(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列の少なくとも80％が反復単位からなり、10〜30個の反復単位を含む、単離された反復タンパク質であって、前記反復単位が、
ペプチド配列PGSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYG(配列番号２の残基51-84)、又は
ペプチド配列SAAAAAAAAGPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSSSYG(配列番号４の残基95-133)、
を含む、前記反復タンパク質。
【請求項２】
前記反復タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２又は４のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離された反復タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された反復タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の単離された核酸を含む、単離された原核又は真核宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された反復タンパク質の製造方法であって、前記タンパク質をコードする単離された核酸を、単離された原核又は真核宿主細胞に導入し、該宿主細胞において前記核酸の発現を誘導することにより該コードされたタンパク質を産生させ、その後該宿主細胞から該タンパク質を単離することを含む、前記方法。
【請求項６】
請求項３に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む、単離された原核又は真核宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な合成反復タンパク質ならびにその製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
WO 2004/104043号には、レジリン(resilin)の反復配列から誘導された合成バイオエラストマーおよびその使用が記載されている。レジリン配列および例えばクモ糸のような他のタンパク質に由来する配列を含むハイブリッド分子も同様に記載されている。
【０００３】
さまざまな反復タンパク質の特性が文献に記載されており、例えば、レジリンはその良好な弾性と高割合で蓄えられた弾性エネルギー（弾力）について知られている (Gosline et al., Philosophical Transactions of the Royal Society of London - Series B: Biological Science, 357(1418): 121:32, 2002)。クモ糸は、とりわけ、その高い引張強さと靭性について知られている (Gosline et al., J Exp Biol., 202(Pt 23): 3295-303 (1999))。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、コンセンサス配列(I)：
X1 X2 X3 X4 S X5 X6 Y G
[式中、
X1はG、Y、AまたはNであり、
X2はG、LまたはQであり、
X3はR、K、TまたはPであり、
X4はP、A、TまたはSであり、
X5はD、TまたはSであり、
X6はS、QまたはTである]、および
コンセンサス配列(II)：
Z1 Z2 (Z3A)nZ4 Z5 Z6
[式中、
Z1はS、Q、N、TまたはGであり、
Z2はアミノ酸の不在またはAであり、
Z3はAまたはGであり、
Z4はアミノ酸の不在、AまたはSであり、
Z5はG、S、Q、NまたはTであり、
Z6はG、P、S、Q、NまたはTであり、
nは2≦n≦12の自然数である]
を含む反復単位を有する反復タンパク質に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】精製したR16およびS16タンパク質の分析。これらのタンパク質の水溶液を調製し、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分画した。タンパク質の検出は、色素クーマシーブリリアントブルーを用いた染色(C)、または双方のタンパク質のアミノ末端に結合したT7ペプチドタグと特異的に結合する抗体を用いるイムノブロット(WB)により行った。
【図２】精製したR16およびS16タンパク質の蛍光スペクトル法による精製度分析。R16およびS16はアミノ酸のトリプトファンを含まないが、チロシンが存在する。対照的に、大腸菌のタンパク質には平均1.5％の頻度でトリプトファンが存在する。蛍光スペクトル法はタンパク質サンプル中のトリプトファンの存在を、それゆえにR16またはS16調製物の汚染を、選択的に検出することができる。チロシンとトリプトファンはどちらも波長280nmの光（青色）により励起されるが、295nmの光（マゼンタ色）はもっぱらトリプトファンを励起する。R16およびS16サンプルはチロシンに特有の蛍光を示すのに対して、トリプトファン存在の兆候が一切検出できない。このことは、本タンパク質サンプルの純度が高いことを示している。
【図３】R16マイクロビーズ。6M GdmSCN中に溶解したR16タンパク質の10mg/ml溶液を1M リン酸カリウム溶液pH7.0に対して透析することによりマイクロビーズを取得し、走査型電子顕微鏡を用いて検査した。
【図４】S16マイクロビーズ。6M GdmSCN中に溶解したS16タンパク質の10mg/ml溶液を1M リン酸カリウム溶液pH7.0に対して透析することによりマイクロビーズを取得し、走査型電子顕微鏡を用いて検査した。
【図５】S16マイクロビーズの安定化。S16タンパク質の10mg/ml水溶液をt＝0の時点に1/4倍容の硫酸アンモニウムを加えて沈殿させた。定めた時点に一部を取り出して4M尿素の濃度を確立し、600nmでの吸光を散乱の（それゆえに、安定したタンパク質粒子の存在の）定性的尺度として測定した。
【図６】0.8％のβ-カロテンを含むR16マイクロビーズ。6M GdmSCN中の10mg/ml R16および0.08mg/ml β-カロテンに4M硫酸アンモニウム溶液を加えてマイクロビーズを取得し、走査型電子顕微鏡を用いて検査した。
【図７】0.8％のβ-カロテンを含むS16マイクロビーズ。6M GdmSCN中の10mg/ml S16および0.08mg/ml β-カロテンに4M硫酸アンモニウム溶液を加えてマイクロビーズを取得し、走査型電子顕微鏡を用いて検査した。
