(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体を含有する、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択される、転移性がんの治療、予防または軽減のための医薬組成物。
【請求項２】
個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択される転移性がん、または個体の転移性がんに対する感受性を検出するためのキットであって、個体または個体から採取した試料におけるＶＨＺの発現を検出するための手段と、使用説明書とを含むキットであって、該検出するための手段が、ＶＨＺ遺伝子を特異的に検出するプライマー対もしくはプローブまたは抗ＶＨＺ抗体からなる群から選択される、キット。
【請求項３】
結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択される転移性がん細胞を検出する方法であって、個体から単離された細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を検出することを含み、該ＶＨＺの発現、量または活性が、非がん性であることがわかっている対照細胞中のＶＨＺの発現、量または活性と比較してアップレギュレーションされている場合に、該単離された細胞が転移性がん細胞であると判定する、方法。
【請求項４】
配列番号１として示される配列または前記配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部を含み、かつ、ＶＨＺ核酸を特異的に検出するプローブによりＶＨＺ核酸を検出することを含むか、または、抗ＶＨＺ抗体によりＶＨＺポリペプチドを検出することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択される転移性がんの治療、予防または軽減に適した分子を同定する方法であって、候補分子が、ＶＨＺのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定することを含む、方法。
【請求項６】
候補分子がアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するためにＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺポリペプチドを発現する細胞に該候補分子を曝露することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体により結合されるエピトープに結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）細胞内ＶＨＺポリペプチドに結合することができる、
（ｂ）細胞の形質膜を通過することができる、
（ｃ）ＶＨＺに結合することができ、ＶＨＺの生物活性を抑制することができる、
（ｄ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの転移を阻害することができる、または
（ｅ）モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である、
抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体、または、それと少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ、ＶＨＺに結合することができる抗原結合断片。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする配列を含む核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む、もしくは、請求項９に記載の核酸により形質転換された、細胞またはその細胞の子孫。
【請求項１１】
個体における、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの腫瘍が、浸潤性もしくは転移性腫瘍であるか、またはその可能性が高いかどうかを判定する方法であって、個体から単離された腫瘍細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性が、正常細胞中のＶＨＺの発現、量または活性と比較してアップレギュレーションされていることを検出することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。本発明は、医学の分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの疾患の治療および診断、ならびにこのような使用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＶＨＺは、ヒトＰＲＬ−ＰＴＰと約２８％のアミノ酸配列同一性を共有するホスファターゼである。ＶＨＺは、多くの組織で発現し、サイトゾルおよび核小体に局在することがこれまでに報告されている（Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ａ）。
【０００４】
しかし、ＶＨＺは進化を通じてカエル、魚類、ハエ、および古細菌のオルソログとともに保存されているにもかかわらず、ＶＨＺの役割は大部分が不明であった。ＶＨＺは、ＶＨＲと同様に、ＶＨ１様のＰＴＰの別個のサブグループに属する（Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ，２００４ｂ）。ＶＨＲは、細胞周期の進行の制御に役割を有することが報告されている（Ｒａｈｍｏｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０００５】
がんは、世界中で重大な健康問題である。２００７年には世界で７６０万人ががんで死亡したと推定される。例えば英国では、がんは年に１２６，０００人が死亡する原因である。４人のうち１人ががんで死亡する。がんに対する公知の治療としては、外科手術、化学療法および放射線療法が挙げられる。多くのがんは十分早期に発見されれば治癒することができる。
【０００６】
改良されたがんの検出および療法に対する必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様に従って、本発明者らは、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを治療、予防または軽減する方法で用いるためのＶＨＺを提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様によれば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減のための抗ＶＨＺ剤が提供され、好ましくは、抗ＶＨＺ剤は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示されるＶＨＺ配列、またはその配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組合せをダウンレギュレーションすることができ、抗ＶＨＺ剤は、好ましくは、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体などの抗ＶＨＺ抗体、例えば、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｐｏｗａｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、ＡｄＢ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などを含むか、または、ＲＮＡ干渉、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、若しくは、ＤＵＳＰ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などのキメラＲＮＡｉを含むものなどによりＶＨＺをダウンレギュレーションすることができる。
【０００９】
本発明の第３の態様によれば、本発明者らは、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんまたはそのようながんに対する個体の感受性を検出するためのキットであって、個体または個体から採取した試料においてＶＨＺ発現を検出するための手段と、任意選択により使用説明書とを含み、好ましくはがんの治療、予防または軽減のための治療薬をさらに含むキットであって、好ましくは、前記検出するための手段は、ＶＨＺポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対して相補的なヌクレオチド配列またはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいは請求項２に記載される抗ＶＨＺ抗体または抗ＶＨＺ剤からなる群から選択される、キットを提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様として、（ａ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞を検出する方法であって、該細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変化（好ましくはアップレギュレーション）を検出することを含み、好ましくはＶＨＺの発現を、非がん性であることがわかっている対照細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性と比較する、方法、（ｂ）上記（ａ）による方法であって、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示される配列またはそのような配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部を含むプローブなどの手段によりＶＨＺ核酸を検出することを含むか、または、例えば、請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体などの手段によりＶＨＺポリペプチドを検出することを含み、好ましくは例えばＥｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ修正Ｓｃａｒｆｆ、Ｂｌｏｏｍ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎの類別方式（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＧＳ））を使用することなどによる組織学的類別を含む、方法、（ｃ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞の増殖状態を決定するか、または該がん細胞が浸潤性または侵襲性となることになる可能性を決定する方法であって、該細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法、（ｄ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体の生存率を推定する方法であって、個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することを含む、方法、（ｅ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体のための療法を選択する方法であって、個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することと、該がんの侵襲性に基づいて、適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを選択することを含む、方法、（ｆ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体において特定の療法の成功の可能性を決定する方法であって、該療法と上記の（ｅ）による方法により決定される療法を比較することを含む、方法、並びに、（ｇ）本発明の第１、第２または第３の態様のいずれか一つに示される特徴をさ��に含む、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の方法、からなる群から選択される方法が提供される。
【００１１】
本発明の第５の態様によれば、本発明者らは、結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞を操作する方法であって、（ａ）好ましくは、操作の結果としてがん細胞が非がん性となるか、あるいは浸潤性または転移性がん細胞が非浸潤性または非転移性となるように、例えば、ＶＨＺに特異的に結合することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに細胞を曝露することによるか、または細胞を請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体に曝露することにより、細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を調節する（好ましくはダウンレギュレーションする）ことを含むか、または（ｂ）（ａ）細胞において増加したＶＨＺ発現、量または活性を検出するステップと、（ｂ）細胞中のＶＨＺのレベルを低下させるステップとを含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明は、第６の態様によれば、（ａ）ＶＨＺポリペプチドに結合することができる分子を同定する方法であって、ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を候補分子と接触させること、および該候補分子が該ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に結合するかどうかを決定することを含む、方法、（ｂ）ＶＨＺのモジュレーターを同定する方法であって、細胞を候補分子と接触させること、および該細胞中のＶＨＺまたは該細胞のＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を検出することを含む、方法、（ｃ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減に適した分子を同定する方法であって、候補分子が、ＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを、好ましくは、候補分子がそのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために、候補分子をＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺポリペプチドを発現する細胞に曝露して決定することを含む、方法、並びに（ｄ）ＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、候補分子を動物に投与することおよび該動物がＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を提示するかどうかを決定することを含む、方法からなる群から選択される方法を提供する。
【００１３】
本発明の第７の態様では、上記に示される方法または使用により同定されるＶＨＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニストが提供される。
【００１４】
本発明の第８の態様によれば、本発明者らは、がんの治療、予防または軽減に用いるためのＶＨＺの発現を調節する（例えばダウンレギュレーションする）ことのできる分子、例えば、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体などを提供する。
【００１５】
本発明者らは、本発明の第９の態様によれば、ＶＨＺポリペプチドに結合することのできる抗体を提供し、該抗体は、抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントにより結合されるエピトープに結合することができ、好ましくは、（ａ）抗体２０９により結合されるＶＨＺポリペプチド上のエピトープに結合することができる、（ｂ）ＶＨＺの残基Ｃ９５を含む配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントであるエピトープに結合することができる抗ＶＨＺ抗体を含む、（ｃ）ＶＨＺに結合することができるモノクローナル抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントの可変領域を含む、（ｄ）細胞内ＶＨＺポリペプチドに結合することができる、（ｅ）細胞の形質膜を通過することができる、（ｆ）ＶＨＺに結合し、かつＶＨＺの生物活性を阻害することができ、（ｇ）がん、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの転移を防ぐことができる、あるいは（ｈ）モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００１６】
本発明の第１０の態様によれば、ＶＨＺに結合することができる、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含むポリペプチドが提供される。
【００１７】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、ＶＨＺ結合活性を有するポリペプチドをコードすることができる、上記に示される分子をコードすることができる配列またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む核酸を提供する。
【００１８】
本発明者らは、本発明の第１２の態様によれば、上記に示される核酸配列を含むか、またはその核酸配列で形質転換された細胞、あるいはそのような細胞の子孫を提供する。
【００１９】
本発明の第１３の態様によれば、本発明者らは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの腫瘍が、個体において、浸潤性もしくは転移性腫瘍であるか、またはその可能性が高いかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、個体の腫瘍細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む。
【００２０】
本発明の第１４の態様によれば、（ａ）個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性を調節することを含み、好ましくは個体のがん細胞においてＶＨＺの発現、量または活性が低下している、方法、及び（ｂ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんまたは個体におけるそのようながんに対する感受性またはそのようながんを有する個体の予後の診断方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法、からなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減あるいは診断の方法が提供される。
【００２１】
本発明者らは、本発明の第１５の態様によれば、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法を提供し、該方法は、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出すること、および腫瘍の侵襲性に基づいて適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを個体に投与することを含む。
【００２２】
診断、予後または療法の選択は、腫瘍のサイズ、またはリンパ節ステージ、あるいはその両方を、所望によりその他の危険因子とともにまたは組み合わせて評価することによりさらに決定されてもよく、好ましくは診断、予後または療法の選択は、腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を評価することによりさらに決定される。
【００２３】
本発明の実行は、特に断りのない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技法を用いることになり、それらは当業者の能力の範囲内である。このような技法は文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５および定期的な補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２），１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）；およびＬａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ  Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの一般的な原文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】外因性ＶＨＺが、中心体および細胞質全体に局在することを示す図である。間接免疫蛍光により中心体の外因性ＶＨＺが示された。
【図１Ａ】ＶＨＺ−ＥＧＦＰ（緑色）は、ＮＲＫ細胞にトランスフェクトされ、細胞内の位置の範囲を示す（ａ）。ＶＨＺの優勢な局在は中心体であり、中心体でＶＨＺは赤色で示される中心体マーカー−ペリセントリンと同時に局在する（ｂ）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３ヨージドを用いて核を青色に可視化する（ｂ）。合成した画像は、ペリセントリンと同時に局在するＶＨＺ−ＥＧＦＰ（緑色）を示した（ｃ）。バーは２０μｍ。
【図１Ｂ】ＶＨＺ−ＥＧＦＰはＮＲＫ細胞にトランスフェクトされ、様々な細胞周期ステージ、すなわち、間期（ａ）、前期（ｂ）、中期（ｃ）、および終期の細胞で可視化される（ｄ）。ペリセントリンは赤色で示され（ａ’−ｄ’）、核は青色のＴｏ−ｐｒｏ−３ヨージドで示される（ａ’−ｄ’）。示されるように画像は合成されている（ａ”−ｄ”）。バーは１０μｍ。
【図２】内因性ＶＨＺが中心体および細胞質に局在することを示す図である。
【図２Ａ】内因性ＶＨＺを、ＮＲＫ（ａ〜ｃ、バーは１０μｍ）細胞およびＭＣＦ−１０Ａ（ｄ〜ｆ、バーは２０μｍ）細胞において、アフィニティー精製したウサギ抗ＶＨＺおよびマウス抗γチューブリン抗体、それに続いて抗ウサギ−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗ウサギＩｇＧおよび抗マウス−テキサスレッドを結合させた抗マウスＩｇＧを用いる二重染色により可視化する。内因性ＶＨＺは、Ａ４３１細胞（ｇ〜ｉ、バーは２０μｍ）においても、マウスモノクローナル抗体抗ＶＨＺ（クローン＃２５）およびウサギ抗ペリセントリン抗体、それに続いて抗マウス−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗マウスＩｇＧおよび抗ウサギ−テキサスレッドを結合させた抗ウサギＩｇＧを用いる二重染色により検出される。
【図２Ｂ】内因性ＶＨＺを、血清飢餓ＮＲＫ（ａ〜ｃ、バーは２０μｍ）において、ウサギ抗ＶＨＺおよびマウス抗γチューブリン抗体、それに続いて抗ウサギ−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗ウサギＩｇＧおよび抗マウス−テキサスレッドを結合させた抗マウスＩｇＧを用いる二重染色により可視化する。
【図３】ＶＨＺがタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有し、細胞周期制御に関与していることを示す図である。
【図３Ａ】本発明者らは、それぞれのタンパク質（０．６７５ピコモル）をそのＰＴＰアーゼ活性について試験する。ＶＨＺのＰＴＰアーゼ活性は、１０μＭオルトバナジン酸ナトリウムを反応に添加することによるか（ＶＨＺ−ＧＳＴ＋バナジン酸塩）、またはＣｙｓ９５のＳｅｒへの点突然変異により［ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ］］完全に消失する。
【図３Ｂ】ａ．３種類の全細胞可溶化液は、ＶＨＺ−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ、またはＥＧＦＰベクターを発現するＭＣＦ−７細胞から得たものである。タンパク質発現レベルは抗ＥＧＦＰ抗体を用いるウエスタンブロットにより分析する。ＧＡＰＤＨをタンパク質負荷対照として使用する。ｂ．ＤＮＡ含量は、ＢｒｄＵ取り込みおよびＦＡＣＳ分析により測定する。新たに合成されたＤＮＡへのＡＰＣ−ＢｒｄＵ取り込み（Ｒ１は赤色の蛍光の量に相当する）。
【図３Ｃ】同じ３種類の発現構築物を安定して発現したＮＲＫ細胞は、ＶＨＺがＧ１を減少させるがＳ集団を増加させることができたことを示した。得られるヒストグラムは、３つの集団（％表示）：Ｍ１：Ｇ１期、Ｍ２：Ｓ期およびＭ３：Ｇ２／Ｍ期からなる。このグラフは、その個別の細胞のＤＮＡ含量をＦＡＣＳ分析により決定する場合に、増殖する細胞集団について得られる典型的な結果を示した。
【図４】ＭＣＦ−７細胞においてＶＨＺがＧ１／Ｓ移行を増強することを示す図である。
【図４Ａ】ＥＧＦＰベクター、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰまたはＶＨＺ−ＥＧＦＰを発現しているＭＣＦ−７細胞を、Ｇ１／Ｓ細胞周期制御に関与するいくつかの分子について分析する。それらは、ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、Ｃｄｋ４、ならびに、Ｓｅｒ７８０、Ｓｅｒ７９５およびＳｅｒ８０７／８１１でリン酸化されたＲｂである。
【図４Ｂ】ＶＨＺがＧ１／Ｓ期移行においてこれらの分子とどのように連係するかを説明するための提案モデルを示す。
【図５】いくつかの乳がん試料において過剰発現したＶＨＺタンパク質が上皮腫瘍細胞の中心体または細胞質に分布していることを示す図である。ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した乳がん試料を、ＶＨＺタンパク質発現について評価する。
【図５Ａ】同じ組織切片への間接的な二重免疫蛍光標識により、ＶＨＺは乳がんの細胞の中心体に局在するように見える。白色の矢印で示されるように、ＶＨＺ（ａ）とγ−チューブリン（ｂ）は、中心体（ｃ）に同時局在する。画像ｃは、ａとｂの合成画像を示す。バー：１００μｍ。
【図５Ｂ】乳がん試料の２つの連続した切片を、それぞれＶＨＺおよびγチューブリンを検出するための免疫組織化学標識用に処理する。陽性シグナルは、３，３’−ジアミノベンジジン色素原（茶色）で染色することにより検出される。ＶＨＺ（ａ）およびγチューブリン局在（ｂ）の類似する中心体標識パターンを黒色の矢印で示す。全体像（ａ’、ｂ’）は、２つの隣接する切片から得たものである。パネルａ’〜ｃ’中の枠で囲まれた３つの長方形の領域（拡大率６３０倍）をさらに拡大し（５倍）およびそれぞれパネルａ〜ｃに示し、中心体を黒色の矢印で示す。パネルｃ’およびｃは、ＶＨＺ陰性試料を対照として示す。元の全体像は（図８Ａ）に示される。
【図５Ｃ】いくつかの乳がん試料において、ＶＨＺタンパク質は、分散した上皮の細胞質全体に過剰発現する。元の全体像は（図８Ｂ）に示される。異なる乳房試料から選択した切片を全体像に示す（ａ’およびｂ’）。全体像中の枠で囲まれた３つの長方形の領域（ａ’、ｂ’およびｃ’、拡大率４００倍）をさらに拡大し（５倍）、それぞれパネルａ、ｂおよびｃに示す。パネルｃおよびｃ’は、ＶＨＺ陰性試料を対照として示す。
【図６】Ｅ−カドヘリン陰性細胞中のＶＨＺ発現およびＶＨＺの過剰発現が、ＭＣＦ−７細胞の運動性を増強することを示す図である。
【図６Ａ】ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した２つの隣接する乳がん試料組織切片は、ＶＨＺ陽性細胞がＥ−カドヘリン陰性であり（ａ、拡大率４００倍）、ＶＨＺ陰性上皮がＥ−カドヘリン陽性である（ｂ、拡大率４００倍）ことを示した。
【図６Ｂ】ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰとＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ細胞運動を評価するため、細胞を、カバーガラス上のコンフルエント単層に蒔く。次に、細胞で覆ったカバーガラスを、新鮮な培養皿の上に細胞側を下にして反転させる。ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞（ａ、ａ’）およびＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ（ｂ、ｂ’）の画像を０時および４８時に撮影する。パネルａ’は、ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞が表面を覆うカバーガラスの下から出て行く（矢印で示す）ことを示した。免疫蛍光画像（ａ、ｂ）。位相差画像（ａ’、ｂ’、拡大率２００倍）。
【図７】ＶＨＺ  ｍＲＮＡが組織および細胞で広範に発現していることを示す図である。  ヒトマルチプル組織アレイ（カタログ番号７７７６−１）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）より入手する。アレイには、６５種類の異なるヒト組織および８種類のヒト細胞株に由来する７３のｍＲＮＡが収容されている。
【図７Ａ】ドットブロットを、製造業者の取扱説明書（カタログ番号１５８５５８４、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識されたヒトＶＨＺ  ｃＤＮＡを用いてプローブする。ＶＨＺ  ｍＲＮＡ発現パターンが示される。ＶＨＺは主に心臓（スポット：４Ａ、４Ｃ−４Ｈ）および多くのその他の組織、ならびに肺癌細胞株−Ａ５４９（スポット−１０Ｈ）で発現する。
【図７Ｂ】ヒトマルチプル組織アレイの完全なマップである。
【図８】免疫組織化学によりＶＨＺタンパク質が乳がんの中心体および細胞質において過剰発現することを示す図である。
【図８Ａ】ＶＨＺタンパク質の過剰発現は、乳がんの中心体で明らかである。中心体は黒色矢印で示される（拡大率４００倍）。
【図８Ｂ】ＶＨＺタンパク質の過剰発現は、乳がん細胞の細胞質で見出される（拡大率２００倍）。
【図９】ウサギおよびマウス抗ＶＨＺ抗体の特徴づけを示す図である。
【図９Ａ】ウサギおよびマウス抗ＶＨＺ抗体を用いるウエスタンブロット分析。全細胞可溶化液は、Ａ４３１、ＨａＬａ、ＮＲＫ、およびＭＣＦ−７細胞から得たものである。ＭＣＦ−７全細胞可溶化液を、２μｇのＶＨＺ−ＧＳＴ（レーン１）とともにプレインキュベートする。ＶＨＺバンドの検出は、ＶＨＺ−ＧＳＴにより特異的に阻止される（矢印で示す）。
【図９Ｂ】ＶＨＺ  ｍＡｂは、ＥＣＬ（Ａ）、ＩＦ（Ｂ）およびＩＨＣ（図５）に使用することができる。
【図１０】創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞が、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞よりも強化された遊走特性を示したことを示す図である。本発明者らは、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターを用いるレトロウイルス媒介性の形質導入によりＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）をＭＣＦ１０Ａ細胞（５×１０５）に発現させた。創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞よりも強化された遊走特性を示した。細胞遊走の開始時（０時間、上のパネル）と終了時（８時間、下のパネル）の明白な違いを観察することができる。
【図１１】創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞が、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して強化された遊走特性を示すことが見られる。本発明者らは、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターを用いるレトロウイルス媒介性の形質導入によりＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）をＭＣＦ１０Ａ細胞（５×１０５）に発現させた。創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して強化された遊走特性を示した。細胞遊走の開始時（０時間、上のパネル）と終了時（８時間、下のパネル）の明白な違いを観察することができる。
【図１２】ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した複数のヒトがん試料におけるＶＨＺタンパク質発現の評価を示す図である。ＤＡＢ色素原（褐色）を用いるＤａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いてＶＨＺ特異的マウスモノクローナル抗体で染色することにより、ＶＨＺタンパク質を明らかにする。
【図１３Ａ】ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体の構築ステップを概説する図である。
【図１３Ｂ】ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体の可変重鎖の配列を示す図である。
【図１３Ｂ】ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体の可変軽鎖の配列を示す図である。
【図１４】ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体を使用した結果を示す図である。
【図１４Ａ】ＥＧＦＰ−ＶＨＺを発現したＮＲＫ（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−６５０９）でＶＨＺ＃２０９キメラ抗体を使用する間接免疫蛍光の結果を示す。
【図１４Ｂ】数種類の細胞株でＶＨＺ＃２０９キメラ抗体を使用するウエスタンブロット解析の結果を示す。ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）は子宮頸がん細胞株であり、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）はチャイニーズハムスター卵巣細胞株であり、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）はヒト乳がん細胞株であり、ＨＣＴ１１６（ＣＣＬ−２４７）はヒト結腸直腸癌細胞株であり、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−３４（商標））はイヌ腎臓細胞株であり、ＤＬＤ−１（ＣＣＬ−２２１）はヒト結腸直腸腺癌細胞株である。ＡＴＣＣはアメリカ培養細胞系統保存期間（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）である。
【図１５Ａ】ウエスタンブロットにより、ＨＣＴ１１６結腸がん細胞株が、ＭＤＣＫ細胞株と比較してＶＨＺ陽性であることを本発明者らは確認した。１日目に１×１０６ＨＣＴ１１６がん細胞を尾静脈からヌードマウスの循環の中に注入した。
【図１５Ｂ】３日目にＰＢＳ（未処理）またはキメラｍＡｂ（処理）のいずれかを尾静脈に投与して最初の処理を開始し、その後に毎週２回投与する。実験期間：上の２匹の動物は、２００９年２月１１日開始−４月２日、下の２匹の動物は２００９年２月１１日開始−４月１３日。
【００２５】
＜配列リスト＞
配列番号１は、ＮＭ＿０１７８２３ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）二重特異性ホスファターゼ２３（ＤＵＳＰ２３）、ｍＲＮＡの配列を示す。配列番号２は、ＮＰ＿０６０２９３二重特異性ホスファターゼ２３［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］の配列を示す。配列番号３は、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＶＨＺペプチドの配列を示す。配列番号４は、２０９の可変領域の重鎖の配列を示す。配列番号５は、２０９の可変領域の軽鎖の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、初めて、ＶＨＺホスファターゼが、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんにおいて役割を果たすという実証に基づくものである。
【００２７】
ＶＨＺは、既知の最も小さい活性のあるタンパク質チロシンホスファターゼ（わずか１６ｋＤａ）であり、小ワクシニアウイルスＶＨ１関連二重特異性ホスファターゼの群に属する。ＶＨＺをコードする遺伝子は、ヒト染色体１ｑ２３．１に位置し、ただ２つのコードエキソンからなる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３６（８）：１５４２−５３）。
【００２８】
ＶＨＺは、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ならびにホスホチロシンおよびホスホトレオニン残基を含むオリゴペプチドに対して特徴的なホスファターゼ活性を示す。さらに、ＶＨＺはインビトロでｐ４４ＥＲＫ１を脱リン酸化できるが、ｐ３８およびｐ５４ＳＡＰＫβは脱リン酸化できない（Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０；２７９（３４）：３５７６８−７４）。
【００２９】
本発明者らは、ＶＨＺが結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がん細胞に関連していることを示す。
【００３０】
ＶＨＺタンパク質の過剰発現は、２５／１４３（１７．５％）の結腸がん組織試料、２０／８２（２４．０％）の肺がん組織試料、２２／６３（３５．０％）の扁平上皮癌組織試料、１７／５１（３３．３％）の膵臓がん組織試料、７／４０（１７．５％）の脳がん組織試料、４／１２（３３．３％）の食道がん組織試料、５／１４（３５．７％）の胃がん組織試料、２／６（３３．３％）の膀胱がん組織試料、２／１１（１８．１％）の腎がん組織試料、２／６（３３．３％）の皮膚がん組織試料、２／６（３３．３％）の卵巣がん組織試料、３／８（３７．５％）の前立腺がん組織試料および２／６（３３．３％）の精巣がん組織試料に見出される。
【００３１】
したがって、ＶＨＺは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんまたは精巣がんの検出のためのマーカーとして使用することができる。ＶＨＺ発現のレベルは、特に転移性、侵襲性または浸潤性のがんにおいて、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんの指標として使用することができる。
【００３２】
ＶＨＺ発現のレベルはまた、そのようながんの可能性の指標としても使用することができる。そのために本発明者らは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんの診断または検出のための方法を提供する。本発明者らはさらに、そのようながんの侵襲性または浸潤性または転移性状態、あるいはこれらの任意の組合せの診断および検出のための方法を提供する。この方法は、タンパク質レベル（例えば、免疫組織化学）またはＲＮＡレベル（例えば、インサイチューハイブリダイゼーションによる）の分析を含んでもよい。このような診断および検出法は、下記にさらに詳細に記載される。
【００３３】
間接免疫蛍光を用いて、本発明者らは、外因性ＶＨＺタンパク質と内因性ＶＨＺタンパク質の両方が、その細胞質分布に加えて中心体に局在することを示す。したがって、ＶＨＺは、中心体構造の検出のためのマーカーとして使用することができる。
【００３４】
本発明者らは、ＶＨＺが細胞周期進行を制御すること、およびＶＨＺがＧ１−Ｓ期移行を促進することができることを実証する。本発明者らは、ＶＨＺの過剰発現ががん発生の一因となることを実証する。ＶＨＺを発現するよう操作された、ＢｒｄＵで標識されたＭＣＦ−７細胞のＦＡＣＳ分析により、ＶＨＺはＧ１→Ｓ期移行を加速させることができることが示される。３種類の発現構築物を安定して発現するＮＲＫ細胞のＦＡＣＳ分析からの類似の結果により、ＶＨＺが、Ｇ１集団を減少させてＳ集団を増加させることにより、Ｇ１→Ｓ期移行を加速させることが示される。
【００３５】
したがって、本発明者らは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんまたは精巣がんに罹患している個体の治療方法または予防方法を提供する。正常組織におけるＶＨＺレベルまでＶＨＺレベルを回復させることも、このような細胞の正常な機能を回復させる手段として使用してもよい。そのために、本発明者らは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんを含むがんの治療のためのＶＨＺ核酸およびポリペプチドの使用を提供する。本発明者らの方法は、がんまたは浸潤性がんの治療または予防に使用することができる。
【００３６】
本発明者らは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がん、例えば浸潤性がんに対する薬剤のスクリーニングにおけるＶＨＺの使用（ｕｓｅｒ）をさらに提供する。ＶＨＺ過剰発現および過少発現する細胞、ならびにこれらを含む組織、器官および生物は、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんのモデルとして、または抗がん剤のスクリーニングに使用することができる。
【００３７】
ＭＣＦ−７細胞におけるＶＨＺの過剰発現は、ｐ２１Ｃｉｐ１のダウンレギュレーションおよびＣｄｋ４アップレギュレーションを引き起こす。結果として、リン酸化部位特異的抗体を用いる免疫ブロット法で評価すると、リン酸化された（不活化された）網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の蓄積が観察される。触媒的に不活性のＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現する細胞は、上記のＶＨＺ媒介性事象が損なわれ、これらの特性がホスファターゼ活性を必要とすることが示される。
【００３８】
ＶＨＺにおける触媒システイン残基（Ｃ９５Ｓ）の突然変異は、そのタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）活性を消失させる。
【００３９】
用語「ＶＨＺ」が使用されている場合、これは、ＶＨＺタンパク質またはＶＨＺ核酸およびその任意のフラグメント、変異、ホモログ、誘導体、変異体を含む、あらゆるＶＨＺ配列を指すものと解釈されるべきである。
【００４０】
ＶＨＺの特性および活性は本明細書、例えば、参照文献に記載されている。
【００４１】
＜ＶＨＺポリペプチド＞
本明細書に記載される方法および組成物はＶＨＺポリペプチドを利用し、それは下に詳細に説明される。
【００４２】
ＶＨＺは、ＤＵＳＰ２３、ＭＯＳＰ、ＬＤＰ−３、ＤＵＳＰ２５、ＦＬＪ２０４４２およびＲＰ１１−１９０Ａ１２．１としても知られている。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「ＶＨＺポリペプチド」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６０２９３．２、ＮＰ＿０８１００１．１、ＸＰ＿３４１１５７．１、ＸＰ＿００１１７０８１９．１、ＸＰ＿００１１７０８３５．１、ＸＰ＿５４５７４７．２、ＮＰ＿００１０７６０７８．１、ＮＰ＿００１０１１３７１．１、ＮＰ＿７８３８５９．１、ＮＰ＿００１０３４７０９．１、ＸＰ＿００１４８０７３０．１、ＸＰ＿００１１１７２５３．１またはＸＰ＿００１１１７２５６．１を有する配列を指すことが意図される。
【００４４】
「ＶＨＺポリペプチド」は、ヒトＶＨＺポリペプチド、例えば、受託番号ＮＰ＿０６０２９３（配列番号２）を有する配列などを含んでもよく、またはそれからなるものでもよい。
【００４５】
これらのポリペプチドのいずれか、一部または全部の、その相同変異体および誘導体も含まれる。
【００４６】
ＶＨＺポリペプチドは、多様な手段、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんまたは精巣がんに罹患しているまたは罹患している疑いのある個体への、その治療のための投与に使用することができる。それらは、特異的ＶＨＺ結合剤、特に、抗ＶＨＺ抗体などの抗ＶＨＺ剤の作製またはスクリーニングに使用してもよい。これらは下にさらに詳細に記載される。ＶＨＺポリペプチドの発現は、がん、特に結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんの診断または検出のために検出することができる。
【００４７】
「ポリペプチド」とは、相互にペプチド結合または修飾ペプチド結合により連結されている２以上のアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターを含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖と、一般にタンパク質と呼ばれるそれよりも長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる２０のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。
【００４８】
「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングのような天然の過程によって、または当分野で周知の化学修飾技法によって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。このような修飾は、基本的な教本およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に十分に説明されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのあらゆる場所で起こり得る。所定のポリペプチドのいくつかの部位で同じ種類の修飾が同じまたは様々な程度で存在し得ることは、当然理解される。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含んでよい。
【００４９】
ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝していてもよく、分枝の有無に関わらず環状であってもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然の過程から生じさせてもよいし、合成法によって作製してもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチン形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化が挙げられる。例として、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３  ａｎｄ  Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２  ｉｎ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６  ａｎｄ  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａＬ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ」，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２を参照されたい。
【００５０】
用語「ポリペプチド」には、当分野で公知の様々な合成ペプチドの変形物、例えばレトロ反転Ｄペプチドなどが含まれる。ペプチドは、抗原決定基および／またはＴ細胞エピトープであってよい。ペプチドはインビボで免疫原性であってもよい。ペプチドは、インビボで抗体の中和を誘導することができるものでもよい。
【００５１】
ＶＨＺに適用されると、得られるアミノ酸配列は、生物学的活性のような１以上の活性を、ヒトＶＨＺポリペプチドのようなＶＨＺポリペプチドと共通して有し得る。例えば、ＶＨＺホモログは、正常細胞と比較して、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がん細胞で高い発現レベルを有し得る。特に、用語「ホモログ」は、得られるアミノ酸配列がＶＨＺ活性を有するならば、構造および／または機能に関して同一性を包含する。配列同一性（すなわち類似性）に関して、少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％など、例えば少なくとも８５％など、例えば少なくとも９０％などの配列同一性があり得る。少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％などの配列同一性があり得る。これらの用語には、ＶＨＺ核酸配列の対立遺伝子変異体であるアミノ酸に由来するポリペプチドも含まれる。
【００５２】
ＶＨＺなどのポリペプチドの「活性」または「生物活性」に言及する場合、これらの用語はＶＨＺの代謝的または生理学的機能を指すことが意図され、それには類似の活性または改良された活性または望ましくない副作用の低減したこれらの活性が含まれる。ＶＨＺの抗原活性または免疫活性も含まれる。このような活性の例、ならびにこれらの活性を検定および定量する方法は当分野で公知であり、本明細書の他所に詳細に記載されている。
