(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）で示される変異を含む変異ｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン（ＦＨＬ−１）タンパク質をコードする核酸配列、又は
ｂ）前記変異ＦＨＬ−１タンパク質をコードする配列に相補的な核酸配列、
を含む核酸。
【請求項２】
Ｘ２がトリプトファンであることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記変異ＦＨＬ−１タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
Ｘ連鎖性筋疾患をもつ対象を特定する方法であり、
アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）で示される変異を含む変異ｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン（ＦＨＬ−１）タンパク質をコードする核酸の有無を決定するために、前記対象からの生体サンプルを分析する段階、
を含み、前記核酸又はＦＨＬ−１タンパク質の存在が、Ｘ連鎖性筋疾患をもつ対象を特定することを特徴とする方法。
【請求項５】
Ｘ２がトリプトファンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変異ＦＨＬ−１タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３からなることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記生体サンプルが血液サンプルであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
分析段階が、ＰＣＲ、プローブハイブリダイゼーション、又は、ヌクレオチドシーケンシングを含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）ｉ）アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）で示される変異を含む変異ｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン（ＦＨＬ−１）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を増幅するための１つ以上の核酸プライマー、
ｉｉ）アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）で示される変異を含む変異ｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン（ＦＨＬ−１）タンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的な、９〜１００ヌクレオチド間の１つ以上の核酸プローブ、
ｉｉｉ）バッファ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、又はＤＮＡポリメラーゼを含む群より選択される１つ以上の試薬、及び、
ｉｖ）前記ｉ）〜ｉｉｉ）の組み合わせ、
からなる群より選択される成分（但し、ｉｉｉ）のみを除く）と、
（ｂ）対象の筋疾患に対するリスクを分析、診断又は決定するための指示書と、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
前記筋疾患が、骨格筋症又は心筋症であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記筋疾患が、筋ジストロフィーであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の変異ｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン（ＦＨＬ−１）タンパク質であって、
前記変異が、１２８位におけるイソロイシンの挿入を含むタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１４】
Ｘ連鎖性筋疾患に罹患するリスクがある対象を特定するためにｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン（ＦＨＬ−１）の変異を検査する方法であり、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１２８位におけるイソロイシンの挿入を含むＦＨＬ−１遺伝子の変異をコードする核酸の有無を検出するために、前記対象からの生体サンプルを分析する段階、
を含み、前記ＦＨＬ−１の変異をコードする核酸の存在が、Ｘ連鎖性筋疾患に罹患するリスクがある対象を示すことを特徴とする方法。
【請求項１５】
Ｘ連鎖性筋疾患に罹患するリスクがある対象を特定する方法であり、
アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）で示される変異を含む変異ｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン（ＦＨＬ−１）タンパク質をコードする核酸の有無を決定するために、前記対象からの生体サンプルを分析する段階、
を含み、前記核酸の存在が、Ｘ連鎖性筋疾患をもつ対象又は罹患するリスクがある対象を特定することを特徴とする方法。
【請求項１６】
Ｘ２がトリプトファンであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異ＦＨＬ−１タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３からなることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体サンプルが血液サンプルであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
分析段階が、ＰＣＲ、プローブハイブリダイゼーション、又は、ヌクレオチドシーケンシングを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
Ｘ連鎖性筋疾患をもつ対象を特定するためにｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン（ＦＨＬ−１）の変異を検査する方法であり、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１２８位におけるイソロイシンの挿入を含む変異ＦＨＬ−１タンパク質をコードする核酸の有無を検出するために、前記対象からの生体サンプルを分析する段階、
を含み、前記変異ＦＨＬ−１タンパク質をコードする核酸の存在が、Ｘ連鎖性筋疾患をもつ対象を示すことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子変異に関する。特に新規Ｘ連鎖性筋疾患に関連するＦＨＬ１変異に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、随意的な骨格筋の進行性変性及び進行性衰弱を特徴とする、遺伝的な筋疾患群として定義される（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｗａｋ、２００６）。ＭＤは、発症年齢、罹患率、遺伝形式、進行率、及び筋衰弱の分布及び重症度から様々な病型に分類される。ある種の筋ジストロフィーは、心筋組織及び平滑筋組織に影響を与える。ＭＤは、Ｘ染色体劣性遺伝形式を最もよくとり、通常、Ｘｐ２１．２上のＤＭＤ遺伝子における変異に起因する。ＤＭＤ変異により、ジストロフィンタンパク質の欠損が生じ、下半身の近位筋に急速進行性の衰弱や萎縮が起こる。最も一般的な神経筋疾患であるＤｕｃｈｅｎｎｅ型ＭＤ（ＤＭＤ）は、機能的なジストロフィンの完全欠損をもたらすフレームシフト変異によって引き起こされるが、一方で、表現型的に軽度なＢｅｃｋｅｒ型ＭＤは、機能的なジストロフィンレベルの低下又は機能性タンパク質の一部に発現の低下をもたらすミスセンス及びインフレーム欠失に関連している（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｗａｋ、２００６）。この構造タンパク質は、その筋鞘を介して、アクチン細胞骨格を筋線維膜と結合させる働きをしており、筋細胞の支持体となっている（Ｅｒｖａｓｔｉ、２００７）。ジストロフィンの欠損は、前記の筋肉における複合体へ影響を与え、筋組織の変性につながる。ＤＭＤは、出生男児４０００人に１人の割合で発生し、発症年齢は６歳未満、標準的な寿命は２０〜２５歳であるが、一方で、Ｂｅｃｋｅｒ型ＭＤの発症年齢には、青年期又は成人期も含まれ、その症状はＤＭＤと同様ではあるが、一般的にＤＭＤより軽度である。これらには、筋の仮性肥大、近位筋萎縮、そしてまれに心筋症及び／又は知能の欠損がみられる。
【０００３】
Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ型ＭＤ（ＥＤＭＤ）は、Ｘｑ２８上のＥＭＤ遺伝子によってコードされるエメリンタンパク質の欠損によって引き起こされる、別の遅発性のＸ染色体劣性型ＭＤである（Ｅｌｌｉｓ、２００６）。ＥＤＭＤは、筋萎縮が上腕・腓骨に分布している点、筋の仮性肥大が認められない点、及び、かなりの高頻度で心筋症を生じる点において、他のＸ連鎖性ＭＤとは表現型的に異なっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当技術分野では、筋ジストロフィー及び心筋症を含む筋疾患に関連するＦＨＬ−１変異、及び、そこからコードされるタンパク質の同定が必要とされている。さらに、当技術分野では、筋ジストロフィー及び心筋症を含む筋疾患に罹患している患者、又は罹患するリスクがある個人を特定するため、前記変異の検査を可能にすることが必要とされている。
