(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測する方法であって、該方法が、肺腺癌を、その亜型であるＴＲＵ型又は非ＴＲＵ型のいずれかに識別し、次いでＴＲＵ型であると識別された場合、ＴＲＵ型肺腺癌をさらにＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型のいずれかに識別し、ＴＲＵ-ｂ型であれば術後予後が良好である、或いは、ＴＲＵ-ａ型又は非ＴＲＵ型であれば術後予後が不良であると評価することを含み、ここで、該ＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型及びＴＲＵ-ｂ型については、該患者の生物学的試料中の下記の各遺伝子セットから選択された１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定し、非ＴＲＵ型肺腺癌と比べてＴＲＵ型肺腺癌において該遺伝子セットのＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいという指標を用いて肺腺癌をＴＲＵ型肺腺癌であると識別し、一方、ＴＲＵ型肺腺癌と比べて非ＴＲＵ型肺腺癌において該遺伝子セットの非ＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいという指標を用いて肺腺癌を非ＴＲＵ型肺腺癌であると識別する、或いは、ＴＲＵ-ｂ型肺腺癌と比べてＴＲＵ-ａ型肺腺癌において該遺伝子セットのＴＲＵ-ａ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいという指標を用いて肺腺癌をＴＲＵ-ａ型肺腺癌であると識別し、一方、ＴＲＵ-ａ型肺腺癌と比べてＴＲＵ-ｂ型肺腺癌において該遺伝子セットのＴＲＵ-ｂ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいという指標を用いて肺腺癌をＴＲＵ-ｂ型肺腺癌であると識別する、ならびに、
該ＴＲＵ型に属する遺伝子セットが、配列番号１〜１９５のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子である、
該非ＴＲＵ型に属する遺伝子セットが、配列番号１９６〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜２８６のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子である、
該ＴＲＵ-ａ型に属する遺伝子セットが、配列番号４，２，９，３，５，８，１６，３７，７，１８，１０，３１，１２，２８７，２８，２８８，８１，２６，４１，６，２４，５４，３４，２１，２８９，１０５，３８，２９０，５８，１２７，３２，１２８，３５，５３，８３，２７，６２，１５，１０６，２２，２９１，７４，１６１，１８７，３６，７６，４８，３０，１５７，１１４，４６，５９，４３，７５，１３４，９７，１５４，２９２，２９３，１１０，６３，４２，４５，１７９，１２６，１２３，７１，３３，１７０，１３３，８６，５５，４４，１９０，１５６，１８６，４９，８５，５２，１４１，１２５，９１，１８０，９６，１８３，１６０，６７，１００，２９４，８２，８８，９５，９３，１２４，１６４，１０２，１１７，２９５，２９６，１１６，２９７，１６５，１７５，１３７，２９８，１１９，１０３，２９９，３００，３０１，１７７，１４３，３０２，３０３，３０４，８０，３０５，３０６，３０７のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子である、および、
該ＴＲＵ-ｂ型に属する遺伝子セットが、配列番号３０８〜３１６，１６８，３１７〜３３４，１７８，３３５〜３４３，７０，１７３，３４４〜３４９，１４２，３５０，３５１，１８８のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子である、
ことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記遺伝子の発現レベルが、該遺伝子に対応する核酸又はタンパク質の存在もしくは量を測定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子の発現レベルが、ハイブリダイゼーション法によって測定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハイブリダイゼーション法が、マイクロアレイ法又はブロット法である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子の発現レベルが、免疫学的方法によって測定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫学的方法が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＲＵ型肺腺癌において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子が突然変異を含む場合、野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む肺腺癌と比べて患者の術後予後が不良であると予測することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
肺腺癌を、ＴＲＵ型又は非ＴＲＵ型のいずれかの亜型に分類し、次いでＴＲＵ型をＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型に分類する方法であって、該方法が、患者の生物学的試料中の下記の各遺伝子セットから選択された１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定し、非ＴＲＵ型肺腺癌と比べてＴＲＵ型肺腺癌において該遺伝子セットのＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいという指標を用いて肺腺癌をＴＲＵ型肺腺癌に分類し、一方、ＴＲＵ型肺腺癌と比べて非ＴＲＵ型肺腺癌において該遺伝子セットの非ＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいという指標を用いて肺腺癌を非ＴＲＵ型肺腺癌に分類する、或いは、ＴＲＵ-ｂ型肺腺癌と比べてＴＲＵ-ａ型肺腺癌において該遺伝子セットのＴＲＵ-ａ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいという指標を用いて肺腺癌をＴＲＵ−ａ型肺腺癌に分類し、一方、ＴＲＵ-ａ型肺腺癌と比べてＴＲＵ-ｂ型肺腺癌において該遺伝子セットのＴＲＵ-ｂ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいという指標を用いて肺腺癌をＴＲＵ−ｂ型肺腺癌に分類することを含み、ただし、
（ａ）該ＴＲＵ型に属する遺伝子セットが、配列番号１〜１９５のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子である、
（ｂ）該非ＴＲＵ型に属する遺伝子セットが、配列番号１９６〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜２８６のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子である、
（ｃ）該ＴＲＵ−ａ型に属する遺伝子セットが、配列番号４，２，９，３，５，８，１６，３７，７，１８，１０，３１，１２，２８７，２８，２８８，８１，２６，４１，６，２４，５４，３４，２１，２８９，１０５，３８，２９０，５８，１２７，３２，１２８，３５，５３，８３，２７，６２，１５，１０６，２２，２９１，７４，１６１，１８７，３６，７６，４８，３０，１５７，１１４，４６，５９，４３，７５，１３４，９７，１５４，２９２，２９３，１１０，６３，４２，４５，１７９，１２６，１２３，７１，３３，１７０，１３３，８６，５５，４４，１９０，１５６，１８６，４９，８５，５２，１４１，１２５，９１，１８０，９６，１８３，１６０，６７，１００，２９４，８２，８８，９５，９３，１２４，１６４，１０２，１１７，２９５，２９６，１１６，２９７，１６５，１７５，１３７，２９８，１１９，１０３，２９９，３００，３０１，１７７，１４３，３０２，３０３，３０４，８０，３０５，３０６，３０７のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子である、
（ｄ）該ＴＲＵ-ｂ型に属する遺伝子セットが、配列番号３０８〜３１６，１６８，３１７〜３３４，１７８，３３５〜３４３，７０，１７３，３４４〜３４９，１４２，３５０，３５１，１８８のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子である、
ことを含む前記方法。
【請求項９】
前記遺伝子の発現レベルが、ハイブリダイゼーション法によって測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーション法が、マイクロアレイ法又はブロット法である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１のヌクレオチド配列又はその配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子の発現を検出することができる複数の核酸であって、
（１）配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１に示されるヌクレオチド配列、
（２）配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（３）前記（１）又は（２）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（４）前記（１）、（２）又は（３）のいずれかのヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、並びに、
（５）前記（１）、（３）又は（４）のヌクレオチド配列の１５塩基から全塩基数未満の部分配列、
からなる群から選択される配列を有する該複数の核酸、或いは該遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体又はそのタンパク質結合断片の複数、を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって、肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測するための又は肺腺癌をＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型のいずれかの亜型に分類するための組成物。
【請求項１２】
配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１のヌクレオチド配列又はその配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子の発現を検出することができる複数の核酸であって、
（１）配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１に示されるヌクレオチド配列、
（２）配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（３）前記（１）又は（２）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（４）前記（１）、（２）又は（３）のいずれかのヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、並びに、
（５）前記（１）、（３）又は（４）のヌクレオチド配列の１５塩基から全塩基数未満の部分配列、
からなる群から選択される配列を有する該複数の核酸、或いは該遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体又はそのタンパク質結合断片の複数、を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって、肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測するための又は肺腺癌をＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型のいずれかの亜型に分類するためのキット。
【請求項１３】
配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１のヌクレオチド配列又はその配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子の発現を検出することができる複数の核酸であって、
（１）配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１に示されるヌクレオチド配列、
（２）配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（３）前記（１）又は（２）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（４）前記（１）、（２）又は（３）のいずれかのヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、並びに、
（５）前記（１）、（３）又は（４）のヌクレオチド配列の１５塩基から全塩基数未満の部分配列、
からなる群から選択される配列を有する該複数の核酸を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって、肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測するための又は肺腺癌をＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型のいずれかの亜型に分類するためのＤＮＡチップ。
【請求項１４】
配列番号１〜２５５,２５７〜２８０,２８２〜３５１のヌクレオチド配列又はその配列と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体又はそのタンパク質結合断片の複数を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって、肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測するための又は肺腺癌をＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型のいずれかの亜型に分類するためのタンパク質アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺腺癌患者の術後予後を予測するための方法及び組成物に関する。
本発明はまた、肺腺癌をその亜型に分類する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、先進諸国において癌関連死亡原因のトップである（非特許文献１、２）。現在、腫瘍の分類は、大きく、顕微鏡観察による組織学的特徴に基づいているが、一方、特定の組織型の中でさえ臨床判定の著しい変化がときどき明らかとなるし、また腺癌が最も高い度合いの形態学的及び臨床的多様性を示すことが知られている（非特許文献３）。それゆえ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、特に腺癌、を分類するためのより詳細で精確かつ目的にあった手段が、病因のより良い理解だけでなく今日の不適切な診断能を改善してより有効な治療法を実施可能にするために大いに期待されている。
【０００３】
最近のマイクロアレイ技術の開発は、種々の臨床パラメーターと、個々の症例の遺伝子発現プロファイルとを相関させることを可能にしている（非特許文献４〜９）。今日まで、本発明者らのグループを含む種々の他のグループが、発現プロファイリングがＮＳＣＬＣの形態学的分類を再現できることを報告しているし、また、いくつかの研究により、腺癌がさらに亜分類可能であることが示されている（非特許文献１０〜１３）。
【０００４】
しかしながら、これまで報告されたこれらの亜分類の結果は、互いにかなり食い違っており、それらの知見に単純に順応することは難しいし、また何らかの明確な結論を得ることも難しい。従来の発現プロファイリング研究は、発現プロファイルと基本的な遺伝子変化との関係について非常に少ない情報しか提供しないということも指摘しなければならない（非特許文献１４）。そのような情報は、本来、肺癌の病因を明らかにするうえで重要であることが知られている。
【０００５】
ところで、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性化型突然変異の発見は、肺癌研究の分野で今日最も注目に値する知見の１つである（非特許文献１５及び１６）。ＥＧＦＲ変異は肺腺癌のサブセットに存在し（非特許文献１５〜２０）、この突然変異を有する腫瘍がゲフィチニブ(ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ；選択的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤；例えばＩｒｅｓｓａＴＭ)に高度に感受性であることが示されている（非特許文献１５〜１７、１９）。ゲフィチニブに対する良好な臨床応答は、日本人や他のアジア民族の女性の非喫煙腺癌患者において最も高頻繁に観察されている（非特許文献２１、２２）。本発明者らはまた、ＥＧＦＲ変異が、末梢気道上皮細胞由来と形態学的に考えられる肺腺癌、いわゆる終末気道単位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｕｎｉｔ；  ＴＲＵ）型腺癌で高頻度に検出されることを報告した（非特許文献２３、２４）。
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｉｎｎａ  ＪＤら（編集），  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１６版），  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ２００１，  ｐｐ５０６−５１６
【非特許文献２】Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，  Ｍｉｎｉｓｔｅｒ’ｓ  Ｓｅｃｒｅｔａｒｉａｔ：  Ｖｉｔａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  ２００１  Ｖｏｌ．  ３，  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｌａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ，  Ｊａｐａｎ，  ２００３，  ｐｐ３８４−４１１
【非特許文献３】Ｔｒａｖｉｓ  ＷＤら，  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ，  ｐｌｅｕｒａ，  ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ，  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ，  Ｌｙｏｎ，  ＩＡＲＣ  ｐｒｅｓｓ，  ２００４
【非特許文献４】Ｐｅｒｏｕ  ＣＭら，  ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７４７−５２，  ２０００
