(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の２つのペプチド：
ａ)Ｃ末端側の、
−  ヒトＢ型肝炎ウイルス(HBV)の単離株のＳタンパク質であって、Ｎ末端に位置する膜貫通ドメインが欠失しているＳタンパク質の、HBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記Ｎ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の同一性パーセンテージを有し、HBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記Ｎ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列に由来し、HBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持する合成変異体のアミノ酸配列
を含んでなる第１のペプチド、及び
ｂ)Ｎ末端側の、
−  Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)単離株の少なくとも１つのエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列、又は
− Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記HCV単離株の少なくともエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列に由来し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持する合成変異体のアミノ酸配列
を含んでなる第２のペプチド
を含んでなり、前記Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質がタンパク質E1、タンパク質E2並びにタンパク質E1及びタンパク質E2を含んでなる融合ペプチドからなる群より選択される、免疫原性融合タンパク質。
【請求項２】
前記第２のペプチドが
−  エンベロープタンパク質E1の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体、又は
− エンベロープタンパク質E1の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記タンパク質E1の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体に由来し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される請求項１に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項３】
前記第２のペプチドが、
−  エンベロープタンパク質E2の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体、又は
− エンベロープタンパク質E2の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記タンパク質E2の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体に由来し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される請求項１に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１及び第２のペプチドが連続し、第２のペプチドのＣ末端が第１のペプチドのＮ末端に共有結合している請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１のペプチドが
−  HBV単離株、具体的にはHBVadw単離株のＮ末端欠失Ｓタンパク質の23位から226位までの領域に位置する連続アミノ酸により画定されるアミノ酸配列、特に配列番号２で表されるアミノ酸配列であって、HBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記Ｎ末端欠失Ｓタンパク質の連続アミノ酸配列により画定されるアミノ酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の同一性パーセンテージを有し、HBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記Ｎ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列に由来し、HBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持する合成変異体のアミノ酸配列
を含んでなる請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項６】
前記第２のペプチドが
−  HCV単離株、具体的にはHCV-1a単離株のエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列であって、HCVタンパク質E1の192位から380位までの領域に位置する連続アミノ酸により画定されるアミノ酸配列、特に配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は
− 前記HCVタンパク質E1の連続アミノ酸配列により確定されるアミノ酸配列と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記HCVタンパク質E1の連続アミノ酸配列により確定されるアミノ酸配列に由来し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持する合成変異体のアミノ酸配列
を含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項７】
第１及び第２のペプチドが連続し、融合タンパク質が
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
− 配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも89％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有し、HBVのＳタンパク質のＮ末端側に位置する膜貫通ドメインを欠失した、HCV及び/又はHBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持するアミノ酸配列、又は
− 配列番号８に由来し、HBVのＳタンパク質のＮ末端側に位置する膜貫通ドメインを欠失した、HCV及び/又はHBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持する合成変異体のアミノ酸配列
を含んでなる請求項５又は６に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項８】
前記第２のペプチドが
−  HCV単離株、具体的にはHCV-1a単離株のエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列であって、HCVタンパク質E2の384位から743位までの領域に位置する連続アミノ酸により画定されるアミノ酸配列、特に配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は
− 前記HCVタンパク質E2の連続アミノ酸配列により確定されるアミノ酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持するアミノ酸配列、又は
− 前記HCVタンパク質E2の連続アミノ酸配列により確定されるエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列に由来し、膜貫通ドメインの性質及びHCVに対する免疫原性を保持する合成変異体のアミノ酸配列
を含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
− 配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも89％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有し、HBVのＳタンパク質のＮ末端側に位置する膜貫通ドメインを欠失した、HCV及び/又はHBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持するアミノ酸配列、又は
− 配列番号10に由来し、HBVのＳタンパク質のＮ末端側に位置する膜貫通ドメインを欠失した、HCV及び/又はHBVに対して免疫原性である非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を保持する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される請求項７に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質をコードするハイブリッド核酸分子。
【請求項１１】
連続する第１及び第２の核酸配列を含んでなり、第１の核酸配列の5'末端が第２の核酸配列の3'末端に共有結合している請求項１０に記載のハイブリッド核酸分子。
【請求項１２】
前記免疫原性融合タンパク質のＮ末端側に転移開始ペプチドをコードする第３の核酸配列を更に含んでなり、
−  配列番号11、又は
− 配列番号11と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性パーセンテージを有する核酸配列
で表される請求項１０又は１１に記載のハイブリッド核酸分子。
【請求項１３】
前記免疫原性融合タンパク質のＮ末端側に転移開始ペプチドをコードする第３の核酸配列を更に含んでなり、
−  配列番号13、又は
− 配列番号13と少なくとも80％、特に少なくとも85％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の相同性パーセンテージを有する核酸配列
で表される請求項１０又は１１に記載のハイブリッド核酸分子。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のハイブリッド核酸分子及びその発現に必要な手段を含んでなるベクター。
【請求項１５】
レンチウイルスベクターである請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ハイブリッド核酸分子が請求項１２又は１３に記載のハイブリッド核酸分子である請求項１４又は１５に記載のベクター。
【請求項１７】
以下のタンパク質：
−  Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株の表面抗原の野生型Ｓタンパク質から構成されるタンパク質、及び
−  請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの免疫原性融合タンパク質
を含んでなる非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子。
【請求項１８】
免疫原性融合タンパク質が
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
− 配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列
を含んでなる請求項１７に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子。
【請求項１９】
免疫原性融合タンパク質が
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
− 配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列
を含んでなる請求項１７に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子。
【請求項２０】
以下の２つの融合タンパク質：
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
− 配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、及び
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
− 配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列
を含んでなる請求項１７に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子。
【請求項２１】
活性成分として、下記の化合物：
−  請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質、
−  請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のハイブリッド核酸分子、
− 請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のベクター、
−  請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子
の少なくとも１つを含み、医薬的に許容され得る賦形剤を含んでなる免疫原性組成物。
【請求項２２】
活性成分が以下の化合物：
−  請求項７に記載の免疫原性融合タンパク質、
−  請求項１２に記載のハイブリッド核酸分子、
− 請求項１２に記載のハイブリッド核酸分子を含んでなるベクター、
−  請求項１８に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子
の少なくとも１つである請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
活性成分が以下の化合物：
−  請求項９に記載の免疫原性融合タンパク質、
−  請求項１３に記載のハイブリッド核酸分子、
− 請求項１３に記載のハイブリッド核酸分子を含んでなるベクター、
−  請求項１９に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子
の少なくとも１つである請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
活性成分として、請求項１７に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子を含んでなり、前記免疫原性融合タンパク質が請求項７又は９に記載の免疫原性融合タンパク質である免疫原性組成物。
【請求項２５】
活性成分として、
−  少なくとも１つの請求項７に記載の免疫原性融合タンパク質及び少なくとも１つの請求項９に記載の免疫原性融合タンパク質、
−  少なくとも１つの請求項１２に記載のハイブリッド核酸分子又は該ハイブリッド核酸分子を含んでなるベクター及び少なくとも１つの請求項１３に記載のハイブリッド核酸分子又は該ハイブリッド核酸分子を含んでなるベクター、
−  少なくとも１つの請求項１８に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子及び少なくとも１つの請求項１９に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子
を含んでなる混合物を含んでなる免疫原性組成物。
【請求項２６】
Ｃ型肝炎の治療又は防止のための医薬の製造についての請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２７】
Ｂ型肝炎の治療又は防止のための医薬の製造についての請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２８】
Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎の治療又は防止のための医薬の製造についての請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２９】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のベクターを含んでなる、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子を発現する細胞株。
【請求項３０】
CHOと呼ばれるチャイニーズハムスター卵巣株である請求項２９に記載の細胞株。
【請求項３１】
特にSaccharomyces cerevisaeであることができる酵母である請求項２９に記載の細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、新規な融合タンパク質、及び特にＣ型肝炎の防止及び/又は予防的及び/又は治療的処置或いはＣ型肝炎及びＢ型肝炎の防止及び/又は予防的及び/又は治療的処置に意図されるワクチンの製造のための、その使用である。本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV、Ｂ型肝炎ウイルスの略号)のエンベロープタンパク質とＣ型肝炎ウイルス(HCV、Ｃ型肝炎ウイルスの略号)のエンベロープタンパク質との間のキメラサブウイルス(sous-virales)エンベロープ粒子の取得に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、1989年に同定され、その後クローンニングされて配列決定されたが、世界中での広範な分布及び疾患の慢性化への頻繁な進行のために、現在でも依然として公衆衛生上の大きな問題である。2000年に、WHOは、世界人口の３％程度、すなわち170百万人程度がHCVに感染していると推定した。
HCVは、肝硬変及び肝細胞ガンに進行し得る慢性肝炎を引き起こす。インターフェロン及びリバビリンは、HCVにより引き起こされた慢性肝炎の基本的処置を構成するが、これら処置は、十分に有効ではなく、重要な副次作用を有する。この利用可能な処置は高価で比較的毒性のままであり、感染症例の半数でのみ効果的である。
【０００３】
ゲノム全体及びウイルスタンパク質は何年も前に公知になっているにもかかわらず、その構造及び形態発生は仮説のままである。Ｃ型肝炎に対するワクチンは未だ存在せず、そのようなワクチンの候補に関する検索は、現在非常に活発である[Houghton, M.及びAbrignani, S. (2005). Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus. Nature 436 (7053), 961-6]。
予防ワクチンの場合、可能性のある候補のほとんど全てが、一般にタンパク質E1及びE2として知られ、細胞性免疫応答及び中和化体液性応答の両方を引き起こし得る、HCVの２つのエンベロープタンパク質の一方又は両方の使用に基づく。
【０００４】
しかし、HCVのタンパク質E1及びE2は、他のウイルスに関してもそうであるかもしれないが、サブウイルス粒子に自己組織化(auto-assemblent)しない。更に、その膜貫通領域の小胞体中への高い貯留率のために、精製には界面活性剤による可溶化が必要である。結果として収量は期待はずれであり、得られる画分の純度は良くも悪くもない[Forns, X., Bukh, J.及びPurcell, R. H. (2002). The challenge of developing a vaccine against hepatitis C virus. J Hepatol 37(5), 684-95]。
膜貫通ドメインを欠失するエンベロープタンパク質を用いることから本質的になる代替手段により、細胞外部へのE1及びE2の分泌を容易にすることが可能になるが、結果として生じる三次元コンホメーションの変化は、野生型タンパク質に対して減少した抗原性能力のために、望ましくないことが判明するかもしれない。
【０００５】
