(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
菱科植物の外皮の抽出物を有効成分として含有する酵素活性阻害剤であって、当該酵素が、リパーゼ、またはアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）であることを特徴とする酵素活性阻害剤。
【請求項２】
菱科植物が、ワビシ（Ｔｒａｐａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａ  ｎａｔａｎｓ）、トウビシ（Ｔｒａｐａ  ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、またはヒメビシ（Ｔｒａｐａ  ｉｎｃｉｓａ）であることを特徴とする請求項１に記載の酵素活性阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の酵素活性阻害剤の製造方法であって、菱科植物の外皮を熱水中で攪拌することによって熱水抽出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学の技術分野に属し、特に、植物から抽出された新規な酵素活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会では、食生活の欧米化や交通手段の発達により、高脂肪な食生活、運動不足等の偏った生活習慣が慢性的に続きがちであり、脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満症等の生活習慣病の症状を訴える人々が増えてきており社会問題化している。
【０００３】
生活習慣病を助長する作用のある酵素の活性を阻害することによって、生活習慣病を予防することや抑制することが期待されている。このような作用のある酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、リパーゼ、およびアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）がよく知られている。
【０００４】
α−アミラーゼは、膵液や唾液に含まれ、デンプンやグリコーゲンのα−１，４結合を不規則に切断し、多糖ないしオリゴ糖を生み出す酵素（消化酵素）である。また、リパーゼは、脂質を構成するエステル結合を加水分解する酵素である。また、アンジオテンシンI変換酵素（ＡＣＥ）は、血圧調節メカニズムの一つであるレニン−アンジオテンシン系において、アンジオテンシンIから昇圧作用を有するアンジオテンシンＩＩを生成し、同時に降圧ペプチドであるブラジキニンを分解するなど、血圧上昇に大きく関係している酵素である。
【０００５】
このような酵素の活性を阻害する酵素活性阻害剤は、それぞれの酵素の関係する生活習慣病の予防に資することができる。例えば、生活習慣病の原因としては、体内への過剰なエネルギー摂取や高血圧症があり、α−アミラーゼ阻害剤は、食物に含まれる糖類の分解を阻害して糖分吸収を抑制することによって、体内への過剰なエネルギー摂取を抑制する作用を有するものである。また、リパーゼ阻害剤は、脂肪吸収を抑制することによって、体内への過剰なエネルギー摂取を抑制する作用を有するものである。また、アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤は、血圧上昇を抑制することによって、高血圧症を予防する作用を有するものである。
【０００６】
生活習慣病に対して優れた予防・抑制作用をもつ酵素活性阻害剤は、これまで多くのものが提案されているが、とりわけ、天然物（特に植物）を原料とするものは、石油を原料とする合成化合物よりも取扱い時の安全性が高いという利点があり、植物由来の酵素活性阻害剤が盛んに開発されている。
【０００７】
植物由来の従来の酵素活性阻害剤としては、例えば、ホップより得られるリパーゼ阻害剤（例えば、特許文献１参照）や、小麦ふすま、大麦糠、米糠からのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤（例えば、特許文献２参照）、黒豆、薩摩芋、桜皮、山ザ子、草豆く、ナツメグ、オレガノ、和山椒、または紫花豆から選択される植物の少なくとも１種類を水とアルコールとの混合液で抽出することによって得ることができるα−アミラーゼ活性阻害剤（例えば、特許文献３参照）などがある。
【０００８】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４５２１７０３号公報
【特許文献２】特許第４６８６７９２号公報
【特許文献３】特許第４６５７３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、従来の酵素活性阻害剤は、原料として、既に食用や観賞用等の他用途で利用されている植物や、大量には採取できない植物が使用されているために、原料コストが高くなりがちであり、さらに原料を安定的に入手できない場合もあることから、酵素活性阻害剤としての実用化が十分に進んでいないという課題がある。
