(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロースを用いて植物の栄養増殖を行うことを特徴とする植物の長期維持方法。
【請求項２】
請求項１に記載の植物の長期維持方法であって、
前記トレハロースを含む培地を用いて植物の栄養増殖を行うことを特徴とする植物の長期維持方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の植物の長期維持方法であって、
前記植物が、種子増殖による後代系統において形質転換当代の遺伝的特性が維持できない植物であることを特徴とする植物の長期維持方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物の長期維持方法であって、
前記植物が、トレニア属またはキク属であることを特徴とする植物の長期維持方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物の長期維持方法であって、スクロースを用いて培養して発根した状態で前記トレハロースを用いて植物の栄養増殖を行う、または、腋芽を複数含む節から葉を取り除いた状態で前記トレハロースを用いて植物の栄養増殖を行うことを特徴とする植物の長期維持方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の長期維持方法、例えば、遺伝子組換え植物等の、種子増殖による後代系統において形質転換当代の遺伝的特性が維持できない植物の栄養増殖において植物を長期に維持する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え花き等の遺伝子組換え植物は、例えば、培地等を用いた栄養増殖（挿し芽）により培養、維持、管理される。遺伝子組換え花きの多くは、遺伝的に固定されていない栽培種を材料に用いているため、栄養増殖での維持管理に多大な時間、経費、労力を必要とする。例えば、遺伝子組換え花きとしてトレニアを培養、維持する場合、スクロースを炭素源として用いる従来の培地では短期間（例えば最長３０日程度）しか培養物を維持することができず、新たな培地に植え替える必要があった。また、遺伝子組換えによる有用花きの作出等では、常時数千系統にも及ぶ大量の培養物を維持する必要があるため、維持期間が短いと多大な時間、経費、労力を必要とする。このような遺伝子組換え植物等の、遺伝的に固定されていない、あるいは自家不和合性等の性質により、種子増殖による後代系統において形質転換当代の遺伝的特性が維持できない植物全般において、培養物として維持する際の時間、経費、労力等を低減することが求められている。
【０００３】
一方、トレハロースは、植物ではイワヒバ、動物ではネムリユスリカ等で見られる、いわゆる「乾燥休眠」を担う（細胞の構造維持と保護によって乾燥ストレス耐性を付与する）糖として知られている（例えば、特許文献１参照）他、野菜、果実等の鮮度維持（例えば、特許文献２参照）や変色抑制、タンパク質変性やデンプン老化の抑制、耐凍性の付与（例えば、特許文献３参照）や吸湿抑制等、動植物に様々な機能性を付与することが知られている。その代謝系や輸送系、あるいは機能性に関する研究はこれまでに多数行われているが、植物培養における炭素源としての利用については、報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−０５５８３２号公報
【特許文献２】特開２０００−１１６３１９号公報
【特許文献３】特開平１０−０２５２０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、植物の栄養増殖において、植物を長期に維持することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、トレハロースを用いて植物の栄養増殖を行う植物の長期維持方法である。
【０００７】
また、前記植物の長期維持方法において、前記トレハロースを含む培地を用いて植物の栄養増殖を行うことが好ましい。
【０００８】
また、前記植物の長期維持方法において、前記植物が、種子増殖による後代系統において形質転換当代の遺伝的特性が維持できない植物であることが好ましい。
【０００９】
また、前記植物の長期維持方法において、前記植物が、トレニア属またはキク属であることが好ましい。
【００１０】
