(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＸＩＩＩ含有サンプルの品質管理試験方法であって、０．５から１０ｍＭのＣａ２＋の存在下で、前記サンプル中のプレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出する、及び／又はプレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度を測定する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプル中のプレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出し、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度を測定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度を測定する工程が、トロンビンの存在下におけるＦＸＩＩＩ（活性化ＦＸＩＩＩ）の活性及びトロンビンの非存在下におけるＦＸＩＩＩ（プレ活性化ＦＸＩＩＩ）の活性を測定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩを測定する工程が、蛍光又は非蛍光ＦＸＩＩＩ基質の存在下における蛍光分析を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光基質がＡｂｚ−ＮＥ（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）ＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩを測定する工程が、蛍光ＦＸＩＩＩ基質の存在下における蛍光分析を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光基質が、トランスグルタミナーゼによって切断され得るものである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが１から２ｍＭのＣａ２＋の存在下で測定される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが２ｍＭのＣａ２＋の存在下で測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃａ２＋の起源、Ｃａ２＋の濃度が、酸性条件下で正確に観察されて制御された状態にされている、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃａ２＋が原子吸光標準液のＣａ２＋として存在する、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが、５０から５００ｍＭのＮａＣｌの存在下で測定される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが、１００から２００ｍＭのＮａＣｌの存在下で測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが６．５から１０の間のｐＨで測定される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが７から８の間のｐＨで測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが７．４のｐＨで測定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩがＨｅｐｅｓバッファーの存在下で測定される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが、５０から２００ｍＭのＨｅｐｅｓバッファーの存在下で測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
活性化ＦＸＩＩＩ及びプレ活性化ＦＸＩＩＩが、１００ｍＭのＨｅｐｅｓバッファーの存在下で測定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＦＸＩＩＩの濃度が界面活性剤の存在下で測定される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール界面活性剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記界面活性剤が０．０５から０．５重量％の量で存在する、請求項２１または２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）含有サンプルの品質管理試験方法であって、前記サンプル中のプレ活性化（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出及び／又は濃度を測定する工程を含む方法、並びに第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）含有サンプルの品質を測定するための品質管理用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は、フィブリン塊を生じる、各種の血液成分（又は因子）の複雑な相互作用からなるプロセスである。一般的には、凝固「カスケード」と称されるものに関与する血液成分は、アクチベーター（これ自体が活性化された凝固因子である）の作用によってタンパク質分解酵素に変換される、酵素に不活性なタンパク質（プロ酵素又はチモーゲン）である。その様な変換を受ける凝固因子は、一般的に「活性因子」と称され、凝固因子の名前に「ａ」という文字を加えて標記される（例えば、第ＸＩＩＩａ因子）。
