(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｓｐ）−Ｒのフルオロカーボンベクター−抗原構築体であって、式中、ｍ＝３〜３０、ｎ≦２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ≦２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０であり、Ｓｐは、任意選択の化学スペーサー部分であり、Ｒは、HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK（配列番号１）であるインフルエンザウイルスペプチドである、フルオロカーボンベクター−抗原構築体。
【請求項２】
次の構造のフルオロカーボンベクター−抗原構築体であって、
【化３】
0005756630.tif 000004
式中、Ｓｐは請求項１に記載された通りであり、Ｒは請求項１に記載された通りである、請求項１に記載のフルオロカーボンベクター−抗原構築体。
【請求項３】
１種または複数の医薬として許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバントと共に、請求項１又は２に記載のフルオロカーボンベクター−抗原構築体を含む、医薬組成物。
【請求項４】
非経口、経口、眼内、直腸、経鼻、経皮、局所もしくは経膣投与のために処方された、または液体、乳濁液、固体、もしくはエアロゾルの形態をした、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
（１）フロイントのアジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ＣｐＧおよびモノホスホリルリピドＡなどの天然の細菌成分を自然に、または合成的に誘導して精製したもの、
（２）サポニン、アルミニウム塩およびサイトカインなどのアジュバントまたは増強剤、
（３）水中油アジュバント、油中水アジュバント、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、製剤化ナノおよびマイクロ粒子、ならびに
（４）細菌の毒素およびトキソイド
から選択されるアジュバントを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
２〜２０種の構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｓｐ）−Ｒ［式中、ｍ＝３〜３０、ｎ≦２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ≦２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０であり、Ｓｐは、任意選択の化学スペーサー部分であり、Ｒは、インフルエンザウイルスペプチド］のフルオロカーボンベクター−抗原構築体を含む、請求項３から５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
２〜８種の前記フルオロカーボンベクター−抗原構築体を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
少なくとも２種の構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｓｐ）−Ｒ［式中、ｍ＝３〜３０、ｎ≦２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ≦２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０であり、Ｓｐは、任意選択の化学スペーサー部分であり、Ｒは、インフルエンザウイルスペプチド］のフルオロカーボンベクター−抗原構築体を含む医薬組成物であって、第１の構築体は、次式のインフルエンザペプチド配列：
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK（配列番号１）
を含み、第２の構築体は、次式のインフルエンザペプチド配列：
YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE（配列番号１７）
を含む医薬組成物。
【請求項９】
５種、６種、７種または８種の構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｓｐ）−Ｒ［式中、ｍ＝３〜３０、ｎ≦２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ≦２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０であり、Ｓｐは、任意選択の化学スペーサー部分であり、Ｒは、インフルエンザウイルスペプチド］のフルオロカーボンベクター−抗原構築体を含む、請求項３から８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記５種、６種、７種または８種のフルオロカーボンベクター−抗原構築体が、以下のインフルエンザペプチド配列を含む構築体から選択されるものである、請求項９に記載の医薬組成物。
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK（配列番号１）
VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG（配列番号４）
YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE（配列番号１７）
APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA（配列番号１８）
SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY（配列番号１９）
KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG（配列番号２０）
DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS（配列番号３２）または
DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER（配列番号３５）
【請求項１１】
インフルエンザの予防又は治療のための予防用ワクチンまたは免疫治療薬の調製における、請求項１又は２に記載のフルオロカーボンベクター−抗原構築体の使用。
【請求項１２】
非経口、粘膜、経口、経鼻、局所、眼内、直腸、経皮または経膣投与のための前記予防用ワクチンまたは免疫治療薬の調製における、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
インフルエンザの治療または免疫接種のための医薬の調製における、請求項３から１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
動物またはヒトにおいて前記インフルエンザウイルスペプチドに対する免疫応答を刺激するための医薬の調製における、請求項３から１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
前記動物がトリ又は哺乳動物である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記組成物が、抗インフルエンザ療法と併用される、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗インフルエンザ療法が、ノイラミニダーゼ阻害剤である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記組成物が、体液応答性インフルエンザワクチンと組み合わせて、同時または個別のいずれかで投与するためのものである、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ワクチンが、ヘマグルチニン含有インフルエンザワクチンである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
１種または複数の医薬として許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバントと、請求項１又は２に記載のフルオロカーボン構築体を組み合わせることを含む、インフルエンザの予防又は治療のための予防用ワクチンまたは治療医薬品を調製する方法。
【請求項２１】
前記予防用ワクチンまたは治療医薬品が、非経口、粘膜、経口、経鼻、局所、眼内、直腸、経皮または経膣投与のためのものである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ抗原送達用のベクターおよび構築体に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウィルスが原因の疾患または感染症の総称である。インフルエンザウィルスは、ウィルスのオルトミクソウィルス（Orthomyxoviridae）科の構成員であり、２つの属、即ち、インフルエンザＡ型およびＢ型ウィルスと、インフルエンザＣ型ウィルスとを含む。インフルエンザＡ型、Ｂ型およびＣ型ウィルスは、各ウィルス型に特異的な内部核タンパク質およびマトリックスタンパク質に基づいて区別される。インフルエンザＡ型ウィルスは、ヒト、ブタ、鳥類、アザラシおよび馬を含む、ある範囲の動物種に自然に感染することができる。しかし、インフルエンザＢ型ウィルスは、ヒトだけに感染し、インフルエンザＣ型ウィルスは、ヒトおよびブタに感染する。インフルエンザＡ型ウィルスは、表面糖タンパク質のヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）の抗原性によって決まるサブタイプに更に分類される。
【０００３】
歴史的には、ヒトのインフルエンザＡ型感染症は、ヘマグルチニンの３サブタイプ（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）ならびにノイラミニダーゼの２サブタイプ（Ｎ１およびＮ２）により引き起こされ、より最近では、以前には鳥類限定であったサブタイプＨ５、Ｈ７およびＨ９によるヒトの感染症も報告されている。これまでに、合計で異なるヘマグルチニン１６種およびノイラミニダーゼ９種のインフルエンザＡ型サブタイプが同定されており、これらは全て鳥類に広まっている。ヒトと同様にブタおよびウマは、遥かに狭い範囲のサブタイプに限られている。
【０００４】
インフルエンザＡ型およびＢ型のビリオンは、構造的に多形態であり、球形例が直径８０〜１２０ｎｍであるのに対し、線状体は長さが３００ｎｍに及ぶこともある。粒子１個当たり、宿主由来の脂質二重層膜中に埋め込まれた表面スパイク糖タンパク質が、およそ５００個存在する（普通、ヘマグルチニンタンパク質４〜５個対ノイラミニダーゼ１個の比で）。その膜内には膜貫通型イオンチャンネルタンパク質のＭ２がある一方、構造タンパク質のＭ１は二重層の下側にある。ウィルスのコア内では、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡが、ゲノムから発現される他のウィルスタンパク質６種、即ち核タンパク質（ＮＰ）、転写酵素３種（ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡ）ならびに非構造タンパク質２種（ＮＳ１およびＮＳ２）と会合している。インフルエンザウィルスのゲノムは、８分節、即ち「遺伝子交換（gene swapping）」による再集合を可能にする特徴を含む。ヘマグルチニンは、宿主細胞受容体とのウィルスの結合を可能にし、後にその中で複製することになる細胞の中へのウィルスの進入を促進する。ノイラミニダーゼタンパク質は、シアール酸末端残基を酵素的に切断するが、気道のムチン層を通るウィルスの輸送を補助し、ならびに宿主細胞からの子孫ウィルスの出芽を促進すると考えられている。ヒトにとって遥かに健康リスクの少ないインフルエンザＣ型ウィルスは、ヘマグルチニン、融合活性および受容体破壊活性を併せ持つ単一の表面タンパク質を有する。
【０００５】
変異性（error prone）ＲＮＡポリメラーゼ酵素の結果として、インフルエンザウィルスのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの両タンパク質は、ウィルスの複製能に必ずしも影響する必要のない点変異を受け易い。宿主抗体の応答で認識される部位の１つにおけるこのような変異（または同時発生変異）は、ワクチン接種または以前の感染で誘発された宿主抗体が、この「新たな」ウィルス株に有効に結合できないため、感染を持続させる結果になる恐れがある。ヒトインフルエンザ株は、こうした点変異を介して継続的に進化しているので、このウィルスは、ヒトの免疫応答の限られた抗体範囲を回避し、流行病を起こすことができる。そのため、インフルエンザ感染症の定期的な「季節性」発作が、集団において抗原連続変異を受けている循環株により起こされる。
【０００６】
季節性流行の間に、インフルエンザは、素早く世界中に広がることができ、病院および他の保健上のコストならびに生産性の損失から見て、大きな経済的負担を被る。このウィルスは、空気中の飛沫となってヒトからヒトへ移され、上気道の気管および気管支中の上皮細胞を標的にする。インフルエンザウィルスは、汚染された表面から取り上げられ、口に運ばれることもある。疾患は、特に込み合った状況では、咳およびくしゃみを介して非常に素早く広がる。このウィルスの安定性は、低い相対湿度および低い温度により促進され、その結果、温帯地域における季節性流行病が冬に発生する傾向がある。インフルエンザＡ型株の方では、高い罹患率および致死率が認められ、インフルエンザＢ型株の方は、普通、発病率が低く、疾患の程度も軽い。しかし、時にはインフルエンザＢ型が、Ａ型ウィルスと同じ重度の流行病を起こすこともある。インフルエンザＢ型は、主に児童の病原体であり、Ａ型と同程度の抗原変異性を示すことが普通はない。
【０００７】
合併症を伴わない典型的なインフルエンザ感染症は、急速な発病（頭痛、咳、寒気）に続く、発熱、喉の痛み、相当な筋肉痛、不定愁訴および食欲不振を特徴とする。更なる症状には、鼻汁、胸苦しさおよび眼球症状を挙げ得る。感染症の最も顕著な症候は、温度範囲が普通３８〜４０℃の発熱である。大多数の人々は、全く医療処置をせずに１〜２週以内にインフルエンザ感染症から回復すると見込まれるが、集団に所属する一定の人たちにとっては、この疾患は、重大な危険性を呈することがある。このような個人には、幼児、高齢者、および肺疾患、糖尿病、癌、腎障害または心臓障害などの病状に罹っている人たちが挙げられる。この「危険状態にある」集団において、該感染症は、基礎疾患の重篤な合併、細菌性肺炎（肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌および黄色ブドウ球菌などの呼吸器系病原体で起こる）、および死亡を起こすこともある。インフルエンザ感染症の臨床的特徴は、子供においても類似しているが、発熱が高くなることがあり、熱性痙攣を起こす恐れもある。それに加え、子供では、嘔吐および腹痛、ならびに中耳炎の合併、クループおよび筋炎の発症率が高い。
【０００８】
世界保健機構の推計では、毎年のインフルエンザ流行で、人口の５〜１５％が上気道感染症に罹る。入院および死亡は、主にハイリスクグループ（高齢者および慢性病患者）で起こる。評価は困難であるが、こうした毎年の流行の結果、重病が３百万から５百万症例、および死亡がおよそ２５万から５０万件、毎年世界中で発生していると考えられる。工業国でインフルエンザに伴う現在の死亡の９０％強が、６５歳を超えた高齢者の間で起こっている。米国では、ＣＤＣの推計によれば、季節性インフルエンザ感染症から生じた合併症の後で、毎年平均して２０万人強が入院しており、３万６千人程の超過死亡率が記録されている。
【０００９】