HBVウイルスは２つの形態で存在する：感染性ビリオンの形態及びウイルス自体より遥かに高量で感染対象の血液中に見出される過剰のエンベロープ粒子の形態。この現象は、HBVのＳタンパク質が自己組織化し、(カプシドタンパク質も核酸も含有しない)サブウイルス粒子(又は過剰のエンベロープ)になる能力に起因する[Moriarty, A. M., Hoyer, B. H., Shih, J. W., Gerin, J. L.及びHamer, D. H. (1981). Expression of the hepatitis B virus surface antigen gene in cell culture by using a simian virus 40 vector. Proc Natl Acad Sci U S A 78(4), 2606-10]。HBVの野生型Ｓタンパク質は、４つの膜貫通ドメインを含んでなる。野生型Ｓタンパク質の自己組織化から生じるサブウイルス粒子は、非感染性であるが、非常に免疫原性である：これらは、1970年代半ば以来、Ｂ型肝炎に対する良好なワクチン候補としてみなされている。これらは、事実、HBVによる感染の保護免疫応答を誘導するに効果的であることが証明されているワクチンを作製するための土台として役立っている。
【０００６】
HBVのサブウイルスエンベロープ粒子をＢ型肝炎ウイルスに対して外来性であるタンパク質用のベクターとして使用することは、既に、先行研究の目的となっている。よって、「HBV /HCV virus like particle」と題する特許出願US2004/0146529は、一方でHBVウイルスのＳタンパク質全体を体系的に含み、他方で、実施例によれば、HBVウイルスのＳタンパク質のＮ末端にグラフトされたHCVのE1又はE2エンベロープタンパク質の１つのエクトドメインのフラグメントを含んでなるHBV-HCVエンベロープキメラを開示している[Mark Selby, Edward Glazer及びMichael Houghton 「HBV /HCV virus like particle」米国特許2004/01465529]。
しかし、これら構築物が十分に構造化されたサブウイルス粒子の形成を誘導し得ること及びそれらが良質な抗原応答を引き起こし得ることは、証明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先行技術の欠点に対して、本発明の目的は、非感染性で、十分に構造化され、効率的に分泌されるサブウイルス粒子を形成することができ、E1及び/又はE2のほぼ全てを含有するHCV-HBV融合タンパク質を提供することである。
本発明の目的の１つはまた、Ｃ型肝炎及び/又はＢ型肝炎に対するワクチンを提供することである。
本発明の更なる関心は、現在市販されているＢ型肝炎に対するワクチン用の既存の商業的生産ラインに容易に適合させることができるという事実から生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、少なくとも以下の２つのペプチドを含んでなる免疫原性融合タンパク質である：
ａ)Ｃ末端側に、以下から構成される第１のペプチド：
−  Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株のＳタンパク質であって、Ｎ末端に位置する膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質のアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列が非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、Ｎ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列が非感染性サブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、HBVウイルスの別の単離株に由来する天然変異体又はＮ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列、
【０００９】
及び
ｂ)Ｎ末端側に、以下から構成される第２のペプチド：
−  Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)単離株の少なくとも１つのエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、Ｃ型肝炎ウイルス単離株のタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又はタンパク質E1又はE2の１つのアミノ酸に由来する合成変異体のアミノ酸配列、
ここで、第２のペプチドは、タンパク質E1、タンパク質E2又はタンパク質E1とタンパク質E2とを含んでなる融合ペプチドから選択される。
【００１０】
本発明はまた、Ｎ末端膜貫通ドメインを欠失するＳタンパク質(Sd)とＣ型肝炎ウイルス単離株のタンパク質(E1又はE2)の膜貫通ドメイン及びエクトドメインとから構成されるアミノ酸配列と、少なくとも83％、特に少なくとも85％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列を有する免疫原性融合タンパク質に関する。
【００１１】
「融合タンパク質」は、HBV単離株の、Ｎ末端に位置する膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質(Sd)とHCV単離株のほぼ完全なエンベロープタンパク質E1及び/又はE2(その膜貫通ドメインはHBVのＳのＮ末端で欠失している膜貫通ドメインと置き換わっている)とを少なくとも含んでなる任意のタンパク質を意味する(図3B、3C、4D及び4E)。
【００１２】
「免疫原性タンパク質」は、本発明に従う任意のタンパク質、特に任意の融合タンパク質及び本明細書に開示された任意の融合タンパク質の、抗原性を備え、免疫反応又は応答を引き起こし得る任意のフラグメントを意味する。より詳細には、タンパク質は、免疫後に、例えば下記のプロトコールに従って検出される抗-E1、抗-E2及び/又は抗-S体液性応答を引き起こせば、それぞれHCV及び/又はHBVに対して免疫原性であるとみなされる：
−  Huzlyら(2008)によるHBVに関するプロトコール[Huzly D, Schenk T, Jilg W, Neumann-Haefelin D. Comparison of nine commercially available assays for quantification of antibody response to hepatitis B virus surface antigen. J Clin Microbiol. 2008 Apr, 46(4):1298-306]、又は
-  Hamedら(2008)によるHCVに関するプロトコール[Hamed MR, Tarr AW, McClure CP, Ball JK, Hickling TP, Irving WL. Association of antibodies to hepatitis C virus glycoproteins 1 and 2 (anti-E1E2) with HCV disease. J Viral Hepat. 2008 May, 15(5):339-45]。
【００１３】
「サブウイルス粒子を形成する能力」は、任意のタンパク質、特にHBVのＳタンパク質、具体的にはＮ末端膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質、より具体的にはＮ末端欠失Ｓタンパク質を含んでなる本発明の融合タンパク質が、フィラメント状又は球状のサブウイルス粒子に、野生型Ｓタンパク質の存在下で組織化するか又は該当する場合には自己組織化する能力を意味する；サブウイルス粒子を形成する能力は、少なくとも、特に電子顕微鏡分析による観察、特に本明細書の実施例１及び２(§I-5及び§II-7)に記載の試験、特に図7D、7G、11B〜11Dで説明される試験により証明することができる。
【００１４】
「非感染性サブウイルス粒子」は、HBVの野生型Ｓタンパク質(図2B)及び/又はＮ末端膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質の組織化から生じる任意のフィラメント状又は球状の粒子であって、ウイルスゲノムを欠き、特に大過剰に合成、分泌され、HBV又はHCVの特異的ヌクレオチドフラグメントの不在を証明することができる任意のプロトコール、特に以前に開示されたPCRによる増幅、例えば：
−  HCVに関しては、[Halfon P, Bourliere M, Ouzan D, Sene D, Saadoun D, Khiri H, Penaranda G, Martineau A, Oules V, Cacoub P.Occult HCV infection revisited with ultra-sensitive real-time PCR assay. J. Clin. Microbiol. 2008 Apr 30]
−  HCVに関しては、[Thibault V, Pichoud C, Mullen C, Rhoads J, Smith JB, Bitbol A, Thamm S, Zoulim F. Characterization of a new sensitive PCR assay for quantification of viral DNA isolated from patients with hepatitis B virus infections. J. Clin. Microbiol. 2007 Dec. 45(12):3948-53]
により分析し得、その結果がネガティブである粒子を意味する。
【００１５】
「HCVウイルスの単離株」は、フラビウイルス科のメンバーでヘパシウイルス属に属し、図１に概説されるHCVウイルスの3000アミノ酸以上のポリタンパク質から構成される任意の単離株メンバー[Choo, Q. L., Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W.及びHoughton, M (1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 244(4902), 359-362；Chooら Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) v88: 2451-2455；Hanら Characterization of the terminal regions of hepatitis C viral RNA: identification of conserved sequences in the 5' untranslated region and poly(A) tails at the 3' end. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715]；又はInternational Committee for the Taxonomy of Viruses (ICTV)によりHCVに関連していると分類された任意の単離株を意味する。
【００１６】
「HBVウイルスの単離株」は、ヘパドナウイルス科のメンバーでオルトヘパドナウイルス属に属する任意の単離株メンバー又はInternational Committee for the Taxonomy of Viruses (ICTV)によりHBVに関連していると分類された任意の単離株を意味する[Schaefer S. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol. 2007 Jan 7: 13(1):14-21]。
【００１７】
「Ｓタンパク質」又は「野生型Ｓタンパク質」(S)は以下を意味する：
−  特に226アミノ酸を含み、４つの膜貫通ドメイン(図2A)、特にHBVadw単離株のエンベロープタンパク質を含んでなるHBVウイルスの単離株のエンベロープタンパク質、又は
−  HBVウイルスの単離株に由来する天然変異体、又は前記Ｓタンパク質の合成変異体。
【００１８】
「組織化」は、野生型Ｓタンパク質との組合わせによりサブウイルス粒子を形成するタンパク質の能力を意味する。「自己組織化」は、自身によりサブウイルス粒子を形成するタンパク質の能力を意味する。
【００１９】
「Ｎ末端に位置する膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質」又は「Ｎ末端欠失Ｓタンパク質」又は「欠失Ｓタンパク質」(Sd)は、以下を意味する：
−  HBVウイルスの単離株のＳタンパク質の１位のアミノ酸から19位のアミノ酸まで、又は１位のアミノ酸から20位のアミノ酸まで、又は１位のアミノ酸から21位のアミノ酸まで、優先的には１位のアミノ酸から22位のアミノ酸までの領域を欠失している、Ｓタンパク質、又は
−  欠失Ｓタンパク質の前記領域と、少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の同一性パーセンテージを有するＳタンパク質、又は
−  HBVウイルスの単離株に由来する「天然変異体」又は前記欠失Ｓタンパク質の「合成変異体」。
【００２０】
「Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質」は、２つのタンパク質E1及びE2の１つのほぼ全体を意味し、これはエクトドメイン及び膜貫通ドメイン(図4B及び4C)から構成され、以下のフラグメント：
＊  以下の領域に位置する、HCVウイルス、特にHCVウイルスのHCV-1a単離株のポリタンパク質のペプチドフラグメントペプチドフラグメント：
−  タンパク質E1に関して、192位のアミノ酸から383位のアミノ酸まで、又は特に192位のアミノ酸から380位のアミノ酸まで伸びる領域、及び
−  タンパク質E2に関して、384位のアミノ酸から746位のアミノ酸まで、又は特に384位のアミノ酸から743位のアミノ酸まで伸びる領域；又は
＊  前記領域E1と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するフラグメント、又は
＊  前記領域E2と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％同一性パーセンテージを有するフラグメント、又は
＊  HCVウイルスの単離株のポリタンパク質の天然変異体又は合成変異体
に対応する。
【００２１】
「Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質のエクトドメイン」は、
＊  HCVウイルス、特にHCVウイルスのHCV-1a単離株のポリタンパク質に由来し、以下の領域に位置するE1又はE2のペプチドフラグメントの部分：
−  タンパク質E1のエクトドメインに関係する、192位のアミノ酸から352位のアミノ酸まで、又は特に192位のアミノ酸から352位のアミノ酸まで伸びる領域、及び
−  タンパク質E2のエクトドメインに関係する、384位のアミノ酸から717位のアミノ酸まで、又は特に384位のアミノ酸から717位のアミノ酸まで伸びる領域；又は
＊  前記領域E1と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するフラグメント、又は
＊  前記領域E2と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するフラグメント、又は
＊  HCVウイルスの単離株のポリタンパク質の天然変異体又は合成変異体
を意味する。
【００２２】
「Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン」は、
＊  HCVウイルス、特にHCVウイルスのHCV-1a単離株のポリタンパク質に由来し、以下の領域に位置する、E1又はE2のペプチドフラグメントの部分：
−  タンパク質E1の膜貫通ドメインに関して、353位のアミノ酸から383位のアミノ酸まで、有利には353位のアミノ酸から380位のアミノ酸まで伸びる領域、及び
−  タンパク質E2の膜貫通ドメインに関して、718位のアミノ酸から746位のアミノ酸まで、有利には718位のアミノ酸から743位のアミノ酸まで伸びる領域；又は
＊  前記領域E1と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するフラグメント、又は
＊  前記領域E2と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するフラグメント、又は
＊  HCVウイルスの単離株のポリタンパク質の天然変異体又は合成変異体
を意味する。
【００２３】
「同一性パーセンテージ」は、ポリペプチド分子の２つの配列の直接比較により決定され、該２つの配列でアミノ酸残基数を決定し、次いでそれを２つのうち長い配列のアミノ酸残基数で除し、得られた結果に100を乗じて決定されるパーセンテージを意味する。
本発明の目的は、本明細書中で開示された具体的配列に関する配列の同一性パーセンテージに関わらず、HCVウイルス及び/又はHBVウイルスの任意の単離株の任意のヌクレオチド及び/又はペプチド配列を含んでなる融合タンパク質に関する。
【００２４】
用語「天然変異体」とは、同じ種又は同じ集団の単離株間での、DNA配列、対立遺伝子又はタンパク質配列の何らかの変動性、多形性、多様性をいう。「天然変動性パーセンテージ」は、野生型参照分子に由来し、かつ目的とする生物学的性質、例えば免疫原性及び/又はサブウイルス粒子を形成する能力を備える、２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド分子の直接比較により決定される。これは、２つの配列間で同一のアミノ酸残基又は核酸残基の正確な数を決定し、次いでその数を２つのうち短い方の配列のアミノ酸残基数又は核酸残基数で除し、得られる結果に100を乗じて定量化される。
【００２５】
２つの配列間の変動性パーセンテージは、具体的には、様々である。なぜなら、それは、特に考慮するウイルス、考慮する遺伝子型、考慮する配列フラグメント−例えばHCVのエクトドメインの領域は膜貫通ドメインの領域より変化に富む−などに依存するからである。よって、HCVのタンパク質E1及びE2の変動性パーセンテージは、同じ遺伝子型の株間で、ヌクレオチドについて88％、アミノ酸について90％である。しかし、それは、異なる遺伝子型の株間では、ヌクレオチドについては55％、アミノ酸については59％に低下する。HBVはDNAウイルスであるので、変動性パーセンテージは、HCVより遥かに変化が小さい[Zhang M, Gaschen B, Blay W, Foley B, Haigwood N, Kuiken C, Korber B. Tracking global patterns of N-linked glycosylation site variation in highly variable viral glycoproteins: HIV, SIV, and HCV envelopes and influenza hemagglutinin. Glycobiology. 2004 Dec. 14(12):1229-46]。
【００２６】
本発明の目的は、本明細書中で開示された具体的配列に関する配列の天然及び/又は合成の変動性パーセンテージに関わらず、任意のHCVウイルス及び/又はHBVウイルスの単離株に由来するペプチド及び/又はヌクレオチド配列を備える任意の天然変異体又は天然変異体の任意のフラグメントを含んでなる融合タンパク質及び/又はハイブリッド核酸分子に関する。
【００２７】
用語「合成変異体」とは、目的とする生物学的性質、例えば免疫原性及び/又はサブウイルス粒子を形成する能力を保存しているという条件で、参照の野生型分子への付加、欠失又は置換による該参照野生型分子の組換えによって誘導される、本発明に従う任意のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド分子又は本明細書中に開示されたポリペプチド若しくはポリヌクレオチド分子の任意のフラグメントをいう。「合成変動性パーセンテージ」は、誘導された分子と参照野生型分子との直接比較により決定され、２つの配列間で位置及び性質に関して同一のアミノ酸残基又は核酸残基の正確な数を決定し、次いでその数を２つのうち短い方の配列のアミノ酸残基数又は核酸残基数で除し、得られる結果に100を乗じて決定される。
【００２８】
本発明の目的は、HCVウイルス及び/又はHBVウイルスの任意の単離株に由来するヌクレオチド及び/又はペプチド配列を備える、任意の合成変異体又は合成変異体の任意のフラグメントを含んでなる融合タンパク質に関する。
本発明の特に有利な観点によれば、融合タンパク質の一部を構成するE1及び/又はE2の膜貫通ドメインは、Ｃ末端位に位置する最後の３アミノ酸の少なくとも１つ、特に該最後の３アミノ酸を欠失し、その結果、E1及び/又はE2を欠失している膜貫通ドメインは、野生型E1及び/又はE2の膜貫通ドメインと、E1に関して少なくとも91％、E2に関して少なくとも90％の同一性パーセンテージを有する。
【００２９】
Ｃ末端位での３アミノ酸のうちの少なくとも１つの欠失、特に最後の３アミノ酸の欠失は、図１中記号
0005656832.tif 000002
で表され、HCVのポリタンパク質の成熟に必要であるが本発明のキメラ構築物の枠内では望ましくないペプチダーゼの切断部位を不活化するという利点を有する。
【００３０】
