(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞中でのＭａｆＡの発現を上方制御することができる短いＲＮＡであって、１９〜２５ヌクレオチド長の、（ａ）配列ＡＵＣＵＧＵＡＣＵＧＧＡＵＧＡＧＣＧＧ（配列番号１）を含むか、または（ｂ）配列ＵＵＵＣＣＣＧＣＡＧＧＡＧＡＵＵＧＡＣ（配列番号２）を含む第１の鎖を含み、かつ１９〜２５ヌクレオチド長の、前記第１の鎖とともに二本鎖を形成する第２の鎖を含む、短いＲＮＡ。
【請求項２】
前記ＲＮＡのそれぞれの鎖が、その３’末端に対をなさない１〜３のヌクレオチドを持ち、オーバーハングを形成している、請求項１に記載の短いＲＮＡ。
【請求項３】
前記３’オーバーハングが１または複数のウラシルヌクレオチドを含む、請求項２に記載の短いＲＮＡ。
【請求項４】
前記３’オーバーハングが１または複数のウラシルヌクレオチドから成る、請求項２に記載の短いＲＮＡ。
【請求項５】
インスリンの産生および分泌をインビトロのヒト細胞によるグルコース反応性の方式で誘導するための、請求項１〜４のいずれか１項に定義された短いＲＮＡの使用。
【請求項６】
請求項１の（ａ）の部分に定義された短いＲＮＡと、請求項１の（ｂ）の部分に定義された短いＲＮＡとが組み合わせて用いられる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
インスリンの産生および分泌をヒト細胞によるグルコース反応性の方式で誘導するインビトロの方法であって、前記細胞を、請求項１〜４のいずれか１項に定義された短いＲＮＡに接触させることを含む方法。
【請求項８】
請求項１の（ａ）の部分で定義された短いＲＮＡと、請求項１の（ｂ）の部分で定義された短いＲＮＡとが組み合わせて用いられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト細胞が幹細胞、肝臓細胞、または膵臓細胞である、請求項７〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に定義された短いＲＮＡを１または複数含む、エクスビボまたはインビトロのヒト細胞。
【請求項１１】
糖尿病または病的肥満の治療での使用のための、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
糖尿病、脂肪肝、または病的肥満の治療での使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の短いＲＮＡ。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に定義された短いＲＮＡ、および／または請求項１０に定義された細胞、ならびに薬学的に許容し得る希釈剤、担体、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
糖尿病、脂肪肝、病的肥満の治療での使用のための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（ｉ）ヒト細胞中のＭａｆＡの発現を上方制御することができ、１９〜２５ヌクレオチド長の鎖であって、配列ＡＵＣＵＧＵＡＣＵＧＧＡＵＧＡＧＣＧＧ（配列番号１）を含む第１の鎖を含み、かつ１９〜２５ヌクレオチド長の、前記第１の鎖とともに二本鎖を形成する第２の鎖を含む、短いＲＮＡ、および
（ｉｉ）ヒト細胞中のＭａｆＡの発現を上方制御することができ、１９〜２５ヌクレオチド長の鎖であって、配列ＵＵＵＣＣＣＧＣＡＧＧＡＧＡＵＵＧＡＣ（配列番号２）を含む第１の鎖を含み、かつ１９〜２５ヌクレオチド長の、前記第１の鎖とともに二本鎖を形
成する第２の鎖を含む、短いＲＮＡ
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン産生能を有する細胞を作る方法に関する。この方法は、ＭａｆＡの発現を増大させることのできる短いＲＮＡ分子の使用を伴う。また本発明は、このような短いＲＮＡ分子およびその療法での使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で、少なくとも２億人が真性糖尿病を患っている。糖尿病は、血中のグルコース値を調節するホルモンであるインスリンを体が十分に作り出すことができない場合に発症する。健康な人では、インスリンは膵臓によって、より具体的には膵臓のβ細胞によって産生される。Ｉ型糖尿病は、免疫系のＴ細胞が膵臓のβ細胞を破壊することによって引き起こされることが多いため、自己免疫疾患が根本原因となっていることが多いが、ほかにも感染、特にウイルス感染、または障害が、膵臓のβ細胞の破壊または機能不全をもたらすことがある。これが、重症のインスリン産生不足をもたらす。
【０００３】
現在の治療法では、おもに外因性のインスリンの投与が用いられている。欠点としては患者にとっての不便さがあり、またこのアプローチは微調整するのが難しく、あるときにはインスリン過剰が、あるときにはインスリン不足が生じる。
【０００４】
１型糖尿病の世界規模の有病率は上昇しており、それに伴い、このような患者に活発なインスリン分泌の恒常的な供給源を維持させようとする臨床的な挑戦によって、これを達成するための代替機構を見出すことに多大な努力が注ぎ込まれてきた。しかしながら、島細胞を再生または移植しようとする現在の試みはすべてが有効というわけではなく、そのためインスリン産生細胞を作り出す必要性が依然として残る。
【０００５】
インスリン産生の増加から恩恵を被ることのできるさらなる疾患としては、２型糖尿病、脂肪肝、肥満、特に病的肥満、ならびにグルコースおよび／またはインスリンの産生、摂取および／または利用の異常に伴う他のあらゆる障害が挙げられる。
【０００６】
膵臓は、外分泌部と内分泌部の２つの部分で構成されており、それぞれが明確な機能を果たしている。内分泌部はランゲルハンス島から成り、これは４つの細胞型で構成されて、ペプチドホルモンインスリン（β細胞）、グルカゴン（α細胞）、ソマトスタチン（δ細胞）および膵臓ポリペプチド（γ細胞）を合成する。 これらの細胞は、胚形成期の逐次的な分化によって膵管上皮幹細胞から分化することが明らかにされている（１０〜１２）。膵臓は、前腸内胚葉の背部および腹部の特異的な胚成長から発生し、この胚成長が内分泌細胞と外分泌細胞の両方を発生させる。（１３）。最も古い公知の膵臓マーカーの発現には、Ｈｌｘｂ９およびＰＤＸ１ホメオボックスタンパク質が含まれる（１４〜１６）。これらの転写因子は、形態形成の前に、膵臓の特定化のための原信号に応答し、膵幹細胞を表示する。ＰＤＸ１は、膵臓の上皮組織の形態形成および分化に必要である。グルカンおよびインスリンの発現が、下流の雷状期に開始される（１６、１７）。ＰＤＸ１はさらに、内分泌細胞系統の祖先としてニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）陽性細胞を発生させる（１８、１９）。続いて、Ｎｇｎ３を活性化させると、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｒｆｘ６、およびＭａｆＡをはじめとするさらなる転写因子の発現が開始され、これが細胞の成熟島細胞への分化を導く（２０、２１）。ベータセルリンの過剰発現がインスリンの分泌を誘発することが明らかにされている。
【０００７】
プロインスリンは小胞体で合成されるが、この中で折り畳まれ、そのジスルフィド結合に酸素が加えられる。これが次にゴルジ体に輸送され、ここで凝縮されて分泌小胞となり、かつ一連のプロテアーゼでプロセシングされて成熟インスリンを形成する。成熟インスリンは３５個の少ないアミノ酸を持つが、４個は完全に取り除かれて、残る３１個がＣペプチドを形成する。Ｃペプチドは、プロインスリン配列の中央から抽出されるが、他の２つの末端（Ｂ鎖およびＡ鎖）はジスルフィド結合で結合されたまま残る。したがって、プロインスリンおよびインスリンは同じ遺伝子でコードされるため、本明細書で「インスリン」遺伝子に言及する場合はプロインスリンをコードする遺伝子を意味すると理解しなければならず、「プロインスリン」遺伝子に言及する場合は、最終的にインスリンとなるタンパク質をコードする遺伝子を意味すると理解しなければならない。
【０００８】
本発明者は、標的遺伝子を上方制御して、好ましくはグルコース反応性の方式でインスリンを産生することのできる方法の開発に着手した。そのような細胞、すなわちインスリンを産生するかまたは産生する能力のある細胞は、本明細書において「特殊化した」細胞として言及されることがある。本明細書において「特異性」細胞への言及がある場合は、好ましくは「インスリンを産生するかまたはインスリンを産生する能力のある細胞」である。
【０００９】
関心の遺伝子の発現を上方制御する現行の方法は、ウイルスを使って当該遺伝子の追加の複製を宿主ゲノムに導入するか、または標的遺伝子の追加の複製を発現するプラスミドを導入することによって、当該遺伝子の余分の複製を細胞に導入することを必要とする。したがって、上方制御には、発現ベクターの細胞への侵襲的な一過性トランスフェクションまたは安定的なウイルスによる形質導入が目下のところ必要であり、安全性に対する懸念が生じる。現行の方法は、一般的に上方制御物質の非一過性の適用を伴うことが多い。このような方法の制約は、影響も同じく非一過性だということである。
【００１０】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、重要な遺伝子制御法であり、標的ｍＲＮＡの配列特異的な下方制御を生じさせる。ＲＮＡｉは「干渉ＲＮＡ」（ｉＲＮＡ）によって仲介されるが、これはＲＮＡｉのプロセスの中で機能するさまざまな短い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を包含する包括的用語である。
【００１１】
外因性のｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼタンパク質のダイサーによってプロセシングし、１９〜２５塩基対、好ましくは２１〜２３塩基対で、それぞれの３‘末端の対をなさないいくつかの塩基が３’末端のオーバーハングを形成する二本鎖の断片にすることができる。好ましくは、それぞれの３‘オーバーハングが１〜３ヌクレオチド長、より好ましくは２ヌクレオチド長である。このような短い二本鎖の断片は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれ、この分子が標的遺伝子の発現の下方制御をもたらす。
【００１２】
ｓｉＲＮＡは、その機能が解明されて以来、特定の遺伝子の下方制御のためのツールとして用いられてきた。一過性の抑制を与えることもでき、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓhＲＮＡ）として安定に組み込まれれば安定な抑制を与えることもできる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、「ノックダウン」実験または「機能喪失」実験に広く用いられてきており、これらの遺伝子の減少が及ぼす影響を観察することによって関心の遺伝子の機能を検討する。ＲＮＡｉは、ゲノムの解析および注釈のための技術として潜在的な便益があると考えられている。ＲＮＡ干渉を治療に利用するための試みも行われてきた。
【００１３】
ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるたんぱく質複合体が、ｓｉＲＮＡ鎖の一方を組み込んで、この鎖を、標的ｍＲＮＡを認識するためのガイドとして用いている。そしてＲＩＳＣは、ガイドＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相補性に応じてｍＲＮＡの翻訳を破壊または阻害する。完全な相補性はｍＲＮＡの開裂と破壊とをもたらし、ｍＲＮＡは開裂の結果として、タンパク質に翻訳されることがもはや不可能となる。部分的相補性は―特にｍＲＮＡの３‘の未翻訳領域（ＵＴＲ）の部位では―翻訳阻害をもたらす。ＲＮＡｉは、ほとんどの真核生物では保存されており、外因性のｓｉＲＮＡを導入することによって、特定の遺伝子を下方制御するためのツールとして用いることができる。
【００１４】
ＲＩＳＣは主として転写後に遺伝子を制御するのであるが、ＲＮＡｉが遺伝子の転写自体も調節することが可能であることが、最近になってわかってきた。分裂酵母では、小分子ＲＮＡがＲＩＳＣ複合体の相同体によってクロマチンを制御する。ＲＮＡが詰めこまれたＲＩＳＣ複合体は、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を結合し、それによってｎｃＲＮＡの遺伝子座にヒストン修飾タンパク質を補充する。このほか植物、ハエ、線虫、繊毛虫、および菌類もよく似た機序を持つ。哺乳類の場合は正確な機序が大部分解明されていないが、制御されるＲＮＡに対してセンスまたはアンチセンスであり、かつ非コード転写産物と思われる転写産物を標的にして破壊することによって、短いＲＮＡが転写を制御すると考えられている。ＲＮＡの標的化によるこれらの非コード転写産物の破壊は、ＲＮＡ標的の性質に応じて、エピジェネティックな制御パターンに様々な影響を及ぼす。所定のｍＲＮＡに対してセンスであるｎｃＲＮＡの破壊は、そのｍＲＮＡの転写抑制をもたらすが、所定のｍＲＮＡに対してアンチセンスのｎｃＲＮＡ標的の破壊は、そのｍＲＮＡの転写活性化をもたらす。そのため、このようなアンチセンス転写産物を標的とすることにより、ＲＮＡｉを特定遺伝子の上方制御に用いることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者は思いがけなく、短いＲＮＡ分子を用いてＭａｆＡを上方制御することによって細胞のインスリン産生を誘導し得ることを見出した。本発明者は、ＭａｆＡ遺伝子の上方制御を達成してインスリン産生細胞を生み出し、従来技術の方法に付随する問題を克服する新たな短いＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を開発した。特に、本発明の分子は、宿主細胞のゲノムに取り込まれる可能性のある遺伝要素の投与にはつきものの、安全上の懸念を生じさせない。
【００１６】
本発明者は、好適なＲＮＡ標的転写物を同定し、これらの短いＲＮＡ分子を設計するために有利な方法／アルゴリズムを用いた。このため、本発明者は、ＭａｆＡの発現を調節するために宿主細胞のＲＮＡ転写物を標的とする新規の短いＲＮＡ分子を提供した。本発明の短いＲＮＡは、従来技術の発現ベクターより小さい分子であり、そのため侵襲性が低い。本発明の分子が宿主自身の制御系を用いて遺伝子を制御することは、遺伝子の追加の複製を宿主に導入することほど侵襲的ではない可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の短いＲＮＡは、ｍＲＮＡとＭａｆＡのタンパク質レベルとを上方制御することができ、これが下流の標的の上方制御につながる。本発明の短いＲＮＡは、本明細書において「特殊化誘導」ＲＮＡとも呼ばれる。本発明のＭａｆＡ活性化ＲＮＡは、再生医療に用いるインスリン産生細胞を作り出すための有効、非侵襲的、かつ安全な代替手段である。
【００１８】
本発明のおもな利点は、これが遺伝子を活性化する小分子ＲＮＡの一過性の適用に関するものであり、その影響もまた一過性だということである。このことは、刺激に反応することができ、特にグルコースに反応してインスリンを産生することができる誘導細胞（つまり、本明細書が開示する方法を用いて特殊化するように誘導された細胞）の作製を可能にする。
【００１９】
したがって、本発明の一態様では、細胞のＭａｆＡを上方制御することができる短いＲＮＡが提供され、ここで前記短いＲＮＡは、１９〜２５ヌクレオチド長の第１の鎖であって、ＡＵＣＵＧＵＡＣＵＧＧＡＵＧＡＧＣＧＧ  （配列番号１）またはＵＵＵＣＣＣＧＣＡＧＧＡＧＡＵＵＧＡＣ（配列番号２）の配列を含む第１の鎖を含む。好ましくは、前記ＲＮＡは、１９〜２５ヌクレオチド長の第２の鎖であって、前記第１の鎖と共に二本鎖を形成する第２の差を含む。好ましくは、前記ＲＮＡのそれぞれの鎖は、その３‘末端に１〜３個の対をなさないヌクレオチドを持ち、オーバーハングを形成する。好ましくは、前記３’のオーバーハングは、１つまたは複数のウラシルヌクレオチドを含むか、またはそれから成る。
【００２０】
一実施形態では、前記短いＲＮＡは、配列番号１を含むかまたはそれから成る第１の鎖と、配列番号２を含むかまたはそれから成る第２の鎖を含むかまたはそれから成る第２の鎖を含む。別の実施形態では、前記短いＲＮＡは、配列番号３を含むかまたはそれから成る第１の鎖と、配列番号４を含むかまたはそれから成る第２の鎖を含む。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に定義される短いＲＮＡの、細胞によるインスリン産生を誘導するための使用を提供する。この使用は、インビトロでもインビボでもよい。
【００２２】
好ましくは、本明細書に開示される使用および方法では、ＡＵＣＵＧＵＡＣＵＧＧＡＵＧＡＧＣＧＧ（配列番号１）の配列を含む短いＲＮＡと、ＵＵＵＣＣＣＧＣＡＧＧＡＧＡＵＵＧＡＣ（配列番号２）の配列を含む短いＲＮＡとが組み合わせて用いられる。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、細胞によるインスリンの産生を誘導する方法を提供し、前記方法は、本明細書に定義される短いＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む。この方法は、インビボでもインビトロでもエクスビボでもよい。
【００２４】
好ましくは、本明細書に開示される使用および方法では、前記インスリン産生はグルコース反応性である。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に定義される短いＲＮＡを１つまたは複数含むエクスビボまたはインビトロの細胞を提供する。さらに、本発明は、本明細書に定義される方法によって得ることのできるインスリンを産生するために誘導されるエクスビボまたはインビトロの細胞を提供する。
【００２６】
