(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に照射された光を、対物レンズを介して観察するための観察光学系と、
前記標本と前記対物レンズとの相対位置を変化させる駆動部の作動を制御することにより、前記対物レンズの焦点を前記標本に対する所望の位置に維持させるオートフォーカス装置と、を有する顕微鏡であって、
前記オートフォーカス装置は、
前記標本に前記対物レンズを介して、前記対物レンズの焦点位置と異なる位置に所定の投影像を形成するフォーカス用照明光学系と、
前記対物レンズを介して前記投影像の前記標本による反射光を受光し、前記投影像の反射像を、光電変換器の撮像面に結像させるフォーカス用結像光学系と、
前記光電変換器で得られた前記反射像の信号に基づいて、前記駆動部の作動を制御するための信号を出力する信号出力部と、を有し、
前記フォーカス用照明光学系は、前記投影像の結像位置を光軸方向に移動させる結像位置調節部材を有し、
前記フォーカス用照明光学系及び前記フォーカス用結像光学系の少なくとも一方に可変絞りを設け、該可変絞りの開口径を前記結像位置調節部材による前記結像位置の移動量に応じて制御することにより、前記フォーカス用照明光学系の開口数及び前記フォーカス用結像光学系の開口数の少なくとも一方を変化可能に構成したことを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
前記結像位置調節部材による前記結像位置の移動量を検出する移動量検出部と、
前記移動量検出部により検出された前記移動量に応じて前記可変絞りの開口径を変化させる制御部と、を有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記結像位置調節部材の作動量を記憶する記憶部と、
前記作動量に応じて前記可変絞りの開口径を変化させる制御部と、を有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記制御部は、前記可変絞りの開口径に応じて、前記フォーカス用照明光学系で前記投影像を形成するためのフォーカス用照明光源の光量を変化させることを特徴とする請求項２又は３に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体中の生物標本を光学顕微鏡（生物顕微鏡）で蛍光観察する場合、観察したい位置に焦点を合わせた後、しばらくすると観察位置が動いてしまい焦点がずれてしまうことがある。この原因としては、標本を乗せたステージと対物レンズとの位置関係が振動や温度などで変化してしまうことなどが挙げられる。長時間観察を行い経時変化を見るタイムラプス観察において、観察の途中で焦点位置が動いてしまうことは大きな問題であった。また短時間の観察であっても、一度蛍光観察を行った位置でもう一度観察を行おうとしたときに、焦点位置が動いてしまっていると改めて焦点調整が必要となってしまうが、蛍光は退色が速く、蛍光像に焦点を合わせている間に像が消えてしまうため、一度調整した観察位置から焦点が動かないように自動追尾するようなオートフォーカス装置が望まれていた。
【０００３】
これまで工業用顕微鏡の分野では、観察位置を反射面としてオートフォーカス用の赤外光を照射し、その反射面から戻ってきた光をシグナルとして追尾して、焦点調整を行い続けることで焦点位置が動かないようにするようなオートフォーカス装置があった。しかしながらこのような構成の装置は、生物用顕微鏡で観察するような反射面を持たない標本に対しては用いることができなかった。そこで、オートフォーカス用の赤外光について焦点位置を調整する調整レンズを導入したオートフォーカス装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。ここでは観察光の焦点位置と、オートフォーカス用の赤外光の焦点位置とを調整レンズ（オフセットレンズ）によりずらし、オートフォーカス用の赤外光の焦点位置を標本とカバーガラスとの界面に合わせ、そこからの反射光をもとにフォーカス調整を行うものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−３２３０９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、最近では標本のより深い位置を見る観察が求められており、また、二光子励起観察などに用いられる高開口数対物レンズにおいては収差の影響を大きく受けるため、前述の調整レンズで観察光の焦点位置とオートフォーカス用の赤外光の焦点位置とを大きくずらしたとき、赤外光の信号強度が弱くなり、オートフォーカス機構がうまく働かなくなってしまうという課題があった。