[1]．本発明の目的は、少なくとも以下の２つのペプチド：
ａ)Ｃ末端側の、
−  Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株のＳタンパク質であって、Ｎ末端に位置する膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質のアミノ酸配列、又は
−  Ｂ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、前記Ｎ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  Ｂ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、HBVウイルスの別の単離株に由来する天然変異体又は欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列、
から構成される第１のペプチド、及び
【００３１】
ｂ)Ｎ末端側の、
−  Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)単離株の少なくとも１つのエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列、又は
−  Ｃ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、Ｃ型肝炎ウイルス単離株のタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  Ｃ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E1若しくはE2のアミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される第２のペプチド
を含んでなり、第２のペプチドがタンパク質E1、タンパク質E2又はタンパク質E1とタンパク質E2とを含んでなる融合ペプチドから選択される、免疫原性融合タンパク質である。
【００３２】
本発明の目的は、特に、少なくとも以下：
−  一方で、本質的にはＣ末端に位置する３つの膜貫通ドメイン(図2A及び3A)から構成されるHBVの欠失Ｓタンパク質(Sd)であって、サブウイルス粒子へ組織化する能力及びHBVウイルスに対する免疫原性を保存する欠失Ｓタンパク質、及び
−  他方で、HCVウイルスに対する免疫原性を保存する、タンパク質E1及びE2の１つの配列のほぼ全体
を含んでなる融合タンパク質であって、(特に図3B又は3Cで表されるものが)野生型Ｓタンパク質の存在下で、サブウイルス粒子に自己組織化することができ、HBV及び/又はHCVウイルスに対する免疫、特にHBV及びHCVウイルスに対する二重免疫を誘導することができる、融合タンパク質に関する。
【００３３】
[1a]．有利には、本発明の目的は、前記第２のペプチド(E1又はE2)のＮ末端に、Ｃ型肝炎ウイルス単離株の転移開始ペプチド(PIT)のアミノ酸配列から構成される第３のペプチドを含んでなる免疫原性融合タンパク質である。
【００３４】
本発明に従う融合タンパク質又はタンパク質E1若しくはE2の「転移開始ペプチド」(それぞれPIT1及びPIT2)は、
下記ペプチドフラグメントが、本発明の融合タンパク質の一部を構成する場合には、翻訳後に該融合タンパク質を小胞体に向かわせる能力を維持し、その結果、該融合タンパク質が正確にグリコシル化され、三次元コンホメーション及び/又は抗原性特性が野生型Ｓタンパク質に関して最良に保持される条件で、
＊  以下の領域に位置する、HCVウイルス、特にHCV-1a単離株のポリタンパク質のペプチドフラグメント：
−  タンパク質E1に関しては、166位のアミノ酸から191位のアミノ酸まで伸びる領域、及び
−  タンパク質E2に関しては、366位のアミノ酸から383位のアミノ酸まで伸びる領域、又は
＊  HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記ペプチドフラグメントの合成変異体、又は
＊  第２のペプチドのＮ末端にグラフトされた任意のペプチドフラグメント
を意味する。
【００３５】
[2]．別の特に有利な観点によれば、本発明の目的は、Ｎ末端側に位置する第２のペプチドが以下：
−  エンベロープタンパク質E1の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、エンベロープタンパク質E1の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E1に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される免疫原性融合タンパク質である。
【００３６】
本発明の１つの具体的目的は、その概説図が図3Bに示された、HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされたHCVのタンパク質E1のほぼ全体を含んでなる融合タンパク質E1-Sdである。
【００３７】
[3]．有利には、本発明の目的は、具体的には、Ｎ末端側に位置する第２のペプチドが以下：
−  エンベロープタンパク質E2の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、エンベロープタンパク質E2の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E2に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される免疫原性融合タンパク質である。
【００３８】
本発明の１つの具体的目的は、その概説図が図3Cに示された、HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされたHCVのタンパク質E2のほぼ全体を含んでなる融合タンパク質E2-Sdである。
【００３９】
[3b]．この観点において、本発明は、より具体的には、以下の３ペプチド：
ａ)Ｃ末端側の、
−  Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株の、Ｎ末端の膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質のアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、Ｎ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、HBVウイルスの単離株に由来する天然変異体又はＮ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される第１のペプチド；
【００４０】
ｂ)以下：
−  Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質E2の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、前記エンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸は列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株の天然変異体又はタンパク質E2のアミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される配列の第２のペプチド、及び
【００４１】
ｃ)Ｎ末端側の、以下：
−  Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質E1の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列の全体、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、前記エンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及びエクトドメインのアミノ酸配列と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又はタンパク質E1のアミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される配列の第３のペプチド
を含んでなり、
第２のペプチドは第１のペプチドと第３のペプチドとの間に位置し、第１、第２及び第３のペプチドは好ましくは連続している、免疫原性融合タンパク質に関する。
【００４２】
本発明の１つの具体的目的は、それ自体HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされているHCVのタンパク質E2のほぼ全体のＮ末端にグラフトされたE1のエクトドメインを含んでなる融合タンパク質E1-E2-Sdである。
本発明の１つの具体的目的はまた、それ自体HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされているHCVのタンパク質E1のほぼ全体のＮ末端にグラフトされたE2のエクトドメインを含んでなる融合タンパク質E2-E1-Sdである。
【００４３】
[4]．本発明の特に有利な観点によれば、免疫原性融合タンパク質を構成する第１及び第２のペプチドは連続しており、第２のペプチドのＣ末端は、第１のペプチドのＮ末端に共有結合している。
有利には、本発明によれば、HCVウイルスのタンパク質E1若しくはE2又は本発明の融合タンパク質のフラグメントPIT1-E1、PIT2-E2、E1-E2若しくはPIT1-E1-E2は、HBVウイルスの欠失Ｓタンパク質と連続様式で共有結合している。
本発明の別の有利な観点によれば、免疫原性融合タンパク質が野生型Ｓタンパク質の存在下でサブウイルス粒子に自己組織化する能力並びにHCVウイルス若しくはHBVウイルス又はHCV及びHBVウイルスに対する免疫原性を維持する条件で、結合性ペプチドが、前記融合タンパク質を構成する第１及び第２のペプチドを連結しており、該結合性ペプチドは１アミノ酸又は２アミノ酸又は３アミノ酸又は４アミノ酸又は５アミノ酸から構成される。
【００４４】
[5]．本発明の別の具体的目的は、Ｃ末端位の第１のペプチドが以下：
−  HBVウイルス、具体的にはHBVadw単離株のＮ末端欠失Ｓタンパク質の23位のアミノ酸から226位のアミノ酸まで伸びる領域に位置する連続アミノ酸により画定されるアミノ酸配列、特に配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、Ｎ末端欠失Ｓタンパク質の連続アミノ酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、HBVウイルスの単離株に由来する天然変異体又はＮ末端欠失Ｓタンパク質のアミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される、免疫原性融合タンパク質である。
【００４５】
本発明のより具体的な目的は、欠失Ｓタンパク質がHBVadw単離株のものであり、配列番号２の配列を有する融合タンパク質E1-Sd又はE2-Sd又はE1-E2-Sdである(表１参照)。
【００４６】
[6]．本発明の別の具体的目的は、Ｎ末端の第２のペプチドが以下：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株のタンパク質E1の192位のアミノ酸から380位のアミノ酸まで伸びる領域に位置する連続アミノ酸により画定されるアミノ酸配列、特に配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、タンパク質E1の前記連続アミノ酸配列と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又はタンパク質E1の前記連続アミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される免疫原性融合タンパク質である。
【００４７】
本発明の別の具体的目的は、タンパク質E1の配列がHCV-1a単離株に由来し、前記領域に具体的に対応する、融合タンパク質、例えば特に配列番号４の融合タンパク質E1-Sd又はE1-E2-Sd、PIT1-E1-E2-Sdである(表１参照)。
【００４８】
[7]．本発明は、具体的には、第１及び第２のペプチドが連続している免疫原性融合タンパク質に関し、該融合タンパク質は、以下：
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される。
【００４９】
本発明の別の目的は、タンパク質E1の配列がHCV-1a単離株に由来し、配列番号８の配列を有する融合タンパク質E1-Sdであり、その配列はE1の配列番号４の前にグラフトされた配列番号２に対応する。
【００５０】
[7b]．この観点では、本発明の目的は、より具体的には、第２のペプチドのＮ末端側に位置する第３の転移開始ペプチドを含んでなる免疫原性融合タンパク質であり、該融合タンパク質は以下：
−  配列番号12、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、、配列番号12と少なくとも83％、特に少なくとも85％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性の相同性を有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号12に由来する合成変異体のアミノ酸配列
で表される。
【００５１】
本発明の別の目的は、タンパク質E1の配列がHCV、具体的にはHCV-1a単離株に由来し、配列番号12の配列を有する融合タンパク質PIT1-E1-Sdであり、その配列は、それ自体タンパク質E1の転移開始ペプチド(PIT1)のアミノ酸配列(HCVの166位のアミノ酸から191位のアミノ酸まで伸びる領域に含まれる)のＮ末端にグラフトされているE1の配列番号４のＮ末端にグラフトされたSdの配列番号２に対応する。
融合タンパク質E1-SdのＮ末端への転移開始ペプチドの挿入は、翻訳された該融合タンパク質を小胞体に向かわせ、その結果、該融合タンパク質が正確にグリコシル化され、三次元コンホメーション及び/又は抗原性特性が野生型タンパク質に関して実質的に何ら変更を示さないという特別な利点を有する。
【００５２】
[8]．本発明の別の目的は、Ｎ末端位の第２のペプチドが以下：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株のタンパク質E2の384位のアミノ酸から743位のアミノ酸までに位置する連続アミノ酸により画定されるアミノ酸配列、特に配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、前記タンパク質E2の連続アミノ酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又はタンパク質E2の前記連続アミノ酸配列に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される免疫原性融合タンパク質である。
【００５３】
本発明の別の目的は、タンパク質E2の配列がHCV、具体的にはHCV-1a単離株に由来し、タンパク質E2の配列の前記領域に特異的に対応する、融合タンパク質E2-Sd又はE1-E2-Sdである。
【００５４】
[9]．本発明は、具体的には、第１及び第２のペプチドが連続する融合タンパク質に関し、該融合タンパク質は
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される。
【００５５】
本発明の別の目的は、タンパク質E2の配列がHCV-1a単離株に由来し、配列番号10の配列を有する融合タンパク質E2-Sdであり、その配列は、E2の配列番号６の前にグラフトされたSdの配列番号２に対応する。
【００５６】
[9b]．この観点において、本発明の目的は、より具体的には、第２のペプチドのＮ末端側に位置する第３の転移開始ペプチドを含んでなる免疫原性融合タンパク質(PIT2-E2-Sd)であり、該融合タンパク質は、以下：
−  配列番号14、又は
−  配列番号14と少なくとも82％、特に少なくとも85％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性の相同性を有するアミノ酸配列、又は
−  配列番号14がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号14に由来する合成変異体のアミノ酸配列
で表される。
【００５７】
本発明の別の目的は、タンパク質E2の配列がHCV-1a単離株に由来し、配列番号14の配列を有する融合タンパク質PIT2-E2-Sdであり、この配列は、それ自体タンパク質E2の転移開始ペプチド(PIT2)のアミノ酸配列(HCVの366位のアミノ酸〜383位のアミノ酸から構成される領域に含まれる)のＮ末端にグラフトされているE2の配列番号６のＮ末端にグラフトされたSdの配列番号２に対応する。
本発明の別の目的は、融合タンパク質E1-E2-Sd又はPIT1-E1-E2-Sdである。本発明の別の目的は精製形態の融合タンパク質である。
【００５８】
本発明はまた、前記融合タンパク質のいずれかをコードするハイブリッド核酸分子に関する。
【００５９】
「ハイブリッド核酸分子」は、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株の、Ｎ末端に位置する膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質をコードする少なくとも１つの配列と、Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質のほぼ全体をコードする少なくとも１つの配列とを含んでなる任意の核酸分子、又は該分子に由来し、遺伝子コードの天然の縮重に従って改変された任意の分子を意味する。
【００６０】
有利には、本発明は、上記融合タンパク質をコードし、以下の３つの核酸配列を含んでなるハイブリッド核酸分子に関する：
ａ)−  3'側の、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株の、Ｎ末端に位置する膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質をコードする第１の核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、Ｎ末端欠失Ｓタンパク質の核酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、HBVウイルスの別の単離株に由来する天然変異体又は前記Ｎ末端欠失Ｓタンパク質の核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列、及び
【００６１】
ｂ)−  第１の配列の5'側の、Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質E1又はE2の少なくとも一方の膜貫通ドメイン及びエクトドメインをコードする第２の核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、Ｃ型肝炎ウイルス単離株の前記タンパク質E1又はE2の１つをコードする核酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性の相同性を有する核酸配列、
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E1若しくはE2の１つの核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列
(ここで、第２の配列は、タンパク質E1、タンパク質E2又はタンパク質E1とタンパク質E2とを含んでなる融合ペプチドをコードする配列から選択される)、及び
【００６２】
ｃ)−  第２の配列の5'側の、Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質E1又はE2の転移開始ペプチド(PIT)をコードする第３の核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされる転移開始ペプチドが、翻訳後に融合タンパク質を小胞体に向かわせる能力を維持し、その結果、該融合タンパク質が正確にグリコシル化され、三次元コンホメーションが野生型Ｓタンパク質に対して最小限の可能な変更を有し及び/又は抗原性特性が野生型Ｓタンパク質に対して最良に保持される条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は転移開始ペプチド(PIT)をコードするタンパク質の前記核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列、又は
