(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１パルス光を発生する第１レーザ光源と、
前記第１パルス光よりも周波数の低い第２パルス光を発生する第２レーザ光源と、
前記第１パルス光の光路又は前記第２パルス光の光路に設けられ、入射光を０．５ＭＨｚ以上の周波数で強度変調させる変調器と、
前記第１パルス光と前記第２パルス光とを重ね合わせる合波器と、を備え、
前記合波器からの前記第１パルス光と前記第２パルス光とは同期されており、
さらに、前記合波器により重ね合わされたパルス光から、複数の光束を生成する光学部品と、
前記複数の光束を試料に照射するための対物レンズと、
前記変調器によって変調された前記第１パルス光又は前記変調器によって変調された前記第２パルス光を減衰させるフィルタと、
前記フィルタを透過した光の強度を検出する２次元検出器と、を備え、
前記２次元検出器は、複数の撮像ピクセル及び当該撮像ピクセル毎に設けられた第１キャパシタ及び第２キャパシタを有しており、
前記フィルタを透過した光により発生する光電荷を前記第１キャパシタに溜める第１期間と前記光電荷を前記第２キャパシタに溜める第２期間との和が、前記変調器の１周期以内となるように同期されていることを特徴とする誘導ラマン散乱顕微鏡。
【請求項２】
前記変調器は、隣り合う複数のパルス群をオンにする区間と、他の隣り合う複数のパルス群をオフにする区間とを有する請求項１に記載の誘導ラマン散乱顕微鏡。
【請求項３】
前記変調器は、１のパルスをオンにする区間と、当該パルスの次のパルスをオフにする区間とを有する請求項１に記載の誘導ラマン散乱顕微鏡。
【請求項４】
前記変調器が電気光学効果を有する電気光学変調素子又は音響光学効果を有する音響光学変調素子からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導ラマン散乱顕微鏡。
【請求項５】
前記光学部品は、複数のマイクロレンズ及び当該複数のマイクロレンズを回転させる回転手段で構成される請求項１〜４のいずれか１項に記載の誘導ラマン散乱顕微鏡。
【請求項６】
前記光学部品は、前記回転手段の代わりに、前記合波器により重ね合わされたパルス光をＸ軸に沿って走査させる第１走査ミラーと、当該パルス光をＹ軸に沿って走査させる第２走査ミラーとを備える請求項５に記載の誘導ラマン散乱顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導ラマン散乱を利用して生細胞等の試料を高速にイメージングする誘導ラマン散乱顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学においては、生体内の分子、例えばＤＮＡやアミノ酸、タンパク質、細胞小器官等の活動を、生きたまま観察したいという需要が多い。従来の蛍光観察や多光子励起蛍光観察を用いて生体内の分子を観察することはある程度可能であるが、観察目標とする分子を蛍光色素で標識する必要がある。
【０００３】
しかしながら、生体を蛍光色素で染色することは、蛍光色素に毒性が存在することや、蛍光色素によって生体反応が妨げられる等、少なからず生体に影響を及ぼすと考えられるため、好ましい方法とはいい難い。
【０００４】
近年、生体内の分子の３次元分布を無染色で観察する目的で、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）を用いた顕微鏡（ＣＡＲＳ顕微鏡）が種々提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
ＣＡＲＳ顕微鏡は、波長の異なる２つの光波を試料の同一部分に同時に入射させ、この２つの光波の周波数差が上記試料を構成する物質の分子振動数に一致することによって発せられるＣＡＲＳ光を検出することにより上記試料の状態を３次元的に観測するものである。このようなＣＡＲＳ顕微鏡を用いれば、試料に対する染色の必要がなくなるという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２７６６６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記ＣＡＲＳ顕微鏡では、非共鳴バックグラウンドと呼ばれる背景光がスペクトル上に重畳することが知られている。この非共鳴バックグラウンドは、単に重畳するだけでなくスペクトルの歪みも与える。そのため、様々な分子振動が数多く現れ、分子の同定能力の高い指紋領域と呼ばれる領域での生細胞のイメージングは、上記非共鳴バックグラウンドの影響とスペクトルの歪により非常に困難となっている。
