(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
欠損Ｉ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子を含む腫瘍細胞崩壊性のポックスウイルスを含み、ポックスウイルスが欠損Ｊ２Ｒ遺伝子を含み、かつポックスウイルスが自殺遺伝子を含む、癌を治療するための、医薬組成物。
【請求項２】
前記ポックスウイルスが、欠損Ｆ２Ｌ遺伝子を更に含んでなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ポックスウイルスが、チョルドポックスウイルス亜科に属するものである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルス種に属するものである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルス株コペンハーゲンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルス株ＷＲである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記自殺遺伝子が、少なくともシトシンデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記自殺遺伝子が、少なくともウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記自殺遺伝子が、ＦＣＹ１、ＦＣＡ１、もしくはＣｏｄＡである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
少なくともシトシンデアミナーゼ活性を有する前記タンパク質が、配列番号２に表されているＦＣＵ１−８ポリペプチドである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記自殺遺伝子が、少なくとも一つのシトシンデアミナーゼ活性と、一つのウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性とを有するタンパク質をコードするものである、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記自殺遺伝子が、配列番号３（ｃｏｄａ：：ｕｐｐ）、配列番号１（ＦＣＵ１）、またはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１のアミノ酸配列に表されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするものである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ポックスウイルスが、パーミアーゼをコードする遺伝子を含む核酸配列を更に含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
パーミアーゼが、Ｓ．セレビシエのプリンパーミアーゼまたはシトシンパーミアーゼである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
パーミアーゼが、ＦＣＹ２およびＦｕｒ４を含んでなる群から選択されるものである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ポックスウイルスが、前記自殺遺伝子の発現に必要な転写プロモーターを更に含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ポックスウイルスが、パーミアーゼの発現に必要な転写プロモーターを更に含んでなる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
薬学上許容される賦形剤を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
全身経路により投与されるものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
薬学上許容される量のプロドラッグがさらに投与され、該プロドラッグが、ガンシクロビル、ガンシクロビルエライジン酸エステル、ペンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン、ジドブジン、２’−エキソ−メタノカルバチミジン、５−フルオロシトシン、６−メチルプリンデオキシリボシド、フルダラビン、５−フルオロウラシル、およびアジドチミジンからなる群から選択されるものである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記プロドラッグが、前記ポックスウイルス投与の少なくとも３日後に投与されるものである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記プロドラッグが、前記ポックスウイルスの投与の７日後に投与されるものである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
腫瘍細胞崩壊性ウイルスとは、腫瘍依存性の自己永続という固有の性質を有する、癌の治療に用いられる新規な治療薬の一種である（HERMISTON. A demand for next-generation oncolytic adenoviruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.322-30.）。腫瘍細胞崩壊性ウイルスは、悪性細胞中において、選択的に複製が可能であり、従って従来の癌治療より潜在的にはるかに高いレベルの効力および特異性を提供する（FISHER. Striking out at disseminated metastases: the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.301-13.）。これらのウイルスを用いることにより、ウイルスが複製する際にウイルスの宿主細胞を溶解するとの利点を有する。癌細胞は、抗ウイルス性インターフェロン経路が不活性化されているか、またはウイルス複製が妨げられずに進行することを可能とする腫瘍抑制遺伝子の変異を有することから、多くのウイルスにとって理想的な宿主である（CHERNAJOVSKY, et al. Fighting cancer with oncolytic viruses. British medical journal 2006, vol.332, no.7534, p.170-2.）。
【０００２】
腫瘍細胞中での選択的複製が天然で可能なウイルスもあるが、天然に存在するウイルスを修飾することにより腫瘍細胞崩壊性ウイルスを得ることもできる。この目的のため、ウイルス修飾に現在使用されている主な戦略として、必須ウイルス遺伝子の機能欠失、これらのウイルス遺伝子の発現を制御するために使用される腫瘍または組織特異的プロモーター、およびアデノウイルスを癌細胞表面方向へ向けるための親和性修飾が挙げられる。近い将来、腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスは、重要な抗癌ツールとしての可能性を十分に実現させ、これにより悪性神経膠腫の患者の予後を向上させるために最適化される必要がある（JIANG, et al. Oncolytic adenoviruses as antiglioma agents. Expert review of anticancer therapy. 2006, vol.6, no.5, p.697-708.）。
【０００３】
例えば、ＯＮＹＸ−０１５、ｐ５３突然変異を内包する細胞中で選択的に複製しそれらの細胞を死滅させるように修飾されたアデノウイルスは、頭頸部腫瘍、胃腸腫瘍、および膵臓腫瘍を含む種々の固形腫瘍の治療可能性について、オニキスファーマシューティカルズ（Onyx Pharmaceuticals）社が開発中である。それはＥ１Ｂ遺伝子座の機能喪失突然変異を保持する組換えアデノウイルスであり、Ｅ１Ｂ遺伝子座の産物はｐ５３腫瘍抑制タンパク質に結合し、それを不活性化する５５ｋＤａタンパク質である。従って、ONYX−０１５アデノウイルスは、正常細胞には影響を及ぼさないと考えられる。ｐ５３癌抑制遺伝子の突然変異は、癌の中で最も一般的な種類の遺伝子異常であり、主な癌種、全ての過半数に生じている。従って、これらの細胞は、容易に複製し細胞死を引き起こす可能性があるウイルスに感受性である。ONYX−０１５は、再発性頭頸部癌の治療については第ＩＩＩ相試験が進行中であり、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、および口腔腫瘍については第ＩＩ相試験、ならびに消化器系疾患、食道腫瘍、および肝腫瘍については第Ｉ相試験にある（COHEN, et al. ONYX-015. Onyx Pharmaceuticals. Current opinion in investigational drugs. 2001, vol.2, no.12, p.1770-5.）。
【０００４】
天然腫瘍細胞崩壊性ウイルスは、腫瘍細胞に選択的に感染し死滅させる先天的な能力を有する複製可能なウイルスである。生きたウイルスを用いて癌を治療しようとした５０年前の当初の試みにおいて使用されたにも関わらず、癌治療剤としては遺伝子操作されたアデノウイルスおよびヘルペスウイルスが支持されているため、天然腫瘍細胞崩壊性ウイルスへの関心は高まっていない。しかしながら、最近、これらの天然に存在する作用剤の効力および選択性の高さに新たな関心が高まっている（ROBERTS, et al. Naturally oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.314-21.）。
【０００５】
天然腫瘍細胞崩壊性ウイルスの中でも、ワクシニアウイルス（ポックスウイルス科）は、腫瘍細胞崩壊性ウイルス療法での使用に理想的なウイルス骨格に要求される重要な属性を数多く有している。これらの属性には、ライフサイクルが短く急速に細胞間で蔓延すること、強力な細胞溶解能力、強力なクローニング能力、および分子生物学的に詳細に明らかにされていることが挙げられる。加えて、ワクシニアウイルスは、ヒト細胞中で複製可能であるが、自然発生的な健康障害とは見なされず、特に詳細に特徴づけられており、天然痘根絶キャンペーン中に何百万もの個人に配られた。ワクチン株または遺伝子改変ワクシニア株のいずれかを使用した初期の臨床結果は、抗腫瘍効果を実証している（THORNE, et al. Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cancer. Current opinion in molecular therapeutics. 2005, vol.7, no.4, p.359-65.）。
【０００６】
対照的に、ポックスウイルス粘液腫ウイルスは、ウサギ目（ウサギ）に対して明確で絶対的な宿主種親和性を有することから、ヒトにおける直接的な使用歴を有していない新規の腫瘍細胞崩壊性の候補である。粘液腫ウイルスは、ヒト腫瘍細胞にも選択的に感染し死滅させることができ、大多数のヒト癌に見出される細胞内シグナル伝達経路の調節異常と関係する固有の親和性を持つことが、最近になって示されてきた。この総説によれば、ヒト癌細胞に対する粘液腫ウイルスの親和性に関する既存の知識、ならびに癌の動物モデルの腫瘍に感染しそれを除去する粘液腫ウイルスの能力を示す前臨床データが概説されている（STANFORD, et al. Myxoma virus and oncolytic virotherapy: a new biologic weapon in the war against cancer. Expert opinion on biological therapy. 2007, vol.7, no.9, p.1415-25.）。
【０００７】
技術的問題
【０００８】
