(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質と標識物質との結合を検出するために用いられる顕微鏡観察用プレートであって、
光透過性を有しかつ非発光性の樹脂材料により形成された平板状のものであり、
一方の表面に、被験物質を結合させたビーズ及び標識物質を含む溶液の流路、又は、被験物質を結合させたビーズを含む溶液及び標識物質を含む溶液の流路、を構成する凹部を少なくとも１つ備え、
前記凹部の底面には、前記ビーズを捕捉するための窪み部が複数形成されている顕微鏡観察用プレート。
【請求項２】
前記凹部を２つ以上備え、各凹部が互いに並行に延びることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡観察用プレート。
【請求項３】
前記ビーズが球状であり、前記窪み部の深さが前記ビーズの直径の１／２よりも小さいことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡観察用プレート。
【請求項４】
前記樹脂材料が、表面が親水加工処理されてなる樹脂材料である、請求項１乃至３のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート。
【請求項５】
親水加工処理された前記樹脂材料が、プラズマ放電処理またはコロナ放電処理により親水加工処理されたポリジメチルシロキサンである、請求項４に記載する顕微鏡観察用プレート。
【請求項６】
内部に請求項１乃至５のいずれかに記載の顕微鏡観察用プレートを載置可能な試料容器と、前記試料容器を収容可能な収容具と、前記収容具を保持可能な顕微鏡ステージに載置される支持ユニットと、前記支持ユニットの上面側開口を覆う蓋とを有し、
前記試料容器は、上面が開口した本体と前記本体の上面を塞ぐ蓋体とを備えており、前記蓋体の上面または前記本体の側面には、少なくとも２つのホース接続部が一体に形成されており、前記ホース接続部には、前記試料容器内に反応液または洗浄液を供給もしくは排出するためのホースを挿通可能なホース挿入穴が形成されている顕微鏡観察用プレート載置装置。
【請求項７】
被験物質と標識物質との結合を検出する方法であって、
顕微鏡ステージに載せ置きした、請求項１乃至５のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート上で、下記（a）、（b）及び（c）の工程を行う方法：
（a）反応液の存在下、被験物質を結合させたビーズと標識物質とを接触させる工程、
（b）顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
（c）標識物質に由来する標識を検出する工程。
【請求項８】
被験物質と標識物質との結合を検出する方法であって、
顕微鏡ステージに載せ置きした、請求項１乃至５のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート上で、下記（a’）、（b）及び（c）の工程を行う方法：
（a’）顕微鏡観察用プレートに、その凹部の目に並行して、被験物質を結合させたビーズと標識物質を含む溶液を通液する工程、
（b）顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
（c）標識物質に由来する標識を検出する工程。
【請求項９】
被験物質または標識物質の一方の物質として、核移行シグナルを有するタンパク質を用い、他方の物質として、核移行シグナルを認識し結合するタンパク質を用いることを特徴とする、請求項７または８に記載する方法。
【請求項１０】
核移行シグナルが、NAC-1（nucleus accumbens-associated protein 1）の核移行シグナル、またはnucleoplasmin の核移行シグナルであるか、または
核移行シグナルを認識し結合するタンパク質が、importin αである、請求項９に記載する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質、特にタンパク質の相互作用をリアルタイムに可視化するための技術に関する。より詳細には、タンパク質相互作用を顕微鏡下でリアルタイムに観察するために有用な顕微鏡観察用プレート、当該顕微鏡観察用プレートを備えた顕微鏡観察用プレート載置装置、及び当該顕微鏡観察用プレートまたは顕微鏡観察用プレート載置装置を用いたタンパク質相互作用の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
興味あるタンパク質の生命現象における機能を探索するうえで、他のタンパク質との「結合」と「解離」から成立する相互作用を無視した研究はもはや不可能である。このため、従来からタンパク質間の相互作用を解析するさまざまな方法や機器が開発されている。例えば、タンパク質間の相互作用を検討する方法として、古典的にはpull-downアッセイが知られている。当該方法は、担体に固定化したタグ付きタンパク質（ベイト）に測定対象のタンパク質を含む溶液を反応させ、次いでベイトに結合したタンパク質を溶出分離し、その結果から両者タンパク質間の相互作用を評価する方法である。しかし、かかる方法によれば、タンパク質間相互作用を評価するのに半日以上要し、また当該方法は、タンパク質間の反応がリアルタイムでは検出できないという問題がある。
【０００３】
しかし、相互作用をリアルタイムに検出できる機器は、表面プラズモン共鳴現象（SPR）を利用したBiacoreのタンパク質相互作用解析システムなど、1000万円を超える高額なものばかりであり、安価にタンパク質間相互作用をリアルタイムに可視化できる装置は皆無である（例えば、非特許文献１及び２など参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】表面プラズモン共鳴(SPR)現象の利用（GE Healthcare）＜URL:http://www.biacore.com/jp/lifesciences/technology/introduction/data_interaction/index.html＞
【非特許文献２】タグ付きタンパク質を用いたタンパク質相互作用解析（GE imagination at work）＜URL: http://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/protein_sciences/tag_interaction.asp＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安価にしかも簡便に、物質間の相互作用をリアルタイムに可視化検出するための方法、当該方法に使用するためのツール、具体的には顕微鏡観察用プレート及びそれを備えた顕微鏡観察用プレート載置装置といった顕微鏡のアプリケーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討していたところ、例えばタンパク質等の、物質と物質との相互作用を検出するにあたり、一方の物質をビーズに結合させ、他方の物質を蛍光色素などで標識化し、当該ビーズに結合させた物質と標識物質との結合（相互作用）を、ビーズの標識の有無を指標にすることで可視的に検出することができること；さらに当該ビーズに結合させた物質と標識物質との結合（相互作用）を、流体の流路として、底部に上記ビーズを収容（捕捉）可能な窪み部が複数形成されてなる凹部を備えた顕微鏡観察用プレート（マイクロ流路付きプレート）上で、これを顕微鏡ステージに載せた状態で、反応液と洗浄液を通液しながら行うことにより、顕微鏡観察によりリアルタイムに検出することができることを見出した。
【０００７】
特に、顕微鏡ステージに載せ置きした上記顕微鏡観察用プレートの流路（凹部）において、ビーズに結合させた物質と標識物質とを一旦結合させた後に任意の洗浄液で通液することにより、流路（凹部）の底面の窪み部に捕捉収容されたビーズに一旦結合した標識物質が、ビーズに結合した物質とのアフィニティーに応じて解離するため、両物質同士の相互作用（結合と解離）や両者のアフィニティーをリアルタイムに観察することができる。
【０００８】
本発明はかかる知見に基づいて開発したものであり、下記の実施形態を備えるものである。
【０００９】
（I）顕微鏡観察用プレート
