(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）微生物のシャペロニン遺伝子の一部のPCR増幅を含む、患者の生物学的試料において該微生物の存在を検出するための方法であって、ここで、該シャペロニン遺伝子はcpn60であり、その部分配列がSEQ ID No 1により示され、さらにここで、該増幅がSEQ ID No 2およびSEQ ID No 3のプライマーのペアを用いて行われる、方法。
【請求項２】
該増幅がリアルタイムPCRである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
増幅産物の検出がSEQ ID No 7のプローブを用いて行われる、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
該プローブが5'末端において6-カルボキシフルオレセインおよび3'末端においてブラックホールクエンチャー1を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料が関節液試料である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
患者が15歳未満の子供である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
患者が急性関節炎を有する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
患者が心内膜炎を有する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
SEQ ID No 2およびSEQ ID No 3のプライマーのペア、ならびに配列SEQ ID No 7のプローブを含む、キンゲラ属の微生物を検出するためのキット。
【請求項１０】
該プローブが5'末端において6-カルボキシフルオレセインおよび3'末端においてブラックホールクエンチャー1を含む、請求項9記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
子供における急性敗血症性関節炎は、長期の続発症の危険度のため緊急に診断かつ処置されなければならない。抗生物質の選択を最適化するため、原因となる生物の同定が必要とされるが、3分の1〜3分の2の患者において培養が陰性である［1〜3］。グラム陰性球桿菌であるキンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）は、6ヶ月〜4歳の幼い子供の正常な口咽頭叢の一部である［4,5］。それは当初、子供における骨格感染症および成人における心内膜炎を含む侵襲性疾患のまれな原因と考えられていた。しかしながら、主に関節検体を用いた血液培養バイアルの接種などの培養技術における改善により、K.キンゲ関節炎の症例の報告される数が1990年代より著しく増加している［3,6］。文献において、K.キンゲは現在、培養陽性骨関節感染症（OAI）の5％〜29％における主な原因であり［2,7〜9］、および2歳未満の子供における敗血症性関節炎の症例の48％における主な原因である［10］。
【０００２】
K.キンゲは偏好性微生物であることから、OAIにおけるその頻度はまだ過小評価されている可能性がある。実際に、いくつかの分子的方法により、本設定において以前に報告されたよりも高いK.キンゲの罹患率が最近示されている。RoseyらおよびVerdierらは、ユニバーサル16SリボソームDNA PCR法を用いて、OAIを有する乳児由来の培養陰性検体のそれぞれ18％および14％においてK.キンゲの配列を見出した［2,9］。最近、Chometonらは、プローブを用いない（nonprobed）リアルタイムPCR法を用いて、K.キンゲがリヨン（フランス）において子供のOAIの主要な原因であることを見出した［7］。
【０００３】
細菌DNAの検出は、関連性のある細菌が病原性の役割を有するという反論不可能な証拠は提供しない［11］。実際に、Daganらは、肺炎球菌などの呼吸器管にコロニー形成する生物のDNAが感染していない患者の血清においてPCRにより検出できることを示している［12］。従って、幼い子供の呼吸器管にコロニー形成するK.キンゲの能力を考慮して［5］、PCRベースの診断の妥当性を確認するために適当な対照が必要とされる。
【０００４】
培養とは対照的に、分子的方法は種々の感染性疾患において有効な抗生物質治療の着手後数日または数週間まで病原体を検出することができる［13〜16］。この点において、関節液吸引より前に既に抗生物質を受けた子供においてK.キンゲの感染を診断するためのPCRの貢献を判定することが興味深いと考えられる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、蛍光発生性プローブを用いた新たなK.キンゲ特異的リアルタイムPCR法を説明および評価し、ならびに急性敗血症性関節炎が疑われた子供由来の血液および関節液試料に適用する。この年齢群におけるK.キンゲ関節炎の特徴もまた説明される。