【００５３】
例えば、このような活性には、次のいずれか１以上が含まれてもよい。ヒドロラーゼ活性、タンパク質チロシンホスファターゼ活性、タンパク質チロシン／セリン／トレオニンホスファターゼ活性およびタンパク質アミノ酸脱リン酸化。これらの活性についてのアッセイは当分野で公知であり、例えばＷｕ  ｅｔ  ａｌ（２００４），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３６（８）：１５４２−５３およびＡｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０；２７９（３４）：３５７６８−７４に記載されている。
【００５４】
＜その他のＶＨＺポリペプチド＞
ＶＨＺ変異体、ホモログ、誘導体およびフラグメントも本明細書に記載される方法および組成物に有用である。
【００５５】
ＶＨＺに関して、用語「変異体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」には、ある配列からの、またはある配列への１個（以上）のアミノ酸の任意の置換、変形、修飾、交換、欠失または付加が含まれる。文脈上その他のものが許容されない限り、「ＶＨＺ」への言及には、このようなＶＨＺの変異体、ホモログ、誘導体およびフラグメントへの言及が含まれる。
【００５６】
本明細書において「欠失」は、それぞれ１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しない、ヌクレオチドかまたはアミノ酸配列のいずれかにおける変化として定義される。本明細書において「挿入」または「付加」は、天然に存在する物質と比較して、それぞれ１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。本明細書において「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換に起因する。
【００５７】
本明細書に記載されるＶＨＺポリペプチドはまた、サイレント変化を生じて機能上同等のアミノ酸配列をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。意図的なアミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われてよい。例えば、負に帯電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ酸には、リジンおよびアルギニンが含まれ、類似の親水価を有する非荷電の極性頭部をもつアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【００５８】
保存的置換は、例えば下記の表に従って行ってもよい。２番目の列の同じブロック中のアミノ酸および３番目の列の同じ行のアミノ酸は、相互に置換されてよい。
【００５９】
【表１】
0005756014.tif 000002
【００６０】
ＶＨＺポリペプチドは、非相同アミノ酸配列を、一般にＮ末端またはＣ末端、例えばＮ末端などにさらに含んでよい。非相同配列には、細胞内もしくは細胞外タンパク質ターゲッティングに影響を及ぼす配列（例えばリーダー配列など）が含まれてよい。また、非相同配列には、ＶＨＺポリペプチドの免疫原性を増やす配列ならびに／あるいはポリペプチドの同定、抽出および／または精製を促進する配列が含まれてよい。使用してよい別の非相同配列は、Ｎ末端であってよいポリヒスチジンなどのポリアミノ酸配列である。少なくとも１０アミノ酸、例えば、少なくとも１７アミノ酸であるが５０アミノ酸よりも少ないポリヒスチジン配列を用いてよい。
【００６１】
ＶＨＺポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であってもよいし、融合タンパク質などのより大型のタンパク質の一部であってもよい。分泌もしくはリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基などの精製を助ける配列、または組換え産生の間の安定性のためのさらなる配列を含む、さらなるアミノ酸配列を含めることが有利である場合が多い。
【００６２】
本明細書に記載されるＶＨＺポリペプチドは、有利には公知の技法を用いて組換え手段により作製される。しかし、それらは固相合成など当業者に周知の技法を用いる合成手段により作製されてもよい。このようなポリペプチドはまた、例えば抽出および精製を助けるために、融合タンパク質として産生されてもよい。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。また、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間のタンパク質切断部位を含めて、融合タンパク質配列、例えばトロンビン切断部位などの除去を可能にすることも便宜であり得る。融合タンパク質は、目的配列のタンパク質の機能を邪魔しないものであってもよい。
【００６３】
ＶＨＺポリペプチドは、実質的に単離された形態であってもよい。この用語は、ヒトの手による自然状態からの変更を指すことが意図される。「単離された」組成物または物質が自然界に存在する場合、それはその元の環境から変化しているかまたは取り出されているか、またはその両方である。例えば、この用語が本明細書で用いられるように、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは、「単離され」ていないが、その自然状態の共存材料から分離された同じポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは「単離され」ている。
【００６４】
しかし、ＶＨＺタンパク質が、ＶＨＺタンパク質の意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合されてもよく、なお実質的に単離されたとみなされてもよいことは当然理解される。ＶＨＺポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であってもよく、その場合その形態は、一般に、その調製物中の９０％より多く、例えば、９５％、９８％または９９％のタンパク質がＶＨＺポリペプチドである調製物中のタンパク質を含む。
【００６５】
異なる種由来のＶＨＺ配列をアラインさせることにより、アミノ酸配列のどの領域が異なる種間で保存され（「相同領域」）、どの領域が異なる種間で変化しているか（「非相同領域」）を決定することが可能である。
【００６６】
そのために、ＶＨＺポリペプチドは、相同領域の少なくとも一部に相当する配列を含んでもよい。相同領域は、少なくとも２つの種間で高い程度の相同性を示す。例えば、相同領域は、上記の試験を用いて、アミノ酸レベルで少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％相同性を示し得る。相同領域に相当する配列を含むペプチドは、下記にさらに詳しく説明される治療戦略で使用することができる。あるいは、ＶＨＺペプチドは、非相同領域の少なくとも一部に相当する配列を含んでもよい。非相同領域は、少なくとも２つの種間で低い程度の相同性を示す。
【００６７】
＜ＶＨＺホモログ＞
使用のために開示されるＶＨＺポリペプチドには、任意の供給源、例えば関連ウイルス／細菌タンパク質、細胞ホモログおよび合成ペプチド、ならびにその変異体または誘導体から得られた相同配列が含まれる。従って、ポリペプチドには、哺乳類（例えばマウス、ラットまたはウサギ）などの動物、特に霊長類、より特にヒトを含むその他の種由来のＶＨＺのホモログをコードするポリペプチドも含まれる。より具体的には、ホモログにはヒトホモログが含まれる。
【００６８】
本明細書の状況において、相同配列は、関連するＶＨＺ配列の配列と、例えば少なくとも５０または１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９アミノ酸にわたって、アミノ酸レベルで少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％同一な、例えば、少なくとも９５または９８％同一なアミノ酸配列、を含むものと解釈される。
【００６９】
特に、相同性は、タンパク質機能に必須でない隣接配列よりも、タンパク質機能に必須であることが公知の配列の領域に関して考慮されるべきである。これは、遠縁生物由来の相同配列を考慮する際に特に重要である。例は、ホスファターゼ機能に必須であることが示されている、ヒトＶＨＺタンパク質の９５番のシステイン残基またはそれに相当するシステイン残基、および周囲の残基である。
【００７０】
相同性は、類似性（すなわち、類似する化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考えることもできるが、本明細書の状況において、相同性は、配列同一性の点から見て表され得る。
【００７１】
相同性比較は目により、またはより通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの力を借りて行ってもよい。これらの公的にかつ商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２以上の配列間の同一性％を算出することができる。
【００７２】
同一性％は連続する配列にわたって算出することができる、すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインさせ、一方の配列のそれぞれのアミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と１回に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップ無し（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。一般に、このようなギャップ無しアラインメントは、比較的短い残基数（例えば、５０個未満の連続アミノ酸）にわたって行われるだけである。
【００７３】
これは非常に単純かつ一貫した方法であるが、この方法は、例えばそれ以外は同一の配列において、１つの挿入または欠失によってそれ以降のアミノ酸残基がアラインメントできなくなることを考慮できない、従ってグローバルアライメントを行った場合に、相同性％の大幅な低下をもたらす可能性がある。結果的に、ほとんどの配列比較法は、総体的な相同性スコアを過度のペナルティを課さずに可能性のある挿入および欠失を考慮に入れる最適なアラインメントを生じるように設計される。これは、局所同一性または類似性を最大化しようと試みるために「ギャップ」を配列アラインメントに挿入することにより達成される。
【００７４】
しかし、これらのより複雑な方法では、アラインメントに生じる各々のギャップに「ギャップペナルティ」が割り当てられるので、同じ数の同一のアミノ酸に対して、できる限りギャップの少ない配列アラインメント（２つの比較配列間の関連性が高いことを反映する）が、ギャップの多いアラインメントよりも高いスコアを達成することになる。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ中のそれぞれの後続残基に対してより小さいペナルティを課す、「アフィンギャップコスト」が一般に使用される。これは、最も一般に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ギャップのより少ない最適化されたアラインメントを生成する。大抵のアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することが認められる。しかし、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する場合にはデフォルト値を用いてよい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を用いる場合には、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティは、ギャップに対して−１２、それぞれの伸張に対して−４である。
【００７５】
そのために、最大相同性％の計算は、まずギャップペナルティを考慮に入れた最適なアラインメントの作製を必要とする。このようなアラインメントを行うのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を行うことのできるその他のソフトウェアの例としては、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ  -  Ｃｈａｐｔｅｒ  １８参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートの比較ツールが挙げられる。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方は、オフラインおよびオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０参照）。ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用してよい。
【００７６】
最終相同性％は同一性に関して測定することができるが、アラインメント処理自体は、一般にオールオアナッシング（ａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｔｈｉｎｇ）ペア比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいてそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケール化（ｓｃａｌｅｄ）類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般的に使用されるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラムスイートためのデフォルトマトリックス）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、供給されている場合、パブリックデフォルト値かまたはカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細はユーザーマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値、またはその他のソフトウェアの場合には、デフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２などを使用してよい。
【００７７】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成すると、配列同一性％のような相同性％を計算することが可能である。ソフトウェアは、一般に配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。
【００７８】
アミノ酸配列に関して用語「変異体」または「誘導体」は、得られるアミノ酸配列が非修飾配列と実質的に同じ活性、例えば少なくともＶＨＺポリペプチドと同じ活性を有するなど、を保持する限り、その配列からの、またはその配列への１個（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変形、修飾、交換、欠失または付加が含まれる。
【００７９】
本明細書に開示されるＶＨＺアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメントもしくはホモログは、本明細書に記載される方法および組成物で使用するために修飾されてよい。一般に、修飾は、配列の生物活性を維持するために行われる。アミノ酸置換は、修飾された配列が修飾されていない配列の生物活性を保持するという条件で、例えば１、２または３から１０、２０または３０までの置換を行ってよい。あるいは、修飾は、本明細書に記載されるポリペプチドの１以上の機能的ドメインを故意に不活化させるために行ってよい。アミノ酸置換には、例えば治療上投与されるポリペプチドの血漿半減期を延長させるために、天然に存在しない類似体の使用が含まれてよい。
【００８０】
＜ＶＨＺフラグメント＞
本明細書に記載される方法および組成物で使用するためのポリペプチドにはまた、上記に定義されるＶＨＺポリペプチドのいずれかの全長配列のフラグメントも含まれる。フラグメントは、少なくとも１つのエピトープを含んでよい。エピトープを同定する方法は、当分野で周知である。フラグメントは、少なくとも１０、２０、３０、５０または１００個のアミノ酸のような、少なくとも６個のアミノ酸を典型的に含む。
【００８１】
関連するＶＨＺアミノ酸配列由来の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５以上の残基を含むかまたはそれらからなるフラグメントが含まれる。
【００８２】
本発明者らは、本明細書に記載されるＶＨＺポリペプチドの一部を含むペプチドをさらに記載する。従って、ＶＨＺのフラグメントおよびそのホモログ、変異体または誘導体が含まれる。これらのペプチドは、２〜２００の間のアミノ酸長、例えば４〜４０の間のアミノ酸長であってよい。ペプチドは、本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチドから、例えば適した酵素、例えばトリプシンなどによる消化により、誘導することができる。あるいは、このペプチド、フラグメントなどは、組換え手段により作製されるか、または合成によって合成することができる。
【００８３】
このようなＶＨＺフラグメントを用いて、例えば、このようなフラグメントに対して産生された抗体によって、ＶＨＺ発現を優先的に検出するプローブを生成することができる。これらの抗体は、ＶＨＺに特異的に結合することが予期され、本明細書に開示される診断および治療方法において有用である。
【００８４】
ＶＨＺおよびそのフラグメント、ホモログ、変異体および誘導体は、組換え手段により作製されてもよい。しかし、それらはまた、固相合成などの当業者に周知の技法を用いる合成手段によっても作製することができる。これらのタンパク質はまた、例えば抽出および精製を助けるために、融合タンパク質として産生されてもよい。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。また、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間のタンパク質切断部位を含めて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることも便宜であり得る。融合タンパク質は、目的配列のタンパク質の機能を邪魔しないものであってよい。タンパク質は、また、動物細胞由来の細胞抽出物の精製により得ることもできる。
【００８５】
本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、実質的に単離された形態であってよい。このようなポリペプチドが、タンパク質の意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合されてよく、なお実質的に単離されたとみなされてよいことは当然理解される。ＶＨＺ変異体、ホモログ、フラグメントまたは誘導体はまた、実質的に精製された形態であってよく、その場合その形態は、一般に、その調製物中の９０％より多い、例えば、９５％、９８％または９９％のタンパク質がタンパク質である調製物中のタンパク質を含む。
【００８６】
本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、明示標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）で標識されてよい。明示標識は、ポリペプチドなどを検出することを可能にするいずれの適した標識であってよい。適した標識には、放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよび、ビオチンなどのリンカーが含まれる。標識されたポリペプチドは、試料中のポリペプチドの量を決定するための、イムノアッセイなどの診断手順で使用することができる。ポリペプチドまたは標識されたポリペプチドはまた、標準的なプロトコールを用いて動物およびヒトにおいてポリペプチドの免疫反応性を検出するための血清学的または細胞媒介性の免疫アッセイでも使用されてもよい。
【００８７】
本明細書に開示される、所望により標識されたＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体はまた、固相、例えばイムノアッセイウェルまたはディップスティックの表面に固定されてもよい。このような標識された、かつ／または固定化されたポリペプチドは、適した試薬、対照、取扱説明書などとともに適した容器中のキットにパッケージングすることができる。このようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによる、ポリペプチドまたはそれらの対立遺伝子変異体または種変異体に対する抗体の検出方法において使用することができる。
【００８８】
イムノアッセイ法は、当分野で周知であり、一般に、（ａ）特定のタンパク質に対する抗体が結合することができるエピトープを含むポリペプチドを準備すること、（ｂ）生体試料を該ポリペプチドとともに、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること、および（ｃ）該ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを決定すること、を含む。
【００８９】
本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、インビトロまたはインビボ細胞培養系で用いて、それらの対応する遺伝子およびそのホモログの、疾患におけるそれらの機能を含む細胞機能における役割を研究することができる。例えば、末端切断型または修飾されたポリペプチドを細胞に導入して、細胞で起こる正常機能を破壊することができる。これらのポリペプチドは、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現により細胞に導入することができる（下記参照）。発現ベクターは、所望により、ポリペプチドの発現を制御するための誘導プロモーターを保有する。
【００９０】
昆虫細胞または哺乳類細胞のような適切な宿主細胞の使用により、最適な生物活性を組換え発現産物に付与するために必要であり得るような翻訳後修飾（例えばミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、トランケーション、ラピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）およびチロシン、セリンまたはトレオニンのリン酸化）が提供されることが予期される。本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体が発現されるこのような細胞培養系を、アッセイ系で使用して、細胞における該ポリペプチドの機能を妨害するかまたは強化する候補物質を同定することができる。
【００９１】
＜ＶＨＺ核酸＞
本明細書に記載される方法および組成物は、ＶＨＺ、ＶＨＺポリヌクレオチド、ＶＨＺヌクレオチドおよびＶＨＺ核酸、ならびにこれらのいずれかの変異体、ホモログ、誘導体およびフラグメントの発現レベルを検出するための手段として用いられてよい。その上、本発明者らは、本明細書に記載される診断方法に有用な特定のＶＨＺフラグメントを開示する。ＶＨＺ核酸はまた、記載される治療または予防の方法に使用することもできる。
【００９２】
用語「ＶＨＺポリヌクレオチド」、「ＶＨＺヌクレオチド」および「ＶＨＺ核酸」は、同義的に使用されてよく、特にｃＤＮＡとゲノムＶＨＺ配列の両方を含むことと理解されるべきである。また、これらの用語は、ＶＨＺポリペプチドおよび／またはこのフラグメント、誘導体、ホモログまたは変異体をコードすることができる核酸配列を含むことが意図される。
【００９３】
ＶＨＺ核酸に言及する場合、核酸のＶＨＺファミリーの任意のメンバーへの言及であると解釈されるべきである。特に注目されるものは、ＮＭ＿０１７８２３．３、ＮＭ＿０２６７２５．２、ＸＭ＿３４１１５６．３、ＸＭ＿００１１７０８１９．１、ＸＭ＿００１１７０８３５．１、ＸＭ＿５４５７４７．２、ＮＭ＿００１０８２６０９．１、ＮＭ＿００１０１１３７１．１、ＮＭ＿１７５７３２．１、ＮＭ＿００１０３９６２０．１、ＸＭ＿００１４８０６８０．１、ＸＭ＿００１１１７２５３．１またはＸＭ＿００１１１７２５６．１からなる群から選択されるＶＨＺ核酸である。
【００９４】
また、下記に「その他のＶＨＺ核酸配列」として示される核酸配列のいずれかの１以上が含まれる。
【００９５】
例えば、ＶＨＺ核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３（配列番号１）を有するヒトＶＨＺ配列を含み得る。
【００９６】
ＶＨＺ核酸は、多様な手段、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんまたは精巣がんに罹患しているまたは罹患している疑いのある個体への、その治療のための投与に使用することができる。ＶＨＺ核酸の発現は、がん、特に結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんの診断または検出のために検出することができる。ＶＨＺ核酸はまた、ＶＨＺポリペプチドの発現または産生のために使用することができる。
【００９７】
「ポリヌクレオチド」は、一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を指す。「ポリヌクレオチド」としては、限定されるものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖領域または、より一般的には、二本鎖領域または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。その上、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。また、ポリヌクレオチドという用語には、１以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性またはその他の理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの珍しい塩基が挙げられる。多様な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに行われている。従って、「ポリヌクレオチド」は、一般に天然に見出されるような、化学的に、酵素的にまたは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞の特徴を示すＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００９８】
遺伝子コードの縮重の結果として多数のヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることができることは当業者に当然理解される。
【００９９】
本明細書において、用語「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列ならびにそれらの変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体（例えばその一部など）を指す。ヌクレオチド配列は、センス鎖またはアンチセンス鎖に相当するものであろうと、その組合せであろうと、二本鎖または一本鎖であってよいゲノムまたは合成または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。用語ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技法（例えば、組換えＤＮＡ）を用いて作製されてもよい。
【０１００】
用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡを意味し得る。
【０１０１】
＜その他の核酸＞
本発明者らはまた、ＶＨＺ核酸のフラグメント、ホモログ、変異体または誘導体である核酸を提供する。ＶＨＺ核酸に関して、用語「変異体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」には、ＶＨＺヌクレオチド配列のその配列からの、またはその配列への１個（またはそれ以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失または付加が含まれる。文脈上その他のものが許容されない限り、「ＶＨＺ」および「ＶＨＺ」への言及には、このようなＶＨＺの変異体、ホモログ、誘導体およびフラグメントへの言及が含まれる。
【０１０２】
結果として得られるヌクレオチド配列は、１以上のＶＨＺ活性を有するポリペプチドをコードし得る。用語「ホモログ」は、得られるヌクレオチド配列がＶＨＺ活性を有するポリペプチドをコードするように、構造および／または機能に関して同一性をカバーすることが意図され得る。例えば、ＶＨＺのホモログなどは、正常細胞と比較して、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんまたは精巣がん細胞において高い発現レベルを有し得る。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性であってもよい。関連する配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するＶＨＺ配列）に対しては、少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％などの配列同一性であってよい。これらの用語はまた、配列の対立遺伝子変異を包含する。
【０１０３】
＜変異体、誘導体およびホモログ＞
ＶＨＺ核酸変異体、フラグメント、誘導体およびホモログは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。それらは一本鎖または二本鎖であり得る。また、それらは合成または修飾されたヌクレオチドをその中に含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドへの多数の異なる種類の修飾が当分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート主鎖、分子の３’および／または５’末端でのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書の目的において、これらのポリヌクレオチドは当分野で利用可能ないずれの方法によって修飾されてもよいことが理解される。このような修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を強化するために行われてもよい。
【０１０４】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その二重鎖の両方の鎖は、個別にまたは組み合わせて、本明細書に記載される方法および組成物に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補的配列も含まれることが理解される。
【０１０５】
ヌクレオチド配列に関して、用語「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」には、その配列からの、またはその配列への１個（以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失または付加が含まれる。前記変異体、ホモログまたは誘導体は、生物活性を有するポリペプチドをコードすることができる。このようなＶＨＺのフラグメント、ホモログ、変異体および誘導体は、上記に示されるように調節された活性を含み得る。
【０１０６】
上記に示されるように、配列同一性に関して、「ホモログ」は、関連する配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するＶＨＺ配列）に対して、少なくとも５％の同一性、少なくとも１０％の同一性、少なくとも１５％の同一性、少なくとも２０％の同一性、少なくとも２５％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも３５％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも４５％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５の同一性％を有してもよい。
【０１０７】
少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％同一性、少なくとも９７％同一性、少なくとも９８％同一性または少なくとも９９％同一性であってもよい。ヌクレオチド同一性比較は、上記のように行うことができる。使用することのできる配列比較プログラムは、上記のＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリックスは、それぞれの同一ヌクレオチドに対して１０のマッチ値（ｍａｔｃｈ  ｖａｌｕｅ）を有し、それぞれのミスマッチには−９を有する。それぞれのヌクレオチドに対してデフォルトギャップ作成ペナルティは−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは−３である。
【０１０８】
＜ハイブリダイゼーション＞
本発明者らは、本明細書において提示される配列のいずれか、あるいはそのいずれかの変異体、フラグメントまたは誘導体と、あるいは上記のいずれかの補体と選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をさらに記載する。ヌクレオチド配列は、少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長などであってよい。
【０１０９】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書において「核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と結合するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術において行われるような増幅プロセスを含むものとする。
【０１１０】
本明細書において提示されるヌクレオチド配列と、またはそれらの補体と選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、本明細書において提示される対応するヌクレオチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するＶＨＺ配列）と、少なくとも４０％相同性、少なくとも４５％相同性、少なくとも５０％相同性、少なくとも５５％相同性、少なくとも６０％相同性、少なくとも６５％相同性、少なくとも７０％相同性、少なくとも７５％相同性、少なくとも８０％相同性、少なくとも８５％相同性、少なくとも９０％相同性、または少なくとも９５％相同性であってよい。このようなポリヌクレオチドは、一般に、少なくとも２０、例えば、少なくとも２５または３０の領域、例として少なくとも４０、６０または１００以上の隣接するヌクレオチドにわたって、対応するヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも８０または９０％または少なくとも９５％または９８％相同性であってよい。
【０１１１】
用語「選択的にハイブリダイズ可能な」とは、プローブとして使用されるポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドが、バックグラウンドより大幅に上のレベルでプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーに存在するその他のポリヌクレオチドのために起こり得る。この事象において、バックグラウンドは、プローブと、ライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用により生じるシグナルのレベルを意味し、標的ＤＮＡで観察される特異的相互作用の強度の１０倍未満、例えば、１００倍未満などである。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐまたは３３Ｐで放射標識することによるか、非放射性プローブ（例えば、蛍光染料、ビオチンまたはジゴキシゲニン）によって測定することができる。
【０１１２】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、下記に説明されるように規定された「ストリンジェンシー」を付与する。
【０１１３】
最大ストリンジェンシーは、一般に約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い）で起こり、高ストリンジェンシーはＴｍよりも約５℃〜１０℃低い温度で起こり、中間ストリンジェンシーは、Ｔｍより約１０℃〜２０℃低い温度で起こり、低ストリンジェンシーは、Ｔｍよりも約２０℃〜２５℃低い温度で起こる。当業者の理解するように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを用いて同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができ、一方中間（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを用いて類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０１１４】
本発明者らは、ストリンジェントな条件下で（例えば６５℃および０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ３  ｐＨ７．０））、ＶＨＺ核酸、フラグメント、変異体、ホモログまたは誘導体とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を提供する。
【０１１５】
＜ホモログ、変異体および誘導体の作成＞
関連する配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するヒトＶＨＺ配列）と１００％同一でないが同様に含められるポリヌクレオチド、ならびにＶＨＺのホモログ、変異体および誘導体は、いくつかの方法で得ることができる。これらの配列のその他の変異体は、例えば、一定範囲の個体、例えば、異なる集団からの個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプロービングすることにより得ることができる。例えば、ＶＨＺホモログは、その他の個体、またはその他の種から同定することができる。さらなる組換えＶＨＺ核酸およびポリペプチドは、ホモログの対応する位置を確認すること、および本明細書の他所に記載される分子を合成または産生することにより作出することができる。
【０１１６】
その上、ＶＨＺのその他のウイルス／細菌、または細胞ホモログ、特に哺乳類細胞（例えばラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）に見出される細胞ホモログを得ることができ、このようなホモログおよびそのフラグメントは、一般にヒトＶＨＺと選択的にハイブリダイズすることができることになる。このようなホモログを用いて、非ヒトＶＨＺ核酸、フラグメント、変異体およびホモログを設計することができる。当分野で公知の手段により突然変異誘発を行って、さらなる変種を作出してよい。
【０１１７】
ＶＨＺホモログの配列は、その他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはその他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリーをプロービングすること、およびこのようなライブラリーを、ＶＨＺ核酸、フラグメント、変異体およびホモログ、またはＶＨＺのその他のフラグメントのいずれかの全部または一部を含むプローブで、中〜高ストリンジェンシー条件下でプロービングすることにより得ることができる。
【０１１８】
本明細書に開示されるポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得るために、同様の考慮点が適用される。
【０１１９】
変異体および株／種ホモログはまた、ＶＨＺ核酸の配列内に保存されたアミノ酸配列をコードする、変異体およびホモログの中の配列を標的とするよう設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得てもよい。保存された配列は、例えば、数種類の変異体／ホモログからのアミノ酸配列をアラインさせることにより、予測することができる。当分野で公知のコンピュータソフトウェアを用いて配列アラインメントを行うことができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用されている。
【０１２０】
縮重ＰＣＲで用いられるプライマーは、１以上の縮重位置を含み、既知配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される条件よりも低いストリンジェンシー条件で使用されることになる。当業者であれば、遠縁生物由来の配列間の全体的なヌクレオチド相同性が非常に低くなる可能性が高く、従ってこれらの状況において、縮重ＰＣＲは、ＶＨＺ配列の標識フラグメントを用いてライブラリーをスクリーニングすることよりも選択される方法であり得ることを理解する。
【０１２１】
その上、相同配列は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートなどの検索アルゴリズムを用いてヌクレオチドおよび／またはタンパク質データベースを検索することにより同定することができる。
【０１２２】
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特徴付けられた配列、例えば、ＶＨＺ核酸、あるいはその変異体、ホモログ、誘導体またはフラグメントの部位特異的突然変異誘発により得ることができる。これは、例えばポリヌクレオチド配列を発現している特定の宿主細胞に対するコドン選択を最適化するために、配列にサイレントコドン変化が必要とされる場合に有利であり得る。制限酵素認識部位を導入するために、あるいは該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの特性または機能を変更するために、その他の配列変化が望まれる可能性もある。
【０１２３】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを用いて、プライマー（例えばＰＣＲプライマー）、代替増幅反応のためのプライマー、プローブ（例えば放射性もしくは非放射性標識を用いる従来手段によって明示標識で標識されたもの）を作製してもよく、あるいは、該ポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。このようなプライマー、プローブおよびその他のフラグメントは、少なくとも８、９、１０、または１５、例えば少なくとも２０など、例えば少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチド長となり、これらもまた本明細書において用いられる用語「ポリヌクレオチド」に包含される。
【０１２４】
ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドおよびプローブは、組換えによって、合成によって、または当業者に利用可能な任意の手段によって作製されてよい。それらはまた、標準法によりクローニングされてもよい。
【０１２５】
一般に、プライマーは、１回に１ヌクレオチドずつ所望の核酸配列を段階的に製造することを伴う合成手段により作製されることになる。自動化された技法を用いてこれを達成するための技法は、当分野で容易に利用可能である。
【０１２６】
ＶＨＺのフラグメントを含むプライマーは、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんに関連するような、ＶＨＺ発現のアップレギュレーションなどのＶＨＺ発現の検出の方法において特に有用である。ＶＨＺの増幅に適したプライマーは、ＶＨＺの任意の適したストレッチから作製することができる。使用することのできるプライマーには、特異的なＶＨＺの配列を増幅することができるプライマーが含まれる。
【０１２７】
ＶＨＺプライマーは単独で提供されてもよいが、それらは最も有用にはフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対として提供される。
【０１２８】
より長いポリヌクレオチドは、一般に組換え手段を用いて、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を用いて作出される。これは、（例えば約１５〜３０ヌクレオチドの）プライマー対を作製すること、これらのプライマーを動物またはヒト細胞から得られるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、（例えばアガロースゲル上で反応混合物を単離することにより）増幅されたフラグメントを単離すること、および増幅されたＤＮＡを回収することを含むことになる。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適したクローニングベクターにクローニングされ得るように、適した制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
【０１２９】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは、明示標識を有してよい。適した標識には、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性同位元素、ジゴキシゲニン、蛍光染料、酵素標識、またはビオチンなどのその他のタンパク質標識が含まれる。このような標識は、ポリヌクレオチドまたはプライマーに付加してよく、それ自体公知の技法を用いて検出することができる。標識されたかまたは標識されていない、ポリヌクレオチドまたはプライマーまたはそのフラグメントは、ヒトまたは動物身体においてポリヌクレオチドを検出または配列決定するための核酸に基づく試験において当業者が使用することができる。
【０１３０】
このような検出のための試験は、一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体試料をハイブリダイズ条件下でポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブに接触させること、および該試料においてプローブと核酸との間に形成されるいずれの二重鎖も検出することを含む。このような検出は、ＰＣＲなどの技法を用いるかまたはプローブを固相支持体上に固定化することにより、該プローブとハイブリダイズしない試料中の核酸を除去し、その後該プローブとハイブリダイズした核酸を検出することにより実現することができる。あるいは、試料核酸は固相支持体に固定されていてもよく、そのような支持体に結合したプローブの量を検出すればよい。この形式およびその他の形式の適したアッセイ法は、例えばＷＯ８９／０３８９１号およびＷＯ９０／１３６６７号に見出すことができる。
【０１３１】
ヌクレオチド、例えば、ＶＨＺ核酸を配列決定するための試験、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体試料をハイブリダイズ条件下でポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブに接触させること、例えば、サンガーのジデオキシ鎖終結法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．参照）により配列を決定することを含む。
【０１３２】
そのような方法は、一般に、適した試薬の存在下で、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な鎖の合成によりプライマーを伸張させ、１以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ残基においてその伸張反応を選択的に終結させること；鎖の延長および終結反応を生じさせること；伸長された産物を大きさに従って分離して、選択的終結が生じたヌクレオチドの配列を決定することを含む。適した試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、バッファーおよびＡＴＰが挙げられる。ジデオキシヌクレオチドは、選択的終結に用いられる。
【０１３３】
＜ＶＨＺ制御領域＞
いくつかの目的のため、ＶＨＺの制御領域を利用または調査することが必要となり得る。このような制御領域には、プロモーター、エンハンサーおよび遺伝子座制御領域が含まれる。制御領域により、本発明者らは、それに作動可能なように連結されたコード配列の発現を調節することができる核酸配列または構造を意味する。
【０１３４】
例えば、制御領域は、ＶＨＺを発現するトランスジェニック動物を作出する際に有用である。さらに、制御領域を用いて、ＶＨＺの発現構築物の作製に使用することができる。これは以下にさらに詳細に記載される。
【０１３５】
ＶＨＺの制御領域の同定は簡単であり、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ＶＨＺのコード配列は、ヒトまたはマウスＶＨＺｃＤＮＡ配列をプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより生物から得ることができる。５’配列は、適切なゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、または当分野で公知のプライマー伸張により得ることができる。ゲノムデータベースのデータベース検索を用いることもできる。特に関心対象であるこのような５’配列には、非コード領域が含まれる。５’領域は、目で調べるか、またはコンピュータプログラムの助けを借りて、プロモーター領域および／またはエンハンサー領域の存在を示す配列モチーフを同定することができる。