【０００５】
本発明は、遺伝子変異に関する。特に、本発明は、筋疾患に関連する遺伝子変異に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜２３０、その断片、又は該アミノ酸と少なくとも７０％の同一性をもつ配列を含み、且つ、アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４)（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）を含むタンパク質を提供する。
【０００７】
Ｘ１はＡ又はＳであり、Ｘ３は、Ｋ、Ｎ、又はＱであることが好適である。
【０００８】
また、本発明は、Ｘ２がトリプトファンである前記タンパク質を提供する。
【０００９】
また、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義される前記タンパク質を提供する。
【００１０】
また、本発明は、核酸であり、
ａ）前記タンパク質又はその断片をコードする配列、
ｂ）前記タンパク質又はその断片をコードする配列に相補的な配列、
ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記タンパク質又はその断片をコードする核酸とハイブリッド形成することができる配列、又は
ｄ）ａ）又はｂ）に定義される核酸と約７０％を超える同一性をもつ配列を含む核酸を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記核酸において、前記断片が、アミノ酸配列ＧＷＫを含む核酸を提供する。
【００１２】
また、本発明は、Ｘ２がトリプトファンである前記核酸を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記核酸において、前記タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義されるものも意図している。
【００１４】
また、本発明は、Ｘ連鎖性筋疾患について対象を検査する方法であり、
ａ）前記対象から生体サンプルを取得する段階、及び、
ｂ）アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４)（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）を含む前記タンパク質又はその断片をコードする核酸について、前記サンプルを分析する段階、又は、
ｃ）アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４)（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）を含む前記タンパク質又はその断片について、前記サンプルを分析する段階を含む方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記方法において、前記筋疾患が、例えば、骨格筋症又は心筋症などであって、筋ジストロフィーに限定されない方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、Ｘ２がトリプトファンである前記方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記方法において、前記タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義されることを特徴とする方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、前記方法において、前記対象がヒトであることを特徴とする方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、前記方法において、前記生体サンプルが血液サンプルであることを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、前記方法において、分析段階が、ＰＣＲ、プローブハイブリダイゼーション、又は、シーケンシングを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、下記ｉ）〜ｖｉｉ）、又はそれらの組み合わせを含むキットを提供するものである。
ｉ）本願記載の筋疾患に関連するタンパク質又はその断片、
ｉｉ）本願記載の筋疾患に関連しない野生型タンパク質よりも、前記筋疾患に関連するタンパク質又はその断片と選択的に結合する抗体、
ｉｉｉ）本願提供のＸ連鎖性筋疾患に関連する変異を含むタンパク質又はその断片をコードするヌクレオチド配列を増幅するための１つ以上の核酸プライマー、
ｉｖ）本願提供のＸ連鎖性筋疾患に関連する変異を含むタンパク質又はその断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成する、約９〜１００ヌクレオチド間の１つ以上の核酸プローブ、
ｖ）これらには限定されないが、バッファ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、又はＤＮＡポリメラーゼを含む１つ以上の試薬、
ｖｉ）対象の筋疾患に対するリスクを分析、診断又は決定するための指示事項、
ｖｉｉ）本願記載の成分を使用する、又は本願記載の方法を行うための指示事項。
【００２２】
また、本発明は、１２８位におけるイソロイシンの挿入を含むＦＨＬ−１タンパク質を提供する。好適な実施形態において、前記タンパク質は、ヒトアイソフォームａ、ｂ、又はｃのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性をもつアミノ酸配列を含む。
【００２３】
また、本発明は、前記ＦＨＬ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００２４】
また、本発明によって、好適には野生型ＦＨＬ−１タンパク質でない前記ＦＨＬ−１タンパク質と選択的に結合する抗体が提供される。
【００２５】
また、本発明は、Ｘ連鎖性筋疾患について対象を検査する方法であり、
ａ）前記対象から生体サンプルを取得する段階、及び、
ｂ）１２８位におけるイソロイシンの挿入を含むＦＨＬ−１タンパク質をコードする核酸について前記サンプルを分析する段階、又は、
ｃ）１２８位におけるイソロイシンの挿入を含むＦＨＬ−１タンパク質について前記サンプルを分析する段階を含み、
前記核酸又はタンパク質の存在によって、前記対象が筋疾患に罹患していること、又は罹患するリスクがあることを示す方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は、１２８位におけるイソロイシン挿入を含むＦＨＬ−１タンパク質、１２８位におけるイソロイシン挿入を含むＦＨＬ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列、１２８位のイソロイシンをコードするヌクレオチド配列を同定するために使用され得るプローブ、前記配列を増幅できるプライマー、好適には野生型ＦＨＬ−１タンパク質でない前記タンパク質を認識する抗体、対象を検査するための指示事項、１つ以上の成分を使用するために用いることができる１つ以上の試薬、又はそれらの組み合わせを含むキットを提供する。本願記載の、又は当業分野で周知であるその他構成要素も含めることができ、上記の羅列は、いかなる場合においても限定することを意図したものではない。
【００２７】
本発明の概要は、必ずしも、本発明の全ての特徴を説明したものではない。
【００２８】
本発明の上記及びその他の特徴は、添付図面を参照する下記説明によって一層明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａは、Ｘ連鎖性姿勢筋疾患家系の家系図である。ＤＮＡサンプルが得られた家系員を矢印で示す（↓）。図１Ｂは、筋疾患を発現する英国家系２の家系図である。図１Ｃは、筋疾患を発現する英国家系３の家系図である。
【００３０】
【図２】図２は、疾患初期段階の患者において、臨床的に評価された姿勢背筋（ｐｏｓｔｕｒａｌ  ｂａｃｋ  ｍｕｓｃｌｅｓ）の萎縮を示す。三角筋に萎縮が見られる。大臀筋、上腕二頭筋、上腕三頭筋、及び前腕は正常に見える。大腿二頭筋（ハムストリング筋）、大内転筋（大腿部）、短母指外転筋、及び母指内転筋（手）は萎縮の兆候を示している。
【００３１】
【図３】図３は、外側広筋（Ａ）及び前脛骨筋（Ｂ）の筋生検を示す。筋肉組織構造から、中等度の筋周膜線維症及び限局性筋内膜線維症を伴う中等度の疾患が明らかとなった。全ての筋生検において、主にII型筋線維に丸い自己貪食空胞がいくつか検出された。これらの空胞変化は、患者Ｂにおいて最も著しかった。また、中心に位置する筋核は増加し、単筋線維壊死及び顆粒状の筋原線維変性はほとんど見られなかった。
【００３２】