インフルエンザ感染症からの回復を制御する宿主免疫応答は、表面タンパク質に向けられる血清抗体、粘膜分泌ＩｇＡ抗体、および細胞性免疫応答の組合せにより与えられる。一次感染から１〜２週後、中和性の赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）抗体ならびにノイラミニダーゼに対する抗体が、血清中に検出でき、およそ３〜４週にピークとなる。再感染の後では、抗体応答が急速になる。インフルエンザ抗体は、数カ月間または数年間持続し得るが、一部のハイリスクグループでは、抗体レベルが、ワクチン接種から２〜３カ月以内に低下し始めることがある。ＩｇＡ分泌抗体は、感染からおよそ１４日後にピークとなり、唾液、鼻汁、痰、および気管洗浄液中に検出することができる。抗体産生細胞の出現に先立って、インフルエンザに対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が出現し、最大ウィルス量を減少させる一方、抗ウィルス性サイトカインの誘導により、より迅速なウィルス消滅を媒介し、更に感染細胞を溶解することによって、感染症を制限するように働く。それに加え、単核細胞が、感染気道に浸潤し、インフルエンザ感染細胞に対して抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害を加える。
【００１０】
現在までのところ、インフルエンザなどの呼吸器系ウィルス感染症に対するワクチン手法は、ビリオンの中和または細胞内へのウィルス進入の阻止によりウィルス感染から防護する、抗体の誘導に本質的に依存している。こうした体液性免疫応答は、所与の株に対して保存されているウィルス表面外部タンパク質を標的にする。そのため、抗体媒介防護は、同種ウィルス株に対しては有効であるが、血清学的に異なる表面タンパク質を有する異種株に対しては十分ではない。この異同は、多くのウィルスの表面タンパク質が急速に変異できるので、重要である。例えば、ある種のインフルエンザウィルスに対して有効な体液応答性ワクチンは、次の季節の変異体に対しては無効になる恐れがある。
【００１１】
現在、認可されたインフルエンザワクチンには主に２種類ある。１群のワクチンは、活性免疫原としてウィルスの表面タンパク質のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを含有する。こうしたワクチンには、不活化全ウィルスワクチン、界面活性剤処理で破壊された不活化ウィルス粒子からなるウィルス成分ワクチン、他のウィルス成分を除去した精製表面タンパク質から本質的になるサブユニットワクチン、およびその表面タンパク質をリポソーム表面上に提示したヴィロソームが挙げられる。第２群は、弱毒化した生の低温適応したウィルス株を含む。こうした全てのワクチンのために、普通は３株または４株のウィルスに由来する表面抗原のブレンドが必要である。現在市販のインフルエンザワクチンは、Ａ型の２サブタイプＨ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１、ならびにＢ型のウィルス１種を含有している。毎年各々９月および２月に、ＷＨＯ世界インフルエンザ計画（Global Influenza Program）は、次の季節のためにインフルエンザワクチンの組成を勧告しているが、この季節は、普通、南半球では５〜６月に始まり、北半球では１１〜１２月に始まる。この組成は、各国インフルエンザセンターおよびＷＨＯ協力センターの世界的ネットワークからの監視データに基づいており、９カ月後に循環しそうな各株を包含することが試みられている。こうした理由から、製造業者は、循環ウィルス株との正確な一致を実現することを保証するために、各年ごとにインフルエンザワクチンの組成を変えざるを得ない。
【００１２】
大抵の不活化インフルエンザワクチンは、三角筋中の筋肉内経路を介して投与されるが、推奨部位が大腿部の前外側面である幼児は別である。不活化ワクチンは、１年につき単回用量が適当であるが、例外として、既往病状のあったワクチン接種未経験の就学前児童は、少なくとも１カ月の間隔を置いて２回の用量を受けるべきである。弱毒化した生のインフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）は、経鼻投与で送達される。こうしたワクチンは、長年ロシアで利用されており、米国では最近、小児集団における使用が認可されている。このようなワクチンは、鼻の上皮表面において局所抗体および細胞性免疫応答を誘発することができる。しかし、弱毒化した生のインフルエンザワクチンは、米国では高齢者集団（５０歳過ぎ）における使用が認可されていない。
【００１３】
インフルエンザウィルスの表面タンパク質に対する免疫応答の広がりおよび強度を高めるために、多様なアジュバントおよび代替的な免疫増強剤をワクチン製剤中に含めることが評価されてきた。これに関するアジュバントは、一緒に投与した抗原に対する免疫応答を調節できるが、それだけを投与した場合は、直接作用があるにしても殆どない作用剤である。インフルエンザワクチン分野における最近の認可済み開発品には、サブミクロンの水中油乳濁液であるＭＦ−５９が含まれる。アルミニウム含有アジュバントも、一部の製造業者により使用されている。こうしたアジュバントの意図は、投与抗原に対して生じる血清抗体の応答を増幅することである。
【００１４】
ワクチン株と一般集団で循環している株とが抗原として良好に一致することを前提とすれば、不活化インフルエンザワクチンは、健常成人の約７０％〜９０％において試験室確認済みの病気を予防する。しかし、ＣＤＣは、高齢者（６５歳過ぎ）におけるワクチンの有効性が、３０％〜４０％もの低さとなり得ると強調している。これに関しては、ヒトの老化は、ワクチンの有効性を低下させ、自然感染の危険性を増加させる記憶Ｔ細胞の応答欠陥を生み出すとの所見が、関係している。更に、地域社会的環境での臨床試験によれば、６０歳過ぎのグループにおけるインフルエンザ疾患の防護には、体液性免疫ではなく、細胞性免疫が相関していることが実証された。
【００１５】
それに加え、ワクチン株が循環株と抗原性が異なる場合、有効率は顕著に低下する。抗原変異性の試験によれば、インフルエンザＡヘマグルチニンの少なくとも２つの抗原部位に及ぶ４個以上のアミノ酸が置換すると、ワクチンの有効性を弱めるのに十分に識別される連続変異体を生じる（Jin H, Zhou H, Liu H, Chan W, Adhikary L, Mahmood K, et al. "Two residues in the hemagglutinin of A/Fujian/411/02-like influenza viruses are responsible for antigenic drift from A/Panama/2007/99." Virology. 2005;336:113-9）Ａ／Ｈ３Ｎ２のワクチン株と循環株が十分に一致しなかった２００３〜０４年時季節中に、インフルエンザが試験室で確認された年齢５０〜６４歳の成人に関する患者対照研究において、ＣＤＣによれば、ワクチンの有効性は、健常者では５２％で、１つまたは複数のハイリスク状態の人では３８％と推定された。不一致の確率は、限られた適時な製造機会によって上昇する。したがって、株の確認から、種株の生産、抗原の製造および精製、ならびに三価混合および製品の充填までの時間が、通常６カ月未満で全て現れなければならない。
【００１６】
時には、病原性が高く、抗原性が新規であり、世界的な汎発性流行病を起こす新たなインフルエンザ株が、出現する。汎発性インフルエンザは、表面タンパク質の抗原不連続変異の結果であり、既存の免疫が各人に発現されなかった際に、世界的な保健にとって重大な脅威となる。汎発性株は、集団における突然の出現および抗原の新規性を特徴とする。２０世紀の間に、４回の汎発性流行病が発生した。１９１８年の原因株はＨ１Ｎ１であり、１９５７年にはＨ２Ｎ２、１９６８年にはＨ３Ｎ２、および１９７７年にはＨ１Ｎ１であった。
【００１７】
抗原不連続変異の発生には、３種の代替的な説明がなされている。第１に、インフルエンザウィルスのゲノムは分節化しているので、インフルエンザ２株は、単一宿主、例えばブタに重感染したときに、各々の遺伝子を交換し、異なる親株ウィルスの遺伝情報を保持する、複製能力ある子孫の構築を果たすことが可能である。遺伝子再集合として知られているこの過程は、１９５７年および１９６８年の汎発性流行病の原因であったと考えられている。１９６８年の汎発性流行病は、鳥類ドナーからのＨ３ヘマグルチニン遺伝子および他の１種の内部遺伝子が、循環していたヒトＨ２Ｎ２株からのＮ２ノイラミニダーゼおよび他の５種の遺伝子と混ぜ合わされたときに発生した。第２に、非ヒトインフルエンザ株は、ヒトに感染する能力を獲得する。１９１８年の汎発性流行病は、鳥類Ｈ１Ｎ１株が、ヒトからヒトへの迅速で効率的な移動を可能にするように変異したときに発生した。第３に、以前の流行病を起こした株は、ヒト集団内に隠れ、変化せずに存続し得る。例えば、１９７７年の汎発性Ｈ１Ｎ１株は、２７年前に流行病を起こした株と本質的に同一であり、その間の年月に亘ってヒトと動物の保有宿主中に検出されなかった。
【００１８】
以下の３つの主な規準が満足されてしまうと、インフルエンザが汎発流行する恐れがある。
１．少なくとも１世代の間見られなかったインフルエンザウィルスＨＡサブタイプが、出現する（再出現する）。
２．該ウィルスが、ヒトにおいて感染し、効率的に複製し、重大な病気を起こす。
３．該ウィルスが、ヒトの間で容易に持続的に伝染する。
【００１９】
世界的な汎発性流行病で、単一年に世界人口の２０％〜４０％が苦しむ恐れがある。例えば、１９１８〜１９年の汎発性流行病で、世界中で２億人が苦しみ、３千万人強が死んだ。米国では、人口の０．５％を占める５０万人強が亡くなった。ワクチンおよび抗ウィルス療法が開発されて、その当時から保険医療が劇的に改善されてきたが、ＣＤＣは、汎発性流行病が今日発生すれば、世界全体で２〜７百万件の死亡が生じると推定している。
【００２０】
１９９９年以来、インフルエンザサブタイプの異なる３株（Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７およびＨ９Ｎ２）が、鳥類の種からヒトに交差伝染してきたが、これらは全てヒトに致死をもたらす。２００７年８月１４日現在、Ｈ５Ｎ１高病原性トリインフルエンザウィルス（ＨＰＡＩＶ）の感染症例が、ヒトで総計３２０例世界的に記録され、死亡は１９３件であった。
【００２１】
感染しても大部分の健常者に軽度の呼吸器症状しか起こさない、普通の季節性インフルエンザと異なり、Ｈ５Ｎ１が起こす疾患は、異常に侵攻的な臨床経過を辿り、急速な悪化および高い致死率をもたらす。原発性ウィルス性肺炎および多臓器不全が、通常起こる。大抵の症例が、以前は健康であった子供および若年成人に発生したことは重要である。Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶは、症状が現れるまでに他のヒトインフルエンザウィルスより長期間、一部の症例では８日間まで潜伏する。家庭の集団症例では、症例間の間隔は、一般に２〜５日間の範囲であったが、１７日間にも及んでいると報告された。
【００２２】
Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶ感染症の初期症状は、下痢を含むことが多く、何らかの呼吸器症状の１週間前まで現れることがある。この特徴は、大便中のウィルスＲＮＡの検出と相俟って、ウィルスが、消化管中で増殖し得ることを示唆している。息切れなどの下気道症状は、病気の過程の早期に現れるが、鼻汁などの上気道症状は、それほど一般的ではない。
【００２３】
Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶは、現在のところ、汎発性流行病に必要な条件を２つ満足しており、Ｈ５ヘマグルチニンは、ヒトにとって新たな抗原である。Ｈ５Ｎ１様の汎発性ウィルスがもし出現すれば、誰にも免疫がなかろう。それに加え、３００人強がこのウィルスに感染し、見掛け致死率は６０％を超えている。
【００２４】
したがって、汎発性流行病を開始する全ての要件は、１要件、即ち、該ウィルスのヒトからヒトへの効率的で持続的な伝染の確立を除き、満足されている。Ｈ５Ｎ１ウィルスがこの能力を獲得する危険性は、ヒトの感染する機会が発生する限り続くことになろう。これが起こる確率は、段階的変異またはヒト適応株との再集合のいずれかを介して現実的であると考えられる。
【００２５】
科学的レベルでは、該ウィルス株が、ヒトからヒトへの容易な伝染を実現し、汎発性流行病を開始し得るまでに、ウィルス表現型の１つまたは複数の変化が必要である。しかし、トルコでの最近のヒト分離株で検出された特異的変異、循環ウィルスの哺乳類に対する増加しつつある病原性、鳥類インフルエンザウィルスへの感染に対して耐性があると以前は考えられていた、虎および猫などの他の哺乳類を含むようなＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶの宿主範囲の拡大を含めた、多くの最近の知見は全て、Ｈ５Ｎ１ウィルスが、最終的にはヒトからヒトへの伝染を促進し得る能力を進化させ続けていることを示している。
【００２６】
汎発性能力が恐らくは遥かに高い他のインフルエンザウィルスも、今後出現する恐れがある。こうしたウィルスには、近年になってやはりヒトに伝染した、Ｈ９およびＨ７の幾つかのウィルス株が挙げられる。Ｈ９ウィルスは、アジアの家禽で現在流行しており、南東および東部中国のブタ集団中にも、効率的に交差伝染した。Ｈ９Ｎ２株は、典型的なヒト様受容体特異性を有し、宿主範囲が広いという事実が、懸念されている。
【００２７】
２００３年の早期に、Ｈ７Ｎ７  ＨＰＡＩＶの発生がオランダの家禽で起こった。Ｈ７Ｎ７ウィルスのトリからヒトへの伝染が、少なくとも８２症例で起こった。結膜炎が、Ｈ７株に感染した人々の最も一般的な疾患症状であり、７症例が、典型的なインフルエンザ様の病気を示したに過ぎない。このウィルスは、ヒトに高度に病原性でないことが判明し、認められた致死例は１件だけであった。汎発性能力のある他のウィルスは、汎発性ウィルスとしての過去の経歴によるＨ２サブタイプ、ならびにアジアおよび北米での家禽種における高い発生率によるＨ６のウィルスである。
【００２８】
こうしたことから、ヒトインフルエンザの新たな汎発性流行の脅威は、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１に特有に関連したものではないことが示される。
【００２９】
インフルエンザの汎発性流行に備えて、Ｈ５Ｎ１インフルエンザの候補ワクチンを用いた多くの臨床試験が行われてきた。これらのワクチンは、防護的と予測される血清の抗体応答を生じるためには、季節性ワクチンの通常使用量より遥かに多量のヘマグルチニン抗原、またはアジュバントの配合のいずれかの多回投与が必要であることを一貫して示している。これは、Ｈ５ヘマグルチニンに対して当該集団が免疫学的に未経験であることを直接反映した結果である。したがって、現在のところ、汎発性インフルエンザワクチンに利用できる唯一の選択肢は、行い得る投与回数が厳しく制限されると思われる、非常に高いＨＡ含量のワクチン、または大半の国々で現在認可されていないアジュバントの使用のいずれかである。汎発性株に適合するワクチンは、ヒトで最初に分離したときから、製造するのに何カ月も要する上に、汎発性流行病の出現以前に製造した備蓄ワクチンは、ほぼ間違いなく抗原性が同一ではなく、そのため防護するにしても、限られた防護しか示さないと見込まれることも認識すべきである。抗原連続変異の証拠は、Ｈ５Ｎ１のつい最近の発生においてもはや明らかである。
【００３０】
要約すると、季節性および汎発性双方のインフルエンザワクチンに対して、改善すべき明瞭な必要性が以下のように存在する。
１．有効性に明白な制限、特に初回接種を受けていない個人に制限がある。これは、抗原不連続変異から生じるインフルエンザの汎発性流行の見通しに関して、特に懸念される。
２．次の秋期／冬期に循環していそうなインフルエンザ株の正確な予測能力に対する依存性。ワクチン株と実際に感染症を起こす株との不一致のために、当該集団の相当な割合がインフルエンザに罹り易くなろう。
３．当該ウィルスが抗原連続変異を受けることによる、年次ごとに危険状態のグループにワクチン再接種を行う必要性。
４．見込みのある生物系製造工場が世界的に限られた数しかないことによる、生産能力上の制約。
５．高齢者年齢層に与えられる防護は、従来ワクチンによって制限されている。
【００３１】
したがって、改良された一群のインフルエンザワクチンは、合成品で安定であり、高齢者（危険状態の）グループに有効性が強化されて、全てのインフルエンザＡ株（潜在的な汎発性株を含む）に対して有効であれば好ましいものとなろう。
【００３２】
インフルエンザ疾患に対する防護におけるＴ細胞の役割