抗腫瘍効果を達成するためには、高用量のポックスウイルスを注射することが必要であり、毒性の問題が提起された。大多数の有害事象は軽症であり、ワクシニアウイルスに通常関係する有害反応は自己限定性であり、発熱、頭痛、疲労、筋痛、悪寒、局所的皮膚反応、非特異性発疹、多形性紅斑、リンパ節症、および予防接種部位の疼痛が挙げられる。他の反応は、追加的な治療（例えば、ＶＩＧ、一次治療、およびシドホビル(cidofovir)、二次治療）を必要とする場合がある。更なる評価または治療を必要とする可能性がある有害反応には、偶発性接種、汎発性種痘疹（ＧＶ）、種痘性湿疹（ＥＶ）、進行性痘疹（ＰＶ）、種痘後の中枢神経系疾患、および胎児ワクシニア症が挙げられる（CONO, et al. Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians. MMWR. Recommendations and reports: Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 2003, vol.52, no.RR-4, p.1-28.）。
【０００９】
従って、それらの天然の対応物と同等の腫瘍細胞崩壊活性を有する安全なポックスウイルスが希求されている。
【００１０】
背景技術
米国特許第５３６４７７３号（バイロジェネティクスコーポレーション（VIROGENETICS CORPORATION）社（トロイ、米国ニューヨーク州）１５／１１／１９９４には、修飾された組換えポックスウイルス、より詳細には組換えポックスウイルスが、病原性の弱毒化および安全性の増強を示すように、不活性化された、必須でないウイルスコード化コード遺伝子機能を有するワクシニアウイルスが記載されている。具体的には、病原性因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または病原性因子をコードするオープンリーディングフレームの挿入による不活化により、遺伝子機能が不活化される。より詳細には、この特許には、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌのオープンリーディングフレームが不活化されているワクシニアウイルスが記載されている。このウイルス（ＮＹＶＡＣ）は外来核酸用のベクターとして遺伝子操作することができ、宿主動物に免疫学的応答を誘導するためのワクチンとして使用することができる。しかしながら、ＮＹＶＡＣは、ほとんどの哺乳類細胞中において効率的に複製することができず、腫瘍細胞崩壊性ウイルスとして使用することができない（XIANGZHI, et al. Vaccinia virus K1L protein supports viral replication in human and rabbit cells through a cell-type-specific set of its ankyrin repeat residues that are distinct from its binding site for ACAP2. Journal of virology. 2006, vol.353, no.1, p.220-233.）。
【００１１】
国際公開第２００４／０１４３１４号（KIRN DAVID（米国））１９／０２／２００４においては、そのウイルスゲノムに一つまたは複数の突然変異を含んでなる、改変ワクシニアウイルスが記載されている。記載されている突然変異は、以下のクラスのポリペプチドの一つまたは複数に存在する：１）インターフェロン調節ポリペプチド、２）補体制御ポリペプチド、３）ＴＮＦまたはケモカイン調節ポリペプチド、４）セリンプロテアーゼ阻害剤、５）ＩＬ−Ｉｐ調節ポリペプチド、６）非感染性ＥＥＶ型ポリペプチド、および７）細胞からの伝染性ウイルスの放出を阻害するように作用するウイルス性ポリペプチド（抗伝染性ウイルス型ポリペプチド）。加えて、ワクシニアウイルスのＡ４１ＬまたはＣ１１Ｒにおける突然変異も開示されている。
【００１２】
より詳細には、Ａ３４Ｒ、Ａ４１Ｌ、Ａ５３Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｂ７Ｒ、Ｂ８Ｒ、Ｂ１３Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２８Ｒ、Ｂ２９Ｒ、ＣＵＲ、Ｅ３Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、ｖＣ１２Ｌ、およびｖＣＫＢＰ等のワクシニアゲノム領域が、この出願に記載されている。本発明の方法は、本明細書中で考察されているポックスウイルスのいずれかを使用することが含まれる。本発明者らは、有効量のこの改変ワクシニアウイルスを癌細胞または癌患者に投与することによって癌を治療する方法も開示する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、欠損Ｉ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子を含んでなるポックスウイルスは、安全性プロファイルを向上されるが、同等の腫瘍崩壊活性が維持される（それらの天然対応物と比較して）ことを見出した。
【００１４】
本発明は、欠損Ｉ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子を含み、但し前記ポックスウイルスがＮＹＶＡＣではないポックスウイルスに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ワクシニアウイルス感染ヒト結腸直腸腫瘍細胞（ＬｏＶｏ）の５−ＦＣに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性を示す図である。０．０００１ＭＯＩで表示ウイルスに感染させたＬｏＶｏ細胞（擬似（●）、ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１（黒四角）、またはＶＶＴＫ−Ｆ２Ｌ−／ＦＣＵ１（△））を種々の濃度の５−ＦＣに曝露させた。細胞生存を感染５日後に測定した。結果は、薬物の存在下または非存在下での細胞生存率のパーセンテージで表わされた。数値は、ウイルスの複製による細胞死以外の３回の個別測定の平均±ＳＤで表わされる。
【図２】ワクシニアウイルス感染ヒト結腸直腸腫瘍細胞（ＬｏＶｏ）の５−ＦＣに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性を示す図である。０．０００１ＭＯＩの表示ウイルスに感染させたＬｏＶｏ細胞（擬似（●）、ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１（黒四角）、またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１（◇））を、種々の濃度の５−ＦＣに曝露させた。細胞生存を感染５日後に測定した。結果は、薬物の存在下または非存在下での細胞生存率のパーセンテージにより表わされる。数値は、ウイルスの複製による細胞死以外の３回の個別測定の平均±ＳＤにより表わされる。
【図３】０．０００１ＭＯＩの表示ウイルスに感染させたＬｏＶｏにおける、感染後５日目のＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１およびＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製効率を示す図である。数値は、３回の個別測定の平均±ＳＤで表される。
【図４】０．０００１ＭＯＩの表示ウイルスに感染させたＬｏＶｏにおける、感染後５日目のＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製効率を示す図である。数値は、３回の個別測定の平均±ＳＤで表される。
【図５】ウイルスを静脈内注射した後のＳｗｉｓｓヌードマウスの皮下ＬｏＶｏの平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す図である。腫瘍（触知可能な腫瘍）を接種した７日後、１０７ｐｆｕの緩衝液＋生理食塩水（◇）、緩衝液＋５−ＦＣ（◆）、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋生理食塩水（△）、またはＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣ（▲）により、マウスを処置した。動物を、ウイルス注射７日後に、経口の胃管栄養法により１日２回で３週間、生理食塩水または１００ｍｇ／ｋｇ／ｊの５−ＦＣで処置した。腫瘍体積を週２回測定した。
【図６】ウイルスを静脈内注射した後のＳｗｉｓｓヌードマウスの皮下ＬｏＶｏの平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す図である。腫瘍（触知可能な腫瘍）を接種した７日後、１０７ｐｆｕの緩衝液＋生理食塩水（◇）、緩衝液＋５−ＦＣ（◆）、ＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋生理食塩水（□）、またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣ（黒四角）により、マウスを処置した。動物を、ウイルス注射７日後に、経口の胃管栄養法により１日２回で３週間、生理食塩水または１００ｍｇ／ｋｇ／ｊの５−ＦＣで処置した。腫瘍体積を週２回測定した。
【図７】ウイルスを静脈内注射した後のＳｗｉｓｓヌードマウスの皮下ＬｏＶｏの平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す図である。腫瘍（触知可能な腫瘍）を接種した１１日後に、緩衝液＋Ｈ２Ｏ（◇）、または緩衝液＋５−ＦＣ（◆）、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋Ｈ２Ｏ（○）の１回の注射、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣの１回の注射（５−ＦＣはウイルス注射の７日後および３週間の間投与された）（●）、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋Ｈ２Ｏの２回の注射（□）（１１日目および３３日目）、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣの２回の注射（１１日目および３３日目）（５−ＦＣは１８日目から３２日目まで、および４０日目から５４日目まで投与された）（黒四角）で、マウスを処置した。動物を、１００ｍｇ／ｋｇの５−ＦＣで１日２回、経口の胃管栄養法により処置した。腫瘍体積を週２回測定した。
【図８】ウイルスを静脈内注射した後のＳｗｉｓｓヌードマウスの皮下Ｕ８７−ＭＧ（神経膠芽腫腫瘍細胞）の平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す図である。腫瘍（触知可能な腫瘍）を接種した１１日後に、緩衝液＋Ｈ２Ｏ（◇）、緩衝液＋５−ＦＣ（◆）、１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋Ｈ２Ｏ（○）、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣ（●）により、マウスを処置した。動物を、ウイルス注射７日後に、経口の胃管栄養法により１日２回で３週間、１００ｍｇ／ｋｇの５−ＦＣで処置した。腫瘍体積を週２回測定した。
【図９】コンフルエント細胞でのウイルス収量に対する、分裂細胞でのウイルス収量の比率を示す図である。ＰＡＮＣ１（膵臓ヒト腫瘍）、Ｈ１２９９（肺ヒト腫瘍）、またはＵ１１８ＭＧ（神経膠腫ヒト腫瘍）細胞を、１００ｐｆｕの（黒四角）ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１、または（□）ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１に感染させる。感染４８時間後に、ウイルス力価を決定した。数値は、コンフルエント細胞でのウイルス収量に対する、分裂細胞でのウイルス収量の比率である。
【図１０】コンフルエント細胞でのウイルス収量に対する、分裂細胞でのウイルス収量の比率を示す図である。ＰＡＮＣ１（膵臓ヒト腫瘍）、Ｈ１２９９（肺ヒト腫瘍）、またはＵ１１８ＭＧ（神経膠腫ヒト腫瘍）細胞を、１００ｐｆｕの（黒四角）ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１または（□）ＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１に感染させる。感染４８時間後に、ウイルス力価を決定した。数値は、コンフルエント細胞でのウイルス収量に対する、分裂細胞でのウイルス収量の比率である。
