(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部刺激を検出するためのインジケータ系であって、一般式
【化１】
0005711218.tif 000069
（式中：
ＸはＯ、ＮＨまたはＳであり、
ＬＧは不安定基であって、Ｘ−ＬＧ部分は、前記外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、および任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
Ｒ５は、水素またはＲ１２のいずれかであり、ここでＲ１２は、
【化２】
0005711218.tif 000070
（式中：
Ｚは、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される）であるインジケータ化合物を含み、かつ、
Ｒ５が水素である場合、インジケータ系はさらに一般式
【化３】
0005711218.tif 000071
（式中：
ＲａおよびＲｂは独立して水素およびＣ１〜４アルキルから選択される）の受容体化合物を含む、インジケータ系。
【請求項２】
Ｒ５が水素であり、前記受容体化合物（Ｂ）が２−メトキシ−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンズアルデヒドである、請求項１記載のインジケータ系。
【請求項３】
ＬＧが、ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ（ＴＢＤＭＳ）、アセテート、コリンホスフェート、アルファ−Ｄ−グルコピラノシド、ベータ−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−ガラクトサミニドおよびベータ−Ｄ−グルコピラノシドからなる群より選択される、請求項１記載のインジケータ系。
【請求項４】
Ｒ１０が水素、メチル、メトキシ、フェニル、ＤＭＰ、ＣＦｕｒ、Ｆｕｒ、ＮＰｙｒ（ここで、
【化４】
0005711218.tif 000072
である）
からなる群より選択される、請求項１記載のインジケータ系。
【請求項５】
対象の領域における外部刺激を検出する方法であって、
対象の領域にインジケータ系を提供するステップ、および
前記外部刺激の結果として形成されるシグナロフォア種からのシグナルについてモニタリングするステップ
を含み、
前記インジケータ系が請求項１で定義した通りであり、Ｘ−ＬＧ部分が前記外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、前記変換が、エノール部分（前記エノール部分において、ＸＨは、二重結合によってさらなる炭素原子に結合した炭素原子と結合している）を含むシグナロゲン種の形成をもたらし、前記シグナロフォア種が前記エノール部分と、カルボニル、イミノおよびチオカルボニルから選択される受容体部分との反応により形成されることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記受容体部分がカルボニル部分である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記カルボニル部分が、一般式
【化５】
0005711218.tif 000073
（式中：
ＲａおよびＲｂは、独立して水素およびＣ１〜４アルキルから選択される）
の受容体化合物を添加することによって提供される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
受容体化合物（Ｂ）が２−メトキシ−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンズアルデヒドである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記受容体部分がインジケータ分子の一部である、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
インジケータ系が請求項１で定義された通りであり、Ｒ５が水素である場合、シグナロフォア種は、構造式
【化６】
0005711218.tif 000074
を有する２−ベンジリデンインドリンであり、Ｒ５がＲ１２である場合、シグナロフォア種は、構造式
【化７】
0005711218.tif 000075
（式中、Ｒ１３はＯＨまたはＲ１０のいずれかである）を有する１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドールである、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
酸素が枯渇した条件下で実施される、請求項５記載の方法。
【請求項１２】
一般式
【化８】
0005711218.tif 000076
（式中、
ＸはＯ、ＮＨまたはＳであり、
ＬＧは不安定基であって、Ｘ−ＬＧ部分は、前記外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、および任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
Ｒ５がＲ１２
【化９】
0005711218.tif 000077
（式中、
Ｚは、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される）である）
のインジケータ化合物を調製する方法であって、
一般式
【化１０】
0005711218.tif 000078
のインドキシル化合物を一般式
【化１１】
0005711218.tif 000079
（式中、Ｑは、ヨード、ブロモ、トリフレートおよびトシレート、好ましくはヨードまたはブロモから選択される脱離基である）
のベンゼン誘導体でＮ−アリール化するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
構造式
【化１２】
0005711218.tif 000080
（式中、ＸはＯ、ＮＨまたはＳであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１３は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される）
の化合物であって、以下の化合物：
【化１３】
0005711218.tif 000081
0005711218.tif 000082
を除く化合物。
【請求項１４】
外部刺激を検出するためのインジケータ系におけるシグナロフォアとしての、構造式
【化１４】
0005711218.tif 000083
（式中、ＸはＯ、ＮＨまたはＳであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１３は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される）
の化合物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的環境、温度または光照射などの外部刺激に反応する新種の発色性および蛍光発生性のインジケータを開示する。新規インジケータは、例えば生物系または光データ記憶に関する多様な用途において幅広い可能性を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インジケータは、外部刺激（「ｅＳ」とも表示）に反応して検出可能なシグナル（「ｄＳ」とも表示）を生成する物質である。そのような刺激としては、典型的には、温度、光（感光性または光発色性インジケータ）、電界（エレクトロクロミックインジケータ）、圧力（圧電インジケータ）、イオン濃度（例えばｐＨインジケータ）および生化学的反応性（例えば酵素インジケータ）が挙げられる。
【０００３】
刺激を検出可能なシグナルに翻訳する機構を、スキームＩに例示し、これは典型的には刺激の経験を介したプロセスにおけるインジケータの不安定な基（「ＬＧ」とも表示）の化学的除去または修飾を含む。
【０００４】
【化１】
0005711218.tif 000002
不安定な基の除去または修飾によって、多くの場合、活性化されたシグナロゲン（「ａＳ」とも表示）が生じ、これは、しばしば補助試薬（「ａＲ」とも表示）と相互作用して、シグナロフォア（「ＳＰ」とも表示）（通常、検出可能なシグナルの発生と同時に形成される）を生成することを含むさらなる変化を典型的に経る。したがって、インジケータとは、不安定な基によってマスクされる、すなわち不活性化される活性化シグナロゲンを表す。インジケータ系（「ＩＳ」とも表示）は、活性化シグナロゲンの要素、不安定基、補助試薬（任意）、検出可能なシグナル、および検出可能なシグナルを調べるために適した手段を含む。検出可能なシグナルの外見は、外部刺激を経験した結果であり、このため、適した器具の使用または人間の肉眼での調査による外部刺激の容易な検出および／または定量化を可能にする。
【０００５】
検出可能なシグナルの例としては、光学濃度、吸収もしくは発光における変化（例えば発色性、蛍光発生および発光性インジケータ）または電流もしくは電位における変化（電気発生インジケータ）が挙げられる。
【０００６】
検出可能なシグナルは、本来、一過性または持続性であり得る。例えば、蛍光発生酵素インジケータは、ある酵素活性を経験すると、蛍光体を放出し得る。この場合、検出可能なシグナルは、本来、持続性である。対照的に、生物発光性インジケータは、ＡＴＰの存在に反応して発光し得る。検出可能なシグナルを表す発光は、本来、一過性である。
【０００７】
検出可能なシグナルは、一過性または持続性の外部刺激と関係し得る。例えば、ｐＨインジケータは、持続性の外部刺激を示すプロトン濃度の変化に反応し連続して変色する。この場合、対応するインジケータは可逆的に変化し、可逆的インジケータ系と称される。対照的に、光不安定インジケータは、短いレーザーパルスに反応した持続性変色を経る場合がある。この場合、対応するインジケータは外部刺激を一回経ると不可逆的に変化し、不可逆的インジケータ系と称される。
【０００８】
不可逆的インジケータに関して、生物学、診断法、化学および光データ記憶をはじめとする多数の重要な技術的用途が存在する。
生物学で使用されるインジケータは、多くの場合、酵素活性に反応する。酵素インジケータは、多くのアッセイフォーマットで使用される。そのようなアッセイは、可溶性インジケータ系を必要とする溶液相で実施することができる。
【０００９】
他のアッセイは、酵素活性の物理的な位置を必要とする。この場合、好適なインジケータは、酵素活性と関連した特定の部位を染色する。このために、インジケータは限局的な酵素刺激に反応して不溶性沈殿物を形成しなければならない。この種のインジケータは、不溶性または沈降性インジケータ系と称される。沈降性インジケータ系は、本来、不可逆的である。
【００１０】
酵素活性の検出は、診断および試験用途において、ならびに生化学、分子生物学および組織学研究において重要である。診断において、酵素活性は、微生物病原体の存在、ならびに代謝的機能不全または遺伝的障害に関連する。
【００１１】
免疫学的方法は、抗体と抗原との相互作用に基づく。そのような相互作用を検出するためには、抗体は標識を有していなければならない。酵素は、通常、二次抗体を標識するために用いられる。このため、酵素活性の検出は、免疫学的アッセイの基本となる。免疫学的アッセイは、臨床診断法、食物および環境試験、ならびにウエスタンブロット法などの生化学プロトコルで広く用いられている。
【００１２】
分子生物学においては、レポーター遺伝子プロトコルでの酵素活性の検出が必要である。レポーター遺伝子の遺伝子発現は、検出可能な酵素活性を生じさせる。このようにして、研究者は遺伝子形質転換に関する情報を得る。
【００１３】
１−Ｈ−インドクス−３−イル（１−Ｈ−ｉｎｄｏｘ−３−ｙｌ）インジケータ系
１Ｈ−インドクス−３−イル（「インドクス」（Ｉｎｄｏｘ）とも表示）インジケータは、細菌学、免疫学、生化学および遺伝学で酵素活性を視覚化するために広く使われている周知の発色性インジケータである。
【００１４】
インドクスインジケータ系は、１Ｈ−インドール−３−オール（３−ヒドロキシインドール、それぞれの互変異性型インドリン−３−オンまたは３−オキソインドリン、インドキソールと表示）構造由来であり、この構造では、３−ヒドロキシル基の水素原子が不安定基により置換されている。不安定基が失われると、活性化シグナロゲンとしてインドキソールが生じ、これは複雑なラジカル連鎖反応において大気酸素（汎用の補助試薬）と相互作用して、シグナロフォアとしてコロイド状インディゴ染色剤を生じる。インディゴ色素形成と関連した試料の光透過における劇的な変化が、インジケータ系の検出可能なシグナルである。
【００１５】
広範囲にわたって使用され、商業的に重要であるにもかかわらず、インドクスインジケータ系の適用には、幾つかの重大な制限がある。
例えば、インドクスインジケータ系は、所望のインディゴシグナロフォアを発現するために、酸素分子または他の酸化性補助試薬に依存する。その要件のために、インドキシル基質は、嫌気性条件での使用が限定されるかまたは使用できない。酸素の非存在下で実施される酵素アッセイの部分を考慮すると、この制限は重大である。
【００１６】
したがって、酸素分子または他の酸化剤に対して望ましくない依存性がなく、かつインドキシルインジケータと類似の特性を有するインジケータは、最新技術を大幅に向上させるであろう。
【００１７】
赤色インディゴは染色の目的であまり有効でないため、最も一般的なインドクスインジケータは紫色から緑色の範囲の染色を生じる。
しかし、発色性または蛍光発生インジケータ系を使用する場合、色の選択を利用できるようにすることが望ましい。このことは、並列検出を必要とする二重または多重の酵素アッセイで、または灰白色のバックグラウンドに対して光学的コントラストを必要とする用途で特に重要である。
【００１８】
したがって、現在の色選択を黄色から赤色までの範囲に拡大する新規発色性酵素インジケータは、技術的にさらに有益性を増すものであろう。
さらに、一般的な酵素インジケータは、本来、発色性または蛍光発生性のいずれかである。例えば、７−ヒドロキシクマリン（可溶性蛍光発生インジケータ）またはキナゾリン（沈降性蛍光発生インジケータ、例えば特許文献１を参照）などのフルオロフォアに基づく一般的な市販の酵素インジケータは、可視電磁帯で有意な吸収がなく、したがって調査用の光学的装置の利用なしでは人間の肉眼による検出から逃れてしまう。対照的に、３−インドキシルに由来するものなどの一般的な発色性インジケータには蛍光が存在しない。固体状態における蛍光は珍しい現象（緊密な格子中に配置された励起状態の分子の自己消光の周知の効果による）であるため、このことは特に沈降性インジケータに当てはまる。
【００１９】
発色性および蛍光発生特性の両方を有する酵素インジケータが利用可能なものとなれば、現在の最先端技術よりも有利であろう。
ジアゾニウム染色
組織学においては、別の種類のインジケータが周知であり、しばしば酵素活性を限局するために使用される。この重要な方法は、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（非特許文献１）、Ｂｕｒｓｔｏｎｅら（非特許文献２）およびＲｕｔｅｎｂｕｒｇら（非特許文献３）によって創始された。これは、安定化ジアゾニウム塩と電子リッチな芳香族アミンおよびフェノールとが反応して、アゾ色素を形成することに基づく。多くのアゾ色素は強烈な色を有し、いくつかは蛍光性である。
【００２０】
このジアゾニウムカップリング反応は、芳香族アミンおよびフェノールを使用すると、それらの対応するエステルやアミドを使用するよりもはるかに速く進行するであろう。したがって、加水分解酵素活性は、試料を好適なフェノールエステルまたはアニリドに曝露し、続いてジアゾニウム塩で染色することによって検出することができる。基質およびジアゾニウム塩によって、良好な局在化を達成することができる。
【００２１】
実際には、ナフチルアミン（ｎａｐｈｔｙｌａｍｉｎｅ）またはナフトール誘導体などの異なる種類のクロモゲンが使用される。好適なジアゾニウム染色塩とともにこの種の市販の基質は多数存在する。
【００２２】
Ｐｅａｒｓｏｎら（非特許文献４）、Ｙａｒｂｏｒｏｕｇｈら（非特許文献５）、Ｇｏｓｓｒａｕら（非特許文献６）などは、組織学において使用される、インドクスインジケータとジアゾニウム親電子物質との反応に基づく染色法を開発した。
【００２３】
ＭｏｈｌｅｒとＢｌａｕ（非特許文献７）は、インドクスインジケータと様々な市販のジアゾニウム塩とを組み合わせたベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼの多くのインジケータ系を評価した。
【００２４】
しかし、ヒトおよび細胞培養に対する発癌性および高い毒性ならびにジアゾニウム塩の他の危険な性質のために、この方法は使用者に対して著しい危険をもたらし、インビボまたは非破壊的タイプのアッセイには概して適合しないことに注意しなければならない。
【００２５】
上述のすべてを考慮すれば、周囲の環境中に存在する酸素分子または任意の試薬または化学種などの外的因子から完全に独立したプロセスにおいて、シグナロフォアを自発性に生成する活性化シグナロゲンを放出する優れた種類のインジケータが望ましい。
【００２６】
金属キレート
別の種類の沈降性基質は、金属イオンと不溶性錯体を形成する金属キレート化分子に基づく。キレート化分子は、金属イオンに配位結合する２つ以上の官能基を含む。これらの官能基を不安定基によってマスクして、インジケータの比較的一般的なデザインである金属錯体の形成を防止することができる。
【００２７】
金属錯体キレートに基づく酵素インジケータは、いくつかの実際的な関連性を有する。例えば、８−ヒドロキシキノリン−ベータ−Ｄ−グルクロニドなどの８−ヒドロキシキノリン由来の基質または自然発生的なエスクレチン（エスクリン−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド）を用いて、鉄（ＩＩＩ）塩の存在下で対応する酵素を検出することができる。
【００２８】
しかし、これらのインジケータは他の欠点を有する。すなわち、これらのキレート化分子の多くは、培養物に対して殺菌効果を示す。そのような毒性は、任意の金属錯体キレート化剤に内在する。なぜなら、これらは一般的に金属酵素の機能を妨害するからである。さらに、アッセイにおいてある濃度の金属イオンの存在を維持しなければならず、このことは望ましくない障害を引き起こし得る。加えて、金属のキレート化から生じるほとんどの染色は褐色で、このため、背景からの良好なコントラストを提供しない。
【００２９】
例えば、８−ヒドロキシキノリンは、多くの遷移金属と安定な錯体を形成する優れたリガンドである。好適な不安定基でヒドロキシル基をマスクすると、潜在的に有用なインジケータが生じる。アッセイは、活性化シグナロゲンとして８−ヒドロキシキノリンを放出し、これは鉄（ＩＩまたはＩＩＩ）と急速に結合することより暗色の沈降性金属錯体を形成する。さらに、８−ヒドロキシキノリンは、微生物学的アッセイのフォーマットにおいて一部の主要な生物の成長を阻害し得る重要な抗菌活性を有している。
【００３０】
したがって、酵素インジケータは、本来的にアッセイの過程を妨げるキレート化剤または非天然金属イオン濃度とは関与していないことが好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３１】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０６４１３５１号明細書
