(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス芽胞細胞を含むバチルス組成物であって、
（ｉ）バチルス芽胞が、４ｍＭの胆汁酸塩を含む胆汁酸塩培地の存在下で、及び６ｍＭの胆汁酸塩を含む胆汁酸塩培地の存在下で、それぞれ１８時間および１９時間未満以内にバチルス芽胞が０．４ＯＤ630の栄養細胞増殖点に達すること、と定義される、迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長を示すこと、
（ここで栄養細胞増殖点とは、ＯＤ値が（栄養細胞の増殖によって）連続的に上昇し始め、０．４のＯＤ630に達する、増殖曲線上の点であり、
（Ｉ）ここで胆汁酸塩培地は、非選択的子牛インフュージョンブロス（ＶＩＢ）培地に、抱合型胆汁酸塩であるタウロデオキシコール酸およびグリコデオキシコール酸ならびに脱抱合型胆汁酸塩であるデオキシコール酸を、タウロデオキシコール酸６０％、グリコデオキシコール酸３０％、およびデオキシコール酸１０％の比率で含む胆汁酸塩混合物を添加したものであり、
ここでＯＤアッセイ分析は次の工程により行われる：
（ａ）マイクロタイタープレート内のウェルを、培地１ｍｌ当たり１０8個のバチルス芽胞を有する０．１５０ｍｌの胆汁酸塩培地で満たすこと（すなわちこれがゼロ時間である）、および
（ｂ）大気条件下にて３７℃でプレートをインキュベートし、各読取りの前に攪拌して分光光度計を用いてＯＤ630値を測定し、典型的な経時的増殖曲線を取得すること）
および
（ｉｉ）バチルス栄養細胞が、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７よりも少なくとも２倍以上の量の、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、およびアルギニンからなる群より選択される少なくとも１の必須アミノ酸を産生しており、ここで産生された必須アミノ酸の量は、上清中で、以下の組成：
（NH4)2SO4                                １ｇ／ｌ
K2HPO4                                    ７ｇ／ｌ
KH2PO4                                    ３ｇ／ｌ
MｇSO4・７H2O                         ０．１ｇ／ｌ
を有する最少塩増殖培地であって、１２１℃で１５分間オートクレーブにかけられ、そしてオートクレーブにかけたグルコースを終濃度０．５％となるように加えられた培地１０ｍｌを入れたチューブ中で、３７℃及び１５０ｒｐｍでバチルス細胞を２日間増殖させた後に、誘導化剤としてメチルクロロギ酸を用いて水性サンプルのアミノ酸アッセイに基づく標準ＧＣ−ＭＳ方法により、計測される
を特徴とするバチルス組成物。
【請求項２】
組成物のバチルス芽胞細胞が、乾燥（例えば噴霧乾燥）した芽胞細胞として存在する、請求項１に記載のバチルス組成物。
【請求項３】
バチルス細胞が、Ｂ．ズブチリス細胞である、請求項１または２に記載のバチルス組成物。
【請求項４】
バチルス芽胞が、請求項１の項目（ｉ）の条件下で、ＤＳＭ１７２３１として寄託されている参照バチルス・ズブチリス芽胞細胞よりも少なくとも３時間早く栄養細胞増殖点に達し、この時点が少なくともインキュベーション後少なくとも２０時間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバチルス組成物。
【請求項５】
請求項１の項目（ｉｉ）のバチルス栄養細胞および参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７をともに同一条件下で増殖させた時、該栄養細胞が、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７よりも多い量の目的の化合物を生産している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバチルス組成物。
【請求項６】
前記必須アミノ酸が、バリン、イソロイシン及びロイシンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である、請求項５に記載のバチルス組成物。
【請求項７】
前記必須アミノ酸がロイシンである、請求項６に記載のバチルス組成物。
【請求項８】
前記バチルス栄養細胞が、請求項１の項目（ｉｉ）条件下で、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７よりも少なくとも４倍以上の量で少なくとも１の必須アミノ酸を産生する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバチルス組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のバチルス組成物を、他の動物用飼料の材料と併せて動物に投与することを含む、動物への給餌方法。
【請求項１０】
動物が、家禽、反芻動物、子牛、ブタ、ウサギ、ウマ、魚、およびペットからなる群より選択される動物である、請求項９に記載の動物への給餌方法。
【請求項１１】
新規なバチルス細胞をスクリーニングし単離する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の項目（ｉ）の条件下で１８時間および１９時間未満以内に栄養細胞増殖点に達する程に迅速に発芽および成長することが可能な新たなバチルス芽胞細胞の個々のバチルス芽胞細胞のプールから選択し単離すること；
（ｂ）工程（ａ）の単離した芽胞細胞から栄養バチルス細胞を作製し、選択し単離した新規な細胞に突然変異を起こして新たな個々のバチルス栄養細胞のプールを得ること；
（ｃ）工程（ｂ）の新たな個々のバチルス栄養細胞のプールから、請求項１の項目（ｉｉ）の条件下で、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７よりも多い量の少なくとも１の必須アミノ酸を産生することができる新規のバチル栄養細胞を選択及び単離し；そして
（ｄ）工程（ｃ）の高生産性栄養バチルス細胞を分析して、該細胞が工程（ａ）の迅速な発芽および成長を維持していることを確認し、選択したバチルス細胞を単離すること；
を含む方法。
【請求項１２】
バチルス細胞が、Ｂ．ズブチリス細胞である、請求項１１に記載の、新規なバチルス細胞をスクリーニングし単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆汁酸塩（擬似的消化管環境）中での急速に発芽および成長、および高レベルの必須アミノ酸により特徴づけられるバチルス組成物に関する。当該バチルス組成物は、動物用飼料中の添加物として用いることができ、飼料中にて、プロバイオティック（健康増進および増殖増進）効果を有し、消化を促進して動物用飼料の栄養分の有効性を高める。
【背景技術】
【０００２】