【０００６】
本発明は従って、キンゲラ属の微生物のシャペロニン遺伝子のすべてまたは一部のPCR増幅を含む、患者の生物学的試料において該微生物の存在を検出するための方法に関する。
【０００７】
シャペロニンまたはシャペロンは、他の巨大分子構造の非共有結合的なフォールディング／アンフォールディングおよび集合／分解を補助するタンパク質であるが、後者がその正常な生物学的機能を行っている場合は、これらの構造において生じない。これらはしばしばタンパク質フォールディングと関係するが、フォールディングしたヒストンおよびDNA由来のヌクレオソームなどの他の構造の集合もまた補助する。特に核におけるいくつかの集合シャペロンは、フォールディングしたサブユニットのオリゴマー構造中への集合と関係する。
【０００８】
シャペロニンのアミノ酸構造は種間で極めて保存されている。例として、K.キンゲのcpn60とナイセリア属（Neisseria）におけるオーソログタンパク質との間にはいくらかの同一性が存在する。
【０００９】
キンゲラ属においてシャペロニンタンパク質を同定するために、他の微生物由来のシャペロニンの保存された領域からプローブを設計すること、およびキンゲラ属のゲノム上でこのプローブを使用することが可能である。該ゲノムは好ましくは切り取られ、およびBACまたはコスミドなどのベクターにクローニングされている。1つ（または複数）のベクターへのプローブのハイブリダイゼーションは、該ベクターにおける、このプローブと相同性を呈する遺伝子の存在を示す。従って、ベクターを配列決定し、遺伝子を同定し、およびそれがシャペロニンタンパク質をコードすると確認することが可能である。該方法（および他のもの）は当業者に周知である。
【００１０】
または、キンゲラ属微生物の全ゲノムを配列決定することが可能である。完全な細菌ゲノムを配列決定することは今や当技術分野においてよく記述されている。従って特定のソフトウェアを用いて、このゲノムにおいてコード配列を予測することが可能である（これはまた、イントロンの欠如のために、細菌ゲノム配列においてそうすることは真核生物ゲノム配列におけるよりも容易である）。予測されたタンパク質のデータベースとの比較が、キンゲラ属ゲノムのシャペロニンタンパク質の同定をもたらすと考えられる。
【００１１】
好ましい態様において、前記シャペロニン遺伝子はcpn60であり、その部分配列はSEQ ID No 1により示される。SEQ ID No 1はGenBank AY123650の配列に相当する。cpn 60は恐らくエシェリキア・コリ（Escherichia coli）におけるGroELに相当する。
【００１２】
GroELタンパク質ファミリーは、当技術分野においてよく記述されている。BrocchieriおよびKarlin（Protein Science, 2000, 9:476-86）は、構造、機能、および進化に関してHsp60（GroELの別名）配列間における保存を記述している。SEQ ID No 1を翻訳することより取得されるペプチドは、GroELタンパク質に特異的なアミノ酸を示す。従って、これらの配列相同性を用いて、キンゲラ属由来のcpn60タンパク質を同定することは容易である。
【００１３】
本発明者らは、種々の生物学的株間で保存されている本タンパク質における配列を同定し、ならびに患者由来の試料において該遺伝子の存在を検出するために使用できる特異的なプライマーおよびプローブを決定した。この遺伝子の存在は、宿主、すなわちキンゲラ属微生物の存在を意味する。
【００１４】
特に、前記保存された配列は、SEQ ID No 1のヌクレオチド225〜399を含み、ならびに（SEQ ID No 2／SEQ ID No 3）および（SEQ ID No 4／SEQ ID No 5）の中で選択されるプライマーのペアを用いて増幅され得る。特にK.キンゲの特異的検出のためには、SEQ ID No 2／SEQ ID No 3を使用することが好ましい。
【００１５】
そのような増幅された核酸は、SEQ ID No 11〜SEQ ID No 16に示される配列を含む。これらの6種類の配列は、参照株および患者から単離された株から増幅された産物に相当する。
【００１６】
本発明の方法は、キンゲラ属の微生物、および特にキンゲラ・キンゲの存在を検出することを可能にする。
【００１７】
増幅が行われる生物学的試料は、任意の生物学的試料（特に、血液、尿、脳脊髄液、心内膜組織、または骨試料）である。それにもかかわらず、探究される微生物の性質のため、前記方法は関節液試料に対して有利に行われる。
【００１８】
本発明の方法は、当技術分野において公知である任意の方法により、患者から以前に収集された生物学的試料に対して行われる。好ましい態様において、該患者は15歳未満の子供である。実際に、キンゲラ属感染症はより高い頻度で子供に存在する。別の態様において、該患者は5歳未満の子供である。
