(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発不明転移の原発巣を同定する方法において、
（ａ）転移性細胞を含むサンプル中の、少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカー遺伝子を評価する工程と、
（ｂ）前記バイオマーカー遺伝子から得られたデータを組み合わせて、線形判別分析にする工程であって、前記線形判別分析は、
（ｉ）前記バイオマーカー遺伝子を基準に対して標準化し、
（ｉｉ）各々のバイオマーカー遺伝子の感度および特異度を最適化し、前記がんの罹患率を重み付けし、原発巣組織を選択するようなカットオフを課す、
工程と、
（ｃ）前記線形判別分析によって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、前記がんが特定のがん群に由来しないことを決定する工程と、
を含み、または、
前記（ａ）の工程と、
前記（ｂ）工程と、
前記（ｃ）の工程と、
（ｄ）１つ以上の追加の異なるがんに特異的なバイオマーカー遺伝子を評価し、前記追加のバイオマーカー遺伝子に対して、工程（ｂ）および工程（ｃ）を反復する工程と、
を含み、
前記少なくとも２つの異なるがんは肺がんを含み、
前記肺がんに関連する前記バイオマーカー遺伝子は、
ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦおよびＤＳＧ３、または、
ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３ＨおよびＳＦＴＰＣよりなる、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも２つの異なるがんに関連する前記バイオマーカー遺伝子は、Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０を含む、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、
請求項２で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、Ｆ５、および、ＰＳＣＡである、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、
請求項２で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０をさらに含むか、または、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０によって置き換えられる、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも２つの異なるがんに関連する前記バイオマーカー遺伝子は、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、もしくは、ＦＡＢＰ１を含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
請求項５で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＣＤＨ１７である、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、
請求項６で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１をさらに含むか、または、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１によって置き換えられる、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号１１〜５８のうちの少なくとも１つを用いて、評価される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも２つの異なるがんに関連する前記バイオマーカー遺伝子は、性特異的バイオマーカー遺伝子から選択されたものをさらに含み、前記性特異的バイオマーカー遺伝子は、
（ｉ）男性患者の場合、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、もしくは、ＮＰＹ；あるいは、
（ｉｉ）女性患者の場合、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−π；および／または、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２；
のうちの少なくとも１つから選ばれる、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
請求項９で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＫＬＫ２である、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法において、
請求項９で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＫＬＫ３である、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、
請求項１１で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹをさらに含むか、または、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹによって置き換えられる、方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法において、
請求項９で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πである、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、
請求項１３で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＰＤＥＦ、および、ＭＧＢである、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、
請求項１３で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πをさらに含むか、または、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πによって置き換えられる、方法。
【請求項１６】
請求項９に記載の方法において、
請求項９で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２である、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、
請求項１６で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＷＴ１である、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、
請求項１７で加えられた前記バイオマーカー遺伝子は、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２をさらに含むか、または、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２によって置き換えられる、方法。
【請求項１９】
請求項９〜１８のいずれか１項に記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号１１〜５８のうちの少なくとも１つの配列を用いて、評価される、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法において、
前記がんの前記原発巣を決定するために、前記転移部位を含む追加の臨床情報をさらに得る工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
治療方針のための情報を提供する方法において、
請求項１に記載の方法にしたがって、原発不明転移の前記原発巣を同定することを含む、方法。
【請求項２２】
予後のための情報を提供する方法において、