【０００６】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、高開口数の対物レンズを用いて、標本のより深部を見る観察をするために、標本の任意の位置に対物レンズの焦点を合わせる場合であっても、それに追従し続けるようなオートフォーカス装置を有する顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明に係る顕微鏡は、標本に照射された光を、対物レンズを介して観察するための観察光学系と、標本と対物レンズとの相対位置を変化させる駆動部の作動を制御することにより、対物レンズの焦点を標本に対する所望の位置に維持させるオートフォーカス装置と、を有する顕微鏡であって、オートフォーカス装置は、標本に対物レンズを介して、対物レンズの焦点位置と異なる位置に所定の投影像を形成するフォーカス用照明光学系と、対物レンズを介して投影像の標本による反射光を受光し、投影像の反射像を、光電変換器の撮像面に結像させるフォーカス用結像光学系と、光電変換器で得られた反射像の信号に基づいて、駆動部の作動を制御するための信号を出力する信号出力部と、を有する。
【０００８】
そして、このような顕微鏡において、フォーカス用照明光学系は、投影像の結像位置を光軸方向に移動させる結像位置調節部材を有し、フォーカス用照明光学系及びフォーカス用結像光学系の少なくとも一方に可変絞りを設け、この可変絞りの開口径を前記結像位置調節部材による前記結像位置の移動量に応じて制御することにより、フォーカス用照明光学系の開口数及びフォーカス用結像光学系の開口数の少なくとも一方を変化可能に構成したことを特徴とする。
【０００９】
このような顕微鏡は、結像位置調節部材による結像位置の移動量を検出する移動量検出部と、この移動量検出部により検出された移動量に応じて可変絞りの開口径を変化させる制御部と、を有することが好ましい。
【００１０】
また、このような顕微鏡は、結像位置調節部材の作動量を記憶する記憶部と、作動量に応じて可変絞りの開口径を変化させる制御部と、を有することが好ましい。
【００１１】
また、このような顕微鏡において、制御部は、可変絞りの開口径に応じて、フォーカス用照明光学系で投影像を形成するためのフォーカス用照明光源の光量を変化させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高開口数な対物レンズを用いて標本の深部を観察する際も観察位置を自動追従し続けて、タイムラプス観察や、同じ位置を何度も観察できるような、オートフォーカス制御が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】オートフォーカス装置を有する顕微鏡の光学系及び制御系の構成を示す説明図である。
【図２】液浸系対物レンズ使用時における可変絞りの動作を説明する説明図である。
【図３】乾燥系対物レンズ使用時における可変絞りの動作を説明する説明図である。
【図４】第１実施例に係る顕微鏡の光学系を示す説明図である。
【図５】第２実施例に係る顕微鏡の光学系を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて、本実施形態に係るオートフォーカス装置１を有する顕微鏡１００の構成について説明する。本実施形態に係る顕微鏡１００の光学系は、ステージ１１上にスライドガラス１５を介して載置された標本１８の上部に配置されている観察光学系３と、その側方に配置されたオートフォーカス装置１の光学系であるフォーカス用照明光学系５及びフォーカス用結像光学系７により構成されている。
