(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及び単離されたパータクチン抗原を含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記パータクチン抗原が、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａタンパク質である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記パータクチン抗原が、組換えｐ６８タンパク質である、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａが、バクテリン又は細菌抽出物である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記組成物が、アジュバント非添加である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記パータクチン抗原が、１μｇないし３０μｇの間で存在する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記パータクチン抗原が、尿素でパータクチン封入体を可溶化することによって調製され、該組成物がパータクチン抗原の凝集物を含まない、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
該パータクチン抗原が、脂質付加されている、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記組成物が、イヌへの非経口投与のための希釈剤又は賦形剤を更に含んでなる、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、脂質付加された単離されたＢｓｐ２２抗原を更に含んでなる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓ（Ｍ．Ｃｙｎｏｓ）及びイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）からなる群から選択されるイヌ呼吸器病原体からの抗原を更に含んでなる、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、イヌ呼吸器病原体からの抗原の少なくとも二つ、三つ又は四つを含んでなる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）及びイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）からの抗原を含んでなる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
イヌにおけるイヌ呼吸器病原体による感染の治療又は予防のための、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１５】
前記組成物が、前記イヌにおける前記イヌ呼吸器病原体による感染を、６ヶ月又はそれより多い期間予防する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
該イヌ呼吸器病原体が、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａである、請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
該イヌ呼吸器病原体が、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）及びイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）の少なくとも一つ、二つ、三つ又は四つを更に含んでなる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
該組成物が、複数の前記病原体による感染を治療又は予防する、イヌ感染性呼吸器病症候群（ＣＩＲＤＣ）の治療又は予防のための、請求項１４−１７のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に、そして特に免疫原性及びワクチン組成物の分野に関する。更に具体的には、本開示は、イヌにおける呼吸器病（複数可）の治療又は予防のための、パータクチンと組合せてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ調製物を含んでなる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、イヌの気道中でコロニー形成し、そして気管気管支炎（ｔｒａｃｈｅｏｂｏｎｃｈｉｔｉｓ）又は“ケンネルコフ”を起こすグラム陰性細菌である。Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｅ．Ｃ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５），ｐｐ．７６７−８１１。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、イヌを他の呼吸器病原体に影響されやすくし、そしてしばしばそれらと同時に存在する。今日まで、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）、Ｂｒｏｎｃｈｉ−Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）、Ｂｒｏｎｃｈｉｃｉｎｅ（登録商標）ＣＡｅ、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）Ｂ、Ｕｎｉｖａｃ  ２、Ｒｅｃｏｍｂｉｔｅｋ（登録商標）ＫＣ２、ＮａｒａｍｕｎｅＴＭ−２及びＫｅｎｎｅｌ−ＪｅｃＴＭ２を含む、多くのワクチンが、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａによって起こされる気管気管支炎の治療のために使用可能である。
【０００３】
然しながら、既存の商業的なワクチンの大多数は、面倒な鼻腔内投与、並びにアジュバントの添加を必要とし、これは、灼熱感及び刺激のような有害な副作用をもたらし得る。Ｖｉｅｒａ  Ｓｃｈｅｉｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｘｕｓ  Ｄｅｃ  ２０００（Ｖｏｌ  ８，Ｎｏ１）。鼻腔内ワクチンは、ワクチン投与中の気難しい動物に伴う彼らの個人的危険性のために、獣医師にとって不評である。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのｐ６８タンパク質（パータクチン）の使用を含むもののような、サブユニットワクチンが開発されているが、恐らくは不十分な免疫原性、反応性、及び／又は製剤の安定性のために、今日までいずれの商業的なイヌのワクチンにも含まれていない。
【０００４】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、イヌ感染性呼吸器病症候群（ＣＩＲＤＣ）の有意な因子であり、これは、リホーミングセンター及び寄宿又は訓練犬舎のような混雑した条件に収容されたイヌに一般的な非常に伝染性の疾病である。ＣＩＲＤＣの病変形成は、多因子性であると考えられ、幾つかのウイルス及び細菌に関係する。ＣＩＲＤＣの原因病原体であることが知られた感染性病原体は、細菌Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（Ｂｅｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２９：４８−５２，１９７７）に加えて、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）（Ｅｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１０（２）：２１６−２２３，２００３）、イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０（５７４７）：４８２−４８５，２００５）、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）（Ｂｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２６：１４０−１４５，１９６７）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓ（Ｃｈａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：３４９１−３４９７，２００４）及びイヌアデノウイルス血清型２（ＣＡＶ−２）（Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．，３：２３８−２４７，１９６２）を含む。今日まで、前述の病原体の全て、又はその大多数に対する包括的な混合ワクチンは、出現していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｅ．Ｃ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５），ｐｐ．７６７−８１１  Ｖｉｅｒａ  Ｓｃｈｅｉｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｘｕｓ  Ｄｅｃ  ２０００（Ｖｏｌ  ８，Ｎｏ１）；
【非特許文献２】Ｂｅｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２９：４８−５２，１９７７；
【非特許文献３】Ｅｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１０（２）：２１６−２２３，２００３；
【非特許文献４】Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０（５７４７）：４８２−４８５，２００５；
【非特許文献５】Ｂｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２６：１４０−１４５，１９６７；
【非特許文献６】Ｃｈａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：３４９１−３４９７，２００４；
【非特許文献７】Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．，３：２３８−２４７，１９６２。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、有害な副作用又は混合ワクチン中の他の抗原との干渉、或いは獣医師への危険を起こすことを伴わずに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する長時間作用型の免疫防御を提供する、イヌへ安全に非経口投与することが可能な免疫原性組成物に対する必要性が残っている。本発明の開示は、これらの及び他の関連する必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
一つの態様において、本発明は、特に、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及び単離されたパータクチン抗原を含んでなる免疫原性組成物を提供する。もう一つの態様において、前記パータクチン抗原は、組換えタンパク質である。もう一つの態様において、前記パータクチン抗原は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａからのものである。もう一つの態様において、前記パータクチン抗原は、ｐ６８である。もう一つの態様において、前記組成物は、単離されたＢｓｐ２２抗原を更に含んでなる。
【０００８】
もう一つの態様において、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ成分は、バクテリン又は細菌抽出物である。もう一つの態様において、前記組成物は、アジュバント非添加である。もう一つの態様において、前記組成物は、アジュバントを更に含んでなる。
【０００９】
もう一つの態様において、前記パータクチン抗原は、約１μｇないし約３０μｇの間で存在する。更に特に、前記パータクチンは、約５μｇないし約２０μｇの間で、更になお特に、約７μｇないし約１５μｇの間で、そしてなお更に、約５μｇ、１０μｇ、１５μｇ又は２０μｇで存在する。好ましくは、前記パータクチン抗原は、尿素でパータクチン封入体を可溶化し、そして所望によりカラムクロマトグラフィーによって精製することによって調製される。前記パータクチン抗原は、可溶性であり、そして好ましくは実質的に凝集物を含まない。
【００１０】
もう一つの態様は、複数の組換えｐ６８パータクチン抗原を含んでなる免疫原性組成物を提供し、ここにおいて、前記組成物は、実質的にｐ６８凝集物を含まない。更に特に、前記複数の組換えｐ６８パータクチン抗原は、尿素でパータクチン封入体を可溶化し、そして所望によりカラムクロマトグラフィーによって精製することによって調製される。本発明は、尿素でパータクチン封入体を可溶化し、そして所望によりカラムクロマトグラフィーによって精製することによる、ｐ６８パータクチン抗原を製造する方法も提供する。
【００１１】
もう一つの態様において、前記組成物は、これがイヌへの非経口投与のための希釈剤又は賦形剤を更に含んでなるように、非経口投与のために製剤化される。
【００１２】
もう一つの態様において、前記組成物は、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）及びイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）からなる群から選択されるイヌ呼吸器病原体からの抗原を更に含んでなる。更に特別の態様において、前記組成物は、イヌ呼吸器病原体からの抗原の少なくとも二つ、三つ又は四つを含んでなる。
【００１３】
