(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）から選択されるタンパク質に由来するムテインであって、配列番号１に示されるｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１１の突然変異させたアミノ酸残基を含み、但しｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置１３８に対応する配列位置のアミノ酸残基は変異されており、検出可能なアフィニティーで所与の小分子である標的に結合するムテイン。
【請求項２】
ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４２、４８、４９、５５、７５、７７、８０、および１２７に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つの突然変異させたアミノ酸残基をさらに含む、請求項１に記載のムテイン。
【請求項３】
ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４３、４４、４６、４７、５０、５１、５９、６５、７８、８６、８７、９８、９９、１０３、１０７、１１０、および１１１に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つの突然変異させたアミノ酸残基をさらに含む、請求項１または２に記載のムテイン。
【請求項４】
ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、または１５８に対応する配列位置のうちの少なくとも１カ所においてＣｙｓ残基が導入される、請求項１から３のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項５】
ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置６５、７１、７３、７４、１１６、１２５、および１３５に対応する配列位置のうちの少なくとも１カ所において、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらなるアミノ酸置換を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項６】
有機低分子またはペプチドに結合する、請求項１から５のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項７】
有機低分子が、金属キレート化剤または薬剤である、請求項６に記載のムテイン。
【請求項８】
突然変異させたアミノ酸が、Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ、Ｌｅｕ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕからなる群から選択される、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対して含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項９】
Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ、Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ、Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ、Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ、Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ、およびＳｅｒ１２７→Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに含む、請求項８に記載のムテイン。
【請求項１０】
Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ、Ｇｌｕ４４→Ｍｅｔ、Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ、Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ、Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ、Ａｓｎ６５→Ａｓｐ、Ｔｙｒ７８→Ｈｉｓ、Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ、Ｓｅｒ８７→Ｐｒｏ、Ｓｅｒ８７→Ｐｈｅ、Ｌｙｓ９８→Ｇｌｕ、Ｓｅｒ９９→Ａｓｎ、Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ、Ｖａｌ１１０→Ｍｅｔ、およびＶａｌ１１１→Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに含む、請求項８または９に記載のムテイン。
【請求項１１】
アミノ酸置換：
（ａ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｂ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｃ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｄ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｅ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｆ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｇ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｈ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｉ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ９８→Ｇｌｕ；Ｖａｌ１１０→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｊ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｋ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ８７→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ９９→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｌ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｍ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ８７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；または
（ｎ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｙｒ７８→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ；Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ；Ｖａｌ１１１→Ａｌａ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ
を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対して含む、請求項９または１０に記載のムテイン。
【請求項１２】
Ｇｌｕ２８→Ｈｉｓ、Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ、およびＴｈｒ１４５→Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項１３】
選択される標的分子に対する結合アフィニティーでターゲティング部分とコンジュゲートされているか、あるいは、有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、金コロイドからなる群から選択される標識にコンジュゲートされている、請求項１から１２のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項１４】
そのＮ末端および／またはそのＣ末端において、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドと融合されているか、あるいは、その血清半減期を延長する部分とコンジュゲートされている、請求項１から１３のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項１５】
ムテインが、所与の小分子である標的に、１μＭ以下、１００μＭ以下、１μＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＫDにより結合する、請求項１から１４のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項１６】
化合物を事前に選択された部位にターゲティングするための、請求項１から１５のいずれか一項に記載のムテインの使用であって、
（ａ）前記ムテインを、前記化合物と接触させるステップと、
（ｂ）前記ムテイン／標的複合体を、前記事前に選択された部位に送達するステップと
を含む使用。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のムテインを含む診断用キットまたは解析用キット。
【請求項１８】
請求項１から１２、１４、および１５のいずれか一項に記載のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のムテインを生成させる方法であって、
（ａ）ｈＮＧＡＬタンパク質をコードする核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちの任意の少なくとも１１カ所をコードするヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかける結果、１または複数のムテイン核酸分子を得るステップ、但しｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置１３８に対応する配列位置のアミノ酸残基は変異されるステップと、
（ｂ）適切な発現系において、（ａ）で得られた１または複数のムテイン核酸分子を発現させるステップと、
（ｃ）選択および／または単離により、所与の小分子である標的に対する検出可能な結合アフィニティーを有する１または複数のムテインを濃縮するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４２、４８、４９、５５、７５、７７、８０、および１２７に対応する配列位置のうちのいずれかをコードする、少なくとも１つのヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４３、４４、４６、４７、５０、５１、５９、６５、７８、８６、８７、９８、９９、１０３、１０７、１１０、および１１１に対応する配列位置のうちのいずれかをコードする、少なくとも１つのヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップをさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が、参照により、すべての目的についてのその全体において本明細書に組み込まれる、２００８年６月２４日に出願された米国仮出願第６１／０７５，１７５号の優先権による利益を主張する。
【０００２】
本発明は、検出可能なアフィニティーで所与の非天然リガンドに結合する、ヒトリポカリン２（ｈＮＧＡＬ）および類縁タンパク質に由来する新規のムテインに関する。本発明はまた、このようなムテインをコードする対応する核酸分子、およびそれらを生成させる方法にも関する。本発明はさらに、このようなムテインを産生する方法に関する。さらにまた、本発明は、このようなリポカリンムテインを含む医薬組成物のほか、該ムテインの各種の使用も対象とする。
【背景技術】
【０００３】
リポカリンは、多くの生物において、可溶性に乏しいか、または化学的に感受性のビタミン、ホルモン、および代謝物（レチノイド、脂肪酸、コレステロール、プロスタグランジン、ビリベルジン、フェロモン、味物質、付臭剤など）の輸送または保存に用いられる、小型でかつ頑健な分泌性タンパク質の多様なファミリーである（Ａｋｅｒｓｔｒｏｅｍら編（２００６年）、「Ｌｉｐｏｃａｌｉｎｓ」、テキサス州、ジョージタウン、Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社；Ｐｅｒｖａｉｚ，Ｓ．およびＢｒｅｗ，Ｋ．（１９８７）、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１巻、２０９〜２１４頁）。かつて、リポカリンは、主に輸送タンパク質として分類されていたが、今日では、各種の生理学的機能を果たすことが明らかである。これらには、レチノール輸送、嗅覚、フェロモンのシグナル伝達、およびプロスタグランジンの合成における役割が含まれる。リポカリンはまた、免疫反応の調節、および細胞ホメオスタシスの媒介にも関与している（例えば、Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９６年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３１８巻、１〜１４頁；およびＦｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（２０００年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４８２巻、９〜２４頁において総説されている）。
【０００４】
リポカリンは、全体的な配列保存のレベルが極めて低く、配列同一性は２０％未満であることが多い。これとは極めて対照的に、それらの全体的な折り畳みパターンは、高度に保存されている。リポカリン構造の中心部分は、自身に近接する形で折り返され、連続的に水素結合してβバレルを形成する、逆平行の８本のストランドによる単一のβシートからなる。βバレルの一方の端部は、その底部を横切るＮ末端ペプチドセグメントのほか、βストランドを連結する３つのペプチドループにより、立体障害的に閉鎖されている。βバレルの他方の端部は溶媒に対して開口しており、４つのペプチドループにより形成される標的結合部位を包含する。その他の点では固定的なリポカリン骨格にあって、ループがこのような多様性を有するために、各々が、サイズ、形状、および化学的特徴の異なる標的に適合しうる、各種の異なる結合方式がもたらされる（例えば、Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９６年）、前出；Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（２０００年）、前出；およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（２０００年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４８２巻、３３７〜３５０頁において総説されている）。
【０００５】
ヒト体内において見出されるリポカリンファミリーの１０〜１２のメンバーのうち、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら（２０００年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４８２巻、２７２〜２８３頁）（リポカリン２（Ｌｃｎ２）としても知られ、より近年では、シデロカリンの別名（Ｇｏｅｔｚら（２００２年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、１０巻、１０３３〜１０４３頁）でも知られる）は、特定の細菌のシデロフォアに結合するＦｅ3+イオンを除去することにより、細菌感染に対する生得的免疫防御における役割を果たす。
【０００６】
このようなシデロフォアは、限界的な鉄濃度に応答して、病原性細菌により分泌される、極めて強力な鉄キレート化剤であり（ＳｃｈａｉｂｌｅおよびＫａｕｆｍａｎｎ（２００４年）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２巻、９４６〜９５３頁）、ヒト体液中で発生すると、細菌による、特化された移入システムを介する鉄の取込みを可能とする（ＢｒａｕｎおよびＢｒａｕｎ（２００２年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５巻、１９４〜２０１頁；Ｆｉｓｃｈｂａｃｈら（２００６年）、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２巻、１３２〜１３８頁）。好中球は、感染部位における抗微生物戦略として、ｈＮＧＡＬを放出すると考えられる。実際、対応するノックアウトマウスでは、ｈＮＧＡＬの生理学的関与性が裏付けられており、そこでは、エンテロバクチンを介する鉄移入に依拠する細菌の増殖を制限するのに、このリポカリンが本質的であることが示された（Ｆｌｏら（２００４年）、Ｎａｔｕｒｅ、４３２巻、９１７〜９２１頁）。
【０００７】
ｈＮＧＡＬ（Ｌｃｎ２とも称する；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号：Ｐ８０１８８）は、大腸菌に特徴的な、カテコレート型のシデロフォアであるＦｅ3+・エンテロバクチン（またはエンテロケリン）に対する強力な結合活性を有する、１７８アミノ酸の糖タンパク質である（Ｒａｙｍｏｎｄら（２００３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、１００巻、３５８４〜８頁）。ｈＮＧＡＬは、ヒト血漿に豊富なタンパク質であり、その正常濃度は約８０μｇ／Ｌであり、細菌感染時には１０倍まで上昇する可能性があり（ＸｕおよびＶｅｎｇｅ（２０００年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４８２巻、２９８〜３０７頁）、そのＮが連結された単一のグリコシル化部位は、折り畳みに不要である（Ｃｏｌｅｓら（１９９９年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８９巻、１３９〜１５７頁）。他のリポカリンと比較して、ｈＮＧＡＬは、極めて大型のポケットを示す。その内部では、正に帯電した側鎖のクラスターが、解離定数（ＫD）０．４ｎＭの、負に帯電した第二鉄のシデロフォアに対する驚くべきアフィニティーを付与し（Ｇｏｅｔｚら、前出）、これにより、細菌による取込みシステムとの効果的な競合が可能となる。ｈＮＧＡＬはまた、化学的に類縁であり、炭疽菌に由来する、バチリバクチン（Ａｂｅｒｇｅｌら（２００６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、１０３巻、１８４９９〜１８５０３頁）、また、サイズおよび形状が同等のシデロフォア類であり、結核菌に由来する、カルボキシマイコバクチン（Ｈｏｌｍｅｓら（２００５年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１３巻、２９〜４１頁）とも、安定的な複合体を形成するので、このリポカリンによるリガンド認識は、かなり特異的である。しかし、ｈＮＧＡＬは、炭疽菌の毒性に極めて重要なシデロフォアであるペトロバクチン（Ａｂｅｒｇｅｌら、前出）、またはサルモネラ属種および肺炎桿菌により生成されるサルモケリンなど、Ｃ−グリコシル化されたエンテロバクチン類似体（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈら、前出）には結合しない。ヒトＬｃｎ２に対する動物の相同体は、ラットα2ミクログロブリン類縁タンパク質（Ａ２ｍ；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号：Ｐ３１０５２）、およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号：Ｐ１１６７２）である。
【０００８】
非共有結合的相互作用を介してそれらの対応する標的に選択的に結合するタンパク質は、バイオテクノロジー、医療、生物学的解析のほか、生物科学および生命科学一般において、試薬として極めて重要な役割を果たす。抗体、すなわち免疫グロブリンは、このクラスのタンパク質の顕著な例である。リガンド／標的の認識、リガンド／標的に対する結合、および／またはリガンド／標的の分離を伴うこのようなタンパク質に対する多岐にわたる必要にもかかわらず、今日用いられているのは、ほぼ免疫グロブリンだけである。明確なリガンド結合特徴を有する他のタンパク質、例えば、レクチンの適用は、依然として特殊な場合に制約されている。
【０００９】
リポカリンファミリーのメンバーが、明確なリガンド結合特性を有するタンパク質に関する研究対象となったのは、ごく近年のことである。ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９９／１６８７３号は、オオモンシロチョウのビリン結合タンパク質の結合ポケットを包含する円筒形のβバレル構造の端部に配置され、また、このタンパク質の直鎖状ポリペプチド配列内における、アミノ酸位置２８〜４５、５８〜６９、８６〜９９、および１１４〜１２９を含むセグメントに対応する、４つのペプチドループの領域内において突然変異したアミノ酸の位置を有するリポカリンファミリーのポリペプチドについて開示している。
【００１０】
ＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／７５３０８号が、ジゴキシゲニンに特異的に結合するビリン結合タンパク質のムテインについて開示する一方、国際特許出願第ＷＯ０３／０２９４６３号および同第ＷＯ０３／０２９４７１号は、それぞれ、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、およびアポリポタンパク質Ｄのムテインに関する。リポカリン変異体のリガンドアフィニティー、リガンド特異性のほか、折り畳み安定性を、さらに改善および微調整するため、さらなるアミノ酸残基の置換など、リポカリンファミリーの異なるメンバーを用いる各種の手法が提起されている（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１年）、Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻、２５７〜２７５頁；Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（２００２年）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９６巻、２１３〜２２８頁）。ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００６／５６４６４号は、ナノモル範囲の低濃度においてＣＴＬＡ−４に対する結合アフィニティーを有する、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンのムテインについて開示している。
【００１１】
ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５／１９２５６号は、異なる標的リガンドまたは同じ標的リガンドに対して少なくとも１つの結合部位を有する、涙液リポカリンのムテインについて開示し、ヒト涙液リポカリンのこのようなムテインを発生させる方法を提供している。このＰＣＴ出願によれば、結合アフィニティーを有するムテインを発生させるために、涙液リポカリンの一次配列内にある特定のアミノ酸ストレッチ、特に、成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸７〜１４、２４〜３６、４１〜４９、５３〜６６、６９〜７７、７９〜８４、８７〜９８、および１０３−１１０を含むループ領域を突然変異誘発にかける。結果として得られるムテインは、選択されたリガンドに対してナノモル範囲の結合アフィニティー（ＫD）を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の参考文献で開示されるリポカリンムテインは、タンパク質様の標的高分子に優先的に結合するように選択され、小分子に結合するようには選択されていない。したがって、この分野でなされた進歩にもかかわらず、高度の結合アフィニティー、例えば、ナノモル範囲のアフィニティーで小分子に結合するように特異的に適合させたｈＮＧＡＬムテインが得られれば望ましいであろう。このようなムテインによれば、診断的適用および治療的適用におけるｈＮＧＡＬムテインの適性がさらに改善されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
独立請求項の特徴を有するｈＮＧＡＬのムテイン、または類縁タンパク質のムテインにより、この目的が達成される。
【００１４】
第１の態様において、本発明は、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットα2ミクログロブリン類縁タンパク質（Ａ２ｍ）、およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）からなる群から選択されるタンパク質に由来するムテインであって、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つの突然変異させたアミノ酸残基を包含し、検出可能なアフィニティーで所与の標的に結合するムテインを提供する。
【００１５】
これに関して、本発明は、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットα2ミクログロブリン類縁タンパク質（Ａ２ｍ）、およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）を、これら上述の１２の配列位置のうちの１または複数の箇所において突然変異誘発にかけることにより、事前に規定された低分子量の標的に対して十分な程度に親和的に結合するムテインが提供されるという驚くべき知見に基づくことが注目される。
【００１６】
これに関してはまた、現代医療において、金属キレート錯体など、低分子量の化合物が、医療目的、例えば、放射免疫療法（ＲＩＴ）の目的で、また、診断的目的、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングで、ますます大きな役割を果たしていることも注目される（ＫｅｎａｎｏｖａおよびＷｕ（２００６年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．、３巻、５３〜７０頁）。このような目的で、腫瘍特異的な細胞表面マーカーを指向する抗体（または疾患に関連する受容体に特異的なペプチド）を、これまでのところ、強力な合成キレート化剤、特に、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）およびＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、またはこれらの誘導体と化学的にコンジュゲートさせ（Ｍｉｌｅｎｉｃら（２００４年）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．、３巻、４８８〜４９９頁）、次いで、Ｙ3+またはＬｕ3+など、希土類元素の放射性核種、または類似の３価金属イオン、例えば、Ｉｎ3+またはＢｉ3+によりこれらを帯電させる。放射性核種とコンジュゲートさせた、ＣＤ２０を指向する２つの抗体である、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標）が、非ホジキンリンパ腫の治療について承認されており、多くの抗体およびそれらのフラグメントが、現在、薬物動態および腫瘍ターゲティングを改善するためのタンパク質操作にかけられている（ＫｅｎａｎｏｖａおよびＷｕ、前出）。
【００１７】
核医学用ヒト化抗体の主要な障害は、循環時間が長いことであり、これにより、ＲＩＴにおける造影コントラストが低下し、腫瘍特異性が制約される。この問題を回避するため、キレート化された放射性核種から、腫瘍ターゲティング抗体を結合解除する、いわゆるプレターゲティング戦略が開発されている（Ｃｈａｎｇら（２００２年）、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、１巻、５５３〜５６３頁）。これにより、第１段階における、抗体による位置特定および循環からのクリアランスという緩徐な過程の後、第２段階において、小分子の放射性積載物の迅速かつ特異的な送達が可能となる。まず、ビオチニル化された放射性核種のキレートと共に、抗体−ストレプトアビジンコンジュゲートを適用し、その後、エピトープペプチドとコンジュゲートしたキレート錯体と共に、二特異性抗体を適用した。さらに、金属キレートに直接的に結合しうるモノクローナル抗体が開発された（Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌら（１９９０年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５０巻、３４４５〜３４５２頁；Ｃｏｒｎｅｉｌｌｉｅら（２００３年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５巻、３４３６〜３４３７頁；Ｃｏｒｎｅｉｌｌｉｅら（２００３年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５巻、１５０３９〜１５０４８頁）。
