(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲからなる、ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドを含む、複数のペプチドを含む組成物。
【請求項３】
被験体において第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制または阻止するのに使用するための組成物であって、請求項１に記載のペプチドまたは請求項２に記載の組成物を含む、組成物。
【請求項４】
インビボにおいて第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制または阻止するための医薬品の製造における、請求項１に記載のペプチドまたは請求項２に記載の組成物の使用。
【請求項５】
被験体において血友病を処置するための組成物であって、請求項１に記載のペプチドまたは請求項２に記載の組成物を含む、組成物。
【請求項６】
前記被験体が血友病Ａを有し、第ＶＩＩＩ因子置換療法を受けているか、受けようとしている、請求項３または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記被験体が後天性血友病を有しているか、後天性血友病に罹患するリスクがある、請求項３または５に記載の組成物。
【請求項８】
前記被験体がＨＬＡ−ＤＲ２陽性である、請求項３および５〜７のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドに関する。特に、本発明は、少なくともそのコア配列が第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）から誘導可能であるペプチドに関する。これらのペプチドを用いることによって、例えば、血友病Ａの処置及び後天性血友病における第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の形成を低下又は阻止することができる。
【背景技術】
【０００２】
血友病
血友病は、血友病Ａ、血友病Ｂ（クリスマス病）及びフォン・ビレブランド病を含む一群の遺伝性血液障害に属する。
【０００３】
血友病では、必須凝固因子が部分的又は完全に欠乏しているために血液の凝固能が大幅に低下しており、その結果、出血時間が延長する。血友病Ａは第ＶＩＩＩ凝固因子の欠乏症であるのに対し、血友病Ｂは第ＩＸ凝固因子の欠乏症である。両疾患とも、Ｘ染色体上に欠陥遺伝子が見出されているので、こうした状態はＸ連鎖性である。血友病Ａは血友病Ｂよりも５倍多く認められる。
【０００４】
血友病は、生涯続く遺伝性遺伝子疾患であり、キャリアである女性及びこの状態を遺伝で受け継ぐ男性を侵す。新規診断結果の約３分の１は家族既往歴のない場合である。この疾患は世界中でみられ、全ての人種集団で生じている。英国では約６，０００人が血友病に罹患している。
【０００５】
血友病患者は、傷害を受けた後、長時間出血する。切り傷、擦り傷などの外傷は通常は大きな問題とならず、ある程度の圧をかけて患部を（例えば、絆創膏で）覆うことにより出血を止めることが可能な場合が多い。
【０００６】
大きな問題となるのは、関節、筋肉及び軟組織内への内出血であり、これは自発的に起こり得る。脳内出血などの内出血は、管理が極めて困難であり、致命的となり得る。関節内に繰り返し出血が起こると、急性疼痛を生じ、関節炎及び／又は身体障害をもたらす長期関節損傷の原因となり得る。
【０００７】
血友病に対する処置は、通常、不足している凝固因子の補充によって行われている。軽症又は中等症の血友病では、出血が生じたときに注射が行われればよい（オンデマンド治療）。しかしながら、重症血友病では、血液凝固を促進し、長期関節損傷が生じる可能性をできるだけ小さくするために規則的な予防的注射が行われればよい。
【０００８】
血友病Ａに対する凝固因子置換療法の深刻な事態となる恐れのある合併症は、第ＶＩＩＩ因子の凝固促進機能を中和する抗体の形成である。第ＶＩＩＩ因子インヒビターは、重症の血友病Ａを有する患者の約２５％に生じる。先天性血友病Ａ患者が遺伝的にＦＶＩＩＩ欠乏性であり得ることから、インヒビターの合成は、出血のエピソードを予防又は処置するために投与された外来蛋白質に対する同種免疫反応である。
【０００９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応において中心的な役割を果たしている。ＦＶＩＩＩは、抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）に取り込まれた後、蛋白質分解によりペプチド断片に分解される（非特許文献１）。その後、これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合してＡＰＣの表面に提示される。次いで、この複合体はＦＶＩＩＩに特異的なＣＤ４＋細胞のＴ細胞受容体によって認識される。適切な共刺激シグナルの存在下に、この認識により、最終的に、ＣＤ４＋細胞がＢ細胞による抗体の合成を誘導する。
【００１０】
インヒビター形成の発生率は、最初は第ＶＩＩＩ因子の処置回数とともに増加するが、曝露日数が５０日〜１００日の後には頭打ちになるように思われる。インヒビターの形成は中等症又は軽症の血友病よりも重症の血友病においてはるかによく起こり、第ＶＩＩＩ因子軽鎖内のいくつかの分子欠損、最も明瞭には大きな欠失及びナンセンス突然変異がインヒビター形成の素因となるように思われる。補充因子の濃度、種類（精製か組換えか）などのパラメータ及び処置歴も抗体産生の可能性に影響を及ぼすと考えられる。
【００１１】
インヒビターを有する血友病患者の管理は継続的課題である。脱感作技術を用いた免疫寛容の誘導（ＩＴＩ：ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は第ＶＩＩＩ因子に対する同種抗体を有する一部の患者において奏功している。この治療的アプローチは、因子置換療法を継続的に受けることを要し、従って長期にわたる方法である。
【００１２】
ＩＴＩは奏功しうるけれども、かなりの割合（約３０％）の患者がＩＴＩに反応しない。インヒビター力価の高い患者は処置に対して極めて反応しにくい。別の重要な要因は、ＩＴＩ開始時の年齢であり、患者が２０歳を超えている場合には奏功率が大きく減少する（非特許文献２）。
【００１３】
ＩＴＩ療法が奏功しない場合、インヒビターは一般に死ぬまでずっと存続し、また、このような患者は通常高反応者であるため、活性型プロトロンビン複合体濃縮製剤（ＦＥＩＢＡ（商標））、および組換え活性型ＦＶＩＩなどのＦＶＩＩＩバイパス製剤で出血のエピソードを処置することが必要である。しかしながら、このような薬剤の使用は、播種性血管内凝固症候群、急性心筋梗塞、肺動脈塞栓及び血栓症などの有害事象を伴う（非特許文献３）。
【００１４】
ＩＴＩに反応しない患者に対しては免疫抑制療法を用いることがある。処置には、非特異的に免疫系を標的にするシクロホスファミド、プレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリンなどの免疫抑制薬の投与が含まれる。こうした処置は全般的な免疫抑制に関連する副作用を示すことがある。
【００１５】
Ｂ細胞ＣＤ２０抗原に対するヒト化モノクロナール抗体であるＲｉｔｕｘｉｍａｂ（商標）を用いる選択的Ｂ細胞枯渇化に新たな関心が集まっている。しかしながら、この薬物で処置した一部の子供において注入反応、血清病及び日和見感染が発生している（非特許文献４）。
【００１６】
後天性血友病
後天性血友病は、百万人ごとに１乃至４人を侵す希な自己免疫状態である。この状態では、血友病を持って生まれたのではない被験体が第ＶＩＩＩ因子などの凝固因子類のうちの１種に対して抗体を作る。妊娠及び関節リウマチなどの自己免疫疾患並びに癌は後天性血友病を発症するリスクを増大させる可能性があると考えられている。凝固因子置換療法に反応して産生されるＦＶＩＩＩインヒビターと後天性血友病で産生されるこのインヒビターとでは、そうした産生をもたらす根底にある免疫機構に違いはあるが、これらの臨床的な発現は類似している。
【００１７】
後天性血友病患者は、獲得インヒビターが重症の出血合併症と関連付けられることが理由の一つであるが、２５％に迫る死亡率を示す。獲得自己抗体インヒビターの治療は、生命及び四肢を脅かすことが多い急性出血性合併症を制御又は予防し、副次的には自己抗体を根絶して正常な凝固を回復させる必要性に主として基づいたものである。
【００１８】
低力価（＜５ベセズダ単位）の自己抗体インヒビターと関連付けられる出血は、ＦＶＩＩＩ濃縮製剤を高用量で投与して効果的に処置することができる場合がある。ブタＦＶＩＩＩ濃縮製剤は、かつては後天性血友病関連の出血の重要な一次治療剤と考えられていた。何故なら、これは実験室で注入後ＦＶＩＩＩ凝固活性レベルを実際に測定する機会を与える唯一の置換療法であったからである。この製品は、ブタパルボウイルスによるブタ血漿プールの汚染のために２００４年に市場から撤去された。現在、「バイパス」剤が最もよく用いられているが、血栓形成の潜在的なリスクが存在し、各製品の有効性は約８０％に過ぎない。バイパス剤又はＦＶＩＩＩ補充が適切な止血をもたらすことができるように一時的にインヒビターの力価を十分低下させるには血漿分離交換法による血漿交換及び体外免疫吸着が必要と考えられる。
【００１９】
自己抗体インヒビターの根絶は、以下のような免疫抑制手段に依存している：（１）３乃至６週間で３０％乃至５０％の有効性を示す副腎皮質ステロイドの投与、（２）細胞毒性及び骨髄抑制化学療法剤、例えばシクロホスファミド、シクロスポリン、２−クロロデオキシアデノシンの使用、（３）免疫グロブリン静注による免疫調節及び（４）リツキシマブによる選択的Ｂリンパ球の枯渇化。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（商標）反応者はステロイドの同時使用を必要とすることがあり、再発しても再処置に反応することがある。
【００２０】
従って、血友病Ａの処置に伴う同種抗体産生及び後天性血友病における自己抗体産生を低下させる現在利用可能な全ての方法には欠点がある。このため、血友病Ａ及び後天性血友病における抗ＦＶＩＩＩ抗体の問題に対処する方法の改良が求められている。
【００２１】
本発明者らは、患者をＦＶＩＩＩ由来ペプチドで予め寛容化することによってＦＶＩＩＩインヒビター抗体の形成を阻止することが可能であることを見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｒｅｄｉｎｇほか、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ（２００６年）１２（補遺６）３０−３６