−  翻訳後に融合タンパク質を小胞体に向かわせ、その結果、該融合タンパク質が正確にグリコシル化され、三次元コンホメーションが野生型Ｓタンパク質に対して最小限の可能な変更を示し及び/又は抗原性特性が野生型Ｓタンパク質に対して最良に保持することができるペプチドをコードする任意の核酸配列。
【００６３】
有利には、本発明の目的は、5'末端から3'末端へ、Ｃ型肝炎ウイルスの単離株の転移開始ペプチド(PIT)をコードする核酸配列、HCVウイルスの単離株のタンパク質E1又はE2をコードする核酸配列、HBVウイルスの単離株の欠失Ｓタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる、前記融合タンパク質(特に、E1-Sd又はE2-Sd、又はE1-E2-Sd、PIT1-E1-Sd又はPIT2-E2-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、下記表１に規定される、分子e1-sd又はe2-sd、又はe1-e2-sd、pit1-e1-sd又はpit2-e2-sd)である。
【００６４】
前記融合タンパク質(特に、E1-Sd又はE2-Sd、又はE1-E2-Sd)のＮ末端にグラフトされた転移開始ペプチドをコードする核酸配列の挿入は、翻訳された融合タンパク質を小胞体に向かわせ、その結果、該融合タンパク質が正確にグリコシル化され、三次元コンホメーション及び/又は抗原性特性が野生型タンパク質に関して実質的に何ら変更を示さないという特別な利点を有する。
本発明の別の目的は、最初の２つの核酸配列のみを含んでなり、転移開始ペプチドをコードする核酸配列を欠いているハイブリッド核酸分子である。
【００６５】
本発明の目的は、特に、本発明の融合タンパク質をコードし、少なくとも以下：
−  Ｃ末端に位置する３つの膜貫通ドメインから本質的に構成されるHBVの欠失Ｓタンパク質(Sd)をコードする核酸配列(図2A及び3A)であって、該欠失Ｓタンパク質がサブウイルス粒子に自己組織化する能力及びHBVウイルスに対する免疫原性を保存する、核酸配列、及び
−  タンパク質E1及びE2の１つの配列のほぼ全体をコードし、HCVウイルスに対する免疫原性を保存する核酸配列(図3B及び3C)、
−  翻訳後に融合タンパク質を小胞体に向かわせる能力を保存し、その結果、該融合タンパク質が正確にグリコシル化され、三次元コンホメーションが野生型Ｓタンパク質に対して最小の可能な変更を有し及び/又は抗原性特性が野生型Ｓタンパク質に対して最良に保持される、本発明の転移開始ペプチドをコードする核酸配列
を含んでなるハイブリッド核酸分子であり、該ハイブリッド核酸分子によりコードされる融合タンパク質が、サブウイルス粒子を形成する能力及びHBV及び/又はHCVウイルスに対する免疫原性(特に、HBV及びHCVウイルスに対して二重免疫を誘導する性質)を維持するハイブリッド核酸分子に関する。
【００６６】
「相同性パーセンテージ」は、ポリヌクレオチド分子の２つの配列の直接比較により決定され、該２つの配列の核酸残基数を決定し、次いでそれを２つのうち長い配列の核酸残基数で除し、得られた結果に100を乗じて決定されるパーセンテージを意味する。
【００６７】
本発明の特に有利な観点に従えば、E1及び/又はE2の膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、3'位に位置する最後の９つの核酸の少なくとも１つ、優先的には最後の９つの核酸を欠失しており、その結果、E1及び/又はE2の膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、以下のものに相当する：
−  以下の領域に位置するHCV単離株のゲノムのヌクレオチドフラグメント：
＊  E1の膜貫通ドメインをコードする核酸配列に関して、1398位の核酸から1490位の核酸まで、有利には1398位の核酸から1481位の核酸まで伸びる領域、又は
＊  E2の膜貫通ドメインをコードする核酸配列に関して、2493位の核酸から2579位の核酸まで、有利には2493位の核酸から2570位の核酸まで伸びる領域、又は
−  HCVのゲノムの野生型ヌクレオチドフラグメントと、E1に関して少なくとも91％、E2に関して少なくとも90％の相同性パーセンテージを有するHCV単離株のゲノムのヌクレオチドフラグメント、又は
−  HCVウイルスの天然変異体及び/又は野生型HCV単離株のゲノムのヌクレオチドフラグメントの合成変異体に由来するヌクレオチドフラグメント。
【００６８】
表現「3'位に位置する最後の９つの核酸の少なくとも１つを欠失しているE1及び/又はE2の膜貫通ドメイン」とは、膜貫通ドメインの１つの、3'位に位置する３核酸又は６核酸又は９核酸の欠失をいう。
【００６９】
有利には、免疫原性融合タンパク質をコードするハイブリッド核酸分子の第１及び第２の核酸配列は連続しており、第１の核酸配列の5'末端が第２の核酸配列の3'末端に共有結合している。
特に有利な観点によれば、ハイブリッド核酸分子は、例えば、以下の融合タンパク質：E1-Sd、E2-Sd、PIT1-E1-Sd又はPIT2-E2-Sd)をそれぞれコードする以下の分子：e1-sd、e2-sd、又はpit1-e1-sd若しくはpit 2-e2-sdに相当する。
【００７０】
本発明の別の有利な観点によれば、結合性ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、第１及び第２のヌクレオチド配列を連結し、そのヌクレオチド配列は以下のものから構成される：
−  ３核酸若しくは６核酸、若しくは９核酸、若しくは12核酸、若しくは15核酸、又は
−  ハイブリッド核酸分子によりコードされる免疫原性融合タンパク質であって、(それ自体は後記ヌクレオチド配列によりコードされる)後記結合性ペプチドを含んでなる免疫原性融合タンパク質が、野生型Ｓタンパク質の存在下で非感染性サブウイルス粒子に自己組織化する能力を維持し、HCVウイルス及び/又はHBVウイルスに対する免疫原性を保存する条件で、任意の結合性ペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列。
【００７１】
この観点において、本発明の目的は、具体的には、HBV、特にHBVadw単離株のＮ末端欠失Ｓタンパク質をコードする第１の核酸配列が、ハイブリッド核酸分子の3'側に位置し、以下のもの：
−  HBVのゲノムの1630位〜2241位に位置する連続核酸により画定される核酸配列、特に、
−  配列番号１で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、前記Ｎ末端欠失Ｓタンパク質をコードする核酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、HBVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記Ｎ末端欠失Ｓタンパク質をコードする核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列
から構成されるハイブリッド核酸分子である。
【００７２】
本発明のより具体的目的は、HCVの欠失Ｓタンパク質をコードする核酸配列がHBVadw単離株のものであり、配列番号１の配列を有する、前記融合タンパク質(特に、E1-Sd又はE2-Sd、又はE1-E2-Sd、PIT1-E1-Sd又はPIT2-E2-Sd、又はPIT1-E1-E2-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、e1-sd又はe2-sd、又はe1-e2-sd、pit1-e1-sd又はpit2-e2-sd、又はpit1-e1-e2-sd)に関する。
【００７３】
またこの点に関して、本発明は、より具体的には、HCV、特にHCV-1a単離株の膜貫通ドメイン及びタンパク質E1のエクトドメインをコードする第２の核酸配列がハイブリッド核酸分子の5'側に位置し、以下のもの：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株のゲノムの915位〜1490位、具体的には915位〜1481位に位置する連続核酸により画定される核酸配列、特に配列番号３で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、タンパク質E1の前記核酸配列と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又はタンパク質E1の前記核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列
から構成されるハイブリッド核酸分子に関する。
【００７４】
本発明のより具体的な目的は、タンパク質E1をコードする核酸配列がHCV-1a単離株のものであり、配列番号３の配列である、融合タンパク質(特に、E1-Sd又はPIT1-E1-Sd、又はE1-E2-Sd、又はPIT1-E1-E2-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、e1-sd又はpit1-e1-sd、又はe1-e2-sd、又はpit1-e1-e2-sd)に関する。
【００７５】
本発明は、具体的には、Ｎ末端側に位置する転移開始ペプチドを含んでなる融合タンパク質をコードするハイブリッド核酸分子に関し、該ハイブリッド核酸分子は、以下：
−  配列番号11、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVに対して免疫原性を保存する条件で、配列番号11と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVに対して免疫原性を保存する条件で、配列番号11に由来する合成変異体の核酸配列
で表される。
【００７６】
配列番号11の核酸配列は、pit1-e1-sdとも呼ばれ、配列番号12の融合タンパク質PIT1-E1-Sdをコードする(表１を参照)。
【００７７】
本発明の別の目的は、以下：
−  タンパク質E1をコードする核酸配列がHCV、具体的にはHCV-1a単離株に由来し、配列番号３の配列であり、
−  Ｓタンパク質をコードする核酸配列がHBV、具体的にはHBVadw単離株に由来し、配列番号１の配列であり、配列番号１は、それ自体がタンパク質E1の転移開始ペプチド(PIT1)をコードする核酸配列(HCVの837位〜914位の核酸から構成される領域に含まれる)の5'側にグラフトされたE1の配列番号３の5'側にグラフトされている、
ハイブリッド核酸分子(特に、配列番号11のpit1-e1-sd)である。
【００７８】
この観点において、本発明の目的は、より具体的には、HCV、特にHCV-1a単離株のタンパク質E2の膜貫通ドメイン及びエクトドメインをコードする第２の核酸配列がハイブリッド核酸分子の5'側に位置し、以下のもの：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株のゲノムの1491位〜2579位、具体的には1491位〜2570位に位置する連続核酸により画定される核酸配列、特に配列番号５で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、タンパク質E2の前記核酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は配列番号５に由来する合成変異体の核酸配列
から構成されるハイブリッド核酸分子に関する。
【００７９】
本発明のより具体的目的は、融合タンパク質(特に、E2-Sd又はPIT2-E2-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、e2-sd又はpit2-e2-sd)に関する。
【００８０】
本発明は、具体的には、Ｎ末端側に位置する転移開始ペプチドを含んでなる本発明の融合タンパク質をコードするハイブリッド核酸分子に関し、該ハイブリッド核酸分子は以下：
−  配列番号13、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、配列番号13と少なくとも80％、特に少なくとも85％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、配列番号13に由来する合成変異体に由来する核酸配列
で表される。
【００８１】
配列番号13の核酸配列は、pit2-e2-sdとも呼ばれ、配列番号14の融合タンパク質PIT2-E2-Sdをコードする(表１を参照)。
【００８２】
本発明の別の目的は、
−  タンパク質E2をコードする核酸配列がHCV、具体的にはHCV-1a単離株に由来し、配列番号５の配列であり
−  Ｓタンパク質をコードする核酸配列がHBV、具体的にはHBVadw単離株に由来し、配列番号１の配列であり、配列番号１は、それ自体がタンパク質E2の転移開始ペプチド(PIT2)をコードする核酸配列(HCVの1437位の核酸〜1490位の核酸から構成される領域に含まれる)の5'側にグラフトされたE2の配列番号５の5'側にグラフトされている、
ハイブリッド核酸分子(特に、配列番号13のpit2-e2-sd)である。
【００８３】
本発明の別の目的は、前記融合タンパク質をコードするハイブリッド核酸分子及び該ハイブリッド核酸分子に作動可能な様式で連結され該核酸分子の発現に必要な手段を含んでなるベクターである。
本発明の目的に適切な発現ベクターに関し、例えば、プラスミド、レンチウイルス型のウイルスベクター、セムリキ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクチンウイルス、バキュロウイルス、サルモネラ型の細菌ベクター及びBCGを挙げることができる。
【００８４】
タンパク質(用語タンパク質は、アミノ酸の任意の分子、例えばタンパク質、融合タンパク質、タンパク質のフラグメント、ペプチド、ポリタンパク質、ポリペプチドなどに使用される)の「発現に必要な手段」は、該タンパク質を得ることを可能にする任意の手段、例えば特にプロモーター、転写ターミネーター、複製起点、好ましくは選択マーカーを意味する。ペプチドの発現に必要な手段は、目的のペプチドをコードする核酸配列に作動可能な様式で連結される。
【００８５】
「作動可能な様式で連結」は、前記発現に必要な成分及び目的のペプチドをコードする遺伝子が期待される様式で機能することを可能にするように近接していることを意味する。例えば、機能的関係が保持される限り、プロモーターと目的の遺伝子との間に補充の塩基が存在してもよい。
【００８６】
ペプチドの発現に必要な手段は、同種手段であってもよいし(換言すれば、使用するベクターのゲノムに含まれていてもよく)、代わりに異種であってもよい。後者の場合、手段は、発現させるべき目的のペプチドと共にクローニングされる。
好ましくは、発現ベクターとして使用されるセムリキベクター及びレンチウイルスベクター中で使用されるプロモーターは、同種プロモーター及びサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。
【００８７】
異種プロモーターの非限定的な例には、特に、(i)ウイルスプロモーター、例えばSV40(シミアンウイルス40)プロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター(TK-HSV-1)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のLTR、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター及びアデノウイルス主要後期プロモーター(MLP)、並びに(ii)高等真核生物でペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する任意の細胞プロモーター、例えばホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)の構成性遺伝子のプロモーター(Adraら, 1987, Gene, 60: 65-74)、肝臓α1-抗トリプシン及びFIXの特異遺伝子のプロモーター及び平滑筋細胞の特異プロモーターSM22(Moesslerら, 1996, Development, 122: 2415-2425)が含まれる。
【００８８】
本発明は、具体的には、レンチウイルスベクターを更に含んでなるベクターに関する。
本発明の目的は、より具体的には、レンチウイルスベクターがベクターpLentiであるベクターである。
ベクターpLentiは、以前に開示されており、特にNaldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M.及びTrono, D. (1996) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263-7により開示されている。
【００８９】
本発明の別の目的は、セムリキ森林ウイルスのゲノムから誘導された欠損ウイルスベクターを更に含んでなるベクターである。
この欠損ウイルスベクターは、以前に開示されており、特にSchlesinger, S.及びT. M. Dubensky, Jr. 1999. Alphavirus vectors for gene expression and vaccines. Curr. Opin. Biotechnol. 10:434-439に開示されている。
本発明の目的は、特に、セムリキ森林ウイルスのゲノムから誘導された欠損ウイルスベクターがベクターpSFV1であるベクターである。このベクターは、特に、Invitrogenから市販されている。
【００９０】
この観点において、本発明の目的は、より具体的には、ハイブリッド核酸分子が以下から構成されるベクターである：
−  配列番号11で表される核酸配列、又は
−  融合タンパク質をコードする後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成し得る条件で、配列番号11の配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性を有する核酸配列(このベクターは、特に、配列番号15で表される)、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成し得る融合タンパク質をコードする条件で、配列番号11で表される核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列。
【００９１】
本発明の別の目的は、前記融合タンパク質(特に、配列番号12のPIT1-E1-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、配列番号11のpit1-e1-sd)を含んでなり、
−  タンパク質E1をコードする核酸配列がHCV、具体的にはHCV-1a単離株に由来し、配列番号３の配列であり、
−  Ｓタンパク質をコードする核酸配列がHBV、具体的にはHBVadw単離株に由来し、配列番号１の配列であり、配列番号１は、それ自体がタンパク質E1の転移開始ペプチド(PIT1)をコードする核酸配列(HCVの837位〜914位の核酸から構成される領域に含まれる)の5'側にグラフトされたE1の配列番号３の5'側にグラフトされている、
配列番号15の配列のpSFV1に由来するベクターである。
【００９２】
この観点において、本発明の目的は、より具体的には、ハイブリッド核酸分子が以下から構成される前記ベクターの１つである：
−  配列番号13で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列がHBV及び/又はHCVウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成し得るペプチドをコードする条件で、配列番号13の配列と少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％、更により具体的には少なくとも95％相同性を有する核酸配列(このベクターは特に配列番号16で表される)、
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHBV及び/又はHCVウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成し得るペプチドをコードする条件で、配列番号13に由来する合成変異体の核酸配列。
【００９３】
本発明の別の目的は、前記融合タンパク質(特に、配列番号14のPIT1-E1-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、配列番号13のpit1-e1-sd)を含んでなり、
−  タンパク質E2をコードする核酸配列がHCV、具体的にはHCV-1a単離株に由来し、配列番号５の配列であり、
−  Ｓタンパク質をコードする核酸配列がHBV、具体的にはHBVadw単離株に由来し、配列番号１の配列であり、