【００１８】
しかし、理想的な系となると、遺伝子融合戦略を用いて、ターゲティングペプチド／タンパク質のモジュール（例えば、天然の受容体リガンド、抗体フラグメント（ＫｅｎａｎｏｖａおよびＷｕ、前出）、または代替的な結合タンパク質（Ｓｋｅｒｒａ（２００７年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、２９５〜３０４頁；Ｓｋｅｒｒａ（２００７年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、９巻、３３６〜３４４頁）に容易に結合させうる、頑健な折り畳み特性を有する単一のポリペプチド鎖を含む、小分子金属キレート（small metal chelate）に特異的な結合タンパク質であろう。ｈＮＧＡＬ、ラットα2ミクログロブリン類縁タンパク質（Ａ２ｍ）、およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）のムテインは、このような標的小分子に対する高度の結合アフィニティーを有する、このようなタンパク質を提供する。
【００１９】
本明細書で用いられる「ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン」もしくは「ｈＮＧＡＬ」または「リポカリン２」もしくは「Ｌｃｎ２」という用語は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号：Ｐ８０１８８を有する成熟ｈＮＧＡＬを指す。ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンのアミノ酸配列を、配列番号１に示す。本出願で用いられる「ラットα2ミクログロブリン類縁タンパク質」または「Ａ２ｍ」、および「マウス２４ｐ３／ウテロカリン」または「２４ｐ３」という用語は、それぞれ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号：Ｐ３１０５２およびＰ１１６７２を有する成熟Ａ２ｍまたは２４ｐ３を指す。
【００２０】
所与の標的は、任意の所望の非天然標的／リガンドでありうる。「非天然リガンド」という用語は、生理学的条件下においては天然の成熟ｈＮＧＡＬに結合しない、任意の化合物を指す。標的（リガンド）は、免疫学的ハプテン、例えば、金属キレート化剤などの有機小分子、または、例えば、２〜約２５、もしくは約３０、もしくは約３５アミノ酸の長さのペプチド（下記を参照されたい）の特徴を示す、遊離形態またはコンジュゲート形態にある任意の化合物でありうる。
【００２１】
本明細書で用いられる「有機分子」または「有機小分子」という用語は、少なくとも２つの炭素原子を含むが、７または１２以下の回転可能な炭素結合を含むことが好ましく、分子量が１００〜２０００ドルトン、好ましくは１００〜１０００ドルトンの範囲にあり、また場合によって、１つまたは２つの金属原子を包含する有機分子を指す。
【００２２】
標的分子に関して本明細書で用いられる「ペプチド」という用語は、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、または２〜１０のアミノ酸残基を有するジペプチドまたはオリゴペプチドを指す。ペプチドは、天然ペプチドの場合もあり、合成ペプチドの場合もあり、また、（２０種類の天然のＬ−アミノ酸のほかに）Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体を含みうる。
【００２３】
本発明のｈＮＧＡＬムテイン（またはラットα2ミクログロブリン類縁タンパク質（Ａ２ｍ）およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）のムテイン）は、突然変異したアミノ酸配列の配列位置以外に、野生型（天然）のアミノ酸配列も含みうる。他方、本明細書で開示されるリポカリンムテインはまた、それらの突然変異が、該ムテインの結合活性および折り畳みを妨げない限りにおいて、突然変異誘発にかける配列位置以外におけるアミノ酸の突然変異も含有しうる。このような突然変異は、確立された標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社）を用いて、ＤＮＡレベルにおいて極めて容易に達成することができる。アミノ酸配列の可能な変化は、挿入または欠失のほか、アミノ酸置換である。このような置換は保存的である、すなわち、アミノ酸残基は、化学的に類似のアミノ酸残基により置換される。保存的置換の例は、以下の群：１）アラニン、セリン、およびトレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリシン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンのメンバー間における置換である。他方、アミノ酸配列内にはまた、非保存的変化も導入することが可能である。加えて、それらの欠失または挿入の結果、安定的に折り畳まれた／機能的なムテインがもたらされる限りにおいて、単一のアミノ酸残基を置換する代わりに、ｈＮＧＡＬの一次構造による１または複数の連続するアミノ酸を挿入するかまたは欠失させることもまた可能である。
【００２４】
アミノ酸配列のこのような変更には、特定の制限酵素に応じた切断部位を組み込むことにより、突然変異したリポカリン遺伝子またはその部分のサブクローニングの簡略化を目的とする、単一アミノ酸の複数位置に対する指向突然変異誘発が含まれる。加えて、これらの突然変異はまた、所与の標的に対するリポカリンムテインのアフィニティーをさらに改善する目的で組み込むこともできる。さらに、突然変異は、折り畳みの安定性、血清中における安定性、タンパク質耐性、または水溶性を改善するなど、ムテインの特定の特徴を調節するか、または必要な場合、凝集傾向を低下させる目的で導入することもできる。例えば、天然のシステイン残基を他のアミノ酸に突然変異させて、ジスルフィド架橋形成を防止することができる。しかし、また、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチド、またはタンパク質など、他の化合物とコンジュゲートさせるため、または非天然のジスルフィド結合を形成するための新規の反応基を導入する目的で、他のアミノ酸配列位置をシステインに意図的に突然変異させることも可能である。ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列内にシステイン残基を導入するこのような突然変異の例示的な可能性には、ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、または１５８に対応する配列位置のうちの少なくとも１カ所におけるシステイン（Ｃｙｓ）残基の導入が含まれる。例えば、各々のｈＮＧＡＬムテインの血清半減期を延長する目的で、アミノ酸位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、および／または１５８のうちのいずれかの側鎖において生成されるチオール部分を用いて、該ムテインをＰＥＧ化またはＨＥＳ化することができる。
【００２５】
本発明の一実施形態において、ムテインは、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちの、任意の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１カ所、または１２カ所すべてにおいて突然変異させたアミノ酸残基を包含する。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態において、ムテインは、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４２、４８、４９、５５、７５、７７、８０、および１２７に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つの突然変異させたアミノ酸残基をさらに包含する。このようなムテインは、例えば、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、４２、４８、４９、５２、５４、５５、６８、７０、７５、７７、７９、８０、８１、１２７、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも９つの突然変異させたアミノ酸残基を包含しうる。本発明の一実施形態において、ムテインは、上記で列挙した配列位置のうちの、任意の少なくとも１０、１４、１５カ所、または２０カ所すべてにおいて突然変異させたアミノ酸残基を包含する。ムテインは、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４３、４４、４６、４７、５０、５１、５９、６５、７８、８６、８７、９８、９９、１０３、１０７、１１０、および１１１に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つの突然変異させたアミノ酸残基をさらに含みうる。このようなムテインは、例えば、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５４、５５、５９、６５、６８、７０、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９９、１０３、１０７、１１０、１１１、１２７、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも９つの突然変異させたアミノ酸残基を包含しうる。
【００２７】
本発明の一実施形態において、ムテインは、上記で列挙した配列位置のうちの、任意の少なくとも１０、１４、１５、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５カ所、または３７カ所すべてにおいて突然変異させたアミノ酸残基を包含する。
【００２８】
本発明のまたさらなる実施形態において、ムテインは、ｈＮＧＡＬの野生型配列のうちの配列位置６５、７１、７３、７４、１１６、１２５、および１３５に対応する配列位置のうちの少なくとも１カ所において、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらなるアミノ酸置換を包含する。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明のムテインは、Ｇｌｕ２８→Ｈｉｓ、Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ、およびＴｈｒ１４５→Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数をさらに包含しうる。
【００３０】
本発明のリポカリンムテインは、検出可能なアフィニティーで、すなわち、少なくとも２００ｎＭの解離定数により、所望の標的に結合することが可能である。一部の実施形態では、所与の標的に対する、少なくともまた１００、２０、１ｎＭ以下の解離定数により所望の標的に結合するリポカリンムテインが好ましい。所望の標的に対するムテインの結合アフィニティーは、フルオレセイン滴定、競合ＥＬＩＳＡ、または表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）など多くの方法により測定することができる。
【００３１】
複合体形成は、結合パートナーの濃度、競合物質の存在、緩衝液系のイオン強度など、多くの因子に依存することは当業者にとっては容易に明らかであろう。選択および濃縮は一般に、所望の標的との複合体において、少なくとも２００ｎＭの解離定数を有するリポカリンムテインの単離を可能とする条件下において実施される。しかし、洗浄ステップおよび溶出ステップは、様々な厳密性の下で実施することができる。反応速度特徴に関する選択もまた可能である。例えば、標的からの緩徐な解離、または、言い換えれば、低値のｋoff速度を示すムテインとの標的の複合体形成を促進する条件下において選択を実施することができる。代替的に、選択は、ムテインと標的との迅速な複合体形成を促進する条件下、または、言い換えれば、高値のｋon速度に見合う条件下において選択を実施することができる。
【００３２】
本発明のｈＮＧＡＬムテインは、単量体タンパク質として存在することが典型的である。しかし、また、本発明のリポカリンムテインが、自発的に二量体化またはオリゴマー化しうることも可能である。例えば、より迅速な拡散、およびより良好な組織透過のために、一部の適用には、安定的な単量体を形成するリポカリンムテインの使用が好ましい可能性もあるが、他の場合においては、安定的なホモ二量体または多量体が、所与の標的に対するアフィニティーおよび／またはアビディティーの（さらなる）上昇をもたらしうるので、このような多量体を形成するリポカリンムテインの使用が有利な可能性もある。さらに、リポカリンムテインのオリゴマー形態は、解離速度がより緩徐な場合もあり、血清半減期が延長される場合もある。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、ムテインは、有機小分子に結合する。有機小分子は、金属キレート化剤の場合もあり、金属キレート化剤を含有するカルボキシ基またはアミノ基などの薬剤の場合もある。このようなキレート化剤の非限定的な例は、少数の例示的な例だけを挙げれば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、または２−メチル−６−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（１Ｂ４Ｍ−ＤＯＴＡ）、２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−５，６−シクロヘキサノ−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＣＨＸ−ＤＯＴＡ）、２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（Ｃ−ＤＯＴＡ）、および１，４，７，１０−テトラアザ−Ｎ−（１−カルボキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロピル）−Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリス（酢酸）シクロドデカン（ＰＡ−ＤＯＴＡ）など、これらの誘導体（例えば、Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｌ、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  １，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３０巻、６号、５８１〜５９５頁を参照されたい）である。ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、またはこれらの誘導体は、例えば、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、インジウム（Ｉｎ）、ルテチウム（Ｌｕ）、およびビスマス（Ｂｉ）からなる群から選択される金属イオンと錯化しうる。ＤＴＰＡ誘導体は、例えば、米国特許第５，１２４，４７１号、同第５，２８６，８５０号、同第５，４３４，２８７号で説明される、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）系列のアミノ酸を含めたシクロヘキシル−ＤＴＰＡでありうる。本発明のムテインにより結合されうるキレート化剤の別の例は、米国特許第５，７５６，８２５号で説明されるヒドロキサム酸ベースの二官能性キレート化剤である。別の例は、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサアザシクロ−オクタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’’，Ｎ’’’’’−六酢酸）（Ｄｅａｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４２巻、２９８８頁、１９９９年）と称するキレート化剤であり、２２５Ａｃなど、放射性核種の有効なキレート化剤である。
【００３４】
これに関して、本発明を用いて任意のキレート化剤に結合しうるムテインを生成させ、該キレート化剤を所与の放射性核種に錯化させうることが注目される。物理的特性および化学的特性などの特徴、ならびに放射線照射の性質が、放射性核種の治療適性の決定因子である。細胞傷害性の放射性核種は、３群の放射性化学物質：ハロゲン（ヨウ素、211Ａｔ）、金属（90Ｙ、67Ｃｕ、213Ｂｉ、212Ｂｉ）、および遷移元素（186Ｒｅ）に分類することができる。放射性核種は、４種類の細胞傷害性薬剤：純粋なβ線放射体（67Ｃｕ、90Ｙ）、α線放射体（213Ｂｉ、211Ａｔ）、γ線を放射するβ線放射体（177Ｌｕ、186Ｒｅ、131Ｉ）、ならびに、125Ｉおよび67Ｇａを含めた、オージェ放射体および内部転換により崩壊する放射性核種にさらに類別することができる。これらの放射性核種のうちのいずれかと錯体を形成するキレート化剤に結合するムテインの使用が、本発明では意図される（例えば、Ｙｕｌｉｙａ  Ｓ．ＪｈａｎｗａｒおよびＣｈａｉｔａｎｙａ  Ｄｉｖｇｉ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４６巻、１号（増刊号）、１４１Ｓ〜１５０Ｓ頁、２００５年を参照されたい）。
【００３５】
所与の標的として用いうる小分子の純粋に例示的な別の例は、［４＋２］ディールス−アルダー反応の遷移状態類似体として関心が見出されている、ノルボルネンハプテンなどのハプテンである（例えば、Ｘｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、２８６巻、２３４５〜２３４８；またはＨｉｌｖｅｒｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８９年、１１１巻、９２６１〜９２６２頁を参照されたい）。それに対しては、免疫反応（これは、抗体の生成を意味する）もまた発生しうる、すべての可能な小分子に対してアフィニティーを有するムテインの生成に対する本発明の適性を示すため、実施例１６では、このようなハプテンを用いた。したがって、ここでもまた、所与の標的が任意のハプテンでありうることが注目される。
【００３６】
代替的に、本発明の別の実施形態において、本発明のムテインは、ペプチド、例えば、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、または２〜１０アミノ酸の長さのペプチドにも結合しうる。ペプチドは、例えば、アンジオテンシン（アンジオテンシンＩ〜ＩＶ）、ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ）、バソプレッシンペプチド、オキシトシンペプチド、またはオピオイドペプチド（エンケファリン、エンドルフィン、ダイノルフィン）などの天然ペプチドの場合もあり、合成ペプチドの場合もある。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、ｈＮＧＡＬのムテインは、５０ｎＭ以下のＫDにより、ＤＯＴＡまたはシクロヘキシル−ＤＴＰＡなどのキレート化剤に結合する。
【００３８】
ＤＯＴＡまたはシクロヘキシル−ＤＴＰＡなどのキレート化剤に結合する、本発明のｈＮＧＡＬムテインは、Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ、Ｌｅｕ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→ＳｅｒおよびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕからなる群から選択される、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ所のアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬのアミノ酸配列に対して含みうる。一般に、このようなムテインは、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、もしくは１ｎＭのＫDにより、さらにまたはそれ未満のピコモル範囲にあるＫDにより、シクロヘキシル−ＤＴＰＡに結合する。したがって、本発明はまた、９００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、２５０ｐＭ、１００ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、または４０ｐＭ以下のＫDによりシクロヘキシル−ＤＴＰＡに結合するｈＮＧＡＬムテインも包含する。ムテイン−リガンド複合体のＫD値を決定するのに適する方法は当業者に知られており、これには、フルオレセイン滴定、競合ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）などの熱量測定法、および表面プラズモン共鳴が含まれる。このような方法の例は、以下で詳述される（例えば、実施例を参照されたい）。
【００３９】
これに関して、各々のムテインおよびそのリガンドにおける複合体形成は、各々の結合パートナーの濃度、競合物質の存在、用いられる緩衝液系のｐＨおよびイオン強度、また、解離定数ＫDの決定に用いられる実験方法（例えば、少数を挙げるにとどめれば、フルオレセイン滴定、競合ＥＬＩＳＡ、または表面プラズモン共鳴）、さらにまたは、該実験データの評価に用いられる数学的アルゴリズムなど、多くの異なる因子により影響されることもまた注目される。
【００４０】
したがって、本明細書で与えられるＫD値（各々のムテインおよびそのリガンドにおいて形成される複合体の解離定数）は、所与のリガンドに対する特定のリポカリンムテインのアフィニティーを決定するのに用いられる方法および実験セットアップに応じ、特定の実験範囲内で変化しうることもまた、当業者には明らかである。これは、例えば、ＫD値が表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により決定されたのか、または競合ＥＬＩＳＡにより決定されたのかに応じて、ＫDの測定値または許容範囲に若干の偏差が生じうることを意味する。
【００４１】
本発明の具体的な実施形態において、このようなムテインは、Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；およびＳｅｒ１２７→Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに包含する。
【００４２】
本発明の一実施形態において、シクロヘキシル−ＤＰＴＡに結合するｈＮＧＡＬムテインは、アミノ酸置換：Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→ＡｌａまたはＬｅｕ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕを包含する。このようなムテインは、Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ｐｒｏ  ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；およびＳｅｒ１２７→Ｇｌｎからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに包含しうる。
【００４３】
別の実施形態において、ｈＮＧＡＬムテインは、アミノ酸置換：
（ａ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｂ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；または
（ｃ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ
を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対して包含する。
【００４４】
このような実施形態において、ムテインは、Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ、Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ、Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ、Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ、Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ、およびＳｅｒ１２７→Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに包含しうる。ムテインは、Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ、Ｇｌｕ４４→Ｍｅｔ、Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ、Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ、Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ、Ａｓｎ６５→Ａｓｐ、Ｔｙｒ７８→Ｈｉｓ、Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ、Ｓｅｒ８７→Ｐｒｏ、Ｓｅｒ８７→Ｐｈｅ、Ｌｙｓ９８→Ｇｌｕ、Ｓｅｒ９９→Ａｓｎ、Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ、Ｖａｌ１１０→Ｍｅｔ、およびＶａｌ１１１→Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに包含しうる。
【００４５】
本発明の一実施形態において、ムテインは、アミノ酸置換：
（ａ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｂ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｃ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｄ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｅ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｆ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｇ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｈ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｉ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ９８→Ｇｌｕ；Ｖａｌ１１０→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｊ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｋ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ８７→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ９９→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｌ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｍ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ８７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；または
（ｎ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｙｒ７８→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ  ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ；Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ；Ｖａｌ１１１→Ａｌａ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ
を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対して含む。
【００４６】
前述の実施形態のうちのいずれかにおいて、ムテインは、Ｇｌｕ２８→Ｈｉｓ、Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ、およびＴｈｒ１４５→Ａｌａからなる群から選択される１つ、２つ、または３つすべてのアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに包含しうる。
【００４７】
