(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１に対応する分子。
【化１】
0005681708.tif 000004
【請求項２】
請求項１に記載の式１の分子および薬学的に許容される担体を含む薬物。
【請求項３】
マラリアを予防および／または治療するために使用するための、請求項２に記載の薬物。
【請求項４】
マラリアの伝染を低下させるために使用するための、請求項２または３に記載の薬物。
【請求項５】
経口投与、直腸投与、注射による投与または外用投与を意図する、請求項２から４の一項に記載の薬物。
【請求項６】
ＳｋＥの１日量が、０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｄ〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄのＳｋＥである、請求項２から５のいずれか一項に記載の薬物。
【請求項７】
以下のステップ：クアッシア・アマラ（Ｑｕａｓｓｉａ  ａｍａｒａ）の乾燥した成熟葉を粉砕し、メタノールを用いて抽出するステップと、この抽出物をｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水に基づいた二相系中に溶解させるステップと、下相を回収し、下相の体積を減圧下で蒸発により半分に低下させるステップと、酢酸エチルを用いてこの溶液を抽出するステップと、酢酸エチルを蒸発させて除くステップと、得られた残渣をクロロホルム中に溶解させ、弱塩基性の水溶液を用いて洗浄するステップと、有機相を回収し、乾燥させ、減圧下で濃縮するステップと、この抽出物を酢酸エチル中に溶解させ、水を用いて洗浄するステップと、有機相を減圧下で蒸発させるステップと、得られた残渣をシリカカラムから、酢酸エチルを用いて溶出するステップとを含む、クアッシア・アマラの乾燥した成熟葉から請求項１に記載のＳｋＥを単離するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、植物クアッシア・アマラ（Ｑｕａｓｓｉａ  ａｍａｒａ）から抽出することができる新規分子シマリカラクトン（Ｓｉｍａｌｉｋａｌａｃｔｏｎｅ）Ｅであり、また、その薬物としての、特に、マラリアの予防および治療における使用である。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳおよび結核と併せて、ＷＨＯが世界で最も重要な疾患のうちの１つであると指定する３つの疾患のうちの１つである。毎年、１００万〜２００万人がマラリアにより死亡し、およそ５億人がマラリアに罹患し、マラリアの大きな影響を受けた国では、ＧＤＰの成長率が最大１．３％まで減少する恐れがある。アノフェレス属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇｅｎｕｓ）の雌の蚊から咬傷を介してヒトに伝染するプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｇｅｎｕｓ）の寄生虫が、この疾患に関与する。ヒトマラリアに関与する４つの種、すなわち、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、および熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）がある。三日熱マラリア原虫と熱帯熱マラリア原虫とが最も一般的である。熱帯熱マラリア原虫への感染が最も重症であり、熱性昏睡の間に患者の死を引き起こす恐れがある。熱帯熱マラリア原虫マラリアは、サハラ以南のアフリカにおいて非常に広範に及び、そうした地域では、極めて高い死亡率が大方の場合、熱帯熱マラリア原虫マラリアに帰し得る。心配な徴候により、熱帯熱マラリア原虫マラリアの新しい領域への蔓延、および熱帯熱マラリア原虫マラリアが排除または制御されていた地域におけるその復活が裏付けられている。
【０００３】
薬物として製剤化され、この疾患に対して活性を示す分子がほんの数個しかなく、耐性の出現により、治療がさらにより緊急の課題となっている。したがって、抗マラリア活性を示す新規分子の同定が不可欠である。
【０００４】
マラリアに対する有効性が現時点で公知の分子のうち、キニーネ、その誘導体、さらに、その他の化合物、すなわち、クロロキン、アモジアキン、メフロキン、ハロファントリン、ルメファントリン、ならびにまた、アルテミシニンおよびその誘導体、例として、アーテスネートおよびアルテテルまたはアーテメターについて言及することができる。最も周知の分子は、原産地で伝統的に使用されている薬用植物に由来する。キニーネは、キナ種（Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｓｐ．）に由来し、アルテミシニンは、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）に由来する。
【０００５】
これらの分子のうちのいくつかは、予防（流行国への旅行の際の予防）または（感染の診断後の）治療のいずれかとして使用することができる。
【０００６】
マラリア原虫のサイクルは、非常に複雑である。簡単に述べると、この寄生虫は、肝臓を通過した後、罹患した個体の赤血球に迅速に進入し、再生した寄生虫が、赤血球の破裂を引き起こすまでその中で再生し、近隣の赤血球に侵入する。次いで、疾患自体が、発熱として出現し、発熱は、初めは程度の差はあるが無秩序であり、次いで、いくつかの増殖サイクルの後に定期的となる。次いで、いくつかの寄生虫が、生殖母細胞に発達する。これらの生殖母細胞により、第１に、このサイクルがアノフェレス属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）の蚊中で継続すること（生殖母細胞は蚊により消化されない）、および第２に、生殖母細胞が、受精のために必要である配偶子を決定付けるので、遺伝子混合が発生することが可能となる。
【０００７】
キニーネおよびアルテミシニン等の分子は、赤血球中の増殖相の間に作用し、この赤血球相が、症候性の相である。抗殺生殖母細胞活性を示す分子に関しては、それらの利点は、これらの分子が集団治療戦略において引き起こすことができるであろう疾患の伝染率（感染性）の潜在的な減少にあり、また、循環している生殖母細胞のレベルに一部関連して、耐性が迅速に出現する現象が低下する可能性にもある（スルファドキシン−ピリメタミン（ＳＰ）およびクロロキンについて実証されている（感受性株対耐性株））。殺生殖母細胞治療を使用する利点にもかかわらず、このタイプの産物を検出し、そうした産物の使用を理論的に説明することを目的とする研究がほとんどない。現時点では、ほんの数個の分子が、この特性を有することが公知であるに過ぎず、これらは、アルテミシニンおよびその誘導体、ならびにプリマキンである。しかし、プリマキンは、その活性レベルに近い急性毒性を示すことから、このように使用するための最も適切な分子ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００５、９８（３）、３５１〜３６０頁