「インスリン産生を誘導すること」には、分化、すなわち特定の（膵臓の）細胞系へと細胞を推し進め、細胞の可能性を減少させること、が伴い得る。したがって、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞は、特定の細胞系の特殊化した細胞、例えばβ細胞へと分化するために誘導され得る。 インスリン産生を誘導することには分化転換が伴い得る、すなわち、特定の細胞系統の細胞が誘導されて、異なる細胞系統に特徴的な特有の機能を身に付け得る。例えば、上皮細胞、肝細胞など肝臓の細胞、または繊維芽細胞などの分化した細胞が誘導されて、インスリンなど別の細胞型の特徴を持つ標的タンパク質を産生することもあり得る。あるいは、インスリン産生の誘導によって、細胞が特殊化した特性を身に付けるように誘導され、その一方で多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）の表現型を保持することもあり得る。したがって、幹細胞にインスリンの産生を誘導することによって、インスリン産生能のある膵臓β細胞の作製に至る可能性もあるが、また、インスリン産生能のある多能性細胞か、または肝細胞などの非膵臓の体細胞でインスリン産生能のあるものが生じる可能性もある。
【００２７】
本明細書に開示された方法で産生される特殊化した、すなわちインスリンを産生する細胞は、インスリンの産生を誘導することによって作られたため、「誘導」細胞と呼ばれる。
【００２８】
本発明の方法では、標的遺伝子ＭａｆＡの上方制御は間接的にインスリンの産生に影響を及ぼす可能性がある。ＭａｆＡは、インスリンの産生を直ちにまたは最終的に制御する（間接的影響）。産生の制御は、とりわけ標的タンパク質インスリンをコードする遺伝子の転写の活性化を伴い得る。またＭａｆＡは、この事象の連鎖を調節することによって、標的タンパク質インスリンの産生にも影響を及ぼす可能性があるが、これは「下流」制御と呼ばれる。下流制御は、標的タンパク質インスリンを制御し得る第２の遺伝子を調節する標的遺伝子ＭａｆＡの短いＲＮＡを用いることによる上方制御を伴い得るか、または第２の遺伝子が第３の遺伝子を調節し得、そしてこの連鎖が最終的に、標的タンパク質インスリンの産生をもたらす。
【００２９】
インスリンの産生に影響（間接的影響）を及ぼす遺伝子としては、ＰＤＸ１、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、Ｒｆｘ６、ＭａｆＡ、Ｈｌｘｂ９．Ｈｎｆ６、Ｐｔｆ１ａ、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ、ベータセルリンおよびＮｋｘ６−１が挙げられる。
【００３０】
本発明の方法のいずれかにおいて、２つまたはそれ以上の異なるｓａＲＮＡ分子を一緒に用いることができる。これらが同じ標的ＲＮＡ転写物を下方制御するか、またはそれぞれのｓａＲＮＡ分子が異なるＲＮＡ転写物を下方制御し得る。
【００３１】
本発明者は、誘導細胞によってインスリンの発現を達成しただけではない。実施例に明らかにされている通り、本発明者の方法はインスリンの分泌ももたらすが、多くの応用ではこれが望ましい。細胞がインスリンのインビトロ産生に向けられたものである場合は、インスリンの分泌が時間のかかるインスリン抽出手順を回避する。細胞が移植のためのものである場合、または方法がインビボで用いられる場合は、誘導細胞がインスリンを分泌できることがきわめて重要である。
【００３２】
また本発明の方法は、グルコース反応性の方法でインスリン産生を実現する。実施例に明らかにされている通り、誘導細胞はグルコース存在下の方が、グルコース不在下よりもインスリン産生量が著しく多い。このことは明らかに、インビボの応用にきわめて有利である。
【００３３】
我々が知る限り、細胞を誘導してグルコース反応性の方法でインスリンを分泌する方法に関する報告はこれが最初のものである。理論に拘泥するつもりはないが、グルコース反応性の方法によるインスリンの産生および分泌は、ｓａＲＮＡ技術の使用、特にＭａｆＡを上方制御するためのｓａＲＮＡ技術の使用によって達成されると考えられている。
【００３４】
本発明の方法／使用は、好ましくは、グルコース反応性の方法でインスリンを産生する／産生する能力のある細胞を作り出す。「グルコース反応性」という表現は当技術分野で周知であり、「グルコース反応性」とは、グルコース存在下ではインスリンの産生および／または分泌がグルコース不在下よりも多いという意味であることを、当業者は認識している。少なくともインビボの状況では、「グルコースの存在」とは生理学的に有意なグルコース濃度を意味し、「グルコースの不在」とは生理学的に有意であるには低すぎるグルコース濃度、ならびにグルコースの完全な不在を意味することを理解しなければならない。好ましくは、グルコース反応性の細胞は、グルコース存在下ではグルコース不在下よりも、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％多いインスリンを産生する。好ましくは、インスリン産生はグルコース濃度と正に相関する。すなわち、細胞が高いグルコース濃度に暴露された場合は、低いグルコース濃度に暴露された場合よりも多量のインスリンを産生する。好ましくは、細胞外環境でグルコース濃度が上昇すると、同時にインスリン産生の上昇がもたらされる。好ましくは、細胞は、健康な膵臓β細胞のものと類似のグルコース反応性を示す。
【００３５】
したがって、好ましくは、細胞はグルコース反応性の方法で誘導されてインスリンを産生する。また好ましくは、細胞は、インスリンの分泌のために誘導される。
【００３６】
インスリン産生は、免疫蛍光検査法、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット法などの標準のプロトコルを用いて分析する。実施例に適切なアッセイを記載した。例えば、サンプルを抗インスリン抗体と接触させ、標識された二次抗体を用いて結合した抗体を検出することもできる。またインスリン産生もＲＮＡレベルで、例えば（逆転写酵素）ＰＣＲ、好ましくは反定量または定量ＰＣＲを用いて分析することもできる。当業者は、インスリン分泌の分析にＥＬＩＳＡを用い得ることを承知している。グルコースに暴露された細胞とグルコースに暴露されない細胞のインスリン産生を比較することによって、グルコース反応性を決定することもきる。
【００３７】
本発明の方法は、全能細胞、多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）、多分化能細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）または体細胞を用いて実施することができ、すなわち、このような細胞のいずれかを開始細胞として用いることができ、これがインスリン産生に特殊化するよう誘導される。本明細書に開示された方法は、開始細胞から特殊化したインスリン産生細胞を作り出す。このような方法によって作り出される特殊化した細胞は、少なくとも標的タンパク質インスリンの発現において開始細胞とは異なる。
【００３８】
好適な開始細胞については、以下にさらに詳細に検討する。全能細胞は、ある生命体に認められるあらゆる細胞型に分化し、その生命体全体を形成する能力を持つ。多能性細胞は、内胚葉（胃内部の内層、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、または外胚葉（上皮組織および神経系）の３種の胚葉のいずれにも分化する能力を持つ細胞である。分化能は、細胞が種類の異なる細胞へと分化し得る範囲である。多能性細胞は、多分化能細胞より大きい分化能を持つ。細胞集団の内部で、個々の細胞は様々な分化能を持ち得る。多分化能細胞の集団は、時間が経つと、体細胞へと分化した一部の細胞と、分化せずに依然として多分化能のままで残る一部の細胞とを含み得る。多能性細胞の集団も同じく、時間が経つと、多分化能細胞と体細胞、そして多能性細胞を含み得る。したがって、本発明の方法は、全能細胞、多能性細胞、多分化能細胞、または体細胞に関して用い得る。細胞は成熟細胞、または、例えば成熟幹細胞、胚幹細胞、または癌由来幹細胞などの胚細胞であり得るが、成熟幹細胞が好ましい。
【００３９】
細胞は、好ましくはヒト細胞である。
【００４０】
多能性細胞は、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞と略される）、即ち、通常は成体の体細胞である非多能性の細胞から、特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって人工的に誘導される多能性幹細胞、の一種であり得る。
【００４１】
国際公開第２００５／０５９１１３号は、特に有利な種類の多能性幹細胞を開示している。 この幹細胞は、骨髄および／もしくは末梢血などの血液から、または臍帯もしくは胎盤から採取された材料から直接単離することが可能であり、外胚葉細胞、中胚葉細胞、および内胚葉細胞へと分化する特有の能力を持つ。そのため、この細胞は、全能ではないとしても明らかに多分化能または多能性である。したがって、ＷＯ第２００５／０５９１１３号に開示された幹細胞は、自己移植（自己由来）の方法で用い得る組織移植用細胞の有用な供給源を提供する。
【００４２】
国際公開第２００５／０５９１１３号に開示された細胞は、当技術分野では「ＯｍｎｉＣｙｔｅ」として公知である。国際公開第２００５／０５９１１３号の教示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。ＯｍｎｉＣｙｔｅは自己再生することができ、造血細胞を含めて、外胚葉、中胚葉、および内胚葉細胞へと分化することが可能なＣＤ３４＋である幹細胞である。上に述べた通り、この細胞は骨髄および／または血液から直接単離することが可能である。さらに、培養中にプラスチック（例えば、標準の組織培養器）に付着するその能力を特徴とする。好適な培養器は、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡによって製造されたものである。
【００４３】
ＯｍｎｉＣｙｔｅはさらに、支持細胞層、つまり幹細胞の成長を支持する細胞（通常は、自分でさらに成長または分裂することなく重要なメタボライトを供給するガンマ線照射によって不活化されている）を必要とすることを特徴とする。
【００４４】
ＯｍｎｉＣｙｔｅはさらに、ａ）ＣＤ３４+細胞のための組織または血液サンプルを濃縮すること、ｂ）サンプルを担体に接触させ、前記担体に付着する細胞を採取すること、によって得られることを特徴とする。好適な組織または血液のサンプルとしては、骨髄、末梢血、臍帯血または組織、胎盤、および脂肪吸引によって得られるサンプルが挙げられる。
【００４５】
さらに具体的には、組織または血液サンプル（好ましくは、血液または骨髄サンプルのような造血組織）を密度勾配分離法にかけ、低密度の細胞をＣＤ３４に対する親和性リガンド（好ましくは、常磁性粒子に付着している）に暴露し、前記ＣＤ３４リガンドに付着した細胞を回収し、ＣＤ３４＋の分集団を組織培養級のプラスチックに暴露し、かつプラスチックに付着したＣＤ３４＋細胞を回収することによって得ることができる。
【００４６】
Ｏｍｎｉｃｙｔｅは、好ましくは成熟しており、それゆえ非胎児性である。
【００４７】
２００４年９月２４日に、ＯｍｎｉＣｙｔｅのサンプルを、寄託番号０４０９２４０１の下にＰｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，  Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，  ＳＰ４０ＪＧのＥＣＡＣＣに 寄託した。寄託は、Ｗｉｌｌｏｗ  Ｔｒｅｅ  Ｃｏｔｔａｇｅ，  Ｓｐｉｎｎｉｎｇ  Ｗｈｅｅｌ  Ｌａｎｅ，  Ｂｉｎｆｉｅｌｄ，  Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ  ＲＧ４２５ＱＨ，  Ｇｒｅａｔ  ＢｒｉｔａｉｎのＭｙｒｔｌｅ  Ｇｏｒｄｏｎ教授によって行われ、細胞株は「幹細胞ＯｍｎｉＣｙｔｅ」と名付けられた。
【００４８】
本発明の方法は、好ましくは、ＯｍｎｉＣｙｔｅ、造血幹細胞（ＨＳＣ）、および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から選択された細胞に対して実施され、ＯｍｎｉＣｙｔｅが特に好ましい。
【００４９】
多分化能細胞は、複数ではあるが限られた数の系統から細胞を生じさせる能力を持つ。多分化能細胞の一例は、数種類の血液細胞へと発達することができるが、脳細胞または他の種類の細胞に発達することはできない血液幹細胞である、造血細胞である。間葉幹細胞、またはＭＳＣは、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（軟骨の細胞）、および含脂肪細胞（脂肪細胞）をはじめとする種々の細胞型へと発達することのできる多分化能幹細胞である。
【００５０】
体細胞は、生殖系列細胞（配偶子）、配偶子を生み出す細胞（生殖母細胞）、多分化能細胞および多能性細胞以外で生命体の体を形成する任意の種類の細胞である。体細胞は任意の動物から誘導することができるが、好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。好適な例としては、肝細胞などの肝臓の細胞、β細胞などの膵臓細胞、上皮細胞、および繊維芽細胞が挙げられるが、肝細胞および膵細胞が好ましい。
【００５１】
本発明の方法が、本発明の短いＲＮＡと接触する細胞母集団の細胞のすべてには誘導を達成し得ず、また実際達成する必要のないことを、十分理解しなければならない。したがって、本発明の方法に供された、すなわち本発明の短いＲＮＡに接触した細胞母集団の中から、好ましくは、少なくとも１０、２０、３０、３５、３８、４０、４２、または４５％、例えば約２５〜５５％、３０〜５０％、３５〜４５％が、インスリンを産生するよう誘導され得るが、一部の実施形態では、少なくとも５０、６０、７０、８０、または９０％がインスリンを産生するよう誘導される。
【００５２】
本明細書で用いる場合、用語「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」が意味するのは、β−Ｄ−リボ−フラノース部分の２‘位にヒドロキシル基を持つヌクレオチドである。これらの用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ，合成ＲＮＡ、組み換え技術によって作られたＲＮＡ、ならびに、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または変更によって天然のＲＮＡとは異なる変更されたＲＮＡが含まれる。このような変更には、ＲＮＡの末端や内部、例えばＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドなど、への非ヌクレオチド材料の付加が含まれ得る。また本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなど、非鎖状のヌクレオチドをも含み得る。このような変更されたＲＮＡは、類似体、または天然ＲＮＡの類似体と称される。
【００５３】
用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書で用いられる場合、二本鎖リボ核酸を指し、内因性および人工のｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むが、これらに限定はされない。
【００５４】
用語「短い干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書に用いられる場合、１つまたは複数の標的ＲＮＡ転写物の配列特異的な媒介開裂により、ＲＮＡｉを介して遺伝子発現を調節することが可能な核酸分子を指す。ＲＮＡｉの場合は通常、ＲＮＡ転写物はｍＲＮＡであり、そのためこの標的の開裂は遺伝子発現の下方制御をもたらす。しかしながら本発明では、標的遺伝子の上方制御または下方制御は、関心の標的遺伝子に対してそれぞれアンチセンスまたはセンスであるＲＮＡ転写物の開裂によって達成される。
【００５５】
ｓｉＲＮＡは、１９〜２５塩基対長の二本鎖ＲＮＡ分子であり、いくつかの対をなさない塩基が各３‘末端にあって、３’オーバーハングを形成している。好ましくは、３‘オーバーハングはそれぞれ１〜３ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは２である。ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ転写物の一領域に対して完全またはほぼ完全に相補性の配列を持つ１つの鎖を含有する。ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のタンパク質が、ｓｉＲＮＡのこの鎖（ガイド鎖）を組込み、標的ＲＮＡ転写物を認識するためのテンプレートとして用いている。ＲＩＳＣは次に、組み込まれた鎖と完全またはほぼ完全な相補性を持つ標的ＲＮＡ転写物の開裂に関与する。標的ＲＮＡ転写物の一領域に対して相補性を持たないｓｉＲＮＡ分子の他方の鎖は、パッセンジャー鎖と名付けられている。
【００５６】
一本鎖または二本鎖のＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子ではないものの、自らと完全またはほぼ完全な相補性を持つ標的ＲＮＡ転写物をＲＩＳＣ関連の開裂によって下方制御することができ、ｓｉＲＮＡに似た活性を有すると言われる。本発明の短いＲＮＡ分子は、この活性を有する。
【００５７】
「相補性」および「相補的」とは、第１の核酸が第２の核酸と、例えば非ワトソン−クリック塩基対形成を介して、水素結合を形成し得ることを意味する。非ワトソン−クリック塩基対形成を介して別の核酸と水素結合を形成することができる核酸も、相補性を持つという定義に該当する。相補性パーセントとは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の残基の割合を表す（例えば、１０中の５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％である）。