ムテインは、配列番号２〜１０、および２８〜３４に記載の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有しうる。
【００４８】
シクロヘキシル−ＤＰＴＡに結合するｈＮＧＡＬムテインは、配列番号２〜１０、もしくは２８〜３４に記載のアミノ酸配列、またはこれらのフラグメントもしくは変異体のうちのいずれか１つを含む場合もあり、本質的にこれからなる場合もあり、これからなる場合もある。一実施形態において、本発明によるムテインは、配列番号８、９、１０、もしくは２８〜３４に記載のアミノ酸配列、またはこれらのフラグメントもしくは変異体を含む場合もあり、本質的にこれからなる場合もあり、これからなる場合もある。この点において、本明細書で開示されるムテインのすべては、Ｎ末端またはＣ末端において、ペンタヒスチジンタグ、ヘキサヒスチジンタグ、またはＳｔｒｅｐタグ（登録商標）などのアフィニティータグに連結しうることが注目される。したがって、本出願はまた、このようなタグを備える、顕示的および包括的に説明されるすべてのムテインも包含する。
【００４９】
本発明のムテインとの関係で本発明において用いられる「フラグメント」という用語は、Ｎ末端および／またはＣ末端において短縮された、すなわち、Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸のうちの少なくとも１つを欠く、全長の成熟ｈＮＧＡＬに由来するタンパク質またはペプチドに関する。このようなフラグメントは、成熟ｈＮＧＡＬの一次配列のうちの好ましくは少なくとも１０、より好ましくは２０、最も好ましくは３０以上の連続アミノ酸を含み、通常、成熟ｈＮＧＡＬに対するイムノアッセイにおいて検出可能である。
【００５０】
本発明で用いられる「変異体」という用語は、例えば、置換、欠失、挿入、または化学修飾を介するアミノ酸配列の修飾を含む、タンパク質またはペプチドの誘導体に関する。このような修飾は、タンパク質またはペプチドの機能性を低下させないことが好ましい。このような変異体には、１または複数のアミノ酸が、それらの各々のＤ−立体異性体により、または、例えば、オルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリシン、ノルバリンなど、２０種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸により置換されたタンパク質が含まれる。しかし、このような置換はまた、保存的な場合もある、すなわち、アミノ酸残基は、化学的に類似のアミノ酸残基により置換される。保存的置換の例は、以下の群：１）アラニン、セリン、およびトレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリシン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンのメンバー間における置換である。
【００５１】
本発明の範囲にはまた、それらの免疫原性に関して変更された上記のムテインも含まれる。
【００５２】
細胞傷害性のＴ細胞は、クラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と会合した抗原提示細胞の細胞表面上において、ペプチド抗原を認識する。ＭＨＣ分子に結合するペプチドの能力は、対立遺伝子特異的であり、それらの免疫原性と相関する。所与のタンパク質の免疫原性を低下させるためには、タンパク質中におけるどのペプチドが、所与のＭＨＣ分子に結合する可能性を有するかを予測する能力が、大きな価値を有する。ＭＨＣクラスＩ分子に対する所与のペプチド配列の結合を予測するのに、潜在的なＴ細胞エピトープを同定するコンピュータスレディング法を用いる手法が、既に説明されている（Ａｌｔｕｖｉａら（１９９５年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４９巻、２４４〜２５０頁）。
【００５３】
このような手法はまた、本発明のムテインにおける潜在的なＴ細胞エピトープを同定し、その意図する使用に応じ、その予測される免疫原性に基づき、特定のムテインを選択するのにも用いることができる。さらに、Ｔ細胞エピトープを含有すると予測されているペプチド領域をさらなる突然変異誘発にかけ、これらのＴ細胞エピトープを低減するかまたは消失させ、これにより免疫原性を最小化することも可能である。遺伝子操作された抗体からの、両親媒性エピトープの除去については説明されており（Ｍａｔｅｏら（２０００年）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９巻、６号、４６３〜４７１頁）、本発明のムテインに適合させることができる。
【００５４】
このようにして得られたムテインは、免疫原性が最小化されており、以下で説明される治療的適用および診断的適用などの治療的適用および診断的適用においてそれらを用いるのに望ましい。
【００５５】
一部の適用では、本発明のムテインをコンジュゲートの形で用いることもまた有用である。したがって、本発明はまた、少数の示唆的な例だけを挙げれば、酵素標識、着色標識、細胞増殖抑制剤、光活性化することが可能であり、光力学療法において用いるのに適する標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、化学療法用金属、および金コロイドからなる群から選択されうるコンジュゲーションパートナーとコンジュゲートするリポカリンムテインも対象とする。ムテインはまた、有機薬物分子ともコンジュゲートしうる。コンジュゲーションは、当技術分野で知られる任意の従来の結合法を用いて実施することができる。
【００５６】
一般に、本明細書に記載のｈＮＧＡＬムテインを、化学反応、物理反応、光学反応、または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に発生させる、任意の適切な化学物質または酵素により標識することが可能である。物理反応であり、また、同時に光学反応／マーカーでもある例は、照射時における蛍光の発光である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼが、発色反応生成物の形成を触媒する酵素標識（また、同時に、光学標識）の例である。一般に、抗体に対して広く用いられるすべての標識（もっぱら、免疫グロブリンのＦｃ部分における糖部分と共に用いられる標識を除く）もまた、本発明のムテインに対するコンジュゲーションに用いることができる。本発明のムテインはまた、例えば、所与の細胞、組織、もしくは内臓に対する治療的に活性な薬剤の標的送達に適するか、または、細胞の選択的ターゲティング、例えば、周囲の正常細胞に影響を与えることのない、腫瘍細胞の選択的ターゲティングに適する、任意のこのような薬剤ともコンジュゲートさせることができる。このような治療的に活性な薬剤の例には、放射性核種、毒素、有機小分子、および治療用ペプチド（細胞表面受容体のアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチド、または所与の細胞標的上におけるタンパク質結合部位について競合するペプチドなど）が含まれる。適切な毒素の例には、百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、シュードモナス属外毒素、カリチアマイシンもしくはその誘導体、タキソイド、メイタンシノイド、ツブリシン、またはドラスタチン類似体が含まれるがこれらに限定されない。ドラスタチン類似体は、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＰＹＥ、およびアウリスタチンＰＨＥでありうる。細胞増殖抑制剤の例には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、タキソテール（ドセタキセル）、パクリタキセル、アントラサイクリン（ドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、コンブレタスタチンＡ−４類縁化合物、スルホンアミド、オキサジアゾリン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、合成スピロケタールピラン、モノテトラヒドロフラン化合物、キュラシンおよびキュラシン誘導体、メトキシエストラジオール誘導体、およびレウコボリンが含まれるが、これらに限定されない。本発明のリポカリンムテインはまた、アンチセンスの核酸分子、小分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムなど、治療的に活性な核酸ともコンジュゲートさせることができる。このようなコンジュゲートは、当技術分野でよく知られる方法により産生することができる。
【００５７】
一実施形態において、本発明のムテインはまた、本発明のムテインを、体内における所望の部位または領域に送達する目的で、具体的な身体部位を標的とするターゲティング部分に結合させることもできる。このような修飾が望ましい１つの例は、血液脳関門の通過である。血液脳関門を越えさせる目的で、本発明のムテインを、この関門を越える能動輸送を促進する部分と結合させることができる（Ｇａｉｌｌａｒｄ  ＰＪら（２００５年）、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ」、１２７７巻、１８５〜１９８頁；またはＧａｉｌｌａｒｄ  ＰＪら（２００５年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．、２巻、２号、２９９〜３０９頁）。このような部分は、例えば、２Ｂ−ＴｒａｎｓTM（オランダ、ライデン、ｔｏ−ＢＢＢ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＢＶ社製）の商標名で市販されている。本発明のムテインを結合させうる他の例示的なターゲティング分子には、所望の標的分子に対するアフィニティーを有する抗体、抗体フラグメント、またはリポカリンムテインが含まれる。ターゲティング部分の標的分子は、例えば、細胞表面抗原でありうる。細胞表面抗原は、例えば、癌細胞など、細胞または組織の種類に特異的でありうる。このような細胞表面タンパク質の例示的な例は、ＨＥＲ−２、または、ＮＥＵ−２などのプロテオグリカンである。
【００５８】
上記で示した通り、一部の実施形態において、本発明のムテインは、その血清半減期を延長する部分とコンジュゲートさせることができる（この点に関しては、ＣＴＬＡ−４に対する結合アフィニティーを有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンのムテインに関してこのようなコンジュゲーション戦略を説明しているＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００６／５６４６４号もまた参照されたい）。血清半減期を延長する部分は、少数だけを挙げれば、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸などの脂肪酸分子（ＶａｊｏおよびＤｕｃｋｗｏｒｔｈ（２０００年）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２巻、１〜９頁）、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミンまたはそのフラグメント、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質であるトランスフェリンでありうる。アルブミン結合タンパク質は、アルブミンに対する結合活性を有する細菌のアルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含めた抗体フラグメント（例えば、米国特許第６，６９６，２４５号を参照されたい）、またはリポカリンムテインでありうる。したがって、本発明のリポカリンムテインの半減期を延長するのに適するコンジュゲーションパートナーには、アルブミン（Ｏｓｂｏｒｎら（２００２年）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、３０３巻、５４０〜５４８頁）、またはアルブミン結合タンパク質、例えば、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１８巻、７３〜８３頁）の１つなど、細菌のアルブミン結合ドメインが含まれる。コンジュゲーションパートナーとして用いうるアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、米国特許出願第２００３／００６９３９５号；またはＤｅｎｎｉｓら（Ｄｅｎｎｉｓら（２００２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７巻、３５０３５〜３５０４３頁で説明される通り、Ｃｙｓ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｃｙｓのコンセンサス配列［式中、Ｘａａ1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり；Ｘａａ2は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり；Ｘａａ3は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり；Ｘａａ4は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである］を有するペプチドである。
【００５９】
他の実施形態では、アルブミン自体またはアルブミンの生物学的に活性なフラグメントを、本発明のリポカリンムテインのコンジュゲーションパートナーとして用いることができる。「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンもしくはラットアルブミンなど、すべての哺乳動物アルブミンを含む。アルブミンまたはそのフラグメントは、米国特許第５，７２８，５５３号；または欧州特許出願ＥＰ０３３０４５１号、および同第ＥＰ０３６１９９１号で説明される通り、組換え法により産生することができる。タンパク質安定化剤として用いられる組換えヒトアルブミン（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））は、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｄｅｌｔａ社（英国、ノッティンガム）から市販されている。
【００６０】
アルブミン結合タンパク質が抗体フラグメントである場合、それは、ドメイン抗体でありうる。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、生物物理的特性およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期に対する精密な制御を可能とすることで、製品の安全性および有効性の最適なプロファイルを創出するように操作される。ドメイン抗体は、例えば、Ｄｏｍａｎｔｉｓ社（英国、ケンブリッジ；および米国、マサチューセッツ州）から市販されている。
【００６１】
本発明のムテインの血清半減期を延長するための部分としてトランスフェリンを用いる場合、該ムテインを、非グリコシル化トランスフェリンのＮ末端もしくはＣ末端、またはこれらの両方と遺伝子融合させることができる。非グリコシル化トランスフェリンの半減期は１４〜１７日間であり、トランスフェリン融合タンパク質の半減期も同様に延長される。トランスフェリンキャリアーはまた、高度のバイオアベイラビリティー、生体内分布、および循環安定性も提供する。この技法は、ＢｉｏＲｅｘｉｓ社（米国、ペンシルベニア州、ＢｉｏＲｅｘｉｓ  Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社）から市販されている。タンパク質安定化剤として用いられる組換えヒトトランスフェリン（ＤｅｌｔａＦｅｒｒｉｎTM）もまた、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｄｅｌｔａ社（英国、ノッティンガム）から市販されている。
【００６２】
本発明のムテインの血清半減期を延長する目的で免疫グロブリンのＦｃ部分を用いる場合は、Ｓｙｎｔｏｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（米国、マサチューセッツ州）から市販されているＳｙｎＦｕｓｉｏｎTM法を用いることができる。このＦｃ融合法を用いることにより、より長時間にわたり作用する生物医薬の創出が可能となり、これらの医薬は、例えば、抗体のＦｃ領域に連結されて、薬物動態、可溶性、および産生効率を改善する、ムテインの２つのコピーからなりうる。
【００６３】
本発明のムテインの半減期を延長するさらに別の代替法は、本発明のムテインのＮ末端またはＣ末端に、長く、構造化されない、可撓性のグリシンに富む配列（例えば、約２０〜８０のグリシン残基が連続するポリグリシン）を融合させることである。例えば、ＷＯ２００７／０３８６１９で開示されるこの手法はまた、「ｒＰＥＧ」（組換えＰＥＧ）とも称されている。
【００６４】
コンジュゲーションパートナーとしてポリアルキレングリコールを用いる場合、該ポリアルキレングリコールは、置換する場合もあり、非置換の場合もある。それはまた、活性化されたポリアルキレン誘導体でもありうる。適切な化合物の例は、ＷＯ９９／６４０１６、米国特許第６，１７７，０７４号、または米国特許第６，４０３，５６４号においてインターフェロンとの関連で説明されるか、または、ＰＥＧ修飾されたアスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アデノシン脱アミノ化酵素（ＰＥＧ−ＡＤＡ）、もしくはＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼ（例えば、Ｆｕｅｒｔｇｅｓら（１９９０年）、「Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ、１１巻、１３９〜１４８頁を参照されたい）など、他のタンパク質について説明されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。このようなポリマー、好ましくはポリエチレングリコールの分子量は、例えば、分子量が約１０，０００ドルトン、約２０，０００ドルトン、約３０，０００ドルトン、または約４０，０００ドルトンのポリエチレングリコールを含めた、約３００〜約７０，０００ドルトンの範囲でありうる。さらに、例えば、米国特許第６，５００，９３０号または同第６，６２０，４１３号で説明される通り、デンプンまたはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）など、炭水化物オリゴマーおよび炭水化物ポリマーを、血清半減期延長の目的で本発明のムテインとコンジュゲートさせることができる。
【００６５】
上記部分のうちの１つを本発明のｈＮＧＡＬムテインとコンジュゲートさせる場合、アミノ酸側鎖に対するコンジュゲーションが有利でありうる。適切なアミノ酸側鎖は、ｈＮＧＡＬのアミノ酸配列内において天然の場合もあり、突然変異誘発により導入される場合もある。突然変異誘発により適切な結合部位を導入する場合、１つの可能性は、適切な位置における、システイン残基によるアミノ酸置換である。一実施形態において、このような突然変異には、ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、または１５８に対応する配列位置のうちの少なくとも１カ所におけるＣｙｓ残基の導入が含まれる。以下では、これらの位置のうちのいずれかにおいて新たに創出されるシステイン残基を用いて、ムテインを、ＰＥＧまたはその活性化誘導体など、ムテインの血清半減期を延長する部分とコンジュゲートさせることができる。
【００６６】
別の実施形態において、上記の部分のうちの１つを、本発明のムテインとコンジュゲートさせるのに適するアミノ酸側鎖をもたらすためには、突然変異誘発により人工アミノ酸を導入することができる。一般に、このような人工アミノ酸は、所望の部分に対してより反応的であり、したがって、これに対するコンジュゲーションを容易にするようにデザインされる。人工ｔＲＮＡを介して導入されうるこのような人工アミノ酸の１つの例は、パラ−アセチル−フェニルアラニンである。
【００６７】
本明細書で開示されるムテインを様々に適用する場合、それらを融合タンパク質の形態で用いるのが有利でありうる。一部の実施形態において、本発明のｈＮＧＡＬムテインは、そのＮ末端またはそのＣ末端において、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはシグナル配列および／もしくはアフィニティータグなどのペプチドと融合する。
【００６８】
医薬に適用する場合、本発明のムテインは、そのｉｎ  ｖｉｖｏにおける血清半減期を延長する融合パートナーと融合させることができる（ここでもまた、ＣＴＬＡ−４に対する結合アフィニティーを有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンのムテインに関して、適切な融合パートナーが説明されているＰＣＴ公報ＷＯ２００６／５６４６４を参照されたい）。上記で説明したコンジュゲートと同様に、融合パートナーは、少数だけを挙げれば、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質でありうる。ここでもまた、アルブミン結合タンパク質は、アルブミンに対する結合活性を有する細菌のアルブミン結合タンパク質、またはリポカリンムテインでありうる。したがって、本発明のリポカリンムテインの半減期を延長するのに適する融合パートナーには、アルブミン（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら（２００２年）、前出、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、３０３巻、５４０〜５４８頁）、またはアルブミン結合タンパク質、例えば、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１８巻、７３〜８３頁）の１つなど、細菌のアルブミン結合ドメインが含まれる。Ｃｙｓ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｃｙｓのコンセンサス配列［式中、Ｘａａ1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり；Ｘａａ2は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり；Ｘａａ3は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり；Ｘａａ4は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである］を有する、Ｄｅｎｎｉｓら、前出（２００２年）；または米国特許出願第２００３／００６９３９５号で説明されるアルブミン結合ペプチドはまた、融合パートナーとしても用いることができる。アルブミン自体またはアルブミンの生物学的に活性なフラグメントはまた、本発明のリポカリンムテインの融合パートナーとしても用いることができる。「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンもしくはラット血清アルブミンなど、すべての哺乳動物アルブミンを含む。アルブミンまたはそのフラグメントの組換え生成物は当技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，７２８，５５３号、欧州特許出願第ＥＰ０３３０４５１、または同第ＥＰ０３６１９９１号で説明されている。
【００６９】
融合パートナーは、他の分子に対する酵素活性または結合アフィニティーなど、新たな特性を、本発明のリポカリンムテインに付与しうる。適切な融合タンパク質の例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＧ、プロテインＡのアルブミン結合ドメイン、抗体フラグメント、オリゴマー化ドメイン、結合特異性が同じであるかまたは異なるリポカリンムテイン（「デュオカリン」の形成を結果としてもたらす；Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１年）、「Ｄｕｏｃａｌｉｎｓ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｆｏｌｄ」、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３８２巻、１３３５〜１３４２頁を参照されたい）、または毒素である。
【００７０】
特に、結果として得られる融合タンパク質の両方の「構成要素」が共に、所与の治療標的上において作用するように、本発明のリポカリンムテインを、個別の酵素活性部位と融合させることが可能でありうる。リポカリンムテインの該結合ドメインを、疾患を引き起こす標的に結合させ、これにより、該酵素ドメインが、該標的の生物学的機能を消失させることを可能とする。
【００７１】
また、組換えタンパク質の容易な検出および／または精製も可能とする、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）もしくはＳｔｒｅｐタグ（登録商標）ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．ら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５５巻、７５３〜７６６頁）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓ6タグ、またはＨＡタグなどのアフィニティータグ、あるいはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのタンパク質が、好ましい融合パートナーのさらなる例である。最後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）など、発色特性または蛍光発光特性を有するタンパク質もまた、本発明のリポカリンムテインに適する融合パートナーである。
【００７２】
本明細書で用いられる「融合タンパク質」という用語はまた、シグナル配列を含有する、本発明によるリポカリンムテインも含む。ポリペプチドのＮ末端におけるシグナル配列は、このポリペプチドを、特定の細胞内コンパートメント、例えば、大腸菌のペリプラズム、または真核細胞の小胞体に方向づける。当技術分野では、多数のシグナル配列が知られている。大腸菌のペリプラズム内へのポリペプチドの分泌に好ましいシグナル配列は、ＯｍｐＡシグナル配列である。
【００７３】
本発明はまた、本明細書で説明されるムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にも関連する。遺伝子コードの縮重により、特定のコドンを、同じアミノ酸を指定する他のコドンにより置換することが可能となるので、本発明は、本発明のムテインをコードする特定の核酸分子に限定されず、機能的なムテインをコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を包含する。
【００７４】
したがって、本発明はまた、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８のうちのいずれかに対する少なくとも１つのコドンにおける突然変異を含めた、本発明によるムテインをコードする核酸配列も包含する。
【００７５】
本明細書で開示される本発明はまた、実験的な突然変異誘発について示される配列位置以外のさらなる突然変異を含む、ｈＮＧＡＬムテインをコードする核酸分子も包含する。このような突然変異は、例えば、ムテインの折り畳み効率、血清中における安定性、熱安定性、またはリガンド結合アフィニティーの改善に寄与する場合、許容されるか、または有利であるとさらにわかることが多い。
【００７６】
本出願で開示される核酸分子は、この核酸分子の発現を可能とするように、調節配列（または複数の調節配列）と「作動可能に連結（operably linked）」されていてもよい。
【００７７】
ＤＮＡなどの核酸分子は、それが、転写および／または翻訳の調節に関する情報を含有する配列エレメントを含み、このような配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」される場合、「核酸分子を発現させうる」か、または「ヌクレオチド配列の発現を可能とする」と称する。作動可能な連結とは、調節配列エレメントと、発現される配列とが、遺伝子発現を可能とする形で接続される連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は種間で変化しうるが、一般に、これらの領域は、原核生物において、プロモーター自体、すなわち転写の開始を誘導するＤＮＡエレメント、ならびに、ＲＮＡに転写されると、翻訳開始のシグナルを発するＤＮＡエレメントの両方を含有するプロモーターを含む。このようなプロモーター領域は通常、原核生物における−３５／−１０ボックスおよびシャイン−ダルガーノエレメント、または、真核生物におけるＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、および５’キャッピングエレメントなど、転写および翻訳の開始に関与する、５’側非コード配列を包含する。これらの領域はまた、エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントのほか、天然ポリペプチドを宿主細胞の特定のコンパートメントにターゲティングするための、翻訳されたシグナル配列およびリーダー配列も包含しうる。
【００７８】