従来のインフルエンザワクチン技術は、ウィルス表面タンパク質に対する抗体応答に主として焦点を当ててきたが、こうした技術は、有効性を弱め、前記の手配上の脆弱性を生み出す、抗原の連続変異および不連続変異を受け易い。対照的に、細胞性免疫応答を媒介するＴ細胞は、異種のウィルスの株およびクレードに横断的に、より高度に保存されているタンパク質を標的にすることができる。この性質は、異種のウィルスの株およびクレードから防護する見込みのある防護的細胞性免疫応答を誘発するワクチンを与える（ヘテロサブタイプ免疫）。インフルエンザウィルスについては、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２の各タンパク質の保存、および対応する抗原特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の持続が、こうしたタンパク質を魅力的なワクチン標的にしている。
【００３３】
防護的な抗ウィルス性細胞性免疫は、１型ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球（Ｔｈ１）に支持される１型応答の誘発からなり、この誘発が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−２などの免疫賦活性サイトカインの誘導および維持を含む、免疫エフェクター機構の活性化を起こす。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、直接的な細胞間相互作用を介して、または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合した抗原性Ｔ細胞ペプチドエピトープを認識した後、サイトカインを分泌することにより、他の免疫細胞の補助を主として担当する。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、通常ＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ分子が提示する外来抗原をその上に認識した細胞の溶解またはアポトーシスを誘発し、ウィルスなどの細胞内病原体から防護する。表現型および機能のこの連合は、ＣＤ４＋細胞が細胞溶解活性を示し得る一方、ＣＤ８＋細胞が、抗ウィルス性サイトカイン、特にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子を分泌するので、絶対的なものではない。事実、ＣＤ４＋ＣＴＬ活性が、ヒトにおける急性および慢性ウィルス感染症を制御する別の免疫機構として提案されている。ＣＤ４＋ＣＴＬは、直接的な抗ウィルス性細胞溶解作用によりウィルスの拡散を制御し、ＩＦＮ−γなどの抗ウィルス性サイトカインの産生により、直接的な抗ウィルス活性を演じ得る。ＩＦＮ−γは、ウィルス産生に対して直接的な阻害的および非細胞溶解的作用を有することが知られている。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞の抗体応答およびクラススイッチの決定、ならびにマクロファージなどの食細胞の殺細菌活性の最大化においても必須である。
【００３４】
細胞性免疫応答は、インフルエンザ感染の抑制、疾患症候の改善および疾患発見の促進に重要な役割を果たすと考えられている。インフルエンザ特異的な細胞性免疫は、自然感染により誘発され、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２＆ＰＡ）、Ｍ１およびＭ２タンパク質、ならびに非構造タンパク質１（ＮＳ１）を含む、数種のウィルスタンパク質が、ヒトの記憶ヘテロサブタイプＴ細胞の応答に対する標的として特定された。ＮＳ２も関与し得る。こうした内部タンパク質は、高度に保存された免疫支配的な領域を含有するため、Ｔ細胞の標的として理想的である。特に、実験研究によれば、インフルエンザＡのＮＰは、マウスおよびヒトにおけるサブタイプ特異的、交差反応性双方のＣＴＬにとって重要な標的抗原を代表することが示された。これは、インフルエンザサブタイプ内およびサブタイプ間の高い配列可変性のために不適当な標的である、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）と対照的である。
【００３５】
より具体的には、細胞性免疫は、高病原性株を含むインフルエンザ疾患に対する防護に強く関与している。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋記憶Ｔ細胞は、肺気道中に存在しており、これらの細胞は、病原体量が少ない場合、感染部位における病原体の固定を媒介することにより、インフルエンザの曝露に対する肺免疫に役割を演じているという証拠が、増加しつつある。ＣＤ８＋Ｔ細胞の減失は、初回抗原投与を受けたマウスがインフルエンザ感染に対して応答する能力を低下させるが、この応答は、防護的二次応答におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の役割を示す。ウィルスの複製は、呼吸器上皮中の細胞に限られるので、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、この部位でエフェクター機能を行使することにより、抗ウィルス性サイトカインを産生し、標的細胞が特異的なＴ細胞受容体をそれに対して有する、ウィルス決定因子を提示する該標的細胞を溶解する。感染上皮細胞の溶解は、パーフォリンおよびグランザイムならびにＦａｓ機構を含有するエキソサイトーシス顆粒によって媒介される。（Thomas PG, Keating R, Hulse-Post DJ, Doherty PC. "Cell-mediated protection in influenza infection." Emerg Infect Dis. 2006 Jan;12(1):48-54）。
【００３６】
インフルエンザに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の活発な応答は、流入領域リンパ節に続いて脾臓で開始され、感染から６〜７日後に肺および気管支肺胞の分泌物中でピークとなる。インフルエンザ感染に対するＣＤ４  Ｔ細胞のこの一次応答は、ＣＤ８応答より大きさでは小さいが、ロバストなＣＤ４＋増殖、Ｔｈ−１の分化および感染部位へのそれらの移動を伴うことが示された。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、インフルエンザ感染に対する長期の有効なＣＤ８記憶にも必要である。ＣＤ４エフェクターＴ細胞および記憶応答は、インフルエンザ特異的なＣＤ８＋ＣＴＬ応答の生成中のヘルパーとしての古典的寄与、感染性ウィルス粒子を中和するためにＩｇＧ２ａを推進する能力、およびＩＦＮ−γの分泌を介した直接的な抗ウィルス活性を含む、多重機構を介するインフルエンザへの免疫に寄与する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両Ｔ細胞エピトープは、ウィルス消失を促進し、インフルエンザ曝露からのマウスの防護を与えることが示された。
【００３７】
インフルエンザＡウィルス用のマウスモデルは、Ｔ細胞媒介免疫を分析するための実験系を提供する。特に、インフルエンザ感染に対するＴ細胞の免疫応答は、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）およびＢａｌｂ／Ｃ（Ｈ２ｄ）のマウス、ならびにそれらのハイブリッドにおいて良く特徴付けられた。Ｐｌｏｔｎｉｃｋｙら（Plotnicky H, Cyblat-Chanal D, Aubry JP, Derouet F, Klinguer-Hamour C, Beck A, Bonnefoy JY, Corva A "The immunodominant influenza matrix T cell epitope recognized in human induces influenza protection in HLA-A2/K(b) transgenic mice." Virology. 2003 May 10;309(2):320-9.）は、トランスジェニックマウスへの致命的曝露に対する、インフルエンザマトリックスタンパク質（Ｍ１）の５８〜６６位エピトープの防護有効性を実証した。ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボでの減失後、防護が失われたので、防護はＴ細胞により媒介されていた。マウスの生存率は、肺中のＭ１特異的Ｔ細胞と相関しており、このＴ細胞は、インフルエンザの曝露後にインフルエンザ感染細胞に対して細胞傷害性を直接示した。Ｗｏｏｄｌａｎｄら（Crowe SR, Miller SC, Woodland DL. "Identification of protective and non-protective T cell epitopes in influenza." Vaccine. 2006 Jan 23;24(4):452-6）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の単一エピトープＨＡ（２１１〜２２５位）が、ワクチン接種マウスにおいてウィルス感染の部分的抑制を与え得ることも実証した。
【００３８】
Ｔ細胞の標的は、インフルエンザウィルス表面タンパク質のＢ細胞エピトープより、少ない頻度の変異を受ける傾向があるが、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープも、防護的免疫圧を受けて次第に変異することになろう（Berkhoff EG, de Wit E, Geelhoed-Mieras MM, Boon AC, Symons J, Fouchier RA, Osterhaus AD, Rimmelzwaan GF. "Fitness costs limit escape from cytotoxic T lymphocytes by influenza A viruses." Vaccine. 2006 Nov 10;24(44-46):6594-6）。この逃避は、ウィルスと高度に多型なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のクラスＩおよびＩＩタンパク質との間における、抗原プロセシング、ならびに宿主のそれぞれＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞へのエピトープ提示を決定する対立から生じると思われる。このウィルス逃避機構は、ＨＩＶおよびＨＣＶについてより明瞭に確立されており、ウィルスの進化を形作ることが知られている。したがって、本来可変性（エントロピー）の低い、高度に保存されたペプチド配列の選択が、抗原の不連続変異および連続変異に特異的に対抗できる、Ｔ細胞ワクチンの設計において検討すべき重要な要因である。このような方法は、Ｂｅｒｋｈｏｆｆら（Berkhoff EG, de Wit E, Geelhoed-Mieras MM, Boon AC, Symons J, Fouchier RA, Osterhaus AD, Rimmelzwaan GF "Functional constraints of influenza A virus epitopes limit escape from cytotoxic T lymphocytes" J Virol. 2005 Sep;79(17):11239-46）によって記載されている。
【００３９】
６５歳過ぎの成人は、現在、インフルエンザ関連の全死亡例のおよそ９０％を占めている。これは、現行ワクチンの効果が最も低い対象層でもある。ヒトにあっては、老化は、記憶亜集団からＴ細胞エフェクターを生成する能力の低下と関連しているようである。ワクチン接種後の高齢者において、セントラル記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度増加およびエフェクター記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度減少が、認められているが、これは血清ＩＬ−７濃度の減少と関連し得る。高齢対象は、インフルエンザワクチンの接種に対する鈍化した１型Ｔ細胞応答も示し、これはＩｇＧ１応答と直接相関している。更に、マウスも、インフルエンザＡの一次感染中にエピトープ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ活性の老化関連傷害を示す。これは、インフルエンザ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター活性とではなく、ＣＤ８＋ＣＴＬの増殖欠陥と関連している。（Mbawuike IN, Acuna C, Caballero D, Pham-Nguyen K, Gilbert B, Petribon P, Harmon M. "Reversal of age-related deficient influenza-virus-specific CTL responses and IFN-gamma production by monophosphoryl lipid A." Cell Immunol. 1996 Oct 10;173(1):64-78.）
【００４０】
Ｔ細胞応答の重要な要素は、感染細胞の消失を対象とするので、Ｔ細胞ワクチンは、記憶を想起するために予防的に、ならびに宿主の自然細胞性免疫を増強するために、感染後に治療方式で使用してもよい。Ｔ細胞ワクチンはまた、従来の抗体生成（体液応答性）インフルエンザワクチンと組み合わせて、同時投与または別時投与のいずれかにより使用してもよい。
【００４１】
Ｔ細胞ワクチン手法
Ｔ細胞およびインフルエンザワクチンの分野に関する総説は、交差防護性の広いＴ細胞ワクチンの設計で直面する多くの決定的難題を強調している。Ｔ細胞ワクチンは、第１に、高い率（％）のワクチン被接種者において、ＣＤ４＋ＨＴＬおよびＣＤ８＋ＣＴＬのＴ細胞の記憶およびエフェクター機能を初回接種および追加接種で刺激できなければならない。このようなワクチンは、ウィルスの遺伝子多様性および進行中の変異、ならびにＭＨＣ対立遺伝子の多型性段階で明らかなヒトの遺伝子多様性にも対処しなければならない。提案した本発明は、高度に保存されたインフルエンザペプチドと共に、新規なフルオロペプチドワクチン送達系を組み合わせることにより、こうした設計上の問題に対処しようとしている。該ペプチドは、１個または複数のエピトープ、特にＴ細胞エピトープを含有することが知られている抗原であることが好ましい。
【００４２】
従来のペプチド系Ｔ細胞ワクチン手法は、エピトープに依拠しており、単一のエピトープまたは再構成された人工鎖として送達される、ＣＴＬ（８〜１１ａａ）またはＴヘルパー（１３ａａ）の最小エピトープに集中してきた。非天然配列は、非効率な抗原プロセシングという制約、ならびに無関係な新エピトープの潜在的形成の生起に直面することがある。重複したＴ細胞エピトープ、クラスター化したＴ細胞エピトープまたは雑多なＴ細胞エピトープを単一のペプチド配列中に含有する、天然の長鎖保存ペプチド配列は、自然な抗原プロセシングを可能にすると共に、集団への広い適用範囲を実現する。その上、１つのワクチン製剤中にこうした天然の長鎖ペプチドを複数種使用すれば、集団への遥かに大きい適用範囲が得られる見込みがある。
【００４３】
