(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイン酸（ＲＡ）または形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）を含む培地中で割球様幹細胞（ＢＬＳＣｓ）を培養する、および
培養細胞から多能性細胞を同定し、濃縮することを含み、
この際前記多能性細胞はＧＡＤＰＨまたはβ−アクチンのｍＲＮＡを発現させる、多能性細胞集団の作製方法。
【請求項２】
前記多能性細胞は、サイズが１〜１５μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地は０．１〜２０μＭのＲＡを含み、前記ＢＬＳＣｓは２〜８週間培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地は１〜１５μＭのＲＡを含み、前記ＢＬＳＣｓは２〜８週間培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培地は５〜１２μＭのＲＡを含み、前記ＢＬＳＣｓは３〜４週間培養される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性細胞は、サイズが１〜１５μｍであり、懸濁中でシート様構造を形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が１〜４０ｎＭのＴＧＦ−βを含み、前記ＢＬＳＣｓは２〜８週間培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記培地が２〜２０ｎＭのＴＧＦ−βを含み、前記ＢＬＳＣｓは２〜８週間培養される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が５〜１２ｎＭのＴＧＦ−βを含み、前記ＢＬＳＣｓは４〜６週間培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性細胞は、サイズが１〜１５μｍであり、円形であり、集合体を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（１）多能性であり、（２）サイズが１〜１５μｍであり、（３）ＧＡＤＰＨまたはβ−アクチンのｍＲＮＡを発現させる培養細胞を複数含み、
この際、培養細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）または形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）を含む培地中で割球様幹細胞（ＢＬＳＣｓ）を培養する、および
前記（１）、（２）および（３）の特性を有する細胞を同定し、濃縮することによって作製される、組成物。
【請求項１２】
前記組成物がレチノイン酸（ＲＡ）または形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
第一の細胞集団がＣＤ６６ｅ＋である、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞が組み換え核酸を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組み換え核酸はポリペプチドをコードし、前記細胞はポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞が請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって作製される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
第二の細胞集団がＣＤ６６ｅ−である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞がβ２−ミクログロブリン遺伝子を発現しない、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞が、細胞に対する抗原抗体反応を介するＴリンパ球を誘発するクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子によってコードされる一以上のタンパク質を発現しない、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞が、ＣＤｌ０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＸＣＲ４＋である、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞が、トリパンブルー染色陰性である、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の組成物を複数含む、セルバンク。
【請求項２３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２２に記載のセルバンク。
【請求項２４】
複数の割球様幹細胞集団を得るために、複数の対象からの細胞をそれぞれ培養する、
少なくとも一の所定の特性を各々に対して得るために前記細胞集団の特性を明らかにする、および
少なくとも一の所定の特性によって前記細胞集団の各々を分類する、請求項２２または２３に記載の細胞バンクの製造方法。
【請求項２５】
さらに前記細胞集団を拡大することを含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願に対する相互参照
本出願は、２００９年１月１３日に出願された、米国特許出願第６１／１４４，２０６号の優先権を主張する。該出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
胚幹（ＥＳ）細胞のような全能性幹細胞は、生体内ですべての細胞系統に分化することができ、インビトロで誘導されると、ほとんどの細胞型に分化することができる。ＥＳ細胞は、早期哺乳類胚由来である。その分化全能性により、変性または遺伝疾患の治療に非常に有望であると考えられている。しかしながら、道徳的配慮およびロジスティックな検討から、研究および治療においてヒトＥＳ細胞の使用が阻まれている。（例えば、成熟した、または若い動物の組織からの）非胚性起源の全能性または多能性幹細胞はこの障害を解決するであろう。そのような非胚性起源の幹細胞が得られてきてはいるが、これらの細胞の中には、発生能が限定されているものもある。また、ロジスティックに、これらの細胞は、得るのが難しく、意義ある臨床または研究用途を満たすには、細胞の量があまりにわずかである。さらに、細胞によっては、生体内で奇形腫に至ることもあり、したがって、インビボでの使用は望めない。より安全で、簡単に作製でき、豊富な量得ることができる、非胚全能性または多能性幹細胞に対する要求がある。
【０００３】
要約
本発明は、非胚起源から作製された幹細胞の集団が全能性または多能性であり、非常に高収率で得ることができ、生体内で奇形腫に至らないという、少なくとも部分的には予期せぬ発見に基づく。
【０００４】
したがって、本発明の一態様は、多能性または全能性幹細胞集団を作製する方法を特徴とする。該方法は、複数の割球様幹細胞（ＢＬＳＣｓ）を得る、レチノイン酸（ＲＡ）または形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）を含む培地中で前記ＢＬＳＣｓを培養する、および培養細胞から多能性または全能性細胞を同定し、濃縮することを含む。多能性または全能性細胞はＧＡＤＰＨまたはβ−アクチンのｍＲＮＡを発現させる。換言すれば、ＧＡＤＰＨまたはβ−アクチンのｍＲＮＡレベルは、下記実施例のセクションで記載したようにＲＴ−ＰＣＲアッセイによって検出することができる。
【０００５】
多能性または全能性幹細胞は、通常サイズが１〜１５μｍ、好ましくはサイズが１〜１０μｍ、より好ましくはサイズが１〜５μｍである。これらのサイズは、浮遊状態で、または接着状態である細胞（すなわち浮遊細胞か接着細胞）のサイズである。
【０００６】
「幹細胞」という用語は、多数の最終的な、分化した細胞型に分化することができる細胞を指す。幹細胞は全能性または多能性でありうる。全能性幹細胞は、典型的にはどんな細胞型にも成長する能力を有する。全能性幹細胞は、胚起源でも非胚起源でもよい。多能性細胞は、典型的には、いくつかの異なる最終的に分化した細胞型に分化することができる細胞である。分化単能幹細胞は、一つの細胞型だけを産生することができるが、非幹細胞とは区別される自己再生の特性を有する。これらの幹細胞は、限定されるものではないが、血管、神経、筋肉、皮膚、腸、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺などの種々の組織または器官システムに由来することができる。本発明によれば、幹細胞は、成熟したまたは新生の組織または器官由来である。下記で詳細に記述するが、ＢＬＳＣは成熟したまたは若い動物の非胚性幹細胞の集合体である。これらの細胞は全能性であり、胚幹細胞と同様の分化能を有する。国際公開第２００７／１００８４５号パンフレット参照。
【０００７】
ＲＡ含有培地中でＢＬＳＣｓを培養することによって得られた細胞はＳＢＲと名付けられる。一実施形態において、培地は０．１〜２０μＭのＲＡを含み、ＢＬＳＣｓを２〜８週間培養することができる。他の実施形態において、培地は１〜１５μＭのＲＡを含み、ＢＬＳＣｓは２〜８週間培養される。さらに他の態様において、培地は５〜１２μＭのＲＡを含み、ＢＬＳＣｓは３〜４週間培養される。こうして作製された多能性または全能性ＳＢＲ細胞は、１〜１５μｍ（例えば、１〜１０、１〜５、２〜５、または３〜５μｍ）のサイズで、懸濁中でシート様構造を形成できる。
【０００８】
ＴＧＦ−β含有培地中でＢＬＳＣｓを培養することによって得られた細胞はＳＢＴと名付けられる。一実施形態において、培地は１〜４０ｎＭのＴＧＦ−βを含み、ＢＬＳＣｓを２〜８週間培養することができる。他の実施形態において、培地は２〜２０ｎＭのＴＧＦ−βを含み、ＢＬＳＣｓは２〜８週間培養される。さらに他の実施形態において、培地は５〜１２ｎＭのＴＧＦ−βを含み、ＢＬＳＣｓは４〜６週間培養される。多能性または全能性ＳＢＴ細胞は、サイズが１〜１５μｍ（例えば、１〜１０、１〜５、２〜５、または３〜５μｍ）であり、円形であり、集合体を形成することができる。
【０００９】