もう一つの態様において、本明細書中に記載される免疫原性組成物は、非呼吸器抗原を含まない。従って、本発明の一つの態様は、非呼吸器抗原を含まないことを条件とする、本明細書中に記載されるような組成物を提供する。非呼吸器抗原は、対象者に呼吸器病を起こさない。このような非呼吸器抗原の非限定的例は、狂犬病ウイルス、イヌパルボウイルス、イヌ腸内コロナウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、及びＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを含む。
【００１４】
もう一つの態様において、前記抗原は、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）からのものである。もう一つの態様において、前記抗原は、イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）からのものである。もう一つの態様において、前記抗原は、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）からのものである。もう一つの態様において、前記抗原は、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）からのものである。もう一つの態様において、前記抗原は、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）及びイヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）からのものである。
【００１５】
もう一つの態様において、前記組成物は、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）及びイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）からの抗原を含んでなる。
【００１６】
もう一つの態様において、該組成物は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ並びにイヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）及びイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）の少なくとも一つに対する免疫反応を誘発する。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ調製物及びイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）を含んでなる免疫原性組成物を提供する。更に特に、前記組成物は、単離されたパータクチン抗原を含んでなる。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、イヌにおけるイヌ呼吸器病原体による感染の治療又は予防のための前記の態様のいずれか一つの免疫原性組成物の方法或いは使用を提供する。もう一つの態様において、前記組成物は、前記イヌにおける前記イヌ呼吸器病原体による感染を、６ヶ月又はそれより多い期間予防する。もう一つの態様において、前記組成物は、前記イヌにおける前記イヌ呼吸器病原体による感染を、約１年の期間予防する。
【００１９】
もう一つの態様において、イヌ呼吸器病原体は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａである。もう一つの態様において、イヌ呼吸器病原体は、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）及びイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）の少なくとも一つ、二つ、三つ又は四つを更に含んでなる。
【００２０】
本発明のもう一つの態様は、イヌ感染性呼吸器病症候群（ＣＩＲＤＣ）の治療又は予防のための前記の態様のいずれか一つの免疫原性組成物の方法或いは使用を提供し、ここにおいて、この組成物は、複数のイヌ呼吸器病原体による感染を治療又は予防する。もう一つの態様は、本明細書中に記載されるような免疫原性組成物を非経口投与する使用又は方法を提供する。
【００２１】
もう一つの態様は、イヌにおけるイヌ呼吸器病原体による感染の治療又は予防のための免疫原性組成物を含んでなる医薬の製造を提供する。
【００２２】
これらの及び他の態様、特徴、並びに本発明の利益は、本明細書中に以下に明記する詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明白となるものである。それぞれの前述の、そして以下の態様は、一つの態様に組合せることができることは理解されることである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の定義は、本開示に適用される。これらは、本明細書中に参照することにより援用されるそれぞれの個々の参考文献中に含まれるいずれもの矛盾する定義にも優先する。定義されていない用語は、当業者によって共通に使用される意味を有する。更に、文脈によって要求されない限り、単数の用語は複数を含み、そして複数の用語は、単数を含むものである。
【００２４】
“約”又は“概略”は、測定可能な数値に関して使用される場合、示された変数の値、及び示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）か、又は示された値の１０パーセント以内である変数のいずれか大きい方の全ての値を指す。“約”が、週の時間間隔に関して使用された場合、“約３週間”は１７ないし２５日であり、そして“約２ないし約４週間”は、１０ないし４０日である。
【００２５】
“アジュバント”は、本明細書中で使用する場合、免疫反応の非特異的刺激剤として役立ついずれもの物質を指す。アジュバントの更なる説明は以下を参照されたい。
【００２６】
用語“動物”は、本明細書中で使用する場合、家畜化された及び野生の両方の哺乳動物を含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａによる感染及び／又はイヌ呼吸器病症候群に対して感受性である、いずれもの動物を含む。好ましくは、動物は、本明細書中で使用する場合、イヌ又はヒトを指す。
【００２７】
“抗体”は、本明細書中で使用する場合、供給源、産生の方法、又は他の特徴に関わらず、抗原結合部位を含んでなるいずれものポリペプチドである。これは、その抗原に対する免疫反応の結果として抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子又はその断片を指す。免疫グロブリンは、“定常”及び“可変”部を有する“軽”及び“重”ペプチド鎖から構成される血清蛋白質であり、そして定常部の組成に基づきクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に分けられる。ある抗原に対して“特異的”である抗体は、抗体の可変部が特異的な抗原を認識し、そしてそれに排他的に結合することを示す。この用語は、制約されるものではないが、以下を含む：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体、単鎖抗体、領域特異的抗体、単一領域抗体、領域欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、及びＣＤＲ移植抗体。抗体は、天然の供給源由来又は組換え供給源由来のインタクトな免疫グロブリンであり得、或いはインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。“抗体”は、抗原結合性タンパク質に転換され得、これは、制約されるものではないが、以下を含む抗体断片を、制約されるものではないが含む：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、Ｆｄ断片、ｄＡｂ断片、二重特異性抗体、ＣＤＲ３ペプチド、制限された（constrained）ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ナノボディー、二価ナノボディー、小型モジュラー免疫医薬品（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）、及びミニボディー、並びに上述の断片のいずれか、及びその化学的又は遺伝子的に操作された対応物、並びに抗原結合機能を保有する他の抗体断片。典型的には、このような断片は、抗原結合領域を含んでなるものである。当業者によって認識されるものであるように、このような分子のいずれもが、その免疫原性を減少するように、その親和性を増加するように、その特異性を変更するように、又は他の目的のために、操作（例えば“生殖（germlined）”）され得る。
【００２８】
“抗原”又は“免疫原”は、本明細書中で使用する場合、対象者に暴露された場合、その抗原に対して特異的である免疫反応を誘発するものである一つ又はそれより多いエピトープ（直線的、立体構造的又は両方）を含有する分子を指す。エピトープは、抗原の特異的部位であり、これは、Ｔ細胞受容体又は特異的抗体に結合し、そして典型的には約３個のアミノ酸残基ないし約２０個のアミノ酸残基を含んでなる。用語抗原は、サブユニット抗原−天然において当該抗原と関連する生物体全体から分離され、そして別個である抗原−並びに死滅、弱毒化又は不活化された細菌、ウイルス、真菌、寄生虫又は他の微生物を指す。用語抗原は、更に抗イディオタイプ抗体又はその断片などの抗体、及び抗原又は抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドのミモトープを指す。用語抗原は、更にＤＮＡ免疫化適用におけるような、ｉｎ  ｖｉｖｏで、抗原又は抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００２９】
“抗原性”は、本明細書中で使用する場合、タンパク質又はポリペプチドの、そのタンパク質又はポリペプチドに対して産生される抗体によって免疫特異的に結合される能力を指す。
【００３０】
用語“Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ”又は“Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ”は、以下を指す：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの生の弱毒化細菌、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの死滅全細胞抽出物（バクテリン）又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの細胞の細菌性抽出物。
【００３１】
“緩衝液”は、別の化学物質の濃度の変化を防止する化学系を意味する。プロトン供与体及び受容体系は、水素イオン濃度（ｐＨ）の顕著な変化を防止する緩衝液として役立つ。緩衝液の更なる例は、弱酸及びその塩（共役塩基）、又は弱塩基及びその塩（共役酸）の混合物を含有する溶液である。
【００３２】
“イヌ”は、本明細書中で使用する場合、イヌと普通に呼ばれるものを含むが、しかしＣａｎｉｄａｅ科の他のメンバーを含む。
【００３３】
用語“細胞株”又は“宿主細胞”は、本明細書中で使用する場合、その中でウイルスが複製し、そして維持され得る原核又は真核細胞を意味する。
【００３４】
用語“培養物”は、本明細書中で使用する場合、他の種又は型の非存在下で増殖する細胞又は微生物の集団を意味する。
【００３５】
“投与（Dose）”は、対象者に与えられるワクチン又は免疫原性組成物を指す。“一回目投与”又は“初回投与”は、０日目に与えられるこのような組成物の投与を指す。“二回目投与”又は“三回目投与”或いは“一年目投与”は、一回目投与の後に与えられるこのような組成物の量を指し、これらは、一回目投与と同じワクチン又は免疫原性組成物であることができるが、しかしそうである必要はない。
【００３６】
“エピトープ”は、抗原の特異的部位であり、これは、Ｔ細胞受容体又は特異的抗体に結合し、そして典型的には、約３個のアミノ酸残基から約２０個のアミノ酸残基を含んでなる。
【００３７】
“賦形剤”は、本明細書中で使用する場合、ワクチン又は免疫原性組成物の、抗原ではない非反応性担体成分を指す。好ましい賦形剤は、非経口注射について当該技術分野において公知のものである。
【００３８】
“断片”は、タンパク質又は遺伝子の切断された部分を指す。“機能的断片”及び“生物学的に活性な断片”は、全長のタンパク質又は遺伝子の生物学的特性を保有する断片を指す。
【００３９】
“相同性”又は“相同性のパーセント”は、最大の配列相同性のパーセントを達成するために、配列を整列させ、そして必要な場合ギャップを導入し、そして更に配列相同性の一部としていずれもの保存的置換を考慮した後の、比較物質の配列（類）中の残基と一致する又は類似である候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセントを指す。
【００４０】
“相同体”又は“種相同体”は、二つ又はそれより多い異なった種中に見出される遺伝子を含み、これは、実質的なポリヌクレオチド配列相同性を保有し、そして同一の、又は類似の、生物学的機能及び／又は特性を保有する。好ましくは、種相同体を表すポリヌクレオチド配列は、実施例によって本明細書中に記載されるような中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして同一の又は類似の生物学的活性及び／又は特性を保有するものである。もう一つの側面において、種相同体を表すポリヌクレオチドは、約６０％より大きい配列相同性、約７０％より大きい配列相同性、約８０％より大きい配列相同性、約９０％より大きい配列相同性、約９５％より大きい配列相同性、約９６％より大きい配列相同性、約９７％より大きい配列相同性、約９８％より大きい配列相同性、又は約９９％より大きい配列相同性を共有するものである。
【００４１】
“同一性”又は“同一性のパーセント”は、最大の配列同一性のパーセントを達成するために、両方の配列を整列させ、そして必要な場合ギャップを導入した後の、そして配列同一性の一部としていずれもの保存的置換を考慮しない、比較物質の配列中の残基と一致する候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸のパーセントを指す。
【００４２】
対象者中の“免疫反応”は、本明細書中で使用する場合、抗原に対する体液性免疫反応、細胞性免疫反応、又は体液性及び細胞性免疫反応の発生を指す。“体液性免疫反応”は、少なくとも部分的に抗体によって仲介されるものを指す。“細胞性免疫反応”は、Ｔリンパ球又は他の白血球細胞或いは両方によって仲介されるものであり、そして活性化されたＴ細胞、白血球細胞、又は両方によって産生されるサイトカイン、ケモカイン及び類似の分子の産生を含む。免疫反応は、当技術分野において既知の標準的な免疫アッセイ及び中和アッセイを使用して決定することができる。
【００４３】
“免疫原性”は、本明細書中で使用する場合、特定された疾病を起こす細菌又はウイルスに対して特異的に指向された免疫反応を誘発するタンパク質又はポリペプチドの能力を指す。
【００４４】
“免疫原性組成物”は、例えば、免疫原性組成物中に存在する一つ又はそれより多い抗原に対する受容者の体液性及び細胞性免疫系を刺激するために投与される、タンパク質、ペプチド、全細胞、不活化、サブユニット又は弱毒化ウイルス、又はポリサッカリド、或いはこれらの組合せを含む免疫原を含有する調製物である。“免疫化”は、免疫原性組成物を投与し、そして宿主中の抗原に対する免疫又は免疫原反応を刺激する過程である。好ましい宿主は、イヌのような哺乳動物である。好ましくは、免疫原性組成物は、ワクチンである。
【００４５】
“免疫学的に保護的な量（immunologically protective amount）”は、本明細書中で使用する場合、その不都合な健康上の影響又は合併症を含む疾病の徴候又は症状を予防或いは寛解するために十分である、受容者に免疫原性反応を誘発するために有効な抗原の量である。体液性免疫又は細胞仲介免疫のいずれか、或いは両方を誘発することができる。組成物に対する動物の免疫原性反応は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイにより間接的に、或いは野生型株を用いたチャレンジ後の徴候及び症状をモニターすることにより直接的に評価することができる。組成物又はワクチンによって与えられる保護免疫は、例えば、チャレンジ生物の排出の減少、死亡率、罹患率、体温、並びに対象者の全体的身体状態、健康及び能力のような臨床的徴候の減少を測定することによって評価することができる。免疫反応は、制約されるものではないが、細胞性及び／又は体液性免疫の誘発を含み得る。治療的に有効である組成物又はワクチンの量は、使用される特定の生物体、或いは治療又はワクチン接種される動物の状態によって変更することができ、そして獣医師によって決定されることができる。
【００４６】
“鼻腔内”投与は、本明細書中で使用する場合、ワクチン又は他の組成物のような物質の、鼻を経由して又はそれによる対象者の身体への導入を指し、そして主として鼻の粘膜を経由する物質の輸送を含む。
【００４７】
用語“単離された”は、実質的に純粋な形態、例えば約９５％の純度より大きいか、或いはその天然の環境から何らかの方法で精製又は濃縮されたかのいずれかである物質を指す。“単離されたパータクチン”に対する言及は、宿主動物／イヌからのようなその天然の環境から除去さるか、増殖培地中にあるか、或いは全細胞のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ調製物から精製され、そしてその後Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抽出物を含んでなる組成物に加え戻し（即ちパータクチン単離物でスパイクされ）てもよい、パータクチンタンパク質を示す。用語、“単離された”は、他の病原体／希釈剤／賦形剤／アジュバント／タンパク質との溶液中にある免疫原を包含する。
【００４８】
“薬用薬剤”は、医学的状態の予防、治癒、又は改善、或いは幾つかの生理学的状態又は発生（occurrence）の予防において有用であるいずれもの薬剤を指す。
【００４９】
“モノクローナル抗体”は、本明細書中で使用する場合、全てが特定の抗原上の一つのエピトープを指向する、ハイブリドーマ細胞の単一の株によって産生される抗体を指す。モノクローナル抗体を製造するために使用される抗原は、病原体の単離されたタンパク質又は全病原体として提供され得る。“ハイブリドーマ”は、骨髄腫細胞及び特異的抗体産生細胞の融合によって形成されたハイブリッド細胞からなるクローン細胞株である。一般的に、モノクローナル抗体は、マウス起源のものである。然しながら、モノクローナル抗体は、更にファージディスプレイ技術、又はファージディスプレイと等価な方法、或いは非マウス起源のハイブリッド細胞によって産生された抗原の特定のエピトープに対して製造された抗体のクローン集団を指す。
【００５０】
“経口”又は“経口的”投与は、本明細書中で使用する場合、口を経由する又はそれによる対象者の身体へのワクチン又は他の組成物のような物質の導入を指し、そして嚥下又は口腔粘膜を経由する輸送（例えば、舌下又は頬側吸収）或いは両方を含む。気管内も経口又は経口的投与の手段である。
【００５１】
“口鼻腔”投与は、本明細書中で使用する場合、例えば、一滴又はそれより多い液滴を鼻に入れることによって起こるような、鼻及び口を経由するか又はそれによる対象者の身体への組成物又はワクチンのような物質の導入を指す。口鼻腔投与は、経口及び鼻腔内投与に伴う輸送過程を含む。
【００５２】
“非経口投与”は、本明細書中で使用する場合、消化管を含まない経路を経由するか又はそれによる対象者の身体への組成物又はワクチンのような物質の導入を指す。非経口投与は、皮下、筋肉内、動脈内、及び静脈内投与を含む。本開示の目的のために、非経口投与は、口、鼻、気管、及び肺の粘膜組織を経由する物質の輸送を主として含む投与経路を除外する。
【００５３】
用語“病原体”又は“病原性微生物”は、本明細書中で使用する場合、その宿主動物に疾病、病気、又は異常状態、好ましくはＣＩＲＤＣのような呼吸器病を誘発又は起こすことが可能である微生物−例えば、ＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２、ＣＲＣｏＶ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓ、ＣＩＶ、又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ−を意味する。
【００５４】
“パータクチン”は、本明細書中で使用する場合、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａの外膜タンパク質を指す。好ましくは、パータクチンは、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａからのものであり、そして最も好ましくは、“ｐ６８”であり、そして遺伝子ｐｒｎＡによってコードされる。パータクチンは、その天然の形態でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａから単離することができるか、又はこれは、組換え的に産生することができる。パータクチンの配列及び例は、米国特許第７，７３６，６５８号中に提供され、その内容は、本明細書中に参考文献として援用される。本明細書中で使用されるパータクチン抗原は、タンパク質の脂質付加された形態を含む。
【００５５】
“医薬的に受容可能”は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、等を伴わずに、妥当な利益−対−危険度比で釣合い、そしてそれらの意図された使用に対して有効である、対象者の組織と接触して使用するために適した物質を指す。
【００５６】
“ポリクローナル抗体”は、本明細書中で使用する場合、特定の病原体又は抗原に対して製造される抗体の混合集団を指す。一般的に、当該集団は、各種の抗体の群を含有し、それぞれの群は、病原体又は抗原の特定のエピトープを指向する。ポリクローナル抗体を製造するために、全病原体、又は単離された抗原が、宿主への接種又は感染によって導入され、これは、病原体又は抗原に対する抗体を製造するように宿主を誘導する。
【００５７】
用語“ポリヌクレオチド”は、本明細書中で使用する場合、鎖状に共有的に結合するヌクレオチドモノマーからなる有機ポリマー分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）は、明確な生物学的機能を持つポリヌクレオチドの例である。
【００５８】
用語“ポリペプチド”は、本明細書中で使用する場合、鎖状に結合する二つ又はそれより多いアミノ酸からなる有機ポリマー分子を意味する。
【００５９】
“感染を予防すること”は、本明細書中で使用する場合、特定された疾病を起こす細菌又はウイルスの複製を予防或いは阻害するか、細菌又はウイルスの伝染を阻害する、細菌又はウイルスがその宿主中に定着することを防止するか、或いは感染によって起こされた疾病の徴候を軽減することを意味する。治療は、細菌又はウイルスの負荷の減少がある場合、治療的であると考えられる。
【００６０】
“保護”、“保護すること”、“保護免疫”、等は、ワクチン又は他の組成物に関して本明細書中で使用する場合、ワクチン又は組成物が、当該ワクチン又は組成物中に使用される抗原（複数可）が由来する生物体によって起こされた疾病の徴候を予防又は減少することを意味する。用語“保護”、“保護すること”等は、ワクチン又は組成物を、対象者中に既に存在している疾病、或いは一つ又はそれより多い疾病の徴候を“治療する”ために使用することができることも意味する。
【００６１】
“呼吸器”投与は、本明細書中で使用する場合、噴霧化（微粒子化）物質の吸入を経由するか又はそれによる対象者の身体へのワクチン又は他の組成物のような物質の導入を指す。呼吸器投与において、一次輸送機構は、微粒子化物質の気管、気管支、及び肺の粘膜を経由する吸収を含み、従って鼻腔内又は経口的投与とは異なる。
【００６２】
用語“特異的結合”、“特異的に結合する”、等は、生理学的又はアッセイ条件下で測定可能であり、そして選択的である、複合体を形成する二つ又はそれより多い分子として定義される。抗体又は他の阻害剤は、適当に選択された条件下で、このような結合が実質的に阻害されず、一方同時に非特異的結合が阻害される場合、タンパク質に“特異的に結合する”と言われる。特異的結合は、高い親和性によって特徴づけられ、そして化合物又はタンパク質に対して選択的である。非特異的結合は、通常低い親和性を有する。例えば、ＩｇＧ抗体における結合は、一般的に、少なくとも約１０−８Ｍ又はそれより高い、或いは少なくとも約１０−９Ｍ又はそれより高い、或いは少なくとも約１０−１０Ｍ又はそれより高い、或いは少なくとも約１０−１１Ｍ又はそれより高い、或いは少なくとも約１０−１２Ｍ又はそれより高いような、少なくとも約１０−７Ｍ又はそれより高い親和性によって特徴づけられる。この用語は、例えば、抗原結合領域が、多数の抗原によって保有されていない特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、この場合、抗原結合部位を保有する抗体は、一般的に他の抗原を結合しないものである。
【００６３】
“特異的免疫原性断片”は、本明細書中で使用する場合、その配列に対して特異的な抗体又はＴ細胞によって認識される配列の一部を指す。
【００６４】
“対象者”は、本明細書中で使用する場合、免疫系を有するいずれもの動物を指し、これは、イヌのような哺乳動物を含む。
【００６５】
“実質的に同一”は、本明細書中で使用する場合、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性の程度を指す。
【００６６】
“サブユニットワクチン”、及び“サブユニット組成物”は、本明細書中で使用する場合、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌のような興味ある病原体からの抗原から誘導されるか或いはそれに相同である抗原−しかし全ての抗原ではない−を含むワクチン又は組成物の種類を指す。このような組成物又はワクチンは、インタクトな病原体細胞又は病原性粒子、或いはこのような細胞又は粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、サブユニットワクチン又はサブユニット組成物は、病原体又はそれらの類似体からの少なくとも部分的に精製された、又は実質的に精製された免疫原性ポリペプチドから調製することができる。サブユニットワクチン又はサブユニット組成物中の抗原又は複数の抗原を得る方法は、標準的な精製技術、組換え生産、又は化学的合成を含む。従って“サブユニットワクチン”又は“サブユニット組成物”は、規定された抗原性成分又はウイルス、細菌、又は他の免疫原の成分からなるワクチン又は組成物を指す。好ましくは、本発明のサブユニット成分は、組換え的に産生され、そして最も好ましくはそれは、パータクチン（ｐ６８）である。
【００６７】
“ＴＣＩＤ５０”は、“組織培養感染量（tissue culture infective dose）”を指し、接種された細胞培養物の所定のバッチの５０％を感染するために必要なウイルスの希釈として定義される。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を含む各種の方法をＴＣＩＤ５０を計算するために使用することができ、これは、本明細書を通して使用される。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法の説明に関しては、Ｂ．Ｗ．Ｍａｈｙ  ＆  Ｈ．Ｏ．Ｋａｎｇｒｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  ２５−４６（１９９６）を参照されたい。
【００６８】
“治療剤”は、本明細書中で使用する場合、ウイルス性、細菌性、寄生虫性又は真菌性感染、これらによって起こされる疾病又は状態の治療を補助するいずれもの分子、化合物、ウイルス、又は治療、好ましくは弱毒化された又は死滅ウイルス、或いはサブユニット又は化合物を指す