【図８】R16マイクロビーズの吸水性。湿度100％でのR16マイクロビーズの重量増加として水の吸収を測定した。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の反復タンパク質は、それらのアミノ酸配列の少なくとも60％、好ましくは少なくとも80％が反復単位からなることを特徴とする。
【０００７】
反復単位は、長さが7〜100、好ましくは12〜60、特に好ましくは15〜40アミノ酸のアミノ酸配列であって、同一の配列として、または70％、好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％の同一性を有する変異体として、タンパク質中に数回現れるアミノ酸配列である。本発明に係る反復タンパク質は、単一のまたは複数の異なるアミノ酸配列の同じコピーまたは変異体を含みうる。
【０００８】
反復単位同士は、好ましくは1〜30アミノ酸、特に好ましくは1〜20アミノ酸からなるリンカーを介して、連結することができる。リンカーのアミノ酸配列は、他のタンパク質（好ましくは、構造タンパク質）に由来するものでもよいし、天然のモデルがないものまたは完全に存在しないものでもよい。
【０００９】
反復単位の数はいくつでも、好ましくは1〜100、特に好ましくは10〜65、最も好ましくは15〜35を、一緒に連結することができる。
【００１０】
本明細書中で用いる「コンセンサス配列」とは、あるアミノ酸が特定の位置に頻繁に現れるが、その他のアミノ酸はいかなる細部も定義されることなく、常用されるアミノ酸の一文字表記に代わるプレースホルダーXで置き換えられたアミノ酸配列をさす。本明細書中で用いるアミノ酸の一文字表記は当業者によく知られている。
【００１１】
一実施形態では、反復タンパク質の60％、好ましくは少なくとも80％の反復単位において、コンセンサス配列(I)の数とコンセンサス配列(II)の数の比は5未満で2より大である。
【００１２】
一実施形態では、反復タンパク質の60％、好ましくは少なくとも80％の反復単位において、コンセンサス配列(I)の数とコンセンサス配列(II)の数の比は2または2未満で1より大であり、好ましくは2である。
【００１３】
一実施形態では、反復タンパク質の60％、好ましくは少なくとも80％の反復単位において、コンセンサス配列(I)の数とコンセンサス配列(II)の数の比は1または1未満であり、好ましくは1である。
【００１４】
ある発展的実施形態では、反復タンパク質の60％、好ましくは少なくとも80％の反復単位が部分配列GGRPSDTYGまたはGGRPSSSYGを含む。
【００１５】
一実施形態では、本発明に係るタンパク質の少なくとも60％、好ましくは少なくとも80％の反復単位が配列モチーフAnまたは(GA)mを含んでなり、ここで、A＝アラニン、G＝グリシン、n＝2〜12、m＝2〜10、好ましくはn＝5〜10、m＝4〜8、特に好ましくはn＝7〜9、m＝6〜7である。
【００１６】
更なる実施形態において、反復タンパク質は次の反復単位を含む：
PGSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYGまたは
SAAAAAAAAGPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSSSYG。
【００１７】
更なる実施形態において、本発明の反復タンパク質は、アミノ末端またはカルボキシ末端に、長さが4〜30、特に好ましくは5〜15アミノ酸のペプチド配列を含み、このペプチド配列はイムノブロット法による該タンパク質の検出のために、またはアフィニティークロマトグラフィーによる該タンパク質の精製のために用いられる。そのようなペプチド配列の非限定的な例としては、6×Hisタグ(HHHHHH)、T7タグ(MASMTGGQQMG)、Sタグ(KETAAAKFERQHMDS)、c-Mycタグ(EQKLISEEDL)、Strepタグ(WSHPQFEK)、およびHAタグ(YPYDVPDYA)がある (Terpe, Appl Microbiol Biotechnol, 60(5): 523-33 (2003))。本発明のタンパク質と追加のペプチド配列の間に、そのペプチド配列を化学的または酵素的に除去することを可能にするアミノ酸配列を挿入してもよい。
【００１８】
更なる発展的実施形態において、反復タンパク質のアミノ酸配列は配列番号2の配列またはその配列の一部に相当する。
【００１９】
更なる発展的実施形態において、反復タンパク質のアミノ酸配列は配列番号4の配列またはその配列の一部に相当する。
【００２０】
本発明に係る反復タンパク質は驚くべき新しい性質を備えている。そうした新しい性質は、例えば、タンパク質水溶液の安定性および集合（アセンブリング）特性に関係する。さらに、新規な反復タンパク質は化粧用または皮膚用組成物に有利な特性を付与し、特に水和作用または軟化作用を改善できることが見い出された。その上に、新規反復タンパク質は良好なフィルム形成剤のような作用があり、特に低い表面密度を有する。
【００２１】
したがって、本発明はまた、化粧品における、ヒトおよび動物の栄養摂取における、物質の製剤化のための、紙、皮革および繊維のリファイニングのための、ならびに表面コーティングのための、単量体型または集合型の新規反復タンパク質の使用に関する。
【００２２】
反復タンパク質は、本発明の構造体が得られるように分子生物学的に改変された天然の遺伝子配列を発現させることにより、製造することができる。天然遺伝子配列を単離および改変する方法は当業者によく知られている。
【００２３】
反復タンパク質は、好ましくは、合成的に作製した遺伝子配列を発現させることにより製造される。合成遺伝子配列を作製するための1つの可能性が、Huemmerich et al., Biochemistry, 43(42):13604-12, (2004)に記載されている。
【００２４】
本発明はさらに、上記のタンパク質をコードする核酸配列に関する。好ましい核酸配列は配列番号1および配列番号3の配列である。
【００２５】
本発明はさらに、上記の核酸配列を含む発現ベクターに関する。発現ベクターとは、一般的に、宿主生物に導入可能であって、そこで所望のヌクレオチド配列を発現させる遺伝要素をさす。発現ベクターの例としては、プラスミド、ファージまたはウイルスがある。発現ベクターは、プロモーターやエンハンサーといった調節エレメント、対応するコードヌクレオチド配列、転写イニシエーターおよび転写ターミネーター、ならびにベクターの複製を可能にするエレメントを含むことが好ましい。
【００２６】
