(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子上の特定部位に特異的に結合し得る第１の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第１の複合体、および前記特定部位と異なる前記生体分子上の部位に特異的に結合し得る第２の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第２の複合体を含む溶液を保持する容器と、
前記第１の複合体が前記第１の物質を介して前記生体分子に結合し、前記第２の複合体が前記第２の物質を介して前記生体分子に結合した第３の複合体を前記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる配向制御手段と、
特定方向の直線偏光成分のみを有し、前記第１の複合体および前記第２の複合体の金属粒子に表面プラズモン共鳴を引き起こす光を前記溶液に照射する光源と、
前記第１の複合体および前記第２の複合体の金属粒子の表面プラズモン共鳴により発生する電場により前記第１の複合体および前記第２の複合体の蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、
前記受光部が検出した蛍光の内、前記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出する同期成分抽出手段と、
を具備する生体分子検出装置。
【請求項２】
前記配向制御手段は、
前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を前記溶液に照射する配向制御偏光光源と、
該配向制御偏光光源から照射される光の偏光軸を回動させることにより、前記第３の複合体を前記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる偏光軸回動手段と、
を具備する請求項１の生体分子検出装置。
【請求項３】
前記配向制御光源は、前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を前記溶液に対して複数の位置から照射する請求項２の生体分子検出装置。
【請求項４】
前記配向制御手段は、
前記光源から照射される光と異なる光を前記溶液に照射する配向制御光源と、
該配向制御光源から照射される光の照射方向を切り替えることにより、前記第３の複合体を前記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる切替手段と、
を具備する請求項１の生体分子検出装置。
【請求項５】
前記光源から照射される光と異なる光を前記溶液の複数の位置に照射する配向制御光源を具備する請求項４の生体分子検出装置。
【請求項６】
前記配向制御手段は、
前記第３の複合体の長軸方向と前記光源から照射される光の振動方向とが平行となる第１の方向、および、
前記第３の複合体の長軸方向と前記光源から照射される光の振動方向とが垂直となる第２の方向、
へ前記第３の複合体を配向させる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項７】
前記配向制御手段は、前記第３の複合体の配向方向を所定の時間間隔で変化させ、
前記同期成分抽出手段は、前記第３の複合体が含まれる溶液から発生する蛍光の強度を複数回測定して前記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項の生体分子検出装置。
【請求項８】
前記所定の時間間隔は、前記溶液中に存在する全ての前記第３の複合体の配向が完了する時間間隔であることを特徴とする請求項７の生体分子検出装置。
【請求項９】
前記光源から照射される光の波長は、前記蛍光分子により吸収されない波長であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項の生体分子検出装置。
【請求項１０】
前記同期成分抽出手段は、
前記第３の複合体の配向方向の変化により、前記第３の複合体から発生する蛍光量が変化することを利用して、記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出する請求項１乃至９のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１１】
前記溶液は、少なくとも一部に平面を有する容器保持部に保持されることを特徴とする請求項２または３に記載の生体分子検出装置。
【請求項１２】
前記配向制御偏光光源は、
前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を、前記溶液を通って前記容器保持部の平面から出射する方向に照射し、
かつ、前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を、前記溶液と前記平面との界面において焦点を結ばせることを特徴とする請求項１１の生体分子検出装置。
【請求項１３】
前記溶液は、少なくとも一部に平面を有する容器保持部に保持されることを特徴とする請求項４または５に記載の生体分子検出装置。
【請求項１４】
前記配向制御光源は、
前記光源から照射される光と異なる光を、前記溶液を通って前記容器保持部の平面から出射する方向に照射し、
かつ、前記光源から照射される光と異なる光を、前記溶液と前記平面との界面において焦点を結ばせることを特徴とする請求項１３の生体分子検出装置。
【請求項１５】
検体に含まれる生体分子上の特定部位に特異的に結合し得る第１の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第１の複合体、および前記特定部位と異なる前記生体分子上の部位に特異的に結合し得る第２の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第２の複合体を含む溶液と検体とを混合するステップと、
前記第１の複合体が前記第１の物質を介して前記生体分子に結合し、前記第２の複合体が前記第２の物質を介して前記生体分子に結合した第３の複合体を前記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させるステップと、
特定方向の直線偏光成分のみを有し、前記第１の複合体および前記第２の複合体の金属粒子に表面プラズモン共鳴を引き起こす光を前記溶液に照射するステップと、
前記第１の複合体および前記第２の複合体の金属粒子の表面プラズモン共鳴により発生する電場により前記第１の複合体および前記第２の複合体の蛍光分子から発せられた蛍光を検出するステップと、
前記受光部が検出した蛍光の内、前記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出するステップと、
を具備する生体分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の検出対象物質を検出する技術に係り、特に、血液や尿等の検体内の生体分子、ウイルス、ＤＮＡ、蛋白質、細菌等を検出することが可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医師や技師等が診療の現場で生体分子検出を行い、その場で測定結果を得て診断や治療に役立てる生体分子検出法が注目されている。生体分子検出法は、抗原抗体反応等の特異的な反応を利用した高い選択性により、血液、尿、汗といった複数成分を有する体液の中から、検出対象物質だけを選択的に検出する方法である。特に、ウイルス、ＤＮＡ、蛋白質、細菌等の生体分子の微量検出、検査、定量、分析などに広く用いられている。
【０００３】
近年、生体分子を高感度に検出する方法として、金属微粒子のプラズモンと光の相互作用を利用したプラズモンセンサの研究が進められている。
【０００４】
特許文献１には、基板に固定した金属微粒子（金ナノロッド）の局在表面プラズモン共鳴の吸収波長が特異的結合によりシフトする現象をセンシング技術に応用した分析チップが開示されている。
【０００５】
特許文献２には、金ナノロッドを配向させて基板に固定することにより、検出感度を向上させる検知素子が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２６５０６２号公報
【特許文献２】特開２００７−２４８２８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１および特許文献２のような金属微粒子を固定した基板を利用した検知素子は、金属微粒子を固定する際の加工コストが高いという問題がある。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、金属微粒子を基板に固定することなく高感度で測定可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子検出装置は、生体分子上の特定部位に特異的に結合し得る第１の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第１の複合体、および上記特定部位と異なる上記生体分子上の部位に特異的に結合し得る第２の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第２の複合体を含む溶液を保持する容器と、上記第１の複合体が上記第１の物質を介して上記生体分子に結合し、上記第２の複合体が上記第２の物質を介して上記生体分子に結合した第３の複合体を上記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる配向制御手段と、特定方向の直線偏光成分を有し、上記第１の複合体および上記第２の複合体の金属粒子に表面プラズモン共鳴を引き起こす光を上記溶液に照射する光源と、上記第１の複合体および上記第２の複合体の金属粒子の表面プラズモン共鳴により発生する電場により上記第１の複合体および上記第２の複合体の蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、上記受光部が検出した蛍光の内、上記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出する同期成分抽出手段と、を具備する。
【００１０】
このような構成にすると、簡便な構成で検出対象物質を高感度に測定することができる。また、上記第１の複合体および上記第２の複合体が固定されていないため、溶液中での生体分子との反応が早い。
【００１１】
また、上記配向制御手段は、上記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を上記溶液に照射する配向制御偏光光源と、該配向制御偏光光源から照射される光の偏光軸を回動させることにより、上記第３の複合体を上記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる偏光軸回動手段と、を具備することが好ましい。
【００１２】
配向制御手段が光を用いて第３の複合体を配向させると、第３の複合体に対して配向のための前処理が不要となる。例えば、磁気を用いて配向制御を行う場合には、第３の複合体に磁性粒子等を結合させる必要があるが、光を用いて配向させると、そのような前処理が不要である。また、光の偏光軸を回動させることにより第３の複合体を溶液中で配向させると、複数の方向から光を照射して第３の複合体の配向方向を切り替える必要がないため、配向制御手段の光学系をコンパクトにすることができる。
【００１３】
また、上記配向制御光源は、上記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を上記溶液に対して複数の位置から照射することが好ましい。
【００１４】
溶液に対して複数の位置から光を照射して第３の複合体を配向させると、溶液内の様々な位置に存在する第３の複合体の配向方向を制御しやすくなる。
【００１５】
また、上記配向制御手段は、上記光源から照射される光と異なる光を上記溶液に照射する配向制御光源と、該配向制御光源から照射される光の照射方向を切り替えることにより、上記第３の複合体を上記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる切替手段と、を具備してもよい。また、上記配向制御光源は、上記光源から照射される光と異なる光を上記溶液の複数の位置に照射することが好ましい。
【００１６】
また、上記配向制御手段は、上記第３の複合体の長軸方向と上記光源から照射される光の振動方向とが平行となる第１の方向、および、上記第３の複合体の長軸方向と上記光源から照射される光の振動方向とが垂直となる第２の方向、へ上記第３の複合体を配向させることが好ましい。
【００１７】
このように分子の配向を制御すると、上記第３の複合体の配向方向の切り替えに伴う蛍光強度の変化が最大となる。そのため、第３の複合体の配向方向の切り替えに伴う蛍光強度の変化をより高精度に測定することができる。
【００１８】
また、上記配向制御手段は、上記第３の複合体の配向方向を所定の時間間隔で変化させ、上記同期成分抽出手段は、上記第３の複合体が含まれる溶液から発生する蛍光の強度を複数回測定して上記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出することが望ましい。
【００１９】