【非特許文献５】Ａｌｉｚａｄｅｈ  ＡＡら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−１１，  ２０００
【非特許文献６】Ｓｈｉｐｐ  ＭＡら，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：６８−７４，  ２００２
【非特許文献７】Ｓｉｎｇｈ  Ｄら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １：２０３−９，  ２００２
【非特許文献８】ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ  ＬＪら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０−６，  ２００２
【非特許文献９】Ｈｅｄｅｎｆａｌｋ  Ｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：２５３２−７，  ２００３
【非特許文献１０】Ｇａｒｂｅｒ  ＭＥら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１３７８４−９，  ２００１
【非特許文献１１】Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ  Ａら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１３７９０−５，  ２００１
【非特許文献１２】Ｂｅｅｒ  ＤＧら，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：８１６−２４，  ２００２
【非特許文献１３】Ｔｏｍｉｄａ  Ｓら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：５３６０−７０，  ２００４
【非特許文献１４】Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  Ｍら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：３２１９−２６，  ２００５
【非特許文献１５】Ｐａｅｚ  ＪＧら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１４９７−５００，  ２００４
【非特許文献１６】Ｌｙｎｃｈ  ＴＪら，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：２１２９−３９，  ２００４
【非特許文献１７】Ｐａｏ  Ｗら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３３０６−１１，  ２００４
【非特許文献１８】Ｋｏｓａｋａ  Ｔら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：８９１９−２３，  ２００４
【非特許文献１９】Ｍｉｔｓｕｄｏｍｉ  Ｔら，  Ｊ  ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：２５１３−２０，  ２００５
【非特許文献２０】Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  Ｈら，  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９７：３３９−４６，  ２００５
【非特許文献２１】Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｍら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２１：２２３７−４６，  ２００３
【非特許文献２２】Ｋｒｉｓ  ＭＧら，  Ｊａｍａ  ２９０：２１４９−５８，  ２００３
【非特許文献２３】Ｙａｔａｂｅ  Ｙら，  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２９：６３３−６３９，  ２００５
【非特許文献２４】Ｙａｔａｂｅ  Ｙら，  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ２６：７６７−７３，  ２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、実際の臨床の場においては、ヒト肺癌は臨床的・病理学的な病型分類に基づいて診断されていた。すなわち、従来の診断は、顕微鏡観察による形態学的診断に頼ることとなるため、客観性に欠けるとともに、患者の予後についての情報はきわめて限定的であった。また、網羅的・系統的発現プロファイルに基づく診断の試みも、肺癌の発生、進展に密接に関わる遺伝子異常がもっているはずの情報を、発現プロファイルと統合的に解析し有用な形で診断に取り込むことができていなかった。
【０００８】
このような状況において、本発明者らは、９０例の腺癌を含む１４９のＮＳＣＬＣ症例において、広範囲の発現プロファイルと、ＥＧＦＲ、ｐ５３及びＫ−ｒａｓの突然変異状態とを同時に分析し、遺伝子的かつ臨床病理学的にともに関連する発現プロファイルによって規定される分類法を確立することを目的とした。
【０００９】
さらに、本発明者らは、この分類法を用いて、肺腺癌で同定された２つの主要な亜型の１つ（ＴＲＵ型）において、有意に高い罹患率と、ＥＧＦＲ突然変異の明瞭な予後への影響を明らかにすることを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願において、本発明者らはヒト肺癌の網羅的な遺伝子解析によって同定した４つの遺伝子セットを見出し、これらのセットを用いることによって肺腺癌が、その発現プロファイルに基づいて客観的に臨床的にも分子生物学的にも意味のある２つの主要な群に大別でき、さらにそのうちうちの１つの群は２つの亜群に分けられることを見出した。
【００１１】
このような知見に基づいて、さらに研究を進めた結果、これらの遺伝子セットを用いることによって、肺腺癌をもつ患者の術後予後の予測を可能とするとともに、肺癌の発生・進展に重要な役割を担うＥＧＦＲ遺伝子の変異と予後との関連性を検出することに成功した。このような新しい知見により、ＮＳＣＬＣ、特に肺腺癌の治療法の決定に重要な情報を提供することが可能になった。
【００１２】
したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
【００１３】
本発明は、第１の態様において、  肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測する方法であって、該方法が、肺腺癌を、その亜型であるＴＲＵ型又は非ＴＲＵ型のいずれかに識別し、次いでＴＲＵ型であると識別された場合、ＴＲＵ型肺腺癌をさらにＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型のいずれかに識別し、ＴＲＵ-ｂ型であれば術後予後が良好である、或いは、ＴＲＵ-ａ型又は非ＴＲＵ型であれば術後予後が不良であると判定することを含み、ここで、該ＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型及びＴＲＵ-ｂ型は、該患者の生物学的試料中の下記の対応する遺伝子セットの１又は２以上の遺伝子について、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌の間、又はＴＲＵ-ａ型腺癌とＴＲＵ-ｂ型腺癌の間、の相対的発現レベルの差を測定することによって識別される、ならびに、
該ＴＲＵ型に属する遺伝子セットが、下記のユニジーン（ＵｎｉＧｅｎｅ）登録番号：
Hs.512690、Hs.153322、Hs.218366、Hs.220629、Hs.436996、Hs.435759、Hs.104555、Hs.247824、Hs.127821、Hs.480281、Hs.529117、Hs.545862、Hs.391561、Hs.479372、Hs.533055、Hs.550526、Hs.322854、Hs.465720、Hs.356664、Hs.26630、Hs.534496、Hs.85962、Hs.211267、Hs.128041、Hs.534458、Hs.495774、Hs.437806、Hs.133062、Hs.501758、Hs.444535、Hs.495480、Hs.326561、Hs.483906、Hs.169943、Hs.271285、Hs.158339、Hs.62604、Hs.469359、Hs.436657、Hs.8417、Hs.155538、Hs.533526、Hs.512756、Hs.87191、Hs.463079、Hs.513779、Hs.476209、Hs.279580、Hs.351544、Hs.269408、Hs.134807、Hs.482417、Hs.176626、Hs.465643、Hs.183390、Hs.411299、Hs.234027、Hs.109358、Hs.103983、Hs.26216、Hs.534352、Hs.240457、Hs.516036、Hs.144875、Hs.411312、Hs.103989、Hs.537722、Hs.333130、Hs.517962、Hs.90250、Hs.478930、Hs.121629、Hs.194061、Hs.520627、Hs.348012、Hs.522836、Hs.1376、Hs.520049、Hs.512856、Hs.355236、Hs.349470、Hs.476231、Hs.137556、Hs.390567、Hs.368353、Hs.412792、Hs.449207、Hs.527095、Hs.118722、Hs.377090、Hs.232696、Hs.447544、Hs.372773、Hs.222055、Hs.511839、Hs.153299、Hs.434374、Hs.287729、Hs.553740、Hs.127189、Hs.497723、Hs.181973、Hs.173656、Hs.451956、Hs.184507、Hs.532492、Hs.370904、Hs.460468、 Hs.520612、Hs.436667、Hs.125116、Hs.459391、Hs.450320、Hs.149769、Hs.325890、Hs.356820、Hs.289319、Hs.73893、Hs.129493、Hs.515069、Hs.34560、Hs.477278、Hs.351571、Hs.112087、Hs.154224、Hs.125950、Hs.438016、Hs.367956、Hs.553778、Hs.329266、Hs.479658、Hs.458713、Hs.249196、Hs.467529、Hs.145061、Hs.49653、Hs.129227、Hs.313343、Hs.194554、Hs.123114、Hs.126561、Hs.42091、Hs.369385、Hs.98661、Hs.458306、Hs.148584、Hs.501684、Hs.422466、Hs.523732、Hs.525557、Hs.1372、Hs.379097、Hs.208124、Hs.389311、Hs.2561、Hs.117545、Hs.446388、Hs.2813、Hs.473894、Hs.502092、Hs.524479、Hs.314261、Hs.382306、Hs.458252、Hs.380222、Hs.379636、Hs.302034、Hs.253495、Hs.345877、Hs.259563、Hs.528569、Hs.152337、Hs.436317、Hs.546408、Hs.46700、Hs.1027、Hs.151219、Hs.279611、Hs.310456、Hs.520319、Hs.406976、Hs.181245、Hs.449621、Hs.515465、Hs.310540、Hs.554891、Hs.449601、Hs.355394、Hs.380710、Hs.171995、Hs.449585、Hs.522484、Hs.298023、Hs.520339、Hs.121443を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体である、
該非ＴＲＵ型に属する遺伝子セットが、下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.62661、Hs.200804、Hs.533185、Hs.461329、Hs.479270、Hs.446201、Hs.35086、Hs.500761、Hs.44298、Hs.469030、Hs.309767、Hs.441047、Hs.98309、Hs.31409、Hs.518299、Hs.532870、Hs.196534、Hs.108106、Hs.289319、Hs.69771、Hs.374378、Hs.369422、Hs.368641、Hs.302963、Hs.530461、Hs.1955、Hs.513726、Hs.148767、Hs.523220、Hs.525796、Hs.271264、Hs.69321、Hs.231367、Hs.500761、Hs.528304、Hs.148685、Hs.87417、Hs.164060、Hs.514843、Hs.418416、Hs.126521、Hs.519839、Hs.103834、Hs.279840、Hs.497741、Hs.531457、Hs.226390、Hs.480143、Hs.473721、Hs.369762、Hs.514527、Hs.204238、Hs.3104、Hs.519873、Hs.519909、Hs.179718、Hs.103183、Hs.520210、Hs.444683、Hs.234545、Hs.80976、Hs.311187、Hs.89497、Hs.444118、Hs.541635、Hs.477898、Hs.511776、Hs.434886、Hs.117299、Hs.252451、Hs.468058、Hs.21554、Hs.165904、Hs.445244、Hs.413924、Hs.99120、Hs.521171、Hs.462379、Hs.481860、Hs.489207、Hs.414407、Hs.505575、Hs.516826、Hs.62180、Hs.368934、Hs.530509、Hs.278906、Hs.511987、Hs.444082、Hs.471873、Hs.24583を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体である、
該ＴＲＵ-ａ型に属する遺伝子セットが、下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.220629、Hs.153322、Hs.127821、Hs.218366、Hs.436996、Hs.247824、Hs.550526、Hs.62604、Hs.104555、Hs.465720、Hs.480281、Hs.495480、Hs.545862、Hs.1051、Hs.133062、Hs.115263、Hs.349470、Hs.495774、Hs.155538、Hs.435759、Hs.128041、Hs.465643、Hs.169943、Hs.534496、Hs.379010、Hs.184507、Hs.469359、Hs.2012、Hs.109358、Hs.438016、Hs.326561、Hs.367956、Hs.271285、Hs.176626、Hs.137556、Hs.437806、Hs.240457、Hs.533055、Hs.532492、Hs.85962、Hs.268698、Hs.520627、Hs.524479、Hs.449585、Hs.158339、Hs.522836、Hs.279580、Hs.444535、Hs.446388、Hs.149769、Hs.513779、Hs.103983、Hs.512756、Hs.348012、Hs.467529、Hs.434374、Hs.389311、Hs.49653、Hs.424542、Hs.436667、Hs.516036、Hs.533526、Hs.463079、Hs.310456、Hs.125950、Hs.351571、Hs.478930、Hs.483906、Hs.259563、Hs.249196、Hs.412792、Hs.183390、Hs.87191、Hs.171995、Hs.117545、Hs.554891、Hs.351544、Hs.368353、Hs.482417、Hs.126561、Hs.154224、Hs.232696、Hs.520319、Hs.153299、Hs.449621、Hs.502092、Hs.537722、Hs.127189、Hs.525589、Hs.476231、Hs.527095、Hs.511839、Hs.372773、Hs.112087、Hs.458252、Hs.181973、Hs.289319、Hs.25333、Hs.513075、Hs.356820、Hs.549577、Hs.380222、Hs.46700、Hs.129227、Hs.100431、Hs.129493、Hs.173656、Hs.9613、Hs.301478、Hs.553740、Hs.151219、Hs.369385、Hs.525383、Hs.473721、Hs.375624、Hs.355236、Hs.116724、Hs.9613、Hs.418055を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体である、および、
該ＴＲＵ-ｂ型に属する遺伝子セットが、下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.334873、Hs.180878、Hs.126521、Hs.519033、Hs.187636、Hs.518448、Hs.322761、Hs.31409、Hs.524513、Hs.253495、Hs.436437、Hs.148989、Hs.279575、Hs.75668、Hs.470791、Hs.104476、Hs.494496、Hs.517549、Hs.278906、Hs.498586、Hs.183617、Hs.499758、Hs.350065、Hs.511138、Hs.150793、Hs.129174、Hs.212606、Hs.275775、Hs.279611、Hs.496414、Hs.436142、Hs.282984、Hs.32417、Hs.69321、Hs.414629、Hs.502618、Hs.405755、Hs.480143、Hs.90250、Hs.436317、Hs.60371、Hs.283683、Hs.208093、Hs.336768、Hs.116459、Hs.131673、Hs.42091、Hs.32417、Hs.75812、Hs.355394を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体である、
ことを特徴とする、前記方法を提供する。
【００１４】
本明細書中、ＴＲＵ（終末気道単位；ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｕｎｉｔ）とは、肺のなかでもとくに末梢に位置する気道上皮からなる単位であり、それらの構成単位から発生した或いはそれらと類似の性格を持つ腺癌をＴＲＵ型腺癌と称する。また、非ＴＲＵ型腺癌は、ＴＲＵ型以外の亜型を指す。
【００１５】
本明細書中、術後予後とは、肺腺癌の手術後の患者の予後を、代表的には術後５年時点での生存率で判定することを意味する。予後は、癌の転移と深く関係しており、予後不良とは、癌の浸潤性、転移性又は進行度が高いことを意味し、一方、予後良好又は予後良とは、そのような浸潤性、転移性又は進行度が低いことを意味する。
【００１６】
本明細書中、前記遺伝子の変異体とは、例えば突然変異、遺伝子多型、選択的スプライシングなどの生物学的事象、遺伝暗号の縮重などに起因して生じる変異体を包含する。変異体は、前記遺伝子の本来のヌクレオチド配列上に１又は複数の置換、欠失、付加、挿入などの変異を有するものである。
【００１７】