タンパク質のための発現系はよく知られており、Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour (2001)に記載されている。原核発現生物の非限定的な例は、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)などである。真核発現生物の非限定的な例は、酵母、例えば出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)など、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)など、哺乳動物細胞、例えばHeLa細胞、COS細胞、CHO細胞など、昆虫細胞、例えばSf9細胞、MEL細胞など、植物または植物細胞、例えばジャガイモ(Solanum tuberosum)、ニコチアナ(Nicotiana：タバコ属)などである。
【００２７】
本発明はさらに、反復タンパク質を集合（アセンブリング）させてタンパク質のマイクロビーズ、ナノフィブリル、ゲルおよびフィルムを形成することに関する。
【００２８】
タンパク質マイクロビーズは、好ましくは下記の方法により製造することができる：
反復タンパク質を第1の溶媒に溶解する。使用可能な溶媒の例は塩の水溶液である。特に好適なものは、濃度が2モル以上、好ましくは4モル以上、特に好ましくは5モル以上の高濃度の塩溶液であって、そのイオンがナトリウムイオンおよび塩化物イオンよりも顕著なカオトロピック特性を有するものである。この種の塩溶液の例は、6Mチオシアン酸グアニジニウムまたは9M臭化リチウムである。さらにまた、反復タンパク質を溶解するために有機溶媒を用いることもできる。特に好適なものは、フッ素化アルコールまたは環式炭化水素である。それらの例としてヘキサフルオロイソプロパノールおよびシクロヘキサンがある。上記の溶媒中でタンパク質マイクロビーズを製造することが可能である。あるいはまた、この溶媒を別の溶媒と、例えば低濃度の塩溶液（c＜0.5M）と、透析または希釈によって取り替えてもよい。溶解したタンパク質の最終濃度は0.1〜100mg/mlの範囲にすべきである。この方法の実施温度は通常0〜80℃、好ましくは5〜50℃、特に好ましくは10〜40℃である。
【００２９】
水溶液を用いる場合は、バッファー、好ましくはpH4〜10、さらに好ましくはpH5〜9、特に好ましくはpH6〜8.5のバッファーをその溶液にさらに添加することができる。
【００３０】
ある種の添加剤を加えると相分離が起こり、溶媒と添加剤の混合液中に乳化されたタンパク質に富む相が生じる。表面効果のため、その乳化されたタンパク質に富む小滴は丸い形状となる。タンパク質マイクロビーズの平均直径は、溶媒、添加剤およびタンパク質濃度の選択の結果として、0.1μm〜50μmの値に設定することができる。
【００３１】
使用できる添加剤は、まず初めに第1の溶媒と混和性であり、次にタンパク質に富んだ相の形成を誘導する物質であれば、どのような物質でもよい。マイクロビーズを有機溶媒中で形成させる場合は、その溶媒より低い極性の有機物質（例えばトルエン）がそれに適している。水溶液の場合には、塩のイオンがナトリウムイオンおよび塩化物イオンよりも顕著なコスモトロピック特性を有する塩類（例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム）を添加剤として用いることができる。添加剤の最終濃度は、添加剤の種類に応じて、タンパク質溶液に基づき1〜50重量％の範囲にすべきである。
【００３２】
タンパク質に富む小滴を硬化処理により固定すると、丸い形状が保たれる。ここでの固定は強い分子間相互作用の形成に基づく。相互作用のタイプは非共有結合（例えば、分子間βシート結晶の形成による）であっても、共有結合（例えば、化学的架橋による）であってもよい。硬化は添加剤により、および/または適当な別の物質の添加により実施することができる。硬化温度は0〜80℃、好ましくは5〜60℃の範囲である。
【００３３】
上記の別の物質は化学的架橋剤でありうる。ここで化学的架橋剤とは、少なくとも2個の化学反応性基がリンカーを介して互いに連結されている分子を意味する。その例としては、スルフヒドリル反応性基（例えば、マレイミド、ピリジルジスルフィド、α-ハロアセチル、ビニルスルホン、スルファトアルキルスルホン、好ましくはスルファトエチルスルホン）、アミン反応性基（例えば、スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、PFPエステル、アルデヒド、イソチオシアネートなど）、カルボキシ反応性基（例えば、アミンなど）、ヒドロキシル反応性基（例えば、イソシアネートなど）、非選択的基（例えば、アリールアジドなど）、および光活性化基（例えば、ペルフルオロフェニルアジドなど）がある。これらの反応性基はタンパク質に存在するアミン、チオール、カルボキシルまたはヒドロキシル基と共有結合による架橋を形成することができる。
【００３４】
マイクロビーズはまた、アミノ酸残基間に共有結合を形成する物質を用いることによって硬化させることも可能である。その例は、ペルオキソ二硫酸アンモニウムとトリス(2,2'-ビピリジル)ジクロロルテニウム(II)の組合せであり、これは可視光線の影響下でジチロシンの形成を媒介する。
【００３５】
安定化させたマイクロビーズは、適当な別の溶媒（例えば、水）で洗浄し、その後当業者によく知られた方法（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）により乾燥する。ビーズ形成の成功を走査型電子顕微鏡検査法によって評価する。
【００３６】
マイクロビーズの製造プロセスは、疎水性の活性化合物を閉じ込めて、それによりマイクロビーズへと製剤化することを可能にする。この方法は2段階からなる。第1段階では、疎水性の活性化合物と反復タンパク質を共有の相に溶解する。そのために、活性化合物と反復タンパク質を溶媒または混合溶媒に直接溶解してもよい。あるいはまた、活性化合物と反復タンパク質を最初に別々の異なる溶媒に溶解してから、それらの溶媒を一緒に混合してもよく、この場合も先と同様に共有の相を生じる。共有の相は分子分散相であっても、コロイド分散相であってもよい。
【００３７】
疎水性の活性化合物と反復タンパク質を共有の溶媒または混合溶媒に溶解できない場合は、疎水性の活性化合物と反復タンパク質を各種溶媒に溶解し、その後これら2つの溶液を混合することが特に有利である。このように、適当な溶媒に溶解しておいた活性化合物を、その活性化合物が溶解しない別の溶媒に加えて希釈することにより、疎水性活性化合物のコロイド分散溶液をこの手順で調製することも可能である。
【００３８】