【非特許文献２】Ｈａｙほか、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ（２００５年）３２：１５−２１
【非特許文献３】Ａｃｈａｒｙａ及びＤｉＭｉｃｈｅｌｅ、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（２００６年）１９：５１−６６
【非特許文献４】ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ（２００７年）５：１４３−５０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
従って、本発明の第一の局面は、ＦＶＩＩＩに対する寛容を誘導又は回復させることができ、その配列の少なくとも一部がＦＶＩＩＩから誘導可能であるペプチドに関する。
【００２４】
第一の実施形態において、本発明は、以下のＦＶＩＩＩ由来配列：
【００２５】
【化１】
0005784009.tif 000002
のうちの一つを含むペプチドであって、以下の改変：
（ｉ）１つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸（複数可）の除去；
（ｉｉ）１つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸（複数可）を荷電した親水性アミノ酸（複数可）と置き換えること；および
（ｉｉｉ）１つまたは両方の末端（複数可）での荷電したアミノ酸の挿入
のうちの一つ以上を有し、その改変ペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得るペプチドを提供する。
【００２６】
「親」（非改変）ペプチドは、ＰＲＣＬＴＲＹＹＳＳＦＶＮＭＥまたはＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹであり得る。
【００２７】
第二の実施形態において、本発明は、配列
Ｘ（ａａ）ｎ−コア配列−（ａａ）ｍ
を含むペプチドであって、
ここで、Ｘは、荷電した親水性残基であり；
ａａは、アミノ酸であり；
ｎは、０と５との間の整数であり；
ｍは、０と５との間の整数であり；そして
上記「コア配列」は以下のＦＶＩＩＩ由来ペプチドの群：
【００２８】
【化２】
0005784009.tif 000003
から選択され、
そのペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得るペプチドを提供する。
【００２９】
例えば、上記ペプチドは、配列
ＸＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳ
を含み得る。
【００３０】
第三の実施形態において、本発明は、配列
Ｙ（ａａ）ｎ−コア配列−（ａａ）ｍＺ
を含むペプチドであって、
ここで、ＹおよびＺは、反対の極性を有する荷電したアミノ酸であり；
ａａは、アミノ酸であり；
ｎは、０と５との間の整数であり；
ｍは、０と５との間の整数であり；そして
上記「コア配列」は以下のＦＶＩＩＩ由来ペプチドの群：
【００３１】
【化３】
0005784009.tif 000004
から選択され、
そのペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得るペプチドを提供する。
【００３２】
例えば、上記ペプチドは、配列：
ＹＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＺ
を含み得る。
【００３３】
第三の実施形態において、例えば、Ｙは、正に荷電したアミノ酸であり得、Ｚは、負に荷電したアミノ酸であり得る。あるいは、Ｙは、負に荷電したアミノ酸であり得、Ｚは、正に荷電したアミノ酸であり得る。
【００３４】
荷電した親水性アミノ酸は、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、またはＲであり得る。正に荷電したアミノ酸は、例えば、Ｋ、Ｈ、またはＲであり得る。負に荷電したアミノ酸は、例えば、ＤまたはＥであり得る。
【００３５】
本発明の第一の局面のペプチドは、例えば、配列ＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲを含み得るか、または配列ＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲからなり得る。
【００３６】
第二の局面において、本発明は、本発明の第一の局面の１つまたはそれより多くのペプチド（複数可）を含む薬学的組成物のような組成物を提供する。上記組成物は、ＦＶＩＩＩに対する寛容を誘導又は回復させることができる、ＦＶＩＩＩから全体的または部分的に誘導可能な複数のペプチドを含み得る。
【００３７】
この組成物は、これら複数のペプチドが個別、引き続き（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）、連続又は同時投与のために別々に提供されるキットの形態であり得る。
【００３８】
本発明のペプチド又は組成物は第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の発生を抑制、低減又は阻止するのに用いることができる。
【００３９】
また、本発明は、第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の発生を抑制、低減又は阻止するための医薬品の製造におけるそのようなペプチド又は組成物の使用を提供する。
【００４０】
また、本発明は、被験体において第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の発生を抑制、低減又は阻止するための方法であって、この被験体にそのようなペプチド又は組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００４１】
この被験体はＦＶＩＩＩ欠乏性であり得る。具体的には、この被験体は血友病Ａを有していてもよく、第ＶＩＩＩ因子置換療法を受けているか、受けようとしていてもよい。
【００４２】
あるいは、この被験体は、後天性血友病を有しているか、後天性血友病に罹患するリスクがあってもよい。
【００４３】
第ＶＩＩＩ因子インヒビターは、ＨＬＡ−ＤＲ２を発現している個体においてより高頻度に存在する。従って、本発明の方法により処置される被験体はＨＬＡ−ＤＲ２陽性であるとすることができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
以下のＦＶＩＩＩ由来配列：
【化１２】
0005784009.tif 000005
のうちの一つを含むペプチドであって、以下の改変：
（ｉ）１つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸（複数可）の除去；
（ｉｉ）１つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸（複数可）を荷電した親水性アミノ酸（複数可）と置き換えること；および
（ｉｉｉ）１つまたは両方の末端（複数可）での荷電したアミノ酸の挿入
のうちの一つ以上を有し、改変された該ペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得る、ペプチド。
（項目２）
配列
Ｘ（ａａ）ｎ−コア配列−（ａａ）ｍ
を含むペプチドであって、
ここで、Ｘは、荷電した親水性残基であり；
ａａは、アミノ酸であり；
ｎは、０と５との間の整数であり；
ｍは、０と５との間の整数であり；そして
該「コア配列」は以下のＦＶＩＩＩ由来ペプチドの群：
【化１３】
0005784009.tif 000006
から選択され、
該ペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得る、ペプチド。
（項目３）
配列：
ＸＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳ
を含む、項目１に記載のペプチド。
（項目４）
配列：
Ｙ（ａａ）ｎ−コア配列−（ａａ）ｍＺ
を含むペプチドであって、
ここで、ＹおよびＺは、反対の極性を有する荷電したアミノ酸であり；
ａａは、アミノ酸であり；
ｎは、０と５との間の整数であり；
ｍは、０と５との間の整数であり；そして
該「コア配列」は以下のＦＶＩＩＩ由来ペプチドの群：
【化１４】
0005784009.tif 000007
から選択され、
該ペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得る、ペプチド。
（項目５）
配列：
ＹＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＺ
を含む、項目４に記載のペプチド。
（項目６）
Ｙが、正に荷電したアミノ酸であり、Ｚが、負に荷電したアミノ酸である、項目４または５に記載のペプチド。
（項目７）
Ｚが、ＫまたはＲである、項目４、５、または６に記載のペプチド。
（項目８）
ＸまたはＹが、ＤまたはＥである、項目２〜７のいずれかに記載のペプチド。
（項目９）
配列ＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲを含む、前述の項目のいずれかに記載のペプチド。
（項目１０）
配列ＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲからなる、前述の項目のいずれかに記載のペプチド。
（項目１１）
前述の項目のいずれかに記載の１つまたはそれより多くのペプチド（複数可）を含む、複数のペプチドを含む組成物。
（項目１２）
インビボにおいて第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制または阻止するのに使用するための項目１〜１０のいずれかに記載のペプチドまたは項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
インビボにおいて第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制または阻止するための医薬品の製造における、項目１〜１０のいずれかに記載のペプチドまたは項目１１に記載の組成物の使用。
（項目１４）
被験体において第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制または阻止するための方法であって、該被験体に項目１〜１０のいずれかに記載のペプチドまたは項目１１に記
載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（項目１５）