【非特許文献２】Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００５、９８（１−２）、４５〜５４頁
【非特許文献３】Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００５、９８（１−２）、４５〜５４頁
【非特許文献４】Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００６、１０８（１）、１５５〜１５７頁
【非特許文献５】Ｚ．Ｇｕｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５、２、１７３〜１９０頁
【非特許文献６】Ｇｕｉｄｏ  Ｆら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、１９９８、２８、６３５〜６４０頁
【非特許文献７】Ｃｕｒｃｉｎｏ  Ｖｉｅｉｒａ  Ｉ．およびＢｒａｚ−Ｆｉｌｈｏ  Ｒ．、Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００６、３３、４３３〜４９２頁
【非特許文献８】Ｗ．ＴｒａｇｅｒおよびＪ．Ｂ．Ｊｅｎｓｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７６、１９３（４２５４）：６７３〜６７５頁
【非特許文献９】Ｌａｍｂｒｏｓ，Ｃ．およびＪ．Ｐ．Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、１９７９、６５（３）：４１８〜４２０頁
【非特許文献１０】Ｒｉｂａｕｔ，Ｃ．ら、Ｍａｌａｒｉａ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００８、７（１）：４５頁
【非特許文献１１】Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ  Ｒ．Ｅ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、１９７９、１６：７１０〜７１８頁
【非特許文献１２】Ｆ．Ｂｅｎｏｉｔら、Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．８９：２１７〜２１８頁
【非特許文献１３】Ｉｆｅｄｉｂａ，Ｔ．およびＪ．Ｐ．Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８１、２９４（５８３９）：３６４〜３６６頁
【非特許文献１４】Ｓａｌｌ，Ｃ．ら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００８  １８（１６）：４６６６〜４６６９頁
【非特許文献１５】Ｍｏｓｍａｎｎら、１９８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
抗マラリア性薬物には、副作用がないわけではなく、特に、ハロファントリンは、心臓の問題と関連付けられており、メフロキンは、神経学的毒性を示す恐れがある。
【００１０】
抗マラリア性薬物のうちのほとんどが、限定的な耐用年限を有し、それらの有効性が、耐性現象の出現のために喪失する。例えば、クロロキンも、また、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（スルファドキシン／ピリメタミン：Ｆａｎｓｉｄａｒ（登録商標））も、最早ほとんどのプラスモジウム属株に対して活性を示さず、最早単独療法としては使用されない。また、耐性は、売りに出されている最新の薬物であるアルテミシニン誘導体についても出現している。ＷＨＯ  ｄｉｒｅｃｔｉｖｅによれば、無効になってしまったかまたは有効性を迅速に喪失する過程にある抗マラリア薬が、アルテミシニン誘導体と別の活性な分子とを組み合わせるＡＣＴ（アルテミシニンに基づいた組合せ療法）により置き換えられている。しかし、２つの分子を組み合わせるにもかかわらず、この治療戦略の有効性が、アルテミシニン耐性現象により脅かされている。
【００１１】
さらに、これらのＡＣＴを問題になっている集団にとって手頃な価格にするために、相当な努力がなされているにもかかわらず、それらのコストは依然として高いままである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、発熱およびマラリアに対してアマゾン北西部およびはるか遠く中央アメリカを通して伝統医学において使用されているニガキ科（Ｓｉｍａｒｏｕｂａｃｅａｅ）の種、クアッシア・アマラ（Ｌ．）に由来する新しい分子シマリカラクトンＥ（ＳｋＥ）を同定するに至った。この分子が、マラリアに対する活性を示すことを示すに至った。
【００１３】
民族薬理学的調査および生物学的試験により、クアッシア・アマラの成熟葉に基づいた調製物が、マラリアを治療するのに好都合であることを同定することが可能となった（Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００５、９８（３）、３５１〜３６０頁；Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００５、９８（１−２）、４５〜５４頁）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスに対する抗寄生虫試験により、この調製物のマラリアに対する活性が確認された（Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００５、９８（１−２）、４５〜５４頁）。マラリアに対して予防的および治癒的に使用される療法におけるこの種の使用頻度、ならびに検出された抗寄生虫活性を考慮して、観察される活性に関与する構成成分を同定するために、綿密な植物化学的研究が着手された。
【００１４】
相当な抗マラリア活性を示すクアシノイドファミリーの分子、すなわち、シマリカラクトンＤが、この種の若葉から単離された（Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００６、１０８（１）、１５５〜１５７頁）。しかし、クアッシア・アマラの成熟葉から調製された伝統的な療法中に存在する少量のシマリカラクトンＤによっては、この療法についてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて観察される活性を正当化することができなかった。したがって、マラリアに対するクアッシア・アマラの活性に関与する、その他の活性薬剤の同定が探求された。幾人かの著者が、マラリアまたはその他の病理学的状態を治療するための活性成分として、クアシノイドに焦点を合わせた：Ｚ．Ｇｕｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５、２、１７３〜１９０頁；Ｇｕｉｄｏ  Ｆら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、１９９８、２８、６３５〜６４０頁；Ｃｕｒｃｉｎｏ  Ｖｉｅｉｒａ  Ｉ．およびＢｒａｚ−Ｆｉｌｈｏ  Ｒ．、Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００６、３３、４３３〜４９２頁。しかし、薬物の開発にまで至る分子は残らなかった。