【００１１】
本発明の目的は、如上の課題を解決することができ、新規な植物材料を原料とすることにより高い安全性とともに低コストで製造できる新しいタイプの酵素活性阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究の結果、菱科植物の外皮を利用することにより、上記の目的を達成できることを見出した。
【００１３】
かくして、本発明に従えば、菱科植物の外皮の抽出物を有効成分として含有する酵素活性阻害剤であって、当該酵素が、α−アミラーゼ、リパーゼ、またはアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）であることを特徴とする酵素活性阻害剤が提供される。菱科植物の外皮は、これまでのところ特段の用途が無く大量に廃棄されていることから、本発明に係る酵素活性阻害剤は、低コストで製造することができるとともに、廃棄資源の有効利用という観点からも有益である。
【００１４】
本発明の酵素活性阻害剤は、特に生活習慣病に深い関連性があるα−アミラーゼ、リパーゼ、またはアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）の各酵素に対して、それら酵素の活性を有意に阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係るヒシ外皮の（ａ）α−アミラーゼ阻害活性、（ｂ）ＡＣＥ阻害活性、および（ｃ）リパーゼ阻害活性に関する各々の実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る酵素活性阻害剤は、菱科植物の外皮の抽出物を有効成分として含有することを特徴としている。本発明でいう菱科植物とは、菱科（Ｔｒａｐａｃｅａｅ）に属する植物（通称ヒシ）であれば特に制限されず、例えば、ワビシ（Ｔｒａｐａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａ  ｎａｔａｎｓ）、トウビシ（Ｔｒａｐａ  ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、ヒメビシ（Ｔｒａｐａ  ｉｎｃｉｓａ）などが挙げられる。
【００１７】
ヒシは、池、沼、およびクリークに自生する一年生水草であり、とげのある実が水底に固着して越冬し、春になると芽を出し、秋に果実をつける。ヒシの果実は、デンプン質が多く、茹でて中身を食用とすることや、民間薬やお茶として煎じて飲用され、さらには焼酎の原料としても利用されている。このようなヒシの果実を利用したリパーゼ阻害剤（特開２００５−８５７２号公報参照）は提案されているが、ヒシの外皮については、今のところ利用価値がなく、大部分が廃棄処分されている。一部ではヒシの外皮をアルコール抽出することによって得られるα−グルコシダーゼ阻害剤（特開２００９−４９９４６号公報参照）が提案されてはいるものの、特に、生活習慣病の進行に影響を与えるα−アミラーゼ、リパーゼ、およびアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）の各酵素を阻害するようなヒシの外皮由来の酵素阻害剤は知られていない。
【００１８】
本発明に係る酵素阻害剤の別の特徴は、菱科植物の外皮を熱水中で攪拌することによって熱水抽出することで製造することにある。熱水とは６０℃〜１００℃に加熱された水を指し、例えば９０℃とすることができる。また、攪拌する際には、超音波振動を適用することもでき、これによって、抽出が効率的に行なわれる。このように熱水で抽出することによって、従来のアルコール抽出法で抽出された酵素阻害剤のように、残留するアルコールによって生じる人体への刺激（例えば、突き刺すような痛み）やアルコール独特の刺激臭が無く、取扱いが容易であり人体にも優しい酵素阻害剤が得られる。
【００１９】
このようにして得られた本発明に係る酵素阻害剤は、生活習慣病に深い関連性があるα−アミラーゼ阻害作用、リパーゼ阻害作用、およびアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害作用を有することを特徴としている。本発明に係る酵素阻害剤は、α−アミラーゼの活性を阻害することで、糖質の吸収を遅延させることができ、血糖値の上昇を抑えることができる。また、リパーゼの活性を阻害することで、脂肪の吸収を遅延させることができ、肥満を防止することができる。さらに、アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）の活性を阻害することで、血圧の上昇を抑えることができる。このように、本発明に係る酵素阻害剤は、α−アミラーゼ阻害作用、リパーゼ阻害作用、およびアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害作用により症状が予防または改善されるような疾患（例えば、糖尿病、肥満、高血圧症）の予防剤又は治療剤の有効成分として用いることができる。