【００５８】
「完全に相補的」または「完全な相補性」とは、第１の核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合を形成する状態を意味する。「ほぼ完全な」相補性とは、第１の核酸配列の基本的にすべての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合を形成する状態を意味するが、第１の核酸が、生体分子の使用を伴う転写または分子の生物学的プロセスなどの不完全なプロセスで調製されるという事実により、第１の配列は第２の配列と１００％相補的ではない可能性も考えられる。しかしながら、第２の配列の対応する残基と水素結合を形成することができない第１の配列の残基の数が十分少ないため、２つの核酸配列は依然として、所望の目的に必要とされる限り、水素結合で結合される。一般的に、「ほぼ完全な相補性」とは、第１の核酸配列が第２の核酸配列に対して、少なくとも９５％の相補性を持つことを意味する。
【００５９】
「同一性」、「同一の」または「配列同一性」とは、第１の核酸の配列が第２の核酸配列と同一であることを意味する。同一性パーセントは、第１の核酸分子の中の第２の核酸配列と同一の残基の割合を表す（例えば、１０中の５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％同一である）。
【００６０】
「完全な同一性」または「完全に同一」とは、第１の核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列中の連続する同数の残基と同一であることを意味する。「ほぼ完全な」同一性とは、第１の核酸配列の基本的にすべての連続する残基が、第２の核酸配列中の連続する同数の残基と同一であることを意味するが、第１の核酸が、生体分子の使用を伴う転写または分子生物学的プロセスなどの不完全なプロセスによって調製されるということから、第１の配列は第２の配列と１００％同一ではない可能性もある。しかしながら、第２の配列の対応する残基と同一ではない第１の配列の同数の残基の数が十分少ないため、２つの核酸配列は依然として、所定の目的に対して十分に同一である。一般的に、「ほぼ完全な同一性」とは、第１の核酸配列が第２の核酸配列と、少なくとも９５％同一であることを意味する。
【００６１】
本明細書で使用される配列の相補性または同一性へのあらゆる言及は、特に別の記載がない限り、本短いＲＮＡの全長を指す。
【００６２】
短いＲＮＡは、標的ＲＮＡ転写物に対して相補性ではないきわめて短い３‘または５’配列を含み得る。好ましくは、このような配列は３‘である。前記配列は、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは２〜３、例えば２または３である。前記配列は、好ましくはウラシルを含むか、またはウラシルから成り、そのため最も好ましくは２または３ウラシルの３’ストレッチである。。この非相補的配列は、「テイル」と呼ぶこともできる。したがって、短いＲＮＡは、好ましくは、（ｉ）標的ＲＮＡの一領域と９５％の相補性を持つ配列、および（ｉｉ）好ましくは、ウラシル残基を含むか、またはこの残基から成る１〜５ヌクレオチドの３’テイル、から成る。したがって、短いＲＮＡは、一般にその長さ全体にわたり、標的ＲＮＡ転写物の３‘テイル（これが存在する場合）以外の一領域と相補性がある。
【００６３】
本明細書に開示される短いＲＮＡ配列のいずれもが、任意でこのような３‘テイルを含み得る。したがって、表に開示された配列のいずれもが、任意でこのような３’テイルを含み得る。
【００６４】
配列アラインメントおよび同一性パーセントまたは相補性パーセントの計算は、ＬＡＳＡＲＧＥＮＥ  バイオインフォマティクス計算パッケージ（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ）（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  （１９８9）  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３）、およびＢＬＡＳＴ  ２．０プログラムパッケージ、を含むがこれらに限定はされない当分野で公知の任意の方法またはツールを用いて決定し得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば全米バイオテクノロジー情報センターを通じて、公的に入手可能である。当業者は、その所望の目的に適うようにこれらのツールのパラメーターを設定することができよう。
【００６５】
一方の配列がＤＮＡ配列であり、他方がＲＮＡ配列である第１および第２の核酸配列の同一性または相補性を評価するにあたっては、ＲＮＡ配列がウラシルを含むのに対して、ＤＮＡ配列はその代わりにチミンを含むことを念頭に置かなければならない。したがって、このような場合に、配列同一性を評価する際にはウラシル残基はチミン残基と同一とみなされ、また相補性を評価する際にはウラシル残基はアデニン残基と相補性である／水素結合を形成する能力がある、とみなされる。
【００６６】
遺伝子の「阻害」または「下方制御」とは、遺伝子（複数可）の発現レベルの低下、または遺伝子によってコードされたポリペプチド（複数可）もしくはその活性のレベルの低下、または、本発明の短いＲＮＡ分子の不在下で観察されたものより低い、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（複数可）のレベルの低下を意味する。あるＲＮＡ分子が「下方制御されている」とされる場合は、そのＲＮＡ分子のレベルが、本発明の短いＲＮＡ分子の不在下で観察されたものより低下することを意味する。
【００６７】
遺伝子の「活性化」もしくは「上方制御」とは、遺伝子（複数可）の発現レベル、または遺伝子に制御されるポリペプチド（複数可）もしくはその活性のレベル、または、本発明の短いＲＮＡ分子の不在下で観察されるものより高いレベルであって、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（複数可）のレベル、の上昇を意味する。
【００６８】
好ましくは、本発明の方法のすべてがインビトロまたはエクスビボで実施されるが、ほかにインビボの方法も企図されている。したがって、前もって対象から単離されている細胞または組織サンプルに対して実施され得る。
【００６９】
好ましくは、上記方法に用いられるこの「短い」ＲＮＡ分子は１３〜３０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは１６〜２５ヌクレオチド長であり、さらに一層好ましくは１７〜２１ヌクレオチド長であり、最も好ましくは１９、２０、２１、２２、２３ヌクレオチド長である。
【００７０】
この短いＲＮＡ分子は一本鎖であるか、または好ましくは、二本鎖であり得る。二本鎖の場合は、好ましくは二本鎖のうちの各鎖が少なくとも１４、さらに好ましくは少なくとも１８、例えば１９ヌクレオチド長である。好ましくは、二本鎖は少なくとも１２、さらに好ましくは少なくとも１５、さらに好ましくは１７、さらに一層好ましくは少なくとも１９ヌクレオチドの長さにわたってハイブリダイズされる。各鎖はきっちり１９ヌクレオチド長、または１９ヌクレオチド＋３‘テイルであり、２０、２１、２２、２３、又は２５ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、二本鎖の長さは３０ヌクレオチド未満であるが、それは、これを超える長さの二本鎖であれば、インターフェロン応答を誘発するリスクが高まり得るからである。二本鎖のｄｓＲＮＡを形成する鎖は、長さが同等でも不等でもあり得る。
【００７１】
最も好ましくは、短いＲＮＡ分子は短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。
【００７２】
任意で、短いＲＮＡ分子は、塩基対が安定に形成された２本の鎖から成り、それぞれの鎖の３‘末端には対をなさないヌクレオチドがいくつも付いて３’オーバーハングを形成しているｄｓＲＮＡ分子である。各鎖の３‘オーバーハングを形成しているヌクレオチドの数は、好ましくは１〜５ヌクレオチドの範囲であり、さらに好ましくは１〜３ヌクレオチド、最も好ましくは２ヌクレオチドである。この３’オーバーハングは、上述の３‘テイルで形成されてもよく、そのため３’テイルが３‘オーバーハングであり得る。
【００７３】
短いＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ転写物を有効かつ特異的に下方制御しなければならない。上述のように、これは標的ＲＮＡ転写物との高度な相補性を持つ短いＲＮＡによって達成することができる。短いＲＮＡは、標的ＲＮＡ転写物とのミスマッチが５以下、好ましくは４または３以下、さらに好ましくは２以下、さらに一層好ましくは１以下であり、最も好ましくはミスマッチがない。
【００７４】
２つまたはそれ以上の配列の相補性の程度の決定は、当分野で公知のいずれかの方法により実施することができる。好ましくは、使用する方法は、Ｈｏｓｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （前掲）に提示されたものである。この方法に従ってhttp://www.mpibpc.mpg.de/groups/luehrmann/siRNAでアクセス可能なＰｅｒｌスクリプトを用いる。
【００７５】
加えて、短いＲＮＡ分子の設計および分析のためのさまざまなツールが公知であり、このことは、当業者が標的ＲＮＡ転写物の有効かつ特異的な下方制御を成し遂げることを可能にする。確立された方法としては、例えばＧＰｂｏｏｓｔアルゴリズムおよびＲｅｙｎｏｌｄｓアルゴリズム（ＰＭＩＤｓ：１５２０１１９０、１４７５８３６６）が挙げられる。さらに、標的ＲＮＡの有効な下方制御をもたらす短いＲＮＡの能力は、細胞中のＲＮＡまたはタンパク質レベルの測定のための標準技術を用いて評価することができる。例えば、本発明の短いＲＮＡを培養細胞に送達し、ノーザンブロット法もしくはドットブロット法を含むがこれに限定はされない技術を用いて、または定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、標的ＲＮＡのレベルを測定することができる。
【００７６】
好ましくは、この短いＲＮＡは、ａａａａ、ｃｃｃｃ、ｇｇｇｇ、またはｕｕｕｕのうちのいずれのモチーフも保有していない。好ましくは、短いＲＮＡは、少なくとも２０％、かつ７５％以下、すなわち２０％と７５％との間、好ましくは２０％〜５５％のＧＣパーセンテージを持っている。上記方法の短いＲＮＡは、理想的には熱力学的に安定な二本鎖であり、その場合は、それぞれの鎖のＧＣパーセンテージは少なくとも２５％、かつ７５％以下、即ち２５％〜７５％、好ましくは２０％〜５５％である。
【００７７】
ＲＮＡが、ａａａａ、ｃｃｃｃ、ｇｇｇｇ、またはｕｕｕｕのモチーフを保有しているかどうかを判定するため、および分子／鎖のＧＣ含有率を判定するためのアルゴリズムは、当業者には周知である。 そのようなツールには、Ｓａｅｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｓｎｏｖｅ，  （２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２１：２４７−２５３  ａｎｄ  Ｖｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７：５２０  （１７  ｐａｇｅｓ）に記載され、参照されるものがある。
【００７８】
短いＲＮＡは、ＲＩＳＣタンパク質複合体に組み込まれる短いＲＮＡ鎖に対するミスマッチの数が少ない非標的転写物の下方制御を誘導することができる。これは短いＲＮＡ分子の効率性を低下させるため、望ましくない。その結果として、意図しない的外れの効果を防止するため、短いＲＮＡ分子は、目的とする標的以外の転写物に対して限られた相補性を持つはずである。短いＲＮＡの候補が開裂に基づく的外れの効果をもつ可能性は、非標的ＲＮＡ配列に対するその相補性の関数であり、当分野の任意の公知の方法で判定することができる。任意で、ungapped Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｍｅｔｈｏｄ（ＴＦ  Ｓｍｉｔｈ  ＆  ＭＳ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （１９８１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １４７：  １９５−１９７）を用いて、短いＲＮＡの候補をＥｎｓｅｍｂｌ（Ｆｌｉｃｅｋ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｅｎｓｅｍｂｌ  ２００８．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：  Ｄ７０７−７１４）ヒトトランスクリトーム・データベース（Ｓｎｏｖｅ，  Ｏ．，  Ｊｒ．，  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２５：７６９−７３３）に対してスクリーニングし、短いＲＮＡの潜在的な的外れ転写物を特定することができる。あるいは、短いＲＮＡを、選択されたＲＮＡ配列の母集団、例えばヒトのトランスクリプトームのデータベース全体を包含しない選択されたＧｅｎＢａｎｋ配列に対して、スクリーニングすることもできる。あるいは、ハミング距離の尺度を用いることもできる。
【００７９】
好ましくは、短いＲＮＡ分子は、特定された的外れ転写物に対して２つを超えるミスマッチを持つ。あるいは別の視点から見ると、好ましくは、短いＲＮＡ分子はすべての潜在的な的外れ転写物に対して、２以上のハミング距離を持つ。短いＲＮＡが二本鎖の場合は、好ましくは両方の鎖がこの要件を満たす。
【００８０】
任意で、短いＲＮＡ分子は、公知のきわめて有効な標準ｓｉＲＮＡと共通の特徴を持つ。好ましくは、短いＲＮＡ、または二重鎖であれば短いＲＮＡの一方または両方の鎖は、０．１を超えるＧＰｂｏｏｓｔスコアを持つ。ＧＰｂｏｏｓｔはｓｉＲＮＡの有効性に対する遺伝子プログラミングによる公知の予測システムであり、ｓｉＲＮＡ鎖のＧＰｂｏｏｓｔスコアの決定に用いられる方法は、“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ＲＮＡｉ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｏｏｓｔｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ”，Ｐaｌ  Ｓａｅｔｒｏｍ  （２００４）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０（１７）：３０５５−３０６３に開示されており、その内容が参照することにより本明細書に組み込まれる。あるいは、または加えて、短いＲＮＡ分子は、きわめて有効なｓｉＲＮＡに付随する特有な配列の特徴を有している。Ｒｅｙｎｏｌｄｓによって記載され、参照によって本明細書に組み込まれるアルゴリズム｛Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（３）：３２６−３３０｝は、短いＲＮＡがこの種の特徴を十分に持っているかどうかという判定を可能にする。当業者であれば、その特定の目的に対するその閾値を定義し、精緻化することができるであろう。
【００８１】
任意で、短いＲＮＡ分子は、きわめて有効なｓｉＲＮＡに付随する位置特異的配列モチーフを含有する。ｓｉＲＮＡ有効性予測アルゴリズムは当技術分野で周知であり、きわめて有効なｓｉＲＮＡに付随するモチーフは、参照によって本明細書にその内容が組み込まれるＳａｅｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｓｎｏｖｅ，（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２１：２４７−２５３において検討されている。
【００８２】
好ましくは、短いＲＮＡ分子は、細胞のＲＮＡｉ機構に直接入ることができるか、または細胞のＲＮＡｉ機構に入る前に、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングが可能である。短いＲＮＡが細胞のＲＮＡｉ機構に入る前に、ダイサーによるプロセシングが可能であるかどうかを判定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｔｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  ＲＮＡ  １６（６）：１２７５−１２８４、およびＲｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：（１３）４１４０−４１５６に開示されているようなインビトロのダイサーアッセイが挙げられる。
【００８３】
短いＲＮＡ分子が二本鎖の場合に、分子内の１本の鎖だけが標的ＲＮＡ転写物を有効かつ特異的に下方制御することができる場合は、好ましくは、その鎖は選択的にＲＩＳＣ内へと取り込まれる。１本の鎖だけが選択的にＲＩＳＣ内へと取り込まれる二本鎖ＲＮＡ分子の設計は、当業者の能力の範囲内である。例えば、標的ＲＮＡ転写物を標的とする短いＲＮＡ分子の当該鎖の５’末端を、他方の鎖の５’末端ほど熱力学的に安定ではないように作製または選択することができる。好ましくは、二本鎖の熱力学的な末端安定性には大きな差があるため、標的ＲＮＡ転写物を標的とする短いＲＮＡ分子の鎖の５‘末端は他方の鎖の５’末端ほど熱力学的に安定ではない。二本鎖の熱力学的な末端安定性（ΔΔＧ）の絶対値の差は、当分野で標準の任意の方法に従って計算することができる。任意で、二本鎖の熱力学的な末端安定性の差の絶対値は、ＲＮＡｆｏｌｄ（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１３，ｐｐ３４２９−３４３１）を用いて、二本鎖の末端の５つの終結ヌクレオチドを検討することによって計算することができる。好ましくは、ＲＮＡｆｏｌｄで計算された二本鎖の熱力学的な末端安定性の差の絶対値は、０ｋｃａｌ／ｍｏｌ超、さらに好ましくは１ｋｃａｌ／ｍｏｌ超、さらに好ましくは３ｋｃａｌ／ｍｏｌ超である。