【図１１】皮下ヒト腫瘍を保持するＳｗｉｓｓヌードマウスに１×１０６ＰＦＵのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１（黒四角）またはＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１（□）を静脈内感染させた後の６日目および２１日目の器官または腫瘍におけるウイルス力価（組織１ｍｇ当たりのｐｆｕ）を示す図である。
【図１２】皮下ヒト腫瘍を保持するＳｗｉｓｓヌードマウスに１×１０６ＰＦＵのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１（黒四角）またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１（□）を静脈内感染させた後の６日目および２１日目の器官または腫瘍におけるウイルス力価（組織１ｍｇ当たりのｐｆｕ）を示す図である。
【図１３】静脈内注射による１×１０８ｐｆｕのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１（黒四角）またはＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１（○）処置後のＳｗｉｓｓヌードマウスの生存率を示す図である。
【図１４】静脈注射による１×１０７ｐｆｕ（Ａ）または１×１０８ｐｆｕ（Ｂ）のＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１（黒四角）またはＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１（◇）処置後の免疫応答性Ｂ６Ｄ２マウスの生存率を示す図である。
【図１５】Ｓｗｉｓｓヌードマウスに１×１０６ｐｆｕのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１を静脈内注射した後の、感染後１３日目および感染後３４日目における尾部の痘疹の平均量を示す図である。
【図１６】Ｓｗｉｓｓヌードマウスに１×１０６ｐｆｕのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１を静脈注射した後の、感染後１３日目および感染後３４日目における尾部の痘疹の平均量を示す図である。
【図１７】Ｓｗｉｓｓヌードマウスに１×１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１を静脈内注射した後の、感染後１５日目および感染後３１日目における尾部の痘疹の平均量を示す図である。
【図１８】Ｓｗｉｓｓヌードマウスに１×１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１を静脈内注射した後の、感染後１５日目および感染後３１日目における尾部の痘疹の平均量を示す図である。
【発明の具体的説明】
【００１６】
本出願の全体にわたって使用される場合、「一つの（a）」および「一つの（an）」という用語は、文脈がそうでないと明白に要求しない限り、参照されている成分または工程の「少なくとも一つの」、「少なくとも第１の」、「一つまたは複数の」、または「複数の」を意味するという意味で使用される。例えば、「細胞（a cell）」という用語には、その混合物を含む複数の細胞が包含される。
【００１７】
「および／または」という用語には、本明細書中のどこで使用されようとも、「および」、「または」、および「前記用語により接続される要素の全てまたは任意の他の組合せ」という意味が包含される。
【００１８】
「約」または「およそ」という用語は、本明細書中で使用される場合、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、およびより好ましくは５％以内を意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「含んでなる（comprising）」および「含んでなる（comprise）」という用語は、産物、組成物、および方法が、参照されている成分または工程を含むが、他を除外しないことを意味する。産物、組成物、および方法を定義するために使用される場合の「本質的にからなる」は、任意の本質的な意義を持つ他の成分または工程を除外することを意味する。従って、列挙された成分から本質的になる組成物は、微量染物質および薬学上許容される担体を除外しない。「からなる」は、他の成分または工程の微量を超える要素を除外することを意味する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「欠損遺伝子を含んでなるポックスウイルス」という用語は、欠損遺伝子の一つまたは複数の核酸の欠失、置換、もしくは付加、またはそれらの可能性の任意の組合せを含んでなるポックスウイルスを指し、前記修飾は、未修飾遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を有するタンパク質を、ウイルスが産生できなくなることに結びつく。本発明の好ましい実施形態では、欠損遺伝子を含むポックスウイルスは、遺伝子配列全体が欠失したポックスウイルスを示す。突然変異は、組換え技術を使用して、当業者に公知である数多くの方法で作製することができる。ポックスウイルスのゲノムを修飾するための方法は、当技術分野で利用可能である。例えば、MCCART, et al. Systemic cancer therapy with a tumor selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.. Cancer res.. 2001, no.61, p.8751-57、KIM, et al. Systemic armed oncolytic ans immunologic therapy for cancer with JX-594, a targeted poxvirus expressing GM-CSF. Molecular Therapeutic. 2006, no.14, p.361-70、国際公開第２００４／０１４３１４号（KIRN DAVID（米国））１９／０２／２００４および米国特許第５３６４７７３号(バイロジェネティクスコーポレーション社（トロイ、米国ニューヨーク州）)１５／１１／１９９４で開示された方法を用いて、本発明のポックスウイルスを産生することができる。本出願の例で開示されている方法は、特に本発明によるポックスウイルスを産生することに関する。種々のポックスウイルスのゲノム配列は、当技術分野において入手可能であり、例えば、ワクシニアウイルスゲノム、牛痘ウイルスゲノム、カナリア痘ウイルスゲノム、エクトロメリアウイルスゲノム、粘液腫ウイルスゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて入手可能である（受入番号は、それぞれＮＣ＿００６９９８、ＮＣ＿００３６６３、ＮＣ＿００５３０９、ＮＣ＿００４１０５、ＮＣ＿００１１３２である）。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「ポックスウイルス」という用語は、ポックスウイルス科に属するウイルスを指す。好ましい実施形態によると、本発明によるポックスウイルスは、チョルドポックスウイルス亜科(Chordopoxvirinae)に属し、より好ましくはオルソポックスウイルス属に属し、更により好ましくはワクシニアウイルス種に属する。
【００２２】
例えば、ワクシニアウイルス株ダイレンＩ（Dairen I）、ＩＨＤ−Ｊ、Ｌ−ＩＰＶ、ＬＣ１６Ｍ８、ＬＣ１６ＭＯ、リステリア（Lister）、ＬＩＶＰ、タシケント（Tashkent）、ＷＲ６５−１６、ワイス（Wyeth）、アンカラ（Ankara）、コペンハーゲン（Copenhagen）、チアンタン（Tian Tan）、およびＷＲを使用することができる。特に好ましい実施形態によると、本発明によるポックスウイルスは、ワクシニアウイルス株コペンハーゲンである。
【００２３】
ポックスウイルスワクシニアは、大型二重鎖ＤＮＡゲノム（１８７キロベース対）を含有しており、感染細胞の細胞質中で複製するＤＮＡウイルスの唯一知られているファミリーのメンバーである。感染細胞は大量のＤＮＡ前駆体を細胞質内複製部位に送達しなければならないため、ウイルスは、リボヌクレオチドレダクターゼおよびデオキシウリジン５’−三リン酸ヌクレオチドヒドロラーゼ（ｄＵＴＰａｓｅ）を含む、ＤＮＡ代謝および合成に必要な数多くの酵素活性をコードおよび発現する。
【００２４】
リボヌクレオチドレダクターゼ（ＥＣ１．１７．４．１）は、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元、ＤＮＡ生合成の最初に関与する工程に相当する反応を触媒する。ウイルス酵素は、サブユニット構造が哺乳類酵素に類似しており、Ｒ１およびＲ２と称される二つの非相同性サブユニットから構成される。ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットをコードする遺伝子は、ワクシニアゲノム上で３５キロベース離れた位置に並んでおり局在化している（SLABAUGH, et al. . Journal of virology. 1988, vol.62, p.519-27.、TENGELSEN, et al. . Virology. 1988, no.164, p.121 -31.、SCHMITT, et al. . Journal of virology. 1988, no.62, p.1889-97.）。ワクシニアウイルス大型サブユニットの単量体（Ｒ１と称され、Ｉ４Ｌ遺伝子によってコードされている）は、８６ｋＤａのポリペプチドであり、ヌクレオチド基質であるアロステリックエフェクターの結合部位を含有している（SLABAUGH, et al. . Journal of virology. 1984, no.52, p.507-14.、SLABAUGH, et al. . Journal of virology. 1984, no.52, p.501 -6.）。小型サブユニット（Ｒ２と称され、Ｆ４Ｌ遺伝子によってコードされている）は、二つの３７ｋＤａポリペプチドを含んでなるホモ二量体であり、各ポリペプチドは、触媒作用に必要な鉄安定化タンパク質に基づくフリーラジカルを含有している（HOWELL, et al. . Journal of Biological Chemistry. 1992, no.267, p.1705-11.）。Ｉ４ＬおよびＦ４Ｌ遺伝子の配列、ならびに種々のポックスウイルスのゲノムにおけるそれらの位置は、例えば、受入番号ＤＱ４３７５９４、ＤＱ４３７５９３、ＤＱ３７７８０４、ＡＨ０１５６３５、ＡＹ３１３８４７、ＡＹ３１３８４８、ＮＣ＿００３３９１、ＮＣ＿００３３８９、ＮＣ＿００３３１０、Ｍ３５０２７、ＡＹ２４３３１２、ＤＱ０１１１５７、ＤＱ０１１１５６、ＤＱ０１１１５５、ＤＱ０１１１５４、ＤＱ０１１１５３、Ｙ１６７８０、Ｘ７１９８２、ＡＦ４３８１６５、Ｕ６０３１５、ＡＦ４１０１５３、ＡＦ３８０１３８、Ｕ８６９１６、Ｌ２２５７９、ＮＣ＿００６９９８、ＤＱ１２１３９４、およびＮＣ＿００８２９１により、公開データベースで入手可能である。
【００２５】
本明細書中に使用されている遺伝子命名法は、コペンハーゲンワクシニア株に用いられ、特に限定されない限り、他のポックスウイルス科の相同性遺伝子にも用いられる。しかしながら、遺伝子命名法は、ポックス株によって異なっている場合もある。ちなみに、コペンハーゲン遺伝子と、ＭＶＡ遺伝子との対応関係は、ANTOINE. . Virology. 1998, no.244, p.365-396の表Ｉに見出すことができる。
【００２６】
好ましい実施形態によると、本発明のポックスウイルスは、欠損Ｊ２Ｒ遺伝子を更に含んでなる。
【００２７】
Ｊ２Ｒ遺伝子は、ピリミジンデオキシリボヌクレオチド合成の再利用経路の一部を形成するチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする。ＴＫによって触媒される反応は、γ−ホスホリル部分をＡＴＰから２’デオキシ−チミジン（ｄＴｈｄ）へと転移させて、チミジン５’一リン酸（ｄＴＭＰ）を産生することに関与する。ワクシニアウイルスＴＫは２型である。２型ＴＫは、１型と比較してより小さなポリペプチド鎖を有しており、約２５ＫＤａであるが、ホモ四量体を形成する。それらは、代謝経路の最後に産生されるフィードバック阻害剤ｄＴＤＰまたはｄＴＴＰに感受性がある。２型ＴＫは、１型ＴＫと比較してはるかに狭い基質特異性を有し、２’デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはｄＴｈｄのみをリン酸化する（EL OMARI, et al. Structure of vaccinia virus thymidine kinase in complex with dTTP: insights for drug design. BMC structural biology. 2006, no.6, p.22.）。