【図４】図４は、外側広筋（Ａ）及び前脛骨筋（Ｂ）の筋生検を示す。酸性ｐＨ４．３／４．６でのミオシンＡＴＰａｓｅ染色により、疾患初期段階の患者におけるＩ型筋線維（暗色箇所）及びII型筋線維（明色箇所）の分布が明らかとなった。全ての標本において、筋線維サイズのばらつきが直径２０〜１００μｍの範囲で大きく、特に、ＩＩ型筋線維で顕著であった。ＮＡＤＨ及びＣＯＸの組織化学的検査では、両患者において、陰性のコア様病変（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｒｅ−ｌｉｋｅ  ｌｅｓｉｏｎ）が中心的に検出され、さらなるミトコンドリアの変化はなかった。
【００３３】
【図５】図５は、多型ＳＴＲ遺伝子内マーカーＳＴＲ−４４、ＳＴＲ−４５、ＳＴＲ−４８、ＳＴＲ−４９、及びＳＴＲ−５０を用いたＤＭＤ遺伝子座の連鎖分析を表したものである。罹患者の様々なハプロタイプが明らかとなり、これによって、ＤＭＤ遺伝子座は除外された。ハプロタイプで表されているように、マーカーＳＴＲ−４４、ＳＴＲ−４８、ＳＴＲ−４９、及びＳＴＲ−５０の組み換えが明らかである。
【００３４】
【図６】図６は、Ｘ染色体の長腕上にある、姿勢筋萎縮を伴うＸ連鎖性疾患（ＸＭＰＭＡ）遺伝子座のイデオグラム的な表現である。電気泳動図は、オーストリアのＸＭＰＭＡ家系における野生型及び変異配列を示しており、ＦＨＬ１の二次構造は、結果として生じるアミノ酸置換Ｃ２２４Ｗの位置を、タンパク質の構造的特徴に応じて表したものである。
【００３５】
【図７】図７は、本願全体を通して記載されるアミノ酸及びヌクレオチド配列、並びに、当該分野で周知の野生型タンパク質配列のいくつかを表したものである。
【００３６】
【図８】図８は、複数の種における、ＦＨＬ１の第４ＬＩＭ結合ドメインの比較分析を表したものである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
下記に、好適な実施形態を説明する。
【００３８】
本出願人は、Ｘ染色体劣性遺伝形式の新型筋疾患を呈する、多世代に渡るオーストリアの一家系を特定した。罹患者は、Ｉ型筋線維の緩徐な萎縮を示す組織構造を伴う、特異な姿勢筋の萎縮を発症している。従来のＸ染色体劣性ＭＤは、免疫細胞化学的染色、マーカー分析、及び遺伝子シーケンシングによって除外された。マーカー分析により、Ｘｑ２６−ｑ２７に意味のある結合を認めた。５人の罹患者及び３人の非罹患家系員の２５０ＫアレイＳＮＰチップデータに基づくハプロタイプ分析により、この結合領域がＸ染色体長腕（Ｘｑ２６−ｑ２７）上にあることを確認し、さらにその候補区間を、約８５０の連続したＳＮＰｓを含む２６Ｍｂに絞り込むことができた。機能的な候補遺伝子のシーケンシングにより、第４ＬＩＭドメインを分断すると推定されるｆｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭドメイン１遺伝子（ＦＨＬ１）内の変異が同定された。Ｘｑ２７．２上のＦＨＬ１は、Ｉ型筋線維に特異的に高発現する。そのため、本出願人は、新型疾患、すなわち、姿勢筋萎縮を伴うＸ連鎖性疾患（ＸＭＰＭＡ）の特性を明らかにし、ＦＨＬ１をその原因遺伝子として同定した。その他の家系における調査でも、ＦＨＬ１が、本願記載のＸ連鎖性疾患及び心筋症の原因遺伝子と確認された。
【００３９】
タンパク質及びアミノ酸
【００４０】
本発明の一実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜２３０、その断片、又は、該アミノ酸と少なくとも７０％の同一性をもつアミノ酸配列を含み、且つ、アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４)（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）を含むタンパク質を提供する。Ｘ１は、Ａ又はＳであり、Ｘ３は、Ｋ、Ｎ、又はＱであることが好適である。好適な実施形態において、Ｘ２は、トリプトファンであり、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義されるものであるがこれに限定されない。
【００４１】
前記アミノ酸と少なくとも７０％の同一性をもつアミノ酸配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はその断片との同一性が７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は１００％、又はその間の任意の値である配列を含むものと理解される。さらに、前記タンパク質は、上記に挙げられた値又はその間の値のうち、任意の２つの値で定義される配列同一性の範囲を含むものであると定義してもよい。
【００４２】
ポリペプチド配列の間の同一性の程度の決定には、当該分野で周知のあらゆる方法を用いることができる。密接に関連した配列を検索するために、例えば、Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７  ２５０(１９９９)）や、全米バイオテクノロジー情報センターウェブページ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）に記載されているようなデフォルトパラメータに従い、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ、Ｇｉｓｈ  Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ、Ｍｙｅｒｓ  Ｅ  Ｗ、Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ  Ｊ（１９９０）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５、４０３  ４１０）などの配列検索方法を用いることができるが、これらに限られることを望むものではない。ＢＬＡＳＴは、所定の配列アラインメントにおいて幅広く使用されており、アラインメントにおけるずれ（ｇａｐｓ）（挿入又は欠失）の導入を可能にするギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）や、配列相同性について高精度な検索を行えるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９  ３４０２（１９９７））のような改良されたＢＬＡＳＴアルゴリズム；又は、ＥｘＰＡＳｙ（ＥＭＢＬ−欧州バイオインフォマティクス研究所）のウェブサイトで入手可能なＦＡＳＴＡなどが挙げられる。ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を比較して配列同一性の程度を決定するために、当該分野で周知の同様の方法を用いてもよい。
【００４３】
本発明の一実施形態では、アミノ酸の挿入を含むＦＨＬ１タンパク質を提供するが、これに限定することを意図するものではない。さらなる実施形態では、イソロイシンアミノ酸の挿入を含むＦＨＬ１タンパク質を提供する。また、さらなる実施形態では、１２８ＩｎｓＩを含むＦＨＬ１タンパク質を提供する。例えば、アイソフォームａ、ｂ又はｃに限定されない、任意のアイソフォームは、このアミノ酸挿入を含み得る。このようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列もまた、下記の通り本発明に包含される。
【００４４】
核酸
【００４５】
また本発明は、核酸であり、
ａ）前記タンパク質又はその断片をコードする配列、
ｂ）前記タンパク質又はその断片をコードする配列に相補的な配列、
ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記タンパク質又はその断片をコードする核酸とハイブリッド形成することができる配列、又は、
ｄ）ａ）又はｂ）に記載の核酸と約７０％を超える同一性をもつ配列を含む核酸を提供する。
【００４６】
前記タンパク質をコードする核酸の代表的な例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及び６（式中、Ｘは、シトシン（ｃ）でも、翻訳の際にシステインを産生するその他のヌクレオチドでもない。）によるものが挙げられるが、これに限定することを望むものでない。
【００４７】
上記核酸としては、Ｘ連鎖性筋疾患に関連するタンパク質を産生するために用いられ得る核酸、筋疾患を発症する又は発症しやすくなる変異を保有する対象を特定又は診断するために使用され得るプローブ、筋疾患に関連する遺伝子からのタンパク質産生を調節するために使用され得るアンチセンス又は短鎖抑制性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）、又はその組み合わせ等が挙げられる。上記タンパク質、その断片、又は核酸は、好適には、当該分野で周知の野生型タンパク質より上記タンパク質を選択的に認識する抗体を産生するために用いてもよい。
【００４８】
上記核酸の好適な一実施形態において、Ｘ２はトリプトファンである。本方法のさらなる実施形態において、前記タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義される。またさらなる実施形態において、前記タンパク質は、１２８位におけるイソロイシンアミノ酸挿入（１２８ＩｎｓＩ）を含むヒトＦＨＬ１タンパク質である。