【００８４】
例えば上に記載されたもののような短いＲＮＡの設計に向けた多くの標準的なツールが、分子のこの特性を評価する手段を提供する。例えば、二本鎖分子の熱力学的な性質が一方の鎖のＲＮＡｉ機構への組み込みを他方の鎖の組み込みより好むようであれば、二本鎖分子を選択することができる。あるいは、一方の鎖の選択的な取り込みは、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または変更によって天然ＲＮＡとは異なるものとなったＲＮＡを含有するｄｓＲＮＡを用いることにより、達成することができる。このような修飾は当業者には周知であり、以下に詳細に論ずる。
【００８５】
ダイサーはリボヌクレアーゼタンパク質であり、外因性のｄｓＲＮＡを開裂して、１９〜２５塩基対から成り、各３‘末端では対をなさないいくつかの塩基が３’オーバーハングを形成する二本鎖の断片にする。上記の方法に用いられる短いＲＮＡは、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（Ｄ−ｓｉＲＮＡ）であってよい。ダイサー基質として設計されたｓｉＲＮＡは、標準の長さのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡより高い効力を持つことができる。
【００８６】
Ｄ−ｓｉＲＮＡは、左右非対称の二本鎖ｓｉＲＮＡであり、その鎖は２２〜３０ヌクレオチド長である。一般に、一方の鎖（パッセンジャー鎖）は２２〜２８ヌクレオチド長、好ましくは２５ヌクレオチド長であり、かつ他方の鎖（ガイド鎖）は２４〜３０ヌクレオチド長、好ましくは２７ヌクレオチド長であり、パッセンジャー鎖の３‘末端の二本鎖は平滑末端であり、ガイド鎖の３’末端にはオーバーハングが付いている。オーバーハングは１〜３ヌクレオチド長、好ましくは２ヌクレオチドである。パッセンジャー鎖もまた５‘リン酸塩を含有する。
【００８７】
Ｄ−ｓｉＲＮＡでは一般に、パッセンジャー鎖の３’末端の２つのヌクレオチドがリボ核酸（ＲＮＡ）ではなく、むしろデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ＤＮＡおよび平滑末端二本鎖によって、酵素ダイサーが二本鎖をプロセシングし、元のＤ−ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とガイド鎖の５‘および３’末端のそれぞれ２１ヌクレオチドから成る２１マー二本鎖にすることが確保される。オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長、好ましくは２ヌクレオチドである。またパッセンジャー鎖は５‘リン酸塩も含有し得る。
【００８８】
Ｄ−ｓｉＲＮＡでは一般に、パッセンジャー鎖の３’末端の２つのヌクレオチドがリボ核酸（ＲＮＡ）ではなく、むしろデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ＤＮＡおよび平滑末端二本鎖によって、酵素ダイマーが二本鎖をプロセシングし、元のＤ−ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖およびガイド鎖の５‘および３’末端のそれぞれ２１ヌクレオチドから成る２１マー二本鎖にすることが確保される。
【００８９】
標準の１９マーｓｉＲＮＡ分子をＤ−ｓｉＲＮＡへと拡張する方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｈｅｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈ．１９（４）：２２３１−２３７に記載されている。
【００９０】
２７マー／２５マーのＤ−ｓｉＲＮＡに拡張されると、多くのｓｉＲＮＡ分子は、パッセンジャー鎖の３’末端の対をなさない塩基の予測された数がガイド鎖の５’末端の対をなさない塩基の予測された数より少ないか、または同等である末端構造を持つようになる。公知のｍｉＲＮＡの構造およびダイサーＰＡＺドメインの結合要件に基づけば、この構造はダイサーのプロセシングにとって最適以下となる可能性がきわめて高く、そのため、このような二本鎖はｓｉＲＮＡとしては有用でも、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ分子に拡張されるとそれほど有用ではなくなる。したがって、好ましくは、本発明の短いＲＮＡはそのような構造を有さず、それよりむしろ、パッセンジャー鎖の３’末端の対をなさない塩基の予測された数が、ガイド鎖の５’末端の対をなさない塩基の予測された数より多い。
【００９１】
任意で、上記の方法に用いられる短いＲＮＡ分子は、修飾、すなわち、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または変更によって、天然のＲＮＡとは異なるものとなったＲＮＡを含み得る。例えば、短いＲＮＡが二本鎖である場合、ｄｓＲＮＡ分子の二本の鎖は化学結合基などの結合成分またはオリゴヌクレオチドのリンカーによって結合され得、その結果生じるｄｓＲＮＡの構造はヘアピン構造となる。結合成分は、ｄｓＲＮＡの活性に対し、例えばＲＩＳＣ複合体への鎖の取り込みまたはダイサーとの会合をブロックすることによってなど、ブロックまたはその他の方法で負の影響を与えてはならない。多くの好適な化学結合基が、当技術分野で公知である。オリゴヌクレオチドのリンカーを用いる場合は、ｄｓＲＮＡの完全な機能性が維持される限り、任意の配列または長さであってよい。好ましくは、リンカー配列は、他のヌクレオチド塩基より多い量のウリジンおよびグアニンを含有し、かつ約４〜９、さらに好ましくは８〜９残基の好ましい長さを持つ。
【００９２】
短いＲＮＡには修飾を含めることができるが、ＲＮＡ組成物がダイサーのための基質の役目を果たすことを妨げない場合に限られる。一層有効なＲＮＡｉの生成をもたらし、細胞に送達されるｄｓＲＮＡの各分子ごとに効果が高まり、かつ／または治療環境でのｄｓＲＮＡの安定性を確保するために役立つような、ｄｓＲＮＡのダイサープロセシングを強化する１つまたは複数の修飾を行うことができる。
【００９３】
修飾は、３‘末端領域、５’末端領域、３’末端および５’末端領域の両方、または、場合によっては配列内のさまざまな位置に組み込むことができる。上記で言及した制約を念頭に置きつつ、任意の数および組み合わせの修飾をＲＮＡに組み込むことができる。多数の修飾が存在する場合、それらは同一でも異なってもよい。基質、糖成分、リン酸骨格、およびその組み合わせに対する修飾が予期される。いずれの５‘末端もリン酸化することができる。
【００９４】
ダイサーのプロセシングのために、パッセンジャー鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子で短いｄｓＲＮＡ分子を修飾することができる、つまり、ｄｓＲＮＡは、ダイサーの結合およびプロセシングを方向付けるように設計される。好適な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、ならびに蛍光分子などの立体障害型分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰに通常存在する２‘−デオキシリボフラノシル糖を２‐ヒドロキシエトキシメチル基で置換する。他のヌクレオチド修飾因子としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３‘−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３‘−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３‘−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２‘，３’−ジデヒドロ−２‘，３’−ジデオキシイノシン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２‘，３’−ジデオキシ−３‘−チアシチジン（３ＴＣ）、および２’，３‘−ジデヒドロ−２’，３‘−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸、が挙げられる。デオキシヌクレオチドは修飾因子として用いることができる。ヌクレオチド修飾因子を用いる場合は、１〜３のヌクレオチド修飾因子をパッセンジャー鎖の３’末端のリボヌクレオチドを２つのヌクレオチド修飾因子で置換する。立体障害分子を用いる場合は、パッセンジャー鎖の３‘末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって、鎖の長さは修飾因子の組み込みによって変化しない。任意で、ｄｓＲＮＡ中で２つのＤＮＡ塩基を置き換えて、ダイサープロセシングを方向付ける。任意で、ガイド鎖の５’末端およびパッセンジャー鎖の３’末端の二本鎖の平滑末端を形成する２つのリボヌクレオチドに代えて、２つのＤＮＡ末端塩基をパッセンジャー鎖の３’末端に置き、２ヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングをガイド鎖の３’末端に置く。これは、ＤＮＡが平滑末端にあり、ＲＮＡ塩基がオーバーハングの末端にある非対象の構成である。
【００９５】
リン酸骨格に企図される修飾の例としては、メチルホスホネートをはじめとするホスホネート、ホスホロチオネート、およびアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル修飾などが挙げられる。糖成分に企図される修飾の例としては、２‘−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、アミノ、およびデオキシなどの２‘−アルキルピリミジン修飾などが挙げられる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照されたい）。基礎群に企図される修飾の例としては、脱塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン（alkyl modified pyrimidine）、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、および５−(３−アミノアリル)などが挙げられる。また、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）も組み込むことができるであろう。ほかにも多くの修飾が公知であり、上記の基準を満たす限り用いることができる。
【００９６】
本発明の短いＲＮＡは、このほか部分精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、対称ＲＮＡ、または組み換え技術によって作られたＲＮＡも含むことができる。短いＲＮＡに対して考えられる他の変更としては、短いＲＮＡの末端（複数可）または短いＲＮＡの１つまたは複数の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド材料の付加、短いＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾（例えば、２’−置換リボヌクレオチドの使用、または糖リン酸骨格に対する修飾）、またはデオキシリボヌクレオチドによる短いＲＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの置換が挙げられる。
【００９７】
短いＲＮＡが二本鎖の場合は、好ましくは両方の鎖とも、上記に定義したように標的ＲＮＡ転写物を有効かつ特異的に下方制御することができる。このような多機能性ｓｉＲＮＡ分子の設計方法は、Ｈｏｓｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（２）：８２−８９に開示されており、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００９８】
短いＲＮＡが二本鎖であり、かついずれの鎖も上記に定義した標的ＲＮＡ転写物を有効かつ特異的に下方制御することができる場合は、好ましくは、二本鎖の熱力学的末端安定性に大きい差はない。二本鎖の熱力学的末端安定性（ΔΔＧ）の差の絶対値は、当技術分野で標準の任意の方法で計算することができる。光学的には、二本鎖の熱力学的末端安定性の絶対値は、ＲＮＡｆｏｌｄ（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．３１，  Ｎｏ．１３，  ｐｐ３４２９−３４３１）を用いて、二本鎖の末端の５つの終結ヌクレオチドを検討することによって計算する。好ましくは、ＲＮＡｆｏｌｄによって計算される二本鎖の熱力学的末端安定性は、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、さらに好ましくは１ｋｃａｌ／未満である。
【００９９】
本発明の方法では、インスリン産生の誘導は、標的の特殊化誘導遺伝子ＭａｆＡを上方制御、すなわち活性化することによって達成される。上方制御は「シス」上方制御である。このような文脈において、「シス」上方制御とは、標的ＲＮＡ転写物が、標的遺伝子ＭａｆＡの遺伝子座と関連する遺伝子座から転写されることを意味する。
【０１００】
標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位から５００ヌクレオチド上流または５００ヌクレオチド下流までの遺伝子座から転写される。
【０１０１】
用語「｛特定の遺伝子座｝から転写される」とは、本発明の標的ＲＮＡ転写物の文脈では、「標的ＲＮＡ転写物の転写開始部位が｛当該特定の遺伝子座に｝見出される」ことを意味する。標的ＲＮＡ転写物の転写開始部位は、標的ＲＮＡ転写物のこれ以外の本質的な特徴が存在する限り、標的遺伝子を含有する染色体のいずれかの鎖に見出され得る。
【０１０２】
標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位の５００、２５０、または１００ヌクレオチド上流から、標的遺伝子の転写終止部位の５００、２５０、または１００ヌクレオチド下流までの間に位置するゲノム配列に対して、アンチセンスの配列を含む。任意で、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード領域を含むゲノム配列に対してアンチセンスの配列を含む。
【０１０３】
用語「センス」は、本発明の文脈で核酸配列を説明するために用いる場合、当該配列が標的遺伝子のコード鎖上の配列に対して同一性を持つことを意味する。用語「アンチセンス」は、本発明の文脈で核酸配列を説明するために用いる場合、当該配列が標的遺伝子のコード鎖上の配列に対して相補性であることを意味する。
【０１０４】
遺伝子の「コード鎖」とは、当該遺伝子のｍＲＮＡに対するコード配列を含有する鎖のことである。遺伝子の「テンプレート鎖」とは、当該遺伝子のｍＲＮＡに対するコード配列を含有しない鎖のことである。
【０１０５】
用語「相補性の」および「相補性」は、上に定義した通りである。好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード鎖上の配列に対し、全長にわたって少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに一層好ましくは少なくとも９５％相補性の配列を含む。好ましくは、標的ＲＮＡ遺伝子は、標的遺伝子のコード鎖上の配列に対し、全長にわたって完全またはほぼ完全な相補性を持つ配列を含む。
【０１０６】
あるいは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード鎖上の配列に対して完全またはほぼ完全な相補性を持つun-gapped配列を、１つまたは複数、通常はいくつか（例えば、少なくとも３つ、または少なくとも６つ）含み、前記un-gapped配列は、少なくとも１６ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、さらに一層好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長である。
【０１０７】
ＲＮＡ転写物（複数可）と上述のゲノム配列（複数可）との同一性／相補性を評価する場合に、コード／テンプレート鎖は、遺伝子の転写領域の上流および下流に伸びると考えられており、つまり、用語「コード鎖」および「テンプレート鎖」は実際の鎖のラベルに過ぎず、長さの制約を示すものではない。
【０１０８】
標的ＲＮＡ転写物は、コードＲＮＡ分子、つまりアミノ酸配列をコードするＲＮＡ分子であるか、または非コードＲＮＡ分子、つまりアミノ酸配列をコードしないＲＮＡ分子であるかのいずれかである。好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は非コードＲＮＡである。
【０１０９】
標的ＲＮＡ転写物は、好ましくは少なくとも１６ヌクレオチド長である。しかし、好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は少なくとも１００、さらに好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド長、可能性としては少なくとも４０００ヌクレオチド長である。
【０１１０】
標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード鎖上のゲノム配列に対して相補的な配列を含む。
【０１１１】
