(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性分子の二分子層を製造する方法であって、
（ｉ）疎水性媒体に水和支持体を供給するステップであって、両親媒性分子の第１単分子層が前記水和支持体の表面上に存在し、前記水和支持体が固体または半固体の基質を含む、ステップと、
（ｉｉ）疎水性媒体に親水体を供給するステップであって、両親媒性分子の第２単分子層が前記親水体の表面上に存在するステップと、
（ｉｉｉ）第１単分子層と第２単分子層とを接触させて両親媒性分子の二分子層を形成するステップと、有し、
（ａ）前記水和支持体が供給された前記疎水性媒体が両親媒性分子を含むとともに、前記親水体が供給された前記疎水性媒体が両親媒性分子を含み、又は、
（ｂ）前記水和支持体が両親媒性分子を含むとともに、前記親水体が両親媒性分子を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記両親媒性分子は脂質分子であり、前記脂質分子は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、リン脂質、糖脂質、コレステロールを含むグループから選択され、前記脂質分子は、モノオレイン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン；１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；またはそれらの混合物、を含むグループから選択される、
方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法において、
前記水和支持体は、
親水性である、方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３の何れか１項に記載の方法において、
前記親水体が、水溶液の液滴を含み、前記液滴の直径が５ｎｍから１０ｃｍである、方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４の何れか１項に記載の方法において、
前記疎水性媒体が油であり、前記油が、アルカン、アルケン、フッ素化油、シリコーンベースの油、四塩化炭素を含むグループから選択される、方法。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５の何れか１項に記載の方法において、
膜結合タンパク質が、
（ａ）前記水和支持体、前記親水体、前記疎水性媒体のうちの少なくとも１つにおいて存在し、前記膜結合タンパク質は前記二分子層に挿入可能であり、又は、
（ｂ）前記二分子層において存在し、
前記膜結合タンパク質は、選択的または非選択的な膜内輸送タンパク質、イオンチャネル、孔形成タンパク質、膜常駐受容体、を含むグループから選択される、
方法。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６の何れか１項に記載の方法において、さらに、
（ａ）前記二分子層中の両親媒性分子との相互作用、又は前記二分子層中の膜結合タンパク質との相互作用が可能な１つ以上の化合物／検体、又は、
（ｂ）１つ以上の膜結合タンパク質、
を検出するために前記二分子層を使用するステップを含む、
方法。
【請求項８】
親水体と水和支持体との間の両親媒性分子の二分子層であって、
前記親水体及び前記水和支持体は、疎水性媒体中にあり、前記水和支持体が固体または半固体の基質を含む、二分子層。
【請求項９】
請求項８に記載の二分子層において、
（ａ）前記二分子層は、請求項１に記載の方法にて製造され、又は、
（ｂ）前記二分子層は、前記親水体の表面上の両親媒性分子の単分子層と、前記水和支持体の表面上の両親媒性分子の単分子層と、の間に形成される、
二分子層。
【請求項１０】
請求項８又は請求項９に記載の二分子層において、
前記両親媒性分子は脂質分子であり、前記脂質分子は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、リン脂質、糖脂質、コレステロールを含むグループから選択され、前記脂質分子は、モノオレイン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン；１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；またはそれらの混合物、を含むグループから選択される、
二分子層。
【請求項１１】
請求項８ないし請求項１０の何れか１項に記載の二分子層において、
前記水和支持体は、
親水性である、二分子層。
【請求項１２】
請求項８ないし請求項１１の何れか１項に記載の二分子層において、
前記親水体が、水溶液の液滴を含み、前記液滴の直径が５ｎｍから１０ｃｍである、二分子層。
【請求項１３】
請求項８ないし請求項１２の何れか１項に記載の二分子層において、  
前記疎水性媒体が油であり、前記油が、アルカン、アルケン、フッ素化油、シリコーンベースの油、四塩化炭素を含むグループから選択される、二分子層。
【請求項１４】
請求項８ないし請求項１３の何れか１項に記載の二分子層において、
膜結合タンパク質が、
（ａ）前記水和支持体、前記親水体、前記疎水性媒体のうちの少なくとも１つにおいて存在し、前記膜結合タンパク質は前記二分子層に挿入可能であり、又は、
（ｂ）前記二分子層において存在し、
前記膜結合タンパク質は、選択的または非選択的な膜内輸送タンパク質、イオンチャネル、孔形成タンパク質、膜常駐受容体、を含むグループから選択される、
二分子層。
【請求項１５】
請求項８ないし請求項１４の何れか１項に記載の二分子層の使用方法であって、
（ａ）前記二分子層中の両親媒性分子との相互作用、又は前記二分子層中の膜結合タンパク質との相互作用が可能な１つ以上の化合物／検体、又は、
（ｂ）１つ以上の膜結合タンパク質、
を検出するための使用方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の使用方法であって、
（ａ）前記膜結合タンパク質が、イオンチャネルタンパク質及び／又は孔形成タンパク質である、及び／又は、
（ｂ）前記化合物／検体及び／又は膜結合タンパク質は、親水体中及び／又は水和支持体中及び／又は疎水性媒体中、に配置されることによって前記二分子層に導入される、及び／又は、
（ｃ）前記化合物／検体及び／又は膜結合タンパク質は、環境試料又は生物試料から得られるか、若しくは、環境試料又は生物試料に含まれる、
使用方法。
【請求項１７】
請求項８ないし請求項１４の何れか１項に記載の二分子層における膜結合タンパク質の濃度を増減する方法であって、
（ｉ）水和支持体と親水体との間に二分子層を供給するステップと、
（ｉｉ）前記二分子層中に膜結合タンパク質を導入するステップと、
（ｉｉｉ）前記二分子層の領域を増減して、前記二分子層中のタンパク質の濃度を増減させるステップと、
を含む方法。
【請求項１８】
二分子層を維持しながら前記二分子層を第１の位置から第２の位置に移動させる方法であって、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の二分子層を提供するステップと、その後で前記二分子層を維持しながら前記二分子層を第１の位置から第２の位置に移動させるステップと、を含む方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、
（ａ）前記二分子層を移動させる際、前記親水体及び前記水和支持体の間の接触を維持することにより前記二分子層を維持し、及び／又は、
（ｂ）前記第１の位置で前記二分子層が第１の試験試料に接触し、前記第２の位置で前記二分子層が第２の試験試料に接触し、及び／又は、
（ｃ）前記二分子層が、前記親水体を水和支持体全体にわたって移動させることにより移動され、前記水和支持体が、２つ以上の試験される検体／化合物を備える、
方法。
【請求項２０】
請求項８〜１４のいずれか１項に記載の２つ以上の二分子層の配列であって、前記２つ以上の二分子層が、２つ以上の親水体と１つ以上の水和支持体との間で、または１つ以上の親水体と２つ以上の水和支持体との間で形成されることを特徴とする配列。
【請求項２１】
両親媒性分子の二分子層とライブラリ中の１つ以上の化合物との間の相互作用のための
スクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項８〜１４のいずれか１項に記載の二分子層を供給するステップであって、前記水和支持体が試験される化合物のライブラリを備えたステップと、
（ｉｉ）前記親水体、その結果前記二分子層を前記水和支持体の表面全体にわたって位置変化させるステップと、
（ｉｉｉ）前記二分子層と前記水和支持体中の化合物との相互作用を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２２】
請求項１または請求項２に記載の方法において、
前記水和支持体は、
ヒドロゲル、アガロース、ポリアクリルアミド、［架橋結合された］ポリエチレングリコール、ニトロセルロース、ポリカーボネート、アノディスク材料、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、ナイロン、ナフィオン（Ｎａｐｈｉｏｎ）材料、メソ多孔質シリカ、水、ガラス、タンパク質、検体分離ゲル、その他の多孔性担体、を含むグループから選択される、  方法。
【請求項２３】
請求項８ないし請求項１０の何れか１項に記載の二分子層において、
前記水和支持体は、
ヒドロゲル、アガロース、ポリアクリルアミド、［架橋結合された］ポリエチレングリコール、ニトロセルロース、ポリカーボネート、アノディスク材料、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、ナイロン、ナフィオン（Ｎａｐｈｉｏｎ）材料、メソ多孔質シリカ、水、ガラス、タンパク質、検体分離ゲル、その他の多孔性担体、を含むグループから選択される、二分子層。
【請求項２４】
両親媒性分子の二分子層を製造する方法であって、
（ｉ）疎水性媒体に支持体を供給するステップであって、両親媒性分子の第１単分子層が前記支持体の表面上に存在し、前記支持体が固体または半固体の基質を含む、ステップと、
（ｉｉ）疎水性媒体に親水体を供給するステップであって、両親媒性分子の第２単分子層が前記親水体の表面上に存在するステップと、
（ｉｉｉ）第１単分子層と第２単分子層とを接触させて両親媒性分子の二分子層を形成するステップと、有し、
（ａ）前記支持体が供給された前記疎水性媒体が両親媒性分子を含むとともに、前記親水体が供給された前記疎水性媒体が両親媒性分子を含み、又は、
（ｂ）前記支持体が両親媒性分子を含むとともに、前記親水体が両親媒性分子を含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、脂質二分子層等の二分子層、二分子層の製造方法、二分子層の使用法、及び二分子層を製造及び／または使用する装置に関する。
人工的な平面脂質二分子層は、生体膜の単純化モデルとしての役割を果たし、イオンチャネル及びタンパク質孔の電気特性化に広く使用されている。イオンチャネルは、細胞膜を通過する特定イオンの移動を選択的に制御する多様な膜タンパク質であって、電圧、及び多種多様な生体内作用に欠かせない電気化学的勾配を規定している。ヒトにおいては、イオンチャネルは、心拍及び筋収縮からホルモンの分泌及び神経伝達物質の放出まであらゆることを調節する。イオンチャネル機能不全は、心不整脈、周期性四肢麻痺、てんかん、糖尿病を含む、ますます増えつつある疾患に関わりがあるとされている（Ａｓｈｃｒｏｆｔ，  Ｆ．Ｍ．２０００，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ａｓｈｃｒｏｆｔ，Ｆ．Ｍ．２００６，Ｎａｔｕｒｅ  ４４０，４４０−４４７；Ｋａｓｓ，Ｒ．Ｓ．２００５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１５，１９８６−１９８９）。タンパク質孔は、分子が細胞膜を通過するのを可能にする非特異性チャネルである。タンパク質孔は、分子センシング（Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １２，１３９−１４２；Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．＆Ｃｒｅｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，２２６−２３０）及びＤＮＡ塩基配列決定法（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３，１３７７０−１３７７３；  Ｈｏｗｏｒｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  ２００１．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  １９，６３６−６３９；Ａｓｔｉｅｒ，Ｙ．２００６．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２８，１７０５−１７１０）等の多くの応用に利用可能である。
【０００２】
