および予測するための診断的および／または予後的方法を提供する。この方法は、ＧＤＦ−８変調剤、たとえば、ＧＤＦ−８と結合するもの、またはＧＤＦ−８の生物活性を阻害するものを受ける、ヒト患者の適合性を評価するための使用に特に適している。
【０１９４】
特定の実施形態では、本発明は、ＧＤＦ−８変調剤または抗ＧＤＦ−８治療を受けている個体の進行を監視する方法を提供する。たとえば、方法は、ＧＤＦ−８変調剤を用いた治療に対する個体の応答を評価するために提供する。治療に対する個体の応答を評価するために、免疫アッセイ方法を、ＧＤＦ−８変調剤を投与する前、その間、およびその後に提供し得る。治療用抗体ＭＹＯ−０２９を受けている哺乳動物においてＧＤＦ−８の存在を検出する方法も、本発明によって包含される。
【０１９５】
一実施形態では、本発明の免疫アッセイ方法は、遊離ＧＤＦ−８を検出する。たとえば、遊離ＧＤＦ−８とは、ＧＤＦ−８結合タンパク質またはＧＤＦ−８変調剤、たとえばＧＤＦ−８結合または中和抗体と結合していないＧＤＦ−８である。別の実施形態では、全ＧＤＦ−８、たとえば、遊離ＧＤＦ−８およびすべての結合したＧＤＦ−８を検出する方法が包含される。
【０１９６】
筋肉関連障害に罹患している、またはそれを発生する危険性にある個体が、本明細書中に提供する方法の候補である。ＧＤＦ−８活性の阻害は、筋肉関連障害に罹患しているものを含めた個体において筋肉量を増加させる。いくつかの障害が筋組織の機能障害に関連しており、たとえば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮、臓器萎縮、虚弱、うっ血性閉塞性肺疾患、心不全、筋肉減少症、悪液質、ならびに他の疾患および状態によって引き起こされる筋消耗症候群である。さらに、筋肉量または筋肉強度を増加させる、原料用動物において成長または筋組織質量を増加させることを所望する個体または哺乳動物が、本明細書中に提供する方法の候補である。
【０１９７】
脂肪組織、代謝、または骨関連の障害または状態に罹患している、またはそれを発生する危険性にある個体も、本明細書中に記載および特許請求した方法の候補である。そのような障害または状態には、たとえば、２型糖尿病、耐糖能異常、代謝症候群（たとえば症候群Ｘ）、熱傷または窒素不均衡などの外傷によって誘導されたインスリン抵抗性、および脂肪組織障害（たとえば肥満症）の発生など、グルコース恒常性に関連するものが含まれる（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２８１：９０２〜９０６（２００１））。たとえば、ＧＤＦ−８は、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を変調し（同上）、間葉前駆細胞および前脂肪細胞からの脂肪細胞の形成を阻害する（Ｒｅｂｂａｐｒａｇａｄａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、２３：７２３０〜７２４２（２００３））。脂肪蓄積は、ＧＤＦ−８タンパク質を全身投与したＧＤＦ−８ノックアウトマウスおよび野生型成体マウスの両方で低下する（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．、１０９：５９５〜６０１（２００２）、Ｚｉｍｍｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６：１４８６〜１４８８（２００２））。
【０１９８】
本発明の方法の他の使用は当業者に明らかであり、以下にさらに例示する。
【０１９９】
免疫アッセイ
本明細書中に記載する免疫アッセイは、少なくとも２個の抗ＧＤＦ−８抗体を利用するサンドイッチ型ＥＬＩＳＡであり、１つはＧＤＦ８に特異的なＧＤＦ−８捕捉試薬として存在し、１つはＧＤＦ８に特異的なＧＤＦ−８検出試薬として存在する。どちらの抗体も、生体試料中に存在するＧＤＦ−８抗原と結合することができる。抗体の１つは、ＧＤＦ−８をＢＭＰ−１１よりも優先的に認識する。どちらの抗体もＧＤＦ−８を認識および結合することができる。さらに、特定の実施形態では、抗体は、その生物学的形態のうちの任意のもので存在するＧＤＦ−８と結合することができる（たとえば、活性ＧＤＦ−８、潜在型ＧＤＦ−８、血清タンパク質と結合したＧＤＦ−８、中和抗ＧＤＦ−８抗体ＭＹＯ−０２９と結合したＧＤＦ−８）。
【０２００】
特定の実施形態では、対象アッセイで使用する抗体は、ＧＤＦ−８と結合する単離したマウスモノクローナル抗体であるＲＫ３５である（配列番号３１〜３５および本明細書中に参考として組み込まれている米国出願ＵＳ２００７／００８７０００号を参照）。一部の実施形態では、ＲＫ３５を捕捉抗体として利用する。ＧＤＦ−８と結合するＲＫ３５の断片も本発明の方法で使用し得る。
【０２０１】
特定の実施形態では、対象アッセイで使用する第２の抗体は、ＧＤＦ−８と結合する単離したマウスモノクローナル抗体であるＲＫ２２である。以下に例示するように、ＲＫ２２はＢＭＰ−１１と結合しない。一部の実施形態では、ＲＫ２２を検出試薬として利用し、一部の実施形態では、これを捕捉試薬として使用する。ＧＤＦ−８と結合するＲＫ２２の断片も本発明のアッセイで使用し得る。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明の免疫アッセイは、ヒトＩｇＧ１抗ＧＤＦ−８抗体である抗体ＭＹＯ−０２９を利用する。ＭＹＯ−０２９（配列番号３３および３４、本明細書中に参考として組み込まれている米国公開出願第２００６／０２４０４８８号および第２００６／０２４０４８７号を参照）は、ＭＹＯ−０２９の非存在下で場合に生じるシグナルから減算することができるバックグラウンドレベルを得るために、免疫アッセイにおいてＧＤＦ−８の検出を遮断するために使用し得る。本実施形態は、定量化アッセイの感度および精度を増加させるために用いることができる。
【０２０３】
また、本発明の方法において有用な抗体には、たとえば、ＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖ断片、定常領域の間でジスルフィド結合によって共有結合されたＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬドメインからなるＦａｂ断片（断片抗原結合）などの、抗原結合断片も包含される。他の可能な抗原結合断片、および抗体構造の総説には、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗら編、１９８８を参照されたい。
【０２０４】
非生殖系列化ｓｃＦｖであるＭＹＯ−０２９をコードしているファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６で個別に形質転換させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養物を、２００２年１０月２日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）に、個別の受託番号ＰＴＡ−４７４１として寄託した。受託機関の住所は、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、２０１１０である。
【０２０５】
ＧＤＦ８を含有する試料を捕捉試薬と合わせた後、すべての非結合構成成分を洗浄によって除去し、その後、構成成分を、ＧＤＦ−８を含有すると疑われる試料と、適切な結合条件下で接触させる。すべての非結合分子を除去するために洗浄した後、第２の抗ＧＤＦ−８抗体を適切な結合条件下で加える。この第２の抗体は、検出抗体または試薬と呼ばれる。検出抗体には検出可能な標識が含まれていてよく、捕捉抗体と反応した分子と結合する。したがって、存在するすべてのＧＤＦ−８は、試料中のＧＤＦ８と結合した捕捉試薬、および検出抗体試薬の両方に結合する。結合していない分子および構成成分を洗浄によって除去する。したがって、標識の存在は、生体試料中のＧＤＦ−８の存在を示す。
【０２０６】
より詳細には、サンドイッチＥＬＩＳＡ方法を使用することができる。ＧＤＦ−８を含有するまたは含有することが疑われる生体試料が、ＧＤＦ８に特異的な捕捉試薬である。ＧＤＦ−８と捕捉試薬との結合を可能にするために十分なインキュベーション期間の後、プレートを洗浄して結合していない構成成分を除去することができ、検出構成成分を加える。これらの分子をすべての捕捉された試料ＧＤＦ−８と反応させ、プレートを洗浄し、当分野で周知の方法を用いて標識の存在を検出する。
【０２０７】
上述の免疫アッセイを実施するために、抗原および捕捉された試料と反応させる抗体を用いた免疫アッセイを含めた、上述のアッセイ試薬を、キットで、適切な指示書および他の必要な試薬と共に提供し得る。また、キットは、使用する具体的な免疫アッセイに応じて、適切な標識および他の梱包した試薬および物質（すなわち洗浄バッファーなど）も含有し得る。上述のものなどの免疫アッセイは、これらのキットを用いて実施することができる。
【０２０８】
免疫アッセイの具体的な実施形態遊離ＧＤＦ−８の分析
一実施形態では、本発明は、生体試料中の遊離ＧＤＦ−８の存在を検出する方法を含む。本実施形態の代表的な例を図２１に示す。
【０２０９】
本明細書中で使用する用語、遊離ＧＤＦ−８には、その活性のある成熟状態で存在するＧＤＦ−８が含まれる。成熟ＧＤＦ−８は、単量体、二量体、またはホモ二量体であり得る。遊離ＧＤＦ−８には、潜在型ＧＤＦ−８（すなわち、ＧＤＦ−８プロペプチドと会合した成熟ＧＤＦ−８）、ＧＤＦ−８結合タンパク質と会合したＧＤＦ−８、または抗ＧＤＦ−８変調剤、たとえば、ＧＤＦ−８結合および中和抗体などと会合したＧＤＦ−８は含有されない。
【０２１０】
一実施形態では、遊離ＧＤＦ−８を検出および定量化する方法は、（ａ）ＧＤＦ−８捕捉抗体および試料を、生体試料中に存在する場合にＧＤＦ−８が１つまたは複数の捕捉抗体と結合して捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体を形成することを可能にする条件下で合わせ、複合体形成条件下で、捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体と結合する検出抗体を加えるステップと、（ｂ）存在する場合は、捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体と検出抗体との間に形成された複合体を、生体試料中のＧＤＦ−８の指標として検出するステップとを含む。
【０２１１】
検出抗体または抗原結合タンパク質は、検出可能な標識をさらに含み得る。一部の例では、検出抗体は標識されておらず、検出抗体を特異的に認識する検出剤を利用する。
【０２１２】
全ＧＤＦ−８分析
一実施形態では、本発明は、生体試料中の全ＧＤＦ−８の存在を検出する方法を含む。
【０２１３】
本明細書中で使用する用語、全ＧＤＦ−８には、その活性のある成熟状態で存在するＧＤＦ−８、ならびにその潜在型（すなわち、ＧＤＦ−８プロペプチドと会合した成熟ＧＤＦ−８）、ＧＤＦ−８結合タンパク質と会合したＧＤＦ−８、または抗ＧＤＦ−８変調剤、たとえば、ＧＤＦ−８結合および中和抗体と会合したＧＤＦ−８で存在するすべてのＧＤＦ−８が含まれる。全ＧＤＦ−８の測定には、治療用抗体ＭＹＯ−０２９によって結合されたＧＤＦ−８の測定が含まれる。
【０２１４】
酸解離
一実施形態では、全ＧＤＦ−８を検出および定量化する方法は、酸解離方法を利用し、（ａ）ＧＤＦ−８捕捉抗体を生体試料と、生体試料中に存在する場合にＧＤＦ−８が１つまたは複数の捕捉抗体と結合して捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体を形成することを可能にする酸性条件下（約ｐＨ１．０〜約ｐＨ６．０、好ましくは約ｐＨ２．５）で合わせ、捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体と結合するＧＤＦ−８検出抗体）を複合体形成条件下で加えるステップと、（ｂ）存在する場合は、捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体と検出抗体との間に形成された複合体を、生体試料中のＧＤＦ−８の指標として検出するステップとを含む。
【０２１５】
検出抗体または抗原結合タンパク質は、検出可能な標識をさらに含み得る。一部の例では、検出抗体は標識されておらず、検出抗体を特異的に認識する検出剤を利用する。
【０２１６】
熱解離
別の実施形態では、全ＧＤＦ−８を検出および定量化する方法は、熱解離方法を利用し、（ａ）ＧＤＦ−８捕捉抗体または抗原結合タンパク質を固体担体の表面と接触させるステップと、（ｂ）生体試料を、少なくとも６３℃、たとえば、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃まで、少なくとも３分間、たとえば、５、７、９、１０、１２、１４、または１５分間加熱し、生体試料を固体担体と、生体試料中に存在する場合にＧＤＦ−８が１つまたは複数の捕捉抗体と結合して捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体を形成することを可能にする条件下で合わせるステップと、（ｃ）捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体と結合する検出抗体を、ステップ（ｂ）の固体担体に複合体形成酸性条件下で加えるステップと、（ｄ）存在する場合は、捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体と検出抗体との間に形成された複合体を、生体試料中のＧＤＦ−８の指標として検出するステップとを含む。
【０２１７】
検出抗体または抗原結合タンパク質は、検出可能な標識をさらに含み得る。一部の例では、検出抗体は標識されておらず、検出抗体を特異的に認識する検出剤を利用する。
【０２１８】
この方法の一実施形態を図１２に示し、これは、抗体ＭＹＯ−０２９が検出抗体（たとえばビオチン標識したＲＫ２２）によって生じたシグナルを阻害することを示している。この様式で、アッセイのバックグラウンドを計算してステップ（ｄ）で得られた値から減算することができる。
【０２１９】
遊離および全ＧＤＦ−８を分析するための代替実施形態
特定の実施形態では、捕捉抗体を、固体担体または反応器の表面、たとえば、表面と共有結合または非共有結合させることによって接触させる。接触は、直接または間接的であり得る。表面は、表面の結合特徴に影響を与えるために、たとえば、化学的または放射線処理によって改変されていてもよい。
【０２２０】
特定の実施形態では、捕捉抗体を生体試料と接触させ、洗浄して結合していない構成成分を除去した後。非特異的な相互作用は、標的と特異的に結合しないタンパク質などの少なくとも１つの遮断剤を含む緩衝液を反応器に加える、遮断ステップを用いて最小限にし得る。遮断緩衝液は、たとえば、市販の遮断緩衝液、血清、ウシ血清アルブミン、乳、カゼイン、ゼラチン、および／または非イオン性洗剤を含み得る。一部の実施形態では、反応器をクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液または酢酸緩衝液などのｐＨ約５〜約９を有する緩衝液で洗浄する。あるいは、たとえば、全ＧＤＦ−８を検出および定量化する酸解離方法では、緩衝液は約ｐＨ３．０〜ｐＨ５．０である。
【０２２１】
本発明の方法で試験する生体試料は、血清、血液、血漿、生検試料、組織試料、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ液、尿、汗、潤滑液、および涙液から選択され得る。特定の実施形態では、生体試料は流体である。一部の実施形態では、生体試料は、血液、血清、および血漿から選択される。具体的な実施形態では、生体試料は、たとえば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、またはニワトリの血清などからの血清である。
【０２２２】
他の実施形態では、生体試料を個体または複数の個体から単離し、試験の前に処理してもよい。たとえば、試料を希釈し得る。希釈緩衝液は、試験生体試料に対応するように、たとえば、バックグラウンド効果または試料マトリックスの干渉を考えて選択された、一定量化の対照生体試料を含んでいてもよい。一実施形態では、ヒト血漿の試験試料を、ＴＨＳＴ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１．０ｍＭのグリシン、０．５ＭのＮａＣｌ、および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有）緩衝液で１：８倍に希釈し、８倍を超える生体試料の希釈液を、ＴＨＳＴ＋ＧＤＦ−８を枯渇させた１２．５％のヒト血清で調製する。生体試料は、約２、４、５、８、１０、１２、１４、１５、１６、３２、６４、または１２８倍に希釈し得る。他の実施形態では、生体試料を１：１．５または１：１．６に段階希釈して、希釈の直線性およびマトリックス効果の検証を可能にするデータ点の範囲を得る。一部の生体試料マトリックスででは、マトリックス干渉およびアッセイ感度が最適化されている希釈を選択し得る。
【０２２３】