本発明の他の実施態様は、（１）多能性または全能性であり、（２）サイズが１〜１５μｍであり、（３）ＧＡＤＰＨまたはβ−アクチンのｍＲＮＡを発現させる、上述の培養細胞を複数含む組成物を特徴とする。細胞は上述の方法によって作製することができる。組成物はＲＡまたはＴＧＦ−βをさらに含むことができる。一実施形態において、細胞はＣＤｌ０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＸＣＲ４＋である。他の実施態様において、細胞はトリパンブルー染色陰性である。すなわち、細胞は、トリパンブルー排除を示す。さらに他の実施態様において、培養細胞は、ＣＤ６６ｅ＋である第一の細胞集合体およびＣＤ６６ｅ−である第二の細胞集合体を含む。
【００１０】
細胞は実質的にピュアである。「実質的にピュア」という用語は、幹細胞またはそれ由来の細胞（例えば分化した細胞）に関して用いられる場合、特定の細胞が集合における細胞の大部分（すなわち２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％より多い）を構成することを意味する。一般的に、実質的に精製された細胞の集合体は、生成（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）中の細胞の少なくとも約７０％、通常生成中の細胞の約８０％、そして特には生成中の細胞の少なくとも約９０％（例えば、９５％、９７％、９９％または１００％）を構成する。そのようなものとして、本発明の方法は、特定の型の細胞（例えばＳＢＲまたはＳＢＴ細胞）の実質的にピュアな集合体を他の細胞型のコンタミネーションなしに得ることができるという利点を与える。
【００１１】
直前に述べた培養細胞は外来性の、組み換えポリペプチドを発現させるために用いることができる。したがって、各々が組み換え核酸を含むそのような培養細胞は、本発明の範囲内である。組み換え核酸は、ポリペプチドをコードすることができ、細胞はポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むことができる。
【００１２】
β２−ミクログロブリン遺伝子を発現しないように、または細胞に対する抗原抗体反応を介するＴリンパ球を誘発するクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子によってコードされる一以上のタンパク質を発現しないように、上述した培養細胞を遺伝子操作することができる。これらの細胞は、移植片のホストの拒絶を引き起こさないので、万能ドナー細胞として用いることができる。
【００１３】
一態様において、本発明は対象の変性疾患を治療する方法を特徴とする。該方法は、必要とする対象に、一以上の上述の多能性または全能性細胞を含む上述の組成物を、有効量投与することを含む。一実施形態において、細胞の少なくとも一は組み換え核酸を含む。組み換え核酸はポリペプチドをコードし、細胞はポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むことができる。変性疾患の例としては、糖尿病、神経変性疾患、関節炎、およびガンが挙げられる。神経変性疾患の例としてはパーキンソン病が挙げられる。
【００１４】
他の態様において、本発明は対象における自己免疫疾患の治療方法を特徴とする。該方法は必要とする対象に上述の組成物を有効量投与することを含む。
【００１５】
上述した疾患の一に対して治療されるべき対象は、その特定の疾患に対する標準的診断技術によって同定することができる。「治療する」は、疾患、疾患の兆候、疾患に続発する病状、または障害／疾患になりやすい傾向を治す、緩和する、軽減する、治療する、開始を遅らせる、防ぐ、または改善することを目的としている、その疾患に罹患している、またはその疾患に至る危険のある、対象への組成物（例えば、細胞組成物）の投与を指す。「有効量」は、治療される対象において医学的に所望の結果をもたらすことができる組成物の量を指す。治療方法は単独で行われてもよいし、他の薬物または治療とともに行われてもよい。
【００１６】
さらに他の態様において、本発明は、変性疾患を治療する薬物候補を同定するための方法を特徴とする。該方法は、上述の組成物または細胞と試験化合物とを接触させる、および、変性疾患において下方制御されるポリペプチドの発現レベルを定量する段階を含む。試験化合物の存在下での発現レベルが、化合物非存在下のレベルよりも高い場合には、化合物は疾患を治療する候補となる。変性疾患の例としては、糖尿病、神経変性疾患、関節炎、ガン、または自己免疫疾患が挙げられる。発現レベルはｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで決定することができる。
【００１７】
さらに他の態様において、本発明は非相同核酸を対象に導入する方法を特徴とする。該方法は、上述の組成物または細胞を得る、および必要とする対象に細胞を投与する段階を含む。非相同核酸はポリペプチドをコードしうる。一度投与されると、対象において細胞はポリペプチドを発現する。
【００１８】
「非相同の」という用語は、核酸の位置に関して用いられる場合、性質において互いに同じ関係にはない２以上の配列を核酸が含むことを示す、相対的な言葉である。例えば、組み換えで作製される核酸は典型的には、新しい機能的核酸を作るために合成的に配列された、関連しない遺伝子からの２以上の配列、例えば一つの源からプロモーターおよび異なる源からのコード領域、を有する。したがって、この意味において２つの核酸は互いに非相同的である。細胞に添加されると、組み換え核酸は、細胞の内因性の遺伝子に対してもまた非相同である。したがって、染色体において、非相同核酸は、染色体中に融合する外来の（自然発生的ではない）核酸、または外来の（自然発生的ではない）染色体外の核酸を含む。一方、本願において、変異細胞由来の内因性の核酸配列を含むので、染色体の自然的に転座した断片は、非相同であるとは考えられない。同様に、非相同性タンパク質は、性質において互いに同じ関係にない２以上の配列をタンパク質が含むことを示す（例えば、２つの配列が単一の核酸配列によってコードされる、「融合タンパク質」）。そのようなタンパク質は、組み換え技術によって作製することができる。
【００１９】
例えば、細胞、あるいは核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合には、「組み換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、非相同性核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されたこと、あるいは細胞がそのように改良された細胞由来であることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（自然発生）型の中で見出せない遺伝子を発現する、または、発現下もしくは非発現下で正常にもしくは非正常に発現された天然遺伝子の２次コピーを発現する。
【００２０】
各々が多能性または全能性培養細胞の集団を含む、上述の組成物を複数有する細胞バンクまたはライブラリーも本発明内である。細胞は、ヒト細胞でも、非ヒト細胞でもよい。ＢＬＳＣｓ集団の複数を得るために、複数の対象からの細胞をそれぞれ培養する；少なくとも一の所定の特性を各々得るために細胞集団の特性を明らかにする；および少なくとも一の所定の特性にしたがって各々の細胞集団を分類することによって該バンクを作製することができる。細胞バンクを作製するために、さらに細胞集団を拡張することができる。特性の例としては、対象の名前、性別、生理的状態（遺伝性疾患およびＭＨＣ情報を含む）が挙げられる。
【００２１】
対象は、ヒトまたはヒト以外の動物を指す。ヒト以外の動物の例としては、ヒト以外の霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、げっ歯類（例えば、ネズミ、またはラット）、モルモット、ネコ、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはブタ）のような哺乳類、およびトリ、両生類、は虫類などのような非哺乳類などのすべての脊椎動物が挙げられる。好適な実施形態において対象はヒトである。他の実施形態において、対象は実験動物または疾患モデルとして適切な動物である。
【００２２】
本発明の一以上の実施形態の詳細は、下記説明において述べる。本発明の他の特徴、目的および利点は説明、図および特許請求の範囲から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、溶血に対するＢＬＳＣｓを得る結果を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、血漿フラクションからのＢＬＳＣｓを得る結果を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、多層の、メッシュネット構造を形成する培養ＢＬＳＣｓを示す写真である。
【図４】図４は、集合体を形成する培養ＢＬＳＣｓを示す写真である。
【図５】図５は、球状様細胞集合体を形成する培養ＢＬＳＣｓを示す写真である。
【図６】図６〜８は、レチノイン酸存在下で培養されたＢＬＳＣｓから作製されたＳＢＲ細胞を示す写真である。
【図７】図６〜８は、レチノイン酸存在下で培養されたＢＬＳＣｓから作製されたＳＢＲ細胞を示す写真である。
【図８】図６〜８は、レチノイン酸存在下で培養されたＢＬＳＣｓから作製されたＳＢＲ細胞を示す写真である。
【図９】図９〜１２は、ＴＧＦ−β存在下で培養されたＢＬＳＣｓから作製されたＳＢＴ細胞を示す写真である。
【図１０】図９〜１２は、ＴＧＦ−β存在下で培養されたＢＬＳＣｓから作製されたＳＢＴ細胞を示す写真である。
【図１１】図９〜１２は、ＴＧＦ−β存在下で培養されたＢＬＳＣｓから作製されたＳＢＴ細胞を示す写真である。
【図１２】図９〜１２は、ＴＧＦ−β存在下で培養されたＢＬＳＣｓから作製されたＳＢＴ細胞を示す写真である。
【図１３】図１３は、ＳＢＲおよびＳＢＴ細胞中のＧＡＤＰＨまたはβ−アクチンの発現、およびＢＬＳＣ中の発現の欠如を示すＲＴ−ＰＣＲの結果の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
ＥＳ細胞は（神経または脳のグリア細胞のような）多様な細胞型を再生するために用いることができ、したがって多様な変性疾患または組織損傷を治療することができることが提案されてきた。しかしながら、道徳的配慮およびロジスティックな検討から、ＥＳ細胞の使用が阻まれている。非胚性由来の幹細胞、すなわち、生後（ｐｏｓｔ−ｎａｔａｌ）幹細胞（例えば、骨髄由来間充織幹細胞（ＭＳＣｓ））は有望な代替物である。しかしながら、この代替は、ロジスティックな検討および限定された増殖／分化能によって常に許容されるわけではない。