【００１５】
しかし、本発明者らは、クアッシア・アマラの成熟葉を使用して、クアシノイドファミリーの別の分子、すなわち、シマリカラクトンＥを首尾よく同定するに至った。本発明者らは、この分子が、シマリカラクトンＤよりも低い毒性を示すことに気付くことができた。
【００１６】
シマリカラクトンＥは、以下の式１に対応する。
【００１７】
【化１】
0005681708.tif 000002
【００１８】
シマリカラクトンＥは、本発明の第１の対象を構成する。
【００１９】
この分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、マラリアに関与する株に対して活性を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウス／プラスモジウム・ビンケイペテリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｎｃｋｅｉ  ｐｅｔｔｅｒｉ）のモデルにおいて、経口により活性を示す。したがって、この分子をマラリアの治療において使用することができる。
【００２０】
新しいクアシノイド、すなわち、シマリカラクトンＥ（ＳｋＥ）をマラリアを治療するためにアマゾンにおいて広く使用されている薬用植物であるクアッシア・アマラ（ニガキ科）から単離するに至った。この新しい分子は、試験株のクロロキン感受性とは独立に、２４ｎＭ〜６８ｎＭの間の用量で、培養物中の熱帯熱マラリア原虫の増殖を５０％阻害する。この新しい分子は、６５７４ｎＭの用量で、ベロ哺乳動物細胞の増殖を５０％阻害し、このことから、この分子の選択指数は、１００超となる。また本発明者らは、この分子は、生殖母細胞のレベルをこの活性についての参照分子であるプリマキンを用いて得られた場合よりも７倍低い濃度で５０％低下させることも示すに至った。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、マラリアのマウスモデルに対して、ＳｋＥは、腹腔内０．５ｍｇ／ｋｇ／日および経口１ｍｇ／ｋｇ／日の用量でそれぞれ、Ｐ．ビンケイペテリの増殖を５０％阻害する（参照分子であるクロロキンは、腹腔内３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、Ｐ．ビンケイペテリの増殖を５０％阻害する）。
【００２１】
したがって、本発明の第２の対象は、ＳｋＥおよび薬学的に許容される担体を含む薬物である。
【００２２】
マラリアの治療および／または予防を意図する薬物中では、シマリカラクトンＥを単独で使用しても、または別の抗マラリア薬と組み合わせて使用してもよい。
【００２３】
そのような薬物をマラリアに罹患しておらず、リスクがある地域に一時的または恒久的に居住する個体に予防的に投与することができる。そのような薬物をマラリアに罹患している個体に、発作の間にも、また、疾患の潜伏期の間にも、治癒的に投与することができる。
【００２４】
したがって、本発明の対象は、マラリアの予防または治療に適応である、ＳｋＥを含む薬物である。また、本発明の対象は、マラリアの伝染の低下に適応である、ＳｋＥを含む薬物でもある。
【００２５】
適切な投与剤形として、経口投与剤形、例として、錠剤、軟質もしくは硬質のジェルカプセル剤、散剤、顆粒剤、および経口の液剤もしくは懸濁剤、舌下、頬側、気管内、眼内および鼻腔内への投与剤形、吸入による投与剤形、外用、経皮、皮下、筋肉内または静脈内の投与剤形、直腸投与剤形、ならびにインプラントが挙げられる。外用への適用のために、本発明による化合物をクリーム剤、ジェル剤、軟膏剤またはローション剤中で使用することができる。
【００２６】
好ましい投与経路は、経口経路、直腸経路および注射による経路である。
【００２７】
錠剤の剤形をとる固体組成物を、活性成分のＳｋＥを、例えば、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、アラビアゴム、マンニトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは類似の構成成分等の１つまたは複数の薬学的賦形剤と混合することによって調製することができる。錠剤をスクロース、セルロース由来の誘導体またはコーティングに適しているその他の材料を用いてコーティングすることができる。錠剤は、当業者に周知の種々の技法、例として、直接圧縮、乾式造粒、湿式造粒または熱融解のプロセスにより調製することができる。
【００２８】
また、ジェルカプセル剤の剤形をとる組成物を、活性成分を希釈剤と混合し、得られた混合物を軟質または硬質のジェルカプセル中に注ぐことによって調製することも可能である。
【００２９】
非経口投与のために、水性懸濁剤、等張生理食塩水または無菌注射用液剤を使用し、これらは、薬理学的に適合性の分散化剤および／または湿潤剤、例えば、プロピレングリコールまたはブチレングリコールを含有する。
【００３０】
好都合には、ＳｋＥの１日量は、以下に示す量、すなわち、０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｄ〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄのＳｋＥである。特に、これらの用量は、経口投与に適している。
【００３１】
より高いまたはより低い投与量が適切である特定の場合があり得、そのような投与量は、本発明の文脈から逸脱しない。通常のやり方に従って、各患者に適している投与量が、医師により、投与方法、ならびに体重および前記患者の治療に対する応答に従って決定される。
【００３２】
本発明の薬物は、１日１回または複数回の服用、好ましくは、１日単回の服用として、優先的には連続５〜１０日間投与することを意図する。
【００３３】
ＳｋＥは、寄生虫株が、クロロキン感受性であれ、クロロキン耐性であれ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同等の活性を示し、このことは、ＳｋＥの、クロロキン耐性マラリア地域（アジア、アフリカ、ギアナを含めた南アメリカの特定地域）における使用を想定することを可能にする。
【００３４】
ＳｋＥは、現時点で市場に存在する、マラリアを治療するための薬物全てと比較して、異なる化学的クラスに属する。したがって、ＳｋＥは、現存する薬物に対して耐性を示す株に対して有効であり得る。
【００３５】
ＳｋＥの殺生殖母細胞活性は、参照分子のプリマキンの殺生殖母細胞活性よりも７倍高く、また、プリマキンは、毒性問題も示す。この活性を生かして、ＳｋＥが使用されるであろう地域の伝染率および耐性現象を低下させることが可能である。
