(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化又は非グリコシル化ポリペプチドとポリマー修飾基の間の共有結合抱合体を形成する方法であって、該ポリペプチドが配列番号１及び配列番号２より選択される外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含み：
Ｘ１ＮＸ２Ｘ３Ｘ４            （配列番号１）；及び
Ｘ１ＤＸ２’ＮＸ２Ｘ３Ｘ４      （配列番号２）、
それにおいて、
Ｎはアスパラギンであり；
Ｄはアスパラギン酸であり；
Ｘ３はスレオニン（Ｔ）及びセリン（Ｓ）より選択されるメンバーであり；
Ｘ１は存在又は非存在のいずれかであり、存在する場合、アミノ酸であり；
Ｘ４は存在又は非存在のいずれかであり、存在する場合、アミノ酸であり；かつ、
Ｘ２及びＸ２’は、Ｘ２及びＸ２’がプロリン（Ｐ）ではないという条件で、アミノ酸から非依存的に選択されるメンバーであり、
それにおいて、ポリマー修飾基が、該ポリペプチドに、該Ｎ連結グリコシル化配列の該アスパラギンで、該アスパラギン及び該ポリマー修飾基の間に挿置され、そして、その両方に共有結合的に連結されたグリコシル連結基を介して共有結合的に抱合され、それにおいて該グリコシル連結基はモノサッカライド及びオリゴサッカライドより選択されるメンバーであり、それにおいて該ポリマー修飾基が、ポリ（アルキレンオキシド）、デキストラン、及びポリシアル酸より選択される直鎖又は分岐水溶性ポリマーであり、
以下の工程：
該ポリペプチド及び式（Ｘ）の構造を有するグリコシル供与体種を、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下で、オリゴサッカリルトランスフェラーゼがグリコシル成分をグリコシル供与体種からＮ連結グリコシル化配列のアスパラギン残基上に転移させるために十分な条件下で接触させること、それにおいて該オリゴサッカリルトランスフェラーゼはＰｇｌＢ及びＳｔｔ３ｐならびにそれらの可溶性変異体より選択されるメンバーであり、式（Ｘ）は、
【化７４】
0005647899.tif 000156
（式中、
ｗは１〜８より選択される整数であり；
ｐは０〜１より選択される整数であり；
Ｆは脂質成分であり；
Ｚ＊が、オリゴサッカライドであり；
各Ｌａは、単結合、官能基、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるリンカー成分であり；
各Ｒ６ｃは、前記ポリマー修飾基であり；
Ａ１は、Ｐ（リン）及びＣ（炭素）より選択されるメンバーであり；
Ｙ３は、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）より選択されるメンバーであり；
Ｙ４は、Ｏ、Ｓ、ＳＲ１、ＯＲ１、ＯＱ、ＣＲ１Ｒ２、及びＮＲ３Ｒ４より選択されるメンバーであり；
Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４は、ＣＲ１Ｒ２、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ３より非依存的に選択されるメンバーであり；及び
各Ｗは、ＳＲ１、ＯＲ１、ＯＱ、ＮＲ３Ｒ４、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換及び非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるメンバーであり；
それにおいて、
各Ｑは、Ｈ、負電荷、及び陽イオンより非依存的に選択されるメンバーであり；及び
各Ｒ１、各Ｒ２、各Ｒ３、及び各Ｒ４は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるメンバーである）
である、
を含む、方法。
【請求項２】
外因性Ｎ連結グリコシル化配列が、ＮＸ２Ｔ及びＮＸ２Ｓより選択されるメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリ（アルキレンオキシド）が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、及びその誘導体より選択されるメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドが親ポリペプチドに対応し、該ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法であって、それにおいてポリペプチドは親ポリペプチドに対応し、それは以下より選択されるメンバーである：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、巨核球増殖発達因子（ＭＧＤＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦインヒビター、骨増殖因子（ＢＧＦ）、グリア増殖因子、ヘパリン結合神経突起促進因子（ＨＢＮＦ）、Ｃ１エステラーゼインヒビター、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副甲状腺ホルモン、ホリトロピン−アルファ、ホリトロピン−ベータ、フォリスタチン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロンアルファ（ＩＮＦ−アルファ）、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、ＩＮＦ−オメガ、ＩＮＦ−タウ、インシュリン、グルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、酸性アルファ−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、イズロニダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ベータ−グルコシダーゼ、アリルスルファターゼ、アスパラギナーゼ、アルファ−グルコセラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、ウロキナーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、骨形成タンパク質１（ＢＭＰ−１）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、新規赤血球生成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ミオスタチン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）、ｖＷＦ切断プロテアーゼ（ｖＷＦプロテアーゼ、ｖＷＦ分解プロテアーゼ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、α１−アンチトリプシン（ＡＴＴ、又はα−１プロテアーゼインヒビター）、組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ヒルジン、レプチン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インシュリン、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、オステオポンチン、オステオプロテグリン、プロテインＣ、ソマトメジン−１、��マトトロピン、ソマトロピン、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボスポンジン−２、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、プロキネチシン、ＣＤ４、α−ＣＤ２０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−アルファインヒビター、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、Ｐセレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、エクステンジン−４、ＢＤＮＦ、ベータ−２−ミクログロブリン、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、リンフォトキシン−ベータ受容体（ＬＴ−ベータ受容体）、フィブリノゲン、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−４、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＧＤＦ−１３、ＧＤＦ−１４、ＧＤＦ−１５、ＧＬＰ−１、インシュリン様増殖因子、インシュリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＢ）、ＩＧＦ／ＩＢＰ−２、ＩＧＦ／ＩＢＰ−３、ＩＧＦ／ＩＢＰ−４、ＩＧＦ／ＩＢＰ−５、ＩＧＦ／ＩＢＰ−６、ＩＧＦ／ＩＢＰ−７、ＩＧＦ／ＩＢＰ−８、ＩＧＦ／ＩＢＰ−９、ＩＧＦ／ＩＢＰ−１０、ＩＧＦ／ＩＢＰ−１１、ＩＧＦ／ＩＢＰ−１２、ＩＧＦ／ＩＢＰ−１３、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）と第ＸＩＩＩ因子の間の複合体、内皮増殖因子（ＥＧＦ）に対する抗体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に対する抗体、抗ＴＮＦ抗体、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２抗体、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対する抗体、ＴＮＦ−αに対する抗体、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体、ＣＤ２０に対する抗体、ＣＤ４に対する抗体、アルファ−ＣＤ３に対する抗体、ＣＤ４０Ｌに対する抗体、ＣＤ１５４に対する抗体、ＰＳＧＬ−１に対する抗体、及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する抗体。
【請求項６】
グリコシル連結基がインタクトなグリコシル連結基である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
グリコシル連結基が、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＨ、バシロサミン、６−ヒドロキシバシロサミン、ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＨ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ、６−ヒドロキシバシロサミン−ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（Ｍａｎ）２、及びそれらの組み合わせより選択されるメンバーである残基である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願では、２００８年１月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０１９，８０５号の利点を主張し、その内容は、参照によりその全体が全ての目的のために本明細書において組み入れられる。
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、グリコシル化によるポリペプチド修飾の分野に関する。特に、本発明は、短い酵素認識Ｎ連結グリコシル化配列を使用したグリコシル化ポリペプチドの調製方法に関する。
【０００３】
発明の背景
特定の生理学的応答を生じさせるためのグリコシル化又は非グリコシル化ポリペプチドの投与は、医学的な技術分野において周知である。例えば、精製及び組換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の両方が、ｈＧＨ欠乏に関連する状態及び疾患（例えば、小児における小人症）を処置するために使用される。他の例は、インターフェロン（抗ウイルス活性を有する）ならびに顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ（白血球の産生を刺激する））を含む。
【０００４】
野生型グリコシル化パターンを伴うポリペプチドを製造するために使用することができる発現系の欠如によって、そのようなポリペプチドの治療用薬剤としての使用が限定されてきた。不適切又は不完全にグリコシル化されたポリペプチドが免疫原性であり、ペプチドの迅速な中和及び／又はアレルギー応答の発生を導きうることが、当技術分野において公知である。組換え産生されるグリコペプチドの他の欠乏は、最適以下の効力及び血流からの迅速なクリアランスを含む。
【０００５】
グリコシル化されたポリペプチド治療剤の産生に特有の問題を解決する１つのアプローチは、ポリペプチドを、インビトロで、それらの発現後に修飾することであった。ポリペプチドの発現後でのインビトロ修飾が、既存のグリカン構造の修飾及びグリコシル成分の非グリコシル化アミノ酸残基への付着の両方のために使用されてきた。組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼの包括的選択が利用可能になっており、注文デザインされたグリコシル化パターン及びグリコシル構造を伴う哺乳動物の複合糖質のインビトロでの酵素合成を可能にする。例えば、米国特許第５，８７６，９８０号；第６，０３０，８１５号；第５，７２８，５５４号；第５，９２２，５７７号；ならびにＷＯ／９８３１８２６；ＵＳ２００３１８０８３５；及びＷＯ  ０３／０３１４６４を参照のこと。
【０００６】
また、グリコペプチドが、１つ又は複数の非サッカライド修飾基（例えば、水溶性ポリマーなど）を用いて誘導体化されてきた。ペプチドに抱合されている例示的なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）である。ＰＥＧ抱合（ポリペプチドの分子サイズを増加させる）を使用し、免疫原性を低下させ、ＰＥＧ抱合ポリペプチドの血中クリアランス時間を延長させてきた。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号（Davis et al.）では、非免疫原性ポリペプチド（例えば、酵素及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）に共役したポリペプチドホルモンなど）が開示される。
【０００７】
ＰＥＧ及びその誘導体のポリペプチドへの付着のための主な方法は、アミノ酸残基を通じた非特異的結合を含む（例えば、米国特許第号４，０８８，５３８号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，４１４，１４７号、米国特許第４，０５５，６３５号、及びＰＣＴ  ＷＯ  ８７／０００５６を参照のこと）。ＰＥＧ抱合の別の方法は、グリコペプチドのグリコシル残基の非特異的酸化を含む（例えば、ＷＯ  ９４／０５３３２を参照のこと）。
【０００８】
これらの非特異的方法において、ＰＥＧを無作為に、非特異的な方法で、ポリペプチド骨格上の反応性残基に加える。このアプローチは、有意な欠点（最終産物の均質性の欠如を含む）、及び修飾ポリペプチドの低下した生物学的活性又は酵素的活性の可能性を有する。従って、特異的に標識され、容易に特性付け可能であり、本質的に均質な産物の形成をもたらす治療用ポリペプチドの誘導体化方法が、高く望ましい。
【０００９】
特異的に修飾された均質なポリペプチド治療剤を、インビトロで酵素の使用を通じて産生することができる。修飾基（例えば、合成ポリマーなど）をポリペプチドに付着させるための非特異的な方法とは異なり、酵素ベースの合成は、位置選択性及び立体選択性の利点を有する。標識ポリペプチドの合成における使用のための２つの主なクラスの酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）及びグリコシダーゼである。これらの酵素を、糖（後に改変されて、修飾基を含むことができる）の特異的な付着のために使用することができる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼ及び修飾グリコシダーゼを使用し、修飾された糖をポリペプチド骨格に直接的に転移させることができる（例えば、米国特許第６，３９９，３３６号、ならびに米国特許出願公開第２００３００４００３７号、第２００４０１３２６４０号、第２００４０１３７５５７号、第２００４０１２６８３８号、及び第２００４０１４２８５６号を参照のこと。これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる）。化学的アプローチと酵素的アプローチの両方を合わせた方法も公知である（例えば、Yamamoto et al., Carbohydr. Res. 305: 415-422 (1998)及び米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号を参照のこと。これは参照により本明細書に組み入れられる）。
【００１０】
炭水化物をグリコペプチドにいくつかの方法で付着させ、その内、アスパラギンへのＮ連結及びセリン及びスレオニンへのＯ連結が、組換え糖タンパク質治療剤について最も関連する。
【００１１】
全てのポリペプチドが、グリコシル化配列を、それらのアミノ酸配列の部分として含むわけではない。また、既存のグリコシル化配列は、修飾基の付着に適さないことがある。そのような修飾は、例えば、修飾ポリペプチドの生物学的活性における望ましくない減少を起こしうる。このように、当技術分野において、正確で再現性のあるグリコシル化及び糖修飾の方法の必要性が存在する。本発明では、これら及び他の必要性に取り組む。
【００１２】
発明の概要
本発明は、酵素的な複合糖質化又は糖ＰＥＧ化（glycoPEGylation）反応が、ポリペプチド内の特定のＮ連結グリコシル化配列を特異的に標的化することができるとの発見を含む。一例において、標的化されるグリコシル化配列を、親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）中に、Ｎ連結グリコシル化配列を含む突然変異ポリペプチドを作る突然変異により導入し、それにおいてＮ連結グリコシル化配列は、対応する親ポリペプチド中において存在しない、又は、同じ位置には存在しない（外因性Ｎ連結グリコシル化配列）。そのような突然変異ポリペプチドを「シークオン（sequon）ポリペプチド」と呼ぶ。
【００１３】
一局面において、本発明は、少なくとも１つの外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含むポリペプチド及びそのようなポリペプチドを作製する方法を提供する。本発明は、また、シークオンポリペプチドのライブラリーを提供する。代表的な実施態様において、ライブラリーは複数の異なるメンバーを含み、それにおいてライブラリーの各メンバーは共通の親ポリペプチドに対応し、及び、それにおいてライブラリーの各メンバーは本発明の外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む。また、そのようなライブラリーを作製し、使用する方法を提供する。
【００１４】
一実施態様において、各Ｎ連結グリコシル化配列は、酵素（例えばオリゴサッカリルトランスフェラーゼなど）の基質、例えば本明細書において記載するものなど例えば、ＰｇｌＢ又はＳｔｔ３）であり、それによって修飾又は非修飾グリコシル成分を、グリコシル供与体種から、Ｎ連結グリコシル化配列のアスパラギン残基上に転移させることができる。故に、別の局面において、本発明は、グリコシル化ポリペプチドと修飾基（例えば、ポリマー修飾基）の間の共有結合抱合体を提供し、それにおいてポリペプチドは外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む。ポリマー修飾基は、Ｎ連結グリコシル化配列内のアスパラギン残基で、ポリペプチドとポリマー修飾基の間に挿置された、及び、その両方に共有結合的に連結されたグリコシル連結基を介して共有結合的に抱合され、それにおいてグリコシル連結基は、モノサッカライド及びオリゴサッカライドより選択されるメンバーである。本発明は、さらに、本発明のポリペプチド抱合体を含む薬学的組成物を提供する。
【００１５】
本発明のポリペプチドにおける使用の例示的なＮ連結グリコシル化配列は、配列番号１及び配列番号２：
Ｘ１ＮＸ２Ｘ３Ｘ４            （配列番号１）；及び
Ｘ１ＤＸ２’ＮＸ２Ｘ３Ｘ４      （配列番号２）、
（配列中、Ｎはアスパラギンであり；Ｄはアスパラギン酸であり；Ｘ３は、スレオニン（Ｔ）及びセリン（Ｓ）より選択されるメンバーであり；Ｘ１は存在又は非存在のいずれかであり、存在する場合、アミノ酸であり；Ｘ４は存在又非存在のいずれかであり、存在する場合、アミノ酸であり；ならびにＸ２及びＸ２’は非依存的に選択されるアミノ酸である）より選択される。一実施態様において、Ｘ２及びＸ２’はプロリン（Ｐ）ではない。
【００１６】
本発明は、さらに、ポリペプチド抱合体を作製及び使用する方法を提供する。一例において、ポリペプチド抱合体は、無細胞インビトロ方法を使用して、ポリペプチドと修飾基（例えば、ポリマー修飾基）の間に形成される。ポリペプチドは、アスパラギン残基を含む本発明のＮ連結グリコシル化配列を含む。修飾基は、ポリペプチドに、アスパラギン残基で、ポリペプチドと修飾基の間に挿置された、及び、その両方に共有結合的に連結されたグリコシル連結基を介して共有結合的に連結される。方法は、ポリペプチド及び本発明のグリコシル供与体種を、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下で、オリゴサッカリルトランスフェラーゼがグリコシル成分をグリコシル供与体種からＮ連結グリコシル化配列のアスパラギン残基上に転移させるために十分な条件下で接触させることを含む。
【００１７】
ポリペプチドと修飾基（例えば、ポリマー修飾基）の間に共有結合抱合体を形成する別の例示的な方法は、宿主細胞内での細胞内グリコシル化を含み、それにおいてポリペプチドが発現される。この方法では、内因性の及び／又は同時発現されたオリゴサッカリルトランスフェラーゼを利用する。方法は、Ｎ連結グリコシル化配列を含むポリペプチド（本発明のポリペプチド）及びグリコシル供与体種を、細胞内酵素（例えば、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ）の存在下で、酵素がグリコシル成分をグリコシル供与体種からＮ連結グリコシル化配列のアスパラギン残基上に転移させるために十分な条件下で接触させることを含む。一例において、グリコシル供与体種は、細胞培養液に加えられ、宿主細胞により内在化され、細胞内（内因性の又は同時発現された）オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより基質として使用される。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本発明の方法において有用なグリコシル供与体種を提供する。例示的なグリコシル供与体種は、化学式（Ｘ）：
【化１】
0005647899.tif 000002
（式中、ｗは１〜２０より選択される整数である）の構造を有する。一例において、ｗは１〜８より選択される。整数ｐは０〜１より選択される。Ｆは脂質成分であり；Ｚ＊は、モノサッカライド及びオリゴサッカライドより選択されるグリコシル成分であり；各Ｌａは、単結合、官能基、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるリンカー成分であり；各Ｒ６ｃは、非依存的に選択される修飾基、例えば本明細書に記載する直鎖又は分岐ポリマー修飾基など（例えば、ＰＥＧ）であり；Ａ１は、Ｐ（リン）及びＣ（炭素）より選択されるメンバーであり；Ｙ３は、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）より選択されるメンバーであり；Ｙ４は、Ｏ、Ｓ、ＳＲ１、ＯＲ１、ＯＱ、ＣＲ１Ｒ２、及びＮＲ３Ｒ４より選択されるメンバーであり；Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４は、ＣＲ１Ｒ２、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ３より非依存的に選択されるメンバーであり；ならびに、各Ｗは、ＳＲ１、ＯＲ１、ＯＱ、ＮＲ３Ｒ４、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるメンバーであり、ここで各Ｑは、Ｈ、単一の負電荷、及び陽イオン（例えば、Ｎａ＋又はＫ＋）より非依存的に選択されるメンバーである。各Ｒ１、各Ｒ２、各Ｒ３、及び各Ｒ４は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるメンバーである。
【００１９】
本発明の追加の局面、利点、及び目的は、続く詳細な説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂ（それぞれ配列番号８及び配列番号９）は、各々が、第ＶＩＩＩ因子の例示的なアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂ（それぞれ配列番号８及び配列番号９）は、各々が、第ＶＩＩＩ因子の例示的なアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、例示的な第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列であり、配列中、Ｂドメイン（アミノ酸残基７４１〜１６４８）が除去されている（配列番号３）。本発明の例示的なポリペプチドは、欠失されたＢドメインが少なくとも１つのアミノ酸残基で置換されたものを含む（Ｂドメイン置換配列）。一実施態様において、Ａｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間のＢドメイン置換配列は、少なくとも１つのＯ連結又はＮ連結グリコシル化配列を含む。
【図３】図３は、Ｂドメインが欠失した第ＶＩＩＩ因子についての例示的なアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図４】図４は、Ｂドメインが欠失した第ＶＩＩＩ因子についての例示的なアミノ酸配列である（配列番号５）。
【図５】図５は、Ｂドメインが欠失した第ＶＩＩＩ因子についての例示的なアミノ酸配列である（配列番号６）。
【図６Ａ】図６は、本発明の例示的な実施態様を概説する表であり、それにおいて本発明の特定のポリペプチドを、本発明の特定のＮ連結グリコシル化配列と共に使用する。図６中の各列は、本発明の例示的な実施態様を表わし、それにおいてＮ連結グリコシル化配列を、ポリペプチド中に、ポリペプチドのアミノ酸配列内の示した位置に導入する。
【図６Ｂ】図６は、本発明の例示的な実施態様を概説する表であり、それにおいて本発明の特定のポリペプチドを、本発明の特定のＮ連結グリコシル化配列と共に使用する。図６中の各列は、本発明の例示的な実施態様を表わし、それにおいてＮ連結グリコシル化配列を、ポリペプチド中に、ポリペプチドのアミノ酸配列内の示した位置に導入する。
【図６Ｃ】図６は、本発明の例示的な実施態様を概説する表であり、それにおいて本発明の特定のポリペプチドを、本発明の特定のＮ連結グリコシル化配列と共に使用する。図６中の各列は、本発明の例示的な実施態様を表わし、それにおいてＮ連結グリコシル化配列を、ポリペプチド中に、ポリペプチドのアミノ酸配列内の示した位置に導入する。
【図６Ｄ】図６は、本発明の例示的な実施態様を概説する表であり、それにおいて本発明の特定のポリペプチドを、本発明の特定のＮ連結グリコシル化配列と共に使用する。図６中の各列は、本発明の例示的な実施態様を表わし、それにおいてＮ連結グリコシル化配列を、ポリペプチド中に、ポリペプチドのアミノ酸配列内の示した位置に導入する。
【図６Ｅ】図６は、本発明の例示的な実施態様を概説する表であり、それにおいて本発明の特定のポリペプチドを、本発明の特定のＮ連結グリコシル化配列と共に使用する。図６中の各列は、本発明の例示的な実施態様を表わし、それにおいてＮ連結グリコシル化配列を、ポリペプチド中に、ポリペプチドのアミノ酸配列内の示した位置に導入する。
【図６Ｆ】図６は、本発明の例示的な実施態様を概説する表であり、それにおいて本発明の特定のポリペプチドを、本発明の特定のＮ連結グリコシル化配列と共に使用する。図６中の各列は、本発明の例示的な実施態様を表わし、それにおいてＮ連結グリコシル化配列を、ポリペプチド中に、ポリペプチドのアミノ酸配列内の示した位置に導入する。
【００２１】
本発明の詳細な説明
Ｉ．略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ｍ−ＰＥＧ、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；ｍ−ＰＰＧ、メトキシ−ポリ（プロピレングリコール）；Ｆｕｃ、フコース又はフコシル；Ｇａｌ、ガラクトース又はガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はＮ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコース又はグルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノース又はマンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミンアセテート又はマンノサミニルアセテート；Ｓｉａ、シアル酸又はシアリル；及びＮｅｕＡｃ、Ｎ−アセチルノイラミン又はＮ−アセチルノイラミニル。
【００２２】
ＩＩ．定義
別に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、通常、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解される同じ意味を有する。一般的に、本明細書において使用される命名法ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野において周知であり、通常用いられるものである。標準的技術を核酸及びペプチド合成のために使用する。技術及び手順は、一般的に、当技術分野における従来の方法及び種々の一般的な参考文献（一般的に、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと。本明細書において参照により組み入れられる）に従って実施され、それは本文書全体にわたって提供される。本明細書において使用される命名法ならびに以下に記載される分析及び合成有機化学の実験手順は、当技術分野において周知であり、通常用いられるものである。標準的な技術、又はその修飾を、化学合成及び化学分析のために使用する。
【００２３】
本明細書において記載される全てのオリゴサッカライドは、非還元サッカライドの名称又は略語（即ち、Ｇａｌ）、続いてグリコシド結合の立体配置（α又はβ）、環状結合（１又は２）、結合に含まれる還元サッカライドの環状部分（２、３、４、６、又は８）、及び次に還元サッカライドの名称又は略語（即ち、ＧｌｃＮＡｃ）を用いて記載される。各サッカライドは、好ましくは、ピラノースである。標準的な糖鎖生物学の命名法の総説については、例えば、Essentials of Glycobiology Varki et al. eds. CSHL Press (1999)を参照のこと。オリゴサッカライドは、グリコシル模倣成分を、糖成分の１つとして含みうる。オリゴサッカライドは還元末端及び非還元末端を有すると考えられる（還元末端のサッカライドが、実際に、還元糖であるか否かを問わない）。
【００２４】
「グリコシル成分」という用語は、糖残基に由来する任意のラジカルを意味する。「グリコシル成分」は、モノサッカライド及びオリゴサッカライドを含み、「グリコシル模倣成分」を包含する。
【００２５】
「グリコシル模倣成分」という用語は、本明細書において使用される通り、構造的にグリコシル成分と似た成分（例えば、ヘキソース又はペントース）を指す。「グリコシル模倣成分」の例は、それらの成分を含み、それにおいてグリコシド酸素もしくはグリコシル成分の環状酸素、又は両方が、結合もしくは別の原子（例えば、硫黄）、又は別の成分、例えば炭素含有基（例えば、ＣＨ２）又は窒素含有基（例えば、ＮＨ）などで置換されている。例は、置換又は非置換シクロヘキシル誘導体、環状チオエーテル、環状第２級アミン、チオグリコシド結合を含む成分などを含む。一例において、「グリコシル模倣成分」を、酵素触媒された反応において、ポリペプチドのアミノ酸残基又はグリコペプチドのグリコシル成分上に転移させる。これは、例えば、「グリコシル模倣成分」を、脱離基（例えばハロゲンなど）で活性化することにより達成することができる。
【００２６】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形状のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。特に示されない限り、特定の核酸配列は、潜在的に、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列ならびに明確に示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成されうる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991);Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985);及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
【００２７】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。それは、コード領域に先行する及び続く領域（リーダー及びトレーラー）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含みうる。
【００２８】
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に適用された場合、核酸又はタンパク質が、それが天然状態で会合する他の細胞成分を実質的に含まないことを表示する。それは好ましくは均質な状態であるが、乾燥又は水溶液のいずれかでありうる。純度及び均質性は、典型的に、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどを使用して決定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質又は核酸が、実質的に精製される。特に、単離遺伝子は、遺伝子に隣接しており、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを表示する。特に、それは、核酸又はタンパク質が少なくとも８５%純粋、より好ましくは少なくとも９５%純粋、最も好ましくは少なくとも９９%純粋であることを意味する。
【００２９】
「アミノ酸」という用語は、天然及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ塩基性化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ酸、及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物を指す（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチルメチオニンスルホニウム）。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド骨格を有するが、しかし、天然アミノ酸と同じ塩基性化学構造を保持する。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、しかし、天然アミノ酸と類似の方法で機能する化学的化合物を指す。
【００３０】
「非荷電アミノ酸」という用語は、酸性官能基（例えば、−ＣＯＯＨ）又は塩基性官能基（例えば、−ＮＨ２）を含まないアミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を含む。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）を含む。「非荷電アミノ酸」は、例えば、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）を含むが、しかし、また、−ＯＨ基、−ＳＨ基、又は−ＳＣＨ３基を含むアミノ酸（例えば、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）、及びメチオニン（Ｍ））も含む。
【００３１】
非天然アミノ酸誘導体又は類似体のポリペプチド鎖中への部位特異的な方法での組み入れを可能にする種々の公知の方法が当技術分野において存在する（例えば、ＷＯ  ０２／０８６０７５を参照のこと）。
【００３２】
アミノ酸は、本明細書において、通常公知の３文字記号により又はIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される１文字記号により呼んでよい。ヌクレオチドは、同じように、それらの通常受け入れられた１文字コードにより呼んでよい。
【００３３】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」は、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を、又は、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。このように、アラニンがコドンにより特定されるあらゆる位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを改変させることなく、記載される対応するコドンのいずれかに改変させることができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列が、また、核酸のあるゆる可能なサイレント変異を記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を生じることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される各配列において潜在している。
【００３４】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列において単一のアミノ酸又は小さなパーセンテージのアミノ酸を改変、付加、又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失、又は付加が、「保存的に修飾された変異体」であり、ここで改変が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらすことを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子への付加であり、これらを除外しない。
【００３５】
以下の８群：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
は、各々が、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。
【００３６】
「ペプチド」は、アミド結合を介して一緒に連結されたアミノ酸に由来するモノマーを含むポリマーを指す。本発明のペプチドは、サイズにおいて変動しうる（例えば、２個のアミノ酸から数百個又は数千個のアミノ酸）。より大きなペプチド（例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、又は少なくとも５０のアミノ酸残基）は、あるいは、「ポリペプチド」又は「タンパク質」と呼ばれる。また、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、ホモアルギニン、及びホモフェニルアラニンも含まれる。遺伝子によりコードされないアミノ酸も本発明において使用してよい。さらに、修飾されて、反応基、グリコシル化配列、ポリマー、治療用成分、生体分子などを含むアミノ酸も本発明において使用してよい。本発明において使用されるアミノ酸の全てが、Ｄ異性体又はＬ異性体のいずれかでありうる。Ｌ異性体が一般的に好ましい。また、他のペプチド模倣体も本発明において有用である。本明細書において使用される「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、グリコシル化及び非グリコシル化ペプチド又は「ポリペプチド」の両方を指す。また、ポリペプチドを発現する系により完全にグリコシル化されるポリペプチドが含まれる。一般的な総説については、Spatola, A. F., CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)を参照のこと。「ポリペプチド」という用語は、また、そのポリペプチドの全ての可能な形状、例えば突然変異形状（１つ又は複数の突然変異）、切断形状、伸長形状、ポリペプチドを含む融合タンパク質、タグ付きポリペプチド、変異体（それにおいて特定のドメインが除去又は部分的に除去されている）などを含む。「ポリペプチド」という用語は、そのポリペプチドのモノマー、オリゴマー、及びポリマーを含む。例えば、「フォンビルブランド因子」（ｖＷＦ）という用語は、ｖＷＦのモノマー、ダイマー、及びオリゴマーの形状を含む。
【００３７】
本願において、アミノ酸残基を、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端メチオニン）（「１」と番号付けられる）からのそれらの相対的位置に従って番号付けする（典型的に上付き文字で）。Ｎ末端アミノ酸はメチオニン（Ｍ）（「１」と番号付けられる）でありうる。各アミノ酸残基に関連する番号を容易に調整し、ポリペプチドのＮ末端がメチオニンなしで開始する場合でのＮ末端メチオニンの非存在を反映することができる。例示的なポリペプチドのＮ末端がメチオニンの有無にかかわらず開始することができることが理解される。
【００３８】
「親ポリペプチド」という用語は、アミノ酸配列を有し、本発明の「外因性」Ｎ連結グリコシル化配列を含まない任意のポリペプチドを指す。しかし、「親ポリペプチド」は、１つ又は複数の天然（内因性）Ｎ連結グリコシル化配列を含みうる。例えば、野生型ポリペプチドは、Ｎ連結グリコシル化配列「ＮＬＴ」を含みうる。「親ポリペプチド」という用語は、野生型ポリペプチド、融合ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド（治療用ポリペプチド）、ならびにその変異体（例えば、アミノ酸の１つ又は複数の置換、アミノ酸の挿入、アミノ酸の欠失などを通じて先に修飾されている）を含む任意のポリペプチドを指す（そのような修飾が本発明のＮ連結グリコシル化配列を形成することにならない限り）。一実施態様において、親ポリペプチドのアミノ酸配列、又は親ポリペプチドをコードする核酸配列が定義され、任意の方法で公に利用可能である。例えば、親ポリペプチドは野生型ポリペプチドであり、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列は公に利用可能なタンパク質データベース（例えば、EMBL Nucleotide Sequence Database, NCBI Entrez, ExPasy, Protein Data Bankなど）の一部である。別の例において、親ポリペプチドは野生型ポリペプチドではないが、しかし、治療用ポリペプチド（即ち、承認済み薬物）として使用され、そのようなポリペプチドの配列は科学刊行物又は特許において公に利用可能である。さらに別の例において、親ポリペプチドのアミノ酸配列又は親ポリペプチドをコードする核酸配列は、本発明の時点で任意の方法で公に利用可能であった。一実施態様において、親ポリペプチドはより大きな構造の一部である。例えば、親ポリペプチドは、抗体の定常領域（Ｆｃ）又はＣＨ２ドメインに対応し、それにおいてこれらのドメインは抗体全体の一部でありうる。一実施態様において、親ポリペプチドは未知の配列の抗体ではない。
【００３９】
「突然変異ポリペプチド」又は「ポリペプチド変異体」という用語は、ポリペプチドの形状を指し、それにおいてそのアミノ酸配列は、その対応する野生型の形状、天然に存在する形状、又は任意の他の親の形状のアミノ酸配列とは異なる。突然変異ポリペプチドは、突然変異ポリペプチドをもたらす１つ又は複数の突然変異（例えば、置換、挿入、欠失など）を含みうる。
【００４０】
「シークオンポリペプチド」という用語は、そのアミノ酸配列中に「外因性Ｎ連結グリコシル化配列」を含むポリペプチド変異体を指す。「シークオンポリペプチド」は、少なくとも１つの外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含むが、しかし、１つ又は複数の内因性（例えば、天然）Ｎ連結グリコシル化配列も含みうる。
【００４１】
「外因性Ｎ連結グリコシル化配列」という用語は、親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）のアミノ酸配列中に導入されるＮ連結グリコシル化配列を指し、それにおいて親ポリペプチドは、異なる位置に、Ｎ連結グリコシル化配列を含まない、又は、Ｎ連結グリコシル化配列を含む。一例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、Ｎ連結グリコシル化配列を有さない野生型ポリペプチド中に導入される。別の例において、野生型ポリペプチドは、天然で、第１の位置に第１のＮ連結グリコシル化配列を含む。第２のＮ連結グリコシル化を、第２の位置でこの野生型ポリペプチド中に導入する。この修飾は、第２の位置に「外因性Ｎ連結グリコシル化配列」を有するポリペプチドをもたらす。外因性Ｎ連結グリコシル化配列を、突然変異により親ポリペプチド中に導入してよい。あるいは、外因性Ｎ連結グリコシル化配列を伴うポリペプチドを化学合成により作製することができる。
【００４２】
「親ポリペプチドに対応する」という用語（又はこの用語の文法的バリエーション）を使用し、本発明のシークオンポリペプチドを記載し、それにおいてシークオンポリペプチドのアミノ酸配列は、対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列とは、本発明の少なくとも１つの外因性Ｎ連結グリコシル化配列の存在だけにより異なる。典型的には、シークオンポリペプチド及び親ポリペプチドのアミノ酸配列は、高いパーセンテージの同一性を示す。一例において、「親ポリペプチドに対応する」は、シークオンポリペプチドのアミノ酸配列が、親ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約５０%の同一性、少なくとも約６０%、少なくとも約７０%、少なくとも約８０%、少なくとも約９０%、少なくとも約９５%、又は少なくとも約９８%の同一性を有することを意味する。別の例において、シークオンポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも約５０%の同一性、少なくとも約６０%、少なくとも約７０%、少なくとも約８０%、少なくとも約９０%、少なくとも約９５%、又は少なくとも約９８%の同一性を有する。
【００４３】
「グリコシル化配列（例えば、Ｎ連結グリコシル化配列）を親ポリペプチド中に導入すること（又は付加すること）」という用語（又はその文法的バリエーション）、又はグリコシル化配列を含めるために「親ポリペプチドを修飾すること」（又はその文法的バリエーション）は、親ポリペプチドがそのような変換のための物理的な出発物質であることを必ずしも意味せず、しかし、むしろ、親ポリペプチドが別のポリペプチドを作製するためのガイドアミノ酸配列を提供することを意味する。一例において、「グリコシル化配列を親ポリペプチド中に導入すること」は、親ポリペプチドのための遺伝子を適切な突然変異を通じて修飾し、シークオンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製することを意味する。別の例において、「グリコシル化配列を親ポリペプチド中に導入すること」は、結果として得られるポリペプチドが、理論上は、親ポリペプチド配列をガイドとして使用してデザインされることを意味する。デザインされたポリペプチドは、次に、化学的手段又は他の手段により生成されうる。
【００４４】
「リードポリペプチド」という用語は、例えば、本発明の方法により有効にグリコシル化及び／又は複合糖質化（例えば、糖ＰＥＧ化）することができる本発明のシークオンポリペプチドを指す。本発明のシークオンポリペプチドをリードポリペプチドとして適格とするために、そのようなポリペプチドを、適した反応条件に供した場合、好ましくはグリコシル化又は複合糖質化（例えば、糖ＰＥＧ化）されて、反応収率は少なくとも約５０%、好ましくは少なくとも約６０%、より好ましくは少なくとも約７０%、さらにより好ましくは約８０%、約８５%、約９０%、又は約９５%である。最も好ましくは本発明のそれらのリードポリペプチドであり、それらはグリコシル化又は複合糖質化（例えば、糖ＰＥＧ化）することができ、反応収率は８０%超、８５%超、９０%超、又は９５%超である。１つの好ましい実施態様において、リードポリペプチドは、各Ｎ連結グリコシル化配列の１つのアミノ酸残基だけがグリコシル化又は複合糖質化（例えば、糖ＰＥＧ化）される（モノグリコシル化）ような様式で、グリコシル化又は糖ＰＥＧ化される。種々の実施態様において、グリコシル化又は複合糖質化された単一のアミノ酸残基が、外因性Ｎ連結グリコシル化配列内に位置する。
【００４５】
「ライブラリー」という用語は、異なるポリペプチドのコレクションを指し、ライブラリーの各メンバーが共通の親ポリペプチドに対応する。ライブラリー中の各ポリペプチド種は、ライブラリーの「メンバー」と呼ばれる。好ましくは、本発明のライブラリーは、リードポリペプチドを同定するための集団を与えるために十分な数及び多様性のポリペプチドのコレクションである。ライブラリーは少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む。一実施態様において、ライブラリーは約２〜約１０のメンバーを含む。別の実施態様において、ライブラリーは約１０〜約２０のメンバーを含む。さらに別の実施態様において、ライブラリーは約２０〜約３０のメンバーを含む。さらなる実施態様において、ライブラリーは約３０〜約５０のメンバーを含む。別の実施態様において、ライブラリーは約５０〜約１００のメンバーを含む。さらに別の実施態様において、ライブラリーは１００を上回るメンバーを含む。ライブラリーのメンバーは、混合物の一部でありうる、又は、互いに単離されうる。一例において、ライブラリーのメンバーは、場合により、他の成分を含む混合物の一部である。例えば、少なくとも２つのシークオンポリペプチドが、細胞培養ブロスの容積中に存在する。別の例において、ライブラリーのメンバーは、各々が別々に発現され、場合により単離される。単離されたシークオンポリペプチドは、場合により、マルチウェル容器中に含まれてよく、それにおいて各ウェルが異なる型のシークオンポリペプチドを含む。
【００４６】
本発明の「ＣＨ２」ドメインという用語は、免疫グロブリン重鎖定常ＣＨ２ドメインを記載することを意味する。免疫グロブリンＣＨ２ドメインを定義する際、一般的には免疫グロブリンを、そして具体的には、免疫グロブリンのドメイン構造を参照する（Kabat E. A. (1978) Adv. Protein Chem. 32: 1-75によりヒトＩｇＧ１に適用される通り）。
【００４７】
「ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド」又は「少なくとも１つのＣＨ２ドメインを含むポリペプチド」という用語は、全抗体分子、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃドメイン）、又は免疫グロブリンのＣＨ２領域と等価な領域を含む融合タンパク質を含むことを意図する。
【００４８】
「ポリペプチド抱合体」という用語は、本発明の種を指し、それにおいてポリペプチドは、本明細書で先に記載する通りに、糖成分（例えば、修飾された糖）で複合糖質化される。代表的な例において、ポリペプチドは、外因性Ｏ連結グリコシル化配列を有するシークオンポリペプチドである。
【００４９】
「プロリン残基に近接する」又は「プロリン残基に近接している」は、本明細書において使用される通り、プロリン残基から除去された約１０未満のアミノ酸、好ましくは、プロリン残基から除去された約９、８、７、６、又は５未満のアミノ酸、より好ましくは、プロリン残基から除去された約４、３、又は２未満の残基であるアミノ酸を指す。「プロリン残基に隣接する」アミノ酸は、プロリン残基のＣ末端側及びＮ末端側にありうる。
【００５０】
「シアル酸」という用語は、９炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も共通のメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮＡＮＡと略される）である。ファミリーの第２のメンバーはＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕＧｃ）であり、この中でＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557;Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)）。また、９置換シアル酸、例えば９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ様９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ又は９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどが含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992);Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)）を参照のこと。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ  ９２／１６６４０において開示されている。
【００５１】
本明細書において使用される「修飾された糖」という用語は、天然又は非天然の炭水化物を指す。一実施態様において、「修飾された糖」は、本発明の方法を使用して、ポリペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基上に酵素的に付加される。修飾された糖は、多くの酵素基質（限定はされないが、糖ヌクレオチド（モノ、ジ、及びトリリン酸）、活性化された糖（例えば、グリコシルハライド、グリコシルメシレート）及び活性化されておらず、またヌクレオチドでもない糖を含む）より選択される。「修飾された糖」は、「修飾基」を用いて共有結合的に官能性を持たせる。有用な修飾基は、限定はされないが、ポリマー修飾基（例えば、水溶性ポリマー）、治療用成分、診断用成分、生体分子などを含む。一実施態様において、修飾基は、天然グリコシル成分（例えば、天然ポリサッカライド）ではない。修飾基は、好ましくは、非天然である。一例において、「非天然修飾基」はポリマー修飾基であり、それにおいて少なくとも１つのポリマー成分は非天然である。別の例において、非天然修飾基は修飾された炭水化物である。修飾基を用いた官能化の位置は、それが、「修飾された糖」がポリペプチドに酵素的に付加されることを妨げないように選択される。「修飾された糖」は、また、修飾基を用いて官能性を持たせ、天然酵素又は修飾酵素（例えばグリコシルトランスフェラーゼなど）の基質である任意のグリコシル模倣成分を指す。
【００５２】
本明細書において使用される「ポリマー修飾基」という用語は、少なくとも１つのポリマー成分（ポリマー）を含む修飾基である。一例において、ポリマー修飾基は、ポリペプチドに加えられた場合、そのようなポリペプチドの少なくとも１つの生物学的特性、例えば、そのバイオアベイラビリティ、生物学的活性、そのインビボでの半減期又は免疫原性を改変させることができる。例示的なポリマーは、水溶性及び水不溶性のポリマーを含む。ポリマー修飾基は直鎖又は分岐であり、１つ又は複数の非依存的に選択されたポリマー成分、例えばポリ（アルキレングリコール）及びその誘導体などを含みうる。一例において、ポリマーは非天然である。例示的な実施態様において、ポリマー修飾基は、水溶性ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体（ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）及びその誘導体（ＰＰＧ、ｍ−ＰＰＧ）などを含む。好ましい実施態様において、ポリ（エチレングリコール）又はポリ（プロピレングリコール）は、本質的に均一分散（homodisperse）である分子量を有する。一実施態様において、ポリマー修飾基は天然又は非天然ポリサッカライド（例えば、ポリシアル酸）である。
【００５３】
「水溶性」という用語は、水中で検出可能な程度の溶解性を有する成分を指す。水溶性を検出及び／又は定量化するための方法は、当技術分野において周知である。例示的な水溶性ポリマーは、ペプチド、オリゴサッカライド及びポリサッカライド、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などを含む。ペプチドは混合配列を有しうる、又は、単一のアミノ酸［ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（リジン）］で構成されうる。例示的なポリサッカライドはポリ（シアル酸）である。例示的なポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）（例えば、ｍ−ＰＥＧ）である。ポリ（エチレンイミン）は例示的なポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。
【００５４】
水溶性ポリマーのポリマー骨格はポリ（エチレングリコール）（即ち、ＰＥＧ）でありうる。しかし、他の関連するポリマーも本発明の実行における使用に適していること、及び、ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）という用語の使用がこの点において包括的であり、排他的ではないことを意図することを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、その形状（アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアーム型ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ペンダント型ＰＥＧ（即ち、ポリマー骨格に対してペンダント状の１つ又は複数の官能基を有するＰＥＧ又は関連するポリマー）、又はその中に分解可能な連結を伴うＰＥＧ）のいずれかのポリ（エチレングリコール）を含む。同じように、ポリ（アルキレンオキシド）という用語は、全ての形状のそのような物質を含むことを意味し、複数の型のポリ（アルキレンオキシド）、例えばＰＥＧとＰＰＧの組み合わせなどを組み入れる物質を含む。
【００５５】
ポリマー骨格は直鎖又は分岐でありうる。分岐ポリマー骨格は、一般的に、当技術分野において公知である。典型的には、分岐ポリマーは、中心分岐コア成分及び中心分岐コアに連結した複数の直鎖ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、通常、種々のポリオール（例えばグリセロール、ペンタエリスリトール、及びソルビトールなど）へのエチレンオキシドの付加により調製することができる分岐形状で使用される。中心分岐成分もいくつかのアミノ酸（例えばリジン又はシステインなど）に由来しうる。一例において、分岐ポリ（エチレングリコール）は、一般的な形状Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍで表わすことができ、式中、Ｒは中心成分、例えばグリセロール又はペンタエリスリトールなどを表わし、ｍはアームの数を表わす。マルチアーム型ＰＥＧ分子、例えば米国特許第５，９３２，４６２号において記載されるものなどが、参照により本明細書においてその全体が組み入れられ、ポリマー骨格として使用することもできる。
【００５６】
多くの他のポリマーも本発明に適する。非ペプチド性及び水溶性であるポリマー骨格は、本発明において特に有用である。適したポリマーの例は、限定はされないが、他のポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのコポリマーなど、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、例えば米国特許第５，６２９，３８４号に記載のものなど（参照により本明細書においてその全体が含まれる）、ならびにコポリマー、ターポリマー、及びその混合物を含む。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変動しうるが、それは典型的に約１００Da〜約１００，０００Da、しばしば約５，０００Da〜約８０，０００Daの範囲にある。
【００５７】
本明細書において使用される「複合糖質化」という用語は、修飾された糖種の、ポリペプチド（例えば、本発明の突然変異ヒト成長ホルモン）のアミノ酸残基又はグリコシル残基への酵素的に媒介された抱合を指す。一例において、修飾された糖は、１つ又は複数の修飾基に共有結合的に付着される。「複合糖質化」の亜群は「グリコールＰＥＧ化」又は「糖ＰＥＧ化」であり、それにおいて修飾された糖の修飾基はポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、例えばアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）又は反応性官能基を伴う誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である。
【００５８】
「大規模」及び「工業規模」という用語は互換的に使用され、少なくとも約２５０mg、好ましくは少なくとも約５００mg、より好ましくは少なくとも約１グラムの複合糖質を、単一の反応サイクルの完了時に産生する反応サイクルを指す。
【００５９】
「Ｎ連結グリコシル化配列」又は「シークオン」という用語は、少なくとも１つのアスパラギン（Ｎ）残基を含む任意のアミノ酸配列（例えば、約３〜約９のアミノ酸、好ましくは約３〜約６のアミノ酸を含む）を指す。一実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、好ましくはポリペプチドのアミノ酸配列の一部である場合、酵素、例えばオリゴサッカリルトランスフェラーゼの基質である。典型的な実施態様において、酵素は、上に記載のアスパラギン残基のアミノ基を修飾することによりグリコシル成分をＮ連結グリコシル化配列上に転移させ、それは「グリコシル化の部位」と呼ばれる。本発明は、野生型ポリペプチド又はその任意の他の親形状において天然であるＮ連結グリコシル化配列（内因性Ｎ連結グリコシル化配列）と「外因性Ｎ連結グリコシル化配列」の間を区別する。外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含むポリペプチドは、「シークオンポリペプチド」と呼ばれる。親ポリペプチドのアミノ酸配列を修飾し、組換え技術、化学合成、又は他の手段を通じて外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含ませてよい。
【００６０】
「グリコシル連結基」という用語は、本明細書において使用される通り、修飾基（例えば、ＰＥＧ成分、治療用成分、生体分子）を共有結合的に付着させたグリコシル残基を指す；グリコシル連結基は、修飾基を抱合体の残部に連結させる。本発明の方法において、「グリコシル連結基」は、グリコシル化又は非グリコシル化ポリペプチドに共有結合的に付着し、それにより修飾基をポリペプチドのアミノ酸残基及び／又はグリコシル残基に連結させる。「グリコシル連結基」は、一般的に、ポリペプチドのアミノ酸残基及び／又はグリコシル残基への「修飾された糖」の酵素的付着による「修飾された糖」に由来する。グリコシル連結基は、修飾基−修飾された糖カセットの形成中に分解されるサッカライド由来構造でありうる（例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元）、又は、グリコシル連結基は「インタクトなグリコシル連結基」でありうる。「グリコシル連結基」はグリコシル模倣成分を含みうる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ）は、修飾された糖をグリコシル化ポリペプチドに加えるために使用され、グリコシル模倣基質（例えば、糖成分がグリコシル模倣成分（例えば、シアリル模倣成分）である修飾された糖）に耐性を示す。修飾されたグリコシル模倣糖の転移は、グリコシル模倣成分であるグリコシル連結基を有する抱合体をもたらす。