希釈剤は特に限定されないが、たとえば、ヒト血清、ＧＤＦ−８を枯渇させたヒト血清、マウス血清、ＧＤＦ−８を枯渇させたマウス血清を含めた血清、脱イオン水、または、アッセイを酸性条件で行うかどうかに応じてｐＨ約３．０〜ｐＨ約９．０の範囲内で緩衝作用を有する様々な緩衝液を含み得る。中性ｐＨで行う遊離ＧＤＦ−８の分析には、ｐＨは、約６．５〜約８．５、約６．５〜約７．０、約７．０〜約７．５、約７．５〜約８．０、または約８．０〜約８．５である（たとえば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、またはホウ酸緩衝液）。酸性ｐＨで行う全ＧＤＦ−８の分析には、ｐＨは、たとえば、約１．０〜約２．５、約２．５〜約５．５、約２．５〜約３．０、約３．０〜約３．５、約３．５〜約４．０、約４．０〜約４．５、または約４．５〜約５．５、約５．５〜約６．５である。
【０２２４】
一部の実施形態では、生体試料を、周知の方法を用いて分画または濃縮してもよく、その後、本明細書中に記載のアッセイに加えてＧＤＦ−８を検出し得る。たとえば、アッセイにおいてマトリックス干渉がＧＤＦ−８変調剤の検出を制限する場合には、分画（精製が含まれる）または濃縮を使用し得る。分画および濃縮技術には、それだけには限定されないが、遠心分離、硫安塩析、ポリエチレングリコール沈殿、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿、親和性技術（抗体、たとえば抗ＧＤＦ−８抗体などの特異的結合パートナーとコンジュゲートした樹脂を用いた免疫沈降など）、クロマトグラフィー技術、および他の分離技術が含まれる。
【０２２５】
生体試料をナイーブ個体から採取するか、または、生体試料を、ＧＤＦ−８変調剤を投与する前、その間もしくはその後に採取し得る。たとえば、試料は、ＧＤＦ−８変調剤を投与した１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、２０、２５、３０日後、またはそれより長い日数後に個体から得てもよい。また、生体試料は、ＧＤＦ−８変調剤を投与した１、２、３、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６週間後、またはそれよりも多い数の週の後に得てもよい。一部の例では、１年間までまたはそれを超える時点が適切である。生体試料は、遊離および全ＧＤＦ−８の両方について試験し得る。全ＧＤＦ−８の分析は、ＧＤＦ−８変調剤で治療している個体において特に重要であり、これらの薬剤は検出剤または捕捉剤のどちらかが生体試料中のＧＤＦ−８と結合する能力を妨げ得るからである。したがって、全ＧＤＦ−８の分析で利用する酸または熱解離方法が特に重要となる。
【０２２６】
特定の実施形態では、試験する生体試料のアリコートを捕捉抗体または抗原結合タンパク質と接触させ、十分な時間（たとえば、２〜１２０分間または１〜４時間）、適切な条件下（たとえば、２３℃）でインキュベーションして、生体試料中にＧＤＦ−８が存在する場合は捕捉抗体とそれとの結合を可能にし、抗体／ＧＤＦ−８の複合体の形成を可能にする。他の実施形態では、ＧＤＦ−８／抗体の反応は、慣用の免疫アッセイでルーチン的に使用される条件下で実施する。典型的な手順は、捕捉抗体および生体試料を含む反応系を、４５℃を超えない温度、たとえば、約４℃〜約４０℃または約２３℃〜約４０℃などで、約０．５〜４０時間、たとえば約１〜約２０時間などの間、インキュベートまたは静置することを含む。
【０２２７】
インキュベーション期間後、一部の実施形態では、抗体／ＧＤＦ−８の複合体を緩衝液で洗浄して、結合していない溶質を除去する。他の実施形態では、生体試料および検出抗体を同時に反応器に加える同時アッセイを行う。
【０２２８】
検出抗体を生体試料の後に加える特定の実施形態では、手順は、抗体／ＧＤＦ−８の複合体および検出抗体を含む反応系を、４５℃を超えない温度、たとえば、約４℃〜約４０℃または約２５℃〜約４０℃などで、約０．５〜４０時間または約１〜約２０時間の間、インキュベートまたは静置することを含み得る。
【０２２９】
一部の実施形態では、検出抗体、抗原結合タンパク質またはその断片は、検出可能な標識を含む。さらなる実施形態では、検出抗体は、たとえば検出剤によって間接的に検出する。一部の実施形態では、反応器中に存在する本質的にすべての検出抗体が結合されるように、検出剤は過剰である。
【０２３０】
一部の実施形態では、「直接」標識は、補助試薬を加えずに検出可能なシグナルを自発的に生成することができる特異的結合メンバーと結合またはコンジュゲートした、任意の分子であり得る。一部の例には、放射性同位体（たとえば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、フルオロフォア（たとえば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、１−Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジル）−５−Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン）、色素（たとえば、フィコシアニン、フィコエリスリン、テキサスレッド、ｏ−フタルアルデヒド）、化学発光性および生物発光分子を含めた発光分子、コロイド状金粒子、コロイド状銀粒子、他のコロイド状金属粒子、ポリスチレン色素粒子、色素ゾルなどの微小有色粒子、ならびに有色ラテックス粒子が含まれる。多くの他の適切な標識分子が当業者に周知であり、本発明の方法で利用し得る。
【０２３１】
特定の例では、標識は、酵素、たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼなどであり得る。様々な実施形態では、特異的酵素と使用する基質は、対応する酵素の存在下における、色、蛍光、または発光の検出可能な変化の生成について選択する。酵素は、グルタルアルデヒドまたは還元性アミノ化架橋結合によって抗体または抗原結合タンパク質とコンジュゲートしていてよい。しかし、容易に認識されるように、幅広い種類の様々なコンジュゲーション技術が存在し、当業者が容易に利用可能である。
【０２３２】
好ましい実施形態では、検出抗体または抗原結合タンパク質をビオチン標識する。検出抗体として有用な抗ＧＤＦ−８抗体は、実施例１に記載のようにビオチン標識し得る（たとえば、実施例１、セクションＩ、サブセクション５を参照）。様々なビオチン化試薬が、抗体を含めたタンパク質を効率的に標識することができる。ビオチン誘導体：抗体のモル比は、約１０、１５、２０、４０、または８０：１であってよく、反応時間、反応物質の濃度、および温度は、反応に取り込ませるビオチンの量を調節するために変動させ得る。可変スペーサーアーム、溶解度に影響を与える修飾、および／またはビオチン部分の切断を可能にする反応基を含めたビオチン誘導体が、当分野で周知かつ利用可能である。たとえば、ビオチンのスクシンイミジルエステルおよび水溶性スルホスクシンイミジルエステルを含めたその誘導体を、ＧＤＦ−８のビオチン化に使用し得る。取り込まれたビオチンの量を定量化するために、たとえば、逆相高圧液体クロマトグラフィー、質量分析などを含めた、周知の分析およびサイズ決定技術を使用する。さらに、たとえば、比色または蛍光定量化アッセイによってビオチンを定量化するための市販のキットが利用可能である（たとえば、ＨＡＢＡ（２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）−安息香酸）を利用するＥＺ（商標）ビオチン定量化キット、Ｐｉｅｒｃｅを参照）。
【０２３３】
一実施形態では、ビオチン標識したＲＫ−２２は、ＲＫ３５と結合するＧＤＦ−８を検出するための検出剤である。
【０２３４】
特定の実施形態では、抗体または抗原結合タンパク質などの、ビオチン標識したおよび／または酵素標識した検出剤をＧＤＦ−８／抗体の複合体に加え、結合させる。過剰の試薬を洗い流し、その後、適切な基質を含有する溶液を反応器に加える。基質は酵素に触媒される反応を受けて、試料中に存在するＧＤＦ−８の量の指標である分光光度で測定可能な変化をもたらす。
【０２３５】
たとえば、ビオチン標識した検出抗体または抗原結合タンパク質は、アビジン−酵素のコンジュゲート、たとえばアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼとのその相互作用によって、アビジン−酵素のコンジュゲートおよび適切な色素原または蛍光原基質との逐次的なインキュベーションの後に、検出することができる。また、ビオチン標識した検出抗体は、ユーロピウムで標識したストレプトアビジンを用いても検出し得る。
【０２３６】
特定の実施形態では、反応器の表面と会合した抗体／ＧＤＦ−８／抗体の複合体は、標識のシグナルの定性的または定量化的評価によって検出する。一部の例では、標識は、たとえば、蛍光もしくは発光によって直接、または基質を加えることによって間接的に測定する。他の例では、標識は、追加の試薬とインキュベーションした後に測定する。標識がビオチンである実施形態では、アビジンコンジュゲート（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を続くステップで加え得る。特定の一実施形態では、アビジンコンジュゲートは、固定した検出抗体または抗原結合タンパク質と結合し得る。過剰のアビジンコンジュゲートを洗い流す。その後、酵素の基質を加え、たとえば、色、蛍光、または発光の測定可能な変化がもたらされる。一部の実施形態では、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【０２３７】
遊離および全ＧＤＦ−８の定量化
ＧＤＦ−８レベルは、当業者に周知の方法を用いて定量化し得る。特定の実施形態では、生体試料中のＧＤＦ−８レベルを、たとえば検量線を用いることによって得られたものなどの既知のレベルと比較する。ＧＤＦ−８検量線の作成を実施例１５に実証する。検量線は、緩衝液で希釈した既知の濃度のＧＤＦ−８を含み得る。特定の実施形態では、緩衝液は、たとえば、ヒト血清、マウス血清、霊長類血清、ウシ血清、またはヒツジ血清などの血清である。血清は、既知の濃度のＧＤＦ−８を加える前に内在性ＧＤＦ−８を枯渇させていてもよい。血清は、天然でＧＤＦ−８を欠くベルジアンブルー畜牛から得てもよい。
【０２３８】
一実施形態では、生体試料中の遊離ＧＤＦ−８を定量化する方法は、ＧＤＦ−８捕捉抗体または抗原結合タンパク質および生体試料を、生体試料中に存在する場合にＧＤＦ−８が１つまたは複数の捕捉抗体と結合して捕捉抗体または抗原結合タンパク質−ＧＤＦ−８の複合体を形成することを可能にする条件下で合わせ、標識したＧＤＦ−８検出抗体または抗原結合タンパク質をステップ（ｂ）の固体担体に加えるステップと、（ｄ）ＧＤＦ−８検出抗体上の標識によって生じたシグナルを検出することによって、捕捉抗体−ＧＤＦ−８の複合体と検出抗体との間に形成された複合体を検出するステップと、（ｅ）標識したＧＤＦ−８検出抗体を含有する複合体によって生じたシグナルを、既知の量のＧＤＦ−８の対応するシグナル強度を決定することによって作成した検量線と比較することによって、生体試料中のＧＤＦ−８のレベルを定量化するステップとを含む。
【０２３９】
全ＧＤＦ−８を定量化する方法は同様であるが、ただし生体試料を酸性緩衝液で希釈する。
【０２４０】
ＧＤＦ８関連障害の進行を治療、寛解、予防、および阻害する方法
ＧＤＦ８関連障害、たとえば、骨格筋、骨、グルコース恒常性などの発生および／または調節におけるＧＤＦ８の関与、ならびに本発明の新規特異的ＧＤＦ８拮抗剤の発見は、ＧＤＦ８関連障害、たとえば、筋肉障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘導性骨障害、グルコース代謝障害、脂肪障害、およびインスリン関連障害を治療、寛解または予防する方法を可能にする。さらに、拮抗剤は、生体試料中のＧＤＦ８のレベルを測定することによって、そのような障害の進行の診断、予後診断および監視を可能にする。特に、本発明のＧＤＦ８に特異的な拮抗剤エピトープ（たとえば、それに対するペプチド模倣体、それに対する阻害性ポリヌクレオチド、それに対する抗体、小分子など）を、ＧＤＦ８関連障害に罹患している個体を治療するために、または患者がＧＤＦ８関連障害に罹患しているかどうかを識別する方法において使用し得る。
【０２４１】
本発明の拮抗剤は、ヒトまたは動物において様々な医学的ＧＤＦ８関連障害を予防、診断、または治療するために有用である。拮抗剤は、ＧＤＦ８に関連する１つまたは複数の活性を阻害、低下および／または中和するために使用することができる。最も好ましくは、拮抗剤は、ＧＤＦ８の活性のうちの１つまたは複数を、本発明の拮抗剤の非存在下におけるＧＤＦ８と比較して、阻害または低下させる。特定の実施形態では、本発明の拮抗剤は、ＧＤＦ８の活性を、１つまたは複数の抗ＧＤＦ８抗体によって結合されていない成熟ＧＤＦ８タンパク質と比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、または８８％、より好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、または９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％〜１００％阻害する。ＧＤＦ８活性の阻害または中和は、たとえば、Ｔｈｉｅｓら、上記に記載のｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）、および実施例中に例示したＡｃｔＲＩＩＢ受容体アッセイで測定することができる。
【０２４２】
本明細書中で開示した拮抗剤によって診断、予後診断、監視、治療、寛解または予防される医学的障害は、ＧＤＦ８関連障害、たとえば、たとえば筋ジストロフィー（ＭＤ、デュシェーヌ型筋ジストロフィーが含まれる）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮、臓器萎縮、虚弱、手根管症候群、うっ血性閉塞性肺疾患、筋肉減少症、悪液質、および筋消耗症候群（たとえば、他の疾患および状態によって引き起こされるもの）を含めた、筋肉または神経筋障害である。さらに、ＧＤＦ８抗体によって診断、予後診断、監視、治療、寛解または予防され得る他の医学的障害は、肥満症、２型糖尿病、耐糖能異常、代謝症候群（たとえば症候群Ｘ）、外傷（熱傷または窒素不均衡など）によって誘導されたインスリン抵抗性、または骨変性疾患（たとえば、骨関節炎および骨粗鬆症）などの脂肪組織障害である。本発明の好ましいが非限定的な実施形態、本明細書中で開示した拮抗剤によって診断、予後診断、監視、治療、寛解または予防される医学的障害は、筋肉または神経筋障害である。本発明のさらに好ましいが非限定的な実施形態では、本明細書中で開示した拮抗剤によって診断、予後診断、監視、治療、寛解または予防される筋肉または神経筋障害は、ＭＤまたはＡＬＳのどちらかである。
【０２４３】
本明細書中で開示した拮抗剤によって診断、治療、寛解または予防され得る他の医学的障害は、特に高齢者および／または閉経後の女性の骨粗鬆症、糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、ならびに骨粗鬆症関連骨折を含めた、骨の損失に関連するものである。他の標的の代謝性骨疾患および障害には、慢性糖質コルチコイド療法による低骨量、早期性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次副甲状腺機能亢進、栄養障害、および神経性無食欲症が含まれる。本発明の拮抗剤は、好ましくは、哺乳動物、特にヒト、たとえば、将来妊娠するまたは妊娠している女性において、そのような医学的障害を予防、診断、寛解または治療するために使用する。
【０２４４】
本発明の拮抗剤は、治療上有効な量で投与する。一般に、治療上有効な量は、対象の年齢、状態、および性別、ならびに対象の病状の重篤度に応じて変動し得る。用量は、医師が決定し、治療の観察された効果に適合させるために必要に応じて調節し得る。そのような化合物の毒性および治療上の有効性は、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物の標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との用量比、すなわちＬＤ５０／ＥＤ５０が治療指数であり、高い治療指数を示す拮抗剤が好ましい。
【０２４５】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで使用するための用量の範囲を定式化するために使用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がわずかしかないまたは毒性がないＥＤ５０が含まれる循環濃度の範囲内にある。用量は、投薬の形態および投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で使用する任意の拮抗剤について、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。細胞培養において決定されるＩＣ５０（たとえば、症状または生物活性の最大半量阻害が達成される試験拮抗剤の濃度）が含まれる循環血漿濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで定式化し得る。血漿中のレベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。任意の特定の用量の効果は、適切なバイオアッセイによって監視することができる。適切なバイオアッセイの例には、それだけには限定されないが、ＤＮＡ複製アッセイ、転写に基づいてアッセイ、ＧＤＦ８タンパク質／受容体結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づいたアッセイ、脂肪細胞におけるグルコース取り込みに基づいたアッセイ、および免疫学的アッセイが含まれる。