任意で、標的ＲＮＡ転写物がアンチセンスであるゲノム配列は、標的遺伝子のプロモーター領域の一部を含む。この特徴を言い表す別の方法は、アンチセンスの標的ＲＮＡ転写物が標的遺伝子のプロモーター領域と「重なる」ということである。遺伝子は複数のプロモーター領域を有する可能性があり、その場合に標的ＲＮＡ転写物は、プロモーター領域のうちの１つ、２つ、又はそれ以上と重なる可能性がある。注釈つきの遺伝子座のオンラインデータベースを用いて、遺伝子のプロモーター領域を特定してもよい。
【０１１２】
いずれのプロモーター領域でも、プロモーター領域全体が重なる必要はなく、プロモーター領域内の部分配列に標的ＲＮＡ転写物が重なれば十分であり、つまり、重なりは部分的な重なりであり得る。同じく、標的ＲＮＡ転写物全体がプロモーター領域内の当該配列に対してアンチセンスである必要はなく、標的ＲＮＡ転写物がプロモーター領域にアンチセンスである配列を含んでいることだけが必要である。
【０１１３】
標的ＲＮＡ転写物と標的遺伝子のプロモーター領域との間の重なりの領域は、単一ヌクレオチド長まで短くてもよいが、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長である。以下の具体的な取り決めのひとつひとつが、用語「重なる」の範囲内に入ることが意図されている。
ａ）標的ＲＮＡ転写物と標的遺伝子のプロモーター領域の長さが同一であり、その長さ全体にわたって重なる（つまり、相補的である）。
ｂ）標的ＲＮＡ転写物は標的遺伝子のプロモーター領域より短く、かつその長さ全体にわたって標的遺伝子のプロモーター領域と重なる（すなわち、その長さ全体にわたって標的遺伝子のプロモーター領域内の配列と相補的である。）。
ｃ）標的ＲＮＡ転写物は標的遺伝子のプロモーター領域より長く、標的遺伝子のプロモーター領域はそれによって完全に重複している、すなわち、標的遺伝子のプロモーター領域はその長さ全体にわたって、標的ＲＮＡ転写物内の配列と相補的である）。
ｄ）標的ＲＮＡ転写物および標的遺伝子のプロモーター領域は、同じまたは異なる長さであり、重なる領域は、標的ＲＮＡ転写物の長さおよび標的遺伝子のプロモーター領域の長さのいずれよりも短い。
【０１１４】
上記の定義「重なり」は、本明細書全体を通じて、他の重なる配列の説明に準用される。明らかに、アンチセンスＲＮＡ転写物が標的遺伝子のプロモーター領域以外の領域と重なりあう場合は、転写物の配列は、プロモーター領域内よりもむしろその領域内の配列に対して相補的である。
【０１１５】
好ましくは、ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位を含むゲノム配列に対してアンチセンスの配列を含む。言い換えれば、好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は標的遺伝子の転写開始部位と重なる配列を含む。
【０１１６】
理論に拘泥するつもりはないが、本発明の短いＲＮＡは、標的遺伝子ＭａｆＡの一領域に対してアンチセンスである標的ＲＮＡ転写物のｓｉＲＮＡ様の開裂を誘導することによって、標的遺伝子ＭａｆＡの修飾を成し遂げ得る。本発明の短いＲＮＡはこのほか、アルゴノートタンパク質との複合体となって、制御クロマチン修飾タンパク質のアンカーとしても作用することができるのではないかと考えられる。正確な機構は未知であるが、効果が観察されるように標的ＲＮＡ転写物が細胞中に存在することは明らかである。
【０１１７】
細胞中に存在する標的ＲＮＡ転写物を判定する方法は、当技術分野で周知である。しかしながら、本発明の目的に関しては、標的遺伝子に対してアンチセンスのいかなるＲＮＡ転写物の確実な確認も実際に求められてはいない。したがって、前記非コードＲＮＡ転写物（すなわち、下方制御するべき標的転写物）の存在を判定する必要はない。本発明者は、遺伝子の転写開始部位を囲む領域にある遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列が得られれば、つまり配列決定によって判定するかデータベース上に見出せば、その領域に対する逆相補的ＲＮＡ配列を判定すれば、この後者の配列に対して相補的な短いＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子を上方制御することができることを見出した。相補性の要件については、本明細書の別の箇所で考察する。遺伝子の転写開始部位を囲む領域は、転写開始部位の１００、２００、３００、４００、５００、８００、１０００、または２０００ヌクレオチド上流と下流との間に位置する領域である。
【０１１８】
理論に拘泥するつもりはないが、ｓａＲＮＡの作用機序は、例えばポリコームグループを介したクロマチンのリモデリングを伴う可能性があると考えられている。ポリコームグループタンパク質は、プロモーターに関連したＲＮＡをはじめとするｎｃＲＮＡと直接相互作用し、それによってプロモーターへと補充されてサイレンシングを生じさせることができるように思われる。したがって、ｓａＲＮＡはそのようなポリコームを補充するｎｃＲＮＡに干渉することによって、プロモーターでのポリコームレベルを低下させ、Ｔｒｉｔｈｏｒａｘグループタンパク質のような「ポジティブな」クロマチンリモデリング複合体がポジティブなヒストンマークを確立することを可能にすることができる。
【０１１９】
「標的遺伝子」または「関心の遺伝子」とは、その発現の修飾が望まれる遺伝子のことであり、本明細書で標的遺伝子への言及が行われる場合、好ましくはＭａｆＡのことであると理解するべきである。上に詳しく述べた通り、標的遺伝子は、インスリンである標的タンパク質をコードする遺伝子とは異なる。したがって、「標的タンパク質」へのいかなる言及も、好ましくはインスリンを意味すると理解するべきである。標的遺伝子を含有する細胞は、好ましくはヒト細胞である。「標的ｍＲＮＡ」配列は、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡ配列である。
【０１２０】
特殊化誘導遺伝子は、上方制御されると細胞の特殊化を誘導する遺伝子である。本明細書における特殊化遺伝子への言及は、好ましくはＭａｆＡへの言及である。
【０１２１】
上に考察した方法は、標的遺伝子ＭａｆＡ、すなわち少なくとも１つの標的の特殊化を誘導する遺伝子、を上方制御するための短いＲＮＡの使用を必要とする。したがって、このような方法は、さらなる短いＲＮＡの使用または当技術分野で公知の他の手段による、さらなる特殊化（インスリン産生）誘導遺伝子の活性化を可能にする。好ましくは、上記の方法は、ＰＤＸ１、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、Ｒｆｘ６、ＭａｆＡ、Ｈｌｘｂ９、Ｈｎｆ６、Ｐｔｆ１ａ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｋｘ６−１、および（プロ）インスリンから成る群から選択される２、３、４、５、６、７、または８個の標的遺伝子、より好ましくはＰＤＸ１、Ｎｇｎ３、Ｒｆｘ６、およびＭａｆＡである標的遺伝子に対する短いＲＮＡを用いた上方制御を含み、前記短いＲＮＡは好ましくは本明細書に述べた原則に適合する。この一連の標的遺伝子のあらゆる組み合わせが企図されている。
【０１２２】
本発明の方法は、細胞を適切な因子と接触させることを含み得る。適切な因子は、好ましくはグルコース、アクチビン、エキセンジン（好ましくはエキセンジン４）、ノギン、ＦＧＦ、ニコチンアミド、トルブタミド、ＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、および／またはＥＧＦから選択され得る。一実施形態では、細胞を、グルコース、好ましくは約２．５ｍＭまたは２．５ｎＭ、および／またはアクチビンＡ、好ましくは約１０ｎｇと、少なくとも１日、好ましくは２〜４日間、例えば３日間接触させる。一実施形態では、細胞をグルコース、好ましくは約１１ｍＭまたは１１ｎＭ、エキセンジン、好ましくは約５ｎｇ、ノギン、好ましくは５０ｎｇ、ＦＧＦ、好ましくは５ｎｇ、および／またはＥＧＦ、好ましくは５ｎｇと、約６日間、例えば４〜８日間接触させる。前記の接触は、適切な間隔で、例えば３日おきに繰り返すこともできる。一実施形態では、細胞を、まずグルコースおよびアクチビンＡと３日間接触させ、次に３日目および６日目に、グルコース、エキセンジン、ノギン、ＦＧＦ、およびＥＧＦと接触させる。一実施形態では、細胞を、好ましくは９日目に、ニコチンアミド、好ましくは約１０ｍＭ、ＩＧＦ−ＩＩ、好ましくは約５０ｎｇ、ＨＧＦ、好ましくは約１０ｎｇ、エキセンジン４、好ましくは約２５ｎｇ、およびアクチビンＡ、好ましくは約１０ｎｇと接触させる。好ましくは、これらのステップの実施中には、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンが、存在しない。典型的なワークフローを図７および９に示す。これらの図に示されたワークフローの各ステップは、別々の実施形態を表す。
【０１２３】
本発明の方法では、細胞または細胞集団を、本発明の短いＲＮＡ分子と接触させる。短いＲＮＡ分子は、本発明の短いＲＮＡとともに任意の好適な送達試薬を用いることによって、インビトロまたはインビボで前記細胞に投与することができる。このような好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリジン）、ウイルス性の粒子、エレクトロポレーション、もしくはリポソームが挙げられる。リポソームの調製には様々な方法が公知であるが、例えばＳｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）、Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７、ならびに米国特許第４，２３５，８７１号および同第５，０１９，３６９号に記載されており、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。細胞をｓａＲＮＡと接触させるステップは、「トランスフェクション」と称することもできる。
【０１２４】
特に好ましくは、本発明の短いＲＮＡを封入するリポソームは、例えばオプソニン化阻害部分を構造体の表面に結合させることによって、単核細胞マクロファージおよび細網内皮系によるクリアランスを回避するように修飾される。一実施形態では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分とリガンドの両方を含む。
【０１２５】
短いＲＮＡを発現する組み換えプラスミドは、そのままで、またはＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えば、ポリリジン）、又はリポソームをはじめとする好適な送達試薬と併せて投与することができる。短いＲＮＡを発現する組み換えウイルスベクター、およびそのようなベクターを細胞に送達する方法は、当技術分野内では公知である。
【０１２６】
好ましくは、前記接触させるステップを２回以上、好ましくは３日おきに実施するが、毎日、または２、４、もしくは５日おきであってもよい。接触は、好ましくは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間実施するが、６または９日間が好ましい。
【０１２７】
上記の方法において、複数の標的遺伝子を上方制御する場合は、この多様な標的遺伝子を上方制御するために用いる短いＲＮＡは、多様な頻度で、多様な期間にわたって投与することができる。用いる特定の投与計画は、当業者がその所望の目的、特定の開始細胞の種類、および送達方法に合わせて容易に決定することができる。一例としては、本発明の短いＲＮＡ分子のピコモル濃度を用いてもよい。
【０１２８】
本発明の短いＲＮＡは、単独で、または考察中の特定の方法で有効であることが公知の他の活性薬剤（複数可）との併用で提供することができる。その他の活性薬剤（複数可）は、本発明の短いＲＮＡと同時に、別々に、または逐次的に投与することができる。したがって、本発明の短いＲＮＡを１つだけ用いることも、本発明の短いＲＮＡを２つ以上組み合わせて用いることも、または、妥当であれば、前記の短いＲＮＡ（複数可）と他の活性物質（複数可）とを組み合わせて用いることも可能である。
【０１２９】
本発明のすべての態様の重要な特徴は、本発明の短いＲＮＡを用いてアンチセンスＲＮＡ転写物を標的とすることが、標的遺伝子の上方制御をもたらすという点である。
【０１３０】
本発明の短いＲＮＡ分子は、任意の好適な方法で、例えば合成により、または細胞での発現によって、当業者には周知の分子生物学の技術を用いて、作製することができる。例えば、短いＲＮＡは、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．の米国公開出願第２００２／００８６３５６号に記載のショウジョウバエインビトロ系、またはＶｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：９９−１３４に記載のＲＮＡ分子の合成方法など（参照によって本明細書に全体として組み込まれる）、当技術分野で公知の方法を用いて、化学合成または組み換え技術によって作製することができる。本発明の短いＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドのホスホラミダイトと従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置とを用いて、化学的に合成することもできる。短いＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである場合は、２つの別個の相補的ＲＮＡ分子としても、または２つの相補的領域を持つ単一のＲＮＡ分子としても合成することができる。合成ＲＮＡまたは合成試薬の供給業者としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡの一部）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）が挙げられる。
【０１３１】
また短いＲＮＡは、任意の好適なプロモーターを用いて、組み換え型の環状または線状ＤＮＡから発現させることもできる。本発明の短いＲＮＡを発現させるための好適なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６またはＨ１のＲＮＡのポルＩＩＩのプロモーター配列、およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当業者の技術の範囲内である。本発明の組み換えプラスミドは、短いＲＮＡを特定の組織または特定の細胞内環境に発現させるための誘導可能または制御可能なプロモーターも含み得る。
【０１３２】
組み換えプラスミドから発現された短いＲＮＡは、標準技術を用いて培養細胞発現系から単離することができる。本発明の二本鎖の短いＲＮＡは、２つの別個の相補的ＲＮＡ分子として、または２つの相補的領域を持つ単一ＲＮＡとして、組み換えプラスミドから発現させることができる。
【０１３３】
短いＲＮＡの発現に好適なプラスミドの選択、プラスミドに短いＲＮＡを発現させるための核酸配列を挿入する方法、および関心の細胞に組み換えプラスミドを送達する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−４４８、およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｔ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３４】
本発明の短いＲＮＡは、インビボで、組み換えウイルスベクターから細胞内に発現させることもできる。本発明の組み換えウイルスベクターは、本発明の短いＲＮＡをコードする配列と、短いＲＮＡ配列を発現するための任意の好適なプロモーターとをふくむ。好適なプロモーターとしては、例えばＵ6またはＨ１のＲＮＡのポルＩＩＩのプロモーター配列、およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当業者の技術の範囲である。本発明の二本鎖の短いＲＮＡは組み換えウイルスベクターから、２つの別個の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を持つ単一のＲＮＡ分子として発現させることができる。例えばアデノウイルス（ＡＶ）由来のベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルスなど、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）のコード配列を受け入れることのできる任意のウイルスベクターを用いることができる。ウイルスベクターの向性は、必要に応じて、他のウイルスに由来する外膜タンパク質または他の表面抗原でベクターを偽型化することによって、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代入することによって、修飾することができる。
【０１３５】
本発明での使用に好適な組み換えウイルスベクターの選択、短いＲＮＡを発現させるための核酸配列をベクター内に挿入する方法、および関心の細胞にウイルスベクターを送達する方法は、当技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３６】
実施例で考察するように、本発明者は、本明細書に開示される方法を用いて、数多くの特殊化遺伝子の活性を有効に修飾する特定の短いＲＮＡ分子を設計した。好ましい特殊化遺伝子については上に考察した。したがって、さらなる態様では、本発明は、表１〜６に示す固有の配列を持つ一本鎖でも二本鎖でもよい短いＲＮＡ分子を提供する。任意で、これらの配列のいずれもが、３’テイルを含み得る。
【０１３７】
本発明はまた、上記の個々の鎖の配列を含む、またはこれらの配列から成る一本鎖または二本鎖のＲＮＡ分子も提供する。
【０１３８】
本発明はまた、上述したＲＮＡ分子と同等のＤＮＡ分子も提供する。
