(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
指示薬を混合した溶液の計測領域内の一方側から２つの波長の光を照射する光照射ステップと、
前記計測領域内の他方側で、前記照射された２つの波長の透過光及び/又は反射光を受光する光受光ステップと、
前記光受光ステップにより受光された透過光及び/又は反射光に基づき、吸光度を求める吸光度演算ステップと、
前記吸光度演算ステップで演算された２つの波長の吸光度から吸光度比を求める吸光度比演算ステップと、
前記２つの波長の吸光度から求められる吸光度比とｐＨ値との対応関係を示す予め準備された吸光度比−ｐＨ値対応データベースと、前記吸光度比演算ステップで演算された前記吸光度比と、に基づいて前記溶液のｐＨ値を求めるｐＨ値演算ステップと、
を含む溶液ｐＨ計測方法であって、
前記２つの波長の光照射ステップ及び光受光ステップを、前記計測領域の溶液を脈動させながら実行するステップと、
を含むことを特徴とする溶液のｐＨ計測方法。
【請求項２】
前記２つの波長の光のうち一方の波長は４００〜４６０ｎｍであり、他方の波長は５３０〜５８０ｎｍの光である、
ことを特徴とする請求項１に記載の溶液のｐＨ計測方法。
【請求項３】
指示薬を混合した溶液の計測領域内の一方から２つの波長の光を照射する光照射手段と、
前記計測領域内の他方で、前記照射された２つの波長の透過光及び/又は反射光を受光する光受光手段と、
前記計測領域の溶液を脈動させる溶液脈動手段と、
前記溶液脈動手段による前記計測領域の溶液の脈動中に、前記光受光手段により受光された透過光及び/又は反射光に基づき、吸光度を求める吸光度演算手段と、
前記吸光度演算手段で求められた２つの波長の吸光度から吸光度比を求める吸光度比演算手段と、
前記２つの波長の吸光度から求められる吸光度比とｐＨ値との対応関係を示す予め準備された吸光度比−ｐＨ値対応データベースと、前記吸光度比演算手段で演算された前記吸光度比と、に基づいて前記溶液のｐＨ値を求めるｐＨ値演算手段と、
を備えたことを特徴とする溶液のｐＨ計測装置。
【請求項４】
前記溶液脈動手段は、前記２つの波長の光を照射する手段と、光を受光する手段との間に存在する前記計測領域の溶液を脈動させることによって実行される、
ことを特徴とする請求項３に記載の溶液のｐＨ計測装置。
【請求項５】
前記溶液脈動手段は、ペリスターポンプとシリンジポンプと遠心ポンプの何れかによって実行される、
ことを特徴とする請求項３に記載の溶液のｐＨ計測装置。
【請求項６】
前記溶液脈動手段は、人間の脈拍数に相当する周波数で前記計測領域の溶液を脈動させる、
ことを特徴とする請求項３に記載の溶液のｐＨ計測装置。
【請求項７】
前記溶液脈動手段は、ｐＨ計測を行う際にのみ前記計測領域の溶液を脈動させる、
ことを特徴とする請求項３に記載の溶液のｐＨ計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養液のｐＨ計測方法及び細胞培養液のpH計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が生育、増殖を行うためには、その細胞培養液のpHが増殖適合範囲にある必要がある。しかしながら、その細胞培養液の調製または保存中に細胞培養液中に含まれる二酸化炭素が放出され、ｐＨが増大することによって増殖適合範囲から外れることが多い。
このため、通常細胞培養液に含まれるフェノールレッドの色変化を目視にて判断したり、或いはｐＨ電極を細胞培養液中に浸漬して測定するなどの方法により、ｐＨの計測を行っているが、次のような問題点があった。
細胞培養液に含まれたフェノールレッドの色変化を目視にて判断する場合、誤認が起こる。一方、ｐＨ電極を細胞培養液に浸漬する場合、ｐＨ電極が十分滅菌されていない場合には、雑菌等のコンタミネーションが起こる。
【０００３】
上記、目視に伴う誤認や、ｐＨ電極を使用する場合のコンタミネーションのような問題の起こらない細胞培養液のｐＨ測定方法として以下のものが知られている。（特許文献１参照）
【０００４】
そして、特許文献１には以下の記載がなされている。
細胞培養培地、血清および可視光の波長領域で２種以上の吸収ピークを有する指示薬からなる細胞培養液の可視光の吸収からｐＨを測定する細胞培養液のｐＨ測定方法であって、ｐＨが既知である細胞培養液に可視光を透過して得られた吸収ピークの２つの波長における吸光度の対数とｐＨとの直線関係に基づいて、ｐＨが未知である細胞培養液試料で測定された各吸収ピークの吸光度の比の対数の値によりｐＨの値を求めることを特徴とする細胞培養液のｐＨ測定方法を提供する。