また、前記植物の長期維持方法において、スクロースを用いて培養して発根した状態で前記トレハロースを用いて植物の栄養増殖を行う、または、腋芽を複数含む節から葉を取り除いた状態で前記トレハロースを用いて植物の栄養増殖を行うことが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明では、トレハロースを用いることにより、植物の栄養増殖において、植物を長期に維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例１−１および比較例１−１における挿し芽７０日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図２】本発明の実施例１−１および比較例１−１における挿し芽７０日目の培養物を容器の底面から観察した様子を示す図である。
【図３】本発明の実施例１−２および比較例１−２における挿し芽４０日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図４】本発明の実施例１−５および比較例１−５における挿し芽４０日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図５】本発明の実施例３−１および比較例３−１における挿し芽９８日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図６】本発明の実施例３−１および比較例３−１における挿し芽１５７日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図７】本発明の実施例３−２および比較例３−２における挿し芽９８日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図８】本発明の実施例３−２および比較例３−２における挿し芽１５７日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図９】本発明の実施例４および比較例４における挿し芽７０日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図１０】本発明の実施例５および比較例５における挿し芽８５日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図１１】本発明の実施例５および比較例５における挿し芽１４４日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図１２】本発明の実施例６および比較例６における挿し芽７１日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図１３】本発明の実施例６および比較例６における挿し芽１３０日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図１４】本発明の実施例７および比較例７における挿し芽７１日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図１５】本発明の実施例７および比較例７における挿し芽１３０日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【図１６】本発明の実施例８における２回目の植え継ぎ２５日目の培養物を観察した様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１４】
本発明者らは、植物の栄養増殖において、培地で通常用いられるスクロースをトレハロースに置き換えることにより、培養物の維持期間を例えば２倍以上に延長できることを見出した。これにより、培養物の長期維持が可能であり、継代間隔の長期化が可能となる。例えば、遺伝子組換え植物等の、遺伝的に固定されていない、あるいは自家不和合性等の性質により、種子増殖による後代系統において形質転換当代の遺伝的特性が維持できない植物全般において、培養物として維持する際の時間、経費、労力等を、１回の植え継ぎで維持できる期間をできるだけ長くすることで低減することができる。また、遺伝子組換え植物等の系統（遺伝的特性）を維持しての長期の培養が可能となる。さらに、遺伝子組換えによる有用花き等の遺伝子組換え植物の作出において、数千系統にも及ぶ大量の培養物を維持する場合であっても、時間、経費、労力を削減することができる。
【００１５】
本実施形態に係る植物の長期維持方法において用いられるトレハロースは、２つのα−グルコースが１，１−グリコシド結合した二糖類の一種である。トレハロースを用いることにより、栄養増殖における根圏環境の改善や養水分吸収のストレス低減等が培養物の長期維持に繋がると考えられる。トレハロースを用いると、根圏ではむしろ植物体の生育が抑制され、結果として老廃物の蓄積とこれによる老化等が抑制されて、培養環境の長期維持に繋がると考えられる。
【００１６】