【０２４６】
一般に、組成物は、拮抗剤またはその結合断片が、１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量で与えられるように投与する。好ましくは、拮抗剤は、拮抗剤の循環レベルを投薬後に最も長い時間の間最大とするために、ボーラス用量として与える。また、持続注入を、ボーラス用量の前、その後またはその代わりに使用してもよい。
【０２４７】
ＧＤＦ８関連障害の治療剤を同定する方法
本発明のさらに別の態様は、たとえば、筋肉、グルコース代謝、脂肪、および骨障害の治療に有用な治療剤を同定する方法を提供する。適切なスクリーニングアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡに基づいたアッセイが当分野で知られている。そのようなスクリーニングアッセイでは、第１の結合混合物は、拮抗剤、特にＧＤＦ８に特異的なエピトープのペプチド模倣体または本発明の抗体もしくは抗原結合タンパク質およびそのリガンド、ＧＤＦ８を合わせることによって形成し、第１の結合混合物中のリガンドと抗体との結合の量（Ｍ０）を測定する。第２の結合混合物も、拮抗剤、リガンド、およびスクリーニング化合物または薬剤を合わせることによって形成し、第２の結合混合物中のリガンドと抗体との結合の量（Ｍ１）を測定する。その後、第１および第２の結合混合物中の結合の量を、たとえばＭ１／Ｍ０比を計算することによって比較する。化合物または薬剤は、第１の結合混合物と比較して第２の結合混合物中の結合の減少が観察された場合に（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜１）、ＧＤＦ８と特異的に相互作用することができるとみなされる。結合混合物の配合および最適化は、当分野の技術レベル内にあり、そのような結合混合物は、結合を増強または最適化するために必要な緩衝液および塩も含有してよく、追加の対照アッセイも本発明のスクリーニングアッセイに含め得る。
【０２４８】
したがって、拮抗剤−リガンドの結合を、少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）、好ましくは約３０％より多く低下させることが見出された化合物を同定し、その後、所望する場合は、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイ、または実施例に記載もしくは当分野で周知の他の細胞に基づいたアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイなどの、他のアッセイにおいて、ＧＤＦ８活性を阻害する能力について二次スクリーニングを行い得る。
【０２４９】
小分子
また、ＧＤＦ８関連障害に罹患している（もしくはその危険性にある）生物（もしくは対象）、またはそのような障害に関与しているそのような生物からの細胞におけるＧＤＦ８活性の阻害は、ＧＤＦ８を拮抗する、すなわちその活性を阻害する拮抗剤小分子（通常は有機小分子）の使用によっても達成し得る。新規拮抗性小分子は、上述のスクリーニング方法によって同定してもよく、本明細書中に記載の本発明の治療方法で使用し得る。
【０２５０】
逆に、減少したＧＤＦ８の発現および／または減少したＧＤＦ８レベルに関連する活性もしくは障害に関連する障害に罹患している（またはその危険性にある）生物（または対象）におけるＧＤＦ８活性の増加は、ＧＤＦ８を刺激する、すなわちその活性を増強する小分子（通常は有機小分子）の使用によっても達成し得る。新規作用剤小分子は、スクリーニング方法によって同定してもよく、本明細書中に記載の本発明の治療方法で使用し得る。
【０２５１】
ＧＤＦ８関連障害の進行を診断、予後診断、および監視する方法
たとえば、筋肉、骨、グルコース代謝、および脂肪障害の治療に加えて、本発明は、生体試料、たとえば、血清、血漿、気管支肺胞洗浄液、痰、生検（たとえば筋組織のもの）など中のＧＤＦ８の減少または増加を検出することによって、そのような障害を診断する方法を提供する。「診断的」または「診断すること」とは、病的状態の存在または非存在を同定することを意味する。診断方法は、たとえば、対象（ヒトまたは非ヒト哺乳動物）からの生体試料中のＧＤＦ８ポリペプチドの試験量を決定し、試験量を、正常な量または範囲（たとえば、そのような障害に罹患していないことが知られている個体（複数可）からの量または範囲）と、ＧＤＦ８ポリペプチドについて比較することによって、ＧＤＦ８の存在を検出することを含む。特定の診断方法はＧＤＦ８関連障害の明確な診断をもたらさない場合があるが、方法が診断を補助する陽性指標を提供すれば十分である。
【０２５２】
また、本発明は、ＧＤＦ８のアップレギュレーション検出することによって、ＧＤＦ８関連障害、たとえば、筋肉、骨、グルコース代謝、および脂肪障害を予後診断する方法も提供する。「予後的」または「予後診断すること」とは、病的状態の予想される発生および／または重篤度を予測することを意味する。予後的方法は、対象からの生体試料中のＧＤＦ８の試験量を決定すること、および試験量を、ＧＤＦ８の予後的な量または範囲（たとえば、様々な重篤度の、たとえばＡＬＳに罹患している個体からの量または範囲）と比較することを含む。試験試料中のＧＤＦ８の様々な量が、ＧＤＦ８関連障害の特定の予後診断に一致している。特定の予後的レベルでのＧＤＦ８の量の検出が、対象の予後診断を提供する。
【０２５３】
また、本発明は、ＧＤＦ８のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを検出することによって、ＧＤＦ８関連の筋肉、骨、グルコース代謝、および脂肪障害の経過を監視する方法も提供する。監視方法は、第１および第２の時点で対象から採取した生体試料中のＧＤＦ８の試験量を決定すること、ならびに量を比較することを含む。第１および第２の時点の間のＧＤＦ８の量の変化は、ＧＤＦ８関連障害の経過、たとえば重篤度の変化を示す。当業者は、筋肉量の増加が望ましいＧＤＦ８関連障害では、第１および第２の時点の間ＧＤＦ８タンパク質の量および／または活性の減少は、障害の寛解を示し、量の増加は、障害の進行を示すことを理解されよう。逆に、筋肉量の減少が望ましいＧＤＦ８関連障害では、第１および第２の時点の間のＧＤＦ８タンパク質の量および／または活性の減少は、障害の進行を示し、量の増加は、障害の寛解を示す。また、そのような監視アッセイは、ＧＤＦ８関連障害を治療している患者において、特定の治療行為（たとえば、疾患の弱毒化および／または逆転）の有効性を評価するためにも有用である。
【０２５４】
本発明の拮抗剤は、ＧＤＦ８の存在をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出することによって、診断、予後診断または監視に使用し得る。そのような検出方法は当分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降、および他の匹敵する技術が含まれる。さらに、拮抗剤は、ＧＤＦ８を検出するためのこれらの技術のうちの１つまたは複数が取り込まれている診断キット中で提供し得る。そのようなキットは、タンパク質の検出およびキットの使用を補助するために、他の構成成分、パッケージング、指示書、または他の材料を含有し得る。
【０２５５】
拮抗剤に診断、予後診断、または監視の目的を意図する場合は、それらを、たとえば、リガンド基（ビオチンなど）または検出可能なマーカー基（蛍光基、放射性同位体もしくは酵素など）で修飾することが望ましい場合がある。所望する場合は、拮抗剤（ポリクローナルまたはモノクローナルにかかわらず）は、慣用技術を用いて標識し得る。適切な標識には、フルオロフォア、発色団、放射性原子、高電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は、典型的にはその活性によって検出される。たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量化可能な青色色素に変換する、その能力によって検出することができる。他の適切な標識には、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとタンパク質Ａ、および当分野で知られている数々の受容体−リガンドの対が含まれ得る。他の順列および可能性は当業者に容易に明らかであり、本発明の範囲内で均等物であるとみなされる。
【０２５６】
医薬組成物および投与方法
本発明は、本明細書中で開示した本発明の拮抗剤、すなわち、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、抗体、抗体または抗原結合タンパク質断片、および小分子を含む組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的使用および患者への投与に適している場合がある。組成物は、典型的には、本発明の１つまたは複数の分子、好ましくは抗体または抗原結合タンパク質と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む。本発明の拮抗剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、または薬学的に許容できる担体と組み合わせた場合は医薬組成物内に取り込まれて使用することができる。本明細書中で使用する語句「薬学的に許容できる賦形剤」には、薬学的投与に適合している任意かつすべての溶媒、溶液、緩衝液、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。そのような組成物は、本発明の拮抗剤および担体に加えて、様々な希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、および当分野で周知の他の物質を含有し得る。用語「薬学的に許容できる」とは、活性成分の生物活性の有効性を妨げない無毒性の物質を意味する。担体の特徴は投与経路に依存する。薬学的に活性のある物質のそのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。また、組成物は、補足の、追加の、または増強した治療機能をもたらす他の活性化合物も含有し得る。また、医薬組成物は、投与の指示と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含めてもよい。
【０２５７】
本発明の医薬組成物は、本発明の拮抗剤を、他の薬学的に許容できる担体に加えて、水溶液中でミセル、不溶性単層、液晶、または層として凝集体で存在する、脂質などの両親媒性の薬剤と合わせる、リポソームの形態であり得る。リポソーム配合物に適した脂質には、それだけには限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれる。そのようなリポソーム配合物の調製は、当分野の技術レベル範囲内にある。
【０２５８】
本明細書中で使用する用語「治療上有効な量」とは、有意味な患者の利点、たとえば、そのような状態の症状の寛解、治癒、または治癒速度の増加を示すために十分な、医薬組成物または方法のそれぞれの活性構成成分の合計量を意味する。単独で投与する個々の活性成分に適用した場合は、この用語はその成分単独をいう。組合せに適用した場合は、この用語は、組み合わせて、連続的にまたは同時に投与したかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の合わせた量をいう。
【０２５９】
本発明の治療方法または使用の実施では、治療上有効な量の、たとえばＧＤＦ８に特異的な拮抗剤を、対象、たとえば哺乳動物（たとえばヒト）に投与する。本発明の拮抗剤は、本発明の方法に従って、単独でまたは抗炎症剤などの他の治療と組み合わせて投与し得る。１つまたは複数の薬剤と同時投与する場合、本発明の拮抗剤は、第２の薬剤と同時に、または逐次的に投与し得る。逐次的に投与する場合、担当医が、他の薬剤と組み合わせた本発明の拮抗剤を投与する適切な順序を決定する。
【０２６０】
一実施形態では、本発明の拮抗剤、たとえばその医薬組成物を、組合せ療法で、すなわち、たとえば、筋肉障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性もしくは誘導性骨障害、脂肪障害、グルコース代謝障害またはインスリン関連障害などの病的状態または障害、ならびにアレルギー性および炎症性の障害を治療するために有用な、他の薬剤、たとえば治療剤と組み合わせて投与する。本コンテキストにおける用語「組み合わせて」とは、薬剤を実質的に同時に、すなわち、同時にまたは逐次的に与えることを意味する。逐次的に与える場合は、第２の化合物の投与の開始時に、２つの化合物のうちの最初のものが、治療部位または対象内で依然として有効濃度で検出可能であることが好ましい。
【０２６１】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路と適合性があるように配合する。投与を達成する方法は当業者に知られている。また、局所もしくは経口投与し得る、または粘膜を横切った透過が可能であり得る組成物を得ることも可能であり得る。本発明の方法を実施するための医薬組成物で使用する本発明の拮抗剤の投与は、経口摂取、吸入、皮膚、皮下、または静脈内注射などの様々な慣用の方法で実施することができる。
【０２６２】
皮内または皮下の施用に使用する溶液または懸濁液には、典型的には、以下の構成成分のうちの１つまたは複数が含まれる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌的希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。そのような調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てのシリンジまたは複数用量のバイアル中に封入し得る。
【０２６３】
注射に適した医薬組成物には、無菌的水溶液または分散液および無菌的注射用溶液または分散液を即時調製するための無菌的散剤が含まれる。静脈内投与では、適切な薬学的に許容できる担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）ＥＬ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合で、組成物は無菌的でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流体であるべきである。薬学的に許容できる担体は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば糖、ポリアルコール、たとえば、マンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０２６４】
本発明の治療上有効な量の抗体または抗原結合タンパク質を、たとえば、静脈内、皮膚または皮下注射によって投与する場合、結合剤は、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態である。そのような非経口的に許容されるタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを相応に考慮して、当分野の技術範囲内にある。静脈内、皮膚、または皮下注射用の好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、等張ビヒクル、たとえば、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル液、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、乳酸加リンゲル液、または当分野で知られている他のビヒクルなどを含有しているべきである。また、本発明の医薬組成物は、安定化剤、保存料、緩衝液、抗酸化剤、または当業者に知られている他の添加剤も含有し得る。
【０２６５】
本発明の医薬組成物中の本発明の拮抗剤の量は、治療する状態の性質および重篤度、ならびに患者が受けた以前の治療の性質に依存する。最終的には、担当医がそれぞれの個々の患者を治療する拮抗剤の量を決定する。最初に、担当医は低用量の拮抗剤を投与して患者の応答を観察する。最適な治療効果が患者で得られるまでより高い用量の拮抗剤を投与してもよく、その時点で、用量は一般にそれよりも増加しない。本発明の方法を実施するために使用する様々な医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜５０μｇの拮抗剤を含有すべきことが企図される。
【０２６６】
本発明の医薬組成物を用いた治療期間は、治療する疾患の重篤度ならびにそれぞれの個々の患者の状態および潜在的な特異体質応答に応じて変動する。拮抗剤のそれぞれの施用期間は、たとえば皮下経路によるものであり、たとえば週に１回の範囲であることが企図される。最終的には、担当医が本発明の医薬組成物を用いた適切な治療期間を決定する。
【０２６７】
経口組成物には、一般に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。これらは、ゼラチンカプセル中に封入するか、または錠剤へと圧縮することができる。経口治療投与の目的には、本発明の拮抗剤（たとえば、抗体または抗原結合タンパク質、小分子など）を賦形剤と共に取り込ませ、錠剤またはカプセルの形態で使用することができる。薬学的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセルなどは、以下の成分のうちの任意のもの、または類似の性質の化合物を含有することができる：結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（商標）、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ（商標）などの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味料。
