(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の細胞を検出するための方法であって、
細胞濃縮剤、細胞抽出剤を含むヒドロゲル、及び細胞を含むことが疑われる液体試料を提供する工程と、
前記液体試料と前記細胞濃縮剤とを所定の時間にわたって接触させ、前記細胞濃縮剤を含む第１の混合物を形成する工程と、
前記細胞濃縮剤を含む前記第１の混合物の少なくとも一部から前記細胞濃縮剤を分離する工程と、
前記分離された細胞濃縮剤及び前記ヒドロゲルを含む第２の液体混合物を形成する工程であって、前記細胞抽出剤が前記ヒドロゲルから前記第２の液体混合物中に放出される、工程と、
前記第２の液体混合物中の生物学的検体を検出する工程と、を含み、
前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体を検出する工程が、前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量を定量することを含み、
前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量が第１の時点と第２の時点を含む２回以上の時点において定量され、
前記第１の時点が、第２の液体混合物を形成した直後であり、かつ試料中の生きた細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから放出される前であり、
前記第２の時点が、前記第１の時点の後に起こり、かつ分離された細胞濃縮剤がヒドロゲルと所定の時間にわたって接触させた後であり、
第１の時点において検出される前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量が、第２の時点において検出される前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量と比較され、
前記第１の時点と比較したときの、前記第２の時点において検出される前記生物学的検体の量の増加が、前記液体試料中に１又は複数の生きた細胞が存在することを示す、方法。
【請求項２】
試料中の細胞を検出するための方法であって、
細胞を含むことが疑われる試料；細胞濃縮剤；細胞抽出剤を含むヒドロゲル；２以上の貯留部を備えるハウジングと、前記試料を受容するように構成された開口部とを含む検出物品；及び、前記細胞濃縮剤を分離して、前記ハウジングの上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段を提供する工程と、
液体媒質中で前記試料を、前記ハウジングの前記上側貯留部内の前記細胞濃縮剤と接触させ、前記細胞抽出剤及び前記試料を含む第１の液体混合物を形成する工程と、
前記第１の液体混合物の前記細胞濃縮剤を分離して、前記ハウジングの前記下側貯留部に移動する工程と、
前記分離された細胞濃縮剤及び前記ヒドロゲルを含む第２の液体混合物を形成する工程であって、前記細胞抽出剤が前記ヒドロゲルから前記第２の液体混合物中に放出される、工程と、
前記第２の液体混合物中の生物学的検体を検出する工程と、を含み、
前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体を検出する工程が、前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量を定量することを含み、
前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量が第１の時点と第２の時点を含む２回以上の時点において定量され、
前記第１の時点が、第２の液体混合物を形成した直後であり、かつ試料中の生きた細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから放出される前であり、
前記第２の時点が、前記第１の時点の後に起こり、かつ分離された細胞濃縮剤がヒドロゲルと所定の時間にわたって接触させた後であり、
第１の時点において検出される前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量が、第２の時点において検出される前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量と比較され、
前記第１の時点と比較したときの、前記第２の時点において検出される前記生物学的検体の量の増加が、前記試料中に１又は複数の生きた細胞が存在することを示す、方法。
【請求項３】
試料中の細胞を検出するための方法であって、
細胞を含むことが疑われる試料；前記試料を受容するように構成された開口部と、細胞濃縮剤が収容された上側貯留部と、細胞抽出剤を含むヒドロゲルが収容された下側貯留部とを備えるハウジングを含む検出物品；前記細胞濃縮剤を前記液体試料の少なくとも一部から分離するための手段；及び、前記細胞濃縮剤を前記ハウジングの前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための手段を提供する工程と、
液体媒質中で前記試料と、前記ハウジングの前記上側貯留部内の前記細胞濃縮剤とを接触させ、前記細胞抽出剤及び前記試料を含む第１の液体混合物を形成する工程と、
前記第１の液体混合物の前記細胞濃縮剤を分離して、前記ハウジングの前記下側貯留部に移動する工程と、
前記分離された細胞濃縮剤及び前記ヒドロゲルを含む第２の液体混合物を形成する工程であって、前記細胞抽出剤が前記ヒドロゲルから前記第２の液体混合物中に放出される、工程と、
前記第２の液体混合物中の生物学的検体を検出する工程と、を含み、
前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体を検出する工程が、前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量を定量することを含み、
前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量が第１の時点と第２の時点を含む２回以上の時点において定量され、
前記第１の時点が、第２の液体混合物を形成した直後であり、かつ試料中の生きた細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから放出される前であり、
前記第２の時点が、前記第１の時点の後に起こり、かつ分離された細胞濃縮剤がヒドロゲルと所定の時間にわたって接触させた後であり、
第１の時点において検出される前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量が、第２の時点において検出される前記第２の液体混合物中の前記生物学的検体の量と比較され、
前記第１の時点と比較したときの、前記第２の時点において検出される前記生物学的検体の量の増加が、前記試料中に１又は複数の生きた細胞が存在することを示す、方法。
【請求項４】
一体型試料調製及び検出装置であって、
少なくとも２個の貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングであって、
上側貯留部が、試料を受容するように構成された開口部、及び上側貯留部内に配置された細胞濃縮剤を含み、
下側貯留部が、その内部に配置された検出試薬を含む、ハウジングと、
前記上側貯留部を前記下側貯留部から隔離し、前記細胞濃縮剤を前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための手段と、を備え、
前記上側貯留部を前記下側貯留部から隔離し、前記細胞濃縮剤を前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための前記手段が、前記上側貯留部と前記下側貯留部との間に配置された行き止まり弁を含み、
前記行き止まり弁が、第１の位置と第２の位置との間で可動の弁キャビティを含み、
前記弁キャビティが前記第１の位置に配置される場合に、前記キャビティが前記上側貯留部と流体連通し、
前記弁キャビティが前記第２の位置に配置される場合に、前記キャビティが前記下側貯留部と流体連通する、装置。
【請求項５】
細胞濃縮剤と、
少なくとも２個の貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングであって、
上側貯留部が、試料を受容するように構成された開口部を含み、
下側貯留部が、その内部に配置された検出試薬を含む、ハウジングと、
前記上側貯留部を前記下側貯留部から隔離し、前記細胞濃縮剤を前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための手段と、を備え、
前記上側貯留部を前記下側貯留部から隔離し、前記細胞濃縮剤を前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための前記手段が、前記上側貯留部と前記下側貯留部との間に配置された行き止まり弁を含み、
前記行き止まり弁が、第１の位置と第２の位置との間で可動の弁キャビティを含み、
前記弁キャビティが前記第１の位置に配置される場合に、前記キャビティが前記上側貯留部と流体連通し、
前記弁キャビティが前記第２の位置に配置される場合に、前記キャビティが前記下側貯留部と流体連通する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、いずれも本明細書に援用する２００８年１２月３１日出願の米国仮特許出願第６１／１４１，６８５号、及び２００９年１２月３０日出願の米国仮特許出願第６１／２９１，３０１号の恩典を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
試料（例えば、表面、水、空気など）中の生物学的検体の存在を評価するために使用することが可能な各種の試験が存在する。こうした試験としては、ホタルルシフェラーゼ反応を利用したＡＴＰの検出に基づく試験、比色計を用いたタンパク質の検出に基づく試験、微生物培養法を用いた微生物の検出に基づく試験、及び免疫化学的方法を用いた微生物の検出に基づく試験がある。スワブ装置を用いたり、あるいは寒天プレートなどの培養装置との直接的な接触によって表面の試料を採取することができる。この試料を、生きた細胞の存在、特に生きた微生物の存在について分析することができる。
【０００３】
これらの試験の結果はしばしば、表面の清浄度について判定を行うために用いられる。例えば、こうした試験は、食品加工機器が生産に使用するうえで充分に洗浄されているか否かを判定するために用いることができる。上記の試験は、汚染された表面の検出に有用であるが、試験の実施に多くの工程を要しうるものであり、生きた細胞の存在を死細胞から迅速かつ／又は容易に区別できない場合があり、場合によっては、結果を判定できるまでに長い時間（例えば、数時間又は数日）を要しうる。
【０００４】
これらの試験を用いて、生きた微生物の存在を示すことができる。こうした試験では、生きた細胞に付随する生物学的検体（例えば、ＡＴＰ）を放出させるために、細胞抽出剤がしばしば使用される。細胞外物質（例えば、死んだ又はストレス下の動物細胞、植物細胞、及び／又は微生物から環境中に放出される非細胞性ＡＴＰなど）が存在すると、高い「バックグラウンド」濃度のＡＴＰを生じ、これが生きた細胞の検出を困難とする場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生きた細胞を検出するための多くの方法及び装置が存在するにも関わらず、生きた細胞、特に生きた微生物細胞の検出のための単純かつ信頼できる試験が依然求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は一般的には、試料中の生きた細胞を検出するための物品及び方法に関する。本物品及び方法により、表面上の細菌などの細胞の存在を迅速に検出する（例えば、蛍光、化学発光、又は色反応などにより）ことが可能になる。特定の実施形態では、本発明の物品は「すぐに試料測定が行える状態（sample-ready）」（すなわち、物品が、試料中の生きた細胞を検出するために必要なすべての要素を含んでいる）である。特定の態様では、本発明の物品及び方法は、真核細胞（例えば、植物細胞又は動物細胞）に関連する生物学的検体（例えば、ＡＴＰ又は酵素）を原核細胞（例えば、細菌細胞）に関連する同様又は同一の生物学的検体から区別するための手段を提供する。更に、本発明の物品及び方法は、環境中に遊離している生物学的検体（すなわち、非細胞性の生物学的検体）を、生きた細胞に関連する同様又は同一の生物学的検体から区別するための手段を提供する。
【０００７】
本開示の方法は、操作者が液体試料から細胞を濃縮し、細胞に関連した検体を検出することを可能とするものである。特定の実施形態では、検体の検出は、特に試料中の生きた微生物細胞を含む生きた細胞の指標となりうる。特定の実施形態では、本方法は、操作者が試料中の生物学的検体の量を測定することを可能とする。特定の実施形態では、本方法は、組成物から有効量の細胞抽出剤が液体混合物中に放出される所定の時間の後に操作者が生物学的検体の量を測定することにより、試料中の非細胞性物質に由来する生物学的検体の量と、生きた細胞に由来する生物学的検体の量を区別して求めることを可能とする。特定の実施形態では、本方法は、操作者が第１の所定の時間内に生物学的検体の量の第１の測定を行ない、更に組成物から有効量の細胞抽出剤が放出される第２の所定の時間内に生物学的検体の量の第２の測定を行なうことによって、試料中の生きた細胞の存在を検出することを可能とする。特定の実施形態では、本方法は、試料中の生物学的検体が生きた植物又は動物細胞から放出されたものであるか、あるいは生きた微生物細胞（例えば、細菌）から放出されたものであるかを操作者が区別することを可能とする。本発明は、食品調理サービス施設、医療環境などの比較的過酷な現場環境において、操作者が使用することが可能である。
【０００８】
一態様において、本開示は、試料中の細胞を検出するための方法を提供する。本方法は、細胞濃縮剤、細胞抽出剤を含むヒドロゲル、及び細胞を含むことが疑われる液体試料を提供する工程を含む。本方法は更に、液体試料と細胞濃縮剤とを所定の時間にわたって接触させる工程と、液体試料の少なくとも一部から細胞濃縮剤を分離する工程と、分離された細胞濃縮剤及びヒドロゲルを含む液体混合物を形成する工程であって、細胞抽出剤が混合物中に放出される、工程と、生物学的検体を検出する工程と、を更に含む。必要に応じて、検体は２以上の別々の時点において検出することができる。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は生きた細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は検出システムを使用することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は検体の量を定量することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は細胞からのＡＴＰを検出することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は遺伝学的又は免疫学的方法によって細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、本方法は、体細胞抽出剤を提供する工程と、この体細胞抽出剤を試料からの細胞と接触させる工程と、を更に含む。
【０００９】
別の態様において、本開示は試料中の細胞を検出するための方法を提供する。本方法は、細胞を含むことが疑われる試料；細胞濃縮剤；細胞抽出剤を含むヒドロゲル；２以上の貯留部を備えたハウジングと、試料を受容するように構成された開口部とを含む検出物品；細胞濃縮剤を分離して、ハウジングの上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段を提供する工程を含む。本方法は更に、液体媒質中で試料とハウジングの上側貯留部内の細胞濃縮剤とを接触させる工程を含む。本方法は更に、細胞濃縮剤をハウジングの下側貯留部に移動する工程を含む。本発明は更に、分離された細胞濃縮剤及びヒドロゲルを含む液体混合物を形成する工程であって、細胞抽出剤が混合物中に放出される、工程を含む。本方法は更に、生物学的検体を検出する工程を含む。必要に応じて、検体は２以上の別々の時点において検出することができる。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は生きた細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は検出システムを使用することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は検体の量を定量することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は細胞からのＡＴＰを検出することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は遺伝学的又は免疫学的方法によって細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、本方法は、体細胞抽出剤を提供する工程と、この体細胞抽出剤を試料からの細胞と接触させる工程と、を更に含む。
【００１０】
別の態様において、本開示は試料中の細胞を検出するための方法を提供する。本方法は、細胞を含むことが疑われる試料；試料を受容するように構成された開口部と、細胞濃縮剤が収容された上側貯留部と、細胞抽出剤を含むヒドロゲルが収容された下側貯留部とを備えるハウジングを含む検出物品；細胞濃縮剤を液体試料の少なくとも一部から分離するための手段；及び、細胞濃縮剤をハウジングの上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段を提供する工程を含む。本方法は更に、液体媒質中で試料と、ハウジングの上側貯留部内の細胞濃縮剤とを接触させる工程を含む。本方法は更に、細胞濃縮剤を分離して、ハウジングの下側貯留部に移動する工程を含む。本方法は更に、分離された細胞濃縮剤及びヒドロゲルを含む液体混合物を形成する工程であって、細胞抽出剤が混合物中に放出される、工程を含む。本方法は更に、生物学的検体を検出する工程を含む。必要に応じて、検体は２以上の別々の時点において検出することができる。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は生きた細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は検出システムを使用することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は検体の量を定量することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は細胞からのＡＴＰを検出することを含む。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は遺伝学的又は免疫学的方法によって細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、本方法は、体細胞抽出剤を提供する工程と、この体細胞抽出剤を試料からの細胞と接触させる工程と、を更に含む。
【００１１】
別の態様において、本開示は一体型試料調製及び検出装置を提供する。本装置は、その間に通路を有する少なくとも２個の貯留部を含むハウジングを備える。ハウジングの上側貯留部は、試料を受容するように構成された開口部、及び上側貯留部内に配置された細胞濃縮剤を含む。ハウジングの下側貯留部はその内部に配置された検出試薬を含む。本装置は更に、上側貯留部を下側貯留部から隔離するための手段を備える。本装置は更に、細胞濃縮剤を上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段を備える。特定の実施形態では、上側貯留部と下側貯留部とを隔離するための手段は、細胞濃縮剤を上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段である。特定の実施形態では、ハウジングは更に、２個の隔離された貯留部の間に破断可能なシールを含む。特定の実施形態では、上側貯留部はテーパ領域を含む。特定の実施形態では、本装置は更に、細胞抽出剤を含むヒドロゲルを備える。特定の実施形態では、ハウジングは更に、第３の貯留部を含む。特定の実施形態では、本装置は更に試料取得装置を備える。特定の実施形態では、検出試薬はＡＴＰを検出するための試薬を含む。特定の実施形態では、本装置は更に、検出試薬を含むヒドロゲルを備える。
【００１２】
別の態様において、本開示は一体型試料調製及び検出装置を提供する。本装置は、少なくとも２個の隔離された貯留部を含み、その間に通路を有するハウジング、及び通路に嵌合するように構成されたピストンを備える。ハウジングの上側貯留部は、試料を受容するように構成された開口部、及び上側貯留部内に配置された細胞濃縮剤を含む。ハウジングの下側貯留部はその内部に配置された検出試薬を含む。特定の実施形態では、ハウジングは更に、２個の隔離された貯留部の間に破断可能なシールを含む。特定の実施形態では、上側貯留部はテーパ状の内壁を含む。特定の実施形態では、本装置は更に、細胞抽出剤を含むヒドロゲルを備える。特定の実施形態では、ハウジングは更に、第３の隔離された貯留部を含む。特定の実施形態では、本装置は更に試料取得装置を備える。特定の実施形態では、検出試薬はＡＴＰを検出するための試薬を含む。特定の実施形態では、本装置は更に、検出試薬を含む徐放性組成物を備える。
【００１３】