請求項１に記載の方法にしたがって、原発不明転移の前記原発巣を同定することを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法を実施するためのキットにおいて、
バイオマーカー検出試薬を含み、
当該バイオマーカー検出試薬は、前記肺がんに関連するバイオマーカー遺伝子にハイブリダイゼーションするための核酸を含み、
前記バイオマーカー遺伝子は、
ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦおよびＤＳＧ３、または、
ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３ＨおよびＳＦＴＰＣからなる、
キット。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
前記マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップは、前記肺がんに関連するバイオマーカー遺伝子にハイブリダイゼーションするための核酸を含み、
前記バイオマーカー遺伝子は、
ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦおよびＤＳＧ３、または、
ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３ＨおよびＳＦＴＰＣからなる、
マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔連邦支援の研究または開発についての宣言〕
本発明を成すために、政府基金は全く用いていない。
【０００２】
〔発明の背景〕
原発不明がん（ＣＵＰ）は、異種の、生検によって確認される悪性腫瘍の群であり、転移性の疾患が、同定可能な原発腫瘍部位、すなわち原発巣組織（ＴｏＯ）なしに現れるものである。この問題は、すべてのがんのおよそ３〜５％に該当し、原発不明がんを７番目に一般的な悪性腫瘍にしている。Ghosh他（２００５年）；および、Mintzer他（２００４年）参照。患者の予後および治療方法は、原発腫瘍の原因次第であり、そのため、原発腫瘍部位を同定する必要性が強調されている。Greco他（２００４年）；Lembersky他（１９９６年）；および、Schlag他（１９９４年）参照。
【０００３】
さまざまな方法が、現在この問題を解決するために用いられている。以下に述べるいくつかの方法を、図１〜図２に示す。血清腫瘍マーカーは、鑑別診断に用いることができる。そのマーカーは十分な特異度を欠いているが、病理学上および臨床上の情報と組み合わせて用いることができる。Ghosh他（２００５年）参照。免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法は、腫瘍系統を同定するために用いることができるが、１００％特異的であるＩＨＣマーカーはほとんど存在しない。それゆえに、病理学者はしばしばＩＨＣマーカーパネルを用いている。いくつかの研究は、４〜１４個のＩＨＣマーカーを用いて、６６〜８８％の確度を示してきた。Brown他（１９９７年）；De Young他（２０００年）；および、Dennis他（２００５年ａ）参照。さらに高額な精密診断には、画像検査法［例えば、胸部Ｘ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、および、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャン］が含まれる。これらの方法の各々が、３０〜５０％の症例で原発腫瘍を同定できる。Ghosh他（２００５年）；および、Pavlidis他（２００３年）参照。これらの高度な技術にもかかわらず、ＣＵＰ症例を治療できるのは、死亡前に２０〜３０％のみである。Pavlidis他（２００３年）；および、Varadhachary他（２００４年）参照。
【０００４】
期待できる新しいアプローチは、腫瘍の原発巣を同定するための、ゲノム規模での遺伝子発現プロファイル解析の能力にある。Ma他（２００６年）；Dennis他（２００５年ｂ）；Su他（２００１年）；Ramaswamy他（２００１年）；Bloom他（２００４年）；Giordano他（２００１年）；および、米国特許出願公開第２００６００９４０３５号参照。これらの研究は、遺伝子発現プロファイルに基づいて原発巣組織を同定することの実現可能性を示した。これらの遺伝子発現プロファイル解析技術が臨床環境条件で役立つためには、２つの主な障害が克服されなければならない。第一に、遺伝子発現プロファイル解析はもっぱら原発組織に対して実施されるため、遺伝子マーカー候補は、それらの組織特異的発現が転移で維持されるということ確かめるために、転移性組織上で確認されなければならない。第二に、遺伝子発現プロファイル解析技術は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を利用することができなければならない。これは固定された組織サンプルが、現在の慣例では標準的な材料であるからである。ホルマリン固定では結果的にＲＮＡの分解が起こるため［Lewis他（２００１年）；およびMasuda他（１９９９年）参照］、現行のマイクロアレイプロトコルは確実には機能しないであろう。Bibikova他（２００４年）参照。加えて、そのプロファイル解析技術は、強固で、再現性があり、そして容易に利用可能でなければならない。
【０００５】
定量ＲＴ−ＰＣＲ法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ＦＦＰＥ組織から信頼性の高い結果を生ずるということが示されてきた。Abrahamsen他（２００３年）；Specht他（２００１年）；Godfrey他（２０００年）；およびCronin他（２００４年）参照。そのため、より実際的なアプローチは、ゲノム規模の方法を発見手段として用い、より強固な技術に基づく診断分析を開発することであろう。Ramaswamy（２００４年）参照。しかし、このパラダイムには、より少ない数の遺伝子の群を開発することが必要である。Oienと同僚は、遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）法を用いて６１個の腫瘍マーカーを同定し、それらのマーカーから、５つの腫瘍の種類について、１１個の遺伝子に基づくＲＴ−ＰＣＲ法を開発した。Dennis他（２００２年）参照。ＳＡＧＥ法とｑＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせたその他の研究では、４つの腫瘍の種類について、５つの遺伝子のパネルを開発し、８１％の確度を達成した。Buckhaults他（２００３年）参照。より最近の研究では、マイクロアレイプロファイル解析をｑＲＴ−ＰＣＲ法と組み合わせたものがあるが、７９個のマーカーを用いるものであった。Tothill他（２００５年）参照。
【０００６】
〔発明の概要〕
本発明は、原発不明転移の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルを入手し；少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価し；バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、分類ツリーにし（ここで、分類ツリーは、基準に対して標準化されたバイオマーカーを用いる）；各々のバイオマーカーの感度と特異度を最適化し、それらのがんの罹患率を重み付けし、原発巣組織を選択するようなカットオフを課し；その分類ツリーによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、そのがんが特定のがん群に由来しないことを決定し；そして、任意に、１つ以上の追加の異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、必要に応じて、追加のバイオマーカーに対して工程を反復することによる。
【０００７】
〔図面の簡単な説明〕
図１〜２は、原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
図３は、本発明のＣＵＰ分類ツリーの図である。