【００３６】
ＳｋＥと同じ化学的クラスの分子であるいくつかのクアシノイドの抗マラリア活性が、すでに実証されている。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、マラリアを有するマウスに対して活性を示すクアシノイドは、セルゴリド、グラウカルビノン、セドロニン、ブルセオリドおよびその誘導体であり、また、シマリカラクトンＤ（ＳｋＤ）でもある。
【００３７】
ＳｋＥについて本発明者らが測定するに至った毒性は、ＳｋＤの哺乳動物細胞株（ベロ細胞）に対する毒性よりも低い。ＳｋＥの、熱帯熱マラリア原虫に関する選択指数は、ＳｋＤの選択指数の２倍である。したがって、ＳｋＥは、毒性がより低いことから、ＳｋＤを上回る利点を示す。
【００３８】
また、この分子は、生殖母細胞に対しても作用する。生殖母細胞は、寄生虫の有性型であり、アノフェレス属のベクターが、汚染されている個体から血液を引き出す際に、この寄生虫に感染する。したがって、この分子は、寄生虫の、ヒトからアノフェレス属への伝染に対して作用を示し（血中の生殖母細胞の量を低下させ、感染性の減少をもたらす）、また、（循環している生殖母細胞のレベルと相関する）耐性の汎発の可能性に対しても作用を示す。後者の点は、より具体的には、これらの耐性現象の予防または遅延を目的とするいくつかの分子を組み合わせる治療において生かすことができるであろう。
【００３９】
また、本発明の対象は、クアッシア・アマラ葉からＳｋＥを単離するための方法でもある。
【００４０】
ＳｋＥをクアッシア・アマラの乾燥した成熟葉から、以下のステップを含むプロトコールを使用して単離することができる。Ｑ．アマラの乾燥した成熟葉を粉砕し、メタノールを用いて抽出する。この抽出物をｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水に基づいた二相系中に溶解させる。下相を回収し、下相の体積を減圧下で蒸発により半分に低下させる。酢酸エチルを用いてこの溶液を抽出する。酢酸エチルを蒸発させて除く。得られた残渣をクロロホルム中に溶解させ、弱塩基性の水溶液を用いて洗浄する。有機相を回収し、乾燥させ、減圧下で濃縮する。この抽出物を酢酸エチル中に溶解させ、水を用いて洗浄する。有機相を減圧下で蒸発させ、得られた残渣をシリカカラムから、酢酸エチルを用いて溶出する。
【００４１】
得られた抽出物を以下のプロトコールに従って精製する。抽出物を遠心分配クロマトグラフィーにより、ｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水から構成されるＡｒｉｚｏｎａ  Ｈ系を使用して、上昇モードで分画する。２５ｍｌの試料を回収する。ＳｋＥを含む試料を組み合わせ、クロマトグラフィーにより、シリカカラム上で、シクロヘキサン／酢酸エチルの混合物を極性を増加させて用いて溶出して精製する。ＳｋＥは、５０／５０のシクロヘキサン／酢酸エチルの混合物により溶出する。
【００４２】
また、本発明の対象は、マラリアを治療および／または予防するための方法でもあり、この方法は、治療有効用量のＳｋＥを患者に投与するステップを含む。また、本発明の対象は、マラリアの伝染を低下させるための方法でもあり、この方法は、治療有効用量のＳｋＥを集団に投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＳｋＥの抗マラリア原虫活性および細胞傷害性を報告する表である。
【図２】寄生虫血の阻害を報告する表である。
【図３】マウスの生存時間（日単位で示す）を治療（用量）および投与経路（ＩＰ／ＰＯ）の関数として示すグラフである。治療および投与経路を示す：ＣＱ：クロロキン（１、５または１０ｍｇ／ｋｇ／日、４日間）；ＳｋＥ：シマリカラクトンＥ（０．５、１、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇ／日、４日間）；ＰＯ：経口経路、ＩＰ：腹腔内経路。
【図４】種々の治療について観察および計算（内挿）されるマウスの平均生存時間を報告する表である。
【図５】ネズミマラリア原虫によるマラリアおよび熱帯熱マラリア原虫によるマラリアの肝臓段階に対する、ＳｋＥの活性および細胞傷害性を報告する表である。
【図６】げっ歯類またはヒトの初代肝細胞上における、ネズミマラリア原虫感染（Ａ）および熱帯熱マラリア原虫感染（Ｂ）の肝臓段階に対する、ＳｋＥの用量−応答作用を示すグラフである。
【実施例】
【００４４】
Ｉ．実験のセクション
Ａ  −  シマリカラクトンＥを得るためのプロトコール
クアッシア・アマラ葉を仏領ギアナのＲｅｍｉｒｅ−Ｍｏｎｔｊｏｌｙにおいて収集した。標本（ＧＢ３０１２）を収集し、その植物学的同一性をギアナのＣａｙｅｎｎｅ  Ｈｅｒｂａｒｉｕｍにおいて確認した。
【００４５】
ＳｋＥをクアッシア・アマラから、以下のプロトコールを使用することによって単離した。１ｋｇのＱ．アマラの乾燥した成熟葉を粉砕し、６ｌのメタノールを用いて２４時間抽出する。この抽出を２回実施して、２００ｇの抽出物を得る。５０ｇのこの抽出物を２ｌの比率３／２／３／２のｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水から構成される二相系中に溶解させる。最も重い相を濃縮して５００ｍｌとし、そこに５００ｍｌの水を添加する。この溶液を１ｌの酢酸エチルを用いて抽出する。酢酸エチルを減圧下で蒸発させて除く。得られた残渣を１．５ｌのクロロホルム中に溶解させ、０．００１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて４回洗浄する。有機相を回収し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、３．３ｇの抽出物を得る。この抽出物を５００ｍｌの酢酸エチル中に溶解させ、５００ｍｌの水を用いて洗浄する。有機相を減圧下で蒸発させ、得られた残渣を短いシリカカラムから、酢酸エチルを用いて迅速に溶出する。酢酸エチルを蒸発させて除くと、１．０ｇの抽出物を得る。この抽出物を遠心分配クロマトグラフィー（１Ｌの回転子が装備されているＫｒｏｍａｔｏｎ装置）により、比率１／３／１／３のｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水から構成されるＡｒｉｚｏｎａ  Ｈ系を使用して、上昇モード、１６℃の温度で分画する。溶媒を２５ｍｌ／分で流し、回転子のスピードは、１０００ｒｐｍとし、溶出の間には、４０バールの圧力を維持するように変化させる。抽出物（１．０ｇ）を４０ｍｌのＡｒｉｚｏｎａ  Ｈ系中に溶解させ、ろ過し、注入する。２５ｍｌの試料を収集する。試料１４−１５−１６を組み合わせて、画分Ｆ１（１２０ｍｇ）を得る。この画分をクロマトグラフィーにより、シリカカラム上で、シクロヘキサン／酢酸エチルの混合物を、極性を増加させて用いて溶出して精製する。ＳｋＥ（１０ｍｇ）を５０／５０のシクロヘキサン／酢酸エチルの混合物を用いて溶出する。植物からの収率は０．００４％である。
【００４６】