このように上記第３の複合体の配向方向を所定の時間間隔で変化させながら、蛍光の強度を複数回測定し、測定した複数の蛍光強度を加算平均等すれば、ノイズ等による測定毎の減光量のばらつきによる測定精度への影響を減少させることができる。
【００２０】
さらに、上記所定の時間間隔は、上記溶液中に存在する全ての上記第３の複合体の配向が完了する時間間隔であることが好ましい。
【００２１】
このように所定の時間間隔を決定すると、全ての上記第３の複合体の配向が完了した後まで測定を行うことがないため、最短の時間で測定を行うことができる。
【００２２】
また、上記光源から照射される光の波長は、上記蛍光分子により吸収されない波長であることが好ましい。光源から照射される光の波長が蛍光分子により吸収されない波長であれば、蛍光分子は表面プラズモン共鳴によって発生する電場によってのみ励起されるため、電場の強度変化が蛍光の強度変化に的確に反映される。
【００２３】
また、上記同期成分抽出手段は、上記第３の複合体の配向方向の変化により、上記第３の複合体から発生する蛍光量が変化することを利用して、記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出することが好ましい。
【００２４】
また、上記溶液は、少なくとも一部に平面を有する容器保持部に保持されることが好ましい。さらに、上記配向制御偏光光源は、上記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を、前記溶液を通って前記容器保持部の平面から出射する方向に照射し、かつ、前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を、前記溶液と前記平面との界面において焦点を結ばせることが好ましい。また、上記配向制御光源は、上記光源から照射される光と異なる光を、前記溶液を通って前記容器保持部の平面から出射する方向に照射し、かつ、前記光源から照射される光と異なる光を、前記溶液と前記平面との界面において焦点を結ばせることが好ましい。
【００２５】
このように配向制御偏光光源または上記配向制御光源が容器保持部から出射する位置において焦点を結ぶように光を照射すると、第３の複合体を容器保持部の壁面に押しつけながら回動させることができるため、配向制御しやすくなる。
【００２６】
また、上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子検出方法は、検体に含まれる生体分子上の特定部位に特異的に結合し得る第１の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第１の複合体、および上記特定部位と異なる上記生体分子上の部位に特異的に結合し得る第２の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第２の複合体を含む溶液と検体とを混合するステップと、上記第１の複合体が上記第１の物質を介して上記生体分子に結合し、上記第２の複合体が上記第２の物質を介して上記生体分子に結合した第３の複合体を上記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させるステップと、特定方向の直線偏光成分を有し、上記第１の複合体および上記第２の複合体の金属粒子に表面プラズモン共鳴を引き起こす光を上記溶液に照射するステップと、上記第１の複合体および上記第２の複合体の金属粒子の表面プラズモン共鳴により発生する電場により上記第１の複合体および上記第２の複合体の蛍光分子から発せられた蛍光を検出するステップと、上記受光部が検出した蛍光の内、上記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出するステップと、を具備する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、固相を用いないため抗原抗体反応が早く、表面プラズモン共鳴によって発生した電場を利用して蛍光検出を行うため、高感度な生体分子検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（Ａ）は実施の形態１において使用する第１の複合体の模式図、（Ｂ）は実施の形態１において使用する第２の複合体の模式図、（Ｃ）は、第１の複合体および第２の複合体が抗原と結合した状態を示す図である。
【図２】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図である。
【図３Ａ】単独で存在する第１の複合体に励起光を照射した際に金ナノ粒子の周囲に発生する電場の強さを表した図である。
【図３Ｂ】Ｙ軸方向に長軸を向けた第３の複合体に励起光を照射した際に金ナノ粒子の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。
【図３Ｃ】Ｘ軸方向に長軸を向けた第３の複合体に励起光を照射した際に金ナノ粒子の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。
【図４】（Ａ）は実施の形態１に係る生体分子検出装置の外観斜視図、（Ｂ）は実施の形態１に係る生体分子検出装置の開閉カバーを開けた図である。
【図５】実施の形態１に係る生体分子検出装置の主要な構成を示す機能ブロック図である。
【図６Ａ】偏光方向制御部が配向制御光を素通りさせた場合における第３の複合体の配向方向を示す図である。
【図６Ｂ】配向制御光の振動方向を９０度切り替えた場合における第３の複合体の挙動を示す図である。
【図６Ｃ】配向制御光の振動方向を９０度切り替えた場合における第３の複合体の配向方向を示す図である。
【図７】配向制御光の焦点の位置を示す図である。
【図８】（Ａ）は偏光方向制御部が配向制御光を素通りさせた場合における第３の複合体の配向方向と励起光の振動方向との関係を示す図、（Ｂ）は配向制御光の振動方向を９０度切り替えた場合における第３の複合体の配向方向と励起光の振動方向との関係を示す図である。
【図９】測定の際にＦＧが出力する配向制御信号、受光部が出力する受光部出力およびロックインアンプが出力するロックインアンプ出力を描いたグラフである。
【図１０】（Ａ）は第１の複合体の別の構造を示す模式図、（Ｂ）は第２の複合体の別の構造を示す模式図、（Ｃ）は第３の複合体の別の構造を示す模式図である。
【図１１】（Ａ）は第１の複合体のさらに別の構造を示す模式図、（Ｂ）は第２の複合体のさらに別の構造を示す模式図、（Ｃ）は第３の複合体のさらに別の構造を示す模式図である。
【図１２】（Ａ）は実施の形態２において使用する第４の複合体の模式図、（Ｂ）は本発明の実施の形態２において使用する第５の複合体の模式図、（Ｃ）は第４の複合体および第５の複合体が抗原と結合した状態を示す図である。
【図１３】実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図である。
【図１４】実施の形態２に係る生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図１５】実施の形態２に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図１６Ａ】実施の形態２に係る生体分子検出装置において第３の複合体を測定する場合における数周期の配向制御信号、受光部出力およびロックインアンプ出力を示したグラフである。
【図１６Ｂ】実施の形態２に係る生体分子検出装置において第６の複合体を測定する場合における数周期の配向制御信号、受光部出力およびロックインアンプ出力を示したグラフである。
【図１７】試薬容器の多点に配向制御光を照射する場合を示す図である。
【図１８】配向制御光を多点に入射させるための配向制御用光源部の構造を示す図である。
【図１９】配向制御光を多点に入射させるための光学系の一例を示す図である。
【図２０】配向制御光を多点に入射させるための光学系の別の例を示す図である。
【図２１】マイクロレンズアレイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、添付図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００３０】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１では、溶液中に存在する抗原を検出するために、この抗原の特定の２箇所に特異的に結合し得る２種類の蛍光標識２０ａ、２０ｂを別途合成する。図１（Ａ）は蛍光標識２０ａの模式図、図１（Ｂ）は蛍光標識２０ｂの模式図である。蛍光標識２０ａ、２０ｂは、金属粒子が含まれるように合成されるので、表面プラズモン共鳴が起こると蛍光を発する。本実施の形態では、これら２種類の蛍光標識を均一溶液中に導入して抗原と結合させることにより、検出対象物質である特定の１種類の抗原を検出する。
【００３１】
図１（Ａ）に示した蛍光標識を以下第１の複合体２０ａと呼ぶこととする。第１の複合体２０ａは、直径が２０ｎｍの略球形の金ナノ粒子８の表面全体をＳｉＯ２からなる厚み１０ｎｍの金属消光防止膜で覆い、金属消光防止膜の表面に複数の第１の抗体１２ａと複数の蛍光分子１４と複数のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）２４とが結合した複合体である。金ナノ粒子８は、ＡｕをコアとしてＳｉＯ２のシェルを有するコアシェル粒子である。金属消光防止膜は、金ナノ粒子８と蛍光分子１４とが近接して蛍光分子１４が励起されたエネルギーが金ナノ粒子８に奪われる、いわゆる金属消光を防止するために設けられている。なお、金属消光防止膜は特に明確には図示しておらず、以降の図においても特に明確には図示しない。第１の抗体１２ａ、蛍光分子１４およびＢＳＡ２４は、金属消光防止膜の表面全体に偏りなく配置される。ＢＳＡ２４は、非特異吸着防止のために結合されており、検出対象物質と抗体１２ａの結合以外の非特異的な吸着を防いでいる。
図１（Ｂ）に示した蛍光標識を以下第２の複合体２０ｂと呼ぶこととする。第２の複合体２０ｂは、直径が２０ｎｍの金ナノ粒子８の表面全体をＳｉＯ２からなる厚み１０ｎｍの金属消光防止膜で覆い、金属消光防止膜の表面に複数の第２の抗体１２ｂと複数の蛍光分子１４と複数のＢＳＡ２４とが結合した複合体である。第２の抗体１２ｂ、蛍光分子１４およびＢＳＡ２４は、金属消光防止膜の表面全体に偏りなく配置される。このように、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状的に等方的な構成を採る。
【００３２】
第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、検出対象物質である抗原の特定部位と反応し、それぞれ異なる位置に結合する抗体である。本実施の形態においては、第１の抗体１２ａとしてＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社のＭＡＢ１１２９（Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２  Ａｎｔiｂｏｄｙ）を用い、第２の抗体１２ｂとして同社のＢＡＦ１１２９（Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた。本実施の形態では、検出対象物質として血漿中のＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２タンパク質を検出する。検出対象物質であるＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２タンパク質を以下では抗原１８と呼ぶ。
【００３３】
蛍光分子１４には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８は、波長６００ｎｍ程度にピークを有し、５５０ｎｍ−７００ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発光する。第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは同種の蛍光分子１４を有する。
【００３４】
第１の複合体２０ａの作成方法について説明する。まず、第１の抗体１２ａのビオチン化を行う。具体的には、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＯｎｅ-Ｓｔｅｐ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用する。例えば、金ナノ粒子８として、田中貴金属製のＡｕコロイド溶液−ＳＣ  粒径２０ｎｍを用いて、マイクロミキサー法によりＡｕをコアとしたＳｉＯ２シェルを有する粒子を製造する。このようにして、金ナノ粒子８の表面全体がＳｉＯ２膜で覆われたコアシェル粒子を作成することができる。ＳｉＯ２へのアビジンの固定は、公知の任意の方法を用いることができる。そして、アビジンービオチン結合を介して金属消光防止膜上に第１の抗体１２ａを固定する。具体的には、粒子と抗体とのモル濃度を等しい割合で混合し、１時間放置する。続いて、金属消光防止膜上に蛍光分子を固定する。蛍光分子の固定方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社のサクシニミジルエステル反応基色素キットに付属しているプロトコルに従ってを用いて行う。ＢＳＡ２４は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社のＡ９４１８−１０Ｇを用いる。まず、Ａ９４１８−１０ＧをＭｉｌｌＱで金ナノ粒子８のモル濃度の１００倍になる濃度とし、Ａ９４１８−１０Ｇと金ナノ粒子８とを混合し、１時間放置することでＢＳＡ２４によって金属消光防止膜の表面がブロッキングされて第１の複合体２０ａは完成する。第２の複合体２０ｂも同様の手順で作成する。本実施例では、ＳｉＯ２のシェルを有する金ナノ粒子の表面に蛍光色素を固定する方法を示したが、シェルであるＳｉＯ２の膜厚を２０ｎｍ程度に厚くして膜内に蛍光色素を含有する方法もある。また、金属消光防止膜を設けない場合は、アビジン標識された金ナノ粒子を用いれば良い。