個々のタンパク質の単一チャネル記録（ＳＣＲ）は、チャネルタンパク質機能を研究する強力な手段である（Ｓａｋｍａｎｎ，Ｂ．＆Ｎｅｈｅｒ，Ｅ．１９９５．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｏｎｄｏｎ）。単一チャネル記録は、単一タンパク質チャネルを通るイオン電流の変化を測定し、単分子レベルでの電圧依存性、ゲーティング挙動、リガンド結合親和性、イオン選択性を調べることができる。結果として、単一チャネル記録は、イオンチャネル疾病の分子病態の決定に役立たせることができる。単一チャネル記録は、特にチャネル病を標的とする新薬の開発や、望ましくない副作用に備えて他の薬をスクリーニングするための重要な技術でもある（Ａｓｈｃｒｏｆｔ，Ｆ．Ｍ．２００６、Ｎａｔｕｒｅ  ４４０，４４０−４４７；Ｒｏｄｅｎ，Ｄ．Ｍ．２００４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５０，１０１３−１０２２）。この分野での進歩は、現在利用可能なものよりはるかに高度なイオンチャネル挙動のスループット分析が必要とされる。
【０００３】
単一チャネル記録は通常、パッチクランプ法（Ｓａｋｍａｎｎ，Ｂ．＆Ｎｅｈｅｒ，Ｅ．１９８４．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ４６，４５５−４７２）または人工平面脂質二分子層（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９６２．Ｎａｔｕｒｅ  １９４，９７９−９８０；Ｗｈｉｔｅ，Ｓ．Ｈ．１９８６．ｅｄ．Ｍｉｌｌｅｒ；Ｃ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）のいずれかを使用する。切取パッチ、ティップディップ、オンチップ法を含む他の方法を使用してもよい。
【０００４】
細胞全体のパッチクランプは、チャネルを調べるための汎用かつ高感度の手段であるが、細胞膜の不均一な性質によりしばしば時間がかかると共に面倒である。対照的に、人工平面脂質二分子層は、システムの構成物質を制御し精製タンパク質を研究するのに利用可能である。平面脂質二分子層は、通常、有機溶剤中の脂質の溶液が２つの水性区画を分離する隙間に直接塗布される刷毛塗りにより（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９６２．Ｎａｔｕｒｅ  １９４，９７９−９８０；Ｗｈｉｔｅ，Ｓ．Ｈ．１９８６．ｅｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、または２つの空気／水単分子層が開口を通過して引き上げられるラングミュア−ブロジェット技術の変形（Ｍｏｎｔａｌ，Ｍ．＆Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．１９７２．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ６９，３５６１−３５６６）のいずれかによって形成される。広く使用されているにもかかわらず、平面脂質二分子層は作製するのが難しく、また寿命が短いために多くの場面で使用できない。
【０００５】
二分子層形成に対する代替乳剤ベースの取り組みも提案されており（Ｔｓｏｆｉｎａ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９６６．Ｎａｔｕｒｅ  ２１２，６８１−６８３）、この場合、二分子層は、油中の脂質溶液に浸された水面間において作られる。非混和性脂質／油溶液に浸されると、水面は自然に脂質単分子層を自己集合させ（Ｃｅｖｃ，Ｇ．１９９３．Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｅｄ．Ｃｅｖｃ，Ｇ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｓｅｄｄｏｎ，Ｊ．Ｍ．＆Ｔｅｍｐｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．１９９５．ｅｄｓ．Ｌｉｐｏｗｓｋｙ，Ｒ．＆Ｓａｃｋｍａｎｎ，Ｅ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｏｘｆｏｒｄ）、２つの水性要素からの単分子層が接触すると、単分子層はジッパーのように合わさって脂質二分子層を形成することができる（Ｔｉｅｎ，Ｈ．Ｔ．１９７４．Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １１９，６７６８−６７７５）。最近の研究によると、マイクロ流体流（Ｍａｌｍｓｔａｄｔ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６，１９６１−１９６５；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８，８１６９−８１７４）及び液滴（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８，８１６９−８１７４;Ｈｏｌｄｅｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｐ８６５０−５）は、脂質／油溶液中で接触して単一チャネル記録実験に適した二分子層を形成可能であることがわかっている。
【０００６】
本発明の第１の局面では、両親媒性分子の二分子層を製造する方法が提供され、該方法は、
（ｉ）疎水性媒体に水和支持体を供給するステップであって、疎水性媒体が両親媒性分子を含むと共に、両親媒性分子の第１単分子層が水和支持体の表面上に存在するステップと、
（ｉｉ）疎水性媒体に親水体を供給するステップであって、疎水性媒体が両親媒性分子を含むと共に、両親媒性分子の第２単分子層が親水体の表面上に存在するステップと、
（ｉｉｉ）第１単分子層と第２単分子層とを接触させて両親媒性分子の二分子層を形成するステップと、
を含む。
【０００７】
本発明の第１の方法のステップ（ｉ）が、疎水性媒体に親水体を供給し、疎水性媒体が両親媒性分子を含み、親水体の表面上に両親媒性分子の第１単分子層を形成するのが好ましい。
【０００８】
本発明の第１方法のステップ（ｉｉ）が、疎水性媒体に水和支持体を供給し、疎水性媒体が両親媒性分子を含み、水和支持体の表面上に両親媒性分子の第２単分子層を形成するのが好ましい。
【０００９】
本発明の第２の局面では、両親媒性分子の二分子層を製造する方法が提供され、該方法は、
（ｉ）両親媒性分子を含む疎水性媒体に水和支持体を供給するステップであって、両親媒性分子の第１単分子層が水和支持体の表面上に存在するステップと、
（ｉｉ）両親媒性分子を含む疎水性媒体に親水体を供給するステップであって、両親媒性分子の第２単分子層が親水体の表面上に存在するステップと、
（ｉｉｉ）第１単分子層と第２単分子層とを接触させて両親媒性分子の二分子層を形成するステップと、
を含む。
【００１０】
本発明の第２の方法のステップ（ｉ）が、両親媒性分子を含む疎水性媒体に親水体を供給し、親水体の表面上に両親媒性分子の第１単分子層を形成するのが好ましい。
本発明の第２の方法のステップ（ｉｉ）が、両親媒性分子を含む疎水性媒体に水和支持体を供給し、水和支持体の表面上に両親媒性分子の第２単分子層を形成するのが好ましい。
【００１１】
本発明の第１及び第２の両局面の方法により、長期間にわたり、環境及び／または物理的なストレスにさらされても安定しているという付加的利点を備えた両親媒性分子の二分子層が自然に形成されることがわかっている。
【００１２】
本発明の方法によって製造される両親媒性分子の二分子層の寿命は、約１時間、５時間、１０時間、２４時間、２日、１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月またはそれ以上であってもよい。
【００１３】
本発明の方法が、少なくとも約９０％の効率、より好ましくは約９５％、９８％、９９％の効率で二分子層を形成するのが好ましい。
二分子層が、水和支持体上の単分子層と親水体上の単分子層との間の１分以内の接触で形成されるのが好ましい。
【００１４】
両親媒性分子の二分子層は、物理的な衝撃に耐えることができ、例えば、二分子層は０．５メーターまたは１メーターを越える高さから一度以上落とされた後でも安定している。この二分子層の安定性により、本発明の方法により製造される二分子層は、既知の従来の方法により製造された二分子層より作業しやすい。
【００１５】
本発明の方法により製造される両親媒性分子の二分子層の驚くほど長い寿命と安定性には、ユーザが二分子層を設置可能であると共に、長期間及び／または多数の実験で使用することができるという利点がある。また従来の二分子層より手軽に、例えば、物理的環境がそれほど制御可能でも予測可能でもない、管理された実験室環境外で、携帯機器に使用できるという利点がある。
【００１６】
水和支持体及び親水体それぞれが両親媒性分子を含む疎水性媒体に配置される際、両親媒性分子の単分子層が、水和支持体及び親水体上で自己集合するのが好ましい。
単分子層における両親媒性分子の配向性は、単分子が接触すると二分子層が形成されることを意味している。
【００１７】
両親媒性分子は、親水グループ及び疎水グループの両方を有している。本発明の方法で形成される単分子層においては、両親媒性分子は、水界面に向かって親水基（または“表”）、水界面から離れるように疎水基（または“裏”）となるように親水体及び水和支持体上で整列している。
【００１８】
本発明の方法で使用される両親媒性分子は脂質分子であってもよく、特に、界面活性剤分子を使用してもよい。脂質分子は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、リン脂質、糖脂質、コレステロールを含むグループから選択されてもよい。
【００１９】
脂質は、モノオレイン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン；１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；またはそれらの混合物を含むグループのいずれかを含んでいてもよい。
【００２０】
単分子層または二分子層における両親媒性分子は、同じタイプまたは異なるタイプであってもよい。例えば、製造される二分子層が非対称になるように、二分子層のそれぞれの単分子層が異なるタイプの両親媒性分子を含んでいてもよい。非対称の二分子層は、第１の単分子層が第１のタイプの両親媒性分子を含む第１の疎水性媒体における水和支持体上に形成される本発明の第１の局面の方法を使用して製造されてもよい。第２の単分子層は、第２のタイプの両親媒性分子を含む第２の疎水性媒体における親水体上に形成される。第１及び第２両親媒性分子は異なっていてもよい。１つは親水体上、１つは水和支持体上の２つの単分子層は、両親媒性分子を含まない第３の疎水性媒体においてまとめられて非対称の両親媒性分子の二分子層を形成する。あるいは、非対称の二分子層は、水和支持体において、親水体において使用されるものと異なるタイプの両親媒性分子を用いることによって本発明の第２の方法によって製造されてもよい。
【００２１】
あるいは、それぞれの単分子層が同じタイプのまたは混合タイプの両親媒性分子を含んでいてもよい。
水和支持体は、固体または半固体の基質を備えていてもよい。本願で使用される“固体”及び“半固体”という用語は、当業者にとって通常の意味を有すると理解される。特に、“固体”という用語は硬くて変形に強い基質に言及し、“半固体”は、固体と液体との中間の性質を有する基質に言及する。半固体基質は、いくらか柔軟性があるものの、容器に入れられたときにその形を維持するのに十分な硬さがあり、容器の形にすぐに適合しないのが好ましい。半固体基質の例はゲルである。
【００２２】
水和支持体が親水性であるのが好ましい。両親媒性分子が存在する疎水性媒体に配置された場合に、両親媒性分子の単分子層が水和支持体の表面上で集合するのが好ましい。
あるいは、水和支持体は親水性でなく、脂質単分子層は脂質分子をその表面に付着させることにより形成されてもよく、例えば、支持体の表面は、変性脂質が表面と反応して付着して単分子層を形成してもよい。
【００２３】
水和支持体は多孔質であっても多孔質でなくてもよい。水和支持体が多孔質であるのが好ましい。
水和支持体はヒドロゲルであってもよい。ヒドロゲルが光架橋結合されていてもよい。
【００２４】
水和支持体が、アガロース、ポリアクリルアミド、［架橋結合された］ポリエチレングリコール、ニトロセルロース、ポリカーボネート、アノディスク材料、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、ナイロン、ナフィオン（Ｎａｐｈｉｏｎ）材料、メソ多孔質シリカ、水及び／またはガラスを含んでいてもよい。
【００２５】
水和支持体は、タンパク質または検体分離ゲル、例えば電気泳動ゲルであってもよい。分離ゲルは、例えば、大きさ、分子量またはイオン特性に基づいて分離したタンパク質、ＤＮＡまたは他の試料を含んでいてもよい。
【００２６】
両親媒性分子の単分子層を担持する水和支持体の表面は、適切であればいかなる構成であってもよい。表面はほぼ平面、あるいは表面がほぼ平面でなくてもよい。表面は湾曲していてもよい。表面はパターン化されていてもよい。
【００２７】
水和支持体は部分的にまたはほぼ透明であってもよい。あるいは、水和支持体は大部分不透明であってもよい。
水和支持体はいかなる厚みの基質を含んでいてもよく、好ましくは約１ｎｍから約１０ｃｍ、より好ましくは約１μｍから約１ｃｍ、最も好ましいのは約１００μｍ〜約１ｃｍである。