先例によれば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のエピトープを含む長鎖ペプチド（３０〜３５ａａ）は、動物およびヒトにおいて多重エピトープ応答を誘発する能力を有することが示されている（Coutsinos Z, Villefroy P, Gras-Masse H, Guillet JG, Bourgault-Villada I. Gahery-Segard H, Pialoux G, Figueiredo S, Igea C, Surenaud M, Gaston J, Gras-Masse H, Levy JP, Guillet JG. "Long-term specific immune responses induced in humans by a human immunodeficiency virus type 1 lipopeptide vaccine: characterization of CD8+ T cell epitopes recognized". J Virol. 2003 Oct;77(20):11220-31）。有効な抗ウィルス性ＣＴＬ応答（ＣＤ８  Ｔ細胞が推進する）のために、適当なＴｈ−１サイトカイン環境が必要であり（ＣＤ４細胞により保証される）、こうしてＣＤ４およびＣＤ８エピトープの同時送達が、細胞応答を高めると予測される（Krowka, JF., Singh, B., Fotedar, A., Mosmann, T., Giedlin, MA., Pilarski, LM. "A requirement for physical linkage between determinants recognized by helper molecules and cytotoxic T cell precursors in the induction of cytotoxic T cell responses" J. Immunol 1986, May 15;136(10):3561-6）。
【００４４】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、外来および自己のタンパク質の細胞外および細胞内プロセシングで生じ、ＭＨＣ系がコードする特異的な細胞表面分子に結合して提示される短鎖ペプチドを認識する。ＭＨＣ分子には、（ｉ）ＭＨＣクラスＩは、内因性ペプチドを提示する、（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩは、外因性ペプチドを提示する、という別々の２クラスが存在する。ＭＨＣクラスＩの抗原提示過程は、タンパク質分解、小胞体へのペプチド輸送、ペプチド−ＭＨＣ結合およびＣＤ８＋Ｔ細胞が認識するための、細胞表面へのペプチド−ＭＨＣ複合体の移出を含む。ペプチドは、特異的なＭＨＣ結合溝内に結合しているが、その溝の形状および特性のために、共通の結合モチーフを共有する特異的なペプチドサブセットの結合が起こる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体が特異的なペプチド−ＭＨＣ複合体を認識した際に活性化され、このようにして、細胞内の寄生生物もしくはウィルスに感染した細胞、または異常タンパク質を含有する細胞（例えば、腫瘍細胞）を特定し、それらに対する適当な免疫応答を増加させる。特異的なペプチド−ＭＨＣ複合体に含まれ、Ｔ細胞の認識のきっかけ（Ｔ細胞エピトープ）となる該ペプチドは、感染性、自己免疫性、アレルギー性および新生物性の疾患を診断し、治療するための重要なツールである。Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ結合性ペプチドのサブセットであるので、ＭＨＣ分子に結合できるタンパク質部分の厳密な同定は、ワクチンおよび免疫治療薬の設計にとって重要である。ＭＨＣ多型性は、ヒト集団において非常に高く、５８０ＨＬＡ−Ａ、９２１ＨＬＡ−Ｂ、３１２ＨＬＡ−Ｃ、５２７ＨＬＡ−ＤＲ（β）、１２７ＨＬＡ−ＤＲＱ（β）および８６ＨＬＡ−ＤＱ（β）の対立遺伝子がこれまでに知られている。この状況は、集団への適用範囲が広いＴ細胞系ワクチンを設計しなければならない際に、難題である。ＭＨＣ結合性ペプチドは、ＭＨＣ分子（複数可）の溝と相互作用し、ペプチドの結合に寄与する位置特異的なアミノ酸を含有する。結合モチーフの各位置の好ましいアミノ酸は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子変異体間で変動し得る。コンピュータ利用モデルにより、各種のＭＨＣ分子に結合するペプチドの同定が促進される。多様なコンピュータ利用法、ＭＨＣ結合アッセイ、Ｘ線結晶解析試験および当技術分野で公知の他の多数の方法が、ＭＨＣ分子に結合するペプチドの同定を可能にしている。新規なコンピュータ内抗原同定手法は、Ｔ細胞ワクチンに有用なウィルス配列の解明に必要なＨＬＡ結合モチーフについて、ペプチド配列をスクリーニングする際に関与する大量のデータを迅速に処理する能力を提供する。ＨＬＡに基づくバイオインフォマティクス手法は、多くの免疫学分野に適用して成功しており、ヒト遺伝子の多様性問題に対処することを可能にしている、例えば、Depil S, Morales O, Castelli FA, Delhem N, Francois V, Georges B, Dufosse F, Morschhauser F, Hammer J, Maillere B, Auriault C, Pancre V. "Determination of a HLA II promiscuous peptide cocktail as potential vaccine against EBV latency II malignancies.", J Immunother (1997). 2007 Feb-Mar;30(2):215-26; Frahm N, Yusim K, Suscovich TJ, Adams S, Sidney J, Hraber P, Hewitt HS, Linde CH, Kavanagh DG, Woodberry T, Henry LM, Faircloth K, Listgarten J, Kadie C, JokjicN, Sango K, Brown NV, Pae E, Zaman MT, Bihl F, Khatri A, John M, Mallal S, Marincola FM, Walker BD, Sette A, Heckerman D, Korber BT, Brander C. "Extensive HLA class I allele promiscuity among viral CTL epitopes." Eur J Immunol. 2007 Aug 17;37(9):2419-2433; Schulze zur Wiesch J, Lauer GM, Day CL, Kim AY, Ouchi K, Duncan JE, Wurcel AG, Timm J, Jones AM, Mothe B, Allen TM, McGovern B, Lewis-Ximenes L, Sidney J, Sette A, Chung RT, Walker BD. "Broad repertoire of the CD4+ Th cell response in spontaneously controlled Hepatitis C virus infection includes dominant and highly promiscuous epitopes." J Immunol. 2005 Sep 15;175(6):3603-13; Doolan DL, Southwood S, Chesnut R, Appella E, Gomez E, Richards A, Higashimoto YI, Maewal A, Sidney J, Gramzinski RA, Mason C, Koech D, Hoffman SL, Sette A. "HLA-DR-promiscuous T cell epitopes from Plasmodium falciparum pre-erythrocytic-stage antigens restricted by multiple HLA class II alleles." J Immunol. 2000 Jul 15;165(2):1123-37.）。
【００４５】
複数のＭＨＣ対立遺伝子変異体に結合するペプチド（「雑多なペプチド」）は、より大きな割合のヒト集団に適するので、ワクチンおよび免疫療法の開発に対する一次目標である。雑多なＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、複数のＭＨＣクラスＩＩ分子にも結合すると報告された。（Panina-Bordignon P, Tan A, Termijtelen A, Demotz S, Corradin G, Lanzavecchia A. Universally immunogenic T cell epitopes: promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells. Eur J Immunol. 1989 Dec;19(12):2237-42.） 他方、一部の雑多なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、複数のＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力を有して結合特性を共有し、いわゆるスーパータイプを形成すると以前に記載された（Frahm N, Yusim K, Suscovich TJ, Adams S, Sidney J, Hraber P, Hewitt HS, Linde CH, Kavanagh DG, Woodberry T, Henry LM, Faircloth K, Listgarten J, Kadie C, JokjicN, Sango K, Brown NV, Pae E, Zaman MT, Bihl F, Khatri A, John M, Mallal S, Marincola FM, Walker BD, Sette A, Heckerman D, Korber BT, Brander C. "Extensive HLA class I allele promiscuity among viral CTL epitopes." Eur J Immunol. 2007 Aug 17;37(9):2419-2433; Sette A, Sidney J. 'HLA supertypes and supermotifs: a functional perspective on HLA polymorphism.' Curr Opin Immunol. 1998 Aug;10(4):478-82）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の雑多なエピトープの同定は、集団への広い適用範囲を実現するためのワクチン設計における重要な戦略を表す。ＭＨＣ多型性は、特定の民族グループにおける、または複数の民族グループにまたがる高頻度のＭＨＣ対立遺伝子に関連する、ＭＨＣ結合モチーフを含有することが知られているまたは予測されるペプチドの選択によっても対処される。
【００４６】
集団への適用範囲が広く、一連のインフルエンザ株にまたがって保存されている配列の組合せ（例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）またはロスアラモス国立研究所（ＬＡＮＬ）のインフルエンザ配列データベースの使用により同定される）の選択によって、ウィルスの遺伝子多様性に対処し、全部とは言わないまでも大多数の関連インフルエンザ株から防護することができる。
【００４７】
歴史的には、Ｔ細胞ワクチン技術（ＤＮＡおよびウィルスベクターワクチン）の鍵となる弱点は、該ワクチンに応答するワクチン対象の低比率（％）、しばしば低い免疫原性レベル、ならびに記憶およびエフェクターＴ細胞の応答の追加免疫による増幅を実現する能力であった。有効なインフルエンザＴ細胞ワクチンの主目標は、抗原に再曝露した際に、ウィルス量を抑制し、肺からのウィルス消失を促進するエフェクター機能の迅速な拡張が起こるように、Ｔ細胞記憶のロバストな応答を促進することである。これを実現するには、ウィルス特異的Ｔｈ−１に指示されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のロバストなセントラル記憶およびエフェクター記憶応答が必要である。実行可能な市販品のためには、この応答は、高率（＞９０％）のワクチン被接種者で誘発され、感染後の記憶想起およびその後の疾患防護にいずれ必要になる、長期の記憶応答を生起できなければならない。しかし、この種の耐久性免疫を生成するには、ワクチンは、反復ワクチン曝露によるロバストな追加免疫増幅効果も実現しなければならない。
【００４８】
ワクチンおよび免疫治療薬が誘発する細胞性免疫を改善する現在の免疫戦略には、弱毒生型病原体の開発、および適当な抗原またはこのような抗原をコードするＤＮＡを送達するための生ベクターの使用が含まれる。非選択集団では意味のある追加免疫応答を生起することがいつもできないこのような手法は、プライム・ブーストの複雑な組合せを生じてしまい、益々厳しくなる規制環境にあって安全上の配慮によっても制限される。それに加え、製造プロセスの規模拡大適性および禁止的なコストから生じる問題のために、生物起源の製品の商業的な実行可能性がしばしば制限される。これに関しては、合成ペプチドは、化学的に良く確定され、非常に安定であり、Ｔおよび／またはＢ細胞エピトープを含有するように設計できるので、非常に魅力的な抗原である。
【００４９】
インビボでＴリンパ球応答を刺激するためには、ワクチンまたは免疫治療製品中に含まれる合成ペプチドは、抗原提示細胞および特に樹状細胞によって好ましくは取り込まれるべきである。樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞媒介一次免疫応答の開始に決定的な役割を演じる。これらの細胞は、異なる機能に関連する２つの主要な成熟段階で存在する。未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）は、大抵の組織または血流中に配置され、体内の炎症部位に動員される。該細胞は、高度に専門化した抗原捕捉細胞であり、抗原の取込みおよび食作用に関わる大量の受容体を発現する。抗原の捕捉およびプロセシングの後、ｉＤＣは、リンパ節または脾臓中にあるＴ細胞の局所位置へ移動する。この過程の間に、ＤＣは、抗原捕捉能を失い、免疫賦活性成熟ＤＣ（ｍＤＣ）に変化する。
【００５０】
樹状細胞は、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子と結合したペプチド抗原に対して、宿主免疫応答を開始する効率的な提示細胞である。該細胞は、未経験（naive）のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞に初回抗原刺激を加えることができる。抗原のプロセシングおよび提示経路に関する現行のモデルによれば、外因性抗原は、抗原提示細胞の細胞内区画中に取り込まれ、そこでペプチドに分解され、その一部はＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する。成熟したＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は、次いで細胞表面に輸送され、ＣＤ４  Ｔリンパ球に提示される。対照的に、内因性抗原は、プロテオソームの作用によって細胞質中で分解された後、細胞質中に輸送され、そこで生成直後のＭＨＣクラスＩ分子と結合する。ペプチドと複合した安定なＭＨＣクラスＩ分子は、次いで細胞表面に輸送され、ＣＤ８  ＣＴＬを刺激する。外因性抗原は、交差提示と称する過程において専門的ＡＰＣにより、ＭＨＣクラスＩ分子上にも提示されることがある。細胞外抗原を含有するファゴソームは、小胞体と融合し、抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子上にペプチドを担持させるのに必要な機構を獲得することもある。
【００５１】
数十年に亘り、ペネトラチン（Penetratin）、ＴＡＴおよびその誘導体、ＤＮＡ、ウィルスベクター、ヴィロソームおよびリポソームを含む、夥しい送達法が評価されてきた。しかし、こうした系は、非常に弱いＣＴＬ応答を誘発する、記憶応答に対する追加免疫増幅を生起できない、毒性問題を付随する、または複雑であるのいずれかであり、商業規模での製造が高価である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５２】
したがって、細胞免疫応答の誘発を意図したワクチンおよび薬物の開発において、抗原の細胞内送達を指示する改良されたベクターに対する必要性が、認識されている。免疫治療薬またはワクチンに関するベクターは、宿主中の免疫応答細胞へ抗原を輸送または誘導できる任意の作用剤である。
【００５３】