【００３５】
本実施の形態で用いた第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、いわゆるサンドイッチ法を行って抗原１８を検出するための抗体である。従って、これらの抗体は、抗原１８をそれぞれ異なるエピトープで認識して結合する。すなわち、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、抗原１８のそれぞれ異なる位置に特異的に結合する。また、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、互いに立体障害とならないように抗原１８の立体構造上の遠い位置に結合する。なお、図１（Ａ）および図１（Ｂ）における第１の抗体１２ａと第２の抗体１２ｂの図は、それぞれ異なる凹形状で図示することにより、抗原１８の異なる位置に結合することを表している。そのため、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは必ずしもこのような形状ではない。
【００３６】
図１（Ｃ）は、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂの双方が抗原１８と結合した場合を示す図である。以下、この図のように第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂの双方が抗原１８に結合した複合体を第３の複合体２２と呼ぶ。図１（Ｃ）においては、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂが抗原１８のそれぞれ異なる位置に特異的に結合することをわかり易く示すために、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂのそれぞれの凹形状と適合した凸形状を有する図により抗原１８を示している。実際の抗原１８がこのような形状を有しているわけではない。
【００３７】
第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは抗原１８に対してサンドイッチ法を行うための抗体であるため、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂの双方が抗原１８と結合した場合には、図１（Ｃ）のように第１の複合体２０ａと第２の複合体２０ｂが抗原１８を挟んで向かい合った位置に結合する。すなわち、第３の複合体２２においては、第１の複合体２０ａ、抗原１８および第２の複合体２０ｂが一直線上に並んだ構造となる。このように、第３の複合体２２は、形状に異方性を有する複合体となる。以下、第３の複合体２２において、第１の複合体２０ａ、抗原１８および第２の複合体２０ｂが並んだ方向を長軸方向といい、長軸方向に垂直な方向を短軸方向という。第３の複合体２２において、第１の複合体２２ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体２２ｂが有する金ナノ粒子８との距離は、約３０ｎｍとなる。
【００３８】
図２（Ａ）および図２（Ｂ）は、本実施の形態に係る生体分子検出装置における抗原抗体反応の概要を示した模式図である。図２（Ａ）は抗原抗体反応前の状態を表す。試薬容器１０は、四角柱状の外形を有し、上面が開口した四角柱状の凹部からなる試薬保持部を内部に有する。図２（Ａ）および図２（Ｂ）においては、外部に露出していない試薬保持部を破線によって示してある。試薬保持部の中には、乾燥した複数の第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂが入れられている。
【００３９】
本実施の形態においては、検体は全血から分離した血漿１６である。試薬容器１０に血漿１６を分注して撹拌すると、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂと特異的に結合する抗原１８が血漿１６中に存在する場合は、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂと抗原１８との間で抗原抗体反応が起こり、図２（Ｂ）に示すように第３の複合体２２が形成される。
【００４０】
第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは抗原１８に対して十分に多い量が入れられているため、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂの一部は、抗原抗体反応をしないまま血漿１６内に残る。すなわち、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂと混合された血漿１６内には第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２が混在している。
【００４１】
なお、血漿１６中には抗原１８以外の成分も存在するが、説明を簡単にするため、図２（Ａ）および（Ｂ）においては抗原１８以外の成分は省略して示してある。
【００４２】
本実施の形態に係る生体分子検出装置１００は、液相であることにより第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２が混在している血漿１６に対して励起光を照射し、励起光と金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を発生させ、表面プラズモン共鳴により発生する電場によって蛍光分子１４を発光させ、当該血漿１６内から発生する蛍光を測定することにより抗原１８の検出および定量を行う。
従って、抗原１８を含む第３の複合体２２から発生する蛍光のみを検出することが望ましいが、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２は血漿１６内に混在しているため、血漿１６に励起光を照射すると、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂに付随している蛍光分子１４も蛍光を発生して不要成分となる。そこで、生体分子検出装置１００は、第３の複合体２２の配向方向を光により切り替えつつ蛍光を検出し、配向の切り替えに伴う蛍光強度の変化に基づいて全蛍光データの中から第３の複合体２２に付随する蛍光分子から発生する蛍光の寄与分を算出する。
【００４３】
生体分子検出装置１００において、第３の複合体２２に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の寄与分と、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂに付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の寄与分とを算出する原理を図３Ａ〜図３Ｃを用いて説明する。図３Ａ〜図３Ｃは、励起光１１９と金ナノ粒子８との表面プラズモン共鳴により発生する電場の強さを濃淡画像により表した図である。図３Ａ〜図３ＣにおいてＸ軸およびＹ軸は位置を表す。また、濃度は電場の強さを表し、濃度が濃いほどその位置における電場が強いことを表す。
【００４４】
図３Ａは、単独で存在する第１の複合体２０ａに対してＸ軸方向に振動しながらＹ軸方向に進行する励起光１１９を照射した際、金ナノ粒子８の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。濃淡画像の中心には第１の複合体２０ａが存在する。この場合、金ナノ粒子８を中心としてＸ軸方向に電場が発生する。つまり、表面プラズモン共鳴を発生させる励起光１１９の振動方向と同方向に電場が発生する。この電場は、金ナノ粒子８の表面近傍において最も強く、金ナノ粒子８から離れるほど弱くなる。金ナノ粒子８表面に存在する蛍光分子１４は発生した電場によって励起され蛍光を発生する。
【００４５】
単独で存在する第１の複合体２０ａについては、形状に異方性がなく、蛍光分子１４は金属消光防止膜の表面全体に偏りなく結合しているため、向きが変わっても発生する蛍光の量に大きな変化はない。なお、第２の複合体２０ｂの表面プラズモン共鳴による強度分布は図示しないが、第１の複合体２０ａと同様の強度分布となる。
【００４６】
一方、形状に異方性を有する第３の複合体２２は、配向を制御することが可能である。図３Ｂは、Ｙ軸方向に長軸方向を向けた第３の複合体２２に対してＸ軸方向に振動しながらＹ軸方向に進行する励起光１１９を照射した際、金ナノ粒子８の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。この場合においても、金ナノ粒子８を中心としてＸ軸方向に電場が発生する。それぞれの電場の強さは、第１の複合体２０ａまたは第２の複合体２０ｂが単独で存在する場合とほぼ同じである。従って、第１の複合体２０ａまたは第２の複合体２０ｂが発生する蛍光の量も第１の複合体２０ａまたは第２の複合体２０ｂが単独で存在する場合とほぼ同じとなる。
【００４７】
図３Ｃは、Ｘ軸方向に長軸方向を向けた第３の複合体２２に対してＸ軸方向に振動しながらＹ軸方向に進行する励起光１１９を照射した際、金ナノ粒子８の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。この場合、第１の複合体２０ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体２０ｂが有する金ナノ粒子８との間の領域において、それぞれが有する金ナノ粒子８により発生した表面プラズモン共鳴による電場が重なり、非常に強い電場を発生する。この電場の強度は、図３Ｂの場合と比べて約２０倍程である。そのため、金属消光防止膜の表面かつ第１の複合体２０ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体２０ｂが有する金ナノ粒子８との間に存在する蛍光分子１４は非常に強い電場により励起され、強い蛍光を発生する。従って、第３の複合体２２が発生する蛍光の量は、図３Ｂの場合と比べて増加する。つまり、Ｘ軸方向に振動しながらＹ軸方向に進行する励起光１１９を照射した場合、第３の複合体２２の長軸方向がＹ軸方向からＸ軸方向に変化すると、第３の複合体２２から発生する蛍光の量が増加する。
【００４８】
そこで、本実施の形態に係る生体分子検出装置１００は、光により第３の分子の配向方向を周期的に変化させ、この周期に同期した蛍光信号のみを検出することにより、第３の複合体２２から発生する蛍光の量の算出を行う。一方、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状に異方性がないため光を照射しても配向しない。第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、ブラウン運動により回転運動するが、向きが変化しても発光する蛍光の量は変化しないため、第３の分子の配向方向を変化させる周期に同期した蛍光を発生しない。従って、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２が混在している血漿１６においても、第３の複合体２２から発生する蛍光の寄与分を算出することができる。
【００４９】
このような処理を行う生体分子検出装置１００の構成について説明する。図４（Ａ）は、生体分子検出装置１００の外観斜視図である。生体分子検出装置１００の側面には、表示部１０２、ユーザー入力部１０４および開閉カバー１０６がある。表示部１０２は、測定結果等を表示する。ユーザー入力部１０４は、モードの設定および検体情報の入力等を行う。開閉カバー１０６は、開閉が可能な構成となっており、検体のセット時には開け、測定時には閉じる。この構成により、外部の光が測定に影響を与えることを防いでいる。
【００５０】
図４（Ｂ）は、開閉カバー１０６を開いた場合における生体分子検出装置１００の外観斜視図である。開閉カバー１０６を開くと、中には試薬容器１０および保持台１１０がある。試薬容器１０は、保持台１１０に保持されており、保持台１１０から着脱可能となっている。試薬容器１０は、溶液を入れる四角柱状の容器である。ユーザーは、試薬容器１０に検体を分注し、上蓋を閉じて測定を行う。図示しないが、生体分子検出装置１００内には試薬タンクおよび分注部があり、測定が開始されると、分注部は試薬タンク内から試薬を吸い上げて試薬容器１０内に分注する。
【００５１】