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）およびバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）等のプロバイオティック細菌は、動物用飼料業界において食餌への添加物として使用されている。それらが使用されているのは、バチルスが、動物用飼料業界において成長促進物質として使用されている抗生物質の代わりとなることができるか、または抗生物質の使用を減少させることができる、ということと関係している。
【０００３】
デンマークのクリスチャン・ハンセンＡ／Ｓ社は、例えば、GalliPro（登録商標）（ＤＳＭ１７２３１として寄託されている）という商品名のそのようなプロバイオティック成長促進製品を商品化している。GalliPro（登録商標）は、バチルス・ズブチリス芽胞細胞組成物である。
【０００４】
提唱されている作用機序（例えば、免疫調節、腸管内菌叢を変化させる）の他、プロバイオティックバチルスは、動物用飼料の添加物として使用された場合、胃腸管（ＧＩＴ）内で分泌される酵素等の多くの有益な成分を生産することができる。フィターゼ等の酵素が分泌され、動物用飼料の消化および取込みの増加が促進される（より高い消化率）。食餌（飼料）は、主に、穀物、トウモロコシ、大豆、大豆油、およびアミノ酸等の植物由来のものから成る。全体的に見ると、これらの効果は、コスト効率のよい畜産物の生産に寄与している。
【０００５】
プロバイオティックバチルスはまた、必須アミノ酸等の他の有益な成分を生産することもできる。
【０００６】
バチルス芽胞は、動物の胃腸管（ＧＩＴ）内において、酸性の胃障壁を通過し、発芽および成長することができる。このことは大きな利点である。なぜならば、バチルス芽胞が摂取された際に、バクテリオシン等の多くの種類の有益な成分を分泌することができ、また有用な必須アミノ酸も分泌することができるからである。さらに、バチルス芽胞は飼料のペレット化プロセスの間において熱安定性であるため、バクテリオシンと、例えば必須アミノ酸との両方をＧＩＴ内に送り込む、優れたデリバリーシステムである。
【０００７】
ＧＩＴ内のバチルスの生存および増殖プロセスにおいて、胆汁の役割は重要である。胆汁は肝臓で生産され、胆嚢に貯蔵される。胆汁は、水、レシチン、ビリルビンおよびビリベルジン、ならびに胆汁酸塩を含有する。
【０００８】
動物のＧＩＴ内でのバチルス芽胞細胞の生存ならびに発芽および栄養細胞への成長に対して胆汁が何らかの悪影響を及ぼすことが、文献により知られている。したがって、プロバイオティック胆汁耐性バチルス株を発見する研究が進められている。
【０００９】
論文（Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. Epub 2006 Jul 4）には、多数のバチルス試料／細胞をニワトリの腸から直接単離することについて記載されている。単離したバチルス細胞のプロバイオティック活性が試験された。プロバイオティック活性が最も高い６つのバチルスの胆汁酸塩耐性が試験され、特定の高プロバイオティックバチルスが、比較的高いレベルの胆汁酸塩耐性を有することがわかった。
【００１０】
この論文では、胆汁耐性の試験期間に関しては特に何の注目もしていない。実験の部分では、バチルス芽胞細胞は、単に、胆汁酸塩中に５日間置いた後に耐性が試験されている（１４１ページの"Simulated small intestinal fluid tolerance test"のパラグラフを参照のこと）。
【００１１】
米国特許出願公開第２００３／０１２４１０４（Ａ）号には、従来のプロバイオティックバチルス内生芽胞が低濃度の胆汁酸塩に感受性であること、すなわち、低濃度の胆汁酸塩が存在するだけでも芽胞の発芽および／または再水和が阻害されること、が記載されている。これは、大腸菌または黄色ブドウ状球菌といった腸内病原体等の他の細菌とは正反対である（段落［００１４］〜［００１５］を参照のこと）。この点を考慮して、胆汁酸塩の阻害活性に対して耐性であり、それにより発芽して栄養細胞となり、その後結腸でコロニー形成するバチルス芽胞をスクリーニング／選択することが推奨されている（［００１９］を参照のこと）。実施例は全て存在下のものであり、実際にスクリーニングされた特定のバチルス細胞の実際の実験データは、明細書中には記載されていない。さらに胆汁酸塩のスクリーニング条件は、比較的一般的に記載されている。特に、胆汁耐性の選択のための期間については何も示されていない。言い換えると、この文献の単に広範囲／一般的な教示に基づいて選択できるのは、単に緩徐に成長（発芽）することができる、すなわち、適切な量の胆汁酸塩の存在下で、例えば２０時間後に芽胞から発芽して栄養細胞になることが可能なバチルス細胞である。
【００１２】
この文献には、迅速に成長（発芽）することができる、すなわち、適切な量の胆汁酸塩の存在下である一定の期間内に規定の増殖点に達し、発芽して芽胞から栄養細胞へと成長することが可能なバチルス細胞を選択するための記載や示唆はない。
【００１３】
まとめると、胆汁耐性バチルス細胞の選択／スクリーニングに関する従来技術の参照文献は、芽胞細胞から栄養バチルス細胞への迅速な成長／発芽には焦点を当てていない。
【００１４】
出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７２９６の国際ＰＣＴ出願は、２００８年１１月６日に出願された。出願人はクリスチャン・ハンセンＡ／Ｓ社であり、本願の出願日には公開されていなかった。
【００１５】
国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７２９６には、胆汁酸塩培地の存在下における発芽および芽胞から栄養細胞への成長の速度が向上した／迅速である、ということを特徴とする新規なバチルス芽胞が記載されている。本明細書に記載のバチルス芽胞は、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７２９６に記載のものと同様に、発芽および芽胞から栄養細胞への成長の速度が向上している／迅速である。
【００１６】
国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７２９６に記載されているのは、単に参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７と比較してフィターゼの生産量が多いバチルス栄養細胞である。参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７に比べて、多い量の必須アミノ酸を産生するバチルス栄養細胞をスクリーニングすることについては、記載も示唆もない。
【００１７】
以下において先行技術への言及があった場合、それは本願の出願日の時点において公衆に利用可能な先行技術（例えば公開論文／特許）であると理解される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明が解決しようとする課題は、動物の胃腸管（ＧＩＴ）内で大量の必須アミノ酸を分泌することができるバチルス組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本解決策は、本発明者らが改良された新規なバチルス組成物を特定するための新たな選択方法を開発したことに基づく。
【００２０】
本明細書中に記載の新たな選択方法の新規な重要な工程は、胆汁酸塩の存在下における発芽および芽胞から栄養細胞への成長の速度が向上した／迅速であるバチルス芽胞細胞を特異的にスクリーニング／選択することである。