【０２６８】
治療上有効な量の本発明の医薬組成物、たとえばＧＤＦ８に特異的な拮抗剤を経口投与する場合、結合剤は、錠剤、カプセル、散剤、溶液またはエリキシルの形態である。錠剤形態で投与する場合、本発明の医薬組成物は、ゼラチンなどの固体担体またはアジュバントをさらに含有し得る。錠剤、カプセル、および散剤は、約５〜９５％の結合剤、好ましくは約２５〜９０％の結合剤を含有する。液体形態で投与する場合、水、石油、動物もしくは植物由来の油、たとえば、ピーナッツ油、鉱物油、ダイズ油、もしくはゴマ油、または合成油状物などの液体担体を加え得る（そのような液体担体に対する個々の患者および／または個体の大集団のアレルギーを考慮した後）。医薬組成物の液体形態は、生理食塩水、デキストロースもしくは他のサッカライド溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールをさらに含有し得る。液体形態で投与する場合、医薬組成物は、約０．５〜９０重量％の結合剤、好ましくは約１〜５０％の結合剤を含有する。
【０２６９】
吸入による投与には、本発明の拮抗剤は、エアロゾルスプレーの形態で、適切な噴霧剤、たとえば二酸化炭素などの気体を含有する加圧した容器もしくはディスペンサー、または噴霧器から送達する。したがって、本明細書中に記載した化合物は、肺組織への吸入によって投与することができる。本明細書中で使用する用語「肺組織」とは、任意の気道の組織をいい、別段に指定する場合以外は、上気道および下気道がどちらも含まれる。特異的ＧＤＦ８拮抗剤は、肺疾患を治療するための既存のモダリティーのうちの１つまたは複数と組み合わせて投与することができる。
【０２７０】
投与の一例では、化合物を噴霧器用に配合する。一実施形態では、化合物を凍結乾燥形態で（たとえば室温で）保管し、吸入前に溶液中で再構成することができる。
【０２７１】
また、化合物を、医薬装置、たとえば吸入器（たとえば米国特許第６，１０２，０３５号（散剤吸入器）および第６，０１２，４５４号（ドライパウダー吸入器））を用いた吸入用に配合することも可能である。吸入器には、活性化合物の保存に適したｐＨの別々の区画および中和緩衝液用の別の区画、ならびに微粒化の直前に化合物を中和緩衝液と合わせるための機構が含まれ得る。一実施形態では、吸入器は定量化吸入器である。
【０２７２】
必ずしも必要ではないが、界面活性剤などの送達エンハンサーを使用して、肺送達をさらに増強することができる。本明細書中で使用する「界面活性剤」とは、２つの非混和性の相の間の界面と相互作用することによって、薬物の吸収を促進する親水性および親油性部分を有する化合物をいう。界面活性剤は、たとえば、粒子の凝集の低下、マクロファージ貪食の低下などの、いくつかの理由により乾燥粒子で有用である。ＤＰＰＣなどの界面活性剤は化合物の拡散を大きく促進するため、肺の界面活性剤と合わせた場合、化合物のより効率的な吸収を達成することができる。界面活性剤は当分野で周知であり、それだけには限定されないが、ホスホグリセリド、たとえば、ホスファチジルコリン、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジパルミトイル（ＤＰＰＣ）およびジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ヘキサデカノール、脂肪酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレン−９、アウリルエーテル、パルミチン酸、オレイン酸、トリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）、グリココレート、サーファクチン、ポロキソマー、ソルビタン脂肪酸エステル、トリオレイン酸ソルビタン、チロキサポール、ならびにリン脂質が含まれる。
【０２７３】
全身投与も、経粘膜または経皮手段によるものであることができる。たとえば、Ｆｃ部分を含む抗体の場合、組成物は、ＦｃＲｎ受容体媒介経路による、粘膜（たとえば、腸管、口、または肺）を横切った透過が可能であり得る（たとえば米国特許第６，０３０，６１３号）。一般に、経粘膜投与は、たとえば、ロゼンジ、鼻腔スプレー、吸入器、または坐薬を使用することで達成することができる。経皮投与には、活性化合物は、一般に当分野で知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、パッチまたはクリームへと配合する。経粘膜または経皮投与には、透過させる障壁に適した透過剤を配合物中で使用する。そのような透過剤は一般に当分野で知られており、たとえば、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。
【０２７４】
また、医薬組成物は、遺伝子治療に適した組成物、すなわち、本明細書中に開示したポリヌクレオチドからなる組成物からなっていてもよい。遺伝子治療の場合、薬学的に許容できる担体には、たとえば、脂質、コラーゲン球、陽イオン性乳濁液系、水、生理食塩水緩衝液、ウイルスベクター、カイロミクロン残遺物、ポリマーナノ粒子（たとえば、ゼラチン−ＤＮＡまたはキトサン−ＤＮＡ）、金粒子、ポリマー複合体、リポプレックス、ポリプレックスなどが含まれ得る。（たとえばＧａｒｄｌｉｋら（２００５）Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．、１１（４）：ＲＡ１１０〜２１参照）。
【０２７５】
安定化および保持
一実施形態では、特異的ＧＤＦ８拮抗剤は、循環中、たとえば、血液、血清、リンパ液、気管支肺もしくは気管支肺胞洗浄液、または他の組織中のその安定化および／または保持を、たとえば、少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍改善する部分と物理的に結合している。
【０２７６】
本明細書中で開示した本発明の拮抗剤は、植込錠および微小カプセル封入送達系を含めた徐放性配合物などの、身体からの迅速な排除に対して保護する担体を用いて調製し得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような配合物の調製方法は、当業者に明らかである。本明細書中で開示した拮抗剤を含有するリポソーム懸濁液も、薬学的に許容できる担体として使用することができる。これらは、当業者に知られている方法に従って調製することができる。
【０２７７】
たとえば、特異的ＧＤＦ８拮抗剤は、ポリマー、たとえば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなどの実質的に非抗原性のポリマーと結合させることができる。適切なポリマーは重量が実質的に変動する。約２００〜約３５，０００（または約１，０００〜約１５，０００、または約２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマーを使用することができる。
【０２７８】
たとえば、特異的ＧＤＦ８拮抗剤は、水溶性ポリマー、たとえば親水性ポリビニルポリマー、たとえば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンとコンジュゲートさせることができる。そのようなポリマーの非限定的なリストには、ブロックコポリマーの水溶解度が維持されている限りは、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーが含まれる。さらなる有用なポリマーには、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレン（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）のブロックコポリマーなどのポリオキシアルキレン、ポリメタクリレート、カルボマー、サッカライド単量体であるＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（たとえば、ポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースならびにノイラミン酸を含む、分枝状または非分枝状多糖類（ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストラン硫酸、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸ムコ多糖類、たとえばヒアルロン酸の多糖サブユニットなどのホモ多糖類およびヘテロ多糖類が含まれる）、ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー、ヘパリンなどが含まれる。
【０２７９】
他の化合物、たとえば、細胞毒素、標識、または別の標的化剤、たとえば、別のＧＤＦ８拮抗剤または非関連のリガンドも、同じポリマーに付着させることができる。モノ活性化アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、たとえば、モノメトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、Ｃ１〜４アルキル末端ポリマー、およびビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）を架橋結合に使用することができる（たとえば米国特許第５，９５１，９７４号）。
【０２８０】
一実施形態では、リガンドと架橋結合させる前のポリマーは、水溶性である必要はないが、そうであることが好ましい。一般に、架橋結合後に生成物は水溶性である、たとえば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶解度を示す。さらに、ポリマーは、コンジュゲート形態で免疫原性が高くあるべきでなく、また、コンジュゲートを静脈点滴、エアロゾル化、または注射の経路によって投与することを意図する場合はそれと適合性のない粘度を保有しているべきでない。
【０２８１】
一実施形態では、ポリマーは、単一の反応性基のみを含有する。これは、リガンド分子が互いに架橋結合することを回避するために役立つ。しかし、リガンド分子間の架橋結合を低下させる反応条件を最大にすること、または反応生成物をゲル濾過もしくはイオン交換クロマトグラフィーによって精製して実質的に均一な誘導体を回収することは、本明細書の範囲内にある。他の実施形態では、ポリマーは、複数のリガンドをポリマー主鎖と連結させる目的のために、２つ以上の反応基を含有する。ここでも、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを用いて、所望の誘導体を実質的に均一な形態で回収することができる。
【０２８２】
ポリマーの分子量は、約５００，０００Ｄまでの範囲であることができ、好ましくは少なくとも約２０，０００Ｄ、または少なくとも約３０，０００Ｄ、または少なくとも約４０，０００Ｄである。選択する分子量は、達成するコンジュゲートの有効な大きさ、ポリマーの性質（たとえば、直鎖状または分枝状などの構造）、および誘導体化の度合に依存する場合がある。
【０２８３】
共有結合を用いて、特異的ＧＤＦ８拮抗剤をポリマーに付着させることができ、たとえば、リガンドのＮ末端アミノ基およびリガンドのリシン残基上に見つかるεアミノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたは他の親水性基に架橋結合させる。ポリマーは、多官能性（通常は二官能性）の架橋結合剤を使用せずに、ＧＤＦ８拮抗剤と直接共有結合させ得る。アミノ基との共有結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、およびアルデヒド反応基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセチル、ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧクロライド＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性スクシンイミジルエステル、活性ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルメート活性ＰＥＧ）に基づいた既知の化学によって達成する。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いてＰＥＧ−アミンをカップリングさせることによって誘導体化することができる。スルフヒドリル基は、マレイミド置換したＰＥＧ（たとえば、アルコキシＰＥＧアミン＋スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＷＯ９７／１０８４７号を参照）またはＰＥＧ−マレイミド）とカップリングさせることによって誘導体化することができる。あるいは、リガンド上の遊離アミノ基（たとえば、リシン残基上のεアミノ基）を、２−イミノ−チオラン（トラウト試薬）でチオール化し、その後、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体と、たとえばＰｅｄｌｅｙら（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７０：１１２６〜３０に記載のようにカップリングさせることができる。
【０２８４】
ＧＤＦ８拮抗剤と付着させることができる官能化したＰＥＧポリマーは、たとえば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）から入手可能である。そのような市販のＰＥＧ誘導体には、たとえば、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−スクシネート、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジルカルボネート、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカルボネート、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、ヘテロ官能化ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン、およびＰＥＧホスホリドが含まれる。これらのＰＥＧ誘導体をカップリングさせるための反応条件は、特異的ＧＤＦ８拮抗剤、所望のＰＥＧ化の度合、および利用するＰＥＧ誘導体に応じて変動し得る。ＰＥＧ誘導体の選択に関与する要素の一部には、所望の付着点（リシンまたはシステインのＲ基など）、誘導体の加水分解安定性および反応性、連結の安定性、毒性および抗原性、分析の適合性などが含まれる。任意の特定の誘導体を使用するための具体的な指示は、製造者から入手可能である。
【０２８５】
ＧＤＦ８拮抗剤とポリマーのコンジュゲートは、未反応の出発物質から、たとえば、ゲル濾過もしくはイオン交換クロマトグラフィー、または他のクロマトグラフィー形態、たとえばＨＰＬＣによって分離することができる。異種のコンジュゲートの種を、同様にして互いから精製する。様々な種（たとえば、１個または２個のＰＥＧ残基を含有）の分離も、未反応のアミノ酸のイオン特性の差異によって可能である（たとえばＷＯ９６／３４０１５号を参照）。
【０２８６】
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、本明細書中で同定した使用または生物活性のうちの１つまたは複数（以下に記載するアッセイに関連するものが含まれる）を示すことが予測される。本発明のタンパク質について記載した使用または活性は、そのようなタンパク質の投与もしくは使用によって、またはそのようなタンパク質をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、遺伝子治療もしくはＤＮＡの導入に適したベクター中など）の投与もしくは使用によって提供し得る。
【０２８７】
投与の容易性および用量の均一性のために、経口または非経口組成物を単位剤形で配合することが有利であり得る。本明細書中で使用する単位剤形とは、治療する対象の単位用量として適している物理的に別個の単位をいい、それぞれの単位は、所望の治療効果をもたらす計算した事前に決定された量の活性化合物を、所要の薬学的担体と会合して含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴、達成する特定の治療効果、および個体を治療するためにそのような活性化合物を配合することにおける、当分野に特有の制限によって指示され、それらに直接依存する。
【０２８８】
したがって、本発明の別の態様は、たとえば他の治療化合物を用いてもしくは用いずに本発明のＧＤＦ８拮抗剤の投与を実施するため、または、ＧＤＦ８拮抗剤を、生体試料中のＧＤＦ８の存在および／もしくはレベルを決定するための研究もしくは治療ツールとして使用するための、ＥＬＩＳＡキットなどのキットに関する。一実施形態では、キットは、薬学的担体中で配合した１つまたは複数の抗ＧＤＦ８拮抗剤と、少なくとも１つの薬剤、たとえば、必要に応じて１つまたは複数の別々の薬学的調製物中で配合した治療剤とを含む。