【０１３９】
本発明の短いＲＮＡ分子は、再生法または修復法をはじめとする治療法にそのまま用いることができる。
【０１４０】
さらなる態様において、本発明は、治療に用いるための本発明の短いＲＮＡを提供する。好ましくは、本明細書に開示する２つの特異的な短いＲＮＡであって、ＭａｆＡを上方制御する短いＲＮＡは、組み合わせて用いられる。
【０１４１】
さらなる態様において、本発明は、本発明の短いＲＮＡを、それを必要とする患者に投与することを含む遺伝子治療の方法を提供する。
【０１４２】
本発明は、患者の特殊化した細胞、好ましくはインスリン産生細胞の欠乏による疾患の治療に使用するための本発明の短いＲＮＡを提供する。
【０１４３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の短いＲＮＡを含む細胞または細胞株を提供する。
【０１４４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法のいずれか１つによって調製される、特殊化した細胞を提供する。
【０１４５】
実施例に詳述するように、本発明の方法は、インスリン分泌能のある細胞の創出を可能にする。したがって、さらなる態様において、本明細書に開示の方法を用いて得ることのできる、インスリン産生能のある細胞が提供される。好ましくは、細胞は、ＯｍｎｉＣｙｔｅなどのＣＤ３４＋幹細胞の特殊化を誘導することによって得られる。
【０１４６】
細胞は、好ましくはエクスビボであり、すなわち生命体の一部ではない。任意で、細胞を「インビトロ」または「単離された」と称することもできる。
【０１４７】
このような細胞の治療への使用が、本発明のさらなる態様である。任意で、本発明の特殊化した細胞および本発明の短いＲＮＡは、本明細書に開示の治療的適応において、組み合わせて用いることができる。「組み合わせて」には、単独投与、同時投与、または逐次的投与が含まれる。
【０１４８】
別の観点から見ると、本発明は、上に定義した特殊化した細胞および／または短いＲＮＡの薬学的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。
【０１４９】
治療的適応は、本発明の特殊化した細胞および／または短いＲＮA分子の投与から恩恵を受ける任意の状態、損傷、または障害の治療であり得る。これは、特殊化した細胞の欠乏に伴う、またはこれを特徴とする状態であり得る。
【０１５０】
好ましくは、治療的適応は、再生又は修復である。任意で、再生または修復は、損傷した臓器、好ましくは膵臓または肝臓に対するものでる。
【０１５１】
あるいは、再生または修復は、「損傷」それ自体ではないが正常な発達を遂げていない臓器に対するものであり得る。したがって「再生」は、臓器の成長または改善のあらゆる方法を含むものと広く解釈されるべきである。
【０１５２】
糖尿病、Ｉ型またはＩＩ型の真性糖尿病の治療は好ましい。治療し得る他の疾患は、肥満、特に病的肥満、脂肪肝、特に脂質およびグリコーゲンの沈着と関連する場合、ならびにグルコースおよび／またはインスリンの摂取および／または利用の不良を特徴とする、またはこれに起因するあらゆる状態である。このような障害は、異常なインスリンの産生、摂取、または利用に起因する状態と呼ぶことができる。
【０１５３】
任意で、本発明は、本発明の短いＲＮＡおよび／または本発明の特殊化した細胞を、膵臓細胞、特にβ細胞が不足した患者の膵臓の少なくとも一部の再生に使用するために提供する。膵臓がインスリンを十分に産生しない、または実際には全く産生しない患者はいずれも、このような治療から恩恵を受ける可能性がある。インスリンの産生不足には、正常な（健康な）対象より低いレベルのインスリン産生が含まれるが、正常な（健康な）対象に匹敵するレベルのインスリンを産生するが、例えばインスリン耐性、過剰な食物消費、病的肥満などの理由からさらに高いインスリンレベルを必要とする対象も含まれる。
【０１５４】
本発明の短いＲＮＡおよび／または細胞は、膵臓を標的とする代わりに、またはそれに加えて肝臓を標的とし、肝細胞、または肝臓を占める本発明の細胞が、インスリンを産生するようにするために用いることもできる。
【０１５５】
短いＲＮＡ分子または細胞は、注射によって、例えば静脈内、皮下、筋肉内、または標的臓器内に投与することができる。したがって、注射は全身、または例えば標的臓器、好ましくは膵臓または肝臓などの標的部位に、または標的部位内に対するものであってよい。あるいは、投与は経口またはｐｒ（経直腸）であってもよい。細胞を膵臓に注射するのが好ましい。
【０１５６】
本発明の短いＲＮＡおよび／または細胞は、それを必要とする患者に対し、当技術分野で公知の任意の手段または送達ビヒクルによって、例えばナノ粒子、陽イオン性脂質、コレステロールもしくはα−トコフェロール、リポソーム、例えば陽性に荷電した陽イオン性リポソーム、ポリエチレンイミンなどのポリマー、デンドリマー、アプタマーを介して、または抗体複合体として、投与することができる。また短いＲＮＡは、ウイルスベクターによって発現したｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ擬態として投与することもできる。
【０１５７】
好ましくは、ｓａＲＮＡまたは細胞は、ｓａＲＮＡまたは細胞を特定の組織または細胞型、例えば膵臓細胞または肝臓細胞、例えば肝細胞もしくはβ細胞へと方向付ける部分と関連するか、錯体を形成するか、連鎖するか、またはその内部に含有されている。前記部分は、上に述べた手段／送達ビヒクルのひとつであり得る。
【０１５８】
アプタマーは、選択性、親和性、および安定性の高いオリゴヌクレオチドまたはペプチドである。特有の安定した形状を帯び、それによって標的分子にきわめて特異的な強力結合を与えている。特定の分子標的のいずれに対しても、核酸の組み合わせライブラリーから、例えば指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ法）と呼ばれる技術によって、核酸アプタマーを特定することができる（例えば、Ｔｕｅｒｋ  Ｃ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｌ：  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０，  ２４９：５０５−５１０を参照されたい）。したがって、当業者は、肝臓細胞または膵臓細胞などの標的細胞、例えばβ細胞に、ｓａＲＮＡまたは本発明の細胞を送達するために好適なアプタマーを設計することができる。ペプチドアプタマーは、例えばイースト２ハイブリッド法を用いて特定することができる。膵臓特異的アプタマーを用いた本発明の短いＲＮＡの膵臓投与が、特に好ましい。ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーおよび膵臓特異的アプタマーが企図される。
【０１５９】
このほか提供されるのは、アプタマーと本発明の短いＲＮＡとの結合体である。結合体は、直接化学結合の形成、ストレプトアビジンなどのリンカーを介した連結法など、２つの部分を連結するための任意の公知の方法を用いて形成してよい。
【０１６０】
標的細胞の表面受容体に対する抗体を作り出す方法は周知である。本発明のｓａＲＮＡを、例えばＲＮＡ担体タンパク質を用いてそのような抗体に結合させてもよい。次に、結果として生じる複合体を対象に投与し、受容体媒介エンドサイト―シスを介して標的細胞に取り込ませてもよい。本発明の細胞は、公知の手段を用いてそのような抗体に連結させてもよい。
【０１６１】
ｓａＲＮＡまたは細胞は、当技術分野で公知の方法を用いてリポソーム内に封入してもよい。リポソームは、任意で、抗体またはペプチドなどの標的細胞特異的な部分と結合させてもよい。
【０１６２】
本開示全体を通じて、例えば刊行物および特許などの様々な文書が列挙されている。そのような文書はすべて、関係のある部分が参照によって本明細書に組み込まれる。いずれの文書の引用も、本発明に先行する技術であることの承認と解釈されてはならない。本文書の中のある用語の意味または定義が、参照によって組み込まれる文書の中のその用語の定義と食い違う限りにおいて、本文書中で当該用語に割り当てられた意味または定義が支配する。
【０１６３】
本明細書で参照するのは、本発明に利用される各種の含有物（ingredient）をはじめとする成分(component)の商標である。本明細書において、本発明者は、特定の商標の下にある材料によって制限されることを意図しない。本明細書の記述では、商標によって参照されるものと等価の材料（例えば、異なる供給源から異なる名称または参照番号の下に得られるもの）を代用し、利用してもよい。
【０１６４】
明確に意図されているのは、上に開示した本発明の任意で好ましい特徴および実施形態は、単独で実施しても、任意の数と任意の組み合わせで一緒に実施してもよいということであるが、ただし、特徴および実施形態が互いに矛盾する場合、そのような実施が不可能な場合、またはそのような実施が本発明の目的に反する場合は別である。
【０１６５】
以下の実施例は、本発明を例示し、当業者に本発明の作製および使用を教示することを意図したものである。これらの実施例は、決して本発明を制限するためのものではない。以下の実施例、ならびに表および図の中で、本発明をさらに説明する。ここで、表１は、ＰＤＸ１の発現を活性化するために設計された短いＲＮＡ分子を示す。右側にアンチセンス（ガイド）配列が示され、左側にセンス（パッセンジャー）配列が示されている。ＲＮＡ配列にはチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）が含有され、この２つの残基は表に提供された配列では等価である。表２は、ニューロゲニンの発現を活性化するために設計された短いＲＮＡ分子を示す。右側にアンチセンス（ガイド）配列が示され、左側にセンス（パッセンジャー）配列が示されている。表３は、Ｒｆｘ６の発現を活性化するために設計された短いＲＮＡ分子を示す。右側にアンチセンス（ガイド）配列が示され、左側にセンス（パッセンジャー）配列が示されている。表４は、ＭａｆＡの発現を活性化するために設計された短いＲＮＡ分子を示す。右側にアンチセンス（ガイド）配列が示され、左側にセンス（パッセンジャー）配列が示されている。表５は、インスリンの発現を活性化するために設計された短いＲＮＡ分子を示す。右側にアンチセンス（ガイド）配列が示され、左側にセンス（パッセンジャー）配列が示されている。表６は、インスリンの発現を活性化するために設計された短いＲＮＡ分子である。
【０１６６】
これらの表は、短いＲＮＡ配列を示す。短いＲＮＡが一本鎖である場合は、好ましくはアンチセンスカラムに掲載された配列を含むか、またはその配列から成る。二本鎖の短いＲＮＡは、センスカラムに示された配列を含むかまたはその配列から成る鎖と、それと対をなす同じ行のアンチセンスカラムに示された配列を含むかまたはその配列から成る鎖とで形成される。言い換えれば、これらの表の各行は、二本鎖の形成にはどの配列を対にし得るかを示している。したがって、二本鎖の短いＲＮＡには、配列番号１と配列番号２、または配列番号３と配列番号４、などが含まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】ＰＤＸ１の遺伝子座および潜在的なアンチセンス標的候補を示す概略図である。この図は、ＰＤＸ１の遺伝子位置、ＰＤＸ１転写物の構造、および周辺領域からスプライスされたＥＳＴを示している（ＵＣＳＣのゲノムブラウザーから編集された画像）。ボックスは、ＰＤＸ１のプロモーター領域およびＰＤＸ１の上流の最も近いアンチセンスＥＳＴの概要を示している（ＣＲ５９３１７５）。ＥＳＴは、ＰＤＸ１の転写開始部位（ＴＳＳ）から１．４ｋｂで開始し、９０ｋｂで終結する。ＥＳＴがＰＤＸ１のＴＳＳを通過して転写され、それと重なることに留意されたい。矢印は、小さいＲＮＡの候補の潜在的な標的部位を示す。
【図２】Ｎｇｎ３の遺伝子座および潜在的なアンチセンス標的候補を示す概略図である。この図は、Ｎｇｎ３の遺伝子位置、Ｎｇｎ３転写物の構造、および周辺領域からスプライスされたＥＳＴを示す（ＵＣＳＣゲノムブラウザーからの画像）。ボックスは、Ｎｇｎ３のプロモーター領域とＮｇｎ３の上流の最も近いアンチセンス転写物の概要を示す（Ａ１７４４５１２）。ＥＳＴは、Ｎｇｎ３のＴＳＳから２．４ｋｂで開始し、３．７ｋｂで終結する。矢印は、小さいＲＮＡの候補の潜在的な標的部位を示す。
【図３】Ｒｆｘ６の遺伝子座および潜在的なアンチセンス標的候補を示す概略図である。この図は、Ｒｆｘ６の遺伝子位置、Ｒｆｘ６転写物の構造、および周辺領域からスプライスされたＥＳＴを示す（ＵＣＳＣゲノムブラウザーからの画像）。ボックスは、Ｒｆｘ６のプロモーター領域とＲｆｘ６の上流の近接したアンチセンス転写物の概要を示す。ＥＳＴはＧＰＲＣ６Ａと呼ばれ、Ｒｆｘ６のＴＳＳから４８ｋｂで開始し、８５ｋｂで終結する。矢印は、短いＲＮＡ候補の潜在的な標的部位を示す。
【図４】ＭａｆＡの遺伝子座および潜在的なアンチセンス標的候補を示す概略図である。この図は、ＭａｆＡの遺伝子位置、ＭａｆＡ転写物の構造、および周辺領域からスプライスされたＥＳＴを示す（ＵＣＳＣゲノムブラウザーからの画像）。矢印は、小さいＲＮＡの候補の潜在的な標的部位を示す。
【図５】Ａ．ＲＮＡを示すゲルの写真である。単離されたばかりのｏｍｎｉｃｙｔｅ（０日目）および培養３日後（３日目）の細胞から単離された全ＲＮＡを、ｍＲＮＡのスクリーニングのために逆転写した。対照として、アクチンＲＮＡの発現を測定した。０日目の細胞は、ＳＯＸ１７などの中胚葉細胞を発現するが、これらの細胞は、インスリン産生β細胞への特殊化に必要なＮｅｕｒｏＤ、ＰＤＸ１，およびＲｆｘ６をも発現する。３日目の結果は、これらの因子が拡大の３日以内に下方制御されたことを示している。Ｂ．ＲＮＡを示すゲルの写真である。Ｏｍｎｉｃｙｔｅを３日間培養し、次にＰＤＸ１を標的とするｓａＲＮＡでトランスフェクトした。考え得る４組のアニールオリゴヌクレオチド（ＣＲ１、ＣＲ２、ＰＲ１、およびＰＲ２）をテストした。９日後（９日目）に、ＲＮＡをアッセイした。ＣＲ２およびＰＲ１は、９日目にＰＤＸ１、Ｒｆｘ６、およびインスリンの発現を増進した。Ｃ．９日目にＰＤＸ１（ＣＲ２およびＰＲ１）でトランスフェクト細胞は、島細胞の集合形成とよく似た形態変化を示した。Ａｌｅｘａ−４８８に抱合させたインスリン一次抗体に対する二次抗体を用いた蛍光染色により、これらの細胞集合がインスリンを発現することが明らかにされた。二次抗体単独での染色は、自己蛍光または非特異的結合を示さなかった（データを示さず）。
【図６】Ａ．ＲＮＡを示すゲルの写真である。島細胞の後期の特殊化に関与する転写因子を標的とするアニーリングしたｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドの一過性トランスフェクションを、培養後３日目および６日目に実施した。ニューゲニン３（ＡＬ２）、ＭａｆＡ（ＰＲ１およびＰＲ２）がプロインスリンの発現を上方制御した一方で、ニューロゲニン３（ＰＲ１およびＰＲ２）、Ｒｆｘ６（ＰＲ１およびＮＭ１）がプレプロインスリンの発現を上方制御した。Ｂ．グルコース勾配に暴露した後のインスリンの発現をアッセイした。細胞に対し、ｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、一過性トランスフェクションを実施した。培養３日目および６日目に、Ｒｆｘ６（ＰＲ１）、Ｎｇｎ３（ＰＲ１）、およびＭａｆＡ（ＰＲ２）を単独で、またはＰＤＸ１（ＣＲ２）とともに、トランスフェクトした。９日目に、１６時間にわたり、１０ｍＭのニコチンアミド、５０ｎｇのＩＧＦ−ＩＩ、１０ｎｇのＨＧＦ、２５ｎｇのエキセンジン４、および１０ｎｇのアクチビンＡを補充したαＭＥＭを用いて細胞に前処理を施し、続いて３時間にわたる２．８ｍＭグルコース添加、およびさらに３時間にわたる２０ｍＭグルコース添加を実施した。培地を単離し、プロインスリンＥＬＩＳＡ用に処理した。結果は、キットに提供された陽性対照（インスリン７．９ｐＭ）に対する割合を表す。
【図７】インスリン産生細胞の誘導を例示したフローチャートである。
【図８】（プロ）インスリンの遺伝子座および潜在的なアンチセンス標的候補を示す概略図である。この図は、（プロ）インスリンの遺伝子位置、（プロ）インスリン転写物の構造、および周辺領域からスプライスされたＥＳＴを示す（ＵＣＳＣゲノムブラウザーから編集された画像）。ボックスは、（プロ）インスリンのプロモーター領域の概略を示す。矢印は、小さいＲＮＡの候補の潜在的な標的部位を示す。
【図９】インスリン産生細胞の誘導のための最適化されたプロトコルを例示するフローチャートである。ＰＳＧは、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンを表す。
【図１０】未処理細胞（対照）とｓａＲＮＡ処理細胞とのアクチンおよびインスリン発現のウェスタンブロット分析である。
【図１１】β細胞の発達に関与する重要な転写因子の定量ＰＣＲのグラフである。トランスフェクトされていない（対照）細胞、ＭａｆＡを上方制御するｓａＲＮＡにトランスフェクトされた細胞、および全正常膵細胞に対し、定量ＰＣＲを実施した。
【図１２】電子顕微鏡法像である。
【図１３】インスリンおよびＣペプチドのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１４】トランスフェクトされていない細胞に対する肝上皮細胞中のアクチンに正規化されたＭａｆＡの相対定量を示すグラフである。同調化のために、細胞をチャコールストリッピングしたフェノールレッド無添加のＲＰＭＩ培地に播種した。１６時間後に、ＭａｆＡの標的となるｓａＲＮＡで細胞をトランスフェクトした（ＰＲ１、ＰＲ２、および両者の組み合わせ）。
【参考文献】
【０１６８】
1.    Guz Y, Nasir I, & Teitelman G (2001) Regeneration of pancreatic beta cells from intra-islet precursor cells in an experimental model of diabetes Endocrinology 142, 4956-4968.