トレハロースとしては、試薬等として入手可能なものを用いてもよいし、例えば、「お米にトレハ」（（株）Ｈ＋Ｂライフサイエンス製、トレハロース含有率９０％（ｗ／ｗ）、乾燥重量での含有率９８％（ｗ／ｗ））等の食品添加用のトレハロース製品を用いてもよい。
【００１７】
ここで、植物の栄養増殖とは、胚、種子を経由せずに根、茎、葉等の栄養器官から、次の世代の植物が繁殖する無性生殖である。栄養増殖の方法としては、トレハロースを用いればよく、特に制限はないが、例えば、寒天培地を用いる方法、液体培地を用いる方法、土への挿し芽による方法等が挙げられ、植物体を一定環境で無菌的に維持する等の観点から寒天培地を用いる方法が好ましい。
【００１８】
培地としては、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）培地、Ｂ５（Ｇａｍｂｏｒｇ'ｓ  Ｂ５）培地、Ｋａｎｏ培地等にトレハロースを含有させたものを用いることができる。
【００１９】
培地を用いる場合、トレハロースの含有量は、例えば、培地の全重量に対して、０．１％（ｗ／ｖ）以上６％（ｗ／ｖ）以下の範囲、通常は３％（ｗ／ｖ）程度である。
【００２０】
培地にはトレハロースの他に、例えば、スクロース、マルトース、フルクトース、グルコース等を含有させてもよい。
【００２１】
例えば、培養および維持対象の植物の節、腋芽、葉、不定芽等を含む地上部の栄養組織片を切り出し、トレハロースを含む培地に置床し、これを例えば１０℃〜３５℃、通常は２０℃〜２５℃の温度範囲で、光量子束密度を例えば０μｍｏｌ／ｍ2／秒〜２，０００μｍｏｌ／ｍ2／秒、通常は８０μｍｏｌ／ｍ2／秒〜１６０μｍｏｌ／ｍ2／秒の範囲とし、例えば０時間明期／２４時間暗期〜２４時間明期／０時間暗期、通常は１６時間明期／８時間暗期〜８時間明期／１６時間暗期で培養すればよい。
【００２２】
本実施形態における植物の長期維持方法により、栄養増殖が行われる植物としては、特制限はなく、トレハロースを用いることにより、長期維持性が向上する植物が挙げられる。このような植物としては、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよい。双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目が挙げられる。また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目等が挙げられる。
【００２３】
このような植物のより具体的な例としては、例えば、ナタネ、ジャガイモ、ホウレンソウ、大豆、キャベツ、レタス、トマト、カリフラワー、さやいんげん、かぶ、大根、ブロッコリー、メロン、オレンジ、スイカ、ネギ、ゴボウ等の各種の食用植物、バラ、キク、あじさい、カーネーション、トレニア等の（花き）園芸植物、ニチニチソウ、イチイ、オウレン、ハナビシソウ、キハダ、オタネニンジン、ケシ、イカリソウ、ベラドンナ、チョウセンアサガオ、Cephaelis ipecacuanha等の薬用植物、ライラック、ナナカマド、ユーカリ、マングローブ、スギ等の樹木等が挙げられる。
【００２４】
本実施形態に係る植物の長期維持方法は、例えば、遺伝子組換え花き等の遺伝子組換え植物等の、遺伝的に固定されていない、あるいは自家不和合性等の性質により、種子増殖による後代系統において形質転換当代の遺伝的特性が維持できない植物全般の栄養増殖に適用される。そのような植物の大量の培養物を維持する場合でも、培養物の長期維持が可能であり、継代間隔の長期化が可能となり、また、遺伝子組換え植物等の系統を維持しての長期の培養が可能となる。遺伝子組換え植物としては、例えば、キク、バラ、カーネーション、シクラメン、リンドウ、トルコギキョウ、アサガオ、ペチュニア、トレニア等の遺伝子組換え花き、イネ、ジャガイモ、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、ナタネ、タバコ等の作物、ポプラ、ユーカリ、マツ、リンゴ、パパイヤ、サクラなどの樹木等が挙げられる。本実施形態に係る植物の長期維持方法を適用することにより、より有用な遺伝子組換え植物等を作出するための開発を、時間、経費、労力を削減して行うことができる。その他、非遺伝子組換え植物でも例えばシクラメン、ラン等の大量に培養、栄養増殖される植物に適用できる。
【００２５】
トレニアは、インドシナ原産のアゼトウガラシ科トレニア属の一年草である。トレニアは、草丈を小さく育てられる（例えば、最小７ｃｍ程度で開花）、挿し芽で簡単に維持、増殖できる、花が咲くまでの期間が短い、日長に関係なくプラントボックスのような湿度の高い栽培条件でも正常に開花する、２倍体（２ｎ＝１６または１８）でゲノムサイズが小さい（１７０Ｍｂｐ程度=シロイヌナズナとほぼ同等）、遺伝子組換えの手法が確立されている等の特徴を有し、本実施形態に係る植物の長期維持方法が好適に適用される。