【００２０】
本発明の酵素阻害剤は、その利用形態は特に限定されず、医薬品、化粧品、食品等の任意の形態であってよい。さらに、本発明の酵素阻害剤は、製薬上許容され得る担体、希釈剤、活性剤、賦形剤、充填剤、浸透促進剤、増粘剤、香料、乳化剤、分散助剤または結合剤等と組み合わされた医薬組成物として使用することもできる。さらに、本発明の酵素阻害剤は、薬剤という用途に限定されず、例えば、加工食品の原料（添加剤）として利用することもでき、この場合には、得られた加工食品によって手軽に健康改善できるという利便性がある。
【００２１】
以下に、本発明の特徴をさらに具体的に示すために実施例を記すが、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。
【００２２】
（実施例１）
ヒシ試料および熱水抽出物の調製
原料のヒシとして、野生のワビシ（Ｔｒａｐａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａｎａｔａｎｓ）およびトウビシ（Ｔｒａｐａｂｉｃｏｒｎｉｓ）を採取して使用した。それぞれのヒシは水道水にて洗浄後、天日で２〜３日間乾燥させ、果実と外皮とに分けた。マイクロ波常温乾燥機にて外皮を乾燥させ、粉砕機にて微粉末とした。比較例として、緑茶も同様に微粉末とした。
【００２３】
各試料の微粉末１０ｇに対して２００ｍｌの熱水（９０℃）を加え、３０分間撹拌子で撹拌しつつ抽出を行った。遠心分離により上清を回収後、不溶分に純水を加え、再度遠心分離を行い、上清を回収した。上清をガラスフィルター（１１Ｇ）およびろ紙（Ｎｏ．６、アドバンテック）にて濾過を行った。これを凍結乾燥し、熱水抽出物の粉末を得た。ワビシ外皮、オニビシ外皮、トウビシ外皮、緑茶の収率は、それぞれ１０．０、１５．３、１４．５、３２．３％（ｗ／ｗ）であった。
【００２４】
（実施例２）
α−アミラーゼ阻害作用の検証
α−アミラーゼ阻害作用を以下の通り検証した。０．４％可溶性デンプンと５ｍＭ塩化カルシウム・２水和物を緩衝液（ｐＨ６）に溶かした基質溶液３００μｌにサンプル溶液５０μｌを加えた。酵素溶液として、α−アミラーゼ（ブタ膵液由来アミラーゼ、シグマ製ＴｙｐｅＶＩ−Ｂ）１．３ｍｇを緩衝液（ｐＨ６）に２０ｍｌに溶解したもの１５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた。その後、沸騰水中で１０分間、加熱することで酵素反応を停止させ、水冷し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１００μｌと０．５％ジニトロサリチル酸水溶液２００μｌを加え、沸騰水浴中で１０分間加熱し、５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２５】
以下の式を用いてα−アミラーゼ阻害活性を求めた。なお、緑茶を比較として用いた。異なる希釈濃度のデータをプロットし、５０％の阻害活性を示す濃度（ＩＣ５０値）を求めた。
【００２６】
α−アミラーゼ阻害活性（％）＝１００−１００×（Ｄ−Ｃ）／（Ｂ−Ａ）・・・（式１）
（上記式中、Ａは対照（水）のブランク（酵素なし）の吸光度、Ｂは対照（水）の吸光度、Ｃはサンプルのブランク（酵素なし）の吸光度、Ｄはサンプルの吸光度を示す。）
【００２７】
図１（ａ）にα−アミラーゼ阻害活性の結果を示す。横軸は濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、縦軸は阻害率（％）を示す。いずれの種類についても、ヒシの外皮の阻害活性は、緑茶と比較して高く、α−アミラーゼによる糖質の急激な分解を妨げることができることを示唆している。その効果は、オニビシに比べてワビシやトウビシで高かった。α−アミラーゼ阻害活性を５０％阻害するサンプルの濃度（ＩＣ５０）およびサンプルの濃度が０．１ｍｇ／ｍｌのときのα−アミラーゼ阻害活性を表１に示す。ヒシの外皮は、糖質分解酵素阻害活性を示したことから、食後血糖値が急激に上昇することを防ぎ、糖尿病の予防や高血糖状態の緩和にもつながることが示された。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
（実施例３）
アンジオテンシンI変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性の検証
アンジオテンシンI変換酵素（ＡＣＥ）に関する検証は、同仁化学研究所のＡＣＥ  Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いて行った。ＡＣＥ  Ｋｉｔ−ＷＳＴは３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ  （３ＨＢ−ＧＧＧ）から切り出されてくる３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（３ＨＢ）を酵素法により検出するものである。
【００３０】