別の態様において、本開示は一体型試料調製及び検出装置を提供する。本装置は、少なくとも２個の隔離された貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングを備える。ハウジングの上側貯留部は、試料を受容するように構成された開口部、及び上側貯留部内に配置された細胞濃縮剤を含む。下側貯留部はその内部に配置された検出試薬を含む。本装置は更に、上側貯留部から下側貯留部への物質の通過を制御するように構成された弁を備える。特定の実施形態では、上側貯留部はテーパ状の内壁を有する。特定の実施形態では、本装置は更に、細胞抽出剤を含むヒドロゲルを備える。特定の実施形態では、ハウジングは更に、第３の隔離された貯留部を有する。特定の実施形態では、本装置は更に試料取得装置を備える。特定の実施形態では、検出試薬はＡＴＰを検出するための試薬を含む。特定の実施形態では、本装置は更に、検出試薬を含む徐放性組成物を備える。
【００１４】
別の態様では、本開示は、少なくとも２個の隔離された貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングと、細胞濃縮剤を上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段とを備えるキットを提供する。ハウジングの上側貯留部は、試料を受容するように構成された開口部を含む。下側貯留部はその内部に配置された検出試薬を含む。本キットは更に細胞濃縮剤を備える。特定の実施形態では、細胞濃縮剤はハウジングの上側貯留部内に配置される。特定の実施形態では、本キットは更に微生物細胞抽出剤を含むヒドロゲルを備える。特定の実施形態では、本キットは更に体細胞抽出剤を備える。特定の実施形態では、本キットは更に試料取得装置を備える。
【００１５】
別の態様において、本開示は、少なくとも２個の隔離された貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングを備えるキットを提供する。ハウジングの上側貯留部は、試料を受容するように構成された開口部を含む。ハウジングの下側貯留部はその内部に配置された検出試薬を含む。本キットは更に、細胞濃縮剤、及びこの細胞濃縮剤を上側貯留部から下側貯留部へと移動するための手段を備える。特定の実施形態では、細胞濃縮剤はハウジングの上側貯留部内に配置される。特定の実施形態では、本キットは更に、微生物細胞抽出剤を含むヒドロゲルを備える。特定の実施形態では、本キットは更に体細胞抽出剤を備える。特定の実施形態では、本キットは更に試料取得装置を備える。
【００１６】
用語集
本明細書で使用するところの「生物学的検体」とは、生物内に生ずる、又は生物によって生成される分子又はその誘導体のことを指して言う。例えば、生物学的検体としては、これらに限定されるものではないが、アミノ酸、核酸、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、糖類、多糖類、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つが含まれうる。生物学的検体の具体例としては、これらに限定されるものではないが、代謝産物（例えば、ＡＴＰなどの小分子、又はタンパク質Ａなどのポリペプチド）、アレルゲン（例えば、落花生アレルゲン）、ホルモン、毒素（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属下痢毒素、アフラトキシンなど）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）、ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ、植物ＤＮＡなど）、タグ付きタンパク質、抗体、抗原、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００１７】
本明細書で使用するところの「液体試料」とは、液体を含む試料物質のことを指して言う。試料は、その元々の形態では、例えば、水、母乳、分泌液、血液、傷口の滲出液などの液体を含むものでよい。また、液体試料は、液体懸濁媒質（例えば、水、水性緩衝液など）中に固体を懸濁した懸濁液であってもよい。例えば、固体、半固体、又はゼラチン状試料を試料取得装置によって採取して、液体に懸濁して液体試料とすることができる。
【００１８】
「清澄化液体試料」とは、液体試料を細胞濃縮剤と接触させ、細胞濃縮剤を液体のバルクから分離した（例えば、沈降、濾過、遠心、又は沈殿により）後に残る液体試料のバルクのことを指して言う。
【００１９】
「試料取得装置」とは、本明細書では最も広い意味で使用され、液体、半固体、又は固体の試料物質を採取するために使用される器具のことを指して言う。試料取得装置の非限定的な例としては、スワブ、ワイプ、スポンジ、ひしゃく、スパチュラ、ピペット、ピペット先端、及びサイフォンホースが挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用するところの「行き止まり弁」とは、検出装置のハウジング内の２以上の貯留部間の物質（例えば、液体、固体、又は液体中の固体の懸濁液）の移動を調節するために使用される弁の一種のことを指して言う。行き止まり弁は、物質の移動に使用される弁内のキャビティが、一度に１つの貯留部とのみ流体連通しうるような設計となっている。
【００２１】
本明細書で使用するところの「ヒドロゲル」なる用語は、親水性であり、極性溶媒によって膨潤しているかあるいは膨潤させることが可能なポリマー材料を指す。このポリマー材料は、通常、極性溶媒と接触すると膨潤はするが溶解はしない。すなわち、ヒドロゲルは極性溶媒に不溶である。膨潤したヒドロゲルは、乾燥することで極性溶媒の少なくとも一部を除去することができる。
【００２２】
本明細書で使用するところの「細胞抽出剤」とは、細胞膜又は細胞壁の透過性を変化させるか、あるいは細胞（例えば、体細胞若しくは微生物細胞）の細胞膜及び／又は細胞壁の完全性を乱す（すなわち、溶解又は孔を形成する）ことにより、生きた細胞に通常見られる生物学的検体を抽出又は放出させるような任意の化合物又は化合物の組み合わせのことを指して言う。
【００２３】
本明細書で使用するところの「検出システム」とは、生物学的検体を検出するために使用される成分のことを指して言い、酵素、酵素基質、結合相手（例えば、抗体又は受容体）、標識、色素、並びに、吸光度若しくは反射率、蛍光及び／又は発光（例えば、生物発光若しくは化学発光）を検出するための装置が含まれる。
【００２４】
「好ましい」及び「好ましくは」なる語は、特定の状況下で特定の効果をもたらしうる本発明の実施形態のことを指して言う。しかしながら、同じ又は他の状況下で、他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１以上の好ましい実施形態の引用は他の実施形態が有用でないことを示唆するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを目的とするものではない。
【００２５】
「含む」なる用語及びその変化形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲中に現れる場合に限定的な意味を有さない。
【００２６】
本明細書で使用するところの「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、互換可能に使用される。したがって、例えば、「ａ」検出試薬を含むハウジングとは、ハウジングが「１以上の」検出試薬を含みうることを意味するものとして解釈することができる。
【００２７】
「及び／又は」なる用語は、列記される要素の１つ若しくはすべて、又は列記される要素のうちの任意の２以上の組み合わせを意味する。
【００２８】
また、本明細書における端点による数の範囲の記載には、その範囲に含まれるすべての数が含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、などが含まれる）。
【００２９】
上記の本発明の概要は、開示される実施形態のそれぞれ、又は本発明のすべての実施の態様を述べることを目的としたものではない。以下の説明文は、実例となる実施形態をより詳細に例示するものである。本出願の複数の箇所において一連の実施例によって指標が与えられるが、各実施例は異なる組み合わせとして使用することができる。それぞれの事例において、記載される一覧はあくまで代表的な群を表すものであり、限定的な一覧として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】２個の受容部を含むハウジングの一実施形態の断面図、及びハウジングと使用するために適合されたプランジャの断面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の構成要素。
【図１Ｂ】プランジャがハウジング内の第１の位置に配置され、ハウジングの上側貯留部内に細胞濃縮剤を含む、組み立てられた状態の図１Ａの装置の断面図を示す。
【図１Ｃ】プランジャがハウジング内の第２の位置に配置され、ハウジングの上側貯留部内に液体試料を含む、図１Ｂの装置の断面図を示す。
【図１Ｄ】プランジャが第１の位置にあり、細胞濃縮剤がハウジングの下側貯留部内にある、図１Ｃの装置の断面図を示す。
【図２Ａ】破断可能なシールによって分離された３個の貯留部を含むハウジングの一実施形態の断面図、及び、ハウジングと使用するために適合されたプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の構成要素。
【図２Ｂ】キャップが取り付けられ、ハウジングの上側貯留部内に液体試料が配置された、図２Ａのハウジングの断面図を示す。
【図２Ｃ】キャップのない状態で、かつプランジャがハウジング内の第１の位置に配置された、図２Ｂのハウジングの断面図を示す。
【図２Ｄ】プランジャがハウジング内の第２の位置に配置され、細胞濃縮剤がハウジングの下側貯留部に移された、図２Ｃの装置の断面図を示す。
【図３Ａ】本開示に基づく、ハウジング及び弁を含む試料調製及び検出装置の一実施形態の正面図を示す。
【図３Ｂ】図３Ａの装置の側面図を示す。
【図３Ｃ】液体試料及び細胞濃縮剤がハウジングの上側貯留部内に配置され、弁が第１の位置にある、図３Ａの装置の断面図を示す。
【図３Ｄ】弁が第２の位置にあり、細胞濃縮剤がハウジングの下側貯留部に移された、図３Ｃの装置の断面図を示す。
【図４Ａ】２個の貯留部及びドレーン弁を含むハウジングの一実施形態の断面図、並びにプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも試料調製及び検出装置の構成要素。
【図４Ｂ】ドレーン弁が開いた配置にあり、プランジャがハウジング内の第１の位置に配置された、組み立てられた状態の図４Ａの装置の断面図を示す。
【図４Ｃ】プランジャがハウジング内の第２の位置に配置され、細胞濃縮剤がハウジングの第２の貯留部に移された、組み立てられた状態の図４Ｂの装置の断面図を示す。
【図４Ｄ】プランジャが破断可能なシールに穿孔して細胞濃縮剤を下側貯留部に移した、図４Ｃの装置の断面図を示す。
【図５Ａ】ハウジングの一実施形態の断面図、及び部分的に断面にて示されたプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の一実施形態の構成要素。
【図５Ｂ】プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図５Ａの装置の断面図を示す。
【図５Ｃ】プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図５Ａの装置の断面図を示す。
【図５Ｄ】プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図５Ａの装置の断面図を示す。
【図６Ａ】図５Ａのプランジャの先端部の、部分的に断面にて示された分解側面図を示す。
【図６Ｂ】組み立てられた状態の図６Ａの先端部の、部分的に断面にて示された側面図を示す。
【図７Ａ】ハウジングの一実施形態の断面図、及び部分的に断面にて示された中空のプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の一実施形態の構成要素。
【図７Ｂ】プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図７Ａの装置の側面図を示す。
【図７Ｃ】プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図７Ａの装置の側面図を示す。
【図７Ｄ】プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図７Ａの装置の側面図を示す。
【図８Ａ】図７Ａのプランジャの先端部の、部分的に断面にて示された分解側面図を示す。
【図８Ｂ】組み立てられた状態の図８Ａの先端部の、部分的に断面にて示された側面図を示す。
【図９】本開示に基づく細胞濃縮剤回収要素の一実施形態を示す。
【図１０Ａ】ハウジングの一実施形態の断面図、及び部分的に断面にて示されたプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の一実施形態の構成要素。
【図１０Ｂ】組み立てられた状態の図１０Ａの装置の、部分的に断面にて示された側面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書に引用する特許、特許出願、政府刊行物、政府規制、及び参照文献はすべて、その全容を本明細書に援用するものとする。記載の不一致の場合には、定義を含めた本明細書の記載内容が優先するものとする。
【００３２】
本発明は、試料中の微生物を検出するための物品及び方法に一般的に関するものである。特定の好ましい実施形態では、本発明は試料中の生きた微生物の検出に関するものである。試料からの細胞を濃縮するための方法及び装置が、いずれも本明細書にその全容を援用する２００８年１２月３１日出願の発明の名称が「微生物を濃縮するための試料採取装置及び方法」（SAMPLING DEVICES AND METHODS FOR CONCENTRATING MICROORGANISMS）である米国特許出願第６１／１４１，９００号、及び２００８年１２月３１日出願の発明の名称が「試料を処理するための方法、キット、及びシステム」（METHODS, KITS AND SYSTEMS FOR PROCESSING SAMPLES）である米国特許出願第６１／１４１，８１３号に述べられている。本明細書で開示する本発明の装置及び方法は、試料中に存在する少数の微生物を検出するための高い感度を与えるものである。
【００３３】
生物学的検体を使用して、試料中の生きた細胞などの生物学的物質の存在を検出することができる。生物学的検体は、検体が関与しうる様々な反応によって検出することができる（例えば、結合反応、触媒反応など）。
【００３４】
様々な形態の化学発光反応を利用して、液体中及び加工処理された材料中の細菌細胞などの細胞を検出することができる。本開示の特定の実施形態では、酵素ルシフェラーゼの存在下でのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とルシフェリンとの反応に基づく化学発光反応による光の発生が、生物学的検体としてのＡＴＰを検出するためのシグナルの発生の化学的基礎を与える。ＡＴＰはすべての微生物細胞を含む、すべての生きた細胞中に存在することから、この方法は、試料中の生きた細胞の数を定量的又は準定量的に推定するための迅速なアッセイを提供しうるものである。基礎となる反応の性質、その発見の経緯、及びその一般的な応用分野に関する初期の論説が、Ｅ．Ｎ．Ｈａｒｖｅｙ（１９５７）、Ａ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｉｅｓｔ  Ｔｉｍｅｓ  Ｕｎｔｉｌ  １９００、Ａｍｅｒ．Ｐｈｉｌ．Ｓｏｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．及びＷ．Ｄ．ＭｃＥｌｒｏｙ及びＢ．Ｌ．Ｓｔｒｅｈｌｅｒ（１９４９）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２：４２０〜４３３に述べられている。
【００３５】
細菌及びその他の微生物種はある程度のＡＴＰを含んでいるため、ＡＴＰ検出は細菌及びその他の微生物種を検出するうえで信頼性の高い手段である。ＡＴＰから得られる化学結合エネルギーは、北米産ホタル（Photinus pyralis）の尾部で起こる生物発光反応に利用されている。この反応の生化学的成分はＡＴＰを含まずに単離することができ、その後これを他の供給源のＡＴＰを検出するために使用することができる。このホタルの生物発光反応の機構はよく特徴付けられている（ＤｅＬｕｃａ，Ｍ．ら、１９７９  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５：１９４〜１９８）。
【００３６】
試料及び試料取得装置：
本開示の物品及び方法は、試料中の生物学的検体の検出法を提供する。特定の実施形態では、本物品及び方法は、試料中の生きた細胞からの生物学的検体の検出法を提供する。特定の実施形態では、本物品及び方法は、試料中の生きた微生物細胞の検出法を提供する。特定の好ましい実施形態では、本物品及び方法は、試料中の生きた細菌細胞の検出法を提供する。
【００３７】
本明細書で使用するところの「試料」なる用語は、その最も広い意味で使用される。試料は、本発明の使用により分析される生物学的検体（例えば、ＡＴＰ）を含むことが疑われる組成物である。生物学的検体は、試料中の細胞（例えば、細菌）内に存在しうる。試料はしばしば、場合により培地又は細胞溶解物中に、細胞又は細胞集団を含むことが知られているかあるいは含むことが疑われるものであるが、試料はまた、細胞又は細胞集団が付着していることが疑われる固体表面（例えば、スワブ、膜、フィルター、粒子）であってもよい。こうした固体試料では、本発明に基づく細胞濃縮剤と混合することが可能な液体（例えば、水溶液）と固体を接触させることによって水性試料を調製することが考えられる。
【００３８】
好適な試料としては、固体物質（例えば、粒子、フィルター）、半固体物質（例えば、ゲル、固体の懸濁液、又はスラリー）、液体、又はこれらの組み合わせが挙げられる。好適なサンプルとしては更に、固体、液体、又はこれらの組み合わせを含む表面残留物が挙げられる。表面残留物の非限定的な例としては、環境表面（例えば、床、壁、天井、媒介物、機器、水、及び水容器、エアフィルター）、食品表面（例えば、野菜、果物、及び肉の表面）、食品加工表面（例えば、食品加工装置及びまな板）、並びに臨床表面（例えば、組織試料、皮膚、及び粘膜）からの残留物が挙げられる。試料には、原油若しくは粗精製油、ガソリン、又は塗料などの混合物が更に含まれる。
【００３９】
生物学的検体の検出のための試料物質（表面残留物を含む）の採取法は、当該技術分野では周知のものである。ピペット、スパチュラ、スポンジ、スワブなどを含む各種の試料取得装置がこれまでに述べられており、本発明の方法において使用することができる。
【００４０】
細胞濃縮剤：
本開示の方法では、液体試料中に存在する細胞と結合する細胞濃縮剤を使用する。細胞濃縮剤は、細胞を含むことが疑われる液体試料と所定の時間接触させる。細胞は、共有結合又は非共有結合（例えば、疎水性又はイオン性相互作用）によって、あるいは共有結合と非共有結合との組み合わせによって細胞濃縮剤と結合しうる。細胞が細胞濃縮剤と結合した後、例えば沈降、凝集、遠心、濾過、又はこれらの任意の組み合わせによって細胞濃縮剤を液体試料から除去することができる。
【００４１】
「細胞濃縮剤」とは、液体に懸濁可能であることによって液体中に存在する微生物を捕捉かつ保持することができる物質（例えば、粒子、繊維）を含む広い意味で使用される。細胞濃縮剤は濾過処理によって回収することができるが、微生物を捕捉するうえで必ずしも濾過処理を必要としない。
【００４２】
特定の細胞濃縮剤が当該技術分野において知られており、本開示の方法における使用に適している。好適な細胞濃縮剤の非限定的な例としては、ヒドロキシアパタイト（Ｂｅｒｒｙら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；６３：４０６９〜４０７４；１９９７）、磁気ビーズ（Ｏｓｔｅｒら、Ｊ．Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍａｔ．；２２５：１４５〜１５０；２００１）、フェリ磁性鉱物、マグネタイト、キトサン、及び親和性支持物質が挙げられる。試料から微生物を捕捉又は濃縮するための固定化金属支持物質を含む組成物の使用について、本明細書にその全容を援用する発明の名称が「生物学的物質を単離するための組成物、方法、及び装置」（COMPOSITIONS, METHODS, AND DEVICES FOR ISOLATING BIOLOGICAL MATERIALS）である、２００７年４月２５日出願の米国特許出願第６０／９１３，８１２号に述べられている。
【００４３】
濃縮剤の例示的な種類の１つとしては、珪藻土及び表面処理した珪藻土が挙げられる。こうした濃縮剤の具体例は、その開示内容を本明細書に援用する、発明の名称が「微生物の濃縮プロセス及び微生物濃縮剤」（MICROORGANISMS CONCENTRATION PROCESS AND AGENT）である、２００７年１０月３日出願の本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第６０／９７７，２００号に見ることができる。無機物は、水系に分散又は懸濁されると、その物質及び水系のｐＨに特徴的な表面電荷を示す。物質−水の界面の両側の電位は「ゼータ電位」と呼ばれ、電気泳動における移動度から（すなわち、水系中に置かれた帯電電極間を物質の粒子が移動する速度から）計算することができる。一実施形態では、濃縮剤は、非処理の珪藻土のゼータ電位よりも少なくともある程度正のゼータ電位を有してよく、こうした濃縮剤は、その表面が一般的に負に帯電する傾向を有する細菌などの微生物を濃縮するうえで非処理の珪藻土と比較して驚くほど顕著に効果的となりうる。
【００４４】