被験体において血友病を処置するための方法であって、該被験体に項目１〜１０のいずれかに記載のペプチドまたは項目１１に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（項目１６）
前記被験体が血友病Ａを有し、第ＶＩＩＩ因子置換療法を受けているか、受けようとしている、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
前記被験体が後天性血友病を有しているか、後天性血友病に罹患するリスクがある、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１８）
前記被験体がＨＬＡ−ＤＲ２である、項目１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１−１】図１ａは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋マウス由来のリンパ節細胞（ＬＮＣ：ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌ）のリコール反応（ｒｅｃａｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｃｅ）を示す。ＦＶＩＩＩペプチド１乃至６に対するＬＮＣ増殖。図１ｂは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋マウス由来のリンパ節細胞（ＬＮＣ：ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌ）のリコール反応を示す。ＦＶＩＩＩペプチド７乃至１２に対するＬＮＣ増殖。
【図１−２】図１ｃは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋マウス由来のリンパ節細胞（ＬＮＣ：ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌ）のリコール反応を示す。ＦＶＩＩＩペプチド１、３及び１１に対するＬＮＣ増殖。
【図２】図２ａは、ＦＶＩＩＩ由来ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンの代表的な例を示す。図２ｂは、ＦＶＩＩＩ由来ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンの代表的な例を示す。
【図３−１】図３ａは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウス由来ＬＮＣのリコール反応を示す。図３ｂは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウス由来ＬＮＣのリコール反応を示す。
【図３−２】図３ｃは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウス由来ＬＮＣのリコール反応を示す。
【図４−１】図４は、ＦＶＩＩＩ由来ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンの代表的な例を示す。
【図４−２】図４は、ＦＶＩＩＩ由来ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンの代表的な例を示す。
【図５】ａ）ＤＮＩＭＶ及びｂ）ＰＲＣＬＴに特異的なＦＶＩＩＩ−／−クローンを示す。
【図６】ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡでの初回刺激の前にペプチドで３回ｉ．ｐ．処置したＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋マウスのＦＶＩＩＩに対するＬＮＣのリコール反応を示す。
【図７−１】図７ａは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の決定を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。図７ｂは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の決定を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。
【図７−２】図７ｃは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の決定を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。
【図７−３】図７ｃは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の決定を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。
【図７−４】図７ｃは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の決定を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。
【図８】ＦＶＩＩＩ由来ペプチドＰＲＣＬＴ、ＤＮＩＭＶ又はこれらの両者の混合物で処置したＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウスにおけるＦＶＩＩＩに反応したリンパ節細胞のＩＦＮ−ガンマ産生を示す。
【図９】ＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲ（ＥＤＮＩＭＶ）または対照ペプチド（ＤＮＩＭＶ）のいずれかで刺激されるナイーブマウスまたは寛容化（ｔｏｌｅｒｉｓｅｄ）マウスからの反応を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
ペプチド
本発明はペプチドに関する。
【００４６】
「ペプチド」という用語は、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間で通常ペプチド結合により一方が他方に結合した一連の残基、通常、Ｌ−アミノ酸、を意味する通常の意味で用いている。この用語には改変ペプチド及び合成ペプチド類似体を含めている。
【００４７】
本発明のペプチドは、化学的方法を用いて作製することができる（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ．  Ｍｉｋｏｓ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、Ｂｅｒｌｉｎ）。例えば、ペプチドは、固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ  ＪＹほか（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４）で合成し、樹脂から切断し、調製的高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）によって精製することができる。自動合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３  １  Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用い、メーカーから提供された使用説明書に従って達成することができる。
【００４８】
あるいは、このペプチドは、組換え法によって、又は第ＶＩＩＩ因子からのペプチドの切断後の１つまたは両方の末端の改変によって作製することができる。ペプチドの組成はアミノ酸分析又は配列決定（例えば、エドマン分解法）によって確認することができる。
【００４９】
実際的には、このペプチドが示し得る種々の他の特性がある。例えば、このペプチドが治療上有用であるためにインビボで十分安定であることも重要である。このペプチドのインビボでの半減期は少なくとも１０分、３０分、４時間又は２４時間とすることができる。
【００５０】
また、このペプチドはインビボで良好な生物学的利用能を示すこともできる。このペプチドは、インビボにおいて、これが然るべき障害なしに細胞表面のＭＨＣ分子に結合することを可能にするコンフォメーションを維持することができる。
【００５１】
コア残基
適応免疫反応では、Ｔリンパ球は蛋白質抗原の内部エピトープを認識することができる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は蛋白質抗原を取り込み、これを短いペプチド断片に分解する。ペプチドは細胞内の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ又はＩＩ分子に結合して細胞表面に運ばれ得る。ＭＨＣ分子との組合せで細胞表面に提示されると、このペプチドはＴ細胞によって（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介して）認識され得、この場合、このペプチドはＴ細胞エピトープである。
【００５２】
このように、エピトープとは、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子のペプチド結合溝に結合し、Ｔ細胞によって認識されることが可能である、抗原から誘導可能なペプチドである。
【００５３】
最小エピトープとは、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子のペプチド結合溝に結合し、Ｔ細胞によって認識されることが可能である、エピトープから誘導可能な最短のペプチドである。所与の免疫原性領域において、全てが最小エピトープを含むが、それらの隣接領域が異なるエピトープとして機能する重複ペプチドの「入れ子セット」を生じることが通常可能である。
【００５４】
同様に、切断ペプチドに対する反応を測定することによって特定のＭＨＣ分子：Ｔ細胞組合せの最小エピトープを同定することが可能である。例えば、重複ライブラリ内の１乃至１５番目の残基を含むペプチドに対して反応が得られる場合、両端において切断されたセット（即ち、１乃至１４、１乃至１３、１乃至１２など及び２乃至１５、３乃至１５、４乃至１５など）を用いて最小エピトープを同定することができる。
【００５５】
本発明は、以下のリスト：
【００５６】
【化４】
0005784009.tif 000008
から選択されるＦＶＩＩＩの「コア残基」配列を含むペプチドを提供する。
【００５７】
こうしたコア残基配列は、実施例に示されるように、各領域の最小エピトープを代表するかこれを含むように、ＨＬＡ−ＤＲ２結合アルゴリズムを用いて予測された。
【００５８】
アピトープ