【非特許文献】
【００３２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９５４，２，２０９−２２９
【非特許文献２】Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９５６，４，２１７−２２６
【非特許文献３】Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９５８，６，１２２−１２９
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐｔｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９６１，１０８，６１９−６１３；Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９６３，１２，７１２−７２０
【非特許文献５】Ｊ．Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｏｃ．１９６７，４，３９０−４０８
【非特許文献６】Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，３９７−４０４
【非特許文献７】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６，１２４２３−１２４２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
本発明は、
・酸素、酸化剤、金属イオン、厳格なｐＨ条件または有毒なジアゾニウム塩などの補助染色試薬を必要とすること、
・アッセイに潜在的に影響を与え得る有毒な試薬、中間体または生成物の存在、
・沈降性発色性インジケータの色が、緑−青−紫の範囲に限定されていること（黄〜赤がない）、
・蛍光発生特性を示す沈降性酵素インジケータの選択の余地がないこと、
・発色性および蛍光発生特性を組み入れた沈降性酵素インジケータがないこと、
などの現行のインジケータの重大な制約を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明は、１Ｈ−インドクス−３−イル化合物およびそれらの誘導体が分子間および分子内アルドール型反応を効率的に経て、事象または環境変化を示すのに適した新しいタイプの色素を生成するという発見に基づく。
【００３５】
「アルドール縮合」という用語は、アルドール供与体基Ｃ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ２またはその互変異性体Ｃ１−Ｃ（ＯＨ）＝Ｃ２（すなわちエノール型）とアルドール受容体Ｃ３−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙとの間の２段階化学反応に関して慣例的に使用される。反応は、（１）後者のカルボニル基に対して前者のカルボニル基を形式的に付加し、それによって供与体のＣ２と受容体のカルボニル炭素原子との間に炭素−炭素結合を形成し、（２）残りのＹの性質に応じて、続いて水（Ｈ２Ｚ、Ｚ＝Ｏ）またはＨＹのいずれかを脱離することを含む。２つのカルボニル酸素のいずれか１つがＮＨまたはＳなどのヘテロ原子含有種Ｚと置換される同等の反応は、ヘテロ−アルドール縮合と称される。以下において、特に別段の記載がない限り、「アルドール」プロセスという用語は、ヘテロ−アルドールプロセスも含むことが意図される。アルドール縮合の一般的な原則を、スキームＩＩに示す。
【００３６】
【化２】
0005711218.tif 000003
上記において、Ｙが有効な脱離基（ＺＨよりも離脱しやすい）、例えばハロゲン、シアノ、チオシアノ、および任意に置換されたアンモニウム、ヒドロキシル、メルカプト、およびスルホニルである場合、縮合生成物の形成はＨＹの脱離を含む（スキームＩＩ、右下の構造）。そうでない場合、Ｈ２Ｚ（典型的には水）が失われると、他の縮合物が得られる（スキームＩＩ、左下の構造）。
【００３７】
本発明の分子間および分子内のアルドール縮合経路の初歩的概要を、先行技術との比較を含むスキームＩＩＩに示す。
【００３８】
【化３】
0005711218.tif 000004
上記において、
・ＲａおよびＲｂは、水素またはＣ１〜４アルキルを表し、
・Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
・Ｒ５は、水素、Ｒ１１またはＲ１２のいずれかを表し
（ここでＲ１１は、
【００３９】
【化４】
0005711218.tif 000005
であり、Ｒ１２は
【００４０】
【化５】
0005711218.tif 000006
である）、
・Ｘは、Ｏ、ＮＨおよびＳから選択され、
・ＭＤＡＢは２−メトキシ−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンズアルデヒドを示す。
【００４１】
以上および以下において、「任意に置換された」という用語は、一般的に不活性な部分での置換を意味し、ここで、「一般的に不活性な」という用語は、本明細書中では、本発明の手順の実施を概して妨害しない任意の部分を指す。一般的に不活性な基または部分の代表例としては、水素ならびに有機基、例えば芳香族（フェニル、アルキル置換および／またはハロゲン置換フェニル、ナフチル、フェニル置換、アルキル置換および／またはハロゲン置換ナフチルを含む）、飽和有機残基（直鎖および分岐鎖アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル（シクロプロピルを含む）、ブチル（シクロブチルおよびメチル置換シクロプロピルを含む）、ペンチル（例えばシクロペンチルおよびメチル置換シクロブチルを含む）、ヘキシル（例えばシクロヘキシル、メチル置換シクロペンチルおよびジメチルまたはエチル置換シクロブチルを含む）、ヘプチル（シクロヘプチルなどを含む）、オクチル（シクロオクチルなどを含む））、ハロゲン置換アルキル（ハロゲン置換シクロアルキル、例えばフルオロアルキル、パーフルオロアルキル、例えばトリフルオロメチル、およびクロルアルキルを含む）、アルコキシ、例えばメトキシ、芳香族オキシ、例えばフェノキシ、アルキルチオキシ、例えばメチルチオキシ、芳香族チオキシ、例えばフェニルチオキシ、アシル、例えばベンゾイルおよびアセチルなどが挙げられる。
【００４２】
本発明の一態様によれば、外部刺激を検出するためのインジケータ系は、一般式
【００４３】
【化６】
0005711218.tif 000007
のインジケータ化合物を含み、
式中、
ＸはＯ、ＮＨまたはＳであり、
ＬＧは、外部刺激の作用による変換に対して感受性であるＸ−ＬＧ部分を有する不安定基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、および任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
Ｒ５は、水素またはＲ１２のいずれかであり、ここでＲ１２は、
【００４４】
【化７】
0005711218.tif 000008
（式中、
Ｚは、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される）であり、
ここで、Ｒ５が水素である場合、インジケータ系は一般式
【００４５】
【化８】
0005711218.tif 000009
の受容体化合物をさらに含み、
式中、ＲａおよびＲｂは、独立して水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。
【００４６】
分子間アルドール反応に基づくインジケータ系の一実施形態よれば、Ｒ５は水素であり、受容体化合物（Ｂ）は、２−メトキシ−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンズアルデヒドであり、意図される目的に好ましく決定されている。
【００４７】
インジケータ系の用途に応じて、ＬＧは様々な可能な不安定基から選択され、その多くは当該技術分野で周知である。特に、ＬＧは、ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ（ＴＢＤＭＳ）、アセテート、リン酸コリン、アルファ−Ｄ−グルコピラノシド、ベータ−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびベータ−Ｄ−グルコピラノシドからなる群より選択される。
【００４８】
分子内アルドール反応に基づくインジケータ系の一実施形態よれば、Ｒ１０は、水素、メチル、メトキシ、フェニル、ＤＭＰまたはヘテロアリール、例えばＣＦｕｒ、Ｆｕｒ、ＮＰｙｒからなる群より選択され、
ここで、
【００４９】
【化９】
0005711218.tif 000010
である。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、対象の領域における外部刺激を検出する方法は、
・上記に定義されたインジケータ系を対象の領域に提供するステップ、および
・外部刺激の結果として形成されたシグナロフォア種からのシグナルについてモニタリングするステップ
を含む。
【００５１】
インジケータ系は、ヘテロ原子Ｘ（ＸはＯ、ＮＨまたはＳである）に結合した不安定基ＬＧを有するインジケータ化合物を含み、Ｘ−ＬＧ部分は外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、その変換は、二重結合によってさらなる炭素原子に結合した炭素原子に結合しているＸからなる部分を含む活性シグナロゲン種（ａＳ）の形成をもたらし、その活性シグナロゲン種は、アルドール供与体特性を有し、これによりアルドール縮合を促進する。したがって、活性シグナロゲン種（ａＳ）は、好適なアルドール受容体分子の存在下でシグナロフォア種を生成し、その受容体分子は、カルボニル、イミノおよびチオカルボニルの群から選択される反応性の基礎構造を含む。
【００５２】
分子間アルドール縮合に基づく好適な実施形態において、受容体部分はカルボニル部分であり、一般式
【００５３】
【化１０】
0005711218.tif 000011
（式中、ＲａおよびＲｂは独立して水素およびＣ１〜４アルキルから選択される）
の受容体化合物を用いることによって提供され、これにより、シグナロフォアが以下に示す２−ベンジリデンインドリン（Ｃ）の一般構造に由来するインジケータ系が得られる。
【００５４】
【化１１】
0005711218.tif 000012
この実施形態において、受容体化合物（Ｂ）は、好ましくは２−メトキシ−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンズアルデヒドとして選択される。
【００５５】
分子内アルドール反応に基づく特に好ましい実施形態において、受容体部分はインジケータ分子の一部であり、Ｒ５がＲ１２である場合、シグナロフォア種は構造式
【００５６】
【化１２】
0005711218.tif 000013
（式中、Ｒ１３はＯＨまたはＲ１０のいずれかである）
を有する１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドールである。
【００５７】
注：Ｒｘのナンバリングは、インジケータからシグナロフォアまで維持されるが、命名法は変わる。したがって、構造（Ｄ）の化学名は、以下のナンバリングスキームから誘導される。
【００５８】
【化１３】
0005711218.tif 000014
一実施形態において、上記に定義された方法は、実質的に酸素が枯渇した条件下で実施される。
【００５９】
本発明のさらに別の態様によれば、一般式（Ａ’）
【００６０】
【化１４】
0005711218.tif 000015
のインジケータ化合物の調製法が提供され、
式中、
ＸはＯ、ＮＨまたはＳであり、
ＬＧは不安定基であり、Ｘ−ＬＧ部分は外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して水素、Ｃ１〜４アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
Ｒ１２は
【００６１】
【化１５】
0005711218.tif 000016
（式中、Ｚは、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して水素、Ｃ１〜４アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される）である。当該方法は、一般式
【００６２】
【化１６】
0005711218.tif 000017
のインドキシル化合物を、一般式
【００６３】
【化１７】
0005711218.tif 000018
（式中、Ｑは、ヨード、ブロモ、トリフレートおよびトシレート、好ましくはヨードまたはブロモから選択される脱離基である）
のベンゼン誘導体でＮ−アリール化するステップを含む。
【００６４】
本発明のさらなる態様によれば、構造式（Ｇ）
【００６５】
【化１８】
0005711218.tif 000019
（式中、ＸはＯ、ＮＨまたはＳであり
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１３は、独立して水素、Ｃ１〜４アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルから選択される）
の化合物が提供される。これらの化合物（Ｇ）は、一般的に、インドロ［１，２−ａ］インドール（以下、「ＩＯ」とも表示）と分類される。
【００６６】
いくつかの式（Ｇ）の化合物が、２００９年４月１４日より入手可能になったとされるＲｏｇｎｅｓｓおよびＬａｒｏｃｋ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００９，５０，４００３−４００８）で言及されている。したがって、好ましい実施形態は、ＲｏｇｎｅｓｓおよびＬａｒｏｃｋの表２および３に記載されている化合物を除く構造式（Ｇ）の上記に定義された化合物を包含する（請求項１３を参照）。
【００６７】
本発明のさらなる態様によれば、構造式（Ｇ）の化合物を、外部刺激を検出するためのインジケータ系において使用する。そのような外部刺激としては、限定されるものではないが、加熱または温度変化；電磁照射；加電圧；酸性、アルカリ性、酸化性または還元性などの特定の化学的環境；イオン、酵素、酸素または酸化剤、水素または還元剤などの特定の化学種の存在；ウイルス、細菌、真菌、抗体、細胞および細胞器官、細胞組織などの特定の生物学的種の存在；さらには植物、動物およびヒトならびにそれらの器官、体液、排泄物または腐敗物が挙げられる。
【００６８】
本発明のインジケータまたは表示システムは、細胞、微生物コロニーまたは細胞組織を染色するために、特に有用である。
一実施形態によれば、本発明のＩＯインジケータを使った染色または表示を、旧来のインドクス染色または表示と組み合わせて使用する。
【００６９】
ＩＯインジケータの様々な使用法としては、限定されるものではないが、血液培養において成長する細菌コロニーの染色、真菌培養の染色、個々の細胞、微生物コロニーまたは細胞組織を標識するための染色、細胞組織、細胞のコロニー、細胞、細胞構造または細胞器官内で蛍光を誘導するための染色が挙げられる。
【００７０】
さらに、ＩＯ染色は、良性または悪性細胞組織、細胞、細胞構造、細胞壁、膜、区画、細胞器官、抗体、染色体、ゲノム、遺伝子、プラスミド、ベクター、核酸鎖、タンパク質または酵素のサイズ、位置、数および広がりなどの静的状態を画像化するために有用である。
【００７１】
さらに、ＩＯ染色は、良性のまたは悪性細胞組織、個々の細胞、細胞構造、細胞器官、抗体、染色体、ゲノム、遺伝子、プラスミド、ベクター、核酸鎖、タンパク質または酵素の拡散、成長または崩壊、ならびに貪食作用および発病のプロセスなどの動的事象を視覚化するためにも有用である。
【００７２】
またさらに、ＩＯ染色は、デジタル情報を記録、検索、保存、またはアーカイブするためにも有用である。
本発明の前記の特徴や他の特徴および目的ならびにそれらを達成する方法は、本発明の様々な実施形態の以下の記載を添付の図面とあわせて参照することによって、さらに明らかになり、本発明自体をよりよく理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１ａ】１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール染色剤（標識「ＩＯ１４」）および対応するベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼインジケータ（標識「Ｉ１４ａ」）のＵＶ／可視光吸収スペクトル（任意吸収単位「ＡＵ」）を示す図である（記号の定義については表ＩａおよびＩｃを参照）。
【図１ｂ】１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール染色剤（標識「ＩＯ１６」）および対応するベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼインジケータ（標識「Ｉ１６ａ」）のＵＶ／可視光吸収スペクトル（任意吸収単位「ＡＵ」）を示す図である（記号の定義については表ＩａおよびＩｃを参照）。
【図１ｃ】１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール染色剤（標識「ＩＯ１９」）および対応するベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼインジケータ（標識「Ｉ１９ａ」）のＵＶ／可視光吸収スペクトル（任意吸収単位「ＡＵ」）を示す図である（記号の定義については表ＩａおよびＩｃを参照）。
【図１ｄ】１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール染色剤（標識「ＩＯ２１」）および対応するベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼインジケータ（標識「Ｉ２１ａ」）のＵＶ／可視光吸収スペクトル（任意吸収単位「ＡＵ」）を示す図である（記号の定義については表ＩａおよびＩｃを参照）。
【図１ｅ】の１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール染色剤（標識「ＩＯ１７」）および対応するベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼインジケータ（標識「Ｉ１７ａ」）のＵＶ／可視光吸収スペクトル（任意吸収単位「ＡＵ」）を示す図である（記号の定義については表ＩａおよびＩｃを参照）。
【図１ｆ】１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール染色剤（標識「ＩＯ１５」）および対応するベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼインジケータ（標識「Ｉ１５ａ」）のＵＶ／可視光吸収スペクトル（任意吸収単位「ＡＵ」）を示す図である（記号の定義については表ＩａおよびＩｃを参照）。
【図２】様々な１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドールで染色された細菌コロニーの３６０ｎｍでの励起についての相対的蛍光単位（ＲＦＵ）で表した蛍光発光スペクトルを示す図である（記号の定義については表Ｉａを参照）。