図４は、組織パネルにおける２つの遺伝子の発現強度を示しているマイクロアレイデータの図である。（Ａ）prostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）、（Ｂ）coagulation factor V（Ｆ５）である。棒グラフは、Ｙ軸に強度、Ｘ軸に組織を表している。Panc Caは、すい臓がん；Panc Nは、正常なすい臓である。
図５は、Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。３時間（Ａ）、もしくは、１６時間（Ｂ）のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＲＮＡをＦＦＰＥ組織から単離した。サンプルＣ２２（赤色）は１年前のブロックであり、サンプルＣ２３（青色）は５年前のブロックである。サイズラダーを緑色で示す。
【０００８】
図６は、異なる３つのｑＲＴ−ＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。それらのｑＲＴ−ＰＣＲ法とは、ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写におけるランダムヘキサマープライミング（ＲＨ２段階）；ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写における遺伝子特異的（リバースプライマー）プライミング（ＧＳＰ２段階）；または、１段階反応の遺伝子特異的プライミングとｑＲＴ−ＰＣＲ（ＧＳＰ１段階）である。１１個のサンプル由来のＲＮＡを３つの方法に分割し、３つの遺伝子［β-actin（Ａ）；ＨＵＭＳＰＢ（Ｂ）；および、ＴＴＦ（Ｃ）］に対するＲＮＡ量を測定した。各方法で得られたＣｔ値の中央値を実線で示す。
図７は、ＣＵＰ解析プレートの図である。
図８は、単変量解析ツリーの図解である。
図９は、ＲＮＡ濃度範囲に渡る解析性能を示した一連のグラフである。
図１０は、マーカー候補の指定および確認を示す実験作業の流れの図解である（図１０Ａ）。
【０００９】
図１１は、ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける、選ばれた１０個の組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。各図表について、Ｘ軸は正規化マーカー発現値を表す。
図１２は、解析の最適化の図である。（Ａ）および（Ｂ）は、Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。３時間（Ａ）、もしくは、１６時間（Ｂ）のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＲＮＡをＦＦＰＥ組織から単離した。サンプルＣ２２（赤色）は１年前のブロックであり、サンプルＣ２３（青色）は５年前のブロックである。サイズラダーを緑色で示す。（Ｃ）および（Ｄ）は、異なる３つのｑＲＴ−ＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。それらのｑＲＴ−ＰＣＲ法とは、ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写におけるランダムヘキサマープライミング（ＲＨ２段階）；ｃＤＮＡを生成するｑＰＣＲが後に続く、逆転写における遺伝子特異的（リバースプライマー）プライミング（ＧＳＰ２段階）；または、１段階反応の遺伝子特異的プライミングとｑＲＴ−ＰＣＲ（ＧＳＰ１段階）；である。１１個のサンプル由来のＲＮＡを３つの方法に分割し、２つの遺伝子［β-actin（Ｃ）；ＨＵＭＳＰＢ（Ｄ）］に対するＲＮＡ量を測定した。各方法で得られたＣｔ値の中央値を実線で示す。
図１３は、２３９個のサンプルに係る１０個のマーカーパネルの相対的な発現量を示すヒートマップである。赤色がより高い発現を表す。
【００１０】
〔詳細な説明〕
原発不明の転移性がん（ＣＵＰ）を有する患者の原発部位を同定することは、特異的な治療方法を適用することを可能にし、延命させるかもしれない。マーカー候補を、特異度を決定するために、他のがんの種類から生じた転移で確認したのと同じく、６つの組織から生じた２０５個のＦＦＰＥ転移性がんで、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってその後確認した。１０個の遺伝子特性が選ばれ、これら６つのがんの種類に対する転移性がんの原発巣組織を予測した。次に、ＲＮＡ単離法およびｑＲＴ−ＰＣＲ法を、これらの１０個のマーカーに対して最適化し、そして、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析を２６０個の転移性腫瘍の群に適用し、全体では７８％の確度を得た。最終的に、４８個の転移性サンプルの独立した群が検査された。重要なことは、この群のうち３７個のサンプルが、既知の原発腫瘍を有したか、もしくは最初にＣＵＰとして示されたがその後消散したもののどちらかであり、その解析は７８％の確度を示した。
【００１１】
バイオマーカーとは、指示マーカー遺伝子の発現量のあらゆるしるしである。このしるしは、直接的もしくは間接的でありうるし、そして、生理学上のパラメータを考慮し、また、体内における対照、正常組織もしくは他のがんと比較して、遺伝子の過剰発現もしくは発現不足を評価することができる。バイオマーカーには、核酸（過剰発現／発現不足および直接的／間接的の両方）が含まれるが、これに限定されない。核酸をバイオマーカーとして用いることには、本技術分野において既知の任意の方法が含まれうる。その方法には、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）、一塩基多型［ＳＮＰｓ；Brookes（１９９９年）参照］、マイクロサテライトＤＮＡ、ＤＮＡ低メチル化、もしくは、ＤＮＡ高メチル化を評価することが含まれるが、これらに限定されない。タンパク質をバイオマーカーとして用いることには、本技術分野において既知の任意の方法が含まれる。その方法には、量、活性、修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化等）、もしくは、免疫組織化学的手法（ＩＨＣ）を評価することが含まれるが、これらに限定されない。他のバイオマーカーには、造影マーカー、細胞計数マーカー、および、アポトーシスマーカーが含まれる。
【００１２】
本明細書において提供する指示遺伝子は、特定の腫瘍もしくは組織の種類と関連している遺伝子である。１つのマーカー遺伝子は多くの種類のがんと関連しうるが、もしその遺伝子の発現が、本明細書に記載された特定の原発巣特異的な分類ツリーを用いて同定される１つの腫瘍もしくは組織の種類と十分に関連するならば、その遺伝子を、特許請求の範囲に記載された発明において、原発不明がん（ＣＵＰ）の原発巣組織を決定するために用いることができる。本技術分野では、１つ以上のがんと関連する数多くの遺伝子が知られている。本発明は、好ましいマーカー遺伝子、および、さらに好ましいマーカー遺伝子の組み合わせを提供する。このことは本明細書中に詳細に記載されている。
【００１３】
「原発巣組織(tissue of origin)」において言及される「原発巣(origin)」とは、特定の医学的状況に応じて、組織の種類（肺、結腸等）、もしくは、組織型（腺がん、扁平上皮がん等）のいずれかを意味し、このことは当業者に理解されるであろう。
【００１４】
マーカー遺伝子は、配列を含む場合に、配列番号(SEQ ID NO)によって示されたその配列に対応する。遺伝子部分もしくは遺伝子断片は、その遺伝子の配列であることを識別するのに十分な、参照配列もしくはその相補配列の一部分を含む場合に、このような遺伝子の配列に対応する。遺伝子発現産物は、そのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは、ｃＤＮＡがこのような配列を有する組成物（例えば、プローブ）とハイブリダイゼーションする場合に、または、ペプチドもしくはタンパク質の場合にはこのようなｍＲＮＡによってコードされている場合に、このような配列に対応する。遺伝子発現産物の部分、もしくは、その断片は、その遺伝子もしくは遺伝子発現産物の配列であることを識別するのに十分な、参照遺伝子発現産物もしくはその補完物の一部分を含む場合に、このような遺伝子もしくは遺伝子発現産物の配列に対応する。
【００１５】