【０１３６】
さらに、２種類以上の生物由来のＶＨＺ核酸配列の配列アラインメントを行ってよい。異なる種由来のＶＨＺ配列をアラインさせることにより、アミノ酸配列のどの領域が異なる種間で保存されたを決定することが可能である。このような保存された領域は、問題になっている遺伝子（すなわちＶＨＺ）に関する制御領域を含む可能性が高い。本明細書に開示されるマウスおよびヒトゲノム配列、例えば、マウスＶＨＺゲノム配列を、この目的のために用いることができる。さらに、その他の生物由来のＶＨＺホモログを、マウスおよびヒトＶＨＺ配列から作製された適切なプローブを用いる標準的なスクリーニング法を用いて得ることができる。また、フグ（トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ））またはゼブラフィッシュのゲノムもスクリーニングしてＶＨＺホモログを同定することができる。従って、いくつかのＶＨＺのゼブラフィッシュ配列が同定されている（上述）。フグまたはゼブラフィッシュＶＨＺ遺伝子の５’非コード領域とマウスまたはヒトゲノムＶＨＺ配列の比較を用いて、制御領域を含有する保存された領域を同定することができる。
【０１３７】
また、欠失の研究を行ってＶＨＺのプロモーター領域および／またはエンハンサー領域を同定することができる。
【０１３８】
推定制御領域の同一性は、候補配列をレポーター遺伝子に連結させ、レポーターの発現を検出する分子生物学実験により確認することができる。
【０１３９】
＜＜検出法および診断法＞＞
＜ＶＨＺの発現の検出＞
本発明者らは、実施例において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がん組織におけるＶＨＺの発現が、正常組織と比較してアップレギュレーションされていることを示す。
【０１４０】
したがって、本発明者らは、個体の細胞または組織においてＶＨＺの発現の変化、例えばＶＨＺの発現のアップレギュレーションなどを検出することを含む、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんを含む、転移性、侵襲性もしくは浸潤性がんなどの、がんの診断法を提供する。
【０１４１】
ＶＨＺ発現、活性または量の検出を用いて、細胞の増殖状態を決定する方法を提供することができる。従って、増殖細胞は、正常細胞と比較して高レベルのＶＨＺ発現、活性または量を有する細胞である。同様に、非増殖細胞は、正常細胞と比較して低レベルのＶＨＺ発現、活性または量を有する細胞であり得る。
【０１４２】
このような検出はまた、細胞が浸潤性または侵襲性となるかどうかを決定するために用いることができる。従って、細胞において高レベルのＶＨＺの発現、ＶＨＺ量または活性が検出されると、該細胞が侵襲性、転移性または浸潤性である可能性が高いか、または侵襲性、転移性または浸潤性となる可能性が高いことが示され得る。同様に、細胞が低レベルのＶＨＺ発現、量または活性を有する場合、該細胞は、侵襲性、転移性または浸潤性ではないか、または侵襲性、転移性または浸潤性である可能性が低い。
【０１４３】
ＶＨＺのレベルが腫瘍の侵襲性によって変化するならば、ＶＨＺ発現、量または活性の検出は、がんの個体の生存率を予測するためにも使用されてよいことは当然理解される。すなわち、正常レベルのＶＨＺを有する個体または同族集団と比較して、高レベルのＶＨＺは低い生存率または生存確率を示し、低レベルのＶＨＺは高い生存率または生存確率を示す。ＶＨＺの発現の検出、量または活性は、そのためにがんの個体の予後診断の方法として使用することができる。
【０１４４】
ＶＨＺ発現、量またはレベルの検出を用いて、がんの個体における特定の療法の成功の可能性を決定することができる。それは、個体の腫瘍が浸潤性もしくは転移性腫瘍であるかどうか、または、浸潤性もしくは転移性腫瘍である可能性が高いかどうかを決定する方法で用いられてもよい。
【０１４５】
本明細書に記載される診断方法は、記載される治療方法と組み合わせてもよい。従って、本発明者らは、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することと、腫瘍の侵襲性に基づいて適切な療法を個体に投与することとを含む、個体におけるがんの治療、予防または軽減の方法を提供する。この療法は、上記の抗ＶＨＺ剤を含んでよい。
【０１４６】
一般に、組織または器官の理学的検査およびＸ線が、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんの検出に使用される。腫瘍の生検は、一般に、がんの診断のための病理組織学的検査のために採取され得る。ＶＨＺ発現、量または活性の検出は、標準的な病理組織学的手順とともに、このようながんを診断するか、またはこのようながんの診断をさらに確認するために使用されてよい。これは、病理組織学的分析により明白な結果が得られない場合に特に有用であり得る。
【０１４７】
下記にさらに詳細に記載されるように、ＶＨＺポリペプチドおよび核酸の存在および量を、試料中で検出することができる。従って、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんを含むＶＨＺ関連疾患は、被験体に由来する試料から、ＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺ  ｍＲＮＡの発現、量または活性の異常な低下または増加、例えば、発現、量または活性の増加を決定することを含む方法により診断することができる。
【０１４８】
試料は、発現、量または活性のレベルまたはパターンの空間的または時間的変化を含む、増加した、低下した、またはそうでなければ異常なＶＨＺ発現、量または活性に関連する疾患に罹患しているかまたは罹患している疑いのある生物または個体由来の細胞または組織試料を含んでよい。そのような疾患に罹患しているかまたは罹患している疑いのある生物におけるＶＨＺの発現、量または活性のレベルまたはパターンは、疾患の診断の手段として正常な生物における発現、量または活性のレベルまたはパターンと有用に比較されてもよい。
【０１４９】
試料は、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんに罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体由来の細胞または組織試料、例えば、それらの組織または細胞のいずれかの組織または細胞試料を含んでよい。
【０１５０】
一部の実施形態では、ＶＨＺの発現、量または活性のレベルの増加が試料中で検出される。ＶＨＺのレベルは、正常細胞、またはがん性でないことが分かっている細胞と比較した場合に、有意な程度まで増加し得る。このような細胞は、試験されている個体、または別の個体、例えば、年齢、体重、ライフスタイルなどで被験個体に匹敵する個体などから得ることができる。
【０１５１】
一部の実施形態では、ＶＨＺのレベルの発現、量または活性は、１０％、２０％、３０％または４０％以上増加する。一部の実施形態では、ＶＨＺのレベルの発現、量または活性は、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションにより判断して、４５％以上、例えば、５０％以上増加する。
【０１５２】
ＶＨＺの発現、量または活性は、当分野で公知であり、下記にさらに詳細に記載される多くの方法で検出することができる。一般に、個体由来の組織試料中のＶＨＺの量を測定し、罹患していない患者由来の試料と比較する。ＶＨＺ核酸、ならびにＶＨＺポリペプチドレベルの両方を測定することができる。
【０１５３】
ＶＨＺの量、活性または発現の検出を用いて、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんまたは精巣がんを類別してよい。例えば、高レベルのＶＨＺの量、活性または発現は、侵襲性、浸潤性または転移性がんを示し得る。同様に、低レベルのＶＨＺの量、活性または発現は、非侵襲性、非浸潤性または非転移性がんを示し得る。
【０１５４】
このような類別方式は、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ類別方式（ＮＧＳ）としても公知のＥｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ修正Ｓｃａｒｆｆ、Ｂｌｏｏｍ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎの類別方式などの確立された類別方式と併せて用いてもよい（５，６，Ｈａｙｂｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８２）。この方式は、最もよく研究され、広く使用されている乳房の腫瘍の類別法である。ＮＧＳは、細管形成の程度、核多形性および有糸分裂数を含む腫瘍細胞の形態学的特徴および細胞学的特徴の顕微鏡評価を伴う、表現型スコアリング法に基づく（６）。これらのスコアの合計により、乳房腫瘍は、グレードＩ（Ｇ１）（高分化型、進行が遅い）、グレードＩＩ（Ｇ２）（中分化型）、およびグレードＩＩＩ（Ｇ３）（低分化型、高増殖性）の悪性腫瘍に階級化される。
【０１５５】
ＶＨＺ遺伝子発現のレベルは、いくつかの異なる技法を用いて決定することができる。
【０１５６】
＜ＲＮＡレベルでのＶＨＺの発現の測定＞
ＶＨＺ遺伝子発現をＲＮＡレベルで検出することができる。
【０１５７】
そのため、一実施形態において、本発明者らは、試料をＶＨＺ核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブと接触させることと、前記試料をＶＨＺ核酸の存在についてモニターすることとを含む、試料中のＶＨＺ核酸を含む核酸の存在を検出する方法を開示する。例えば、核酸プローブは、ＶＨＺ核酸またはその一部と特異的に結合することができ、その２者間の結合を検出し；複合体自体の存在も検出することができる。
【０１５８】
従って、一実施形態では、ＶＨＺ  ｍＲＮＡの形態のＶＨＺ核酸の量を試料において測定することができる。ＶＨＺ  ｍＲＮＡは、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法および逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応によりアッセイすることができる。核酸配列は、特異的プライマーを用いる、インサイチューハイブリダイゼーション、サザンブロット法、一本鎖高次構造多型分析、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡチップ分析により同定することができる。（Ｋａｗａｓａｋｉ，１９９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９９２；Ｌｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９０；Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９８９；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【０１５９】
ＶＨＺ  ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、またはＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）の使用を含む、ＲＮＡ抽出技法を用いて細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ラン・オン（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｕｎ−ｏｎ）アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５）が挙げられる。用いることのできる検出のための方法としては、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識およびその他の適した標識が挙げられる。
【０１６０】
これらの各方法は定量を可能にするものであり、当分野で周知である。そのため、ＶＨＺ発現、量または活性の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量化のための当分野で周知の方法のいずれかを用いて、ＲＮＡレベルで測定することができる。ＶＨＺ配列由来の任意の適したプローブ、例えば、適したヒトＶＨＺ配列の任意の一部分をプローブとして用いてよい。ＶＨＺプローブを設計するための配列としては、受託番号ＮＭ＿０１５４７２を有する配列、またはその一部分を挙げることができる。
【０１６１】
一般に、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡ標的を増幅する。この過程において、逆転写酵素を用いてＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、その後それを増幅させて検出を促進することができる。
【０１６２】
多くのＤＮＡ増幅法が公知であり、その大部分は酵素連鎖反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、または自家持続配列複製法など）に依存するか、またはそれがクローニングされたベクターの全部または一部の複製からのものである。
【０１６３】
多くの標的およびシグナル増幅法が文献、例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２２９−２３７（１９８８）ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １０：１，５４−５５（１９９０）のこれらの方法の一般的総説に記載されている。
【０１６４】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてＶＨＺ  ｍＲＮＡを検出することができる。
【０１６５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載される核酸増幅法である。ＰＣＲを用いて診断の状況で任意の既知核酸を増幅することができる（Ｍｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５２：２４７−２５２）。自家持続配列複製法（３ＳＲ）は、ＴＡＳの変形であり、酵素カクテルおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーにより媒介される、逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ活性の順次ラウンドによる核酸鋳型の等温増幅を含む（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４）。連結増幅反応または連結増幅系は、ＤＮＡリガーゼおよび４つのオリゴヌクレオチド、すなわち、標的鎖ごとに２つのオリゴヌクレオチドを用いる。この技法は、Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０に記載されている。Ｑβレプリカーゼ技法では、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７に記載されるように、バクテリオファージＱβに対するＲＮＡレプリカーゼ（一本鎖ＲＮＡを複製する）を用いて標的ＤＮＡを増幅する。
【０１６６】
ＰＣＲ法は、基本的に、（１）抽出したＤＮＡを処理して一本鎖相補鎖を形成すること、（２）オリゴヌクレオチドプライマー対を加えること、ここで、対の一方のプライマーはセンス鎖の配列の一部分と実質的に相補的であり、各々の対の他方のプライマーは相補的なアンチセンス鎖の同じ配列の異なる一部分と実質的に相補的である、（３）対になったプライマーを相補的配列とアニールすること、（４）それぞれのプライマーの３’末端からアニールしたプライマーを同時に伸長させて、それぞれのプライマーとアニールした鎖と相補的な伸長産物を合成すること、ここで、伸長産物は、相補物から分離後、各々の対の他方のプライマーの伸長産物の合成のための鋳型として働く、（５）伸長産物を鋳型から分離して一本鎖分子を作製すること、（６）前記アニーリングステップ、伸長ステップおよび分離ステップを少なくとも１回反復することにより、前記一本鎖分子を増幅することを含む。
【０１６７】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いることができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲも用いることができる。このようなＰＣＲ技法は当分野で周知であり、ＶＨＺ配列由来の任意の適したプライマーを用いてもよい。
【０１６８】
代わりとなる増幅技術も活用することができる。例えば、ローリングサークル増幅（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：２２５）は、市販されている増幅技術（ＲＣＡＴ（商標））であり、ＤＮＡポリメラーゼにより駆動され、等温条件下で直線的または幾何学的速度論を用いて環状オリゴヌクレオチドプローブを増幅することができる。さらなる技法の鎖置換増幅（ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３９２）は、特定の標的に対して唯一の具体的に定義された配列を用いて始める。
【０１６９】
＜ポリペプチドレベルでのＶＨＺの発現の測定＞
ＶＨＺ発現は、ポリペプチドレベルで検出することができる。
【０１７０】
さらなる実施形態では、そのために、ＶＨＺ発現、量または活性は、試料中のＶＨＺポリペプチドの存在または量を検出することにより検出することができる。これは、ＶＨＺポリペプチドに結合している分子を用いて実現することができる。その存在を検出するために直接的にまたは間接的にＶＨＺポリペプチドに結合する適した分子／薬剤としては、天然に存在する分子、例えばペプチドおよびタンパク質など、例えば抗体が挙げられ、または、それらは合成分子であってもよい。
【０１７１】
従って、本発明者らは、細胞試料をポリペプチドと結合することができる抗体に接触させること、および前記試料をポリペプチドの存在についてモニターすることによる、ＶＨＺポリペプチドの存在を検出する方法を開示する。
【０１７２】
例えば、ＶＨＺポリペプチドは、抗ＶＨＺ抗体を用いて検出することができる。このような抗体は、（下記でさらに詳細に記載される）当分野で公知の手段により作製されてよい。例えば、抗ＶＨＺ抗体は、ＶＨＺに対するあらゆる市販の抗体、例えば、限定されるものではないが、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｐｏｗａｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、ＡｄＢ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などを含んでよい。
【０１７３】
これは、抗体とポリペプチドとの間に形成された複合体の存在をモニターするか、またはポリペプチドと抗体との間の結合をモニターすることにより便宜に実現することができる。２つの実態間の結合を検出する方法は、当分野で公知であり、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴法などが含まれる。
【０１７４】
上記のような免疫ブロット法などの標準的な実験室手法を用いて、同じ細胞集団中の非処理細胞と比較した、ＶＨＺタンパク質のレベルの変化を検出することができる。
【０１７５】
遺伝子発現は、ＶＨＺポリペプチドの翻訳後プロセシングまたはＶＨＺ核酸の転写後修飾の変化を検出することにより決定することもできる。例えば、ＶＨＺポリペプチドのリン酸化の差、ＶＨＺポリペプチドの切断またはＶＨＺ  ＲＮＡの選択的スプライシングなどを測定すればよい。ＶＨＺポリペプチドなどの遺伝子産物の発現のレベル、ならびにそれらの翻訳後修飾は、特許所有の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）タンパク質アッセイまたは二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような技法を用いて検出することができる。
【０１７６】
宿主由来の試料中のＶＨＺタンパク質のレベルを決定するために用いることのできるアッセイ技法は、当業者に周知である。当分野で公知の任意の方法によって、抗体を免疫特異的結合についてアッセイすることができる。
【０１７７】
使用することのできるイムノアッセイとしては、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技法を用いる競合および非競合アッセイ系を挙げることができる。このようなアッセイは、当分野で日常的なものである（例えば、参照によりその全文が本明細書に援用される、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【０１７８】
検体は、免疫組織化学染色および免疫細胞化学染色（一般に、Ｓｔｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｒ，Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，１９９４参照）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット、ウエスタンブロット法、免疫沈降、機能アッセイおよびタンパク質トランケーション試験により、ポリペプチド／タンパク質についてアッセイすることができる。その他のアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【０１７９】
ＥＬＩＳＡアッセイは当業者に周知である。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方をこのアッセイで使用することができる。適切であれば、当業者に公知のように、その他のイムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などを用いてよい。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９２を参照されたい。
【０１８０】
＜診断キット＞
本発明者らはまた、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がん、あるいは個体においてそのようながんに対する感受性を検出するための診断キットも提供する。
【０１８１】
診断キットは、本明細書に記載されるあらゆる手段による、個体においてＶＨＺの発現、量または活性を検出するための手段を含み得る。そのために、診断キットは以下のうちのいずれか１以上を含んでもよい。ＶＨＺポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対して相補的なヌクレオチド配列またはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはＶＨＺに対する抗ＶＨＺ抗体を含む抗体のようなＶＨＺに対する抗体、例えば、抗ペプチド抗体ヒトＶＨＺ抗体。
【０１８２】
診断キットは、使用説明書、またはその他の証印（ｉｎｄｉｃｉａ）を含み得る。診断キットは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんまたは精巣がんの治療または予防のための手段、例えば、本明細書に記載される組成物のいずれか、またはこのようながんを治療するための当分野で公知のいずれかの手段などをさらに含んでよい。特に、診断キットは、記載される抗ＶＨＺ剤、例えばスクリーニングにより得られるものを含んでよい。診断キットは、タモキシフェン、クエン酸タモキシフェンまたは任意のその他の抗エストロゲン剤またはエストロゲン遮断剤のような、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）またはその改良体などの治療薬を含んでよい。治療薬はまた、抗ＶＨＺ抗体も含んでよい。
【０１８３】
＜予防法および治療法＞
本発明者らは、不十分な量のＶＨＺ発現または活性に関連する異常な状態、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどを治療する方法を開示する。このようながんを回避（すなわち予防）する方法も、同じまたは同様のアプローチを適切に用いる。
【０１８４】
一般的な用語において、本発明者らの方法は、細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性を変化させる（例えばダウンレギュレーションする）ことによる、がん細胞の操作を含む。細胞において変化したＶＨＺ発現、量または活性を検出するステップは、操作ステップの前または後に行うことができる。検出ステップは、アップレギュレーションされたまたはダウンレギュレーションされたＶＨＺ発現、量または活性を検出することであり得る。本明細書の他所に詳細に記載されるように、ＶＨＺを調節するかまたはダウンレギュレーションするあらゆる方法を用いてよい。
【０１８５】
この方法は、細胞を適したｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに曝露することを含んでもよい。例えば、ＤＵＳＰ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）を用いてＶＨＺのｍＲＮＡ発現をダウンレギュレーションしてもよい。キメラＲＮＡ干渉（キメラＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが元の遺伝子のｍＲＮＡの破壊を誘発するプロセスである。キメラ（Ｃｈｉｍｅｒ）ＲＮＡｉは、Ｕｉ−Ｔｅｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ａｐｒｉｌ  ２００８；３６：２１３６−２１５１，Ｎａｉｔｏ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｊｕｌ  ２００５；３３：Ｗ５８９−Ｗ５９１，Ｕｉ−Ｔｅｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｆｅｂ  ９；３２（３）：９３６−４８  ａｎｄ  Ｎａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊｕｌ  １；３２（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１２４−９に詳細に記載されている。
【０１８６】
この方法は、細胞をＶＨＺに特異的に結合することができる抗ＶＨＺ抗体に曝露することを含み得る。そのような抗体は、上記に記載されるような任意の市販の抗ＶＨＺ抗体を含み得る。
【０１８７】
本発明者らの方法によれば、操作の結果として、がん細胞は非がん性となるか、あるいは該浸潤性または転移性がん細胞が非浸潤性または非転移性となる。がんには、特に、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんが含まれ得る。それには浸潤性または転移性のがんが含まれてよい。
【０１８８】
ＶＨＺは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんの侵襲性および浸潤性に関連するので、ＶＨＺのレベルは、がんを有する個体の細胞で、がんもしくは非がん細胞で検出することができ、がんの侵襲性を評価することができる。正常細胞と比較して高レベルのＶＨＺ量、発現または活性は、侵襲性もしくは浸潤性がんであることを示し、そのためにより強いかまたはより厳しい療法が必要とされ選択され得る。同様に、より低いレベルは侵襲性または浸潤性の低い療法を示し得る。
【０１８９】
本明細書に記載されるアプローチは、一般にあらゆるＶＨＺ関連疾患の療法に使用することができる。ＶＨＺ関連疾患には、増殖性疾患が含まれ、特にがんが含まれる。例えば、ＶＨＺ関連疾患としては、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がん、例えば、転移性、浸潤性または侵襲性の結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどを挙げることができる。
【０１９０】
ＶＨＺ関連疾患は、該疾患に関連する状態が対照と比較して有意に（すなわち５０％以上まで）抑制される場合に「治療される」と定義される。抑制は、対照と比較して少なくとも７５％まで、例えば、対照と比較して９０％まで、９５％までまたは１００％までであってよい。状態は、細胞増殖を含んでよいし、または、それは細胞周期時間、細胞数、細胞遊走、細胞浸潤性などを含んでよい。用語「治療」により、本発明者らは、がんの予防または軽減も含むことを意味する。
【０１９１】
ＶＨＺポリペプチドは、特に腫瘍細胞およびその他の増殖細胞における、療法に対するその機能の抑制のための標的を表す。
【０１９２】
増殖性障害という用語は、本明細書において細胞周期の制御を必要とするあらゆる障害を含む広い意味に使用される。特に、増殖性障害には、悪性障害および新生物発生前の障害が含まれる。本明細書に記載される方法および組成物は、小細胞肺がん、ならびに、腎臓、子宮、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、膀胱、卵巣、結腸のがんおよび乳房のがんなどの腺癌の治療または診断に関して特に有用である。例えば、治療可能であり得る悪性腫瘍としては、急性および慢性の白血病、リンパ腫、骨髄腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫（ｌｅｉｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、横紋筋肉腫のような肉腫、結腸癌、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、精上皮腫、胎生期癌、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、乏突起細胞腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫（ｎｅｕｔｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）および網膜芽細胞腫が挙げられる。
【０１９３】
本明細書に記載される方法および組成物は、脳、食道、胃、皮膚および精巣がんの治療または診断に使用することができる。それらは、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部、陰茎がんなどの扁平上皮癌の治療または診断に使用することができる。
【０１９４】
このような障害の療法の可能性のある１つのアプローチは、本明細書に記載されるＶＨＺポリヌクレオチドに対して産生されるアンチセンス構築物を発現させ、それらを腫瘍細胞に投与して、遺伝子の機能を抑制し、腫瘍細胞が増殖または進行することを回避することである。
【０１９５】
アンチセンス構築物を用いて、増殖細胞における増殖または進行を回避するように遺伝子の機能を抑制することができる。アンチセンス構築物、すなわち核酸、例えば、ＲＮＡ、センス核酸またはｍＲＮＡと相補的な構築物などは、米国特許第６，１００，０９０号（Ｍｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．）、およびＮｅｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｇ  ３（１−２）：１７５−２３１に詳細に記載され、その文書の教示は参照することにより本明細書に具体的に組み入れられる。
【０１９６】
特定の例では、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんまたは精巣がんは、例えばＶＨＺ  ｍＲＮＡに結合して破壊することができるｓｉＲＮＡにより、ＶＨＺの量、発現または活性を全体的にまたは部分的に低下させることにより、治療または予防することができる。本発明者らは、ＲＮＡ干渉によりＶＨＺをダウンレギュレーションする抗ＶＨＺ剤を具体的に提供する。抗ＶＨＺ剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含み得る。それは、キメラＲＮＡｉ、例えば、ＤＵＳＰ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などを含み得る。
【０１９７】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の直接導入により誘導される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）の方法であり、多様な生物において特定の遺伝子の発現をノックアウトするための有用なツールとして浮上した。ＲＮＡｉは、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１（１９９８）により記載されている。ＰＴＧＳのその他の方法は公知であり、それには、例えば、導入遺伝子またはウイルスの導入が含まれる。一般に、ＰＴＧＳにおいて、サイレンシングされた遺伝子の転写物は合成されるが、急速に分解されるために蓄積しない。ＲＮＡｉを含むＰＴＧＳのための方法は、例えば、ワールドワイドウェブサイトＡｍｂｉｏｎ．ｃｏｍのディレクトリ「／ｈｏｔｔｏｐｉｃｓ／」の、「ｒｎａｉ」ファイルに記載されている。
【０１９８】
インビトロでのＲＮＡｉに適した方法が本明細書に記載される。このような一方法は、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）の導入を伴う。現行モデルは、これらの２１〜２３ヌクレオチドｄｓＲＮＡがＰＴＧＳを導入することができることを示す。効果的なｓｉＲＮＡを設計するための方法は、例えば、上記のＡｍｂｉｏｎウェブサイトに記載されている。低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのＲＮＡ前駆体も、ＶＨＺ核酸配列の全部または一部によってコードされ得る。
【０１９９】
あるいは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、近年哺乳類において成功することが示された、一定範囲の生物において遺伝子発現に干渉する有力な方法である（Ｗｉａｎｎｙ  ａｎｄ  Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ，２０００，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：７０−７５）。ＶＨＺポリヌクレオチドの配列に相当する二本鎖ＲＮＡを、候補生物の卵母細胞および細胞に導入またはそこで発現させて、ＶＨＺ活性を干渉することができる。
【０２００】
ＶＨＺ遺伝子発現を調節するその他の方法は当業者に公知であり、ドミナントネガティブアプローチを含む。従って、別のアプローチは、内因性遺伝子産物と協業して機能の抑制をもたらす本明細書のＶＨＺポリペプチドの非機能的変異体を使用することである。ＶＨＺの非機能的変異体の一例は、ヒト配列の９５位の（またはそれに相当する）システインへの突然変異である。これらの例は、ホスファターゼおよび関連する生物学的活性の欠損しているＶＨＺのＣ９５Ｓ変異体の作成および使用を示す。
【０２０１】
また、ＶＨＺ遺伝子発現を、遺伝子発現または機能活性を抑制するペプチドまたは小分子を導入することにより調節することもできる。従って、本明細書に記載されるアッセイによってＶＨＺポリペプチドと結合するまたはＶＨＺポリペプチドの量、活性または発現を変化させる（例えばダウンレギュレーションする）として同定された化合物を、腫瘍または増殖細胞に投与して、ＶＨＺポリペプチドの機能を防ぐことができる。そのような化合物は、ＶＨＺの発現または活性をダウンレギュレーションするために効果的な量で製薬上許容される担体とともに投与されてよいし、または、ＶＨＺ発現、活性または量を制御する第二のシグナルを活性化またはダウンレギュレーションし、それにより異常な状態を軽減させることにより投与されてよい。
【０２０２】
本明細書に記載されるＶＨＺポリペプチドに対する適した抗体も、治療薬として用いてよい。抗ＶＨＺ抗体は、ＶＨＺに対するウサギ抗ＶＨＺ抗体を含み得る。さらに、抗ＶＨＺ抗体は、次のいずれか１以上を含み得る。ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｐｏｗａｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、ＡｄＢ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）。
【０２０３】
あるいは、遺伝子療法を用いて、被験体における結腸、肺、扁平細胞（口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含む）、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎臓、皮膚、卵巣、前立腺および精巣細胞などの関連する細胞によるＶＨＺの内因性産生を制御する。例えば、ＶＨＺｓｉＲＮＡまたはこの一部分をコードするポリヌクレオチドは、下記に考察されるように、複製欠損レトロウイルスベクターで発現させるように操作されてよい。このレトロウイルス発現構築物を、次に単離し、抗ＶＨＺｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入したパッケージ細胞の中に導入することができ、それによりパッケージ細胞が今度は目的の配列を含有する感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作してインビボでＶＨＺポリペプチドの発現を制御するために被験体に投与してよい。遺伝子療法の概説には、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ  Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ａ  Ｐ  Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ（１９９６）中のＣｈａｐｔｅｒ  ２０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，（およびそこに引用される参照文献）を参照されたい。
【０２０４】
一部の実施形態では、ＶＨＺのレベルは、結腸、肺、扁平細胞（口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含む）、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎臓、皮膚、卵巣、前立腺および精巣細胞において低下する。さらに、そのような実施形態では、治療はこのような細胞を標的とし得るか、またはこのような細胞に特異的であり得る。ＶＨＺの発現は、罹患細胞（すなわちがん性である細胞）においてのみ特異的に低下し、その他の非罹患細胞において実質的に低下しないものであり得る。これらの方法において、ＶＨＺの発現は、その他の細胞、すなわち、結腸、肺、扁平細胞（口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含む）、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎臓、皮膚、卵巣、前立腺および精巣細胞でない細胞において実質的に低下しなくてよい。従って、そのような実施形態では、治療の過程でまたは治療の後に、このような細胞におけるＶＨＺのレベルは実質的に同じであるかまたは類似のままである。
【０２０５】
ＶＨＺレベルの、結腸、肺、扁平細胞（口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含む）、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎臓、皮膚、卵巣、前立腺および精巣細胞特異的な低下は、標的化された投与により、すなわち、このような細胞にだけ治療を適用し、その他の細胞に適用しないことにより、実現されてよい。しかし、その他の実施形態では、このような細胞におけるＶＨＺ発現のダウンレギュレーション（かつ、その他の細胞または組織種では実質的にない）が用いられる。このような方法は、例えば下記でさらに詳細に記載されるｓｉＲＮＡの組織または器官特異的発現のために、組織または器官特異的発現ベクターを有利に利用する。
【０２０６】
＜導入遺伝子（抗ＶＨＺ  ｓｉＲＮＡ）の組織特異的発現＞
がん遺伝子療法は、正常組織での望ましくない副作用を減少させるために腫瘍組織を選択的に標的化しなければならない。導入遺伝子発現を悪性組織にターゲティングすることは、腫瘍生物学に基づくプロモーター、組織特異的プロモーターおよび誘導性の調節エレメント（Ａ１）を含む、特異的調節エレメントの使用を必要とする。
【０２０７】
＜腫瘍生物学に基づくプロモーター＞
特定の遺伝子が、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんにおいてアップレギュレーションされる。これらの遺伝子のプロモーターを用いて、組換え複製欠損レトロウイルスベクターを用いる導入遺伝子の腫瘍選択的発現を推進することができる。乳がんに関するこのような遺伝子の例としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子受容体−１（ＶＥＧＦＲ−１）およびＶＥＧＦＲ−２を挙げることができ、これらは乳がんにおいて腫瘍期依存性な様式でアップレギュレーションされることが知られている（Ａ２）。ｃ−ｅｒｂＢ２がん遺伝子は、乳がんにおいて選択的にアップレギュレーションされる（Ａ３、Ａ６）。Ｌ−プラスチン、ヒトアクチン結合タンパク質は、悪性上皮細胞において構成的にかつ豊富に発現されるが、正常組織では、熟造血細胞での低レベルの発現を除いて発現されない（Ａ４）。抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２は、乳がん細胞においてアップレギュレーションされることが見出されている（Ａ５）。ヒト乳房腫瘍は、正常な乳房組織と比較して高レベルのＭＵＣ１を発現する（Ａ７）。
【０２０８】
＜組織特異的プロモーター＞
特定の遺伝子が、乳房組織において特異的に発現される。このような遺伝子の例は、ヒトα−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）およびヒツジβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）である。このような遺伝子のプロモーターを用いて、乳がん細胞特異的な様式でアデノウイルスベクターでの導入遺伝子の発現を推進することができる（Ａ８）。乳癌の遺伝子療法は、この組織に親和性をもつウイルス、例えば、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）などを目的に合わせて作ることによりアプローチすることができる。このレトロウイルスのグルココルチコイド応答性の長い末端反復配列（ＬＴＲ）を、グルココルチコイド誘導性の導入遺伝子の発現のプロモーターとして使用することができる（Ａ９）。
【０２０９】
＜誘導プロモーター＞
誘導プロモーターは、一時的な導入遺伝子発現のメディエーターとして使用される。乳房腫瘍において、放射線照射または化学療法治療の際に様々なストレス遺伝子がアップレギュレーションされる。このようなストレス遺伝子の例は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（Ａ１０）および多剤耐性遺伝子−１（ＭＤＲ−１）である（Ａ１１）。そのために、これらの遺伝子のプロモーターを用いて、放射線照射または化学療法に供された乳がんにおいて導入遺伝子の腫瘍特異的発現を推進することができる。
【０２１０】
転写により標的化された遺伝子療法は、通常、目的の導入遺伝子を含有する複製欠損アデノウイルス発現ベクターの直接的な腫瘍内注射により実現される（Ａ６、Ａ１２、Ａ１３）。導入遺伝子はまた、陽イオン性リポソームを含む脂質複合体として腫瘍内注射により送達することもできる（Ａ１４、Ａ１５）。
【０２１１】
＜がん＞
本明細書に記載される方法および組成物によれば、ＶＨＺは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんを診断または治療するために有用である。本明細書で「がん」に言及する場合、これは、転移性、侵襲性もしくは浸潤性がんを含むと考えられるべきである。例えば、がんは、ＶＨＺ過剰発現に関連するがんであってよい。これにより本発明者らは、問題になっているがんのがん細胞が、非がん細胞と比較して、高レベルのＶＨＺの発現または活性（または両方）を提示することを意味する。
【０２１２】
＜診断＞
本発明者らの診断方法は、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんの診断の任意の既知の方法と併せて用いてよい。
【０２１３】
＜治療＞
結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんに対する既知の治療は、外科手術、放射線療法、化学療法、高用量化学療法、ホルモン療法および免疫療法のうち、いずれか１以上からなるものであってもよい。したがって、本明細書に記載される治療方法のいずれかを、先行する公知の療法のうちのいずれかと組み合わせてよい。その上、がんの治療または軽減に効果的であることが知られている以下の一般的療法のいずれか１以上を用いてよい。
【０２１４】
＜非特異的免疫調節剤＞
非特異的免疫調節剤は、免疫系を刺激するかまたは間接的に増強する物質である。多くの場合、これらの薬剤は、主要な免疫系細胞を標的化し、サイトカインおよび免疫グロブリンの産生増加などの応答を引き起こす。がん治療に用いられる２つの非特異的免疫調節剤は、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）およびレバミソールである。本明細書に記載される抗ＶＨＺ剤は、このような非特異的免疫調節剤のいずれかと併せて使用することができる。
【０２１５】
＜生物反応修飾物質＞
一部の抗体、サイトカイン、およびその他の免疫系物質は、がん治療で用いるために実験室で産生させることができる。これらの物質は、多くの場合、生物反応修飾物質（ＢＲＭ）と呼ばれる。それらは、身体の免疫防御とがん細胞との間の相互作用を変更して、身体の疾患と戦う能力を後押しし、導き、または回復させる。ＢＲＭとしては、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、モノクローナル抗体、およびワクチンが挙げられる。本明細書に記載される抗ＶＨＺ剤は、このような生物反応修飾物質のいずれかと併せて使用することができる。
【０２１６】
＜インターフェロン（ＩＦＮ）＞
インターフェロンには３つの主要な種類がある、すなわち、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγである。インターフェロンαは、がん治療で最も広く用いられている種類である。
【０２１７】
インターフェロンは、がん患者の免疫系ががん細胞に対して作用する方法を改善することができる。その上、インターフェロンは、がん細胞の増殖を遅らせるか、またはより正常な挙動を有する細胞への発展を促進することにより直接がん細胞に作用することができる。一部のインターフェロンは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージも刺激して、免疫系の抗がん機能を後押しすることができる。
【０２１８】
本明細書に記載される抗ＶＨＺ剤は、このようなインターフェロンと併せて使用することができる。
【０２１９】
＜インターロイキン（ＩＬ）＞
インターフェロンと同じように、インターロイキンは、身体内に天然に存在するサイトカインである。多くのインターロイキンがこれまでに同定されている。インターロイキン−２（ＩＬ−２またはアルデスロイキン）はがん治療において最も広く研究されている。ＩＬ−２は、リンパ球のような、がん細胞を破壊することのできる多くの免疫細胞の増殖および活性を刺激する。
【０２２０】
本明細書に記載される抗ＶＨＺ剤は、このようなインターロイキンと併せて使用することができる。
【０２２１】
＜コロニー刺激因子（ＣＳＦ）＞
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（造血増殖因子と呼ばれることもある）は、通常、腫瘍細胞に直接影響を及ぼさない。むしろ、それらは骨髄幹細胞が分裂して白血球、血小板、および赤血球に成長するのを促す。骨髄は、全ての血液細胞の源であるので、身体の免疫系に極めて重要である。
【０２２２】
Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）およびＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチム）は、白血球の数を増加させ、それにより、化学療法を受けている患者の感染のリスクを低下させることができる。Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦはまた、幹細胞移植片または骨髄移植片の調製において幹細胞の産生を刺激することもできる。エリスロポエチンは、化学療法を受けている患者において赤血球の数を増加させ、赤血球輸血の必要性を低下させることができる。さらに、オプレルベキンは、化学療法を受けている患者において血小板輸血の必要性を低下させることができる。
【０２２３】
本明細書に記載される抗ＶＨＺ剤は、このようなコロニー刺激因子と併せて使用することができる。
【０２２４】
＜モノクローナル抗体（ＭＯＡＢ）＞
本明細書に記載される抗ＶＨＺ剤は、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんを治療するために有用であることが公知のモノクローナル抗体と併せて使用することができる。