タンパク質は一般に水への良好な溶解性を示すため、水溶液または水と水混和性有機溶媒との混合物を用いて実施することが好ましい。適当な水混和性溶媒の例は、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）、フッ素化アルコール（例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール、トリフルオロエタノール）、アルカノン（例えば、アセトン）、さらにスルホキシド（例えば、ジメチルスルホキシド）、ホルムアミド（例えば、ジメチルホルムアミド）、または他の有機溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、N-メチル-2-ピロリドン）である。一般的に、本発明に係るタンパク質を溶解可能であれば、どのような溶媒または混合溶媒を用いても実施することができる。適当な溶媒の例は、フッ素化アルコール（例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール、トリフルオロエタノール）、イオン性液体（例えば、EMIMアセテート）、カオトロピック塩（例えば、尿素、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム）の水溶液、または有機酸（例えば、ギ酸）、さらにこれらの溶媒と他の有機溶媒との混合物である。タンパク質を溶解する溶媒と混合可能な溶媒の例は、とりわけ、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）、アルカノン（例えば、アセトン）、スルホキシド（例えば、ジメチルスルホキシド）、ホルムアミド（例えば、ジメチルホルムアミド）、ハロアルカン（例えば、塩化メチレン）、または他の有機溶媒（例えば、テトラヒドロフラン）である。
【００３９】
第2段階では、共有の活性化合物-タンパク質溶液中で、相分離とその後のマイクロビーズの硬化を誘導する。この方法は、純粋なタンパク質マイクロビーズの製造について先に記載した方法と同じ原理により実施される。マイクロビーズの形成中に、疎水性の活性化合物は本発明に係る反復タンパク質と相互作用する。
【００４０】
疎水性活性化合物と反復タンパク質との相互作用は本質的にそれらの疎水性の性質によるものであるが、水素結合による架橋、イオン相互作用およびファンデルワールス相互作用が関与する可能性もある。疎水性の活性化合物はマイクロビーズの表面に結合したり、内部に閉じ込められたり、あるいはその両方でマイクロビーズに保持されると考えられる。疎水性活性化合物のマイクロビーズへの結合は、集合（アセンブリング）ミックス中に溶解している活性化合物の枯渇として確認することができる。活性化合物の濃度はその性質の定量分析により測定可能である。こうして、例えば、光吸収性の活性化合物の結合は光度測定法により分析しうる。そのために、例えば、マイクロビーズの染色、あるいは製剤化ミックスのタンパク質と活性化合物が枯渇した相の脱染色を、着色活性化合物の吸収を測定することにより確認する。マイクロビーズに含まれる活性化合物の割合もこれらの方法を用いて測定することができる。
【００４１】
活性化合物は、適当な溶媒への脱着により、またはプロテアーゼによるマイクロビーズの分解により、または適当な溶媒を用いたマイクロビーズの溶解により、マイクロビーズから遊離させることができる。脱着に適する溶媒は、活性化合物を溶解できるものであれば、どのような溶媒または混合溶媒でもよい。適当なプロテアーゼは、タンパク質マイクロビーズの懸濁液に工業用プロテアーゼとして特別に添加してもよいし、あるいは、例えば皮膚のプロテアーゼ、胃腸管のプロテアーゼ（例えば、胃や腸のプロテアーゼ）、または微生物が放出するプロテアーゼのように、エフェクター分子の所望の作用部位にもともと存在するものでもよい。マイクロビーズを溶解できる溶媒は、例えば、フッ素化アルコール（例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール、トリフルオロエタノール）、イオン性液体（例えば、EMIMアセテート）、カオトロピック塩（例えば、尿素、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム）の水溶液、または有機酸（例えば、ギ酸）、さらにこれらの溶媒と他の有機溶媒との混合物である。エフェクター分子の遊離速度および動態は、例えば、活性化合物の占有密度およびマイクロビーズの大きさまたはそれらの体積対表面積比により、制御することができる。
【００４２】
適当な条件のもとで、本発明に係る反復タンパク質からナノフィブリルを製造することができる。ナノフィブリルの形成は、ナノフィブリル濃度が1mg/mlに等しいかまたはそれより高いタンパク質水溶液のゲル様濃厚化として肉眼的レベルで自ずと明らかである。
【００４３】
タンパク質ナノフィブリルへと集合させるための出発点は、タンパク質濃度が0.1〜400mg/ml、好ましくは1〜100mg/ml、特に好ましくは5〜20mg/mlの反復タンパク質の水溶液である。この水溶液に、バッファー、好ましくはpH4〜10、さらに好ましくはpH5〜9、特に好ましくはpH6〜8.5の範囲のバッファーを添加混合してもよい。集合（アセンブリング）プロセスは数週間以内に自然に起こる。溶液の極性を低下させる水溶解性の有機溶媒を添加することにより、このプロセスを加速することが可能である。それらの例はエタノールやメタノールのようなアルコールである。この溶媒の最終濃度はタンパク質溶液に基づき1〜50重量％の範囲にすべきである。
【００４４】
集合したタンパク質ナノフィブリルは適当な溶媒（例えば、水）を用いて洗浄し、その後当業者によく知られた方法により、例えば凍結乾燥、接触乾燥または噴霧乾燥により、乾燥する。繊維形成の成功を透過型電子顕微鏡または走査型力顕微鏡法により検査する。
【００４５】
適当な条件のもとで、本発明に係る反復タンパク質からフィルムを製造することができる。そのために、反復タンパク質を第1の溶媒に溶解する。使用できる溶媒の例は塩の水溶液である。特に好適なものは、濃度が2モル以上、好ましくは4モル以上、特に好ましくは5モル以上の高濃度の塩溶液であって、そのイオンがナトリウムイオンおよび塩化物イオンよりも顕著なカオトロピック特性を有するものである。この種の塩溶液の例は、6Mチオシアン酸グアニジニウムまたは9M臭化リチウムである。さらにまた、反復タンパク質を溶解するために有機溶媒を用いてもよい。フッ素化アルコールまたは環式炭化水素が特に適している。それらの例としてヘキサフルオロイソプロパノールおよびシクロヘキサンがある。第1の溶媒が不揮発性物質をまったく含まない限り、その第1溶媒中でフィルムを製造することができる。不揮発性成分を含む溶媒は、不揮発性物質を一切含まない別の溶媒と、例えば透析により、置き換える必要がある。フィルムを形成するのに好適な揮発性溶媒はヘキサフルオロイソプロパノール、シクロヘキサン、ギ酸および水である。溶解タンパク質の最終濃度は1〜200mg/ml、好ましくは20〜150mg/ml、特に好ましくは50〜100mg/mlの範囲にすべきである。この方法の実施温度は通常0〜80℃、好ましくは5〜50℃、特に好ましくは10〜40℃である。揮発性溶媒中に溶解した反復タンパク質を滑らかな表面上に薄く広げる。溶媒を室温で蒸発させると、あとにタンパク質フィルムが残る。
【００４６】