【００２８】
Ｊ２Ｒ領域を欠損するポックスウイルス、およびそれらを取得する方法は、当技術分野で利用可能である。例えば、MCCART, et al. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. cancer research. 2001, vol.61, no.24, p.8751-7、PUHLMANN, et al. Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant. Cancer gene therapy. 2000, vol.7, no.1, p.66-73、GNANT, et al. Systemic administration of a recombinant vaccinia virus expressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with 5-fluorocytosine leads to tumor-specific gene expression and prolongation of survival in mice. Cancer Research. 1999, vol.59, no.14, p.3396-403の教示に従って、Ｊ２Ｒ領域を欠失するポックスウイルスを産生することができる。
【００２９】
好ましい実施形態によると、本発明のポックスウイルスは、欠損Ｆ２Ｌ遺伝子を更に含んでなる。
【００３０】
デオキシウリジン５’−三リン酸ヌクレオチドヒドロラーゼ（ｄＵＴＰａｓｅ、ＥＣ３．６．１．２３）は、Ｍｇ（２＋）イオンの存在下で、ｄＵＴＰの、ｄＵＭＰおよびピロリン酸への加水分解を触媒する。ｄＮＴＰ貯留からｄＵＴＰを除去しｄＵＭＰを生成するｄＵＴＰａｓｅは、ＤＮＡ複製の正確性の維持、およびチミジル酸シンターゼによりＴＭＰを産生するための前駆体の提供の両方に関与している。ワクシニアｄＵＴＰａｓｅは、Ｆ２Ｌ遺伝子によってコードされた１５ｋＤａのタンパク質である（MCGEOGH. . Nucleic Acids Research. 1990, no.18, p.4105-10.、BROYLES. . Virology. 1993, no.195, p.863-5.）。ワクシニアウイルスのＦ２Ｌ遺伝子の配列は、受入番号Ｍ２５３９２によりｇｅｎｂａｎｋで入手可能であり、種々のポックスウイルスゲノムにおけるＦ２Ｌ遺伝子の配列および位置も、例えば、受入番号ＮＣ＿００６９９８、ＤＱ１２１３９４、ＮＣ＿００１６１１、ＡＹ６８９４３６、ＡＹ６８９４３７、ＮＣ＿００８２９１、ＤＱ４３７５９４、ＤＱ４３７５９３、ＡＹ３１３８４７、ＡＹ３１３８４８、ＮＣ＿００６９６６、ＮＣ＿００５３０９、ＮＣ＿００３３９１、ＮＣ＿００３３８９、ＮＣ＿００１１３２、ＮＣ＿００３３１０、ＮＣ＿００２１８８、Ｍ３５０２７、ＡＹ２４３３１２、ＡＦ１７０７２６、ＤＱ０１１１５７、ＤＱ０１１１５６、ＤＱ０１１１５５、ＤＱ０１１１５４、ＤＱ０１１１５３、Ｘ９４３５５、Ｙ１６７８０、ＡＹ３１８８７１、Ｕ９４８４８、ＡＦ１９８１００、およびＭ３４３６８により、ｇｅｎｂａｎｋにおいて入手可能である。
【００３１】
好ましい実施形態によると、本発明によるポックスウイルスは、目的の核酸を更に含んでなる。
【００３２】
好ましい実施形態においては、目的の核酸は、治療用分子（つまり治療用遺伝子）である遺伝子産物をコードする少なくとも一つの目的の配列を含有する。「治療用分子」とは、患者に、特に疾患または疾病状態に苦しんでいる患者、またはこの疾患もしくは状態から保護すべき患者に適切に投与されると、薬理学的または保護的活性を示すものである。そのような薬理学的または保護的活性とは、前記疾患または前記状態の経過または症状に対する有益な効果に関連すると期待されるものである。当業者が本発明の過程で治療用分子をコードする遺伝子を選択する場合、一般的に、当業者であれば、以前に得られた結果を自らの選択と関連づけ、特許請求の範囲にあるように本発明を実行する以外の過度の実験をすることなく、そのような薬理学的性質を取得することが合理的に期待できる。本発明によると、目的の配列は、それが導入される標的細胞に相同的であってもよくまたは非相同的であってもよい。有利には、前記目的の配列は、ポリペプチド、特に治療的または予防的特性を与える治療用または予防用ポリペプチドの全てまたは一部をコードする。ポリペプチドは、大きさに関わらず、およびグリコシル化されているかどうかに関わらず、ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物であると理解され、ペプチドおよびタンパク質を包含する。治療用ポリペプチドには、主な例として、動物またはヒト生体の欠損または欠乏タンパク質を補完することができるそれらのポリペプチド、または毒性効果により作用して有害細胞を制限もしくは体内から除去するものが挙げられる。それらは、内因性抗原として作用して体液性もしくは細胞性応答またはその両方を誘発する免疫付与ポリペプチドであってもよい。
【００３３】
治療用遺伝子によってコードされたポリペプチドの例としては、サイトカイン（アルファ、ベータ、またはガンマインターフェロン、インターロイキン、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ．．．）、免疫賦活性ポリペプチド（Ｂ７．１、およびＢ７．２等）、凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ．．．）、増殖因子（形質転換増殖因子ＴＧＦ、および線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ等）、酵素（ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、一酸化窒素合成酵素ＮＯＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ．．．）、酵素阻害剤（アルファ１アンチトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤ＰＡＩ−１）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子）タンパク質、インスリン、ジストロフィン、クラスＩまたはＩＩのＭＨＣ抗原、細胞遺伝子の発現を調節／制御することができるポリペプチド、細菌性、寄生虫性、もしくはウイルス性感染またはその発症を阻害することが可能なポリペプチド（抗原性ポリペプチド、抗原性エピトープ、競合によって天然タンパク質の作用を阻害するトランスドミナント変異体）、アポトーシス誘発因子または阻害剤（Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸ．．．）、細胞増殖抑制剤（ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ．．．）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ．．．）、血管新生の阻害剤（アンギオスタチン、エンドスタチン．．．）、血管新生ポリペプチド（血管内皮増殖因子ＶＥＧＦのファミリー、ＦＧＦファミリー、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６ｌ、およびＮｏｖを含むＣＣＮファミリー）、酸素ラジカル捕捉剤、抗腫瘍効果を有するポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、およびマーカー（ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ．．．）をコードする遺伝子、または当技術分野で臨床状態の治療もしくは予防に有用であると認められる任意の他の目的遺伝子が挙げられる。
【００３４】
好適な抗腫瘍遺伝子には、それらに限定されないが、腫瘍抑制遺伝子（例えば、Ｒｂ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ウィルムス腫瘍、ＮＭ２３、ＢＲＵＳＨ−１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ５６、ｐ７３、ならびにそれらのそれぞれの突然変異）、自殺遺伝子産物、抗体、細胞分裂、または伝達シグナルを阻害するポリペプチドをコードするものが挙げられる。
【００３５】
特に好ましい実施形態によると、本発明のポックスウイルスは、自殺遺伝子を更に含んでなる。
【００３６】
自殺遺伝子とは、薬物の前駆体を細胞毒性化合物に変換することができるタンパク質をコードする遺伝子を指す。
【００３７】
自殺遺伝子は、これらに限定されないが、シトシンデアミナーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性、および／またはチミジル酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる。
【００３８】
自殺遺伝子、および対応する一つの核酸塩基部分を含んでなる薬物の前駆体の例を以下の表に開示する。
【００３９】
【表１】
0005710261.tif 000002
【００４０】
本発明の好ましい実施形態によると、自殺遺伝子は、少なくともＣＤａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするものである。ＣＤａｓｅは、外来性シトシンが加水分解性脱アミノ化によってウラシルに変換されるピリミジン代謝経路に関与する。ＣＤａｓｅ活性は、原核生物および下等真核生物で実証されている一方で（JUND, et al. . Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15.、BECK, et al. . Journal of Bacteriology. 1972, no.110, p.219-28.、HOEPRICH, et al. . Journal of Infectious Diseases. 1974, no.130, p.112-18.、ESDERS, et al. . J. biol. chem.. 1985, no.260, p.3915-22.）、哺乳類には存在しない（KOECHLIN, et al. . Biochemical pharmacology. 1966, no.15, p.435-46.、POLAK, et al. . Chemotherapy. 1976, no.22, p.137-53.）。
【００４１】
また、ＣＤａｓｅは、シトシンの類似体、つまり５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を脱アミノ化し、それにより、５−フルオロ−ＵＭＰ（５−ＦＵＭＰ）に変換されると、細胞毒性が高い化合物である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を形成する。酵素をコードする遺伝子を不活性化する突然変異のためか、この酵素が天然で欠乏しているためかのいずれかにより、哺乳類細胞のようにＣＤａｓｅ活性を欠く細胞は、５−ＦＣに耐性である（JUND, et al. . Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15.、KILLSTRUP, et al. . Journal of Bacteriology. 1989, no.171, p.2124-2127.）。対照的に、ＣＤａｓｅ活性をコードする配列が移入された哺乳類細胞は、５−ＦＣに感受性となる（HUBER, et al. . Cancer Research. 1993, no.53, p.4619-4626.、MULLEN, et al. . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, no.89, p.33-37.、国際公開第９３／０１２８１号（ＵＳヘルス（US HEALTH）社）。加えて、近隣の未形質転換細胞も、５−ＦＣに感受性になる（HUBER, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, no.91, p.8302-6.）。傍観者効果と名づけられているこの現象は、５−ＦＵを分泌するＣＤａｓｅ活性を発現している細胞が原因であり、その後単純な拡散により原形質膜を越えて近隣細胞を毒性化する。受動的拡散という５−ＦＵのこの特性は、ｔｋを発現している細胞とそこで接触することが傍観者効果に必要であるｔｋ／ＧＣＶ参照系と比較して利点を表す（MESNIL, et al. . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996, no.93, p.1831-35.）。従って、遺伝子治療、特に抗癌遺伝子治療との関連でＣＤａｓｅが提供する利点は全て、容易に理解することができる。
