(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片であって、
前記ＤＮａｓｅが、配列番号１の配列又はそれと少なくとも９０％同一である配列を有するが、配列番号１の位置２３７におけるプロリン残基又は他の配列中の同等プロリンが、置換されており、かつ
前記ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片が、
（ｉ）２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＤＴＴからなるバッファー中で５分間５０℃の温度での加熱によって少なくとも９５％不可逆的不活性化され、かつ
（ｉｉ）０．０１〜０．０５Ｕ／μｌの濃度で、二本鎖ＤＮＡを切断するが、一本鎖ＤＮＡに対する検出可能な活性を本質的に有しない、
上記ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項２】
ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片であって、
前記ＤＮａｓｅが、配列番号５の配列又はそれと少なくとも９０％同一である配列を有するが、配列番号５の位置２１４におけるプロリン残基又は他の配列中の同等プロリンが、置換されており、かつ
前記ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片が、
（ｉ）２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＤＴＴからなるバッファー中で５分間５０℃の温度での加熱によって少なくとも９５％不可逆的不活性化され、かつ
（ｉｉ）０．０１〜０．０５Ｕ／μｌの濃度で、二本鎖ＤＮＡを切断するが、一本鎖ＤＮＡに対する検出可能な活性を本質的に有しない、
上記ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項３】
前記ＤＮａｓｅが、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を有するが、配列番号１の位置２３７と同等のプロリン残基が、置換されている、請求項１に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項４】
前記ＤＮａｓｅが、配列番号１と少なくとも９８％同一である配列を有するが、配列番号１の位置２３７と同等のプロリン残基が、置換されている、請求項３に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項５】
前記ＤＮａｓｅが、配列番号５と少なくとも９５％同一である配列を有するが、配列番号５の位置２１４と同等のプロリン残基が、置換されている、請求項２に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項６】
前記ＤＮａｓｅが、配列番号５と少なくとも９８％同一である配列を有するが、配列番号５の位置２１４と同等のプロリン残基が、置換されている、請求項５に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項７】
前記ＤＮａｓｅが節足動物門（ｐｈｙｌｕｍ  ａｒｔｈｒｏｐｏｄｏａ）の種から得られるＤＮａｓｅの配列を有するが、配列番号１の位置２３７におけるプロリンと同等のプロリン残基が置換されている、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項８】
前記ＤＮａｓｅが、甲殻類（ｃｒｕｓｔａｃｅａ）、六脚類（ｈｅｘｐｏｄａ）、鋏角亜門（ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）又は多足類（ｍｙｒｉａｐｏｄａ）から選択される亜門の種から得られるＤＮａｓｅの配列を有するが、配列番号１の位置２３７におけるプロリンと同等のプロリン残基が置換されている、請求項７に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項９】
前記ＤＮａｓｅが、ホンホッコクアカエビ（ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）、タラバガニ（ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ）（キングクラブ）、クルマエビ（ｍａｒｓｐｅｎｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）（車海老科）又はマエビ（ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）から選択される種から得られるＤＮａｓｅの配列を有するが、配列番号１の位置２３７におけるプロリンと同等のプロリン残基が置換されている、請求項７又は請求項８に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項１０】
前記ＤＮａｓｅが、ホンホッコクアカエビ（ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）から得られるＤＮａｓｅの配列を有するが、配列番号１の位置２３７におけるプロリンと同等のプロリン残基が置換されている、請求項９に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項１１】
配列番号１の位置２３７と同等のプロリン残基が、アラニン、グリシン、セリン又はシステインによって置換されている、請求項１、３、４及び７〜１０のいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項１２】
配列番号５の位置２１４と同等のプロリン残基が、アラニン、グリシン、セリン又はシステインによって置換されている、請求項２、５及び６のいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項１３】
前記ＤＮａｓｅが配列番号３又は配列番号７の配列を有する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片。
【請求項１４】
逆転写反応から核酸汚染を除去する方法であって、前記方法が、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片の使用を含む上記方法。
【請求項１５】
ホットスタートＰＣＲから核酸汚染を除去する方法であって、前記反応がバリアーホットスタートＰＣＲ設定である及び／又はホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含み、前記方法が、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片の使用を含む上記方法。
【請求項１６】
逆転写反応混合物、ホットスタートＰＣＲ設定、ホットスタートＰＣＲ混合物、又はこれらの任意の個々の構成要素を、いかなる汚染二本鎖ＤＮＡの消化も可能にする条件下においてＤＮａｓｅと接触させ、且つその後反応混合物を加熱してＤＮａｓｅを不活性化させる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで逆転写する方法であって、前記方法が、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片で、逆転写反応混合物を処理するステップを含む上記方法。
【請求項１８】
逆転写反応混合物が完全な混合物であり、逆転写酵素の作用温度で加熱してＤＮａｓｅを不活性化させる、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
１つ又は複数の以下のステップ：
（ｉ）プライマーのアニーリング
（ｉｉ）プライミングされたポリヌクレオチドからの鎖伸長
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドデュプレックスの融解
を含む１サイクル又は複数サイクルを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記逆転写反応に核酸増幅反応を続ける、請求項１４及び１６から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸増幅反応がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、３ＳＲ又はＬＡＭＰである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸増幅反応が、ＰＣＲである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記逆転写反応と核酸増幅反応を１つの反応容器内で実施する、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ホットスタートＰＣＲの方法であって、前記反応がバリアーホットスタートＰＣＲ設定である及び／又はホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含み、前記方法が、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片で、ホットスタートＰＣＲの開始前に、前記ホットスタートＰＣＲ設定／混合物又はホットスタートＤＮＡポリメラーゼを処理するステップを含む上記方法。
【請求項２５】
１つ又は複数の以下のステップ：
（ｉ）ポリヌクレオチドデュプレックスの融解
（ｉｉ）プライマーのアニーリング
（ｉｉｉ）プライミングされたポリヌクレオチドからの鎖伸長
を含む複数サイクルをさらに含む、請求項２１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片をコードする核酸分子。
【請求項２７】
配列番号４又は配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
核酸を増幅する方法における汚染除去剤としての、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片の使用。
【請求項２９】
請求項１４から２５までのいずれか一項に記載の方法中での、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片の使用。
【請求項３０】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片を単離及び精製するための方法であって、適切な宿主細胞中で前記ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片を発現させること、及び前記宿主細胞及び／又は前記細胞を培養した培地からＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片を後に分離することを含む上記方法。
【請求項３１】
請求項１４から２５までのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット又は組成物であって、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＤＮａｓｅ若しくはその酵素活性断片及び／又は請求項２６又は２７に記載の核酸を含む上記キット又は組成物。
【請求項３２】
前記キット又は組成物が、以下の
（ｉ）ヌクレオチド三リン酸、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマー、
（ｉｉｉ）逆転写酵素、
（ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｖ）ＤＮＡリガーゼ、及び
（ｖｉ）制限酵素
の１つ又は複数をさらに含む、請求項３１に記載のキット又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮａｓｅの使用による、逆転写反応混合物、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ調製物及びホットスタートＰＣＲ反応混合物からの汚染ＤＮＡの除去に関する。本発明は、ＤＮａｓｅの使用による、核酸増幅反応、特に標的配列の逆転写、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ及び／又はバリアーホットスタートＰＣＲ設定を含む増幅反応における偽陽性結果の予防にも関する。本発明は、このような方法中での使用に適した非常に熱不安定なＤＮａｓｅにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅技法は、ごく少量の核酸を含有するサンプルから標的配列の多数のコピーの調製を可能にする、バイオテクノロジーにおいて利用可能な最も強力なツールの１つである。ＰＣＲの場合、二本鎖標的配列のその各鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、標的配列及び遊離ヌクレオチドを含有する反応混合物に加える。ＤＮＡポリメラーゼの存在下での熱循環は、プライマー間の配列の増幅をもたらす。後のＰＣＲサイクル用の鋳型として作用するＰＣＲ法により作製した増幅断片の能力は、相当量の標的配列の迅速な生成をもたらす。１コピーの標的配列でさえ、例えば標識プローブとのハイブリダイゼーション、又は増幅セグメントへの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みによる、検出を可能にするのに十分な核酸を与えることができる。
【０００３】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）としても知られるリガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）は、ＰＣＲと同様に、反復サイクル及び変温を使用して、標的配列のコピー数の指数関数的増加を得る。この方法中、ＤＮＡリガーゼは、標的ＤＮＡ鎖の一本の隣接領域と相補的な２つのオリゴヌクレオチドの接合を触媒する。他方の鎖と相補的な２つの他のオリゴヌクレオチドを連結させることも可能である。変性後、原型鋳型鎖及び２つの連結対は、さらなるハイブリダイゼーション及び連結用の鋳型として作用することができる。
【０００４】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、ＤＮＡ切除ＤＮＡ修復に関与する酵素の性質を利用して、ＤＮＡデュプレックス中のＤＮＡのニック入り一本鎖と新たに合成された鎖を置換する。ニック入り一本鎖を繰り返し生成するために、反対の鎖が半ホスホロチオエート型である時その認識部位の一本鎖上のＤＮＡのみにニックを入れる、エンドヌクレアーゼ制限酵素、例えばＨｉｎｄＩ又はＢｓｏＢＩを使用する。この方法中で使用するプライマーは適切な認識部位を含有し、ｄＡＴＰαＳは重合反応において使用される。