フッ素化界面活性剤は、低い臨界ミセル濃度を有し、したがって低濃度で多分子ミセル構造に自己組織化することが示された。この物理化学的性質は、フッ素化鎖に伴う強い疎水性相互作用および低いファンデルワールス相互作用に関連しており、こうした相互作用のために、フッ素化両親媒性物質は、水中で自己集合し、界面に集まる傾向を劇的に増大させる。このような構造の形成は、細胞、例えば抗原提示細胞による細胞内取込みを促進する（Reichel F. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 7989-7997）。更に、フッ素化鎖を界面活性剤中に導入すると、溶血活性が強く減少し、しばしば抑制される（Riess, J.G.; Pace, S.; Zarif, L. Adv. Mater. 1991, 3, 249-251）ことにより、細胞毒性の低下を生じる。
【課題を解決するための手段】
【００５４】
本発明は、フルオロカーボンベクターを使用することにより、免疫応答細胞へインフルエンザ抗原を送達するという問題を克服し、その免疫原性を高めようとするものである。該フルオロカーボンベクターは、ペルフルオロカーボン基または混合フルオロカーボン／炭化水素基に由来する１個または複数の鎖を含み得るもので、飽和または不飽和でもよく、各鎖は、炭素原子３〜３０個を有する。
【００５５】
共有結合によりベクターを抗原に連結するために、反応性基またはリガンドをベクターの成分として組み入れる、例えば、−ＣＯ−、−ＮＨ−、Ｓ、Ｏまたは任意の適切な他の基が含まれる。共有結合を実現するためのこのようなリガンドの使用は、当技術分野で周知である。反応性基は、フルオロカーボン分子の任意の位置に配置し得る。
【００５６】
フルオロカーボンベクターの抗原とのカップリングは、抗原の任意の部位上に自然に存在する、またはその部位上に導入された−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２などの官能基を介して実現し得る。適切な連結部は、直鎖形または環状形のいずれかに窒素、酸素または硫黄原子を含有し得る。連結により形成される結合の例には、オキシム、ヒドラゾン、ジスルフィドもしくはトリアゾール、または任意の適切な共有結合を含み得る。特に、フルオロカーボン部分は、ペプチドの免疫原性を増すためにチオエステル結合を介して導入することができよう（Beekman, N.J.C.M. et al, "Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity." J. Peptide Res. 1997, 50, 357-364）。場合により、スペーサー要素（ペプチド性、偽ペプチド性または非ペプチド性）を組み込むことにより、リポペプチドについて以前に示されたように、抗原提示細胞内でのプロセシングのために、抗原をフルオロカーボン要素から切断することを可能にし、抗原提示を最適化してもよい（Verheul, A.F.M.; Udhayakumar, V; Jue, D.L.; Wohlheuter, R.M.; Lal, A.L. Monopalmitic acid-peptide conjugates induce cytotoxic T cell responses against malarial epitopes: importance of spacer amino acids. Journal of Immunological Methods 1995, volume 182, pp219-226）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢＦ６マウスにおいて多価フルオロペプチドワクチンと天然ペプチド等価物の免疫原性を、プライム後またはプライム−ブースト後に、エクスビボでのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる評価で比較して示した図である。１群当たり７匹または８匹のマウスに、フルオロペプチドワクチン（１００μｌ中にフルオロペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化したフルオロペプチド８種から構成される）または天然ペプチド等価物（１００μｌ中にペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化した天然ペプチド８種から構成される）で皮下に免疫接種をした。対照群は、賦形剤だけを含有する製剤を受けた。最終注射から１０日後に、頚部脱臼によりマウスを犠牲死させた。脾臓を取り出し、脾臓細胞の単一懸濁液を個々のマウスから調製した。マウスのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Mabtech, Sweden）は、製造業者の使用説明書に従って行った。脾臓細胞（５×１０５個）を、総量２００μｌの完全培地（ウシ胎児血清１０％を補給したＲＰＭＩ）中ペプチド１種当たり濃度１０μｇ／ｍｌの個別天然ペプチド８種で、３７℃および５％ＣＯ２で１８時間刺激し、これを２点用意した。スポットは、ＣＴＬイムノスポット読取器を用いて計数した。各マウスに対して、スポットの総数をペプチド全８種について累積し、対照ウェル（培地だけ）の値の８倍を差し引いた。その結果は、導入脾臓細胞百万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均値±標準偏差に相当する。
【図２】ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢＦ６マウスにおいて多価フルオロペプチドワクチンと天然ペプチド等価物の免疫原性を、プライム後またはプライム−ブースト後に、エクスビボでのＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔアッセイによる評価で比較して示した図である。１群当たり７匹または８匹のマウスに、フルオロペプチドワクチン（１００μｌ中にフルオロペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化したフルオロペプチド８種から構成される）または天然ペプチド等価物（１００μｌ中にペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化した天然ペプチド８種から構成される）で皮下に免疫接種をした。対照群は、賦形剤だけを含有する製剤を受けた。最終注射から１０日後に、頚部脱臼によりマウスを犠牲死させた。脾臓を取り出し、脾臓細胞の単一懸濁液を個々のマウスから調製した。マウスのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Mabtech, Sweden）は、製造業者の使用説明書に従って行った。脾臓細胞（５×１０５個）を、総量２００μｌの完全培地（ウシ胎児血清１０％を補給したＲＰＭＩ）中ペプチド１種当たり濃度１μｇ／ｍｌのペプチド８種の混合物で、３７℃および５％ＣＯ２で１８時間刺激し、これを２点用意した。スポットは、ＣＴＬイムノスポット読取器を用いて計数した。各マウスに対して、スポットの総数をペプチド全８種について累積し、対照ウェル（培地だけ）の値の８倍を差し引いた。その結果は、導入脾臓細胞百万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均値±標準偏差に相当する。
【図３】ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢＦ６マウスにおいてフルオロペプチド対天然ペプチドの個別ペプチド免疫原性を、プライム後またはプライム−ブースト後に、エクスビボでのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによる評価で比較して示した図である。１群当たり７匹または８匹のマウスに、フルオロペプチドワクチン（１００μｌ中にフルオロペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化したフルオロペプチド８種から構成される）または天然ペプチド等価物（１００μｌ中にペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化した天然ペプチド８種から構成される）で皮下に免疫接種をした。対照群は、賦形剤だけを含有する製剤を接種した。最終注射から１０日後に、頚部脱臼によりマウスを犠牲死させた。脾臓を取り出し、脾臓細胞の単一懸濁液を個々のマウスから調製した。マウスのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Mabtech, Sweden）は、製造業者の使用説明書に従って行った。脾臓細胞（５×１０５個）を、総量２００μｌの完全培地（ウシ胎児血清１０％を補給したＲＰＭＩ）中ペプチド１種当たり濃度１０μｇ／ｍｌの個別天然ペプチド８種で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１８時間刺激し、これを２点用意した。スポットは、ＣＴＬイムノスポット読取器を用いて計数した。その結果は、導入脾臓細胞百万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均値±標準偏差に相当する。
【図４】ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢＦ６マウスにおいて多価フルオロペプチドワクチン対天然ペプチド等価物の免疫原性を、プライム−ブースト免疫後に、サイトカインプロファイルの評価で比較して示した図である。１群当たり８匹のマウスに、フルオロペプチドワクチン（１００μｌ中にフルオロペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化したフルオロペプチド８種から構成される）または天然ペプチド等価物（１００μｌ中にペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化した天然ペプチド８種から構成される）で皮下に免疫接種をした。対照群のマウスには、賦形剤だけを含有する製剤を注射した。マウスには、１５日間隔で免疫接種をした。最終注射から１０日後に、頚部脱臼によりマウスを犠牲死させた。脾臓を取り出し、脾臓細胞の単一懸濁液を個々のマウスから調製した。脾臓細胞を、総量２００μｌの完全培地（ウシ胎児血清１０％を補給したＲＰＭＩ）中ペプチド１種当たり濃度１μｇ／ｍｌの天然ペプチド８種の混合物で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４８時間刺激した。刺激細胞の培養上清のサイトカイン濃度（インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））に関する分析は、マウス用サイトメトリービーズアレイキット（CBA; BD Biosciences, UK）を用い、製造業者の使用説明書に従って行い、ＦａｃｓＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターを用いて分析した。各サイトカインの標準曲線は、２１０〜２５００ｐｇ／ｍｌの範囲から決定した。ＣＢＡの検出下限値は、製造業者によれば被分析物質に応じて２．５〜３．２ｐｇ／ｍｌである。その結果は、各群のマウスの各サイトカインについて計算した平均値および標準偏差に相当する。結果は、ｐｇ／ｍｌ単位のサイトカイン濃度で表示している。
【図５】ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を共に、フルオロペプチドワクチンで刺激する。１群当たり４匹のマウスに、フルオロペプチドワクチン（１００μｌ中にフルオロペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化したフルオロペプチド８種から構成される）で皮下に免疫接種をした。マウスは、１５日間隔で２回の注射（プライム−ブースト）を受けた。最終注射から１０日後に、頚部脱臼によりマウスを犠牲死させた。脾臓を取り出し、脾臓細胞の単一懸濁液を個々のマウスから調製した。細胞を０．５×１０６個／ウェルで再懸濁し、培地だけまたは天然ペプチド８種の混合物（ワクチン）で、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間刺激した。陽性対照培養物（ＰＭＡ／Ｉ）は、培養の最後５時間の間にＰＭＡ５０ｎｇ／ｍｌおよびイオノマイシン０．５μｇ／ｍｌを受けた。全ての培養物は、培養の最後５時間の間にブレフェルジンＡ１０μｌ／ｍｌを受けた。細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８について細胞外で、ＩＦＮ−γについて細胞内で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩサイトメーターを用いたフローサイトメトリーにより分析した。個別マウスの結果は、細胞内ＩＦＮ−γを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）として示す。
【図６】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて多価フルオロペプチドワクチン対ＣＦＡ中乳化ワクチンの免疫原性を、単一の免疫接種後に、サイトカインプロファイルの評価で比較して示した図である。１群当たり１０匹のマウスに、フルオロペプチドワクチン（１００μｌ中にフルオロペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化したフルオロペプチド８種から構成される）またはフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化したフルオロペプチドワクチンで皮下に免疫接種をした。対照群のマウスには、賦形剤だけを含有する製剤を注射した。１０日後に、頚部脱臼によりマウスを犠牲死させた。脾臓を取り出し、脾臓細胞の単一懸濁液を個々のマウスから調製した。脾臓細胞を、総量２００μｌの完全培地（ウシ胎児血清１０％を補給したＲＰＭＩ）中ペプチド１種当たり濃度１μｇ／ｍｌの天然ペプチド８種の混合物で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４８時間刺激した。刺激細胞の培養上清のサイトカイン濃度（インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））に関する分析は、マウス用サイトメトリービーズアレイキット（CBA; BD Biosciences, UK）を用い、製造業者の使用説明書に従って行い、ＦａｃｓＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターを用いて分析した。各サイトカインの標準曲線は、２．５〜２５００ｐｇ／ｍｌの範囲から決定した。ＣＢＡの検出下限値は、製造業者によれば被分析物質に応じて２．５〜３．２ｐｇ／ｍｌである。その結果は、各群のマウスの各サイトカインについて計算した平均値±標準偏差に相当する。結果は、ｐｇ／ｍｌ単位の平均サイトカイン濃度で表示している。
【図７】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてフルオロペプチドワクチン投与の皮下対皮内経路を、単一の免疫接種後に、エクスビボでのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイで比較して示した図である。１群当たり１０匹のマウスに、フルオロペプチドワクチン（１００μｌ中にフルオロペプチド１種当たり１ｎｍｏｌ用量の製剤化したフルオロペプチド８種から構成される）で皮下（ｓ．ｃ．）または皮内（ｉ．ｄ．）に免疫接種をした。対照群には、賦形剤だけを含有する製剤を皮下に投与した。１０日後に、頚部脱臼によりマウスを犠牲死させた。脾臓を取り出し、脾臓細胞の単一懸濁液を個々のマウスから調製した。マウスのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Mabtech, Sweden）は、製造業者の使用説明書に従って行った。脾臓細胞（５×１０５個）を、総量２００μｌの完全培地（ウシ胎児血清１０％を補給したＲＰＭＩ）中ペプチド１種当たり濃度１０μｇ／ｍｌの個別天然ペプチド８種で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１８時間刺激し、これを２点用意した。スポットは、ＣＴＬイムノスポット読取器を用いて計数した。各マウスに対して、スポットの総数をペプチド全８種について累積し、対照ウェル（培地だけ）の値の８倍を差し引いた。その結果は、導入脾臓細胞百万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均値±標準偏差に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