濃縮剤の代表的な種類の１つとして珪藻土がある。濃縮剤の別の代表的な種類として、表面処理した珪藻土がある。代表的な表面処理としては、二酸化チタンなどの表面改質剤、微細なナノスケールの金若しくは白金、又はこれらの組み合わせがある。こうした表面処理は、微生物を濃縮するうえで非処理の珪藻土と比較して驚くほど顕著に効果的となりうる。表面処理としては更に、酸化第二鉄、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、及びこれらに類するもの、並びにこれらの組み合わせから選択される金属酸化物が挙げられる。一実施形態では、酸化第二鉄が使用される。金などの貴金属は抗微生物特性を示すことが知られているが、金含有濃縮剤は、微生物を結合するうえで有効であるばかりでなく、検出又はアッセイ用に微生物を生存状態に維持するうえでも有効である。
【００４５】
有用な表面改質剤としては、微細なナノスケールの金、微細なナノスケールの白金、少なくとも１つの金属酸化物（例えば、二酸化チタン、酸化第二鉄、又はこれらの組み合わせ）と組み合わせた微細なナノスケール金、二酸化チタン、少なくとも１つの他の（すなわち、二酸化チタン以外）金属酸化物と組み合わせた二酸化チタン、及びこれらに類するもの、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、微細なナノスケール金、微細なナノスケール白金、少なくとも酸化第二鉄若しくは二酸化チタンと組み合わせた微細なナノスケール金、二酸化チタン、少なくとも酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、又はこれらの組み合わせのような表面改質剤を使用することができる。
【００４６】
一実施形態では、以下のような表面改質剤を使用することができる。すなわち、微細なナノスケール金、微細なナノスケール白金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細なナノスケール金、二酸化チタン、酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、及びこれらの組み合わせ。一実施形態では、微細なナノスケール金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細なナノスケール金、酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、及びこれらの組み合わせを使用することができる。一実施形態では、微細なナノスケール金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細なナノスケール金、及びこれらの組み合わせを使用することができる。
【００４７】
濃縮剤の別の代表的な種類として、γ−ＦｅＯ（ＯＨ）（レピドクロサイトとしても知られる）がある。こうした濃縮剤の具体例は、その開示内容を本明細書に援用する、発明の名称が「微生物の濃縮プロセス」（MICROORGANISM CONCENTRATION PROCESS）である、２００７年１０月３日出願の本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第６０／９７７，１８８号に見ることができる。こうした濃縮剤は、食品及び水によって媒介される疾患及びヒトの細菌感染において重大な問題となりうるグラム陰性菌を捕捉するうえで他の鉄含有濃縮剤と比較して、驚くほど効果的であることが見出されている。濃縮剤は、他の成分（例えば、ベーマイト（α−ＡｌＯ（ＯＨ））、粘土、酸化鉄、及び酸化ケイ素など）を（γ−ＦｅＯ（ＯＨ）以外に）更に含んでもよい。このような他の成分が含まれる実施形態では、他の成分は試料と濃縮剤との密接な接触を一般的に大きく妨げない。
【００４８】
γ−ＦｅＯ（ＯＨ）は既知の物質であり、公知の方法によって化学的に合成することができる（例えば、米国特許第４，７２９，８４６号（マツイ（Matsui）ら）（この記載内容を本明細書に援用する）に磁気テープ製造を目的として述べられているように、中性又は弱酸性ｐＨで水酸化第一鉄の酸化によって）。γ−ＦｅＯ（ＯＨ）は市販もされている（例えば、ジョンソン・マッセイ社（Johnson Matthey Company）（マサチューセッツ州ウォードヒル）グループの一企業であるアルファ・エイサー社（Alfa Aesar）及びシグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Corporation）（ミズーリ州セントルイス）より）。
【００４９】
γ−ＦｅＯ（ＯＨ）を濃縮剤として使用する一実施形態では、γ−ＦｅＯ（ＯＨ）は一般的に微粒子の形態である。一実施形態では、γ−ＦｅＯ（ＯＨ）は、約３マイクロメートル（他の実施形態では、約５マイクロメートル、又は約１０マイクロメートル）〜約１００マイクロメートル（他の実施形態では、約８０マイクロメートル、又は約５０マイクロメートル、又は約３５マイクロメートル、ただし任意の下限値を範囲の任意の上限値と組み合わせることができる）の範囲の粒径（最大の寸法）を有する微粒子の形態である。一実施形態では、粒子はより小さな粒子の凝集体である。粒子は、粒径約１マイクロメートル未満（一実施形態では粒径約０．５マイクロメートル未満）の微結晶を含みうる。微結晶は、針状微結晶として、針状微結晶を含むいかだ状構造として、又は針状微結晶といかだ状構造との組み合わせとして存在しうる。
【００５０】
一実施形態では、濃縮剤は、ＢＥＴ（ブルナウアー・エメット・テラー（Brunauer-Emmett-Teller））法（窒素ガス分子の物理的吸着による固体の表面積計算）によって測定される表面積が、１グラム当たり約２５平方メートル（ｍ２／ｇ）よりも大きく、一実施形態では約５０ｍ２／ｇよりも大きく、更に別の実施形態では約７５ｍ２／ｇよりも大きい。
【００５１】
粒子の凝集形態は、微粒子にしばしばともなう取扱い及びその他の危険性をともなわずに、微粒子システムの吸着能を与えうるものである。更に、そのような凝集体粒子は液体中で容易に沈殿しうるものであり、このため液相から微生物を速やかに分離することが可能となる（同時に、濾過時の背圧が低くて済む）。
【００５２】
濃縮剤の別の代表的な種類として金属ケイ酸塩がある。こうした濃縮剤の具体例は、その開示内容を本明細書に援用する、発明の名称が「微生物の濃縮プロセス」（MICROORGANISM CONCENTRATION PROCESS）である、２００７年１０月３日出願の本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第６０／９７７，１８８号に見ることができる。代表的な金属ケイ酸塩は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって測定した場合にケイ素原子に対する金属原子の比が約０．５以下（一実施形態では約０．４以下、別の実施形態では約０．３以下、更に別の実施形態では約０．２以下）である表面組成を有しうる。一実施形態では、表面組成は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって測定した場合に少なくとも約１０平均原子％の炭素（一実施形態では少なくとも約１２平均原子％の炭素、更なる別の実施形態では少なくとも約１４平均原子％の炭素）を更に含む。ＸＰＳは、試料表面の最も外側の約３〜１０ナノメートル（ｎｍ）の元素組成を測定できる方法であり、水素及びヘリウムを除く周期表のすべての元素に対する感度を有する。ＸＰＳは、ほとんどの元素に対して０．１〜１原子パーセントの濃度範囲の検出限界を有する定量的測定法である。ＸＰＳの代表的な表面組成の評価条件としては、受光立体角±１０°で試料表面に対して測定される取り出し角９０°がある。
【００５３】
金属ケイ酸塩などの無機材料は、水系中に分散又は懸濁されると、材料及び水系のｐＨに特徴的な表面電荷を示す。物質−水の界面の両側の電位は「ゼータ電位」と呼ばれ、電気泳動における移動度から（すなわち、水系中に置かれた帯電電極間を物質の粒子が移動する速度から）計算することができる。代表的な濃縮剤は、例えば、普通のタルクなどの一般的な金属ケイ酸塩のゼータ電位よりも負のゼータ電位を有しうる。それにも関わらず、こうした濃縮剤は、表面が一般的に負に帯電する傾向を有する細菌などの微生物を濃縮するうえでタルクと比較して驚くほど効果的である。一実施形態では、濃縮剤はｐＨ約７において負のゼータ電位（一実施形態では、ｐＨ約７において約−９ミリボルト〜約−２５ミリボルトの範囲のスモルコフスキー（Smoluchowski）ゼータ電位、別の実施形態では、ｐＨ約７において約−１０ミリボルト〜約−２０ミリボルトの範囲のスモルコフスキーゼータ電位、更に別の実施形態では、ｐＨ約７において約−１１ミリボルト〜約−１５ミリボルトの範囲のスモルコフスキーゼータ電位）を有する。
【００５４】
有用な金属ケイ酸塩としては、これらに限定されるものではないが、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、鉄、チタン、及びこれらに類するもの、並びにこれらの組み合わせなどの金属の非晶質ケイ酸塩が挙げられる。一実施形態では、マグネシウム、亜鉛、鉄、チタン、又はこれらの組み合わせを使用することができる。更に別の実施形態では、マグネシウムを使用することができる。一実施形態では、少なくとも部分的に融合した粒子の形態の非晶質金属ケイ酸塩を使用することができる。一実施形態では、非晶質の長球化された金属ケイ酸塩を使用することができる。更に別の実施形態では、長球化された非晶質ケイ酸マグネシウムを使用することができる。金属ケイ酸塩は公知のものであり、公知の方法によって化学的に合成するか、あるいは天然に生じる未加工鉱石の採鉱及び処理によって得ることができる。
【００５５】
一部の非晶質金属ケイ酸塩は市販されている。例えば長球化された非晶質ケイ酸マグネシウムは、化粧料における使用を目的として市販されている（例えば、スリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール）より販売されるＣｏｓｍｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ＣＭ−１１１として）。
【００５６】
濃縮剤は、非晶質金属ケイ酸塩以外に、濃縮剤が上記の表面組成を有するかぎりにおいて、金属（例えば、鉄又はチタン）の酸化物、結晶性金属ケイ酸塩、他の結晶性物質、及びこれらに類するものを含む他の物質を更に含んでもよい。一実施形態では、濃縮剤は結晶性シリカを基本的に含まない。
【００５７】
濃縮剤は試料の接触及び微生物の捕捉に適した任意の形態で使用することができる。一実施形態では、濃縮剤は粒子の形態で使用される。一実施形態では、濃縮剤は微粒子の形態である。一実施形態では、濃縮剤は約１マイクロメートル（一実施形態では約２マイクロメートル）〜約１００マイクロメートル（一実施形態では約５０マイクロメートル、別の実施形態では約２５マイクロメートル、更に別の実施形態では約１５マイクロメートル、ただし任意の下限値を範囲の任意の上限値と組み合わせることができる）の範囲の粒径を有する微粒子の形態である。
【００５８】
濃縮剤を使用した微生物の濃縮又は捕捉は、微生物の特定の株、種又はタイプに特異的なものではなく、したがって試料中の一般的な微生物の集団を濃縮するものである。次いで、株特異的なプローブによる任意の公知の検出方法を用いて、捕捉された微生物の集団から微生物の特定の株を検出することができる。したがってこの濃縮剤は、臨床試料、食品試料、環境試料、又は他の試料中の汚染微生物又は病原体（特に細菌などの食品によって媒介される病原体）の検出に使用することができる。
【００５９】
本発明のプロセスを実施するうえで、濃縮剤は試料との接触及び微生物の捕捉に適した任意の形態で使用することができる（例えば、粒子の形態で使用するか、あるいは微小流体装置のディップスティック、フィルム、フィルター、チューブ、ウェル、プレート、ビーズ、膜、若しくはチャネル、又はこれらに類するものなどの支持体に塗布して）。好ましくは、濃縮剤は粒子の形態で使用される。
【００６０】
必要に応じて、細胞濃縮剤は微生物と結合することが可能な結合相手（例えば、抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメイン、レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）、受容体、ファージ受容体、又はこれらに類するもの）を含んでもよい。結合は直接的なものであっても、間接的なものであってもよい。結合は特定の微生物の種類に対して選択的であってもよく、あるいは非選択的あってもよい。
【００６１】
試料から微生物を捕捉するために使用される濃縮剤の量は、使用される濃縮剤の種類、試料のサイズ、貯留部の種類及びサイズ、試料の混合、特定の用途、本明細書では詳細に考察されない他の因子、又はこれらの組み合わせに少なくとも一部よって決まる。捕捉効率（濃縮剤と結合した試料中の微生物の比率）は、微生物を濃縮剤と長時間かけて接触させることによって一般的に高めることができる。捕捉効率は、濃縮剤の濃度を高くすることによって高めることもできる。高濃度の濃縮剤は、微生物が捕捉されるまでに移動する平均拡散距離を小さくすることから、インキュベーション時間が短縮される。したがって、一般論として、より多くの濃縮剤を加えるほど、同じ量の微生物を捕捉するために必要とされるインキュベーション時間は短くなる。
【００６２】
一実施形態では、濃縮剤の適切な量は、微生物が濃縮剤に結合するのを待つのに要する時間（「捕捉時間」と呼ぶ）に応じて変わりうる。例えば、１分間の捕捉時間では、試料１０ｍＬ当たり１０００ｍｇの濃縮剤が適切であり、１０分間の捕捉時間では、試料１０ｍＬ当たり１００ｍｇの濃縮剤が適切であり、６０分間の捕捉時間では、試料１０ｍＬ当たり１０ｍｇの濃縮剤が適当でありうる。一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇの濃縮剤を使用することができる。一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約１ｍｇ〜約５０ｍｇの濃縮剤を使用することができる。一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約１０ｍｇ〜約２５ｍｇの濃縮剤を使用することができる。例えば、金属ケイ酸塩濃縮剤を使用する一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約１０ｍｇの金属ケイ酸塩濃縮剤を使用することができる。例えば、金属ケイ酸塩濃縮剤を使用する一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約２５ｍｇの金属ケイ酸塩濃縮剤を使用することができる。
【００６３】
検出装置：
本開示は、試料中の微生物を検出するために使用することができる装置を提供する。装置は、少なくとも２個の貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングと、ハウジングの上側貯留部内に配置された必要に応じて用いられる細胞濃縮剤と、ハウジング内の少なくとも２個の貯留部を隔離するための手段と、ハウジングの上側貯留部から下側貯留部へと細胞濃縮剤を移動するための手段とを含みうる。特定の実施形態では、ハウジングは２個の貯留部を隔離するための手段（例えば、破断可能なシール）を含みうる。特定の実施形態では、ハウジングは、細胞濃縮剤をハウジングの上側貯留部から下側貯留部へと移動するための手段（例えば、弁）を含みうる。特定の実施形態では、装置は微生物を検出するための試薬を更に含みうる。特定の実施形態では、装置は細胞抽出剤を含むヒドロゲルを更に含みうる。細胞抽出剤は、微生物からの生物学的検体の検出を促進することができる。
【００６４】
ここで図１Ａを参照すると、本開示に基づく検出装置１００の一実施形態の構成要素の断面図が示されている。検出装置の構成要素は、ハウジング１１０とプランジャ１５０とを含んでいる。ハウジング１１０は、下側部分１１４に隣接した上側部分１１２を含んでいる。上側部分１１２と下側部分１１４とは、型成形などの当該技術分野では周知の方法によって、ポリエチレン又はポリプロピレンなどのポリマー材料から別々に形成することができる。各部分は、実質的に液密な結合を与えるように一体に圧入されるような寸法とするか、あるいは当該技術分野において知られる手段（例えば、接着剤、超音波溶接など）によって一体に結合することができる。また、ハウジングは、例えば、中空体を押し出し成形し、通路を型成形し、熱を用いたプロセスによってハウジングの底をシールするなど、当該技術分野において知られるプロセスによって単一のユニットとして形成することもできる。他の実施形態では、狭い通路を有する挿入部材を一体のハウジング内に配置することによって上側及び下側貯留部（それぞれ１２０及び１２４）を形成することができる。
【００６５】
上側部分１１２の、下側部分１１４からみて遠位となる端部には、プランジャ１５０を受容するような寸法の開口部１１３が形成されている。上側部分１１２の反対側の端部には、ハウジング１１０の下側部分１１４内に開口する通路１１６が形成されている。図に示される実施形態では、上側貯留部１２０の断面積よりも小さい断面積を有する通路１１６が、上側部分１１２を形成する壁の内側の延長部として示されている。また、通路１１６は、上側部分１１２の壁の内側にハウジング１１０の下側部分１１４に隣接して嵌まる挿入要素によって形成されてもよい（図に示されていない）。挿入要素は、ハウジング１１０の下側部分１１４に隣接した通路１１６を形成することができる。図１Ａの上側部分１１２、下側部分１１４、及び通路１１６の相対的比率はあくまで例示的なものであって、試料の体積及び／又は器具の制限条件などの異なるパラメータに対応するうえで必要に応じて適合させることができる。
【００６６】
プランジャ１５０は、一端にハンドル１５２を、他端に複数のシール（第１の下側シール１５６及び第２の下側シール１５７）を有するシャフト１５１を含んでいる。必要に応じて、プランジャ１５０は１以上の上側シール１５４及び／又はインデックスマーク１５３を含んでもよい。ハンドル１５２、第１の下側シール１５６、及び第２の下側シール１５７間の相対的な距離については後述する。図１Ａには更に、必要に応じて用いられる検出試薬１６５及び必要に応じて用いられるヒドロゲル１６２が示されている。
【００６７】
「検出試薬」とは、本明細書ではその最も広い意味で使用される。検出試薬とは、生物学的検体を検出するために反応中で使用することのできる試薬である。検出反応の非限定的な例としては、結合相手間の相互作用（例えば、抗原−抗体、受容体−リガンド、プローブ−標的分子、及びハイブリダイゼーション結合相互作用など）、及び／又は酵素反応（例えば、蛍光発生反応、色素生成反応、光発生反応、又は重合反応などの酵素媒介反応）が挙げられる。検出試薬は検出反応に関与する（例えば、結合相手、酵素、酵素基質、又は指示薬として）ものでもよく、かつ／又は検出反応を促進する（例えば、緩衝剤、補因子、又は共役反応の成分として）ものでもよい。検出試薬の例としては、例えば、ルシフェラーゼ、アデニル酸キナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アピラーゼなどの酵素、例えば、ルシフェリン、リン酸メチルウンベリフェリル、ｏ−ニトロフェニルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−リン酸塩などの酵素基質、例えば、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、及びＨＥＰＥＳ緩衝液などの緩衝液、並びに、ＦＡＤＨ、ＮＡＤＨ、補酵素Ａなどの補因子が挙げられる。
【００６８】
検出試薬は、様々な形態でハウジング１１０内に含まれうる。例えば、検出試薬１６５は、図１Ａに示されるような乾燥した又は部分的に乾燥したコーティングからなるものでよい。検出試薬１６５に適した別の形態（図に示されていない）は当該技術分野では周知のものであり、例えば、液体試薬（必要に応じて、アンプルのような破断可能な区画内に入った）、粉末、ゲル、錠剤、凍結乾燥試薬、コーティングされたフィルム、ケーキ、及び、完全乾燥試薬（dried-down reagent）などが挙げられる。
【００６９】
図１Ｂは、図１Ａのプランジャ１５０を有するハウジング１１０を含む検出装置１００の断面図を示す。この図は、装置１００を使用前に保管することができるような形態を示している。プランジャ１５０は、ハウジング１１０内に完全に挿入されている。この位置では、ハンドル１５２の下縁部がハウジング１１０の上側部分１１２の開口部１１３を封鎖することによって、ハウジング１１０への物質の出入りが防止されている。必要に応じて用いられる上側シール１５４も、ハウジング１１０への物質の出入りを防止するうえで機能しうる。上側シール１５４はハウジング１１０の上側部分１１２の壁の内表面と接触するような寸法に構成され、バリア、好ましくは液密バリアを形成するのに適した材料（例えば、ポリプロピレン、ブチルゴムなど）で形成される。
【００７０】
プランジャ１５０が図１Ｂに示される位置にある場合、第１の下側シール１５６が通路１１６を封鎖することにより、ハウジング１１０の上側貯留部１２０が下側貯留部１２４から隔離される。プランジャ１５０が図１Ｂに示される位置にある場合、プランジャ１５０の第２の下側シール１５７を含む部分が下側貯留部１２４内に延びており、この部分はハウジング１１０の下側部分１１４の壁と接触していない。第１の下側シール１５６及び第２の下側シール１５７は通路１１６の壁と接触するような寸法となっており、上側貯留部１２０と下側貯留部１２４との間において通路１１６内にバリア、好ましくは液密バリアを形成するのに適した材料（例えば、ポリプロピレン、ブチルゴムなど）で形成される。図１Ｂには更に、上側貯留部１２０内に配置された、必要に応じて用いられる濃縮剤１３０が示されている。
【００７１】