【００２６】
キクは、キク科キク属の植物である。キクは、商業的な価値が高く需要も大きい、花色等の研究材料として古くから用いられている、挿し芽で簡単に維持、増殖できる、幅広い栽培品種で遺伝子組換えの手法が確立されている等の点で、本実施形態に係る植物の長期維持方法が好適に適用される。
【００２７】
本実施形態における植物の栄養増殖において、例えば、スクロース培地等の培地を用いて、所定の期間培養して、幼植物を得て、この幼植物より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、トレハロース培地に置床して、培養を行ってもよい。このスクロース培地等からトレハロース培地に移す際に、一部の挿し芽に挿し芽の茎切断面からの一過的かつ急激なトレハロースの吸い上げによると思われる一過的な葉の黄化や萎凋が見られる場合がある。これについては、特に１回目の植え継ぎにおいて、スクロースを用いて培養して発根した状態でトレハロースを用いて植物の栄養増殖を行う、または、腋芽を複数含む節から葉を取り除いた状態でトレハロースを用いて植物の栄養増殖を行うことが好ましい。例えば、１）挿し芽をスクロース培地で３日〜１４日、好ましくは１週間程度培養し、発根した状態でトレハロースに移す、あるいは２）腋芽を複数含む節から葉を全て取り除いた状態で挿し芽する、のいずれかの方法を用いることで改善することができる。これにより、急激なトレハロースの吸い上げが抑制され、一過的な葉の黄化や萎凋等を抑制することができる。
【００２８】
トレハロース培地における挿し芽植物の初期生育はスクロース培地等と比較するとやや劣る傾向にあり、特にスクロース培地からトレハロース培地に葉を除いた節の状態で移行させたキク等でその差が顕著である。この差は、２回目以降の植え継ぎ（トレハロース培地で一度育てたものをトレハロース培地に植え継ぐ）では小さくなる傾向があるものの、完全に同等とはならない傾向にあるため、植物種や使用目的（例えば、培養の長期維持が目的なのか、材料の短期間での育生が重要なのか等）等によって使い分けることが好ましい。
【００２９】
また、トレハロース培地で初期生育の速度が遅いことは培養物の長期維持に少なからず寄与しているものと考えられるが、維持期間の延長度合いの割に植物体の大きさの差がわずかであることを考えると、炭素源の枯渇までの時間が延長されたことよりもむしろ、トレハロースの持つ植物の活性を維持する、あるいは向上させる何らかの働きの結果、長期維持が可能となったと推察される。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
＜実施例１−１＞
３％（ｗ／ｖ）のスクロース（和光純薬製一級試薬）を含む１／２ＭＳスクロース培地（組成：１／２ＭＳ培地  ｐＨ５．７、３％  スクロース、０．３８％  ゲランガム）を用いて、２５日間培養してトレニア幼植物（クラウンバイオレット（紫花系統））を得た。このトレニア幼植物より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、３％（ｗ／ｖ）のトレハロース（和光純薬製一級試薬）を含む１／２ＭＳトレハロース培地（組成：１／２ＭＳ培地  ｐＨ５．７、３％  トレハロース、０．２％  ゲランガム）に置床した。これを２５℃、光量子束密度８５μｍｏｌ／ｍ2／秒、１６時間明期／８時間暗期で培養し、植物体の生育と萎凋の状況を観察した。最大７５日まですべてのトレニアの植物体を健全に維持することができた。また、実際の挿し芽による植物の維持でも、継代間隔を従来の倍以上の７０日としてもトレニアの植物体を健全に維持することができた。
【００３２】
＜比較例１−１＞
トレハロースの代わりに、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む１／２ＭＳスクロース培地を用いた以外は、実施例１−１と同様にして培養を行った。最大３０日までしかトレニアの植物体を健全に維持することができなかった。また、実際の挿し芽による植物の維持では、２５日ごとの植え継ぎが必要であった。
【００３３】
図１に実施例１−１および比較例１−１の挿し芽７０日目の培養物を観察した様子を示す。また、図２には培養物を容器の底面から観察した様子を示す。図１，２の右側がトレハロースを用いた実施例１−１のトレニアの植物体であり、左側がスクロースを用いた比較例１−１のトレニアの植物体である。
【００３４】