【０２２５】
＜結腸がん＞
肺がんは、米国特許第５，８６１，４９４号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０２２６】
胃腸管は、米国において毎年生じる新規に診断されるがんと致死性のがんの療法の最も一般的な部位であり、女性についての数字よりも男性についての数字のほうが多少高い。
【０２２７】
米国において結腸がんの発生率は増加しているが、胃がんの発生率は低下し、小腸のがんはまれである。胃腸がんの発生率は、地理的に変化する。胃がんが日本では一般的であって、米国では珍しいのに対して、結腸がんは日本では珍しくＵＳＡでは一般的である。ハイリスク地域に移動する人々が高リスクとなることを示す統計データにより、環境による病因的因子が強く示唆される。一部の示唆されている胃がんの病因的因子には、アフラトキシン（アスペルギルス・フラバスにより形成される発がん物質であり、汚染された食品に存在する）、燻製魚、アルコール、ならびにビタミンＡおよびマグネシウム欠乏症が挙げられる。脂肪分が高く食物線維の少ない食事、および、場合により、ステロール代謝の分解産物が、結腸がんの病因的因子であり得る。特定の障害は、がんに罹患しやすくする、例えば、悪性貧血は胃がんに罹患しやすくし、未処理の非熱帯性スプルーおよび免疫欠如はリンパ腫および癌腫に罹患しやすくし、かつ、潰瘍性および肉芽腫性大腸炎、単離されたポリープ、および遺伝性家族性ポリープ症は、結腸の癌腫に罹患しやすくする。
【０２２８】
結腸の最も一般的な腫瘍は、腺腫性ポリープである。原発性リンパ腫は、結腸ではまれであり、小腸では最も一般的である。
【０２２９】
腺腫性ポリープは、最も一般的な良性の胃腸腫瘍である。それらは、胃腸管全体に、最も一般的には結腸および胃に生じ、女性よりも男性においてより頻繁に見出される。腺腫性ポリープは、単発性、またはより一般に多発性であってよく、無茎性または有茎性であり得る。それらは、家族性ポリープ症およびガードナー症状群において見られるように、遺伝性である可能性があり、主として結腸を含む。結腸がんの発症は、家族性ポリープ症でよく起こる。ポリープは多くの場合出血を引き起こし、それは肉眼で見えないかまたは肉眼で見ることができ、合併症が続いて起こらない限り痛みを引き起こすことはまれである。乳頭状腺腫は、結腸にのみ見出されるあまり一般的でない形態であるが、電解質の損失およびムコイドの放出を引き起こし得る。
【０２３０】
悪性腫瘍には、浸潤しているかまたは外方増殖性であって、最も一般的には直腸Ｓ状部に生じる結腸の癌腫が含まれる。上行結腸の内容物は液体であるので、この領域の癌腫は通常、閉塞を引き起こさないが、患者は、疾患の経過の後期で貧血、腹痛、または腹部腫瘤もしくは触知腫瘤を示す傾向がある。
【０２３１】
結腸の腫瘍の予後は、腸壁浸潤の程度ならびに所属リンパ節の浸潤および遠位転移の存在に依存する。直腸および下行結腸の癌腫の予後は、予想外にかなり良い。結節浸潤が進行する前の早期摘出によって、８０〜９０％の治癒率が可能である。このため、以前は健康であった患者において説明のつかない貧血、潜在胃腸出血、または用便習慣の変化が進む場合には、充分なケアを行ってこの疾患を取り除かなければならない。病巣がリンパ節に拡がる前にそれを完全に取り除くことによって、結腸のがんを有する患者について生存の最良のチャンスが提供される。潜血、血液スクリーニングによる無症候群性患者中の検出によって、最高５年の生存がもたらされる。
【０２３２】
臨床上疑わしい悪性病変は、通常、Ｘ線写真によって検出することができる。１ｃｍ未満のポリープは、特に上部Ｓ状結腸においておよび憩室症存在するときは、容易に見逃されやすい。臨床上疑わしく、Ｘ線写真によって検出される、食道、胃または結腸の病変は、狙撃生検およびブラシ擦過細胞診（ｂｒｕｓｈ  ｓｉｔｏｌｏｇｙ）により作成される組織学的組織診断と組み合わせて、光ファイバー内視鏡により確認することができる。結腸内視鏡検査は、結腸疾患を検出するために利用されるもう一つの方法である。Ｘ線により可視化されない良性および悪性ポリープは、多くの場合結腸内視鏡検査で検出される。その上、Ｘ線で１つの病変を有する患者は、結腸内視鏡検査でさらなる病変が検出される場合が多い。しかし、Ｓ状結腸鏡検査は、結腸の腫瘍の約５０％しか検出しない。
【０２３３】
本明細書に記載される方法および組成物は、結腸がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、結腸がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０２３４】
＜肺がん＞
肺がんは、米国特許第５，７３３，７４８号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０２３５】
肺は、２つのスポンジ様の器官である。空気は気管を通って肺の中に入る。気管は、気管支と呼ばれる管に分かれ、気管支は細気管支と呼ばれるさらに小さい分岐に分かれる。細気管支の終端は、肺胞として知られる極めて小さい気嚢である。多くの極めて小さい血管が肺胞の中を通り抜け、吸入空気から血流に酸素を吸収し、二酸化炭素を放出する。酸素を取り込み、二酸化炭素を排出することが肺の主な機能である。胸膜と呼ばれる、よく滑る内層が、肺を取り囲んでいる。この内層は肺を保護し、呼吸の間に肺が拡張および収縮を行うときに肺が前後にスライドするのを助ける。
【０２３６】
ほとんどの肺がんは、気管支の内層で起こる。それが、肺がんのもう一つの用語が、気管支原性がんである理由である。肺がんはまた、気管支の内層の下の腺で形をなし、高い頻度で肺の末梢で生じる。肺がんは、数年の期間にわたって発症すると考えられている。第一に、肺に前がん病変の領域が存在する可能性がある。これらの前がん病変は多くの場合、進行して本物のがんになる。これらの前がん病変を検出できることはとても有用であろう。がんが発達するにつれて、がん細胞は、新しい血管を近くに形成させる化学物質を産生し得る。これらの新しい血管はがん細胞に栄養を与え、がん細胞は増殖を継続してＸ線で見ることができるほど大きい腫瘍を形成することができる。がんからの細胞は、元の腫瘍から離脱して身体のその他の部位に広がり得る。この過程を転移と呼ぶ。
【０２３７】
肺がんには主に２つの種類がある。小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）と非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。肺がんが両方の種類の特徴を有する場合、それは混合小細胞／大細胞癌と呼ばれる。
【０２３８】
全肺がんの約１３％が、これらのがんを構成する小型の円形細胞に由来する小細胞型（ＳＣＬＣ）である。ＳＣＬＣは、身体全体に広範囲に広がる傾向がある。がん細胞は、増殖速度が速く、大型の腫瘍を形成し、かつ、リンパ節およびその他の器官、例えば骨、脳、副腎、および肝臓などに広がる。この種類のがんは、多くの場合、胸部の中央近くの気管支で起こる。小細胞肺がんは、大抵、喫煙が原因で引き起こされる。喫煙したことが一度もなく小細胞肺がんを有する人は極めて希である。ＳＣＬＣのその他の名前は、燕麦細胞癌および小細胞未分化癌である。
【０２３９】
肺がんの残りの８７％は、非小細胞（ＮＳＣＬＣ）である。ＮＳＣＬＣには３つのサブタイプがある。これらのサブタイプの細胞は、サイズ、形状、および化学的構造の点で異なる。全肺がんの約２５％〜３０％が扁平上皮癌である。扁平上皮癌は、喫煙の履歴に関連し、気管支の近くの中央で見出される傾向がある。腺癌は、肺がんの約４０％を占める。腺癌は、通常、肺の外側の領域に見出される。細気管支肺胞上皮癌（気管支肺胞癌または細気管支肺胞上皮癌と呼ばれることもある）として知られる、１種類の腺癌を有する患者は、その他の種類の肺がんを有する患者よりも良好な予後を有する傾向がある。大細胞未分化癌は、肺がんの約１０％〜１５％を占める種類のがんである。それは肺のあらゆる部分に出現する可能性があり、増殖および拡散速度が速く不良な予後をもたらす傾向がある。
【０２４０】
これら２種類の主な肺がんに加えて、その他の腫瘍が肺に起こる可能性がある。これらの一部は、非がん性（良性）である。肺のカルチノイド腫瘍は、肺腫瘍の５％未満を占める。大部分は、典型的なカルチノイド腫瘍と呼ばれる進行の遅い腫瘍である。それらは一般に外科手術により治癒する。一部の典型的なカルチノイド腫瘍は広がる可能性もあるが、それらは通常、小細胞または非小細胞肺がんよりも良好な予後を有する。良性カルチノイドと小細胞肺がんの間の中間にあるがんは、非定型カルチノイド腫瘍として知られている。
【０２４１】
＜肺がんのステージ＞
ステージ決定とは、がんがどのように局在するかまたは広範囲に及んでいるかを決定するプロセスである。ステージは、がんがどの程度まで広がったかを表現する。治療および予後は、かなりの程度まで、がんのステージによって決まる。ＣＴ、ＭＲＩ、スキャン、骨髄生検、縦隔鏡、および血液検査などの試験を用いてそのがんが示される（ｓｔａｇｅ）。
【０２４２】
＜非小細胞肺がんのステージ決定＞
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の増殖および拡散を説明するために用いるシステムは、対米国がん病期分類合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）システムとしても知られている、ＴＮＭステージングシステムである。Ｔは、腫瘍を表し（腫瘍サイズ、ならびに、肺の内部および近傍の器官にどの程度まで腫瘍が広がったか）、Ｎは、リンパ節への転移を表し、Ｍは、転移を表す（遠位器官への拡散）。ＴＮＭステージングでは、腫瘍、リンパ節、および転移についての情報を組み合わせて、特定のＴＮＭ分類にステージが指定される。グループ分けされたステージは、数字０とＩ〜ＩＶ（１〜４）のローマ数字を用いて記載される。一部のステージはＡとＢに細分されている。
【０２４３】
一部のがんにおいて、グレードと呼ばれる別の基準が使用される。これは、がんがいかに速く増殖し、どのように拡散する可能性があるかの病理学者の評価を反映するものである。これは、通常、肺がんには行われない。
【０２４４】
＜非小細胞肺がんのＴステージ＞
Ｔｉｓ：がんは、気道の内側を覆う細胞の層にのみ見出される。それはまだその他の肺組織を浸潤していない。このステージは、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）としても公知である。
【０２４５】
Ｔ１：がんは、３センチメートル以下（わずかに１１／４インチ未満）であり、肺を取り囲む膜（臓側胸膜）まで拡散しておらず、気管支の主な分岐を冒していない。
【０２４６】
Ｔ２：がんは、次の特徴のうちの１以上を有する。３ｃｍよりも大きい。主な気管支に浸潤しているが、気管（ｔｒａｃｈｅａ）（気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ））が左右の（ｌｅｆｔ  ａｎｄ  ｎｉｇｈｔ）主な気管支（気管分岐部）に分岐しているポイントに対して２ｃｍ（約３／４インチ）よりも近くない。肺を取り囲む膜（胸膜）まで拡散している。がんは、部分的に気道を詰まらせる可能性があるが、これが肺全体を崩壊させるかまたは肺炎を発症させる原因にはなっていない。
【０２４７】
Ｔ３：がんは、次の特徴のうちの１以上を有する。胸壁、胸部を腹部（横隔膜）から分離する呼吸筋、２つの肺の間の空間を取り囲んでいる膜（縦隔胸膜）、または心臓を取り囲んでいる嚢の膜（壁側心膜）まで拡散している。主な気管支を浸潤し、気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ）（気管（ｔｒａｃｈｅａ））が左右の主な気管支に分岐しているポイントに対して２ｃｍ（約３／４インチ）よりも近いが、この領域を冒していない。肺全体を崩壊させるかまたは肺全体で肺炎を発症させる原因となるほど気道の中まで増殖している。
【０２４８】
Ｔ４：がんは、次の特徴のうちの１以上を有する。胸骨の後かつ心臓の前の空間（縦隔）、気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ）が左右の主な気管支に分岐する場所まで拡散している。２以上の離れた腫瘍結節が、同じ葉、気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ）（気管（ｔｒａｃｈｅａ））、食道（咽頭と胃をつないでいる管）、背骨、またはポイントに存在している。肺を取り囲んでいる空間に流体を含むがん細胞が存在する。
【０２４９】
＜非小細胞肺がんのＮステージ＞
Ｎ０：リンパ節まで拡散していない。
【０２５０】
Ｎ１：肺の中のリンパ節まで拡散している、および／または気管支が肺に入る領域（肺門リンパ節）の周囲に局在している。転移は、がん性の肺と同じ側のリンパ節のみに及ぶ。
【０２５１】
Ｎ２：気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ）が左右の気管支に分岐するポイントの周囲のリンパ節または胸骨の後かつ心臓の前の空間（縦隔）内まで拡散している。罹患したリンパ節は、がん性の肺と同じ側である。
【０２５２】
Ｎ３：がん性の肺のどちらかの側の鎖骨の近くのリンパ節まで、がん性の肺の反対側の肺門もしくは縦隔リンパ節まで拡散している。
【０２５３】
＜非小細胞肺がんのＭステージ＞
Ｍ０：遠位器官または領域への拡散はない。遠位と見なされる部位としては、肺のその他の葉、Ｎステージで言及したリンパ節よりも遠いリンパ節、および、肝臓、骨、または脳などのその他の器官または組織が挙げられる。
【０２５４】
Ｍ１：がんが遠くまで拡散した。
【０２５５】
＜非小細胞肺がんのステージの分類＞
ひとたびＴ、Ｎ、およびＭのカテゴリーが割り当てられると、この情報を総合（ステージをグループ分け）して、０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの全体的なステージを割り当てる。ステージの数の小さい患者は、より良好な予後を有する。
【０２５６】
ステージ０；Ｔｉｓ、Ｎ０、Ｍ０：がんは、気道の内側を覆っている細胞の層にのみ見出される。がんはその他の肺組織を浸潤することもリンパ節または遠位部位まで拡散することもない。
【０２５７】
ステージＩＡ；Ｔ１、Ｎ０、Ｍ０：がんは、３ｃｍ以下であり、肺を取り囲む膜まで拡散しておらず、気管支の主な分岐を冒さず、かつリンパ節または遠位部位まで拡散していない。
【０２５８】
ステージＩＢ；Ｔ２、Ｎ０、Ｍ０：がんは、３ｃｍよりも大きいか、または主な気管支に浸潤しているが、気管分岐部の近くにないか、または胸膜まで拡散したか、またはがんが部分的に気道を詰まらせている。がんはリンパ節または遠位部位まで拡散していない。
【０２５９】
ステージＩＩＡ；Ｔ１、Ｎ１、Ｍ０：がんは、３ｃｍ以下であり、肺を取り囲む膜まで拡散しておらず、気管支の主な分岐を冒していない。がんは近傍または肺門リンパ節まで拡散しているが、遠位部位には拡散していない。
【０２６０】
ステージＩＩＢ；Ｔ２、Ｎ１、Ｍ０またはＴ３、Ｎ０、Ｍ０：がんは、３ｃｍよりも大きいか、または主な気管支に浸潤しているが、気管分岐部の近くにないか、または胸膜まで拡散したか、またはがんが部分的に気道を詰まらせている。がんは近傍または肺門リンパ節まで拡散しているが、遠位部位には拡散していないか、あるいは、がんは、胸壁または横隔膜、縦隔胸膜、または心臓を取り囲んでいる膜まで拡散しているか、または、がんは、主な気管支に浸潤し、気管分岐部の近くにあるか、または、がんは、肺全体を崩壊させるかまたは肺全体で肺炎を発症させる原因となるほど気道の中まで増殖している。がんはリンパ節または遠位部位まで拡散していない。
【０２６１】
ステージＩＩＩＡ；Ｔ１もしくは２、Ｎ２、Ｍ０、またはＴ３、Ｎ１もしくは２、Ｍ０：がんはどのようなサイズであってもよく、またはがんは主な気管支に浸潤しているが気管分岐部の近くにないか、または胸膜まで拡散したか、またはがんは部分的に気道を詰まらせている。がんは、胸部の中央（縦隔）にある結節まで拡散したが、遠位部位には拡散していない、あるいは、がんは、胸壁または横隔膜、縦隔胸膜、または心臓を取り囲んでいる膜まで拡散しているか、または、がんは、主な気管支に浸潤し、気管分岐部の近くにあるか、または、がんは、肺全体を崩壊させるかまたは肺全体で肺炎を発症させる原因となるほど気道の中まで増殖している。がんは、がんと同じ側の胸部のあらゆる場所でリンパ節まで拡散しているが、遠位部位まで拡散していない。
【０２６２】
ステージＩＩＩＢ；Ｔ１、２もしくは３、Ｎ３、Ｍ０、またはＴ４、Ｎ０、１、２もしくは３、Ｍ０：がんはどのようなサイズであってもよい。がんは、どちらかの側の鎖骨の周囲のリンパ節、またはがん性の肺の反対側の肺門もしくは縦隔リンパ節まで拡散しているか、あるいは、がんは、縦隔、心臓、気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ）（気管（ｔｒａｃｈｅａ））、食道（咽頭と胃をつないでいる管）、背骨、または気管分岐部まで拡散しているか、または２２以上の離れた腫瘍結節が同じ葉に存在するか、または肺を取り囲んでいる空間に流体を含むがん細胞が存在する。がんは、リンパ節まで拡散していてもしていなくてもよい。がんは、遠位部位には拡散していない。
【０２６３】
ステージＩＶ；Ｔのいずれか、Ｎのいずれか、Ｍ１：がんが遠位部位まで拡散している。
【０２６４】
＜小細胞肺がんのステージング＞
小細胞肺がんをＮＳＣＬＣのようにステージ分類することもできるが、大抵の医師は２病期方式（２−ｓｔａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を好む。これらは、「限局期（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｔａｇｅ）」と「進行期（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｓｔａｇｅ）」である。限局期は、通常、がんが一方の肺および同じ側の胸部のリンパ節にのみ存在することを意味する。
【０２６５】
がんのもう一方肺、もう一方の側の胸部のリンパ節、または遠位器官への拡散は、広範囲に及ぶ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）疾患を示す。多くの医師は、肺の周囲の流体にまで拡散した小細胞肺がんを進行期と見なす。
【０２６６】
小細胞肺がんは、このようにしてステージ分類される。それにより有望な予後を有し治癒する可能性のある患者を、見通しが悪く治癒の見込みのない患者から分けるのに役立つためである。小細胞肺がんの患者の約３分の２は、そのがんが最初に発見される時に広範囲に及ぶ疾患を有する。
【０２６７】
本明細書に記載される方法および組成物は、肺がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、肺がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０２６８】
＜扁平上皮癌＞
扁平上皮癌は、米国特許第６，４３２，４５２号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０２６９】
皮膚の太陽光の紫外光成分へ皮膚を露出することと、皮膚がん、例えば、悪性黒色腫および非黒色腫皮膚がん、主に基底細胞癌（ＢＣＣ）および扁平上皮癌（ＳＣＣ）などの発症との間には強い関連がある。これらのがんの発生率は、世界中で急速に増加している。英国では、１９９４年に４０００の新規診断症例が悪性黒色腫であった、これは過去１０年の間で８０％の増加である（Ｗｅｓｓｅｘ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｕｓｔ，１９９６）。米国では、およそ３４，１００の新規症例が予想され、１年あたり４％の増加である。オーストラリアのクイーンズランド州は世界で黒色腫の発生率が最も高いが、早期検出および広範な公衆衛生キャンペーンおよび日焼け止めの使用促進および紫外線曝露の減少が、死者の数を減らすことに役立った。ＢＣＣは現在英国の人口の１，０００人に１人が罹患し、発生率は過去２０年で２倍を上回った（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄ，Ｕ．Ｋ．，１９９７）。１９９０年の６００，０００件および１９８０年の４００，０００件と比較して、１９９７年に米国では１００万件のＢＣＣおよびＳＣＣの新規症例が診断されることが予測される（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｃｅａｎｉｃ  ａｎｄ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９７）。オーストラリアでは、太陽光線および紫外線の危険性（クイーンズランド住民が最も大きいリスクがある）を広範に宣伝しているにもかかわらず、同じように増加する発生率が同様に当てはまらないと思う理由がない。
【０２７０】
全ての皮膚がんの９０％超が、太陽光またはその他の紫外線に定期的に曝されている皮膚の領域に生じ、ここでＵ．Ｖ．Ｂ．は、皮膚の熱傷の原因であり、悪性黒色腫に関係し、Ｕ．Ｖ．Ａ．は、未成熟な皮膚の老化ならびにＢＣＣおよびＳＣＣの発症に関係する（Ｗｅｓｓｅｘ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｕｓｔ，１９９６）。小児期の太陽への露出は、若年成人における悪性黒色腫の発症に関連している。その他の危険因子には、遺伝的素因（色白、多くの皮膚のほくろ）、化学的汚染、Ｘ線への過剰な曝露、および何らの薬物や殺虫剤への曝露が含まれる。成層圏のオゾン層の枯渇は、皮膚がんの長期的増加の一因であると考えられる。
【０２７１】
外科的切除が、悪性黒色腫、ＢＣＣおよびＳＣＣに対する群を抜いて最も一般的な治療である。これは、電気乾固および掻爬術、凍結手術、単純な広範切除、顕微鏡手術、またはレーザー療法の形態をとり得る。がんが発症の後期に検出された場合に使用されるその他の治療は、外部照射療法、化学療法または程度は低くなるが生体免疫療法または光線力学的療法である。治療の選択は、疾患の種類およびステージ、ならびに患者の年齢および健康によって決まる（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９７）。
【０２７２】
現在の治療はすべて、深刻な制限に悩まされている。主要な懸念は、切除部位でのがん性細胞の認識が不良であること、および再発の可能性が高いことであり、その結果フォローアップ手術および治療を必要とし、さらに美観を損ない瘢痕化するリスクがある。１つの刊行物では、不完全に切除されたＢＣＣが報告される割合は３０〜６７％であった（Ｓｕｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｇｇｉｎｓ，１９９６）。外科手術に関連する免疫抑制は、あらゆる残存細胞を増殖させ、転移のリスクを増大させる可能性がある。黒色腫患者において、最初の手術の時点でがんがすでに転移しているという高い危険性が存在し、死に至る遅発性再発が一般的である。現在の手術の代替法、例えば放射線療法および化学療法なども、免疫抑制および特異性の不足というリスクを有する。免疫療法および遺伝子療法は最も期待できるが、これらの合理的適用は、まだ数十年先となりそうである。
【０２７３】
腫瘍が手術を受け入れられるステージを過ぎている場合、全ての種類の黒色腫または転移性皮膚がんの最も一般的な治療は化学療法であり、これは大部分が不成功である（Ｂｅｌｊａｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｃｒｏｃｈｅｔ，１９９６）。
【０２７４】
本明細書に記載される方法および組成物は、扁平上皮癌の検出、診断、治療または予防に適している。それらは、扁平上皮癌を治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０２７５】
＜膵臓がん＞
膵臓がんは、米国特許第７，４０５，２２７号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０２７６】
膵臓がんは、膵管組織の類上皮細胞癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および膵管の腺癌を含み得る。
【０２７７】
最も一般的な種類の膵臓がんは、腺癌であり、膵管の内層に起こる。膵臓がんに利用できる可能性のある治療は、外科手術、免疫療法、放射線療法、および化学療法である。可能性のある外科的治療の選択肢には、膵尾部切除術または膵全摘出術および膵頭十二指腸切除術（ウィップル手順）が含まれる。
【０２７８】
放射線療法、特に身体の外の機械によって放射線を腫瘍に集中させる外部照射は、膵臓がん患者の選択肢であり得る。もう一つの選択肢は、手術中に投与される術中電子線照射である。
【０２７９】
化学療法を用いて膵臓がん患者を治療することができる。適切な抗がん薬としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、マイトマイシン、イホスファミド、ドキソルビシン、ストレプトゾシン（ｓｔｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、クロロゾトシン、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０２８０】
本明細書に記載される方法および組成物は、膵臓がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、膵臓がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０２８１】
＜脳がん＞
脳がんは、米国特許第７，１４８，２５２号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０２８２】
脳腫瘍の発生率は毎年約１０，０００であり、脊髄腫瘍の発生率は毎年約４０００である（Ｋｏｍｂｌｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄ．，ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４１：Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）。中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍は、若年患者における最も一般的な固形腫瘍の群をなす（同上文献）。神経膠腫は、全原発性ＣＮＳ腫瘍の約６０％を占め、最も一般的な大脳の原発腫瘍は、星状細胞腫、髄膜腫、乏突起細胞腫および組織球性リンパ腫（ｈｉｓｔｏｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）である（同上文献）。神経膠腫は、通常、脳の大脳半球に生じるが、視神経、脳幹または小脳などのその他の領域にも見出すことができる（Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ；ｗｗｗ／ｔｂｔｓ．ｏｒｇ／ｐｒｉｍａｒｙ．ｈｔｍ）。
【０２８３】
神経膠腫は、それらが生じるグリア細胞の種類に従ってグループに分類される（同上文献）。最も一般的な種類の神経膠腫は星状細胞腫である。これらの腫瘍は、星状細胞と呼ばれる星の形状をしたグリア細胞から発生する。星状細胞腫には、それらの悪性度に応じてグレードが割り当てられる。グレードＩ及びＩＩ星状細胞腫としても知られる低グレードの星状細胞腫は、悪性度が最も小さく、比較的ゆっくりと増殖し、多くの場合外科手術を用いて完全に除去することができる。グレードＩＩＩ星状細胞腫としても知られる中グレード星状細胞腫は、より急速に増殖し、より悪性度が大きい。グレードＩＩＩ星状細胞腫は、外科手術に続いて放射線及び何らかの化学療法で治療される。グレードＩＶ星状細胞腫としても知られる高グレード星状細胞腫は、急速に増殖し、近傍の組織に浸潤し、非常に悪性度が大きい。グレードＩＶ星状細胞腫は、通常、外科手術に続いて放射線療法と化学療法の組合せによって治療される。多形性膠芽腫は、グレードＩＶ星状細胞腫であり、最も悪性度が大きく、致命的な原発性脳腫瘍である（同上文献）。
【０２８４】
従来、星状細胞腫の治療は、腫瘍を除去するための外科手術、その後に続く放射療法を伴ってきた。化学療法を放射線療の前または後に投与することもできる（Ｋｏｒｎｂｌｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄ．，ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４１：Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）。同じ外科的手法および原理が、多形性膠芽腫および悪性度の低い脳腫瘍を治療するために適用されてきたが、多形性膠芽腫腫瘍の完全除去は、実現することが一層困難であった（同上文献）。
【０２８５】
グレードＩＶ星状細胞腫脳腫瘍を有すると診断された患者の予後は、従来不良であった。グレードＩ星状細胞腫に対して治療された人は、一般に再発することなく１０年以上生存することができるが、グレードＩＶ星状細胞腫の患者の平均生存期間は、外科的治療後１５週間である。グレードＩＶ星状細胞腫腫瘍の悪性増殖能が高いため、外科的治療単独の後１年間生存した患者はたった５％であり、２年後の生存率はほぼ０％である。放射線治療を外科的治療と組み合わせると、治療の２年後の生存率は約１０％に増加する；しかし、５年より長く生存する患者は実質的に存在しない（同上文献）。
【０２８６】
ニトロソ尿素化学療法薬は、これまで脳腫瘍の治療に通常使用されてきた。これらの化合物の重要な特性は、それらが血液脳関門を横断できることである。１−３−ビス−２−クロロエチル−１−ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ、カルムスチンとしても公知）は、これらの化合物のうち臨床的に使用された最初の化合物であった。ＢＣＮＵを外科手術および／または放射線治療と組み合わせて使用することが有益であると示されてきたが、それは多形性膠芽腫脳腫瘍を治癒させていない。その上、長期間のニトロソ尿素治療による合併症が報告されている（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．６０，１２５７  １２６１）。これらの合併症としては、肺線維症、肝障害（ｈｅｐａｔｉｃ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）、腎不全およびニトロ尿素治療に付随する続発性腫瘍の症例が挙げられる。
【０２８７】
がん治療におけるエストロゲン受容体モジュレーターであるタモキシフェンおよびラロキシフェンの使用も調査された。タモキシフェンは、再発性悪性膠腫の治療を伴うヒト臨床試験で使用された（Ｃｏｕｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２，６１９  ６２２）。ラロキシフェンは、ラットモデルにおいて尾腫瘍の肺への転移を抑制することが示された（Ｎｅｕｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２７，２２０  ２２９）。
【０２８８】
外科手術、放射線療法及び化学療法の治療処置は、グレードＩＶ星状細胞腫脳腫瘍の患者に寿命を適度に延ばす機会をもたらすが、それぞれの治療方法に付随するリスクは多い。治療の利益はわずかであり、治療により患者の短い余寿命の質を著しく低下させる可能性がある。
【０２８９】
本明細書に記載される方法および組成物は、脳がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、脳がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０２９０】
＜食道がん＞
食道がんは、米国特許第７，２２３，４０５号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０２９１】
食道がんは、食道（食物を口から胃へと推進させる筋肉の管）の悪性腫瘍である。食道がんは北米では比較的まれで、北米での発生率は１００，０００人のうち５人未満であるが、世界のその他の領域、特に中国、日本、イランおよび南アフリカにおいては、その有病率はほぼ流行病の割合に達している。しかし、西欧諸国でも食道がんに罹患している人の数は、過去数十年にわたって増加の一途をたどっている。例として、１９９４年から１９９９年の間、米国での食道がんの年間発生率は、１９７４年から１９８９年までの発生率の４〜５倍であり、その間の食道がんの年間発生率は、１９３５年から１９７１年までの発生率の５〜６倍である。
【０２９２】
食道の癌腫は、ほとんどの場合、５０歳以上の男性に生じる。男性対女性の比は、およそ３：１である（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．３０：３９  ４４）。食道がんの正確な原因は不明であり、多様な病因的因子が食道がんの原因として疑われる。遺伝的要因は、常染色体優勢形質として受け継がれた手掌足底角化症（胼胝症）というまれな状態の個体を除いて関与しないと思われる。食道がんの発生率の高い中国の地域から得た食物および水試料中のニトロソアミンおよびそれらの前駆体（硝酸塩および亜硝酸塩）の濃度が高いため、食事要因が関与する可能性がある。その他のリスク因子としては、喫煙、アルコール消費、社会経済的地位が低いことおよび欠乏食が挙げられる。胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）の合併症であるバレット食道も、食道がんの発症のリスク因子である。
【０２９３】
嚥下障害は、食道がんの患者の群を抜いて最も頻度の高い訴えである。固体または液体を嚥下することの困難、食物の逆流、胸焼け、血液嘔吐および摂食に無関係の胸部痛（ｃｈｅｓｔ  ｐｌａｎ）が、その他の共通する症状である。食道がんに付随する合併症としては、重度の体重減少および身体のその他の部分への腫瘍の拡散が挙げられる。疾患のステージの進行を示唆する徴候としては、頚部リンパ節腫大（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）；気管の浸潤を示唆する慢性咳嗽；瘻孔と気管気管支樹を示唆する食後の窒息；隣接する血管構造への病変の穿孔を示唆する、大量の喀血または吐血あるいはその両方；及び、再発性咽頭神経麻痺を示唆する嗄声が挙げられる。
【０２９４】
嚥下困難を訴える患者に多くの場合用いられる診断手順は、ガリウム６７またはコバルト５７飲み込み、ＥＧＤ（食堂胃十二指腸内視鏡検査）、生検、胸部ＭＲＩ、胸部ＣＴ（疾患のステージを決定するために通常使用される）、ＰＥＴスキャンの使用、および便中の潜血の徴候に及ぶ。内腔狭窄で不規則なでこぼこした粘膜パターンという特徴的な知見は、食道の癌腫の典型である。良性の閉塞性病変とは違って、食道がんは、食道の近位拡張に通常関係しない。
【０２９５】
食道がんには２つの主な種類がある、扁平上皮癌および腺癌である。ある時には、扁平上皮癌はこれら２種類のがんのうちではるかに一般的であって、以前は全食道がんのほぼ９０％を担っていた。しかし、最近の医学研究により、扁平上皮癌は現在の食道がんの約３分の２を構成するに過ぎないことが示されている。食道全体は通常扁平細胞で内側を覆われているので、扁平上皮癌は食道の長さに沿ってどこにでも生じ得る。一方、腺癌は、普通は食道を覆っていない腺組織で起こり、通常バレット粘膜の異形成から生じる。唾液腺に生じる腫瘍と顕微鏡像が類似する、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫および偽肉腫などの腫瘍は、食道の腺腫瘍（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｔｕｍｏｒｓ）の残りの大部分を占める。肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌および燕麦細胞癌は、一緒に全悪性食道腫瘍の１パーセント未満を表す。
【０２９６】
食道がんのステージ決定は、１９８８年に発行された、米国がん病期分類合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）による、ＴＮＭステージングの改正された判定基準に基づく。ステージ決定は、がんがその元の部位から拡散した程度を表現するプロセスである。それを用いて、患者の予後を評価し、療法の選択を決定する。がんのステージは、原発腫瘍のサイズおよび身体内の位置、ならびにそれが身体のその他の部位まで拡散したかどうかによって決定される。ステージ決定は、Ｔ、ＮおよびＭの文字を用いて、原発腫瘍のサイズ（Ｔ）、所属リンパ節の浸潤の程度（Ｎ）、および、遠位転移（元の（原発）腫瘍から遠位器官または遠位リンパ節まで拡散したがん）の欠如または存在（Ｍ）によって腫瘍を評価することを伴う。これらのカテゴリーの各々は、１から４の数字でさらに分類されて、全てのステージを与える。Ｔ、ＮおよびＭが決定されると、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの「ステージ」が割り当てられる。ステージＩのがんは、小さく、局在し、通常治療できる。ステージＩＩおよびＩＩＩのがんは、一般に局所的に進行し、かつ／または局所リンパ節まで拡散している。ステージＩＶのがんは、通常転移性であり（身体の遠位部位まで拡散した）、一般に手術不可能であるとみなされる。
【０２９７】
従来の治療選択肢には、腫瘍および食道の全部または一部を除去するための外科手術（食道切除）、化学療法および放射線療法が含まれる。外科手術は、初期ステージの腫瘍の一般的な選択であり、がんが食道に限局される場合に疾患を治癒させる頻度が高い。しかし、がんが食道の外に拡散した患者に関して（転移性疾患）、治癒は一般に可能性がなく、治療は症状の軽減に対して行われる（緩和療法）。患者が嚥下する能力を向上させるために用いることのできるその他の様式としては、食道を開けるための内視鏡による食道の拡張（ステント設置の場合もある）、または光線力学的療法が挙げられる。
【０２９８】
食道がんの最終的治療において放射線療法を単独療法として使用すると、腫瘍に対する総線量を増加させ、照射された正常組織の量を減少させるための努力にもかかわらず、ほとんど成功しなかった。放射線治療した患者の平均生存期間は、１２ヶ月前後であり、長期の生存はほとんどない（Ｂｅａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｃａｎｃｅｒ  ４３：２２５４  ６７；Ｎｅｗａｉｓｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｃｌｉｎ  Ｒａｄｉｏｌ．３３：３４７  ３５２；Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８０，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．７９：６７  ７３）。放射線単独による最良の結果は、Ｐｅａｒｓｏｎが報告した系によってもたらされ、そこでは１画分で５０Ｇｙ、２．５Ｇｙの後に、１７％の５年生存率が実現された（１９７７，Ｃａｎｃｅｒ  ３９：８８２  ９０）。しかし、４９系からの８，４００名以上の患者からなるＥａｒｌａｍおよびＣｕｎｈａ−Ｍｅｌｏの再調査は、全体的な１年、２年および５年生存率が、それぞれ１８％、８％および６％であったと結論付けた（１９８０，Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．６７：４５７  ６１）。さらに、根治的治療をするかまたは緩和を実現するために必要な放射線量が４０Ｇｙを超えるため、大部分の患者はいくらかの程度の嚥下障害を経験する。
【０２９９】
食道がんの管理における化学療法の役割は、継続的に進化している。多くの場合、放射線による化学療法が、外科手術を補助して使用される。一般に、化学療法は、たとえ再発性または転移性疾患の患者においてさえ、最大１５％〜２０％の長期生存率を実現することができる（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４（８）：１２２３  ３０）。残念ながら、初回化学療法に対する初期奏功率が高いことは、延命効果とならないように思われる（Ｋｏｈｎｏ  ａｎｄ  Ｋｉｔａｈａｒａ，２００１，Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ  ２８（４）：４４８  ５３）。さらに、化学療法に付随する多くの望ましくない副作用、例えば一時的な抜け毛、口の痛み、貧血（疲労、めまい、および息切れを引き起こし得る赤血球数の減少）、白血球減少症（感染に対する抵抗性を低下させ得る白血球数の減少）、血小板減少症（容易に出血または挫傷を導き得る血小板数の減少）、ならびに、悪心、嘔吐、および下痢のような胃腸症状などがある。有効な化学療法薬としては、ブレオマイシン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、オキソルビシン（ｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メトトレキサート、パクリタキセル（タキソール）、およびイリノテカン（ＣＰＴ−１１、またはカンプトサール）が挙げられる。
【０３００】
本明細書に記載される方法および組成物は、食道がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、食道がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０３０１】
＜胃がん＞
胃がんは、米国特許第６，９６２，７７９号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０３０２】
胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）とも呼ばれる、胃のがん（ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ）は、多くの場合、初期段階での診断が困難であり、長い間胃の中にあって、大きいサイズに増殖した末にやっと症状が出る可能性がある。このがんは、近接しているために、高い頻度で小腸に転移する。
【０３０３】
胃がんの初期段階では、個体は、消化不良および胃の不快感、食後の膨張感、軽度の悪心、食欲不振または胸焼けを経験し得る。さらに進行した段階の胃がんでは、血便、嘔吐、体重減少または一層の激痛が起こり得る。
【０３０４】
これらの種類のがんの発生頻度（１年だけで結腸および直腸がんの新規症例はおよそ１６０，０００）、高リスク群の同定、実証された一次病巣の遅延増殖性、および初期病巣のより良好な生存のために、胃腸がんのスクリーニングは、５０歳で開始する、全ての成人、特に結腸直腸がんを有する第一度近親者をもつ成人に対する日常的なケアの一部であるべきである。
【０３０５】
結腸、小腸または胃のがんを検出、診断、モニター、ステージ決定、および予測するために用いる手順は、患者の成績（ｏｕｔｃｏｍｅ）に非常に重要である。初期段階のがんと診断された患者は、一般に、遠隔転移がんと診断された患者の生存率と比較して、５年をはるかに上回る生存率を有する。初期の胃、小腸および結腸のがんを検出するのにより感受性が高く、特異的な新規な診断方法が、明らかに必要とされる。
【０３０６】
胃腸がんの患者は、初期療法の後およびアジュバント療法の間に厳密にモニターされ、療法に対する応答を決定し、持続性もしくは再発性疾患の転移を検出する。これらの種類のがんの再発を検出する際の、より感受性が高く、特異的ながんマーカーに対する必要性が明らかに存在する。
【０３０７】
胃腸がんを管理する際のもう一つの重要な段階は、患者の疾患のステージを決定することである。ステージ決定は、起こり得る予後値（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ）を有し、最適な療法を設計するための判定基準を提供する。一般に、病理学的病期のほうがより正確な予後を与えるので、がんの病理学的病期が臨床病期よりも好ましい。しかし、それが病理学的病期と少なくとも同程度に正確であるならば臨床病期が好ましい。なぜなら、臨床病期は、病理学的評価用に組織を得るための侵襲的手技に依存しないためである。胃腸がんのステージングは、細胞、組織、または体液中で、異なる段階の浸潤を区別することのでき得る新規なマーカーを同定することにより改良される。
【０３０８】
本明細書に記載される方法および組成物は、胃がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、胃がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０３０９】
＜膀胱がん＞
膀胱がんには、膀胱の移行上皮癌が含まれる。膀胱がんは、尿路上皮癌（移行上皮癌）または膀胱の内側を覆う尿路上皮細胞の腫瘍である。膀胱がんの残りの症例は、扁平上皮癌、腺癌、および小細胞がんである。それらが非浸潤性であるかまたは浸潤性であるか、およびそれらが乳頭状であるかまたは扁平であるかによって、数種類の尿路上皮癌のサブタイプが存在する。非浸潤性の腫瘍が、膀胱の最内層である尿路上皮に存在するのに対して、浸潤性腫瘍は、尿路上皮から膀胱の主な筋層（ｍｕｓｃｌｅ  ｗａｌｌ）のより深い層に拡散している。浸潤性の乳頭状尿路上皮癌は、膀胱の中空の中に分岐し、かつ膀胱壁の中に外側にも増殖する細長い指のような突起である。非浸潤性の乳頭状尿路上皮腫瘍は、膀胱の中心に向かって増殖する。非浸潤性の扁平尿路上皮腫瘍（扁平上皮内癌とも呼ばれる）が、膀胱の内部の空洞部分に最も近い細胞層に限定されるのに対して、浸潤性の扁平尿路上皮癌は、膀胱の深層、特に筋層に浸潤する。
【０３１０】
膀胱がんを治療するため、外科手術、放射線療法、免疫療法、化学療法、またはそれらの組合せが適用されてよい。一部の可能性のある外科的選択肢は、経尿道的切除術、嚢胞切除術、または根治的膀胱全摘術である。膀胱がんに対する放射線療法には、外部照射と近接照射療法が含まれてよい。
【０３１１】
免疫療法は、膀胱がん患者を治療するために使用されるもう一つの方法である。一般に、これは膀胱内で達成され、カテーテルを経由して膀胱に直接治療薬が投与される。一方法が、結核ワクチン接種に時々使用される細菌を、直接カテーテルを通して膀胱に投与されるカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）である。身体は、この細菌に対する免疫応答を開始し、それによりがん細胞を攻撃し、死滅させる。
【０３１２】
免疫療法のもう一つの方法は、免疫応答を調節する糖タンパク質であるインターフェロンの投与である。インターフェロンαは、多くの場合、膀胱がんを治療するために使用される。
【０３１３】
膀胱がんを治療するために化学療法で使用されてよい抗がん薬としては、チオテパ（ｔｈｉｔｅｐａ）、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、イホスファミド、ゲムシタビン、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０３１４】
本明細書に記載される方法および組成物は、膀胱がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、膀胱がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０３１５】
＜皮膚がん＞
皮膚がんは、米国特許第６，７９２，１３７号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０３１６】
皮膚がんは、その最も致命的な形態が黒色腫であるが、一般に、皮膚科医が患者の色素性の皮膚病変（口語的に「ほくろ（ｍｏｌｅｓ）」として知られている）および／またはその他の皮膚の異常を調べることによって診断される。一般に、皮膚科医は、一つ一つの皮膚病変の形態の目視検査に基づいて、それが皮膚がんまたは皮膚がんの潜在的前駆体である可能性があるかどうかを決定する。この決定は、患者の臨床歴、皮膚がんに対するリスク因子、およびその他の情報に照らして行われる。次に、皮膚科医は、色素性の病変を病理組織学的評価のために切除するべきであるかどうかを決定する。
【０３１７】
皮膚黒色腫は、皮膚の最上層、すなわち表皮で増殖を開始する。それがまだ表皮に限局されている間に検出されて完全に除去されれば、完全に治癒することができ、それがその次の表皮層である乳頭状真皮にちょうど入ったばかりであれば、治癒率は非常に高い。従って、スクリーニングおよび早期発見が、発生率が急速に増加している、若者、特に若い女性の最も一般的ながんの一つであるこのがんの罹患率および死亡率を低下させるためにきわめて重要である。
【０３１８】
１９９２年に、米国国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の主催するコンセンサス会議（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）は、米国で皮膚がんのスクリーニングを開始することを推奨したが、一次診療医がそれを行うための十分な実習をしないことを認めた。
【０３１９】
本明細書に記載される方法および組成物は、皮膚がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、皮膚がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０３２０】
本明細書に記載される方法および組成物は、皮膚がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、皮膚がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０３２１】
＜卵巣がん＞
卵巣がんは、米国特許第７，３２１，０３０号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０３２２】