【００１９】
本発明の方法は、急性関節炎、骨髄炎、または心内膜炎を有する患者においてキンゲラ属感染の特徴を評価または確認することを関心対象とする。
【００２０】
増幅は、当技術分野において公知である方法に従って行われる。米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159号、および第4,965,188号は従来のPCR技術を開示する。PCRは典型的に、熱により変性された選択された核酸鋳型（例えばDNAまたはRNA）に結合する2種類のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。耐熱性ポリメラーゼが、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒する。
【００２１】
リアルタイム定量PCR（qPCR）は、試料において特異的DNAの量を測定することを可能にする。それはRNA鋳型に対して直接（逆転写が増幅の前に行われる場合）、またはcDNAから（逆転写が別個のチューブにおいて行われる）行われ得る。また細菌ゲノムDNAに対しても直接容易に行われる。
【００２２】
出発核酸の定量は基本的に、増幅の各サイクルで取得された2本鎖核酸に結合すると考えられる標識されたプライマーまたは部分を使用することにより行われる。これらの標識部分はひとたびDNAに連結されると、2本鎖DNAの量に比例しかつ増幅の2サイクル間に反応チューブにおいてリアルタイムで直接測定できる検出可能なシグナル（一般に蛍光）を放出すると考えられる。
【００２３】
qPCRについての重要なパラメータは、レポーターシグナルにおいて有意な増加があるサイクルであるCt値である。この値はDNAの最初の量に関連し、およびCt値がより低いほど、アッセイの感度はより高い。Ct後のサイクルについては、増幅されたDNAがプラトーに達するまで、検出された蛍光の指数関数的増加（増幅されたDNAの指数関数的増加に関連）がある。
【００２４】
SYBR（登録商標）Green IはqPCRのために極めて一般的に使用される試薬である。これは2本鎖DNA（dsDNA）の中に非特異的にインターカレートする色素である。インターカレートした色素の量は2本鎖DNAの量に比例する。
【００２５】
別の可能性はTaqMan（登録商標）プローブを使用することである。蛍光体がプローブの5'末端に付加され、およびクエンチャーが3'末端に付加される。該クエンチャーは、機械による励起時に最初の蛍光体により放出されるエネルギー（波長）によって励起される際、FRET（蛍光共鳴エネルギー転移）により蛍光を放出する蛍光体であってもよい。そのような蛍光体／クエンチャーの対の例は、FAM／TAMRAの対である。
【００２６】
前記クエンチャーはまた、蛍光体により放出されるエネルギーを吸収するが、蛍光よりもむしろ熱としてそれを放出し、従ってより良好なシグナル対ノイズ比をもたらす「ブラックホール」（またはダーク）クエンチャーであってもよい。
【００２７】
TaqMan（登録商標）プローブの原理は、いかなるクエンチャーが使用されようと同一である。プローブはPCRの各アニーリング段階の間に単位複製配列に結合する。Taqポリメラーゼにより単位複製配列に結合したプライマーから伸長される場合、Taqポリメラーゼはプローブの5'末端をはずし、その後Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によりプローブは分解される。切断は、残りのプローブが融解して単位複製配列から離れるまで継続する。この過程が蛍光体およびクエンチャーを溶液中に放出し、空間的にそれらを分離する（プローブにより一緒に保持されていた際と比較して）。
【００２８】
蛍光体の対（FAM／TAMRAなどの）が使用される場合、これは第1の蛍光体（FAM）からの蛍光における不可逆的な増加、およびクエンチャー（TAMRA）の蛍光における減少をもたらす。ブラックホールクエンチャーを使用する際は、蛍光体からの蛍光において不可逆的な増加を観察することができる。
【００２９】
ダーククエンチャーは完全に非蛍光であり、および極めて低いバックグラウンドを有する。ダーククエンチャーを使用することはシグナル対ノイズ比を有意に改善し、および従って多様なPCRにおいてより高い感度を与える。
【００３０】
分子ビーコンプローブを使用することもまた可能である。これらは当技術分野において周知であり、かつ、ループが標的配列に相補的なプローブ配列を含有し、ステムがプローブ配列の両側に位置する相補的アーム配列のアニーリングにより形成される、ステム-アンド-ループ構造を形成する1本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。蛍光体が1つのアームの末端に共有結合的に連結され、およびクエンチャーがもう1つのアームの末端に共有結合的に連結されることから、分子ビーコンが溶液において遊離している場合、該蛍光体は非蛍光クエンチャーに非常に近接する。従って蛍光の放出は無い。