新しく製造したタンパク質フィルムは通常水溶性である。フィルムは、それらの内部に安定した二次、三次および四次構造を形成させる物質と共にフィルムをインキュベートすることで安定化することができる。そうした物質の例は、例えばメタノールやエタノールのようなアルコール、または例えば硫酸アンモニウムやリン酸カリウムのような塩（そのイオンがナトリウムイオンおよび塩化物イオンよりも顕著なコスモトロピック特性を有するもの）の溶液である。フィルムを安定化した後、アルコールまたは水などの適当な溶媒でフィルムを洗浄し、その後乾燥することができる。
【００４７】
本発明はさらに、本発明に係る反復タンパク質とエフェクター分子の結合体からなる分子に関する。エフェクター分子とは、特定の予測可能な作用を有する分子を意味する。それらは酵素のようなタンパク質様分子であってもよいし、あるいは染料、光安定剤、ビタミン、プロビタミン、酸化防止剤、脂肪酸、調節物質（conditioner）または金属イオン含有化合物のような非タンパク質性（non-proteinogenic）分子であってもよい。
【００４８】
エフェクター分子は反復タンパク質に結合される。エフェクター分子とタンパク質の間の結合は共有結合だけでなく、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用もしくは疎水性相互作用、水素結合または吸着に基づく結合であってもよい。
【００４９】
エフェクター分子は、反復タンパク質のポリペプチド配列の側鎖を介して、特にアミノ官能基、ヒドロキシ官能基、カルボキシ官能基またはチオール官能基を介して、共有結合により連結することができる。好ましい連結は、1個以上のリシン残基のアミノ官能基、1個以上のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基のカルボキシ官能基、1個以上のシステイン残基のチオール官能基、または反復タンパク質のN-末端もしくはC-末端官能基を介した連結である。反復タンパク質のアミノ酸配列中に存在するアミノ酸官能基のほかに、適当な官能基をもつアミノ酸（例えば、システイン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸）を該配列に付加または挿入することが可能であり、また、そのような官能基のアミノ酸を反復タンパク質のアミノ酸の代わりに用いることも可能である。
【００５０】
エフェクター分子は反復タンパク質に直接的に、すなわち、すでに存在する2つの化学官能基の共有結合によって、連結することができる。それを行うには、反復タンパク質の上記の化学官能基をエフェクター分子に存在する反応性基に連結することが必要である。そのような反応性基の例としては、スルフヒドリル反応性基（例えば、マレイミド、ピリジルジスルフィド、α-ハロアセチル、ビニルスルホン、スルファトアルキルスルホン、好ましくはスルファトエチルスルホン）、アミン反応性基（例えば、スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、PFPエステル、アルデヒド、イソチオシアネートなど）、カルボキシ反応性基（例えば、アミンなど）、ヒドロキシル反応性基（例えば、イソシアネートなど）、非選択的基（例えば、アリールアジドなど）、および光活性化基（例えば、ペルフルオロフェニルアジドなど）がある。
【００５１】
本発明に係る反復タンパク質とエフェクター分子の連結すべき官能基の反応性が、直接連結させるには低すぎる場合、その官能基を当業者によく知られた方法で活性化することができる（例えば、カルボジイミドによるカルボキシル官能基の活性化）。
【００５２】
また一方、連結は「リンカー」を介して、すなわち、1個以上の官能基をもつエフェクター分子と結合しかつ1個以上の異なる官能基をもつ反復タンパク質に連結される少なくとも二官能性の分子を介して、行うこともできる。そのようなオーダーメードリンカーを使用すると、連結を希望のエフェクター分子に正確に適合させることが可能となる。さらに、そうすることにより、反復タンパク質に複数のエフェクター分子を一定の方法で連結することも可能となる。
【００５３】
用いるリンカーは連結しようとする官能基によって異なる。適当な例は、スルフヒドリル反応性基（例えば、マレイミド、ピリジルジスルフィド、α-ハロアセチル、ビニルスルホン、スルファトアルキルスルホン、好ましくはスルファトエチルスルホン）、アミン反応性基（例えば、スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、PFPエステル、アルデヒド、イソチオシアネートなど）、カルボキシ反応性基（例えば、アミンなど）、ヒドロキシル反応性基（例えば、イソシアネートなど）、非選択的基（例えば、アリールアジドなど）、および光活性化基（例えば、ペルフルオロフェニルアジドなど）によって反復タンパク質と結合し、かつ
-  スルフヒドリル反応性基（例えば、マレイミド、ピリジルジスルフィド、α-ハロアセチル、ビニルスルホン、スルファトアルキルスルホン、好ましくはスルファトエチルスルホン）、
-  アミン反応性基（例えば、スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、PFPエステル、アルデヒド、イソチオシアネートなど）、
-  糖または酸化糖反応性基（例えば、ヒドラジドなど）
-  カルボキシ反応性基（例えば、アミンなど）
-  ヒドロキシル反応性基（例えば、イソシアネートなど）
-  チミン反応性基（例えば、プソラレンなど）
-  非選択的基（例えば、アリールアジドなど）
-  光活性化基（例えば、ペルフルオロフェニルアジドなど）
-  金属錯体形成基（例えば、EDTA、ヘキサHis、フェリチン）
-  抗体および抗体フラグメント（例えば、一本鎖抗体、抗体のF(ab)フラグメント、触媒抗体）
によってエフェクター分子に連結される分子である。
【００５４】
リンカーの化学官能基はスペーサー要素によって連結されてもよい。スペーサー要素は例えばアルキル鎖、エチレングリコールまたはポリエチレングリコールで構成されうる。
【００５５】
特に好ましいリンカー要素および/またはスペーサー要素は、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼのための潜在的切断部位をもつもの、すなわち酵素的に切断可能なものである。
【００５６】
本発明の分子に使用できる酵素的に切断可能なリンカーの例は、例えば、WO 98/01406号（その全体を参考として本明細書に組み入れる）に記載されている。
【００５７】
特に好ましいリンカーおよびスペーサーは、熱切断可能または光切断可能なものである。これらに相当する化学構造は当業者に公知であり、本発明に係る分子のエフェクター分子成分と反復タンパク質成分の間に組み込まれる。
【００５８】
エフェクター分子がポリペプチド配列からなる場合は、エフェクター分子と反復タンパク質を「融合」タンパク質として連結することができ、すなわち、エフェクターサブ配列と反復タンパク質サブ配列からなる連続ポリペプチド配列が用いられる。