ヨーロッパおよび米国において、卵巣がんは、五大主要がんの一つと考えられている。日本では、卵巣がんにより毎年約４，０００人が死亡し、犠牲者の数は過去４０年で約３０倍に急速に増加し、肺がんおよび膵臓がんとともに最も数の増加しているがんのうちの１つである。卵巣がんは腹腔に存在するため、早期に診断することが困難であり、卵巣がんの被膜は簡単に破れる、従って早期に腹腔に転移する傾向があり、患者の６０％が最終的に死亡する、従って膵臓がんとともに予後の不良ながんの一つである。外科的手法ならびにシスプラチンおよびタキソールなどの抗がん剤の開発による治療法のパフォーマンスの改良は認識されているが、治療上の措置のそれに続く改良はどれも有効ではなかった、従って、新規な治療方法の開発に対する必要性が存在する。
【０３２３】
本明細書に記載される方法および組成物は、卵巣がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、卵巣がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０３２４】
＜前立腺がん＞
前立腺がんは、米国特許第７，４７０，５１４号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０３２５】
前立腺のがんは、成人男性において、皮膚がんを除いて最も蔓延している悪性腫瘍であり、米国においてますます一般的な健康問題である。１９９６年に、米国では、４１，４００名の死亡はこの疾患が原因であると推定され、前立腺がんが同一集団中で最も一般的な死亡原因として肺がんに次いで２番目であることが示された。がんがまだ前立腺に限局されている早期に診断および治療されれば、治癒の可能性はきわめて高い。
【０３２６】
個体に対する治療決定は、その個体に存在する前立腺がんのステージに関連している。前立腺がんの拡散の一般的な分類が、米国泌尿器学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＡＵＡ）により作成された。ＡＵＡの分類は、前立腺腫瘍を４つのステージ、Ａ〜Ｄに分ける。ステージＡ（前立腺内部の顕微鏡レベルのがん）は、ステージＡ１およびＡ２にさらに細分される。下位ステージＡ１は、前立腺内部の１つの部位に限局される高分化型がんである。治療は、一般に観察、前立腺全摘除術、または放射線である。下位ステージＡ２は、前立腺内部の複数の部位の中分化〜低分化がんである。治療は、前立腺全摘除術または放射線である。ステージＢ（前立腺内部の触知できるしこり）は、ステージＢ１およびＢ２にさらに細分される。下位ステージＢ１では、がんは前立腺の１つの葉で小結節を形成する。下位ステージＢ２では、がんは大結節または多数の結節を形成するか、または前立腺の両方の葉に生じる。下位ステージＢ１およびＢ２の両方の治療は、前立腺全摘除術かまたは放射線である。ステージＣは、前立腺の大部分または全部を侵す大きな腫瘤であり、２つのステージにさらに細分される。下位ステージＣ１では、がんは前立腺を超えて拡大していてよい連続する腫瘤を形成する。下位ステージＣ２では、がんは周囲組織を浸潤する腫瘤を形成する。これらの下位ステージの両方の治療は、薬剤を伴うまたは伴わない放射線である。４番目のステージは、転移性がんであり、同様に２つのステージにさらに細分される。下位ステージＤ１では、がんは骨盤のリンパ節に出現する。下位ステージＤ２では、がんはリンパ節を超えて組織を侵す。これらの下位ステージの両方の治療は、がんならびに疼痛に対応する全身薬である。
【０３２７】
しかし、現行の前立腺がんステージ決定法は限られている。最初にＡ２、Ｂ、またはＣとしてステージ決定された前立腺がんの５０％程度が、実際はステージＤの、転移性である。転移性がんの患者は予後が一層不良であり、限局性のがんの患者よりもかなり違う療法を必要とするので、転移の発見は重要である。限局性前立腺がんの患者と転移性前立腺がんの患者の５年生存率は、それぞれ９３％および２９％である。
【０３２８】
本明細書に記載される方法および組成物は、前立腺がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、前立腺がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０３２９】
＜精巣がん＞
精巣がんは、米国特許第６，９８９，２５３号に詳細に記載され、その中から以下の段落を引用する。
【０３３０】
精巣がんは、男性の全てのがんの約１％にしか相当しないが、それは１５歳〜３５歳の間の若い男性で最も一般的ながんである。２０００年には、米国では推定７，６００症例の精巣がんおよびおよそ４００の死亡が診断された。白人はラテンアメリカ系アメリカ人よりも精巣がんになる可能性が高く、黒人またはアジア人よりもはるかに精巣がんになる可能性が高い。精巣がんの発生率は、デンマークで最も高く、極東で最も低い。憂慮することに、世界各国での精巣がんの発生率は、過去３０〜４０年でほぼ倍になっている。
【０３３１】
一般に、初期症状はない。大部分の精巣がんは、痛みのない塊、精巣の硬化またはサイズの変化（増大または減少）、陰嚢の重い感じまたは陰嚢に流体が突然集まること（ｓｕｄｄｅｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ）、下腹部または鼠径部の鈍痛、あるいは陰嚢または精巣の疼痛または不快感のいずれかで、男性が自分で発見する。全身症状は、通常転移、例えば肺の転移などを示し、呼吸困難または喀血、腹部腫瘤、あるいはリンパ節浸潤による尿道閉塞を引き起こす。時には、背部痛、胃痛、息切れ、持続性の乾性咳、および圧痛のある乳頭などのその他の症状が存在することもある。それにもかかわらず、精巣がんの早期診断は、特に重要である、なぜなら精巣がんは早期に発見されれば、ほとんどの場合治癒できるためである。がんが治療されなければ、がん細胞は元の部位から抜け出して近くのリンパ節まで拡散するが、その他の器官にはめったに拡散しない。
【０３３２】
精巣がんが存在するかどうかを知る唯一の確かな方法は、生検を行うことである。今まで、精巣がんの原因は不明である。停留精巣（ｕｎｄｅｓｃｅｎｄｅｄ  ｔｅｓｔｉｃｌｅ）または停留精巣（ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ）をもって生まれた子供は、外科手術を行って問題を矯正してもしなくても、精巣がんとなるリスクが増加する（３〜１４倍）（Ｆａｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３４：１０７１  １０７６）。研究により、精巣がんが時々、精巣が正常に発達しない特定のその他のまれな状態に関連していることも示された。研究により、母親が妊娠中に流産を防ぐためにＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）と呼ばれるホルモンを投与された一部の男性が、精巣異常を発症する可能性があることが示されている。一部の精巣がん患者は、陰嚢への損傷の病歴を有する。損傷またはスポーツによる緊張（ｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎ）が、精巣がんを発症するリスクを増大させる証拠はない。その他のリスク因子には、一方の精巣の以前の精巣がん、（特に後天性免疫不全症状群（ＡＩＤＳ）を発症している）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、および性染色体異常を伴い、低レベルの男性ホルモン、不妊、胸部肥大、および精巣萎縮をもたらすクラインフェルター症状群が含まれる。がんが二番目の精巣で生じない場合、それは大体最初の腫瘍からの転移よりはむしろ新しい疾患である。
【０３３３】
６０歳未満の男性において、精巣腫瘍の９５％は生殖細胞、精巣内の特別な精子形成細胞から発生する。精巣がんには主に２つの種類がある、精上皮腫と非精上皮腫（奇形腫とも呼ばれる）である。純粋精上皮腫は、全精巣がんの約４０パーセントを占め、未成熟生殖細胞で構成されている。通常、精上皮腫は、増殖速度が遅く、精巣に長期間限局性のまま留まる傾向がある。一方、非精上皮腫は、多くの場合、絨毛癌、胎生期癌、未熟奇形腫および卵黄嚢腫瘍を含む、相互に相まって生じるがんの一群である。非精上皮腫は、より成熟し分化した生殖細胞から生じ、精上皮腫よりも侵襲性である傾向がある。精巣がんのその他の形態としては、ライディッヒ細胞腫およびセルトリ細胞腫が挙げられる。ＰＮＥＴ、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、中皮腫などのさらに珍しい腫瘍は、精巣で起こり得る。
【０３３４】
精巣がんのステージングは、１９８８年に発行された、米国がん病期分類合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）による、ＴＮＭステージングの改正された判定基準に基づく。ステージングは、がんがその元の部位から拡散した程度を表現するプロセスである。それを用いて、患者の予後を評価し、療法の選択を決定する。がんのステージは、原発腫瘍のサイズおよび身体内の位置、ならびにそれが身体のその他の部位まで拡散したかどうかによって決定される。ステージ決定は、Ｔ、ＮおよびＭの文字を用いて、原発腫瘍のサイズ（Ｔ）；所属リンパ節の浸潤の程度（Ｎ）；および、遠位転移（元の（原発）腫瘍から遠位器官または遠位リンパ節まで拡散したがん）の欠如または存在（Ｍ）によって腫瘍を評価することを伴う。これらのカテゴリーの各々は、１から４の数字でさらに分類されて、全てのステージを与える。Ｔ、ＮおよびＭが決定されると、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの「ステージ」が割り当てられる。ステージＩのがんは、小さく、局在し、通常治療できる。ステージＩＩおよびＩＩＩのがんは、一般に局所的に進行し、かつ／または局所リンパ節まで拡散している。ステージＩＶのがんは、通常転移性であり（身体の遠位部位まで拡散した）、一般に手術不可能であるとみなされる。
【０３３５】
精巣がんは、早期に発見されれば、たとえそれが身体のその他の部位まで拡散していたとしても、ほとんどの場合治癒できる。具体的には、ステージＩの精上皮腫と診断された男性の生存率は、約９９％である。ステージＩの非精上皮腫と診断された男性の生存率は、約９８％である。ステージＩＩの腫瘍の治癒率は、９０％を上回る範囲であり、一方、ステージＩＩＩの腫瘍の治癒率は、５０〜８０％の間でさまざまである。さらに、患者が疾患から開放された後の精上皮腫と非精上皮腫の両方に対する再発率は非常に低い（５％未満）。
【０３３６】
精巣がんは、外科手術、放射線療法、化学療法、サーベイランス、またはこれらの治療の組合せによって治療することができる。精巣がんを治療するための最も一般的な外科手術は、精巣の完全除去である（高位精巣摘除術と呼ばれる）。外科医は、疾患を拡散させる危険のために、精巣の部分だけを除去しない。精巣がんは、通常非常に予測可能な経路によってリンパ節を通って上へ向かって肺に、その後外側に向かって肝臓、脳、および他の場所に拡散するので、時には、腹部深部のリンパ節を除去すること（ＲＰＬＮＤ術と呼ばれる）も必要である。その上、身体のその他の部位まで拡散した腫瘍は、外科手術によって部分的にまたは完全に取り除くことができる。残念ながら、リンパ節を除去するための外科手術は、勃起またはオルガズムを有する男性の能力を変えることはないが、射精に関与する神経に干渉し得るので、手術が不妊症を引き起こすことがあり得る。
【０３３７】
放射線療法は、外科手術のように局所治療であり、処置された領域の細胞にのみ作用する。精上皮腫は、放射線に高感受性であるが、非精上皮腫は放射線に対する感受性がはるかに低い。さらに、放射線療法は、精子産生に干渉し得るが、その影響は通常一時的である。放射線療法の一部のその他の不快な作用には、下痢および嘔吐が含まれる。処置された領域に皮膚反応が起こることもあり得る。
【０３３８】
精巣がんを治療するために数種類の薬剤：プラチノール（シスプラチン）、ベプシドまたはＶＰ−１６（エトポシド）およびブレノキサン（硫酸ブレオマイシン）、ブレオマイシン、エトポシド、およびシスプラチンが一般に使用される。その上、イフェックス（イホスファミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ））、ベルバン（硫酸ビンブラスチン）などが使用されてよい。多くの医療従事者が、プラチノールを、精巣がん治療のための「魔法の弾丸」とみなしている。その主な理由は、精巣がんが治癒できる疾患であると考えられていることである。しかし、化学療法は多くの副作用を引き起こす、なぜなら化学療法はがん細胞だけでなく、毛髪および歯肉組織などのその他の急速に増殖する細胞にも同様にダメージを与えるためである。望ましくない副作用としては、一時的な抜け毛、口の痛み、貧血（疲労、めまい、および息切れを引き起こし得る赤血球数の減少）、白血球減少症（感染に対する抵抗性を低下させ得る白血球数の減少）、血小板減少症（容易に出血または挫傷を導き得る血小板数の減少）、ならびに、悪心、嘔吐、および下痢のような胃腸症状などが挙げられる。
【０３３９】
多くの場合、放射線による化学療法が、外科手術を補助して使用される。一般に、化学療法は、たとえ再発性または転移性疾患の患者においてさえ、最大１５％〜２０％の長期生存率を実現することができる（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４（８）：１２２３  ３０）。残念ながら、初回化学療法に対する初期奏功率が高いことは、延命効果とならないように思われる（Ｋｏｈｎｏ  ａｎｄ  Ｋｉｔａｈａｒａ，２００１，Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ  ２８（４）：４４８  ５３）。さらに、化学療法に付随する多くの望ましくない副作用、例えば一時的な抜け毛、口の痛み、貧血（疲労、めまい、および息切れを引き起こし得る赤血球数の減少）、白血球減少症（感染に対する抵抗性を低下させ得る白血球数の減少）、血小板減少症（容易に出血または挫傷を導き得る血小板数の減少）、ならびに、悪心、嘔吐、および下痢のような胃腸症状などがある。
【０３４０】
がんに対して有効な化学療法薬の同定は、伝統的には、がんの様々な動物モデルの使用を伴った。マウスは、発癌（Ｓｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２０：１８７  １９８）、がん療法（Ｍａｌｋｉｎｓｏｎ，２００１，Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ３２（３）：２６５  ２７９；Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｒ  Ｍ．，１９９９，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  １７（４）：３４３  ３５９）、およびがんの化学防御（Ｙｕｎ，１９９９，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８８９：１５７  １９２）を研究するための最も情報的に有益で生産的な実験系の一つである。がん研究は、動物での移植腫瘍から始め、それにより治験のための再現性があり制御可能な材料が得られた。動物の原発腫瘍の断片、これらの腫瘍から作成した細胞懸濁液、およびこれらの腫瘍細胞から確立した不死細胞株は、同じ種の動物に移植すると増殖する。
【０３４１】
ヒトのがんを動物に移植するため、そして、拒絶によるその破壊を防ぐため、その動物の免疫系は損なわれる。最初は放射線照射、胸腺摘除術、およびステロイド剤の投与により獲得免疫の除去を果たしたが、先天的に胸腺欠損のヌードマウスが、多様なヒト腫瘍のレシピエントとして使用されている（Ｒｙｇａａｒｄ，１９８３，ｉｎ  １３．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｐａｒｔ  Ｃ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２），ｐｐ３７  ４４，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ；Ｆｅｒｇｕｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８７，Ｔｈｏｒａｘ，４２：７５３  ７５８）。胸腺欠損ヌードマウスモデルは、インビボで多数のヒト腫瘍を研究するための有用なモデルを提供するが、それは自然転移を発生させないので全ての種類の腫瘍には適していない。次に、獲得免疫系が遺伝子突然変異により完全に無能になった重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスが作製される。ＳＣＩＤマウスモデルにおけるヒトのがんの生着の成功を実証するため、ヒト肺がんが最初に使用された（Ｒｅｄｄｙ  Ｓ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７（９）：２４５６  ２４６０）。その後、ＳＣＩＤマウスモデルは、いくつかのヒト腫瘍、特に血液障害および悪性黒色腫について散在性転移成長を許容することを示した（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１０（３）：１９３  ２００；Ｂａｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３８６  ３９３）。近年の遺伝子導入技術の出現と共に、マウスゲノムは、がんの研究のための主要な哺乳類の遺伝的モデルとなった（Ｒｅｓｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃ  Ｇｅｎｅｔ．１０：６６９  ６７５）。
【０３４２】
本明細書に記載される方法および組成物は、精巣がんの検出、診断、治療または予防に適している。それらは、精巣がんを治療するための上記の方法のいずれかと組み合わされてよい。
【０３４３】
＜抗ＶＨＺ剤のスクリーニング＞
＜ＶＨＺモジュレーター、アゴニストおよびアンタゴニストの同定＞
アンタゴニスト、特に小分子を抗ＶＨＺ剤用として用いてＶＨＺを特異的に阻害することができる。
【０３４４】
そのために本発明者らは、ＶＨＺアンタゴニストおよび小分子ＶＨＺ阻害剤、ならびにこれらをスクリーニングするためのアッセイ法を開示する。ＶＨＺのアンタゴニストは、結合または他のＶＨＺ活性の変化、例えばダウンレギュレーションなどを検出することによりスクリーニングすることができる。そのために、本発明者らは、ＶＨＺポリペプチドの発現、量または活性をダウンレギュレーションすることができる化合物を提供する。このような化合物は、がん、特に結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、および精巣がんを治療または予防するための本明細書に記載の方法および組成物において使用することができる。
【０３４５】
そのために、ＶＨＺは、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然物混合物において小分子基質とリガンドの結合を評価するために使用されてよい。これらの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドであってもよいし、あるいは構造的または機能的ミメティクスであってもよい。Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１）を参照されたい。さらに、特に結腸、肺、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含む扁平上皮細胞、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎がん、皮膚、卵巣、前立腺、および精巣細胞においてＶＨＺの発現に影響を及ぼす因子を同定するためにスクリーニングを行ってもよい。
【０３４６】
一般に、アゴニストおよびアンタゴニストに関するアッセイは、ＶＨＺの１以上の活性への候補分子の効果を決定することによる。アッセイには、候補分子の存在下、および所望により候補分子の不在下で、またはＶＨＺ活性を阻害もしくは活性化することが知られている分子の存在下でＶＨＺ活性をアッセイすることが含まれ得る。
【０３４７】
本発明者らは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、および精巣がんの細胞においてＶＨＺの発現が上昇し、したがって、ＶＨＺ発現の制御は結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、および精巣がんならびに他のがんの治療に使用することができることを実証した。そのために、ＶＨＺの発現および／または活性を刺激するか、またはこのタンパク質の機能を阻害することができる化合物および薬剤を発見することが望まれる。一般に、アゴニストおよびアンタゴニストは、既知の任意のがん、特に結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、および精巣がんの治療および予防目的で用いられる。
【０３４８】
「ダウンレギュレーション」には、検討される挙動へのいずれの負の効果も含まれ、これは全体的なものであっても部分的なものであってもよい。従って、結合が検出される場合には、候補アンタゴニストは、２つの物体間の結合を低下させ、軽減し、または無効にすることができる。候補分子によって達成される結合（または任意のその他の活性）のダウンレギュレーションは、候補分子の不在下での結合（またはどのような活性でも）と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれを超えるものであり得る。従って、アンタゴニストとしての使用に適した候補分子は、結合またはその他の活性を１０％以上低下させることができるものである。
【０３４９】
用語「化合物」とは、化学化合物（天然または合成）、例えば生体高分子など（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチドまたは有機分子）、または生体材料、例えば細菌、植物、真菌もしくは動物など（特に哺乳類）の細胞もしくは組織などから作製された抽出物、またはさらには無機元素または分子を指す。化合物は抗体であり得る。
【０３５０】
ＶＨＺの可能性のあるアンタゴニストの例としては、抗体、小分子、ヌクレオチドおよびそれらの類似体（プリンおよびプリン類似体を含む）、ＶＨＺの結合パートナーに近縁のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えば結合パートナーのフラグメント、またはＶＨＺポリペプチドと結合するが反応を誘発せず、そのポリペプチドの活性を妨げる小分子などが挙げられる。
【０３５１】
＜スクリーニングキット＞
このようなスクリーニングを行うために必要な材料は、スクリーニングキットにパッケージングすることができる。
【０３５２】
このようなスクリーニングキットは、ＶＨＺの産生を低下させるかまたは促進するＶＨＺポリペプチドまたは化合物に対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素などを同定するために有用である。スクリーニングキットは、（ａ）ＶＨＺポリペプチド、（ｂ）ＶＨＺポリペプチドを発現する組換え細胞、または（ｃ）ＶＨＺポリペプチドに対する抗体を含み得る。スクリーニングキットはライブラリーを含み得る。スクリーニングキットは、以下に記載されるように、スクリーニングに必要な任意の１以上の成分を含み得る。スクリーニングキットは、所望により使用説明書を含み得る。
【０３５３】
スクリーニングキットはまた、ＶＨＺ発現を核酸レベルで検出することができるものを提供することができる。このようなキットはＶＨＺの増幅のためのプライマー、または増幅のためのプライマー対を含み得る。このプライマーまたはプライマー対は、任意の適した配列、例えばＶＨＺ配列の一部から選択することができる。プライマー配列を同定する方法は当分野で周知であり、当業者ならばこのようなプライマーを容易に設計することができる。これらのキットは、本明細書に記載されるようなＶＨＺ発現のための核酸プローブを含み得る。これらのキットはまた所望により使用説明書も含み得る。
【０３５４】
＜合理的設計＞
ＶＨＺと相互作用することができる見込みのある候補化合物の合理的設計は、ＶＨＺポリペプチドの分子形状の構造研究に基づき得る。どの部位が特定のその他のタンパク質と相互作用するかを決定する一手段は、物理的構造決定、例えばＸ線結晶学または二次元ＮＭＲ法である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについての指針を与える。タンパク質構造決定の詳細な記載については、例えばＢｌｕｎｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０３５５】
＜ポリペプチド結合アッセイ＞
ＶＨＺ活性または発現のモジュレーターおよびアンタゴニストは、当分野で公知の任意の手段によって同定することができる。
【０３５６】
それらの最も単純な形態では、これらのアッセイは単に、候補化合物を、ＶＨＺポリペプチドを含有する溶液と混合して混合物を形成する工程、その混合物においてＶＨＺポリペプチドの活性を測定する工程、およびその混合物の活性を標品と比較する工程を含み得る。
【０３５７】
さらに、ＶＨＺと推定分子の間の結合を検出するアッセイにおいて、それらのＶＨＺへの結合によって分子を同定することができる。
【０３５８】
本明細書に記載のＶＨＺポリペプチドと結合する物質を同定するためのアッセイの一種では、固相支持体に固定されているＶＨＺポリペプチドを非固定候補物質と接触させ、目的のＶＨＺポリペプチドと候補物質が互いに結合かするかどうか、および／またはどの程度結合するかを決定することを含む。あるいは、候補物質を固定して、本明細書に示されるようなＶＨＺポリペプチドを非固定としてもよい。
【０３５９】
物質とＶＨＺポリペプチドとの結合は、一時的、可逆的または恒久的なものであってよい。物質は、対照ポリペプチド（例えば、がんの増殖または進行に関与しないことが知られるポリペプチド）との結合に関するＫｄ値よりも低いＫｄ値で該ポリペプチドと結合し得る。物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合に関するＫｄ値の２分の１、例えば、１００分の１のＫｄ値または１０００分の１のＫｄ値であり得る。
【０３６０】
アッセイ法の一例では、ＶＨＺポリペプチドはアガロースビーズなどのビーズに固定することができる。一般に、これは、ＶＨＺポリペプチドを細菌、酵母または高等真核細胞系統においてＧＳＴ−融合タンパク質として発現させ、粗細胞抽出物からグルタチオン−アガロースビーズを用いてＧＳＴ−ＶＨＺ融合タンパク質を精製することにより達成され得る（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８；Ｇｅｎｅ  ６７（１０）：３１−４０）。対照として、ＧＳＴ−融合タンパク質ではない候補物質と固定ポリペプチドの結合をＶＨＺポリペプチドの不在下で測定することができる。次いで、この候補物質の固定ＶＨＺポリペプチドとの結合を測定すればよい。この種のアッセイは当分野でＧＳＴプルダウンアッセイとして公知である。この場合にも、候補物質を固定して、ＶＨＺポリペプチドを非固定としてもよい。
【０３６１】
また、成分の一方、例えばＮｉ−ＮＴＡアガロース成分およびヒスチジンタグ成分を固定するための様々なアフィニティー精製系を用いて、この種のアッセイを行うことも可能である。
【０３６２】
ポリペプチドの候補物質との結合は、当分野で周知の様々な方法によって測定することができる。例えば、非固定成分を（例えば、放射性標識、エピトープタグまたは酵素−抗体コンジュゲートで）標識してもよい。あるいは、結合を免疫学的検出法によって測定してもよい。例えば、反応混合物にウエスタンブロットを行い、非固定成分を検出する抗体でブロットをプローブすることができる。ＥＬＩＳＡ法も使用してよい。
【０３６３】
候補物質は一般に、１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、例えば１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌの最終濃度で加える。抗体の場合、用いる最終濃度は一般に１００〜５００μｇ／ｍｌ、例えば２００〜３００μｇ／ｍｌである。
【０３６４】
ＶＨＺのモジュレーターおよびアンタゴニストは、また、ＶＨＺとこのポリペプチドが結合する任意の分子との間の結合の変化、またはこのような結合または遊離の結果として生じる任意の活性の変化を検出することにより同定されてもよい。
【０３６５】
＜細胞系アッセイ＞
細胞系アッセイは単に候補化合物の結合を試験するものであってよく、そこではＶＨＺポリペプチドを担持する細胞への付着が、候補化合物と直接的もしくは間接的に関連する標識を利用するか、または標識された競合物との競合を含むアッセイにおいて検出される。
【０３６６】
さらに、これらのアッセイは、その表面にポリペプチドを担持する細胞に適当な検出系を用いて、候補化合物が、ＶＨＺポリペプチドとの結合によって生じるシグナルをもたらすかどうかを試験することができる。活性化の阻害剤は一般に既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、候補化合物の存在による、アゴニストによる活性化への効果を観察する。
【０３６７】
化合物をスクリーニングするもう一つの方法は、化合物のライブラリーを発現する組換えＤＮＡ分子で安定形質転換されている真核生物または原核生物宿主細胞を利用する。このような細胞は、生きた形または固定された形のいずれかで標準的結合パートナーアッセイに使用することができる。また、細胞応答を検出するための感度の高い方法を記載しているＰａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２４３−２４７；およびＯｗｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７；４００７−４０１１も参照されたい。
【０３６８】
競合アッセイが特に有用であり、そこでは、化合物のライブラリーを発現する細胞を、ＶＨＺポリペプチドに結合することが知られている標識抗体、例えば１２５Ｉ−抗体など、および試験試料、例えば結合組成物に対するその結合親和性が測定される候補化合物などと接触させるかまたはインキュベートする。次いで、ＶＨＺポリペプチドに対する結合および遊離型の標識結合パートナーを分離して結合の程度を評価する。結合した試験試料の量は、ＶＨＺポリペプチドに結合する標識抗体の量に反比例する。
【０３６９】
多くの技法のいずれか１つを用いて、遊離型の結合パートナーから結合型の結合パートナーを分離し、結合の程度を評価することができる。この分離工程は一般に、例えばフィルターへ接着させた後の洗浄、プラスチックへ接着させた後の洗浄、または細胞膜の遠心分離などの手順を含み得る。
【０３７０】
これらのアッセイは、候補分子を細胞、例えば結腸、肺、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含む扁平上皮細胞、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎、皮膚、卵巣、前立腺、および精巣細胞などに曝すこと、およびいずれかの適した手段によりＶＨＺの発現をアッセイすることを含み得る。このようなアッセイでＶＨＺの発現をダウンレギュレーションする分子を、所望によりさらなる研究のために選択し、ＶＨＺ発現をダウンレギュレーションするための薬剤として使用することができる。このような薬剤は通常、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、および精巣がんを治療または予防するために有用に用いることができる。
【０３７１】
ＶＨＺタンパク質をコードするｃＤＮＡおよびそのタンパク質に対する抗体はまた、細胞においてＶＨＺ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加した化合物の効果を検出するためのアッセイを構成するために使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡを、当分野で公知の標準的方法により、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて分泌された、または細胞と会合したＶＨＺポリペプチドのレベルを測定するために構成することができ、これを用いて、適宜操作された細胞または組織からのＶＨＺタンパク質の産生を阻害または促進し得る薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を発見することができる。スクリーニングアッセイを行うための標準的方法は当分野で十分に理解されている。
【０３７２】
＜活性アッセイ＞
モジュレーターまたはアンタゴニストを検出するためのアッセイは、一般に候補分子の存在下で（任意選択により、候補分子の不在下での活性の変化の検出とともに）、ＶＨＺの任意の活性の変化を検出することを含む。
【０３７３】
ＶＨＺの特定の生物活性、例えばホスファターゼ活性などを検出するアッセイを使用してよい。これらのアッセイは一般に、候補分子（例えば、ライブラリーの形態）を、ポリペプチド、そのポリペプチドをコードする核酸、またはこのようなものを含む細胞、オルガネラ、抽出物もしくは他の材料のいずれかの形態のＶＨＺと、候補モジュレーターとともに接触させることを含む。ＶＨＺの関連活性（例えば下記に記載されるホスファターゼ活性など）を検出して、候補モジュレーターの存在が何らかの効果を有するかどうかを確定してよい。
【０３７４】
ホスファターゼアッセイは当分野で公知であり、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ（２００４），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３６（８）：１５４２−５３およびＡｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０；２７９（３４）：３５７６８−７４に記載されている。このようなアッセイは、適した基質、例えばｐ−ニトロフェニルホスフェートなど、またはホスホチロシンおよびホスホトレオニン残基を含有するオリゴペプチドなどを脱リン酸化するＶＨＺの能力をアッセイすることを含む。これらのアッセイは、候補モジュレーターの存在下または不在下で行い、ＶＨＺ活性の変化を検出するのに適当な活性を検出し、したがって、ＶＨＺの候補モジュレーターおよび／またはアンタゴニストの同定を行うことができる。
【０３７５】
ＶＨＺと結合し、かつ／またはその転写または発現に影響を及ぼす候補モジュレーターを検出するためのプロモーター結合アッセイも使用することができる。その後、候補モジュレーターをさらなる試験のために選択するか、または使用のために単離してよい。このようなスクリーニング手順の詳細は当分野で周知であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）に記載されている。
【０３７６】
本明細書に記載のスクリーニング方法はインビボアッセイを使用してよいが、それらはインビトロ使用のために構成することもできる。インビボアッセイは一般に、ＶＨＺを含む細胞を候補分子に曝すことを含む。インビトロアッセイでは、ＶＨＺを、所望により、他の成分、例えば未精製もしくは半精製細胞抽出物または精製タンパク質などの存在下で候補分子に曝す。インビトロアッセイを行う場合、これらは候補分子のアレイ（例えば、アレイライブラリー）を用いてもよい。インビボアッセイを用いることもできる。そのために、ＶＨＺポリペプチドは、細胞に、例えば異種的に含まれてよい。このような細胞は、上記のようにＶＨＺを発現するように操作されたトランスジェニック細胞であり得る。
【０３７７】
抽出物を用いる場合、それは細胞質抽出物または核抽出物を含んでよく、その調製方法は当分野で周知である。
【０３７８】
当然のことながら、ＶＨＺを含む任意の細胞成分、例えばオルガネラなどを用いてよい。一実施形態では、細胞質調製物または核調製物、例えば、記載のようなＶＨＺを含む細胞核を含むものを利用する。核調製物は１以上の核を含み、それらは例えば洗剤処理により、透過性または半透過性であり得る。
【０３７９】
したがって、特定の実施形態では、アッセイ形式には以下のものが含まれ得る：マルチウェルマイクロタイタープレートは、各ウェルにＶＨＺポリペプチドを発現する１以上の細胞を含むように設定し；例えばライブラリー由来の個々の候補分子または候補分子プールを個々のウェルに加え、ＶＨＺ活性の変化を測定することができる。プールを用いる場合、これらはさらなるプールに細分され、同様に試験されてよい。次いで、本明細書の他所に記載されているように、ＶＨＺ活性、例えば、結合活性または転写同時活性化活性をアッセイすることができる。
【０３８０】
上記のアッセイ方法の代わりに、またはそれに加えて、ＶＨＺのモジュレーターまたはアンタゴニストを同定するために「差し引き」法も使用することができる。このような「差し引き」法では、モジュレーターとして機能し得る１以上の候補分子を含む複数の分子（例えば、細胞抽出物、核抽出物、分子ライブラリーなど）が提供され、その複数の分子から１以上の成分が除去されるか、枯渇されるか、または差し引かれる。次いで、「差し引かれた」抽出物などの活性を、記載のようにＶＨＺを含む細胞（またはその成分）に曝すことによりアッセイする。
【０３８１】
したがって、例えば、次のようにこのようなモジュレーターの同定のために「免疫枯渇」アッセイを行うことができる。細胞質抽出物または核抽出物は、適した細胞から調製することができる。この抽出物を、枯渇または分画して、推定モジュレーターを除去することができ、例えば適当な抗体による免疫枯渇を用い得る。抽出物のモジュレーターを枯渇させれば、それはＶＨＺの機能または活性または発現に影響を及ぼす能力を失う。モジュレーターまたはアンタゴニストを同定するために、一連の差し引きおよび／または枯渇が必要となる可能性がある。
【０３８２】
また、当然のことながら、上記の「枯渇」または「差し引き」アッセイは、さらなるスクリーニングのための推定モジュレーター因子を同定するための予備工程としても使用することができる。さらに、またはあるいは、「枯渇」または「差し引き」アッセイは、他の手段（例えば、本明細書の他所に記載されているような「陽性」スクリーニング）により推定モジュレーターとして同定された分子のモジュレーター活性を確認するために使用することができる。
【０３８３】
アッセイを受け、目的とするものであることが分かった候補分子を単離し、さらに検討することができる。目的の分子の単離方法は、用いられる分子の種類、それがライブラリーの形態かどうか、いくつの候補分子を同時に試験するか、続いて回分法を行うかどうかなどによって決まる。
【０３８４】
候補分子は、ライブラリーの形態で提供されてもよい。一実地形態では、１を超える候補分子を同時にスクリーニングすることができる。候補分子のライブラリー、例えば、小分子ライブラリー、ポリペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、化合物のライブラリー（例えばコンビナトリアルライブラリーなど）、アンチセンス分子のライブラリー、例えばアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなど、抗体ライブラリーなどは、当分野で公知の手段により作成することができる。このようなライブラリーは、ハイスループットスクリーニングに好適である。ＶＨＺを含む様々な細胞をそのライブラリーの個々のメンバーに曝し、ＶＨＺ活性に対する効果を測定することができる。この目的でアレイ技術を用いてもよい。これらの細胞を、例えばマイクロタイタープレートのウェルにおいて、空間的に分離することもできる。
【０３８５】
一実施形態では、小分子ライブラリーを用いる。「小分子」により本発明者らは、分子量が約５０ｋＤａ未満であり得る分子を指す。特定の実施形態では、小分子は約３０ｋＤａ未満、例えば約１５ｋＤａ未満または１０ｋＤａ未満などの分子量であり得る。このような小分子のライブラリーを、本明細書では「小分子ライブラリー」とよび、ポリペプチド、小ペプチド、例えば、２０アミノ酸以下、例えば、１５、１０または５アミノ酸のペプチド、単純化合物などを含み得る。
【０３８６】
その代わりに、それに加えて、以下にさらに詳細に記載されるように、コンビナトリアルライブラリーを、ＶＨＺのモジュレーターまたはアンタゴニストに関してスクリーニングすることもできる。ＶＨＺ活性のアッセイは上に記載されている。
【０３８７】
＜ライブラリー＞
候補分子ライブラリー、例えばポリペプチドまたは核酸のライブラリーなどを、本明細書に記載のＶＨＺアンタゴニストおよび阻害剤のスクリーニングにおいて使用することができる。このようなライブラリーをＶＨＺタンパク質に曝し、タンパク質の活性に対するそれらの効果があれば測定する。
【０３８８】
大きなライブラリーの所望のメンバーを単離する選択プロトコールは、ファージディスプレイ技術に代表されるように、当分野で公知である。繊維状バクテリオファージの表面に多様なペプチド配列がディスプレイされる、このような系（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０  上掲））は、標的抗原と結合する特異的抗体フラグメントのインビトロ選択および増幅のための抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作出するために有用であることが証明されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を、それらを大腸菌のペリプラズム空間に向けるリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結すると、その結果として、得られた抗体フラグメントはバクテリオファージの表面に、一般にバクテリオファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）との融合物としてディスプレイされる。あるいは、抗体フラグメントは、λファージキャプシッド（ファージボディー）の外部にディスプレイされる。ファージディスプレイ系の利点は、それらが生物系であるので、選択されたライブラリーメンバーが、その選択されたライブラリーメンバーを含むファージを単に細菌細胞で増殖させることにより増幅することができることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクターに含まれるので、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作が比較的容易である。
【０３８９】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築方法は、当分野で周知である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔ  ａｌ．（１９９０）上掲；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０４：１４７；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上掲；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）上掲；Ｈａｗｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：８６７；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３１３。これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。このような技法は、一般にポリペプチドライブラリーの発現にとって必要であれば改変することができる。
【０３９０】
特に有利なアプローチの１つは、ｓｃＦｖファージライブラリーを使用したものである（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）上掲；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上掲；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上掲；Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：８０；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）上掲）。バクテリオファージコートタンパク質上にディスプレイされるｓｃＦｖライブラリーの、様々な実施形態が記載されている。また、例えば、ＷＯ９６／０６２１３号およびＷＯ９２／０１０４７号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｅｔ  ａｌ．）およびＷＯ９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，上掲）に記載されているように、ファージディスプレイアプローチの精密化も公知である。これらの文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３９１】
代替のライブラリー選択技術としては、バクテリオファージプラークまたは溶原菌コロニーとして、直接スクリーニングすることができるバクテリオファージλ発現系を含み、両方とも従前に記載の通り（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５；Ｃａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：２４３２）、本明細書に記載の方法および組成物において用いられる。これらの発現系は、約１０６またはさらにはそれを超える程度の、多数の異なるライブラリーメンバーをスクリーニングするために使用することができる。他のスクリーニング系は、例えば、ライブラリーメンバーの直接的化学合成によるものである。１つの初期の方法は、１組のピンまたはロッド上でのペプチド合成、例えばＷＯ８４／０３５６４号に記載されているものなどを含む。ビーズ上でのペプチド合成を含む類似の方法で、各ビーズが１個のライブラリーメンバーであるペプチドライブラリーを形成する方法が、米国特許第４，６３１，２１１号に記載され、関連の方法がＷＯ９２／０００９１号に記載されている。これらのビーズに基づく方法の有意義な改良としては、各ビーズにユニークな識別子タグ、例えばオリゴヌクレオチドなどを付け、各ライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を容易にすることを含む。これらの改良型のビーズに基づく方法はＷＯ９３／０６１２１号に記載されている。
【０３９２】
別の化学合成方法は、アレイの離れた所定の位置に、異なる各ライブラリーメンバー（例えば、特有のペプチド配列）を配置する方法で表面にペプチド（またはペプチドミメティクス）のアレイを合成することを含む。各ライブラリーメンバーの存在の確認は、アレイにおけるその空間的な位置によって決定される。所定の分子（例えば、受容体）と反応性ライブラリーメンバーの間の結合相互作用が生じるアレイ内の位置を求め、それにより空間的な位置に基づいて反応性ライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９０／１５０７０号およびＷＯ９２／１００９２号；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７；Ｄｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６：２７１に記載されている。
【０３９３】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作成するための他の系は、ライブラリーメンバーのインビトロ合成のための無細胞酵素機構の使用を含む。１つの方法では、ＲＮＡ分子を、標的リガンドに対する選択とＰＣＲ増幅を交互に行うことにより選択する（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）。同様の技術を、所定のヒト転写因子と結合するＤＮＡ配列を同定するために使用することもできる（Ｔｈｉｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３２０３；Ｂｅａｕｄｒｙ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５；ＷＯ９２／０５２５８号およびＷＯ９２／１４８４３号）。同様にして、大きなライブラリーを作成する方法としてのポリペプチドの合成のために、インビトロ翻訳を使用することもできる。これらの方法は、一般に安定化されたポリソーム複合体を含み、ＷＯ８８／０８４５３号、ＷＯ９０／０５７８５号、ＷＯ９０／０７００３号、ＷＯ９１／０２０７６号、ＷＯ９１／０５０５８号およびＷＯ９２／０２５３６号にさらに記載されている。ファージに基づかない別のディスプレイ系、例えばＷＯ９５／２２６２５号およびＷＯ９５／１１９２２号（Ａｆｆｙｍａｘ）に開示されているものなどは、選択のためのポリペプチドのディスプレイにポリソームを用いる。これらおよび上記の文献は全て、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３９４】
＜コンビナトリアルライブラリー＞
ライブラリー、特に、候補分子のライブラリーは、好適にはコンビナトリアルライブラリー（コンビナトリアル化学ライブラリーとしても知られる）の形であり得る。
【０３９５】
「コンビナトリアルライブラリー」とは、本明細書で用いる場合、無作為に選択されたサブユニットからなる化学化合物の複数の種の集合体である。コンビナトリアルライブラリーを、ＶＨＺを阻害することができる分子に関してスクリーニングすることができる。
【０３９６】