【図３】様々な１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドールで染色した細菌コロニーの５５０ｎｍでの発光についての相対的蛍光単位（ＲＦＵ）で表した蛍光励起スペクトルを示す図である（記号の定義については表Ｉａを参照）。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
分子間アルドールインジケータ：ＭＤＡＢ染色およびＢＩインジケータ系
この最初の章では、ＭＤＡＢアルドール染色と称する新規方法を開示する。当該方法は、ある一定の１Ｈ−インドクス−３−イル活性化シグナロゲンおよび２−メトキシ−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（ＭＤＡＢ）補助試薬が効率的に分子間アルドール縮合を経て、表示目的に適した暗赤色から褐色の沈殿を生じ、これにより現行の技術よりも大幅に拡大された新規インジケータ系が得られるという発見に基づく。
【００７５】
本明細書中で開示されるＭＤＡＢ染色技術の根拠は、インドクス活性化シグナロゲンが重要なアルドール供与体特性を有すること、そしてそのような特性は、アルドール受容体、特にＭＤＡＢに対して非常に特異的であるという発見である。
【００７６】
具体的には、インドキソール活性化シグナロゲンである５−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−オール（表Ｉｂ、ａＳ４）および５−ブロモ−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−オール（表Ｉｂ、ａＳ５）を放出する、広く使用されている市販のインドクスインジケータは、２−ベンジリデンインドリン−２−オン親構造（表Ｉｃ、エントリー１１〜２２）由来の暗紫色の染色剤を生じることが判明した。
【００７７】
さらに、インドクス活性化シグナロゲンのアルドール供与体特性は、水素を不安定基で置換することにより３位のＸ−Ｈ部分をマスクすることによって、抑制または除去可能であることが認められた。
【００７８】
原則として、補助試薬として酸素または他の酸化剤を含むインジケータ系で現在使用されるインドクスインジケータは、代用の補助試薬としてのＭＤＡＢとともに使用することができる。
【００７９】
しかし、実際には、すべてのインドクス活性化シグナロゲン（またはそれら由来のインジケータ）が、ＭＤＡＢと有効なアルドール供与体／受容体対を形成するというわけではない。例えば、一般的に用いられる５−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−オール（表Ｉｂ、ａＳ４）および５−ブロモ−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−オール（表Ｉｂ、ａＳ５）活性化シグナロゲンは、６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−オール（表Ｉｂ、ａＳ３）よりはるかに効果的であるということが判明した。
【００８０】
例えば、Ｏ−シリル化５−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−オール（表Ｉａ、Ｉ４ｂ）を、フッ化物イオン（外部刺激）の簡単なインジケータとして使用した。シリル基はフッ化物イオンに対して不安定であり、その存在下で５−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−オール（ａＳ４）がＭＤＡＢと自由に反応して、不溶性ピンク色の沈殿（表Ｉｃ、ＢＩ４）を生じる。
【００８１】
第２の例で、市販の試薬５−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（表Ｉａ、Ｉ４ａ）とＭＤＡＢのブレンドを、酸素の非存在下でベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼとともにインキュベートすると、ピンク色素が生じ、一方、Ｉ４ａそれ自体は、インジケータとしての機能に関して酸素または酸化剤の存在に依存することは当該技術分野で周知である。
【００８２】
さらに、インドクス活性化シグナロゲン３−アミノインドールまたは３−メルカプトインドール（表Ｉｂ、ａＳ６およびａＳ７）をそれらのアルドール供与体特性について試験した。３−アミノインドールはＭＤＡＢ（表Ｉｃ、ＢＩ６）とアルドール産物を生成しなかったが、３−メルカプトインドールおよびＭＤＡＢは強酸性条件下で特徴的なピンク色素（ＢＩ７）を生じた（表ＩＩａ〜ｃ、エントリー１４および１５）。
【００８３】
試験したインドクスインジケータ系は、表ＩＩａ（好気性、ＭＤＡＢなし）、ＩＩｂ（好気性、ＭＤＡＢ）およびＩＩｃ（嫌気性、ＭＤＡＢ）に記載されている。
さらなる詳細から、インドクス／ＭＤＡＢ表示を使用して、外部刺激として特徴的なバイオマーカー酵素を使用することにより微生物コロニーを染色できることが明らかになった。重要なことに、ＭＤＡＢはこれら研究では微生物細胞成長に関して毒性を示さなかった。結果を表ＩＩＩにまとめる。
【００８４】
例えば、Ｉ４ａ／ＭＤＡＢインジケータ系を含む微生物平板培地を、大気酸素の存在下および非存在下でインキュベートした。大気酸素濃度ではターコイズインディゴ（表Ｉｃ、ＩＮ４）の形成が優勢であるが、微嫌気性（ｍｉｃｒｏａｎａｅｒｏｂｉｃ）または嫌気性の条件下では、ＢＩ４（表Ｉｃ）の形成により、染色されたコロニーはピンク色を呈し、これはＭＤＡＢ染色の効果に起因する（表ＩＩＩ、エントリー１０）。
【００８５】
一般的に、２〜４当量のＭＤＡＢと組み合わせたａＳ４またはａＳ５由来の市販のインドクスインジケータは、嫌気性条件下での微生物培養を染色するために好ましいインジケータ系であることが判明した。
【００８６】
ＭＤＡＢと組み合わせたインジケータＩ９ａ、Ｉ１０ａ、Ｉ１１ａおよびＩ１２ａは、好気性条件下で有効なインジケータ系である（表ＩＩＩ、エントリー２６〜３７）。Ｎ−アリール化インドクス活性化シグナロゲンからのインディゴの形成は非効率的であり、その代わりに分子内アルドール縮合が優勢であると考えられる。
【００８７】
分子内アルドールインジケータ：ＩＯインジケータ系
開示のＭＤＡＢ染色は、アルドール供与体とＭＤＡＢアルドール受容体の対の独自の適合に基づく。以下で、アルドール供与体と受容体を化学的に結合することによって同様の効果を達成できることを開示する。
【００８８】
分子内アルドール反応を含む分子内閉環反応が、特に５員環または６員環がプロセス中に形成される場合に高速度で進行することは、当該技術分野で周知である。したがって、供与体部分および受容体部分の立体配置が分子内アルドール縮合の事象に有利であるように、アルドール供与体と受容体とを結合する概念が生み出された。
【００８９】
ＭＤＡＢ染色と同様に、アルドール縮合の時期尚早な発生は、アルドール供与体に結合した不安定基のマスキング効果によって防止することができる。自発性アルドール縮合は、外部刺激に反応した不安定基の脱離または修飾（例えば化学的還元）後に起こる。
【００９０】
分子内アルドールインジケータのデザインは、アルドール受容体のＣ３原子を結合する化学構造によってアルドール受容体が供与体に結合されることを必要とする（スキームＩＩ）。伝統的なＩＮインドクスインジケータは、リンカーのための完全なアンカー部位、すなわちインドール窒素を提供する。その結合は、スキームＩＶに示すように１個または２個の連続した配置の原子Ｃ１およびＣ２を含んでもよい。前者の場合は、形式的分子内アルドール縮合により５員環が生じるが、後者の場合は、シグナロフォア構造の６員環が生じる。
【００９１】
【化１９】
0005711218.tif 000020
・Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３は、水素、Ｃ１〜４アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、チオ−シアノ、ニトロ、ニトロソ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシル、メルカプトおよびスルホニルにより任意に置換された炭素原子を表し、。
・Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、水素、Ｃ１〜４アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、チオシアノ、ニトロ、ニトロソ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシル、メルカプトおよびスルホニルからなる群より選択され、
・Ｘは、Ｏ、ＮＨおよびＳから選択される。
【００９２】
アルドール受容体は、好ましくは芳香族カルボニル化合物として選択され（したがってＣ１およびＣ２は芳香環の構成要素を表す）、分子内アルドール縮合の結果、拡張された共役系が形成され、これにより所望の光学特性を有するシグナロフォアが得られる。
【００９３】
分子内アルドール反応の動力学的優位性のために、供与体および受容体分子は、インドクス／ＭＤＡＢなどの適合する供与体／受容体対を形成する必要はない。
供与体構造と受容体構造との間に所望の結合を得るために検討された多くの合成経路のうち、Ｎ−アリール化が、好ましい方法であることが判明した。
【００９４】
Ｎ−アリール化は、十分に確立された合成法である。例えば、インドールがヨードベンゼンと容易に反応してＮ−フェニルインドールを高収率で生成することは、当該技術分野で周知である。
【００９５】
例えば３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド（Ｉ１ａ）を、ＤＭＦ中、銅触媒の存在下でヨードベンゼンの誘導体と反応させて、対応する１−フェニル−３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（１８ａ）を得た。不安定基は炭水化物となるように選択され、その炭水化物を化学的に保護せずに使用したため、これは特筆すべきことである。
【００９６】
同様に、新規アルドール型インジケータは、対応する市販の１Ｈ−インドクス−３−イルインジケータを、伝統的なウルマン型銅触媒作用またはその新種、例えばＴａｉｌｌｅｆｅｒら（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｒｏｎ／Ｃｏｐｐｅｒ  Ｃｏ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ａｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６，９３４−９３６）により最近公開されたものを包含する様々な条件下でＮ−アリール化することにより、１つの簡単なステップにおいて高収率で得られた。
【００９７】
【化２０】
0005711218.tif 000021
・Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、水素、Ｃ１〜４アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミルならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される。
・Ｘは、Ｏ、ＮＨおよびＳから選択される。
【００９８】
この概念は、一般的な妥当性のあることが証明された。膨大数の市販のインドクスインジケータを、Ｎ−アリール化技術によって、様々な芳香族アルドール受容体にうまく結合させ、これにより、簡単で、効果的かつ一般的なものが新規ファミリーのインジケータに登録された（表Ｉａ、エントリー１５〜４６）。
【００９９】
予想どおり、新規インジケータは好適な外部刺激に対して広く反応した（表ＩＶａ〜ｃ）。不安定マスキング基の除去は、想定されるアルドール縮合を誘発した。
ケトン類（内部受容体として作用する）は、黄色、橙、赤色から褐色の色を有する、色鮮やかな不溶性色素を広く生成した。場合により、ａＳ種に代表されるような３−インドキシル種に特徴的な一時的性質の強力な緑色蛍光が観察されることもあったが、これは、想定されるアルドール縮合のプロセスにおいても同様に一時的性質のものである。
【０１００】
エステル類（内部受容体として作用する）は、対照的に、ｐＨ５を超える水中に溶けやすい持続性緑色蛍光色素（表Ｉｃ：ＩＯ１０、ＩＯ１１、ＩＯ１２）を生成した。さらなる酸性化により、その色素は、水溶液から橙色の非蛍光沈殿物を形成した。このプロセスは、塩基の添加によって完全に逆転することが判明した。明らかに、その色素は、本来的に強い酸性であり、脱プロトン化形態で高度に蛍光性である。
【０１０１】
一般的に、これらの色素はすべて、親インドロ［１，２−ａ］インドール由来である（表Ｉｃ、エントリー２３〜４６）。インドロ［１，２−ａ］インドール構造は、形式上、窒素および隣接するピロール炭素を共有する２つのインドールから構成されている。この構造の魅力および単純性にもかかわらず、インドロ［１，２−ａ］インドール（以下、「ＩＯ］と表示）は新規のようである。
【０１０２】
図１において、様々なＩＯ染色剤の吸収スペクトルに、対応するインジケータの吸収スペクトルを重ねる。グラフは、３００〜４００ｎｍおよび４００〜５００ｎｍのＩＯ吸収はいずれも対応するインジケータを欠いており、したがって、有用な検出可能なシグナルを提供することを示す。
【０１０３】
例えば、６−クロロインドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド（Ｉ２１ａ）とベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼとのＮ−ベンゾフェノン共役体を２４時間インキュベートすると、鮮黄色の沈殿が生じ、これを回収し、水で洗浄し、乾燥し、７−クロロ−１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（表Ｉｃ、１０２１）として特徴付けられた。これは予想されたアルドール縮合生成物と一致する。
【０１０４】
様々な細菌性ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ陽性株を播種した平板培地上でＩＯ染色を試験した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ陽性株のコロニーは、使用されるインジケータによって、黄色〜赤色に見え、一方、ベータ‐ガラクトシダーゼ陰性サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌コロニーは、試験されたガラクトシダーゼインジケータの有無による差は見られなかった（表ＩＶａおよびＩＶｂ）。
【０１０５】
更に、種々の異なるバイオマーカー酵素を産生する異なる細菌に関してＩＯ染色を試験した（表ＩＶｃ）。
ＩＯ染色および旧来のインディゴ（ＩＮ）染色を有用に組み合わせることができ、これによってカラースキームを拡大することができる点に留意すべきである（表ＩＶｄ）。例えば、インジケータＩ４ｈを二重平板培地アッセイでＩ２１ａと組み合わせて使用して、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼおよびベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ菌種を同時に染色した。前者のバイオマーカーについて陽性の株は青色に着色され、後者について陽性の株は黄色に着色されたのに対し、両方の酵素に対して陽性の株は緑色（青色と黄色の混合）に着色された。
【０１０６】
通性嫌気性微生物種のコロニー成長は、嫌気性条件下で比較的遅いことは周知である。インキュベーション時間が長いために、嫌気培養されたコロニーを染色する目的で用いられるインジケータ系は、優れた局在性（または最小の拡散）をもたらすものでなければならない。表ＩＶｅに示される実験データから、いくつかのＩＯインジケータ系がその目的に非常に適していると結論することができる。同時に、そのデータは、旧来のＩＮ染色（Ｉ４ａ）の不具合を示し、適合する補助試薬（例えば酸素）の不在によって生じる、対応する活性化シグナロゲンの蓄積が、微生物増殖を部分的に阻害することを証明している。
【０１０７】
血液培養は、臨床微生物学において一般的かつ必須の手段である。寒天プレート上の微生物コロニーの染色は、血液寒天プレートの暗色と低い透光性のために不鮮明である。したがって、ＩＯインジケータ系を、血液寒天上での使用について評価した（表ＩＶｆ）。実験により、非常に良好な結果が得られた。ＩＯシグナロフォアは、優れた光学コントラストおよび局在性を呈した。
【０１０８】
真菌培養の染色は、生物学的インジケータ系の利用の別の重要な領域である。この目的のために、周知の病原体カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）のバイオマーカー酵素であるＤ−ガラクトサミダーゼ（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｄａｓｅ）の作用に対して不安定であるＩＯインジケータ系が考案された。選択された培養条件下でのコロニー成長は中程度であったが、対応する外部刺激を生じる真菌コロニーはＩ２１ｇの存在下で鮮黄色に変わり、肉眼で容易に識別可能になった（表ＩＶｇ）。
【０１０９】
インキュベーションの前、最中および後に、表ＩＶａ〜ｆに記載する平板培地のすべてを３６６ｎｍの照明下で検査した。これによって、１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オンが固体状態で蛍光性であり、蛍光の効果がＩＯ染色されたコロニーにより維持されることが判明した。概して、ＩＯインジケータ系を含む平板培地（血液寒天プレートを除く）は３６６ｎｍにおいて青みがかったバックグラウンドを呈し、これを背景にして染色されていないコロニーは薄い陰影を呈する一方、ＩＯ染色されたコロニーは黄緑色から赤褐色の鮮やかな色で際立ち、優れた視覚コントラストと高い感度がもたらされる。
【０１１０】
血液寒天プレートの血液成分は、蛍光を効果的に消光する。したがって、プレートは３６６ｎｍのＵＶ光下では黒くみえる。興味深いことに、血液寒天プレート上で成長するコロニー中に分散したＩＯ染色剤の蛍光は妨害されず、黒色背景に対してコロニーを鮮烈に明るくする（表ＩＶｆ）。
【０１１１】
以下では、ＩＯ染色剤は微生物コロニー内で持続性の蛍光を誘導したという発見について詳述している。蛍光は、標準的プレートリーダーを使用することにより平板培地から回収したコロニーで定量化することができた。発光の強度および波長は、使用したインジケータ系の種類に強く依存していた。様々な発光スキャンで集められたデータを図２に示す。
【０１１２】
対応する試料も励起スキャンに付し、５５０ｎｍでの発光を記録した（図３）。興味深いことに、ＩＯ染色剤は３００〜５００ｎｍで励起可能であることが判明し、これは際立って広範囲なものである。明らかに、多くのＩＯ染色剤の明るく光る色は、環境光による励起作用（光学的増光）に起因する。
【０１１３】
上記の延長で、蛍光シグナロフォアを生成するＩＯインジケータ系の存在下での大腸菌の標準液体培養が、個々の細胞の蛍光標識のための新規方法を提供することも認められた。その培養から採取された試料において、大腸菌の個々の細胞は、標準的蛍光顕微鏡下で明らかに見えるようになった。
【０１１４】