“治療的有効量”は、本明細書中で使用する場合、抗原又はワクチン或いは組成物を投与される対象者（例えばイヌ）に免疫反応を誘発するものである抗原又はワクチン或いは組成物の、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌のような病原体による感染によって起こされる不都合な健康上の影響又はその合併症を含む疾病の徴候又は症状を予防又は寛解するために十分である量を指す。体液性免疫又は細胞仲介免疫、或いは体液性免疫及び細胞仲介免疫の両方を誘発することができる。抗原、ワクチン、又は組成物に対する動物の免疫原性反応は、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイによって間接的に、又は野生型株を用いたチャレンジ後の徴候及び症状をモニターすることにより直接的に評価することができる。ワクチン又は組成物によって与えられる保護免疫は、チャレンジ生物の排出の減少、並びに／又は死亡率、罹患率、体温、及び対象者の全体的身体状態、健康、及び能力のような臨床的徴候の減少を測定することによって評価することができる。治療的に有効であるワクチン又は組成物の量は、使用される特定の免疫原、又は対象者の状態によって変更することができ、そして当業者によって決定されることができる。
【００６９】
“治療する”又は“治療すること”は、本明細書中で使用する場合、このような用語が適用される疾患、状態又は疾病の進行を逆転、軽減、阻害するか、又はそれを予防すること、或いはこのような疾患、状態又は疾病の一つ又はそれより多い徴候を予防することを指す。
【００７０】
“治療”は、本明細書中で使用する場合、すぐ上で定義したような“治療すること”の行為を指す。
【００７１】
“ワクチン”又は“ワクチン組成物”は、本明細書中で使用する場合、改変された生、弱毒化、又は死滅のいずれかのウイルス又は細菌、或いはサブユニットワクチン、或いは前述のもののいずれもの組合せから選択される免疫原性組成物を指す。ワクチンの対象者への投与は、免疫反応をもたらす。ワクチンは、非経口、経口的等を含むいずれもの既知の投与の経路によって対象者に直接導入することができる。この用語は、感染を予防又は軽減する、或いは感染の一つ若しくはそれより多い徴候又は症状を予防或いは軽減する組成物を意味する。病原体に対するワクチン組成物の保護効果は、通常、免疫反応を対象者中に誘発することによって達成される。一般的に言って、感染の発生率の消滅又は減少、徴候又は症状の寛解、又は感染された対象者からの微生物の排除の促進は、ワクチン組成物の保護効果を示す。本発明のワクチン組成物は、イヌ呼吸器病病原体によって起こされた感染に対する保護効果を提供する。
【００７２】
“獣医学的に受容可能な”は、本明細書中で使用する場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、等を伴わずに、妥当な利益−対−危険度比で釣合い、そしてそれらの意図された使用に対して有効である、獣医学的対象者の組織との接触における使用に適した物質を指す。
【００７３】
“獣医学的に受容可能な担体”は、本明細書中で使用する場合、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、そしてこれが投与される獣医学的対象者に対して毒性ではない担体媒体を指す。
【００７４】
抗原、免疫原性組成物、及びワクチン
本開示は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ調製物と組合せた単離されたパータクチン抗原の封入が実質的に改善された効力及び安全性をもたらすという予期しない発見に基づく。即ち、細菌のチャレンジに先立ちイヌに非経口投与した場合、組成物は、気管気管支炎の発症を予防し、そして不都合な副作用をもたらさない。
【００７５】
本発明は、ＣＩＲＤＣに対する治療のためのイヌへの投与のために適した一つ又はそれより多いウイルス及び細菌又はサブユニットを含んでなる、免疫原性組成物及びワクチンも提供する。本発明に包含されるイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）は、感染性呼吸器病を持つイヌの気道中に存在するコロナウイルスとして特徴づけられ得る。ＣＲＣｏＶは、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）ＯＣ４３株及びブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ＨＥＶ）に系統学的に最も密接に関係する；イヌ腸内コロナウイルス（ＣＣｏＶ）は、ＣＲＣｏＶの遠縁にあたるのみである。本発明に使用するために適したＣＲＣｏＶの代表的な例は、ＣＲＣｏＶの４１８２株として特定される株を含む（Ｅｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１２４：７８−８７，２００７）。
【００７６】
本発明によって包含されるインフルエンザウイルス抗原は、制約されるものではないが、サブタイプＨ３赤血球凝集素及びサブタイプＮ８ノイラミニダーゼを有するインフルエンザウイルス、又はより一般的にはＨ３Ｎ８ウイルスと呼ばれる、Ｈ３Ｎ８サブタイプを含む、いずれもの鳥又は哺乳動物からのいずれもの確認されたインフルエンザウイルス株であることができる。インフルエンザは、制約されるものではないが、ブタ、ウマ又はイヌ起源を含む哺乳動物又はトリ起源であることができる。一つの態様において、イヌインフルエンザ抗原が使用される。一つの態様において、ウマインフルエンザ抗原が使用される。一つの態様において、Ｈ３又はＮ８と命名されたサブタイプの糖タンパク質を有する株が使用される。一つの態様において、両方のサブタイプＨ３及びＮ８糖タンパク質を有する株が使用される。
【００７７】
本発明によって包含されるインフルエンザ抗原は、家畜及び野生の両方のイヌ、ウマ、ブタ、及び家禽から単離することができる。試料採取に選択される動物は、軽度から重度の呼吸器の徴候及び発熱を含んでよい急性及び／又は亜急性臨床的症候群を示しているべきである。動物は、更に食欲不振及び嗜眠の徴候を示してもよい。ウイルス単離の方法は、当業者にとって公知であり、以下を含む：哺乳動物又はトリ細胞培養物に接種すること、臨床検体からの鼻又は食道粘膜試料を胚発育卵に接種すること、鼻腔内通路又は喉の拭取りによるか、又は脾臓、肺、扁桃腺及び肝臓のような組織を収集すること並びに肺洗浄による収集。ウイルスの細胞変性効果は、細胞培養物中で観察することができる。尿膜腔液又は細胞溶解物を、インフルエンザウイルスの存在に対する仮定的証拠である、ヒト、ニワトリ、七面鳥又はモルモットの赤血球細胞を凝集させるそれらの能力について試験することができる。
【００７８】
本発明において使用するために適したイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）株の代表的な例は、Ａ／ｃａｎｉｎｅ／Ｉｏｗａ／９Ａ１／Ｂ５／０８／Ｄ１２として特定される株を含み、これは、アメリカ培養細胞株統保存機関（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に、２００６年６月２９日にＰＴＡ−７６９４として寄託された。ＣＩＶ抗原の代表的株は、商業的なワクチン、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）ＣＩＶ（Ｐｆｉｚｅｒ）中のＣＩＶウイルス株である。本発明は、ウマインフルエンザ株Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／２／Ｍｉａｍｉ／１／６３として特定される株を含んでなるワクチンも包含する。この株は、アクセッション番号ＶＲ３１７としてＡＴＣＣに寄託された。本発明において使用するためのインフルエンザウイルスの更なる例は、Ａ／ｃａｎｉｎｅ／Ｉｏｗａ／１３６２８／２００５、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１９９８、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１５／２００２、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｏｈｉｏ／１／２００３、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１／１９９４、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２１３／２００３、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２００３、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／ＮｅｗＹｏｒｋ／１９９９、及びＡ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ／Ａ２／１９９３である。ＣＩＶの他の好ましい株及び／又は分離株は、米国特許第７，９５９，９２９号（特にＪａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ／２００５、Ｍｉａｍｉ／２００５、ＦＬ／２４２／０３及びＦｌｏｒｉｄａ／４３／０４としてその中で特定されている株及びＨＡ配列）、７，３８４，６４２号、７，５７２，６２０号及び７，４６８，１８７号中に開示されているものを含み、全ての配列、特にＨＡ配列、及び株を含むこれらの内容は、その全てが本明細書中に記載されているかのように、本明細書中に参考文献として援用される。更に、本明細書中の使用のために適したＣＩＶ株は、アクセッション番号ＡＤＷ４１７８４を有する、Ｂａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２４（６），１５２４−１５２７（２０１０）中に記載されているＣｏｌｏｒａｄｏ  ＣＩＶ分離株を含む。
【００７９】
本発明によって包含されるイヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）は、ケンネルコフに関連する原因病原体であると知られているウイルスの一つとして特徴付けることができる。ＣＰＩＶ抗原の代表的株は、商業的ワクチン、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ５（Ｐｆｉｚｅｒ）中の弱毒化ＣＰＩウイルス株である。ＣＰＩＶ抗原のもう一つの代表的株は、“ＮＬ−ＣＰＩ−５”（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の名称を有する弱毒化ＣＰＩウイルス株である。
【００８０】
本発明によって包含されるイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）は、ケンネルコフに関連する原因病原体としても知られているウイルスの一つとして特徴付けることができる。ＣＡＶ−２抗原の代表的株は、商業的ワクチン、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ５（Ｐｆｉｚｅｒ）中の弱毒化ＣＡＶ−２ウイルス株である。ＣＡＶ−２抗原の代表的株は、“Ｍａｎｈａｔｔａｎ”株（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）と命名された弱毒化ＣＡＶ−２株である。
【００８１】
本発明に包含されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓ（Ｍ．ｃｙｎｏｓ）は、Ｃｈａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：３４９１−３４９７，２００４中に記載され、そして呼吸器病に普通に伴うマイコプラズマの唯一の種である。Ｍ．ｃｙｎｏｓに対する免疫原性組成物は、本明細書中に参考文献として援用されるＵＳ２００７／００９８７３９中に記載されている。
【００８２】
本発明によって包含されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ成分は、ケンネルコフに関連する細菌性原因病原体として特徴付けることができる。本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、生の弱毒化されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａバクテリン又は細菌抽出物の一つ以上であることができる。更に、当該組成物は、好ましくはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの単離されたサブユニット抗原も含む。
【００８３】
一つの態様において、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、１９８４年１０月１２日に出願された特許出願ＦＲ２５７１６１８中に提供されているようにカラムクロマトグラフィーによって精製された全細胞の超音波処理物として調製される。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのもう一つの代表的例は、細菌抽出物ＢｒｏｎｃｈｉｃｉｎｅＴＭＣＡｅ（Ｐｆｉｚｅｒ）であり、これは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ細胞から抽出された抗原性物質から調製される。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのもう一つの例は、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）中に存在する生の弱毒化ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ株のＢ−Ｃ２及び／又はＩｎｔｒａ−Ｔｒａｃ（登録商標）、Ｂｒｏｎｃｈｉ−Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）、ＮａｒａｍｕｎｅＴＭ、Ｒｅｃｏｍｂｉｔｅｋ（登録商標）、Ｕｎｉｖａｃ、及び／又はＫｅｎｎｅｌ−ＪｅｃＴＭからの生のｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ株である。
【００８４】