2.    Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman NM, & Rajotte RV (2000) Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen N Engl J Med 343, 230-238.
3.    Bonner-Weir S, Taneja M, Weir GC, Tatarkiewicz K, Song KH, Sharma A,  & O'Neil JJ (2000) In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue Proc Natl Acad Sci U S A 97, 7999-8004.
4.    Halvorsen T & Levine F (2001) Diabetes mellitus-cell transplantation  and gene therapy approaches Curr Mol Med 1, 273-286.
5.    Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, Mars WM, Sullivan AK, Murase N, Boggs SS, Greenberger JS, & Goff JP (1999) Bone marrow as a potential  source of hepatic oval cells Science 284, 1168-1170.
6.    Theise ND, Badve S, Saxena R, Henegariu O, Sell S, Crawford JM, & Krause DS (2000) Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation Hepatology 31,  235-240.
7.    Oh SH, Miyazaki M, Kouchi H, Inoue Y, Sakaguchi M, Tsuji T, Shima N,  Higashio K, & Namba M (2000) Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro Biochem Biophys Res Commun 279, 500-504.
8.    Gordon MY, Riley GP, & Greaves MF (1987) Plastic-adherent progenitor  cells in human bone marrow Exp Hematol 15, 772-778.
9.    Gordon MY (1994) Plastic-adherent cells in human bone marrow generate long-term hematopoiesis in vitro Leukemia 8, 865-870.
10.   Hellerstrom C (1984) The life story of the pancreatic B cell Diabetologia 26, 393-400.
11.   Rosenberg L & Vinik AI (1992) Trophic stimulation of the ductular-islet cell axis: a new approach to the treatment of diabetes Adv  Exp Med Biol 321, 95-104; discussion 105-109.
12.   Swenne I (1992) Pancreatic beta-cell growth and diabetes mellitus Diabetologia 35, 193-201.
13.   Zaret KS (2008) Genetic programming of liver and pancreas progenitor      s: lessons for stem-cell differentiation Nat Rev Genet 9, 329-340.
14.   Jonsson J, Carlsson L, Edlund T, & Edlund H (1994) Insulin-promoter-      factor 1 is required for pancreas development in mice Nature  371, 606-609.
15.   Guz Y, Montminy MR, Stein R, Leonard J, Gamer LW, Wright CV, & Teitelman G (1995) Expression of murine STF-1, a putative insulin gene transcription factor, in beta cells of pancreas, duodenal epithelium and pancreatic exocrine and endocrine progenitors during ontogeny Development 121, 11-18.
16.   Offield MF, Jetton TL, Labosky PA, Ray M, Stein RW, Magnuson MA, Hogan BL, & Wright CV (1996) PDX-1 is required for pancreatic outgrowth  and differentiation of the rostral duodenum Development   122, 983-995.
17.   Ahlgren U, Jonsson J, & Edlund H (1996) The morphogenesis of the pancreatic mesenchyme is uncoupled from that of the pancreatic epithelium in IPF1/PDX1-deficient mice Development 122, 1409-1416.
18.   Ahlgren U, Pfaff SL, Jessell TM, Edlund T, & Edlund H (1997) Independent requirement for ISL1 in formation of pancreatic mesenchyme and islet cells Nature 385, 257-260.
19.   Gradwohl G, Dierich A, LeMeur M, & Guillemot F (2000) neurogenin3 is  required for the development of the four endocrine cell lineages of  the pancreas Proc Natl Acad Sci U S A 97, 1607-1611.
20.   Murtaugh LC (2007) Pancreas and beta-cell development: from the actual to the possible Development 134, 427-438.
21.   Smith SB, Qu HQ, Taleb N, Kishimoto NY, Scheel DW, Lu Y, Patch AM, Grabs R, Wang J, Lynn FC, et al. Rfx6 directs islet formation and insulin production in mice and humans Nature 463,  775-780.
22.   Gordon MY, Levicar N, Pai M, Bachellier P, Dimarakis I, Al-Allaf F, 'Hamdi H, Thalji T, Welsh JP, Marley SB, et al. (2006) Characterization and clinical application of human CD34+ stem/progenitor  cell populations mobilized into the blood by granulocyte colony-stimulating factor Stem Cells 24, 1822-1830.
23.   Li LC, Okino ST, Zhao H, Pookot D, Place RF, Urakami S, Enokida H, &  Dahiya R (2006) Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells Proc Natl Acad Sci U S A 103, 17337-17342.
24.   Janowski BA, Younger ST, Hardy DB, Ram R, Huffman KE, & Corey DR (2007) Activating gene expression in mammalian cells with promoter-targeted duplex RNAs Nat Chem Biol 3, 166-173.
25.   Huang V, Qin Y, Wang J, Wang X, Place RF, Lin G, Lue TF, & Li LC RNA  a is conserved in mammalian cells PLoS One 5, e8848.
【実施例】
【０１６９】
実施例１
ＰＤＸ１の発現を活性化するための短いＲＮＡの設計
上述の方法を用いてｓａＲＮＡの設計を実施した。さらに具体的な詳細を以下に示す。
【０１７０】
ＰＤＸ１は、染色体１３（図１参照）のバンドｑ１２．２上に位置する。ＰＤＸ１の正式な遺伝子名は、「ホモサピエンス膵臓十二指腸ホメオボックス１」である。ｍＲＮＡの寄託番号は、ＮＭ＿０００２０９である。ＰＤＸ１の参照配列のｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００２０９）は２つのエキソンを持ち、プラス鎖から転写した。
【０１７１】
ＰＤＸ１の遺伝子座から潜在的なアンチセンス転写物を特定するため、ＰＤＸ１を取り囲むゲノム領域の適切な鎖（マイナス鎖）に位置するスプライスされた発現配列タグ（ＥＳＴ）を探索した。
【０１７２】
ＥＳＴの転写の方向を判定するのは一般に難しいが、スプライスされたＥＳＴのスプライス部位サインを用いることによって判定することができる。ＥＳＴ  ＣＲ５９３１７５を、標的候補として選択した。
【０１７３】
アンチセンスＲＮＡはＴＳＳを囲む領域に見出されることが多いことを、最近の深いシークエンシング実験が明らかにしているため、ＰＤＸ１のプロモーター領域から潜在的なアンチセンス転写物を標的とする短い活性化ＲＮＡを設計することを決定した。さらに具体的に言えば、ＰＤＸ１のＴＳＳから５００ｎｔｓ上流および下流のアンチセンス配列（ＰＤＸ１＿ＡＳ＿ＴＳＳ＋／−５００と略す）を、第２の標的候補として用いた。
【０１７４】
目的は、２つの候補配列を下方制御するための短いＲＮＡを設計することであった。候補の短いＲＮＡは、標的配列を有効に阻害しなければならず、かつ理想的には、潜在的な的外れ効果が最小となるように、できる限り特異的でなければならなかった。そのため、ＧＰｂｏｏｓｔのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを用いて、２つの候補配列を下方制御するための潜在的な短いＲＮＡを特定した。予測されたｓｉＲＮＡ候補のリストから、ＥＳＴ  ＣＲ５９３１７５のエキソン１および２にある最も有望な２つの非オーバーラップｓｉＲＮＡ標的部位、およびプロモーター配列内にあるＰＤＸ１のＴＳＳのそれぞれの側にある最も有望なｓｉＲＮＡ標的部位（ＰＤＸ１＿ＡＳ＿ＴＳＳ＋／−５００）を選択した。これらのｓｉＲＮＡ候補を、ＧＰｂｏｏｓｔによる予測有効性スコア（配列モチーフａａａａ、ｃｃｃｃ、ｇｇｇｇ、およびｕｕｕｕの不在、２０％〜５５％の中程度のＧＣ含量、およびすべての潜在的的外れ転写物に対して少なくとも２のハミング距離）に基づいて選択した。表１は、結果として生じたＰＤＸ１発現活性化のための候補の短いＲＮＡを示す。この表は一本鎖の配列を示すが、活性化ＲＮＡは二本鎖分子として投与してもよい。
【０１７５】
実施例２
ニューロゲニン３の発現を活性化させるための短いＲＮＡの設計
設計は、実施例１のように実施したが、以下の相違があった。
【０１７６】
ニューロゲニンは染色体１０（図２参照）、バンドｑ２１．３上に位置する。ニューロゲニン３遺伝子の正式名称は、「ホモサピエンスニューロゲニン３」である。ｍＲＮＡ寄託番号は、ＮＭ＿０２０９９９である。ニューロゲニン３参照配列ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０２０９９９）は２つのエキソンを持ち、マイナス鎖から転写される。
【０１７７】
ＥＳＴ  Ａ１７４４５１２が標的候補として選ばれた。ＮＥＵＲＯＧ３＿ＡＳ＿ＴＳＳ＋／−５００）が第２の標的候補として用いられた。
【０１７８】
表２に、結果として生じたニューロゲニン３の発現を活性化するための短いＲＮＡの候補を示す。この表は一本鎖の配列を示すが、活性化ＲＮＡは二本鎖の分子として投与されてもよい。
【０１７９】
実施例３
Ｒｆｘ６の発現を活性化するための短いＲＮＡの設計
設計は、実施例１のように実施したが、以下の相違があった。
【０１８０】
Ｒｆｘ６は、染色体６（図３参照）、バンドｑ２２．２上に位置する。Ｒｆｘ６遺伝子の正式名称は、「ホモサピエンス制御因子Ｘ，６」である。ｍＲＮＡ寄託番号は、ＮＭ＿１７３５６０である。Ｒｆｘ６参照配列ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１７３５６０）は１９のエキソンを持ち、プラス鎖から転写される。
【０１８１】
ＥＳＴ  ＮＭ＿１４８９６３が標的候補として選択された。ＲＦＸ６＿ＡＳ＿ＴＳＳ＋／−５００）が第２の標的候補として用いられた。
【０１８２】
表３に、結果として生じたＲｆｘ６の発現を活性化するための短いＲＮＡの候補を示す。この表は一本鎖の配列を示すが、活性化ＲＮＡは二本鎖分子として投与されてもよい。
【０１８３】
実施例４
ＭａｆＡの発現を活性化するための短いＲＮＡの設計
設計は、実施例１のように実施したが、以下の相違があった。
【０１８４】
ＭａｆＡは、染色体８（図４）ｑ２４．３上に位置する。ＭＡＦＡ遺伝子の正式名称は、「ホモサピエンスＶ−ｍａｆ筋腱膜繊維肉腫オンコジーン相同体Ａ（ａｖｉａｎ）」である。ｍＲＮＡ寄託番号は、ＮＭ＿２０１５８９である。ＭａｆＡ参照配列ｍＲＮＡ（ＮＭ＿２０１５８９）は、１つのエキソンを持ち、マイナス鎖から転写される。
【０１８５】
ＭＡＦＡ＿ＡＳＴＳＳ＋／−５００）が標的候補として用いられた。
【０１８６】
表４に、結果として生じたＭａｆＡの発現を活性化するための短いＲＮＡを示す。この表は一本鎖の配列を示すが、活性化ＲＮＡは二本鎖の分子として投与されてもよい。
【０１８７】
実施例５
特殊化の誘導―インスリン産生細胞の作製
材料および方法
以下のようにして多能性細胞（ｏｍｎｉｃｙｔｅｓ）を得た：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に動員された末梢血液細胞を、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌによって処理された白血球除去輸血から、臨床的必要量を超えて得た。すべてのケースについて、インフォームドコンセントおよび地元の研究倫理委員会の承認を得た。ＣＤ３４＋細胞をハンクス緩衝食塩水（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  Ｕ．Ｋ）で、１：４に希釈してから、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ，  Ｋｉｍｂｏｌｔｏｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）密度勾配にわたる１８００ｒｐｍでの遠心分離に３０分間かけて単核細胞（ＭＮＣ）を分離した（Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＮＣ部分を回収し、まずＨＢＳＳ中で、次に、０．５％のヒト血清アルブミンおよび５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を補充したＭＡＣＳ（磁気細胞選別）緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて洗浄した。ＣＤ３４＋陽性細胞選択キット（ＬａｒｇｅＭａｃｓ；  Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｓｂａｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて，ＭＮＣからＣＤ３４＋細胞を単離した。単離したＣＤ３４＋細胞を、２４ウェル培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＵＳＡ）上．１ウェルにつき５００μｌのα−最小必須培地（α−ＭＥＭ）を入れて、2.５ｘ１０5細胞の密度で平板培養し、３７℃および５％ＣＯ2で３０分間インキュベートした。このインキュベーションの後、プレートをＰＢＳで４回洗浄することにより、この非接着性の細胞集団を除去した。
【０１８８】
特殊化の誘導を、図７の通りに実施した。ｏｍｎｉｃｙｔｅ（ＣＤ３４＋、接着性）を、２．５ｍＭのグルコースおよび１０ｎｇのアクチビンＡを補充した無血清拡大培養基（Ｏｍｎｉｃｙｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）中、３日間培養した。
【０１８９】