【００２１】
上記の通り、従来技術には、胆汁酸塩の存在下で増殖可能なバチルス細胞の選択方法が記載されているが、従来技術のスクリーニング／選択方法は、胆汁酸塩の存在下での発芽および成長の速度には焦点を当てていない。したがって、従来技術で選択される胆汁耐性バチルス細胞は、本明細書に記載の発芽および成長の速度の基準を満たすのに十分な速度にて発芽および成長をしない。例えば、（例えば上記のAntonie Van Leeuwenhoekの論文に記載のように）ニワトリ等の腸から直接単離した腸内環境中のバチルス細胞は、腸内で迅速に発芽および成長するようにと選択されたものではない（自然圧下）。
【００２２】
本明細書中の実施例に示す通り、このことは市販のバチルス組成物であるGalliPro（登録商標）についても当てはまるが、この組成物は、単に発芽および成長が緩徐過ぎるだけで、生理的レベルの胆汁酸塩の存在下において最初の２０時間以内に規定の増殖点には達せず、本明細書に記載の発芽および成長の速度の基準を満たさない。GalliPro（登録商標）は、商業的に成功しているバチルス・ズブチリス組成物である。
【００２３】
本明細書中に記載の新規なＤＳＭ１９４６７は、本明細書に記載の胆汁酸塩の存在下において迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長をするため、出発株としてGalliPro（登録商標）を、また選択圧法（selective pressure method）と、それに続いて単離を用いることにより選択された。
【００２４】
さらなる詳細については、例えば表１を参照されたい（GalliPro（登録商標）は、本明細書中においてＤＳＭ１７２３１と呼ぶこともある）。本明細書中の図１において、このことが模式的に図示されている。
【００２５】
まとめると、１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス細胞を含む単離されたバチルス組成物であって、バチルス組成物の細胞が、本明細書に記載の胆汁酸塩の存在下での迅速な発芽および成長の基準を満たす組成物、について記載している先行技術はないと考えられる。
【００２６】
理論に限定されるものではないが、本発明者らは、バチルス芽胞は、胆汁に耐性であるが十分な速度で発芽および成長をせず、栄養バチルス細胞によって必須アミノ酸生産等のいずれかの好ましい特性が相当な量で示される前に分泌されるため、迅速な発芽および成長が本発明の非常に重要な態様であることを見極めた。
【００２７】
発芽が余りにも緩徐なバチルス芽胞は、細菌が任意の相当量の必須アミノ酸等を生産できる前に胃腸管（ＧＩＴ）を素通りすることになる。
【００２８】
多くの詳細な試験および分析の後、その結果を受け、本発明者らは、最大で２０時間までの時間範囲を用い、高い生理的濃度の胆汁酸塩の存在下でこの時間内に最も速く発芽および成長する芽胞を選択することに決めた。理論に限定されるものではなく、また本明細書中に開示される詳細な実験作業に基づき、本発明者らは、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩の存在下で、それぞれ最初の１８時間および１９時間以内の迅速な発芽および成長を示すことが重要であることを見極めた。
【００２９】
次いで本発明者らは、胆汁酸塩培地中で迅速な発芽および成長を示すバチルス細胞を一旦選択すると、これらの細胞は、必須アミノ酸の生産量が向上した新たな細胞を得るための突然変異誘発の出発細胞として非常に有用であることを見極めた。
【００３０】
図１および実施例４に模式的に図示されているように、迅速に成長し胆汁耐性である選択された株、ＤＳＭ１９４６７、を古典的突然変異の出発株として用い、必須アミノ酸高生産性株を選択した。実施例４からわかるように、選択した株のいくつかは、必須アミノ酸であるロイシンをＤＳＭ１９４６７およびGalliPro（登録商標）よりも少なくとも５倍多く生産している。
【００３１】
本明細書に記載される新規プロバイオティック細胞は、胆汁抵抗性であり、迅速に発芽及び成長し、そして多量の必須アミノ酸を分泌する細胞である。得られた株は、動物の食餌に加えるためのプロバイオティックバチルス組成物として極めて有用である。当該株は、動物の腸において（高いレベルの胆汁酸塩の存在下で）生存及び増殖し、病原性細菌を抑制し（バクテリオシン類の産生）、そしてさらに多くの量の有益な必須アミノ酸を産生するという、プロバイオティック細菌の有益な能力の全てを併せた株である。
【００３２】
したがって、本発明の第１の態様は、１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス芽胞細胞を含むバチルス組成物であって、
（ｉ）バチルス芽胞が、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩を含む胆汁酸塩培地の存在下で、それぞれ１８時間および１９時間未満以内にバチルス芽胞が０．４ＯＤ630の栄養細胞増殖点に達すること、と定義される、迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長を示すこと、
（ここで栄養細胞増殖点とは、ＯＤ値が（栄養細胞の増殖によって）連続的に上昇し始め、０．４のＯＤ630に達する、増殖曲線上の点であり、
（Ｉ）ここで胆汁酸塩培地は、本明細書中の実施例１の標準的な公知の非選択的子牛インフュージョンブロス（ＶＩＢ）培地に、抱合型胆汁酸塩であるタウロデオキシコール酸およびグリコデオキシコール酸ならびに脱抱合型胆汁酸塩であるデオキシコール酸を、タウロデオキシコール酸６０％、グリコデオキシコール酸３０％、およびデオキシコール酸１０％の比率で含む胆汁酸塩混合物を添加したものであり、
ここでＯＤアッセイ分析は次の工程により行われる：
（ａ）マイクロタイタープレート内のウェルを、培地１ｍｌ当たり１０8個のバチルス芽胞を有する０．１５０ｍｌの胆汁酸塩培地で満たすこと（すなわちこれがゼロ時間である）、および
（ｂ）大気条件下にて３７℃でプレートをインキュベートし、各読取りの前に攪拌して分光光度計を用いてＯＤ630値を測定し、典型的な経時的増殖曲線を取得すること）
および
（ｉｉ）バチルス栄養細胞が、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７よりも多い量で少なくとも１の必須アミノ酸を産生しており、ここで当該産生された必須アミノ酸の量は、本明細書の実施例２の標準既知最小塩増殖培地中で３７℃で２日間増殖させた後に、実施例２の標準ＧＣ−ＭＳ方法に基づくアミノ酸アッセイにより計測される
を特徴とするバチルス組成物に関する。
【００３３】
上記の通り、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７は、胆汁酸塩の存在下で迅速な発芽および成長をするために、出発株としてGalliPro（登録商標）を用いることにより選択される。ＤＳＭ１９４６７は、必須アミノ酸の生産性が向上していることについて選択されるものではない。理論に限定されるものではないが、本明細書中のＤＳＭ１９４６７の関連する必須アミノ酸産生は、ＧａｌｌｉＰｒｏ（商標）に対応することが知られている。
【００３４】
