(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対照ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークの活性と比べて低下された活性を有するヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークであって、
前記活性の低下が
（ｉ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御であって、前記ＳＮＦ１α−サブユニットが配列番号２７の配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、前記下方制御、
（ii）前記ＳＮＦ１α−サブユニットの制御ドメインをコードするポリヌクレオチドの上方制御であって、前記ＳＮＦ１α−サブユニットの制御ドメインが配列番号２６の＋８３５から＋１７４０のヌクレオチドによってコードされる、前記上方制御、または、
（iii）配列番号２７と少なくとも95％の配列同一性を有する触媒的に不活性なＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの上方制御、
による、
前記低下された活性を有するヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークを含み、
（ｂ）対照ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞の総脂質含量と比べたときの総脂質含量が増大した、
遺伝子導入ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞。
【請求項２】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークの活性の低下がヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御による、請求項１記載の遺伝子導入ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞。
【請求項３】
ＳＮＦ１α−サブユニットが配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１または２記載の遺伝子導入ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞。
【請求項４】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークの活性の低下が触媒的に不活性なＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの上方制御による、請求項１記載の遺伝子導入ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／０９３００７号の利益を主張し、その開示は参照によってその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、バイオテクノロジーの分野である。より具体的には、本発明は、遺伝子発現の包括的制御因子であるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下に基づいて、油性生物の脂質画分内の含油量を操作するために有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
包括的制御システムはゲノム全体にわたって位置する多数の遺伝子の発現を調節して、生物の全体的な生理状態、代謝状態および発生状態が、急速に、そして時には劇的に環境の変化に応答できるようにする。「包括的制御因子」という用語は、その産物が細胞状態に広範囲の影響を与える比較的少数の遺伝子を表す。これらの制御因子の１つの機能は、これらによってその発現が影響される遺伝子のエンハンサーまたはサイレンサーなどのプロモーター要素と結合する産物をコードすることであり、その他の制御因子は、カスケードシリーズ（ｃａｓｃａｄｉｎｇ  ｓｅｒｉｅｓ）の細胞反応を活性化または不活性化することによって機能する。これらの制御因子を用いて微生物株において強力な制御システムを作り出す可能性は、今やっと認識され始めたところである。
【０００４】
多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］に関連する健康上の利益は、文書で十分に証明されている。結果として、多くの研究が、１）従属栄養珪藻類のキクロテラ種（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）およびニッチア種（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）種、ピシウム属（ｇｅｎｕｓ  Ｐｙｔｈｉｕｍ）、またはモルチエレラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（ｅｘｉｇｕａ）もしくはＭ．ヒグロフィラ（ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）の糸状菌などの、選択された脂肪酸を天然に産生する微生物の培養による、ならびに２）脂肪酸の合成を可能にする脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ）遺伝子の発見と、それに続く、ω−３／ω−６ＰＵＦＡを天然には産生しない生物への遺伝子操作法を用いたこれらの遺伝子の導入とによる、大量のＰＵＦＡの産生に向けられている。しかしながら、好ましいω−３／ω−６ＰＵＦＡの産生が限定されているため、そして／あるいは油の収率を実質的に改善する／産生される油組成の特徴を調節することができないために、この研究の商業的開発は限られている。
【０００５】
共同所有される米国特許第７，２３８，４８２号明細書には、ＰＵＦＡの産生のための産生宿主として、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の使用が記載されている。油性酵母は、油の合成および蓄積（典型的には、細胞乾燥質量の２５％よりも多い）が天然に可能な酵母であると定義される。産生宿主の最適化は当該技術分野において記載されている（例えば、国際公開第２００６／０３３７２３号パンフレット、米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６号明細書および米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書を参照）。そこに記載される組換え株は、異種デサチュラーゼおよびエロンガーゼの多数のコピーを発現する種々のキメラ遺伝子を含み、そして場合により、ＰＵＦＡの合成および蓄積を可能にするために種々の天然デサチュラーゼ、アシルトランスフェラーゼおよびペルオキシソームバイオジェネシスタンパク質のノックアウトを含んでいてもよい。
【０００６】
ＰＵＦＡの商業的な生産のためには、宿主細胞のさらなる最適化が必要とされる。本発明者らは、油性の増殖段階から脂質生合成の工程を切り離し得る、油性生物中の包括的制御因子を同定することに関心があった。このような制御要素は、他の点では正常またはほぼ正常な発生および増殖が可能である株を提供しながら、二次代謝産物遺伝子の活性化および／または抑制に対して広い特異性を有し得るので極めて望ましいであろう。
【０００７】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における脂質の蓄積の増大をもたらすことが分かった。ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークに関するこれまでの多数の研究にもかかわらず、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの細胞内の役割およびその制御に関する多くの詳細はまだ完全には理解されておらず、依然として解明されていない。またＳＮＦ１ノックアウトのこれまでの研究は、油性生物では行われていない。ＡＭＰＫ／ＳＮＦ１キナーゼファミリーは真核生物を通して高度に保存され、細胞エネルギー恒常性の維持に必要であるが、その特異的な制御モードは、異なる生物の間では異なり得る。
【０００８】
これは、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下が、脂質生合成の増大という驚くべき発見を導き、構成的な油性（ｏｌｅａｇｉｎｙ）がもたらされる汎用メカニズムの最初の発見であると思われる。
【発明の概要】
【０００９】
第１の実施形態では、本発明は、
（ａ）非遺伝子導入油性真核宿主細胞のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性と比べて低下された活性を有するヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼと、
（ｂ）活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む非遺伝子導入油性真核宿主細胞の総脂質含量と比べたときの総脂質含量の増大、
とを含む、遺伝子導入油性真核宿主細胞に関する。
【００１０】
第２の実施形態では、本発明は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下および総脂質含量の増大が、
（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質の変更、
（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの変更、および
（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質の変更、
からなる群から選択される改変によるものである、本明細書に記載されるような遺伝子導入油性真核宿主細胞に関する。
【００１１】
第３の実施形態では、本発明は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下および総脂質含量の増大が、
（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｓａｋ１およびＴｏｓ３からなる群から選択されるキナーゼである上流制御タンパク質の下方制御と、
（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、ヘキソキナーゼアイソザイム２（Ｈｘｋ２）からなるヘキソキナーゼである上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｄ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｒｅｇ１およびＧｌｃ７からなる群から選択されるＲｅｇ１−Ｇｌｃ７タンパク質−ホスファターゼ１複合体のタンパク質である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｅ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｆ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの制御ドメインの上方制御と、
（ｇ）触媒的に不活性なＳｎｆ１α−サブユニットの上方制御と、
（ｈ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの、Ｇａｌ８３からなるＳＮＦ１β−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｉ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１γ−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｊ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、Ｒｍｅ１およびＭｈｙ１からなる群から選択される亜鉛−フィンガータンパク質である下流タンパク質の上方制御と、
（ｋ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、ミクロソームチトクロムｂ５レダクターゼ（Ｃｂｒ１）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｌ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、グルコーストランスポーター（Ｓｎｆ３）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｍ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるリン酸化によって制御され、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるタンパク質である下流タンパク質の、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによってリン酸化することができない突然変異体の上方制御と
からなる群から選択される改変によるものである、本発明の遺伝子導入油性真核宿主細胞に関する。
【００１２】
第４の実施形態では、本発明は、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのα−サブユニットをコードするポリヌクレオチドが、
ａ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ＢＬＡＳＴＰアライメント法に基づいて、配列番号２、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＢＬＡＳＴＮアライメント法に基づいて、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比べて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェント条件でハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補配列（相補配列およびヌクレオチド配列は同じ数のヌクレオチドからなり、１００％相補的である）
を含む単離Ｓｎｆ１ヌクレオチド分子を含む、本明細書に記載されるような油性真核宿主細胞に関する。
【００１３】
第５の実施形態では、本発明は、油性真核宿主細胞が、藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイルおよび酵母からなる群から選択される、本明細書に記載されるような遺伝子導入油性真核宿主細胞を含む。特に、前記酵母は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される。好ましい酵母はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【００１４】
また、本発明の遺伝子導入油性真核宿主細胞から得られる油または脂質も本発明の範囲内に入る。
【００１５】
第６の実施形態では、本発明は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む油性真核宿主細胞の総脂質含量を増大させる方法に関し、前記方法は、
（ａ）油性真核宿主細胞を形質転換し、それによりヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性が、非形質転換油性真核宿主細胞中のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性のレベルと比べて低下されることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換細胞を適切な条件下で増殖させ、それにより、総脂質含量が、活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを有する非形質転換油性真核宿主細胞から得られる総脂質含量と比べて増大されることと、
（ｃ）場合により、ステップ（ｂ）の細胞から油または脂質を回収してもよいこと、
とを含む。
【００１６】
第７の実施形態では、本発明は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを有する油性真核宿主細胞が、
（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質の変更、
（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの変更、および
（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質の変更、
からなる群から選択される改変によって形質転換される方法に関する。
【００１７】
第８の実施形態では、本発明は、改変が、
（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｓａｋ１およびＴｏｓ３からなる群から選択されるキナーゼである上流制御タンパク質の下方制御と、
（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、ヘキソキナーゼアイソザイム２（Ｈｘｋ２）からなるヘキソキナーゼである上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｄ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｒｅｇ１およびＧｌｃ７からなる群から選択されるＲｅｇ１−Ｇｌｃ７タンパク質−ホスファターゼ１複合体のタンパク質である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｅ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｆ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの制御ドメインの上方制御と、
（ｇ）触媒的に不活性なＳｎｆ１α−サブユニットの上方制御と、
（ｈ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの、Ｇａｌ８３からなるＳＮＦ１β−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｉ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１γ−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｊ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、Ｒｍｅ１およびＭｈｙ１からなる群から選択される亜鉛−フィンガータンパク質である下流タンパク質の上方制御と、
（ｋ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、ミクロソームチトクロムｂ5レダクターゼ（Ｃｂｒ１）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｌ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、グルコーストランスポーター（Ｓｎｆ３）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｍ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるリン酸化によって制御され、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるタンパク質である下流タンパク質の、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによってリン酸化することができない突然変異体の上方制御、
からなる群から選択される方法に関する。
【００１８】
第９の実施形態では、本発明は、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドが、
ａ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ＢＬＡＳＴＰアライメント法に基づいて、配列番号２、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＢＬＡＳＴＮアライメント法に基づいて、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比べて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補配列（相補配列およびヌクレオチド配列は同じ数のヌクレオチドからなり、１００％相補的である）、
を含む単離ヌクレオチド分子を含む方法に関する。
【００１９】
油性真核宿主細胞は、藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイルおよび酵母からなる群から選択することができる。好ましくは、前記酵母は、ヤロウイア属、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属およびリポマイセス属からなる群から選択される。最も好ましくは、酵母はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【００２０】
第１０の実施形態では、本発明は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む油性真核宿主細胞から得られる微生物油中の総多価不飽和脂肪酸含量を増大させるための方法に関し、前記方法は、
（ａ）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする単離ポリヌクレオチドで油性真核宿主細胞を形質転換し、非形質転換油性真核宿主細胞中のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性のレベルと比べて、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性も低下されることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換細胞を適切な条件下で増殖させ、それにより、総脂質含量が、活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを有する非形質転換油性真核宿主細胞から得られる総脂質含量と比べて増大されることと、
（ｃ）場合により、ステップ（ｂ）の細胞から油または脂質を回収してもよいこと、
とを含む。
【００２１】
第１１の実施形態では、本発明は、機能性多価不飽和脂肪酸をコードする遺伝子が、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼからなる群から選択され、そしてヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下が、
（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質の変更、
（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの変更、および
（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質の変更、
からなる群から選択される改変によるものである、本明細書に記載されるような方法に関する。
【００２２】
さらに、多価不飽和脂肪酸は、ω−３脂肪酸またはω−６脂肪酸であり得る。
【００２３】
生物寄託
以下の生物材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、以下の名称、受入番号および寄託日を有する。
【００２４】
0005656836.tif 000002
【００２５】
上記の生物材料は、特許手続きの目的のための微生物寄託の国際的承認（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に関するブダペスト条約の条件下で寄託された。記載される寄託物は、表示された国際寄託機関に少なくとも３０年間保持され、それを開示する特許の付与の際に一般に公開されるであろう。寄託物の利用可能性は、政府の行為によって付与された特許権を逸脱して主題の発明を実施するための認可を与えるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】キナーゼに影響を及ぼす上流制御タンパク質と共に、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ（その不活性および活性形態における）の略図である。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂはω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を説明するものであり、以下のこの経路の説明を考える際に一緒に見るべきである。
【図３】ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４（全脂質画分中に３０．７％よりも多いＥＰＡを産生する）および株Ｙ４１８４Ｕの発生を図示する。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、一緒に見たときに、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（配列番号２７）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１３９７１、配列番号２）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８７９７５、配列番号１７）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ７８１２９、配列番号２１）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０２４５３５、配列番号２３）およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ７８１３０、配列番号２５）のＳｎｆ１α−サブユニットタンパク質のアライメントを示す。
【図５】以下の：（Ａ）ｐＹＰＳ１６１および（Ｂ）ｐＹＲＨ１０のプラスミドマップを提供する。
【図６】ｐＹＲＨ１８のプラスミドマップを提供する。
【図７】図７Ａは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２対Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）株、ＲＨＹ１１において、ＤＣＷの割合としての脂質含量（すなわち、脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］）を比較する時間経過実験の結果のグラフ表示である。同様に、図７Ｂは、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株（すなわち、株Ｃｏｎｔ−４）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株、ＲＨＹ４６において、ＤＣＷの割合としての脂質含量を比較する時間経過実験の結果のグラフ表示である。
【図８】以下の：（Ａ）ｐＹＲＨ４４および（Ｂ）ｐＺＵＦｍＥａＤ５Ｓのプラスミドマップを提供する。
【図９】ｐＹＲＨ４７のプラスミドマップを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、以下の詳細な説明および添付の配列の説明（本出願の一部を形成する）からより完全に理解することができる。
【００２８】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列規則」）に適合し、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および属書Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で規定される規則に適合する。
【００２９】
配列番号１〜１９１は、表１で同定されるように、遺伝子もしくはタンパク質（またはその一部）、プライマーまたはプラスミドをコードするＯＲＦである。
【００３０】
表１：核酸およびタンパク質の配列番号の概要
【表１】
0005656836.tif 000003
0005656836.tif 000004
0005656836.tif 000005
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0005656836.tif 000007
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【００３１】
本明細書で援用される特許および非特許文献は全て、参照によってその全体が「本明細書に援用される。
【００３２】
以下の定義が規定される。
「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と略される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「ＰＣＲ」と略される。
「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は、「ＡＴＣＣ」と略される。
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略される。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略される。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略される。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略される。
「乾燥細胞質量」は、「ＤＣＷ」と略される。
【００３３】
本明細書で使用される「発明」または「本発明」という用語は、本発明のいずれか１つの特定の実施形態に限定することは意図されないが、特許請求の範囲および明細書に記載されるように、本発明のどの全ての実施形態にも広く当てはまる。
【００３４】
「包括的制御因子」という用語は、その産物が細胞状態に広範囲の影響を与える比較的少数の遺伝子を指す。真核生物中のこのような制御因子ファミリーの１つは、高度に保存されたタンパク質キナーゼのＳＮＦ１−ＡＭＰＫファミリーであり、エネルギー恒常性を維持するために必要である（すなわち、哺乳類、植物および真菌の細胞ＡＭＰ：ＡＴＰ比に応答して、異化対同化エネルギー過程を制御することによる）。このファミリーは、哺乳類のＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）と、酵母／真菌のＳＮＦ１タンパク質キナーゼ（最初に、スクロースを利用することができない［すなわち、スクロース非発酵性（ｓｕｃｒｏｓｅ−ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ）］サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異体の探索においてｓｎｆ１変異が発見されたときに名付けられた（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｍ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９８：２５−４０（１９８１年））と、植物のＳＮＦ１関連キナーゼとである、３つの関連するヘテロ三量体セリン／スレオニンキナーゼを含む。キナーゼは「ヘテロ三量体」であり、従って、機能酵素を形成するするために３つのタンパク質サブユニット（すなわち、α、βおよびγ）の複合体を必要とする。
【００３５】
「遺伝子制御ネットワーク」という用語は、一般的に、互いにそして細胞内の他の物質と相互作用し、それにより、ネットワーク内の遺伝子がｍＲＮＡに転写される速度を支配する細胞内のＤＮＡセグメントのコレクションを指し、多くの場合、これらのネットワークは、多段階の制御を特徴とし、第１段階の遺伝子産物は別の遺伝子群の発現を制御し、その後も同様である。本明細書における目的のために、「ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク」という用語は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む遺伝子制御ネットワークを指す。従って、このネットワークは、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼをコードする全てのサブユニット、およびヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質を含む。
【００３６】
「セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ」という用語は、セリンまたはスレオニンの−ＯＨ基をリン酸化する能力を有するキナーゼを指す（ＥＣ２．７．１１．１）。セリン／スレオニンタンパク質キナーゼは全て、その基質内のセリンまたはスレオニン残基をリン酸化するが、これらは、ホスホアクセプター（ｐｈｏｓｐｈｏａｃｃｅｐｔｏｒ）部位に隣接して一緒にコンセンサス配列を含む残基に基づいて、特異的な残基を選択してリン酸化する。通常、リン酸化すべき基質のコンセンサス配列残基は、いくつかの重要なアミノ酸においてキナーゼの触媒間隙（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｌｅｆｔ）と接触する（通常、疎水力およびイオン結合によって）。
【００３７】
「ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ」という用語は、１）触媒Ｓｎｆ１αサブユニットと、２）βサブユニット（種によって、１〜３個の代替のタンパク質によりコードされる［例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、Ｓｉｐ１、Ｓｉｐ２およびＧａｌ８３であると同定される３つの代替のβサブユニットを有し、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（およびおそらくヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））はそれぞれ、２つのβサブユニットを有し、そしてクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）はそれぞれ、単一のβサブユニットを有する］と、３）Ｓｎｆ４と表されるγサブユニットとを含む、ヘテロ三量体セリン／スレオニンタンパク質キナーゼを指す。ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼは、グルコース制限または他の環境ストレス（例えば、窒素制限、ナトリウムイオンストレス、アルカリｐＨ、酸化ストレス）に応答してリン酸化により活性化される。タンパク質サブユニットのそれぞれは、ヘテロ三量体のサブユニット相互作用および／または機能を容易にする特異的な保存ドメインに対応して種々の配列保存領域を含む（Ｈｅｄｂａｃｋｔｅｒ，Ｋ．およびＭ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３：２４０８−２４２０（２００８年）によって概説される）。
【００３８】
「Ｓｎｆ１」という用語は、ＳＮＦ１遺伝子によってコードされるＳＮＦ１タンパク質キナーゼのαサブユニットを指す。このサブユニットは、Ｓｎｆ４およびキナーゼドメインと相互作用する、Ｎ末端キナーゼドメインおよびＣ末端制御領域を含む（Ｈｅｄｂａｃｋｔｅｒ，Ｋ．およびＭ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３：２４０８−２４２０（２００８年）によって概説される）。Ｓｎｆ１触媒サブユニットの活性化は、触媒キナーゼドメインのＮ末端活性化−ループセグメント内の保存Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ［「ＤＦＧ」］およびＡｌａ−ｐｒｏ−Ｇｌｕ［「ＡＰＥ」］モチーフ間のスレオニン残基のリン酸化を必要とする（Ｅｓｔｒｕｃｈ，Ｆ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３２：６３９−６５０（１９９２年）、ＭｃＣａｒｔｎｅｙ，Ｒ．Ｒ．およびＭ．Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３９）：３６４６０−３６４６６（２００１年））。
【００３９】
「ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質」という用語は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークにおけるその機能が、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ自体の上流である様々なタンパク質を指す。従って、上流制御タンパク質には、例えば、Ｓａｋ１、Ｔｏｓ３およびＥｌｍ１などのキナーゼ、ヘキソキナーゼアイソザイム１（Ｈｘｋ１）およびヘキソキナーゼアイソザイム２（Ｈｘｋ２）などのヘキソキナーゼ、Ｇｌｋ１などのグルコキナーゼ、ならびにＲｅｇ１およびＧｌｃ７などのＲｅｇ１−Ｇｌｃ７ホスファターゼ複合体のタンパク質が含まれる。
【００４０】
「ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質」という用語は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークにおけるその機能が、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ自体の下流である様々なタンパク質を指す。従って、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク内の下流タンパク質には、例えば、Ｒｍｅ１およびＭｈｙ１などの亜鉛−フィンガータンパク質、Ｓｎｆ３などのグルコーストランスポーター、Ｃｂｒ１などのミクロソームチトクロムｂ５レダクターゼ、ならびにアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［「ＡＣＣ」］およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＤＧＡＴ」］などの、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるリン酸化によって制御される他のタンパク質が含まれる。
【００４１】
「バイオディーゼル燃料」または「バイオディーゼル」という用語は、国内の再生可能な資源から生産される、きれいに燃える代替燃料を指す。より具体的には、バイオディーゼルは、ディーゼルエンジンで使用するためのＡＳＴＭ  Ｄ６７５１仕様に従う植物性油または動物性脂肪（最も典型的には、主にトリアシルグリセロール脂質で構成される植物油）に由来する長鎖脂肪酸モノアルキルエステルであると定義される。バイオディーゼルは、ディーゼル燃料とブレンドする前の純粋な燃料を指す。バイオディーゼルブレンドは「ＢＸＸ」と示され、「ＸＸ」はブレンド中に含有されるバイオディーゼルの割合を表す。例えば、Ｂ２０は、２０体積パーセントのバイオディーゼルと８０体積パーセントの石油ディーゼルとのブレンドである。バイオディーゼルは、ほとんどまたは全く改変されずに圧縮点火（ディーゼル）エンジンにおいて使用することができる。バイオディーゼルは使用するのが簡単であり、生分解性で、非毒性であり、そして硫黄および芳香族化合物を本質的に含まない。
【００４２】
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連するタンパク質の整列された配列に沿って特定の位置で保存されたアミノ酸のセットを意味する。その他の位置のアミノ酸は相同タンパク質間で異なり得るが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須であるアミノ酸を示す。これらは、タンパク質相同体のファミリーの整列された配列におけるその高度の保存によって同定されるので、識別子または「サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」としてこれらを使用すして、新たに決定された配列を有するタンパク質がすでに同定されているタンパク質ファミリーに属するかどうかを決定することができる。
【００４３】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼにおける、あるいはそれに関連する「活性の低下」という用語は、野生型ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性と比較して、α−、β−、またはγ−サブユニットを含むヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ複合体のキナーゼ活性の下方制御（一部でも全部でも）を指す。下方制御は、通常、α−、β−、またはγ−サブユニットをコードする天然の遺伝子が、その遺伝子の一部において挿入、欠失、または標的変異を指す「破壊」または「改変」を有する場合に生じ、例えば、遺伝子がゲノムから欠失されるような完全遺伝子ノックアウトをもたらし、タンパク質が翻訳されないか、あるいは翻訳されたサブユニットタンパク質が挿入、欠失、アミノ酸置換または他の標的変異を有する。タンパク質内の改変の位置は、例えば、タンパク質のＮ末端部分内［例えば、Ｓｎｆ１のＮ末端活性化−ループセグメントにおいて］でも、あるいはタンパク質のＣ末端部分内でもよい。改変されたサブユニットタンパク質は、破壊されなかったα−、β−、またはγ−サブユニットタンパク質に関して活性障害を有し、非機能性であり得る。ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は、上流制御タンパク質または制御ドメインを操作することによって、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質、転写および翻訳因子および／またはシグナル伝達経路を変化させることによって、あるいはセンス、アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術の使用などによっても起こり得る。
【００４４】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本化学構造単位を指すであろう。参照によって本明細書中に援用されるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：３０２１−３０３０（１９８５年）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２１９（２）：３４５−３７３（１９８４年）に記載されるＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に従って、アミノ酸は、アミノ酸の１文字コードまたは３文字コードのいずれかによって同定される。
【００４５】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、別のアミノ酸を有する所与のタンパク質において、そのタンパク質の化学的または機能的な性質を変化させることのない、アミノ酸残基の置換を指す。例えば、所与の部位において化学的に等価なアミノ酸を生じるが、コード化折り畳みタンパク質の構造および機能特性に影響を与えない遺伝子の変更が一般的であることは、当該技術分野においてよく知られている。本発明の目的のために、「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群：
１．  小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ［Ａ］、Ｓｅｒ［Ｓ］、Ｔｈｒ［Ｔ］（ｐｒｏ［Ｐ］、Ｇｌｙ［Ｇ］）、
２．  極性の負帯電残基およびそのアミド：Ａｓｐ［Ｄ］、Ａｓｎ［Ｎ］、Ｇｌｕ［Ｅ］、Ｇｌｎ［Ｑ］、
３．  極性の正帯電残基：Ｈｉｓ［Ｈ］、Ａｒｇ［Ｒ］、Ｌｙｓ［Ｋ］、
４．  大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ［Ｍ］、Ｌｅｕ［Ｌ］、Ｉｌｅ［Ｉ］、Ｖａｌ［Ｖ］（Ｃｙｓ［Ｃ］）、および
５．  大きい芳香族残基：Ｐｈｅ［Ｆ］、Ｔｙｒ［Ｙ］、Ｔｒｐ［Ｗ］
のうちの１つにおける交換であると定義される。
【００４６】
従って、わずかに疎水性のアミノ酸Ａｌａは、別のあまり疎水性でない残基（例えば、Ｇｌｙ）によって置換され得る。同様に、１つの負帯電残基による別の残基（例えば、ＡｓｐによるＧｌｕ）の置換、あるいは１つの正帯電残基による別の残基（例えば、ＬｙｓによるＡｒｇ）の置換をもたらす変化も、機能的に等価な産物を生じることが予期され得る。従って、保存的アミノ酸置換は、通常、１）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、２）標的部位における分子の電荷または疎水性、または３）側鎖の大部分を保持する。さらに、多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変更もタンパク質の活性を変化させないと予期されるであろう。
【００４７】
「非保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質特性の最大の変化を生じることが通常予期されるアミノ酸置換を指す。従って、例えば、非保存的アミノ酸置換は、１）親水性残基が、疎水性残基を置換する／疎水性残基によって置換される（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒによるＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ／Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌによるＳｅｒまたはＴｈｒの置換）ものか、２）Ｃｙｓまたはｐｒｏが、任意の他の残基置換を置換する／任意の他の残基によって置換されるものか、３）電気的陽性の側鎖を有する残基が、電気的陰性の残基を置換する／電気的陰性の残基によって置換される（例えば、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓによるＡｓｐまたはＧｌｕ／ＡｓｐまたはＧｌｕによるＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓの置換）ものか、あるいは４）かさ高い側鎖を有する残基が、側鎖を有さない残基を置換する／側鎖を有さない残基によって置換される（例えば、ＰｈｅによるＧｌｙ／ＧｌｙによるＰｈｅの置換）ものであり得る。時には、５つの群のうちの２つの間の非保存的アミノ酸置換がコード化タンパク質の活性に影響を与えないこともある。
【００４８】
「脂質」という用語は、脂溶性（すなわち、親油性）の天然に存在する任意の分子を指す。脂質は、細胞膜の構造成分、エネルギー貯蔵源およびシグナル伝達経路における中間体などの多くの重要な生物学的機能を有する多様な化合物群である。脂質は、広義に、完全または部分的にケトアシルまたはイソプレン基から得られる疎水性または両親媒性の小分子であると定義することができる。全ての脂質の種類の総括については、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ（ＬＩＰＩＤ  ＭＡＰＳ）分類システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を参照されたい。
【００４９】
「油」という用語は、２５℃で液体であり、普通は多価不飽和である脂質物質を指す。油性生物において、油は、全脂質の主要部分を構成する。「油」は、主としてトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］から構成されが、他の中性脂質、リン脂質および遊離脂肪酸も含有し得る。油中の脂肪酸組成および全脂質中の脂肪酸組成は通常類似しており、従って、全脂質中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少は油中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少に一致し、逆も同じである。
【００５０】
「中性脂質」は、貯蔵脂肪として、脂質体の細胞中に一般に見られる脂質を指し、細胞ｐＨにおいて脂質は帯電基を持たないのでそのように呼ばれる。一般に、これらは完全に非極性であり、水に対する親和性を有さない。中性脂質は、一般に、グリセロールの脂肪酸とのモノ−、ジ−、および／またはトリエステル（それぞれ、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールとも呼ばれ、あるいは集合的にアシルグリセロールとも呼ばれる）を指す。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出するためには、加水分解反応が生じなければならない。
【００５１】
「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］という用語は、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびにそれより短鎖の飽和および不飽和脂肪酸を含有することができる。
【００５２】
本明細書における「全脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、所与のサンプル（例えば、バイオマスまたは油でよい）において、塩基エステル交換反応方法（当該技術分野において知られているような）によって、脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化することができる全ての細胞脂肪酸の合計を指す。従って、全脂肪酸は、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールおよびＴＡＧを含む）および極性脂質画分（ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］およびホスファチジルエタノールアミン［「ＰＥ」］画分を含む）からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。
【００５３】
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞質量［「ＤＣＷ」］のパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、総脂質含量は、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥの尺度［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］として近似することができる。従って、総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば、１００ミリグラムのＤＣＷあたりの全脂肪酸のミリグラムに等しい。
【００５４】
全脂質中の脂肪酸の濃度は、本明細書では、ＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］、例えば、１００ミリグラムのＴＦＡあたりの所与の脂肪酸のミリグラムとして表される。本明細書の開示において他に特に記載されない限り、全脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸の濃度に等しい（例えば、全脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
【００５５】