【００６１】
「インタクトなグリコシル連結基」という用語は、グリコシル成分に由来するグリコシル連結基を指し、それにおいて修飾基を抱合体の残部に連結するサッカライドモノマーは分解されず、例えば、を使用して化学的に酸化される。例えば、環状構造が、酸化、例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウムにより開環される、又はそれにおいて。本発明の例示的な「インタクトなグリコシル連結基」はシアル酸成分であり、それにおいてＣ−６側鎖はインタクトである（ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ）。
【００６２】
「標的成分」という用語は、本明細書において使用される通り、身体の特定の組織又は部位に選択的に局在する種を指す。局在化は、分子決定基の特異的認識、標的薬剤又は抱合体の分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用などにより媒介される。薬剤を特定の組織又は部位に標的化する他の機構は、当業者に公知である。例示的な標的成分は、抗体、抗体フラグメント、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどを含む。
【００６３】
「連結基」という用語は、２つの成分を連結する任意の化学基である。一例において、連結基は少なくとも１つのヘテロ原子を含む。例示的な連結基は、エーテル、チオエーテル、アミン、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジン、カルボニル、カルバメート、尿素、チオ尿素、エステル、及びカーボネートを含む。
【００６４】
本明細書において使用される「治療用成分」は、治療のために有用な任意の薬剤（限定はされないが、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒、及び放射性薬剤を含む）を意味する。「治療用成分」は、生物活性剤のプロドラッグ、複数の治療用成分が担体に結合されたコンストラクト（例えば、多価薬剤）を含む。治療用成分は、また、タンパク質及びタンパク質を含むコンストラクトを含む。例示的なタンパク質は、限定はされないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ）、インターロイキン（例えば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば、第ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸ因子）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ならびに抗体融合タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子受容体（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））を含む。
【００６５】
本明細書において使用される「抗腫瘍薬」は、癌と闘うために有用な任意の薬剤（限定はされないが、細胞毒及び薬剤、例えば代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、有糸分裂阻害剤、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、インターフェロン、及び放射性薬剤など）を意味する。また、「抗腫瘍薬」という用語の範囲内には、抗腫瘍活性を伴うポリペプチド（例えば、ＴＮＦ−α）の抱合体が包含される。抱合体は、限定はされないが、治療用タンパク質と本発明の糖タンパク質の間に形成されるものを含む。代表的な抱合体は、ＰＳＧＬ−１とＴＮＦ−αの間に形成されるものである。
【００６６】
本明細書において使用される「細胞毒又は細胞毒薬剤」は、細胞に有害な任意の薬剤を意味する。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシンならびにその類似体又はホモログを含む。他の毒素は、例えば、リシン、ＣＣ−１０６５及び類似体、デュオカルマイシンを含む。さらに他の毒素は、ジフテリア毒素及び蛇毒（例えば、コブラ毒）を含む。
【００６７】
本明細書において使用される「放射性薬剤」は、腫瘍を診断又は破壊する際に有効である任意のラジオアイソトープを含む。例は、限定はされないが、インジウム−１１１、コバルト−６０を含む。また、天然の放射性元素、例えばウラニウム、ラジウム、及びトリウムなどは、典型的に、ラジオアイソトープの混合物を表わし、放射性薬剤の適した例である。金属イオンは、典型的に、有機キレート成分を用いてキレートされる。
【００６８】
多くの有用なキレート基、クラウンエーテル、クリプタンドなどが当技術分野において公知であり、本発明の化合物中に組み入れることができる（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡなど、及びそれらのホスホネート類似体、例えばＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰなど）。例えば、Pitt et al., "The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload," INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE; Martell, Ed.; American Chemical Society, Washington, D.C1980, pp.279-312; Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES; Cambridge University Press, Cambridge,1989; Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer-Verlag, New York, 1989、及び本明細書に含まれる参考文献を参照のこと。
【００６９】
また、キレート剤、クラウンエーテル、及びシクロデキストリンの他の分子への付着を可能にする多様なルートが、当業者に利用可能である。例えば、Meares et al., "Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides", MODIFICATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL, AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS; Feeney, et al., Eds., American Chemical Society, Washington, D.C1982, pp.370-387;Kasina et al., Bioconjugate Chem., 9: 108-117 (1998); Song et al., Bioconjugate Chem., 8: 249-255 (1997)を参照のこと。
【００７０】
本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」は任意の物質を含み、それは、抱合体と合わされた際に、抱合体の活性を保持し、被験者の免疫系と非反応性である。「薬学的に許容可能な担体」は、固体及び液体、例えば媒体、希釈剤、及び溶媒などを含む。例は、限定はされないが、標準的な薬学的担体（例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液など）、水、エマルジョン（例えば油／水エマルジョンなど）、及び種々の型の湿潤剤のいずれかを含む。他の担体は、また、滅菌溶液、錠剤（コーティングされた錠剤を含む）、及びカプセルを含みうる。典型的に、そのような担体は、賦形剤、例えばデンプン、乳、糖、特定の型の粘土、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩、マグネシウム又はステアリン酸カルシウム、タルク、植物性の脂肪又は油、ガム、グリコール、又は他の公知の賦形剤などを含む。そのような担体は、また、香料及び着色添加剤又は他の成分を含みうる。そのような担体を含む組成物は、周知の従来方法により製剤化される。
【００７１】
本明細書において使用される「投与する」は、経口投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋内、病巣内、又は皮下投与、吸入による投与、又は徐放デバイス（例えば、ミニ浸透圧ポンプ）の被験者への移植を意味する。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、経口、経鼻、腟、直腸、又は経皮）を含む任意のルートによる、特に吸入による。非経口投与は、例えば、静脈内、筋内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内を含む。さらに、注入が腫瘍を処置するため、例えば、アポトーシスを誘導するためである場合、投与は、腫瘍に直接的に及び／又は腫瘍の周囲の組織中でよい。他の送達形態は、限定はされないが、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどを含む。
【００７２】
「回復させること」又は「回復させる」という用語は、病理又は状態の処置における成功の任意の兆候（任意の客観的又は主観的なパラメーター、例えば症状の軽減、寛解、もしくは減弱又は患者の身体的もしくは精神的な幸福における改善など）を指す。症状の回復は客観的又は主観的なパラメーターに基づきうる；身体検査及び／又は精神医学的評価の結果を含む。
【００７３】
「治療」という用語は、疾患又は状態を「処置すること」又は「処置」を指し、疾患の傾向がありうるが、しかし、まだ、疾患の症状を経験していない、又は、示さない被験者（例えば、ヒト）において、疾患又は状態が生じることを防ぐこと（予防的処置）、疾患を阻止すること（その発生を遅らせる、又は、停止させること）、疾患の症状又は副作用からの軽減を提供すること（対症処置を含む）、及び疾患を軽減すること（疾患の退行を起こすこと）を含む。
【００７４】
「有効量」もしくは「に対して有効な量」もしくは「治療的有効量」という用語、又は任意の文法的に等価な用語は、動物又はヒトに対して疾患を処置するために投与された場合、その疾患の処置に効果を及ぼすために十分である。
【００７５】
「単離された」という用語は、物質を産生するために使用される成分を実質的又は本質的に含まない物質を指す。本発明のポリペプチド抱合体では、「単離された」という用語は、ポリペプチド抱合体を調製するために使用される混合物中の物質に通常伴う成分を、実質的又は本質的に含まない物質を指す。「単離された」及び「純粋な」は互換的に使用される。典型的に、本発明の単離されたポリペプチド抱合体は、好ましくは範囲として表現される純度のレベルを有する。ポリペプチド抱合体についての純度の範囲の下端は、約６０%、約７０%、又は約８０%であり、純度の範囲の上端は、約７０%、約８０%、約９０%、又は約９０%超である。
【００７６】
ポリペプチド抱合体が約９０%超純粋である場合、それらの純度も好ましくは範囲として表現される。純度の範囲の下端は、約９０%、約９２%、約９４%、約９６%、又は約９８%である。純度の範囲の上端は、約９２%、約９４%、約９６%、約９８%、又は約１００%純粋である。
【００７７】
純度は、任意の当技術分野で認識されている分析方法（例えば、銀染色ゲル上でのバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、マススペクトロメトリー、又は類似の手段）により決定される。
【００７８】
「集団の実質的に各々のメンバー」は、本明細書において使用される通り、本発明のポリペプチド抱合体の集団の特徴を記載し、それにおいてポリペプチドに加えられた選択されたパーセントテージの修飾された糖が、ポリペプチド上の複数の同一受容体部位に加えられる。「集団の実質的に各々のメンバー」は、修飾された糖に抱合されたポリペプチド上の部位の「均質性」を言い、本発明の抱合体を指し、それは少なくとも約８０%、好ましくは少なくとも約９０%、より好ましくは少なくとも約９５%均質である。
【００７９】
「均質性」は、修飾された糖が抱合される受容体成分の集団にわたる構造的な一貫性を指す。このように、本発明のポリペプチド抱合体において（それにおいて、各々の修飾された糖成分を、あらゆる他の修飾された糖が抱合される受容体部位と同じ構造を有する受容体部位に抱合させる）、ポリペプチド抱合体は約１００%均質であると言われる。均質性は、典型的に、範囲として表現される。ポリペプチド抱合体についての均質性の範囲の下端は、約５０%、約６０%、約７０%、又は約８０%であり、純度の範囲の上端は、約７０%、約８０%、約９０%、又は約９０%超である。
【００８０】
ポリペプチド抱合体が約９０%超又はそれと等しく均質である場合、それらの均質性も好ましくは範囲として表現される。均質性の範囲の下端は、約９０%、約９２%、約９４%、約９６%、又は約９８%である。純度の範囲の上端は、約９２%、約９４%、約９６%、約９８%、又は約１００%均質である。ポリペプチド抱合体の純度は、典型的に、１つ又は複数の当業者に公知の方法（例えば、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離ー飛行時間型マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動など）により決定される。
【００８１】
「実質的に均一なグリコフォーム」又は「実質的に均一なグリコシル化パターン」は、グリコペプチド種を指す場合、目的のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）によりグリコシル化される受容体成分のパーセンテージを指す。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、実質的に均一なフコシル化パターンが存在する（Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ及びそのシアル化類似体の実質的に全て（以下で定義する）が、本発明のペプチド抱合体においてフコシル化される場合）。出発物質がグリコシル化された受容体成分（例えば、フコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ成分）を含みうることが当業者により理解されるであろう。このように、計算されたパーセントのグリコシル化は、本発明の方法によりグリコシル化される受容体成分、ならびに出発物質中で既にグリコシル化されている受容体成分を含む。
【００８２】
「実質的に均一な」の上の定義における「実質的」という用語は、一般的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼについて受容体成分の少なくとも約４０%、少なくとも約７０%、少なくとも約８０%、又は好ましくは少なくとも約９０%、さらにより好ましくは少なくとも約９５%がグリコシル化されることを意味する。
【００８３】
置換基がそれらの従来の化学式（左から右に書かれる）により定められる場合、それらは等しく化学的に同一の置換基を包含し、それらは構造を右から左に書くことに起因しうる（例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−も記載することを意図する）。
【００８４】
「アルキル」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、別に記載しない限り、直鎖もしくは分岐鎖、又は環状（即ち、シクロアルキル）炭化水素ラジカル、又はその組み合わせを意味し、それらは十分に飽和、モノ飽和、又はポリ飽和されることがあり、指定された炭素原子数（即ち、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０の炭素を意味する）を有する二価（例えば、アルキレン）及び多価ラジカルを含みうる。飽和炭化水素ラジカルの例は、限定はされないが、基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロヒル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなど、ホモログ及び異性体（例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの）を含む。不飽和アルキル基は、１つ又は複数の二重結合又は三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例は、限定はされないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル及びより高級なホモログ及び異性体を含む。「アルキル」という用語は、別に記載しない限り、以下でより詳細に定義されるアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」などを含むことも意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と名付けられる。
【００８５】
「アルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、アルカンに由来する二価ラジカルを意味し、限定はされないが、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示され、「ヘテロアルキレン」として以下に記載される基をさらに含む。典型的に、アルキル（又はアルキレン）基は１〜２４の炭素原子を有し、１０又はそれより少ない炭素原子を有するそれらの基が本発明において好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」はより短いアルキル基又はアルキレン基であり、一般的に、８又はそれより少ない炭素原子を有する。
【００８６】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味で使用され、分子の残部に酸素原子、アミノ基、又は硫黄原子をそれぞれ介して付着されたそれらのアルキル基を指す。
【００８７】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体で又は別の用語との組み合わせで、別に記載しない限り、安定な直鎖又は分岐鎖、又は環状炭化水素ラジカル、又はその組み合わせを意味し、記載した数の炭素原子及びＯ、Ｎ、Ｓｉ、及びＳからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、それにおいて窒素原子及び硫黄原子は場合により酸化されうる、及び、窒素ヘテロ原子は場合により四級化されうる。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ及びＳ、ならびにＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に又はアルキル基が分子の残部に付着する位置に置かれてよい。例は、限定はされないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３を含む。最高２つのヘテロ原子が連続的でありうる（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など）。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、ヘテロアルキルに由来する二価ラジカルを意味し、限定はされないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−により例示される。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子は、また、鎖末端のいずれか又は両方を占めうる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレン連結基及びヘテロアルキレン連結基について、連結基の配向は、連結基の化学式が書かれる方向により暗示されない。例えば、化学式−ＣＯ２Ｒ’は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’及び−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’の両方を表わす。
【００８８】
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それら自体で又は他の用語との組み合わせで、別に記載しない限り、「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状バージョンをそれぞれ表わす。また、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残部に付着する位置を占めうる。シクロアルキルの例は、限定はされないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどを含む。ヘテロシクロアルキルの例は、限定はされないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエノ−２−イル、テトラヒドロチエノ−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどを含む。
【００８９】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、別に記載しない限り、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子を意味する。また、例えば「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」という用語は、限定はされないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意味する。
【００９０】
「アリール」という用語は、別に記載しない限り、単環又は複環（好ましくは１〜３環）でありうるポリ飽和された芳香族置換基を意味し、それは共に縮合される、又は、共有結合的に連結される。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、及びＢより選択される１〜４のヘテロ原子を含むアリール基（又は環）を指し、それにおいて窒素原子及び硫黄原子は場合により酸化され、窒素原子は場合により四級化される。ヘテロアリール基は、分子の残部に、ヘテロ原子を通じて付着させることができる。アリール基及びヘテロアリール基の非限定的な例は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリルを含む。上に記載するアリール環系及びヘテロアリール環系の各々についての置換基は、下に記載する許容可能な置換基の群より選択される。
【００９１】
簡潔さのために、「アリール」という用語は、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて使用された場合、上で定義するアリール環及びヘテロアリール環の両方を含む。このように、「アリールアルキル」という用語は、アリール基がアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）に付着したそれらのラジカルを含むことを意味し、炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子により置換されているそれらのアルキル基を含む（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）。
【００９２】
上の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、及び「ヘテロアリール」）の各々は、示したラジカルの置換形状及び非置換形状の両方を含むことを意味する。ラジカルの各型についての好ましい置換基を以下に提供する。
【００９３】
アルキルラジカル及びヘテロアルキルラジカル（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含む）のための置換基は、総称的に、「アルキル基置換基」と呼ばれ、それらは、限定はされないが、以下より選択される１つ又は複数の種々の基でありうる：置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ'''、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ'''）＝ＮＲ''''、ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、及び−ＮＯ２、多くにおいて０〜（２ｍ’＋１）の範囲で、ここでｍ’はそのようなラジカル中の炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''、及びＲ''''の各々は、非依存的に、水素、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、例えば、１−３ハロゲンで置換されたアリール、置換又は非置換アルキル、アルコキシ基もしくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々が、非依存的に、各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''、及びＲ''''基として選択される（これらの基の複数が存在する場合）。Ｒ’及びＲ”が同じ窒素原子に付着する場合、それらは窒素原子と合わされ、５、６、又は７員環を形成する。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、限定はされないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むことを意味する。置換基に関する上の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えばハロアルキルなど（例えば、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）を含むことを意味することを理解するであろう。
【００９４】
アルキルラジカルについて記載される置換基と同様に、アリール基及びヘテロアリール基についての置換基は、総称的に、「アリール基置換基」と呼ばれる。置換基は以下より選択される。例えば：置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ'''、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ'''）＝ＮＲ''''、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル。多くにおいて、芳香族環系上の０から開放原子価（open valence）の総数までの範囲である；ならびにＲ’、Ｒ”、Ｒ'''、及びＲ''''は、好ましくは、非依存的に、水素、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、及び置換又は非置換ヘテロアリールより選択される。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々が、非依存的に、各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''、及びＲ''''基として選択される（これらの基の複数が存在する場合）。
【００９５】
アリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、場合により、化学式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基で置換してよく、式中、Ｔ及びＵは、非依存的に、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−、又は単結合であり、ｑは０〜３の整数である。あるいは、アリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、場合により、化学式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置換してよく、式中、Ａ及びＢは、非依存的に、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−、又は単結合であり、ｒは０〜４の整数である。そのように形成された新たな環の単結合の１つは、場合により、二重結合で置換してよい。あるいは、アリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、場合により、化学式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ'''）ｄ−の置換基で置換してよく、式中、ｓ及びｄは非依存的に０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、又は−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ'''は、好ましくは、水素又は置換もしくは非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルより非依存的に選択される。
【００９６】
本明細書において使用される「アシル」という用語は、カルボニル残基Ｃ（Ｏ）Ｒを含む置換基を記載する。Ｒについての例示的な種は、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルを含む。
【００９７】
本明細書において使用される「縮合環系」という用語は、少なくとも２つの環を意味し、それにおいて各環が少なくとも２つの原子を共通して別の環と共に有する。「縮合環系」は、芳香環ならびに非芳香環を含みうる。「縮合環系」の例は、ナフタレン、インドール、キノリン、クロメンなどである。
【００９８】
本明細書において使用される「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）、ホウ素（Ｂ）、及びリン（Ｐ）を含む。
【００９９】
記号「Ｒ」は、置換基を表わす一般的な略語である。例示的な置換基は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基を含む。
【０１００】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本明細書において記載される化合物上で見出される特定の置換基に依存し、比較的非毒性の酸又は塩基を用いて調製される塩を含む。本発明の化合物が比較的酸性の官能性を含む場合、塩基添加塩が、そのような化合物（例えば、それらの中性形状）を、そのままで（neat）又は適した不活性溶媒中のいずれかで、十分量の所望の塩基と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容可能な塩基添加塩の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、又はマグネシウム塩、又は類似の塩を含む。本発明の化合物が比較的塩基性の官能性を含む場合、酸添加塩が、そのような化合物（例えば、それらの中性形状）を、そのままで又は適した不活性溶媒中のいずれかで、十分量の所望の酸と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容可能な酸添加塩の例は、無機酸、例えば塩化水素酸、スルホン酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、又は亜リン酸などに由来するもの、ならびに比較的非毒性の有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などに由来する塩を含む。また、例えばアルギン酸などのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸又はガラクツロン酸などの有機酸の塩が含まれる（例えば、Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66: 1-19 (1977)を参照のこと）。本発明のある特定の化合物は、塩基性及び酸性の両方の官能性を含み、それによって化合物を塩基添加塩又は酸添加塩のいずれかに変換することが可能になる。
【０１０１】
化合物の中性形状は、好ましくは、塩を塩基又は酸と接触させ、親化合物を従来の方法で単離することにより再生される。化合物の親形状は、特定の物理的特性（例えば極性溶媒中での溶解性など）において種々の塩形状とは異なるが、しかし、別の点では、塩は、本発明の目的のための化合物の親形状と等価である。
【０１０２】
塩形状に加えて、本発明は、プロドラッグ形状である化合物を提供する。本明細書において記載される化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学変化を受け、本発明の化合物を提供するそれらの化合物である。また、プロドラッグを、化学的又は生化学的な方法によりエクスビボの環境において本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、適した酵素又は化学試薬を伴う経皮パッチリザーバー中に置かれた場合、本発明の化合物にゆっくりと変換させることができる。
【０１０３】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形状ならびに溶媒和形状（水和形状を含む）で存在しうる。一般的に、溶媒和形状は、非溶媒和形状と等価であり、本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物が、複数の結晶又は非結晶の形状で存在しうる。一般的に、全ての物理的形状が、本発明により熟慮される使用において等価であり、本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１０４】
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）又は二重結合を持つ；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、及び個々の異性体が本発明の範囲内に包含される。
【０１０５】
本発明の化合物は、単一の異性体（例えば、鏡像異性体、シストランス異性体、位置異性体、ジアステレオマー）又は異性体の混合物として調製してよい。好ましい実施態様において、化合物は実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体として純粋である化合物を調製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、鏡像異性的に濃縮された混合物及び純粋な鏡像異性化合物を、鏡像異性的に純粋である合成中間体を、キラル中心で立体化学を非荷電のままにする、又は、その完全な転化をもたらす反応と組み合わせて使用することにより調製することができる。あるいは、合成ルートに沿った最終産物又は中間体を、単一の立体異性体中に分解することができる。特定の立体中心を転化する又は非荷電のままにするための技術、及び立体異性体の混合物を分解するための技術は、当技術分野において周知であり、それは、特定の状況のための適切な方法を選ぶ当業者の能力の十分に範囲内である。一般的に、Furniss et al. (eds.), VOGEL'S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5TH ED., Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, pp.809-816;及びHeller, Acc. Chem. Res. 23: 128 (1990)を参照のこと。
【０１０６】
本明細書において使用されるラセミ、アンビスカレミック（ambiscalemic）、及びスカレミック（scalemic）又は鏡像異性的に純粋な化合物のグラフ表現は、Maehr, J. Chem. Ed., 62: 114-120 (1985)から取られている：実線及び破線くさびを使用して、キラル元素の絶対的な立体配置を示す；波線は、それが表す結合が生成されうる任意の立体化学的暗示の否認を示す；太い実線及び破線は、示されるが、しかし、任意の絶対的な立体化学を暗示しない相対的な立体配置を示す幾何学的な記述語である；及びくさびは輪郭を描き、点線又は破線は、不確定な絶対的な立体配置の鏡像異性的に純粋な化合物を示す。
【０１０７】
「鏡像体過剰率」及び「ジアステレオマー過剰率」という用語は、本明細書において互換的に使用される。単一の立体中心を伴う化合物は、「鏡像体過剰率」において存在すると呼び、少なくとも２つの立体中心を伴う化合物は「ジアステレオマー過剰率」において存在すると呼ぶ。
【０１０８】
本発明の化合物は、また、非天然の割合の原子同位元素を、そのような化合物を構成する１つ又は複数の原子で含みうる。例えば、化合物は、放射性同位元素、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、又は炭素１４（１４Ｃ）などで放射標識してよい。本発明の化合物の全ての同位元素のバリエーションは、放射活性の有無にかかわらず、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【０１０９】
「反応性官能基」は、本明細書において使用される通り、限定はされないが、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハライド、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン、尿素、擬似尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、及びニトロソ化合物を含む基を指す。反応性官能基は、また、バイオコンジュゲート、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなどを調製するために使用されるものを含む。これらの官能基の各々を調製するための方法は、当技術分野において周知であり、特定の目的のためのそれらの適用又は修飾は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Sandler and Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989を参照のこと）。
【０１１０】
「非共有結合タンパク質結合基」は、インタクトな又は変性したポリペプチドと会合的な方法で相互作用する成分である。相互作用は、生物学的な環境において可逆的又は非可逆的のいずれかでありうる。「非共有結合タンパク質結合基」のキレート剤又は本発明の複合体への組み入れは、ポリペプチドと非共有結合的な方法で相互作用する能力を伴う薬剤又は複合体を提供する。例示的な非共有結合的な相互作用は、疎水性−疎水性相互作用及び静電気的な相互作用を含む。例示的な「非共有結合タンパク質結合基」は、陰イオン基（例えば、リン酸、チオリン酸、ホスホネート、カルボキシレート、ボロン酸、硫酸、スルホン、スルホン酸、チオ硫酸、及びチオスルホン酸）を含む。
【０１１１】
「酵素切断」もしくは「切断酵素」又は文法的な変形、ならびに「ドメイン欠失酵素」又は文法的な変形は、対応する天然酵素よりも少ないアミノ酸残基を有するが、しかし、特定の酵素活性を保持する酵素を指す。任意の数のアミノ酸残基を、酵素が活性を保持する限り、欠失させることができる。一部の実施態様において、ドメイン又はドメインの部分を欠失させることができ、例えば、膜アンカードメインを欠失させて、可溶性酵素を残すことができる。一部のＧａｌＮＡｃＴ酵素、例えばＧａｌＮＡｃ−Ｔ２などは、酵素活性を減弱させることなく欠失させることができるＣ末端レクチンドメインを有する。
【０１１２】
「リフォールディング発現系」は、酸化的な細胞内環境を伴う細菌又は他の微生物を指し、この微生物において発現される場合、ジスルフィド含有タンパク質をそれらの適切な／活性な形状でリフォールディングする能力を有する。例は、大腸菌（例えば、Origami（商標）（修飾大腸菌ｔｒｘＢ−／ｇｏｒ−）、Origami 2（商標）など）、シュードモナス（例えば、フルオレセンス）に基づく系を含む。Origami（商標）技術に関する例示的な参照については、例えば、Lobel et al. (2001) Endocrine 14(2), 205-212;及びLobel et al. (2002) Protein Express. Purif. 25(1), 124-133を参照のこと。
【０１１３】
ＩＩＩ．序論
本発明は、少なくとも１つの外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含むポリペプチド（シークオンポリペプチド）を提供する。各ポリペプチドは親ポリペプチドに対応する。親ポリペプチドは、野生型ポリペプチド及び他のポリペプチドを含む任意のポリペプチドでありうる。それらについてアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が公知である（例えば、薬学的薬物）。一実施態様において、親ポリペプチドはＮ連結グリコシル化配列を含まない。別の実施態様において、親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）は、天然で、Ｎ連結グリコシル化配列を含む。そのような親ポリペプチドに対応するシークオンポリペプチドは、追加のＮ連結グリコシル化配列を異なる位置に含む。一実施態様において、親ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用抗体、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−７）、又は血液因子（例えば、第ＶＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、又は第ＩＸ因子）などである。したがって、本発明は、それらのアミノ酸配列内に１つ又は複数の外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む治療用ポリペプチド変異体を提供する。
【０１１４】
一実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は酵素（例えば、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、例えばＰｇｌＢなど）の基質である。酵素は、グリコシル供与体種（例えば、脂質−ピロリン酸連結グリコシル成分）からアスパラギン（Ｎ）残基（Ｎ連結グリコシル化配列の一部である）へのグリコシル成分の転移を触媒する。グリコシル化配列に抱合することができる例示的なグリコシル成分は、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＨ、バシロサミン、６−ヒドロイバシロサミン（６−hydroybacillosamine）、ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＨ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ、及びＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（Ｍａｎ）２を含む。例示的なグリコシル供与体種を本明細書において記載する。
【０１１５】
したがって、本発明は、修飾又は非修飾糖成分が本発明のＮ連結グリコシル化配列に付着されたポリペプチド抱合体を提供する。本発明は、さらに、そのようなポリペプチド抱合体を作製する方法を提供する。代表的な実施態様において、方法は無細胞インビトロ方法であって、それにおいてポリペプチドを（反応容器中で）、グリコシル供与体種（例えば、脂質−ピロリン酸連結グリコシル成分、例えばウンデカプレニル−ピロリン酸連結グリコシル成分など）と、グリコシル供与体種が基質であるオリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下において接触させる。このグリコシル供与体種中のグリコシル成分は、場合により、修飾基（例えば水溶性ポリマー修飾基など）で誘導体化される。酵素によって、修飾又は非修飾グリコシル成分がポリペプチド上に転移され、それによりポリペプチド抱合体が作製される。修飾基が少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）成分を含む場合、そのようなグリコシル化反応を糖ＰＥＧ化と呼ぶ。
【０１１６】
別の代表的な方法において、上に記載する酵素反応は宿主細胞内で生じ、それにおいてポリペプチドが発現される。オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、宿主細胞中で内因性に存在してよく、又は、宿主細胞中で過剰発現させてよい。この方法に従った細胞内グリコシル化は、無細胞のインビトログリコシル化よりも優れた種々の利点を与える。例えば、グリコシル化前での細胞培養からポリペプチドの精製の必要性がない。また、他の内因性の又は同時発現された酵素を利用してよく、それは最初に形成されたグリコシル化ポリペプチドのさらなる修飾のために利用することができる。
【０１１７】
本発明の糖修飾（例えば、糖ＰＥＧ化）方法を、Ｎ連結グリコシル化配列を組み入れる任意のポリペプチドで実行することができる。一実施態様において、本発明の方法は、例えば、クリアランス速度の低下、又は免疫系又は細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込み速度の低下に起因して増加した治療半減期を伴うポリペプチド抱合体を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、ポリペプチド上の抗原決定基をマスクするための手段を提供し、それによりポリペプチドに対する宿主の免疫応答を低下又は排除する。適切な修飾された糖を使用した標的薬剤のポリペプチドへの選択的付着を使用し、特定の標的薬剤に特異的である特定の組織又は細胞表面受容体をポリペプチドの標的化することができる。また、タンパク質分解による分解に対して増強した耐性を示すポリペプチドを提供し、それは、タンパク質分解酵素により切断又は認識されるポリペプチド上の特定の部位を改変させることにより達成される結果である。一実施態様において、そのような部位は、本発明のＮ連結グリコシル化配列で置換又は部分的に置換される。
【０１１８】
また、本発明の方法を使用して、親ポリペプチドの「生物学的活性プロファイル」を調節することができる。本発明者らは、本発明の方法を使用した、修飾基、例えば水溶性ポリマー（例えば、ｍＰＥＧ）などの、親ポリペプチドへの共有結合的付着によって、結果として得られるポリペプチド種のバイオアベイラビリティ、薬力学的特性、免疫原性、代謝的安定性、体内分布、及び水溶性を改変させることができるだけでなく、非所望の治療活性の低下又は所望の治療活性の増大をもたらすこともできることを認識している。例えば、前者は、造血剤エリスロポエチン（ＥＰＯ）について観察されている。例えば、特定の化学的にＰＥＧ化されたＥＰＯ変異体は、低下した赤血球生成活性を示したが、野生型ポリペプチドの組織保護活性は維持されていた。そのような結果は、例えば、米国特許第６，５３１，１２１号；ＷＯ２００４／０９６１４８、ＷＯ２００６／０１４４６６、ＷＯ２００６／０１４３４９、ＷＯ２００５／０２５６０６、及びＷＯ２００２／０５３５８０において記載されている。例示的な細胞株は、選択されたポリペプチドの生物学的活性の差異の評価のために有用であり、表１において以下にまとめている：
【０１１９】
【表１】
0005647899.tif 000003
【０１２０】
一実施態様において、本発明のポリペプチド抱合体は、生物学的標的タンパク質（例えば、受容体）、天然リガンド、又は非天然リガンド、例えばインヒビターなどに対する低下又は増強した結合親和性を示す。例えば、特異的受容体のクラスに対する結合親和性を抑止することによって、関連する細胞シグナル伝達及び下流の生物学的事象（例えば、免疫応答）が低下又は排除されうる。故に、本発明の方法を使用して、抱合体が対応する親ポリペプチドと同一の、類似の、又は異なる治療プロファイルを有するポリペプチド抱合体を作製することができる。本発明の方法を使用して、特異的な（例えば、改善された）生物学的機能を伴う糖ＰＥＧ化治療剤を同定し、任意の治療用ポリペプチド又は他の生物学的に活性なポリペプチドの治療プロファイルを「微調整」することができる。GlycoPEGylation（商標）はNeose Technologies社の商標であり、本願の権利者が所有する特許及び特許出願（例えば、ＷＯ２００７／０５３７３１；ＷＯ２００７／０２２５１２；ＷＯ２００６／１２７８９６；ＷＯ２００５／０５５９４６；ＷＯ２００６／１２１５６９；及びＷＯ２００５／０７０１３８）において開示される技術を指す。
【０１２１】
ＩＶ．組成
ポリペプチド
一局面において、本発明は、本発明の少なくとも１つの外因性Ｎ連結グリコシル化配列（シークオンポリペプチド）を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。Ｎ連結グリコシル化配列を本明細書において以下に記載する。一実施態様において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、１つ又は複数の野生型、突然変異、又は切断オリゴサッカリルトランスフェラーゼの基質である外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む。例示的なオリゴサッカリルトランスフェラーゼが本明細書において以下に記載され、本明細書において記載されるそれらの酵素の全長又は切断バージョンを含む（例えば、配列番号１０２〜１１４）。
【０１２２】
例示的な実施態様において、本発明のポリペプチドは、対応する親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）のアミノ酸配列を改変させることによる組換え技術を通じて生成される。組換えポリペプチドの調製のための方法は、当業者に公知である。例示的な方法を本明細書において以下に記載する。ポリペプチドのアミノ酸配列は、天然又は外因性（即ち、非天然）Ｎ連結グリコシル化配列の組み合わせを含みうる。
【０１２３】
本発明のポリペプチド又は親ポリペプチドは、任意のポリペプチドでありうる。種々の実施態様において、ポリペプチドは治療用ポリペプチドである。一例において、ポリペプチドは組換えポリペプチドである。ポリペプチドは、グリコペプチドでありえ、そして、任意の数のアミノ酸を有しうる。一実施態様において、本発明のポリペプチドは分子量約５kDa〜約５００kDaを有する。別の実施態様において、ポリペプチドは分子量約１０kDa〜約４００kDa、約１０kDa〜約３５０kDa、約１０kDa〜約３００kDa、約１０kDa〜約２５０kDa、約１０kDa〜約２００kDa、又は約１０kDa〜約１５０kDaを有する。別の実施態様において、ポリペプチドは分子量約１０kDa〜約１００kDaを有する。さらに別の実施態様において、ポリペプチドは分子量約１０kDa〜約５０kDaを有する。さらなる実施態様において、ポリペプチドは分子量約１０kDa〜約２５kDaを有する。
【０１２４】
例示的なポリペプチドは、野生型ポリペプチド及びそのフラグメントならびにそれらの天然対応物から（例えば、突然変異又は切断により）修飾されたポリペプチドを含む。ポリペプチドは、また、融合タンパク質でありうる。例示的な融合タンパク質は、ポリペプチドが、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、治療用ポリペプチド、抗体、受容体リガンド、タンパク質性毒素、ＭＢＰ、Ｈｉｓタグなどに融合されたものを含む。
【０１２５】
一例において、本発明のポリペプチドは、本発明のＮ連結グリコシル化配列を含み、また、Ｏ連結グリコシル化配列を含む。例示的なＯ連結グリコシル化配列及びＯ連結グリコシル化配列をグリコシル化するために有用な例示的な酵素が、２００７年７月２３に出願された米国特許出願第１１／７８１，８８５号において記載されており、本明細書において参照によりその全体が組み入れられる。ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを使用したＯ連結グリコシル化技術が、米国仮特許出願第６０／９４１，９２６号及び２００８年６月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５８２５において記載されており、その開示も本明細書においてそれらの全体が組み入れられる。
【０１２６】
一実施態様において、ポリペプチドは治療用ポリペプチド、例えば薬学的薬剤として現在使用されているものなど（即ち、承認済み薬物）である。ポリペプチドの非限定的な選択を、２００６年６月８日に出願された米国特許出願第１０／５５２，８９６号の図２８において示し、本明細書において参照により組み入れられる。
【０１２７】
例示的なポリペプチドは、増殖因子、例えば肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、及びＦＧＦ−２３）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、巨核球増殖発達因子（ＭＧＤＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（例えば、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；例えば、ＶＥＧＦ−２）など、ＶＥＧＦインヒビター、例えばＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ（Aflibercept）、骨増殖因子（ＢＧＦ）、グリア増殖因子、ヘパリン結合神経突起促進因子（ＨＢＮＦ）など、Ｃ１エステラーゼインヒビター、ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び副甲状腺ホルモン、ホリトロピン（例えば、ホリトロピン−アルファ、ホリトロピン−ベータ）、フォリスタチン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）など、ならびにサイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８）、インターフェロン（例えば、ＩＮＦ−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、ＩＮＦ−オメガ、ＩＮＦ−タウ）、及びインシュリンなどを含む。
【０１２８】
他の例示的なポリペプチドは、酵素、例えばグルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ（例えば、Fabrazyme（商標））、酸性アルファ−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、イズロニダーゼ、例えばアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（例えば、Aldurazyme（商標））、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ベータ−グルコシダーゼ（例えば、米国特許出願第１０／４１１，０４４号において記載される酵素を参照のこと）、アリルスルファターゼ、アスパラギナーゼ、アルファ−グルコセラミダーゼ（glucoceramidase）（例えば、イミグルセラーゼ）、スフィンゴミエリナーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、ウロキナーゼ、及びアルファ−ガラクトシダーゼＡ（例えば、米国特許出願第７，１２５，８４３号において記載される酵素を参照のこと）を含む。
【０１２９】
他の例示的な親ポリペプチドは、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン（例えば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、新規赤血球生成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ；例えば、Aranesp）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ミオスタチン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；例えば、Neupogen（登録商標）、Neulasta（登録商標））、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、α１−アンチトリプシン（ＡＴＴ、又はα−１プロテアーゼインヒビター）、組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ヒルジン、レプチン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インシュリン、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、オステオポンチン、オステオプロテグリン、プロテインＣ、ソマトメジン−１、ソマトトロピン、ソマトロピン、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、グルカゴン様ペプチド（例えば、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２）、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボスポンジン−２、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、プロキネチシン、ＣＤ４、α−ＣＤ２０、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−アルファインヒビター、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、Ｐセレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、エクステンジン（extendin）−４、ＢＤＮＦ、ベータ−２−ミクログロブリン、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、リンフォトキシン−β受容体（ＬＴ−ベータ受容体）、フィブリノゲン、ＧＤＦ（例えば、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−４、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＧＤＦ−１３、ＧＤＦ−１４、ＧＤＦ−１５）、ＧＬＰ−１、インシュリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ１）、インシュリン様増殖因子結合タンパク質（例えば、ＩＧＢ−５）、ＩｇＦ／ＩＢＰ−２、ＩｇＦ／ＩＢＰ−３、ＩｇＦ／ＩＢＰ−４、ＩｇＦ／ＩＢＰ−５、ＩｇＦ／ＩＢＰ−６、ＩｇＦ／ＩＢＰ−７、ＩｇＦ／ＩＢＰ−８、ＩｇＦ／ＩＢＰ−９、ＩｇＦ／ＩＢＰ−１０、ＩｇＦ／ＩＢＰ−１１、ＩｇＦ／ＩＢＰ−１２、及びＩｇＦ／ＩＢＰ−１３を含む。上に列挙するポリペプチドの一部についての例示的なアミノ酸配列を、米国特許第７，２１４，６６０号において記載し、その全てが本明細書において参照により組み入れられる。
【０１３０】
一例において、ポリペプチドはフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）又はｖＷＦの部分である。組換えｖＷＦが記載されている（例えば、Fischer B. E. et al., Cell. Mol. Life Sci. 1997, 53: 943-950を参照のこと。それは本明細書において参照により組み入れられる）別の例において、ポリペプチドはｖＷＦ切断プロテアーゼ（ｖＷＦプロテアーゼ、ｖＷＦ分解プロテアーゼ）である。
【０１３１】
一例において、本発明のポリペプチドは血液凝固因子（血液因子）である。例示的な血液因子は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（例えば、第ＶＩＩＩ−２因子、第ＶＩＩＩ−３因子）、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、及び第ＸＩＩＩ因子を含む。別の例において、ポリペプチドは血液因子インヒビター（例えば、第Ｘａ因子インヒビター）である。
【０１３２】
特定の例において、ポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子である。第ＶＩＩＩ因子及び第ＶＩＩＩ因子変異体は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，６６８，１０８号には第ＶＩＩＩ因子変異体が記載されており、それにおいて１２４１番目の位置のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換されている。米国特許第５，１４９，６３７号には、Ｃ末端分画を含む、グリコシル化又は非グリコシル化第ＶＩＩＩ因子変異体が記載されており、米国特許第５，６６１，００８号には、少なくとも３つのアミノ酸残基によりアミノ酸１６４９〜２３３２に連結されたアミノ酸１〜７４０を含む第ＶＩＩＩ因子変異体が記載されている。従って、第ＶＩＩＩ因子の変異体、誘導体、修飾、及び複合体は、当技術分野において周知であり、本発明において包含される。第ＶＩＩＩ因子の産生のための発現系も当技術分野において周知であり、米国特許第５，６３３，１５０号、第５，８０４，４２０号、及び第５，４２２，２５０号において例示される原核細胞及び真核細胞を含む。上で考察した第ＶＩＩＩ因子配列のいずれかを修飾して、外因性Ｏ連結、Ｓ連結、又はＮ連結グリコシル化配列を含んでよい。
【０１３３】
一例において、第ＶＩＩＩ因子は全長又は野生型の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。全長第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を図１Ａ及び１Ｂにおいて示す（配列番号８及び９）。さらに別の例において、ポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり、それにおいてＢドメインは、野生型又は全長の第ＶＩＩＩ因子のＢドメインよりも少ないアミノ酸残基を含む。それらの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメイン欠失又は部分的Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子と呼ばれる。当業者は、所定の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド内のＢドメインを同定することができるであろう。一例において、Ｂドメインは、２つの隣接配列ＩＥＰＲ（Ｎ末端側）とＥＩＴＲ（Ｃ末端側）の間にアミノ酸残基を含む。しかし、当業者は、これらの２つの隣接配列が存在しない、又は、例えば突然変異により修飾されることがあることを理解するであろう。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド内のＢドメインの典型的な位置は、以下の略図において例証される：
例示的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド内のＢドメイン：
......ＩＥＰＲ−Ｂ−ドメイン−ＥＩＴＲ....
【０１３４】
一例において、Ｂドメインが、全長の第ＶＩＩＩ因子配列のアミノ酸残基Ａｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間に見出される（例えば、図１Ｂにおいて示される配列）：
...ＩＥＰＲ７４０−Ｂ−ドメイン−Ｅ１６４９ＩＴＲ....