【０２８９】
以下の実施例は、本発明の理解を支援するために記載するが、これらは、本発明の範囲をいかなる様式でも限定することを意図せず、またそのように解釈されるべきでない。実施例には、ハイブリドーマの形成、ＥＬＩＳＡ、増殖アッセイ、フローサイトメトリー分析および組換えＤＮＡ技術などの慣用方法の詳細な説明は含まれない。そのような方法は当業者に周知である。
【０２９０】
本出願の全体にわたって引用するすべての参考文献、特許、公開特許出願、および他の特許文献の全内容は、本明細書中に参考として組み込まれている。
【０２９１】
本発明を、以下の実施例によってさらに例示および支援する。しかし、これらの実施例は、決して本発明の範囲をさらに限定するとみなされるべきでない。それとは反対に、当業者には、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱せずに、本発明の他の実施形態、変形、および均等物が存在することを容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０２９２】
（実施例１）
ハイブリドーマ細胞の作製およびＲＫ２２抗ＧＤＦ８抗体の単離
ＧＤＦ８（ミオスタチン）ノックアウトマウス（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２４５７〜６１）を、ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、９：６０４〜０７に記載のように、フロイント完全アジュバントおよび２０μｇのＣＨＯ細胞馴化培地から精製した組換えＧＤＦ８二量体を用いた皮下注射によって免疫化した。同じ量のＧＤＦ８およびフロイント不完全アジュバントのいくつかの追加免疫注射を、２週間間隔で与えた。２μｇのＰＢＳの尾部静脈への最終の静脈内注射を、マウスから脾細胞を単離する前に与え、高力価の抗ＧＤＦ８抗体が実証された。単離した脾細胞をマウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ受託番号Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）と融合させた。１０〜１４日後、ハイブリドーマからの上清を収集し、ＥＬＩＳＡによって抗ＧＤＦ８抗体レベルについて試験した。実施例２を参照されたい。モノクローナル性を確実にするために、さらなる研究用に選択されたハイブリドーマを限界希釈の繰り返しによってクローニングした。
【０２９３】
抗ＧＤＦ８を発現するハイブリドーマからの上清および／または当分野で周知の標準のアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて上清から精製した抗体を、実施例２に記載のアッセイにおいて特異性について試験した。ＧＤＦ８との結合について最初に試験した１３個のクローンのうち、ＲＫ２２がさらなる分析のために選択されたものの１つであった。
【０２９４】
（実施例２）
ＧＤＦ８と特異的に相互作用するＲＫ２２抗体
（実施例２．１）
ＲＫ２２はＥＬＩＳＡアッセイにおいてＢＭＰ１１よりもＧＤＦ８に対して高い親和性を有する
ＧＤＦ８またはＢＭＰ１１のどちらかを用いた標準のＥＬＩＳＡ技術を使用して、ＧＤＦ８と結合するＲＫ２２の特異性を決定した、すなわち、ＢＭＰ１１よりもＧＤＦ８に対して高い親和性を実証したかどうかを決定した。組換えヒトＧＤＦ８（成熟ＧＤＦ８およびＧＤＦ８プロペプチド）ならびにＢＭＰ１１タンパク質を精製し、米国特許公開出願第２００４／０１４２３８２号に以前に記載されているように特徴づけた。ＧＤＦ８潜在型複合体およびＢＭＰ１１潜在型複合体を、２０モルのＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、カタログ番号２１２１７）対１モルの複合体の比で、氷上で２時間、それぞれ個別にビオチン標識した。０．５％のＴＦＡを用いてｐＨを低下させることによって反応を停止させ、ビオチン標識した複合体をＣ４  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ２５０×４．６ｍｍのカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア州Ｔｏｒｒａｎｃｅ）上のクロマトグラフィーに供して、成熟タンパク質（たとえば、ＧＤＦ８プロペプチドからの成熟ＧＤＦ８またはＢＭＰ１１プロペプチドからの成熟ＢＭＰ１１）を分離した。ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮの勾配で溶出させた成熟ビオチン標識ＧＤＦ８または成熟ビオチン標識ＭＰ１１の画分をプールし、濃縮し、ＭｉｃｒｏＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、カタログ番号２３２３５）によって定量化した。
【０２９５】
９６ウェルのマイクロタイタープレート（終夜４℃で、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンでプレコーティングした）を、０．５μｇ／ｍｌのビオチン標識したＧＤＦ８またはビオチン標識したＢＭＰ１１で、１時間、室温でコーティングした。過剰のＧＤＦ８またはＢＭＰ１１を、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ緩衝液）で洗浄することによって除去した。プレートを１時間、室温でＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて遮断し、その後、ＰＢＳですすいだ。ＧＤＦ８またはＢＭＰ１１をコーティングしたプレートを、室温で１時間、ＲＫ２２ハイブリドーマから採取した１００μｌの事前に遮断した上清、または様々な濃度の精製したＲＫ２２抗体と共にインキュベーションした。非特異的結合を考慮するために、ＧＤＦ８およびＢＭＰ１１をどちらも結合および阻害することが示されているＲＫ３５抗体（その全体が参考として本明細書中に組み込まれている米国特許出願第６０／７０９，７０４号を参照）を、ＧＤＦ８またはＢＭＰ１１のどちらとも結合しないことが実証されている無関係の抗体（Ｉｒｒ．Ａｂ）と共に使用し、また、対照培地も個々に試験した。結合していない抗体を、ＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＰＢＳで３回洗浄することによって除去した。５０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲートの１：５０００希釈液をそれぞれのウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションした。それぞれのプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）試薬を加えることによって呈色反応を展開させた。呈色反応は、１００μｌの０．１８ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって停止させた。生じたシグナルは、マイクロタイタープレートリーダーを用いてそれぞれのウェルの４５０ｎｍでの光学密度を読み取ることによって測定した。
【０２９６】
図１Ａおよび１Ｂに示すように、ＲＫ２２ハイブリドーマからの上清は、対照抗体ＲＫ３５から単離した上清と比較して、ＢＭＰ１１よりもＧＤＦ８との結合が高かった。ＲＫ２２によるＧＤＦ８に対する高い親和性の均一性は、これらの抗体のＧＤＦ８に対するより高い親和性が用量依存的でないことを実証することによって確認した。図１ＡおよびＢから見ることができるように、試験したすべての濃度で、ＲＫ２２抗体は、ＢＭＰ１１よりも高いＧＤＦ８に対する結合を実証した。ＲＫ２２は、ＢＭＰ１１に対して非常にわずかな結合を示し、対照的に、ＲＫ３５対照抗体は、ＧＤＦ８およびＢＭＰ１１のどちらとも結合した。
【０２９７】
（実施例２．２）
ＧＤＦ８に対するＲＫ２２の結合親和性
ＲＫ２２抗体とＧＤＦ−８との分子動態相互作用は、ＢＩＡｃｏｒｅプラズモン共鳴技術を用いて定量化的に分析し、見かけの動態速度定数を誘導した。これらの研究では、本発明者らは、可溶性抗体と固相結合したＧＤＦ−８との結合を測定した。固定したＧＤＦ−８のバイオセンサー表面上への表面配向は、ビオチン標識したＧＤＦ−８（ビオ−ＧＤＦ−８）を用いて制御し、ビオＧＤＦ−８をストレプトアビジンバイオセンサーチップ上に固定し、その後、様々な濃度の抗体を３つ組で施用し、結合を時間の関数として測定した。これらの測定から、見かけの解離（Ｋｄ）および会合（Ｋａ）速度定数を誘導し、これらを用いて相互作用の結合親和定数（Ｋｄ）を計算した。生物学的に機能的である抗体の画分として定義されるＲＫ２２の活性濃度は、高表面密度をコーティングすることによる部分的質量輸送制限下で、抗体を様々な流速で注入するＢＩＡｃｏｒｅを用いて、チップ上に固定したビオＧＤＦ−８と結合することができる抗体の画分を測定することによって決定した。抗体のそれぞれの濃度の会合速度および解離速度は、ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０．２で網羅的適合（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔ）を用いて同時に計算した。
【０２９８】
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００システム、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ（ＢＲ−１０００−３２）、ＨＢＳ／ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３．０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５％のポリソルベート２０（ｖ／ｖ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ−ＥＰ）は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａから得た。ヒトのビオ−ＧＤＦ８（ロット２５２５１−１５）を精製した。０．１％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ）を水中で作製した。抗体−抗原の相互作用の動態決定からの実験データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０．２を用いて分析した。
【０２９９】
ビオ−ＧＤＦ８表面を調製するために、ＨＢＳ／ＥＰ緩衝液の連続流をセンサー表面上に維持した。センサー表面上のストレプトアビジンは、１ＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのＮａＯＨを含有する溶液の３回の注入（それぞれ１分間）で調整した。高密度のコーティング（＞２０００ＲＵ）には、ビオ−ＧＤＦ８をＨＢＳ／ＥＰ緩衝液で１ｕｇ／ｍｌまで希釈し、ストレプトアビジンチップ上に流すことによってそれ上に固定した。低密度のコーティング（２０〜６０ＲＵ）には、ＧＤＦ−８を０．１ｕｇ／ｍｌまでさらに希釈し、注入したビオ−ＧＤＦ−８の体積は所要の密度に応じて様々であった。フローセル１上のストレプトアビジン表面を参照表面として使用した。対照として、第１のフローセルを、バルクの屈折率、マトリックス効果および非特異的結合を補正するための参照表面として使用し、第２、第３および第４のフローセルを捕捉分子でコーティングした。
【０３００】
チップ上に固定したビオＧＤＦ−８と結合することができるＲＫ２２抗体の画分を、部分的質量輸送制限下でＢＩＡｃｏｒｅを用いて分析した。この実験では、２００ｎＭおよび１００ｎＭ（濃度はＯＤ２８０に基づいて測定）の抗ＧＤＦ−８抗体を、２、１０、３０、５０および１００ｕｌ／分の流速で注入した。流速の増加に伴って傾きが増加したため、質量輸送制限は、センサーグラム目視検査によって検出することができる。バイオセンサー表面は、５ｕｌの０．１％のＴＦＡを用いて再生した。
【０３０１】
ＲＫ２２、抗ＧＤＦ−８抗体をどちらもＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）で希釈し、アリコートを３０ｕｌ／分の流速で固定したビオ−ＧＤＦ−８上に注入し、３分間の注入に続いて、ＢＩＡｃｏｒｅ緩衝液中で１０分間、同じ流速で解離を監視した。注入した抗体の濃度は、３００、１５０、７５、３７．５、１８．７、９．３、４．６、２．３および０ｎＭであり、それぞれの注入を３つ組で行った。二重参照を用いたそれぞれのセンサーグラムについてブランクおよび緩衝液の効果を減算した。バイオセンサー表面を５ｕｌの０．１％のＴＦＡを用いて再生した後、次の試料ＨＢＳ−ＥＰの注入を単独でそれぞれのセルに流した。応答は、ＲＫ２２の結合質量を表す共鳴単位（ＲＵ）で測定した。
【０３０２】
動態データはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．０．２を用いて分析した。一価リガンド（Ｂ）と結合する二価分析物（Ａ）Ａ＋Ｂ＝ＡＢ  Ｋａ１＊Ｋｄ１、ＡＢ＋Ｂ＝ＡＢ２  Ｋａ２＊Ｋｄ２、および一価リガンド（Ｂ）と結合する一価分析物（Ａ）Ａ＋Ｂ＝ＡＢ  Ｋａ１＊Ｋｄ１をどちらも仮定。見かけの解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数をセンサーグラムの適切な領域から計算した。抗体とＧＤＦ８との間の相互作用の結合親和定数は、以下Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａによって動態速度定数から計算した。図２で見ることができるように、ＲＫ２２では、３つの実験の平均で７ｎＭのＫｄ値が実証された。
【０３０３】
（実施例３）
ＲＫ２２はＧＤＦ８シグナル伝達をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する
（実施例３．１）
ＲＫ２２を用いた細胞に基づいたレポーター遺伝子アッセイにおける、精製した組換えヒトＧＤＦ−８の生物活性の阻害
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞に基づいたアッセイでＧＤＦ−８の活性を実証するために、ＴＧＦ−β誘導性プロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を用いて、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を開発した。ＣＡＧＡ配列は、ＴＧＦ−β誘導性遺伝子ＰＡＩ−１のプロモーター内でＴＧＦ−βに応答性の配列であることが以前に報告されている（Ｔｈｉｅｓ  Ｓ他、２００１）。１２個のＣＡＧＡボックスを含有するレポーターベクターを、塩基性ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いて作製した。アデノウイルス主要後期プロモーターからのＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位（−３５／＋１０）をＢｇＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入した。ＣＡＧＡボックスＡＧＣＣＡＧＡＣＡの１２個のリピートを含有するオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＸｈｏＩ部位内にクローニングした。ヒト横紋筋肉腫細胞系Ａ２０４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２）を、ＦｕＧＥＮＥ６形質移入試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ、ドイツ）を用いてｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２と共に一過的に形質移入した。形質移入後、細胞を９６ウェルプレート上で、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１０％のウシ胎児血清を添加したマッコイの５Ａ培地中で１６時間培養した。その後、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８を用いてまたは用いずに、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリン、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むマッコイの５Ａ培地中で、６時間、３７℃で処置した。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼを処置した細胞中で定量化した。１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−１１を用いてアッセイを繰り返した。
【０３０４】
ＲＫ２２の阻害活性を試験するために、ＧＤＦ−８をＲＫ２２抗体と共に１時間、室温でプレインキュベーションした。その後、この混合物を形質移入した細胞に加え、６時間、３７℃でインキュベーションした。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼを定量化した。同じプロトコルを用いてＢＭＰ−１１活性を遮断するＲＫ２２の能力を測定した。
【０３０５】