【００１５】
フォーカス用照明光学系５は、その光軸上に順に、ＬＥＤ光源２０、第１コレクタレンズ２１、スリット板２２、第２コレクタレンズ２３、第１瞳制限マスク２４、可変絞り２、第１ハーフミラー２５、結像位置調節部材である焦点位置調節レンズ８及び可視光カットフィルタ１０が配設されて構成されている。スリット板２２の中央部には長方形の細長いスリット開孔２２ａが形成されており、このスリット板２２は、スリット開孔２２ａの長手方向が図１において紙面に垂直方向に延びるように光軸を中心に配設されている。
【００１６】
このフォーカス用照明光学系５のＬＥＤ光源２０から出射された赤外光（近赤外光）は第１コレクタレンズ２１で集光されてスリット板２２に入射し、標本面（カバーガラス１４と標本１８が浸された媒質との境界面）１８ａと共役位置に配置したスリット板２２のスリット開孔２２ａを通り、第２コレクタレンズ２３で略平行光に変換され、第１瞳制限マスク２４に照射される。第１瞳制限マスク２４は、瞳の半分を遮光するものであり、光軸を中心にスリット状の赤外光の長手方向の中心線にそって半分が遮光されるように配設されている。そして、この第１瞳制限マスク２４を通過した赤外光（図１の赤外光Ｌａ）は、可変絞り２を通過した後、第１ハーフミラー２５に入射する。この第１ハーフミラー２５は、フォーカス用照明光学系５とフォーカス用結像光学系７の光軸が交差する点に配設されており、赤外光（図１のＬａ及びＬｄ）の一部を反射して、他の一部を透過するものであり、後述するように、フォーカス用結像光学系７でも共用されている。
【００１７】
フォーカス用照明光学系５と観察光学系３の光軸が交差する点には、ダイクロイックミラー１６が配設されており、後述するように観察光学系３でも共用されている。ダイクロイックミラー１６は、観察光学系３の観察光路上のアフォーカル系に配設され、赤外光（Ｌａ及びＬｃ）を反射して可視光（図１において破線で示す観察光）を透過する作用をする。第１ハーフミラー２５を透過した赤外光Ｌａは焦点位置調節レンズ８を透過した後、可視光カットフィルタ１０を介して、ダイクロイックミラー１６に入射し下方に反射され（赤外光Ｌｂ）、第１対物レンズ１２によって標本１８に集光されて照射される。すなわち、ＬＥＤ光源２０及びスリット板２２からなるフォーカス用照明光源から放射されるフォーカス用照明光により、このスリット板２２のスリット開孔２２ａの像が第１対物レンズ１２を介して標本１８に照射される。なお、第１対物レンズ１２は、後述するように、観察光学系３でも共用されている。
【００１８】
観察光学系３は、標本１８に近い方から順に、第１対物レンズ１２、ダイクロイックミラー１６、赤外光カットフィルタ１９、第２ハーフミラー１７及び接眼用第２対物レンズ１３が配設されて構成されており、さらに接眼用第２対物レンズ１３の先には図示しないが接眼レンズが配設されて構成されている。また、図示しないが、この顕微鏡１００には、ステージ１１上に載置された標本１８を照明する照明装置が設けられている。この照明装置は、透過型または落射型であり、透過型の照明装置の場合はステージ１１の下方に配置され、落射型の照明装置の場合はステージ１１の上方に配置される。照明装置から照射された可視光は標本１８を透過して観察光となり、第１対物レンズ１２を経て、ダイクロイックミラー１６を透過し、赤外光カットフィルタ１９で赤外光が除去されて、第２ハーフミラー１７に入射する。第２ハーフミラー１７は、観察光の一部を反射して、他の一部を透過するものであり、第２ハーフミラー１７に入射した観察光は、一部が反射され接眼用第２対物レンズ１３及び接眼レンズで標本１８の観察像が結像され、観察に供せれる。
【００１９】
なお、第２ハーフミラー１７を透過した一部の観察光を、カメラ用第２対物レンズ３６とカメラ用リレーレンズ３７を通し、カメラ用ＣＣＤセンサ３８の撮像面に結像させ、カメラ用信号処理部３９で処理して標本１８の画像をモニタ（図示せず）に投影して利用することも可能である。このカメラ用信号処理部３９の動作はＣＰＵ４１により制御される。
【００２０】