【００２５】
本発明は、非胚性起源から作製される幹細胞、ＳＢＲ細胞またはＳＢＴ細胞の集合体に関連する。ＥＳ細胞のように、これらの細胞は全能性または多能性である。より重要なことは、それらは高収率で得ることができ、生体内で奇形腫に至らない。したがって、これらを多様な変性疾患または組織損傷の治療において分化した、機能性細胞を再生するために用いることができる。下記実施例で示されるように、ＳＢＲおよびＳＢＴ細胞は容易にビトロで作製、維持、および増やすことができ、所定の技術的アプローチを用いて分化を誘導することができる。また、動物の対象（例えば、マウス）に細胞の移植をした後、分裂活性細胞、奇形腫、または悪性腫瘍に至る結果はない。これらの利点により、該細胞は他の幹細胞の代替手段を示す。
【００２６】
本発明の好適な実施形態において、これらのＳＢＲおよびＳＢＴ細胞は、割球様幹細胞（ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）（ＢＬＳＣ）から作製される。ＢＬＳＣｓは、成熟したまたは若い動物の非胚性幹細胞の集合である。これらの細胞は全能性であり、胚幹細胞と同様の分化能を有する。国際公開第２００７／１００８４５号参照。通常の染色体対を含有すると、ＢＬＳＣｓは系統中立となり、体のすべての体（非生殖）細胞を形成することができる。これらはまた生殖配偶子精子および／または卵子、ならびに胎盤の胎児（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｆｅｔａｌ）部分の細胞および組織を形成することもできる。細胞は系統誘導剤（ｌｉｎｅａｇｅ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）、増殖剤（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）、および分化抑制剤に反応する。一方、これらは進行剤（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）には反応しない。胚盤葉上層様（ｅｐｉｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ）幹細胞と同様、ＢＬＳＣｓはコンフルエントでは接触阻害されず、むしろ十分な栄養供給がされている限り、細胞の多融合層を形成する。ＢＬＳＣｓは前駆または分化細胞、胚葉系統幹細胞あるいは胚盤葉上層様幹細胞の表現型発現マーカーを発現しない。その代り、胚幹細胞マーカーＣＤ６６ｅ、ＨＣＥＡ、ＣＥＡ、およびＣＥＡ−ＣＡＭ−Ｉのような、一般的で特定の胚系統マーカーをこれらは発現する。ＢＬＳＣｓは通常成熟組織では不活化している。しかしながら、そのような組織が損傷すると、ＢＬＳＣｓは損傷組織を修復するために活性化し、分化する。
【００２７】
他の幹細胞と比較すると、ＢＬＳＣｓは生後（ｐｏｓｔ−ｎａｔａｌ）組織から高収率で得ることができる。例えば、２×ｌ０８／血液ｍｌより多い収率で血液から得ることができる。一方、ＢＬＳＣｓは不活性で遺伝子を発現しないので、研究および治療目的のこれらの使用は限定的である。
【００２８】
ある種の化学剤を用いて内因性遺伝子および非相同性遺伝子を発現させる全能性または多能性幹細胞を産生するＢＬＳＣｓを培養することは予期されなかった。２つのそのような全能性または多能性幹細胞集団はＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞である。ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞を得るために、ＲＡおよびＴＧＦ−βそれぞれの存在下でＢＬＳＣｓを培養することができる。
【００２９】
ＢＬＳＣｓは、下記実施例のセクションで述べられている方法または国際公開第２００７／１００８４５号中で記載されている方法によって準備することができる。一般的には、細胞は血液、骨髄、および骨格筋などの成熟したまたは若い動物の多数の組織から単離することができる。分離された細胞が確かにＢＬＳＣであることを確認するために、（１）１μｍ未満である懸濁中の細胞のサイズ、（２）細胞表面マーカー、例えばＣＤ６６ｅ＋および（３）トリパンブルー染色陽性などの多数の特性を調べることができる。ＣＤ６６ｅのような細胞表面マーカーに対する抗体を用いることができる。これらは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、または量子ドットのような適当な標識を結合させることができる。ＣＤ６６ｅ＋であるＢＬＳＣは、フローサイトメトリーを用いてさらに濃縮することができる（図１〜２）。
【００３０】
次いで、濃縮された細胞は、標準的な技術によって試験される。細胞の分化能を確認するために、本分野で既知の方法によって、これらは、例えば神経グリア細胞、骨細胞、および脂肪細胞を形成するように誘導される。例えば、細胞を流し、コンフルエントまで培養し、骨形成培地または脂肪生成培地に移し、適当な時間（例えば３週間）インキュベートすることができる。骨形成の分化能は、カルシウム蓄積の鉱化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）によって算定され、フォンコッサ染色によって可視化することができる。脂肪生成分化を調べるために、細胞内の脂肪滴をオイルレッドＯによって染色することができ、顕微鏡で観察することができる。神経分化については、細胞を神経性培地中で適当な時間（例えば７日間）インキュベートし、次いで血清をなくし、β−メルカプトエタノールでインキュベーションすることができる。分化の後、細胞はネットワーク中に配列された伸長した神経突起様構造を有する屈折細胞体の形態を示す。神経分化を確認するために、系統特異的なマーカーの免疫細胞化学的な染色をさらに行うことができる。マーカーの例としては、神経特定的クラスＩＩＩ  β−チューブリン（Ｔｕｊ−１）、ニューロフィラメント、およびＧＦＡＰが挙げられる。
【００３１】
一方、分離細胞の固有性を確認するために、ＢＬＳＣｓが接触阻止できないことを利用することができる。そのために、コンフルエントまで分離した細胞を培養することができる。その条件の下、ＢＬＳＣｓは球様細胞集合体、多融合層、またはメッシュ−ネット構造を形成することができる。対照的に、ＣＤ４２＋細胞は細胞集合体のような上述した構造を形成することができない。
【００３２】
したがって、確認されたＢＬＳＣｓを、自然分化、老化、形態変化、増殖速度、または神経への分化能における変化を示すことなく、非分化培地中でさらに１０、２０、５０、または１００分裂回数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）以上に増殖させることができる。細胞は、使用前に標準的な方法によって貯蔵することができる。
【００３３】
ＳＢＲ細胞を準備するために、０．１〜２０μＭのＲＡの存在下、２〜８週間ＢＬＳＣｓを培養することができる。好適な実施形態において、１〜１５μＭのＲＡの存在下、２〜８週間、より好適には５〜１２μＭのＲＡの存在下、３〜４週間、ＢＬＳＣｓを培養する。多能性または全能性幹細胞はしたがって、大きさが１〜１５μｍで準備され、懸濁中でシート様構造を形成することができる。細胞培養に適切な商業的に入手可能なＲＡを用いることができる。
【００３４】
ＳＢＴ細胞を準備するために、１〜４０ｎＭのＴＧＦ−β存在下、２〜８週間、ＢＬＳＣｓを培養することができる。好適な実施形態において、２〜２０ｎＭのＴＧＦ−βの存在下、２〜８週間、より好適には、５〜１２ｎＭのＴＧＦ−β存在下、４〜６週間ＢＬＳＣｓを培養する。多能性または全能性幹細胞は、大きさが１〜１５μｍであり、円形であり、集合体を形成することができる。どんなＴＧＦ−βのタイプも用いることができるが、高純度ＴＧＦ−βが好適である。ＴＧＦ−βの例としては、哺乳類ＴＧＦ−β（例えばヒトＴＧＦ−β）または哺乳類ＴＧＦ−βと同じ生化学的活性を実質的に有するＴＧＦ−βが挙げられる。天然のＴＧＦ−βおよび遺伝子操作されたＴＧＦ−βの双方を用いることができる。組み換えＤＮＡ技術によって得られたＴＧＦ−βは、天然のＴＧＦ−βと同じアミノ酸配列、またはそれと機能的な等価物を有するものである。「機能的な等価物」とは、天然のＴＧＦ−βのポリペプチド派生物、例えば、一以上の変異、挿入、欠失、切断を有するタンパク質、融合タンパク質あるいはこれらの組み合わせを指す。「ＴＧＦ−β」という用語はまた化学的に改変されたＴＧＦ−βまで含む。化学的に改変されたＴＧＦ−βの例としては、構造変化、糖鎖の付加または切断を受けたＴＧＦ−β、およびポリエチレングリコールのような化合物が結合しているＴＧＦ−βなどが挙げられる。
【００３５】
ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞は、大きさ、接触阻害、およびトリパンブルー排除（すなわち、トリパンブルー染色陰性）にしたがって、確認することができ、ＢＬＳＣｓとは区別される。ＢＬＳＣｓは、ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞より小さく（１μｍ未満）、接触阻害またはトリパンブルー排除を起こさない。ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞は、フローサイトメトリー分析またはＲＴ−ＰＣＲのような他の標準分析によって、ＣＤｌ０＋、ＣＤ９０＋、およびＣＸＣＲ４＋のような関連する細胞マーカーにしたがって確認することができる。
【００３６】
したがって、ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞は、上述したＢＬＳＣｓに対するものと同じように、または本分野で既知の他の標準的技術と同様に、全能性および多能性についてさらに試験することができる。適当な誘導条件下で、これらの細胞は、インビトロで、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨形成系統中の細胞に分化することができる。また、これらの細胞は、上述した誘導条件下で、グリア細胞に分化することができる。
【００３７】