図３に見られるように、細胞を、ＲＫ２２の非存在または存在下で、処置しない（バックグラウンド）または１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ８で処置した場合に、ＬＣＰＳとしてのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター活性の誘導。これらの抗体のそれぞれは、少なくとも１つのＧＤＦ８活性、すなわち、ＧＤＦ８媒介ルシフェラーゼ誘導を用量応答性の様式で低下し、ＲＫ２２ではＩＣ５０が０．４ｎＭであった。対照抗体ＲＫ３５はＩＣ５０が０．２ｎＭであり、無関係の抗体はＩＣ５０が＞１００ｎＭであった。ＲＫ２２はＧＤＦ８に媒介されるシグナル伝達を阻害したが、これらの抗体はＢＭＰ１１の生物活性を有意に阻害しなかった。ＲＫ２２によるＢＭＰ１１活性の阻害のＩＣ５０は検出可能でなく、それぞれ３０ｎＭおよび＞１００ｎＭであった。これらのデータは、ＲＫ２２は、非特異的抗体ＲＫ３５と同じ度合まで、ＧＤＦ８シグナル伝達をｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的に阻害することを実証している。
【０３０６】
（実施例３．２）
ＲＫ２２はＧＤＦ８活性をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する
ＲＫ２２抗体がＧＤＦ８活性をｉｎ  ｖｉｖｏで拮抗するかどうかを決定するために、ＲＫ２２を成体ＳＣＩＤマウスにおけるさらなる試験のための代表的な抗体として選択した。ＳＣＩＤマウスは重篤な複合免疫不全に罹患しており、したがって、ＲＫ２２などの抗体を注射した後に免疫学的反応を生じない。４週間の期間をかけてＲＫ２２をＳＣＩＤマウスに注射した。３つの用量のＲＫ２２を投与した：１ｍｇ／ｋｇ／週、１０ｍｇ／ｋｇ／週および４０ｍｇ／ｋｇ／週。１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で投与したＭｙｏ−２９を陽性対照として使用し、様々な濃度の投与したＲＫ２２と比較した。
【０３０７】
筋肉量を、ＲＫ２２で治療したマウスにおけるＧＤＦ８活性の指標として使用した。３つの異なる筋肉群、腓腹筋、前脛骨筋および四頭筋を取り出し、筋肉重量を決定した。図４に示すように、ＲＫ２２は、１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で筋肉量を有意に増加させた。陽性対照のＭｙｏ２９と比較して、筋肉量はＲＫ２２およびＭｙｏ２９のどちらにおいても１０ｍｇ／ｋｇ／週で約１０％増加した。
【０３０８】
（実施例４）
ＲＫ２２結合部位の特徴づけ
（実施例４．１）
ＡｃｔＲＩＩＢと結合するＧＤＦ８のＲＫ２２阻害の評価
ＲＫ２２抗体が、ＧＤＦ８がそのＡｃｔＲＩＩＢ受容体と結合することを防止することによってＧＤＦ８活性を拮抗できるかどうかを決定するために、抗体をＡｃｔＩＩＲＢ結合アッセイ（たとえば中和アッセイ）で試験した。精製したＲＫ２２抗体を、ビオチン標識したＧＤＦ８とプラスチック上に固定したＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質との結合を阻害する能力について、９６ウェルマイクロタイタープレートアッセイでスクリーニングした。組換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、カタログ番号３３９−ＲＢ／ＣＦ）を、９６ウェル平底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＮＹ、カタログ番号３５９０）上に、０．２Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液中に１μｇ／ｍｌで、終夜４℃でコーティングした。その後、プレートを１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンで遮断し、標準のＥＬＩＳＡプロトコルに従って洗浄した。単独の、または１時間、室温で様々な濃度のＲＫ２２と共にプレインキュベーションした、２０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識したＧＤＦ８を、遮断したＥＬＩＳＡプレートに加えた。ＩＣ５０値によって測定したクローンの力価を確立するために、抗体の滴定を加えた。無関係の抗体またはＧＤＦ８とＡｃｔＩＩＲＢとの結合を遮断する対照抗体と共にプレインキュベーションしたビオチン標識したＧＤＦ８を、対照として含めた。室温で１時間後、抗体−遮断したタンパク質の複合体を洗い流し、プレートと結合したＡｃｔＩＩＲＢと結合したＧＤＦ８の量を、ユーロピアムで標識したストレプトアビジンを用いて、ＤＥＬＦＩＡ（商標）試薬キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）を使用して、時間分解蛍光定量化的（ＴＲＦ）アッセイで検出した。
【０３０９】
ＡｃｔＲＩＩＢ中和アッセイの結果を図５に示す。したがって、ＲＫ２２抗体が、ＡｃｔＲＩＩＢと結合するＧＤＦ８の能力を阻害することによってＧＤＦ８シグナル伝達を阻害することは可能であるが、別の機構が関与している可能性が高い。
【０３１０】
（実施例４．２）
ＲＫ２２はＧＤＦ８に特異的なエピトープと結合する
ＧＤＦ８およびＢＭＰ１１は密に関連しているが、ＲＫ２２はＧＤＦ８に特異的である。したがって、これらの抗体によって認識されるエピトープもＧＤＦ８に特異的であると仮定され、したがって、ＧＤＦ８に特異的なエピトープは、ＧＤＦ８シグナル伝達を特異的に阻害するためおよび／またはＧＤＦ８に特異的な拮抗剤をスクリーニングもしくは作製するための拮抗剤として（たとえばとしてペプチド模倣体）使用し得る。
【０３１１】
抗体ＲＫ２２によって認識されるＧＤＦ８エピトープを決定するために、配列番号１として記載した成熟ＧＤＦ８の配列全体を表す、４８個の重複を有する１３個の残基のペプチドを、スポット合成技術を用いてセルロース紙上で直接合成した（Ｍｏｌｉｎａら（１９９６）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．、９：１５１〜５５、Ｆｒａｎｋら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８：９２１７〜３２）。ペプチドの重複部分は１１個のアミノ酸であった。このアレイでは、システインの存在によって引き起こされる化学的な問題を減らすために、システイン残基をセリンで置き換えた。ポリエチレングリコールおよびＦｍｏｃ保護のアミノ酸で修飾したセルロース膜をＡｂｉｍｅｄ（Ｌａｇｅｎｆｅｌｄ、ドイツ）から購入した。アレイは、β−アラニンスペーサーのカップリングによって膜上に定義し、ペプチドは、以前に記載のように標準のＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）カップリング化学を用いて合成した（Ｍｏｌｉｎａら、上記、Ｆｒａｎｋら、上記）。
【０３１２】
Ａｂｉｍｅｄ  ＡＳＰ  ２２２ロボットを用いて活性アミノ酸をスポットした。洗浄および脱保護ステップは手動で行い、最終合成サイクルの後にペプチドのＮ末端をアセチル化した。ペプチド合成後、膜をメタノールで１０分間洗浄し、遮断剤（ＴＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（商標）２０を含むトリス緩衝溶液）および１％（ｗ／ｖ）のカゼイン）で１０分間洗浄した。その後、膜を、遮断剤中の２．５μｇ／ｍｌのＲＫ２２抗ＧＤＦ８抗体と共に、１時間、穏やかに振盪しながらインキュベーションした。遮断剤で３回、１０分間洗浄した後、膜を、ＨＲＰで標識した二次抗体（遮断剤中に０．２５μｇ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベーションした。その後、膜を、遮断剤で３回、それぞれ１０分間洗浄し、ＴＢＳＴで２回、それぞれ１０分間洗浄した。結合した抗体を、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標）Ｗｅｓｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）およびデジタルカメラ（Ａｌｐｈａｎａｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｏｍａｇｅｒ）を用いて可視化した。ドットブロットを図６に示し、結果を表４に要約する。ドットブロットは、ＲＫ２２が、ＤＦＧＬＤＳ（配列番号４）、ＦＥＡＦＧＷＤＷＩＩＡＰＫＲＹ（配列番号６）、ＦＶＦＬＱＫＹＰＨＴＬＶＨＱ（配列番号８）、ＳＳＧＥＳＥＦＶＦ（配列番号１０）、ＷＩＩＡＰＫＲＹＫＡＮＹＳＳＧＥＳＥＦＶＦＬＱＫＹ（配列番号１１）、および潜在的にはその部分配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するおよび／またはそれから本質的になるＧＤＦ８エピトープと結合することを実証している。特に、ＲＫ２２に対するエピトープは、ＧＤＦ８Ｉ型受容体（ＡＬＫ４／ＡＬＫ５）と相互作用すると推定されるＧＤＦ８領域にマップ付けされている。
【０３１３】
【表４】
0005756291.tif 000006
【０３１４】
（実施例５）
ＲＫ２２のヒト化
（実施例５．１）
抗体の配列決定
ＲＫ２２をコードしている可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子を、ＲＫ２２抗体を産生するハイブリドーマ細胞からクローニングし、その後、アミノ酸配列を決定した。これらの配列は、表１中に配列番号１４および１６として記載されている。
【０３１５】
（実施例５．２）
ＲＫ２２抗体の生殖系列化
抗体の配列データを用いて、ＲＫ２２の重鎖および軽鎖に最も近い生殖系列配列を同定し、たとえば、ＤＰ−５およびＤＰ−７は、ＲＫ２２のＶＨにそれぞれ約６５％および７１％の同一性を示し（図７）、ＤＰＫ２４は、ＲＫ２２のＶＬに約７８％の同一性を示した（図８）。適切な突然変異は、適切な突然変異原性プライマーを用いた標準の部位特異的突然変異誘発技術を使用して行った。配列および抗体の突然変異を配列解析によって確認した。本明細書は、すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、本明細書中に引用した参考文献の教示に鑑みて、最も徹底的に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が特許請求した発明によって包含されることを理解されよう。
【０３１６】
（実施例６）
ＧＤＦ８を定量化および検出するためのサンドイッチ免疫アッセイ様式
以下の実施例中に記載する抗体のそれぞれは、ＰｉｅｒｃｅのＥＺ  Ｌｉｎｋスルホ−ＬＣビオチン化キットを用いてビオチン標識した。以前の研究から、４０倍過剰のＮＨＳ−ビオチンが、これらの抗体の両方のビオチン化に最適であることが決定されている。４００ｕｇのそれぞれの抗体を、４０倍モル濃度の過剰のビオチンを用いてビオチン標識した。これにより、１ｍｍｏｌｅの抗体あたり約３〜５ｍｍｏｌｅのビオチンの取り込みがもたらされた。ビオチン化後、すべての抗体をＰＢＳ中で終夜、４℃で透析し、全タンパク質濃度をＢＣＡによって決定した。ビオチンの取込みのモル比を決定するために、ビオチン標識した抗体の溶液を、２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸（ＨＡＢＡ）およびアビジンの混合物に加えた。ビオチンのアビジンに対する親和性がより高いため、ＨＡＢＡとアビジンとの相互作用が置き換えられ、５００ｎｍの吸光度が比例して減少した。抗体とコンジュゲートしたビオチンの量は、ビオチン標識した試料を加える前および後にＨＡＢＡ−アビジン溶液の吸光度を測定することによって測定することができる。吸光度の変化は、抗体内に取り込まれたビオチンの量に関連する。
【０３１７】
さらに、以下に記載する研究中で使用する血清は、内在性ＧＤＦ８を欠く。ＧＤＦ−８血清枯渇用の親和性カラムは、臭化シアン活性化セファロースビーズ上に固定した１ｍｇのＭＹＯ−０２９モノクローナル抗体を用いて調製した。カラムを０．１Ｍの酢酸で事前に洗浄し、２５０ｍＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．２で中和した後、ヒト血清を加えた。６５℃まで加熱することによって潜在型ＧＤＦ−８が明らかに活性化されるため、血清を６５℃まで１０分間予熱し、その後、１ｍｇのＭＹＯ−０２９抗ＧＤＦ８親和性カラムに３回通し、遊離および全ＧＤＦ−８アッセイで活性を確認した。最初に、２．５ｍｌ体積の血清をカラムに通した。初期試験後、親和性カラムに複数回、間に０．１Ｍの酢酸でカラムを洗浄して通すことによって、より大きな体積の血清（１３ｍｌのアリコート）を加熱してＧＤＦ−８を枯渇させた。この枯渇させた血清は、既知の濃度の成熟ＧＤＦ−８を用いた検量線の作成のためのマトリックスとして使用した。
【０３１８】
（実施例６．１）
抗体対合実験：免疫アッセイ様式の比較：ＲＫ２２検出を用いたＲＫ３５捕捉またはＲＫ３５検出を用いたＲＫ２２捕捉
それぞれの抗ＧＤＦ−８モノクローナル抗体を、０．１Ｍのホウ酸ナトリウム中で、高結合の９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ＨＢＸ）上に、終夜４℃または１時間３７℃で、１μｇ／ｍｌの濃度で個別にコーティングした。プレートを洗浄し、その後、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ試薬で１０分間遮断した。ストックＧＤＦ−８（０．１％のトリフルオロ酢酸−ＴＦＡ中に１．７７ｍｇ／ｍｌ）を、シリコン処理したプラスチックチューブ内で０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で１０μｇ／ｍｌまで希釈し、検量線を作成するための較正物質として、ＧＤＦ８を枯渇させたヒト血清で１２．５ｎｇ／ｍｌ〜０．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度にさらに希釈した。検量線は、アッセイプレートのカラム１〜３を用いて３つ組で実行した。別の事前に遮断した９６ウェルプレートで、３０μｌアリコートの試験血清を、１２０μｌのＴＨＳＴ緩衝液（最終濃度は２０％の血清、合計体積は１５０μｌ）を含有する６個のウェルのそれぞれ（３つ組の決定のため）に加えた。全ＧＤＦ−８アッセイには、８０μｌのこの溶液を９６ウェルのＰＣＲプレートに移し、８０℃まで５分間加熱した。加熱した試料を氷上で冷却した後、アッセイプレートに加えた。
【０３１９】
検量線に使用したウェルでは、６５μｌのＴＨＳＴ緩衝液をすべてのウェルに加え、続いて１０μｌの較正物質血清を加えて、最終体積を１００μｌとした。調製プレートから、５０μｌの未加熱の２０％の血清試料を取り出し、アッセイプレートに加えて、最終血清濃度を１０％の血清、合計体積を１００μｌとした。加熱したプレートから、５０μｌの２０％の血清を第２のアッセイプレートに加えた。これらの第２のアッセイプレートを室温で振盪しながらインキュベーションした。１．５時間後、プレートを洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ試薬を５分間加えた。ビオチン標識したＲＫ２２またはビオチン標識したＲＫ３５を、ウェルに、１５０ｎｇ／ｍｌで１．５時間、振盪しながら加えた。プレートを洗浄し、再度遮断した後、１００ｕｌの超高感度ストレプアビジン−ＨＲＰ（１：２０，０００）希釈液を１時間、室温で振盪しながら加えた。プレートを洗浄し、再度遮断した後、ＴＭＢ基質を１５分間、室温で振盪しながら加えた。反応は０〜５ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって停止させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで、４５０ｎｍで読み取った。免疫アッセイ様式：ＲＫ３５捕捉／ＲＫ２２検出またはＲＫ２２捕捉／ＲＫ３５検出の比較は、図９Ａおよび９Ｂに見ることができる。示されたように、どちらの様式も、ＴＨＳＴアッセイ緩衝液または１０％の血清中で１００〜１０ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ８を検出することができた。
【０３２０】
（実施例６．２）
ＧＤＦ−８アッセイに対する血清の効果
以前の結果から、血清バックグラウンド効果により吸光度値を、分析した血清試料に応じて０．３ＯＤ単位〜約０．５ＯＤ単位の範囲で増加したことが示唆されている（データ示さず）。ヒト血清を、ＲＫ２２をコーティングしたまたはコーティングしていない（対照）ＨＢＸアッセイプレートに対して試験することによって、シグナル増加の原因はＨＡＭＡ効果（すなわち、ヒト血清ＩｇＧとアッセイで使用したマウスモノクローナル抗体との反応）であることが決定された（図１０）。モノクローナル抗体を含まないプレートはシグナルの増加を示さず、バックグラウンドの増加は、プレートと非特異的に結合する血清が原因ではなく、モノクローナル抗体の存在に依存することが示唆された。
【０３２１】