図１からわかるように、トレハロースを用いた実施例１−１のトレニアの植物体では、挿し芽７０日目でも健全な状態を維持しており、地上部からの異的な出根も少なかった。一方、スクロースを用いた比較例１−１のトレニアの植物体では、植物の萎凋が進んでおり、地上部からの異的な出根が多かった。また、図２からわかるように、トレハロースを用いた実施例１−１のトレニアの植物体では、挿し芽７０日目でも根の密度が低く健全な状態を維持している。一方、スクロースを用いた比較例１−１のトレニアの植物体では、根の密度が高く、ポリフェノール類の蓄積と思われる培地の褐変が確認された。比較例１−１における培地の褐変は、挿し芽４０日目以降に明確に確認された。実施例１−１のようにトレハロースを用いることにより、根圏環境の改善や養水分吸収のストレス低減が培養物の長期維持に繋がっていると考えられる。
【００３５】
＜実施例２＞
トレハロースの代わりに、３％（ｗ／ｖ）の「お米にトレハ」（Ｈ＋Ｂライフサイエンス製、食品添加用のトレハロース製品、トレハロース含有率９０％（ｗ／ｗ））を含む１／２ＭＳ培地を用いた以外は、実施例１−１と同様にして培養を行った。最大７５日まですべてのトレニアの植物体を健全に維持することができた。また、実際の挿し芽による植物の維持でも、継代間隔を従来の倍以上の７０日としてもトレニアの植物体を健全に維持することができた。
【００３６】
このようにトレハロースを用いてトレニアの栄養増殖を行うことにより、従来から常用されているスクロースを用いた場合に比べて、培養物の維持期間を２倍以上に延長することができた。これにより、培養物の長期維持が可能であり、継代間隔の長期化が可能となった。トレニア等の遺伝子組換え植物等の系統を維持しての長期の培養が可能となり、大量の培養物を維持する場合であっても、時間、経費、労力をほぼ半減することができた。このようなトレハロースを用いて植物の栄養増殖を行う植物の長期維持方法は、例えば、遺伝的に固定されていない、あるいは自家不和合性等の性質により、種子増殖による後代系統において形質転換当代の遺伝的特性が維持できない植物全般に適用可能である。
【００３７】
＜実施例１−２〜１−５、比較例１−２〜１−５＞
トレニアとして、「クラウンバイオレット」の代わりに、「クラウンバーガンディ」（実施例１−２、比較例１−２）、「クラウンブルー」（実施例１−３、比較例１−３）、「クラウンレモンドロップ」（実施例１−４、比較例１−４）、匍匐性の「サマーウェーブブルー」（実施例１−５、比較例１−５）を用いた以外は、それぞれ実施例１−１、比較例１−１と同様にして、培養を行った。
【００３８】
トレハロースを用いた実施例１−２〜１−５のトレニアの植物体では、最大７０日まですべてのトレニアの植物体を健全に維持することができた。一方、スクロースを用いた比較例１−２〜１−５のトレニアの植物体では、最大４０日までしか維持できなかった。
【００３９】
図３に実施例１−２および比較例１−２の挿し芽４０日目の培養物を観察した様子を示す。図３の左側２つがトレハロースを用いた実施例１−２のトレニア「クラウンバーガンディ」の植物体であり、右側２つがスクロースを用いた比較例１−２のトレニア「クラウンバーガンディ」の植物体である。また、図３の下側には培養物を容器の底面から観察した様子を示す。図４に実施例１−５および比較例１−５の挿し芽４０日目の培養物を観察した様子を示す。図４の左側２つがトレハロースを用いた実施例１−５のトレニア「サマーウェーブブルー」の植物体であり、右側２つがスクロースを用いた比較例１−５のトレニア「サマーウェーブブルー」の植物体である。また、図４の下側には培養物を容器の底面から観察した様子を示す。
【００４０】
図３，４からわかるように、トレハロースを用いた実施例１−２，１−５のトレニアの植物体では、挿し芽４０日目でも健全な状態を維持していた。一方、スクロースを用いた比較例１−２，１−５のトレニアの植物体では、植物の萎凋がやや進んでいた。
【００４１】
＜実施例３−１〜３−４、比較例３−１〜３−４＞
トレニアの代わりに、キク「セイマリン」（実施例３−１、比較例３−１）、「大平」（実施例３−２、比較例３−２）、「神馬」（実施例３−３、比較例３−３）、二倍体のキクタニギク実験系統「猿沢−１」（実施例３−４、比較例３−４）を用いた以外は、それぞれ実施例１−１、比較例１−１と同様にして、培養を行った。
【００４２】
トレハロースを用いた実施例３−１のキク「セイマリン」の植物体では、最大１４０日まですべてのキクの植物体を健全に維持することができた。一方、スクロースを用いた比較例３−１のキク「セイマリン」の植物体では、最大７０日までしか維持できなかった。トレハロースを用いた実施例３−２のキク「大平」の植物体では、最大１６０日まですべてのキクの植物体を健全に維持することができた。一方、スクロースを用いた比較例３−２のキク「大平」の植物体では、最大９０日までしか維持できなかった。トレハロースを用いた実施例３−３のキク「神馬」の植物体では、最大４８０日まですべてのキクの植物体を健全に維持することができた。一方、スクロースを用いた比較例３−３のキク「神馬」の植物体では、最大１１２日までしか維持できなかった。トレハロースを用いた実施例３−４のキク「猿沢−１」の植物体では、最大４８０日まですべてのキクの植物体を健全に維持することができた。一方、スクロースを用いた比較例３−４のキク「猿沢−１」の植物体では、最大１１２日までしか維持できなかった。