したがって、ＩＯ染色により、通常、蛍光抗体または蛍光タンパク質をコード化する遺伝子ベクターの綿密な適用に依存する生細胞標識のための簡単かつ経済的な方法を提供することができる。
【０１１５】
最後に、本発明の範囲を、１−アリール−１Ｈ−インドール−３−オール活性化シグナロゲンの窒素および硫黄類似体から誘導されるＩＯインジケータ系の構造変動の評価によりさらに調査した。
【０１１６】
【化２１】
0005711218.tif 000022
その目的のために、１−（２−ベンゾイルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イルエチルカーバメート（Ｉ３２）をアルカリ性およびブタ肝臓エステラーゼにより触媒された加水分解に付した。黄色の沈殿物が単離され、これは、標準試料との比較によって、予想された１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−イミン（ＩＯ３２）ではなく、１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１９）と同定された。ＩＯ３２を観察されたＩＯ１９に変化させたと考えられる、アッセイ条件下でのイミノ基の加水分解の可能性により、納得できる説明が得られる。作用機序およびその実際の関連性とは関係なく、原則として不安定基が窒素原子に結合しているインジケータ系を含むようにこの概念を拡大することができることを、実験は証明している。この知見の関連性は、アミノペプチダーゼ活性の検出に基づく多数の重要な生物学的適用および有用な沈降性インジケータ系が最新技術で利用できないという事実にある。
【０１１７】
第２の例で、１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−チオール（ａＳ３３）の酸化形態、ビス［１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−ジスルファン（Ｉ３３）をＴＣＥＰ（タンパク質生化学で用いられる標準的試薬）によるＳ−Ｓブリッジの還元に付し、これによってａＳ３３を放出させた。中性条件で検出可能なシグナルは観察されなかったが、アルカリ性条件が用いられた場合、アッセイ溶液は黄色に変わり、それによって明らかにジスルフィド還元の事象が示された。この例は、ＩＯインジケータ系が汎用であり非常に多目的な概念を表すという事実を示す。このことはまた、ＩＯインジケータ系が酵素活性と関連した外部刺激を検出するだけに限定されるものではないことを示すうえで有用である。本明細書中で以下に示す多くの実施例は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではなく、単に発明者が従事している実際の分野を反映するのみである。
【０１１８】
実施例
（実施例１）
Ｉ１〜Ｉ４のＮ−アリール化によるインジケータＩ８〜Ｉ３１の調製（表Ｉａ）
注：芳香族ヨード化合物は市販されているか、またはオルト−ヨード安息香酸を用いた標準的フリーデル・クラフツアシル化によって調製されるかのいずれかであった。２−（２−ヨードベンゾイル）−Ｎ−メチルピロールを、Ｃａｒｓｏｎら（国際公開第２００００４８５８４号）と同様にして調製し、２−（２−ヨードベンゾイル）フランおよび２−（２−ヨードベンゾイル）−５−カルボキシフランをＧａｒｌａｎｄら（独国特許出願公開第２５５７９５６号明細書）と同様にして調製し、４−クロロ−２−ヨードベンゾフェノンをＧａｂｂｕｔｔら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００６，６２，７３７−７４５）にしたがって調製した。１−アセチル−２−ヨード−４−メトキシベンゼンおよび１−ベンゾイル−２−ヨード−４−メトキシベンゼンを、塩化アルミニウムの存在下で３−ヨードアニソールのフリーデル・クラフツ反応により得た。
【０１１９】
実験をＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＧｍｂＨ製のＳｙｎｔｈｏｓ３０００マルチモードマイクロ波リアクター中で実施した。以下のパラメータを調節した。Ｐ（ｍａｘ）＝１４００Ｗ、７（ＩＲｍａｘ）＝２００℃、ドライブ：回転、スターラー：３、ｐ速度＝２００ｋＰａ／ｓ（２．０ｂａｒ／ｓ）。昇温（ｒａｍｐ）時間＝２分（１３０℃）および保持時間＝１８０分（１３０℃）。テフロン（登録商標）コーティングされた攪拌棒を備えたＰＴＦＥライナー（１００ｍｌ）を反応容器として使用した。典型的な手順で、５ｍｍｏｌの１Ｈ−インドール−３−イルインジケータ、１０ｍｍｏｌの対応するヨウ化アリール、５ｍｍｏｌの炭酸カリウム、０．５ｍｍｏｌのヨウ化銅（Ｉ）のＤＭＦ２０ｍｌ中の混合物を、ＭＷ照射に付した。生成混合物をろ過し、固体を１０ｍｌのエタノールで洗浄した。濾液を蒸発乾固させ、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー［例えば、シリカゲル、トルエン／エタノール（５：１）］により精製した。
【０１２０】
ＩＲスペクトルを純固体としてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＦＴ−ＩＲ分光光度計（モデルＳｐｅｃｔｒｕｍ  ＯＮＥ）（ｖ［ｃｍ−１］）で記録した。１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｃｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ−４００［４００．１３ＭＨｚ（１Ｈ）、１００．６１ＭＨｚ（１３Ｃ）］分光計（δ［ｐｐｍ］、Ｊ［Ｈｚ］）で２９８Ｋにて記録した。
【０１２１】
１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ８ａ）：収量：６２８ｍｇ（３４％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４７。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７３−７．７１（ｍ，１Ｈ）、７．５６−７．５４（ｍ，５Ｈ）、７．４２（ｓ，１Ｈ）、７．３７−７．３２（ｍ，１Ｈ）、７．２３−７．１９（ｍ，１Ｈ）、７．１４−７．１０（ｍ，１Ｈ）、５．３０−５．２８（ｄ，１Ｈ）、４．８９−４．８７（ｄ，１Ｈ）、４．７４−４．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．７１−４．６９（ｄ，１Ｈ）、４．５４−４．５３（ｄ，１Ｈ）、３．７２−３．６６（ｍ，１Ｈ）、３．６１−３．５６（ｍ，３Ｈ）、３．４８−３．４１（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１３９．１８、１３９．０１、１３２．２８、１２９．７３、１２５．７３、１２３．３３、１２２．９９、１２１．４２、１１９．６０、１１８．１９、１１３．３５、１１０．１７、１０４．２２、７５．７１、７３．３３、７０．３９、６８．２３、６０．５４。
【０１２２】
６−クロロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ９ａ）：
収量：５６０ｍｇ（２８％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４３。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７２−７．７０（ｍ，１Ｈ）、７．５８−７．５６（ｍ，４Ｈ）、７．５２−７．５１（ｍ，１Ｈ）、７．４５（ｓ，１Ｈ）、７．４１−７．３７（ｍ，１Ｈ）、７．１６−７．１３（ｍ，１Ｈ）、５．３０−５．２９（ｄ，１Ｈ）、４．８９−４．８７（ｄ，１Ｈ）、４．７２−４．７１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６９−４．６７（ｍ，１Ｈ）、４．５４−４．５３（ｄ，１Ｈ）、３．７１−３．６３（ｍ，２Ｈ）、３．５９−３．５５（ｍ，３Ｈ）、３．４３−３．３９（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１３８．７５、１３８．５５、１３２．４８、１２９．８５、１２７．８２、１２６．２９、１２３．５６、１２０．１１、１１９．９９、１１９．６５、１１４．４３、１０９．８１、１０４．１８、７５．７３、７３．２３、７０．３０、６８．１８、６０．５０。
【０１２３】
１−［２−（メトキシカルボニル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１０ａ）：
収量：４９６ｍｇ（２３％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４１。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８９−７．８７（ｍ，１Ｈ）、７．７７−７．６９（ｍ，２Ｈ）、７．５６−７．５２（ｍ，２Ｈ）、７．２５−７．０２（ｍ，４Ｈ）、５．２７−５．２６（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８７（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．６７−４．６５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６５−４．６４（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．５３−４．５２（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、３．７１−３．６３（ｍ，２Ｈ）、３．５８−３．４９（ｍ，３Ｈ）、３．４４−３．３９（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１６６．３８、１３８．９４、１３７．６８、１３３．７７、１３３．１６、１３０．７３、１２８．２１、１２８．０４、１２７．４１、１２２．７９、１２０．９６、１１９．４１、１１８．１６、１１４．６２、１０９．３９、１０４．５４、７５．６５、７３．３４、７０．５０、６８．１６、６０．４３、５２．２４。
【０１２４】
６−クロロ−１−［２−（メトキシカルボニル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１１ａ）：
収量：５２６ｍｇ（２３％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４１。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．９１−７．８９（ｍ，１Ｈ）、７．７８−７．７４（ｍ，１Ｈ）、７．７０−７．６８（ｍ，１Ｈ）、７．６０−７．５５（ｍ，２Ｈ）、７．１９（ｓ，１Ｈ）、７．１０−７．０８（ｍ，１Ｈ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、４．６５−４．６３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．６６−３．６１（ｍ，２Ｈ）、３．５６−３．５１（ｍ，３Ｈ）、３．４８（ｓ，３Ｈ）、３．４２−３．３９（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１６５．９４、１３８．５８、１３６．９９、１３４．０１、１３３．２９、１３０．７７、１２８．２５、１２８．１４、１２７．９４、１２７．５２、１１９．６８、１１９．６２、１１９．５８、１１５．７３、１０９．１２、１０４．４６、７５．６４、７３．１９、７０．３５、６８．０５、６０．３４、５２．２３。
【０１２５】
５−ブロモ−４−クロロ−１−［２−（メトキシカルボニル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１２ａ）：
収量：５７２ｍｇ（２１％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４１。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．９３−７．９１（ｍ，１Ｈ）、７．８１−７．７４（ｍ，１Ｈ）、７．６２−７．５８（ｍ，１Ｈ）、７．５４−７．５２（ｍ，１Ｈ）、７．３７−７．３４（ｍ，１Ｈ）、７．２７（ｓ，１Ｈ）、６．８７−６．８４（ｍ，１Ｈ）、４．７０−４．６８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．７０−３．６３（ｍ，２Ｈ）、３．５４−３．５２（ｍ，３Ｈ）、３．４９（ｓ，３Ｈ）、３．４３−３．３９（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１６５．５６、１３９．５３、１３７．８５、１３６．７６、１３３．６６、１３３．４０、１３０．８８、１２８．６３、１２８．３８、１２８．２０、１２６．６０、１２３．６７、１１６．２１、１１２．７３、１１０．１２、１０３．９１、７５．５９、７３．４６、７０．３１、６８．０５、６０．３０、５２．３３。
【０１２６】
１−（２−ホルミルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１３ａ）：
収量：４４３ｍｇ（２２％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４２。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：９．６４（ｓ，ＣＨＯ）、８．０１−７．９９（ｍ，１Ｈ）、７．８９−７．８５（ｍ，１Ｈ）、７．７５−７．７３（ｍ，１Ｈ）、７．６６−７．５９（ｍ，２Ｈ）、７．４５（ｓ，１Ｈ）、７．２６−７．０９（ｍ，３Ｈ）、５．２９−５．２７（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８９−４．８８（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．７５−４．７３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６３−４．６１（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．５４−４．５３（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、３．７１−３．６５（ｍ，２Ｈ）、３．５４（ｂｒ．ｓ，３Ｈ）、３．４３−３．３６（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１８９．４０、１４１．０７、１３９．２７、１３５．４６、１３５．０２、１３１．０３、１２８．３７、１２７．９９、１２７．９１、１２３．３７、１２０．９２、１１９．８８、１１８．２４、１１５．６０、１０９．６６、１０４．１３、７５．６１、７３．２６、７０．３６、６８．０９、６０．３５。
【０１２７】
１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１４ａ）：
収量：１．２０ｇ（６０％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．３８。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７５−７．７０（ｍ，３Ｈ）、７．５９−７．５４（ｍ，２Ｈ）、７．２１（ｓ，１Ｈ）、７．１８−７．０９（ｍ，２Ｈ）、７．０５−７．０３（ｍ，１Ｈ）、５．２９−５．２７（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８７−４．８５（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．６９−４．６７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６３−４．６１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５２−４．５１（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、３．７１−３．６２（ｍ，２Ｈ）、３．５８−３．５０（ｍ，３Ｈ）、３．４６−３．３９（ｍ，１Ｈ）、１．８２（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：２００．１２、１３９．１３、１３７．０９、１３６．５９、１３３．７５、１３２．６１、１２９．１４、１２７．８６、１２７．６９、１２３．１０、１２０．７２、１１９．６４、１１８．１６、１１４．５８、１０９．５６、１０４．２４、７５．５６、７３．２３、７０．３８、６８．０５、６０．２８、２８．２８。
【０１２８】
１−（２−アセチルフェニル）−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１５ａ）：
収量：１．０９ｇ（４９％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４１。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７９−７．７２（ｍ，２Ｈ）、７．６２−７．５８（ｍ，１Ｈ）、７．５４−７．５３（ｍ，１Ｈ）、７．２９（ｓ，１Ｈ）、７．１２−７．０７（ｍ，２Ｈ）、６．９７−６．９２（ｍ，１Ｈ）、５．０２−５．０１（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８６−４．８５（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．７７−４．７５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６３（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５５−４．５４（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、３．７２−３．６５（ｍ，２Ｈ）、３．５５（ｂｒ．ｓ，３Ｈ）、３．４６−３．４０（ｍ，１Ｈ）、１．９２（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９９．７５、１３８．４８、１３７．１４、１３６．００、１３５．０１、１３２．７２、１２９．２７、１２８．２４、１２８．０７、１２４．２１、１２３．６３、１２０．４１、１１７．２４、１１４．９５、１０８．６５、１０３．５１、７５．５３、７３．５４、７０．３９、６８．０７、６０．２７、２８．４０。
【０１２９】
１−（２−アセチルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１６ａ）：