項目（ｉ）に関して、GalliPro（登録商標）の栄養細胞増殖点は、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩中でのインキュベーション後少なくとも２０時間であり、本明細書に記載の新規なＤＳＭ１９４６７株については、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩中におけるそれぞれ１４時間および１５時間後である（本明細書中の図２および実施例３を参照のこと）。
【００３５】
ここで注目しておきたい関連事項は、本発明者らが、栄養細胞増殖点を決定するために、第１の態様の項目（ｉ）の条件下で、市販品であるCALSPORIN（登録商標）（カルピス株式会社、日本）も試験したということである。GalliPro（登録商標）と同様、市販品であるCALSPORIN（登録商標）は、プロバイオティック飼料添加物として使用されるバチルス・ズブチリス組成物である。CALSPORIN（登録商標）の、第１の態様の項目（ｉ）の条件下での栄養細胞増殖点は、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩にて、それぞれ２０時間超であった。これは項目（ｉ）で必要とされる１８時間および１９時間よりもはるかに長く、このことは、これまでの市販品が、迅速に発芽および成長するために選択されてきたのではない、ということを示している。上記の通り、「天然の」バチルス細胞は、迅速な発芽および成長を獲得するために何の選択圧も受けていない。したがって、理論に限定されるものではないが、「天然の」バチルス細胞は第１の態様の項目（ｉ）の条件を満たしていないと考えられる。
【００３６】
［項目（ｉ）の］胆汁耐性および［項目（ｉｉ）の］必須アミノ酸アッセイは両方とも、公知の市販の標準的な要素（例えば標準的な培地、胆汁酸塩；標準的なＯＤ測定法および標準的な試験等）に基づいている。参照バチルス細胞はＤＳＭ１９４６７として寄託されており、したがって公衆に利用可能である。バチルス・ズブチリス細胞であるGalliPro（登録商標）はＤＳＭ１７２３１（「GalliPro（登録商標）」と命名）として寄託されており、したがって公衆に利用可能である。
【００３７】
したがって、本明細書中の詳細なアッセイの説明（例えば、胆汁耐性アッセイについては本明細書中の実施例１、また必須アミノ酸アッセイについては本明細書中の実施例２を参照のこと）を基に、当業者は、日常的に、これらのアッセイを繰り返して、目的の特定のバチルス細胞が本発明の第１の態様の［項目（ｉ）の］胆汁耐性および［項目（ｉｉ）の］必須アミノ酸のレベルを満たすか否かを客観的に決定することが可能である。
【００３８】
本明細書に記載の新規なバチルス組成物は、動物用飼料へのプロバイオティック添加物として使用してもよい。用量および投与は、例えば先行技術のGalliPro（登録商標）バチルス組成物について行うのと同様にして、当該技術に従って行ってもよい。
【００３９】
したがって、本発明の第２の態様は、第１の態様および本明細書中に記載の関連する実施形態のバチルス組成物を他の動物用飼料の材料と併せて動物に投与することを含む、動物への給餌方法に関する。
【００４０】
本発明の第３の態様は、新規なバチルス細胞をスクリーニングし単離する方法であって、以下の工程：
（ａ）第１の態様の項目（ｉ）の条件下で１８時間および１９時間未満以内に栄養細胞増殖点に達する程に迅速に発芽および成長することが可能な新たなバチルス芽胞細胞の個々のバチルス芽胞細胞のプールから選択し単離すること；
（ｂ）工程（ａ）の単離した芽胞細胞から栄養バチルス細胞を作製し、選択し単離した新規な細胞に突然変異を起こして新たな個々のバチルス栄養細胞のプールを得ること；
（ｃ）工程（ｂ）の新たな個々のバチルス栄養細胞のプールから、第一態様の項目（ii)の条件下で、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７よりも高い量で、少なくとも１の必須アミノ酸を産生することができる新たなバチルス栄養細胞を選択し単離すること；および
（ｄ）工程（ｃ）の高生産性栄養バチルス細胞を分析して、この細胞が工程（ａ）の迅速な発芽および成長を維持していることを確認し、選択したバチルス細胞を単離すること；
を含む方法に関する。
【００４１】
本発明者らが、適切な試験アッセイ（特に実施例１の、迅速な発芽および成長を試験するためのアッセイ）、加えて参照株ＤＳＭ１９４６７を本明細書中において一旦開示したならば、本明細書中の第１の態様の基準を満たす他の新たなバチルス細胞を選択することが当業者にとっては日常業務となる、ということは当業者には明白である。
【００４２】
本明細書に記載の通り、本明細書に記載の新規なスクリーニング／選択方法を用いることにより、本発明者らは多くの改良された新たなバチルス細胞を選択かつ単離した。
【００４３】
本発明の実施形態を以下に記載するが、これは単に例示を目的としたものである。
【００４４】
定義
本明細書中の関連用語の全ての定義は、本明細書中の関連する技術的背景との関連で当業者により理解されるものに従う。
【００４５】
「バチルス細胞」という用語は、本明細書中において、バチルス芽胞細胞およびバチルス栄養細胞の両方に関する。
【００４６】
本明細書中においては、バチルス芽胞細胞に関連した「バチルス芽胞」という用語は、当技術分野によれば、バチルス細菌によって生産される、休眠中の、頑丈な、非生殖性構造を特徴とし得る芽胞、に関する。芽胞の主な機能は、通常は、細菌が環境ストレス下の期間を生き延びることを確保することである。したがって芽胞は、紫外線およびγ線、乾燥、リゾチーム、温度、飢餓、ならびに化学殺菌剤に対して耐性である。通常、芽胞は土壌および水中に存在するが、芽胞はそこでは長期間生存することができる。芽胞の外皮は多くの毒性分子に対して不透過性であり、また発芽に関与する酵素も含有する。その中心部は、ＤＮＡおよびリボソーム等の標準的な細胞構造を有するが、代謝的に不活性である。細菌は、環境条件が悪化しつつあることを感知すると芽胞形成のプロセスを開始することがあるが、これには約８時間かかる。
【００４７】
「バチルス栄養細胞」という用語は、分裂してさらに栄養細胞を生産することができる、機能的な栄養バチルス細胞に関する。
【００４８】
「発芽および成長」という用語は、バチルス芽胞が発芽してバチルス栄養細胞に成長することに関する。当業者には公知であるが、芽胞の再活性化は、条件が好適な場合に起こり、発芽および成長を伴う。発芽においては、休眠芽胞が代謝活動を開始し、そして冬眠状態から脱する。通常、発芽は、芽胞の外皮の破裂または吸収、芽胞の膨張、代謝活性の増加、および環境ストレスに対する耐性の喪失を特徴とする。発芽に続いて成長が起こるが、成長においては、芽胞の中心部が新たな化学成分を生産し、古い芽胞の外皮を脱ぎ捨て、分裂してさらに細胞を生産することができる機能的な栄養細菌細胞へと進化する。バチルス細胞の増殖曲線（ＯＤ対時間）は明確な増殖相を示している。芽胞が富栄養培地に移されると発芽が始まり、続いてＯＤが一時的に減少する（相Ｉ）。これは、ジピコリン酸が放出された結果芽胞の外皮が水和したことに起因する。第２の相（相ＩＩ＝成長相）ではＯＤの変化が比較的小さい期間が存在するが、これは芽胞が機能的な栄養細菌細胞へと進化するまでであり、この細胞は分裂してさらに細胞を生産することができ、それによりＯＤ値が継続的な上昇を示す。ＯＤ値の継続的な増大の確認を開始して０．４のＯＤに達した時の点を、本明細書中において「栄養細胞増殖点」と呼ぶ。