【００４３】
図５，６に実施例３−１および比較例３−１の挿し芽９８日目、１５７日目の培養物を観察した様子をそれぞれ示す。図５，６の上側がトレハロースを用いた実施例３−１のキク「セイマリン」の植物体であり、下側がスクロースを用いた比較例３−１のキク「セイマリン」の植物体である。図７，８に実施例３−２および比較例３−２の挿し芽９８日目、１５７日目の培養物を観察した様子をそれぞれ示す。図７，８の上側がトレハロースを用いた実施例３−２のキク「大平」の植物体であり、下側がスクロースを用いた比較例３−２のキク「大平」の植物体である。
【００４４】
図５，６からわかるように、トレハロースを用いた実施例３−１のキク「セイマリン」の植物体では、挿し芽９８日目でも健全な状態を維持しており、挿し芽１５７日目でも健全な状態をほぼ維持していた。一方、スクロースを用いた比較例３−１のキク「セイマリン」の植物体では、挿し芽９８日目で植物の萎凋が進んでいた。また、図７，８からわかるように、トレハロースを用いた実施例３−２のキク「大平」の植物体では、挿し芽１５７日目でも健全な状態をほぼ維持していた。一方、スクロースを用いた比較例３−１のキク「大平」の植物体では、挿し芽９８日目で植物の萎凋が進んでいた。
【００４５】
＜実施例４＞
キク「セイマリン」の幼植物より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、スクロース培地（組成：１／２ＭＳ培地  ｐＨ５．７、３％  スクロース、０．３８％  ゲランガム）を用いて１週間培養して発根した状態とした後、トレハロース培地を用いて培養した以外は、実施例１−１と同様にして、培養を行った。
【００４６】
＜比較例４＞
キク「セイマリン」の幼植物より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、スクロース培地（組成：１／２ＭＳ培地  ｐＨ５．７、３％  スクロース、０．３８％  ゲランガム）を用いて１週間培養して発根した状態とした後、スクロース培地を用いて培養した以外は、比較例１−１と同様にして、培養を行った。
【００４７】
図９に実施例４および比較例４の挿し芽７０日目の培養物を観察した様子をそれぞれ示す。図９の左側がスクロース培地を用いて培養して発根した状態とした後、トレハロース培地を用いて培養した実施例４のキク「セイマリン」の植物体であり、右側がスクロース培地を用いて培養して発根した状態とした後、スクロース培地を用いて培養した比較例４のキク「セイマリン」の植物体である。
【００４８】
図９からわかるように、スクロース培地を用いて培養して発根した状態とした後、トレハロース培地を用いて培養した実施例４のキク「セイマリン」の植物体では、挿し芽７０日目でも健全な状態を維持していた。一方、スクロース培地を用いて培養して発根した状態とした後、スクロース培地を用いて培養した比較例４のキク「セイマリン」の植物体では、植物の萎凋が進んでいた。
【００４９】
＜実施例５＞
キク「セイマリン」の幼植物より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、腋芽を複数含む節から葉を全て取り除いた状態でトレハロース培地を用いて培養した以外は、実施例１−１と同様にして、培養を行った。
【００５０】
＜比較例５＞
キク「セイマリン」の幼植物より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、腋芽を複数含む節から葉を全て取り除いた状態でスクロース培地を用いて培養した以外は、比較例１−１と同様にして、培養を行った。
【００５１】
図１０，１１に実施例５および比較例５の挿し芽８５日目、１４４日目の培養物を観察した様子をそれぞれ示す。図１０，１１の上側がトレハロース培地を用いて培養した実施例５のキク「セイマリン」の植物体であり、下側がスクロース培地を用いて培養した比較例５のキク「セイマリン」の植物体である。
【００５２】
図１０，１１からわかるように、トレハロース培地を用いて培養した実施例５のキク「セイマリン」の植物体では、挿し芽１４４日目でも健全な状態を維持していた。一方、スクロース培地を用いて培養した比較例５のキク「セイマリン」の植物体では、１４４日目では植物の萎凋が進んでいた（挿し芽１００日前後にほぼ枯死した）。