（I-1）被験物質と標識物質との結合を検出するために用いられる顕微鏡観察用プレートであって、光透過性を有しかつ非発光性の樹脂材料により形成された平板状のものであり、一方の表面に、被験物質を結合させたビーズ及び標識物質を含む溶液の流路、又は、被験物質を結合させたビーズを含む溶液及び標識物質を含む溶液の流路、を構成する凹部を少なくとも１つ備え、前記凹部の底面には、前記ビーズを捕捉するための窪み部が複数形成されている顕微鏡観察用プレート。
（I-2）前記凹部を２つ以上備え、各凹部が互いに並行に延びることを特徴とする（I-1）に記載の顕微鏡観察用プレート。
（I-3）前記ビーズが球状であり、前記窪み部の深さが前記ビーズの直径の１／２よりも小さいことを特徴とする（I-1）または（I-2）に記載の顕微鏡観察用プレート。
（I-4）上記樹脂材料が親水加工処理されてなるものである、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート。
（I-5）親水加工処理が、プラズマ放電処理またはコロナ放電処理である（I-4）に記載する顕微鏡観察用プレート。
（I-6）上記樹脂材料がポリジメチルシロキサンである、（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート。
【００１０】
（II）顕微鏡観察用プレート載置装置
（II-1）内部に（I-1）乃至（I-6）のいずれかに記載の顕微鏡観察用プレートを載置可能な試料容器と、前記試料容器を収容可能な収容具と、前記収容具を保持可能であり顕微鏡ステージに載置される支持ユニットと、前記支持ユニットの上面側開口を覆う蓋とを有し、
前記試料容器は、上面が開口した本体と前記本体の上面を塞ぐ蓋体とを備えており、前記蓋体の上面または前記本体の側面には、少なくとも２つのホース接続部が一体に形成されており、前記ホース接続部には、前記試料容器内に反応液または洗浄液を供給もしくは排出するためのホースを挿通可能なホース挿入穴が形成されている顕微鏡観察用プレート載置装置。
【００１１】
（III）物質と物質との相互作用を検出する方法
（III-1）被験物質と標識物質との結合を検出する方法であって、
顕微鏡ステージに載せ置きした、（I-1）乃至（I-6）のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート上で、下記（a）、（b）及び（c）の工程を行う方法：
（a）反応液の存在下、被験物質を結合させたビーズと標識物質とを接触させる工程、
（b）顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
（c）標識物質に由来する標識を検出する工程。
（III-2）被験物質と標識物質との結合を検出する方法であって、
顕微鏡ステージに載せ置きした、（I-1）乃至（I-6）のいずれかに記載する顕微鏡観察用プレート上で、下記（a’）、（b）及び（c）の工程を行う方法：
（a’）顕微鏡観察用プレートに、その凹部の目に並行して、被験物質を結合させたビーズと標識物質を含む溶液を通液する工程、
（b）顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
（c）標識物質に由来する標識を検出する工程。
（III-3）被験物質または標識物質が、ペプチド、タンパク質、核酸、糖類、脂質、酵素、酵素基質、受容体、リガンド、抗体、抗原、レクチン、ハプテン、その他の低分子または高分子化合物からなる群から選択される少なくとも一種である、（III-1）または（III-2）に記載する方法。
（III-4）被験物質または標識物質が、ペプチドまたはタンパク質である、（III-1）または（III-2）に記載する方法。
（III-5）被験物質がタグ付き物質である、（III-1）乃至（III-4）のいずれかに記載する方法。
（III-6）タグ付き物質のタグが、GSTタグ、MBPタグ、Hisタグ、Strep(II)タグ、FLAGタグ、HAタグ、mycタグ、及びBCCPタグからなる群から選択される少なくとも１つである、（III-5）に記載する方法。
（III-7）被験物質または標識物質の一方の物質として、核移行シグナルを有するタンパク質を用い、他方の物質として、核移行シグナルを認識し結合するタンパク質を用いることを特徴とする、（III-1）乃至（III-6）のいずれかに記載する方法。
（III-8）核移行シグナルが、NAC-1（nucleus accumbens-associated protein 1）の核移行シグナル、またはnucleoplasmin の核移行シグナルである（III-7）に記載する方法。
（III-9）核移行シグナルを認識し結合するタンパク質が、importin αである、（III-7）または（III-8）に記載する方法。
（III-10）被験物質と標識物質との相互作用を評価する方法である、（III-1）乃至（III-9）のいずれかに記載する方法。
（III-11）被験物質と標識物質とのアフィニティーを評価する方法である、（III-1）乃至（III-9）のいずれかに記載する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、物質と物質との相互作用、特にタンパク質とタンパク質との相互作用を、底面に窪み部が形成されてなる凹部を、流体の流路として備えた特定形状の顕微鏡観察用プレート（マイクロ流路付きプレート）上で、当該プレートを顕微鏡ステージに載せた状態で行うことにより、顕微鏡観察によりリアルタイムに可視的に検出することができる。特に、顕微鏡ステージに載せ置きした上記顕微鏡観察用プレートの流路（凹部）において、ビーズ結合物質と標識物質とを一旦結合させた後に任意の洗浄液で通液することにより、流路（凹部）の底面の窪み部に捕捉収容されたビーズに一旦結合した標識物質が、ビーズに結合した物質とのアフィニティーに応じて解離するため、両物質同士の相互作用（結合と解離）や両者のアフィニティーをリアルタイムに観察することができる。
【００１３】
本発明の顕微鏡観察用プレート及びそれを備えた顕微鏡観察用プレート載置装置は、物質と物質との相互作用、特にタンパク質とタンパク質との相互作用を、顕微鏡を用いて、可視的に且つリアルタイムに検出するために好適に用いられる顕微鏡のアプリケーターとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用プレートの外観構成を示す斜視図である。
【図２】図１のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
【図３】図１のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
【図４】他の実施形態に係る顕微鏡観察用プレートの外観構成を示す正面図である。
【図５】窪み部の構成を示す断面図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用プレート載置装置の分解斜視図である。
【図７】顕微鏡観察用プレート載置装置に用いられる試料容器の斜視図である。
【図８】図７に示す試料容器を分離して示す斜視図である。
【図９】図７のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
【図１０】pull-down法により、グルタチオンビーズに結合させたGST融合importin α3(野生型)タンパク質（図中、「wild-type」と標記）及びGST融合importin α3（W179A、N183A）タンパク質（図中、「WN→AA」と標記）をそれぞれ各テストサンプル〔mCherry融合NAC-1(180-207）[図中、「mC-NAC-1(180-207)」と標記]、mCherry融合nucleoplasmin-NLS [図中、「mC-nucleoplasmin(NLS)」と標記]、mCherry [図中、「mC」と標記]）と混合し、次いで溶出させ、SDS-PAGEに供した結果を示す（実験例１）。図中、「input」のレーンは、各テストサンプル（mCherry融合NAC-1(180-207）、mCherry融合nucleoplasmin-NLS、mCherry）そのものをSDS-PAGEに供したstandard結果を示す。また図中「mC fusion proteins」は、mCherry融合NAC-1(180-207)及びmCherry融合nucleoplasmin-NLSを意味する。
【図１１】カバーガラス上で「on beads 顕微鏡アッセイ（その１）」（実験例２）を行う概略を示す図である。