図５は、生体分子検出装置１００の主要な構成を説明するための機能ブロック図である。生体分子検出装置１００は、表示部１０２、ユーザー入力部１０４、試薬容器１０、試薬タンク１１２、分注部１１４、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、偏光方向制御部１２０、ＦＧ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）１２２、受光部１２４、増幅部１２６、ロックインアンプ１２７、Ａ／Ｄ変換部１２８、サンプリングクロック発生部１３０、およびＣＰＵ１３２を有する。
【００５２】
試薬容器１０は、試薬タンク１１２に保存してある試薬と患者等から採取した検体とを反応させる容器である。試薬容器１０は、生体分子検出装置１００から着脱可能となっている。試薬容器１０の容量は、約１２０μＬである。
【００５３】
試薬タンク１１２は複数種類の試薬を貯めておくタンクである。第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは試薬タンク１１２中に試薬として保存されている。
【００５４】
分注部１１４は、着脱可能なピペットや吸引器によって構成される。分注部１１４は、ＣＰＵ１３２からの命令に従い、測定に使用する試薬を試薬タンク１１２からピペットで吸い上げ、試薬容器１０へ分注する。
【００５５】
配向制御用光源部１１６は、内部の偏光子により直線偏光した配向制御光１１７を偏光方向制御部１２０に向けて照射する光源である。ここで、直線偏光とは、光の振動方向が一定であり、偏光面が変化しない光を指す。直線偏光した光の進行方向および振動方向が存在する面を偏光面といい、直線偏光した光の振動方向を偏光軸という。配向制御用光源部１１６は、配向制御光１１７により試薬容器１０内の溶液中に存在する第３の複合体２２に外力を加えて第３の複合体２２を配向させる。配向制御光１１７には、例えば、波長９０９ｎｍ、出力７００ｍＷのレーザーを用いる。配向制御光１１７は、蛍光分子１４が吸収しない波長のレーザーであり、蛍光分子１４の色素が壊れる等の影響を与えない。配向制御光１１７は、試薬容器１０の溶液全体を照らす程度の幅を有している。
【００５６】
配向制御光１１７による外力は、配向制御光１１７が第３の複合体２２に当たって散乱する際の反作用として生じるものである。第３の複合体２２は、図１（Ｃ）に示したように、形状に異方性を有した複合体となっている。従って、配向制御光１１７第３の複合体２２に当たった場合、配向制御光１１７に対する反作用がより小さくなるように第３の複合体２２は回動する。その結果、第３の複合体２２の長軸方向と配向制御光１１７の振動方向とが平行となる。この平行関係となったときがエネルギー的に最も安定した状態であるため、第３の複合体２２の回動はここで停止する。換言すると、第３の複合体２２は、配向制御光１１７が照射されていないときは溶液中でランダムな方向を向いて分散しているが、配向制御光１１７が照射されると回動し、長軸方向が配向制御光１１７の振動方向と平行になる位置で停止する。一方、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状に異方性を有しないため、配向されない。
【００５７】
偏光方向制御部１２０は、配向制御光１１７の振動方向を切り替えることで、第３の複合体２２の配向方向を切り替える。偏光方向制御部１２０は、λ／２波長板を有する。λ／２波長板は、垂直な方向に振動する偏光の光路差を１／２波長変化させる機能を有する位相板であり、光の偏光面を回転操作するために用いられる。λ／２波長板の光学軸方向と平行な方向に直線偏光した光はλ／２波長板を素通りするが、λ／２波長板の光学軸方向と４５度の角度をなす方向に直線偏光した光は振動方向が９０度変化する。つまり、直線偏光した光に対するλ／２波長板の角度を切り替えることで、光を素通りさせる場合と、光の振動方向を９０度変化させる場合とを切り替えることができる。偏光方向制御部１２０は、ＦＧ１２２からの信号を受けてλ／２波長板を回転し、配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。換言すれば、配向制御光１１７の振動方向は、ＦＧ１２２が発生する電圧信号によって決まる。偏光方向制御部１２０は、ＦＧ１２２から０Ｖの信号が出力されている場合は配向制御光１１７を素通りさせ、ＦＧ１２２から５Ｖの信号が出力されている場合は配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。以下、ＦＧ１２２から配向制御部１２０へ出力される信号を配向制御信号という。
【００５８】
励起光源部１１８は、内部に備えた偏光子により直線偏光した励起光１１９を、試薬容器１０の底面から上方に向けて照射する光源である。励起光源部１１８は、励起光１１９を照射して励起光１１９と金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を発生させる。励起光１１９には、波長６３５ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いる。
【００５９】
ＦＧ１２２は、様々な周波数と波形をもった電圧信号を発生させることのできる装置である。ＦＧ１２２は、ＣＰＵ１３２から出力される命令を受けて、偏光方向制御部１２０、ロックインアンプ１２７およびサンプリングクロック発生部１３０へ電圧信号を出力する。
【００６０】
ＣＰＵ１３２は、ＦＧ１２２に対して出力する配向制御信号を指定することで、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の進行方向を切り替えるタイミングを制御する。
【００６１】
受光部１２４は、フィルタやフォトダイオード等によって構成される。受光部１２４は、試薬容器１０の下部に設けられ、試薬容器１０内の蛍光分子１４から発生する蛍光１２３を試薬容器１０の下部で受光し、アナログ電気信号に変換して増幅部１２６へ出力する。受光部１２４の内部のフィルタは、蛍光分子１４から発生する蛍光以外の波長の光をカットするフィルタである。
【００６２】
増幅部１２６は、受光部１２４から出力されるアナログ蛍光データを増幅してロックインアンプ１２７へ出力する。
【００６３】
ロックインアンプ１２７は、アナログ蛍光データを直流に周波数変換する。ロックインアンプ１２７には、ＦＧ１２２から参照信号である方形波が入力される。ロックインアンプ１２７は、増幅部１２６から出力されたアナログ蛍光データから、参照信号と等しい周波数成分の検出を行う。具体的には、ロックインアンプ１２７は、参照信号と等しい周波数成分のみを同期検波により直流信号に変換し、内部に設けられたローパスフィルタにより直流信号のみを通過させる。ロックインアンプ１２７は、直流信号をＡ／Ｄ変換部１２８へ出力する。
【００６４】
サンプリングクロック発生部１３０は、ＦＧ１２２から入力される電圧信号に基づいて、Ａ／Ｄ変換部１２８がアナログ蛍光データをサンプリングするタイミングを指定するサンプリングクロックをＡ／Ｄ変換部１２８に入力する。
【００６５】
Ａ／Ｄ変換部１２８は、サンプリングクロック発生部１３０から出力されるサンプリングクロックに基づいて、ロックインアンプ１２７から出力されたアナログ蛍光データのサンプリングを行い、デジタルデータに変換してＣＰＵ１３２へ出力する。
【００６６】
ＣＰＵ１３２は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ１３２は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、分注部１１４およびＦＧ１２２の動作の指示命令を行う。具体的には、配向制御用光源部１１６および励起光源部１１８のＯＮ、ＯＦＦ命令、分注部１１４に対して、使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令、ＦＧ１２２に対して、出力する信号波形の指示命令および出力命令を行う。
【００６７】
図６Ａ〜図６Ｃは、配向制御光１１７の振動方向に対する第３の複合体２２の配向方向を表した図である。これらの図を用いて配向制御光１１７の振動方向が変化した場合における第３の複合体２２の配向方向の変化について説明する。なお、図６Ａ〜図６Ｃにおいては、第１の複合体２０ａを省略して描いてある。
【００６８】
図６Ａは、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７を素通りさせた場合における第３の複合体２２の配向方向を示す図である。配向制御信号が０Ｖであり、紙面上下方向に振動している配向制御光１１７が偏光方向制御部１２０を素通りして試薬容器１０に入射すると、第３の複合体２２は、長軸方向を配向制御光１１７の振動方向と同一方向に向けて配向する。一方、血漿１６内に混在している第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状が等方的なため配向しない。
【００６９】
図６Ｂは、配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替え、配向制御光１１７の振動方向が紙面に垂直な方向に変化した場合における第３の複合体２２の挙動を示す図である。配向制御信号が０Ｖから５Ｖに変化すると、偏光方向制御部１２０は、配向制御光１１７の振動方向を紙面上下方向から紙面に垂直な方向に切り替える。紙面に垂直な方向に振動する配向制御光１１７が試薬容器１０に入射すると、第３の複合体２２は、長軸方向が配向制御光１１７の振動方向と平行となるように回転運動を行う。一方、血漿１６内に混在している第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状が等方的なため回転運動も行わない。
【００７０】
図６Ｃは、ＦＧ１２２から５Ｖの信号が出力され、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を９０度変化させた場合における第３の複合体２２の配向方向を示す図である。この場合においても、第３の複合体２２は、長軸方向を配向制御光１１７の振動方向と同一方向に向けて配向する。一方、血漿１６内に混在している第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状が等方的なため配向しない。
【００７１】
このように生体分子検出装置１００は、ＦＧ１２２から配向制御信号を出力することにより偏光方向制御部１２０が有するλ／２波長板の向きを切り替えることで、配向制御光１１７の振動方向、すなわち第３の複合体２２の配向方向を、角度が９０度異なる２つの方向に切り替えることができる。
【００７２】
図７は、配向制御光１１７の焦点の位置を示す図である。配向制御光１１７は、レンズ１０８に入射し、血漿１６と試薬容器１０の内壁面１０ａとの界面において焦点１１７ａを結ぶ。配向制御光の焦点の位置は、配向制御光が最も強い力で第３の複合体２２を配向させる。従って、図６Ａ〜図６Ｃのように配向制御光を入射させると、配向制御光１１７は、焦点１１７ａの位置において第３の複合体を内壁面１０ａに押しつけつつ、より効率的に第３の複合体２２を配向させることができる。配向制御光１１７の振動方向を回動させることで、第３の複合体２２の配向方向を焦点１１７ａの位置において変化させることができる。なお、図６Ａ〜図６Ｃにおいては、説明を分かりやすくするために第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２を内壁面１０ａと離れた位置において示した。なお、試薬保持部は必ずしも四角柱状の形状を有している必要はなく、少なくとも一部に平面を有していれば同様の効果が得られる。すなわち、その平面と溶液との界面において焦点を結ぶように配向制御光を照射すれば第３の複合体は横に移動して配向制御光の外に出ることがなく、平面に押しつけられて配向される。
【００７３】
図８（Ａ）および図８（Ｂ）は、第３の複合体２２の配向方向に対する励起光１１９の振動方向を示す図である。
【００７４】
図８（Ａ）は偏光方向制御部が配向制御光を素通りさせた場合における第３の複合体の配向方向と励起光の振動方向との関係を示す図である。図８（Ａ）に示す試薬容器１０の側面図に対し、励起光１１９は紙面に垂直な方向に振動しながら紙面上方に向かって進行して血漿１６中に入射する。図８（Ａ）に示す試薬容器１０の上面図に対しては、励起光１１９の振動方向は紙面の上下方向となる。この場合、励起光１１９の振動方向と第３の複合体２２の配向方向との関係は、図３Ｂと同様になる。従って、励起光１１９と第３の複合体２２との表面プラズモン共鳴により発生する電場の強度は図３Ｂと同様になる。
【００７５】
図８（Ｂ）は、配向制御光の振動方向を９０度切り替えた場合における第３の複合体の配向方向と励起光の振動方向との関係を示す図である。図８（Ｂ）においても、試薬容器１０の側面図に対し、励起光１１９は紙面に垂直な方向に振動しながら紙面上方に向かって進行して血漿１６中に入射する。図８（Ｂ）に示す試薬容器１０の上面図に対しても、励起光１１９の振動方向は紙面の上下方向となる。この場合、励起光１１９の振動方向と第３の複合体２２の配向方向との関係は、図３Ｃと同様になる。従って、励起光１１９と第３の複合体２２との表面プラズモン共鳴により発生する電場の強度は図３Ｃと同様になる。そのため、配向制御信号が０Ｖから５Ｖに変化すると、第３の複合体２２から発生する蛍光の量が増加する。一方、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂから発生する蛍光の量は、配向制御信号に依らず一定である。なお、図８（Ａ）〜図８（Ｂ）においても、説明を分かりやすくするために第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２を内壁面１０ａと離れた位置において示した。