【０００５】
さらに、細胞培養培地、血清および可視光の波長領域で２種以上の吸収ピークを有する指示薬からなる細胞培養液の可視光の吸収からｐＨを測定する細胞培養液のｐＨ測定方法であって、ｐＨが既知である細胞培養液に可視光を透過して得られた吸収ピークの２つの波長における吸光度と各吸収ピークのない波長における吸光度との差を求めたものの比の対数とｐＨとの直線関係に基づいて、ｐＨが未知である細胞培養液試料で測定された同様の吸光度の差の比の対数の値によりｐＨの値を求めることを特徴とする細胞培養液のｐＨ測定方法を提供する。
【０００６】
この細胞培養液のｐＨ測定方法は、細胞培養培地、牛胎児などの血清及び指示薬からなる細胞培養液を透明な容器に入れ、該細胞培養液に可視光を照射し、得られる透過スペクトルまたは反射スペクトルからｐＨを算出することを特徴とする。
【０００７】
細胞培養液中には通常細胞に害を与えないような希薄な濃度にてフェノールレッドがｐＨ変化の検出のため含まれているが、このような希薄な濃度においてはフェノールレッドは可視光の範囲において４３０〜４４０nm付近と５６０nm付近に吸収ピークをもち、また４８０nmに等吸収点をもっている。細胞の生育可能なｐＨ領域であるｐＨ６．８〜７．６の範囲では、ｐＨが下がるにつれて４３０〜４４４nm付近の吸収ピークは増大し、５６０nm付近の吸収ピークは減少していく。フェノールレッドのみの吸収が得られれば、この４３０〜４４０nm付近の吸収と５６０nm付近の吸収の比をとると、プロットは１本の曲線上にのり、この２つのピークの比から培養液のｐＨを算出することが可能である。
【０００８】
また、人工授精細胞培養の様な細胞培養を行う場合は、健康な細胞の成長を保証するため環境を調整するための重要な二大パラメータである培養媒体の温度とｐＨとを監視するものとして以下のものが参考例として知られている。（特許文献２参照）
【０００９】
図９に示す参考例の実施形態は、培養皿２０６が載置されたトレイ２０４を有する培養器２０２を備えている。フラスコの様な他の培養容器を使用してもよい。また、培養器は、どの様な大きさ又は構造のものでもよい。各培養皿には、媒体のキュベット２０８と関係付けられたｐＨセンサ及び温度センサが付帯している。センサは、光センサ及びサーモカプルを培養皿の中へと向ける必要無しに、キュベット内の媒体のｐＨと温度、従って培養皿内の媒体のｐＨと温度、の測定を行う。以下、それらユニットを「読み取り器ユニット」と称する。この好適な実施形態では、それら読み取り器ユニットは、発光ダイオード（ＬＥＤ）を光源として使用して光学的にｐＨ測定を行い、サーモカプルを使用して温度測定を行う。
【００１０】
読み取り器ユニットの或る好適な実施形態は、洗浄し滅菌することのできる適したプラスチックで作られているパッケージングで、中身がこぼれないように完全密封されたユニットを備えている。大型の皿又はフラスコを使用した他の細胞培養を行う場合には、監視対象の実際の溶液中にユニットを浸すこともできる。その場合、フェノールレッドが溶液に溶かされていない場合には、固定表示器付オプトードを使用してもよい。読み取り器ユニットは、再充電式でも、十分長期に亘って持続性があるか又は交換可能な電池を有していても、何れでもよい。
【００１１】
読み取り器ユニット２１０は、スレーブ受信機／送信機ユニット２１２に対する無線通信能力を有している。スレーブ受信機／送信機ユニット２１２は、読み取り器ユニットからのデータを記録するデータ自動記録装置１４に無線接続されている。データ自動記録装置２１４は、温度及びｐＨの詳細を表示し保存するコンピュータシステム２１６に対するダウンロード能力を有している。或いは、スレーブ受信機／送信機ユニット２１２は、データ自動記録装置２１４に配線接続されていてもよい。
【００１２】
出来上がったシステムは、モジュール式であり拡張可能である。中央データ自動記録装置は、データの保管庫であり、複数の読み取り器からのデータストリームを収納することができる。データはＰＣにダウンロードすることができ、データをダウンロードし提示するのに適したソフトウェアがシステムの一部を形成している。読み取り器ユニットは、培養器の状態を監視しフィードバックを制御するのに使用できるが、培養容器毎に読み取り器を使用すると、個々の培養容器の履歴を追跡できるようになる。検査や媒体交換などのために容器を培養器の外に出したとき、温度及びｐＨの変動を最も受け易いので、このときが、状況を監視するのに本当に重要な時間である。その様な状況では、読み取り器ユニット２１０ａは無線で直接データ自動記録装置２１４に送信することができる。