図１Ｃは、プランジャ１５０が第２の位置にある図１Ｂの装置１００の断面図を示す。このプランジャ１５０は、例えばハウジング１１０内に試料を装填するために使用することができる。プランジャ１５０は、ハンドル１５２を把持して、第２の下側シール１５７が通路１１６の上端に近くなる位置にまで引き出すことができる。必要に応じて用いられるプランジャシャフト１５１上のインデックスマーク１５３を用いて（例えば、インデックスマーク１５３が開口部１１３と整列した時点で）、この位置に達するためのプランジャ１５０の適切な位置を示すことができる。図１Ｃは更に、上側貯留部１２０内の濃縮剤１３０と接触している液体試料１４０を含んでいる。使用時には、装置１００を例えばボルテックスにかける又は振動させることによって濃縮剤１３０と液体試料１４０とを混合することができる。所定の時間の後、濃縮剤１３０は図１Ｃに示されるように上側貯留部１２０の底に沈殿しうる。特定の実施形態では、必要に応じて用いられるテーパ領域１１８が通路１１６に隣接して配置される。テーパ領域１１８は、ハウジング１１０の上側部分１１２及び／又は通路１１６と同じ材料及び／又はプロセスによって形成することができる。使用時には、テーパ領域１１８は、ハウジング１１０の内部において通路１１６の方向に沈降する、液体に懸濁された粒子（例えば、細胞濃縮剤１３０）を通路１１６の方向に向かわせることができる。
【００７２】
図１Ｄは、図１Ｂに示される第１の位置にプランジャ１５０が戻された、図１Ｃの装置１００の断面図を示す。ハンドル１５２の下縁部は開口部１１３に近い位置にあり、液体試料の、濃縮剤１３０を含む部分１４２が下側貯留部１２４に移され、そこで部分１４２は検出試薬１６５（図１Ａに示される）が存在する場合に試薬１６５と相互作用することができる。部分１４２と検出試薬１６５との間の相互作用の非限定的な例としては、検出試薬の溶解及び／又は懸濁、検出試薬と部分中に存在する生物学的検体との間の結合相互作用、及び／又は酵素反応が挙げられる。図１Ｄは更に、液体試料の部分１４２が下側貯留部１２４内のヒドロゲル１６２と接触している状態を示しており、これによりヒドロゲル１６２から細胞抽出剤が放出されうる。
【００７３】
図１に示される実施形態では、下側貯留部１２４から上側貯留部１２０を隔離するための手段は、プランジャ１５０の第１の下側シール１５６及び／又は第２の下側シール１５７と通路１１６との組み合わせからなっている。図１に示される実施形態では、濃縮剤１３０を上側貯留部１２０から下側貯留部１２４に移動するための手段は、通路１１６、並びにプランジャ１５０の第１の下側シール１５６及び第２の下側シール１５７を含んでいる。
【００７４】
図２Ａは、本発明に基づく検出装置２００の一実施形態の構成要素であるプランジャ２５０の断面図、及びハウジング２１０の部分分解断面図である。ハウジング２１０は、下側部分２１４に隣接した上側部分２１２を含んでいる。上側部分２１２及び下側部分２１４は上記に述べたように形成することができる。
【００７５】
上側部分２１２の、下側部分２１４からみて遠位となる端部には、プランジャ２５０を受容するような寸法の開口部２１３が形成されている。上側部分２１２の反対側の端部には、上記に述べたような通路２１６が形成されている。必要に応じて用いられる上記に述べたようなテーパ領域２１８が、通路２１６に隣接して形成されている。破断可能なシール２６０ａ及び２６０ｂによって、ハウジングが上側貯留部２２０、下側貯留部２２４、及び第３の貯留部２２６に分割されている。破断可能なシール２６０ａ及び２６０ｂは耐水性材料（例えば、薄いポリマーフィルム、ポリマーコーティングされた紙、薄い箔など）で形成されることが好ましく、当該技術分野では周知の材料及び／又はプロセス（例えば、接着剤、熱シール、超音波接着）を用いて耐水性の破断可能なバリアを形成するようにハウジング２１０の壁に固定することができる。
【００７６】
第３の貯留部２２６内には、細胞抽出剤を含むハイドロゲル２６２が配置されている。細胞抽出剤を含む好適なヒドロゲルについては、本明細書にその全容を援用する、発明の名称が「生体検出用物品」（BIODETECTION ARTICLES）である、２００８年９月３０日出願の米国特許出願第６１／１０１，５４６号に述べられている。
【００７７】
図２Ａの３個の貯留部の相対的比率はあくまで例示的なものであって、試料の体積及び／又は器具の制限条件などの異なるパラメータに対応するうえで必要に応じて適合させることができる。図２Ａには更に、必要に応じて用いられる濃縮剤２３０、本明細書で述べるような必要に応じて用いられる検出試薬２６５、及び必要に応じて用いられる着脱式キャップ２７８が示されている。キャップ２７８は、当該技術分野では周知のプロセス（例えば、型成形）を用いてポリマー材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）から形成することができ、ハウジング２１０の液密カバーを形成するような寸法とすることができる。
【００７８】
プランジャ２５０は、一方の端部にハンドル２５２を、反対側の端部に下側シール２５６及び穿孔端２５９を有するシャフト２５１を含んでいる。好ましくは、下側シール２５６は通路２１６の壁と接触するような寸法となっており、通路２１６内にバリア、好ましくは液密バリアを形成するのに適した材料（例えば、ポリプロピレン、ブチルゴムなど）で形成される。必要に応じて、プランジャ２５０は上記に述べたような１以上の上側シール２５４を含んでよい。ハンドル２５２、下側シール２５６、及び穿孔端２５９間の相対距離については後述する。
【００７９】
図２Ｂは、図２Ａの装置２００の断面図を示す。この図では、ハウジング２１０は上側貯留部２２０内に液体試料２４０を更に含んでいる。キャップ２７８はハウジング２１０上にしっかりと着座しているため、ハウジング２１０をボルテックス、振動、振盪、又は反転するなど、当該技術分野では周知のプロセスによって液体試料２４０を細胞濃縮剤２３０と混合することができる。混合の後、細胞濃縮剤２３０を通路２１６内の破断可能なシール２６０ａ上に沈殿させることができる。
【００８０】
図２Ｃは、プランジャ２５０が部分的に挿入された図２Ｂのハウジング２１０を含む装置２００の断面図を示す。この位置では、プランジャ２５０の下側シール２５６が通路２１６の壁と接触することにより、通路２１６内において少なくとも部分２４２を液体試料２４０の残りの部分から隔離している。通路２１６内には細胞濃縮剤２３０が更に隔離されている。
【００８１】
図２Ｄは、プランジャ２５０が完全に挿入された図２Ｃの装置２００の断面図を示す。プランジャ２５０の下側シール２５６が通路２１６の壁に接触し、穿孔端２５９が破断可能なシール２６０ａ及び２６０ｂに穿孔していることにより、液体試料の部分２４２、細胞濃縮剤２３０、及びヒドロゲル２６２が下側貯留部２２４内に移され、そこで必要に応じて用いられる検出試薬２６５（図２Ａに示される）が存在する場合に部分２４２が検出試薬２６５と相互作用することができる。部分２４２と検出試薬２６５との間の相互作用の非限定的な例としては、検出試薬の溶解及び／又は懸濁、検出試薬と部分中に存在する生物学的検体との間の結合相互作用、及び／又は酵素反応が挙げられる。
【００８２】
図２に示される実施形態では、下側貯留部２２４から上側貯留部２２０を隔離するための手段には、破断可能なシート２６０ａ及び２６０ｂが含まれる。下側貯留部２２４から上側貯留部２２０を隔離するための手段には、プランジャ２５０の下側シール２５６と通路２１６との組み合わせが更に含まれる。図２に示される実施形態では、上側貯留部２２０から下側貯留部２２４に細胞濃縮剤２３０を移動させるための手段には、プランジャ２５０の穿孔端２５９及び下側シール２５６、並びに通路２１６が含まれる。
【００８３】
図３Ａは、本開示に基づく検出装置３００の一実施形態の正面図を示す。装置３００は、ハウジング３１０及び必要に応じて用いられるキャップ３７８を含んでいる。ハウジング３１０は、上記に述べたように上側部分３１２、通路３１６、及び下側部分３１４を有するように構成することができる。必要に応じて用いられるキャップ３７８は、上記に述べたように構成することができる。装置３００は、図３Ａの第１の位置に示される弁アクチュエータ３７２を有する行き止まり弁３７０を更に含んでいる。図３Ｂは、図３Ａの装置３００及び弁アクチュエータ３７２の側面図である。
【００８４】
図３Ｃは、図３Ａに示される装置３００の断面図を示す。装置３００は、キャップ３７８及びハウジング３１０を含んでいる。ハウジング３１０は、上側部分３１２及び下側部分３１４を含んでいる。上側部分３１２は、内部に行き止まり弁３７０が配置された通路３１６を含んでいる。行き止まり弁３７０は、弁がこの第１の位置にある場合に上側貯留部３２０と流体連通する弁キャビティ３７４を含んでいる。弁キャビティ３７４は、上側貯留部３２０内の液体試料３４０と接触する、必要に応じて用いられる細胞濃縮剤３３０を含んでいる。下側貯留部３２４には、いずれも本明細書で述べるような、必要に応じて用いられるヒドロゲル３６２及び／又は必要に応じて用いられる検出試薬３６５が入っている。図３Ｃには更に、本明細書で述べるような必要に応じて用いられるテーパ領域３１８が示されている。
【００８５】
図３Ｄは、弁３７０が第２の位置にある図３Ｃの装置３００の断面図が示されている。弁３７０が第２の位置にある場合、液体試料の、細胞濃縮剤３３０を含む部分３４２は隔離されて下側貯留部３２４に移され、そこで部分３４２は、本明細書で述べるようなヒドロゲル３６２が存在する場合にはヒドロゲル３６２と接触し、検出試薬３６５が存在する場合には検出試薬３６５と相互作用することができる。
【００８６】
弁キャビティ３７４の寸法が既知の所定用量を与え、そのため弁３７０を１回以上使用して所定量の液体試料３４０を上側貯留部３２０から下側貯留部３２４に移すことが可能である点は認識される。更に、液体試料の部分３４２が上側貯留部３２０から下側貯留部３２４に移された後、上側貯留部３２０内の液体試料３４０の残部を捨て、異なる物質（例えば、希釈剤、緩衝剤、液体及び／又は粉末試薬）を上側貯留部３２０内に入れ、その後弁３７０を使用して所定量を下側貯留部３２４に移すことが可能である点も認識される（図には示されていない）。
【００８７】
図３に示される実施形態では、ハウジングの上側貯留部３２０と下側貯留部３２４とを隔離するための手段には弁３７０が含まれる。図３に示される実施形態では、上側貯留部３２０から下側貯留部３２４に細胞濃縮剤３３０を移動するための手段には、通路３１６及び弁３７０が含まれる。
【００８８】
図４Ａは、いずれも本開示に基づく検出装置４００の構成要素である、プランジャ４５０の側面図及びハウジング４１０の断面図を示す。プランジャは、シャフト４５１、必要に応じて用いられるＯリング４５５、及び穿孔端４５９を含んでいる。Ｏリングは、ハウジング４１０との液密なシールを与えるように柔軟性のある材料（例えば、ブチルゴム）で形成することができる。ハウジング４１０は、上記に述べたように上側部分４１２及び下側部分４１４を有するように構成することができる。必要に応じて用いられるキャップ４７８は、上記に述べたように構成することができる。破断可能なシール４６０が、ハウジング４１０を３個の貯留部（上側貯留部４２０、下側貯留部４２４、及び第３の貯留部４２６）に分割している。この図では、破断可能なシール４６０は上側貯留部４２０の下側貯留部４２４に近い方の端部に配置されている。破断可能なシール４６０間の空間によって第３の貯留部４２６が画定されている。第３の貯留部４２６内には、細胞抽出剤を含むハイドロゲル４６２が配置されている。別の構成（図に示されていない）では、下側貯留部４２４の近くに１個のみの破断可能なシール４６０を有し、図３Ｃに示されるようにヒドロゲル４６２が下側貯留部４２４内に配置されていてもよい。
【００８９】
上側貯留部４２０内の破断可能なシール４６０の近くには、閉位置で示されている弁ゲート４８２を有するドレーン弁４８０が配置されている。上側貯留部４２０内には、液体試料４４０及び必要に応じて用いられる細胞濃縮剤４３０が更に配置されている。必要に応じて用いられる検出試薬４６５が下側貯留部４２４内に示されている。
【００９０】
図４Ｂは、図４Ａのハウジング４１０及びプランジャ４５０を含む組み立てられた状態の検出装置４００の断面図を示す。細胞濃縮剤４３０は上側貯留部４２０の底に沈殿している。ドレーン弁４８０の弁ゲート４８２は開位置にあり、矢印によって示される方向に力が作用する（例えば、指又は手からの圧力によって）と、清澄化した液体試料４４５がドレーン弁４８０から排出される。図４Ｂには更に、下側貯留部４２４の壁にコーティングされた検出試薬４６５が示されている。
【００９１】
図４Ｃは、図４Ｂの検出装置４００の断面図を示す。この図では、プランジャ４５０のＯリング４５５及び穿孔端４５９が、ドレーン弁４８０の、最も近くの破断可能なシール４６０に近い方の側でハウジング４１０内に挿入されている。この位置では、プランジャ４５０によって、液体試料の細胞濃縮剤４３０を含む部分４４２がプランジャ４５０と最も近くの破断可能なシール４６０との間に閉じ込められる。
【００９２】
図４Ｄは、図４Ｃの検出装置４００の断面図を示す。この図では、プランジャ４５０の穿孔端４５９が破断可能なシール４６０の両方を貫通しており、液体試料の部分４４２が下側貯留部４２４へと移動しており、下側貯留部４２４において部分４４２が検出試薬（図４Ｃに示される）を溶解し、細胞抽出剤を含むヒドロゲル４６２と接触している。
【００９３】
図５Ａは、いずれも検出装置５００の構成要素であるプランジャ５５０及びハウジング５１０の断面図を示す。プランジャ５５０は、必要に応じて用いられるハンドル５５２及び先端部５９０を備えるシャフト５５１を含んでいる。任意の実施形態において、ハンドル５５２は必要に応じて用いられるＯリング５５５を更に含んでもよい。
【００９４】
ハウジング５１０は、上記に述べたように上側部分５１２及び下側部分５１４を有するように構成することができる。破断可能なシール５６０ａ及び５６０ｂが、ハウジング５１０を３個の貯留部（上側貯留部５２０、下側貯留部５２４、及び第３の貯留部５２６）に分割している。この図では、破断可能なシール５６０ａ及び５６０ｂは上側貯留部５２０の、下側貯留部５２４に近い方の端部に配置されている。破断可能なシール５６０ａと５６０ｂとの間の空間によって、第３の貯留部５２６が画定されている。第３の貯留部５２６内には、本明細書で述べるような細胞抽出剤を含むヒドロゲル５６２が配置されている。図に示される実施形態では、下側貯留部５２４は必要に応じて用いられる検出試薬５６５を含んでいる。別の構成（図に示されていない）では、下側貯留部の近くに１個のみの破断可能なシールを有し、図３Ｃに示されるようにヒドロゲルが下側貯留部内に配置されてもよい。
【００９５】
ハンドル５５２は、例えば、プラスチック、木材、金属、及びこれらの組み合わせなどの各種の材料から、当該技術分野では周知のプロセスを用いて作製することができる。必要に応じて用いられるＯリング５５５は、ハンドル５５２の切り欠き５５４内に配置されている。ハンドル５５２は、プランジャ５５０がハウジング５１０に完全に挿入される際に、ハンドル５５２の少なくとも一部がハウジング５１０に挿入されうるような形状及び寸法とすることができる。一実施形態では、ハンドル５５２は、ハウジング５１０の開口部と係合して、ハンドル５５２がハウジング５１０に完全に挿入されることを防止するリム５５４を更に含む。
【００９６】
プランジャ５５０のシャフト５５１は、例えば、プラスチック、木材、金属、及びこれらの組み合わせなどの各種の材料で形成することができる。シャフト５５１の一端は、例えば、凹部（図５に示される）に圧入することにより、超音波溶接により、又は接着剤を使用することによりハンドル５５２に対して結合される。シャフト５５１の他端は、例えば、圧入により、超音波溶接により、又は接着剤を使用することにより先端部５９０に対して結合される。
【００９７】
プランジャ５５０の先端部５９０の細部が図６Ａ及び６Ｂに示されている。
【００９８】
図６Ａは、部分的に断面にて示された図５Ａの先端部５９０の部分分解側面図を示す。先端部６９０は、本体６９１、一方向弁６９７、及びフィルター６９６を含んでいる。
【００９９】
本体６９１は、第１の端部６９１ａ、第２の端部６９１ｂ、及び第１の端部６９１ａから第２の端部６９１ｂへと本体６９１を通じて延びる導管６９２を含んでいる。第１の端部６９１ａにおいて、導管６９２はプランジャのシャフト６５１によってシールされている。第２の端部６９１ｂにおいて、導管６９２は陥凹した開口部６９４内に開口する。２本のドレーン通路６９５が、本体６９１の第１の端部６９１ａから導管６９２へと延びている。したがって、各ドレーン通路は導管６９２及び陥凹開口部６９４に流体接続されている。一実施形態（図に示されていない）では、先端部６９０は１本のみのドレーン通路６９５を含んでもよい。複数のドレーン通路６９５によれば背圧が低くなりうるために、先端部６９０を通じた流体の輸送速度が大きくなり有利である。
【０１００】
本体６９１は、例えば、型成形することなどによりプラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレンなど）から作製することができる。本体６９１は、ハウジング（例えば、図５Ａのハウジング５１０）内に嵌合するような形状及び寸法に構成される。任意の実施形態において、本体６９１又はＯリング６８６は、本体６９１がハウジングに挿入される際に、ハウジングの壁と実質的に液密なシールを形成することができる。Ｏリング６８６を含む任意の実施形態では、Ｏリング６８６は液密なシールを形成することと、Ｏリング６８６がハウジングの壁に対して動かされる際に、ハウジングの壁から粒子状物質（例えば、細胞濃縮剤）を拭い取ることとの両方の機能を有しうる。シャフト６５１は、当該技術分野では周知の手段によって（例えば、接着剤、圧入などにより）導管６９２と連結することができる。必要に応じて用いられるＯリング６８６は、本体６９１の切り欠き６８９内に配置される。
【０１０１】
先端部６９０はフィルター６９６を更に含んでいる。フィルター６９６は、本体６９１に対して結合されている。図に示される実施形態では、フィルター６９６は、陥凹開口部６９４に圧入及び／又は接着剤により結合することが可能な多孔質材料で形成されている。特定の実施形態では、多孔質材料は半剛性の多孔質材料（例えば、ポレックス社（Porex Corporation）（ジョージア州フェアバーン）により部品番号Ｘ６８５４として販売されるＰＯＲＥＸ濾過媒質）であってよい。フィルター６９６は、比較的角張った、あるいは尖った端部を有するように構成することにより、端部が破断可能なシールを容易に貫通することができる。代替的な実施形態（図に示されていない）では、フィルターは、本体に対して結合された膜フィルターからなるものでよい。膜フィルターは本体と結合されると、導管及びドレーン通路を含む流体経路の一部を形成する。
【０１０２】
特定の実施形態では、フィルター６９６の多孔度は、フィルター６９６が比較的大きな粒子（例えば、＞１μｍ、＞５μｍ、又は＞１０μｍ）の通過のみを防止するように選択することができる。比較的大きな粒子には、例えば、本明細書で述べるような細胞濃縮剤が含まれる。これらの実施形態では、細菌、酵母、及び／又は真菌類（カビ）の糸状体などの微生物はフィルター６９６を通過することができる。
【０１０３】
特定の実施形態では、フィルター６９６の多孔度は、フィルター６９６が比較的小さな粒子（例えば、＜１μｍ、＜０．４５μｍ、又は＜０．２μｍ）の通過のみを防止するように選択することができる。これらの実施形態では、細菌、酵母、及び／又は真菌類（カビ）の糸状体などの微生物はフィルター６９６によって保持されうる。
【０１０４】
先端部６９０は、陥凹開口部６９４内においてフィルター６９６と導管６９２との間に配置される一方向弁６９７を更に含む。必要に応じて用いられる、一方向弁６９７を定位置に保持する機能を有する保持ワッシャ６９８も更に示されている。一方向弁６９７はプラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステルなど）又はゴムで形成することができ、例えば、ダックビル弁として構成することができる。使用時には、一方向弁６９７は、フィルター６９６を通過した液体の流れがフィルター６９６を通じて逆方向に戻ることを実質的に防止する。
【０１０５】
図６Ｂは、組み立てられた状態の図６Ａの先端部６９０の、部分的に断面にて示された側面図を示す。一方向弁６９７、必要に応じて用いられる保持ワッシャ６９８、及びフィルター６９６が陥凹した開口部内に配置され、導管６９２及びドレーン通路６９５と流体接続している。シャフト６５１は、先端部６９０の本体６９１に対して結合されている。
【０１０６】
図５Ａを再び参照すると、ハウジング５１０及びプランジャ５５０を含む検出装置５００は、微生物、特に生きた微生物を検出するための方法において使用される。
【０１０７】
使用時には、液体試料はハウジング５１０の上側貯留部５２０内に移され、そこで細胞濃縮剤５３０と接触させられる。液体試料５４０がハウジング５１０に加えられた後、プランジャ５５０の先端部がハウジング５１０に挿入され、図５Ｂに示されるようにハウジング５１０の下側貯留部５２４の方向に押される（例えば、手動により、又は機械的に）。プランジャ５５０の先端部５９１が液体試料５４０と接触すると、図５Ｂに示されるように液体は先端部５９０を通過してハウジング５１０内に戻る。このプロセスでは、細胞濃縮剤５３０、及び特定の実施形態では遊離微生物が、液体試料の第３の貯留部５２６に近い部分５４２内に保持される。
【０１０８】
プランジャ５５０の先端部５９０が図に示されていない破断可能なシール５６０ａを貫通すると、液体試料の細胞濃縮剤５３０を含む部分５４２がヒドロゲル５６２と接触する。プランジャ５５０が更に動く（図５Ｄに示されるように）と破断可能なシール５６０ｂを貫通し、これにより液体試料の部分５４２及びヒドロゲル５６２が下側貯留部５２４に移動し、そこで検出試薬５６５と接触する。
【０１０９】
図７Ａは、本開示に基づく検出装置７００の別の実施形態の側断面図を示す。検出装置７００はプランジャ７５０及びハウジング６１０を含んでいる。
【０１１０】
ハウジング７１０は、上記に述べたようにして上側部分７１２及び下側部分７１４を有するように構成することができる。破断可能なシール７６０ａ及び７６０ｂが、ハウジング７１０を３個の貯留部（上側貯留部７２０、下側貯留部７２４、及び第３の貯留部７２６）に分割している。この図では、破断可能なシール７６０ａ及び７６０ｂは、上側貯留部７２０の下側貯留部７２４に近い方の端部に配置されている。破断可能なシール７６０ａと７６０ｂとの間の空間によって第３の貯留部７２６が画定されている。第３の貯留部７２６内には、細胞抽出剤を含むヒドロゲル７６２が配置されている。図に示される実施形態では、下側貯留部７２４は必要に応じて用いられる検出試薬７６５を含んでいる。別の構成（図に示されていない）では、下側貯留部７２４の近くに１個のみの破断可能なシール７６０を有し、図３Ｃに示されるようにヒドロゲル７６２が下側貯留部７２４内に配置されてもよい。