分化全能性および分化多能性は、インビトロで試験することができる。例えば、細胞内にＳＢＲ細胞またはＳＢＴ細胞片を移植された脳内虚血ラットは、溶媒処理のコントロールラットよりも顕著な脳機能の向上を示す。この結果は、脳内に投与されたＳＢＲ細胞またはＳＢＴ細胞は、脳に入り、生存し、移動し、脳卒中の機能的回復を向上させることを示す。事実、移植された細胞は、虚血脳において神経可塑的効果を向上させるために、グリア細胞（ＧＦ  ＡＰ＋）、神経（Ｎｅｓｔｉｎ＋、ＭＡＰ−２＋およびＮｅｕ−Ｎ＋）、および血管内皮細胞（ｖＷＦ＋）に分化することができる。プロトンＭＲスペクトロスコピー（１Ｈ−ＭＲＳ）によって評価されるように皮質神経活性もまたコントロールと比較して移植グループにおいて顕著に増加する。また、虚血脳半球中の神経栄養因子の発現の顕著に増加した調節もまた移植グループにおいて見られた。
【００３８】
このようにして確認されたＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞は、自然分化、老化、形態変化、増殖速度、または神経への分化能における変化を示すことなく、非分化培地中でさらに１０、２０、５０、または１００分裂回数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）以上に増殖させることができる。細胞は、使用前に標準的な方法によって貯蔵することができる。
【００３９】
本明細書で細胞に関して相互に用いられる「増殖」（「ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」）および拡大（「ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」）という用語は、分裂によって同じタイプの細胞の数が増えることを指す。「分化」という用語は、細胞が特定の機能に特化するようになる、例えば、細胞が初期の細胞型とは異なる一以上の形態特性および／または機能を獲得する、発展的なプロセスを指す。「分化」という用語は、系列決定および末端分化過程の双方を含む。例えば、免疫化学または当業者に既知の他の手段を用いて、系統マーカーの存在または非存在をモニタリングすることによって分化を測定することができる。幹細胞由来の分化した子孫細胞は、必ずしもとは限らないが、幹細胞の起源組織と同じ胚葉または組織と関連しうる。例えば、神経前駆細胞および筋肉前駆細胞は、造血細胞系統に分化することができる。
【００４０】
本明細書で相互に用いられる「系列決定」および「仕様（Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、幹細胞が行うプロセスを指し、該プロセスにおいて、幹細胞は、特定の限られた範囲の分化した細胞タイプの形成を行う前駆細胞を生じさせる。関係した前駆細胞はしばしば自己再生または細胞分裂ができる。
【００４１】
「最終分化」という用語は、成熟した、完全に分化した細胞へと細胞が最終的に分化したことを指す。例えば、神経前駆細胞および筋前駆細胞は造血細胞系統へと分化することができ、その最終分化により特定の細胞型の成熟した血液細胞になる。通常、最終分化は細胞サイクルからの離脱および増殖の停止と関係する。本明細書で用いられる「前駆細胞」という用語は、特定の細胞系統に関係し、細胞分裂の連続によってこの系統の細胞を生じさせる細胞を指す。前駆細胞の例としては、細胞の１タイプにのみ分化することができるが、それ自身は完全に成熟していない、または十分に分化していない筋芽細胞である。
【００４２】
１．一般的使用
本発明のＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞は、さまざまな方法で用いることができる。変性または遺伝子疾患を治療するために、ヒト胚操作の倫理的考慮を避けるために、細胞を用いることができる。
【００４３】
そうするために、例えば、組織または器官の正常な発達に必要な機能遺伝子が欠如した患者からＢＬＳＣｓを分離することができる。ＢＬＳＣからＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞を作製した後、遺伝子の機能的型をコードする発現核酸ベクターを細胞に導入することができる。リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在トランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはウイルス介在技術などの種々の技術を用いて細胞内にベクターを導入することができる。細胞の分化多能性に影響を与えない方法が好ましい。そのような技術の記述は、例えば、米国特許第７，４２２，７３６号および第５，５９１，６２５号ならびに米国特許出願第２００２０１２７７１５号に見出すことができる。細胞内に機能的遺伝子を導入した後、本分野で既知の方法を用いて患者に細胞を戻すことができる。細胞は患者から作製されているので、治療は免疫拒絶を引き起こさない。
【００４４】
あるいは、健康な対象から作製されるＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞から普遍的ドナー細胞を作製することができる。普遍的なドナー細胞の作製方法は、本分野で既知であり、普遍的なＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞の作製方法は、下記に記載する。
【００４５】
適切な条件下で、移植したＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞は機能的組織または器官に成長できる。この成長を促進するため、細胞の成長を誘発させる因子を患者に投与してもよい。そのような因子は、低分子量化合物、ペプチド、および核酸でありうる。限定されるものではないが、例としては、形質転換増殖因子β、骨形態形成タンパク質、および神経成長因子が挙げられる。
【００４６】
ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞はまた、系統発生および分化の発展または分化機構を調べるためにも有用である。モデルシステムのような細胞を使って、全能性多能性幹細胞の特定の組織または器官への発展を誘導する条件を同定することができる。さらに、本分野で既知の分化ｃＤＮＡスクリーニングを用いて成長の間役割を果たす遺伝子を単離することができる。例えば、Ｓｈｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２４：４２９−４２、１９９７参照。ある系統、例えば、上述した神経グリア系統へ成長するために誘発される細胞からｃＤＮＡを作製することができる。したがって、ライブラリーは特異的に発現した遺伝子を分離および調べるために用いることができる。これらの単離された遺伝子は、各プロセスでそれぞれの役割を規定するためにさらに調べられる。関連する技術は本分野で既知である。例えば、米国特許第７，４２２，７３６号および米国特許出願第２００６００３５３７３号。ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞は、また本分野で既知の方法を用いて動物の器官またはクローンへと変化しうる。例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：６４−６６、１９９６参照。したがって、これらの細胞は、ペットおよび畜産業において価値があり、絶滅寸前の動物を保護するために用いることもできる。
【００４７】
２．スクリーニング方法
上述の幹細胞は、細胞型に関連した疾患の治療に薬物が有用であることを示す形で、特定の細胞型に影響を与えることができる薬物を同定するためのスクリーニングアッセイに用いることができる。
【００４８】
したがって、本発明の一態様は、細胞と試験化合物とを接触させることによって、分化していないＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞の機能を変化させる薬剤（ａｇｅｎｔ）を同定する方法に関する。試験化合物非存在下と比較して、試験化合物存在下で細胞の機能または遺伝子発現が変化した場合、試験化合物は細胞の機能または細胞における遺伝子発現を変化させる化合物であることを示す。「試験化合物」という用語は、細胞の機能または細胞における遺伝子発現を変化させる能力について調べられるどんな分子をも指す。該方法は、所望の活性を有するこれまで知られていない分子を同定するためのスクリーニングアッセイとして一般的に用いられるが、本発明のスクリーニング方法は、特定の活性を有することが知られている既知の化合物を確認するためにも用いることができる。
【００４９】
該機能は、細胞内で通常発現している（または発現していない）遺伝子の発現であり、化合物は、発現遺伝子の発現レベルを増加させる、または減少させる（例えば、ＣＤ６６ｅの発現を減少させる）ことによって、または細胞内で発現していない遺伝子の発現を変化させる（例えば、系特異的抗原の発現を誘導する）ことによって、機能を変化させることができる。
【００５０】
一実施形態において、細胞の機能に影響を与える化合物は、細胞の分化を誘導し、それにより分化した細胞を産生するものである。そのような分化した細胞は、多能性ヒト幹細胞（例えば、造血幹細胞）であっても、最終的に分化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞、血液細胞、結合組織、または上皮細胞）であってもよい。そのような場合、該方法は、膵β細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、または他の細胞型などの最終的に分化した細胞へのＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞の分化を誘導する化合物を同定するために用いることができる。このようにして同定された化合物は、変性疾患、ガンまたは免疫疾患を治療するために用いることができる。
【００５１】