【００１３】
培養サイクルの大部分は金属被覆された培養器の内側で経過するので、それらの期間中にユニットからの無線信号を受信するために、スレーブ受信機／送信機を培養器の内側又は外側に置くことができると考えられる。このユニットは、培養器の外側に置かれているメイン自動記録装置ユニットに接続することができ、無線接続でも配線接続でもよい。代わりに、読み取り器ユニットは、データ自動記録装置に配線接続してもよいし、データ自動記録装置が、培養器に挿入されるアンテナを有していてもよい（これにより、スレーブ受信機／送信機ユニットが不要になる）。しかしながら、上記好適な実施形態は、中央データ自動記録装置が複数の培養器（及びその中の複数の皿）からデータを受け取る実施形態なので、培養器毎にスレーブ受信機／送信機ユニットを持たせることによって、より柔軟に対応できるようになる。培養器が、無線信号を通す材料で被覆されている場合は、受信機／送信機も直接自動記録装置ユニットに送信することができる。
【００１４】
従って、培養皿２０６ａが培養器２０２の外側にあるとき、読み取り器ユニット２１０ａは直接データ自動記録装置２１４に送信することができる。
【００１５】
読み取り器ユニットを、個々の容器の履歴を監視するのに使用している場合、読み取り器ユニットは当該容器に付帯させておく必要があり、その場合は、容器と読み取り器ユニットを一緒にあちこち運ぶことができるように、両者を保持するホルダを使用することができる。
【００１６】
好適な実施形態では、読み取り器ユニットはデータを無線で送信する。一方、培養器の内側では、データはスレーブユニットによって受信されることになる。メイン自動記録装置ユニットもデータストリームを探しており、ユニットが培養器の外側にあるときは、スレーブユニットが培養器の金属被覆を通して信号を受信することはないので、メイン自動記録装置ユニットがこのデータストリームを受信する。代わりに、スレーブ受信機／送信機ユニットは、培養器の外側に設置して、アンテナを培養器の内側と外側に設置し、常に信号を受信するようにしてもよい。電力を節約するため、読み取り器ユニットは、培養器内にある間は、データを継続的に送信するのではなく所定の時間間隔で送信してもよい。読み取り器ユニットが一旦培養器の外に出されると、この時は、より急激に変化が起き易いので、読み取り器はより頻繁に送信することができる。読み取り器に培養器の外側にいることを知らせる１つの方法は、フォトダイオードを使用して、周辺光の変化を探ることである。培養器の内側は一般に暗いものである。読み取り器ユニットは、ｐＨ又は温度が許容範囲から逸脱し始めると、容器を培養器内に戻すべきであることを警告する警告表示部を更に有することになる。サイクルが完了し及び／又は皿が長期間外に出されたままになると、ユニットはより緩慢なサンプリングの期間に戻ってもよい。
【００１７】
〔ｐＨ測定原理〕
好適な実施形態では、読み取り器は、光学的測定に３つの波長を使用する（３つより多くを使用してもよい）。それら波長の内の２つは、指示薬の酸と塩基の形態の濃度の比率からｐＨを求めるのに使用されることになる。これは、指示薬の酸と塩基の形態の吸光係数を使用し、２つの波長の吸光の連立方程式を解くことにより求められる。比率を利用することで、測定を、キュベットに添加された指示薬の実際の量に比較的左右されないものにすることができる。装置は、可能な限り低コストにすべきなので、自動ゼロ化の方法を組み込むことが参考例の別の態様である。通常、光学的測定では、試料を測定する前に、試料を空にした状態でゼロレベル測定を行う。空の吸光レベルを、試料の読み取り値から減算すると、試料の正味吸光度が出る。この装置では、第３の波長は、指示薬による吸光性を殆ど示さないように選定され、ゼロレベルの変化を追跡する手段として利用されている。この波長チャネルの吸光レベルに変化があれば、ゼロレベルに変化があったことを示しており、測定に使用される他の２つの波長は、この第３の波長で測定された変化に基づいてゼロ補正することができる。これにより、例えば、異なる壁厚キュベット又は溶液からキュベットの壁の上へ沈積した被覆に起因する、オフセットにより生じる変動が補正されることになる。