次にフォーカス用結像光学系７について説明する。このフォーカス用結像光学系７は、上述のようにフォーカス用照明光学系５によりステージ１１上の標本１８に照射されて反射するスリット状の赤外光（スリット開孔２２ａの投影反射像）を受光するものである。ここで、ステージ１１上の標本１８はカバーガラス１４によって覆われているため、第１対物レンズ１２で結像された赤外光Ｌｂは、カバーガラス１４の表面１４ａやカバーガラス１４と標本１８との境界面（標本面１８ａ）で反射する。カバーガラス１４の表面１４ａや標本面１８ａ等で反射した赤外光は、第１対物レンズ１２で略平行光に変換され（赤外光Ｌｃ）、ダイクロイックミラー１６に入射して側方に反射され（赤外光Ｌｄ）、さらに可視光カットフィルタ１０で可視光（ノイズとなる標本面１８ａからの観察光）が除去された後、焦点位置調節レンズ８を通り、第１ハーフミラー２５に入射する。
【００２１】
第１ハーフミラー２５に入射した赤外光Ｌｄは、上方に一部が反射されフォーカス用結像光学系７に入る。フォーカス用結像光学系７は、光軸に沿って、第１ハーフミラー２５、オートフォーカス用第２対物レンズ２６、オートフォーカス用リレーレンズ２７、第２瞳制限マスク２８、オートフォーカス用リレーレンズ２７、シリンドリカルレンズ２９及び光電変換器であるオートフォーカス用ＣＣＤセンサ３０が配設されて構成されている。第１ハーフミラー２５で反射された赤外光Ｌｄは、オートフォーカス用第２対物レンズ２６で集光して結像光に変換されスリット開孔２２ａの投影反射像を結像する。オートフォーカス用リレーレンズ２７は、オートフォーカス用第２対物レンズ２６によって結像された反射像（赤外光Ｌｅ）をリレーし、シリンドリカルレンズ２９を経て、オートフォーカス用ＣＣＤセンサ３０の撮像面に反射像を再結像する。
【００２２】
なお、第２瞳制限マスク２８は、瞳の半分を遮光するように配設されており、遮光される領域は、上記に述べた第１瞳制限マスク２４によって遮光される領域に対応している。また、シリンドリカルレンズ２９は、所定方向のみに屈折作用を持つレンズであり、赤外光Ｌｅを図１において紙面に垂直方向（スリット像の長手方向）に圧縮して、オートフォーカス用ＣＣＤセンサ３０の撮像面に結像させる作用をする。また、オートフォーカス用ＣＣＤセンサ３０は、複数の受光部が１次元に配列されたラインセンサ、または、２次元に配列されたエリアセンサで構成することが可能である。
【００２３】
オートフォーカス装置１は、オートフォーカス用ＣＣＤセンサ３０で取得したスリット開孔２２ａの投影反射像を、信号出力部であるオートフォーカス用信号処理部３１で処理することにより第１対物レンズ１２の標本１８に対する相対位置を算出し、第１対物レンズ１２の焦点を標本１８に対する所定の位置に一致させるための信号を出力する。そして、ＣＰＵ４１はオートフォーカス用信号処理部３１から出力された信号に基づいて、ステージ駆動部３４又は対物レンズ駆動部３５のフォーカスアクチュエータにより、ステージ１１又は第１対物レンズ１２を光軸方向に移動させることにより、第１対物レンズ１２の焦点面が、標本１８の所望の位置に維持されるように制御する。
【００２４】
以上の説明ではフォーカス用照明光学系５において、ＬＥＤ光源２０から出射した光をスリット板２２のスリット開孔２２ａを通してスリット状にすることによりこのスリット開孔２２ａの像を標本１８に照射している。これは、スポット光とした場合、標本面１８ａ等に段差部分があると、その反射光が散乱して理想的な光量信号を得ることができないためであるが、標本面１８ａ等の状態によってはこのスリット板２２を無くし、上述の方法でＬＥＤ光源２０の像を標本に照射してオートフォーカス制御をすることも可能である。また、第１コレクタレンズ２１はなくても実現可能である。
【００２５】