【０００３】
ＦＸＩＩＩは、組換えＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ−Ａ２）、血漿ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ−Ａ２Ｂ２）、又は細胞内ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ−Ａ２）のいずれかにおいてチモーゲンの形態で主に認められる。血漿中では、血液凝固の間に、トロンビン活性化経路が優位にある。トロンビンは、各ＦＸＩＩＩ−ＡサブユニットのＮ末端部分から３７アミノ酸残基の活性化ペプチドを切断し、Ｃａ２＋の存在下において、活性化形態であるＦＸＩＩＩａ*を生じさせる。一方、細胞内ＦＸＩＩＩはトロンビンに接近することができず、タンパク質分解性でない活性化がある条件下で起こり、活性化ＦＸＩＩＩ種（ＦＸＩＩＩａｏ）を生じ、これは、各ＦＸＩＩＩ−Ａサブユニットの１−７３１アミノ酸の全てを含んでいるため、活性化トロンビンによって切断されていない（Polgar et al (1990) Biochem. J. 267, 557-560）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Polgar et al (1990) Biochem. J. 267, 557-560
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
重度の血友病患者には、血液凝固因子、例えば、ＦＸＩＩＩを投与して血液凝固プロセスを助けている。ＦＸＩＩＩは、不活性／チモーゲンの形態で投与され、これは必要に応じて（例えば、裂傷が生じた際に）最初にインビボで自然に活性化される。製品の品質のパラメータとして、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の含有量を測定し、かつ、最小の状態に維持する必要がある。しかしながら、医薬製剤中において、所定量のＦＸＩＩＩは、ＦＸＩＩＩａｏへと非タンパク質分解性の活性化を受ける可能性があり、これによって非特異的な凝固のリスクが高まる。
【０００６】
かくして、ＦＸＩＩＩ製品の安全を確実なものとし、かつ、血友病の治療の最適化を確実にする、ＦＸＩＩＩ含有製剤の品質を測定する方法が非常に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）含有サンプルの品質管理試験方法であって、前記サンプル中のプレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出及び／又は濃度を測定する工程を含む、方法が提供される。
【０００８】
本発明の第二の態様によれば、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩ）含有サンプルの品質を測定するための品質管理用キットであって、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の検出及び／又は測定用成分、並びに本明細書に記載する方法にしたがって前記キットを使用するための説明書を含む、キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、各種の異なる量のＣａ２＋の存在下において測定したＦＸＩＩＩ力価及びＦＸＩＩＩａｏの％を示す。左側の図はＦＸＩＩＩａｏの％を示し、右側の図は相対的な力価を示す。上側の図は０．０５ｍＭから５ｍＭのＣａ２＋を示し、下側の図は１ｍＭから５０ｍＭのＣａ２＋を示す。
【図２】図２は、各種の異なる量のＮａＣｌの存在下において測定したＦＸＩＩＩ力価及びＦＸＩＩＩａｏの％を示す。左側の図はＦＸＩＩＩａｏの％を示し、右側の図は１５０ｍＭのＮａＣｌに対して正規化した相対的な力価を示す。
【図３】図３は、ｐＨの関数として測定した力価、ＦＸＩＩＩａｏ、ＦＸＩＩＩａｏの％を示す。左上の図はＦＸＩＩＩａｏの活性（ＲＦＵ／秒／ｎＭ）であり、左下の図はｐＨの関数としての相対的な力価であり、右上の図は得られたＦＸＩＩＩａｏの％である。相対的な力価は、ｐＨ７．４に対して正規化した。