【００５９】
エフェクター分子と反復タンパク質の間に、この場合も「スペーサー要素」を組み込むことが可能であり、このスペーサー要素は、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼのための潜在的切断部位を有するポリペプチド配列であったり、または融合タンパク質の精製を容易にするオリゴ-もしくはポリペプチド配列（例えば「His」タグ、すなわちオリゴヒスチジン残基）であったりする。
【００６０】
反復タンパク質に共有結合または非共有結合で連結されたエフェクター分子はその結合形態のままで活性でありうる。あるいはまた、反復タンパク質に連結されたエフェクター分子をその反復タンパク質から遊離させることもできる。
【００６１】
共有結合で連結されたエフェクター分子は、特別に導入された切断可能なスペーサーまたは連結リンカー（例えば、熱、光もしくは酵素により切断可能）を切断することにより、あるいはタンパク質分解（例えば、プロテアーゼによる）により、反復タンパク質から遊離させることができる。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）コンセンサス配列(I)：
X1 X2 X3 X4 S X5 X6 Y G
[式中、
X1はG、Y、AまたはNであり、
X2はG、LまたはQであり、
X3はR、K、TまたはPであり、
X4はP、A、TまたはSであり、
X5はD、TまたはSであり、
X6はS、QまたはTである]、および
コンセンサス配列(II)：
Z1 Z2 (Z3A)nZ4 Z5 Z6
[式中、
Z1はS、Q、N、TまたはGであり、
Z2はアミノ酸の不在またはAであり、
Z3はAまたはGであり、
Z4はアミノ酸の不在、AまたはSであり、
Z5はG、S、Q、NまたはTであり、
Z6はG、P、S、Q、NまたはTであり、
nは2≦n≦12の自然数である]
を含む反復単位を有する反復タンパク質。
（２）10〜30の反復単位を含む、（１）に記載の反復タンパク質。
（３）反復単位：PGSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYGを含む、（１）に記載の反復タンパク質。
（４）反復単位：SAAAAAAAAGPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSSSYGを含む、（１）に記載の反復タンパク質。
（５）前記タンパク質が配列番号２または４のアミノ酸配列を含む、（１）に記載の反復タンパク質。
（６）（１）〜（５）のいずれか１に記載の反復タンパク質をコードする核酸配列。
（７）（６）に記載の核酸配列を含む宿主生物。
（８）（１）〜（５）のいずれか１に記載の反復タンパク質の製造方法であって、（７）に記載の宿主生物により該タンパク質を産生させ、その後単離することを含む、上記方法。
（９）化粧品における（１）〜（５）のいずれか１に記載の反復タンパク質の使用。
（１０）活性化合物およびエフェクターを製剤化するための（１）〜（５）のいずれか１に記載の反復タンパク質の使用。
（１１）紙、皮革および繊維をリファイニングするための（１）〜（５）のいずれか１に記載の反復タンパク質の使用。
（１２）表面コーティングのための（１）〜（５）のいずれか１に記載の反復タンパク質の使用。
（１３）ヒトおよび動物の栄養摂取における（１）〜（５）のいずれか１に記載の反復タンパク質の使用。
【００６２】
［実験の部］
【実施例１】
【００６３】
反復タンパク質R16（配列番号2）の製造
反復タンパク質R16をコードする合成遺伝子は、Huemmerich et al., Biochemistry 43(42): 13604-12, (2004)に記載の方法に従って、合成オリゴヌクレオチドR：
ggcccgggttctagcgcggctgcagccgcggcagctgcgtccggcccgggtcagggccagggtcagggtcaaggccagggtggccgtccttctgacacctac
の多量体化によって16merの多量体を形成し、発現ベクターpET21a（Novagen社）にクローニングした。大腸菌BLR [DE3]株（Novagen社）において発現を行った。
【００６４】
増殖およびタンパク質合成は、pO2＞20％、pH＝6.8で流加培養法により実施した。
【００６５】
培地：
水                                        8リットル
酵母エキス                                230g
バクトトリプトン(Bacto tryptone)          150g
グリセロール(99％)                        30g
リン酸二水素カリウム(KH2PO4)               20g
硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)                50g
硫酸マグネシウム7水和物(MgSO4・7H2O)      10.5g
塩化カルシウム2水和物(CaCl2・2H2O)        1.0g
微量塩溶液                                100ml
水を加えて9.7リットルにフィルアップする
濃度25％のNaOHを加えてpHを6.8に調整する
Tego KS 911 (消泡剤；Goldschmidt社製品)   3ml
アンピシリン                               1g
【００６６】
微量塩溶液：
水                      5リットル
クエン酸1水和物         200.00g
ZnSO4・7H2O              55.00g
(NH4)2Fe(SO4)2・6H2O      42.50g
MnSO4・H2O               15.00g
CuSO4・5H2O              4.00g
CoSO4・7H2O              1.25g
【００６７】
供給溶液：
水                         800g
クエン酸1水和物           30g
硫酸ナトリウム(Na2SO4)      60g
(NH4)2Fe(SO4)2・6H2O         4.5g
グリセロール99.5％         3400g
【００６８】
基本培地中のグリセロールがすべて使い尽くされた後に、一定の供給を100ml/hの流速で開始した。
【００６９】
タンパク質の合成を誘導するために、細菌培養液がOD600＝40の光学密度に達した後で、1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを添加した。この時点で、培養液の温度を37℃から32℃へと低下させた。誘導後7時間で細胞を回収した。