【０１１１】
プランジャ７５０は、ハンドル７５２及び先端部７９０に連結されたシャフト７５１を含んでいる。この実施形態では、シャフト７５１は中空であり、ハンドルはシャフト７５１の内部と外部との間で圧力を等しくするための通気口７４８を含んでいる。プランジャは、必要に応じて用いられるドレーン管７５３を更に含んでいる。ドレーン管７５３は先端部７９０から液体濾液を受けて、この濾液をシャフト７５１の内部に分配する。ドレーン管７５３は更に、オーバーフロー弁として機能することによって逆方向に先端部７９０を通じて逆流する濾液の量を低減させる。
【０１１２】
プランジャ７５０の先端部７９０の細部が図８に示されている。
【０１１３】
図８Ａは、部分的に断面にて示された図７Ａの先端部７９０の部分分解側面図を示す。先端部８９０は、本体８９１、必要に応じて用いられる一方向弁８９７、及びフィルター８９６を含んでいる。図８Ａには更には、プランジャ８５０の、中空シャフト８５１及びドレーン管８５３を含む部分も示されている。
【０１１４】
本体８９１は、第１の端部８９１ａ、第２の端部８９１ｂ、及び第１の端部８９１ａから第２の端部８９１ｂへと本体８９１を通じて延びる導管８９２を含んでいる。第１の端部８９１ａにおいて、導管８９２はプランジャのドレーン管８５３と連結されている（例えば、圧入、及び接着剤、又はネジによる連結により）。第２の端部８９１ｂにおいて、導管８９２は陥凹した開口部８９４内に開口している。したがって、陥凹開口部８９４は導管８９２及びドレーン管８５３と流体連結されている。
【０１１５】
本体８９１は、例えば、型成形することなどによりプラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレンなど）から作製することができる。本体８９１は、ハウジング（例えば、図７Ａのハウジング７１０）内に嵌合するような形状及び寸法に構成される。任意の実施形態において、本体８９１又はＯリング８８６は、本体８９１がハウジングに挿入される際に、ハウジングの壁と実質的に液密なシールを形成することができる。Ｏリング８８６を含む任意の実施形態では、Ｏリング８８６は液密なシールを形成することと、Ｏリング８８６がハウジングの壁に対して動かされる際に、ハウジングの壁から粒子状物質（例えば、細胞濃縮剤）を拭い取ることとの両方の機能を有しうる。シャフト８５１は、当該技術分野では周知の手段によって（例えば、接着剤、圧入などにより）導管８９２と連結することができる。必要に応じて用いられるＯリング８８６は、本体８９１の切り欠き８８９内に配置される。
【０１１６】
先端部８９０はフィルター８９６を更に含んでいる。フィルター８９６は、陥凹開口部８９４において本体８９１に対して結合されている。図に示される実施形態では、フィルター８９６は、陥凹開口部８９４に圧入及び／又は接着剤により結合することが可能な多孔質材料で形成されている。特定の実施形態では、多孔質材料は半剛性の多孔質材料（例えば、ポレックス社（Porex Corporation）（ジョージア州フェアバーン）により部品番号Ｘ６８５４として販売されるＰＯＲＥＸ濾過媒質）であってよい。フィルター８９６は、比較的角張った、あるいは尖った端部を有するように構成することにより、端部が破断可能なシールを容易に貫通することができる。代替的な実施形態（図に示されていない）では、フィルターは、本体に対して結合された膜フィルターからなるものでよい。膜フィルターは本体と結合されると、導管及びドレーン通路を含む流体経路の一部を形成する。
【０１１７】
特定の実施形態では、フィルター８９６の多孔度は、フィルター８９６が比較的大きな粒子（例えば、＞１μｍ，＞５μｍ、又は＞１０μｍ）の通過のみを防止するように選択することができる。比較的大きな粒子には、例えば、本明細書で述べるような細胞濃縮剤が含まれる。これらの実施形態では、細菌、酵母、及び／又は真菌類（カビ）の糸状体などの微生物はフィルター８９６を通過することができる。
【０１１８】
特定の実施形態では、フィルター８９６の多孔度は、フィルター８９６が比較的小さな粒子（例えば、＜１μｍ、＜０．４５μｍ、又は＜０．２μｍ）の通過のみを防止するように選択することができる。これらの実施形態では、細菌、酵母、及び／又は真菌類（カビ）の糸状体などの微生物はフィルター８９６によって保持されうる。
【０１１９】
先端部８９０は、陥凹開口部８９４内においてフィルター８９６と導管８９２との間に配置される、必要に応じて用いられる一方向弁８９７を更に含みうる。必要に応じて用いられる、一方向弁８９７を定位置に保持する機能を有する保持ワッシャ８９８も示されている。一方向弁８９７は、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステルなど）又はゴムで形成することができ、例えば、ダックビル弁として構成することができる。使用時には、一方向弁８９７は、フィルター８９６を通過した液体の流れがフィルター８９６を通じて逆方向に戻ることを実質的に防止する。
【０１２０】
図８Ｂは、組み立てられた状態の図７Ａの先端部７９０の、部分的に断面にて示された側面図を示す。一方向弁８９７、必要に応じて用いられる保持ワッシャ８９８、及びフィルター８９６が陥凹した開口部内に配置され、導管８９２及びドレーン管８５３と流体接続している。シャフト８５１は、先端部８９０の本体８９１に対して結合されている。
【０１２１】
図７Ａを再び参照すると、ハウジング７１０及びプランジャ７５０を含む検出装置７００は、微生物、特に生きた微生物を検出するための方法において使用される。
【０１２２】
使用時には、液体試料はハウジング７１０の上側貯留部７２０内に移され、そこで細胞濃縮剤７３０と接触させられる。液体試料７４０がハウジング７１０に加えられた後、プランジャ７５０の先端部７９０がハウジング７１０に挿入され、図７Ｂに示されるようにハウジング７１０の下側貯留部７２４の方向に押される（例えば、手動により、又は機械的に）。プランジャ７５０の先端部７９１が液体試料７４０と接触すると、図７Ｂに示されるように液体は先端部７９０を通過して、ドレーン管７５３を通過して、プランジャ７５０の中空シャフト内に戻る。このプロセスでは、細胞濃縮剤７３０、及び特定の実施形態では、遊離微生物が、液体試料の第３の貯留部７２６に近い部分７４２内に保持される。
【０１２３】
プランジャ７５０の先端部７９０が図に示されていない破断可能なシール７６０ａを貫通すると、液体試料の細胞濃縮剤７３０を含む部分７４２がヒドロゲル７６２と接触する。プランジャ７５０が更に動く（図７Ｄに示されるように）と破断可能なシール７６０ｂを貫通し、これにより液体試料の部分７４２及びヒドロゲル７６２が下側貯留部７２４に移動し、そこで検出試薬７６５と接触する。
【０１２４】
本開示の装置は、ハウジング内に破断可能なシールを含んでいる。破断可能なシールが穿孔されることによって、装置の１つの区画から別の区画へと細胞濃縮剤が輸送される。特定の実施形態では、このプロセスで移動させられる細胞濃縮剤の量を、破断可能なシールの比較的面積に細胞濃縮剤を集めることによって大きくすることができる。図９は、細胞濃縮剤の回収率を高めるための回収要素９６７の一実施形態を示す。回収要素９６７は、本開示に基づく検出装置のハウジング内に嵌合するような寸法に構成されている。回収要素９６７は、細胞濃縮剤（図に示されていない）を含む試料の方向に向けられる面取りされた縁部９６８を含んでいる。通常、面取りされた縁部９６８は、重力によって沈降する粒子を回収するように上側を向いている。また、面取りされた縁部９６８を、例えば遠心力又は流体力の方向に向けることによって、重力以外の力が作用する粒子を回収することもできる。回収要素９６７は、必要に応じて用いられる破断可能なシール９６９を更に含む。
【０１２５】
回収要素９６７は、例えば、ポリマー（例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、並びにこれらの組み合わせ及び誘導体）、ガラス、及び金属などの各種の材料で形成することができる。回収要素９６７は、その表面に対する粒子の接着を阻止するための潤滑性コーティングを更に含んでもよい。面取りされた縁部９６８は、その斜面に沿った粒子の運動を促進するために角度（例えば、４５°の角度、４５°よりも大きな角度）が付けられていてもよい。破断可能なシール９６９は本明細書に述べられるようにして作製し、本明細書に述べられるような手段によって回収要素９６７に結合することができる。
【０１２６】
図１０Ａは、回収要素１０６７を含む検出装置１０００の一実施形態を示す。装置１０００は、ハウジング１０１０及びプランジャ１０５０を含んでいる。ハウジング１０１０は、上側部分１０１２及び下側部分１０１４を含んでいる。上側部分１０１２の内部かつ下側部分１０１４の近くに、破断可能なシール１０６９が結合された回収要素１０６７が配置されている。破断可能なシール１０６９は、回収要素１０６７の下側部分１０１４に面した側面に結合されている。したがって破断可能なシール１０６９は、ハウジング１０１０を上側貯留部１０２０及び下側貯留部１０２４の２個の隔離された貯留部に分割する。
【０１２７】
プランジャ１０５０は、ハンドル１０５２、シャフト１０５１、及び先端部１０９０を含む。ハンドル１０５２は上記に述べたように形成することができ、プランジャ１０５０がハンドル１０１０内に過度に深く挿入されることを防止するための、ハウジング１０１０と係合する、必要に応じて用いられるリム１０５４を含んでよい。ハンドル１０５２は、ネジ嵌め又は他の連結手段（例えば、圧入、接着剤）によってシャフト１０５１に対して連結することができる。先端部１０９０は、本明細書で述べる他の先端部の実施形態について述べられるプロセス及び材料を用いて作製することができる。先端部１０９０は１以上のガイド１０８３を含んでもよい。各ガイドはハウジング１０１０の内部にゆるく嵌まるような寸法に構成され、先端部１０９０がハウジング１０１０を通じて長手方向に動く際に、先端部１０９０の横方向の運動を低減させる機能を有する。
【０１２８】
先端部１０９０は、先端部１０９０上の固定位置に保持されたスクレーパー１０８６を更に含んでいる。図の実施形態では、スクレーパー１０８６は保持部材１０８７によって固定位置に保持されている。保持部材１０８７は先端部１０９０の一部として成形又は機械加工するか、あるいは先端部１０９０に結合されたブラケット又は複数のブラケットからなるものでよい。また、スクレーパー１０８６を先端部１０９０に直接結合する（例えば、接着剤により結合する）こともできる。
【０１２９】
スクレーパー１０８６はディスク形状をしており、ハウジング１０１０の内部に比較的緊密な嵌合を形成するような寸法となっている。特定の実施形態では、スクレーパーはＯリングを含みうる。スクレーパー１０８６は、水性の液体に浸漬される際に、その形状をほぼ維持する必要がある。スクレーパーはハウジングの内部に比較的緊密な嵌合を形成するような寸法でなければならないが、スクレーパーは、プランジャがハウジング１０１０内の液体試料を通じて押されるに従って液体がその縁部を回り込んで流れることができるように比較的可撓性のものでなければならない。スクレーパー１０８６を作製するのに適した材料としては、例えば、ポリウレタンゴムが挙げられる。
【０１３０】
使用時には、図１０Ｂに示されるように液体試料１０４０と細胞濃縮剤１０３０とは、装置のハウジング１０１０内で接触させられる。プランジャ１０５０がハウジング１０１０内に挿入され、プランジャ１０５０の先端部１０９０がハウジング１０１０の底の方向に押される。先端部１０９０が液体試料１０４０を通過するに従って、スクレーパー１０８６によって細胞濃縮剤１０３０がハウジング１０１０の底の方向に押されるのと同時に、液体試料１０４０がスクレーパー１０８６の縁部を回り込んで流れる。有利な点として、この装置によって使用者は、細胞濃縮剤１０３０が重力によってハウジング１０１０の底へと沈降させられる場合に、可能であるよりも大幅に短い時間で細胞濃縮剤１０３０を回収かつ濃縮することができる。更に、可撓性のスクレーパーによって、スクレーパーがなければハウジングの壁に接着しうる細胞濃縮剤１０３０の部分の回収が容易となる。したがって、本発明の装置１０００は細胞濃縮剤の回収率を高め、これにより微生物を濃縮するために細胞濃縮剤を使用する方法の感度を高めるものである。
【０１３１】
細胞濃縮剤が強磁性材料（例えば、粒子）を含む試料調製及び検出装置では、磁石又は電磁石を装置の近傍に配置することによって粒子（及び粒子に結合した微生物）を、粒子を回収し、かつ／又は粒子を別の貯留部に移すための所望の位置に引き寄せることができる点は認識されるはずである。特定の実施形態では、細胞濃縮剤が液体試料中の微生物のほぼすべてを結合するだけの充分な時間の後に、磁石を装置の近傍（例えば、装置の底の近傍）に配置することができる。
【０１３２】
生きた細胞からの生物学的検体の検出方法：
本開示の方法には、有効量の細胞抽出剤への曝露後に、例えば生きた微生物などの、生きた細胞から放出される生物学的検体を検出するための方法が含まれる。
【０１３３】
本開示の方法には、生きた細胞を含むことが疑われる試料、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物を形成することが含まれる。本開示の方法は、生物学的検体を検出する工程を更に含む。生物学的検体を検出する工程は、試料中の生物学的検体の量を定量することを更に含みうる。
【０１３４】
一態様では、本開示は試料中の細胞を検出する方法を提供する。本方法は、細胞濃縮剤、細胞抽出剤を含むヒドロゲル、及び細胞を含むことが疑われる液体試料を提供する工程を含む。好適な細胞濃縮剤が、本明細書にその全容を援用する、２００７年１０月３日出願の発明の名称が「微生物の濃縮プロセス」（MICROORGANISM CONCENTRATION PROCESS）である米国特許出願第６０／９７７，１８０号に述べられている。
【０１３５】
本方法は、液体試料を細胞濃縮剤と所定の時間にわたって接触させる工程を更に含む。細胞濃縮剤は、粒子、繊維、粒子を含むマトリクス（例えば、繊維状マトリクス）、又は上記の２以上のものの任意の組み合わせを含みうる。細胞濃縮剤は、接触時間の間に液体試料に懸濁することができる。懸濁液は試験管、試験管、フラスコ、ビーカー又は本明細書で述べる検出装置のいずれかのような容器に入れることができる。特定の好ましい実施形態では、液体試料は、例えば、懸濁液を攪拌、ボルテックス、又は振動することによって、所定の時間にわたって細胞濃縮剤と混合される。細胞濃縮剤が液体試料と接触させられている間に、液体試料からの細胞が細胞濃縮剤と結合する。
【０１３６】
本方法は、液体試料の少なくとも一部から細胞濃縮剤を分離する工程を更に含む。このプロセスにおいて、細胞濃縮剤を最初の液体試料よりも小さな体積に濃縮することができる。細胞濃縮剤は、様々な手段によって液体試料の少なくとも一部から分離することができる。例えば、細胞濃縮剤が液体試料よりも大きな比重を有する場合、細胞濃縮剤は懸濁液の底に沈降しうる。液体試料の少なくとも一部を除去する（例えば、ピペッティング又はデカンテーションにより）ことができる。これに代えるか又はこれに加えて、液体試料の少なくとも一部を遠心分離又は濾過によって除去することもできる。
【０１３７】
フィルターはその孔径によって（例えば、その泡立ち点の孔径によって）定義することができる。フィルターの泡立ち点の孔径は、一般的にフィルターの孔の最大径の平均である。特定の実施形態では、フィルターは細胞濃縮剤の平均径よりも小さい平均孔径を有しうる。これらの比較的大きな孔径を有するフィルターを利用することができるために、本明細書で開示される方法は、水試料などの試料から微生物を分離するための他の方法と比較した場合に大きな利点を有する。
【０１３８】
一実施形態では、フィルターは少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）以上の平均孔径を有しうる。一実施形態では、フィルターは少なくとも約１．５μｍ以上の平均孔径を有しうる。一実施形態では、フィルターは少なくとも約５μｍ以上の平均孔径を有しうる。一実施形態では、フィルターは少なくとも約１０μｍ以上の平均孔径を有しうる。より大きな孔径のフィルターを利用すると、孔径が大きくなるにつれて背圧が低くなるために、試料はより容易かつ迅速に濾過される。
【０１３９】
試料の濾過は公知の方法によって行うことができる。一実施形態では、選択される濾過方法は、その方法の特定の用途の少なくとも一部によって決定されうる。例えば、試料は、重力によって陽圧を作用させることにより、負の真空を用いて濾過することができる。試料を濾過するために使用される特定の方法は、本方法を実行するために利用される装置の種類の少なくとも一部によって決定されうる。例えば、負の真空を利用するためには、装置を真空源に取り付ける、あるいは逆向きに取り付けることができるポートを有するように構成することが可能であり、陽圧を作用させるためには、使用者が手で力を加えることによって陽圧を作用させることができるように装置を構成することが可能である。一実施形態では、試料は陽圧を作用させることによって濾過することができる。陽圧を利用した（又は重力を利用した）濾過によれば、真空ポンプなどの更なる機器を一切使用することなく、現場で本方法を容易に行うことができるという利点が与えられる。
【０１４０】
特定の実施形態では、遠心分離工程において、細胞濃縮剤は液体から分離する（例えば、沈降によって）が、細胞濃縮剤に結合していない微生物（例えば、細菌、酵母カビ、胞子）は液体中に浮遊したままとなるような比較的低速の遠心分離を使用することができる。
【０１４１】
必要に応じて、細胞濃縮剤を洗浄液（例えば、水又は緩衝溶液）に再懸濁し、洗浄液の少なくとも一部から細胞濃縮剤を分離することができる。洗浄工程は、増殖及び／又は検出プロセスを妨害しうる夾雑物を液体試料から除去する機能を有しうる点は認識されるであろう。
【０１４２】
本方法は、分離された細胞濃縮剤及びヒドロゲルを含む液体混合物を形成する工程を更に含み、この工程においてヒドロゲルから細胞抽出剤が放出される。特定の実施形態では、細胞濃縮剤が液体試料の少なくとも一部から分離される際に、細胞濃縮剤が液体の残部に残る。必要に応じて更なる液体（例えば、水又は緩衝溶液）を細胞濃縮剤に加えることができる。細胞濃縮剤が液体試料から濾過される実施形態では、細胞濃縮剤を所定の体積の液体（例えば、水又は緩衝溶液）に再懸濁することができる。細胞濃縮剤を含む液体懸濁液をヒドロゲルと接触させることにより、細胞抽出剤を液体混合物中に放出させる。細胞濃縮剤を回収するためにフィルターを使用する方法では、細胞濃縮剤を含む液体懸濁液がフィルターを含んでもよい。混合物中に細胞が存在する場合に、細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤をヒドロゲルから放出させることができる。有効量の細胞抽出剤の放出は、所定の時間にわたって起こりうる（例えば、最大で数秒間、最大で数分間、最大で数時間、又はそれよりも長時間）。
【０１４３】
本方法は、検体を検出する工程を更に含む。生物学的検体の検出では、検出システムを使用することができる。ヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ）、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又は酵素（例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、又はアデニル酸キナーゼ）などの特定の生物学的検体の検出システムは当該技術分野では周知のものであり、本開示に従って使用することができる。本開示の方法には、生物学的検体を検出するための公知の検出システムが含まれる。この検出システムの精度及び感度は、細胞抽出剤によって大きく低減されないことが好ましい。検出システムは均一アッセイを含むことがより好ましい。
【０１４４】
特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は、容器（例えば、試験管、多穴プレート、及び本明細書で述べる検出装置）中の検体を直接検出することを含んでよく、この工程では試料、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物が形成される。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程は、液体混合物の少なくとも一部を、試料、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物が形成される容器以外の容器に移すことを含んでよい。特定の実施形態では、生物学的検体を検出する工程には、例えばｐＨ調整、希釈、濾過、遠心分離、抽出などの１以上の試料調製プロセスが含まれうる。
【０１４５】
特定の実施形態では、検出システムは検出試薬を含む。検出試薬としては、例えば、色素、酵素、酵素基質、結合相手（例えば、抗体、モノクローナル抗体、レクチン、受容体など）、標識された結合相手、及び／又は、補因子が挙げられる。特定の実施形態では、検出試薬は、２００８年９月３０日出願の発明の名称が「生体検出物品」（BIODETECTION ARTICLES）である米国特許出願第６１／１０１，５４６号に述べられるような酵素又は酵素基質を含むヒドロゲルなどのヒドロゲルを含む。特定の実施形態では、検出システムは器具を含む。検出器具の非限定的な例としては、分光光度計、ルミノメーター、プレートリーダー、サーモサイクラー、インキュベーターが挙げられる。
【０１４６】
検出システムは検出器具を含んでよい。検出器具は当該技術分野では周知のものであり、比色測定法（すなわち、光の吸光度及び／又は散乱により）、蛍光測定法、又は光量測定法によって生物学的検体を検出するために使用することができる。発光による生体分子検出の例は、Ｆ．Ｇｏｒｕｓ及び、Ｅ．Ｓｃｈｒａｍ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｏ−ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７９、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２５：５１２〜５１９）に述べられている。