酸解離およびヒトＩｇＧとマウスＩｇＧとの結合を遮断するための様々な種由来の過剰のＩｇＧの添加を含めた、バックグラウンドを低下させるいくつかの試みは失敗であった（データ示さず）。ＨＡＭＡアッセイ干渉免疫グロブリン阻害試薬（ＩＩ  Ｒ）を低下させるために特別に設計された市販の試薬の添加は、以下の免疫アッセイに加えた場合に成功した。０．１Ｍのホウ酸Ｎａ、ｐＨ８．５で希釈した１ｕｇ／ｍｌのＲＫ３５を捕捉試薬として使用した。Ｍｙｏ−０２９をプレート＋／−血清＋／−ＩＩＲおよび２５０ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ８上で滴定し、１．５時間インキュベーションした。ビオチン標識したＲＫ２２を１：１０，０００希釈でＴＨＳＴアッセイ緩衝液に加え、１．５時間インキュベーションした。ＴＨＳＴで１：２０，０００に希釈した１００μｌのストレプアビジン−ＨＲＰ、続いてＴＭＢ中で反応を展開した。図１１から見ることができるように、ＨＡＭＡバックグラウンドは、ＩＩＲ試薬を用いることによって低下する。
【０３２２】
（実施例６．３）
ＭｙＯ−０２９抗体と結合するＧＤＦ８の阻害
ＭｙＯ−０２９（２００２年１０月２日に対応する受託指定番号ＰＴＡ−４７４１の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託）は、筋肉障害に罹患している患者において筋肉強度を増加させる目的で臨床治験において使用されている治療用抗体である。本明細書中に記載のようにＭｙｏ−０２９を投与した患者においてＧＤＦ８を検出する免疫アッセイでは、ＧＤＦ−８との結合についてアッセイ抗体ＲＫ３５およびＭＹＯ−０２９の交差反応性が存在することが示された。この交差反応性を確認するために、ＭＹＯ−０２９をアッセイプレート上にコーティングした。１２００ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ−８をそれぞれのウェルに加えた。その後、漸増濃度のビオチン標識したＲＫ２２またはビオチン標識したＲＫ３５のいずれかを加えた。図１２に見られるように、この構成ではシグナルが生じなかったため、未標識のＧＤＦ−８は、ＭＹＯ−０２９との結合についてビオチン標識したＲＫ３５と競合する。ビオチン標識したＲＫ３５ではシグナルが生じず、これは、ＧＤＦ８との結合についてＲＫ３５およびＭｙｏ−０２９の交差反応性を示している。
【０３２３】
（実施例６．４）
ＧＤＦ８の競合相手としてのＭｙＯ−０２９の使用
両方のアッセイ構成（ＲＫ３５／ＲＫ２２またはＲＫ２２／ＲＫ３５）を用いてアッセイを行い、一定濃度のＧＤＦ−８（２５０ｐｇ／ｍｌ）を含む漸増量のＭＹＯ−０２９治療用抗体を、アッセイ緩衝液または１０％のヒト血清に添加。図１３Ａに見られるように、ＲＫ２２を捕捉抗体として使用した。２５０ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ−８を１．５時間、室温で、１５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識したＲＫ３５および漸増濃度のＭＹＯ−０２９（０〜２０ｕｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションした。最高濃度のＭＹＯ−０２９でも、約３０％の阻害しか見られなかった。図１３Ｂに示すように、ＲＫ３５を捕捉抗体として使用した。２５０ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ−８を、１．５時間、室温で、ビオチン標識したＲＫ２２および漸増濃度のＭＹＯ−０２９と共にインキュベーションした。ほぼ１００％のシグナルの阻害が、≧５ｕｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９濃度で観察された。
【０３２４】
（実施例６．５）
ＲＫ３５捕捉／ＲＫ２２検出様式を用いたヒト血清における添加回収
３個のヒト血清試料を、添加回収実験でＧＤＦ−８の回収について分析した。それぞれの試料を、１００％の血清中に６００ｐｇ／ｍｌの成熟ＧＤＦ−８まで希釈し、２倍に段階希釈して６００、３００、および１５０ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ−８の試料を生成した。これらの試料のそれぞれを、ＲＫ３５捕捉／ＲＫ２２検出様式で、２０μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９を添加してまたは添加せずに分析した。図１４Ａを参照されたい。ＭＹＯ−０２９の添加によるシグナルの低下を計算する。図１４Ｂを参照されたい。これらの値をＴＨＳＴアッセイ緩衝液で作成したＧＤＦ−８検量線と比較し、ＧＤＦ−８の観察値対予測値を図１５にプロットする。観察値は予測値よりもはるかに低く、これは、緩衝液単独での検量線は血清試料中に見つかるＧＤＦ−８値を正確に定量化しないことを示す。
【０３２５】
（実施例６．６）
検量線を作成するための血清対アッセイ緩衝液の使用
正常なマウス血清およびＧＤＦ−８ＫＯマウス血清を本研究で研究した。これらの血清を、正常なヒト血清およびＴＨＳＴ緩衝液と共に利用して、成熟ＧＤＦ−８タンパク質を用いた検量線を作成した。図１５を参照されたい。血清で作成した検量線と緩衝液で作成したものとの間の傾きの差異により、緩衝液を検量線の作成の媒体として使用した場合に添加／回収実験の観察値対予測値が劇的に異なっていた理由が説明される（図１６）。緩衝液中の検量線と比較して血清中の検量線の傾きが低下していることが、生じたシグナルに対する血清のマトリックス効果を明らかにしており、検量線は血清中で作成すべきことを示唆している。ＫＯマウス血清はアッセイ開発に必要な量で入手可能でなく、正常なマウス血清は、未知の血清試料中のＧＤＦ−８の予測を妨げる高い内在性レベルのＧＤＦ−８を有する。正常なヒト血清も、正常なマウスよりは低いが、内在性レベルのＧＤＦ−８を有し、これも所望しない妨害要素を付加する。可能性のある代替物質は、アッセイ較正マトリックスとして使用するために、正常なヒト血清のプールのＧＤＦ−８を枯渇させることである。
【０３２６】
（実施例６．７）
血清中のＭｙｏ−０２９抗体の不活性化／解離
以前の研究により、ＲＫ３５抗体のエピトープとの交差反応性によって、ＭＹＯ−０２９の存在が、ＲＫ３５／ＲＫ２２様式においてＧＤＦ−８の正確な定量化を妨害することが実証されている。試料中のＧＤＦ−８／ＭＹＯ−０２９の複合体を解離させることができれば、ＧＤＦ−８をＭＹＯ−０２９の存在下で正確に測定する免疫アッセイを開発することが可能であり得ると仮定された。酸解離および熱変性を含めた、抗体をその抗原から解離させるいくつかの可能性が存在する。熱処理によって潜在型ＴＧＦ−βを不可逆的に活性化させることができるという報告書に基づく（Ｂｒｏｗｎら、１９９０、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３、３５〜４３）。ＴＨＳＴアッセイ緩衝液中の６５℃〜８０℃の温度勾配は、ＧＤＦ−８アッセイ中のＭＹＯ−０２９抗体によって実証された効果に影響を与えなかった。しかし、正常な無添加の血清、４００ｐｇ／ｍｌの成熟ＧＤＦ−８を添加した血清、または潜在型ＧＤＦ−８を添加した血清を用いたパイロット実験を行った。この実験では、ＭＹＯ−０２９抗体を２０％の血清に添加し、８０℃まで７分間加熱した（図１７を参照）。結果により、アッセイにおけるＧＤＦ−８活性はこの温度で保持され、ＭＹＯ−０２９抗体は８０℃まで加熱した血清中で不活性化されたことが示された。この不活性化は２つの方法で実証した：１）ＭＹＯ−０２９の存在下で加熱した血清試料は、ＭＹＯ−０２９を加えない対照の加熱した試料と同じシグナル出力を有しており、２）アッセイシグナルは、試料の加熱する後に新鮮なＭＹＯ−０２９を加えることによって、再度バックグラウンドレベルまで低下させることができる。これらの結果は、正常な血清、成熟ＧＤＦ−８を添加した血清、および潜在型ＧＤＦ８を添加した血清で観察された。潜在型ＧＤＦ−８を添加した血清試料は、潜在型ＧＤＦ−８物質に依存し、成熟ＧＤＦ８に依存しないと考えられるシグナルの増加を実証する。有効に不活性化させるためのより正確な時間を決定するために、５μｇ／ｍｌのＭＹＯ−０２９を添加した正常な血清を用いた経時変化実験を実施した。結果により、ＭＹＯ−０２９抗体は、８０℃で３分間という早い時間で完全に不活性化されることが示された。
【０３２７】
（実施例６．８）
ヒト血清におけるＧＤＦ８枯渇
ヒト血清から内在性ＧＤＦ−８を枯渇させるために、臭化シアン活性化によってセファロースビーズに共有的に固定した１ｍｇのＭＹＯ−０２９抗体を用いて、親和性カラムを作製した。カラムを事前に洗浄し、小アリコートのヒト血清をカラムに通し、ＧＤＦ−８  ＥＬＩＳＡアッセイでＧＤＦ−８活性について試験した。さらに、血清を６５℃まで事前に加熱し、その後、カラムに通す前に冷却した。加熱した血清は、ＧＤＦ−８アッセイで実行した場合に、血清中の潜在型ＧＤＦ−８の免疫学的活性化が原因であり得る増加したシグナルを示す。図１８は、加熱した際のＧＤＦ−８アッセイにおけるシグナル増加、また、加熱／枯渇のＨ／Ｄ血清におけるシグナルの枯渇も示す。注目すべきことに、８０℃まで再度加熱した場合は、Ｈ／Ｄ血清中のシグナルの増加は観察されなかった。
【０３２８】
（実施例６．９）
Ｈ／Ｄ血清中の検量線
内在性ＧＤＦ−８を欠く血清を用いて、加熱および非加熱条件下で、成熟ＧＤＦ−８および潜在型ＧＤＦ−８をどちらも使用して免疫反応性検量線を作成した。成熟ＧＤＦ−８を１００％の血清に添加し、２５００ｐｇ／ｍｌから４０ｐｇ／ｍｌまで段階希釈した。潜在型ＧＤＦ−８は、５０，０００ｐｇ／ｍｌ〜８００ｐｇ／ｍｌの範囲の、成熟ＧＤＦ８の２０倍のタンパク質濃度で使用した（図１９）。この実験の結果は、潜在型ＧＤＦ−８を１００％のＨ／Ｄ血清中で８０℃まで加熱した場合に、アッセイシグナルの顕著な増加を示す。図１８で、８０℃まで加熱したＨ／Ｄ血清は、正常な血清で観察される特徴的なシグナル増加を示さなかったことに注意されたい。これは、正常な血清で見られる増加が内在性潜在型ＧＤＦ−８によるものであるという仮説の信用度を高める。対照的に、成熟ＧＤＦ−８で生じたシグナルは、加熱の際に増加せず、繰り返し実験では、８０℃での加熱に伴って減少する傾向にある。
【０３２９】
（実施例６．１０）
８個の正常な血清試料における遊離および全ＧＤＦ８の分析
事前に凍結した８個の正常な血清試料を解凍し、室温アッセイ（遊離）および潜在型ＧＤＦ−８を活性化するために８０℃加熱ステップ（全）を用いて、遊離および全ＧＤＦ−８についてアッセイした。この分析用の検量線は、ＧＤＦ−８較正物質と同様に既知の濃度の成熟ＧＤＦ−８タンパク質を添加したＨ／Ｄ血清を用いて作成した。検量線は１２，５００ｐｇ／ｍｌ〜１８８ｐｇ／ｍｌの範囲であり、相関係数０．９９９の非線形回帰曲線のフィッティング分析（図２０を参照）を用いて、８個の未知の血清試料中のＧＤＦ−８値を計算した。既に記載したように、Ｍｙｏ−０２９を加えることによって誘導された光学密度の変化は、試料中のＧＤＦ−８の内在性量と直接比例する。図２１は、ＧＤＦ−８の濃度を決定するために使用する生データを表す。この図は、遊離ＧＤＦ−８シグナルおよびＭＹＯ−０２９抗体を加えることによるその対応する低下したシグナル、ならびに全ＧＤＦ−８およびＭＹＯ−０２９を加えることによるその対応する低下したシグナルを例示する。図２２は、アッセイ再現性実験の結果を表す。遊離および全ＧＤＦ８アッセイは、高い度合の再現性を示す。これは、遊離ＧＤＦ−８（室温）アッセイに特に当てはまる。全（８０℃まで加熱）の日ごとのアッセイの増加したアッセイシグナルは、５から１０分間への加熱時間の増加が原因である。試料加熱の時間の増加に伴ったアッセイシグナルの低下が繰り返して観察され、これは抗原の変性および免疫反応性の損失を反映している可能性がある。
【０３３０】
（実施例６．１１）
熱活性化した内在性ＧＤＦ８はＭＹＯ−０２９の存在下で過小検出される
図２３に示す実験では、ヒト血清をＭＹＯ−０２９の存在または非存在下でインキュベーションし、その後、ＥＬＩＳＡによる分析の前に様々な温度で熱変性した。試験試料中のＧＤＦ−８レベルの定量化は、ＧＤＦ−８を枯渇させたプールしたヒト血清内に添加した既知の濃度の精製した組換えＧＤＦ−８二量体の希釈系列からなる検量線のアッセイ結果からの内挿によって、アフィニティークロマトグラフィーによって行った。ＭＹＯ−０２９を存在させない場合のＧＤＦ−８の最大検出は、約６０℃で起こった。ＭＹＯ−０２９の存在は、低温で血清中のＧＤＦ−８の検出をマスキングした。６５℃より高い温度でのインキュベーションにより、ＭＹＯ−０２９の存在下でのＧＤＦ−８の検出が部分的に回復した。しかし、６５℃より高い温度でのＧＤＦ−８の計算濃度により、アッセイが、血清中に存在するＧＤＦ８の合計量を実質的に過小評価したことが示される。
【０３３１】
（実施例６．１２）
ＧＤＦ８はＭＹＯ−０２９の存在下で、低ｐＨで検出される
ＭＹＯ−０２９の解離に必要な温度まで加熱した場合の最適以下のＧＤＦ−８の検出は、代替方法の評価を促した。図２４は、ＭＹＯ−０２９の非存在および存在下において同様のレベルのＧＤＦ−８を検出する、酸解離ＥＬＩＳＡの能力を実証する。以前の実験では、ＧＤＦ−８／ＭＹＯ−０２９混合物を、捕捉抗体と結合させる前に中和した。これらの条件下では、ＭＹＯ−０２９は、中和された際に捕捉抗体であるＲＫ３５との結合について競合することができた。図２４では、捕捉条件を低い酸性ｐＨで維持した場合に、ＲＫ３５は依然としてＧＤＦ−８と結合することができるが、ＭＹＯ−０２９結合できず、したがって、ＧＤＦ−８の検出の完全回収を治療用抗体の存在または非存在下で達成できることが実証されている。
【０３３２】
（実施例６．１３）
ＲＫ３５は酸性条件下でＧＤＦ８と結合する
ＲＫ３５が酸性条件下でＧＤＦ−８と結合できる（ＭＹＯ−０２９はできない）ことを確認するために、ＲＫ３５およびＭＹＯ−０２９をヒト血清中で個別に滴定し、分析物捕捉ステップを酸性条件下で行った。溶液中の漸増量のＲＫ３５は、結合してプレートと結合したＲＫ３５と結合するＧＤＦ−８について競合することができ、酸性条件下でＧＤＦ−８の検出の減少がもたらされた。ＭＹＯ−０２９は、加えたＭＹＯ−０２９の濃度にかかわらず、ｐＨ３．０に近づく溶液中でＧＤＦ−８と結合することができず、溶液中のＧＤＦ−８は、ＥＬＩＳＡウェル上にコーティングしたＲＫ３５抗体に利用可能なまま残された（図２５を参照）。したがって、ＭＹＯ−０２９が有用な属性として役割を果たすことができない条件下でＧＤＦ−８と結合するＲＫ３５の能力は、ＭＹＯ−０２９の存在下でＧＤＦ−８レベルを測定するために利用することができる。ＧＤＦ−８からのＭＹＯ−０２９の酸解離は、増大する濃度のＭＹＯ−０２９でも有効である。図２５中のデータは、ＭＹＯ−０２９濃度を１００μｇ／ｍｌまで増加することでは、酸解離プロトコルを用いたＧＤＦ−８の検出が消失されなかったことを示す。また、この図は、熱解離プロトコルを用いたＧＤＦ−８の検出の顕著な低下も示す、図２６。
【０３３３】
ヒト血清の酸性化は、以前に報告されているよりもはるかに大きなＧＤＦ−８血清レベルの推定値をもたらす。増加した血清の推定値がより高いＧＤＦ−８の検出の結果であって、酸に誘導された人為的結果によるものではないことを実証するために、遺伝子操作したノックアウトマウスおよび天然に存在するＧＤＦ−８ノックアウト動物であるベルジアンブルー牛の両方からの血清を分析した。図２７は、ノックアウトマウスおよびベルジアンブルー牛のどちらからの血清も、中性または酸性ｐＨのいずれかで測定した場合に、プレートのバックグラウンドを超えるシグナルを生じることができなかったことを示す。ここで報告した値は光学密度の単位であり、比較評価が可能であるが、検量線が欠如するため、ＧＤＦ−８の絶対量を決定することができない。
【０３３４】
（実施例６．１４）
検量線のフィッティング
酸解離方法のアッセイ間およびアッセイ内のばらつきを評価するために、組換えＧＤＦ−８二量体を添加したベルジアンブルー血清アリコートを分析した。４つのストック溶液を検量線とは独立して調製し、３つ組で、９６ウェルプレートの５つの異なる位置でアッセイした。
【０３３５】
４つまたは５つのパラメータのロジスティックモデルを用いて、このアッセイに検量線をフィッティングさせることができる。３つ組の算術平均を、モデルフィッティングの生データとして使用することができる。典型的には、異なる濃度レベルの分散は異なる傾向にある。低濃度および高濃度のどちらでも正確な検量線を得るために、光学密度データの重み付き非線形最小二乗方法、または分散安定化変換、続いて非重み付き非線形最小二乗方法を用いるべきである。
【０３３６】
図２８Ａ〜Ｃは、較正標準の逆算した濃度のその相対誤差に関して、５個のＧＤＦ−８  ＥＬＩＳＡプレートの検量線のフィッティングの３つの異なる方法を対比する。２０％の相対誤差を許容されるとする場合、光学密度の平方根にフィッティングさせた４つおよび５個のパラメータの両方のロジスティックモデルを使用することができる。
【０３３７】
（実施例６．１５）
アッセイの正確さおよび精度
酸解離方法のアッセイ間およびアッセイ内のばらつきを評価するために、組換えＧＤＦ−８二量体を添加したベルジアンブルー血清のアリコートを分析した。４つのストック溶液を検量線とは独立して調製し、３つ組で、９６ウェルプレートの５つの異なる位置でアッセイした。図２９は、３日の異なる日に処理した５個のプレートのプレート設計を示す。添加した試料の濃度を、５個のパラメータのロジスティックモデルによってそれぞれのプレートにフィッティングさせた検量線から計算した。プレート内およびプレート間の変動係数（ＣＶ）および相対誤差（ＲＥ）を表１および２に要約する。プレート内およびプレート間の正確さはどちらも、いずれのＣＶ計算の方法に基づいても十分に２０％の範囲内にあった。
【０３３８】
【表５】
0005756291.tif 000007
【０３３９】
【表６】
0005756291.tif 000008