【００３１】
分子ビーコンが標的配列を含有する核酸鎖にハイブリダイズする際には、これらはステムハイブリッドより長くかつより安定であるプローブ-標的ハイブリッドを形成し、それによりステムハイブリッドを強制的に解離させる自発的コンホメーション再編成を起こす。蛍光体およびクエンチャーは移動して互いに離れ、従って蛍光を回復する。
【００３２】
TagMan（登録商標）および分子ビーコンプローブの両方の利点を有するプローブを使用することもまた可能である。これらのプローブは標的配列に相補的であり、およびプローブの最初のヌクレオチドに相補的である3'末端に「テイル」（数個のヌクレオチド）が付加される。蛍光体がプローブの1つのアームの末端に共有結合的に連結され、かつクエンチャーがもう1つのアームの末端に共有結合的に連結される。プローブが溶液において遊離している際には、分子ビーコンのようにループを形成し、それにより蛍光をもたらさない。標的配列が存在する際には、プローブはそれにハイブリダイズし、それにより蛍光の回復をもたらす。プローブの5'末端は標的配列に相補的であるため、Taqポリメラーゼ（単位複製配列に結合するプライマーから伸長させる）はプローブの5'末端をはずし、かつプローブを分解することができ（TaqMan（登録商標）において起きるように）、それにより蛍光体を放出すると考えられる。従って、増幅中に蛍光放出の2つの源が存在し（増幅された標的へのプローブの結合および蛍光体の放出）、それにより検出の感度が増加する。
【００３３】
リアルタイムPCRの使用は、従来のPCRよりも迅速かつより容易に、試料において特異的DNAの存在を検出することを可能にする。
【００３４】
本発明はまた、（SEQ ID No 2／SEQ ID No 3）および（SEQ ID No 4／SEQ ID No 5）の中で選択されるプライマーのペア、ならびに配列SEQ ID No 7のプローブを含む、キンゲラ属（特にK.キンゲ）の微生物を検出するためのキットに関する。
[1] キンゲラ（Kingella）属の微生物のシャペロニン遺伝子のすべてまたは一部のPCR増幅を含む、患者の生物学的試料において該微生物の存在を検出するための方法。
[2] シャペロニン遺伝子がcpn60であり、その部分配列がSEQ ID No 1により示される、[1]記載の方法。
[3] 増幅された配列が、SEQ ID No 1のヌクレオチド225〜399を含む、[2]記載の方法。
[4] 増幅が（SEQ ID No 2／SEQ ID No 3）および（SEQ ID No 4／SEQ ID No 5）の中で選択されるプライマーのペアを用いて行われる、[1]〜[3]のいずれか一項記載の方法。
[5] キンゲラ属の微生物がキンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）である、[1]〜[4]のいずれか一項記載の方法。
[6] 生物学的試料が関節液試料である、[1]〜[5]のいずれか一項記載の方法。
[7] 患者が15歳未満の子供である、[1]〜[6]のいずれか一項記載の方法。
[8] 患者が急性関節炎を有する、[1]〜[7]のいずれか一項記載の方法。
[9] 患者が心内膜炎を有する、[1]〜[7]のいずれか一項記載の方法。
[10] （SEQ ID No 2／SEQ ID No 3）および（SEQ ID No 4／SEQ ID No 5）の中で選択されるプライマーのペア、ならびに配列SEQ ID No 7のプローブを含む、キンゲラ属の微生物を検出するためのキット。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】キンゲラ・キンゲ株および陽性試料におけるcpn60遺伝子増幅領域配列の最適のアラインメント（SEQ ID No 11〜SEQ ID No 16）を示す。第1の配列：K.キンゲタイプ株についての参照配列。第2〜第4の配列：K.キンゲの他の参照株。第5および第6の配列：陽性培養を伴わない患者試料に対して直接行われたcpn60 PCR。第2〜第6の配列において、点は第1の配列と同一の塩基を示す。第7の配列において、点は4種類のK.キンゲ参照株の間でコンセンサスでない塩基を示す。プローブおよびプライマーのハイブリダイゼーション領域を、コンセンサス配列において太字および下線のフォントで示す（第7の配列、SEQ ID No 17）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
実施例
材料および方法
患者および診断
本研究は、2006年1月〜2008年1月の間に急性敗血症性関節炎が疑われたために病院に入院したすべての子供を含んだ。本診断は、発熱（≧38℃）を伴うかまたは伴わない関節痛および制限された肢の動き、ならびにX線撮影法または超音波検査により可視化された関節滲出液により定義された。急性敗血症性関節炎が疑われたすべての子供は、感染を実証するために、X線透視で先導された関節液吸引を受けた。生物学的評価は、末梢血白血球数（WBC）、C反応性タンパク質（CRP）およびフィブリノーゲンレベルを含んだ。