【００４９】
「光学濃度」という用語は、分光光度計を用いた吸光度の測定値と定義される。光学濃度（ＯＤ）は、単位距離当たりの所定の波長λについての光学素子の吸収度である。例えばＯＤを波長６３０ｎｍで測定した場合、ＯＤ630と呼ぶこともある。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】この図では、本明細書の改良された新規な株に到達するための工程が図示されている。本明細書中の実施例は、ＤＳＭ１７２３１（GalliPro（登録商標））から出発し、これに古典的な突然変異を起こさせ、胆汁酸塩の存在下で迅速な発芽および成長を示すものをスクリーニング／選択し、新規な選択された株ＤＳＭ１９４６７を得た。ＤＳＭ１９４６７を古典的突然変異の出発株として用い、必須アミノ酸高生産性株を選択した。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、本明細書に記載の４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩の存在下における、ＤＳＭ１７２３１と比較した、本発明のＤＳＭ１９４６７バチルス芽胞の向上した迅速な発芽および成長を明確に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
バチルス組成物：
「バチルス組成物」という用語は、当技術分野に従って理解される。本明細書中においては、目的の性質を有する多くのバチルス芽胞細胞を含むバチルス組成物と理解される。
【００５２】
バチルス組成物は、異なる種類のバチルス細胞（例えばＢ．ズブチリスおよびバチルス・リケニフォルミス）を含んでもよい。基本的には、組成物は、本明細書中の第１の態様で定められている量の、第１の態様で定められている基準を満たすバチルス芽胞細胞を単に含むものである。
【００５３】
当業者には公知であるが、本明細書中の商業的に適切なバチルス芽胞細胞組成物は、通常は醗酵により生成される。通常、得られた芽胞細胞は、濃縮され、乾燥され、担体と混合され、次いで好適な容器に詰められる。
【００５４】
組成物の、例えば１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇの適切なバチルス細胞は、当業者に公知の商業的に適切な形態で存在してもよい。
【００５５】
したがって、ある実施形態においては、組成物の１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス芽胞細胞は、乾燥（例えば噴霧乾燥）した細胞または凍結した芽胞細胞として存在する。
【００５６】
好ましい実施形態においては、バチルス組成物は、１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス芽胞細胞、より好ましくは１０7〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス芽胞細胞を含む。
【００５７】
「ＣＦＵ／ｇ」という用語は、組成物そのもののグラム重量に関し、組成物中に存在する好適な適切な添加剤も含まれる。バチルス組成物の包装に用いる好適な容器の重量は含まれない。
【００５８】
ある実施形態は、バチルス組成物が好適な容器に包装されることに関する。
【００５９】
当業者には公知であるが、通常、商業的に適切な細菌組成物は、例えば、乳清、乳清透過物、炭酸カルシウム／石灰石に属する群のうちの１つの担体／成分、ならびにケイ酸アルミニウムおよび珪藻土（kieselgur）（ケイソウ土）等の固化防止剤等の他の適切な添加剤もまた含む。
【００６０】
本明細書中の適切なバチルス細胞の他に、組成物は、例えば目的の乳酸菌等の、他の適切な目的の微生物もまた含んでもよい。
【００６１】
バチルス細胞
バチルス細胞は、いずれかの適切な目的のバチルス細胞であってもよい。
【００６２】
好ましい実施形態においては、バチルス細胞は、
バチルス・ズブチリス、バチルス・ユニフラゲラツス（Bacillus uniflagellatus）、バチルス・ラテロプソルス（Bacillus lateropsorus）、バチルス・ラテロスポルスＢＯＤ（Bacillus laterosporus BOD）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステロテルモフィルス（Bacillus sterothermophilus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・テルモフィルス（Bacillus thermophilus）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、およびバチルス・シルクランス（Bacillus circulans）
からなる群より選択されるバチルス種より選択される少なくとも１つのバチルス細胞である。
【００６３】
より好ましい実施形態においては、バチルス細胞は、Ｂ．ズブチリス細胞またはバチルス・リケニフォルミス細胞である。
【００６４】
最も好ましいのは、バチルス細胞がＢ．ズブチリス細胞である場合である。
【００６５】
胆汁酸塩の存在下で迅速な発芽および成長を示すものを選択するためのアッセイ
上記の通り、第１の態様の項目（ｉ）の胆汁耐性アッセイは、公知の市販の標準的な要素（例えば標準的な培地、胆汁酸塩；標準的なＯＤ測定法）に基づいている。
【００６６】
したがって、本明細書中の詳細なアッセイの説明（例えば本明細書中の実施例１を参照のこと）を基に、当業者は、日常的に、このアッセイを繰り返して、目的の特定のバチルス芽胞細胞が項目（ｉ）に記載の迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長の基準を満たすか否かを客観的に決定することが可能である。
【００６７】
項目（ｉ）において、栄養細胞増殖点は、約０．２〜０．３のＯＤに相当する１０8芽胞／ｍｌで開始し、ＯＤ値が（栄養細胞の増殖によって）連続的に上昇してＯＤ０．４に達した時点までの増殖曲線上の点である、と説明されている。これは、当業者によるそのような栄養細胞増殖点の理解と一致するものであり、当業者は、本明細書中で説明した通り、増殖曲線を基に、およそ±３０分の限定的なばらつきの範囲内で、これを日常的に決定することができる。
【００６８】
本明細書中の実施例１は、胆汁酸塩の存在下で迅速な発芽および成長を示すものを選択するのに好適な胆汁耐性アッセイの詳細な説明を提供している。この実施例１の詳細な条件は、本明細書中において、目的のバチルス芽胞細胞が第１の態様の項目（ｉ）の基準を満たすか否かを決定する好ましいアッセイである。
【００６９】
「胆汁酸塩」という用語は、胆汁酸の塩に関する。胆汁酸は、哺乳動物の胆汁中に優勢に存在するステロイド酸である。胆汁酸は、コレステロールの酸化により肝臓で生産され、胆嚢に貯蔵され、次いで塩の形態で腸内に分泌される。胆汁酸は、界面活性剤として働き、脂質を乳化してその吸収および消化を助ける。実施例１で使用した胆汁酸塩は、ブタ胆汁酸塩の生理的濃度および組成を模して調製した。当業者には公知であるが、ブタ胆汁酸塩の組成は、本明細書中において、鳥類の胆汁酸塩の組成に比べると比較的「過酷な」条件と考えられ得る。