【図１２】カバーガラス上で「on beads 顕微鏡アッセイ（その１）」（実験例２）を行った観察データを示す。GST融合importin α3(野生型)タンパク質（図中、「wild-type」と標記）及びGST融合importin α3（W179A、N183A）タンパク質（図中、「WN→AA」と標記）の各結果において、黒く見える左側の図は蛍光観察結果を、灰色に見える右側の図は透過光観察結果を示す。上段、中段及び下段に、テストサンプルとして、mCherry、mCherry融合nucleoplasmin-NLS [図中、「mCherry-nucleoplasmin(NLS)」と標記]、及びmCherry融合NAC-1(180-207)[図中、「mCherry-NAC-1(180-207)」と標記]を用いた場合の、ビーズに結合したGST融合importin α3タンパク質との相互作用をそれぞれ示す。
【図１３】カバーガラス上での「on beads 顕微鏡アッセイ（その１）」（実験例２）の観察データを統計処理した結果を示す。
【図１４】カバーガラス上で希釈しながら行った「on beads 顕微鏡アッセイ（その２）」（実験例３）の観察データを示す。上の２段は、反応液中でGST融合importin α3（野生型）タンパク質を結合させたグルタチオンビーズと mCherry融合nucleoplasmin-NLSとを混合し、順次、当該反応液を回収しながら洗浄液（1% Triton-X 100を含むPBS）を添加して希釈したものである。下の２段は、GST融合importin α3(W179A、N183A) タンパク質を結合させたグルタチオンビーズと mCherry融合nucleoplasmin-NLS とを混合し、順次、当該反応液を回収しながら洗浄液（1% Triton-X 100を含むPBS）を添加して希釈したものである。上と下の各２段において、黒く見える上一列の図は蛍光観察結果を、灰色に見える下一列の図は透過光観察結果を示す。
【図１５】カバーガラス上で希釈しながら行った「on beads 顕微鏡アッセイ（その２）」（実験例３）の観察データを統計処理した結果を示す。
【図１６】本発明の顕微鏡観察用プレート（マイクロ流路付きプレート）上での「on beads 顕微鏡アッセイ（その３）」（実験例４）の概略を示す図である。図に示す平面部は、顕微鏡観察用プレートの流路（凹部）の、窪み部３が形成された底面２２を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（I）顕微鏡観察用プレート
図１は、本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用プレート１の外観構成を示している。また、図２は、図１の顕微鏡観察用プレート１のＡ−Ａ線に沿う断面図を、図３は、図１の顕微鏡観察用プレート１（以下、単に「プレート１」とも称する）のＢ−Ｂ線に沿う断面図を、それぞれ示している。
【００１６】
本実施形態のプレート１は、光透過性を有するとともに非発光性の樹脂材料によって平板状に形成されている。かかる樹脂材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ナイロン、ポリメチルペンテン、ポリエーテルサイフォン、ポリサルフォン、ポリイソブレン、ポリジメチルシロキサン、またはこれらの共重合体等が挙げられる。光透過性及び非発光性であり、しかも加工がしやすい樹脂材料であるという点で、好ましくはポリジメチルシロキサンである。
【００１７】
これらの樹脂材料からなる本実施形態のプレート１は、その表面の少なくとも検体と接触する部分、具体的には、プレート１における流体の流路を構成する凹部２が窪み部３を含めて親水加工処理されていることが好ましい。親水加工処理方法は、特に制限されないが、例えばプラズマ放電処理またはコロナ放電処理を例示することができる。
【００１８】
ちなみに、プラズマ放電処理は、気体分子に電場をかけることで、気体中に存在する自由電子が加速されて速度エネルギーをもち、その電子と衝突した気体分子が解離して種々の化学種を含むいわゆるプラズマを形成し、このプラズマを材料表面に照射することにより表面改質する方法である。また、コロナ放電処理は、極性基の少ない材料表面に、高周波及び高電圧を用いて大気中でコロナ放電を発生させ、それによって生成される反応基と共に、電子を直接材料表面に照射することにより表面改質する方法である。かかる処理により、プレート１の表面の少なくとも検体と接触する部分が親水加工される。ここで親水加工されたプレート１の表面の濡れ張力は、制限されないものの、３．５×１０−２〜９．５×１０−２Ｎ／ｍになるように調製することもできる。当該濡れ張力は、水の接触角を測定することにより算出することもできるし、また表面張力測定試薬を用いて測定し算出することもできる。
【００１９】
このプレート１の一方の表面１０（プレート１の他方の表面と区別するために、「上面１０」ともいう）には、プレート１の長さ方向に延びる凹部２が少なくとも１つ（図１に示す実施形態では５つ）設けられている。この凹部２は、反応液や洗浄液等の流体を、流通可能な状態で溜め置き、また流通させるための流路として機能するものであり、それぞれが互いに並行に、プレート１の一端部から他端部まで障壁なく連通するように設けられている。
【００２０】
プレート１に形成される当該凹部２の数は、少なくとも１以上であればよく、その上限は特に制限されず、プレート１の幅方向の長さと凹部２の横幅の長さから適宜設定することができる。例えば、プレート１の大きさとして、幅方向と長さ方向の長さ（幅方向×長さ方向）が、通常１０〜２５ｍｍ×１０〜６０ｍｍ、好ましくは１０〜２５ｍｍ×１５〜４０ｍｍ、より好ましくは１５〜２５ｍｍ×２０〜３０ｍｍを例示することができる。また、プレート１の片方表面に形成される凹部２の横幅の長さとしては、通常０．８〜２．２ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍ、より好ましくは１．２〜１．８ｍｍを例示することができる。制限されないが、凹部２の数の上限として１０以下、好ましくは８以下、より好ましくは７以下、特に好ましくは６以下を例示することができる。
【００２１】
本実施形態では、プレート１の表面１０（上面１０）上には、６つの立壁２０が所定の間隔をあけて互いに平行に立設されており、隣り合う２つの立壁２０とその間に挟まれたプレート１の上面１０とによって凹部２が形成されている。ここで隣り合う２つの立壁２０により形成された凹部２の内側の底面は、プレート１の上面１０であると同時に凹部２の底面２２でもある（図２及び３参照）。なお、必ずしもこれに限られるものではなく、図４に示すように、平板状のプレート１の上面１０に、１以上の溝２１を互いに平行に凹設することによっても（図４では３つの溝２１を形成した実施形態を示す）、反応液や洗浄液等の流体の流路となる凹部２を形成することが可能である。この場合、溝２１を凹設することによって形成された凹部２の内側の底面は、凹部２の底面２２でもあると同時にプレート１の上面１０でもある。
【００２２】
斯くして調製される各凹部２の底面２２（図１〜図４）には、図５に示すように、物質を結合したビーズＭを収容することが可能な窪み部３が複数形成されている（図２、図３および図４参照）。
【００２３】
この窪み部３は、プレート１の凹部２に、ビーズＭを含む反応液等の流体を流通させたときにビーズＭを窪み部３内に捕捉収容し、またそれに引き続いて洗浄液等の流体を流通させたときに、当該流体の流れによってビーズＭが窪み部３から出ないよう窪み部３内に拘束するためのものである。そのため、窪み部３は、ビーズＭが窪み部３内に捕捉収容されるように、また一旦捕捉収容されたビーズＭが、窪み部３内から飛び出さずに、窪み部３内に嵌まって保持されるよう、ビーズＭの大きさに沿った大きさおよび形状に形成される。
【００２４】
ここでビーズＭの形状は、略球状、好ましくは球状である。またその大きさは、制限されないが、通常、直径20〜150μｍ程度、好ましくは30〜100μｍ程度、より好ましくは50〜100μｍ程度を例示することができる。
【００２５】
本実施形態では、窪み部３は、断面視形状が円形の円錐台状に形成されている（図５）。円錐台状に形成することで、流体とともに凹部２内を流れるビーズＭを窪み部３に捕捉収容しやすくすることができる。なお、窪み部３の形状は、必ずしもこれに限られるものではなく、断面視形状が正方形の角錐台状に形成されていてもよい。また、一旦捕捉したビーズＭを窪み部３内にしっかりと保持するために、窪み部３の側周面３０を、図５に示されているように窪み部３の上端から下端に向けて内方に傾斜させるよりも、まっすぐ下方に垂下させて、窪み部３を円柱状もしくは角柱状に構成することもできる。
【００２６】