【００２８】
親水体は、液体、固体、または半固体あるいはそれらの混合物であってもよい。親水体が、水等の水溶液の液滴を含むのが好ましい。
親水体が水溶液の液滴である場合、その直径が約５ｎｍから１０ｃｍ以上、好ましくは１μｍから１ｍｍであるのが好ましい。ある実施例においては、液滴の直径は約１００μｍである。
【００２９】
親水体は、水和固体または半固体支持体／基質を含んでいてもよい。親水体は、水和アガロース等のヒドロゲルを含んでいてもよい。
親水体の構成が、的確な塩類を含むよう調整されて電流が流れるのが好ましい。例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2及び／またはその他の塩類が含まれていてもよい。
【００３０】
親水体はまた、ｐＨを制御するための一般的な緩衝剤、例えば、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、トリス、ヘペス、リン酸ナトリウム及び／またはリン酸カリウムを含んでいてもよい。
塩類はまた、例えば、タンパク質の安定化、結合成分の調整、二分子層全体の浸透勾配の調整及び／または蛍光プローブの活性化等、その他の理由により含まれていてもよい。
【００３１】
親水体は、浸透圧、蛍光プローブ、ミクロスフェアまたはビーズを安定化するために使用されるさまざまな量の、スクロースまたはＰＥＧ等のその他の成分も含んでいてもよい。親水体は、尿素またはグアニジンＨＣｌ等の変性剤も含んでいてもよい。
【００３２】
１つ以上の親水体が使用される場合、それぞれが同じ構成でもよいし、または異なる構成であってもよい。
疎水性媒体は油であってもよい。油は分岐または非分岐、及び、置換または非置換の炭化水素であってもよい。例えば、炭素水素は５から２０の炭素原子、より好ましくは１０から１７の炭素原子を有していてもよい。適切な油は、ヘキサデカン、デカン、ペンタンまたはスクアレン等のアルカンまたはアルケン、またはフッ素化油、またはシリコーンベースの油、または四塩化炭素を含む。
【００３３】
本発明の方法が、油（疎水性媒体）溶液中の脂質（両親媒性分子）を使用するのが好ましい。油溶液中の脂質が、油中に約１ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌの脂質を含むのが好ましい。油溶液中の脂質が、約５ｍｇ／ｍｌの脂質を含むのが好ましい。脂質／油溶液が、ｎ−ヘキサデカン（Ｃ16）中に１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）を含むのが好ましい。
【００３４】
二分子層を形成するための単分子層の接触に関連して本願で使用される“接触して”または“接触”という用語は、別々の両親媒性分子の単分子層からの両親媒性分子の二分子層の集合を可能にするための実際の物理的接触、及び／または十分な接近を意味するものと理解される。接触過程が、Ｇｉｂｂｓのプラトーボーダー作用の様式であるのが好ましい。
【００３５】
両親媒性分子の二分子層の直径は、約１μｍ未満から約１ｃｍを超えてもよく、好ましくは約５μｍから約５０００μｍ、より好ましくは約３０μｍから約３０００μｍである。二分子層の直径は、約５μｍから約５００μｍ、より好ましくは約３０μｍから約３００μｍであってもよい。当業者であれば二分子層が円形である必要がないことがわかる。非円形の二分子層が形成される場合、二分子層が前述した好ましい直径を有する部分を含むのが好ましい。例えば、本発明の非円形二分子層は、約１μｍから約１ｃｍ以上の直径を有する部分を含んでいてもよい。本発明の非円形二分子層の寸法の１つが、約１μｍから約１ｃｍ以上であるのが好ましい。
【００３６】
両親媒性分子の二分子層の領域は調整可能であってもよい。二分子層の使用前、使用中、または使用の合間に、二分子層の領域が調整可能であるのが好ましい。二分子層の領域は、親水体と水和支持体との間の接触領域を増加または減少することにより調整されてもよい。親水体と水和支持体との間の接触領域は、親水体の中心を水和支持体に向かって、または親水体の中心を水和支持体から離れるように移動することにより、あるいは水和支持体を親水体の中心に向かって、または水和支持体を親水体の中心から離れるように移動することにより調整されてもよい。二分子層の領域を増加するためには、親水体の中心を水和支持体に向かって移動するのが好ましい。二分子層の領域を減少するためには、親水体の中心を水和支持体から離れるように移動するのが好ましい。親水体を保持するのに電極が使用されている場合、二分子層の領域は、電極を水和支持体に向かって、または電極を水和支持体から離れるようにそれぞれ移動することによって増減されてもよい。代替実施例においては、親水体の位置は、光線（光学トラップ等）または圧力を使用することにより、付与される電界または磁界を利用して制御されてもよい。二分子層の領域は、親水体の容積、大きさ及び／または形を増減することにより調整されてもよい。二分子層を壊さずに二分子層の領域を変更可能であるのが好ましい。
【００３７】
５μｍと約５００μｍとの間のどの直径にも二分子層の領域を移動できてもよく、あるいは約１０秒未満、約５秒未満、約３秒未満、約２秒未満、約１秒未満または約０．５秒未満で二分子層の大きさを１００倍まで変更できてもよい。
【００３８】
二分子層の領域の制御は、驚くほど簡単で速い。二分子層の領域の制御は、二分子層に結合する膜タンパク質の数／量を制御できるという利点を持つ。驚いたことに、二分子層の領域の変更により、膜結合タンパク質が変性したり、あるいは二分子層から除去されることはない。実際、膜タンパク質がすでに二分子層に挿入されている場合、二分子層の領域が減少すると膜タンパク質は凝縮される。親水体と水和支持体との間の接触がなくなると二分子層は分解し、その中に位置する膜貫通タンパク質はもはや二分子層またはどちらの単分子層にも存在しない。
【００３９】
当該方法には、両親媒性分子の単分子層及び／または二分子層が形成されることができる安定期が含まれていてもよい。安定期は、システムを均衡にするためであってもよい。安定期は、約０秒から約５秒であってもよく、好ましくは、安定期が約１０秒から約１時間である。安定期は約１５分であるのが好ましい。いくつかの実施例においては、方法の１要素、例えば第１または第２の単分子層のいずれかが形成後に安定化された場合、他方の単分子層を二分子層の形成前に安定化する必要はない。
【００４０】
安定期は、親水体及び水和支持体が二分子層を形成せずに融合する危険を減少するという利点がある。
二分子層は倒立顕微鏡、またはいくつかの状況においては裸眼によって水和支持体を通して視覚化されてもよい。脂質二分子層の視覚化は、形態、位置、大きさ、またはその他の二分子層の特性を追跡するのに使用されてもよい。二分子層の視覚化は、二分子層におけるまたは二分子層中の標識検体／タンパク質／化合物を見たり調べたりすることを可能にする。
【００４１】
両親媒性分子の二分子層は、二分子層において、または二分子層中で、または二分子層を通して起きる処理を研究するために使用されてもよい。二分子層は、細胞膜の挙動を研究するための人工／モデルシステムとして使用できる。
【００４２】
タンパク質は、両親媒性分子の二分子層に挿入されてもよい。二分子層の環境、例えば、疎水性媒体及び／または親水体及び／または水和支持体におけるタンパク質は、二分子層に自然に挿入されてもよい。その代わりに、タンパク質は、圧力を付与することにより及び／またはタンパク質負荷小胞を二分子層と融合させることにより、二分子層に入れられてもよい。小胞は親水体内部に含まれていてもよいし、あるいは親水体に導入されてもよい。タンパク質はＧＢ０６１４８３５．７に開示されるプローブ法を使用して膜に導入されてもよい。タンパク質は、二分子層が既知の技術により形成された場合と同じ方法で二分子層に挿入されてもよい。
【００４３】
挿入されたタンパク質は、既知の膜結合タンパク質であってもよい。
タンパク質は、二分子層に直接または間接に固定される膜結合タンパク質であってもよい。タンパク質は、選択的または非選択的な膜内輸送タンパク質、イオンチャネル、孔形成タンパク質または膜常駐受容体であってもよい。
【００４４】
二分子層と結合及び／または二分子層に挿入される膜結合タンパク質は、例えばグラミシジンのようなペプチド；例えばバクテリオロドプシンまたはＫ+チャネルのようなαらせん束；及び例えばα溶血素、ロイコシジンまたは大腸菌ポーリンのようなβバーレル；またはそれらの組み合わせを含むグループのいずれかを含む。
【００４５】
両親媒性分子の二分子層は、二分子層中の両親媒性分子と、あるいは二分子層中の膜結合タンパク質と、相互作用できる化合物／検体を検出するのに使用されてもよい。膜結合タンパク質または両親媒性分子との相互作用は、二分子層全体の検体／化合物の特異的または非特異的の転位によるものであってもよく、膜結合タンパク質または両親媒性分子によって仲介されてもよい。その代わりに、化合物／検体は膜貫通タンパク質と、あるいは脂質二分子層と、相互作用して、物理的、工学的、電気的、または生化学的変化を引き起こしてもよい。このような相互作用には、視覚的変化、特定の静電容量変化、または二分子層中の蛍光標識脂質またはタンパク質の活性化が含まれるがそれらに限定されない、多くの異なる方法で検出されてもよい。
【００４６】
二分子層は膜結合タンパク質を検出するのに使用されてもよい。膜結合タンパク質は、イオンチャネルタンパク質及び／または孔形成タンパク質であるのが好ましい。膜結合タンパク質は、二分子層に拡散及び／または結合されて、二分子層における検出可能な特性変化を引き起こすのが好ましい。変更される特性は、物理的、光学的、電気的または生化学的であってもよい。
【００４７】
本発明の方法により製造される両親媒性分子の二分子層を利用して、膜結合タンパク質を調査及び／またはスクリーニングする；膜結合タンパク質と相互作用する検体を調査及び／またはスクリーニングする；異なる両親媒性分子から作られる二分子層と相互作用する化合物を調査及び／またはスクリーニングしてもよい。異なる両親媒性分子の二分子層をスクリーニングして、異なる両親媒性分子の役割及び／または異なる両親媒性分子のさまざまな検体／化合物との相互作用を研究してもよい。
【００４８】
二分子層を利用して、二分子層に挿入された膜結合タンパク質の電圧依存性を研究してもよい。例えば、ＤＰｈＰＣから構成される二分子層は、２２℃で約０．３から約０．９μＦｃｍ-2、好ましくは２２℃で約０．６５μＦｃｍ-2、の間の特定の静電容量を有していてもよい。特定静電容量特性の変化を研究することにより、異なる条件により引き起こされる二分子層の特性変化を研究することができる。異なる検体／化合物との膜貫通結合タンパク質の相互作用と同様に、例えば、二分子層を横断するイオン電流を研究することにより、イオン透過膜貫通結合タンパク質の特性を研究してもよい。
【００４９】
二分子層を利用して、二分子層に挿入された膜結合タンパク質の能力を研究し、膜全体にわたって分子を移動させてもよい。例えば、タンパク質を通して、または単純に二分子層を通しての非仲介輸送のいずれかによって膜全体にわたって移動させられる分子の量を、電圧調査、質量分析、ＥＬＩＳＡ等の酵素的技術を使用することにより、または蛍光または放射能標識基質を使用することにより、決定してもよい。
【００５０】
本発明の方法により製造される二分子層を利用して、二分子層中のタンパク質または二分子層そのものに対する二分子層の物理的変化の効果を研究してもよい。研究可能な物理的変化には、例えば、膜湾曲、横力、表面張力等が含まれる。
【００５１】
スクリーニングにおいて、試験され、研究され及び／または使用される化合物／検体は、化合物／検体を親水体及び／または水和支持体及び／または疎水性媒体に配置することによりシステムに導入されてもよい。親水体に含まれる場合、化合物／検体は、親水体が形成される際に組み込まれてもよいし、あるいは、例えば形成された親水体に注入することにより、後で付加されてもよい。同様に、化合物／検体が水和支持体にある場合、化合物／検体は、支持体が形成される際に組み込まれてもよいし、あるいは後で付加されてもよい。
【００５２】
ある実施例において、水和支持体は、分析のためのタンパク質（検体／化合物）を含むタンパク質分解ゲルまたは膜であってもよい。例えば、試料は、大きさに基づいて分離されたタンパク質を含むポリアクリルアミドゲルであってもよい。この実施例において、検体／化合物は、水和支持体を介して二分子層に導入される。
【００５３】
検体／化合物は、精製タンパク質または抽出粗タンパク質であってもよい。
試験される検体／化合物は、試料内にあってもよい。試料は、例えば川または貯水池など等の水域からの環境試料、または試料は生物試料、例えば、血液、尿、血清、唾液、細胞または組織の試料であってもよい。試料は、細胞増殖培地からの液体であってもよい。
【００５４】
両親媒性分子の二分子層のまたは二分子層に挿入された膜結合タンパク質の化学、生化学、電気、光学、物理及び／または環境特性を検出するのに、検出手段を１つ以上使用してもよい。特に、検出手段を１つ以上使用して、化合物／検体により誘発される二分子層中または二分子層における変化を検出してもよい。
【００５５】
検出手段は、二分子層中に挿入されたタンパク質チャネルを通過するイオン電流の変化または水和支持体、親水体または二分子層における分子の電気化学特性を検出するために使用される電極を備えていてもよい。
【００５６】