【００７０】
「胆汁酸塩培地」という用語は、適切な栄養素等のバチルス増殖成分および胆汁酸塩を含む培地に関する。
【００７１】
胆汁酸塩アッセイにおける栄養細胞増殖点‐第１の態様の項目（ｉ）
上記の通り、第１の態様の項目（ｉ）に関して、バチルス芽胞細胞は、本明細書に記載の通り、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩にて、それぞれ１８時間および１９時間未満以内に０．４ＯＤの栄養細胞増殖点に達する程に迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長を示す。
【００７２】
上記の通り、新規なＤＳＭ１９４６７株は、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩中において、それぞれ１４時間および１５時間のインキュベーション後に栄養細胞増殖点に達する。
【００７３】
したがって、好ましい実施形態においては、バチルス芽胞は、第１の態様の項目（ｉ）の条件下で、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩中において１７時間および１８時間のインキュベーション後に栄養細胞増殖点に達し、より好ましくは、バチルス芽胞は、第１の態様の項目（ｉ）の条件下で、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩中において１５時間および１６時間のインキュベーション後に栄養細胞増殖点に達する。
【００７４】
上記で説明した通り、また図１に模式的に示す通り、突然変異誘発の出発株として市販のGalliPro（登録商標）を使用し、本明細書に記載の胆汁酸塩の存在下で迅速な成長を示すものを選択することにより、本明細書中に記載の新規なＤＳＭ１９４６７株を選択した。
【００７５】
GalliPro（登録商標）は、バチルス・ズブチリス細胞を含む組成物であり、バチルス・ズブチリスは、ＤＳＭ１７２３１として寄託されている。したがってGalliPro（登録商標）は、本明細書中において参照株と見なすことができる。
【００７６】
上記の通り、GalliPro（登録商標）の栄養細胞増殖開始点は、第１の態様の項目（ｉ）の条件下での、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩中におけるインキュベーション後２０時間である。したがって、ある実施形態においては、バチルス芽胞は、第１の態様の項目（ｉ）の条件下で、ＤＳＭ１７２３１（「GalliPro（登録商標）」）として寄託されている参照バチルス・ズブチリス芽胞細胞よりも少なくとも３時間早く栄養細胞増殖点に達し、より好ましくは、第１の態様の項目（ｉ）の条件下で、ＤＳＭ１７２３１（「GalliPro（登録商標）」）として寄託されている参照バチルス・ズブチリス芽胞細胞よりも少なくとも４時間早く栄養細胞増殖点に達し、最も好ましくは、第１の態様の項目（ｉ）の条件下で、ＤＳＭ１７２３１（「GalliPro（登録商標）」）として寄託されている参照バチルス・ズブチリス芽胞細胞よりも少なくとも５時間早く栄養細胞増殖点に達する。
【００７７】
必須アミノ酸
当業者には公知であるが、必須アミノ酸は、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、およびアルギニンからなる群より選択される必須アミノ酸であってもよい。
【００７８】
好ましい実施形態においては、必須アミノ酸は、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、およびリジンからなる群より選択される少なくとも１つの必須アミノ酸である。
【００７９】
より好ましい実施形態においては、必須アミノ酸は、バリン、イソロイシン、およびロイシンからなる群より選択される少なくとも１つの必須アミノ酸である。
【００８０】
本明細書中における非常に適切な必須アミノは、ロイシンである。
【００８１】
当業者が理解しているように、バチルス栄養細胞は、例えばより多い量の２つまたは３つ以上の異なる必須アミノ酸といった、より多い量の２つ以上の必須アミノ酸を生産することができる。
【００８２】
アミノ酸アッセイ
上記の通り、第１の態様の項目（ｉｉ）のアミノ酸アッセイは、標準的な公知の市販の要素（例えば標準的な培地、標準的な試験等）に基づいている。
【００８３】
したがって、本明細書中の詳細なアッセイの説明（例えば本明細書中の実施例２を参照のこと）を基に、当業者は、日常的に、このアッセイを繰り返して、目的の特定のバチルス栄養細胞が項目（ｉｉ）に記載の必須アミノ酸の生産量を満たすか否かを客観的に決定することが可能である。
【００８４】
本明細書中の実施例２は、必須アミノ酸アッセイの詳細な説明を提供している。
【００８５】
この実施例２の詳細な条件は、本明細書中において、目的のバチルス栄養細胞が第１の態様の項目（ｉｉ）の基準を満たすか否かを決定する好ましい必須アミノ酸アッセイである。
【００８６】
必須アミノ酸の生産量‐第１の態様の項目（ｉｉ）
第１の態様の項目（ｉｉ）に関して、バチルス栄養細胞は、好ましくは、第１の態様の項目（ｉｉ）の条件下で、少なくとも１つの必須アミノ酸を、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７の少なくとも２倍の量生産している。
【００８７】
より好ましい実施形態においては、第１の態様の項目（ｉｉ）に関して、バチルス栄養細胞は、好ましくは、第１の態様の項目（ｉｉ）の条件下で、少なくとも１つの必須アミノ酸を、参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７の少なくとも４倍の量生産している。
【００８８】
バチルス芽胞の動物への給餌／投与方法
上記の通り、本発明の第２の態様は、第１の態様および本明細書中に記載の関連する実施形態のバチルス組成物を他の動物用飼料の材料と併せて動物に投与することを含む、動物への給餌方法に関する。
【００８９】
動物は、いずれかの目的の動物であってもよい。好ましくは、動物は、家禽、反芻動物、子牛、ブタ、ウサギ、ウマ、魚、およびペットからなる群より選択される動物である。
【００９０】
当該技術に従ってGalliPro（登録商標）を投与する場合、標準的には、飼料１ｇ当たり約１０4〜１０8ＣＦＵ、通常は飼料１ｇ当たり１０5〜１０6ＣＦＵの用量で、または動物の生体重１ｋｇ当たりの標準的飼料摂取量と同等の用量で行われる。
【００９１】
あるいは、バチルス芽胞は、次の方法のいずれか１つにより、動物に投与してもよい：
（１）動物用の飲料水に入れる；
（２）動物に噴霧する；または
（３）ペースト、ゲル、またはボーラスによる適用。
【００９２】
新規なバチルス細胞のスクリーニングおよび単離方法
上記の通り、第３の態様は、新規なバチルス細胞のスクリーニングおよび単離方法に関する。
【００９３】
第３の態様の方法においては、第１の態様の項目（ｉ）および（ｉｉ）の条件を満たすことが可能なバチルス細胞を選択する。
【００９４】