【００３７】
微生物学的方法
外科手術の前に、血液試料を好気性血液培養バイアル（BacT/ALERT 3D, BioMerieux）中へ接種した。外科手術の間に、関節液を直ちに好気性血液培養瓶中へ接種した。残りの関節液試料をグラム染色、細胞計数のため、ならびにコロンビア血液寒天（嫌気性条件においてインキュベートする）、チョコレート寒天（CO2富化空気においてインキュベートする）、および脳-心臓培地上への直ちの接種のために研究所に送った。アリコート（100〜200μl）をDNA抽出のために-80℃で保存した。血液培養瓶および他の培地は、それぞれ5および10日間インキュベートした。十分な試料が入手可能であった場合は、100〜200μlの血漿をWBC計数または凝固試験のために取得した血液試料から分離し、DNA抽出のために-80℃で保存した。関節液ドレナージ試料を外科手術の2、4、および6日後に収集し、DNA抽出のために-80℃で保存した。
【００３８】
K.キンゲの同定は微生物学的特徴に基づいた［10］。抗生物質感受性は、以前に記述されたようなCO2富化空気におけるミュラー-ヒントン（Mueller-Hinton）ヒツジ血液寒天上でのディスク拡散法を用いて試験した［17］。β-ラクタマーゼ活性はニトロセフィン（nitrocefin）試験を用いて検出した。
【００３９】
予備的な分子の調査
K.キンゲのための高度に特異的なPCRベースの診断法を開発する目的で、2種類のプライマーペア、すなわち
175-bp断片を増幅する
0005688021.tif 000002
および
0005688021.tif 000003
ならびに169-bp断片を増幅する
0005688021.tif 000004
および
0005688021.tif 000005
を、研究の始めに、公的データベースにおいて入手可能な唯一の配列であった非リボソーム遺伝子cpn60の配列（アクセッション番号AY123650）を用いて最初に設計した。プライマーの特異性を、K.キンゲの4種類の参照株、12種類の遺伝的に関連する種および属、ならびに敗血症性関節炎を有する患者由来のK.キンゲでない4種類の単離株に対する従来のPCRにより評価した（表1）。最も特異的なプライマーを用いて取得された増幅産物を配列決定して、コンセンサス配列を産生し、その結果、特異的な「キングプローブ（Kingprobe）」：
0005688021.tif 000006
を設計することが可能になった。使用するための優先的なキングプローブ配列は、6-カルボキシフルオレセイン-
0005688021.tif 000007
-ブラックホールクエンチャー1（SEQ ID No 7）である。
【００４０】
分子診断
週に一度、EZ1 DNA Tissue Kit（Qiagen）を用いて製造業者の推奨に従い、BioRobot EZ1ワークステーションで検体からDNAを抽出した。DNA抽出物の一部を直ちに増幅し、残りは-80℃で保存した。DNA抽出のために使用されるすべての試薬からなり、試料が無い陰性抽出対照を各実施に含めた。リアルタイムPCR混合物は、50μLの最終容積において、5μLのDNA、1μLの10μM各プライマー（Ksm1およびKsm2）、1μLの10μMプローブ、および25μLのIQ Multiplex Powermix（BioRad）を含有した。増幅はiCycler（BioRad）において、95℃で15分の最初の段階、続いて95℃で15秒、55℃で30秒、および72℃で30秒の45サイクル、ならびに72℃で10分の最終伸長段階で行った。K.キンゲCIP8016から抽出されたDNAからなる陽性対照を各反応に含めた。各試料について、プライマー
0005688021.tif 000008
および
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ならびにプローブ
0005688021.tif 000010
を用いたヒトβグロブリン遺伝子（262 bp）の増幅が、内部陽性抽出対照としておよびPCR阻害剤の存在を検出するために働いた。
【００４１】
処置
化膿性体液が関節液吸引より回収された場合には、オープン関節切開術または関節鏡検査法を関節洗浄のために行った。外科手術後、すべての患者が標準化された処置プロトコルを受けた。経験的な抗生物質治療は、7日間の静脈内セフォタキシム（200 mg/kg/24 h）およびホスホマイシン（200 mg/kg/24 h）で始まり、実証されていない関節炎の場合は、経口のアモキシシリン／クラブラン酸（80 mg/kg/24 h）およびリファンピン（20 mg/kg/24 h）が5週間その後に続いた。実証されたK.キンゲ関節炎の場合、抗生物質投与計画は、同一の長さの時間、アモキシシリン単独（3分画において150 mg/kg/24 h）からなった。ギプス固定は使用しなかった。すべての患者は最低6ヶ月の経過観察を受けた。
【００４２】
統計解析