本明細書で説明され主張された、発明に係る方法、組成物、物品、および、キットは、１つ以上のマーカー遺伝子を含む。「マーカー」もしくは「マーカー遺伝子」は、本明細書全体を通じて、過剰発現もしくは発現不足が腫瘍もしくは組織の種類と関連している遺伝子に対応する遺伝子、および、遺伝子発現産物について言及するために用いられる。好ましいマーカー遺伝子は、表１において、より詳細に説明されている。本明細書で議論された全ての配列は、本明細書に記載され、配列表中に提示されている。
【表１】
0005666136.tif 000002
【００１６】
本発明は、原発不明転移の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルにおいて、少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価し；バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、分類ツリーにし（ここで、その分類ツリーは、基準に対して標準化されたバイオマーカーを用いる）；各々のバイオマーカーの感度と特異度を最適化し、それらのがんの罹患率を重み付けし、原発巣組織を選択するようなカットオフを課し、；その分類ツリーによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、そのがんが特定のがん集団に由来しないことを決定し；そして、任意に、１つ以上の追加の異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、必要に応じて、追加のバイオマーカーに対して工程を反復することによる。
【００１７】
本発明は、原発不明転移の原発巣を同定する方法を提供する。その方法は、転移性細胞を含むサンプルを入手し；少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価し；バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、分類ツリーにし（ここで、その分類ツリーは、（ｉ）基準に対して標準化されたバイオマーカーを用い；（ｉｉ）各々のバイオマーカーの感度と特異度とを最適化し、それらのがんの罹患率を重み付けし、原発巣組織を選択するようなカットオフを課す）；その分類ツリーによって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくはそのがんが特定のがん集団に由来しないことを決定し；そして、任意に、１つ以上の追加の異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、その追加のバイオマーカーに対して、工程（ｃ）および工程（ｄ）を反復することによる。
【００１８】
１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、（ｉ）ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、もしくは、ＳＦＴＰＣ；（ｉｉ）Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０；および／または、（ｉｉｉ）ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、もしくは、ＦＡＢＰ１から選択される。好ましくは、マーカー遺伝子は、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣである。より好ましくは、マーカー遺伝子は、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および／もしくは、ＤＳＧ３である。それらのマーカー遺伝子はさらに、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣを含みうるか、または、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣと置き換えてもよい。
【００１９】
１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０である。より好ましくは、マーカー遺伝子は、Ｆ５、および／もしくは、ＰＳＣＡである。好ましくは、それらのマーカー遺伝子は、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０を含むことができ、または、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０と置き換えることができる。
【００２０】
もう１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１であり、好ましくは、ＣＤＨ１７である。それらのマーカー遺伝子はさらに、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１を含むことができ、または、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１と置き換えることができる。
【００２１】
１つの実施形態において、配列番号１１〜５８のうちの少なくとも１つの配列を用いて、遺伝子発現を評価する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、および／もしくは、５８の単位複製配列のうちの少なくとも１つを生成し、そして、それらを測定することによって、遺伝子発現を評価する方法を含む。
【００２３】
１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、以下のマーカーのうち、少なくとも１つのマーカーから選択される性特異的マーカーから選ぶことができる。そのマーカーとは、（ｉ）男性患者の場合、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、もしくは、ＮＰＹであり；あるいは、（ｉｉ）女性患者の場合、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πであり；ならびに／または、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２である。好ましくは、マーカー遺伝子は、ＫＬＫ２、もしくは、ＫＬＫ３である。この実施形態において、それらのマーカー遺伝子は、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹを含むことができ、または、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹと置き換えることができる。１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πであり、好ましくは、ＰＤＥＦ、および、ＭＧＢである。この実施形態において、それらのマーカー遺伝子は、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πを含むことができ、または、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πと置き換えることができる。１つの実施形態において、マーカー遺伝子は、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２であり、好ましくは、ＷＴ１である。この実施形態において、それらのマーカー遺伝子は、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２を含むことができ、または、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２と置き換えることができる。
【００２４】
本発明は、以下の方法を提供する。その方法とは、がんの原発巣を決定するために、転移部位を含む、追加の臨床情報を得る方法であり；既知の原発巣の転移を用いる工程と、その転移のためのバイオマーカーを決定する工程と、そのバイオマーカーを原発不明転移のバイオマーカーと比較する工程とを含む、がんに対する最適なバイオマーカー群を得る方法であり；原発不明転移の原発巣を決定することによって、および、それに対して適切な治療法を同定することによって、治療方針を提供する方法であり；ならびに、原発不明転移の原発巣を決定することによって、および、それに対して対応する予後を同定することによって、予後を提示する方法である。
【００２５】