本明細書中、同族体とは、生物種が異なるなどの理由のために前記遺伝子と部分的に配列が異なるが、該遺伝子と同一の生物学的機能又は作用を有することから同一のファミリーに属する核酸を指す。
【００１８】
変異体及び同族体は、前記対応する遺伝子の各々とヌクレオチドレベルで７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する。ここで、同一性（％）は、ギャップを導入した公知のＢＬＡＳＴプラグラムを用いて決定することができる。一般に、全塩基数に対する一致した塩基数の百分率として同一性（％）を算出できる。
【００１９】
本明細書中、誘導体とは、塩基の化学的修飾を含む前記遺伝子を指し、そのような化学的修飾には、例えばメチル化、アセチル化、チオ化、カルボキシメチル化、メトキシ化などが含まれる。
【００２０】
本明細書中、患者とは、ヒト、イヌ、ネコを含む哺乳動物を指し、好ましい哺乳動物はヒトである。
【００２１】
本発明の一の実施形態において、前記ＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.512690、Hs.153322、Hs.218366、Hs.220629、Hs.436996、Hs.435759、Hs.104555、Hs.247824、Hs.127821、Hs.480281、Hs.529117、Hs.545862、Hs.391561、Hs.479372、Hs.533055、Hs.550526、Hs.322854、Hs.465720、Hs.356664、Hs.26630、Hs.534496、Hs.85962、Hs.211267、Hs.128041、Hs.534458、Hs.495774、Hs.437806、Hs.133062、Hs.501758、Hs.444535、Hs.495480、Hs.326561、Hs.483906、Hs.169943、Hs.271285、Hs.158339、Hs.62604、Hs.469359、Hs.436657、Hs.8417、Hs.155538、Hs.533526、Hs.512756、Hs.87191、Hs.463079、Hs.513779、Hs.476209、Hs.279580、Hs.351544、Hs.269408、Hs.134807、Hs.482417、Hs.176626、Hs.465643、Hs.183390、Hs.411299、Hs.234027、Hs.109358、Hs.103983、Hs.26216、Hs.534352、Hs.240457、Hs.516036、Hs.144875、Hs.411312、Hs.103989、Hs.537722、Hs.333130、Hs.517962、Hs.90250、Hs.478930、Hs.121629、Hs.194061、Hs.520627、Hs.348012、Hs.522836、Hs.1376、Hs.520049、Hs.512856、Hs.355236、Hs.349470、Hs.476231、Hs.137556、Hs.390567、Hs.368353、Hs.412792、Hs.449207、Hs.527095、Hs.118722、Hs.377090、Hs.232696、Hs.447544、Hs.372773、Hs.222055、Hs.511839、Hs.153299、Hs.434374、Hs.287729、Hs.553740、Hs.127189、Hs.497723、Hs.181973、Hs.173656、Hs.451956、Hs.184507、Hs.532492、Hs.370904、Hs.460468、 Hs.520612、Hs.436667、Hs.125116、Hs.459391、Hs.450320、Hs.149769、Hs.325890、Hs.356820、Hs.289319、Hs.73893、Hs.129493、Hs.515069、Hs.34560、Hs.477278、Hs.351571、Hs.112087、Hs.154224、Hs.125950、Hs.438016、Hs.367956、Hs.553778、Hs.329266、Hs.479658、Hs.458713、Hs.249196、Hs.467529、Hs.145061、Hs.49653、Hs.129227、Hs.313343、Hs.194554、Hs.123114、Hs.126561、Hs.42091、Hs.369385、Hs.98661、Hs.458306、Hs.148584、Hs.501684、Hs.422466、Hs.523732、Hs.525557、Hs.1372、Hs.379097、Hs.208124、Hs.389311、Hs.2561、Hs.117545、Hs.446388、Hs.2813、Hs.473894、Hs.502092、Hs.524479、Hs.314261、Hs.382306、Hs.458252、Hs.380222、Hs.379636、Hs.302034、Hs.253495、Hs.345877、Hs.259563、Hs.528569、Hs.152337、Hs.436317、Hs.546408、Hs.46700、Hs.1027、Hs.151219、Hs.279611、Hs.310456、Hs.520319、Hs.406976、Hs.181245、Hs.449621、Hs.515465、Hs.310540、Hs.554891、Hs.449601、Hs.355394、Hs.380710、Hs.171995、Hs.449585、Hs.522484、Hs.298023、Hs.520339、Hs.121443、
Hs.62661、Hs.200804、Hs.533185、Hs.461329、Hs.479270、Hs.446201、Hs.35086、Hs.500761、Hs.44298、Hs.469030、Hs.309767、Hs.441047、Hs.98309、Hs.31409、Hs.518299、Hs.532870、Hs.196534、Hs.108106、Hs.289319、Hs.69771、Hs.374378、Hs.369422、Hs.368641、Hs.302963、Hs.530461、Hs.1955、Hs.513726、Hs.148767、Hs.523220、Hs.525796、Hs.271264、Hs.69321、Hs.231367、Hs.500761、Hs.528304、Hs.148685、Hs.87417、Hs.164060、Hs.514843、Hs.418416、Hs.126521、Hs.519839、Hs.103834、Hs.279840、Hs.497741、Hs.531457、Hs.226390、Hs.480143、Hs.473721、Hs.369762、Hs.514527、Hs.204238、Hs.3104、Hs.519873、Hs.519909、Hs.179718、Hs.103183、Hs.520210、Hs.444683、Hs.234545、Hs.80976、Hs.311187、Hs.89497、Hs.444118、Hs.541635、Hs.477898、Hs.511776、Hs.434886、Hs.117299、Hs.252451、Hs.468058、Hs.21554、Hs.165904、Hs.445244、Hs.413924、Hs.99120、Hs.521171、Hs.462379、Hs.481860、Hs.489207、Hs.414407、Hs.505575、Hs.516826、Hs.62180、Hs.368934、Hs.530509、Hs.278906、Hs.511987、Hs.444082、Hs.471873、Hs.24583、
Hs.1051、Hs.115263、Hs.379010、Hs.2012、Hs.268698、Hs.49653、Hs.424542、Hs.525589、Hs.25333、Hs.513075、Hs.549577、Hs.100431、Hs.9613、Hs.301478、 Hs.553740、Hs.525383、Hs.473721、Hs.375624、Hs.116724、Hs.9613、Hs.418055、
Hs.334873、Hs.180878、Hs.126521、Hs.519033、Hs.187636、Hs.518448、Hs.322761、Hs.31409、Hs.524513、Hs.436437、Hs.148989、Hs.279575、Hs.75668、Hs.470791、Hs.104476、Hs.494496、Hs.517549、Hs.278906、Hs.498586、Hs.183617、Hs.499758、Hs.350065、Hs.511138、Hs.150793、Hs.129174、Hs.212606、Hs.275775、Hs.496414、Hs.436142、Hs.282984、Hs.32417、Hs.69321、Hs.414629、Hs.502618、Hs.405755、Hs.480143、Hs.60371、Hs.283683、Hs.208093、Hs.336768、Hs.116459、Hs.131673、Hs.32417、Hs.75812
を有する遺伝子はそれぞれ、配列番号１〜３５１に示される配列又はその相補的配列を含むことを特徴とする。
【００２２】
別の実施形態において、 ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌との間で、上記ＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ型腺癌と判定し、一方、上記非ＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌を非ＴＲＵ型腺癌と判定する。
【００２３】
あるいは、ＴＲＵ−ａ型腺癌とＴＲＵ−ｂ型腺癌との間で、上記ＴＲＵ−ａ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ−ａ型腺癌と判定し、一方、上記ＴＲＵ−ｂ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ−ｂ型腺癌と判定する。
【００２４】
そのような発現レベルの差は、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌の間、或いはＴＲＵ-ａ型腺癌とＴＲＵ型-ｂ腺癌の間、の相対的な差であるため、一方が他方に比べて大きいか小さいかで決まる。好ましくは、そのような差は１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上である。
【００２５】
別の実施形態において、前記遺伝子の発現レベルが、該遺伝子に対応する核酸又はタンパク質の存在もしくは量を測定することによって決定される。
【００２６】
本明細書中、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかであり、例えば各遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどが含まれる。
【００２７】
また、タンパク質は、各遺伝子によってコードされるタンパク質、その変異体又はその断片を意味する。変異体は、スプライシングや多型性に基づく変異体を含む。断片は、生体内でプロテアーゼやペプチダーゼの作用によって自然発生的に生じたタンパク質断片であり、目的タンパク質の断片であるとして識別できるならば、いずれのサイズの断片も包含する。断片の好ましいサイズは、２０以上のアミノ酸数、より好ましくは３０以上のアミノ酸数、さらに好ましくは５０以上のアミノ酸数である。
【００２８】
さらに別の実施形態において、前記遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイゼーション法や遺伝子増幅法によって測定することができる。
【００２９】
ハイブリダイゼーション法には、例えばマイクロアレイ法、ブロット法、例えばノーザンブロットもしくはサザンブロット法、更にはノーザンもしくはサザンハイブリダイゼーション法、ｉｎ  ｓｉｔｕｅハイブリダイゼーションなどが含まれる。好ましいハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法、例えばＤＮＡマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ及びタンパク質マイクロアレイである。遺伝子増幅法には、逆転写酵素でＲＮＡから変換したｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法や、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＰＡＬＳＡＲ法などが含まれる。好ましい遺伝子増幅法はＰＣＲ法である。
【００３０】
別の実施形態において、前記遺伝子の発現レベルは、代替的に、免疫学的方法によって測定することができる。
【００３１】
免疫学的方法では、前記遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出することを含む。ここで、タンパク質又はその断片は、好適には、遺伝子バンクに登録された配列に基づく慣用のｃＤＮＡクローニング法と発現ベクター/宿主系を利用するタンパク合成法とによって得ることができる。免疫学的方法には、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡなど）、蛍光抗体法、放射性免疫測定法、凝集法、比濁法などが含まれる。また、抗原-抗体反応は、均一又は不均一、或いは、固相又は非固相のいずれの条件で行うこともできるが、固相法による反応が望ましい。さらに、標識二次抗体を使用するサンドイッチ法も好ましく使用される。
【００３２】
さらに別の実施形態において、本発明の予後予測法には、前記ＴＲＵ型肺腺癌において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子が突然変異を含む場合、野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む肺腺癌と比べて患者の術後予後が不良であると予測することをさらに含むことができる。
【００３３】
ＥＧＦＲ遺伝子に突然変異が含まれるかどうかは、例えばＫｏｓａｋａ  Ｔら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：８９１９−２３，２００４（非特許文献１８）、Ｍｉｔｓｕｄｏｍｉ  Ｔら，  Ｊ  ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：２５１３−２０，２００５（非特許文献１９）などに記載される方法によって検出することができる。簡単に説明すると、そのような方法は当該遺伝子領域をＰＣＲ法を用いて遺伝子増幅して変異をゲル電気泳動法や塩基配列の決定などを用いた検出が可能である。
【００３４】
本発明はまた、第２の態様において、肺腺癌を、ＴＲＵ型又は非ＴＲＵ型のいずれかの亜型に分類し、次いでＴＲＵ型腺癌をＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型に分類する方法であって、該方法が、患者の生物学的試料中の下記の対応する遺伝子セットの１又は２以上の遺伝子について、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌の間、又はＴＲＵ-ａ型腺癌とＴＲＵ-ｂ型腺癌の間、の相対的発現レベルの差を測定し、該発現レベルの差を示す遺伝子が、
（ａ）下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.512690、Hs.153322、Hs.218366、Hs.220629、Hs.436996、Hs.435759、Hs.104555、Hs.247824、Hs.127821、Hs.480281、Hs.529117、Hs.545862、Hs.391561、Hs.479372、Hs.533055、Hs.550526、Hs.322854、Hs.465720、Hs.356664、Hs.26630、Hs.534496、Hs.85962、Hs.211267、Hs.128041、Hs.534458、Hs.495774、Hs.437806、Hs.133062、Hs.501758、Hs.444535、Hs.495480、Hs.326561、Hs.483906、Hs.169943、Hs.271285、Hs.158339、Hs.62604、Hs.469359、Hs.436657、Hs.8417、Hs.155538、Hs.533526、Hs.512756、Hs.87191、Hs.463079、Hs.513779、Hs.476209、Hs.279580、Hs.351544、Hs.269408、Hs.134807、Hs.482417、Hs.176626、Hs.465643、Hs.183390、Hs.411299、Hs.234027、Hs.109358、Hs.103983、Hs.26216、Hs.534352、Hs.240457、Hs.516036、Hs.144875、Hs.411312、Hs.103989、Hs.537722、Hs.333130、Hs.517962、Hs.90250、Hs.478930、Hs.121629、Hs.194061、Hs.520627、Hs.348012、Hs.522836、Hs.1376、Hs.520049、Hs.512856、Hs.355236、Hs.349470、Hs.476231、Hs.137556、Hs.390567、Hs.368353、Hs.412792、Hs.449207、Hs.527095、Hs.118722、Hs.377090、Hs.232696、Hs.447544、Hs.372773、Hs.222055、Hs.511839、Hs.153299、Hs.434374、Hs.287729、Hs.553740、Hs.127189、Hs.497723、Hs.181973、Hs.173656、Hs.451956、Hs.184507、Hs.532492、Hs.370904、Hs.460468、 Hs.520612、Hs.436667、Hs.125116、Hs.459391、Hs.450320、Hs.149769、Hs.325890、Hs.356820、Hs.289319、Hs.73893、Hs.129493、Hs.515069、Hs.34560、Hs.477278、Hs.351571、Hs.112087、Hs.154224、Hs.125950、Hs.438016、Hs.367956、Hs.553778、Hs.329266、Hs.479658、Hs.458713、Hs.249196、Hs.467529、Hs.145061、Hs.49653、Hs.129227、Hs.313343、Hs.194554、Hs.123114、Hs.126561、Hs.42091、Hs.369385、Hs.98661、Hs.458306、Hs.148584、Hs.501684、Hs.422466、Hs.523732、Hs.525557、Hs.1372、Hs.379097、Hs.208124、Hs.389311、Hs.2561、Hs.117545、Hs.446388、Hs.2813、Hs.473894、Hs.502092、Hs.524479、Hs.314261、Hs.382306、Hs.458252、Hs.380222、Hs.379636、Hs.302034、Hs.253495、Hs.345877、Hs.259563、Hs.528569、Hs.152337、Hs.436317、Hs.546408、Hs.46700、Hs.1027、Hs.151219、Hs.279611、Hs.310456、Hs.520319、Hs.406976、Hs.181245、Hs.449621、Hs.515465、Hs.310540、Hs.554891、Hs.449601、Hs.355394、Hs.380710、Hs.171995、Hs.449585、Hs.522484、Hs.298023、Hs.520339、Hs.121443を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体からなる遺伝子セット中の遺伝子である場合、該肺腺癌がＴＲＵ型であると決定する、あるいは、