【図４】図４は、力価、ＦＸＩＩＩａｏ、ＦＸＩＩＩａｏの％に対するバッファー成分の影響を示す。左上の図はＦＸＩＩＩａｏの活性（ＲＦＵ／秒／ｎＭ）であり、左下の図はバッファー及びＣａ２＋の関数としての相対的な力価であり、右上の図は得られたＦＸＩＩＩａｏの％を示す。全てのアッセイは、図面に記載しているとおり、バッファー成分及び１又は５ｍＭのＣａ２＋の存在下においてｐＨ７．４で実施した。相対的な力価は１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＨｅｐｅｓに対して正規化した。
【図５】図５は、チモーゲンであるＦＸＩＩＩ−Ａ２（図５Ａ）及び活性化ＦＸＩＩＩａｏ（図５Ｂ）を用いた陰イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、トロンビン＋ＦＸＩＩＩ及びトロンビンの非存在下におけるＦＸＩＩＩからのシグナルを示すアッセイ原理を示す。ＦＸＩＩＩの非存在下では、経時的な蛍光増加が検出されない。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の第一の態様によれば、第ＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ）因子含有サンプルの品質管理試験方法であって、前記サンプル中のプレ活性化されたＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出及び／又は濃度を測定する工程を含む、方法が提供される。
【００１１】
本発明は、トロンビンの非存在下でＦＸＩＩＩの活性を測定するための方法を提供するため、サンプル中のＦＸＩＩＩａｏ及び既に形成されたＦＸＩＩＩａ*の双方がシグナルを生じるであろう。活性化メカニズムが区別されないため、この活性はＦＸＩＩＩａと称する。実際には、ＦＸＩＩＩａ*はＦＸＩＩＩとは異なる質量を有するため、標準的なＨＰＬＣ及びＭＳ法によってＦＸＩＩＩａ*は容易に検出される。さらに、ＦＸＩＩＩａ*の生成は、製薬学的なＦＸＩＩＩの調製において容易に避けられる。対照的に、ＦＸＩＩＩａｏは、ＦＸＩＩＩと同一の質量を有するため、標準的な方法で検出することがより困難である。サンプル中におけるＦＸＩＩＩａ*の非存在下において、酵素アッセイ方法によってＦＸＩＩＩａｏのレベルを測定する。
【００１２】
本発明は、ＦＸＩＩＩ含有サンプルの品質を評価及び保証するために必須であると解されている、プレ活性化ＦＸＩＩＩの正確かつ高感度な測定をするという点で顕著な利点を提供する。特に、本発明の方法は、約０．１％の感度で、チモーゲンであるＦＸＩＩＩの中から微量のプレ活性化ＦＸＩＩＩを検出できることが認められている。したがって、本発明は、所定のＦＸＩＩＩ含有製剤中に存在するプレ活性化ＦＸＩＩＩの量と直接的に相関する、前記製剤の品質及び有効性の正確な測定を提供する。例えば、ある製剤からのサンプルが、所定の割合を超えるプレ活性化ＦＸＩＩＩ（例えば、０．３、０．６、１、又は２％）を含有している場合には、ＦＸＩＩＩ含有製剤のバッチが廃棄されると予期される。
【００１３】
本明細書で使用する用語「プレ活性化ＦＸＩＩＩ」又は「ＦＸＩＩＩａｏ」の各々は、トロンビンの非存在下において、非タンパク質分解性の活性化を受けたＦＸＩＩＩである。本明細書で使用する用語「活性化ＦＸＩＩＩ」は、トロンビンの存在下でタンパク質分解性の活性化を受けたＦＸＩＩＩである。
【００１４】
１つの実施態様では、前記サンプル中のＦＸＩＩＩａｏの存在は、クロマトグラフィーによる分離によって検出される。
【００１５】
本発明のさらなる態様によれば、クロマトグラフィーによる分離工程を含む、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出及び／又は濃度を測定する方法が提供される。
【００１６】
１つの実施態様では、前記クロマトグラフィーによる分離は、陰イオン交換ＨＰＬＣを含む。
【００１７】
チモーゲンであるＦＸＩＩＩ及びＦＸＩＩＩａｏは、異なる溶出プロファイル及び保持時間を有することが認められた。例えば、チモーゲンであるＦＸＩＩＩは７．１分の保持時間を有し（図５Ａ）、ＦＸＩＩＩａｏは１０．４分の保持時間を有する（図５Ｂ）ことが図５において認められる。陰イオン交換法は、ＦＸＩＩＩ及びＦＸＩＩＩａｏをベースラインが別の２つのピークとして検出することができる。図５Ｂに示すピークから得られた溶出フラクションを回収し、本明細書に記載のアッセイにしたがってＦＸＩＩＩａｏの活性について試験し、１００％ＦＸＩＩＩａｏを含有することが認められた。ＦＸＩＩＩａｏ検出限界は、有益なことに、０．１から０．２％のＦＸＩＩＩａｏほど小さいことが示され、このことは、クロマトグラフィーによる分離技術が高感度かつ迅速な品質管理方法であることを示す。さらに、クロマトグラフィーによる検出方法は、任意のアッセイ成分から干渉を受けることなくＦＸＩＩＩａｏを測定することもでき、それによって分析中のインサイチュ活性化の可能性を排除する。
【００１８】
クロマトグラフィーによる分離の１つの実施態様では、陰イオン交換ＨＰＬＣは、陰イオン交換カラム、例えば、ＤＥＡＥ−陰イオン又はＱ−陰イオンカラムの使用を含む。さらなる実施態様では、陰イオン交換カラムは、ＤＥＡＥ−陰イオンカラム（例えば、ＴＳＫゲル ＤＥＡＥ−ＮＰＲ  （Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ））を含む。