【００７０】
タンパク質を次のプロトコールに従って精製した：
-  湿潤バイオマス1gにつき5mlの20mM MOPS (3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸) pH7.0中に細胞ペレットを再懸濁する；
-  高圧ホモジナイザーに入れて1400バールで溶菌する；
-  5000×gで30分遠心する；
-  湿潤バイオマス1gにつき5mlの50mM Tris/HCl pH8.0、100mM NaCl、0.5mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.1％トリトンX-100を用いてペレットを洗浄する；
-  湿潤バイオマス1gにつき5mlの50mM Tris/HCl pH8.0、100mM NaCl、0.5mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を用いてペレットを洗浄する；
-  ペレット1gにつき1.6gのチオシアン酸グアニジニウム(GdmSCN)を加えることによりペレットを溶解する（最終濃度：6M GdmSCN）；
-  5000×gで60分遠心する；
-  5mM リン酸カリウム pH7.0に対して上清を透析する；
-  5000×gで30分遠心する；
-  1/4倍容の4M 硫酸アンモニウムを加えることにより室温で1時間にわたり上清からタンパク質を沈殿させる；
-  ペレットを8M 尿素で洗浄する；
-  ペレットを水で2回洗浄する；
-  凍結乾燥する；
-  凍結乾燥したタンパク質は−20℃で保存可能である；
-  タンパク質を利用する際には、凍結乾燥したタンパク質を6M GdmSCNに取り上げ、5mM リン酸カリウム pH7.0に対して透析する；
-  溶液中のタンパク質含有量を光度測定法(E(280;1mg/ml)＝0.42)により測定した；
-  タンパク質の純度をSDS PAGEとウェスタンブロット分析（図1）により、また、蛍光スペクトル法（図2）により調べた。
【００７１】
10リットルの発酵から20gの純粋なR16タンパク質（純度＞95％）が回収された。
【実施例２】
【００７２】
反復タンパク質S16（配列番号4）の製造
反復タンパク質S16をコードする合成遺伝子は、Huemmerich et al., Biochemistry 43(42): 13604-12, (2004)に記載の方法に従って、合成オリゴヌクレオチドS：
ggttctgcggctgcagccgcggcagctgcgggtccgggcggtggcaacggtggccgtccgtctgacacctacggtgcgccgggtggcggtaacggtggccgtccttcttcctcttac
の多量体化によって16merの多量体を形成し、発現ベクターpET21a（Novagen社）にクローニングした。大腸菌BLR [DE3]株（Novagen社）において発現を行った。
【００７３】
増殖およびタンパク質合成は、pO2＞20％、pH＝6.8で流加培養法により実施した。
【００７４】
培地：
水                                        8リットル
酵母エキス                                230g
バクトトリプトン(Bacto tryptone)          150g
グリセロール(99％)                        30g
リン酸二水素カリウム(KH2PO4)               20g
硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)                50g
硫酸マグネシウム7水和物(MgSO4・7H2O)      10.5g
塩化カルシウム2水和物(CaCl2・2H2O)        1.0g
微量塩溶液                                100ml
水を加えて9.7リットルにフィルアップする
濃度25％のNaOHを加えてpHを6.8に調整する
Tego KS 911 (消泡剤；Goldschmidt社製品)   3ml
アンピシリン                               1g
【００７５】
微量塩溶液：
水                       5リットル
クエン酸1水和物         200.00g
ZnSO4・7H2O              55.00g
(NH4)2Fe(SO4)2・6H2O      42.50g
MnSO4・H2O               15.00g
CuSO4・5H2O              4.00g
CoSO4・7H2O              1.25g
【００７６】
供給溶液：
水                         800g
クエン酸1水和物           30g
硫酸ナトリウム(Na2SO4)      60g
(NH4)2Fe(SO4)2・6H2O         4.5g
グリセロール99.5％         3400g
【００７７】
基本培地中のグリセロールがすべて使い尽くされた後に、一定の供給を100ml/hの流速で開始した。
【００７８】
タンパク質の合成を誘導するために、細菌培養液がOD600＝40の光学密度に達した後で、1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを添加した。この時点で、培養液の温度を37℃から25℃へと低下させた。誘導後4時間で細胞を回収した。
【００７９】
タンパク質を次のプロトコールに従って精製した：
-  湿潤バイオマス1gにつき5mlの20mM MOPS (3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸) pH7.0中に細胞ペレットを再懸濁する；
-  高圧ホモジナイザーに入れて1400バールで溶菌する；
-  5000×gで30分遠心する；
-  上清を80℃で20分インキュベートする；
-  5000×gで30分遠心する；
-  1倍容の4M 硫酸アンモニウムを加えることにより室温で1時間にわたり上清からタンパク質を沈殿させる；
-  ペレットを8M 尿素で洗浄する；
-  ペレットを水で2回洗浄する；
-  凍結乾燥する；
-  凍結乾燥したタンパク質は−20℃で保存可能である；
-  タンパク質を利用する際には、硫酸アンモニウム沈殿物を6M GdmSCNに取り上げ、5mM リン酸カリウム pH7.0に対して透析する；
-  溶液中のタンパク質含有量を光度測定法(E(280;1mg/ml)＝0.76)により測定した；
-  タンパク質の純度をSDS PAGEとウェスタンブロット分析（図1）により、また、蛍光スペクトル法（図2）により調べた。