したがって、第１の態様において、本発明は、化学構造ＣｍＦｎ−ＣｙＨｘ−（Ｓｐ）−Ｒまたはその誘導体を有するフルオロカーボンベクター−抗原構築体を提供し、式中、ｍ＝３〜３０、ｎ≦２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ≦２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０であり、Ｓｐは、任意選択の化学スペーサー部分であり、Ｒは、インフルエンザウィルス由来の抗原である。
【００５９】
本発明に関しては、「誘導体」とは、フルオロカーボン化合物が本明細書に記載のように抗原をなおも送達できるような、該化合物の比較的小さな修飾物を指す。したがって、例えば、多くのフッ素部分は、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）などの他のハロゲン部分で置き換えることができる。それに加え、多くのフッ素部分をメチル基で置換え、本明細書に考察するような該分子の性質をなおも保持することも可能である。
【００６０】
前記式の特定の例では、該ベクターは、次式の２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロウンデカン酸でもよい。
【００６１】
【化１】
0005756630.tif 000002
【００６２】
したがって、第２の態様では、本発明は、次の構造のフルオロカーボンベクター−抗原構築体を提供し、
【００６３】
【化２】
0005756630.tif 000003
式中、Ｓｐは、任意選択の化学スペーサー部分であり、Ｒは、インフルエンザウィルス由来の抗原である。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「抗原」とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲもしくは抗体）などの免疫受容体に認識される能力を有する分子を指す。抗原は、天然または非天然を問わず、タンパク質、タンパク質サブユニット、ペプチド、炭水化物、脂質またはそれらの組合せでもよいが、但し、少なくとも１つのエピトープ、例えばＴ細胞および／またはＢ細胞エピトープを提示することを前提とする。
【００６５】
このような抗原は、天然タンパク質の精製により誘導してもよく、または組換え技術もしくは化学合成により生成してもよい。抗原を調製する方法は、当技術分野において周知である。更に、抗原には、抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドも含まれる。
【００６６】
ベクターと結合している抗原は、ヒトを含む動物において免疫応答を誘発できる任意のインフルエンザ抗原でもよい。該免疫応答は、宿主において有益な効果を示すことが好ましかろう。
【００６７】
インフルエンザ抗原は、１つもしくは複数のＴ細胞エピトープ、または１つもしくは複数のＢ細胞エピトープ、あるいはＴおよびＢ細胞エピトープの組合せを含有してもよい。
【００６８】
Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに限定されてもよい。
【００６９】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」には、
（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含有し、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって抗原提示細胞の表面に提示される能力を有するペプチド性配列である、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープと、
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ結合モチーフを含有し、ＭＨＣクラスＩ分子によって該細胞表面に提示される能力を有するペプチド性配列である、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと、
（ｉｉｉ）Ｂ細胞受容体に対して結合親和性を有するペプチド性配列である、Ｂ細胞エピトープ
が含まれる。
【００７０】
該抗原は、インフルエンザＡ型タンパク質、インフルエンザＢ型タンパク質またはインフルエンザＣ型タンパク質の１つまたは複数のエピトープを含み得る。インフルエンザＡ型およびＢ型双方からのインフルエンザウィルスタンパク質の例は、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックス（Ｍ１）タンパク質、Ｍ２、核タンパク質（ＮＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＳ１またはＮＳ２をそのような任意の組合せで含む。
【００７１】
したがって、更なる態様では、本発明は、インフルエンザウィルス抗原が、タンパク質、タンパク質サブユニット、ペプチド、炭水化物もしくは脂質またはそれらの組合せである、ベクター−抗原構築体を提供する。構築体が免疫活性であるためには、抗原が１つまたは複数のエピトープを含まなければならない。好ましくは、抗原は、インフルエンザウィルスに由来するペプチド配列である。本発明のペプチドまたはタンパク質は、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは９〜１００個の間のアミノ酸、最も好ましくは約１５〜４０個の間のアミノ酸の配列を含有する。エピトープ（複数可）保有ペプチドのアミノ酸配列は、好ましくは、水性溶媒中においてその分子の溶解度を高めるように選択される。更に、ベクターとコンジュゲートしていないペプチドの末端は、ミセル、ラメラ、小管またはリポソームなどの多分子構造の形成を介して構築体の溶解度を促進するように、変更してもよい。例えば、陽荷電アミノ酸は、ミセルの自発的集合を促進するために、ペプチドに付加することができよう。ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかをベクターにカップリングして、構築体を創作することができる。構築体の大規模合成を促進するために、ペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸残基は、修飾することができる。所望のペプチドが、ペプチダーゼによる切断に特に敏感である場合、通常のペプチド結合を非切断性ペプチド模倣物質で置き換えることができる。このような結合および合成法は、当技術分野で周知である。
【００７２】
非標準的で非天然のアミノ酸も、ペプチド配列中に組み込むことができるが、但し、該アミノ酸は、ペプチドが、ＭＨＣ分子と相互作用し、天然配列を認識するＴ細胞との交差反応性を維持する能力を妨害しないことが前提である。非天然アミノ酸は、プロテアーゼに対するペプチドの耐性または化学的安定性を改善するために、使用することができる。非天然アミノ酸の例には、Ｄ−アミノ酸およびシステイン修飾物が含まれる。
【００７３】
フルオロカーボンベクターに結合する前に、複数の抗原を相互に連結してもよい。このような一例は、融合ペプチドの使用であり、その場合雑多な（promiscuous）Ｔヘルパーエピトープを、ペプチド、炭水化物または核酸でもよい、１つもしくは複数のＣＴＬエピトープまたは１つもしくは複数のＢ細胞エピトープに、共有結合で連結することができる。一例として、雑多なＴヘルパーエピトープは、ＰＡＤＲＥペプチド、破傷風トキソイドペプチド（８３０〜８４３）、またはインフルエンザヘマグルチニンＨＡ（３０７〜３１９）でもよい。あるいは、該ペプチド配列は、２つ以上のエピトープを含有してもよく、該エピトープは、重なり合い、そのために高密充填の多重特異性エピトープのクラスターを創り出し、または連続的であり、またはアミノ酸連鎖により隔離されていてもよい。
【００７４】
したがって、更なる態様では、本発明は、Ｒが相互に連結した複数のエピトープまたは抗原である、ベクター−抗原構築体を提供する。エピトープはまた、線状に重なり合うことにより、高密充填の多重特異性エピトープのクラスターを創り出してもよい。
【００７５】
フルオロカーボンに特徴的な非共有結合的な強い分子間相互作用のために、抗原は、ベクターと非共有結合でも結合し、抗原提示細胞に有利に取り込まれる目的をなおも実現し得る。
【００７６】
したがって、更なる態様では、本発明は、抗原が、フルオロカーボンベクターと非共有結合で結合している、ベクター／抗原構築体を提供する。
【００７７】
１つまたは複数のＢ細胞エピトープを保有する抗原も、１つまたは複数のＴ細胞エピトープとともに、又は伴わずに、フルオロカーボンベクターに結合し得る。Ｂ細胞エピトープは、コンピュータ内手法を用いて予測することができる（Bublil EM, Freund NT, Mayrose I, Penn O, Roitburd-Berman A, Rubinstein ND, Pupko T, Gershoni JM. "Stepweise prediction of conformational discontinuous B-cell epitopes using the Mapitope algorithm." Proteins. 2007 Jul 1;68(1):294-304. Greenbaum JA, Andersen PH, Blythe M, Bui HH, Cachau RE, Crowe J, Davies M, Kolaskar AS, Lund O, Morrison S, Mumey B, Ofran Y, Pellequer JL, Pinilla C, Ponomarenko JV, Raghava GP, van Regenmortel MH, Roggen EL, Sette A, Schlessinger A, Sollner J, Zand M, Peters B. "Towards a consensus on datasets and evaluation metrics for developing B-cell epitope prediction tools" J Mol Recognit. 2007 Mar-Apr;20(2):75-82）。
【００７８】
本発明は、１つまたは複数のフルオロカーボンベクター−抗原構築体を含む、ワクチンおよび免疫治療薬も提供する。この種の多成分製品は、より多数の個人に適当な免疫応答を誘発する際に、より有効であると見込まれるので望ましい。ヒトにおける極端なＨＬＡ多型性のために、単一のフルオロペプチドでは、所与の集団の高い率（％）に多重エピトープ性免疫応答を誘発しそうにない。そのため、ワクチン製品が集団全体に有効であるためには、多くのフルオロペプチドが、広い適用範囲を得るためにワクチン製剤中に必要になり得る。その上、インフルエンザワクチンまたは免疫治療薬の最適製剤は、異なるインフルエンザウィルス抗原に由来する異なる多くのペプチド配列を含み得る。この場合、ペプチドは、単一のフルオロカーボンベクターに結合して、相互に連結されてもよく、または各ペプチド抗原は、専用のベクターに結合することもできる。
【００７９】
多成分製品は、ベクター−抗原構築体を１種または複数、より好ましくは２〜約２０種、より好ましくは３〜約１０種含有し得る。特定の実施形態では、多成分ワクチンは、５種、６種、７種または８種の構築体を含有し得る。これにより、多重エピトープ性Ｔ細胞応答が、集団の広い適用範囲（即ち、ＨＬＡ多様性に対処する）で生成することが保証される。例えば、多重フルオロペプチドの製剤は、インフルエンザＡ由来ペプチド単独、インフルエンザＢ由来ペプチド単独、もしくはインフルエンザＣ由来ペプチド単独、またはインフルエンザ型の組合せ、最も好ましくはインフルエンザＡおよびＢで構成されてもよい。
【００８０】
一実施形態では、該製品は、少なくとも２種のベクター−抗原構築体を含み、第１の構築体は、次式のインフルエンザペプチド配列：
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
を含み、第２の構築体は、次式のインフルエンザペプチド配列：
YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
を含む。
【００８１】
更なる実施形態では、該製品は、８種のベクター−抗原構築体を含み、該構築体は以下のインフルエンザペプチド配列：
構築体１  HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
構築体２  VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG
構築体３  YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
構築体４  APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA
構築体５  SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY
構築体６  KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG
構築体７  DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS
構築体８  DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER
を含む。
【００８２】
あるいは、多重エピトープを製剤中に組み込むことにより、その１種がインフルエンザウィルスである一連の病原体に対する免疫を付与し得る。例えば、呼吸器感染ワクチンは、インフルエンザウィルスおよび呼吸器合胞体ウィルスの抗原を含有し得る。
【００８３】
本発明の組成物は、場合により１種または複数の医薬として許容される担体および／またはアジュバントと共に、抗原に結合したフルオロカーボンベクターを含む。このようなアジュバントおよび／または医薬として許容される担体は、大きさおよび／またはサイトカインプロファイルの双方から見て免疫応答を更に増強できると思われ、そのようなものには、それだけに限らないが、
（１）フロイントのアジュバントおよびその誘導体、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧ、モノホスホリルリピドＡなどの天然の細菌成分を自然に、または合成的に誘導して精製したもの、
（２）サポニン、アルミニウム塩およびサイトカインなどの他の既知のアジュバントまたは増強剤、
（３）水中油アジュバント、油中水アジュバント、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、製剤化ナノおよびマイクロ粒子などの外来アジュバント（上記１、２参照）と共に、またはそれを用いずに抗原を製剤化する方法、
（４）細菌の毒素およびトキソイド、ならびに
（５）当業者に周知の他の有用なアジュバント
を挙げ得る。
【００８４】
必要な場合の担体の選択は、該組成物の送達経路に依存することが多い。本発明の範囲内では、適当な任意の投与の経路および手段のために組成物を処方し得る。医薬として許容される担体または希釈剤には、経口、眼内、直腸、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、経膣、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経皮）投与に適切な製剤中に使用するものが挙げられる。
【００８５】