発現レベルは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのどちらかで決定することができる。試料中のｍＲＮＡレベルを測定する方法は、本分野で公知である。ｍＲＮＡレベルを測定するために、細胞を溶解し、例えば、（検出できる標識された遺伝子特異的ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いた）ハイブリダイゼーションアッセイおよび（適当な遺伝子特異的プライマーを用いた）量的または半定量的なＲＴ−ＰＣＲによって、溶解物中のｍＲＮＡレベルを、精製していようとなかろうと、決定することができる。一方、定量的な、または半定量的なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは、検出可能な（例えば、蛍光または酵素）標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて、組織切片または溶解していない細胞懸濁上で行うことができる。さらなるｍＲＮＡ定量化方法としては、アレイ（ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ）技術の他、ＲＮＡプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）法および遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）法が挙げられる。
【００５２】
試料中のタンパク質レベルの測定法もまた本分野で公知である。これらの中には、標的タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を用いるものもある。そのようなアッセイにおいて、抗体それ自身または抗体に結合する二次抗体を、検出可能に標識することができる。一方、抗体はビオチンに結合させてもよい。その存在は、検出可能に標識されたアビジン（ビオチンに結合するポリペプチド）によって測定することができる。該方法の感度を高めるために、これらのアプローチ（「多層サンドイッチ」アッセイを含む）を組み合わせて用いることができる。体液または細胞の溶解物に対しては、タンパク質測定アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）を適用することができ、組織切片または非溶解細胞懸濁に対しては、他の方法（例えば、免疫組織学的な方法または蛍光フローサイトメトリー）を用いることができる。適切な標識としては、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、または３２Ｐ）、酵素（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）、蛍光／発光剤（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、ＢＦＰ、およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（パロアルト、カリフォルニア州）によって供給されるＱｄｏｔ（登録商標）ナノ粒子）が挙げられる。他の適用できる方法としては、定量的免疫沈降または補体結合アッセイが挙げられる。
【００５３】
試験化合物は、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣薬、ビニル性のペプトイドのようなペプトイド、有機小分子などのどんなタイプの分子であってもよく、ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞の機能を変化させるために種々の方法のどんな形態であっても作用することができる。例えば、細胞によって発現される細胞表面受容体に結合し、それにより、通常受容体に結合し、受容体を介して作用するリガンドの結合によって介される機能を変化させることによって、試験化合物は細胞外で作用することができる。一方、試験化合物は、機能を変化させるために、受動的、または活性トランスポーター機構を経て、細胞膜を通過して、細胞内で作用するものであってもよい。
【００５４】
ペプチド試験化合物は、アミノ酸またはアミノ酸類似体であってもよく、３〜４残基から数百または数千の範囲にまでわたる。ペプチド試験化合物は、化学合成またはタンパク質精製、続いてタンパク質分解、必要によりクロマトグラフまたは電気泳動法によるさらなる精製の方法を使うことによって作製することができ、あるいはコードするポリヌクレオチドから発現させることができる。ペプチド試験化合物は既知のペプチド、例えば、天然のペプチドに基づくことができるが、例えば、一以上のアミノ酸類似体を含むことによって天然の配列から変化させることができる。
【００５５】
ポリヌクレオチド化合物は、ホスホジエステル結合によってともに結合している、２以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列であってもよい。遺伝子またはその一部であるＲＮＡまたはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡｉ化合物、合成ポリデオキシリボ核酸配列などであってもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの他、一本鎖または二本鎖であってもよい。細胞から単離することができる天然の核酸分子であってもよく、例えば、化学合成法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるような酵素反応によって作製される合成分子であってもよい。種々の形態で、本発明のポリヌクレオチドはヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体、あるいはホスホジエステル結合以外の骨格結合を含むことができる。そのようなヌクレオチド類似体、またはそのようなヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドは本分野で公知であり、商業的に入手可能である（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５２２０−５２３４、１９９４；Ｊｅｌｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２、１９９５；Ｐａｇｒａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３、１９９７）。
【００５６】
ポリヌクレオチド試験化合物は、本明細書で開示されている方法または本分野で既知の他の方法を用いて、ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞と接触させることができ、ＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞中に導入することができる。一般的には、必ずしもそうではないが、ポリヌクレオチドは細胞に導入され、細胞で直接的あるいは転写もしくは翻訳または双方に続いてその機能に影響を与える。例えば、ポリヌクレオチドは、細胞内で発現され、細胞の機能を変化させるペプチド試験化合物をコードすることができる。ポリヌクレオチドの試験化合物はまた、一以上の特異的標的核酸分子をターゲットにするように設計されたアンチセンス分子、リボザイムまたは三重化合物（ｔｒｉｐｌｅｘｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）であってもよく、またはそれらをコードしていてもよい。
【００５７】
スクリーニングされる候補薬剤または化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、抗体、低分子、または他の薬剤）は、本分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法で多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。そのようなライブラリーとしては：ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが、酵素分解耐性の新規非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー）；空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー；解析またはアフィニティクロマトグラフィー選択によって得られる合成ライブラリー；および１−ビーズ１−化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ライブラリーが挙げられる。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−２６８５；およびＬａｍ、１９９７、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５参照。分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ、１９９３、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ、１９９４、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ、１９９４  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、バクテリア（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ、１９９２、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  １９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ、１９９０、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ１９９１、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；および米国特許第５，２２３，４０９号）上に存在しうる。
【００５８】
３．変性疾患の治療
対象における変性疾患の治療、疾患の兆候の軽減、または疾患の始まりを遅らせる方法は本発明の範囲内である。治療されるべき対象は、状態または興味がある疾患を診断するための標準的技術によって同定することができる。治療方法は、必要とする対象に上述のＳＢＲ細胞またはＳＢＴ細胞の有効量を投与することを必要とする。
【００５９】