【０００５】
３ＳＲ（自律配列複製）としても知られる核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）は本質的に、天然レトロウイルス転写のｉｎ  ｖｉｔｒｏバージョンである。３ＳＲはＲＮＡ鋳型から反復逆転写してｃＤＮＡ鋳型を形成することを含む。ｃＤＮＡ鋳型から、ＲＮＡポリメラーゼは対応するＲＮＡを生成する。
【０００６】
ループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ；Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０００  Ｖｏｌ２８（１２）ｅ６３）は、自動循環型鎖置換ＤＮＡ合成の原理に基づく。高い鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ巨大断片）を、特異的設計プライマーと共に使用する。このプロセスは、鎖の融解を必要とせずに、鎖を分離して新たな標的配列を明らかにすることを含む（したがってこのプロセスは等温である）。
【０００７】
逆転写は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）鋳型が相補的一本鎖ＤＮＡに転写されるプロセスである。したがって一本鎖ＤＮＡを使用して二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を形成することができる。いくつかの酵素は第一のＤＮＡ鎖を生成することができ、第二鎖を合成してｄｓＤＮＡを形成することができ、他は２ステップの１つのみに特異的である。したがってｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡは、様々な分子生物学の適用例において使用することができる。例えば、プローブベースの検出アッセイ（例えば、サザンブロッティング）、配列決定実験又はクローニングプロトコールにおいてそれらを直接使用することができる。ｃＤＮＡは、例えばＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ若しくは３ＳＲなどの増幅反応においてさらに増幅して前述の実験用のさらなる材料を与える、又は原型サンプル中に存在するＲＮＡ鋳型の量の定量化を可能にすることが非常に多い。
【０００８】
逆転写関連増幅反応は「１ステップ」又は「２ステップ」のプロセスであってよい。１ステップのプロセスでは、逆転写反応及び核酸増幅反応の構成要素は１つの反応容器中に存在し、典型的には、初期反応条件を選択して逆転写反応を終了まで進行させることができ、次いで反応条件を、核酸増幅反応の進行を可能にするのに適した条件に変える。
【０００９】
２ステップのプロセスでは、逆転写反応の構成要素を最初に組み合わせ、逆転写反応を実施する。次いで逆転写産物を増幅反応の構成要素と組み合わせ、増幅反応に施す。「１チューブ」の２ステッププロトコールでは、増幅反応の構成要素を、逆転写反応を実施する同じ反応容器に加える。「２チューブ」の２ステッププロトコールでは、新たな反応容器中で増幅反応を実施する。
【００１０】
逆転写は１ステップ又は２ステップのプロセス中でＰＣＡ、ＬＡＭＰ、ＬＣＲ、ＳＤＡ又はＢＳＲのいずれかと組み合わせることができる。ＳＤＡの場合、耐熱性鎖置換酵素及び耐熱性制限酵素（例えばＢｓｏＢ１）を選択しなければならない。
【００１１】
少量の標的配列を増幅するこれらの増幅技法の能力によって、ＲＮＡ標的配列の場合（即ち、逆転写後の増幅反応又は逆転写を使用する増幅反応）におけるゲノムＤＮＡによる汚染、及び前の増幅反応からのＤＮＡ分子中の標的配列による汚染の影響をそれらが非常に受けやすくなっており、それらの汚染は共に試薬（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、反応バッファーなど）、ピペッティングデバイス、研究室壁面、手袋及びエアロゾル化において持ち越される可能性がある。エアロゾルは、流出中などの溶液の攪乱によって、又はさらに、チューブ開封時にエアロゾル化し得るプラスチックチューブのキャップの内側表面上の残渣などの、容器表面上での少量の物質の攪乱によって発生し得る。医学的診断又は法医学的理由でサンプル核酸を調べるとき、キャリーオーバーとしても知られる標的配列を含み得る核酸の反応混合物への偶発的導入によって引き起こされる、偽陽性結果の影響は遠くまで及ぶ可能性がある。
【００１２】
核酸汚染の有害効果に対して特定の感受性の増幅反応は定量ＰＣＲ技法である。これらは、一反応において２０コピー未満のＤＮＡ配列を定量化する能力を有するからである。したがって、最小レベルの核酸汚染でさえ、ｑＰＣＲ技法において偽の結果を与える可能性がある。さらに、これらの方法は、必須バックグラウンドシグナルを超える増幅標的核酸からのシグナルの検出が必要である。汚染核酸はこのバックグラウンドシグナルに貢献し、したがって技法の感度を低下させる可能性がある。このように、核酸汚染を最小にすることによって定量ＰＣＲ実験の感度は最大になる。標的核酸の少数コピーを検出する実験、例えば定量ＰＣＲベースの病原体診断及び病原体負荷定量化では、定量ＰＣＲの感度が最大化され、偽陽性は最小化されることが最重要である。高度に保存された細菌ＤＮＡのセグメント（例えば、１６ＳｒＲＮＡ又は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子）がｑＰＣＲ技法によってターゲッティングされる細菌同定及び診断の分野では、（典型的には細菌及び細菌発現系から得られる）ＤＮＡポリメラーゼ調製物から生じる核酸汚染は重大な問題である。ＤＮＡポリメラーゼ調製物から細菌核酸汚染を効率良く除去するための方法が、したがって必要とされる。特に求められるのは、下流増幅反応に対して有害な影響を有することなく、且つポリメラーゼを損傷せずに、これを実施することができる方法である。
【００１３】
キャリーオーバーの影響を予防又は制限するためのいくつかの技法が開発されている。ＰＣＲの場合、これらは、ネストプライマー、ＰＣＲ開始用に使用する２プライマーのアニーリング境界内の標的配列とアニーリングするプライマーを含む（Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  Ｖｏｌ．ＬＩ、２６３〜２７３頁、１９８６）。ネストプライマーの短いＰＣＲ増幅産物は開始プライマーとアニーリングできない。したがって、キャリーオーバーされるのがこの産物である場合、開始プライマーの使用がこのキャリーオーバーを増幅することはない。しかしながら、キャリーオーバーは除去されておらず、同じネストプライマーを後のＰＣＲで使用する場合、前に増幅したネストプライマーの産物を増幅する。
【００１４】
デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の代わりに逆転写／増幅核酸配列へのヌクレオチドデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）の取り込みを含む、いくつかの方法が開発されている。デオキシウリジン（ｄＵ）は天然に存在するＤＮＡでは通常見られないので、この塩基は以前に生じたアンプリコンと新たな標的配列を区別する。さらなる逆転写／増幅反応の開始前に、増幅反応混合物は、ウラシル塩基を除去し、糖−ホスホジエステル骨格を完全な状態に保ち、一本鎖（ｓｓ）及び二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡにおいて脱塩基部位を生成する、酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）で処理することができる（ＵＳ−Ａ−５，４１８，１４９）。増幅反応混合物の温度が上昇して脱塩基部位でＤＮＡを切断し、これがキャリーオーバーの分解をもたらす。
【００１５】
この方法も問題がないわけではない。逆転写／増幅産物中のｄＵＴＰの導入は、例えば制限酵素切断又はＰＣＲによる産物の後の分析に干渉し得るからである（重合効率が低下する可能性があり、プルーフリーディングポリメラーゼの使用は除外する）。さらに、後の逆転写／ＰＣＲ反応からの産物が分解されない限り、ＵＮＧは不可逆的に不活性化されるはずである。高温はＵＮＧ酵素を不活性化するための一般的なメカニズムであるが、今日まで市販されている多くのＵＮＧ酵素は、ＰＣＲ反応の温度に曝された後でさえ首尾よく不活性化されない。残留ＵＮＧ活性の影響を最小にするため、増幅反応中に使用する温度ステップは５４℃を超えなければならず、反応容器は高温に保つ又は即座に凍結して、ウラシルも含有し得る新たに生じる増幅産物が分解されるのを妨げなければならない。近年、１０分間５０℃でインキュベートすると完全に不可逆的不活性化することができるタラ由来のＵＮＧが記載されており、これによってＵＮＧベースの手法はより広く適用可能になっている。
【００１６】
しかしながら、任意のＵＮＧ系に関するさらなる制約は、それが汚染ゲノムＤＮＡの反応混合物を除去することができないことである。ゲノムＤＮＡはウラシル修飾を有し得ないからである。したがってＵＮＧ系は、逆転写反応のゲノムＤＮＡ汚染に対処することができない。
【００１７】
個々のＰＣＲ反応混合物を、標的ＤＮＡ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加える前に、標的配列内部を切断するＤＮａｓｅＩ又は制限エンドヌクレアーゼで処理し、これによって汚染ＤＮＡの増幅を妨げることも示唆されている（Ｆｕｒｒｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．３４６、３２４頁、１９９０）。同様に、逆転写反応混合物を、逆転写酵素を加える前にこのようにして処理することができる。この方法は３０分の汚染除去時間を必要とし、ＤＮａｓｅＩ又は制限エンドヌクレアーゼを不活性化するため、汚染除去後に反応混合物を煮沸する。この煮沸ステップのため、汚染除去後にＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を加えることが必要である。当然ながら、これは増幅前／逆転写前混合物へのキャリーオーバー導入のさらなるリスクを表し、ＤＮＡポリメラーゼ自体の汚染除去は除外される。一本鎖ＤＮＡに対するＤＮａｓｅＩ活性のため、１μＭのプライマー濃度をこの方法中で使用しなければならない。
【００１８】
より熱不安定なＤＮａｓｅも記載されている。ＷＯ９９／００７８８７は、９４℃で２分間後に実質的に不可逆的不活性化されるホンホッコクアカエビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）から単離したＤＮａｓｅを開示する。さらに、この同じ酵素は６５℃で１５分間後に実質的に不可逆的不活性化される。Ａｎｉｓｉｍｏｖａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ；２００９、３１：２５１〜２５７）は、６５℃で１０分間のインキュベーション後に不活性化されるランダムに突然変異した型のキングクラブのＤＮａｓｅ（カムチャッカガニ（Ｋａｍｃｈａｔｋａ  ｃｒａｂ）、タラバガニ（Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ））を記載するが、不活性化添加剤ＤＴＴ（１−４ジチオスレイトール）及びＥＤＴＡを使用する場合、１０分後５５℃の低温で不活性化を得ることができる。
【００１９】
ＥＤＴＡは金属イオンキレート剤であり、したがって金属イオン濃度に敏感である酵素の作用に干渉することができる。Ａｎｉｓｉｍｏｖａは、キングクラブのＤＮａｓｅの活性はＭｇ２＋イオンによってプラスの影響を受け、したがってＥＤＴＡはこのアクチベータを金属イオン封鎖することによってその不活性化に貢献することを示す。ＤＮＡポリメラーゼも金属イオン濃度に非常に敏感であり、及び特に、ポリメラーゼ反応混合物のＭｇ２＋含有物は注意深く制御しなければならない。結果として、ＤＮａｓｅ不活性化ステップ中でのＥＤＴＡの使用は、下流ポリメラーゼ反応の活性を直接阻害する可能性がある。したがって、ポリメラーゼ反応（例えば、逆転写、ＰＣＲ、ＳＤＡ、３ＳＲ）に先行する処理ステップ中ではＥＤＴＡを使用しないことが好ましい。
【００２０】
Ａｎｉｓｉｍｏｖａによって提供された突然変異型のキングクラブのＤＮａｓｅは、６５℃未満の温度で不活性化が起こるのを可能にするためにＥＤＴＡの存在を必要とするので、このＤＮａｓｅは、（典型的には約５０℃で実施される）逆転写反応に先行するＤＮＡ汚染除去ステップ中で使用するのに適していない。下流ステップのＥＤＴＡ阻害のリスク無しでこの酵素を使用するのを可能にするため、混合物を６５℃より高く加熱する不活性化ステップが存在しなければならない。これは典型的な逆転写反応温度を超えるので、逆転写ステップ以外にこのステップは別個である。これはプロセスに追加ステップを加え、これによってプロセスの複雑性及び労働強度が増大し、これはさらに、プロセスを多数回繰り返すことのある分子生物学の分野で、エネルギーコスト及び機器使用時間の点で相当な欠点を示す。さらに、逆転写酵素をＤＮａｓｅ処理及び不活性化後に加えない限り、ＤＮａｓｅが逆転写ステップ中に活性化し、したがってｃＤＮＡ産物が分解し得るリスクが存在する。反応混合物への逆転写酵素の後の添加は、汚染が起こる可能性、及び概してプロセスの複雑化、再度コストの影響を示し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明者らは、逆転写のステップと適合性がある温度で実質的に不可逆的不活性化される可能性があり、二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的であるＤＮａｓｅは、非常に有効且つ効率の良い方法をもたらし得ることを理解している。しかしながら、これらの性質を有し現在利用可能であるＤＮａｓｅは存在しない。このようなＤＮａｓｅを使用して、逆転写反応の直前に、完全逆転写反応混合物（即ち、ＲＮＡ分子の逆転写が起こるのに必要とされる基本成分の全てを含有する反応混合物）を汚染除去することが可能であり、次いで逆転写反応の開始（即ち、選択した逆転写酵素の作用温度、例えば５０℃以上までの反応混合物の温度の上昇）によって、ＤＮａｓｅは逆転写反応の行程にわたり実質的に不可逆的不活性化され得る（不活性化の大部分は反応の最初の数分間で起こるのが理想的である）。不活性化のこの時系列は重要である。それは新たに形成されるｃＤＮＡはＤＮａｓｅによって分解されないことを意味するからである。高い不活性化温度を有するＤＮａｓｅと異なり、このようなＤＮａｓｅは別の不活性化ステップ及び／又は逆転写酵素の後の添加を必要としない。
【００２２】
本発明者らは、これらの独自の性質を有する酵素を現在生成している。全てのＤＮａｓｅと同様に、本発明の非常に熱不安定なＤＮａｓｅは、糖リン酸核酸骨格のホスホジエステル結合を切断することによってＤＮＡを消化する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