ＳｋＥを質量分析、ＮＭＲおよび赤外分光法、ならびにＳｋＥの旋光度により特徴付けた。また、結晶が、重水素化メタノールから得られたので、分子のＸ線画像も得られた。ＳｋＥの物理化学的特徴を以下に示す。
【００４７】
【表１】
0005681708.tif 000003
【００４８】
Ｂ  −  生物学的活性
Ｂ１  −  材料および方法
−  熱帯熱マラリア原虫の培養
熱帯熱マラリア原虫の以下の３つの株を使用した。
−  クロロキン感受性のＦ３２  Ｔａｎｚａｎｉａ、
−  クロロキン耐性ＦｃＢ１  Ｃｏｌｏｍｂｉａ、
−  Ｗ２  Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ。
【００４９】
日常的に維持される唯一のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養物が、（疾患の臨床所見に対応する）赤血球内段階の培養物である。全てのステップを、培養物が任意の細菌または真菌により汚染される危険を冒さないように、層流フード（ＰＳ２、Ｊｏｕａｎ）下で、無菌性の基本則を適用することによって実施する。培養は、いずれの抗菌性または抗真菌性の分子も存在しない状態下で実施する（これらの分子には、抗マラリア原虫活性の評価を妨げる可能性がある）。
【００５０】
熱帯熱マラリア原虫の培養は、２５または７５ｃｍ２の無菌の培養皿（供給元：ＴＰＰ、スイス）中で実施する。毎日、培地を交換しなければならず、寄生虫の生存に適したｐＨ（ｐＨ≒７．２〜７．４）を維持しなければならない。使用する技法は、Ｗ．ＴｒａｇｅｒおよびＪ．Ｂ．Ｊｅｎｓｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７６、１９３（４２５４）：６７３〜６７５頁により最初に記載された技法から得られる。
【００５１】
使用する培地は、ＲＰＭＩ１６４０（供給元：Ｌｏｎｚａ、Ｅｍｅｒａｉｎｖｉｌｌｅ）である。この出発培地に、
−  ２５ｍｍｏｌ／ｌのヘペス（供給元：Ｌｏｎｚａ、Ｅｍｅｒａｉｎｖｉｌｌｅ）、
−  ２００ｍＭのＬ−グルタミン（供給元：Ｌｏｎｚａ、Ｅｍｅｒａｉｎｖｉｌｌｅ）、
−  ７％ｖ／ｖのＡＢヒト血清（供給元：ＳＨＡＢ、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ［フランス血液銀行］、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ  Ｒａｎｇｕｅｉｌ）
を補充する。
【００５２】
次いで、およそ４％のヘマトクリットを維持し、寄生虫血をおよそ２％に維持するように、寄生されている健常な赤血球（ＨＲＢＣ）をまた、寄生されている赤血球（ＰＲＢＣ）を添加する（ＲＢＣ  Ｏ＋、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ［フランス血液銀行］、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ  Ｒａｎｇｕｅｉｌ）。この点を検証するために、毎日、血液塗抹標本を培養皿から調製し、Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ（供給元：Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｐａｒｉｓ  Ｌａ  Ｄｅｆｅｎｓｅ）を用いて染色する。次いで、寄生虫血を光学顕微鏡（倍率、×１００）下で読み取ることによって視覚的に評価する。
【００５３】
例えば、塗抹標本の読取り後の寄生虫血が８％である場合、前記寄生虫血を２％に戻すために、培養物ペレットを４つに分割することが必要である。ヘマトクリットをおよそ４％、すなわち、およそ１０ｍｌの培地（２５ｃｍ２皿）中では４００μｌの赤血球ペレット、またはおよそ３０ｍｌの培地（７５ｃｍ２皿）中では１．２ｍｌの赤血球ペレットに継続的に維持する。
−  塗抹標本の染色
Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ（登録商標）迅速染色セットは、ギムザ染色を用いて得られる結果に近い結果を出し、非常に素早く使用される。したがって、Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ（登録商標）を日常的に使用して、寄生虫の増殖を毎日評価する。ギムザ技法は、より面倒であり、正確な寄生虫血の評価（同調アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける評価）のために後で使う。
Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ（登録商標）
あらかじめ乾燥した血液塗抹標本をＤｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ（登録商標）溶液中に数回浸し、したがって、わずか３０秒後に固定および染色することができる。
【００５４】
このセットは、３つの試薬、すなわち、
−  固定液：メタノール中に溶解させたＦａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ（０．００２ｇ／ｌ）、
−  第１の色素：ｐＨ＝６．６のリン酸緩衝液中に溶解させたエオシン（１．２２ｇ／ｌ）、および保存剤としての０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム中に溶解させたエオシン、
−  第２の色素：ｐＨ＝６．６のリン酸緩衝液中に溶解させたチアジン色素（１．１ｇ／ｌ）
を含む。
使用するための技法
最初に、種々の反応物を、蓋を有する染色皿または任意のその他の適切な容器中に置く。
【００５５】
次いで、塗抹標本を固定液に５回連続して出し入れして１秒間、次いで、第１の色素に７回連続して出し入れして１秒間、最後に第２の色素に２０回連続して出し入れして１秒間浸す。
【００５６】
５、７または２０秒間の単回の浸漬では、染色が芳しくない。
【００５７】
過剰な溶液は、各試薬の間に、迅速に流して除かなければならない。
【００５８】
乾燥後、スライドを光学顕微鏡下で読み取ることができる。
ギムザ
ギムザは、酸性色素のエオシン酸アズールと、塩基性色素のメチルバイオレット、メチルブルーおよびメチルアズールとから構成される中性の染色であり、水中で沈殿する。得られた沈殿物は、水中では不溶性であるが、メチルアルコール中では溶解性である。
【００５９】
酸性の細胞構成成分が、塩基性色素により選択的に染色される。これらの構成成分は、好塩基性と記載され（寄生虫のＤＮＡ）、ブルー〜バイオレットに染色される。
【００６０】
塩基性の細胞構成成分が、酸性色素により選択的に染色される。これらの構成成分は、好酸性（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｃ）または好酸性（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ）と記載され（赤血球の細胞質）、オレンジ様〜ピンクに染色される。