加えて、３’側非コード配列は、転写終結、ポリアデニル化などに関与する調節エレメントも含有しうる。しかし、これらの終結配列は、特定の宿主細胞では十分に機能的でなく、その場合、それらを、該細胞内において機能的なシグナルにより置換することができる。
【００７９】
したがって、本発明の核酸分子は、調節配列、好ましくはプロモーター配列を包含しうる。別の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、プロモーター配列および転写終結配列を含む。適切な原核生物プロモーターは、例えば、ｔｅｔプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、またはＴ７プロモーターである。真核細胞内における発現に有用なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。
【００８０】
本発明の核酸分子はまた、プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、または人工染色体など、ベクターまたは他の任意の種類のクローニング用媒体の一部でもありうる。
【００８１】
一実施形態において、核酸分子は、ファスミド内に含まれる。ファスミドベクターとは、Ｍ１３もしくはｆ１など、溶原性ファージの遺伝子間領域、または対象のｃＤＮＡに融合したその機能的部分をコードするベクターを指す。細菌宿主細胞へのこのようなファージミドベクターおよび適切なヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３Ｋ０７、ＶＣＳ−Ｍ１３、またはＲ４０８）の重複感染後、完全なファージ粒子が生成され、これにより、コードされる異種ｃＤＮＡを、該ファージ表面上において提示される、それに対応するポリペプチドと物理的に連結することが可能となる（例えば、Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら（１９９６年）、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ―Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第１版、ニューヨーク州、ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７年）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．、２６巻、４０１〜４２４頁；またはＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．およびＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０巻、８７〜９３頁において総説されている）。
【００８２】
このようなクローニング用媒体は、上記で説明した調節配列、および本発明のリポカリンムテインをコードする核酸配列以外に、発現に用いられる宿主細胞に適合可能な種に由来する複製配列および制御配列のほか、形質転換細胞またはトランスフェクト細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーも包含しうる。当技術分野では、多数の適切なクローニングベクターが知られており、市販されている。
【００８３】
本発明のリポカリンムテインをコードするＤＮＡ分子、また、特に、このようなリポカリンムテインのコード配列を含有するクローニングベクターは、該遺伝子の発現が可能な宿主細胞内に入れて形質転換することができる。形質転換は、標準的な技法を用いて実施することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９年）、前出）。
【００８４】
したがって、本発明はまた、本明細書で開示される核酸分子を含有する宿主細胞も対象とする。
【００８５】
形質転換された宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に適する条件下において培養される。適切な宿主細胞は、大腸菌または枯草菌など、原核細胞の場合もあり、出芽酵母、メタノール資化酵母、ＳＦ９昆虫細胞もしくはＨｉｇｈ５昆虫細胞、哺乳動物の不死化細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞）、または哺乳動物の初代細胞など、真核細胞の場合もある。
【００８６】
本発明はまた、本発明のムテインを産生する方法であって、遺伝子操作法により、該ムテインをコードする核酸から出発して、該ムテイン、該ムテインのフラグメント、または該ムテインの融合タンパク質、および別のポリペプチドを産生する方法にも関する。方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができ、例えば、ムテインを、細菌宿主生物または真核宿主生物内で産生し、この宿主生物またはその培養物から単離することができる。また、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける翻訳系を用いることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてタンパク質を産生することも可能である。
【００８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてムテインを産生する場合は、本発明のムテインをコードする核酸を、組換えＤＮＡ法により、適切な細菌宿主生物または真核宿主生物内に導入する（上記で既に概括した）。この目的では、まず、確立された標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９年）、前出）を用いて、本発明のムテインをコードする核酸分子を含むクローニングベクターにより、宿主細胞を形質転換する。次いで、宿主細胞を、異種ＤＮＡの発現を可能とし、したがって、対応するポリペプチドの合成を可能とする条件下において培養する。その後、細胞または培地からポリペプチドを回収する。
【００８８】
一態様において、本発明は、本発明のムテインを生成させる方法であって、
（ａ）ｈＮＧＡＬタンパク質をコードする核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちの任意の少なくとも１カ所をコードするヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかける結果、１または複数のムテイン核酸分子を得るステップと、
（ｂ）適切な発現系において、（ａ）で得られた１または複数のムテイン核酸分子を発現させるステップと、
（ｃ）選択および／または単離により、所与の標的に対する検出可能な結合アフィニティーを有する１または複数のムテインを濃縮するステップと
を含む方法に関する。
【００８９】
本明細書で用いられる「突然変異誘発」という用語は、ｈＮＧＡＬ（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンクエントリー：Ｐ８０１８８）の所与の配列位置にある天然のアミノ酸が、各々の天然ポリペプチド配列中におけるこの特定の位置には存在しない少なくとも１つのアミノ酸により置換されうるように、実験条件を選択することを意味する。「突然変異誘発」という用語はまた、１または複数のアミノ酸の欠失または挿入による、配列セグメントの長さの（付加的）修飾も包含する。したがって、例えば、選択された配列位置における１つのアミノ酸が、３カ所にわたるランダムな突然変異により置換され、野生型タンパク質の各々のセグメントの長さと比較して、２つのアミノ酸残基の挿入がもたらされる場合は、本発明の範囲内にある。このような挿入または欠失は、本発明において突然変異誘発にかけうるペプチドセグメントのいずれかにおいて、互いから独立した形で導入することができる。本発明の例示的な一実施形態では、複数カ所の突然変異の挿入を、選択されたリポカリン骨格のループＡＢ内に導入することができる（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＷＯ２００５／０１９２５６号を参照されたい）。「ランダムな突然変異」という用語は、突然変異時において、特定の配列位置に所定の単一のアミノ酸（突然変異）が存在せず、所定の配列位置に、少なくとも２つのアミノ酸が、特定の確率で組み込まれうることを意味する。
【００９０】
本発明で選択されるペプチドセグメントの突然変異誘発の開始位置としては、ｈＮＧＡＬのコード配列が用いられる。列挙されたアミノ酸位置を突然変異誘発させる場合、当業者は、部位指向突然変異誘発を行うのに確立された各種の標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９年）、前出）を自由に用いることができる。一般に用いられる技法は、所望の配列位置において縮重塩基組成を保有する合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による突然変異の導入である。例えば、突然変異時において、コドンＮＮＫまたはＮＮＳ（ここで、Ｎ＝アデニン、グアニン、またはシトシン、またはチミン；Ｋ＝グアニンまたはチミン；Ｓ＝アデニンまたはシトシン）を用いることにより、２０種類のアミノ酸すべてにアンバー終止コドンを加えた組込みが可能となるのに対し、コドンＶＶＳは、ポリペプチド配列の選択された位置への組込みから、アミノ酸Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌを除外するので、該コドンによる組込みが可能なアミノ酸の数は１２に制限される；例えば、コドンＮＭＳ（ここで、Ｍ＝アデニンまたはシトシン）は、選択された配列位置における組込みから、アミノ酸Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌを除外するので、該コドンを用いることにより、選択される配列位置において可能なアミノ酸の数は１１に制約される。この点では、セレノシステインまたはピロリシンなど、他のアミノ酸（通常の２０種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸）に対するコドンもまた、ムテインの核酸に組み込みうることが注目される。Ｗａｎｇ，Ｌ．ら（２００１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２巻、４９８〜５００頁；またはＷａｎｇ，Ｌ．およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２年）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１巻、１〜１１頁により説明される通り、通常は終止コドンとして認識されるＵＡＧなどの「人工」コドンを、他のまれなアミノ酸、例えば、ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、またはｐ−アミノフェニルアラニンを挿入する目的で用いることも可能である。
【００９１】
例えば、イノシン、８−オキソ−２’デオキシグアノシン、または６（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミジノ−１，２−オキサジン−７−オン（Ｚａｃｃｏｌｏら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５５巻、５８９〜６０３頁）など、塩基対の特異性を低下させたヌクレオチド構成要素の使用は、選択された配列セグメントに突然変異を導入するための別の選択肢である。
【００９２】
さらなる可能性は、いわゆるトリプレットによる突然変異誘発である。この方法は、その各々が１つのアミノ酸をコードする異なるヌクレオチドトリプレットの混合物を用いる（Ｖｉｒｎｅｋａｓ  Ｂ、Ｇｅ  Ｌ、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＫＣ、Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ  Ｇ、Ｍｏｒｏｎｅｙ  ＳＥ、１９９４年、「Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ：ｉｄｅａｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２２巻、５６００〜５６０７頁）。
【００９３】
各々のポリペプチドの選択された領域内に突然変異を導入する１つの可能な戦略は、その各々が、突然変異させる、対応する配列セグメントのうちの１つに部分的に由来する、４つのオリゴヌクレオチドの使用に基づく。これらのオリゴヌクレオチドを合成する場合、すべての天然アミノ酸をコードするコドンがランダムに生じ、ついには、リポカリンペプチドのライブラリーが結果として生成されるように、当業者は、核酸構成要素の混合物を用いて、突然変異させるアミノ酸位置に対応するヌクレオチドトリプレットを合成することができる。例えば、第１のオリゴヌクレオチドは、（突然変異させる位置を除く）その配列において、リポカリンポリペプチドの最Ｎ末端位置にある、突然変異させるペプチドセグメントに対するコード鎖に対応する。したがって、第２のオリゴヌクレオチドは、ポリペプチド配列において後続する、第２の配列セグメントに対する非コード鎖に対応する。第３のオリゴヌクレオチドは、対応する第３の配列セグメントに対するコード鎖に対応する。最後に、第４のオリゴヌクレオチドは、第４の配列セグメントに対する非コード鎖に対応する。ポリメラーゼ連鎖反応は、第１および第２の各オリゴヌクレオチドにより実施することができ、また、必要な場合、第３および第４の各オリゴヌクレオチドにより別個に実施することができる。
【００９４】
各種の既知の方法により、これら両方の反応の増幅産物を、選択された位置において突然変異が導入された、第１〜第４の配列セグメントの配列を含む単一の核酸と組み合わせることができる。この目的で、両方の産物を、例えば、隣接するオリゴヌクレオチドのほか、第２の配列セグメントと第３の配列セグメントとの間の配列をもたらす、１または複数の媒介核酸分子を用いる、新たなポリメラーゼ連鎖反応にかけることができる。配列内における、突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドの数および配置を選択する場合、当業者は、多数の代替法を自由に用いることができる。
【００９５】
上記で定義した核酸分子は、ライゲーションにより、リポカリンポリペプチドをコードする核酸の５’側および３’側における逸失配列ならびに／またはベクターと連結することができ、既知の宿主生物内においてクローニングすることができる。ライゲーションおよびクローニングについては、多くの確立された手順を用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９年）、前出）。例えば、クローニングベクターの配列内にも存在する、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を、合成オリゴヌクレオチドの配列に操作することができる。したがって、各々のＰＣＲ産物の増幅および酵素的切断の後では、対応する認識配列を用いて、結果として得られるフラグメントを容易にクローニングすることができる。
【００９６】
突然変異誘発に選択されるタンパク質をコードする遺伝子内におけるより長い配列セグメントはまた、既知の方法により、例えば、エラー率が上昇する条件下においてポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより、化学的突然変異誘発により、または細菌の突然変異株を用いることにより、ランダム突然変異にもかけることができる。このような方法はまた、リポカリンムテインの標的のアフィニティーまたは特異性をさらに最適化するのにも用いることができる。実験的な突然変異誘発セグメント以外で生じる可能性のある突然変異は、許容されることが多いか、または、例えば、それらが、リポカリンムテインの折り畳みの効率または折り畳みの安定性の改善に寄与する場合、有利であると分かる可能性がある。
【００９７】
本発明の一実施形態によれば、上記の方法は、ｈＮＧＡＬタンパク質をコードする核酸分子を、上記に表示されるｈＮＧＡＬの配列位置のうちのいずれかをコードする、少なくとも９、１０、１１、または１２すべてのヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップを包含する。
【００９８】
さらなる一実施形態において、方法は、核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４２、４８、４９、５５、７５、７７、８０、および１２７に対応する配列位置のうちのいずれかをコードする、少なくとも１つのヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップをさらに包含する。方法は、核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４３、４４、４６、４７、５０、５１、５９、６５、７８、８６、８７、９８、９９、１０３、１０７、１１０、および１１１に対応する配列位置のうちのいずれかをコードする、少なくとも１つのヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップをさらに包含しうる。
【００９９】
本発明のさらに別の実施形態において、方法は、核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、４２、４８、４９、５２、５４、５５、６８、７０、７５、７７、７９、８０、８１、１２７、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちの少なくとも任意の９カ所をコードするヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップをさらに包含する。
【０１００】
またさらなる実施形態において、方法は、核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５４、５５、５９、６５、６８、７０、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９９、１０３、１０７、１１０、１１１、１２７、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちの少なくとも任意の９カ所をコードするヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップを包含する。
【０１０１】
本発明の方法によれば、ムテインは、ｈＮＧＡＬをコードする核酸から出発して得られる。組換えＤＮＡ法により、このような核酸を突然変異誘発にかけ、適切な細菌宿主生物または真核宿主生物に導入する。抗体様特性を有するリポカリンムテイン、すなわち、所与の標的に対してアフィニティーを有するムテインを生成させる、当技術分野で知られる任意の適切な技法を用いて、ｈＮＧＡＬの核酸ライブラリーを得るステップを実施することができる。このような組合せ方法の例は、例えば、国際特許出願第ＷＯ９９／１６８７３号、同第ＷＯ００／７５３０８号、同第ＷＯ０３／０２９４７１号、同第ＷＯ０３／０２９４６２号、同第ＷＯ０３／０２９４６３号、同第ＷＯ２００５／０１９２５４号、同第ＷＯ２００５／０１９２５５号、同第ＷＯ２００５／０１９２５６号、または同第ＷＯ２００６／５６４６４号において詳細に説明されている。これらの特許出願各々の内容は、参照によりその全体において組み込まれる。適切な宿主内において突然変異誘発を受けた核酸配列の発現後において、所与の標的に結合する複数のリポカリンムテイン各々の遺伝情報を保有するクローンを、得られたライブラリーから選択することができる。これらのクローンの選択には、ファージディスプレイ（Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら（１９９６年）、前出；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７年）、前出；またはＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．およびＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９年）、前出において総説されている）、コロニースクリーニング（Ｐｉｎｉ，Ａ．ら（２００２年）、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．、５巻、５０３〜５１０頁において総説されている）、リボソームディスプレイ（Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ら（２００１年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻、４００〜４０５頁において総説されている）、もしくはＷｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．ら（２００１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８、３７５０〜３７５５頁において報告されているｍＲＮＡディスプレイ、またはＷＯ９９／１６８７３、ＷＯ００／７５３０８、ＷＯ０３／０２９４７１、ＷＯ０３／０２９４６２、ＷＯ０３／０２９４６３、ＷＯ２００５／０１９２５４、ＷＯ２００５／０１９２５５、ＷＯ２００５／０１９２５６、もしくはＷＯ２００６／５６４６４において具体的に説明されている方法など、よく知られた技法を用いることができる。
【０１０２】
本開示によれば、上記方法の別の実施形態において、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）所与のリガンドとして、免疫学的ハプテン、ペプチド、タンパク質、もしくは多糖、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）など、別の高分子、または例えば、全ウイルス粒子もしくはウィロイドの特徴を示す、遊離形態またはコンジュゲート形態の化合物からなる群から選択される化合物を供給するステップと、
（ｉｉ）前記リガンドと、前記リガンドに対する結合アフィニティーを有するムテインとの複合体の形成を可能とするために、複数のムテインを前記リガンドと接触させるステップと、
（ｉｉｉ）結合アフィニティーを有さないかまたは実質的に有さないムテインを除去するステップと
をさらに含む。
【０１０３】
本発明の具体的な実施形態において、リガンドは、金属キレート化剤など、有機小分子でありうる。
【０１０４】
本発明の一実施形態において、ステップ（ｃ）における選択は、競合的条件下において実施される。本明細書で用いられる競合的条件とは、ムテインの選択が、ムテインおよびｈＮＧＡＬの所与の非天然リガンド（標的）を、該標的に対するムテインの結合と競合するさらなるリガンドの存在下において接触させる少なくとも１つのステップを包含することを意味する。このさらなるリガンドは、標的の生理学的リガンドの場合もあり、標的自体の過剰の場合もあり、本発明のムテインにより認識されるエピトープに対する少なくとも１つの重複エピトープに結合し、これにより、該ムテインの標的結合に干渉する、標的に対する他の任意の非生理学的リガンドの場合もある。代替的に、さらなるリガンドは、ムテインの結合部位とは異なるエピトープを、アロステリック効果により標的に複合体化させることによって、該ムテインの結合と競合する。
【０１０５】
溶原性Ｍ１３ファージを用いるファージディスプレイ法（Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら（１９９６年）、前出；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７年）、前出；またはＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．およびＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９年）、前出に総説がある）の実施形態は、本発明において用いられうる選択法の例として与えられる。本発明のムテインを選択するのに用いうるファージディスプレイ法の別の実施形態は、Ｂｒｏｄｅｒｓら（Ｂｒｏｄｅｒｓら（２００３年）、「Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０５巻、２９５〜３０２頁）により説明される、ハイパーファージ法である。ｆ１など他の溶原性ファージも、Ｔ７などの溶菌性ファージも用いることができる。例示的な選択法では、Ｎ末端においてシグナル配列、好ましくはＯｍｐＡシグナル配列を有し、また、Ｃ末端においてファージＭ１３のカプシドタンパク質ｐＩＩＩ、または該ファージカプシド内に組み込むことが可能なそのフラグメントを有する融合タンパク質として、突然変異させたリポカリン核酸配列の発現を可能とするＭ１３ファージミドを産生する。融合タンパク質を産生するには、野生型配列のアミノ酸２１７〜４０６を含むファージカプシドタンパク質のＣ末端フラグメントであるΔｐＩＩＩを用いることが好ましい。一実施形態においては、位置２０１においてシステイン残基を逸失するか、またはこれが別のアミノ酸により置換されたｐＩＩＩのＣ末端フラグメントがとりわけ好ましい。
【０１０６】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、所与のリガンドの結合について少なくとも１つのムテインを選択する目的で、複数のｈＮＧＡＬムテインをコードし、３’端における突然変異誘発から生じる核酸を、Ｍ１３ファミリーの線維状バクテリオファージのコートタンパク質ｐＩＩＩ、またはこのコートタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子と作動可能に融合させるステップを伴う。
【０１０７】
融合タンパク質は、融合タンパク質またはその一部の固定化、検出、および／または精製を可能とするアフィニティータグなどのさらなる成分を含みうる。さらに、停止コドンは、リポカリンまたはそのムテインをコードする配列領域と、ファージカプシド遺伝子またはそのフラグメントとの間に位置することが可能であり、その場合、該停止コドン、好ましくは、アンバー停止コドンは、適切なサプレッサー菌株において翻訳される際に、少なくとも部分的にアミノ酸に翻訳される。
【０１０８】
例えば、本明細書に記載の、現在はｐＴｌｃ２７とも呼ばれるファスミドベクターｐＴＬＰＣ２７を用いて、ｈＮＧＡＬムテインをコードするファージミドライブラリーを調製することができる。２つのＢｓｔＸＩ制限部位を用いて、ｈＮＧＡＬムテインをコードする本発明の核酸分子を、ベクター内に挿入する。ライゲーション後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの適切な宿主菌株を、結果として得られる核酸混合物により形質転換して、多数の独立クローンをもたらす。所望の場合、ハイパーファージミドライブラリーを調製するための各ベクターを作製することができる。
【０１０９】
その後、機能的ファージミドを産生する目的で、液体培養物において、結果として得られるライブラリーに、適切なＭ１３ヘルパーファージまたはハイパーファージを重複感染させる。組換えファージミドが、コートタンパク質ｐＩＩＩまたはそのフラグメントとの融合体として、その表面上においてリポカリンムテインを提示する一方、該融合タンパク質のＮ末端シグナル配列は、通常切断されて除去される。他方、それはまた、ヘルパーファージにより供給される天然のカプシドタンパク質ｐＩＩＩの１または複数のコピーも保有し、したがって、レシピエント、一般には、ＦプラスミドまたはＦ’プラスミドを保有する細菌株に感染することが可能である。ハイパーファージディスプレイの場合、ハイパーファージミドは、それらの表面上において、感染性のコートタンパク質ｐＩＩＩとの融合体としてのリポカリンムテインを提示するが、天然のカプシドタンパク質は提示しない。ヘルパーファージまたはハイパーファージによる感染時または感染後には、例えば、アンヒドロテトラサイクリンを添加することにより、リポカリンムテインとカプシドタンパク質ｐＩＩＩとの融合タンパク質の遺伝子発現を誘導することができる。得られるファージミドの実質的部分が、それらの表面上において、少なくとも１つのリポカリンムテインを提示するように、誘導条件を選択する。ハイパーファージディスプレイの場合、誘導条件は、リポカリンムテインおよびカプシドタンパク質ｐＩＩＩからなる３〜５つの融合タンパク質を保有するハイパーファージミド集団を結果としてもたらす。ポリエチレングリコールによる沈殿など、ファージミドを単離する各種の方法が知られている。単離は、６〜８時間のインキュベーション時間後において生じることが典型的である。
【０１１０】
次いで、単離されたファージミドを、それらのコート内における融合タンパク質としての、所望の結合活性を有するムテインを保有するこれらのファージミドに対する少なくとも一時的な固定化を可能とする形態において提示される、所望の標的とのインキュベーションによる選択にかけることができる。例えば、標的を、血清アルブミンなどのキャリアータンパク質とコンジュゲートさせ、このキャリアータンパク質を介して、タンパク質結合表面、例えば、ポリスチレンに結合させうることは、当業者に知られる各種の実施形態の内にある。このような標的の固定化には、ＥＬＩＳＡ法に適するマイクロ滴定プレート、またはいわゆる「イムノスティック」を用いうることが好ましい。代替的に、ビオチンなど、他の結合基との標的のコンジュゲートも用いることができる。次いで、この基に選択的に結合する表面、例えば、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、またはアビジンによりコーティングしたマイクロ滴定プレートまたは常磁性粒子上に、標的を固定化することができる。標的を免疫グロブリンのＦｃ部分に融合させる場合もまた、固定化は、表面、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧによりコーティングしたマイクロ滴定プレートまたは常磁性粒子により達成することができる。