【０１４７】
生物学的検体の検出システムの一例としては、ＡＴＰ検出システムがある。ＡＴＰ検出システムは、酵素（例えば、ルシフェラーゼ）及び酵素基質（例えば、ルシフェリン）を含んだものでよい。ＡＴＰ検出システムは、ルミノメーターを更に含んでもよい。特定の実施形態では、ルミノメーターには、例えば、ＦＢ−１２シングルチューブ型ルミノメーター（バートホールド・ディテクション・システムズ・ユー・エス・エー社（Berthold Detection Systems USA）、テネシー州オークリッジ）のようなベンチトップ型のルミノメーターが含まれる。特定の実施形態では、ルミノメーターには、例えば、ＮＧルミノメーターＵＮＧ２（スリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール））のような手持ち式のルミノメーターが含まれる。
【０１４８】
特定の実施形態では、生物学的検体は単一の時点において検出される。特定の実施形態では、生物学的検体は２以上の時点において検出される。２以上の時点で生物学的検体が検出される場合、第１の時点（例えば、試料の少なくとも一部の生きた細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから放出される前）において検出された生物学的検体の量を、第２の時点（例えば、試料の少なくとも一部の生きた細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤がヒドロゲルから放出された後）において検出された生物学的検体の量と比較することができる。特定の実施形態では、１以上の時点における生物学的検体の測定は、処理装置を備えた器具によって行われる。特定の好ましい実施形態では、第１の時点における生物学的検体の量と、第２の時点における生物学的検体の量との比較は処理装置によって行われる。
【０１４９】
例えば、操作者は、試料、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物が形成された後に、試料中の生物学的検体の量を測定する。この第１の測定における生物学的検体の量（Ｔ１）は、「遊離した」（すなわち、非細胞性）生物学的検体、及び／又は、試料中の非生存細胞からの生物学的検体の存在を示しうる。特定の実施形態では、第１の測定は、試料、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物が形成された直後（例えば、約１秒後）に行うことができる。特定の実施形態では、第１の測定は、試料、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物が形成された少なくとも約５秒後、少なくとも約１０秒後、少なくとも約２０秒後、少なくとも約３０秒後、少なくとも約４０秒後、少なくとも約６０秒後、少なくとも約８０秒後、少なくとも約１００秒後、少なくとも約１２０秒後、少なくとも約１５０秒後、少なくとも約１８０秒後、少なくとも約２４０秒後、少なくとも約５分後、少なくとも約１０分後、少なくとも約２０分後に行うことができる。これらの時間は例示的なものであり、生物学的検体の検出が開始されるまでの時間のみを挙げたものである。生物学的検体の検出を開始することには、試料を希釈すること、及び／又は細胞抽出剤の活性を阻害する試薬を添加することが含まれる。特定の検出システム（例えば、核酸の増幅又はＥＬＩＳＡ）は、通常、完了までに数分〜数時間を要する点は認識されるであろう。
【０１５０】
操作者は、生物学的検体の第１の測定を行った後、細胞抽出剤を含むヒドロゲルに試料を所定の時間にわたって接触させる。試料を所定の時間にわたってヒドロゲルと接触させた後、生物学的検体の第２の測定を行う。特定の実施形態では、第２の測定は、生物学的検体の第１の測定後の約０．５秒以内、約１秒以内、約５秒以内、約１０秒以内、約２０秒以内、約３０秒以内、約４０秒以内、約６０秒以内、約９０秒以内、約１２０秒以内、約１８０秒以内、約３００秒、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約６０分以内、又はそれ以降に行うことができる。これらの時間は例示的なものであり、生物学的検体を検出するための第１の測定が開始されてから生物学的検体を検出するための第２の測定が開始されるまでの時間間隔のみを挙げたものである。生物学的検体の検出を開始することには、試料を希釈すること、及び／又は、細胞抽出剤の活性を阻害する試薬を添加することが含まれる。
【０１５１】
好ましくは、生物学的検体の第１の測定は、試料、及び細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物が形成された約１秒後〜約２４０秒後に行われ、第１の測定の後に行われる第２の測定は、液体混合物が形成された約１．５秒後〜約５４０秒後に行われる。より好ましくは、生物学的検体の第１の測定は、液体混合物が形成されてから約１秒後〜約１８０秒後に行われ、第１の測定の後に行われる第２の測定は、液体混合物が形成されてから約１．５秒後〜約１２０秒後に行われる。最も好ましくは、生物学的検体の第１の測定は、液体混合物が形成されてから約１秒後〜約５秒後に行われ、第１の測定の後に行われる第２の測定は、液体混合物が形成されてから約１．５秒後〜約１０秒後に行われる。
【０１５２】
操作者は、第１の測定において検出された生物学的検体の量を、第２の測定において検出された生物学的検体の量と比較する。第２の測定において検出された生物学的検体の量が増加している場合、試料中に１以上の生きた細胞が存在することを示す。
【０１５３】
特定の方法では、生きた体細胞（例えば、非微生物細胞）の存在を検出することが望ましい場合がある。これらの実施形態では、ヒドロゲルには、体細胞から生物学的検体を選択的に放出させる細胞抽出剤が含まれる。体細胞の抽出剤の非限定的な例としては、これらに限定されるものではないが、例えば、エトキシル化オクチルフェノールであるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴＸ−１００）及びその他のエトキシル化アルキルフェノールを含む非イオン性エトキシル化アルキルフェノールなどの非イオン性洗剤；例えば、カルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）、ＮＰ−４０、ＴＷＥＥＮ、タージトール、イゲパール、市販のＭ−ＮＲＳ（セルシス社（Celsis）（イリノイ州シカゴ））、Ｍ−ＰＥＲ（ピアース社（Pierce）（イリノイ州ロックフォード））、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｍ（シグマ・アルドリッチ社（Sigma Aldrich））などのベタイン洗剤が挙げられる。細胞抽出剤は、検体及びその検出試薬を不活性化しないように選択されることが好ましい。
【０１５４】
特定の方法では、生きた微生物細胞の存在を検出することが望ましい場合がある。これらの実施形態では、ヒドロゲルには、微生物細胞から生物学的検体を選択的に放出させる細胞抽出剤が含まれる。微生物細胞抽出剤の非限定的な例には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、「セトリミド」（ドデシル−、テトラデシル−、及びヘキサデシル−臭化トリメチルアンモニウムの混合物）、塩化セチルピリジウムなどの四級アンモニウム化合物；トリエチルアミン（ＴＥＡ）及びトリエタノールアミン（ＴｅｏｌＡ）などのアミン；クロルヘキシジン、アレキシジン及びポリヘキサメチレンビグアニドなどのビス−ビグアニド；Ｎ−（ｎ−ドデシル）−ジエタノールアミンなどのジアルキルアンモニウム塩；ポリミキシンＢ（例えば、ポリミキシンＢ１及びポリミキシンＢ２）、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）などの抗生物質；オクチル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシド（本明細書にその全容を援用する米国特許第６，１７４，７０４号を参照）などのアルキルグルコシド又はアルキルチオグルコシド；エトキシル化オクチルフェノールであるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴＸ−１００）及びその他のエトキシル化アルキルフェノール類を含むがこれらに限定されない非イオン性エトキシル化アルキルフェノールなどの非イオン性洗剤；カルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）などのベタイン洗剤；並びに、ポリリシン、ナイシン、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＡ２活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）などのカチオン性、抗細菌性、孔形成性、膜活性、及び／又は細胞壁活性であるポリマー；バクテリオファージ；並びにこれらに類するものが挙げられる。例えば本明細書にそれらの全容を援用する、イオン性界面活性化合物を開示するＭｏｒｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９７）ｖｏｌ．１５２、ｐｐ．３８５〜３９４ページ、及び米国特許第４，３０３，７５２号を参照されたい。細胞抽出剤は、生物学的検体、及び／又は生物学的検体を検出するために使用される検出試薬を不活性化しないように選択されることが好ましい。
【０１５５】
試料中の生きた微生物細胞の存在を検出するための特定の代替的方法では、試料を所定の時間にわたって体細胞抽出剤で前処理することができる（例えば、試料、及び微生物細胞抽出剤を含むヒドロゲルを含む液体混合物を形成する前に、体細胞を抽出するうえで充分な時間にわたって試料を体細胞抽出剤と接触させる）。この代替的な実施形態では、第１の測定において検出される生物学的検体の量には、体細胞から放出されたすべての生物学的検体が含まれ、第２の測定で検出される更なる生物学的検体（検出される場合）の量には、試料中の生きた微生物細胞からの生物学的検体が含まれることになる。
【０１５６】
試料中の微生物の存在を検出するための方法では、本明細書で開示される検出装置を使用することができる。特定の実施形態では、本方法は、ｉ）細胞を含むことが疑われる試料、ｉｉ）２以上の貯留部及び試料を受容するように構成された開口部を備えるハウジングを含む検出物品、ｉｉｉ）細胞濃縮剤、及び、ｉｖ）細胞濃縮剤を隔離して、ハウジングの上側貯留部から下側貯留部へと移動させるための手段、及び、ｖ）細胞抽出剤を含むヒドロゲルを提供する工程を含む。これらの実施形態では、検出装置は図１〜４に示される検出装置１００、２００、３００、又は４００のいずれか１つのものを含みうる。必要に応じて、検出装置は細胞濃縮剤及び／又はヒドロゲルを含んでもよい。
【０１５７】
本方法は、ハウジングの上側貯留部内に試料を移動させる工程を更に含み、この工程では液体媒質中で試料物質を細胞濃縮剤と接触させる。試料には、ハウジングの上側貯留部に移動させられる液体、固体、半固体又はこれらの組み合わせが含まれうる。試料が液体媒質を含んでいない場合には、液体媒質（例えば、水又は緩衝溶液など）を上側貯留部に加えることができる。細胞濃縮剤を液体試料に加える。細胞濃縮剤を、所定の時間にわたって液体試料と接触させる。必要に応じて、ハウジングを例えば振盪、攪拌、ボルテックス、及び／又は振動することによって、接触時間の間に混合物を混合することができる。試料及び／又は細胞濃縮剤の損失を防止するために、ハウジングは接触時間の間、閉鎖される（例えば必要に応じて用いられるキャップによって）ことが好ましい。
【０１５８】
方法は、液体媒質の少なくとも一部から細胞濃縮剤を隔離する更に工程を含み、細胞濃縮剤を隔離する工程は、細胞濃縮剤をハウジングの下側貯留部に移動させることを含む。本明細書で述べるように、細胞濃縮剤を隔離するための各種の手段がある。細胞濃縮剤を隔離及び移動するための手段の非限定的な例には、プランジャを用いて通路を通じて細胞濃縮剤を分割及び移動すること（図１及び２を参照）、一方向弁のキャビティ内に細胞濃縮剤を回収及び移動すること（図３を参照）、並びに、ドレーン弁及びプランジャを用いて細胞濃縮剤を濃縮及び移動すること（図４を参照）が含まれる。
【０１５９】
本方法は、隔離された細胞濃縮剤及びヒドロゲルを含む液体混合物を形成する工程を更に含み、この工程では細胞抽出剤が混合物中に放出される。細胞濃縮剤を含む液体混合物は、細胞抽出剤を含むヒドロゲルと接触させられる。ヒドロゲル（例えば、ヒドロゲルビーズ）は、ハウジングの上側貯留部及び／又は下側貯留部内で液体混合物と接触させることができる。特定の実施形態では、ハウジングの下側貯留部がヒドロゲルを含み（図１及び３を参照）、液体混合物は下側貯留部に混合物が移される際に、ヒドロゲルと接触する。特定の実施形態では、ヒドロゲルは第３の貯留部内に配置され（図２及び４を参照）、液体試料が上側貯留部から下側貯留部に移される際に、第３の貯留部を液体試料が通過する（これにより液体試料がヒドロゲルと接触する）。
【０１６０】
図２及び４では、破断可能なシールに穿孔して細胞濃縮剤を下側貯留部に移すためのプランジャの使用が示されているが、プランジャの代わりに代替的な器具（例えば、スワブ、ピペット、フィルターなど）を使用することも可能である。このような代替的な器具が使用される方法では、破断可能なシールが代替的器具によって穿孔される際に液体試料の全体が第２の貯留部に移されないように、液体試料の少なくとも一部を除去する（例えば、デカンテーション、ピペッティング、濾過により又はドレーン弁が設けられている場合にはドレーン弁を開放することにより）ことが好ましい。
【０１６１】
本方法は、生物学的検体を検出する工程を更に含む。生物学的検体は、ヒドロゲルから有効量の細胞抽出剤が細胞濃縮剤を含む液体混合物中に放出される前に、検出装置の下側貯留部内で本明細書で述べるようにして検出することができる。生物学的検体は、ヒドロゲルから有効量の細胞抽出剤が細胞濃縮剤を含む液体混合物中に放出された後で、検出装置の下側貯留部内で本明細書で述べるようにして検出することもできる。生物学的検体は、ヒドロゲルから有効量の細胞抽出剤が細胞濃縮剤を含む液体混合物中に放出される前及び後に、検出装置の下側貯留部内で本明細書で述べるようにして検出することもできる。
【０１６２】
本明細書で開示される方法のいずれも、生物学的な増殖工程を更に含みうることは予想されることである。増殖工程は、微生物の増殖を支持する栄養培地を与えることによって促進される。栄養培地は、細胞濃縮剤による微生物の濃縮の前、その間、又はその後に試料と混合することができる。特定の実施形態では、生物学的増殖工程は、細胞濃縮剤によって微生物が濃縮された後であるが、生物学的検体が検出される前に行われる。特定の実施形態では、栄養培地は、試料中に存在しうる他の微生物よりも特定の種類の微生物の増殖にとって有利な栄養素及び／又は選択物質（例えば、塩類、抗生物質）を含有してよい。
【０１６３】
粒子状細胞濃縮剤を濃縮する方法：
本開示は粒子状の細胞濃縮剤を濃縮するための装置を提供する。本方法は、液体試料の一部を液体試料中への粒子状物質の懸濁液から分離する装置を提供する工程を含む。好適な装置としては、例えば、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図７Ａ、及び図１０Ａに図示及び説明される装置が挙げられる。各装置は、粒子状の細胞濃縮剤を含む液体試料を収容するためのハウジングと、粒子状細胞濃縮剤を液体試料の少なくとも一部から分離するための手段とを含んでいる。
【０１６４】
図２Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段には、テーパ領域２１８、及び下側シール２５６を含むプランジャが含まれる。図３Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段には、行き止まり弁３７０及び弁アクチュエータ３７２が含まれる。図４Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段には、ドレーン弁４８０及び弁ゲート４８２が含まれる。図５Ａ及び７Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段には、フィルター５９６が内部に配置された流体経路を含むプランジャが含まれる。図１０Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段には、スクレーパーの縁部とハウジングとの間で液体を通過させるように構成されたスクレーパーを備えるプランジャが含まれる。
【０１６５】
本方法は、液体試料中への粒子状細胞濃縮剤の懸濁液を形成する工程を更に含む。懸濁液はハウジング内において形成するか、あるいはハウジングの外部で形成することができる。懸濁液がハウジングの外部で形成される場合、本方法はハウジング内に懸濁液を移動する工程を更に含む。本方法は、微生物を捕捉するだけの充分な時間にわたって、粒子状細胞濃縮剤を液体試料と接触させる工程を更に含む。接触はハウジング内で起こってもよい。接触はハウジングの外部で起こってもよい。接触はハウジングの外部及び内部の両方で起こってもよい。本方法は、図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ及び１０Ａの装置について上記に述べたように、液体試料中への粒子状物質の懸濁液から液体試料の一部を分離する工程を更に含む。
【０１６６】
試料の調製及び検出キット：
本開示の構成要素及び／又は装置は、使用説明書及び必要に応じて付属物品又は試薬とともにパッケージングすることによって、試料の調製及び検出キットとすることができる。したがって、一態様において本開示は、ｉ）少なくとも２個の貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングと、ｉｉ）ハウジングの上側貯留部を下側貯留部から隔離するための手段と、ｉｉｉ）細胞濃縮剤と、ｉｖ）細胞濃縮剤を上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段とを備えるキットを提供する。上側貯留部は試料を受容するように構成された開口部を含む。下側貯留部はその内部に配置された検出試薬を含む。特定の実施形態では、ハウジングは、本明細書で述べたように上側貯留部を下側貯留部から隔離するための手段を更に含みうる。特定の実施形態では、ハウジングは、細胞濃縮剤を上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段を更に含みうる。特定の実施形態では、細胞濃縮剤はハウジングの上側貯留部内に配置される。
【０１６７】
特定の実施形態では、本開示のキットには、試料調製及び検出装置とともに使用することができる付属物品及び試薬が含まれる。付属物品の非限定的な例としては、試料取得装置、フィルター、グローブ、培養装置（例えば、ペトリ皿、培養試験管、スリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール））より入手されるＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートなど）、核酸の単離又は増幅試薬、ラテラルフロー装置、ＥＬＩＳＡプレート及び試薬などの免疫アッセイ装置、又は上記の物品の２以上のものの任意の組み合わせが挙げられる。付属試薬の非限定的な例としては、水、緩衝剤、指示薬（例えばｐＨ指示薬）、色素、体細胞抽出剤、細胞抽出剤を含むヒドロゲル、本明細書で述べるような結合相手、酵素、酵素基質、オリゴヌクレオチド、対照試料、又は上記の試薬の２以上のものの任意の組み合わせが挙げられる。
【実施例】
【０１６８】
以上、本発明を、その実施を可能とする説明文が与えられた、発明者によって予見される複数の具体的な実施形態を参照して説明した。しかしながら、現時点において予見されえない改変を含む、本発明の実体的でない改変は、これらの実施形態の均等物を構成しうるものである。したがって本発明の範囲は、本明細書に記載された詳細及び構造によって限定されるべきものではなく、以下の請求項及びその均等物によってのみ限定されるべきである。
【０１６９】
材料：
細菌培養は、特に断らないかぎり、すべてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）より入手した。
【０１７０】
水はすべて、特に断らないかぎり、ミリポア社（Millipore Corporation）（マサチューセッツ州ベッドフォード）より販売されるＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）勾配脱イオンシステムを使用して１８メガオームの滅菌脱イオン水として得た。
【０１７１】
ＣＭ−１１１：長球化された非晶質ケイ酸マグネシウム：マイクロスフェアをスリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール）より販売される３Ｍ（商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ＣＭ−１１１として得た。粒子は２．３ｇ／ｃｃの粒子密度を有する中実の球として成形したものであり、約３．３ｍ２／ｇの表面積を有していた。粒子の９９％は約１１マイクロメートル未満であった。粒子の５０％は約５マイクロメートル未満であった。粒子の１０％は約２マイクロメートル未満であった。ＣＭ−１１１マイクロスフェアは、本明細書にその全容を援用する２００９年１２月２２日出願の発明の名称が「微生物の濃縮プロセス及び該プロセスで使用するための濃縮剤」（MICROORGANISM CONCENTRATION PROCESS AND CONCENTRATION AGENT FOR USE THEREIN）である米国特許出願第６１／２８９，２１３号に述べられるようにして調製した。