化学化合物の様々なコンビナトリアルライブラリーを現在利用することができ、とりわけ、タンパク質分解酵素および非タンパク質分解酵素に対して活性なライブラリー、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストおよびアンタゴニストのライブラリー、非ＧＰＣＲ標的（例えば、インテグリン、イオンチャネル、ドメイン相互作用、核受容体および転写因子）に対して活性なライブラリー、ならびに全細胞腫瘍学および抗感染標的のライブラリーなどが含まれる。コンビナトリアルライブラリー、特に、それらの構築および使用の包括的総説は、Ｄｏｌｌｅ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ  １  Ｎｏ  ４，２３５−２８２に提供されている。また、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｈｍｕｅｌ  Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｃ１９９８．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖ．８７）も参照されたい。特異的コンビナトリアルライブラリーおよびそれらの構築方法は、米国特許第６，１６８，９１４号（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）ならびにＢａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｇｓ，」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５５８８−５５８９およびそれらの文献に挙げられている参照文献に開示されている。
【０３９７】
一実地形態において、スクリーニングされるコンビナトリアルライブラリーは、細胞の成分と相互作用して遺伝子発現に影響を及ぼす分子を含み得るように設計されたものである。例えば、クロマチン構造タンパク質に対するコンビナトリアルライブラリーがスクリーニング可能である。この実施形態に有用な他のライブラリーとしては、ヒストン修飾酵素（例えば、ヒストンアセチル化酵素またはヒストンメチル化酵素）、またはＤＮＡ修飾、例えば、ＤＮＡメチル化または脱メチル化に対するコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。
【０３９８】
化学コンビナトリアルライブラリー、それらの製造および使用を記載しているさらなる参照は、ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｔｓｃｉ．ｏｒｇ／Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｃｏｍｂｉｃｈｅｍ／から入手可能であり、それには、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｐａｖｉａ，Ｓｐｈｉｎｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｌｙ，１９９５）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  −  ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｄｉｓｃｕｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｉｔｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｌａｙｓ  ｉｎ  ｍａｎａｇｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｌｙ，１９９５）；Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｌｅａｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ＳＡＲ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ａｄｎａｎ  Ｍ．Ｍ．Ｍｊａｌｌｉ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ  Ｅ．Ｔｏｙｏｎａｇａ，Ｏｎｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｌｙ，１９９５）；Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｉｃ  Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  Ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓａｒｖａｊｉｔ  Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ，Ｂａｂｕ  Ｊ．Ｍａｖｕｎｋｅｌ，Ｒｏｂｉｎ  Ａｎｄｙ，Ｄｏｎａｌｄ  Ｊ．Ｋｙｌｅ＊，Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ  Ｉｎｃ．（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｌｙ，１９９５）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｋｅｉｔｈ  Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｖｅ  Ｂｒｉａｎｔ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｌｙ，１９９５）；Ａ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  −  Ｃｒａｉｇ  Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｌｙ，１９９５）；Ａｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｅｉｔｈ  Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｌｙ，１９９５）；Ｎｏｖｅｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒ．Ｓ．Ｐｅａｒｌｍａｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｎｅ／Ｊｕｌｙ，１９９６）；Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ���ｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ａｆｆｏｒｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：Ａｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ，Ｙｖｏｎｎｅ  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｎｅ／Ｊｕｌｙ，１９９６）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ：Ａ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ａｒｎｏ  Ｆ．Ｓｐａｔｏｌａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｎｅ／Ｊｕｌｙ，１９９６）；Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｐａｖｉａ，Ｓｐｈｉｎｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｎｅ／Ｊｕｌｙ，１９９６）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｔｏ  Ｔｈｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ．．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｓｏｆｉａ，Ｔｒａｎｓｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｎｅ／Ｊｕｌｙ，１９９６）；Ｄａｔａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍａｒｙｊｏ  Ｚａｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｉｌａ  Ｈ．ＤｅＷｉｔｔ，Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，１９９５）；およびＴｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  Ｒ＆Ｄ  ｉｎ  Ｂｉｏ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｐ．Ｄｅｖｌｉｎ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｍａｒｃｈ，１９９６）などが挙げられる。
【０３９９】
コンビナトリアルケミストリーにおける技術は、新規な医薬リードの創出のための現在の方法の中で広く受け入れられている（Ｇａｌｌｏｐ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１）。使用における１つのコンビナトリアルアプローチは、固相支持体の各粒子上での、異なる構造を含むライブラリーの合成、ライブラリーと可溶性受容体との相互作用、その高分子標的と相互作用する「ビーズ」の同定、および同定された「ビーズ」が持っている構造の決定を含む戦略に基づく（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）。このアプローチの別法では、固相支持体から所定のアリコートの化合物を順次遊離させた後、溶液中で活性を測定し、その活性化合物が遊離された粒子を同定し、直接配列決定（Ｓａｌｍｏｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２）、またはそのコードを読むことにより（Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：２５２９−２５３１；Ｎｉｋｏｌａｉｅｖ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６：１６１−１７０；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６）、その構造を解明する。
【０４００】
可溶性ランダムコンビナトリアルライブラリーは、Ｆｕｒｋａ（Ｆｕｒｋａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ  １９８８；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８，１４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｒａｇｕｅ  １９８８；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３）によって最初に記載された、ペプチドの等モル混合物の作成のための簡単な原理を用いて合成することができる。反復スクリーニングのための可溶性ライブラリーの構築も記載されている（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６）。Ｋ．Ｓ．Ｌａｍは、不溶性ランダムコンビナトリアルライブラリーを用いる、新規かつ予期されないほど有力な技術を開示している。Ｌａｍは各支持体が均一な分子構造の試験化合物を有するように固相支持体上でランダムコンビナトリアルライブラリーを合成し、固相結合プロトコールにより、支持体から試験化合物を予め除去することなくライブラリーをスクリーニングした（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）。
【０４０１】
したがって、候補分子のライブラリーは、合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、コンビナトリアル化学ライブラリー）、細胞抽出物、体液（例えば、尿、血液、涙、汗もしくは唾液）、または合成品もしくは天然物のその他の混合物（例えば、小分子もしくは発酵混合物のライブラリー）であり得る。
【０４０２】
分子ライブラリーとしては、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質のフラグメント；核酸（例えば、アンチセンス；ＤＮＡ；ＲＮＡ；またはペプチド核酸、ＰＮＡ）；アプタマー；または炭水化物もしくは多糖類を含み得る。ライブラリーの各メンバーは単一のものであってもよいし、あるいは混合物の一部（例えば、圧縮ライブラリー）であってもよい。ライブラリーは精製された化合物を含んでもよいし、あるいは「不純」（すなわち、有意な量の不純物を含有する）であってもよい。
【０４０３】
市販のライブラリー（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＡｒＱｕｌｅ、Ｎｅｏｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｒｃｏ、Ｃｉｄｄｃｏ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐａｎｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、ＳｉｇｍａまたはＴｒｉｐｏｓｅから）も本明細書に記載の方法とともに使用することができる。
【０４０４】
上記のようなライブラリーに加え、多様性ファイルと呼ばれる特殊なライブラリーを、新規な方法の特異性、信頼性または再現性を評価するために使用することができる。多様性ファイルは、アッセイにおいて非特異的検出をもたらす可能性のある多くの化合物種を代表する多数の化合物（例えば、１０００以上の小分子）を含む。多様性ファイルは市販されているか、または上記に挙げられている販売者から市販されている個々の化合物から構築することができる。
【０４０５】
＜抗体＞
このタンパク質の活性を調節するために使用することのできる、ＶＨＺのアンタゴニストまたはモジュレーターを含む抗ＶＨＺ剤（例えば、本明細書に記載されるがんなどの疾患を治療または予防する方法のためのもの）には、ＶＨＺタンパク質に対する抗体が含まれ得る。
【０４０６】
よって、本発明者らは、ＶＨＺポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体または誘導体と結合する抗体を提供する。このような抗体は、ＶＨＺ発現の検出に、特に、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどのＶＨＺ関連疾患の診断に有用である。他の抗体には、治療活性を有する抗体、すなわち、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんを含むあらゆるＶＨＺ関連疾患を治療、管理または予防する治療方法に使用することのできる抗体が含まれる。
【０４０７】
ＶＨＺに対する抗体は、実施例に記載されるように、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するペプチドＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫ（配列番号３）を用いた免疫によって生成することができる。
【０４０８】
ＶＨＺと結合することができる抗体の例としては、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｉｎｃ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｐｏｗａｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、ＡｄＢ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）が挙げられる。
【０４０９】
さらに、ＶＨＺに特異的な抗体は、任意の適したエピトープ、例えば、ＶＨＺタンパク質に由来するエピトープに対して作製することができる。適したＶＨＺフラグメントの配列は、ＶＨＺの残基Ｃ９５を含んでもよく、この配列のあらゆるエピトープを特異的ＶＨＺ抗体の作製に使用してよい。
【０４１０】
本明細書の目的では、用語「抗体」は、選択された標的と結合することができる完全抗体または抗体フラグメントを指す。特に断りのない限り、その用語には、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、天然抗体またはキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体およびヒト化抗体を含む操作抗体、ならびにファージディスプレイまたは代替技術を用いて作製された人為的に選抜された抗体が含まれる。その用語にはまた、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーにより作製されたフラグメントも含まれる。このようなフラグメントには、標的物質に対する完全抗体の結合活性を保持する完全抗体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質およびその抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質が含まれる。小フラグメント、例えば、ＦｖおよびＳｃＦｖなどは、大きさが小さくその結果として組織分布が優れていることから診断用途および治療用途に有利な特性を有する。
【０４１１】
抗体およびそのフラグメントは、例えば、ＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されているように、ヒト化抗体であってよい。さらに、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号および同第６，０７５，１８１号に記載されているように、完全ヒト可変領域（またはそれらのフラグメント）を有する抗体もまた使用することができる。中和抗体、すなわち、ＶＨＺの任意の生物活性を阻害するものは診断薬および治療薬に使用することができる。
【０４１２】
本明細書に記載される抗体は、標識などのエフェクタータンパク質を含む改変された抗体であってよい。インビボまたはインビトロでの抗体の分布の画像化を可能にする標識を使用してよい。このような標識は、胚または細胞塊内で容易に視覚化できる、放射性標識または放射線不透過性標識、例えば、金属粒子などであってよい。さらに、それらは蛍光標識または組織試料上で視覚化できる他の標識であってよい。
【０４１３】
抗体は、標準的な技術によって、例えば、免疫化によってまたはファージディスプレーライブラリーを使用することによってなど作製することができる。このような抗体は、ＶＨＺタンパク質またはホモログ、フラグメントなどと特異的に結合することができるものでもよい。
【０４１４】
＜ポリクローナル抗体＞
ポリクローナル抗体が望まれる場合、選択された哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）をＶＨＺポリペプチドまたはペプチドを含む免疫原性組成物を用いて免疫すればよい。宿主種に応じて、様々なアジュバントを使用し免疫応答を増強してよい。このようなアジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質が挙げられる。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）は、使用することのできる潜在的に有用なヒトアジュバントであり、該物質のアミノ酸配列を精製すれば、全身性防御を刺激する目的で免疫力が低下した個体に投与される。
【０４１５】
免疫動物の血清は既知の手順により回収され処理される。ＶＨＺポリペプチドから得られるエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含む場合には、ポリクローナル抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。ポリクローナル抗血清を作製し処理するための技術は当分野で公知である。このような抗体を作製することができるように、本発明者らはまた、動物またはヒトにおいて免疫原として使用する別のアミノ酸配列に対してハプテン化されたＶＨＺアミノ酸配列またはそのフラグメントも提供する。
【０４１６】
＜モノクローナル抗体＞
ＶＨＺポリペプチドまたはペプチドから得られるエピトープに対して作製されるモノクローナル抗体も当業者ならば容易に作出することができる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論は周知である。不死の抗体産生細胞株は、細胞融合によって、また、発がんＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技術によっても作出することができる。オービットエピトープ（ｏｒｂｉｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）に対して作製されたモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性、すなわちアイソタイプおよびエピトープ親和性についてスクリーニングすることができる。
【０４１７】
モノクローナル抗体は、連続培養細胞株による抗体分子の作製を提供する任意の技術を用いて調製してよい。これらには、限定されるものではないが、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に記載されたハイブリドーマ技術（１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０：２０２６−２０３０）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が含まれる。
【０４１８】
本明細書に記載される抗体を改良するために組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。従って、診断用途または治療用途においてその免疫原性を低下させるために、キメラ抗体を構築してもよい。このような技術には、適当な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングが含まれる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）。さらに、ＣＤＲ移植による抗体のヒト化［欧州特許出願０  ２３９  ４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）］、および所望によりフレームワーク修飾［ＥＰ０  ２３９  ４００号］によって免疫原性を最小限に抑えることができる。
【０４１９】
あるいは、単鎖抗体の製造に関して記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７９号）を該物質に特異的な単鎖抗体を作製するように適合させることもできる。
【０４２０】
ＶＨＺポリペプチドまたはペプチドから得られるエピトープに対して作製された抗体（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）は診断において特に有用である。モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を作製するために使用することができる。抗イディオタイプ抗体は、保護が望まれる物質および／または薬剤の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を作製するための技術は当分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体も療法に有用であり得る。
【０４２１】
抗体は、また、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３８３３−３８３７）、およびＷｉｎｔｅｒ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９９１；Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）に開示されているように、リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導することによってまたは組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高特異的結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても産生することができる。
【０４２２】
ポリペプチドまたはペプチドの特異的結合部位を含む抗体フラグメントも作製することができる。例えば、このようなフラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作出することのできるＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって作出することのできるＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするためにＦａｂ発現ライブラリーを構築してもよい（Ｈｕｓｅ  ＷＤ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２７５−１２８１）。
【０４２３】
また、単鎖抗体の製造のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）をＶＨＺポリペプチドに対する単鎖抗体を作出するように適合させることもできる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳類を含む他の生物を用いてヒト化抗体を発現させてもよい。
【０４２４】
上記の抗体は、該ポリペプチドを発現するクローンを単離するためもしくは同定するため、または該ポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーにより精製するためにも使用することができる。
【０４２５】
＜抗体製造の組換え技術＞
細菌または哺乳類の細胞培養物において、確立された手順により抗体を製造するために組換えＤＮＡ技術を用いてよい。選択された細胞培養系は抗体産物を分泌し得る。
【０４２６】
よって、本発明者らは、該抗体タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列に適切な読み枠で連結されたシグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列に機能し得る形で連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換された、宿主、例えば、大腸菌または哺乳類細胞を培養すること、および該タンパク質を単離することを含む、抗体の製造方法を開示する。
【０４２７】
インビトロでのハイブリドーマ細胞または哺乳類宿主細胞の増殖は、慣例の標準培養培地、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ  １６４０培地任意選択により、哺乳類血清、例えば、ウシ胎児血清、または微量元素および増殖維持サプリメント、例えば、正常マウス腹腔滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸などのフィーダー細胞などを補給してもよい）である適した培養培地で行われる。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増幅も同様に、当分野で公知の適した培養培地で、例えば、細菌の場合には、培地ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２ｘＹＴまたはＭ９最少培地、酵母の場合には、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最少培地、または完全最少ドロップアウト培地で行われる。
【０４２８】
インビトロでの製造は比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の所望の抗体を得るためのスケールアップが可能である。細菌細胞、酵母または哺乳類細胞の培養に関する技術は当分野で公知であり、それらには、例えばエアリフトリアクター内もしくは連続攪拌リアクター内での均質懸濁培養、または例えば中空繊維、マイクロカプセル中での、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化または封入細胞培養が挙げられる。
【０４２９】
大量の所望の抗体はまた、インビボで哺乳類細胞を増殖させることによって得ることもできる。この目的のため、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合哺乳類に注射し抗体産生腫瘍を増殖させる。任意選択により、注射前に該動物を炭化水素、とりわけプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などのミネラルオイルを用いて初回抗原刺激してよい。１〜３週間後、該哺乳類の体液から抗体を単離する。例えば、適した骨髄腫細胞とＢａｌｂ／ｃマウス由来の抗体産生脾臓細胞との融合により得られたハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト細胞を、所望によりプリスタンで前処理したＢａｌｂ／ｃマウスに腹膜内注射し、１〜２週間後に該動物から腹水を採取する。
【０４３０】
上述のおよび他の技術は、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに論じられている。組換え抗体分子の調製のための技術は、上記参考文献に記載され、また、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれるＥＰ  ０６２３６７９号；ＥＰ  ０３６８６８４号およびＥＰ  ０４３６５９７号にも記載されている。
【０４３１】
細胞培養上清を、好ましくは、ＰＧＣ又はＥＳ細胞若しくはＥＧ細胞のような他の多能性細胞の免疫蛍光染色により、免疫ブロット法により、酵素イムノアッセイ、例えば、サンドイッチアッセイもしくはドットアッセイにより、またはラジオイムノアッセイにより、所望の抗体についてスクリーニングする。
【０４３２】
抗体の単離のため、培養上清中または腹水中の免疫グロブリンは、例えば、硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿材での透析または選択膜での濾過などによって濃縮させてよい。必要に応じて、および／または所望により、抗体は、慣例のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィーおよび／または（イムノ）アフィニティークロマトグラフィー、例えば、抗原、もしくはそのフラグメントによる、またはプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。
【０４３３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も提供される。ハイブリドーマ細胞は、遺伝的に安定したものであってよく、所望の特異性のモノクローナル抗体を分泌することができ、急速冷凍した培養物から解凍および再クローニングにより活性化させることができる。
【０４３４】
また、ＶＨＺポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製のためのプロセスも含み、該プロセスは、適した哺乳類、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを１以上のＶＨＺポリペプチド、またはその抗原フラグメントを用いて免疫し、該免疫哺乳類の抗体産生細胞を適した骨髄腫細胞株の細胞と融合させ、融合で得たハイブリッド細胞をクローニングし、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とする。例えば、ＶＨＺを用いて免疫したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【０４３５】
本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１０〜１０７〜１０８間のＶＨＺ発現細胞と適したアジュバントを数回、例えば、４〜６回、数ヶ月かけて、例えば、２〜４ヶ月の間、皮下および／または腹膜内注射することにより免疫し、最後の注射から２〜４日後に該免疫マウスの脾臓細胞を採取し、融合促進剤、例えば、ポリエチレングリコールなどの存在下で骨髄腫細胞株ＰＡＩの細胞と融合させることを特徴とする、ハイブリドーマ細胞株の調製のためのプロセスを記載する。骨髄腫細胞は、分子量およそ４０００のポリエチレングリコールを約３０％〜約５０％含有する溶液中で、３〜２０倍過剰の免疫マウスの脾臓細胞と融合させてよい。融合後、正常骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞より増殖しすぎないように定期的に選択培地、例えば、ＨＡＴ培地を補給した、上記に記載される適した培養培地で該細胞を増殖させる。
【０４３６】
以上に記載されるＶＨＺに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする挿入断片を含む組換えＤＮＡもまた開示される。定義によれば、このようなＤＮＡには、コード一本鎖ＤＮＡ、該コードＤＮＡとそれと相補的なＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補的（一本鎖）ＤＮＡ自体が含まれる。
【０４３７】
さらに、ＶＨＺに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするオーセンティック（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＤＮＡ配列、またはその突然変異体を有する酵素的または化学的に合成されたＤＮＡであり得る。オーセンティックＤＮＡの突然変異体は、１以上のアミノ酸が欠失しているかまたは１以上の他のアミノ酸と交換されている、上述の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。該改変（群）は、抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲ外および／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲ外にあり得る。このような突然変異ＤＮＡは、１以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換されているが、新しいコドンは同じアミノ酸（群）をコードしているというサイレント突然変異体であることも意図される。このような突然変異配列は縮重配列でもある。縮重配列は、限定されない数のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換されているが、本来コードされていたアミノ酸配列の変化は起こらないという点において遺伝子コードの意味の範囲内で縮重している。特定の宿主、特に大腸菌に好ましい制限部位および／または特定のコドン頻度が異なることから、このような縮重配列は、重鎖ネズミ可変ドメインおよび／または軽鎖ネズミ可変ドメインの最適な発現を得るために有用であり得る。
【０４３８】
突然変異体という用語は、当分野で公知の方法よるオーセンティックＤＮＡのインビトロ突然変異誘発により得られるＤＮＡ突然変異体を含むことが意図される。
【０４３９】
完全四量体免疫グロブリン分子の集合およびキメラ抗体の発現のためには、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡ挿入断片を、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインをコードする対応ＤＮＡと融合させて、例えばハイブリッドベクターへの組み込み後に、適当な宿主細胞に導入する。
【０４４０】
また、ヒト定常ドメインｇ、例えばγ１、γ２、γ３またはγ４（例えばγ１またはγ４など）と融合したＶＨＺに対する抗体の重鎖ネズミ可変ドメインをコードする挿入断片を含む組換えＤＮＡも開示される。同様に、ヒト定常ドメインκまたはλ（例えばκなど）と融合したＶＨＺに対する抗体の軽鎖ネズミ可変ドメインをコードする挿入断片を含む組換えＤＮＡも開示される。
【０４４１】
もう１つの実施形態では、本発明者らは、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがスペーサー基によって連結され、任意選択により、宿主細胞中の抗体のプロセシングを容易にするシグナル配列および／または抗体の精製を容易にするペプチドをコードするＤＮＡおよび／または切断部位および／またはペプチドスペーサーおよび／またはエフェクター分子を含む、組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを開示する。
【０４４２】
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断用途または治療用途において有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであることが意図される。よって、毒素または酵素、とりわけプロドラッグの活性化を触媒することができる酵素であるエフェクター分子が具体的に指示される。このようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは天然に存在する酵素または毒素をコードするＤＮＡ、またはその突然変異体の配列を有し、当分野で周知の方法によって調製することができる。
【０４４３】
＜抗ＶＨＺ抗体＞
実施例により、ＶＨＺタンパク質に対する抗体、すなわち、抗ＶＨＺ抗体の作製および産生を記載する。このような抗ＶＨＺ抗体は、細胞内ＶＨＺなどのＶＨＺと結合することができるものであり得る。
【０４４４】
モノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体の両方とそれらの特性は、本明細書および実施例において詳細に記載される。該抗体には、ＶＨＺと結合することができるモノクローナル抗体２０９が含まれる。この抗体のヒト化型も開示する。
【０４４５】
本発明者らは、ＶＨＺポリペプチドと結合することができる抗体であって、抗体２０９により結合されるエピトープと結合することができる抗体、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを記載する。
【０４４６】
該抗体は、抗体２０９により結合されるＶＨＺポリペプチドのエピトープと結合することができるものであり得る。該抗体には、ＶＨＺの残基Ｃ９５を含む配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントであるエピトープに結合することができる抗ＶＨＺ抗体が含まれてもよい。
【０４４７】
該抗体は、モノクローナル抗体２０９の可変領域を含んでもよい。
【０４４８】
本発明者らはさらに、ＶＨＺと結合することができる、モノクローナル抗体２０９の可変領域、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む抗体を記載する。
【０４４９】
該抗体は、細胞内ＶＨＺポリペプチドと結合することができるものでもよい。該抗体は、細胞の原形質膜を通過することができるものでもよい。
【０４５０】
該抗体は、ＶＨＺと結合しかつＶＨＺの生物活性を阻害することができるものでもよい。
【０４５１】
該抗体は、がん、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの転移を防ぐことができるものでもよい。該がんには、ＶＨＺを発現するがんが含まれてよい。
【０４５２】
該抗体には、モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体が含まれてもよい。
【０４５３】
本発明者らはさらに、抗ＶＨＺ抗体とさらなる治療抗体とを含む組合せを記載する。
【０４５４】
本発明者らはさらに、このような抗体または組合せを、製薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに含む医薬組成物を記載する。
【０４５５】
本発明者らはさらに、がんまたはその転移の治療または予防の方法での使用のための、記載されるような抗体を含み得る、ＶＨＺと結合することができる抗体、上記に示される組合せまたは上記に示される医薬組成物を記載する。
【０４５６】
該方法は、がん細胞を該抗体または組合せに曝露することを含んでもよい。該方法は、治療上有効な量の該抗体、組合せまたは組成物をがんに罹患しているまたは罹患している疑いのある個体に投与することを含んでもよい。該がんには、転移性がんが含まれ得る。該がんはＶＨＺを発現するがんであり得る。
【０４５７】
該がんには、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんが含まれ得る。
【０４５８】
治療した個体における転移性腫瘍の数は未治療の個体と比べて少なくとも５０％減少し得る。治療した個体における転移性腫瘍の数は少なくとも６０％減少し得る。治療した個体における転移性腫瘍の数は少なくとも７０％減少し得る。治療した個体における転移性腫瘍の数は少なくとも８０％減少し得る。治療した個体における転移性腫瘍の数は未治療の個体と比べて少なくとも９０％減少し得る。
【０４５９】
本発明者らはさらに、がんまたはその転移の診断方法における使用のための、上記に示される抗体、記載される組合せまたは記載される医薬組成物を記載する。
【０４６０】
本発明者らはさらに、がんまたはその転移の診断における使用のための、このような抗体、このような組合せまたはこのような医薬組成物を使用説明書とともに含む診断キットを記載する。
【０４６１】
本発明者らはさらに、ＶＨＺと結合することができる、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含むポリペプチドを記載する。
【０４６２】
本発明者らはさらに、ＶＨＺ結合活性を有するポリペプチドをコードすることができる、上記に示される分子をコードすることができる配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む核酸を記載する。
【０４６３】
本発明者らはさらに、このような核酸配列を含むか、またはこのような核酸配列によって形質転換された細胞、あるいはそのような細胞の子孫を記載する。
【０４６４】
本発明者らはさらに、記載される抗体を作製する方法を記載し、該方法は、このような細胞を準備することおよび該細胞から該抗体を発現させることを含む。
【０４６５】
本発明者らはさらに、個体におけるがん、例えば、転移性がんなどの診断方法を記載し、該方法は、個体の生体試料を上記に示される抗体に曝露することおよび該抗体とＶＨＺポリペプチドとの結合を検出することを含む。
【０４６６】
本発明者らはさらに、がんに罹患しているまたは罹患している疑いのある個体におけるがん、例えば、転移性がんなどの治療または予防方法を記載し、該方法は、治療上有効な量の記載される抗体、記載される組合せまたは記載される組成物を該個体に投与することを含む。
【０４６７】
該方法は、上記段落のいずれかに記載される特徴を含んでもよい。
【０４６８】
本発明者らはさらに、がんに罹患しているまたは罹患している疑いのある個体におけるがん、例えば転移性がんなどの治療または予防方法を記載し、該方法は、記載される方法により該個体においてがんを診断することおよび記載される方法により該個体を治療することを含む。
【０４６９】
本発明者らはさらに、転移細胞を検出する方法を記載し、該方法は、候補細胞を上記の抗体に曝露することおよび該細胞によるＶＨＺポリペプチドの発現を検出することを含む。
【０４７０】
本発明者らはさらに、転移性腫瘍の動物モデルを作成する方法を記載し、該方法は、（ａ）複数の転移性がん細胞、例えば、ＶＨＺを発現するがん細胞などを第１の動物に投与することと、（ｂ）第１の動物において該細胞に転移性腫瘍を発生させることと、（ｃ）第１の動物から転移性腫瘍を摘出し該転移性腫瘍から細胞株を得ることと、（ｄ）該細胞株の複数の細胞を第２の動物に投与することとを含む。
【０４７１】
本発明者らはさらに、このような方法により得られる動物モデルを記載する。
【０４７２】
本発明者らはさらに、このような方法により作成された動物モデルまたは転移性腫瘍のモデルとして上記に示される動物モデルの使用を記載する。
【０４７３】
本発明者らはさらに、記載される抗体を準備するステップと、該抗体をＶＨＺポリペプチドと結合させるステップとを含む方法を記載する。
【０４７４】
該抗体は、ＶＨＺポリペプチドを発現する細胞と結合させ得る。
【０４７５】
誤解を避けるために、本明細書において特異的抗体を指す場合には、文脈上特に断りのない限り、これはマウスモノクローナル抗体（ハイブリドーマによって分泌されるもの）、ならびにそのヒト化型の両方への言及を含むものと解釈されるべきである。よって、例えば、抗体２０９を指す場合には、これにはモノクローナル抗体２０９（すなわち、２０９と呼ばれるマウスハイブリドーマ分泌抗体）、ならびにヒト化モノクローナル抗体２０９の両方が含まれる。
【０４７６】
本明細書において記載される特異的抗体は、当業者ならば本明細書において開示される情報から、本発明者らがさらに詳細に記載している分子生物学技術を使用して作製することができる。
【０４７７】
この目的のため、本発明者らは、モノクローナル抗体２０９の可変領域の配列を開示する。本発明者らはさらに、該可変領域の変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体を開示する。この配列情報を用い、当業者は該可変領域を含む抗体、またはその変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体を作製することができる。
【０４７８】
本発明者らはさらに、該モノクローナル抗体を発現させるための核酸構築物を記載する。これらの構築物は、２０９と同一の配列を有するモノクローナル抗体の製造を可能にする。本発明者らはさらに、２０９の変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体を開示する。
【０４７９】
最後に、本発明者らはヒト化モノクローナル抗体２０９を発現させることができる構築物を記載する。本発明者らは、該構築物、ならびにこれらのヒト化構築物の変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体によりトランスフェクトした細胞から対象となる抗体を発現させる方法を記載する。
【０４８０】
このような配列およびその発現方法を用い、当業者であれば関連宿主細胞を容易にトランスフェクトし該細胞に完全モノクローナルもしくはヒト化抗ＶＨＺ抗体、またはその変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体を発現させることができる。
【０４８１】
本発明者らはさらに、ＶＨＺ結合活性を一般に有するポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドには、抗ＶＨＺ抗体が含まれる。ＶＨＺ結合ポリペプチドは、モノクローナル抗体２０９と同一または類似の特性の１つ以上を含み得る。該ポリペプチドは便宜上一般的に「抗ＶＨＺ抗体」と呼ぶ。
【０４８２】
抗体や免疫グロブリンでなくてもよい（または抗体や免疫グロブリンとして記載されなくてもよい）本明細書に記載される抗ＶＨＺ結合活性を有する結合分子を構築することは、読者の技能の範囲内である。従って、文脈上許容される場合、用語「抗ＶＨＺ抗体」は、それがＶＨＺと結合することができる限りあらゆる分子を含むものと解釈されるべきである。このような分子には、抗体および免疫グロブリンだけでなく、ポリペプチド、小分子も含まれてよく、それらは、当分野で公知の様々な手段によって、例えば、適したライブラリーをＶＨＺ結合活性についてスクリーニングすることにより同定されてよい。
【０４８３】
抗ＶＨＺ抗体（ＶＨＺ結合分子を含む）は、モノクローナル抗体２０９と類似または同一の特性を有し得る。このような類似または同一の特性には、特に結合特性が含まれ得る。抗ＶＨＺ抗体は、一般的に、ＶＨＺポリペプチド、例えば、ＶＨＺと結合することができるものでもよい。
【０４８４】
よって、用語「抗ＶＨＺ抗体」は、モノクローナル抗体２０９（ならびにそのヒト化対応物）を含むものと解釈される。また、抗体２０９の可変領域またはその変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体を含むポリペプチドも含まれる。この用語は、文脈上許容される場合、下記に記載されるような、抗ＶＨＺ抗体の変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体への言及を含むものとも解釈されるべきである。
【０４８５】
＜ＶＨＺエピトープ＞
抗ＶＨＺ抗体は、２０９と同一または類似の結合特異性、結合親和性および／または結合親和性を有し得る。抗ＶＨＺ抗体は、抗体２０９により結合されているエピトープと特異的に結合し得る。
【０４８６】
特定の抗体が結合するエピトープを決定する方法は、当分野で公知である。このようなエピトープマッピング方法は、例えば、Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：１２６に記載されている。さらに、当業者であれば、抗体を生成し、それらを特定の特性についてスクリーニングすることができよう。このような方法の詳細な説明は実施例２７に示す。従って、当業者であれば、２０９と同じエピトープと結合する抗ＶＨＺ抗体を容易に同定することができることになる。
【０４８７】
抗ＶＨＺ抗体は、抗体２０９の可変領域を含んでよく、それについては下記に詳細に記載する。抗ＶＨＺ抗体は、単一抗体分子内に同じまたは異なる可変領域を含み得る。抗ＶＨＺ抗体は、１つの可変領域、または２つ以上の可変領域を含み得る。従って、本発明者らは、抗体２０９と同一または類似の結合反応性を有する任意の数の抗体を作製する能力を当業者に提供する。