【００１９】
クロマトグラフィーによる分離工程が、既知の手法、例えば、平衡化バッファー及び溶出バッファーの使用にしたがって実施されることは当業者には直ちに明らかであろう。
【００２０】
不溶性の塩、例えば、カルシウムを形成することができないことに基づいて、平衡化バッファー及び溶出バッファーが望ましく選択されると解されるであろう。かくして、クロマトグラフィーによる分離の１つの実施態様では、平衡化バッファー及び溶出バッファーは、２０から１００ｍＭの間（例えば、５０ｍＭ）の濃度でＴｒｉｓを含む。
【００２１】
クロマトグラフィーによる分離の１つの実施態様では、平衡化バッファー及び溶出バッファーは、７と８の間（例えば、７．５）のｐＨに緩衝化される。
【００２２】
クロマトグラフィーによる分離の１つの実施態様では、平衡化バッファー及び溶出バッファーは少なくとも２ｍＭのＣａ２＋を含有する。さらなる実施態様では、平衡化バッファー及び溶出バッファーは、３ｍＭ及び５ｍＭの間のＣａ２＋を含有する。
【００２３】
クロマトグラフィーによる分離の１つの実施態様では、溶出工程は、選択した塩、例えば、２００ｍＭから７００ｍＭの間（例えば、５００ｍＭ）のＮａＣｌの濃度を増大させることによって得られてよい、イオン強度を増大させることによって実施する。
【００２４】
１つの実施態様では、前記方法は、前記サンプルのプレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出し、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度を測定する工程をさらに含む。
【００２５】
１つの実施態様では、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度を測定する工程は、トロンビンの存在下又は非存在下においてＦＸＩＩＩの活性を測定する工程を含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様によれば、トロンビンの存在下及び非存在下においてＦＸＩＩＩの活性を測定する工程を含む、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度を測定する方法が提供される。
【００２７】
本発明の当該態様は、プレ活性化ＦＸＩＩＩの割合を、全ＦＸＩＩＩ活性の割合として算出することを可能にする。トロンビンの添加の後に測定される全ＦＸＩＩＩの活性は、トロンビンによる活性化によって生じた活性に加えて、サンプル中に既に存在するプレ活性化（もしあれば）を含む。例えば、下式である。
【数１】
0005833444.tif 000002
【００２８】
１つの実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩの測定工程は、ＦＸＩＩＩ基質の存在下における分析、すなわち、蛍光又は非蛍光（すなわち、吸光）分析を含む。
【００２９】
１つの実施態様では、活性化／非活性化ＦＸＩＩＩの測定工程は、蛍光基質の存在下における蛍光分析を含む。
【００３０】
さらなる実施態様では、前記蛍光基質は、トランスグルタミナーゼによって切断され得るものである。さらなる実施態様では、前記蛍光基質は、Ａｂｚ−ＮＥ（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）ＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫ（ZEDIRA GmbH, Roesslerstrasse 83, D-64293 Darmstadt, Germany - Product Number A101）である。本発明のさらなる態様によれば、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の測定におけるＡｂｚ−ＮＥ（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）ＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫの使用が提供される。
【００３１】
学説につなげるわけではないが、グリシンエチルエステルの存在下において、ＦＸＩＩＩは、Ａｂｚ−ＮＥ（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）ＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫの側鎖から消光剤（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）を切断し、前記エステル基を取込むと解される。
【００３２】
さらなる実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、その測定方法を参照によって本明細書に取り込むＷＯ ２００６／０１８１６４（N-Zyme Biotec GmBH）に開示された方法にしたがって測定される。