更に、サブユニットは、好ましくはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ成分との組合せでも存在する（即ち、補充される）。サブユニットの代表的例は、単離されたパータクチン抗原、好ましくは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのｐ６８抗原、特に組換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ  のｐ６８抗原であり、これは、ｐ６８特異的モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ２−７（米国特許７，７３６，６５８号中に記載、本明細書中に参考文献として援用される）によって認識され、そして一つの好ましい態様において、米国特許７，７３６，６５８号中に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対する相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８５】
組換えｐ６８パータクチン抗原は、好ましくは天然様の構造が加工中に保存又は修復されるように、可溶な形態で調製される。従って、本発明の一つの側面は、凝集物を実質的に含まない（約８０％、９０％、９５％又は更に９９％より少ない）組換えｐ６８パータクチンを提供する。もう一つの態様において、組換えｐ６８パータクチンは、尿素、好ましくは尿素の約０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、又は６Ｍ溶液により可溶化される。その後、Ｐ６８抗原は、カラムクロマトグラフィーなどにより精製することができる。このような可溶化法の一つは、Ｓｕｒｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖ．９９（４），ｐｇｓ  ３０３−３１０（２００５）中に記載されている。
【００８６】
本明細書中で使用されるパータクチン抗原は、脂質付加された形態も含む。脂質付加されたタンパク質の産生の例は、参考文献として援用されるＥｒｄｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（１９９３）ｖ．６１（１），ｐ．８１−９０中に提供されている。その中で開示されている方法は、付加された脂質部分を含有する翻訳後修飾されたパータクチンタンパク質を調製するために使用することができる。
【００８７】
更に、もう一つの態様において、免疫原性組成物は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及び単離されたＢｓｐ２２抗原を含んでなる。もう一つの態様において、免疫原性組成物は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、単離されたパータクチン抗原を含んでなり、そして単離されたＢｓｐ２２抗原を更に含んでなる。Ｂｓｐ２２抗原は、Ｍｅｄｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）７１（２），４９２−５０４中に提供されているように調製することができる。好ましくは、単離されたＢｓｐ２２抗原は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抽出物及び単離されたパータクチン抗原、具体的には組換えｐ６８と組合せて（即ち、それに加えて）存在する。“Ｂｓｐ２２”は、抗原の脂質付加された形態も含む。脂質付加されたタンパク質の産生の例は、参考文献として援用されるＥｒｄｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（１９９３）ｖ．６１（１），ｐ．８１−９０中に提供されている。その中に開示されている方法は、付加された脂質部分を含有する翻訳後修飾されたＢｓｐ２２タンパク質を調製するために使用することができる。
【００８８】
本発明によって包含されるウイルスは、細胞、細胞株及び宿主細胞中で増殖することができる。前記の細胞、細胞株又は宿主細胞は、例えば、制約されるものではないが、哺乳動物細胞、並びに昆虫及び植物細胞を含む非哺乳動物細胞であることができる。本発明によって包含されるウイルスが増殖することができる細胞、細胞株、及び宿主細胞は、当業者にとって容易に知られ、そして利用可能である。
【００８９】
本発明によって包含される細菌は、ブロス（液体）及び寒天（固体；半固体）の両方の培養培地を含む当業者にとって既知の各種の培養培地を使用して培養及び増殖することができる。幾つかの細菌は、更に、哺乳動物細胞又は非哺乳動物細胞中で培養及び増殖することができる。
【００９０】
本発明によって包含されるウイルス及び細菌は、免疫原性組成物又はワクチン中で使用に先立ち弱毒化又は不活化することができる。弱毒化又は不活化の方法は、当業者にとって周知である。弱毒化の方法は、制約されるものではないが、適した細胞株の細胞培養における一連の継代（ウイルス及び幾つかの細菌）、ブロス培養における一連の継代（細菌）、紫外線照射（ウイルス及び細菌）、及び化学的変異誘発（ウイルス及び細菌）を含む。ウイルス又は細菌の不活化の方法は、制約されるものではないが、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎ）（ＢＰＬ）又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）による処理、或いは当業者にとって既知の他の方法を含む。
【００９１】
ホルマリンによる不活化は、微生物を含有する懸濁液を、３７％ホルムアルデヒドと、０．５％の最終ホルムアルデヒド濃度まで混合することによって行うことができる。微生物−ホルムアルデヒド混合物を、概略２４時間の室温における一定の撹拌によって混合する。次いで不活化された微生物の混合物は、適した細胞株又はブロス培地上の増殖について分析することによって残存する生存生物体について試験される。
【００９２】
幾つかの抗原のために、ＢＥＩによる不活化は、本発明の微生物を含有する懸濁液を、０．１ＭのＢＥＩ（０．１７５ＮのＮａＯＨ中の２−ブロモ−エチルアミン）と、１ｍＭの最終ＢＥＩ濃度まで混合することによって行うことができる。他の抗原のために、最終ＢＥＩ濃度は、２ｍＭである。当業者は、使用する適当な濃度を知るものである。ウイルス−ＢＥＩ混合物を、概略４８時間、室温で一定に撹拌することによって混合し、続いて１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウムを０．１ｍＭの最終濃度まで加える。混合を更に２時間続ける。不活化された微生物を含有する混合物は、適した細胞株又はブロス培地上の増殖について分析することによって残存する生存ウイルスについて試験される。
【００９３】
本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、一つ又はそれより多い獣医学的に受容可能な担体を含むことができる。本明細書中で使用する場合、“獣医学的に受容可能な担体”は、いずれもの、そして全ての溶媒、分散媒体、被覆、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、等を含む。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、等を含むことができる。等張剤は、当業者にとって既知のものの中でも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを含むことができる。安定剤は、当業者にとって既知のものの中でも、アルブミンを含む。保存剤は、当業者にとって既知のものの中でも、マーシオレートを含む。
【００９４】
アジュバントは、代謝可能であることができ、植物油ベースのアジュバントのような、標的種によって代謝されることが可能な成分からなるアジュバントを指す。代謝可能なアジュバントは、代謝可能な油であることができる。代謝可能な油は、典型的に植物及び動物中に存在する脂肪及び油であり、そして通常大部分は、トリグリセリド又は天然の脂肪としても知られるトリアシルグリセロールの混合物からなる。これらの非極性の、水不溶性の物質は、グリセロールの脂肪酸トリエステルである。トリアシルグリセロールは、その三つの脂肪酸残基又は側鎖の同一性及び配置によって異なる。
【００９５】
アジュバントは、代謝不可能であることもでき、乳液が投与される動物の対象者の身体によって代謝することができない成分からなるアジュバントを指す。本発明の組成物中で使用するために適した代謝不可能な油は、アルカン、アルケン、アルキン、並びにその対応する酸及びアルコール、そのエーテル及びエステル、並びにそれらの混合物を含む。好ましくは、油の個々の化合物は、軽質炭化水素化合物であり、即ち、このような成分は、６ないし３０個の炭素原子を有する。油は、合成的に調製するか又は石油製品から精製することができる。本明細書中に記載される組成物中で使用するために好ましい代謝不可能な油は、鉱油、例えば、パラフィン油、及びシクロパラフィンを含む。用語“鉱油”は、ペトロラタムから蒸留技術によって得られる液体炭化水素の混合物である、代謝不可能なアジュバントの油を指す。この用語は、“液化パラフィン”、“液体ペトロラタム”及び“白色鉱油”と同義である。この用語は、“軽質鉱油”、即ち同様にペトロラタムの蒸留によって得られるが、しかし白色鉱油より僅かに低い比重を有する油を含むことも意図する。鉱油は、各種の商業的供給源、例えばＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，  ＰＡ），ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得ることができる。軽質鉱油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）の名称で商業的に入手可能である。
【００９６】
アジュバントは、制約されるものではないが、当業者にとって既知の多くの他のアジュバントの中で、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎアジュバント系（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｒａｌｓｔｏｎ，ＮＥ）、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油乳液、例えばフロイントの完全及び不完全アジュバントのような油中水乳液、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ；Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）又は他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉからの熱不安定性エンテロトキシン（組換え又はその他）、コレラ毒素、ムラミルジペプチド、スクアレン／プルロニックブロックコポリマー／界面活性剤（ＳＰ−ｏｉｌ）、スルホリポベータ−シクロデキストリン（ＳＬ−ＣＤ）、免疫調節物質（immumodulator）を含有するリポソーム（例えば、ＣｐＧ又はポリＩ：Ｃ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ  （Ｑｕｉｌ  Ａ／ホスファチジルコリン（phosphotidyl choline））、ＣｐＧ／ＤＥＡＥ−デキストラン／鉱油（ＴＸＯ）、ＣｐＧ、トリテルペノイド（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ又は他の精製又は部分的に精製されたサポニン調製物）、ステロール（例えば、コレステロール）、免疫調節剤（例えば、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム−ＤＤＡ）、ポリマー（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）のようなポリアクリル酸）、及びＴｈ２刺激物質（例えば、Ｂａｙ  Ｒ１００５（登録商標）のような糖脂質）、並びにこれらの組合せを含む。
【００９７】
使用することができる各種の組合せの非限定的例は、トリテルペノイド＋ステロール（例えば、ＱＡＣとしても知られる、Ｑｕｉｌ  Ａ／コレステロール）、トリテルペノイド＋ステロール、免疫調節剤、及びポリマー（例えば、ＱＣＤＣとしても知られる、Ｑｕｉｌ  Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））、並びにトリテルペノイド＋ステロール、免疫調節剤、ポリマー、及びＴｈ２刺激物質（例えば、ＱＣＤＣＲとしても知られる、Ｑｕｉｌ  Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、及びＢａｙ  Ｒ１００５（登録商標））を含む。
【００９８】
本発明の文脈において有用なアジュバント及び添加剤の量並びに濃度は、当業者によって容易に決定することができる。一つの態様において、本発明は、約２０μｇから約２０００μｇまでのアジュバントを含んでなる免疫原性組成物及びワクチンを意図する。もう一つの態様において、アジュバントは、約１００μｇから約１５００μｇまで、又は約２５０μｇから約１０００μｇまで、或いは約３５０μｇから約７５０μｇまでの量で含まれる。もう一つの態様において、アジュバントは、約５００μｇ／２ｍｌの免疫原性組成物又はワクチンの投与の量で含まれる。
【００９９】
免疫原性組成物及びワクチンは、抗生物質も含むことができる。このような抗生物質は、制約されるものではないが、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、及びテトラサイクリンのクラスからのものを含む。一つの態様において、本発明は、約１μｇ／ｍｌから約６０μｇ／ｍｌまでの抗生物質を含んでなる免疫原性組成物及びワクチンを意図する。もう一つの態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、約５μｇ／ｍｌから約５５μｇ／ｍｌまでの抗生物質、又は約１０μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌまでの抗生物質、又は約１５μｇ／ｍｌから約４５μｇ／ｍｌまでの抗生物質、又は約２０μｇ／ｍｌから約４０μｇ／ｍｌまでの抗生物質、又は約２５μｇ／ｍｌから約３５μｇ／ｍｌまでの抗生物質を含んでなる。なおもう一つの態様において、免疫原性組成物及びワクチンは、約３０μｇ／ｍｌより少ない抗生物質を含んでなる。