したがって、本発明によれば、逆転写反応から核酸汚染を除去する方法であって、５分間約５０℃の温度での加熱によって実質的に不可逆的不活性化され、二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的であるＤＮａｓｅの使用を含む方法を提供する。これらの不活性化特性はＥＤＴＡの不在下で得られることが好ましい。
【００２４】
したがって、本発明のＤＮａｓｅを使用して、逆転写反応混合物中に存在する又はその個々の構成要素中に存在する汚染二本鎖ＤＮＡを分解する。それによって、逆転写産物中の汚染ＤＮＡ（逆転写産物をそのように使用する場合、増幅されそれによって偽陽性結果を与える可能性がある）を低減又は回避することができ、且つ非特異的逆転写を低減又は回避することもできる。
【００２５】
特にこの方法は、任意の二本鎖ＤＮＡ内部の消化を可能にする条件下において逆転写反応混合物、又はその個々の構成要素と本発明のＤＮａｓｅを接触させること、及び次いで前記反応混合物、又はその個々の構成要素を加熱して前記ＤＮａｓｅを不活性化することを含む。反応混合物は完全反応混合物（即ち、ＤＮＡプライマーを含む）であることが好ましく、完全反応混合物は、内部に含有される逆転写酵素の作用温度に相当する温度で加熱することが好ましい。
【００２６】
別の実施形態では、逆転写反応に核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、３ＳＲ、ＬＡＭＰ）を続ける。ＰＣＲ、ＬＣＲ又はＬＡＭＰが逆転写反応に続くことが好ましい。最も好ましい実施形態では、増幅反応はＰＣＲである。
【００２７】
別の実施形態では、逆転写反応と増幅反応を１ステップのプロセスとして実施する、即ち反応容器は、同時に存在する逆転写反応及び増幅反応に関する全ての構成要素を有する。しかしながら、２ステップのプロセスを使用することもできる。このような実施形態では、反応の様々な構成要素及び一部分の反応混合物は、本発明のＤＮａｓｅで個別に処理することができる。
【００２８】
他に考察すると、本発明のこの態様は、逆転写反応から核酸汚染を除去する際の、５分間約５０℃の温度での加熱によって実質的に不可逆的不活性化され、二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的であるＤＮａｓｅの使用を提供し、逆転写反応に核酸増幅反応を続けること、例えば、逆転写−ＰＣＲが好ましい。ＤＮａｓｅのこれらの不活性化特性はＥＤＴＡの不在下で得られることが好ましい。
【００２９】
前述のように本発明は、ゲノムＤＮＡに関する汚染及びキャリーオーバーを予防又は制限する際に、及び特にキャリーオーバー及び／又はゲノムＤＮＡに関する汚染が原因である偽陽性結果を予防又は制限する際に特定の有用性がある。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、逆転写反応におけるゲノムＤＮＡ汚染及び／又はキャリーオーバーが原因である偽陽性結果を予防又は低減する方法をさらに提供し、前記方法は、５分間約５０℃の温度での加熱によって実質的に不可逆的不活性化され、二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的であるＤＮａｓｅを使用して、逆転写反応混合物又はその個々の構成要素中に存在する汚染ゲノムＤＮＡ及び／又はキャリーオーバー二本鎖ＤＮＡを分解することを含む。ＤＮａｓｅのこれらの不活性化特性はＥＤＴＡの不在下で得られることが好ましい。
【００３１】
本発明のＤＮａｓｅは、全ての増幅反応中のキャリーオーバーの除去又は低減における使用にも適している。これは、ＤＮａｓｅの不活性化温度が低いほど、増幅プロセス中にそれを不活性化することが容易であり、好都合にはｄｓＤＮＡ増幅プロトコール用のＤＮＡ変性ステップ（例えば、９４℃で５分間）であってよい不活性化ステップ中で使用する任意の所与の温度で得ることができる、不活性化の程度が高くなるためである。
【００３２】
本発明によれば、本発明のＤＮａｓｅの使用を含む、核酸増幅反応から核酸汚染を除去する方法をさらに提供する。
【００３３】
したがって本発明のＤＮａｓｅを使用して、増幅反応混合物又はその個々の構成要素中に存在する非標的二本鎖ＤＮＡを分解する。それによって、非特異的増幅を低減又は回避することができる。
【００３４】
特に方法は、任意の二本鎖ＤＮＡ内部の消化を可能にする条件下において増幅反応混合物、又はその個々の構成要素と本発明のＤＮａｓｅを接触させること、前記反応混合物、又はその個々の構成要素を加熱して前記ＤＮａｓｅを不活性化すること、及びその後前記混合物、又はその個々の構成要素を増幅する前記標的核酸と接触させることを含む。
【００３５】
他に考察すると、本発明のこの態様は、増幅反応混合物から核酸汚染を除去する際の、本発明のＤＮａｓｅの使用を提供する。
【００３６】
前述のように本発明は、核酸増幅反応におけるキャリーオーバーを予防又は制限する際に、及び特にキャリーオーバーが原因である偽陽性結果を予防又は低減する際に特定の有用性がある。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、核酸増幅反応におけるキャリーオーバーが原因である偽陽性結果を予防又は低減する方法をさらに提供し、前記方法は、本発明のＤＮａｓｅを使用して、増幅反応混合物、又はその個々の構成要素中に存在するキャリーオーバー非標的二本鎖ＤＮＡを分解することを含む。
【００３８】
本発明のＤＮａｓｅを使用してＤＮＡポリメラーゼ調製物から核酸汚染を除去することもでき、且つこれを使用してＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応混合物から核酸汚染を除去することができる。本発明のＤＮａｓｅの低い不活性化温度は、汚染除去後のＤＮａｓｅの不活性化は、ポリメラーゼに対する有害影響を有さずに、又は最小の有害影響を有しながら得ることができることを意味する。
【００３９】
本発明は、いわゆるホットスタートＤＮＡポリメラーゼからの核酸汚染の除去に特に適している。多数のホットスタートポリメラーゼが開発されている。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの背景にある目的は、増幅反応混合物がＤＮＡポリメラーゼの最適触媒温度に近い温度、又は少なくともプライマーアニーリングが非特異的増幅を回避若しくは最小化するほど十分配列特異的である温度に達するまで、ポリメラーゼを修飾してこの酵素がＤＮＡポリメラーゼとして作用すること（プライマーポリヌクレオチド配列を伸長する能力）を妨げることである。これは、低温において、プライマーは核酸サンプルに非特異的にアニーリングする可能性があり、非特異的増幅産物が生じ、これによって偽牲の結果をもたらし及び／又は反応に対する阻害効果がある可能性があるためである。さらに、いくつかの場合、ポリメラーゼ活性は正確性が低く、配列の誤差が増幅産物において生じる可能性がある。この増大した特異性によって、ホットスタートポリメラーゼは、定量ＰＣＲ中での使用に非常に適したものとなる。
【００４０】
ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを作製するための一手法は、結合中にポリメラーゼの触媒作用を阻害又は予防するが、ＤＮＡポリメラーゼの最適触媒温度に近い温度、又は少なくともプライマーアニーリングが非特異的増幅を回避若しくは最小化するほど十分配列特異的である温度でポリメラーゼから解離する熱不安定基を、ポリメラーゼに結合させることである。
【００４１】
適切な熱不安定基には、ポリメラーゼ特異的抗体及びアフィボディ、他の特異的ポリメラーゼ結合タンパク質、特異的オリゴヌクレオチドアプタマー、非特異的コーティング（例えばワックス）、及びポリメラーゼのアミノ酸（例えば、活性部位中のアミノ酸）の共有結合化学修飾がある。ホットスタートポリメラーゼのホットスタート活性化温度を超える温度で不活性化状態であるＤＮａｓｅによるこのようなポリメラーゼの汚染除去は、ホットスタートポリメラーゼのホットスタート性が悪影響を受ける可能性があることを意味し得る。本発明は有利なことに、ＤＮａｓｅによるホットスタートポリメラーゼ調製物におけるＤＮＡ汚染の除去、及び典型的なホットスタートポリメラーゼのホットスタート活性化温度未満である温度でのＤＮａｓｅのその後の不活性化を可能にし、したがってホットスタートポリメラーゼのホットスタート性に対する有害な影響は回避することができる。
【００４２】
前に論じたホットスタートポリメラーゼは、ホットスタートＰＣＲを実施するための単なる一手法である。他の手法は、１つ又は複数のＰＣＲ反応混合物成分が残りの成分と接触するのを妨げる。典型的には、ポリメラーゼ又は標的核酸を、融点、ポリメラーゼの最適触媒温度に近い温度、又は少なくともプライマーアニーリングが非特異的増幅を回避若しくは最小化するほど十分配列特異的である温度において、物質（典型的には脂質、例えばワックス）上又は内に封鎖する。したがって本発明のＤＮａｓｅは、この型のホットスタートＰＣＲに対する有害な影響無しで、これらのいわゆる「バリアー」ホットスタートＰＣＲ設定の核酸汚染を除去することもできる。
【００４３】
したがって、本発明はホットスタートＰＣＲから核酸汚染を除去する方法を提供し、前記反応はバリアーホットスタートＰＣＲ設定である及び／又はホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含み、この方法は本発明のＤＮａｓｅの使用を含む。
【００４４】
したがって本発明のＤＮａｓｅを使用して、ホットスタートＰＣＲ反応設定／混合物中に存在する非標的二本鎖ＤＮＡを分解する。それによって、非特異的増幅を低減又は回避することができる。
【００４５】
特に方法は、任意の二本鎖ＤＮＡ内部の消化を可能にする条件下において、ホットスタートＰＣＲ反応設定／混合物と本発明のＤＮａｓｅを接触させること、前記反応設定／混合物を加熱して前記ＤＮａｓｅを不活性化すること、及びその後増幅する前記標的核酸と反応設定／混合物の残りの構成要素を接触させることを含む。
【００４６】
他に考察すると、本発明のこの態様は、ホットスタートＰＣＲ反応から核酸汚染を除去する際の本発明のＤＮａｓｅの使用を提供し、前記反応はバリアーホットスタート反応である及び／又はホットスタートポリメラーゼを含む。
【００４７】
本発明は、バリアーホットスタート反応である及び／又はホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含むホットスタートＰＣＲ反応におけるキャリーオーバーを予防又は制限する際に、及び特にキャリーオーバーが原因である偽陽性結果を予防又は制限する際にも特定の有用性がある。
【００４８】
さらなる態様では、本発明は、ホットスタートＰＣＲ反応におけるキャリーオーバーが原因である偽陽性結果を予防又は低減する方法をさらに提供し、前記反応はバリアーホットスタート反応である及び／又はホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含み、前記方法は、本発明のＤＮａｓｅを使用して、ホットスタートＰＣＲ反応設定／混合物中に存在するキャリーオーバー非標的二本鎖ＤＮＡを分解することを含む。
【００４９】
本発明は、本発明のＤＮａｓｅの使用を含む、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ調製物から核酸汚染を除去する方法をさらに提供する。この方法中での本発明のＤＮａｓｅの使用をさらに提供する。
【００５０】
したがって本発明のＤＮａｓｅを使用して、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ調製物中に存在する二本鎖ＤＮＡを分解する。特に方法は、ＤＮＡポリメラーゼ調製物中に存在する任意の二本鎖ＤＮＡの消化を可能にする条件下において、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ調製物と本発明のＤＮａｓｅを接触させること、及び次いで調製物を加熱して前記ＤＮａｓｅを不活性化することを含む。
【００５１】
本発明は、標的核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅、逆転写又はホットスタートＰＣＲ増幅の方法であって、前記ホットスタートＰＣＲがバリアーホットスタート反応である及び／又はホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含み、実際の増幅又は逆転写反応の開始前に、反応混合物、反応設定、又はその個々の構成要素を本発明のＤＮａｓｅで処理するステップを含むことを特徴とする方法をさらに提供する。
【００５２】
「逆転写」は、それによってＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ鋳型と相補的なＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ）の形成を触媒するプロセスである。より具体的には、ポリメラーゼは、（即ち、ワトソン−クリックの塩基対形成の法則に従い）プライマー鋳型ＲＮＡ配列と相補的な配列におけるデオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する。
【００５３】
この反応を触媒する能力を有する多数の酵素が同定されており、例には、ＨＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、Ｃ  ｔｈｅｒｍ．ポリメラーゼ、及びＴｔｈポリメラーゼがあるが、これらだけに限られない。これらの酵素は一定範囲の最適作用温度を有する。動物宿主に感染するウイルスなどの生物から単離された酵素は、約３７℃の作用温度を有する。しかしながら耐熱性逆転写酵素が同定されており、野生型逆転写酵素を突然変異させることによっても産生されており、研究室中での逆転写反応において典型的に使用される酵素であるのはこれらの耐熱性酵素である。下限範囲でＡＭＶは４２〜６０℃の作用温度範囲であり、一方ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ及びＣ  ｔｈｅｒｍ．ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性は、それぞれ５５〜７０℃及び６０〜７０℃の作用温度範囲を有する。
【００５４】
その最も基本的なレベルで、完全逆転写反応混合物は、逆転写酵素、ＲＮＡ鋳型、鋳型に結合することができそこから逆転写酵素が重合を開始することができる適切なプライマー、ｄＮＴＰ及び適切なバッファーを含有する。逆転写酵素の作用温度での混合物のインキュベーションはｃＤＮＡの生成をもたらす。逆転写反応の終了時に、ｃＤＮＡを配列決定若しくは遺伝子型決定実験中で直接使用することができ、又はクローニング若しくは検出プロトコール中で使用することができる。
【００５５】