（ｂ）下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.62661、Hs.200804、Hs.533185、Hs.461329、Hs.479270、Hs.446201、Hs.35086、Hs.500761、Hs.44298、Hs.469030、Hs.309767、Hs.441047、Hs.98309、Hs.31409、Hs.518299、Hs.532870、Hs.196534、Hs.108106、Hs.289319、Hs.69771、Hs.374378、Hs.369422、Hs.368641、Hs.302963、Hs.530461、Hs.1955、Hs.513726、Hs.148767、Hs.523220、Hs.525796、Hs.271264、Hs.69321、Hs.231367、Hs.500761、Hs.528304、Hs.148685、Hs.87417、Hs.164060、Hs.514843、Hs.418416、Hs.126521、Hs.519839、Hs.103834、Hs.279840、Hs.497741、Hs.531457、Hs.226390、Hs.480143、Hs.473721、Hs.369762、Hs.514527、Hs.204238、Hs.3104、Hs.519873、Hs.519909、Hs.179718、Hs.103183、Hs.520210、Hs.444683、Hs.234545、Hs.80976、Hs.311187、Hs.89497、Hs.444118、Hs.541635、Hs.477898、Hs.511776、Hs.434886、Hs.117299、Hs.252451、Hs.468058、Hs.21554、Hs.165904、Hs.445244、Hs.413924、Hs.99120、Hs.521171、Hs.462379、Hs.481860、Hs.489207、Hs.414407、Hs.505575、Hs.516826、Hs.62180、Hs.368934、Hs.530509、Hs.278906、Hs.511987、Hs.444082、Hs.471873、Hs.24583を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体からなる遺伝子セット中の遺伝子である場合、該肺腺癌が非ＴＲＵ型であると決定する、あるいは、
（ｃ）下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.220629、Hs.153322、Hs.127821、Hs.218366、Hs.436996、Hs.247824、Hs.550526、Hs.62604、Hs.104555、Hs.465720、Hs.480281、Hs.495480、Hs.545862、Hs.1051、Hs.133062、Hs.115263、Hs.349470、Hs.495774、Hs.155538、Hs.435759、Hs.128041、Hs.465643、Hs.169943、Hs.534496、Hs.379010、Hs.184507、Hs.469359、Hs.2012、Hs.109358、Hs.438016、Hs.326561、Hs.367956、Hs.271285、Hs.176626、Hs.137556、Hs.437806、Hs.240457、Hs.533055、Hs.532492、Hs.85962、Hs.268698、Hs.520627、Hs.524479、Hs.449585、Hs.158339、Hs.522836、Hs.279580、Hs.444535、Hs.446388、Hs.149769、Hs.513779、Hs.103983、Hs.512756、Hs.348012、Hs.467529、Hs.434374、Hs.389311、Hs.49653、Hs.424542、Hs.436667、Hs.516036、Hs.533526、Hs.463079、Hs.310456、Hs.125950、Hs.351571、Hs.478930、Hs.483906、Hs.259563、Hs.249196、Hs.412792、Hs.183390、Hs.87191、Hs.171995、Hs.117545、Hs.554891、Hs.351544、Hs.368353、Hs.482417、Hs.126561、Hs.154224、Hs.232696、Hs.520319、Hs.153299、Hs.449621、Hs.502092、Hs.537722、Hs.127189、Hs.525589、Hs.476231、Hs.527095、Hs.511839、Hs.372773、Hs.112087、Hs.458252、Hs.181973、Hs.289319、Hs.25333、Hs.513075、Hs.356820、Hs.549577、Hs.380222、Hs.46700、Hs.129227、Hs.100431、Hs.129493、Hs.173656、Hs.9613、Hs.301478、Hs.553740、Hs.151219、Hs.369385、Hs.525383、Hs.473721、Hs.375624、Hs.355236、Hs.116724、Hs.9613、Hs.418055を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体からなる遺伝子セット中の遺伝子である場合、該肺腺癌がＴＲＵ-ａ型であると決定する、あるいは、
（ｄ）下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.334873、Hs.180878、Hs.126521、Hs.519033、Hs.187636、Hs.518448、Hs.322761、Hs.31409、Hs.524513、Hs.253495、Hs.436437、Hs.148989、Hs.279575、Hs.75668、Hs.470791、Hs.104476、Hs.494496、Hs.517549、Hs.278906、Hs.498586、Hs.183617、Hs.499758、Hs.350065、Hs.511138、Hs.150793、Hs.129174、Hs.212606、Hs.275775、Hs.279611、Hs.496414、Hs.436142、Hs.282984、Hs.32417、Hs.69321、Hs.414629、Hs.502618、Hs.405755、Hs.480143、Hs.90250、Hs.436317、Hs.60371、Hs.283683、Hs.208093、Hs.336768、Hs.116459、Hs.131673、Hs.42091、Hs.32417、Hs.75812、Hs.355394を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体からなる遺伝子セット中の遺伝子である場合、該肺腺癌がＴＲＵ-ｂ型であると決定する、
ことを含む前記方法を提供する。
【００３５】
ここで、ＴＲＵ、非ＴＲＵ、変異体、同族体及び誘導体は、上記と同義である。
また、ここで、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌との間で、上記ＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ型腺癌と判定し、一方、上記非ＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌を非ＴＲＵ型腺癌と判定する。
【００３６】
さらに、ＴＲＵ−ａ型腺癌とＴＲＵ−ｂ型腺癌との間で、上記ＴＲＵ−ａ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ−ａ型腺癌と判定し、一方、上記ＴＲＵ−ｂ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ−ｂ型腺癌と判定する。
【００３７】
その一の実施形態において、前記ＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.512690、Hs.153322、Hs.218366、Hs.220629、Hs.436996、Hs.435759、Hs.104555、Hs.247824、Hs.127821、Hs.480281、Hs.529117、Hs.545862、Hs.391561、Hs.479372、Hs.533055、Hs.550526、Hs.322854、Hs.465720、Hs.356664、Hs.26630、Hs.534496、Hs.85962、Hs.211267、Hs.128041、Hs.534458、Hs.495774、Hs.437806、Hs.133062、Hs.501758、Hs.444535、Hs.495480、Hs.326561、Hs.483906、Hs.169943、Hs.271285、Hs.158339、Hs.62604、Hs.469359、Hs.436657、Hs.8417、Hs.155538、Hs.533526、Hs.512756、Hs.87191、Hs.463079、Hs.513779、Hs.476209、Hs.279580、Hs.351544、Hs.269408、Hs.134807、Hs.482417、Hs.176626、Hs.465643、Hs.183390、Hs.411299、Hs.234027、Hs.109358、Hs.103983、Hs.26216、Hs.534352、Hs.240457、Hs.516036、Hs.144875、Hs.411312、Hs.103989、Hs.537722、Hs.333130、Hs.517962、Hs.90250、Hs.478930、Hs.121629、Hs.194061、Hs.520627、Hs.348012、Hs.522836、Hs.1376、Hs.520049、Hs.512856、Hs.355236、Hs.349470、Hs.476231、Hs.137556、Hs.390567、Hs.368353、Hs.412792、Hs.449207、Hs.527095、Hs.118722、Hs.377090、Hs.232696、Hs.447544、Hs.372773、Hs.222055、Hs.511839、Hs.153299、Hs.434374、Hs.287729、Hs.553740、Hs.127189、Hs.497723、Hs.181973、Hs.173656、Hs.451956、Hs.184507、Hs.532492、Hs.370904、Hs.460468、 Hs.520612、Hs.436667、Hs.125116、Hs.459391、Hs.450320、Hs.149769、Hs.325890、Hs.356820、Hs.289319、Hs.73893、Hs.129493、Hs.515069、Hs.34560、Hs.477278、Hs.351571、Hs.112087、Hs.154224、Hs.125950、Hs.438016、Hs.367956、Hs.553778、Hs.329266、Hs.479658、Hs.458713、Hs.249196、Hs.467529、Hs.145061、Hs.49653、Hs.129227、Hs.313343、Hs.194554、Hs.123114、Hs.126561、Hs.42091、Hs.369385、Hs.98661、Hs.458306、Hs.148584、Hs.501684、Hs.422466、Hs.523732、Hs.525557、Hs.1372、Hs.379097、Hs.208124、Hs.389311、Hs.2561、Hs.117545、Hs.446388、Hs.2813、Hs.473894、Hs.502092、Hs.524479、Hs.314261、Hs.382306、Hs.458252、Hs.380222、Hs.379636、Hs.302034、Hs.253495、Hs.345877、Hs.259563、Hs.528569、Hs.152337、Hs.436317、Hs.546408、Hs.46700、Hs.1027、Hs.151219、Hs.279611、Hs.310456、Hs.520319、Hs.406976、Hs.181245、Hs.449621、Hs.515465、Hs.310540、Hs.554891、Hs.449601、Hs.355394、Hs.380710、Hs.171995、Hs.449585、Hs.522484、Hs.298023、Hs.520339、Hs.121443、
Hs.62661、Hs.200804、Hs.533185、Hs.461329、Hs.479270、Hs.446201、Hs.35086、Hs.500761、Hs.44298、Hs.469030、Hs.309767、Hs.441047、Hs.98309、Hs.31409、Hs.518299、Hs.532870、Hs.196534、Hs.108106、Hs.289319、Hs.69771、Hs.374378、Hs.369422、Hs.368641、Hs.302963、Hs.530461、Hs.1955、Hs.513726、Hs.148767、Hs.523220、Hs.525796、Hs.271264、Hs.69321、Hs.231367、Hs.500761、Hs.528304、Hs.148685、Hs.87417、Hs.164060、Hs.514843、Hs.418416、Hs.126521、Hs.519839、Hs.103834、Hs.279840、Hs.497741、Hs.531457、Hs.226390、Hs.480143、Hs.473721、Hs.369762、Hs.514527、Hs.204238、Hs.3104、Hs.519873、Hs.519909、Hs.179718、Hs.103183、Hs.520210、Hs.444683、Hs.234545、Hs.80976、Hs.311187、Hs.89497、Hs.444118、Hs.541635、Hs.477898、Hs.511776、Hs.434886、Hs.117299、Hs.252451、Hs.468058、Hs.21554、Hs.165904、Hs.445244、Hs.413924、Hs.99120、Hs.521171、Hs.462379、Hs.481860、Hs.489207、Hs.414407、Hs.505575、Hs.516826、Hs.62180、Hs.368934、Hs.530509、Hs.278906、Hs.511987、Hs.444082、Hs.471873、Hs.24583、
Hs.1051、Hs.115263、Hs.379010、Hs.2012、Hs.268698、Hs.49653、Hs.424542、Hs.525589、Hs.25333、Hs.513075、Hs.549577、Hs.100431、Hs.9613、Hs.301478、Hs.553740、Hs.525383、Hs.473721、Hs.375624、Hs.116724、Hs.9613、Hs.418055、
Hs.334873、Hs.180878、Hs.126521、Hs.519033、Hs.187636、Hs.518448、Hs.322761、Hs.31409、Hs.524513、Hs.436437、Hs.148989、Hs.279575、Hs.75668、Hs.470791、Hs.104476、Hs.494496、Hs.517549、Hs.278906、Hs.498586、Hs.183617、Hs.499758、Hs.350065、Hs.511138、Hs.150793、Hs.129174、Hs.212606、Hs.275775、Hs.496414、Hs.436142、Hs.282984、Hs.32417、Hs.69321、Hs.414629、Hs.502618、Hs.405755、Hs.480143、Hs.60371、Hs.283683、Hs.208093、Hs.336768、Hs.116459、Hs.131673、Hs.32417、Hs.75812
を有する遺伝子はそれぞれ、配列番号１〜３５１に示される配列又はその相補的配列を含むものである。
【００３８】
別の実施形態において、前記遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイゼーション法によって測定することができる。
【００３９】
ハイブリダイゼーション法は、上記と同様の方法、例えばマイクロアレイ法、又はノーザンブロットもしくはサザンブロットなどのブロット法を例示することができる。この目的には、マイクロアレイが好ましく使用できる。
【００４０】
本発明は、第３の態様において、下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.512690、Hs.153322、Hs.218366、Hs.220629、Hs.436996、Hs.435759、Hs.104555、Hs.247824、Hs.127821、Hs.480281、Hs.529117、Hs.545862、Hs.391561、Hs.479372、Hs.533055、Hs.550526、Hs.322854、Hs.465720、Hs.356664、Hs.26630、Hs.534496、Hs.85962、Hs.211267、Hs.128041、Hs.534458、Hs.495774、Hs.437806、Hs.133062、Hs.501758、Hs.444535、Hs.495480、Hs.326561、Hs.483906、Hs.169943、Hs.271285、Hs.158339、Hs.62604、Hs.469359、Hs.436657、Hs.8417、Hs.155538、Hs.533526、Hs.512756、Hs.87191、Hs.463079、Hs.513779、Hs.476209、Hs.279580、Hs.351544、Hs.269408、Hs.134807、Hs.482417、Hs.176626、Hs.465643、Hs.183390、Hs.411299、Hs.234027、Hs.109358、Hs.103983、Hs.26216、Hs.534352、Hs.240457、Hs.516036、Hs.144875、Hs.411312、Hs.103989、Hs.537722、Hs.333130、Hs.517962、Hs.90250、Hs.478930、Hs.121629、Hs.194061、Hs.520627、Hs.348012、Hs.522836、Hs.1376、Hs.520049、Hs.512856、Hs.355236、Hs.349470、Hs.476231、Hs.137556、Hs.390567、Hs.368353、Hs.412792、Hs.449207、Hs.527095、Hs.118722、Hs.377090、Hs.232696、Hs.447544、Hs.372773、Hs.222055、Hs.511839、Hs.153299、Hs.434374、Hs.287729、Hs.553740、Hs.127189、Hs.497723、Hs.181973、Hs.173656、Hs.451956、Hs.184507、Hs.532492、Hs.370904、Hs.460468、 Hs.520612、Hs.436667、Hs.125116、Hs.459391、Hs.450320、Hs.149769、Hs.325890、Hs.356820、Hs.289319、Hs.73893、Hs.129493、Hs.515069、Hs.34560、Hs.477278、Hs.351571、Hs.112087、Hs.154224、Hs.125950、Hs.438016、Hs.367956、Hs.553778、Hs.329266、Hs.479658、Hs.458713、Hs.249196、Hs.467529、Hs.145061、Hs.49653、Hs.129227、Hs.313343、Hs.194554、Hs.123114、Hs.126561、Hs.42091、Hs.369385、Hs.98661、Hs.458306、Hs.148584、Hs.501684、Hs.422466、Hs.523732、Hs.525557、Hs.1372、Hs.379097、Hs.208124、Hs.389311、Hs.2561、Hs.117545、Hs.446388、Hs.2813、Hs.473894、Hs.502092、Hs.524479、Hs.314261、Hs.382306、Hs.458252、Hs.380222、Hs.379636、Hs.302034、Hs.253495、Hs.345877、Hs.259563、Hs.528569、Hs.152337、Hs.436317、Hs.546408、Hs.46700、Hs.1027、Hs.151219、Hs.279611、Hs.310456、Hs.520319、Hs.406976、Hs.181245、Hs.449621、Hs.515465、Hs.310540、Hs.554891、Hs.449601、Hs.355394、Hs.380710、Hs.171995、Hs.449585、Hs.522484、Hs.298023、Hs.520339、Hs.121443、