収量：０．９６ｇ（４４％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４６。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７８−７．７０（ｍ，３Ｈ）、７．６２−７．５７（ｍ，２Ｈ）、７．２５（ｓ，１Ｈ）、７．１７−７．１２（ｍ，１Ｈ）、７．０５−７．０４（ｍ，１Ｈ）、５．３０−５．２９（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８８−４．８６（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．６８−４．６６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ．１Ｈ）、４．６３−４．６１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５２−４．５１（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、３．７０−３．６２（ｍ，２Ｈ）、３．５６−３．５０（ｍ，３Ｈ）、３．４２−３．３９（ｍ，１Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９９．９５、１３８．８３、１３７．０６、１３５．８３、１３３．９７、１３２．７１、１２９．２９、１２８．１８、１２７．８５、１２５．２３、１２０．０４、１１９．７０、１１９．４９、１１５．７３、１０９．３８、１０４．２５、７５．６２、７３．１７、７０．３３、６８．０４、６０．２９、２８．４５。
【０１３０】
１−（２−アセチルフェニル）−５−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１７ａ）：
収量：０．６１ｇ（２３％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４２。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８３−７．８０（ｍ，１Ｈ）、７．７７−７．７３（ｍ，１Ｈ）、７．６４−７．６０（ｍ，１Ｈ）、７．５６−７．５３（ｍ，１Ｈ）、７．４１−７．３９（ｍ，１Ｈ）、７．３５（ｓ，１Ｈ）、６．９２−６．９０（ｍ，１Ｈ）、５．０７−５．０６（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８７−４．８６（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．７４−４．７２（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．６２（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５５−４．５３（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、３．７１−３．６４（ｍ，１Ｈ）、３．５５（ｂｒ．ｓ，３Ｈ）、３．４７−３．３９（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９９．５６、１３８．０４、１３７．０３、１３５．４４、１３３．６０、１３２．７７、１２９．３８、１２８．５４、１２８．３３、１２６．９６、１２３．７７、１１８．５５、１１６．２７、１１３．０５、１１０．３９、１０３．７２、７５．５７、７３．４４、７０．３２、６８．０６、６０．２７、２８．５０。
【０１３１】
１−（２−アセチル−５−メトキシフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１８ａ）：
収量：１．６ｇ（６５％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（４：１）］：Ｒ１０．３６。
ＦＴ−ＩＲ：３４５９ｍ、２９６４ｗ、２９２７ｗ、２８６７ｗ、１６６５ｓ、１６０１ｓ、１５６９ｍ、１４９７ｍ、１４７１ｓ、１４５１ｓ、１３７２ｓ、１２６７ｓ、１２２０ｓ、１１４０ｓ、１０８１ｓ、１０５３ｓ、１０２０ｓ、９７５ｍ、９４５ｍ、８８０ｍ、８００ｍ、７３５ｍ、６９６ｍ。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８０（ｄ，Ｊ＝８．７，１ａｒｏｍ．Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．５，１ａｒｏｍ．Ｈ）、７．２８（ｓ，１ａｒｏｍ．Ｈ）、７．１７−７．１１（ｍ，２ａｒｏｍ．Ｈ）、７．０７（ｄ，Ｊ＝２．５，１ａｒｏｍ．Ｈ）、７．０６（ｄ，Ｊ＝１．７，１ａｒｏｍ．Ｈ）、５．３０（ｄ，Ｊ＝５．０，ＯＨ）、４．８７（ｄ，Ｊ＝５．８，ＯＨ）、４．６８（ｄ，Ｊ＝７．８，Ｈ−Ｃ（Ｉ）Ｇａｌ）、４．６４（ｔ，Ｊ＝５．２，ＯＨ）、４．５２（ｄ，Ｊ＝４．７，ＯＨ）、３．８８（ｓ，ＯＣＨ３）、３．７０（ｔ，Ｊ＝４．０，Ｈ−Ｃ（４）Ｇａｌ）、３．６５（ｍｃ，１Ｈ−ＣＧａｌ）、３．５８−３．５１（ｍ，３Ｈ−ＣＧａｌ）、３．４８−３．３９（ｍ，１Ｈ−ＣＧａｌ）、１．８６（ｓ，ＣＨ３）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９７．８６（ｓ，Ｃ＝Ｏ）、１６２．５４（ｓ，Ｃ−ＯＣＨ３）、１３８．７９、１３８．１８、１３４．０１（３ｓ）、１３１．６８（ｄ）、１２９．００（ｓ）、１２８．８２、１２８．１２（２ｄ）、１２７．８５（ｓ）、１２５．２３、１２０．０１、１１９．６６（３ｄ）、１１９．５３（ｓ）、１１５．６７、１１３．９２、１１３．２７、１０９．４４（４ｄ）、１０４．２２（ｄ，Ｃ（１）Ｇａｌ）、７５．６８、７３．２２、７０．３６、６８．１１（４ｄ，Ｃ（２−５）Ｇａｌ）、６０．３８（ｔ，Ｃ（６）Ｇａｌ）、５５．９０（ｑ，ＯＣＨ３）、２８．０３（ｑ，ＣＨ３−Ｃ＝Ｏ）。
【０１３２】
１−（２−ベンゾイルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ１９ａ）：
収量：１．０９ｇ（４６％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４１。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８２−７．８１（ｍ，１Ｈ）、７．８０−７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．７８−７．７７（ｍ，２Ｈ）、７．７０−７．６９（ｍ，１Ｈ）、７．６８−７．６７（ｍ，３Ｈ）、７．６４−７．１３（ｍ，４Ｈ）、７．０３（ｓ，１Ｈ）、６．９９−６．９５（ｍ，１Ｈ）、５．２３−５．２２（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８５−４．８３（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．６８−４．６５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５１−４．５０（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．２９−４．２７（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．７２−３．７０（ｍ，１Ｈ）、３．６３−３．５２（ｍ，３Ｈ）、３．４２−３．３２（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．５４、１３８．８３、１３６．９７、１３５．６８、１３５．４８、１３３．４１、１３２．９２、１３２．２１、１２９．９２、１２８．３０、１２８．１４、１２７．８６、１２７．４８、１２７．１８、１２５．２４、１２２．６３、１２０．６１、１１９．３８、１１７．８０、１１５．２７、１０９．８７、１０４．４９、７５．４０、７３．１９、７０．３１、６７．９１、６０．１７。
【０１３３】
１−（２−ベンゾイルフェニル）−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２０ａ）：
収量：０．８７ｇ（３４％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．５２。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８２−７．７８（ｍ，１Ｈ）、７．７０−７．６０（ｍ，３Ｈ）、７．４５−７．４１（ｍ，３Ｈ）、７．２６−７．２２（ｍ，２Ｈ）、７．１０（ｓ，１Ｈ）、７．０５−６．９４（ｍ，３Ｈ）、４．８９−４．８７（ｄ，１Ｈ）、４．８３−４．８１（ｄ，１Ｈ）、４．６６−４．６４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５３−４．５２（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．４３−４．４１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、３．７２−３．７０（ｍ，１Ｈ）、３．６１−３．５１（ｍ，３Ｈ）、３．４８−３．４１（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．２５、１３８．２０、１３６．４１、１３５．８７、１３５．５８、１３４．７０、１３３．１４、１３２．２３、１２９．８４、１２８．４８、１２８．０２、１２７．６２、１２３．７６、１２３．１５、１２０．１９、１１７．０１、１１５．４０、１０８．９４、１０３．６８、７５．３６、７３．４６、７０．２６、６７．９１、６０．１０。
【０１３４】
１−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２１ａ）：
収量：１．３０ｇ（５１％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．２１。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８３−７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．７１−７．６４（ｍ，３Ｈ）、７．４８−７．４６（ｍ，１Ｈ）、７．４１−７．３７（ｍ，３Ｈ）、７．２６−７．１３（ｍ，３Ｈ）、７．０７（ｓ，１Ｈ）、７．０１−６．９８（ｍ，１Ｈ）、５．２４−５．２３（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８６−４．８４（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．６８−４．６５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５２−４．５０（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．２９−４．２７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、３．７１−３．６９（ｍ，１Ｈ）、３．５９−３．５３（ｍ，３Ｈ）、３．４４−３．３３（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．４５、１３８．６０、１３６．３２、１３５．６６、１３５．６３、１３３．６６、１３３．０４、１３２．３５、１２９．９３、１２８．８２、１２８．４１、１２８．１２、１２７．９６、１２７．４９、１２７．３４、１２５．２３、１１９．７８、１１９．３５、１１９．２８、１１６．３０、１０９．６９、１０４．４９、７５．４６、７３．１３、７０．２６、６７．９１、６０．１８。
【０１３５】
１−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ２１ｅ）：
収量：１．５７ｇ（６１％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．２８。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８３−７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．７２−７．６２（ｍ，３Ｈ）、７．４６−７．４４（ｍ，１Ｈ）、７．３９（ｓ，１Ｈ）、７．３８−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．２１−７．１７（ｍ，３Ｈ）、７．１２（ｍ，１Ｈ）、７．００−６．９８（ｍ，１Ｈ）、５．０８−５．０６（ｄ，１Ｈ）、５．００−４．９９（ｄ，１Ｈ）、４．９６−４．９５（ｄ，１Ｈ）、４．９１−４．９０（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．５９−４．５７（ｍ，１Ｈ）、３．６８−３．５８（ｍ，２Ｈ）、３．５４−３．３１（ｍ，３Ｈ）、３．２１−３．１５（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．５３、１３７．９１、１３６．４２、１３５．６３、１３５．４５、１３３．５９、１３３．００、１３２．４５、１３０．０６、１２８．３４、１２７．９７、１２７．８８、１２７．５６、１２７．３２、１１９．７０、１１９．３６、１１９．２０、１１５．８２、１０９．７０、１００．６３、７３．５３、７３．００、７１．７０、７０．０１、６０．８３。
【０１３６】
１−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩（Ｉ２１ｆ）：
収量：１．７９ｇ（６９％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．０７。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８２−７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．６９−７．６３（ｍ，３Ｈ）、７．５７−７．５４（ｍ，１Ｈ）、７．４０−７．３８（ｍ，３Ｈ）、７．２４−７．２０（ｍ，２Ｈ）、７．１１（ｍ，２Ｈ）、６．９９−６．９７（ｍ，１Ｈ）、６．６６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、５．４５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、３．４７−３．４０（ｍ，１Ｈ）、３．２７−３．２２（ｍ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．３９、１７２．８４、１３８．６９、１３６．３０、１３５．６１、１３３．７３、１３３．０９、１３２．４１、１２９．９４、１２８．４３、１２８．０２、１２７．４５、１２７．４０、１１９．７９、１１９．６２、１１９．３８、１１８．３１、１１６．６２、１１６．５７、１０９．６４、１０３．９６、７６．４３、７３．９３、７３．０４、７１．９２。
【０１３７】
１−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−ガラクトサミニド（Ｉ２１ｇ）：
収量：１．４６ｇ（５３％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．２８。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８２−７．７４（ｍ，２Ｈ）、７．７０−７．６４（ｍ，２Ｈ）、７．６２（ｄ，ＮＨ）、７．４３−７．３５（ｍ，３Ｈ）、７．２４−７．１７（ｍ，３Ｈ）、７．０９（ｄ，１Ｈ）、７．０２（ｓ，１Ｈ）、６．９８（ｄｄ，１Ｈ）、４．７３（ｄ，１Ｈ）、４．６３（ｔ，１Ｈ）、４．６０（ｄ，１Ｈ）、４．４２（ｄ，１Ｈ）、３．９３（ｑ，１Ｈ）、３．７０（ｔ，１Ｈ）、３．６０−３．４８（ｍ，３Ｈ）、３．４０−３．３２（ｍ，１Ｈ）、１．８３（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．５、１６９．６、１６２．３、１３８．７、１３６．３４、１３５．７２、１３３．７０、１３３．１５、１３２．４５、１２９．９５、１２８．５、１２８．０、１２７．５５、１２７．５、１２０．０、１１９．３、１１８．８、１１６．２、１０９．８、１０３．０、７５．５５、７０．８、６７．３、６０．２５、５２．０、２３．２。
【０１３８】
１−（２−ベンゾイルフェニル）−５−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２２ａ）：
収量：１．１４ｇ（３９％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４８。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８３−７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．７１−７．６１（ｍ，３Ｈ）、７．４６−７．４２（ｍ，３Ｈ）、７．３４−７．３２（ｍ，１Ｈ）、７．２８−７．２４（ｍ，２Ｈ）、７．１６（ｓ，１Ｈ）、７．００−６．９８（ｍ，１Ｈ）、４．９６−４．９５（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．８４−４．８２（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．６６−４．６５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５３−４．５２（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．３８−４．３５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、３．７２−３．７０（ｍ，１Ｈ）、３．６１−３．５４（ｍ，３Ｈ）、３．４８−３．４３（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．１２、１３７．８１、１３５．９２、１３５．５５、１３３．３２、１３３．２３、１３２．３０、１２９．８８、１２８．５１、１２８．３５、１２８．０８、１２７．６９、１２６．５５、１２３．３８、１１８．３４、１１６．７０、１１２．８４、１１０．６４、１０３．８９、７５．４１、７３．３７、７０．１８、６７．９０、６０．１０、５５．９８。
【０１３９】
１−（２−ベンゾイル−５−クロロフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２３ａ）：
収量：１．２８ｇ（４７％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４９。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７９（ｓ，１Ｈ）、７．７２（ｍ，２Ｈ）、７．４５−７．３９（ｍ，４Ｈ）、７．２２−７．１７（ｍ，３Ｈ）、７．１２（ｓ，１Ｈ）、７．０２−６．９９（ｍ，１Ｈ）、５．２３−５．２２（ｄ，１Ｈ）、４．８５−４．８４（ｄ，１Ｈ）、４．６８−４．６５（ｍ，１Ｈ）、４．５１−４．５０（ｄ，１Ｈ）、４．２９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、３．７１−３．６９（ｍ，１Ｈ）、３．５７−３．５２（ｍ，３Ｈ）、３．４４−３．３３（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９４．５１、１３８．８９、１３７．７４、１３６．５１、１３５．３８、１３４．２８、１３３．６４、１３３．１５、１３１．６５、１２８．４１、１２８．０５、１２７．９３、１２７．６６、１２７．３２、１２０．０５、１１９．４９、１１９．２４、１１６．０６、１０９．８４、１０４．３６、７５．４９、７３．１２、７０．２３、６７．９０、６０．１９。