【００４２】
これらの二つの生物のＣＤａｓｅをそれぞれコードするサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（Ｓ．セレビシエ）ＦＣＹ１、カンジダ・アルビカンス（Candida Albicans）ＦＣＡ１、および大腸菌（E. coli）ｃｏｄＡの遺伝子は、公知であり、それらの配列は公開されている（それぞれ、配列番号４、配列番号５、配列番号６）。
【００４３】
この点で、本発明のより好ましい実施形態によると、ＣＤａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ＦＣＹ１、ＦＣＡ１、もしくはｃｏｄＡ、またはそれらの類似体である。これらの遺伝子の類似体とは、親遺伝子の核酸配列と７０％を超える、有利には８０％を超える、好ましくは９０％を超える、および最も好ましくは９５％を超える同一性の程度を少なくとも示す核酸配列を有する遺伝子を表す。
【００４４】
特許国際公開第２００５／００７８５７号においては、ＣＤａｓｅ活性が向上したタンパク質をコードする遺伝子が開示されている。このポリペプチドは、アミノ酸配列の付加によって天然ＣＤａｓｅから誘導された。本発明の別の好ましい実施形態によると、ＣＤａｓｅ活性を有するタンパク質は、国際公開第２００５／００７８５７号において開示されているポリペプチドであり、より好ましくは配列番号２に表されているＦＣＵ１−８ポリペプチドおよびその類似体である。
【００４５】
原核生物および下等真核生物においては、ウラシルは、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）の作用によってＵＭＰに変換される。この酵素は、５−ＦＵを５−ＦＵＭＰに変換する。本発明の別の好ましい実施形態によると、自殺遺伝子は、ＵＰＲＴａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする。
【００４６】
問題のＵＰＲＴａｓｅは、由来が任意であってよく、特に原核生物、真菌、または酵母由来であってもよい。実例として、大腸菌（ANDERSEN, et al. Characterization of the upp gene encoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12. European Journal of Biochemistry. 1992, no.204, p.51-56.）ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（MARTINUSSEN, et al. Cloning and characterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Lactococcus lactis. Journal of Bacteriology. 1994, vol.176, no.21, p.6457-63.）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）（KIM, et al. Complete sequence of the UPP gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Mycobacterium bovis BCG. Biochemistry and molecular biology international. 1997, vol.41, no.6, p.1117-24.）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）（MARTINUSSEN, et al. Two genes encoding uracil phosphoribosyltransferase are present in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 1995, vol.177, no.1, p.271-4.）に由来するＵＰＲＴａｓｅをコードする核酸配列を、本発明との関連で用いることができる。しかしながら、酵母ＵＰＲＴａｓｅを使用することが特に最も好ましく、特に、その配列がKERN, et al. The FUR1 gene of Sacc
haromyces cerevisiae: cloning, structure and expression of wild-type and mutant alleles. Gene. 1990, vol.88, no.2, p.149-57に開示されているＳ．セレビシエＦＵＲ１遺伝子によってコードされているものは、引用することにより本明細書の開示の範囲とされる。参考として、遺伝子の配列および対応するＵＰＲＴａｓｅの配列は、文献および専門データバンク（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｂａｎｋ、およびＭｅｄｌｉｎｅ等）に見出すことができる。
【００４７】
欧州特許出願公開第０９９８５６８Ａ号においては、Ｎ末端位置の最初の３５残基が欠失し、天然タンパク質では３６位のメチオニンから始まるＵＰＲＴａｓｅの合成を可能にする、コード部分の５’にある１０５個のヌクレオチドを欠如するＦＵＲ１遺伝子について記載されている。ＦＵＲ１Δ１０５と呼ばれる突然変異遺伝子の発現産物は、Ｓ．セレビシエのｆｕｒ１突然変異体を補完することが可能である。加えて、欠失変異体(truncated mutant)は、天然酵素の活性より高いＵＰＲＴａｓｅ活性を示す。従って、本発明の特に有利な実施形態によると、自殺遺伝子は、天然ＵＰＲＴａｓｅの欠失変異体をコードする。欠失は、好ましくは元々のＵＰＲＴａｓｅのＮ末端領域に位置する。欠失は、完全であってもよく（前記Ｎ末端領域の全残基が影響を受ける）、または部分的であってもよい（一次構造の一つまたは複数の連続または不連続残基が影響を受ける）。一般的に、ポリペプチドは、Ｎ末端部分、中央部分、およびＣ末端部分からなり、各々は分子の約３分の１に相当する。例えば、Ｓ．セレビシエＵＰＲＴａｓｅは２５１個のアミノ酸を有し、そのＮ末端部分は、天然型の第１位に位置するいわゆる開始メチオニンから始まる最初の８３残基からなる。大腸菌ＵＰＲＴａｓｅの場合、そのＮ末端部分は１から６９位を包含する。
【００４８】
ＵＰＲＴａｓｅ活性を有する好ましいタンパク質は、欧州特許出願公開第０９９８５６８Ａ号の配列番号１に表されるアミノ酸配列を実質的に含んでなり、１位のＭｅｔ残基から始まり、２１６位のＶａｌ残基で終わる。「実質的に」という用語は、欧州特許出願公開第０９９８５６８Ａ号に記載の前記配列番号１と、７０％を超える、有利には８０％を超える、好ましくは９０％を超える、および最も好ましくは９５％を超える同一性の程度を示す。更により好ましくは、それは、欧州特許出願公開第０９９８５６８Ａ号の配列番号１に表されているアミノ酸配列を含んでなる。上記で言及したように、それは追加的な突然変異を含んでなっていてもよい。２位のセリン残基（天然ＵＰＲＴａｓｅでは３７位）のアラニン残基による置換に、特に言及することができる。
【００４９】
本発明の別の好ましい実施形態によれは、自殺遺伝子は、少なくとも一つのＣＤａｓｅ活性と、一つのＵＰＲＴａｓｅ活性を有するタンパク質とをコードする。特許出願国際公開第９６／１６１８３号および欧州特許出願公開第０９９８５６８Ａ号においては、ＣＤａｓｅ活性およびＵＰＲＴａｓｅ活性を有する二つのドメインを有する酵素をコードする融合タンパク質の使用が記載されており、発現プラスミドにより保持されたハイブリッド遺伝子ｃｏｄＡ：：ｕｐｐまたはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１またはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１Δ１０５（つまりＦＣＵ１）の移入が、形質移入されたＢ１６細胞の５−ＦＣに対する感受性を増加させることを実証している。本発明のより好ましい実施形態によると、自殺遺伝子は、配列番号３（ｃｏｄａ：：ｕｐｐ）、配列番号１（ＦＣＵ１）、またはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１に表されるアミノ酸配列を実質的に含んでなるポリペプチドをコードする。「実質的に」という用語は、前記配列と、７０％を超える、有利には８０％を超える、好ましくは９０％を超える、および最も好ましくは９５％を超える同一性の程度を指す。更により好ましくは、それは、配列番号３（ｃｏｄａ：：ｕｐｐ）、配列番号１（ＦＣＵ１）、またはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１に表されるアミノ酸配列を含んでなる。上記で言及したように、それは追加的な突然変異を含んでいてもよい。
【００５０】
核酸配列は、クローニングによって、ＰＣＲによって、または用いられている従来技術による化学合成によって容易に取得することができる。それらは、天然の遺伝子であってもよく、或いは一つもしくは複数のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換、および／または付加によって後者から誘導される遺伝子であってもよい。更に、それらの配列は、当業者であれば調べることができる文献に広く記載される。
【００５１】
当業者であれば、公開されたデータからＣＤａｓｅ配列またはＵＰＲＴａｓｅ配列をクローニングすること、考え得る突然変異を実行すること、従来技術によりまたは欧州特許出願公開第０９９８５６８Ａ号に示されているプロトコールに基づき、無細胞または細胞系において突然変異型の酵素活性を試験すること、ならびにＣＤａｓｅ活性およびＵＰＲＴａｓｅ活性を有するポリペプチドおよび結果的には対応する遺伝子の全てまたは一部を、特にインフェーズで融合することが可能である。
【００５２】
より好ましい実施形態によると、本発明のポックスウイルスは、パーミアーゼをコードする遺伝子を含む核酸配列を更に含んでなる。
【００５３】
パーミアーゼとは、一つの核酸塩基部分を含んでなる薬物またはその前駆体の、細胞膜を通した移動に関与する膜貫通型タンパク質を指す。
【００５４】
パーミアーゼは、これらに限定されないが、プリンパーミアーゼ、シトシンパーミアーゼ、およびヌクレオシド輸送体を含んでなる。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態によれば、パーミアーゼは、Ｓ．セレビシエのプリンパーミアーゼまたはシトシンパーミアーゼである。Ｓ．セレビシエの核酸塩基輸送体は、ＦＣＹ２として知られているプリン−シトシンパーミアーゼ、およびＦＵＲ４として知られているウラシルパーミアーゼからなる。プリン−シトシンパーミアーゼ、ＦＣＹ２は、酵母原形質膜を横切るプロトンおよびアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、およびシトシンの共輸送を媒介する（Grenson 1969、Jund and Lacroute 1970、Polak and Grenson 1973、Chevallier et al. 1975、Hopkins et al. 1988）。ＦＣＹ２タンパク質は、５−フルオロシトシン、シトシンの類似体の輸送も媒介する（Grenson 1969、Jund and Lacroute 1970）。ＦＣＹ２遺伝子は、１０〜１２個の膜貫通ドメイン（Weber et al. 1990）を有すると当初は予測され、今では９個であることが支持されている５３３個のアミノ酸（５８ｋＤａ）のタンパク質をコードする（Ferreira et al. 1999）。ＦＣＹ２は、プリン核酸塩基およびシトシンに対して同様の親和性を示す（Brethes et al. 1992）。ウラシルのＳ．セレビシエへの取り込みは、ウラシルパーミアーゼ、ＦＵＲ４によって媒介される（Jund and Lacroute 1970、Jund et al. 1977）。ＦＵＲ４は、１０個の膜貫通ドメインおよび長鎖細胞質内親水性ＮおよびＣ末端尾部を有する６３３個のアミノ酸（７１．７ｋＤａ）のタンパク質であると予測されている（Jund et al. 1988、Garnier et al. 1996）ウラシル−プロトン共輸送体（Hopkins et al. 1988）である。ＦＵＲ４タンパク質は、５−フルオロウラシル、ウラシルの類似体の輸送も媒介することができる（Jund and Lacroute 1970）。