一方、窪み部３の深さＤは、ビーズＭを窪み部３内にしっかりと保持するためにはより深く設計されるのが望ましいが、後述するように反応液によってビーズＭの外周中央部の円状の蛍光シグナルＳを標識として付けるためには、少なくともビーズＭの上半分は窪み部３の上方に露出している必要がある。よって、窪み部３の深さＤとしては、ビーズＭの直径ｒの１／２よりも小さく設定されているのが望ましい。好ましくは１／２未満１／４以上、より好ましくは１／２未満１／３以上である。
【００２７】
各窪み部３は、本実施形態では、図２および図３に示すように、凹部２の長さ方向に５個、所定の間隔をあけて並列配置されているとともに（図３参照）、この窪み部３の列が凹部２の幅方向に３列（図２参照）、所定の間隔をあけて設けられることで、計１５個の窪み部３がマトリクス状に配置されている。この１５個の窪み部３は、各凹部２の長さ方向の中央部に密集するようにかためて配置されている。当該長さ方向の中央部は、プレート１を顕微鏡ステージに載せ置きした場合に、観察できる実視野領域に相当する部分である。つまり、窪み部３を凹部２の長さ方向中央部に密集するように配置することで、窪み部３に捕捉収容されたビーズＭにおいて、当該ビーズＭに結合させたタンパク質と他のタンパク質（標識タンパク質）との間の相互作用を効率よく観察することができる。
【００２８】
ただし、プレート１の凹部２の底面２２における窪み部３の配置の仕方は、必ずしもこれに限られるものではなく、１列に設ける窪み部３の数を５個から増減させることも可能であるし、列の数を３列から増減させることも可能である。また、窪み部３が各凹部２の長さ方向のほぼ全域にわたって散在するように各窪み部３を配置させることも可能である。このように、各窪み部３は、凹部２の底面２２の任意の位置に配置させることができる。
【００２９】
凹部２の底面２２の窪み部３が配置されていない領域には、適宜、傾斜溝４が形成されている。この傾斜溝４は、反応液や洗浄液等の流体の流れる方向Ｆ（図３で示す例では、右から左に向かう方向）に向かって低くなるように傾斜する傾斜面４０と、傾斜面４０の傾斜下端に連続して形成された垂直面４１とを備えている。反応液や洗浄液等の流体の流れによって、ビーズＭが仮に窪み部３内から飛び出して、流れに乗って凹部２内を移動すると、このビーズＭが、別の窪み部３内に保持されているビーズＭに勢いよく衝突することで、正常に窪み部３内に保持されているビーズＭが押し出されてしまうおそれがある。この傾斜溝４は、上記した問題を解消するためのもので、窪み部３内から飛び出したビーズＭを傾斜面４０を介して下端の底部４２に向けて落とし込むことで、ビーズＭを捕らえて、ビーズＭが凹部２内を移動することを規制している。
【００３０】
以上で説明する本発明の顕微鏡観察用プレートは、下記（II）顕微鏡観察用プレート載置装置に組み込んだ形で、またはそのままの形態で、後述する（III）に記載の方法において好適に用いることができる。
【００３１】
（II）顕微鏡観察用プレート載置装置
顕微鏡観察用プレート載置装置５は、図６に示すように、支持ユニット６、収容具７および蓋８によって構成されている。支持ユニット６１は、略長方形型の枠状に形成された本体部６０を有している。この本体部６０は、外壁６１、内壁６２および底壁６３によって構成されており、上面には上面側開口６４が、下面には下面側開口６５が、それぞれ形成されている。内壁６２の内側面の下端部には、内側へ突き出す支持部６６が形成されている。本体部６０の底壁６２の裏面には、ヒータ７４が設けられている。このヒータ７４は、金属板にニクロム線が埋設状に備えられた構成のものであり、底壁６２の裏面に密着した状態に貼り付けられ、底壁６２の下面側開口６５はこのヒータ７４によって覆われている。ヒータ７４には長方形状の孔７５が形成されている。なお、図６中、６７は電気コードであり、電気コード６７はヒータ７４のニクロム線に電気的に接続されている。
【００３２】
収容具７は、略長方形型の板状のベース７０を有しており、このベース７０は外縁が本体部６０の支持部６６に載る寸法に形成されている。ベース７０の中央部には孔７１が形成され、孔７１の周辺には凹部７２が形成されている。この凹部７２内に後述するディッシュなどの試料容器９が着脱自在に装着されるようになっている。また、ベース７０には、一対の押えバネ７３が回動自在に設けられており、試料容器９が凹部７２内に設けられた状態では、押えバネ７３によって試料容器９が固定される。
【００３３】
蓋８は、略長方形型の枠体８０と、枠体８０により保持されている透明なガラス８１により構成されている。
【００３４】
図７中、試料容器９は、透明なプラスチックまたはガラスにより形成されており、やや深めの円形皿状をした本体９０と、これに被せる蓋体９１とで構成されている。本体９０の底面９２上に、上記した顕微鏡観察用プレート１が載置される。蓋体９１には、その上面から突き出たホース接続部９３が一体に２つ形成されている。各ホース接続部９３は、蒲鉾形をしていて、蓋体９１の中心を挟んで互いに反対側に位置しており、いずれもホース挿入穴９４が形成されている。このホース挿入穴９４は、その一端がホース接続部９３の一側面に開口するとともに他端が蓋体９１の底面に開口したＬ字形に屈曲しており、各ホース挿入穴９４の一端側の開口は互いに反対側に向かって開口している。一方のホース挿入穴９４には反応液や洗浄液を試料容器９内に供給するための供給ホース９５が、他方のホース挿入穴９４には試料容器９内の反応液や洗浄液を試料容器９外に排出するための排出ホース９６が、それぞれ挿入されており、各ホース９５，９６の先端は蓋体９１の底面より下方へ引き出される。各ホース９５，９６の他端は、蓋８の内周面まで延び、ホースホルダー９７を介して顕微鏡観察用プレート載置装置５の外部も延びている。なお、本実施形態では、各ホース接続部９３が試料容器９の蓋体９１の上面に形成されているが、本体９０の側面に一体形成されていてもよい。また、反応液と洗浄液とを別々のルートで試料容器９内に供給／排出するために、反応液の供給／排出用のホース接続部９３、および、洗浄液の供給／排出用のホース接続部９３を少なくとも２つずつ設けるようにしてもよい。
【００３５】
（III）物質と物質との相互作用を検出する方法
本発明は、上記（I）顕微鏡観察用プレートまたは当該プレートを備えた（II）顕微鏡観察用プレート載置装置を用いて、顕微鏡を用いて、物質と物質との結合をリアルタイムに検出する方法である。
【００３６】
当該方法は、具体的には、上記顕微鏡観察用プレートまたは当該プレートを備えた顕微鏡観察用プレート載置装置を顕微鏡ステージに載せ置きし、その状態で、顕微鏡観察用プレートのうえで、下記（a）〜（c）の工程を行うことによって実施することができる。なお、（c）の工程は、（a）及び（b）の工程と同時並行して行われるか、少なくとも（b）の工程と同時並行して行われる。
（a）反応液の存在下、被験物質を結合させたビーズと標識物質とを接触させる工程、
（b）顕微鏡観察用プレートの凹部の目に並行して洗浄液を通液する工程、
（c）標識物質に由来する標識を検出する工程。
【００３７】
また、上記（a）工程に代えて、下記（a’）工程を行ってもよい。
（a’）顕微鏡観察用プレートに、その凹部の目に並行して、被験物質を結合させたビーズと標識物質を含む溶液を通液する工程。
【００３８】
以下、各工程について説明する。
（a）工程
当該（a）工程は、反応液中で物質と物質とを接触させる工程である。
【００３９】
ここで物質は、お互いの相互作用を評価する対象の物質である。制限されないが、一方の物質と他方の物質とが、静電的相互作用、水素結合作用、イオン結合作用、疎水性相互作用または親水性相互作用等の１以上の作用によって、お互いに特異的に相互作用することが予想される物質を例示することができる。特異的な結合の例としては、抗原と抗体との結合、受容体とそのリガンド（アンタゴニストまたはアゴニスト）との結合、酵素と基質との結合、アプタマー（ペプチドまたは核酸）とそれに結合する物質との結合、レクチンと糖鎖を有する物質（糖類、糖タンパク質）との結合、複合体を構成するサブユニット同士の結合、シグナル伝達過程におけるタンパク質を初めとする物質同士の結合を例示することができる。
【００４０】
しかし、このような結合様式にかかわらず、本発明が対象とする物質には、ペプチド（例えば、アプタマーが含まれる）、タンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体、抗原、レクチン、糖タンパク質が含まれる）、核酸（例えば、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、アプタマーが含まれる）、糖類（例えば、レクチンに結合する糖類が含まれる）、脂質、酵素に対する基質（例えば、低分子及び高分子化合物が含まれる）、受容体に対するリガンド（例えば、低分子及び高分子化合物が含まれる）、抗体に対する抗原やハプテン、並びにタンパク質等に結合することにより、その機能阻害することのできる低分子あるいは高分子化合物等が、制限なく含まれる。