【０１４０】
１−（２−ベンゾイル−５−メトキシフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２４ａ）：
収量：２．４ｇ（７６％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（４：１）］：Ｒｆ０．２３。
ＦＴ−ＩＲ：３３６７ｍ、２９１１ｗ、２８５３ｗ、１６５４ｓ、１６００ｓ、１５７９ｍ、１４９９ｍ、１４７０ｍ、１４４８ｍ、１３６５ｍ、１２６４ｓ、１２３９ｓ、１１１８ｓ、１０７５ｓ、１０２２ｓ、９７５ｍ、９２３ｍ、８７２ｓ、７５０ｍ、７０３ｓ。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．６６（ｄ，Ｊ＝８．６，１ａｒｏｍ．Ｈ）、７．４４（ｄ，Ｊ＝８．５，１ａｒｏｍ．Ｈ）、６．３６−７．３２（ｍ，１ａｒｏｍ．Ｈ）、７．３４（ｓ，１ａｒｏｍ．Ｈ）、７．３２（ｓ，１ａｒｏｍ．Ｈ）、７．２１−７．１４（ｍ，６ａｒｏｍ．Ｈ）、６．９８（ｄｄ，Ｊ＝８．５，１．８，１ａｒｏｍ．Ｈ）、５．２３（ｄ，Ｊ＝４．９，ＯＨ）、４．８５（ｄ，Ｊ＝５．７，ＯＨ）、４．６９（ｔ，Ｊ＝５．５，ＯＨ）、４．５１（ｄ，Ｊ＝４．７，ＯＨ）、４．２９（ｂｒ．ｓ，Ｈ−Ｃ（Ｉ）Ｇａｌ）、３．９２（ｓ，ＯＣＨ３）、３．７１（ｔ，Ｊ＝４．０，Ｈ−Ｃ（４）Ｇａｌ）、３．６０−３．５３（ｍ，３Ｈ−ＣＧａｌ）、３．４６（ｔ，Ｊ＝６．２，１Ｈ−Ｇａｌ）、３．３９−３．３４（ｍ，１Ｈ−ＣＧａｌ）。
【０１４１】
１−［２−（２，４−ジメトキシベンゾイル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２５ａ）：
収量：１．２８ｇ（４８％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４５。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７０−７．６５（ｍ，１Ｈ）、７．５５−７．４７（ｍ，４Ｈ）、７．０９−６．９５（ｍ，５Ｈ）、６．２６−６．２３（ｍ，２Ｈ）、５．２５−５．２３（ｄ，１Ｈ）、４．８６−４．８４（ｄ，１Ｈ）、４．６９−４．６６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５１−４．５０（ｄ，１Ｈ）、４．３３−４．３１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）、３．６１−３．５４（ｍ，４Ｈ）、３．４４（ｓ，３Ｈ）、３．４８−３．４１（ｍ，１Ｈ）、３．３９−３．３４（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９３．０５、１６３．７７、１５９．６６、１３８．９１、１３８．７０、１３６．４２、１３３．７８、１３１．８９、１３１．３３、１２８．９５、１２７．２１、１２６．７８、１２２．３０、１２０．４５、１１９．５０、１１９．０２、１１７．７３、１１５．１０、１０９．６５、１０５．２３、１０４．７５、９７．５５、７５．５０、７３．１８、７０．３５、６８．０１、６０．３２、５５．４１、５５．３８。
【０１４２】
１−［２−（２，４−ジメトキシベンゾイル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イルコリンホスフェート（Ｉ２５ｄ）：
収量：０．９２ｇ（６８％）、ＴＬＣ［酢酸エチル／ピリジン／酢酸／水（３０：２５：５：１５）］：Ｒｆ０．４６。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．６８−７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．４８（ｍ，２Ｈ）、７．４３（２ｄ，２Ｈ）、７．２０（ｄ，１Ｈ）、７．１０（ｓ，１Ｈ）、７．０５（ｔ，１Ｈ）、７．０２（ｔ，１Ｈ）、６．９４（ｔ，１Ｈ）、６．３５（ｄ，１Ｈ）、６．３２（ｄｄ，１Ｈ）、４．０５（ｍ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，３Ｈ）、３．５３（ｓ，３Ｈ）、３．４６（ｔ，３Ｊ［Ｈ，Ｐ］＝４．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．０３（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９３．０、１６４．１、１６０．０、１５７．０、１３８．８、１３６．７、１３４．０（ｄ，Ｊ［Ｃ，Ｐ］＝７．４Ｈｚ）、１３３．６、１３２．３、１３１．３、１２９．０、１２７．０（Ｊ［Ｃ，Ｐ］＝２．４Ｈｚ）、１２２．０、１２１．６（Ｊ［Ｃ，Ｐ］＝６．３Ｈｚ）、１１９．５、１１８．９、１１７．６、１１６．１、１０９．７、１０５．７、９７．９、６５．４（Ｊ［Ｃ，Ｐ］＝４．８Ｈｚ）、５９．０（Ｊ［Ｃ，Ｐ］＝５．３６Ｈｚ）、５５．５（２  ＯＣＨ３）、５３．０。
【０１４３】
４−クロロ−１−［２−（２，４−ジメトキシベンゾイル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２６ａ）：
収量：１．７６ｇ（６２％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．５４。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７０−７．６６（ｍ，１Ｈ）、７．５８−７．５３（ｍ，２Ｈ）、７．４９−７．４７（ｍ，１Ｈ）、７．１２−７．１０（ｍ，１Ｈ）、７．０２（ｓ，１Ｈ）、７．０１−６．９９（ｍ，１Ｈ）、６．９６−６．９３（ｍ，２Ｈ）、６．３４−６．２９（ｍ，２Ｈ）、４．８５−４．８３（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）、４．６７−４．６４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５３−４．５２（ｄ，１Ｈ）、４．４８−４．４６（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，３Ｈ）、３．７２−３．７０（ｍ，１Ｈ）、３．６４−３．５５（ｍ，３Ｈ）、３．４８（ｓ，３Ｈ）、３．４６−３．３８（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９２．８４、１６３．９９、１５９．７２、１３９．２５、１３８．１７、１３５．７７、１３５．０７、１３１．９２、１３１．３３、１２８．９１、１２７．１８、１２３．７４、１２２．８８、１１９．８４、１１９．３６、１１６．８６、１１５．１４、１０８．７７、１０５．４０、１０３．９４、９７．５９、７５．５０、７３．４４、７０．３２、６８．００、６０．２４、５５．４８、５５．４０。
【０１４４】
６−クロロ−１−［２−（２，４−ジメトキシベンゾイル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２７ａ）：
収量：１．８８ｇ（６６％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．４５。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７２−７．６７（ｍ，１Ｈ）、７．５７−７．５６（ｍ，２Ｈ）、７．５２−７．５０（ｍ，２Ｈ）、７．１２−７．１０（ｍ，１Ｈ）、７．０２（ｓ，１Ｈ）、７．００−６．９８（ｍ，２Ｈ）、６．３１−６．２６（ｍ，２Ｈ）、５．２７−５．２６（ｄ，１Ｈ）、４．８７−４．８６（ｄ，１Ｈ）、４．６９−４．６６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５２−４．５１（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．３８−４．３５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）、３．７０−３．６８（ｍ，１Ｈ）、３．６０−３．５５（ｍ，３Ｈ）、３．４８（ｓ，３Ｈ）、３．４８−３．４３（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９２．８９、１６３．８９、１５９．５４、１３８．８９、１３８．５２、１３５．６９、１３３．９８、１３１．９２、１３１．５４、１２９．０６、１２７．７７、１２７．２１、１２７．０３、１１９．３６、１１９．２１、１１９．１８、１１６．０９、１０９．４２、１０５．３８、１０４．６８、９７．４１、７５．５９、７３．１３、７０．３０、６８．０３、６０．３６、５５．４４、５５．３２。
【０１４５】
５−ブロモ−４−クロロ−１−［２−（２，４−ジメトキシベンゾイル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２８ａ）：
収量：２．１７ｇ（６７％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．５８。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７２−７．６７（ｍ，１Ｈ）、７．６１−７．４９（ｍ，３Ｈ）、７．３４−７．３１（ｍ，１Ｈ）、７．１２−７．１０（ｍ，１Ｈ）、７．０６（ｓ，１Ｈ）、６．８８−６．８６（ｍ，１Ｈ）、６．３４−６．３１（ｍ，１Ｈ）、６．２８−６．２７（ｍ，１Ｈ）、４．９５−４．９４（ｄ，１Ｈ）、４．８５−４．８４（ｄ，１Ｈ）、４．６７−４．６４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５３−４．５２（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．４５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，３Ｈ）、３．７２−３．７０（ｍ，１Ｈ）、３．６４−３．５１（ｍ，３Ｈ）、３．４７（ｓ，３Ｈ）、３．４６−３．３７（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９２．７６、１６３．９８、１５９．６３、１３９．３０、１３７．８４、１３５．２７、１３３．６８、１３１．８２、１３１．４２、１２８．９７、１２８．１４、１２７．２４、１２６．３２、１２３．３３、１１９．２８、１１８．１７、１１６．３８、１１２．５１、１１０．４５、１０５．４０、１０４．０６、９７．４８、７５．５３、７３．３６、７０．２４、６７．９９、６０．２４、５５．４８、５５．３９。
【０１４６】
１−［２−（５−カルボキシルフラノイル）フェニル］−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２９ａ）：
収量：０．９９ｇ（３６％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＣＤ３ＣＯＯＤ］：７．８２−７．７４（ｍ，２Ｈ）、７．６９−７．６７（ｍ，１Ｈ）、７．６３−７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．５５−７．４９（ｍ，１Ｈ）、７．３３−７．３２（ｍ，１Ｈ）、７．１２（ｓ，１Ｈ）、７．０４−７．０２（ｍ，１Ｈ）、６．９７−６．９６（ｄ，１Ｈ）、６．８８−６．８７（ｄ，１Ｈ）、４．６９−４．６７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．１４−４．１３（ｄ，１Ｈ）、４．０４−３．９４（ｍ，３Ｈ）、３．８６−３．８２（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＣＤ３ＣＯＯＤ］：１８４．９、１５４．０、１４７．７、１３９．６、１３８．２、１３５．２、１３５．１、１３３．６、１３０．９、１２９．８、１２８．４、１２７．８、１２１．３、１２０．６、１１９．８、１１９．５、１１９．１、１１６．６、１１０．９、１０４．３、７５．５、７３．９、７１．９、６９．８、６２．１。
【０１４７】
６−クロロ−１−（２−フラノイルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ３０ａ）：
収量：１．６５ｇ（６６％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．３８。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８４（ｍ，１Ｈ），７．８０−７．７６（ｍ，１Ｈ）、７．７２−７．７０（ｍ，１Ｈ）、７．６４−７．５７（ｍ，３Ｈ）、７．１８（ｓ，１Ｈ）、７．１０−７．０３（ｍ，３Ｈ）、６．５４−６．５３（ｍ，１Ｈ）、５．２８−５．２７（ｄ，１Ｈ）、４．８７−４．８５（ｄ，１Ｈ）、４．６６−４．６３（ｍ，１Ｈ）、４．５２−４．５１（ｄ，１Ｈ）、４．４７−４．４５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．７１−３．６９（ｍ，１Ｈ）、３．６３−３．５３（ｍ，３Ｈ）、３．４８−３．４１（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１８１．５５、１５１．０１、１４８．８１、１３８．５８、１３６．０６、１３５．２４、１３３．７８、１３２．３２、１２９．６２、１２７．８３、１２７．６２、１２７．５６、１２０．８３、１１９．８５、１１９．４８、１１９．４２、１１６．２４、１１２．６１、１０９．６４、１０４．５０、７５．５４、７３．１６、７０．３２、６８．００、６０．２７。
【０１４８】
６−クロロ−１−［２−（Ｎ−メチルピロール−２−カルボニル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ３１ａ）：
収量：１．７６ｇ（６９％）、ＴＬＣ［トルエン／エタノール（５：３）］：Ｒｆ０．３６。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．９５（ｍ，１Ｈ）、７．７３−７．６９（ｍ，１Ｈ）、７．６３−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．１７（ｍ，１Ｈ）、７．１０（ｓ，１Ｈ）、７．０５−７．０２（ｍ，２Ｈ）、６．３５−６．３４（ｍ，１Ｈ）、５．９１−５．９０（ｍ，１Ｈ）、５．２７−５．２６（ｄ，１Ｈ）、４．８６−４．８４（ｄ，１Ｈ）、４．６３−４．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、４．５１−４．５０（ｄ，１Ｈ）、４．４５−４．４３（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．７１−３．６８（ｍ，１Ｈ）、３．６１−３．３３（ｍ，５Ｈ）、２．８８（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１８３．７８、１６２．２３、１３８．４９、１３７．２７、１３５．６７、１３３．７２、１３２．７３、１３１．１６、１２９．８６、１２９．４１、１２７．４４、１２７．３４、１２７．１８、１２１．９９、１１９．６２、１１９．３４、１１６．０７、１０９．８７、１０８．０５、１０４．６２、７５．４２、７３．１４、７０．２９、６７．８６、６０．０８、３６．４０。
【０１４９】
（実施例２）
Ｉ１ｃのＮ−アリール化によるＩ１９ｃおよびＩ２５ｃの調製（表Ｉａ）
２５ｍｌの乾燥ジメチルアセトアミド中５．０ｍｍｏｌのヨウ化アリール、１．３１ｇ（７．４８ｍｍｏｌ）のＩ１ｃおよび０．６７ｇ（５．４７ｍｍｏｌ）の酢酸銅（Ｉ）を窒素雰囲気下で２時間、１５０℃まで加熱した。生成混合物を室温まで冷却し、２５ｍｌの酢酸エチルで希釈した。懸濁液を５０ｍｌの飽和塩化アンモニウム水溶液上に注ぎ、３０分間攪拌した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた油状物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより精製した［トルエン、トルエン／アセトン（１０：１）］。
【０１５０】
１−（２−ベンゾイルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イルアセテート（Ｉ１９ｃ）：
収量：５９０ｍｇ（３３％）、ＴＬＣ（トルエン）：Ｒｆ０．１５。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８３−７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．７１−７．６４（ｍ，３Ｈ）、７．４２−７．３６（ｍ，３Ｈ）、７．３２−７．３０（ｍ，１Ｈ）、７．２６−７．２５（ｍ，１Ｈ）、７．２３−７．１１（ｍ，４Ｈ）、７．０５−７．０１（ｍ，１Ｈ）、２．２７（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．２７、１６８．０３、１３６．３６、１３５．７８、１３５．６３、１３３．４１、１３３．０８、１３２．２３、１３０．６９、１２９．９１、１２８．４９、１２８．１１、１２７．９４、１２７．６１、１２２．８９、１２０．２４、１２０．０４、１１８．３７、１１７．３５、１１０．２７、２０．４６。
【０１５１】
１−［２−（２，４−ジメトキシベンゾイル）フェニル］−１Ｈ−インドール−３−イルアセテート（Ｉ２５ｃ）：
収量：１．２３ｇ（５９％）、ＴＬＣ［トルエン／アセトン（１０：１）］：Ｒｆ０．６６。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７１−７．６７（ｍ，１Ｈ）、７．５６−７．５２（ｍ，３Ｈ）、７．３７−７．３５（ｍ，１Ｈ）、７．３１（ｓ，１Ｈ）、７．１８−７．１６（ｍ，１Ｈ）、７．１４−７．１０（ｍ，３Ｈ）、７．０６−７．０２（ｍ，１Ｈ）、６．３０（ｓ，１Ｈ）、３．７０（ｓ，３Ｈ）、３．４９（ｓ，３Ｈ）、２．３０（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９２．７７、１６７．９９、１６３．９９、１３９．０７、１３５．７２、１３３．６０、１３１．９２、１３１．３１、１３０．４２、１２８．９２、１２８．７９、１２８．０９、１２７．６５、１２７．１３、１２５．２１、１２２．６４、１１９．７５、１１８．２４、１１７．１６、１１０．０９、１０５．５２、９７．５８、５５．３８、５５．３３、２０．５１。
【０１５２】
（実施例３）
Ｉ６のＮ−アリール化によるＩ３２の調製（表Ｉａ）
１−（２−ベンゾイルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イルエチルカーバメート（Ｉ３２）：
２５ｍｌの乾燥ジメチルアセトアミド中１．３０ｇ（４．２２ｍｍｏｌ）の２−ヨードベンゾフェノン、１．２９ｇ（６．３２ｍｍｏｌ）の３−アミノインドール−３−エチルカーバメートおよび０．５７ｇ（４．６５ｍｍｏｌ）の酢酸銅（Ｉ）を窒素雰囲気下で２時間、１５０℃まで加熱した。生成混合物を室温まで冷却し、２５ｍｌの酢酸エチルで希釈した。懸濁液を５０ｍｌの飽和塩化アンモニウム水溶液上に注ぎ、３０分間攪拌した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた油状物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより精製した［トルエン、トルエン／アセトン（１０：１）］。