【００４９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、例えば、６５℃にて４×ＳＳＣで一晩（約１６〜２０時間）ハイブリダイゼーションした後、６５℃にて０．１×ＳＳＣで１時間洗浄、又は、６５℃にて０．１×ＳＳＣで２０又は３０分間の洗浄を２回行うものが挙げられるが、これに限るものではない。又は、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、４２℃にて４×ＳＳＣ、５０％のホルムアミド中で一晩（１６〜２０時間）ハイブリダイゼーションした後、６５℃にて０．１×ＳＳＣで１時間洗浄、又は、６５℃にて０．１×ＳＳＣで２０又は３０分間の洗浄を２回、又は一晩（１６〜２０時間）；又は、６５℃でチャーチリン酸緩衝溶液（７％ＳＤＳ；０．５Ｍ  ＮａＰＯ４バッファ  ｐＨ７．２；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）にてハイブリッド形成し、５０℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０又は３０分間の洗浄を２回、又は、ユニーク配列領域に対し、６５℃にて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０又は３０分間の洗浄を２回行うことが挙げられる。
【００５０】
本発明はさらに、１以上の調節エレメント又は調節領域へ有効に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合する上記核酸を含むヌクレオチド構造物に関する。「調節エレメント」又は「調節領域」という用語は、必ずではないが、遺伝子の上流にある核酸の一部を通常は意味し、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか、又はＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含み得る。調節エレメントとしては、器官特異性を媒介できるもの、又は発生遺伝子又は時間的な遺伝子活性化を調整できるものが挙げられる。さらに、「調節エレメント」には、プロモーターエレメント、コアプロモーターエレメント、外的刺激に反応して誘導されるエレメント、構成的に活性化されたエレメント、又は、陰性調節エレメント又は転写エンハンサーのようなプロモーター活性を増減させるエレメントを、各々含んでもよい。調節エレメント活性を示すヌクレオチド配列とは、プロモーター、コアプロモーター、構成的調節エレメント、陰性エレメント又はサイレンサー（すなわち、プロモーター活性を減少させるエレメント）、又は、転写又は翻訳エンハンサーなどの対象となる機能のコード配列と有効に結合する際のヌクレオチド配列を意味している。
【００５１】
「有効に結合」とは、特定の配列同士、例えば、調節エレメントと対象となるコード領域とが、直接的又は間接的に相互作用し、遺伝子発現の媒介又は調節などの目的とする機能を果たすことを意味する。有効に結合する配列の相互作用は、例えば、有効に結合する配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。
【００５２】
本願で用いられる調節エレメントには、転写開始又は転写の後に活性化されるエレメント、例えば、翻訳及び転写エンハンサー、翻訳及び転写リプレッサー、及び、ｍＲＮＡ安定性又は不安定性デターミナントなどの、遺伝子発現を調節する調節エレメントも含まれる。本開示において、「調節エレメント」という用語は、必ずではないが、通常は、構造遺伝子のコード配列の上流（５’）側の配列も意味し、その配列には、ある特定の部位で転写を開始するのに必要なＲＮＡポリメラーゼ及び／又はその他因子に対する認識を備えることによってコード領域の発現を調整する配列が含まれる。ある特定の部位で確実に転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼ又はその他転写因子に対する認識を備えた調節エレメントの例として、プロモーターエレメントが挙げられる。プロモーターエレメントは、転写開始に関与するコアプロモーターエレメント、及び、遺伝子発現を修正するその他調節エレメントを含む。当然のことながら、イントロン内に位置するヌクレオチド配列、又は、コード領域配列の３’もまた、対象となるコード領域の発現調節に寄与し得る。また、調節エレメントには、転写開始部位の下流（３’）、又は転写領域内、又はその両方に位置するエレメントも含まれる。本発明においては、転写後調節エレメントとして、例えば、翻訳及び転写エンハンサー、翻訳及び転写リプレッサー、及びｍＲＮＡ安定性デターミナントなどの、転写開始後に活性化されるエレメントが挙げられる。
【００５３】
上記調節エレメント又はその断片は、異種の調節エレメントの活性を調節するために、その異種の調節エレメント又はプロモーターと効果的に付随（有効に結合）していてもよい。そのような調節としては、異種の調節エレメントの転写活性の増強又は抑制、転写後事象の調節、又は異種の調節エレメントの転写活性の増強／抑制及び転写後事象の調節の両方が挙げられる。例えば、１つ以上の調節エレメント又はその断片は、構成的誘導性の組織特異性プロモーター又はその断片、又は調節エレメントの断片と効果的に付随し得る。例えば、植物、昆虫、菌類、細菌、酵母、又は動物細胞内にある前記プロモーターの活性を調節するために、ＴＡＴＡ又はＧＣ配列を本発明の調節エレメントと効果的に付随させてもよいが、これに限るものではない。
【００５４】
調節エレメントには複数の種類があり、発生的に調節され、誘導性で且つ構成的なものが挙げられる。発生的に調節された調節エレメント、又はその制御下で遺伝子の発現差異を調整する調節エレメントは、特定の器官又は器官の組織内において、その器官又は組織が発達する間の特定の時期に活性化される。しかし、発生的に調節された調節エレメントには、ある器官又は組織内において、特定の発達段階で優先的に活性化されるものもあり、それらはまた、発生的に調節された方法で活性化されるか、又は植物内のその他の器官又は組織においても基礎レベルで活性化され得る。
【００５５】
「プロモーター」とは、コード領域の５’末端におけるヌクレオチド配列、又は転写開始及び転写速度調節に不可欠なシグナル全てを含む前記ヌクレオチド配列の断片を意味する。通常、誘導性プロモーターと構成的プロモーターの２種類のプロモーターがある。
【００５６】
誘導性プロモーターは、誘導因子に反応して、１つ以上のＤＮＡ配列又は遺伝子の転写を、直接的又は間接的に活性化できるプロモーターである。誘導因子が存在しなければ、ＤＮＡ配列又は遺伝子は転写されない。通常、転写を活性化する誘導性プロモーターへ特異的に結合するタンパク質因子は不活性化状態で存在し、該タンパク質因子はその後、誘導因子によって、直接的又は間接的に活性化状態へ変換される。上記誘導因子は、例えば、タンパク質、代謝体、成長調節物質、又は、熱、低温、又は有毒物質によって直接的に課せられるか、又は、ウィルスなどの病原体や病因物質の作用によって間接的に課せられる生理的ストレスなどの化学的因子であり得る。
【００５７】
構成的プロモーターは、生物の様々な部分を通じるか、及び／又は、生物の発生を通じて連続的に、遺伝子の発現を指示する。本願記載のタンパク質又はその断片の発現を促進するために、任意の適当な構成的プロモーターを使用することができる。周知の構成的プロモーターの例としては、ＣａＭＶ  ３５Ｓ転写物（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０−８１２）に関連するものが挙げられるがこれに限られない。
【００５８】
本願で用いられる「構成的」という用語は、遺伝子が全ての細胞型において同じレベルで発現されることを必ずしも意味するとは限らず、多数の変異が頻繁に認められながらも、遺伝子が幅広い細胞型において発現されることを意味する。
【００５９】
本発明の遺伝子構造物は、さらに、３’非翻訳領域を含むものである。３’非翻訳領域とは、ポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡプロセッシングや遺伝子発現をもたらし得るその他の調節シグナルを含むＤＮＡセグメントを含む遺伝子部分を意味している。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へポリアデニル酸トラック（ｔｒａｃｋｓ）を付加するという特徴を有する。
【００６０】
また、本発明の遺伝子構造物は、必要とあらば、追加的なエンハンサー（翻訳又は転写エンハンサーのいずれか）を含み得る。これらのエンハンサー領域は、当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得る。前記開始コドンは、配列全体を確実に翻訳するために、コード配列のリーディングフレームと一致しなければならない。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方を含む、様々な起源に由来するものであり得る。翻訳開始領域は、転写開始領域源、又は構造遺伝子から提供され得る。この配列はまた、遺伝子を発現させるために選択される調節エレメントを由来としてもよく、ｍＲＮＡの翻訳を強化させるために特異的に修飾させてもよい。
【００６１】
本発明は、さらに、上記核酸を含むベクターを含む。本発明の核酸配列での使用に適した発現ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルス粒子及びベクター、ファージ等が挙げられるがこれらに限られない。昆虫細胞においては、バキュロウイルス発現ベクターが適している。植物細胞においては、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどのウィルス発現ベクター、及び、Ｔｉプラスミドのようなプラスミド発現ベクターが適している。発現ベクター全体又はその一部は、宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。