平均および度数は、マン-ホイットニー（Mann-Whitney）U検定およびChi-2検定を用いて比較した。0.05より低いP値が有意な差異を示すと考えられた。
【００４３】
結果
リアルタイムK.キンゲ特異的PCRの開発
2種類のプライマーペアのうち、Ksm1-Ksm2のみがK.キンゲに高度に特異的であった（表1）。このペアを、4種類のK.キンゲ参照株からおよび本発明者らの臨床的単離株のうち2種類から、部分的なcpn60遺伝子配列を取得するために使用した。本発明者らがいくつかの点変異を含有することを見出した領域を除いて、結果として生じた配列（n=8）(アクセッション番号：EU864312〜EU864316)をその後、プローブを設計するために使用した（図１）。試験株のパネルについてのRT PCRの結果は、従来のPCRの結果と完全に一致した。106コピー〜1コピー数を含有するK.キンゲゲノムDNAの連続希釈物を用いて測定したRT PCR法の検出限界は、200コピー数であった。
【００４４】
人口統計および微生物の特徴
研究期間の間に、1ヶ月〜14歳の年齢の89人の患者（平均：45ヶ月）が、敗血症性関節炎が疑われたために病院で外科手術を受けた。いずれも入院の前の週には抗生物質を受けていなかった。微生物が36（40％）の症例において培養された。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）が最も優勢（19症例、53％）であり、続いてK.キンゲ（7症例、19％）であった。 K.キンゲの単離のための様々な培養法の成績を表2に示す。K.キンゲは末梢血培養では全く単離されなかった。7種類のK.キンゲ単離株のうちいずれもβ-ラクタマーゼを産生せず、かつすべてがアモキシシリン、セフロキシム、セフォタキシム、コトリモキサゾール、シプロフロキサシン、およびリファンピシンに感受性であった。他の病原体は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（4症例、11％）、サルモネラ（Salmonella）属の種（3症例、8.3％）、ならびに各々1症例の非被包性ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）血清型W135、および大腸菌（E. coli）K1であった。
【００４５】
本発明者らの特異的RT PCR法は、K.キンゲ陽性培養を伴うすべての患者において陽性であり、および微生物学的に実証されている関節炎を有するすべての他の患者において陰性であった。53人の培養陰性患者の中で、RT PCRアッセイは24症例（45％）においてK.キンゲを同定した。従って、培養およびRT PCRを合わせると、K.キンゲはS.アウレウス（19/60；32％）を超えて、実証された症例において主要な病原体（31/(36＋24)；52％）であった。RT PCRをまた、K.キンゲ感染との分子診断を有する15人の患者の血液試料由来のDNA抽出物へも適用した（表2）。いずれも陽性ではなかった。RT PCRをまた、9人の患者由来の関節ドレナージ液試料へも適用した。処置開始から48時間後に取得されたすべての9試料が陽性であった。4日後に取得された5試料のうち4試料（80％）が陽性であり、および6日後に取得された4試料のうち3試料（75％）が陽性であった（表2）。
【００４６】
K.キンゲ関節炎を有する患者の臨床的および生物学的なベースライン特性（表3）
S.アウレウス関節炎を有する19人の子供のうちの3人のみ（16％）と比較して、K.キンゲ関節炎を有する31人の子供のうち27人（87％）が24ヶ月未満であった（p＜0.001）。症状は平均で入院3日前に始まった（範囲1〜10 d）。最も頻繁に影響を受けた関節は膝（52％）であり、続いて股関節（26％）であった。患者の3分の1が入院時発熱していなかった。CRPレベルは1症例以外のすべてにおいてわずかに上昇していた。フィブリノーゲンレベルは、試験したすべての患者において上昇していた。対照的に、白血球数は3症例のみにおいて異常であった。関節液のグラム染色は、1症例のみにおいてK.キンゲを示した。関節液は6症例において血液であり、および他においては106,000細胞/mm3の中央値細胞数（範囲、5,900〜3,200,000細胞/mm3）を有して化膿性であった。K.キンゲ関節炎の季節的な分布は以下であった：秋において9症例、冬において7症例、春において13症例、および夏において2症例。
【００４７】
結果
静脈内抗生物質治療の3日後に、CRPは8症例のみにおいて正常であったが、体温はすべての症例において37.5℃未満であった（表3）。7日後には、CRPレベルは試験した30人の患者すべてにおいて正常であった。標準的な処置プロトコルを使用したことから、すべての症例において病院への滞在は7日続いた。骨端線閉鎖（epiphyseal arrest）を含む、いずれの合併症も経過観察の間に報告されなかった。患者のいずれも修正処置を受けなかった。
【００４８】
考察