【０１００】
本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、ウイルス又は細菌、或いはウイルス又は細菌のタンパク質をコードする一つ若しくはそれより多いポリヌクレオチド分子を含むことができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、免疫原性組成物又はワクチン中で使用することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、他の薬剤の非存在で投与することができ、或いはこれは、細胞の取込みを容易にする薬剤（例えばリポソーム又はカチオン性脂質）と一緒に投与することができる。免疫原性組成物及びワクチン中の全ポリヌクレオチドは、一般的に約０．１μｇ／ｍｌないし約５．０ｍｇ／ｍｌの間であるものである。もう一つの態様において、免疫原性組成物及びワクチン中の全ポリヌクレオチドは、約１μｇ／ｍｌないし約４．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０μｇ／ｍｌないし約３．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌないし約２．０ｍｇ／ｍｌである。核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を使用するワクチン及びワクチン接種法は、当技術、例えば米国特許第５，７０３，０５５号、米国特許第５，５８０，８５９号、５，５８９，４６６号において十分に説明され、これらの全ては、本明細書中に参考文献として援用される。
【０１０１】
先に記載したウイルス及び細菌に加えて、本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、他の更なる抗原を含むことができる。抗原は、微生物の不活化された全体又は部分的調製物の形態、又は遺伝子操作技術又は化学的合成によって得られる抗原性分子の形態であることができる。本発明によって使用するために適当な他の抗原は、制約されるものではないが、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルスのような病原性ウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｈａｒｄｊｏｂｏｖｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ亜種ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｙｎｏｓを含むＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、及びＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓのような病原性細菌由来のものを含む。抗原は、Ｃａｎｄｉｄａのような病原性真菌、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．のような原虫、又はＴａｅｎｉａ、Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、及びＰａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｓｐｐ．のような蠕虫由来であることもできる。
【０１０２】
投与の形態、投与量、経路
本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、ＣＩＲＤＣに対する有効な免疫反応を誘発するために動物に投与することができる。従って、本発明は、治療的有効量の本明細書中に記載される免疫原性組成物又はワクチンを動物に投与することによる、有効な免疫反応を刺激する方法を提供する。
【０１０３】
本明細書中に記載される免疫原性組成物及びワクチンは、動物の対象者にＣＩＲＤＣに対するワクチン接種をするために動物に投与することができる。免疫原性組成物及びワクチンは、動物のＣＩＲＤＣを予防又は治療するために動物に投与することができる。従って、本明細書中には、治療的有効量の本明細書中に記載される免疫原性組成物又はワクチンを動物に投与することを含んでなる、ＣＩＲＤＣに対して動物にワクチン接種し、そしてＣＩＲＤＣを予防又は治療する方法が記載される。
【０１０４】
本発明によって包含される免疫原性組成物及びワクチンは、投与の経路によって各種の形態で製造することができる。例えば、免疫原性組成物及びワクチンは、注射使用のために適した滅菌水溶液又は懸濁液の形態で製造するか、或いは冷凍乾燥技術を使用して凍結乾燥された形態に製造することができる。凍結乾燥された免疫原性組成物及びワクチンは、典型的には約４℃で維持され、そして安定化した溶液、例えば、アジュバントを伴って又は伴わずに、生理食塩水又はＨＥＰＥＳ中で再構成することができる。免疫原性組成物及びワクチンは、懸濁液又は乳液の形態で製造することもできる。
【０１０５】
本発明の免疫原性組成物及びワクチンは、治療的有効量の一つ又はそれより多い上記の微生物を含む。精製されたウイルス及び／又は細菌を、免疫原性組成物及びワクチン中に直接使用することができ、或いは更に弱毒化、又は不活化することができる。典型的には、免疫原性組成物又はワクチンは、約１×１０２ないし約１×１０１２個の間のウイルス又は細菌粒子、或いは約１×１０３ないし約１×１０１１個の間の粒子、又は約１×１０４ないし約１×１０１０個の間の粒子、又は約１×１０５ないし約１×１０９個の間の粒子、又は約１×１０６ないし約１×１０８個の間の粒子を含有する。保護効果を提供するために有効な免疫原性組成物又はワクチン中の微生物の正確な量は、当業者によって決定されることができる。
【０１０６】
免疫原性組成物及びワクチンは、一般的に約０．５ｍｌないし約５ｍｌの間の体積で獣医学的に受容可能な担体を含んでなる。もう一つの態様において、担体の体積は、約１ｍｌないし約４ｍｌの間、又は約２ｍｌないし約３ｍｌの間である。もう一つの態様において、担体の体積は、約１ｍｌ、又は約２ｍｌ、又は約５ｍｌである。免疫原性組成物及びワクチンにおける使用のために適した獣医学的に受容可能な担体は、本明細書中に先に記載したもののいずれかであることができる。
【０１０７】
当業者は、ウイルス又は細菌を投与前に弱毒化又は不活化する必要があるか否かを容易に決定することができる。本発明のもう一つの態様において、ウイルス又は細菌は、更なる弱毒化を行わずに動物に直接投与することができる。治療的に有効である微生物の量は、使用される特定の微生物、動物の状態及び／又は感染の程度によって変化することができ、そして当業者によって決定されることができる。
【０１０８】
本発明の方法によれば、一回の投与を動物に投与することができ、或いは、二回又はそれより多い接種を約２から約１０週間までの間隔で行うことができる。追加免疫投与計画を必要とすることがあり、そして投与計画は、最適な免疫化を与えるために調節することができる。当業者は、最適な投与計画を容易に決定することができる。
【０１０９】
免疫原性組成物及びワクチンは、血流、筋肉、内部器官中に、又は皮膚の下に直接投与することができる。非経口投与のために適した手段は、静脈内、動脈内、筋肉内、及び皮下投与を含む。非経口投与のために適したデバイスは、有針（マイクロニードルを含む）注射器及び無針注射器を含む。
【０１１０】
非経口製剤は、典型的には、塩、炭水化物、タンパク質、及び緩衝剤（好ましくは約３から約９まで、又は約４から約８まで、又は約５から約７．５まで、又は約６から約７．５まで、又は約７から約７．５までのｐＨ）のような賦形剤を含有することができる水溶液であるが、しかし幾つかの適用のために、それらは、滅菌非水性溶液として、或いは滅菌パイロジェンフリーの水又は生理食塩水のような適したビヒクルと共に使用される乾燥した形態として、より適切に製剤化することができる。
【０１１１】
例えば凍結乾燥による、滅菌条件下の非経口製剤の調製は、当業者にとって周知の標準的な製薬技術を使用して容易に達成することができる。
【０１１２】
非経口溶液の調製において使用される物質の溶解性は、緩衝液、塩、界面活性剤、リポソーム、シクロデキストリン、等を含む溶解性向上剤の組込みのような当業者にとって既知の適当な製剤化技術の使用によって増加することができる。
【０１１３】
非経口投与のための組成物は、即時又は改変放出であるように製剤化することができる。改変放出製剤は、遅延、継続、パルス、制御、標的化及びプログラム放出を含む。従って、免疫原性組成物及びワクチンは、固体、半固体、又は免疫原性組成物及びワクチンの改変放出を提供するインプラントのデポーとしての投与のための揺変性液体として製剤化することができる。
【０１１４】
免疫原性組成物又はワクチンの投与の他の手段は、マイクロニードル又は無針（例えば、ＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔＴＭ、ＢｉｏｊｅｃｔＴＭ、等）注射による送達を含む。
【０１１５】
皮下又は筋肉内注射が使用される場合、等張製剤が好ましい。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含むことができる。特定の場合において、リン酸緩衝生理食塩水のような等張溶液が使用される。製剤は、ゼラチン及びアルブミンのような安定剤を更に包含することができる。幾つかの態様において、血管収縮剤を製剤に加える。本発明による医薬調製物は、一般的に滅菌及びパイロジェンフリーで提供される。然しながら、医薬的に受容可能な担体の処方は、いずれものイヌワクチン、ポリペプチド（抗原）サブユニット免疫原性組成物及びワクチン、組換えウイルスベクターワクチン、及びＤＮＡワクチンについて、米国農務省、或いはカナダ若しくはメキシコ、又は欧州国家のいずれか一つのような外国の同等な政府機関によって公表された規則において認可された医薬的担体であることは当業者にとって周知である。従って、免疫原性組成物又はワクチンの商業的産生のための医薬的に受容可能な担体は、米国又は外国の適当な政府機関によってすでに認可された、又は認可されるものである担体である。免疫原性組成物及びワクチンは、更に医薬的に受容可能であるアジュバントと混合することができる。免疫原性組成物及びワクチンのある種の製剤において、免疫原性組成物又はワクチンは、他のイヌ病原体によって起こされる広い範囲の疾病に対してイヌを保護することができる多価産物を製造するために、他のイヌ免疫原性組成物又はワクチンと混合される。
【０１１６】
検出及び診断方法
動物において誘発された免疫反応の程度及び特質は、各種の技術を使用することによって評価することができる。例えば、血清を、接種された動物から収集し、そして免疫原に対して特異的な抗体の存在又は非存在を試験することができる。細胞性免疫反応の誘発を示すリンパ系組織中の反応性細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の検出は、Ｔ細胞増殖のようなアッセイによって達成することができる。関連する技術は、当技術分野において十分に記載されている。
【０１１７】
キット
免疫原性組成物又はワクチンを、更なる組成物又は化合物と組合せて−例えば、特定の疾病又は状態を治療する目的のために−投与することが好ましいことであり得る限り、免疫原性組成物又はワクチンを、都合よく、組成物の投与又は同時投与のために適したキットの形態に含めるか、又は組合せることができることは本発明の範囲内である。
【０１１８】
従って、本発明によって包含されるキットは、少なくともその一つが本発明による免疫原性組成物又はワクチンである一つ又はそれより多い別個の医薬組成物、及びコンテナー、別々のビン、又は別々のホイル包装のような前記組成物を別個に保持する手段を含んでなることができる。このようなキットの例は、シリンジ及び針、等である。本発明のキットは、例えば、経口及び非経口のための、別個の組成物の異なった投与間隔の投与のための、又は別個の組成物を互いに力価測定するための、異なった剤形の投与に特に適している。本発明によって包含される組成物を投与するものを援助するために、キットは典型的には投与のための説明書を含んでなる。
【０１１９】
本発明によって包含されるもう一つのキットは、感染された動物の検出のために有用な一つ又はそれより多い試薬を含んでなることができる。キットは、全微生物、ポリペプチド、エピトープ又はポリヌクレオチド配列の存在について試料を分析するための試薬を含むことができる。ウイルス、細菌、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の存在は、抗体、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、及び当業者にとって既知の他の検出方法を使用して決定することができる。
【０１２０】
本発明によって包含されるもう一つのキットは、特定のエピトープに対する抗体の検出のための試薬を提供することができる。このような試薬は、抗体の存在について試料を分析するために有用であり、そして当業者にとって容易に知られ、そして使用可能である。抗体の存在は、当業者にとって既知の標準的な検出方法を使用して決定することができる。
【０１２１】
ある態様において、キットは、当該キットが感染された動物の検出のために有用であることを表示する印刷された説明書、又はラベルの組合せを含むことができる。
【０１２２】
抗体
抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又は組換え型のいずれかであることができる。抗体は、免疫原又はその一部に対して調製することができる。例えば、免疫原のアミノ酸配列に基づいて、又はクローニング技術によって組換え的に調製された合成ペプチド、或いは天然の遺伝子産物及び／又はその一部を、単離し、そして免疫原として使用することができる。免疫原は、当業者にとって周知の標準的な抗体産生技術によって、抗体を産生するために使用することができる。抗体の断片も、当業者にとって既知の方法によって抗体から調製することができ、そしてＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片を含む。
【０１２３】