【００６２】
本願定義のタンパク質又はその断片を産生するために、様々な発現系が使用できることは当業者に理解されるであろう。体外産生に関し、使用される明確な使用宿主細胞は、本発明において重要ではない。タンパク質又はその断片は、原核宿主（例えば、大腸菌又は枯草菌）又は、真核宿主（例えば、サッカロミセス又はピキア（Ｐｉｃｈｉａｔ）；ＣＯＳ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、又はＨｅＬａ細胞のような哺乳類細胞；昆虫細胞；又は植物細胞）において産生することができる。形質転換又は形質移入の方法、及び、発現ベクターの選択は、選択される宿主系に依存し、当業者が容易に決定することができる。形質転換及び形質移入の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋに記載されており、また、様々な発現ベクターは、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｓｕｐｐ．１９８７）にて提供されているもの、及び様々な商業供給業者によって提供されているものから選択できる。さらに、宿主細胞は、挿入配列の発現を調節するもの、又は特定の望ましい方法で遺伝子産物を修飾／処理するものを選べばよい。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）、及びプロセッシング（例えば、切断）は、タンパク質活性において重要である。種々の宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセッシング及び修飾に対し、特徴的で且つ特異的なメカニズムをもつ。発現した心筋幹細胞増殖タンパク質の正確な修飾及びプロセッシングを確実に行うための適切な細胞株又は宿主系は、当業者が選択することができる。
【００６３】
検査方法
【００６４】
また、本発明は、Ｘ連鎖性筋疾患について対象を検査する方法であり、
ａ）前記対象から生体サンプルを取得する段階であって、該生体サンプルが、核酸について分析する場合にはＤＮＡ又はＲＮＡ、また、タンパク質について分析する場合にはＦＨＬ−１タンパク質を含むことを特徴とする段階、及び、
ｂ）アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４)（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）を含む前記タンパク質又はその断片をコードする核酸について、前記サンプルを分析する段階、又は、
ｃ）アミノ酸配列ＶＡＫＫＣＸ１ＧＸ２Ｘ３ＮＰＩＴ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４)（式中、Ｘ２はＣ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ３は、それぞれ任意のアミノ酸である。）を含む前記タンパク質又はその断片について、前記サンプルを分析する段階を含む方法を提供する。
【００６５】
また、本発明は、Ｘ連鎖性筋疾患について対象を検査する方法であり、
ａ）前記対象から生体サンプルを取得する段階であって、該生体サンプルが、核酸について分析する場合にはＤＮＡ又はＲＮＡ、また、タンパク質について分析する場合にはＦＨＬ−１タンパク質を含むことを特徴とする段階、及び、
ｂ）１２８位におけるイソロイシン挿入（１２８ＩｎｓＩ）を含むＦＨＬ−１タンパク質をコードする核酸について前記サンプルを分析する段階、又は、
ｃ）１２８位におけるイソロイシン挿入（１２８ＩｎｓＩ）を含むＦＨＬ−１タンパク質について前記サンプルを分析する段階を含む方法を提供する。
前記ＦＨＬタンパク質は、本願記載のヒトＦＨＬ−１タンパク質アイソフォームａ、ｂ、又はｃと同一又は実質的に同一であってよく、実質的に同一とは、それらと少なくとも７０％の同一性をもつことを含み、より好適には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の同一性をもつことを意味している。
【００６６】
また、本発明は、前記方法において、前記筋疾患が、例えば、筋ジストロフィーに限定されない骨格筋症である方法を提供する。もしくは、前記筋疾患は心筋症であってもよいが、これに限定されることを望むものではない。心筋症は、本願で調査される罹患者がそのような症状を示す、及び／又は、心臓に関連した病気で死亡すると思われるときに、特に検討される。
【００６７】
上記実施形態では、当然のことながら、対象から得た生体サンプルにおける標的核酸、タンパク質、又はその両方の同定は、例えば、これに限定されるものでないが、Ｘ連鎖性筋ジストロフィー又は心筋症のような筋疾患に罹患している、又は罹患するリスクがある対象の特定に利用することができる。
【００６８】
「核酸について前記サンプルを分析」という用語は、前記タンパク質をコードする核酸について、対象から提供されたサンプルを検査すること、及び／又は特性を明らかにすることを意味しており、また、ハイブリダイゼーションアッセイ、ヌクレオチドシーケンシング、ＲＴ−ＰＣＲ（ただし、必ずしもこれに限定されない）等を含むヌクレオチドＰＣＲ、又はその組み合わせを含むことを意味しているがこれらに限されない。
【００６９】
前記検査方法の好適な実施形態において、Ｘ２は、トリプトファンである。別の実施形態において、前記タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義されるが、これらに限定されない。また、前記検査方法は様々な対象について行うことができるが、好適には、前記対象はヒトである。
【００７０】
対象から得られたサンプルは、ＤＮＡ又はＲＮＡが得られる任意の組織サンプル又は生体液サンプルを含む。例えば、ＤＮＡは、血液、毛包細胞、皮膚細胞、頬の細胞、組織生検等から得られるが、これらに限られない。好適な実施形態において、前記サンプルは、血液である。
【００７１】
また、本発明は、複数の対象からの生体サンプル内において、前記タンパク質を同定する及び／又はその特性を明らかにする検査方法も意図している。そのようなサンプルは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよいし、含まなくてもよい。例えば、前記検査方法では、サンプル中の上記タンパク質を同定するために、ＥＬＩＳＡｓ等の抗体結合アッセイ、タンパク質シーケンシング、電気泳動分離といった、免疫学的方法を用いてもよいが、これらに限るものではない。当業者には自明であるが、前記検査方法によって、本願定義のタンパク質と、当該分野で周知の野生型タンパク質との区別が可能となる。
【００７２】
キット
【００７３】
また、本発明は、キットを提供するものであり、該キットは、例えば、これらに限定されないが、本願記載の筋ジストロフィーや心筋症などの筋疾患に関連する１以上のタンパク質又はその断片；筋疾患、筋ジストロフィー、又は心筋症に関連しない野生型よりも、本願記載の筋疾患、筋ジストロフィー、又は心筋症に関連するタンパク質又はその断片と選択的に結合する抗体；本願記載のＸ連鎖性筋疾患、筋ジストロフィー、又は心筋症に関連する変異を含むタンパク質又はその断片をコードするヌクレオチド配列を増幅するための１つ以上の核酸プライマー；本願記載のＸ連鎖性筋疾患、筋ジストロフィー、又は心筋症に関連する変異又は挿入を含むタンパク質又はその断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成する約９から１００ヌクレオチドの１つ以上の核酸プローブ；バッファ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ（ただし、これらに限られない）を含む１つ以上の試薬；筋疾患、筋ジストロフィー、又は心筋症に対する対象のリスクを分析、診断、又は決定するための指示事項；本願記載の成分を使用するため、又は本願記載の方法を行うための指示事項、又はそれらの組み合わせを含むものである。
【００７４】
さらなる実施形態では、いかなる場合においても限定することを意図するものではないが、本願全体を通して定義されるタンパク質を含む非ヒト動物を産生する方法であって、
前記タンパク質、好適には野生型ＦＨＬ−１タンパク質が存在しないタンパク質、さらに好適にはＦＨＬ−１タンパク質の全てのアイソフォームが存在しないタンパク質をコードするヌクレオチド構造物で、非ヒト動物を形質転換する段階を含む方法を提供する。ヒト対象が特定の筋肉の肥大化を示すとき、様々な身体部分で筋肉量の増加を示す動物を生産するために、例えば、肉用牛、ウマ、家禽、ブタ、又はその他の非ヒト動物で前記方法を用いてもよい。
【００７５】
本発明を、下記実施例においてさらに説明する。
【実施例１】
【００７６】
実施例１：材料及び方法
【００７７】
臨床的評価
【００７８】
発端者は、前述の筋ジストロフィーとは臨床的差異を有するＭＤを示唆する臨床的特徴を現す、数世代のあるオーストリア家系に由来する（図１）。本出願人は、生存する６人の患者（全て男性）を特定した。神経筋疾患（Ｓ．Ｑ．）に長けた神経内科医が神経学的検査を行った。可能であれば第一度近親も検査した。全ての罹患者及びその家系員において、血清中クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルが測定された。
【００７９】
ミオシンＡＴＰａｓｅ染色
【００８０】