本研究において、新たなK.キンゲ特異的リアルタイムPCR法を、急性敗血症性関節炎を有して継続的に入院した子供の予想されるシリーズにおいて評価した。本発明者らはまた、最初に、入院時に取得された血液試料および処置の間に取得された関節液も試験した。
【００４９】
蛍光発生性プローブを用いたK.キンゲRT PCRの特異性を、敗血症性関節炎に高い頻度で関与する病原体だけでなく、他のキンゲラ属種、および系統学的に関連する属も試験することにより評価した。本発明者らは、相同のcpn60遺伝子が恐らく、K.キンゲ、K.オラリス（K. oralis）、およびK.デニトリフィカンス（K. denitrificans）により、ならびにアリシエラ（Alyssiela）属の種により共有されることを見出した。しかしながら、1つのプライマーペア（Ksm1-2）がK.キンゲに高度に特異的であった。プローブの設計は、このプライマーペアおよびK.キンゲの6株を用いて取得された単位複製配列の配列に基づき、かつ点変異を有するいくつかの領域の存在を考慮に入れた。本発明者らの方法の特異性をさらに評価するために、本発明者らはまた、最近配列決定された溶血素遺伝子rtxAに基づいた別のプライマーペアも試験した［18］。すべての本発明者らのリアルタイムPCR陽性試料はrtxAについても陽性であり（示していない）、本発明者らのPCR法の高い特異性の証拠を提供した。
【００５０】
疑われた急性敗血症性関節炎の89症例のうち36症例（40％）が培養により実証され、他の研究と一致した割合であった［1〜3］。S.アウレウスが培養により検出された主要な病原体であった（19症例、53％）。K.キンゲは培養陽性症例の19％（7/36）を占め、Yagupskyらにより報告されたもの（22％）［3］と同様であり、およびLuhmannらにより報告されたもの（8％）［1］より高い割合であった。しかしながら、本発明者らがリアルタイムPCR法の結果を追加した際には、実証された関節炎の割合は40％から67％に上昇し、K.キンゲが最も優勢な病原体になった（31症例、52％）。24ヶ月より幼い子供においては、K.キンゲが実証された症例の75％（27/36）を占めた。
【００５１】
本発明者らが知る限りでは、これはK.キンゲ感染症の診断のための特異的PCR法の潜在的な利点を示す2番目の研究である［7］。従来の培養との比較により、本発明者らのPCR法はK.キンゲの検出率を4倍より多く、7から31症例へ増加させた。Chometonらは最近、異なる特異的PCR法の使用がK.キンゲ骨髄炎および関節炎の同定された症例の数を約2倍（17から39へ）増加させ、これらの疾患を有する子供においてK.キンゲを最も優勢な病原体にしたことを報告した［7］。Roseyらは、広範囲のPCR法を用いて、32ヶ月の中央年齢を有する小児科集団において敗血症性関節炎の症例の30％がK.キンゲに起因することを見出した［2］。本明細書において観察された、より高い割合（52％）は、部分的に、特異的PCR法のより良好な感度のためである可能性がある［7］。
【００５２】
幼い乳児の喉にコロニー形成するS.ニューモニエ由来のDNAは血流に入ることができ、結果として、血液からの核酸抽出に対してPCRを用いた場合、この生物に感染の偽陽性診断をもたらし得る［12］。K.キンゲは20％までの幼い乳児の喉にコロニー形成するため、Yagupskyらは、関節液についての陽性のPCR結果は必ずしもK.キンゲの関与を証明しない可能性があることを指摘した［11］。しかしながら、興味深いことに、本発明者らはK.キンゲ関節炎の診断を有する15人の患者の前外科的な血液試料を試験したところ、すべてがPCR陰性であった。これらの結果は、血液試料に対するRT PCRが病原学的診断に寄与しないこと、および関節液のPCR陽性が血液に由来する細菌DNAに起因するものではないことを示す。そのため、本発明者らは、K.キンゲ関節炎の診断に対するRT PCRの有益性が真実であることの証拠をもたらす対照セットを提供したと考える。加えて、K.キンゲ感染症を有する子供より高齢である傾向はあるが、対照セットとしても働く、他の病原体による関節炎を有する患者において、RT PCRは常に陰性であった［11］。
【００５３】
急性K.キンゲ関節炎の31症例の主な人口統計および臨床的特徴は、以前の報告と一致する［6〜9、19〜21］。特に、K.キンゲ感染症を有する患者は幼い傾向にあり（S.アウレウス関節炎についての98ヶ月に対して、平均年齢19.3ヶ月、p＜0.001）、3歳未満の子供における本微生物のより高い罹患率を確認した［6〜9、19〜21］。入院時の臨床的および生物学的徴候は、わずかに上昇した体温、CRP、およびフィブリノーゲン値からなり、高い頻度で軽度であった。フィブリノーゲンは、本発明者らの患者において最も感度の高い炎症のマーカーであり、患者のすべてが異常値を有した。K.キンゲ感染症の頻度は、以前の研究においても述べられているように［7、9、19］、夏に最も低かった（2症例）。再び文献と一致して、本発明者らは、キンゲラ属関節炎が常に1関節であり、および主に下肢に影響を及ぼす（本発明者らのシリーズにおいて27/31症例）ことを見出した［10］。K.キンゲは、予想されたように主に膝に感染し［10］、一方S.アウレウスまたはS.ニューモニエは他のシリーズにおいて主に股関節に感染した［22、23］。実際に本発明者らのシリーズにおいて、S.アウレウスは19のうち9症例において股関節に感染した（示していない）。