「逆転写酵素」によって、逆転写活性（即ち、プライミングされたＲＮＡ鋳型配列と相補的ＤＮＡ相当物の重合を触媒する能力、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性）を有する任意の酵素を意味する。この活性は酵素の唯一の活性である可能性があり、又はより典型的には、酵素（例えば、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ  ｔｈｅｒｍ．ポリメラーゼ）の一成分の活性である可能性がある。ポリメラーゼの典型的な他の活性は、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡ誘導性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ−ＲＮＡ巻き戻し活性、Ｍｎ２＋依存性エンドヌクレアーゼを含み得る。しかしながら、ＲＮａｓｅＨ及び／又はエンドヌクレアーゼ活性は、最小又は不在であることが好ましい。
【００５６】
「逆転写酵素調製物」は、逆転写酵素を含む任意の物質、典型的には溶液、一般に水溶液である。特に、それは市販の調製された逆転写酵素の調製物、即ち、実験用酵素の供給業者によって供給され得る逆転写酵素試薬を指すが、このような調製物の希釈、調節及び／又は修飾型もこの用語によって包含される。逆転写酵素調製物は、逆転写酵素を本来発現する細菌供給源から得られた、及び／又は逆転写酵素をコードする発現カセットを含む逆転写酵素の調製物であってもよい。調製物は、細菌供給源から直接得た初期逆転写酵素調製物に匹敵する程度まで精製することができる。
【００５７】
用語「核酸増幅反応」は、核酸の標的配列のコピー数を増大するための任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ手段を指す。これらの方法は「熱循環」を含む、即ち高温循環を含むことが好ましい。増幅法には、ＰＣＲ及びその改変型、３ＳＲ、ＳＤＡ、ＬＡＲ又はＬＣＲ並びにＬＡＭＰ及びその改変型があるが、これらだけには限られない。ＰＣＲ、ＬＡＭＰ並びにＬＣＲ及びそれらの改変型は熱循環法である。これらの方法は標的配列のコピー数の直線的又は指数関数的増加をもたらす可能性がある。「改変型」は、リアルタイム増幅、定量的及び半定量的増幅、競合増幅などを包含するが、これらだけには限られない。
【００５８】
選択する増幅法に応じて、標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。例えば、ＰＣＲに関して標的はＤＮＡであるが、逆転写ステップと組み合わせたとき、標的はＲＮＡ配列であると考えることができる。３ＳＲはＲＮＡ標的配列を直接増幅する。
【００５９】
用語「増幅／逆転写反応混合物」は、標的核酸を増幅／逆転写するために使用する様々な試薬を含む、任意の溶液、一般に水溶液を指す。これらは酵素、水性バッファー、塩及びヌクレオシド三リン酸を含む。この用語は、首尾良い増幅反応を実施するのに必要な全ての構成要素を含有する混合物、及び不完全でありしたがっていくつか（例えば、少なくとも２、３又は４個）の必要な構成要素のみを含有する混合物を指す。用語「完全」によって始める場合、反応混合物は逆転写及び／又は増幅に必要な全ての構成要素を含有する。
【００６０】
「ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ」は、典型的には熱不安定な分子的実体の付加により修飾されて、それがプライミングされたＤＮＡポリヌクレオチドの検出可能な重合を実施することができる温度まで上昇したＤＮＡポリメラーゼである。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼが検出可能なレベルのＤＮＡ重合を実施することができる温度は、ポリメラーゼの最適触媒温度に近いことが好ましい。
【００６１】
用語「ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ調製物」は、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含む任意の物質、典型的には溶液、一般に水溶液を指す。特に、それは市販の調製されたホットスタートＤＮＡポリメラーゼの調製物、即ち、実験用酵素の供給業者によって供給され得るホットスタートＤＮＡポリメラーゼ試薬を指すが、このような調製物の希釈、調節及び／又は修飾型もこの用語によって包含される。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ調製物は、ポリメラーゼを本来発現する細菌供給源から得られた、及び／又はポリメラーゼをコードする発現カセットを含むホットスタートＤＮＡポリメラーゼの調製物であってもよい。調製物は、細菌供給源から直接得た初期ポリメラーゼ調製物に匹敵する程度まで精製することができる。典型的には、ホットスタート阻害実体をポリメラーゼに適合させるために調製物はさらに処理されている。
【００６２】
「ホットスタートＰＣＲ反応」は、プライミングされたＤＮＡポリヌクレオチドからの検出可能な重合が、ポリメラーゼの最適触媒温度に近い温度のみで起こるＰＣＲ増幅反応である。検出可能な重合の好ましい温度は、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの考察と一致すると解釈すべきである。
【００６３】
「ホットスタートＰＣＲ混合物」は、ホットスタートポリメラーゼを含む前に定義したＰＣＲ反応混合物である。
【００６４】
「バリアーホットスタートＰＣＲ設定」は、ＰＣＲ反応混合物の２つ以上の構成要素を含み、少なくとも１つの構成要素が、前に定義した検出可能なＤＮＡ重合の温度に相当する融解温度を有する物質の背後又は内の他の構成要素（単数又は複数）から隔離されている反応容器である。物質は脂質、例えばワックスであることが好ましい。
【００６５】
「汚染」によって、逆転写／増幅の標的である核酸集団の一部ではない逆転写及び／又は増幅用の鋳型として働くことができる核酸の、反応混合物における存在を意味する。反応混合物中で使用するプライマーは汚染物質ではない。
【００６６】
用語「核酸汚染の除去」は、核酸汚染の予防と低減の両方を含むものとする。
【００６７】
用語「キャリーオーバー」を使用して、反応混合物中に偶然又は非意図的に導入された任意の核酸、特に前の増幅又は逆転写反応からキャリーオーバーされた標的配列を記載する。
【００６８】
用語「偽陽性結果」は、調査中の核酸サンプルが標的配列を含有することを一見して示すが、増幅産物がキャリーオーバー、及び／又は逆転写ベースの増幅反応の場合、おそらくゲノムＤＮＡに由来する結果を指す。明らかに、本発明がもたらす偽陽性結果の減少は、法医学及び診断分野において特に有利である。本発明の方法は核酸増幅の特異性を高めることができる。
【００６９】
用語「ＤＮａｓｅ」は、ＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合を加水分解し、ヌクレオチド配列特異的ではない酵素を指す。
【００７０】
「実質的に不可逆的不活性化された」によって、加熱によって、酵素が少なくとも９５％不活性化された、好ましくは９８％不活性化された、より好ましくは酵素が１００％不活性化されたことを意味する。不活性化の割合は、３７℃において適切なバッファー（例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ）中で不活性化ＤＮａｓｅ又は非不活性化ＤＮａｓｅのいずれかと共に３時間ＤＮＡサンプル（例えば、５００塩基対ＰＣＲ産物）をインキュベートすること、電気泳動によって臭化エチジウムアガロースゲル上の反応産物を分離すること、及びＵＶ光下でのＤＮＡバンドの蛍光の相対強度を測定することによって都合よく測定することができる（例２）。不活性化と非不活性化ＤＮａｓｅの相対活性を測定するための他の方法は、当業者によって考案され得る。例えば、ＤＮＡサンプルを含有するＳＹＢＲグリーンの蛍光の相対変化を使用することができる。さらなる方法は、Ｋｕｎｉｔｚアッセイ（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ；１９５０、Ｓ．Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、３３：３６３及び例１、及びＹａｍａｍｏｔｏ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ；１９７１、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、２２８：９５及び例４）によって考案された改変型Ｋｕｎｉｔｚアッセイである。
【００７１】
反応混合物の温度が室温に戻るときでさえ、ＤＮａｓｅがその活性を取り戻すことはなく、実質的に残留活性はない。具体的には、５％未満、好ましくは２％未満、最も好ましくは検出不能なＤＮａｓｅ活性が存在する。
【００７２】
実質的不可逆的不活性化は、５０℃又は約５０℃、例えば４８〜５２℃の温度で５分間のインキュベーション以内に、例えば５０℃で１、２又は３分間のインキュベーション中に起こることが好ましい。本発明のＤＮａｓｅは低温又は短時間の間で実質的に不可逆的不活性化することができるが、本発明によれば、約５０℃で５分間の加熱はこの酵素を実質的に不可逆的不活性化するのに十分であるはずである。この２つのパラメーターの１つに対する調節は、他方を調節することによって補うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。例えば、不活性化温度を高めることによって、インキュベーション時間の短縮を可能にすることができる。逆に、インキュベーション時間を増大することによって、低い不活性化温度の使用を可能にすることができる。例えば、本発明によるＤＮａｓｅは、５５℃の温度で１又は２分間のインキュベーション中に、５２℃の温度で３分間のインキュベーション中に、５１℃の温度で４分間のインキュベーション中に、４９℃の温度で１０分間のインキュベーション中に、又は４８℃の温度で１５分間のインキュベーション中に不活性化することができる。当然ながら、当業者には容易に明らかでもあり、実施例中に示すように、本発明のＤＮａｓｅを本発明の方法中で使用する場合、５分間より長いインキュベーション時間を使用することができ、実際の場合、約５０℃を超える不活性化温度を使用することができる（例えば、不活性化は、それぞれ１５、３０又は６０分間それぞれ５０℃、５５℃、６５℃又は９４℃で、１５分間６０℃で、又は１０分間９５℃で起こる可能性がある）。しかしながら、本発明によれば、５分間５０℃又は約５０℃の温度でインキュベートした場合、ＤＮａｓｅは実質的不活性化を示すはずである。
【００７３】
ＤＮａｓｅに関する不活性化温度及び時間は、典型的なＰＣＲ又は逆転写酵素バッファー（例えば、２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２）に似た溶液中でＤＮａｓｅをインキュベートすることによって評価すべきである。ＥＤＴＡは不在であることが好ましいはずである。ＤＮａｓｅは約０．０１Ｕ／μｌと１０Ｕ／μｌの間、好ましくは０．０５Ｕ／μｌと５Ｕ／μｌの間、例えば０．５Ｕ／μｌと１．５Ｕ／μｌの間で存在しなければならない。
【００７４】
任意の所与の温度における不活性化は、不活性化バッファー中のジスルフィド結合還元剤（即ち、タンパク質中の２つ以上のシステイン残基間のジスルフィド結合を阻害及び／又は妨害する作用物質）の存在による程度及び／又は速度の点で高めることができる。このような作用物質の例には、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン・ＨＣｌ、ＴＣＥＰ・ＨＣｌ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）、Ｎ−エチルマレイミドがあるが、これらだけには限られない。ＤＴＴが好ましい。或いはジスルフィド結合還元剤（例えばＤＴＴ）を使用して、特定時間の不活性化ステップに必要とされる不活性化温度を下げることができる。当業者は、不活性化を改善し得るがその下流反応には有害ではないと思われる、そのニーズに適したジスルフィド結合還元剤の適切な濃度を決定することが可能である。例えば、ＤＴＴは０．０５ｍＭと５０ｍＭの間の濃度で不活性化ステップに都合よく取り込むことができる。ＤＴＴは通常１ｍＭと１０ｍＭの間の濃度で逆転写反応において使用され、しばしばＰＣＲ反応において使用される。
【００７５】
本発明の方法中でのＤＮａｓｅの不活性化は、０．１ｍＭと１０ｍＭの間、好ましくは０．５ｍＭと５ｍＭの間、及び最も好ましくは１ｍＭと２ｍＭの間のＤＴＴ濃度で行うことが好ましい。不活性化温度の標準評価用に、２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＤＴＴのバッファーを使用することが好ましい。
【００７６】
線状二本鎖ＤＮＡとスーパーコイルド環状ＤＮＡは、いずれも本発明による酵素の基質である。酵素は、増幅／逆転写酵素プライマーなどの一本鎖ＤＮＡに対して、わずかな、無視できる程度の、又はほぼ検出不能な活性を有する。言い換えると、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的である。
【００７７】
「二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的である」によって、０．０１〜０．０５Ｕ／μｌの濃度で、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡを切断するが、一本鎖ＤＮＡに対して、わずかな、無視できる程度の、又はほぼ検出不能な活性を有することを意味する。このような濃度では、一本鎖ＤＮＡに対する検出可能な活性がないことが好ましい。当業者は、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡに対する相対的ＤＮａｓｅ活性を比較する実験を容易に考案することができると思われる。Ａｎｉｓｉｍｏｖａら（ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８、９：１４）はこのような実験を開示する。簡単に言うと、試験下の２Ｋｕｎｉｔｚ単位のＤＮａｓｅを、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２（３０μｌの最終反応体積）中でＭ１３ファージＤＮＡ（一本鎖）又はラムダファージＤＮＡ（二本鎖）と１時間インキュベートし、産物は臭化エチジウムアガロースゲル上で分離する。一本鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡに対する活性は、未処理対照に対するバンドの位置によって観察可能であった。別の手法は例６中でより詳細に記載する。この手法では、ＤＮａｓｅの二本鎖及び一本鎖ＤＮＡに対する特異性を、５’末端においてフルオロフォアＦＡＭ（フルオレセイン）及び３’末端においてＴＡＭＲＡで標識したオリゴヌクレオチドからの、蛍光の増大を測定することによって試験することができる。２つの標識が接近しているとき、ＦＡＭからの発光はＴＡＭＲＡによって吸収（消光）される。ＤＮａｓｅによるオリゴヌクレオチドの切断は、ＴＡＭＲＡからのＦＡＭの分離、及び励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５２０ｎｍで蛍光光度計において測定することができるＦＡＭからの蛍光の増大をもたらす。二本鎖ＤＮＡ基質は、標識オリゴヌクレオチドと相補的な第二のオリゴヌクレオチドと標識オリゴヌクレオチドを混合することによって調製することができる。当然ながら、他の適切なフルオロフォア対を同様に使用することができる。