【００３３】
１つの実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、０．５から１０ｍＭのＣａ２＋の存在下で測定される。更なる実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは１から２ｍＭのＣａ２＋の存在下で測定される。ＦＸＩＩＩａｏ％の測定がカルシウム濃度に依存するため（図１に示す分析から認められる）、２ｍＭ未満のカルシウム濃度を維持することが望ましいことが認められた。さらなる実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、２ｍＭのＣａ２＋の存在下で測定される。２ｍＭのＣａ２＋を選択する利点は、生理的な値に近い値であるため、インビボの環境を最も良好に摸倣することである。
【００３４】
１つの実施態様では、Ｃａ２＋は、原子吸光標準液のＣａ２＋（Ｆｌｕｋａ又はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し得る）として存在するであろう。原子吸光標準液のＣａ２＋を使用する利点は、Ｃａ２＋の濃度が正確に測定され、酸性条件下で制御された状態にされていることである。対照的に、塩基性条件では、望ましくないことに、不溶性水酸化カルシウム及び酸化カルシウムの形成を生じさせる。さらに、原子吸光標準液のＣａ２＋は、塩化カルシウム粉末によって示される欠点に悩まされることがない。例えば、塩化カルシウム粉末は、典型的には、周囲から水分を捕捉し、塩化カルシウム塩の水和レベルが容易に不正確なものとなるため、所定のモル量のＣａ２＋の正確な秤量が妨げられる。
【００３５】
ＦＸＩＩＩの非タンパク質分解性の活性化のリスクを最小化にするために、アッセイ成分とのサンプルのインキュベーションと活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩの測定との間の時間の長さは最小化されるべきであると解されるであろう。かくして、１つの実施態様では、アッセイ成分とのサンプルのインキュベーションと活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩとの間の時間の長さが１時間未満である。
【００３６】
１つの実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、５０から５００ｍＭのＮａＣｌの存在下で測定される。さらなる実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、１００から２００ｍＭのＮａＣｌの存在下で測定される。ＮａＣｌ濃度を変動させることによってＦＸＩＩＩａｏ％が影響を受けるため（図２に示す分析から認められる）、アッセイにおいてＮａＣｌの濃度を制御することが望ましいことが認められた。さらなる実施態様では、ＦＸＩＩＩの濃度は、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で測定される。１５０ｍＭのＮａＣｌを選択する利点は、生理的な値に近いため、インビボの環境を最も良好に摸倣することである。
【００３７】
１つの実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、６．５から１０の間のｐＨで測定される。さらなる実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは７から８の間のｐＨで測定される。ｐＨは力価及びＦＸＩＩＩａｏ％の双方に影響を与えることが認められたため（図３に示す分析から認められる）、アッセイのｐＨを調節することが望ましいと解された。例えば、ＦＸＩＩＩ*の活性化部位は、ｐＨによって影響を受けることが認められた。さらなる実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩはｐＨ７．４で測定される。ｐＨ７．４を選択する利点は、生理的な値に近く、インビボの環境を最も良好に摸倣することである。
【００３８】
活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、一般的には、７から８の間のｐＨ（例えば、７．４）に緩衝化することができるバッファーの存在下で測定されると解されるであろう。１つの実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩはＨｅｐｅｓバッファーの存在下で測定される。Ａｂｚ−ＮＥ（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）ＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫに推奨されるバッファーは、塩酸を使用してｐＨ７．５に調整した５０ｍＭ Ｔｒｉｓである。しかしながら、バッファーの選択は力価及びＦＸＩＩＩａｏ％の双方に大きな影響を有することが認められた。例えば、ＦＸＩＩＩａｏ％のより低い値が、驚くべきことに、Ｈｅｐｅｓで認められ、このことは、Ｔｒｉｓが新たなインサイチュＦＸＩＩＩａｏを誘導する可能性があることを示唆する（図４）。誤った値によってＦＸＩＩＩ含有製剤のバッチの不必要な廃棄をもたらされ得るため、これは品質管理試験の間には明らかに不利益である。さらなる実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、５０から２００ｍＭ（例えば、１００ｍＭ）のＨｅｐｅｓバッファーの存在下で測定される。