標準的な組織学的プロトコルを用い、酸性ｐＨ４．３／４．６でミオシンＡＴＰａｓｅを染色し、Ｉ型筋線維（遅筋線維）及びＩＩ型筋線維（速筋線維）の分布を評価した。この手順は、内転筋、二頭筋、三角筋、勃起筋、伸筋、屈筋、前頭筋、腓腹筋、臀筋、広背筋、胸筋、腓骨筋、直筋、縫工筋、ヒラメ筋、脛骨筋、三頭筋、広筋等について行った。
【００８１】
筋肉免疫細胞化学
【００８２】
患者５０の筋生検後、標準的な免疫細胞化学プロトコルを利用して、ジストロフィン、アドハリン（ａｄｈａｌｉｎ）、メロシン、ジスフェルリン、カベオリン、α―ジストログリカン、エメリン、ラミンＡ／Ｃ、デスミン、β―遅筋型ミオシン重鎖、スペクトリン、及び、α―サルコグリカンの染色を行った。Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．(Ｖｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、英国)より、スペクトリン（ＮＣＬ−ＳＰＥＣ１）、ジスフェルリン（ＮＣＬ−Ｈａｍｌｅｔ）、エメリン（ＮＣＬ−Ｅｍｅｒｉｎ）、及びα―サルコグリカン（ＮＣＬ−α−ＳＡＲＣ）についてのモノクローナル抗体を入手した。ジストロフィンの棒状領域（ＮＣＬ−ＤＹＳ１）、Ｃ末端（ＮＣＬ−ＤＹＳ２）、及びＮ末端（ＮＣＬ−ＤＹＳ３）に特異的な、別のＮｏｖｏｃａｓｔｒａ製抗体をジストロフィン染色に用いた。メロシン（ＭＡＢ  １９２２；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ドイツ）、カベオリン（Ｃａｖｅｏｌｉｎ３；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、欧州）、α―ジストログリカン（ＫｌｏｎＶＩＡ４−ｌ；  Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、欧州）、ラミンＡ／Ｃ（マウスハイブリドーマ上清）、デスミン（Ｍ０７６０、Ｋｌｏｎ  Ｄ３３；Ｄａｋｏ、欧州）、及びミオシン（８０５−５０２−Ｌ００１、Ｌｏｔ  Ｌ０２２７９、Ｋｌｏｎ  Ａ４．９５１；Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、欧州）の染色処理には、モノクローナル抗体を用いた。
【００８３】
ＤＭＤ遺伝子座の排除
【００８４】
標準的な手順を用い、血液サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｓｅｔ  ｖ２．５で設定されたプロトコルによる熱サイクルに必要な条件を使用し、ＰＣＲでＤＮＡを増幅させた。変性は、９５℃で１５分間の後、９４℃で１５分間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を１０サイクル繰り返して行った。その後、８９℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を２０サイクル行い、７２℃で１０分間の最終伸長段階（ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を設けた。反応混合物は、その１０μＬ当たりが、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．１μｍｏｌの各プライマー、及びＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ、欧州）で構成されていた。ＤＭＤ遺伝子座に対する連鎖分析は、下記「連鎖分析」で説明されるように、標準的な方法を用いて行った。この目的のために、ＤＭＤ遺伝子周囲の５つの多型ＳＴＲマイクロサテライトマーカー、すなわち、ＳＴＲ−４４（ＤＸＳ１２３８；１８０−２１０ｂｐ）、ＳＴＲ−４５（ＤＸＳ１２３７；１６０−１８５ｂｐ）、ＳＴＲ−４８（ＤＸＳ９９７；１０５−１２０ｂｐ）、ＳＴＲ−４９（ＤＸＳ１２３６；２３０−２６０ｂｐ）、及びＳＴＲ−５０（ＤＸＳ１２３５；２３０−２６０ｂｐ）を選択した。５−カルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）又はＮＥＤ蛍光色素を用い、フォワードプライマーをその５’末端で標識した。ＳＴＲ−４４（フォワードプライマー：ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  Ａ；リバースプライマー：ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＡＴＡ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＣＡＧ）、ＳＴＲ−４５（フォワードプライマー：ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  Ｃ；リバースプライマー：ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  Ｃ）、ＳＴＲ−４８（フォワードプライマー：ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＧＧＡ；リバースプライマー：ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＴＡ）、ＳＴＲ−４９（フォワードプライマー：ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＡＡＣ；リバースプライマー：ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＴＧＣ）、及びＳＴＲ−５０（フォワードプライマー：ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  Ｇ；リバースプライマー：ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  Ｃ）。
【００８５】
ゲノム全体でのＳＮＰ分析：Ｘｑ２６−ｑ２７に対する新遺伝子座のマッピング
【００８６】
Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＧｅｎｏｍｉｃｓのＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（トロント、カナダ）にて、５人の罹患者（患者２０、２９、５０、１１及び４５）及び３人の非罹患親族について、全ゲノムの２５０Ｋ  ＮｓｐＩ  Ａｆｆｙｍｅｒｔｉｘ  ＳＮＰマイクロアレイを行った。平均２５０，０００のＳＮＰについて遺伝子型決定ができる装置において、ＳＮＰ間の物理的距離の中央値２．５Ｋｂ、及び、平均距離５．８Ｋｂで、単一ヌクレオチド多型を分離する（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州、米国）。１０Ｋｂ内に１つのＳＮＰが存在するヒトゲノムの約８５％において、これらＳＮＰの平均ヘテロ接合性は０．３０である。続いて、ｄＣＨＩＰソフトウェアを使用し、ＳＮＰマイクロアレイ遺伝子チップデータを分析した。
【００８７】
連鎖分析
【００８８】
ｅａｓｙＬＩＮＫＡＧＥ  ｐｌｕｓ  ｖ５．０２を用い、多点Ｘ染色体劣性ノンパラメトリック連鎖を計算した。対立遺伝子頻度は同等と判断された。１ｃＭは、１Ｍｂに等しいと推測された。
【００８９】
候補遺伝子のシーケンシング及び変異分析（ＭＢＮＬ３、ＶＧＬＬ１、ＦＧＦ１３）
【００９０】
周知の遺伝子、発現配列タグ、及びＸｑ２６−ｑ２７に位置する推定上の新規遺伝子を位置付けるため、全米バイオテクノロジー情報センターのＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐ  Ｖｉｅｗｅｒ、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｒｖｅｒ、及びＧｅｎＢａｎｋデータベースが用られた。全米バイオテクノロジー情報センターのヒトゲノム配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索によって、候補配列のエクソン-イントロン境界を決定した。ＰＣＲで機能的候補遺伝子の全てのエクソンを増幅させるため、イントロンプライマー（必要に応じて利用可能なプライマー配列）が使用された。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＰＣＲ産物の配列を決定した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にシーケンシング反応を読み込ませ、ＡＢＩ（登録商標）  ＤＡＴＡ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  バージョン１．１を用いて生じたデータを収集し、続いて、ＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  バージョン３．６ソフトウェアを用いて分析した。シーケンシング及び変異分析は、Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ（トロント、カナダ）で行った。
【実施例２】
【００９１】
実施例２：新規Ｘ連鎖性筋疾患の同定及び特性解析
【００９２】