【００７８】
逆転写反応の場合、これらの特徴は、ＲＮＡサンプル、プライマー、ヌクレオチド、逆転写酵素及びバッファーを含む逆転写反応混合物（即ち、完全反応混合物）内のＤＮａｓｅの封入、及び例えば室温でのキャリーオーバー物質及びゲノムＤＮＡの迅速な分解を可能にする。これらの特徴は、完全な１ステップの逆転写ベースの増幅反応混合物中のＤＮａｓｅの封入も可能にする。
【００７９】
これらの特徴は、プライマー、ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及びバッファーを含む増幅反応混合物中のＤＮａｓｅの封入、及び例えば室温でのキャリーオーバー物質の迅速な分解も可能にする。
【００８０】
有利なことに、本発明の熱不安定なＤＮａｓｅは完全増幅反応混合物中で完全に機能し、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅反応及び条件と適合性がある。この酵素は、反応混合物から適量の汚染ゲノムＤＮＡ及び／又はキャリーオーバー、通常ｆｇ−又はｐｇ−レベル、ただし好ましくは最大１ｎｇを除去することもできるはずである。好ましくは、ＤＮａｓｅは室温で５分以内、より好ましくは３分以内、最も好ましくは２分以内に、全てのキャリーオーバーを分解することができる。
【００８１】
短時間（例えば５分間）で本発明のＤＮａｓｅの不活性化温度（約５０℃）まで反応混合物の温度が上昇することによって、本発明のＤＮａｓｅを不可逆的に不活性化する。
【００８２】
逆転写反応の場合、これは逆転写ステップと同時に存在することが好都合であり得る。（ホットスタートＰＣＲを含めた）ＤＮＡ増幅反応の場合、増幅及び分析する核酸サンプル（即ち、標的核酸）を次いで加えることができ、増幅が始まる。熱循環中及び増幅又は逆転写後に反応混合物の温度が低下するときでさえ、標的配列のコピーが分解することはない。ＤＮａｓｅが不可逆的に不活性化しているからである。汚染除去及び後の不活性化ステップを行いながら、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼを逆転写及び／又は増幅反応混合物中に封入することができることは、本発明の特定の利点である。これはＤＮａｓｅの不活性化をもたらす穏やかな条件（５分間約５０℃）の結果としてであり、したがってさらに考えられる汚染供給源は除去される。
【００８３】
ＤＮａｓｅは、ＤＮＡ：ＲＮＡデュプレックスのＤＮＡ鎖に対して最小ヌクレアーゼ活性を有することが好ましい。「最小」によって、ＤＮａｓｅが二本鎖ＤＮＡに対するその活性の４０％未満であるＤＮＡ：ＲＮＡデュプレックスのＤＮＡ鎖に対するヌクレアーゼ活性を有することを意味する。ＤＮａｓｅは、二本鎖ＤＮＡに対するその活性の３０％未満又は２０％未満であるＤＮＡ：ＲＮＡデュプレックスに対する活性を有することが好ましい。
【００８４】
これらのＤＮａｓｅを１ステップの逆転写増幅プロトコールの汚染除去に非常に適したものにするのは、本発明の好ましいＤＮａｓｅのこれらの特定の特徴（即ち、迅速な実質的不可逆的不活性化、二本鎖特異性及び、好ましくは最小ＤＮＡ：ＲＮＡデュプレックスヌクレアーゼ活性）である。これは、１ステップ中での増幅又は逆転写産物の望ましくない分解を恐れずに、反応混合物全体を汚染除去することができ、さらなる物質の添加が必要とされないためである。これは、初期逆転写産物及び／又は増幅産物の望ましくない消化による（ゲノムＤＮＡの汚染リスクを含めた）汚染リスクを、感度を犠牲にせずに最小にする。
【００８５】
前述の方法中で使用するＤＮａｓｅ酵素は、それ自体が本発明のさらなる態様を構成する。したがって本発明のこの態様は、５分間約５０℃の温度での加熱によって実質的に不可逆的不活性化され、二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的であるＤＮａｓｅを提供する。これらの不活性化特性はＥＤＴＡの不在下で得られることが好ましい。
【００８６】
前に記載した特性を有する任意の熱不安定なＤＮａｓｅが、本発明による方法中での使用に適している可能性があることは明らかであるが、ホンホッコクアカエビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）のＤＮａｓｅ由来の修飾ＤＮａｓｅｓ、又は他、好ましくは、特定プロリン残基が修飾、欠失若しくは置換されている海洋生物由来の同様のＤＮａｓｅは、本発明の別の態様を形成する。生物は原核生物又は真核生物であってよい。「原核生物」によって、細胞核を欠く任意の生物、すなわち真正細菌及び古細菌由来の任意の生物を意味する。生物は細菌であることが好ましい。生物は真核生物、例えば、分類界、動物、植物、真菌又は原生生物に分類される生物、例えば、植物門／動物門、鉤頭動物（Ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ）、無腸動物（Ａｃｏｅｌｏｍｏｒｐｈａ）、環形動物（Ａｎｎｅｌｉｄａ）、節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）、腕足類（Ｂｒａｃｈｉｏｐｏｄａ）、コケムシ類（Ｂｒｙｏｚｏａ）、毛顎動物（Ｃｈａｅｔｏｇｎａｔｈａ）、脊索動物（Ｃｈｏｒｄａｔａ）、刺胞動物（Ｃｎｉｄａｒｉａ）、有櫛動物（Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ）、有輪動物（Ｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ）、きょく皮動物（Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ）、ユムシ動物（Ｅｃｈｉｕｒａ）、内肛動物（Ｅｎｔｏｐｒｏｃｔａ）、腹毛動物（Ｇａｓｔｒｏｔｒｉｃｈａ）、顎口動物（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍｕｌｉｄａ）、半索動物（Ｈｅｍｉｃｈｏｒｄａｔａ）、動吻類（Ｋｉｎｏｒｈｙｎｃｈａ）、胴甲動物（Ｌｏｒｉｃｉｆｅｒａ）、花虫網類（Ｍｉｃｒｏｇｎａｔｈｏｚｏａ）、軟体動物（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）、線虫類（Ｎｅｍａｔｏｄａ）、類線虫類（Ｎｅｍａｔｏｍｏｒｐｈａ）、ヒモムシ類（Ｎｅｍｅｒｔｅａ）、有爪動物（Ｏｎｙｃｈｏｐｈｏｒａ）、直泳類（Ｏｒｔｈｏｎｅｃｔｉｄａ）、ホウキムシ類（Ｐｈｏｒｏｎｉｄａ）、平板動物（Ｐｌａｃｏｚｏａ）、扁形動物（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、海綿動物（Ｐｏｒｉｆｅｒａ）、エラヒキ動物（Ｐｒｉａｐｕｌｉｄａ）、菱形類（Ｒｈｏｍｂｏｚｏａ）、ワムシ類（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）、ホシムシ類（Ｓｉｐｕｎｃｕｌａ）、クセノトルベラ（Ｘｅｎｏｔｕｒｂｅｌｌｉｄａ）、ツノゴケ植物（Ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔｏｐｈｙｔａ）、コケ植物（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ）、苔類（Ｍａｒｃｈａｎｔｉｏｐｈｙｔａ）、ヒカゲノカズラ植物（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｏｐｈｙｔａ）、シダ植物（Ｐｔｅｒｉｄｏｐｈｙｔａ）、シダ種子植物（Ｐｔｅｒｉｄｏｓｐｅｒｍａｔｏｐｈｙｔａ）、針葉樹類（Ｃｏｎｉｆｅｒｏｐｈｙｔａ）、ソテツ類（Ｃｙｃａｄｏｐｈｙｔａ）、イチョウ類（Ｇｉｎｋｇｏｐｈｙｔａ）、グネツム類（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔａ）、開花植物（Ａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）（又は被子植物（Ｍａｇｎｏｌｉｏｐｈｙｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、不完全菌門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）又は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）であることがより好ましい。動物界からの生物、例えば無脊椎動物及び脊椎動物は注目に値する。生物は、節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）門の生���、例えば亜門甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ）、六脚類（Ｈｅｘｐｏｄａ）、鋏角類（Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）又は多足類（Ｍｙｒｉａｐｏｄａ）の生物、例えば甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ）の綱、さい脚類（Ｂｒａｎｃｈｉｏｐｏｄａ）、ムカデエビ（Ｒｅｍｉｐｅｄｉａ）、カシラエビ（Ｃｅｐｈａｌｏｃａｒｉｄａ）、アゴアシ（Ｍａｘｉｌｌｏｐｏｄａ）、貝虫類（Ｏｓｔｒａｃｏｄａ）又は軟甲類（Ｍａｌａｃｏｓｔｒａｃａ）、好ましくは軟甲類（Ｍａｌａｃｏｓｔｒａｃａ）の綱の生物、及びより好ましくは十脚類目（ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｐｏｄａ）の生物から選択されることが好ましい。これらの生物は、タラバエビ科（ｆａｍｉｌｙ  Ｐａｎｄａｌｉｄａｅ）、例えばウミカラマツエビ（Ａｎａｃｈｌｏｒｏｃｕｒｔｉｓ）、深海エビ（Ａｔｌａｎｔｏｐａｎｄａｌｕｓ）、カザリジンケンエビ（Ａｕｓｔｒｏｐａｎｄａｌｕｓ）、キャリパンダラス（Ｃａｌｉｐａｎｄａｌｕｓ）、アオウミガメ（Ｃｈｅｌｏｎｉｋａ）、ヒメモバコエビ（Ｃｈｌｏｒｏｃｕｒｔｉｓ）、クラゲエビ（Ｃｈｌｏｒｏｔｏｃｅｌｌａ）、サヨエビ（Ｃｈｌｏｒｏｔｏｃｕｓ）、ディシェロパンダラス（Ｄｉｃｈｅｌｏｐａｎｄａｌｕｓ）、ドロドーテス（Ｄｏｒｏｄｏｔｅｓ）、アカモンミノエビ（Ｈｅｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ）、ビシャモンエビ（Ｍｉｒｏｐａｎｄａｌｕｓ）、モロゲエビ（Ｎｏｔｏｐａｎｄａｌｕｓ）、パンダリナ（Ｐａｎｄａｌｉｎａ）、モロトゲアカエビ（Ｐａｎｄａｌｏｐｓｉｓ）、北国赤海老（Ｐａｎｄａｌｕｓ）、パントムス（Ｐａｎｔｏｍｕｓ）、ペリパンダラス（Ｐｅｒｉｐａｎｄａｌｕｓ）、ジンケンエビ（Ｐｌｅｓｉｏｎｉｋａ）、ベニエビ（Ｐｒｏｃｌｅｔｅｓ）、シュードパンダラス（Ｐｓｅｕｄｏｐａｎｄａｌｕｓ）又はカザリジンケンエビ（Ｓｔｙｌｏｐａｎｄａｌｕｓ）属、深海ガニ科（ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｔｈｏｄｉｄａｅ）、例えばバタフライクラブ（Ｃｒｙｐｔｏｌｉｔｈｏｄｅｓ）、グリプトリトデス（Ｇｌｙｐｔｏｌｉｔｈｏｄｅｓ）、ハリイバラガニ（Ｌｉｔｈｏｄｅｓ）、茶色箱カニ（Ｌｏｐｈｏｌｉｔｈｏｄｅｓ）、アガシイバラガニ（Ｎｅｏｌｉｔｈｏｄｅｓ）、アラスカタラバガニ（Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ）、エゾイバラガニ（Ｐａｒａｌｏｍｉｓ）、フィロリトデス（Ｐｈｙｌｌｏｌｉｔｈｏｄｅｓ）又はリノリトーデ（Ｒｈｉｎｏｌｉｔｈｏｄｅ）属、又はクルマエビ科（ｆａｍｉｌｙ  Ｐｅｎａｅｉｄａｅ）、例えばブラウンシュリンプ（Ｆａｒｆａｎｔｅｐｅｎａｅｕｓ）、コウライエビ（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓ）、パシフィックホワイトシュリンプ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ）又は十脚目クルマエビ（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ）属に分類することができる。生物は、進化して寒冷な環境、例えば寒冷な海洋又は水性環境に生息する生物であることが好ましい。生物は、例えばタラバガニ（Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ）（キングクラブ）、クルマエビ（Ｍａｒｓｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）（車海老科）又はマエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）から選択されることが好ましい。他の実施形態では、ＤＮａｓｅは、原核生物ではない、例えば細菌ではない、例えば好冷細菌ではな��生物種に由来する。
【００８７】
これらの修飾ＤＮａｓｅの酵素活性断片も本発明の範囲内に含まれる。
【００８８】
したがって、さらなる態様において、本発明はＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片を提供し、前記ＤＮａｓｅは配列番号１の配列、又はそれと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％、例えば少なくとも９８％同一である配列を有するが、配列番号１の位置２３７におけるプロリン残基又は他の配列中の同等プロリンが修飾、欠失若しくは置換されており、前記ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片は、５分間約５０℃の温度での加熱によって実質的に不可逆的不活性化され、且つ二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的である。
【００８９】
配列番号１は、ホンホッコクアカエビのＤＮａｓｅに関するｃＤＮＡの翻訳部分のアミノ酸配列である。ｃＤＮＡ配列は配列番号２において示す。配列番号１はＭＩＧＲＴＴＦＩＡＬＦＶＫＶＬＴＩＷＳＦＴＫＧ（配列番号９）のシグナルペプチド配列を含む。成熟型のホンホッコクアカエビのＤＮａｓｅは配列番号５において示す（即ち、シグナルペプチド（配列番号９）を含まない配列番号１の配列）。したがって配列番号１の残基２３７におけるプロリンは、配列番号５の残基２１４におけるプロリンと同じ位置にある。
【００９０】