場合によっては、細胞中の所与の脂肪酸の含量を、その乾燥細胞質量の質量パーセント［「％ＤＣＷ」］として表すことが有用である。従って、例えば、エイコサペンタエン酸％ＤＣＷは、以下の式：［（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）*（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００に従って決定され得る。しかしながら、その乾燥細胞質量の質量パーセント［「％ＤＣＷ」］としての細胞中の所与の脂肪酸の含量は、［（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）*（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００として近似することができる。
【００５６】
「脂質プロファイル」および「脂質組成」という用語は交換可能であり、全脂質または油などの特定の脂質画分中に含有される個々の脂肪酸の量を指し、ここで、量はＴＦＡの質量パーセントとして表される。混合物中に存在する個々の各脂肪酸の合計は１００のはずである。
【００５７】
「抽出油」という用語は、油を合成した微生物などの他の細胞材料から分離された油を指す。抽出油は様々な種類の方法によって得られ、最も簡単な方法は物理的な手段のみを含む。例えば、種々の圧搾構成（例えば、スクリュー、エキスペラー（ｅｘｐｅｌｌｅｒ）、ピストン、ビードビーター（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｅｒ）など）を用いる機械的な破砕は、油を細胞材料から分離することができる。あるいは、油の抽出は、種々の有機溶媒（例えば、ヘキサン）による処理によって、酵素抽出によって、浸透圧ショックによって、超音波抽出によって、超臨界流体抽出（例えば、ＣＯ2抽出）によって、けん化によって、そしてこれらの方法に組み合わせによって生じることができる。抽出油は、必ずしも精製またはさらに濃縮される必要のないことを要求しない。
【００５８】
「脂肪酸」という用語は、約Ｃ12〜Ｃ22の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指すが、これよりも長いおよび短い鎖長の酸も知られている。優勢な鎖長はＣ16〜Ｃ22の間である。脂肪酸の構造は、「Ｘ：Ｙ」の簡単な表記方法によって表され、ここで、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。一般に、脂肪酸は、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸に分類される。「飽和脂肪酸」という用語は、その炭素骨格中に「二重結合」を持たない脂肪酸を指す。対照的に、「不飽和脂肪酸」は、その炭素骨格に沿って「二重結合」を有するシス異性体である。「単不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「オメガ−６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］対「オメガ−３脂肪酸」［「ω−３」］または［「ｎ−３」］の間の区別に関するさらなる詳細は、参照によって本明細書中に援用される米国特許第７，２３８，４８２号明細書において提供される。
【００５９】
本明細書においてＰＵＦＡを表すために使用される命名は表２に示される。「簡単な表記」という表題の列には、オメガ−参照システムを用いて、炭素の数、二重結合の数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えてオメガ炭素に最も近い二重結合の位置が示される。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびその前駆体の慣用名、本明細書を通して使用され得る略語、ならびに各化合物の化学名を要約する。
【００６０】
表２：多価不飽和脂肪酸および前駆体の命名
【表２】
0005656836.tif 000009
【００６１】
表２に列挙されるω−３／ω−６ＰＵＦＡは、本明細書に記載される方法を用いて油性酵母の油画分中に蓄積される可能性が最も高いが、このリストは限定的または完全なものであると解釈されてはならない。
【００６２】
「油性」という用語は、そのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，「Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，第２版，Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年において）。
【００６３】
「油性酵母」という用語は、油を作ることができる酵母に分類される微生物を指す。一般に、油性微生物の細胞含油量はＳ字形曲線に従い、脂質の濃度は、後期対数増殖期または初期定常増殖期において最大に到達するまで増大し、次に、後期定常期および死滅期中は徐々に低下する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１年））。油性微生物が、その乾燥細胞質量の約２５％を超える量を油として蓄積することは一般的である。油性酵母の例としては、以下の属：ヤロウイア属、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属およびリポマイセス属が挙げられるが、決してこれらに限定されない。
【００６４】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸を、ＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＲＡ、ＤＴＡおよびＤＰＡｎ−などのω−６脂肪酸、ならびにＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に転換する代謝過程を指す。この過程は文献に十分に記載されている。例えば、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい。簡単に言うと、この過程は、小胞体膜中に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と呼ばれる一連の特別な不飽和化および伸長酵素による、炭素原子の付加を介した炭素鎖の伸長と、二重結合の付加を介した分子の不飽和化とを含む。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、ＰＵＦＡの生合成に関連する以下の酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す：Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼおよび／またはＣ20/22エロンガーゼが含まれる。
【００６５】
「デサチュラーゼ」という用語は、不飽和化することができる、すなわち１つまたは複数の脂肪酸中に二重結合を導入して、対象の脂肪酸または前駆体を生じることができるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸に言及するために明細書を通してオメガ−参照システムを使用したにもかかわらず、デルタ−システムを用いて基質のカルボキシル末端から数えることによってデサチュラーゼの活性を示す方が便利である。本明細書において特に興味深いのは、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼおよびΔ９デサチュラーゼである。当該技術分野において、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼは、ω−６脂肪酸をそのω−３対応物に転換する（例えば、ＬＡのＡＬＡへの、およびＡＲＡのＥＰＡへの、それぞれの転換）その能力に基づいて、場合により、「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と呼ばれることもある。適切な宿主を脂肪酸デサチュラーゼの遺伝子で形質転換し、宿主の脂肪酸プロファイルに対するその効果を決定することによって、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を実験的に決定することが望ましいかもしれない。
【００６６】
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を伸長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生じることができるポリペプチドを指す。この伸長過程は、米国特許出願公開第２００５／０１３２４４２号明細書および国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットに記載されるように、脂肪酸シンターゼと関連して多段階メカニズムにおいて起こる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへ、ＳＴＡからＥＴＡへ、そしてＥＰＡからＤＰＡへの転換である。一般に、エロンガーゼの基質選択性はいくらか広いが、鎖長と、不飽和の程度およびタイプとの両方によって区別される。例えば、Ｃ14/16エロンガーゼは、Ｃ14基質、例えばミリスチン酸を利用し、Ｃ16/18エロンガーゼは、Ｃ16基質、例えばパルミチン酸を利用し、Ｃ18/20エロンガーゼは、Ｃ18基質（例えば、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＬＡ、ＡＬＡ）を利用し、そしてＣ20/22エロンガーゼ［Δ５エロンガーゼとも呼ばれる］は、Ｃ20基質（例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡ）を利用するであろう。本明細書における目的のために、２つの別個のタイプのＣ18/20エロンガーゼを定義することができ、Δ６エロンガーゼは、ＧＬＡおよびＳＴＡのＤＧＬＡおよびＥＴＡへのそれぞれの転換を触媒し、Δ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡのＥＤＡおよびＥＴｒＡへのそれぞれの転換を触媒することができる。
【００６７】
いくつかのエロンガーゼは広い特異性を有するので、単一の酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒して、例えば、それによりＣ16/18エロンガーゼおよびＣ18/20エロンガーゼの両方として作用できることもあることに注意することが重要である。適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼの遺伝子で形質転換し、宿主の脂肪酸プロファイルに対するその効果を決定することによって、脂肪酸エロンガーゼの特異性を実験的に決定することが望ましいかもしれない。
【００６８】
「転換効率」および「基質転換パーセント」という用語は、デサチュラーゼなどの特定の酵素が基質を産物に転換することができる効率を指す。転換効率は、以下の式：（［産物］／［基質＋産物］）*１００に従って測定され、ここで、「産物」は、それに由来する経路における即時産物（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）および全ての産物を含む。
【００６９】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」および「単離核酸断片」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有していてもよい。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの混合物の１つまたは複数のセグメントで構成され得る。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸塩の形態で見られる）は、以下のように１文字の名称によって言及される：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡについて）に対しては「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸に対しては「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対しては「Ｇ」、ウリジル酸に対しては「Ｕ」、デオキシチミジル酸に対しては「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対しては「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対しては「Ｙ」、ＧまたはＴに対しては「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対しては「Ｈ」、イノシンに対しては「Ｉ」、そしてあらゆるヌクレオチドに対しては「Ｎ」。
【００７０】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、参照によって本明細書中に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）、特に１１章および表１１．１において例証される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似した断片（遠縁の生物からの相同配列など）から高度に類似した断片（近縁の生物から機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件セットは、６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより室温で１５分間から始まり、次に、２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより４５℃で３０分を繰り返し、そして次に、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより５０℃で３０分間を２回繰り返すという一連の洗浄を用いる。より好ましいストリンジェント条件セットはより高温を用い、最終の０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにおける２回の３０分間洗浄の温度を６０℃に上昇させたことを除いて、洗浄は上記のものと同一である。もう１つの好ましい高ストリンジェント条件セットは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおける６５℃での２回の最終洗浄を用いる。付加的なストリンジェント条件セットには、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃におけるハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる洗浄が含まれる。
【００７１】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド形成するために適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値も大きい。以下の順：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで、核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は低下する。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記，９．５０−９．５１を参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記，１１．７−１１．８を参照）。１つの実施形態では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの因子に従って必要であれば温度および洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
【００７２】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを用いるコンピュータ自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、１０以上の近接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、微生物コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイツハイブリダイゼーションなどの配列依存性の遺伝子同定法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離において、２０〜３０の近接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用されてもよい。さらに、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。本明細書における開示は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告されるような配列の利益を得て、開示される配列の全てまたは実質的部分をこれから当業者に既知の目的のために使用することができる。従って、添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに上記で定義したこれらの配列のかなり部分は、本開示に包含される。
【００７３】
「相補的」という用語は、互いにハイブリッド形成することができるヌクレオチド塩基間の関係を表すために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、添付の配列表で報告されるような完全な配列に相補的な単離核酸断片、ならびに実質的に類似した核酸配列には、本発明の開示に包含される。
【００７４】
「相同性」および「相同の」という用語は交換可能に使用される。これらは、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を仲介するまたは特定の表現型を生じる核酸断片の能力に影響を与えない核酸断片を指す。またこれらの用語は、得られる核酸断片の機能特性を最初の非改変断片に対して実質的に変化させない、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの核酸断片の改変も指す。
【００７５】
さらに、当業者は、相同の核酸配列が、中程度のストリンジェント条件（０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６０℃など）下で、本明細書に例示される配列と、またはこれらと機能的に等価である本明細書で開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリッド形成することができるその能力によっても定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似した断片（遠縁の生物からの相同配列など）から高度に類似した断片（近縁の生物から機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングすることができる。
【００７６】
「選択的にハイブリッド形成する」という用語は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、非標的核酸配列へのそのハイブリダイゼーションよりも検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）の、指定の核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーション、ならびに非標的核酸の実質的な排除への言及を含む。選択的にハイブリッド形成する配列は、通常、互いに少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、１００％までおよび１００％を含む配列同一性（すなわち、完全に相補的）を有する。
【００７７】
「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列に選択的にハイブリッド形成し得る条件への言及を含む。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる状況下では異なり得る。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを調節することによって、プローブに１００％相補的である標的配列を同定することができる（相同プロービング）。あるいは、ストリンジェンシー条件を調整して、より低い程度の類似性が検出されるように配列のいくらかのミスマッチを可能にすることもできる（異種プロービング）。一般に、プローブは、長さが約１０００ヌクレオチド未満であり、場合により、長さは５００ヌクレオチド未満であってもよい。
【００７８】
通常、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．５Ｍ未満のＮａイオン、通常は約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については温度が少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）については温度が少なくとも約６０℃であるような条件である。またストリンジェント条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成されてもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件には、０〜３５％のホルムアミドの緩衝溶液、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）による３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）における５０〜５５℃での洗浄が含まれる。例示的な中程度ストリンジェンシー条件には、４０〜４５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳにおける３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．５×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣにおける５５〜６０℃での洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳにおける３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣにおける６０〜６５℃での洗浄が含まれる。付加的なストリンジェント条件セットには、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃におけるハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる洗浄が含まれる。
【００７９】
特異性は、通常、ハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、熱的融点［「Ｔm」］は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７−２８４（１９８４年）の式：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似することができ、式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、そしてＬは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔmは、相補的な標的配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリッド形成する温度（規定のイオン強度およびｐＨ下）である。Ｔmは１％のミスマッチごとに約１℃低下し、従って、Ｔm、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列とハイブリッド形成することができる。９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔmは１０℃低下され得る。通常、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列およびその相補配列のＴmよりも約５℃低いように選択される。しかしながら、厳しいストリンジェント条件は、Ｔmよりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、中程度のストリンジェント条件は、Ｔmよりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件は、Ｔmよりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成、ならびに所望のＴmを用いて、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが本質的に説明されることを理解するであろう。所望の程度のミスマッチが、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴmをもたらす場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲に及ぶガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，パートＩ，２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２章，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５年）に見られる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０または２４０分間適用され得る。
【００８０】
「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチド配列間、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。また「同一性パーセント」は、場合によっては、比較される配列間の一致の割合によって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性パーセント」および「類似性パーセント」は、１）「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８年）、２）「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３年）、３）「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，パートＩ」（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４年）、４）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７年）、および５）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）において記載される方法を含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。
【００８１】
同一性パーセントを決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最良の一致を与えるように設計される。同一性パーセントおよび類似性パーセントを決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎTMプログラムを用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法」および「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９年）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２年）によって記載）を含む数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎTM（バージョン８．０．２）プログラムにおいて見られる「Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法」を用いて実施される。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを用いた配列のアライメントの後、プログラムの「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００８２】
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法を用いる多重アライメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を用いるペアワイズアライメントおよびタンパク質配列の同一性パーセントの計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法を用いる多重アライメントのためのデフォルトパラメータは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに相当する。
【００８３】
「ＢＬＡＳＴＮアライメント法」は、デフォルトパラメータを用いてヌクレオチド配列を比較するための、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｒｏｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって提供されるアルゴリズムであるが、「ＢＬＡＳＴＰアライメント法」は、デフォルトパラメータを用いてタンパク質配列を比較するための、ＮＣＢＩによって提供されるアルゴリズムである。
【００８４】
他の種からのポリペプチドの同定において（このようなポリペプチドは、同一または類似の機能または活性を有する）、多数の配列同一性レベルが有用であることは、当業者によって十分に理解されている。本明細書に記載される方法および宿主細胞において適切な核酸断片、すなわち、ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドは、少なくとも約７０〜８５％同一であるポリペプチドをコードするが、より好ましい核酸断片は、本明細書で報告されるアミノ酸配列と少なくとも約８５〜９５％同一であるアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲が上記に記載されるが、同一性パーセントの有用な例としては、５０％〜１００％の任意の整数の百分率、例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などが挙げられる。また、興味深いのは、この単離ヌクレオチド断片の任意の全長または部分相補体である。
【００８５】
適切な核酸断片は上記の相同性を有するだけでなく、通常、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８６】
「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えずに、ヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝暗号の性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。従って、宿主細胞における発現の改善のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【００８７】
「合成遺伝子」は、当業者に知られている手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成要素から組み立てることができる。これらの構成要素はアニールされ、次に連結されて遺伝子セグメントを形成し、これは次に酵素的に組み立てられて遺伝子全体を構築する。従って、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて遺伝子を最適な遺伝子発現に合わせて作り、宿主細胞のコドン塩基を反映することができる。当業者は、コドン使用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合に、遺伝子発現が成功する可能性を認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能である、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用プロファイルは、米国特許第７，１２５，６７２号明細書において提供される。
【００８８】
「遺伝子」は特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、コード領域のみを指してもよいし、あるいは、コード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）の制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」は、その独自の制御配列を有する天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない制御およびコード配列を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同じ源に由来するが、天然に見出されるものとは異なった形で配列された制御配列およびコード配列を含むことができる。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物中に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム内に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するようにそのコドン使用頻度が設計された遺伝子である。
【００８９】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。
【００９０】
「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよいし、あるいは天然に見出される異なるプロモーターに由来するエンハンサーおよびサイレンサーなどの異なる要素で構成されてもよいし、あるいはさらに合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、あるいは異なる発生段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に応答して遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者によって理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型において遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【００９１】
「３’非コード配列」および「転写ターミネーター」という用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる制御シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸経路の付加に影響を与えることを特徴とする。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響することができる。
【００９２】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼに触媒されるＤＮＡ配列の転写から得られる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、それは一次転写物と呼ばれ、あるいは、一次転写物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的であり、ｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むので細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。
【００９３】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸断片における核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響することができる場合に、そのコード配列と作動可能に連結されている。すなわち、コード配列は、プロモーターの転写調節下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で、制御配列に作動可能に連結され得る。
【００９４】
「組換え」という用語は、例えば、化学合成によって、あるいは遺伝子操作技術による核酸の単離セグメントの操作によって行われる、そうでなければ分離されている２つの配列セグメントの人工的な組み合わせを指す。
【００９５】
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともできる。従って、「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、機能性最終産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質［前駆体または成熟］）の産生も指す。
【００９６】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、核酸分子の宿主生物への転移を指す。核酸分子は、例えば自己複製するプラスミドであってもよいし、あるいは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」または「形質転換体」生物と称される。
【００９７】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、任意の源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（直鎖または環状）であってもよく、ここで、多数のヌクレオチド配列は、発現カセットを細胞内に導入することができる独特の構成に結合または組換えられている。
【００９８】
「発現カセット」という用語は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の発現の強化を可能にする要素を有するＤＮＡの断片を指す。一般に、発現カセットは、選択された遺伝子産物の発現に必要とされる、選択された遺伝子のコード配列、およびコード配列の前の制御配列（５’非コード配列）、およびコード配列の後の制御配列（３’非コード配列）を含むであろう。従って、発現カセットは、通常、１）プロモーター配列、２）コード配列［「ＯＲＦ」］、および３）３’非翻訳領域、すなわち、真核生物中では通常ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは通常ベクター内に含まれ、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対して正しい制御配列が使用される限りは、異なる発現カセットを、細菌、酵母、植物および哺乳類細胞を含む異なる生物に形質転換することができる。
【００９９】
「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書において交換可能に使用される。組換え構築物は、天然に一緒に見出されない核酸断片、例えば制御およびコード配列の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同じ源に由来するが、天然に見出されるものとは異なった形で配列された制御配列およびコード配列を含むことができる。このような構築物はそれ自体で使用されてもよいし、あるいはベクターと共に使用されてもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本明細書に記載される単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞をうまく形質転換、選択および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝因子をよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象が発現の異なるレベルおよびパターンをもたらし（Ｊｏｎｅｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８（１９８５年）、Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９年））、従って、所望の発現レベルおよびパターンを表すラインを得るために多数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識するであろう。
【０１００】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、１）ＧＣＧのプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０年））、３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、および５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１−２０．編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が含まれ得るがこれらに限定されない。この説明において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用されるときはいつも、分析結果は他に規定されない限りは、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に元々ロードされた任意の値またはパラメータセットを意味するであろう。
【０１０１】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，第２版，ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）によって、Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」，ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）によって、そしてＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪによる出版（１９８７年）によって記載されている。
【０１０２】
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応答して誘発される。油性微生物中に遊離パルミチン酸（１６：０）の新規の合成をもたらすこの過程は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に詳細に記載されている。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用によって形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆体である（図２）。
【０１０３】
広範囲の脂肪酸（飽和および不飽和脂肪酸ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含む）は、脂肪酸の主要な貯蔵単位であるＴＡＧに取り込むことができる。本明細書に記載される方法および宿主細胞において、「長鎖」ＰＵＦＡ［「ＬＣ−ＰＵＦＡ」］のＴＡＧへの取り込みが最も望ましく、ここで、ＬＣ−ＰＵＦＡには、少なくとも炭素１８個の長さを有する１８：１基質（すなわち、Ｃ18またはそれ以上である）から誘導されるあらゆる脂肪酸が含まれる。ＬＣ−ＰＵＦＡの構造形態は制限されない（従って、例えば、ＬＣ−ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、あるいはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で、全脂質中に存在し得る）。またこれには、ヒドロキシル化脂肪酸、エポキシ（ｅｘｐｏｘｙ）脂肪酸および共役リノール酸も含まれる。
【０１０４】
ほとんどのＰＵＦＡは中性脂質としてＴＡＧに取り込まれて、脂質体中に貯蔵されるが、油性生物内の全ＰＵＦＡの測定は、ＰＣ画分、ＰＥ画分およびＴＡＧ画分中に位置するＰＵＦＡを最小限に含むべきであることに注意することが重要である。
【０１０５】
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に転換される代謝過程は、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長、および二重結合の付加による分子の不飽和化を含む。これには、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化および伸長酵素が必要とされる。しかしながら、図２に示され、以下で説明されるように、特定のω−３／ω−６脂肪酸の産生のために多数の代替経路が存在する。
【０１０６】
具体的には、図２は、以下で説明される経路を示す。全ての経路は、Δ１２デサチュラーゼによるオレイン酸のリノール酸［「ＬＡ」］（ω−６脂肪酸の一番目）への最初の転換を必要とする。次に、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」およびＬＡを基質として用いて、以下のように長鎖ω−６脂肪酸が形成される：１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］に転換され、２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に転換され、３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に転換され、４）ＡＲＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に転換され、５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に転換される。
【０１０７】
また「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」は、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用して、以下のように長鎖ω−３脂肪酸を産生することもできる：１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによってＡＬＡ（ω−３脂肪酸の一番目）に転換され、２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」に転換され、３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に転換され、４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に転換され、５）ＥＰＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に転換され、６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に転換される。場合により、ω−６脂肪酸はω−３脂肪酸に転換されもよい。例えば、ＥＴＡおよびＥＰＡはΔ１７デサチュラーゼ活性によってそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから産生される。本明細書の目的のために有利なことに、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路は、かなりの量のγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］が欠けたＥＰＡ油の産生を可能にする。
【０１０８】
ω−３／ω−６脂肪酸の生合成のための代替経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ18/20エロンガーゼ、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」を利用する。より具体的には、ＬＡおよびＡＬＡは、Δ６デサチュラーゼによってそれぞれＧＬＡおよびステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に転換させることができ、次に、Ｃ18/20エロンガーゼが、ＧＬＡをＤＧＬＡに、および／またはＳＴＡをＥＴＡに転換する。
【０１０９】
本発明の宿主生物は、場合により、天然あるいは遺伝子操作技術のいずれかによってＰＵＦＡの産生能力を有していてもよい。具体的には、多数の微生物は細胞代謝の通常の過程でＰＵＦＡ（ω−３／ω−６脂肪酸を含む）を合成することができるが、商業的に培養され得るのはそのうちのいくつかであり、これらの生物のうち、医薬品、代用食、医療食品、栄養補助食品、その他の食品、工業油脂化学物質または他の最終用途で使用するために所望される含油量および組成を有する油を産生するものは少ししか〜全くない。従って、脂肪酸含量および組成が遺伝子操作によって注意深く特定された「デザイナー」脂質および油の産生のために微生物を操作するする能力がますます重要視されるようになっている。宿主は恐らく機能性ＰＵＦＡ生合成経路をコードする異種遺伝子を含むであろうと予期されるが、必須ではない。
【０１１０】
宿主生物が所望のＰＵＦＡを天然に産生しないか、あるいは所望の脂質プロファイルを有さない場合、当業者は、ＰＵＦＡ生合成に適切な酵素をコードする１つまたは複数の発現カセット、例えば、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼおよび／またはＣ20/22エロンガーゼをコードする発現カセットを選択された宿主生物に導入するために必要な検討事項および技術に精通しているであろう（図２）。ω−３／ω−６脂肪酸の生合成のために所望される酵素のそれぞれをコードする種々の候補遺伝子の適合性を同定および評価し、そしてこのような発現カセットを種々の宿主生物に導入するために、文献において多数の教示が当業者に提供される。当然ながら、特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主生物、そのＰＵＦＡプロファイルおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロファイル、基質の有効性、ならびに所望の最終産物に依存するであろう。宿主生物ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を用いるいくつかの参考文献は以下のように提供される：米国特許第７，２３８，４８２号明細書、米国特許第７，４６５，５６４号明細書、米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書。この一覧は網羅的なものではなく、限定として解釈されてはらない。
【０１１１】
好ましくは、油性真核（ｅｕｌａｒｙｏｔｉｃ）宿主細胞は、宿主細胞の全脂質中少なくとも約２〜５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは全脂質中少なくとも約５〜１５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは全脂質中少なくとも約１５〜３５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは全脂質中少なくとも約３５〜５０％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは全脂質中少なくとも約５０〜６５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、そして最も好ましくは全脂質中少なくとも約６５〜７５％のＬＣ−ＰＵＦＡを産生することができるであろう。ＬＣ−ＰＵＦＡの構造形態は限定されず、従って、例えば、ＥＰＡまたはＤＨＡは、遊離脂肪酸として、あるいはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で、全脂質中に存在し得る。