【００５６】
ＦＣＹ２およびＦｕｒ４のアミノ酸配列は、特にｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（それぞれ、受入番号Ｐ１７０６４およびＰ０５３１６）において入手可能である。好ましくは、パーミアーゼは、特許出願国際公開第２００６／０４８７６８号に開示されているアミノ酸配列の配列番号１および配列番号２を含んでなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５７】
この点に関して、本発明の好ましい実施形態によると、パーミアーゼは、ＦＣＹ２およびＦｕｒ４ならびにそれらの類似体を含んでなる群から選択される。Ｆｕｒ４およびＦＣＹ２の類似体とは、本明細書中で上記に記述される親タンパク質のアミノ酸配列と、７０％を超える、有利には８０％を超える、好ましくは９０％を超える、および最も好ましくは９５％を超える同一性の程度を少なくとも有し、一つの核酸塩基部分を含んでなる薬物を、細胞膜を通して輸送する能力を保持するポリペプチドを指す。
【００５８】
当業者であれば、一つの核酸塩基部分を含んでなる薬物または薬物の前駆体に関連する可能性があるパーミアーゼを選択することができる。例えば、ＦＣＹ２およびＦｕｒ４は、好ましくは５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）と関連している。
【００５９】
より好ましい実施形態によると、本発明のポックスウイルスは、目的の核酸の発現に必要なエレメントを更に含んでなっていてもよい。
【００６０】
より好ましい実施形態によると、本発明のポックスウイルスは、パーミアーゼをコードする遺伝子を含む核酸配列の発現に必要なエレメントを更に含んでなっていてもよい。
【００６１】
目的の核酸および／またはパーミアーゼをコードする遺伝子を含む核酸配列の発現に必要なこれらの要素は、前記ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、および必要に応じてｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳に必要なエレメントを含んでなる。種々の脊椎動物系で使用するのに好適な転写プロモーターは、文献に広く記述されている。例えば、好適なプロモーターには、ＲＳＶ、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＣＭＶまたは７．５ｋ、ワクシニアプロモーター、誘導可能なプロモーター等のウイルスプロモーターが挙げられる。好ましいプロモーターは、ポックスウイルスから単離され、例えば、ワクシニアウイルスの７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１、またはＫ１Ｌである。或いは、CHAKRABARTI. . Biotechniques. 1997, no.23, p.1094-97.、HAMMOND, et al. . Journal of Virological Methods. 1997, no.66, p.135-38.、およびKUMAR. . Virology. 1990, no. 179, p.151-8に記述されているもの等の合成プロモーター、ならびに初期ポックスウイルスプロモーターと、後期ポックスウイルスプロモーターとのキメラプロモーターを用いてもよい。
【００６２】
目的の核酸配列、およびパーミアーゼをコードする遺伝子を含む核酸配列は、イントロン配列、標的化配列、輸送配列、分泌シグナル、核移行シグナル、ＩＲＥＳ、ポリＡ転写終結配列、トリパタイト（tripartite）リーダー配列、複製または組み込みに関与する配列等の追加的な、機能的エレメントを更に含んでなっていてもよい。前記配列は文献に報告されており、当業者であれば容易に取得することができる。
【００６３】
本発明は、本発明によるポックスウイルスを製造方法に関し、この製造方法は、
（ｉ）本発明によるポックスウイルスを細胞へ導入する工程、
（ｉｉ）前記細胞を、前記ポックスウイルスの産生を可能にする適切な条件下において培養する工程、および
（ｉｉｉ）前記ポックスウイルスを細胞培養から回収する工程
を含む。
【００６４】
ポックスウイルスは、当然、培養上清から回収できるが、細胞からも回収することができる。一般に使用される方法の一つは、溶解上清中のビリオンを収集するために、凍結／解凍サイクルを繰り返すことによって細胞を溶解することがある。その後、ビリオンを増幅し、当技術分野の技術（クロマトグラフ法、特に塩化セシウム勾配による超遠心分離法等）を用いて精製することができる。
【００６５】
本発明は、また薬学上許容される賦形剤と組み合わせて、本発明によるポックスウイルスを含んでなる組成物に関する。
【００６６】
本発明による組成物は、より具体的には遺伝子治療による疾患の予防または治療処置を目的としており、より具体的には増殖性疾患（癌、腫瘍、再狭窄等）を標的するか、または破骨細胞活性の増加（例えば、関節リウマチ、骨粗しょう症）に関連する疾患を標的とする。
【００６７】
本発明による組成物は、それを局所的に、非経口的に、または消化経路によって投与することを目的として、従来通りに作製することができる。特に、治療上有効量の本発明の組換えベクターまたはポックスウイルスは、薬学上許容される賦形剤と組み合わされる。数多くの投与経路を起想することが可能である。言及することができる例は、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻腔内、肺内、および気管内経路である。これらの後者三つの実施形態の場合は、エアロゾルまたは滴下によって投与を行うことが有利である。投与は、単回投与、または特定の時間的間隔後の一つもしくは複数の機会に繰り返される投与として行うことができる。適切な投与経路および用量は、様々なパラメーター、例えば治療される個体、治療される疾患、または移入される目的遺伝子（一つまたは複数）に依存して変動する。本発明によるウイルス粒子に基づく調製物は、１０４から１０１４ｐｆｕ（プラーク形成単位）、有利には１０５から１０１３ｐｆｕ、好ましくは１０６から１０１２ｐｆｕ、より好ましくは１０６から１０７の用量の形態で処方することができる。
【００６８】
組成物としては、薬学上の視点から許容される希釈剤、アジュバント、または賦形剤、ならびに可溶化剤、安定化剤、および保存剤も挙げることができる。注射可能な投与の場合には、水性、非水性、または等張性溶液中の製剤が好ましい。それは、適切な希釈剤を使用して使用時に再構成することができる液体または乾燥（粉末、凍結乾燥物等）形態により、単回用量または複数用量として提供することができる。
【００６９】
本発明は、人体または動物体を遺伝子治療によって治療することを目的とする薬剤を製造するための、本発明によるポックスウイルスまたは組成物の使用にも関する。薬剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて直接的に（例えば、静脈内注射によってアクセス可能な腫瘍へ、エアロゾルによって肺中へ、適切なカテーテルを使用して脈管系へ等）投与することができる。好ましい使用は、望まれない細胞増殖に起因する癌、腫瘍、および疾患の治療または予防にある。言及することができる考え得る応用は、乳癌、子宮癌（特に、乳頭腫ウイルスによって誘発されるもの）、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、中枢神経系の癌（例えば、神経膠芽腫）、および血液の癌（リンパ腫、白血病等）である。他の好ましい使用は、関節リウマチ、骨粗しょう症、および破骨細胞活性の増加に関連する他の疾患の治療または予防である。それは、例えば、血管壁の平滑筋細胞の増殖（再狭窄）を阻害または遅延させるために、心血管疾患との関連でも使用することができる。最後に、感染症の場合には、エイズに適用されている薬剤を起想することが可能である。
【００７０】
本発明のポックスウイルス、組成物、または方法が癌の治療に用いられる場合、本発明によるポックスウイルスは、腫瘍細胞を特異的に標的とすることができるため、好ましい投与経路は全身経路である。
【００７１】
本発明は、本発明によるポックスウイルス、組成物が、その治療を必要とする宿主生物または細胞に投与されることを特徴とする、疾患の治療方法にも及ぶ。
【００７２】
有利な実施形態によれば、治療上の使用または治療方法は、薬学上許容される量のプロドラッグ、有利にはシトシンの類似体、特に５−ＦＣが宿主生物または細胞に投与される追加の工程も含んでなる。実例として、５０から５００ｍｇ／ｋｇ／日までの用量を使用することが可能であり、２００ｍｇ／ｋｇ／日または１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量が好ましい。本発明との関連では、プロドラッグは、標準的技法に従って（例えば、経口により、系統的に）投与される。
【００７３】
好ましくは、本発明による治療薬の投与後に、本発明による治療薬を投与した好ましくは少なくとも３日後、より好ましくは少なくとも４日後、および更により好ましくは少なくとも５日後に投与される。本発明の更により好ましい実施形態によると、プロドラッグは、治療薬投与の７日後に投与される。経口経路が好ましい。単回用量のプロドラッグ、または宿主生物または細胞内で毒性代謝産物の産生が可能になるのに十分な長さの時間繰り返される用量のプロドラッグを投与することが可能である。
【００７４】
更に、本発明による組成物または方法は、５−ＦＵの細胞毒性効果を増強する一つまたは複数の物質と組み合わせることができる。特に言及することができるのは、ピリミジンのデノボ生合成経路の酵素を阻害する薬物（例えば、下記で言及されているもの）、５−ＦＵ（５ＦｄＵＭＰ）の代謝産物の存在下において、チミジル酸シンターゼの阻害を強め、複製に必要であるｄTMPの貯留を減少させる結果となるロイコボリン等の薬物（Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685-692）、および最後には、ジヒドロ葉酸還元酵素を阻害し、ＰＲＰＰ（ホスホリボシルピロリン酸）の貯留を増加させることによって、５−ＦＵの細胞ＲＮＡへの組み込みの増加をもたらすメトトレキサート等の薬物（Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137）である。
【００７５】
本発明によると、ピリミジンのデノボ生合成経路の酵素を阻害する薬物は、好ましくは、ＰＡＬＡ（Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸、Moore et al., 1982, Biochem. Pharmacol. 31, 3317-3321）、レフルノミド、Ａ７７１７２６（active metabolite of Leflunomide; Davis et al., 1996, Biochem. 35, 1270-1273）、およびブレキナル（Chen et al., 1992, Cancer Res. 52, 3251-3257）からなる群から選択されるものである。
【００７６】