当業者が理解しているように、本明細書中で詳細に説明されている胆汁耐性アッセイおよび必須アミノ酸量アッセイ（例えば、胆汁耐性アッセイについては本明細書中の実施例１、また必須アミノ酸アッセイについては本明細書中の実施例２を参照のこと）の具体的なパラメーターは、本明細書に記載の主な目的、すなわち第１の態様の項目（ｉ）および（ｉｉ）の条件を満たすことが可能なバチルス細胞、をやはり得ることができる代わりのスクリーニング法を作るために変更してもよい。
【００９５】
好ましい実施形態においては、実施例１の胆汁耐性アッセイは、第３の態様のスクリーニング法の工程（ａ）で使用され、実施例２の必須アミノ酸アッセイは、第３の態様のスクリーニング法の工程（ｃ）で使用される。
【００９６】
第３の態様のスクリーニング法の工程（ｄ）では、栄養バチルス細胞が単離される。この栄養バチルス細胞を用いてバチルス芽胞を形成させてもよい。
【００９７】
したがって、ある実施形態においては、第３の態様のスクリーニング法には追加の工程（ｅ）が続き、この工程では、工程（ｄ）で単離したバチルス栄養細胞を醗酵させて１０5〜１０12個のバチルス栄養細胞を形成させ、これらの１０5〜１０12個のバチルス栄養細胞を用いて１０5〜１０12個のバチルス芽胞細胞を形成させ、これらを単離して１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス芽胞細胞を含むバチルス組成物を得る。
【００９８】
工程（ｅ）の最終結果は、第１の態様の項目（ｉ）および（ｉｉ）の条件を満たすことが可能である１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス芽胞細胞を含む、新規なバチルス組成物である。
【００９９】
したがって、本発明の別の態様は、第１の態様の項目（ｉ）および（ｉｉ）の条件を満たすことが可能である１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇのバチルス芽胞細胞を含み、上記の追加の工程（ｆ）が続く第３の態様のスクリーニング法により得ることができるバチルス組成物に関する。
【０１００】
工程（ｂ）では、工程（ｃ）で必須アミノ酸高生産性細胞を選択するために、先に選択した胆汁耐性バチルス細胞の突然変異を起こす。当業者が理解しているように、これは、例えば、遺伝子を特異的に交換していわゆる遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）を作製する古典的な突然変異（例えば化学処理またはＵＶ）によるものであり得る。
【０１０１】
寄託株
新規なバチルス・ズブチリス株の試料は、寄託日２００７年６月２７日、受託番号ＤＳＭ１９４６７で、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig）に寄託されている。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に行わていれる。
【実施例】
【０１０２】
実施例１：胆汁耐性アッセイ
培地：
培地は、標準的な市販の非選択的培地である子牛インフュージョンブロス（ＶＩＢ）（Difco, 234420）であった。
【０１０３】
本出願の出願日において、供給元であるＢＤダイアグノスティック・システムズ社（BD Diagnostic Systems）（ｗｗｗ．ｂｄ．ｃｏｍ）の製品カタログ（"Difco(商標)/BBL(商標) Manual）には、子牛インフュージョンブロスに関して、
「子牛赤身からの浸出物とペプトンとにより、子牛インフュージョン培地中で、窒素、ビタミン、炭素、およびアミノ酸が得られる。塩化ナトリウムにより、配合物の浸透圧バランスが維持される」と記載されており、
製造指示書に従い、２５ｇの子牛インフュージョンブロス粉末を１Ｌの精製水に懸濁（２．５％溶液）させ、頻繁に攪拌しながら加熱し、次いで１分間沸騰させて粉末を完全に溶解させることにより培地を調製した。２．５％子牛インフュージョンブロス溶液は、１リットル当たり：
子牛赤身浸出物：１０ｇ
プロテオースペプトン：１０ｇ
塩化ナトリウム  ５ｇ
を含んでいた。
【０１０４】
培地を滅菌瓶に分注し、１２１℃で１５分間オートクレーブした。
【０１０５】
胆汁塩溶液／培地：
胆汁酸塩の混合物を、ブタ胆汁中の胆汁酸塩の生理的組成および濃度を模して調製し、この胆汁酸塩を、上記で調製した子牛インフュージョンブロス培地に溶解させて、最終胆汁酸塩濃度を８ｍＭとした。
【０１０６】
抱合型胆汁酸塩は、タウロデオキシコール酸（シグマ社Ｔ−０８７５、米国）およびグリコデオキシコール酸（シグマ社Ｇ−９９１０、米国）であり、脱抱合型胆汁酸塩は、デオキシコール酸（シグマ社Ｄ−５６７０、米国）であり、最終濃度８ｍＭの胆汁酸塩混合溶液は、６０％のタウロデオキシコール酸、３０％のグリコデオキシコール酸、および１０％のデオキシコール酸を含有していた。１２１℃で１５分間オートクレーブする前に、水酸化ナトリウムを用いて溶液をｐＨ７．４に調整した。調製した８ｍＭ胆汁酸塩培地を希釈して、０、１、２、４、６、および８ｍＭの胆汁酸塩濃度を得た。
【０１０７】
胆汁酸塩を、子牛インフュージョンブロス培地に濃縮状態で加えた。
【０１０８】
したがって、子牛赤身浸出物、プロテオースペプトン、および塩化ナトリウムの最終量は、胆汁酸塩を加える前の２．５％子牛インフュージョンブロス培地での量と実質的に同じであった。
【０１０９】
芽胞懸濁液
栄養細胞と芽胞とを区別して純粋な芽胞接種用生成物を確保するため、バチルス生成物の芽胞数を、８０℃で１０分間の＋／−加熱処理を用いて測定した。加熱処理に続いて室温に冷却した後、１０倍系列希釈を食塩加ペプトン水中で行った。トリプトース血液寒天プレート（Difco 0232-01）の複製に、適当な１０倍希釈物からの０．１ｍｌを接種した。プレートを３７℃で翌日までインキュベートした。前述の生成物の芽胞数測定に基づいて、芽胞懸濁液を、最終的に算出される芽胞濃度が１０8ＣＦＵ／ｍｌに達するように滅菌蒸留水中で調製した。最終接種材料中の栄養細胞および芽胞の数を、上記の方法を用いて測定した。最終濃度１０8ＣＦＵ／ｍｌは、０．２〜０．３の開始ＯＤ630に相当していた。
【０１１０】
増殖測定：光学濃度測定
滅菌平底９６ウェルマイクロタイタープレートを用いた（グライナー・バイオ・ワン社（Greiner Bio-one GmbH）、ドイツ）。各ウェルを、芽胞（１ｍｌ当たり約１×１０8芽胞、開始ＯＤ630約０．２〜０．３と同等／に相当）を接種した０．１５０ｍｌのＶＩＢで満たし、プレートを、各読取りの前に、強度４（高）の１分間の振盪サイクルにて３７℃で２０時間インキュベートした。
【０１１１】
プレートカバーの内側での濃縮を避けるため、蓋をTriton X-100の希釈溶液にさらした。
【０１１２】
バチルス株の発芽および成長の動態を、分光光度計（バイオテック・インスツルメンツ社（Bio-tek Instruments, Inc.）、ヴァーモント州）を用いて、波長６３０ｎｍ（ＯＤ630）にて測定した。１０分間隔で読取りを行い、KC4（商標）ソフトウェア（バイオテック・インスツルメンツ社、米国）を用いて解析した。２０時間後、データをExcel（登録商標）スプレッドシートにエクスポートしてさらに解析を行い、ＳＡＳバージョン９．０にインポートして統計的に解析した。