化学または生化学的変化を、酵素測定または免疫測定を利用して検出してもよい。あるいは、一定の条件下で活性化される標識タンパク質、例えば放射能または蛍光標識タンパク質の利用により二分子層における変化を監視してもよい。反応の際の光吸収の変化に反応する比色法を利用して、二分子層における変化を検出してもよく、特に、二分子層の大きさの変化を検出するのにこの方法を使用してもよい。
【００５７】
検出手段は、二分子層の、または二分子層における変化の特性を、継続的にまたは断続的に検出可能であってもよい。
膜結合タンパク質、検体及びその他の化合物のような検出試薬が、親水体及び／または水和支持体への組み込み、親水体及び／または水和支持体への直接注入、及び／または疎水性媒体への組み込み、または追加、により二分子層に加えられてもよい。
【００５８】
膜容量の変化が調査されている実施例において、電極を検出手段として使用してもよい。電極はＡｇ／ＡｇＣｌであってもよく、そのような電極の直径は、約１０ミクロンから１ｍｍであってもよい。第１の電極は親水体と電気的に接触していてもよく、第２の電極は水和支持体と電気的に接触していてもよい。二分子層の特定容量等の二分子層の電気特性は、電極を使用して決定されてもよい。
【００５９】
極微操作装置が使用されて、親水体及び／または水和支持体に電極を挿入してもよい。
二分子層の物理的、化学的または電気的環境を、試薬、検体、化合物及び／またはタンパク質の、二分子層及び／または親水体及び／または水和支持体への、または二分子層及び／または親水体及び／または水和支持体からの導入、除去、または隔離によって制御してもよく、例えば、親水体及び／または水和支持体へ緩衝剤を追加することによって、二分子層を囲む環境のｐＨを制御してもよい。
【００６０】
二分子層は、親水体と水和支持体との間の接触を断ち、その後、二分子層を再形成するために再接触させることにより、繰り返し再生されてもよい。親水体の中心と水和支持体との間の距離を、二分子層が不安定になり自然に分解するポイントまで増加することにより、二分子層を分解してもよい。
【００６１】
例えば親水体と水和支持体との間の接触を断って二分子層を分解することにより、二分子層における膜結合タンパク質の二分子層との結合を断ってもよい。一旦二分子層が分解されて膜結合タンパク質が除去されてしまえば、二分子層を再生して、膜結合タンパク質、あるいは異なる膜結合タンパク質が二分子層と結合しないようにしてもよい。
【００６２】
二分子層の領域を縮小することによって二分子層と結合された膜結合タンパク質の濃度を増加してもよい。逆に、二分子層と結合された膜結合タンパク質の濃度を、二分子層の領域を増加することによって縮小してもよい。
【００６３】
二分子層における膜結合タンパク質の濃度を増加する能力を利用して、膜結合タンパク質を含む二分子層の領域を縮小し、その結果、膜タンパク質が拡散する領域を制限することにより、膜結合タンパク質の二次元結晶を製造してもよい。
【００６４】
二分子層における膜結合タンパク質の濃度を増加または縮小する能力を利用して、例えばタンパク質のサブユニット間またはタンパク質複合体の要素間のタンパク質間相互作用を調節してもよい。
【００６５】
一旦形成されると、本発明のいずれかの方法によって製造される二分子層を、水和支持体の表面全体にわたって位置移動または移動してもよい。このことが、親水体を水和支持体の表面全体にわたって移動させることにより達成されるのが好ましい。脂質二分子層を、約１または２ｍｍ  ｓ-1以上の速度で水和支持体の表面全体にわたって位置移動してもよい。二分子層を水和支持体の表面全体にわたって位置移動した場合、二分子層内部の膜結合タンパク質が二分子層との結合を断たないことが好ましい。
【００６６】
親水体または水和支持体と接触する部材を移動することにより、水和支持体の表面全体にわたっての二分子層の位置移動を達成してもよい。その部材は電極であるのが好ましい。水和支持体全体にわたって親水体を移動する、または親水体全体にわたって水和支持体を移動することのいずれかにより二分子層の位置を移動するために、極微操作装置を使用してその部材を移動するのが好ましい。あるいは、水和支持体及び親水体の両方を移動してもよい。
【００６７】
二分子層の位置移動を利用して、二分子層中のタンパク質に力を加えてもよく、例えば、機械感受性タンパク質チャネルを調査するため、または二分子層自身の特性に対するそのような力の影響を調べてもよい。
【００６８】
二分子層の位置移動を利用して、二分子層及び／または二分子層中の膜結合タンパク質の特性を変える水和支持体中の検体／化合物の識別のために、水和支持体の表面全体をスキャンしてもよい。
【００６９】
水和支持体の表面全体にわたって位置移動する二分子層の驚くべき特性には、膜結合タンパク質及び／または同じ水和支持体の異なる部位に位置する試薬または基質等の検体／化合物を検出するために二分子層を用いて水和支持体全体にわたってのスキャンが可能という利点がある。このことは、それぞれの試料部位間で二分子層を分解せずに有利に行うことができる。
【００７０】
二分子層を、異なる化合物の配列またはライブラリを備える水和支持体全体にわたって位置移動してもよい。所定の位置において、異なる化合物を支持体上に見つけてもよい。あるいは、水和支持体が、大きさまたはイオン特性に基づいて分離されたタンパク質またはＤＮＡ等の化合物を含む分離ゲルまたは膜を備えていてもよい。
【００７１】
１つ以上の二分子層の位置移動により、１つ以上の特定の膜結合タンパク質を備える二分子層を水和支持体中の化合物のライブラリに対して迅速にスクリーニングすることが可能になる。スクリーニングにより、膜結合タンパク質と反応して二分子層での特性に検出可能な変化を起こすライブラリ中の化合物の検出が可能になる。ライブラリ中の化合物は、タンパク質、ＤＮＡまたはその他の小分子であってもよい。検出可能な変化は、例えば、伝導性の変化または蛍光性またはその他のマーカーパターンの変化であってもよい。
【００７２】
あるいは、または付加的に、二分子層の位置移動が、潜在的な膜結合タンパク質を求めて、水和支持体中の化合物のライブラリをスクリーニングするのを可能にしてもよい。この場合も、二分子層における特性の変化、例えば、膜全体にわたる伝導性または容量の変化により、膜結合タンパク質を検出してもよい。ライブラリは、細胞または細胞集団から抽出されるタンパク質を含んでいてもよい。
【００７３】
二分子層を多孔水和支持体上に形成し、ＡＴＰ等の排出化合物中の局所的な濃度差を検出するために細胞の表面全体にわたってスキャンしてもよい。細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。二分子層を使用して、インビトロ（in  vitro）またはインビボ（in  vivo）で細胞表面上の、細胞排出物等の検体／化合物を検出してもよい。
【００７４】
二分子層をピペットチップ等のモバイル機器中のつり下げ水和支持体上に形成し、細胞の表面全体にわたってスキャンしてもよい。あるいは、モバイル機器を使用して、例えば異なる生物試料などの異なる溶剤を精査してもよい。
【００７５】
複数の別々の親水体及び１つ以上の水和支持体との間で複数の別々の二分子層を形成してもよい。親水体を同じ水和支持体上で１つ以上のその他の親水体と接触させて、それぞれの親水体間及び親水体と水和支持体との間で、複数の別々の脂質二分子層を形成してもよい。親水体を２次元配列または３次元配列に配置してもよい。
【００７６】
同じ水和支持体上の２つ以上の別々の親水体が、それぞれに対し、同じまたは異なる検出手段及び／または異なる試薬、及び／または同じまたは異なる膜結合タンパク質を含んでいてもよい。
【００７７】
水滴の配列を水和支持体表面に配置して、例えば親水体の蛍光性または検体／化合物が検出される際に記録された伝導性の変化により、水和支持体中の検体／化合物の位置を検出してもよい。
【００７８】
別の局面によると、本発明は親水体及び水和支持体を含み、その間に両親媒性分子の二分子層を備えた二分子層製品を提供する。親水体上の両親媒性分子の単分子層と水和支持体上の両親媒性分子の単分子層との相互反応により、二分子層を形成するのが好ましい。
【００７９】
本発明のどの方法により二分子層を形成してもよい。
当業者であれば、本発明の第１または第２局面に関連して議論されたあらゆる好ましい特徴、そして特に二分子層の製造ではなく二分子層自身に関連する特徴が、本発明による二分子層製品及び二分子層を使用する発明のあらゆる局面に適用できることがわかるだろう。
【００８０】
本発明の別の局面によると、蛍光顕微鏡検査法との関連で本発明による二分子層製品の使用法が提供される。
水和支持体の性質により、顕微鏡を用いて二分子層を見ることが可能であるのが好ましい。したがって、本発明のこの局面では、水和支持体は約２ｍｍ未満の厚さの層であるのが好ましい。支持体の厚さが、約１ｎｍから約２ｍｍ、好ましくは約１００ｎｍから約１ｍｍ、さらに好ましくは支持体の厚さが約１００ｎｍから約４００ｎｍであるのが好ましい。
【００８１】
約４００ｎｍ未満の厚さの薄い水和支持体を使用する場合、かなりの量の水和液または水和支持体等の再水和媒体と接触させておくことで、薄い支持体が乾燥しないようにするのが好ましい。再水和媒体は、材料／構成について薄い水和支持体と同じまたは異なっていてもよく、薄層から水分が失われるのを防止するために存在する。再水和支持体は、アガロースゲル、水またはポリアクリルアミドゲルであってもよい。再水和支持体は、多孔質または固体であってもよい。
【００８２】
観察される分子を蛍光色素分子で蛍光標識してもよい。
親水液滴及び／または水和支持体中の蛍光色素分子が、全内部反射蛍光を使用して観察されるのが好ましい。全内部反射蛍光を使用した観察が電気計測と組み合わせて使用されるのが好ましい。
【００８３】
二分子層のバルク特性として、または個々の分子レベルに至る適切な検出と合わせてのいずれでも、全内部反射蛍光顕微鏡を使用して二分子層中に存在する実在物から蛍光性を観察してもよい。
【００８４】
全内部反射蛍光を使用して蛍光色素分子を観察する利点は、脂質二分子層に接近していないその他の蛍光色素分子は発光せず観察されない一方で、脂質二分子層の約２００ｎｍ以内の蛍光色素分子のみが発光して観察されることである。電気計測と組み合わせて全内部反射蛍光計測の利用は、タンパク質間相互作用を調べることができるという利点があり、例えば、標識サブユニットまたはイオンチャネルの電気的反応から蛍光基質の結合までのα溶血素等のチャネルタンパク質の集合体を調べることができる。
【００８５】
本発明のさらなる局面によると、両親媒性分子の二分子層とライブラリ中の１つ以上の化合物との間の相互作用のためのスクリーニング方法であって、
ｉ）親水体及び水和支持体を備え、その間に両親媒性分子の二分子層を備えた二分子層製品を提供するステップと、
ｉｉ）親水体を、それにより水和支持体の表面全体にわたって二分子層を位置移動させるステップと、
ｉｉｉ）水和支持体中での二分子層と化合物との間の相互作用を検出するステップと、
を含む。
【００８６】
二分子層製品が、本発明の第１または第２の局面の方法により製造されるのが好ましい。
水和支持体が、試験されるべき化合物のライブラリを含むのが好ましい。
【００８７】
ある実施例において、二分子層が水和支持体全体にわたって位置移動される前またはされる際に、膜結合タンパク質を二分子層に挿入してもよい。
二分子層の位置移動は、親水体を移動するように配置された極微操作装置と親水体との直接または間接接触により行われてもよい。親水体は、移動される電極に接触し、水和支持体全体にわたって二分子層を位置移動してもよい。
【００８８】
生産性の高いスクリーニングが行われることができるようにスクリーニング方法を自動化してもよい。
当業者であれば、二分子層の製造方法、二分子層そのもの及び二分子層の位置移動に関する本発明のいずれの局面の好ましい特徴も、本発明のこの局面に適用できることが理解される。
【００８９】
本発明のさらなる局面によると、本発明の二分子層製品が水和支持体または親水体中及び／または親水体上に存在する１つ以上の膜結合タンパク質を識別するための使用法が提供される。
【００９０】
本発明のさらなる局面によると、本発明の二分子層製品が二分子層の中に位置する膜結合タンパク質と相互作用し得る基質を識別するための使用法が提供される。
本発明の別の局面によると、水溶液中に存在する１つ以上の検体を検出するための方法が提供され、該方法が、
（ａ）壁付き容器に、油中に脂質が入った溶液を供給するステップであって、容器の壁の少なくとも一部が多孔水和支持体を備えるステップと、
（ｂ）油中に脂質が入った溶液に親水体を供給するステップと、
（ｃ）多孔水和支持体の表面上に脂質分子の第１単分子層及び親水体の表面上に脂質分子の第２単分子層を形成するステップと、
（ｄ）多孔水和支持体を親水体と接触させて、親水体上の脂質単分子層と多孔水和支持体上の脂質単分子層との間に脂質二分子層を形成するステップと、
（ｅ）多孔水和支持体を水溶液と接触させて、水溶液に存在する検体を脂質二分子層に利用可能にするステップと、
（ｆ）検出手段を使用して、脂質二分子層への検体の挿入及び／または脂質膜全体にわたる検体の位置移動及び／または検体の二分子層との相互作用を検出するステップと、
を含む方法。
【００９１】
脂質／油溶液を保持するための壁付き容器を備えた脂質二分子層と共に使用される装置であって、容器の壁の少なくとも一部が使用中に水和されるように配置される多孔支持体を備える。
【００９２】
装置は検出手段を備えていてもよい。検出手段は電極または光検出器であるのが好ましい。
装置が携帯可能であるのが好ましい。装置は手持ち式であるのが好ましい。