【０１１２】
多数の概説において、ＡＭＰＫ／ＳＮＦ１タンパク質キナーゼファミリー、ならびに包括的制御因子としてのタンパク質の構造および機能についての現時点での理解が記載されている。例えば、Ｈａｒｄｉｅ，Ｄ．Ｇ．ら，「Ｔｈｅ  ＡＭＰ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ／ＳＮＦ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ？」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：８２１−８５５（１９９８年）、ならびにＨｅｄｂａｃｋｅｒ，Ｋ．およびＭ．Ｃａｒｌｓｏｎ，「ＳＮＦ１／ＡＭＰＫ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ」，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３：２４０８−２４２０（２００８年）を参照されたい。ＨｅｄｂａｃｋｅｒおよびＣａｒｌｓｏｎ（上記）において記載されるように、細胞がグルコース制限に適合し、スクロース、ガラクトース、エタノールなどのグルコースよりも好ましくない代替炭素源を利用するために、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼが必要とされる。キナーゼは、栄養物および環境ストレスに対する種々の他の細胞応答において付加的な役割を有する。ＳＮＦ１タンパク質キナーゼは多数のグルコース抑制遺伝子の転写を制御し、これらの遺伝子の実質的部分は転写およびシグナル伝達において機能する。一般に、ヘテロ三量体キナーゼがリン酸化により活性化される（例えば、グルコース制限に応答して）際、ＡＴＰを産生する異化経路が増大する。すなわち、呼吸、糖新生およびβ−酸化は上方制御されるが、多くの他のグルコース抑制遺伝子の発現が増大され、ＡＴＰを消費する同化経路が減少し、すなわち、複雑な酵素カスケード反応により脂肪酸合成およびグリコーゲン代謝が下方制御される。
【０１１３】
任意の生物システムと同様に、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性はいくつかの上流制御タンパク質によって厳重に調節されて、その活性レベルが適切に制御されることが保証される。これらの上流制御タンパク質、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニット、およびヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質は、合わせてＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークと称される。
【０１１４】
ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク内のタンパク質間の複雑な相互作用は、恐らく決して完全に理解されることはないであろう。例えば、Ｙｏｕｎｇ，Ｅ．Ｔ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：２６１４６（２００３年））は、ゲノム発現研究およびマイクロアレイ解析に基づいて、４００以上のＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子がグルコース制限下でＳＮＦ１依存性であることを見出した。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるマイクロアレイ解析に基づいて、ｓｎｆ１Δ株では、対照株におけるその発現と比べて、２００を超える遺伝子が１．３倍よりも多く異なって発現されることが決定された（実施例１１、表２５）。
【０１１５】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの制御の概要は、本明細書に記載される実験に基づいて、そして種々の他の刊行物から、図１に概略的に示される。簡単に言うと、不活性（左）および活性（右）のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼはいずれも、触媒サブユニットＳｎｆ１、制御サブユニットＳｎｆ４、および架橋β−サブユニット（すなわち、Ｓｉｐ１、Ｓｉｐ２および／またはＧａｌ８３によってコードされる）から構成される。Ｓｎｆ１自体は、そのキナーゼ活性を与える触媒キナーゼドメイン［「ＫＤ」］、ならびにＳｎｆ４、Ｓｎｆ１  ＫＤ、およびβ−サブユニットと相互作用する制御ドメイン［「ＲＤ」］から構成される。ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性化は、Ｓｎｆ１  ＫＤの活性化−ループセグメントにおけるスレオニンのリン酸化を必要とする。従って、Ｓｎｆ１、Ｓｎｆ４またはβ−サブユニットをコードする遺伝子のいずれかの発現の下方制御は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの機能性を変化させるであろう。
【０１１６】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質には、種々のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ（例えば、Ｓａｋ１、Ｔｏｓ３およびＥｌｍ１）、ヘキソキナーゼ（例えば、Ｈｘｋ２）、およびタンパク質−ホスファターゼ１複合体のタンパク質（例えば、Ｒｅｇ１およびＧｌｃ７）が含まれる。ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ活性化の範囲は、Ｓａｋ１、Ｔｏｓ３および／またはＥｌｍ１キナーゼの発現によって制御されると思われるが、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ不活性化の程度は、Ｈｘｋ２、Ｇｌｋ１、Ｒｅｇ１およびＧｌｃ７の発現によって操作されると思われる。
【０１１７】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼが不活性の場合、様々な下流タンパク質が影響を受ける。例えば、亜鉛−フィンガータンパク質（例えば、Ｒｍｅ１、Ｍｈｙ１）、ミクロソームチトクロムｂ5レダクターゼタンパク質（例えば、Ｃｂｒ１）およびグルコーストランスポーター（例えば、Ｓｎｆ３）などの転写因子は上方制御される。対照的に、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼが活性である場合、リン酸化によってその活性が調節される種々のタンパク質（例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［「ＡＣＣ」］およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＤＧＡＴ」］）は不活性化され得る。
【０１１８】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は、酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの遺伝子導入油性真核宿主細胞内の総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷとして測定）の増大をもたらすことが発見された。このヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は、１）Ｓａｋ１およびＴｏｓ３の下方制御によって、２）Ｈｘｋ２、Ｇｌｋ１またはＲｅｇ１の上方制御によって、３）Ｓｎｆ１、Ｓｎｆ４、Ｓｉｐ２またはＧａｌ８３の下方制御によって、４）Ｓｎｆ１制御ドメインの上方制御によって、４）Ｓｎｆ１の触媒的に不活性な変異形の上方制御によって、６）Ｒｍｅ１、Ｃｂｒ１またはＳｎｆ３の上方制御によって、そして７）ＡＣＣまたはＤＧＡＴの突然変異体（ここで、前記突然変異体は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによってリン酸化することができない）の上方制御によって達成することができる。ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性を制御するためのこれらのメカニズムのそれぞれに関する詳細は、以下で議論されるであろう。
【０１１９】
サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるグルコース抑制は、複雑な代謝経路によって厳重に制御されることが分かっている。この経路の一部として、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼは、３つの上流キナーゼ、Ｓａｋ１、Ｔｏｓ３またはＥｌｍ１のうちのどれか１つによって活性化され得る。３つのＳｎｆ１活性化キナーゼは全て、そのＮ末端付近のセリン／スレオニンキナーゼドメイン、および配列保存が少ししかない大きいＣ末端ドメインを含有する。これらのキナーゼの経路特異性は、一連の欠失変異体の形成に基づいて、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｍ．ら（Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．，５（４）：６２０−６２７（２００６年））によって最近研究されている。本明細書では、そのキナーゼの活性を阻害するのに適切な方法でＳａｋ１を破壊することによって、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ活性が低下されることが実証される。
【０１２０】
グルコース抑制経路のもう１つの主要構成要素は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ複合体の制御におけるその役割によって推測されるように、Ｒｅｇ１−Ｇｌｃ７タンパク質ホスファターゼ複合体である（Ｓａｎｚ，Ｐ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０（４）：１３２１−１３２８（２０００年）において概説される）。Ｇｌｃ７は、タンパク質ホスファターゼ１型の触媒サブユニットをコードする必須遺伝子である。それは、ホスファターゼを対応する基質に向ける特定の制御サブユニットの結合によって、グルコース抑制および様々な他の細胞過程の制御に関与する。Ｇｌｃ７を基質に向けてグルコースを抑制するこれらの制御サブユニットのうちの１つはＲｅｇ１である。Ｇｌｃ７は、グルコースに応答し、Ｒｅｇ１により標的とされて、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ複合体のＳｎｆ１α−サブユニットまたは別の成分を脱リン酸化し、それにより、活性状態から自己阻害形態へのその立体構造変化を容易にすると仮定される。その他の知見は、Ｓｎｆ１がＲｅｇ１とのその独自の相互作用を負に制御することを示唆する。本明細書では、ホスファターゼ複合体が高活性であるような形でＲｅｇ１−Ｇｌｃ７タンパク質ホスファターゼ複合体を改変することによって、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ活性を減少し得ることが実証される。
【０１２１】
ヘキソキナーゼＰＩＩ（Ｈｘｋ２）は、グルコースのリン酸化に加えて、グルコース抑制の制御に関与する糖分解酵素である。より具体的には、Ｓａｎｚ，Ｐ．ら（上記）の研究に要約されるように、Ｈｘｋ２はヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ複合体および／またはＲｅｇ１−Ｇｌｃ７タンパク質ホスファターゼ複合体と相互作用しすると思われる。本明細書では、ヘキソキナーゼＰＩＩの活性を変更することによってＳＮＦ１タンパク質キナーゼ活性は低下されることが実証される。
【０１２２】
興味深いことに、Ｈｘｋ２は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてＧｌｋ１、Ｈｘｋ１およびＨｘｋ２の発現を制御することが分かった（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３５５（３）：６２５−６３１（２００１年））。具体的には、この文献では、Ｈｘｋ２はＨＸＫ１およびＧＬＫ１遺伝子のグルコース誘発性の抑制、ならびにＨＸＫ２遺伝子のグルコース誘発性の発現に関与するが、Ｈｘｋ１は、ＧＬＫ１およびＨＸＫ２遺伝子の発現に負の因子として関与することが実証された。
【０１２３】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼは細胞内の何百ものタンパク質に影響し得るが、キナーゼによって直接的に（間接的に対して）影響されるタンパク質の決定は困難であり、従って、広範囲にわたるスクリーニングおよび分析が必要とされ得る。種々の下流タンパク質間の相互作用も、増殖条件などに応じて変動を受けやすいであろう。
【０１２４】
上記の不確かさにもかかわらず、環境変化においてまたは種々の欠失変異体において生じる代謝リプログラミングを理解するためにマイクロアレイ解析が広範囲にわたって使用されており、これまで特徴付けられていなかった多くの遺伝子発現パターンが、その可能性のある機能への手掛かりを与える。例えば、ＤｅＲｉｓｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８（５３３８）：６８０−６８６（１９９７年））は、マイクロアレイ解析を用いて、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のジオーキシーシフト（ｄｉａｕｘｉｃ  ｓｈｉｆｔ）のための重要な転写因子としてＳｉｐ４およびＨａｐ４を同定した。
【０１２５】
同様の方法を用いて、本明細書では、ｓｎｆ１欠失変異体株と野生型株との間の表現型の違いに責任のある、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク内の潜在的に重要なタンパク質を同定した。これらの中で２つの潜在的な亜鉛フィンガータンパク質は、野生型と比べてｓｎｆ１欠失株において、その認知遺伝子の転写の増大を示した。これらのタンパク質は、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒｍｅ１およびＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｈｙ１と相同である。
【０１２６】
多くのＣｙｓ2Ｈｉｓ2型の亜鉛−フィンガータンパク質が遺伝子発現に関与する転写因子であることは周知である。例えば、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒｍｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１１５５８）は、減数分裂の活性化剤ＩＭＥ１の転写リプレッサーとして機能する亜鉛−フィンガータンパク質である（Ｃｏｖｉｔｚ，Ｐ．Ａ．，およびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ａ．Ｐ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，７：１５９８−１６０８（１９９３年））。ヤロウイアＲｍｅ１相同体（配列番号１１６）およびＭｈｙ１亜鉛−フィンガータンパク質相同体（配列番号１２１）はいずれも、ｓｎｆ１Δ株において、１．５４倍よりも多く、異なって発現された。これらのタンパク質は特徴付けられておらず、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における脂質代謝のための潜在的に重要な転写因子であり得る。
【０１２７】
さらに、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＮＦ３遺伝子の相同体をコードする遺伝子の発現は、ｓｎｆ１Δ株において上方制御された。ＳＮＦ３遺伝子は、酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における高親和性グルコース輸送に必要であり、グルコース抑制による遺伝子発現の調節にも関与している。
【０１２８】
上記のタンパク質に加えて、活性ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによる脱リン酸化によって様々なタンパク質が活性化される（ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼは逆反応、すなわちリン酸化による不活性化を実行することができないが）。ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに依存するこのタンパク質ファミリーの中で、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［「ＡＣＣ」］およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＤＧＡＴ」］はいずれも、脂質生合成において多大な役割を果たす。具体的には、ＡＣＣ（ＥＣ  ６．４．１．２）は、脂肪酸合成における重要な制御工程を触媒する。ＤＧＡＴ（ＥＣ  ２．３．１．２０）はトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］生合成に排他的に関係付けられる酵素であり、アシル−ＣｏＡおよび１，２−ジアシルグリセロールのＣｏＡおよびＴＡＧ（細胞中の主要な貯蔵脂質）への転換を触媒する。２つのＤＧＡＴ酵素ファミリー：ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２が存在する。
【０１２９】
残念ながら、ＡＣＣおよびＤＧＡＴ配列のほとんどにおいて、ＡＣＣおよびＤＧＡＴ内の正確なリン酸化部位は分かっていない。例えば、ラットＡＣＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０７１５２９、配列番号１４７）のセリン残基７９［「Ｓｅｒ−７９」］はＡＭＰＫによるＡＣＣの不活性化に対して完全に責任がある（Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８７：１８３−１９０（１９９０年）、Ｈａ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（３５）：２２１６２−２２１６８（１９９４年））が、対応するＳｅｒ−７９残基は、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のどちらにも存在しない。ＡＭＰＫ／Ｓｎｆ１タンパク質キナーゼファミリーのコンセンサスリン酸化部位はＨｙｄ−（Ｘａａ−Ｂａｓ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｄ（配列番号１４８）であると示唆されており、ここで、Ｈｙｄはかさ高い疎水性側鎖（すなわち、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）であり、Ｂａｓは塩基性残基（すなわち、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓ（ＡｒｇはＬｙｓよりも塩基性であり、ＬｙｓはＨｉｓよりも塩基性である））であり、そしてＸａａは任意のアミノ酸残基である（Ｈａｒｄｉｅ，Ｄ．Ｇ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：８２１−８５５（１９９８年）において概説される）。当業者は、活性ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによる脱リン酸化によってタンパク質の活性化を可能にする特定のＡＣＣまたはＤＧＡＴタンパク質内の適切なＳｅｒ／Ｔｈｒリン酸化部位を決定することができるであろう。Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基がリン酸化可能でない中性残基（例えば、Ａｌａ）で置換されるようなリン酸化部位の変異は、活性ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるＡＣＣまたはＤＧＡＴタンパク質の下方制御を防止するであろう。これは、細胞における脂質産生を増大させることが予期される（Ｘｕ，Ｊｉｎｇｙｕら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．，６（８）：７９９−８１８（２００８年）。
【０１３０】
既に説明したように、タンパク質キナーゼのＳＮＦ１−ＡＭＰＫファミリーは、哺乳類の高度に保存されたＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ［ＡＭＰＫ］、酵母／真菌のＳＮＦ１タンパク質キナーゼ、および植物のＳＮＦ１関連キナーゼを含む。細菌においてこれらのタンパク質キナーゼに対する相同体は知られていない。
【０１３１】
サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの種々のドメインおよびサブユニットにおける欠失、変異およびノックアウトなどの種々の改変の効果を検討する多数の研究が行われている。種々のＳＮＦ１タンパク質キナーゼサブユニット、すなわちＳｎｆ１、Ｓｉｐ１、Ｓｉｐ２、Ｇａｌ８３、Ｓｎｆ４のそれぞれの中の配列保存は、例えばＧｅｎＢａｎｋにおけるエントリーにより観察されるように、そして本出願において実証される（表３）ように、コンピュータでの多くのオルソロガスタンパク質の同定を可能にした。
【０１３２】
【表３−１】
0005656836.tif 000010
【表３−２】
0005656836.tif 000011
【表３−３】
0005656836.tif 000012
【０１３３】
好ましい宿主生物中のＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク内の特定の遺伝子の配列（すなわち、α、βおよび／またはγサブユニットをコードする遺伝子、上流制御タンパク質、またはヘテロ三量体ＳＮＦタンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質）またはそのタンパク質が分からない場合、当業者は、コードされるタンパク質の活性を制御して、それにより真核生物中の総脂質含量を変化させる前に、これらの遺伝子またはその一部を同定および単離することが最も望ましいことを認識するであろう。これらの配列、特に、例えばＳｎｆ１、Ｓｉｐ１、Ｓｉｐ２、Ｇａｌ８３、Ｓｎｆ４が分かれば、所望の宿主における標的破壊が容易になる。
【０１３４】
表３のＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク配列は、配列分析ソフトウェアを用いて、同一または他の藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイル、または酵母種における相同体を探索するために使用することができる。一般に、このようなコンピュータソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の改変に相同性の程度を割り当てることによって、類似の配列を対応させる。低複雑性フィルタおよび以下のパラメータ：Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ＝１０、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２を用いるＢＬＡＳＴＰアライメント法（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７年））などのソフトウェアアルゴリズムの使用は、表３中の任意のＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークタンパク質を、核またはタンパク質配列のデータベースに対して比較し、それにより、好ましい宿主生物内の類似した既知の配列を同定するためによく知られている。
【０１３５】
ソフトウェアアルゴリズムを用いて既知の配列のデータベースを徹底的に探索することは、表３に記載されるものなどの比較的低い同一性パーセントを有する相同体の単離に特に適している。公的に入手可能なＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク配列と少なくとも約７０％〜８５％の相同性を有するＳＮＦ１タンパク質キナーゼ相同体については、単離が比較的容易であり得ることは予測可能である。さらに、少なくとも約８５％〜９０％同一である配列は特に単離に適しており、少なくとも約９０％〜９５％同一である配列は最も容易に単離されるであろう。
【０１３６】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）タンパク質をヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムデータベースに対してクエリー配列として利用して、対応するヤロウイア属の相同体を容易に同定した。従って、例えば、好ましい真核宿主細胞中のＳｎｆ１をコードする遺伝子は、配列番号２で表記されるＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）タンパク質および／または表３に記載されるものなどの他のＳｎｆ１タンパク質に対する相同性を有することが予期されるであろう。
【０１３７】
またＳＮＦ１タンパク質キナーゼのいくつかのサブユニット相同体は、セリン／スレオニンキナーゼに特有のモチーフの使用によって単離されている。例えば、Ｓｎｆ１がＮ末端活性化−ループセグメント内に保存Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ［ＤＦＧ］およびＡｌａ−ｐｒｏ−Ｇｌｕ［ＡＰＥ］モチーフを含むことはよく知られている。これらのモチーフは、Ｓｎｆ１の活性化の際にリン酸化されるスレオニン残基に隣接する（Ｈａｒｄｉｅ，Ｄ．Ｇ．およびＤ．Ｃａｒｌｉｎｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４６：２５９−２７３（１９９７年））。この「保存ドメイン」領域は、特定の位置で高度に保存され、Ｓｎｆ１タンパク質の構造、安定性または活性に必須であるアミノ酸セットに対応する。例えば、ＳｃＳｎｆ１（配列番号２）のＴｈｒ２１０からＡｌａ、ＧｌｕまたはＡｓｐへの変更は、不活性キナーゼをもたらすことが実証されている（Ｅｓｔｒｕｃｈ，Ｆ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３２：６３９−６５０（１９９２年）、Ｌｕｄｉｎ，Ｋ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：６２４５−６２５０（１９９９年））。関連して、Ｓｎｆ４は、Ｂａｔｅｍａｎドメインと同定されるシスタチオニン−β−シンターゼ［ＣＢＳ］反復の２つの対を含有する（Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２２：１２−１３（１９９７年））。モチーフは、タンパク質相同体のファミリーの整列された配列におけるその高度の保存によって同定され、従って、独特な「サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」として使用して、新しく決定された配列を有するタンパク質が既に同定されているタンパク質ファミリーに属するかどうかを決定することもできる。当業者には周知であるように、これらのモチーフは、それぞれ、新規のＳｎｆ１、Ｓｎｆ４、Ｓｉｐ１、Ｓｉｐ２および／またはＧａｌ８３遺伝子の迅速な同定のための診断手段として有用である。
【０１３８】
あるいは、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークの遺伝子をコードする公的に入手可能な配列またはそのモチーフは、相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として使用されてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素は、プローブ、対象の遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法を含む。プローブは、通常、検出すべき核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出すべき核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は、５個の塩基から数万個の塩基まで様々であり得るが、通常は、約１５個の塩基〜約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部だけが、検出すべき核酸配列に相補的であればよい。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は完全でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子の間でも生じ、その結果、ハイブリッド形成した領域内の塩基の特定の画分は適切な相補的塩基と対を形成しない。
【０１３９】
ハイブリダイゼーション法は十分に定義されている。通常、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下で無機または有機塩を存在させてプローブおよびサンプルを接触させることが含まれる。プローブおよびサンプル核酸は、プローブおよびサンプル核酸間の可能性のあるあらゆるハイブリダイゼーションが起こるように十分に長い時間接触していなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間を決定し得る。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要とされるハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は短くなる。場合により、例えば、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムまたはトリフルオロ酢酸セシウムなどのカオトロピック剤が添加されていてもよい。所望される場合には、通常は３０〜５０％（ｖ／ｖ）［「体積による」］のホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に添加することができる。
【０１４０】
種々のハイブリダイゼーション溶液を使用することができる。通常、これらは、約２０〜６０体積％、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲は約６〜９））、約０．０５〜０．２％の洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭの間のＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識キャリア核酸、断片化核ＤＮＡ（仔ウシ胸腺もしくはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡなど）、および場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌ［「質量／体積」］のグリシンも含まれ得る。様々な極性の水溶性または膨潤性の薬剤（例えば、ポリエチレングリコール）、アニオンポリマー（例えば、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）、およびアニオン糖ポリマー（デキストラン硫酸など）を含む体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）などのその他の添加剤も含まれ得る。
【０１４１】
核酸ハイブリダイゼーションは、様々なアッセイ形式に適応できる。最も適切なものの１つはサンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適応できる。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブにそれを吸着または共有結合させる。
【０１４２】
ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークの遺伝子をコードする核酸断片のいずれかまたは同定された任意の相同体は、同一または他の藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイルまたは酵母種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用することができる。配列依存性プロトコールを用いる相同遺伝子の単離は当該技術分野でにおいて周知である。配列依存性プロトコールの例としては、１）核酸ハイブリダイゼーション法、２）ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４（１９８５年））、または鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２年）などの核酸増幅技術の種々の使用により例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法、および３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
例えば、公的に入手可能なＳｎｆ１、Ｓｎｆ４、Ｓｉｐ１、Ｓｉｐ２および／またはＧａｌ８３またはこれらのモチーフに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、これらの公的に入手可能な核酸断片の全てまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、当業者に周知の方法を用いてあらゆる所望の生物からライブラリーをスクリーニングすることによって直接単離され得る。公的に入手可能な核酸配列に基づいた特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野において既知の方法で設計および合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）。さらに、ランダムプライマーＤＮＡ標識化、ニックトランスレーションまたは末端標識化技術などの当業者に既知の方法によってＤＮＡプローブを合成するため、あるいは利用可能なインビトロ転写システムを用いてＲＮＡプローブを合成するために、配列全体を直接使用することができる。さらに、特定のプライマーを設計および使用して、公的に入手可能な配列またはそのモチーフの一部または全長を増幅することができる。得られた増幅産物は増幅反応中に直接標識化されるか、あるいは増幅反応後に標識化され、適切なストリンジェンシー条件下で全長ＤＮＡ断片を単離するためのプローブとして使用することができる。
【０１４４】
通常、ＰＣＲタイプの増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的ではない。所望の試験条件に依存して、プライマーの配列は、標的核酸の効率的で忠実な複製を提供するように設計されなければならない。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的であり、当該技術分野において周知である（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編，（１９８６年）３３−５０頁におけるＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ，「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」，ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ、およびＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編，（１９９３年）第１５巻、３１−３９頁におけるＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）。
【０１４５】
一般に、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク遺伝子からの利用可能な配列の２つの短いセグメントをＰＣＲプロトコールにおいて使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅することができる。またＰＣＲは、クローン化核酸断片のライブラリーにおいて実施されてもよく、ここで、１つのプライマーの配列は利用可能な核酸断片またはそのモチーフに由来する。他のプライマーの配列は、遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸経路の存在を利用する。
【０１４６】
あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいていてもよい。例えば、当業者はＲＡＣＥプロトコール（Ｆｒｏｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：８９９８（１９８８年））に従って、転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅するためにＰＣＲを用いてｃＤＮＡを生成することができる。３’および５’方向に向けられたプライマーは、利用可能な配列から設計することができる。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えば、ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（Ｏｈａｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：５６７３（１９８９年）、Ｌｏｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：２１７（１９８９年））。
【０１４７】
議論したばかりのこれらの周知の方法のいずれかに基づいて、選択された任意の好ましい真核生物においてヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのα−、β−、またはγ−サブユニットをコードする相同遺伝子（Ｓｎｆ１、Ｓｉｐ１、Ｓｉｐ２、Ｇａｌ８３およびＳｎｆ４を含む）、上流制御タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｓａｋ１、Ｔｏｓ１、Ｅｌｍ１、Ｈｘｋ２、Ｒｅｇ１およびＧｌｃ７を含む）、および／またはヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｒｍｅ１、Ｍｈｙ１、Ｃｂｒ１、Ｓｎｆ３、ＡＣＣ、ＤＧＡＴを含む）を同定および／または単離することが可能であろう。総脂質含量は、非遺伝子導入真核宿主内の総脂質含量に対して、遺伝子導入真核宿主において増大され得るので、本明細書に記載される方法に従って宿主生物の内在性遺伝子の活性を操作することによって、任意の推定上のＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークタンパク質の活性を容易に確認することができる。
【０１４８】
本明細書には、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む油性真核宿主細胞の総脂質含量を増大させるための方法が記載されており、前記方法は、
（ａ）油性真核宿主細胞を形質転換し、それにより、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性が、非形質転換油性真核宿主細胞中のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性のレベルと比べて低下されることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換細胞を適切な条件下で増殖させ、それにより、総脂質含量が、活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを有する非形質転換油性真核宿主細胞から得られる総脂質含量と比べて増大されることと、
（ｃ）場合により、ステップ（ｂ）の細胞から油または脂質を回収してもよいこと、
とを含む。
【０１４９】
先の開示に基づいて、上記の方法のためのヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は、従って、（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質の変更、（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの変更、あるいは（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質の変更によって達成できることは明らかであろう。より具体的には、油性真核宿主細胞の総脂質含量を増大させるための方法は、
（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｓａｋ１、Ｔｏｓ３およびＥｌｍ１からなる群から選択されるキナーゼである上流制御タンパク質の下方制御と、
（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、ヘキソキナーゼアイソザイム２（Ｈｘｋ２）からなるヘキソキナーゼである上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｄ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｒｅｇ１およびＧｌｃ７からなる群から選択されるＲｅｇ１−Ｇｌｃ７タンパク質−ホスファターゼ１複合体のタンパク質である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｅ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｆ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの制御ドメインの上方制御と、
（ｇ）触媒的に不活性なＳｎｆ１α−サブユニットの上方制御と、
（ｈ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの、Ｇａｌ８３からなるＳＮＦ１β−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｉ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１γ−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｊ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、Ｒｍｅ１およびＭｈｙ１からなる群から選択される亜鉛−フィンガータンパク質である下流タンパク質の上方制御と、
（ｋ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、ミクロソームチトクロムｂ５レダクターゼ（Ｃｂｒ１）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｌ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、グルコーストランスポーター（Ｓｎｆ３）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｍ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるリン酸化によって制御され、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるタンパク質である下流タンパク質の、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによってリン酸化することができない突然変異体の上方制御、
とからなる群から選択される手段によって、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性を低下させることによって達成することができる。
【０１５０】
油性真核宿主細胞がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である場合、以下のタンパク質はいずれも上記方法に従って操作され得る：配列番号３６［ＹｌＳａｋ１］、配列番号３８［ＹｌＥｌｍ１］、配列番号２７［ＹｌＳｎｆ１］、配列番号３２［ＹｌＧａｌ８３］、配列番号３４［ＹｌＳｉｐ２］、配列番号３０［ＹｌＳｎｆ４］、配列番号９１［ＹｌＲｅｇ１］、配列番号１０１［ＹｌＨｘｋ２］、配列番号１０３［ＹｌＧｌｋ１］、配列番号１１６［ＹｌＲｍｅ１］、配列番号１２１［ＹｌＭｈｙ１］、配列番号１３１［ＹｌＣｂｒ１］、配列番号１４４［ＹｌＳｎｆ３］、配列番号１５０［ＹｌＡＣＣ］、配列番号１８２［ＹｌＤＧＡＴ１］または配列番号１８４［ＹｌＤＧＡＴ２］。
【０１５１】
本明細書には、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む油性真核宿主細胞から得られる微生物油中の総ＰＵＦＡ含量を増大させるための方法も記載されており、前記方法は、
（ａ）機能性ＰＵＦＡ生合成経路をコードする単離ポリヌクレオチドで油性真核宿主細胞を形質転換し、非形質転換油性真核宿主細胞中のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性のレベルと比べて、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性も低下されることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換細胞を適切な条件下で増殖させ、それにより、総脂質含量が、活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを有する非形質転換油性真核宿主細胞から得られる総脂質含量と比べて増大されることと、
（ｃ）場合により、ステップ（ｂ）の細胞から油または脂質を回収してもよいこと、
とを含む。
【０１５２】
好ましくは、機能性ＰＵＦＡ生合成経路をコードする遺伝子は、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼからなる群から選択され、ＰＵＦＡは、ω−３脂肪酸またはω−６脂肪酸であり、そしてヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は、（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質の変更、（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの変更、および（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質の変更からなる群から選択される改変によるものである。
【０１５３】
例えば、本明細書において実証される方法は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性が低下されていない非形質転換油性ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞と比べて、増大した総脂質含量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］および増大したＥＰＡ生産性［ＥＰＡ％ＤＣＷ］を生じる形質転換油性ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞をもたらす（例えば、Ｓａｋ１、Ｓｎｆ１、Ｓｎｆ４、Ｇａｌ８３、Ｒｅｇ１、Ｈｘｋ２、Ｇｌｋ１、Ｒｍｅ１、Ｃｂｒ１またはＳｎｆ３の発現を変化させることによって達成される）。
【０１５４】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下により形質転換油性真核宿主細胞の総脂質含量を増大させる（非形質転換宿主細胞に対して）上記の方法のいくつかでは、飽和脂肪酸に対する不飽和化脂肪酸の比率も増大される（非形質転換宿主細胞に対して）。
【０１５５】
上記のこれらの方法の全てにおいて、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク内のタンパク質をコードする天然遺伝子の下方制御は、遺伝子の一部、例えば、タンパク質のＮ末端部分（Ｓｎｆ１のＮ末端活性化−ループセグメントなど）、またはタンパク質のＣ末端部分における挿入、欠失、または標的変異によって達成することができる。あるいは、下方制御が完全な遺伝子ノックアウトをもたらすか、あるいは標的変異が非機能性タンパク質をもたらし得る。本明細書において記載される好ましい方法では、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下をもたらす下方制御は、ＳＮＦ１、ＳＮＦ４、ＧＡＬ８３またはＳＩＰ２遺伝子ノックアウトを引き起こす（それぞれ、ｓｎｆ１Δ、ｓｎｆ４Δ、ｇａｌ８３Δまたはｓｉｐ２Δ細胞をもたらす）ことによって達成される。
【０１５６】
対照的に、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク内のタンパク質をコードする天然遺伝子の上方制御は、当業者によく知られている手段によって達成することができる。例えば、Ｒｅｇ１、Ｈｘｋ２、Ｇｌｋ１、Ｒｍｅ１、Ｍｈｙ１、Ｃｂｒ１、Ｓｎｆ３、変異体ＡＣＣまたは変異体ＤＧＡＴの発現は、発現の増大を引き起こすためのより強力なプロモーター（制御または構成的）の使用によって、ｍＲＮＡまたはコード化タンパク質のいずれかから不安定化配列を除去／欠失させることによって、あるいは安定化配列をｍＲＮＡに付加することによって転写レベルで増大され得る（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）。あるいは、単一の発現構築物内に遺伝子の付加的なコピーをクローニングすることによって、またはプラスミドのコピー数を増大させることにより付加的なコピーを宿主細胞内に導入することによって、またはクローン化遺伝子をゲノム内に多重に組み込むことによって、過剰発現される遺伝子の付加的なコピーが組換え宿主細胞内に導入され、それにより、総脂質含量を増大させてもよい。過剰発現される遺伝子は油性真核宿主細胞にとって天然のものであってもよいし、異種性であってもよい。
【０１５７】
本明細書において記載される方法は、細胞の総脂質含量の増大、細胞中の飽和脂肪酸に対する不飽和化脂肪酸の比率の増大、および／または細胞中の総ＰＵＦＡ含量の増大をもたらすことができ、包括的制御因子ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの普遍的な存在のために、通常全ての真核生物において適用可能である。しかしながら、好ましい真核宿主細胞は油性であり、すなわち、脂質／油の形態でそのエネルギー源を貯蔵する傾向のある生物である。
【０１５８】