【００８０】
10リットルの発酵から1.4gの純粋なS16タンパク質が回収された。
【実施例３】
【００８１】
反復タンパク質R16およびS16からのタンパク質マイクロビーズの形成
プロトコール：
-  凍結乾燥したR16またはS16を6M チオシアン酸グアニジニウム中に最終濃度10mg/mlで溶解する；
-  室温で1M リン酸カリウムpH7.0に対して透析する；
-  水で洗浄する；
-  凍結乾燥する。
【００８２】
カオトロピックなチオシアン酸グアニジニウムをコスモトロピックなリン酸カリウムで置き換えると、R16またはS16マイクロビーズの形成が誘導される。あるいはまた、5mM リン酸カリウムに対して透析することによりチオシアン酸グアニジニウムを除去することもできる。マイクロビーズの形成は1/4倍容の4M 硫酸アンモニウムまたは1/2倍容の1M リン酸カリウムの添加により誘導される。
【００８３】
プロトコール：
-  凍結乾燥したR16またはS16を6M チオシアン酸グアニジニウム中に最終濃度15mg/mlで溶解する；
-  4℃で5mM リン酸カリウムpH7.0に対して透析する；
-  10,000×gで30分遠心して沈殿物を取り除く；
-  タンパク質濃度を10mg/mlに調整する；
-  1/4倍容の4M 硫酸アンモニウムまたは1/2倍容の1M リン酸カリウムを添加する；
-  室温で1時間インキュベートする；
-  水で洗浄する；
-  凍結乾燥する。
【００８４】
マイクロビーズ形成の成功を走査型電子顕微鏡によって検査する（図3および4）。
【実施例４】
【００８５】
S16マイクロビーズの安定化
S16マイクロビーズ形成のプロセスには、リン酸カリウムまたは硫酸アンモニウムにより誘導される相分離と、これに続く安定した二次構造の形成によるタンパク質に富んだ相の安定化が含まれる。硬化されなかったタンパク質に富む小滴は、安定化されたマイクロビーズから、4M尿素中でのそれらの異なる安定性により、実験的に区別することができる。安定化の動態を検討した。
【００８６】
プロトコール：
-  5mM リン酸カリウムpH7.0中に溶解したS16タンパク質の10mg/ml水溶液を調製する；
-  時点0で1/4容の4M 硫酸アンモニウムを用いてS16タンパク質を沈殿させる；
-  沈殿したタンパク質懸濁液の一部を時点tで取り出し、それを同倍容の8M 尿素と混合する；
-  600nmでのサンプルの吸光を、散乱の定性的尺度として測定する。
【００８７】
沈殿によって生じたサンプルの濁りは、4M 尿素の濃度を達成することにより30分以内で消失しうる。40分後、濁りの状態はこの処理によってそのままである。したがって、この間に、4M 尿素中で安定な構造がタンパク質に富んだ相に形成していたと結論づけられる（図5）。
【実施例５】
【００８８】
R16およびS16マイクロビーズへのβ-カロテンの封入
R16およびS16マイクロビーズが活性化合物のための担体または製剤用の賦形剤として適することを実証するために、水に難溶性の活性化合物の例としてβ-カロテンをR16およびS16マイクロビーズに封入した。
【００８９】
そのために、5mM リン酸カリウム(pH8.0)中に溶解したR16またはS16タンパク質の10mg/ml溶液500μlを、10％テトラヒドロフラン(THF)と90％N-メチル-2-ピロリドン(NMP)中に溶解したβ-カロテンの0.9mg/ml溶液50μlと混合した。その後、275μlの4M 硫酸アンモニウム溶液を加えてマイクロビーズの形成を誘導した。
【００９０】
R16およびS16マイクロビーズが形成されている間に、β-カロテンが溶液から除かれた。遠心により分離されたマイクロビーズは黄橙色に見えた。マイクロビーズを水で洗浄し（その間、β-カロテンはマイクロビーズに結合したままであった）、その後凍結乾燥した。凍結乾燥後、β-カロテン負荷R16またはS16マイクロビーズを走査型電子顕微鏡検査法により分析した（図6および7）。この電子顕微鏡画像では、負荷マイクロビーズ（図6および7）は無負荷マイクロビーズ（図3および4）と非常によく似た形態を示し、これにより、マイクロビーズとβ-カロテンは共有の固相を形成していることが明らかになった。
【実施例６】
【００９１】
R16マイクロビーズによる水の吸収
反復タンパク質のマイクロビーズは、空気から水を吸収しかつそれを放出する能力があり、したがって、例えば化粧用途において、水分調節物質として作用することができる。
【００９２】
それを実証するために、前もって−20℃で保存しておいた0.4gのR16マイクロビーズを真空下で16時間乾燥して、その乾燥重量を測定した。その後、室温で湿度100％にて保存したところ、66日間のうちに44％の重量増加を徐々にもたらした（図8）。真空乾燥させて水分を除去すると、もとの乾燥重量に戻った。
【実施例７】
【００９３】
R16およびS16のゲル形成
プロトコール：
-  凍結乾燥したR16またはS16タンパク質を6M チオシアン酸グアニジニウム中に最終濃度20mg/mlで溶解する；
-  5mM リン酸カリウムpH7.0に対して4℃で透析する；
-  10,000×gで30分遠心することにより沈殿物を取り除く；
-  2.5mM リン酸カリウムpH7.0、10mg/ml R16またはS16タンパク質、および40％v/v エタノールを含む溶液を調製する；
-  室温でインキュベートする。
【００９４】
この溶液は4〜5日以内にゲル様の濁った状態になる。
【実施例８】
【００９５】
R16およびS16のフィルム形成
プロトコール：
-  凍結乾燥したR16またはS16タンパク質をヘキサフルオロイソプロパノール中に最終濃度100mg/mlで溶解する；
-  滑らかなポリスチレン製の表面に300μlを薄く広げる；
-  ヘキサフルオロイソプロパノールを室温で蒸発させる；
-  タンパク質フィルムの面を1M リン酸カリウムpH7.0で5分間薄くおおう；
-  水で2回洗浄する；
-  空気乾燥する。
【００９６】
この処理により、透明な水不溶性のタンパク質フィルムが得られる。R16の乾燥フィルムは脆いのに対して、S16のフィルムは柔軟性がある。
【図１】
0005743542.tif 000002
【図２】
0005743542.tif 000003
【図３】
0005743542.tif 000004
【図４】
0005743542.tif 000005
【図５】
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【図６】
0005743542.tif 000007
【図７】
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【図８】
0005743542.tif 000009
【配列表】
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