次に本実施形態に係るオートフォーカス装置１において使用する可変絞り２について説明する。図１において可変絞り２は、第１瞳制限マスク２４と第１ハーフミラー２５の間、つまり、フォーカス用照明光学系５の光路上に位置し、アフォーカル系に配設されている。この可変絞り２は、後述するように焦点位置調節レンズ８により移動されるオートフォーカス用の赤外光の焦点位置（スリット板２２のスリット開孔２２ａの像位置）に応じて開口部の径（開口径）の大きさを変化させる（絞る量を変化させる）ことにより、オートフォーカス用赤外光の開口数を制御するものである。この可変絞り２の作動は、移動量検出部３２により検出されたオートフォーカス用赤外光の焦点位置（スリット板２２のスリット開孔２２ａの像位置）に応じて制御部であるＣＰＵ４１が制御信号を出力し、この制御信号に基づいて駆動部９により制御され、また、それに連動して、同じくＣＰＵ４１で制御されるＬＥＤ光源２０の光量が調整される。例えば可変絞り２を絞ったとき、標本１８に向かうフォーカス用赤外光の光量が少なくなるので、ＬＥＤ光源２０の光量を上げ、オートフォーカス用ＣＣＤセンサ３０に届くシグナルの強度を確保する。なお、ＣＰＵ４１により制御を行うための情報は、メモリ４２に記憶されており、また、観察者による指示は、入力部４３を介してＣＰＵ４１に入力される。また、焦点位置調節レンズ８の作動を、カバーガラス１４と標本１８との界面（標本面１８ａ）から観察面までの距離、標本の屈折率等から算出される作動量（予めメモリ４２等の記憶部に記憶された作動量）を用いてＣＰＵ４１により制御する場合は、移動量検出部３２を設けずに、ＣＰＵ４１による焦点位置調節レンズ８の作動量から可変絞り２及びＬＥＤ光源２０の光量を調整するように構成しても良い。
【００２６】
それでは、可変絞り２の作用について、図２及び図３を用いて説明する。なお図２及び図３ではオートフォーカス用の赤外光を実線もしくは点線で示し、観察光を２重線で示している。
【００２７】
図２は第１対物レンズ１２として液浸用対物レンズを用いたときの観察位置付近を模式的に示したものである。液浸用対物レンズを使用するときは、カバーガラス１４と標本１８との界面（標本面１８ａ）でオートフォーカス用の赤外光を反射させる。図２（ａ）のようにカバーガラス１４からあまり離れていない深さを観察する場合、焦点位置調節レンズ８によってオートフォーカス用の赤外光の焦点位置はカバーガラス１４と標本１８との界面（標本面１８ａ）におかれる。これが図２（ｂ）のようにカバーガラス１４から離れた深い位置を観察する場合、焦点位置調節レンズ８でオートフォーカス用の赤外光の焦点位置を調整しても、第１対物レンズ１２の収差の影響を受けてうまく集光されず、反射光のシグナルが受信できないためにオートフォーカス機構が働かない。これは高開口数の第１対物レンズ１２のときより顕著となる。そこで可変絞り２を絞り、図２（ｃ）のようにオートフォーカス用赤外光の開口数を小さくすることで第１対物レンズ１２の収差の影響を抑え、反射光のシグナルを回復させることができる。
【００２８】
第１対物レンズ１２に乾燥系対物レンズを用いるときも同様のことが言える。図３は乾燥系対物レンズを用いたときの観察位置付近を模式的に示したものである。乾燥系対物レンズを使用するときは、カバーガラス１４と第１対物レンズ１２側の空気層との界面（カバーガラス１４の表面１４ａ）でオートフォーカス用の赤外光を反射させる。この位置で反射させる理由は、カバーガラス１４と標本１８との界面（標本面１８ａ）での反射に比べより大きい屈折率差から、より大きい反射光が得られるためである。図３（ａ）のようにカバーガラス１４からあまり離れていない深さを観察する場合、焦点位置調節レンズ８によってオートフォーカス用の赤外光の焦点位置はカバーガラス１４と空気層との界面（表面１４ａ）におかれる。これが図３（ｂ）のようにカバーガラス１４から離れた深い位置を観察する場合、焦点位置調節レンズ８でオートフォーカス用の赤外光の焦点位置を調整しても、第１対物レンズ１２の収差の影響を受けてうまく集光されず、反射光のシグナルが受信できないためにオートフォーカス機構が働かない。高開口数の第１対物レンズ１２のときこれはより顕著となる。そこで可変絞り２を絞り、図３（ｃ）のようにオートフォーカス用赤外光の開口数を小さくすることで第１対物レンズ１２の収差の影響を抑え、反射光のシグナルを回復させることができる。
【実施例】
【００２９】