抗体の産生において、所望の抗体に対するスクリーニングは、当技術分野において既知の免疫学の標準的な方法によって達成することができる。一般的に、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法が免疫アッセイの好ましい種類である。両方のアッセイは、当業者にとって周知である。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を、このアッセイにおいて使用することができる。抗体は、当技術分野において周知のように、固体支持基質と結合するか、検出可能な部分とコンジュゲートするか、或いは結合及びコンジュゲートの両方をすることができる。抗体の固体支持基質との結合も、当技術分野において周知である。本発明において使用することを意図する検出可能な部分は、制約されるものではないが、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、１４Ｃ、及びヨウ素化のような蛍光、金属、酵素及び放射性マーカーを含むことができる。
【０１２４】
本発明は、以下の実施例によって更に例示されるが、しかし決してそれに限定されない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ細菌抽出物、サブユニットワクチンの免疫原性。
【０１２６】
低いＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（≦１６の微小凝集抗体（Micro-agglutinating antibody）（ＭＡＴ）力価）を持つ３２匹の概略生後８週間のビーグル犬を、研究に登録した。子イヌをそれぞれ１６匹の二つの処置群（Ｔ１及びＴ２）にランダムに分割した。Ｔ２の１匹の子イヌは、鼠径ヘルニアのために、一回目のワクチン接種に先立ち除外した。
【０１２７】
【表１】
0005833145.tif 000002
【０１２８】
イヌを、表１に示す研究設計により、０及び２１日目に適当なワクチンで皮下的（ＳＣ）にワクチン接種した。ワクチンを、一回目のワクチン接種については右肩部に、そして二回目のワクチン接種については左肩部にそれぞれのイヌに投与した。
【０１２９】
４２日目に、全ての処置群のイヌを、プレキシガラスの部屋で３０分間のエアゾール化を使用して、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａで鼻腔内的にチャレンジした。１匹の動物を先に研究から除外したため、一つの群が、Ｔ１の２匹及びＴ２の１匹の３匹の動物のみを有したことを除き、４匹のイヌ、Ｔ１の２匹及びＴ２の２匹、を同時にチャレンジした。
【０１３０】
主要な有効性項目は、咳であった。全ての他の項目（鼻汁、涙、くしゃみ、抑鬱、悪心、呼吸作用）は、支持的二次項目と考えられた。咳を含む呼吸器病の徴候の臨床的観察は、一日二回（“観察期間”；午前及び午後）それぞれのセッション当たりそれぞれの部屋で概略３０分間、４２日目から、そして７０日目（研究の結末）まで行った。チャレンジ後の２回の連続した観察期間に動物が咳をしたか否かを、それぞれの動物について計算した。２回の連続した観察期間に咳をしたもの／咳をしないものの頻度分布を、それぞれの処置について計算した。２回の連続した観察期間に咳をしたもの／咳をしないものを、一般化線形混合モデルによりデータを解析することが可能ではなかったため、部屋ごとに調節して、Ｃｏｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ試験で解析した。鼻腔内の細菌単離（＋／−）の頻度分布を、それぞれの処置及び時点について計算した。チャレンジ後に単離された細菌を有していたことがあるか否かもそれぞれの動物について決定した。
【０１３１】
動物が、チャレンジ後に単離されたＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを有していたことがあるかか否かの頻度分布を、それぞれの処置について計算し、そして可能な場合、一般化線形混合モデルにより解析した。チャレンジ後の鼻腔内排出の期間を、それぞれの動物について計算し、そして一般化線形混合モデルにより解析した。抗体力価を対数的に変換し、そして繰返し測定について一般化線形混合モデルを使用して解析した。
【０１３２】
結果：ワクチン接種後、いずれのイヌも疼痛又は発熱（≧３９．５℃）の報告は無かった。両方の処置群の幾匹かのイヌは、ワクチン接種時に引掻き行為を有したと報告された。小さい大きさの注射部膨潤（２×２×１ｃｍ）が、一回目のワクチン接種後観察の３−６時間中にＴ２の２匹のイヌのみで報告された。データは、ワクチンが安全であり、そしてイヌによって十分許容されたことを示す。
【０１３３】
全ての生理食塩水の対照は、咳を発生し、チャレンジが十分であることを示した。対照群の咳の期間の最小二乗（ＬＳ）平均は、２０．３であった。対照的に、ワクチンは、ワクチン接種したものの咳の期間を、ｐ値＜．０００１で５．２のＬＳ平均に有意に減少させた。更に、対照と比較した場合、ワクチン接種したもの悪心及び呼吸作用のような他の呼吸器の臨床的徴候を減少させた。
【０１３４】
チャレンジ後の細菌単離のデータは、試験ワクチンが、生理食塩水対照（２５．３のＬＳ平均）と比較した場合、ワクチン接種群のチャレンジ生物の鼻腔内排出の期間（２０．５のＬＳ平均）を、０．００６１のｐ値で有意に減少させることを示した。データは、ワクチンが、ワクチン接種したものにおける排出の期間の減少によって確認されるように、感染のレベルを減少させることに有効であることを示す。
【０１３５】
Ｔ２群においてワクチン接種後（２１及び４２日目）に発生した抗体反応は、恐らく凝集抗体アッセイの特質により、そして抗原性の欠損によるのではなく、Ｔ１と類似であった。７０日目のチャレンジ後のワクチン接種したものの大多数において誘発された強い既往性の反応が、生理食塩水対照（ＬＳ平均１３）と比較して観察され（ＬＳ平均４２６）、有効な免疫化を示した。
【０１３６】
まとめれば、この研究からのデータは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ細菌抽出物、サブユニットワクチンが、咳及び鼻腔内排出の期間の減少によって効力を証明したことを明らかに示す。
【０１３７】
実施例２：注射用Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａワクチンの効力及び安全性の評価。
【０１３８】
概略生後８週間の５０匹のビーグル犬を研究に登録した。イヌを、それぞれ１０匹の５群に分割した。全ての動物は、良好な一般的健康状態であり、そしていずれものＢｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチン接種を受けていなかった。予備スクリーニングの血清試料は、一回目のワクチン接種に先立つ微小凝集試験（ＭＡＴ）により＜１６の力価で、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａについて陰性であった。全ての動物が、一回目のワクチン接種（０日目）に先立つ細菌の鼻腔拭取り検体の単離試験によって、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを持たないことを決定した。
【０１３９】
【表２】
0005833145.tif 000003
【０１４０】
動物を、表２に示す研究設計により、０及び２１日目に適当なワクチンでワクチン接種した。Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０３、及びＴ０４群に対するワクチンは、それぞれのイヌに、一回目のワクチン接種を右肩部に、そして二回目のワクチン接種を左肩部に皮下投与した。Ｔ０５群は、０日目に商業的に入手可能な鼻腔内ワクチンの一回の鼻腔内ワクチン投与を受けた。この群は、施設中の生ワクチンの拡散を防止するために最後にワクチン接種し、そしてこの群のイヌを、他の群への暴露を防止するために異なった部屋に別個に収容した。
【０１４１】
４２日目に、全ての処置群からのイヌを、合計３０分間のプレキシガラスの部屋の中におけるエアゾール投与によって、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａで鼻腔内的にチャレンジした。同じ囲いからの５匹のイヌ（それぞれの処置群から１匹）を、同時にチャレンジした。
【０１４２】
主要な有効性項目は咳であった；細菌の単離は、二次的項目であった。咳を含む呼吸器病の徴候に対する臨床的観察は、それぞれのセッション当たり概略３０分間、４２日目から、６２日目まで一日二回（“観察期間”；午前及び午後）、そして６３日目（研究の終結）に一回（午前）行った。咳の解析に先立ち、咳をした観察期間のパーセントを、アークサイン平方根変換で変換した。変換した観察期間のパーセント、及び咳を伴った日数を、一般化線形混合モデルで解析した。動物が咳をしたチャレンジ後の観察期間のパーセント、及び咳を伴ったチャレンジ後の日数を、それぞれの動物について計算した。
【０１４３】
結果：軽度から中等度の膨潤が、処置群Ｔ０２及びＴ０４のイヌの注射部位において観察された（データは示さない）。反応の重篤度及び関係するイヌの数は、二回目のワクチン接種後増加した。軽度の注射部位反応が、処置群Ｔ０３の幾匹かのイヌにおいて観察された。測定可能な注射部膨潤は、生理食塩水群Ｔ０１において観察されなかった。臨床的発熱（≧３９．５℃）は、ワクチン接種後４日目のＴ０２群の１匹のイヌを除き観察されなかった。ワクチン接種したイヌのいずれにもいても疼痛は報告されなかった。
【０１４４】
Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａチャレンジ接種は、全てのワクチン接種しない対照において咳を誘発し（５３．３％、そして１４．７日咳をした）、チャレンジが、試験ワクチンを評価するために十分であったことを示した。商業的な鼻腔内ワクチンを受けたＴ０５群（正の対照）から得られた結果は、４．６％でチャレンジ後２日まで咳が観察されたことを示し、チャレンジのレベルが最適であり、そして圧倒的なものではないことを示唆した。
【０１４５】
三つの試験製剤をこの研究で評価した。Ｔ０２は、１６．１％でチャレンジ後６日まで咳が観察され、Ｔ０３は、３４．７％でチャレンジ後１０．５日まで咳が観察され、そしてＴ０４は、３４．５％でチャレンジ後１０．７日まで咳が観察された。従って、全てのワクチン接種群は、ワクチン非接種の対照と比較した場合、咳の得点の減少を示した。パータクチンを添加し、そしてＱＣＤＣでアジュバント添加したＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ細菌抽出物でワクチン接種したＴ０２群は、咳の採点基準において統計的に有意な減少を示した。従って、Ｔ０２において試験した製剤の効力は、有効であるように見受けられた。
【０１４６】
実施例３．イヌにおけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを含有するワクチンの安全性及び効力。
【０１４７】
五つの処置群に分割した五十（５０）匹のイヌを、研究のために選択した。動物を、−４日目の身体検査に基づいて研究のために適しているか決定した。
【０１４８】
血清学のための血液試料（概略８ｍＬ）を、全ての動物から研究の−２、２１及び２８日目にそれぞれのワクチン接種に先立ちＳＳＴ試験管に収集した。−２日目に収集した血清試料を、動物がＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを持たないことを確認するために使用した。鼻腔拭取り検体を０日目のワクチン接種に先立ち収集し、そしてＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの存在について試験した。耳内温度を、ワクチン接種に先立つ基線を確立するために−４日目に開始して収集した。
【０１４９】
動物に、表３に示す研究設計により０、２１、及び２８日目に適当なワクチンでワクチン接種した。ワクチンを、一回目のワクチン接種を右肩部に、そして二回目のワクチン接種を左肩部に、それぞれのイヌに皮下投与した。
【０１５０】
【表３】
0005833145.tif 000004
【０１５１】
全ての動物を、ワクチン接種後の注射部位反応について、ワクチン接種の０、２１、及び２８日目に観察した。それらを、ワクチン接種後の注射部の反応について１から７日目まで、及び２２−３５日目に毎日観察した。耳内温度を０ないし７、及び２１ないし３５日目に収集した。
【０１５２】
血清学のための血液試料（概略６ｍＬ）を、チャレンジに１日先立つ５５日目に収集した。耳内温度をチャレンジに先立ち５４、５５、及び５６日目に収集した。鼻腔拭取り検体をチャレンジに１につ先立ち５５日目に収集し、そしてＢ.ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの存在について試験した。動物を、一日二回（午前及び午後）５４及び５５日目に、そして５６日目の午前に、それぞれ概略３０分のセッション、呼吸器病の臨床的徴候について基線値を確立するために観察した。
【０１５３】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａチャレンジ株）を、１０９ＣＦＵ／４ｍＬ／イヌの目標チャレンジ投与量を調製するために使用した。５６日目に、全ての処置群からのイヌを、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより、プレキシガラスの部屋におけるエアゾール投与によって、チャレンジされるそれぞれの囲いに対して合計３０分間鼻腔内的にチャレンジした。同じ囲いからの５匹のイヌ（それぞれの処置群から１匹）を、同時にチャレンジした。
【０１５４】
耳内温度を、チャレンジ後一日一回、５６から７７日目まで記録した。臨床的観察を、一日二回（午前及び午後）、それぞれのセッション当たり、それぞれの部屋において概略３０分間、５６日目から、そして７６日目まで、そして７７日目に一回（午前）行った。簡単には、咳、鼻汁、くしゃみ、涙、悪心、及び抑鬱を、次の採点系を使用して観察した：非存在（０）、軽度（１）、中等度（２）、及び重度（３）。鼻腔拭取り検体を、５９、６２、６６、６９、７４、７６及び７７日目に収集して、チャレンジ生物の排出を決定した。
【０１５５】