【０１１３】
実施例２：アミノ酸アッセイ
本研究で用いるバチルス細胞により生産されるアミノ酸を測定および定量する方法は、誘導化剤としてクロロギ酸メチルを用いる、水試料についての標準的なＧＣ−ＭＳ法である。
【０１１４】
バチルス細胞の増殖
最少塩増殖培地にバチルス細胞を接種して３７℃、１５０ｒｐｍで増殖させ、２日間増殖させ、次いで、下記の通りアミノ酸の量を上清中で測定した。
【０１１５】
バチルス細胞を、以下の組成のＣｈａｐｍａｎ（１９７２）の最少塩培地中で繁殖させる：
（ＮＨ4）2ＳＯ4（メルク社  １．０１２１７．１０００）  １ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4（メルク社  １．０５１０１．１０００）  ７ｇ／ｌ
ＫＨ2ＰＯ4（メルク社  １．０４８７３．１０００）  ３ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（メルク社  １．０５８８６．１０００）  ０．１ｇ／ｌ
【０１１６】
１２１℃で１５分間オートクレーブし、オートクレーブしたグルコースを加えて終濃度０．５％とする。
【０１１７】
１０ｍｌの培地を含む管内にて、３７℃および１５０ｒｐｍで２日間インキュベートを行う。
【０１１８】
アミノ酸アッセイ
アミノ酸アッセイは、アミノ酸が培地に分泌されるため、細胞上清で行う。試料を滅菌濾過し、解析するまで−２０℃で保持する。
【０１１９】
試薬：
試薬１：内部標準溶液。ノルバリン  １ｍＭ：０．０１７２ｇのノルバリン＋１００ｍｌのＭＱＷ
試薬２：メタノール／ピリジン  ３２／８（ｖ／ｖ）（触媒）
試薬３：クロロギ酸メチル  ｐ．ａ．（ＭＣＦ）（誘導化剤）
試薬４：１％  ＭＣＦ／ＣＨＣｌ3（ｖ／ｖ）（抽出液）：１ｍｌのクロロギ酸メチル  ｐ．ａ．＋クロロホルム  ａｄ  １０００ｍｌ。
【０１２０】
試料調製：
・１５０μｌ（２５μｌ＋１２５μ  ＭＱＷ）の試料を、ピペットで２ｍｌ注入バイアルに入れる。
・１５０μｌのＩＳを加える
・２００μｌの１−メタノール／ピリジン  ３２／８％（ｖ／ｖ）を加える。よく混合する。
・２５μｌのＭＣＦ（クロロギ酸メチル）を加える。ガス発生が生じるまでよく混合する。
・５００μｌの１％  ＭＣＦ／ＣＨＣｌ3（ｖ／ｖ）を加え、蓋をして激しく混合する。数分以内に相分離が起きる。相分離が遅すぎる場合は、バイアルを遠心分離する（５００ｒｐｍ／１０分）。
【０１２１】
ノルバリンを代謝拮抗物質として用いる場合は、外部標準または他の好適な内部標準を代わりに用いるべきであり、１５０μｌのＩＳは、ＭＱＷまたは試料のいずれかに代えるべきである。
【０１２２】
試料を、標準的なアミノ酸カラムおよびプロトコルを用いるＧＣ−ＭＳにかける。
【０１２３】
実施例３：胆汁耐性バチルス・ズブチリス細胞ＤＳＭ１９４６７の選択
出発バチルス細胞は、バチルス・ズブチリス細胞GalliPro（登録商標）であった。
【０１２４】
GalliPro（登録商標）に突然変異を誘発させて新たな個々のバチルス細胞のプールを得る。上記実施例１に記載の通り、芽胞を形成させ、４ｍＭおよび６ｍＭの胆汁酸塩を含む胆汁酸塩培地の存在下で迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長を示すものを選択した。
【０１２５】
バチルス・ズブチリス細胞ＤＳＭ１９４６７を選択した。
【０１２６】
下記表１は、発芽および成長のデータを示す。
【０１２７】
時間（時間）は、ＯＤ０．２〜０．３に相当する１０8ＣＦＵ／ｍｌからの、ＯＤ０．４に達するまでの時間である（３回の反復の平均）。
【０１２８】
【表１】
0005711144.tif 000002
【０１２９】
本実施例のデータのいくつかは、ＤＳＭ１９４８９を過剰発現するフィターゼを試験することにより作成した。しかしながら本実施例の技術的結果に関しては、ＤＳＭ１９４６７はＤＳＭ１９４８９と概ね同程度の発芽および成長を示すため、これは本明細書中において比較的不適切である。さらなる詳細については、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７２９６を参照されたい。
【０１３０】
結論
ＤＳＭ１９４６７は胆汁耐性株であり、GalliPro（登録商標）よりも明らかに急速に発芽および成長している。
【０１３１】
実施例４：ＤＳＭ１９４６７からのアミノ酸過剰生産性バチルス細胞の選択
出発バチルス細胞は、実施例３で選択したバチルス・ズブチリス細胞ＤＳＭ１９４６７であった。
【０１３２】
野生型または例えばＵＶ突然変異誘発により生産された変異体のいずれかのＤＳＭ１９４６７を、上記の実施例２Ｂに記載の最少塩寒天培地で増殖させ、好適な阻害量のアミノ酸類似体を含有する１．５％寒天を加えた。過剰発現させるアミノ酸に応じて、ノルバリン、またはロイシンを過剰生産させるための４−アザ−ＤＬ−ロイシン（Bardos, 1974, Topics in Current Chemistry 52, 63-98）等の、種々のアミノ酸類似体を用いることが可能であった。アミノ酸類似体に対して耐性のコロニーを採取し、最少塩培地で増殖させ、次いでアミノ酸生産量をアッセイした。栄養細胞は、上記実施例２Ｂに記載のＧＣ−ＭＳ法を用いることにより、大量のアミノ酸を生産するものを選択した。アミノ酸高生産性バチルス・ズブチリス細胞を選択した。
【０１３３】
アミノ酸測定結果
必須アミノ酸であるロイシンを参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７よりも有意に多い量で生産していた多くの株を選択した。
【０１３４】
選択した多くの株は、ＤＳＭ１９４６７よりも少なくとも５倍多くロイシンを生産した。
【０１３５】
結論：
本実施例から、少なくとも１つの必須アミノ酸（ここではロイシンを例とする）を参照バチルス細胞ＤＳＭ１９４６７よりも有意に多い量で生産する株を、本明細書中の指示に基づいて、日常的にスクリーニングおよび同定できることがわかる。
【０１３６】
ＤＳＭ１９４６７はGalliPro（登録商標）に由来するものであって、必須アミノ酸を高生産するために選択されるものではない。したがって、GalliPro（登録商標）は、ＤＳＭ１９４６７とおよそ同じ量の必須アミノ酸を生産すると考えられる。
【０１３７】
実施例５：必須アミノ酸高生産性バチルス細胞の胆汁耐性「確認」
実施例４で選択した好ましい必須アミノ酸高生産性バチルス細胞の、実施例１に記載の、発芽および芽胞から栄養細胞への成長を迅速に行う能力を再確認する。
【０１３８】
結果は予想通り、当該細胞は、当該細胞を得るのに用いた出発細胞ＤＳＭ１９４６７とおよそ同程度の良好な迅速な発芽および成長を維持していた。
【０１３９】
参考文献
１．Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. Epub 2006 Jul 4
２．米国特許出願公開第２００３／０１２４１０４（Ａ）号
３．米国特許第６２５５０９８号
４．国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７２９６
【図１】
0005711144.tif 000003
【図２】
0005711144.tif 000004