本実施形態に係るオートフォーカス装置１において、図１に示す可変絞り２は、フォーカス用照明光学系５の第２コレクタレンズ２３より略平行となった赤外光の光路上に配置した場合を示しているが、フォーカス用結像光学系７の第１ハーフミラー２５とオートフォーカス用第２対物レンズ２６との間の略平行光束中にも配置できる。以下、それぞれの場合の実施例について説明する。
【００３０】
［第１実施例］
図４は、本実施形態に係るオートフォーカス装置１を有する顕微鏡１００の光学系の第１実施例を示している。なお、図４においてはオートフォーカス用の赤外光を実線で示し、観察光を点線で示している。この第１実施例において、可変絞り２は第１瞳制限マスク２４と第１ハーフミラー２５との間、つまり、フォーカス用照明光学系５の光路上に位置し、アフォーカル系に配設されている。この図４には、可変絞り２を絞ると標本位置付近におけるオートフォーカス用赤外光の開口数が小さくなる様子が表されている。なお、図４は、説明に関係しない構成要素は省略している。
【００３１】
ここで、第１対物レンズ１２として液浸用対物レンズ使用時にカバーガラス１４と標本１８との界面（標本面１８ａ）から標本内側に、焦点位置調節レンズ８で２５μｍと５０μｍだけずらした位置に観察面を設定した場合における、可変絞り２のそれぞれの絞り量について表１に示す。なお、この表１において、ｆｏは対物レンズの焦点距離、ＮＡｏは対物レンズの開口数を示している。
【００３２】
【表１】
0005655617.tif 000002
【００３３】
可変絞り２を開放した場合（オートフォーカス用赤外光の開口数は使用する対物レンズの開口数に相当）、オートフォーカス用赤外光の信号は第１対物レンズ１２の収差による劣化でピークが検出できない。そこで可変絞り２を絞り、カバーガラス１４と標本１８との界面（標本面１８ａ）に照射されるオートフォーカス用赤外光の開口数が、深さが２５μｍのときは０．９５、深さが５０μｍのときは０．８０にそれぞれなるよう調整する。
【００３４】
この場合、可変絞り２が絞られたことによるオートフォーカス用赤外光の光量の低下をＬＥＤ光源２０の光量を変化させることで調整する。ＬＥＤ光源２０からの光量は可変絞り２の開孔の面積、即ち開口数ＮＡの２乗に比例するので、ＮＡｏ＝１．４０の対物レンズの使用時における開口数ＮＡを０．９５、０．８０に絞った場合、光量は、可変絞り２を絞る前の光量を１とすると、それぞれ２．１７、３．０６となる。また、ＮＡｏ＝１．３８の対物レンズの使用時における開口数ＮＡを０．９５、０．８０に絞った場合、光量は、可変絞り２を絞る前の光量を１とすると、それぞれ２．１１、２．９８となる。さらに、ＮＡｏ＝１．３０の対物レンズの使用時における開口数ＮＡを０．９５、０．８０に絞った場合、光量は、可変絞り２を絞る前の光量を１とすると、それぞれ２．０９、２．６４となる。これによりオートフォーカス用赤外光の信号はオートフォーカス機構が働くのに十分な程度まで回復し、観察位置を追従しながらの観察が可能になる。このとき、上記絞り量よりも絞る量が大きすぎると焦点深度が深くなるため焦点位置合せの精度が落ちてしまう他、信号のピークがなだらかになることにより焦点調整速度が遅くなってしまう。逆に、上記絞り量よりも絞る量が小さすぎると信号が回復し切らず、オートフォーカス機構がうまく働かない。ここで、絞り量が大きいとは開口数を小さくすること、絞り量が小さいとは開口数の低下量が小さいことに対応する。
【００３５】
次に、第１対物レンズ１２として乾燥系対物レンズ使用時にカバーガラス１４と空気層との界面（表面１４ａ）から標本内側に、焦点位置調節レンズ８で１７０μｍと２２０μｍだけずらした位置に観察面を設定した場合における、可変絞り２のそれぞれの絞り量について表２に示す。ただし、１７０μｍとはカバーガラス１４の厚さに相当し、ずらした位置の前者はカバーガラス１４と標本１８との界面（標本面１８ａ）、後者はカバーガラス１４と標本１８との界面（標本面１８ａ）から標本内側に５０μｍ進入した位置となる。なお、この表２において、ｆｏは対物レンズの焦点距離、ＮＡｏは対物レンズの開口数を示している。
【００３６】
【表２】
0005655617.tif 000003
【００３７】