収量：１００ｍｇ（６％）、ＴＬＣ［トルエン］：Ｒｆ０．１０。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：９．５０（ｓ，ＮＨ）、７．８１−７．７７（ｍ，１Ｈ）、７．７１−７．６０（ｍ，４Ｈ）、７．４１−７．３６（ｍ，４Ｈ）、７．２０−７．１６（ｍ，３Ｈ）、７．１１−７．０７（ｍ，１Ｈ）、６．９９−６．９５（ｍ，１Ｈ）、４．１３（ｑ，２Ｈ）、１．２４（ｔ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９５．４２、１５３．５７、１３６．９８、１３５．７３、１３５．４３、１３３．９２、１３２．９５、１３２．１５、１２９．８９、１２８．４２、１２７．８６、１２７．４３、１２７．１３、１２２．５９、１２１．０６、１１９．２１、１１８．４４、１１７．５３、１１７．０８、１０９．７８、６０．１５、１４．５３。
【０１５３】
（実施例４）
ビス［１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−ジスルファンの調製（Ｉ３３、表Ｉａ）
１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル−イソチウロニウムヨージド：
１．８０ｇ（７．６５ｍｍｏｌ）の１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール（実施例１の方法により調製）および１．１７ｇのチオ尿素（１５．４ｍｍｏｌ）を３５ｍｌのメタノール（３５ｍｌ）と４ｍｌの水との混合液中に溶解させた。３．９０ｇのヨウ素（１５．４ｍｍｏｌ）をヨウ化カリウム（３．８２ｇ、２３ｍｍｏｌ）の水（７．７ｍｌ）中の溶液中に溶解させた。このヨウ素溶液を、周囲温度で前記の溶液に１時間かけて滴加し、３５℃で３時間温めた。蒸発により溶媒を除去した。残留油状物を酢酸エチル（４０ｍｌ）中に溶解させた。溶液を水で３回抽出した（３×１０ｍｌ）。有機層を乾燥し、木炭（１ｇ）で処理した。濾液を蒸発させた後に粗生成物を得、シリカゲル上クロマトグラフィーにより精製した（１００ｇ、酢酸エチル）。
収量：１．２７ｇ（３８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：９．０６（ｓ，ＮＨ２）、８．６２（ｓ，ＮＨ２）、８．１８（ｓ，１Ｈ）、７．９８（ｄ，１Ｈ）、７．８４（ｔ，１Ｈ）、７．７０（２ｔ，２×１Ｈ）、７．６１（ｍ，１Ｈ）、７．３０（ｍ，２Ｈ）、７．１２（ｍ，１Ｈ）、２．１８（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９９．４、１７０．２、１３９．３、１３７．８、１３６．２、１３５．０、１３３．１、１２９．９、１２９．３、１２９．０、１２８．５、１２３．９、１２２．０、１１８．２、１１１．０、９２．６、２９．０
ビス［１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−ジスルファン（Ｉ３３）：
１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル−イソチウロニウムヨージド（０．４７ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を、脱気オキサン（２．７ｍｌ）と脱気水（１．５７ｍｌ）との混合液中に窒素雰囲気下で溶解させた。水酸化ナトリウムの脱気した５％水溶液（０．８ｍｌ、１．２２ｍｍｏｌ）を周囲温度で滴加すると、溶液は暗褐色になった。溶液を４８時間４５℃で攪拌した。生成混合物を蒸発させ、水（５ｍｌ）中に溶解させ、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させると、粗生成物が粘稠性油状物として残り、これをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
収量：７０ｍｇ（２４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８４（ｄｄ，１Ｈ）、７．６６（ｄｔ，１Ｈ）、７．６２（ｄｔ，１Ｈ）、７．６０（ｄ，１Ｈ）、７．５５（ｓ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，１Ｈ）、７．１９（２ｔ，２×１Ｈ）、７．０３（ｄ，１Ｈ）、１．９４（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１９９．１、１３７．５、１３６．４、１３５．３、１３２．８、１２９．６、１２８．８、１２８．７、１２８．５、１２３．５、１２１．３、１１９．３、１１０．４、１０８．０、２８．４。
【０１５４】
（実施例５）
１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドールの調製（表Ｉｃ）
ｐＨ７．３、１ｍＭのＭｇＣｌ２および６７０ｍｇ／ｌの酵素基質を含む１００ｍＭのＮａ２ＰＯ４緩衝液中で酵素反応を実施した。大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼまたはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ラクターゼを、それぞれ１０００Ｕ／ｌまたは１５００Ｕ／ｌの最終濃度になるように添加した。３０ｍｌの反応体積を穏やかに振盪しながら５〜１８時間、３７℃でインキュベートした。反応生成物を遠心分離（４４００ｇ、１５分）により回収し、ペレットを１０ｍｌのＨ２Ｏで洗浄し、再度遠心分離した（４４００ｇ、１５分）。
【０１５５】
１１−ヒドロキシ−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１０）
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．７３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２ａｒｏｍ．Ｈ）、７．６９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２ａｒｏｍ．Ｈ）、７．５０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２ａｒｏｍ．Ｈ）、７．０７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２ａｒｏｍ．Ｈ）、５．７９（ｂｒ．ｓ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１６０．７５（ｓ，Ｃ＝Ｏ）、１３８．３２（ｓ，ａｒｏｍ．Ｃ）、１３２．１０（ｄ，ａｒｏｍ．Ｃ−Ｈ）、１２７．１５（ｓ，ａｒｏｍ．Ｃ）、１２３．２７、１２１．５２（２ｄ，ａｒｏｍ．Ｃ−Ｈ）、１１８．６５（ｓ，Ｃ（１０ａ）、１１１．７２（ｄ，ａｒｏｍ．Ｃ−Ｈ）。
【０１５６】
注：ＩＯ１０はｐＨ５超で容易に水に溶けるようになる。
１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１３）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．９４（ｍ，１Ｈ）、７．８４（ｍ，１Ｈ）、７．７４（ｍ，１Ｈ）、７．６７（ｍ，１Ｈ）、７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．４８（ｍ，１Ｈ）、７．３５（ｍ，１Ｈ）、７．１８（ｍ，１Ｈ）、７．１７（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１８０．７、１４４．８、１３６．３、１３５．０、１３３．７、１３２．０、１２８．５、１２８．４、１２４．９、１２４．７、１２４．３、１２２．２、１１２．２、１１２．０、１０８．１。
ＭＳ（Ｃｌ）：２２０．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０１５７】
１１−メチル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１４）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８５（ｍ，１Ｈ）、７．７７（ｍ，１Ｈ）、７．７１（ｍ，１Ｈ）、７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．４７（ｍ，１Ｈ）、７．１６（ｍ，１Ｈ）、７．１３（ｍ，１Ｈ）、２．５０（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１８０．８、１４４．０、１３５．８、１３３．３、１３２．６、１３１．７、１２８．６、１２８．５、１２４．１、１２３．４、１２２．８、１２１．５、１２１．３、１１１．７、１１１．６、８．８。
ＵＶ：λｍａｘ＝２５５、３５５、４３５ｎｍ。
【０１５８】
９−クロロ−１１−メチル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１５）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．８８−７．８６（ｍ，１Ｈ）、７．７６−７．７２（ｍ，２Ｈ）、７．６０−７．５６（ｍ，１Ｈ）、７．５１−７．４７（ｍ，１Ｈ）、７．２１−７．１７（ｍ，１Ｈ）、７．１２−７．１０（ｍ，１Ｈ）、２．４９（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１７８．３、１４５．６、１３６．８、１３３．２、１３３．０、１３２．３、１３０．８、１２８．８、１２４．８、１２４．３、１２３．０、１２２．２、１２１．９、１１２．０、１１０．８、８．９。
ＵＶ：λｍａｘ＝２４５、３６５、４４０ｎｍ。
【０１５９】
７−クロロ−１１−メチル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１６）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：８．００−７．９８（ｍ，１Ｈ）、７．９２（ｍ，１Ｈ）、７．７３−７．７１（ｍ，１Ｈ）、７．５８−７．５６（ｍ，１Ｈ）、７．５０−７．４６（ｍ，１Ｈ）、７．２０−７．１５（ｍ，２Ｈ）、２．４８（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１７９．９、１４４．８、１４０．４、１３３．４、１３２．９、１３２．１、１２８．９、１２７．７、１２５．６、１２３．５、１２３．０、１２２．６、１２２．０、１１２．２４、１１２．２１、９．００。
ＵＶ：λｍａｘ＝２４５、３６０、４３０ｎｍ。
【０１６０】
８−ブロモ−９−クロロ−１１−メチル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１７）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：７．９６−７．９４（ｍ，１Ｈ）、７．９０−７．８７（ｍ，１Ｈ）、７．７６−７．７２（ｍ，２Ｈ）、７．５３−７．４８（ｍ，１Ｈ）、７．２２−７．１８（ｍ，１Ｈ）、２．５０（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１７７．３、１４４．６、１３９．５、１３３．２、１３２．９、１３１．９、１３０．７、１２９．２、１２６．０、１２３．２、１２３．１、１２２．２、１１６．９、１１２．２、１１２．１、９．０。
ＵＶ：λｍａｘ＝２４５、３６５、４５０ｎｍ。
【０１６１】
７−クロロ−３−メトキシ−１１−メチル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１８）
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：８．０７（ｄ，Ｊ＝１．６，１Ｈ）、７．６１（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ）、７．５６（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ）、７．３９（ｄ，Ｊ＝２．１，１Ｈ）、７．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．６，１Ｈ）、６．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．２，１Ｈ）、３．９４（ｓ，ＯＣＨ３）、２．４６（ｓ，ＣＨ３）。
【０１６２】
１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１９）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：８．０４−８．０２（ｍ，１Ｈ）、７．９９−７．９２（ｍ，４Ｈ）、７．７１−７．６５（ｍ，２Ｈ）、７．５９−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．５１−７．４７（ｍ，１Ｈ）、７．２９−７．１９（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１８０．１、１４４．０、１３６．０、１３３．９、１３０．７、１３０．２、１２８．９、１２８．８、１２４．６、１２４．５、１２４．３、１２３．７、１２２．７、１１２．４、１１２．３。
ＵＶ：λｍａｘ＝２４５、３７０、４６０ｎｍ。
【０１６３】
９−クロロ−１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ２０）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：８．０５−８．０３（ｍ，１Ｈ）、７．９７−７．９０（ｍ，４Ｈ）、７．６７−７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．５９−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．５１−７．４９（ｍ，１Ｈ）、７．３１−７．２７（ｍ，１Ｈ）、７．２０−７．１８（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１４５．５、１３７．０、１３３．７、１３１．０、１３０．５、１２９．０、１２８．８、１２５．４、１２４．９、１２４．４、１２３．８、１２３．１、１１２．６、１１１．１。
【０１６４】
８−ブロモ−９−クロロ−１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ２２）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：８．０４−８．００（ｍ，２Ｈ）、７．９８−７．９２（ｍ，３Ｈ）、７．８９−７．８６（ｍ，１Ｈ）、７．６０−７．４８（ｍ，４Ｈ）、７．３１−７．２８（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１４４．３、１３９．５、１３３．７、１３１．０、１３０．４、１３０．２、１２９．０、１２８．９、１２８．７、１２６．２、１２５．４、１２３．９、１２３．１、１１７．５、１１２．６、１１２．５。
【０１６５】
７−クロロ−３−メトキシ−１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ２４）
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：８．１３（ｄ，Ｊ＝１．６，１Ｈ）、７．９４、７．９２（２  ｂｒ．ｓ，２Ｈ）、７．７７（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ）、７．５９（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ）、７．５４（ｂｒ．ｔ，Ｊ＝８．０，２Ｈ）、７．４８−７．４４（ｍ，２Ｈ）、７．２１（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．６，１Ｈ）、６．８７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．２，１Ｈ）、３．３７（ｓ，ＯＣＨ３）。
【０１６６】
１１−（５−カルボキシフラン−２−イル）−７−クロロ−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ２９）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：８．５７−８．５４（ｍ，１Ｈ）、８．０８−８．０６（ｍ，１Ｈ）、８．００（ｍ，１Ｈ）、７．８４（ｍ，１Ｈ）、７．７１−７．６９（ｍ，１Ｈ）、７．６１−７．５７（ｍ，１Ｈ）、７．３６−７．３３（ｍ，１Ｈ）、７．２６−７．２４（ｍ，１Ｈ）、６．８５−６．８４（ｍ，１Ｈ）。
【０１６７】
７−クロロ−１１−（フラン−２−イル）−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ３０）：
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：８．３３−８．３０（ｍ，１Ｈ）、８．１６−８．１４（ｍ，１Ｈ）、８．０９（ｍ，１Ｈ）、８．０３（ｍ，１Ｈ）、７．８６−７．８３（ｍ，１Ｈ）、７．７０−７．６８（ｍ，１Ｈ）、７．６０−７．５６（ｍ，１Ｈ）、７．３４−７．３１（ｍ，１Ｈ）、７．２７−７．２５（ｍ，１Ｈ）、６．８２−６．８１（ｍ，１Ｈ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１７７．７、１４８．０、１４５．０、１４４．２、１４０．２、１３３．９、１２９．４、１２８．３、１２７．４、１２５．８、１２５．２、１２４．０、１２３．１、１１４．０、１１３．２、１１２．７、１１２．６、１１２．４。
【０１６８】
結論：ＩＯ染色剤は、酵素外部刺激（ｅＳ）に曝された対応するインジケータから効率的に生成される。
（実施例６）
１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドールの光吸収（図１）
実施例５の手順から得られる乾燥１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドールペレットを、２．５ｍＭでエタノール／ＤＭＦ（１：１）中に溶解させた。このストック溶液を１００％ＥｔＯＨ中で０．２２ｍＭまで希釈し、スペクトルスキャンをＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で記録した。対応するインジケータのスペクトルを比較のために記録した。データを図１に示す。
【０１６９】
インジケータと対応するＩＯ染色剤の吸収スペクトルは、可視吸収帯で実質的に異なる。
結論：ＩＯ染色により強力かつ容易に検出可能なシグナルが生じる。
【０１７０】
（実施例７）
インジケータ系Ｉ４ｂ／ＭＤＡＢおよびＩ４ｃ／ＭＤＡＢでのフッ化物および水酸化物イオンのインビトロ表示