【００４１】
一方の物質として、好ましくはペプチドまたはタンパク質を挙げることができ、他方の物質として、上記ペプチドまたはタンパク質に結合しえる各種の物質を挙げることができる。当該各種の物質には、前述するように、例えばペプチドアプタマーに結合する物質、酵素に結合する基質、レクチンに結合する糖類または糖タンパク質、抗体に結合する抗原やハプテン、抗原に結合する抗体、受容体に結合するリガンド、シグナル伝達過程等においてタンパク質等に結合する相手方の物質等を挙げることができる。また、一方の物質が、核移行シグナルを有するペプチドまたはタンパク質である場合は、他方の物質として核移行シグナルを認識し結合するペプチドまたはタンパク質を例示することができる。
【００４２】
ここで、核移行シグナル（nuclear localization signal：NLS）としては、特に制限されないが、後述する実験例で用いるNAC-1（nucleus accumbens-associated protein 1）の核移行シグナル(NLS)、またはnucleoplasmin の核移行シグナル(NLS)を例示することができる。これらの核移行シグナル(NLS)を認識し結合するタンパク質としては、細胞の核膜に存在し、NLS依存的にタンパク質を核内に運び込むことが知られているimportin αを例示することができる。
【００４３】
importin αの由来は特に制限されず、植物やヒトを含む動物に由来するimportin αを制限なく挙げることができるが、好ましくはヒト由来のimportin α3である。当該ヒトimportin α3の遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。当該塩基配列において、塩基番号10-1575の領域が、ヒトimportin α3（野生型）のコーディング領域（CDS領域）である。また、そのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００４４】
なお、後述する実験例に示すように、当該ヒトimportin α3（野生型）のN末端から179番目のトリプトファンと183番目のアスパラギンをいずれもアラニンに置換することで、NLSに対する結合能が消失する（Conti, e. et al., Cell 94; 193-204, 1998）。
【００４５】
一方、NAC-1（nucleus accumbens-associated protein 1）は、核内転写制御タンパク質である（Nakayama, K., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 103: 18739-18744, 2006）。NAC-1は核移行シグナルを有するものであればよく、ヒト由来に限られず、ヒト以外の動物由来のものであってもよい。当該ヒトNAC-1のアミノ酸配列を配列番号５に示す。当該アミノ酸配列において、アミノ酸番号183〜205の領域が、核移行シグナル（NLS）に相当する領域である。
【００４６】
またnucleoplasminについても、その由来も特に制限されず、ヒトを含む動物に由来するnucleoplasmin を制限なく挙げることができる。一例として、後述の実験例で使用するアフリカツメガエルのnucleoplasminを挙げることができる。当該nucleoplasminのアミノ酸配列を配列番号６に示す。当該アミノ酸配列において、アミノ酸番号155〜172の領域が、核移行シグナル（NLS）に相当する領域である。
【００４７】
本発明が対象とする物質は、ペプチドやタンパク質を初め、天然由来のものであっても、また化学合成、発酵、及び遺伝子組み換えなどの技術によって人工的に合成されたものであってもよい。またこれらの物質は、ペプチドやタンパク質を初め、糖や核酸やその他の物質（ペプチドやタンパク質を含む）で修飾されるか、若しくはこれらの物質と融合してなるものであってもよい。さらに、本発明においてペプチドとは、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む意味で用いられる。また、
本発明において、一方の物質は、発色性または化学発光性の可視化プローブにより予め標識し、標識物質として調製しておくことが好ましい。可視化プローブとしては、好ましくは蛍光プローブを挙げることができる。なお、標識化は、定法に従って行うことができる。
【００４８】
蛍光プローブとは、特別な波長の光への曝露により励起されるときに、異なる波長で光を放出する化合物（フルオロフォア）を意味する。当該フルオロフォアは、蛍光タンパク質と称されるタンパク質と、非タンパク質とに分類される。
【００４９】
蛍光タンパク質としては、AcGFP1やZsGreen1等の緑色蛍光タンパク質：AmCyan1などの青色蛍光タンパク質：ZsYellow1やmBanana等の黄色蛍光タンパク質：DsRed-Monomer、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Express2、AsRed2、tdTomato、mCherry、mStrawberry、mOrange等の赤色蛍光タンパク質；HcRed1などの真紅色蛍光タンパク質等を、制限なく、例示することができる。標識する対象の物質が、ペプチドまたはタンパク質である場合、標識物質は、当該対象物質（ペプチドまたはタンパク質）に上記の蛍光タンパク質を融合させることによって調製することができる。
【００５０】
非タンパク質に分類されるフルオロフォアは、その発光プロフィールまたは「色」によって特徴付けられる。緑色のフルオロフォア（例えばFITC、及びオレゴングリーン）は、概して515〜540nmの範囲の波長でのその発光を特徴とする。赤色のフルオロフォア（例えば、テキサスレッド、Cy5、及びテトラメチルローダミン）は、概して590〜690nmの範囲の波長でのその発光を特徴とする場合がある。フルオロフォアの例には、限定されないが、4-アセトアミド-4'-イソチオシアナートスチルベン-2,2'-ジスルホン酸、アクリジン、アクリジン及びアクリジンイソチオシアネートの誘導体、5-（2'-アミノエチル）アミノナフタレン-1-スルホン酸（EDANS）、4-アミノ-N-［3-ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド-3,5-ジスルホネート（ルシファーイエローVS）、N-（4-アニリノ-1-ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン、クマリン誘導体、7-アミノ-4-メチルクマリン（AMC、クマリン120）、7-アミノ-トリフルオロメチルクマリン（クマリン151）、シアノシン；4',6-ジアミニジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、5',5”-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、7-ジエチルアミノ-3-（4'-イソチオシアナートフェニル）-4-メチルクマリン、4,4'-ジイソチオシアナートジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸、4,4'-ジイソチオシアナートスチルベン-2,2'-ジスルホン酸、5-［ジメチルアミノ］ナフタレン-1-スルホニルクロリド（DNS、ダンシルクロリド）、エオジン、エオジンイソチオシアネートのようなエオジンの誘導体、エリスロシン、エリスロシンB及びイソチオシアン酸エリスロシンのようなエリスロシンの誘導体；エチジウム；フルオレセインと5-カルボキシフルオレセイン（FAM）、5-（4,6-ジクロロトリアジン-2-イル）アミノフルオレセイン（DTAF）、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、QFITC（XRITC）のような誘導体；フルオレスカミン誘導体（アミンとの反応時に蛍光）；IR144；IR1446；マラカイトグリーンイソチオシアネート；4-メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド、B-フィコエリスリン；o-フタルジアルデヒド誘導体（アミンとの反応時に蛍光）；ピレンとピレン、ピレンブチレート、及びスクシンイミジル1-ピレンブチレートのような誘導体；リアクティブレッド4（Cibacron.RTM.ブリリアントレッド3B-A）、ローダミンと6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、6-カルボキシローダミン（R6G）、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、ローダミン（Rhod）、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、及びスルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）；テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）のような誘導体；リボフラビン；ロゾール酸とランタニドキレート誘導体、量子ドット、シアニン、ピレリウム（pyrelium）色素、及びスクアライン（squaraine）が含まれる。