変性疾患は、遺伝子異常、損傷、適正な細胞分化の欠如（例えば、細胞の増殖性疾患におけるもの）、通常の身体疲労、またはライフスタイルの選択によるものであるかどうかにかかわらず、感染した組織または器官の機能または構造が長期間にわたって進行的に衰退する疾患を指す。変性疾患の例としては、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））、他の神経システム障害（横断性脊髄炎、脳または脊髄の外傷の後に起こる脱髄、急性脳障害、頭部外傷、脊髄損傷、抹消神経損傷、脳虚血損傷、ＣＮＳの遺伝性ミエリン疾患、てんかん、周産期仮死、呼吸停止、酸素欠乏症、てんかん重積症、シャイ・ドレーガー症候群、自閉症、および脳卒中を含む）、ガン、またはガン関連治療（例えば、化学療法）に起因する状態；代謝異常（例えば、糖尿病／真性糖尿病、ニーマン・ピック病）；自己免疫または炎症関連疾患（例えば、エリテマトーデス、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、前立腺炎、変形性関節症、骨粗しょう症、リウマチ関節炎、紅斑性狼瘡、糖尿病、およびぜんそく）、（緑内障、網膜色素変性、ノリエ病、および黄斑変性のような）眼疾患；心臓および循環疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、心不全心筋梗塞、および心臓血管疾患）；ウィスコット・アルドリッチ症候群のような血液疾患；筋ジストロフィー；消化器疾患；腎疾患；肝疾患；肺疾患、（アジソン病のような）副腎障害、（新しい傷、加齢性損傷細胞および加齢性損傷組織のような）損傷組織を含む、やけどや発作のような障害に起因する状態、加齢に関連する状態（例えば、男性型脱毛症および円形脱毛症を含む脱毛症）、（Ｃ型肝炎および後天性免疫不全疾患のような）ウイルス性疾患、および疾患に関連するサインおよび／または兆候を回復させる、再生させる、または改善させるために臓器移植または幹細胞を用いることができる他の疾患が挙げられる。本発明の方法は、勃起不全の治療および女性のための美容整形手術または乳房インプラントにおいて用いることができる。
【００６０】
４．パーキンソン病および他の神経変性疾患の治療
対象における脳またはＣＮＳ組織損傷の治療または疾患の兆候の軽減の方法は本発明の範囲内である。該方法は、脳組織損傷を受けている、または脳組織損傷に発展する危険性のある対象を同定することを含む。対象はヒトであってもよいし、ネコ、イヌ、またはウマのようなヒト以外の哺乳類であってもよい。脳組織損傷の例としては、脳虚血（例えば、慢性脳卒中）または神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳疾患、またはハンチントン病）によって引き起こされる損傷が挙げられる。治療されるべき対象は、興味のある状態または疾患に対する標準的診断技術によって同定することができる。治療方法は、上述したＳＢＲ細胞またはＳＢＴ細胞あるいは活性薬剤／化合物の有効量を必要とする対象に対して投与することを必要とする。
【００６１】
細胞の治療効果は、標準的方法にしたがって入手することができる。例えば、脳血管新生を促進させる効果を確かめるために、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ドップラー超音波撮像（ＤＵＩ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、およびプロトン磁気共鳴分光学（１Ｈ−ＭＲＳ）のような標準的脳画像技術によって処置前後で対象を検査することができる。例えば、１Ｈ−ＭＲＳは、脳代謝活性に関連する生化学的情報を得るための非侵襲的手段の代表である（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．３７、１８−２３）。この技術は、幹細胞移植あり、なしで、脳虚血中に起こる代謝変化を評価するために応用することができる。例えば、神経の健全性のマーカーである脳中のＮ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）濃度を調べるために用いることができる。神経残屑中のＮＡＡの再分配および捕捉は定量的な神経マーカーとしてのその利用を制限するが、脳虚血中で脳のＮＡＡ濃度が減少することが、神経欠損または機能障害の兆候として考えられている（Ｄｅｍｏｕｇｅｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９０、７７６−８３）。したがって、１Ｈ−ＭＲＳによって測定されるＮＡＡレベルは、脳虚血後の幹細胞移植の効果を追うための有用な指標である。
【００６２】
５．ガン
上述のＳＢＲ細胞またはＳＢＴ細胞はまたガンおよび他の細胞増殖性疾患を治療するためにも用いることができる。細胞増殖性疾患とは、（悪性および良性腫瘍などの）制御できない、自律的な細胞増殖によって特徴付けられる疾患を指す。「ガン」という用語は、制御できない細胞増殖、浸潤、および時には転移によって特徴付けられる疾患の分類を指す。ガン細胞は、自律的増殖（すなわち、細胞成長を急速に増殖させることによって特徴付けられる異常状態）をすることができる。この用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の状態にかかわらず、癌性増殖または腫瘍形成プロセス、転移性組織または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官のあらゆるタイプを含むことを意味する。ガンの例としては、限定されるものではないが、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、黒色腫、神経膠腫、褐色細胞腫、肝癌、卵巣癌、皮膚癌、精巣癌、胃癌、膵癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、脳腫瘍、食道癌、膀胱癌、副腎皮質癌、肺癌、気管支癌、子宮内膜癌、上咽頭癌、子宮頸癌または肝癌、および未知の原発部位の癌が挙げられる。
【００６３】
６．遺伝子治療
上述した細胞および方法は、本分野で既知の種々の遺伝子治療法において用いることができる。遺伝子治療としては、生体外および生体内技術の双方を含む。特に上述した幹細胞は、オリゴヌクレオチド調節物質または調節物質をコードする核酸分子を用いて、通常は生体外で設計することができ、設計された細胞は、次いで治療される患者に提供される。細胞培養物は、例えば、細胞を分離し（例えば、機械的分離）、薬学的に許容されるキャリア（例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液）と細胞とを密に混合することによって、患者に対して投与できるように製剤化される。あるいは、細胞は適切な細胞適合性支持体上で培養され、患者に移植されてもよい。設計された細胞は、異種のまたはアロタイプの拒絶を回避するように通常自己移植である。そのような生体外の方法は本分野で既知である。
【００６４】
細胞は、本分野で既知の技術を用いてオリゴヌクレオチドまたは核酸分子の投与によって設計されてもよい。例えば、「裸の」核酸分子（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：３５１−３５２；米国特許第５，６７９，６４７号）、あるいは、サポニン（例えば米国特許第５，７３９，１１８号参照）またはカチオン性ポリアミン（例えば、米国特許第５，８３７，５３３号参照）のような、細胞による核酸分子の取り込みを促進する一以上の化合物とともに組成物中に製剤化される核酸分子の直接投与によって；微小粒子照射（例えば「遺伝子銃」を用いて；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）によって；脂質、細胞表面受容体または核酸導入剤を用いて核酸分子を被覆することによって；リポソーム、微小粒子、またはマイクロカプセル中に核酸分子をカプセル化することによって；核に入ることが知られているペプチドに結合させた核酸分子の投与によって；または受容体を特異的に発現している標的細胞型に用いることができ、受容体を介するエンドサイトーシスを受けるリガンドに結合させた核酸分子の投与によって、オリゴヌクレオチドおよび他の核酸分子を投与してもよい。
【００６５】
エンドソームを崩壊させ、核酸がリソソーム分解を受けないようにリガンドが融合ウイルスペプチドを含むように、または特異的受容体を標的にすることによって核酸分子が生体内での細胞特異的取り込みおよび発現に対して標的化されるように、核酸リガンド複合体を形成することができる。また、細胞核内でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入、発現および蓄積に対する効果的な方法が米国特許第６，２６５，１６７号に記載され、核内でアンチセンスオリゴヌクレオチドがセンスｍＲＮＡにハイブリダイズするようになり、処理されるか細胞質中に移送されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを阻害する。本発明はまた、本分野で既知の相同的組み換えによる発現を目的とした核酸分子の細胞内導入および続いての宿主細胞ＤＮＡ内への導入も検討する。
【００６６】
ポリヌクレオチドは、適切な発現ベクター中に組み込むこともできる。遺伝子治療適用に適した多数のベクターが本分野で既知である（例えば、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（２０００）参照）。
【００６７】
発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよい。プラスミドＤＮＡの作製および精製方法は、迅速で簡便である。また、通常プラスミドＤＮＡは宿主細胞のゲノム中に一体化することはなく、染色体への組み込みが引き起こされるような遺伝毒性事象を除外する個別的な構成要素として、エピソーム位で維持される。多数のプラスミドが現在簡便に商業的に入手可能であり、哺乳類システムにおける使用を目的として特別に多くが設計された、大腸菌および枯草菌由来のものを含む。本発明に用いることができるプラスミドの例としては、限定されるものではないが、真核性発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン）、ｐＣＲ２．１（インビトロジェン）、ｐＡｄ／ＣＭＶおよびｐＡｄ／ＴＲ５／ＧＦＰｑ（Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ、（１９９８）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：５３−６４）が挙げられる。具体的実施形態において、プラスミドは、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ２（インビトロジェン）、ｐＡｄＣＭＶ５（ＩＲＢ−ＮＲＣ）、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、ｐＡｄＭＬＰ５（ＩＲＢ−ＮＲＣ）またはＰＶＡＸ（インビトロジェン）である。