【００９３】
壁付き容器はピペットチップであってもよい。
本発明のいくつかの局面のみに関連して議論された本発明の選択的及び／または好ましい特徴の全てが、本発明のあらゆる局面に適用可能であることが理解される。
【００９４】
本発明の好ましい実施例／局面を、添付の図面に関してのみ例として以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】水和支持体二分子層上の水滴（親水体）を示しており、本願では液滴載置水和支持二分子層（ＤＨＢ）として参照される。図１Ａは、液滴載置水和支持二分子層の概略図である。疎水性油中に脂質を入れた溶液中に水（水）滴及び水和支持体（ヒドロゲル）それぞれを浸すと、水（水）滴及び水和支持体（ヒドロゲル）の水性表面上に脂質単分子層が自然に形成される。２つの要素の単分子層が接触すると脂質二分子層が形成される。図１Ｂは、倒立顕微鏡で下から視覚化された液滴二分子層（ＤＨＢ）を示し、その画像は、電極なしでヒドロゲル表面上に支持された液滴を示す。液滴の中心の単一連続二分子層領域は、インターフェイスでの屈折率の変化が大きいために容易に観察できる。図１Ｃは、液滴と水和支持体との間の脂質二分子層が、液滴及び水和支持体の両方に挿入される電極を介して電気的にアクセス可能であることを表している。電気容量トレースは脂質二分子層の形成を示している。二分子層の容量は、三角潜在波形を脂質二分子層に適用し方形波最大振幅電流応答を計測することにより決定される。
【図２】液滴載置水和支持二分子層を使用したヒドロゲル中のタンパク質のスキャニングを示す。図２Ａ及び２Ｂは、放射能標識タンパク質バンドを視覚化するために、乾燥ゲル（視認可能な予め着色されたマーカーレーンＭを含む）の画像にオートラジオグラフを重ねることにより作成された、液滴載置水和支持二分子層スキャニング後のポリアクリルアミドゲルの複合画像を示す。マーカーレーン（Ｍ）バンドは約２１０、１１１、７１ｋＤａの分子量に相当する。図２Ａは、カリウムチャネルＫｃｖを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図２Ｂは、孔形成タンパク質アルファ溶血素（αＨＬ）αＨＬ−ＷＴ（ＷＴ）及び七量体のタンパク質孔を形成するαＨＬＭ１１３Ｆ−Ｄ８（１１３Ｆ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。ＤＰｈＰＣ／Ｃ16（脂質／油）溶液中に浸された後、ゲル（水和支持体）との接触で二分子層を形成した水滴２００ｎＬでゲルがスキャンされた。ゲル表面上の液滴二分子層の位置に応じてパッチクランプ増幅電気記録により二分子層におけるタンパク質挿入及び結合が監視された。図２Ｃは、Ｋｃｖ（＋２０ｍＶ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０）、αＨＬ−ＷＴ及びαＨＬ−Ｍ１１３Ｆ−Ｄ８（＋１０ｍＶ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａiＰＯ4、ｐＨ７．０）を含むゲルの部位からの典型的な電気記録を示す。αＨＬチャネルは、１０μＭ  β−シクロデキストリン（βＣＤ）を含む液滴でスキャンされて、２つの突然変異体を識別する。図２Ｄは、分離されたタンパク質バンドの周囲の局所的な部位でのみチャネルタンパク質挿入が観察されたことを示す。このことは、二分子層の位置に応じたチャネルタンパク質挿入の割合を示す、αＨＬ−ＷＴバンド（図２Ｂにおけるゲル上に印を付けられた点線）全体にわたる１２ｍｍ線形スキャンにより示されている。
【図３】液滴載置水和支持二分子層を使用したゲル中の細胞抽出物のスキャニング結果を示す。図３Ａは、液滴載置水和支持二分子層スキャニング後のクマシー染色ポリアクリルアミドゲルを示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製大腸菌細胞抽出物を示す。大腸菌細胞株は、別々に変容して、漏出性発現を通してαＨＬ−ＷＴ（レーン１）及びαＨＬ−Ｍ１１３Ｆ−Ｄ８（レーン２）を製造する。ＤＰｈＰＣ／Ｃ16（脂質／油）溶液中に浸された後、ゲルを、１０μＭのβ−シクロデキストリンを含む水滴２００ｎＬでスキャニングした。ゲル表面上の液滴二分子層の位置に応じて、パッチクランプ増幅電気記録を介して二分子層におけるタンパク質挿入及び結合を監視した。図３Ｂは、ゲル上に円で囲まれた部位のスキャンからの典型的な電気記録を示す。大量のαＨＬ−ＷＴ（上部）及びαＨＬ−Ｍ１１３Ｆ−Ｄ８（中間）チャネルが示された部位から挿入された。少量の正体不明のポーリン状のチャネル（底部）がゲルの下方の部位で見つかった。
【図４】液滴載置水和支持二分子層を使用したシクロデキストリンのスキャニングを示す。図４Ａは、吸収によりポリアクリルアミドにドープされた分子をスキャニングするために使用された実験的方法の概略図を示す。γ−シクロデキストリン(γＣＤ)及びヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン（ｈβＣＤ）を約１０ｍｍ離してゲルの底部に導入した。脂質／油溶液に浸して安定化した後、ゲルをαＨＬ−ＷＴチャネルを含む液滴でスキャニングした。液滴二分子層中のαＨＬ−ＷＴチャネルに結合しているシクロデキストリンを、ゲル表面上の液滴二分子層の位置に応じて、パッチクランプ増幅電気記録を介して監視した。図４Ｂは、αＨＬ−ＷＴに対するγＣＤ（上部、６８％ブロック)及びｈβＣＤ（底部、９５％ブロック）の結合特性が、電気記録（−５０ｍＶ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａiＰＯ4、ｐＨ７．０）においてはっきりと区別できることを示す。図４Ｃは、２つのドープ位置間のスキャンにおける距離に応じて描画された２つのシクロデキストリンの結合頻度を示す。線は、測定された結合頻度に合致するガウス分布を示す。
【図５】脂質／油溶液に浸されつつ、ピペットチップから射出された液滴（親水体）の図を示す。液滴はヒドロゲル（水和支持体）と接触して脂質二分子層を形成する。
【図６】倒立顕微鏡を使用して下から視覚化された図５の方法を使用して製造された液滴載置水和支持二分子層を示す。
【図７】水性システムをスキャンまたは探査するために使用可能なピペットの先端に固定された水和支持体上に形成された脂質二分子層の図である。
【図８】液滴中にまたは液滴との電気接触において挿入される電極を使用して水和支持体に向かってまたは水和支持体から離れるように水滴の中心を移動させることにより、脂質二分子層がどのように領域内で増加及び減少可能かを示す図である。
【図９】試薬を積んだ第２の水滴が、二分子層を破らずに、いかにして水滴と一緒に破裂できるかを示す。
【図１０】（Ａ）マイクロピペットまたは（Ｂ）多孔毛細血管を供えたマイクロピペットからの注入により、試薬をいかにして水滴中に導入可能かを示す図である。
【図１１】単一水和支持体上の複数の液滴載置水和支持二分子層を示す。図１１Ａは、独立した／別個の液滴を示す。図１１Ｂは、液滴間及び下部の水和支持体と共に多数の脂質二分子層を形成する結合された液滴を示す。
【図１２】液滴載置水和支持二分子層上の全反射蛍光顕微鏡を示す。
【図１３Ａ】本発明の二分子層を製造するのに使用される代替携帯装置を示す。
【図１３Ｂ】倒立顕微鏡を使用して下から視覚化した図１３Ａの装置を使用して製造された二分子層を示す。
【図１４Ａ】二分子層の配列を製造するための装置を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａの装置を使用して製造された二分子層を示す。
【図１５Ａ】水相がかん流可能な二分子層を製造するための装置を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａの装置を使用して作り出された電気トレースを示しており、上部トレースにはα溶血素チャネルが二分子層に挿入されているのが示され、底部トレースにはシクロデキストリンが結合されているのが示されている。
【図１５Ｃ】図１５Ａの装置により製造された二分子層を示す。
【図１６】水滴がマイクロ流体チャネルである、図１５Ａの装置の代替装置を示す。
【図１７】本発明の方法により製造された大きな二分子層を示す。
【図１８】本発明の方法により製造されたさらに大きな二分子層を示す。
【図１９】本発明の二分子層を使用している膜結合タンパク質の濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
特定の例において参照される“液滴載置水和支持二分子層”は、先に説明した“両親媒性分子の二分子層”と同じである。
方法
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ヘキサデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、γ−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン（Ｃｙｃｌｏｌａｂ）が、さらなる精製を行わずに使用された。
タンパク質のインビトロ（in vitro）転写／翻訳
αＨＬ−ＷＴ、αＨＬ−Ｍ１１３Ｆ−Ｄ８（Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１８，４８１−４９３）（ＲＬ２バックグラウンド（Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８，１２５７−１２６７）及びαＨＬ−ＷＴに関連するゲルシフトを引き起こすＣ末端Ｄ８伸長部）及びＫｃｖを、前述したように（Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７，１０９０２−１０９０９）結合インビトロ（in vitro）転写／翻訳（ＩＶＴＴ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ｐＴ７．ＳＣ１ベクター（Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０，１４３３−１４４３）においてクローンが作られた遺伝子から作製した。オートラジオグラフィによる視覚化のために、35Ｓメチオニンをタンパク質に組み込んだ。
【００９７】
αＨＬタンパク質の５０μＬのインビトロ（in vitro）転写／翻訳反応を、前述したようにオリゴマー化し（Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７，１０９０２−１０９０９）、その後ペレット状にして再懸濁した（２０μＬ，１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝剤,ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍｇ  ｍＬ-1  ＢＳＡ）。電気泳動の前に、２０μＬの再懸濁されたオリゴマー標本を、５μＬの５ｘ  ＳＤＳ含有Ｌａｅｍｍｌｉバッファ（終末濃度：１０％（ｖ：ｖ）グリセロール、５％  ２−メルカプトエタノール、２．３％  ＳＤＳ、０．０６２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）と混合した。
【００９８】
１００μＬのインビトロ（in vitro）転写／翻訳反応をＫｃｖについて実行し、ついでその生成物を電気泳動により１０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル中で分離した。ゲルを室温で真空下において紙上で乾燥し、その後オートラジオグラフィにより撮像した。Ｋｃｖ四量体に対応するバンドをゲルから切り取って再水和した（３００μｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）。再水和されたゲルを押し砕いて、０．２μｍの酢酸セルロース精密ろ過チューブ（Ｒａｉｎｉｎ）に移し、２５０００ｇで３０分遠心分離して可溶化タンパク質を回収した。
インビトロ（in vitro）転写／翻訳タンパク質の電気泳動
５μＬアリコートのゲル精製されたＫｃｖ四量体を８．５％トリス酢酸ポリアクリルアミドゲルに積み、ＴＢＥバッファ（８．９ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３、８．９ｍＭ  ホウ酸、２００μＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ）中で電気泳動を行って（２００Ｖ、２０分）タンパク質バンドを分離した。その後ＳＤＳなしのＴＢＥバッファをゲルタンクに補充し、電気泳動を継続して（５０Ｖ、２時間）ゲル中のＳＤＳを除去した。
【００９９】
５μＬアリコートのインビトロ（in vitro）転写／翻訳α溶血素オリゴマーを７％トリス酢酸ポリアクリルアミドゲル（ＸＴ  Ｃｔｒｉｔｅｒｉｏｎ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に積み、ＸＴ  Ｔｒｉｃｉｎｅバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）中で電気泳動を行って（２００Ｖ、１時間）タンパク質バンドを分離した。その後ＳＤＳなしのＬａｅｍｍｌｉバッファをゲルタンクに補充し、電気泳動が継続して（１００Ｖ、２時間）ＳＤＳを除去した。
【０１００】