本発明者らはこれまでに、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合してＴ細胞に提示されるペプチドの能力とインビボで寛容を誘導するペプチドの能力との間に関連があることを決定した（ＷＯ０２／１６４１０）。ペプチドは、更にプロセシング（例えば、トリミング）されなければ長すぎてＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合できないか、又は不適切なコンフォメーションで結合するのであれば、インビボで寛容原性とはならないであろう。他方、このペプチドが適切な大きさ及び立体構造であることによりそのままＭＨＣペプチド結合溝に結合してＴ細胞に提示されるのであれば、このペプチドは寛容誘導に有用であると予測することができる。
【００５９】
従って、ペプチドがインビトロで更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合し、Ｔ細胞に提示されうるかどうかを調べることによって、ペプチドの寛容原能力を調査することが可能である。
【００６０】
本発明のペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞からの反応を刺激することができる点において、アピトープ（抗原プロセシング非依存性エピトープ）である。このようなアピトープは、ＷＯ０２／１６４１０に記載されているルールに基づいた方法に従ってＦＶＩＩＩに対する寛容をもたらすと予測することができる。
【００６１】
本発明のペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合することができる任意の長さとすることができる。通常、本発明のペプチドはＭＨＣクラスＩＩに結合することができる。
【００６２】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、普通７乃至１３、より普通には８乃至１０アミノ酸長である。このペプチドの結合は、ペプチドの主鎖内の原子と全てのＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝内のインバリアント部位との接触によって両端で安定化されている。ペプチドのアミノ及びカルボキシ末端と結合する溝の両端にインバリアント部位がある。ペプチドの長さの変動については、ペプチド主鎖内の、多くの場合、必要な柔軟性を与えるプロリン又はグリシン残基におけるよじれによって説明される。
【００６３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、普通８乃至２０アミノ酸長、より普通には１０乃至１７アミノ酸長であり、さらに長くする（例えば、最大４０アミノ酸長）ことも可能である。こうしたペプチドは、（ＭＨＣクラスＩペプチド結合溝と異なって）両端が開いているＭＨＣクラスＩＩのペプチド結合溝に沿って伸長されたコンフォメーションで横たわる。このペプチドは、主に主鎖の原子をペプチド結合溝に沿って並ぶ保存残基と接触させることによって所定の位置に保持される。
【００６４】
ペプチド配列
本発明の第一の実施形態は、以下のＦＶＩＩＩ由来配列：
【００６５】
【化５】
0005784009.tif 000009
のうちの一つを含むペプチドであって、以下の改変：
（ｉ）１つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸（複数可）の除去；
（ｉｉ）１つまたはそれより多くの疎水性アミノ酸（複数可）を荷電した親水性アミノ酸（複数可）と置き換えること；および
（ｉｉｉ）１つまたは両方の末端（複数可）での荷電したアミノ酸の挿入
のうちの一つ以上を有し、その改変ペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得るものとするペプチドに関する。
【００６６】
標準のアミノ酸の列挙を、その側鎖の極性、電荷、および疎水性親水性指数（ｈｙｄｒｏｐｈａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ）ととも表１に示す。
【００６７】
表１
【００６８】
【表１】
0005784009.tif 000010
疎水性アミノ酸としては、Ｇ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ならびに芳香族アミノ酸ＦおよびＷが挙げられる。疎水性アミノ酸は、配列の末端または配列内から除去され得る。
【００６９】
荷電した親水性アミノ酸としては、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｈ、およびＥが挙げられる。疎水性アミノ酸は、配列の末端または配列内で荷電した親水性アミノ酸と交換され得る。
【００７０】
１つまたはそれより多くのアミノ酸（複数可）は、配列のＮ末端で挿入され得る。有利に、電荷双極子（ｃｈａｒｇｅ  ｄｉｐｏｌｅ）を作り出すために、正に荷電したアミノ酸は、１つの末端において挿入または置換され得、負に荷電したアミノ酸は、もう１つの末端において挿入／置換され得る。
【００７１】
親配列の改変は、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に対するペプチドの結合、Ｔ細胞によって認識されるその能力、またはアピトープ（ＭＨＣ分子に結合し、更なる抗原プロセシングを受けることなくＴ細胞に提示される）として働くその能力を、顕著には損なうべきではない。このことは、公知の抗原提示アッセイおよびＴ細胞ハイブリドーマを用いて容易に試験され得る。
【００７２】
本発明の第二の実施形態は、配列
Ｘ（ａａ）ｎ−コア配列−（ａａ）ｍ
を含むペプチドであって、
ここで、Ｘは、荷電した親水性残基であり；
ａａは、アミノ酸であり；
ｎは、０と５との間の整数であり；
ｍは、０と５との間の整数であり；そして
上記「コア配列」は以下のＦＶＩＩＩ由来ペプチドの群：
【００７３】
【化６】
0005784009.tif 000011
から選択され、
そのペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得るペプチドに関する。
【００７４】
配列（ａａ）ｎまたは（ａａ）ｍは、４アミノ酸と５アミノ酸との間の任意の配列であり得る。例えば、上記ペプチドは、配列：
ＸＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳ
を有し得、
その場合、ｎ＝３およびｍ＝０である。
【００７５】
本発明の第三の実施形態は、配列
Ｙ（ａａ）ｎ−コア配列−（ａａ）ｍＺ
を含むペプチドであって、
ここで、ＹおよびＺは、反対の極性を有する荷電したアミノ酸であり；
ａａは、アミノ酸であり；
ｎは、０と５との間の整数であり；
ｍは、０と５との間の整数であり；そして
上記「コア配列」は以下のＦＶＩＩＩ由来ペプチドの群：
【００７６】
【化７】
0005784009.tif 000012
から選択され、
そのペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得るペプチドに関する。
【００７７】
例えば、ペプチドＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲについて
Ｙ＝Ｅ；
（ａａ）ｎ＝ＤＮＩ
ｍ＝０；および
Ｚ＝Ｒ
である。
【００７８】
このペプチドは、得られるペプチドが更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるという条件で、これらのコア残基配列を、Ｎ及び／又はＣ末端での別の隣接配列（それぞれ（ａａ）ｎおよび（ａａ）ｍ）と共に含むことができる。
【００７９】
こうしたＮ及び／又はＣ末端の隣接配列はヒトＦＶＩＩＩ中のコア残基配列の両端に隣接する配列から誘導可能なものとすることができる。
【００８０】
ＡＰＩＰＳ
ａ）（ＣＤ２８に対する抗体の存在又は非存在下の）固定ＡＰＣ、
ｂ）（ＣＤ２８に対する抗体の存在又は非存在下の）クラスＩ又はＩＩ  ＭＨＣ分子含有脂質膜及び
ｃ）（ＣＤ２８に対する抗体の存在又は非存在下の）プレートに結合させた状態の精製天然又は組換えＭＨＣ
を含む種々の抗原プロセシング非依存性提示系（ＡＰＩＰＳ：ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）が知られている。
【００８１】
これらの系は全て抗原をＭＨＣ分子との組合せで提示することができるが、抗原をプロセシングすることはできない。これらの全ての系において、このプロセシング機能は存在しないか、無効化されている。これによって、ペプチドが更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合してＴ細胞に提示され得るかどうかを調べることが可能となる。
【００８２】
Ｔ細胞の反応を検討するための固定ＡＰＣの使用については、当該分野では、例えば、ポリペプチド内の最小エピトープを切断ペプチドに対する反応を測定することによって調べる研究（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄほか（１９９６年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１０３５−１０４３）において公知である。ＡＰＣは、例えば、ホルムアルデヒド（通常、パラホルムアルデヒド）又はグルタルアルデヒドを用いて固定することができる。
【００８３】
脂質膜（平面膜でもリポソームでもよい）は、人工脂質を用いて調製することができ、又はＡＰＣからの細胞膜／ミクロソーム画分であり得る。
【００８４】
使用に当たっては、ＡＰＩＰＳを組織培養プレートのウェルに加える。次いで、ペプチド抗原を加え、ＡＰＩＰＳのＭＨＣ部分へのこのペプチドの結合を選択したＴ細胞株又はクローンの添加によって検出する。Ｔ細胞株又はクローンの活性化については、当該分野で公知の方法のいずれかによって、例えば、３Ｈ−チミジン取り込み又はサイトカイン分泌によって測定することができる。
【００８５】
第ＶＩＩＩ因子
本発明のペプチドのコア配列は、第ＶＩＩＩ因子から誘導可能である。１つまたは両方の隣接配列（（ａａ）ｎおよび（ａａ）ｍ）もまた、第ＶＩＩＩ因子から誘導可能であり得る。
【００８６】
第ＶＩＩＩ因子は血液凝固の内因性経路に関与するが、第ＶＩＩＩ因子は、Ｃａ＋２及びリン脂質の存在下に第Ｘ因子を活性型Ｘａに変換する第ＩＸａ因子の補因子である。
【００８７】
第ＶＩＩＩ因子遺伝子は、選択的スプライシングによる２種の転写産物を生じる。転写産物変異体１は、血漿中を循環し、フォンウィルブランド因子と結合して非共有結合複合体を形成する大きな糖蛋白質、イソ型ａ、をコードしている。この蛋白質は複数の切断事象を起こす。転写産物変異体２は、主として第ＶＩＩＩｃ因子のリン脂質結合ドメインからなる推定小蛋白質（イソ型ｂ）をコードしている。この結合ドメインは凝集活性に必須である。