血清学のための血液試料（概略６ｍＬ）を、７７日目に収集した。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの単離のための鼻腔拭取り検体を、綿棒及び輸送培地を使用して収集した。
【０１５６】
Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する凝集抗体を、微小凝集試験（Micro Agglutination Test）（ＭＡＴ）によって決定した。処置群Ｔ０４及びＴ０５からの０、２８、５５、及び７７日目からの血清試料を、ＣＲＣｏＶ抗体について血清中和及びＩＦＡによって、そしてＣＩＶについてＨＡＩによって力価測定した。鼻腔拭取り検体からのＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ単離を、標準的な方法で行った。それぞれの試料を、細菌の存在又は非存在について定性的に試験した。
【０１５７】
結果。五十（５０）匹の健康な概略生後８週間のビーグルの子イヌが、０日目にＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ生物体を含まないことを、鼻腔拭取り検体の培養物単離によって確認した。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ凝集抗体についてＭＡＴによって評価した血清試料は、全ての子イヌが−２日目に≦８のＭＡＴ力価で感受性であることを確認した。
【０１５８】
この研究で評価した全ての実験用ワクチンは、一回目のワクチン接種後、軽度から無の注射部膨潤を生じた。注射部膨潤は、ワクチン接種したものの大多数において研究の０日目に限られた。軽度から無の注射部膨潤は、二回目のワクチン接種後にも報告された。注射部位膨潤は、それらが起こった場合、二回目のワクチン接種後１ないし３日の間に消散した。引掻き行為は、主として５種混合群（Ｔ０４）において報告された。ワクチン接種後の臨床的発熱の報告はなかった。生理食塩水群の注射部膨潤の報告はなかった。データは、ワクチンの安全性を確認した。
【０１５９】
チャレンジ接種前及び後に行われたコロニー計数は、部屋内でイヌ当たり平均１．４５×１０８ＣＦＵのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａが、部屋でエアゾール化されたことを確認した。チャレンジ接種は、全ての生理食塩水対照のイヌ（Ｔ０２）において咳を誘発し、咳を観察した平均パーセントは４３．５％で、１２．２日咳をした。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原を含まない４種のウイルス（ＣＲＣｏＶ／ＣＩＶ／ＣＰＩＶ／ＣＡＶ２）のみでワクチン接種した処置群Ｔ０５は、生理食塩水対照と同様の咳を発生し、咳を観察した平均パーセントは４３．４％で、１２．２日咳をした。これらの発見は、チャレンジが、試験ワクチンを評価するために十分であり、そして一貫していることを示す。
【０１６０】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチンでワクチン接種した処置群Ｔ０１のイヌは、対照群（１２．２日咳をした）と比較した場合、チャレンジに対して有意に保護（３．６日咳をした、ｐ＜０．０００１）された。同じワクチンは、３週間の間隔の計画で与えた場合、Ｔ０３のイヌも有意に保護した（５．８日咳をした、ｐ＝０．０００４）。これらの二つの群（Ｔ０１対Ｔ０３）における咳の得点の減少は、有意には異ならず（ｐ値＝０．１８８３）、３又は４週間の間隔で与えたワクチンについての保護のレベルが同様であることを示唆した。
【０１６１】
アジュバント非添加の５種混合ワクチンを受けたＴ０４のイヌは、生理食塩水対照（１２．２日咳をした）と比較した場合、そして４種ウイルス（ＣＲＣｏＶ／ＣＩＶ／ＣＰＩＶ／ＣＡＶ２）混合を受けたＴ０５（１２．１日咳をした、ｐ＝０．００１９）と比較した場合、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａチャレンジに対して有意に（ｐ＝０．００１６）保護され（６．６日咳をした）、アジュバントを欠く混合ワクチン中のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ画分の効力を示した。
【０１６２】
５種混合ワクチン中のウイルス画分の血清学的評価は、ＣＩＶ及びＣＲＣｏＶの二つの画分のみについて可能であり、ここでイヌは研究の−２日目に血清学的陰性であると確認された。研究の５６日目における４種ワクチン群（Ｔ０４）におけるＣＩＶのＨＡＩ反応は、５種ワクチン群（Ｔ０５）のそれと数字的に同様であり、そしてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ画分によるＣＩＶ抗原に対する干渉の欠如を示した。研究の５６日目のＣＲＣｏＶのＳＮ反応は、４種ワクチン群（Ｔ０４）において、５種ワクチン群（Ｔ０５）より数字的に高く、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａによるＣＲＣｏＶ画分に対する干渉の可能性を示した。然しながら、これらの発見は、これらのワクチンがアジュバント非添加であり、そして処方は最適化されていなく、そしてＣＲＣｏＶチャレンジは効力を試験するために行われなかったため、決定的ではない。
【０１６３】
一価のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチンは、安全で、そして有効であることが確認された。一価ワクチンの効力は、当該ワクチンを２１又は２８日の間隔で与えた場合に示された。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ画分は、５種アジュバント非添加混合ワクチン中で与えた場合、有効であることも示された。
【０１６４】
実施例４．多価血清学研究
生後概略８週間の、そして良好な一般的健康状態の４０匹のイヌを、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａについて微小凝集試験（ＭＡＴ）によって、そしてイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）について間接蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）によって予備スクリーニングした。血清中和（ＳＮ）を、更に抗体レベルを評価するために使用した。０日目、全てのイヌは、ＭＡＴ（≦１６）によって決定されるようにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する抗体について陰性であり、そしてＩＦＡ（＜４０）によって決定されるようにＣＲＣｏＶに対する抗体について陰性であった。全てのイヌは、更に一回目のワクチン接種（０日目）に先立つ鼻腔拭取り検体の単離試験によって決定されるように、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びＣＲＣｏＶを持っていなかった。
【０１６５】
イヌを、それぞれ８匹のイヌの五つの処置群に分割し、そして表４に示す研究設計によってワクチン接種した。ワクチンを、それぞれのイヌに、一回目のワクチン接種を右肩部に、そして二回目のワクチン接種を左肩部に投与した。
【０１６６】
【表４】
0005833145.tif 000005
【０１６７】
二回目のワクチン接種後、合併症のために、Ｔ０４及びＴ０５群を研究から外した。残りの群（Ｔ０１、Ｔ０２、及びＴ０３）のイヌを、ワクチン接種後の反応について毎日観察し、そしてそれぞれのワクチン接種後７日間体温（耳内温度）をモニターした。血液試料を、抗体反応を測定するために０、２１、４２及び５６日目にイヌから収集した。
【０１６８】
０、２１、４２及び５６日目の血清試料を、ＭＡＴアッセイによってＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する凝集抗体について試験した。同じ日の血清試料を、更にＣＲＣｏＶ抗体について血清中和によって、ＣＩＶについてＨＡＩによって、そしてＣＡＶ−２及びＣＰＩ抗体について血清中和によって力価測定した。抗体力価の幾何平均を、それぞれの処置群について得た。
【０１６９】
結果：
Ｔ０２及びＴ０３群の試験ワクチンは、二回目の投与後、全て（１００％）のワクチン接種したイヌに抗体反応を誘発し、ウイルス抗原に対する活性な免疫化を示した。抗体反応は、大多数のワクチン接種したイヌにおいて二回目のワクチン接種後増加し、二回目のワクチン接種の追加免疫効果を示した。ウイルス画分の中での抗体反応が、多数のウイルス及び細菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）抗原の存在下で達成され、免疫学的干渉の欠如を示したことを注記することは重要である。ＭＡＴの血清学は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａに対する保護に相関しないが、しかしむしろ適した研究動物を登録するための価値あるスクリーニングの道具である。結論として、ワクチン接種したイヌにおける免疫学的反応に基づけば、ウイルス抗原の効力は、５種多価ワクチンにおいて予測される。
【０１７０】
実施例５．免疫研究の期間
Ａ．一価：
この研究の目的は、病原性Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａチャレンジに対する生後８週間のイヌにおける、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抽出物−サブユニットワクチンの免疫の期間を証明することにある。
【０１７１】
全ての動物は、良好な一般的健康状態であり、そしていずれものＢｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチン接種を受けていない。動物は、一回目のワクチン接種に先立つ微小凝集試験（ＭＡＴ）によって決定されるように、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する低い（≦１６）抗体力価を有するか又は抗体力価を有さない。全ての動物は、一回目のワクチン接種に先立ち、細菌の鼻腔拭取り検体の単離試験によって決定されるように、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを持ってもいない。
【０１７２】
イヌを、二つの処置群に分割する；一つの群はプラセボのワクチンを、そして他方は組換え抗原で補充されたＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抽出物を受ける。抗原は、パータクチン、Ｂｓｐ２２、又は両方である。動物を、概略３−４週間離して二回ワクチン接種する。それらを、それぞれのワクチン接種後の注射部位の反応について観察する。
【０１７３】
ワクチン接種の概略６−１２ヶ月後、全ての処置群からのイヌを、エアゾール投与によってＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａでチャレンジする。チャレンジ投与量及びチャレンジ接種物の純度は、チャレンジの前及び後に決定する。臨床的観察は、チャレンジまで、そしてその後に行う。
【０１７４】
Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの単離のための鼻腔拭取り検体を収集する。それぞれの動物の血液を血清のために収集する。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対する凝集抗体を、ＭＡＴによって決定する。血清試料を、ＥＬＩＳＡを使用してパータクチン特異的ＩｇＧ抗体反応について力価測定する。鼻腔拭取り検体からのＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ単離を、標準的方法によって行う。
【０１７５】
咳、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ単離（チャレンジ後）、及びワクチン接種後の血清学的反応は、研究におけるワクチン効力の判定のために使用される基準である。
【０１７６】
Ｂ．多価
この研究の目的は、イヌにおける多価呼吸器混合ワクチンの免疫の期間を証明することである。ワクチンは、パータクチン、Ｂｓｐ２２、又は両方のいずれかの組換え抗原で補充された次の抗原性成分を含有する：改変生ＣＡＶ−２、改変生ＣＰＩＶ、不活化ＣＩＶ、不活化ＣＲＣｏＶ及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抽出物。
【０１７７】
全ての動物は、良好な一般的健康状態であり、そして当該ワクチンがそれに対して保護するように設計されているいずれもの病原体に対するいずれものワクチン接種を受けていない。イヌを、多数の組の処置群に分割する。それぞれの組は、プラセボワクチンを受ける対照群、及び試験ワクチンを受けるワクチン接種群の二つの処置群からなる。動物を、概略２−４週間離して二回ワクチン接種する。それらを、それぞれのワクチン接種後、注射部位反応について観察する。
【０１７８】
ワクチン接種後概略６−１２ヶ月、二つの処置群（ワクチン接種及び対照）のそれぞれの組を、ワクチンがそれに対して保護するように設計された病原体の一つでチャレンジする。臨床的観察を、チャレンジまで及びその後に行う。チャレンジ病原体の単離のための鼻腔拭取り検体を、チャレンジ後の期間中に採取する。それぞれの動物からの血液を、血清を得るために収集し、これをその後の分析的解析に使用する。呼吸器病の臨床的徴候、チャレンジ後の病原体排出、及び血清学的反応を、ワクチンの効力の判定のための基準として使用する。
【０１７９】
このように本発明の詳細な各種の態様が記載されてきたが、付属の特許請求の範囲によって定義される本発明が、その多くの明白な変更が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく可能であるため、上記の説明中に記載された特定の詳細に制約されるものではないことは理解されることである。
【０１８０】
全ての前述の参考文献は、全てが本明細書中に記載されているかのように、本明細書中に参考文献として援用される。