本研究は、主に姿勢筋のＩ型筋線維に限定される萎縮を明確な特徴とする、軽度のＸ連鎖性ＭＤを発症した家系について説明する最初の研究である。この多世代に亘るオーストリア家系はチェコ共和国を起源とし、今までに６人の生存する罹患者が確認され、検査されている。家系分析（図１）には、遺伝のＸ連鎖パターンが示されている。この家系の６人の患者全員並びに２人の死亡罹患者における臨床的評価から、極めて均一で特徴的な表現型が明らかとなった（表１参照）。全ての対象は、逞しい体格であるように見えたが（図２）、さらなる精密検査によって、他の筋肉が肥大する一方で、姿勢筋の一種の選択的萎縮及びやせが明らかとなった。主に衰弱及び萎縮のある筋肉は、ヒラメ筋、長腓骨筋、前脛骨筋、内側広筋、脊柱起立筋、広背筋下部、及び母指外転筋であった。さらに、全患者に、アキレス腱及びハムストリング筋、短頸、及び頸部の屈曲と伸展が機構上制限される範囲の著しい拘縮が認められた。腱反射、感覚検査、及び精神状態は正常であった。全罹患者において、脊柱側弯症、背痛、歩行障害、及びクレアチンキナーゼ値の上昇が認められた。見せかけの逞しい（ｐｓｅｕｄｏ−ａｔｈｌｅｔｉｃ）筋肉組織は、姿勢筋の萎縮に対する代償性反応とみられる。症状としては、３０歳まで無症状であり、その病気にかかった６人の死亡家系員における死亡年齢は（４５〜７２歳と）様々であったが、ほとんどが原因不明の心疾患で死亡している。家系員の生活スタイルが活動的であるほど、表現型は軽度であり、病気の進行もより遅いようである。
【００９３】
罹患者の筋生検より、姿勢筋における筋線維サイズの変動を伴ったジストロフィー変化、筋持久力型Ｉ型筋線維の変性、脂肪組織及び結合組織の増加、及び多核化した筋節が明らかとなった（図３）。生検筋組織の免疫細胞化学的染色によって、ジストロフィン及びエメリンなどの、常染色体性又はＸ連鎖性ＭＤに関連するタンパク質は欠損していないことが判明した。このことは、本新型ＭＤを識別し象徴する、臨床的且つ明らかな疫学的差異に合致している。ミオシンＡＴＰａｓａ染色により、姿勢筋において、酸化性が高く、解糖能が低い持久力型のＩ型筋線維の緩徐な萎縮が明らかとなった。この病気の初期疾患患者では、Ｉ型及びＩＩ型筋線維は比較的正常に分布しているものの、病気が進むにつれＩ型筋線維が減少し、結果として萎縮したように見える（図４）。特に、中臀筋、大臀筋、上腕二頭筋、上腕三頭筋、前腕、広背筋、及び伸筋などの姿勢筋以外の筋肉は、筋線維分布及び機能の点で正常のようである（表２）。
【００９４】
ジストロフィンタンパク質の特徴的な領域を検出するため、３つの異なる抗体を用いた。染色はかすかであったが罹患者と有意差はなく、ゆえに、この家系は、ＤＭＤの変異型又はＢｅｃｋｅｒ型ＭＤの変異型を現さないことが示唆された。アドハリン染色を行い、それによって、常染色体劣性肢帯ＭＤ２Ｃ（ＬＧＭＤ２Ｃ）、ＬＤＭＤ２Ｄ、ＬＧＭＤ２Ｅ、及びＬＧＭＤ２Ｆが除外された。正常なメロシン染色により、先天性ＭＤが除外された。ジスフェルリン及びカベオリン染色によって、ＬＧＭＤ２Ｂ及びＬＧＭＤ１Ｃがそれぞれ除外された。α−ジストログリカン染色によってＬＧＭＤ１Ｉが除外された。正常なエメリン染色によって、本姿勢ＭＤが異型Ｘ染色体劣性ＥＤＭＤである可能性が取り除かれた。α−サルコグリカン（ＬＧＭＤ２Ｄ）及びスペクトリン（ＳＣＡ５）染色によって、ＬＧＭＤ２Ｄ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型に類似した常染色体劣性ＭＤ）及び脊髄小脳失調症５型（ＳＣＡ５）が除外された。ラミンＡ／Ｃ、デスミン、及び、β−遅筋型ミオシン重鎖の正常な染色により、常染色体優性ＥＤＭＤ２及びＬＧＭＤ１Ｂ（ラミンＡ／Ｃ）、デスミノパチー（ｄｅｓｍｉｎｏｐａｔｈｙ）（デスミン）、及び、遠位型ミオパチーＭＰＤ１（ミオシン）がそれぞれ除外された。筋緊張性ジストロフィー２（ＤＭ２）及び近位型筋緊張性ミオパチー（ＰＲＯＭＭ）も原因因子候補として考えられたが、分子遺伝学的分析により、変異は確認されなかった。
【００９５】
免疫細胞化学的データ及び家系分析により、この家系は、多核性の筋節を示し、Ｘ染色体劣性遺伝型をもつ軽度の筋疾患を現すことが示唆された。この家系の表現型がＤＭＤの変異型やＢｅｃｋｅｒ型ＭＤの変異型である可能性を排除するため、ＤＭＤ遺伝子周辺の５つの多型ＳＴＲマイクロサテライトマーカー、すなわち、ＳＴＲ−４４（ＤＸＳ１２３８）、ＳＴＲ−４５（ＤＸＳ１２３７）、ＳＴＲ−４８（ＤＸＳ９９７）、ＳＴＲ−４９（ＤＸＳ１２３６）、及びＳＴＲ−５０（ＤＸＳ１２３５）を選択及び使用して、ＤＭＤ遺伝子座に対する連鎖分析を行った。罹患者のＤＭＤ遺伝子座の至るところで異なるハプロタイプが明らかとなり、前記遺伝子座は、この家系における原因遺伝子から除外された。遺伝子内マーカーＳＴＲ−４４、ＳＴＲ−４８、ＳＴＲ−４９、及びＳＴＲ−５０の組み換えは明らかであった（図５）。続いて、前記遺伝子内マーカーの及ぶ領域の近位にあるｃＤＮＡをシーケンシングすることにより、ＤＭＤ遺伝子における変異を検査した結果、遺伝子内組み換えが除外された。Ｘ染色体全域のマーカーについて遺伝子型を分析した。Ｘｑ２６−ｑ２７領域において多点ロッドスコアが高い（ロッド＞３）ことが判明し、ＤＭＤ遺伝子座の除外がさらに確実なものとなった。多点ロッドスコアにより、後でＳＮＰ分析で特定される候補区間を囲む領域にとって肯定的で非重要な結果が得られた（図５）。Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（トロント、カナダ）において、５人の罹患者及び３人の非罹患家系員に対する、全ゲノムのＳＮＰ遺伝子型分析を行った。２５０ＫまでのＮｓｐＩ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰマイクロアレイを使用し、続いて行ったｄＣＨＩＰを用いた分析は、Ｘｑ２６−ｑ２７上のある候補領域を関連付けた。その候補領域は、約８５０の連続したＳＮＰを含んでいる。
【００９６】
筋肉中に発現された構造タンパク質をコードするＸｑ２６−ｑ２７の重要な領域に由来する３つの候補遺伝子を検査した。マッスルブラインド（ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ）様タンパク質３（ＭＢＮＬ３）、ベスティジアル（ｖｅｓｔｉｇｉａｌ）様１（ＶＧＬＬｌ）、遺伝子線維芽細胞増殖因子１３（ＦＧＦ１３）は、ゲノムＤＮＡから全て配列決定されたが、コード変異は同定されなかった。
【００９７】
ＦＨＬ１のコード及び５’非翻訳領域（ＮＭ＿００１４４９）のシーケンシングにより、アミノ酸置換Ｃ２２４Ｗをもたらす、６７２位におけるＣからＧへの塩基転換が明らかとなった。この変異は、家系内の疾病状態と共分離され、６人の罹患者全てが半接合であり、全ての絶対保因者（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒｓ）は変異対立遺伝子に対してヘテロ接合であった。この変異は、コーカサス人種とオーストリア人の混血型である対照染色体では検出されなかった。
【００９８】
ＦＨＬ１は、ＬＩＭ−ｏｎｌｙタンパク質の一員であり、共通コンセンサス配列Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１６−２１−Ｈ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１７−Ｃ−Ｘ２−Ｃとともに、ｆｏｕｒ  ａｎｄ  ａ  ｈａｌｆ  ＬＩＭ領域を含んでいる。ＬＩＭ−ｏｎｌｙタンパク質は、細胞シグナリング及び転写調節の役割を果たすことで知られる亜鉛結合タンパク質である。これまでのところ、５つのＦＨＬタンパク質が同定され、ＦＨＬ１〜５は、転写調節として機能することが知られている。
【００９９】
Ｃ２２４Ｗ変異は、亜鉛イオンの中心結合に必要な４つのシステインの１つである、ＦＨＬ１の第４ＬＩＭ領域の高度に保存されたシステインを置換する。亜鉛結合に部分的に関与する保存システインの変異は、タンパク質の三次構造に大きな悪影響を及ぼすとされてきた（Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ、１９９４）。さらに、Ｃ２２４Ｗ変異は、また、選択的に発現されたアイソフォームＦＨＬ１ｂ（ＳＬＩＭＭＥＲ）の第一核局在化シグナル（ＮＬＳ１）に位置しており、それによって、細胞質と核間におけるシャトルからのＦＨＬ１ｂタンパク質の障害がもたらされる可能性がある（Ｂｒｏｗｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｓｅｐ  １７；２７４（３８）：２７０８３−９１）。
【０１００】
ＦＨＬ１は、少なくとも３つの異なるアイソフォーム（ａ、ｂ、及びｃ）を有しており、各アイソフォームの組織特異性は異なっている。Ｃ２２４Ｗ変異は、ＦＨＬ１アイソフォームａ（最も多くみられるアイソフォーム）及びｂに影響するが、アイソフォームｃには影響しない。したがって、当該遺伝子の異なる領域内での変異は、特定のアイソフォームに影響を与えるが、それ以外のアイソフォームには影響せず、ゆえに、異なる表現型の結果を示す。さらに、ＦＨＬ１は、タンパク質内の様々なＬＩＭ領域に結合する多くのタンパク質結合パートナーを有しており、ゆえに、あるＬＩＭ領域の配座に影響する変異は、別のＬＩＭ領域に影響する変異に対して異なる表現型の結果を示し得る。
【０１０１】