【００８８】
ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の１８６，０００塩基対の完全な配列は１９８０年代半ばに解明された（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒほか（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、３２６−３３０）。同時に、アミノ酸２，３５１個の完全な配列をコードしているＤＮＡクローンを用いて培養哺乳動物細胞で生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子が作製された（Ｗｏｏｄほか（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３０−３３７）。ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸２，３５１個の完全な配列を配列番号１として示した。
【００８９】
本発明のペプチドのコア残基は、第ＶＩＩＩ因子から誘導可能である。必要に応じて、上記隣接配列（複数可）もまた、それらが天然のＦＶＩＩＩポリペプチドにおいて、コア配列に隣接する配列と同じ場合、第ＶＩＩＩ因子から誘導可能であり得る。この配列は、第ＶＩＩＩ因子の配列の切断から取得可能とすることができ、又は取得することができる。
【００９０】
溶解度
本発明の第一の実施形態のペプチドは、以下のペプチド：
【００９１】
【化８】
0005784009.tif 000013
のうちの一つの改変された形態である。
【００９２】
これらのペプチドは、アピトープとして働くことがすでに示されており、インビボで寛容原性である（実施例および国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３９９６号を参照のこと）。
【００９３】
ペプチドが媒介する寛容誘導において、溶解度が重要な考慮点であることは、それ以来明らかになっている。溶解度は、以下：
（ｉ）１つまたはそれより多くの疎水性残基の除去；
（ｉｉ）１つまたはそれより多くの親水性残基を添加するための添加／置換
（ｉｉｉ）電荷双極子を作り出すために、いずれか任意の末端に正に荷電したアミノ酸および負に荷電したアミノ酸を置くこと
のうちの一つ以上によって改善され得る。
【００９４】
改変ペプチドは、親（非改変）ペプチドよりも可溶性であり得る。上記改変ペプチドは、親ペプチドよりも２倍、３倍、４倍、または５倍大きい溶解度を有し得る。上記ペプチドは、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で可溶性であり得る。
【００９５】
寛容
Ｔ細胞エピトープは、自己のものであれ外来性であれ任意の抗原に対する適応免疫反応において中心的な役割を果たしている。過敏性疾患（例えば、アレルギー、自己免疫疾患及び移植片拒絶反応）においてＴ細胞エピトープが果たしている中心的な役割については実験モデルを使用することによって明らかにされている。炎症性又はアレルギー性疾患は、（Ｔ細胞エピトープの構造に基づいた）合成ペプチドをアジュバントとの併用で注射することにより誘導することが可能である。
【００９６】
これに対して、特定の抗原に対する免疫寛容は、可溶型のペプチドエピトープを投与することによって誘導可能であることが分かっている。可溶性ペプチド抗原の投与は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ−多発性硬化症（ＭＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）のモデル）（Ｍｅｔｚｌｅｒ及びＷｒａｉｔｈ（１９９３年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１１５９−１１６５、Ｌｉｕ及びＷｒａｉｔｈ（１９９５年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１２５５−１２６３並びにＡｎｄｅｒｔｏｎ及びＷｒａｉｔｈ（１９９８年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１２５１−１２６１）並びに関節炎、糖尿病及びブドウ膜網膜炎の実験モデル（上記のＡｎｄｅｒｔｏｎ及びＷｒａｉｔｈ（１９９８年）で概説されている）において疾患を抑制する効果的な手段であることが明らかにされている。また、これはＥＡＥにおいて進行中の疾患を処置する手段となることが明らかにされている（上記のＡｎｄｅｒｔｏｎ及びＷｒａｉｔｈ（１９９８年））。
【００９７】
寛容とは、抗原に対して反応しないことである。自己抗原に対する寛容は免疫系の本質的な特徴であり、これが失われると、自己免疫疾患が生じ得る。適応免疫系は、それ自身の組織内に含まれる自己抗原の自己免疫性攻撃を回避しつつ膨大な種類の感染性因子に対して反応する能力を維持しなければならない。これは、未熟なＴリンパ球の胸腺におけるアポトーシス細胞死に対する感受性によってかなりの程度まで制御されている（中枢性寛容）。しかしながら、全ての自己抗原が胸腺において検出される訳ではないので、自己反応性胸腺細胞の死は不完全なままである。従って、末梢組織の成熟自己反応性Ｔリンパ球によって寛容が獲得されるメカニズムも存在する（末梢性寛容）。中枢性及び末梢性寛容のメカニズムについては、Ａｎｄｅｒｔｏｎほか（１９９９年）（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６９：１２３−１３７）に総説されている。
【００９８】
血友病Ａでは、患者は第ＶＩＩＩ因子の遺伝子に欠陥を有する。このことは、第ＶＩＩＩ因子は免疫系によって「自己」抗原として認識されないことを意味している。従って、凝固因子置換療法時に第ＶＩＩＩ因子を投与すると、この外来タンパク質に対する同種免疫反応が生じ、ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の産生を招く。
【００９９】
本発明のペプチドは、ＦＶＩＩＩを治療的に投与する場合にこれが免疫反応を誘導せず、ＦＶＩＩＩインヒビターが生じないように、第ＶＩＩＩ因子に対する寛容を誘導することができる。
【０１００】
後天性血友病は、第ＶＩＩＩ因子に対する寛容が機能しなくなっている自己免疫疾患である。この場合、本発明のペプチドを投与することによりこの自己蛋白質に対する寛容を回復させ、病因となる免疫反応を抑えることができる。
【０１０１】
寛容は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも一部においてアネルギーが誘導されることから生じ、又はこれを特徴とすることができる。Ｔ細胞を活性化するためには、ペプチドはＴ細胞に２つのシグナルを送達することができる「プロフェッショナル」ＡＰＣと結合する必要がある。第一のシグナル（シグナル１）は、ＡＰＣの細胞表面のＭＨＣ−ペプチド複合体によって送達され、ＴＣＲを介してＴ細胞に受け取られる。第二のシグナル（シグナル２）は、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの、ＡＰＣの表面の共刺激分子によって送達され、Ｔ細胞の表面のＣＤ２８によって受け取られる。Ｔ細胞は、シグナル２の無い状態でシグナル１を受け取ると、活性化されないばかりか、アネルギーの状態になると考えられている。アネルギーのＴ細胞は、その後の抗原投与に対して不応性であり、他の免疫反応を抑制できる場合がある。アネルギーのＴ細胞はＴ細胞寛容の媒介に関与していると考えられている。
【０１０２】
理論にとらわれることを望まないが、ＭＨＣ分子と共に提示される前にプロセシングを必要としているペプチドは、成熟した抗原提示細胞により処理される必要があるので寛容を誘導しないと、本発明者らは予測する。（マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞などの）成熟抗原提示細胞は抗原をプロセシングすることができるが、シグナル１及び２の両方をＴ細胞に送達することもでき、その結果、Ｔ細胞の活性化がもたらされる。他方、アピトープは未熟ＡＰＣのクラスＩＩＭＨＣに結合することができると考えられる。従って、これは共刺激なしにＴ細胞に提示され、その結果、Ｔ細胞のアネルギー及び寛容がもたらされると考えられる。
【０１０３】
勿論、アピトープは成熟ＡＰＣの細胞表面においてＭＨＣ分子に結合することもできる。しかしながら、免疫系は成熟ＡＰＣよりも未熟ＡＰＣをより豊富に含んでいる（樹状細胞の１０％未満が活性化されると示唆されている、Ｓｕｍｍｅｒｓほか（２００１年）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：２８５−２９５）。従って、アピトープに対する初期状態（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、活性化ではなくアネルギー／寛容である。
【０１０４】
ＦＶＩＩＩに対する寛容の誘導は、当該分野で周知の技術によって
（ｉ）ＦＶＩＩＩ阻害性抗体、
（ｉｉ）ＦＶＩＩＩに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩ阻害性抗体を分泌することができるＢ細胞
のレベルの低下を探索することによってインビボでモニターすることができる。
【０１０５】
ペプチド投与によって寛容が誘導されると、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能が低下することが分かっている。また、この細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の産生は下方制御されるが、ＩＬ−１０の産生は増加する。ペプチドにより寛容が誘導された状態のマウスにおいてＩＬ−１０を中和すると、疾患への罹患性が完全に元に戻ることが分かっている。寛容状態では、ＩＬ−１０を産生し、免疫調節を媒介する制御性細胞集団が存続することが提唱されている（Ｂｕｒｋｈａｒｔほか（１９９９年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１６２５−１６３４）。
【０１０６】
従って、寛容の誘導は、
（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導（これはその後のインビトロでのＦＶＩＩＩ投与によって検出することができる）
（ｂ）（ｉ）増殖の低下、
（ｉｉ）ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生の下方制御、及び
（ｉｉｉ）ＩＬ−１０の産生増加
を含むＣＤ４＋Ｔ細胞集団の変化