該製剤は、適切な任意の形態、例えば、液体、固体、エアロゾルまたは気体として投与してもよい。例えば、経口製剤は、乳濁液、シロップもしくは溶液、または胃の中での分解から活性成分を保護するために腸溶コーティングをしてもよい、錠剤もしくはカプセルの形態を取ってもよい。経鼻製剤は、スプレーまたは溶液でもよい。経皮製剤は、特定の送達系に適合させてもよく、パッチを含み得る。注射用製剤は、蒸留水中、または医薬として許容される別の溶媒もしくは懸濁化剤中の溶液または懸濁でもよい。
【００８６】
したがって更なる態様では、本発明は、適切な担体および／またはアジュバントと共に、あるいはそれを用いずにベクター−抗原構築体（複数可）を含む、予防または治療製剤を提供する。
【００８７】
患者に投与すべきワクチンまたは免疫治療薬の適当な用量は、診療所にて決定されよう。しかし、指針として、好ましい投与経路に依存し得る適切なヒト向け用量は、１〜１０００μｇになり得る。免疫または臨床効果を実現するには、複数回の用量が必要なこともあるが、必要な場合には、２〜１２週間の間隔で通常投与されよう。より長期に亘り免疫応答を増強する場合、１カ月から５年の間隔で反復用量を施すこともある。
【００８８】
複数のワクチンまたは薬物の投与を行うために、該製剤は、ベクター−抗原構築体を別の活性成分と組み合わせてもよい。２種以上の活性成分を共用投与することにより、相乗効果も認められることがある。
【００８９】
１種または複数のフルオロペプチドを含む本発明のワクチン製剤は、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）、Ａｇｒｉｐｐａｌ（商標）、Ｂｅｇｒｉｖａｃ（商標）、Ｆｌｕｖａｘ（登録商標）、Ｅｎｚｉｒａ（登録商標）、Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）、Ｆｌｕｌａｖａｌ（商標）、ＦｌｕＡｄ（登録商標）、Ｉｎｆｌｕｖａｃ（登録商標）、Ｆｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）、ＦｌｕＢｌｏｋ（登録商標）などの体液応答性インフルエンザワクチン、または活性成分としてヘマグルチニンを含む任意のインフルエンザワクチン、またはＦｌｕｍｉｓｔ（登録商標）などの低温適応株を含む弱毒化生インフルエンザウィルスと組み合わせて、使用してもよい。投与は、同時にまたは時間を隔てて投与される、組合せ混合物または別々のワクチン薬剤として行ってもよい。
【００９０】
更なる態様では、該インフルエンザワクチン製剤は、アマニジン、リマンチジン、ザナミビルまたはオセルタミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤処置薬を含む、抗ウィルス治療組成物と組み合わせて投与してもよい。投与は、同時でも、または時間を隔ててもよい。
【００９１】
他の態様では、本発明は以下のことを提供する。
ｉ）疾患またはその症状を治療または予防するための医薬の調製における、本明細書に記載したような免疫原性構築体の使用。
ｉｉ）本明細書に記載の製剤を投与した後の免疫応答の誘発による治療法。
【００９２】
以下の実施例に関して、本発明を以下説明する。これらの実施例は、対応する非フッ素化抗原と比較して、フルオロカーボンベクターの抗原への結合で得られるＴ細胞の差次的（differential）免疫応答を強調している。例示した８種の抗原は、本明細書に規定したインフルエンザ配列のリストから選択した。この暫定的選択では、イムノインフォマティクス選択、インビトロ結合アッセイ、予めインフルエンザで感染したヒトＰＢＭＣを用いるエクスビボ再賦活アッセイ、製造および処方パラメーターを含む、パラメーターの組合せを包含する独自の選択アルゴリズムを利用した。最後に、マウスにおける評価によって、こうして選択したフルオロペプチドが、単独または併用のいずれかで免疫原性を示し、得られる応答が、天然ペプチド抗原より優れていることを確認した。このワクチン試作品のために、抗原の選択に専心し、抗原の組合せを利用することを所望する理由は、この合理的なワクチン設計においてウィルス遺伝子、ヒトＨＬＡ双方の多様性に対処するためである。これまで、これがペプチドワクチン分野における重大な欠陥の１つであった。フルオロペプチドワクチン中で単一抗原を利用することは可能ではあるが、そうすると、異系交配したヒト（または他の）集団で見込みのあるワクチン免疫原性が制限されると思われ、そのため複数のペプチドの選択が、有効性の広範なワクチンにとって必須である。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「フルオロペプチド」とは、ペプチド系抗原とコンジュゲートしたフルオロカーボンベクター（鎖）を指す。実施例では、以下の図を参照する。
【実施例１】
【００９４】
実施例のペプチド
フルオロカーボンベクターにコンジュゲートし、インフルエンザ用予防または治療ワクチン中に導入するための候補には、以下の１種または複数のペプチドもしくはその断片、または相同体（ロスアラモス国立研究所のインフルエンザ配列データベース（Macken, C., Lu, H., Goodman, J., & Boykin, L., "The value of a database in surveillance and vaccine selection." in Options for the Control of Influenza IV. A.D.M.E. Osterhaus, N. Cox & A.W. Hampson (Eds.) 2001, 103-106.）またはＮＣＢＩのインフルエンザウィルス資源において参照されるような、対応するコンセンサス、祖先型または中央系統樹の配列）、あるいはその天然型および非天然型変異体を含み得るが、必ずしもそれだけに限らない。適当なペプチドの具体例を以下に示すが、そこでは標準的な１文字コードが利用されている。相同体は、基準配列と比較した際、少なくとも５０％の同一性を有する。相同体は、好ましくは、天然配列と８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性を有する。非天然アミノ酸の使用で、当該ペプチドのＭＨＣクラスＩまたはＩＩ受容体と結合する能力を妨害してはならない。１つまたは複数のエピトープを含有するこうした配列の断片も、フルオロカーボンベクターに結合するための候補ペプチドである。
【００９５】
こうした配列は、インフルエンザＡ型のコンセンサス配列から選択した。インフルエンザウィルスのタンパク質およびそのタンパク質内にあるペプチドの位置が、特定されている。タンパク質の配列は、上記インフルエンザウィルス資源から収集した。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/
配列番号１
ＰＢ２    ２７〜６１位
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
配列番号２
ＰＢ２    １２３〜１５７位
ERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDINPGHADLSAK
配列番号３
ＰＢ２    １５５〜１８９位
SAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEK
配列番号４
ＰＢ２    ２０３〜２３７位
VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG
配列番号５
ＰＢ２    ２４９〜２８３位
EVRNDDVDQSLIIAARNIVRRAAVSADPLASLLEM
配列番号６
ＰＢ２    ３５８〜３９２位
EGYEEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQ
配列番号７
ＰＢ２    ３７０〜４０４位
ATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVF
配列番号８
ＰＢ２    ４１５〜４４９位
RGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNW
配列番号９
ＰＢ２    ５３２〜５６６位
SSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWETVKIQWSQ
配列番号１０
ＰＢ２    ５９２〜６２６位
YSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPP
配列番号１１
ＰＢ２    ６０７〜６４１位
LGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVR
配列番号１２
ＰＢ２    ６２７〜６５９位
QSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNK
配列番号１３
ＰＢ１    １２〜４６位
VPAQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRT
配列番号１４
ＰＢ１    １１４〜１４８位
VQQTRVDKLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALANTIE
配列番号１５
ＰＢ１    ２１６〜２５０位
SYLIRALTLNTMTKDAERGKLKRRAIATPGMQIRG
配列番号１６
ＰＢ１    ２６７〜３０１位
EQSGLPVGGNEKKAKLANVVRKMMTNSQDTELSFT
配列番号１７
ＰＢ１    ３２４〜３５８位
YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
配列番号１８
ＰＢ１    ３４０〜３７４位
APIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLA
配列番号１９
ＰＢ１    ４０４〜４３６位
SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY
配列番号２０
ＰＢ１    ４７９〜５１３位
KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG
配列番号２１
ＰＢ１    ４８６〜５２０位
KTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINES
配列番号２２
ＰＢ１    ５２６〜５６０位
GVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFIKDYRYTYR
配列番号２３
ＰＢ１    ６５６〜６９０位
EYDAVATTHSWIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQ
配列番号２４
ＰＢ１    ７００〜７３４位
FPSSSYRRPVGISSMVEAMVSRARIDARIDFESGR
配列番号２５
ＰＡ      １０７〜１４１位
PDLYDYKENRFIEIGVTRREVHIYYLEKANKIKSE
配列番号２６
ＰＡ      １２２〜１５６位
VTRREVHIYYLEKANKIKSEKTHIHIFSFTGEEMA
配列番号２７
ＰＡ      １４５〜１７９位
IHIFSFTGEEMATKADYTLDEESRARIKTRLFTIR
配列番号２８
ＰＡ      １６６〜２００位
ESRARIKTRLFTIRQEMASRGLWDSFRQSERGEET
配列番号２９
ＰＡ      ４９５〜５２９位
RRKTNLYGFIIKGRSHLRNDTDVVNFVSMEFSLTD
配列番号３０
ＰＡ      ６４２〜６７６位
AKSVFNSLYASPQLEGFSAESRKLLLIVQALRDNL
配列番号３１
ＰＡ      １７３〜２０７位
PRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFW
配列番号３２
ＮＰ      ２４０〜２７４位
DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS
配列番号３３
Ｍ１      ２〜２６位
SLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKN
配列番号３４
Ｍ１      ２３〜５７位
EIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTK
配列番号３５
Ｍ１      ３８〜７２位
DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER
配列番号３６
Ｍ１      ５５〜８９位
LTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGD
配列番号３７
Ｍ１      １６６〜２００位
ATTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAA
配列番号３８
ＮＳ１    １２８〜１６２位
IILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISP
配列番号３９
ＮＳ２    ２６〜６０位
EDLNGMITQFESLKLYRDSLGEAVMRMGDLHSLQN
【００９６】
以下の配列は、インフルエンザＢ型コンセンサス配列から選択した。インフルエンザウィルスのタンパク質およびそのタンパク質内にあるペプチドの位置が、特定されている。タンパク質の配列は、上記インフルエンザウィルス資源から収集した。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/
配列番号４０
ＰＢ２    １６〜５０位
NEAKTVLKQTTVDQYNIIRKFNTSRIEKNPSLRMK
配列番号４１
ＰＢ２    １１７〜１５１位
YESFFLRKMRLDNATWGRITFGPVERVRKRVLLNP
配列番号４２
ＰＢ２    １４１〜１７５位
ERVRKRVLLNPLTKEMPPDEASNVIMEILFPKEAG
配列番号４３
ＰＢ２    １９７〜２３１位
GTMITPIVLAYMLERELVARRRFLPVAGATSAEFI
配列番号４４
ＰＢ２    ３１１〜３４５位
DIIRAALGLKIRQRQRFGRLELKRISGRGFKNDEE
配列番号４５
ＰＢ２    ４０４〜４３８位
MVFSQDTRMFQGVRGEINFLNRAGQLLSPMYQLQR
配列番号４６
ＰＢ２    ５１９〜５５３位
VSELESQAQLMITYDTPKMWEMGTTKELVQNTYQW
配列番号４７
ＰＢ２    ５３７〜５７１位
MWEMGTTKELVQNTYQWVLKNLVTLKAQFLLGKED
配列番号４８
ＰＢ２    ５７２〜６０６位
MFQWDAFEAFESIIPQKMAGQYSGFARAVLKQMRD
配列番号４９
ＰＢ２    ７１７〜７５１位
LEKLKPGEKANILLYQGKPVKVVKRKRYSALSNDI
配列番号５０
ＰＢ１    １〜３５位
MNINPYFLFIDVPIQAAISTTFPYTGVPPYSHGTG
配列番号５１
ＰＢ１    ９７〜１３１位
EEHPGLFQAASQNAMEALMVTTVDKLTQGRQTFDW
配列番号５２
ＰＢ１    ２２７〜２６１位
MTKDAERGKLKRRAIATAGIQIRGFVLVVENLAKN
配列番号５３
ＰＢ１    ３９３〜４２７位
KPFFNEEGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVAALGI
配列番号５４
ＰＢ１    ６１６〜６５０位
DPEYKGRLLHPQNPFVGHLSIEGIKEADITPAHGP
配列番号５５
ＰＢ１    ７０１〜７３５位
SASYRKPVGQHSMLEAMAHRLRMDARLDYESGRMS
配列番号５６
ＰＡ      １６０〜１９４位
SSLDEEGKGRVLSRLTELQAELSLKNLWQVLIGEE
配列番号５７
ＰＡ      ４９１〜５２５位
ESFDMLYGLAVKGQSHLRGDTDVVTVVTFEFSSTD
配列番号５８
ＰＡ      ６９６〜７２３位
VIQSAYWFNEWLGFEKEGSKVLESVDEIMDE
配列番号５９
ＮＰ      １７３〜２０７位
FLKEEVKTMYKTTMGSDGFSGLNHIMIGHSQMNDV
配列番号６０
ＮＰ      ２５３〜２８７位
EAIRFIGRAMADRGLLRDIKAKTAYEKILLNLKNK