【００１８】
ゼロレベルに影響を及ぼすもう１つの要因は、ＬＥＤの温度である。実験は、３つの波長の強度が温度によって変化し、しかも同一絶対量で変化するわけではないことを示している。装置の単純な工場較正は、異なる波長のＬＥＤの間の関係に対する係数を提供している。第３の波長の吸光度レベルに何らかの変化があれは、それは（先に述べたように）オフセットの影響と温度ドリフトに起因することになる。測定された温度を使って熱ドリフト成分を計算することができ、第３の波長のゼロレベルでの変化の残りは、全てオフセットの影響によることになる。次いで、オフセットと温度ドリフトの補正を求め、ｐＨを求めるのに使用される他の２つの波長に適用することができる。
【００１９】
図１０は、参考例による読み取り器ユニットの１つの実施形態を示している。読み取り器ユニット２２０は、読み取り器本体２１と、培養容器２２４を受けて保持するための把持部２２とを有している。把持部は、培養容器を把持し担持できるどの様な好都合な大きさであってもよい。例えば、把持部は、シリコンエラストマーで形成され、３５ｍｍ培養皿を把持し保持できる大きさに作られている。これは、培養皿を読み取り器ユニットと共に移送できるようにし、培養器の外側でも監視作業を続行できるようにする。
【００２０】
読み取り器本体２２１は、上で述べたように培養皿の中ものと同じ流体の試料を担持するキュベット２２８のための陥凹部２２６を含んでいる。
【００２１】
図１１に示すように、読み取り器本体内には、上で述べたように異なる周波数の３つ又はそれ以上のＬＥＤから成るＬＥＤ光源配列２３０が、光がスロット２２６を横切りＬＥＤ受光部アッセンブリ２３６に進むように、光導部２３２に向けられている。ＬＥＤ受光部アッセンブリ２３６は、ＬＥＤ光源配列の各周波数毎に受光器を含んでいる。電子回路２３８は、様々な読み取り値を処理し、電池２３９（電子回路の下にあり点線で図示）は、読み取り器ユニットを内蔵型にしている。光源２３０に隣接して、送光中のＬＥＤアッセンブリ２３０のドリフトを測定し補正する第２ＬＥＤ受光器２４０が設けられている。電子回路に付帯している空中線２４２は、読み取り値を、培養器内のデータ自動記録装置又は培養器外側の監視装置に送る。読み取り器ユニットは、更に、温度を測定するためサーモカプル２４４を含んでおり、電子回路２３８は、ｐＨデータの他に温度データも送信することができる。
【００２２】
図１０及び図１１に示す読み取り器ユニットの或るバージョンは、把持部無しに供給してもよい。その様な装置は、培養器室全体を監視するのに使用することができ、警告装置として機能し、ｐＨ又は温度が所定の限界を外れると警報を発する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】特公平０６−３４７５４号公報
【特許文献２】特表２００９−５３３０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
上述の如く、従来のｐＨの光学的測定では、試料を測定する前に、試料を空にした状態でゼロレベル測定を行い、空の吸光レベルを、試料の読み取り値から減算すると、試料の正味吸光度が得られる。第３の波長として指示薬による吸光性を殆ど示さない波長(700nm)付近を選定して、ゼロレベルの変化を追跡する手段として利用されている。この波長チャネルの吸光レベルに変化があれば、ゼロレベルに変化があったことを示すので、測定に使用される他の２つの波長を、この第３の波長で測定された変化に基づいてゼロ補正する必要があった。
【００２５】
本発明の課題（目的）は、指示薬による吸光性を殆ど示さない700nm付近の波長によるゼロレベルの補正の必要の無い溶液のｐＨ測定方法及び細胞培養液のpH測定装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記課題を達成する本発明の溶液のｐＨ計測方法は、指示薬を混合した溶液の計測領域内の一方側から２つの波長の光を照射する光照射ステップと、前記計測領域内の他方側で、前記照射された２つの波長の透過光を受光する光受光ステップと、前記光受光ステップにより受光された透過光及び/又は反射光に基づき吸光度を求める吸光度演算ステップと、前記吸光度演算ステップで演算された２つの波長の吸光度から吸光度比を求める吸光度比演算ステップと、前記吸光度比と予め格納された吸光度比−ｐＨ値対応データベースに基づいて前記溶液のｐＨ値をｐＨ値演算ステップとを含む溶液ｐH計測方法であって、