【０１３５】
一実施態様において、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、通常、Ｂドメインと会合する任意のアミノ酸残基を含まない（完全Ｂドメイン欠失）。この実施態様に従った例示的なアミノ酸配列を図２において示し、それにおいて全長の第ＶＩＩＩ因子配列のＡｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間の全てのアミノ酸残基（図１Ｂ）を除去する。別の実施態様において、本来のＢドメインを別の配列（Ｂドメイン置換配列）で置換する。一例において、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメイン置換配列は、少なくとも２つのアミノ酸を含む。例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、又は少なくとも１０のアミノ酸残基が、図２におけるＡｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間で見出される。置換配列は、任意の数のアミノ酸残基を含み、任意のアミノ酸配列を有しうる。
【０１３６】
一例において、Ｂドメインを置換する配列は、部分Ｂドメイン配列を含む。例えば、Ｂドメインを置換する配列は、約２つ、約４つ、約６つ、約８つ、約１０、約１２、約１４、又は１４を上回るＢドメインのＮ末端アミノ酸を含む（例えば、図２におけるＡｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間）。例えば、置換配列は、ＳＦＳＱＮ、ＳＦＳＱＮＳ、ＳＦＳＱＮＳＲ、及びＳＦＳＱＮＳＲＨより選択される部分Ｎ末端Ｂドメイン配列を含みうる。別の例において、Ｂドメインを置換する配列は、約２つ、約４つ、約６つ、約８つ、約１０、約１２、約１４、又は１４を上回る本来のＢドメインのＣ末端アミノ酸を含む（例えば、図２におけるＡｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間）。例えば、置換配列は、ＱＲ、ＨＱＲ、ＲＨＱＲ、ＫＲＨＱＲ、ＬＫＲＨＱＲ、ＶＬＫＲＨＱＲ、及びＰＰＶＬＫＲＨＱＲより選択される部分Ｃ末端Ｂドメイン配列を含みうる。さらに別の例において、Ｂドメインを置換するアミノ酸配列は、複数の部分配列の組み合わせを含む。例えば、置換配列は、本来のＢドメインの部分Ｃ末端配列に連結された部分Ｎ末端配列を含み、それにおいてＮ末端及びＣ末端のＢドメイン配列は、場合により、追加のアミノ酸残基（例えば、１つ又は複数のアルギニン残基）を介して連結される。Ｂドメイン欠失させた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドについての例示的なアミノ酸配列は、図３〜５において示す配列を含む（配列番号４〜６）。
【０１３７】
一実施態様において、Ｂドメイン置換配列は、天然又は非天然（例えば、外因性）Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化配列を含む。一例において、本来のＢドメインを切断し、Ｏ連結又はＮ連結グリコシル化配列の少なくとも１つをインタクトで残すようにし、それは天然で本来のＢドメイン中に存在する。別の例において、上に記載する部分Ｂドメイン配列の組み合わせは、グリコシル化配列の形成をもたらす。例を図５において観察することができる：Ｐ７４９ＳＱＮＰ。
【０１３８】
さらに別の例において、Ｂドメイン置換配列は、天然のＢドメイン中に存在しないアミノ酸配列を含み、それにおいてこの非天然配列は、外因性のＯ連結又はＮ連結グリコシル化配列（例えば、本発明のＯ連結グリコシル化配列）を含む。一例において、Ｂドメイン置換配列は、本発明の外因性Ｏ連結グリコシル化配列（例えば、
【表２】
0005647899.tif 000004
など）を含む。別の例において、Ｂドメイン置換配列は、本発明の外因性Ｎ連結グリコシル化配列（例えばＮＬＴなど）を含む。
【０１３９】
一実施態様において、本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、図２、図３、図４、又は図５のアミノ酸配列を含み、さらに、Ｎ末端又は１〜７４０（重鎖）より選択されるアミノ酸位置で前記アミノ酸配列中に導入された外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを提供する。別の例示的な実施態様において、本発明は、図４のアミノ酸配列を含み、さらに、７８２〜１，４６５（軽鎖）より選択されるアミノ酸位置で前記アミノ酸配列中に導入された外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを提供する。別の例示的な実施態様において、本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、図２、図３、図４、又は図５のアミノ酸配列を含み、さらに、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖内のアミノ酸位置で前記アミノ酸配列中に導入された外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを提供する。別の例示的な実施態様において、本発明は、図４のアミノ酸配列を含み、さらに、７４１〜７８１（Ｂドメインフラグメント）より選択されるアミノ酸位置で前記アミノ酸配列中に導入された外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを提供する。別の例示的な実施態様において、本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、図２、図３、図４、又は図５のアミノ酸配列を含み、さらに、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメイン又はＢドメインフラグメント内の前記アミノ酸配列中に導入された外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを提供する。一例において、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをＣＨＯ細胞中で産生させる。別の例において、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを、当技術分野において公知のｔｒｘＢ  ｇｏｒ突然変異大腸菌発現系（Origami）を使用して産生する。
【０１４０】
別の例において、ポリペプチドは、２つ又はそれ以上のポリペプチドの間の融合タンパク質である。別の例において、ポリペプチドは、２つ又はそれ以上のポリペプチドの間の複合体である。例示的な実施態様において、複合体は血液因子を含む。別の例示的な実施態様において、複合体は第ＶＩＩＩ因子を含む。この複合体中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、全長のＢドメイン欠失、又は部分Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子でありうる。一例において、複合体は、第ＶＩＩＩ因子とフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）の間である。
【０１４１】
また、本発明の範囲内には抗体であるポリペプチドがある。抗体という用語は、免疫グロブリン、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃドメイン）、一本鎖抗体、ラマ抗体、ナノボディなどを含むことを意味する。また、この用語には抗体−融合タンパク質、例えばＩｇキメラなどが含まれる。好ましい抗体は、ヒト化モノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む。そのような抗体の全ての公知のアイソタイプが、本発明の範囲内である。例示的な抗体は、増殖因子、例えば内皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体、例えばラニビズマブ（Lucentis（商標）））、及び線維芽細胞増殖因子（例えばＦＧＦ−７、ＦＧＦ−２１、及びＦＧＦ−２３など）に対する抗体ならびにそれらの各受容体に対する抗体を含む。他の例示的な抗体は、抗ＴＮＦ抗体、例えば抗ＴＮＦ−アルファモノクローナル抗体（例えば、米国特許出願第１０／４１１，０４３号を参照のこと）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質（例えば、Enbrel（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（例えば、Herceptin（商標））、呼吸器合胞体ウイルスのプロテインＦに対するモノクローナル抗体（例えば、Synagis（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（例えば、Remicade（商標））、糖タンパク質に対するモノクローナル抗体、例えばＩＩｂ／ＩＩＩａ（例えば、Reopro（商標））など、ＣＤ２０（例えば、Rituxan（商標））、ＣＤ４、アルファ−ＣＤ３、ＣＤ４Ｌ、及びＣＤ１５４（例えば、Ruplizumab）に対するモノクローナル抗体、ＰＳＧＬ−１及びＣＥＡに対するモノクローナル抗体を含む。上に列挙したポリペプチドのいずれかの任意の修飾（例えば、突然変異）バージョンも本発明の範囲内である。
【０１４２】
例示的な実施態様において、親ポリペプチドは、（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＥＰＯであり、それは以下：
【表３】
0005647899.tif 000005
に示される。
【０１４３】
例示的な実施態様において、親ポリペプチドは、塩基性アミノ酸残基（例えばアルギニン又はリジンなど）を非荷電アミノ酸（例えばグリシン又はアラニンなど）で置換する少なくとも１つの突然変異を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＥＰＯポリペプチドは、Ａｒｇ１３９→Ａｌａ１３９、Ａｒｇ１４３→Ａｌａ１４３、及びＬｙｓ１５４→Ａｌａ１５４より選択される少なくとも１つの突然変異を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
Ｎ連結グリコシル化配列
本発明のＮ連結グリコシル化配列は、任意の短いアミノ酸配列でありうる。一実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、約３〜約２０、好ましくは約３〜約１０、より好ましくは約３〜約９、最も好ましくは約３〜約７のアミノ酸残基を含む。本発明のＮ連結グリコシル化配列は、アミノ基を有する少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。一実施態様において、本発明のＮ連結グリコシル化配列は、少なくとも１つのアスパラギン（Ｎ）残基を含む。別の実施態様において、アスパラギン残基のアミノ基は、シークオンポリペプチドが酵素的グリコシル化又は複合糖質化反応に供される場合、グリコシル化される。この反応中、アミノ基の水素原子がグリコシル成分で置換される。グリコシル成分を受けるアミノ酸残基を、「グリコシル化の部位」又は「グリコシル化部位」と呼ぶ。
【０１４５】
一実施態様において、本発明のＮ連結グリコシル化配列は、天然では、野生型ポリペプチド中に存在する。そのような野生型ポリペプチドのポリペプチド抱合体は、本発明の範囲内である。別の実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、対応する親ポリペプチド（外因性Ｎ連結グリコシル化配列）において、存在しない、又は、同じ位置に存在しない。外因性Ｎ連結グリコシル化配列の親ポリペプチド中への導入によって、本発明のシークオンポリペプチドが生成される。Ｎ連結グリコシル化配列を、突然変異により親ポリペプチド中に導入してよい。別の例において、Ｎ連結グリコシル化配列を、シークオンポリペプチドの化学合成により親ポリペプチドのアミノ酸配列中に導入する。
【０１４６】
一実施態様において、本発明のＮ連結グリコシル化配列は、化学式（Ｉ）（配列番号１）のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、化学式（ＩＩ）（配列番号２）のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、化学式（Ｉ）のアミノ酸配列からなる。さらなる実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、化学式（ＩＩ）のアミノ酸配列からなる：
Ｘ１ＮＸ２Ｘ３Ｘ４            （Ｉ）（配列番号１）
Ｘ１ＤＸ２’ＮＸ２Ｘ３Ｘ４      （ＩＩ）（配列番号２）。
【０１４７】
化学式（Ｉ）及び化学式（ＩＩ）において、Ｎはアスパラギンであり、Ｄはアスパラギン酸である。一実施態様において、Ｘ３はスレオニン（Ｔ）である。別の実施態様において、Ｘ３はセリン（Ｓ）である。Ｘ１は存在又は非存在のいずれかである。存在する場合、Ｘ１は任意のアミノ酸でありうる。一実施態様において、Ｘ１は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、及びプロリン（Ｐ）より選択されるメンバーである。Ｘ４は存在又は非存在のいずれかである。存在する場合、Ｘ４は任意のアミノ酸でありうる。一実施態様において、Ｘ４は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）より選択されるメンバーである。
【０１４８】
化学式（Ｉ）及び化学式（ＩＩ）において、Ｘ２は任意のアミノ酸でありうる。好ましい実施態様において、Ｘ２はプロリン（Ｐ）ではない。Ｘ２’は任意のアミノ酸でありうる。一実施態様において、Ｘ２’はプロリンではない。一実施態様において、Ｘ２及びＸ２’は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、及びシステイン（Ｃ）より非依存的に選択されるメンバーである。Ｎ連結グリコシル化配列は、追加のＣ末端又はＮ末端アミノ酸残基を含みうる。一実施態様において、追加のアミノ酸は、グリコシル化部位に近接しているポリペプチドの三次構造を調整するための有用である。
【０１４９】
一実施態様において、化学式（Ｉ）中のＸ２は非荷電アミノ酸である。例示的な実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、
【表４】
0005647899.tif 000006
より選択されるメンバーであって、それにおいてＸ１及びＸ４は上で定義される通りである。この実施態様の一例において、Ｘ１は存在しない。別の例において、Ｘ４は存在しない。さらに別の実施態様において、Ｘ１及びＸ４の両方が存在しない。
【０１５０】
したがって、別の例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、
【表５】
0005647899.tif 000007
より選択されるメンバーである。
【０１５１】
一実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、化学式（ＩＩ）の伸長されたグリコシル化配列である。別の実施態様において、伸長されたグリコシル化配列は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼが細菌由来の酵素（例えば、ＰｇｌＢ）である場合に使用される。別の実施態様において、化学式（ＩＩ）中のＸ２は非荷電アミノ酸である。この実施態様の一例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、
【表６】
0005647899.tif 000008
より選択されるメンバーであって、それにおいてＸ１、Ｘ２’、及びＸ４は上で定義される通りである。
【０１５２】
別の例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、
【表７】
0005647899.tif 000009
より選択されるメンバーであって、それにおいてＸ２’は上で定義される通りである。別の例において、上の実施態様のいずれかにおけるＸ２’は、非荷電アミノ酸より選択される。一例において、Ｘ２’はＧである。別の例において、Ｘ２’はＡである。さらに別の例において、Ｘ２’はＶである。さらなる例において、Ｘ２’はＬである。さらなる実施態様において、Ｘ２’はＩである。別の例において、Ｘ２’はＦである。
【０１５３】
Ｎ連結グリコシル化配列のポジショニング
一実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は、ポリペプチド（例えば、本発明のシークオンポリペプチド）の部分である場合、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｔｔ３ｐ又はＰｇｌＢ）の基質である。別の例において、グリコシル化配列は、修飾酵素、例えば欠失又は切断された膜アンカードメインを有する酵素などの基質である。本発明の各Ｎ連結グリコシル化配列が適切なグリコシル化反応中にグリコシル化される効率は、酵素の型及び性質に依存しうる、また、グリコシル化配列の状況、特にグリコシル化部位周辺のポリペプチドの三次元構造に依存しうる。
【０１５４】
一般的に、Ｎ連結グリコシル化配列は、ポリペプチドのアミノ酸配列内の任意の位置に導入することができる。好ましい実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列は（使用された反応条件下で）オリゴサッカリルトランスフェラーゼに接近可能である。一例において、グリコシル化配列は、親ポリペプチドのＮ末端（即ち、第１のアミノ酸の前又は第１のアミノ酸の直後）に導入される（アミノ末端突然変異体）。別の例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、親ポリペプチドのアミノ末端近く（即ち、Ｎ末端の１０アミノ酸残基内）に導入される。別の例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、親ポリペプチドのＣ末端で、親ポリペプチドの最後のアミノ酸の直後に位置付けられる（カルボキシ末端突然変異体）。さらに別の例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、親ポリペプチドのＣ末端近く（例えば、Ｃ末端の１０アミノ酸残基内）に導入される。さらに別の例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、親ポリペプチドのＮ末端とＣ末端の間のどこかに位置付けられる（内部突然変異体）。修飾ポリペプチドが生物学的に活性であること（たとえその生物学的活性が、対応する親ポリペプチドの生物学的活性から改変されている場合でも）が一般的に好ましい。
【０１５５】
シークオンポリペプチドのグリコシル化効率に影響を及ぼす重要な因子は、グリコシル化部位（例えば、アスパラギン側鎖）へのグルコシル／サッカリルトランスフェラーゼ及び他の反応パートナー（溶媒分子を含む）の接近可能性である。グリコシル化配列がポリペプチドの内部ドメイン内に位置付けられる場合、グリコシル化は非効率的である可能性が高い。故に、一実施態様において、グリコシル化配列を、ポリペプチドの溶媒暴露表面に対応するポリペプチドの領域に導入する。例示的なポリペプチド立体構造は、グリコシル化配列の標的アミノ基が内側に向いていないものであり、ポリペプチドの他の領域と水素結合を形成するものである。別の例示的な立体構造は、アミノ基が隣接タンパク質と水素結合を形成する可能性が低いものである。
【０１５６】
一例において、Ｎ連結グリコシル化配列は、親タンパク質の事前に選択された特定領域内に作製される。天然では、ポリペプチド骨格のグリコシル化は、通常、ポリペプチドのループ領域内で生じ、典型的に、ヘリカル又はベータシート構造内では生じない。従って、一実施態様において、本発明のシークオンポリペプチドは、Ｎ連結グリコシル化配列を親ポリペプチドの区域（ループドメインに対応する）中に導入することにより生成される。
【０１５７】
例えば、タンパク質ＢＭＰ−７の結晶構造は、Ａｌａ７２とＡｌａ８６ならびにＩｌｅ９６とＰｒｏ１０３の間に２つの伸長したループ領域を含む。ＢＭＰ−７突然変異体（それにおいてＮ連結グリコシル化配列がポリペプチド配列のそれらの領域内に置かれる）を生成することによって、突然変異がポリペプチドの本来の三次構造の破壊をほとんど起こさないポリペプチドがもたらされうる。
【０１５８】
しかし、ベータ−シート又はアルファ−ヘリカル立体構造の範囲内に入るアミノ酸位置でのＮ連結グリコシル化配列の導入は、また、シークオンポリペプチドをもたらすことがあり、それは新たに導入されたＮ連結グリコシル化配列で効率的にグリコシル化される。Ｎ連結グリコシル化配列のベータ−シート又はアルファ−ヘリカルドメイン中への導入によって、ポリペプチドに構造変化が起こされうるが、それは、次に、効率的なグリコシル化を可能にする。
【０１５９】
タンパク質の結晶構造を使用し、Ｎ連結グリコシル化配列の導入のために最も適した野生型ポリペプチド又は親ポリペプチドのドメインを同定することができ、有望な修飾部位の事前の選択を可能にしうる。
【０１６０】
結晶構造が利用可能ではない場合、ポリペプチドのアミノ酸配列を使用し、有望な修飾部位を事前に選択することができる（例えば、ループドメイン対アルファ−ヘリカルドメインの予測）。しかし、たとえポリペプチドの三次元構造が公知の場合でも、構造動態及び酵素／受容体相互作用が溶液中で変動する。故に、適した突然変異部位の同定ならびに適したグリコシル化配列の選択は、いくつかのシークオンポリペプチド（例えば、本発明のシークオンポリペプチドのライブラリー）の作製、及び、適切なスクリーニングプロトコル（例えば、本明細書に記載のもの）を使用した望ましい特徴についてのそれらの変異体のテストを含みうる。
【０１６１】
一実施態様において、親ポリペプチドは抗体又は抗体フラグメントであり、抗体又は抗体フラグメントの定常領域（例えば、ＣＨ２ドメイン）は、本発明のＮ連結グリコシル化配列で修飾される。一例において、Ｎ連結グリコシル化配列を、天然グリコシル化配列を置換する、又は、機能的に損なわせる様な方法で導入する。抗体の定常領域についてのアミノ酸配列及び核酸配列は、当業者に公知である。
【０１６２】
一実施態様において、シークオンスキャンを、抗体（各々が本発明の外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む）のライブラリーを作製するＣＨ２ドメインの選択された区域を通して実施する。さらに別の実施態様において、結果として得られるポリペプチド変異体を、グリコシル成分をグリコシル化配列に付加することを目的とする酵素的グリコシル化反応に供する。十分にグリコシル化されるそのような変異体を、それらが適した受容体（例えば、Ｆｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩａなど）に結合する能力について分析することができる。一実施態様において、そのようなグリコシル化抗体又は抗体フラグメントは、親抗体又はその天然グリコシル化バージョンと比較された場合、Ｆｃ受容体に対する増加した結合親和性を示す。本発明のこの局面は、２００７年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／８８１，１３０号においてさらに記載され、その開示は本明細書においてその全体が組み入れられる。記載される修飾は、抗体のエフェクター機能を変化させることができる。一実施態様において、グリコシル化された抗体変異体は、低下したエフェクター機能（例えば、ナチュラルキラー細胞の表面上又はキラーＴ細胞の表面上に見出される受容体に対する低下した結合親和性）を示す。別の例において、抗体の複合糖質化は、非修飾抗体と比較された場合、修飾抗体の薬物動態的及び／又は薬力学的特性を修飾するために有用である。例えば、複合糖質化抗体は、非修飾抗体よりも長いインビボでの半減期を有する。
【０１６３】
Ｎ連結グリコシル化配列を含むペプチドリンカーフラグメント
別の実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列を親ポリペプチド配列内に導入せず、しかし、むしろ、親ポリペプチドの配列を、親ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかへのペプチドリンカーフラグメントの付加を通じて伸長させ、ここでペプチドリンカーフラグメントは、本発明のＮ連結グリコシル化配列（例えば「ＮＬＴ」又は「ＤＦＮＶＳ」など）を含む。ペプチドリンカーフラグメントは、任意の数のアミノ酸を有しうる。一実施態様において、ペプチドリンカーフラグメントは、少なくとも約５つ、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、又は５０を上回るアミノ酸残基を含む。ペプチドリンカーフラグメントは、場合により、反応性官能基、例えばアミノ基（例えば、リジン）又はスルフヒドリル基（例えば、システイン）などを有する内部又は末端アミノ酸残基を含む。そのような反応性官能基を使用し、ポリペプチドを、別の成分（例えば別のポリペプチド、細胞毒素、小分子薬物、又は本発明の別の修飾基など）に連結してよい。本発明のこの局面は、２００７年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／８８１，１３０号においてさらに記載され、その開示は本明細書においてその全体が組み入れられる。
【０１６４】
一実施態様において、本発明のペプチドリンカーフラグメントで修飾された親ポリペプチドは、抗体又は抗体フラグメントである。この実施態様の一例において、親ポリペプチドはｓｃＦｖである。本明細書において記載される方法を使用し、本発明のｓｃＦｖを調製することができ、それにおいて、ｓｃＦｖ又はリンカーは、グリコシル成分、又はグリコシル連結基を通じてペプチドに付着された修飾基を用いて修飾される。グリコシル化及び複合糖質化の例示的な方法が、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３及び米国特許出願第１０／４１１，０１２号において記載され、その各々が参照により本明細書においてその全体が組み入れられる。
【０１６５】
一実施態様において、特定のアミノ酸残基がＮ連結グリコシル化配列中に含まれ、特定の生物（例えば大腸菌など）における突然変異ポリペプチドの発現可能性、タンパク質分解安定性、構造特徴、及び／又はポリペプチドの他の特性を調整する。
【０１６６】
例示的なポリペプチド
本発明のＮ連結グリコシル化配列を任意の親ポリペプチド中に導入し、本発明のシークオンポリペプチドを作製することができる。本発明のシークオンポリペプチドは、当技術分野において公知であり、本明細書において以下に記載される方法を使用して（例えば、組換え技術又は化学合成を通じて）生成することができる。一実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列が親配列中に挿入され、全長及び各数のアミノ酸を親ポリペプチドのアミノ酸配列に付加するような方法で、親配列を修飾する。別の実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列によって親ポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸を置換する。別の実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列を、グリコシル化配列の一部となるべき既存のアミノ酸の１つ又は複数を使用して、親ポリペプチド中に導入する。例えば、親ペプチド中のアスパラギン残基を維持し、プロリン直後のそれらのアミノ酸を突然変異させて、本発明のＮ連結グリコシル化配列を作製する。さらに別の実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列を、アミノ酸の挿入及び既存のアミノ酸の置換の組み合わせを用いて作製する。
【０１６７】
特定の実施態様において、本発明の特定の親ポリペプチドを、本発明の特定のＮ連結グリコシル化配列と共に使用する。例示的な親ポリペプチド／Ｎ連結グリコシル化配列の組み合わせを図６においてまとめる。図６における各列は、本発明の例示的な実施態様を表わす。示した組み合わせを、本発明の全ての局面（単一シークオンポリペプチド、ポリペプチドのライブラリー、ポリペプチド抱合体、及び本発明の方法を含む）において使用してよい。当業者は、示した親ポリペプチドについて図６において記載する実施態様を、本明細書において記載する他の親ポリペプチドに等しく適用することができることを理解するであろう。当業者は、また、列挙したポリペプチドを、例証した方法で、本明細書において記載する任意のグリコシル化配列と使用することができることを理解するであろう。
【０１６８】
ポリペプチドのライブラリー
グリコシル化又は複合糖質化（例えば、糖ＰＥＧ化）反応に供された際に効率的に（例えば、満足できる収率で）グリコシル化又は複合糖質化されるポリペプチドの同定のための１つの戦略は、本発明のＮ連結グリコシル化配列を、親ポリペプチドのアミノ酸配列内の種々の異なる位置（例えば、ベータ−シートドメイン及びアルファ−ヘリカルドメインを含む）に挿入し、次に多くの結果として得られるシークオンポリペプチドを、それらがオリゴサッカリルトランスフェラーゼの効率的な基質として機能する能力についてテストすることである。
【０１６９】
故に、別の局面において、本発明は、複数個の異なるメンバーを含むシークオンポリペプチドのライブラリーを提供し、それにおいてライブラリーの各メンバーは共通の親ポリペプチドに対応し、本発明の少なくとも１つの非依存的に選択される外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む。一実施態様において、ライブラリーの各メンバーは、同じＮ連結グリコシル化配列を含み、各々が親ポリペプチド内の異なるアミノ酸位置にある。別の実施態様において、ライブラリーの各メンバーは、異なるＮ連結グリコシル化配列を、しかし、親ポリペプチド内の同じアミノ酸位置に含む。Ｎ連結グリコシル化配列は、本発明のライブラリーとの併用で有用であり、本明細書において記載される。一実施態様において、本発明のライブラリーにおいて使用されるＮ連結グリコシル化配列は、化学式（Ｉ）（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、本発明のライブラリーにおいて使用されるＮ連結グリコシル化配列は、化学式（ＩＩ）（配列番号２）のアミノ酸配列を有する。化学式（Ｉ）及び化学式（ＩＩ）が本明細書において上に記載される。
【０１７０】
好ましい実施態様において、本発明のライブラリーと共に使用されるＮ連結グリコシル化配列は、以下：
【表８】
0005647899.tif 000010
より選択されるアミノ酸配列を有し、それにおいてＸ１、Ｘ２’、及びＸ４は上の通りに定義される。
【０１７１】
一実施態様において、ライブラリーの各メンバーが共通のＮ連結グリコシル化配列を有し、親ポリペプチドが、「ｍ」アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。一例において、シークオンポリペプチドのライブラリーは、（ａ）Ｎ連結グリコシル化配列を親ポリペプチド内の第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎに有する第１のシークオンポリペプチド（それにおいてｎは１〜ｍより選択されるメンバーである）；及び（ｂ）少なくとも１つの追加のシークオンポリペプチド（それにおいて、各々の追加のシークオンポリペプチドにおいて、Ｎ連結グリコシル化配列が追加のアミノ酸位置に導入され、各々の追加のアミノ酸位置が（ＡＡ）ｎ＋ｘ及び（ＡＡ）ｎ−ｘより選択され、それにおいてｘは１〜（ｍ−ｎ）より選択されるメンバーである）を含む。例えば、第１のシークオンポリペプチドが、第１のアミノ酸位置での選択されたＮ連結グリコシル化配列の導入を通じて生成される。後のシークオンポリペプチドを、次に、同じＮ連結グリコシル化配列をアミノ酸位置（親ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらに向かって位置付けられる）に導入することにより生成してよい。
【０１７２】
これに関連して、ｎ−ｘが０（ＡＡ０）である場合、グリコシル化配列を、親ポリペプチドのＮ末端アミノ酸の直前に導入する。例示的なシークオンポリペプチドは部分配列：「ＮＬＴＭ１...」を有しうる。
【０１７３】
第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎは、親ポリペプチドのアミノ酸配列内のどこかでありうる。一実施態様において、第１のアミノ酸位置が（例えば、ループドメインの開始部で）選択される。
【０１７４】
各々の追加のアミノ酸位置は、親ポリペプチド内のどこかでありうる。一例において、シークオンポリペプチドのライブラリーは、Ｎ連結グリコシル化配列を、（ＡＡ）ｎ＋ｐ及び（ＡＡ）ｎ−ｐより選択されるアミノ酸位置に有する第２のシークオンポリペプチドを含み、それにおいて、ｐは、１〜約１０、好ましくは１〜約８、より好ましくは１〜約６、さらにより好ましくは１〜約４、最も好ましくは１〜約２より選択される。一実施態様において、シークオンポリペプチドのライブラリーは、Ｎ連結グリコシル化配列をアミノ酸位置（ＡＡ）ｎに有する第１のシークオンポリペプチド及びＮ連結グリコシル化配列をアミノ酸位置（ＡＡ）ｎ＋１又は（ＡＡ）ｎ−１に有する第２のシークオンポリペプチドを含む。
【０１７５】
別の例において、追加のアミノ酸位置の各々は、先に選択されたアミノ酸位置に直接隣接している。さらに別の例において、各々の追加のアミノ酸位置は、先に選択されたアミノ酸位置より除去された正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸である。
【０１７６】
親ポリペプチドの「所定のアミノ酸位置での」Ｎ連結グリコシル化配列の導入は、突然変異が導入され、所定のアミノ酸位置の直ぐ次から（Ｃ末端に向かって）開始することを意味する。導入は、完全挿入（任意の既存のアミノ酸を置換しない）を通じて、又は、任意の数の既存のアミノ酸を置換することにより生じうる。
【０１７７】
例示的な実施態様において、シークオンポリペプチドのライブラリーは、Ｎ連結グリコシル化配列を親ポリペプチドの連続アミノ酸位置に導入することにより生成され、各々が先に選択されたアミノ酸位置に直接隣接して位置付けられ、それによりグリコシル化配列を、アミノ酸鎖を通じて、所望の最終アミノ酸位置に達するまで「スキャンニング」する。「直接隣接する」とは、親ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらに向かって正確に１つのアミノ酸位置を意味する。例えば、第１の突然変異体は、アミノ酸位置ＡＡｎでのグリコシル化配列の導入により作製される。ライブラリーの第２のメンバーは、アミノ酸位置ＡＡｎ＋１での、第３の突然変異体はＡＡｎ＋２での、など、グリコシル化部位の導入を通じて作製される。この手順は「シークオンスキャンニング」と呼ばれている。当業者は、第１のメンバーがアミノ酸位置（ＡＡ）ｎに、第２のメンバーがアミノ酸位置（ＡＡ）ｎ＋２に、第３が（ＡＡ）ｎ＋４に、など、グリコシル化配列を有するように、シークオンスキャンニングがライブラリーをデザインすることを含みうることを理解するであろう。同じように、ライブラリーのメンバーは、グリコシル化配列の他の戦略的配置により特徴付けてよい。例えば：
Ａ）メンバー１：（ＡＡ）ｎ；メンバー２：（ＡＡ）ｎ＋３；メンバー３：（ＡＡ）ｎ＋６；メンバー４：（ＡＡ）ｎ＋９など。
Ｂ）メンバー１：（ＡＡ）ｎ；メンバー２：（ＡＡ）ｎ＋４；メンバー３：（ＡＡ）ｎ＋８；メンバー４：（ＡＡ）ｎ＋１２など。
Ｃ）メンバー１：（ＡＡ）ｎ；メンバー２：（ＡＡ）ｎ＋５；メンバー３：（ＡＡ）ｎ＋１０；メンバー４：（ＡＡ）ｎ＋１５など。
【０１７８】
一実施態様において、シークオンポリペプチドの第１のライブラリーを、本発明の選択されたＮ連結グリコシル化配列を親ポリペプチドの特定の領域（例えば、特定のループ領域の開始からそのループ領域の終わりまで）を通してスキャンすることにより生成する。第２のライブラリーを、次に、同じグリコシル化配列をポリペプチドの別の領域を通してスキャンすることにより生成し、第１の領域と第２の領域の間に位置付けられるそれらのアミノ酸位置を「スキッピング」する。除外されるポリペプチド鎖の一部は、例えば、生物学的活性のために重要な結合ドメイン又はグリコシル化に不適であることが公知であるポリペプチド配列の別の領域に対応しうる。任意の数の追加ライブラリーを、ポリペプチドの追加ストレッチについて「シークオンスキャンニング」を実施することにより生成することができる。例示的な実施態様において、ライブラリーは、Ｎ連結合グリコシル化配列を、親ポリペプチド内の各アミノ酸位置に突然変異を導入するポリペプチド全体を通してスキャンすることにより生成される。
【０１７９】
一実施態様において、ライブラリーのメンバーは、ポリペプチドの混合物の一部である。例えば、細胞培養を複数の発現ベクターで感染させ、それにおいて各ベクターは本発明の異なるシークオンポリペプチドのための核酸配列を含む。発現時に、培養ブロスは複数個の異なるシークオンポリペプチドを含んでよく、したがってシークオンポリペプチドのライブラリーを含む。この技術は、ライブラリーのシークオンポリペプチドのいずれが、所定の発現系において最も効率的に発現されるのかを決定するために有用でありうる。
【０１８０】
別の実施態様において、ライブラリーのメンバーは互いに単離されて存在する。例えば、上の混合物のシークオンポリペプチドの少なくとも２つが単離されうる。一緒に、単離ポリペプチドはライブラリーを表わす。あるいは、ライブラリーの各シークオンポリペプチドは別々に発現され、シークオンポリペプチドは場合により単離される。別の例において、ライブラリーの各メンバーは化学的手段により合成され、場合により精製される。
【０１８１】
例示的なポリペプチド及びポリペプチドライブラリー
例示的な親ポリペプチドは組換えヒトＢＭＰ−７である。例示的な親ポリペプチドとしてのＢＭＰ−７の選択は、例証的な目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意味しない。当業者は、任意の親ポリペプチド（例えば、本明細書において記載されるもの）が、以下の例示的な修飾のために等しく適することを理解するであろう。このようにして得られた任意のポリペプチド変異体は、本発明の範囲内にある。本発明の生物学的に活性なＢＭＰ−７変異体は、任意のＢＭＰ−７ポリペプチドを一部として又は全体で含み、それは当業者に公知である任意の適した機能アッセイにより測定される通り、その生物学的活性の実質的な又は全体の喪失を招かない少なくとも１つの修飾を含む。以下の配列（１４０のアミノ酸）は、全長ＢＭＰ−７配列（配列Ｓ．１）：
【表９】
0005647899.tif 000011
の生物学的に活性な部分を表わす。
【０１８２】
例示的なＢＭＰ−７変異体ポリペプチドは、上の親ポリペプチド配列に基づいており、表３−１１において以下に列挙する。
【０１８３】
一つの例示的な実施態様において、突然変異を野生型ＢＭＰ−７アミノ酸配列Ｓ．１（配列番号１０）中に導入し、親配列中の対応する数のアミノ酸を置換し、親ポリペプチドと同じ数のアミノ酸残基を含むシークオンポリペプチドをもたらす。例えば、通常ＢＭＰ−７中にある３つのアミノ酸をＮ連結グリコシル化配列「アスパラギン−ロイシン−スレオニン」（ＮＬＴ）で直接的に置換し、次にポリペプチドのＣ末端に向かうＮＬＴ配列を連続的に移動させることによって、１３７のＢＭＰ−７変異体（各々がＮＬＴを含む）が提供される。この実施態様の例示的な配列を表３において、以下に列挙する。
【０１８４】
表３：１４０のアミノ酸を含み、３つの既存のアミノ酸がＮ連結グリコシル化配列「ＮＬＴ」で置換されているＢＭＰ−７変異体の例示的なライブラリー。
位置１での導入（３つの既存のアミノ酸を置換する）：
【表１０】
0005647899.tif 000012
位置２での導入（３つの既存のアミノ酸を置換する）：
【表１１】
0005647899.tif 000013
位置３での導入（３つの既存のアミノ酸を置換する）：
【表１２】
0005647899.tif 000014
追加ＢＭＰ−７変異体は、グリコシル化配列を上の様式で配列全体を通して「スキャン」することにより生成することができる。このようにして得られた全ての変異ＢＭＰ−７配列は、本発明の範囲内にある。そのようにして生成された最終シークオンポリペプチドは、以下の配列を有する：
位置１３７での導入（３つの既存のアミノ酸を置換する）：
【表１３】
0005647899.tif 000015
【０１８５】
別の例示的な実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列を、野生型ＢＭＰ−７アミノ酸配列Ｓ．１（配列番号１０）中に、１つ又は複数のアミノ酸を親配列に加えることにより導入する。例えば、Ｎ連結グリコシル化配列ＮＬＴを親ＢＭＰ−７配列に加えて、親配列中の２、１、又は０のいずれかのアミノ酸を置換する。この例において、加えられるアミノ酸残基の最高数は、挿入されるグリコシル化配列の長さに対応する。例示的な実施態様において、親配列を、正確に１個のアミノ酸だけ伸長させる。例えば、Ｎ連結グリコシル化配列ＮＬＴを親ＢＭＰ−７ペプチドに加えて、ＢＭＰ−７中に通常存在する２つのアミノ酸を置換する。この実施態様の例示的な配列を表４において、以下に列挙する。
【０１８６】
表４：１４１のアミノ酸を含み、２つの既存のアミノ酸がＮ連結グリコシル化配列「ＮＬＴ」で置換されている突然変異ＢＭＰ−７ポリペプチドの例示的なライブラリー。
位置１での導入（２つのアミノ酸（ＳＴ）を置換する）：
【表１４】
0005647899.tif 000016
位置２での導入（２つのアミノ酸（ＴＧ）を置換する）：
【表１５】
0005647899.tif 000017
位置３での導入（２つのアミノ酸（ＧＳ）を置換する）：
【表１６】
0005647899.tif 000018
位置４での導入（２つのアミノ酸（ＳＫ）を置換する）：
【表１７】
0005647899.tif 000019
位置５での導入（２つのアミノ酸（ＫＱ）を置換する）：
【表１８】
0005647899.tif 000020
追加のＢＭＰ−７変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、以下の配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
位置１３８での導入（２つの既存のアミノ酸（ＣＨ）を置換する）：
【表１９】
0005647899.tif 000021
このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
【０１８７】
別の例は、Ｎ連結グリコシル化配列（例えば、ＮＬＴ）の親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）への付加を含み、親ポリペプチド中に通常存在する１つのアミノ酸を置換する（二重アミノ酸挿入）。この実施態様の例示的な配列を表５において、以下に列挙する。
【０１８８】
表５：ＮＬＴを含むＢＭＰ−７突然変異の例示的なライブラリー；１つの既存のアミノ酸の置換（１４２アミノ酸）。
位置１での導入（１つのアミノ酸（Ｓ）を置換する）：
【表２０】
0005647899.tif 000022
位置２での導入（１つのアミノ酸（Ｔ）を置換する）：
【表２１】
0005647899.tif 000023
位置３での導入（１つのアミノ酸（Ｇ）を置換する）：
【表２２】
0005647899.tif 000024
位置４での導入（１つのアミノ酸（Ｓ）を置換する）：
【表２３】
0005647899.tif 000025
位置５での導入（１つのアミノ酸（Ｋ）を置換する）：
【表２４】
0005647899.tif 000026
追加のＢＭＰ−７変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、以下の配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
位置１３９での導入（１つの既存のアミノ酸（Ｈ）を置換する）：
【表２５】
0005647899.tif 000027
このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
【０１８９】
さらに別の例は、親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）内のＮ連結グリコシル化配列の作製を含み、親ポリペプチド中に通常存在するアミノ酸のいずれも置換せず、グリコシル化配列の全長を加える（例えば、ＮＬＴについてのトリプルアミノ酸挿入）。この実施態様の例示的な配列を表６において、以下に列挙する。
【０１９０】
表６：ＮＬＴを含むＢＭＰ−７変異体の例示的ライブラリー；３つのアミノ酸の付加（１４３のアミノ酸）。
位置１での導入（３つのアミノ酸を付加する）：
【表２６】
0005647899.tif 000028
位置２での導入（３つのアミノ酸を付加する）：
【表２７】
0005647899.tif 000029
位置３での導入（３つのアミノ酸を付加する）：
【表２８】
0005647899.tif 000030
位置４での導入（３つのアミノ酸を付加する）：
【表２９】
0005647899.tif 000031
追加のＢＭＰ−７突然変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、最終配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
位置１４０での導入（３つのアミノ酸を付加する）：
【表３０】
0005647899.tif 000032
このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
【０１９１】
表３〜６におけるそれらの例と類似のＢＭＰ−７変異体を、本発明のＮ連結グリコシル化配列のいずれかを使用して生成することができる。全ての結果として得られるＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。例えば、ＮＬＴの代わりに、配列ＤＲＮＬＴ（配列番号３２）を使用することができる。例示的な実施態様において、ＤＲＮＬＴを親ポリペプチド中に導入し、ＢＭＰ−７中に通常存在する５つのアミノ酸を置換する。この実施態様の例示的な配列を表７において、以下に列挙する。
【０１９２】
表７：ＤＲＮＬＴを含むＢＭＰ−７変異体の例示的なライブラリー；５つのアミノ酸の置換（１４０のアミノ酸）
【表３１】
0005647899.tif 000033
追加のＢＭＰ−７突然変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、最終配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
【表３２】
0005647899.tif 000034
このようにして得られた全ての突然変異ＢＭＰ−７配列は、本発明の範囲内にある。
【０１９３】
別の例において、Ｎ連結グリコシル化配列ＤＲＮＬＴを、親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）に、親配列のＮ末端又はＣ末端のいずれかに、又は、その近くに加え、１〜５のアミノ酸を親ポリペプチドに加える。この実施態様の例示的な配列を表８において、以下に列挙する。
【０１９４】
表８：ＤＲＮＬＴを含むＢＭＰ−７変異体の例示的なライブラリー（１４１〜１４５のアミノ酸）
アミノ末端突然変異体：
位置１での導入（５つのアミノ酸を付加する）：
【表３３】
0005647899.tif 000035
位置１での導入（４つのアミノ酸を付加し、１つのアミノ酸（Ｓ）を置換する）：
【表３４】
0005647899.tif 000036
位置１での導入（３つのアミノ酸を付加し、２つのアミノ酸（ＳＴ）を置換する）：
【表３５】
0005647899.tif 000037
位置１での導入（２つのアミノ酸を付加し、３つのアミノ酸（ＳＴＧ）を置換する）：
【表３６】
0005647899.tif 000038
位置１での導入（１つのアミノ酸を付加し、４つのアミノ酸（ＳＴＧＳ）を置換する）：
【表３７】
0005647899.tif 000039
カルボキシ末端突然変異体
位置１４０での導入（５つのアミノ酸を付加する）：
【表３８】
0005647899.tif 000040
位置１３９での導入（４つのアミノ酸を付加し、１つのアミノ酸（Ｈ）を置換する）：
【表３９】
0005647899.tif 000041
位置１３８での導入（３つのアミノ酸を付加し、２つのアミノ酸（ＣＨ）を置換する）：
【表４０】
0005647899.tif 000042
位置１３７での導入（２つのアミノ酸を付加し、３つのアミノ酸（ＧＣＨ）を置換する）：
【表４１】
0005647899.tif 000043
位置１３６での導入（１つのアミノ酸を付加し、４つのアミノ酸（ＣＧＣＨ）を置換する）：
【表４２】
0005647899.tif 000044
【０１９５】
さらに別の例は、Ｎ連結グリコシル化配列ＤＦＮＶＳ（配列番号４８）の親ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ−７）中への挿入を含み、１〜５のアミノ酸を親配列に加える。この実施態様の例示的な配列を表９において、以下に列挙する。
【０１９６】
表９：ＤＦＮＶＳを含むＢＭＰ−７変異体の例示的なライブラリー
１つのアミノ酸の挿入
【表４３】
0005647899.tif 000045
追加のＢＭＰ−７突然変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、最終配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
【表４４】
0005647899.tif 000046
このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
２つのアミノ酸の挿入
【表４５】
0005647899.tif 000047
追加のＢＭＰ−７変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、最終配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
【表４６】
0005647899.tif 000048
このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
３つのアミノ酸の挿入
【表４７】
0005647899.tif 000049
追加のＢＭＰ−７変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、最終配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
【表４８】
0005647899.tif 000050
このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
４つのアミノ酸の挿入
【表４９】
0005647899.tif 000051
追加のＢＭＰ−７変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、最終配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
【表５０】
0005647899.tif 000052
このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
５つのアミノ酸の挿入
【表５１】
0005647899.tif 000053
追加のＢＭＰ−７変異体を、グリコシル化配列を、配列全体を通して、上の様式で、最終配列に達するまで「スキャンすること」により生成することができる：
【表５２】
0005647899.tif 000054
このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
【０１９７】
一例において、Ｎ連結グリコシル化配列（例えば、ＮＬＴ又はＮＶＳ）が、選択されたポリペプチド領域内の全ての可能なアミノ酸位置で、既存のアミノ酸の置換により及び／又は挿入により置かれる。この実施態様の例示的な配列を表１０及び表１１において、以下に列挙する。
【０１９８】
表１０：Ａ７３とＡ８２の間にＮＬＴを含むＢＭＰ−７変異体の例示的なライブラリー
既存のアミノ酸の置換
【表５３】
0005647899.tif 000055
【０１９９】
表１１：Ｉ９５とＰ１０３の間にＮＬＴを含むＢＭＰ−７変異体の例示的なライブラリー
既存のアミノ酸の置換
【表５４】
0005647899.tif 000056
既存のアミノ酸の間での挿入（１つのアミノ酸を付加）
【表５５】
0005647899.tif 000057
既存のアミノ酸の間での挿入（１つのアミノ酸を付加）
【表５６】
0005647899.tif 000058
【０２００】
上の置換及び挿入は、本発明の任意のＮ連結グリコシル化配列（例えば、ＮＬＴならびに配列番号３２及び４８）を使用して作製することができる。このようにして得られた全てのＢＭＰ−７変異体は、本発明の範囲内にある。
【０２０１】
別の例示的な実施態様において、１つ又は複数のＮ連結グリコシル化配列（例えば上に記載のものなど）を血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、又は第ＩＸ因子ポリペプチド）中に挿入する。ＢＭＰ−７に関連して記載される通り、Ｎ連結グリコシル化配列を、ＢＭＰ−７で例示される種々のモチーフのいずれかにおいて挿入することができる。例えば、Ｎ連結グリコシル化配列を、野生型配列に固有の任意のアミノ酸を置換することなく、野生型配列中に挿入することができる。例示的な実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列を、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に、又は、その近くに挿入する。別の例示的な実施態様において、野生型ポリペプチド配列に固有の１つ又は複数のアミノ酸残基を、Ｎ連結グリコシル化配列の挿入前に除去する。さらに別の例示的な実施態様において、野生型配列に固有の１つ又は複数のアミノ酸残基は、Ｎ連結グリコシル化配列の成分であり（例えば、アスパラギン）、Ｎ連結グリコシル化配列は野生型アミノ酸を包含する。野生型アミノ酸は、Ｎ連結グリコシル化配列のいずれかの末端、又は、Ｎ連結グリコシル化配列の内部にありうる。
【０２０２】
さらに、任意の既存のＮ連結又はＯ連結グリコシル化配列を、本発明のＮ連結グリコシル化配列で置換することができる。また、Ｎ連結グリコシル化配列を、１つ又は複数のＯ連結グリコシル化配列に隣接して挿入することができる。一実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列の存在によって、Ｏ連結グリコシル化配列のグリコシル化が妨げられる。
【０２０３】
代表的な例において、親ポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子である。この実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列を、上に記載するモチーフのいずれかに従いＡ、Ｂ、又はＣドメイン中に挿入することができる。複数のＮ連結グリコシル化配列を、単一ドメイン又は複数のドメイン中に挿入することができる；ここでも、上のモチーフのいずれかに従う。例えば、Ｎ連結グリコシル化配列を、Ａ、Ｂ、及びＣドメイン、Ａ及びＣドメイン、Ａ及びＢドメイン、又はＢ及びＣドメインの各々の中に挿入することができる。あるいは、Ｎ連結グリコシル化配列をＡ及びＢドメイン又はＢ及びＣドメインに隣接させることができる。第ＶＩＩＩ因子についての例示的なアミノ酸配列を、図２に提供する。
【０２０４】
別の例示的な実施態様において、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。この実施態様において、Ｎ連結グリコシル化配列を、第ＶＩＩＩ因子ヘテロダイマーの８０Kdと９０Kdサブユニットを連結するペプチドリンカー中に挿入することができる。あるいは、Ｎ連結グリコシル化配列は、Ａドメイン及びリンカー又はＣドメイン及びリンカーに隣接させることができる。ＢＭＰ−７に関連して上に記載する通り、Ｎ連結グリコシル化配列を、既存のアミノ酸の置換なく挿入することができ、又は、挿入して、親ポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸を置換してよい。Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子についての例示的な配列を、図３に提供する。
【０２０５】
他のＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドも、本発明での使用のために適しており、例えば、Sandberg et al., Seminars in Hematology 38(2): 4-12 (2000)において開示されるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含み、その開示は本明細書において参照により組み入れられる。
【０２０６】
当業者には明らかなように、本発明の複数の突然変異Ｎ連結グリコシル化配列を含むそのポリペプチドも本発明の範囲内にある。追加の突然変異を導入し、ポリペプチドの特性、例えば生物学的活性、代謝的安定性（例えば、タンパク質分解の低下）、薬物動態などの調整を可能にしうる。
【０２０７】
ひとたび種々の変異体が調製されれば、それらは、Ｎ連結グリコシル化又は糖ＰＥＧ化の基質として機能するそれらの能力について評価することができる。成功したグリコシル化及び／又は糖ＰＥＧ化を、当技術分野において公知の方法、例えばマススペクトロメトリー（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ又はＱ−ＴＯＦ）、ゲル電気泳動（例えば、デンシトメトリーとの組み合わせで）、又はクロマトグラフィー分析（例えば、ＨＰＬＣ）などを使用して検出及び定量化してよい。生物学的アッセイ、例えば酵素阻害アッセイ、受容体結合アッセイ、及び／又は細胞ベースのアッセイなどを使用して、所定のポリペプチド又はポリペプチド抱合体の生物学的活性を分析することができる。評価戦略は、本明細書において、以下により詳細に記載されている（例えば、「リードポリペプチドの同定」を参照のこと）。各ポリペプチドの化学的及び生物学的評価のために有用な適切なアッセイ系を選択及び／又は開発することは、当業者の能力の範囲内でありうる。
【０２０８】
ポリペプチド抱合体
別の局面において、本発明は、ポリペプチド（例えば、シークオンポリペプチド）と選択された修飾基（例えば、ポリマー修飾基）の間の共有結合抱合体を提供し、それにおいて修飾基を、ポリペプチドに、グリコシル連結基（例えば、インタクトなグリコシル連結基）を介して抱合させる。グリコシル連結基を、ポリペプチドと修飾基の間に挿置し、その両方に共有結合的に連結させる。このポリペプチド抱合体の調製において有用である例示的な方法を、本明細書において記載する。他の有用な方法が、米国特許第５，８７６，９８０号；第６，０３０，８１５号；第５，７２８，５５４号；及び第５，９２２，５７７号、ならびにＷＯ  ９８／３１８２６；ＷＯ２００３／０３１４６４；ＷＯ２００５／０７０１３８；ＷＯ２００４／９９２３１；ＷＯ２００４／１０３２７；ＷＯ２００６／０７４２７９；及び米国特許出願公報第２００３１８０８３５号において記載されており、その全てが本明細書において参照により全ての目的のために組み入れられる。
【０２０９】
本発明の抱合体は、典型的に、一般的な構造：
【化２】
0005647899.tif 000059
（式中、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｓは、正の非ゼロの整数を表わし；ｔは０又は正の整数のいずれかである）に対応する。「修飾基」は、治療用薬剤、生物活性剤（例えば、毒素）、検出可能標識、ポリマー（例えば、水溶性ポリマー）、又は同様のものでありうる。リンカーは、以下の多様な連結基のいずれかでありうる。あるいは、リンカーは単結合でありうる。ポリペプチドの同一性は限定されない。
【０２１０】
例示的なポリペプチド抱合体は、Ｎ連結グリコシル化配列に、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの作用を通じて結合されているＮ連結ＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＨ残基を含む。一実施態様において、ＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＨ自体は、修飾基で誘導体化され、グリコシル連結基を表わす。別の実施態様において、追加のグリコシル残基はＧｌｃＮＡｃ成分に結合している。例えば、別のＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、又はＧａｌ−Ｓｉａ成分は、その各々を修飾基で修飾することができ、ＧｌｃＮＡｃ成分に結合されている。代表的な実施態様において、Ｎ連結サッカリル残基はＧｌｃＮＡｃ−Ｘ＊、ＧｌｃＮＨ−Ｘ＊、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｘ＊、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ−Ｘ＊、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｘ＊、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｘ＊、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｘ＊であって、それにおいてＸ＊は修飾基（例えば、水溶性ポリマー修飾基）である。
【０２１１】
一実施態様において、本発明は、それらの置換パターンにおいて高度に均質であるポリペプチド抱合体を提供する。本発明の方法を使用して、本発明の抱合体の集団にわたる修飾された糖成分の本質的に全てが、構造的に同一のアミノ酸又はグリコシル残基に付着されるポリペプチド抱合体を形成することが可能である。このように、例示的な実施態様において、本発明は、Ｎ連結グリコシル化配列内のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン）に、グリコシル連結基を通じて共有結合的に結合された少なくとも１つの修飾基（例えば、水溶性ポリマー修飾基）を含むポリペプチド抱合体を提供する。一例において、それに付着したグリコシル連結基を有する各アミノ酸残基は、同じ構造を有する。別の例示的な実施態様において、修飾基（例えば、水溶性ポリマー成分）の集団の本質的に各メンバーが、グリコシル連結基を介して、ポリペプチドのグリコシル残基に結合され、グリコシル連結基が付着しているポリペプチドの各グリコシル残基は同じ構造を有する。
【０２１２】
一局面において、本発明は、ポリペプチドと修飾基（例えば、ポリマー修飾基）の間の共有結合抱合体を提供し、それにおいてポリペプチドは本発明の外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む。典型的に、Ｎ連結グリコシル化配列はアスパラギン（Ｎ）残基を含む。ポリマー修飾基は、Ｎ連結グリコシル化配列のアスパラギン残基で、ポリペプチドとポリマー修飾基の間に挿置され、それらの両方に共有結合的に連結されたグリコシル連結基を介して、ポリペプチドに共有結合的に抱合される。グリコシル連結基は、モノサッカライド又はオリゴサッカライドでありうる。例示的なＮ連結グリコシル化配列が、本明細書において記載され、配列番号１又は配列番号２の構造を有しうる。例示的なポリマー修飾基、例えば水溶性ポリマー修飾基（例えば、ＰＥＧ又はｍ−ＰＥＧ）なども本明細書において記載される。