【０１７２】
５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含むｐＨ  ７．２の１００倍の吸着緩衝液を調製し、使用前にフィルター滅菌した。
【０１７３】
表面を滅菌した各構成要素を、７０％イソプロピルアルコールと接触させた（イソプロピルアルコールで拭くか又はイソプロピルアルコールに浸漬した）。余分なアルコールを流れ落とし、各構成要素を使用前に少なくとも３０分間風乾した。
【０１７４】
化学物質はすべて、特に断らないかぎり、シグマ・アルドリッチ・ケミカル社（Sigma-Aldrich Chemical Company）（ウィスコンシン州ミルウォーキー）より入手した。
【０１７５】
（実施例１）
ヒドロゲルの重合後のヒドロゲルビーズへの細胞抽出剤の取り込み。
【０１７６】
国際特許出願公開第２００７／１４６７２２号の実施例１に述べられるようにしてヒドロゲルビーズを調製した。国際特許出願公開第２００７／１４６７２２号の実施例１９に述べられるようにして乾燥させた後、実施例２３に述べられるようにして活性溶液中に浸漬することによって活性ビーズを調製した。１ｇのビーズを６０℃で２時間乾燥させて、ビーズから水を除去した。乾燥したビーズを２ｇのＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍ（ロンザ・グループ（Lonza Group Ltd.）、スイス、バライス）の５０％（ｗ／ｖ）水溶液中に少なくとも３時間〜一晩、室温で浸漬した。浸漬後、ビーズをブフナー漏斗に注いでビーズの水分を切り、次いで１０〜２０ｍＬの蒸留水ですすいだ。ペーパータオルを押し付けることによって余分な水をビーズ表面から除去した。使用する前に、ビーズを室温で少なくとも２週間、ジャーに保存した。
【０１７７】
（実施例２）
微小粒子の使用による細胞濃縮、並びに細胞抽出剤を充填したヒドロゲル及びＡＴＰ生物発光を利用した検出
３Ｍ（商標）ＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ表面ＡＴＰシステムをスリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール）より入手した。大腸菌ＡＴＣＣ  ５１１８３の純粋培養物をトリプシン処理した大豆ブロス中に接種して、３７℃で一晩増殖させた。細菌培養物をＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液（ｐＨ  ７．２±０．２、一塩基性リン酸カリウム緩衝溶液、ブイ・ダブリュー・アール社（ＶＷＲ）（ペンシルベニア州ウェストチェスター））中で約１０６又は１０５ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、１００マイクロリットルの希釈懸濁液を１０ｍＬの脱イオン水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｂｉｏｃｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ、ミリポア社（Millipore）（マサチューセッツ州））試料の入った個々の試験管に直接加えることによってそれぞれ１０ｍＬ中、約１０５ＣＦＵ又は１０４ＣＦＵを得た。１０ｍｇのオートクレーブしたＣＭ−１１１  ３Ｍ（商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（か焼した非晶質の長球化ケイ酸マグネシウム粉末、スリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール））を細胞の入った試験管に加え、室温で約１５分間混合した。粒子を沈降させ、上清を除去した。粒子を１００μＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液に懸濁し、１．５ｍＬの微量遠心管に移した。４００マイクロリットルのＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ表面ＡＴＰシステムからのルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液を遠心管に加えた。コントロール（非濃縮）反応として、１００μＬの約１０６又は１０５ＣＦＵ／ｍＬの細胞懸濁液を１．５ｍＬの微小遠心管に加え、４００μＬのＣｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムからのルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液を遠心管に加えた。試薬を加えた直後に、細胞抽出剤を含むヒドロゲルビーズ（約１１ｍｇ）を個々の遠心管に加え、相対発光量（ＲＬＵ）の測定値をベンチトップ型ルミノメーター（ターナー・バイオシステムズ社（Turner Biosystems）（カリフォルニア州サニーベール）より販売される２０／２０ｎシングルチューブ型ルミノメーター）で１０秒間隔で記録した。発光量の測定値は、ルミノメーターとともに提供される２０／２０ｎ  ＳＩＳソフトウェアを使用してルミノメーターから得た。光信号を１秒間にわたって積分し、ＲＬＵで表される結果を表１に示した。
【０１７８】
これらのデータは、本明細書で述べるプロトコールを使用することにより、微小粒子が微生物細胞を濃縮することができ、更にヒドロゲルビーズから放出された細胞抽出剤が大腸菌からＡＴＰを抽出することができたことを示している。この結果は、細胞から放出されたＡＴＰがＡＴＰ検出試薬と反応し、測定可能な生物発光を生じたことを更に示している。
【０１７９】
【表１】
0005833450.tif 000002
【０１８０】
（実施例３）
ＡＴＰ生物発光検出システムを利用した一体型試料調製及び検出装置による微生物細胞の検出
この実施例では、図２に示されるような一体型の試料調製及び検出装置２００を使用する。装置の上側貯留部２２０には約１０ｍｇのオートクレーブしたＣＭ−１１１  ３Ｍ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓが入っている。下側貯留部２２４には、約０．６ミリリットルのＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ表面ＡＴＰシステムからのルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液からなる液体検出試薬２６５が入っている。第３の貯留部２２６には、２００８年９月３０日出願の米国特許出願第６１／１０１，５４６号の調製例５に従って調製された２個のＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズが入っている。１０ミリリットルの滅菌脱イオン水を、使用直前に一体型装置２００の上側貯留部２２０に加える。
【０１８１】
大腸菌の一晩培養物を実施例２で述べたようにして調製する。この細菌培養物を、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液中で約１０６又は１０５ＣＦＵ／ｍＬに希釈する。１００マイクロリットルの希釈懸濁液を一体型装置２００の上側貯留部２２０に直接ピペットで加えることによって、それぞれ１０ミリリットル中約１０５ＣＦＵ又は１０４ＣＦＵの懸濁液を得る。キャップ２７８を使用してハウジング２１０を閉鎖し、細菌懸濁液を室温でマイクロスフェア（細胞濃縮剤２３０）と混合して通路２１６内に沈降させる。キャップ２７８を外して、プランジャ２５０を挿入することにより沈降したマイクロスフェアを含む液体試料の部分及びヒドロゲルビーズをＡＴＰ検出試薬の入った下側貯留部２２４内に移す。一体型装置を直ちにルミノメーター（例えば、ＮＧルミノメーターＵＮＧ２）の読み取りチャンバに挿入し、ＵＮＧルミノメーターの非計画試験モードを用いてＲＬＵ測定値を１０秒間隔で記録する。ＲＬＵ測定値をＲＬＵの数がプラトーに達するまで収集する。データをＮＧルミノミーターとともに提供されるソフトウェアを使用してダウンロードする。このデータは、微生物細胞がマイクロスフェアによって濃縮され、ヒドロゲルによって細胞抽出剤が放出され、この細胞抽出剤が細胞からのＡＴＰの放出を引き起こし、かつ細胞から放出されたＡＴＰがＡＴＰ検出システムによって検出されることを示すものである。
【０１８２】
（実施例４）
ＡＴＰ生物発光検出システムを利用した一体型試料調製及び検出装置による微生物細胞の検出
この実施例では、図３に示されるような一体型試料調製及び検出装置３００を使用する。弁アクチュエータ３７２は、使用に先だって、弁キャビティ３７４が上側貯留部３２０と流体連通するように配置されている。装置の上側貯留部３２０には、約１０ｍｇのオートクレーブしたＣＭ−１１１  ３Ｍ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓが入っている。下側貯留部３２４には、約０．６ミリリットルのＣｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ表面ＡＴＰシステムからのルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液からなる液体検出試薬３６５が入っている。ＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズは、２００８年９月３０日出願の米国特許出願第６１／１０１，５４６号の調製例５に従って調製されたものである。１０ミリリットルの滅菌脱イオン水を、使用直前に一体型装置３００の上側貯留部３２０に加える。
【０１８３】
大腸菌の一晩培養物を実施例２で述べたようにして調製する。この細菌培養物をＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液中で約１０６又は１０５ＣＦＵ／ｍＬに希釈する。１００マイクロリットルの希釈懸濁液を一体型装置３００の上側貯留部３２０に直接ピペットで加えることによって、それぞれ１０ミリリットル中約１０５ＣＦＵ又は１０４ＣＦＵの懸濁液を得る。キャップ３７８を使用してハウジング３１０を閉鎖し、細菌懸濁液を室温でマイクロスフェア（細胞濃縮剤３３０）と混合して弁キャビティ３７４内に沈降させる。キャップ３７８を外して、２個のＢＡＲＤＡＣ  ２０５Ｍビーズ（ヒドロゲル３６２）をハウジング３１０の中に落とす。ビーズが弁キャビティ３７４内に沈降した直後に、弁アクチュエータ３７２を回して弁キャビティ内の液体試料の部分（細胞濃縮剤３３０及びヒドロゲル３６２を含む）をＡＴＰ検出試薬の入った下側貯留部３２４内に移す。一体型装置を直ちにルミノメーター（例えば、ＮＧルミノメーター、ＵＮＧ２）の読み取りチャンバに挿入し、ＵＮＧルミノメーターの非計画試験モードを用いてＲＬＵ測定値を１０秒間隔で記録する。ＲＬＵ測定値をＲＬＵの数がプラトーに達するまで収集する。データをＮＧルミノミーターとともに提供されるソフトウェアを使用してダウンロードする。このデータは、微生物細胞がマイクロスフェアによって濃縮され、ヒドロゲルによって細胞抽出剤が放出され、この細胞抽出剤が細胞からのＡＴＰの放出を引き起こし、かつ細胞から放出されたＡＴＰがＡＴＰ検出システムによって検出されることを示すものである。
【０１８４】
（実施例５）
検出装置の調製：
Ｉ型の装置：これらの検出装置では、以下に述べる相違点を有する以外は図１０Ａのハウジングと同様のハウジングを構成した。以下の参照符合は図１０Ａの対応する部材を示す。ハウジング１１００の上側部分１０１２及び下側部分１０１４は、３Ｍ  Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰ試験（スリー・エム社（3M Company）（英国、ブリジェンド））から同様の構成要素を使用して得た。破断可能なシール１０６８が結合された回収要素１０６７を、下側部分１０１４の上側部分に、破断可能なシール１０６８がハウジング１１００の下側部分１０１４に面するようにして圧入した。上側部分１０１２は、ヒートガン（マスター・アプライアンス社（Master Appliances Corp）、ウィスコンシン州ラシーン）を使用してｂｕｙｈｅａｔｓｈｒｉｎｋ．ｃｏｍより入手した、３：１ポリオレフィン２重壁の接着剤でライニングされた熱収縮フィルム（部品番号＿ＨＳＣ３Ａ−０５０−ｃｃ、直径１．５ｃｍ）の２ｃｍの切片を用いて下側部分１０１４と連結した。
【０１８５】
これらの検出装置では、図２Ａのプランジャと同様のプランジャを構成した。以下の参照符合は図２Ａの対応する部材を示す。３Ｍ  Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰ試験からのポリオレフィン製プラスチックハンドル（２５２）の一部、真鍮製金属シャフト（２５１）及びアセタール製穿孔部材２５９を用いてプランジャ（２５０）を組み立てた。ハンドル２５２及び穿孔部材２５９は、ネジによる連結によって真鍮シャフトの両端に取り付けた。真鍮製金属シャフトは長さ１１．５ｃｍ及び直径３．９ｍｍであった。旋盤を使用してシャフトの両端に６ｍｍの６〜２３のネジ山を切った。穿孔部材２５９は、１０インチ（２５．４ｃｍ）のサウスベンド旋盤を使用して１／２インチ（１２．７ｍｍ）のアセタールコポリマーロッド（部品番号８４９７Ｋ２１１、マクマスター・カー社（McMASTER-CARR）カリフォルニア州サンタフェスプリングスより入手）から作製した。下側シール２５６としてＯリング（マクマスター・カー社（McMASTER-CARR）より入手したＢｕｎａ  Ｎ  ＡＳ５６８Ａ−０１０）を使用し、プランジャ２５０の穿孔端２５９の約１１．５ｍｍ上に取り付けた。プランジャは１回の使用毎に表面を滅菌した。
【０１８６】
ＩＩ型の装置：これらの検出装置は、図６Ａに示されるものと同様の先端部を有する図５Ａで図示及び説明したものと同様のプランジャを使用して組み立てた。ハウジングはＩ型の装置について述べたのと同様に構成した。プランジャの先端部は、１０インチ（２５．４ｃｍ）のサウスベンド旋盤を使用して１／２インチ（１２．７ｍｍ）のアセタールコポリマー製ロッド（部品番号８４９７Ｋ２１１、マクマスター・カー社（McMASTER-CARR）（カリフォルニア州サンタフェスプリングス）より入手）から作製した。ダックビル型一方向弁及びプラスチック製保持ワッシャを、プランジャの先端部の本体の陥凹した開口部内に圧入した。フィルターは、ＰＯＲＥＸフィルター（ポレックス社（Porex Corporation）（ジョージア州フェアバーン）より入手される部品番号Ｘ６８５４）を図６Ａに示される形状に機械加工し、一端を先端部の陥凹した開口部に圧入し、弁及び保持ワッシャを定位置に保持するような寸法に形成することによって作製した。プランジャは１回の使用毎に表面を滅菌した。
【０１８７】
ＩＩＩ型の装置：以下に述べる相違点を有する以外は図１０Ａに示されるものと同様の検出装置を構成した。以下の参照符合は図１０Ａの対応する部材を示す。ハウジング１１００の上側部分１０１２及び下側部分１０１４は、３Ｍ  Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰ試験（スリー・エム社（3M Company）（英国、ブリジェンド））から同様の構成要素を使用して得た。破断可能なシール１０６８が結合された回収要素１０６７を、下側部分１０１４の上側部分に、破断可能なシール１０６８がハウジング１１００の下側部分１０１４に面するようにして圧入した。上側部分１０１２は、ヒートガン（マスター・アプライアンス社（Master Appliances Corp）、ウィスコンシン州ラシー上側部分）を使用してｂｕｙｈｅａｔｓｈｒｉｎｋ．ｃｏｍより入手した、３：１ポリオレフィン２重壁の接着剤でライニングされた熱収縮フィルム（部品番号＿ＨＳＣ３Ａ−０５０−ｃｃ、直径１．５ｃｍ）の２ｃｍの切片を用いて下側部分１０１４と連結した。
【０１８８】
３Ｍ  Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰ試験からのポリオレフィン製プラスチックハンドル（１０５２）の一部、真鍮製金属シャフト（１０５１）及び先端部１０９０を用いてプランジャ（１０５０）を組み立てた。ハンドル１０５２及び先端部１０９０は、ネジによる連結によって真鍮シャフトの両端に取り付けた。真鍮製金属シャフトは長さ１１．５ｃｍ及び直径３．９ｍｍであった。旋盤を使用してシャフトの両端に６ｍｍの６〜２３のネジ山を切った。先端部１０９０は、１０インチ（２５．４ｃｍ）のサウスベンド旋盤を使用して１／２インチ（１２．７ｍｍ）のアセタールコポリマー製ロッド（部品番号８４９７Ｋ２１１、マクマスター・カー社（McMASTER-CARR）（カリフォルニア州サンタフェスプリングス）より入手）から作製した。Ｏリング１０８６を先端部１０９０に取り付けた。先端部は、図１０に示されるような保持部材１０８７を含むように機械加工した。厚さ１ｍｍのポリウレタンゴムの小片を打抜き、これを保持部材１０８７内に滑り込ませることによってスクレーパーを構成した。スクレーパー１０８６の外径は、ハウジング１０１０の内側に緊密に嵌合するような寸法に構成した。プランジャは１回の使用毎に表面を滅菌した。
【０１８９】
（実施例６）
Ｉ型装置を使用した、スパイク水からの粒子状濃縮剤による大腸菌の捕捉
トリプシン処理大豆寒天（Tryptic Soy Agar）プレート（ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickinson）メリーランド州スパークス）から単離した大腸菌（ＡＴＣＣ  ５１８１３）のコロニーを使用して５ｍＬのトリプシン処理大豆ブロス（Tryptic Soy Broth）（ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickinson）メリーランド州スパークス）に接種し、３７℃のインキュベーター内で一晩インキュベートした。約１０９個のコロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）を含む一晩培養物をフィルター滅菌した１８メガオームの水で１：１０，０００に希釈した（約１０５ＣＦＵ／ｍＬにまで、以後、「初期希釈懸濁液」と呼ぶ）。５００マイクロリットルの希釈培養液を５０ｍＬのフィルター滅菌した１８メガオームの水に移し、約１０００個／ｍＬの最終濃度とした。
【０１９０】
１００倍の吸着緩衝液（ｐＨ  ７．２）の一定分量（０．５ｍＬ）を、上記の５０ｍＬの希釈した大腸菌懸濁液に加えた（以後、「スパイク水試料」と呼ぶ）。内容物を約１分間、手動で混合した。
【０１９１】
１０ｍｇの蒸気滅菌したＣＭ−１１１を秤量し、実施例５で述べたようにして調製したＩ型装置に加えた。体積１０ｍＬのスパイク水試料を各装置に加え、表面滅菌したパラフィルムで装置をキャップした。内容物を室温（２５℃）で約３０秒間、手で振ることによって混合した。
【０１９２】
混合後、各装置を、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｖａｒｉ  Ｍｉｘ（商標）ロッキングプラットフォーム（バーンステッド・インターナショナル社（Barnstead International）アイオワ州、１４サイクル／分）上で異なる時間（それぞれ１、５、１０及び２０分間）にわたってインキュベートした。インキュベート後、各管をベンチトップに１０分間置いて粒子状の濃縮剤ＣＭ−１１１を沈降させた。沈降後、パラフィルムのラッピングを外し、予め滅菌したプランジャ装置を使用して箔シールに穿孔し、沈降したＣＭ−１１１剤を装置の下側部分内に堆積させた。ピペットを用いて上清を除去し、カミソリ刃を用いて装置の下側部分（細胞濃縮剤が入った）を装置の上側部分から分離した。沈降したＣＭ−１１１濃縮剤（約１００マイクロリットルの水中）を装置から取り出し、滅菌水で１：１００に希釈し、希釈した濃縮剤の１ミリリットルの一定分量を、製造者の指示に従って３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔプレート（スリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール））上にプレートした。
【０１９３】
コントロールとして、初期希釈懸濁液を滅菌水で１：１０００の希釈度で更に希釈し、製造者の指示に従って３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔプレート（スリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール））上にプレートした。滅菌性のコントロールとして、粒子状物質も３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔプレート上にプレートした。各プレートを３７℃のインキュベーター（ＶＷＲ  Ｏｒｂｉｔａｌ  Ｓｈａｋｅｒインキュベーター、ブイ・ダブリュー・アール社（ＶＷＲ）（ペンシルベニア州ウェストチェスター））内で一晩インキュベートした。
【０１９４】
すべてのプレートを、製造者の指示に従って３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（スリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール））により分析し、コロニーのカウントを得た。結果を表２に示す。結果は下式によって計算した。
【０１９５】
捕捉効率＝（濃縮剤上のコロニー数）／（スパイクコントロール中の全コロニー数）×１００
【０１９６】
【表２】
0005833450.tif 000003
【０１９７】
（実施例７）
ＩＩＩ型装置を使用したＣＭ−１１１による大腸菌の濃縮