【００６８】
発現ベクターはウイルス系ベクターであってもよい。ウイルス系ベクターの例としては、限定されるものではないが、複製欠損性レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス由来のものが挙げられる。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、現在のところ、生体内、特にヒトへの外因性オリゴヌクレオチドまたは遺伝子の導入を選択する組み換え遺伝子運搬システムである。これらのベクターは細胞内への効果的な遺伝子運搬をもたらし、導入された核酸は宿主の染色体ＤＮＡに安定的に一体化する。レトロウイルスを使用するにあたり主な必要条件は、特に、細胞集団中に野生型ウイルスが増殖する可能性があるという点で、それらの使用の安全性を確保することである。レトロウイルスベクターの起源となるレトロウイルスとしては、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、膵臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどが挙げられる。特異的なレトロウイルスとしては、当業者に公知である、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。
【００６９】
７．細胞バンク
本発明は、異なる幹細胞ラインを簡便で系統的に利用する手段を目的として幹細胞バンクまたはライブラリーを特徴とする。バンクまたはライブラリーにおける幹細胞は、健康な対象またはユーザー例えば研究者に有益な既知の病態または病的兆候を有する対象からの上述のＢＬＳＣ、ＳＢＲ細胞、またはＳＢＴ細胞由来である。上述の幹細胞から分化した細胞を有する細胞バンクまたはライブラリーも本発明の範囲内である。幹細胞から分化した細胞の例としては、脳細胞、神経、星状膠細胞、グリア細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、軟骨細胞、骨細胞、膵島細胞、脂肪細胞、心細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、筋細胞、および眼細胞が挙げられる。対象はヒトまたはヒト以外の脊椎動物である。幹細胞は、ヒト、マウス、ウサギ、ウシ、ブタなどのどんな哺乳類器官由来であってもよい。
【００７０】
表現型情報、形態学的特徴、分化プロファイル、血液型、主要組織適合遺伝子複合体、ドナーの病状、または遺伝子型情報（例えば、遺伝子あるいはゲノムのまたはミトコンドリアのＤＮＡに関連した特定の核酸配列の一塩基多型（ＳＮＰｓ））などの、所定の特性にしたがって、バンクまたはライブラリーにおける細胞は分類される。細胞は、幹細胞を生存させ、機能を維持するために適切な条件下で（通常、冷凍によって）保存される。分類化は、限定されるものではないが、情報が中に入力された集積された文書記録またはコンピューターデータベースのような、各細胞集合体から得られた特性の一元化された記録の作成を構成してもよい。実質的に、本実施形態は、幹細胞バンクの作製に関連する。幹細胞バンクによって、複数のサンプルからユーザーのニーズに適した特定の幹細胞サンプルを選択することが促進される。したがって、本発明の他の実施形態は、別々の源から得られる複数の幹細胞サンプルを含み、少なくとも一の所定の特性にしたがって特徴付けられ、分類される幹細胞バンクに関連する。他の実施形態は、複数の源から幹細胞サンプルを集める；少なくとも一の所定の特性にしたがってサンプルを分類する、および細胞の生存を維持できる条件下で細胞を保存することを含む、幹細胞バンクを構築する方法に関連する。
【００７１】
幹細胞集合体が生存を維持できる条件下で各容器内に収納された複数の幹細胞集合体；処理モジュール、ディスプレイ、および各幹細胞集合体に対する少なくとも一の特性の情報を有する保存媒体を含むデータベースコンピューター；ならびにユーザーによる指令にしたがって前記ディスプレイ上で見ることができる情報を引き出すための少なくとも一のプログラムモジュールを含む、幹細胞バンキングシステムは、本発明の範囲内である。具体的な実施形態では、本発明は、幹細胞集合体が病的状態である対象から得られる幹細胞を含む幹細胞バンキングシステムを特徴とする。病的状態としては、上述の変性疾患が挙げられる。幹細胞は、異なる疾患を有する異なる対象から培養され、幹細胞の特性が明らかにされる。（複数の）特性はデータベースコンピューターに入力される。加えて、あるいは代わりに、細胞は、病的状態に必ずしも関連しない特定の表現型に基づいて特徴付けられる。例えば、異なる代謝能力の遺伝的基礎またはこれらの関連する基本的な生理機能を研究するために、カフェイン、アルコール、薬剤などのような化合物を代謝する能力に基づいて、肝細胞を特徴付けることができる。他の細胞型は、機能的および／または形態学的表現型に基づいて特徴付けることができる。
【００７２】
一実施形態において、ＳＢＲ細胞またはＳＢＴ細胞から分化した細胞は、設計されたベクターまたは他の遺伝的材料の導入によって、分化または脱分化に影響を与える状態に晒されうる。脱分化は、分化がより少ない細胞の特性となるような細胞の操作を含む。
【００７３】
本発明の幹細胞ライブラリーは、上述した方法で変性疾患、ガンまたは免疫疾患を治療するために用いることができる薬剤または化合物をスクリーニングするために用いることができる。ライブラリーは、ハイスループットスクリーニングに適しており、特定の対象に特に有効な化合物を同定するのに有用である。ハイスループットスクリーニングを目的として、マルチウェルプレートまたはスライドガラスのウェル、あるいはマイクロチップ中に幹細胞を入れ、試験化合物と接触させることができる。細胞および溶液を操作し、特に検討される機能に関して細胞を監視するためにロボットを簡便に利用できるように、通常、細胞は、一列に、特に利用可能なような列に配置される。ハイスループットフォーマトを用いる利点は、平行して多数の試験化合物を調べることができ、所望により、試験化合物について、理想的な条件でコントロール反応も行うことができることである。その場合、本発明のスクリーニング方法は、幹細胞の機能を変えることができる化合物、例えば、所望の細胞型に細胞が分化するように誘導する、または例えば調節分子の発現を高いレベルに維持することによって、自発的な分化を阻害する薬剤を同定するために、１つの、数種のまたは多数の試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００７４】
８．万能なドナー細胞
移植を目的とした組織適合ドナー細胞または組織を作製するために遺伝的に上述の幹細胞を操作することができる。移植および細胞治療のゴールは、機能不全の組織または器官を機能的なドナー組織または器官にうまく置換することである。しかしながら、移植を成功させるためには、二つの主な障壁を克服する必要がある：適切なドナー組織または器官を入手すること、および免疫拒絶である。利用できるドナーの数が限定されること、および長期間の免疫抑制プロトコールとともに毒性の高い免疫抑制剤を一緒に投与する必要があることによって、機能不全の組織または器官の置換および拒絶の治療は制限される。現在のおよび実験的な移植プロトコールは、主に兄弟のドナー、同種異系ドナーの他の小さなプールおよび異種ドナーに主に依存している。上述の遺伝的に設計された幹細胞は、これらの限界を克服するために用いることができる。
【００７５】
より具体的には、本明細書で記述されている幹細胞は、これらの表面状にクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を発現させないように遺伝子的に設計することができる。より好適には、実質的に全ての細胞表面クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を発現させないように細胞は設計される。本明細書で用いられる場合、「発現しない」という用語は、反応を起こすためには細胞表面上に十分には発現していないこと、または発現しているタンパク質が十分ではなく、したがって反応を起こさないことのどちらかを意味する。
【００７６】
ＭＨＣ分子は、特には、クラスＨＬＡ  Ａ、ＢおよびＣ、ならびにクラスＩＩ  ＨＬＡ  ＤＰ、ＤＱ、およびＤＲ、ならびにそのサブクラスのＨＬＡ分子を指す。この技術は、一般的にヒトＭＨＣに特異的であると解釈されているが、本明細書では、ドナー細胞種からの等価のＭＨＣ遺伝子を含むことまで拡張され、例えば、細胞がブタ起源であれば、ＨＬＡという用語は、等価のブタＭＨＣ分子、ＭＨＣ  ＩかＩＩを指す。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子を除去する場合、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、遺伝子操作された内皮細胞を認識せず；クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の双方が除去された場合、ＣＤ４＋もＣＤ８＋細胞も改変された細胞を認識しない。
【００７７】
幹細胞上で行われる好適な遺伝子改変としては、１）集合および細胞表面へのクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の輸送ならびに抗原的ペプチドの積み込みにおいて機能する内因性不変鎖遺伝子を破壊し、２）すべてのクラスＩＭＨＣ分子の細胞表面発現に必要なタンパク質をコードする内因性β２−ミクログロブリン遺伝子（β２Ｍ遺伝子）を妨害する。あるいは、単に不変鎖遺伝子が破壊される。不変鎖には、ＭＨＣクラスＩＩ分子中に抗原性ペプチド断片を挿入することが必要であると考えられている。それとともに、抗原性ペプチドおよびＭＨＣはＴ細胞によって認識される。抗原性ペプチドがない場合、Ｔ細胞認識は普通には行われないし、ＭＨＣクラスＩＩ分子は適切に折りたたまれない。したがって、不変鎖を欠く細胞では、ペプチドの存在は意味がなく、細胞表面ＭＨＣのほんのわずかな量が得られたとしても、これらはペプチドを欠き、したがって非免疫原性である。