本発明はさらに、バイオマーカーを発見する方法を提供する。その方法とは、特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現レベルを決定することによって；その発現を決定するためにマーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価することによって；本明細書において提供された方法のいずれか、もしくは、本技術分野において知られている方法のいずれかにしたがって、マーカー遺伝子の発現を分析することによって；および、マーカー遺伝子が原発巣腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうか決定することによって；バイオマーカーを発見する方法である。
【００２６】
本発明はさらに、配列番号１１〜５８から選ばれる、少なくとも１つの単離された配列を含む組成物を提供する。本発明はさらに、本明細書において提供された方法にしたがって解析を実施するためのキットであって、バイオマーカー検出試薬をさらに含む、キットを提供する。
【００２７】
本発明はさらに、本明細書に記載された方法を実行するためのマイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップを提供する。
【００２８】
本発明はさらに、本明細書に記載された遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、それらの部分配列を含む、診断／予後ポートフォリオを提供する。この組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物サンプルにおける、遺伝子発現を評価するために、または、その遺伝子発現を特徴付けるのに十分なものである。
【００２９】
本発明において説明された任意の方法は、サンプルにおいて構成的に発現する、少なくとも１つの遺伝子の発現を評価することをさらに含むことができる。
【００３０】
好ましくは、すい臓がんのためのマーカーは、coagulation factor V（Ｆ５）、prostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）、integrin β6（ＩＴＧＢ６）、kallikrein 10（ＫＬＫ１０）、claudin 18（ＣＬＤＮ１８）、 trio isoform（ＴＲ１０）、および、hypothetical protein FLJ22041 similar to FK506 binding proteins（ＦＫＢＰ１０）である。好ましくは、Ｆ５、および、ＰＳＣＡのバイオマーカーを、同時に評価する。ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および、ＦＫＢＰ１０のバイオマーカーを、Ｆ５、および／もしくは、ＰＳＣＡに加えて、または、Ｆ５、および／もしくは、ＰＳＣＡの代わりに、評価することができる。Ｆ５は、例えば、米国特許出願公開第２００４００７６９５５号；同第２００４０００５５６３号；および、国際公開番号ＷＯ２００４０３１４１２号に開示されている。ＰＳＣＡは、例えば、国際公開番号ＷＯ１９９８０４０４０３号；米国特許出願公開第２００３０２３２３５０号；および、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号に開示されている。ＩＴＧＢ６は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０１８９９９号；および、米国特許第６３３９１４８号に開示されている。ＫＬＫ１０は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０７７０６０号；および、米国特許出願公開第２００３０２３５８２０号に開示されている。ＣＬＤＮ１８は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号；および、同ＷＯ２００５００５６０１号に開示されている。ＴＲ１０は、例えば、米国特許出願公開第２００２００５５６２７号に開示されている。ＦＫＢＰ１０は、例えば、国際公開番号ＷＯ２００００５５３２０号に開示されている。
【００３１】
好ましくは、結腸がんのためのマーカー遺伝子は、intestinal peptide-associated transporter HPT-1（ＣＤＨ１７）、caudal type homeo box transcription factor 1（ＣＤＸ１）、および、fatty acid binding protein 1（ＦＡＢＰ１）である。好ましくは、ＣＤＨ１７のバイオマーカーを、単独で評価する。ＣＤＸ１およびＦＡＢＰ１のバイオマーカーを、ＣＤＨ１７のバイオマーカーに加えて、もしくは、ＣＤＨ１７のバイオマーカーの代わりに評価することができる。ＣＤＨ１７は、例えば、Takamura他（２００４年）；および、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号に開示されている。ＣＤＸ１は、例えば、Pilozzi他（２００４年）；米国特許出願公開第２００５００５９００８号；および、同第２００１００２９０２０号に開示されている。ＦＡＢＰ１は、例えば、Borchers他（１９９７年）；Chan他（１９８５年）；Chen他（１９８６年）；および、Lowe他（１９８５年）により開示されている。
【００３２】
好ましくは、肺がんのためのマーカー遺伝子は、surfactant protein-B（ＳＰ−Ｂ）、thyroid transcription factor（ＴＴＦ）、desmoglein 3（ＤＳＧ３）、keratin 6 isoform 6F（ＫＲＴ６Ｆ）、p53-related gene（ｐ７３Ｈ）、および、surfactant protein C（ＳＦＴＰＣ）である。好ましくは、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および、ＤＳＧ３のバイオマーカーを、同時に評価する。ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および、ＳＦＴＰＣのバイオマーカーを、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および／もしくは、ＤＳＧ３のバイオマーカーのいずれかに加えて、または、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および／もしくは、ＤＳＧ３のバイオマーカーのいずれかの代わりに評価することができる。ＳＰ−Ｂは、例えば、Pilot-Mathias他（１９８９年）；米国特許出願公開第２００３０２１９７６０号；および、同第２００３０２３２３５０号に開示されている。ＴＴＦは、例えば、Jones他（２００５年）；米国特許出願公開第２００４０２１９５７５号；国際公開番号ＷＯ１９９８０５６９５３号；同ＷＯ２００２０７３２０４号；米国特許出願公開第２００３０１３８７９３号；および、国際公開番号ＷＯ２００４０６３３５５号に開示されている。ＤＳＧ３は、例えば、Wan他（２００３年）；米国特許出願公開第２００３０２３２３５０号；国際公開番号ＷＯ２００４０３０６１５号；および、同ＷＯ２００２１０１３５７号に開示されている。ＫＲＴ６Ｆは、例えば、Takahashi他（１９９５年）；米国特許出願公開第２００４０１４６８６２号；および、米国特許出願第２００４０２１９５７２号に開示されている。ｐ７３Ｈは、例えば、Senoo他（１９９８年）；および、米国特許出願公開第２００３０１３８７９３号に開示されている。ＳＦＴＰＣは、例えば、Glasser他（１９８８年）により開示されている。
【００３３】
マーカー遺伝子をさらに、性特異的マーカーから選択することができる。それらの性特異的マーカーとは、例えば、男性患者の場合、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、もしくは、ＮＰＹであり；あるいは、女性患者の場合、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−π；ならびに／または、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２である。
【００３４】