Hs.62661、Hs.200804、Hs.533185、Hs.461329、Hs.479270、Hs.446201、Hs.35086、Hs.500761、Hs.44298、Hs.469030、Hs.309767、Hs.441047、Hs.98309、Hs.31409、Hs.518299、Hs.532870、Hs.196534、Hs.108106、Hs.289319、Hs.69771、Hs.374378、Hs.369422、Hs.368641、Hs.302963、Hs.530461、Hs.1955、Hs.513726、Hs.148767、Hs.523220、Hs.525796、Hs.271264、Hs.69321、Hs.231367、Hs.500761、Hs.528304、Hs.148685、Hs.87417、Hs.164060、Hs.514843、Hs.418416、Hs.126521、Hs.519839、Hs.103834、Hs.279840、Hs.497741、Hs.531457、Hs.226390、Hs.480143、Hs.473721、Hs.369762、Hs.514527、Hs.204238、Hs.3104、Hs.519873、Hs.519909、Hs.179718、Hs.103183、Hs.520210、Hs.444683、Hs.234545、Hs.80976、Hs.311187、Hs.89497、Hs.444118、Hs.541635、Hs.477898、Hs.511776、Hs.434886、Hs.117299、Hs.252451、Hs.468058、Hs.21554、Hs.165904、Hs.445244、Hs.413924、Hs.99120、Hs.521171、Hs.462379、Hs.481860、Hs.489207、Hs.414407、Hs.505575、Hs.516826、Hs.62180、Hs.368934、Hs.530509、Hs.278906、Hs.511987、Hs.444082、Hs.471873、Hs.24583、
Hs.1051、Hs.115263、Hs.379010、Hs.2012、Hs.268698、Hs.49653、Hs.424542、Hs.525589、Hs.25333、Hs.513075、Hs.549577、Hs.100431、Hs.9613、Hs.301478、Hs.553740、Hs.525383、Hs.473721、Hs.375624、Hs.116724、Hs.9613、Hs.418055、
Hs.334873、Hs.180878、Hs.126521、Hs.519033、Hs.187636、Hs.518448、Hs.322761、Hs.31409、Hs.524513、Hs.436437、Hs.148989、Hs.279575、Hs.75668、Hs.470791、Hs.104476、Hs.494496、Hs.517549、Hs.278906、Hs.498586、Hs.183617、Hs.499758、Hs.350065、Hs.511138、Hs.150793、Hs.129174、Hs.212606、Hs.275775、Hs.496414、Hs.436142、Hs.282984、Hs.32417、Hs.69321、Hs.414629、Hs.502618、Hs.405755、Hs.480143、Hs.60371、Hs.283683、Hs.208093、Hs.336768、Hs.116459、Hs.131673、Hs.32417、Hs.75812
を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体の発現を検出することができる核酸であって、
（１）配列番号１〜３５１に示されるヌクレオチド配列、
（２）配列番号１〜３５１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（３）前記（１）又は（２）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（４）前記（１）、（２）又は（３）のいずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、並びに、
（５）前記（１）、（３）又は（４）のヌクレオチド配列の１５塩基から全塩基数未満の部分配列、
からなる群から選択される配列を有する核酸、或いは該遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体によってコードされるタンパク質又は断片に対する抗体又はその断片、を含む、肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測するための又は肺腺癌をＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型のいずれかの亜型に分類するための組成物
を提供する。
【００４１】
本発明の組成物は、上記の肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測する方法、ならびに、上記のとおり、肺腺癌を４つの型に分類するために使用されうる。
【００４２】
本明細書中、ストリンジェントな条件とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズするようなハイブリダイゼーション及び洗浄条件を意味し、例えばマイクロアレイ解析におけるハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、１Ｍ塩化ナトリウム／０．５％（Ｗ／Ｖ）サルコシル／３０％ホルムアミド中、６０℃、１７時間のハイブリダイゼーション、その後、６×ＳＳＣ／０．００５％（Ｗ／Ｖ）トライトンＸ-１０２溶液中、室温、10分間を一回、さらに、０．１×ＳＳＣ／０．００５％（Ｗ／Ｖ）トライトンＸ-１０２溶液中で０〜４℃に保ちながら５分間を一回が洗浄の条件である。ここでの１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１５ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液(ｐＨ７．２)である。ハイブリダイゼーションについては、Ａｕｓｂｅｌ  ＦＭら，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（３版）Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５年，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（米国）に記載されている。
【００４３】
別の実施形態において、本発明はまた、前記組成物を構成する核酸又は抗体もしくはその断片を含む、キット又はＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップともいう）又はタンパク質アレイも提供する。
【発明の効果】
【００４４】
本発明により、肺腺癌をその亜型（ＴＲＵ、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ及びＴＲＵ-ｂ）に分類し、各亜型と術後予後との関係、並びに、ＴＲＵ型の肺腺癌におけるＥＧＦＲ遺伝子変異と術後予後との関係が明らかになった。本発明の方法を用いることによって、術後に再発する可能性の高い患者を選別して生存率を改善するための治療計画を立てることができるし、或いは、肺癌の分子標的薬として臨床使用されているゲフィチニブ（商品名Ｉｒｅｓｓａ）の反応性に関わることが知られるＥＧＦＲ変異をもつ患者の中から特に予後が悪い患者を選別して、ＥＧＦＲ阻害剤による術後治療の対象者として選択することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
愛知県がんセンター（名古屋）で非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であると診断された症例のうち、９０例の腺癌、３５例の扁平上皮癌、１８例の大細胞癌、４例の扁平上皮腺癌及び２例の大細胞神経内分泌癌を含む１４９症例からの腫瘍標本について、二本鎖ｃＤＮＡ、次いでｃＲＮＡを調製し、１８,１７５個のユニーク遺伝子を結合したマイクロアレイを使用して網羅的・系統的発現プロファイルを得た。さらに、ＣＬＵＳＴＥＲプログラムを用いて、遺伝子と症例の序列的クラスタリングを行い、ＴＲＥＥＶＩＥＷ（Ｅｉｓｅｎ  ＭＢら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１４８６３−８，  １９９８）により結果を表示し、マイクロアレイの有意解析法（ＳＡＭ）を用いて患者亜型の各々に特異的な遺伝子に評点を付けた（Ｔｕｓｈｅｒ  ＶＧら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１６−２１，  ２００１）。
【００４６】
ジーンオントロジー（ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ；ＧＯ）（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ  Ｍら，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：２５−９，  ２０００）を用いた解析により、患者亜型の各々に特異的な遺伝子セットの機能的に異なる生物学的特徴を明らかにした。
【００４７】
さらに、種々の臨床パラメーターと、発現プロファイルで規定される亜型の発現との関係を調べるために、多変量ロジスティック回帰分析を実施し、また、Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ法を用いて術後の生存率を評価した。
【００４８】
その結果、肺腺癌症例が、２つの主要なサブクラスターに分類できることを見出し、これをＴＲＵ型及び非ＴＲＵ型と称した。腺癌内で最も可変的に発現された４,１３８個の転写物を用いて行った分類体系的クラスタリングにより、２つの主要な樹形図（ＴＲＵ型及び非ＴＲＵ型）と、右側樹形図中にさらに２つのサブクラスター（ＴＲＵ-ａ型及びＴＲＵ-ｂ型）の存在が明らかになった（図２Ａ）。
【００４９】
これらの２つの主要な発現プロファイルによって規定される肺腺癌亜型、すなわち非ＴＲＵ型及びＴＲＵ型、の樹形図及び生物学的性質について更に知見を得るために、ＳＡＭ分析を行い、０．１％未満の擬陽性率の有意レベルでのプレフィルタリングにおいて、示差的に発現された１,６５７個の遺伝子を抽出した。これらの遺伝子のうち２８６個の遺伝子が、ＴＲＵ型と非ＴＲＵ型において２倍以上の倍率で発現レベルに差異を示した。今回見出した２８６個の遺伝子は、ＴＲＵ型においてより高い発現を有する１９４個の遺伝子と、非ＴＲＵ型においてより高い発現を有する９２個の遺伝子からなっていた。ＴＲＵ型と非ＴＲＵ型との間の基本的な機能の差異を調べた結果、ＴＲＵ型は正常の肺機能との明らかな関係を示したのに対し、非ＴＲＵ型は細胞周期及び増殖との関係を示すことが判明した。
【００５０】
さらにまた、術後の予後について調べた結果、ＴＲＵ-ａ型は非ＴＲＵ型のものと類似した予後不良を示したのに対して、ＴＲＵ-ｂ型の予後は非ＴＲＵ型の予後よりも有意に良好であることが判明した（図４）。同様の基準（０．１％未満の擬陽性率）でＳＡＭ分析を行い、ＴＲＵ−a型とＴＲＵ−ｂ型において２倍以上の倍率で発現レベルに差異を示す１６９個の遺伝子を抽出した。この１６９個の遺伝子は、ＴＲＵ−a型においてより高い発現を有する１１９個の遺伝子と、ＴＲＵ−ｂ型においてより高い発現を有する５０個の遺伝子からなっていた。
【００５１】
ＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ及びＴＲＵ-ｂの各腺癌亜型に属する遺伝子セットをそれぞれ表１〜４に示す。表中、Ｕｎｉ-Ｇｅｎｅ  ｓｙｍｂｏｌ及びＵｎｉＩＤはそれぞれ、Ｕｎｉ−Ｇｅｎｅデータバンクに登録された遺伝子の記号及び配列の登録番号であり、ＧＢＩＤは、ＧｅｎＢａｎｋに登録された遺伝子の配列の登録番号を表す。また同時に、遺伝子名（或いは、タンパク質の名称又は特徴）も表示する。
【００５２】
【表１】
0005688497.tif 000002
0005688497.tif 000003
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【００５３】
【表２】
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【００５４】
【表３】
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【００５５】
【表４】
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【００５６】
したがって、本発明は、その一の態様により、肺腺癌を、ＴＲＵ型又は非ＴＲＵ型に識別、分類し、次いでＴＲＵ型腺癌をＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型に識別、分類する方法を提供する。
【００５７】
この方法は、患者の生物学的試料中の上記の各遺伝子セットの１又は２以上の遺伝子について、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌の間、又はＴＲＵ-ａ型腺癌とＴＲＵ-ｂ型腺癌の間、の相対的発現レベルの差を測定し、該発現レベルの差を示す遺伝子が、表１に列挙された遺伝子群のいずれかである場合、肺腺癌がＴＲＵ型であると決定し、表２に列挙された遺伝子群のいずれかである場合、肺腺癌が非ＴＲＵ型であると決定する。さらに、ＴＲＵ型と決定された腺癌のうち、表３に列挙された遺伝子群のいずれかである場合、肺腺癌がＴＲＵ−a型であると決定し、表４に列挙された遺伝子群のいずれかである場合、肺腺癌がＴＲＵ−ｂ型であると決定することを含む。
【００５８】
より具体的にいうと、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌との間で、上記ＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ型腺癌と判定し、一方、上記非ＴＲＵ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌を非ＴＲＵ型腺癌と判定する。
【００５９】
さらに、ＴＲＵ−ａ型腺癌とＴＲＵ−ｂ型腺癌との間で、上記ＴＲＵ−ａ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ−ａ型腺癌と判定し、一方、上記ＴＲＵ−ｂ型に属する遺伝子の発現レベルが相対的に大きいとき上記腺癌をＴＲＵ−ｂ型腺癌と判定する。
【００６０】
例えば、ＴＲＵ型腺癌に属する遺伝子Ａ，Ｂ，Ｃ、非ＴＲＵ型腺癌に属する遺伝子Ｘ，Ｙ，Ｚについて、腺癌試料１及び試料２中の遺伝子Ａの発現レベルがそれぞれ130、80（恣意的単位）であり、腺癌試料１及び試料２中の遺伝子Ｂの発現レベルがそれぞれ25、20（恣意的単位）であり、腺癌試料１及び試料２中の遺伝子Ｃの発現レベルがそれぞれ1050、950（恣意的単位）であり、腺癌試料１及び試料２中の遺伝子Ｘの発現レベルがそれぞれ600、650（恣意的単位）であり、腺癌試料１及び試料２中の遺伝子Ｙの発現レベルがそれぞれ350、450（恣意的単位）であり、同じ試料１及び試料２中の遺伝子Ｚの発現レベルがそれぞれ25、50（恣意的単位）であるとき、試料１がＴＲＵ型腺癌、試料２が非ＴＲＵ型腺癌であると識別する。
【００６１】
本発明はさらに、別の態様により、肺腺癌のＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型を、患者の生物学的試料中の上記の表１〜４に列挙した対応の遺伝子セットの１又は２以上の遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体について、上記分類法と同様に、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌の間、又はＴＲＵ-ａ型腺癌とＴＲＵ-ｂ型腺癌の間、の相対的発現レベルの差を測定することによって識別することを含む、患者の術後予後を予測する方法を提供する。
【００６２】
この方法によれば、肺腺癌を先ずＴＲＵ型又は非ＴＲＵ型に識別し、次いでＴＲＵ型腺癌であると判定された場合、ＴＲＵ型をさらにＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型に識別することを含み、肺腺癌の亜型がＴＲＵ-ｂ型であれば術後予後が良好である、或いは、ＴＲＵ-ａ型又は非ＴＲＵ型であれば術後予後が不良であると判定することを含む。
【００６３】
さらに、本発明者ら、ＴＲＵ型腺癌において、ＥＧＦＲ突然変異の存在が非ＴＲＵ型腺癌よりも有意に多く観察されたこと（４５．３％対２１．６％）、及びＥＧＦＲ突然変異を含むＴＲＵ型腺癌をもつ患者の術後予後が、野生型の非突然変異ＥＧＦＲを含むＴＲＵ腺癌をもつ患者の予後と比べて不良であるという興味ある知見を得た。ＥＧＦＲ遺伝子変異を有する肺癌、特にＮＳＣＬＣがゲフィチニブ（ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）に高い感受性を示すことが知られているため、このような分子標的薬治療を施すための患者の選別のために前記知見を利用することができる。
【００６４】
すなわち、本発明は、上記予後予測方法において、特にＴＲＵ型肺腺癌でＥＧＦＲ遺伝子が突然変異を含む場合、野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む肺腺癌と比べて患者の術後予後が不良であると予測することをさらに含む。ＴＲＵ型肺腺癌におけるこのような予測は上記の亜型と予後との関係に基づく予測と組み合わせることによって、より確度が高く臨床的な応用価値の高い診断又は判定が可能になると考えられる。
【００６５】
また、すべての腺癌において、ＥＧＦＲ突然変異を有しかつ腺癌内に２倍以上のアップレギュレーションをもつ５つの遺伝子と、ＥＧＦＲ突然変異の存在と関連して１．５〜２倍のアップレギュレーションを示す１１の遺伝子を同定し、さらに、高い頻度で出現するＥＧＦＲ突然変異を有するＴＲＵ型腺癌内で特異的かつ示差的に発現される遺伝子について検索し、ＥＧＦＲ突然変異の存在下で２倍以上のアップレギュレーションを有するＧＧＴＬＡ４遺伝子、及び１．５〜２倍のアップレギュレーションを示す、ＲＡＭＰ１、ＡＰＯＨ、ＰＥＸ３、ＥＳＴ及びＤＨＲＳ７遺伝子を同定した。
【００６６】
さらにまた、非ＴＲＵ型腺癌症例は、最も高いパーセンテージの、ｐ５３及び/又はＫ−ｒａｓ突然変異（ｐ５３について４１％；Ｋ−ｒａｓについて１６％）を有する腫瘍を含み、次いでＴＲＵ-ａ型（それぞれ２９％及び１２％）、ＴＲＵ-ｂ型（それぞれ２１％及び０％）の順であった。このことは、非ＴＲＵ型腺癌は、他の亜型、特にＴＲＵ-ａ型及びＴＲＵ-ｂ型腺癌、と比べて、相対的に高いｐ５３及び/又はＫ−ｒａｓ突然変異を含むことを示している。
【００６７】
これらの知見もまた、同様に、肺腺癌患者の術後予後の判定と組み合わせて使用することによって、予後判定のために役立つと考えられる。
【００６８】
本発明の方法においては、はじめに、表１〜４に列挙される各遺伝子セットに含まれる遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体の発現を測定するための核酸を準備する。