【０００８】
本発明は上記のような事情に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、生細胞にダメージを与えることを低減でき、高波数領域（１８００〜３５００ｃｍ−１）だけでなく、いわゆる指紋領域（５００〜１８００ｃｍ−１）での生細胞のイメージングをも行うことができる誘導ラマン散乱顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る誘導ラマン散乱顕微鏡は、第１パルス光を発生する第１レーザ光源と、
前記第１パルス光よりも周波数の低い第２パルス光を発生する第２レーザ光源と、
前記第１パルス光の光路又は前記第２パルス光の光路に設けられ、入射光を０．５ＭＨｚ以上の周波数で強度変調させる変調器と、
前記第１パルス光と前記第２パルス光とを重ね合わせる合波器と、を備え、
前記合波器からの前記第１パルス光と前記第２パルス光とは同期されており、
さらに、前記合波器により重ね合わされたパルス光から、複数の光束を生成する光学部品と、
前記複数の光束を試料に照射するための対物レンズと、
前記変調器によって変調された前記第１パルス光又は前記変調器によって変調された前記第２パルス光を減衰させるフィルタと、
前記フィルタを透過した光の強度を検出する２次元検出器と、を備え、
前記２次元検出器は、複数の撮像ピクセル及び当該撮像ピクセル毎に設けられた第１キャパシタ及び第２キャパシタを有しており、
前記フィルタを透過した光により発生する光電荷を前記第１キャパシタに溜める第１期間と前記光電荷を前記第２キャパシタに溜める第２期間との和が、前記変調器の１周期以内となるように同期されていることを要旨とする。
【００１０】
本発明において、前記変調器は、隣り合う複数のパルス群をオンにする区間と、他の隣り合う複数のパルス群をオフにする区間とを有することが好ましい。
【００１１】
本発明において、前記変調器は、１のパルスをオンにする区間と、当該パルスの次のパルスをオフにする区間と有してもよい。
【００１２】
本発明において、前記変調器が電気光学効果を有する電気光学変調素子又は音響光学効果を有する音響光学変調素子からなることが好ましい。
【００１３】
本発明において、前記光学部品は、複数のマイクロレンズ及び当該複数のマイクロレンズを回転させる回転手段で構成されることが好ましい。
【００１４】
本発明において、前記光学部品は、前記回転手段の代わりに、前記合波器により重ね合わされたパルス光をＸ軸に沿って走査させる第１走査ミラーと、当該パルス光をＹ軸に沿って走査させる第２走査ミラーとを備えてもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る誘導ラマン散乱顕微鏡によれば、複数の光束を生成する光学部品の採用により、試料（特に生細胞）にダメージを与えることが低減される。そして、誘導ラマン散乱効果の利用により、ＣＡＲＳ顕微鏡のような非共鳴バックグラウンドの影響とスペクトルの歪が生じることなく、指紋領域（５００〜１８００ｃｍ−１）での生細胞のイメージングを行うことができる。
【００１６】
また、２次元検出器の検出処理を変調器に同期させることによって、誘導ラマン散乱によって第１パルス光に生じる僅かな強度変調をリアルタイム（例えば３３ｍｓ／１画像）で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係る誘導ラマン散乱顕微鏡の全体構成を示す説明図である。
【図２】誘導ラマン散乱顕微鏡の検出システムの構成を示す説明図である。
【図３】（ａ）は第１パルス光ω１の時間情報と変調後の第２パルス光ω２の時間情報を示す図であり、（ｂ）は第２パルス光ω２の変調に起因して変調された第１パルス光ω１の時間情報を示す図である。
【図４】図２の２次元検出器のピクセル（受光素子）毎の構成を示す簡単な断面図である。
【図５】入射光を多焦点化するための光学部品の他の例を示す図である。
【図６】変調を行うための他の例を示す図である。
【図７】多焦点化するための他の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面に示した実施の形態に基づいて本発明を詳細に説明する。