【０３４０】
（実施例７）
ヒト血清中のミオスタチン濃度の測定
上述のアッセイを用いて、健康なヒト血清中のミオスタチンの循環濃度を測定および比較した。一研究では、若年および高齢の男性の血清をミオスタチンレベルについて評価した。テストステロン用量応答研究からの保管試料を用いた、循環ミオスタチンレベルに対するテストステロン治療の効果も検査した。詳細が以前に公開されているその研究では（Ｂｈａｓｉｎ  Ｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、２００５、９０：６７８〜８８、Ｂｈａｓｉｎ  Ｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、２００１、２８１：Ｅｌ  １７２〜８１、およびＳｔｏｒｅｒ  ＴＶＶら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、２００３、８８：１４７８〜８５）、健康な若年および高齢の男性への段階づけた用量のテストステロンの投与は、骨格筋量および強度の用量依存性の増加に関連していた。別の研究では、健康な女性および手術閉経女性の血清を評価した。
【０３４１】
第１の研究では、血清試料は、上述のテストステロン用量応答研究の参加者であった、正常なテストステロンレベルを有する１８〜３５歳の健康な若年男性および６０〜７５歳の高齢男性に由来するものであった。研究プロトコルは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ．Ｄｒｅｗ大学およびＨａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ研究教育施設（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の施設審査委員会によって承認された。除外基準には、前立腺癌の既往歴、ＰＳＡ＞４ｎｇ／ｍｌ、ＡＵＡ下部尿路症状質問表で＞７のスコア、ヘマトクリット＞４８％、重篤な睡眠時無呼吸、真性糖尿病、鬱血性心不全、過去６カ月の心筋梗塞、過去１年間のアンドロゲンの使用、または中等度から激しい運動トレーニングレジメンへの参加が含まれていた。４週間のコントロール期間の後、参加者を５個の治療グループのうちの１つにランダムに割り当てて、内在性ゴナドトロピン産生を抑制するためにＧｎＲＨ作用剤（ロイプロリドデポー、７．５ｍｇ、ＴＡＰ、イリノイ州Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ）の月１回の注射を与えた。また、参加者に、５つの用量、すなわち、週１回の２５ｍｇ、５０ｍｇ、１２５ｍｇ、または３００ｍｇのうちの１つで、エナント酸テストステロン（ＴＥ、Ｄｅｌａｔｅｓｔｒｙｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、Ｓａｖｉｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｉｓｅｌｉｎ）の週１回の筋肉内注射も与えた。
【０３４２】
血清試料（またはベルジアンブルー血清中の較正物質試料）を、酸解離緩衝液（０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５）と１：１３．３の比で混合した。非解離アッセイには、試料をグリシン−ＨＣｌ緩衝液の代わりにＴＨＳＴ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのグリシン、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）と混合した。アッセイプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ＨＢＸ＃３８５５）を、コーティング緩衝液（１００ｍＭのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．１）中の２．０ｍｇ／ｍｌのＲＫ３５と共に終夜４℃でインキュベーションし、洗浄した、２００μｌ／ウェルのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ−ＴＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ＃３７５３５）で遮断した。希釈した血清試料（１００μＬ）をアッセイプレートに移し、室温で９０分間インキュベーションし、ＴＨＳＴで４回洗浄し、１００μｌのビオチン化ＲＫ−２２二次抗体（０．１μｇ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに９０分間、室温で加えた。プレートをＴＨＳＴで４回洗浄し、ＴＨＳＴ緩衝液で１：４０，０００に希釈した１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ＃７１００−０５）を１時間、室温で加えた。プレートをＴＨＳＴで４回、再度洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質を１２分間、室温で加えることによって展開した。ウェル１個あたり１００μｌの０．５ＭのＨ２ＳＯ４を加え、波長補正を５４０ｎｍに設定して、ＥＬＩＳＡプレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取った。
【０３４３】
検量線範囲：検量線は、それぞれの較正物質のＯＤおよび対応する濃度をプロットすることによって作成した。５個のパラメータのロジスティックのフィッティングをもちいて検量線をフィッティングさせた。７３ｐｇ／ｍｌから７５，０００ｐｇ／ｍＬまで広がるベルジアンブルー血清中の組換えヒト成熟ミオスタチンの２倍希釈液からなる検量線を、それぞれのアッセイの前に調製した。１１個の較正物質のリードバック値のアッセイ内およびアッセイ間の不正確さを、６回の分析の実行から決定した。外挿した濃度の平均、ＳＤ、％ＣＶ、および％バイアスを、それぞれの分析の実行（アッセイ内の不正確さを評価するため）およびすべての分析の実行（アッセイ間の不正確さを評価するため）について計算した。定量化の下限および上限を、アッセイ内の％ＣＶおよび％バイアス≦３０％で測定できる最も低い（ＬＬＱ）および最も高い（ＵＬＱ）較正物質濃度（それぞれ）として定義した。
【０３４４】
妥当性確認試料の調製：低、中範囲、および高血清濃度のミオスタチンに対応する３組の妥当性確認試料を、それぞれ検量線の下端および中範囲の内在性ミオスタチン濃度を有する健康な対象からの血清試料を用いて調製した。高濃度の妥当性確認試料は、組換えミオスタチンタンパク質を添加した健康な対象からの血清試料であった。
【０３４５】
アッセイ内およびアッセイ間の不正確さ：アッセイ内およびアッセイ間のＣＶを、３個の妥当性確認試料（低、中、高）のそれぞれの６個の別々のアリコートで、５回の独立した分析の実行で測定した。ＱＣ分析の実行の許容範囲（合計アッセイばらつき平均＋／−２ＳＤ）は、３個のＱＣ試料のそれぞれの２３個の別々のアリコートにおいて、２５回の独立した分析の実行で測定したミオスタチン濃度から決定した。３個のＱＣ試料（ＱＣ−低、ＱＣ−中、およびＱＣ−高）のそれぞれの１つのアリコートを、試料のそれぞれの分析の実行で分析した。３個のＱＣ試料のうちの２個のミオスタチンの測定した濃度が確立された許容範囲内にあった場合に、分析の実行は許容された。
【０３４６】
他のアッセイ：血清全テストステロンレベルは、液体クロマトグラフィータンデム質量分光測定（ＬＣ−ＭＳＩ／ＭＳ）に対して以前に妥当性確認されている特異的ラジオイムノアッセイによって測定した。全Ｔアッセイのアッセイ内およびアッセイ間の変動係数はそれぞれ８．２％および１３．２％であった。平衡透析手順によって血清から分離した遊離Ｔは、０．２２ｐｇ／ｍｌの感度を有し、アッセイ内およびアッセイ間の変動係数がそれぞれ４．２％および１２．３％である高感度ラジオイムノアッセイによって測定した（Ｓｉｎｈａ−Ｈｉｋｉｍら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、１９９８、８３：１３１２〜８）。ラジオイムノアッセイおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法は、既知の量のＴを加えた、木炭ストリップ血清中で調製した試料を分析することによって比較した。これらの測定により、ラジオイムノアッセイおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定値の間に０．９９の相関が実証された。血清性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）レベルは、６．２５ｎｍｏｌ／Ｌの感度を有する免疫蛍光定量化アッセイによって測定した。体組成は、ベースラインおよび２０週目中、二重エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＥＷ、Ｈｏｌｏｇｉｃ  ４５００、マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）によって評価した。それぞれの測定の前に、体組成模型を使用して機器を較正した。
【０３４７】
統計的分析：すべての結果変数を、分布および分散の均一性について評価した。分散の均一性または正常な分布の仮定を満たさなかった変数はログ変換した。ＡＮＯＶＡを用いて、単一の時点での、若年対高齢の年齢によって階層化した用量グループにわたる差異を評価し、差異をＡＮＯＶＡによって同定した場合は、どのグループが顕著に異なっていたかを決定するためにシェフ（Ｓｈｅｆｆｅ）試験を用いた。ベースラインから治療へのグループ内の変化は、対応のあるｔ検定で評価した。統計的有意性を決定するためのαを０．０５に設定した。データは、図の凡例中で別段に指定しない限りは、ベースライン＋／−ＳＥＭからの平均＋／−ＳＥＭまたは平均％変化として表す。
【０３４８】
ミオスタチンアッセイの特徴：線形範囲：平均のアッセイ内およびアッセイ間の不正確さは、検量線中の１１個の較正物質（７３〜７５，０００ｐｇ／ｍＬ）のそれぞれについて６回の分析の実行から決定した（表７、以下）。７３ｐｇ／ｍＬの較正物質のアッセイ間ＣＶは３６．４％であり、これは許容される限界（＜３０％）を超えていた。したがって、アッセイのＬＬＱは次の較正物質点（１４７ｐｇ／ｍＬ）によって決定し、この点でのアッセイ間のＣＶおよび％バイアスはそれぞれ１９．７％および３．４％であった。また、７５，０００ｐｇ／ｍＬの較正物質のアッセイ間ＣＶ３２．４％も許容される限界（＜３０％）内になく、したがって、ＵＬＱは次に低い較正物質点（３７，５００ｐｇ／ｍＬ）に定義され、この点でのＣＶおよび％バイアスはそれぞれ３．６％および０．８％であった。アッセイの線形定量化的範囲は、生物学的に関連性のあるマトリックスにおいて１４３ｐｇ／ｍＬから３７，５００ｐｇ／ｍＬに広がる。
【０３４９】
【表７】
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【０３５０】
アッセイ内およびアッセイ間の不正確さ：５回の分析の実行における低、中、および高の妥当性確認試料の平均ミオスタチン濃度（ｐｇ／ｍＬ、＋／−ＳＤ）は、それぞれ３７３９＋／−１４６、７６１５＋／−１２５、および１８２６８＋／−９４８であった。低、中、および高の妥当性確認試料で測定されたアッセイ内ＣＶ（それぞれの妥当性確認試料についてｎ＝５）は、それぞれ４．１％、４．７％、および７．２％であり、アッセイ間ＣＶはそれぞれ３．９％、１．６％、および５．２％であった。
【０３５１】
アッセイの特異性：成熟ミオスタチンタンパク質は哺乳動物種間で高い度合の配列保存性を有し、ミオスタチンアッセイをマウス、ラット、イヌ、ウシ、およびサルを含めた多くの非ヒト試料で使用することが可能となる。ミオスタチン欠乏畜牛（ベルジアンブルー）およびミオスタチン遺伝子の不活性化の突然変異を有するマウス（ｍｓｔｎ  ＫＯ）からの血清試料を解離性の酸性条件下でアッセイし、同じ種の正常な動物と比較した（図２９Ａ）。血清ミオスタチンは正常なマウスで豊富である一方で（−１２０ｎｇ／ｍｌ）、正常なウシ血清の平均は約４０ｎｇ／ｍＬであった。対照的に、これらのミオスタチンヌル動物中の突然変異はタンパク質の合成を消滅させるため、ミオスタチンタンパク質は、ベルジアンブルー畜牛およびミオスタチンＫＯマウスのどちらからの血清でも検出不可能であり、ミオスタチンに対するアッセイの特異性が確認された。
【０３５２】
ヒト対象のベースライン特徴：６１人のランダム化された若年男性のうちの５２人および６０人のランダム化された高齢男性のうちの５１人が治療段階を完了した。ミオスタチンアッセイ用の十分な血清および体組成データが、２０週目まで５０人の若年男性および４８人の高齢男性で入手可能であり、これらの対象をこの二次分析に含め、そのベースライン特徴を以下の表８に示す。全体的な薬物コンプライアンス率は９９％を超えていた。
【０３５３】
ベースライン全テストステロン、遊離テストステロン、％遊離テストステロン、ＳＨＢＧ濃度は、若年または高齢のグループのどちらでも、ベースラインで５つの用量グループ間の差異がなかった。しかし、高齢男性は、若年男性よりも低い血清の全および遊離テストステロンおよび高いＳＨＢＧを有していた。体重、体重指数、および％体脂肪量は若年男性よりも高齢男性で高い一方で、身長はどちらでも同様であった。
【０３５４】
【表８】
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【０３５５】
若年および高齢の男性におけるミオスタチンレベル：血清ミオスタチンレベルはは、若年および高齢の男性のどちらでも正常の分布であった。若年男性は、高齢男性よりも有意に高いミオスタチンレベルを有していた（８．０＋／−０．３対７．０＋／−０．４ｎｇ／ｍＬ、Ｐ＝０．０３）（図３０Ａ）。血清ミオスタチンレベルは、若年または高齢の男性のどちらにおいても、ＤＥＸＡによって測定した除脂肪体重と有意に相関していなかった（図３０Ｂおよび３０Ｃ）。同様に、ベースラインでミオスタチンレベルと体重、体重指数、または血清テストステロンレベルとの間に有意な相関は存在しなかった（示さず）。
【０３５６】
男性におけるミオスタチンレベルに対するテストステロン投与の効果：ベースラインでの血清ミオスタチンレベルは、若年または高齢の男性のどちらにおいても、５つの用量グループにわたって有意な差異が存在しなかった。血清ミオスタチンレベルは、若年および高齢の男性のどちらにおいても、ベースラインと比較して５６日目で有意に高かった（図３１Ａ）。血清ミオスタチン濃度の変化は、若年または高齢の男性のどちらにおいても、５つの用量グループ間で有意な差異が存在しなかった。高齢男性は、若年男性よりも有意に高いミオスタチンレベルの％増加を経験した（図３１Ｂ）。テストステロン治療中のミオスタチンレベルの増加は持続しなかった。したがって、１４０日目の血清ミオスタチンレベルは、ベースラインとは有意な差異が存在しなかった。
【０３５７】
ベースラインを超えるミオスタチンレベルの増加量は、テストステロン濃度の変化に関連していた。ベースラインから５６日目のミオスタチンレベルの変化は、若年男性においては全（図３２Ａ）および遊離（図３２Ｃ）テストステロン濃度の変化と有意に正相関していたが、高齢男性ではそうではなかった（図３２Ｂおよび３２Ｄ）。以前に報告されているように、テストステロン治療は除脂肪体重の有意な増加に関連しており、以前に記載したように、除脂肪体重の変化はテストステロン用量およびテストステロン濃度と有意に相関していた。しかし、除脂肪体重の変化は、ミオスタチン濃度の絶対的または％変化（図３２Ｅおよび３２Ｆ）のどちらとも有意に相関していなかった。
【０３５８】
女性におけるミオスタチンレベル：別の研究で、１９〜２１歳の健康な月経期若年女性および６７〜８７歳の閉経後の女性の血清試料を、ＢｉｏＳｅｒｖｅ、メリーランド州Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅから購入した。これらの参加者は、ＩＲＢに承認されたＢｉｏｓｅｒｖｅ研究に参加することに同意していた。手術閉経女性は、１８〜５５歳であり、登録の少なくとも６カ月前に卵巣手術を受け、血清ＦＳＨ＞３０Ｕ／Ｌ、ＢＭＩ＜３５ｋｇ／ｍ２、過去１２カ月内に正常なＰＡＰスメアおよびマンモグラムを有し、ボストン大学ＩＲＢによって承認された書面のインフォームドコンセントを提出した。
【０３５９】
若年女性中の血清ミオスタチンレベルは、若年男性と有意な差異が存在しなかった（図３３）。月経期若年女性、手術閉経女性、および自然な閉経期の女性のミオスタチンレベルは、有意な差異が存在しなかった。
【受託番号】
【０３６０】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４７４１
ＡＴＣＣ  Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３
ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
0005756291.tif 000050
【図３２−１】
0005756291.tif 000051
【図３２−２】
0005756291.tif 000052
【図３２−３】
0005756291.tif 000053
【図３３】
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【配列表】
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