【０１１１】
表面上に存在する非特異的なファージミド結合部位は、ＥＬＩＳＡ法について知られるブロッキング溶液により飽和化させることができる。次いで、ファージミドを、生理学的緩衝液の存在下において、表面上に固定化された標的と接触させることが典型的である。複数回の洗浄により、結合しなかったファージミドを除去する。次いで、表面上に残存するファージミド粒子を溶出させる。溶出には、複数の方法が可能である。例えば、プロテアーゼの添加により、または酸、塩基、洗浄剤、もしくはカオトロピック塩の存在下において、または中程度の変性条件下において、ファージミドを溶出させることができる。好ましい方法は、ｐＨ２．２の緩衝液を用いる溶出であり、その後、溶出物を中和化させる。代替的に、ファージミドに対する結合について固定化された標的と競合する目的で、遊離標的の溶液を添加することもでき、対象の標的に特異的に結合する免疫グロブリンまたはリガンド結合する天然タンパク質と競合させることにより、標的特異的ファージミドを溶出させることもできる。
【０１１２】
その後、大腸菌細胞に、溶出したファージミドを感染させる。代替的に、溶出したファージミドから核酸を抽出し、別の形における配列解析、増幅、または細胞の形質転換に用いることもできる。このようにして得られる大腸菌クローンから出発して、上記の方法によるＭ１３ヘルパーファージまたはハイパーファージによる重複感染を介して、再度新規のファージミドまたはハイパーファージミドを産生し、このようにして増幅されるファージミドを、今一度固定化した標的上における選択にかける。十分に濃縮された形態における本発明のムテインを伴うファージミドを得るためには、複数の選択サイクルが必要となることが多い。後続の機能的解析において、被験対象となるクローンの少なくとも０．１％が、所与の標的に対して検出可能なアフィニティーを有するムテインを生成するように、選択サイクルの数を選択することが好ましい。サイズ、すなわち、用いられるライブラリーの複雑性に応じて、この目的には、２〜８サイクルが必要とされることが典型的である。
【０１１３】
選択されたムテインを機能的に解析するために、大腸菌株に、選択サイクルから得られたファージミドを感染させ、対応する二本鎖ファスミドＤＮＡを単離する。このファスミドＤＮＡから出発し、または、該ファージミドから抽出した一本鎖ＤＮＡからも出発し、当技術分野で知られる方法により、本発明の選択されたムテインの核酸配列を決定することができ、また、該核酸配列からアミノ酸配列を推定することができる。ｈＮＧＡＬムテイン全体の突然変異領域または突然変異配列を、別の発現ベクター上においてサブクローニングし、適切な宿主生物内において発現させることができる。例えば、現在はまたｐＴｌｃ２６とも呼ばれるベクターｐＴＬＰＣ２６を用いて、大腸菌ＴＧ１株などの大腸菌株内において発現させることができる。このようにして産生されるｈＮＧＡＬのムテインは、各種の生化学的方法により精製することができる。例えば、ｐＴｌｃ２６により産生されるｈＮＧＡＬムテインは、それらのＣ末端においてアフィニティーペプチドであるＳｔｒｅｐタグＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、前出）を保有し、したがって、ストレプトアビジンによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製しうることが好ましい。
【０１１４】
選択はまた、他の方法によって実施することもできる。多くの対応する実施形態が、当業者に知られているか、または文献において説明されている。さらに、方法の組合せも適用することができる。例えば、「ファージディスプレイ」により選択されるか、または少なくともこれにより濃縮されるクローンを、さらに「コロニースクリーニング」にかけることができる。この手順は、標的に対する検出可能な結合アフィニティーを有するｈＮＧＡＬムテインの産生に関して、個々のクローンを直接単離しうるという利点を有する。
【０１１５】
「ファージディスプレイ」法または「コロニースクリーニング」法における宿主生物として大腸菌を用いるのに加えて、他の細菌株、酵母、または昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞もまた、この目的で用いることができる。上記のランダムライブラリーからのｈＮＧＡＬムテインの選択にさらに加えて、標的に対してある程度の結合活性を既に保有するムテインを、標的に対するアフィニティーまたは特異性に関して、反復後において最適化する目的で、限定的な突然変異誘発を含めた発展的方法も適用することができる。
【０１１６】
所与の標的に対してアフィニティーを有するムテインを選択したら、その後、より高度の熱安定性、血清中における安定性の改善、熱力学的安定性、可溶性の改善、単量体挙動の改善、熱変性、化学変性、タンパク質溶解、または洗浄剤などに対する耐性の改善など、さらにより高度のアフィニティーを有する変異体、または特性の改善された変異体を選択する目的で、このようなムテインを別の突然変異誘発にかけることもさらに可能である。より高度なアフィニティーを目的とする場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける「アフィニティー成熟」として考えうる、このさらなる突然変異誘発は、合理的なデザインまたはランダムな突然変異に基づく部位特異的な突然変異により達成することができる。より高度のアフィニティーまたは特性の改善を得るために可能な別の方法は、リポカリンムテインの選択された範囲の配列位置にわたる点突然変異を結果としてもたらすエラープローンＰＣＲの使用である。エラープローンＰＣＲは、Ｚａｃｃｏｌｏら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５５巻、５８９〜６０３頁により説明されるプロトコールなど、任意の既知のプロトコールにより実施することができる。このような目的に適する他のランダム突然変異誘発の方法には、Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００２年）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻、７６〜８１頁により説明されるランダム挿入／欠失（ＲＩＤ）による突然変異誘発、またはＢｉｔｔｋｅｒら（２００２年）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻、１０２４〜１０２９頁により説明されるランダム非相同組換え（ＮＲＲ）が含まれる。所望の場合、アフィニティー成熟はまた、ジゴキシゲニンに対して高度のアフィニティーを有するビリン結合タンパク質のムテインを得た、ＷＯ００／７５３０８；またはＳｃｈｌｅｈｕｂｅｒら（２０００年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９７巻、１１０５〜１１２０頁に記載の手順によっても実施することができる。アフィニティーを改善するさらなる手法は、位置飽和突然変異誘発の実施である。この手法では、アミノ酸の交換／突然変異が、４つのループセグメントのいずれかの内にある単一の位置だけに導入される、「小型の」核酸ライブラリーを作製することができる。次いで、これらのライブラリーを、さらなるパニングのラウンドなしに、直接、選択ステップ（アフィニティースクリーニング）にかける。この手法により、所望の標的の結合改善に寄与する残基の同定が可能となり、該結合に重要な「ホットスポット」の同定が可能となる。
【０１１７】
一実施形態において、ムテインを修飾する上記の方法は、ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、または１５８に対応する配列位置のうちの任意の少なくとも１カ所においてＣｙｓ残基を導入するステップと、ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、または１５８に対応する配列位置のうちの任意の少なくとも１カ所において導入されたＣｙｓ残基のチオール基を介して、前記ムテインの血清半減期を改変することが可能な部分を結合させるステップとをさらに包含する。前記ムテインの血清半減期を改変することが可能な部分は、ポリアルキレングリコール分子およびヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択することができる。
【０１１８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の上記において詳述された方法により得ることができるか、または得られるｈＮＧＡＬの所与の非天然リガンドに対して検出可能な結合アフィニティーを有するｈＮＧＡＬムテインを対象とする。
【０１１９】
本発明の一部のｈＮＧＡＬムテインでは、Ｃｙｓ  ７６とＣｙｓ  １７５との間における天然のジスルフィド結合が除去される。したがって、このようなムテイン（または分子内のジスルフィド結合を含まない他の任意のｈＮＧＡＬムテイン）は、還元的なレドックス環境を有する細胞コンパートメント内、例えば、グラム陰性菌の細胞質中において産生することができる。
【０１２０】
本発明のリポカリンムテインが、分子内のジスルフィド結合を含む場合は、新生ポリペプチドを、適切なシグナル配列用いて、酸化的なレドックス環境を有する細胞コンパートメントに方向づけることが好ましい場合がある。このような酸化的環境は、グラム陽性菌の細胞外環境において、または真核細胞の小胞体内腔において、大腸菌などグラム陰性菌のペリプラズムによりもたらされる場合があり、通常、構造的なジスルフィド結合の形成に好都合である。
【０１２１】
しかしまた、宿主細胞、好ましくは大腸菌の細胞質ゾル中において、本発明のムテインを産生することも可能である。この場合、ポリペプチドは、可溶性の折り畳まれた状態で直接得ることもでき、封入体の形態で回収された後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて復元することもできる。さらなる選択肢は、酸化的な細胞内環境を有する特異的な宿主菌株の使用であり、これにより、細胞質ゾル中におけるジスルフィド結合の形成を可能としうる（Ｖｅｎｔｕｒｉら（２００２年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３１５巻、１〜８頁）。
【０１２２】
しかし、本発明のムテインは必ずしも、遺伝子操作だけを用いて生成させるか、または産生することが可能なわけではない。そうではなく、リポカリンムテインはまた、メリフィールド固相ポリペプチド合成などの化学合成により得ることもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写および翻訳により得ることもできる。例えば、分子モデリングを用いて有望な突然変異を同定し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて望ましい（意図される）ポリペプチドを合成し、所与の標的に対する結合活性を探索することが可能である。固相および／または溶液相においてタンパク質を合成する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９７年）、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ボカラトン、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社；Ｆｉｅｌｄｓ，ＧＢおよびＣｏｌｏｗｉｃｋ（１９９７年）、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社；またはＢｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒら（２００４年）、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５巻、２９〜４３頁に総説がある）。
【０１２３】
別の実施形態において、本発明のムテインは、当業者に知られる十分に確立された方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写／翻訳により産生することができる。
【０１２４】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明のｈＮＧＡＬムテイン、またはその融合タンパク質もしくはコンジュゲート、および、場合によって、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物にも関する。
【０１２５】
本発明によるリポカリンムテインは、タンパク質性薬物に治療上有効な、任意の非経口経路または非経口以外の経路（経口経路）を介して投与することができる。非経口の適用方法は、例えば、注射溶液、注入溶液、または滴下剤の形態における、例えば、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内における注射法および注入法のほか、例えば、エアゾール混合物、スプレー、または粉末の形態におけるエアゾールの導入および吸入を含む。非経口以外の送達方式は、例えば、丸薬、錠剤、カプセル、溶液、もしくは懸濁液の形態における、例えば、経口送達方式、または、例えば、座薬の形態における、例えば、直腸内送達方式である。本発明のムテインは、所望に応じて、薬学的に許容される従来の非毒性の賦形剤または担体、添加剤、および媒体を含有する製剤により、全身投与することもでき、局所投与することもできる。
【０１２６】
本発明の一実施形態において、薬剤は、哺乳動物、特に、ヒトに非経口投与される。対応する投与方法には、例えば、注射溶液、注入溶液、または滴下剤の形態における例えば、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内における注射法および注入法のほか、例えば、エアゾール混合物、スプレー、または粉末の形態におけるエアゾールの導入および吸入が含まれるがこれらに限定されない。血清半減期が比較的短い化合物の場合なら、静脈内注入および／または注射と皮下注入および／または注射とを組み合わせると、最も好都合であるかもしれない。医薬組成物は、水溶液の場合もあり、水中油エマルジョンの場合もあり、油中水エマルジョンの場合もある。
【０１２７】
この点において、本明細書で説明されるムテインの経皮送達には、ＭｅｉｄａｎおよびＭｉｃｈｎｉａｋ（２００４年）、Ａｍ．Ｊ．Ｔｈｅｒ．、１１巻、４号、３１２〜３１６頁において説明される経皮送達法、例えば、イオントフォレーシス、ソノフォレーシス、またはマイクロ針増強送達も用いうることが注目される。非経口以外の送達方式は、例えば、丸薬、錠剤、カプセル、溶液、もしくは懸濁液の形態における経口投与、または、例えば、座薬の形態における直腸内投与である。本発明のムテインは、薬学的に許容される従来の各種の非毒性の賦形剤または担体、添加剤、および媒体を含有する製剤により、全身投与することもでき、局所投与することもできる。
【０１２８】
望ましい予防効果または治療応答を達成するのに適用されるムテインの用量は、広範な限界値内で変化しうる。それは、例えば、選択されるリガンドに対する化合物のアフィニティーのほか、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ムテインとリガンドとの複合体の半減期にも依存する。さらに、最適用量は、ムテインまたはその融合タンパク質もしくはそのコンジュゲートの生体内分布、投与方式、治療される疾患／障害の重症度のほか、患者の治療状態にも依存する。例えば、局所適用用の軟膏中において用いられる場合は、高濃度のｈＮＧＡＬムテインを用いることができる。しかし、望ましい場合、ムテインはまた、持続放出製剤、例えば、リポソームによる分散剤、または、ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅTMまたはＯｃｔｏＤＥＸTMなど、ハイドロゲルベースのポリマーマイクロスフェア中において施すこともできる（Ｂｏｓら、「Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｂｒｉｅｆｉｎｇ：Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ  ２００３」、１〜６頁を参照されたい）。
【０１２９】
したがって、本発明のムテインは、薬学的に許容される成分のほか、確立された調製方法も用いて、組成物に調合することができる（ＧｅｎｎａｒｏおよびＧｅｎｎａｒｏ（２０００年）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、ペンシルベニア州、フィラデルフィア、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ社）。医薬組成物を調製するには、薬学的に不活性な無機賦形剤または有機賦形剤を用いることができる。例えば、丸薬、粉末、ゼラチンカプセル、または坐剤を調製するには、例えば、ラクトース、滑石、ステアリン酸およびその塩、脂肪、蝋、固体または液体のポリオール、天然油および硬化した油を用いることができる。使用前に溶液またはエアゾール混合物に再構成するための溶液、懸濁液、エマルジョン、エアゾール混合物、または粉末を製造するのに適する賦形剤には、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、およびこれらの適切な混合物のほか、植物油が含まれる。
【０１３０】
医薬組成物はまた、例えば、充填剤、結合剤、保湿剤、潤滑剤、安定化剤、防腐剤、乳化剤などの添加剤、またさらに、デポ効果を達成するための溶媒または可溶化剤または薬剤も含有しうる。後者は、融合タンパク質を、リポソームおよびマイクロカプセルなど、徐放系もしくは持続放出系、または標的送達系内に組み込みうるということである。
【０１３１】
製剤は、細菌を保持するフィルターを介する濾過、または使用直前に滅菌水または他の滅菌媒体中に溶解または分散させうる滅菌の固体組成物の形態内に滅菌剤を組み込むことを含めた、多数の手段により滅菌することができる。
【０１３２】
本発明のムテイン、またはその融合タンパク質もしくはコンジュゲートは、多くの適用において用いることができる。一般に、このようなムテインは、Ｆｃ部分のグリコシル化に特異的に依拠する適用を除き、抗体が用いられるすべての適用において用いることができる。
【０１３３】
したがって、本発明の別の態様では、本発明のｈＮＧＡＬムテインを用いて、所与の非天然のｈＮＧＡＬリガンドに結合させ、かつ／またはこれを検出することができる。このような使用は、適切な条件下において、ムテインを、所与のリガンドを含有することが疑われる試料と接触させ、これにより、該ムテインと該所与のリガンドとの複合体の形成を可能とするステップと、適切なシグナルにより、複合体化したムテインを検出するステップとを含みうる。
【０１３４】
検出可能なシグナルは、上記で説明した標識によりもたらすこともでき、結合、すなわち、複合体の形成自体に起因する物理的特性の変化によりもたらすこともできる。１つの例は、そのうちの一方が金箔などの表面上に固定化される結合パートナーの結合時においてその値が変化する、プラズモン表面共鳴である。
【０１３５】
本明細書で開示されるｈＮＧＡＬムテインはまた、所与の非天然ｈＮＧＡＬリガンドの分離にも用いることができる。このような使用は、適切な条件下において、ムテインを、前記リガンドを含有すると推測される試料と接触させ、これにより、該ムテインと該所与のリガンドとの複合体の形成を可能とするステップと、該試料からムテイン／リガンド複合体を分離するステップとを含みうる。
【０１３６】
所与の非天然リガンドを検出するためのムテインの使用、ならびに所与のリガンドを分離するためのムテインの使用のいずれにおいても、ムテインおよび／または標的を、適切な固相上において固定化することができる。
【０１３７】
本発明のｈＮＧＡＬムテインはまた、事前に選択された部位を、化合物の標的とするのに用いることもできる。このような一実施形態では、ｈＮＧＡＬムテインを、生物または組織内における事前に選択された部位に対する薬学的に活性な化合物のターゲティングであって、
ａ）該ムテインを前記化合物とコンジュゲートさせるステップと、
ｂ）ムテイン／化合物複合体を、該事前に選択された部位に送達するステップと
を含む標的化にも用いることができる。
【０１３８】
このような目的で、複合体の形成を可能とするために、ムテインを対象の複合体と接触させる。次いで、ムテインおよび対象の化合物を含む複合体を、事前に選択された部位に送達する。これは、例えば、ムテインを、選択される標的に対する結合アフィニティーを有する抗体、抗体フラグメント、またはリポカリンムテインもしくはリポカリンムテインフラグメントなどのターゲティング部分に結合させることにより達成することができる。
【０１３９】
この使用は、薬物を、該薬物により治療されることが推測される、感染した身体部分、組織、または内臓など、生物内において事前に選択された部位に（選択的に）送達するのに特に適するが、これに制約されない。ムテインと対象化合物との複合体の形成のほか、ムテインはまた、ムテインと化合物とのコンジュゲートをもたらすように、該所与の化合物と反応させることもできる。上記の複合体と同様に、このようなコンジュゲートも、事前に選択された標的部位に対する化合物の送達に適しうる。ムテインと化合物とのこのようなコンジュゲートはまた、ムテインと化合物とを互いに対して共有結合させるリンカーも包含しうる。場合によって、このようなリンカーは、血流中において安定であるが、細胞内環境においては切断可能である。
【０１４０】
したがって、本明細書で開示されるムテイン、およびその誘導体は、抗体またはそれらのフラグメントと同様に、多くの分野で用いることができる。所与のムテインの標的またはこの標的のコンジュゲートもしくは融合タンパク質の固定化または分離を可能とする支持体に対する結合にそれらを用いることに加えて、ムテインは、酵素、抗体、放射性物質、または生化学活性もしくは明確な結合特徴を有する他の任意の基による標識化にも用いることができる。このように用いることにより、それらの各々の標的、またはそれらのコンジュゲートもしくは融合タンパク質を検出することもでき、それらと接触させることもできる。例えば、本発明のムテインは、確立された分析方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）または顕微鏡法もしくは免疫センサー法による化学構造の検出に用いることができる。この場合、検出シグナルは、適切なムテインコンジュゲートまたは融合タンパク質を用いて直接的に発生させることもでき、抗体を介して、結合したムテインの免疫化学的検出により間接的に発生させることもできる。
【０１４１】
本発明のムテインについての可能な多数の適用はまた、医療においても存在する。診断法および薬物送達におけるそれらの使用に加え、例えば、組織特異的または腫瘍特異的な細胞表面分子に結合する、本発明の突然変異体ポリペプチドを生成させることができる。このようなムテインは、例えば、「腫瘍イメージング」用のコンジュゲート形態において、または融合タンパク質として用いることもでき、癌治療に直接用いることもできる。
【０１４２】
したがって、本発明はまた、所与の非天然リガンドまたは標的との複合体形成のための、本発明のｈＮＧＡＬムテインの使用にも関与する。
【０１４３】
さらなる態様において、本発明はまた、医薬組成物の製造のための、本発明によるムテインの使用も包含する。このようにして得られる医薬組成物は、放射免疫療法（ＲＩＴ）において用いるのに適する場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに用いるのに適する場合もある。医薬組成物は、単剤療法として用いることもでき、組合せ療法として用いることもできる。
【０１４４】
さらに別の態様において、本発明は、本発明によるムテインを含む診断用キットまたは解析用キットを特徴とする。
【０１４５】
本発明の別の態様は、放射免疫療法（ＲＩＴ）により対象を治療する方法であって、本発明のムテイン、または本発明のムテインを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを包含する方法に関する。対象は、このような治療に適し、また、例えば、癌または別の細胞増殖性障害でありうる疾患または障害に罹患している場合がある。
【０１４６】
このような治療を必要とする対象は、少数の例示的な例だけを挙げれば、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ブタ、カニクイザルなどのサルなどの哺乳動物でありうる。
【０１４７】
さらに別の態様において、本発明は、対象のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング方法であって、前記対象に、本発明のムテイン、または本発明のムテインを含む医薬組成物を投与するステップを包含する方法を特徴とする。対象は、上記の通りに定義することができる。
【０１４８】
本発明は、以下の非限定的な実施例、および付属の図面によりさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】ｈＮＧＡＬについてデザインされるランダムライブラリーの概略表示と併せて、エンテロバクチンと複合体化されたｈＮＧＡＬの３次元構造を示す図である。
【図２】Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体の特性を示す図である。
【図３】Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体の結晶構造を示す図である。
【図４】放射免疫療法またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのプレターゲティングに、Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体を適用する可能性を示す図である。
【図１Ａ】エンテロバクチンと複合体化されたヒトｈＮＧＡＬ（ＰＤＢエントリー：１Ｌ６Ｍ、鎖Ａ、完全リガンドを含有する；Ｒｏｌａｎｄ  Ｓｔｒｏｎｇ博士のご厚意による）の３次元構造を示す図である。ポリペプチド骨格をライトグレーのリボンとして示す一方、天然リガンドを黒色で示す。初期「天然」ライブラリーにおいてランダム化された側鎖は、グレーで示す。
【図１Ｂ】１２のアミノ酸位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対し、同時的なランダム突然変異誘発を行うためのアセンブリーＰＣＲ戦略の概略表示を示す図である。フラグメント（ａ）をもたらす縮重オリゴデオキシヌクレオチドＰ１およびＰ２、また、フラグメント（ｂ）をもたらす縮重プライマーＰ３およびＰ４と共に、ＮＧＡＬの構造遺伝子を、ＰＣＲにおける鋳型として用いた。ランダム化された位置を、明色のバーで示す。両方のフラグメントを単離し、組み合わせて、ＰＣＲプライマーＰ５およびＰ６により実施される次回の増幅において適用した。２つの異なるＢｓｔＸＩ制限部位を、ファージディスプレイのためのプラスミドベクターであるｐＮＧＡＬ３５上において遺伝子カセットをサブクローニングするのに用いた。
【図２】Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体の特性を示す図である。
【図２Ａ】ＳｔｒｅｐタグＩＩによるアフィニティー精製およびゲル濾過後における、組換えによる野生型ｈＮＧＡＬ（レーン１、４）、および変異体Ｔｂ７．Ｎ９（レーン２、５）のほか、Ｃ２６（レーン３、６）に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。レーン１〜３は、２−メルカプトエタノールにより還元された試料を示す。非還元性条件下において、電気泳動の運動性がわずかながら増強されたことは、各場合において一重のジスルフィド結合が適正に形成されていることを示す。
【図２Ｂ】ＥＬＩＳＡにおける結合活性を示す図である。ＳｔｒｅｐタグＩＩに対して特異的な抗体により捕捉された精製ｈＮＧＡＬ変異体によりマイクロ滴定プレートをコーティングし、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＤＩＧ（小分子）コンジュゲートの希釈系列と共にインキュベートした後で、抗ＤＩＧ  Ｆａｂ／ＡＰおよびｐＮＰＰ基質により検出した（シグナル強度は、ｍＯＤ／分単位で与えられる）。このアッセイにおいて、組換えによる野生型ｈＮＧＡＬが示したシグナルは、無視できるものであった（図示しない）。最後の成熟ステップに由来するｈＮＧＡＬ変異体であるＣ２６（挿入図を参照されたい）は、著明な低密度（２．５対１０μｇ／ｍｌの捕捉抗体濃度による、１００対２５０ｎＭ）で固定化したことに留意されたい。
【図２Ｃ】競合ＥＬＩＳＡにおけるｈＮＧＡＬ変異体Ｃ２６の金属キレート結合活性を示す図である。このＥＬＩＳＡのセットアップは、パネル（Ｂ）で示したセットアップと同様であったが、可変濃度の遊離Ｍｅ・Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ−トリスキレート錯体、または（比較としての）Ｆｅ3+・エンテロバクチンの存在下におけるトレーサーとして、固定濃度のＹ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ−ＤＩＧ（タンパク質）コンジュゲートを用いた。