全てのゲルを予め着色されたマーカーレーン（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って試験した。液滴載置水和支持二分子層ゲルスキャニングに続いて、オートラジオグラフィによりゲルを撮像した。
大腸菌粗抽出物及び電気泳動
コンピテント大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をαＨＬ−ＷＴまたはαＨＬ−Ｍ１１３Ｆ−Ｄ８のいずれかをコード化するｐＴ７プラスミドとの熱ショックにより形質転換した。単一コロニー形質転換細胞を取り出し、５０μｇ  ｍＬ−１アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１６時間培養した。その後、細胞を２５００ｇで２０分間遠心分離し再懸濁した（２００μＬ、２５ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％（ｗ：ｖ）ＳＤＳ、５００ｎｇ  ＤＮａｓｅ  １）。氷上での３０分間のインキュベーションに続いて、２００μＬサンプルを５０μＬの５ｘ  ＳＤＳ含有Ｌａｅｍｍｌｉバッファと混合した（終末濃度:１０％（ｖ:ｖ）グリセロール、５％  ２-メルカプトエタノール、２．３％  ＳＤＳ、０．０６２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）。この溶液４５μＬをその後１０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（ＸＴ  Ｃｔｒｉｔｅｒｉｏｎ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に積み、ＸＴ  ＭＯＰＳバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）中で電気泳動（２００Ｖ、３０分）を行った。その後ＳＤＳなしのバッファ（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０）をゲルタンクに補充し、電気泳動が継続して（１００Ｖ、２時間）ＳＤＳを除去した。
【０１０１】
液滴載置水和支持二分子層ゲルスキャニングに続いて、クマシーブリリアントブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でゲルを染色した。
液滴載置水和支持二分子層ゲルスキャニング
電気泳動後、Ｋｃｖゲルを５００ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファ（ｐＨ７．０）に少なくとも３０分間浸した。αＨＬ及び大腸菌ゲルを１Ｍ  ＫＣｌを含む１０ｍＭ  Ｎａ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）バッファに浸した。透析後、ゲルは１０ｍＭ  ＤＰｈＰＣ／Ｃ16溶液中に１０分間放置され、その後、約２００ｎＬ液滴のゲル中のバッファと同じバッファでスキャンされた。液滴をｄｘｄｙｄｚ極微操作装置（ＮＭＮ−２１；Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）に取り付けられた挿入Ａｇ／ＡｇＣｌ電極と共にヒドロゲルの表面のあちこちに移動させた。
電気測定及び二分子層撮像
直径１００μｍのＡｇ／ＡｇＣｌワイヤー電極を使用して、液滴及びゲルに電気的にアクセスした。電流をパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ；Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で記録し、１ｋＨｚ（ＭｉｎｉＤｉｇｉ−１Ａ；Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でデジタル化した。電気トレースを獲得後にフィルタにかけ（１００Ｈｚローパスガウシアンフィルタ）、ｐＣｌａｍｐ９．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して分析した。ゲルスキャニング装置及び増幅ヘッドステージを、液滴載置水和支持二分子層の撮像及び位置追跡のためのカメラ（ＤＳ−１ＱＭ；Ｎｉｋｏｎ）を装備する倒立顕微鏡（ＴＥ−２０００；Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＵＫ）に取り付けられたファラデー箱に入れた。
結果液滴載置水和支持二分子層の製造
ヘキサデカン（Ｃ16）中の１０ｍＭ  １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）を全ての実験において脂質／油溶液として使用した。この溶液に浸された水滴は、ＤＰｈＰＣ単分子層を自然に自己収集し、２つの要素の単分子層が接触すると、自然に脂質二分子層を形成する（Ｔｓｏｆｉｎａ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９６６．Ｎａｔｕｒｅ  ２１２，６８１−６８３；Ｍａｌｍｓｔａｄｔ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６，１９６１−１９６５；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８，８１６９−８１７４；Ｈｏｌｄｅｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  −近刊）。水滴をヒドロゲル等の多孔水和支持体に接触させることにより、液滴載置水和支持二分子層を形成する（図１Ａ）。溶解を防ぐために単分子層を接触させる前に少なくとも１５分の安定期を必要とした。この期間の後、ほぼ１００％の効率性で水滴と水和支持体との接触の数秒から数分以内に二分子層の形成を観察した。液滴載置水和支持二分子層を、倒立顕微鏡（図１Ｂ）で視覚化し、この技術を利用して、試験中に脂質二分子層の位置を追跡した。
【０１０２】
極微操作装置を使用して液滴（図１Ａ）に直径１００μｍのＡｇ／ＡｇＣｌ電極を挿入することにより、脂質二分子層に電気的にアクセスした。水和支持体中の対応するＡｇ／ＡｇＣｌ接地電極で、脂質二分子層全体の電気測定を実施した。脂質二分子層は、１００ＧΩを超えてシールを保持する一方で、通常は約３００ｍＶまでの電圧に耐えることができた。電気ノイズレベルは、通常は１ｋＨｚ記録バンド幅で約±０．５ｐＡだった。これは、この装置の限界を反映し、液滴載置水和支持二分子層中の固有のノイズを反映していない。
【０１０３】
静電容量測定（図１Ｃ）と併せての二分子層部位（図１Ｂ）の同期光学的測定により、本システム中のＤＰｈＰＣ二分子層に２２℃で０．６５μＦｃｍ-2の特定容量がもたらされた。これは他の報告された値（０．４〜０．８μＦｃｍ-2）（Ｍｏｎｔａｌ，Ｍ．＆Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．１９７２．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  of  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ６９，３５６１−３５６６；Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １１９，６７６８−６７７５；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８，８１６９−８１７４）によく合致し、脂質二分子層が厚さにおいて自らの平面二分子層の片割れに類似することを示している。
液滴載置水和支持二分子層を用いたゲルスキャニング
単一チャネル記録測定を行う一方でゲル全体における二分子層の位置をスキャンすることによって、脂質二分子層に挿入された単離膜チャネルの位置を決定できる。ヒドロゲル中の電気泳動により分離されたタンパク質バンドに適用した場合、スキャニングは、特定のバンドがチャネル形成タンパク質を含んでいたかどうかの判断を可能にする。この技術を有効にするために、ウイルス性カリウムチャネルＫｃｖ（Ｐｌｕｇｇｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，１６４１−１６４４；Ｇａｚｚａｒｒｉｎｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５５２，１２−１６）を含むポリアクリルアミドゲル、及びブドウ球菌孔形成毒素α溶血素（αＨＬ）（Ｓｏｎｇ，Ｌ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，１８５９−１８６６）の２つの突然変異体がスキャンされた。
【０１０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ポリアクリルアミドゲル（図２Ａ及び図２Ｂ）中のインビトロ（in vitro）転写／翻訳（ＩＶＴＴ）発現されたＫｃＶ、野生型α溶血素（αＨＬ−ＷＴ）及びＭ１１３Ｆ  α溶血素の突然変異体（αＨＬ−Ｍ１１３Ｆ−Ｄ８）（Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１８，４８１−４９３）を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは電気泳動クリーニングの後にゲルから遊離ＳＤＳを除去した（さもないと脂質二分子層が不安定になる）。このステップは自然の洗剤を使わない状況下でゲルを操作する際には省略できる。電気泳動後、ＫＣｌを含む適切なバッファでゲルを透析して電気記録に必要な電解質を導入する。透析後、ゲルを３０分間ＤＰｈＰＣ／Ｃ16脂質／油溶液中に浸し、その後、２００ｎＬ液滴（直径約２００μｍの二分子層を製造する）でスキャンした。挿入されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を移動させることにより液滴をヒドロゲルの表面のあちこちに移動し、脂質二分子層の位置を倒立顕微鏡で視覚的に追跡した。
【０１０５】
液滴載置水和支持二分子層が、チャネルタンパク質を含むゲルの部位の上に位置した場合、チャネルの自然な挿入から発生するイオン流の階段状変化が検出できた。図２ＣはＫｃｖ、αＨＬ−ＷＴ、αＨＬＭ１１３Ｆ−Ｄ８を含むゲルの各部位をスキャンしたときに獲得された電気トレースの典型例を示す。Ｋｃｖの挙動は、チャネルが一時的に開閉する際の電流の階段状のバーストによって特徴付けられる。（図２Ｃ上部）。αＨＬ−ＷＴ孔は開いたままであり、その結果、挿入事象毎に電流は階段状に増加する（図２Ｃ中間）。
【０１０６】
２つのα溶血素の突然変異体を区別する能力を証明するために、αＨＬゲルをβ−シクロデキストリン（βＣＤ）を含む液滴でスキャンした。β−シクロデキストリンは、αＨＬのβバレル内にとどまる非共有阻害薬として働き、電気記録中の電流の逆階段状変化として観察される（Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，６８６−６９０；Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．２０００．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７９，１９６７−１９７５）。αＨＬ−ＷＴは、β−シクロデキストリンと強く結合せず（Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，６８６−６９０；Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．２０００．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７９，１９６７−１９７５）、その一方、αＨＬＭ１１３Ｆ−Ｄ８突然変異体は、約１０秒の電圧依存平均滞留時間でβ−シクロデキストリンと強く結合する（Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｙｓｉｌｏｇｙ  １１８，４８１−４９３）。β−シクロデキストリンなしでは、２つのαＨＬ変異体の電気特性は大体同一である。β−シクロデキストリンを使うと、αＨＬ−Ｍ１１３Ｆ−Ｄ８チャネルは、伝導性の階段状増加に重なるβ−シクロデキストリン結合事象により、容易に区別可能である（図２Ｃ下部）。
【０１０７】
ゲルスキャニングの間、タンパク質は拡散するようには見えず、挿入事象のみが、ゲル中の集中的なバンド周囲の非常に局所的な部位で観察されることがわかった。このことは、図２Ｄに定量的に示されており、直径約２００μｍの脂質二分子層の液滴を使用した、野生型αＨＬバンド全体にわたる線形スキャンでのタンパク質挿入速度を示している。
【０１０８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥまで拡張されたゲルスキャニング実験により細胞抽出物が精製された。図３は、漏出性発現を通してαＨＬ−ＷＴ（レーン１）及びαＨＬ−Ｍ１１３Ｆ−Ｄ８（レーン２）を製造するために変容した大腸菌からの粗抽出物を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図３Ａ）をスキャンした結果を示す。先の図２のゲルの例と同様に、これらのタンパク質は、続くクマシー染色により示されるように期待された部位のゲルから電気的に特徴付けられる（図３Ｂ）。チャネル挿入速度は、大腸菌における発現から製造されたタンパク質の濃度がかなり高かったのを反映して、インビトロ（in vitro）転写／翻訳ゲルから観察されたものより速かった。驚いたことに、αＨＬチャネルに加えて、数多くの他のチャネルたんぱく質を、再びゲルの特定領域に局所化された顕著に異なる挙動（例えば図３Ｂ下部）と共に検出した。チャネルは通常３の倍数を挿入し、大体の電圧依存ゲーティング挙動を示す。