【００６１】
好中性の構成成分は、酸性色素および塩基性色素の両方により染色される。
ギムザ保存液の調製
アルミ箔を用いて覆われている（遮光）三角フラスコ中の１００ｍｌのグリセロール（供給元：Ｓｉｇｍａ  Ｕｌｔｒａ、Ｇ６２７９−１Ｌ）中に、１．５２ｇのギムザ（供給元：Ｓｉｇｍａ、Ｇ５６３７−２５Ｇ）を添加し、６０℃の水浴中で数分間加熱する。
【００６２】
次いで、混合物を周囲温度でおよそ４時間磁気撹拌する。メタノール（１００ｍｌ）を添加し、容器を一晩磁気撹拌し続ける。
【００６３】
翌日、撹拌を停止する。調製物を１週間静置状態に保ち、次いで、ひだろ紙Ｎｏ．３を使用して、遮光したフラスコ中にろ過する。
−  ｐＨ＝７．２の緩衝液の保存液の調製
２ｇのリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）および５ｇのリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ）を１Ｌの蒸留水に添加する。
−  塗抹標本染色溶液の用時調製
この溶液は、ギムザ保存液を緩衝溶液中で１０％に希釈することによって得られる。次いで、塗抹標本を溶液中に、スライドホルダーを使用して浸し、接触のおよそ２０分後に、水を用いて濯ぐ。乾燥後、スライドを光学顕微鏡下で読み取ることができる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、培養物の、古い形態の溶解による同調
この技法（Ｌａｍｂｒｏｓ，Ｃ．およびＪ．Ｐ．Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、１９７９、６５（３）：４１８〜４２０頁）は一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて観察される寄生虫の同調的な発達の状態を再構成するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗マラリア原虫活性の評価試験を実施する前に培養物に対して実施される。この技法により、古い寄生虫の形態を排除し、単一の段階、すなわち、環状期の若い形態のみを保つことが可能となる。また、この技法により、古い形態の選択的濃縮と組み合わせて（Ｒｉｂａｕｔ，Ｃ．ら、Ｍａｌａｒｉａ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００８、７（１）：４５頁）、試験する分子が優先的に作用する寄生段階を評価することも可能となる。
【００６４】
原理：寄生虫は、赤血球内増殖の間に、代謝のために大量の栄養素を必要とする。宿主細胞が、限定的な資源しかもたないので、寄生虫は、基質および異化産物の膜を越えた輸送を増加させるように、赤血球膜を透過性にする。赤血球の透過性が、寄生虫の加齢と共に増加する。したがって、熱帯熱マラリア原虫に感染している赤血球の高いヘキシトール透過性を使用して、古い寄生虫に感染している赤血球（シゾント段階）を選択的に溶解させる。若い寄生虫の形態、すなわち、環状期のみが生存する。
【００６５】
技法：５ｇのＤ−ソルビトール（Ｓｉｇｍａ、フランス）を１００ｍｌの蒸留水中に可溶化する。次いで、無菌溶液を得るために、混合物全体を０．２２μｍのミリポアフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ、Ｃｏｒｋ）を通過させることによってろ過する。同調させようとする培養物は、顕著な量の若い（環）形態を有さなければならない。前記培養物を４５０ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除去する。
【００６６】
あらかじめ調製し、３７℃に加熱したソルビトール溶液を培養物ペレットに、滴下して添加する。全体をホモジナイズした後、３７℃の水浴中に１０分間保つ。
【００６７】
次いで、さらに遠心分離し、ソルビトールを含有する上清を除去し、赤血球ペレットを血清を含有しないＲＰＭＩを用いて２回洗浄する。次いで、赤血球ペレットをあらかじめ調製し、３７℃に保った完全培地を含有する皿中の培養物中に戻す。
抗マラリア原虫活性の評価
種々の産物の抗マラリア活性をＤｅｓｊａｒｄｉｎｓらが記載し、Ｂｅｎｏｉｔらが改変を導入した、トリチウム標識したヒポキサンチンを使用する放射活性による方法により評価する（Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ  Ｒ．Ｅ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、１９７９、１６：７１０〜７１８頁；Ｆ．Ｂｅｎｏｉｔら、Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．８９：２１７〜２１８頁）。
【００６８】
試験を９６ウエル培養プレート（供給元：ＴＰＰ、スイス）中で、主として環状期の培養物に対して実施する。寄生虫を産物と３７℃および５％ＣＯ２で４８時間接触させる。次いで、寄生虫の増殖を以下の寄生虫の核酸内へのトリチウム標識したヒポキサンチンの組込みにより推定する。ＩＣ５０値を濃度の関数としての増殖のパーセント阻害曲線に関するグラフから決定する。したがって、ＳｋＥの抗マラリア活性を以下のプロトコールに従って評価した。
【００６９】
各試験物質について、ウエルに、寄生されている赤血球を含有する溶液（１．５％寄生虫血、２％ヘマトクリットを有する溶液）１００μｌを播種し、次いで、ウエルに、希釈度を増加させたＳｋＥ１００μｌ（保存液は、ＤＭＳＯ中に調製し、希釈は、完全培地中で行う）を添加する。
【００７０】
プレートを調製したら、インキュベーター中に２４時間置く（３７℃、５％ＣＯ２および加湿雰囲気）。対照分子のクロロキンを、１０％血清を補充した３７℃のＲＰＭＩ中に直接可溶化する。
【００７１】
２４時間のインキュベーションの後、ＲＰＭＩ中で０．３７ＧＢｑ／ｍｌに希釈した、トリチウム標識したヒポキサンチン溶液２０μｌを各ウエルに添加する（トリチウム標識したヒポキサンチン１ｍＣｉ／ｍｌ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。次いで、プレートを２４時間インキュベートし、次いで、赤血球の溶解を引き起こすために凍結する。
【００７２】
プレートを周囲温度でおよそ１時間かけて解凍する。次いで、赤血球を細胞ハーベスター（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ、Ｐａｃｋａｒｄ）により、フィルター（Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ａフィルター、１４５０−４２１、Ｗａｌｌａｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上に収集する。次いで、フィルターを周囲温度で乾燥する。フィルターを乾燥したら、密封したバッグ（Ｓａｍｐｌｅ  Ｂａｇ、１４５０−４３２、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中に置き、次いで、２ｍｌのシンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加する。