本明細書において示されるように、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下（例えば、α−、β−またはγ−サブユニットヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの遺伝子ノックアウトによって、Ｓａｋ１の遺伝子ノックアウトによって、Ｓｎｆ１の制御ドメインの過剰発現によって、あるいはＨｘｋ２、Ｇｌｋ１、Ｒｅｇ１、Ｒｍｅ１、Ｃｂｒ１またはＳｎｆ３の過剰発現によって）は、細胞内の脂質／微生物油を合成する増大した能力を有する油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の変異体を作り出す。これは新規の知見であり、他の生物による研究では確証を見出さない。いずれかの特定の説明または理論にとらわれることは望まないが、本明細書では、油性酵母細胞内のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は構成的な油性をもたらし、それにより発酵過程全体にわたって油の生合成が起こることが可能になり、従って、細胞内に脂質の蓄積がもたらされる（通常、より短い期間で）と仮定される。さらに、その天然ＳＮＦ１タンパク質キナーゼが変更されていない油性酵母と比較して、全脂質中のＰＵＦＡパーセントを増大させることができ、全体の不飽和化が変更され、その結果、細胞の脂質プロファイルに対する改変が生じる。
【０１５９】
形質転換細胞における構成的な油性は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載されるように、油性酵母による通常の発酵（ｆｅｒｒｍｅｎｔａｔｉｉｏｎ）と正反対である。通常、油性酵母細胞中の高レベルのＰＵＦＡの蓄積は、代謝状態が増殖と脂肪の合成／貯蔵との間で「平衡状態」になければならないので、２段階プロセスを必要とする。このアプローチでは、発酵の第１段階は、細胞集団の生成および蓄積のみを行い、急速な細胞増殖および細胞分裂を特徴とする。発酵の第２段階では、培養内の窒素欠乏条件を確立して、高レベルの脂質蓄積を促進することが好ましい。この窒素欠乏の効果は、細胞内のＡＭＰの有効濃度を低下させ、それにより、ミトコンドリアのＮＡＤ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させることである。これが起こると、クエン酸が蓄積し、従って、細胞質中にアセチル−ＣｏＡの豊富なプールを形成し、脂肪酸合成を刺激する。従って、この段階は、細胞分裂の停止と、それに続く脂肪酸の合成および油の蓄積を特徴とする。
【０１６０】
これらの考察から、本明細書において記載される好ましい方法は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼにおける破壊を含む藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイルおよび酵母などの油性真核宿主細胞に関し、それにより、宿主細胞は乾燥細胞質量の２５％の油を含む。特に好ましいのは、ヤロウイア属、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属またはリポマイセス属の油性酵母である。
【０１６１】
本明細書において提供されるＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ１のα−サブユニットは、
ａ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ＢＬＡＳＴＰアライメント法に基づいて、配列番号２、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＢＬＡＳＴＮアライメント法に基づいて、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比べて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補配列（相補配列およびヌクレオチド配列は同じ数のヌクレオチドからなり、１００％相補的である）
を含む単離ヌクレオチド分子であると定義することができる。
【０１６２】
本明細書において記載される方法および形質転換油性真核宿主細胞に加えて、これらの形質転換細胞から得られる脂質または油も記載されている。これらの脂質および油は、食品、動物飼料として、または工業用途において、そして／あるいは食品または動物飼料中の副産物として有用である本明細書において記載される製品を定義してもよいし、あるいはこれらに取り込まれてもよい。例えば、脂質蓄積の増大をもたらすようにそのヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼが操作されている真核細胞は、バイオディーゼル燃料の製造において使用するために極めて望ましいであろう。
【０１６３】
本発明は、好ましい宿主細胞におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの改変を含む。このような改変を達成するために多数の技術が当業者に利用可能であるが、通常、特定の遺伝子の内在性の活性は以下の技術、例えば：１）標的遺伝子の全てまたは一部の挿入、置換および／または欠失により遺伝子を変更させること、あるいは２）突然変異されたヘテロサブユニット（すなわち、２つ以上のヘテロサブユニットを含む酵素において）を過剰発現させ、それにより、「優性ネガティブ効果（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）」の結果として酵素の活性を低下させることによって、低下または除去することができる。これらの技術はいずれも以下で論じられる。しかしながら、当業者は、これらが既存の文献において十分に記載されており、本明細書において記載される方法、宿主細胞、および製品に対する限定ではないことを認識するであろう。また当業者は、任意の特定の油性酵母と共に使用するために最も適切な技術も認識するであろう。
【０１６４】
挿入、置換および／または欠失による改変：
遺伝子改変には、遺伝子の機能性を改変するために構造遺伝子内に外来性ＤＮＡ断片（通常は、選択可能なマーカー遺伝子）が挿入される。宿主細胞への破壊カセットの形質転換の結果、非機能性破壊遺伝子による相同組換えによって機能性の天然遺伝子が置換される（例えば：Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：４６１７−４６２２（１９８９年）、Ｂａｌｂａｓら，Ｇｅｎｅ，１３６：２１１−２１３（１９９３年）、Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：２５１９−２５２４（１９９６年）、およびＳｍｉｔｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２７０−２７７（１９９６年）を参照されたい）。当業者は、糸状菌、藻類、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイル、酵母および／または微生物系において、ポジティブまたはネガティブ選択、遺伝子ノックアウトの作製、ならびに特定のゲノム部位への外因性ＤＮＡ配列の挿入を認める、遺伝子ターゲティングの一般的方法の多くのバリエーションを認識するであろう。
【０１６５】
対照的に、非特異的な遺伝子改変方法は、転位因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡにランダムに挿入する遺伝因子であるが、後で配列に基づいて検索して、挿入の遺伝子座を決定することができる。インビボおよびインビトロの転位技術は既知であり、トランスポザーゼ酵素と組み合わせた転位因子の使用を含む。転位因子またはトランスポゾンがトランスポザーゼの存在下で核酸断片と接触されると、転位因子は核酸断片内にランダムに挿入するであろう。破壊された遺伝子が転位因子の配列に基づいて同定されるので、この技術はランダム変異誘発および遺伝子単離に有用である。インビトロ転位のためのキットは市販されており、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪから入手可能なＰｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（酵母Ｔｙ１要素に基づく）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能なＧｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（細菌トランスポゾンＴｎ７に基づく）、おびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能なＥＺ：：ＴＮ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｎ５細菌転位因子に基づく）が含まれる。
【０１６６】
優性ネガティブ効果：優性ネガティブ阻害は、機能性オリゴマーの組立てが損なわれるようにマルチサブユニットタンパク質の変異体サブユニットが野生型タンパク質と同時発現される場合に最も一般的にみられる（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９（６１３６）：２１９−２２（１９８７年））。従って、優性ネガティブ阻害は、同じ遺伝子産物の突然変異体の同時発現の結果、野生型遺伝子産物の機能が損なわれる現象である。当業者に周知の手段を用いて、油性酵母の天然ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの優性ネガティブ阻害を引き起こすことにより、その天然ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼが破壊されていない油性酵母と比べて脂質蓄積の増大がもたらされ得る。
【０１６７】
当業者はこれらおよび他の周知の技術を使用して、哺乳類系、植物細胞、糸状菌、藻類、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイルおよび酵母などの本明細書において記載される好ましい宿主細胞内のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの上流制御タンパク質をコードする遺伝子、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼをコードするサブユニット、またはヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質を改変することができる。例えば、他の破壊技術としては、１）センス、アンチセンスまたはｉＲＮＡ技術の使用、２）特定の遺伝子の活性を天然に少ししかまたは全く持たない［あるいは、持たないように変異されている］宿主細胞の使用、３）突然変異されたヘテロサブユニットの過剰発現（すなわち、２つ以上のヘテロサブユニットを含む酵素において）により、「優性ネガティブ効果」の結果としての酵素の活性の低下、４）タンパク質の発現を調節する転写および翻訳因子の操作、および／または５）タンパク質の発現を調節するシグナル伝達経路の操作が挙げられる。
【０１６８】
当業者は、天然ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを改変して、その天然ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼが破壊されていない真核生物と比べて脂質の蓄積の増大を達成するために最適な手段を識別することができる。
【０１６９】
組換え構築物を作製するために有用な標準的なリソース材料は、特に、１）ＤＮＡ分子、プラスミドなどの巨大分子の構築、操作および単離のための特定の条件および手順、２）組換えＤＮＡ断片および組換え発現構築物の生成、および３）クローンのスクリーニングおよび単離を表す。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，」第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」と称される）、Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．著「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら著，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪにより出版（１９８７年）を参照されたい。
【０１７０】
一般に、構築物に含まれる配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および非形質転換細胞に対して形質転換細胞を分離するのに提唱される手段に依存する。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞をうまく形質転換、選択および増殖させるためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝因子をよく知っている。しかしながら通常、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体の組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写の開始を調節する遺伝子の領域５’（すなわち、プロモーター）、遺伝子コード配列、および転写の終結を調節するＤＮＡ断片の領域３’（すなわち、ターミネーター）を含む。調節領域は両方とも形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来するのが最も好ましいが、産生宿主に天然の遺伝子に由来する必要はない。
【０１７１】
所望の宿主細胞において異種遺伝子またはその一部の発現を駆動するために有用な転写開始領域またはプロモーターは多数あり、周知である。これらの調節領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、およびタンパク質および／またはＲＮＡ安定化要素を含むことができる。このような要素は、その長さおよび特異性が様々であり得る。選択された宿主細胞におけるこれらの遺伝子の発現を指示することができる仮想的に任意のプロモーター（すなわち、天然、合成、またはキメラ）が適切であるが、宿主種からの転写および翻訳領域は特に有用である。宿主細胞における発現は、誘発的または構成的な形で起こり得る。誘発性の発現は、対象のＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワーク遺伝子に作動可能に連結された制御可能なプロモーターの活性を誘発することによって生じるが、構成的な発現は、構成的プロモーターの使用によって生じる。
【０１７２】
転写終結領域をコードする３’非コード配列が組換え構築物中に提供されてもよく、開始領域を得た遺伝子の３’領域からのものであってもよいし、異なる遺伝子からのものであってもよい。多数の終結領域が知られており、これらが由来するものと同一および異なる属および種のどちらで用いる場合も、様々な宿主において満足に機能する。また終結領域は、好ましい宿主に天然の種々の遺伝子に由来してもよい。終結領域は、通常、どれか特定の特性についてよりも、便宜性について選択される。
【０１７３】
酵母において使用するために特に有用な終結領域は、酵母遺伝子、特にサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属、ヤロウイア属またはクルイベロミセス属（ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類遺伝子の３’−領域も酵母中で機能することが分かっている。当業者は、転写ターミネーターとして機能する３’−領域配列を設計および合成するために利用可能な情報を用いることができるので、３’−領域は合成であってもよい。終結領域は不要なこともあるが、非常に好ましい。
【０１７４】
またベクターは、上記の制御要素に加えて選択可能なおよび／またはスコア化可能なマーカーを含んでもよい。好ましくは、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり、抗生物質により細胞を処置することにより非形質転換細胞の増殖阻害または死滅が生じ、形質転換細胞の増殖は阻害されない。酵母形質転換体を選択するために、カナマイシン、ハイグロマイシンおよびアミノグリコシドＧ４１８に耐性で、酵母中で機能するマーカーはどれも有用であり、ウラシル、リジン、ヒスチン（ｈｉｓｔｉｎｅ）またはロイシンを含まない培地における増殖能力が特に有用である。
【０１７５】
単に遺伝子（例えば、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークのタンパク質をコードする）をクローニングベクターに挿入することは、所望の速度、濃度、量などにおけるその発現を保証しない。高発現速度の必要性に答えて、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性および位置、酸素制限、ならびに宿主細胞からの分泌を調節する多数の異なる遺伝因子を操作することによって多くの特定化された発現ベクターが作製されている。操作される特徴のいくつかには、関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、クローン化遺伝子のコピー数および遺伝子がプラスミド由来であるか宿主細胞のゲノムに組み込まれたかどうか、合成されたタンパク質の最終的な細胞位置、宿主生物中のタンパク質の翻訳および正しい折畳みの効率、宿主細胞内のクローン化遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の本質的な安定性、ならびに宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度にその頻度近づくようなクローン化遺伝子内のコドン使用が含まれる。これらのそれぞれを本明細書に記載される方法および宿主細胞において使用して、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性を低下させることができる（例えば、Ｓａｋ１、Ｅｌｍ１、Ｔｏｓ３、Ｓｎｆ１、Ｓｎｆ４、Ｇａｌ８３、Ｓｉｐ１、Ｓｉｐ２、Ｒｅｇ１、Ｈｘｋ１、Ｈｘｋ２、Ｇｌｋ１、Ｒｍｅ１、Ｍｈｙ１、Ｃｂｒ１またはＳｎｆ３の発現の変更によって）。
【０１７６】
プロモーター、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム［「ＯＲＦ」］、およびターミネーターを含む少なくとも１つのキメラ遺伝子を含む組換え構築物が作製されたら、それは、宿主細胞内で自己複製することができるプラスミドベクター内に配置されるか、あるいは宿主細胞のゲノムに直接組み込まれる。発現カセットの組込みは、宿主ゲノム内でランダムに起こり得るか、あるいは、宿主遺伝子座による組換えの標的化に十分な宿主ゲノムと相同性の領域を含有する構築物の使用により標的化され得る。構築物が内在性遺伝子座を標的とする場合には、転写および翻訳制御領域の全てまたはいくつかは、内在性遺伝子座によって提供され得る。
【０１７７】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現される場合、各ベクターは異なる選択手段を有することが可能であり、安定な発現を維持し、構築物の中の要素の再集合を防止するために、他の構築物に対する相同性が欠けていなければならない。制御領域の賢明な選択、選択手段、および導入された構築物の増殖方法は、全ての導入遺伝子が、所望の産物の合成を提供するのに必要なレベルで発現されるように、実験的に決定することができる。
【０１７８】
対象の遺伝子を含む構築物は、任意の標準技術によって、宿主細胞内に導入され得る。これらの技術としては、形質転換、例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１年））、微粒子銃衝撃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、真空ろ過、または対象の遺伝子を宿主細胞内に導入する任意の他の方法が挙げられる。
【０１７９】
便宜上、例えば発現カセット内にＤＮＡ配列を取り込むために任意の方法によって操作された宿主細胞は、本明細書では、「形質転換」または「組換え」または「形質転換体」と称される。形質転換宿主は発現構築物の少なくとも１つのコピーを有し、遺伝子がゲノム内に組み込まれて増幅されるか、あるいは多数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかによって、２つ以上を有してもよい。
【０１８０】
形質転換宿主細胞は、導入される構築物上に含有されるマーカーの選択によって同定することができる。あるいは、多くの形質転換技術は多数のＤＮＡ分子を宿主細胞に導入するので、所望の構築物と共に別のマーカー構築物が同時形質転換されてもよい。
【０１８１】
通常、形質転換宿主は、抗生物質を組み込むか、あるいは非形質転換宿主の増殖に必要な因子（栄養物または成長因子など）が欠けている選択培地において、増殖するその能力について選択される。導入されたマーカー遺伝子は抗生物質耐性を付与するか、あるいは必須の成長因子または酵素をコードすることができ、それにより、形質転換宿主内で発現されると選択培地における増殖を可能にする。また、形質転換宿主の選択は、発現されたマーカータンパク質が直接または間接的に検出できる場合にも起こり得る。付加的な選択技術は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記載されている。
【０１８２】
選択される宿主または発現構築物に関係なく、所望の発現レベル、制御およびパターンを示す株を得るために多数の形質転換体をスクリーニングしなければならない。例えば、Ｊｕｒｅｔｚｅｋら（Ｙｅａｓｔ，１８：９７−１１３（２００１年））は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に組み込まれたＤＮＡ断片の安定性が、使用される個々の形質転換体、レシピエント株および標的プラットフォームに依存することを指摘している。このようなスリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３年））、タンパク質発現のウエスタン分析、表現型分析、または脂質およびＰＵＦＡ産物のＧＣ分析によって達成することができる。
【０１８３】
本明細書の方法に従って様々な真核生物が適切な宿主であり、得られた遺伝子導入宿主はヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下を含み、その天然ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼが変化されていない真核生物に比べて、細胞の総脂質含量が増大される（そして場合により、細胞中の総ＰＵＦＡ含量が増大されていてもよく、そして／あるいは細胞中の飽和脂肪酸に対する不飽和化脂肪酸の比率が増大されていてもよい）。宿主は、広範囲にわたる温度およびｐＨ値で、単純または複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、グリセロールおよびアルコール、および／または炭化水素を含む様々な原料において増殖することができる。例えば、種々の真菌、藻類、卵菌、酵母、ストラメノパイルおよび／またはユーグレナは有用な宿主であり得る。サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非油性生物におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は十分な脂質の蓄積をもたらすことができ、破壊変異体は油性であると分類されるので、これらの生物も宿主細胞として有用であり得る。
【０１８４】
好ましい宿主は油性真核生物である。これらの油性生物は天然に油の合成および蓄積が可能であり、ここで、総含油量は、乾燥細胞質量の約２５％を超える量、より好ましくは乾燥細胞質量の約３０％を超える量、最も好ましくは乾燥細胞質量の約４０％を超える量を含むことができる。種々の細菌、藻類、ユーグレナ、蘚類、真菌、酵母およびストラメノパイルは、天然に、油性であると分類される。この広範の宿主群の中で、特に興味深いのは、ω−３／ω−６脂肪酸を天然に産生する生物である。例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡは、シクロテラ種（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、クリプテコディニウム種（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）、モルティエレラ種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、ニッチア種（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、スラウストキトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびシゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ）によって産生される。Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）の形質転換の方法は、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：４６５５（２０００年））によって記載されている。同様に、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えば、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））の形質転換の方法は、米国特許第７，００１，７７２号明細書に開示されている。代替の実施形態では、非油性生物（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母）は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下の前に、遺伝子改変されて油性になることができる。
【０１８５】
より好ましい実施形態では、油性真核宿主細胞は油性酵母である。油性酵母として通常同定される属には、ヤロウイア属、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属およびリポマイセス属が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、実例となる油合成酵母として、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルチェリマ（ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．アティリス（ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．キュータネウム（ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（ｇｒａｍｉｎｉｓ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）と分類）が挙げられる。最も好ましいのは、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施形態では、最も好ましいのは、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１として指定されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３−９（２００２年））。
【０１８６】
宿主のゲノムへの直鎖ＤＮＡ断片の組込みによってヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において遺伝子を発現させる好ましい方法、好ましいプロモーター、終結領域、組込み遺伝子座および破壊、ならびにこの特定の宿主種を用いる場合の好ましい選択方法は、米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書において提供される。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡの産生を操作するために適用可能な特定の教示も含まれる。
【０１８７】
当業者は、米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書で引用される教示を使用して、ＰＵＦＡ産生のために他の宿主細胞を組換えで操作することができるであろう。
【０１８８】
遺伝子導入真核宿主細胞は、脂質蓄積を最適化する（場合により、ＬＣ−ＰＵＦＡの最大および最も経済的な収率を可能にし得る）条件下で増殖される。一般に、培地条件は、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なるミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス産生段階の長さ、油蓄積段階の長さ、ならびに細胞採取の時間および方法を変更することによって最適化することができる。
【０１８９】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス［「ＹＰＤ」］などの複合培地、あるいは増殖に必要な成分が欠けていることにより所望の発現カセットの選択を強制する限定最少培地（例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））において増殖される。
【０１９０】
本明細書において記載される方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で教示されるものなどの適切な炭素源を含有しなければならない。利用される炭素源は様々な種類の炭素含有源を包含し得ると考えられるが、好ましい炭素源は糖、グリセロールおよび／または脂肪酸である。最も好ましいのは、グルコースおよび／または１０〜２２個の炭素を含有する脂肪酸である。
【０１９１】
窒素は、無機源（例えば、（ＮＨ4）2ＳＯ4）または有機源（例えば、尿素またはグルタミン酸）から供給され得る。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および酵素的脂質産生経路の増殖および促進に適した当業者に既知の他の成分も含有しなければならない。Ｆｅ+2、Ｃｕ+2、Ｍｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2、Ｍｇ+2などの脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオンが特に注目されている（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編、６１−９７頁（１９９２年））。
【０１９２】
本明細書において記載される方法および宿主細胞のために好ましい増殖培地は、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの市販の調製培地である。その他の限定または合成増殖培地が使用されてもよく、遺伝子導入宿主細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者には分かるであろう。発酵のために適切なｐＨ範囲は、通常、約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、初期増殖条件の範囲としてはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性条件下でも嫌気性条件下でも行うことができ、微好気性条件が好ましい。
【０１９３】
いくつかの態様では、主要産物は油性酵母バイオマスである。従って、バイオマスからの油の単離および精製は不要であり得る（すなわち、全細胞バイオマスが産物である）。しかしながら、特定の最終用途および／または産物形態は、部分精製バイオマス、精製油、および／または精製ＬＣ−ＰＵＦＡを得るためにバイオマスからの油の部分的および／または完全な単離／精製を必要とし得る。
【０１９４】
ＰＵＦＡを含む脂肪酸は、遊離脂肪酸として、あるいはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で、宿主生物中に見出すことができ、当該技術分野で周知の様々な手段によって宿主細胞から抽出することができる。酵母脂質のための抽出技術、品質分析および受入基準についての１つの概説は、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓのもの（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２（５／６）：４６３−４９１（１９９２年））である。また下流プロセシングについての簡単な概説は、Ａ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：２７１−３１２（１９９７年））によって得られる。
【０１９５】
一般に、脂肪酸を精製するための手段としては、有機溶媒による抽出（例えば、米国特許第６，７９７，３０３号明細書および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば、二酸化炭素を用いる）、けん化および物理的手段（プレスなど）、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。米国特許第７，２３８，４８２号明細書が挙げられる。
【０１９６】
実施例において実証され、以下の表４に要約されるように、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の遺伝子導入ＰＵＦＡ産生株におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は、そのＳＮＦ１タンパク質キナーゼ活性が変化されていない非遺伝子導入ヤロウイアに比べて、総脂質含量の増大をもたらす。
【０１９７】
表４は実施例２〜３、５〜１０、および１２〜１４からのデータを集めており、総脂質含量の増大パーセント［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＥＰＡ生産性の増大パーセント［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］についての傾向を対照株に対して推定することができる。単一の株に対して多数のデータセットが提供される場合、これは、異なる増殖条件から得られた結果を表す。
【０１９８】
【表４−１】
0005656836.tif 000013
【表４−２】
0005656836.tif 000014
【０１９９】
実施例間でデータを直接比較することはできないが、活性が低下されたヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む遺伝子導入油性ヤロウイアが、活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む非遺伝子導入油性真核宿主細胞の総脂質含量と比べて総脂質含量の増大をもたらすことは明らかである。ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下は、多数の手段によって達成することができる。
【０２００】
総脂質含量において観察される増大に加えて、活性が低下されたヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む遺伝子導入油性ヤロウイアは、ＥＰＡ生産性の増大（すなわち、総ＰＵＦＡ含量の増大）も実証する。上記の研究で用いられる特定のヤロウイア細胞におけるＥＰＡ産生は、ＰＵＦＡ産生のための宿主細胞における特定の遺伝子操作の結果であり、特にＥＰＡは、ＰＵＦＡ中間体または副産物とは対照的に、導入された機能性ＰＵＦＡ生合成経路の所望の最終産物であった。例えば、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の同様の低下が行われる場合には（本明細書において記載される方法に従って）、所望のＰＵＦＡ産物としてＡＲＡを産生するように操作された株ではＡＲＡ生産性の増大［ＡＲＡ％ＤＣＷ］が観察され、所望のＰＵＦＡ産物としてＤＨＡを産生するように操作された株ではＤＨＡ生産性［ＤＨＡ％ＤＣＷ］の増大が観察され得ることが予期される。
【０２０１】
上記の表４は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークにおいて役割を果たすことが仮定される１６の異なる遺伝子を試験したときに得られた結果を要約する。これらのうち、Ｓｉｐ２、Ｅｌｍ１、Ｈｘｋ１、Ａｃｓ２、Ｓｋｓ１およびＳｃｓ２だけが、遺伝子導入宿主細胞中の総脂質含量の改善を導かなかった。これは、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下を有さない非遺伝子導入宿主細胞と比べて、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下が総脂質含量の増大をもたらすことを仮定する本出願の前提を疑うものではない。代わりに、Ｓｉｐ２、Ｅｌｍ１、Ｈｘｋ１、Ａｃｓ２、Ｓｋｓ１およびＳｃｓ２について上記で得られた否定的な結果によって、特定の実験が実施されている増殖条件下でヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性を制御する際に重要な役割を果たす遺伝子の活性を操作することの重要性が強調される。例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｏｓ３による研究に基づいて、Ｓｎｆ１タンパク質キナーゼキナーゼが異なる条件下における細胞制御に対して異なる寄与をすることが分かる。特に、細胞をグリセロール−エタノールにおいて増殖させると、ｔｏｓ３Δは、増殖速度、Ｓｎｆ１触媒活性、および糖新生遺伝子のプロモーターにおけるＳｎｆ１依存性炭素源応答配列［「ＣＳＲＥ」］の活性化を低下させた。対照的に、急激なグルコース欠乏中は、ｔｏｓ３ΔはＳｎｆ１触媒活性またはＣＳＲＥ機能にあまり影響を与えない（Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｄ．ら，Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．，４（５）：８６１−８６６（２００５年））。
【０２０２】
本明細書において記載される教示および結果に基づいて、油性真核生物中の総脂質含量を増大させる手段として、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性を低下させることの実現可能性および商業的実用性が認識され得ることが予期される。
【実施例】
【０２０３】
本発明の実施化を説明するが、その可能な変化形の全てを完全に定義するものではない以下の実施例において、本発明はさらに説明される。
【０２０４】
一般的方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）、ならびに３）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪによる出版（１９８７年）によって説明されている。
【０２０５】
微生物培養物の維持および増殖に適した材料および方法は当該技術分野においてよく知られている。以下の実施例における使用に適した技術は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年））、またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）に記載されることが分かるであろう。微生物細胞の増殖および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、他に指定されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、通常、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）プレートにおいて３７℃で増殖させた。
【０２０６】
一般的な分子クローニングは、標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）に従って実施した。ＤＮＡ配列は、ベクターおよび挿入特異的プライマーの組み合わせを用いる染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ配列決定装置上で生成した。配列の編集は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）において実施した。全ての配列は、両方向に少なくとも２倍の範囲を示す。本明細書において他に指示されない限り、遺伝子配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて達成した。
【０２０７】
略語の意味は以下の通りである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０２０８】
発現カセットの命名：
発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の簡単な表記方法によって表され、Ｘはプロモーター断片を表し、Ｙは遺伝子断片を表し、Ｚはターミネーター断片を表し、これらは全て、互いに作動可能に連結されている。
【０２０９】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの遺伝子増幅：
他に指定されない限り、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの過剰発現プラスミドｐＹＲＨ４４、ｐＹＲＨ４５、ｐＹＲＨ４６、ｐＹＲＨ４７、ｐＹＲＨ３８、ｐＹＲＨ４０、ｐＹＲＨ４０、ｐＹＲＨ４１、ｐＹＲＨ４２、ｐＹＲＨ４８、ｐＹＲＨ５１およびｐＹＲＨ５０の構築のためのヤロウイア遺伝子のＰＣＲ増幅は、テンプレートとしての株ＡＴＣＣ＃２０３６２からのゲノムＤＮＡ、ならびに対象となる所望の遺伝子の増幅に特異的な順方向および逆方向プライマーを用いて実施した。反応混合物は、５０１μｌの全反応容積中に、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、それぞれ４００μＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ、２０μＭのプライマー（それぞれ１μｌ）、１１μｌのゲノムのＤＮＡ、２２１μｌの水および２ＵのＴａｑポリメラーゼを含有した。サーモサイクラーの条件は、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で２分秒間を３０サイクル、その後７２℃で７分間の最終伸長とした。
【０２１０】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、以下に示される処方に従って、いくつかの培地中２８〜３０℃でルーチン的に増殖させた。標準方法に従って２０ｇ／Ｌの寒天を各液体培地に添加することによって、必要に応じて寒天板を調製した。
【０２１１】
ＹＰＤ寒天培地（１リットルあたり）：１０ｇの酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］、および２０ｇのグルコース。
【０２１２】
高グルコース培地（ＨＧＭ）（１リットルあたり）：８０グルコース、２７ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、６．３ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4。
【０２１３】
合成デキストロース培地（ＳＤ）（１リットルあたり）：６．７ｇのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（硫酸アンモニウムを有し、アミノ酸を含まない）、および２０ｇのグルコース。
【０２１４】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるように行った。
【０２１５】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４およびＹ４１８４Ｕの作製
参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４号明細書の実施例１３に記載されるように、株Ｙ２２２４（野生型ヤロウイア株ＡＴＣＣ＃２０３６２のＵｒａ３遺伝子の自律性変異からのＦＯＡ耐性変異体）を単離した。
【０２１６】
参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８−０１５３１４１号明細書の実施例７に記載されるように、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現によって全脂質に対するＥＰＡを産生する株Ｙ４１８４およびＹ４１８４Ｕを生成した。図３に示される株Ｙ４１８４Ｕの発生は、中間体株Ｙ２２２４（上記）、Ｙ４００１、Ｙ４００１Ｕ、Ｙ４０３６、Ｙ４０３６Ｕ、Ｙ４０６９、Ｙ４０８４、Ｙ４０８４Ｕ１、Ｙ４１２７（２００７年１１月２９日に受入番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８８０２でＡＴＣＣに寄託）、Ｙ４１２７Ｕ２、Ｙ４１５８、Ｙ４１５８Ｕ１およびＹ４１８４の構築を必要とした。株Ｙ４１８４は、全脂質に対して約３１％のＥＰＡを産生することができた。野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に関して株Ｙ４１８４の最終遺伝子型は、以下の通りであった：ｕｎｋｎｏｗｎ  １−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ６−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ（ここで、ＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり、ＦｍＤ１２Ｓはフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来するコドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子であり、ＭＥ３Ｓはモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ16/18エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］であり、ＥｇＤ９ｅはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］であり、ＥｇＤ９ｅＳはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］であり、ＥｇＤ８Ｍはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇ��ｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成変異体Δ８デサチュラーゼ［国際公開第２００８／０７３２７１号パンフレット］［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］であり、ＥｇＤ５はユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４−Ａ１号明細書］であり、ＥｇＤ５Ｓはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４号明細書］であり、ＲＤ５Ｓはペリディニウム種（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＣＣＭＰ６２６に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ、［米国特許出願公開第２００７−０２７１６３２号明細書］であり、ＰａＤ１７はピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり、ＰａＤ１７Ｓはピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり、そしてＹｌＣＰＴ１はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット］である）。
【０２１７】
次に、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子を株Ｙ４１８４のＵｒａ３遺伝子内に組み込み、それによりＵｒａ−表現型を産生することによって株Ｙ４１８４Ｕを生成した。
【０２１８】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９年））に記載されるように、遠心分離によって細胞を採取し、脂質を抽出した。脂質抽出物とナトリウムメトキシドとのエステル交換反応によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥＳ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，およびＮｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０年））、続いて、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを取り付けたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度を１７０℃（２５分間保持）から、３．５℃／分で１８５℃までにした。
【０２１９】
直接塩基エステル交換反応のために、ヤロウイア培養物（１ｍＬ）を採取した。ナトリウムメトキシド（５００μｌの１％）をサンプルに添加し、次にサンプルをボルテックスし、６０分間振とうさせた。１００μｌの１ＭのＮａＣｌおよび４００μｌのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスおよび回転させた。上層を取り出し、上記のようにＧＣで分析した。
【０２２０】
油性条件下におけるヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の総脂質含量および組成の分析
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の特定の株における総脂質含量および組成の詳細な分析のために、以下のようにフラスコアッセイを行った。具体的には、約０．１の出発ＯＤ600nmで、１２５ｍＬのフラスコ内の２５ｍＬのＳＤ培地中で４８時間、培養物を増殖させた。５０ｍＬの円錐管中、４３００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を採取した。上澄みを廃棄し、新しい１２５ｍＬのフラスコ内で細胞を２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁させた。２５０ｒｐｍおよび３０℃のシェーカーインキュベータ内で５日後に、１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離の後、１ｍＬのアリコートを脂肪酸分析（上記）のために使用し、５ｍＬのアリコートを乾燥細胞質量［「ＤＣＷ」］の決定のために乾燥させた。
【０２２１】
ＤＣＷの決定のために、４３００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって５ｍＬの培養物を採取した。ペレットを１０ｍＬの無菌水中に再懸濁させ、上記のように再度採取した。洗浄したペレットを１ｍＬの水中に再懸濁させ（３回）、予め秤量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を８０℃の真空オーブン内で一晩乾燥させた。細胞の質量を決定した（ｇ／Ｌ）。
【０２２２】
細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］が計算され、ＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度、およびＥＰＡが産生された場合には乾燥細胞質量のパーセント［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］としてのＥＰＡ含量を示すデータと併せて考察される。フラスコアッセイからのデータは、細胞の全乾燥細胞質量［「ＤＣＷ」］、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度、および乾燥細胞質量のパーセント［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］としてのＥＰＡ含量を要約する表で示されるであろう。より具体的には、脂肪酸１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、およびＥＰＡと同定されるであろう。