【００７６】
このように生体分子検出装置１００は、第３の複合体２２の配向方向を配向制御信号に同期して変化させ、第３の複合体２２から発生する蛍光強度を配向制御信号に同期して変化させる。ロックインアンプ１２７に入力する参照信号の周期を配向制御信号と同一のものとすれば、血漿１６全体から発生する蛍光から、第３の複合体２２から発生する蛍光の寄与分を検出することができる。
【００７７】
測定の際にＦＧ１２２が出力する配向制御信号、測定の際に受光部１２４が出力する受光部出力および測定の際にロックインアンプ１２７が出力するロックインアンプ出力の例を図９に示す。なお、ここでは説明を容易にするため、受光部出力およびロックインアンプ出力については、グラフを模式的に示してある。
【００７８】
ＦＧ１２２から出力される配向制御信号は、測定前は０Ｖとなっている。配向制御信号は、０〜Ｔ（秒）までの間は５Ｖの信号を出力し、Ｔ〜２Ｔ（秒）までの間は０Ｖの信号を出力する周期２Ｔの方形波である。
【００７９】
生体分子検出装置１００は、時刻Ｔ１で配向制御信号を５Ｖにすると共に、励起光を試薬容器１０に向けて照射する。配向制御信号を５Ｖとすると、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を切り替える。
【００８０】
時刻Ｔ１において励起光１１９が血漿１６に照射されると受光部出力はｉｚの値を出力する。受光部出力ｉｚは、血漿１６中に含まれる第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２が有する蛍光分子１４が発生する蛍光の総和である。
【００８１】
時刻Ｔ１において配向制御光１１７の振動方向が切り替わったことに伴い、第３の複合体２２の配向方向が切り替わり、第３の複合体２２が有する２つの金ナノ粒子８の間の電場が増強される。第３の複合体２２が有する２つの金ナノ粒子８の間の電場が増強されたことに伴い、受光部出力もｉｚから増加していく。血漿１６中の全ての第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了すると、受光部出力は値ｉｔで飽和する。
【００８２】
配向制御信号は、５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。このＴ秒は、少なくとも全ての第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了する以上の期間、すなわち受光部出力が値ｉｔで飽和をする以上の期間を取る。全ての第３の複合体２２の配向の切り替えが完了し、時刻Ｔ２になると配向制御信号が５Ｖから０Ｖに変わる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに変わると、第３の複合体２２の配向方向が切り替わり、第３の複合体２２が有する２つの金ナノ粒子８の間の電場が弱くなる。そのため、受光部出力は徐々に減少してｉｚとなる。
【００８３】
時刻Ｔ２から時間Ｔが経過し、時刻Ｔ３で再び配向制御信号が５Ｖとなると、受光部出力も増加して値ｉｔで飽和する。ここで、配向制御信号を０Ｖとする期間は、配向制御信号を５Ｖとしていた期間と同じＴ秒とした。これは、配向制御光１１７の出力が一定という条件下では、血漿１６中の第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了するまでに要する時間は、配向制御信号を０Ｖから５Ｖとした場合と、配向制御信号を５Ｖから０Ｖにした場合とで、ほぼ同じ時間がかかるためである。
【００８４】
時刻Ｔ３から時間Ｔが経過し、時刻Ｔ４で配向制御信号が０Ｖとなることに伴い、受光部出力も減少して値ｉｚとなる。なお、配向制御信号の１周期は２Ｔであるため、Ｔ４−Ｔ３＝Ｔ３−Ｔ２＝Ｔ２−Ｔ１＝Ｔである。つまり、受光部出力は配向制御信号と同様に周期２Ｔで値の増減を繰り返す周期的な出力となる。
【００８５】
ロックインアンプ１２７は、入力された信号から参照信号と同期して増減する成分を検出する。生体分子検出装置１００では、配向制御信号と同じ周期を有する信号が参照信号としてロックインアンプ１２７に入力されている。すなわち、ロックインアンプ１２７は、受光部出力から配向制御信号に同期した成分を検出する。受光部出力は、配向制御信号と同様に周期２Ｔの周期的な信号であるが、受光部出力の周期的な成分に寄与しているものは、配向制御信号により配向される第３の複合体２２に付随した蛍光分子１４である。従って、ロックインアンプ１２７により、配向制御信号と同期した成分を検出すると、受光部出力の中から第３の複合体２２による寄与分を検出することができる。ロックインアンプ出力は、当初は増減を繰り返す不安定な出力であるが、徐々に値Ｓに収束する。値Ｓは、血漿１６中の全ての第３の複合体２２に付随した蛍光分子１４が発生した蛍光に基づく受光部出力である。
【００８６】
ＣＰＵ１３２は、ロックインアンプ出力Ｓから検出対象物質の濃度Ｃを算出する。具体的には、次式（１）によって求める。
Ｃ＝ｆ（Ｓ）・・・（１）
【００８７】
ここで、ｆ（Ｓ）は、検量線関数である。生体分子検出装置１００は、あらかじめ測定項目ごとに異なる検量線関数を持っておき、測定値Ｓを診断値Ｃに変換する。ＣＰＵ１３２は、得られた診断値Ｃを表示部１０２へ出力する。
【００８８】
以上説明したように、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００によれば、配向制御光１１７の振動方向の切り替えにより、血漿１６内に存在する第３の複合体２２の配向方向を切り替えることが可能な構成とした。配向制御光１１７による第３の複合体２２の配向方向は、表面プラズモン共鳴により第３の複合体２２が有する２つの金ナノ粒子８の間に発生する電場の強度が大きく異なる２つの方向である。そのため、第３の複合体２２の配向方向の変化により、第３の複合体２２から発生する蛍光の強度は大きく異なる。そして、第３の複合体２２の配向方向を周期的に変化させながら表面プラズモン共鳴を起こさせ、血漿１６から発生した全蛍光量から第３の複合体の配向方向が変化する周期と同期する成分をロックインアンプ１２７によって検出するため、配向制御光１１７により配向される第３の複合体に付随した蛍光の寄与分を算出することができ、簡便な構成で検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
【００８９】
また、以上の構成において、生体分子検出装置１００は、配向制御光１１７による外力によって、第３の複合体２２の配向を全て同一方向に制御するため、ブラウン運動というランダムな運動を利用して測定する場合に比べて、高感度な測定をすることができる。
【００９０】
また、配向制御信号を５Ｖと０Ｖとの間で切り替える際の時間間隔は、第３の複合体２２の質量や体積、溶媒の粘度、溶液の温度等に基づいて変化させることが望ましい。すなわち、配向制御光の振動方向の切り替わりにより第３の複合体２２が配向方向が変化し始め、その変化が完了するまでに要する時間は、第３の複合体２２の体積、溶媒の粘度、溶液の温度、溶液中における第３の複合体２２の回転しやすさ等によって決まる。例えば、検体の粘度が高い場合等、第３の複合体２２が溶液中で回転しにくい場合は、第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了するまでに要する時間が長くなるため、配向制御信号を５Ｖまたは０Ｖとする期間を、第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了する程度まで長くすることが望ましい。ここで、第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了するまでに要する時間は、受光部出力に基づいて決定することができる。例えば、図９においては、受光部出力が最大値となった時刻Ｔ２から初めに配向制御信号を５Ｖにした時刻Ｔ１を減算すること、すなわちＴ２−Ｔ１を行うことにより、第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了するまでに要する時間を求めることができる。
【００９１】
また、本実施の形態では、配向制御光１１７として波長９０９ｎｍ、出力７００ｍＷのレーザー用いたが、配向制御光１１７はこのレーザーに限られない。配向制御光１１７の波長および出力強度は、第３の複合体２２の体積、質量等、これらに起因する溶液中での回転しやすさに基づいて決定することが望ましい。配向制御光１１７の波長は、第３の複合体２２蛍光測定に影響を与えない波長であれば何でも良い。また、配向制御光１１７の出力は、第３の複合体２２等の複合体に悪影響を与えない程度の出力とすることが望ましい。また、配向制御光１１７は、必ずしも第３の複合体を配向させる程度の出力である必要はない。第３の複合体および第６の複合体は、溶液中でブラウン運動をしており、配向方向を切り替えていない場合においても発生する蛍光の強度は変化している。第３の複合体または第６の複合体が配向しない程度の強度の配向制御光１１７を照射すると、第３の複合体または第６の複合体は、ブラウン運動を阻害される。
【００９２】
また、本実施の形態では、励起光１１９として波長６３５ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いたが、励起光１１９に用いる光はこの光に限られない。励起光１１９の波長は、金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を起こす波長であれば良いが、蛍光分子１４を直接励起しない波長帯の光を用いることが望ましい。また、励起光１１９の出力は、金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を起こし、発生した電場によって発生する蛍光が受光部１２４によって検出可能な程度の強度となる出力以上であれば何でも良い。一方、第３の複合体２２等に悪影響を与えない程度の出力であることが望ましい。また、励起光源部１１８は、ランプと干渉フィルタの組み合わせによって構成しても良い。
【００９３】
なお、実施の形態１においては、第１の複合体２０ａは、第１の抗体１２ａ、蛍光分子１４およびＢＳＡ２４が金属消光防止膜の表面全体に偏りなく結合している構造であったが、第１の複合体は必ずしもこのような構造である必要はない。また、第２の複合体も必ずしも実施の形態１で説明したような構造である必要はない。同様に、第１の複合体および第２の複合体が検出対象物質と結合して生成される第３の複合体も必ずしも実施の形態１で説明したような構造である必要は無い。
【００９４】
図１０（Ａ）は、第１の複合体の別の構造を示す模式図である。第１の複合体２６ａは、金ナノ粒子８全体に偏りなく結合したＢＳＡ２４と、金ナノ粒子８に単独で結合された第１の抗体１２ａと、第１の抗体１２ａに結合された複数の蛍光分子１４とによって構成される。このように蛍光分子が標識された抗体を蛍光色素標識抗体という。第１の複合体２６ａと第１の複合体２０ａとの違いは、金ナノ粒子８に結合されている第１の抗体１２ａが単数であること、蛍光分子１４が第１の抗体１２ａに結合されていること、および金ナノ粒子８上に金属消光防止膜が設けられていないことである。抗体に蛍光色素を標識することで、金ナノ粒子と蛍光色素の間の距離を数ｎｍ〜１５ｎｍ程度離すことができるため、抗体に標識されている蛍光色素の一部については金属消光が防止され、ＳｉＯ２シェルのような特別な構造を有する粒子を用いる必要がないというメリットがある。
【００９５】
このような構造を作成するため、金ナノ粒子８と蛍光色素標識抗体とを結合させる際は、金ナノ粒子８の数と蛍光色素標識抗体の数をほぼ同数混合する。すると、蛍光色素標識抗体は、金ナノ粒子８に単数のみ結合する。
【００９６】
図１０（Ｂ）は、第２の複合体の別の構造を示す模式図である。第２の複合体２６ｂは、金ナノ粒子８と、金ナノ粒子８の表面全体に偏りなく結合したＢＳＡ２４と、金ナノ粒子８に単独で結合された第２の抗体１２ｂと、第２の抗体１２ｂに結合された複数の蛍光分子１４とによって構成される。第１の複合体２６ｂと第１の複合体２０ｂとの違いは、金ナノ粒子８に結合されている第２の抗体１２ｂが単数であること、蛍光分子１４が第２の抗体１２ｂに結合されていること、および金ナノ粒子８上に金属消光防止膜が設けられていないことである。
【００９７】
第１の複合体２６ａおよび第２の複合体２６ｂは、通常の抗体の代わりに蛍光標識抗体を用いて、金ナノ粒子８として、アビジン標識された直径２０ｎｍの金ナノ粒子であるＮａｎｏｐａｒｔｓ社の２０−ＰＮ―２０を用いれば、第１の複合体２０ａと同様の手順により作成することができる。蛍光標識抗体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社のＡｌｅｘａたんぱく質標識キットを用いて作成する。
【００９８】