【００１９】
１．誘導ラマン散乱顕微鏡の全体構成
図１は本発明に係る誘導ラマン散乱顕微鏡１の全体構成を示す説明図である。
【００２０】
図１に示すように、本発明に係る誘導ラマン散乱顕微鏡１は、ピコ秒レーザ光源である第１レーザ光源２及び第２レーザ光源３、変調器４、パルス発生器５、バランス相互相関器６、ミラー７，８，９，１０、並びに検出システム１１を主として備えている。変調器４は、電気光学効果を有する電気光学変調素子又は音響光学効果を有する音響光学変調素子により構成することができる。
【００２１】
検出システム１１は、マイクロレンズアレイ１２、対物レンズ１３、フィルタ１４、及び２次元検出器１５を主として備えている。なお、検出システム１１の詳細については後述する。
【００２２】
第１レーザ光源２は、第１パルス光ω１を発生する。第２レーザ光源３は、第１パルス光ω１よりも周波数の低い第２パルス光ω２を発生する。第１パルス光ω１は短波長（例えば７１０ｎｍ）であり、第２パルス光ω２は長波長（例えば９２０ｎｍ）である。
【００２３】
第１レーザ光源２により発生された第１パルス光ω１は、ミラー７を介して合波器としてのミラー（ダイクロイックミラー）８に照射される。
【００２４】
また、第２レーザ光源３により発生された第２パルス光ω２は変調器４により０．５ＭＨｚ以上２ＧＨｚ以下の周波数、好ましくは、０．５ＭＨｚ以上４０ＭＨｚ以下でその強度が変調されるようになっている。これは次の理由による。パルス光の強度は通常１％程度揺らいでいる。この強度揺らぎは０．５ＭＨｚ以下の周波数で主に生じることから、後述の誘導ラマン散乱に起因して第１パルス光ω１に現れる１０−４以下の非常に僅かな変調度を検出するために、０．５ＭＨｚ以上の周波数で変調するのである。
【００２５】
変調器４は、パルス発生器５により発生されたパルスを、後述の方法でオン又はオフすることで第２パルス光ω２の変調を行う。変調器４は第２パルス光ω２の光路に設けられていればよく、その配設は第２レーザ光源３の内外を問わない。なお以下において、変調器４による変調後の第２パルス光ω２を単に第２パルス光ω２と呼ぶことがある。
【００２６】
変調後の第２パルス光ω２はミラー８に照射される。ミラー８では、第１パルス光ω１と第２パルス光ω２とが空間的に重ね合わされて合波されるようになっている。
【００２７】
第１パルス光ω１と第２パルス光ω２との合波の一部は、ミラー１０を介してバランス相互相関器６に入射される。
【００２８】
バランス相互相関器６は第１パルス光ω１と第２パルス光ω２とを時間的に高精度に同期させるものである。すなわち、バランス相互相関器６は、第１パルス光ω１と第２パルス光ω２とをそれぞれ高速応答が可能な光検出器により検出し、位相検出器により２つのパルス光間の時間をピコ秒の分解能で検出する。また、バランス相互相関器６は光学的に２つのパルス光間の時間をフェムト秒の分解能で検出する。これら２種類の時間信号を第２レーザ光源３のレーザ共振器に設けられたピエゾ素子３ａにフィードバックして、第１パルス光ω１と第２パルス光ω２とを時間的に高精度に同期させるようになっている。なお、バランス相互相関器６により２つのレーザ光間のジッター（時間揺らぎ）を例えば８フェムト秒まで抑えることができる。（これに関しては、特許出願している。国際出願番号WO2007/132540, 発明者: 橋本守、南川丈夫、谷本尚生、小林実、藤田克昌、河田聡、荒木勉、“パルスレーザ光のタイミング調整装置、調整方法及び光学顕微鏡”，出願人:国立大学法人大阪大学、優先日2006年5月15日）。
【００２９】
このような構成により、第１パルス光ω１と第２パルス光ω２とが時間的及び空間的に重ね合わされて、検出システム１１の光学部品としてのマイクロレンズアレイ１２に照射される。以下、検出システム１１について説明する。
【００３０】
２．検出システムの構成
図２は検出システム１１の構成を示す説明図である。
【００３１】
図２に示すように、ドーナツ型のマイクロレンズアレイ１２には、凸状または凹状の複数のマイクロレンズ１２ａが形成されている。
【００３２】