したがって、本発明はＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片をさらに提供し、前記ＤＮａｓｅは配列番号５の配列、又はそれと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％、例えば少なくとも９８％同一である配列を有するが、配列番号５の位置２１４におけるプロリン残基又は他の配列中の同等プロリンが修飾、欠失若しくは置換されており、前記ＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片は、５分間約５０℃の温度での加熱によって実質的に不可逆的不活性化され、且つ二本鎖ＤＮＡに対して実質的に特異的である。
【００９１】
酵素活性断片及び配列番号１の変異体は、配列番号５の成熟型酵素の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％及び最も好ましくは少なくとも９９％の酵素機能（即ち、ヌクレオチド配列特異性なしでＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合を加水分解する能力）を示す。他の箇所で論じるように、ＤＮａｓｅの活性は通常の技法を使用して容易に評価することができる。
【００９２】
本発明により、配列同一率を、デフォルトパラメータ（ＤＮＡギャップオープンペナルティ＝１５．０；ＤＮＡギャップエクステンションペナルティ＝６．６６；ＤＮＡマトリックス＝同一性；タンパク質ギャップオープンペナルティ＝１０．０；タンパク質ギャップエクステンションペナルティ＝０．２；タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ；タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１；タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４）を使用して、（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２多重配列アラインメントプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌＷ２を使用する）広く利用されているアルゴリズムのいずれかを使用して計算することができる。
【００９３】
配列番号１又は５以外の「他の配列中の同等プロリン残基」は、図１１中に表すアラインメントなどのアラインメントを生成するための、ＣｌｕｓｔａｌＷ２などの標準的な配列アラインメント技法を使用することによって容易に同定することができる。
【００９４】
本発明のＤＮａｓｅ又はその断片は、前述の任意の分類群に分類される種から、例えば節足動物門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｒｔｈｒｏｐｏｄｏａ）又は亜門の甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ）、六脚類（Ｈｅｘｐｏｄａ）、鋏角亜門（Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）及び多足類（Ｍｙｒｉａｐｏｄａ）、例えばホンホッコクアカエビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）、タラバガニ（Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ）（キングクラブ）、クルマエビ（Ｍａｒｓｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）（車海老科）又はマエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）から得られるが、配列番号１の位置２３７におけるプロリンと同等のプロリン残基が修飾、欠失又は置換されているＤＮａｓｅの配列を有することが好ましい。配列番号１の位置２３７におけるプロリンと同等のプロリン残基が修飾、欠失又は置換されている、ホンホッコクアカエビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）由来のＤＮａｓｅが好ましい。
【００９５】
最も好ましい実施形態では、本発明のＤＮａｓｅは配列番号３又は７のアミノ酸配列を有する。
【００９６】
（例えば、配列番号１の残基２３７／配列番号５の残基２１４における）プロリンの「置換」によって、プロリン残基が、典型的には遺伝的にコードされた別の天然に存在するアミノ酸、又はアミノ酸アナログによって置換されていることを意味する。プロリンは、アラニン、グリシン、セリン又はシステインによって置換されていることが好ましい。
【００９７】
プロリンの「修飾」によって、プロリン残基が、例えばその側鎖基を異なる基で置換すること、側鎖自体の組成を変えること、又は側鎖と反対側の水素を異なる側鎖基で置換することによって、その通常の立体化学性が改変されていることを意味する。
【００９８】
本発明は、本発明のＤＮａｓｅをコードする核酸分子も提供する。配列番号３及び７のアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配列は、配列番号４及び８において開示する。遺伝コードの縮重は、配列番号４及び８が多くの考えられるヌクレオチド配列のわずか２つであることを意味する。
【００９９】
本発明は、核酸を増幅する方法における汚染除去剤としての、前に記載した特定のＤＮａｓｅの使用も提供する。本明細書に記載する汚染除去法における前に記載した特定のＤＮａｓｅの使用は、本発明の特に好ましい実施形態を表す。
【０１００】
前に記載したＤＮａｓｅ又はその酵素活性断片を単離及び精製するための方法は、本発明のさらなる態様を表す。したがって、この態様において本発明は、適切な宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）、バキュロウイルス感染昆虫細胞）中で前記ＤＮａｓｅ又はその断片を発現させること、及び前記宿主細胞及び／又は前記細胞を培養した培地からＤＮａｓｅを後に分離することを含むような方法を提供する。前記ＤＮａｓｅ又はその断片の発現は、適切な宿主細胞中への、前記ＤＮａｓｅ又はその断片をコードする発現ベクター、例えば配列番号３及び７のアミノ酸配列をコードする核酸分子、例えば配列番号４又は８のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターの取り込みによって実施することができる。これらの発現カセット及び核酸分子を含む宿主細胞は本発明によって包含される。
【０１０１】
ＤＮａｓｅ酵素は、当技術分野で知られており文献中に広く記載されているタンパク質に関する任意の精製技法、又はその任意の組合せを使用して、宿主細胞／培養培地から分離又は単離することができる。このような技法は、例えば沈殿、限外濾過、透析、様々なクロマトグラフィー技法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離などを含むことができる。
【０１０２】
同様に、宿主細胞の抽出物を、当技術分野でよく知られている技法、例えば均質化、凍結−解凍などを使用して調製することもでき、この抽出物から本発明のＤＮａｓｅを精製することができる。
【０１０３】
イオン交換クロマトグラフィーと親和性クロマトグラフィーの組合せ、例えばセファロースカラム、例えばレッドセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）又はブルーセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに基づく精製プロトコールを容易に使用して、酵素を単離することが可能であることが分かっている。
【０１０４】
より詳細には、抽出物をイオン交換クロマトグラフィーに施すことができ、タンパク質はＮａＣｌ勾配で溶出することができる。ＤＮａｓｅ活性を含有する画分は透析することができ、次いでＮａＣｌでの最終溶出前に親和性カラムに施すことができる。
【０１０５】
本発明は、少なくとも本発明によるＤＮａｓｅを含むキットも提供する。キットは、核酸増幅及び／又は逆転写反応を実施するのに必要な試薬、バッファー、酵素などの一部又は全部をさらに含有することができる。より詳細にはキットは、ヌクレオチド三リン酸（ＳＤＡ用のｄＮＴＰαＳ含む）、オリゴヌクレオチドプライマー、逆転写酵素、好ましくは約５０℃で機能することができる酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ又はＢｓｔポリメラーゼ（及びそのホットスタート型）などの耐熱性ポリメラーゼ、又はＬＡＲの場合、ＤＮＡリガーゼ（好ましくは、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）又はピューロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から単離されＵＳ６２８０９９８中で開示されたリガーゼなどの耐熱性ＤＮＡリガーゼ）、又は制限酵素（好ましくは、ＢｓｏＢ１などの耐熱性制限酵素）を含有することができる。ＤＮａｓｅは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換ポリメラーゼ又はＬＣＲリガーゼと共に一区画で与えることができる。
【０１０６】
本発明は、例えばその構成要素を前に記載した、本発明のＤＮａｓｅ及び核酸増幅及び／又は逆転写の反応及び方法を実施するのに必要な１つ又は複数の試薬を含む組成物も提供する。典型的には、このような組成物は水性であり、例えばトリス、ＨＥＰＥＳなどの標準的なバッファーで緩衝処理する。
【０１０７】
逆転写法は現在当然ながら当技術分野では標準的であり、任意の公知又は標準的な試薬及び技法を使用して実施することができる。
【０１０８】
典型的な逆転写プロトコールでは、汚染除去ステップは、短時間の間、例えば室温で１〜３０分間、好都合には２〜１５分間、ＤＮａｓｅを含有する逆転写反応混合物をインキュベートすることを単に含み得る。このインキュベーション時間は重要ではなく、使用する正確なＤＮａｓｅ及び濃度、及び反応系の他の構成要素に応じて変わる可能性がある。温度は酵素が活性状態である任意の温度、即ち不活性化温度未満（例えば３７℃）であってよいが、室温が好都合である。
【０１０９】
このような反応混合物は、前述のように、逆転写反応に必要な全ての反応物を含有することができる。
【０１１０】
典型的な代表的逆転写混合物は例えば以下のものを含むことができる：
【表１】
0005813637.tif 000002
【０１１１】
前述の代表的な例では、（バッファー、ｄＮＴＰ、プライマー、酵素及びＭｇＣｌ２溶液を含めた）反応の全体積が５０〜１００μｌに相当する限り、滅菌蒸留水と実験鋳型体積の任意の組合せを使用することができる。しかしながら、他の最終体積を選択に従い使用して、例えば、類似又は他の望ましい最終濃度の反応物を得ることができる。任意の好都合な又は市販の逆転写バッファーを使用することができる。適切な５×逆転写バッファーは２５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．５）、４０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴであってよい。逆転写バッファーはＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入することができる。
【０１１２】
考えられる汚染のレベルに応じて、必要とされるＤＮａｓｅの量は変わる可能性がある。短時間のインキュベーションステップ（室温で０〜１５分間）では、２．０単位／５０μｌの反応混合物が一般に十分以上である。０．１〜２．０単位／５０μｌの反応混合物が適切であり、約０．５単位／５０μｌの反応混合物、例えば０．２〜１．０単位／５０μｌの反応混合物の活性が好ましい。２．０単位／５０μｌの反応混合物の濃度で、ある程度のｓｓＤＮａｓｅ活性が観察され、したがって前に列挙した活性が好ましい。一単位の酵素は、Ｋｕｎｉｔｚアッセイ又はＹａｍａｍｏｔｏの改変型Ｋｕｎｉｔｚアッセイ（いずれも上記）において２６０ｎｍで１分間当たり０．００１吸収が増大する量として定義する。インキュベーション後、反応混合物を加熱することによってＤＮａｓｅを不活性化させる。好都合なことに、逆転写ステップ中に例えば約５０℃で３０分間加熱することによって、これを実施することができる。
【０１１３】
本発明のＤＮａｓｅを使用する汚染除去ステップを含む増幅法は、ＰＣＲを含むか又はＰＣＲに基づくことが好都合である。ＰＣＲ法は当技術分野では標準的であり、任意の公知又は標準的な試薬及び技法を使用して実施することができる。
【０１１４】
典型的なＰＣＲ反応プロトコールでは、汚染除去ステップは、短時間の間、例えば室温で１〜１０分間、好都合には２〜５分間、ＤＮａｓｅを含有する増幅反応混合物をインキュベートすることを単に含み得る。このインキュベーション時間は重要ではなく、使用する正確なＤＮａｓｅ及び濃度、及び反応系の他の構成要素に応じて変わる可能性がある。温度は酵素が活性状態である任意の温度、即ち不活性化温度未満（例えば３７℃）であってよいが、室温が好都合である。
【０１１５】
このような反応混合物は、前述のように、鋳型、即ち増幅する標的核酸以外、増幅反応に必要な全ての反応物を含有することができる。
【０１１６】
典型的な代表的ＰＣＲ増幅反応混合物は例えば以下のものを含むことができる：
【表２】
0005813637.tif 000003
【０１１７】
前述の代表的な例では、（バッファー、ｄＮＴＰ、プライマー、酵素及びＭｇＣｌ２溶液を含めた）反応の全体積が２５〜５０μｌに相当する限り、滅菌蒸留水と実験鋳型体積の任意の組合せを使用することができる。しかしながら、他の最終体積を選択に従い使用して、例えば、類似又は他の望ましい最終濃度の反応物を得ることができる。任意の好都合な又は市販のＰＣＲバッファーを使用することができる。
【０１１８】
汚染除去後、反応混合物を加熱することによってＤＮａｓｅを不活性化させる。好都合なことに、第一ＰＣＲサイクル中に加熱することによって、これを実施することができる。
【０１１９】
ＰＣＲプロセスの最適化性能は、サイクル中の各ステップに関する温度、温度での時間、及び温度間の時間の長さの選択によって影響を受ける。新たに加えた標的核酸のＰＣＲ増幅前にＤＮａｓｅを利用して汚染ｄｓＤＮＡを分解する、典型的なサイクルのプロファイルは、以下の通り：（ａ）室温で０〜１０分間のＤＮａｓｅのインキュベーション、（ｂ）９４℃で２分間のＤＮａｓｅのインキュベーション、（ｃ）鋳型の添加、９４℃で１分間のＤＮＡ融解、（ｄ）５０〜６５℃で１５秒間のプライマーアニーリング、（ｅ）７２℃で３０秒間のプライマー伸長、（ｆ）９４℃で１０秒間のＤＮＡ融解であり、ステップ（ｄ）〜（ｆ）は必要に応じて多数回繰り返して望ましいレベルの増幅を得る。
【０１２０】
前述のように、本発明のＤＮａｓｅは、１ステップの逆転写増幅反応、例えば逆転写ＰＣＲに特に適している。このようなプロトコールは当技術分野で十分確立されているが、完全性のため、典型的な代表的逆転写ＰＣＲ混合物は例えば以下のものを含むことができる：