【００３９】
１つの実施態様では、活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩは、界面活性剤の存在下において測定される。さらなる実施態様では、前記界面活性剤は、ポリエチレングリコール界面活性剤（例えば、ＰＥＧ８０００）である。存在する際には、前記界面活性剤は、典型的には、０．０５から０．５％（例えば、０．１％）の量で存在するであろう。
【００４０】
本発明の第二の態様によれば、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）含有サンプルの品質を測定するための品質管理用キットであって、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）検出及び／又は測定用成分、並びに本明細書に開示する方法にしたがって前記キットを使用するための説明書を含む、キットが提供される。
【００４１】
１つの実施態様では、前記検出用成分は、陰イオン交換ＨＰＬＣカラム、例えば、ＤＥＡＥ−陰イオンカラム（例えば、ＴＳＫゲル ＤＥＡＥ−ＮＰＲ）を含む。さらなる実施態様では、前記検出用成分は、これまでに規定したとおりの平衡化バッファー及び溶出バッファーをさらに含む。
【００４２】
１つの実施態様では、前記測定用成分は、これまでに規定したとおりの蛍光基質（例えば、Ａｂｚ−ＮＥ（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）ＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫ）を含む。さらなる実施態様では、前記測定用成分は、Ｃａ２＋（例えば、２ｍＭの原子吸光標準液のＣａ２＋）も含む。さらなる実施態様では、前記測定用成分は、１００から２００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌ）も含む。さらなる実施態様では、前記測定用成分は、６．５から１０の間のｐＨ（例えば、７．４）に緩衝化された、５０から２００ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー（例えば、１００ｍＭ）をさらに含む。さらなる実施態様では、前記測定用成分は、０．０５から０．５％（例えば、０．１％）の界面活性剤（例えば、ＰＥＧ８０００）をさらに含む。
【００４３】
以下の非限定的な実施例を参照することによって、本発明を説明する。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ＦＸＩＩＩａｏのＨＰＬＣ検出
表１に記載の条件にしたがって、ＦＸＩＩＩ含有サンプルを陰イオン交換ＨＰＬＣ分析に供して、ＦＸＩＩＩａｏの存在の検出及び定量をすることができる。
【００４５】
【表１】
0005833444.tif 000003
【００４６】
ＦＸＩＩＩａｏ％は、サンプルについて全て統合した面積のうち、ＦＸＩＩＩａｏが占めるピークの面積の割合として決定される。例えば、図５に示すとおりのものである。
【００４７】
実施例２
ＦＸＩＩＩａｏの活性の蛍光測定
トロンビンの存在下におけるＦＸＩＩＩの活性は、典型的には、表２に記載の成分を含有する２００μｌの反応混合物を９６ウェルマイクロタイタープレートに添加することによって測定した。
【００４８】
【表２】
0005833444.tif 000004
【００４９】
次いで、４１８ｎｍの発光及び３１３ｎｍの励起で蛍光を観察した。典型的には、ＳｏｆｔＭａｃＰｒｏソフトウェアを使用して、蛍光をプレートリーダー（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で観察した。
【００５０】
トロンビンの非存在下におけるＦＸＩＩＩの活性は、典型的には、表３に記載の成分を含有する２００μｌの反応混合物を９６ウェルマイクロタイタープレートに添加することによって測定した。トロンビンの存在下又は非存在下におけるＦＸＩＩＩの測定は、同一のプレート上で、最も正確な蛍光シグナルの比較を提供することを確実にした。
【００５１】
【表３】
0005833444.tif 000005
【００５２】
次いで、上述のものと類似の様式で蛍光を観察した。結果は図６に認められる。トロンビンの存在下及び非存在下における活性を、ＦＸＩＩＩのＲＦＵ／秒／ｎＭ（ＲＦＵは相対的な蛍光単位）で測定し、ＦＸＩＩＩａｏの％を２つの測定の比率として計算した。
【００５３】