【００５４】
Lebelらは、抗生物質治療後に随意の関節の動きおよび末梢白血球増加症が改善した場合は、K.キンゲ関節炎に対する外科的関節切開を延期できたことを示唆した［20］。しかしながら、本発明者らの経験においては系統的な外科手術が好ましいように見える。化膿性関節液の症例においてはすべての本発明者らの患者が外科的関節洗浄を受けた。K.キンゲが単離された際、経口の抗生物質治療は、5週間のアモキシシリン単独（150 mg/kg/24h）からなった。すべての患者が治癒し、かつ6ヶ月続発症も無く、恐らくは外科的管理の重要性、ならびに本細菌の低い病原性およびアモキシシリンへの高い感受性を反映した。
【００５５】
PCRベースの診断の1つの限界は、抗菌剤感受性についての情報を何も提供しないことである。しかしながら、K.キンゲはβ-ラクタム抗生物質に高度に感受性であり：ペニシリンGおよびアモキシシリンの報告されているMIC50値は0.023および0.16 mg/Lである［17、24］。アイスランドにおける3種類を含めて非常にわずかな単離株がβ-ラクタマーゼを産生することが報告されている［25］。従って、本発明者らは、大部分の国においてはPCRにより診断されたK.キンゲ関節炎をアモキシシリンなどのβ-ラクタム薬物で確信的に処置してもよく、静脈内から経口の抗菌治療（antibiotherapy）への容易な切り換えを提供することを確信する。
【００５６】
PCR法の1つの他の利点は、処置開始の数日後または数週間後に病原学的診断をもたらし得ることである［13〜15］。本発明者らの知る限りでは、1つの研究のみが敗血症性関節炎においてこの特性を調査している［16］。広範囲のPCRを種々の細菌による敗血症性関節炎を有する6人の成人由来の連続的な関節液試料に適用した。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ナイセリア・メニンギティス（Neisseria meningitis）、およびペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Peptostreptococcus anaerobius）のDNAが処置開始1週間後に検出された。同様に、本発明者らは、K.キンゲのDNAが処置開始後6日まで関節液において検出され得ることを本明細書において初めて示す。
【００５７】
結論として、本発明者らの新たな高度に特異的なRT PCRは、K.キンゲが子供における関節炎の主要な細菌性の原因であることを確認する。本発明者らは、関節液におけるK.キンゲのDNAが血流を介して鼻咽頭コロニー形成から生じないこと、および、細菌のDNAが処置開始後数日間持続して遡及的診断を可能にすることの強力な証拠を提供する。この高感度の技術は、K.キンゲ関節炎を有する患者について静脈内および経口の抗生物質治療の最適な長さならびに入院を、さらなる研究において決定するために役立つはずである。より一般的な考察において、本発明者らのRT PCRはまた、心内膜炎の診断、本病原体のコロニー形成特徴への知識、および大発生調査にも将来貢献する可能性がある［4］。
【００５８】
参照文献
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【００５９】
（表１）K.キンゲDNA増幅のためのプライマー特異性
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a： +、予想された長さのバンドを伴う陽性増幅； -、バンドが観察されない。
n.s.バンド：（予想されない長さの）非特異的バンド。
【００６０】
（表２）急性キンゲラ・キンゲ関節炎の31の小児科症例の微生物学的診断
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【００６１】
（表３）急性キンゲラ・キンゲ関節炎の31の小児科症例の臨床的および生物学的特徴
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a： WBC；白血球数。
b：異常値の割合（体温≧38℃、CRP＞10 mg/l、WBC  6ヶ月〜2歳の間は＞17000/mm3；4〜6歳の間は＞15000/mm3、フィブリノーゲン＞4 g/l）。
【図１】
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【配列表】
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