【図２Ｄ】Ｂｉａｃｏｒｅ測定器上で測定された、ｈＮＧＡＬ変異体Ｃ２６についての、リアルタイムにおける反応速度解析を示す図である。アミン化学反応により、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートを、ＣＭ５センサーチップに結合させ（ΔＲＵ＝２４０）、様々な濃度で、精製されたｈＮＧＡＬ変異体Ｃ２６を適用した。各場合において、測定されたシグナルをグレーの線で示す一方、曲線近似は黒色の線で示す。この曲線セットから決定される反応速度定数を、表３に列挙する（実施例１３）。
【図２Ｅ】流速２５μｌ／分のＢｉａｃｏｒｅ測定器上で測定された、ｈＮＧＡＬ変異体ＣＬ３１についての、リアルタイムにおける反応速度解析を示す図である。アミン化学反応により、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートを、ＣＭ５センサーチップに結合させ（ΔＲＵ＝３００）、表示される様々な濃度で、精製されたｈＮＧＡＬ変異体ＣＬ３１を適用した。各場合において、測定されたシグナルをグレーの線で示す一方、曲線近似は黒色の線で示す。
【図３】ポリペプチド骨格を有する、Ｙ・ＤＴＰＡ−トリスキレートと複合体化させたｈＮＧＡＬ変異体Ｔｂ７．Ｎ９の結晶構造を、ライトグレーのリボンとして示す一方、結合したＹ3+・ＤＴＰＡリガンドは、２Ｆo−Ｆc電子密度（配位子であるＤＴＰＡ、およびＹ3+に配位する１つの水分子の周囲の１σ軌道、ならびにＹ3+イオンの周囲の４σ軌道を輪郭とする）を含めた黒色のスティックによるモデルとして示す。結合した金属キレート錯体との接触距離である半径４Å以内に、８本のβストランド各々において少なくとも１つずつの、全体で１５の残基：Ｇｌｎ３３、Ａｒｇ３６、Ｔｈｒ５２、Ｇｌｎ５４、Ｖａｌ６６、Ａｌａ６８、Ａｒｇ７０、Ａｓｐ７７、Ｔｙｒ７８（骨格を介してだけ）、Ｌｅｕ７９、Ｍｅｔ８１、Ｐｈｅ８３、Ｔｙｒ１０６、Ｐｈｅ１２３、およびＴｈｒ１３６が見出されている。これらの残基の側鎖は、残基Ｓｅｒ１３４、および金属に結合する水への架橋を形成する、水素結合した水分子と共に、グレーのスティックとして示す。
【図４】放射免疫療法またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのプレターゲティングに、Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体を適用する可能性を示す図である。図４（Ａ）は、（ｉ）本発明による、Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するＮＧＡＬムテイン（黒色）、および（ｉｉ）腫瘍標的に対する特異性を有する、抗体／フラグメント、または代替的な結合タンパク質（例えば、別のリポカリンムテイン）を含む、二特異性融合タンパク質またはコンジュゲートが、血流に適用されることを示す。図４（Ｂ）は、融合タンパク質が腫瘍において蓄積される一方で、結合しなかった融合タンパク質は腎臓を経て消失することを示す。図４（Ｃ）：放射性核種−ＤＴＰＡ複合体を血流に適用することを示す図である。図４（Ｄ）：放射性核種−ＤＴＰＡ複合体に、腫瘍に結合した融合タンパク質が結合する一方で、過剰な複合体は腎臓により迅速に排出されることを示す図である。図４（Ｅ）：結合した放射性核種の局所的な崩壊により、腫瘍内における効果的な細胞死がもたらされ、また、バイスタンダー効果も活用されることを示す図である。図４（Ｄ*）：Ｍｅ・ＤＴＰＡ複合体の２価形を適用することにより、アビディティー効果を介して腫瘍部位においてより堅固な結合がもたらされ、これにより、放射性核種の半減期の延長が可能となることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１５０】
Ｍｅ・ＤＴＰＡ錯体コンジュゲートの調製
１ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3（＞９９．５％；ドイツ、カールスルーエ、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ社製）、ｐＨ８．３中で溶解させた、最大１０個のＬｙｓ側鎖のほか、共有結合するその遊離アミノ末端を示す、３６５ナノモル（５ｍｇ）のウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ；スイス、ブックス、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ社製）を、撹拌しながら４℃で一晩にわたり、１０μｌ  ＤＭＳＯ中に１．８マイクロモル（１．２８ｍｇ）のｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ（［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−ｔｒａｎｓ−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸・３ＨＣｌ；テキサス州、ダラス、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製）溶液と反応させた。これらの条件下においては、ＥＳＩ−ＭＳ（ＱｔｏＦ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｌｏｂａｌ；ドイツ、エシュボーン、Ｗａｔｅｒｓ  ＧｍｂＨ社製）により定量化された、タンパク質１分子当たり１つの活性化ＤＴＰＡ基を反応させることが典型的である。同様に、１５０ナノモル（１０ｍｇ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ドイツ、ミュンヘン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、７５０ナノモル（５２８μｇ）のｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡと結合させた。過剰な試薬を除去し、緩衝液を交換するため、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（＞９９．９％；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）／酢酸、ｐＨ５により、ＰＤ−１０カラム（ドイツ、フライブルク、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）上におけるゲル濾過を実施した（Ｗｕら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、５巻、１９２５〜１９３４頁（１９９７年））。次いで、同じ酢酸アンモニウム緩衝液中におけるＴｂＣｌ3（または、ＹＣｌ3、ＬｕＣｌ3、ＧｄＣｌ3、ＩｎＣｌ3）（すべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の等モル溶液（キャリアータンパク質に対して）を添加し、室温で１０分間にわたるインキュベーション後、結果として得られるコンジュゲートを、−８０℃で保存した。この手運を用いて、重量測定法により調製されたＴｂＣｌ3溶液（λEx＝２９５ｎｍ、λEm＝５４５ｎｍ；ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−３；フランス、ロンジュモー、Ｊｏｖｉｎ  Ｙｖｏｎ社製）による、ゲル濾過されたＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ試料の蛍光滴定を介して確認された、平均化学量論比１：１：１のＭｅ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートを得、これにより、飽和化が達成されるまで、十分に検出可能なＴｂ発光の増大が示された。
【０１５１】
まず、４℃で一晩にわたり、１０μｌ  ＤＭＳＯ中に９１５ナノモルのｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡを、９７０μｌの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．３中に溶解させた１８３ナノモルのキャリアータンパク質と反応させ、次いで、室温で１時間にわたり、２０μｌ  ＤＭＳＯ中に３６６ナノモルのジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＤＩＧ−ＮＨＳ；ドイツ、マンハイム、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を添加した後、上記の通り、ゲル濾過および金属イオンとの錯体形成を実施することにより、ＤＴＰＡおよびジゴキシゲニン（ＤＩＧ）との、ＲＮアーゼ（またはＢＳＡ）の二重コンジュゲートを調製した。
【０１５２】
室温で一晩にわたり、１００μＬの１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス；＞９９．９％；ドイツ、ダルムシュタット、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社製）／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に５２８μｇ（７５０ナノモル）のｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡをインキュベートし（チオ尿素の形成を達成し）、２２７μｇ（７５０ナノモル）のＹ3+を添加し、結果として７．５ｍＭの最終リガンド濃度をもたらすことにより、Ｙ−ＤＴＰＡ−トリスコンジュゲートを調製し、ｈＮＧＡＬ変異体と共結晶化させた。
【０１５３】
１００μｌ  ＤＭＦ中に２マイクロモルのｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ（［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−アミノフェニル）プロピル］−ｔｒａｎｓ−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸・４ＨＣｌ；Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製）を溶解させ、１．７μＬ（１２マイクロモル）のジイソプロピルエチルアミン（Ｆｌｕｋａ社製）を添加し、室温で一晩にわたり２マイクロモルのＤＩＧ−ＮＨＳと反応させることにより、ＤＩＧ−ＮＨＳとのＭｅ・ＤＴＰＡの直接的なコンジュゲートを調製した。１０μｌのこの溶液を、９８０μｌの酢酸アンモニウム緩衝液により希釈し、同じ緩衝液中に２００ナノモルのＹＣｌ3またはＴｂＣｌ3を１０μｌ添加した。
【実施例２】
【０１５４】
突然変異体ｈＮＧＡＬファージディスプレイライブラリーの構築
単一の不対チオール側鎖を除去するアミノ酸置換であるＣｙｓ８７Ｓｅｒ（Ｇｏｅｔｚら（２０００年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻、１９３５〜１９４１頁）のほか、合致しない突出を伴う２つの固有のＢｓｔＸＩ制限部位を導入するＧｌｎ２８ＨｉｓおよびＴｈｒ１４５Ａｌａも保有する、クローニングされたｃＤＮＡ（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔら（２００６年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１７６４巻、１６１〜１７３頁）に基づき、ｈＮＧＡＬ変異体の組合せライブラリーを発生させ、これにより、突然変異誘発させた中心遺伝子カセットの一方向クローニングを可能とした。公表された戦略（Ｂｅｓｔｅら（１９９９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、１８９８〜１９０３頁；Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１年）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻、２５７〜２７５頁）に従い、２段階で、この領域に対する突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるアセンブリーを実施した。第１に、それぞれ、アミノ酸位置３３／３６／４１、５２／５４、６８／７０／７９／８１、および１３４／１３６／１３８を対象とする、縮重オリゴデオキシヌクレオチドの対であるＰ１：５’−ＣＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＹＮＳ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＹＮＳ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＮＮＳ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡ−３’（配列番号１１）；およびＰ２：５’−ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＣＴＣ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＡＧ  ＡＴＳ  ＮＲＧ  ＧＣＳ  ＮＮＣ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣ−３’（配列番号１２）のほか；Ｐ３：５’−ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＮＮＳ  ＧＴＣ  ＮＮＳ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＮＮＳ  ＡＴＣ  ＮＮＳ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  Ｃ−３’（配列番号１３）；およびＰ４：５’−ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＣＳ  ＮＲＧ  ＡＧＳ  ＮＲＧ  ＡＴＳ  ＮＮＧ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  Ｇ−３’（配列番号１４）を用いて、２つのＤＮＡフラグメントを個別に増幅した。第２に、結果として得られる両方のＰＣＲ産物を、２つのフランキングプライマーであるＰ５：５’−ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  Ｇ−３’（配列番号１５）；およびＰ６：５’−ＧＴＴ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  ＴＣ−３’（配列番号１６）の存在下で混合した後、数サイクルにわたるＰＣＲにより、全長中心遺伝子カセットのアセンブリーおよび増幅を実施した。説明される通り（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら（２０００年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９７巻、１１０５〜１１２０頁）に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ドイツ、ザンクトレオン−ロート、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＭＢＩ社製）を用いて、すべてのＰＣＲステップを実施した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（ドイツ、ウルム）からＨＰＬＣグレードのオリゴデオキシヌクレオチドを購入し、必要に応じて、尿素ＰＡＧＥによりさらに精製した。ＢｓｔＸＩ（ドイツ、マンハイム、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により、結果として得られるＤＮＡライブラリーを切断し、遺伝子発現ベクターｐＡＳＫ７５（Ｓｋｅｒｒａ（１９９４年）、Ｇｅｎｅ、１５１巻、１３１〜１３５頁）に基づき、ＯｍｐＡシグナルペプチド、Ｔ７タグ、修飾された成熟ｈＮＧＡＬからなる融合タンパク質に続き、アンバーコドン、および線維状バクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩによるコートタンパク質のＣ末端フラグメント、すなわち、ビリン結合タンパク質について既に説明された（Ｂｅｓｔｅら、前出；Ｓｋｅｒｒａ、前出）フラグメントと同様のフラグメントをコードする、ファージミドベクターｐＮＧＡＬ３５上でクローニングした。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋら（１９８７年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５巻、３７６〜３７８頁）に、６μｇのＰＣＲ産物および５６μｇの消化されたプラスミドＤＮＡによるライゲーション混合物を電気穿孔させた後で、約６．５×１０10個の形質転換体を得た。
【実施例３】
【０１５５】
ファージディスプレイおよびコロニースクリーニングによる、金属キレート錯体Ｙ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡに対してアフィニティーを有するｈＮＧＡＬ変異体の選択
組換えファージミドを産生するため、ｐＮＧＡＬ３５ライブラリーにより形質転換した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅの培養物に、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（オランダ、アムステルダムズイドースト、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を感染させ、これを介して、公表されたプロトコール（Ｂｅｓｔｅら、前出；Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、前出）に従い、２５μｇ／Ｌのアンヒドロテトラサイクリン（ベルギー、ゲール、Ａｃｒｏｓ社製）により、ｈＮＧＡＬ−ｐＩＩＩ融合タンパク質の生合成を誘導した。
【０１５６】
各パニングサイクルにつき、ＰＢＳ（４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に約１０12個の組換えファージミドを、１００μｇ／ｍｌのＴｂ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートによりコーティングし、１．２ｍｌのブロッキング緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０［ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社製］、および２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ）により２時間にわたりブロッキングした、ＩｍｍｕｎｏＳｔｉｃｋｓ（ドイツ、ヴィースバーデン、Ｎｕｎｃ社製）と共に、１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔ（０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）による８回の洗浄ステップの後、結合したファージミドを、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２により１５分間にわたり溶出させた後、０．５Ｍトリス塩基により即時に中和させた。次回のパニング前に、ファージミドを滴定および再増幅した。７サイクル後、酸により溶出させたファージミドは、１回目のサイクル後に観察されたファージミド数と比較して１０００倍濃縮された。
【０１５７】
最後のパニングステップに由来するファージミド調製物のプールを用いて、突然変異させた遺伝子カセットを、ＯｍｐＡシグナルペプチド、Ｃ末端のＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｋｅｒｒａ（２００７年）、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２巻、１５２８〜１５３５頁）を有するｈＮＧＡＬコード領域に続く、アンバーストップコドンのほか、連鎖球菌属プロテインＧに由来するアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）遺伝子（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、前出）による融合体をコードするプラスミドｐＮＧＡＬ３８上において、ＢｓｔＸＩを介してサブクローニングした。次いで、フィルターサンドイッチによるコロニースクリーニングアッセイを実施し、これにより、親水性フィルター膜上に播種され、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）によりコーティングされた第２の基底膜上において機能的に捕捉された生細胞コロニーから、ｈＮＧＡＬ−ＡＢＤ融合タンパク質を放出させる（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、前出）。ＰＢＳ／Ｔ中に１５０ｎＭのＴｂ・ＤＴＰＡ−ＢＳＡ−ＤＩＧ（または対応するＲＮアーゼコンジュゲート）により、１時間にわたり、この膜をプローブした後、公表されているプロトコールに従い、抗ＤＩＧ  Ｆａｂ／アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、および発色性染色により現像した。この膜上における強い発色シグナルによりスポットを同定したら、第１のフィルターから対応するコロニーを採取して増殖させ、プラスミドの単離、および／または第２のコロニースクリーンにおける対照比較を行った。このステップでは、金属イオンにより帯電させないＤＴＰＡコンジュゲートを陰性対照として用い、また、微量金属イオン汚染から生じるエラーシグナルを回避するため、高純度の０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（＞９９．９％）、ｐＨ７．１を用いた。
【０１５８】
次いで、選択されたｈＮＧＡＬ変異体Ｔｂ７（配列番号２）のアフィニティーを改善するため、以下に記載の通りに、対応するＢｓｔＸＩカセットをエラープローンＰＣＲにかけた後、ファージミドディスプレイを行った。この場合、１０11個の組換えファージミドを、第１のサイクルでは２５μｇ／ｍｌのＴｂ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートにより、また、第２〜４のサイクルでは１０μｇ／ｍｌのＴｂ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートによりコーティングしたＩｍｍｕｎｏＳｔｉｃｋｓと共に、１時間にわたりインキュベートした。
【０１５９】
ｈＮＧＡＬ変異体Ｙｄ５（配列番号９）をアフィニティー成熟させるため、対応するＢｓｔＸＩカセットをエラープローンＰＣＲ（以下を参照されたい）にかけた後、ファージミドディスプレイであるが、これを制限的なオフレート条件下において行った。この目的で、１０12個のファージミドを、１０μｇ／ｍｌのＹ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートによりコーティングしたＩｍｍｕｎｏＳｔｉｃｋｓと共に、室温で１時間にわたりインキュベートした。８回にわたる洗浄ステップの後、該スティックを、室温で３０分間にわたり、ＰＢＳ中５００μＭの遊離金属キレート錯体Ｙ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ溶液８００μＬと共にインキュベートし、競合を達成した。ＰＢＳによる、さらに３回にわたる洗浄ステップの後、上記の酸性条件下において、結合した残りのファージミドを溶出させた。この場合、合計で３回にわたる選択サイクルを実施した。
【０１６０】
ある程度のアフィニティー成熟ステップを行うため、突然変異誘発させたｈＮＧＡＬライブラリーをコロニースクリーンに直接適用したが、Ｔｂ／Ｙ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ−ＤＩＧコンジュゲートの濃度を、５０ｎＭから５ｎＭに低下させることにより、厳密性を上昇させる条件下において行った。厳密性をさらに上昇させるため、２０ｎＭ〜１ｎＭの濃度において、厳密に１価のＴｂ／Ｙ・ＤＴＰＡ−ＤＩＧ小分子コンジュゲートを適用した。最後に、第２の膜を、まず、１０ｎＭ  Ｙ・ＤＴＰＡ−ＤＩＧと共に１時間にわたり、また、次いで、ＰＢＳ／Ｔによる３回にわたる洗浄後において、１０μＭの遊離錯体であるＹ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡと共にインキュベートした後、上記の通り、洗浄、検出、および染色することにより、競合コロニースクリーンを実施した。
【実施例４】
【０１６１】
エラープローンＰＣＲによるｈＮＧＡＬの突然変異誘発
ｄＮＴＰ類似体を有するｐＮＧＡＬ１５（Ｚａｃｃｏｌｏら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５５巻、５８９〜６０３頁）上においてクローニングされた、Ｔｂ７をコードする遺伝子のＰＣＲにより、第２世代の突然変異体ライブラリーの構築を実施した。２０μｌの反応混合物は、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２５μＭずつのｄＮＴＰ類似体である８−オキソ−ｄＧＴＰ（８−オキソ−２’デオキシグアノシン−５’−三リン酸）およびｄＰＴＰ（６−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミド−［４，５−ｃ］［１，２］−オキサジン−７−オン−５’−三リン酸）（いずれも、カリフォルニア州、サンディエゴ、ＴｒｉＬｉｎｋ社製）、５００μＭの従来型ｄＮＴＰ、０．５μＭのフランキングプライマーであるＰ５およびＰ６、２ｍＭのＭｇＣｌ2、および２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有した。１分間にわたる９２℃、１．５分間にわたる５５℃、および５分間にわたる７２℃の温度による１０サイクルを実施した。次いで、同じ条件下においてはあるが、類似体は伴わず、２０サイクルを用いて、容量１００μｌ中における、上記に由来する５μｌの試料により、再増幅を実施した。
【０１６２】
５０μＭのｄＰＴＰ、５０μＭの８−オキソ−ｄＧＴＰ、１ユニットの９°Ｎm  ＤＮＡポリメラーゼ（ドイツ、フランクフルトアムマイン、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）の存在下で、プライマーＰ５およびＰ６を用いるエラープローンＰＣＲにより、変異体Ｙｄ５のランダム化を同様に実施し、その後、上記の通り、再増幅を行った。突然変異体の９°Ｎm  ＤＮＡポリメラーゼは、野生型の該酵素と比較して１〜５％のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、５２８１〜５２８５頁）が、これを適用して、トランスバージョン頻度を増強した。
【０１６３】
ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、前出）により精製し、ＢｓｔＸＩにより切断し、ｐＮＧＡＬ３５上でサブクローニングして、ファージディスプレイにより選択した。
【実施例５】
【０１６４】
第１のｈＮＧＡＬ変異体におけるアミノ酸サブセットを標的ランダム突然変異誘発
位置７９および８０をランダム化するため、ｐＮＧＡＬ１５−Ｔｂ７を鋳型として用いて、上記の通りのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲにおいて、プライマーＰ５（配列番号１５）およびｍｕｔ７９ｂａｃｋ：５’−ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＳＮＮ  ＳＮＮ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＣ  Ａ  ＣＴＴ  ＣＴＴ−３’（配列番号１７）を適用した。プライマーｍｕｔ７９ｆｏｒ：５’−ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  Ｃ−３’（配列番号１８）およびＰ６（配列番号１６）を用いて、第２のＰＣＲフラグメントを発生させた。上記でさらに説明した通り、フランキングプライマーＰ５（配列番号１５）およびＰ６（配列番号１６）を用いて、両方のフラグメントをアセンブリングした。位置１２５および１２７をランダム化するため、ｐＮＧＡＬ１５−Ｔｂ７．Ｎ９を鋳型として用いるＰＣＲにおいて、プライマーＰ５（配列番号１５）およびｍｕｔ１２７ｂａｃｋ：５’−ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＴＧＳ  ＮＮＡ  ＡＣＳ  ＮＮＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ−３’（配列番号１９）を適用した。プライマーＰ５（配列番号１５）およびＰ６（配列番号１６）による再増幅を介して、ＰＣＲ産物を全長まで伸長させた。位置７７および１３６をランダム化するため、ｐＮＧＡＬ１５−Ｔｂ７．Ｎ９．Ｎ３４を鋳型として用いるＰＣＲにおいて、プライマーＰ５（配列番号１５）およびｍｕｔ７７ｂａｃｋ：５’−ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＳＮＮ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  Ｇ−３’（配列番号２０）を適用した。プライマーｍｕｔ７９ｆｏｒ（配列番号１８）およびｍｕｔ１３６ｂａｃｋ：５’−ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＡＧＧ  ＡＧＳ  ＮＮＧ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴ−３’（配列番号２１）を用いて、第２のＰＣＲフラグメントを作製した。ここでもまた、プライマーＰ５およびＰ６（配列番号１５および１６）を用いて、２つのフラグメントをアセンブリングした。