【０２２３】
実施例１
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ１α−サブユニットをコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定
「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＬａＢＲＩ，Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）の公的なＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベースに対するクエリー配列としてＳｃＳｎｆ１を用いてＢＬＡＳＴ検索を行うことによって、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＳｎｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１３９７１、配列番号２）［「ＳｃＳｎｆ１」］に対するオルソログをヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において同定した（Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４３０（６９９５）：３５−４４（２００４年）も参照）。
【０２２４】
「ＹｌＳｎｆ１」と命名される１つのタンパク質配列は、ＳｃＳｎｆ１に対する実質的な相同性を有すると同定された。配列番号２７のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）配列の同一性は、デフォルトパラメータ（期待しきい値（ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１０、ワードサイズ＝３、スコアリングパラメータマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップコスト：存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）＝１１、伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝１）を用いて、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」タンパク質データベース（全ての非冗長ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ［「ＰＤＢ」］からの３次元構造に由来する配列、ＷＧＳプロジェクトからの環境サンプルを除いて、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＰＩＲおよびＰＲＦの最新の主要なリリースに含まれる配列を含む）内に含有される配列に対する類似性について、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ［「ＮＣＢＩ」］ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．１８（タンパク質−タンパク質Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７年）、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２：５１０１−５１０９（２００５年））検索を実行することによって評価した。配列番号２７が最大類似性を有する配列を要約するＢＬＡＳＴＰ比較の結果は、％同一性、％類似性および期待値に従って報告される。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一であるアミノ酸の割合と定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質の間で同一であるかあるいは保存されているアミノ酸の割合と定義される。「期待値」は、全く偶然にこのサイズのデータベースの検索で期待される所与のスコアとの一致の数を特定する一致の統計的有意性を推定する。
【０２２５】
従って、ＹｌＳｎｆ１（すなわち、配列番号２７）の全長アミノ酸配列をクエリー配列として用いたＢＬＡＳＴＰ検索の結果によって、０．０の期待値でピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＣＢＳ６０５４Ｓｎｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＮ６８１０４）と６８％の同一性および７８％の類似性を共有することが示された（ベストヒット）。さらに、配列番号２７は、０．０の期待値でサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｎｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１３９７１）と６０％の同一性および７１％の類似性を共有した。
【０２２６】
ＹｌＳｎｆ１（配列番号２７）のアライメントは、ＳｃＳｎｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１３９７１、配列番号２）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）のＳｎｆ１相同体（「ＫｌＳｎｆ１」、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８７９７５、配列番号１７）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（Ｓｎｆ１（「ＣａＳｎｆ１」、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ７８１２９、配列番号２１）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｓｎｆ１（「ＣｔＳｎｆ１」、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０２４５３５、配列番号２３）、およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）Ｓｎｆ１（「ＣｇＳｎｆ１」、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ７８１３０、配列番号２５）と共に図４に示される。マルチプルアライメントは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ９．１．０のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）およびデフォルトパラメータ：ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．０５、ギャップ分離ペナルティ＝８、トランジション・ウェイティング（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）＝０）を用いて作製した。保存「ＤＦＧ」および「ＡＰＥ」モチーフにわたるＮ末端活性化−ループセグメントは、図面ではボックス内に示される。
【０２２７】
実施例２
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ１α−サブユニットをコードする遺伝子の欠失は全蓄積脂質レベルおよび脂質不飽和化の増大をもたらす。
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４からの染色体ＳＮＦ１遺伝子をノックアウトすることにより、株Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）を生成するための構築物ｐＹＲＨ１０（図５Ｂ、配列番号３９）の使用を説明する。蓄積脂質レベルに対するＳｎｆ１ノックアウトの効果を決定および比較した。具体的には、Ｓｎｆ１のノックアウトは、その天然Ｓｎｆ１がノックアウトされていない細胞と比べて、細胞中の全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）および脂質不飽和化をもたらした。
【０２２８】
ｐＹＲＨ１０の構築：
プラスミドｐＹＲＨ１０は、以下の構成要素を含有するプラスミドｐＹＰＳ１６１に由来した（図５Ａ）。
【０２２９】
表５：プラスミドｐＹＰＳ１６１（配列番号４０）の説明
【表５】
0005656836.tif 000015
【０２３０】
具体的には、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＮＦ１遺伝子（「ＹｌＳＮＦ１」、配列番号２６）の７０２ｂｐの５’プロモーター領域（配列番号４１）がｐＹＰＳ１６１（配列番号４０）のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換し、ＹｌＳＮＦ１遺伝子の７１９ｂｐの３’ターミネーター領域（配列番号４２）がｐＹＰＳ１６１のＰａｃＩ／ＳｐｈＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ１０（配列番号３９、図５Ｂ）を生じた。
【０２３１】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）ノックアウト株Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）の生成：
ＳＮＦ１ノックアウト構築物ｐＹＲＨ１０（配列番号３９）の精製した４．０ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４を形質転換した（一般的方法）。
【０２３２】
ｓｎｆ１欠失を有する細胞をスクリーニングするために、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および２つの異なるＰＣＲプライマーセットを用いてコロニーＰＣＲを実施した。無処置のＹｌＳＮＦ１遺伝子の１．８ｋＢ領域を増幅するように最初のＰＣＲプライマーセット（すなわち、ＳＮＦ１Ｆｉｉ［配列番号４３］およびＳＮＦ１Ｒｉｉ［配列番号４４］）を設計したので、ｓｎｆ１欠失変異体、すなわちｓｎｆ１Δはバンドを生じないであろう。第２のプライマーセットは、ＳＮＦ１遺伝子が欠失された場合にのみバンドを生じるように設計した。具体的には、一方のプライマー（すなわち、３ＵＴＲ−ＵＲＡ３、配列番号４５）は、導入された４．０ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ破壊断片のベクター配列内の領域に結合し、他方のプライマー（すなわち、３Ｒ−ＳＮＦ１、配列番号４６）は、破壊断片の相同領域の外側の染色体ＳＮＦ１ターミネーター配列に結合する。
【０２３３】
２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、それぞれ４００μＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ、それぞれ２μＭのプライマー、２０μｌの水および２ＵのＴａｑポリメラーゼを含有する反応混合物を用いてコロニーＰＣＲを実施した。以下のように増幅を行った：９４℃で２分間の初期変性の後、９４℃で１分間の変性を３５サイクル、５５℃で１分間のアニーリング、そして７２℃で２分間の伸長。７２℃で５分間の最終伸長サイクルを行った後、４℃で反応を終結させた。
【０２３４】
スクリーニングした２４個のコロニーのうち、２３個は染色体中のランダムな部位に組み込まれたｓｎｆ１ノックアウト断片を有し、従ってｓｎｆ１Δ変異体ではなかったが、ｐＹＲＨ１０断片の存在のために、細胞はｕｒａプレートにおいて増殖できた。２２２４−１および２２２４−２と称されるこれらのランダム組込み体のうちの２つは、脂質産生実験における対照として用いた（以下の表６）。
【０２３５】
スクリーニングしたコロニーの１つは、ｓｎｆ１ノックアウトであった。Ｙ２２２４のこのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ｓｎｆ１Δ変異体をＲＨＹ１１と命名した。
【０２３６】
定量リアルタイムＰＣＲによるヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）ノックアウト株Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）の確認
株ＲＨＹ１１におけるｓｎｆ１ノックアウトのさらなる確認は、ヤロウイア翻訳伸長因子遺伝子ＴＥＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０５４５１０）を対照として用いて、ＹｌＳＮＦ１における定量リアルタイムＰＣＲにより行った。
【０２３７】
初めに、それぞれＹｌＳＮＦ１遺伝子および対照ＴＥＦ１遺伝子を標的とするリアルタイムＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により設計した。具体的には、リアルタイムＰＣＲプライマーｅｆ−３２４Ｆ（配列番号４７）、ｅｆ−３９２Ｒ（配列番号４８）、ＳＮＦ−７３４Ｆ（配列番号４９）およびＳＮＦ−７９６Ｒ（配列番号５０）ならびにＴａｑＭａｎプローブｅｆ−３４５Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号５１で示される）およびＳＮＦ−７５６Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＴＧＣＣＧＧＣＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＴＧ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号５２で示される）を設計した。ＴａｑＭａｎ蛍光発生プローブの５’末端は結合した６−ＦＡＭTM蛍光のレポーター染料を有するが、３’末端はＴＡＭＲＡTM失活剤を含む。全てのプライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０２３８】
１つのコロニーを５０μｌの水中に懸濁させることによってノックアウト候補ＤＮＡを調製した。ＴＥＦ１およびＹｌＳＮＦ１のための反応は、各サンプルにつき３通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応は、反応あたり２０μｌの全容積に対して、それぞれ２０ｐｍｏｌｅの順方向および逆方向プライマー（すなわち、ｅｆ−３２４Ｆ、ｅｆ−３９２Ｒ、ＳＮＦ−７３４ＦおよびＳＮＦ−７９６Ｒ、上記）、５ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブ（すなわち、ｅｆ−３４５ＴおよびＳＮＦ−７５６Ｔ、上記）、１０μｌのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ―Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（カタログＮｏ．ＰＮ４３２６６１４、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μｌのコロニー懸濁液および８．５μｌのＲＮａｓｅ／デオキシリボヌクレアーゼを含まない水を含んだ。反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、以下の条件下で実行した：９５℃で１０分間の初期変性の後、９５℃で１５秒間の変性を４０サイクル、そして６０℃で１分間のアニーリング。６−ＦＡＭTM蛍光を監視することによって、各サイクル中、リアルタイムデータを自動的に収集した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの取扱説明書の通りに、データ正規化のためにＴＥＦ１遺伝子しきい値サイクル（ＣT）値を用いてデータ分析を行った。
【０２３９】
この分析に基づいて、ＲＨＹ１１は妥当なＳｎｆ１ノックアウト（すなわち、ｓｎｆ１Δ）であり、ｐＹＲＨ１０構築物（配列番号３９）は染色体ＹｌＳＮＦ１に組み込まれたと結論付けた。
【０２４０】
脂質産生についてのヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）の評価：
細胞内の全脂質画分および総脂質含量中のＰＵＦＡのパーセントに対するＳｎｆ１ノックアウトの効果を評価するために、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ１１を同等の油性条件下で増殖させた（一般的方法）。
【０２４１】
それぞれの株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表６に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０２４２】
表６：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）中の脂質組成
【表６】
0005656836.tif 000016
【０２４３】
表６の結果は、その天然Ｓｎｆ１がノックアウトされていないＡＴＣＣ＃２０３６２と比べて、Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）中の染色体ｓｎｆ１遺伝子のノックアウトが脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を２２％増大させることを示した。また、ｓｎｆ１Δ株、ＲＨＹ１１では、飽和脂肪酸（１６：０、１８：０）に対する不飽和化脂肪酸（１６：１、１８：１、１８：２）の比率は約６０％増大された。
【０２４４】
脂質産生についてのヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４（Ｕｒａ＋）およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）の評価：
細胞内の全脂質画分および総脂質含量中のＰＵＦＡのパーセントに対するＳｎｆ１ノックアウトの効果を評価するために、染色体中のランダムな部位に組み込まれたＳＮＦ１ノックアウト断片を有するＳＮＦ１野生型株（すなわち、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４（Ｕｒａ＋）株２２２４−１および２２２４−２）およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）株（すなわち、ＲＨＹ１１）を同等の油性条件下で増殖させたが、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）のために上記で使用したものに関して、培養物の採取方法を変更した。具体的には、ＳＤ培地における２日間の増殖の後、ＨＧＭ中で５日間のインキュベーションの最後に同様の最終ＤＣＷ（ｇ／Ｌ）に達するように、Ｙ２２２４（Ｕｒａ＋）およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）培養物の類似の細胞集団（培養物のＯＤ600により判断）をＨＧＭに移した。
【０２４５】
ＤＣＷおよび脂質含量を前述のように決定した。
【０２４６】
それぞれの株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表７に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０２４７】
表７：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ２２２４（Ｕｒａ＋）およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）中の脂質組成
【表７】
0005656836.tif 000017
【０２４８】
上記の表６で説明した結果と同様に、表７の結果は、その天然Ｓｎｆ１がノックアウトされていないＹ２２２４（Ｕｒａ＋）と比べて、Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）中の染色体ＳＮＦ１遺伝子のノックアウトが、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を５０％以上増大させることを示した。ｓｎｆ１Δ変異体、ＲＨＹ１１では、飽和脂肪酸（１６：０、１８：０）に対する不飽和化脂肪酸（１６：１、１８：１、１８：２）の比率は約６０％以上増大された。
【０２４９】
実施例３
ＥＰＡ産生ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕにおけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ１α−サブユニットをコードする遺伝子の欠失は全蓄積脂質レベルの増大および脂質不飽和化をもたらす。
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の、特に株Ｙ４１８４ＵのＥＰＡ産生改変株からの染色体ＳＮＦ１遺伝子をノックアウトするための構築物ｐＹＲＨ１８（図６、配列番号５３）の使用を説明する。ＳＮＦ１ノックアウト構築物断片によるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕの形質転換は、株Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）をもたらした。蓄積脂質レベルおよびＥＰＡ産生に対するＳｎｆ１ノックアウトの効果を決定および比較した。具体的には、ＳＮＦ１のノックアウトは、その天然Ｓｎｆ１がノックアウトされていない細胞と比べて、全脂質の増大および脂質不飽和化をもたらした。
【０２５０】
構築物ｐＹＲＨ１８：
プラスミドｐＹＲＨ１８は、プラスミドｐＹＲＨ１０（実施例２、配列番号３９）に由来した。最初に、ＹｌＳＮＦ１遺伝子（配列番号２６）の１４４８ｂｐの５’プロモーター領域（配列番号５４）が、ＹｌＳＮＦ１の７０２ｂｐの５’プロモーター領域を含むｐＹＲＨ１０のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換し、それにより、組込みを容易にするより長い相同性領域を作製した。次に、ｌｏｘＰリコンビナーゼ認識部位（プラスミドｐＹＬｏｘＵ−ＥＣＨ（配列番号５８）から切除）により隣接されるヤロウイアＵＲＡ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ３０６４２１）を含む１．６ｋＢ断片を用いて、ｐＹＲＨ１０のＢｓｉＷＩ／ＳｐｈＩ断片を置換した。この結果、ｐＹＲＨ１８（配列番号５３、図６）が生じた。
【０２５１】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）ノックアウト株Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）の作製：
Ｓｎｆ１ノックアウト構築物ｐＹＲＨ１８（配列番号５３）の精製した３．９ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕを形質転換した（一般的方法）。実施例２に記載される方法を用いて、株Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）を単離した。
【０２５２】
コロニーＰＣＲによってスクリーニングした７８個のコロニーのうち、５５個は染色体中のランダムな部位に組み込まれたＳＮＦ１ノックアウト断片を有し、従ってｓｎｆ１Δ変異体ではなかったが、ｐＹＲＨ１８断片の存在のために、細胞はウラシルを欠いたプレートにおいて増殖できた。Ｃｏｎｔ−１〜Ｃｏｎｔ−８と称されるこれらのランダム組込み体のうちの８個は、脂質産生実験における対照として用いた（以下の表８〜１０および１２〜１６）。
【０２５３】
残りの２３個のコロニーは、Ｙ４１８４Ｕ株バックグラウンド内にｓｎｆ１ノックアウトを含有した。これらの２３個のｓｎｆ１Δ変異体の中で、１１個をさらなる脂質分析のためにランダムに選択し、ＲＨＹ４３〜ＲＨＹ５３と命名した。ｓｎｆ１Δ株におけるＳｎｆ１ノックアウトのさらなる確認は、実施例２に記載されるように、ＹｌＳＮＦ１遺伝子における定量リアルタイムＰＣＲにより行った。
【０２５４】
脂質産生についてのヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）の評価：
総脂質含量およびＦＡ組成に対するＳｎｆ１ノックアウトの影響を評価するために、一般的方法に記載されるように、選択したＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株（すなわち、対照株Ｃｏｎｔ−１、Ｃｏｎｔ−２およびＣｏｎｔ−３、およびｓｎｆ１Δ変異体株ＲＨＹ４３〜ＲＨＹ５３）を同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、ＳＤ中で２日後に遠心分離によって１ｍＬの細胞培養物を採取して、脂質含量の決定を容易にしたことであった。
【０２５５】
それぞれの株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表８に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０２５６】
【表８−１】
0005656836.tif 000018
【表８−２】
0005656836.tif 000019
【０２５７】
表８の結果は、その天然Ｓｎｆ１がノックアウトされていない株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）と比べて、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）中の染色体ｓｎｆ１遺伝子のノックアウトが、ＳＤ培地中で２日間の培養後には１６０％、そしてＨＧＭ中で５日間のインキュベーション後には約６１％、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を増大させることを示した。また、ＳＤ培地中で２日後およびＨＧＭ中で５日後のいずれも場合も、ｓｎｆ１Δ変異体中の不飽和化１８：１および１８：２脂肪酸は、飽和１８：０脂肪酸と比べて著しく増大した。ｓｎｆ１Δ株中の脂肪酸不飽和化の増大は、実施例２の結果と一致する。
【０２５８】
ＨＧＭ中で５日間の最後に最大の平均ＥＰＡ％ＴＦＡを生じる上記のＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株（株ＲＨＹ４３、ＲＨＹ４４、ＲＨＹ４６、ＲＨＹ４７およびＲＨＹ４９、ならびにＲＨＹ４８である）を、Ｃｏｎｔ−３、Ｃｏｎｔ−４、Ｃｏｎｔ−５、Ｃｏｎｔ−６、Ｃｏｎｔ−７およびＣｏｎｔ−８の培養物と共に上記のように再度２通りで増殖させた。上述のように培養物を分析した。結果は表９に示される。ＥＰＡ％ＤＣＷも決定した。
【０２５９】
【表９−１】
0005656836.tif 000020
【表９−２】
0005656836.tif 000021
【０２６０】
表９の結果は、対照Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）株と比べて、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株の平均脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］が、ＳＤ培地中で２日後に約１３３％、そしてＨＧＭ中で５日後に６０％増大されることを示した。またＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株は、ＳＤ培地中で２日後およびＨＧＭ中で５日後のいずれも場合も、ｓｎｆ１Δ変異体中の不飽和化１８−Ｃ脂肪酸（１８：１、１８：２）の著しい増大も示し、表８の結果と一致する。ｓｎｆ１Δ株中の脂肪酸不飽和化の増大も実施例２の結果と一致する。
【０２６１】
Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株の全ＥＰＡ％ＴＦＡは対照と同等である（表８）。しかしながら、総脂質含量の著しい増大のために、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株は、対照よりも平均で５０％以上高いＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を示した。
【０２６２】
実施例４
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）の全脂質およびＰＵＦＡ産生についての時間経過実験
本実施例は、ｓｎｆ１Δ変異体の油合成のパターンに対するさらなる洞察を得るために、Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）株（すなわち、実施例２からの株ＲＨＹ１１）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株（すなわち、実施例３からの株ＲＨＹ４６）を用いて実施した時間経過実験を説明する。
【０２６３】
それぞれの時間経過実験を通して６回または７回の異なる時点で、脂質分析のために各ｓｎｆ１Δ株サンプルおよび適切な対照サンプルを取った。従って、初めに以下の培養物：Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ１１、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）ｃｏｎｔ−４（実施例３）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ４６をＳＤ培地に播種して、１７５ｍＬの全培養容積中に約０．１の開始ＯＤ600を得た。次に、各細胞培養物を１２５ｍＬのフラスコ中の７つのアリコート（それぞれ２５ｍＬ）に分けた。全ての培養物を通気しながら３０℃で４８時間インキュベートした後、以下に記載されるように、ＤＣＷおよび脂質分析のために最初の時点（０日目）のサンプル（２５ｍＬ）を取った。次に、各１５０ｍＬの培養物の残りの全容積を合わせ、２５０ｍＬの管内で、４３００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上澄みを廃棄し、細胞を１５０ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁させ、新しい６個の１２５ｍＬのフラスコにそれぞれ２５ｍＬずつ移した。次に、通気しながら３０℃で１６８時間まで細胞をインキュベートした。それぞれの時点で、１つの２５ｍＬのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２培養物、１つの２５ｍＬのＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ１１培養物、１つの２５ｍＬのＹ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）Ｃｏｎｔ−４培養物、および１つの２５ｍＬのＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ４６培養物を脂質分析のために使用した。
【０２６４】
一般的方法に従って、５ｍＬのＳＤ増殖培養物またはＨＧＭ増殖培養物からの細胞のいずれかを用いてＤＣＷを決定した。
【０２６５】
一般的方法に従って、１ｍＬのＳＤ増殖培養物またはＨＧＭ増殖培養物からの細胞のいずれかを用いて脂質含量を決定した。
【０２６６】
ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）についての７日間の時間経過にわたるＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表１０に示され、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）についての同等の結果は表１１に示される。同様に、ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）ついての時間経過にわたる結果は図７Ａに、そしてＹ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）についての時間経過にわたる結果は図７Ｂにそれぞれグラフで示される。
【０２６７】
表１０：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＹ２２２４（ｓｎｆ１Δ）中の脂質含量および組成の時間経過
【表１０】
0005656836.tif 000022
【０２６８】
表１１：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）中の脂質含量および組成の時間経過
【表１１】
0005656836.tif 000023
【０２６９】
表１０の結果は、ＡＴＣＣ＃２０３６２の対照培養物と比較して、分析した全ての時点で、Ｙ２２２４バックグラウンドにおける染色体ＳＮＦ１遺伝子のノックアウトが総脂質含量を増大させることを示した。しかしながら、最も著しいのは、０日目における全脂質産生の差がＳＤ培地における２日間の増殖の最後に相当することであり、特に、Ｙ２２２４（ｓｎｆ１Δ）株は、対照よりも１７０％高い脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を有した。ｓｎｆ１Δ変異体はＳＤ培地中窒素源の存在下でも油の蓄積を示し、１）細胞の脂質蓄積を調節する制御メカニズムがこの変異体により破壊されること、および２）所与の増殖条件下で細胞が構成的に油性であることを示唆した。他の酵母、植物、および哺乳類の中心的な炭素代謝におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの役割を考慮すると、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼは、恐らく、脂質蓄積のための制御タンパク質として機能すると仮定される。
【０２７０】
表１１の結果は表１０の結果と一致して、Ｙ４１８４Ｕバックグラウンドにおける染色体ＳＮＦ１遺伝子のノックアウトが、対照培養物と比べて著しく高い油の蓄積をもたらすことを示した。ＳＤ培地中の２日間の増殖の最後に相当する０日目の脂質蓄積は、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）において著しく増大され、さらに、ｓｎｆ１Δ変異体中の含油量は時間経過を通して連続的により高かった。これは、恐らくβ−酸化および／またはリパーゼ作用のために、３日目に最高になってそれから低下する対照株における油蓄積とは対照的である。ＥＰＡ％ＴＦＡは、対照とｓｎｆ１Δ培養物との間で類似していたが、ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べてＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）のほうが約２倍高かった。
【０２７１】
興味深いことに、株ＲＨＹ４６（Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ））を複合培地（すなわち、ＦＭ培地、６．７０ｇ／ＬのＹｅａｓｔ窒素ベース、６．００ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．００ｇのＫ2ＨＰＯ4、１．５０ｇのＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏ、２０ｇのグルコースおよび５．００ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）を含む、データは示されず）中で増殖させたときには、ｓｎｆ１Δの構成的な脂質蓄積は観察されなかった。しかしながら、細胞を高グルコース培地［ＨＧＭ］に移した後、株ＲＨＹ４６は、前記のように、対照株よりも著しく高い脂質含量を有した。Ｓｎｆ１とは関係なくＦＭ培地中で活性な、脂質蓄積に対する別の阻害要素が存在し得ると思われる。
【０２７２】
実施例５
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ４γ−サブユニットをコードする遺伝子の欠失は、全蓄積脂質レベルを増大させる
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＳＮＦ４遺伝子の同定、ノックアウト構築物ｐＹＲＨ２８（配列番号５９）の合成、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）の単離を説明する。蓄積脂質レベルに対する染色体ＳＮＦ４ノックアウトの効果を決定および比較した。具体的には、ＳＮＦ４のノックアウトは、その天然ＳＮＦ４がノックアウトされていない細胞と比較して、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合（ＴＦＡ％ＤＣＷ）で測定）をもたらした。
【０２７３】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ４γ−サブユニットをコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定：
ＹｌＳｎｆ１（実施例１）について記載したのと同様の方法で、「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」の公的なＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース内の遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ０３４２１ｇ（配列番号２８）は、ｓｐ｜Ｐ１２９０４サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＧＬ１１５ｗ  ＳＮＦ４核制御タンパク質に非常に類似すると同定された。しかしながら、注釈は、１１１６ｂｐの遺伝子が、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンを欠いた「ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）偽遺伝子」であることを示す。
【０２７４】
配列番号２８周囲の上流配列のさらなる分析は、１０塩基上流の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンを同定した。配列番号２９で示される１１２６ｂｐの配列はヌクレオチド塩基２５−１７５にイントロンを含有し、翻訳されたタンパク質は配列番号３０で示される配列を有し、「ＹｌＳｎｆ４」という名称を有すると仮定される。配列番号３０はヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ４γ−サブユニットをコードし、機能性タンパク質をコードすることが予期される。配列番号３０の全長アミノ酸配列をクエリー配列として用いるＢＬＡＳＴ「ｎｒ」タンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴＰ検索は、４ｅ−１２９の期待値でピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＣＢＳ６０５４Ｓｎｆ４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００１３８３７６１）と６９％の同一性および８５％の類似性を共有することを示した（ベストヒット）。さらに、配列番号３０は、６ｅ−１１６の期待値でサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｎｆ４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ３０４７０、配列番号４）と６５％の同一性および８１％の類似性を共有した。
【０２７５】
ｐＹＲＨ２８の構築：
プラスミドｐＹＰＳ１６１（実施例２、配列番号４０）に由来するプラスミドｐＹＲＨ２８は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのＳＮＦ４遺伝子座の完全な欠失を可能にするように設計した。具体的には、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＮＦ４遺伝子（「ＹｌＳＮＦ４」、配列番号２９）の２３６４ｂｐの５’プロモーター領域（配列番号６０）がｐＹＰＳ１６１（配列番号４０、図５Ａ）のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換し、ＹｌＳＮＦ４遺伝子の１４９３ｂｐの３’ターミネーター領域（配列番号６１）がｐＹＰＳ１６１のＰａｃＩ／ＳｐｈＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ２８（配列番号５９）を生じた。
【０２７６】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）ノックアウト株Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）の作製：
一般的方法に従って、ｓｎｆ４ノックアウト構築物ｐＹＲＨ２８（配列番号５９）の精製した６．５ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕを形質転換した。
【０２７７】
ｓｎｆ４欠失を有する細胞をスクリーニングするために、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および２つの異なるＰＣＲプライマーセットを用いてコロニーＰＣＲを実施した。無処置のＹｌＳＮＦ４遺伝子の１．０ｋＢ領域を増幅するように最初のＰＣＲプライマーセット（すなわち、ＳＮＦ４Ｆｉｉ［配列番号６２］およびＳＮＦ４Ｒｉｉ［配列番号６３］）を設計したので、ｓｎｆ４欠失変異体、すなわちｓｎｆ４Δはバンドを生じないであろう。第２のプライマーセットは、ｓｎｆ４遺伝子が欠失された場合にのみバンドを生じるように設計した。具体的には、一方のプライマー（すなわち、３ＵＴＲ−ＵＲＡ３、配列番号４５）は、導入された６．５ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ破壊断片のベクター配列内の領域に結合し、他方のプライマー（すなわち、ＳＮＦ４−ｃｏｎｆ、配列番号６４）は、破壊断片の相同領域の外側の染色体ＳＮＦ４ターミネーター配列に結合する。
【０２７８】
実施例２に記載されるようにコロニーＰＣＲを実施した。スクリーニングした３０個のコロニーのうち、１９個は染色体中のランダムな部位に組み込まれたＳＮＦ４ノックアウト断片を有し、従ってｓｎｆ４Δ変異体ではなかったが、ｐＹＲＨ２８断片の存在のために、細胞はＵｒａ−プレートにおいて増殖できた。スクリーニングした１１個のコロニーはｓｎｆ４ノックアウトを含有した。Ｙ４１８４Ｕ株Ｙ４１８４Ｕ株バックグラウンド内のこれらのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ｓｎｆ４Δ変異体をＲＨＹ８６〜ＲＨＹ９６と命名した。
【０２７９】
脂質産生についてのヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）の評価：
総脂質含量およびＦＡ組成に対するｓｎｆ４ノックアウトの効果を評価するために、一般的方法に記載されるように、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株Ｃｏｎｔ−１およびＣｏｎｔ−２（実施例３）、ならびにＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）株ＲＨＹ８６〜ＲＨＹ９６を、同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、ＳＤ中で２日後に遠心分離によって１ｍＬの細胞培養物を採取して脂質含量の決定を容易にし、５ｍＬＳＤ培養物を処理してＤＣＷを決定したことであった。
【０２８０】
それぞれの株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は、以下の表１２に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０２８１】
【表１２−１】
0005656836.tif 000024
【表１２−２】
0005656836.tif 000025
【０２８２】
表１２の結果は、その天然Ｓｎｆ４がノックアウトされていない株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）と比べて、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）中の染色体ｓｎｆ４遺伝子のノックアウトが、ＳＤ培地中で２日間の培養後には脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を３倍増大させ、そしてＨＧＭ中で５日間のインキュベーション後には脂質含量を４４％高く増大させることを示した。平均ＥＰＡ％ＴＦＡは、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株よりもＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）において約１４％低かったが、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は、主に総脂質含量の増大のために、ｓｎｆ４Δ株のほうが２３％高かった。
【０２８３】
ＨＧＭ中で５日間の最後に最大の平均ＥＰＡ％ＴＦＡを生じる上記のＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）株（株ＲＨＹ８６、ＲＨＹ８９およびＲＨＹ９３である）を、Ｃｏｎｔ−１およびＣｏｎｔ−２の培養物と共に上記のように再度２通りで増殖させた。直接比較のために、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ４３およびＲＨＹ４６（実施例３）も含めた。上述のように培養物を分析した。結果は表１３に示される。
【０２８４】
表１３：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）、Ｙ４８１４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）およびＹ４８１４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）中の脂質組成
【表１３】
0005656836.tif 000026
【０２８５】
表１３の結果は、その天然ＳＮＦ１またはＳＮＦ４がノックアウトされていない株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）と比べて、Ｙ４１８４Ｕにおける染色体ＹｌＳＮＦ１またはＹｌＳＮＦ４遺伝子のいずれかのノックアウトが、ＳＤ培地中で２日間の培養後に約３倍、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を増大させることを示した。ＨＧＭ中で５日間のインキュベーション後、両方の変異体における総脂質含量は、対照の約１５０％であった。
【０２８６】
Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）株の全ＥＰＡ％ＴＦＡは、対照（すなわち、Ｃｏｎｔ１およびＣｏｎｔ２株）と同等であった。総脂質含量の著しい増大のために、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ４Δ）株は、対照よりも平均して高いＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を示した。
【０２８７】
実施例６
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのβ−サブユニットをコードする遺伝子の欠失は、全蓄積脂質レベルを増大させる。
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの２つの推定上のβ−サブユニットの同定、ノックアウト構築物ｐＹＲＨ３０（配列番号６５）およびｐＹＲＨ３３（配列番号６６）の合成、ならびにＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｉｐ２Δ）の単離を説明する。蓄積脂質レベルに対する染色体ノックアウトの効果を決定および比較した。具体的には、Ｇａｌ８３のノックアウトは、その天然ＧＡＬ８３がノックアウトされていない細胞と比べて、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）をもたらした。
【０２８８】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのβ−サブユニットをコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定：
ＹｌＳｎｆ１（実施例１）について記載したのと同様の方法で、「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」の公的なＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース内のＹＡＬＩ０Ｅ１３９２６ｐ（配列番号３２）およびＹＡＬＩ０Ｃ００４２９ｐ（配列番号３４）は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｇａｌ８３β−サブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ７２８９３、配列番号１０）に非常に類似すると同定された。
【０２８９】
ＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ１３９２６ｐ（配列番号３２）は、２ｅ−６６の期待値で、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）ＣＢＳ１３８からの仮想タンパク質ＣＡＧＬ０Ａ０３６９６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿４４４９２８．１）と最大類似性を共有し、５２％の同一性および６６％の類似性であった。次のベストヒットは、５２％の同一性、６３％の類似性および２ｅ−６５の期待値を有するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＤＮ６２９９６．１のＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｇａｌ８３タンパク質に対してであった。
【０２９０】
遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ００４２９ｐ（配列番号３４）は、４ｅ−４７の期待値で配列番号１０と４４％の同一性および５９％の類似性を共有した（ベストヒット）。
【０２９１】
相同性によって、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｇａｌ８３はＹＡＬＩ０Ｅ１３９２６ｐに対して最も相同であり、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｉｐ２は、ＹＡＬＩ０Ｃ００４２９ｐに対して最も相同である。上記の分析に基づいて、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ１３９２６ｇ（配列番号３１）に「ＹｌＧＡＬ８３」という名称を与え、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ００４２９ｇ（配列番号３３）に「ＹｌＳＩＰ２」という名称を与えた。
【０２９２】
ｐＹＲＨ３０およびｐＹＲＨ３３の構築：