【００６９】
そのような核酸は、下記のＵｎｉＧｅｎｅ登録番号：
Hs.512690、Hs.153322、Hs.218366、Hs.220629、Hs.436996、Hs.435759、Hs.104555、Hs.247824、Hs.127821、Hs.480281、Hs.529117、Hs.545862、Hs.391561、Hs.479372、Hs.533055、Hs.550526、Hs.322854、Hs.465720、Hs.356664、Hs.26630、Hs.534496、Hs.85962、Hs.211267、Hs.128041、Hs.534458、Hs.495774、Hs.437806、Hs.133062、Hs.501758、Hs.444535、Hs.495480、Hs.326561、Hs.483906、Hs.169943、Hs.271285、Hs.158339、Hs.62604、Hs.469359、Hs.436657、Hs.8417、Hs.155538、Hs.533526、Hs.512756、Hs.87191、Hs.463079、Hs.513779、Hs.476209、Hs.279580、Hs.351544、Hs.269408、Hs.134807、Hs.482417、Hs.176626、Hs.465643、Hs.183390、Hs.411299、Hs.234027、Hs.109358、Hs.103983、Hs.26216、Hs.534352、Hs.240457、Hs.516036、Hs.144875、Hs.411312、Hs.103989、Hs.537722、Hs.333130、Hs.517962、Hs.90250、Hs.478930、Hs.121629、Hs.194061、Hs.520627、Hs.348012、Hs.522836、Hs.1376、Hs.520049、Hs.512856、Hs.355236、Hs.349470、Hs.476231、Hs.137556、Hs.390567、Hs.368353、Hs.412792、Hs.449207、Hs.527095、Hs.118722、Hs.377090、Hs.232696、Hs.447544、Hs.372773、Hs.222055、Hs.511839、Hs.153299、Hs.434374、Hs.287729、Hs.553740、Hs.127189、Hs.497723、Hs.181973、Hs.173656、Hs.451956、Hs.184507、Hs.532492、Hs.370904、Hs.460468、 Hs.520612、Hs.436667、Hs.125116、Hs.459391、Hs.450320、Hs.149769、Hs.325890、Hs.356820、Hs.289319、Hs.73893、Hs.129493、Hs.515069、Hs.34560、Hs.477278、Hs.351571、Hs.112087、Hs.154224、Hs.125950、Hs.438016、Hs.367956、Hs.553778、Hs.329266、Hs.479658、Hs.458713、Hs.249196、Hs.467529、Hs.145061、Hs.49653、Hs.129227、Hs.313343、Hs.194554、Hs.123114、Hs.126561、Hs.42091、Hs.369385、Hs.98661、Hs.458306、Hs.148584、Hs.501684、Hs.422466、Hs.523732、Hs.525557、Hs.1372、Hs.379097、Hs.208124、Hs.389311、Hs.2561、Hs.117545、Hs.446388、Hs.2813、Hs.473894、Hs.502092、Hs.524479、Hs.314261、Hs.382306、Hs.458252、Hs.380222、Hs.379636、Hs.302034、Hs.253495、Hs.345877、Hs.259563、Hs.528569、Hs.152337、Hs.436317、Hs.546408、Hs.46700、Hs.1027、Hs.151219、Hs.279611、Hs.310456、Hs.520319、Hs.406976、Hs.181245、Hs.449621、Hs.515465、Hs.310540、Hs.554891、Hs.449601、Hs.355394、Hs.380710、Hs.171995、Hs.449585、Hs.522484、Hs.298023、Hs.520339、Hs.121443、
Hs.62661、Hs.200804、Hs.533185、Hs.461329、Hs.479270、Hs.446201、Hs.35086、Hs.500761、Hs.44298、Hs.469030、Hs.309767、Hs.441047、Hs.98309、Hs.31409、Hs.518299、Hs.532870、Hs.196534、Hs.108106、Hs.289319、Hs.69771、Hs.374378、Hs.369422、Hs.368641、Hs.302963、Hs.530461、Hs.1955、Hs.513726、Hs.148767、Hs.523220、Hs.525796、Hs.271264、Hs.69321、Hs.231367、Hs.500761、Hs.528304、Hs.148685、Hs.87417、Hs.164060、Hs.514843、Hs.418416、Hs.126521、Hs.519839、Hs.103834、Hs.279840、Hs.497741、Hs.531457、Hs.226390、Hs.480143、Hs.473721、Hs.369762、Hs.514527、Hs.204238、Hs.3104、Hs.519873、Hs.519909、Hs.179718、Hs.103183、Hs.520210、Hs.444683、Hs.234545、Hs.80976、Hs.311187、Hs.89497、Hs.444118、Hs.541635、Hs.477898、Hs.511776、Hs.434886、Hs.117299、Hs.252451、Hs.468058、Hs.21554、Hs.165904、Hs.445244、Hs.413924、Hs.99120、Hs.521171、Hs.462379、Hs.481860、Hs.489207、Hs.414407、Hs.505575、Hs.516826、Hs.62180、Hs.368934、Hs.530509、Hs.278906、Hs.511987、Hs.444082、Hs.471873、Hs.24583、
Hs.1051、Hs.115263、Hs.379010、Hs.2012、Hs.268698、Hs.49653、Hs.424542、Hs.525589、Hs.25333、Hs.513075、Hs.549577、Hs.100431、Hs.9613、Hs.301478、Hs.553740、Hs.525383、Hs.473721、Hs.375624、Hs.116724、Hs.9613、Hs.418055、
Hs.334873、Hs.180878、Hs.126521、Hs.519033、Hs.187636、Hs.518448、Hs.322761、Hs.31409、Hs.524513、Hs.436437、Hs.148989、Hs.279575、Hs.75668、Hs.470791、Hs.104476、Hs.494496、Hs.517549、Hs.278906、Hs.498586、Hs.183617、Hs.499758、Hs.350065、Hs.511138、Hs.150793、Hs.129174、Hs.212606、Hs.275775、Hs.496414、Hs.436142、Hs.282984、Hs.32417、Hs.69321、Hs.414629、Hs.502618、Hs.405755、Hs.480143、Hs.60371、Hs.283683、Hs.208093、Hs.336768、Hs.116459、Hs.131673、Hs.32417、Hs.75812
を有する遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体の発現を検出することができる核酸であって、
（１）配列番号１〜３５１に示されるヌクレオチド配列、
（２）配列番号１〜３５１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（３）前記（１）又は（２）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（４）前記（１）、（２）又は（３）のいずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、並びに、
（５）前記（１）、（３）又は（４）のヌクレオチド配列の１５塩基から全塩基数未満の部分配列、
からなる群から選択される配列を有する１又は２以上の核酸である。
【００７０】
上記核酸は、例えば約１００塩基以下のＤＮＡ分子であれば、ホスホアミダイト法を利用するＤＮＡ自動合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて合成することができる。或いは、上記核酸は、ｃＤＮＡクローニングによって作製することができる。腫瘍の肺組織から全ＲＮＡを取得し、オリゴｄＴセルロースカラム処理によってポリＡ（＋）ＲＮＡを得たのち、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから、遺伝子バンクに登録された配列に基づいて予め作製したプローブ（１５以上、好ましくは３０以上、より好ましくは、５０〜１００以上の塩基長）とのハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡクローンを得ることができる。取得したクローンは、例えば市販されるような発現ベクターに組み込んだのち大腸菌、枯草菌などの適当な宿主細胞に導入し、宿主細胞を増殖することによって、或いは遺伝子バンクに登録された配列に基づいて予め作製したプライマー（通常１５〜３０塩基、好ましくは１７〜２５塩基長）を使用し、かつ前記ｃＤＮＡクローンを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、増幅することができる。ｃＤＮＡクローニング及びＰＣＲ法の具体的手順や試薬等については、市販のキット、装置、試薬を使用することができるし、また、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９年,  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（米国）；Ａｕｓｂｅｌ  ＦＭら，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（３版）Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５年，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（米国）などに教示されている。
【００７１】
上記（４）の核酸において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号１〜３５１に示される配列又はその相補的配列を含むいずれかの核酸とハイブリダイズする任意の核酸である。このような核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００７２】
ストリンジェントな条件は、上に定義し例示した条件を含む。すなわち、そのような条件の例は、１Ｍ塩化ナトリウム／０．５％（Ｗ／Ｖ）サルコシル／３０％ホルムアミド中、６０℃、１７時間のハイブリダイゼーション、その後、６×ＳＳＣ／０．００５％（Ｗ／Ｖ）トライトンＸ-１０２溶液中、室温、10分間を一回、さらに、０．１×ＳＳＣ／０．００５％（Ｗ／Ｖ）トライトンＸ-１０２溶液中で０〜４℃に保ちながら５分間を一回が洗浄の条件である。ここでの１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１５ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液(ｐＨ７．２)である。
【００７３】
ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ法、ブロット法、例えばノーザンもしくはサザンブロット、ノーザンもしくはサザンハイブリダイゼーション法、ｉｎ  ｓｉｔｕｅハイブリダイゼーション、定量ＲＴ-ＰＣＲ法などを含む。
【００７４】
上記（５）の核酸において、上記（１）、（３）又は（４）のヌクレオチド配列を有する核酸の断片は、１５塩基数〜全塩基数未満のサイズを有する。断片は、この範囲の任意の塩基数、例えば２０塩基以上、３０塩基以上、５０塩基以上、７０塩基以上、１００塩基以上、１５０塩基以上、２００塩基以上、３００塩基以上、４００塩基以上、５００塩基以上などの塩基数である。
【００７５】
本発明によれば、患者の生物学的試料中の上記表中の各遺伝子セットの１又は２以上の遺伝子について、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌の間、又はＴＲＵ-ａ型腺癌とＴＲＵ-ｂ型腺癌の間、の相対的発現レベルの差を測定する。
【００７６】
ここで、相対的発現レベルの差とは、ＴＲＵ型腺癌と非ＴＲＵ型腺癌の間或いはＴＲＵ-ａ型腺癌とＴＲＵ-ｂ型腺癌の間で、上記遺伝子セットのある特定の遺伝子の発現レベルを比較したとき、該遺伝子が上記の亜型間で示す発現レベルの差を意味する。本発明では、特定の遺伝子についての好ましい発現レベルの差は、１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上である。
【００７７】
発現レベルの差を示す遺伝子を同定することによって、該遺伝子と肺腺癌の亜型（すなわちＴＲＵ、ＴＲＵ-ａ、ＴＲＵ-ｂ又は非ＴＲＵ型）との関係を明らかにすることができる。これによって、例えば、肺腺癌の亜型を識別することによって患者の術後予後を予測することができるし、或いは、同定された遺伝子が含まれる遺伝子セットと亜型との上記関係に基づいて肺腺癌を４つの型に分類することができる。
【００７８】
本発明によれば、遺伝子の発現レベルの差は、該遺伝子に対応する核酸又はタンパク質の存在又は量を測定することによって行うことができる。
【００７９】
生物学的試料は、肺癌患者の肺癌組織又細胞を含み、手術によって切除された癌組織、生検によって得られた組織又は細胞などである。
【００８０】
以下に、これらの２つの異なる方法について具体的に説明する。
【００８１】
（核酸による方法）
本発明に関わる３５１個の遺伝子マーカーを検出するために、それらの各マーカーとハイブリダイズする上記核酸を使用する。検出すべき遺伝子の数は、各遺伝子セット毎に１又は２以上であり、好ましくは２以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、又は６０以上である。遺伝子の数が多いほど、肺腺癌の亜型の識別の確度が向上する。
【００８２】
ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ法、ブロット法、例えばノーザンもしくはサザンブロット、ノーザンもしくはサザンハイブリダイゼーション法、ｉｎ  ｓｉｔｕｅハイブリダイゼーション法、定量ＲＴ-ＰＣＲ法などの方法で実施することができる。好ましいハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ、定量ＲＴ-ＰＣＲ又はブロット法である。また、好ましいマイクロアレイの例は、ＤＮＡマイクロアレイ及びタンパク質マイクロアレイである。
【００８３】
ＤＮＡマイクロアレイ法では、上記表１〜４に列挙した遺伝子（１〜全数）とハイブリダイズする核酸プローブを基板に結合したＤＮＡチップを作製し使用する。
【００８４】
ＤＮＡチップは、核酸プローブを固相化できるものであればいずれの種類の基板も使用できる。固相には、例えばガラス、ポリマーなどが含まれ、さらに核酸を共有結合するための反応性基を含むスペーサーやクロスリンカーを導入することができる。このようなチップは市販されているため、それらを使用することが望ましい。
【００８５】
核酸プローブの固相化は、特に制限はないが、一般的な方法、例えばスポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてＤＮＡをスポットする方法、ノズルから液滴を噴射するインクジェット方式などの方法を用いて実施することができる。
【００８６】
生物学的試料中のＤＮＡ又はＲＮＡ、それから誘導されたｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどの核酸を、Ｃｙ染料（Ｃｒ３又はＣｙ５）などの蛍光物質で標識した核酸を、ＤＮＡチップ上のプローブとハイブリダイズさせる。レーザースキャンによる読み取り装置を用いて蛍光強度を読み取り、コンピュータでデータを解析する。
【００８７】
ブロット法では、本発明の核酸プローブを放射性同位元素（例えば、３２Ｐ及び３５Ｓ）や蛍光物質（ローダミン誘導体、Ｃｙ染料など）などで標識したのち、ナイロンなどのポリマーメンブレンに転写した生物学的試料中のＤＮＡ又はＲＮＡ、それから誘導されたｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどの核酸との間でハイブリダイゼーションを行う。シグナルを、放射線検出器又は蛍光検出器を用いて検出し、その強度を測定する。
【００８８】
定量ＲＴ―ＰＣＲ法では、生物学的試料中のＲＮＡから作製したｃＤＮＡを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、プライマーをｃＤＮＡとアニーリングさせＰＣＲを行い、得られた二本鎖ＤＮＡを検出する。プライマーを予め放射性同位元素や蛍光物質で標識しておくか、或いは、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色するなどの方法で、標的遺伝子を検出、定量することができる。
【００８９】
ＰＣＲ条件は、例えば変性：９２〜９４℃で３０〜６０秒；アニーリング：５０〜５５℃で３０〜６０秒；伸長：６８〜７２℃で３０〜６０秒を１サイクルとして３０〜４０サイクルの反応を含む。逆転写酵素は、市販の酵素、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）、Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ−）（宝酒造、京都）などを使用することができる。
【００９０】
（タンパク質による方法）
上記遺伝子の発現レベルの代替的測定法は、免疫学的方法である。
この方法では、各遺伝子に対応するタンパク質又はその断片を、タンパク質合成又は遺伝子組換え技術を用いて合成し、その結果得られたタンパク質又はその断片を抗原としてウサギ、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの動物を免疫し、それらの抗原に対する抗体を産生し、精製する。
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗ペプチド抗体などを含む。
【００９１】
ポリクローナル抗体は、前記動物を１０〜３００μｇ程度の抗原で皮下に免疫し、さらに約２週間後に追加免疫し、初回免疫から約３週間〜1か月後に採血し、抗血清から目的のポリクローナル抗体を含むＩｇＧ成分を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィーを使用して分離することを含む方法によって作製することができる。特異性を高めるために、得られたＩｇＧを、目的タンパク質をセルロース又はアガロースなどの担体に結合して作製されたカラムに結合させたのち、高塩濃度のバッファーで溶出し、透析や限外ろ過などの方法で脱塩して、特異的ポリクローナル抗体を得ることができる。抗体価は、通常の免疫測定法、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法などによって測定することができる。