前記２つの波長の光照射ステップ及び光受光ステップを、前記計測領域の溶液を脈動させながら実行するステップとを含むことを特徴とする。
【００２７】
また、前記２つの波長の光のうち一方の波長は４００〜４６０ｎｍであり、他方の波長は５３０〜５８０ｎｍの光であることを特徴とする。
好ましくは、一方の波長は４２０〜４６０ｎｍであり、他方の波長は５４０〜５８０ｎｍの光である。
【００２８】
上記課題を達成する本発明の溶液のｐＨ計測装置は、指示薬を混合した溶液の計測領域内の一方から２つの波長の光を照射する光照射手段と、前記計測領域内の他方で、前記照射された２つの波長の透過光及び/又は反射光を受光する光受光手段と、前記２つの波長の光照射部及び光受光部との間の前記計測領域の溶液を脈動させる溶液脈動手段と、前記溶液脈動手段による溶液の脈動中に、前記光受光手段により受光された透過光及び/又は反射光に基づき吸光度を求める吸光度演算手段と、前記吸光度演算ステップで演算された２つの波長の吸光度から吸光度比を求める吸光度比演算手段と、前記吸光度比と予め格納された吸光度比−ｐＨ値対応データベースに基づいて前記溶液のｐＨ値をｐＨ値演算手段とを備えたことを特徴とする。
【００２９】
また、前記溶液脈動手段は、前記２つの波長の光を照射する手段と、光を受光する手段との間に存在する溶液を脈動させることによって実行されることを特徴とする。
【００３０】
また、前記溶液脈動手段は、前記溶液の計測領域の前又は後に配置されたペリスターポンプとシリンジポンプと遠心ポンプの何れかによって実行されることを特徴とする。
【００３１】
また、前記溶液脈動手段は、脈動が検出できる周波数で脈動させることを特徴とする。
また、前記溶液脈動手段は、ｐＨ計測を行う際にのみ脈動させることを特徴とする。
また、前記溶液脈動手段は、前記２つの波長の光を照射する手段と光を受光する手段との間の距離を変動させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の溶液のｐＨ測定方法、溶液のｐＨ測定装置及びｐＨ計測機能付き培養皿によれば、指示薬による吸光性を殆ど示さない700nm付近の波長によるゼロレベルの補正の必要の無い溶液のｐＨ測定方法、溶液のｐＨ測定装置及びｐＨ計測機能付き培養皿を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の溶液のｐH計測装置の基本的なブロック図である。
【図２】本発明の溶液のｐH計測装置による溶液のｐＨの測定の手順を示すフローチャートである。
【図３】波長３００〜７００ｎｍにおけるフェノールレッドの吸光度をｐＨ６．４５〜ｐＨ８．２５毎に示した図である。
【図４】吸光度比（Ａ５５８）／（Ａ４３０）とｐＨとの関係を示した図である。
【図５】吸光度比log（Ａ５５８）／（Ａ４３０）とｐＨとの関係を示した図である。
【図６】溶液脈動手段の具体例であるペリスタポンプを説明する図である。
【図７】図６のペリスタポンプの吐出量の変化を示す図である。
【図８】本発明の溶液のｐH計測装置を培養器に載置される具体的なｐＨ計測装置付き培養皿に適用した例を示す図である。
【図９】従来の培養皿が載置されたトレイを有する培養器を説明するための図である。
【図１０】従来の読み取り器ユニットの説明をするための図である。
【図１１】従来の読み取り器ユニット構成を説明をするための図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
先ず、本発明の溶液のｐH計測装置の前提となるｐＨ指示薬としてフェノールレッドを用いた２波長によるｐＨ測定の原理について説明する。
【００３５】
図３は、波長３００〜７００ｎｍにおけるフェノールレッドの吸光度をｐＨ６．４５〜ｐＨ８．２５毎に示したものである。
図３に示す如く、波長４３０ｎｍ及び５５８ｎｍ付近にピークが存在し、波長７００ｎｍ付近では吸光度がほぼゼロである。
【００３６】
散乱がないと仮定すると、ランベルト・ベールの法則から、
【００３７】
【数１】
0005797911.tif 000002
【００３８】
よって、吸光度比は、
【００３９】
【数２】
0005797911.tif 000003
【００４０】
吸光度比（Ａ５５８）／（Ａ４３０）とｐＨとの関係は図４に示す関係となる。
吸光度比log（Ａ５５８）／（Ａ４３０）とｐＨとの関係は図５に示す関係となる。