【０４８８】
このような抗体は、抗体の完全なまたは実質的に完全な配列（すなわち、重鎖および軽鎖）を含み得るか、または全抗体のフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントまたは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）など）を含み得る。該抗体はさらに、下に詳細に記載されるような、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質または合成タンパク質を含み得る。また、このような抗体は、望ましい特性、例えば、宿主反応性の低減、拒絶反応の低減などについて操作し得ることも明らかである。
【０４８９】
操作には、「ヒト化」が含まれることがあり得る。この用語は、マウス抗体配列などの抗体配列中への１つ以上のヒト残基または配列の組込み（または置換）を意味する。本明細書の文脈における「ヒト化」には、「キメラ」抗体が含まれ、「キメラ」抗体はマウス配列およびヒト配列の分離した部分を含み、例えば、可変領域の一方または両方がマウス配列を含み、抗体分子の残りの部分（例えば、その定常領域など）がヒト配列を含む。このようなキメラ抗体では、例えば、マウスまたはラット抗体の可変領域全体をヒト定常領域とともに発現させることができる。これにより、そのようなキメラ抗体にヒトエフェクター機能が与えられ、ネズミＦｃ領域により引き起こされる免疫原性（ＨＡＭＡ）も低下させる。
【０４９０】
一般的には、「キメラ抗体」とは、ネズミ免疫グロブリン遺伝子に由来するヌクレオチド配列によってコードされる重鎖および軽鎖のいずれかと、ヒト免疫グロブリン遺伝子に由来するヌクレオチド配列によってコードされる重鎖および軽鎖のいずれかとを有する抗体をさし得る。
【０４９１】
「ヒト化」にはまた、ＣＤＲ移植もしくは再形成抗体も含まれる。よって、「ヒト化」には、より分離したレベルでの操作、例えば、免疫原性を低下させるためにヒト残基を含むようにマウス可変領域を変異させた抗体が含まれる。そのような抗体では、齧歯類抗体Ｖ領域に由来する相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）だけが、ヒトＶ領域に由来するフレームワーク領域と組み合わせることができる。このような抗体はキメラ抗体よりもヒトに近くかつ免疫原性が低いはずである。
【０４９２】
抗ＶＨＺ抗体は、一般的に、複数の条件においてＶＨＺと結合することができるポリペプチドであってよい。
【０４９３】
一実施形態では、結合環境は細胞内条件を含む。つまり、抗ＶＨＺ抗体は無傷細胞または非透過性細胞内でＶＨＺポリペプチドと結合することができるものであり得る。このような非透過性細胞には、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはジギトニンなどの透過処理剤に曝露されていない、または実質的に曝露されていない細胞が含まれ得る。
【０４９４】
本明細書に記載される抗ＶＨＺ抗体は、ＶＨＺが細胞内部に存在するか、細胞膜内に存在するか、または細胞内に封入されているときに、ＶＨＺと結合することができるものでもよい。同様に、本明細書において一般的に記載されるように、細胞の内部を含む環境を背景にして、ＶＨＺポリペプチドに抗ＶＨＺ抗体が結合することができる。抗ＶＨＺ抗体は、特に、細胞内ＶＨＺポリペプチドと結合することができるものでもよい。細胞内ＶＨＺポリペプチドは、１つまたは複数の細胞構造、例えば、細胞膜の内側の膜、オルガネラ、細胞骨格構造、核膜などと関連し得る。ＶＨＺポリペプチドは核内に位置し得る。これらの各場合では、抗ＶＨＺ抗体は細胞内環境にあるＶＨＺポリペプチドと結合することができるものでもよい。
【０４９５】
抗ＶＨＺ抗体は、いくつかの方法で細胞内環境にあるＶＨＺポリペプチドと結合することができるものでもよい。抗ＶＨＺ抗体は、原形質膜を通過することができるものでもよい。抗ＶＨＺ抗体は、別の方法で、例えば、細胞取り込みによって、ＶＨＺポリペプチドの結合領域に接近することができるものでもよい。抗ＶＨＺ抗体は、任意の手段によって細胞内に内在化させてもよいし、または転移させてもよいし、あるいは送達させてもよい。
【０４９６】
もう１つの実施形態では、結合条件は細胞外条件を含む。よって、抗ＶＨＺ抗体は、細胞外環境にあるその同種ＶＨＺポリペプチドと結合することができるものでもよい。
【０４９７】
よって、抗ＶＨＺ抗体はＶＨＺポリペプチドと細胞外で結合することができるものでもよい。言い換えれば、ＶＨＺが細胞外に存在する場合に、本明細書に記載される抗ＶＨＺ抗体はＶＨＺと結合できるものでもよい。同様に、本明細書において一般的に記載されるように、細胞の内部に対して外側の環境を背景にして、ＶＨＺポリペプチドに抗ＶＨＺ抗体が結合することができる。抗ＶＨＺ抗体は、場合によっては、分泌されたＶＨＺポリペプチドと結合することができるものでもよい。ＶＨＺポリペプチドには、循環ＶＨＺポリペプチドが含まれてよい。
【０４９８】
抗ＶＨＺ抗体は、外部または外在化ＶＨＺポリペプチドと結合することができるものでもよい。抗ＶＨＺ抗体は、血液循環中の分泌されたＶＨＺポリペプチドと結合することができる。
【０４９９】
抗ＶＨＺ抗体とその標的との結合は、幾分強くまたは弱く、一時的、半永久的、または永久的なものであってよい。
【０５００】
抗ＶＨＺ抗体とＶＨＺポリペプチドとの結合は、細胞内で起こり得る。このような結合は、ＶＨＺポリペプチドの活性を不活性化し、阻害し、または低下させることができる。該結合は、ＶＨＺ活性を中和することができる。該活性は、ＶＨＺポリペプチドによって引き起こされるかまたはＶＨＺポリペプチドと関連している任意の生物活性を含み得る。該活性には、別のタンパク質、例えば、下流のタンパク質または因子との結合が含まれ得る。抗ＶＨＺ抗体とＶＨＺポリペプチドとの結合は、下流のタンパク質または因子の活性を不活性化し、阻害し、または低下させることができる。該活性は、他の細胞、例えば、循環中の転移性がん細胞などの細胞との伝達を含み得る。従って、抗ＶＨＺ抗体は、血液循環中のＶＨＺポリペプチドを中和して、ＶＨＺ−ホスファターゼが下流の因子と結合すること、またはそれらが循環中の他の細胞と伝達することを阻止することができる。
【０５０１】
活性には、生化学的活性または病原活性が含まれ得る。生化学的活性には、触媒活性が含まれ得る。触媒活性には、ホスファターゼ活性が含まれ得る。活性には、増殖調節活性、がん活性、発がん活性または転移活性が含まれ得る。
【０５０２】
モノクローナル抗体２０９は、ヒトまたは他の動物における疾患の治療に使用することができる。本発明者らは、このような抗ＶＨＺ抗体が抗がん活性を有することを実施例において示す。具体的には、実施例により、抗ＶＨＺ抗体ががん性腫瘍の転移拡散を防ぐことができることを示す。
【０５０３】
実施例２７は、抗ＶＨＺ抗体で治療した動物が抗ＶＨＺ抗体で治療していない動物と比較して有意に少ない腫瘍を示すことを示している。抗ＶＨＺ抗体は、ＶＨＺポリペプチドと結合しその活性を阻害することができる。
【０５０４】
従って、本発明者らは、疾患、例えば、がんなどの治療または予防における抗ＶＨＺ抗体の使用を提供する。該がんには、転移性がんが含まれ得る。抗ＶＨＺ抗体は、がん、例えば、確立した腫瘍（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｕｒ）などの転移を治療するために薬物または療法として使用することができる。抗ＶＨＺ抗体は、がんまたはその転移を防ぐために使用することができる。
【０５０５】
治療できるまたは予防できるがんとしては、ＶＨＺタンパク質の発現または過剰発現と関連しているがんを挙げることができる。ＶＨＺタンパク質は、そのファミリーの関連メンバーであり得る。これは、ＶＨＺの発現または過剰発現と関連しているがんが２０９などの抗ＶＨＺ抗体、または類似もしくは同一の特性を有する抗体により治療できるまたは予防できる可能性があることを意味する。同様に、ＶＨＺの発現または過剰発現と関連しているがんは、２０９などの抗ＶＨＺ抗体、または類似もしくは同一の特性を有する抗体により治療できるまたは予防できる可能性がある。
【０５０６】
治療は、一般的に、がん細胞、またはがん細胞の疑いのある細胞を、抗ＶＨＺ抗体と接触させることを含んでもよい。該細胞を抗ＶＨＺ抗体に曝露させてもよい。曝露は複数回反復してよい。抗ＶＨＺ抗体の任意の組合せをどんな量または相対量においても、どんな曝露時期においても用いることができる。
【０５０７】
よって、本発明者らは、がんなどの疾患の治療における上記のような抗ＶＨＺ抗体の組合せの使用を提供する。
【０５０８】
該細胞は、個別の細胞であってもよいし、または細胞塊、例えば、がんもしくは腫瘍細胞塊などで存在してもよい。該細胞は生物の体内に存在し得る。該生物は、がんに罹患していることがわかっている生物であるか、またはがんの疑いのある生物であってよい。治療は、抗体または複数の抗体を該生物に投与することを含んでよい。上記のように、単一の抗体を投与してもよいし、または抗ＶＨＺ抗体と別の治療抗体との組合せを投与してもよい。投与は、上記のように、同時または逐次的であってよい。従って、治療は、抗ＶＨＺ抗体をさらなる治療抗体と同時または逐次的に個体に投与することを含んでよい。
【０５０９】
抗ＶＨＺ抗体は、一般的に、下記にさらに詳細に記載されるように、ＶＨＺ分子と結合することができる任意の免疫グロブリンを含む。
【０５１０】
＜抗体＞
本明細書において用いられる用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、文脈上許容される場合、同義的に使用してよい。これらの用語には、２０９により結合されるＶＨＺのエピトープのように、ＶＨＺまたはそのエピトープに選択的に反応することができるかまたはそれを認識することができる抗体分子の、タンパク質分解により切断されたまたは組換えにより調製された部分のフラグメントが含まれる。
【０５１１】
このようなタンパク質分解フラグメントおよび／または組換えフラグメントの限定されない例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖフラグメント、およびペプチドリンカーによって連結されたＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。これらのＦｖは、共有結合または非共有結合し２つ以上の結合部位を有する抗体を形成し得る。
【０５１２】
「ＳｃＦｖ分子」とは、ＶＨパートナードメインおよびＶＬパートナードメインが柔軟性のあるオリゴペプチドを介して連結されている分子を意味する。特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関わる技術の一般的総説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９において見られる。
【０５１３】
完全抗体、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、「二価」である。「二価」とは、該抗体およびＦ（ａｂ’）フラグメントが２つの抗原結合部位を有することを意味する。これに対して、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂフラグメントは一価でありただ１つの抗原結合部位を有する。
【０５１４】
抗ＶＨＺ抗体には、オフ速度が１０−２ｓ−１〜１０−４ｓ−１の高親和性抗体が含まれてもよい。オフ速度は約２×１０−４ｓ−１であり得る。
【０５１５】
本明細書において用いられる用語「オフ速度」は、本明細書において開示される抗ＶＨＺ抗体などの抗体の解離速度（ｋｏｆｆ）を指す。オフ速度は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定することができる。オフ速度は抗原に対するＦａｂフラグメントの親和性を反映するので、低いオフ速度が望ましい。
【０５１６】
用語「親和性」は、抗ＶＨＺ抗体などの抗体の解離速度またはオフ速度（ｋｏｆｆ）という観点から定義される。オフ速度が小さいほど、ＶＨＺなどの抗原に対して抗ＶＨＺ抗体などの抗体が有する親和性は高くなる。
【０５１７】
抗ＶＨＺ抗体は、ペプチド自体を含むまたは融合タンパク質の一部を形成することができる。
【０５１８】
本明細書において記載される抗ＶＨＺ抗体には、ＶＨＺ結合活性、例えば、細胞内ＶＨＺとの結合能、または場合によっては２０９により結合されている同じエピトープとの結合などを有する任意の抗体が含まれる。
【０５１９】
抗ＶＨＺ抗体にはまた、完全または全抗体（マウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を問わない）、このような抗体の誘導体および生物学的活性フラグメントも含まれる。これらには、アミノ酸置換を有するかまたは糖もしくは他の分子がアミノ酸官能基に結合している、ＶＨＺ結合活性を有する抗体フラグメントなども含まれ得る。
【０５２０】
抗ＶＨＺ抗体には、単離抗体または精製抗体が含まれてよい。抗ＶＨＺ抗体は、天然であるかどうかを問わず、任意の適した供給源から入手できるかまたはそのような供給源によって作製されてよい。また、抗ＶＨＺ抗体は、合成抗ＶＨＺ抗体、半合成抗ＶＨＺ抗体、誘導体化抗ＶＨＺ抗体または組換え抗ＶＨＺ抗体であってよい。
【０５２１】
抗ＶＨＺ抗体が非天然抗ＶＨＺ抗体である場合、抗ＶＨＺ抗体には、少なくとも一部が組換えＤＮＡ技術により調製されたものまたは化学合成技術により作出された抗ＶＨＺ抗体またはそれらの組合せが含まれ得る。
【０５２２】
本明細書において用いられる用語「誘導体」は、抗ＶＨＺ抗体の化学修飾を含む。このような修飾を例示するものとしては、例えば、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換がある。抗ＶＨＺ抗体の配列は、天然に存在する形態のものと同一であり得るしまたはその変異体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体であり得る。
【０５２３】
＜抗体可変領域＞
本明細書において用いられる用語「可変領域」は、場合によっては、ＶＨＺに対する抗体（または変異体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体）の結合認識特異性についておよび全体親和性についての決定因子を含む軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域またはドメインを指す。
【０５２４】
軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の各対の可変ドメインは抗原認識に関与し抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖のドメインは、同一の全体構造を有し、各ドメインは、配列が比較的保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を有し、ＦＲ領域は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結される。ＦＲ領域は可変ドメインの構造的完全性を維持する。ＣＤＲは、抗原の結合を媒介する可変ドメイン内のポリペプチドセグメントである。
【０５２５】
本明細書において用いられる用語「定常領域」は、構造的安定性および抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、および補体結合などの他の生物学的機能を提供するが、ＶＨＺエピトープとの結合には関与しない抗体（または変異体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体）の軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）のドメインを指す。定常領域の遺伝子のアミノ酸配列および対応するエキソン配列は、その起源となる種に依存する。しかしながら、アロタイプをもたらすアミノ酸配列の変異は、種内では特定の定常領域に比較的限られている。「アロタイプ」とは、対立遺伝子を識別する抗原決定基（またはエピトープ）である。
【０５２６】
各鎖の可変領域は、連結ポリペプチド配列により定常領域に連結される。連結配列は、軽鎖遺伝子の「Ｊ」配列と重鎖遺伝子の「Ｄ」配列および「Ｊ」配列との組合せによりコードされる。
【０５２７】
＜＜抗体：可変領域配列＞＞
＜抗体２０９＞
モノクローナル抗体２０９の可変領域の重鎖のアミノ酸配列は次の通りである（配列番号４）：
ＬＶＤＭＤＳＲＬＮＬＶＦＬＶＬＩＬＫＧＶＱＣＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＰＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＷＱＴＡＲＡＴＲＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
【０５２８】
モノクローナル抗体２０９の可変領域の軽鎖のアミノ酸配列は次の通りである（配列番号５）：
ＶＭＴＱＳＨＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＦＴＧＶＰＤＬＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＮＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＨＨＰＶＳＬＧ
【０５２９】
本明細書に記載される方法および組成物による抗ＶＨＺ抗体は、当分野で公知の方法によりこれらの可変領域配列から生成することができる。例えば、重鎖および軽鎖配列は、当業者には公知の組換え遺伝子工学技術によって、選択された抗体の定常配列に組み換えてもよい。
【０５３０】
定常領域配列は当分野で公知であり、複数のデータベース、例えば、ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４（Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７８１−Ｄ７８４およびＬｅＦｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）ＬＩＧＭ−ＤＢ／ＩＭＧＴ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｉｇ  ａｎｄ  ＴｃＲ，Ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７６４（１），４７-４７  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７４９−６６３２．１９９５．ｔｂ５５８０５．ｘに記載）およびＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００５  Ｊａｎ  １；３３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２５６−６１に記載）などから入手可能である。ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢおよびＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢはｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／にあるＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースの一部である。
【０５３１】
完全抗体を作出するために所与の配列を有する可変領域と定常領域とを組み合わせるための方法は当分野で公知であり、例えば実施例１６およびＨａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：１２６に記載されている。Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントまたは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの完全抗体のフラグメントは当分野で公知の手段によって作出してもよい。
【０５３２】
開示される配列と文献に記載されている方法を用いて、例えば、上に示される配列を有する、抗体２０９の可変領域の重鎖および軽鎖を、マウスＩｇＧ定常領域配列と遺伝子導入によって融合させてマウスモノクローナル抗ＶＨＺ抗体を作出することができる。
【０５３３】
＜使用＞
抗ＶＨＺ抗体は、（ａ）抗ＶＨＺ抗体を準備することと、（ｂ）生体試料を該抗体とともに、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと、（ｃ）該抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを決定することとを含む方法によって生体試料中に存在するＶＨＺポリペプチドを検出する方法において使用することができる。
【０５３４】
適した試料としては、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉および骨組織などの組織の摘出物、またはこのような組織に由来する新生物の発生物からの摘出物が挙げられる。特に、試料には、関連がんに罹患している疑いのある個体の結腸、肺、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含む扁平上皮細胞、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎臓、皮膚、卵巣、前立腺および精巣組織などの組織が含まれ得る。
【０５３５】
抗体は固相支持体に結合させ、かつ／または適した試薬、対照および使用説明書などとともにキットとして適した容器中にパッケージングしてよい。
【０５３６】
＜抗体送達＞
ＶＨＺタンパク質に対する抗体は、当分野で公知の技術によって、例えば、リポソーム、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ＨＥＭＡ、直鎖ポリアミドアミンポリマーなど）などの使用によって細胞へ送達することができる。免疫グロブリンおよび／または抗体はまた、原形質膜および／または核膜を通過することができるタンパク質とのタンパク質融合物またはコンジュゲートとしても細胞へ送達することができる。例えば、免疫グロブリンおよび／または標的を、転移活性に関与するこのようなタンパク質に由来するドメインまたは配列と融合またはコンジュゲートさせてよい。転移ドメインおよび配列には、ＨＩＶ−１トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアホメオドメインタンパク質および単純ヘルペス−１ウイルスＶＰ２２タンパク質に由来するドメインおよび配列が含まれてよい。
【０５３７】
＜医薬組成物および投与＞
ＶＨＺ核酸、ポリペプチド、フラグメント、ホモログ、その変異体または誘導体、モジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニスト、構造的に関連のある化合物、またはいずれかの酸性塩を含む抗ＶＨＺ剤は、単独で投与することができるが、この有効成分は医薬処方物として処方してもよい。
【０５３８】
そのために、本発明者らはまた、抗ＶＨＺ剤を含む医薬組成物も開示する。このような医薬組成物は、抗ＶＨＺ剤を、例えば記載されるような組成物の形態で、記載されるような症状の治療または軽減のために個体へ送達するために有用である。
【０５３９】
本明細書に関して医薬組成物とは、有効成分として少なくとも抗ＶＨＺ剤を含む物質の組成物である。
【０５４０】
医薬処方物は、有効量の抗ＶＨＺ剤を１以上の製薬上許容される担体とともに含む。「有効量」とは、記載されるような疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために十分な量である。
【０５４１】
有効量は、治療または軽減される特定の疾患もしくは症候群、ならびに患者の年齢および体重、疾患などの状態がどの程度進行しているか、患者の健康状態、症状の重篤度、および抗ＶＨＺ剤が単独で投与されるか他の療法とともに投与されるかどうかを含む、その他の因子によって異なる。
【０５４２】
適した製薬上許容される担体は当分野で周知であり、その医薬処方物の所望の形態および投与様式によって異なる。例えば、それらは希釈剤または賦形剤、例えば、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、および同様のものを含み得る。一般に、担体は固体、液体または揮発可能な担体、またはその組合せである。各担体は、その処方物中の他の成分と適合し、患者に害がないという意味で「許容される」ものでなければならない。担体は、宿主に投与した際に有害反応（例えば、免疫応答）を誘発せずに生物学的に許容されるものでなければならない。
【０５４３】
医薬組成物の有効成分（類）は、例えば、がん、腫瘍、新生物および他の関連疾患の軽減において治療活性を示すことが意図される。投薬計画は、最適な治療応答を提供するために調節することができる。例えば、数回に分割した用量を毎日投与してもよいし、あるいは治療状況の緊急性によって指示されるように、用量を比例的に減らしてもよい。
【０５４４】
有効化合物は、通常の様式、例えば経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内もしくは坐剤経路、またはインプラント（例えば、徐放性分子を使用）などにより投与することができる。投与経路に応じて、有効成分は酵素、酸、および前記成分を不活性化する可能性のあるその他の天然条件の作用から前記成分を保護するための材料でコーティングする必要があり得る。
【０５４５】
抗ＶＨＺ剤は単独で投与してもよいし、あるいは他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。本明細書における使用に適した他の治療薬は、意図される目的に有効な任意の適合薬物、またはその薬剤処方物を補う薬物である。併用療法に用いられる処方物は、組合せ効果が達成されるように、他の治療と同時にまたは連続して投与することができる。
【０５４６】
＜経口投与＞
ある実施形態において、ＶＨＺ活性、発現または量の阻害剤は経口組成物として提供され、相応に投与される。ＶＨＺ活性、発現または量の阻害剤の用量は約１ｍｇ／日〜約１０ｍｇ／日の間であり得る。
【０５４７】
この医薬組成物は、錠剤、カプセル剤または溶液の形態の経口処方物で投与することができる。有効量の経口処方物を患者に毎日１〜３回、疾患の症状が軽減されるまで投与する。
【０５４８】
薬剤の有効量は、患者の年齢、体重および状態によって異なる。一般に、薬剤の１日経口用量は１２００ｍｇ未満、１００ｍｇ超である。１日経口用量は約３００〜６００ｍｇであり得る。経口処方物は、好都合には単位剤形で提供され、製薬分野で公知の任意の方法によって調製することができる。組成物は、適した製薬上許容される担体とともに任意の所望の剤形に処方することができる。典型的な単位剤形としては、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤が挙げられる。一般に処方物は、薬剤組成物を液体担体または微粉固体担体またはその両方と均一かつ密に会合させ、必要に応じて、その生成物を成形することによって調製される。有効成分は、液剤、散剤、錠剤またはカプセル剤の形態の様々な基本材料に組み入れ、疾患の治療に有効な量の有効成分とすることができる。
【０５４９】
組成物は、適切には例えば不活性希釈剤または吸収可能な食用担体などとともに経口投与してよく、あるいはゼラチン硬カプセルもしくは軟カプセルに封入してよく、あるいは圧縮して錠剤にしてよく、あるいは食事の食物中に直接組み入れてもよい。経口治療薬の投与では、有効化合物は賦形剤とともに組み入れてもよく、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤およびウエハーなどの形態で使用することができる。このような治療上有用な組成物中の有効化合物の量は、適した用量が得られる量である。
【０５５０】
これらの錠剤、トローチ剤、丸剤およびカプセル剤などはまた、次のものを含み得る：結合剤、例えばトラガカントガム、アラビアガム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなど；賦形剤、例えば第ニリン酸カルシウムなど；崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムなど；および甘味剤、例えばスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどを加えてよく、あるいは香味剤、例えばペパーミント、冬緑油またはチェリーフレーバーなどを加えてよい。投薬単位形がカプセルである場合、上記の種類の材料に加えて液体担体を含んでよい。
【０５５１】
様々なその他の材料が、コーティング剤として、またはその他の点で投薬単位の物理的形態を改良するために、存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はセラック、糖またはその両方でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は有効化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素および香味剤、例えばチェリーまたはオレンジフレーバーなどを含み得る。もちろん、いずれの投薬単位形の調製に用いるいずれの材料も薬学上純粋で、その使用量において実質的に無毒でなければならない。その上、有効化合物を持続放出製剤および処方物に組み入れてもよい。
【０５５２】
＜注射液または静脈内投与＞
一部の実施形態では、抗ＶＨＺ剤は注射可能物質または静脈内組成物として提供され、相応に投与される。抗ＶＨＺ剤抑制剤の用量は、約５ｍｇ／ｋｇ／２週間〜約１０ｍｇ／ｋｇ／２週間の間であり得る。抗ＶＨＺ剤抑制剤は１０〜３００ｍｇ／日の間、例えば、少なくとも３０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日未満または３０ｍｇ／日〜２００ｍｇ／日の間の用量で提供することができる。
【０５５３】
注射用に適した医薬形としては、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤、および無菌注射溶液もしくは分散剤の即時調製用の無菌散剤が挙げられる。全ての場合において、その形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度の流動性があるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌などの汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えばレチシンなどの使用によって、分散物の場合では必要とされる粒径の維持によって、また、界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０５５４】
＜局所投与＞
本明細書に開示される医薬組成物は、局所投与および経口投与に適したものを含み、罹患組織が主として皮膚または表皮である場合（例えば、乾癬、湿疹および他の上皮疾患）には局所処方物が好ましい。
【０５５５】
局所処方物には、組成物が、治療される皮膚表面との直接的接触により外的に適用される医薬形が含まれる。局所適用の従来の医薬形としては、浸漬剤、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スティック、スプレー、エアゾール、バスオイル、溶液などが挙げられる。局所療法は様々なビヒクルにより送達され、ビヒクルの選択は重要であり、一般に急性疾患を治療するか慢性疾患を治療するかに関連する。一例として、急性皮膚増殖性疾患は一般に水性乾燥製剤で治療するが、慢性皮膚増殖性疾患は水和製剤で治療する。浸漬剤は急性湿性発疹を乾燥させる最も簡単な方法である。ローション（水中の粉末懸濁液）および溶液（溶媒に薬剤を溶かしたもの）は、有毛部および間擦部に理想的である。軟膏または油中水エマルジョンは、乾性落屑性発疹に適当な最も効果的な水和剤であるが、べとつきがあり、病変の部位によっては望ましくない場合がある。必要に応じて、特に病巣への薬剤組成物の浸透を高めることが望まれる場合には、それらは包帯と組み合わせて適用することができる。クリームまたは水中油エマルジョンおよびゲルは吸収性があり、患者にとって美容的に最も許容される（Ｇｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，ｐ．１５９３−１５９５０（１９９６））。クリーム処方物は一般に、例えば石油、ラノリン、ポリエチレングリコール、鉱油、グリセリン、パルミチン酸イソプロピル、グリセリルステアレート、セテアリルアルコール、酢酸トコフェリル、ミリスチン酸イソプロピル、ラノリンアルコール、シメチコン、カルボメン、メチルクロロイソチアゾリノン（ｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅ）、メチルイソチアゾリノン、シクロメチコンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにこれらの混合物などの成分を含む。
【０５５６】
他の局所適用処方物としては、シャンプー、石鹸およびシェークローションなど、特に下にある皮膚、例えば頭皮などに残留させるように処方されたものが挙げられる（Ａｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２８３８（１９９３））。
【０５５７】
一般に、局所処方物中の組成物の濃度は、組成物の約０．５〜５０重量％、例えば約１〜３０％、約２〜２０％または約５〜１０％の量である。使用濃度は、最初はその範囲の上の部分とし、治療を続けるにつれて濃度を引き下げるか、またはその処方物の適用頻度を少なくすることができる。局所適用は多くの場合、１日に２回行う。しかし、より高用量を１日１回適用しても、またはより低用量をより高い頻度で適用しても効果的であり得る。角質層は貯蔵庫として働き、長時間かけて活性のある皮膚層に薬剤を徐々に浸透させることができる。
【０５５８】
局所適用では、所望の薬理作用を得るためには、十分な量の有効成分が患者の皮膚に浸透しなければならない。一般に、皮膚への薬物の吸収は薬物の性質、ビヒクルの挙動、および皮膚の関数であると理解される。３つの主要な変数が、異なる局所薬または異なるビヒクル中の同じ薬物の吸収または流動速度；ビヒクル中の薬物の濃度；角質層とビヒクルの間の分配係数および角質層における薬物の拡散係数、の違いを説明する。治療に有効となるためには、薬物は皮膚のバリア機能を担う角質層を通過しなければならない。一般に、高いインビトロ皮膚浸透を発揮する局所用処方物はインビボにおいて有効である。Ｏｓｔｒｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６０：１１７５−１１７９（１９７１）は、局所適用されたステロイドのインビボ有効性が、インビトロでの採取された（ｄｅｒｍａｔｏｍｅｄ）ヒト皮膚へのステロイド浸透速度に比例することを実証した。
【０５５９】
皮膚科学的に許容され、かつ、当該薬剤に適合する皮膚浸透エンハンサーは、皮膚表面から上皮ケラチノサイトへの有効化合物の浸透を増強するために処方物に組み入れることができる。有効化合物の皮膚への吸収を高める皮膚エンハンサーは、有効な治療に必要とされる薬剤の量を低減し、その処方物のより長く持続する効果を提供する。皮膚浸透エンハンサーは当分野で周知である。例えば、ジメチルスルホキシド（米国特許第３，７１１，６０２号）；オレイン酸、１，２−ブタンジオール界面活性剤（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７３：１１５３−１１５６（１９８４））；エタノールとオレイン酸またはオレイルアルコールの組合せ（ＥＰ２６７，６１７）、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＷＯ８７／０３４９０号）；デシルメチルスルホキシドおよびＡｚｏｎｅ．ＲＴＭ．（Ｈａｄｇｒａｆｔ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，２１：１６５−１７３（１９９６））；アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ．、ピロリドン、尿素およびポリオール（Ｋａｌｂｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１：６１９−６３７（１９９６））；
テルペン、例えば１，８−シネオール、メントン、リモネンおよびネロリドールなど（Ｙａｍａｎｅ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＆  Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｙ，４７：９７８−９８９（１９９５））；Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ．およびトランスクトール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１３：５４２−５４６（１９９６））；およびオレイン酸、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１：７４１−７４４（１９９６））が有効成分の皮膚浸透を向上させることが知られている。
【０５６０】
薬剤または組成物の浸透のレベルは、当業者に知られている技術により決定することができる。当業者ならば、例えば、有効化合物を放射性標識した後、皮膚が吸収した放射性標識化合物の量を測定することで、試験化合物の皮膚浸透を測定するいくつかの方法のいずれかを用いて、吸収された組成物のレベルを決定することができる。皮膚浸透試験に関する刊行物としては、Ｒｅｉｎｆｅｎｒａｔｈ，Ｗ  Ｇ  ａｎｄ  Ｇ  Ｓ  Ｈａｗｋｉｎｓ．Ｔｈｅ  Ｗｅａｎｉｎｇ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ  Ｐｉｇ  ａｓ  ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｓｗｉｎｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍ．Ｅ．Ｔｕｍｂｌｅｓｏｎ  Ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６、およびＨａｗｋｉｎｓ，Ｇ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｋｉｎ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｋｉｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｂ  Ｗ  Ｋｅｍｐｐａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｗ  Ｇ  Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ  Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９０，ｐｐ．６７−８０；およびＷ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  ＆  Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ，１１０：３−９（１９９５）が挙げられる。
【０５６１】
いくつかの適用では、長時間作用型の薬剤または組成物は、当分野で公知の処方物、例えばポリマーなどを用いて投与することができる。この薬剤は、当分野で公知の方法に従って、皮膚パッチ（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｉｎ  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｎｏｒｄｉｃａ  ４：１１７（１９９２）；Ｔｈａｃｈａｒｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １６：１４５−１４８（１９９５）；Ｎｉｅｄｎｅｒ  Ｒ．，ｉｎ  Ｈａｕｔａｒｚｔ  ３９：７６１−７６６（１９８８））または包帯に組み入れて、処置される領域への薬物の送達効率を高めることができる。
【０５６２】
任意選択により、本明細書に記載される局所用処方物は、さらなる賦形剤、例えば；防腐剤、例えばメチルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸または第四級アンモニウム化合物など；安定剤、例えばＥＤＴＡなど、酸化防止剤、例えばブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソールなど、ならびにバッファー、例えばクエン酸塩およびリン酸塩などを含んでよい。
【０５６３】
＜非経口投与＞
有効化合物はまた、非経口的にまたは腹膜内に投与してもよい。また分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびにオイル中で調製することができる。一部の実施形態では、分散剤は３０％カプシトール（ＣｙＤｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ）中で調製することができる。カプシトールは、ナトリウムスルホン酸塩がブチルエーテルスペーサー基またはスルホブチルエーテル（ＳＢＥ）により親油性キャビティーから分離されたポリアニオン性β−シクロデキストリン誘導体である。シクロデキストリンはＳＢＥ７−β−ＣＤであり得る。
【０５６４】
＜アジュバント＞
組成物は、酵素阻害剤と同時投与されるアジュバント中、またはリポソーム中で投与することができる。アジュバントは広義で用いられ、任意の免疫刺激化合物、例えばインターフェロンなどを含む。本明細書で意図されるアジュバントとしては、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルなど）が含まれる。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシンが含まれる。リポソームとしては、水中油中水型ＣＧＦエマルジョンならびに従来のリポソームが含まれる。
【０５６５】
＜微生物増殖の防止＞
通常の保存および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含み得る。
【０５６６】
微生物作用の防止は、様々な抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チルメロサール（ｔｈｉｒｍｅｒｏｓａｌ）などによってもたらされてよい。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含んでよい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中での、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【０５６７】
無菌注射溶液は、必要量の有効化合物を、上記に挙げた様々な他の成分とともに適当な溶媒中に組み入れ、必要に応じて、その後、濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散剤は、滅菌した有効成分を、基本分散媒と上記に挙げたものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに組み入れることにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合は、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術を含み、有効成分と、予め濾過滅菌したその溶液からの付加的な所望の成分の粉末が得られる。
【０５６８】
＜製薬上許容される担体＞
本明細書において「製薬上許容される担体および／または希釈剤」としては、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などのいずれか、また全てが含まれる。医薬有効成分に関するこのような媒体および薬剤の使用は当分野で周知である。従来の媒体または薬剤が有効成分に不適合である場合を除き、その治療組成物中での使用が意図される。補助的有効成分も組成物に組み入れることができる。
【０５６９】
＜投薬単位形＞
投与の容易さと用量の均一性のため、医薬組成物は投薬単位形（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒｍ）で処方することが特に有利である。
【０５７０】
本明細書において投薬単位形とは、治療される被験体にとって単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の有効物質を含有する。新規な投薬単位形の仕様は、（ａ）有効物質と実現されるべき特定の治療効果の他に類を見ない特徴、および（ｂ）調剤技術に固有の制限、例えば身体的健康が損なわれている罹患状態の生きている被験体における疾患の治療のための有効物質など、により決定づけられ、かつ、それらに直接的に依存する。
【０５７１】
主要有効成分は、簡便かつ効果的な投与のために、有効量で、適した製薬上許容される担体とともに投薬単位形で調合される。補助的有効成分を含む組成物の場合、投薬量は前記成分の通常の用量および投与様式を参考にして決定される。
【実施例１】
【０５７２】
＜ＶＨＺ−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ−ＧＳＴ、およびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ発現構築物の生成＞
ヒトＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｑｕｉｃｋ−クローンＩＩ  ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ、カタログ番号６３７２６０）を、ＶＨＺフラグメントの生成における鋳型として使用する。フォワードプライマーＡ；５’ｇｃｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇｇｇｃｇｔｇｃａｇｃｃｃｃｃｃａａｃｔｔｃｔｃｃ３’およびリバースプライマーＢ；５’ｇｔｇｇａｔｃｃｃｇｔｔｔｃｇｔｔｃｇｃｔｇｇｔａｇ３’を用いてＰＣＲを行う（９４、５５、７２℃、４０サイクル）。次に、ＶＨＺ  ＰＣＲフラグメントをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲ１部位およびＢａｍＨ１部位に挿入して、ＥＧＦＰによりＣ末端にタグをつけたＶＨＺ（ＶＨＺ−ＥＧＦＰ）を得る。ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を構築するため、上記フォワードプライマーＡおよびリバースプライマーＢを、ミッド−リバースプライマー（ｍｉｄ−ｒｅｖｅｒｅｓ  ｐｒｉｍｅｒ）５’ｇｃｃａａａｇｃｃｃａｇａｇｃａｇａｇｔｇｃａｃｔｃｃｃａｃａｇｃ３’およびミッド−フォワードプライマー５’ｇｃｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇｇｇｃｇｔｇｃａｇｃｃｃｃｃｃａａｃｔｔｃｔｃｃ３’とともに、これまでに記載されているもの（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３）と類似の戦略を用いて、触媒的に不活性なＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を作製する。次に、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）ＰＣＲフラグメントを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲ１部位およびＢａｍＨ１部位に挿入して、ＥＧＦＰによりＣ末端にタグをつけた変異ＶＨＺ株であるＶＨＺ−（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰを形成する。ＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）ＰＣＲ産物を、それぞれｐＧＥＸ−ＫＧに挿入してＶＨＺ−ＧＳＴおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴを形成する。全てのクローンを、コード領域のＤＮＡ塩基配列決定により確認する。
【実施例２】
【０５７３】
＜ＶＨＺ−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ−ＥＧＦＰ（Ｃ９５Ｓ）およびＥＧＦＰベクターを単独で安定して発現するＭＣＦ−７およびＮＲＫ細胞プールの生成＞
これらの３つの発現構築物を、ヒト乳がん細胞株−ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）または正常ラット腎臓細胞−ＮＲＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６５０９）に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてそれぞれトランスフェクトする。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養する。細胞を１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中で２０〜３０日間選択し、安定した細胞プールを確立する。次に、これらの安定したプール（１０６細胞／ｍｌ）を、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ、ＳＥモード（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によるＥＧＦＰソーティングに供し、ＥＧＦＰ陽性細胞を選択する。
【実施例３】
【０５７４】