【００５１】
また他方の物質（本発明では、上記「標識物質」に対して「被験物質」と称する）は、予めビーズに結合させておくことが好ましい。ここでビーズは、本発明の方法において、前述する本発明の顕微鏡観察用プレートにおいて、その凹部２の底面２２に形成された窪み部３に捕捉収容させて用いられるものであり、好ましくは球状である。その大きさは、制限されないが、通常、直径20〜150μｍ程度、好ましくは30〜100μｍ程度、より好ましくは50〜100μｍ程度を例示することができる。
【００５２】
その素材は、特に制限されないが、例えば、シリカ、アガロースゲル、セルロース、ポリエチレンイミン、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、スチレン−マレイン酸共重合体、磁性体（マグネタイト、及びマグネタイト−デキストラン架橋複合体やマグネタイト−シリカ架橋複合体等のマグネタイトの複合体）、生体高分子（キトサン等）、生分解性ポリマー（ポリ乳酸等）を例示することができる。
【００５３】
これらのビーズは、表面に被験物質を結合できるように、表面に活性エステル基、またはカルボキシル基若しくはアミノ基を提示した形態で、または、被験物質に結合させたタグを認識し結合するリガンドを表面に提示した形態で、アフィニティービーズまたは機能性ナノ・マイクロビーズとして市販されており、商業的に入手することができる。
【００５４】
被験物質は、好ましくは、タグで標識されているか、タグ（タンパク質タグ）と融合された状態で用いられる。ここでタグとしては、ニッケルなどの金属イオンと特異的に結合するポリヒスチジン（Hisタグ）；グルタチオンと特異的に結合するGST（glutathione S-transferase）（GSTタグ）；マルトースやデキストリンと特異的に結合するマルトース結合タンパク質（MBPタグ）；StrepTactinと特異的に結合するStrep(II)タグ；Biotin Carboxyl Carrier Protein(BCCP)タグ（ビオチン化ペプチド）；その他、インフルエンザ凝集素HA（HAタグ）、ヒトc-myc（mycタグ）、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7遺伝子10タンパク質（T7タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSVタグ）、Eタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のエピトープタグを例示することができる。被験物質として、このようなタグで標識された被験物質を用いる場合、前述するビーズは、上記タグに結合するリガンドで標識されたものが使用される。
【００５５】
本発明方法の(a)工程は、上記被験物質を結合させたビーズと前述する標識物質とを、顕微鏡観察用プレート１上の好ましくは流路内（凹部２内）で、反応液中で接触させる工程である。接触させる方法は、特に制限されないが、例えば、後述する実験例４で説明するように、先に被験物質（被験タンパク質）を結合させたビーズを含む反応液を顕微鏡観察用プレート１上の流路内（凹部２内）に通液し、被験物質（被験タンパク質）結合ビーズを、凹部２の底面２２に形成された窪み部３に捕捉収容させた状態で、次いで標識物質（標識タンパク質）を通液する方法によって行うことができる、ここで、反応液は、対象とする物質が変性しない塩濃度範囲とｐＨ範囲と温度範囲を有する水溶液であればよく、その範囲で目的に応じて、適宜に設定することができる。例えば、体内でのタンパク質とタンパク質の相互作用を検出し評価する場合は、生理的条件（塩濃度[NaClまたはKCl] 150mM程度、pH 7.2-7.6程度、20-40℃程度）と同一またはそれに近似する条件にある水溶液として調製することが好ましい。
【００５６】
接触させる時間も特に制限なく、１秒〜３０分の範囲で適宜設定することができる。また、かかる接触は、被験物質を結合させたビーズを捕捉収容させた顕微鏡観察用プレート１の流路内（凹部２内）に、前述の標識物質を含む反応液を溜め置き（静置）して行ってもよいし、当該標識物質を含む反応液を、例えば本発明の顕微鏡観察用プレート載置装置を用いて、顕微鏡観察用プレート１の流路内（凹部２内）に連続して通液しながら行ってもよい。
【００５７】
（a’）工程
当該（a’）工程は、物質と物質との接触反応を顕微鏡観察用プレート上で行う上記（a）工程とは異なり、予め被験物質を結合させたビーズ（被験物質結合ビーズ）と標識物質を試験管やペトリ皿などに入れた反応液中で混合して、当該被験物質結合ビーズと標識物質を含む反応液を、顕微鏡観察用プレート１の流路内（凹部２内）に供し、その目に並行して通液する工程である。反応液の条件や接触させる時間は、上記（a）工程に関して説明した通りである。
【００５８】
顕微鏡観察用プレート１の流路内（凹部２内）への反応液の通液は、例えばピペット等を用いて手動で行ってもよいし、また例えば本発明の顕微鏡観察用プレート載置装置を用いて、顕微鏡観察用プレート１の流路内（凹部２内）に反応液を連続して通液若しくは循環させながら行ってもよい。
【００５９】
（b）工程
当該（b）工程は、上記（a）工程で標識物質を接触させた被験物質結合ビーズを洗浄する工程である。被験物質に対するアフィニティーが弱い標識物質は、（a）工程において、被験物質を介して一旦はビーズに結合しているものの、当該（b）工程により当該ビーズから解離する。
【００６０】
当該（b）工程は、被験物質を結合させたビーズと標識物質との接触と結合が行われた顕微鏡観察用プレート１の流路内（凹部２内）に、その流路の目に並行して洗浄液を通液することによって行うことができる。当該洗浄液の通液は、例えばピペット等を用いて手動で行ってもよいし、また例えば本発明の顕微鏡観察用プレート載置装置を用いて、顕微鏡観察用プレート１の流路内（凹部２内）に洗浄液を連続して通液しながら行ってもよい。
【００６１】
ここで、洗浄液は、反応液と同様に、対象とする物質が変性しない塩濃度範囲とｐＨ範囲と温度範囲を有する水溶液であればよく、その範囲で目的に応じて、適宜に設定することができる。例えば、体内でのタンパク質とタンパク質との相互作用を検出評価する場合は、生理的条件と同一またはそれに近似する条件にある水溶液として調製することが好ましい。
【００６２】
洗浄に要する時間も特に制限なく、１秒〜３０分の範囲で適宜設定することができる。
【００６３】
（c）工程
当該（c）工程は、標識物質に由来する標識を検出する工程である。当該工程は、前述する（a）と（b）の工程または（a’）と（b）の工程と同時並行して行われるか、少なくとも（b）の工程と同時並行して行われる。
【００６４】
当該標識は、前述するように好ましくは蛍光プローブであり、蛍光プローブで標識された物質の当該蛍光プローブは、蛍光が検出できる蛍光顕微鏡により検出することができる。蛍光顕微鏡としては、具体的には、例えば透過型蛍光顕微鏡、落射型蛍光頭微鏡、コンフォーカルレーザー顕微鏡、及び全反射照明蛍光顕微鏡の各種の蛍光顕微鏡を挙げることができる。好ましくはコンフォーカルレーザー顕微鏡である。
【００６５】