【表３】
0005813637.tif 000004
【０１２１】
逆転写及びＰＣＲ反応における体積及びバッファーに関する前述の考察がここで適用可能である。汚染除去後、ＤＮａｓｅが不活性化する温度で逆転写反応を実施する（例えば５０℃で１時間）。このステップ中、ＤＮａｓｅは不活性化状態である。これは、ｃＤＮＡ産物はその生成時に分解せず、ＰＣＲ反応が始まるとき、いずれのその産物も分解しないことを意味する。逆転写反応後、前に記載したプロファイルなどの循環プロファイルに反応容器を曝すことによって、反応混合物へのさらなる添加なしでＰＣＲ反応を実施する。
【０１２２】
ここで本発明を、以下の図を参照しながら非制限的な実施例によって記載する：
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】３時間３７℃においてプラスミドＤＮＡに対して１５、３０又は６０分間５０、５５、６５又は９４℃でＤＴＴの存在又は不在下において不活性化した配列番号７のＤＮａｓｅ及び野生型ホンホッコクアカエビ（配列番号６）の活性を示す、いくつかのアガロースゲルの写真を示す図である。
【図２】ＤＴＴの存在下５５℃での、配列番号７のＤＮａｓｅの不活性化の時系列を示す図である。
【図３】ＤＴＴの存在下５０℃での、配列番号７のＤＮａｓｅの不活性化の時系列を示す図である。
【図４】本発明の成熟型Ｐ２１４Ａ突然変異ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。
【図５】成熟型ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのＰ２１４Ａ突然変異体のコードヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。
【図６】本発明のＰ２３７Ａ突然変異ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である（配列番号３及び４）。このアミノ酸配列はシグナルペプチドＭＩＧＲＴＴＦＩＡＬＦＶＫＶＬＴＩＷＳＦＴＫＧ（配列番号９）を含む。
【図７】成熟型ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのアミノ酸配列を示す図である（配列番号５）。
【図８】成熟型ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのコードヌクレオチド配列を示す図である（配列番号６）。
【図９】ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのｃＤＮＡヌクレオチド配列及び翻訳アミノ酸配列を示す図である（配列番号１及び２）。このアミノ酸配列はシグナルペプチドＭＩＧＲＴＴＦＩＡＬＦＶＫＶＬＴＩＷＳＦＴＫＧ（配列番号９）を含む。
【図１０】１ステップＲＴ−ＰＣＲの効率に対する、野生型ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅ及びＰ２１４Ａ突然変異体の影響を示す図である。
【図１１】キングクラブ（タラバガニ（Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ）のＤＮａｓｅ（配列番号１５）及びホンホッコクアカエビＤＮａｓｅ（配列番号５）のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。３７９残基重複において同一率６５．７％。スコア、１３８４．０。ギャップ頻度、０．０％。
【図１２】定量ＰＣＲプロトコールに対する漸増する濃度のＰ２１４Ａ突然変異体の影響を示す図である。
【図１３】定量ＰＣＲプロトコールに対する熱処理酵素の阻害効果を測定したことによる、ＤＮａｓｅＩ及びＰ２１４Ａ突然変異体の熱不安定性の比較を示す図である。
【図１４】漸増する量のＰ２１４Ａ突然変異体を含む定量ＰＣＲ反応混合物からの、スパイクＤＮＡの除去の程度を示す図である。
【図１５】１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応に対する漸増する濃度のＰ２１４Ａ突然変異体の影響を示す図である。
【図１６】無鋳型ｑＰＣＲ対照に対するＰ２１４Ａ突然変異体の影響を示す図である。
【０１２４】
且つその中で
配列番号１は、ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのｃＤＮＡヌクレオチド配列の翻訳部分のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのｃＤＮＡヌクレオチド配列である。
配列番号３は、Ｐ２３７Ａ突然変異ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのアミノ酸配列である。
配列番号４は、Ｐ２３７Ａ突然変異ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのコードヌクレオチド配列である。
配列番号５は、成熟型ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのアミノ酸配列である。
配列番号６は、成熟型ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのコードヌクレオチド配列である。
配列番号７は、成熟型Ｐ２１４Ａ突然変異ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのアミノ酸配列である。
配列番号８は、成熟型Ｐ２１４Ａ突然変異ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのコードヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅのシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ＤＮａｓｅ活性を測定するための５’ＦＡＭ及び３’ＴＡＭＲＡ標識オリゴヌクレオチドである。
配列番号１１は、配列番号１０の相補配列である。
配列番号１２は、大腸菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部分を増幅するためのフォワードプライマーである。
配列番号１３は、大腸菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部分を増幅するためのリバースプライマーである。
配列番号１４は、配列番号１３及び配列番号１４と相補的な領域間の大腸菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部分と相補的な５’ＦＡＭ及び３’ＢＨＱ標識オリゴヌクレオチドプローブである。
配列番号１５は、キングクラブ（タラバガニ（Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ）のＤＮａｓｅのアミノ酸配列である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２５】
配列番号１０
＜２２３＞ＤＮａｓｅ活性を測定するための５’ＦＡＭ及び３’ＴＡＭＲＡ標識オリゴヌクレオチドプローブ。
配列番号１１
＜２２３＞配列番号１０の相補配列。
配列番号１２
＜２２３＞大腸菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部分を増幅するためのフォワードプライマー。
配列番号１３
＜２２３＞大腸菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部分を増幅するためのリバースプライマー。
配列番号１４
＜２２３＞配列番号１３及び配列番号１４と相補的な領域間の大腸菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部分と相補的な５’ＦＡＭ及び３’ＢＨＱ標識オリゴヌクレオチドプローブ。
【実施例】
【０１２６】
（例１．ＤＮａｓｅ活性の測定）
Ｋｕｎｉｔｚアッセイ
Ｋｕｎｉｔｚの手順（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．、１９５０、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＩＩ、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｙｍｕｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ．Ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３３、３６３〜３７７）に従いＤＮａｓｅ活性をアッセイすることができる。１０μｌの酵素調製物を、１ｍｌの最終体積で１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、５ｍＭのＭｇＣｌ２中の５０μｇの仔牛胸腺ＤＮＡに加える。混合物は２５℃でインキュベートし、吸光度の増大を２６０ｎｍで測定する。１Ｕ＝０．００１のＯＤ２６０増大×ｍｉｎ−１。
【０１２７】
Ｙａｍａｍｏｔｏの改変型Ｋｕｎｉｔｚアッセイ
Ｙａｍａｍｏｔｏ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．１９７１  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｉｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｅｓｔｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｏｏｋ  ｓａｌｍｏｎ  Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、２２８、９５〜１０４）により記載された改変型Ｋｕｎｉｔｚアッセイ、エンドポイントアッセイはＫｕｎｉｔｚアッセイのさらに感度の良いバージョンであり、不活性化後の残留ＤＮａｓｅ活性を測定するのにより適していると考えられる。１０μｌの酵素を、１ｍｌの最終体積で２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ２中の２００μｇの仔牛胸腺ＤＮＡに加える。混合物は２０分間３７℃でインキュベートする。次いで０．５ｍｌの氷冷１２％ＨＣｌＯ４を加え、完全に混合し、２０分間氷上に放置する。１０分間エッペンドルフ遠心分離機において、チューブを全速で遠心分離する。２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、そこから単位を計算する。１Ｕ＝０．００１のＯＤ２６０増大×ｍｉｎ−１。
【０１２８】
（例２．ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅの突然変異）
ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅ（配列番号５）を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＱｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発キット及び製造者の説明書を使用した、（配列番号１中の残基２３７に相当する）残基２１４で突然変異させた。プロリンは野生型残基であり、アラニンは置換残基であった。図４〜９は、ホンホッコクアカエビＤＮａｓｅの野生型及び突然変異型の、アミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。突然変異体を配列決定し、正確でありピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において形質転換されたことが分かった。野生型と同様の良い発現を示した形質転換体を得た。Ｐ２１４Ａ突然変異体に関する初期不活性化試験は、それが５５℃において野生型ＤＮａｓｅより容易に不活性化されることを示した。
【０１２９】
突然変異Ｐ２１４ＡＤＮａｓｅ発現カセットを含有する組換えピキア・パストリスのクローンを、次いで１リットルの発酵装置中で発現させた。発酵はＰｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ中に記載されたように行った。発酵液（約１リットル）は１５分間４５００ｇで遠心分離して細胞を除去し、上清は新たな容器に注いだ。次いで０．５ＭのＮａＯＨを加えることによりｐＨを８に調節し、次いでそれを１５分間４５００ｇで遠心分離して沈殿した塩を除去した。新たな上清は、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルターを介して最後に濾過した。
【０１３０】
Ｐ２１４Ａ  ＤＮａｓｅタンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して最初に精製した。ｐＨを調節し、濾過した上清（１１５０ｍｌ）は、２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ＭのＮａＣｌ（バッファーＡ）で平衡状態にしたＱ−セファロースＦＦカラム（２．６／１０）に施した。次いでカラムは１９カラム体積のバッファーＡで洗浄し、次いでＰ２１４Ａタンパク質をバッファー２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ＭのＮａＣｌで溶出した。１０ｍｌの画分を回収した。使用した流速は１０ｍｌ／分であった。Ｐ２１４Ａタンパク質を含有する画分を、例１中に記載したＫｕｎｉｔｚの方法に従い活性を測定することによって選択した。
【０１３１】
選択した画分をプールし、４℃において１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２（バッファーＢ）で透析した。透析サンプルの体積は同じバッファーを使用して２００ｍｌに調節し、次いでバッファーＢで平衡状態にしたブルーセファロースＦＦカラム（５．０／１０）に施した。カラムは２カラム体積のバッファーＢで洗浄し、Ｐ２１４Ａ  ＤＮａｓｅタンパク質はバッファーＢ及び０．２５ＭのＮａＣｌを使用して溶出し、１０ｍｌの画分を回収した。使用した流速は１０ｍｌ／分であった。最後に、Ｐ２１４Ａ含有画分を前に記載したように活性を測定することによって選択し、プールし濃縮した。
【０１３２】
（例３．異なる温度における不活性化後の残留活性の測定）
Ｐ２１４Ａ突然変異体が熱により完全に不活性化されたかどうか決定するために、熱不活性化Ｐ２１４Ａ突然変異体又は野生型酵素の存在下でのＰＣＲ産物の完全性を評価した。
【０１３３】