【０１６５】
位置３３、５４、および１３６を同時にランダム化するため、ｐＮＧＡＬ１５−Ｔｂ７．Ｎ９．Ｎ３４を鋳型として用いるＰＣＲにおいて、ｍｕｔ３３ｆｏｒ：５’−ＣＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＮＮＳ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＧＧＧ−３’（配列番号２２）、およびｍｕｔ５４ｂａｃｋ：５’−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＴＳＮ  ＮＧＧ  ＣＧＧ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  Ｇ−３’（配列番号２３）を適用した。プライマーｍｕｔ１３６ｆｏｒ：５’−ＡＴＣ  ＴＡＴ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  Ｇ−３’（配列番号２４）およびｍｕｔ１３６ｂａｃｋ（配列番号２１）を用いて、第２のＰＣＲフラグメントを増幅させた。ここでもまた、フランキングプライマーＰ５（配列番号１５）およびＰ６（配列番号１５および１６）を用いて、両方のＰＣＲフラグメントをアセンブリングした。いずれの場合も、変異誘発させたＤＮＡフラグメントを、次に行うコロニースクリーニング用にｐＮＧＡＬ３８にサブクローニングした。
【実施例６】
【０１６６】
可溶性タンパク質の産生および精製
組換えｈＮＧＡＬおよびその変異体は、いずれも、成熟ｈＮＧＡＬタンパク質およびＣ末端におけるＳｔｒｅｐタグＩＩとのＯｍｐＡシグナルペプチドの融合体をコードし、後者は、突然変異させた遺伝子カセットを一方向サブクローニングするための、２つの合致しないＢｓｔＸＩ制限部位を保有する、それぞれ、野生型ｈＮＧＡＬおよびその変異体のための、プラスミドｐＮＧＡＬ１４（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔら、前出）およびｐＮＧＡＬ１５による、アクリジニウムオレンジを用いてそのエピソームから取り出した大腸菌ＢＬ２１株（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ（１９８６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９巻、１１３〜１３０頁）またはＴＧ１−Ｆ株のｓｕｐＥ遺伝子型（大腸菌Ｋ１２  ＴＧ１（Ｇｉｂｓｏｎ（１９８４年）、「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ」、英国、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の誘導体）中におけるペリプラズム分泌を介して産生した。ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｋｅｒｒａ、前出）により該可溶性タンパク質をアフィニティー精製した後、ＰＢＳ緩衝液を用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）上におけるサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＦｌｉｎｇおよびＧｒｅｇｅｒｓｏｎ（１９８６年）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５５巻、８３〜８８頁）により確認し、タンパク質の濃度は、野生型ＮＧＡＬ（配列番号１）には２９，９３０Ｍ-1ｃｍ-1、また、その変異体であるＴｂ７（配列番号２）、Ｔｂ７．１４（配列番号４）、Ｔｂ７．Ｎ９（配列番号６）、Ｙｄ５（配列番号９）、およびＣ２６（配列番号１０）には２１，６８０Ｍ-1ｃｍ-1の計算による減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより決定した（Ｇｉｌｌおよびｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ（１９８１）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２巻、３１９〜３２６頁）。
【実施例７】
【０１６７】
ＥＬＩＳＡによるＭｅ・ＤＴＰＡ基に対する結合活性の測定
Ｃ末端においてＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｋｅｒｒａ、前出）を保有するｈＮＧＡＬ変異体を選択的に捕捉するため、９６ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐポリスチレンマイクロ滴定プレート（Ｎｕｎｃ社製）を、４℃で一晩にわたり、ＰＢＳ中に５〜１０μｇ／ｍＬのＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏ（ドイツ、ゲッティンゲン、ＩＢＡ社製）５０μｌによりコーティングし、室温で１時間にわたり、ＰＢＳ／Ｔ中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡによりブロッキングした。ＰＢＳ／Ｔによる３回にわたる洗浄ステップの後で、精製されたｈＮＧＡＬ変異体の２５０ｎＭ溶液５０μＬを、１時間にわたり、すべてのウェルに適用した。洗浄後、Ｍｅ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ−ＤＩＧコンジュゲートの希釈系列５０μＬを添加し、１時間にわたりインキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＰＢＳＴ中において１：１０００に希釈した抗ＤＩＧ  Ｆａｂ／ＡＰコンジュゲート５０μＬにより、１時間にわたり、結合したコンジュゲートを検出した後、１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中０．５ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート１００μｌの存在下においてシグナルを発生させた。４０５ｎｍにおける吸収の時間経過であるΔＡ／Δｔを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０リーダー（カリフォルニア州、サニーベール、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）により測定し、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェア（ペンシルベニア州、リーディング、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）により、データを式
ΔＡ＝ΔＡmax×［Ｌ］tot／（ＫD＋［Ｌ］tot）
［式中、［Ｌ］totは、適用したリガンドコンジュゲートの濃度を表し、ＫDは、解離定数である（ＶｏｓｓおよびＳｋｅｒｒａ（１９９７年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１０巻、９７５〜９８２頁）］により近似した。代替的に、同様の方式で競合ＥＬＩＳＡを実施し、０．０１６〜１００ｎＭの範囲で濃度を変化させる遊離Ｍｅ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡキレート錯体の存在下において、固定濃度２．５〜５ｎＭのＭｅ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ−ＤＩＧコンジュゲートを適用した。この場合、データを、さらなるパラメータとして曲線の傾きｐ（ヒル係数）を伴うＳ字形曲線の式
ΔＡ＝（ΔＡmax−ΔＡmin）／（１＋（［Ｌ］totfree／ＫD）p）＋ΔＡｍｉｎ
により近似した。
【０１６８】
代替的に、定常状態におけるアッセイ成分濃度をさらに低下させるため、蛍光光度法用のＡＰ基質を用いた。この場合、５μｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏ  ５０μｌにより黒色のＭａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）をコーティングした後、精製されたｈＮＧＡＬ変異体の１００ｎＭ溶液、および固定濃度２，５ｎＭのＹ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ−ＤＩＧを適用した。製造元により提供される緩衝液中に１ｍＭのＡｔｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ社製）５０μｌを添加することにより、シグナルを発生させた。ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−３マイクロプレートリーダー上において反応速度蛍光測定を実施し（λEx＝４３０ｎｍ、λEm＝５３５ｎｍ）、上記の通りに評価した。
【実施例８】
【０１６９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＭｅ・ＤＴＰＡ基に対する結合活性の測定
ランニングバッファーとしてＰＢＳ／ｔ（０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）を用いるＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘシステム（スウェーデン、ウプサラ、ＢＩＡｃｏｒｅ社製）上で、ｈＮＧＡＬ変異体のリアルタイム解析を実施した。標準的なアミン結合化学反応を用いて、１０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０中において５〜２７μｇ／ｍｌのＭｅ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲート溶液を、ＣＭ５チップ上に固定化し、結果として、リガンド密度２４０〜１８００共鳴単位（ＲＵ）を得た。濃度０．５〜５００ｎＭの精製されたｈＮＧＡＬ変異体を、５〜２５μｌ／分の流速で適用した。エタノールアミンにより活性化および遮断された対照チャネルについて測定された、対応するシグナルを差し引くことにより、センサーグラムを補正した。反応速度データの評価は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ  ３．０（Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９９１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４５巻、２２９〜２４０頁）による全体的近似により実施した。代替的に、適用されたタンパク質濃度に対して、会合相（２００秒以後）の終端におけるプラトー値をプロットし、ＥＬＩＳＡにおける場合（上記を参照されたい）と同様に近似し、平衡解離定数（ＫD）を決定した。
【実施例９】
【０１７０】
ｈＮＧＡＬ変異体の結晶化
１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対する透析後において、１０ｋＤａカットオフのＵｌｔｒａｆｒｅｅ濃縮器（ミネソタ州、ビレリカ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、ｈＮＧＡＬ変異体Ｔｂ７．１４（配列番号４）およびＴｂ７．Ｎ９（配列番号６）を、それぞれ１８および２５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、０．４５ｍｍのＣｏｓｔａｒ  Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心分離ユニット（ニューヨーク州、コーニング、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）により滅菌濾過した。いずれのタンパク質とも、ハンギングドロップ蒸気拡散法（Ｍｃ  Ｐｈｅｒｓｏｎ、「Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｒｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社）を用いて結晶化させた。Ｔｂ７．１４を結晶化させるには、アポタンパク質の１μｌ溶液を、２Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２００ｍＭ  Ｌｉ2ＳＯ4、１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０を含む１μｌのレザバー溶液と混合した。２０℃で６週間後において、非対称格子当たり３つずつの分子を伴う空間群Ｐ４1２1２の結晶が得られた。若干過剰量のＹ・ＤＴＰＡ−トリス（１．６ｍＭ）を添加した後において、最終タンパク質濃度２２ｍｇ／ｍＬ（１．１ｍＭ）のＴｂ７．Ｎ９（配列番号６）が結晶化された。この場合、１μｌのタンパク質／リガンド溶液を、１μｌの水により希釈し、２２％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ  ３３５０、１００ｍＭビス−トリス／ＨＣｌ、ｐＨ５．５を含む１μｌのレザバー溶液と混合した。２０℃で１週間後において、非対称格子当たり２本ずつのタンパク質鎖を伴う空間群Ｐ４1２1２の結晶が得られた。液体窒素中において凍結させる前に、２つのｈＮＧＡＬ変異体による結晶を、それぞれ、３０および２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを補充した、対応する沈殿溶液中に浸漬した。
【実施例１０】
【０１７１】
データの収集およびモデルの構築
Ｔｂ７．１４（配列番号４）アポタンパク質およびＴｂ７．Ｎ９（配列番号６）−リガンド複合体についての結晶回折データを、ＢＥＳＳＹ（ドイツ、ベルリン）ビームラインの、それぞれ、１４．１および１４．２により収集した（表１）。
【０１７２】
【表１】
0005711118.tif 000002
【０１７３】
ＭＯＳＦＬＭによりデータを加工し、ＳＣＡＬＡによりスケーリングし、また、ＴＲＵＮＣＡＴＥにより縮約化した（ＣＣＰ４（１９９４年）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ、５０巻、７６０〜７６３頁）。Ｔｂ７．１４アポタンパク質の分子置換は、非対称格子の３つの分子すべてを有する野生型のシデロカリンｈＮＧＡＬの構造（Ｈｏｌｍｅｓら（２００５年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１３巻、２９〜４１頁）（ＰＤＢエントリー１Ｘ７１）を用いて、プログラムＥＰＭＲ（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒら（２００１年）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、５７巻、１４７４〜１４７９頁）により実施した。次いで、Ｔｂ７．１４（配列番号４）の精密化モデルを用いて、プログラムＭＯＬＲＥＰ（ＣＣＰ４、前出）により、リガンド結合したＴｂ７．Ｎ９（配列番号６）の分子置換を実施した。
【０１７４】
プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら（１９９１年）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ、４７巻、１１０〜１１９頁）により、原子モデルを構築した。Ｔｂ７．１４（配列番号４）では、分子１の残基Ｓｅｒ３〜Ｌｅｕ４２、Ｐｒｏ４８〜Ｇｌｙ１７８、分子２の残基Ｓｅｒ３〜Ａｌａ４１、Ｇｌｎ４９〜Ａｓｐ１７７、および分子３の残基Ｔｈｒ４〜Ｌｅｕ４２、Ｐｒｏ４８〜Ａｓｐ１７７に電子密度が存在した（分解能２．５Åのとき）。Ｔｂ７．Ｎ９（配列番号６）では、分子１の残基Ａｓｐ６〜Ａｌａ４０、Ａｒｇ４３〜Ａｓｐ１７７、および分子２の残基Ｌｅｕ７〜Ａｌａ４０、Ｌｅｕ４２〜Ｇｌｙ１７８に電子密度が存在した（分解能２．０Åのとき）。Ｉｎ・ＤＴＰＡ錯体（ＣＳＤエントリーＭＯＱＶＯＤ）の結晶構造に基づき、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（カリフォルニア州、サンディエゴ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて、リガンドＹ・ＤＴＰＡ−トリスをモデル化し、ＰＲＯＤＲＧ（Ｓｃｈｕｔｔｅｌｋｏｐｆおよびｖａｎ  Ａａｌｔｅｎ（２００４年）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６０巻、１３５５〜１３６３頁）を用いて、対応するトポロジーパラメータおよび精密化パラメータを発生させた。いずれの結晶構造もＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら（１９９８年）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５４巻、９０５〜９２１頁）により精密化し、水分子を添加した。ＮＱ−Ｆｌｉｐｐｅｒ（ＷｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒおよびＳｉｐｐｌ（２００６年）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２２巻、１３９７〜１３９８頁）により、アスパラギン残基およびグルタミン残基のロータマーを確認した。ＰＲＯＣＫＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら（１９９３年）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．、２６巻、２８３〜２９１頁）およびＷＨＡＴ＿ＣＨＥＣＫ（Ｈｏｏｆｔら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３８１巻、２７２頁）により、精密化された構造モデルを検証した。ＤＳＳＰ（ＫａｂｓｃｈおよびＳａｎｄｅｒ（１９８３年）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２巻、２５７７〜２６３７頁）を用いて二次構造エレメントを割り当て、ＰＩＳＡ（ＫｒｉｓｓｉｎｅｌおよびＨｅｎｒｉｃｋ（２００７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７２巻、７７４〜７９７頁）によりタンパク質−リガンド間の接触面を計算した。ＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ（２００２年）、「Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ」、米国、カリフォルニア州、サンカルロス、ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により分子グラフィックスおよび構造重合せを行う一方で、ＬＩＧＰＬＯＴ（Ｗａｌｌａｃｅら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻、１２７〜１３４頁）によりタンパク質−リガンド間相互作用のダイアグラムを作製した。
【実施例１１】
【０１７５】
リポカリンランダムライブラリーからの、Ｍｅ・ＤＴＰＡ特異性を有するリポカリン変異体の選択
その天然リガンドであるエンテロバクチン（Ｇｏｅｔｚら、前出）およびそのクローニングされたｃＤＮＡ（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔら、前出）と複合体化したｈＮＧＡＬについての既知の結晶構造に基づき、本発明者らは、結合ポケット内における１２のアミノ酸位置に対するコドンを特異的にランダム化することにより、組合せライブラリーを構築した（図１、表２）。
【０１７６】
３つの正に帯電した側鎖であるＲ８１、Ｋ１２５、およびＫ１３４（Ｇｏｅｔｚら、前出）のうちの２つを含めた、リガンドポケットの底部にあり、天然の鉄シデロフォア錯体に近接する残基を、標的突然変異誘発に優先的に選択した。これらの位置は、βバレルの下方部分における疎水性残基の封入に影響を与えることなく、可能な限り深く空隙に達する、小型側鎖および大型側鎖の置換を共に許容すると予測された。
【０１７７】
【表２】
0005711118.tif 000003
【０１７８】
この戦略であれば、リガンドとしての昆虫リポカリンおよび有機分子について既に示された（Ｂｅｓｔｅら、前出；Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、前出）のと同様に、リガンドポケットを効果的に再整形して、より小分子のＤＴＰＡ金属キレート錯体(smaller DTPA metal chelate complex)に対する新たな特異性を達成すると予測できるだろう。
【０１７９】
既に開発されたＰＣＲによるアセンブリー戦略（Ｂｅｓｔｅら、前出；Ｓｋｅｒｒａ（２００１年）、前出）に適切な改変を加えてこれに従い、ｈＮＧＡＬの一次配列の大部分にわたり広がる、これらの位置に対するランダム突然変異誘発の調整を実現した。この目的で、まず、所望の位置に縮重ＮＮＳコドンを有するオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、各々が全体で４つのランダム化された残基のクラスターによる１対（＃１：３３、３６、４１；＃２：５２、５４；＃３：６８、７０、７９、８１；＃４：１３４、１３６、１３８）を含む、２つの遺伝子セグメントを個別に増幅した。結果として得られる２つのＰＣＲ産物（ＮＧＡＬ遺伝子の中央部において短い重複を包含した）を単離、混合し、次いで、２つの固有のＢｓｔＸＩ制限部位（上記を参照されたい）をもたらすフランキングプライマーを用いて、わずか数サイクルにわたる別の増幅においてアセンブリングした。線維状のファージディスプレイに適するファスミドベクター上における一方向クローニング（Ｓｋｅｒｒａ（２００１年）、前出）の後、約６．５×１０10個の個別の形質転換体による多様な分子ライブラリーを得た。
【０１８０】
このライブラリーを用いて、固定化されたリガンドによりコーティングされたＩｍｍｕｎｏＳｔｉｃｋｓ上におけるパニングを介し、Ｍｅ・ＤＴＰＡ特異的なｈＮＧＡＬ変異体を濃縮した。この目的で、化学的に反応性のイソチオシアン酸基を伴うリガンド誘導体であるｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡを、非特異的な結合活性を欠く頑健なキャリアータンパク質として用いられるリボヌクレアーゼＡ（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、前出）に共有結合させ、遷移金属イオンＴｂ3+により帯電させた。このランタニドは、（ｉ）その分子環境に強く依存する発光挙動を示し（Ｍａｒｔｉｎｉら（１９９３年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１１巻、４６７〜４７３頁；Ｃｏｒｎｅｉｌｌｉｅら、前出；ＨａｎｄｌおよびＧｉｌｌｉｅｓ（２００５年）、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、７７巻、３６１〜３７１頁）、これは、タンパク質−ＤＴＰＡコンジュゲートの適正な帯電を分析するのに有用であり、また、（ｉｉ）その半径が、90Ｙ3+、111Ｉｎ3+、および177Ｌｕ3+など、治療的または診断的に重要な放射性同位元素（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（２００２年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、４３巻、６９３〜７１３頁；Ｂｏｅｒｍａｎら（２００２年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、４４巻、４００〜４１１頁；Ｃｏｒｎｅｉｌｌｉｅら、前出；ＫｅｎａｎｏｖａおよびＷｕ、前出）とさほど異ならないので、これを、最初の選択実験のモデルイオンとして選択した。
【０１８１】
７サイクルにわたりファージミドディスプレイパニングを行った後、濃縮されたｈＮＧＡＬ変異体遺伝子のプールを別のプラスミド上においてサブクローニングし、フィルターサンドイッチによるコロニースクリーン（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、前出）にかけた。この実験において、ｈＮＧＡＬ変異体は、細菌のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）との融合体として大腸菌の生菌コロニーから分泌され、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）によりコーティングされたフィルター基底膜に即座に結合した。Ｔｂ・ＤＴＰＡおよびジゴキシゲニン基を伴うＲＮアーゼ二重コンジュゲートの結合について、機能的に固定化されたｈＮＧＡＬ変異体をプローブした。抗ＤＩＧ  Ｆａｂ／ＡＰコンジュゲートによるシグナル発生後、特異的なリガンド結合活性を有する複数のクローンを同定した。選択された１６のクローンに対する配列解析により、これらのうちの７つが同一の配列を有し、これをＴｂ７（配列番号２）と名付けた（表２）が、残りのクローンも極めて類似の配列を示し、Ｔｂ７と比較して、最大で４アミノ酸の変化であった。
【実施例１２】
【０１８２】
Ｍｅ・ＤＴＰＡキレート錯体に対する、選択されたｈＮＧＡＬ変異体のアフィニティーおよび特異性
ｈＮＧＡＬ変異体を、適切な発現ベクターにサブクローニングし、内因性エンテロバクチンを欠く大腸菌株ＢＬ２１のペリプラズム（Ｇｏｅｔｚら、前出）中における可溶性タンパク質として産生した。Ｃ末端におけるＳｔｒｅｐタグＩＩによる、該ペリプラズムタンパク質抽出物からの精製（ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｋｅｒｒａ、前出）、およびサイズ除外クロマトグラフィーにより、野生型タンパク質の組換えの場合（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔら、前出）と同様に、１Ｌの振とうフラスコ培養物当たり０．５〜３ｍｇのタンパク質がもたらされた。クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された純度は、９５％を超えた（図２）。
【０１８３】
これもまた選択手順において用いられた、Ｔｂ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼＡコンジュゲートについて、まず、ＥＬＩＳＡにより結合活性を調べた（「材料と方法」を参照されたい）。変異体Ｔｂ７が、見かけのアフィニティーが低濃度のナノモル範囲（７４．５±７．８ｎＭ）にある強力で金属依存的なシグナル（図２）を示したのに対し、野生型のｈＮＧＡＬは、測定可能な結合活性を示さなかった。
【実施例１３】
【０１８４】
ｈＮＧＡＬ変異体であるＴｂ７のアフィニティー成熟によるＭｅ・ＤＴＰＡ結合の改善
ｈＮＧＡＬ変異体であるＴｂ７のコード領域から出発して、デオキシヌクレオチド類似体（Ｚａｃｃｏｌｏら、前出）の存在下における中心遺伝子カセット（アミノ酸位置２５〜２９および１４１〜１４５における２つのＢｓｔＸＩ制限部位により挟み込まれる）に対するエラープローンＰＣＲにより、第２世代のライブラリーを構築した後、より厳密な条件（上記を参照されたい）下において、４サイクルにわたりファージミドディスプレイおよびコロニースクリーニングを行った。Ｔｂ・ＤＴＰＡ結合について最も強いシグナルをもたらすコロニースクリーンに由来する１０クローンに対するＤＮＡ配列決定により、それらのうちの９つが、位置６５、７１、７３、７４、７５、１１６、または１３５における１つまたは２つのさらなる置換と共に、アミノ酸置換Ｉｌｅ８０Ｔｈｒを保有することが示された。３つの変異体であるＴｂ７．１（Ｌｙｓ７５Ａｓｐ／Ｉｌｅ８０Ｔｈｒ）（配列番号３）、Ｔｂ７．１４（Ｉｌｅ８０Ｔｈｒ）（配列番号４）、およびＴｂ７．１７（Ｐｈｅ７１Ｓｅｒ／Ｌｙｓ７３Ｇｌｕ／Ｉｌｅ８０Ｔｈｒ）（配列番号５）は、ここでもまた、大腸菌ＢＬ２１株内における可溶性タンパク質として発現させた。上記と同様の精製後において、ＥＬＩＳＡにより、それらのリガンド結合特性を調べた（データは示さない）。これらの３つの変異体は、飽和時において、Ｔｂ７よりいくぶんか強いシグナル強度を示したが、Ｔｂ−ＤＴＰＡ錯体の結合についてのそれらの５０％最大濃度値は約１５ｎＭであり、したがって、それほど改善されたわけではなかった。
【０１８５】
第２段階では、位置７９／８０、１２５／１２７、および７７／１３６のほか、３３／５４／１３６におけるアミノ酸セットについて、逐次的な形で飽和突然変異誘発を実施した。これまでに同定されている有望な変異体の突然変異パターンに従い、また、野生型のｈＮＧＡＬ構造のほか、その変異体であるＴｂ７．１４（配列番号４；以下を参照されたい）の結晶構造にも基づく分子モデル構築を用いることにより、位置を選択した。この目的で、所望の位置（上記を参照されたい）において完全な縮重コドン（またはアンチコドン）配列を保有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの対を用いて、元のライブラリーの構築に対する戦略と同様の、ＰＣＲによるアセンブリー戦略を適用した。結果として得られる分子ライブラリーは、組合せの複雑性が低度であったので、前回と同様、直接コロニースクリーニングアッセイにかけたが、選択時にはより低度のリガンド濃度を用いた。位置７７／１３６および３３／５４／１３６を突然変異誘発するため、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＤＩＧコンジュゲートを標的として適用する（すなわち、Ｔｂ3+から、医学的により重要なＹ3+に転換させる）一方、Ｔｂ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ−ＤＩＧコンジュゲートにより、位置７９／８０および１２５／１２７における選択を実施した。