好ましくは、乳がんのためのマーカー遺伝子は、prostate derived epithelial factor（ＰＤＥＦ）、mammaglobin（ＭＧ）、prolactin-inducible protein（ＰＩＰ）、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、および、ＧＡＢＡ−πである。好ましくは、ＰＤＥＦ、および、ＭＧのバイオマーカーを、同時に評価する。ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、および、ＧＡＢＡ−πのバイオマーカーを、ＰＤＥＦ、および／もしくは、ＭＧのバイオマーカーに加えて、もしくは、ＰＤＥＦおよび／もしくは、ＭＧのバイオマーカーの代わりに評価することができる。ＰＤＥＦは、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０３０６１５号；同ＷＯ２０００００６５８９号；同ＷＯ２００１０７３０３２号；Wallace他（２００５年）；Feldman他（２００３年）；および、Oettgen他（２０００年）により開示されている。ＭＧは、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４０３０６１５号；米国特許出願公開第２００３０１２４１２８号；Fleming他（２０００年）；Watson他（１９９６年、および、１９９８年）；および、米国特許第５６６８２６７号に開示されている。ＰＩＰは、例えば、Autiero他（２００２年）；Clark他（１９９９年）；Myal他（１９９１年）；および、Murphy他（１９８７年）により開示されている。Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、および、ＧＡＢＡ−πは、Reinholz他（２００５年）により開示されている。ＮＧＥＰは、例えば、Bera他（２００４年）により開示されている。
【００３５】
好ましくは、卵巣がんのためのマーカーは、Wilm's tumor 1（ＷＴ１）、ＰＡＸ８、steroidogenic acute regulatory protein（ＳＴＡＲ）、および、ＥＭＸ２である。好ましくは、ＷＴ１のバイオマーカーを評価する。ＳＴＡＲ、および、ＥＭＸ２のバイオマーカーを、ＷＴ１のバイオマーカーに加えて、もしくは、ＷＴ１のバイオマーカーの代わりに評価することができる。ＷＴ１は、例えば、米国特許第５３５０８４０号；同第６２３２０７３号；同第６２２５０５１号；米国特許出願公開第２００４０００５５６３号；および、Bentov他（２００３年）により開示されている。ＰＡＸ８は、例えば、米国特許出願公開第２００５００３７０１０号；Poleev他（１９９２年）；Di Palma他（２００３年）；Marques他（２００２年）；Cheung他（２００３年）；Goldstein他（２００２年）；Oji他（２００３年）；Rauscher他（１９９３年）；Zapata-Benavides他（２００２年）；および、Dwight他（２００３年）により開示されている。ＳＴＡＲは、例えば、Gradi他（１９９５年）；および、Kim他（２００３年）により開示されている。ＥＭＸ２は、例えば、Noonan他（２００１年）により開示されている。
【００３６】
好ましくは、前立腺がんのためのマーカーは、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、および、ＮＰＹである。好ましくは、ＫＬＫ３のバイオマーカーを評価する。ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、および、ＮＰＹのバイオマーカーを、ＫＬＫ３に加えて、もしくは、ＫＬＫ３の代わりに評価することができる。ＫＬＫ２、および、ＫＬＫ３は、例えば、Magklara他（２００２年）により記載されている。ＫＬＫ２は、例えば、米国特許出願公開第２００３０２１５８３５号；および、米国特許第５７８６１４８号に記載されている。ＫＬＫ３は、例えば、米国特許第６２６１７６６号に記載されている。
【００３７】
本方法はまた、がんの原発巣を決定するために、転移部位を含む追加の臨床情報を得ることを含むことができる。フロー図を図３に示す。
【００３８】
本発明はさらに、既知の原発巣の転移を用いることによって；その転移のためのバイオマーカーを決定することによって；および、そのバイオマーカーを原発不明転移のバイオマーカーと比較することによって；がんに対する最適なバイオマーカー群を得るための方法を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、本明細書に記載された方法にしたがって、原発不明転移の原発巣を決定することによって、および、その原発巣に対する適切な治療法を同定することによって、治療方針を提供するための方法を提供する。
【００４０】
本発明はさらに、本明細書に記載された方法にしたがって、原発不明転移の原発巣を決定することによって、および、その原発巣に対して対応する予後を特定することによって、予後を提供するため方法を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現レベルを決定すること；そのマーカー遺伝子の発現を決定するためにマーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価すること；本明細書に記載された方法にしたがって、マーカー遺伝子の発現を分析すること；および、マーカー遺伝子が原発腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうかを決定すること；を含む、バイオマーカーを発見する方法を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、配列番号１１〜５８から選ばれる、少なくとも１つの単離された配列を含む組成物を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、本明細書に記載された解析を実施するためのキット、物品、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ、診断／予後ポートフォリオ、および、本願方法によって得られた結果を報告するための患者報告を提供する。
【００４４】
特定の核酸配列が、組織サンプルに単に存在するかしないかということだけでは、診断上の、もしくは、予後上の価値を持つことはほとんどわからなかった。一方、さまざまなタンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡの発現についての情報は、ますます重要なものとみなされている。ゲノムの中に、タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡを発現する可能性を有する核酸配列（このような配列を「遺伝子」という）が単に存在するということは、それだけでは、タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡが所与の細胞において発現するかどうか、決定的なものではない。タンパク質、ペプチド、もしくは、ｍＲＮＡを発現することができる所与の遺伝子が発現するかどうかということ、および、たとえそうであっても、どの程度このような発現が起こるかということは、さまざまな複合的要因によって決定される。これらの要因を理解すること、および、判定することの難しさに関わりなく、遺伝子発現を解析することは、重要な事象（例えば、腫瘍形成、転移、アポトーシス、および、臨床上関連のあるその他の現象）の発生についての有用な情報を提供することができる。遺伝子が活性であるか、もしくは、不活性である程度についての相対的な指標は、遺伝子発現プロファイルに見出すことができる。本発明の遺伝子発現プロファイルは、ＣＵＰの患者に対して診断を提供するために、および、ＣＵＰの患者を治療するために用いられる。
【００４５】
サンプルの準備には、患者サンプルの収集が必要である。本発明の方法で用いられた患者サンプルは、組織の細針吸引（ＦＮＡ）により小節から採取された細胞のような、異常細胞を含む疑いがあるサンプルである。生検、もしくは、外科的な標本、および、レイザーキャプチャーマイクロダイセクションにより得られた大量組織標本も使用に適している。レイザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）技術は、研究用の細胞を選ぶ１つの方法であり、細胞の種類の不均一性によって生ずるばらつきを最小限にする。その結果、マーカー遺伝子発現における、正常もしくは良性細胞と悪性腫瘍細胞との間の、中程度の、もしくは、小さな変化が容易に検出できる。サンプルはまた、末梢血から抽出された循環系上皮細胞も含みうる。これらは多くの方法にしたがって手に入れることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第６１３６１８２号に記載された磁気分離法である。ひとたび目的の細胞を含むサンプルが得られれば、適切なポートフォリオにおける遺伝子のためのバイオマーカーを用いて、遺伝子発現プロファイルが手に入る。