【００７８】
これらの遺伝子の破壊は、同種の組み換え遺伝子標的技術の方法によって達成されうる。これらの技術は本分野で公知である。米国特許第６９１６６５４号および第６９８６８８７号、Ｚｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５４３８；ならびにＫｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１２２７−１２３０参照。
【００７９】
９．組成物
本発明は、上述の細胞または活性薬剤／化合物を含む薬剤組成物を提供する。治療的に有効な量の細胞または活性薬剤／化合物および任意の他の活性物質を製薬上許容しうるキャリアと混合することによって薬剤組成物を準備することができる。キャリアは投与経路によって、異なる形態であってもよい。他の活性物質の例としては、既知の、または上述のスクリーニング方法によって同定される活性化合物が挙げられる。
【００８０】
従来の薬剤賦形剤および製造方法を用いることによって、上述の薬剤組成物を製造することができる。あらゆる賦形剤を、崩壊剤、溶媒、造粒剤、湿潤剤および結合剤とともに混合することができる。本明細書において用いられる場合、「有効量」または「治療的に有効な量」という用語は、特定の疾患の少なくとも一の兆候または特定の疾患のパラメータを適度に改善させることができる量を指す。上述の細胞の治療的に有効な量は、本分野で既知の方法によって測定することができる。疾患を治療する有効量は、当業者に既知の経験的方法によって容易に測定することができる。患者に投与されるべき正確な量は、疾患の状態および重症度ならびに患者の健康状態によって変化しうる。兆候またはパラメータの適度な改善は、当業者が決定することができ、または医師に対して患者によって報告される。上述の疾患の兆候またはパラメータの臨床学的にまたは統計学的に顕著な減退または改善は本発明の範囲内であると理解されるであろう。臨床的に顕著な減退または改善は、患者および／または医師に認識できることを意味する。
【００８１】
「製薬上許容しうる」というフレーズは、ヒトに対して投与したときに、生理的に耐性で、通常望まれない反応を引き起こさないような組成物の分子全体および他の成分を指す。好適には、「製薬上許容しうる」いう用語は、哺乳類、より好適にはヒトでの使用に対して、連邦もしくは州政府の、または米国薬局方もしくは他の一般的に承認された薬局方にリストされている監督官庁によって承認されていることを意味する。製薬上許容しうる塩、エステル、アミドおよびプロドラッグは、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応などを引き起こすことなく、患者の組織に接触させる際に用いることに適しており、理にかなった利益／リスク比に見合っていて、意図している用途に有効である、それらの塩（例えば、カルボン酸塩、アミノ酸付加塩）、エステル、アミド、およびプロドラッグを指す。
【００８２】
上述の薬剤組成物に適用されるキャリアは、希釈剤、賦形剤、または溶媒を指し、これらとともに化合物が投与される。そのような薬剤キャリアは、水または油のような滅菌された液体でありうる。水または水性溶液、食塩水、ならびに水性ブドウ糖およびグリセロール溶液は、特に注射剤用途でキャリアとして好適に用いられる。適切な薬剤キャリアはＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」中に記載されている。
【００８３】
上述の細胞は、点滴または注射（例えば、静脈内、くも膜下、筋肉内、腔内、気管内、腹腔内、または皮下）、経口、経皮投与、または本分野で既知の他の方法によって個体に投与することができる。投与は、２週間に１回であってもよいし、１週間に１回であってもよく、またはそれより頻回であってもよいが、病気または疾患の維持相の間には頻度を減らしてもよい。
【００８４】
異種および自己移植細胞の双方を用いることができる。前者の場合、ホスト反応を避ける、または最小限化するためにＨＬＡ適合を行わなければならない。後者の場合、自己移植細胞は対象から濃縮され、精製され、後の使用のために保存される。細胞は、生体外でホストまたはグラフトＴ細胞の存在下培養され、ホスト中に再導入される。これは、自身で細胞を認識し、Ｔ細胞活性の減少がよりもたらされるホストの利点を有する。
【００８５】
投与量および投与回数は、当業者に公知の急性期の少なくとも１、またはより好適には１以上の臨床的兆候の減少または消失を伴う、寛解期の持続を確かにする、臨床兆候に依存する。より一般的には、投与量および投与回数は、上述の組成物を用いた治療を検討している病的状態または疾患の病理的兆候ならびに臨床的および亜臨床的兆候の減退に一部依存している。投与量および投与計画は、当業者によって認識されているように、治療される患者または哺乳類対象における共役効果および副作用、ならびに医師の判断とともに、投与される対象の年齢、性別、健康状態によって判断することができる。上述の方法のすべてにおいて、細胞は対象に、１×１０４〜１×１０１０／時間で投与することができる。
【００８６】
下記特定の実施例は、単に説明であると解釈されるべきであり、なんであれ決して開示の残余を限定するものではない。労することなく、本明細書の記載に基づいて、当業者が本発明を最大限利用することができるものと信じている。
【実施例】
【００８７】
ＳＢＲおよびＳＢＴ細胞の作製
ＢＬＳＣｓの活性化、精製および増殖方法は、国際公開第２００７／１００８４５号に記載されている。本実施例において、ＢＬＳＣｓは、２つの方法を用いてヒト対象の血液から精製された。分離された細胞は、フローサイトメトリーによって分析された。結果を図１Ａ〜１Ｃおよび図２Ａ〜２Ｃに示す。２つの方法により、各々２００×１０６および２３０×１０６ＢＬＳＣ／血液ｍｌが産生したことがわかる。
【００８８】
精製されたＢＬＳＣｓは、ＳｔｅｍＢｉｏｓ−００１中で培養した。ＳＢＲおよびＳＢＴ細胞を作製するため、ＢＬＳＣｓをＳｔｅｍＢｉｏｓ−００２培地中で２週間培養した。次いで、２〜６週間にわたって、０．１〜２０μＭのＲＡおよび１〜４０ｎＭのＴＧＦ−βを含むＳｔｅｍＢｉｏｓ−００３培地中でＢＬＳＣｓを培養した。培養された細胞は、徐々にその形態およびサイズを変化させることがわかった（図６〜１２）。これらの細胞は、それぞれＳＢＲおよびＳＢＴ細胞と名づけられた。
【００８９】
ＳＢＲおよびＳＢＴ細胞を、これらの成長−分化能について標準的方法を用いて試験した。これらは、すべての３つの胚葉、すなわち外胚葉、中胚葉、および内胚葉由来の細胞に分化することができることがわかった。細胞のすべてまたは大部分がＣＤｌ０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＸＣＲ４＋であることがわかった。
【００９０】
ＳＢＲ、ＳＢＴおよびＢＬＳＣｓのＲＴ−ＰＣＲの結果
ＳＢＲ細胞、ＳＢＴ細胞、およびＢＬＳＣｓの遺伝子発現について調べた。全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、Ｐａｒｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）、またはＲＮＡｚｏｌ  ｋｉｔ（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ）を使って、培養したＳＢＲ細胞またはＳＢＴ細胞（各々６百万以上）から分離した。ｃＤＮＡは０．２５ｎｇ  オリゴ−（ｄＴ）１２−１８および逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ）を使って、メーカー（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールにしたがって、２．０μｇのＲＮＡから作製した。しかしながら、１億以上のＢＬＳＣｓから検出できるＲＮＡは何ら得られなかった。
【００９１】
ＲＴ−ＰＣＲは、９４℃（１５秒）、５５℃（１５秒）、７２℃（２０秒）、３０サイクルの条件で行った。β−アクチンに対するプライマーは：フォワード  ５’−ＡＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＣＴＴＧＣＧＣＡＧ−３’、リバース  ５’−ＴＣＣＴＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＴＣＴＣＡ−３’。ＧＡＤＰＨに対するプライマーは：フォワード  ５’−ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣ−３’  リバース５’−ＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＧ−３’。結果を図１３に示す。β−アクチンおよびＧＡＤＰＨはＳＢＲ細胞およびＳＢＴ細胞中で発現したが、ＢＬＳＣｓ細胞中で発現しないことがわかった。
【００９２】
他の実施形態
本明細書で開示されているすべての特徴は、どのような組み合わせにおいても組み合せることができる。明細書で開示されている各特徴は、同じ、等価の、または同様の目的を果たす他の特徴によって置換することができる。したがって、他で明示的に述べられていない限り、開示されている各特徴は等価のまたは他の特徴を有する包括的一群の一例に過ぎない。
【００９３】
上述の明細書から、当業者であれば本発明の本質的特性を容易に確かめることができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に適用するために本発明の多数の改変および改良を行うことができる。したがって、他の実施形態もまた下記特許請求の範囲内である。
【図１】
0005711149.tif 000002
【図２】
0005711149.tif 000003
【図３】
0005711149.tif 000004
【図４】
0005711149.tif 000005
【図５】
0005711149.tif 000006
【図６】
0005711149.tif 000007
【図７】
0005711149.tif 000008
【図８】
0005711149.tif 000009
【図９】
0005711149.tif 000010
【図１０】
0005711149.tif 000011
【図１１】
0005711149.tif 000012
【図１２】
0005711149.tif 000013
【図１３】
0005711149.tif 000014
【配列表】
0005711149000001.app