配列番号６１
ＮＰ      ３０８〜３４２位
IADIEDLTLLARSMVVVRPSVASKVVLPISIYAKI
配列番号６２
ＮＰ      ３３８〜３７２位
IYAKIPQLGFNVEEYSMVGYEAMALYNMATPVSIL
配列番号６３
ＮＰ      ４１８〜４５２位
GFHVPAKEQVEGMGAALMSIKLQFWAPMTRSGGNE
配列番号６４
Ｍ１      １６６〜３００位
ARSSVPGVRREMQMVSAMNTAKTMNGMGKGEDVQK
配列番号６５
Ｍ１      ２０９〜２３７位
IGVLRSLGASQKNGEGIAKDVMEVLKQSS
【００９７】
インフルエンザ用予防または治療ワクチン中に導入するための候補ペプチドは、ウィルスタンパク質のいずれか、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックス（Ｍ１）タンパク質、Ｍ２、核タンパク質（ＮＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＳ１またはＮＳ２に由来する、このような任意の組合せのペプチドでもよい。
【００９８】
フルオロペプチドおよび天然ペプチド（非修飾ペプチド）の合成
８種の天然ペプチドおよび８種のフルオロペプチド（本明細書に含めたペプチドリストの配列番号１から６５までから選択した）を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって得た。全てのペプチドは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の標準的化学反応を用いることにより、ＲｉｎｋアミドＰＥＧ樹脂上で合成した。ペプチド鎖は、２０％ピペリジン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで３０分間処理することにより、Ｆｍｏｃ保護基を反復除去し、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール／Ｎ−メチルモルホリンを１２０分間使用することにより、保護アミノ酸をカップリングすることによって、樹脂上で組み立てた。カップリング効率を調べるために、各カップリングの後でニンヒドリン試験を行った。Ｎ末端リシニル残基を付加した後、樹脂ブロックを分割して、（１）樹脂の第１半量上で、Ｎ末端リシンのε鎖上に２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロウンデカン酸のフルオロカーボン鎖（Ｃ８Ｆ１７（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ）を組み込んで、フルオロペプチドを誘導し、（２）樹脂の第２半量上で、Ｎ末端リシンのε鎖をアセチル化して天然ペプチドを誘導した。樹脂は、洗浄し、乾燥した後、側鎖保護基を切断、除去するためにＫ試薬で処理した。粗製ペプチドを冷エーテルから沈殿させ、ろ過により集めた。純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析し、全ペプチドについて９２％より優れていた。凍結乾燥したフルオロペプチドを窒素下で調製し、−２０℃で保存した。保存条件下のフルオロペプチドの安定性は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより６カ月を超えることが確認された。
【００９９】
ワクチン投与製剤
８種の凍結乾燥フルオロペプチド（フルオロペプチド１、フルオロペプチド２、フルオロペプチド３、フルオロペプチド４、フルオロペプチド５、フルオロペプチド６、フルオロペプチド７＆フルオロペプチド８）、または８種の凍結乾燥天然ペプチド等価物（ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５、ペプチド６、ペプチド７＆ペプチド８）を処方して、非経口用に広範な中性ｐＨを生じる等モル製剤を創製した。
【０１００】
該構築体のインフルエンザペプチド部分の配列は、以下の通りであった。
フルオロペプチド１  HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK-NH2
フルオロペプチド２  VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG-NH2
フルオロペプチド３  YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE-NH2
フルオロペプチド４  APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA-NH2
フルオロペプチド５  SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY-NH2
フルオロペプチド６  KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG-NH2
フルオロペプチド７  DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS-NH2
フルオロペプチド８  DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER-NH2
【０１０１】
動物および免疫接種
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃまたはＣＢ６Ｆ１（ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）雌性マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（ＵＫ）および／またはＨａｒｌａｎ（ＵＫ）から購入した。注射は、１ｍｌのシリンジおよび２２−Ｇの針を用いて皮下に行った。免疫接種は、マウスが、単一の免疫接種（プライム）または２回の免疫接種（プライム／ブースト）のいずれかを受けるように行った。免疫接種は、各注射間に１４日の間隔を置いて行った。
【０１０２】
フルオロペプチドワクチンは、免疫原性が強く、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ６Ｆ１の両マウスにおいて天然ペプチドより優れている
フルオロペプチドワクチン（上記のようなフルオロペプチド８種の混合物）の免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ６Ｆ１マウスにおいて天然ペプチド等価物（上記のような天然ペプチドと称する、非修飾ペプチド８種の混合物）と比較した。この試験では、プライムまたはプライム−ブースト投与計画を用いる両製剤の免疫原性も比較した。両製剤は、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢＦ６マウスにおいてアジュバントなしで皮下に注射した。マウスには、１ｎｍｏｌ／フルオロペプチド（フルオロペプチド８種で合計８ｎｍｏｌ）を含有するフルオロペプチドワクチンの用量、または１ｎｍｏｌ／ペプチド（天然ペプチド８種で合計８ｎｍｏｌ）の天然ペプチドワクチン等価物を免疫接種した。ワクチン製剤は、いずれもアジュバントを全く含有していなかった。最終の免疫接種から１０日後に、脾臓細胞を１０μｇ／ｍｌの個々の各天然ペプチドで再刺激し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて評価した。エクスビボでのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（図１および２）によれば、フルオロペプチドワクチンの免疫原性は、プライム−ブースト免疫投与計画の後、賦形剤単独および天然ペプチドワクチン等価物の両方より優れていた（Ｐ＜０．００１）。この結果は、フルオロペプチドワクチン群の単一免疫接種だけと比較して、プライム−ブースト投与計画を用いたスポット形成細胞数の顕著な増加も実証した（図１および２）。以上の結果は、ペプチド配列に連結されたフルオロカーボン鎖の自己アジュバント性を実証している。
【０１０３】
フルオロペプチドワクチンは、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ６Ｆ１の両マウスにおいてＴ細胞のロバストな多重エピトープ応答を誘発する
フルオロペプチドワクチン（上記のようなフルオロペプチド８種の混合物）の免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ６Ｆ１マウスにおいて天然ペプチド等価物（上記のような「天然ペプチド」と称する、非修飾ペプチド８種の混合物）と比較した。この試験では、プライムおよびプライム−ブースト投与計画における両製剤の免疫原性も比較した。両製剤は、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ６Ｆ１マウスにおいてアジュバントなしで皮下に注射した。マウスには、１ｎｍｏｌ／フルオロペプチド（フルオロペプチド８種で合計８ｎｍｏｌ）を含有するフルオロペプチドワクチンの用量、１ｎｍｏｌ／ペプチド（天然ペプチド８種で合計８ｎｍｏｌ）の天然ペプチドワクチン等価物を免疫接種した。ワクチン製剤は、いずれもアジュバントを全く含有していなかった。対照群は、賦形剤単独の免疫接種を受けたマウスからなっていた。免疫接種から１０日後に、脾臓細胞を１０μｇ／ｍｌの個々の各天然ペプチドで再刺激し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて評価した。フルオロペプチドワクチンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてペプチド８種中５種、およびＣＢ６Ｆ１マウスにおいてペプチド８種中７種に対するペプチド特異的応答を誘発し、ワクチン（非修飾ペプチド）が誘発する応答より優れている。これは、フルオロペプチドによるワクチン接種が、質的にも量的にも天然ペプチド等価物より優れた免疫応答を誘発できることを実証している。
【０１０４】
フルオロペプチドワクチンは、試験したマウス株に応じてＴｈ１サイトカインプロファイルを誘導する
フルオロペプチドワクチン（上記のようなフルオロペプチド８種の混合物）の免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ６Ｆ１マウスにおいて天然ペプチド等価物（上記のような非修飾ペプチド８種の混合物）と比較した。製剤は、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ６Ｆ１マウスにおいてアジュバントなしで皮下に注射した。マウスには、１ｎｍｏｌ／フルオロペプチド（フルオロペプチド８種で合計８ｎｍｏｌ）を含有するフルオロペプチドワクチンの用量、１ｎｍｏｌ／ペプチド（天然ペプチド８種で合計８ｎｍｏｌ）の天然ペプチドワクチン等価物を免疫接種した。ワクチン製剤は、いずれもアジュバントを全く含有していなかった。最後の免疫接種から１０日後に、脾臓細胞をペプチド１種当たり１μｇ／ｍｌの天然ペプチド８種の混合物で再刺激した。４８時間の刺激後、培養上清を多重化ビーズアッセイ（CBA）によってサイトカインについて評価した。その結果から、ＣＢＦ６マウスのサイトカインプロファイルは、ＩＦＮ−γの産生およびＴＮＦ−αの有意な産生により支配され、Ｔｈ１プロファイルを強調することが示されている（図４）。このＴｈ１支配的サイトカインプロファイルは、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較すると、ＣＢ６Ｆ１マウスに比べてこうしたＴｈ１応答の強度低下（ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによっても認められる、図１および２を参照）およびＴｈ２サイトカインの増加のために、より顕著となった。とは言え、Ｔｈ１応答の増強は、天然ペプチド等価物と比較して、フルオロペプチドを免疫接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて認められた。
【０１０５】
フルオロペプチドワクチンは、ＩＦＮ−γを産生する、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のペプチド特異的Ｔ細胞を刺激する
ＩＦＮ−γを産生する、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のペプチド特異的Ｔ細胞の頻度に関する情報を得るために、ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色を使用した。マウスにフルオロペプチドワクチン（上記のようなフルオロペプチド８種の混合物）を免疫接種し、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋脾臓細胞を、天然ペプチド８種の混合物（ワクチン）で短期間刺激した後、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色について評価した。その結果は、フルオロペプチドワクチンでマウスを免疫接種すると、ＩＦＮ−γを産生する、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のペプチド特異的Ｔ細胞が、０．５〜２．６％の頻度で誘導できたことを示している（図５）。これによって、フルオロペプチドは、適切なＭＨＣクラスＩおよびＩＩエピトープを含有すれば、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ双方の抗原プロセシングペプチドに会合することが確認される。
【実施例２】
【０１０６】
フルオロペプチドワクチンの接種で誘発される免疫応答は、アジュバントとの組合せで増強される
フルオロペプチドワクチン（上記のようなフルオロペプチド８種の混合物）の免疫原性を、アジュバントとしてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）の存在下でのフルオロペプチドワクチンの免疫原性と比較した。フルオロペプチドワクチン（１ｎｍｏｌ／ペプチド）またはＣＦＡ中に乳化したフルオロペプチドワクチン（１ｎｍｏｌ／ペプチド）を使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫接種した。免疫接種から１０日後、脾臓細胞を１０μｇ／ｍｌの個別ペプチドで刺激した。４８時間後、培養上清を収集し、多重サイトカインアッセイ（CBA）を用いてサイトカインについて試験した。その結果は、ＣＦＡを付加的なアジュバントとして使用することにより、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５）の産生に影響を与えることなく、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）産生を有意に増強できることを示している（図６）。したがって、フルオロペプチドワクチンの接種で誘発されるＴｈ１応答は、アジュバントとの組合せで免疫中に優先的に増強される。
【０１０７】
フルオロペプチドワクチンの皮下および皮内の両投与経路は、免疫応答を誘発することができる
フルオロペプチドワクチン（上記のようなフルオロペプチド８種の混合物）の免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける皮内または皮下いずれかの投与経路を用いて比較した。免疫接種から１０日後、脾臓細胞を１０μｇ／ｍｌの個別ペプチドで刺激し、ＥＬＩＳＰＯＴによってエクスビボでのＩＦＮ−γ産生について評価した。その結果は、フルオロペプチドの皮下および皮内の両投与経路は、ロバストな抗原特異的応答の誘発に適切であることを示している（図７）。
【図１】
0005756630.tif 000005
【図２】
0005756630.tif 000006
【図３】
0005756630.tif 000007
【図４】
0005756630.tif 000008
【図５】
0005756630.tif 000009
【図６】
0005756630.tif 000010
【図７】
0005756630.tif 000011
【配列表】
0005756630000001.app