酵素（０．８ＵのＰ２１４Ａ、又は１．５Ｕの野生型）を、２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＭｇＣｌ２、±１ｍＭのＤＴＴバッファー中に２０μｌの合計体積を含有するＰＣＲチューブに加えた。酵素は様々な温度で１５、３０及び６０分間熱不活性化させ、チューブはその後氷上に置いた。０．５μｇの精製した約５００ｂｐのＰＣＲ産物を加え、反応混合物は３７℃で３時間インキュベートした。最後に、アガロースゲル電気泳動を使用して反応混合物を分析した。陰性対照（酵素なし）及び陽性対照（熱不活性化ステップ後に加えた１００×希釈酵素）は、前の反応と同じ方法で処理した。
【０１３４】
図１に、５０℃、５５℃、６５℃及び９４℃で野生型酵素と比較した、Ｐ２１４Ａ突然変異体の熱不活性化実験をまとめる。無酵素対照（−）は完全ＰＣＲ産物を示し、一方、陽性対照（＋）、熱不活性化していない１００倍希釈酵素は、１％残留活性の影響を示す。
【０１３５】
対照実験から、ＰＣＲ産物の目に見える分解がなかったことは、アッセイ中に約１Ｕの酵素を使用したときの検出限界である０．０１％未満の残留活性（結果示さず）を示す。５０℃及び５５℃では、Ｐ２１４Ａ突然変異体のみが完全に熱不活性化され、Ｐ２１４Ａ置換の影響を実証する。両酵素の完全な不活性化にはＤＴＴの付加（この実験では１ｍＭ）が必要である。９４℃で６０分インキュベートしたときのみ、ＤＴＴの不在下で完全な熱不活性化が見られた。
【０１３６】
（例４．５０℃及び５５℃におけるＰ２１４Ａの不活性化の時系列）
ＤＮａｓｅを使用して完全な逆転写酵素反応混合物を汚染除去する場合、逆転写酵素ステップ中の初期にそれを不活性化することが重要である。ヌクレアーゼがすぐに不活性化されない場合、それはｃＤＮＡを切断し始め逆転写産物に対して有害な影響を有する可能性がある。逆転写がサンプル中のＲＮＡの量を測定するための定量アッセイの一部である場合、これは特に重要である。したがって、短時間地点での５０℃及び５５℃におけるＰ２１４Ａ突然変異体ＤＮａｓｅの不活性化を試験した。
【０１３７】
Ｐ２１４Ａ、１２．５〜１２５Ｕを典型的なＲＴ−バッファー（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ）に２５μｌの全体積で希釈した。サンプルは０〜５分間ＰＣＲ機器で５０℃及び５５℃においてインキュベートした。次いで例１中に記載した改変型Ｋｕｎｉｔｚアッセイを使用して、残存活性を測定した。
【０１３８】
図２及び３から見ることができるように、Ｐ２１４Ａ突然変異体は５５℃において１分以内に完全に不活性化することができ、５０℃において１分以内にほぼ完全に不活性化することができる。
【０１３９】
（例５．１ステップＲＴ−ＰＣＲの効率に対する、野生型及びホンホッコクアカエビＤＮａｓｅ及びＰ２１４Ａ突然変異体の影響）
１ステップのｑＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＱＲＴ−ＰＣＲマスター混合物キット１−ステップ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、並びにスマートサイクラーＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ）における熱循環及び検出を使用して実施した。
【０１４０】
反応混合物（２５μｌ）は、１２．５μｌの２×ＱＲＴ−ＰＣＲマスター混合物、１．２５μｌの２０×プライマー／プローブ混合物（ＧＡＰＤＨ  ＨＳ９９９９９９０５＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．１μｌのＳｔｒａｔａｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、１μｌのＤＮａｓｅ酵素を含有していた。鋳型として、１μｌ（１ｎｇ／μｌ）のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱＰＣＲヒト参照全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。それぞれの反応混合物は３０℃で１５分プレインキュベートした。次いで１ステップの逆転写ＰＣＲを、５０℃で３０分間、９５℃で１０分間、次に９４℃で１５秒間、６０℃で１分間の４５サイクルで実施した。
【０１４１】
図１０中に示すように、Ｐ２１４Ａ突然変異体を含有するサンプル中では、ＲＴ−ＰＣＲの効率に対する影響はほとんど又は全く観察されない。他方で、野生型ヌクレアーゼはＲＴ−ＰＣＲの効率に強く影響を与える。
【０１４２】
（例６．Ｐ２１４Ａに対するｄｓ／ｓｓＤＮＡの特異性の分析）
Ｐ２１４Ａの二本鎖及び一本鎖ＤＮＡに対する特異性を、５’末端においてフルオロフォアＦＡＭ（フルオレセイン）及び３’末端においてＴＡＭＲＡで標識したオリゴヌクレオチドからの蛍光を測定することによって試験した。ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの切断は、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５２０ｎｍで蛍光光度計において測定されるＦＡＭからの蛍光の増大をもたらす可能性がある。二本鎖ＤＮＡ基質は、標識オリゴヌクレオチドと相補的であった第二のオリゴヌクレオチドと標識オリゴヌクレオチドを混合することによって調製した。
【０１４３】
３７単位のＰ２１４Ａ突然変異体を、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２μＭの標識オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ基質）を含有した反応混合物（合計体積１００μＬ）に加えた。混合物は蛍光透視法用に白いウェルのマイクロタイタープレートにおいて２５℃でインキュベートした。
【０１４４】
同様に、０．２μＭの相補オリゴヌクレオチド、相補的ＤＮＡ基質を、前述の反応混合物に加えて二本鎖ＤＮＡ基質を形成した。０．０１単位のＰ２１４Ａ突然変異体を次いで反応混合物に加えた。
【０１４５】
経時的蛍光をＶｉｃｔｏｒ３装置で測定し、活性は１分間当たりの蛍光の初期増加として計算し、ヌクレアーゼなし（ブランク反応）の蛍光の増加に補正し、（蛍光単位／１分間）／Ｋｕｎｉｔｚ単位として表した。
【０１４６】
二本鎖ＤＮＡ基質に関して、結果は２１１，９２２（蛍光単位／１分間）であり、一本鎖ＤＮＡ基質に関して、結果は１０．４（蛍光単位／１分間）Ｋｕｎｉｔｚ単位であった。したがって、二本鎖ＤＮＡ基質は一本鎖ＤＮＡより２０，３６６倍速い速度で分解される。
オリゴヌクレオチド：
【化１】
0005813637.tif 000005
【０１４７】
（例７．Ｐ２１４Ａ突然変異体を使用したｑＰＣＲによる汚染除去）
材料及び方法
大腸菌ＴＯＰ１０ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、ＤＮＡ濃度はＱｕａｎｔ−ｉＴ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲアッセイキット及びＱｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用した大腸菌ゲノムＤＮＡの検出及び定量化用に、（Ｓｍｉｔｈ  ＧＪ  ＩＩＩら；１９９９；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２６（３）：５１８〜２２、５２４、５２６）中に記載されたように、高度に保存された２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の小領域を使用してプライマー／プローブセットを設計した。この遺伝子は大腸菌ゲノムにおいて７コピーで存在する。
【０１４８】
一般にｑＰＣＲは、１２．５μｌの２×Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｑＰＣＲマスター混合物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３μＭの各プライマー及び１μＭのプローブ、１ｍＭのＤＴＴ、１又は１０ｐｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、及び様々な量のＰ２１４Ａ突然変異体酵素又はＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する２５μｌの反応混合物においてＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ）で行う。ｑＰＣＲ反応を、以下のように：９５℃で１０分間、次に９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルで実施した。
プライマー／プローブ：
【化２】
0005813637.tif 000006
【０１４９】
プライマー／プローブ完全性に対するＰ２１４Ａ突然変異体の影響（ｓｓＤＮＡ）
この実験は、Ｐ２１４Ａ突然変異体がｑＰＣＲ混合物中のプライマー／プローブの分解（即ち、一本鎖ＤＮＡの分解）によるｑＰＣＲプロトコールに対する阻害効果を有するかどうか試験した。
【０１５０】
前に記載した反応混合物（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｑＰＣＲマスター混合物）は鋳型（大腸菌ゲノム）ＤＮＡなしで設定し、１０分間３７℃においてインキュベートした。１０分間９５℃の不活性化ステップは、鋳型として１０ｐｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを加える前に行った。次いでｑＰＣＲ増幅を前に記載したように実施した。
【０１５１】
３７℃のインキュベーションステップは、Ｐ２１４Ａ突然変異体がＤＮＡのその分解を触媒するのを可能にする。１０分間９５℃のインキュベーションは、鋳型ＤＮＡを加える前に、この突然変異体を完全に不活性化する。したがって、ｑＰＣＲ結果の任意の阻害はｓｓＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性のみに原因がある可能性がある（プライマー／プローブは分解されている）。図１２中に示すように、ｑＰＣＲの結果は最大１ＵのＰ２１４Ａ突然変異体を加えることによって影響を受けず、ｑＰＣＲ反応混合物中のプライマー／プローブに対する測定可能な活性がないことを示す。
【０１５２】
ｑＰＣＲプロトコールにおけるＤＮａｓｅＩ及びＰ２１４Ａ突然変異体の熱不安定性の比較
前に記載した反応混合物を、ＤＮａｓｅＩ（１Ｕ）又はＰ２１４Ａ（１Ｕ）の存在又は不在下において鋳型ＤＮＡなしで設定した。次いで１０分間３７℃のインキュベーションステップに、１５分間５０℃又は５５℃の不活性化ステップを続けた。１ｐｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを次いで混合物に加え、ｑＰＣＲを前に記載したように実施した。
【０１５３】
ｑＰＣＲ実験における様々な反応設定−時間を説明するために、増幅を施す前に、反応混合物を１５分間室温でインキュベートした。反応混合物中の任意の残留ＤＮａｓｅ活性は鋳型ＤＮＡを分解し、ｑＰＣＲ結果を阻害する。
【０１５４】
図１３中に示すように、Ｐ２１４Ａ突然変異体は対照反応物（対照（−Ｅｎｚ）；酵素加えず）と比較してｑＰＣＲを阻害せず、したがってこの実験中１５分間５０℃のインキュベーションステップによって完全に不活性化されたと考えることができる。ＤＮａｓｅＩ酵素は不活性化されず、Ｃｔは８を超えて変化し、インキュベーションステップ後の高い残存活性又は／及び反応混合物中のプライマー／プローブに対する活性を示す。
【０１５５】
ｑＰＣＲ反応混合物からのスパイクＤＮＡの除去
「汚染」ＤＮＡを除去するＰ２１４Ａ突然変異体の能力を試験するために、様々な量のＰ２１４Ａ突然変異体を１ｐｇの大腸菌ゲノムＤＮＡでスパイクした前に記載したｑＰＣＲ反応混合物（ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスター混合物）に加えた。次いで反応混合物は３７℃で１０分間インキュベートし、次いで６０℃で１５分間インキュベートした。結果は図１４中に示す。見ることができるように、２５μｌの反応混合物当たり０．２５Ｕ以上のＰ２１４Ａ突然変異体が８を超えるＣｔの増大を引き起こす。これは２５０倍を超えるスパイクＤＮＡの濃度の低下を示す。
【０１５６】
前に論じた個々の結果以外に、無鋳型対照（ＮＴＣ）は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｑＰＣＲマスター混合物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の両方に関して肯定的な結果をもたらしたことに留意しなければならない。これは、細菌を検出又は診断するための細菌又は大腸菌ＤＮＡを標的化する共通プライマーを使用したときの、ｑＰＣＲ混合物中の汚染ＤＮＡの問題を示す。
【０１５７】
（例８．１ステップＲＴ−ＰＣＲの効率に対するＰ２１４Ａ突然変異体の影響）
例５中に記載した実験をいくつかの濃度のＰ２１４Ａ突然変異体で繰り返して、漸増する濃度の酵素がＲＴ−ＰＣＲ反応の感度にどのように影響を与えたかを調べた。０〜１ＵのＤＮａｓｅの範囲で５つの異なる濃度を試験し、結果は図１５中に示す。０．１〜０．５ＵのＤＮａｓｅの使用はＲＴ−ＰＣＲの感度に影響を与えない。１Ｕの酵素の使用は１．５のＣｔで感度を下げる。
【０１５８】
（例９．市販のＰＣＲ産物からの細菌ＤＮＡ汚染の除去）
微量の細菌ＤＮＡが、しばしば市販の核酸増幅反応混合物（いわゆる「マスター混合物」）中に存在することは示されている（例７）。病原体を検出するためのｑＰＣＲ実験中、これはしばしば問題である。これらの汚染物質の増幅は、無鋳型対照（ＮＴＣ）を含めて偽陽性をもたらすからである。この実施例では、１ＵのＰ２１４Ａ突然変異体ＤＮａｓｅを４つの異なる供給業者からのｑＰＣＲマスター混合物に加え、３７℃で１０分間プレインキュベートした。この後、マスター混合物は６０℃で１５分間インキュベートし、例７中に記載したｑＰＣＲ反応における未処理マスター混合物と比較した。いずれの反応にも鋳型は加えなかった。結果は図１６中に示し、酵素とプレインキュベートしたマスター混合物のみが陰性ＮＴＣをもたらすことを見ることができる。
【図４】
0005813637.tif 000007
【図５】
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【図６ａ】
0005813637.tif 000009
【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
0005813637.tif 000013
【図９ｂ】
0005813637.tif 000014
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図１０】
0005813637.tif 000019
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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