本明細書で参照した文献、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、本明細書の他の部分で特定の文献が別に取込まれているかどうかにかかわらず、それらの全体が参照によって本明細書に取込み、かつ、参照によって取込む各文献が個別かつ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されているのと同程度に（法が許容する最大限まで）参照によって本明細書に取込む。
【００５４】
本発明を説明する背景における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに類似の記載の使用は、本明細書中でそうではないと示しているか又は文脈に明らかに矛盾していないかぎり、単数及び複数の双方を包含すると解されるべきである。例えば、「化合物（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、そうではないと示していないかぎり、本発明又は特定の開示した態様の各種の「化合物」を参照するものと解されるべきである。
【００５５】
そうではないと示していないかぎり、本明細書で挙げた全ての厳密値は、対応する近似値を代表するものである（例えば、特定の因子又は測定に関して挙げた全ての例示した厳密値は、適当な場合には、「約」によって修飾された対応する近似する測定値も提供するものと解することができる）。
【００５６】
単数又は複数の因子に関連した「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の態様又は任意の態様の本明細書における記載は、そうではないと言及しているか又は文脈に明らかに矛盾していないかぎり、その特定の単数又は複数の因子「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｓ ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、又は「実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」本発明の態様又は類似の態様についてのサポートを提供することを意図する（例えば、特定の因子を含むものとして本明細書に記載の組成物は、そうではないと言及しているか又は文脈に明らかに矛盾していないかぎり、その要素からなる組成物も記載しているものと解されるべきである）。
【００５７】
本発明の好ましい特徴は以下のとおりである。
１．ＦＸＩＩＩ含有サンプルの品質管理試験方法であって、前記サンプル中のプレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出及び／又は濃度を測定する工程を含む、方法。
２．前記サンプル中のＦＸＩＩＩａｏの存在がクロマトグラフィーによる分離によって検出される、第１項に記載の方法。
３．前記クロマトグラフィーによる分離が陰イオン交換ＨＰＬＣを含む、第２項に記載の方法。
４．前記陰イオン交換ＨＰＬＣが、陰イオン交換カラム、例えば、ＤＥＡＥ−陰イオン又はＱ−陰イオンカラムを含む、第３項に記載の方法。
５．前記陰イオン交換カラムがＤＥＡＥ−陰イオンカラム、例えば、ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−ＮＰＲを含む、第４項に記載の方法。
６．平衡化及び溶出バッファーが、２０から１００ｍＭの間（例えば、５０ｍＭ）の濃度でＴｒｉｓを含む、第２から５項のいずれかに記載の方法。
７．平衡化及び溶出バッファーが、７から８の間、例えば、７．５のｐＨに緩衝化されている、第２から６項のいずれかに記載の方法。
８．平衡化及び溶出バッファーが少なくとも２ｍＭのＣａ２＋を含む、第２から７項のいずれかに記載の方法。
９．前記平衡化及び溶出バッファーが３ｍＭから５ｍＭの間のＣａ２＋を含む、第８項に記載の方法。
１０．溶出バッファーが、２００ｍＭから７００ｍＭの間、例えば、５００ｍＭのＮａＣｌも含む、第２から９項のいずれかに記載の方法。
１１．前記サンプル中のプレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在を検出し、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度を測定する工程を含む、第１項に記載の方法。
１２．前記プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度を測定する工程が、トロンビンの存在下（活性化ＦＸＩＩＩ）及び非存在下（プレ活性化ＦＸＩＩＩ）においてＦＸＩＩＩの活性を測定することを含む、第１１項に記載の方法。
１３．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩを測定する工程が、蛍光又は非蛍光ＦＸＩＩＩ基質の存在下における蛍光分析を含む、第１２項に記載の方法。
１４．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩを測定する工程が、蛍光ＦＸＩＩＩ基質の存在下における蛍光分析を含む、第１２項に記載の方法。
１５．前記蛍光基質がトランスグルタミナーゼによって切断され得るものである、第１４項に記載の方法。