【００５３】
このように、キク「セイマリン」では、特に、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、腋芽を複数含む節から葉を全て取り除いた状態でトレハロース培地を用いて培養する手法を用いることで、培養の維持期間をさらに延長することが可能となった。
【００５４】
＜実施例６、比較例６＞
実施例１−１と同様にして得たトレニア「クラウンバイオレット」の幼植物より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、３％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む１／２ＭＳトレハロース培地（組成：１／２ＭＳ培地、３％  トレハロース、０．３８％  ゲランガム）のｐＨを４．６，５．０，５．４，５．８，６．２と変えたものをそれぞれ用いて、実施例１−１と同様にして培養を行った（実施例６）。また、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む１／２ＭＳスクロース培地のｐＨを４．６，５．０，５．４，５．８，６．２と変えたものをそれぞれ用いて、実施例１−１と同様にして培養を行った（比較例６）。
【００５５】
図１２，１３に実施例６の挿し芽７１日目、１３０日目の培養物を観察した様子をそれぞれ示す。図１２，１３の上側がトレハロース培地を用いて培養した実施例６のトレニア「クラウンバイオレット」の植物体であり、下側がスクロース培地を用いて培養した比較例６のトレニア「クラウンバイオレット」の植物体である。
【００５６】
＜実施例７、比較例７＞
実施例３−１と同様にして得たキク「セイマリン」の幼植物より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、３％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む１／２ＭＳトレハロース培地のｐＨを４．６，５．０，５．４，５．８，６．２と変えたものをそれぞれ用いて、実施例１−１と同様にして培養を行った（実施例７）。また、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む１／２ＭＳスクロース培地のｐＨを４．６，５．０，５．４，５．８，６．２と変えたものをそれぞれ用いて、実施例１−１と同様にして培養を行った（比較例７）。
【００５７】
図１４，１５に実施例７の挿し芽７１日目、１３０日目の培養物を観察した様子をそれぞれ示す。図１４，１５の上側がトレハロース培地を用いて培養した実施例７のキク「セイマリン」の植物体であり、下側がスクロース培地を用いて培養した比較例７のキク「セイマリン」の植物体である。
【００５８】
図１２〜１５からわかるように、トレハロース培地による培養物の長期維持効果は、トレニア「クラウンバイオレット」およびキク「セイマリン」のいずれにおいても、通常の１／２ＭＳ培地の作製法（ｐＨ緩衝剤を用いない）で培地の初期ｐＨを４．６〜６．２の範囲で変化させてもほぼ安定であり、効果にほとんど差異がないことを確認した。ただし、スクロース培地を用いた場合でも、初期ｐＨによる差異はほとんど確認されなかったので、初期ｐＨによる効果にほとんど差異がないことは、植物自体のｐＨ緩衝能によるものと思われる。
【００５９】
＜実施例８＞
実施例３−１と同様にして「トレハロース培地」を用いて得た挿し芽７２日目のキク「セイマリン」より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、トレハロース培地を用いて培養した。また、比較例３−１と同様にして「スクロース培地」を用いて得た挿し芽２８日目のキク「セイマリン」より、節を含む地上部の栄養組織片を切り出し、スクロース培地を用いてそれぞれ培養した。なお、このとき用いた挿し芽７２日目のキク「セイマリン」と挿し芽２８日目のキク「セイマリン」とは、植物体サイズと植え継いだ穂のサイズはほぼ同等であった。
【００６０】
図１６に実施例８の植え継ぎ２５日目の培養物を観察した様子を示す。図１６の右側がトレハロース培地を用いて培養したキクの植物体であり、左側がスクロース培地を用いて培養したキクの植物体である。
【００６１】
図１６からわかるように、２回目以降の植え継ぎでは初期生育の差が小さくなる傾向となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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