【００９２】
モノクローナル抗体は、例えば以下の一般的方法によって作製することができる。
標的タンパク質又はその断片を、ポリクローナル抗体の作製と同様にマウス又はラット（例えばＢａｌｂ／ｃマウス）の皮下に投与し、１〜４週間間隔で、約２〜４回追加免疫を行う。抗体価が頭打ちになったとき、抗原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。２〜５日後、抗体産生細胞（例えば脾臓細胞又はリンパ節細胞）を採取する。次いで、抗体産生細胞を骨髄腫細胞株（好ましくはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株）に融合させてハイブリドーマ細胞を生成し、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を行う。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１〜 ２０：１の割合で混合し、ポリエチレングリコールなどの細胞融合促進剤の存在下で実施する。目的の抗体かどうかの確認は、上記の免疫測定法によって行うことができる。さらに、ハイブリドーマの増殖のために、マウスの腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを増殖させたのち、１〜２週間後に腹水を採取する。抗体の精製は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００９３】
抗ペプチド抗体は、タンパク質の表面上のリニアーなペプチドに対する抗体であり、免疫学的特異性を高めることができる。そのようなペプチドは、例えばＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅらの親水性-疎水性領域の推定法、Ｅｍｉｎｉらによるタンパク質分子上の特定ペプチド部位の表面に位置する確率、ポリペプチド鎖の折れ曲がり程度、例えばＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎらなどのαヘリックス、βシート、ターンを表示するタンパク質の二次構造予測、等を単独で又は組み合わせて使用して推定しうる。次いで、推定されたペプチドは、ペプチド合成機を用いて合成することができる。
【００９４】
ここで、標的タンパク質（上記表１〜４に示される遺伝子によってコードされる）の合成は、ｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から得ることができる。発現ベクターは市販のものを使用することができる。宿主細胞は、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌、シュウドモナス属細菌など）、酵母（例えばサッカロマイセス属、ピチア属など）、昆虫細胞（例えばSf細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３など）などを含む。また、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージなどからなり、標的タンパク質をコードするＤＮＡ、プロモーター、必要ならエンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカーなどを含むことができる。ポリペプチドの精製を容易にするために、標識ペプチド、例えば６〜１０残基のヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰポリペプチドなどをコードするＤＮＡ配列を含有させることもできる。遺伝子組換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）に記載されており、それらに記載の技術を本発明のために使用することができる。
【００９５】
上記のようにして得られた標的タンパク質は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、等電点電気泳動、電気泳動、限外ろ過、塩析、透析などを適宜組み合わせて精製することができる。
【００９６】
標的タンパク質又はその断片の配列は、上記表１〜４に記載されるＧｅｎＢａｎｋ登録番号に基づいてＮＣＢＩ  ＨｏｍｅＰａｇｅにアクセスすることによって入手可能である。
【００９７】
上記の抗体を、生物学的試料中の標的タンパク質又はその断片の検出のために使用することができる。多数の抗体をマイクロアレイ基板上に結合したタンパク質マイクロアレイを作製することによって、或いは、多数の抗体をＰＶＤＦ膜などのフィルター上にドット状にスポットすることによって、一度に多数の標的タンパク質を検出又は定量することが可能になる。或いは、慣用の免疫学的測定法、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光抗体法、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応またはウェスタンブロット法などによって、生物学的試料中の標的タンパク質又はその断片を検出又は定量することができる。
【００９８】
固相上で反応を行うときには、固相担体として、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンなどのポリマーの膜（フィルター）、プレート、チューブ、ストリップなど、ラテックス、磁性体などの粒子、などが含まれる。固相化は、物理的に或いは化学的に行うことができる。化学的結合のためには、例えばマレイル化試薬、臭化シアンなどの試薬で固相を処理し、タンパク質のアミノ基などと反応する官能基を固相に導入することができる。
【００９９】
標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、フルオレセイン、ローダミン、それらの誘導体などの蛍光物質、ルシフェラーゼ系、ルミノール系などの発光物質、３２Ｐ、１２５Ｉなどの放射性同位元素などが含まれる。標識化は、例えばグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、クロラミンＴ法、ボルトンハンター法などを含む。
【０１００】
本発明はまた、上記表１〜４に列挙される各遺伝子セットに含まれる遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体の発現を測定するための上記核酸（１）〜（５）、或いは該遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体によってコードされるタンパク質又は断片に対する抗体又はその断片、を含む、肺腺癌をもつ患者の術後予後をインビトロで予測するための又は肺腺癌をＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型のいずれかの亜型に分類するための組成物を提供する。
【０１０１】
本発明の実施形態により、前記組成物を構成する核酸又は抗体もしくはその断片を含む、キット又はマイクロアレイが提供される。
本発明のキットでは、上記（１）〜（５）に示す核酸であってＴＲＵ型、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型及びＴＲＵ-ｂの各遺伝子セット（それぞれ表１〜４参照）からの１又は２以上から全数の遺伝子を検出することができる核酸を、遺伝子セット毎に包装する。
【０１０２】
本発明の別のキットは、上記表１〜４に列挙される各遺伝子セットに含まれる遺伝子、又はその変異体、同族体もしくは誘導体によってコードされるタンパク質又はその断片に対する抗体又はその断片を、各遺伝子セットに対応するタンパク質セット毎に包装する。
【０１０３】
本発明の組成物に含まれる抗体は、上記の方法で作製されるようなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗ペプチド抗体などであるが、それらに限定されないものとする。抗体の種類は、いずれのタイプ、クラス、サブクラスでもよく、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡなどを含む。また、抗体の断片は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖなどを含む。
【０１０４】
キットにはさらに、ハイブリダイゼーションを行うための試薬類、例えばバッファー、逆転写酵素、標識二次抗体などを含有させてもよい。
【０１０５】
本発明のマイクロアレイは、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップともいう）又はタンパク質マイクロアレイである。
【０１０６】
これらのマイクロアレイチップにはそれぞれ、上記の核酸（１）〜（５）或いは上記の抗体又はその断片が結合される。すなわち、チップの表面に、上記表１〜４に列挙される遺伝子セットに含まれる遺伝子又はその変異体、同族体もしくは誘導体とハイブリダイズすることが可能な核酸、或いはそれらの遺伝子によってコードされるタンパク質、又はその変異体もしくは誘導体と免疫学的に特異的に反応する抗体又はその断片が結合される。
【０１０７】
変異体は、上記遺伝子又はタンパク質の完全成熟配列と、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルで７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、９５％以上又は９８％以上の同一性を有するものである。ここで、同一性（％）は、ギャップを導入した公知のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡプラグラムを用いて決定することができる。一般に、全塩基数に対する一致した塩基数の百分率として同一性（％）を算出できる。
【０１０８】
タンパク質の誘導体は、例えば、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、アルキル化、アシル化などの化学修飾誘導体を含む。
【０１０９】
チップの基板としては、ガラス又は樹脂（ポリマー）が通常使用され、その表面に例えばポリＬ-リジン、シラン又は高密度化アミノ基が導入される。
【０１１０】
基板上への核酸又は抗体の結合は、上記のとおり、スポット法又はインクジェット法によって行われる。
【０１１１】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はそれらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０１１２】
Ａ．材料と方法
患者
９０例の腺癌、３５例の扁平上皮癌、１８例の大細胞癌、４例の扁平上皮腺癌及び２例の大細胞神経内分泌癌を含む一連の１４９のＮＳＣＬＣ症例を、愛知県がんセンターの胸部外科（名古屋）で１９９５年１２月から１９９９年１２月の間に治癒的切除術を行い成功した患者のファイルから得た。術後の生存解析のために、腺癌をもつ、かつ、６〜１０８か月（中間値７７．０か月；平均６５．１か月）の範囲の追跡期間をもつ症例のうち８２例を使用した。残りの８例はゲフィチニブ治療を受けていたため排除した。すべての腫瘍標本をＯＣＴ化合物に包埋し、正規の検討部門からの必要な承認と患者からのインフォームドコンセントの書面を得たあとで−８０℃に保存した。
【０１１３】
発現プロファイルの取得
腫瘍標本の凍結組織を、ギムザ染色したすべて第１０切片を用いて病理学者の指導下で大まかな顕微解剖にかけた。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用いて全ＲＮＡを抽出したのち、ＤＮａｓｅ  Ｉで処理した。すべて主要組織型の肺癌を表す２０種の肺細胞系統を使用することによって大バッチの参照ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡ２５０ｎｇから、Ｔ７プロモーターを取り込んだポリｄＴプライマーとＭＭＬＶ−ＲＴを用いて、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＲＮＡを作製し、低ＲＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｉｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を用いてＣｙ３又はＣｙ５（Ｃｙ染料；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国）で標識した。Ｃｙ５-サンプルｃＲＮＡ及びＣｙ３-通常参照ｃＲＮＡを、１８,１７５個のユニーク遺伝子に相当する全２１,６１９スポットを含む注文して作ったＡｇｉｌｅｎｔオリゴヌクレオチドマイクロアレイとハイブリダイズさせたのち、共焦点レーザースキャニング（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）で分析した。スキャンしたイメージ上の蛍光強度を定量し、その値をバックグラウンド値に対し補正し正規化した。
【０１１４】
バイオインフォマティクス解析
解析中の潜在的ノイズをフィルターにかけるため、１０サンプル以上で十分な発現シグナルが得られなかった遺伝子は更なる解析から排除された。さらに、その発現レベルが目的のサンプルセットを通じて３倍未満変化した遺伝子を排除したが、これはそのような遺伝子は有益な情報を提供しうるとは考えられなかったからである。ＣＬＵＳＴＥＲプログラムを用いて、遺伝子と症例の両方の平均連関序列クラスタリングを、メジアンセンタリングと正規化を用いて行い、次いで、ＴＲＥＥＶＩＥＷ（Ｅｉｓｅｎ  ＭＢら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１４８６３−８，  １９９８）によって結果を表示した。特徴的なシグナル抽出手法であるＳＡＭを用いて、患者の肺腺癌亜型の各々に特異的な遺伝子に評点を付けた（Ｔｕｓｈｅｒ  ＶＧら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１６−２１，  ２００１）。
【０１１５】
ＥＧＦＲ、ｐ５３及びＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異分析
ｐ５３（エクソン４〜１０）、ＥＧＦＲ（エクソン１５〜２４）及びＫ−ｒａｓ（エクソン１〜２）遺伝子を、マイクロアレイ分析のために使用した同一のＲＮＡから増幅した。その結果得られたＰＣＲ産物を、先に記載されたと同様に直接配列決定した（Ｋｏｓａｋａ  Ｔら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：８９１９−２３，  ２００４）。
【０１１６】
ＧＯ項目に基づいた同定法と他の統計分析
ジーンオントロジー（ＧＯ）（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ  Ｍら，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：２５−９，  ２０００）を用いた解析により、患者の腺癌亜型の各々に特異的な遺伝子セットの異なる機能の生物学的特徴を明らかにした。このＧＯ分析に使用したデータベースファイルは、ＵｎｉＧｅｎｅのｆｔｐサイト（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）からダウンロードした。マイクロアレイ上のスポットに対応するＵｎｉｇｅｎｅ  ＩＤを、本発明者らが新たに開発したＰｅｒｌで書かれたプログラムの支援下で、Ｈｓ．  ｓｅｑ．  ａｌｌ、  Ｈｉｓ  ｄａｔａ及び  ＬＬ＿ｔｅｍｐｌを含むデータベースファイルを解析することによってＬｏｃｕｓＬｉｎｋ  ＩＤを介して対応するＧＯ項目に接続した。最終的に、マイクロアレイ上の１８,１７５個のユニーク遺伝子のうち１２,７４５個の既知の遺伝子が、約６７,０００個のＧＯ項目に対応付けられた。これらの項目のうち、目的の遺伝子セットにおいて有意に頻出する項目をＦｉｓｈｅｒの正確テストによって同定した。
【０１１７】
頻度解析には、χ２テスト又はＦｉｓｈｅｒの正確テストを用いた。種々の臨床パラメーターと、発現プロファイルで規定される亜型の発現との関係を調べるために、多変量ロジスティック回帰分析を実施した。Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ法を用いて時間の関数として生存を評価し、生存率の差をｌｏｇ−ｒａｎｋテストで解析した。Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて、生存に影響を与える独立した因子の解析を行った。解析はすべて、Ｓｔａｔａソフトウエア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ７；  Ｓｔａｔａ  Ｃｏｒｐ社、米国）を用いて行い、両側有意レベルがＰ＜０．０５に設定された。
【０１１８】
Ｂ．結果
非小細胞肺癌の発現プロファイル分類
はじめ教師値なしの系統クラスタリング法を用いて１４９個のすべてのサンプルを分類した。このとき、４,８３４個の最も可変的に発現された転写物を用い、個々の腫瘍におけるゲノムワイドの発現パターンの類似性に基づく分子分類法を確立した。その結果得られたクラスターは、十分に確立され広く使用されているＮＳＣＬＣ組織学的分類を精確に再現した（図１）。ＳＡＭ分析は、各クラスターについてアップレグレーション又はダウンレギュレーションを有する異なる遺伝子セットの存在を明らかにし、また、この遺伝子セットは、本発明者ら（Ｔｏｍｉｄａ  Ｓら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：５３６０−７０，  ２００４）及び他の研究者ら（Ｇａｒｂｅｒ  ＭＥら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１３７８４−９，  ２００１；  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ  Ａら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１３７９０−５，  ２００１）によってこれまで報告された遺伝子セットと類似することが判明した。
【０１１９】
本研究では、肺癌の発症の原因であると強く考えられているＥＧＦＲ、ｐ５３及びＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異について広範囲にわたる検索を行い、発現プロファイルによって規定される亜型がこれらの遺伝子変化の存在又は非存在と関係があるかどうかを調べた。慣用のＮＳＣＬＣ組織学的分類の明らかに精確な再現と、これら３つの遺伝子変化に関する従来の報告から予測されるように、高度に有意な関係が、ＥＧＦＲ突然変異と対応腺癌の樹形図との間（３６％対０％；Ｐ＜０．００１）で、並びに、ｐ５３突然変異と、ほとんど扁平上皮癌及び大細胞癌からなる樹形図との間（６７％対３３％；Ｐ＜０．００１）で観察された。
【０１２０】
発現プロファイルによって特定される２つの腺癌腫瘍型