を含む種々の方法によってモニターすることもできる。
【０１０７】
本明細書に用いている「寛容原性の」という用語は寛容を誘導することができることを意味している。
【０１０８】
組成物
また、本発明は、本発明による１つまたはそれより多くのペプチド（複数可）を含む薬学的組成物などの組成物に関する。
【０１０９】
このペプチドは、複数のペプチド、例えば、２種、３種、４種、５種又は６種のペプチドを含むことができる。
【０１１０】
本発明の組成物は予防用又は治療用とすることができる。
【０１１１】
この組成物は、予防用に投与する場合、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応の発生を低減又は阻止することができる。免疫反応のレベルは、この組成物で処置しなかった場合に患者で得られたであろうレベルより低い。「低減する」という用語は、この組成物で処置しなかった場合に患者で観察されたであろう反応に対して（又は同じ時間枠にわたって未処置の患者で観察された反応に対して）５０％、７０％、８０％又は９０％低減などの免疫反応の部分的な低減が観察されることを意味している。「阻止する」という用語は、ＦＶＩＩＩに対する測定可能な免疫反応が認められないことを意味している。
【０１１２】
治療用に投与する場合、この組成物は、ＦＶＩＩＩに対して既に進行中の免疫反応を抑制することができる。「抑制する」という用語は、ペプチド処置の前のレベル又は処置がなされなかった場合に同時点で観察されたであろうレベルと比較した場合の進行中の免疫反応のレベルの低下を意味する。
【０１１３】
本発明の組成物で処置することにより
（ｉ）ＦＶＩＩＩ阻害性抗体、
（ｉｉ）ＦＶＩＩＩに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩ阻害性抗体を分泌するＢ細胞
のうちのいずれか又は全てのレベルの低下をもたらすことができる。
【０１１４】
これらの因子全ての検出は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどの、当該分野で公知の技術によって実施することができる。
【０１１５】
本発明の組成物で処置することにより、ＦＶＩＩＩに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞においてアネルギーを追加的に又は代わりに、もたらすことができる。アネルギーは、例えばその後にインビトロでＦＶＩＩＩを投与することにより検出することができる。
【０１１６】
ＦＶＩＩＩに対する全ての免疫反応が病因となる訳ではないことを念頭に置いておくことは重要である。インヒビターを有しない血友病患者（Ｍｏｒｅａｕほか（２０００年）Ｂｌｏｏｄ  ９５：ｐ．３４３５−４１）及び健康な献血者の約１５％（Ａｌｇｉｍａｎほか（１９９２年）８９：ｐ．３７９５−９）において非阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体を見出すこともある。
【０１１７】
ＦＶＩＩＩインヒビターは、正常血漿中のＦＶＩＩＩに対する患者の血漿の不活化能を試験するベセズダ凝固アッセイのＮｉｊｍｅｇｅｎの変法によって検出することができる。ベセズダ単位は、血漿ＦＶＩＩＩ活性の５０％を中和する抗体の量と定義され、０．６ＢＵ以上の力価は抗体の存在を示唆する。
【０１１８】
インヒビターは、一般に、そのレベルが＜５ＢＵであれば低力価に、≧５ＢＵであれば高力価に分類される。
【０１１９】
循環ＦＶＩＩＩ阻害性抗体のレベルは、患者が処置を受けなかった場合に観察されたであろう抗体レベルの９０％、７５％、５０％、２０％、１０％、５％にまで低下させることができる。
【０１２０】
循環ＦＶＩＩＩ阻害性抗体のレベルは、５ＢＵ、４ＢＵ、３ＢＵ、２ＢＵ、１ＢＵ又は０．５ＢＵにまで低下させることができる。
【０１２１】
本発明のペプチド及び組成物は、患者における凝固を助けるのに使用することができる治療的に投与されるＦＶＩＩＩの量及び割合を増大させることができる。これは、ある割合のＦＶＩＩＩをその治療的作用を発揮することから効果的に排除することができるＦＶＩＩＩインヒビターが低減するためである。本発明のペプチド又は組成物は、利用可能なＦＶＩＩＩの量を、例えば、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％増加させることができる。
【０１２２】
従って、本発明のペプチド及び組成物は、患者における凝固を助けるために投与する必要のあるＦＶＩＩＩの量を低減させることができる。
【０１２３】
製剤化
この組成物は溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製することができ、注射に先立って液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。この調製物は乳化してもよく、ペプチドはリポソームに封入することができる。有効成分は、医薬用として許容可能であり、この有効成分と適合性の賦形剤と混合することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びこれらの組合せである。
【０１２４】
さらに、必要に応じて、この組成物は、湿潤剤又は乳化剤及び／又はｐＨ緩衝剤などの補助物質を少量含有することができる。緩衝塩としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩が挙げられる。塩酸及び／又は水酸化ナトリウムをｐＨ調整に用いることができる。安定化にはスクロース、トレハロースなどの二糖類を用いることができる。
【０１２５】
この組成物が複数のペプチドを含む場合、これらのペプチドの相対比率はほぼ等しいものとすることができる。或いは、例えば、特定のサブセットの自己反応性Ｔ細胞に寛容原性反応を集中させるために、又はあるペプチドがその他のペプチドよりも特定のＨＬＡ型において効果的に作用することが分かっている場合に、各ペプチドの相対比率を変更することができる。
【０１２６】
製剤化後に、この組成物を滅菌容器に入れ、これを密封して低温、例えば４℃で保存することができ、又はこの組成物を凍結乾燥することができる。
【０１２７】
この組成物は凍結乾燥（フリーズドライの）粉末として調製するのが好都合である。凍結乾燥によって安定化状態での長期保存が可能となる。凍結乾燥の手順については当該分野で週知であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｖｉｃｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｉｖｄｔ／ａｒｃｈｉｖｅ／９７／０１／００６．ｈｔｍｌを参照されたい。凍結乾燥に先だって、一般に、マンニトール、デキストラン、グリシンなどの増量剤が用いられる。
【０１２８】
この組成物は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、舌下、鼻腔内、皮内もしくは坐剤による経路又は埋め込み（例えば、持続放出分子を使用）などの都合のよい様式で投与することができる。
【０１２９】
この組成物は、鼻腔内、皮下又は皮内経路によって有利に投与すればよい。
【０１３０】
本発明のペプチド及び組成物はヒト被験体を処置するのに用いることができる。この被験体は、血友病Ａ、特に重症の血友病Ａを有し得る。この被験体は遺伝的にＦＶＩＩＩを欠損し得る。この被験体は後天性血友病を有し得る。この被験体は阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体を有し得る。
【０１３１】
この被験体はＦＶＩＩＩによる凝固剤置換療法を受けているか、受けようとしていてもよい。
【０１３２】
この被験体はＦＶＩＩＩ遺伝子による遺伝子療法を受けているか、受けようとしていてもよい。
【０１３３】
この被験体は、阻害性抗ＦＶＩＩＩ同種抗体又は自己抗体を生じやすい素因と関連付けられるＨＬＡハプロタイプとすることができる。この被験体は、ＨＬＡ−ＤＲ２を発現することができる。個体のＨＬＡハプロタイプを決定するための方法は当該分野では公知である。
【０１３４】
通常、医師は個々の被験体に最も適している実際の投与量を決定することになり、これは特定の患者の年齢、体重及び反応によって様々に異なる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、複数の用量を濃度を段階的に上げて患者に投与する「用量漸増」プロトコルに従うことができる。このような手法は、例えば、ハチ毒アレルギーに対する免疫療法用途におけるホスホリパーゼＡ２ペプチドに関して用いられている（Ｍｕｅｌｌｅｒほか（１９９８年）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：ｐ．７４７−７５４及びＡｋｄｉｓほか（１９９８年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：ｐ．９８−１０６）。
【０１３６】
キット
好都合なことに、組成物が複数のペプチドを含む場合、これらを混合組成物又はカクテルの形態で一緒に投与することができる。しかしながら、同時投与、個別投与、連続投与又は併用投与のために、これらのペプチドをキットの形態で別々に提供することが好ましい状況がある場合がある。
【０１３７】
また、このキットは混合及び／又は投与手段（例えば、鼻腔内投与用気化器又は皮下／皮内投与用注射器及び注射針）を含むこともできる。また、このキットは使用説明書を含むこともできる。
【０１３８】
本発明の薬学的組成物又はキットは疾患を処置及び／又は予防するために用いることができる。
【０１３９】
特に、この組成物／キットは血友病Ａ又は後天性血友病を処置及び／又は予防するために用いることができる。
【０１４０】
血友病Ａ
血友病Ａ（古典的血友病）は第ＶＩＩＩ因子の欠損に起因する。
【０１４１】
血友病Ａの推定発症率は男性では１０，０００人当たり１人であり、一方、血友病Ｂは男性では４０，０００人当たり１人の率で発症すると推定される。女性では５，０００人当たり約１人が血友病Ａの保因者であり、２０，０００人当たり１人が血友病Ｂの保因者である。
【０１４２】
血友病は、通常、血中の凝固因子のレベルに基づいて３種類、即ち、重症、中等症及び軽症に分類される。重症血友病では、凝固因子は正常値の１％未満である。重症度は何世代にもわたって一貫している傾向がある。
【０１４３】
一般に信じられているのとは反対に、小さな傷口及び創傷は血友病患者には通常は脅威ではない。むしろ、最大の危険は関節及び筋肉内に生じることがある突発性出血によってもたらされる。これは、成長の急な年齢期、通常５乃至１５歳に最も生じやすい。
【０１４４】