図１０（Ｃ）は、第３の複合体の別の構造を示す模式図である。第１の複合体２６ａおよび第２の複合体２６ｂが抗原１８に結合すると、第３の複合体２８が生成される。第１の複合体２６ａおよび第２の複合体２６ｂの蛍光分子１４は、それぞれ第１の抗体１２ａまたは第２の抗体１２ｂに結合されているため、第３の複合体２８においては、第１の複合体２６ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体２６ｂが有する金ナノ粒子８との間にのみ蛍光分子１４が存在することになる。
【００９９】
このような構造の第３の複合体２８は、第３の複合体２２に比べ蛍光分子１４の絶対量は減少する。そのため、単一の第３の複合体が発生する蛍光の量も減少する。しかし、表面プラズモン共鳴に伴って発生する電場は、図３Ｂ、図３Ｃに示したように第３の複合体の配向方向の変化により、主に第１の複合体が有する金ナノ粒子８と第２の複合体が有する金ナノ粒子８との間において強度が変化する。すなわち、第３の複合体２８が有する蛍光分子１４は、第３の複合体２８の配向方向の変化に伴い電場の強度が変わる位置にのみ存在する。そのため、このような構成の第１の複合体２６ａおよび第２の複合体２６ｂを用いて実施の形態１と同様の測定を行うと、第３の複合体２８からは、表面プラズモン共鳴に伴って発生する電場の強度を反映した強さの蛍光のみが発生する。つまり、第３の複合体２８の配向方向の変化が、より蛍光の強度に的確に反映されるため、測定の精度を向上させることができる。
【０１００】
また、配向方向の変化に伴い電場の強度が変わる位置にのみ蛍光分子が存在する第３の複合体を形成する第１の複合体および第２の複合体の別の例を図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示す。図１１（Ａ）は、第１の複合体の別の構造を示す模式図である。第１の複合体３２ａは、金ナノロッド３０と、金ナノロッド３０の表面全体に偏りなく結合したＢＳＡ２４と、金ナノロッド３０に単独で結合された第１の抗体１２ａと、第１の抗体１２ａに結合された複数の蛍光分子１４とによって構成される。第１の複合体３２ａと第１の複合体２６ａとの違いは、金ナノ粒子８の代わりに金ナノロッド３０を用いたことである。金ナノロッド３０は、柱状の形状を有する金ナノ粒子である。金ナノロッド３０は、短軸１０ｎｍ、長軸５０ｎｍ程度の大きさのものを使用する。
【０１０１】
図１１（Ｂ）は、第２の複合体の別の構造を示す模式図である。第２の複合体３２ｂは、金ナノロッド３０と、金ナノロッド３０の表面全体に偏りなく結合したＢＳＡ２４と、金ナノロッド３０に単独で結合された第２の抗体１２ｂと、第２の抗体１２ｂに結合された複数の蛍光分子１４とによって構成される。第２の複合体３２ｂと第２の複合体２６ｂとの違いは、金ナノ粒子８の代わりに金ナノロッド３０を用いたことである。
【０１０２】
第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂは、通常の抗体の代わりに蛍光標識抗体を用いて、金ナノ粒子の代わりにアビジン標識された金ナノロッドを用いれば、第１の複合体２０ａと同様の手順により作成することができる。
【０１０３】
図１１（Ｃ）は、第３の複合体の別の構造を示す模式図である。第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂが抗原１８に結合すると、第３の複合体３４が生成される。第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂの蛍光分子１４は、それぞれ第１の抗体１２ａまたは第２の抗体１２ｂに結合されているため、第３の複合体３２においてに、第１の複合体３２ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体３２ｂが有する金ナノ粒子８との間にのみ蛍光分子１４が存在することになる。このような構成の第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂを用いて実施の形態１と同様の測定を行っても、第１の複合体２８ａおよび第２の複合体２８ｂを用いて測定を行った場合と同様に、測定の精度を向上させることができる。また、このような構成の第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂを用いても、蛍光分子１４が金ナノロッド３０の表面から十分離れるため、金ナノロッド３０に金属消光防止膜等をもうけることなく金属消光を防止することができる。
【０１０４】
（実施の形態２）
実施の形態２では、４種類の複合体を使用し、均一溶液中で検出対象物質である特定の２種類の抗原を検出する。４種類の複合体の内２種類は、実施の形態１で示した第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂと同一のものであるため説明を省略する。本実施の形態で使用する残りの２種類の複合体である第４の複合体および第５の複合体について説明する。
【０１０５】
図１２（Ａ）は、第４の複合体２０ｃの模式図である。第４の複合体２０ｃは、直径が２０ｎｍの略球形の金ナノ粒子８の表面全体をＳｉＯ２からなる厚み１０ｎｍの金属消光防止膜で覆い、金属消光防止膜の表面複数の第３の抗体１２ｃと複数の蛍光分子３６と複数のＢＳＡ２４とが結合されている。第３の抗体１２ｃ、蛍光分子３６およびＢＳＡ２４は、第４の複合体２０ｃが有する金属消光防止膜の表面全体に偏りなく結合している。すなわち、第４の複合体２０ｃは、第１の複合体２０ａと比べ、抗体と蛍光分子の種類が異なる。
【０１０６】
図１２（Ｂ）は、本発明の実施の形態１において使用する第５の複合体２０ｄの模式図である。第５の複合体２０ｄは、直径が２０ｎｍの金ナノ粒子８の表面全体をＳｉＯ２からなる厚み１０ｎｍの金属消光防止膜で覆い、金属消光防止膜の表面に複数の第４の抗体１２ｄと複数の蛍光分子３６と複数のＢＳＡ２４とが結合されている。第４の抗体１２ｄ蛍光分子３６およびＢＳＡ２４は、第５の複合体２０ｄが有する金属消光防止膜の表面全体に偏りなく結合している。すなわち、第５の複合体２０ｄは、第１の複合体２０ａと比べ、抗体と蛍光分子の種類が異なる。このように、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄは、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂと同様に等方的な形状を有する。
【０１０７】
第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは、検出対象物質である抗原の特定部位と反応し、それぞれ異なる位置に結合する抗体である。本実施の形態においては、第３の抗体１２ｃとしてＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社のＭＡＢ４１２８（Ｈｕｍａｎ ＣＥＡＣＡＭ-５  Ａｎｔiｂｏｄｙ）を用い、第４の抗体１２ｄとしてＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社のＭＡＢ４１２８（Ｈｕｍａｎ ＣＥＡＣＡＭ-５）を用いた。本実施の形態では、検出対象物質として血漿中のＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２タンパク質およびＣＥＡたんぱく質の２種類の抗原を検出する。以下では、検出対象物質であるＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２タンパク質を以下では抗原１８と呼び、検出対象物質であるＣＥＡたんぱく質を抗原４０と呼ぶ。本実施の形態で用いた第１の抗体１２ａ、第２の抗体１２ｂ、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは、いわゆるサンドイッチ法を行って抗原を検出するための抗体である。従って、これらの抗体は、抗原をそれぞれ異なるエピトープで認識して結合する。すなわち、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、抗原１８のそれぞれ異なる位置に特異的に結合する。第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは、抗原４０のそれぞれ異なる位置に特異的に結合する。また、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂならびに第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは、互いに立体障害とならないように抗原の立体構造上の遠い位置に結合する。なお、図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）における第３の抗体１２ｃと第４の抗体１２ｄの図は、それぞれ異なる凹凸形状を示すことにより、抗原の異なる位置に結合することを表しているが、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは必ずしもこのような形状をしているわけではない。
【０１０８】
蛍光分子３６には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７は、波長６７０ｎｍ程度にピークを持ち、６２０ｎｍ−７５０ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発光する。第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄは同種の蛍光分子３６を有する。第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄは、第１の複合体２０ａと同様の手順により作成する。
【０１０９】
図１２（Ｃ）は、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄの双方が抗原４０と結合した場合を示す図である。以下、この図のように第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄの双方が抗原４０に結合した複合体を第６の複合体３８と呼ぶ。図１２（Ｃ）においては、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄが抗原４０のそれぞれ異なる位置に特異的に結合することを示すため、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄのそれぞれの凹凸形状と合った凹凸形状を有する図により抗原４０を示している。そのため、実際の抗原１８は必ずしもこのような形状ではない。
第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは抗原４０に対してサンドイッチ法を行うための抗体であるため、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄの双方が抗原４０と結合した場合には、図１２（Ｃ）のように第４の複合体２０ｃと第５の複合体２０ｄが抗原４０を挟んで向かい合った位置に結合する。すなわち、第６の複合体３８においては、第４の複合体２０ｃ、抗原４０および第５の複合体２０ｄが直線上に並んだ構造となる。以下、第６の複合体３８において、第４の複合体２０ｃ、抗原４０および第５の複合体２０ｄが並んだ方向を長軸方向といい、長軸方向に垂直な方向を短軸方向という。第６の複合体３８において、第４の複合体２２ｃが有する金ナノ粒子８と第５の複合体２２ｄが有する金ナノ粒子８との距離は、約３０ｎｍとなる。
【０１１０】
図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）は、本実施の形態に係る生体分子検出装置における抗原抗体反応の概要を示した模式図である。図１３（Ａ）は抗原抗体反応前の状態を表す。図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）においては、外部に露出していない試薬保持部を破線によって示してある。試薬保持部の中には、乾燥した複数の第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄが入れられている。
【０１１１】
本実施の形態においても、実施の形態１と同様に検体は全血から分離した血漿１６である。試薬容器１０に血漿１６を分注して撹拌すると、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂと特異的に結合する抗原１８が血漿１６中に存在する場合は、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂと抗原１８との間で抗原抗体反応が起こり、図２（Ｂ）に示すように第３の複合体２２が形成される。また、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄと特異的に結合する抗原４０が血漿１６中に存在する場合は、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄと抗原４０との間で抗原抗体反応が起こり、図２（Ｂ）に示すように第６の複合体３８が形成される。
【０１１２】