【００７３】
次いで、放射活性を測定するために、フィルターをβ−カウンター中に置かれているカセット中に置く。結果をいずれの活性成分も与えられていない対照（０％阻害）と比べた組込みの阻害を、試験した活性成分の濃度の関数として示す曲線上に表す。次いで、ＩＣ５０（寄生虫の増殖の５０％を阻害する濃度）をグラフから計算する。
細胞傷害性の評価
この評価は、２つの細胞型、すなわち、乳房腫瘍細胞株であるＭＣＦ−７系、およびベロ細胞（サル腎臓細胞）に対して実施する。
【００７４】
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が強化されたＤＭＥＭ培地中でＭＣＦ−７細胞を培養する。その他の培養または試験を実施するように、細胞がコンフルエントになった場合には、週２回、細胞を継代培養（継代）する、すなわち、細胞を再度利用するために、細胞を細胞の支持体から引き離すことが必要になる。継代は、３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を細胞の単層に添加し、次いで、３７℃でインキュベートして３分間保つことによって実施する。トリプシン−ＥＤＴＡは、細胞外マトリックスを消化することによって、付着細胞を引き離し、次いで、懸濁液中の細胞を回収することを可能にする。ＦＣＳを有するＤＭＥＭを添加することによって反応を停止する。次いで、細胞数をＭａｌａｓｓｅｚ細胞上で評価する。死んだ細胞のパーセントを決定するために、トリパンブルーを用いて生体染色を実施する（死んだ細胞は、３０％を上回るべきではない）。
【００７５】
７５ｃｍ２皿当たり３００万個で、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳの３０ｍｌ中に細胞を再播種し、インキュベーター（３７℃、加湿空気、５％ＣＯ２）中に置く。
【００７６】
ベロ細胞は、サル腎臓上皮細胞である。ＭＣＦ−７と同じ方法でベロ細胞を培養するが、１０％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ヘペスおよびグルタミンを補充したＥＭＥＭ培地中で培養する。
【００７７】
細胞傷害性の評価は、抗マラリア活性試験と同じ方法に従うが、熱帯熱マラリア原虫をＭＣＦ−７またはベロ細胞で置き換える。
【００７８】
しかし、培養の異なる様式に起因する小さな改変がいくつかある。これは、細胞傷害性試験のために使用する細胞が付着細胞であり、それらの増殖がより緩慢であることによる。したがって、試験産物と接触させる２４時間前に、９６ウエルプレート中に細胞を播種する。２４時間後、細胞をウエルの底部に付着させ、培地を交換し、次いで、試験分子を添加し、それらの希釈を完全培地中で実施する。使用する培地は、使用する細胞によって異なる（ＤＭＥＭまたはＥＭＥＭ）。
【００７９】
抗マラリア活性試験と同じように、産物と接触させた２４時間後にトリチウム標識したヒポキサンチンを添加し、４８時間後にプレートをフリーザー中に置く。最後に、抗マラリア活性試験について放射活性を測定する。熱帯熱マラリア原虫のＩＣ５０値の評価について、ＩＣ５０値の評価をグラフから実施する。
殺生殖母細胞活性の評価
Ｗ２株の培養物に対してのみ殺生殖母細胞活性を評価する。使用する技法は、ＩｆｅｄｉｂａおよびＶａｎｄｅｒｂｅｒｇが記載し（Ｉｆｅｄｉｂａ，Ｔ．およびＪ．Ｐ．Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８１、２９４（５８３９）：３６４〜３６６頁）、Ｓａｌｌらが記載した改変（Ｓａｌｌ，Ｃ．ら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００８  １８（１６）：４６６６〜４６６９頁）を伴う技法から得られる。Ｄ−ソルビトールを用いて培養物を溶解した後に、２％の寄生虫血（ヘマトクリット４％）に調節する。完全培地を有し、さらに、２００ｍＭのヒポキサンチンも含有する培養皿（７５ｃｍ２）を垂直に保つ。１１日間毎日この培地を交換する。この時期に、Ｎ−アセチルグルコサミンを培地に添加する。２日後に、２４ウエルのプレート中に生殖母細胞を分配し、濃度を増加させて活性成分を添加する（三つ組）。４８時間後に、塗抹標本を各ウエルに対して実施する。ｇａｍｅｔｏｃｙｔｅｍｉａを視覚的に評価し、対照（活性成分を有さないウエル）と比べたパーセント阻害を濃度の関数として示す曲線をプロットする。次いで、ＩＣ５０ｇ（生殖母細胞）をグラフから決定する。使用する対照は、プリマキン、すなわち、参照の殺生殖母細胞性の抗マラリア薬である。
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗マラリア活性の評価
Ｐ．ビンケイペテリに感染させた雌Ｓｗｉｓｓマウス（２２ｇ±２）上でＳｋＥの抗マラリア活性を評価した。試験のために使用するマウスに感染させる前に、寄生虫を解凍し、２バッチのマウス中に注射し、継代することにより維持した。寄生されている血液を後眼窩鼻腔から採取し、研究の各マウスに、２×１０７個の寄生虫を腹腔内感染させた。感染動物を１ケージ当たり５匹のバッチに分け、４日間毎日腹腔内から治療した。各マウスに２００μｌの調製物を与えるように、９０％ＤＭＳＯ（腹腔内経路）またはカルボキシメチルセルロース（経口経路）中に調製した４つの濃度でＳｋＥを試験した。実験は、２００μｌの９０％ＤＭＳＯまたはＣＭＣを単独で経口により与えた、対照の寄生されているマウス、および３バッチの５匹のマウスを含み、これらのバッチのそれぞれは、ＰＢＳ中に希釈した１、５および１０ｍｇ／ｋｇのクロロキン溶液を用いて治療した（ＩＰ）。
【００８０】
治療の終わり（感染の５日後）に、各マウスの尾から１滴の血液を得、メタノールを用いて固定し、ギムザを用いて染色して、血液塗抹標本を実施した。スライドを顕微鏡下で調べ、寄生虫血を１００００個の赤血球について数えた。
【００８１】
マウスの生存を２１日間モニターした。
ネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）および熱帯熱マラリア原虫の肝臓段階に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるシマリカラクトンＥ（ＳｋＥ）の活性の評価