【０１０９】
ゲルスキャニング中に脂質／油溶液に延長して浸しても、ゲルマトリクスからのタンパク質の多大な喪失が引き起こされないことがわかった。同様に、透析ステップの間に電解質バッファに延長して浸しても、ゲル中のタンパク質を著しく枯渇させない。この結果、個々のゲルは、多くの、少なくとも６つの連続したゲルスキャニング実験において再利用でき、ゲルバッファの状態を必要に応じて変化させることができる。さらに、スキャニング手続きは、その後のゲルの染色または撮像、またはさらなる分析のためにゲルから特定なタンパク質を回復する能力に影響しない。
液滴載置水和支持二分子層の検体検出
ゲルスキャニング実験を本質的に逆にして、水和支持二分子層上の液滴中のタンパク質チャネルをヒドロゲル中の異なる検体をスキャンするための分子センサとして使用することができる。
【０１１０】
２％ポリアクリルアミドゲルを、約１０ｍｍ離れた２つの部位（図４Ａ）で約１０μＭのγ−シクロデキストリン（γＣＤ）及びヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン（ｈβＣＤ）のタンパク質をブロットした溶液から吸収によりドープした。ＤＰｈＰＣＣ16溶液中に３０分浸した後、ゲルを、αＨＬ−ＷＴを含む２００ｎＬの液滴を含む２つのシクロデキストリン部位間でスキャンした。実験条件下で、αＨＬ−ＷＴに結合するγＣＤは６８％の電流ブロックを生じ、αＨＬ−ＷＴに結合するｈβＣＤは９５％の電流ブロックを生じる。これらの異なる結合振幅によりαＨＬ−ＷＴと両方の検体とは確実に識別可能になる（図４Ｂ）。
【０１１１】
本実験では、液滴は、スキャンの間ずっと脂質二分子層中にαＨＬ−ＷＴを保持し、表面から脂質二分子層を除去せずにヒドロゲルのいたるところで翻訳された。脂質二分子層の位置を倒立顕微鏡上にその位置を撮像することにより記録し、シクロデキストリン結合事象を電気的に観察した。事象の合計を脂質二分子層におけるαＨＬ−ＷＴチャネルの数で割ることにより、シクロデキストリン結合頻度を決定した。図４Ｃは、２つのシクロデキストリン検体の拡散制限局所結合を示し、２つの部位間のスキャンにおいてγＣＤ及びｈβＣＤ結合頻度をプロットしている。
ピペットを使用した二分子層製造
図５を参照すると、ヒドロゲル１１は、基質１３上に重ねられて水和支持体を形成し、水和支持体を脂質／油溶液７に浸すことで、脂質単分子層をヒドロゲルの上面上に形成する。水滴９は、ピペットチップ３を脂質／油溶液７に浸している間にピペットチップ３からある程度放出される。脂質単分子層は、水滴の表面上に形成される。水滴の大きさは、ピペットに圧力が加えられたときにどのくらい量の水溶液がピペットチップから押し出されるかによって制御される。水滴とヒドロゲルとの間の接触領域の大きさは、形成された二分子層の長さを決定する。接触領域は、水滴の大きさと、ピペットチップのヒドロゲルに対する近接度とを制御することにより制御可能である。
【０１１２】
水滴９は、ヒドロゲル１１と接触して脂質二分子層１を形成する。ヒドロゲル１１と接触する第２電極（図示せず）と併せて水滴９と接触する第１電極５を使用して脂質二分子層１全体の電気活動を測定する。電極はＡｇ／ＡｇＣｌである。
【０１１３】
ピペットをｘ／ｙ平面で移動することにより、ヒドロゲルの表面全体にわたって二分子層を位置移動可能である。
図６は、倒立顕微鏡を使用して、水滴と支持体とが接触した際に、水滴８０９と透明な水和支持体（図示せず）との間に脂質二分子層８０１が形成されるのを視覚化したものである。
スキャニング‘ピペット’における液滴
図７は、移動可能なスキャニングピペットチップに載せられた水和支持体上に液滴載置水和支持二分子層を形成できることを示している。より具体的には、水和支持体１１１がピペットチップ１０３の開口部に固定され、ピペットチップは脂質／油溶液１０７で満たされている。水滴１０９は脂質／油溶液に浸されて水和支持体１１１と接触して脂質二分子層１０１を形成する。ピペットチップ１０３を水性システム１１３に浸すことにより、脂質二分子層１０１を使って水性システム１１３をスキャンまたは精査することができる。脂質二分子層１０１全体にわたる電気活動を測定するために一組の電極１０５が設けられている。一方の電極１０５は水滴１０９と接触しており、他方の電極１０５は水性システム１１３に接触している。
【０１１４】
水和支持体が多孔性である限り、二分子層は孔を通過できる水性システム中の分子を感知可能である。支持体の孔の大きさを制御することで、どんな物質が実際に二分子層に到達するかフィルタにかけることができる。
二分子層の製造のための代替装置
図１３Ａは本発明の二分子層を製造するための代替携帯装置を示す。装置８０１はＰＭＭＡから作られており、第１スクリュー８１１と、第２スクリュー８１２と、チャンバ８１６と、孔８２０とを備える。
【０１１５】
使用の際、チャンバ８１６は油で満たされ、液滴またはアガロースボール８２２が第２スクリュー８１２の端部上に設置される。第１スクリュー８１１を調整することでチャンバ８１６中の油の容積を調整することができる。第２スクリュー８１２を調整することで液滴またはアガロースボール８２２の高さを調整することができる。
【０１１６】
二分子層８３０を形成するために、油が入り、水滴またはアガロースボール８２２を含んだ装置８０１を溶液８２５中に設置する。溶液は水であってもよい。その後、第１スクリューを上昇させてチャンバ８１６内の容積を増加させてチャンバ内へ溶液８２５を引き込む。溶液８２５が水滴またはアガロースボール８２２に接触すると、二分子層８３０が自然に形成される。第２スクリュー８１２の高さを調整することにより、二分子層８３０の大きさを調整できる。第２スクリュー８１２を電極に接続し、溶液８２５中に別の電極を設置することにより、二分子層８３０への電気的アクセスが可能である。さらに、装置８０１を溶液８２５から除去すると、装置は十分な溶液８２５を保持して二分子層８３０を維持する。このことは、二分子層をある溶液から取り除いて別の溶液に戻すことを可能にしている。
【０１１７】
図１３Ｂは図１３Ａの装置を使用して形成された二分子層８３０を示す。二分子層８３０の縁８２９がはっきり確認できる。
二分子層の配列を製造する装置
図１４Ａは、二分子層の配列を製造するために利用可能な装置を示す。装置は、基部８４２と蓋８４１とを備える。基部８４２は、低チャネルにおいてアガロースで満たされ、その後、脂質／油溶液で満たされて平衡化するまで放置され、その結果、単分子層をアガロース基質上に形成する。蓋８４１は、バルク水溶液に浸され、蓋を作るために使用されたプラスチックとの親水性相互作用を通じて、小さな水滴が蓋上に残る。その後、平衡化するまでの間、水滴が油中に留まるように蓋を基部内に降下し、その後さらに降下して水滴を下部のアガロースと接触させる。これにより、水滴がアガロースに接触する場所で自然に二分子層が形成される。蓋を通して各水滴に接続された電極を使用することによって、またアガロース中の共通の電極を使って、配列中の各二分子層は電気測定のために個別にアクセス可能である。図１４Ｂからわかるように、装置の性質により、個々の二分子層８４４を顕微鏡で下から撮像できる。図１４Ｂでは、アガロース壁８４５、プラスチック支持体８４６、浮遊する水滴８４７も見ることができる。
水相の環流が可能な装置
図１５Ａは、本発明の液滴載置水和支持二分子層を製造するための基本装置を、いかにして油相の容積を制御（この場合は、調整スクリューを使用する）して、装置に引き込まれるバルク液体相を操作するように拡張することができるかを示している。
【０１１８】
本実施例では、ＰＭＭＡ装置８７０が、ガラス８７３上に載置された下部のアガロース層８７２に取り付けられている。内部空洞８７５、チャネル、またはチャネルのネットワークは、脂質／油溶液で満たされている。油で満たされた内部空洞８７５は、一方で周囲に開き、もう一方で油の容積を制御するための機構、この場合はスクリューに接続している。スクリューが回転または逆回転すると、油が空洞に押し込まれるまたは空洞から引き出される。容積を調整する手段はスクリューである必要はなく、油の容積を制御するあらゆる手段に拡張できる。例えば、標本に押し込まれたピンまたは針のような固体であってもよく、例えばステッピングモータまたは注射器ドライバにより作動されることができる。あるいは、空洞中の容積を、上流の注射器により、またはマイクロ流体ポンプにより制御してもよい。あるいは、空洞そのもの、または空洞の一部が、圧縮されたときに油の容積を調整する変形可能な材料からできている、または膜部を備えていてもよい。油が空洞８７５に引き込まれると、バルク水または水滴８７８（装置の外側に追加されたもの）もまた空洞に引き込まれる。水滴が下部のアガロースに接触すると、二分子層が自然に形成される。
【０１１９】
バルク水または水滴８７８中の電極８７９、及びアガロース中の別の電極８７２を使って、二分子層は、電気測定のためにアクセス可能である。図１５Ｂは、二分子層に挿入されているα溶血素（上部）、及び結合シクロデキストリンの例を示す図１５Ａの装置を使用して生成された電気トレースを示す。
【０１２０】
顕微鏡を使用して二分子層を撮像することもできる。二分子層８８０及び二分子層縁部８８２を示す図１５Ｃを参照されたい。
装置中の水滴は図１６に示すように微小流体チャネル８８５であってもよい。
【０１２１】
本実施例の装置は、図１５Ａ及び１６に示すように、水滴が外部環境に対して開かれている点で有利であり、これは、閉じられた水滴システムにおいては難しい、システムに要素を追加しやすいことを意味すると共に、水滴の中身を十分に交換及び変化させるために容積を環流することができることを意味する。
二分子層領域についての制御及び静電容量測定
本願の主題である液滴載置水和支持二分子層は非常に大きくて、１ｃｍより大きくてもよく、または非常に小さくて、１ミクロンより小さくてもよい。水和支持体に対する水滴の高さを調節することにより、二分子層の領域を非常に迅速に調整することができる。図８に示すように、水滴１０９の中心を水和支持体１１１に向かってまたは水和支持体１１１から遠ざかるように移動させることによって、脂質二分子層２０１の大きさ／領域２１５、３１５、４１５を増加したりまたは減少したりすることができる。本例では、水滴中の電極２０５を水和支持体１１１に向かってまたは水和支持体１１１から遠ざかるように移動させることにより、水滴を移動する。
【０１２２】
二分子層全体の静電容量を監視することにより、二分子層の領域を監視できる。本発明の方法によって形成された二分子層は、静電容量に対する領域への二分子層の線形応答を示す。この関係は、二分子層が再形成されたかどうか及び二分子層がどの領域変更を経たかに関わらない。
大きな二分子層の製造
本願に記載したような装置、及び本発明の方法を使用することによって、１ｍｍ、１ｃｍまたはそれ以上の大きな二分子層を形成できる。例えば、本願に記載の油撤収技術を使用することにより、バルク水は、装置の空洞の中のますます下のチャンネルへに引き入れられ、大きな二分子層を製造できる。
【０１２３】
図１７は、１０ｘの対物レンズを使用した顕微鏡上で撮られた画像の合成画像（二分子層は大きすぎてその全体を観察することができない）を示す。この場合、二分子層９００は、ほぼ横１ｍｍ、縦２ｍｍである。二分子層縁部９０２は、小さな油内包物９０３及びバルク水入口９０５として見えている。
【０１２４】
図１８は、図１７の二分子層がさらにチャネルに引き込まれたときの、わずかに大きな二分子層を示す。この二分子層は、大体横１ｍｍ、縦５ｍｍの大きさである。横１ｍｍ、縦１ｃｍの大きさの二分子層もまた製造され、大きさが数十ｃｍのもっと大きな二分子層も製造された。これらのより大きな二分子層は、ＤｉＰｈｙｔａｎｏｙｌＰＣ二分子層のための〜１００，０００ｐＦａｒａｄ以上の静電容量を有していてもよい。これは、直径数百マイクロメートルで、ＤｉｐｈｙｔａｎｏｙｌＰＣ二分子層のための数百ｐＦａｒａｄの静電容量を有する、既知の方法を使用して製造された人工二分子層との比較である。液滴載置水和支持二分子層の破裂、注入、環流
液滴載置水和支持二分子層の水滴部分は、二分子層を破くことなく破裂可能である。このことは図９に示されており、カーゴ輸送水滴の既存の水滴中での破裂は、二分子層を破裂させない。より具体的には、試薬のカーゴを輸送する第２の水滴５１７が、二分子層５０１を破ることなく既存の水滴５０９と共に破裂／溶融するのが示されている。
【０１２５】
図１０は、マイクロピペット６１９または多孔毛細血管６２１を備えたマイクロピペットからの注入によって、試薬を水滴６０９に導入できることを示している。これにより、既存の水滴中に化合物を導入する簡単な方法が提供される。
大きな接続または非接続ネットワークにおける液滴載置水和支持二分子層
多数の液滴載置水和支持二分子層が、水和支持体上の個々の非結合の水滴間または水和支持体上の多結合の水滴間に形成されてもよい。
【０１２６】
図１１を参照すると、多数の液滴載置水和支持二分子層７０９が単一の水和支持体１１１上に分散されている。図１１Ａは、水和支持体１１１上の複数の独立した／別個の水滴７０９を示しており、その全てが支持体と共に二分子層を形成している。図１１Ｂは、水和支持体１１１上の配列に結合された複数の水滴７０９を示しており、水滴７０９間及び水和支持体１１１と共に多数の二分子層を形成している。