−  配列番号１が、それ自体がタンパク質E2の転移開始ペプチド(PIT2)をコードする核酸配列(HCVの1437位〜1490位の核酸から構成される領域に含まれる)の5'側にグラフトされたE2の配列番号５の5'側にグラフトされている、
配列番号16のベクターである。
【００９４】
本発明はまた、以下の３つの核酸配列から構成されるハイブリッド核酸分子を含んでなるベクターに関する：
ａ)−  3'側の、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株の、Ｎ末端に位置する膜貫通ドメインを欠失しているＳタンパク質(Sd)をコードする第１の核酸配列、又は
−  後記核酸配列がHBVウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成し得るペプチドをコードする条件で、Ｎ末端欠失Ｓタンパク質の核酸配列と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHBVウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成し得るペプチドをコードする条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は欠失Ｓタンパク質(Sd)をコードする核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列、及び
【００９５】
ｂ)−  第１の核酸配列の5'末端の、Ｃ型肝炎ウイルス単離株のエンベロープタンパク質E1又はE2の少なくとも１つの膜貫通ドメイン及びエクトドメインをコードする第２の核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性のペプチドをコードする条件で、Ｃ型肝炎ウイルス単離株のタンパク質E1又はE2の１つをコードする核酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性のペプチドをコードする条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又はエンベロープタンパク質E1若しくはE2をコードする第２の核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列
(ここで、第２の配列は、タンパク質E1をコードする配列、タンパク質E2をコードする配列又はタンパク質E1とタンパク質E2とを含んでなる融合ペプチドをコードする配列から選択される)、及び
【００９６】
ｃ)−  第２の核酸配列の5'末端の、Ｃ型肝炎ウイルス単離株の転移開始ペプチド(PIT)をコードする第３の核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされる転移開始ペプチドが翻訳後に融合タンパク質を小胞体に向かわせる能力を維持し、その結果、該融合タンパク質が正確にグリコシル化され、三次元コンホメーションが野生型タンパク質に対し最小の可能な変更を有し及び/又は抗原性特性が野生型タンパク質に対して最良に保持される条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は転移開始ペプチド(PIT)をコードするタンパク質の前記核酸配列に由来する合成変異体の核酸配列、又は
−  翻訳後融合タンパク質を小胞体に向かわせ、その結果、該融合タンパク質が正確にグリコシル化され、三次元コンホメーションが野生型タンパク質に対し最小の可能な変更を有し及び/又は抗原性特性が野生型タンパク質に対し最良に保持されることができるペプチドをコードする任意の核酸配列。
【００９７】
有利には、本発明の別の目的は、前記免疫原性融合タンパク質(特に、E1-Sd又はE2-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、e1-sd又はe1-e2-sd)の第１及び第２の核酸配列が連続し、第１の核酸配列の5'末端が第２の核酸配列の3'末端に共有結合しているベクターである。
【００９８】
別の有利な観点によれば、本発明は、結合性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が前記免疫原性融合タンパク質(特に、E1-Sd又はE2-Sd)をコードする第１及び第２のヌクレオチド配列を連結する、ベクターであって、
結合性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記免疫原性融合タンパク質(特に、E1-Sd又はE2-Sd)の、野生型Ｓタンパク質の存在下でサブウイルス粒子に自己組織化する能力を変更せず、該融合タンパク質がHCVウイルス及び/又はHBVウイルスに対する免疫原性を保存する条件で、結合性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が３核酸又は６核酸又は９核酸又は12核酸又は15核酸から構成される、
ベクター(特に、レンチウイルスベクター、例えばベクターpLenti、又はセムリキ森林ウイルスのゲノムから誘導された欠損ウイルスベクター、例えばベクターpSFV1)に関する。
【００９９】
有利には、前記ベクターは、HBV、具体的にはＢ型肝炎ウイルスのHBVadw単離株のＮ末端欠失Ｓタンパク質をコードする第１の核酸配列を含んでなり、その配列は：
−  HBV、具体的にはHBVadw単離株の1630〜2241位に位置する連続核酸により画定される核酸配列、特に配列番号１で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号１と少なくとも91％、特に少なくとも93％、具体的には少なくとも95％、より具体的には少なくとも97％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、HBVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は配列番号１に由来する合成変異体の核酸配列
である。
【０１００】
本発明のより具体的な目的は、前記融合タンパク質(特に、E1-Sd又はE2-Sd、又はE1-E2-Sd、PIT1-E1-Sd又はPIT2-E2-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、e1-sd又はe2-sd、又はe1-e2-sd、pit1-e1-sd又はpit2-e2-sd)を含んでなるベクターであって、HBVの欠失Ｓタンパク質をコードする核酸配列がHBVadw単離株のものであり、配列番号１の配列を有する、ベクター(特に、レンチウイルスベクター、例えばベクターpLenti、又はセムリキ森林ウイルスのゲノムから誘導された欠損ウイルスベクター、例えばベクターpSFV1)である。
【０１０１】
本発明の１つの具体的な観点によれば、前記ベクターは、HCV、具体的にはHCV-1a単離株のタンパク質E1の膜貫通ドメイン及びエクトドメインをコードする第２の核酸配列を含んでなり、第２の核酸配列は、分子の5'側に位置し、以下のものから構成される：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株のゲノムの915位〜1490位、具体的には915位〜1481位に位置する連続核酸により画定される核酸配列、特に配列番号３で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、タンパク質E1をコードする核酸配列と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E1をコードする核酸に由来する合成変異体の核酸配列。
【０１０２】
本発明のより具体的な目的は、HCVのタンパク質E1をコードする核酸配列がHCV-1a単離株のものであり、配列番号３の配列を有する、融合タンパク質(特に、E1-Sd、又はE1-E2-Sd、PIT1-E1-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、e1-sd、又はe1-e2-sd、pit1-e1-sd)を含んでなるベクター(特に、レンチウイルスベクター、例えばベクターpLenti、又はセムリキ森林ウイルスのゲノムから誘導された欠損ウイルスベクター、例えばベクターpSFV1)である。
【０１０３】
本発明の有利な観点によれば、前記ベクターは、HCV、具体的にはHCV-1a単離株のタンパク質E2の膜貫通ドメイン及びエクトドメインをコードする第２の核酸配列を含んでなり、第２の核酸配列は、分子の5'側に位置し、以下のものから構成される：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株のゲノムの1491位〜2579位、具体的には1491位〜2570位に位置する連続核酸により画定される核酸配列、特に配列番号５で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、タンパク質E2をコードする核酸配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E2をコードする核酸に由来する合成変異体の核酸配列。
【０１０４】
本発明のより具体的な目的は、HCVのタンパク質E2をコードする核酸配列がHCV-1a単離株のものであり、配列番号５の配列を有する、融合タンパク質(特に、E2-Sd、又はE1-E2-Sd、PIT2-E2-Sd)をコードするハイブリッド核酸分子(特に、e2-sd、又はe1-e2-sd、pit2-e2-sd)を含んでなるベクター(特に、レンチウイルスベクター、例えばベクターpLenti、又はセムリキ森林ウイルスのゲノムから誘導された欠損ウイルスベクター、例えばベクターpSFV1)である。
【０１０５】
本発明の別の目的は、以下のタンパク質を含んでなる非感染性で免疫原性のキメラサブウイルスエンベロープ粒子である：
−  Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株の表面抗原の野生型Ｓタンパク質から構成されるタンパク質、及び
−  前記免疫原性融合タンパク質の少なくとも１つ。
用語「キメラサブウイルス粒子」は、HBVの野生型Ｓタンパク質と、野生型Ｓタンパク質の自己組織化又は野生型Ｓタンパク質の存在下での融合タンパク質の組織化から生じる免疫原性融合タンパク質とを少なくとも含んでなる任意のサブウイルス粒子を意味する。
【０１０６】
有利には、免疫原性キメラサブウイルス粒子の免疫原性融合タンパク質は：
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、HCVウイルス及び/若しくはHBVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は配列番号８に由来する合成変異体のアミノ酸配列
である。
【０１０７】
本発明の別の目的は、タンパク質E1の配列が特に配列番号４であり、特にＣ末端に配列番号２の配列の欠失Ｓタンパク質(Sd)のアミノ酸配列がグラフトされている融合タンパク質、特に配列番号８の融合タンパク質E1-Sd又はE1-E2-Sdを含んでなる免疫原性キメラサブウイルス粒子である。
【０１０８】
本発明の１つの特別な観点によれば、免疫原性キメラサブウイルス粒子の免疫原性融合タンパク質は、以下のものから構成される：
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10に由来する合成変異体のアミノ酸配列。
【０１０９】
本発明の別の目的は、タンパク質E1の配列が特に配列番号６であり、特にＣ末端に配列番号２の配列の欠失Ｓタンパク質(Sd)のアミノ酸配列がグラフトされている融合タンパク質、特に配列番号10の融合タンパク質E1-Sd又はE1-E2-Sdを含んでなる免疫原性キメラサブウイルス粒子である。
【０１１０】
本発明の有利な観点によれば、免疫原性キメラサブウイルス粒子は、以下の２つの融合タンパク質を含んでなる：
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
−  配列番号８がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持するタンパク質をコードする条件で、配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  配列番号８がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持するタンパク質をコードする条件で、配列番号８に由来する合成変異体のアミノ酸配列、及び
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10に由来する合成変異体のアミノ酸配列。
【０１１１】
本発明の別の目的は、前記融合タンパク質の２つ(特に、配列番号８のE1-Sd又はE1-E2-Sd；及び配列番号10のE2-Sd)を含んでなる免疫原性キメラサブウイルス粒子である。
【０１１２】
本発明はまた、免疫原性融合タンパク質がＣ型肝炎ウイルス単離株の少なくとも１つのエンベロープタンパク質(E1)を含んでなる免疫原性キメラサブウイルス粒子に関し、前記タンパク質が以下のものから構成される：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株の野生型Ｓタンパク質の192位〜380位のアミノ酸から構成される領域に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCV単離株の野生型タンパク質E1と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E1に由来する合成変異体のアミノ酸配列。
【０１１３】
本発明の別の目的は、タンパク質E1の配列がHCV-1a単離株に由来する、融合タンパク質(特に、E1-Sd、又はE1-E2-Sd又はPIT1-E1-E2-Sd、又はPIT2-E2-E1-Sd)を含んでなる免疫原性キメラサブウイルス粒子である。
【０１１４】
本発明の別の目的は、免疫原性融合タンパク質がＣ型肝炎ウイルス単離株の少なくとも１つのエンベロープタンパク質を含んでなり、該タンパク質が以下のものから選択されるアミノ酸配列から構成される、免疫原性キメラサブウイルス粒子である：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株の野生型Ｓタンパク質E2の384位〜743位のアミノ酸から構成される領域に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCV単離株の野生型タンパク質E2の配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E2に由来する合成変異体アミノ酸配列。
【０１１５】
本発明の別の目的は、タンパク質E2の配列がHCV-1a単離株に由来する融合タンパク質(特に、E2-Sd、又はE1-E2-Sd又はPIT1-E1-E2-Sd)を含んでなる免疫原性キメラサブウイルス粒子である。
【０１１６】
１つの特定の観点によれば、本発明はまた、以下の２つの融合タンパク質を含んでなる免疫原性キメラサブウイルス粒子に関する：
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株の野生型タンパク質E1の192位〜383位のアミノ酸、具体的には192位〜380位のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質；又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCV単離株の野生型タンパク質E1の配列と少なくとも75％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E1に由来する合成変異体のアミノ酸配列、及び
−  HCV、具体的にはHCV-1a単離株の野生型タンパク質E2の384位〜746位のアミノ酸、具体的には384位〜743位のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCV単離株の野生型タンパク質E2の配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＣ型肝炎ウイルスに対して免疫原性を保存する条件で、HCVウイルスの単離株に由来する天然変異体又は前記タンパク質E2に由来する合成変異体のアミノ酸配列。
【０１１７】
本発明の別の目的は、前記融合タンパク質の２つ(特に、E1-Sd、又はPIT1-E1-Sd又はE2-Sd又はPIT1-E1-Sd又はE1-E2-Sd又はPIT1-E1-E2-Sd)を含んでなる免疫原性キメラサブウイルス粒子である。
【０１１８】
本発明の別の目的は、活性成分として以下：
−  前記融合タンパク質、
−  前記ハイブリッド核酸分子、
−  前記ハイブリッド核酸分子を含んでなるベクター、
−  前記キメラサブウイルス粒子
から選択される少なくとも１つの化合物及び医薬的に許容され得るビヒクルを含んでなる免疫原性組成物である。
【０１１９】
本発明の１つの具体的な実施形態によれば、医薬組成物はまた、医薬的に許容され得るビヒクルを含有する。当業者は、通常のパラメータ並びに所望の医薬組成物の構成要素、医薬形態及び投与様式に応じて、その性質及び使用する量を容易に決定できる。
本発明の医薬組成物は、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所、局在性、気管内、鼻内、経皮、直腸内、眼内、耳介内投与に適切であり、活性成分は単位投与形態で投与することができる。
【０１２０】
単位投与形態は、例えば、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、注射剤又は経口懸濁液、経皮パッチ、舌下、バッカル(buccal)、気管内、眼内、鼻内、耳介内投与形態、吸入による、局所投与形態、経皮、皮下、筋肉内又は静脈内、直腸投与形態、移植物であり得る。局所投与用には、クリーム、ゲル、軟膏、ローション又は点眼剤が考えられる。
【０１２１】
有利には、免疫原性組成物は、以下の３つの化合物の少なくとも１つから選択される活性成分を含んでなる：
ａ)以下のものから構成される融合タンパク質：
＊  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
＊  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
＊  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８に由来する合成変異体のアミノ酸配列、
【０１２２】
ｂ)以下のものから構成されるハイブリッド核酸分子、又は該ハイブリッド核酸分子を含んでなるベクター：
＊  配列番号11で表される核酸配列、又は
＊  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号11の配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性を有する核酸配列、又は
＊  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号11に由来する合成変異体の核酸配列、
【０１２３】
ｃ)以下のものから構成される免疫原性融合タンパク質を含んでなるキメラサブウイルス粒子：
＊  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
＊  後記アミノ酸配列がHBV及びHCVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
＊  後記アミノ酸配列がHBV及びHCVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８に由来する合成変異体のアミノ酸配列。
【０１２４】
本発明の具体的な目的は、以下の３つの化合物の１つに関する：
ａ)タンパク質E1を含んでなる融合タンパク質(特に、E1-Sd、PIT1-E1-Sd、E1-E2-Sd、PIT1-E1-E2-Sd)であって、その概略図が図3Bに示され、HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされているHCVのタンパク質E1のほぼ全体を含んでなる融合タンパク質、又は
ｂ)タンパク質E1をコードする核酸配列を含んでなるハイブリッド核酸分子(特に、e1-sd、pit1-e1-Sd、e1-e2-sd、pit1-e1-e2-sd)であって、HBVの欠失Ｓタンパク質をコードする核酸配列の5'側にグラフトされているHCVのタンパク質E1をコードする核酸配列のほぼ全体を含んでなるハイブリッド核酸分子、又は