関節において特発性出血を繰り返すと、関節炎を生じる恐れがあり、周囲の筋肉が弱くなる。血液の蓄積によって神経への圧迫が生じると、痛み、しびれ及び患部の一時的動作不能が起こる。
【０１４５】
血友病Ａは、通常、凝固の有効性を測定し、凝固因子のレベルが異常かどうかを調べる血液テストを用いて診断される。
【０１４６】
献血された血液から単離された精製凝固因子が１９７０年代に開発されたことにより血友病患者の長期予後が著しく改善された。軽症乃至中等症の血友病患者はＦＶＩＩＩによる処置を臨時的に利用するのに対して、重症の血友病患者は定期的で無期限の処置を必要とすると考えられる。
【０１４７】
従来、患者は何千もの血漿献血からプールされた第ＶＩＩＩ因子濃縮物を投与されていた。このため、ウイルス性の病原体、特にヒト免疫不全ウイルス及び肝炎ウイルスによる汚染という深刻な問題がもたらされた。モノクロナール抗体による精製技術、熱不活化及び殺ウイルス性界面活性剤処置によって血漿由来濃縮物は比較的安全になっている。
【０１４８】
今や、組換えＤＮＡ技術によってＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（商標）、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（商標）などの一連の合成製品が供給されている。Ｋｏｇｅｎａｔｅは、ヒト第ＶＩＩＩ因子を発現する新生仔ハムスター腎細胞を用いて作製されている。得られた因子は高度に精製され、血漿からのウイルス感染のあらゆる可能性が排除されている。
【０１４９】
本発明のペプチド又は組成物は第ＶＩＩＩ因子置換療法の施行前及び／又は施行中に投与することができる。
【０１５０】
血友病Ａは遺伝子治療の理想的な疾患標的である。何故なら、ｉ）これが特定の単一遺伝子の突然変異に起因しており、ｉｉ）インビボで凝固因子レベルを僅かに上昇させることにより重症の血友病をより軽症のものに変えることができ、ｉｉｉ）現行の置換療法が最適以下と考えられているからである。また、凝固活性の所望レベルを超過しても安全性の範囲は広い。
【０１５１】
残念なことに、現在に至るまで血友病の治療法としての遺伝子療法の将来性は実現されていない。その主な理由は、凝固因子の長期発現を可能にするのに十分非免疫原性である遺伝子送達系を見出すのが困難であることにある。
【０１５２】
本発明のペプチドは、第ＶＩＩＩ因子による遺伝子療法に先立って被験体を寛容化し、及び／又は遺伝子療法後の患者におけるＦＶＩＩＩインヒビターの形成を管理するのにも適していると考えられる。
【０１５３】
後天性血友病
後天性血友病は、以前に凝固が正常であった個体におけるＦＶＩＩＩに対する自己抗体インヒビターの存在を特徴とする。これは、年間の推定発症率が百万人当たり１乃至３人の希な状態である。獲得自己抗体インヒビターと関連付けられる死亡率は、同種抗体を有する個体における死亡リスクが実質的により低いのに対して２５％に達する。
【０１５４】
同種抗体インヒビターを有する患者と比較して、後天性血友病は、（１）より重篤な出血パターン、（２）高齢集団における発症率の上昇、（３）約５０％の症例における、根底にある特定可能な自己免疫疾患、リンパ球増殖性又は固形腫瘍悪性疾患、妊娠及びペニシリン、スルホンアミドなどの特定の抗生物質の使用に関連した発生、並びに（４）通常、患者血漿において２％乃至１８％の範囲の残存第ＶＩＩＩ因子レベルをもたらす、その自己抗体による標的化凝固因子活性の不完全な中和を示すＩＩ型薬物動態パターンをたどるインビトロインヒビター活性、を特徴とする。
【０１５５】
本発明のペプチド又は組成物は、後天性血友病を有する患者に対して、又は、例えば、
ｉ）例えば、ペニシリンもしくはスルホンアミドによる処置が迫っていること、
ｉｉ）腫瘍もしくは他の悪性疾患が進行していること、
ｉｉｉ）妊娠が間近もしくはその早期であること
のために後天性血友病を発症するリスクがあると考えられる患者に対して、投与することができる。
【０１５６】
次に、実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は、本発明の実施に当たり当業者の便をはかるのに役立つものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１５７】
実施例１
ＨＬＡ−ＤＲ２第ＶＩＩＩ因子ペプチドの選択
一連のＦＤＶＩＩＩ  １５マーペプチドを以下の３種のＨＬＡ−ＤＲ結合アルゴリズムを用いて比較した：
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍ）
ＰｒｏＰｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／）及び
及びＩＥＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）。
【０１５８】
これらのプログラムのうちの２種以上によってＨＬＡ−ＤＲ２結合であると予測されるペプチドを選択し、その予測されたコア残基群の隣接配列を設計した（表２）。
【０１５９】
表２
【０１６０】
【表２】
0005784009.tif 000014
実施例２
第ＶＩＩＩ因子免疫化マウスからのＨＬＡ−ＤＲ２拘束性細胞のペプチドに対する反応の調査
ＨＬＡ−ＤＲ２トランスジェニックマウスをアジュバント中のヒト第ＶＩＩＩ因子で免疫化した。流入領域リンパ節細胞を採集し、表２からの１２種のペプチドを種々の濃度で用いてインビトロで再刺激した。その結果を図１に示した。
【０１６１】
第ＶＩＩＩ因子免疫化マウスからのＨＬＡ−ＤＲ２拘束性細胞は明らかにペプチドＤＮＩＭＶ（第１アミノ酸  １７８８）に対して強く反応する。ペプチドＰＲＣＬＴ（５４５）及びＰＰＩＩＡ（２１６１）に対する反応も見られる。
【０１６２】
実施例３
ＨＬＡ−ＤＲ２マウスからのＴ細胞のペプチドに対する反応の調査
先ず、ＨＬＡ−ＤＲ２マウスをアジュバント中の第ＶＩＩＩ因子で免疫化した。免疫マウスからの脾細胞を第ＶＩＩＩ因子によりインビトロで再刺激し、得られたリンパ芽球をポリエチレングリコールを用いてＢＷ５１４７胸腺腫と融合させた。
【０１６３】
Ｔ細胞ハイブリドーマをＨＡＴ培地で選択し、こうしたハイブリドーマをクローニングして第ＶＩＩＩ因子に対する反応について調べた。次いで、これらのハイブリドーマを上記１２種の予測ペプチドに対する反応についてスクリーニングした。スクリーニングした２７種のハイブリドーマのうち、１１種がＤＮＩＭＶに、３種がＰＲＣＬＴに、３種がＰＰＩＩＡに反応したが、ＰＰＩＩＡに対する反応はより弱く、特異性が低かった。ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴに特異的な２種のハイブリドーマの反応を図２に示した。
【０１６４】
実施例４
ＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウスからのリンパ節細胞のペプチドに対する反応の調査
ＨＬＡ−ＤＲ２トランスジェニックマウスを第ＶＩＩＩ因子欠損マウスと交配させてヒトＨＬＡクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を発現する血友病のモデルを作製した。
【０１６５】
これらのＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋動物をアジュバント中の第ＶＩＩＩ因子で免疫化した。流入領域リンパ節を単離し、上記ペプチドパネルに対する反応を調べた。図３に示したように、こうした細胞はＰＲＣＬＴ及びＤＮＩＭＶによく反応した。ＧＴＬＭＶに対する反応は弱かったが、ＲＹＬＲＩに対する反応は顕著だった。
【０１６６】
実施例５
ＨＬＡ−ＤＲ２マウスからのＴ細胞のペプチドに対する反応の調査
ＨＬＡ−ＤＲ２を発現する第ＶＩＩＩ因子欠損マウスをアジュバント中の第ＶＩＩＩ因子で免疫化した。この免疫化マウスからの脾細胞を第ＶＩＩＩ因子によりインビトロで再刺激し、得られたリンパ芽球を上述のようにしてＢＷ５１４７と融合させた。Ｔ細胞ハイブリドーマを上記１２種の予測ペプチドに対する反応についてスクリーニングした。さらにこの場合も、ハイブリドーマの大部分はペプチドＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴに反応した。第ＶＩＩＩ因子に特異的な１９種のハイブリドーマのうち、１０種がＤＮＩＭＶに、６種がＰＲＣＬＴに、１種がＰＰＩＩＡに、１種がＳＬＹＩＳに、１種がＤＴＬＬＩに反応した。これらのハイブリドーマによる反応の例を図４に示した。
【０１６７】
これらの実験から、２種のペプチドＤＮＩＭＶ（第１アミノ酸  １７８８番目）及びＰＲＣＬＴ（第１アミノ酸  ５４５）がヒト第ＶＩＩＩ因子に対するＨＬＡ−ＤＲ２拘束性Ｔ細胞の反応において免疫優性Ｔ細胞エピトープを構成することは明らかである。
【０１６８】
実施例６
ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴはアピトープとして挙動する
アピトープであるためには、ペプチドは更なる抗原プロセシング（即ち、トリミング）を受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合することができ、Ｔ細胞に提示されなければならない。この例では、固定ＡＰＣにより提示されるペプチドの能力を調査した。
【０１６９】
Ｍｇａｒ細胞は新鮮なもの又は１％パラホルムアルデヒドで固定したものとした。２０μｇ／ｍｌのｒｈＦＶＩＩＩ又はペプチドエピトープの存在又は非存在下に１００μｌのハイブリドーマ細胞を５×１０４個のＭｇａｒ細胞と共に一夜培養することによってクローンの抗原特異性を調べた。次いで、上清を採集し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２産生について評価した。ｒｈＦＶＩＩＩが生きたＭｇａｒ細胞によって提示されなければならないという事実は、完全な状態の蛋白質が提示されるには抗原プロセシングを受ける必要があることを示している。他方、ペプチドＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴは生及び固定Ｍｇａｒ細胞のいずれによっても提示され、このことはこれらのペプチドがアピトープとして機能することを示している（図５）。
【０１７０】
実施例７
アピトープとして機能することができるペプチドエピトープの範囲の決定
重複ペプチドのパネル（本明細書の原文の３６乃至３７ページに示した）を調製し、実施例５と同様の方法によりＴ細胞ハイブリドーマを用いてこれらをスクリーニングすることによって、ＤＮＩＭＶ、ＰＲＣＬＴ及びその他のペプチドを取り囲む配列内のアピトープとして機能することができるペプチドエピトープの範囲を特定した（図７）。
【０１７１】
実施例８
ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴは第ＶＩＩＩ因子蛋白質全体に対する寛容を誘導する
ＨＬＡ−ＤＲ２トランスジェニックマウスをアジュバント中の第ＶＩＩＩ因子による免疫化に先だってこれら２種の可溶性ペプチドのいずれか又は対照としてのＰＢＳで処置した。流入領域リンパ節を単離し、マウスの免疫状態を評価するために細胞を第ＶＩＩＩ因子蛋白質によりインビトロで再刺激した。図６に示したように、ＤＮＩＭＶ又はＰＲＣＬＴのいずれかでマウスを処置すると、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応の実質的な抑制がもたらされた。
【０１７２】
実施例９
ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴが第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおいて寛容を誘導することができるかどうかについての調査
実施例８から、これらの２種のペプチドが内因性第ＶＩＩＩ因子を発現するマウスにおいて第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応を阻止することができることが分かった。ＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋動物でこの実験を繰り返すことによりこれらのペプチドが第ＶＩＩＩ因子欠損マウスにおける第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応をも阻止するかどうかを明らかにした。
【０１７３】
実施例１０
ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴの併用が第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおいて寛容を誘導することができるかどうかについての調査
実施例９において第ＶＩＩＩ因子欠損マウスにおける第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応を単独で低下させることが示された２種のペプチドを併用した。図８に示したように、ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴの両者でマウスを処置すると、ＩＦＮ−ガンマ産生の減少によって示されるように、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応の実質的な抑制がもたらされた。ＩＦＮ−ガンマは、マウスにおいて抗体を中和するのに必要とされる主要なクラススイッチリンホカインである。示された効果はいずれかのペプチドを単独で用いて観察される効果よりも大きかった。
【０１７４】
実施例１１
改変ペプチドを用いた寛容の誘導
ペプチドＤＮＩＭＶは、部分的に可溶性であるが、完全に可溶性ではない。上記ペプチドの溶解度を改善するために、改変バージョンを以下の配列：ＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲで設計した。
【０１７５】
これは、荷電した親水性残基を添加するためにＮ末端において伸長されている。また、Ｃ末端において、プロリン残基およびチロシン残基を除去するために切断されている。さらに、正に荷電したアミノ酸および負に荷電したアミノ酸を上記ペプチドのいずれかの末端に置くことによって、溶解度を増大させると報告される荷電双極子を作り出す。
【０１７６】
その改変ペプチドは、ＤＮＩＭＶよりも可溶性であり、鼻腔内ペプチド送達を可能にするのに十分に可溶性である。このペプチドエピトープを用いて寛容の誘導を評価するために、ＦＶＩＩＩ欠損マウスを取得し、改変ＥＤＮＩＭＶペプチド（図９における「寛容化」と呼ぶ）でマウスの半数を処置した。上記マウスを次に、ＣＦＡ中のＤＮＩＭＶで免疫化し、１０日後、流入領域リンパ節を回収し、ＤＮＩＭＶまたはＥＤＮＩＭＶのいずれかでインビトロで刺激した。図９は、インビトロでＤＮＩＭＶまたはＥＤＮＩＭＶのいずれかで刺激したナイーブマウスまたは寛容化マウスからの反応についての結果を示す。
【０１７７】
結果は、ＥＤＮＩＭＶが、ＤＮＩＭＶで免疫化したマウスからの免疫反応をリコールすることが可能であることを実証する。さらに、これらは、ＥＤＮＩＭＶで寛容化したマウスが、ＣＦＡ中のＤＮＩＭＶで初回刺激の後、インビトロでＤＮＩＭＶまたはＥＤＮＩＭＶのいずれに対する反応の不足によって明らかにされるように、インビボでＤＮＩＭＶに対する免疫反応を樹立（ｍｏｕｎｔ）できないことを非常に明らかに実証する。
【０１７８】
実施例１２
ＥＤＮＩＭＶは第ＶＩＩＩ因子蛋白質全体に対する寛容を誘導する
図８に記載される実験を改変ペプチドＥＤＮＩＭＶについて繰り返し、ＥＤＮＩＭＶが、第ＶＩＩＩ因子蛋白質全体に対する免疫反応を抑制することが可能であることを実証する。
【０１７９】
方法
（ｉ）ｒｈＦＶＩＩＩで初回刺激したＤＲ２＋マウスのリコール反応
ＨＬＡ−ＤＲ２＋マウスＭＨＣクラスＩＩヌルマウスを、尾の基部へ皮下的に、４００μｇの加熱死菌Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａを補充した完全フロイントアジュバントに乳化した４０μｇのｒｈＦＶＩＩＩで免疫化した。１０日後、マウスを屠殺し、流入領域リンパ節を取り出した。単一細胞浮遊液を調製し、９６ウェル平底プレートにおいてウェル当たり４乃至５×１０５個のリンパ球を、示した濃度のペプチド又は対照抗原と共に７２時間インキュベートした後、さらに１６時間０．５μＣｉ／ウェルのトリチウム標識チミジンでパルスした。次いで、プレートを凍結した後、細胞をガラスフィルターマット上に採取し、放射能取込を液体シンチレーションβ−カウンターを用いて測定した。
【０１８０】
（ｉｉ）ＤＲ２＋マウスから得られたＴ細胞ハイブリドーマのＦＶＩＩＩペプチド特異性
ＨＬＡ−ＤＲ２＋マウスＭＨＣクラスＩＩヌルマウスを上記のようにして免疫化した。１０日目に流入領域リンパ節を取り出し、２０μｇ／ｍｌのｒｈＦＶＩＩＩの存在下の２４ウェルプレートにおいて２．５×１０６個／ｍｌのリンパ球を１ｍｌ／ウェル３日間培養した。この刺激の後に、リンパ球を回収し、洗浄して、Ｎｅｌｓｏｎほか（１９８０年）ＰＮＡＳ  ７７（５）：ｐ．２８６６に記載されるようにポリエチレングリコールを用い、ＴＣＲα−β−ＢＷ融合パートナー細胞と１個のリンパ球に対して４個のＢＷ細胞の割合で融合させた。融合細胞を注意深く洗浄した後、平底９６ウェルプレートで２日間平板培養し、次いで、ＨＡＴ培地を加えてＴ細胞ハイブリドーマを選択した。細胞の増殖をモニターし、融合を実施してから約１０日後に、個々のクローンを選択してＨＡＴ培地中２４ウェルプレートに移した。クローンは、少なくとも２週間ＨＡＴ培地に維持した後、ＨＴ培地、次いで完全培地に移した。クローンの抗原特異性について、２０μｇ／ｍｌのｒｈＦＶＩＩＩの存在又は非存在下に１００μｌのハイブリドーマ細胞を５×１０４Ｍｇａｒ細胞と共に一夜培養することによって調べた。次いで、上清を採集してＥＬＩＳＡによりＩＬ−２産生について評価し、ｒｈＦＶＩＩＩに反応してＩＬ−２を産生するクローンをＦＶＩＩＩ特異性に関して陽性であるとみなした。予測されるＦＶＩＩＩペプチドのレパートリーを調査するために、ＦＶＩＩＩ特異的クローンについて上記１２種のペプチドのそれぞれ２０μｇ／ｍｌと一夜インキュベーションした後、ＩＬ−２産生を再度調べた。
【０１８１】
（ｉｉｉ）ｒｈＦＶＩＩＩで初回刺激したＦＶＩＩＩ−／−マウスのリコール反応
マウスがＦＶＩＩＩ欠損、ＨＬＡ−ＤＲ２＋及びマウスＭＨＣクラスＩＩヌルである以外は（ｉ）の場合と同じ方法に従った。
【０１８２】
（ｉｖ）ＦＶＩＩＩ−／−マウスから得られたＴ細胞ハイブリドーマのＦＶＩＩＩペプチド特異性
マウスがＦＶＩＩＩ欠損及びＨＬＡ−ＤＲ２＋である以外は（ｉｉ）の場合と同じ方法に従った。
【０１８３】
（ｖ）免疫優性ＦＶＩＩＩペプチドでの前処置によるＤＲ２＋マウスにおけるＦＶＩＩＩ特異的反応の寛容化
ＨＬＡ−ＤＲ２＋マウスＭＨＣクラスＩＩヌルマウスをＰＢＳに溶かした１００μｇのＤＮＩＭＶ、ＰＲＣＬＴもしくはＰＰＩＩＡ又は同等の体積のＰＢＳ単独で３回処置した。ペプチドは、各用量の間に３乃至４日をおいて腹腔内投与した。最後の投与の後、（ｉ）の場合のように、マウスを完全フロインドアジュバントに乳化したｒｈＦＶＩＩＩで初回刺激した。１０日後、流入領域リンパ節を回収し、次いで、リンパ球をｒｈＦＶＩＩＩ又は各寛容化ペプチド及び対照抗原と共にインビトロで７２時間培養した後、（ｉ）の場合のようにトリチウム標識チミジンを加えた。
【０１８４】
（ｖｉ）免疫優性ＦＶＩＩＩペプチドの組み合わせでの前処置によるＤＲ２＋マウスにおけるＦＶＩＩＩ特異的反応の寛容化
ＨＬＡ−ＤＲ２＋マウスＭＨＣクラスＩＩヌルマウスをＰＢＳに溶かしたＤＮＩＭＶ、ＰＲＣＬＴもしくはＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴの両者の組合せ又は同等の体積のＰＢＳ単独で３回処置した。ペプチドは８日間にわたって腹腔内投与した。最後の投与の後、（ｉ）の場合のように、マウスを完全フロインドアジュバントに乳化したｒｈＦＶＩＩＩで初回刺激した。１０日後、流入領域リンパ節を回収し、次いで、リンパ球をｒｈＦＶＩＩＩを用いてインビトロで再刺激した。次いで、上清を採集してＩＦＮ−ガンマを測定した。
【０１８５】
上記明細書に記載した刊行物は全て、引用により本明細書に組み込まれている。本発明の範囲および精神を逸脱することなく、開示した本発明の方法および系の種々の変更および改変を行うことができることは、当業者には明瞭に理解されよう。本発明については特定の好ましい実施態様に関して説明したが、本発明の特許請求の範囲がこのような実施態様に不当に限定されるべきではないことは理解されよう。それどころか、分子免疫学もしくはその関連分野の当業者には自明である、発明実施のために開示した実施態様の種々の変更は、以下の特許請求の範囲に含まれるものである。
【０１８６】
配列番号１
【０１８７】
【化９】
0005784009.tif 000015
【０１８８】
【化１０】
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【０１８９】
【化１１】
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【図１−１】
0005784009.tif 000018
【図１−２】
0005784009.tif 000019
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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