【００４６】
遺伝子発現プロファイルを確立するための好ましい方法は、タンパク質、もしくは、ペプチドをコードしうる遺伝子によって生成されるＲＮＡ量を決定することを含む。このことは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット分析、および、その他の関係した検査法によって達成される。個々のＰＣＲ反応を用いてこれらの技術を実施することが可能であるが、ｍＲＮＡから生成される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、もしくは、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅すること、および、マイクロアレイによって分析することが最善である。多くの異なるアレイ配置、および、それらを作製する方法が当業者に知られており、例えば、米国特許第５４４５９３４号；同第５５３２１２８号；同第５５５６７５２号；同第５２４２９７４号；同第５３８４２６１号；同第５４０５７８３号；同第５４１２０８７号；同第５４２４１８６号；同第５４２９８０７号；同第５４３６３２７号；同第５４７２６７２号；同第５５２７６８１号；同第５５２９７５６号；同第５５４５５３１号；同第５５５４５０１号；同第５５６１０７１号；同第５５７１６３９号；同第５５９３８３９号；同第５５９９６９５号；同第５６２４７１１号；同第５６５８７３４号；および、同第５７００６３７号に記載されている。
【００４７】
マイクロアレイ技術は、何千個もの遺伝子の定常状態ｍＲＮＡ量を同時に評価することができ、制御されていない細胞の増殖の開始、停止、あるいは、調節といった効果を特定するための強力な手法を提供することができる。２つのマイクロアレイ技術、すなわち、ｃＤＮＡアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイが、現在広く使われている。これらのチップの構造にはちがいがあるけれども、本質的に、すべての下流データの解析、および、それらの出力は同一のものである。これらの解析の成果は、通常、標識プローブから受信されるシグナルの強度の測定値である。標識プローブは、マイクロアレイ上の既知の位置にある核酸配列にハイブリダイゼーションするサンプル由来のｃＤＮＡ配列を検出するために用いられる。通常、シグナルの強度は、サンプル細胞において発現されたｃＤＮＡ、および、ひいてはｍＲＮＡの量に比例する。大変多くのこのような技術が利用可能であり、有用である。遺伝子発現を決定するための好ましい方法は、米国特許第６２７１００２号；同第６２１８１２２号；同第６２１８１１４号；および、同第６００４７５５号に見出すことができる。
【００４８】
発現量の分析は、このようなシグナル強度を比較することによって実施される。このことは、対照サンプルの発現強度に対する試験サンプルでの遺伝子の発現強度の比率行列を生成することによって、最もよく行われる。例えば、罹患組織由来の遺伝子発現強度は、同じ種類の良性組織、もしくは、正常組織から生じた発現強度と比べることができる。これらの発現強度の比率は、試験サンプルと対照サンプルとの間で、遺伝子発現において、倍の変化があることを示している。
【００４９】
選択は統計的検定に基づくことができる。この統計的検定は、腫瘍のもともとの原発巣部位に関係する因子間において、各遺伝子が差異のある発現をすることに対する有意性の証拠と関係した順位付けされた一覧を提出する。このような検定の例には、分散分析(ＡＮＯＶＡ)、および、クラスカル・ウォリス検定が含まれる。順位付けは、このような、カットオフまでの重みの総計を、他の分類以上に１つの分類の利益になるような証拠の優越として解釈するように設計されたモデルにおいて、重み付けとして用いることができる。文献に記載されたような従来の証拠も、その重み付けを調整するために用いてもよい。
【００５０】
本発明において、６つの腫瘍の種類間で差異のある発現の有意な証拠を示した１０個のマーカーが選択された。選択過程には、統計的検定、平均分散最適化、および、専門知識のアドホックな収集が含まれた。他の実施形態では、特徴抽出法は、教師あり学習法を通じて、マーカーの選択および試験をするように自動化することができた。データベースが蓄積されるにつれ、データベースの任意の所与の状態において可能である最も高度な診断確度を生み出すべく、マーカーの選択をくり返すことができる。
【００５１】
好ましい実施形態は、安定した対照群を同定し、この群をすべてのサンプルにわたってゼロ分散に設定することによって、各測定を標準化することである。解析における系統誤差によって作用され、かつ、この誤差から独立して変化することが知られていない、あらゆる単一の内因性転写産物、もしくは、そのようなあらゆる内因性転写産物の集合として、この対照群は定義される。すべてのマーカーは、対照群のあらゆる記述的統計値（例えば、平均値、もしくは、中央値）に対するゼロ分散、または、直接測定に対するゼロ分散を生ずるサンプル特異的な因子によって調整される。あるいは、系統誤差にのみ関係する対照の分散の前提が真ではなく、しかし標準化が行われた場合に、生ずる分類誤差がより小さくなる場合、対照群はなお、前述のとおり用いられるであろう。非内因性のスパイクコントロールもまた役に立ったが、好ましいものではない。
【００５２】
分類ツリーを、Matlab関数「treefit」を用いて構築した。この関数は、Mathworks社から市販されている。関数は、Breiman, L.「Classification and Regression Tree」Chapman & Hall, Boca Raton（１９９３年）に記載された仕事に基づいている。
【００５３】
以下の工程を以下の順番で、インストールされたStatistical Toolboxとともに、Matlab７．３．０版（http://www.mathworks.com）を用いて、コードが実行する。用語treefitとは、Statistical Toolbox名前空間におけるtreefit関数から生成されたツリーをいう。
【００５４】
（１）１０個のマーカー遺伝子、および、２個の対照に対するＣＴ値は、利用可能なすべての訓練群のサンプルについて、ハードドライブに蓄積される。
（２）各サンプルについて、各マーカーから対照サンプル特異的な平均を差し引くことにより、１０個のマーカー遺伝子に係る値を標準化する。
（３）訓練データ群は、原発巣部位がわかっている転移から構成され、各サンプルは標的マーカーのうち少なくとも１つを有する。この標的マーカーは、ラベルされた原発巣組織に特異的であり、５未満の四捨五入整数値に概数化された、標準化されたＣＴ値を有している。
（４）Treefitは、（３）における訓練データから、７つのツリーを構築するために用いられる。２以上のクラスを含む各ノードは、分岐するために１０個以上の観察を有さなければならない。分岐を選ぶための基準は、Gini多様性指数である。任意の特定のツリーで用いられる各クラスについて、事前確率は等しい。１００個の１０倍交差検定の平均により決定されるような最小コストより１つ下のレベルまで、各ツリーを剪定する。各剪定レベルについてのコストを、Matlab Statistical Toolbox関数「treetest」により決定する。３つで１組のツリーは、肺のバックグラウンド組織に相当するツリーを有する男性に特異的であり、別のツリーは、結腸のバックグラウンドについて特異的であり、一般ツリーは、結腸、肺、すい臓、または、前立腺ではない、任意の他のバックグラウンド組織について特異的である。４つの女性特異的ツリーがある。それらのツリーは、結腸バックグラウンドツリー、肺バックグラウンドツリー、卵巣バックグラウンドツリー、および、乳房、結腸、肺、すい臓、または、卵巣ではない任意の他のバックグラウンドとともに用いられる一般ツリーである。各男性特異的ツリーには、ＷＴ１、ＭＧ、および、ＰＤＥＦを用いないだろう。というのは、男性特異的ツリーは、サンプルを乳房または卵巣として分類するよう試みないからである。同様に、女性特異的ツリーは、ＫＬＫ３を用いないだろう。女性ツリーにおけるクラスとして、前立腺を用いないからである。結腸バックグラウンド特異的ツリーは、ＨＰＴ１を用いない。肺バックグラウンド特異的ツリーは、ＨＵＭＰ、ＴＴＦ１、または、ＤＳＧ３を用いない。卵巣バックグラウンド特異的ツリーでは、ＷＴ１を用いない。