Ｉ４ｂ（０．４ｇ、１．１１ｍｍｏｌｌ）およびＭＤＡＢ（０．２５ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）をエタノール（８ｍｌ）中に溶解させた。得られたインジケータ溶液を、窒素ガス雰囲気下で維持した。テトラブチルアンモニウムフルオリドのＴＨＦ中１ｍＭ溶液（１．６ｍｌ）を室温でインジケータ溶液に添加した。１０分後にＢＩ４は強い紫色の重い固体として沈殿し、これを回収して、乾燥した（０．１９ｇ、４２％）。
【０１７１】
同様に、ＢＩ４は、Ｉ４ｃ／ＭＤＡＢを水性塩基に曝露することによって得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：９．８４（ｓ，Ｈ１）、７．６８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ６）、７．６１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ６’）、７．０７（ｓ，＝ＣＨ−）、７．０２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ７）、６．３８（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ５’）、６．２４（ｄ，Ｈ３’）、３．８８（ｓ，ＯＣＨ３）、３．０２（ｓ，Ｎ（ＣＨ３）２）。
１３Ｃ−ＮＭＲ［ＤＭＳＯ−ｄ６］：１８１．０（Ｃ＝Ｏ）、１６０．０、１５２．８、１５２．５、１３８．３、１３０．７４、１３０．７１、１２９．９、１１８．３、１１３．０、１１１．４、１１０．０、１０９．１、１０４．９、９４．６（ＯＣＨ３）、５５．５（Ｎ（ＣＨ３）２）。
【０１７２】
注：ＢＩ４の２つの可能な立体異性体、（Ｅ）−５−ブロモ−４−クロロ−２−（４−ジメチルアミノ−２−メトキシベンジリデン）インドリン−３−オンおよび（Ｚ）−５−ブロモ−４−クロロ−２−（４−ジメチルアミノ−２−メトキシベンジリデン）インドリン−３−オンが存在する。ＮＯＥ  ＮＭＲ測定は、このプロセスで（Ｚ）−ＢＩ４のみが形成されたことを示す。
【０１７３】
結論：（１）インジケータ系Ｉ４ｂ／ＭＤＡＢは、フッ化物イオンの嫌気性検出に潜在的に有用であり、（２）インジケータ系Ｉ４ｃ／ＭＤＡＢは、一時的なアルカリ性ｐＨ状態の不可逆的検出に潜在的に有用である（一般的なｐＨインジケータは可逆的検出のみが可能である）。
【０１７４】
（実施例８）
ＭＤＡＢとインドール−３−アミン（ａＳ６）およびインドール−３−チオール（ａＳ７）との反応
活性シグナロゲンａＳ６（対応するニトロソ化合物の還元により調製）を大気酸素に曝露すると、ビス−イミノ−インディゴ誘導体ではなく、ポリマーの褐色の沈殿が生じた。ＭＤＡＢの存在下および酸素の非存在下で、ａＳ６は黄色の恐らくシッフ塩基を生じたが、これは単離されなかった。予想されたヘテロアルドール生成物の形成は観察されなかった。
【０１７５】
活性シグナロゲンａＳ７（Ｉ３３と同様にして得る）を酸素に曝露すると、ビス−チオン−インディゴ類似体ではなく対応するジスルファンが生じる。ＭＤＡＢの存在下および酸素の非存在下で、予想された紫色は、強酸性条件下でのみ現れた。
【０１７６】
結論：ＭＤＡＢ染色は、インドール−３−アミンまたはインドール−３−チオール由来のインジケータに適さない可能性がある。
（実施例９ａ）
インジケータＩ４ａおよびＩ５ａでの細菌コロニーのＭＤＡＢ染色（表ＩＩＩ、エントリー１〜２５）
酵母エキス（０．６％）を含むトリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）を基礎平板培地として使用した。培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、５０℃の水浴中に入れて冷却した。インジケータを基礎培地に４０ｍｇ／１００ｍｌの最終濃度で添加した（８０ｍｇ／ｍｌのＤＭＦ中ストック溶液から）。ブレインハートインフュージョンブロス中の腸内細菌細胞の一晩培養物をプレート上に画線し、好気性条件下および嫌気性条件下、３５℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレート上のコロニーの形態を記録した（表ＩＩＩ）。
【０１７７】
嫌気性条件下およびＭＤＡＢの非存在下で、試験したインジケータは、好適な外部刺激（ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）を生じる細菌コロニーを染色しなかった。残存酸素（微嫌気性条件）に起因する弱い染色が観察される場合もあった。好気性条件下で、インディゴ（ＩＮ染色剤）は一般的にＭＤＡＢ染色の効果よりも優位であった。例えばインジケータ系Ｉ４ａ／ＭＤＡＢは嫌気性下ではコロニーを紫色に染色したが、好気性条件下では青色に染色した。
【０１７８】
結論：ＭＤＡＢ染色は、微生物種の特に嫌気性条件下での検出および単離のための潜在的に有用な方法である。
注：４−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミノベンズアルデヒド（ＤＡＢ）および芳香族カルボニル化合物から選択される多数の他の潜在的に好適なアドール（Ａｄｏｌ）受容体は、ＭＤＡＢを置換するために使用した場合、試験したすべての条件下でＢＩ染色剤を生じなかった。
【０１７９】
（実施例９ｂ）
インジケータＩ９ａ、Ｉ１０ａ、Ｉ１１ａおよびＩ１２ａのインジケータでの細菌コロニーのＭＤＡＢ染色（表ＩＩＩ、エントリー２６〜３７）
栄養寒天プレート上で生きた培養菌を用いてインジケータを試験した。栄養寒天（５ｇ／ｌのペプトン、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌの酵母エキス、１ｇ／ｌの牛肉エキス、１３ｇ／ｌの寒天、ｐＨ７．４）をオートクレーブ処理し、５０℃まで冷却した。次いで基質を１５０ｍｇ／ｌの最終濃度になるまで添加した（２０ｍｇ／ｍｌのＤＭＦ中ストック溶液から）。任意に、ＭＤＡＢを１ｍＭの濃度まで添加し（２００ｍＭのＤＭＦ中ストック溶液から）、プレートに注いだ。寒天プレートに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＮＭ１）または腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）（ＲＫＩ０５／０７９９２）の培養物（栄養ブロス中で８〜１８時間前もって成長させておく）を播種し、３７℃で好気的にインキュベートした。インキュベーションの４８時間後に結果を記録し、表ＩＩＩに示す。
【０１８０】
結論：インジケータＩ９ａ、Ｉ１１ａおよびＩ１２ａは、好気性条件下でのＭＤＡＢ染色について潜在的に有用である。
（実施例１０）
細菌コロニーの１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール（ＩＯ）染色（表ＩＶａ〜ｃ）
栄養寒天（５ｇ／ｌのペプトン、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌの酵母エキス、１ｇ／ｌの牛肉エキス、１３ｇ／ｌの寒天、ｐＨ７．４）をオートクレーブ処理し、５０℃まで冷却させた。次いでインジケータを１５０ｍｇ／ｌの最終濃度まで添加した（２０ｍｇ／ｍｌのＤＭＦ中ストック溶液から）。
【０１８１】
任意に、ＩＰＴＧを１００ｍｇ／ｌになるように添加し（１００ｍｇ／ｍｌのＨ２Ｏ中ストック溶液から）、プレートに注いだ。寒天プレートにベータ−ガラクトシダーゼ陽性大腸菌（ＮＭ１）またはベータ−ガラクトシダーゼ陰性腸炎菌（ＲＫＩ０５／０７９９２）の培養物（栄養ブロス上で８〜１８時間あらかじめ成長させた）を播種し、３７℃でインキュベートした。プレートを１６、２０、２４および４８時間後に調べ、１８、２４、および４８時間後に、Ｄｉｇｉｓｔｏｒｅ２Ｉｍａｇｅドキュメンテーションシステム（ＣＡＭＡＧ）を用いて白色光下で画像を記録した。データを表ＩＶａ、ＩＶｂおよびＩＶｃに示す。
【０１８２】
相当数のインジケータ分子（表ＩＶａ、ＩＶｂ）および不安定基の選択（表ＩＶｃ）を、様々なバイオマーカー酵素（外部刺激、ｅＳ）を生じる様々な微生物種で試験した。染色の色は黄色から赤まで及ぶ。試験したいくつかの染色剤は、外部刺激（酵素活性）の優れた局在化を示し、他のものは媒体中で顕著な可溶性を示し、溶液系アッセイに有用となり得る（表ＩＶａ）。染色は蛍光を伴い、緑色蛍光は一時的な性質のものであることが観察され、（活性シグナロゲンの蛍光に起因する）さらに長い波長での１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール蛍光（黄〜赤）は安定であった。
【０１８３】
結論：ＩＯ染色は、新規カラースキーム、長波蛍光、アッセイを潜在的に妨害する補助試薬（ａＲ）からの完全な独立性をもたらす微生物種の検出および単離のための潜在的に有用な方法である。
【０１８４】
（実施例１１）
インディゴ（ＩＮ）および１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール（ＩＯ）同時染色（表ＩＶｄ）
１５０ｍｇ／ｌの１−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２１ａ）、１００ｍｇ／ｌのＩＰＴＧおよび７５ｍｇ／ｌの５−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ４ｈ）を含む栄養寒天に、大腸菌、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）およびエンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）を播種した。３７℃で２４時間インキュベートした後に回収したデータを表ＩＶｄに示す。ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼおよびベータ−Ｄ−グルコシダーゼの両方を産生する微生物コロニーは、青色ＩＮおよび黄色ＩＯ染色が並行して形成されるために緑色を呈した。
【０１８５】
結論：相補的なＩＮおよびＩＯ染色の組合せは、現在利用できるカラースキームを拡大するために、潜在的に有用である。
（実施例１２）
嫌気性条件下での細菌コロニーのＩＮおよびＩＯ染色（表ＩＶｅ）
１５０ｍｇ／ｌの様々な基質および１００ｍｇ／ｌのＩＰＴＧを含む栄養寒天プレートに大腸菌を播種した。プレートを嫌気性ジャー（Ａｎａｅｒｏｊａｒ、Ｏｘｏｉｄ社）中に入れ、ＡｎａｅｒｏＧｅｎ（登録商標）サシェ（Ｏｘｏｉｄ社）を添加し、ジャーを閉じ、２４時間、３７℃でインキュベートした。データを記録し、表ＩＶｅに示す。
ＩＮ染色は嫌気性条件下では使用できない。コロニー成長が遅いために、一部のＩＯ染色剤の拡散は嫌気性条件下で増大するが、インジケータＩ２２ａから生成されるＩＯ２２などの他の染色剤は完全な局在化をもたらす。
【０１８６】
結論：ＩＯ染色は、微好気性または嫌気性条件下で使用するための潜在的に有用な技術である。
（実施例１３）
血液寒天プレート上での細菌コロニーのＩＯ染色（表ＩＶｆ）
標準的な市販の血液寒天プレートを１５０ｍｇ／ｌの１−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ２１ａ）および１００ｍｇ／ｌのＩＰＴＧで含浸させた。プレートに肺炎桿菌を播種した。３７℃で２４時間インキュベートした後の結果を表ＩＶｆに示す。
【０１８７】
ＩＯ染色剤は、寒天プレートと非常に良いコントラストを示す。さらに、血液のクエンチング効果にもかかわらず、ＩＯ蛍光が完全に維持され、容易に検出可能である。
結論：ＩＯ染色は、微生物血液培養において使用するために潜在的に有用である。
【０１８８】
（実施例１４）
実施例１４：真菌コロニーのＩＯ染色（表ＩＶｇ）
寒天ベース（６ｇ／ｌのソイトン、１．５ｇ／ｌの酵母エキス、１ｇ／ｌのグルコース、１０ｍＭのリン酸塩ナトリウム緩衝液、１３ｇ／ｌの寒天、ｐＨ７．０）をオートクレーブ処理し、５０℃まで冷却させた。次いで、１ｍＭのＭｎＳＯ４、１ｇ／ｌのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンおよび１−（２−ベンゾイルフェニル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−ガラクトサミニド（Ｉ２１ｇ）を０．６４ｍＭの最終濃度になるように添加し（５０ｍＭのＤＭＦ中ストック溶液から）、プレートに注いだ。プレートにカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クルゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）および出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。結果を記録し、表ＩＶｇに示す。
【０１８９】
（実施例１５）
１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール染色された微生物細胞の蛍光（図２）
実施例１０からの平板培地を、３６６ｎｍのＵＶ照射下、１６、２０、２４および４８時間後の蛍光についてＤｉｇｉｓｔｏｒｅ２Ｉｍａｇｅドキュメンテーションシステム（ＣＡＭＡＧ）を用いて調べた。データを表ＩＶａ、ＩＶｂおよびＩＶｃに示す。１５０ｍｇ／ｌのベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼインジケータおよび１００ｍｇ／ｌのＩＰＴＧを含む栄養寒天プレート上で４８時間成長させた細菌細胞のループを、黒色透明底のマイクロタイタープレートのウェル中に直接画線した。蛍光スキャンをＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で記録した。データを図２に示す。染色された細胞は標準的蛍光顕微鏡下で検出可能であることが示された。
【０１９０】
ＩＯ染色は、強い蛍光を伴う。観察された緑色蛍光は一時的性質によるものと思われたが、（活性１Ｈ−インドール−３−イルシグナロゲンに起因する）長波長のＩＯ蛍光（黄〜赤）は持続性であることが判明した。
【０１９１】
結論：ＩＯ染色は、生きている微生物コロニーの長波蛍光染色の手段および個々の細胞の蛍光標識のための新しい簡単なツールを提供する微生物種の検出および単離のための潜在的に有用な方法である。
【０１９２】
（実施例１６）
カーバメート加水分解の表示
１−（２−ベンゾイルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イルエチルカーバメート（Ｉ３２）を１ＮのＮａＯＨ水溶液で短時間処理するか、またはブタ肝臓エステラーゼに長時間曝露すると、黄色の沈殿が生じ、これは参照試料とのＴＬＣ比較により、１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−オン（ＩＯ１９）として同定された。
【０１９３】
明らかに、アルドール縮合から得られると予想される１１−フェニル−１０Ｈ−インドロ［１，２−ａ］インドール−１０−イミン（ＩＯ３２）は、急速に加水分解されてＩＯ１９になる。
【０１９４】
結論：ＩＯ染色の概念は、１−（２−ベンゾイルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−アミン（ａＳ３２）または類似の活性シグナロゲンを生成し、ひいてはアミノ−ペプチダーゼ酵素の念願の沈降性インジケータの潜在的なデザインを提供するインジケータを包含するように拡大することができる。
【０１９５】
（実施例１７）
ジスルフィド還元の表示
ビス［１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−ジスルファン（Ｉ３３、２ｍｇ）をメタノール（０．５ｍｌ）中に溶解させた。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、２０ｍｇ）をほぼ無色の溶液に添加した。続いて１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を添加すると、溶液は黄色になった。
【０１９６】
結論：（１）ＩＯ染色／表示は、還元性環境を検出するために潜在的に有用であり、（２）ＩＯ染色の概念は、１−（２−アセチルフェニル）−１Ｈ−インドール−３−チオール（ａＳ３３）または類似の活性シグナロゲンを生じるインジケータを包含するように潜在的に拡大することができる。
【０１９７】
【表１】
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0005711218.tif 000024
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【０１９８】
【表２】
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0005711218.tif 000029
0005711218.tif 000030
【０１９９】
【表３】
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0005711218.tif 000032
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【０２００】
【表４】
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0005711218.tif 000037
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【０２０１】
【表５】
0005711218.tif 000041
0005711218.tif 000042
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【０２０２】
【表６】
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0005711218.tif 000047
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【０２０３】
【表７】
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【０２０４】
【表８】
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【０２０５】
【表９】
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【０２０６】
【表１０】
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【０２０７】
【表１１】
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【０２０８】
【表１２】
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【０２０９】
【表１３】
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【０２１０】
【表１４】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２】
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【図３】
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