ｃ)タンパク質E1(特に、E1-Sd、PIT1-E1-Sd、E1-E2-Sd、PIT1-E1-E2-Sd)を含んでなるサブウイルス粒子であって、その概略図が図3Bに示され、HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされているHCVのタンパク質E1のほぼ全体を含んでなるサブウイルス粒子。
【０１２５】
本発明の１つの特別な観点によれば、免疫原性組成物は、以下の化合物の少なくとも１つから選択される活性成分を含んでなる：
ａ)以下のものから構成される融合タンパク質：
＊  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
＊  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
＊  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10に由来する合成変異体のアミノ酸配列、
【０１２６】
ｂ)以下のものから構成されるハイブリッド核酸分子、又は該ハイブリッド核酸分子を含んでなるベクター：
＊  配列番号13で表される核酸配列、又は
＊  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号13と少なくとも80％、特に少なくとも85％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の相同性を有する核酸配列、又は
＊  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号13に由来する合成変異体の核酸配列、
【０１２７】
ｃ)以下のものから構成される免疫原性融合タンパク質を含んでなるキメラサブウイルス粒子：
＊  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
＊  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
＊  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10に由来する合成変異体のアミノ酸配列。
【０１２８】
本発明の具体的な目的は以下の３つの化合物の１つに関する：
ａ)タンパク質E2を含んでなる融合タンパク質(特に、E2-Sd、PIT2-E2-Sd、E1-E2-Sd、PIT1-E1-E2-Sd)であって、その概略図が図3Cに示され、HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされているHCVのタンパク質E2のほぼ全体を含んでなる融合タンパク質、又は
ｂ)タンパク質E2をコードする核酸配列を含んでなるハイブリッド核酸分子(特に、e2-sd、pit2-e2-Sd、e1-e2-sd、pit1-e1-e2-sd)であって、HBVの欠失Ｓタンパク質をコードする核酸配列の5'側にグラフトされているHCVのタンパク質E1をコードする核酸配列のほぼ全体を含んでなるハイブリッド核酸分子、又は
ｃ)タンパク質E1(特に、E1-Sd、PIT-E1-Sd、E1-E2-Sd、PIT-E1-E2-Sd)を含んでなるサブウイルス粒子であって、HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされているHCVのタンパク質E2のほぼ全体を含んでなるサブウイルス粒子。
【０１２９】
本発明の有利な観点によれば、免疫原性組成物は、活性成分として、以下のものから構成される２つの免疫原性融合タンパク質を少なくとも含んでなるキメラサブウイルス粒子を含んでなる：
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８に由来する合成変異体のアミノ酸配列、及び
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、E2-Sdの配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10に由来する合成変異体のアミノ酸配列。
【０１３０】
本発明の具体的な目的は、２つの融合タンパク質を含んでなるサブウイルス粒子に関し、その一方は、
−  HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされたHCVのタンパク質E1(特に、E1-Sd、PIT1-E1-Sd、E1-E2-Sd、PIT-E1-E2-Sd)及びHCVのタンパク質E2を含んでなり、
他方は、
−  HBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされたHCVのタンパク質E2(特に、E2-Sd、PIT2-E2-Sd、E1-E2-Sd、PIT-E1-E2-Sd)を含んでなる。
【０１３１】
[27]．本発明の特に有利な観点に従えば、免疫原性組成物の活性成分は以下のものを含んでなる混合物から構成される：
−  少なくとも下記の２つの融合タンパク質：
＊  一方が
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成され、
＊  他方が
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも90％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルス及び/又はＣ型肝炎ウイルスに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される；
【０１３２】
−  少なくとも下記の２つのハイブリッド核酸分子：
＊  一方が
−  配列番号11で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号11の配列と少なくとも78％、特に少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％の相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号11の配列に由来する合成変異体の核酸配列
から構成されるか、又は該ハイブリッド核酸分子を含んでなるベクターから構成され；
＊  他方が
−  配列番号13で表される核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号13の配列と少なくとも80％、具体的には少なくとも85％、より具体的には少なくとも90％、更により具体的には少なくとも95％相同性を有する核酸配列、又は
−  後記核酸配列によりコードされるタンパク質がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号13の配列に由来する合成変異体の核酸配列
から構成されるか、又は該ハイブリッド核酸分子を含んでなるベクターから構成される；
【０１３３】
−  少なくとも下記の２つのキメラサブウイルス粒子：
＊  １つが
−  配列番号８で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８と少なくとも88％、特に少なくとも90％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号８に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される免疫原性融合タンパク質を含んでなり、
＊  １つが
−  配列番号10で表されるアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10と少なくとも86％、特に少なくとも88％、具体的には少なくとも92％、より具体的には少なくとも95％の同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列、又は
−  後記アミノ酸配列がHCV及び/又はHBVに対して非感染性で免疫原性のサブウイルス粒子を形成する能力を維持する条件で、配列番号10に由来する合成変異体のアミノ酸配列
から構成される免疫原性融合タンパク質を含んでなる。
【０１３４】
本発明の具体的な目的は、以下の化合物を含んでなる混合物に関する：
ａ)一方がHCVのタンパク質E1(特に、配列番号８の配列のE1-Sd、又はPIT1-E1-Sd、又はE1-E2-Sd、又はPIT1-E1-E2-Sd)を含んでなり、他方がHBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされたHCVのタンパク質E2(特に、配列番号10の配列のE2-Sd、又はPIT2-E2-Sd、又はE1-E2-Sd、又はPIT1-E1-E2-Sd)を含んでなる少なくとも２つの融合タンパク質、又は
ｂ)一方がタンパク質E1をコードする核酸配列(特に、配列番号11の配列のpit1-e1-sd、又はe1-sd、又はe1-e2-Sd、又はpit1-e1-e2-sd)を含んでなり、他方がHBVの欠失Ｓタンパク質をコードする核酸配列の5'側にグラフトされたタンパク質E1をコードする核酸配列(特に、配列番号13の配列のpit2-e2-sd、又はe2-sd、又はe1-e2-Sd、又はpit1-e1-e2-sd)を含んでなる少なくとも２つのハイブリッド核酸分子、又は
ｃ)一方がHCVのタンパク質E1(特に、配列番号８の配列のE1-Sd、又はPIT1-E1-Sd、又はE1-E2-Sd、又はPIT1-E1-E2-Sd)を含んでなり、他方がHBVの欠失Ｓタンパク質のＮ末端にグラフトされたHCVのタンパク質E2(特に、配列番号10の配列のE2-Sd、又はPIT2-E2-Sd、又はE1-E2-Sd、又はPIT1-E1-E2-Sd)を含んでなる少なくとも２つのサブウイルス粒子。
【０１３５】
本発明の別の目的は、Ｃ型肝炎の予防的及び/若しくは治療的処置用並びに/又は防止用の医薬の製造のための免疫原性組成物の使用に関する。
本発明はまた、Ｂ型肝炎の予防的及び/若しくは治療的処置用並びに/又は防止用の医薬の製造のための免疫原性組成物の使用に関する。
有利には、本発明の目的は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎の予防的及び/若しくは治療的処置用並びに/又は防止用の医薬の製造のための免疫原性組成物の使用に関する。
【０１３６】
本発明の別の目的は、上記の非感染性で免疫原性のキメラサブウイルス粒子を発現する細胞株である。
本発明の目的に適切である微生物の例として、酵母、例えば以下の科の酵母：Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluveromyces、Pichia、Hanseluna、Yarowia、Schwaniomyces、Zygosaccharomyces (Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces carlsbergensis、Kluveromyces lactisが好ましい)；及び細菌、例えばE. coli及び以下の科の細菌：Lactobacillus、Lactococcus、Salmonella、Streptococcus、Bacillus及びStreptomycesを挙げることができる。
【０１３７】
真核生物細胞としては、動物、例えば哺乳動物、爬虫類、昆虫の細胞及び等価物を挙げることができる。好ましい真核生物細胞は、チャイニーズハムスター由来細胞(CHO細胞)、サル由来細胞(COS及びVero細胞)、ドワーフ(dwarf)ハムスター腎臓由来細胞(BHK細胞)、ブタ腎臓由来細胞(PK15細胞)及びウサギ腎臓由来細胞(RK13細胞)、ヒト骨肉腫細胞株(143 B細胞)、ヒトHeLa細胞株及び肝細胞腫のヒト細胞株(Hep G2型細胞)並びに昆虫細胞株(例えばSpodoptera frugiperda)である。
【０１３８】
有利には、本発明の目的は、CHOとして知られるチャイニーズハムスター卵巣細胞株に関する。
これらは、以前に開示されており、特にMichel ML, Pontisso P, Sobczak E, Malpiece Y, Streeck RE, Tiollais P. Synthesis in animal cells of hepatitis B surface antigen particles carrying a receptor for polymerized human serum albumin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Dec; 81(24):7708-12により開示されている。
【０１３９】
本発明はまた酵母の細胞株に関し該酵母は特にSaccharomyces cerevisaeであり得る。
本発明の別の目的は、新生仔ハムスター腎臓細胞株(BHK)の細胞株であり、具体的には新生仔ハムスター腎臓細胞株(BHK-21)である。
後者は、以前に記載されており、特にGoldman RD, Follett EA. Birefringent filamentous organelle in BHK-21 cells and its possible role in cell spreading and motility. Science. 1970 Jul 17; 169(942):286-8により開示されている。
【０１４０】
１つの特定の観点によれば、本発明はまた、以下の工程を含んでなる、細胞株から非感染性で免疫原性のキメラサブウイルス粒子を製造する方法に関する：
１−  Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)単離株の野生型Ｓタンパク質をコードする核酸配列を含んでなるレンチウイルスベクターで細胞株の細胞を形質導入する工程、
２−  Ｂ型肝炎ウイルスの野生型サブウイルスエンベロープ粒子を発現することができる細胞株を産生するために前記細胞を培養する工程、
３−  Ｂ型肝炎ウイルスの野生型サブウイルスエンベロープ粒子を最適に分泌するクローンを選択する工程、
４−  前記ベクターで前記クローンを過剰形質導入(over-transduction)する工程、
【０１４１】
５−  非感染性で免疫原性のキメラサブウイルス粒子を発現することができる細胞株を産生するために前記細胞を培養する工程、
６−  非感染性で免疫原性のキメラサブウイルス粒子を最適様式で分泌することができる細胞を選択する工程、
７−  非感染性で免疫原性のキメラサブウイルス粒子を製造するために前記クローンを培養する工程、及び
８−  採集した培養培地からサブウイルス粒子を精製する工程(遠心分離、グラジエントでの超遠心分離、キメラサブウイルス粒子についてポジティブ画分の採集、透析)。
【０１４２】
表１は、本発明で開示される核酸及びアミノ酸配列の一覧を提供する。慣例により、核酸配列には小文字を使用し、アミノ酸配列には大文字を使用する。
【表１】
0005656832.tif 000003
【０１４３】
簡単で解説的、非制限的な例示として提供され、添付の図面に言及する下記の優先的な実施形態の説明を読めば、本発明の他の特徴および利点がより明確になる。
添付図面において、
図１は、HCVウイルスの3000アミノ酸以上からなるポリタンパク質のフラグメントのトポロジーを図示する。細胞のペプチダーゼ
0005656832.tif 000004
による切断によって、ポリタンパク質の成熟、特に構造タンパク質(カプシド、エンベロープE1及びE2)への成熟が生じる。数字は、ポリタンパク質の異なる構造タンパク質のドメインを画定するアミノ酸残基の位置を示す。
【０１４４】
図2A及び2Bは、HBVウイルスの野生型Ｓタンパク質の膜貫通トポロジーを図示する。
−図2Aは、HBVウイルスの野生型Ｓタンパク質の226アミノ酸残基を図示する。これは、特に、(灰色の縦長四角で表される)４つの膜貫通ドメインを含んでなり、そのＮ-及びＣ-末端部は、REの内腔(lumiere)に向かって配向している。HBVadw単離株の場合、約25kDのこのタンパク質は226残基のアミノ酸を含んでなる。
−図2Bは、野生型Ｓタンパク質の自己組織化後に得られるサブウイルス粒子を表す。
【０１４５】
図3A〜3Cは、野生型Ｓタンパク質(図3B)の存在下で、本発明のキメラサブウイルス粒子に組織化する融合タンパク質E1-Sd(図3B)又はE2-Sd(図3C)の同時発現を表す。
−図3Aは、サブウイルス粒子に自己組織化するHBVの野生型Ｓタンパク質を表す。
−図3Bは、(黒縦長四角で表される)HCVウイルスのエンベロープタンパク質E1の膜貫通ドメイン及び(点線で表される)E1のエクトドメインによる、野生型Ｓタンパク質のＮ末端に位置する膜貫通ドメインの置換で得られた融合タンパク質E1-Sdを表し；併せて、融合タンパク質E1-Sdの、野生型Ｓタンパク質の存在下でのサブウイルス粒子S+E1-Sdへの組織化を図示する。
【０１４６】
本発明の特定の非制限的実施形態によれば、約50kDの融合タンパク質E1-Sdは、タンパク質E1及びＳドメインに由来する393残基のアミノ酸を含んでなる。完全なタンパク質E1の残基192〜380が、野生型Ｓタンパク質の残基23〜226から構成される欠失Ｓタンパク質のＮ末端に連結している。
【０１４７】
−図3Cは、(白縦長四角で表される)HCVウイルスのエンベロープタンパク質E2の膜貫通ドメイン及び(点線で表される)E2のエクトドメインによる、野生型Ｓタンパク質のＮ末端に位置する膜貫通ドメインの置換で得られた融合タンパク質E2-Sdを表し；併せて、融合タンパク質E2-Sdの、野生型Ｓタンパク質の存在下でのサブウイルス粒子S+E2-Sdへの組織化を図示する。
【０１４８】
本発明の特定の非制限的実施形態によれば、約85kDの融合タンパク質E2-Sdは、タンパク質E2及びドメインＳに由来する564残基のアミノ酸を含んでなる。完全なタンパク質E2の残基384〜743は、野生型Ｓタンパク質の残基23〜226から構成される欠失Ｓタンパク質のＮ末端に連結している。
【０１４９】
図4A〜4Eは、HBVの野生型エンベロープＳタンパク質、HCVのE1及びE2並びに融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdのトポロジーを図示する。
−図4Aは、独特な膜貫通ドメイン(黒縦長四角)及びREの内腔に向かって配向した大きなエクトドメインから構成される、HCVの野生型エンベロープタンパク質E1のトポロジーを表す。HCV1a単離株の場合、約35kDのこのタンパク質は192アミノ酸残基を含んでなる。
【０１５０】
−図4Bは、独特な膜貫通ドメイン(白縦長四角)及びREの内腔に向かって配向した大きなエクトドメインから構成される、HCVの野生型エンベロープタンパク質E2のトポロジーを表す。HCV1a単離株の場合、約70kDのこのタンパク質は363アミノ酸残基を含んでなる。
−図4Cは、HBVの野生型エンベロープＳタンパク質のトポロジーを表す。Ｓタンパク質は、特に、４つの膜貫通ドメイン(灰色縦長四角)を含んでなる。
【０１５１】
−図4Dは、以下(5'末端から3'末端へ)から構成されるハイブリッド核酸分子pit1-e1-sdのDNA配列、及び本発明の融合タンパク質E1-Sdの産生のためのその使用を表す：
−  HCVウイルスの転移開始ペプチドPIT1をコードする配列、
−  HCVウイルスのタンパク質E1のエクトドメイン全体をコードする配列及び3'末端の最後の少なくとも３コドンを欠失したタンパク質E1の膜貫通ドメインをコードする配列、
−  HBVウイルスの欠失Ｓタンパク質をコードする配列。
【０１５２】
−図4Eは、以下(5'末端から3'末端)から構成されるハイブリッド核酸分子pit2-e2-sdのcDNA配列、及び本発明の融合タンパク質E2-Sdの産生のためのその使用を表す：
−  HCVウイルスの転移開始ペプチドPIT2をコードする配列、
−  HCVウイルスのタンパク質E2のエクトドメイン全体をコードする配列及び3'末端の最後の少なくとも３コドンを欠失したタンパク質E2の膜貫通ドメインをコードする配列、
−  HBVウイルスの欠失Ｓタンパク質をコードする配列。
【０１５３】
図５は、本発明の融合タンパク質をコードするcDNAを得るために使用されるプロトコールを図示する。タンパク質E1及びE2をコードする配列は、黒線で表される(配列Ａ)。欠失Ｓタンパク質をコードする配列は、灰色線で表される(配列Ｂ)。BamHI制限部位は、黒色菱形で表される。核酸配列e1-sd A、e1-sd B、e2-sd A及びe2-sd Bの増幅に使用されるフォワード及びリバースプライマーは、表ｘに列挙される。
【０１５４】
図6A及び6Bは、セムリキ/BHK-21細胞系における本発明の融合タンパク質E1-Sd又はE2-Sdの一方の一過性産生のための実験プロトコールの概説図を提案する。
−図6Aは、キメラサブウイルスエンベロープ粒子E1-Sdを産生するために、プラスミドpSFV1-E1-Sdに由来するRNAを、BHK-21細胞中にトランスフェクトすることを示す。
−図6Bは、キメラサブウイルスエンベロープ粒子E2-Sdを産生するために、プラスミドpSFV1-E2-Sdに由来するRNAを、BHK-21細胞中にトランスフェクトすることを示す。