マイクロプレートの各ウェルにサンプル溶液もしくは水を２０μｌずつ入れた。各ウェルに基質溶液を２０μｌずつ加えた。サンプル溶液を入れたウェルに酵素溶液を２０μｌずつ加えた。３７℃で６０分間インキュベートし、各ウェルに発色剤を２００μｌずつ加えた。室温で１０  分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３１】
ＡＣＥ阻害活性値（阻害率％）を下記の計算式により求めた。なお、緑茶も比較として用いた。異なる希釈濃度のデータをプロットし、５０％の阻害活性を示す濃度（ＩＣ５０値）を求めた。
【００３２】
ＡＣＥ阻害活性（％）＝１００−１００×（Ｄ−Ｃ）／（Ｂ−Ａ）・・・（式２）
（上記式中、Ａは対照（水）のブランク（酵素なし）の吸光度、Ｂは対照（水）の吸光度、Ｃはサンプルのブランク（酵素なし）の吸光度、Ｄはサンプルの吸光度を示す。）
【００３３】
ＡＣＥの阻害活性に関する結果を図１（ｂ）に示す。横軸は濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、縦軸は阻害率（％）を示す。また、ＡＣＥ阻害活性を５０％阻害するサンプルの濃度（ＩＣ５０）およびサンプルの濃度が０．４ｍｇ／ｍｌのときのＡＣＥ阻害活性を表２に示す。ヒシの外皮は、緑茶に比べて高いＡＣＥ阻害活性を示した。ＡＣＥ阻害活性に関しては、３種類のヒシにあまり違いは見られなかった。このような結果から、ヒシの外皮は、血圧上昇を抑制し、高血圧を予防できる食品素材として有益であることが示された。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
（実施例４）
リパーゼ阻害活性の検証
リパーゼ阻害活性は、リパーゼキットＳ（大日本住友製薬）を用いて確認した。その原理は次のとおりである。リパーゼは、基質である三酪酸ジメルカプロール（ＢＡＬＢ）を分解してジメルカプロール（ＢＡＬ）を生成させる。生成したＢＡＬはＤＴＮＢと定量的に反応し、黄色の５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）アニオンを生成する。反応停止液を加えることにより、リパーゼの反応を停止すると同時に、反応混液を清澄にする。呈色の強さ（吸光度）は検体中のリパーゼ活性を反映するので、吸光度から直接リパーゼ活性を算出することができる。これを利用して、リパーゼ活性の阻害活性を調べた。
【００３６】
マイクロチューブに、サンプル溶液または蒸留水（コントロール）１００μｌを入れ、酵素液｛ブタ膵リパーゼ（シグマ、ＴｙｐｅＩＩ）を０．０５ｍｇ／ｍｌとなるよう、トリス塩酸（ｐＨ７．５）に溶解し、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した上清｝を３０μｌ加えた。リパーゼキットＳ（大日本住友製薬）の発色液を４００μｌ加え、３０℃で５分間インキュベートした。基質液として、リパーゼキットＳ（大日本住友製薬）の基質液｛６．６９ｍｇ／ｍｌ三酪酸ジメルカプロール（ＢＡＬＢ）＋５．７３ｍｇ／ｍｌドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）｝を４０μｌ加え、さらに、遮光下、３０℃で３０分間インキュベートした。リパーゼキットＳ（大日本住友製薬）の反応停止剤を８００μｌ加え、４１２ｎｍの吸光度を測定した。
【００３７】
対照は、サンプルの代わりに水を用いて同様の操作をしたもので、サンプルまたは対照のブランクは、サンプルまたは水を入れて、酵素液、発色液を添加して３０分反応させ、反応停止剤を入れて、最後に基質液を添加したものである。各希釈濃度のサンプル溶液のデータをプロットし、５０％の阻害活性を示す濃度（ＩＣ５０値）を求めた。なお、緑茶も比較例として用いた。リパーゼ阻害活性を下記の計算式により求めた。
【００３８】
リパーゼ阻害率（％）＝１００−１００×（Ｄ−Ｃ）／（Ｂ−Ａ）・・・（式３）
（上記式中、Ａは対照（水）のブランク（酵素なし）の吸光度、Ｂは対照（水）の吸光度、Ｃはサンプルのブランク（酵素なし）の吸光度、Ｄはサンプルの吸光度を示す。）
【００３９】
ヒシの外皮のリパーゼの阻害活性を図１（ｃ）に示す。横軸は濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、縦軸は阻害率（％）を示す。また、リパーゼ阻害活性を５０％阻害するサンプルの濃度（ＩＣ５０）およびサンプルの濃度が０．２ｍｇ／ｍｌのときのリパーゼ阻害活性を表３に示す。ヒシの外皮のリパーゼ阻害活性は、緑茶よりも高くなった。ヒシの中でもトウビシのリパーゼ阻害活性が特に高い値を示した。このようにヒシの外皮から得られた抽出物はリパーゼを阻害することが判明したことから、脂肪の消化・吸収を抑制して血中脂質を低下させ、抗肥満作用が得られることが示された。
【００４０】
【表３】
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【図１】
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