概して、本出願人は、新型筋疾患のＸＭＰＭＡに関与する遺伝子であるＦＨＬ１、及びそのコードタンパク質を同定した。このオーストリア家系において述べられている表現型特性、特に、姿勢筋の特異的萎縮及び見せかけの強健性は、ＦＨＬ１のＳＲＦ、ＭｙＢＰＣ１（Ｉ型筋線維特異アイソフォーム）、及びＥＲＫ２結合領域内の変異に対して特異的であるとみられる。遺伝子のその他の場所における変異は、はるかに異種の筋障害性表現型をもたらす。このことは、特に、家族性タイプがＸ連鎖性遺伝を示しており、Ｂｅｃｋｅｒ型／Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型ＭＤ及びＥｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ型ＭＤの遺伝子座が除外された場合、また散発性症例の場合においても、未知の遺伝子的要因による筋ジストロフィー又は筋緊張性ジストロフィー患者（及び保因者）に対する診断的評価、検査、及び遺伝カウンセリングに対してかなりの影響を有している。本実施例に関する追加情報は、Ｗｉｎｄｐａｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８２、８８−９９、２００８年１月号より入手でき、参照することにより本願に組み込まれる。
【実施例３】
【０１０２】
実施例３：筋疾患を発現する英国家系（家系２及び３）
【０１０３】
連続した３世代における４人の男性家系員が、緩徐進行性の臀部及び上肢筋衰弱を示し、発症年齢は３０〜４０代であった。指標となる患者（ｉｎｄｅｘ  ｐａｔｉｅｎｔ）は、顕著な肩帯及び上肢肥大を示し、そのＣＫレベルは１３００Ｕ／ｌまで上昇した。５０代で死亡した２人の患者においては、呼吸不全が報告されている。この英国家系２の家系図を図１Ｂに示す。
【０１０４】
三つ目の家系は、Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーの推定診断を下された家系であって、５世代に渡って６人の女性及び６人の男性が発症している。この英国家系３の家系図を図１Ｃに示す。男性患者の発病年齢は１０代後半〜３０代であり、主な臨床症状は、顕著な翼状肩甲（ｓｃａｐｕｌａｒ  ｗｉｎｇｉｎｇ）を伴う進行性肢帯衰弱であった。３人の患者において、項部／頸部硬直又は衰弱、及びアキレス腱拘縮が報告されたが、筋肉肥大は顕著な特徴ではなかった。ＣＫレベルは１５００〜２２００Ｕ／ｌ程度であった。２人の患者が３０代から車椅子での生活を余儀なくされた。２人の患者の死因は、４０代後半〜５０代での呼吸不全及び心不全であった。女性の変異保因者は、同様ではあるがより軽度の臨床像を呈し、発症は５０代以降であり、ＣＫレベルは上昇してもわずか３００Ｕ／ｌであった。１人の女性患者は、鬱血性心不全により８８歳で死亡した。指標となる患者は、股関節屈筋衰弱（ＭＲＣ４）の初期症状、及び、１３００Ｕ／ｌ程度の血清ＣＫレベルの上昇を３５歳で示した。当時、前記患者は競技野球をしており、非常に逞しい体格であった。その筋肉肥大は、肩甲帯及び上腕筋で顕著であった。また、脊椎硬直によって頸部屈曲の危険性を有していた。前記患者の肺機能は、座位で４．６１のＦＶＣ（９０％）であったが、横位では４．０１（７８％）まで低下した。潜在する骨格筋疾患又は心臓病のさらなる臨床的兆候又は症状はなかった。神経伝導検査及びＥＭＧは正常であった。その外側広筋の筋生検では、Ｉ型筋線維萎縮、最大直径１２５μｍのものも測定されるような筋線維サイズのばらつき、及び、少数の壊死した筋線維がみられた。ジストロフィン糖タンパク質複合体、エメリン、ジスフェルリン、カベオリン、及びカルパインのタンパク質における免疫組織化学的分析、及び、ウエスタンブロット分析は正常であった。ジストロフィン及びエメリンについての遺伝子変異分析では、何の異常も見られなかった。指標となる患者の母方の祖父は、４２歳で歩行に困難を生じ始め、晩年は車椅子を使用していた。彼は、Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーと診断され、呼吸不全のため５２歳で死亡した。彼の２人の甥もまた、Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーと診断され、４０代前半から上下肢に緩徐進行性の筋衰弱を示した。そのうちの１人は、呼吸不全のため５０代で死亡した。
【０１０５】
家系２における指標となる患者のデータ
発病年齢：３５歳
ＣＫ：１３４２Ｕ／Ｌ
ＥＭＧ：正常
筋ＭＲＩ：Ｎ．Ｄ．
初期段階の逞しい体格：はい
筋生検：筋障害性
心臓障害：心臓の評価は正常
頸部及びアキレス腱：短い（ＡＴ）
【０１０６】
（ｐ．Ｐｈｅ１２７＿Ｔｈｒ１２８ｉｎｓＩｌｅに至る）ｃ．３８１＿３８２ｉｎｓＡＴＣ変異が、両家系の指標となる患者において同定され、それは、表現型で分離する。Ｆ１２７＿Ｔ１２８ＩｎｓＩ変異は第２ＬＩＭ領域内で生じており、ゆえに、ＦＨＬ１の全３アイソフォーム、ａ、ｂ、及びｃに存在している。結論として、本願で示されたデータより、この同じＦＨＬ１変異が、Ｘ連鎖劣性又は優勢遺伝の異種表現型を生じさせる可能性がある。
【実施例４】
【０１０７】
実施例４：オーストリアＸＭＰＭＡ家系における心筋症についての研究
【０１０８】
ＸＭＰＭＡの臨床的診断を受けた患者及びそのごく近い親類が、ＸＭＰＭＡの心臓血管調査の研究に参加した。標準１２誘導心電図を臥位で記録した。心エコー検査は、ＧＥ
Ｖｉｖｉｄ７スキャナーを用い、全て１人の技師によって行われた。測定は米国心エコー図学会の規格に従って行い、分析は前記スキャナーのソフトウェアプログラムを用いて行った。測定されたドップラー変数は、ピーク大動脈及びＬＶＯＴ速度、及び、拡張を評価するための僧帽弁通過血流（ｔｒａｎｓｍｉｔｒａｌ  ｆｌｏｗ）であった。歪み及び歪み速度測定は、非ドップラー２Ｄ歪イメージング技術、及び、ＴＤＩ技術を用いて得た。ゲノムＤＮＡ及び血清プロファイル（酵素）は、標準的な手順を用いて血液サンプルから抽出した。その他としては、磁気共鳴像（Ｍａｇｎｅｔ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）；左室生検をともなう心臓カテーテル；トレッドミル検査；ＥＣＧホルターモニタリングも用いた。
【０１０９】
最も共通した異常は、Ｖ４〜Ｖ６におけるＴ波逆転及びその他ＳＴ−Ｔ変化であり、その一部は左心室肥大の兆候である。病理的トレッドミル検査により、全罹患家系員において、ＳＴ波変化及び期外収縮をともなった不整脈がみられた（ホルターＥＣＧはまだ行っていない）。全罹患家系員において、心尖（ａｐｅｘ）に限局し且つ右心室の病変をともなう左心室肥大がみられた。左心室は正常な大きさであり正常収縮であったが、拡張機能に障害を有していた。僧帽弁及びその支持組織では異常は見られず、ＬＶＯＴの勾配もなかった。全ての罹患者が、左心房の拡張及び左心房容積の増加を呈していた。組織速度、歪み速度、及び歪みも減少している。全ての男性罹患者において、血清クレアチニンキナーゼ、ＣＫ−ＭＢ、ＬＤＨ、ＮＴ−ｐｒｏ  ＢＮＰ、Ｔｒｏｐ  Ｔ及び肝臓酵素のレベルが上昇していた。いかなる場合においても限定することを望むものではないが、重要な臨床所見は、Ｄｙｓｐｎｏｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓ  ＩＩの症状を含んでいた。
【０１１０】
全ての引用文献は、参照することにより、本願に組み込まれる。
【０１１１】
本発明は、１つ以上の実施形態について述べられている。しかしながら、請求項に記載された発明の範囲を逸脱することなく多くの変形及び改良が可能であることは、当業者なら言うまでもない。
【０１１２】
参考文献
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Ｈｏ  Ｍ、Ｃｈｅｌｌｙ  Ｊ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｎ、Ｄａｎｅｋ  Ａ、Ｃｒｏｃｋｅｒ  Ｐ、Ｍｏｎａｃｏ  ＡＰ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ＭｃＬｅｏｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｈａｔ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｃｅｌｌ  １９９４；７７：８６９−８８０。
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【０１１３】
ＵＲＬ
全米バイオテクノロジー情報センターＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐ  Ｖｉｅｗｅｒは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍａｐｙｉｅｗ／にて入手可能である。Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｒｖｅｒは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにて入手可能である。ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにて入手可能である。
【０１１４】
【表１】
0005680407.tif 000002
【０１１５】
【表２】
0005680407.tif 000003
0005680407.tif 000004
【図１Ａ】
0005680407.tif 000005
【図１Ｂ】
0005680407.tif 000006
【図１Ｃ】
0005680407.tif 000007
【図５】
0005680407.tif 000008
【図６】
0005680407.tif 000009
【図７−１】
0005680407.tif 000010
【図７−２】
0005680407.tif 000011
【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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