単離した大腸菌（ＡＴＣＣ５  １８１３）のコロニーをストリークプレートから５ｍＬのトリプシン処理大豆ブロス（Tryptic Soy Broth）（ＴＳＢ、ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickinson）メリーランド州スパークス）に接種し、３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。約１０９個のコロニー形成単位／ｍＬのこの一晩培養物をフィルター滅菌した脱イオン水（ＭｉｌｌｉＱ、ミリポア社（Millipore）マサチューセッツ州）中で希釈し、１０ｍＬのフィルター滅菌した脱イオン水中でスパイクして１×１０３個／ｍＬ及び１×１０４個／ｍＬ（全体で約１×１０４／ｍＬ  ｃｆｕ〜１×１０５／ｍＬ  ｃｆｕ）の最終濃度を得た。スパイクした水を、１０ｍｇの予め滅菌した（１２１℃、１５分）ＣＭ−１１１（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ−１１１、スリー・エム社（3M Company）、セントポール）の粉末及び１００マイクロリットルの１００倍吸着緩衝液（ｐＨ  ７．２）の入ったＩＩＩ型装置のハウジングに加えた。ハウジングを表面滅菌したパラフィルムで密封し、ロッキングプラットフォーム上に置いた。次いで、キャップした装置を、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｖａｒｉ  Ｍｉｘ（商標）ロッキングプラットフォーム（バーンステッド・インターナショナル社（Barnstead International）アイオワ州、１４サイクル／分）上で５分間の接触時間にわたって室温（２５℃）でインキュベートした。次いで装置を振盪させずに（重力によって粒子を沈降させるため）５分間静置し（ロッキング及び沈降の全経過時間＝１０分間）、パラフィルムを取り外して、ＩＩ型装置のプランジャをハウジングに挿入し、ハウジングの底の方向に押し込むことによってバルク試料からＣＭ−１１１粒子を分離した。プランジャが破断可能なシールを破ると、約０．１ｍＬの液体試料に懸濁されたＣＭ−１１１粒子はハウジングの下側貯留部に移された。ＣＭ−１１１粒子を下側貯留部から回収して、１．５ｍＬの滅菌した微小遠心管に移した。体積１００マイクロリットルのＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬（プロメガ社（Promega）、ウィスコンシン州マディソン）をペレットに加え、ＶＷＲ  Ｆｉｘｅｄ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖｏｒｔｅｘミキサー上で５秒間（３２００ｒｐｍで５秒）ボルテックスして混合し、卓上型ルミノメーター（ＦＢ１２シングルチューブ型ルミノメーター、バートホールド・ディテクション・システムズ・ユー・エス・エー社（Berthold Detection Systems USA）、テネシー州オークリッジ）上で読み取った。大腸菌細胞の１×１０５個／ｍＬ及び１×１０６個／ｍＬの懸濁液から１００マイクロリットルの体積を試験することにより、ポジティブコントロール（「１００％シグナル」）を調製した。結果は下式によって計算し、下記表２にまとめた。
【０１９８】
ＡＴＰシグナル捕捉効率（％）＝（ＣＭ−１１１ペレットのＲＬＵ／１００％シグナルからのＲＬＵ）×１００
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位。
【０１９９】
【表３】
0005833450.tif 000004
【０２００】
Ｎ＝２、標準偏差＜１０％。データは、大腸菌コントロールについては水のみ（１６，４６４  ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化し、細菌と接触させたＣＭ−１１１ペレットについては未反応のＣＭ−１１１（４１，４２４  ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化した。
【０２０１】
上記実施例から、粒子状の捕捉剤を使用して水性試料から細菌を濃縮できることが分かる。
【０２０２】
（実施例８）
ＩＩ型装置を使用したＣＭ−１１１による大腸菌の濃縮
単離した大腸菌（ＡＴＣＣ  ３３０９０）のコロニーをストリークプレートから５ｍＬのトリプシン処理大豆ブロス（Tryptic Soy Broth）（ＴＳＢ、ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickinson）メリーランド州スパークス）に接種し、３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。約１０８個のコロニー形成単位／ｍＬのこの一晩培養物をフィルター滅菌した脱イオン水（ＭｉｌｌｉＱ、ミリポア社（Millipore）マサチューセッツ州）中で希釈し、１０ｍＬのフィルター滅菌した脱イオン水中でスパイクして１×１０３個／ｍＬ（全体で約１０４ｃｆｕ）の最終濃度を得た。スパイクした水を、１０ｍｇの予め滅菌した（１２１℃、１５分）ＣＭ−１１１（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ−１１１、スリー・エム社（3M Company）、セントポール）の粉末及び１００マイクロリットルの１００倍吸着緩衝液が既に入っている装置に加えた。装置を表面滅菌したパラフィルムで密封し、ロッキングプラットフォーム上に置いた。次いで、キャップした装置を、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｖａｒｉ  Ｍｉｘ（商標）ロッキングプラットフォーム（バーンステッド・インターナショナル社（Barnstead International）アイオワ州、１４サイクル／分）上で１及び９分間（全経過＝時間２分間及び１０分間）、室温（２５℃）でインキュベートした。
【０２０３】
インキュベートの後、パラフィルムを取り外し、プランジャを破断可能なシールと接触するまでハウジング内に挿入した。プランジャを更に挿入して破断可能なシールを破ることにより、大腸菌が結合したＣＭ−１１１が約１００マイクロリットルの液体試料とともにハウジングの下側貯留部に移された。微小粒子なしの大腸菌が入ったコントロールの管を同様に処理した。
【０２０４】
下側貯留部を切り開いてＣＭ−１１１ペレットを回収し、粒子を１．５ｍＬの滅菌した微小遠心管に移した。体積１００ｍＬのＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬（プロメガ社（Promega）、ウィスコンシン州マディソン）をペレットに加え、ＶＷＲ  Ｆｉｘｅｄ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖｏｒｔｅｘミキサー上で５秒間（３２００ｒｐｍで５秒）ボルテックスして混合し、卓上型ルミノメーター（ＦＢ１２シングルチューブ型ルミノメーター、バートホールド・ディテクション・システムズ・ユー・エス・エー社（Berthold Detection Systems USA）、テネシー州オークリッジ）上で読み取った。１００％シグナルについては、１０５個／ｍＬの希釈液から体積１００マイクロリットルを使用した。結果は下式によって計算し、下記表３にまとめた。
【０２０５】
ＡＴＰシグナル捕捉効率（％）＝（ＣＭ−１１１ペレットのＲＬＵ／約１０４個の全大腸菌からのＲＬＵ）×１００
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位。
【０２０６】
【表４】
0005833450.tif 000005
【０２０７】
Ｎ＝２、標準偏差＜１０％。データは、大腸菌コントロールについては水のみ（２７，９３８  ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化し、細菌と接触させたＣＭ−１１１ペレットについては未反応のＣＭ−１１１（３０，６１１  ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化した。
【０２０８】
（実施例９）
ＩＩ型装置を使用したＡＢ−ＣＭ−１１１による大腸菌の濃縮
実施例８において述べた手順を用い、ＡＢ−ＣＭ（吸着緩衝液で処理したＣＭ−１１１）の１０ｍｇの一定分量についても、１０ｍＬの水からの大腸菌の濃縮について試験を行った。接触時間を９分、１分として、ＰＯＲＥＸプランジャを使用してＡＢ−ＣＭを沈降させた。データを表４にまとめた。
【０２０９】
【表５】
0005833450.tif 000006
【０２１０】
Ｎ＝２、標準偏差＜１０％。データは、大腸菌コントロールについては水のみ（２０，２８１  ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化し、細菌と接触させたＣＭ−１１１ペレットについては未反応のＡＢ−ＣＭ（４４，４８８  ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化した。
【０２１１】
上記実施例から、粒子状の捕捉剤を使用して水性試料から細菌を濃縮できることが分かる。
【０２１２】
（実施例１０）
比較例−非濃縮試料における大腸菌の検出
現時点の技術水準における水試験法として、標準的なＡＴＰ生物発光アッセイ（例えば、スリー・エム社（3M Company）（ミネソタ州セントポール）より入手可能な３Ｍ  ＣＬＥＡＮＴＲＡＣＥ  Ｗａｔｅｒ−Ｆｒｅｅ  ＡＴＰ、カタログ番号ＡＱＦ１００）を用いて１００マイクロリットルの水をＡＴＰについて試験する方法がある。
【０２１３】
トリプシン処理大豆ブロス（tryptic soy broth）中での大腸菌の一晩培養物（ＡＴＣＣ  ３３０９０）を、滅菌水で希釈して２つの懸濁液を得た。懸濁液Ａは約１０３ＣＦＵ／ｍＬを含み、懸濁液Ｂは約１０５ＣＦＵ／ｍＬを含んでいた。
【０２１４】
各懸濁液の１００マイクロリットルの一定分量を体積１００マイクロリットルのＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬（プロメガ社（Promega）、ウィスコンシン州マディソン）と混合し、生じた生物発光を実施例８で述べたようにしてルミノメーターで測定した。結果を表５に示す。
【０２１５】
【表６】
0005833450.tif 000007
【０２１６】
Ｎ＝２、標準偏差＜１０％
本明細書に引用するすべての特許、特許出願及び公開公報、並びに電子的に入手可能な資料の開示内容の全体を援用する。本出願の開示内容と本明細書に援用されるいずれかの文書の開示内容との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例はあくまで理解を助けるために示したものである。これらによって不要な限定をするものと理解されるべきではない。本発明は、図示及び説明された厳密な詳細に限定されるものではなく、当業者には明らかな変形例は特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれるものとする。
【０２１７】
特に断らないかぎり、明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される各成分の量、分子量などを表すすべての数値は、すべての場合において「約」という語によって修飾されたものとして理解されるべきである。したがって、特に断らないかぎり、本明細書及び添付の「特許請求の範囲」に記載される数値パラメータは、本発明が実現しようとする所望の性質に応じて変わりうる近似値である。少なくとも、また、均等論を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、それぞれの数値パラメータは少なくとも報告される有効数字の数を考慮し、更に通常の数値の端数処理を適用して解釈されるべきである。
【０２１８】
本発明の広義の範囲で示す数値的範囲及びパラメータは近似値ではあるが、具体例に記載される数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、数値はすべて、それぞれの試験測定値における標準偏差から必然的に生じる一定の範囲を本質的に含むものである。
【０２１９】
すべての見出しは読者の便宜のためのものであって、特に断らないかぎり、見出しの後に続く文面の意味を限定するために使用されるものではない。
本発明の実施態様の一部を以下の項目１−５１に列記する。
[１]
試料中の細胞を検出するための方法であって、
細胞濃縮剤、細胞抽出剤を含むヒドロゲル、及び細胞を含むことが疑われる液体試料を提供する工程と、
前記液体試料と前記細胞濃縮剤とを所定の時間にわたって接触させる工程と、
前記液体試料の少なくとも一部から前記細胞濃縮剤を分離する工程と、
前記分離された細胞濃縮剤及び前記ヒドロゲルを含む液体混合物を形成する工程であって、前記細胞抽出剤が前記混合物中に放出される、工程と、
生物学的検体を検出する工程と、を含む、方法。
[２]
試料中の細胞を検出するための方法であって、
細胞を含むことが疑われる試料；細胞濃縮剤；細胞抽出剤を含むヒドロゲル；２以上の貯留部を備えるハウジングと、前記試料を受容するように構成された開口部とを含む検出物品；及び、前記細胞濃縮剤を分離して、前記ハウジングの上側貯留部から下側貯留部に移動するための手段を提供する工程と、
液体媒質中で前記試料を、前記ハウジングの前記上側貯留部内の前記細胞濃縮剤と接触させる工程と、
前記細胞濃縮剤を分離して、前記ハウジングの前記下側貯留部に移動する工程と、
前記分離された細胞濃縮剤及び前記ヒドロゲルを含む液体混合物を形成する工程であって、前記細胞抽出剤が前記混合物中に放出される、工程と、
生物学的検体を検出する工程と、を含む、方法。
[３]
試料中の細胞を検出するための方法であって、
細胞を含むことが疑われる試料；前記試料を受容するように構成された開口部と、細胞濃縮剤が収容された上側貯留部と、細胞抽出剤を含むヒドロゲルが収容された下側貯留部とを備えるハウジングを含む検出物品；前記細胞濃縮剤を前記液体試料の少なくとも一部から分離するための手段；及び、前記細胞濃縮剤を前記ハウジングの前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための手段を提供する工程と、
液体媒質中で前記試料と、前記ハウジングの前記上側貯留部内の前記細胞濃縮剤とを接触させる工程と、
前記細胞濃縮剤を分離して、前記ハウジングの前記下側貯留部に移動する工程と、
前記分離された細胞濃縮剤及び前記ヒドロゲルを含む液体混合物を形成する工程であって、前記細胞抽出剤が前記混合物中に放出される、工程と、
生物学的検体を検出する工程と、を含む、方法。
[４]
前記生物学的検体を検出する工程が、生きた細胞の存在を検出することを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
[５]
前記生物学的検体を検出する工程が、検出システムを使用することを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
[６]
前記生物学的検体を検出する工程が、微生物細胞に関連する生物学的検体を検出することを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
[７]
体細胞抽出剤を提供する工程と、該体細胞抽出剤を前記試料からの細胞と接触させる工程と、を更に含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
[８]
前記生物学的検体を検出する工程が、前記生物学的検体の量を定量することを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
[９]
前記生物学的検体の量が２回以上定量される、項目８に記載の方法。
[１０]
第１の時点において検出される前記生物学的検体の量が、第２の時点において検出される前記生物学的検体の量と比較される、項目９に記載の方法。
[１１]
前記生物学的検体を検出する工程が、細胞からのＡＴＰを検出することを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
[１２]
前記細胞からのＡＴＰを検出する工程が、微生物細胞からのＡＴＰを検出することを含む、項目１１に記載の方法。
[１３]
前記ＡＴＰを検出する工程が、細菌細胞からのＡＴＰを検出することを含む、項目１２に記載の方法。
[１４]
前記細胞からのＡＴＰを検出する工程が、ルシフェリン及びルシフェラーゼが関与する反応においてＡＴＰを検出することを含む、項目１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
[１５]
ＡＴＰを加水分解することが可能な酵素を提供する工程と、該酵素を前記試料の少なくとも一部と接触させる工程と、を更に含む、項目１４に記載の方法。
[１６]
前記生物学的検体を検出する工程が、前記生物学的検体を免疫学的に検出することを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
[１７]
前記生物学的検体を検出する工程が、前記生物学的検体を遺伝学的に検出することを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
[１８]
前記生物学的検体を検出する工程が、前記試料中の生きた細胞から放出される酵素を検出することを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
[１９]
前記酵素がアデニル酸キナーゼの酵素活性を含む、項目１８に記載の方法。
[２０]
前記生物学的検体を検出する工程が、比色測定法により、蛍光測定法により、電気化学的方法により、又は光量測定法により検出することを含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
[２１]
一体型試料調製及び検出装置であって、
少なくとも２個の貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングであって、
上側貯留部が、試料を受容するように構成された開口部、及び上側貯留部内に配置された細胞濃縮剤を含み、
下側貯留部が、その内部に配置された検出試薬を含む、ハウジングと、
前記上側貯留部を前記下側貯留部から隔離するための手段と、
前記細胞濃縮剤を前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための手段と、を備える、装置。
[２２]
前記細胞濃縮剤が、粒子状又は分散された細胞濃縮剤を含む、項目２１に記載の装置。
[２３]
前記ハウジングの前記上側貯留部と前記下側貯留部とを隔離するための前記手段が、プランジャ、弁、又は破断可能なシールを含む、項目２１又は２２に記載の装置。
[２４]
前記細胞濃縮剤を前記ハウジングの前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための前記手段が、プランジャ、スワブ、又は弁を含む、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の装置。
[２５]
テーパ状の内壁を備える、項目２１〜２４のいずれか一項に記載の装置。
[２６]
細胞抽出剤を含むヒドロゲルを更に含む、項目２１〜２５のいずれか一項に記載の装置。
[２７]
前記ヒドロゲルが、ビーズ、繊維、リボン、又はシートである、項目２６に記載の装置。
[２８]
前記ヒドロゲルが固体基材上にコーティングされる、項目２６に記載の装置。
[２９]
前記ハウジングが第３の貯留部を更に含む、項目２１〜２８のいずれか一項に記載の装置。
[３０]
前記ヒドロゲルが前記第３の貯留部内に配置される、項目２９に記載の装置。
[３１]
体細胞抽出剤を更に含む、項目２１〜３０のいずれか一項に記載の装置。
[３２]
プランジャを更に備える、項目２１に記載の装置。
[３３]
前記プランジャが流体経路を含む、項目３２に記載の装置。
[３４]
前記流体経路がフィルターを含む、項目３３に記載の装置。
[３５]
前記フィルターが微多孔性フィルターを含む、項目３４に記載の装置。
[３６]
前記プランジャがスクレーパーを更に含む、項目３２に記載の装置。
[３７]
前記スクレーパーが、前記スクレーパーの縁部と前記ハウジングとの間に液体を通過させるように構成されている、項目３６に記載の装置。
[３８]
少なくとも２個の貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングであって、
上側貯留部が、試料を受容するように構成された開口部を含み、
下側貯留部が、その内部に配置された検出試薬を含む、ハウジングと、
前記上側貯留部を前記下側貯留部から隔離するための手段と、
細胞濃縮剤と、
前記細胞濃縮剤を前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための手段と、を備える、キット。
[３９]
前記ハウジングが、前記上側貯留部を前記下側貯留部から隔離するための前記手段を含む、項目３８に記載のキット。
[４０]
前記ハウジングが、前記細胞濃縮剤を前記上側貯留部から前記下側貯留部に移動するための前記手段を含む、項目３８又は項目３９に記載のキット。
[４１]
前記細胞濃縮剤が、前記ハウジングの前記上側貯留部内に配置される、項目３８〜４０のいずれか一項に記載のキット。
[４２]
前記細胞濃縮剤が、粒子状又は分散された細胞濃縮剤を含む、項目３８〜４１のいずれか一項に記載のキット。
[４３]
微生物細胞抽出剤を含むヒドロゲルを更に含む、項目３８〜４２のいずれか一項に記載のキット。
[４４]
体細胞抽出剤を更に含む、項目４３に記載のキット。
[４５]
試料取得装置を更に備える、項目３８〜４４のいずれか一項に記載のキット。
[４６]
プランジャを更に備える、項目３８〜４５のいずれか一項に記載のキット。
[４７]
前記プランジャが流体経路を含む、項目４６に記載のキット。
[４８]
前記流体経路がフィルターを含む、項目４７に記載のキット。
[４９]
前記フィルターが微多孔性フィルターを含む、項目４８に記載のキット。
[５０]
前記プランジャがスクレーパーを更に含む、項目４６に記載のキット。
[５１]
前記スクレーパーが、前記スクレーパーの縁部と前記ハウジングとの間に液体を通過させるように構成されている、項目５０に記載のキット。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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