本発明による組成物または方法は、抗癌療法に有効な一つまたは複数の物質と組み合わせることができる。本発明による組成物と一緒にまたは組み合わせて使用することができる抗癌療法に有効な医薬物質の中では、例えばマイトマイシンＣ、シクロホスファミド、ブスルファン、イホスファミド、イソスファミド（isosfamide）、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、クロラムブシル、またはダカルバジン等のアルキル化剤、例えばゲムシタビン、カペシタビン、５−フルオロウラシル、シタラビン、２−フルオロデオキシシチジン、メトトレキサート、イダトレキサート（idatrexate）、トムデックス、またはトリメトレキサート等の代謝拮抗剤、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、テニポシド、またはミトキサントロン等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）、またはトポテカン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、パクリタキセル、ドセタセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン等の抗有糸分裂薬、および例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、スピロプラチナム（spiroplatinum）、カルボプラチナム（carboplatinum）等の白金誘導体に言及することができる。
【００７７】
本発明による組成物または方法は、また放射線療法と組み合わせて使用することができる。
【００７８】
本発明による組成物または方法は、これらに限定されないが、例えば、アルファ、ベータ、もしくはガンマインターフェロン、インターロイキン（特に、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１２）、または腫瘍壊死因子等の免疫調節剤、例えば、上皮成長因子受容体の阻害剤（特に、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、またはラパチニブ）、またはヒト上皮成長因子受容体−２の阻害剤（特に、トラスツズマブ）等の細胞表面受容体の調節に影響を与える作用剤、および例えば、血管内皮増殖因子の阻害剤（特に、ベバシズマブまたはラニビズマブ）等の血管新生に影響を与える作用剤を含む一つまたは複数の他の作用剤と組み合わせても使用することができる。
【実施例】
【００７９】
ベクタープラスミドの構築
Ｉ４Ｌを欠失させるためのシャトルプラスミドは、チミジンキナーゼ遺伝子上で欠失され、ワクシニア合成プロモーターｐ１１Ｋ７．５の制御下でＦＣＵ１遺伝子を発現するワクシニアウイルス株コペンハーゲン（受入番号Ｍ３５０２７）のＤＮＡを使用して構築された。Ｉ４ＬのＤＮＡ隣接領域をＰＣＲによって増幅した。Ｉ４Ｌの下流隣接領域のプライマーは、５’−ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＡＣＡ−３’（配列番号７、下線はＳｍａＩ部位）、および５’−ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＴＣＴ−３’（配列番号８、下線はＳａｃＩ部位）であった。上流領域用のプライマーは、５’−ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＴＡＡ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＧＴＴ−３’（配列番号９、下線はＭｓｃＩ部位）、および５’−ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＴＡＡ  ＣＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ−３’（配列番号１０、下線はＰｖｕＩＩ部位）であった。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩ／ＳａｃＩまたはＭｓｃＩ／ＰｖｕＩＩで消化し、ＰｐｏｌｙＩＩＩプラスミドの対応する部位にライゲーションした。Ｉ４Ｌの下流隣接領域の反復領域を、プライマー５’−ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＣＧＡ−３’（配列番号１１、下線はＳｐｈＩ部位）、および５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＡＴＣ  ＴＧ−３’（配列番号１２、下線はＸｂａＩ部位）を用いて、ＰＣＲによって増幅し、ＰｐｏｌｙＩＩＩプラスミドに挿入した。反復領域は、欠失ウイルスの産生中に選択カセットを除去するために用いられる。ｐＨ５Ｒワクシニアプロモーターの制御下でＧＦＰ／ＧＰＴ融合遺伝子に対応する選択カセットを、ＰｐｏｌｙＩＩＩプラスミドのＳａｃＩ／ＳｐｈＩ部位に挿入した。取得されたプラスミドは、Ｉ４Ｌ遺伝子を欠失しているためｐΔＩ４Ｌと名づけられた組換えシャトルプラスミドである。
【００８０】
Ｆ４Ｌを欠失させるためのシャトルプラスミドを、ワクシニアウイルス株コペンハーゲン（受入番号Ｍ３５０２７）のＤＮＡを使用して構築した。Ｆ４ＬのＤＮＡ隣接領域をＰＣＲによって増幅した。Ｆ４Ｌの下流隣接領域のプライマーは、５’−ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＣＣＡ−３’（配列番号１３、下線はＢａｍＨＩ部位）および５’−ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＣＣＡ−３’（配列番号１４、下線はＳｍａＩ部位）であった。上流領域用のプライマーは、５’−ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＴＣＣ−３’（配列番号１５、下線はＰｖｕＩＩ部位）および５’−ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＣＡＴ  ＣＴＡ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧ−３’（配列番号１６、下線はＢｇｌＩＩ部位）であった。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＳｍａＩまたはＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩで消化し、ＰｐｏｌｙＩＩＩプラスミドの対応する部位にライゲーションした。Ｉ４Ｌの下流隣接領域の反復領域を、プライマー５’−ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＡＡＡ−３’（配列番号１７、下線はＳａｃＩ部位）、および５’−ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＣＡＡ−３’（配列番号１８、下線はＳｐｈＩ部位）を用いて、ＰＣＲによって増幅し、ＰｐｏｌｙＩＩＩプラスミドに挿入した。反復領域は、欠失ウイルスの産生中に選択カセットを除去するために使用される。ｐＨ５Ｒワクシニアプロモーターの制御下でＧＦＰ／ＧＰＴ融合遺伝子に対応する選択カセットを、ＰｐｏｌｙＩＩＩプラスミドのＳａｃＩ／ＳｍａＩ部位に挿入した。取得されたプラスミドは、Ｆ４Ｌ遺伝子を欠失するためｐΔＦ４Ｌと名づけられた組換えシャトルプラスミドである。
【００８１】
組換えワクシニアウイルスの産生
ＣＥＦ細胞を、ＶＶＴＫ−ＦＣＵ１（ワクシニアウイルス、Ｊ２Ｒキナーゼ遺伝子欠損、合成プロモーターｐ１１ｋ７．５の制御下でＦＣＵ１遺伝子を発現する）コペンハーゲン株に０．１ＭＯＩで感染させ、２時間３７℃でインキュベートし、その後組換えシャトルプラスミド（０．２μｇ）のＣａＣｌ２共沈物で形質移入した。細胞を４８時間３７℃でインキュベートした。その後、出現ウイルスの希釈液を使用して、終濃度が１５μｇ／ｍｌのヒポキサンチン、終濃度が２５０μｇ／ｍｌのキサンチン、および終濃度が２５０μｇ／ｍｌのミコフェノール酸を含有する選択培地中でＣＥＦ細胞を感染させた。蛍光性（ＧＦＰ）および陽性（ＧＰＴ選択）プラークを単離し、ＧＰＴ選択培地の存在下でＣＥＦ細胞の選択を数ラウンド行って選択した。ＶＶＴＫ−ＦＣＵ１の存在下または非存在を、欠失領域内部のプライマーを用いた４０サイクルのＰＣＲによって決定した。親ウイルスの除去後、２重欠失ウイルスを使用して、ＧＰＴ選択培地を用いずにＣＥＦに感染させ、選択カセットを除去した。非蛍光性プラークを単離し、２サイクルでＣＥＦを選択した。最終組換えＶＶウイルスをＣＥＦ中で増幅させて精製し、ウイルス株をプラークアッセイによりＣＥＦに滴定した。
【００８２】
５−ＦＣに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞感受性
ヒト腫瘍細胞を、０．０００１ＭＯＩのそれぞれの組換えＶＶを用いて形質導入した。合計３×１０５細胞／ウエルを、６ウエル培養皿上の、種々の濃度の５−ＦＣを含有する２ｍｌ培地にプレーティングした。その後、細胞を５日間３７℃で培養し、生細胞をトリパンブルー排除法によって計数した。図１、２、３、および４に記載された結果は、ＦＣＵ１活性が、Ｉ４ＬおよびＪ２Ｒ遺伝子を欠損するウイルスまたはＦ４ＬおよびＪ２Ｒ遺伝子を欠損するウイルスよりも、Ｊ２Ｒ遺伝子を欠損するウイルスと等しいことを示す。
【００８３】
培養細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製
分裂細胞またはコンフルエント細胞を、６−ウエルプラーク中で、１００ＰＦＵのウイルス（ＭＯＩがほぼ０．０００５）に感染させた。１０％ＦＣＳで補完された２ｍＬの培地を分裂細胞に、補完されていない培地をコンフルエント細胞に添加した。細胞を、感染４８時間後に回収した。細胞を−２０℃で保管し、超音波処理してウイルスを放出させ、ＣＥＦ細胞にプラーク滴定することによってウイルスも定量化した。分裂細胞とコンフルエント細胞との比率は、全ての細胞で類似している。両ウイルスＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１、およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１は、コンフルエント細胞よりも分裂細胞においてより多く複製する。
【００８４】
複製ウイルス特異性をアッセイする間接的な手段として、コンフルエント腫瘍細胞（膵臓ヒト腫瘍ＰＡＮＣ１、肺ヒト腫瘍Ｈ１２９９、神経膠腫ヒト腫瘍Ｕ１１８ＭＧ）と比べた、分裂細胞で産生されたウイルス収量を決定した。コンフルエント細胞を１×１０６細胞／ウエルでプレーティングし、完全培地で７日間培養し、次いで、感染の１日前に細胞を洗浄し、無血清培地で培養した。分裂細胞を、感染の１日前に３×１０５細胞／ウエルでプレーティングした。細胞分裂のレベルを評価するために、核酸に組み込まれた滴定チミジンの量を、細胞をプレーティングした５時間後、２４時間後、および４８時間後に測定した。この期間中のチミジン組み込みは、コンフルエント細胞では比較的一定であったが、分裂細胞では、組み込みの増加が時間と共に見られた。その後、細胞を１００ｐｆｕのウイルスに感染させ、感染４８時間後に、分裂腫瘍細胞で産生されたウイルス収量と、コンフルエント腫瘍細胞で産生されたウイルス収量との比率を、ＣＥＦでのプラーク滴定によって決定した。図９および１０に記載された結果は、両ウイルスＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１、およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１が、コンフルエント細胞より分裂細胞においてより多く複製することを示す。更に、図９および１０に記載された結果は、ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１と比較して、両ウイルスＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１の場合、全ての異なる種類の細胞において比率が増加したことを示す。異なる種類の細胞全てにおいて比率がこのように増加したことは、コンフルエント細胞において、両ウイルスＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１の複製がより少なかったことに起因する。これらの結果により、両ウイルスＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１が、ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１と比較して、分裂細胞に対する特異性の増加を示すことが実証された。
【００８５】
皮下腫瘍モデル