プラスミドｐＹＲＨ３０およびｐＹＲＨ３３はいずれもプラスミドｐＹＰＳ１６１（実施例２）に由来し、それぞれ、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からＹｌＧＡＬ８３およびＹｌＳＩＰ２遺伝子座を欠失するように設計された。具体的には、ＹｌＧＡＬ８３遺伝子（配列番号３１）の７４５ｂｐの５’プロモーター領域（配列番号６７）がｐＹＰＳ１６１（配列番号４０、図５Ａ）のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換し、ＹｌＧＡＬ８３遺伝子の２０３０ｂｐの３’ターミネーター領域（配列番号６８）がｐＹＰＳ１６１のＰａｃＩ／ＳｐｈＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ３０（配列番号６５）を生じた。
【０２９３】
同様に、ＹｌＳＩＰ２遺伝子（配列番号３３）の２９３３ｂｐの５’プロモーター領域（配列番号６９）がｐＹＰＳ１６１（配列番号４０、図５Ａ）のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換し、ＹｌＳＩＰ２遺伝子の１７０８ｂｐの３’ターミネーター領域（配列番号７０）がｐＹＰＳ１６１のＰａｃＩ／ＳｐｈＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ３３（配列番号６６）を生じた。
【０２９４】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）ノックアウト株Ｙ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｉｐ２Δ）の生成：
ＹｌＧＡＬ８３ノックアウト構築物ｐＹＲＨ３０（配列番号６５）の精製した５．４ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片、またはＹｌＳＩＰ２ノックアウト構築物ｐＹＲＨ３３（配列番号６６）の７．３ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片のいずれかで、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕを個々に形質転換した。
【０２９５】
ｇａｌ８３またはｓｉｐ２欠失を有する細胞をスクリーニングするために、ヤロウイアＴＥＦ１遺伝子を対照として用いて（実施例２）、ＹｌＧＡＬ８３およびＹｌＳＩＰ２における定量リアルタイムＰＣＲを実施した。ＹｌＧＡＬ８３およびＹｌＳＩＰ２遺伝子を標的とするように、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、リアルタイムＰＣＲプライマーＧＡＬ８３−３６７Ｆ（配列番号７１）、ＧＡＬ８３−４３０Ｒ（配列番号７２）、ＳＩＰ２−８２７Ｆ（配列番号７３）およびＳＩＰ２−８８９Ｒ（配列番号７４）、ならびにＴａｑＭａｎプローブＧＡＬ８３−３８８Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＡＣＡＴＣ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号７５で示される）およびＳＩＰ２−８４７Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＣＣＴＡＴＧＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＣＧＧ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号７６で示される）を設計した。プライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０２９６】
１つのコロニーを５０μｌの水中に懸濁させることによってノックアウト候補ＤＮＡを調製した。ＴＥＦ１、ＹｌＳＩＰ２およびＹｌＧＡＬ８３のための反応は、各サンプルにつき３通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応の組成は、順方向および逆方向プライマーが、ＳＮＦ−７３４ＦおよびＳＮＦ−７９６Ｒ（配列番号４９および５０）とは対照的にＧＡＬ８３−３６７Ｆ、ＧＡＬ８３−４３０Ｒ、ＳＩＰ２−８２７ＦおよびＳＩＰ２−８８９Ｒ（上記）を含み、ＴａｑＭａｎプローブが、ＳＮＦ−７５６Ｔ（配列番号５２で示されるヌクレオチド配列）とは対照的にＧＡＬ８３−３８８ＴおよびＳＩＰ２−８４７Ｔ（上記）を含んでいた点を除いて、実施例２に記載されるのと同一であった。増幅、データ収集およびデータ分析は、実施例２に記載されるとおりであった。
【０２９７】
スクリーニングした９０個のコロニーのうち２個だけが、Ｙ４１８４Ｕ株バックグラウンド内にＹｌＧＡＬ８３ノックアウトを含有し、従ってｇａｌ８３Δ変異体であった。これらの株はＲＨＹ１１４およびＲＨＹ１１５と命名した。同様に、スクリーニングした９０個のコロニーのうち３個だけが、Ｙ４１８４Ｕ株バックグラウンド内にＹｌＳＩＰ２ノックアウトを含有し、従ってｓｉｐ２Δ変異体であった。これらの株をＲＨＹ１０１、ＲＨＹ１０２、およびＲＨＹ１０９と命名した。
【０２９８】
残りの１７５個のコロニーは、ゲノム内のランダムな部位に組み込まれたＧＡＬ８３およびＳＩＰ２ノックアウト断片を有し、従って、ｇａｌ８３Δまたはｓｉｐ２Δ変異体ではなかった。
【０２９９】
脂質産生についてのヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）、Ｙ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）Ｙ４１８４Ｕ（ｓｉｐ２Δ）の評価：
総脂質含量およびＦＡ組成に対するｇａｌ８３およびｓｉｐ２ノックアウトの効果を評価および比較するために、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株Ｃｏｎｔ−１およびＣｏｎｔ−２（実施例３）、Ｙ４１８４（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ４６（実施例３）、Ｙ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）株ＲＨＹ１１４およびＲＨＹ１１５、ならびにＹ４１８４Ｕ（ｓｉｐ２Δ）株ＲＨＹ１０１、ＲＨＹ１０２、およびＲＨＹ１０９を、一般的方法に記載されるように同等の油性条件下で増殖させた。
【０３００】
一般的方法における手順に対する唯一の例外は、各株の培養物を２５ｍＬのＳＤ培地中約０．３の開始ＯＤ600（約０．１の開始ＯＤ600に対して）で増殖させ、ＳＤ中２日後に遠心分離により１ｍＬの細胞培養物を採取して脂質含量の決定を容易にし、５ｍＬのＳＤ培養物を処理してＤＣＷを決定したことであった。
【０３０１】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照、Ｙ４１８４（ｓｎｆ１Δ）、Ｙ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）および４１８４Ｕ（ｓｉｐ２Δ）株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表１４に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０３０２】
【表１４−１】
0005656836.tif 000027
【表１４−２】
0005656836.tif 000028
【０３０３】
表１４の結果は、その天然Ｇａｌ８３がノックアウトされていない株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）と比べて、Ｙ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）中の染色体ＧＡＬ８３遺伝子のノックアウトが、ＳＤ培地中で２日間の培養後には脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約２倍増大させ、ＨＧＭ中で５日間のインキュベーション後には脂質含量を２０％増大させることを示した。さらに、平均ＥＰＡ％ＴＦＡは、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株よりもＹ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）においてわずかに増大し（約１０％）、対照に対して平均して約３７％のＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］の増大が得られた。
【０３０４】
対照的に、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｉｐ２Δ）は、対照と比べて脂質蓄積に対する著しい効果を示さなかった。Ｓｎｆ１−Ｓｉｐ２複合体はＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における脂質蓄積に関与しないかもしれない。あるいは、Ｇａｌ８３が、単に、この生物におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ複合体の主要なβ−サブユニットであることもあり得る。後者が事実であれば、Ｓｉｐ２は、本実施例で試験した条件とは異なる条件下で、脂質蓄積において重要な役割を果たし得る。
【０３０５】
Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）と比べて、Ｙ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）は、増殖培地および油性培地の両方において、より少ない脂質蓄積を示した。
【０３０６】
この実験の重複が、Ｙ４１８４Ｕ（ｇａｌ８３Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｉｐ２Δ）変異体の総脂質含量およびＥＰＡ生産性に関してほとんど同一の結果をもたらすことは注目すべきである（データは示さず）。
【０３０７】
実施例７
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの上流キナーゼ遺伝子の欠失は全蓄積脂質レベルを増大させる
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの２つの上流キナーゼの同定、ノックアウト構築物ｐＹＲＨ３１（配列番号７７）およびｐＹＲＨ５４（配列番号７８）の合成、ならびにＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（ｓａｋ１Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｅｌｍ１Δ）の単離を説明する。蓄積脂質レベルに対する染色体ノックアウトの効果を決定および比較した。ＹｌＳＡＫ１のノックアウトは、その天然Ｓａｋ１がノックアウトされていない細胞と比較して、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）をもたらした。
【０３０８】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの上流キナーゼをコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定：
サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）には、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ３つの上流キナーゼ：Ｓａｋ１、Ｔｏｓ３およびＥｌｍ１が存在する。Ｓｎｆ１のこれらの３つの上流キナーゼは、ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのリン酸化および活性化において冗長な役割を有する。
【０３０９】
ＹｌＳｎｆ１（実施例１）について記載したのと同様の方法で、「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」の公的なＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース内のＹＡＬＩ０Ｄ０８８２２ｐ（配列番号３６）およびＹＡＬＩ０Ｂ１７５５６ｐ（配列番号３８）は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓａｋ１相同体、Ｓａｋ１、Ｔｏｓ３およびＥｌｍ１に対する相同性を有するＳＮＦ１の推定上の上流キナーゼであると同定された。より具体的には、上記のＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｄ０８８２２ｇ（配列番号３６）によってコードされるタンパク質が最大類似性を共有したのは、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）ＣＢＳ１３８からの仮想タンパク質ＣＡＧＬ０Ｋ０２１６７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿４４８３１９．１、ｓｐ｜Ｐ３８９９０  Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＥＲ１２９ｗセリン／スレオニン−タンパク質キナーゼと類似性であるとその中で注釈される、類似性により開始）であり、５５％の同一性および６７％の類似性と１ｅ−８６の期待値（断片＃１）、ならびに３２％の同一性および５３％の類似性と４ｅ−０５の期待値（断片＃２）を有した。第２のベストヒットはアシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＡＴＣＣ＃１０８９５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿９８３３５１）のＡＣＬ０５３Ｃｐタンパク質に引きつけられ、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＥＲ１２９Ｗ（ＰＡＫ１）およびＹＧＬ１７９Ｃ（ＴＯＳ３）の相同体と注釈される。配列番号３６およびＮＰ＿９８３３５１は、５２％の同一性、６５％の類似性および２ｅ−８４の期待値を共有し（断片＃１）、アライメントの断片＃２は３１％の同一性および５５％の類似性（０．００１の期待値）を共有した。
【０３１０】
ＹＡＬＩ０Ｂ１７５５６ｐ（配列番号３８）は、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）ＲＳからの仮想タンパク質ＣＩＭＧ＿０６２１６と（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００１２４２３２０）最大類似性を共有した。タンパク質は、４４％の同一性、６０％の類似性および３ｅ−８６の期待値を共有した。第２のベストヒットは、ボトリオチニア・フケリアナ（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＷ８２７１１）のカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼに引きつけられ、４２％の同一性、６０％の類似性および６ｅ−８３の期待値を共有した。
【０３１１】
ＹＡＬＩ０Ｄ０８８２２ｐ（配列番号３６）はＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓａｋ１に対して最高の相同性を示したが、ＹＡＬＩ０Ｂ１７５５６ｐ（配列番号３８）はＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓａｋ１およびＥｌｍ１タンパク質の両方に相同であったので、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｄ０８８２２ｇ（配列番号３５）に「ＹｌＳＡＫ１」という名称を与え、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ１７５５６ｇ（配列番号３７）に「ＹｌＥＬＭ１」という名称を与えた。
【０３１２】
ｐＹＲＨ３１およびｐＹＲＨ５４の構築：
プラスミドｐＹＲＨ３１およびｐＹＲＨ５４はいずれもプラスミドｐＹＰＳ１６１（実施例２）に由来し、それぞれ、ＹｌＥＬＭ１およびＹｌＳＡＫ１遺伝子座を欠失するように設計された。具体的には、ＹｌＥＬＭ１遺伝子（配列番号３７）の２５４２ｂｐの５’プロモーター領域（配列番号７９）がｐＹＰＳ１６１（配列番号４０、図５Ａ）のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換し、ＹｌＥＬＭ１遺伝子の１７５７ｂｐの３’ターミネーター領域（配列番号８０）がｐＹＰＳ１６１のＰａｃＩ／ＳｐｈＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ３１（配列番号７７）を生じた。
【０３１３】
同様に、ＹｌＳＡＫ１遺伝子（配列番号３５）の１０３８ｂｐの５’プロモーター領域（配列番号８１）がｐＹＰＳ１６１（配列番号４０、図５Ａ）のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換し、ＹｌＳＡＫ１遺伝子の１７１７ｂｐの３’ターミネーター領域（配列番号８２）がｐＹＰＳ１６１のＰａｃＩ／ＳｐｈＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ５４（配列番号７８）を生じた。
【０３１４】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）ノックアウト株Ｙ４１８４Ｕ（ｅｌｍ１Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｓａｋ１Δ）の生成：
ｅｌｍ１ノックアウト構築物ｐＹＲＨ３１（配列番号７７）の精製した６．９ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片、またはｓａｋ１ノックアウト構築物ｐＹＲＨ５４（配列番号７８）の５．４ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕを形質転換した。
【０３１５】
ｅｌｍ１またはｓａｋ１欠失を有する細胞をスクリーニングするために、ヤロウイアＴＥＦ１遺伝子を対照として用いて（実施例２）、ＹｌＥＬＭ１およびＹｌＳＡＫ１における定量リアルタイムＰＣＲを実施した。ＹｌＥＬＭ１およびＹｌＳＡＫ１遺伝子を標的とするように、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、リアルタイムＰＣＲプライマーＥＬＭ１−１４０６Ｆ（配列番号８３）、ＥＬＭ１−１４６７Ｒ（配列番号８４）、ＳＡＫ１−２１０Ｆ（配列番号８５）おびＳＡＫ１−２７２Ｒ（配列番号８６）、ならびにＴａｑＭａｎプローブＥＬＭ１−１４３１Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号８７で示される）およびＳＡＫ１−２３１Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＣＡＴＣＡＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＴ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号８８で示される）を設計した。プライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０３１６】
１つのコロニーを５０μｌの水中に懸濁させることによってノックアウト候補ＤＮＡを調製した。ＴＥＦ１、ＹｌＥＬＭ１およびＹｌＳＡＫ１のための反応は、各サンプルにつき３通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応の組成は、順方向および逆方向プライマーが、ＳＮＦ−７３４ＦおよびＳＮＦ−７９６Ｒ（配列番号４９および５０）とは対照的にＥＬＭ１−１４０６Ｆ、ＥＬＭ１−１４６７Ｒ、ＳＡＫ１−２１０ＦおよびＳＡＫ１−２７２Ｒ（上記）を含み、ＴａｑＭａｎプローブが、ＳＮＦ−７５６Ｔ（配列番号５２で示されるヌクレオチド配列）とは対照的にＥＬＭ１−１４３１ＴおよびＳＡＫ１−２３１Ｔ（上記）を含んでいた点を除いて、実施例２に記載されるのと同一であった。増幅、データ収集およびデータ分析は、実施例２に記載されるとおりであった。
【０３１７】
スクリーニングした９０個のコロニーのうち２個だけが、Ｙ４１８４Ｕ株バックグラウンド内にＹｌＥＬＭ１ノックアウトを含有し、従ってｅｌｍ１Δ変異体であった。これらの株はＲＨＹ９８およびＲＨＹ９９と命名した。同様に、スクリーニングした８１個のコロニーのうち１１個が、Ｙ４１８４Ｕ株バックグラウンド内にＹｌＳＡＫ１ノックアウトを含有し、従ってｓａｋ１Δ変異体であった。これらの株はＲＨＹ１４１〜ＲＨＹ１５１と命名した。
【０３１８】
残りの１５８個のコロニーは、ゲノム内のランダムな部位に組み込まれたＥＬＭ１およびＳＡＫ１ノックアウト断片を有し、従って、ｅｌｍ１Δまたはｓａｋ１Δ変異体ではなかった。
【０３１９】
脂質産生についてのヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）、Ｙ４１８４Ｕ（ｅｌｍ１Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｓａｋ１Δ）の評価：
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のｅｌｍ１およびｓａｋ１ノックアウトの、総脂質含量およびＦＡ組成に対する効果を評価および比較するために、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株Ｃｏｎｔ−１およびＣｏｎｔ−２（実施例３）、Ｙ４１８４（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ４６（実施例３）、Ｙ４１８４Ｕ（ｅｌｍ１Δ）株ＲＨＹ９８およびＲＨＹ９９、ならびにＹ４１８４Ｕ（ｓａｋ１Δ）株ＲＨＹ１４１〜ＲＨＹ１５１を、一般的方法に記載されるように同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、一般的方法における手順に対する唯一の例外は、各株の培養物を２５ｍＬのＳＤ培地中約０．３の開始ＯＤ600（約０．１の開始ＯＤ600に対して）で増殖させ、ＳＤ中２日後に遠心分離により１ｍＬの細胞培養物を採取して脂質含量の決定を容易にし、５ｍＬのＳＤ培養物を処理してＤＣＷを決定したことであった。
【０３２０】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照、Ｙ４１８４（ｓｎｆ１Δ）、Ｙ４１８４Ｕ（ｅｌｍ１Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｓａｋ１Δ）株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表１５に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０３２１】
表１５：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）、Ｙ４１８４（ｓｎｆ１Δ）およびＹ４１８４Ｕ（ｅｌｍ１Δ）中の脂質組成
【表１５】
0005656836.tif 000029
【０３２２】
表１６の結果は、その天然Ｇａｌ８３がノックアウトされていない対照株と比べて、Ｙ４１８４Ｕ（ｅｌｍ１Δ）中の染色体ｅｌｍ１遺伝子ノックアウトが、ＳＤ培地中で２日間の培養後およびＨＧＭ中で５日間のインキュベーション後に脂質含量の変化［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］をあまり示さないことを示した。
【０３２３】
表１６：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ（ｓａｋ１Δ）中の脂質組成
【表１６】
0005656836.tif 000030
【０３２４】
表１６の結果は、その天然ＳＡＫ１がノックアウトされていない株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）と比べて、Ｙ４１８４Ｕ中の染色体ＳＡＫ１遺伝子ノックアウトが、ＳＤ培地中で２日間の培養後に脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を２．６倍増大させ、ＨＧＭ中で５日間のインキュベーション後に脂質含量を約３８％増大させることを示した。さらに、平均ＥＰＡ％ＴＦＡは、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株と比べてＹ４１８４Ｕ（ｓａｋ１Δ）においてあまり変わらず、対照よりも平均して約３７％のＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］の増大が得られた。
【０３２５】
ＹｌＳＡＫ１は、試験した条件下でＳＮＦ１複合体の主要な上流キナーゼであると思われる。しかしながら、異なる条件下でＹｌＥＬＭ１が脂質蓄積において大きな役割を果たすという可能性を排除することはできない。例えば、Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｄ．らによる研究（Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．，４（５）：８６１−８６６（２００５年））が参照され、その中で、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のｔｏｓ３Δは、細胞をグリセロール−エタノール中で増殖させるときにだけＳｎｆ１触媒活性をもたらすが、急激なグルコース欠乏中はもたらさないことが分かった。
【０３２６】
実施例８
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの推定上の制御サブユニットＲｅｇ１をコードする遺伝子の過剰発現は全蓄積脂質を増大させた。
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの推定上の制御サブユニットの同定、過剰発現構築物ｐＹＲＨ４４（図８Ａ、配列番号８９）の合成、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｅｇ１の単離を説明する。蓄積脂質レベルに対するＹｌＲＥＧ１過剰発現の効果を決定および比較した。その天然Ｒｅｇ１レベルが操作されていない細胞と比べて、ＹｌＲＥＧ１過剰発現は全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）をもたらした。
【０３２７】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの制御サブユニットＲｅｇ１をコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定：
サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、Ｒｅｇ１は、Ｇｌｃ７タンパク質ホスファターゼ１のための制御サブユニットである。Ｒｅｇ１−Ｇｌｃ７複合体は、脱リン酸化によりＳｎｆ１を不活性化することによってＳｎｆ１活性を制御する。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中には、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ１６８０８ｇによってコードされるＲｅｇ１の相同体が存在する。
【０３２８】
より具体的には、ＹｌＳｎｆ１（実施例１）について記載したのと同様の方法で、「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」の公的なＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース内の遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ１６８０８ｐ（配列番号９１）は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒｅｇ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１０３１１、配列番号５６）に非常に類似すると同定された。
【０３２９】
ＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて、ＹＡＬＩ０Ｂ１６８０８ｐ（配列番号９１）は、３２％の同一性および４８％の類似性、および４ｅ−５１の期待値で、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＣＢＳ７６７からの仮想タンパク質ＤＥＨＡ０Ａ０１４８５ｇ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿４５６３８６）と最大類似性を共有した。次のベストヒットは、３１％の同一性、４８％の類似性および５ｅ−５１の期待値で、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿７１９５８２の仮想タンパク質ＣａＯ１９．９５５６に対するものであった。既知の機能を有するタンパク質の中で、ベストヒットは、３２％の同一性および４８％の類似性、ならびに２ｅ−４６の期待値で、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００２４８９７１８）からの１型タンパク質ホスファターゼの制御サブユニットであった。
【０３３０】
上記の分析に基づいて、配列番号９０は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ホスファターゼ複合体制御サブユニットをコードすると仮定され、「ＹｌＲＥＧ１」という名称を与えた。
【０３３１】
ｐＹＲＨ４４の構築：
ＹｌＲＥＧ１をコードするＹＡＬＩ０Ｂ１６８０８ｇ遺伝子を過剰発現するように、プラスミドｐＹＲＨ４４を構築した。プラスミドｐＹＲＨ４４は、プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓ（図８Ｂ、配列番号９２、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書の実施例６に記載）に由来した。プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓはキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ５Ｓ：：ＰＥＸ２０遺伝子を含有した。ここで、ＦＢＡＩＮｍはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プロモーター（米国特許第７，２０２，３５６号明細書）であり、ＥａＤ５Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼであり、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素部位に隣接されるヤロウイアにおいて発現に対してコドン最適化されており、ＰＥＸ２０ターミネーター配列はヤロウイアＰＥＸ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０５４６１３）からのものである。
【０３３２】
プライマーＲＥＧ１−Ｆ（配列番号９３）およびＲＥＧ１−Ｒ（配列番号９４）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲ（一般的方法）によって、ＹｌＲＥＧ１遺伝子の２．２ｋＢ断片を増幅した。増幅された遺伝子をＰｃｉＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ４４を生じた。従って、ｐＹＲＨ４４は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＲＥＧ１：：ＰＥＸ２０遺伝子を含有した。
【０３３３】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｅｇ１の生成：
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４ＵにおいてＹｌＲＥＧ１を過剰発現させるために、ｐＹＲＨ４４をＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩで切断し、５．０ｋＢ断片を単離して形質転換のために使用し（一般的方法）、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｅｇ１を生じた。
【０３３４】
ＹｌＲＥＧ１の過剰発現を確認するために、ヤロウイアＴＥＦ１遺伝子を対照として用いて（実施例２）ＹｌＲＥＧ１における定量リアルタイムＰＣＲを実施した。ＹｌＲＥＧ１遺伝子を標的とするためにＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、リアルタイムＰＣＲプライマーＲＥＧ１−１２３０Ｆ（配列番号１５１）およびＲＥＧ１−１２９６Ｒ（配列番号１５２）、ならびにＴａｑＭａｎプローブＲＥＧ１−１２５４Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＣＧＡＴＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＡＴＣＴ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１５３で示される）を設計した。プライマーおよびプローブはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０３３５】
以下に詳述されるゲノムＤＮＡの希釈系列およびＰＣＲ条件を用いてリアルタイム定量化のためのプライマーを認定した。各プライマーおよびプローブセットに対して線形回帰を実施し、効率が９０〜１１０％内であることを確認した。
【０３３６】
まずＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙTMキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＲＮＡを単離することによってｃＤＮＡを調製した。次に、２μｇのＲＮＡをデオキシリボヌクレアーゼ（カタログＮｏ．ＰＮ７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ）により室温で１５分間処理した後、７５℃で５分間不活性化することによって残留ゲノムＤＮＡを除去した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログＮｏ．ＰＮ４３６８８１３））を用いて、製造業者に推奨されるプロトコールに従って、１μｇの処理したＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。
【０３３７】
以下の試薬：１０μｌのＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗ／ｏ  ＵＮＧ（ＰＮ４３２６６１４）、それぞれ０．２μｌの順方向および逆方向プライマー（１００μＭ）、０．０５μｌのＴａｑＭａｎプローブ（１００μＭ）、２μｌの１：１０希釈ｃＤＮＡおよび７．５５μｌのＲｎａｓｅを含まない水を用いて、ＡＢＩ  ７９００においてリアルタイムＰＣＲ反応（２０μｌ）を実行した。
【０３３８】
ＴＥＦ１およびＹｌＲＥＧ１のための反応は、各サンプルにつき２通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応は、反応あたり２０μｌの全容積に対して、それぞれ０．２μｌの順方向および逆方向プライマー（１００μＭ）（すなわち、ｅｆ−３２４Ｆ、ｅｆ−３９２Ｒ、ＲＥＧ１−１２３０ＦおよびＲＥＧ１−１２９６Ｒ、上記）、それぞれ０．０５μｌのＴａｑＭａｎプローブ（１００μＭ）（すなわち、ｅｆ−３４５ＴおよびＲＥＧ１−１２５４Ｔ、上記）、１０μｌのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ−Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（カタログＮｏ．ＰＮ４３２６６１４、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２μｌの希釈ｃＤＮＡ（１：１０）、および７．５５μｌのＲＮａｓｅ／デオキシリボヌクレアーゼを含まない水を含んだ。反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、以下の条件下で実行した：９５℃で１０分間の初期変性の後、９５℃で１５秒間の変性を４０サイクル、そして６０℃で１分間のアニーリング。各サンプルの負の逆転写ＲＮＡ対照をＥＦ１プライマーセットにより実行して、ゲノムのＤＮＡがないことを確認した。
【０３３９】
６−ＦＡＭTM蛍光を監視することによって、各サイクル中、リアルタイムデータを自動的に収集した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ取扱説明書の通りに、データ正規化のためにＴＥＦ１遺伝子しきい値サイクル（ＣT）値を用いてデータ分析を行った（ＡＢＩ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃２「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」を参照）。
【０３４０】
この分析に基づいて、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株と比べて、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｅｇ１株は、約２．７倍高いＹｌＲＥＧ１遺伝子の発現レベルを示すと結論付けた。
【０３４１】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｒｅｇ１の評価：
総脂質含量およびＦＡ組成に対して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＲｅｇ１の過剰発現が与える効果を評価および比較するために、一般的方法に記載されるように、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）（対照）および株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｅｇ１を同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、各株の培養物を２５ｍＬのＳＤ培地中約０．３の開始ＯＤ600（約０．１の開始ＯＤ600に対して）で増殖させたことであった。
【０３４２】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照およびＹ４１８４Ｕ＋Ｒｅｇ１株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は表１７に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０３４３】
表１７：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｒｅｇ１中の脂質含量および組成の時間経過
【表１７】
0005656836.tif 000031
【０３４４】
表１７の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）と比べて、Ｙ４１８４Ｕにおける遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ１６８０８ｇに対応するＹｌＲＥＧ１の過剰発現が、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約６７％増大させ、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を約６０％増大させることを示した。
【０３４５】
実施例９
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの推定上のグルコースキナーゼタンパク質の過剰発現は、全蓄積脂質を増大させる。
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの３つの推定上のグルコースキナーゼの同定、グルコース抑制シグナリングを増大させるための過剰発現構築物ｐＹＲＨ４５（配列番号９５）、ｐＹＲＨ４６（配列番号９６）およびｐＹＲＨ４７（配列番号９７）の合成、ならびにＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ２、およびＹ４１８４Ｕ＋Ｇｌｋ１の単離を説明する。ＹｌＨＸＫ１、ＹｌＨＸＫ２およびＹｌＧＬＫ１過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果を決定および比較した。その天然ＹｌＨＸＫ２およびＹｌＧＬＫ１レベルが操作されていない細胞とくらべて、ＹｌＨＸＫ２およびＹｌＧＬＫ１過剰発現は、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）をもたらす。
【０３４６】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの推定上のグルコースキナーゼタンパク質Ｈｘｋ１、Ｈｘｋ２およびＧｌｋ１をコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定：
サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、Ｃ６位におけるグルコースのリン酸化は、２つのヘキソキナーゼ（すなわち、Ｈｘｋ１、Ｈｘｋ２）およびグルコキナーゼ（すなわち、Ｇｌｋ１）によって触媒される。これらの中で、Ｈｘｋ２は、細胞内のグルコースシグナリングにおいて重要な役割を果たす。ｈｘｋ２欠失は、ｒｅｇ１欠失と同様に、グルコース抑制を抑制解除する。Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｈｘｈ２またはｒｅｇ１変異体において、Ｓｎｆ１は、過剰のグルコースの存在下（すなわち、抑制解除状態）でも活性になる。Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の間でグルコースのシグナル伝達経路が保存されれば、推定上のＨｘｋ２相同体の過剰発現はＳｎｆ１活性を低下させ、細胞は脂質蓄積を増大させるであろう。
【０３４７】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中には、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ２２３０８ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ２０２０７ｇおよびＹＡＬＩ０Ｅ１５４８８ｇによってコードされるヘキソキナーゼ／グルコキナーゼの３つの推定上の相同体が存在する。
【０３４８】
より具体的には、ＹｌＳｎｆ１（実施例１）について記載したのと同様の方法で、「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」の公的なＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース内の遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ２２３０８ｐ（配列番号９９）、ＹＡＬＩ０Ｅ２０２０７ｐ（配列番号１０１）およびＹＡＬＩ０Ｅ１５４８８ｐ（配列番号１０３）は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨｘｋ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿１１６７１１）、Ｈｘｋ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１１２６１、配列番号５７）、またはＧｌｋ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００９８９０）タンパク質に非常に類似すると同定された。
【０３４９】
ＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて、ＹＡＬＩ０Ｂ２２３０８ｐ（配列番号９９）は、５８％の同一性および７４％の類似性、ならびに１ｅ−１７９期待値で、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのタンパク質ＨＸＫ＿ＫＬＵＬＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿４５３５６７）と最大類似性を共有した。次のベストヒットは、５６％の同一性、７２％の類似性および２ｅ−１７３の期待値で、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿９８５８２６のＡＦＲ２７９Ｃｐに対するものであった。
【０３５０】
同様に、ＹＡＬＩ０Ｅ２０２０７ｐ（配列番号１０１）は、３３％の同一性および４９％の類似性、ならびに３ｅ−４５の期待値で、ペニシリウム・マルネッフィ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）ＡＴＣＣ１８２２４からの推定上のヘキソキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００２１４６３４７）と最大類似性を共有した。次のベストヒットは、３１％の同一性、５０％の類似性および４ｅ−４５の期待値で、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００１９３８４８６のヘキソキナーゼ−１に対するものであった。
【０３５１】
また、ＹＡＬＩ０Ｅ１５４８８ｐ（配列番号１０３）は、４５％の同一性および６２％の類似性、ならびに２ｅ−１１１の期待値で、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）Ａｆ２９３からのタンパク質グルコキナーゼＧｌｋＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿７４７８５４）と最大類似性を共有した。次のベストヒットは、４５％の同一性、６１％の類似性および２ｅ−１１０の期待値で、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００１２５７４１２の推定上のグルコキナーゼＧｌｋＡタンパク質に対するものであった。
【０３５２】
上記の分析に基づいて、配列番号９８、配列番号１００および配列番号１０２は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における３つの異なるヘキソキナーゼ／グルコキナーゼ相同体アイソフォームをコードすると仮定される。より具体的には、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ２２３０８ｇ（配列番号９８）に「ＹｌＨＸＫ１」という名称を与え、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ２０２０７ｇ（配列番号１００）に「ＹｌＨＸＫ２」という名称を与え、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ１５４８８ｇ（配列番号１０２）に「ＹｌＧＬＫ１」という名称を与えた。
【０３５３】
ｐＹＲＨ４５、ｐＹＲＨ４６およびｐＹＲＨ４７の構築：
推定上のＹｌＨｘｋ１およびＹｌＨｘｋ２をコードするＹＡＬＩ０Ｂ２２３０８ｇ遺伝子座およびＹＡＬＩ０Ｅ２０２０７ｇ遺伝子座をそれぞれ過剰発現するように、プラスミドｐＹＲＨ４５（配列番号９５）およびｐＹＲＨ４６（配列番号９６）を構築した。プラスミドｐＹＲＨ４５およびｐＹＲＨ４６は、ｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓ（図８Ｂ、配列番号９２、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書の実施例６に記載）に由来した。
【０３５４】
プライマーＨＸＫ１−Ｆ（配列番号１０４）およびＨＸＫ１−Ｒ（配列番号１０５）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲ（一般的方法）によって、ＹＡＬＩ０Ｂ２２３０８ｇの２．０ｋＢ断片を増幅した。同様に、プライマーＨＸＫ２−Ｆ（配列番号１０６）およびＨＸＫ２−Ｒ（配列番号１０７）を用いて、ＹＡＬＩ０Ｅ２０２０７ｇの１．４ｋＢ断片を増幅した。増幅された遺伝子をＰｃｉＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ４５およびｐＹＲＨ４６を生じた。従って、ｐＹＲＨ４５は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＨＸＫ１：：ＰＥＸ２０遺伝を含有し、ｐＹＲＨ４６は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＨＸＫ２：：ＰＥＸ２０遺伝子を含有した。
【０３５５】
ＹｌＧＬＫ１を過剰発現させるために、プライマーＧＬＫ１−Ｆ（配列番号１０８）およびＧＬＫ１−Ｒ（配列番号１０９）を用いて、ＯＲＦをコードする１．４４ｋＢ断片を増幅した。次に、これをＰｃｉＩＩ／ＮｏｔＩで切断し、以下の構成要素を含有するプラスミドｐＹＲＨ４７（図９）を作製するために用いた。
【０３５６】
表１８
プラスミドｐＹＲＨ４７（配列番号９７）の説明
【表１８】
0005656836.tif 000032
【０３５７】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ２およびＹ４１８４Ｕ＋Ｇｌｋ１の作製：
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４ＵにおいてＹｌＨＸＫ１、ＹｌＨＸＫ２およびＹｌＧＬＫ１を過剰発現させるために、ｐＹＲＨ４５、ｐＹＲＨ４６およびｐＹＲＨ４７プラスミドをＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩで切断し、４．９ｋＢ断片（キメラＹｌＨＸＫ１遺伝子を包含する）、４．２ｋＢ断片（キメラＹｌＨＸＫ２遺伝子を包含する）または４．２ｋＢ断片（キメラＹｌＧＬＫ１遺伝子を包含する）を単離して形質転換のために使用し（一般的方法）、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ２およびＹ４１８４Ｕ＋Ｇｌｋ１を生じた。
【０３５８】
ＹｌＨＸＫ１、ＹｌＨＸＫ２およびＹｌＧＬＫ１の過剰発現を確認するために、ヤロウイアＴＥＦ１遺伝子を対照として用いて（実施例２）、ＹｌＨＸＫ１、ＹｌＨＸＫ２およびＹｌＧＬＫ１における定量リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、リアルタイムＰＣＲプライマーＨＸＫ１−８０２Ｆ（配列番号１５４）、ＨＸＫ１−８６３Ｒ（配列番号１５５）、ＨＸＫ２−７３８Ｆ（配列番号１５７）、ＨＸＫ２−７９９Ｒ（配列番号１５８）、ＧＬＫ１−１０５Ｆ（配列番号１６０）およびＧＬＫ１−１６８Ｒ（配列番号１６１）、ならびにＴａｑＭａｎプローブＨＸＫ１−８２３Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＣＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＧ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１５６で示される）、ＨＸＫ２−７５９Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＡＴＴＴＣＣＡＡＣＧＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１５９で示される）およびＧＬＫ１−１２６Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＡＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＣＴＣ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１６２で示される）を設計した。プライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０３５９】