可変絞り２を開放した場合（オートフォーカス用赤外光の開口数は使用する対物レンズの開口数に相当）、オートフォーカス用赤外光の信号は第１対物レンズ１２の収差による劣化でピークが検出できない。そこで可変絞り２を絞り、カバーガラス１４と空気層との界面（表面１４ａ）に照射されるオートフォーカス用赤外光の開口数が、深さが１７０μｍのときは０．６０、深さが２２０μｍのときは０．５０にそれぞれなるよう調整する。
【００３８】
この場合、可変絞り２が絞られたことによるオートフォーカス用赤外光の光量の低下を、ＬＥＤ光源２０の光量を変化させることで調整する。ＬＥＤ光源２０からの光量は、可変絞り２の開孔の面積、即ち開口数ＮＡの２乗に比例するので、ＮＡｏ＝０．８５の対物レンズの使用時における開口数ＮＡを０．６０、０．５０に絞った場合、光量は、可変絞り２を絞る前の光量を１とすると、それぞれ２．０１、２．８９となる。また、ＮＡｏ＝０．７５の対物レンズの使用時における開口数ＮＡを０．６０、０．５０に絞った場合、光量は、可変絞り２を絞る前の光量を１とすると、それぞれ１．５６、２．２５となる。これによりオートフォーカス用赤外光の信号はオートフォーカス機構が働くのに十分な程度まで回復し、観察位置を追従しながらの観察が可能になる。このとき、上記絞り量よりも絞る量が大きすぎると焦点深度が深くなるため焦点位置合せの精度が落ちてしまう他、信号のピークがなだらかになることにより焦点調整速度が遅くなってしまう。逆に、上記絞り量よりも絞る量が小さすぎると信号が回復し切らず、オートフォーカス機構がうまく働かない。ここで、絞り量が大きいとは開口数を小さくすること、絞り量が小さいとは開口数の低下量が小さいことに対応する。
【００３９】
なお、可変絞り２の位置は、上述の第１瞳制限マスク２４と第１ハーフミラー２５との間に限定されず、スリット板２２からダイクロイックミラ−１６までの光路上であればどこに配置しても良い。
【００４０】
［第２実施例］
本実施形態に係るオートフォーカス装置１を有する顕微鏡１００の光学系の第２実施例を図５に示す。この図５において、可変絞り２′は第１ハーフミラー２５とオートフォーカス用第２対物レンズ２６との間、つまり、フォーカス用結像光学系７の光路上に位置し、アフォーカル系に配設されている。可変絞り２′を絞るとカバーガラス１４で反射したオートフォーカス用赤外光のうち、開口数が小さい成分のみがフォーカス用結像光学系７に届く様子が表されている。なお、この第２実施例において、使用する第１対物レンズ１２と可変絞り２′の絞り量との関係については、第１実施例における第１対物レンズ１２と可変絞り２の絞り量との関係に等しく、それぞれ表１、表２と同様になる。
【００４１】
以上の第１及び第２実施例に示すように、可変絞を配置する位置（フォーカス用照明光学系５又はフォーカス用結像光学系７）に対応してフォーカス用照明光の開口数及び反射光の開口数の少なくとも一方を変化可能に構成することにより、高開口数な第１対物レンズ１２を用いて標本の深部を観察する際も観察位置を自動追従し続けて、タイムラプス観察や、同じ位置を何度も観察できるようなオートフォーカス制御が可能なオートフォーカス装置１を実現することができる。
【符号の説明】
【００４２】
１  オートフォーカス装置    ２，２′  可変絞り
５  フォーカス用照明光学系    ７  フォーカス用結像光学系
８  焦点位置調節レンズ（結像位置調節部材）
１２  第１対物レンズ（対物レンズ）    １８  標本
２０  ＬＥＤ光源（フォーカス用照明光源）
２２  スリット板（フォーカス用照明光源）
３０  オートフォーカス用ＣＣＤセンサ（光電変換器）
３１  オートフォーカス用信号処理部（信号出力部）
３２  移動量検出部    ３４  ステージ駆動部    ３５  対物レンズ駆動部
４１  ＣＰＵ（制御部）    ４２  メモリ（記憶部）    １００  顕微鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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