【０２１３】
一局面において、本発明は、Ｎ連結グリコシル化配列（例えば、外因性Ｎ連結グリコシル化配列）を有するシークオンポリペプチドを含む共有結合抱合体を提供する。一実施態様において、ポリペプチド抱合体は化学式（ＩＩＩ）：
【化３】
0005647899.tif 000060
の成分を含む。
【０２１４】
化学式（ＩＩＩ）において、ｗは０〜２０より選択される整数である。一実施態様において、ｗは０〜８より選択される。別の実施態様において、ｗは０〜４より選択される。さらに別の実施態様において、ｗは０〜１より選択される。１つの特定の例において、ｗは１である。ｗが０である場合、（Ｘ＊）ｗはＨで置換される。Ｘ＊は修飾基（例えば、直鎖又は分岐ポリマー修飾基）である。一例において、Ｘ＊は、修飾基をＺ＊に連結するリンカー成分を含む。別の例において、Ｘ＊は−Ｌａ−Ｒ６ｃ又は−Ｌａ−Ｒ６ｂである。ＡＡ−ＮＨ−は、アミノ基（例えば、アスパラギン）を含む側鎖を有するＮ連結グリコシル化配列内のアミノ酸に由来する成分である。一実施態様において、整数ｑは０であり、アミノ酸はＮ末端又はＣ末端アミノ酸である。別の実施態様において、ｑは１であり、アミノ酸は内部アミノ酸である。
【０２１５】
化学式（ＩＩＩ）において、Ｚ＊はグリコシル成分であり、それはモノサッカライド及びオリゴサッカライドより選択される。Ｚ＊はグリコシル模倣成分でありうる。ｗが１又はそれより大きい場合、Ｚ＊はグリコシル連結基である。一実施態様において、Ｚ＊は天然Ｎ連結グリカン、例えばトリマンノシル中心成分［ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（Ｍａｎ）２］などであり、それは場合によりフコース残基で置換される。一実施態様において、Ｚ＊はモノアンテナ型グリカンである。別の実施態様において、Ｚ＊はジアンテナ型グリカンである。さらに別の実施態様において、Ｚ＊はトリアンテナ型グリカンである。さらなる実施態様において、Ｚ＊はテトラアンテナ型グリカンである。Ｚ＊グリカンの各アンテナを、非依存的に選択された修飾基に共有結合的に連結してよい。例えば、Ｚ＊の各末端糖成分を、修飾基に共有結合的に連結してよい。
【０２１６】
一実施態様において、成分−Ｚ＊−（Ｘ＊）ｗは、以下の化学式により表わされ、モノ、ジ、トリ、及びテトラアンテナ型グリカン：
【化４】
0005647899.tif 000061
（式中、整数ｔ、ａ’、ｂ’、ｃ’、ｄ’、ｅ’、ｆ’、ｇ’、ｈ’、ｊ’、ｋ’、ｌ’、ｍ’、ｎ’、ｏ’、ｐ’、ｑ’、及びｒ’は０及び１より非依存的に選択される整数である）を含む。好ましい実施態様において、ｔは０である。
【０２１７】
場合により修飾基に結合している例示的なＮ連結グリカンを以下：
【化５】
0005647899.tif 000062
0005647899.tif 000063
0005647899.tif 000064
（式中、各Ｑは、Ｈ、単一の負電荷、及び陽イオン（例えば、Ｎａ＋）より非依存的に選択されるメンバーであり；及び、各Ｘａは、Ｈ、アルキル基、アシル基（例えば、アセチル）、及び修飾基（Ｘ＊）より非依存的に選択されるメンバーである）である。例示的な実施態様において、本発明のＮ連結グリカンは、少なくとも１つの修飾基を含む（例えば、少なくとも１つのＸａはＸ＊である）。追加のＮ連結グリカンが、２００２年１０月９日に出願されたＷＯ０３／３１４６４及び２００４年４月９日に出願されたＷＯ０４／９９２３１において開示され、その開示は本明細書において参照により全ての目的のために組み入れられる。
【０２１８】
例示的な実施態様において、化学式（ＩＩＩ）中のＺ＊はＧｌｃＮＡｃ成分を含む。別の例示的な実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＨ成分を含む。さらに別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＨ模倣成分を含む。さらなる実施態様において、Ｚ＊はバシロサミン（即ち、２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシグルコース）成分又はその誘導体を含む。別の実施態様において、Ｚ＊は、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＨ、Ｇａｌ、Ｍａｎ、Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＨ、Ｓｉａ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、及びこれらの成分の組み合わせより選択される。さらに別の実施態様において、Ｚ＊は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、及びＧｌｃ成分の組み合わせである。さらなる実施態様において、Ｚ＊は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、及びＳｉａ成分の組み合わせである。さらなる実施態様において、Ｚ＊は、バシロサミン、ＧａｌＮＡｃ、及びＧｌｃ成分の組み合わせである。一実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＨ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＭａｎ成分である。さらに別の実施態様において、Ｚ＊はＳｉａ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧａｌ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧａｌＮＡｃ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧａｌＮＨ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＦｕｃ成分である。さらに別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ、又はＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＨ成分である。一実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ又はＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、ＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ、又はＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、又はＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ−Ｓｉａ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ成分である。
【０２１９】
一実施態様において、本発明のポリペプチド抱合体は、アスパラギン残基を有するＮ連結グリコシル化配列を有するポリペプチドを含む。この実施態様の一例において、ポリペプチド抱合体は、化学式（ＩＶ）：
【化６】
0005647899.tif 000065
の構造を有する成分を含む。
【０２２０】
化学式（ＩＶ）において、ｗ、Ｘ＊、及びＺ＊は、化学式（ＩＩＩ）について上の通りに定義される。
【０２２１】
グリコシル連結基
修飾された糖のサッカライド成分は、ポリペプチドと修飾基の間に挿置された場合、「グリコシル連結基」になる。例示的な実施態様において、グリコシル連結基は、適切なオリゴサッカリルトランスフェラーゼの基質である、修飾されたモノサッカライド又はオリゴサッカライド（例えば、修飾されたドリコールピロリン酸糖）に由来する。別の例示的な実施態様において、グリコシル連結基はグリコシル模倣成分を含む。本発明のポリペプチド抱合体は、一価又は多価（例えば、アンテナ構造）であるグリコシル連結基を含みうる。このように、本発明の抱合体は、修飾基が、ポリペプチドに、一価グリコシル連結基を介して付着される種を含む。また、本発明内には、複数の修飾基が、ポリペプチドに、マルチアンテナグリコシル連結基を介して付着される抱合体が含まれる。
【０２２２】
例示的な実施態様において、化学式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）中の成分−Ｚ＊−（Ｘ＊）ｗは、化学式（Ｖ）：
【化７】
0005647899.tif 000066
の成分を含む。
【０２２３】
一実施態様において、化学式（Ｖ）中で、ＥはＯである。別の実施態様において、ＥはＳである。さらに別の実施態様において、ＥはＮＲ２７又はＣＨＲ２８であり、それにおいてＲ２７及びＲ２８は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるメンバーである。一実施態様において、Ｅ１はＯである。別の実施態様において、Ｅ１はＳである。別の実施態様において、Ｅ１はＮＲ２７（例えば、ＮＨ）である。別の実施態様において、Ｅ１は、ポリペプチドのアミノ酸残基への結合である。
【０２２４】
一実施態様において、化学式（Ｖ）中で、Ｒ２はＨである。別の実施態様において、Ｒ２は−Ｒ１である。さらに別の実施態様において、Ｒ２は−ＣＨ２Ｒ１である。さらなる実施態様において、Ｒ２は−Ｃ（Ｘ１）Ｒ１である。これらの実施態様において、Ｒ１は、ＯＲ９、ＳＲ９、ＮＲ１０Ｒ１１、置換又は非置換アルキル及び置換又は非置換ヘテロアルキルより選択され、それにおいて、Ｒ９は、Ｈ、金属イオン、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル及びアシルより選択されるメンバーである。Ｒ１０及びＲ１１は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル及びアシルより非依存的に選択されるメンバーである。一実施態様において、Ｘ１はＯである。別の実施態様において、Ｘ１は、置換又は非置換アルケニル、Ｓ及びＮＲ８より選択されるメンバーであり、それにおいて、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、置換又は非置換アルキル及び置換又は非置換ヘテロアルキルより選択されるメンバーである。特定の例において、Ｒ２はＣＯＯＱであり、それにおいてＱはＨ、単一の負電荷、又は塩対イオン（陽イオン）である。
【０２２５】
一実施態様において、化学式（Ｖ）中で、ＹはＣＨ２である。別の実施態様において、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２である。さらに別の実施態様において、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２である。さらなる実施態様において、ＹはＣＨである。一実施態様において、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨである。別の実施態様において、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨである。さらに別の実施態様において、ＹはＣＨ（ＯＨ）である。さらなる実施態様において、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）である。一実施態様において、ＹはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）である。Ｙ２は、Ｈ、ＯＲ６、Ｒ６、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、
【化８】
0005647899.tif 000067
（式中、Ｒ６及びＲ７は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル及び−Ｌａ−Ｒ６ｂより非依存的に選択されるメンバーである）より選択されるメンバーである。一例において、−Ｌａ−Ｒ６ｂは、Ｃ（Ｏ）Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）−Ｌｂ−Ｒ６ｂ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｌｂ−Ｒ６ｂ又はＮＨＣ（Ｏ）−Ｌｂ−Ｒ６ｂを含む。Ｒ６ｂは、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、及び修飾基、例えば本発明の直鎖又は分岐ポリマー修飾基などより選択されるメンバーである。
【０２２６】
化学式（Ｖ）中で、Ｒ３、Ｒ３’、及びＲ４は、Ｈ、ＮＨＲ３”、ＯＲ３”、ＳＲ３”、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル及び−Ｌａ−Ｒ６ｃより非依存的に選択されるメンバーである。一例において、−Ｌａ−Ｒ６ｃは、−Ｏ−Ｌｂ−Ｒ６ｃ、−Ｃ（Ｏ）−Ｌｂ−Ｒ６ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｌｂ−Ｒ６ｃ、−ＮＨ−Ｌｂ−Ｒ６ｃ、＝Ｎ−Ｌｂ−Ｒ６ｃ、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｌｂ−Ｒ６ｃ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｌｂ−Ｒ６ｃ又は−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−Ｌｂ−Ｒ６ｃを含み、それにおいて、各Ｒ３”は、Ｈ、置換又は非置換アルキル及び置換又は非置換ヘテロアルキルより非依存的に選択されるメンバーである。各Ｒ６ｃは、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、ＮＲ１３Ｒ１４及び修飾基より非依存的に選択されるメンバーであり、それにおいて、Ｒ１３及びＲ１４は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、及び置換又は非置換ヘテロアルキルより非依存的に選択されるメンバーである。
【０２２７】
上の実施態様において、各Ｌａ及び各Ｌｂは、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより選択される結合及びリンカー成分より非依存的に選択されるメンバーである。
【０２２８】
一実施態様において、化学式（Ｖ）の成分は、化学式（ＶＩ）：
【化９】
0005647899.tif 000068
（式中、Ｅ１、Ｒ３’、Ｒ３”、及びＲ４は上の通りに定義される）の構造を有する。一実施態様において、化学式（ＶＩ）中で、Ｅ１はＯである。別の実施態様において、Ｅ１はＮＨである。別の実施態様において、化学式（ＶＩ）中で、−ＯＲ３”はＯＨである。さらに別の実施態様において、Ｒ３’はＮＨＡｃ又はＯＨである。
【０２２９】
一実施態様において、化学式（ＶＩ）の成分は、ポリペプチドのアミノ酸残基に直接的に結合される。この実施態様の一例において、Ｅ１はそのアミノ酸残基への結合であり、化学式（ＶＩ）の成分は、以下：
【化１０】
0005647899.tif 000069
より選択されるメンバーである構造を有する。
【０２３０】
別の実施態様において、化学式（ＶＩ）の成分は、ポリペプチドに、別の糖残基を通じて結合される。例示的な実施態様において、化学式（ＶＩ）の成分は、以下：
【化１１】
0005647899.tif 000070
より選択される構造を有する。
【０２３１】
一例において、上の実施態様のいずれかに従い、Ｒ３’及びＲ４は、ＮＨＡｃ及びＯＨより非依存的に選択されるメンバーである。
【０２３２】
上の実施態様の一例において、化学式（Ｖ）又は（ＶＩ）の成分はＧｌｃＮＡｃ成分である。一例において、成分は、以下：
【化１２】
0005647899.tif 000071
より選択される構造を有する。
【０２３３】
別の実施態様において、化学式（Ｖ）の成分は、化学式（ＶＩＩ）：
【化１３】
0005647899.tif 000072
（式中、Ｙ２、Ｒ１、Ｅ１、Ｒ３”、及びＲ４は上の通りに定義される）の構造を有する。一実施態様において、化学式（ＩＶ）中で、Ｅ１はＯである。別の実施態様において、Ｅ１はＮＨである。別の実施態様において、Ｅ１は、ポリペプチドのアミノ酸残基への結合である。一実施態様において、化学式（ＶＩＩ）中で、Ｒ１はＯＲ９である。この実施態様の一例において、Ｒ９はＨ、負電荷、又は塩対イオン（陽イオン）である。別の実施態様において、化学式（ＶＩＩ）中で、Ｒ３”はＨである。
【０２３４】
別の実施態様において、化学式（ＶＩＩ）の成分は、以下：
【化１４】
0005647899.tif 000073
（式中、Ｒ９はＨ、単一の負電荷、又は塩対イオンである）より選択されるメンバーである構造を有する。一例において、Ｒ４はＯＨ及びＮＨＡｃより選択されるメンバーである。
【０２３５】
上の実施態様のいずれかの一例において（例えば、化学式Ｖ、ＶＩ又は化学式ＶＩＩ中で）、−Ｌａ−Ｒ６ｃは、以下：
【化１５】
0005647899.tif 000074
（式中、ｒは１〜２０より選択される整数であり、ｆ及びｅは１〜５０００より非依存的に選択される整数である）より選択されるメンバーである成分を含む。Ｒ１及びＲ２は、Ｈ及びＣ１−Ｃ１０置換又は非置換アルキルより非依存的に選択されるメンバーである。一例において、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、及びイソブチルより非依存的に選択されるメンバーである。一実施態様において、Ｒ１及びＲ２は各メチルである。
【０２３６】
上の実施態様のいずれかの別の例において、−Ｌａ−Ｒ６ｃ又は−Ｌａ−Ｒ６ｃは、
【化１６】
0005647899.tif 000075
である。
【０２３７】
上の実施態様の別の例において（例えば、化学式Ｖ、ＶＩ又は化学式ＶＩＩ中で）、−Ｌａ−Ｒ６ｃ又は−Ｌａ−Ｒ６ｃは、
【化１７】
0005647899.tif 000076
（式中、ｒは１〜２０より選択される整数であり、ｆ及びｅは１〜５０００より非依存的に選択される整数である）である。Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、及びイソブチルより非依存的に選択されるメンバーである。一実施態様において、Ｒ１及びＲ２は各メチルである。「＊」で示される立体中心は、ラセミ体でありうる、又は、定義できる。一実施態様において、立体中心は（Ｓ）立体配置を有する。別の実施態様において、立体中心は（Ｒ）立体配置を有する。
【０２３８】
上の実施態様のいずれかのさらなる別の例において（例えば、化学式Ｖ、ＶＩ又は化学式ＶＩＩ中で）、−Ｌａ−Ｒ６ｃ又は−Ｌａ−Ｒ６ｃは、
【化１８】
0005647899.tif 000077
（式中、ｅ、ｆ、Ｒ１、及びＲ２は上の通りに定義される）である。
【０２３９】
上の実施態様のいずれかのさらなる例において（例えば、化学式Ｖ、ＶＩ又は化学式ＶＩＩ中で）、−Ｌａ−Ｒ６ｃ又は−Ｌａ−Ｒ６ｃは、
【化１９】
0005647899.tif 000078
（式中、ｅ、ｆ、Ｒ１、及びＲ２は上の通りに定義される）である。
【０２４０】
さらに別の実施態様において、Ｒ６ｂ（例えば、化学式Ｖ中）又はＲ６ｃ（例えば、化学式Ｖ〜ＶＩＩ中）の少なくとも１つは、以下：
【化２０】
0005647899.tif 000079
（式中、ｇ、ｊ、及びｋは０〜２０より非依存的に選択される整数である）より選択されるメンバーである。各ｅは、０〜２５００より非依存的に選択される整数である。整数ｓは１〜５より選択される。Ｒ１６及びＲ１７は、非依存的に選択されるポリマー成分である。Ｇ１及びＧ２は、ポリマー成分Ｒ１６及びＲ１７をＣに連結する非依存的に選択された連結フラグメントである。例示的な連結フラグメントは、芳香族成分又はエステル成分のいずれも含まない。あるいは、これらの連結フラグメントは、生理学的に関連する条件下で分解するようにデザインされている１つ又は複数の成分（例えば、エステル、ジスルフィドなど）を含むことができる。
【０２４１】
Ｇ１及びＧ２を含む例示的な連結フラグメントは、非依存的に選択され、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ及びＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ｏＯ、（ＣＨ２）ｏＳ、又は（ＣＨ２）ｏＹ’−ＰＥＧを含み、それにおいて、Ｙ’はＳ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、又はＯであり、ｏは１〜５０からの整数である。例示的な実施態様において、連結フラグメントＧ１及びＧ２は異なる連結フラグメントである。
【０２４２】
Ｇ３は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリールより選択されるメンバーである。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、及びＡ１１は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２、及び−ＳｉＡ１２Ａ１３より非依存的に選択されるメンバーであり、それにおいて、Ａ１２及びＡ１３は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、及び置換又は非置換ヘテロアリールより非依存的に選択されるメンバーである。
【０２４３】
修飾基
本発明の修飾基は、任意の化学成分でありうる。例示的な修飾基を以下で考察する。修飾基は、所定のポリペプチドの特性（例えば、生物学的又は物理化学的特性）を改変するそれらの能力について選択することができる。修飾基の使用により改変されうる例示的なポリペプチドの特性は、限定はされないが、薬物動態、薬力学、代謝的安定性、体内分布、水溶性、脂溶性、組織標的化能力、及び治療活性プロファイルを含む。好ましい修飾基は、そのような修飾基で修飾されている本発明のポリペプチド抱合体の薬力学及び薬物動態を改善させるものである。他の修飾基は、診断用製品を含む、インビトロ生物学的アッセイ系における適用が見出されるポリペプチドの修飾のために有用でありうる。
【０２４４】
例えば、治療用グリコペプチドのインビボでの半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分で増強させることができる。ＰＥＧでのポリペプチドの化学的修飾（ＰＥＧ化）によってそれらの分子サイズが増加し、典型的に、表面及び官能基の接近可能性が減少し、それらの各々は、ポリペプチドに付着したＰＥＧ成分の数及びサイズに依存的である。高い頻度で、この修飾は、血漿中半減期の改善及びタンパク質分解安定性、ならびに免疫原性及び肝取り込みの減少をもたらす（Chaffee et al. J. Clin. Invest. 89: 1643-1651 (1992);Pyatak et al. Res. Commun. Chem. Pathol Pharmacol. 29: 113-127 (1980)）。例えば、インターロイキン２のＰＥＧ化によって、そのインビボでの抗腫瘍効力が増加することが報告されており（Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USＡ８4: 1487-1491 (1987)）、モノクローナル抗体Ａ７に由来するＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化によってその腫瘍局在化が改善されている（Kitamura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387-1394 (1990)）。このように、別の実施態様において、本発明の方法によりＰＥＧ成分で誘導体化されたポリペプチドのインビボでの半減期は、非誘導体化親ポリペプチドのインビボでの半減期と比べて増加する。
【０２４５】
ポリペプチドのインビボでの半減期における増加は、親ポリペプチドと比べたパーセント増加の範囲として最も良く表現される。パーセント増加の範囲の下端は、約４０%、約６０%、約８０%、約１００%、約１５０%、又は約２００%である。範囲の上端は、約６０%、約８０%、約１００%、約１５０%、又は約２５０%超である。
水溶性ポリマー修飾基
【０２４６】
一実施態様において、修飾基は、直鎖又は分岐より選択されるポリマー修飾基である。一例において、修飾基は１つ又は複数のポリマー成分を含み、それにおいて、各ポリマー成分は非依存的に選択される。
【０２４７】
多くの水溶性ポリマーが当業者に公知であり、本発明の実行において有用である。水溶性ポリマーという用語は、種、例えばサッカライド（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）及びポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えばポリ（エチレングリコール）など；ペプチド、タンパク質などを包含する。本発明は、任意の水溶性ポリマーで実行してよく、唯一の限定として、ポリマーは、抱合体の残部を付着させることができる点を含まなければならない。
【０２４８】
修飾基を１つ又は複数のポリペプチド成分に付着させるための修飾基の反応性誘導体（例えば、反応性ＰＥＧ類似体）の使用は、本発明の範囲内である。本発明は、反応性類似体の同一性により限定されない。
【０２４９】
好ましい実施態様において、修飾基はＰＥＧ又はＰＥＧ類似体である。ポリ（エチレングリコール）の多くの活性化誘導体が市販されており、文献において記載されている。適切な活性化ＰＥＧ誘導体を選び、又は、必要な場合、合成することは当業者の能力の十分に範囲内であり、それを用いて本発明において有用な基質を調製する。Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984); Abuchowski et al., J. Biol. Chem., 252: 3582-3586 (1977);Jackson et al., Anal. Biochem., 165: 114-127 (1987);Koide et al., Biochem Biophys. Res. Commun., 111: 659-667 (1983)）、トレシレート（Nilsson et al., Methods Enzymol., 104: 56-69 (1984);Delgado et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 12: 119-128 (1990)）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド由来活性エステル（Buckmann et al., Makromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981); Joppich et al., Makromol. Chem., 180: 1381-1384 (1979); Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984);Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.Ａ８4: 1487-1491 (1987);Kitamura et al., Cancer Res., 51: 4310-4315 (1991);Boccu et al., Z. Naturforsch., 38C: 94-99 (1983)、カーボネート（Zalipsky et al., POLY(ETHYLENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, Harris, Ed., Plenum Press, New York, 1992, pp.347-370;Zalipsky et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 15: 100-114 (1992); Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141-152 (1985)）、イミダゾリルホルメート（Beauchamp et al., Anal. Biochem., 131: 25-33 (1983);Berger et al., Blood, 71: 1641-1647 (1988)）、４−ジチオピリジン（Woghiren et al., Bioconjugate Chem., 4: 314-318 (1993)）、イソシアネート（Byun et al., ASAIO Journal, M649-M-653 (1992)）、及びエポキシド（Noishiki et al., (1989)により公開された米国特許第４，８０６，５９５号）を参照のこと。他の連結基は、アミノ基と活性化ＰＥＧの間のウレタン連結を含む。Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 11: 141-152 (1985)を参照のこと。
【０２５０】
ポリマーの活性化のための方法は、ＷＯ  ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ  ９４／１８２４７、ＷＯ  ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ  ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８号、及びさらにＷＯ  ９３／１５１８９において、及び、活性化ポリマーとペプチド、例えば、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ  ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ  ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ（Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)）の間の抱合について見出すことができる。
【０２５１】
本発明のにおいて有用な活性化ＰＥＧ分子及びそれらの試薬を作製する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ＷＯ０４／０８３２５９において記載されている。
【０２５２】
本明細書において記載される化合物を調製する際に使用される直鎖ＰＥＧを活性化するために適切な活性化基又は脱離基は、限定はされないが、
【化２１】
0005647899.tif 000080
種を含む。
【０２５３】
例示的な水溶性ポリマーは、ポリマーのサンプル中のポリマー分子の実質的な割合がおよそ同じ分子量のものである；そのようなポリマーは「均一分散」である。
【０２５４】
本発明は、ポリ（エチレングリコール）抱合体を参照することによりさらに例証される。ＰＥＧの官能化及び抱合に関するいくつかの総説及びモノグラムを利用可能である。例えば、Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); 及びBhadra, et al., Pharmazie, 57: 5-29 (2002)を参照のこと。反応性分子を使用して反応性ＰＥＧ分子を調製し、抱合体を形成するためのルートは、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号には、直鎖又は分枝ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、及びポリ（アクリロモルホリン）より選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性で単離可能な抱合体が開示されている。
【０２５５】
米国特許第６，３７６，６０４号には、有機溶剤中でポリマーの末端ヒドロキシルをジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネートと反応させることにより、水溶性で非ペプチド性のポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリルカーボネートエステルを調製するための方法が記載されている。活性エステルを使用して、生物学的に活性な薬剤（例えばポリペプチドなど）と抱合体を形成させる。
【０２５６】
ＷＯ  ９９／４５９６４には、安定な連結を通じてポリマー骨格に連結された少なくとも１つの末端を有するポリマー骨格を含む生物学的に活性な薬剤及び活性化水溶性ポリマーを含む抱合体が記載されており、それにおいて、少なくとも１つの末端は、分岐成分に連結された近接する反応基を有する分岐成分を含み、それにおいて、生物学的に活性な薬剤は、近接する反応基の少なくとも１つに連結される。他の分枝ポリ（エチレングリコール）は、国際公開第９６／２１４６９号において記載されており、米国特許第５，９３２，４６２号には、反応性の官能基を含む分枝末端を含む分枝ＰＥＧ分子を用いて形成された抱合体が記載されている。遊離の反応基は、生物学的に活性な種（例えばポリペプチドなど）と反応させ、ポリ（エチレングリコール）と生物学的に活性な種の間で抱合体を形成させるために利用可能である。米国特許第５，４４６，０９０号には、二官能性ＰＥＧリンカー及びＰＥＧリンカー末端の各々でペプチドを有する抱合体を形成する際でのその使用が記載されている。
【０２５７】
分解可能なＰＥＧ連結を含む抱合体は、ＷＯ  ９９／３４８３３；及びＷＯ  ９９／１４２５９、ならびに米国特許第６，３４８，５５８号において記載されている。そのような分解可能な結合は、本発明において適用可能である。
【０２５８】
上に記載されるポリマー活性化の当技術分野で認識されている方法は、本明細書において記載される分枝ポリマーの形成において、及び、また、他の種（例えば、糖、糖ヌクレオチドなど）へのこれらの分枝ポリマーの抱合のために、本発明に関連して有用である。
【０２５９】
例示的な水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、例えばＰＥＧ又はメトキシ−ＰＥＧ（ｍ−ＰＥＧ）などである。本発明において使用するポリ（エチレングリコール）は、任意の特定の形状又は分子量範囲に制限されない。各々の非依存的に選択されたポリ（エチレングリコール）成分について、分子量は、好ましくは、約５００Da〜約１００kDaである。一実施態様において、ＰＥＧ成分の分子量は、約２〜約８０kDaである。別の実施態様において、ＰＥＧ成分の分子量は、約２〜約６０kDa、好ましくは約５〜約４０kDaである。例示的な実施態様において、ＰＥＧ成分は分子量約１ｋＤａ、約２ｋＤａ、約５kDa、約１０kDa、約１５kDa、約２０kDa、約２５kDa、約３０kDa、約３５kDa、約４０kDa、約４５kDa、約５０kDa、約５５kDa、約６０kDa、約６５kDa、約７０kDa、約７５kDa、又は約８０kDaを有する。
【０２６０】
本発明において使用される例示的なポリ（エチレングリコール）分子は、限定はされないが、以下：
【化２２】
0005647899.tif 000081
（式中、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｑ−、ＨＳ−（ＣＨ２）ｑ、又は（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ）Ｚ１である。指数「ｅ」は、１から２５００の整数を表す）の化学式を有するものを含む。指数ｂ、ｄ、及びｑは、非依存的に０から２０の整数を表す。記号Ｚ及びＺ１は、非依存的に、ＯＨ、ＮＨ２、脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハライド、Ｓ−Ｒ９、活性化エステルのアルコール部分；−（ＣＨ２）ｐＣ（Ｙ１）Ｖ又は（ＣＨ２）ｐＵ（ＣＨ２）ｓＣ（Ｙ１）ｖを表す。記号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ１０を表す。記号Ｘ、Ｙ、Ｙ１、Ａ１、及びＵは、非依存的に、成分Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ１１を表す。記号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１２、活性化エステルのアルコール成分、活性化アミドのアミン成分、糖ヌクレオチド、及びタンパク質を表す。指数ｐ、ｑ、ｓ、及びｖは、０〜２０の整数より非依存的に選択されるメンバーである。記号Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、非依存的に、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、及び置換又は非置換ヘテロアリールを表す。
【０２６１】
本発明の抱合体を形成する際に有用なポリ（エチレングリコール）は、直鎖又は分枝のいずれかである。本発明における使用に適した分枝ポリ（エチレングリコール）分子は、限定はされないが、以下：
【化２３】
0005647899.tif 000082
（式中、Ｒ８及びＲ８’は、上のＲ８について定義された基より非依存的に選択されるメンバーである）の化学式により記載されるものを含む。Ａ１及びＡ２は、上のＡ１について定義された基より非依存的に選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆ、ｏ、及びｑは、上に記載の通りである。Ｚ及びＹは、上に記載の通りである。Ｘ１及びＸ１’は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ及びＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨより非依存的に選択されるメンバーである。
【０２６２】
他の例示的な実施態様において、分枝ＰＥＧは、システイン、セリン、又はジリジン中心に基づく。別の例示的な実施態様において、ポリ（エチレングリコール）分子は、以下：
【化２４】
0005647899.tif 000083
の構造より選択される。
【０２６３】
さらなる実施態様において、ポリ（エチレングリコール）は、付着した複数のＰＥＧを有する分岐ＰＥＧである。分枝ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号；米国特許第５，３４２，９４０号；米国特許第５，６４３，５７５号；米国特許第５，９１９，４５５号；米国特許第６，１１３，９０６号；米国特許第５，１８３，６６０号；ＷＯ  ０２／０９７６６；Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994);及びYamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998に記載されている。好ましい実施態様において、分岐ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、４０，０００ダルトン未満又はそれと等しい。
【０２６４】
代表的なポリマー修飾成分は、側鎖含有アミノ酸、例えば、セリン、システイン、リジン、及び小ペプチド（例えば、ｌｙｓ−ｌｙｓ）に基づく構造を含む。例示的な構造は以下：
【化２５】
0005647899.tif 000084
を含む。
【０２６５】
当業者は、ジリジン構造中の遊離アミンも、ＰＥＧ成分とのアミド又はウレタン結合を通じてＰＥＧ化させることができることを理解するであろう。
【０２６６】
さらに別の実施態様において、ポリマー修飾成分は、トリリジンペプチドに基づく分岐ＰＥＧ成分である。トリリジンは、モノ、ジ、トリ、又はテトラＰＥＧ化させることができる。この実施態様の例示的な種は、以下：
【化２６】
0005647899.tif 000085
（式中、指数ｅ、ｆ、及びｆ’は、１〜２５００より非依存的に選択される整数であり；そして、ｑ、ｑ’、及びｑ”は、１〜２０より非依存的に選択される整数である）の化学式を有する。
【０２６７】
当業者に明らかな通り、本発明において使用される分岐ポリマーは、上に記載するテーマに関するバリエーションを含む。例えば、上に示すジリジンＰＥＧ抱合体は、３つのポリマーサブユニットを含みうる。第３のものは、上の構造において非修飾として示されるα−アミンに結合している。同様に、３又は４のポリマーサブユニット（ポリマー修飾成分を用いて所望の方法で標識されている）を用いて官能性を持たせたトリリジンの使用は、本発明の範囲内である。
【０２６８】
１つ又は複数のポリマー成分（例えば、ＰＥＧ）を含む分岐修飾基を用いてポリペプチド抱合体を形成するために有用な例示的な前駆体は、以下：
【化２７】
0005647899.tif 000086
の化学式を有する。
【０２６９】
一実施態様において、この化学式の分岐ポリマー種は、本質的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｘ３’は、イオン化可能な（例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ２ＰＯ４、ＨＳＯ３、ＮＨ２、及びその塩など）又は他の反応性官能基（例えば、以下）を含む成分である。Ｃは炭素である。Ｇ３は、非反応基（例えば、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨなど）である。一実施態様において、Ｇ３は、好ましくは、ポリマー性成分ではない。Ｒ１６及びＲ１７は、非反応基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）及びポリマーアーム（例えば、ＰＥＧ）より非依存的に選択される。Ｇ１及びＧ２は、好ましくは、生理学的条件下で本質的に非反応性である連結フラグメントである。Ｇ１及びＧ２は、非依存的に選択される。例示的なリンカーは、芳香族成分又はエステル成分のいずれも含まない。あるいは、これらの連結は、生理学的に関連する条件下で分解するようにデザインされている１つ又は複数の成分（例えば、エステル、ジスルフィドなど）を含み、Ｇ１及びＧ２はポリマーアームＲ１６及びＲ１７をＣに連結させる。一実施態様において、Ｘ３’が、リンカー、糖、又はリンカー−糖カセット上の相補的な反応性の反応性官能基と反応する場合、Ｘ３’は連結フラグメントの成分に変換される。
【０２７０】
例示的な連結フラグメント（Ｇ１及びＧ２を含む）は、非依存的に選択され、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ及びＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ｏＯ、（ＣＨ２）ｏＳ、又は（ＣＨ２）ｏＹ’−ＰＥＧを含み、それにおいて、Ｙ’はＳ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、又はＯであり、ｏは１〜５０の整数である。例示的な実施態様において、連結フラグメントＧ１及びＧ２は異なる連結フラグメントである。
【０２７１】
例示的な実施態様において、上の前駆体の１つ又はその活性化誘導体は、糖、活性化糖、又は糖ヌクレオチドと反応し、それにより、Ｘ３’と糖成分上の相補的な反応性の基（例えば、アミン）の間での反応を通じて、それらに結合する。あるいは、Ｘ３’は、反応性官能基と、リンカーＬａの前駆体上で、以下のスキーム２に従って反応する。
【０２７２】
スキーム２：
【化２８】
0005647899.tif 000087
【０２７３】
例示的な実施態様において、修飾基は、天然もしくは非天然アミノ酸、アミノ酸類似体もしくはアミノ酸模倣体、又は１つ又は複数のそのような種から形成される小ペプチドに由来する。例えば、本発明の化合物中に見出される特定の分岐ポリマーは、以下：
【化２９】
0005647899.tif 000088
の化学式を有する。
【０２７４】
この例において、連結フラグメントＣ（Ｏ）Ｌａは、分岐ポリマー修飾成分の前駆体上の反応性官能基（例えば、Ｘ３’）及び糖成分上の反応性官能基、又はリンカーへの前駆体の反応により形成される。例えば、Ｘ３’がカルボン酸である場合、それは活性化されて、アミノ−サッカライド（例えば、Ｓｉａ、ＧａｌＮＨ２、ＧｌｃＮＨ２、ＭａｎＮＨ２など）からペンダント状であるアミン基に直接的に結合することができ、アミドを形成する。追加の例示的な反応性官能基及び活性化された前駆体が、本明細書の以下において記載されている。記号は、上で考察したものと同じ同一性を有する。
【０２７５】
別の例示的な実施態様において、Ｌａは以下の構造：
【化３０】
0005647899.tif 000089
（式中、Ｘａ及びＸｂは非依存的に選択される連結フラグメントであり、Ｌ１は、結合、置換又は非置換アルキル、又は置換又は非置換ヘテロアルキルより選択される）を有する連結成分である。
【０２７６】
Ｘａ及びＸｂについての例示的な種は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ及びＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨを含む。
【０２７７】
別の例示的な実施態様において、Ｇ２はＲ１７へのペプチド結合であり、それはアミノ酸、ジペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）又はトリペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）であり、それにおいてアルファ−アミン成分及び／又は側鎖ヘテロ原子はポリマー修飾成分で修飾される。
【０２７８】
上に記載する本発明の実施態様は、ポリマーが水溶性ポリマー、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である種を参照することによりさらに例示される。当業者は、続くセクションにおける焦点が、例証の明確さのためであり、ＰＥＧを例示的なポリマーとして使用して記載される種々のモチーフは、ＰＥＧ以外のポリマーが利用される種に等しく適用可能であることを理解するであろう。
【０２７９】
他の例示的な実施態様において、ポリペプチド抱合体は、以下の群：
【化３１】
0005647899.tif 000090
より選択される成分を含む。
【０２８０】
上の化学式の各々において、指数ｅ及びｆは、１〜２５００の整数より非依存的に選択される。さらなる例示的な実施態様において、ｅ及びｆを選択して、約１kDa、２kDa、５kDa、１０kDa、１５kDa、２０kDa、２５kDa、３０kDa、３５kDa、４０kDa、４５kDa、５０kDa、５５kDa、６０kDa、６５kDa、７０kDa、７５kDa、及び８０kDaであるＰＥＧ成分を提供する。記号Ｑは、置換又は非置換アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル、例えば、メチル）、置換又は非置換ヘテロアルキル又はＨを表わす。
【０２８１】
他の分岐ポリマーは、ジリジン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチド、例えば：
【化３２】
0005647899.tif 000091
及びトリリジンペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）、例えば：
【化３３】
0005647899.tif 000092
に基づく構造を有する。
【０２８２】
上の図の各々において、指数ｅ、ｆ、ｆ’、及びｆ”は、１〜２５００より非依存的に選択される整数を表わす。指数ｑ、ｑ’、及びｑ”は、１〜２０より非依存的に選択される整数を表わす。
【０２８３】
別の例示的な実施態様において、本発明の抱合体は、以下：
【化３４】
0005647899.tif 000093
（式中、Ｑは、Ｈ及び置換又は非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルより選択されるメンバーである）より選択されるメンバーである化学式を含む。指数ｅ及びｆは、１〜２５００より非依存的に選択される整数であり、指数ｑは、０〜２０より選択される整数である。
【０２８４】
別の例示的な実施態様において、本発明の抱合体は、以下：
【化３５】
0005647899.tif 000094
（式中、Ｑは、Ｈ及び置換又は非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、好ましくはＭｅより選択されるメンバーである）より選択されるメンバーである化学式を含む。指数ｅ、ｆ、及びｆ’は、１〜２５００より非依存的に選択される整数であり、指数ｑ及びｑ’は、１〜２０より非依存的に選択される整数である。
【０２８５】
別の例示的な実施態様において、本発明の抱合体は、以下：
【化３６】
0005647899.tif 000095
（式中、指数ｅ及びｆは０〜２５００より非依存的に選択される）の化学式の構造を含む。指数ｊ及びｋは、０〜２０より非依存的に選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、及びＡ１１は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２、及び−ＳｉＡ１２Ａ１３より非依存的に選択されるメンバーである。Ａ１２及びＡ１３は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、及び置換又は非置換ヘテロアリールより非依存的に選択されるメンバーである。
【０２８６】
上の化学式の一実施態様において、分岐ポリマーは、以下：
【化３７】
0005647899.tif 000096
の化学式の構造を有する。
【０２８７】
例示的な実施態様において、Ａ１及びＡ２は、ＯＣＨ３及びＯＨより非依存的に選択されるメンバーである。
【０２８８】
別の例示的な実施態様において、リンカーＬａは、アミノグリシン誘導体より選択されるメンバーである。この実施態様の例示的なポリマー修飾基は、以下：
【化３８】
0005647899.tif 000097
の化学式の構造を有する。
【０２８９】
一例において、Ａ１及びＡ２は、ＯＣＨ３及びＯＨより非依存的に選択されるメンバーである。この例の例示的なポリマー修飾基は以下：
【化３９】
0005647899.tif 000098
を含む。
【０２９０】
上の実施態様の各々において、修飾基は立体中心（例えば、アミノ酸リンカー又はグリセロールベースのリンカーを含むもの）を含み、立体中心はラセミ体でありうる又は定義することができる。一実施態様において、そのような立体中心が定義され、それは（Ｓ）立体配置を有する。別の実施態様において、立体中心は（Ｒ）立体配置を有する。
【０２９１】
当業者は、分岐ポリマーのｍ−ＰＥＧアームの１つ又は複数を、異なる末端（例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２−Ｃ１０−アルキルなど）を伴うＰＥＧ成分により置換することができることを理解するであろう。さらに、上の構造は、アルキルリンカーを、α−炭素原子と側鎖の官能基の間に挿入することにより（又は、炭素原子を除去することにより）容易に修飾される。このように、「ホモ」誘導体及びより高いホモログ、ならびにより低いホモログが、本発明において使用される分岐ＰＥＧのための中心の範囲内にある。
【０２９２】
本明細書において記載する分岐ＰＥＧ種は、以下のスキーム３において記載するものなどの方法により容易に調製される：
【０２９３】
スキーム３：分岐ＰＥＧ種の調製
【化４０】
0005647899.tif 000099
式中、ＸａはＯ又はＳであり、ｒは１〜５の整数である。指数ｅ及びｆは、１〜２５００の非依存的に選択される整数である。
【０２９４】
このように、スキーム３に従い、天然又は非天然アミノ酸を活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体（この場合はトシレート）と接触させ、側鎖ヘテロ原子Ｘａをアルキル化させることにより１を形成させる。単官能化ｍ−ＰＥＧアミノ酸を、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体を伴うＮ−アシル化条件にかけて、それにより分岐ｍ−ＰＥＧ２を組み立てる。当業者が理解する通り、トシレート脱離基を、任意の適した脱離基（例えば、ハロゲン、メシレート、トリフレートなど）で置換することができる。同様に、アミンをアシル化するために利用される反応性カーボネートを、活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなど）で置換することができ、又は、酸を、インサイチュで、脱水剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなど）を使用して活性化することができる。
【０２９５】
例示的な実施態様において、修飾基はＰＥＧ成分であるが、しかし、任意の修飾基（例えば、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療用成分など）を、グリコシル成分中に、適切な連結を通じて組み入れることができる。修飾された糖は、酵素的手段、化学的手段、又はそれらの組み合わせにより生成され、それにより修飾された糖を産生する。例示的な実施態様において、糖は、修飾成分の付着を可能にするが、しかし、依然として、糖が、修飾された糖をＧ−ＣＳＦポリペプチドに共役させることが可能な酵素の基質として機能することを可能にする任意の位置で、活性アミンと置換される。例示的な実施態様において、ガラクトサミンが修飾された糖である場合、アミン成分は炭素原子に６の位置で付着される。
【０２９６】
水不溶性ポリマー
別の実施態様において、上で考察したものと類似しているが、修飾された糖は、水溶性ポリマーよりむしろ、水不溶性ポリマーを含む。本発明の抱合体は、また、１つ又は複数の水不溶性ポリマーを含んでよい。本発明のこの実施態様は、媒体としての抱合体の使用により例証され、それを用いて治療用ポリペプチドを制御された方法で送達する。ポリマー薬物送達系は当技術分野において公知である。例えば、Dunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.Ｃ１991を参照のこと。当業者は、実質的に任意の公知の薬物送達系を、本発明の抱合体に適用可能であることを認識しうる。
【０２９７】
代表的な水不溶性ポリマーは、限定はされないが、ポリホスファジン（polyphosphazines）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック及びポリビニルフェノールならびにそれらのコポリマーを含む。
【０２９８】
本発明の抱合体において使用される合成的に修飾された天然ポリマーは、限定はされないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、及びニトロセルロースを含む。広範なクラスの合成的に修飾された天然ポリマーの特に好ましいメンバーは、限定はされないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルローススルフェートナトリウム塩、アクリルエステル及びメタクリルエステルのポリマー、ならびにアルギン酸を含む。
【０２９９】
これら及び本明細書において考察する他のポリマーは、商業的な供給源、例えばSigma Chemical Co.（St. Louis, MO.）、Polysciences（Warrenton, PA.）、Aldrich（Milwaukee, WI.）、Fluka（Ronkonkoma, NY）、及びBioRad（Richmond, CA）などから容易に得ることができる、又は、これらの供給源から得られるモノマーから、標準的な技術を使用して合成することができる。
【０３００】
本発明の抱合体において使用される代表的な生物分解性ポリマーは、限定はされないが、ポリラクチド、ポリグリコリド及びそのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（バレリアン酸）、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コグリコリド）、多無水物、ポリオルトエステル、それらの混合物及びコポリマーを含む。特に使用されるのは、ゲルを形成する組成物、例えばコラーゲン、プルロニック等を含むものである。
【０３０１】
本発明において使用されるポリマーは、それらの構造の少なくとも部分内に生物吸収性分子を有する水不溶性物質を含む「ハイブリッド」ポリマーを含む。そのようなポリマーの例は、水不溶性コポリマーを含むものであり、それは生物吸収性領域、親水性領域、及び１ポリマー鎖当たり複数の架橋性官能基を有する。
【０３０２】
本発明の目的のために、「水不溶性物質」は、水中で又は水含有環境において実質的に不溶性である物質を含む。このように、コポリマーの特定の領域又はセグメントは親水性又はさらに水溶性でありうるが、ポリマー分子は、全体として、任意の実質的な測定で、水に溶解しない。
【０３０３】
本発明の目的のために、「生物吸収性分子」という用語は、身体により、代謝又は分解され、そして再吸収及び／又は通常の排泄ルートを通じて排除されることができる領域を含む。そのような代謝産物又は分解産物は、好ましくは、実質的に、身体に無毒性である。
【０３０４】
生物吸収性領域は、コポリマー組成物が全体として水溶性にならない限り、疎水性又は親水性のいずれでもよい。このように、生物吸収性領域は、ポリマーが全体として水溶性のままであるとの優先度に基づいて選択される。したがって、相対特性（即ち、含まれる官能基の種類、及び生物吸収性領域の相対的割合、及び親水性領域）を選択し、有用な生物吸収性組成物が水溶性のままであることを保証する。
【０３０５】
例示的な吸収性ポリマーは、例えば、合成的に産生される、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の吸収性ブロックコポリマーを含む（Cohn et al.、米国特許第４，８２６，９４５号を参照のこと）。これらのコポリマーは、架橋されず、水溶性であり、身体は分解ブロックコポリマー組成物を排泄することができる。Younes et al., J Biomed. Mater. Res. 21: 1301-1316 (1987); 及びCohn et al., J Biomed. Mater. Res. 22: 993-1009 (1988)を参照のこと。
【０３０６】
現在、好ましい生物吸収性ポリマーは、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ（チオエステル）、ポリサッカライド、及びそれらの混合物より選択される１つ又は複数の成分を含む。より好ましくは、生物吸収性ポリマーは、ポリ（ヒドロキシ）酸成分を含む。ポリ（ヒドロキシ）酸の内、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリバレリアン酸、ならびにそれらのコポリマー及び混合物が好ましい。
【０３０７】
インビボで吸収される（「生物吸収性」）フラグメントの形成に加えて、本発明の方法における使用のための好ましいポリマーコーティングは、また、排泄可能及び／又は代謝可能なフラグメントを形成することができる。
【０３０８】
より高次のコポリマーも本発明において使用することができる。例えば、Casey et al.、米国特許第４，４３８，２５３号（１９８４年３月２０日に公開）では、ポリ（グリコール酸）及びヒドロキシ末端化ポリ（アルキレングリコール）のトランスエステル化から産生されるトリブロックコポリマーが開示されている。そのような組成物は、吸収性モノフィラメント縫合としての使用のために開示されている。そのような組成物の柔軟性は、芳香族オルトカーボネート（例えばテトラ−ｐ−トリルオルトカーボネートなど）のコポリマー構造中への組み入れにより制御される。
【０３０９】
乳酸及び／又はグリコール酸に基づく他のポリマーも利用することができる。例えば、Spinu、米国特許第５，２０２，４１３号（１９９３年４月１３日に公開）には、オリゴマーのジオール又はジアミン残基のいずれかへのラクチド及び／又はグリコリドの開環重合、それに続く二官能性化合物（例えばジイソシアネート、ジアシルクロライド（diacylchloride）、又はジクロロシラン）を用いた鎖伸長によって産生される、ポリ乳酸及び／又はポリグリコリドの連続的に順序付けられたブロックを有する、生物分解性マルチブロックコポリマーが開示されている。
【０３１０】
本発明において有用なコーティングの生物吸収性領域は、加水分解的及び／又は酵素的に切断可能であるようにデザインすることができる。本発明の目的のために、「加水分解的に切断可能な」は、コポリマー、特に生物吸収性領域が、水又は水含有環境における加水分解に対して感受性であることを指す。同様に、「酵素的に切断可能な」は、本明細書において使用される通り、コポリマー、特に生物吸収性領域が、内因性又は外因性の酵素による切断に対して感受性であることを指す。
【０３１１】
体内に置かれた場合、親水性領域を排泄可能及び／又は代謝可能なフラグメントに加工することができる。このように、親水性領域には、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、ポリサッカライド、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ならびにそれらのコポリマー及び混合物が含まれうる。さらに、親水性領域は、また、例えば、ポリ（アルキレン）オキシドでありうる。そのようなポリ（アルキレン）オキシドは、例えば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシド、ならびにそれらの混合物及びコポリマーが含まれうる。
【０３１２】
ヒドロゲルの成分であるポリマーも本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収することが可能なポリマー物質である。ヒドロゲル形成化合物の例は、限定はされないが、ポリアクリル酸、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン（polyvinyl pyrrolidine）、ゼラチン、カラゲナン及び他のポリサッカライド、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体などを含む。安定で、生物分解性の、生物吸収性のヒドロゲルを産生することができる。さらに、ヒドロゲル組成物は、これらの特性の１つ又は複数を示すサブユニットを含むことができる。
【０３１３】
その整合性を、架橋を通じて制御することができる、生物適合性ヒドロゲル組成物が公知であり、現在、本発明の方法における使用のために好ましい。例えば、Hubbell et al.、米国特許第５，４１０，０１６号（１９９５年４月２５日に公開）、第５，５２９，９１４号（１９９６年６月２５日に公開）には、水溶性系が開示されており、それは、２つの加水分解的に変化しやすい伸長部の間にサンドイッチされた、水溶性の中心ブロックセグメントを有する架橋されたブロックコポリマーである。そのようなコポリマーは、さらに、光重合性アクリレート官能基を用いてエンドキャップされる。架橋される場合、これらの系はヒドロゲルになる。そのようなコポリマーの水溶性の中心ブロックは、ポリ（エチレングリコール）を含みうるが；加水分解的に変化しやすい伸長部は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えばポリグリコール酸又はポリ乳酸など）でありうる。Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-587 (1993)を参照のこと。
【０３１４】
別の実施態様において、ゲルは、熱可逆的ゲルである。熱可逆的ゲル（例えばプルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリサッカライド、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲル、及びそれらの組み合わせなどの成分を含む）が、現在、好ましい。
【０３１５】