【０１５５】
図6C及び6Dは、プラスミドpSFV1-E1-Sd及びpSFV1-E2-Sdに由来するRNAでトランスフェクトした細胞の溶解物について、抗-Ｓ抗体(6C)又は抗-E1及び抗-E2抗体(6D)を用いて顕色させたウェスタンブロットを示す。
−図6Cは、融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sd(枠で囲ったバンド)が理論上のサイズに対応するそれぞれ50kD及び85kDのサイズで検出されることを示す。Ｍ：分子量マーカー(kD)。
−図6Dは、融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sd(枠で囲ったバンド)が、それぞれ抗-E1及び抗-E2抗体によって、理論上のサイズに対応するそれぞれ50kD及び85kDのサイズで検出されることを示す。Ｍ：分子量マーカー(kD)。
【０１５６】
図7A〜7Bは、セムリキ/BHK-21細胞系におけるHBVの野生型Ｓタンパク質並びに２つの融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdの同時産生を示す。
説明：Ｍ：分子量マーカー(kD)；β-gal、E1E2又はE1E2及びＳレーンは、対応するSFV RNAによるBHK-21細胞のトランスフェクションに由来するコントロールの細胞溶解物を表す。
【０１５７】
−図7Aは、実験プロトコールの概説図を提案する。第１のものが野生型Ｓタンパク質及び融合タンパク質E1-Sdを含んでなり、第２のものが野生型Ｓタンパク質及び融合タンパク質E2-Sdを含んでなる２つのタイプのキメラサブウイルスエンベロープ粒子S+E1-Sd及びS+E2-Sdの産生のために、プラスミドpSFV1-E1-Sd及びpSFV1-E2-Sdに由来するRNAを個別に、プラスミドpSFV1-Sに由来するRNAとBHK-21細胞に同時トランスフェクトする。
【０１５８】
−図7Bは、ベクターpSFV1-E1-Sd及びpSFV1-Sに由来するRNAでトランスフェクトした細胞から精製された細胞内粒子について、抗-E1抗体を用いて顕色させたウェスタンブロットを示す。結果は、融合タンパク質E1-Sd(枠で囲ったバンド)が理論上のサイズに対応する50kDのサイズで検出されることを示す。
【０１５９】
−図7Cは、ベクターpSFV1-E1-Sd及びpSFV1-Sに由来するRNAでトランスフェクトした細胞から精製された細胞内粒子について、抗-S抗体を用いて顕色させたウェスタンブロットを示す。結果は、融合タンパク質E1-Sd(枠で囲ったバンド)が理論上のサイズに対応する50kDのサイズで検出されることを示す。
【０１６０】
−図7Dは、プラスミドpSFV1-E1-Sd及びpSFV1-Sに由来するRNAでトランスフェクトした細胞から精製された細胞内粒子について、ネガティブ染色(coloration negtive)よる透過型電子顕微鏡写真を示す。バー：100nm。
【０１６１】
−図7Eは、プラスミドpSFV1-E2-Sd及びpSFV1-Sに由来するRNAでトランスフェクトした細胞から精製された細胞内粒子について、抗-E2抗体を用いて顕色させたウェスタンブロットを示す。結果は、融合タンパク質E2-Sd(枠で囲ったバンド)が理論上のサイズに対応する85kDのサイズで検出されることを示す。
【０１６２】
−図7Fは、プラスミドpSFV1-E2-Sd及びpSFV1-Sに由来するRNAでトランスフェクトした細胞から精製された細胞内粒子について、抗-S抗体を用いて顕色させたウェスタンブロットを示す。結果は、キメラタンパク質E2-Sd(枠で囲ったバンド)が理論上のサイズに対応する85kDのサイズで検出されることを示す。
【０１６３】
−図7Gは、プラスミドpSFV1-E2-Sd及びpSFV1-Sに由来するRNAでトランスフェクトした細胞から精製された細胞内粒子について、ネガティブ染色よる透過型電子顕微鏡写真を示す。バー：100nm。
【０１６４】
図８は、野生型Ｓタンパク質及び本発明の融合タンパク質を産生するCHOクローン株の取得プロトコールを表す。この図は、CHO細胞株から、如何にして、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子(hph)及びHBVの野生型Ｓタンパク質をコードする遺伝子を含有するレンチウイルス(LV)による形質導入によって、CHO-Sと呼ぶ一次細胞クローン及び野生型Ｓタンパク質の産生体の開発が可能になるかを図示する。次いで、このクローンを、GFP遺伝子(gfp)及び２つの融合タンパク質E1-Sd又はE2-Sdの一方をコードする遺伝子を含有するレンチウイルス(LV)で過剰形質導入した。この第２の形質導入によって、CHO-S/E1-Sd及び-S/E2-Sdと呼ぶ２つの細胞クローンの開発が可能になった。
【０１６５】
図９は、異なる安定CHOクローンにおける、野生型Ｓタンパク質及び本発明の融合タンパク質の細胞内産生のウェスタンブロットによる分析を示す。この図は、クローンCHO-S、CHO-S/E1-Sd及びCHO-S/E2-Sdの細胞内タンパク質が、抗-E1、抗-E2及び抗-Ｓ抗体で顕色されることを示している。検索対象の融合タンパク質は黒囲みで示されている。Ｍ：分子量マーカー(kD)；β-gal、E1E2及びＳレーン：対応するSFV RNAでのBHK-21細胞のトランスフェクションに由来するコントロールの細胞溶解物。
【０１６６】
図10は、CsClグラジエントから採集した画分におけるELISAによる野生型Ｓタンパク質の定量ヒストグラムを表す。横軸は採集した異なる画分を示し、縦軸は各々の290nmでの光学密度を示す。クローンCHO-S、CHO-S/E1-Sd及びCHO-S/E2-Sdの培養上清から、CsCl中での超遠心分離によりキメラサブウイルスＳ粒子を精製する。グラジエントの頂部から画分を採集し(画分１)、野生型Ｓタンパク質の量をELISAにより評価した。黒ヒストグラムは、クローンCHO-Sの画分の野生型Ｓタンパク質の分布を表し、淡灰色ヒストグラムは、クローンCHO-S/E1-Sdの画分中の野生型Ｓタンパク質の分布を表し、濃灰色ヒストグラムは、クローンCHO-S/E2-Sdの画分中の野生型Ｓタンパク質の分布を表す。
【０１６７】
図11Aは、CsClで精製された粒子のタンパク質含量を、抗-E1、抗-E2及び抗-S抗体を用いるウェスタンブロットで分析しことを示す。野生型Ｓタンパク質は、３つのタイプのサブウイルス粒子中、２つのグリコシル化状態(24及び27kD)で検出される。融合タンパク質E1-Sd又はE2-Sdは、それぞれの粒子中で、理論上のサイズに対応するそれぞれ50及び85kDのサイズで検出される。Ｍ：分子量マーカー(kD)。
【０１６８】
図11Bは、約20nm直径の球状タイプの野生型Ｓタンパク質の自己組織化から生じるサブウイルス粒子の、クローンCHO-Sの上清からの精製の透過型電子顕微鏡観察によるネガティブ染色での分析を示す。バー：20nm。
図11Cは、野生型Ｓタンパク質の存在下での融合タンパク質E1-Sdの組織化から生じるサブウイルス粒子の、クローンCHO-S/E1-Sdの上清からの精製の透過型電子顕微鏡観察によるネガティブ染色での分析を示す。球状タイプのこれら粒子は直径約20nmである。バー：20nm。
図11Dは、野生型Ｓタンパク質の存在下での融合タンパク質E1-Sdの組織化から生じるサブウイルス粒子の、クローンCHO-S/E2-Sdの上清からの精製の透過型電子顕微鏡観察によるネガティブ染色での分析を示す。球状タイプのこれら粒子は直径約20nmである。バー：20nm。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】HCVウイルスの3000アミノ酸以上からなるポリタンパク質のフラグメントのトポロジーを示す。
【図２】HBVウイルスの野生型Ｓタンパク質の膜貫通トポロジーを示す。
【図３】野生型Ｓタンパク質(図3B)の存在下で、本発明のキメラサブウイルス粒子に組織化する融合タンパク質E1-Sd(図3B)又はE2-Sd(図3C)の同時発現を表す。
【図４】HBVの野生型エンベロープＳタンパク質、HCVのE1及びE2並びに融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdのトポロジーを示す。
【図５】本発明の融合タンパク質をコードするcDNAを得るために使用されるプロトコールを示す。
【図６−１】セムリキ/BHK-21細胞系における本発明の融合タンパク質E1-Sd又はe2-Sdの一方の一過性産生のための実験プロトコールの概説図を示す。
【図６−２】プラスミドpSFV1-E1-Sd及びpSFV1-E2-Sdに由来するRNAでトランスフェクトした細胞の溶解物について、抗-Ｓ抗体(6C)又は抗-E1及び抗-E2抗体(6D)を用いて顕色させたウェスタンブロットを示す。
【図７−１】実験プロトコールの概説図を示す。
【図７−２】セムリキ/BHK-21細胞系におけるHBVの野生型Ｓタンパク質並びに２つの融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdの同時産生を示す。
【図８】野生型Ｓタンパク質及び本発明の融合タンパク質を産生するCHOクローン株の取得プロトコールを表す。
【図９】異なる安定CHOクローンにおける、野生型Ｓタンパク質及び本発明の融合タンパク質の細胞内産生のウェスタンブロットによる分析を示す。
【図１０】CsClグラジエントから採集した画分におけるELISAによる野生型Ｓタンパク質の定量ヒストグラムを表す。
【図１１】精製粒子のタンパク質含量の抗-E1、抗-E2及び抗-S抗体を用いるウェスタンブロットでの分析を示す。
【実施例】
【０１７０】
非制限的な実施例として、以下に、セムリキ系においてＣ型肝炎ウイルス(HCV)のサブウイルスエンベロープ粒子を得るための本発明の１つの特定の実施形態を記載する(図４〜７を参照)。
この実施形態は、本発明の免疫原性融合タンパク質、具体的には一方でＢ型肝炎ウイルス(HBV)の、Ｎ末端でその膜貫通ドメインを欠失しているＳエンベロープタンパク質(Sd)を含んでなり、他方でHCVのエンベロープタンパク質E1又はE2の１つのほぼ全体を含んでなる融合タンパク質E1-Sd又はE2-Sdの取得に基づく。この実施形態は、野生型Ｓタンパク質の存在下での欠失Ｓタンパク質(Sd)の組織化能力により、キメラサブウイルス粒子を取得することが可能になり、これは、特に、レンチウイルスベクターによる前記粒子の産生体たる安定クローンの取得に先立つ、セムリキ森林ウイルスの複製特性に基づくベクター(pSFVベクター)の高レベル発現の結果であることを証明する。
【０１７１】
実施例Ｉ：セムリキ系(pSFV)におけるＣ型肝炎ウイルスのキメラサブウイルスエンベロープ粒子の取得
I.1)プラスミドpSFV1-E1-Sd及びpSFV1-E2-Sdの構築
11033pbの二シストロン構造を有するpSFV1ベクター(Invitrogen)を以下の構築に使用する。このベクターは、インビトロ転写により陽極性の完全RNA(42S(+)と呼ぶRNA)の合成を開始することができるように、第１のシストロンの5'側に挿入されたSP6-RNA-ポリメラーゼのプロモーター配列を備えて提供される。哺乳動物細胞へのトランスフェクション後、インビトロでキャップされたこれら組換えRNAは、SFVのnsP1-4レプリカーゼの存在下で自己複製し、26S(+)と呼ぶmRNAを介して目的のタンパク質の産生に役立つ。
【０１７２】
野生型相補性DNA(cDNA)又は本発明の融合タンパク質をコードするハイブリッド核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による数シリーズの増幅を行うことによって得ることができる。プラスミドpSFV1-E1E2(HCVの２つのタンパク質E1及びE2をコードする配列を含有するSFVベクターから本質的になる)から始めて、第１のPCR(PCR Aと呼ぶ)により、膜貫通ドメインを有し、小胞体に向かわせるそれぞれの転移開始ペプチドをコードする配列が先行する、HCVのエンベロープタンパク質E1又はE2をコードする配列を増幅することができた。以前に開示されたプラスミドpHBV1.5 [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C.及びRoingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]から始めて、第２のPCR(PCR Bと呼ぶ)により、HBVの欠失Ｓタンパク質をコードする配列を増幅することができた。本発明に従う融合タンパク質をコードする配列の「HCV」部分を「Ａ」とし、「HBV」部分を「Ｂ」とした(図５)。PCR A及びBの産物をゲル上で定量、精製した後、最終PCRに等量部で含ませた。二重HCV-HBVプライマーの使用により、端部でオーバーラップするドメインを有するPCR A及びBの産物を合成することができた。これにより、最終的に、本発明の融合タンパク質をコードするcDNAの完全配列を得ることができた。
【０１７３】
I.1.1)本発明の融合タンパク質(特に、E1-Sd及びE2-Sd)をコードするcDNA配列の増幅：
PCRによる増幅は、50ngのDNA、15pmolの各プライマー対(Proligo)、200μMの各デオキシリボヌクレオチドdNTP(Invitrogen)及び連続増幅に関係するエラーが最小になるように補正活性を含んでなる10単位のTaq-DNA-ポリメラーゼ(Takara)を含有する50μLの反応媒体中で行う(図５)。「Vector NTI Advance 10」(Invitrogen)及び「Primer premier」(Biosoft International)ソフトウェアにより、増幅したDNAフラグメントの5'末端及び3'末端にBamHI部位を創出するように、Ａ配列の「フォワード」プライマー及びＢ配列の「リバース」プライマーを規定した。
【０１７４】
下記の表２「キメラ配列を構成する配列Ａ及びＢの遺伝子増幅に使用したオリゴヌクレオチド」は、使用したプライマーの配列を示す。
表２中、HCVに対応する配列は黒字で表し、HBVに対応する配列は下線を付した黒字で表し、BamHI制限部位に対応する配列は下線を付したイタリック体で表し、ATG翻訳開始コドンに対応する配列は太字で表し、ATT翻訳終止コドンに対応する配列は太字で表す。
【０１７５】
【表２】
0005656832.tif 000005
【０１７６】
これら増幅反応は、「iCycler」サーマルサイクラー(Biorad)で行い、95℃で５分間の最初の変性、続いて95℃で１分間の変性、60℃で１分間のハイブリダイゼーション及び69℃で１分間の伸長を含んでなる25サイクルから本質的になる。25サイクルの後に69℃で10分間の最終伸長を行う。PCR A及びBにより増幅したフラグメントを、１％アガロースゲル上で、「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」システム(Promega)を製造業者の推奨に従って用いて精製する。次いで、PCR A及びBの精製フラグメントを、PCRHYBと呼ばれるPCRにより、プライマーの不在下で10サイクルの間ハイブリダイズさせた後、PCRFINと呼ばれる最終のPCRにより、配列Ａの「フォワード」プライマー及び配列Ｂの「リバース」プライマーの存在下で、25サイクルの間増幅させる。後者の２つのPCRのサイクルのプログラムは、PCR A及びBに使用したものと同様である。得られた本発明のハイブリッド核酸分子の増幅フラグメントを、上記のようにゲル上で精製する。
【０１７７】
I.1.2)pSFV1ベクターにおけるcDNAのハイブリッド配列のクローニング
精製PCRFIN産物を、pGEM-T(登録商標)ベクター(「pGEM-T Easy Vector System」, Promega)中で、製造業者の推奨に従ってクローニングする。本発明のハイブリッド核酸分子のフラグメントは、酵素BamHI (Biolabs)での制限によりpGEM-T(登録商標)が除去された後、プラスミドpSFV1のBamHI部位にクローニングされる。本発明の融合タンパク質を含んでなる異なるプラスミド(特に、プラスミドpSFV1-E1-Sd及びpSFV1-E2-Sd)を、細菌形質転換により増幅させた後、フェノール/クロロホルム中でのDNAのmaxipreparationにより精製する。挿入物の方向は酵素制限により検証し、全ての構築物を配列決定により検証する。
【０１７８】
I-2)異なるSFV構築のRNAにより一過性にトランスフェクトされた細胞株の取得
新生仔ハムスター腎臓細胞(BHK-21)の培養手順並びにSFVマトリクスプラスミドのインビトロ転写及び自己複製性組換えRNAのトランスフェクションのプロトコールは、以前に記載されたものと同一であった[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C.及びRoingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]。HBVの野生型Ｓタンパク質を発現し、前記論文で以前に開示されているpSFV-S構築物を、コントロールとして使用した。
【０１７９】
I-3)野生型キメラエンベロープタンパク質の細胞内産生の分析
免疫蛍光共焦点顕微鏡観察及びウェスタンブロットによる目的のタンパク質(特に、Ｓ、Sd、E1、E2、E1-Sd、E2-Sdなど)を分析する生化学的手順、透過型電子顕微鏡観察におけるトランスフェクト細胞の超微細構造分析手順並びにHCV-HBVキメラサブウイルスエンベロープ粒子の定量手順(ELISA)/精製手順(スクロースグラジエント後のアフィニティークロマトグラフィー)は、以前に開示されたものである[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C.及びRoingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]。
【０１８０】
野生型ＳHCVのタンパク質E1及びE2並びに本発明の融合タンパク質の検出は、モノクローナルマウス抗-E1抗体(A4、Harry Greenberg博士(University of Stanford, California)による提供)[Dubuisson, J., Hsu, H. H., Cheung, R. C., Greenberg, H. B., Russell, D. G.及びRice, C. M. (1994). Formation and intracellular localization of hepatitis C virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbis viruses. J Virol 68(10), 6147-60)]又は抗-E2抗体(H52、Jean Dubuisson博士(Institut Pasteur de Lille)による提供)[Deleersnyder, V., Pillez, A., Wychowski, C., Blight, K., Xu, J., Hahn, Y. S., Rice, C. M.及びDubuisson, J. (1997). Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes. J Virol 71(1), 697-704]で行う。
【０１８１】
I-4)培養上清の分析
トランスフェクション後、約107のトランスフェクト細胞の培養上清を、1500ｇで10分間の遠心分離により明澄化した後、SW41ローター(L70 Ultracentrifuge, Beckman)により35,000rpmで16時間４℃にて超遠心分離する。沈澱物を50μLの溶解緩衝液中に採集し、ウェスタンブロットで分析する。
【０１８２】
I.5)本発明の融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdの産生
本発明のハイブリッド核酸分子pit1-e1-sd、pit2-e2-sdを含んでなるプラスミドpSFV1によるトランスフェクションの16時間後、BHK-21細胞を溶解した後、モノクローナル抗-E1及び抗-E2抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。BHK-21細胞における一過性の産生後、融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdのサイズは、タンパク質E1-Sdについて約50kDであり、タンパク質E2-Sdについて約85kDである。これら結果は、抗-E1、抗-E2及び抗-S抗体を用いる本発明の融合タンパク質の検出により得られた強い免疫蛍光と相関し、該融合タンパク質が正確に産生され、正確にグリコシル化され、よって所望の膜貫通トポロジーに従ってレイアウトされることを示す(図6A〜6D)。
【０１８３】