吸光度比log（Ａ５５８）／（Ａ４３０）の場合は、ｐＨとの関係がほぼ直線に近似した関係となる。
【００４１】
基準（吸光度ゼロ）となる波長７００ｎｍにおけるゼロレベル補正をした場合には、波長５５８ｎｍと波長４３０ｎｍとの吸光度比は、フェノールレッドの濃度及び光路長が変化しても変化しない。
【００４２】
次に、図１〜２を用いて本発明の溶液のｐH計測装置及びｐＨ測定方法の説明をする。
図１は、本発明の溶液のｐH計測装置の基本的なブロック図である。
異なる波長の光を発光する発光素子（LED）１、２は、電池４より供給される電力で交互に発光するように駆動回路３により駆動される。
ここでは、発光素子１、２に採用する光としてそれぞれ吸光度のピークを示す４３０[nm]及び５５８[nm]）を採用するが、これに限られない。具体的にはいずれか一方が４００ｎｍ〜４６０ｎｍの間（好ましくは４２０ｎｍ〜４４０ｎｍの間）に吸光度のピークを示し、いずれか他方が５３０ｎｍ〜５８０ｎｍの間（好ましくは５４０ｎｍ〜５８０ｎｍの間）に吸光度のピークを示すのが望ましい。
【００４３】
これらの発光素子１、２から照射された光はｐＨの測定溶液５を透過して受光素子であるフォトダイオード６で受光して電気信号に変換される。
なお、図１では受光素子を１個で構成しているが、２個の発光素子に対向して２個の受光素子を設けても良い。
なお、反射光を受光するようにしてもよい。
そして、これらの変換された信号は増幅器６で増幅され、マルチプレクサ８によりそれぞれの光波長に対応したフィルタ９−１、９−２に振り分けられる。
各フィルターに振り分けられた信号はフィルタ９−１、９−２によりフィルタリングされてノイズ成分が低減され、図示しないＡ／Ｄ変換器によりデジタル化されて処理部（ＣＰＵ）１０に入力される。
【００４４】
溶液脈動手段１１は、前記２つの波長の光を照射する手段と、光を受光する手段との間の距離（図ではｐＨ測定容器内の被測定溶液）を物理的に脈動させるための手段である。
【００４５】
次に、図１の本発明の溶液のｐH計測装置による溶液のｐＨの測定を図２のフローチャートを用いて説明する。
・指示薬（フェノールレッド）を混合した溶液５の計測領域の溶液を溶液脈動手段１１によって脈動させる。（ステップS1）
・前記溶液５の計測領域内の一方側に配置された発光素子（LED）を交互に駆動して２つの波長（４３０ｎｍ，５５８ｎｍ）の光を照射する。（ステップS2）
・前記計測領域内の他方側に配置した受光素子（PD）で、前記溶液５を透過した透過光を受光する。（ステップS3）
・前記溶液脈動手段１１による前記溶液５の脈動により生じる透過光の変動から吸光度を求める。（ステップS4）
・前記吸光度演算ステップで演算された２つの波長の吸光度から吸光度比を求める。（ステップS5）
・前記吸光度比と予め格納された吸光度比−ｐＨ値対応データベースに基づいて前記溶液のｐＨ値を求める。（ステップS6）
【００４６】
次に、溶液脈動手段１１の具体的な例として公知のペリスタポンプ（特開２００４−９２５３７号公報参照）を図６を用いて説明する。
ペリスタポンプ吐出量制御装置１は、ハウジング１１１を有しており、ハウジング１１１内には、ロータ１２０と、複数個のローラ１２１と、チューブ１３０と、制御部１４０と、センサ１４１とが設けられており、ハウジング１１１とロータ１２０と複数のローラ１２１とチューブ１３０とによってペリスタポンプが構成されている。また、ハウジング１１１には、図示せぬモータケースが接続されており、図示せぬモーターケース内にはモータ１５０が設けられている。
また、制御部１４０には、当該ペリスタポンプのユーザが操作可能な位置に設けられた図示せぬ入力部が接続されており、ペリスタポンプ１１０によってこれから吐出しようとする所望の吐出量を、ユーザが入力部から入力することができるように構成されている。
【００４７】
ロータ１２０は、略円盤状をしており、ハウジング１１１によってその軸を中心として回転可能に支持されている。ロータ１２０上の円周近傍の位置には４つのローラ１２１が設けられており、これらは、軸心を中心として回転可能にロータ１２０に支持されている。４つのローラ１２１の回転軸は、ロータ１２０の回転軸と同軸的な同一円周上に位置しており、ロータ１２０の回転軸と平行の位置関係にある。また、４つのローラ１２１の回転軸は、当該同一円周上において周方向に等間隔に配置されている。ローラ１２１の周面は、ロータ１２０の円周よりもロータ１２０の半径方向外方へ突出した状態となっている。