さらに別の例示的な実施態様において、本発明の抱合体は、リポソームの成分を含む。リポソームは、当業者に公知の方法に従って、例えば、Eppstein et al.、米国特許第４，５２２，８１１号（１９８５年６月１１日に公開）に記載されている通りに調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（例えばステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイル（arachadoyl）ホスファチジルコリン、及びコレステロールなど）を、無機溶媒中に溶解させ、次に蒸発させ、容器の表面上に乾燥した脂質の薄膜を残すことによって調製してよい。活性化合物又はその薬学的に許容され得る塩の水溶液を、次に、その容器中に導入する。この容器を、次に、手で回し、脂質物質を容器の側面から遊離させ、脂質凝集物を分散させ、それによりリポソーム懸濁液を形成させる。
【０３１６】
上に記載する微粒子及び微粒子を調製する方法は、例として与えられ、それらは、本発明において使用される微粒子の範囲を定義することを意図しない。異なる方法により製作される一連の微粒子が、本発明において有用であることは、当業者に明らかであろう。
【０３１７】
水溶性ポリマー（直鎖及び分枝の両方）に関連して上で考察した構造的フォーマットは、一般的に、水不溶性ポリマーに関しても適用可能である。このように、例えば、システイン、セリン、ジリジン、及びトリリジン分岐中心は、２つの水不溶性ポリマー成分を用いて官能性を持たせることができる。これらの種を産生するために使用される方法は、一般的に、水溶性ポリマーを産生するために使用される方法と密接に類似している。
【０３１８】
他の修飾基
本発明は、また、ポリペプチドが、治療用成分、診断用成分、標的成分、毒素成分などにグリコシル連結基を介して抱合された、上に記載ものに類似する抱合体を提供する。上に記載する成分の各々は、小分子、天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）又は合成ポリマーでありうる。
【０３１９】
さらなる実施態様において、本発明は、抱合体の成分としての標的薬剤の存在に起因して、特定の組織において選択的に局在化する抱合体を提供する。例示的な実施態様において、標的薬剤はタンパク質である。例示的なタンパク質は、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ−糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体特異的抗原を伴う組織、血液プール）、凝固因子Ｖ−ＸＩＩ（損傷組織、血餅、癌、血液プール）、血清タンパク質、例えば、α−酸性糖タンパク、フェチュイン、α−胎児タンパク質（脳、血液プール）、β２−糖タンパク質（肝臓、アテローム性動脈硬化巣粥腫、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、及びＥＰＯ（免疫刺激、癌、血液プール、赤血球過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期の増加）、ＩＬ−２及びＩＦＮ−αを含む。
【０３２０】
例示的な標的抱合体において、インターフェロンアルファ２β（ＩＦＮ−α２β）を、トランスフェリンに、グリコシル連結基をＰＥＧ成分の各末端に含む二官能性リンカーを介して抱合させる（スキーム１）。例えば、ＰＥＧリンカーの１つの末端を、トランスフェリンに付着させたインタクトなシアル酸リンカーを用いて官能性を持たせ、他を、ＩＦＮ−α２βに付着させたインタクトなＣ連結Ｍａｎリンカーを用いて官能性を持たせる。
【０３２１】
生体分子
別の実施態様において、修飾された糖は生体分子を持つ。さらなる実施態様において、生体分子は、機能性のタンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（例えば、単一のヌクレオチド又はヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び一本鎖又はそれ以上の核酸）、レクチン、受容体、又はそれらの組み合わせである。
【０３２２】
好ましい生体分子は、本質的に非蛍光性であり、又は、そのような最小量の蛍光を発光し、それらはアッセイにおける蛍光マーカーとしての使用に不適切である。さらに、一般的に、糖ではない生体分子を使用することが好ましい。この優先度に対する例外は、別の実体（例えば、ＰＥＧ、生体分子、治療用成分、診断用成分など）の共有結合的な付着により修飾される本来なら天然である糖の使用である。例示的な実施態様において、糖成分は、生体分子であり、リンカーアームに抱合され、糖リンカーアームカセットは、後に、ポリペプチドに、本発明の方法を介して抱合される。
【０３２３】
本発明を実行する際に有用な生体分子は、任意の供給源に由来しうる。生体分子は天然の供給源から単離することができ、又は、それらは合成方法により産生することができる。ポリペプチドは天然ポリペプチド又は突然変異ポリペプチドでありうる。突然変異は、化学的な突然変異誘発、部位特異的な突然変異誘発、又は当業者に公知の突然変異を誘発する他の手段により影響を受ける。本発明を実行する際に有用なポリペプチドは、例えば、酵素、抗原、抗体、及び受容体を含む。抗体はポリクローナル又はモノクローナルのいずれか、インタクト又はフラグメントのいずれかでありうる。ポリペプチドは、場合により、進化分子工学のプログラムの産物である。
【０３２４】
天然由来及び合成のペプチドならびに核酸の両方が、本発明に関連して有用である。これら分子は、糖残基成分に、又は、任意の利用可能な反応基により架橋薬剤に付着させることができる。例えば、ポリペプチドは、反応性のアミン、カルボキシル、スルフヒドリル、又はヒドロキシル基を通じて付着させることができる。反応基は、ポリペプチド末端又はペプチド鎖内部の部位に存在しうる。核酸は、塩基（例えば、環外アミン）上の反応基を通じて、又は、糖成分（例えば、３’−又は５’−ヒドロキシル）上の利用可能なヒドロキシル基を通じて付着させることができる。ペプチド及び核酸鎖は、１又は複数の部位でさらに誘導化でき、鎖上への適切な反応基の付着を可能にすることができる。Chrisey et al. Nucleic Acids Res. 24: 3031-3039 (1996)を参照のこと。
【０３２５】
さらなる実施態様において、生体分子は、本発明の方法により修飾されたポリペプチドを、特定の組織に向けるように選択され、それにより、組織に送達される非誘導体化ポリペプチドの量と比べ、その組織へのポリペプチドの送達が増強される。さらなる実施態様において、特定の組織に、選択された時間内に送達される誘導体化ポリペプチドの量は、少なくとも約２０%、より好ましくは、少なくとも約４０%、より好ましくは少なくとも約１００%だけ誘導体化により増強される。現在、標的適用のための好ましい生体分子は、抗体、ホルモン、及び細胞表面受容体に対するリガンドを含む。
【０３２６】
さらなる例示的な実施態様において、ビオチンを伴う抱合体として提供される。このように、例えば、選択的にビオチン化されたポリペプチドは、１つ又は複数の修飾基を持つアビジン又はストレプトアビジン成分の付着により合成される。
【０３２７】
治療用成分
別の実施態様において、修飾された糖は治療用成分を含む。当業者は、治療用成分のカテゴリーと生体分子の間に重複が存在することを理解するであろう；多くの生体分子は治療特性又は可能性を有する。
【０３２８】
治療用成分は、臨床使用のために既に承認された薬剤でありうる。又は、それらは使用が実験的である（すなわちその活性もしくは作用機構が研究中である）薬物でありうる。治療用成分は、所定の病状における証明された作用を有しうる、又は、所定の病状において所望の作用を示すことが仮定されるだけでありうる。別の実施態様において、治療用成分は化合物であり、それらは、選択された組織と相互作用するそれらの能力についてスクリーニングされている。治療用成分は、本発明を実行する際に有用であり、種々の薬理学的活性を有する広範な薬物クラスからの薬物を含む。好ましい治療用成分は、本質的に非蛍光性であり、又は、そのような最小量の蛍光を発光し、それらはアッセイにおける蛍光マーカーとしての使用に不適切である。さらに、一般的に、糖ではない治療用成分を使用することが好ましい。この優先度に対する例外は、別の実体（例えば、ＰＥＧ、生体分子、治療用成分、診断用成分など）の共有結合的な付着により修飾される糖の使用である。別の例示的な実施態様において、治療用糖成分はリンカーアームに抱合され、糖リンカーアームカセットは、後に、ポリペプチドに、本発明の方法を介して抱合される。
【０３２９】
治療用及び診断用の薬剤を種々の他の種に抱合する方法は、当業者に周知である。例えば、Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; 及びDunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C1991を参照のこと。
【０３３０】
例示的な実施態様において、治療用成分は、選択された条件下で切断される連結を介して修飾された糖に付着させる。例示的な条件は、限定はされないが、選択されたｐＨ（例えば、胃、腸、エンドサイトーシス液胞）、活性酵素の存在（例えば、エステラーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ）、光、熱などを含む。多くの切断可能な基が当技術分野において公知である。例えば、Jung et al., Biochem. Biophys. Acta, 761: 152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol. Chem., 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al., J. Immunol., 124: 913-920 (1980); Bouizar et al., Eur. J. Biochem., 155: 141-147 (1986); Park et al., J. Biol. Chem., 261: 205-210 (1986); Browning et al., J. Immunol., 143: 1859-1867 (1989)を参照のこと。
【０３３１】
有用な治療用成分のクラスは、例えば、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤＳ）を含む。ＮＳＡＩＤＳは、例えば、以下のカテゴリーより選択することができる：（例えば、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体、及びオキシカム）；ヒドロコルチゾンなどを含むステロイド性抗炎症薬；抗ヒスタミン薬（例えば、クロルフェニラミン、トリプロリジン）；鎮咳剤（例えば、デキストロメトルファン、コデイン、カラミフェン、及びカルベタペンタン）；止痒薬（例えば、メトジラジン及びトリメプラジン）；抗コリン作用薬（例えば、スコポラミン、アトロピン、ホマトロピン、レボドパ）；制吐薬及び制嘔吐薬（例えば、シクリジン、メクリジン、クロルプロマジン、ブクリジン）；食欲減退薬（例えば、ベンズフェタミン、フェンテルミン、クロルフェンテルミン、及びフェンフルラミン）；中枢刺激薬（例えば、アンフェタミン、メタンフェタミン、デクストロアンフェタミン、及びメチルフェニデート）；抗不整脈薬（例えば、プロパノルオール、プロカインアミド、ジソピラミド、キニジン、エンカイニド）；β−アドレナリン遮断薬（例えば、メトプロロール、アセブトロール、ベタキソロール、ラベタロール、及びチモロール）；強心薬（例えば、ミルリノン、アムリノン、及びドブタミン）；降圧薬（例えば、エナラプリル、クロニジン、ヒドララジン、ミノキシジル、グアナドレル、グアネチジン）；利尿薬（例えば、アミロライド及びヒドロクロロチアジド）；冠血管拡張薬（例えば、ジルチアゼム、アミオダロン、イソクスプリン、ナイリドリン、トラゾリン、及びベラパミル）；血管収縮薬（例えば、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、及びメチルセルギド）；抗潰瘍薬（例えば、ラニチジン及びシメチジン）；麻酔薬（例えば、リドカイン，ブピバカイン、クロロプロカイン、ジブカイン）；抗鬱薬（例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン）；精神安定薬及び鎮静薬（例えば、クロルジアゼポキシド、ベナシチジン、ベンズキナミド、フルラゼパム、ヒドロキシジン、ロキサピン、及びプロマジン）；抗精神病薬（例えば、クロルプロチキセン、フルフェナジン、ハロペリドール、モリンドン、チオリダジン、及びトリフルオペラジン）；抗微生物薬（抗菌、抗真菌、抗原虫、及び抗ウイルス薬）。
【０３３２】
本発明の組成物中に組み入れられるための好ましい抗微生物薬は、例えば、β−ラクタム薬、キノロン薬、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アミカシン、トリクロサン、ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クリンダマイシン、エタムブトール、ヘキサミジンイソチオネート、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネオマイシン、メタサイクリン、メタンアミド、ミノサイクリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ミコナゾール、及びアマンタジンの薬学的に許容されうる塩を含む。
【０３３３】
本発明を実行する際に使用される他の薬物成分は、抗悪性腫瘍薬（例えば、アンチアンドロゲン（例えば、ロイプロリド又はフルタミド）、細胞破壊薬（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、β−２−インターフェロン）抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）、代謝拮抗薬（例えば、フルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン）を含む。また、このクラスに含まれるのは、診断及び治療の両方のためのラジオアイソトープベースの薬剤、及び抱合毒素（例えばリシン、ゲルダナマイシン、マイタンシン、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、クリケアマイシン（Chlicheamycin）、ならびにそれらの関連する構造及び類似体など）である。
【０３３４】
治療的成分は、また、ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラジオール、ロイプロリド、メゲステロール、オクトレチド、又はソマトスタチン）；筋弛緩薬（例えば、シンナメドリン、シクロベンザプリン、フラボキセート、オルフェナドリン、パパヴェリン、メベヴェリン、イダヴェリン、リトドリン、ジフェノキシレート、ダントロレン、及びアズモレン）；抗痙薬；骨−活性薬（例えば、ジホスホネート及びホスホノアルキルホスフィネート薬化合物）；内分泌調節薬（例えば、避妊薬（例えば、エチノジオール、エチニルエストラジオール、ノレチンドロン、メストラノール、デソゲステレル、メドロキシプロゲステロン）、糖尿病の調節物質（例えば、グリブリド又はクロルプロパミド）、同化剤（例えばテストラクトン又はスタノゾロールなど）、アンドロゲン（例えば、メチルテストステロン、テストステロン、又はフルオキシメステロン）、抗利尿薬（例えば、デスモプレッシン及びカルシトニン）でありうる。
【０３３５】
また、本発明において使用されるのはエストロゲン（例えば、ジエチルシチルベステロール）、グルココルチコイド（例えば、トリアムシノロン、ベタメサゾンなど）、及びプロゲステロン（例えばノレチンドロン、エチノジオール、ノレチンドロン、レボノルゲストレルなど）；甲状腺剤（例えば、リオチロニン又はレボチロキシン）又は抗甲状腺剤（例えば、メチマゾール）；抗過プロラクチン血症薬（例えば、カベルゴリン）；ホルモンサプレッサー（例えば、ダナゾール又はゴセレリン）、子宮収縮剤（例えば、メチルエルゴノビン又はオキシトシン）及びプロスタグランジン（例えばミオプロストール、アルプロスタジル、又はジノプロストーンなど）であり、これらを用いることもできる。
【０３３６】
他の有用な修飾基は、免疫調節薬（例えば、抗ヒスタミン剤、マスト細胞安定化剤（例えばロドキサミド及び／又はクロモリンなど）、ステロイド（例えば、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベクロメタゾン、又はクロベタゾル）、ヒスタミンＨ２アンタゴニスト（例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン）などを含む。抗炎症活性を伴うグループ、例えばスリンダク、エトドラク、ケトプロフェン、及びケトロラクなども有用である。本発明と共に使用される他の薬物は、当業者に明らかであろう。
【０３３７】
グリコシル供与体種
一実施態様において、本発明のポリペプチド抱合体は、ポリペプチドをグリコシル供与体種と、酵素（それに対してグリコシル供与体種は基質である）の存在下において接触させることにより調製される。一例において、グリコシル供与体種は、化学式（Ｘ）：
【化４１】
0005647899.tif 000100
の構造を有する。
【０３３８】
化学式（Ｘ）において、ｐは０〜１より選択される整数である；及び、ｗは０〜２０より選択される整数である。一例において、ｗは１〜８より選択される。別の例において、ｗは１〜６より選択される。別の例において、ｗは１〜４より選択される。さらに別の例（それにおいてｗは０である）において、−Ｌａ−Ｒ６ｃをＨで置換される。Ｆは脂質成分である。例示的な脂質成分が、本明細書において以下に記載される。一例において、脂質成分はドリコール又はウンデカプレニル成分である。
【０３３９】
化学式（Ｘ）において、Ｚ＊は本発明のグリコシル成分を表わす。グリコシル成分は、本明細書において、例えば、ポリペプチド抱合体に関連して（例えば、化学式ＩＩＩについて）定義され、本発明のグリコシル供与体種に等しく適用される。代表的な実施態様において、グリコシル成分はモノサッカライド及びオリゴサッカライドより選択される。別の代表的な実施態様において、Ｚ＊は、モノアンテナ、ジアンテナ、トリアンテナ、及びテトラアンテナのサッカライドより選択される。別の実施態様において、Ｚ＊は、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、又はバシロサミン中と同様にＣ−２−Ｎ−アセトアミド基を含む。
【０３４０】
化学式（Ｘ）において、各Ｌａは、単結合、官能基、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるリンカー成分である。各Ｒ６ｃは、非依存的に選択される本発明の修飾基である。Ａ１は、Ｐ（リン）及びＣ（炭素）より選択されるメンバーである。Ｙ３は、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）より選択されるメンバーである。Ｙ４は、Ｏ、Ｓ、ＳＲ１、ＯＲ１、ＯＱ、ＣＲ１Ｒ２、及びＮＲ３Ｒ４より選択されるメンバーである。Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４は、ＣＲ１Ｒ２、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ３より非依存的に選択されるメンバーである。一例において、Ｅ２はＯである。別の例において、Ｅ３はＯである。さらに別の例において、Ｅ４はＯである。特定の例において、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４の各々はＯである。各Ｗは、ＳＲ１、ＯＲ１、ＯＱ、ＮＲ３Ｒ４、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるメンバーである。化学式（Ｘ）において、各Ｑは、Ｈ、負電荷、及び塩対イオン（陽イオン）より非依存的に選択されるメンバーであり、各Ｒ１、各Ｒ２、各３、及び各Ｒ４は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるメンバーである。一例において、酵素はオリゴサッカリルトランスフェラーゼであり、グリコシル供与体種は脂質−ピロリン酸連結グリコシル成分である。
【０３４１】
グリコシル供与体の脂質成分
一実施態様において、化学式（Ｘ）の脂質成分は、１〜約２００の炭素原子、好ましくは約５〜約１００の炭素原子を含み、直鎖又は分岐鎖で配置されている。この鎖中の炭素−炭素結合は、飽和及び不飽和より非依存的に選択される。二重結合はシス又はトランス立体配置を有しうる。一実施態様において、炭素鎖は、少なくとも１つの芳香族又は非芳香族の環状構造を含む。一例において、脂質成分は、少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、又は少なくとも１０の炭素原子を含む。別の実施態様において、炭素原子は、少なくとも１つの官能基により中断されている。例示的な官能基は、エーテル、チオエーテル、アミン、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジン、カルボニル、カルバメート、尿素、チオ尿素、エステル、及びカーボネートを含む。
【０３４２】
一実施態様において、脂質成分は置換又は非置換アルキルである。別の実施態様において、脂質成分は、少なくとも１つのイソプレニル又は還元イソプレニル成分を含む。さらに別の実施態様において、脂質成分は、ポリ−イソプレニル、還元ポリ−イソプレニル、及び部分還元ポリ−イソプレニルより選択される。例示的な脂質成分は、以下の構造：
【化４２】
0005647899.tif 000101
（式中、ｂ、ｃ、ｄ、及びｄ’は、０〜１００より非依存的に選択される整数である）の１つを含む。一実施態様において、脂質成分は、合計約２〜約４０のイソプレニル及び／又は還元イソプレニル単位を含む。別の実施態様において、脂質成分は、合計約５〜約２２のイソプレニル及び／又は還元イソプレニル単位を含む。
【０３４３】
この実施態様の一例において、脂質成分はウンデカプレニル、Ｃ５５イソプレノイドである。別の例において、脂質成分は、還元又は部分還元ウンデカプレニルである。例示的な脂質成分は以下：
【化４３】
0005647899.tif 000102
を含む。
【０３４４】
別の実施態様において、脂質成分は、脂肪酸アルコール、例えば天然であるものなどに由来する。さらに別の実施態様において、脂質成分は、ドリコール又はポリプレノールに由来する。ドリコール由来成分は、本発明のポリペプチド抱合体の形成において真核生物のオリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用する際に特に有用である。一例において、脂質成分は、以下の一般的な構造：
【化４４】
0005647899.tif 000103
（式中、ｂ及びｄは、０〜１００より非依存的に選択される整数である）を有する。一例において、ｄは、１〜約５０より、好ましくは１〜約４０より、より好ましくは１〜約３０より、さらにより好ましくは１〜約２０より、又は１〜約１０より選択される。別の例において、ｄは、７〜２０より、好ましくは７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、又は７〜８より選択される。別の例において、ｄは、１３〜２０より、好ましくは１４〜１９より、及びより好ましくは１４〜１７より選択される。別の例において、ｂは０〜６より選択される。さらに別の例において、ｂは０〜２より選択される。さらなる例において、ドリコール成分は、約１５〜約２２のイソプレノイド単位を有する。星印でマークした立体中心は、（Ｓ）又は（Ｒ）立体配置を有しうる。
【０３４５】
例示的なドリコール及びポリプレノール成分が、例えば、T. Chojnacki et al., Cell. Biol. Mol. Lett. 2001, 6(2), 192; T. Chojnacki and G. Dallner, Biochem. J. 1988, 251, 1-9; E. Swiezewska et al., Acta Biochim. Polon. 1994, 221-260; 及びG. Van Duij et al., Chem. Scripta 1987, 27, 95-100において記載されており、その開示は本明細書においてそれらの全体が全ての目的のために組み入れられる。特定の例において、ドリコール成分は以下の構造：
【化４５】
0005647899.tif 000104
を有する。
【０３４６】
グリコシル供与体の修飾基
化学式（Ｘ）において、Ｒ６ｃは本発明の修飾基を表わす。修飾基が、本明細書において、例えば、ポリペプチド抱合体に関連して記載され、本発明の化合物（即ち、グリコール供与体種）に等しく適用される。代表的な実施態様において、化学式（Ｘ）のグリコシル供与体種は、以下
【化４６】
0005647899.tif 000105
（式中、ｇ、ｊ、ｋ、ｅ、ｆ、ｓ、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、及びＡ１２は上の通りに定義される）より選択されるメンバーである構造を有する修飾基Ｒ６ｃを含む。
【０３４７】
例示的なグリコシル供与体種
例示的な実施態様において、グリコシル供与体種は、リン酸又はピロリン酸成分を含み、以下の構造：
【化４７】
0005647899.tif 000106
（式中、ｗ、ｐ、Ｌａ、Ｒ６ｃ、Ｆ、Ｑ、及びＺ＊は、本明細書において上で化学式（Ｘ）について定義される）を有する。この実施態様の例示的な化合物は、以下の化学式：
【化４８】
0005647899.tif 000107
（式中、ｂ及びｄは、０〜１００より非依存的に選択される）のものを含む。一実施態様において、ｂは３である。別の実施態様において、ｄは７である。さらに別の実施態様において、ｄは７であり、ｂは３である。
【０３４８】
例示的な実施態様において、化学式（Ｘ）中のグリコシル成分Ｚ＊は、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ、又はＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＨ成分より選択されるメンバーである。一実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ又はＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、ＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ、又はＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ成分である。別の実施態様において、Ｚ＊はＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ−Ｓｉａ、又はＧｌｃＮＨ−ＧｌｃＮＨ−Ｇａｌ−Ｓｉａ成分である。例示的なグリコシル供与体種は以下：
【化４９】
0005647899.tif 000108
0005647899.tif 000109
（式中、ｂ、ｄ、Ｑ、Ｌａ、及びＲ６ｃは本明細書において上で定義される通りである）を含む。Ｑ１はＨ、単一の負電荷、又は陽イオン（例えば、Ｎａ＋又はＫ＋）である。Ａ及びＢは、ＯＲ（例えば、ＯＨ）及びＮＨＣＯＲ（例えば、ＮＨＡｃ）より非依存的に選択されるメンバーである。上に示すピロリン酸は、場合により、リン酸でありうる。
【０３４９】
例示的なグリコシル供与体種は以下：
【化５０】
0005647899.tif 000110
0005647899.tif 000111
0005647899.tif 000112
0005647899.tif 000113
0005647899.tif 000114
0005647899.tif 000115
0005647899.tif 000116
を含む。
【０３５０】
グリコシル供与体種の合成
本発明のグリコシル供与体種は、当技術分野で認識されている方法の組み合わせを使用して合成してよい。例えば、ウンデカプレニル−ピロリン酸連結バシロサミンの合成が、E. Weerapana et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127: 13766-13767により報告されており、その開示は本明細書において参照によりその全体が組み入れられる。この合成手順を採用して、種々のポリプレニルサッカライドを合成することができる。脂質−ピロリン酸連結ＧｌｃＮＡｃ成分の合成のための例示的な合成ルートを、スキーム３において以下に示す。
【０３５１】
スキーム３ａ：脂質リン酸糖及び脂質ピロリン酸糖の例示的な合成
【化５１】
0005647899.tif 000117
【０３５２】
スキーム３ａにおいて、Ｆは脂質成分、例えばウンデカプレニルなどである；Ｐ＊は保護基であり、アミノ基の保護に適する；及び、整数ｑは１〜４０より選択される。
【０３５３】
スキーム３ａにおいて、化合物ＩＩは、公知のベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドＩから、３−及び６−ヒドロキシル基の保護、例えば、ベンゾイルクロライドを用いて、離脱基（例えば、トリフラート）への５−ヒドロキシル基の変換及び後の求核置換（例えば、アジ化ナトリウムを使用）を通じて調製することができる。化合物ＩＩＩを、次に、アジド基の還元及び適した保護基（例えばＦｍｏｃなど）を用いた結果として得られるアミノ基の保護により合成してよい。Ｂｎ保護基の選択的除去及び塩基（例えば、ＬｉＨＭＤＳ）及び保護されたリン酸供与体、例えば保護されたホスホ無水物など（例えば、［（ＢｎＯ）２Ｐ（Ｏ）］２Ｏ）を用いた産物の処理。後のリン酸基の脱保護によって化合物ＩＶが与えられ、それは脂質リン酸（ウンデカプレニル−リン酸）及び適した共役試薬（例えばカルボニルジイミダゾール）を使用してＶに変換されうる（アミノ基の脱保護が続く）。結果として得られる一次アミノ基を使用して、ピロリン酸糖を修飾糖に、活性化修飾基前駆体（例えば本明細書において記載のものなど）を用いた反応により共役させることができる。一例において、修飾基はポリ（エチレングリコール）成分を含む。活性化ＰＥＧ試薬は市販されている。あるいは、アミノ基をＮＨＡｃ基に変換することができる。
【０３５４】
あるいは、スキーム３ａにおいて、化合物ＶＩは、公知のベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドＩから、３−及び６−ヒドロキシ基の保護（例えば、ベンゾイルクロライドを用いて）及びＣ−５での立体中心の転化（例えば、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ化学反応を通じて）を通じて調製してよい。上に記載する後の脂質成分のリン酸化及び共役によって化合物ＶＩＩＩが与えられる。化合物は、さらに、１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼ及び各糖供与体（例えばヌクレオチド糖）を使用してＩＸに変換させることができる。一例において、糖供与体は、本発明の修飾基（例えば、修飾されたシアル酸成分）を含む修飾されたヌクレオチド糖である。修飾された糖供与体を、修飾された糖供与体が基質であるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ）と組み合わせて使用する。スキーム３中の反応は例示的であり、本発明の範囲を限定することを意味しない。当業者は、種々のリン酸を類似の合成ルートを通じて作製するために、化合物Ｉの代わりに、任意の他の糖成分を出発物質として使用することができることを理解するであろう。
【０３５５】
脂質−ピロリン酸糖又は脂質ピロリン酸糖の合成のための別のアプローチを、スキーム３ｂにおいて例証する。このアプローチにおいて、脂質リン酸Ｘを、第１糖成分、例えばＵＤＰ−糖など（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＨ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＨ、ＵＤＰ−バシロサミン、ＵＤＰ−Ｇｌｃなど）を含む糖ヌクレオチドと、酵素の存在下で反応させ、それによってヌクレオチド糖の第１の糖成分が、脂質リン酸上に移され、化合物ＸＩがもたらされ、それはリン酸基又はピロリン酸基を含みうる。一実施態様において、酵素はホスホ−ドリコール−ＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸トランスフェラーゼ（ＧＰＴ）である。例示的なリン−ドリコール−ＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸トランスフェラーゼが本明細書において以下に記載されている。追加の糖成分を、次に、１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼ及び適切な糖ヌクレオチドを使用して第１の糖成分に加えて、化合物ＸＩＩを与えてよい。例示的なグリコシルトランスフェラーゼも本明細書において以下に記載されている。
【０３５６】
スキーム３ｂ：
【化５２】
0005647899.tif 000118
【０３５７】
スキーム３ｂにおいて、各Ｑは、Ｈ、単一の負電荷、及び陽イオン（例えば、Ｋ＋又はＮａ＋）より選択されるメンバーである。整数ｐは０及び１より選択される；及び、整数ｑは１〜４０より選択される。
【０３５８】
一実施態様において、スキーム３ｂにおける第１の糖成分はＧｌｃＮＡｃであり、第１の糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃである。一例において、第１のＧｌｃＮＡｃ成分を、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−又はＧｌｃＮＨ−成分に連結させる。別の例において、別のＧｌｃＮＡｃ成分を、第１のＧｌｃＮＡｃ成分に加える。結果として得られるＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ成分を、次に、修飾されたＧａｌ成分に連結させてよい。あるいは、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ成分を、最初に、Ｇａｌ成分に連結させて、修飾されたＳｉａ成分を、結果として得られるＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ成分に加える。これらの実施態様の例示的な合成ルートを、スキーム３ｃにおいて以下に例証する。
【０３５９】
スキーム３ｃ：修飾された脂質−ピロリン酸糖の例示的な合成
【化５３】
0005647899.tif 000119
【０３６０】
さらに別の実施態様において、スキーム３ｃにおける化合物ＸＩＩＩの第１のＧｌｃＮＡｃ成分は、修飾されたＧａｌ成分に連結される。さらなる実施態様において、化合物ＶＩＩＩの第１のＧｌｃＮＡｃ成分は、最初に、Ｇａｌ成分に連結される。Ｇａｌ成分は、次に、修飾されたＳｉａ又はノイラミン酸成分に連結される。これらの実施態様をスキーム３ｄにおいて以下に例証する。
【０３６１】
スキーム３ｄ：
【化５４】
0005647899.tif 000120
【０３６２】
別の実施態様において、リン脂質Ｘは、修飾された糖ヌクレオチド（例えば、修飾されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）と、適切なドリコールリン酸Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼの存在下で反応させ、修飾された脂質−リン酸糖又は脂質ピロリン酸糖を生じる。この実施態様の例示的な合成アプローチを、スキーム３ｅにおいて以下に例証する。
【０３６３】
スキーム３ｅ：
【化５５】
0005647899.tif 000121
【０３６４】
さらなる実施態様において、脂質−リン酸糖又は脂質−ピロリン酸糖が、スキーム３ｆにおいて以下に概説される合成ルートに従って合成される。この例において、モノサッカライド又はポリサッカライド（例えば、Ｇａｌ成分を含むジサッカライド）は、最初に、修飾されたグリコシル成分（例えば、修飾されたＳｉａ）に連結される。一例において、修飾されたグリコシル成分は、出発物質に、グリコシルトランスフェラーゼ（例えばシアリルトランスフェラーゼなど）及び適切な修飾された糖ヌクレオチド（例えば、修飾されたＣＭＰ−Ｓｉａ）を使用して連結される。グリコシドＯＨ基は、次に、例えば、それらの対応するメチルエーテルとして保護されることがあり、結果として得られる保護された修飾サッカライドは、次に、リン酸脂質又はピロリン酸脂質に連結することができる。
【０３６５】
スキーム３ｆ：
【化５６】
0005647899.tif 000122
式中、Ｒ２Ｏは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＡｃ、ＮＨＣＯアリール、及びＮＨＣＯアルキルより選択されるメンバーである。
【０３６６】
スキーム３ｃ〜３ｆにおいて、Ｆは本明細書において記載される脂質成分である；各Ｑは、Ｈ、単一の負電荷、及び陽イオン（例えば、Ｋ＋又はＮａ＋）より非依存的に選択されるメンバーである。整数ｗは１〜８より、好ましくは１〜４より（例えば、Ｇｌｃ又はＧａｌ成分について）又は１〜５（例えば、Ｓｉａ成分について）選択される；整数ｎは０〜４０より選択される；及び、各整数ｍは０及び１より非依存的に選択されるメンバーである。ｍが０である場合、（Ｘ＊）ｍはＨで置換される。一例において、各Ｘ＊は、本明細書において記載される直鎖又は分岐ポリマー修飾基より非依存的に選択されるメンバーである。別の例において、Ｘ＊は、少なくとも１つのポリマー成分、例えばＰＥＧ成分など（例えば、ｍＰＥＧ）を含む。さらに別の例において、Ｘ＊は、ポリマー修飾基を分子の残部に連結するリンカー成分を含む。さらなる例において、各Ｘ＊は、本明細書において化学式（Ｖ）について記載されるＬｂ−Ｒ６ｃである。Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、及びＥ８は、ＣＲ１Ｒ２（例えば、ＣＨ２）及び官能基、例えばＯ、Ｓ、ＮＲ３（例えば、ＮＨ）、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３（例えば、ＣＯＮＨ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏなどより選択されるメンバーである；及び、Ｄは、Ｈ２（この場合において、二重結合は、２つの単結合で置換される）、Ｏ、Ｓ、ＮＲ３（例えば、ＮＨ）より非依存的に選択されるメンバーであり、それにおいて、各Ｒ１、各Ｒ２、各Ｒ３、及び各Ｒ４は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルより非依存的に選択されるメンバーである。
【０３６７】
種々のグリコシルトランスフェラーゼ及び適切な修飾又は非修飾糖ヌクレオチドを使用して、リン酸糖又はピロリン酸糖の第１の糖成分が合成されうる（例えば、スキーム３における化合物ＶＩＩＩ）。例えば、第２のＧｌｃＮＡｃ成分を第１のＧｌｃＮＡｃ成分に加えることができる。第２のＧｌｃＮＡｃ成分は、場合により、本発明の修飾基で修飾されうる（例えばスキーム３ｃと比較すること）。別の例において、修飾されたシアル酸成分は、酵素的に、リン酸糖又はピロリン酸糖のＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−、又はＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ成分に移されうる（例えばスキーム３ｃと比較すること）。あるいは、任意の他のグリコシル成分（例えば、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃなど）は、第１の糖成分に、本明細書において記載される適切なグリコシルトランスフェラーゼを使用して加えることができる。
【０３６８】
修飾された糖残基を、既存の糖残基に、酵素的に、修飾された糖ヌクレオチド又は修飾された活性化糖を、適したグリコシルトランスフェラーゼ（それについて、修飾された糖種が基質である）を組み合わせて使用して加えてよい。故に、修飾された糖は、好ましくは。修飾された糖ヌクレオチド、活性化・修飾された糖、及び単純サッカライド（ヌクレオチドではなく、活性化もされていない）修飾された糖より選択される。典型的に、構造はモノサッカライドであるが、しかし、本発明は、修飾されたモノサッカライド糖の使用に限定されない。オリゴサッカライド、ポリサッカライド、及びグリコシル−模倣成分も有用である。
【０３６９】
別の実施態様において、グリコシル供与体種は、脂質−リン酸前駆体（例えば、ウンデカプレニル−リン酸）から、精製酵素（例えば、細菌又は酵母Ｎ−グリコシル化経路から）を使用して合成される。組換え酵素を使用したそのような反応は、KJ Glover et al.（PNAS 2005, 102(40): 14255-14259）により記載されており、その開示は本明細書において参照によりその全体が組み入れられる。例えば、ＰｇｌＣを使用して、ＵＤＰ−バシロサミンからの修飾又は非修飾バシロサミン成分を、ウンデカプレニル−リン酸上に加えて、ウンデカプレニル−ピロリン酸連結バシロサミンを与えてよく、それは、さらに、ウンデカプレニル−ピロリン酸連結バシロサミンに、ＰｇｌＡ及びＵＤＰ  ＧａｌＮＡｃを使用して変換させてよく、それにおいて、ＧａｌＮＡｃ成分は、場合により、修飾させることができる。追加の糖成分を、他の酵素（例えばＰｇｌＨＪ又はＰｇｌＩなど）を使用して加えてよい。２つ又はそれ以上のこれらの反応は、単一の反応容器において実施してよい。２つ又はそれ以上の工程のための試薬（即ち、酵素及びヌクレオチド糖）を、連続的に又は同時に加えてよい。酵母経路からの例示的な酵素は、本発明のグリコシル供与体種を作製するために使用してよく、Ａｌｇ１−１４（例えば、Ａｌｇ１、Ａｌｇ２、Ａｌｇ７、及びＡｌｇ１３／１４）を含む。
【０３７０】
修飾基を、糖成分に、酵素的手段、化学的手段、又はそれらの組み合わせにより付着させ、それにより修飾された糖を産生する。糖は、修飾基の付着を可能にする任意の位置で置換されるが、しかし、それによって、依然として、糖は、修飾された糖を脱離構造に連結するために使用される酵素の基質として機能することが可能になる。例示的な実施態様において、シアル酸が糖である場合、シアル酸は、ピルビル（pyruvyl）側鎖で、又は、通常はシアル酸においてアセチル化される５の位置のアミンで、修飾基で置換される。
【０３７１】
修飾された糖ヌクレオチド
本発明の特定の実施態様において、修飾された糖は利用し、修飾された糖成分をグリコシル供与体種の前駆体に加える。本発明において使用される例示的な糖ヌクレオチドは、それらの修飾された形状で、ヌクレオチドモノ、ジ、又はトリリン酸又はその類似体を含む。好ましい実施態様において、修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、及びＧＤＰ−グリコシドより選択される。さらにより好ましくは、修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＵＤＰ−バシロサミン、ＵＤＰ−６−ヒドロキシバシロサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃより選択される。糖ヌクレオチドのＮ−アセチルアミン誘導体も、本発明の方法において有用である。
【０３７２】
一例において、ヌクレオチド糖種は水溶性ポリマーで修飾される。例示的な修飾された糖ヌクレオチドは、糖上のアミン成分を通じて修飾される糖基を持つ。修飾された糖ヌクレオチド（例えば、糖ヌクレオチドのサッカリル−アミン誘導体）も、本発明の方法において有用である。例えば、サッカリルアミン（修飾基を伴わない）を、酵素的に、ポリペプチド（又は他の種）に抱合させることができ、遊離サッカリルアミン成分を後に所望の修飾基に抱合させる。あるいは、修飾された糖ヌクレオチドは、修飾された糖をポリペプチド上のサッカリル受容体に転移させる酵素の基質として機能しうる。
例示的な修飾された糖ヌクレオチドは、例えば以下：
【化５７】
0005647899.tif 000123
（式中、ｅ、ｆ、及びＱは本明細書において定義され、ｇは１〜２０より選択される整数である）の修飾されたシアル酸ヌクレオチドを含む。
【０３７３】
例示的な実施態様において、修飾された糖は、６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル成分に基づく。スキーム４において以下に示す通り、Ｎ−アセチルガラクトサミンについて、修飾された糖ヌクレオチドは、標準的な方法を使用して容易に調製することができる。
【０３７４】
スキーム４：例示的な修飾された糖ヌクレオチドの調製
【化５８】
0005647899.tif 000124
【０３７５】
スキーム４において、上で、指数ｎは０〜２５００、好ましくは１０〜１５００、より好ましくは１０〜１２００の整数を表わす。記号「Ａ」は、活性化基（例えば、ハロ）、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の成分、カーボネート（例えば、ｐ−ニトロフェニルカーボネート）などを表わす。当業者は、他のＰＥＧアミドヌクレオチドが、これ及び類似の方法により容易に調製されることを認識するであろう。
【０３７６】
他の例示的な実施態様において、アミド成分は、基（例えばウレタン又は尿素など）により置換される。
【０３７７】
さらなる実施態様において、Ｒ１は分岐ＰＥＧ、例えば、上に記載する種の１つである。この実施態様の例証的な化合物は以下：
【化５９】
0005647899.tif 000125
（式中、Ｘ４は結合又はＯであり、ＪはＳ又はＯである）を含む。
【０３７８】
さらに、上で考察した通り、本発明は、水溶性ポリマー（直鎖又は分岐のいずれかである）で修飾されるヌクレオチド糖を提供する。例えば、下に示す化学式：
【化６０】
0005647899.tif 000126
（式中、Ｘ４はＯ又は結合であり、ＪはＳ又はＯである）を有する化合物は、本発明の範囲内である。
【０３７９】
同様に、本発明は、それらの修飾された糖のヌクレオチド糖を使用して形成されるポリペプチド抱合を提供し、それにおいて６の位置の炭素が修飾される：
【化６１】
0005647899.tif 000127
（式中、Ｘ４は結合又はＯであり、ＪはＳ又はＯであり、ｙは０又は１である）。
【０３８０】
また、以下の化学式：
【化６２】
0005647899.tif 000128
（式中、ＪはＳ又はＯである）を有するポリペプチド及びグリコペプチドを提供する。
【０３８１】
活性化された糖
他の実施態様において、修飾された糖は活性化された糖である。活性化及び修飾された糖は、本発明において有用であり、典型的に、合成的に改変され、脱離基を含むグリコシドである。一例において、活性化された糖を酵素反応において使用し、活性化された糖を、ポリペプチド又はグリコペプチド上の受容体上に転移させる。別の例において、活性化された糖を、化学的手段によりポリペプチド又はグリコペプチドに加える。「脱離基」（又は活性化基）は、それらの成分を指し、それらは酵素調節された求核置換反応において容易に置換され、又は、あるいは、求核反応パートナー（例えば、スルフヒドリル基を保有するグリコシル成分）を利用した化学的反応において置換される。各型の反応のために適した脱離基を選択することは当業者の能力の範囲内である。多くの活性化された糖が、当技術分野において公知である。例えば、Vocadlo et al., In CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY, Vol. 2, Ernst et al. Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Germany, 2000; Kodama et al., Tetrahedron Lett. 34: 6419 (1993); Lougheed, et al., J. Biol. Chem. 274: 37717 (1999)を参照のこと。
【０３８２】
脱離基の例は、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステルなどを含む。酵素媒介性反応において使用するための好ましい脱離基は、グリコシドの受容体への酵素的転移を、有意に、立体的に邪魔しないものである。したがって、活性化されたグリコシド誘導体の好ましい実施態様は、グリコシルフルオライド及びグリコシルメシレートを含み、グリコシルフルオライドが特に好ましい。グリコシルフルオライドの内、α−ガラクトシルフルオライド、α−マンノシルフルオライド、α−グルコシルフルオライド、α−フコシルフルオライド、α−キシロシルフルオライド、α−シアリルフルオライド、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオライド、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオライド、β−ガラクトシルフルオライド、β−マンノシルフルオライド、β−グルコシルフルオライド、β−フコシルフルオライド、β−キシロシルフルオライド、β−シアリルフルオライド、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオライド、及びβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオライドが最も好ましい。非酵素的な求核置換では、これら及び他の脱離基が有用でありうる。例えば、活性化された供与体グリコシドは、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、又はブロモ−グリコシドでありうる。
【０３８３】
例証として、グリコシルフルオライドを、糖成分を最初にアセチル化し、次にＨＦ／ピリジンで処理することにより、遊離糖から調製することができる。これによって、保護された（アセチル化された）グリコシルフルオライド（即ち、α−グリコシルフルオライド）の熱力学的に最も安定なアノマーが生成される。それほど安定ではないアノマー（即ち、β−グリコシルフルオライド）が望ましい場合、それは、ペルアセチル化糖をＨＢｒ／ＨＯＡｃ又はＨＣＩを用いて変換し、アノマーブロマイド又はクロライドを生成することにより調製することができる。この中間体をフッ化塩（例えばフッ化銀など）と反応させて、グリコシルフルオライドを生成させる。アセチル化グリコシルフルオライドを、メタノール（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）中の弱（触媒）塩基を用いた反応により脱保護させてよい。また、多くのグリコシルフルオライドが市販されている。
【０３８４】
他の活性化されたグリコシル誘導体は、当業者に公知の従来方法を使用して調製することができる。例えば、グリコシルメシレートを、メシルクロライドを用いた、完全にベンジル化されたヘミアセタール形状の糖の処理、続くベンジル基を除去するための触媒水素化により調製することができる。
【０３８５】
さらなる例示的な実施態様において、修飾された糖は、アンテナ構造を有するオリゴサッカライドである。別の実施態様において、アンテナの１つ又は複数の末端は、修飾成分を持つ。複数の修飾成分を、アンテナ構造を有するオリゴサッカライドに付着させる場合、オリゴサッカライドは、修飾成分を「増幅させる」ために有用である；ポリペプチドに抱合させた各オリゴサッカライド単位は、複数コピーの修飾基をポリペプチドに付着させる。上の図面において記載する本発明の典型的な抱合体の一般的な構造は、アンテナ構造を利用した本発明の抱合体の調製に起因する多価種を包含する。多くのアンテナサッカライド構造が、当技術分野において公知であり、本方法はそれらを用いて、限定なく実行することができる。
【０３８６】
修飾された糖の調製
一般的に、糖成分（脂質−ピロリン酸糖のものを含む）と修飾基の間の共有結合は、典型的に、連結プロセスにより新たな有機官能基又は非反応性種に転換される反応性官能基の使用を通じて形成される。結合を形成するために、修飾基及び糖成分は、相補的な反応性官能基を保有する。反応性官能基は、糖成分上の任意の位置に位置付けることができる。
【０３８７】
本発明を実行する際に有用な反性基及び反応のクラスは、一般的に、バイオコンジュゲート（bioconjugate）化学の分野において周知のものである。反応性糖成分と利用可能な現在好適なクラスの反応は、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらは、しかし限定されないが、求核性置換（例えば、アミン及びアルコールとアシルハライド、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、及び炭素−炭素及び炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス−アルダー付加）を含む。これらの及び他の有用な反応は、例えば、March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRＹ３rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996;及びFeeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C1982において考察されている。
【０３８８】
反応性官能基
糖核又は修飾基からペンダント状の有用な反応性官能基は、しかし限定されないが、以下：
（ａ）カルボキシル基及びそれらの種々の誘導体、しかし限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル及び芳香族エステルを含む；
（ｂ）アルデヒド等に転換できるヒドロキシル基（例えば、エステル、エーテル）；
（ｃ）ハロアルキル基、それにおいてハライドは、例えばアミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、又はアルコキシドイオンなどの求核性基で後に置換することができ、それによりハロゲン原子の官能基での新たな基の共有結合をもたらす；
（ｄ）ディールス−アルダー反応に関与することが可能なジエノフィル基、例えばマレイミド基など；（ｅ）後の誘導化が、例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン又はオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、あるいはグリニャール付加又はアルキルリチウム付加などの機構を介して可能となるアルデヒド又はケトン基；
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するために、アミンとの後の反応のためのスルホニルハライド基；
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換される、又は、アシルハライドと反応することができるチオール基；
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化又は酸化されうるアミン基又はスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば、付加環化、アシル化、マイケル付加などを受けることができるアルケン；及び
（ｊ）例えば、アミン及びヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド
を含む。
【０３８９】
反応性官能基は、それらが反応性糖核（reactive sugar nucleus）又は修飾基の集合に必要な反応に関与せず、又は妨害しないように選択することができる。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在により反応へ関与することから保護することができる。当業者は、選択した組の反応条件を妨害しないように、どのように特定の官能基を保護するかを理解している。有用な保護基の例については、Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991を参照のこと。
【０３９０】
架橋基
本発明の方法における使用のための修飾された糖の調製には、修飾基の糖残基への付着、及びグリコシルトランスフェラーゼの基質である安定な付加物の形成を含む。糖及び修飾基は、ゼロ又はそれより高いオーダーの架橋剤により共役させることができる。修飾基を炭水化物成分に付着させるために使用することができる例示的な二官能性化合物は、しかし限定されないが、二官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどを含む。炭水化物を他の分子に連結するための一般的アプローチは、文献において公知である。例えば、Lee et al., Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia et al., Anal. Biochem. 178: 408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 8886 (1990)及びBednarski et al.、ＷＯ  ９２／１８１３５を参照のこと。続く考察において、反応基は、新生の修飾された糖の糖成分上で良性（benign）として処理される。この考察に焦点は、例証の明確さのためである。当業者は、考察が修飾基上の反応基にも関連することを理解するであろう。
【０３９１】
種々の試薬を使用して、分子内の化学架橋で修飾糖の成分を修飾する（架橋試薬及び架橋手順の総説に関しては：Wold, F., Meth. Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., and Cooney, D. A., In: ENZYMES AS DRUGS. (Holcenberg, and Roberts, eds.) pp.395-442, Wiley, New York, 1981;Ji, T. H., Meth. Enzymol. 91: 580-609, 1983; Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17: 167-183, 1993を参照のこと（これら全てが本明細書において参照により組み入れられる））。好ましい架橋試薬は、種々のゼロ長（zero-length）、ホモ二官能性、及びヘテロ二官能性架橋試薬に由来する。ゼロ長架橋試薬は、外因性物質の導入を伴わない、２つの内因性化学基の直接的抱合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、このカテゴリーに属する。別の例は、カルボキシルと一級アミノ基の縮合を誘導して、アミド結合を形成する試薬、例えばカルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード（Woodward's）試薬Ｋ−（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホン酸）、及びカルボニルイミダゾールなどである。これらの化学試薬に加えて、酵素トラスングルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ  ２．３．２．１３）をゼロ長架橋試薬として使用してよい。この酵素は、通常、基質として一級アミノ基を用いて、タンパク質−結合グルタミニル残基のカルボキサミド基でアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ及びヘテロ二官能性試薬は、それぞれ２つの同一又は２つの非類似部位を含み、それらはアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、又は非特異的基について反応性となりうる。
【０３９２】
部位特異的な反応性成分の使用に加えて、本発明では、糖を修飾基に連結するための非特異的反応基の使用を熟慮する。
【０３９３】
例示的な非特異的架橋剤は、暗中で完全に不活性な光活性化可能な（photoactivatable）基を含み、それは適切なエネルギーの光子の吸収時に反応性種に変換される。一実施態様において、光活性化可能な基は、アジドの加熱又は光分解時に生成されるニトレンの前駆体より選択される。電子欠損ニトレンは極めて反応性であり、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−Ｈ、及びＣ＝Ｃを含む種々の化学結合と反応することができる。３型のアジド（アリール、アルキル、及びアシル誘導体）を用いてよいが、アリールアジドが現在好適である。光分解時のアリールアジドの反応性は、Ｃ−Ｈ結合よりもＮ−Ｈ及びＯ−Ｈでより良い。電子欠損アリールニトレンは迅速に環が拡大してデヒドロアゼピンを形成し、それはＣ−Ｈ挿入産物を形成するより、求核性物質と反応する傾向がある。アリールアジドの反応性は、電子吸引置換基、例えば環中のニトロ基又はヒドロキシル基などの存在により増加させることができる。そのような置換基は、アリールアジドの最大吸収をより長い波長に押す（push）。非置換アリールアジドは２６０〜２８０nmに範囲において最大吸収を有し、ヒドロキシ及びニトロアリールアジドは３０５nmを越えて有意な光を吸収する。従って、ヒドロキシ及びニトロアリールアジドが最も好ましい。なぜなら、それらでは、非置換アリールアジドよりも親和性成分についてより害が少ない光分解条件を用いることを可能にするためである。
【０３９４】
さらなる実施態様において、リンカー基には、切断されて糖残基から修飾基を放出することができる基が提供される。多くの切断可能基が当該技術分野において公知である。例えばJung et al., Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol. Chem. 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al., J. Immunol. 124: 913-920 (1980); Bouizar et al., Eur. J. Biochem. 155: 141-147 (1986); Park et al., J. Biol. Chem. 261: 205-210 (1986); Browning et al., Immunol. 143: 1859-1867 (1989)を参照のこと。さらに、広範な切断可能な二官能性（ホモ及びヘテロ二官能性の両方）リンカー基が供給源（例えばPierceなど）から市販されている。
【０３９５】
例示的な切断可能成分は、光、熱、又は試薬（例えばチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩など）を使用して切断することができる。さらに、特定の好ましい基は、エンドサイトーシスに応答してインビボで切断される（例えば、シス−アコニチル；  Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048 (1991)を参照のこと）。好ましい切断可能基は、ジスルフィド、エステル、イミド、カーボネート、ニトロベンジル、フェナシル、及びベンゾイン基からなる群より選択されるメンバーである切断可能成分を含む。
【０３９６】
続く考察において、本発明の実行において有用である修飾された糖の多くの具体例が記載されている。例示的な実施態様において、シアル酸誘導体を糖核として利用し、それに修飾基を付着させる。シアル酸誘導体に関する考察の焦点は、例証の明確さだけのためであり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。当業者は、例としてシアル酸を使用して記載されるものと類似の方法で、種々の他の糖成分を活性化させ、誘導化することができることを理解するであろう。例えば、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、及びフコースを修飾して、当該技術分野で認識されている方法により容易に修飾される数個の糖基質を名付けるために多数の方法を利用することができる。例えば、Elhalabi et al., Curr. Med. Chem. 6: 93 (1999)及びSchafer et al., J. Org. Chem. 65: 24 (2000)を参照のこと。