【０１２７】
このような大きな配列は、蛍光試験に適している。これらの配列は、より大きな統計的研究に利用することもできる。例えば、約１０ｓナノリットルから１０ｓピコリットルのとても小さい水滴の配列を、それぞれが所定のタンパク質／試薬の分子をたった１つ含むように確率を調整して製造することができる。その結果、例えば単分子レベルでの酵素の代謝回転を観察する実験を行うことができる。
【０１２８】
単離されたタンパク質バンドを含むヒドロゲルを蛍光スキャンするのに、大きな配列を使用してもよい。例えばポリマーを含むＣａに敏感な蛍光色素分子を含む水滴の配列が、電気泳動的に焦点を合わせたバンドにおいて、カルシウム及び単離されたアルファ溶血素チャネルを含むゲルの上方に配置される場合、タンパク質バンドの上方に位置する水滴は、カルシウムが水滴に入るにつれてαＨＬを挿入して蛍光を発する。
蛍光発光のための液滴載置水和支持二分子層
薄い水和支持体上に置かれた液滴載置水和支持二分子層は、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を使用して蛍光的に考察することができる。
【０１２９】
液滴載置水和支持二分子層上の全内部反射蛍光顕微鏡を示す図１２では、アガロースの薄膜からなる支持基板は、ガラスのカバースリップ上に形成されている。この薄い基板は、水性アガロースでポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）マイクロチャネル装置を満たすことによって再水和される。装置の穴は油中の脂質溶液で満たされている。水滴は、油の下のヒドロゲルの上部に置かれる。脂質二分子層は、２つの水相間のインターフェイスで形成される。エバネッセント場が、水滴中の脂質二分子層及び蛍光標識された生体分子を照らす液滴載置水和支持二分子層に伝播する。
【０１３０】
ＴＩＲＦ技術は、他の分析技術との組み合わせで、例えば電気データの獲得と組み合わせて、使用されてもよい。データの組み合わせにより、タンパク質機能についての改良された情報が提供される可能性がある。
二分子層形成の効率性
親水体が水滴で、超純水で作られた平面１％アガロースゲルが水和支持体であった実験は、２０の水滴全てが、水滴とアガロースゲルとの間の接触１分以内で、二分子層を形成したことを示した。二分子層は、２週間経っても完全な状態であることが観察された。
膜タンパク質の凝縮及び結晶化
図１９は、本発明の二分子層をどのように使用したら膜タンパク質を凝縮させることができるかを示す。これは、さらなる研究のための膜タンパク質の２次元結晶または半順序格子を製造する手段となりうる。膜タンパク質を液滴載置水和支持二分子層に挿入し、表面から水平に水滴を引っ張ることによって二分子層の大きさを小さくすることにより、膜タンパク質を、二分子層から除去することなく、二分子層の縁に沿って内側に向かって引き入れることが可能である。この結果、二分子層の中心に向かって挿入された膜タンパク質の凝縮が起きる。
【０１３１】
図１９は水滴載置ヒドロゲル二分子層に埋め込まれたα溶血素孔の凝縮を示す。１％（ｗ：ｖ）の薄いアガロースゲルを、カバースリップ上に配置して脱水し、その後、緩衝剤及び７５０ｍＭのＣａＣｌ2を含む１．５％（ｗ：ｖ）アガロースを用いて再水和した。
カルシウム指示染料Ｆｌｕｏ−４（２５μＭ）、α溶血素７量体、１．５ＭのＫＣｌ、緩衝剤を含む水滴を使用して、この薄いアガロースゲル上に水滴載置ヒドロゲル二分子層を生成した。
【０１３２】
二分子層の蛍光性（非キレートＦｌｕｏ−４により提供されたもの）を、ＴＩＲＦ照明を通して円盤として撮像した。α溶血素孔を二分子層に挿入する際に、水滴中へのカルシウム流出が起こりうる。この例では、ゲル（下地）及び水滴に挿入された電極からの外部付与負電位の付与により流出が増進された。この結果、孔（斑点として撮像されている）の周辺から発せられる蛍光発光が強くなった。これは、水滴に入る際のカルシウムの即時のキレート化に際し、孔の近くのＦｌｕｏ−４の蛍光発光の強度が大いに増加したことによるものである。
【０１３３】
図１９は、上述した方法を用いて二分子層に拡散する拡散α溶血素孔（蛍光斑点としてのもの）９４０を示す。二分子層はその後、徐々に小さくなり（９４１）、その結果、侵入してくる二分子層の縁によって内側へと引き入れられるにつれ、孔が凝縮される（９４２）。二分子層領域が再び拡大されると（９４３）、二分子層の縁が小さくなったところに孔が凝縮されているのがわかった。このプロセスを繰り返すことにより、孔の凝縮はさらに続き（９４４）、二分子層領域の中心に向かって孔はさらに凝縮されていく（９４５）。
考察
液滴載置水和支持二分子層は、従来の平面脂質二分子層とは大きく異なるものの、作製するのもそれを用いて作業するのもよりたやすく、主要な分類の膜タンパク質両方の単一チャネル記録試験に同様にも適している。液滴載置水和支持二分子層は、平面二分子層よりも安定しており、典型的な平面二分子層の寿命が数時間である（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．１９８６．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）のに対し、液滴載置水和支持二分子層は、多くの場合、形成後数週間たっても機能する。このことは、以前は可能でなかった長期にわたる試験のための道を開くものである。
【０１３４】
液滴載置水和支持二分子層はまた、その他の数多くの優れた性質を持つ：（ｉ）脂質二分子層が水和支持体の表面全体にわたって移動できる。このことは、ヒドロゲルスキャニング試験において利用されている；（ｉｉ）液滴載置水和支持二分子層は、代替技術を用いて可能なものよりはるかに大きな大きさ範囲（＜１μｍ〜＞１ｍｍ）に渡って安定した二分子層への確実なアクセスを提供する；（ｉｉｉ）脂質二分子層の領域は、実験中に調整可能である。例えば、このことを利用して、単一チャネル記録試験において挿入されたタンパク質の数を制御してもよい。脂質二分子層は、最初に拡大されてタンパク質挿入の確率を増やすと、その後、単一タンパク質が挿入されてさらなる挿入の機会を最小限にするやいなや急速に縮小される。脂質二分子層の領域を縮小することを利用して、脂質二分子層に挿入される膜貫通タンパク質を凝縮してもよい。これにより、膜タンパク質を結晶化し、タンパク質間の相互反応を観察する確率を改善するための代替手段が提供されてもよい。（ｉｖ）脂質二分子層は、水滴とヒドロゲル溶液とを混合することなく何度も除去及び再生されることができる。このことを利用して、単一チャネル記録試験をリセットしてもよい。なぜなら、脂質二分子層の除去により、挿入された膜貫通タンパク質が除去されるように見えるためである。内容物の混合が起きないという事実も、二次汚染が問題となる実験にとって重要である。
【０１３５】
液滴載置水和支持二分子層ゲルスキャニングの感受性により、過剰発現の必要なく細胞抽出物からの低レベルの内因性タンパク質の直接研究が可能である。それに対し、伝統的なパッチクランプ法または平面脂質二分子層を用いた過剰発現を伴わずにタンパク質を検査することは難しい。細胞全体のパッチクランプにより低レベルの内因性タンパク質を検査することはできるが、細胞膜の異種の性質により、システムの他の成分を相殺する必要がしばしばある（Ｈａｍｉｌｌ，Ｏ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９８１．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈｉｖ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３９１，８５−１００；Ａｓｈｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．１９９５．ＩＲＬ）。人工脂質二分子層を用いてこの問題を回避することができるが、これらの二分子層を成功裡に再構成するための十分な量のタンパク質を抽出及び凝縮することは難しい（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．１９８６．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｓｈｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．１９９５．ＩＲＬ）。
【０１３６】
新しいタンパク質の発見及び特性評価のために、液滴載置水和支持二分子層ゲルスキャニングを、複雑な混合の細胞成分を分離するための２Ｄゲル電気泳動に頼る既存のプロテオミクス法に組み込んでもよい（Ｐａｌｚｋｉｌｌ，Ｔ．２００２  Ｐｒｏｔｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．２００３.Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）。液滴載置水和支持二分子層ゲルスキャニングは、２Ｄゲル中のチャネルタンパク質を識別するための手段を提供する。液滴載置水和支持二分子層ゲルスキャニングがゲルマトリクス内のタンパク質に影響を与えるようにみえないという所見は、様々な条件下で個々のゲルの液滴載置水和支持二分子層スキャニングを繰り返し行い、その後、従来のプロテオミクス法（例えば、質量分析法）を用いた分析を行うことが可能であることを意味する。
【０１３７】
本発明は、イオンチャネルのハイスループット研究のための新しいプラットホームを提供する。具体的には、ナノリットル量しか必要としないことにより、液滴載置水和支持二分子層を拡大するとともに自動化するための、多くの確立した乳液ベースの技術の適用を可能にする（Ｊｏａｎｉｃｏｔ，Ｍ．＆  Ａｊｄａｒｉ，Ａ．２００５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，８８７−８８８;Ａｓｈｎ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８８；Ｌｉｎｋ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４５，２５５６−２５６０；Ｈｕｎｇ．Ｌ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ  ６，１７４−１７８）。例えば、脂質／油及び水の流れを組み合わせることにより（Ｔｈｏｒｓｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８６，４１６３−４１６６）、制御された大きさの何千もの水滴を作ることができる。多くの液滴載置水和支持二分子層は、油中にナノリットル水滴を作って分類することが可能な既存のマイクロ流体技術を用いて自動で操作されてもよい（Ａｈｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８８；Ｌｉｎｋ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４５，２５５６−２５６０）。
【０１３８】
液滴載置水和支持二分子層を撮像する能力はまた、蛍光技術の組み込みを可能にする。単一チャネル記録試験は、多くのイオンチャネルに豊富な機能詳細を提供したが、タンパク質構造中でこのことを動的変化にリンクすることは難しい。標識タンパク質の単分子蛍光発光は、付加的な構造的及び動的情報を提供する可能な方法の１つである。さらに、液滴載置水和支持二分子層は、光学的及び電気的測定を同時に行うことを可能にし、個々の技術、例えば、イオンチャネルの折りたたみ及び挿入の力学、だけでは解明されることができなかったチャネル機能の新しい局面を明らかにする可能性がある（Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８４，６１２−６２２;Ｉｄｅ，Ｔ．＆Ｙａｎａｇｉｄａ，Ｔ．１９９９．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２６５，５９５−５９９；Ｉｄｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３，３３−４２；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ａ．Ｇ．＆Ｗｒａｉｇｈｔ，Ｐ．Ｃ．１９９５．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６３，１−２９；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２２，１１１１−１１１５；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２２，１９３７−１９４２）。
【０１３９】
総合的にいえば、強化された安定性、脂質二分子層を操作する能力、電気的アクセス、撮像の組み合わせは、本発明の液滴載置水和支持二分子層が膜タンパク質機能の多くの局面を調べるための多目的プラットホームを提供することを証明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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