図示しないが、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄは抗原１８および抗原４０に対して十分に多い量が入れられているため、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄの一部は、抗原抗体反応をしないまま血漿１６内に残る。すなわち、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄと混合された血漿１６内には第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第３の複合体２２、第４の複合体２０ｃ、第５の複合体２０ｄおよび第６の複合体３８が混在している。
なお、血漿１６中には抗原１８および抗原４０以外の成分も存在するが、説明を簡単にするため、図１３（Ａ）および（Ｂ）においては抗原１８および抗原４０以外の成分は省略して示してある。
【０１１３】
本実施の形態に係る生体分子検出装置２００は、液相であることにより第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第３の複合体２２、第４の複合体２０ｃ、第５の複合体２０ｄおよび第６の複合体３８が混在している血漿１６に対して励起光を照射し、励起光と金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を発生させ、表面プラズモン共鳴により発生する電場によって蛍光分子１４および蛍光分子３６を発光させ、当該血漿１６内から発生する蛍光を測定することにより抗原１８または抗原４０の検出および定量を行う。
【０１１４】
図１４は、生体分子検出装置２００の主要な構成を説明するための機能ブロック図である。なお、実施の形態１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。生体分子検出装置２００は、生体分子検出装置１００の構成に対して、ＣＰＵ２０２および受光部２０４が主に異なる。
【０１１５】
ＣＰＵ２０２は、Ａ／Ｄ変換部１２８から送られたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ２０２は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、分注部１１４、ＦＧ１２２および受光部２０４の動作の指示命令を行う。具体的には、配向制御用光源部１１６および励起光源部１１８のＯＮ、ＯＦＦ命令、分注部１１４に対して、使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令、ＦＧ１２２に対して、出力する信号波形の指示命令および出力命令、受光部２０４に対して、フィルタの切り替え命令を行う。
【０１１６】
受光部２０４は、試薬容器１０内の蛍光分子から発生した蛍光を検出する受光部である。受光部２０４は、ＣＰＵ２０８からの命令（Ｓ１）を受けて、蛍光分子１４と蛍光分子３６との蛍光を分離して受光できるように構成されている。
【０１１７】
受光部２０４の構成について、図１５を用いて具体的に説明する。図１５は、実施の形態２に係る生体分子検出装置２００における受光部２０４の詳細な構成を表した模式図である。受光部２０４は、レンズ２０６、レンズ２１６、フィルタ切り替え部２０８および偏光子２１４を有する。試薬容器１０内の蛍光分子１４および蛍光分子３６から発生した蛍光は、レンズ２０６によって集光され、フィルタ切り替え部２０８、偏光子２１４およびレンズ２１６を通ってフォトダイオード２１８へ入射する。
【０１１８】
フィルタ切替部２０８は、フィルタ２１０およびフィルタ２１２の２種類のフィルタを備えている。２種類のフィルタは可動式となっており、レンズ２０６によって集光された蛍光が通過するフィルタを切り替えることができる。フィルタ切替部２０８は、ＣＰＵ２０２からの命令Ｓ１を受けて、蛍光が通過するフィルタを切り替える。
【０１１９】
フィルタ２１０は、蛍光分子１４が発生する波長帯の光のみを透過するバンドパスフィルタである。フィルタ２１２は、蛍光分子３６が発生する波長帯の光のみを透過するバンドパスフィルタである。フィルタ切り替え部２０８はＣＰＵ２０２からの命令Ｓ１に従い、抗原１８の測定を行う際はフィルタ２１０を蛍光の光路に位置させて測定を行い、抗原４０の測定を行う際はフィルタ２１２を蛍光の光路に位置させて測定を行う。このような構成により、受光部２０４は、検出対象物質を含む複合体以外から発生する光がフォトダイオード２１８に到達することを防いでいる。なお、必ずしもフィルタを用いる必要はなく、例えば回折格子等を用いて分光してもよい。
【０１２０】
偏光子２１４は、励起光１１９の偏光方向と同じ方向に偏光した光のみを透過する。試薬容器１０内で散乱された励起光１１９や配向方向を切り替えている途中の蛍光分子１４または蛍光分子３６から発光した蛍光は、偏光方向が元々の励起光の偏光方向と異なっているため偏光子１４６を透過できない。
【０１２１】
ＰＤ２１８は、ＡＰＤ（Ａｖａｌａｎｃｈｅ  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）によって構成され、レンズ２１６によって集光された蛍光を受光し、蛍光の強度に応じた電荷を発生させて増幅部１２６へ出力する。
【０１２２】
続いて生体分子検出装置２００の測定動作について説明する。生体分子検出装置２００の測定動作は、基本的には実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の測定動作と同じであるが、細かな点で異なる。検出対象物質を含む複合体から発生する蛍光のみを分離可能な理由については実施の形態１で説明したため、ここでは２種類の検出対象物質をそれぞれ含む第３の複合体２２と第６の複合体３８とを分離して検出する方法を説明する。
【０１２３】
生体分子検出装置２００は、まず抗原１８または抗原４０のどちらを先に検出するか決定する。これは、ユーザーが、ユーザー入力部１０４を通して入力する等して任意に決定することができる。ここでは、抗原１８を有する第３の複合体２２から先に検出する。ＣＰＵ２０２は、受光部２０４内のフィルタ切替部２０８に、フィルタ２１０の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２０８は、ＣＰＵ２０２からの命令を受け、レンズ２０６により集光された光が通る位置にフィルタ２１０を移動させる。配向制御信号が５Ｖに変わり、試薬容器１０に向けて励起光１１９が照射されると、溶液内の蛍光分子１４および蛍光分子３６は、蛍光を発生する。蛍光分子１４および蛍光分子３６から発生した蛍光は、レンズ２０６によって集光され、フィルタ２１０へ入射する。フィルタ２１０は、蛍光分子１４が発生するの波長帯の光のみを透過するため、蛍光分子３６から発生した蛍光は、ほぼ全て遮断する。このようにして受光部２０４は、蛍光分子１４から発生した蛍光のみを検出することができる。
【０１２４】
実施の形態１と同様に、生体分子検出装置２００によって配向制御信号の数周期分の測定を行い、蛍光分子１４から発生した蛍光の検出を行った結果の受光部出力を、図１６Ａに示す。受光部出力は、配向制御信号と同じ周期を有する信号を出力する。ロックインアンプは、受光部出力の中から配向制御信号に同期した成分を検出して、値Ｓ１を出力する。
【０１２５】
続いて、ＣＰＵ２０２は、得られた値Ｓ１から、抗原１８の濃度を算出する。具体的には、実施の形態１と同様に検量線関数ｆ１（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ１から濃度Ｃ１に変換する。ＣＰＵ２０２は、得られた濃度Ｃ１を表示部１０２へ出力する。
【０１２６】
次に、生体分子検出装置２００は、抗原４０を有する第６の複合体３８の測定を行う。ＣＰＵ２０２は、受光部２０４内のフィルタ切替部２０８に、フィルタ２１２の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２０８は、ＣＰＵ２０２からの命令を受け、レンズ２０６で集光された光が通る位置にフィルタ２１２を移動させる。フィルタ２１２は、蛍光分子３６が発生するの波長帯の光のみを透過するため、蛍光分子１４から発生した蛍光は、ほぼ全て遮断する。このようにして、受光部２０４は、蛍光分子３６から発生した蛍光のみを検出することができる。
【０１２７】
生体分子検出装置２００によって配向制御信号の数周期分の測定を行い、蛍光分子３６から発生した蛍光の検出を行った結果の受光部出力を、図１６Ｂに示す。なお、図１６Ａおよび図１６Ｂにおいては、計算を容易にするためグラフを模式的に示してある。受光部出力は、配向制御信号と同じ周期を有する信号を出力する。
【０１２８】
第６の複合体３８を測定する場合の配向制御信号の切り替えタイミングは、第３の複合体２２を測定する場合と異なる。これは、第３の複合体２２および第６の複合体３８の体積および質量が異なるため、それぞれの複合体が配向を完了するまでに要する時間が異なるためである。
【０１２９】
図１６Ａおよび図１６Ｂに示したように、第３の複合体２２を測定する場合と、第６の複合体３８を測定する場合とでは、受光部出力の最大値および最小値は異なる。これは、第３の複合体２２と第６の複合体３８との溶液中での濃度の違いに起因する。
【０１３０】
続いて、ＣＰＵ２０２は、得られた値Ｓ２から抗原４０の濃度を求める。具体的には、検量線関数ｆ２（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ２から濃度Ｃ２に変換する。ＣＰＵ２０２は、得られた濃度Ｃ２を表示部１０２へ出力する。
【０１３１】
以上説明したように、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００によれば、実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の構成に加え、検出対象物質と特異的に結合する物質として４種類の複合体および２種類の蛍光分子を用い、フィルタ切替部２０８を２種類のフィルタの切り替えが可能な構成とした。そのため、検出対象物質を含む複合体に付随した蛍光分子に対応したフィルタを使用することで、検出対象物質を含む複合体に付随した蛍光分子から発生する蛍光のみを検出することができ、一の検体に含まれる２種類の検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
【０１３２】
なお、本実施の形態では、蛍光分子としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７を使用したが、使用する蛍光分子はこれらに限られない。複数の検出対象物質のそれぞれ特異的に結合する複合体を、それぞれ異なった蛍光分子で標識し、フィルタで分離できる程度にそれぞれの蛍光波長、励起波長または蛍光寿命が離れている蛍光分子を用いれば良い。
【０１３３】
また、本実施の形態では検出対象物質が２種類の場合について説明したが、検出対象物質は、それより多くても良い。その場合においても、それぞれの検出対象物質と特異的に結合する２種類の複合体でサンドイッチ法を行い、それぞれ異なった蛍光分子で標識し、それぞれの蛍光分子から発生する蛍光を、それぞれの蛍光に対応したフィルタで分離して検出することで、それぞれの検出対象物質を分離して検出することができる。
【０１３４】
なお、検出対象物質が増えるほど蛍光分子の種類も増え、複数の蛍光分子から発生する蛍光が混在することになるため、より狭い通過帯域を持つバンドパスフィルタを用いることで、目的の蛍光分子が発生する蛍光を検出しやすくすることができる。
【０１３５】
なお、溶液中の第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向の切り替えはレーザーによるものに限られず、それらの複合体を配向できれば、磁気的な方法や電気的な方法としても良い。
【０１３６】
光により分子の配向制御を行うと、磁力等によって分子の配向を制御する場合に比べ複雑な機構が必要ない。例えば、磁力を用いて分子の配向を制御するためには、それぞれの分子が磁性を持ったものであるか、磁性を持った分子を用意して、配向を制御したい分子に結合させる必要があり、測定にあたって準備が煩雑となる。
【０１３７】
また、第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向方向は、必ずしもλ／２波長板によって切り替える必要はない。例えば、配向制御光１１７の振動方向を切り替える代わりに、配向制御光１１７の照射方向をＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｏ  Ｏｐｔｉｃ  Ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）により切り替えることで配向方向を切り替えても良い。また、配向制御光１１７の照射方向を切り替えることで配向方向を切り替える場合、配向制御光配向制御用光源部を複数設けて配向制御光を照射する方向を切り替えても良い。
【０１３８】