【０３９７】
例示的な実施態様において、本発明の方法により修飾されるポリペプチドは、原核細胞（例えば、大腸菌）、真核細胞（酵母及び哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を含む）、又はトランスジェニック動物において産生されるグリコペプチドであり、このようにしてＮ−及び／又はＯ−連結オリゴサッカライド鎖を含み、それらは不完全にシアル化されている。シアル酸を欠き、末端ガラクトース残基を含むグリコペプチドのオリゴサッカライド鎖は、糖ＰＥＧ化、糖ＰＰＧ化、又は別の方法で、修飾されたシアル酸を用いて修飾することができる。
【０３９８】
スキーム５において、アミノグリコシド１を、保護されたアミノ酸（例えば、グリシン）誘導体の活性化エステルを用いて処理し、糖のアミン残基を対応する保護されたアミノ酸アミド付加物に変換させる。付加物を、アルドラーゼを用いて処理し、α−ヒドロキシカルボキシレート２を形成する。化合物２を、ＣＭＰ−ＳＡシンテターゼの作用により対応するＣＭＰ誘導体へ変換させ、続いてＣＭＰ誘導体の触媒的水素付加により化合物３を産生させる。グリシン付加物の形成を介して導入されたアミンは、化合物３を活性化（ｍ−）ＰＥＧ又は（ｍ−）ＰＰＧ誘導体と反応させることによりＰＥＧ又はＰＰＧ付着の位置として利用して（例えば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＰＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ）、それぞれ４又は５を産生する。
【０３９９】
スキーム５
【化６３】
0005647899.tif 000129
【０４００】
以下の表１１には、ＰＥＧ又はＰＰＧ成分を用いて誘導化される糖一リン酸の代表例が記載される。表２の特定の化合物が、スキーム４の方法により調製される。他の誘導体は、当技術分野で認識されている方法により調製される。例えば、Keppler et al., Glycobiology 11: 11R (2001);及びCharter et al., Glycobiology 10: 1049 (2000)を参照のこと。他のアミン反応性ＰＥＧ及びＰＰＧ類似体は市販されているか、又は、当業者が容易に入手できる方法により調製することができる。
【０４０１】
表１１：ＰＥＧ又はＰＰＧを用いて誘導体化された糖一リン酸の例
【化６４】
0005647899.tif 000130
【０４０２】
本発明を実行する際に使用される修飾された糖リン酸を、他の位置ならびに上に記載する位置において置換することができる。シアル酸のこの好ましい置換基を化学式（ＶＩＩＩ）：
【化６５】
0005647899.tif 000131
（式中、Ｘは、好ましくは−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、ＣＨ２−、及びＮ（Ｒ）２より選択される連結基であり、それにおいて、各ＲはＲ１〜Ｒ５より非依存的に選択されるメンバーである）において記載する。記号Ｙ、Ｚ、Ａ、及びＢは、各々がＸの同一性について上に記載される基より選択される基を表す。Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ａ、及びＢは、各々が非依存的に選択され、従って、それらが同じ又は異なりうる。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、Ｈ、水溶性ポリマー、治療用成分、生体分子、又は他の成分を表す。あるいは、これらの記号は、水溶性ポリマー、治療用成分、生体分子、又は他の成分に結合したリンカーを表す。
【０４０３】
本明細書において開示する抱合体に付着する例示的な成分は、しかし限定されないが、ＰＥＧ誘導体（例えば、アルキル−ＰＥＧ、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アルキル−ＰＥＧ、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療用成分、診断用成分、マンノース−６−リン酸、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−リン酸、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、アンテナ状オリゴサッカライド、ペプチドなどを含む。種々の修飾基をサッカライド成分に抱合する方法は、当業者が容易に入手できる（POLY (ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992;POLY (ETHYLENE GLYCOL) CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997;Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996;及びDunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C 1991）。
【０４０４】
例示的な戦略は、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰ（ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を使用すること、及び次に修飾基上の別のスルフヒドリルとのジスルフィド結合の形成のためにスルフヒドリルを脱保護することを含む。
【０４０５】
ＳＰＤＰがグリコシルトランスフェラーゼの基質として作用する修飾された糖の能力に悪影響を及ぼす場合、一連の他の架橋剤、例えば２−イミノチオラン又はＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの１つを使用して、ジスルフィド結合を形成する。２−イミノチオランは一級アミンと反応し、直ちに非保護スルフヒドリルがアミン含有分子に組み入れられる。ＳＡＴＡも一級アミンと反応するが、しかし、保護されたスルフヒドリルを組み入れ、それは後にヒドロキシルアミンを使用して脱アセチル化され、遊離スルフヒドリルを産生する。各々の場合において、組み入れられたスルフヒドリルは、他のスルフヒドリル又は保護されたスルフヒドリルとＳＰＤＰのように自由に反応し、要求されるジスルフィド結合を形成する。
【０４０６】
上記の戦略は例示的であり、本発明において使用する架橋剤を限定しない。他の架橋剤を利用可能であり、それらは修飾基をポリペプチドに架橋するための様々な戦略において使用することができる。例えば、ＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジド及びＴＰＭＰＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプト−プロピオノヒドラジド）は、穏やかな過ヨウ素酸塩処理により以前に酸化された炭水化物成分と反応し、このように架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩が生成したアルデヒドの間にヒドラゾン結合を形成する。ＴＰＣＨ及びＴＰＭＰＨは２−ピリジルチオン保護スルフヒドリル基を糖上に導入し、それはＤＴＴで脱保護することができ、そして後に抱合のために使用される（例えば成分間でのジスルフィド結合の形成など）。
【０４０７】
ジスルフィド結合が安定な修飾された糖を産生するには不適であることが見出された場合、成分間により安定な結合を組み入れる他の架橋剤を使用してよい。ヘテロ二官能性架橋剤ＧＭＢＳ（Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）及びＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン）は一級アミンと反応し、このようにしてマレイミド基を成分上に導入する。マレイミド基は、後に、以前に言及した架橋剤により導入することができる他の成分上のスルフヒドリルと反応し、このようにして成分間に安定なチオエーテル結合を形成する。成分間の立体障害がいずれかの成分の活性又は修飾された糖がグリコシルトランスフェラーゼの基質として作用する能力を妨害する場合、成分間に長いスペーサーアームを導入し、そして以前に言及した架橋剤（即ち、ＳＰＤＰ）の一部の誘導体を含む架橋剤を使用することができる。このように、有用である適した架橋剤が豊富に存在する：その各々が、最適なポリペプチド抱合体及び修飾された糖の産生に有する効果に依存して選択される。
【０４０８】
種々の試薬を使用して、分子内の化学架橋で修飾糖の成分を修飾する（架橋試薬及び架橋手順の総説に関しては：Wold, F., Meth. Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., and Cooney, D. A., In: ENZYMES AS DRUGS. (Holcenberg, and Roberts, eds.) pp.395-442, Wiley, New York, 1981;Ji, T. H., Meth. Enzymol. 91: 580-609, 1983; Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17: 167-183, 1993を参照のこと（これら全てが本明細書において参照により組み入れられる））。好ましい架橋試薬は、種々のゼロ長、ホモ二官能性、及びヘテロ二官能性架橋試薬に由来する。ゼロ長架橋試薬は、外因性物質の導入を伴わない、２つの内因性化学基の直接的抱合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、このカテゴリーに属する。別の例は、カルボキシルと一級アミノ基の縮合を誘導して、アミド結合を形成する試薬、例えばカルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホン酸）、及びカルボニルイミダゾールなどである。これらの化学試薬に加えて、酵素トラスングルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ  ２．３．２．１３）をゼロ長架橋試薬として使用してよい。この酵素は、通常、基質として一級アミノ基を用いて、タンパク質−結合グルタミニル残基のカルボキサミド基でアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ及びヘテロ二官能性試薬は、それぞれ２つの同一又は２つの非類似部位を含み、それらはアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、又は非特異的基について反応性となりうる。
【０４０９】
架橋試薬中の好ましい特異的部位
１．アミノ反応基
一実施態様において、架橋剤上の部位はアミノ反応基である。アミノ反応基の有用な非限定的な例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、イソシアネート、アシルハライド、アリールアジド、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルデヒド、及びスルホニルクロライドを含む。
【０４１０】
ＮＨＳエステルは、修飾された糖成分の一級（芳香族を含む）アミノ基と優先的に反応する。ヒスチジンのイミダゾール基は一級アミンと反応を競合するが、反応産物は不安定であり、容易に加水分解される。この反応は、ＮＨＳエステルの酸カルボキシル上でのアミンの求核的攻撃が含み、アミドを形成してＮ−ヒドロキシスクシンイミドを放出する。このように、元のアミノ基の正電荷が失われる。
【０４１１】
イミドエステルは、修飾された糖成分のアミン基との反応のための最も特異的なアシル化試薬である。ｐＨ７〜１０で、イミドエステルは一級アミンとだけ反応する。一級アミンはイミデートを求核的に攻撃し、高ｐＨでアミジンに、又は低ｐＨで新たなイミデートに分解する中間体を産生する。この新たな中間体は別の一級アミンと反応することができ、このように、推定上、単官能性イミデートが二官能的に反応する場合、２つのアミノ基を架橋する。一級アミンとの反応の主な産物は、元のアミンよりも強い塩基であるアミジンである。元のアミノ基の正電荷が、従って、保持される。
【０４１２】
イソシアネート（及びイソチオシアネート）は、修飾された糖成分の一級アミンと反応して、安定な結合を形成する。スルフヒドリル基、イミダゾール基、及びチロシル基とそれらの反応は、比較的不安定な産物を与える。
【０４１３】
アシルアジドもアミノ特異的試薬として使用され、それにおいて親和性成分の求核性アミンがわずかにアルカリ条件下、例えばｐＨ８．５で酸性カルボキシル基を攻撃する。
【０４１４】
アリールハライド、例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどは、修飾された糖成分のアミノ基及びチロシンフェノール基と優先的に反応するが、しかし、スルフヒドリル基及びイミダゾール基とも反応する。
【０４１５】
モノ及びジカルボン酸のｐ−ニトロフェニルエステルも有用なアミノ反応基である。試薬の特異性はそれほど高くないが、α−及びε−アミノ基は最も迅速に反応するように見える。
【０４１６】
アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）は、修飾された糖の一級アミンと反応する。不安定なシッフ塩基がアミノ基とアルデヒドのアルデヒドとの反応で形成されるが、グルタルアルデヒドは安定な架橋で修飾糖を修飾することが可能である。ｐＨ６〜８で（このｐＨは典型的な架橋条件である）、環状ポリマーは脱水を受けてα−β不飽和アルデヒドポリマーを形成する。シッフ塩基は、しかし、別の二重結合と抱合した時に安定である。両方の二重結合の共鳴的相互作用は、シッフ連結の加水分解を妨げる。さらに、アミンは、高い局所濃度で、エチレン二重結合を攻撃し、安定なマイケル付加産物を形成することができる。
【０４１７】
芳香族スルホニルクロライドは、修飾された糖成分の種々の部位と反応するが、しかし、安定なスルホンアミド連結を生じるアミノ基との反応が最も重要である。
【０４１８】
２．スルフヒドリル反応基
別の実施態様において、部位はスルフヒドリル反応基である。スルフヒドリル反応基の有用な非限定的な例は、マレイミド、アルキルハライド、ピリジルジスルフィド、及びチオフタルイミドを含む。
【０４１９】
マレイミドは修飾された糖成分のスルフヒドリル基と優先的に反応し、安定なチオエーテル結合を形成する。それらは、また、ずっと遅い速度で、一級アミノ基及びヒスチジンのイミダゾール基と反応する。しかし、ｐＨ７では、マレイミド基はスルフヒドリルに特異的な基と考えることができる。なぜなら、このｐＨで、単純チオールの反応速度は、対応するアミンの反応速度よりも１０００倍大きいからである。
【０４２０】
アルキルハライドは、スルフヒドリル基、スルフィド、イミダゾール、及びアミノ基と反応する。中性からわずかにアルカリ性のｐＨでは、しかし、アルキルハライドは主にスルフヒドリル基と反応し、安定なチオエーテル結合を形成する。より高ｐＨで、アミノ基との反応が好適である。
【０４２１】
ピリジルジスルフィドは、ジスルフィド交換を介して遊離スルフヒドリルと反応し、混合ジスルフィドを与える。結果として、ピリジルジスルフィドは最も特異的なスルフヒドリル反応基である。
【０４２２】
チオフタルイミドは遊離スルフヒドリル基と反応し、ジスルフィドを形成する。
【０４２３】
３．カルボキシル反応性残基
別の実施態様において、水及び有機溶媒の両方において可溶性のカルボジイミドをカルボキシル反応試薬として使用する。これらの化合物は遊離カルボキシル基と反応してプソイドウレアを形成し、次にこれは利用可能なアミンに共役してアミド連結を生じることができる。カルボジイミドを用いてカルボキシル基を修飾する方法が教示されている（Yamada et al., Biochemistry 20: 4836-4842, 1981）。
【０４２４】
架橋試薬中の好ましい非特異的部位
部位特異的な反応性成分の使用に加えて、本発明では、糖を修飾基に連結するための非特異的反応基の使用を熟慮する。
【０４２５】
例示的な非特異的架橋剤は、暗中で完全に不活性な光活性化可能な基を含み、それは適切なエネルギーの光子の吸収時に反応性種に変換される。一実施態様において、光活性化可能な基は、アジドの加熱又は光分解時に生成されるニトレンの前駆体より選択される。電子欠損ニトレンは極めて反応性であり、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−Ｈ、及びＣ＝Ｃを含む種々の化学結合と反応することができる。３型のアジド（アリール、アルキル、及びアシル誘導体）を用いてよいが、アリールアジドが現在好適である。光分解時のアリールアジドの反応性は、Ｃ−Ｈ結合よりもＮ−Ｈ及びＯ−Ｈでより良い。電子欠損アリールニトレンは迅速に環が拡大してデヒドロアゼピンを形成し、それはＣ−Ｈ挿入産物を形成するより、求核性物質と反応する傾向がある。アリールアジドの反応性は、電子吸引置換基、例えば環中のニトロ基又はヒドロキシル基などの存在により増加させることができる。そのような置換基は、アリールアジドの最大吸収をより長い波長に押す。非置換アリールアジドは２６０〜２８０nmに範囲において最大吸収を有し、ヒドロキシ及びニトロアリールアジドは３０５nmを越えて有意な光を吸収する。従って、ヒドロキシ及びニトロアリールアジドが最も好ましい。なぜなら、それらでは、非置換アリールアジドよりも親和性成分についてより害が少ない光分解条件を用いることを可能にするためである。
【０４２６】
別の好ましい実施態様において、光活性化可能な基はフッ素化されたアリールアジドより選択される。フッ素化されたアリールアジドの光分解産物はアリールニトレンであり、その全てが、高い効率で、Ｃ−Ｈ結合の挿入を含むこの基の特徴的な反応を受ける（Keana et al., J. Org. Chem. 55: 3640-3647, 1990）。
【０４２７】
別の実施態様において、光活性化可能な基はベンゾフェノン残基より選択される。ベンゾフェノン試薬は、一般的に、アリールアジド試薬よりも高い架橋収率を与える。
【０４２８】
別の実施態様において、光活性化可能な基は、ジアゾ化合物より選択され、それは光分解時に電子欠損カルベンを形成する。これらのカルベンは、Ｃ−Ｈ結合への挿入、二重結合への付加（芳香族系を含む）、水素誘引、及び求核中心への配位を含む種々の反応を受け、炭素イオンを与える。
【０４２９】
さらに別の実施態様において、光活性化可能な基はジアゾピルベートより選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルジアゾピルベートのｐ−ニトロフォニルエステルは、脂肪族アミンと反応してジアゾピルビン酸アミドを与え、それは紫外線光分解を受けてアルデヒドを形成する。光分解されたジアゾピルベートで修飾された親和性成分は、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドのように反応して架橋を形成する。
【０４３０】
ホモ二官能性試薬
１．一級アミンと反応性であるホモ二官能性架橋剤
アミン反応性架橋剤の合成、特性、及び適用は、文献において商業的に記載されている（架橋手順及び試薬の総説については上記を参照のこと）。多くの試薬が利用可能である（例えば、Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.）。
【０４３１】
ホモ二官能性ＮＨＳエステルの好ましい非限定的な例は、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルトレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（スルホ−ＤＳＴ）、ビス−２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス−２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、及びジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（スルホ−ＤＳＰ）を含む。ホモ二官能性イミドエステルの好ましい非限定的な例は、ジメチルマロンイミデート（ＤＭＭ）、ジメチルスクシンイミデート（ＤＭＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−オキシジプロピオンイミデート（ＤＯＤＰ）、ジメチル−３，３’−（メチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＭＤＰ）、ジメチル−３’−（ジメチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＤＤＰ）、ジメチル−３，３’−（テトラメチレンジオキシ）−ジプロピオンイミデート（ＤＴＤＰ）、及びジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）を含む。
【０４３２】
ホモ二官能性イソチオシアネートの好ましい非限定的な例は：ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）、及び４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン（ＤＩＤＳ）を含む。
【０４３３】
ホモ二官能性イソシアネートの好ましい非限定的な例は、キシレン−ジイソシアネート、トルエン−２，４−ジイソシアネート、トルエン−２−イソシアネート−４−イソチオシアネート、３−メトキシジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−アゾフェニルジイソシアネート、及びヘキサメチレンジイソシアネートを含む。
【０４３４】
ホモ二官能性アリールハライドの好ましい非限定的な例は、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、及び４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニル−スルホンを含む。
【０４３５】
ホモ二官能性脂肪族アルデヒド試薬の好ましい非限定的な例は、グリオキサール、マロンジアルデヒド、及びグルタルアルデヒドを含む。
【０４３６】
ホモ二官能性アシル化試薬の好ましい非限定的な例は、ジカルボン酸のニトロフェニルエステルを含む。
【０４３７】
ホモ二官能性芳香族スルホニルクロライドの好ましい非限定的な例は、フェノール−２，４−ジスルホニルクロライド及びα−ナフトール−２，４−ジスルホニルクロライドを含む。
【０４３８】
追加のアミノ反応性ホモ二官能性試薬の好ましい非限定的な例は、アミンと反応してビスカルバメートを与えるエリトリトールビスカルボネートを含む。
【０４３９】
２．遊離スルフヒドリル基と反応性であるホモ二官能性架橋剤
そのような試薬の合成、特性、及び適用は、文献において記載されている（架橋手順及び試薬の総説については上記を参照のこと）。試薬の多くが市販されている（例えば、Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）。
【０４４０】
ホモ二官能性マレイミドの好ましい非限定的な例は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−フェニレン）ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミド、及びビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルを含む。
【０４４１】
ホモ二官能性ピリジルジスルフィドの好ましい非限定的な例は、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミドブタン（ＤＰＤＰＢ）を含む。
【０４４２】
ホモ二官能性アルキルハライドの好ましい非限定的な例は、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α，α’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、α，α’−ジブロモ−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｂ−ブロモメチル）ベンジルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ（ブロモアセチル）フェニルヒドラジン、及び１，２−ジ（ブロモアセチル）アミノ−３−フェニルプロパンを含む。
【０４４３】
３．ホモ二官能性の光活性化可能な架橋剤
そのような試薬の合成、特性、及び適用は、文献において記載されている（架橋手順及び試薬の総説については上記を参照のこと）。試薬のいくつかが市販されている（例えば、Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）。
【０４４４】
ホモ二官能性の光活性化可能な架橋剤の好ましい非限定的な例は、ビス−β−（４−アジドサリチルアミド）エチルジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ジ−Ｎ−（２−ニトロ−４−アジドフェニル）−シスタミン−Ｓ，Ｓ−ジオキシド（ＤＮＣＯ）、及び４，４’−ジチオビスフェニルアジドを含む。
【０４４５】
ヘテロ二官能性試薬
１．ピリジルジスルフィド部分を伴うアミノ反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性、及び適用は、文献において記載されている（架橋結合の手順及び試薬の総説については上記を参照のこと）。試薬の多くが市販されている（例えば、Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）。
【０４４６】
ピリジルジスルフィド成分及びアミノ反応性ＮＨＳエステルを伴うヘテロ二官能性試薬の好ましい非限定的な例は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノエート（スルホ−ＬＣＳＰＤＰ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、及びスルホスクシンイミジル６−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミドヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）を含む。
【０４４７】
２．マレイミド成分を伴うアミノ反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性、及び適用は、文献において記載されている。マレイミド成分及びアミノ反応性ＮＨＳエステルを伴うヘテロ二官能性試薬の好ましい非限定的な例は、スクシンイミジルマレイミジルアセテート（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルプロピオネート（ＢＭＰＳ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）スクシンイミジル６−マレイミジルヘキサノエート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルベンゾエート（ＳＭＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレ
ート（ＳＭＰＢ）、及びスルホスクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）を含む。
【０４４８】
３．アルキルハライド成分を伴うアミノ反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性、及び適用は、文献において記載されている。アルキルハライド成分及びアミノ反応性ＮＨＳエステルを伴うヘテロ二官能性試薬の好ましい非限定的な例は、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−６−（ヨードアセチル）アミノヘキサノエート（ＳＩＡＸ）、スクシンイミジル−６−（６−（（ヨードアセチル）−アミノ）ヘキサノイルアミノ）ヘキサノエート（ＳＩＡＸＸ）、スクシンイミジル−６−（（（４−ヨードアセチル）−アミノ）−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノヘキサノエート（ＳＩＡＣＸ）、及びスクシンイミジル−４（（ヨードアセチル）−アミノ）−メチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＩＡＣ）を含む。
【０４４９】
アミノ反応性ＮＨＳエステル及びアルキルジハライド成分を伴うヘテロ二官能性試薬の好ましい例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ２，３−ジブロモプロピオネート（ＳＤＢＰ）を含む。ＳＤＢＰは、クロスリンカーを、そのアミノ基に抱合することにより親和性成分に分子内架橋剤を導入する。一級アミン基に対するジブロモプロピオニル成分の反応性は、反応温度により制御される（McKenzie et al., Protein Chem. 7: 581-592 (1988)）。
【０４５０】
アルキルハライド成分及びアミノ反応性ｐ−ニトロフェニルエステル成分を伴うヘテロ二官能性試薬の好ましい非限定的な例は、ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）を含む。
【０４５１】
他の架橋剤も当業者に公知である。例えばPomato et al.、米国特許第５，９６５，１０６号を参照のこと。特定の適用のための適切な架橋剤を選ぶ能力は、当業者の能力の範囲内である。
【０４５２】
切断可能リンカー基
さらなる実施態様において、リンカー基には、切断されて糖残基から修飾基を放出することができる基が提供される。多くの切断可能基が当該技術分野において公知である。例えば、Jung et al., Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol. Chem. 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al., J. Immunol.124: 913-920 (1980); Bouizar et al., Eur. J. Biochem. 155: 141-147 (1986); Park et al., J. Biol. Chem. 261: 205-210 (1986); Browning et al., J. Immunol. 143: 1859-1867 (1989)を参照のこと。さらに、広範な切断可能な二官能性（ホモ及びヘテロ二官能性の両方）リンカー基が供給源（例えばPierceなど）から市販されている。
【０４５３】
例示的な切断可能成分は、光、熱、又は試薬（例えばチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩など）を使用して切断することができる。さらに、特定の好ましい基は、エンドサイトーシスに応答してインビボで切断される（例えば、シス−アコニチル；Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048 (1991)を参照のこと）。好ましい切断可能基は、ジスルフィド、エステル、イミド、カーボネート、ニトロベンジル、フェナシル、及びベンゾイン基からなる群より選択されるメンバーである切断可能成分を含む。
【０４５４】
本発明の反応性ＰＥＧ試薬の特定の実施態様は、
【化６６】
0005647899.tif 000132
ならびにカーボネート及びこれらの種の活性エステル、例えば、
【化６７】
0005647899.tif 000133
などを含む。
【０４５５】
核酸
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。ポリペプチドは、そのアミノ酸配列内に、本発明の１つ又は複数の外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む。一実施態様において、本発明の核酸は発現ベクターの一部である。別の関連する実施態様において、本発明は、本発明の核酸を含む細胞を提供する。例示的な細胞は、宿主細胞、例えば大腸菌の種々の株、昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞など）などを含む。
【０４５６】
薬学的組成物
本発明のポリペプチド抱合体は、広範囲の薬学的適用を有する。例えば、複合糖質化されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、一般的な貧血、再生不良性貧血、化学療法により誘発された傷害（例えば骨髄傷害など）、慢性腎不全、腎炎、及びサラセミアを処置するために使用してよい。修飾されたＥＰＯは、さらに、神経障害、例えば脳／脊椎傷害、多発性硬化症、及びアルツハイマー病などを処置するために使用することができる。
【０４５７】
第２の例はインターフェロンα（ＩＦＮ−α）であり、ＡＩＤＳ及びＢ又はＣ型肝炎、種々のウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＢＶ）、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）などによって引き起こされるウイルス感染症、癌（例えばヘアリー細胞白血病など）、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、悪性黒色腫、濾胞性非ホジキンリンパ腫、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性の慢性期の骨髄性白血病（ＣＭＬ）、腎臓癌、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、頭部及び頸部の癌、骨癌、ならびに子宮頚部異形成、及び中枢神経系（ＣＮＳ）の障害（例えば多発性硬化症など）を処置するために使用することができる。さらに、本発明の方法に従って修飾されたＩＦＮ−αは、他の疾患及び状態の分類、例えばシェーグレン症候群（自己免疫疾患）、ベーチェット病（自己免疫性炎症性疾患）、線維筋痛症（筋骨格の疼痛／疲労を伴う疾患）、アフタ性潰瘍（口内糜爛）、慢性疲労症候群、及び肺線維症などを処置するために有用である。
【０４５８】
別の例はインターフェロンβであり、それはＣＮＳ障害、例えば多発性硬化症（再発寛解型又は慢性進行性）など、ＡＩＤＳ及びＢ又はＣ型肝炎、種々のウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）などによって引き起こされるウイルス感染症、耳感染症、筋骨格感染症、ならびに、癌（乳癌、脳の癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、頭部、及び頸部の癌、基底細胞癌、子宮頚部異形成、黒色腫、皮膚癌、肝臓癌を含む）を処置するために有用である。本発明の方法に従って修飾されたＩＦＮ−βは、また、他の疾患及び状態、例えば移植拒絶（例えば、骨髄移植）、ハンチントン舞踏病、大腸炎、脳炎、肺線維症、黄斑変性症、肝硬変、及び角結膜炎などを処置する際に使用される。
【０４５９】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、さらなる例である。本発明の方法に従って修飾されたＧ−ＣＳＦは、癌を処置するための化学療法における補助剤として使用してよく、また、一部の医療処置に関連した状態又は合併症、例えば、化学療法により誘発された骨髄傷害、白血球減少症（全般的）、化学療法により誘発された発熱性好中球減少症、骨髄移植に関連した好中球減少、及び重度の慢性好中球減少を予防又は軽減する。修飾されたＧ−ＣＳＦは、移植、末梢血細胞動メンバー、骨髄破壊的化学療法又は骨髄抑制性化学療法を受ける予定の患者において採取するための末梢血前駆細胞動メンバー、ならびに、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する導入／強化処置後の好中球減少、発熱、抗生物質使用、入院期間の低下に使用してもよい。他の状態又は障害（喘息及びアレルギー性鼻炎を含む）を、修飾されたＧ−ＣＳＦを用いて処置してよい。
【０４６０】
１つの追加の例として、本発明の方法に従って修飾されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を、成長に関連した状態、例えば小人症、小児及び成人における低身長、カヘキシー／筋衰弱、全身の筋萎縮、及び性染色体異常（例えば、ターナー症候群）などを処置するために使用してよい。他の状態（短腸症候群、リポジストロフィー、骨粗しょう症、尿毒症（ｕｒａｅｍａｉａ）、火傷、女性の不妊症、骨再生、一般の糖尿病、ＩＩ型糖尿病、変形性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び不眠症を含む）を、修飾されたｈＧＨを使用して処置してよい。さらに、修飾されたｈＧＨを、種々のプロセス（例えば、全組織の再生、骨再生、及び創傷治癒）を促進するために、又は、ワクチン補助剤として使用してもよい。
【０４６１】
このように、別の局面において、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリペプチド又はポリペプチド抱合体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。薬学的に許容可能な担体は、希釈剤、媒体、添加剤、及びそれらの組み合わせを含む。例示的な実施態様において、薬学的組成物は、水溶性ポリマー（例えば、非天然水溶性ポリマー）、及び本発明のグリコシル化又は非グリコシル化ポリペプチドの間の共有結合抱合体ならびに薬学的に許容可能な希釈剤を含む。
【０４６２】
本発明の薬学的組成物は、種々の薬物送達系における使用に適する。本発明における使用のための適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PＡ１7th ed.(1985)において見出される。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)を参照のこと。
【０４６３】
薬学的組成物は、任意の適切な投与方法（例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、又は筋内投与を含む）のために製剤化してよい。非経口投与、例えば皮下注入などでは、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、又はバッファーを含む。経口投与では、上の担体又は固体担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウムなどを用いてよい。生分解性マトリクス、例えば微小球など（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）を本発明の薬学的組成物のための担体として用いてもよい。適した生分解性微小球は、例えば米国特許第４，８９７，２６８号及び第５，０７５，１０９号に開示されている。
【０４６４】
通常、薬学的組成物は皮下又は非経口的、例えば静脈内に投与される。このように、本発明は、許容可能な担体、好ましくは水性担体（例えば、水、緩衝化水、生理食塩水、ＰＢＳなど）に溶解又は懸濁された化合物を含む非経口投与用の組成物を提供する。組成物は、また、界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ  ２０及びＴｗｅｅｎ  ８０など）；安定化剤（例えばマンニトール、ソルビトール、スクロース、及びトレハロースなど）；及び保存剤（例えばＥＤＴＡ及びメタ−クレゾールなど）を含みうる。その組成物は、生理的条件を模倣するために要求される、薬学的に許容可能な補助物質（例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含みうる。
【０４６５】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してよく、又は濾過滅菌してよい。結果として得られる水溶液は、そのままで、又は凍結乾燥して使用のためにパッケージングしてよく、その凍結乾燥させた調製物は、投与前に滅菌水性担体と合わせられる。調製物のｐＨは、典型的には、３と１１との間、より好ましくは５〜９、そして最も好ましくは７〜８である。
【０４６６】
いくつかの実施態様において、本発明のグリコペプチドは、標準的なベシクル形成脂質から形成されたリポソーム中に組み入れられうる。例えば、Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980)、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、及び第４，８３７，０２８号に記載されるように、リポソームを調製するための種々の方法が利用可能である。種々の標的薬剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を使用するリポソームの標的化は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号及び第４，６０３，０４４号を参照のこと）。
【０４６７】
標的薬剤をリポソームに共役させるための標準的方法を使用することができる。これらの方法は、一般的に、脂質成分（例えばホスファチジルエタノールアミンなど）のリポソーム中への組み入れを含み、それは標的薬剤、又は誘導体化された脂溶性化合物（例えば本発明の脂質−誘導体化グリコペプチド）の付着にために活性化させることができる。
【０４６８】
標的化機構は、一般的に、標的薬剤をリポース表面上に、標的成分が標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用のために利用可能であるような方法で、位置付けられることを要求する。本発明の炭水化物は、リポソームが当業者に公知の方法を使用して形成される前に、脂質分子に付着されうる（例えば、炭水化物上に存在するヒドロキシル基の、それぞれ長鎖アルキルハライドを用いた、又は、脂肪酸を用いたアルキル化又はアシル化）。あるいは、リポソームは、コネクター部分が、最初に、膜を形成する時に、膜中に組み入れられるように形作ってよい。コネクター部分は脂溶性部分を有さなければならず、それは膜中に堅く包埋及び固定される。それは、また、反応性部分を有さなければならず、それはリポソームの水性表面上で化学的に利用可能である。反応性部分は、それが標的薬剤又は炭水化物（後に加えられる）との安定な化学結合を形成するために化学的に適するように選択される。一部の場合において、標的薬剤をコネクター分子に直接的に付着させることが可能であるが、しかし、大半の例において、第３の分子を化学的架橋として作用するように使用することがより適しており、このようにして膜中にあるコネクター分子を標的薬剤又は炭水化物（媒体表面から三次元的に伸長される）と連結される。
【０４６９】
本発明の方法によって調製される化合物は、また、診断用試薬として使用してよい。例えば、標識された化合物を用いて、炎症を有することが疑われる患者において炎症又は腫瘍転移の領域を位置付けることができる。この使用のために、化合物を１２５Ｉ、１４Ｃ、又はトリチウムで標識することができる。別の例において、化合物は、発光成分（例えばランタニド複合体など）で標識される。
【０４７０】
本発明の例示的な抱合体
一実施態様において、本発明の抱合体は、以下：
【化６８】
0005647899.tif 000134
0005647899.tif 000135
（式中、ＡＡは、アミノ基を含むアミノ酸残基に由来する）より選択される成分を含む。このアミノ酸残基はポリペプチドの一部である。一例において、ＡＡはアスパラギン残基に由来する。Ｑ、Ｌａ、及びＲ６ｃは、本明細書において上に定義する通りである。Ｑ１はＨ、単一の負電荷、又は陽イオン（例えば、Ｎａ＋又はＫ＋）である。Ａ及びＢは、ＯＲ（例えば、ＯＨ）及びＮＨＣＯＲ（例えば、ＮＨＡｃ）より非依存的に選択されるメンバーである。
【０４７１】
上の実施態様のいずれかの一例において、抱合体は、以下：
【化６９】
0005647899.tif 000136
0005647899.tif 000137
より選択される成分を含む。
【０４７２】
Ｖ．方法
ポリペプチドの生成
ポリペプチドを（例えば、組換え技術を通じて）生成する方法は、当技術分野において公知である。例示的な方法が、本明細書において記載されている例示的な方法は、（ｉ）外因性Ｎ連結グリコシル化配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを生成すること。方法は、さらに、（ｉｉ）宿主細胞を発現ベクターでトランスフェクトすることを含んでよい。方法は、さらに、（ｉｉｉ）ポリペプチドを宿主細胞において発現させることを含みうる。方法は、さらに、（ｉｖ）ポリペプチドを単離することを含んでよい。方法は、さらに、（ｖ）ポリペプチドを、Ｎ連結グリコシル化配列で、例えば、内因性又は組換えオリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用して酵素的にグリコシル化することを含んでよい。例示的なグリコシルトランスフェラーゼ（例えば細菌ＰｇｌＢなど）が、本明細書において記載される。
【０４７３】
ポリペプチド抱合体の形成
別の局面において、本発明は、修飾基とポリペプチドの間に共有結合抱合体を形成する方法を提供する。本発明のポリペプチド抱合体は、グリコシル化又は非グリコシル化ポリペプチドと多様な種（例えば水溶性ポリマー、治療用成分、生体分子、診断用成分、標的成分など）の間に形成される。ポリマー、治療用成分、又は生体分子は、ポリペプチドに、グリコシル連結基を介して抱合され、それはポリペプチド及び修飾基（例えば、水溶性ポリマー）の間に挿置され、その両方に共有結合的に連結される。
【０４７４】
ポリペプチドの無細胞インビトログリコシル化
一実施態様において、ポリペプチドのグリコシル化及び／又は糖ＰＥＧ化はインビトロで実施される。例えば、ポリペプチドは、宿主細胞中で合成又は発現され、場合により、精製される。ポリペプチドは、次に、本発明のグリコシル供与体種（例えば、ウンデカプレニル−ピロリン酸連結グリコシル成分）ならびに適したオリゴサッカリルトランスフェラーゼを含むグリコシル化又は糖ＰＥＧ化に供する。
【０４７５】
一実施態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドをグリコシル供与体種に接触させることにより修飾基に共有結合的に連結させ、それにおいて、グリコシル供与体種の少なくとも１つのグリコシル供与体成分が、グリコシル供与体種が基質であるオリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下で、修飾基に共有結合的に連結される。故に、例示的な実施態様において、本発明は、ポリペプチドと修飾基（例えば、ポリマー修飾基）の間に共有結合抱合体を形成する無細胞インビトロ方法を提供する。この方法において、ポリペプチドは、アスパラギン残基を含む、本発明のＮ連結グリコシル化配列を含む。修飾基は、ポリペプチドに、アスパラギン残基で、ポリペプチドと修飾基の間に挿置され、その両方に共有結合的に連結されたグリコシル連結基を介して、共有結合的に連結される。方法は、ポリペプチド及び本発明のグリコシル供与体種を、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下で、オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、グリコシル供与体種からのグリコシル成分を、Ｎ連結グリコシル化配列のアスパラギン残基上に転移させるために十分な条件下で、接触させることを含む。方法は、さらに、ポリペプチドを、例えば、組換え技術又は化学合成を通じて生成することを含んでよい。ポリペプチドを生成するための方法が、本明細書において記載される。方法は、さらに、共有結合抱合体を単離することを含んでよい。一実施態様において、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである親ポリペプチドに対応する。例示的な親ポリペプチドが、本明細書において記載される。
【０４７６】
宿主細胞内でのグリコシル化
本発明のＮ連結グリコシル化配列を含むポリペプチドのグリコシル化は、また、宿主細胞内で生じうる（それにおいてポリペプチドが発現される）。一実施態様において、宿主細胞は、本発明の適したグリコシル供与体種と接触させて、それを内在化する。例えば、グリコシル供与体種を細胞培養液に加えて、それを使用して宿主細胞を培養する。宿主細胞内のオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、内在化されたグリコシル供与体種を基質として使用し、グリコシル成分を発現されたポリペプチド上に転移させる。一実施態様において、細胞内グリコシル化を使用して、宿主細胞を、修飾基で誘導体化されたグリコシル成分を含むグリコシル供与体種と接触させることにより、修飾基をポリペプチドに共有結合的に連結する。したがって、本発明は、ポリペプチドと修飾基（例えば、ポリマー修飾基）の間に共有結合抱合体を形成する方法を提供し、それにおいて、ポリペプチドは、アスパラギン残基を含むＮ連結グリコシル化配列を含む。修飾基は、ポリペプチドに、アスパラギン残基で、ポリペプチドと修飾基の間に挿置され、その両方に共有結合的に連結されたグリコシル連結基を介して、共有結合的に連結される。方法は、（ｉ）ポリペプチド及び本発明のグリコシル供与体種を、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下で、オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、グリコシル成分をグリコシル供与体種からＮ連結グリコシル化配列のアスパラギン残基上に転移させるために十分な条件下で、接触させることを含み、それにおいて接触が宿主細胞内で生じ、それにおいてポリペプチドが発現される。方法は、さらに、（ｉｉ）宿主細胞を本発明のグリコシル供与体種と接触させることを含んでよい。方法は、さらに、（ｉｉｉ）宿主細胞を、宿主細胞がグリコシル供与体種を内在化するために十分な条件下でインキュベートすることを含んでよい。方法は、さらに、（ｉｉｉ）ポリペプチドを、例えば、組換え技術又は化学合成を通じて生成することを含んでよい。ポリペプチドを生成するための方法が、本明細書において記載される。方法は、さらに、（ｉｖ）共有結合抱合体を単離することを含んでよい。一実施態様において、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである親ポリペプチドに対応する。例示的な親ポリペプチドが、本明細書において記載される。
【０４７７】
一例において、宿主細胞は、内在化されたグリコシル供与体種を基質として使用することが可能である内因性オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含み、グリコシル供与体種のグリコシル成分をポリペプチド上に細胞内に転移させることができる。
【０４７８】
別の例示的な実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは組換え酵素であり、宿主細胞において、ポリペプチドと一緒に同時発現される。細胞内グリコシル化は、次に、発現されたポリペプチドを基質として使用することができるオリゴサッカリルトランスフェラーゼを同時発現させることにより達成される。酵素は、ポリペプチドを、グリコシル化配列で、細胞内で、内在化されたグリコシル供与体種をグリコシル基質として使用して、グリコシル化することが可能である。
【０４７９】
宿主細胞は、ポリペプチドの発現のために適した任意の細胞でありうる。一実施態様において、宿主細胞は細菌細胞である。別の実施態様において、宿主細胞は真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞などである。
【０４８０】
ポリペプチドが効率的にグリコシル化されるか否かを決定するための方法を利用可能である。例えば、細胞ライセート（１又は複数のサンプル調製工程後）を、マススペクトロメトリーにより分析し、グリコシル化ポリペプチド及び非グリコシル化ポリペプチドの間の比率を測定する。別の例において、細胞ライセートをゲル電気泳動により分析し、グリコシル化ポリペプチドを非グリコシル化ポリペプチドから分離する。
【０４８１】
別の例示的な実施態様において、ポリペプチドが発現される微生物は細胞内酸化環境を有する。微生物は、遺伝的に修飾され、細胞内酸化環境を有しうる。細胞内グリコシル化は、単一のグリコシル残基の転移に限定されない。いくつかのグリコシル残基を、連続的に、要求される酵素の同時発現及び各グリコシル供与体の存在により加えることができる。このアプローチを使用して、商業スケールでポリペプチドを産生することもできる。例示的な技術が、米国仮特許出願第６０／８４２，９２６号（２００６年９月６日に出願）において記載されており、それは本明細書において参照によりその全体が組み入れられる。宿主細胞は、原核微生物、例えば大腸菌又はシュードモナス株などでよい。例示的な実施態様において、宿主細胞は、ｔｒｘＢ  ｇｏｒ  ｓｕｐｐ突然変異大腸菌細胞である。
【０４８２】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼの基質としてのシークオンポリペプチドの同定
酵素及びグリコシル供与体種を使用したグリコシル化反応に供した際に満足な収率でグリコシル化させることができるシークオンポリペプチドの同定のための１つの戦略は、シークオンポリペプチドのライブラリーを調製することであり（それにおいて、各シークオンポリペプチドは、本発明の少なくとも１つの外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む）、及び、各シークオンポリペプチドを、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの効率的な基質として機能するその能力についてテストすることである。シークオンポリペプチドのライブラリーは、本発明の選択されたＮ連結グリコシル化配列を、親ポリペプチド内の異なる位置で含むことにより生成することができる。
【０４８３】
シークオンポリペプチドのライブラリー
一局面において、本発明は、シークオンポリペプチドの１つ又は複数のライブラリーを生成する方法を提供し、それにおいて、シークオンポリペプチドは親ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）に対応する。一実施態様において、親ポリペプチドはｍのアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。シークオンポリペプチドのライブラリーを生成する例示的な方法は、以下の工程を含む：（ｉ）第１のシークオンポリペプチド（例えば、組換え的に、化学的に、又は他の手段により）を、親ポリペプチド内の本発明のＮ連結グリコシル化配列を第１のアミノ酸位置（ＡＡ）ｎ（ｎは１〜ｍより選択されるメンバーである）に導入することにより産生すること；（ｉｉ）少なくとも１つの追加のシークオンポリペプチドを、Ｎ連結グリコシル化配列を追加のアミノ酸位置に導入することにより産生すること。一実施態様において、追加のアミノ酸位置は、（ＡＡ）ｎ＋ｘ、例えば（ＡＡ）ｎ＋１である。別の実施態様において、追加のアミノ酸位置は、（ＡＡ）ｎ−ｘ、例えば（ＡＡ）ｎ−１である。これらの実施態様において、ｘは、１〜（ｍ−ｎ）より選択されるメンバーである。一実施態様において、追加のシークオンポリペプチドは、第１のシークオンポリペプチドと同じＮ連結グリコシル化配列を含む。別の実施態様において、追加のシークオンポリペプチドは、第１のシークオンポリペプチドとは異なるＮ連結グリコシル化配列を含む。例示的な実施態様において、シークオンポリペプチドのライブラリーは、本明細書において上に記載される「シークオンスキャンニング」により生成される。本発明のライブラリーにおいて有用な、例示的な親ポリペプチド及びＮ連結グリコシル化配列も本明細書において記載される。
【０４８４】
リードポリペプチドの同定
ライブラリーのメンバー中で、酵素的グリコシル化及び／又は糖ＰＥＧ化反応に供した場合に、有効にグリコシル化及び／又は糖ＰＥＧ化されるそれらのポリペプチドを選択することが望ましい。有効にグリコシル化及び／又は糖ＰＥＧ化されることが見出されているシークオンポリペプチドは、「リードポリペプチド」と呼ばれる。例示的な実施態様において、酵素的グリコシル化又は糖ＰＥＧ化反応の収率を使用し、１つ又は複数のリードポリペプチドを選択する。別の例示的な実施態様において、リードポリペプチドでの酵素的グリコシル化又は糖ＰＥＧ化の収率は、約１０%〜約１００%、好ましくは約３０%〜約１００%、より好ましくは約５０%〜約１００%、最も好ましくは約７０%〜約１００%である。ポリペプチドが複数のＮ連結グリコシル化配列を含む場合、収率は、別々に、各Ｎ連結グリコシル化配列について決定される。効率的にグリコシル化することができるリードポリペプチドは、場合により、さらに、例えば、グリコシル化リードポリペプチドを別の酵素的グリコシル化又は糖ＰＥＧ化反応に供することにより評価される。
【０４８５】
このように、本発明は、リードポリペプチドを同定するための方法を提供する。例示的な方法は以下の工程を含む：（ｉ）本発明のシークオンポリペプチドのライブラリーを生成すること；（ｉｉ）ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを酵素的グリコシル化（又は、場合により、酵素的糖ＰＥＧ化反応）に供すること。一実施態様において、この反応中に、グリコシル成分を、グリコシル供与体分子から、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化配列に移し、それにおいてグリコシル成分は、場合により、修飾基で誘導体化される。方法は、さらに、（ｉｉｉ）ライブラリーの少なくとも１つのメンバーについて酵素的グリコシル化又は糖ＰＥＧ化反応での収率を測定することを含んでよい。測定は、当技術分野において公知の任意の方法及び本明細書において以下に記載される方法を使用して達成することができる。方法は、さらに、工程（ｉｉ）の前に、（ｉｖ）ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを精製することを含んでよい。
【０４８６】
工程（ｉｉ）の移されたグリコシル成分は、モノサッカライド及びオリゴサッカライドを含む任意のグリコシル成分ならびにグリコシル模倣基でありうる。それらは、場合により、修飾基、例えば水溶性ポリマー修飾基などで誘導体化される。例示的な実施態様において、グリコシル成分は、最初のグリコシル化反応においてシークオンポリペプチドに加えられ、ＧｌｃＮＡｃ成分、ＧａｌＮＡｃ成分、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ成分、又は６−ヒドロキシ−バシロサミン成分である。後のグリコシル化反応は、場合により、少なくとも１つの追加のグリコシル残基（例えば、修飾されたＳｉａ成分）を結果として得られるグリコシル化されたポリペプチドに加えるために用いることができる。修飾基は、本発明の任意の修飾基（水溶性ポリマー（例えばｍＰＥＧなど）を含む）でありうる。一実施態様において、工程（ｉｉ）の酵素的グリコシル化反応が、宿主細胞において生じ、それにおいてポリペプチドが発現される。方法は、さらに、（ｖ）工程（ｉｉ）の産物をＰＥＧ化反応に供することを含んでよい。一実施態様において、工程（ｉｉ）及び工程（ｖ）は、同じ反応容器中で実施される。一実施態様において、ＰＥＧ化反応は酵素的糖ＰＥＧ化反応である。別の実施態様において、ＰＥＧ化反応は化学的ＰＥＧ化反応である。方法は、さらに、（ｖｉ）ＰＥＧ化反応の収率を測定することを含んでよい。ＰＥＧ化反応の収率を測定するために有用な方法が、以下に記載されている。方法は、さらに、（ｖｉｉ）シークオンポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを生成することを含んでよい。方法は、さらに、（ｖｉｉｉ）宿主細胞を発現ベクターでトランスフェクトすることを含んでよい。
【０４８７】
例示的な実施態様において、シークオンポリペプチドのライブラリーの各メンバーを、酵素的グリコシル化反応に供する。例えば、各シークオンポリペプチドを別々にグリコシル化反応に供し、グリコシル化反応の収率を１つ又は複数の選択された反応条件について決定する。
【０４８８】
例示的な実施態様において、ライブラリーの１つ又は複数のシークオンポリペプチドは、さらなるプロセシング（例えばグリコシル化及び／又は糖ＰＥＧ化など）の前に精製される。
【０４８９】
別の例において、シークオンポリペプチドのグループを合わせることができ、結果として得られるシークオンポリペプチドの混合物を、グリコシル化又は糖ＰＥＧ化反応に供することができる。１つの例示的な実施態様において、ライブラリーの全てのメンバーを含む混合物を、グリコシル化反応に供する。一例において、この実施態様に従い、グリコシル供与体試薬を、グリコシル化反応混合物に化学量論量未満（存在するグリコシル化部位に関して）で加えることができ、シークオンポリペプチドが基質として酵素について競合する環境を作る。それらのシークオンポリペプチドは、酵素の基質であり、次に、例えば、先行するグリコシル化混合物の分離又は精製を伴う、又は、伴わない質量スペクトル解析により同定することができる。この同じアプローチを、各々が本発明の異なるＯ連結グリコシル化配列を含む、シークオンポリペプチドのグループについて使用してよい。
【０４９０】
酵素的グリコシル化反応、酵素的糖ＰＥＧ化反応、又は化学的糖ＰＥＧ化反応についての収率を、任意の適した当技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。例示的な実施態様において、グリコシル化又は糖ＰＥＧ化ポリペプチドと未反応（例えば、非グリコシル化又は糖ＰＥＧ化）ポリペプチドの間を区別するために使用される方法は、マススペクトロメトリー（例えば、ＬＣ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を含む技術を使用して決定される。別の例示的な実施態様において、収率は、ゲル電気泳動を含む技術を使用して決定される。さらに別の例示的な実施態様において、収率は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を含む技術を使用して決定される。さらなる例示的な実施態様において、収率は、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ又はＧＣなど）を含む技術を使用して決定される。一実施態様において、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）を使用して、多くのグリコシル化反応を並行して行う。プレートは、場合により、分離又はろ過媒質（例えば、ゲルろ過膜）を各ウェルの底に備えてよい。スピニングを使用して、マススペクトロメトリー又は他の手段による分析前に、各サンプルを前条件付けしてよい。
【０４９１】
目的のシークオンポリペプチド（例えば、選択されたリードポリペプチド）は、個々のスケールで発現させることができる（例えば、２５０mg超、好ましくは５００mg超のタンパク質の単離を導く）。
【０４９２】
リードポリペプチドのさらなる評価
一実施態様において、それにおいて最初のスクリーニング手順が、未修飾グリコシル成分を使用した酵素グリコシリ化を含み（例えば、ＧｌｃＮＡｃ成分の転移）、選択されたリードポリペプチドを、さらなる修飾（例えば、別の酵素反応又は化学修飾を通じた）のための効率的な基質になるそれらの能力についてさらに評価してよい。例示的な実施態様において、後の「スクリーニング」は、グリコシル化されたリードポリペプチドを、別のグリコシル化及び／又はＰＥＧ化反応に供することを含む。