本発明の異なる融合タンパク質の分泌能力を回復させるために、本発明の融合タンパク質の各々に、HBVの野生型形態のＳタンパク質をトランスで導入することによって、同時トランスフェクションを行う(図7A)。トランスフェクションの16時間後に、同時トランスフェクト細胞を破砕し、細胞内サブウイルス粒子を、以前に開示されたスクロースグラジエント後のアフィニティークロマトグラフィーにより精製する[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]。全ての場合で、透過型電子顕微鏡観察及び実施例I.3に記載した抗-Ｓ、抗-E1又は抗-E2抗体を用いるウェスタンブロットによりサブウイルス粒子を調べる(図7B〜7G)。
【０１８４】
透過型電子顕微鏡観察画像は、野生型Ｓタンパク質と本発明の融合タンパク質の１つとの同時産生実験のすべてで、有意な量の球状及びフィラメント状のサブウイルス粒子の産生が可能であることを示す。ウェスタンブロット分析により、多かれ少なかれフィラメント状サブウイルス粒子が本発明の融合タンパク質に富むことが示される。
【０１８５】
「セムリキ」系における本発明の実施例１に従う実施は、HCVのタンパク質E1又はE2のほぼ全体(その膜貫通ドメインは、HBVのＳタンパク質のＮ末端に位置する膜ドメインと置き換わっている)を含有する本発明の融合タンパク質が、Ｂ型肝炎に対するワクチンの産生に使用されるサブウイルス粒子と同じ性質のキメラサブウイルス粒子に組織化することを示している。このことによって、本発明のキメラサブウイルス粒子の精製及びおそらく(HBVに対するワクチンの産業的適用を再現する)HCVに対するワクチンの産業的適用の開発が容易になる。
【０１８６】
本発明の実施例１に従う実施はまた、HCVの非短縮化タンパク質E1及び/又はE2を含んでなる融合タンパク質の産生を示す。この特徴は、最適な中和化及び細胞性免疫応答を誘導するために極めて重要であり得る。
しかし、「セムリキ」系では、キメラサブウイルス粒子は、細胞の一過性トランスフェクションにより産生される。事実、これらベクターの高い細胞傷害性のため、キメラサブウイルス粒子の長期の効率的分泌を得ることができない。更に、同時トランスフェクト細胞のホモジネートからのこの粒子の精製は、産業的産生に不適切な比較的厄介な実施を必要とする。
【０１８７】
非制限的例として、HBVの野生型Ｓタンパク質及び融合タンパク質E1-Sd又は融合タンパク質E2-Sdを安定な様式で発現するCHOタイプの株からＣ型肝炎ウイルスのサブウイルスエンベロープ粒子を得るための実施形態が、図８〜11に言及しながら開示されている。CHOのこれら安定なクローンを得ることは、レンチウイルスタイプの組込みベクターの使用によって可能になる。この系の価値の１つは、組換えタンパク質(例えば、本発明の融合タンパク質)の産生が、際立った短期毒性効果(例えば、SFV系で遭遇するようなもの)を有さないことである。
本実施形態の目的の１つは、Ｂ型肝炎に対するワクチンの産業的製造に使用されるものに類似する本発明のキメラサブウイルス粒子を産生する細胞系を得ることでもある。
【０１８８】
実施例II：レンチウイルス系におけるＣ型肝炎ウイルスのサブウイルスエンベロープ粒子の取得
レンチウイルスベクターの使用により、融合タンパク質E1-Sd及び/又はE2-Sdの１つと結合したHBVの野生型Ｓタンパク質を安定な様式で産生する細胞クローンの開発が可能になった。
【０１８９】
II-1)pLENTIプラスミドレンチウイルスベクター
選択マーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性タンパク質をコードする選択遺伝子hphを含む9955bpのpLENTIhphプラスミドを下記の構築に使用した[Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M., and Trono, D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263-7]。
【０１９０】
最初に、野生型Ｓタンパク質をコードする核酸配列を、以前に記載されるように[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C.及びRoingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]、酵素BamHI (Biolabs)での制限によりpSFV1-Sから遊離させた後、１％アガロースゲル上で「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」システム(Promega)を製造業者の推奨に従って用いて精製する。次いで、この精製フラグメントを、pLENTIhphプラスミドの多クローニング部位に含まれるBamHI部位に、T4-DNA-リガーゼ(Biolabs)を製造業者の推奨に従って用いてクローニングした。最後に、pLENTIhph-Sプラスミドを細菌形質転換により増幅した後、「Nucleobond PC 500 Kit」システム(Qiagen)を製造業者の推奨に従って用いるDNAのmaxipreparationによって精製した。その後、挿入物の配向を酵素制限により検証した。
【０１９１】
同様に、本発明の融合タンパク質(特に、E1-Sd及びE2-Sd)をコードするcDNAの異なる本発明のハイブリッド核酸分子を、pLENTIgfpプラスミドのBamHI部位にクローニングする。次いで、こうして得られたプラスミド(特に、pLENTIgfp-E1-Sd及びE2-Sd)を増幅し、精製し、配列決定する(II-1参照)。
【０１９２】
II-2)組換えレンチウイルスの産生
レンチウイルスプラスミドのトランスフェクションの24時間前に、10％の補体除去胎仔ウシ血清(ATGC)、100UI/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシンを補充したDMEM-glutamax培地(Invitrogen)中、75cm2フラスコ(Falcon)当たり3.106細胞の割合で、HEK 293T細胞を播種した。これら細胞を５％ CO2下で培養し、トランスフェクションの４時間前に培養培地を交換した。１pmoleの各プラスミドp8.74、pVSV-G及びpLENTI(pLENTIhph-S、pLENTIgfp-E1-Sd、E2-Sd)を、HEK 293T細胞に、「Calcium Phosphate Transfection Kit」システム(Invitrogen)を製造業者の推奨に従って用い、同時にトランスフェクトした。培養培地を、トランスフェクションの24時間後に交換し、トランスフェクションの48時間及び72時間後に採集する。採集した培地を0.45μmで濾過した後、20％スクロースクッション上で、100.000ｇで４℃にて90分間の超遠心分離により濃縮する。組換えレンチウイルスを含有する沈澱物を500μLのリン酸緩衝液(PBS)中に採り、-80℃で保存する。本発明の組換えレンチウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターLVhph-S、LVgfp-E1-Sd、LVgfp-E2-Sdのバッチが作製された。各バッチのレンチウイルスの力価 形質導入単位(TU)は、「Innotest HIV Kit」(Innogenetics)システムを製造業者の推奨に従って用いるp24タンパク質アッセイから決定される。
【０１９３】
II-3)細胞培養及び形質導入
HCV-HBVキメラサブウイルス粒子の安定で構成的な産生のために使用される細胞株は、CHOと呼ばれるチャイニーズハムスター卵巣株である。この株は、医用目的の組換えタンパク質の産生、特にＢ型肝炎に対するワクチン「GenHevac B Pasteur(登録商標)」(Sanofi Pasteur MSD)に関して、完全に妥当性が証明されている。これらCHO細胞を、10％補体除去胎仔ウシ血清(ATGC)、100UI/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシンを補充したDMEM-F12培地(Invitrogen)中５％ CO2下で培養する。形質導入の24時間前に、CHO細胞を６-ウェルプレート(Falcon)にウェル当たり105細胞の割合で培養する。次いで、これらを、新たな培地中、４μg/mLのポリブレン(Sigma-Aldrich)の存在下、2.5の感染多重度(すなわち、細胞当たりの2.5の形質導入単位(TU)の割合)で形質導入した後、24時間培養する。翌日、形質導入培地を除去し、本発明の実施により得られる細胞をPBS緩衝液中でリンスした後、更に２日間正常に培養状態で維持する。
【０１９４】
II-3.1)野生型Ｓタンパク質の安定CHOクローン産生体の創出
使用したCHO細胞株を、図８にも図示される上記プロトコールに従ってレンチウイルスLVhph-Sを用いて形質導入する。形質導入効率は、以前に開示されたプロトコール[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C.及びRoingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]に従い、野生型Ｓタンパク質に対する抗体を用いる免疫蛍光により検証する。形質導入の３日後、細胞をトリプシン処理し、10cm直径の培養ボックス(Falcon)において、１mg/mLのハイグロマイシン(Euromedex)の存在下に再培養し、培養状態で３週間維持する。生じた細胞クローンをクローニングシリンダー(Invitrogen)により回収した後、24-ウェルプレート(Falcon)中で増幅させる。続いて、培養上清中の野生型Ｓタンパク質をELISAにより定量した後、使用するCHOクローンを選択する[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C.及びRoingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]。この細胞クローンをCHO-Sとした。
【０１９５】
II-3.2)HBVウイルスの野生型Ｓタンパク質並びに本発明の融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdの安定なCHOクローン産生体の創出
選択マーカーとしてGFPタンパク質をコードし、本発明のハイブリッド核酸分子を含んでなる組換えレンチウイルスLVgfp、特にベクターレンチウイルスLVgfp-PIT1-E1-Sd又はLVgfp-PIT2-E2-Sdを用いて、上記§II-3.1に記載のプロトコール(図８)に従り、CHO-S細胞クローンを過剰形質導入する。GFPタンパク質が存在するので、FACScalibur cytometer in flux (Becton-Dickinson)を用いて形質導入効率を検証する。形質導入の３日後、細胞をトリプシン処理し、96-ウェルプレート(Falcon)中ウェル当たり１細胞の割合の限界希釈で再培養し、培養中に３週間維持する。生じるGFP＋の細胞クローンを回収した後、大量に増幅させる。こうして得られた細胞クローンを特にCHO-E1-Sd又はCHO-E2-Sdとした。
【０１９６】
II-4)HBV及びHCVのキメラ及び野生型のエンベロープタンパク質の細胞内産生の分析
免疫蛍光及びウェスタンブロットによる各細胞クローンの目的タンパク質Ｓ、E1-Sd又はE2-Sdの生化学分析の手順は、実施例Ｉに§I-4で既に開示した。
【０１９７】
II-5)培養上清に由来するキメラサブウイルス粒子の精製及び分析
選択した各クローンについて約200mLの培養上清を、1500ｇで４℃にて10分間の遠心分離により明澄化する。(NH4)2SO4溶液(pH7.5；45％最終)の添加、次いで10.000ｇで４℃にて15分間の遠心分離により、タンパク質を沈澱させる。沈殿物を最小容量のTNE緩衝液(10mM Tris/HCl pH7.5/100mM NaCl/１mM EDTA)中に取る。TNE緩衝液中での一連の透析後、約1.22ｇ/cm3の比重が得られるまでCsClを加え、次いで45Tiローター(L70 Ultracentrifuge, Beckman)を用いて２回の連続する等密度超遠心分離を40.000rpmで15℃にて48時間行う。グラジエントの頂部から画分を採集し、野生型Ｓタンパク質をELISAによって定量する[Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C.及びRoingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]。ポジティブ画分を合わせ、TNE緩衝液中で４℃にて透析した。
この精製調製物を、最終的にウェスタンブロット及び透過型電子顕微鏡観察により実施例Ｉに§I-4で既に開示したように分析した。
【０１９８】
II-6)Ｓタンパク質及び融合タンパク質の細胞内産生
拡大後、CHO-S、CHO-E1-Sd及びCH0-E2-Sd細胞クローンを、タンパク質Sd、E1又はE2に対する抗体を用いる免疫蛍光により、次いでウェスタンブロットにより分析した(§I-4の実施例Ｉ及び図９)。期待されるように、全てのクローンが、２つのグリコシル化状態(p24及びgp27)のHBVの野生型Ｓタンパク質を強力に産生することができる。同様に、CHO-E1-Sd及びCHO-E2-Sdクローンは、予想されたサイズの本発明の融合タンパク質を細胞質で強力に産生することができる。よって、これら結果は、CHO株で、全ての本発明の融合タンパク質が正確に産生されることを示す。
【０１９９】
II-7)粒子の精製
CHO-S、CHO-E1-Sd又はCHO-E2-Sdクローンの200mLの培養上清からの第１の精製試験を行った。これら上清(この上清中の野生型Ｓタンパク質の濃度は、ELISAにより、３クローンについて約100ng/mLと評価された)を、CsClの等密度グラジエントで超遠心分離した。次いで、形成したグラジエントの各画分を野生型Ｓタンパク質の定量により分析する(図10)。精製した３つのタイプのキメラサブウイルス粒子(Ｓ、E1-Sd及びE2-Sd)について、野生型Ｓタンパク質の濃度ピークは、1.17〜1.18の密度に対応する第９画分で観察された。次いで、各調製物の第８、第９及び第10の画分を再構成して透析した後、野生型タンパク質Ｓ、E1又はE2に対する抗体を用いるウェスタンブロット(§I-4の実施例Ｉ及び図11Aを参照)及びネガティブ染色で透過型電子顕微鏡観察(図11B〜11D)により分析する。
【０２００】
アクリルアミドゲルでの分析のために、各精製について１μgの野生型Ｓタンパク質に対応する堆積を行う。これにより、本発明の融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdが、それぞれの調製物において、抗-E1又は抗-E2抗体により、予想されたサイズで、相当な量で検出されることを示すことができる。同様に、２つの予想されるグリコシル化形態の野生型Ｓタンパク質が各調製物において検出される。透過型電子顕微鏡観察におけるネガティブ染色による分析によって、調べた３つの調製物中に約20nm直径の球状サブウイルスエンベロープ粒子が存在することを確証することができる。
【０２０１】
実施例III：２つの融合タンパク質E1-Sd及びE2-Sdを含んでなるサブウイルスエンベロープ粒子の取得
遺伝子gfpに代えてGaussia princepsの選択遺伝子glucを含んでなる新たなpLENTIglucプラスミドを生成する。このプラスミドは選択マーカーとして分泌されるルシフェラーゼ(GLuc)をコードする。融合タンパク質E1-SdをコードするcDNAフラグメントを、pLENTIglucプラスミドのBamHI部位にクローニングする。こうして得られるpLENTIgluc-E1-Sdプラスミドを増幅させ、精製し、配列決定する(II-1を参照)。
【０２０２】
III.1．組換えレンチウイルスの産生
レンチウイルスプラスミドのトランスフェクションの24時間前に、10％の補体除去胎仔ウシ血清(ATGC)、100UI/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシンを補充したDMEM-glutamax培地(Invitrogen)中、75cm2フラスコ(Falcon)当たり3.106細胞の割合で、HEK 293T細胞を培養した。これら細胞を５％ CO2下で培養し、トランスフェクションの４時間前に培養培地を交換する。１pmoleの各p8.74、pVSV-G及びpLENTIgluc-E1-Sdプラスミドを、HEK 293T細胞中に、「Calcium Phosphate Transfection Kit」システム(Invitrogen)を製造業者の推奨に従い用いて同時にトランスフェクトする。培養培地を、トランスフェクションの24時間後に交換し、トランスフェクションの48時間及び72時間後に採集する。採集した培地を0.45μmで濾過した後、20％スクロースクッション上で、100.000ｇで４℃にて90分間の超遠心分離により濃縮する。組換えレンチウイルスを含有する沈澱物を500μLのリン酸緩衝液(PBS)中に取り、-80℃で保存する。こうして組換えレンチウイルスベクターの新たなバッチが作製された：LVgluc-E1-Sd。このバッチのレンチウイルスの力価 形質導入単位(TU)は、「Innotest HIV Kit」(Innogenetics)システムを製造業者の推奨に従って用いるp24タンパク質アッセイから決定される。
【０２０３】
III.2．HBVウイルスの野生型Ｓタンパク質、本発明の融合タンパク質E2-Sd及びE1-Sdの安定なCHOクローン産生体の創出
実施例IIについて開示され使用されたCHO細胞の培養及び形質導入の方法が、本実施例に適合される。CHO-S細胞クローンが得られるレンチウイルスLVhph-Sでの第１の形質導入後、CHO-E2-Sd細胞クローンが得られるレンチウイルスLVgfp-E2-Sdでの第２の形質導入を実施例IIについて開示されたプロトコールに従って行う。
【０２０４】
後者を再度レンチウイルスLVgluc-E1-Sdで上記のプロトコールに従って形質導入する。形質導入の３日後、細胞をトリプシン処理し、96-ウェルプレート(Falcon)中ウェル当たり１細胞の割合の限界希釈で再培養する。この細胞を培養下に３週間維持する。維持の終了後に、生じる細胞クローンの上清を回収する。これら上清中で、ルシフェラーゼの存在を、「Gaussia Luciferase Assay Kit」システム(Biolabs)を製造業者の推奨に従って用いて酵素活性を測定することにより検出する。Centro LB 960 luminometer (Berthold Technologies)を用いて、酵素反応によって射出される光を測定する。GLuc+上清に対応する細胞クローンを回収した後、大量に増幅させる。こうして得られたクローンをCHO-S/E2-Sd/E1-Sdとした。
【０２０５】
実施例IV：キメラサブウイルス粒子の免疫学的活性のインビボ分析
各タイプの粒子(S+E1-Sd、S+E2-Sd、HBVのＳのみ)について５〜10ミリグラムのキメラサブウイルス粒子を、細胞培養物の上清から上記の方法に従って精製する。
４群のマウス及びウサギを免疫化シリーズに使用する。
古典的方法に従って10マイクログラムの免疫原の３回の注射により免疫化を行う。
第１の群は粒子S+E1-Sdで免疫する。
第２の群は粒子S+E2-Sdで免疫する。
第３の群は粒子HBV Ｓ単独で免疫する。
第４の群はキメラサブウイルス粒子S+E1-Sd及びキメラサブウイルス粒子S+E2-Sdの混合物で免疫する。
【０２０６】
これら動物において生じる全体の体液性応答を、ELISA及びウェスタンブロット分析により検出する。抗-S抗体に関しては、市販のELISA(Abbott, Roche)により、HBVに対する中和特性を有することが知られている抗-Ｓ抗体の国際単位(UI)数を決定することができる。少なくとも10UIに等しい濃度がHBVに対して保護的であると考えられる(Jilg Wら、Hepatitis B-vaccination: Strategy for booster doses in high risk population groups. Progress in Hepatitis B Immunization. P. Coursagetら編、Colloque Inserm. 1990; 190: 419-427)。抗-E1及び抗-E2抗体に関しては、ウェスタンブロットを使用して、抗-E1及び抗-E2抗体応答が生じるか否かを評価する。その場合には、この分析は、ウイルスを中和化する抗-E1及び抗-E2抗体の存在の分析によって終了する。これら抗体によるHCVの中和の分析は、インビトロで遺伝子型２のHCV株を増殖させることができるJFH-1システム(Wakitaら, Nat Med 2005)において、又は遺伝子型１若しくは３のHCVの構造タンパク質を含んでなるキメラウイルス株を使用することよって行う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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