【０１８６】
各々に対するランダム突然変異誘発の後、基準としてのそのリガンドアフィニティー、ペリプラズム内における可溶性の発現収量、およびゲル濾過時における安定的な単量体の形成により、結果として得られる最良のクローンを選択した。この手順では、結合活性が改善された（最大で約３０倍）３つの有望な変異体が続いて出現した：Ｔｂ７．Ｎ９（Ａ７９Ｌ／Ｉ８０Ｔ）（配列番号６）、Ｔｂ７．Ｎ９．Ｎ３４（Ｓ１２７Ｑ）（配列番号７）、およびＹｄ５（Ｄ７７Ｅ／Ｔ１３６Ｓ）（配列番号９）（表２）。最後の変異体Ｙｄ５が、最良の結合活性を示し、ＫD値は３．５ｎＭであった（以下および表３を参照されたい）。
【０１８７】
【表３】
0005711118.tif 000004
【０１８８】
第３段階では、Ｙｄ５（配列番号９）ベースの、全中枢コードカセットに対してさらなるエラープローンＰＣＲ突然変異誘発を実施した後、競合的条件を用いることにより、解離反応速度を緩徐化する方向で、ファージディスプレイの選択を実施した。この目的で、ＩｍｍｕｎｏＳｔｉｃｋｓに吸着させたＹ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ標的によりパニングを実施し、洗浄後、結合したファージミドを、競合物質としての遊離金属キレート錯体であるＹ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡの５００μＭ溶液の存在下で、３０分間にわたりインキュベートした後、さらに３回の洗浄ステップを実施し、最後に酸により溶出させた。３サイクルにわたりファージミドを選択した後、ｈＮＧＡＬ変異体の濃縮プールをサブクローニングし、コロニースクリーニングアッセイにかけ、ここでもまた競合的条件を適用した。モル濃度が約１０００倍である非標識リガンドの存在下においても強い染色シグナルをもたらす１６の変異体を配列決定した。こうして、変異体Ｃ２６（配列番号１０）を単離したが、これは、５カ所のさらなる突然変異（Ｌ４２Ｐ／Ｐ４８Ｌ／Ｑ４９Ｌ／Ｉ５５Ｔ／Ｋ７５Ｍ）を示し、その大半はループ＃１に存在した。
【実施例１４】
【０１８９】
競合ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴による、選択されたｈＮＧＡＬ変異体の生化学的な特徴付け
Ｔｂ７のアフィニティー成熟から得られるｈＮＧＡＬ変異体を、大腸菌内において、可溶性タンパク質として、振とうフラスコのスケールで産生し、前回と同様に、ＳｔｒｅｐタグＩＩおよびＳＥＣにより精製した。選択されたすべての変異体が、優れた発現特徴を示し、ペリプラズム中における細胞抽出物から、安定的で完全な単量体タンパク質（図２Ａ）として精製され、振とうフラスコ培養物１リットル当たり０．５〜３ｍｇの最終収量を示した。
【０１９０】
まず、マイクロ滴定プレートに捕捉されたｈＮＧＡＬ変異体を用いて、ＥＬＩＳＡにより結合活性を比較し、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＤＩＧコンジュゲートの濃度を変化させながらそれらをインキュベートし、抗ＤＩＧ  Ｆａｂ／ＡＰコンジュゲートにより検出した（図２Ｂ）。Ｔ７ｂから出発してその最も新たに改善された誘導体に至るすべての変異体が、双曲線状の飽和曲線を示したのに対し、野生型のｈＮＧＡＬは、金属キレート錯体に対する結合活性を示さなかった（図示しない）。飽和曲線の振幅が増大する一方、５０％最大リガンド濃度（見かけのＫD値である７４±８ｎＭ（Ｔｂ７）、１０．８±１．２ｎＭ（Ｔｂ７．Ｎ９）、５．０±０．７ｎＭ（Ｙｄ５）、０．４３±０．０６ｎＭ（Ｃ２６）に対応する）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアフィニティー成熟が経過するにつれて低下した。
【０１９１】
Ｔｂ3+およびＹ3+のほか、他の３価金属イオンも用いて、遊離リガンド競合物質としてのＴｂ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼおよびＭｅ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡによりコーティングしたマイクロ滴定プレートを用いる競合ＥＬＩＳＡにおいて、小分子の可溶性キレートリガンド(small soluble chelate ligand)に対するｈＮＧＡＬ変異体の結合活性をさらに調べた。これらの測定は、Ｔｂ3+／Ｙ3+により帯電させたキレート複合体、とりわけ、アフィニティー成熟から得られる変異体Ｔｂ７．Ｎ９、Ｙｄ５、およびＣ２６の場合に、良好な阻害曲線を示した。これに対し、固定化されたリガンドに対するＴｂ７の結合活性は、適正な競合効果をもたらすにはおそらく低度に過ぎた。最後の変異体であるＣ２６は、異なる金属イオンを用いてより完全に解析された（図２Ｃ）。遊離金属キレートの５０％最大濃度から推定されるそのＫD値は、２．７±０．０３ｎＭ（Ｙ3+）、３．６±０．２４ｎＭ（Ｇｄ3+）、２．９±０．１７ｎＭ（Ｔｂ3+）、９．４±０．３３ｎＭ（Ｌｕ3+）、４４．７±２．５ｎＭ（Ｉｎ3+）、および９５±７ｎＭ（Ｂｉ3+）であった。したがって、操作されたｈＮＧＡＬ変異体、とりわけＣ２６が、小分子の金属キレートリガンドに対して強力な結合活性を示すのに対し、選択時におけるキャリアータンパク質として用いられたＲＮアーゼの関連は、さほどの役割を果たさない。
【０１９２】
最後に、Ｙ−ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼＡコンジュゲートを共有結合させたＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ−５チップを用い、精製された組換えタンパク質を適用するＳＰＲにより、ｈＮＧＡＬ変異体を解析した（表３）。ここでもまた、野生型のｈＮＧＡＬが著明な結合活性を示さなかったのに対し、Ｔｂ７については、中程度の結合シグナルが得られた（図示しない）。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアフィニティー成熟の異なる段階において単離されたその誘導体は、固定化された標的に対するアフィニティーの上昇を示し、Ｙａ６およびＹｄ５について約３ｎＭのより高値がもたらされた。これは、親のリポカリンムテインＴｂ７を約３０倍上回る改善を示す（ＫD＝７５〜１００ｎＭ）。ＫD値の改善は主に、リガンド解離の緩徐化から生じる。この点において、アフィニティーが高値である２つの変異体は異なり、Ｙｄ５が、著明に長い解離半減期（約２００秒間）を示す。競合的選択実験から得られる変異体Ｃ２６が、金属キレートリガンドに対して２８２ｐＭものアフィニティーを示したことは注目に値する（図２Ｄ）。
【実施例１５】
【０１９３】
Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体に対する結晶構造解析
ｈＮＧＡＬ変異体であるＴｂ７．１４（配列番号４）およびＴｂ７．Ｎ９（配列番号６）を、Ｘ線結晶構造解析にかけ、後者は、リガンドであるＹ・ＤＴＰＡ−トリスと複合体化させた。予測される通り、いずれのタンパク質も、その側面にαヘリックスを結合させた、８本のストランドによる逆平行βバレルを含む、典型的なリポカリンの折り畳みを示す（図３）。リポカリンのβバレルについて構造的に保存されている（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）、前出）、Ｔｂ７．１４およびＴｂ７．Ｎ９の５８の互いに同等な骨格位置（各々が鎖Ａに由来するＣα原子２８〜３７、５２〜５８、６３〜６９、７７〜８４、９１〜９４、１０６〜１１３、１１８〜１２４、１３３〜１３９）を重ね合わせた結果、０．３１Åの標準偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）が得られた。分子置換に用いられてきたトレンカム−３，２−ホポ（ＰＤＢエントリー１Ｘ７１）と複合体化させたＴｂ７．１４およびｈＮＧＡＬの鎖Ａについてのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．が０．２４Å（Ｃα原子７〜４０および４９〜１７７について）であったのに対し、Ｔｂ７．１４の非対称格子の鎖Ａ／ＢおよびＡ／Ｃ相互間のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．は、それぞれ０．４３Åおよび０．３５Åであった。Ｔｂ７．１４の鎖Ａ、およびエンテロバクチン（ＰＤＢエントリー：１Ｌ６Ｍ）と複合体化させたｈＮＧＡＬの鎖Ａについてのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．が０．２６Åであったのに対し、Ｔｂ７．Ｎ９の対応するｒ．ｍ．ｓ．ｄ．は、若干高値であり、０．３１Åであった。Ｔｂ７．Ｎ９の非対称格子内における鎖ＡおよびＢ相互間のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．は、０．５８Åであった。Ｔｂ７．１４およびＴｂ７．Ｎ９の側鎖の立体構造を比較したところ、大きな変化が示されたのは、残基Ｇｌｎ３３、Ａｒｇ３６、Ｇｌｎ４９、Ｇｌｎ５４、およびＴｈｒ１３６だけについてであった。Ａｒｇ３６の側鎖は、そのグアニジニウムのＮＨ１原子と、結合したＤＴＰＡのカルボン酸酸素（Ｏ２）との間において水素結合（３．３Å）を形成する。
【０１９４】
Ｔｂ７．Ｎ９との複合体において、結合したＹ・ＤＴＰＡ−トリスは、βバレルの開口側にある裂け目の一方の側に横たわり、その容量の約３分の１を満たす。空隙の残りの部分は、水素結合のネットワークを形成する９つの水分子により占められる。アミノ酸とランタニドイオンとは、直接には接触しない。該ＤＴＰＡ誘導体が、Ｙ3+の９つの配位部位のうちの８つを満たすのに対し、９つ目の部位は、水分子（ＨＯＨ９）により占められる。この水分子は、ＤＴＰＡのカルボン酸基のうちの２つと水素結合の距離にあり（ＨＯＨ９−ＬＩＧ  Ｏ１：２．９Å；ＨＯＨ９−ＬＩＧ  Ｏ９：３．０Å）、また、結晶構造解析により定義された別の水分子（金属イオン周囲の第２殻にある）とも水素結合の距離にあり（ＨＯＨ１４３：２．６Åの距離）、この水分子自体も、Ｓｅｒ１３４に水素結合する（ＨＯＨ１４３−Ｓｅｒ１３４  ＯＧ：２．９Å）。
【０１９５】
キレート錯体の全体は、シクロヘキサン環およびベンジル側鎖を含めたその炭化水素基と共に、βストランドＢ、Ｃ、およびＤ上において隣接する疎水性ストレッチの方向に配向している（図３）。Ｙ3+に配位する水分子を含めた極性のカルボン酸基は、βストランドＧ、Ｈ、およびＡの方向を指し、ここに、水分子により満たされた（野生型ｈＮＧＡＬの場合なら、以前は天然のシデロフォアにより占められていた）ギャップが形成される。
【０１９６】
予測されるキラリティーを示す電子密度により良好に定義される（ＢｒｅｃｈｂｉｅｌおよびＧａｎｓｏｗ（１９９２年）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ、１巻、１１７３〜１１７８頁）、配位子のＤＴＰＡ部分は、Ｉｎ3+・ＤＴＰＡ錯体の小分子結晶構造において既に見られている（Ｍａｅｃｋｅら（１９８９年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３０巻、１２３５〜１２３９頁）のと同様に、金属イオンが、捕捉された野球ボールを表す、野球グラブとして説明することができる。Ｙ3+イオンには、９つの原子が配位している。それらのうちの８つが、８座のキレート化配位子に由来し、５つがそのカルボン酸酸素（距離２．３〜２．５Å）に由来し、３つがそのアミン窒素（距離２．５〜２．７Å）に由来するのに対し、１つは、結合水の酸素（距離約２．７Å）である。天然のｈＮＧＡＬエンテロバクチン複合体の場合と同様、金属イオンとタンパク質側鎖との間には、直接の配位的接触が存在するわけではない。該ＤＴＰＡ誘導体のベンジル側鎖から突出するチオ尿素基と、コンジュゲートしたトリス部分とは、リポカリンの裂け目の外側に配向する。チオ尿素基の原子Ｎ４と、Ａｓｐ７７の２つのカルボン酸酸素との間には、２つの水素結合が存在する（ＯＤ１：距離３．４Å；ＯＤ２：距離２．９Å）。末端のトリスヒドロキシメチル基は、電子密度において部分的に定義されるに過ぎない（図３）。
【０１９７】
アポＴｂ７．１４およびＴｂ７．Ｎ９  Ｙ・ＤＴＰＡ−トリス複合体の結晶構造に由来する、個別に精密化されたタンパク質鎖を、エンテロバクチンと複合体化させた野生型のｈＮＧＡＬと構造的に重ね合わせると、１６という多数のアミノ酸変化にもかかわらず、全体の折り畳みは、極めて良好に保存されていることが示される。特に、βバレル自体、その閉口端における短いループ、その側面に結合したαヘリックス、また、該ポリペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端における多少とも可撓性の伸長部分さえも、ほぼ見分けがつかない（図３）。３つのタンパク質が、非同型空間群において結晶化され、したがって、近傍では結晶充填を異にするが、リポカリンファミリーの間で構造的に保存されている５８カ所のＣα位置のセット（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）、前出）は、それぞれ、０．２５６、０．４４０、０．２９０、０．３７１、および０．３８６Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．値を示す。
【０１９８】
ＤＴＰＡを結合させるためのリガンドポケットを再整形する目的で導入した側鎖置換の大半を保有する、βバレルの開口端にある４つのループのセットが、野生型のタンパク質と比較してそれらの形状を大部分において保持していたことは、さらにいっそう驚くべきことである。とりわけ、ループ＃２、＃３、および＃４（βストランドＣ／Ｄ、Ｅ／Ｆ、およびＧ／Ｈを連結する）は、立体構造が変化しないことを示した（ループ全体としての、個別のわずかなシフトを除く）。約１．２Åの最大シフトは、アポＴｂ７．１４構造の鎖Ｃのループ＃２の先端のＣα位置７３について見られるが、これは、結晶充填効果を反映する可能性が高い。
【０１９９】
これに対し、やや長いΩ型のループ＃１は、３つの異なる結晶構造の間で、顕著な骨格の可撓性を示す。とりわけ、アポＴｂ７．１４骨格の鎖ＡおよびＣの場合、残基４６の領域では、野生型のｈＮＧＡＬとほぼ同一であるのに対し、残基４１の周囲では著明な偏差が生じている。しかし、鎖Ｂの場合、残基４０と４９との間のセグメント全体が、ほぼ５Åシフトしている（骨格の場合）。Ｔｂ７．Ｎ９  ＤＴＰＡ複合体の２本の鎖の場合、このシフトはさらにより重大で、個別に異なっており、鎖Ｂの場合、残基４４の周囲で３10ヘリックスが１回転していると考えられる。アポＴｂ７．１４のＸ線構造では、このループの残基４３〜４７（鎖Ａ）、４２〜４８（鎖Ｂ）、および４３〜４７（鎖Ｃ）に電子密度が存在せず、このループが、この構造のほか、ＤＴＰＡ複合体の構造においても結晶による接触を形成しないことは注目に値する。したがって、ループ＃１の立体構造は、分子環境によるだけでなく、金属キレートリガンドの存在によっても影響されると考えられる。結合したＤＴＰＡリガンドとのより密接な相互作用をもたらし、また、おそらくは、より高度のアフィニティーももたらす骨格の立体構造変化を達成するためには、将来の突然変異研究がループ＃１に焦点を合わせるべきことを、この挙動は示唆する。
【０２００】
Ｙ・ＤＴＰＡ−トリスは、天然のリガンドであるエンテロバクチンより深くｈＮＧＡＬの空隙底部において結合し、元のランダムライブラリーにおいてランダム化された１２残基のほぼ中央部に位置する。ジエチレントリアミノ部分は、βストランドＣおよびＤ上の残基と主に相互作用し、ここで、シクロヘキサン環が、疎水性残基であるＶａｌ６６、Ｌｅｕ７９、およびＭｅｔ８１を背景に集塊するのに対し、ベンジル側鎖は、Ａｒｇ７０とＬｅｕ７９との間に挟まれ、そのトリス置換基と共に溶媒中に突出する。空隙の全体は、空隙底部の残基Ｖａｌ１１１、Ｖａｌ１２１、およびＰｈｅ１２３によるストレッチを除き、野生型のｈＮＧＡＬと同様（Ｇｏｅｔｚら、前出）、正に帯電する。結合したエンテロバクチンとのカチオンπ相互作用に関与すると説明された（Ｇｏｅｔｚら、前出）、正に帯電した３つの側鎖のうちの１つである、ｈＮＧＡＬのＡｒｇ７１が、Ｍｅｔ８１により置換されていることは、注目に値する。Ｌｙｓ１３４は、Ｓｅｒにより置換され、これにより、金属イオンのほか、ＤＴＰＡカルボン酸基のうちの２つ、および配位する水分子にも空間をもたらし、より遠隔の残基であるＬｙｓ１２５は、全体として負に帯電した金属キレート錯体との一般的な静電相互作用に寄与しうる。
【０２０１】
変異体Ｔｂ７．１４におけるＡｌａの１つと比較して、位置７９における残基Ｌｅｕのより大型の側鎖は、ＤＴＰＡのフェニルチオ尿素基に対するファンデルワールス接触の改善をもたらす。新規の側鎖であるＴｈｒ８０のＯＧ１（表２を参照されたい）と、Ｔｈｒ６７のＯＧ１との間のさらなる水素結合は、βバレルの外側におけるストランドＣ／Ｄの対合を局所的に安定化させる。Ｙ・ＤＴＰＡ−トリスの包埋表面積は５８６Å2であり、これは、ｈＮＧＡＬに結合したエンテロバクチンの場合とほぼ同じ包埋表面積である。
【０２０２】
結合した金属キレート錯体との接触距離である半径４Å以内に、８本のβストランド各々において少なくとも１つずつの、全体で１５の残基：Ｇｌｎ３３、Ａｒｇ３６、Ｔｈｒ５２、Ｇｌｎ５４、Ｖａｌ６６、Ａｌａ６８、Ａｒｇ７０、Ａｓｐ７７、Ｔｙｒ７８（骨格を介してだけ）、Ｌｅｕ７９、Ｍｅｔ８１、Ｐｈｅ８３、Ｔｙｒ１０６、Ｐｈｅ１２３、およびＴｈｒ１３６が見出されている。エンテロバクチンと比較して配位子のサイズが小型であるにもかかわらずこれが可能であるのは、それが、リポカリン空隙内により深く包埋されているためである。他方、４つのループとはほとんど接触が見られない。これらの残基のうち、９つの位置が、初期のｈＮＧＡＬランダムライブラリーにおける突然変異誘発を受けていた（表２を参照されたい）。置換Ａｓｐ７７Ｇｌｕが、アフィニティー成熟の後期段階で見出されたのに対し、ｈＮＧＡＬの元の残基に対応するのは、接触する側鎖のうちの４つの側鎖である６６、８３、１０６、および１２３だけである。それらが、Ｙ・ＤＴＰＡ複合体内における同じロータマーを依然として示していることは興味深い。これらのわずかな残存物を別にすれば、操作されたリポカリンの場合におけるＹ3+・ＤＴＰＡ錯体に対する結合方式は、ｈＮＧＡＬによるＦｅ3+・エンテロバクチンに対する結合方式とまったく異なっている。
【０２０３】
アフィニティー成熟過程の中間段階において、ｈＮＧＡＬ変異体について２つの結晶構造が得られたが、本発明者らによる最終的な変異体であるＣ２６に至る途上で得られたさらなる突然変異の少なくとも一部は、それらに基づいて理解することができる。本発明者らによるスクリーニング実験において繰り返し見出された置換Ｉｌｅ８０Ｔｈｒは、上述のＬｅｕ７９とＭｅｔ８１との間の極めて重要な位置において生じる。その側鎖は、βバレルの外側に提示され、ｈＮＧＡＬにおける元の残基と比較するとわずかにシフトしていると考えられ、したがって、その置換は、骨格形状における局所的な変化に影響を及ぼしうる。置換Ｓｅｒ１２７Ｇｌｎは、ループ＃４の先端で生じ、結合したリガンドとは極めて隔たっており、これは、アフィニティーに対するその効果が小さいことと符合する（表３）。変異体Ｃ２６について同定された５つのさらなる側鎖置換（４２、４８、４９、５５、７５）のうち、３つは、ループ＃１に位置しており、これは、大幅な立体構造変化をもたらし、このループを該リガンドに近づける可能性がある。位置５５における側鎖は、βバレルの外側で生じるが、位置８０の場合と同様、Ｉｌｅ残基がＴｈｒにより置換され、これは、ＤＴＰＡリガンドに接触する近傍のＧｌｎ５４に対して、骨格を介した同様の影響を及ぼしうる。さらに、ＭｅｔによるＬｙｓ７５の置換は、３つの連続するＬｙｓ残基によるストレッチの最後の位置であるループ＃２の先端で生じ、したがって、ＤＴＰＡ基の側鎖との相互作用に影響を及ぼしうる。
【実施例１６】
【０２０４】
ヘキサクロロノルボルネンハプテンに対するアフィニティーを有するｈＮＧＡＬ変異体の生成
実施例２で得られたｈＮＧＡＬライブラリーを用いて、ヘキサクロロノルボルネンハプテンに対するアフィニティーを有するムテインを生成させた。より詳細に述べると、用いられたヘキサクロロノルボルネンハプテンは、ヘキサクロロノルボルネンＮ−（ＣＨ2）5−ＣＯＯＨであり、その合成は、Ｈｉｌｖｅｒｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９年、１１１巻、９２６１〜９２６２頁により報告されており（Ｈｉｌｖｅｒｔらの図１における化合物２）、これは、［４＋２］ディールス−アルダー反応に関する遷移状態類似体を表す（また、Ｘｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、２８６巻、２３４５〜２３４８頁も参照されたい）。該ｈＮＧＡＬムテインの生成は、上記の実施例３で説明した実験手順に本質的に従い実施され、ヘキサクロロノルボルネンハプテンに対する結合活性を有するムテインを、ＥＬＩＳＡにより単離および特徴付けした。これらのＥＬＩＳＡ実験では、ＫDが少なくともマイクロモル単位であるムテインが生成されたことを示すシグナルが、選択されたｈＮＧＡＬムテインについて得られた（データは示さない）。また、このデータは、予備的なものではあるが、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列のわずか１２のアミノ酸残基３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８を突然変異誘発にかけることにより、抗体様の特性（これは、例えば、選択された任意のハプテンに対する結合アフィニティーを有することを意味する）を有するｈＮＧＡＬムテインを生成させるのに本発明が適することも示す。
【実施例１７】
【０２０５】
ファージディスプレイおよびコロニースクリーニングによる、金属キレート錯体Ｙ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡに対するｈＮＧＡＬ変異体Ｃ２６のアフィニティー成熟
ｈＮＧＡＬの変異体であるＣ２６のループ１（配列番号１０）をランダム化するため、ｐＮＧＡＬ１５−Ｃ２６プラスミドＤＮＡを鋳型として用いて、上記の通り、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲにおいて、プライマーＮＧＡＬ２６（配列番号２５：５’−ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＣ−３’）およびＬ１Ｍｂａｃｋ（配列番号２６：５’−ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＣＣＣ  ＴＧＣ−３’）を適用した。プライマーＬ１Ｍｆｏｒ（配列番号２７：５’−ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＧＡＧ  Ｃ−３’）およびＰ６（配列番号１６）を用いて、第２のＰＣＲフラグメントを生成させた。フランキングプライマーＮＧＡＬ２６（配列番号２５）およびＰ６（配列番号１６）を用いて、両方のフラグメントをアセンブリングした。該ＰＣＲ産物を、ｐＮＧＡＬ３５上でサブクローニングし、ファージミドディスプレイにより選択した。
【０２０６】
実施例３で説明した通り、ファージディスプレイパニングを実施したが、競合的条件およびＩｍｍｕｎｏＳｔｉｃｋｓに吸着させたＹ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ標的を用いた。８回にわたる洗浄後、第１のサイクルでは３０分間にわたり、第２のサイクルでは３時間にわたり、また、第３のサイクルでは２４時間にわたり、競合物質としての遊離金属キレート錯体であるＹ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡの４００μＭ溶液の存在下において、結合したファージミドをインキュベートした後、さらに３回にわたる洗浄ステップを実施し、最後に酸により溶出させた。３サイクルにわたりファージミドを選択した後、濃縮されたｈＮＧＡＬ変異体のプールをサブクローニングし、実施例３と同様にコロニースクリーニングアッセイにかけ、ここでも競合的条件を適用した。モル濃度が約１０００倍である非標識リガンドの存在下において強い染色シグナルをもたらす変異体を、配列決定した。この方式で、変異体Ｌ１（配列番号２８）を単離したが、これは、表４に記載される６つのさらなる突然変異（Ｒ４３Ｐ／Ｅ４４Ｖ／Ｋ４６Ｐ／Ｄ４７Ｅ／Ｋ５０Ｌ／Ｍ５１Ｌ）を示す。
【０２０７】
Ｙ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ  Ａコンジュゲートを共有結合させたＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ−５チップを用い、また、精製された組換えタンパク質を適用して、実施例８と同様、ＳＰＲにより新規のｈＮＧＡＬ変異体であるＬ１を解析した。測定による解離速度定数２．１１×１０-4秒-1が、ｈＮＧＡＬ変異体Ｃ２６と比較して３．４倍改善される一方、測定による結合速度定数２．９６×１０5Ｍ-1秒-1は、１０分の１に低下し、７１３ｐＭのＫDが結果として得られた。
【０２０８】
次いで、５０μＭのｄＰＴＰ、５０μＭの８−オキソ−ｄＧＴＰ、および１単位の９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、鋳型として、それぞれ、Ｃ２６およびＬ１をコードするプラスミドＤＮＡ、また、プライマーＰ５（配列番号１５）およびＰ６（配列番号１６）を用いるエラープローンＰＣＲにより、ｈＮＧＡＬ変異体のさらなるランダム化を実施した後、実施例４で説明した通りに再増幅した。２つの鋳型に関して１：１で混合したファージディスプレイライブラリーを調製し、競合的条件下において、上記の通り、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ標的に対するパニングに用いた。３サイクルにわたりファージミドを選択した後、濃縮されたｈＮＧＡＬ変異体のプールをサブクローニングし、コロニースクリーニングアッセイにかけ、ここでも競合的条件を適用した。強い染色シグナルをもたらす６つの変異体を、配列決定した。これらの変異体のすべては、見かけ上はＬ１の直接的な誘導体であり、Ｃ２６の誘導体ではなかった。これらのうち、クローンＣＬ３１（配列番号３１）を、最も有望なｈＮＧＡＬ変異体として単離したが、これは、表４に列挙される通り、Ｌ１と比較して、６つのさらなる突然変異（Ｖ４４Ｍ／Ｎ６５Ｄ／Ｇ８６Ｓ／Ｓ８７Ｐ／Ｓ９９Ｎ／Ｌ１０７Ｆ）を示す。
【０２０９】
対応する可溶性タンパク質の調製およびＳＰＲ解析の後、変異体ＣＬ３１は、４．４６×１０5Ｍ-1秒-1の結合速度定数、１．０６×１０-4秒-1の解離速度定数、および金属キレートリガンドに対する２３７ｐＭのアフィニティーで、パラメータの明白な改善を示した（図２Ｅ）。したがって、複合体形成の後、ＣＬ３１は、親のリポカリンムテインであるＣ２６（１６分）より著明に長い解離半減期（約１．８時間）を示す。他の選択された変異体も、同様の結合活性を示した（データは示さない）。
【０２１０】
【表４】
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【０２１１】
本明細書で例示的に説明された本発明は、本明細書で具体的に開示されていない１または複数のエレメント、１または複数の限定の不在下において実施することが適切でありうる。したがって、例えば、「含む」、「包含する」、「含有する」などの用語は、拡大的に、また、限定なしに読まれるものとする。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は、説明を目的として用いられているものであり、限定を目的として用いられているものではなく、また、このような用語および表現の使用において、示され、また、説明される特徴の同等物、またはその部分を除外する意図はなく、主張される本発明の範囲内では様々な改変が可能であると認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示してきたが、当業者が、本明細書で実施される本発明に対して改変および変更を行うことは可能であり、また、このような改変および変更は、本発明の範囲内にあると考えられることを理解されたい。本明細書では、本発明を、広範かつ一般的に説明してきた。一般的な開示内に該当する、より限定された種分類および亜属分類の各々もまた、本発明の部分を形成する。これには、除外される物質が本明細書で具体的に列挙されているかどうかに関わらず、属から任意の対象物質を除外する条件または否定的限定を伴う、本発明の一般的説明が含まれる。加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群との関係で説明される場合、本発明はまた、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群との関係でも説明されることを、当業者は認めるであろう。本発明のさらなる実施形態は、以下の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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