１６．前記蛍光基質がＡｂｚ−ＮＥ（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）ＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫである、第１５項に記載の方法。
１７．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩが、０．５から１０ｍＭのＣａ２＋、例えば、１から２ｍＭのＣａ２＋の存在下で測定される、第１２から１６項のいずれかに記載の方法。
１８．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩが、２ｍＭのＣａ２＋の存在下で測定される、第１７項に記載の方法。
１９．Ｃａ２＋の起源、Ｃａ２＋の濃度が、酸性条件下で正確に観察されて制御された状態にされている、第１７項に記載の方法。
２０．Ｃａ２＋が原子吸光標準液のＣａ２＋として存在する、第１７又は１８に記載の方法。
２１．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩが、５０から５００ｍＭのＮａＣｌ、例えば、１００から２００ｍＭのＮａＣｌの存在下で測定される、第１２から２０項のいずれかに記載の方法。
２２．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩが１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で測定される、第２１項に記載の方法。
２３．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩが６．５から１０の間、例えば７から８の間のｐＨで測定される、第１２から２２項のいずれかに記載の方法。
２４．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩが７．４のｐＨで測定される、第２３項に記載の方法。
２５．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩがＨｅｐｅｓバッファーの存在下で測定される、第１２から２５項のいずれかに記載の方法。
２６．前記活性化／プレ活性化ＦＸＩＩＩが、５０から２００ｍＭ、例えば、１００ｍＭのＨｅｐｅｓバッファーの存在下で測定される、第２５項に記載の方法。
２７．ＦＸＩＩＩの濃度が界面活性剤の存在下で測定される、第１２から２６項のいずれかに記載の方法。
２８．前記界面活性剤がポリエチレングリコール界面活性剤、例えば、ＰＥＧ８０００である、第２７項に記載の方法。
２９．前記界面活性剤が０．０５から０．５％、例えば、０．１％の量で存在する、第２７又は２８項に記載の方法。
３０．第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）の品質を測定するための品質管理用キットであって、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）検出及び／又は測定用成分、並びに第１から２９項のいずれかに記載の方法にしたがって前記キットを使用するための説明書を含む、キット。
３１．前記検出用成分が、第４又は５項に記載の陰イオン交換ＨＰＬＣカラムを含む、第３０項に記載のキット。
３２．前記検出用成分が、第６から１０項のいずれかに記載の平衡化及び溶出バッファーも含む、第３０又は３１項に記載のキット。
３３．前記測定用成分が、第１５又は１６項に記載の蛍光基質を含む、第３０項に記載のキット。
３４．前記測定用成分が、Ｃａ２＋、例えば、２ｍＭの原子吸光標準液のＣａ２＋も含む、第３３項に記載のキット。
３５．前記測定用成分が、１００から２００ｍＭのＮａＣｌ、例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌも含む、第３３又は３４項に記載のキット。
３６．前記測定用成分が、５０から２００ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー、例えば、１００ｍＭのＨｅｐｅｓバッファーも含む、第３３から３５項のいずれかに記載のキット。
３７．前記Ｈｅｐｅｓバッファーが、７から８の間、例えば、７．４のｐＨに緩衝化されている、第３６項に記載のキット。
３８．前記測定用成分が、０．０５から０．５％の界面活性剤、例えば、０．１％のＰＥＧ８０００も含む、第３３から３７項のいずれかに記載のキット。
３９．プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の測定における、Ａｂｚ−ＮＥ（Ｃａｄ−Ｄｎｐ）ＥＱＶＳＰＬＴＬＬＫの使用。
４０．クロマトグラフィーによる分離工程を含む、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の存在の検出及び／又は濃度の測定をする方法。
４１．トロンビンの存在下及び非存在下でＦＸＩＩＩの活性の測定をすることを含む、プレ活性化ＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａｏ）の濃度の測定方法。