前述するように、本発明の顕微鏡観察用プレート１は、ビーズを捕捉収容し得る窪み部３を、凹部２の長さ方向の中央部に密集するようにかためて配置した形態を有するものであることが好ましい。この場合、当該凹部２の長さ方向中央部が、顕微鏡で観察できる実観察領域にくるように、当該顕微鏡観察用プレート１を顕微鏡のステージに載せ置きすることで、当該窪み部３に捕捉収容されたビーズに標識物質が結合する様子や標識物質が解離する様子が、標識（例えば、蛍光プローブ）をシグナルとして可視的に、かつリアルタイムに検出することができる。
【００６６】
このように、本発明の方法は、物質（被験物質）と物質（標識物質）との相互作用（結合、アフィニティー）を、顕微鏡という比較的簡単な装置を用いて、可視的にかつリアルタイムに測定し評価することができる方法として、有用である。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を、実験例を利用してより詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００６８】
実験例１：pull-downアッセイ
（１）実験方法
（1-1）GST融合importin α3タンパク質の調製
importin αは細胞の核膜に存在し、タンパク質に存在する核移行シグナル（NLS）を認識し結合するタンパク質で、NLS依存的にタンパク質を核内へ運び込むことが知られている。当該importin αは、Ｃ末端領域のアルマジロ反復配列に存在する、種を超えて高度に保存されているアミノ酸を変異させることでその結合能が消失することが知られている（Goldfarb D. et al., Trends Cell Biol., 14: 505-514, 2004 および Lange A., et al., J. Biol. Chem., 282: 5101-5105, 2007）。中でもヒトimportin α3は、Ｎ末端側から179番目のトリプトファン(Ｗ)と183番目のアスパラギン(Ｎ)をアラニン(Ａ)に変異することでその結合能が消失する（Conti, E. et al., Cell 94: 193-204, 1998）。
【００６９】
以下、ヒトimportin α3の野生型（importin α3 [Homo sapiens]、GenBank: AAC25605.1、GI:1928975）を「ヒトimportin α3（野生型）」若しくは「importin α3（野生型）」と称し、またその上記変異体を「ヒトimportin α3(W179A、N183A）」若しくは「importin α3(W179A、N183A）」と称する。なお、ヒトimportin α3（野生型）の遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す（NCBI Reference Sequence: NM_002268.2）。当該塩基配列において、塩基番号10-1575の領域がヒトimportin α3（野生型）のコーディング領域（CDS領域）である。またそのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００７０】
（ｉ）GST融合importin α3(野生型)タンパク質の調製
ヒトimportin α3 (GenBank: AAC25605.1、GI:1928975)のcDNA（アミノ酸配列では65-521）を組み込んだGST融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（GEヘルスケア・ジャパン社）（Kosugi S. et al., J. Biol. Chem., 284: 478-485, 2008）を用いて、大腸菌の形質転換を行った。イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）誘導されたGST融合importin α3（野生型）タンパク質を含む大腸菌溶解液から、グルタチオンアガロースビーズ（Sigma社）を用いて、GST融合importin α3（野生型）タンパク質を精製した。
【００７１】
（ii）GST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質の調製
ヒトimportin α3のcDNA を鋳型として、下記のプライマーを用いて常法に従ってoverlap PCR 法を行い、ヒトimportin α3(W179A、N183A)cDNAを作成した。ヒトimportin α3(W179A、N183A)のcDNA（アミノ酸配列では65-521）を組み込んだGST融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（GEヘルスケア・ジャパン社）を用いて、大腸菌の形質転換を行った。イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）誘導されたGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を含む大腸菌溶解液から、グルタチオンアガロースビーズ（Sigma社）を用いて、GST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を精製した。
【００７２】
プライマー
W179A N183A-S: 
5′-TGT GAG CAA GCA GTG GCG GCA TTG GGA GCT ATC ATA GGT GAT GGG- 3’（配列番号３）
W179A N183A-AS:
5′-CCC ATC ACC TAT GAT AGC TCC CAA TGC CGC CAC TGC TTG CTC ACA- 3’（配列番号４）。
【００７３】
（1-2）テストサンプルの調製
テストサンプルとして、赤色蛍光タンパク質mCherryを融合させた「NAC-1（180-207）」、赤色蛍光タンパク質mCherryを融合させた「nucleoplasmin-NLS」、及び対照例として赤色蛍光タンパク質mCherryを調製した。
【００７４】
なお、ここで「NAC-1（180-207）」は、核内転写制御タンパク質であるヒトNAC-1（nucleus accumbens-associated protein 1）（Nakayama, K., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 103: 18739-18744, 2006）の核移行シグナル（NLS）（183〜205配列）を含む180-207領域のアミノ酸配列からなるペプチド断片である。ヒトNAC-1のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。当該アミノ酸配列において、アミノ酸番号183〜205の領域が核移行シグナル（NLS）に相当する領域である。
【００７５】
また、「nucleoplasmin-NLS」は、既にヒトimportin α3（野生型）と結合することが知られているnucleoplasmin（Robbins, J., wt al., Cell 64: 615-623, 1991）の核移行シグナル（NLS）である。アフリカツメガエルのnucleoplasmin のアミノ酸配列を配列表の配列番号６に示す。当該アミノ酸配列において、アミノ酸番号155〜172の領域が核移行シグナル（NLS）に相当する領域である。
【００７６】
（1-3）pull-downアッセイ
上記で調製したGST融合importin α3（野生型）タンパク質、及びGST融合importin α3（W179A、N183A）タンパク質を、それぞれ定法に従ってグルタチオンビーズに結合させ、次いでこれらを各テストサンプル（mCherry融合NAC-1(180-207)、mCherry融合nucleoplasmin-NLS、mCherry）と混合した。得られたビーズを遠心処理して沈降させ、1% Triton X-100を含むPBSで複数回洗浄した後、SDSサンプル緩衝液を加え加熱してビーズから各タンパク質を遊離した。ビーズから遊離したタンパク質を、SDS-PAGE法により分離し、クマシー染色してタンパク質を同定した。
【００７７】
（２）実験結果
結果を図１１に示す。図１１中、「input」のレーンは、各テストサンプル（mCherry融合NAC-1(180-207）、mCherry融合nucleoplasmin-NLS、mCherry）の標品そのものをSDS-PAGEに供したstandard結果を示す。
【００７８】