前赤内期の段階に対するＳｋＥのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性を、異なるプラスモジウム属の種で試験した。熱帯熱マラリア原虫（Ｒ．Ｓａｕｅｒｗｅｉｎ、オランダによる収集物）の連続的な培養物を与えた蚊ステフェンスハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）の感染唾液腺、またはネズミマラリア原虫を寄生させたマウス（Ｉｎｓｅｃｔａｒｉｕｍ  ｏｆ  ＩＮＳＥＲＭ  Ｕｎｉｔ  ９４５）の感染唾液腺からスポロゾイトを得た。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアッセイをヒト初代肝細胞（ＨＨ）またはマウス初代肝細胞（ＭＨ）の培養物それぞれを使用して実施した。一次細胞を（それぞれ、ヒトまたは雌のＳｗｉｓｓマウスから得た）肝臓の小片のコラーゲナーゼの灌流により単離し、続いて、分離した細胞をパーコール勾配上で精製した。肝細胞を９６ウエルマイクロプレート中に播種し（３５０００個のＭＨ／ウエルおよび８２５００個のＨＨ／ウエル）、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、５μｇ／ｍｌのインスリンおよび５×１０−７Ｍのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンを補充したＷｉｌｌｉａｍ培地中の培養物中に３７℃および５％ＣＯ２で維持した。ＳｋＥの保存液をＤＭＳＯ中に２００ｍｇ／ｍｌで調製し、次いで、所望の濃度を得るように、上記の完全培地中で希釈した。肝細胞に、ネズミマラリア原虫のスポロゾイト（３００００個）、または熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト（４００００個）を感染させた。ＳｋＥ化合物を種々の濃度で、スポロゾイトと同時に添加した。次いで、培地をスポロゾイトの接種の３時間後に置き換え、次いで、毎日置き換えた。ネズミマラリア原虫については感染の４８時間後に、および熱帯熱マラリア原虫については感染の５日後に培養物を固定した。ＰｆＨＳＰ７０に対して作られたマウス血清を用いて肝臓のシゾントを蛍光免疫標識した後、化合物の阻害作用を蛍光顕微鏡解析により定量化した。Ｅｘｃｅｌソフトウエアを用いて活性を評価して、ＩＣ５０、すなわち、未処理の対照と比べて感染の５０％を阻害する濃度を計算した。
初代げっ歯類肝細胞または初代ヒト肝細胞に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＳｋＥの細胞傷害性の評価
並行して、化合物の細胞傷害性も、試験化合物の活性についてのアッセイにおけるのと同じ条件下で処理したヒトおよびげっ歯類の肝細胞上で、ＭＴＴ（テトラゾリウム）比色分析アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎら、１９８３）により評価した。初代のげっ歯類またはヒトの肝細胞をそれぞれ、種々の濃度の試験化合物と共に２日間または５日間インキュベートした後、１００μｌのＭＴＴ溶液（５００μｌ／ｍｌ）を各ウエルに添加した。次いで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。次いで、ホルマザンの結晶を１００μｌのＤＭＳＯ−エタノールの混合物（Ｖ／Ｖ）中に溶解させた。光学密度を分光光度法により５４０ｎｍにおいて測定した。結果を未処理の対照と比べたパーセント細胞生存率として表す。
Ｂ２  −  結果
ＳｋＥの抗マラリア原虫活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて決定した。結果を図１の表に報告する。
【００８２】
ＳｋＥは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、熱帯熱マラリア原虫の３つの異なる株に対して、２４ｎＭ〜６８ｎＭの間のＩＣ５０値を示す。活性は、使用した株のクロロキン耐性のレベルに依存しない。
【００８３】
Ｐｅｔｅｒｓ試験プロトコールによれば、ＳｋＥは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｐ．ビンケイペテリに感染させたマウスに対して経口（ＰＯ）または腹腔内（ＩＰ）により活性を示す。対照がクロロキン、ｉｐ（ＥＤ５０＝３ｍｇ／ｋｇ／日）である場合、ＩＰ経路（対照の寄生虫血の平均して５０％に等しい寄生虫血を付与する用量に対応する５０％有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ  ５０）、ＥＤ５０＝０．５ｍｇ／ｋｇ／日）は、ＰＯ経路（ＥＤ５０＝１ｍｇ／ｋｇ／日）よりも有効である（図２の表）。
【００８４】
マウスの生存を３週間モニターし、生存時間を１つの実験について求める（図３および表３）。ＳｋＥ、ｉｐ、１ｍｇ／ｋｇ／日を用いて治療したマウスの平均生存時間は、１８．６日超であり、クロロキン、ｉｐ、１０ｍｇ／ｋｇ／日を用いて治療したマウス平均生存時間に類似する。
【００８５】
生存曲線（図３）が示すように、ＩＰ経路については、１ｍｇ／ｋｇ／ｄの用量が、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＣＱについて得られるものと同等であることが明らかである。さらに、表１により確認されるように、ＩＰ経路を介すると、マウスの生存は常に、１の用量のＣＱを用いて治療したマウスの生存よりも良好であり、ｐ＜０．０５を示す（統計学的に有意な差を示す可能性が９５％であると仮定される）。ＳｋＥ、ＩＰ、０．５群およびＳｋＥ、ＩＰ、１群を５ｍｇ／ｋｇ／ｄのＣＱと比較する場合、同じ有意な差が見出される（ｐ＜０．０５）。
【００８６】
また、以下の細胞傷害性活性も実証された。
【００８７】
ＳｋＥの細胞傷害性は、細胞傷害性の評価のために使用する細胞によって異なり、６μＭ（ベロ細胞）〜３３ｎＭ（ＴＨＰ１細胞）の範囲に及ぶ。
【００８８】
また、ＳｋＥは、寄生虫の有性型（生殖母細胞）に対しても作用し、優れた殺生殖母細胞活性を示し、この活性は、参照分子であるプリマキンよりも７倍高い。
【００８９】
ＳｋＥの、ネズミマラリア原虫に感染させたマウス肝細胞に対する活性。３つの実験に関して計算した平均から、１８６±１６ｎＭのＩＣ５０を得た（図５の表および図６Ａを参照されたい）。ＳｋＥは、参照薬物のプリマキンと比較した場合、同じ条件下では、プリマキン（ＩＣ５０＝６４０ｎＭ）よりも少なくとも３倍活性である。並行して、細胞傷害性も評価した。毒性が、実施した３つの実験のうちの１つにおいて観察され（ＴＣ５０＝１．１２μＭ）、一方、その他の２つの実験においては、最も高い試験濃度（５．５４μＭ）でも、毒性は観察されなかった。
【００９０】
また、ＳｋＥは、熱帯熱マラリア原虫の肝臓段階に対しても活性を示す（ＩＣ５０＝１．１９８±０．１９μＭ、２つの実験に関して計算した平均）（図５の表および図６Ｂ）。観察される活性は、げっ歯類の変形体（ｐｌａｓｍｏｄｉａ））上で観察される活性よりも低いが、同じ種に対してプリマキンを用いる場合に観察される活性（ＩＣ５０＝０．８０μＭ）に近い。さらに、式ＴＩ＝ＴＣ５０／ＩＣ５０により計算した治療指数（ＴＩ＝７５）は、プリマキンの治療指数（ＴＩ＝８１）に匹敵する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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