【０４９３】
ＰＥＧ化反応は、例えば、化学的ＰＥＧ化反応又は酵素的糖ＰＥＧ化反応でありうる。効率的に糖ＰＥＧ化されるリードポリペプチドを同定するために、少なくとも１つのリードポリペプチド（場合により、先にグリコシル化されている）をＰＥＧ化反応に供し、この反応での収率を決定する。一例において、各リードポリペプチドについてのＰＥＧ化収率を決定する。例示的な実施態様において、ＰＥＧ化反応での収率は、約１０%〜約１００%、好ましくは約３０%〜約１００%、より好ましくは約５０%〜約１００%、最も好ましくは約７０%〜約１００%である。ＰＥＧ化収率は、当技術分野において公知の任意の分析方法を使用して決定することができ、それはポリペプチド分析に適しており、例えばマススペクトロメトリー（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｑ−ＴＯＦ）、ゲル電気泳動（例えば、定量のための手段と組み合わせる、例えばデンシトメトリーなど）、ＮＭＲ技術など、ならびにクロマトグラフィー方法、例えば、分析されるポリペプチドのＰＥＧ化種及び非ＰＥＧ化種の分離のために有用な適切なカラム物質を使用したＨＰＬＣなどである。上でグリコシル化について記載する通り、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）を使用して、多くのＰＥＧ化反応を並行して行うことができる。プレートは、場合により、分離又はろ過媒質（例えば、ゲルろ過膜）を各ウェルの底に備えてよい。スピニング及び再構成を使用して、マススペクトロメトリー又は他の手段による分析前に、各サンプルを前条件付けしてよい。
【０４９４】
別の例示的な実施態様において、シークオンポリペプチドのグリコシル化及び糖ＰＥＧ化は、「ワンスポット反応」において、以下に記載の通りに生じる。一例において、シークオンポリペプチドを第１の酵素（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）及び適切な供与体分子（例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）と接触させる。混合物を、第２の酵素（例えば、Ｃｏｒｅ−１−ＧａｌＴ１）及び第２のグリコシル供与体（例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌ）を加える前に、適した量の時間のわたりインキュベートする。任意の数の追加のグリコシル化／糖ＰＥＧ化反応をこの方法で実施することができる。あるいは、複数の酵素及び複数のグリコシル供与体を突然変異ポリペプチドと接触させて、複数のグリコシル残基を１つの反応工程において加えることができる。例えば、突然変異ポリペプチドを、３つの異なる酵素（例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、Ｃｏｒｅ−１−ＧａｌＴ１、及びＳＴ３Ｇａｌ１）及び３つの異なるグリコシル供与体成分（例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、及びＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ）と、適したバッファー系において接触させて、糖ＰＥＧ化された突然変異ポリペプチド、例えばポリペプチド−などを生成する（実施例４．６を参照のこと）。全収率は、上に記載する方法を使用して決定することができる。
【０４９５】
グリコシル成分の除去
本発明は、また、１つ又は複数の選択されたグリコシル残基をポリペプチドに加える（又は除去する）手段を提供し、その後に、修飾された糖が、ポリペプチドの少なくとも１つの選択されたグリコシル残基に抱合される。この実施態様は、例えば、修飾された糖を、ポリペプチド上に存在しない又は所望の量で存在しない選択されたグリコシル残基に抱合させることが望ましい場合、有用である。このように、修飾された糖をポリペプチドに抱合させる前に、選択されたグリコシル残基をポリペプチドに酵素的又は化学的な共役により抱合させる。別の実施態様において、グリコペプチドのグリコシル化パターンは、グリコペプチドからの炭水化物残基の除去による修飾された糖の抱合の前に改変される。例えば、ＷＯ  ９８／３１８２６を参照のこと。
【０４９６】
ＧＤＦプロペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成されうる。化学的脱グリコシル化は、ＧＤＦプロペプチドの化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は等価な化合物への曝露を必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんど糖又は全ての糖の切断を生じるが、アミノ酸配列はインタクトなままにする。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)及びEdge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981)により記載されている。ＧＤＦプロペプチド上の炭水化物部分の酵素学的切断は、Thotakura et al., Meth.Enzymol. 138: 350 (1987)によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成されうる。
【０４９７】
グリコシル成分の化学的付加は、当技術分野で認識されている方法で行う。糖成分の酵素的付加は好ましくはここに示した方法の修正を用いて行い本発明で用いた修飾糖を天然グリコシル単位で置換する。糖成分付加の他法は米国特許５，８７６，９８０、６，０３０，８１５、５，７２８，５５４及び５，９２２，５７７に開示されている。本発明で用いる典型的方法はＷＯ  ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）、及びAplin and Wriston, CRC CRIT. REV. BIOCHEM., pp.259-306 (1981)において記載されている。
【０４９８】
２つ又はそれ以上のポリペプチドを含むポリペプチド抱合体
また、リンカーアームを通じて一緒に連結された２つ又はそれ以上のポリペプチドを含む抱合体、即ち、多機能性抱合体を提供する；少なくとも１つのポリペプチドがＮグリコシル化されている、又は、外因性Ｎ連結グリコシル化配列を含む。本発明の多機能性抱合体は、２つ又はそれ以上のコピーの同じポリペプチド又は異なる構造及び／又は特性を伴う多様なポリペプチドのコレクションを含みうる。この実施態様の例示的な抱合体において、２つのポリペプチドの間のリンカーを、少なくとも１つのポリペプチドに、Ｎ連結グリコシル残基（例えばＮ連結グリコシルインタクトグリコシル連結基など）を通じて付着させる。
【０４９９】
一実施態様において、本発明は、２つ又はそれ以上のポリペプチドを、連結基を通じて連結させるための方法を提供する。連結基は任意の有用な構造であり、直鎖及び分岐鎖構造より選択してよい。好ましくは、リンカーの各末端は、ポリペプチドに付着され、修飾された糖を含む（即ち、新生インタクトグリコシル連結基）。一実施態様において、２つのポリペプチドの連結は、ポリペプチドで修飾されたグリコシル供与体種を使用することにより達成される。
【０５００】
修飾された糖のペプチドへの酵素的抱合
修飾された糖は、抱合を媒介する適切な酵素によって、グリコシル化ペプチド又は非グリコシル化ペプチドに抱合される。好ましくは、修飾された供与体糖、酵素、受容体ポリペプチドの濃度は、受容体が消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。以下で考察する検討は、シアリルトランスフェラーゼに関連して記載するが、一般的に、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。
【０５０１】
グリコシルトランスフェラーゼを使用して、望ましいオリゴサッカライド部分を有する糖タンパク質及び糖脂質を合成する多くの方法が公知である。例示的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１，Ito et al.,(1993) Pure Appl. Chem. 65:753、ならびに米国特許第５，３５２，６７０号、第５，３７４，５４１号、及び第５，５４５，５５３号に記載されている。
【０５０２】
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼ又はグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用して実行される。例えば、シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用することができる。複数の酵素を使用するそれらの実施態様において、酵素及び基質は、好ましくは、最初の反応混合物中で合わされ、又は、第２の酵素反応のための酵素及び試薬が、第１の酵素反応が完了した、又は、ほとんど完了した時点で、加えられる。２つの酵素反応を連続して単一の容器中で行うことにより、全収率が、中間種が単離される手順にわたり改善される。さらに、余分な溶媒及び副産物の精製及び廃棄が低下される。
【０５０３】
本発明の抱合体のＯ連結グリコシル成分は、一般的に、ポリペプチドに付着されているＧａｌＮＡｃ成分に由来する。ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのファミリーの任意のメンバーを用いて、ＧａｌＮＡｃ部分をポリペプチドに結合させることができる（例えば、Hassan H, Bennett EP, Mandel U, Hollingsworth MA, and Clausen H (2000);及びControl of Mucin-Type O-Glycosylation: O-Glycan Occupancy is Directed by Substrate Specificities of Polypeptide GalNAc-Transferases; Eds.Ernst, Hart, and Sinay; Wiley-VCH chapter "Carbohydrates in Chemistry and Biology - a Comprehension Handbook", 273-292を参照のこと）。ＧａｌＮＡｃ部分それ自体が完全なグリコシルリンカーになりうる。あるいは、サッカリル残基を、１つ又は複数の酵素及び１つ又は複数の適切なグリコシル基質を使用して構築する。修飾された糖を、伸長されたグリコシル成分に加えてよい。
【０５０４】
変異体酵素は、通常、エンドグリカナーゼ加水分解工程の逆反応に類似した合成工程によって、反応を触媒する。これらの実施態様において、グリコシル供与体分子（例えば、所望のオリゴサッカライド構造体又は単糖構造体）は脱離基を含み、反応は、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基への供与体分子の付加とともに進行する。例えば、脱離基は、フルオリドなどのハロゲンでよい。別の実施態様において、脱離基は、Ａｓｎ、又はＡｓｎ−ペプチド部分である。さらに別の実施態様において、グリコシル供与体分子上のＧｌｃＮＡｃ残基が修飾される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含んでよい。
【０５０５】
別の実施態様において、本発明の抱合体を産生するために利用される各酵素は、触媒量で存在している。個々の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度、ならびに温度、時間、ｐＨ値などの反応条件に応じて変動する。予め選択された基質濃度及び反応条件における所与の酵素の触媒量を決定するための手段は、当業者には周知である。
【０５０６】
上記の方法が実施される温度は、氷点をちょうど上回る温度から最も敏感な酵素が変性する温度までの範囲をとりうる。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃、より好ましくは約２０℃〜約３２℃である。別の例示的な実施態様において、本発明の方法の１つ又は複数の構成要素が、好熱性酵素を用いて昇温で実施される。
【０５０７】
反応混合物を、受容体がグリコシル化されるのに十分な期間にわたり維持し、それにより所望の抱合体を形成させる。抱合体の一部を、しばしば、数時間後に検出することができ、回収可能な量が通常２４時間以内に得られる。当業者は、反応速度が、選択された系について最適化されるいくつかの変動要因（例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒体積）に依存していることを理解する。
【０５０８】
本発明は、修飾ペプチドの工業規模の作製も提供する。本明細書では、工業規模では、通常、少なくとも約２５０mg、好ましくは少なくとも約５００mg、より好ましくは少なくとも１グラムの完成し、精製された抱合体を作製する。その際、１回の反応サイクルの後であること、即ち、抱合体は、連続的に反復された同一の合成サイクルから得られた反応生成物の組合せ物ではないことが好ましい。
【０５０９】
続く考察において、本発明は、グリコシル化ペプチドへの修飾されたシアル酸部分の抱合により例示される。例示的な修飾されたシアル酸は、（ｍ−）ＰＥＧで標識される。ＰＥＧ修飾されたシアル酸及びグリコシル化ペプチドの使用に関する以下の考察の焦点は、例示を明確にするためのものであり、本発明がこれら２つのパートナーの抱合に限定されることを意味するためのものではない。当業者は、考察が、一般的に、シアル酸以外の修飾されたグリコシル成分の付加に適用可能であることを理解する。さらに、考察は、ＰＥＧ以外の薬剤（他の水溶性ポリマー、治療用成分、及び生体分子を含む）を用いたグリコシル単位の修飾にも等しく適用可能である。
【０５１０】
（ｍ−）ＰＥＧ化又は（ｍ−）ＰＰＧ化された糖をペプチド又はグリコペプチド上に選択的に導入するために、酵素的手法を使用することができる。この方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、又はマスクされた反応性官能基を含む修飾された糖を利用し、また、適切なグリコシルトランスフェラーゼ又はグリコシンターゼと併用される。所望の糖連結を作るグリコシルトランスフェラーゼを選択し、修飾された糖を供与体基質として利用することによって、修飾基を、ポリペプチド骨格上、グリコペプチドの既存の糖残基上、又はポリペプチドに付加された糖残基上に直接的に導入することができる。別の実施態様において、方法は修飾された糖を利用し、それはマスクされた反応性官能基を保有し、それは、修飾された糖のポリペプチド又はグリコペプチド上への転移後に、修飾基の付着のために使用することができる。
【０５１１】
一例において、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼであり、修飾されたシアリル残基をグリコペプチドに付加するために使用される。シアリル残基のためのグリコシド受容体を、Ｏ連結グリコシル化配列に、例えばポリペプチドの発現中に加えることができ、又は、ポリペプチドの発現後に、適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、又はそれらの組み合わせを使用して、化学的又は酵素的に加えることができる。適した受容体成分は、例えば、ガラクトシル受容体、例えばＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）、及び当業者に公知の他の受容体などを含む（例えば、Paulson et al., J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 (1978)を参照のこと）。
【０５１２】
例示的な実施態様において、ＧａｌＮＡｃ残基を、Ｏ連結グリコシル化配列に、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用により加える。Hassan H, Bennett EP, Mandel U, Hollingsworth MA, and Clausen H (2000), Control of Mucin-Type O-Glycosylation: O-Glycan Occupancy is Directed by Substrate Specificities of Polypeptide GalNAc-Transferases (Eds. Ernst, Hart, and Sinay), Wiley-VCH chapter "Carbohydrates in Chemistry and Biology - a Comprehension Handbook", pages 273-292．方法は、修飾すべきポリペプチドを、適した量のガラクトシルトランスフェラーゼ及び適したガラクトシル供与体を含む反応混合物とインキュベートすることを含む。反応を実質的に完了まで進めさせて、又は、あるいは、反応を、前選択された量のガラクトース残基を加える際に終結させる。選択されたサッカライド受容体を組み立てる他の方法は、当業者に明らかであろう。
【０５１３】
続く考察において、本発明の方法は、それに付着した水溶性ポリマーを有する修飾された糖の使用により例示される。考察の焦点は、例証の明確さのためである。当業者は、考察がそれらの実施態様（それにおいて修飾された糖は、治療用成分、生体分子などを持つ）と等しく関連することを理解するであろう。
【０５１４】
別の例示的な実施態様において、水溶性ポリマーが、ＧａｌＮＡｃ残基に、修飾されたガラクトシル（Ｇａｌ）残基を介して加えられる。あるいは、非修飾Ｇａｌを、末端ＧａｌＮＡｃ残基に加えることができる。
【０５１５】
さらなる例において、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を、末端Ｇａｌ残基上に、修飾されたシアル酸成分及び適切なシアリルトランスフェラーゼを使用して加える。この実施態様は、スキーム９において以下に例証される。
【０５１６】
スキーム９：修飾されたシアリル成分の糖タンパク質への添加
【化７０】
0005647899.tif 000138
【０５１７】
さらなるアプローチにおいて、マスクされた反応性官能基がシアリル酸上に存在する。マスクされた反応基は、好ましくは、修飾されたシアル酸をポリペプチドに付着させるために使用される条件による影響を受けない。修飾されたシアル酸のポリペプチドへの共有結合的付着後、マスクを除去し、ポリペプチドを、修飾基（例えば水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ又はＰＰＧ）など）に、修飾された糖残基上の非マスク反応基と反応性修飾基との反応により抱合させる。この戦略を、スキーム１０において以下に例証する。
【０５１８】
スキーム１０：反応性官能基を保有するシアリル成分を使用したグリコペプチドの修飾
【化７１】
0005647899.tif 000139
【０５１９】
任意の修飾された糖を、グリコペプチドのオリゴサッカライド側鎖の末端糖に依存して、適切なグリコシルトランスフェラーゼとの組み合わせで使用することができる（表１２）。
【０５２０】
表１２：例示的な修飾された糖
【化７２】
0005647899.tif 000140
【０５２１】
代わりの実施態様において、修飾された糖を、ペプチド骨格に、糖残基をポリペプチド骨格上のＯ連結グリコシル化配列に転移させることが公知のグリコシルトランスフェラーゼを使用して、直接的に加える。この例示的な実施態様を、スキーム１１において以下に記載する。本発明を実行する際に有用である例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、限定はされないが、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ  Ｔ１〜ＧａｌＮＡｃ  Ｔ２０）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどを含む。このアプローチの使用によって、修飾された糖の、任意の炭水化物を欠くポリペプチド上への、又は、あるいは、既存のグリコペプチド上への直接的な付加を可能になる。
【０５２２】
スキーム１１：先行するグリコシル化なしでのポリペプチド上への例示的な修飾された糖の転移
【化７３】
0005647899.tif 000141
【０５２３】
上に記載した例示的な実施態様の各々において、１つ又は複数の追加の化学的又は酵素的修飾工程を、修飾された糖のペプチドへの抱合後に利用することができる。例示的な実施態様において、酵素（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）を用いて、ポリペプチドに付着されている末端の修飾された糖にグリコシル単位（例えばフコース）を付加させる。別の実施例では、酵素反応を利用して、修飾された糖が抱合することができなかった部位を「キャップ」（例えば、シアル酸付加）する。あるいは、化学反応を利用して、抱合された修飾された糖の構造を改変する。例えば、抱合された修飾された糖を、その修飾された糖が付着しているペプチド成分との結合を安定化又は不安定化させる薬剤と反応させる。別の実施例では、修飾された糖の成分を、ペプチドへの抱合の後に脱保護する。当業者は、修飾された糖がペプチドに抱合された後の段階で、本発明の方法において有用な一連の酵素的手順及び化学的手順があることを理解するであろう。修飾された糖とペプチド抱合体のさらなる加工も本発明の範囲内である。
【０５２４】
別の例示的な実施態様において、グリコペプチドは、標的薬剤、例えば、トランスフェリン（血液脳関門を越え、また、エンドソームへとペプチドを送達する）、カルニチン（ペプチドを筋肉細胞に送達する；例えば、LeBorgne et al., Biochem. Pharmacol. 59: 1357-63 (2000)を参照のこと）、ならびにホスホネート、例えば、ビスホスホネート（骨及び他の石灰質組織にペプチドを標的化する；例えば、Modern Drug Discovery, August 2002, page 10を参照のこと）に抱合される。ホスホネート標的化に有用な他の薬剤は、当業者には明らかである。例えば、グルコース、グルタミン、及びＩＧＦも、筋肉を標的とするために有用である。
【０５２５】
標的成分及び治療用ポリペプチドは、本明細書で考察する任意の方法によって、又は当技術分野公知の別の方法によって抱合される。当業者は、上に記載したもの以外のポリペプチドも、本明細書において記載される通りに誘導体化できることを理解するであろう。例示的なペプチドは、本願の権利者が所有する同時係属中の２００１年１０月１０日に出願された米国仮出願第６０／３２８，５２３号の付属書類において記載されている。
【０５２６】
例示的な実施態様において、標的薬剤及び治療用ポリペプチドは、リンカー成分を介して結合している。この実施態様において、治療用ポリペプチド又は標的薬剤のうちの少なくとも１つが、本発明の方法による完全なグリコシル結合基を通じてリンカー成分に結合している。例示的な実施態様において、リンカー成分は、ポリ（エーテル）、例えばポリエチレングリコールなどを含む。別の例示的な実施態様において、リンカー成分は、インビボで分解されて、身体の標的とされている組織又は領域にその抱合体を送達した後、標的薬剤から治療用ポリペプチドを放出させる少なくとも１つの結合を含む。
【０５２７】
さらに別の例示的な実施態様において、標的成分に治療用ポリペプチドを抱合させずに治療用成分上のグリコフォームを改変することを介して、治療用成分のインビボでの分布が改変される。例えば、治療用ポリペプチドは、グリコシル基の末端ガラクトース成分をシアル酸（又はその誘導体）でキャップすることによって、細網内皮系による取り込みから回避させることができる。
【０５２８】
酵素
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ
本発明の方法において有用なオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、真核生物又は原核生物の酵素でありうる。一実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、特定の宿主細胞（それにおいてポリペプチドが発現される）に内因性である。例えば、ポリペプチドを細菌宿主細胞において発現させる場合、内因性酵素はＰｇｌＢ又はＰｇｌＢと有意な配列同一性を有する別の酵素でよい。一例において、内因性酵素は、少なくとも約５０%、少なくとも約６０%、少なくとも約７０%、少なくとも約８０%、少なくとも約９０%、少なくとも約９２%、少なくとも約９４%、少なくとも約９６%、少なくとも約９８%、又は約９８%超の配列同一性をＰｇｌＢ又はＰｇｌＢの対応する部分と有する。一例において、酵素はＰｇｌＢより小さいが、しかし、ＰｇｌＢ配列の少なくとも部分に対応するアミノ酸配列を有する。別の例において、ポリペプチドは、真核生物宿主細胞（例えば酵母細胞など）において発現される。この例において、内因性オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ｓｔｔ３ｐ酵素又はＳｔｔ３ｐと有意な配列同一性を呈する別の酵素を含んでよい。
【０５２９】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、単一の酵素又はタンパク質複合体の部分、場合により膜結合でありうる。例えば、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性を有する膜結合酵素を含む膜調製物を、グリコシル化反応のための試薬として使用してよい。１つの特定の例において、細菌酵素ＰｇｌＢを宿主細胞（例えば、細菌細胞）において過剰発現させ、そのような宿主細胞の膜調製物を無細胞インビトログリコシル化反応のために使用する。
【０５３０】
一実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは組換え酵素である。この実施態様の一例において、組換えオリゴサッカリルトランスフェラーゼを宿主細胞において同時発現させ、それにおいてポリペプチドが発現される。故に、一例において、宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＰｇｌＢ）をコードする核酸配列を含むベクター及び基質ポリペプチドをコードする核酸配列を含む別のベクターを含む。あるいは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ及びポリペプチドの両方の核酸配列が、同じトランスフェクションベクターの一部である。
【０５３１】
別の実施態様において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、膜アンカードメインを欠く可溶性タンパク質である。例えば、酵素はＰｇｌＢでよく、それにおいてＮ末端疎水性部分の少なくとも一部を除去する。そのような切断は、残りの配列が、少なくともある程度のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を表わす限り、任意の数のアミノ酸残基を含みうる。一例において、可溶性酵素を宿主細胞において発現させ、次に単離する。単離された酵素をインビトログリコシル化プロトコールにおいて使用してよい。
【０５３２】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼは任意の種に由来しうる。オリゴサッカリルトランスフェラーゼの代表的な例は、真核生物（例えば、酵母、哺乳動物）タンパク質、例えばＳｔｔ３ｐなど、細菌（例えば、大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ）タンパク質、例えばＰｇｌＢなど、昆虫タンパク質などを含む。一例において、本発明では、組換えＰｇｌＢ、又はＰｇｌＢ酵素と高い配列同一性を有する酵素を使用する。本発明の例示的なオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。例示的なオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、少なくとも約５０%、少なくとも約６０%、少なくとも約７０%、少なくとも約８０%、少なくとも約９０%、少なくとも約９２%、少なくとも約９４%、少なくとも約９６%、少なくとも約９８%、又は約９８%超の配列同一性を配列番号１０２又はそのＳＴＴ３サブユニット（アミノ酸残基９〜６２６）と有するアミノ酸配列を有する。
【０５３３】
ＰｇｌＢ（カンピロバクター・ジェジュニ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＣＡＬ３５２４３）
【表５７】
0005647899.tif 000142
【０５３４】
ＰｇｌＢ（ナイセリア・ゴノレア、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＹＰ＿２０７２５８）
【表５８】
0005647899.tif 000143
【０５３５】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（サッカロマイセス・セレビシエ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＥＤＮ６４３７３）
【表５９】
0005647899.tif 000144
【０５３６】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ホモ・サピエンス、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＢＡＡ２３６７０）
【表６０】
0005647899.tif 000145
【０５３７】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ムス・ムスクスル、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＢＡＡ２３６７１）
【表６１】
0005647899.tif 000146
【０５３８】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（カンジダ・アルビカンス、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＸＰ＿７１４３６６又はＸＰ＿４４０１４５）
【表６２】
0005647899.tif 000147
【０５３９】
ホスホ−ドリコール−ＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸トランスフェラーゼ
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−ドリチル−リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン−ホスホトランスフェラーゼアイソフォームｂ（ホモ・サピエンス、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＰ＿９７６０６１）
【表６３】
0005647899.tif 000148
【０５４０】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−ドリチル−リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン−ホスホトランスフェラーゼアイソフォームａ（ホモ・サピエンス、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＰ＿００１３７３）
【表６４】
0005647899.tif 000149
【０５４１】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−ドリチル−リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＰＴ、Ｇ１ＰＴ、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ−トランスフェラーゼ）（ムス・ムスクスル、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｐ４２８６７）
【表６５】
0005647899.tif 000150
【０５４２】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−ドリチル−リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＰＴ、Ｇ１ＰＴ、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ−トランスフェラーゼ）（サッカロマイセス・セレビシエ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｐ０７２８６）
【表６６】
0005647899.tif 000151
【０５４３】
グリコシル供与体分子の合成のために有用な他の酵素ＰｇｌＣ（カンピロバクター・ジェジュニ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＡＤ５１３８５）
【表６７】
0005647899.tif 000152
【０５４４】
ＰｇｌＣ（ナイセリア・ゴノレア、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＹＰ＿２０７２５７）
【表６８】
0005647899.tif 000153
【０５４５】
グリコシルトランスフェラーゼ（メタノブレビバクター・スミシイ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＹＰ＿００１２７３８６３）
【表６９】
0005647899.tif 000154
【０５４６】
グリコシルトランスフェラーゼ
一実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼが、本発明のグリコシル供与体種の合成において使用される。別の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼを、本発明のポリペプチド抱合体を作製する方法において使用してよい。グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、グリコペプチド、脂質もしくは糖脂質、又は、伸長中のオリゴサッカライドの非還元末端に、活性化された糖（供与体のＮＤＰ−糖）を段階的様式で付加する反応を触媒する。例えば、第１の工程において、ポリペプチドは、本発明のグリコシル供与体種（例えば、脂質−ピロリン酸連結グリコシル成分）及び適したオリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用してグリコシル化してよい。このグリコシル化反応は、場合により、宿主細胞において生じてよく、それにおいてポリペプチドが発現される。第２の工程において、グリコシル化されたポリペプチドを、修飾又は非修飾糖ヌクレオチド及び適したグリコシルトランスフェラーゼを含むグリコシル化又は糖ＰＥＧ化反応に供する。
【０５４７】
多数のグリコシルトランスフェラーゼが当技術分野において公知である。そのような酵素の例は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼ（glucurononyltransferase）などルロワール経路のグリコシルトランスフェラーゼを含む。
【０５４８】
グリコシルトランスフェラーゼ反応を使用する酵素的糖合成のために、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化し、又は、任意の供給源から単離することができる。多くのクローン化グリコシルトランスフェラーゼが公知であり、それらのポリヌクレオチド配列が知られている。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、及びアミノ酸配列をそれから推測できる、グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ、及び他のものを含めて、公的に利用可能な種々のデータベースにある。
【０５４９】
本発明の方法において用いることができるグリコシルトランスフェラーゼは、限定はされないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む。適したグリコシルトランスフェラーゼは、真核生物、ならびに原核生物から得られるものを含む。
【０５５０】
グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、化学合成によって、適切な細胞もしくは細胞株培養物からのｍＲＮＡの逆転写物のスクリーニングによって、適切な細胞からのゲノムライブラリーのスクリーニングによって、又は、これらの手順の組合せによって得ることができる。ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施することができる。プローブは、公知の手順に従って、化学発光基、放射性原子、又は化学発光基などの検出可能な基で標識し、従来のハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる。代替方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順により、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作製されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子配列を得ることができる。Mullis et al.、米国特許第４，６８３，１９５号、及びMullis et al.、米国特許第４６８３２０２号を参照のこと。
【０５５１】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換させた宿主細胞中で、グリコシルトランスフェラーゼを合成することができる。ベクターを用いて、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増幅させ、かつ／又は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現させる。発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列が、適した宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現をもたらすことができる適した制御配列に機能的に連結している、複製可能なＤＮＡコンストラクトである。そのような制御配列の必要性は、選択される宿主及び選ばれる形質転換方法に依存して変動しうる。通常、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは、発現制御ドメインを要求しない。必要とされるのは、複製起点によって通常与えられる、宿主中で複製する能力と、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子だけである。
【０５５２】
例示的な実施態様において、本発明は、原核生物の酵素を利用する。そのようなグリコシルトランスフェラーゼは、多くのグラム陰性細菌によって産生される、リポオリゴサッカライド（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素を含む（Preston et al., Critical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180 (1996)）。そのような酵素は、限定はされないが、大腸菌やネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）などの種のｒｆａオペロンのタンパク質が含まれ、β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＭＢＬアクセッション番号Ｍ８０５９９及びＭ８６９３５（大腸菌）；ＥＭＢＬアクセッション番号Ｓ５６３６１（ネズミチフス菌）、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２５７４０（大腸菌）、β１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２７１２９（大腸菌）及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９８１７（ネズミチフス菌））、ならびにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｕ０００３９（大腸菌）を含む。アミノ酸配列が公知である他のグリコシルトランスフェラーゼは、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌、ネズミチフス菌、サルモネラエンテリカ（Salmonella enterica）、腸炎エルシニア（Yersinia enterocolitica）、らい菌（Mycobacterium leprosum）などの生物で特徴付けられているｒｆａＢや緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のｒｈ１オペロンなどのオペロンによってコードされているものを含む。
【０５５３】
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１、４−Ｄ−グルコース、ならびに、粘膜病原菌の淋菌（Neisseria gonnorhoeae）及び髄膜炎菌（N. meningitidis）のＬＯＳ中で同定されたＰｋ血液型の３糖配列、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース（Scholten et al., J. Med. Microbiol. 41: 236-243 (1994)）を含む構造体を作るのに関与しているグリコシルトランスフェラーゼも本発明で使用するために適している。これらの構造体の生合成に関与しているグリコシルトランスフェラーゼをコードする、髄膜炎菌及び淋菌からの遺伝子は、髄膜炎菌の免疫型Ｌ３及びＬ１（Jennings et al., Mol. Microbiol. 18: 729-740 (1995)）ならびに淋菌変異体Ｆ６２（Gotshlich, J. Exp. Med. 180: 2181-2190 (1994)）から同定されている。髄膜炎菌では、３種の遺伝子、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢ、及びｌｇＥからなる部位が、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖中の糖の最後の３つを付加するために要求されるグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271: 19166-73 (1996)）。最近、ｌｇｔＢ及びｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が実証され、提唱されているそれらのグリコシルトランスフェラーゼ機能に関して初めて直接的な証拠が提供された（Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271(45): 28271-276 (1996)）。淋菌（N. gonorrhoeae）では、２種の追加の遺伝子、β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃをラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造体の末端ガラクトースの３位に付加するｌｇｔＤ、及び、切断ＬＯＳのラクトースエレメントに末端α−Ｄ−Ｇａｌを付加し、このようにしてＰｋ血液型の抗原構造を作製するｌｇｔＣがある（Gotshlich (1994)、上記）。髄膜炎菌では、分離した免疫型Ｌ１も、Ｐｋ血液型抗原を発現し、また、ｌｇｔＣ遺伝子を有することが示されている（Jennings et al., (1995)、上記）。ナイセリア（Neisseria）のグリコシルトランスフェラーゼ及び関連遺伝子は、米国特許第５５４５５５３号（Gotschlich）でも記載されている。ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）からのα１，２−フコシルトランスフェラーゼ及びα１，３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子も、特徴付けられている（Martin et al., J. Biol. Chem. 272: 21349-21356 (1997)）。また、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）のグリコシルトランスフェラーゼも本発明において有用である（例えば、http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf_42.htmlを参照のこと）。
【０５５４】
（ａ）ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ
一実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ＧａｌＮａｃの大ファミリーのメンバーである：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）は、通常、ＧａｌＮＡｃをセリン及びトレオニン受容体部位に転移させる（Hassan et al., J. Biol. Chem. 275: 38197-38205 (2000)）。これまでに、哺乳動物のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼファミリーの１２種のメンバーが同定され、特徴付けされており（Schwientek et al., J. Biol. Chem. 277: 22623-22638 (2002)）、また、ゲノムデータベースの解析により、この遺伝子ファミリーの数種の推定上の追加メンバーが予測されている。ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのアイソフォームは種々の動態諸特性を有し、時間的かつ空間的に異なる発現パターンを示す。これは、それらの生物学的機能が異なることを示唆している（Hassan et al., J. Biol. Chem. 275: 38197-38205 (2000)）。ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの配列解析により、これらの酵素が２種の異なるサブユニットを有するという仮説が導かれた。これらのサブユニットは、中央の触媒ユニット、ならびに、「レクチンドメイン」と呼ばれる、植物のレクチンリシンに配列が類似したＣ末端ユニットである（Hagen et al., J. Biol. Chem. 274: 6797-6803 (1999); Hazes, Protein Eng. 10: 1353-1356 (1997); Breton et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 563-571 (1999)）。選択された保存残基の部位特異的突然変異誘発を伴う以前の実験により、触媒ドメインの変異は触媒活性を消失させることが確認された。一方、「レクチンドメイン」における変異は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのアイソフォームであるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の触媒活性に対して有意な影響を及ぼさなかった（Tenno et al., J. Biol. Chem. 277(49): 47088-96 (2002)）。したがって、Ｃ末端の「レクチンドメイン」は、機能的ではなく、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの酵素機能に対して役割を果たしていないと考えられていた（Hagen et al., J. Biol. Chem. 274: 6797-6803 (1999)）。
【０５５５】
ポリペプチドＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼも、明らかなＧａｌＮＡｃグリコペプチド特異性は示していないが、その推定上のレクチンドメインによって調節されているようである（ＰＣＴ出願ＷＯ０１／８５２１５  Ａ２号）。最近、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の推定上のレクチンドメインにおける変異が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４において以前に分析された変異と同様に（Hassan et al., J. Biol. Chem. 275: 38197-38205 (2000)）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４と同様の様式で酵素の活性を変更することが発見された。このように、野生型ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、複数の受容体部分を有するペプチド基質に複数の連続ＧａｌＮＡｃ残基を付加したが、突然変異ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、同じ基質に複数のＧａｌＮＡｃ残基を付加することができなかった（Tenno et al., J. Biol. Chem. 277(49): 47088-96 (2002)）。より最近では、マウスＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（Fritz et al., PNAS 2004, 101(43): 15307-15312）ならびにヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（Fritz et al., J. Biol. Chem. 2006, 281(13): 8613-8619）のＸ線結晶構造が決定されている。ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２構造によって、触媒ドメイン及びレクチンドメインの間の予想外の柔軟性が明らかにされており、グリコシル化基質を捕捉するためのＧａｌＮＡｃ−Ｔ２による新たな機構が示唆された。レクチンドメインを欠くＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の動態解析によって、このドメインのグリコペプチド基質に作用する際の重要性が確認された。しかし、非グリコシル化基質に関する酵素活性は、レクチンドメインの除去により有意な影響を受けなかった。このように、レクチンドメインを欠く切断ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素又は切断レクチンドメインを有するそれらの酵素は、ポリペプチド基質のグリコシル化のために有用でありうる（ここで、結果として得られるモノグリコシル化ポリペプチドのさらなるグリコシル化は望まれない）。
【０５５６】
遺伝子操作によりクローン化した遺伝子からの酵素ＧａｌＮＡｃ  ＴＩ−ＸＩＶのようなタンパク質の生産も周知である。例えば米国特許第４，７６１，３７１号を参照のこと。１つの方法は、十分なサンプルの回収を含み、次に、酵素のアミノ酸配列をＮ−末端シークエンシングにより決定する。この情報を次に使用して全長の（膜に結合した）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離し、これは昆虫細胞系Ｓｆ９中で発現して完全に活性な酵素の合成をもたらす。酵素の受容体特異性を、次に、１６種の異なるタンパク質における既知のグリコシル化配列周辺のアミノ酸の半定量的分析、それに続く合成ペプチドのインビトロでのグリコシル化試験により決定する。この操作によって、特定のアミノ酸残基がグリコシル化ペプチドセグメント中で過剰提示されること、及び、グリコシル化されたセリン及びトレオニン残基周辺の特異的位置の残基が、他のアミノ酸成分よりも顕著な効果を受容体効率に有しうることが実証された。
【０５５７】
ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの突然変異を利用し、野生型酵素により産生されるものとは異なるグリコシル化パターンを産生することができることが実証されているため、本発明の１つ又は複数の突然変異又は切断ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを利用することは本発明の範囲内である。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２タンパク質の触媒ドメイン及び切断突然変異体が、例えば、米国仮特許出願第６０／５７６，５３０号（２００４年６月３日に出願）；及び米国仮特許出願第６０／５９８，５８４号（２００４年８月３日に出願）において記載されている；これらの両方が、本明細書において参照により全ての目的のために組み入れられる。触媒ドメインは、また、公知のグリコシルトランスフェラーゼを伴うアラインメントにより同定することができる。切断ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素（例えばヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（Δ５１）、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（Δ５１  Δ４４５）など）及びこれらの酵素を得る方法も、ＷＯ  ０６／１０２６５２（ＰＣＴ／ＵＳ０６／０１１０６５、２００６年３月２４日に出願）及びＰＣＴ／ＵＳ０５／００３０２（２００５年１月６日に出願）において記載されており、それらは本明細書において参照により全ての目的のために組み入れられる。
【０５５８】
（ｂ）フコシルトランスフェラーゼ
いくつかの実施態様において、本発明の方法において使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者には公知である。例示的なフコシルトランスフェラーゼは、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースから受容体糖のヒドロキシ位置に転移させる酵素を含む。非ヌクレオチド糖を受容体に転移させるフコシルトランスフェラーゼも、本発明において有用である。
【０５５９】
いくつかの実施態様において、受容体糖は、例えば、オリゴサッカライドグリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ基のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適したフコシルトランスフェラーゼは、ヒトの乳から最初に特徴を明らかにされたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（Palcic, et al., Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels, et al., J. Biol. Chem. 256: 10456-10463 (1981);及びNunez, et al., Can. J. Chem. 59: 2086-2095 (1981)を参照のこと）、ならびにヒト血清中に存在するＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）を含む。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）、シアリルα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼも特徴を明らかにされている。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え型も特徴を明らかにされている（Dumas, et al., Bioorg. Med. Letters 1: 425-428 (1991)及びKukowska-Latallo, et al., Genes and Development 4: 1288-1303 (1990)を参照のこと）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼは、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）を含む。Mollicone, et al., Eur. J. Biochem. 191: 169-176 (1990)又は米国特許第５，３７４，６５５号で記載されている方法によって、酵素的フコシル化を実施することができる。フコシルトランスフェラーゼを得るために使用される細胞は、また、ＧＤＰ−フコースを合成するための酵素系を含む。
【０５６０】
（ｃ）ガラクトシルトランスフェラーゼ
別の群の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的なガラクトシルトランスフェラーゼは、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼを含む（E.C.No.2.4.1.151、例えば、Dabkowski et al., Transplant Proc. 25: 2921 (1993)及びYamamoto et al. Nature 345: 229-233 (1990)、ウシ（Genbank j04989、Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264: 14290-14297 (1989)）、マウス（GenBank m26925；Larsen et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USＡ８6: 8227-8231 (1989)）、ブタ（GenBank L36152；Strahan et al., Immunogenetics 41: 101-105 (1995)）を参照のこと。他の適したα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｂ血液型抗原の合成に関与しているものである（EC2.4.1.37, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265: 1146-1151 (1990)（ヒト））。さらに別の例示的なガラクトシルトランスフェラーゼは、コアＧａｌ−Ｔ１である。Cho, S.K. and Cummings, R.D. (1997) J. Biol. Chem., 272, 13622-13628により報告されているものなどα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの可溶型も、本発明を実施するうえで適切である。
【０５６１】
別の実施態様において、ガラクトシルトランスフェラーゼは、β（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばＣｏｒｅ−１−ＧａｌＴ１など）である。ヒトＣｏｒｅ−１−β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼが記載されている（例えば、Ju et al., J. Biol. Chem. 2002, 277(1): 178-186を参照のこと）。キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）酵素が、Correia et al., PNAS 2003, 100(11): 6404-6409及びMuller et al., FEBS J. 2005, 272(17): 4295-4305において記載されている。追加のＣｏｒｅ−１−β３ガラクトシルトランスフェラーゼ（その切断バージョンを含む）が、ＷＯ／０１４４４７８及び米国仮特許出願第６０／８４２，９２６号（２００６年９月６日に出願）において開示されている。例示的な実施態様において、β（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＰｕｂＭｅｄ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＦ５２７２４（ＣＧ９５２０−ＰＣの転写物）により記載される酵素及びその修飾バージョン、例えばその変異体など（それらは細菌中での発現のためにコドン最適化されている）より選択されるメンバーである。例示的な可溶性Ｃｏｒｅ−１−ＧａｌＴ１（Ｃｏｒｅ−１−ＧａｌＴ１  Δ３１）酵素の配列が以下に示されている：
【０５６２】
β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼも本発明の方法で使用するために適しており、例えば、ＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）及びＥＣ２．４．１．２２（ラクトースシンテターゼ）（ウシ（D’Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)）、ヒト（Masri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 657-663 (1988)）、マウス（Nakazawa et al., J. Biochem. 104: 165-168 (1988)）、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８及びセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（EC2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38: 234-242 (1994)）を含む。他の適したガラクトシルトランスフェラーゼは、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、シゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）から、Chapell et al., Mol. Biol. Cell 5: 519-528 (1994)）を含む。
【０５６３】