このような複数のマイクロレンズ１２ａで構成されるマイクロレンズアレイ１２に第１パルス光ω１と第２パルス光ω２を照射することにより、これらの各光を複数の光束に分割することができる。つまり、マイクロレンズアレイ１２を採用することによって、試料上での多焦点化の実現が可能となる。これにより、試料Ｓが生細胞等である場合に、単焦点で光を照射するよりも該生細胞に対して与えるダメージを低減することができる。なお、各マイクロレンズ１２ａを凹状に形成すれば、色収差による影響をより低減できる。
【００３３】
マイクロレンズアレイ１２には、当該マイクロレンズアレイ１２を周方向に回転させる回転手段１２ｂが設けられている。この回転手段１２ｂは、例えばマイクロレンズアレイ１２の中央に接続された回転軸と該回転軸を回転させるモータ等とにより構成することができる。回転手段１２ｂによりマイクロレンズアレイ１２を回転させることで、試料Ｓの全体を走査できこの試料Ｓの画像を取得することができる。
【００３４】
ここで、第１パルス光ω１と第２パルス光ω２の時間情報について図面を参照しつつ説明する。
【００３５】
図３（ａ）は第１パルス光ω１の時間情報と変調後の第２パルス光ω２の時間情報を示す図であり、図３（ｂ）は第２パルス光ω２の変調に起因して変調された第１パルス光ω１の時間情報を示す図である。
【００３６】
図３（ａ）に示すように、第１パルス光ω１は所定間隔で発せられた複数のパルスで構成される。
【００３７】
上記の変調器４により変調された後の第２パルス光ω２は、例えば図３（ａ）に示すように、隣り合う複数のパルス群をオンにする区間と、他の隣り合う複数のパルス群をオフにする区間とを有するものとなる。なお、変調された後の第２パルス光ω２のその他の例として、この第２パルス光ω２が１のパルスをオンにする区間と、当該パルスの次のパルスをオフにする区間とを有するものも挙げられる。
【００３８】
上記のように時間的及び空間的に重ね合わされた第１パルス光ω１と変調後の第２パルス光ω２とがマイクロレンズアレイ１２及び対物レンズ１３を介して試料Ｓに同時に照射され、これら２つのパルス光の周波数の差がラマン活性な分子振動の周波数と一致すると、誘導ラマン散乱効果によって第１パルス光ω１の強度は減衰し、第２パルス光ω２の強度は増強される。その結果、図３（ｂ）に示すように、第１パルス光ω１の強度も変調されることとなる。
【００３９】
なお、第１パルス光ω１と第２パルス光ω２の時間幅は、５００フェムト秒〜５００ピコ秒であることが好ましい。上記時間幅が５００フェムト秒よりも短くなると、波長幅が広がってしまい、得られるラマン散乱スペクトルの波数（波長）分解能が悪くなり個々の分子振動を検出し難くなり、５００ピコ秒よりも長くなると、ピークパワーが小さくなってしまい、誘導ラマン散乱の効率が低下するためである。
【００４０】
図２に戻って、試料Ｓを透過した第１パルス光ω１及び第２パルス光ω２のうち、第２パルス光ω２がフィルタ１４によって減衰される。
【００４１】
誘導ラマン散乱により第１パルス光ω１に現れる変調度は、１０−４〜１０−５程度の非常に僅かなものである。そこで本発明では、フィルタ１４を透過した第１パルス光ω１の強度変化を検出することが可能な下記の２次元検出器１５を採用する。
【００４２】
３．２次元検出器の構成
図４は図２の２次元検出器１５のピクセル（受光素子）毎の構成を示す簡単な断面図である。
【００４３】
図４に示すように、２次元検出器１５は複数の撮像ピクセルｐｘ及び当該撮像ピクセルｐｘ毎に設けられた第１キャパシタ１５ａ及び第２キャパシタ１５ｂを有している。
【００４４】
２次元検出器１５は、０．５ＭＨｚ以上の周波数で図１の変調器４と同期して上記のフィルタ１４を透過した第１パルス光ω１の強度を検出する。すなわち、フィルタ１４を透過した第１パルス光ω１により発生する光電荷を第１キャパシタ１５ａに溜める第１期間と光電荷を第２キャパシタ１５ｂに溜める第２期間との和が、変調器４の１周期以内となるように同期されている。これにより、０．５ＭＨｚ以上の周波数で変調されて発生する光電荷を、１素子当たり２つのキャパシタ１５ａ，１５ｂに振り分ける電荷変調を行うことができる。
【００４５】
このように、本発明に係る誘導ラマン散乱顕微鏡１においては、マイクロレンズアレイ１２の採用により生細胞にダメージを与えることが低減される。そして、誘導ラマン散乱効果の利用により、ＣＡＲＳ顕微鏡のような非共鳴バックグラウンドの影響とスペクトルの歪が生じることなく、指紋領域（５００〜１８００ｃｍ−１）での生細胞のイメージングを行うことができる。
【００４６】