雌Ｓｗｉｓｓヌードマウスは、チャールスリバーラボラトリーズ（Charles River Laboratories）社から取得した。本研究で使用された動物は、年齢が同じ（６週齢）であり、体重は２３〜２６ｇの範囲であった。Ｓｗｉｓｓヌードマウスの側腹に、５×１０６ＬｏＶｏ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍の直径が５０〜７０ｍｍ３に達した時、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験用に、マウスを盲検法で無作為化し、表示ベクターで処置した。
【００８６】
ウイルスの生体内分布
種々のウイルスの存在を、腫瘍試料および器官試料のウイルス滴定によって評価した。１×１０６ＰＦＵのＶＶ−ＦＣＵ１、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１、またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１を、確立した皮下ＬｏＶｏ腫瘍を保持するヌードマウスの尾部静脈に注射することによって静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。指示された時点でマウスを屠殺し、腫瘍および他の器官を収集および計量した。腫瘍および器官をＰＢＳ中でホモジナイズし、これまでに記述されているように、力価をＣＥＦで決定した。ウイルス力価を、ミリグラムの組織に標準化した。ウイルス力価を、ミリグラムの組織に標準化した。表２、３、４、および５に記載された結果（ウイルス力価の範囲は、組織１ｍｇ当たりのｐｆｕで示されている）は、１４日後には、本発明によるウイルスがほとんどの腫瘍で見出されることを示す。図１１および１２に記載された結果は、両ウイルスＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１、およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１が、ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１の場合の尾部を除き、分析された他の器官より腫瘍において約１０００から１００００倍多いウイルスで腫瘍を標的にすることを示す。少量のＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１が、肺、脾臓、腎臓、およびリンパ節（１０ｐｆｕ／ｍｇ未満）で検出され、６日目の皮膚、尾部、および骨髄、ならびに２１日目の皮膚および尾部でより多くが検出される。対照的に、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１は両方とも、より高い腫瘍特異性を示し、６日目のリンパ節および尾部、ならびに２１日目の腫瘍に少量だけ検出される。
【００８７】
【表２】
0005710261.tif 000003
【００８８】
【表３】
0005710261.tif 000004
【００８９】
【表４】
0005710261.tif 000005
【００９０】
【表５】
0005710261.tif 000006
【００９１】
皮下腫瘍モデルにおける本発明のポックスウイルスの抗腫瘍活性
確立した皮下ＬｏＶｏ腫瘍（５０〜７０ｍｍ３）を保持するヌードマウスを、静脈内で１回（尾部静脈により）、それぞれ１．１０７ＰＦＵの用量の表示ベクターで処置した。ウイルス注射後の７日目から開始し、１００ｍｇ／ｋｇ（０．５ｍｌの水中０．５％５−ＦＣ）の５−ＦＣを、経口の胃管栄養法によって１日２回で３週間与えた。腫瘍サイズは、週２回カリパスを使用して測定した。腫瘍体積は、式（ｐ／６）（長さ×幅２）を使用して、ｍｍ３で計算した。図５および６に記載された結果により、種々のウイルスが、腫瘍の増殖を制御することができる腫瘍崩壊活性（ｐ＜０．０５）および腫瘍成長の制御を更に向上させることができる５−ＦＣ投与との併用活性（ウイルスの腫瘍崩壊およびＦＣＵ１遺伝子の治療）（ｐ＜０．０１）と同様の効能を有することが示された。
【００９２】
確立した皮下ＬｏＶｏ腫瘍（５０〜７０ｍｍ３）を保持するヌードマウスも、下記のように、１．１０７ＰＦＵの用量の表示ベクターを、静脈内に（尾部静脈により）処置した。腫瘍（触知可能な腫瘍）を接種した１１日後に、緩衝液＋Ｈ２Ｏ、または緩衝液＋５−ＦＣ、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋Ｈ２Ｏの１回の注射、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣ（５−ＦＣは、ウイルス注射７日後、および３週間の間投与された）の１回の注射、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋Ｈ２Ｏの２回の注射剤（１１日目および３３日目）、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣ（５−ＦＣは、１８日目から３２日目まで、および４０日目から５４日目まで投与された）の２回の注射（１１日目および３３日目）で、マウスを処置した。動物を、１００ｍｇ／ｋｇの５−ＦＣで１日２回、経口の胃管栄養法により処置した。腫瘍サイズは、週２回カリパスを使用して測定した。腫瘍体積は、式（ｐ／６）（長さ×幅２）を使用して、ｍｍ３で計算した。図７に記載された結果は、１回または２回の注射後にウイルス単独では抗腫瘍活性がなかったことを示す。５０日目までの媒体群とウイルス単独（５−ＦＣ無し）とを比較すると、５−ＦＣ処置を追加することにより、統計学的に有意な腫瘍成長の阻害が示される（ｐ＜０．０５）。単回注射１回の場合と同様に、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣの２回の静脈内注射により、媒体群とウイルス単独（５−ＦＣ無し）の２回注射とを比較すると、有意な抗腫瘍活性が示される（ｐ＜０．０５）。更に、腫瘍進展における有意差は、５−ＦＣ処置と組み合わせたウイルスの１回注射と２回注射との間で５６日目から観察される（ｐ＜０．０５）。
【００９３】
確立した皮下Ｕ８７−ＭＧ（神経膠芽腫腫瘍細胞）を保持するヌードマウスを、１．１０７ＰＦＵの用量の表示ベクターで静脈内（尾部静脈）に、以下のように処置した。腫瘍（触知可能な腫瘍）を接種した１１日後に、マウスを、緩衝液＋Ｈ２Ｏ、または緩衝液＋５−ＦＣ、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋Ｈ２Ｏ、または１０７ｐｆｕのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１＋５−ＦＣにより処理した。動物を、ウイルス注射７日後に、経口の胃管栄養法により１日２回で３週間、１００ｍｇ／ｋｇの５−ＦＣで処置した。腫瘍サイズは、週２回カリパスを使用して測定した。腫瘍体積は、式（π／６）（長さ×幅２）を使用して、ｍｍ３で計算した。図８に記載された結果により、Ｕ８７−ＭＧ細胞に対するＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１の高い腫瘍崩壊活性が示され（ｐ＜０．０００１）、それは強力な抗腫瘍活性に帰着する。経口の胃管栄養法による５−ＦＣ追加の併用活性は、同様の活性に帰着する（ｐ＜０．０００１）。
【００９４】
ウイルス病原性
ウイルス病原性を、Ｓｗｉｓｓヌードマウス（図１３）および免疫応答性Ｂ６Ｄ２マウス（図１４）の両方に対して行なった生存研究で評価した。マウス１匹当たり１００μｌの緩衝液中の１．１０７または１．１０８ＰＦＵの全ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１およびＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１をマウスに注射した。実験期間中はマウスを毎日観察した。Ｓｗｉｓｓヌードマウス（図１３）においては、１×１０８ＰＦＵのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１を注射すると、感染３日後には動物の４０％が死亡する結果となった。残りのマウスは、感染後５０日目から８０日目の間に死亡した。ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１の投与は、それほど病原性ではなく、大多数の動物は６５日目から１４０日目の間に死亡した（ｐ＜０．０１）。毒性があるという証拠は、１０７ｐｆｕの両ウイルスでは観察されていない（図１４（Ａ））。１０８ｐｆｕのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１を静脈内注射した後、マウスは全て死亡した（図１４（Ｂ））。ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１処置群は、ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１感染マウスと比較して、生存率が７０％にまで著しく延長した（図１４（Ｂ））。従って、この結果により、二重欠失ウイルスＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１を用いた場合の毒性の減少が実証された。
【００９５】
痘疹尾部病変モデル
Ｓｗｉｓｓヌードマウスに、１．１０６（図１５および１６）または１．１０７（図１７および１８）ＰＦＵの各ウイルスを静脈内注射した。尾部病変を週１回計数した。図１５（Ａ）および図１６（Ａ）に示されているように、ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１を注射され、感染後１３日目のマウスでは平均８個の痘疹を有するマウスと比較して（ｐ＜０．００１）、１．１０６ＰＦＵのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１を注射されたマウスは、マウス１匹当たり１個未満の痘疹を有する。結果は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）に示されているように、注射後３４日目では類似しており、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１の場合のほぼ１個と比較して（ｐ＜０．０００１）、ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１では痘疹は平均４個である。感染後１５日目では、平均１０個の痘疹／マウスを有する１．１０７ＰＦＵのＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１を注射されたマウスと比較して、１．１０７ＰＦＵのＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１を注射されたマウスは、平均３個の痘疹／マウスおよび平均２個の痘疹／マウスをそれぞれ有する（図１７（Ａ）および図１８（Ａ））。感染後３１日目では、平均７個の痘疹／マウスを有するＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１を注射されたマウスと比較して、ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１を注射されたマウスは、平均１．５個の痘疹／マウスおよび平均２個の痘疹／マウスをそれぞれ有する（図１７（Ｂ）および図１８（Ｂ））。ＶＶＴＫ−／ＦＣＵ１とＶＶＴＫ−ｌ４Ｌ−／ＦＣＵ１およびＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１の両方との間の痘疹数の差は、統計学的に有意である（ｐ＜０．０１）。痘疹形成は、尾部におけるウイルス複製と相関しており、病原性および毒性とも相関している。ＶＶＴＫ−Ｉ４Ｌ−／ＦＣＵ１またはＶＶＴＫ−Ｆ４Ｌ−／ＦＣＵ１の静脈内注射は、単一欠失ＴＫウイルスより毒性が少ない。
【００９６】
統計分析
【００９７】
統計分析は、ノンパラメトリックのマンホイットニーＵ検定およびSTATISTICA 7.1ソフトウェア（スタットソフト（StatSoft, Inc.）社製）を用いて実施した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなした。
【００９８】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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