（ｄ）シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、組換え細胞及び本発明の反応混合物において有用な別の型のグリコシルトランスフェラーゼである。組換え型シアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は、また、シアリルトランスフェラーゼに対するシアル酸供与体であるＣＭＰ−シアル酸を産生する。本発明で使用するために適したシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（例えば、ラット又はヒトのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩ、及びＳＴ６Ｇａｌ  ＮＡｃ  ＩＩＩを含む（本明細書において使用されるシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Tsuji et al., Glycobiology 6: v-xiv (1996)において記載される通りである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と呼ばれる例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、２糖Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃの非還元末端Ｇａｌ又はグリコシドにシアル酸を転移させる。Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982), 及びWen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992)を参照のこと。別の例示的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、２糖の非還元末端Ｇａｌ又はグリコシドにシアル酸を転移させる。Rearick et al., J. Biol. Chem. 254: 4444 (1979)及びGillespie et al., J. Biol. Chem. 267: 21004 (1992)を参照のこと。別の例示的な酵素は、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６シアリルトランスフェラーゼを含む（Kurosawa et al. Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)を参照のこと）。
【０５６４】
好ましくは、グリコペプチドの糖をグリコシル化する場合、シアリルトランスフェラーゼは、完全にシアル酸付加された糖構造体上で末端シアル酸の土台となる最も一般的な末端から２番目の配列であるＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列にシアル酸を転移させることができる（以下の表１４を参照のこと）。
【０５６５】
【表７０】
0005647899.tif 000155
【０５６６】
特許請求の範囲の方法で有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも呼ばれるＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩである。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（例えば、Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1991)）を参照のこと）、グリコペプチド中のアスパラギン結合型オリゴサッカライドのシアル酸付加を司っている。シアル酸は、Ｇａｌに結合し、２つの糖の間にα結合が形成される。これらの糖の間の結合形成（結合）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間にある。この特定の酵素は、ラットの肝臓（Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982)）；ヒトｃＤＮＡ（Sasaki et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394-1401）及びゲノム（Kitagawa et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 931-938）から単離することができる。ＤＮＡ配列が公知であり、組換え発現によってこの酵素を作製することを容易にしている。別の実施態様において、特許請求の範囲のシアル酸付加の方法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩを使用する。
【０５６７】
本発明において有用な他の例示的なシアリルトランスフェラーゼは、α（２，３）を含めて、カンピロバクター・ジェジュニから単離されるものを含む。例えば、ＷＯ９９／４９０５１号を参照のこと。
【０５６８】
表５に記載したもの以外のシアリルトランスフェラーゼも、商業的に重要なグリコペプチドにシアル酸付加するための経済的かつ効率的な大規模プロセスにおいて有用である。これら他の酵素の有用性を調べるための簡単な試験として、種々の量の各酵素（１〜１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）を、（１〜１０mg／mlで）アシアロ−α１ＡＧＰと反応させて、問題のシアリルトランスフェラーゼがグリコペプチドにシアル酸付加する能力を、ウシのＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ、又は両方のシアリルトランスフェラーゼに対して比較する。あるいは、他のグリコペプチドもしくはグリコペプチド、又は、ペプチド主鎖から酵素的に遊離されたＮ−結合型オリゴサッカライドを、アシアロ−α１ＡＧＰの代わりにこの評価に使用することができる。（本開示においてＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩに関して例示するように）ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉより効率的にグリコペプチドのＮ−結合型オリゴサッカライドにシアル酸付加する能力を有するシアリルトランスフェラーゼは、ペプチドにシアル酸付加するための実用的な大規模プロセスにおいて有用である。他の例示的なシアリルトランスフェラーゼは、図１０に示す。
【０５６９】
本発明の抱合体において、Ｓｉａ修飾基カセットを、Ｇａｌに、α２，６又はα２，３連結において連結させることができる。
【０５７０】
融合タンパク質
他の例示的な実施態様において、本発明の方法は、所望のグリコペプチド抱合体の合成に関与している複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば、補助酵素の触媒活性ドメインに結合しているグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインから構成されるものでよい。補助酵素の触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのための供与体であるヌクレオチド糖を形成する工程を触媒することができ、又は、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与している反応を触媒することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド糖合成に関与している酵素をコードするポリヌクレオチドにインフレームで結合させることができる。結果として得られる融合タンパク質は、次に、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、受容体分子への糖成分の転移も触媒することができる。融合タンパク質は、１つの発現可能なヌクレオチド配列に結合された２種以上のサイクル酵素になることができる。他の実施態様において、融合タンパク質は、２種以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインを含む。例えば、５６４１６６８を参照のこと。本発明の修飾されたグリコペプチドは、種々の適した融合タンパク質を利用することによって、容易にデザインし製造することができる（例えば、１９９９年６月２４日にＷＯ９９／３１２２４号として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０号を参照のこと）。
【０５７１】
固定化酵素
細胞結合型酵素に加えて、本発明は、固体及び／又は可溶性の支持体上に固定化された酵素の使用も提供する。例示的な実施態様において、本発明の方法による完全なグリコシルリンカーを介してＰＥＧに抱合されているグリコシルトランスフェラーゼが提供される。ＰＥＧ−リンカー−酵素抱合体は、場合により、固体支持体に付着されている。本発明の方法において固体に支持された酵素を使用することにより、反応混合物の精密な検査及び反応生成物の精製が簡易になり、また、酵素を容易に回収することも可能になる。グリコシルトランスフェラーゼ抱合体は、本発明の方法で利用される。酵素及び支持体の他の組合せ物は、当業者に明らかであろう。
【０５７２】
ペプチド抱合体の精製
本明細書において記載されるプロセスにより産生されたポリペプチド抱合体は、精製なしで使用することができる。しかし、通常は、生成物を回収することが好ましい。薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又は膜ろ過など、グリコシル化された糖を回収するための標準的な周知の技術を使用することができる。より好ましくは、逆浸透膜を利用した膜ろ過、又は、以下及び本明細書において引用する文献において考察されている通りに、１つ又は複数のカラムクロマトグラフィー技術を回収のために使用することが好ましい。例えば、分子量カットオフ値が約３０００〜１０，０００の膜による膜ろ過を用いて、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することができる。次に、ナノろ過又は逆浸透法を用いて、塩類の除去及び／又は糖生成物の精製を行うことができる（例えば、ＷＯ９８／１５５８１号を参照のこと）。ナノフィルター膜は、使用する膜に応じて、１価の塩類を通過させるが多価の塩類及び約１００〜約２０００ダルトンより大きい非荷電の溶質は保持する、ある種類の逆浸透膜である。このように、典型的な適用において、本発明の方法により調製されるサッカライドは膜中に保持され、混入塩は通過する。
【０５７３】
修飾された糖タンパク質が細胞内で産生される場合、第１の工程として、粒子状細片（細胞及び細胞細片を含む）を、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって除去する。場合により、市販のタンパク質濃縮フィルターを用いてタンパク質を濃縮し、続いて、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又はマトリクス含有カルボキシメチル基又はスルホプロピル基）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ））の１つ又は複数の工程により、他の不純物からポリペプチド変異体を分離してよい。例示的な固定相は、Ｂｌｕｅ−セファロース、ＣＭ  Ｂｌｕｅ−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、Ｃｏｎ  Ａ−セファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、ＳＰ−セファロース、又はタンパク質Ａセファロースを含む。
【０５７４】
他のクロマトグラフィー技術は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基を付加されたシリカゲル）、例えばセファデックスの分子ふるいもしくはサイズ排除クロマトグラフィーを用いたゲルろ過、ポリペプチドを選択的に結合するカラムでのクロマトグラフィー、及びエタノールもしくは硫酸アンモニウム沈殿を含む。
【０５７５】
培養において産生される修飾されたグリコペプチドは、通常、細胞、酵素などから最初に抽出し、それに続き、１つ又は複数の濃縮、塩析、水系イオン交換、又はサイズ排除クロマトグラフィーの工程、例えば、ＳＰセファロースを用いた工程を行うことによって単離される。さらに、修飾された糖タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって精製してもよい。ＨＰＬＣを、１つ又は複数の精製工程のために用いてもよい。
【０５７６】
タンパク分解を阻害するために、前述の工程のいずれかに、プロテアーゼ阻害剤、例えばメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含めてよく、また、外因性の汚染菌の増殖を防止するために、抗生物質を含めてよい。
【０５７７】
別の実施態様において、本発明の修飾されたグリコペプチドを作製する系から得た上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いて、最初に濃縮する。濃縮工程に続き、濃縮物を適した精製マトリックスに適用してよい。例えば、適した親和性マトリックスは、ポリペプチドに対するリガンド、適した支持体に結合されたレクチン又は抗体分子を含んでよい。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダント状のＤＥＡＥ基を有するマトリックス又は基質を用いてよい。適したマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又は、タンパク質精製で通常用いられる他の型のものを含む。あるいは、陽イオン交換工程を用いてよい。適した陽イオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が特に好ましい。
【０５７８】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダント状のメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた１つ又は複数のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を用いて、ポリペプチド変異体組成物をさらに精製してよい。前述の精製工程のうちの一部又は全てを、種々の組合せで用いて、均質な修飾された糖タンパク質を提供することもできる。
【０５７９】
大規模な発酵から得られる本発明の修飾されたグリコペプチドを、Urdal et al., J. Chromatog. 296: 171 (1984)により開示されているものに類似した方法により精製してよい。この参考文献では、調製ＨＰＬＣカラムでの組換えヒトＩＬ−２の精製のための２回連続したＲＰ−ＨＰＬＣ工程について記載されている。あるいは、技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーなどを利用して、修飾された糖タンパク質を精製してもよい。
【０５８０】
ペプチドコード配列の取得
一般的な組換え技術
突然変異ポリペプチド（本発明のＯ連結グリコシル化配列を組み入れる）の作製は、ポリペプチドの突然変異により又は完全化学合成により、対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列を改変することにより達成することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、具体的には、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成するように予め選択された塩基で、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を突然変異させることにより改変される。ＤＮＡ突然変異は、好ましくは、当技術分野において公知の方法を使用して作製される。
【０５８１】
本発明は、組換え遺伝学の分野における慣用技術に依存する。本発明において有用な一般的方法を開示している基本的な教科書は、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed.2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);及びAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)を含む。
【０５８２】
核酸のサイズは、キロベース（kb）又は塩基対（bp）で与えられる。これらは、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、又は公開されているＤＮＡ配列に由来する推定値である。タンパク質について、サイズはキロダルトン（kDa）又はアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、派生するアミノ酸配列から、又は公開されているタンパク質配列から推定される。
【０５８３】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)により最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従い、Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984)において記載されている通りに自動合成機を使用して化学的に合成することができる。遺伝子全体も、化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野で認識されている任意の戦略、例えば、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、又はPearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)において記載されている陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて実施される。
【０５８４】
クローン化された野生型ポリペプチド遺伝子、突然変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981)の二本鎖鋳型を配列決定するためのチェーンターミネーション法によって、クローニング後に検証することができる。
【０５８５】
例示的な実施態様において、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドをシャッフリングすることにより加えられる。候補ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡシャッフリングプロトコールを用いて調節することができる。ＤＮＡシャッフリングは、関連遺伝子のプールのランダムフラグメント化と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応様プロセスによるフラグメントの再構築により実施される、反復される組換え及び突然変異のプロセスである。例えば、Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA９1: 10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370: 389-391 (1994)；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８３７，４５８号、第５，８３０，７２１号、及び第５８１１２３８号を参照のこと。
【０５８６】
野生型ペプチドコード配列のクローニング及びサブクローニング
野生型ポリペプチドをコードする多数のポリヌクレオチド配列が決定されており、商業的な供給者から利用可能である。例えば、ヒト成長ホルモン、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ０００５１５、ＮＭ００２０５９、ＮＭ０２２５５６、ＮＭ０２２５５７、ＮＭ０２２５５８、ＮＭ０２２５５９、ＮＭ０２２５６０、ＮＭ０２２５６１、及びＮＭ０２２５６２である。
【０５８７】
ヒトゲノム研究の迅速な進歩によって、公知のヌクレオチド配列に対してある程度の割合の配列相同性を有する任意の遺伝子セグメント、例えば以前に同定されているポリペプチドのコード配列などを調べるためにヒトＤＮＡ配列データベースを検索することができるクローニングアプローチが可能になっている。そのようにして同定された任意のＤＮＡ配列は、後に、化学合成及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばオーバーラップ伸長法などにより得ることができる。短い配列について、完全なデノボ合成が十分となりうるが、より大きな遺伝子を得るには、合成プローブを使用したヒトｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーからの全長コード配列のさらなる単離が必要となることがある。
【０５８８】
あるいは、標準的クローニング技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを使用して、ポリペプチドをコードする核酸配列を、ヒトｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーから単離することもできる。それにおいて、ホモロジーベースのプライマーは、しばしば、ポリペプチドをコードする公知の核酸配列に由来することができる。この目的のために最もよく使用される技術は、標準的な教科書、例えば、Sambrook及びRussell（上記）において記載されている。
【０５８９】
野生型ポリペプチドのコード配列を得るために適したｃＤＮＡライブラリーは、市販されているものでもよく、あるいは、構築してよい。ｍＲＮＡを単離し、逆転写によりｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡを組換えベクター中に連結し、組換え宿主にトランスフェクトして増殖させ、スクリーニングし、クローニングする一般的方法は、周知である（例えば、Gubler and Hoffman, Gene, 25: 263-269 (1983); Ausubel et al.（上記）を参照のこと）。ＰＣＲによりヌクレオチド配列の増幅セグメントを得た直後に、そのセグメントをプローブとしてさらに使用して、野生型ポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチド配列をｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。適切な手順の一般的な記載は、Sambrook及びRussell（上記）において見出すことができる。
【０５９０】
類似の手順に従って、野生型ポリペプチド、例えば、上で言及したＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．のうちの任意のものをコードする全長配列をヒトゲノムライブラリーから得ることができる。ヒトゲノムライブラリーは市販されており、又は、当技術分野で認識されている種々の方法に従って構築することができる。一般的に、ゲノムライブラリーを構築するためには、ＤＮＡを、最初に、ポリペプチドが見出される可能性の高い組織から抽出する。ＤＮＡを、次に、機械的に剪断し、又は、酵素的に消化して、約１２〜２０kbの長さのフラグメントを生じる。フラグメントを、後に、勾配遠心分離により、非所望のサイズのポリヌクレオチドフラグメントから分離し、バクテリオファージλベクター中に挿入する。これらのベクター及びファージを、インビトロでパッケージングする。組換えファージは、Benton and Davis, Science, 196: 180-182 (1977)において記載されている通り、プラークハイブリダイゼーションにより解析する。コロニーハイブリダイゼーションを、Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA72: 3961-3965 (1975)により記載される通りに行う。
【０５９１】
配列相同性に基づき、縮重オリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてデザインすることができ、及び、ＰＣＲを適した条件下で実施して（例えば、White et al., PCR Protocols: Current Methods and Applications, 1993;Griffin and Griffin, PCR Technology, CRC Press Inc. 1994を参照のこと）、ヌクレオチド配列のセグメントをｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから増幅させることができる。増幅されたセグメントをプローブとして使用して、野生型ポリペプチドをコードする全長核酸を得る。
【０５９２】
野生型ポリペプチドをコードする核酸配列を得ると、コード配列をベクター、例えば発現ベクター中にサブクローニングして、組換え野生型ポリペプチドを、結果として得られるコンストラクトから産生できるようにすることができる。野生型ポリペプチドのコード配列にさらなる修飾、例えば、ヌクレオチド置換を後に行って、分子の特性を改変してよい。
【０５９３】
ポリペプチド配列中への突然変異の導入
コードポリヌクレオチド配列から、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。後に、このアミノ酸配列を修飾して、アミノ酸配列中の種々の位置に追加のグリコシル化配列を導入することにより、タンパク質のグリコシル化パターンを改変してよい。
【０５９４】
いくつかの型のタンパク質グリコシル化配列は、当技術分野において周知である。例えば、真核生物において、Ｎ連結グリコシル化が、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のアスパラギン上で生じる（Kornfeld et al., Ann Rev Biochem 54: 631-664 (1985); Kukuruzinska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USＡ８4: 2145-2149 (1987); Herscovics et al., FASEB J 7: 540-550 (1993); 及びOrlean, Saccharomyces Vol. 3 (1996)）。Ｏ連結グリコシル化は、セリン又はトレオニン残基上で起こる（Tanner et al., Biochim. Biophys. Acta. 906: 81-91 (1987);及びHounsell et al., Glycoconj. J. 13: 19-26 (1996)）。他のグリコシル化パターンは、タンパク質のカルボキシル末端のカルボキシル基にグリコシルホスファチジルイノシトールを連結することにより形成される（Takeda et al., Trends Biochem. Sci. 20: 367-371 (1995);及びUdenfriend et al., Ann. Rev. Biochem. 64: 593-591 (1995)）。この知識に基づき、適した突然変異を野生型ポリペプチド配列にこのように導入して、新たなグリコシル化配列を形成することができる。
【０５９５】
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基の直接的な修飾が、新たなＮ連結又はＯ連結グリコシル化部位の導入に適していることもあるが、より頻繁には、ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を変異させることによって、新たなグリコシル化配列の導入が行われる。これは、公知の突然変異誘発方法のうちのいずれかにを使用することにより達成することができ、そのうちのいくつかを以下で考察する。
【０５９６】
突然変異を生成する種々のプロトコールが確立されており、当技術分野において記載されている。例えば、Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA94: 4504-4509 (1997);及びStemmer, Nature, 370: 389-391 (1994)を参照のこと。これらの手順を別々に又は組み合わせて使用して、１組の核酸の変異体、故に、コードされるポリペプチドの変異体を得ることができる。突然変異誘発、ライブラリー構築、及び他の多様性を生成する方法のためのキットが市販されている。
【０５９７】
多様性を生成する突然変異方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発（Botstein and Shortle, Science, 229: 1193-1201 (1985)）、ウラシル含有鋳型を用いた突然変異誘発（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USＡ８2: 488-492 (1985)）、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Zoller and Smith, Nucl. Acids Res., 10: 6487-6500 (1982)）、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発（Taylor et al., Nucl. Acids Res., 13: 8749-8764及び8765-8787 (1985)）、及びギャップ二重鎖ＤＮＡを使用した突然変異誘発（Kramer et al., Nucl. Acids Res., 12: 9441-9456 (1984)）を含む。
【０５９８】
突然変異を生成するための他の方法は、点ミスマッチ修復（Kramer et al., Cell, 38: 879-887 (1984)）、修復能欠損宿主株を使用した突然変異誘発（Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4431-4443 (1985)）、欠失突然変異誘発（Eghtedarzadeh and Henikoff, Nucl. Acids Res., 14: 5115 (1986)）、制限選択及び制限精製（Wells et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A317: 415-423 (1986)）、全遺伝子合成による突然変異誘発（Nambiar et al., Science, 223: 1299-1301 (1984)）、二重鎖切断修復（Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA83: 7177-7181 (1986)）、ポリヌクレオチドチェーンターミネーション法（米国特許第５，９６５，４０８号）による突然変異誘発、及びエラープロンＰＣＲ（Leung et al., Biotechniques, 1: 11-15 (1989)）を含む。
【０５９９】
宿主生物における好ましいコドン使用のための核酸の修飾
ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド配列をさらに改変して、特定の宿主の好ましいコドン使用に合致させることができる。例えば、１株の細菌細胞での好ましいコドン使用を使用して、本発明のポリペプチド変異体をコードし、この株に好適なコドンを含むポリヌクレオチドを派生させることができる。宿主細胞によって示される好ましいコドン使用頻度は、その宿主細胞によって発現されている多数の遺伝子における好ましいコドン使用頻度を平均することによって計算することができる（例えば、計算サービスは、かずさＤＮＡ研究所（Kazusa DNA Research Institure）（日本）のウェブサイトから利用可能である）。この解析は、好ましくは、宿主細胞により高発現される遺伝子に限定される。米国特許第５，８２４，８６４号には、例えば、双子葉植物及び単子葉植物により示される高発現遺伝子によるコドン使用頻度が提供されている。
【０６００】
修飾の完了時に、ポリペプチド変異体コード配列を配列決定により確認し、次に、組換え産生用の適切な発現ベクター中に、野生型ポリペプチドと同じ方法でサブクローニングする。
【０６０１】
突然変異ポリペプチドの発現
配列確認に続き、本発明のポリペプチド変異体を、組換え遺伝学の分野における慣用技術を使用して、本明細書において開示するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に依存して産生することができる。
【０６０２】
発現系
本発明の突然変異ポリペプチドをコードする核酸の高レベル発現を得るために、典型的に、突然変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を指示する強いプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中にサブクローニングする。適した細菌プロモーターは当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook及びRussell（上記）、ならびにAusubel et al.（上記）において記載されている。野生型ポリペプチド又は突然変異ポリペプチドを発現するための細菌発現系は、例えば、大腸菌、バチルス種（Bacillus sp）、サルモネラ属（Salmonella）、及びコーロバクター属（Caulobacter）において利用可能である。そのような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母、及び昆虫細胞のための真核生物発現系が、当技術分野において周知であり、また、市販されている。一実施態様において、真核細胞用発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ベクター、又はレトロウイルスベクターである。
【０６０３】
異種核酸を直接発現させるために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。プロモーターは、場合により、その天然の設定においてプロモーターが転写開始部位から離れている距離とおよそ同じ距離だけ、異種の転写開始部位から離れた位置にある。当技術分野において公知であるように、しかし、この距離のいくらかの変動は、プロモーター機能の喪失なく適応させることができる。
【０６０４】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的に、宿主細胞における突然変異ポリペプチドの発現のために要求される全ての追加エレメントを含む転写単位又は発現カセットを含む。典型的な発現カセットは、このように、突然変異ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーターならびに転写物の効率的なポリアデニル化のために要求されるシグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結部位を含む。ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的に、形質転換細胞によるペプチド分泌を促進するための切断可能なシグナルペプチド配列に連結されている。そのようなシグナルペプチドは、とりわけ、組織プラスミノゲンアクチベーター、インシュリン、及び神経成長因子、ならびにオオタバコガ（Heliothis virescens）の幼虫ホルモンエステラーゼからのシグナルペプチドを含む。このカセットの追加エレメントは、エンハンサー、及び、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合、機能性のスプライス供与部位及び受容体部位を伴うイントロンを含んでよい。
【０６０５】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含むべきである。この終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てよく、又は、異なる遺伝子から得てよい。
【０６０６】
遺伝情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞又は原核細胞における発現用に使用される従来のベクターのいずれかを使用してよい。標準的な細菌発現ベクターは、プラスミド（例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなど）及び融合発現系（例えばＧＳＴやＬａｃＺなど）を含む。エピトープタグ、例えば、ｃ−ｍｙｃを組換えタンパク質に付加し、便利な単離方法を提供することができる。
【０６０７】
真核生物ウイルスからの調節エレメントを含む発現ベクターが、典型的に、真核細胞用発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、及びエプスタイン・バーウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核細胞用ベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ならびに、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は、真核細胞中での発現のために有効であることが示されている他のプロモーターの指示下でのタンパク質発現を可能にする他の任意のベクターを含む。
【０６０８】
一部の例示的な実施態様において、発現ベクターは、２００４年４月９日出願の共有の米国特許出願明細書において開示されている通り、ｐＣＷｉｎ１、ｐＣＷｉｎ２、ｐＣＷｉｎ２／ＭＢＰ、ｐＣＷｉｎ２−ＭＢＰ−ＳＢＤ（ｐＭＳ３９）、及びｐＣＷｉｎ２−ＭＢＰ−ＭＣＳ−ＳＢＤ（ｐＭＸＳ３９）から選ばれ、それは本明細書において参照により組み入れられる。
【０６０９】
一部の発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸レダクターゼなどを有する。あるいは、遺伝子増幅を含まない高収率発現系、例えばポリヘドリンプロモーター又は他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示下で突然変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、昆虫細胞中のバキュロウイルスベクターなども適している。
【０６１０】
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントは、大腸菌中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、及び真核生物の配列の挿入を可能にする、プラスミドの非必須領域中の固有の制限酵素認識部位も含む。選ばれる特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野において公知の多くの耐性遺伝子のうちの任意のものが適する。原核生物の配列を、場合により、それらが真核細胞中のＤＮＡの複製を妨害しないように、必要な場合に選択する。
【０６１１】
組換えタンパク質（例えば、本発明のｈｇｈ突然変異体）のペリプラズム発現が望まれる場合、発現ベクターは、発現させるべきタンパク質のコード配列の５’に直接結合している、大腸菌ＯｐｐＡ（ペリプラズムのオリゴペプチド結合タンパク質）分泌シグナルやその修飾バージョンなどの分泌シグナルをコードする配列をさらに含む。このシグナル配列は、細胞質中で産生された組換えタンパク質を、細胞膜を通じてペリプラズム空間中に導く。この発現ベクターは、さらに、組換えタンパク質がペリプラズム空間に入る際にシグナル配列を酵素的に切断することが可能であるシグナルペプチダーゼ１のコード配列も含んでよい。組換えタンパク質のペリプラズムでの産生に関するより詳細な説明は、例えば、Gray et al., Gene 39: 247-254 (1985)、米国特許第６，１６０，０８９号、及び第６，４３６，６７４号において見出すことができる。
【０６１２】
上で考察した通り、当業者は、ポリぺプチドの生物活性を依然として保持しつつ、任意の野生型ポリペプチドもしくは突然変異ポリペプチド又はそのコード配列に種々の保存的置換を作製することができることを認識するであろう。さらに、ポリヌクレオチドコード配列の修飾を作製し、結果として得られるアミノ酸配列を改変することなく特定の発現宿主において好ましいコドン使用を適応させてよい。
【０６１３】
トランスフェクション方法
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量の突然変異ポリペプチドを発現する細菌、哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞株を産生し、それらを次に標準技術を使用して精製する（例えば、Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)を参照のこと）。真核細胞及び原核細胞の形質転換を、標準技術に従って実施する（例えば、Morrison, J. Bact.132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照のこと）。
【０６１４】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための周知の手順のうちの任意のものを使用してよい。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター（plasma vector）、ウイルスベクター、ならびにクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む（例えば、Sambrook及びRussell（上記）を参照のこと）。使用される特定の遺伝子工学手順が、突然変異ポリペプチドを発現することが可能である宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子を上手く導入することが可能であることだけ必要である。
【０６１５】
宿主細胞における突然変異ポリペプチド発現の検出
適切な宿主細胞中に発現ベクターを導入した後、トランスフェクトされた細胞を、突然変異ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する。細胞を、次に、標準技術を使用して培養物から後に回収される組換えポリペプチドの発現について細胞をスクリーニングする（例えば、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；米国特許第４，６７３，６４１号；Ausubel et al.（上記）；ならびにSambrook及びRussell（上記）を参照のこと）。
【０６１６】
遺伝子発現をスクリーニングするためのいくつかの一般的な方法は、当業者の間では周知である。第１に、遺伝子発現を核酸レベルで検出することができる。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用した特定のＤＮＡ及びＲＮＡ測定の種々の方法が、通常使用される（例えば、Sambrook及びRussell（上記））。一部の方法は、電気泳動による分離（例えば、ＤＮＡ検出用のサザンブロット及びＲＮＡ検出用のノーザンブロット）を含むが、しかし、電気泳動なしに（例えばドットプロットによるなど）ＤＮＡ又はＲＮＡの検出を行うこともできる。トランスフェクトされた細胞における突然変異ポリペプチドをコードする核酸の存在も、配列特異的プライマーを使用したＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。
【０６１７】
第２に、遺伝子発現をポリペプチドレベルで検出することができる。種々の免疫学的アッセイ、特に、本発明の突然変異ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用したアッセイが、遺伝子産物のレベルを測定するために、当業者により通常使用される（例えば、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor, 1988; Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)）。そのような技術は、突然変異ポリペプチド又はその抗原性部分に対する高い特異性を伴う抗体を選択することによる抗体調製を要求する。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生じさせる方法は十分に確立されており、それらの記載は、文献、例えば、Harlow及びLane（上記）、ならびに、Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976)において見出すことができる。本発明の突然変異ポリペプチドに対する抗体の調製及び突然変異ポリペプチドを検出する免疫学的アッセイの実施に関するより詳細な説明は、後のセクションで提供される。
【０６１８】
組換え産生された突然変異ポリペプチドの精製
ひとたびトランスフェクトされた宿主細胞における組換え突然変異ポリペプチドの発現が確認されれば、宿主細胞を、次に、組換えポリペプチドを精製する目的ために適切なスケールで培養する。
【０６１９】
１．細菌からの精製
本発明の突然変異ポリペプチドが、形質転換細菌により大量に組換え産生される場合、典型的に、プロモーター導入後、発現は構成的となりうるが、それらのタンパク質は不溶性の凝集体を形成することがある。タンパク質封入体の精製に適したいくつかのプロトコールが存在する。例えば、凝集タンパク質（以下、封入体と呼ぶ）の精製は、典型的に、細菌細胞の破壊により、例えば、約１００〜１５０μg／mlのリゾチーム及び０．１%  Nonidet P40（非イオン系界面活性剤）のバッファー中でのインキュベーションによる封入体の抽出、分離、及び／又は精製を含む。細胞懸濁液は、Polytron粉砕機（Brinkman Instruments, Westbury, NY）を使用して粉砕することができる。あるいは、細胞を氷上で超音波処理することができる。細菌を溶解する代替方法は、Ausubel et al.（上記）、ならびにSambrook及びRussell（上記）において記載されており、当業者に明らかであろう。
【０６２０】
細胞懸濁液は、一般的に、遠心分離し、封入体を含む沈殿を、封入体を溶解しないが洗浄するバッファー、例えば、２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１mM  ＥＤＴＡ１５０mM  ＮａＣｌ、及び２% Triton-X100（非イオン系界面活性剤）中に再懸濁する。可能な限り多くの細胞細片を除去するために洗浄工程を繰り返すことが必要となりうる。封入体の残存沈殿を、適切なバッファー（例えば、２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１５０mM  ＮａＣｌ）中に再懸濁してよい。他の適切なバッファーは、当業者に明らかであろう。
【０６２１】
洗浄工程に続き、封入体を、強い水素受容体及び強い水素供与体の両方である溶剤（又は、これらの特性の１つを各々が有する溶剤の組合せ）の添加により可溶化する。封入体を形成したタンパク質を、次に、適合するバッファーを用いた希釈又は透析により再生してよい。適した溶媒は、限定はされないが、尿素（約４M〜約８M）、ホルムアミド（少なくとも約８０%（体積／体積ベース）、及びグアニジン塩酸塩（約４M〜約８M）を含む。凝集体形成タンパク質を可溶化することが可能であるいくつかの溶媒、例えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び７０%ギ酸などを、タンパク質を不可逆的に変性させ、免疫原性及び／又は活性の欠如を伴う可能性があるため、この手順における使用に不適切でありうる。グアニジン塩酸塩及び類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、変性剤を除去（例えば、透析による）又は希釈すると再生が生じ、免疫学的及び／又は生物学的に活性な目的のタンパク質の再形成を可能にしうる。可溶化後、そのタンパク質を、他の細菌タンパク質から標準的な分離技術により分離することができる。細菌の封入体からの組換えポリペプチドの精製に関するさらなる記載については、例えば、Patra et al., Protein Expression and Purification 18: 182-190 (2000)を参照のこと。
【０６２２】
あるいは、組換えポリペプチド、例えば突然変異ポリペプチドを細菌のペリプラズムから精製することが可能である。組換えタンパク質が細菌のペリプラズム中に排出される場合、細菌のペリプラズム分画は、当業者に公知の他の方法に加えて低温浸透圧ショックにより単離することができる（例えば、Ausubel et al.（上記）を参照のこと）。組換えタンパク質をペリプラズムから単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成させる。ペレットを、２０%スクロースを含むバッファー中に再懸濁させる。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、沈殿を氷冷した５mM  ＭｇＳＯ４に再懸濁し、氷浴中で約１０分間保つ。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、保存する。上清中に存在する組換えタンパク質を、当業者に周知の標準的な分離技術により宿主のタンパク質から分離することができる。
【０６２３】
２．精製のための標準的なタンパク質分離技術
組換えポリペプチド、例えば本発明の突然変異ポリペプチドが、宿主細胞において可溶化形状で発現される場合、その精製は標準的なタンパク質精製手順（例えば、本明細書において以下に記載するもの）に従うことができる、又は、精製は、他の場所に開示される方法（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／１０５４２６）を使用して達成することができ、それは参照により本明細書において組み入れられる。
【０６２４】
溶解性分画
しばしば、最初の工程として、及び、タンパク質混合物が複雑な場合、最初の塩分画によって、不必要な宿主細胞タンパク質（又は細胞培養培地に由来するタンパク質）の多くを、目的の組換えタンパク質、例えば、本発明の突然変異ポリペプチドから分離することができる。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を有効に低下させることによりタンパク質を沈殿させる。タンパク質は、次に、それらの溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、それは、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコールは、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に加え、結果として得られる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０%になるようにすることである。これによって大半の疎水性タンパク質は沈殿する。この沈殿は（目的タンパク質が疎水性ではない場合）廃棄し、硫酸アンモニウムを上清に、目的タンパク質を沈殿させることが公知である濃度まで加える。沈殿を、次に、バッファー中で可溶化させ、過剰な塩を、必要な場合、透析又はダイアフィルトレーションのいずれかを通じて除去する。タンパク質の溶解性に依存する他の方法、例えば低温エタノールによる沈殿などは、当業者に周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用することができる。
【０６２５】
限外ろ過
計算された分子量に基づき、サイズのより大きなタンパク質及びサイズのより小さなタンパク質を、限外ろ過を使用し、様々なポアサイズの膜（例えば、Amicon又はMillipore社製の膜）を通して単離することができる。第１の工程として、タンパク質混合物を、目的タンパク質、例えば、突然変異ポリペプチドの分子量より低い分子量のカットオフ値を有するポアサイズの膜を通して限外ろ過する。限外ろ過の濃縮液を、次に、目的タンパク質の分子量より大きな分子カットオフ値を伴う膜に対して限外ろ過する。組換えタンパク質は、膜を通過してろ液中に入る。このろ液を、次に、以下に記載する通りにクロマトグラフィーにかけることができる。
【０６２６】
カラムクロマトグラフィー
目的タンパク質（例えば本発明の突然変異ポリペプチドなど）は、それらのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、又はリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。また、ポリペプチドに対して生じた抗体を、カラムマトリックスに抱合させ、ポリペプチドを免疫精製することもできる。これらの方法の全てが、当技術分野において周知である。
【０６２７】
クロマトグラフィー技術を、任意のスケールで、多くの様々な製造業者（例えば、Pharmacia Biotech）からの装置を使用して実施できることは、当業者に明らかであろう。
【０６２８】
突然変異ポリペプチド発現の検出のためのイムノアッセイ
組換え突然変異ポリペプチドの産生を確認するために、免疫学的アッセイが、サンプル中でポリペプチドの発現を検出するために有用となりうる。免疫学的アッセイは、また、組換えホルモンの発現レベルを定量化するために有用である。突然変異ポリペプチドに対する抗体が、これらの免疫学的アッセイを行うために必要である。
【０６２９】
突然突然変異ポリペプチドに対する抗体の産生
目的の免疫原と特異的に反応するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NＹ１991;Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NＹ１989;Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA、及び本明細書において引用される参考文献；Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York, NＹ１986;及びKohler and Milstein Nature 256: 495-497, 1975）を参照のこと）。そのような技術は、ファージ又は類似のベクター中の組換え抗体ライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製を含む（Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989;及びWard et al., Nature 341: 544-546, 1989を参照のこと）。
【０６３０】
所望の特異性を伴う抗体を含む抗血清を産生するために、目的ポリペプチド（例えば、本発明の突然変異ポリペプチド）又はその抗原性フラグメントを使用して、適した動物（例えば、マウス、ウサギ、又は霊長類）を免疫化することができる。標準的なアジュバント、例えばフロイントのアジュバントなどを、標準的な免疫化プロトコールに従って使用することができる。あるいは、その特定のポリペプチドに由来する合成の抗原ペプチドを、担体タンパク質に抱合させ、後に免疫原として使用することができる。
【０６３１】
免疫原調製物に対する動物の免疫応答を、試験血液を採取し、目的の抗原に対する反応性の力価を測定することによりモニターする。抗原に対する抗体の適切に高い力価が得られた場合、血液を動物から採取し、抗血清を調製する。抗原に特異的に反応する抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画及び抗体の精製を、後に実施することができる。Harlow及びLane（上記）、ならびに上に提供されたタンパク質精製に関する一般的な記載を参照のこと。
【０６３２】
モノクローナル抗体は、当業者に周知の種々の技術を使用して得られる。典型的には、所望の抗原を用いて免疫化された動物からの脾臓細胞を、通常、骨髄腫細胞との融合により不死化させる（Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976を参照のこと）。不死化の代替方法は、例えば、エプスタインバーウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、又は当技術分野において周知の他の方法を含む。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、所望の特異性及び抗原に対する親和性を有する抗体の産生のためにスクリーニングし、そのような細胞により産生されるモノクローナル抗体の収率を、脊椎動物宿主の腹腔中への注入を含む、種々の技術により増強させてよい。
【０６３３】
また、モノクローナル抗体を、Huse et al.（上記）により概説されている一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体又はそのような抗体の結合フラグメントをコードする核酸配列を同定した時点で、組換え産生してよい。上で考察した組換えポリペプチド産生の一般的な原理及び方法は、組換え方法による抗体産生に適用可能である。
【０６３４】
望まれる場合、本発明の突然変異ポリペプチドを特異的に認識することが可能である抗体を、野生型ポリペプチドに対するそれらの交差反応性について試験し、このようにして野生型タンパク質に対する抗体から区別することができる。例えば、突然変異ポリペプチドを用いて免疫化した動物から得られた抗血清を、野生型ポリペプチドを固定化したカラムに通すことができる。カラムを通過する抗血清部分は、突然変異ポリペプチドだけを認識し、野生型ポリペプチドは認識しない。同様に、突然変異ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、また、突然変異体だけを認識し、野生型ポリペプチドは認識しないそれらの排他性についてスクリーニングすることができる。
【０６３５】
本発明の突然変異ポリペプチドだけを特異的に認識し、野生型ポリペプチドは認識しないポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、例えば、固体支持体上に固定化された、突然変異ペプチドに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と共にサンプルをインキュベートすることにより、突然変異タンパク質を野生型タンパク質から単離するために有用である。
【０６３６】
組換えペプチド発現を検出するためのイムノアッセイ
ひとたび本発明の突然変異ポリペプチドに対して特異的な抗体が利用可能になれば、サンプル中のポリペプチド、例えば、細胞ライセートの量は、当業者に定性的及び定量的結果を提供する種々のイムノアッセイ法により測定することができる。一般的な免疫学的手順及びイムノアッセイ手順の総説については、例えば、Stites（上記）、米国特許第４，３６６，２４１号、第４，３７６，１１０号、第４，５１７，２８８号、及び第４，８３７，１６８号を参照のこと。
【０６３７】
イムノアッセイにおける標識
イムノアッセイでは、抗体及び標的タンパク質により形成された結合複合体に特異的に結合し、それを標識する標識薬剤をしばしば利用する。標識薬剤は、それ自体が、抗体／標的タンパク質複合体を含む成分の１つでよく、又は、抗体／標的タンパク質複合体に特異的に結合する第３の成分（例えば別の抗体など）でよい。標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、又は化学的手段により検出可能でありうる。例は、限定はされないが、磁性ビーズ（例えば、「Dynabeads（商標）」）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド（Texas red）、ローダミンなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡにおいて通常使用される他の酵素）、及び比色標識薬剤、例えばコロイド金又は有色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどを含む。
【０６３８】
一部の場合において、標識薬剤は、検出可能な標識を持つ二次抗体である。あるいは、二次抗体は標識を欠いてよいが、しかし、それは、代わりに、二次抗体が対応する種の抗体に特異的な、標識された三次抗体により結合されうる。二次抗体は、検出可能成分（例えばビオチンなど）を用いて修飾することができ、それに第３の標識分子（例えば酵素標識ストレプトアビジンなど）が特異的に結合することができる。
【０６３９】
免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合することが可能である他のタンパク質、例えばプロテインＡ又はプロテインＧも、標識薬剤として使用することができる。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成成分である。それらは、種々の種からの免疫グロブリンの定常領域との強い非免疫原性の反応性を示す（一般的には、Kronval, et al. J. Immunol., 111: 1401-1406 (1973);及びAkerstrom, et al., J. Immunol., 135: 2589-2542 (1985)を参照のこと）。
【０６４０】
イムノアッセイのフォーマット
目的の標的タンパク質（例えば、突然変異ヒト成長ホルモン）をサンプルから検出するためのイムノアッセイは、競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイは、捕捉された標的タンパク質の量が直接測定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、標的タンパク質に特異的な抗体を固体基質に直接結合させ、そこでその抗体を固定化することができる。それは、次に、試験サンプル中の標的タンパク質を捕捉する。このようにして固定化された抗体／標的タンパク質複合体を、次に、標識を持つ、上に記載した標識薬剤、例えば二次抗体又は三次抗体などにより結合させる。
【０６４１】
競合アッセイにおいて、サンプル中の標的タンパク質の量を、サンプル中に存在する標的タンパク質により標的タンパク質に特異的な抗体から置換された（又は競争して追いやられた）、追加の（外因性の）標的タンパク質の量を測定することにより間接的に測定する。そのようなアッセイの典型的な例において、抗体を固定化し、外因性の標的タンパク質を標識する。抗体に結合する外因性標的タンパク質の量は、サンプル中に存在する標的タンパク質の濃度に反比例するため、サンプル中の標的タンパク質レベルを、抗体に結合し、このようにして固定化された外因性標的タンパク質の量に基づいて決定することができる。
【０６４２】
一部の場合において、ウエスタンブロット（イムノブロット）解析を使用し、サンプル中の突然変異ポリペプチドの存在を検出及び定量する。この技術は、一般的に、分子量を基づくゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を分離すること、分離されたタンパク質を適した固体支持体（例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、又は誘導体化ナイロンフィルターなど）に転移させること、及び標的タンパク質に特異的に結合する抗体と共にサンプルをインキュベートすることを含む。これらの抗体を直接標識してよく、あるいは、突然変異ポリペプチドに対する抗体に特異的に結合する標識抗体（例えば、標識されたヒツジの抗マウス抗体）を使用して、後に検出してよい。
【０６４３】
他のアッセイフォーマットはリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）を含み、それでは特定の分子（例えば、抗体）に結合するようにデザインされたリポソームが使用され、封入された試薬又はマーカーを放出する。放出された化学物質を、次に、標準技術に従って検出する（Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev., 5: 34-41 (1986)を参照のこと）。
【０６４４】
処理の方法
上で考察した抱合体に加えて、本発明は、本発明のポリペプチド抱合体を、疾患を発生するリスクがある被験者又は疾患を有する被験者に投与することにより、病状を予防、治癒、又は回復させる方法を提供する。また、本発明は、本発明の抱合体を身体の特定の組織又は部分に標的化するための方法を提供する。
【０６４５】
以下の例を提供して、本発明の組成物及び方法を例証するが、しかし、主張する本発明を限定しない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【配列表】
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