実施例８に記載されるように候補ｃＤＮＡを調製した。ＴＥＦ１、ＹｌＨＸＫ１、ＹｌＨＸＫ２およびＹｌＧＬＫ１のための反応は、各サンプルにつき２通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応の組成は、順方向および逆方向プライマーが、ＲＥＧ１−１２３０ＦおよびＲＥＧ１−１２９６Ｒ（配列番号１５１および１５２）とは対照的にＨＸＫ１−８０２Ｆ、ＨＸＫ１−８６３Ｒ、ＨＸＫ２−７３８Ｆ、ＨＸＫ２−７９９Ｒ、ＧＬＫ１−１０５ＦおよびＧＬＫ１−１６８Ｒ（上記）を含み、ＴａｑＭａｎプローブが、ＲＥＧ１−１２５４Ｔ（配列番号１５３示されるヌクレオチド配列）とは対照的にＨＸＫ１−８２３Ｔ、ＨＸＫ２−７５９ＴおよびＧＬＫ１−１２６Ｔ（上記）を含んでいた点を除いて、実施例８に記載されるのと同一であった。増幅、データ収集およびデータ分析は、実施例８に記載されるとおりであった。
【０３６０】
この分析に基づいて、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株と比べて、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｋｘ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｋｘ２およびＹ４１８４Ｕ＋Ｇｌｋ１株は、それぞれ、約１４．７倍、５５．５倍および３．２倍高いＹｌＨＸＫ１、ＹｌＨＸＫ２およびＹｌＧＬＫ１遺伝子の発現レベルを示すと結論付けた。
【０３６１】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ２およびＹ４１８４Ｕ＋Ｇｌｋ１の評価：
総脂質含量およびＦＡ組成に対して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるグルコースキナーゼの過剰発現が与える効果を評価するために、一般的方法に記載されるように、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）（対照）、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ２およびＹ４１８４Ｕ＋Ｇｌｋ１を同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、各株の培養物を２５ｍＬのＳＤ培地中、約０．３の開始ＯＤ600（約０．１の開始ＯＤ600に対して）で増殖させたことであった。
【０３６２】
株Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｈｘｋ２およびＹ４１８４Ｕ＋Ｇｌｋ１についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表１９、表２０および表２１に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０３６３】
表１９：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｈｋｘ１中の脂質含量および組成
【表１９】
0005656836.tif 000033
【０３６４】
表１９の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べて、Ｙ４１８４Ｕにおける遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ２２３０８ｐに対応するＹｌＨｘｋ１の過剰発現が、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］またはＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］の著しい増大をもたらさないことを示した。
【０３６５】
表２０：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｈｋｘ２中の脂質含量および組成
【表２０】
0005656836.tif 000034
【０３６６】
表２０の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べて、Ｙ４１８４Ｕにおける遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ２０２０７ｐに対応するＹｌＨｘｋ２の過剰発現が、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約２６％増大させ、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を約２０％増大させることを示した。
【０３６７】
表２１：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｇｌｋ１中の脂質含量および組成
【表２１】
0005656836.tif 000035
【０３６８】
表２１の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べて、Ｙ４１８４Ｕにおける遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ１５４８８ｐに対応するＹｌＧｌｋ１の過剰発現が、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約１４％増大させ、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を１８％増大させることを示した。
【０３６９】
実施例１０
ヤロウイア・リポリティア（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉａ）におけるヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ１α−サブユニットの制御ドメイン（または、触媒的に不活性なＳｎｆ１）の過剰発現は全蓄積脂質を増大させる。
本実施例は、１）ＹｌＳｎｆ１制御ドメインの過剰発現のために設計された構築物ｐＹＲＨ３８（配列番号１１０）の合成、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ＲＤの単離と、２）触媒的に不活性なＹｌＳｎｆ１の過剰発現のために設計された構築物ｐＹＲＨ４０（配列番号１１２）の突然変異体の合成、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１  Ｄ１７１Ａの単離とを説明する。ＹｌＳｎｆ１制御ドメインおよび触媒的に不活性なＹｌＳｎｆ１の過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果を決定および比較した。いずれの場合も、過剰発現は、同様に操作されていない細胞と比べて、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）をもたらした。
【０３７０】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ１α−サブユニットの操作のための実験原理：
ＳＮＦ１タンパク質キナーゼ複合体は、触媒サブユニットＳｎｆ１、制御サブユニットＳｎｆ４、およびターゲティング（または架橋）β−サブユニットで構成されるヘテロ三量体である。Ｓｎｆ１自体は、触媒および制御ドメインから構成される。Ｓｎｆ１触媒ドメインはそのキナーゼ活性を与え、その制御ドメインはＳｎｆ４、Ｓｎｆ１触媒ドメイン、およびβ−サブユニットと相互作用する。Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、アミノ末端キナーゼドメインは配列番号２の残基１−３９１に対応し、カルボキシ末端制御ドメインは残基３９２−６３３に対応する（Ｊｉａｎｇ  ＆  Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１０（２４）：３１０５−３１１５（１９９６年））。
【０３７１】
植物では、ＳｎＲＫ１は構造的および機能的に、酵母オルソログ、Ｓｎｆ１に類似している。Ｓｎｆ１制御ドメインの過剰発現は、抑制解除条件下でグルコース抑制の解放を低下させることが示された（Ｌｕら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９（８）：２４８４−２４９９（２００７年））。
【０３７２】
Ｓｎｆ１制御ドメインの過剰発現は、ヘテロ三量体のＳＮＦ１複合体のβ−サブユニットの結合のための内在性Ｓｎｆ１と競合し、それにより天然Ｓｎｆ１活性を低下し得る。同様に、こ触媒的に不活性な全長Ｓｎｆ１の過剰発現は、β−サブユニットおよびＳｎｆ４のための内在性Ｓｎｆ１と競合するとが予期される。ＳＮＦ１遺伝子の欠失の代わりに、Ｓｎｆ１タンパク質変異形の過剰発現は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における脂質蓄積に対するｓｎｆ１欠失の効果を模倣することができる。
【０３７３】
ｐＹＲＨ３８の構築：
ＹｌＳＮＦ１遺伝子の＋８３５〜＋１７４０領域に対応すると明細書では定義されるＹｌＳｎｆ１制御ドメイン［「ＹｌＳｎｆ１ＲＤ」］の過剰発現のためにプラスミドｐＹＲＨ３８を構築した。具体的には、プライマーＳＮＦ１ＲＤ−Ｆ（配列番号１１１）およびＳＮＦ１Ｒｉｉ（配列番号４４）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲ（一般的方法）によってＹｌＳｎｆ１ＲＤをコードする０．９ｋＢのＤＮＡ断片を増幅した。増幅された遺伝子をＰｃｉＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＹＲＨ４７（配列番号９７、図９、上記実施例９で記載）骨格のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローン化した。
【０３７４】
ｐＹＲＨ４０の構築：
ｐＹＲＨ４０（配列番号１１２）を構築するために、プライマーＳＮＦ１Ｆｉｉ（配列番号４３）およびＳＮＦ１Ｒｉｉ（配列番号４４）用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲ（一般的方法）によって野生型全長ＹｌＳＮＦ１遺伝子（配列番号２６）を増幅した。増幅された遺伝子をＰｃｉＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＹＲＨ４７骨格（図９、配列番号９７、上記実施例９で記載）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローン化した。
【０３７５】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ＲＤおよびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１の作製：
株Ｙ４１８４ＵにおいてＹｌＳｎｆ１ＲＤを過剰発現させるために、ｐＹＲＨ３８をＳｐｈＩ／ＡｓｃＩで切断し、５．９ｋＢ断片を単離して形質転換のために使用し（一般的方法）、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ＲＤを生じた。ｐＹＲＨ３９プラスミドを同様に切断し、６．７ｋＢ断片を単離して形質転換のために使用し、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１を生じた。
【０３７６】
株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ＲＤにおけるＹｌＳｎｆ１ＲＤ、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１におけるＹｌＳＮＦ１の過剰発現を確認するために、ヤロウイアＴＥＦ１遺伝子を対照として用いて（実施例２）、定量リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、リアルタイムＰＣＲプライマーＳＮＦ−７３４Ｆ（配列番号４９）、ＳＮＦ−７９６Ｒ（配列番号５０）、ＳＮＦ−１２３０Ｆ（配列番号１８５）およびＳＮＦ−１２９３Ｒ（配列番号１８６）、ならびにＴａｑＭａｎプローブＳＮＦ−７５６Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＴＧＣＣＧＧＣＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＴＧ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号５２で示される）およびＳＮＦ−１２５０Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１８７で示される）を設計した。プライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０３７７】
実施例８に記載されるように候補ｃＤＮＡを調製した。ＴＥＦ１、ＹｌＳｎｆ１ＲＤおよびＹｌＳＮＦ１のための反応は、各サンプルにつき３通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応の組成は、順方向および逆方向プライマーが、ＲＥＧ１−１２３０ＦおよびＲＥＧ１−１２９６Ｒ（配列番号１５１および１５２）とは対照的にＳＮＦ−７３４Ｆ、ＳＮＦ−７９６Ｒ、ＳＮＦ−１２３０ＦおよびＳＮＦ−１２９３Ｒ（上記）を含み、ＴａｑＭａｎプローブが、ＲＥＧ１−１２５４Ｔ（配列番号１５３で示されるヌクレオチド配列）とは対照的にＳＮＦ−７５６ＴおよびＳＮＦ−１２５０Ｔ（上記）を含んでいた点を除いて、実施例８に記載されるのと同一であった。増幅、データ収集およびデータ分析は、実施例８に記載されるとおりであった。
【０３７８】
この分析に基づいて、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株における天然ＹｌＳＮＦ１遺伝子発現レベルと比べて、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１およびＹ４１８４＋Ｓｎｆ１ＲＤ株は、それぞれ、約３．８倍および４．９倍高いＹｌＳＮＦ１およびＹｌＳｎｆ１ＲＤ遺伝子の発現レベルを示すと結論付けた。
【０３７９】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１Ｄ１７１Ａの作製：
次に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびに２つのプライマー、ＹｌＳｎｆ１Ｄ１７１Ａ−Ｆ（配列番号１１３）およびＹｌＳｎｆ１Ｄ１７１Ａ−Ｒ（配列番号１１４）を用いて、プラスミドｐＹＲＨ４０に部位特異的変異誘発を受けさせた。アスパラギン酸［ＡｓｐまたはＤ］をコードするＹｌＳｎｆ１（配列番号２７）の残基１７１は、ＡＴＰ結合に関与する高度に保存された残基である（Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１（４８６１）：４２−５２（１９８８年））。従って、残基１７１におけるアスパラギン酸のアラニン［ＡｌａまたはＡ］への置換（すなわち、Ｄ１７１Ａ変異）は、触媒的に不活性なキナーゼをもたらすであろう。
【０３８０】
株Ｙ４１８４Ｕ中にＤ１７１Ａ変異を含む触媒的に不活性なＹｌＳＮＦ１を過剰発現させるために、ｐＹＲＨ４０をＳｐｈＩおよびＡｓｃＩで切断し、６．７ｋＢ断片を単離して形質転換のために使用し（一般的方法）、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１  Ｄ１７１Ａを生じた。
【０３８１】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ＲＤおよびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１  Ｄ１７１Ａの評価：
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＳｎｆ１変異形の過剰発現が総脂質含量およびＦＡ組成に与える優性ネガティブ効果を評価および比較するために、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）（対照）、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ４６（実施例３）、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ＲＤおよび株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１  Ｄ１７１Ａを、一般的方法に記載されるように同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、各株の培養物を２５ｍＬのＳＤ培地中約０．３の開始ＯＤ600（約０．１の開始ＯＤ600に対して）で増殖させたことであった。
【０３８２】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ４６、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ＲＤおよび株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１  Ｄ１７１ＡについてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表２２および表２３に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０３８３】
表２２：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ＲＤ中の脂質含量および組成
【表２２】
0005656836.tif 000036
【０３８４】
表２２の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べて、Ｙ４１８４ＵにおけるＹｌＳＮＦ１制御ドメイン［「ＹｌＳｎｆ１ＲＤ」］の過剰発現が、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約１０％増大させ、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を１６％増大させることを示した。
【０３８５】
表２３：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ１ Ｄ１７１Ａ中の脂質含量および組成
【表２３】
0005656836.tif 000037
【０３８６】
表２３の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べてＹ４１８４Ｕにおける触媒的に不活性なＹｌＳｎｆ１変異体［「ＹｌＳｎｆ１  Ｄ１７１Ａ」］の過剰発現が、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約１３％増大させ、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を２１％増大させることを示した。
【０３８７】
実施例１１
マイクロアレイ解析によるＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークの描写
本実施例は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）の全ゲノム遺伝子発現プロファイルに対する洞察を得るためのマイクロアレイ解析の使用を説明する。脂質代謝に関与する多数の遺伝子は、対照株と比べて、Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株において上方制御されることが分かった。遺伝子オントロジー分析によってＹ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株において異なって発現した遺伝子は脂質代謝関連の機能が非常に豊富であることが明確に示される。これは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｓｎｆ１が脂質代謝遺伝子の発現のための重要な制御因子であることを示唆する。
【０３８８】
サンプル調製およびマイクロアレイ解析：
Ｙ４１８４Ｕ（ｓｎｆ１Δ）株ＲＨＹ４３、ＲＨＹ４６およびＲＨＹ４７（実施例３）を生物学的複写物として選択した。同様に、染色体中のランダムな部位に組み込まれたＳｎｆ１ノックアウト断片を有するのでｓｎｆ１Δ変異体（実施例３）ではない株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）Ｃｏｎｔ−１、Ｃｏｎｔ−２、およびＣｏｎｔ−３は対照として使用した。
【０３８９】
ＲＮＡサンプルを調製するために、２５ｍＬの開始培養物容積および０．０５〜０．１０の間の開始ＯＤ600で、ＳＤ培地中で細胞を増殖させた。細胞を３０℃で２．０のＯＤ600まで増殖させた。１５ｍＬの円錐管中、約２，０００×ｇで２分間の遠心分離によって、各培養物から１０ｍＬのアリコートを収集した。液体培地を廃棄し、各細胞ペレットを直ぐに液体窒素中で凍結させ−８０℃で貯蔵した。
【０３９０】
ＴｒｉｏｚｏｌTM試薬（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、細胞ペレットから全ＲＮＡを調製した。０．５ｍｍのガラスビーズおよびＭｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ  ８（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を用い、製造業者の使用説明書に従って、最高速度で３．５分間細胞破損を達成した。次に、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙTMキットを用いて、抽出した全ＲＮＡを精製した。
【０３９１】
独自のＭａｓｋｌｅｓｓ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ技術に基づいたｃＤＮＡ合成およびマイクロアレイチップへのハイブリダイゼーションのためにＲＮＡサンプルをＲｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に送った。またデータ収集もＲｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎにより行った。
【０３９２】
個々のアレイからのデータをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ１０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にロードした。分位数正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）法を用いて、データを正規化した。不等分散によるスチューデントのｔ検定を実施して、ｓｎｆ１Δ変異体サンプルと対照サンプルとの間でその発現レベルが著しく変化した遺伝子を同定した。０．０５以下のｐ値しきい値、および１．５倍または２倍の変化カットオフからなる二重基準を適用して、ｓｎｆ１Δ変異体サンプルにおいてその発現レベルが著しく変化した遺伝子を同定した。また、０．０５のｐ値カットオフを適用して、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ［「ＧＯ」］濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）分析（以下）のために伸長された遺伝子セットを作製した（表２４）。
【０３９３】
ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの調節下での遺伝子発現：
マイクロアレイ解析の結果は、対照株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）Ｃｏｎｔ−１、Ｃｏｎｔ−２およびＣｏｎｔ−３に対して、ｓｎｆ１Δ変異体株ＲＨＹ４３、ＲＨＹ４６およびＲＨＹ４７において異なって発現した遺伝子が、脂肪酸代謝および有機酸異化反応の生物学的過程において著しく濃縮されることを示した（表２４）。
【０３９４】
表２４：Ｓｎｆ１Δ変異株中で異なって発現された遺伝子の生物学的過程による遺伝子オントロジー分析
【表２４】
0005656836.tif 000038
【０３９５】
対照株と比べて、ｓｎｆ１Δ株において１．５倍よりも大きい発現レベルの差を示す遺伝子は表２５に示される。
【０３９６】
【表２５−１】
0005656836.tif 000039
【表２５−２】
0005656836.tif 000040
【表２５−３】
0005656836.tif 000041
【０３９７】
表２５の遺伝子の発現レベルはｓｎｆ１Δ株において最も顕著に変化したので、これらの遺伝子は、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼネットワークの直接または間接的な調節の下で機能すると結論される。さらに、ｓｎｆ１Δ変異体は増大した脂質蓄積の表現型（対照株と比べて）を実証した［実施例２〜１０］ので、ｓｎｆ１Δ株における発現の増大を示す他の遺伝子は、過剰発現されたときに脂質蓄積の増大を同様にもたらし得る適切な候補である。同等の方法で、ｓｎｆ１Δ株において発現の低下を示す遺伝子は、脂質蓄積の増大をもたらし得る下方制御または完全遺伝子ノックアウトのための適切な候補である。
【０３９８】
実施例１２
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、マイクロアレイ解析によって同定された推定上の亜鉛フィンガータンパク質Ｒｍｅ１の過剰発現は、全蓄積脂質を増大させた。
推定上の亜鉛フィンガータンパク質をコードするＲＭＥ１遺伝子は、対照株と比べて、ｓｎｆ１Δ株において１．５４倍上方制御される（実施例１１、表２５）。本実施例は、過剰発現構築物ｐＹＲＨ４９（配列番号１１７）の合成、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｍｅ１の単離を説明する。ＹｌＲＭＥ１過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果を決定および比較した。ＹｌＲＭＥ１過剰発現は、その天然Ｒｍｅ１レベルが操作されていない細胞と比べて、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）をもたらした。
【０３９９】
推定上の亜鉛フィンガータンパク質Ｒｍｅ１の操作のための実験原理：
ＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ１９９６５ｇによってコードされるヤロウイアタンパク質は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００２４９００９２）の減数分裂の調節に関与する亜鉛フィンガータンパク質と最大相同性を共有し、１ｅ−１６の期待値で３８％の同一性および５０％の類似性を共有した。
【０４００】
Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒｍｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１１５５８）は、減数分裂の活性化剤ＩＭＥ１の転写リプレッサーとして機能する亜鉛−フィンガータンパク質である（Ｃｏｖｉｔｚ，Ｐ．Ａ．およびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ａ．Ｐ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，７：１５９８−１６０８（１９９３年））。より具体的には、ＹＡＬＩ０Ｅ１９９６５ｐおよびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１１５５８は、２．０ｅ−１２の期待値で、３５％の同一性および４８％の類似性を共有する。これらの２つのタンパク質間の相同領域は主に亜鉛−フィンガードメインの周囲であるが、亜鉛−フィンガー転写因子は、これらのドメインの外側では、多くの場合、あまり相同でないことが分かっている。遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ１９９６５ｐは、配列番号１１６アミノ酸残基２５８−２８２、２９１−３１７および３２４−３４５に位置する３つの潜在的な亜鉛−フィンガー［Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２］を含有し、従って、「ＹｌＲｍｅ１」と命名される推定上の亜鉛−フィンガータンパク質と考えられる。ＹｌＲｍｅ１がＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒｍｅ１の機能性相同体であるかどうか、あるいはＹｌＲｍｅ１がその亜鉛−フィンガードメインにおいて配列相同性を共有するだけかどうかは不明である。
【０４０１】
多くの亜鉛−フィンガータンパク質は、遺伝子発現の制御に関与する転写因子なので、、全脂質に対するＹｌＲｍｅ１過剰発現の効果を調査する価値がある。
【０４０２】
ｐＹＲＨ４９の構築：
ＹｌＲＭＥ１（配列番号１１５）を過剰発現させるようにプラスミドｐＹＲＨ４９を構築した。プラスミドｐＹＲＨ４９は、プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓ（図８Ｂ、配列番号９２、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書の実施例６に記載）に由来した。
【０４０３】
プライマーＲＭＥ１−Ｆ（配列番号１１８）およびＲＭＥ１−Ｒ（配列番号１１９）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲ（一般的方法）によって、ＹｌＲＭＥ１遺伝子の１．２ｋＢ断片を増幅した。増幅された遺伝子をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ４９を生じた。従って、ｐＹＲＨ４９は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＲＭＥ１：：ＰＥＸ２０遺伝子を含有した。
【０４０４】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｍｅ１の作製：
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４ＵにおいてＹｌＲＭＥ１を過剰発現させるために、ｐＹＲＨ４９をＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、４．０ｋＢ断片を単離して形質転換のために使用し（一般的方法）、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｍｅ１を生じた。
【０４０５】
ＹｌＲＭＥ１を過剰発現させる細胞をスクリーニングするために、ヤロウイアＴＥＦ１遺伝子を対照として用いて（実施例２）、ＹｌＲＭＥ１における定量リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、リアルタイムＰＣＲプライマーＲＭＥ１−８５３Ｆ（配列番号１６３）およびＲＭＥ１−９１９Ｒ（配列番号１６４）、ならびにＴａｑＭａｎプローブＲＭＥ１−８８１Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＣＴＧＣＧＴＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧ−ＴＡＭＲＡTM、おこで、ヌクレオチド配列は配列番号１６５で示される）を設計した。プライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０４０６】
実施例８に記載されるように候補ｃＤＮＡを調製した。ＴＥＦ１およびＹｌＲＭＥ１のための反応は、各サンプルにつき２通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応の組成は、順方向および逆方向プライマーが、ＲＥＧ１−１２３０ＦおよびＲＥＧ１−１２９６Ｒ（配列番号１５１および１５２）とは対照的にＲＭＥ１−８５３ＦおよびＲＭＥ１−９１９Ｒ（上記）を含み、ＴａｑＭａｎプローブが、ＲＥＧ１−１２５４Ｔ（配列番号１５３で示されるヌクレオチド配列）とは対照的にＲＭＥ１−８８１Ｔ（上記）を含んでいた点を除いて、実施例８に記載されるのと同一であった。増幅、データ収集およびデータ分析は、実施例８に記載されるとおりであった。
【０４０７】
この分析に基づいて、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株と比べて、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｍｅ１株は、約２．７倍高いＹｌＲＭＥ１遺伝子の発現レベルを示すと結論付けた。
【０４０８】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｒｍｅ１の評価：
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＹｌＲｍｅ１の過剰発現の、総脂質含量およびＦＡ組成に対する効果を評価および比較するために、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）（対照）および株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｒｍｅ１を、一般的方法に記載されるように同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、各株の培養物を２５ｍＬのＳＤ培地中約０．３の開始ＯＤ600（約０．１の開始ＯＤ600に対して）で増殖させたことであった。
【０４０９】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照およびＹ４１８４Ｕ＋Ｒｍｅ１株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表２６に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０４１０】
表２６：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｒｍｅ１中の脂質含量および組成
【表２６】
0005656836.tif 000042
【０４１１】
表２６の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べて、Ｙ４１８４Ｕにおける遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ１９９６５ｐに対応する推定上の亜鉛フィンガータンパク質ＹｌＲｍｅ１の過剰発現が、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約２４％増大させ、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を約２２％増大させることを示した。
【０４１２】
ＹｌＲＭＥ１（対照株と比べて、ｓｎｆ１Δ株において１．５４倍上方制御された）の過剰発現が脂質蓄積を増大させるという上記で実証された肯定的な結果に基づいて、候補を実施例１１に示される仮説に対する信用が得られる。この仮説は、対照株と比べてｓｎｆ１Δ株においてより高い転写物レベルを実証する表２５に示される遺伝子が、細胞中の脂質蓄積を増大させるための手段として過剰発現され得ることを特に示唆する。例えば、タンパク質Ｍｈｙ１（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ２１５８２ｐ、配列番号１２１）は、ＹｌＲｍｅ１について本明細書において記載されるのと同様の方法で容易に過剰発現され得るもう１つのＣｙｓ２Ｈｉｓ２型亜鉛フィンガーであり、細胞中の脂質蓄積の増大（そして恐らく、ＥＰＡ生産性の増大）が期待されるであろう。
【０４１３】
実施例１３
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）においてマイクロアレイ解析により同定されたＡｓｃ２  Ｓｋｓ１、Ｃｂｒ１およびＳｃｓ２相同体の過剰発現
ＡＳＣ２、ＳＫＳ１、およびＣＢＲ１遺伝子はそれぞれ、対照株と比べて、ｓｎｆ１Δ株において１．３６倍、１．３８倍、および１．３４倍上方制御された（実施例１１、表２５）。同様に、Ｓｃｓ２が制御すると考えられるタンパク質はそれぞれ、２．５５倍および３．０７倍上方制御された。本実施例は、過剰発現構築物ｐＹＲＨ４１（配列番号１２２）、ｐＹＲＨ４２（配列番号１２３）、ｐＹＲＨ４８（配列番号１２４）およびｐＹＲＨ５１（配列番号１２５）の合成、ならびにＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ａｓｃ２、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｋｓ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｃｂｒ１およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｃｓ２の単離を説明する。ＹｌＡｓｃ２、ＹｌＳｋｓ１、ＹｌＣｂｒ１およびＹｌＳｃｓ２過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果を決定および比較した。過剰発現された遺伝子はどれも、その天然ＹｌＡｓｃ２、ＹｌＳｋｓ１、ＹｌＣｂｒ１およびＹｌＳｃｓ２レベルが操作されていない細胞と比較して、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）を引き起こさなかった。
【０４１４】
Ａｓｃ２、Ｓｋｓ１、Ｃｂｒ１およびＳｃｓ２の操作のための実験原理：
７０未満の遺伝子が、対照株におけるこれらの発現と比べて、ｓｎｆ１Δ株において１．５倍よりも多く、異なって発現された（実施例１１、表２５）。遺伝子が１．３以上の発現増大倍数を有すると、遺伝子の数は約２００に増大する。本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕにおいてこれらのタンパク質のいくつかを過剰発現させる際の値を見積もるために実施した。
【０４１５】
実施例１１の表２５に記載されるように、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｆ０５９６２ｇの発現は、ｓｎｆ１Δ株において１．３６倍増大された。このＯＲＦ（本明細書ではＹｌＡＳＣ２（配列番号１２６）と称される）は、以下の反応：ＡＴＰ＋酢酸＋ＣｏＡ⇔ＡＭＰ＋ピロリン酸＋アセチル−ＣｏＡを触媒することができるアセチル−ＣｏＡシンテターゼ［Ｅ．Ｃ．６．２．１．１］をコードする。サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にはアセチル−ｃｏＡシンテターゼの２つのアイソフォーム（すなわち、Ａｃｓ１［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００９３４７］およびＡｃｓ２［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１３２５４］）が存在するが、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）にはアセチル−ＣｏＡ−シンテターゼの単一の遺伝子が存在する。
【０４１６】
同様に、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ０８５５８ｇの発現は、ｓｎｆ１Δ株において１．３８倍増大された。このＯＲＦ（本明細書では、ＹｌＳＫＳ１（配列番号１２８）と称される）は、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＳＫＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１５２９９）に対して相同性である推定上のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼをコードする。Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＫＳ１は、ＳＮＦ３制御経路に関係なく低濃度のグルコースへの適応に関与することが分かっている（Ｙａｎｇ，Ｚ．およびＢｉｓｓｏｎ，Ｌ．Ｆ．，Ｙｅａｓｔ，１２（１４）：１４０７−１４１９（１９９６年）、Ｖａｇｎｏｌｉ，Ｐ．およびＢｉｓｓｏｎ，Ｌ．Ｆ．，Ｙｅａｓｔ１４（４）：３５９−３６９（１９９８年））。ｓｎｆ１Δ株において上方制御されたセリン／スレオニンタンパク質キナーゼのうち、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ０８５５８ｐの発現が最も増大された。
【０４１７】
最後に、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｄ０４９８３ｇの発現は、ｓｎｆ１Δ株において１．３４倍増大された。このＯＲＦ（本明細書では、ＹｌＣＢＲ１（配列番号１３０）と称される）は、ミクロソームチトクロムｂ5レダクターゼ［Ｅ．Ｃ．１．６．２．２］をコードし、脂肪酸不飽和化において役割を果たすことが予期される。
【０４１８】
配列番号１２６、１２８および１３０で表されるＯＲＦに加えて、以下の過剰発現実験に含めるために遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｄ０５２９１ｇ（本明細書では、ＹｌＳＣＳ２（配列番号１３２と称される）も選択した。具体的には、ＡＬＫ１（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ２５９８２ｇ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０４４０６］）およびＡＬＫ２（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｆ０１３２０ｇ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０４８５７］）は、ｓｎｆ１Δ細胞において最も強く誘発される遺伝子の１つである（すなわち、それぞれ２．５５倍、および３．０７倍）。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＬＫ１およびＡＬＫ２の転写調節系は、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＮＯ１遺伝子のものと似ており（Ｅｎｄｏｈ−Ｙａｍａｇａｍｉ，Ｓ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ，６：７３４−７４３（２００７年））、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＣＳ２遺伝子は、この制御において重要な役割を果たす（Ｌｏｅｗｅｎ，Ｃ．Ｊ．Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０４（５６７７）：１６４４−１６４７（２００４年））。
【０４１９】
プラスミドｐＹＲＨ４１、ｐＹＲＨ４２、ｐＹＲＨ４８およびｐＹＲＨ５１の構築：
ＹｌＡｓｃ２（配列番号１２７）、ＹｌＳｃｓ２（配列番号１３３）、ＹｌＣｂｒ１（配列番号１３１）およびＹｌＳｋｓ１（配列番号１２９）をそれぞれ過剰発現させるために、プラスミドｐＹＲＨ４１、ｐＹＲＨ４２、ｐＹＲＨ４８、およびｐＹＲＨ５１を構築した。これらのプラスミドは全てプラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓ（図８Ｂ、配列番号９２、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書の実施例６に記載）に由来した。
【０４２０】
具体的には、プライマーＡＳＣ２−Ｆ（配列番号１３４）およびＡＳＣ２−Ｒ（配列番号１３５）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲ（一般的方法）によってＹｌＡＳＣ２遺伝子の２．０ｋＢ断片を増幅した。ＹｌＳＣＳ２遺伝子の１．７ｋＢ断片は、プライマーＳＣＳ２−Ｆ（配列番号１３６）およびＳＣＳ２−Ｒ（配列番号１３７）Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲによって同様に増幅した。ＹｌＣＢＲ１遺伝子の０．９ｋＢ断片は、プライマーＣＢＲ１−Ｆ（配列番号１３８）およびＣＢＲ１−Ｒ（配列番号１３９）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲによって増幅した。そして、ＹｌＳＫＳ１遺伝子の１．３ｋＢ断片は、プライマーＳＫＳ１−Ｆ（配列番号１４０）およびＳＫＳ１−Ｒ（配列番号１４１）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲによって増幅した。増幅したそれぞれの遺伝子をＰｃｉＩ／ＮｏｔＩまたはＮｃｏＩ／ＮｏｔＩのずれかで消化し、次に、ｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置換するために使用して、それぞれ、ｐＹＲＨ４１、ｐＹＲＨ４２、ｐＹＲＨ４８およびｐＹＲＨ５１を生じた。従って、新しく構築した各プラスミドは、ヤロウイアＦＢＡＩＮｍプロモーターによってその発現が駆動されるキメラ遺伝子を含有した。
【０４２１】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ａｓｃ２、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｋｓ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｃｂｒ１およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｃｓ２の作製：
株Ｙ４１８４ＵにおいてＹｌＡＳＣ２、ＹｌＳＫＳ１、ＹｌＣＢＲ１およびＹｌＳＣＳ２を過剰発現させるために、ＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩ（ＹｌＡＳＣ２、ＹｌＳＫＳ１およびＹｌＣＢＲ１）またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＰａｃＩ（ＹｌＳＣＳ２）で各プラスミドを消化し、適切な断片を単離して形質転換のために使用し（一般的方法）、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ａｓｃ２、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｋｓ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｃｂｒ１およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｃｓ２を生じた。
【０４２２】
ＹｌＡＳＣ２、ＹｌＳＫＳ１、ＹｌＣＢＲ１およびＹｌＳＣＳ２を過剰発現させる細胞をスクリーニングするために、ヤロウイアＴＥＦ１遺伝子を対照として用いて（実施例２）、ＹｌＡＳＣ２、ＹｌＳＫＳ１、ＹｌＣＢＲ１およびＹｌＳＣＳ２における定量リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、リアルタイムＰＣＲプライマーＡＣＳ２−ＹＬ−１５２７Ｆ（配列番号１６６）、ＡＣＳ２−ＹＬ−１５９８Ｒ（配列番号１６７）、ＳＫＳ１−７８４Ｆ（配列番号１６９）、ＳＫＳ１−８４６Ｒ（配列番号１７０）、ＣＢＲ１−４６１Ｆ（配列番号１７２）、ＣＢＲ１−５２７Ｒ（配列番号１７３）、ＳＣＳ２−３１０Ｆ（配列番号１７５）およびＳＣＳ２−３７１Ｒ（配列番号１７６）、ならびにＴａｑＭａｎプローブＡＣＳ２−ＹＬ−１５４８Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＧＡＣ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１６８で示される）、ＳＫＳ１−８０６Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＴＧＣＣＧＧＣＡＴＴＣＴＣＡＡＣＣＧＣＡ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１７１で示される）、ＣＢＲ１−４８２Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１７４で示される）およびＳＣＳ２−３２８Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１７７で示される）を設計した。プライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０４２３】
実施例８に記載されるように候補ｃＤＮＡを調製した。ＴＥＦ１、ＹｌＡＳＣ２、ＹｌＳＫＳ１、ＹｌＣＢＲ１およびＹｌＳＣＳ２のための反応は、各サンプルにつき２通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応の組成は、順方向および逆方向プライマーが、ＲＥＧ１−１２３０ＦおよびＲＥＧ１−１２９６Ｒ（配列番号１５１および１５２）とは対照的にＡＣＳ２−ＹＬ−１５２７Ｆ、ＡＣＳ２−ＹＬ−１５９８Ｒ、ＳＫＳ１−７８４Ｆ、ＳＫＳ１−８４６Ｒ、ＣＢＲ１−４６１Ｆ、ＣＢＲ１−５２７Ｒ、ＳＣＳ２−３１０ＦおよびＳＣＳ２−３７１Ｒ（上記）を含み、ＴａｑＭａｎプローブが、ＲＥＧ１−１２５４Ｔ（配列番号１５３で示されるヌクレオチド配列）とは対照的にＡＣＳ２−ＹＬ−１５４８Ｔ、ＳＫＳ１−８０６Ｔ、ＣＢＲ１−４８２ＴおよびＳＣＳ２−３２８Ｔ（上記）を含んでいた点を除いて、実施例８に記載されるのと同一であった。増幅、データ収集およびデータ分析は、実施例８に記載されるとおりであった。
【０４２４】
この分析に基づいて、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株と比べて、Ｙ４１８４Ｕ＋Ａｓｃ２、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｋｓ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｃｂｒ１およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｃｓ２株は、それぞれ、約２．７倍、１．３倍、４．６倍および３．１倍高いＹｌＡＳＣ２、ＹｌＳＫＳ１、ＹｌＣＢＲ１およびＹｌＳＣＳ２遺伝子の発現レベルを示すと結論付けた。
【０４２５】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）、Ｙ４１８４Ｕ＋Ａｓｃ２、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｋｓ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｃｂｒ１およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｃｓ２の評価：
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＡｓｃ２、Ｓｃｓ２、Ｃｂｒ１およびＳｋｓ１の過剰発現の、総脂質含量およびＦＡ組成に対する効果を評価および比較するために、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）（対照）および株Ｙ４１８４Ｕ＋Ａｓｃ２、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｋｓ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｃｂｒ１およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｃｓ２を、一般的方法に記載されるように同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、各株の培養物を２５ｍＬのＳＤ培地中約０．３の開始ＯＤ600（約０．１の開始ＯＤ600に対して）で増殖させたことであった。