＜ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞内局在の共焦点顕微鏡法および分析＞
ＶＨＺ−ＥＧＦＰ発現ベクターをトランスフェクトしたＮＲＫ細胞をカバーガラス上で増殖させ、ＰＢＳＣＭ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＰＢＳ）で１回洗浄する。次に、細胞を２．７％パラホルムアルデヒド中で室温（ＲＴ、２４℃）にて２０分間固定する。ＰＢＳＣＭでさらに２回洗浄した後、細胞をＰＢＳＣＭ中０．１２％サポニンで１５分間透過処理し、Ｃｏｖａｎｃｅ’  Ｉｎｃ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）製ウサギ抗ペリセントリン抗体とともに室温にて１時間、その後４℃にて一晩インキュベートする。細胞をＰＢＳＣＭで３回穏やかに洗浄し、テキサスレッド（Ｓｉｇｍａ）結合抗マウスＩｇＧとともに室温にて４時間インキュベートする。ＶＨＺ−ＥＧＦＰを蛍光顕微鏡により直接可視化（緑）する。共焦点画像解析を行う（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ）。
【実施例４】
【０５７５】
＜マウスモノクローナル抗ＶＨＺ抗体およびウサギポリクローナル抗ＶＨＺ抗体の生成＞
この方法は既に記載されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。本発明者らは、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹハイブリドーマクローニングキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いてＶＨＺハイブリドーマを生成した。
【０５７６】
ＶＨＺ−ＧＳＴで免疫したマウスに由来する脾臓細胞と、ＳＰ２／０骨髄腫細胞を融合させた後、５０６の生存ハイブリドーマクローンを単離し、増殖させる。全てのクローンを、最初にＥＬＩＳＡによりＶＨＺ結合について試験する。８０のクローンがＶＨＺとの良好な反応を示し、最も強い反応性を有する２つの特定のＶＨＺクローンを、これらの２つのクローンがいくつかの用途で使用することのできるように選択する（図１０）。
【０５７７】
ウサギポリクローナル抗ＶＨＺ血清を生成する（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．）。抗体を、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当する合成ペプチドＣ−ＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫでウサギを免疫することにより産生させる。抗体を、プロテインＡ、次いでペプチドアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。数種類の細胞株に由来する細胞溶解液の免疫ブロット分析において、予測されたサイズ（１６ｋＤａ）の特異的バンドがこの抗体により検出され、このバンドの検出はＶＨＺ−ＧＳＴ融合タンパク質により特異的に遮断される（図１０Ａ）。
【実施例５】
【０５７８】
＜ＮＲＫ、ＭＣＦ−１０Ａ、およびＡ４３１細胞における内因性ＶＨＺの共焦点顕微鏡法および分析＞
ＮＲＫ細胞、ヒト乳腺上皮細胞−ＭＣＦ−１０Ａ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０３１７）、およびヒト上皮癌細胞−Ａ４３１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５５）をカバーガラス上で増殖させ、ＰＢＳＣＭ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＰＢＳ）で１回洗浄する。次に、細胞を、１００％メタノール中で−２０℃にて１５分間固定する。ＰＢＳＣＭでさらに２回洗浄した後、細胞をＰＢＳＣＭ中０．１２％サポニンで１５分間透過処理し、マウス抗γ−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）およびウサギ抗ＶＨＺ抗体（１：１５０希釈）とともに室温にて１時間、次いで４℃にて一晩インキュベートする。細胞をＰＢＳＣＭで３回穏やかに洗浄し、テキサスレッド（Ｓｉｇｍａ）結合抗マウスＩｇＧおよびＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）結合抗ウサギＩｇＧとともに室温にて４時間インキュベートする。共焦点画像解析を行う（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ）。
【実施例６】
【０５７９】
＜チロシンホスファターゼアッセイ＞
ＥｎｚＣｈｅｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ２２０６５）を使用する。製造業者のプロトコール通りに、蛍光性基質をアッセイウェル中でバッファーを用いて再構成する；所望の可能なＰＴＰアーゼ（それぞれのタンパク質：ＶＨＺ−ＧＳＴ、ＶＨＺ−ＧＳＴ＋ホスファターゼ阻害剤、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ、および対照ＧＳＴ、に対して０．６７５ピコモル）をウェルに加え、それぞれ３０分または９０分インキュベートする。次に、Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳマイクロプレート分光蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて蛍光を定量する。蛍光は、それぞれ３５８および４５２ｎｍの励起波長および発光波長で１０分間隔で測定される。ホスファターゼ阻害剤オルトバナジン酸ナトリウム（１０μＭ）をこのアッセイで陰性対照として用いる。
【実施例７】
【０５８０】
＜ＢｒｄＵ標識による、新たに合成されたＤＮＡの測定＞
ＡＰＣ  ＢｒｄＵ  Ｆｌｏｗキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、新たに合成されたＤＮＡを測定することにより細胞増殖を評価する。ＷｉｎＭＤＩ  ２．８ソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析する。ＡＰＣ標識細胞（ＦＬ２）のパーセンテージを決定する。
【実施例８】
【０５８１】
＜ウエスタンブロット解析＞
詳細な工程はこれまでに記載されている通りであった（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ウサギ抗ＶＨＺ抗体は、１：５００希釈で用られる。ホスホ−Ｒｂ（Ｓｅｒ  ７８０）、ホスホ−Ｒｂ（Ｓｅｒ  ７９５）、ホスホ−Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）、およびβ−アクチン抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）より得られた。ＧＡＰＤＨ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）製である。
【実施例９】
【０５８２】
＜免疫組織化学（ＩＨＣ）＞
本発明者らは、ヒト乳がん検体でのＶＨＺタンパク質発現を調査した。ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣキット（Ｏｒｔｏｎ  Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ｅｎｇｌａｎｄ）とともに、ウサギ抗ＶＨＺ抗体（１：３００希釈）を用いてＩＨＣ試験を行う。合計６５のホルマリンで固定しパラフィンに包埋した原発性ヒト乳がん試料の外科検体を、Ｈｅｎａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの病理学部のアーカイブより収集する。その上、ヒト乳癌組織アレイＴＭＡ（ＣＣ０８−１１−００８）をＣｙｂｒｄｉ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）より購入して結果を再確認する。ＩＨＣ法は、これまでに記載されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。Ｅ−カドヘリン抗体を購入する（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【実施例１０】
【０５８３】
＜ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰおよびＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ細胞運動性＞
本発明者らは、これまでに記載されている通りに評価した（Ｓｈｅｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。カバーガラス上のコンフルエント単層（１２ｍｍ）に細胞を蒔くことにより、細胞で覆われたカバーガラスを、次に新鮮培養ディッシュ（３５ｍｍ）に細胞の側を下にして反転させる。新鮮培地（１０％  ＦＢＳを含む２ｍｌ  ＲＰＭＩ）を穏やかにディッシュの中に添加する。０時間目と４８時間目に画像を撮影する。
【実施例１１】
【０５８４】
＜レトロウイルス生成および感染による、ＶＨＺ−ＥＧＦＰおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰを発現するＭＣＦ−１０Ａの安定したプールの確立＞
ＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）ＰＣＲフラグメントを、レトロウイルスベクター（ｐＢＡＢＥｐｕｒｏ）のＥｃｏＲ１酵素部位およびＢａｍＨ１酵素部位にそれぞれクローニングする。リポフェクタミンを製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明書に従って用いて、両種指向性のＰｈｏｅｎｉｘパッケージ細胞を、それぞれｐＢＡＢＥｐｕｒｏ−ＶＨＺもしくはｐＢＡＢＥｐｕｒｏ−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）レトロウイルスベクターによりトランスフェクトする。４８時間後、レトロウイルス上清を回収し、濾過し（０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、５μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、６〜８時間、標的ＭＣＦ１０Ａ細胞に添加する。感染は２回行う。感染後、分析する１週間前にピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で細胞を選択する。
【実施例１２】
【０５８５】
＜創傷治癒アッセイにおけるＭＣＦ−１０Ａ−ＶＨＺ−ＥＧＦＰおよびＭＣＦ−１０Ａ−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ細胞運動性＞
アッセイは、黄色のピペットチップによって創傷を作ることにより細胞の単層に行う。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を新鮮培地で連続インキュベートする。創傷領域を、アッセイの開始時（０時間、上のパネル）および終了時（８時間、下のパネル）に写真に撮る。
【実施例１３】
【０５８６】
＜外因性ＶＨＺは、中心体および細胞質の全体に局在する＞
タンパク質の細胞内局在性を決定することにより、そのタンパク質の可能性のある単数又は複数の生物学的機能に関して手がかりが得られることがあり得る。
【０５８７】
ＶＨＺの細胞内局在性を評価するため、本発明者らはＶＨＺ−ＥＧＦＰを安定して発現するＮＲＫ細胞を生成する。これらの細胞の共焦点顕微鏡法により、ＶＨＺが一連の細胞内部位を有することが示される。ＥＧＦＰシグナルは、形質膜および細胞質に見出される（図１Ａ）。重要なことには、ＥＧＦＰタグを付けたＶＨＺは、中心体のマーカーであるペリセントリンと同時局在するため、中心体にＥＧＦＰタグを付けたＶＨＺが高密度で存在することは、細胞周期の全ての段階において明白である（図１Ｂ）。
【０５８８】
内因性ＶＨＺは、中心体および細胞質に局在する。ＥＧＦＰタグを付けたＶＨＺタンパク質は、その細胞内局在性に関する有用な情報を提供する。ＶＨＺの原因となる性質を理解するためには、内因性ＶＨＺタンパク質の細胞内分布を調査することが不可欠である。
【０５８９】
アフィニティー精製したウサギポリクローナル抗ＶＨＺ抗体と同時にマウスモノクローナル（ｍＡｂ）抗γチューブリン（もう一つの中心体のマーカー）抗体による二重免疫蛍光標識を用いると、ＮＲＫ細胞（図２Ａ、パネルＡ〜Ｃ）、およびＭＣＦ−１０Ａ細胞（図２Ａ、パネルＤ〜Ｆ）において、γチューブリンと同時局在する内因性ＶＨＺが中心体にはっきりと見える。その上、抗ＶＨＺｍＡｂは、ウサギポリクローナル抗ペリセントリン抗体とともに、この場合もやはり、内因性ＶＨＺがＡ４３１細胞（図２Ａ、パネルＧ〜Ｉ）において中心体に同時局在することを示す。
【０５９０】
内因性ＶＨＺは、血清飢餓の後に細胞質から核へ移行し、中心体に高密度で存在する。ＮＲＫ細胞を一晩血清飢餓状態にする。ウサギ抗ＶＨＺ抗体および抗γ−チューブリンｍＡｂによる二重免疫蛍光標識により、内因性ＶＨＺタンパク質が中心体に一層集中していることが観察される。さらに、核での増加に伴う細胞質分布の低下が、驚くことにＮＲＫ細胞で観察される（図２Ｂ）。
【実施例１４】
【０５９１】
＜ＶＨＺはタンパク質チロシンホスファターゼである＞
ＶＨＺが本当に活性チロシンホスファターゼであることを検証するため、本発明者らは、ＶＨＺ−ＧＳＴまたは触媒的に不活性のＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ融合タンパク質のＰＴＰ活性を対照タンパク質としてＧＳＴ単独と比較してアッセイする。増大する青色蛍光（励起／発光最大値約３５８／４５２ｎｍ）により示されるＶＨＺ−ＧＳＴのＰＴＰアーゼ活性は、Ｃｙｓ９５のＳｅｒへの突然変異によるかまたはホスファターゼ阻害剤（オルトバナジン酸ナトリウム）をアッセイに添加することにより消失する（図３Ａ、パネルＡ）。
【実施例１５】
【０５９２】
＜ＶＨＺは、Ｇ１／Ｓ移行を促進することにより細胞増殖を強化する＞
ＶＨＺの中心体との会合は、ＶＨＺが細胞周期制御の調節において潜在的な機能を有し得ることを本発明者らに示唆する。これを試験するため、本発明者らは、３つの異なる発現構築物：１．ＶＨＺ−ＥＧＦＰ；２．ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ；および３．ＥＧＦＰベクターを安定して発現するＭＣＦ−７細胞を生成した。これら３つの安定なプールを、その細胞増殖について分析する。ＶＨＺは、細胞増殖速度を増進することができることが見出される（データは示さず）。この所見を確認するため、新たに合成されたＤＮＡへのＡＰＣ−ＢｒｄＵ取り込みを用いてこれらの３つの細胞株におけるＤＮＡ合成速度を測定する。この実験により、ＢｒｄＵ取り込みは、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰベクター単独よりもＶＨＺ−ＥＧＦＰを発現する細胞において著しく高いことが示された（図３Ｂ）。類似の結果が、同じ３つの発現構築物を安定して発現するＮＲＫ細胞のＦＡＣＳ分析からも得られ、ＶＨＺが、Ｇ１集団を減らしてＳ集団を増加させることによりＧ／Ｓ移行を加速し得ることを意味づけた（ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ）（図３Ｃ）。これにより、野生型ＶＨＺがＧ１／Ｓ期進行に役割を持つ可能性が高まった。
【実施例１６】
【０５９３】
＜ＶＨＺは、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の高リン酸化を間接的に引き起こし得る＞
ＶＨＺがどのようにしてＧ１／Ｓ期移行を促進するのかを理解し、その可能性のある分子機構に取り組むため、本発明者らは、Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行を制御する際に重要ないくつかの主要な分子について免疫ブロット研究を行った。本発明者らは、ＶＨＺが腫瘍抑制タンパク質ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１をダウンレギュレーションし、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）４をアップレギュレーションし得ることを見出した。Ｃｄｋ４は、Ｇ１期からＳ期への進行を支配する主な担い手の１つであり、網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲＢをリン酸化し得る（Ｓｈｅｒｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９）。これに一致して、本発明者らは、リン酸化部位特異的抗体により評価されるように、ＶＨＺホスファターゼの過剰発現により、残基Ｓｅｒ７８０、Ｓｅｒ７９５、およびＳｅｒ８０７／８１１でＲｂのリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｒｙｌａｔｉｏｎ）の蓄積が間接的に引き起こされ得ることを示した（図４Ａ、レーン３）。
【実施例１７】
【０５９４】
＜過剰産生ＶＨＺタンパク質は、ヒト乳がんにおいて上皮の中心体（約１０％）かまたは細胞質（約１７％）のいずれかに見出される＞
ＶＨＺは、ＰＲＬ−３ホスファターゼと２８％のアミノ酸配列類似性を共有する。ＰＲＬ−３が結腸直腸がんの転移に関連するホスファターゼであるという事実に基づいて（Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、本発明者らは、ＶＨＺホスファターゼが、一部のがんの転移に関与する類似の機能を有する可能性があると仮定した。ＶＨＺと複数のヒトがん検体との間の関係を調査するため、アフィニティー精製した抗ＶＨＺウサギ抗体を免疫組織化学に用いてＶＨＺタンパク質発現を評価する。本発明者らは、ＶＨＺ過剰発現が乳がんに優先的に関連していることを見出した。６５の乳がん試料のうち（３０がＩＤＣ／ＩＬＣステージＩ、３５がＩＤＣステージＩＩ）、６試料が高レベルのＶＨＺタンパク質を中心体に発現した。これは、ウサギ抗ＶＨＺおよび中心体マーカーであるマウス抗γ−チューブリンによるがん試料の同じ切片での二重免疫蛍光（図５Ａ）と、ウサギ抗ＶＨＺ抗体またはマウス抗γチューブリン抗体のいずれかによる２つの隣接する切片での単一の免疫組織化学的検査（図５Ｂ、パネルＡ〜Ｂ）の両方により実証される。免疫蛍光と免疫組織化学の両方により、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）または浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）ステージＩと診断された一部の乳がん試料の中心体においてＶＨＺが過剰発現することが確認された（図８Ａ）。ＶＨＺの中心体染色以外で、本発明者らは、ＩＤＣステージＩＩと診断された乳がん試料の異なるサブセットにおいてＶＨＺの代わりの染色パターンを見出した。６５の乳がん試料のうち、１１が、線維芽様形態を示す拡散した上皮腫瘍細胞の細胞質全体に分布した高レベルのＶＨＺタンパク質を示した（図５Ｃ、パネルＡ〜Ｂ）（図８Ｂ）。
【実施例１８】
【０５９５】
＜過剰ＶＨＺの発現は、乳がんにおけるＥ−カドヘリン発現の消失に相関する＞
本発明者らは、乳がん試料の拡散した線維芽細胞様細胞でＶＨＺタンパク質特異的に過剰発現している一部の微小環境内で予期せぬ現象をとらえたため、本発明者らはこれらの細胞が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受けているのかを調査した。ＥＭＴは、胚発生および腫瘍形成の間に起こり、そこで上皮細胞は線維芽細胞様の特性を得て上皮細胞接着および細胞骨格成分を失う（Ｔｈｉｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｌｅｅｍａｎ，２００６）。Ｅ−カドヘリンの消失により、結果として細胞間接着接合部の分解およびインビボでの腫瘍細胞浸潤性の増加がもたらされる、これはＥＭＴの顕著な特徴である（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。本発明者らは、ＶＨＺ過剰発現細胞の大部分（赤色矢印で示される）が、Ｅ−カドヘリンの発現を失った（黒色矢印で示される）（図６Ａ）ことを観察し、これらのがん細胞がＥＭＴプロセスを受けた可能性のあることが示唆された。
【実施例１９】
【０５９６】
＜ＭＣＦ−７細胞における過剰ＶＨＺの発現は細胞遊走を強化する＞
ＶＨＺは乳がん進行中のＥＭＴに関連していると思われたため、本発明者らは次にＶＨＺががん細胞遊走の誘発に役割を有し得るかどうか試験した。ＶＨＺにより駆動される細胞移動性を研究するため、ＶＨＺ−ＥＧＦＰ、またはＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰを発現しているＭＣＦ−７細胞を細胞遊走特性について調査する。ＭＣＦ−７細胞の遊走は、従来の創傷治癒またはトランスウェルチャンバーアッセイを用いて測定することが困難であるので、本発明者らは、これまでに記載されている別の「反転カバーガラス」アッセイを用いた（Ｓｈｅｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。示されるように、ＭＣＦ−ＶＨＺ細胞は、カバーガラスから遊走したが（図６Ｂ、パネルＡ’白色矢印）、ＭＣＦ−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）細胞は、カバーガラス内にとどまった（図６Ｂ、パネルＢ’白色矢印）。これらの結果から、ＶＨＺは細胞運動を促進することができることが示唆される。細胞遊走を促進する際のＶＨＺの特性を、不死化ヒト乳房上皮−ＭＣＦ１０Ａ細胞を用いてさらに調査する（図１０）。
【実施例２０】
【０５９７】
＜材料および方法：特異的ＶＨＺマウスモノクローナル抗体の作製＞
ハイブリドーマを、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（ＵＢＣ  Ｃａｎａｄａ）製のＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹハイブリドーマクローニングキットを用いて生成する。手順は製造業者の仕様説明書に従う。手短に言えば、１．ＢＡＬＢ／ｃマウスのＧＳＴ−ＶＨＺ融合タンパク質による免疫化。２．ＢＡＬＢ／ｃ親骨髄腫細胞ＳＰ２／０の増殖；３．免疫マウス由来脾臓細胞のためのＢＡＬＢ／ｃマウスの調製  ４．脾臓細胞とＳＰ２／０細胞の融合：５．ハイブリドーマクローンの選択および特性決定、である。
【実施例２１】
【０５９８】
＜材料および方法：腹水の生成＞
ハイブリドーマ細胞（５×１０６）を、２００μｌの血清フリーＤＭＥＭ培地に懸濁させ、２６ゲージ針で腹膜腔の中に注入する。
【０５９９】
１０日後、マウスは大量の腹水を生じ、腹部は非常に膨張した。マウスを犠牲にし、小さく浅部（ｓｍａｌｌ  ｓｈａｌｌｏｗ）を切って腹腔を開口する。
【０６００】
１８ゲージ針を備えた１０ｍｌシリンジによって腹水を抜く。液体を２００ｇで１０分間４℃にて遠心する。上澄み液を収集し、さらなる使用まで−７０℃にて凍結させる。
【実施例２２】
【０６０１】
＜材料および方法：免疫組織化学＞
本発明者らは、（ｈｔｔｐ：／／ｃｙｂｒｄｉ．ｃｏｍ／）よりＶＨＺタンパク質発現を複数のヒトがんについて調査した。
【０６０２】
乳がんアレイに対して：ＣＣ０８−０２−００１およびＣＣ０８−０２−００２；結腸がんアレイに対して：ＣＣ０５−０１−００１；肺がんアレイに対して：ＣＣ０４−０１−００６；複数のがんアレイに対して：ＣＣ００−０１−００６；扁平上皮癌アレイに対して：ＣＣ００−０１−００９。
【０６０３】
本発明者らは、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｋ１３９５（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いてＩＨＣ実験を行った。ホルマリン固定パラフィン包埋スライドを新鮮キシレン中で５分間脱蝋する。この工程をもう一回反復する。スライドを、順次１００％、９５％、８０％、および７５％エタノール、次いでＰＢＳ（それぞれ交換ごとに２分）に通過させることによる再水和に供し、それに続いて、３７℃水浴中で５分間、２００μｌ（２．５ｍｇ／ｍｌ）ペプシン（ＥＫ０００−１０Ｋ  ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）をそれぞれのスライドに用いて抗原回復を行う。
【０６０４】
スライドを、２％グリシンを含むＰＢＳに２分間移し、次いで暗所で１％Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳに５分間移す。スライドをＰＢＳ中で数回洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％ＴＸ−１００、および０．１％サポニン（Ｍｅｒｃｋ）を含むＰＢＳ中で室温にて２０分間処理する。次に、各々のスライドを、１０％ヤギ血清、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ−４１６１）および０．１％サポニンを含む３００μｌのＰＢＳ中で室温にて２時間ブロッキングする。過剰なブロッキング溶液を拭い取る。
【０６０５】
ｍＡｂをブロッキング緩衝液（１０％ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ））中、１：１５０で希釈する。適切なｍＡｂ（１５０μｌ）を各々のスライドに添加し、室温にて３時間、次いで４℃にて一晩インキュベートする。
【０６０６】
翌日、スライドを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０５％ＴＸ−１００を含有するＰＢＳ中で穏やかに振盪させて数回洗浄する。次に、スライドを標識したポリマー−ＨＲＰとともにインキュベートする。この洗浄工程を反復する。２００μｌの基質−色素原溶液（ポリマー−ＨＲＰに対して１ｍｌ緩衝液＋２０μｌ  ＤＡＢ）を、暗所で１０〜２０分間、各々のスライドに適用する。この洗浄工程を反復する。
【実施例２３】
【０６０７】
＜実施例２０〜２２の結果＞
ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋したヒトの複数のがん試料を、ＶＨＺタンパク質発現について評価する。
【０６０８】
ＶＨＺタンパク質は、ＤＡＢ色素原（褐色）とともにＤａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いるＶＨＺ特異的マウスモノクローナル抗体による染色により明らかとなる。ＶＨＺ−陽性シグナルは、主に形質膜および細胞質のゴルジ様細胞下構造に局在する。
【０６０９】
ＶＨＺの過剰発現は、肺、膀胱、食道、皮膚、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部、陰茎などにおける扁平上皮癌に密接に関連している。組織アレイから選択されたＶＨＺ陽性のがん試料を図１２に示す。倍率、２００倍または４００倍。Ｘ２００。下記の表Ｅ１に示されるように、ＶＨＺタンパク質は複数のヒトがんにおいて検出される。
【０６１０】
【表２】
0005756014.tif 000003
【０６１１】
表Ｅ１．様々ながんにおけるＶＨＺの発現。扁平上皮癌とは、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部、陰茎などの扁平細胞の癌を指す。
【実施例２４】
【０６１２】
＜ＶＨＺヒト／マウスキメラｍＡｂ（クローン＃２０９）の生成＞
ＶＨＺキメラｍＡｂ生成のため、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４１０４）を用いて、全ＲＮＡを６×１０６ハイブリドーマ細胞（クローン＃２０９）から抽出する。次に、スーパースクリプトＩＩ  ＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１８０６４−０１４）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。
【０６１３】
得られる全ｃＤＮＡを鋳型として用いて、３０サイクルのＰＣＲ（９５℃、５４℃、７２℃）のためにＩｇ−Ｐｒｉｍｅ  Ｋｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９８３１−３）を用いて「ユニバーサル可変領域」を生成する。ＰＣＲフラグメントを、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、品番４５−０６４０）を用いてＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ−ベクターにクローニングする。ＰＣＲフラグメントをＭｆｅ１およびＸｈｏ１で切断し、次いでヒトＩｇＧ１定常領域発現ベクター−ｐＣＭＶ−ヒトＩｇＧ１のそれぞれの部位に挿入して、重鎖のマウス可変領域（クローン＃２０９）とヒトＩｇＧ１定常領域を結合する。
【０６１４】
同様のＰＣＲ手順を、ＡｐａＬ１およびＰｓｔ１の制限部位を含有する末端を含む軽鎖のマウス可変領域（クローン＃２０９）に対して行う。ＰＣＲフラグメントをＡｐａＬ１ＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クローン＃２０９の重鎖の可変領域を含有するヒトＩｇＧ１定常領域発現ベクターのそれぞれの部位に挿入する。
【０６１５】
図１３Ａは、ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体構築の概略工程を示す。
【０６１６】
図１３Ｂは、クローン２０９の可変重鎖の配列（配列番号４）を示す。該配列は、次の通りである：
ＬＶＤＭＤＳＲＬＮＬＶＦＬＶＬＩＬＫＧＶＱＣＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＰＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＷＱＴＡＲＡＴＲＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
【０６１７】
図１３Ｃは、クローン２０９の可変軽鎖の配列（配列番号５）を示す。該配列は、次の通りである：
ＶＭＴＱＳＨＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＦＴＧＶＰＤＬＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＮＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＨＨＰＶＳＬＧ
【実施例２５】
【０６１８】
＜ＶＨＺヒト／マウスキメラｍＡｂ（クローン＃２０９）産生＞
完成した構築物を、超低ＩｇＧ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１６２５０−０７８）で培養した２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトする。キメラｍＡｂを培養上清から回収し、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９００５９６）で４０倍まで濃縮した。
【実施例２６】
【０６１９】
＜ＶＨＺヒト／マウスキメラｍＡｂ（クローン＃２０９）：間接免疫蛍光およびウエスタンブロット＞
数種類の細胞株および複数のマウス組織での間接免疫蛍光およびウエスタンブロット解析により、キメラｍＡｂを、ＮＲＫ（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−６５０９）発現ＥＧＦＰ−ＶＨＺでその特異性について試験する。
【０６２０】
ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）は、子宮頸がん細胞株であり、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株であり、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）は、ヒト乳がん細胞株であり、ＨＣＴ１１６（ＣＣＬ−２４７）は、ヒト結腸直腸癌細胞株であり、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−３４（商標））は、イヌ腎臓細胞株であり、ＤＬＤ−１（ＣＣＬ−２２１）は、ヒト結腸直腸腺癌細胞株である。ＡＴＣＣ：アメリカ培養細胞系統保存期間（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）。
【０６２１】
図１４Ａは、間接免疫蛍光の結果を示す。
【０６２２】
図１４Ｂは、細胞株でのウエスタンブロット解析の結果を示す。
【０６２３】
図１４Ｃは、マウス組織でのウエスタンブロット解析の結果を示す。
【０６２４】
複数のマウス組織での抗体検査の結果により、ＶＨＺが脾臓および結腸では低いレベルでしか発現しないことが示され、ＶＨＺが組織において偏在的に発現されないことが示唆される。
【０６２５】
ＶＨＺ抗体は正常組織を攻撃せず、余計な副作用を引き起こさないため、このデータによりＶＨＺが優れた治療標的であることが示される。
【実施例２７】
【０６２６】
＜ＶＨＺヒト／マウスキメラｍＡｂ（クローン＃２０９）は、ＶＨＺを発現するＨＣＴ１１６結腸がん細胞によって、腫瘍の形成を効果的に抑制する＞
全ての動物実験は、ＩＭＣＢの治験審査委員会により承認されたものである。本発明者らは、シンガポール科学技術研究庁（Ｔｈｅ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ａ＊ＳＴＡＲ）の動物施設センター（Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）の規則および方針に充実に従う。９週齢のヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用する。
【０６２７】
ウエスタンブロットにより、ＨＣＴ１１６結腸がん細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株と比較してＶＨＺ陽性であると本発明者らは確認する。１日目に、１×１０６個のＨＣＴ１１６がん細胞を、尾静脈を介してヌードマウスの循環の中に注射した。
【０６２８】
図１５Ａは、この実験の結果を示す。
【０６２９】
ＰＢＳ（未処理）またはキメラｍＡｂ（処理）のいずれかを、３日目の最初の治療から開始して尾静脈に投与し、その後毎週２回投与した。実験期間：上の２匹の動物は、２００９年２月１１日に開始し、４月２日まで、下の２匹の動物は２００９年２月１１日に開始し、４月１３日まで。
【０６３０】
図１５Ｂは、この実験の結果を示す。見て分かるように、ＶＨＺヒト／マウスキメラｍＡｂ（クローン＃２０９）は、ＶＨＺを発現するＨＣＴ１１６結腸がん細胞によって、腫瘍の形成を効果的に抑制する
【実施例２８】
【０６３１】
＜免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いる組織病理的分析＞
本発明者らは、６４８のヒトがん試料においてＶＨＺタンパク質発現を調査した。これらの組織の大部分は、Ｃｙｂｒｄｉ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５０ＵＳＡ：ｈｔｔｐ：／／ｃｙｂｒｄｉ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）より購入される。
【０６３２】
これらには、主な固形腫瘍組織アレイ（ＣＣ００−０１−００６）；扁平上皮癌（ＣＣ００−０１−００９）；肺癌（ＣＣ０４−０１−００６）；結腸腺癌（グレードＩ〜ＩＩＩ）と正常組織対照組織アレイ（ＣＣ０５−０１−００１）；乳癌（ＣＣ０８−０２−００１）；膵臓癌（導管腺癌／膵島細胞腺腫／粘液性癌）と正常対照組織アレイ（ＣＣ１４−０１−００１）が含まれる。ヒト低密度前立腺組織アレイ（ＴＳ４２０８１００４）は、ＩｎｎｏＧｅｎｅｘ（Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）より購入される。
【０６３３】
本発明者らは、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｋ  １３９５（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いてＩＨＣ分析を行った。
【実施例２９】
【０６３４】
＜免疫組織化学（ＩＨＣ）の詳細な工程＞
ホルマリン固定パラフィン包埋スライドを新鮮なキシレン中で５分間脱蝋する。この工程を１回反復する。
【０６３５】
次に、スライドを、順次１００％、９５％、８０％、および７５％エタノール、次いでＰＢＳ（それぞれ交換ごとに２分）に通過させることによる再水和に供し、それに続いて、３７℃水浴中で５分間、２００μｌ（２．５ｍｇ／ｍｌ）ペプシン（ＥＫ０００−１０Ｋ  ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）をそれぞれのスライドに用いて抗原回復を行う。
【０６３６】
スライドを、２％グリシンを含むＰＢＳに２分間移し、次いで暗所で１％Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳに５分間保持する。スライドをＰＢＳ中で数回洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％ＴＸ−１００、および０．１％サポニン（Ｍｅｒｃｋ）を含有するＰＢＳ中で室温にて２０分間処理する。次に、各々のスライドを、１０％ヤギ血清、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ−４１６１）および０．１％サポニンを含む３００μｌのＰＢＳ中で室温にて２時間ブロッキングする。過剰なブロッキング溶液を拭い取る。ＶＨＺｍＡｂをブロッキング緩衝液で希釈する（１：１５０）。
【０６３７】
希釈したＶＨＺ  ｍＡｂ（１５０μｌ）をそれぞれのスライドに添加し、室温にて３時間、次いで４℃にて一晩インキュベートする。翌日、スライドを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０５％ＴＸ−１００を含有するＰＢＳ中で穏やかに振盪させて数回洗浄する。次に、スライドを標識したポリマー−ＨＲＰとともに２時間インキュベートする。この洗浄工程を反復する。
【０６３８】
２００μｌの基質−色素原溶液（ポリマー−ＨＲＰに対して１ｍｌ緩衝液＋２０μｌ  ＤＡＢ）を、暗所で１０〜２０分間、各々のスライドに適用する。この洗浄工程を反復する。顕微鏡を用いて結果を分析し、代表的な画像を図１２Ａ〜Ｆに示す。
【０６３９】
結果は、上の表Ｅ１に示す。ＶＨＺタンパク質は、多くの場合複数のヒトがんで検出される。ＶＨＺ陽性のがんタイプの割合を、合計６４８のヒトがん試料から要約する。
【実施例３０】
【０６４０】
＜考察＞
本発明者らは、ＶＨＺが新規な中心体ホスファターゼであることを示した。中心体は、細胞周期の進行および細胞分裂に重要な役割を果たすオルガネラである。中心体は細胞周期を通して微小管アレイを組織化し、減数分裂細胞および有糸分裂細胞における細胞分裂の制御に中心的役割を果たす。中心体オルガネラの制御解除はヒトの遺伝病およびがんに関連している。実際に、多くのヒト腫瘍が中心体の異常を示している（Ｄｏｘｓｅｙ，２００１；Ｎｉｇｇ，２００２）。
【０６４１】
本発明者らのＭＣＦ−７細胞およびＮＲＫ細胞におけるＶＨＺ過剰発現の結果は、ＶＨＺホスファターゼが細胞周期進行中のＧ１／Ｓ移行の促進に役割を果たし得るという結論を裏付ける。ＭＣＦ−７細胞増殖の促進におけるＶＨＺの機構的役割を検討しようとする試みにおいて、Ｇ１／Ｓ細胞周期の制御に重要な役割を果たす数種類の重要な分子を調べる。本発明者らはＶＨＺの過剰発現が細胞周期進行の阻害剤である腫瘍抑制タンパク質ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１をダウンレギュレーションすることができることを見出した。ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１はキナーゼ活性を阻害し、Ｇ１／Ｓ進行を遮断する働きをする（Ｐｅｓｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＶＨＺによるｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１のダウンレギュレーションは、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）４へのｐ２１の阻害を解除する可能性がある（Ｓｈｅｒｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９）。このことに一致して、本発明者らは、ＶＨＺがＣｄｋ４発現をアップレギュレーションすることができることを見出した。真核細胞の周期進行は、一部において、厳重に制御されたＣＤＫの活性に依存する。Ｃｄｋ４の活性化は、リン酸化について網膜芽細胞腫タンパク質Ｒｂを標的にすることができた（Ｌｕｋａｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。結果として、ＶＨＺは間接的にＲｂリン酸化の強化を引き起こす。Ｒｂの高リン酸化は、細胞周期のＧ１期の中の制限点を通過する進行を制御するＲｂの機能を不活性化することが知られている（Ｌｕｋａｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｈｅｒｒ，１９９６）。従って、ＶＨＺの過剰発現は、Ｒｂの不活性化を介して間接的にＧ１／Ｓ期制限点を乗り越えることができた。今後の研究は必要であるが、本発明者らの結果により、細胞周期進行におけるＶＨＺの役割のワーキングモデルを提案することができた（図４Ｂ）。
【０６４２】
一部の乳がん試料において、本発明者らは、上皮腫瘍細胞の中心体（約１０％）かまたは細胞質（約１７％）において、ＶＨＺの過剰発現タンパク質を見出した。ＶＨＺは、多くの場合、遊走性線維芽細胞様形態を提示したがん細胞においてより多く過剰発現する。本発明者らは、ＩＬＣまたはＩＤＣステージＩ乳がん試料においてＶＨＺ−中心体−陽性細胞が典型的な上皮形態を示し、一方、ＩＤＣステージＩＩ試料においてＶＨＺ−サイトゾル−陽性細胞がより高い頻度で分散した上皮に関連していることを見出した。これらの結果は、ＶＨＺが最初に中心体で過剰発現され、その後、細胞運動性を獲得した腫瘍細胞のサイトゾル全体を通じて過剰発現され得ることを示すものであろう。重要なことには、強く染色されたＶＨＺ−サイトゾル−陽性細胞はＥ−カドヘリン陰性である。Ｅ−カドヘリンの消失が、上皮細胞を遊走性間葉細胞へ変換するＥＭＴの複雑なプロセスの初期段階を果たす（Ｌｕｋａｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｈｅｒｒ，１９９６）。Ｅ−カドヘリンの消失の結果、細胞間接着接合部が解離し、腫瘍細胞浸潤性が増大する。ＶＨＺのアップレギュレーションは、ＥＭＴを惹起する、または典型的な上皮の現象を細胞遊走を促進するように変えるための駆動力の１つとして働き得る。がん細胞は、隣接する新生物性上皮の障壁を乗り越えるために強化された運動性を獲得する必要があり、それにより悪性細胞の新しい場所への浸潤および増殖につながる（Ｔｈｉｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｌｅｅｍａｎ，２００６）。腫瘍細胞は、個別細胞および集合細胞両方の遊走戦略を含む多様なパターンで周囲の組織基質に浸潤する（Ｆｒｉｅｄｌ，２００３；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，２００４）。本発明者らの研究では、本発明者らは、個別細胞遊走（図５Ｃ、パネルＡ）と集合細胞遊走（図５Ｃ、パネルＢ）の双方が、ＶＨＺ−サイトゾル−陽性細胞に同時に存在することを示した。これらの現象は、インビボでの微小環境内のＶＨＺにより駆動される比較的初期の局部浸潤の開始を再現し、表すだろう。ＶＨＺが腫瘍進行およびがん細胞遊走に果たす正確な役割は分かっていないが、本発明者らのデータは、ＶＨＺの過剰発現またはその活性の上昇が局部浸潤にとって重要な初期事象であり得ることを示唆する。この仮説に一致して、本発明者らは、ＶＨＺがＭＣＦ−７細胞遊走を強化することができたことを示すことが可能である（図６Ｂ）。
【０６４３】
本発明者らの研究は、ＶＨＺが細胞周期制御および乳がん進行に関与するホスファターゼであるという証拠を本明細書において提供する。本発明者らの知見は、今後の診断および治療戦略における重要な標的としてのこの小さなホスファターゼへの新規な洞察を明らかにする。本発明者らは、ＶＨＺの阻害が初期段階の乳がん転移の拡散を遮断するための治療的アプローチの基礎となり得ることを提案する。
【０６４４】
【表３Ａ】
0005756014.tif 000004
【表３Ｂ】
0005756014.tif 000005
【表３Ｃ】
0005756014.tif 000006
【０６４５】
本明細書において言及されるあらゆる特許出願および特許、ならびに上記特許出願および特許の各々で引用または参照されるあらゆる文書（各々の特許出願および特許の審査中のものを含む）（「出願引用文書」）、ならびに特許出願および特許の各々および出願引用文書のいずれかで引用または言及されるあらゆる生産品のあらゆる製造業者の取扱説明書またはカタログは、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。さらに、本文中で引用される全ての文書、および本文中で引用される文書において引用または参照される全ての文書、および本文中で引用または言及されるあらゆる生産品に対するあらゆる製造業者の取扱説明書またはカタログは、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０６４６】
記載される本発明の方法およびシステムのさまざまな変更および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者には明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載されたが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に不当に制限されるべきでないことは当然理解される。実際に、分子生物学または関連分野の当業者には明白な、記載される本発明を実施するための様式の様々な変更は、特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１Ａ−ａ】
0005756014.tif 000007
【図１Ａ−ｂ】
0005756014.tif 000008
【図１Ａ−ｃ】
0005756014.tif 000009
【図１Ｂ−ａ】
0005756014.tif 000010
【図１Ｂ−ｂ】
0005756014.tif 000011
【図２Ａ】
0005756014.tif 000012
【図２Ｂ−ａ】
0005756014.tif 000013
【図２Ｂ−ｂ】
0005756014.tif 000014
【図２Ｂ−ｃ】
0005756014.tif 000015
【図３Ａ】
0005756014.tif 000016
【図３Ｂ−ａ】
0005756014.tif 000017
【図３Ｂ−ｂ】
0005756014.tif 000018
【図３Ｂ−ｃ】
0005756014.tif 000019
【図３Ｂ−ｄ】
0005756014.tif 000020
【図３Ｃ−ａ】
0005756014.tif 000021
【図３Ｃ−ｂ】
0005756014.tif 000022
【図３Ｃ−ｃ】
0005756014.tif 000023
【図４Ａ】
0005756014.tif 000024
【図４Ｂ】
0005756014.tif 000025
【図５Ａ−ａ】
0005756014.tif 000026
【図５Ａ−ｂ】
0005756014.tif 000027
【図５Ａ−ｃ】
0005756014.tif 000028
【図５Ｂ−ａ】
0005756014.tif 000029
【図５Ｂ−ｂ】
0005756014.tif 000030
【図５Ｂ−ｃ】
0005756014.tif 000031
【図５Ｃ−ａ】
0005756014.tif 000032
【図５Ｃ−ｂ】
0005756014.tif 000033
【図５Ｃ−ｃ】
0005756014.tif 000034
【図６Ａ−ａ】
0005756014.tif 000035
【図６Ａ−ｂ】
0005756014.tif 000036
【図６Ｂ−ａ】
0005756014.tif 000037
【図６Ｂ−ｂ】
0005756014.tif 000038
【図７Ａ】
0005756014.tif 000039
【図７Ｂ】
0005756014.tif 000040
【図８Ａ】
0005756014.tif 000041
【図８Ｂ】
0005756014.tif 000042
【図９Ａ−ａ】
0005756014.tif 000043
【図９Ａ−ｂ】
0005756014.tif 000044
【図９Ｂ】
0005756014.tif 000045
【図１０．１１】
0005756014.tif 000046
【図１２Ａ．１２Ｂ】
0005756014.tif 000047
【図１２Ｃ．１２Ｄ】
0005756014.tif 000048
【図１２Ｅ．１２Ｆ】
0005756014.tif 000049
【図１３】
0005756014.tif 000050
【図１４】
0005756014.tif 000051
【図１５Ａ】
0005756014.tif 000052
【図１５Ｂ】
0005756014.tif 000053
【配列表】
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