また、２次元検出器１５の検出処理を変調器４に同期させることにより、誘導ラマン散乱によって第１パルス光ω１に生じる僅かな強度変調をリアルタイム（３３ｍｓ／１画像）で検出することができる。
【００４７】
４．他の実施形態
図５は入射光を多焦点化するための光学部品の他の例を示す図である。
【００４８】
マイクロレンズアレイ１２で多焦点化された複数のスポットは、当該マイクロレンズアレイ１２を回転させることで走査しているが、これに限定されるものではない。
【００４９】
図５に示すように、回転手段１２ｂ（図２）を設ける代わりに、つまりマイクロレンズアレイ１２を回転させる代わりに、例えば２つのガルバノミラーからなる第１，第２走査ミラー２０ａ，２０ｂを設けて、ミラー８により重ね合わされたパルス光を振ることによって走査させてもよい。この場合、上述のマイクロレンズアレイ１２の代わりに、図５に示すように、複数のマイクロレンズ２２ａを有する矩形状のレンズ２２を採用することができる。なお、第１，第２走査ミラー２０ａ，２０ｂと上記のレンズ２２との間にレンズ２１が設けられる。
【００５０】
また上記では、第２パルス光ω２を変調器４により変調させて、第１パルス光ω１の強度を２次元検出器１５で検出することとしたが、これに限定されるものではなく、第１パルス光ω１を変調器４により変調させて、第２パルス光ω２の強度を２次元検出器１５で検出してもよい。この場合、第１パルス光ω１の光路に変調器４が設けられる。
【００５１】
また、フィルタ１４と２次元検出器１５との間に１又は複数のリレーレンズを設けてもよい。
【００５２】
さらに、上記の誘導ラマン散乱を利用した検出システム１１を内視鏡等の他の機器に応用することもできる。
【００５３】
また、変調をかける代わりに、発振周期が２倍異なるパルス光を用いてもよい。例えば、８０ＭＨｚで発振するレーザ光源と、１６０ＭＨｚで発振するレーザ光源とを同期させれば、８０ＭＨｚで変調したことと同様な効果を奏する。
【００５４】
なお、１６０ＭＨｚで発振するレーザー光源を用いずとも、図６に示すように、ハーフミラー３０，３４とミラー３１,３２とを組み合わせて、８０ＭＨｚで発振するレーザ光源から１６０ＭＨｚで繰り返すパルス光源を作り出すことができる。なお、同図の３３は光強度調整装置である。
【００５５】
また、マイクロレンズアレイ１２を用いるだけでなく、図７に示すように、複数のハーフミラーと複数のミラーとを組み合わせて複数のビームを形成することも可能である。なお図７ではｘ軸方向のみを表しており、ｙ軸方向にも同様な光学系を用いることで、８×８の６４のビームを形成することが可能である。この場合には、上記のような２つのガルバノミラーによって走査することが好ましい。
【００５６】
また、上記のように２台の別のレーザ光源２，３を採用する形態とする場合に限らず、１台のレーザ光源を元に、ＯＰＯ（Optical Parametric Oscillation）等によって波長変換した光を用いても良い。この場合、元にした光と波長変換した光、あるいは波長変換した２つの光を、光学遅延等によって時間的に重ね合わせて用いる。
【００５７】
さらに、上記実施形態では、試料Ｓを透過してきた光を検出するようにしているが、このような透過光に限定されるものではなく、後方に散乱してきた光を検出してもよい。
【００５８】
以上が本発明を実施するための形態であるが、本発明はもとより上記実施形態によって制限を受けるものではなく、本発明の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【符号の説明】
【００５９】
１  誘導ラマン散乱顕微鏡
２  第１レーザ光源
３  第２レーザ光源
４  変調器
５  パルス発生器
６  バランス相互相関器
８  ミラー（合波器）
１１  検出システム
１２  マイクロレンズアレイ
１２ａ  マイクロレンズ
１２ｂ  回転手段
１３  対物レンズ
１４  フィルタ
１５  ２次元検出器
１５ａ  第１キャパシタ
１５ｂ  第２キャパシタ
２０ａ  第１走査ミラー
２０ｂ  第２走査ミラー
ｐｘ  ピクセル
ω１  第１パルス光
ω２  第２パルス光
【図３】
0005831901.tif 000002
【図４】
0005831901.tif 000003
【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
0005831901.tif 000008