【００４８】
ハウジング１１１の一部であってロータ１２０の円周の一部に対向する位置には、円弧状壁部１１２が設けられている。円弧状壁部１１２はロータ１２０の円周に沿って略半円状に設けられており、円弧の中心の位置はロータ１２０の回転軸と一致する。円弧状壁部１１２は、図６においてロータ１２０の上半分を覆うように設けられており、４つのローラ１２１が、図６に示されているように上下左右に位置しているときには、上、左、右の３つのローラ１２１が円弧状壁部１１２に対向し、円弧状壁部１１２の２つの端部１１２Ａ、１１２Ａは左右のローラ１２１に対向する位置関係となる。
【００４９】
ロータ１２０の円周よりもロータ１２０の半径方向外方へ突出しているローラ１２１の周面と円弧状壁部１１２との間は所定の距離を隔て離間しており、そこにはチューブ１３０が配設されている。チューブ１３０は、その半径方向に弾性変形可能であり、ロータ１２０の円周に沿って配置されており、ロータ１２０を取巻いた状態でハウジング１１１に対して移動不能となっている。ローラ１２１の周面と円弧状壁部１１２との間の距離は、弾性変形されていない状態のチューブ１３０の外径よりも小さい。このため、チューブ１３０は、ロータ１２０の円周よりもロータ１２０の半径方向外方へ突出しているローラ１２１の周面と円弧状壁部１２とによって挟まれて、半径方向に押潰された状態となっている。一方、チューブ１３０の、ローラ１２１の周面と円弧状壁部１１２とによって挟まれていない部分は弾性変形されていない。ロータ１２０の回転により、ローラ１２１の周面と円弧状壁部１１２との対向位置が変化し、チューブ１３０の、ローラ１２１と円弧状外壁部とによって押潰されている部分の位置が変化することによって、チューブ１３０内の流体がチューブ１３０から押出されて、チューブ１３０に接続されている図示せぬ分注装置へ、流体たる試薬等が吐出されるように構成されている。
【００５０】
ロータ１２０はモータ１５０に駆動連結されており、モータ１５０と同一回転量となるように直結されている。４つのローラ１２１は、ロータ１２０の回転に伴い回転しながら回動（ロータ１２０の軸心を中心として公転）する。モータ１５０は、より具体的にはステッピングモータであり、制御部１４０に接続されている。制御部１４０は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）１４２と、ＲＡＭ及びＲＯＭからなるメモリ１４３と、ドライバ１４４とを有しており、ＣＰＵ１４２はドライバ１４４を介してモータ１５０の回転速度及び回転角度を制御する。また、ＣＰＵ１４２はエンコーダによって構成されるセンサ１４１に接続されており、センサ１４１を介してＣＰＵ１４２は、常時ローラ１２１の回動位置を把握するように構成されている。メモリ１４２のＲＯＭには、図７に示されるような、ロータ１２０上におけるローラ１２１の回動位置に固有の吐出量のデータが記憶されている。ペリスタポンプ１１０が所望の量の吐出を行うときには、センサ１４１によって検知されたロ一ラ１２１の回動位置と、メモリ１４３のＲＯＭに記憶されている吐出量のデータとに基づいて、所望の吐出量に必要なロータ１２０の回転角度をＣＰＵ１４２が計算して、ロータ１２０の当該回転角度に対応するモータ回転角度を制御するように構成されている。センサ１４１、メモリ１４３、及びＣＰＵ１４２は、ロータ回転角度制御手段に相当する。
【００５１】
ここで、図７のグラフに示される、ペリスタポンプ１１０で生ずる脈流について説明する。図７のグラフにおいて、ロータ回転角度０°とは、図６に示されるように４つのローラ１２１が図６の上下左右に位置している状態を示している。なお、この位置を原点位置とする。この状態からモータ１５０を駆動させてロータ１２０を微小角度回転させ続けたときの、各微小角度におけるそれぞれの吐出量を測定し、ロータ１２０が１回転するまで、即ち、４つのローラ１２１がそれぞれ元の位置に戻るまで、順次吐出量をプロットしていった値が図７のグラフに示されている。図７に示される４周期の山はローラ１２１の数に関係がある。即ち、図６においてロータ１２０が右に９０度回転して、図６の上の位置にあるローラ１２１が右の位置へと回動してゆくと、図７においてロータ回転角度が０〜９０°の間に示されているような山が一つ生成される。同様に、ロータ１２０が更に右に９０度回転して、図６の右の位置にあるローラ１２１が下の位置へと回動してゆくと、図７においてロータ回転角度が９０〜１８０°の間に示されているような山が一つ生成される。図７のロータ回転角度が１８０〜２７０°、２７０〜３６０°の間についても同様にして山がそれぞれ生成され、ロータ１２０が１回転する間に４つの山が生成される。即ち、山の数はローラの数に対応する。