【０４２６】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照、Ｙ４１８４Ｕ＋Ａｓｃ２、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｋｓ１、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｃｂｒ１およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｃｓ２株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表２７、表２８、表２９および表３０に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０４２７】
表２７：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ａｃｓ２中の脂質含量および組成
【表２７】
0005656836.tif 000043
【０４２８】
表２８：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｋｓ１中の脂質含量および組成
【表２８】
0005656836.tif 000044
【０４２９】
表２９：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｃｂｒ１中の脂質含量および組成
【表２９】
0005656836.tif 000045
【０４３０】
表３０：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｃｓ２中の脂質含量および組成
【表３０】
0005656836.tif 000046
【０４３１】
表２７、２８および３０の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べて、Ｙ４１８４ＵにおけるＹｌＡｓｃ２（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｆ０５９６２ｇに対応する）、ＹｌＳｋｓ１（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｂ０８５５８ｐに対応する）およびＹｌＳｃｓ２（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｄ０５２９１ｇに対応する）の過剰発現が、脂質含量の増大［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］をもたらさないことを示した。
【０４３２】
対照的に、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べて、Ｙ４１８４Ｕにおける遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｄ０４９８３ｇ対応するＹｌＣｂｒ１の過剰発現は、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約１３％増大させ、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を約１５％増大させた。
【０４３３】
実施例１４
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）においてマイクロアレイ解析により同定されたグルコーストランスポーターＳｎｆ３の過剰発現は全蓄積脂質レベルを増大させる。
推定上のグルコーストランスポーターをコードするＳＮＦ３遺伝子は、対照株と比べて、ｓｎｆ１Δ株において１．３倍上方制御される（実施例１１、表２５）。本実施例は、過剰発現構築物ｐＹＲＨ５０（配列番号１４２）の合成、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ３の単離を説明する。ＹｌＳｎｆ３過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果を決定および比較した。ＹｌＳＮＦ３の過剰発現は、その天然Ｓｎｆ３レベルが操作されていない細胞と比べて、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）をもたらした。
【０４３４】
グルコーストランスポーターＳｎｆ３の操作のための実験原理：
実施例１１の表２５に記載されるように、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ０６４２４ｇ（配列番号１４３）の発現は、ｓｎｆ１Δ株において１．３倍増大された。ＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ０６４２４ｇによってコードされるヤロウイアタンパク質は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＳｎｆ３タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１００８７）と最大相同性を共有した（すなわち、タンパク質は、５ｅ−１３０の期待値で、４６％の同一性および６７％の類似性を共有した）。従って、ＹＡＬＩ０Ｃ０６４２４ｇ  ＯＲＦは本明細書ではＹｌＳＮＦ３と称した。
【０４３５】
Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｎｆ３［ＳｃＳｎｆ３］は、グルコースセンサーとして機能する形質膜タンパク質である（Ｏｅｚｃａｎ，Ｓ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：２５６６−２５７３（１９９８年））が、このタンパク質はグルコースを輸送する能力が欠けている（グルコーストランスポーターに対して著しく相同性であるにもかかわらず）。ＳｃＳｎｆ３は、他のグルコーストランスポーターとは違って、グルコース感知において重要な役割を果たす細胞質中に３４１のアミノ酸を含む長いＣ末端テイルを含有する（Ｏｅｚｃａｎ，Ｓ．ら，上記）。
【０４３６】
ＹｌＳｎｆ３がＳｃＳｎｆ３のＣ末端テイルに相当するものを有さないことは明らかであるが、ＹｌＳｎｆ３は、グルコーストランスポーターをコードすることが可能である。従って、ＹｌＳｎｆ３の過剰発現の全脂質に対する効果を以下で調べた。
【０４３７】
ｐＹＲＨ５０の構築：
ＹｌＳｎｆ３（配列番号１４４）を過剰発現させるようにプラスミドｐＹＲＨ５０を構築した。プラスミドｐＹＲＨ５０は、プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓ（図８Ｂ、配列番号９２、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書の実施例６に記載）に由来した。
【０４３８】
プライマーＳＮＦ３−Ｆ（配列番号１４５）およびＳＮＦ３−Ｒ（配列番号１４６）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲ（一般的方法）によって、ＹｌＳＮＦ３遺伝子の１．５５ｋＢ断片を増幅した。増幅された遺伝子をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置換してｐＹＲＨ５０を生じた。従って、ｐＹＲＨ５０は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＳＮＦ３：：ＰＥＸ２０遺伝子を含有した。
【０４３９】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ３の作製：
株Ｙ４１８４ＵにおいてＹｌＳＮＦ３を過剰発現させるために、ｐＹＲＨ５０を制限酵素切断し、４．３ｋＢのＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩ断片を単離して形質転換のために使用し（一般的方法）、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ３を生じた。
【０４４０】
ＹｌＳＮＦ３を過剰発現させる細胞をスクリーニングするために、ヤロウイアＴＥＦ１遺伝子を対照として用いて（実施例２）、ＹｌＲＭＥ１における定量リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、リアルタイムＰＣＲプライマーＳＮＦ３−９９９Ｆ（配列番号１７８）およびＳＮＦ３−１０６６Ｒ（配列番号１７９）、ならびにＴａｑＭａｎプローブＳＮＦ３−１０２０Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭTM−ＡＴＣＧＧＡＧＣＴＡＴＣＧＴＣＡＴＧＴＧＣＴＣ−ＴＡＭＲＡTM、ここで、ヌクレオチド配列は配列番号１８０で示される）を設計した。プライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手した。
【０４４１】
実施例８に記載されるように候補ｃＤＮＡを調製した。ＴＥＦ１およびＹｌＳＮＦ３のための反応は、各サンプルにつき２通りで別々に行った。リアルタイムＰＣＲ反応の組成は、順方向および逆方向プライマーが、ＲＥＧ１−１２３０ＦおよびＲＥＧ１−１２９６Ｒ（配列番号１５１および１５２）とは対照的にＳＮＦ３−９９９ＦおよびＳＮＦ３−１０６６Ｒ（上記）を含み、ＴａｑＭａｎプローブが、ＲＥＧ１−１２５４Ｔ（配列番号１５３で示されるヌクレオチド配列）とは対照的にＳＮＦ３−１０２０Ｔ（上記）を含んでいた点を除いて、実施例８に記載されるのと同一であった。増幅、データ収集およびデータ分析は、実施例８に記載されるとおりであった。
【０４４２】
この分析に基づいて、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株と比べて、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ３株は、約２．２倍高いＹｌＳＮＦ３遺伝子の発現レベルを示すと結論付けた。
【０４４３】
ヤロウイア・リポティティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｔｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ３の評価：
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＳｎｆ３過剰発現の、総脂質含量およびＦＡ組成に対する効果を評価および比較するために、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）（対照）および株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ３を、一般的方法に記載されるように同等の油性条件下で増殖させた。一般的方法における手順に対する唯一の例外は、各株の培養物を２５ｍＬのＳＤ培地中約０．３の開始ＯＤ600（約０．１の開始ＯＤ600に対して）で増殖させたことであった。
【０４４４】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ３株についてのＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸の濃度は以下の表３１に示されるが、平均はグレーで強調され、「Ａｖｅ」で示される。
【０４４５】
表３１：Ｙ．リポリティカ（lipolytica）株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）およびＹ４１８４Ｕ＋Ｓｎｆ３中の脂質含量および組成
【表３１】
0005656836.tif 000047
【０４４６】
表３１の結果は、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照と比べて、Ｙ４１８４Ｕにおける遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ０６４２４ｇに対応する推定上のグルコーストランスポーターＹｌＳｎｆ３の過剰発現が、脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約１４％増大させ、平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を約１４％増大させることを示した。
【０４４７】
推定上のグルコーストランスポーターＹｌＳｎｆ３の過剰発現が対照株に対して脂質産生を増大させるという上記で実証された肯定的な結果に基づいて、他のグルコーストランスポーターの過剰発現が同様の結果を生じるであろうと仮定される。例えば、グルコーストランスポーターＹＡＬＩ０Ｃ０８９４３ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５０１６２１）およびＹＡＬＩ０Ｆ１９１８４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５０５６１０）は、ＹｌＳｎｆ３について本明細書において記載されるのと同様の方法で容易に過剰発現され、細胞の脂質蓄積の増大（そして恐らく、ＥＰＡ生産性の増大）ことが期待されるであろう。同様に、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＨＸＴタンパク質（例えば、Ｈｘｔ１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１１９６２、Ｈｘｔ３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１０６３２、Ｈｘｔ４、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１１９６０）などの、異種グルコーストランスポーターも過剰発現され得る。
【０４４８】
実施例１５
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼリン酸化部位の操作は、全蓄積脂質を増大させた。
本実施例は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［「ＡＣＣ」］内のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼリン酸化部位の同定、リン酸化することができない変異体ＡＣＣタンパク質を賛成するためのこの部位の変異、変異体ＡＣＣ*タンパク質を過剰発現させるために適したベクターの合成、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋ＡＣＣ*の単離を説明する。ＹｌＡＣＣ*過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果が決定および比較されるであろう。ＹｌＡＣＣ*過剰発現は、その天然ＡＣＣが変異されていない細胞と比べて、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）もたらすことが予期される。
【０４４９】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの操作のための実験原理：
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［「ＡＣＣ」；ＥＣ  ６．４．１．２］は、脂肪酸合成における重要な制御工程を触媒する。哺乳類において、ＡＣＣの酵素活性は、ＡＭＰ−活性化タンパク質キナーゼ［「ＡＭＰＫ」］、すなわち、哺乳類におけるＳｎｆ１哺乳類オルソログによって制御される。ＡＭＰＫは、特定のＡＣＣ残基を脱リン酸化することによって、ＡＣＣの発現を上方制御すると思われる。例えば、ラットＡＣＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０７１５２９、配列番号１４７）のセリン残基７９［「Ｓｅｒ−７９」］は、ＡＭＰＫによるＡＣＣの不活性化に対して完全に責任があることが示された（Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８７：１８３−１９０（１９９０年）、Ｈａ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（３５）：２２１６２−２２１６８（１９９４年））。言い換えると、ＡＣＣ活性は、リン酸化によるＡＭＰＫ／ＳＮＦ１によって阻害され得る。
【０４５０】
サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、ＡＣＣの酵素活性が、リン酸化によりヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御されることも実証された（Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ，Ｋ．Ｉ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２３６１−２３６４（１９９４年）、Ｗｏｏｄｓ，Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１９５０９−１９５１５（１９９４年））が、ラットＡＣＣの対応するＳｅｒ−７９部位は、酵母ＡＣＣ中には存在しない。従って、ＳＮＦ１によるＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＣＣの制御は、そのため、タンパク質上の異なる部位におけるリン酸化によって生じるはずであることが予期される。
【０４５１】
ＡＭＰＫ／Ｓｎｆ１タンパク質キナーゼファミリーのためのコンセンサスリン酸化部位は、Ｈｙｄ−（Ｘａａ−Ｂａｓ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｄ（配列番号１４８）であることが示唆されている。ここで、Ｈｙｄはかさ高い疎水性側鎖（すなわち、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）であり、Ｂａｓは塩基性残基（すなわち、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、ＡｒｇはＬｙｓよりも塩基性であり、ＬｙｓはＨｉｓよりも塩基性である）であり、そしてＸａａは任意のアミノ酸残基である（Ｈａｒｄｉｅ，Ｄ．Ｇ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：８２１−８５５（１９９８年）において概説される）。
【０４５２】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ１１４０７ｇ（配列番号１４９）はＡＣＣをコードする。マウス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿５７９９３８）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０７１５２９）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０７１５２９）、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿７７６６４９）およびヤロウイアからのＡＣＣタンパク質のアライメントを実施した。ラットＡＣＣの対応するＳｅｒ−７９位がヤロウイアＡＣＣ中に存在しないことは明らかである。ヤロウイアＡＣＣタンパク質内の推定上のＨｙｄ−（Ｘａａ−Ｂａｓ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｄコンセンサスリン酸化部位は、配列番号１５０のアミノ酸７１１−７１９、１１７３−１１８２、１４５２−１４６２、１６１２−１６２１、１８６３−１８７３、１８８０−１８８９、２０３３−２０４１および／または２１０９−２１１９に対応する。
【０４５３】
哺乳類およびＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の両方におけるＡＣＣ制御の保存メカニズムに基づいて、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＡＣＣの酵素活性は、リン酸化によりヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって同様に制御される（すなわち、ＡＣＣのＡＭＰＫ／Ｓｎｆ１ファミリーキナーゼ部位がリン酸化されない場合にＡＣＣ活性が増大される）と仮定される。リン酸化することができない変異体ＡＣＣを作製できれば（例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒリン酸化部位を、Ａｌａなどのリン酸化不可能な中性残基に置換することによって）、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼは、もはや、ＡＣＣの活性を下方制御することができず、細胞内の脂質産生を増大させるであろう。
【０４５４】
興味深いことに、ＹｌＡＣＣ１遺伝子（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ１１４０７ｇ、配列番号１４９）の活性は、対照株と比べて、ｓｎｆ１Δ株において１．３６倍上方制御され（実施例１１）、ＹｌＦＡＳ２遺伝子（遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｃ１１４０７ｇ、鎖飽和脂肪酸の合成を触媒することに責任がある脂肪酸シンテターゼのα−サブユニットをコードする、ＥＣ  ２．３．１．４１）はｓｎｆ１Δ株において１．３１倍上方制御された。これは、Ｓｎｆ１によるＡＣＣの翻訳後調節に加えて、脂質生合成における２つの重要な酵素の転写がＳｎｆ１によって制御されることを示唆し得る。
【０４５５】
ｐＹＲＨ＿ＹｌＡＣＣの構築：
プラスミドｐＹＲＨ＿ＹｌＡＣＣは、ＹｌＡＣＣをコードするＯＲＦ  ＹＡＬＩ０Ｃ１１４０７ｇ（配列番号１４９）を過剰発現させるように構築されるであろう。プラスミドｐＹＲＨ＿ＹｌＡＣＣは、プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓに由来し得る（図８Ｂ、配列番号９２、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書の実施例６に記載）。具体的には、ＹｌＡＣＣ遺伝子の０．４ｋＢ断片は、プライマーＡＣＣ１−Ｆ（配列番号１８８）およびＡＣＣ−ＮｏｔＲ（配列番号１８９）を用いて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムからＰＣＲ（一般的方法）によって増幅され得る。ＹｌＡＣＣ遺伝子の別の６．９ｋＢ断片は、プライマーＡＣＣ−ＮｏｔＦ（配列番号１９０）およびＡＣＣ１−Ｒ（配列番号１９１）を用いて、ＰＣＲ（一般的方法）によって増幅され得る。増幅された０．４ｋＢ断片はＮｃｏＩ−ＮｏｔＩで消化され、６．９ｋＢ断片はＮｏｔＩで消化され得る。精製した断片を使用して、ｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置換し、それにより、ｐＹＲＨ＿ＹｌＡＣＣを生じるであろう。従って、ｐＹＲＨ＿ＹｌＡＣＣはキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＡＣＣ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含有し得る。
【０４５６】
部位特異的変異誘発によるＡＣＣにおけるＡＭＰＫ／ＳＮＦ１リン酸化部位の同定：
部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＹｌＡＣＣ（配列番号１５０）のＳｅｒ−７１５、Ｓｅｒ−１１７８、Ｔｈｒ−１４５８、Ｓｅｒ−１６１７、Ｔｈｒ−１８６９、Ｓｅｒ−１８８５、Ｓｅｒ−２０３７またはＳｅｒ−２１１５を個々に変異させるために、ｐＹＲＨ＿ＹｌＡＣＣをテンプレートとして用いて単一のアミノ酸変異を実行し、それにより、Ａｌａ置換を起こし、一連のＹｌＡＣＣ*変異体（すなわち、ＹｌＡＣＣ*−Ｓ７１５Ａ、ＹｌＡＣＣ*−Ｓ１１７８Ａ、ＹｌＡＣＣ*−Ｔ１４５８Ａ、ＹｌＡＣＣ*−Ｓ１６１７Ａ、ＹｌＡＣＣ*−Ｔ１８６９Ａ、ＹｌＡＣＣ*−Ｓ１８８５Ａ、ＹｌＡＣＣ*−Ｓ２０３７ＡおよびＹｌＡＣＣ*−Ｓ２１１５Ａ）を作製することができる。変異誘発に続いて、変異体ＹｌＡＣＣ*プラスミドは直線化され、単離され、そして株Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕに形質転換され（一般的方法）、それにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋ＹｌＡＣＣ*−Ｓ７１５Ａ、Ｙ４１８４Ｕ＋ＹｌＡＣＣ*−Ｓ１１７８Ａ、Ｙ４１８４Ｕ＋ＹｌＡＣＣ*−Ｔ１４５８Ａ、Ｙ４１８４Ｕ＋ＹｌＡＣＣ*−Ｓ１６１７Ａ、Ｙ４１８４Ｕ＋ＹｌＡＣＣ*−Ｔ１８６９Ａ、Ｙ４１８４Ｕ＋ＹｌＡＣＣ*−Ｓ１８８５Ａ、Ｙ４１８４Ｕ＋ＹｌＡＣＣ*−Ｓ２０３７Ａ、およびＹ４１８４Ｕ＋ＹｌＡＣＣ*−Ｓ２１１５Ａを生じ得る。
【０４５７】
ＹｌＡＣＣ*過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果は、これまでの実施例に記載されるように決定および比較され得る。その天然ＡＣＣが変異されていない細胞に比べて全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）を実証する変異体Ｙ４１８４Ｕ株は、ＡＭＰＫ／Ｓｎｆ１リン酸化部における変異を有する変異体ＡＣＣに対応するであろう。
【０４５８】
実施例１６
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＤＧＡＴ」］リン酸化部位の操作は、全蓄積脂質を増大させる。
本実施例は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＤＧＡＴ」］内のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼリン酸化部位の同定、リン酸化することができない変異体ＤＧＡＴタンパク質を産生するためのこの部位の変異、変異体ＤＧＡＴ*タンパク質を過剰発現させるのに適したベクターの合成、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ＋ＤＧＡＴ*の単離を説明する。ＹｌＤＧＡＴ*過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果は、決定および比較されるであろう。ＹｌＤＧＡＴ*過剰発現は、その天然ＤＧＡＴが変異されていない細胞と比べて、全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）をもたらすことが予期される。
【０４５９】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの操作のための実験原理：
トリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］は、細胞中の主要な貯蔵脂質である。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＤＧＡＴ」］（アシル−ＣｏＡ−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼまたはジアシルグリセロール  Ｏ−アシルトランスフェラーゼとしても知られる）（ＥＣ  ２．３．１．２０）はＴＡＧ生合成に排他的に関係付けられる酵素であり、アシル−ＣｏＡおよび１，２−ジアシルグリセロールのＴＡＧおよびＣｏＡへの転換を触媒する。ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２の２つのファミリーのＤＧＡＴ酵素が存在する。前者のファミリーはアシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ［「ＡＣＡＴ」］遺伝子ファミリーと相同性を共有するが、後者のファミリーは関係ない（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４２）：３８８６２−２８８６９（２００１年））。
【０４６０】
ＤＧＡＴは脂質蓄積における律速段階の１つであり得ることが示唆されている。そのため、ＤＧＡＴ活性を増大させると脂質蓄積も増大することが仮定される。ＤＧＡＴ活性は、ＡＣＣについて実施例１５で記載したのと同様の方法でリン酸化によりヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御されると思われる。
【０４６１】
より具体的には、トロパエオルム・マジャス（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ  ｍａｊｕｓ）（園芸用キンレンカ）のＳｎＲＫ１（Ｓｎｆ１の植物オルソロジー）についての研究は、ＤＧＡＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ０８４０５２）内の推定上のリン酸化部位（すなわち、Ｓｅｒ−１９７）の変異がその酵素活性を３８％〜８０％の間で増大させることを実証した（Ｘｕ，Ｊｉｎｇｙｕら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．，６（８）：７９９−８１８（２００８年））。さらに、改変ＤＧＡＴ１（すなわち、Ｓｅｒ１９７Ａｌａ変異を有する）を含有する構築物でＡ．タリアナ（ｔｈａｌｉａｎａ）を形質転換すると、種子ごとに、種子含油量が２０％〜５０％高くなった。Ｘｕらは、「．．．この推定上のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ部位の改変はＤＧＡＴ１活性を強化するために利用でき、変異ＤＧＡＴ１の発現は含油量を高めるために使用することができる」と結論付けた。残念なことに、Ｔ．マジャス（ｍａｊｕｓ）ＤＧＡＴのＳｅｒ−１９７は植物および真菌種間で保存されないが、推定上のＳｎＲＫ１リン酸化部位は、他の植物からのＤＧＡＴにおいて見出されている。
【０４６２】
ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるＤＧＡＴのリン酸化の決定：
ＤＧＡＴをコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）および／またはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｉｖｉｓａｅ）遺伝子がヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによってリン酸化されるかどうかを決定するために、ＤＧＡＴ１および／またはＤＧＡＴ２は細菌発現ベクターから発現され、アフィニティ精製法によって精製され得る。より具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１１４７（遺伝子座ＮＰ＿０１４８８８）は、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＧＡＴ２酵素（ＰＤＡＴと一緒に、この生物における油の生合成の９５％に関与する）をコードする［Ｓａｎｄａｇｅｒ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（８）：６４７８−６４８２（２００２年）、Ｏｅｌｋｅｒｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：８８７７（２００２年）］。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２（配列番号１８４）は米国特許第７，２６７，９７６号明細書に記載されており、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１（配列番号１８２）は米国特許第７，２７３，７４６号明細書に記載されている。当業者は、ＢＬ２１（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などの市販の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株において発現させる前に、これらの遺伝子をＰＣＲによって容易に増幅して、ｐＥＴ−３２（Ｍｅｒｃｋ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などの適切な発現ベクター内にクローン化することができるであろう。Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）などの市販のキットは、容易なアフィニティ精製を可能にするであろう。
【０４６３】
Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｉｖｉｓａｅ）Ｓｎｆ１タンパク質キナーゼおよび／またはＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｓｎｆ１タンパク質キナーゼは、部分的に精製され、次にＶｉｎｃｅｎｔ，Ｏ．およびＭ．Ｃａｒｌｓｏｎ（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８（２３）：６６７２（１９９９年））、ならびにＨｏｎｇ，Ｓ．−Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：８８３９−８８４３（２００３年））で記載されるようにインビトロキナーゼアッセイが実施され得る。この実験研究により、ＤＧＡＴ１またはＤＧＡＴ２がヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって実際にリン酸化されることが確認されれば、ＤＧＡＴ内の推定上のＳｎｆ１リン酸化部位は、変異誘発のために選択されるであろう。
【０４６４】
部位特異的変異誘発によるＤＧＡＴにおけるＡＭＰＫ／ＳＮＦ１リン酸化部位の同定：
キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＤＧＡＴ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含む過剰発現プラスミドは、実施例１５においてＹｌＡＣＣの過剰発現について記載したのと同様の方法で構築されるであろう。次に、部位特異的変異誘発（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によってＹｌＤＧＡＴ内の推定上のＳｅｒ／Ｔｈｒリン酸化部位を個々に変異させるために、発現プラスミドをテンプレートとして用いて単一のアミノ酸変異を実行し、それにより、Ａｌａ置換を起こし、一連のＹｌＤＧＡＴ*変異体を作製することができる。変異誘発に続いて、変異体ＹｌＤＧＡＴ*プラスミドは直線化され、単離され、そして株Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕに形質転換され（一般的方法）、それにより、種々のＹ４１８４Ｕ＋ＹｌＤＧＡＴ*株を生じ得る。
【０４６５】
ＹｌＤＧＡＴ*過剰発現の蓄積脂質レベルに対する効果は、これまでの実施例に記載されるように決定および比較され得る。実際に、ＤＧＡＴが、ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるその不活性化のためにリン酸化されれば、その天然ＤＧＡＴが変異されていない細胞に比べて全脂質の増大（全乾燥細胞質量の割合［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で測定）を実証する変異体Ｙ４１８４Ｕ株は、ＡＭＰＫ／Ｓｎｆ１リン酸化部位における変異を有する変異体ＤＧＡＴに対応するであろう。
本発明の例示的態様を以下に列挙する。
（１）（ａ）非遺伝子導入油性真核宿主細胞のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性と比べて低下された活性を有するヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼと、
（ｂ）活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む非遺伝子導入油性真核宿主細胞の総脂質含量と比べたときの総脂質含量の増大と
を含む、遺伝子導入油性真核宿主細胞。
（２）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下および総脂質含量の増大が、
（ａ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質の変更、
（ｂ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの変更、および
（ｃ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質の変更、
からなる群から選択される改変によるものである、（１）に記載の遺伝子導入油性真核宿主細胞。
（３）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下および総脂質含量の増大が、
（ａ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｓａｋ１およびＴｏｓ３からなる群から選択されるキナーゼである上流制御タンパク質の下方制御と、
（ｂ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、ヘキソキナーゼアイソザイム２（Ｈｘｋ２）からなるヘキソキナーゼである上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｃ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｄ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｒｅｇ１およびＧｌｃ７からなる群から選択されるＲｅｇ１−Ｇｌｃ７タンパク質−ホスファターゼ１複合体のタンパク質である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｅ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｆ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの制御ドメインの上方制御と、
（ｇ）触媒的に不活性なＳｎｆ１α−サブユニットの上方制御と、
（ｈ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの、Ｇａｌ８３からなるＳＮＦ１β−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｉ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１γ−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｊ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、Ｒｍｅ１およびＭｈｙ１からなる群から選択される亜鉛−フィンガータンパク質である下流タンパク質の上方制御と、
（ｋ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、ミクロソームチトクロムｂ5レダクターゼ（Ｃｂｒ１）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｌ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、グルコーストランスポーター（Ｓｎｆ３）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｍ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるリン酸化によって制御され、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるタンパク質である下流タンパク質の、前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによってリン酸化することができない突然変異体の上方制御、
とからなる群から選択される改変によるものである、（２）に記載の遺伝子導入油性真核宿主細胞。
（４）ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのα−サブユニットをコードするポリヌクレオチドが、
ａ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ＢＬＡＳＴＰアライメント法に基づいて、配列番号２、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＢＬＡＳＴＮアライメント法に基づいて、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比べて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは
ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補配列（前記相補配列および前記ヌクレオチド配列は同じ数のヌクレオチドからなり、１００％相補的である）、
を含む、単離Ｓｎｆ１ヌクレオチド分子を含む、（３）に記載の油性真核宿主細胞。
（５）油性真核宿主細胞が、藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイルおよび酵母からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の遺伝子導入油性真核宿主細胞。
（６）酵母が、ヤロウイア属、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属およびリポマイセス属からなる群から選択される、（５）に記載の遺伝子導入油性真核宿主細胞。
（７）酵母が、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、（６）に記載の遺伝子導入油性真核酵母細胞。
（８）（１）〜（６）のいずれか一項に記載の遺伝子導入油性真核宿主細胞から得られる油または脂質。
（９）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む油性真核宿主細胞の総脂質含量を増大させるための方法であって、
（ａ）前記油性真核宿主細胞を形質転換し、それにより、前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性が、非形質転換油性真核宿主細胞中のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性のレベルと比べて低下されることと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）の形質転換細胞を適切な条件下で増殖させ、それにより、前記総脂質含量が、活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを有する非形質転換油性真核宿主細胞から得られる総脂質含量と比べて増大されることと、
（ｃ）場合により、前記ステップ（ｂ）の細胞から油または脂質を回収してもよいことと
を含む前記方法。
（１０）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを有する油性真核宿主細胞が、
（ａ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質の変更、
（ｂ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの変更、および
（ｃ）前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質の変更
からなる群から選択される改変によって形質転換される、（９）に記載の方法。
（１１）形質転換が、
（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｓａｋ１およびＴｏｓ３からなる群から選択されるキナーゼである上流制御タンパク質の下方制御と、
（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、ヘキソキナーゼアイソザイム２（Ｈｘｋ２）からなるヘキソキナーゼである上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、グルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｄ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連し、Ｒｅｇ１およびＧｌｃ７からなる群から選択されるＲｅｇ１−Ｇｌｃ７タンパク質−ホスファターゼ１複合体のタンパク質である上流制御タンパク質の上方制御と、
（ｅ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｆ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの制御ドメインの上方制御と、
（ｇ）触媒的に不活性なＳｎｆ１α−サブユニットの上方制御と、
（ｈ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの、Ｇａｌ８３からなるＳＮＦ１β−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｉ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳＮＦ１γ−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの下方制御と、
（ｊ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、Ｒｍｅ１およびＭｈｙ１からなる群から選択される亜鉛−フィンガータンパク質である下流タンパク質の上方制御と、
（ｋ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、ミクロソームチトクロムｂ5レダクターゼ（Ｃｂｒ１）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｌ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御され、グルコーストランスポーター（Ｓｎｆ３）である下流タンパク質の上方制御と、
（ｍ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによるリン酸化によって制御され、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるタンパク質である下流タンパク質の、前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによってリン酸化することができない突然変異体の上方制御、
とからなる群から選択される、（１０）に記載の方法。
（１２）ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのＳｎｆ１α−サブユニットをコードするポリヌクレオチドが、
ａ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ＢＬＡＳＴＰアライメント法に基づいて、配列番号２、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＢＬＡＳＴＮアライメント法に基づいて、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比べて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは
ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補配列（前記相補配列および前記ヌクレオチド配列は同じ数のヌクレオチドからなり、１００％相補的である）
を含む単離ヌクレオチド分子を含む、（１１）に記載の方法。
（１３）油性真核宿主細胞が、藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイルおよび酵母からなる群から選択される、（１０）〜（１２）のいずれか一項に記載の方法。
（１４）酵母が、ヤロウイア属、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属およびリポマイセス属からなる群から選択される、（１３）に記載の方法。
（１５）酵母が、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、（１４）に記載の方法。
（１６）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを含む油性真核宿主細胞から得られる微生物油中の総多価不飽和脂肪酸含量を増大させるための方法であって、
（ａ）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする単離ポリヌクレオチドで前記油性真核宿主細胞を形質転換し、非形質転換油性真核宿主細胞中のヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性のレベルと比べて、前記ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性も低下されることと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）の形質転換細胞を適切な条件下で増殖させ、それにより、総脂質含量が、活性が低下されていないヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼを有する非形質転換油性真核宿主細胞から得られる総脂質含量と比べて増大されることと、
（ｃ）場合により、前記ステップ（ｂ）の細胞から油または脂質を回収してもよいことと
を含む方法。
（１７）機能性多価不飽和脂肪酸をコードする遺伝子が、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼからなる群から選択され、そしてヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼの活性の低下が、
（ａ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼに関連する上流制御タンパク質の変更、
（ｂ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼのサブユニットをコードするポリヌクレオチドの変更、および
（ｃ）ヘテロ三量体ＳＮＦ１タンパク質キナーゼによって制御される下流タンパク質の変更
からなる群から選択される改変によるものである、（１６）に記載の方法。
（１８）多価不飽和脂肪酸がω−３脂肪酸またはω−６脂肪酸である、（１６）または（１７）に記載の方法。
【図１】
0005656836.tif 000048
【図２Ａ】
0005656836.tif 000049
【図２Ｂ】
0005656836.tif 000050
【図３】
0005656836.tif 000051
【図４Ａ】
0005656836.tif 000052
【図４Ｂ】
0005656836.tif 000053
【図４Ｃ】
0005656836.tif 000054
【図４Ｄ】
0005656836.tif 000055
【図４Ｅ】
0005656836.tif 000056
【図５Ａ】
0005656836.tif 000057
【図５Ｂ】
0005656836.tif 000058
【図６】
0005656836.tif 000059
【図７】
0005656836.tif 000060
【図８Ａ】
0005656836.tif 000061
【図８Ｂ】
0005656836.tif 000062
【図９】
0005656836.tif 000063
【配列表】
0005656836000001.app