３日目および６日目には、細胞がｓａＲＮＡ分子でトランスフェクトされていた。対になったｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドを、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、および５ｍＭのＥＤＴＡを用いてアニールした。９０℃での変性ステップの後、室温に至るまでの段階的なアニールステップが続いた。Ｎａｎｏｆｅｃｔａｍｉｎ（ＰＡＡ）をメーカーのプロトコルに従って用いて、アニールされたｓａＲＮＡオリゴヌクレオチド（０．１５μｇ／ウェル）のトランスフェクションを実施した。
【０１９０】
１１ｍＭグルコースの３日目および６日目に、５ｎｇエキセンジン、５０ｎｇヒトノギン、５ｎｇＦＧＦ、５ｎｇＥＧＦを添加した。
【０１９１】
ＲＮＡ分析
ＲＮＡ分析用に、９日目に細胞を採取し、遠心分離により粒状化した。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏキット（Ａｍｂｉｏｎ）をメーカーの指示に従って用いて、全ＲＮＡを回収した。ＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００マイクロサンプル定量装置を用いて定量した。ＱｉａｇｅｎのＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットをメーカー推奨に従って用いて、各サンプルから１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。ＰＤＸ１、Ｒｆｘ６、ＭａｆＡ、およびインスリンの発現を、半定量的に測定した。ローディング対照としてアクチンを用いた。
【０１９２】
免疫蛍光
４％パラホルムアルデヒドで細胞を２０分間、１ｃｍのガラス製カバースリップ上に固定し、続いて０．２％トリトンＸ１００で２０分間透過化処理をした。カバースリップを３回洗浄し、続いて１０％ウサギ血清で４５分間ブロックした。ウサギで育てた抗ヒトインスリン（１：２００）（シグマ）を１０％血清中の細胞に１時間添加した。ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、続いてさらに１５分間１０％血清を添加した後、Ａｌｅｘａ−４８８抱合抗ウサギ二次抗体（１：６００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で５回洗浄した後、カバースリップを４’６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄとともにガラススライド上に載せた。スライドをＬｅｉｃａ  ＤＭ４０００上で６０倍の倍率で視覚化した。平均で５つの画像を撮影し、二次抱合抗体単独での染色と比較して、自己蛍光が存在しないことを確認した。
【０１９３】
プロインスリンＥＬＩＳＡ
９日目に、１０ｍＭのニコチンアミド、５０ｎｇのＩＧＦ−ＩＩ、１０ｎｇのＨＧＦ、２５ｎｇのエキセンジン４、および１０ｎｇのアクチビンＡを補充した前条件付けのα−ＭＥＭ培地に細胞を移した（付属書類Ｅ）。３７℃および５％のＣＯ2で１６時間、細胞をインキュベートした後、グルコース勾配を添加した。２．８ｍＭのグルコースを３時間添加し、続いて２０ｍＭのグルコースをさらに３時間添加した。培地を単離し、メーカー指示に従って全ヒトプロインスリンＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）用に処理した。キットが供給する陽性対照は、７．９ｐＭのインスリンを含有する。
【０１９４】
結果
ｏｍｎｉｃｙｔｅは、膵臓β細胞の特殊化に必要な因子を発現する。プラスチック付着性の骨髄由来幹細胞の初期の性質は、Ｇｏｒｄｏｎ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）およびＧｏｒｄｏｎ  ＭＹ（１９９４）（８，９）によってすでに証明されている。われわれは、単離されたばかりのｏｍｎｉｃｙｔｅからＮｅｕｒｏＤ、ＰＤＸ１、およびＲｆｘ６をはじめとする膵臓β細胞への特殊化に必要な転写因子の存在を確認した。これらの因子の発現は、当然、培養３日のうちに下方制御された（図５Ａ）。
【０１９５】
アニールされたｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、標的遺伝子を上方制御する。インスリン産生細胞へと特殊化するためのこれらの必要な転写因子の発現を維持し、または増加させるために、材料および方法で述べたバイオインフォマティクスおよびソフトウェアアルゴリズムを用いて、小型の活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）オリゴヌクレオチドを作成した。このオリゴヌクレオチドを３日目および６日目にアニールし、トランスフェクトしてから、９日目に細胞採取した。ｍＲＮＡ分析では、膵島の形成とインスリンの発現に必要な下流の転写因子Ｒｆｘ６の順次活性化を促進するために、ＰＤＸ１（図１）の上方制御が十分であることが示された（２１）（図５Ｂ）。９日目にＰＤＸ１でトランスフェクトされた細胞の形態は、免疫蛍光染色によってインスリンの発現が示された膵島細胞の集合形成の特徴を示すものであった（図５Ｃ）。しかしながら、これらの細胞は、グルコース勾配への暴露後にインスリンを分泌していないことから、未成熟の膵島細胞であることが示唆される。
【０１９６】
成熟β細胞の特殊化に必要な転写因子の上方制御
成熟β細胞の特殊化に必要な遺伝子一式を補完するために、ニューロゲニン３（図２）、Ｒｆｘ６（図３）、ＭａｆＡ（図４）を標的とするｓａＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。ｍＲＮＡ分析は、細胞培養９日目までにはプレプロインスリンおよびプロインスリンの発現が有意に上方制御されたことを明らかにしている（図６Ａ）。
【０１９７】
ＰＤＸ１を標的とするｓａＲＮＡとβ細胞の特殊化のための後期トランスクリプション因子との組み合わせ
ｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションに続くｍＲＮＡ分析によってＰＤＸ１、Ｒｆｘ６、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、およびＭａｆＡの標的上方制御が確認されたため、われわれはこれらのオリゴヌクレオチドの組み合わせをｏｍｎｉｃｙｔｅｓに添加して、この細胞が一層成熟したインスリン分泌性β細胞へと発達する兆候が示されるかどうかを評価した。３日目および６日目にトランスフェクトされたＲｆｘ６、Ｎｇｎ３、およびＭａｆＡ単独の組み合わせ、またはＰＤＸ１＋Ｒｆｘ６、ＰＤＸ１＋Ｎｇｎ３、もしくはＰＤＸ１＋ＭａｆＡに続いて、９日目のグルコース反応テストのために材料および方法に記載したように細胞を準備し、続いて全プロインスリン分泌のためのＥＬＩＳＡを実施した。示された数値は、ＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が提供する７．９ｐＭインスリンの陽性対照に対する割合であり、２４ウェルプレートの単一ウェル中で培養された細胞を表す（図６Ｂ）。
【０１９８】
考察
この１０年間にわたって幹細胞の理解と操作に関して得られた進歩は、研究者が再生医療にこのような細胞を用いることを可能にした。胚細胞は催腫瘍性のリスクを抱えていることから、その臨床応用への使用に対する倫理的な制約は、成体前駆細胞の使用に多くの焦点が当たることを意味した。この分野の研究は、臨床的使用に移すことのできない遺伝子組み換え成分に依存することから、かつては制限されてきた。しかしながら、ｏｍｎｉｃｙｔｅｓは、治療で補充用幹細胞として使用するために必要な安全基準をすべて満たすものである（２２）。自己細胞から単離することが可能であり、無血清環境で力強い拡大能力があり、かつ肝細胞、膵細胞、心血管細胞、および神経細胞をはじめとする様々な系統への拘束に必要な転写因子をすでに発現していることから優れた発生的柔軟性を示す（２２）。本明細書に示すデータは、新規の小型活性化ＲＮＡ分子の使用により、ｏｍｎｉｃｙｔｅｓをインスリン分泌細胞中に誘導し得ることを明らかにしている。このような分子は疑いなく、ウイルス性のバックボーンを持つベクターに依存する標準技術を用いるよりも安全なアプローチを可能にする。インスリン産生の誘導に必要な下流の遺伝子を制御するカスケード効果を生じさせるには、標的転写因子を２つ３つだけ活性化すれば十分だということは、すでに明らかにした。
【０１９９】
実施例６
（プロ）インスリンの発現を活性化させるための短いＲＮＡの設計
実施例１のように設計を行ったが、以下の相違があった。
【０２００】
（プロ）インスリンは、染色体１１（図８参照）、バンドｐ１５．５上に位置する。このインスリン遺伝子の正式名称は、「ホモサピエンスインスリン」である。ｍＲＮＡ寄託番号は、ＮＭ＿０００２０７である。（プロ）インスリン参照配列ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００２０７）は、３つのエキソンを持ち、マイナス鎖から転写される。
【０２０１】
標的候補としてＩＮＳ（ＮＭ００１１８５0９８）＿ＡＳ＿ＴＳＳ＋／−５００を用いた。
【０２０２】
表５および６に、結果として生じた（プロ）インスリンの発現を活性化するための短いＲＮＡの候補を示す。
【０２０３】
実施例７
ＭａｆＡを上方制御するためのｓａＲＮＡを用いたインスリン産生の誘導
ａ）ＣＤ３４＋細胞をインスリン分泌表現型へと誘導するための最適化プロトコル
誘導プロトコルは、０日目に７２時間、付着性のＣＤ３４＋細胞集団（Ｏｍｎｉｃｙｔｅｓ）を１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）および２．５ｎＭのグルコース（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）とともに、０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質中にＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、２５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン３およびインターロイキン６を含有する無血清ＣｅｌｌＧｒｏ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、ＵＫ）に補充することで開始された。細胞を８０％の密集度に拡大させてから、１１ｎＭのグルコース、５ｎｇのエキセンジン４（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、５０ｎｇのノギン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、５ｎｇのｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、および５ｎｇのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を７２時間おきに添加し、それとともに、α−ＭＥＭ培地を伴うＮａｎｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＰＡＡ、ＵＫ）（抗生物質なし）をメーカー指示に従って用いて、ＭａｆＡを上方制御するために設計された１５０ｎｇの二本鎖ｓａＲＮＡのトランスフェクションを実施した。このプロセスを、２／３日目、５／６日目、および８／９日目に３回繰り返した（適切な細胞密度の確立に依存）。最大のトランスフェクション効率を達成するため、２４時間ごとに細胞をピペットでそっと取ることにより、細胞のクラスター形成を防いだ。
【０２０４】
最適化プロトコルのワークフローを図９に示す。ＭａｆＡを上方制御することのできる２つの特異的ｓａＲＮＡを組み合わせて用いた。これらはＰｒ−１およびＰｒ−２に指定されている。このようなｓａＲＮＡで処理された細胞を、本実施例において「トランスフェクトされた」細胞と呼ぶ。
【０２０５】
ｂ）アクチンおよびインスリンのウェスタンブロット
未分化ＣＤ３４＋細胞（対照）からの全タンパク質抽出物１０μｇおよびトランスフェクトしたＣＤ３４＋細胞（上記プロトコルに従って調製）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの４〜１２％ＴｒｉｓＧｌｙｃｉｎｅ変性アクリルアミドゲル）上で分離した。ニトロセルロース膜上に移した後、ブロットを抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）（１：８０００）および抗インスリン（Ａｂｃａｍ）、続いてＨＲＰ抱合二次抗体（１：１００００）（Ｄａｋｏ）とともにインキュベートした。インスリンは、小さいαサブユニットとそれより大きいβサブユニットを含み、分子重量が約６ｋＤａ（キロダルトン）の小型ペプチドである。結果を図１０に示す。
【０２０６】
ｃ）β細胞の発達に関与する重要な転写因子の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
トランスフェクトしたＣＤ３４＋細胞（上記プロトコルに従って調製）との比較による分化した（トランスフェクトしていない）ＣＤ３４＋細胞（対照）からの転写物の相対量（ＲＱ）および全ヒト正常膵臓ＲＮＡを評価した。結果を図１１に示す。
【０２０７】
ＰＤＸ１は、転写因子膵臓十二指腸ホメオボックス１である。インスリンの発現に関与する様々な遺伝子の下流活性化にとって重要なものである。このような因子としては、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、およびＧＬＵＴ２が挙げられる。ＮＧＮ３が基本的なヘリックス−ループ−へリックス転写因子ニューロゲニン３であり、これがＮＥＵＲＯＤ（ニューロゲニン分化因子）と一緒にインスリンの発現を制御する。ＮＫＸ６．１が、β細胞の発達に必要なＮＫ６ホメオボックス１転写因子である。ＧＣＫは、グルコース代謝の最初のステップでグルコースをリン酸化するヘキソキナーゼ酵素である。ＡＢＢＣ８（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣ、第８員）は、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターのスーパーファミリーの一員である。ＡＢＢＣ８は、インスリン放出のためのＡＴＰ感受性カリウムチャンネル内で機能する。ＧＬＰ１は、グルカゴン様ペプチド１であり、インスリン分泌を制御する。ＭＡＦＡ（ｖ−ｍａｆ筋腱膜繊維肉腫腫瘍遺伝子相同体Ａ）は、β細胞特異的な転写因子であり、β細胞のＲＩＰＥ３ｂ―β細胞の成熟期間にインスリン遺伝子（ＩＮＳ）の発現を制御する保存されたエンハンサーエレメント―に結合する。標的遺伝子のためのプライマーは、Ｑｉａｇｅｎの有効なＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒｓである。
【０２０８】
ｄ）Ａ）未分化であるか、またはＢ）トランスフェクトされているかのいずれかであるＣＤ３４＋細胞に対し、電子顕微鏡分析を実施した。トランスフェクト細胞（Ｂ）は、上記のプロトコルに従って調製した。結果を図１２に示す。細胞がＰＤＸ１への分化とインスリンの発現に向かって分化を始めた（Ｂ）では、（Ａ）に比べて顆粒小胞がはっきりと見られる（ｑＰＣＲデータ参照）。明白でクラスター化した小胞は、トランスフェクト細胞中で細胞膜に向かって極性化するのが認められる。
【０２０９】
ｅ）インスリンおよびＣ−ペプチドの酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）
未分化ＣＤ３４＋細胞およびトランスフェクト細胞からの培地を、低グルコース（２．８ｎＭ）パルス、およびそれに続く高グルコース（１６ｎＭ）パルスに細胞を暴露した後に、回収した。次に、この培地を、メーカーの指示に従って、ヒトインスリンおよびヒトＣ−ペプチド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対して特異的な免疫吸収ＥＬＩＳＡプレート上に移した。図１３に示すデータは、トランスフェクト細胞がインスリンを分泌することによってグルコース勾配に反応することができたことを示している。
【０２１０】
実施例８
本発明の短いＲＮＡを用いたＭａｆＡの上方制御は、肝細胞に関しても達成された。肝上皮細胞を、Ｐｒ−１およびＰｒ−２と表わされるｓａＲＮＡでトランスフェクトした（表４参照）。結果は、それぞれのｓａＲＮＡが単独でＭａｆＡの発現を上方制御することができ、かつ両方のｓａＲＮＡの組み合わせの方が、各ｓａＲＮＡの単独よりも大幅な上方制御を達成したことを示している。図１４を参照されたい。
表
表中、Ｌｏｃは位置を、Ｅはエキソンを表す。
【０２１１】
【表１】
0005681955.tif 000002
【０２１２】
【表２】
0005681955.tif 000003
【０２１３】
【表３】
0005681955.tif 000004
【０２１４】
【表４】
0005681955.tif 000005
【０２１５】
【表５】
0005681955.tif 000006
【０２１６】
【表６】
0005681955.tif 000007
【図１】
0005681955.tif 000008
【図７】
0005681955.tif 000009
【図９】
0005681955.tif 000010
【図１３】
0005681955.tif 000011
【図１４】
0005681955.tif 000012
【図２】
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【図３】
0005681955.tif 000014
【図４】
0005681955.tif 000015
【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
0005681955.tif 000020
【図１２】
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【配列表】
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