この研究中に、本発明者らは、腺癌症例が大きな単一の樹形図として一緒にクラスター化される一方で、２つの主要なサブクラスターがあることに気付いた。この知見は、腺癌の別個の分析を、他のＮＳＣＬＣ組織型の強い特徴が腺癌内で違いを曖昧にする可能性があるという理由のために実施した。この目的のために、腺癌内で最も可変的に発現された４,１３８個の転写物を用いて行った分類体系的クラスタリングにより、２つの主要な樹形図と、右側樹形図中のさらに２つのサブクラスターの存在が明らかに示された（図２Ａ）。形態学的分析により、細気管支肺胞癌が極右手サブクラスター内に位置するが、他の腺癌亜型又はＷＨＯ分類に準ずる変異体は任意の特定の樹形図内にはっきりとはクラスター化されないことが示された。しかしながら、本発明者らは、右側樹形図内の症例の特徴がＴＲＵ型腺癌、すなわち本発明者らが先にその異なる細胞形態などに基づいて提案した異なる腺癌サブセット（Ｙａｔａｂｅ  Ｙら，  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２９：６３３−６３９，  ２００５；  Ｙａｔａｂｅ  Ｙら，  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｌ  ２６：７６７−７３，  ２００２；  Ｙａｔａｂｅ  Ｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００４，  ｐｐ１６９−１７９，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）と類似することに気付いた。（（注）便宜的に、右側樹形図と左側樹形図の腫瘍をそれぞれ、ＴＲＵ腺癌及び非ＴＲＵ腺癌と称する。）
【０１２１】
これらの２つの主要な発現プロファイルによって規定される腺癌亜型、すなわち非ＴＲＵ型及びＴＲＵ型、の樹形図及び生物学的性質について更に見識を得るために、ＳＡＭ分析をはじめに行い、示差的に発現された遺伝子を選択した。ＳＡＭ分析において０．１％未満の擬陽性率の有意のレベルでのプレフィルタリングにより１,６５７個の遺伝子を抽出し、これらの遺伝子のうち２８６個の遺伝子が、２以上の倍率でＴＲＵ型と非ＴＲＵ型とでのそれらの発現レベルの間に差異を示した。これらの２８６個の遺伝子は、ＴＲＵ型においてより高い発現を有する１９４個の遺伝子と、非ＴＲＵ型においてより高い発現を有する９２個の遺伝子からなっていた（データを示さず）。ＴＲＵと非ＴＲＵとの間の基本的な機能の差異をより良く理解するために、ＳＡＭで同定した遺伝子セットを、ＧＯ項目を用いて解析した。この方法は本研究のために本発明者らの研究室で開発されたものである。この同定法を用いて、９個の生物学的プロセス、６個の分子機能、及び２個の細胞成分に関係したＧＯ項目が、ＴＲＵ型腺癌に有意に頻出するものとして抽出され、これは正常の肺機能との明らかな関係を示した（表５）。
【０１２２】
【表５】
0005688497.tif 000019
【０１２３】
これに対して、非ＴＲＵ型に特異的なものとして同定されたＧＯ項目は、細胞周期及び増殖に関係するものを含んでおり、このことは、非ＴＲＵ型腺癌の固有の攻撃的性質を示唆している。
【０１２４】
腺癌のこれらの非常に確固たる発現プロファイルによって特定される亜型の同定は、独立したデータセットを用いて類似の教師値なしクラスタリング分析により行われた。３４症例の肺腺癌からなるＳｔａｎｆｏｒｄデータセット（Ｇａｒｂｅｒ  ＭＥら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１３７８４−９，  ２００１）を、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ−ａ型及びＴＲＵ-ｂ型における区別的発現に関して、３０個の上位にランクされた遺伝子の発現プロファイルに基づいた教師値なしの分類体系的クラスタリングによって解析した。この解析により、サブクラスターをもつ２つの主要な樹形図の明瞭な視覚化が生じた。この樹形図は、本研究で同定された３つの発現プロファイルで特定された腺癌亜型によく対応しているように思われた（図３）。
【０１２５】
発現プロファイルで特定される腺癌亜型を臨床病理学的特徴との有意な関係
次に、種々の臨床病理学的性質と、２つの発現プロファイルで特定される腺癌亜型、すなわちＴＲＵ腺癌及び非ＴＲＵ腺癌、との間の関係を調べた（表６）。
【０１２６】
【表６】
0005688497.tif 000020
【０１２７】
ＴＲＵ型腺癌は、女性（Ｐ＝０．００５）及び非喫煙者（Ｐ＜０．００１）において、非ＴＲＵ型よりも有意により頻繁にＴＲＵ型腺癌が認められた。一方、詳細な顕微鏡検査により、より高い悪性の可能性/出現と急速な増殖性との指標である、侵襲的増殖及び壊死の存在が、非ＴＲＵ型腫瘍と区別される細胞周期関連のＧＯ項目及び優勢な増殖にしたがって、非ＴＲＵ型において特徴的に広く認められた（侵襲的な増殖及び壊死の双方についてＰ＜０．００１）。年齢、性別、喫煙状態及び病理学的ステージを変数とする多変量ロジスティック回帰分析により、有意に関連する変数として非喫煙状態が同定された（Ｐ＝０．００１）。術後の予後について、本発明者らは、図２に見られるＴＲＵ型腺癌の樹形図下の２つの明らかなクラスター、すなわちＴＲＵ-ａ及びＴＲＵ-ｂ、に属する症例は、それらの術後の予後の点で区別されることに気付いた。ＴＲＵ-ａ型は非ＴＲＵ型のものと類似した予後を有するのに対して、ＴＲＵ-ｂ型腺癌の予後は非ＴＲＵ型の予後よりも有意に良好であった（Ｐ＝０．０２１；図４）。このことは、顕微鏡検査により、ＴＲＵ-ｂ型腺癌において他の腺癌型に比べてはるかに少ない頻度で明示的な侵襲的増殖が生じたことが示された、という事実と一致するように思われる（Ｐ＜０．００１）。
【０１２８】
発現プロファイルで特定される腺癌の亜型とＥＧＦＲ突然変異状態との有意の関係
ＮＳＣＬＣにおける３つの主要な遺伝子変化のいずれかが、発現プロファイルで特定される腺癌の亜型と有意に関係付けられるかどうかを調べた（図２Ｂ）。ＥＧＦＲ突然変異の存在が、ＴＲＵ型腺癌において、非ＴＲＵ型腺癌におけるよりも有意により多く頻出的であることが判明した（４５．３％対２１．６％；Ｐ＝０．０２６）。また、本発明者らは、ＴＲＵ型腺癌の樹形図下の２つの明らかなクラスター、すなわちＴＲＵ-ａ及びＴＲＵ-ｂ、はＥＧＦＲ突然変異の頻出度の点でわずかに異なっている、すなわちＴＲＵ-ａ型腺癌（４１．２％）についてよりもＴＲＵ-ｂ型腺癌（５２．６％）について、より高いＥＧＦＲ突然変異頻度を示すことに気付いた。これに対して、Ｋ−ｒａｓとｐ５３は腺癌の亜型と相関性を示さなかったが（ｐ５３についてＰ＝０．３３；Ｋ−ｒａｓについてＰ＝０．１７）、突然変異頻度の興味深い逆相関が、これらの遺伝子変化とＥＧＦＲ突然変異との間で観察された。非ＴＲＵ型腺癌は、最も高いパーセンテージの、ｐ５３及び/又はＫ−ｒａｓ突然変異（ｐ５３について４１％；Ｋ−ｒａｓについて１６％）を有する腫瘍を含み、次いでＴＲＵ-ａ型（それぞれ２９％及び１２％）、ＴＲＵ-ｂ型（それぞれ２１％及び０％）の順であった。
【０１２９】
ＴＲＵ型腺癌におけるＥＧＦＲ突然変異の予後有意性
本発明者ら及び他の研究者は、ＥＧＦＲ突然変異の存在がＮＳＣＬＣ患者の術後の予後に影響を与えないことを報告しているが（Ｋｏｓａｋａ  Ｔら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：８９１９−２３，  ２００４；  Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  Ｈら，  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９７：３３９−４６，  ２００５）、このことは、この独立のデータセットにおいて確認された（図５Ａ；Ｐ＝０．４２）。今回の知見が、特にＴＲＵ型の腺癌の発症において、他の肺癌型の発症におけるよりも、ＥＧＦＲ突然変異のより重要な役割を示している可能性があるという理由に基づいて、本発明者らは、ＴＲＵ型腺癌症例の別個の解析を行い、ＥＧＦＲ突然変異と術後の予後との間の潜在的な関係を調べた。有意な関係が、ＴＲＵ型腺癌において術後の悪い予後とＥＧＦＲ突然変異の存在との間で検出された（図５Ｂ；Ｐ＝０．０２４）。この関係はさらに、多変数Ｃｏｘ回帰分析の結果によって確認された（表７）。
【０１３０】
【表７】
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【０１３１】
ＴＲＵ型腺癌でのＥＧＦＲ突然変異の存在は、病気の段階（Ｈ．Ｒ．＝７．６１；Ｐ＝０．００１）及び発現プロファイルで特定された組織学的亜型（Ｈ．Ｒ．＝８．２５；Ｐ＝０．００３）の他に、独立の予後因子（Ｈ．Ｒ．＝７．７１；Ｐ＝０．００３）を示したが、一方、性別、年齢及び喫煙状態はいかなる有意な関係も示さなかった。
【０１３２】
ＥＧＦＲ突然変異の存在又は非存在下の有意の示差的発現を有する遺伝子の検索
すべての腺癌症例において、ＥＧＦＲ突然変異の存在と関連がある遺伝子を選択するために、５％の擬陽性率といった有意レベルを使用したが、これは、１％の擬陽性率を用いたときにはまったく選択されなかったからである（表８）。
【０１３３】
【表８】
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【０１３４】
ＥＧＦＲ突然変異を有し腫瘍内に２倍以上のアップレギュレーションをもつ５つの遺伝子を同定し、一方、さらに１１の遺伝子がＥＧＦＲ突然変異の存在と関連して１．５〜２倍のアップレギュレーションを示した。本発明者らはさらに、有意により高い頻度で出現するＥＧＦＲ突然変異を有するＴＲＵ型腺癌内で特異的にかつ示差的に発現される遺伝子について検索した。ＳＡＭにより遺伝子を選択するためにかなり高い擬陽性率（１０％）を使用する必要があったが、ＥＧＦＲ突然変異の存在下で２倍以上のアップレギュレーションを有する単一の遺伝子、すなわちＧＧＴＬＡ４を同定した。さらに８つの遺伝子は、同じ有意差レベルで１．５〜２倍のアップレギュレーションを示した（表５）。
【０１３５】
考察
所与の腫瘍での発現プロファイルは、複雑な影響の結果とみなすことができる。このような影響は、病因に重要な蓄積された遺伝子変化、並びに始原細胞の分化−コミットメントの結果によるものである。その理解を求める本研究において、本発明者らは、発現プロファイルによって特定される非常にしっかりした腺癌分類法の確立に成功した。その方法との関連性は、種々の区別的な分子遺伝学的及び臨床病理学的特徴を包含することによって明らかに支持される。２つの主要な亜型、すなわちＴＲＵ型と非ＴＲＵ型は多数の遺伝子の示差的発現を特徴とし、したがって遺伝子使用の点でそれらの有意の差異を示す（Ｙａｔａｂｅ  Ｙら，  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２９：６３３−６３９，  ２００５）。本発明者らのＧＯ項目の同定法を用いて得られる結果はさらにそれらの異なる性質を支持する。ＴＲＵ型腫瘍は末梢の肺機能の管理にとって重要である生物学的プロセスによって特徴付けられる（Ｖｅｌｄｈｕｉｚｅｎ  ＥＪら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４６７：２５５−７０，  ２０００）。同様に、ＴＲＵ型に関連した分子機能はそれらの始原細胞の特徴の保持を反映しているように思われる。対照的に、多くの非ＴＲＵ型関連ＧＯ項目は、細胞周期及び細胞増殖に関連しており、高グレードの特性の顕微鏡所見と一致するように思われる。
【０１３６】
ＴＲＵと非ＴＲＵの亜型間の臨床的特徴の著しい差異はまた、本発明の発現プロファイルで特定される分類法が確固たるものであることを支持している。ＴＲＵ型の注目に値する臨床上の特徴は、女性及び非喫煙者の割合が有意に高いことであり、一方、多変数解析の結果は、独立的に関連した因子として、非喫煙状態を示すが性別を示していないことである。すなわち、この腫瘍型は、喫煙の影響がはるかに少ない中で末梢肺気道細胞から生じるように思われること、並びに、ＧＯ項目ベースの解析によって示されるようにその先祖の特徴を保持するように思われることである。ＴＲＵ-ｂ型は最も好ましい予後を有しており、侵襲的増殖の頻度が小さく、また、ＴＲＵ-ａ型と比較したときでさえ、より高いレベルの種々の分化マーカーを発現する。このことは、ＴＲＵ-ｂ型が他の型よりもより良い正常の末梢肺気道細胞の特徴を保持するがＴＲＵ-ａ型に進行するかもしれないことを示唆している。
【０１３７】
本研究は明らかに、ＥＧＦＲ突然変異の存在が有意にＴＲＵ型腺癌と関連性があることを示している。実際、ＴＲＵ型腺癌症例の４５．３％がＥＧＦＲ突然変異を有しているのに対して、非ＴＲＵ型では２１．６％の発生率である。一方、ｐ５３やＫ−ｒａｓはそれらの突然変異頻度の点で有意な差異を示さなかったが、非ＴＲＵ型において最も高い発生率であるという興味ある逆の傾向があった。ＥＧＦＲ突然変異の存在は、特にＴＲＵ型腺癌について、病気の段階と無関係に術後の短い生存と有意に関係があった。実際、ＴＲＵ型のステージＩＩ／ＩＩＩの病気をもつ患者の５年生存率は、ＥＧＦＲ突然変異の存在下で２５％、その非存在下で７８％であることが判明した。これらの知見から、可能ならゲフィチニブによる集中的なアジュバント療法のための候補薬剤を選択するための、発現プロファイルで特定される亜型とＥＧＦＲの突然変異状態の同時分析の可能な臨床的有用性を示唆している。
【０１３８】
結論として、本研究は、肺癌、特に腺癌における不均質性の存在に対し、遺伝子的及び臨床病理学的に関連する発現プロファイルにより特定された分子分類法を確立することによって、光をあてた。
【０１３９】
Ｃ．ＴＲＵ型腺癌及び非ＴＲＵ型腺癌の識別例
肺腺癌をＴＲＵ型と非ＴＲＵ型に分類するために、シグナル−ノイズ関数（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ ｍｅｔｒｉｃｓ、Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２８６， ｐｐ５３１ ｔｏ５３７， １９９９）を用いた。肺腺癌症例群をＴＲＵ型の場合ｃｌａｓｓ1、非ＴＲＵ型の場合ｃｌａｓｓ2とそれぞれ規定した場合、シグナル−ノイズ統計値である重みＳは次式によって計算される（図６）。
Ｓ＝（μｃｌａｓｓ1−μｃｌａｓｓ2／σｃｌａｓｓ1＋σｃｌａｓｓ2）
【０１４０】
ここで、各遺伝子について、μｃｌａｓｓ1はｃｌａｓｓ1の全発現強度データの平均値を示し、μｃｌａｓｓ２はｃｌａｓｓ2の全発現強度データの平均値を示し、σｃｌａｓｓ1はｃｌａｓｓ1の全発現強度データの標準偏差を示し、σｃｌａｓｓ2はｃｌａｓｓ2の全発現強度データの標準偏差を示す。
【０１４１】
次に、遺伝子ｘに関する重み付き投票を、下記のWeighted-Voting の計算式を用いて計算する（図７）。
Ｖｘ＝Ｓ（Ｇｘ−ｂｘ）
【０１４２】
ここで、VＸは、遺伝子ｘに関する重み付き投票を示し、Ｓは上記式によって算出される重みを示し、ＧＸは、遺伝子ｘの発現強度（又は発現レベル）を示し、ｂＸは、
ｂＸ＝（μ1+μ2）/2
（ここで、μ1及びμ2は、それぞれclass1、class2の各平均値の平均を示す。）によって示され、２つの群の中心（すなわち、重心）を示す。
【０１４３】
重心からのずれに応じて重みを加算していく手法により、各群のＶＸの総和が０より大きいとき、腺癌はclass1に分類され、ＶＸの総和が０より小さいとき、腺癌はclass2に分類される、とすることができる。
【０１４４】
例えば、class1に属するsample1, 2, 3, 4 及び5と、class2  に属するsample6, 7, 8, 9及び10について、遺伝子(Gene)A, B, C（以上、ＴＲＵ特徴遺伝子）、遺伝子(Gene)X, Y,Z（以上、非ＴＲＵ遺伝子）の発現強度（又は発現レベル）を測定し、各群の５つのサンプルの各遺伝子の発現強度の平均値（μ）と標準偏差（σ）を算出し、さらに、上記の式から、重み（S）と重心(bX)を計算する。この結果を、表９に示す。
【０１４５】
【表９】
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【０１４６】
型分類すべきsampleAとsampleBについて、各遺伝子の発現強度（又は発現レベル）を測定し、上記式から重み(S)、Ｇｘ−ｂｘを計算して各VXを求め、さらに６つの遺伝子のVXの総和を求める（図８）。
【０１４７】
その結果、sampleAは、VXの総和が０より大きいため、ＴＲＵ型と識別される。また、sampleBは、VXの総和が０より小さいため、非ＴＲＵ型と識別される。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明により、肺腺癌患者において腺癌の亜型と術後予後の関係、及びある亜型（ＴＲＵ型）のＥＧＦＲ遺伝子変異と術後予後の関係を予測することが可能となるため、術後の患者に適した治療計画を立てることができる。このように、本発明は、肺腺癌の治療のために医療産業に寄与することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】１４９のＮＳＣＬＣ症例における４つの主要遺伝子変化の教師値なし分類体系的クラスタリング及び分析結果を示す。組織学の行中のボックス（「Ｈｉｓｔ」）は、扁平上皮癌（青色；ＳＱ）、大細胞癌（赤色、ＬＡ）、腺癌（橙色、ＡＤ）、扁平上皮腺癌（灰色）、及び大細胞内分泌癌（黄色）を表す。黒色のボックスは、それらの個々の行において、ＥＧＦＲ、ｐ５３及びＫ−ｒａｓ突然変異の存在を示す。試料（列）中の転写物配列（行）の発現指数は、カラーコードによって示されている（図中の底部のバー中の発現指数を参照のこと）。
【図２】９０の肺腺癌症例における４つの主要遺伝子変化の教師値なし分類体系的クラスタリング（ＴＲＵ，非ＴＲＵ(non-TRU)，ＴＲＵ−ａ，ＴＲＵ−ｂ）及び分析結果を示す。図２Ａは、突然変異の分類体系的クラスタリングと検索の結果を示す。発現指数は図１と同様である。図２Ｂは、ＥＧＦＲ、ｐ５３及びＫ−ｒａｓ突然変異の頻度(Frequencies of mutations)（％）を示すグラフである。黒色ボックスは、それらの個々の行において、ＥＧＦＲ、ｐ５３及びＫ−ｒａｓ突然変異の存在を示す。顕著な侵襲的増殖は黒色ボックスによって、限局性の侵襲的増殖は灰色ボックスによって、陰性の又は無視しうる侵襲的増殖は白色ボックスによってそれぞれ示されている。
【図３】非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型、及びＳｔａｎｆｏｒｄデータセット（Ｇａｒｂｅｒ  ＭＥら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１３７８４−９，  ２００１）を用いて同定されたプロファイリングで特定された肺腺癌サブセットにおける、区別的発現の点で上位にランクされた３０個の遺伝子の発現プロファイルに基づいた、教師値なし分類体系的クラスタリングの結果を示す。発現指数は図１と同様である。この図は、腺癌症例は、体系的にＴＲＵ型と非ＴＲＵ型に大きく分類され、ＴＲＵ型として識別された症例はさらにＴＲＵ-ａ型又はＴＲＵ-ｂ型に分類されることを示している。
【図４】発現プロファイルで特定された肺腺癌亜型のＫａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。横軸は術後観察月数(Months after surgery)、縦軸は生存率(Survaival)を示す。また、各術後観察月数における、非ＴＲＵ型、ＴＲＵ-ａ型及びＴＲＵ-ｂ型に分類されたリスク患者数を併せて示した。図から、ＴＲＵ-ｂ腺癌は、非ＴＲＵ型よりも有意に良好な予後を有したが、ＴＲＵ-ａ型の予後は非ＴＲＵ型のものと類似していた。
【図５】肺腺癌の全症例及びＴＲＵ型肺腺癌におけるＥＧＦＲ突然変異の存在又は非存在に関するＫａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。図５Ａは、ＥＧＦＲ遺伝子変異を有する又は有さない腺癌症例の術後生存曲線を示す。図５Ｂは、ＴＲＵ型腺癌におけるＥＧＦＲ遺伝子変異の存在又は非存在に関する術後生存曲線を示す。横軸は術後観察月数(Months after surgery)、縦軸は生存率(Survaival)を示す。また、各術後観察月数における、野生型又は突然変異型ＥＧＦＲ（それぞれwt-EGFR、 mut-EGFR）をもつリスク患者数を併せて示した。
【図６】重み(S)の計算式を示す。
【図７】Weighted-Voting（重み付き-投票）の計算式とその意味を示す。
【図８】Weighted-Votingによる判別モデルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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