【００５２】
図７の如く吐出量を脈動させることが可能なペリスタポンプによって、図６の２つの波長の光を照射する手段と、光を受光する手段との間の距離（図ではｐＨ測定容器内の被測定溶液）を物理的に脈動させる。
【００５３】
なお、本実施例において、溶液脈動手段１１としてペリスタポンプを挙げたが、これに限られるものではなく、例えばシリンジポンプや遠心ポンプなど溶液を脈動できればいかなる態様でもよい。
【００５４】
また、本実施例におけるチューブにｐＨ計測部（発光素子と受光素子）は取り付けられてもよい。その際、チューブはペリスタポンプなどの脈動流に伴い変位できる程度の剛性であり、さらに光が透過できるように透明ないしは半透明であるのが望ましい。
【００５５】
また、溶液脈動手段１１による脈動は、常時行われる必要は無く、ｐＨ計測の際にのみ脈動をさせればよく、さらに、脈動を検出できる所定の周波数（例えば人間の脈拍数など）で脈動させることが望ましい。
【００５６】
図６において、図７の如き吐出量を脈動させることが可能な手段であるペリスタポンプによって、図６の２つの波長の光を照射する手段と、光を受光する手段との間の距離（図ではｐＨ測定容器内の被測定溶液）を物理的に脈動させた場合には以下の如くなる。
散乱がないと仮定すると、ランベルト・ベールの法則から、
【００５７】
【数３】
0005797911.tif 000004
【００５８】
よって、吸光度比は、
【００５９】
【数４】
0005797911.tif 000005
【００６０】
上記の如く、本発明のｐＨ測定装置（方法）によれば、指示薬による吸光性を殆ど示さない700nm付近の波長によるゼロレベルの補正無しに、事前に求めたｐHと吸光係数比の関係からｐHを算出することが可能である。
【００６１】
次に、図１の本発明の溶液のｐH計測装置の基本的なブロック図の構成を、培養器に載置される具体的なｐＨ計測装置付き培養皿に適用した例を図８を用いて説明する。
異なる波長の光を発光する発光素子（LED）１、２は、電池４より供給される電力で交互に発光するように駆動回路３により駆動される。
図８のｐＨ測定装置付き培養皿は、培養皿ＢとｐＨ計測装置Ａとで構成され、ｐＨ測定装置Ａが培養皿のｐＨ測定溶液エリアを前記発光素子(LED)と受光素子（PD）とで挟む様に挿入可能な別体で構成されている。
培養皿Ｂ内の指示薬を混入した測定溶液の少なくとも一部が前記ｐＨ測定溶液エリアに流入可能に形成されている。
発光素子１、２に採用する光はそれぞれ吸光度のピークを示す４３０[nm]及び５５８[nm]）を採用する。
【００６２】
これらの発光素子１、２から照射された光はｐＨの測定溶液配置部５を透過して受光素子であるフォトダイオード（PD）６で受光して電気信号に変換される。
そして、これらの変換された信号は増幅器７で図示しない、マルチプレクサ及びフィルタを介して、増幅した後マルチプレクサによりそれぞれの光波長に対応したフィルタによりノイズ成分が低減され、図示しないＡ／Ｄ変換器によりデジタル化されて処理部（CPU）１０に入力される。
【００６３】
１１は溶液脈動手段であって、前記２つの波長の光を照射する手段と、光を受光する手段との間の距離（図ではｐＨ測定容器内の被測定溶液）を物理的に脈動させるための手段である。
この溶液脈動手段としては、上述のペリスタポンプよりは、受光素子（PD）又は発光素子（LED）と並置された周期的に押圧して発光手段と受光手段との間の距離（図ではｐＨ測定容器内の被測定溶液）を物理的に脈動させるものが適している。
【符号の説明】
【００６４】
１：発光素子（LED）（430nm）
２：発光素子（LED）（558nm）
３：LED駆動回路
４：電池
５：ｐH測定溶液エリア
６：受光素子（PD）
７：増幅器（マルチプレクサ，フィルタ）
８：マルチプレクサ
9-1，9-2：フィルタ
１０：処理部（CPU）
１１：溶液脈動手段
１２：データ（ｐH測定値等）伝送部
１３：ＲＦＩＤ（温度測定機能付き）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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