図１１のレーン５及び６に示すように、テストサンプル（mCherry融合NAC-1(180-207）、mCherry融合nucleoplasmin-NLS)のバンドが検出できたことから、核移行シグナル（NLS）を認識し結合するヒトimportin α3(野生型)により、核移行シグナル（NLS）を含むnucleoplasmin-NLS、及びNAC-1(180-207)はいずれも、pull-downすることができた。しかし、レーン８及び９に示すように、ヒトimportin α3(野生型)に代えて、ヒトimportin α3の変異体であるimportin α3(W179A、N183A）を用いた場合には、nucleoplasmin-NLS、及びNAC-1(180-207)はいずれもpull-downできなかった。
【００７９】
以上のことから、nucleoplasminやNAC-1等の核移行シグナル（NLS）は、importin α3(野生型）タンパク質と直接結合すること、また種を超えて高度に保存されているアミノ酸に変異を導入したimportin α3変異体（例えば、importin α3(W179A、N183A）)にはいずれも結合しないことが確認された。つまり、importin α3（野生型）タンパク質とそのアミノ酸配列の179位と183位を変異させた変異体（例えば、importin α3(W179A、N183A））を用いることで、NLSを介したタンパク質の相互作用を検出し評価できることが確認された。
【００８０】
しかし、pull-down法及びそれに続く電気泳動法は、タンパク質相互作用を検出し評価する古典的な実験方法であり、その実験には少なくとも半日以上の時間を要する。従って、これをより短時間に、またタンパク質の相互作用が経時的に観察できる方法を確立する必要がある。
【００８１】
実験例２：on beads 顕微鏡アッセイ（その１）
（１）実験方法
市販のカバーガラスの上で、グルタチオンビーズ（実験例１で調製した、GST融合importin α3(野生型)タンパク質またはGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を結合させたグルタチオンビーズ）とテストサンプル（実験例１で調製したmCherry融合NAC-1(180-207)、mCherry融合nucleoplasmin-NLS、mCherry）を、1% Triton X-100を含むPBS（反応溶液）中でそれぞれ混合し、蛍光顕微鏡（コンフォーカルレーザー顕微鏡；オリンパス社製）を用いて観察した。図１１にアッセイの概略を示す。単に混ぜるだけで、１分もかけないでアッセイできる簡単な方法である。
【００８２】
（２）実験結果
実際の観察データを図１２に示す。左図は蛍光観察結果であり、右図は透過光観察結果である。コンフォーカル顕微鏡を用いているため、グルタチオンビーズに結合させたタンパク質とテストサンプルのタンパク質との間にタンパク質相互作用がある場合、蛍光観察で、ビーズの周囲に円状に赤色蛍光タンパク質mCherryに起因するシグナルが観察される。ビーズ１２個分の蛍光強度を測定し、統計処理した結果を図１３に示す。ここでは、図１１のレーン８に示すように実験例１のpull-downアッセイでは結合が見られなかったヒトimportin α3(W179A、N183A)とnucleoplasmin-NLSとの結合を示すシグナルが認められた（図１２：右側の中段、図１３：右から３番目）。
【００８３】
この結果から、標識タンパク質を含むテストサンプルを、被験タンパク質を結合させたビーズ上で反応させるだけでは、標識タンパク質と被験タンパク質との相互作用（結合と解離）を定量的に評価することができないことが判明した。
【００８４】
実験例３：on beads 顕微鏡アッセイ（その２）
実験例２の実験において、顕微鏡観察用の市販のカバーガラス上の反応溶液（1% Triton X-100を含むPBS）を一部回収し、洗浄液（1% Triton X-100を含むPBS）をその容量分追加するという方法によって、反応溶液の希釈を繰り返し、顕微鏡観察を行った。
【００８５】
実際の観察データを図１４に示す。上２段は、GST融合importin α3（野生型）タンパク質を結合させたグルタチオンビーズにmCherry 融合nucleoplasmin-NLSを混合し、順次希釈したものである（２段中、上一列は蛍光観察結果、下一列は透過光観察結果を示す）。下２段は、GST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を結合させたグルタチオンビーズにmCherry 融合nucleoplasmin-NLSを混合し、順次希釈したものである（２段中、上一列は蛍光観察結果、下一列は透過光観察結果を示す）。ビーズ５個分の蛍光強度を測定し、統計処理した結果を図１５に示す。
【００８６】
この結果からわかるように、GST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質は、希釈前はGST融合importin α3（野生型）タンパク質と遜色なくmCherry融合nucleoplasmin-NLSと結合していたが、希釈するに従って、GST融合importin α3（野生型）タンパク質と比べて速やかに解離していく様子が観察された。
【００８７】
この結果から、カバーガラス上の反応溶液を順次希釈していくことで、顕微鏡下でリアルタイムにタンパク質同士の相互作用（結合と解離）が観察できることが確認された。
【００８８】
実験例４：on beads 顕微鏡アッセイ（その３）
市販のカバーガラスに代えて、本発明の顕微鏡観察用プレート（マイクロ流路付きプレート）（図１参照）を用いて、グルタチオンビーズ（実験例１で調製したGST融合importin α3(野生型）タンパク質、またはGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を結合させたビーズ）とテストサンプル（実験例１で調製したmCherry融合nucleoplasmin-NLS）との相互作用を蛍光顕微鏡（コンフォーカルレーザー顕微鏡；オリンパス社製）を用いて観察した。
【００８９】
この顕微鏡観察用プレート上での一連の反応を、リアルタイムで蛍光顕微鏡で観察した結果、グルタチオンビーズとしてGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を結合させたビーズを用いた場合は、mCherry融合nucleoplasmin-NLSは、一旦は結合するものの、洗浄液を通液することで速やかに解離した（図１６のStep 3の右図）。これに対して、グルタチオンビーズとしてGST融合importin α3(野生型)タンパク質を結合させたビーズを用いた場合は、mCherry融合nucleoplasmin-NLSと結合し、またその結合が洗浄液の通液にも関わらず安定して維持されることが観察された（図１６のStep 3の左図）。
【００９０】
この顕微鏡観察用プレート上での一連の反応を、リアルタイムで蛍光顕微鏡観察した結果、実験例４と同様に、グルタチオンビーズとしてGST融合importin α3(W179A、N183A)タンパク質を結合させたビーズを用いた場合は、mCherry融合nucleoplasmin-NLSは、一旦は結合するものの、洗浄液を通液することで速やかに解離したのに対して、グルタチオンビーズとしてGST融合importin α3(野生型)タンパク質を結合させたビーズを用いた場合は、mCherry融合nucleoplasmin-NLSと結合し、またその結合が洗浄液の通液にも関わらず安定して維持されることが観察された。
【００９１】
以上のことから、本発明の顕微鏡観察用プレートによれば、顕微鏡という簡便な装置を用いてタンパク質同士の相互作用をリアルタイムに観察測定できることが確認された。
【符号の説明】
【００９２】
１    顕微鏡観察用プレート
２    凹部
３    窪み部
５    顕微鏡観察用プレート載置装置
６    支持ユニット
７    収容具
８    蓋
９    試料容器
１０  プレートの表面
２２  凹部の底面
９０  本体
９１  蓋体
９３  ホース接続部
９４  ホース挿入穴
Ｍ    ビーズ
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号３及び４は、ヒトimportin α3のcDNA を鋳型として、overlap PCR 法を用いてヒトimportin α3(W179A、N183A)cDNAを作成するために使用したプライマー（W179A N183A-SとW179A N183A-AS）を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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