また、配向制御用光源部は必ずしも１つのみを設ける必要はなく、複数の配向制御用光源部を設けて、同一方向に複数の配向制御光を照射しても良い。例えば、図１７（試薬容器１０の側面図）に示すように、４２ａ〜４２ｉの９点にそれぞれ対応した９本の配向制御光を入射させるような態様でも良い。このように複数の位置から配向制御光を照射すると、配向制御光の偏光軸の中心に位置する第３の複合体２２または第６の複合体３８が増える。配向制御光の偏光軸の中心は、最も効率良く第３の複合体２２または第６の複合体３６を回動させることができる。なお、ここでは９点に配向制御光を入射させる例を示したが、配向制御光を入射させる点は９点に限られず、９点より多くても少なくても良い。配向制御光を細く絞るほど、多くの点に入射させることが望ましい。これにより、複数箇所で配向に同期して第３の複合体２２または第６の複合体３８を回動させることができる。その結果、突発的な蛍光強度の変動を低下させることができ、相対的な散らばりを表す指標である変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を改善させることができる。この場合においても、それぞれの配向制御光は試薬容器１０を出射する端面において焦点を結ぶように照射されることが望ましい。
【０１３９】
このように、配向制御光を多点に入射させるための配向制御用光源部の構造について図１８に示す。配向制御用光源部２３０は、３×３の２次元レーザーアレイである。配向制御用光源部２３０は、発光点４４ａ〜４４ｉの９点が発光する。発光点の大きさは縦が１μｍで横が１００μｍである。配向制御用光源部２３０を用いた光学系の例について図１９に示す。なお、図１９においては、配向制御光に係わる光学系以外は省略して示してある。
【０１４０】
配向制御用光源部２３０から照射された直線偏光した配向制御光２４０は、コリメータレンズ２３２を通って焦点において平行光線となる。コリメータレンズ２３２を通った配向制御光２４０は、ビームエキスパンダ２３４およびビームエキスパンダ２３６を通ってλ／２波長板を有する偏光方向制御部２３８へ入射する。ビームエキスパンダ２３４およびビームエキスパンダ２３６を通った配向制御光２４０は、特定の倍率の平行光束に広げられる。λ／２波長板は、回転ステージ上にあり回転可能となっている。これにより配向制御光２４０の偏光軸を回動することができる。λ／２波長板を透過した配向制御光２４０は、レンズ２４２により集光されて試薬容器１０の側面へ入射する。
【０１４１】
図１９に示す光学系において、コリメータレンズ２３２の焦点距離を３．１ｍｍ、レンズ２４２の焦点距離を４ｍｍとすると、倍率は１．２９倍となる。そのため、試薬容器１０の側面において、配向制御光２４０の大きさは約１．３μｍ×１３０μｍとなり、ピッチは約１２９μｍとなる。
【０１４２】
配向制御光を多点に入射させる別の光学系の例について図２０に示す。なお図２０においても、配向制御光の光学系以外は省略して描いてある。また、図１９と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
【０１４３】
図２０に示す光学系において、配向制御用光源部１１６は実施の形態１と同様のものである。配向制御光２４６は、コリメータレンズ４０６、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通り、マイクロレンズアレイ２４２へ入射する。マイクロレンズアレイ２４２は、図２１に示すように、複数のマイクロレンズ２４８を格子状に並べたものである。マイクロレンズアレイ２４８を通った配向制御光２４６は、複数の光源から照射された光のように、異なる位置で焦点を結ぶ複数の光束となる。配向制御光２４６は、ピンホールアレイ２４４によって絞られ、偏光方向制御部２３８を通り、レンズ２４２により集光されて試薬容器１０の側面へ入射する。このようにマイクロレンズアレイを用いても、配向制御光を多点に入射させることができる。
【０１４４】
また、実施の形態１のような配向制御光を照射する方向を変える光学系においては、配向光を多点に照射するために、光学系を複数段用意しても良い。例えば、同様の光学系を３段重ねれば、３つの配向制御用光源部から配向制御光が照射され、試薬容器１０へ３点から入射させることができる。このようにしても、配向制御光を多点から照射することができ、複数箇所で第３の複合体２２または第６の複合体３８を回動させることができる。
【０１４５】
また、本発明に係る各実施の形態では、配向制御光１１７の振動方向を２つの直交する方向の間で切り替えたが、必ずしも２つの直交する方向の間で切り替える必要はない。例えば、検出対象物質の検出のみを行いたい場合は、第３の複合体２２または第６の複合体３８から発生する蛍光の強度が変わる程度だけ異なる方向に第３の複合体２２または第６の複合体３８を配向させれば良い。
【０１４６】
配向制御光１１７の振動方向を２つの直交する方向の間で切り替えれば、第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向が完了するまでに要する時間が最大となって、最もＳ／Ｎが良くなる。一方で、例えば配向制御光１１７が進行する２つの方向の成す角度が６０度であれば、配向制御光１１７の進行方向が直交する場合と比べ、第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向の切り替えが完了するまでに要する時間が短くなり、測定に要する時間も短くなる。このように配向制御光１１７が進行する２つの方向の成す角度が９０度より小さいほど、第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向の切り替えが完了するまでに要する時間が短くなり、測定時間も短くなる。
【０１４７】
なお、上記各実施の形態では、生体分子検出装置内に試薬容器１０を１つ設ける場合を説明したが、必ずしも試薬容器１０は１つである必要はなく、装置内に複数の試薬容器を設けて複数の検体をセットできる構成としても良い。その場合は、装置が試薬容器を順に測定位置に移動させて測定を行う構成とすれば、自動で複数の検体を測定することができる。
【０１４８】
なお、上記各実施の形態では、既に生成された第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃまたは第５の複合体２０ｄを用いて測定を行ったが、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃまたは第５の複合体２０ｄの生成を試薬容器１０内で行っても良い。この場合、ユーザーは、金ナノ粒子、抗体および蛍光分子をそれぞれ別の試薬タンクに用意しておき、測定時に生体分子検出装置が、金ナノ粒子、抗体、蛍光分子および検体をそれぞれ試薬容器１０へ分注して、反応させる。
【０１４９】
なお、上記各実施の形態においては、励起光と表面プラズモン共鳴を起こす粒子として金のナノ粒子を用いたが、必ずしも金ナノ粒子である必要はない。例えば、銀ナノ粒子や、銅ナノ粒子を用いても良い。
【０１５０】
また、配向制御用光源部１１６や励起光源部１１８は、着脱可能な構成として、検出対象物質および蛍光分子等に応じて、適切なものに交換できるような構成としても良い。
【０１５１】
配向方向を切り替える時間間隔は、検出対象物質、第３の複合体２２、第６の複合体３８の質量または体積と、配向制御手段による外力の強度等に基づいて、全ての第３の複合体２２または第６の複合体３８が配向の切り替えを完了するまでに要する時間によって決定することが望ましい。すなわち、全ての第３の複合体２２または第６の複合体３８が配向の切り替えを完了するまでに要する時間毎に配向方向を切り替えることが望ましい。このように配向方向を切り替える時間を決定すれば、全ての第３の複合体２２または第６の複合体３８が配向を完了した後も同一方向に配向制御光１１７を照射することがなくなり、消費電力を削減することができる。また、不要な時まで測定を続けることがなくなり、測定時間を短くすることができる。
【０１５２】
全ての第３の複合体２２または第６の複合体３８が配向の切り替えを完了するまでに要する時間は、受光部出力やＡ／Ｄ変換部出力に基づいて求めてもよい。例えば、測定を何周期か繰り返せば、それぞれの出力が飽和するまでにどのくらいの時間を要するかおおよそ分かるため、それぞれの出力が飽和するまでに要する時間を加算平均等して、算出した時間を所定の時間間隔として決めれば良い。
【０１５３】
なお、本発明に係る各実施の形態では、検体として全血から分離した血漿を用いる場合を例にとって説明したが、検体は全血から分離した血漿に限られず、尿や唾液等、検出対象物質が溶液中に分散していれば検体とすることができる。
【０１５４】
なお、上記各実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と、検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、抗原、抗体に限られず、例えば、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定のＤＮＡを用いて当該ＤＮＡとハイブリダイゼーションをするＤＮＡを検出する場合、ＤＮＡを用いてＤＮＡ結合性たんぱく質を結合する場合、リガンドを用いてレセプターを検出する場合、糖を用いてレクチンを検出する場合、プロテアーゼ検出を利用する場合、高次構造変化を用いる場合等がある。検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質の組み合わせが、抗原と抗体以外の場合においても、検出対象物質の異なる部位に特異的に結合する２種類の物質と金属ナノ粒子とをそれぞれ結合させて第１の複合体および第２の複合体２を構成し、第１の複合体および第２の複合体と検出対象物質を結合させて第３の複合体を構成すれば、本実施の形態に係る生体分子検出装置により検出対象物質の濃度を測定することができる。
【０１５５】
また、本発明に係る各実施の形態では、抗原１８、抗原４０、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄが液体中に分散している液相で測定ができるため、抗体等を反応層に固定して測定を行う固相での測定に比べ、前処理が簡単であるという利点がある。また、これらの抗原や複合体が溶液中を自由に動き回ることができ、固相に比べて反応が早いという利点もある。
【０１５６】
また、本発明に係る各実施の形態は、従来の蛍光偏光法のようにブラウン運動の変化による蛍光の偏光度の変化を調べるものではないため、検体の成分が蛍光分子の蛍光寿命に影響を与えたとしても測定に与える影響は少ない。
【０１５７】
なお、以上説明した本発明に係る各実施の形態は、本発明の一例を示すものであり、本発明の構成を限定するものではない。本発明に係る生体分子検出装置は、上記各実施の形態に限定されず、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々変更して実施することが可能である。
【０１５８】
また、上記各実施の形態では試薬容器１０内の試薬保持部を四角柱状の形状としたが、試薬保持部は必ずしも四角柱状の形状とする必要は無く、円柱状の形状であっても良い。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明に係る生体分子検出装置および生体分子検出方法は、例えば、検出対象物質と、その検出対象物質に特異的に結合する物質との相互作用を利用して、検出対象物質の検出又は定量を行う装置に利用することができる。
【符号の説明】
【０１６０】
８  金ナノ粒子
１２ａ  第１の抗体
１２ｂ  第２の抗体
１４、３６  蛍光分子
１６  血漿
１８、４０  抗原
２０ａ、２６ａ、３２ａ  第１の複合体
２０ｂ、２６ｂ、３２ｂ  第２の複合体
２０ｃ  第４の複合体
２０ｄ  第５の複合体
２２、２８、３４  第３の複合体
２４  ＢＳＡ
３０  金ナノロッド
３８  第６の複合体
１００、２００  生体分子検出装置
１１６、２３０  配向制御用光源部
１１８  励起光源部
１２０、２３８  偏向方向制御部
１２４、２０４  受光部
２０８  フィルタ切替部
２１０、２１２  フィルタ
２１４  偏光子
２１８  フォトダイオード
【図４】
0005703098.tif 000002
【図５】
0005703098.tif 000003
【図７】
0005703098.tif 000004
【図９】
0005703098.tif 000005
【図１４】
0005703098.tif 000006
【図１６Ａ】
0005703098.tif 000007
【図１６Ｂ】
0005703098.tif 000008
【図１７】
0005703098.tif 000009
【図１８】
0005703098.tif 000010
【図１９】
0005703098.tif 000011
【図２０】
0005703098.tif 000012
【図２１】
0005703098.tif 000013
【図１】
0005703098.tif 000014
【図２】
0005703098.tif 000015
【図３Ａ】
0005703098.tif 000016
【図３Ｂ】
0005703098.tif 000017
【図３Ｃ】
0005703098.tif 000018
【図６Ａ】
0005703098.tif 000019
【図６Ｂ】
0005703098.tif 000020
【図６Ｃ】
0005703098.tif 000021
【図８】
0005703098.tif 000022
【図１０】
0005703098.tif 000023
【図１１】
0005703098.tif 000024
【図１２】
0005703098.tif 000025
【図１３】
0005703098.tif 000026
【図１５】
0005703098.tif 000027