【００５５】
サンプルを試験するために、以下のことを行った。
（１）試験データ群を読み込む。
（２）両方の対照のサンプル特異的平均を生成する。
（３）各サンプルについて、サンプル特異的平均を、各マーカーから差し引くために用いる。
（４）４０の生のＣＴ値から生成した任意の標準化ＣＴ値を、４０で置換する。
（５）試験群における各サンプルについて、以下のことを試験する。
ａ．両方の対照の平均が３４より大きい場合、その後、そのサンプルを、事後確率が０である「CTR_FAILURE」とラベルする。
ｂ．バックグラウンドを、結腸、卵巣、もしくは、肺について調べる。もし一致が見られれば、その後、性に対しても同様に調べる。バックグラウンドおよび性特異的なツリーを、その後サンプルを評価するために用いる。
ｃ．乳房、すい臓、肺ＳＣＣ、もしくは、前立腺が、バックグラウンドラベルとして見出された場合、そのサンプルに、「FAILURE_ineligible_sample」のラベルを付し、事後確率をすべて０に設定する。
ｄ．男性もしくは女性のどちらかのための一般ツリーを、他のすべてのサンプルに対して用いる。
【００５６】
工程（５）ｂ〜ｄで決定された分類結果を、特定されたツリーのルートノードから開始し、各エンカウンターノードでのカットオフに基づいた末端リーフへの経路をたどることにより、生成することができる。あるいは、Matlab Statistical Toolbox関数「treeval」と同様の機能性を有するプログラムを、結果を生成し、それら結果をファイルに書き込むために用いることができる。
【００５７】
本発明は、この過程から得られた遺伝子発現ポートフォリオを含む。
【００５８】
遺伝子発現プロファイルは、多くのやり方で表示することができる。最も一般的な方法は、縦に試験サンプルを、横に遺伝子を示した図形的な系統樹中に、未加工の蛍光強度もしくは比率行列を配置することである。データは、類似の発現プロファイルを有する遺伝子が互いに近位にあるように配置される。各遺伝子の発現率は、色として視覚化される。例えば、１未満の発現率（ダウンレギュレーション）は、スペクトルの青色部分に現れ、１を超える発現率（アップレギュレーション）は、スペクトルの赤色部分に現れる。「GeneSpring」（Silicon Genetics, Inc.）、ならびに、「Discovery」および「Infer」（Partek, Inc.）を含む、市販のコンピュータソフトウェアプログラムは、このようなデータを表示するために利用できる。
【００５９】
多数の独自のＲＮＡ種の測定値は、原発腫瘍、もしくは、既知の起源の原発腫瘍由来の転移性腫瘍から収集される。関係のあるデータベースを生成するために、臨床記録［患者の年齢、性別、原発腫瘍の原発巣部位、および、（もし適用できるなら）転移部位が含まれるが、これらに限定されない］と共にこれらの示度を用いる。ＲＮＡ転写物、および、臨床上の因子を選択するために、データベースを用いる。これらのＲＮＡ転写物、および、臨床上の因子は、転移性腫瘍の原発巣を予測するためのマーカー変数として用いることができるものである。
【００６０】
遺伝子発現を決定するためにタンパク質量を測定する場合、もしそれが結果的に適切な特異度および感度をもたらすならば、本技術分野において既知の任意の方法が適当である。例えば、タンパク質特異的な抗体、もしくは、抗体断片へ結合することによって、また、抗体結合タンパク質の量を測定することによって、タンパク質量を測定することができる。検出を容易にするために、放射性試薬、蛍光性試薬、もしくは、他の検出可能な試薬で、抗体を標識することができる。検出方法には、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および免疫ブロット法が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明の方法で用いられる調節された遺伝子を、実施例中で説明する。差異のある発現をする遺伝子は、特定の原発巣のがんを有する患者では、異なる原発巣由来のがんを有する者と比べて、アップレギュレートされるか、またはダウンレギュレートされる。アップレギュレーション、および、ダウンレギュレーションとは、いくつかの基準と比較して、遺伝子発現量において（その測定に用いられたシステムにおけるノイズが寄与する以上に）検出可能な差異が見られることを意味する相対的な用語である。この場合、基準は分類ツリーに基づいて決定される。異常細胞における目的遺伝子はしたがって、同一の測定方法を用いた基準レベルと比較して、アップレギュレートされるか、もしくは、ダウンレギュレートされるかのどちらかである。本明細書の内容において、異常な(diseased)とは、制御されない細胞増殖とともに起こるような、身体的機能の適切な作動を中断する（すなわち、阻害する）身体の状態変化、もしくは、その適切な作動を阻害する可能性がある身体の状態変化をいう。ある人間の遺伝子型もしくは表現型のいくつかの観点が病気の存在と一致する場合に、その人間は、その病気であると診断される。しかしながら、診断もしくは予後を実施するという行為には、再発の可能性、治療の種類、および、治療観察を決定するといった、病気／状態についての課題の決定を含んでいてもよい。治療観察においては、遺伝子発現プロファイルが正常組織とより矛盾のないパターンに変化したかどうか、もしくは、変化しつつあるかどうかを決定するために、時間をかけて遺伝子発現を比較することによって、所与の一連の治療の効果について、臨床上の判断がなされる。
【００６２】
遺伝子は、グループ化することができる。このため、そのグループの遺伝子群について得られた情報が、診断、予後、もしくは、治療選択のような臨床上関連のある判断を行うためのしっかりした基準を提供する。これらの遺伝子群は、本発明のポートフォリオを作り上げる。大部分の診断マーカーと同様に、正しい医療上の判断を行うのに十分なほどの最も少ない数のマーカーを用いることが、しばしば望ましい。このことは、時間および資源の非生産的な使用を防止すると同時に、更なる分析の間の治療の遅延を防止する。
【００６３】
遺伝子発現ポートフォリオを確立する１つの方法は、株式ポートフォリオを確立するのに広く用いられている、平均分散アルゴリズムのような最適化アルゴリズムを使用することである。この方法は、米国特許出願公開第２００３０１９４７３４号に詳細に記載されている。本質的には、その方法は、収益の変動を最小化すると同時にその収益を使用するために、受け取る収益（例えば、生成されたシグナル）を最適化するであろう入力群（金融応用における株式、本明細書においては、強度によって評価されるような発現）の確立を要求する。多くの市販のソフトウェアプログラムが、このような作業を実行するために利用可能である。本明細書全体を通じて「Wagner Software」といわれる「Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application」が、好ましい。このソフトウェアは、有効フロンティアを決定するために、「Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library」由来の関数を用い、マーコウィッツの意味における最適ポートフォリオが好ましい。Markowitz（１９５２年）参照。この種のソフトウェアを用いるには、そのソフトウェアを意図された金融分析の目的で用いる場合に株式収益および危険率評価が用いられるように、マイクロアレイデータを入力として扱うことを可能にするために、そのマイクロアレイデータを変換することが必要である。
【００６４】
ポートフォリオを選択する過程はまた、ヒューリスティクスなルールの適用を含むことができる。好ましくは、このようなルールは、生物学、および、臨床上の結果を生むために用いられた技術への理解に基づいて公式化される。より好ましくは、それらは最適化法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択における平均分散法は、がん患者において差異のある発現をする多くの遺伝子に対するマイクロアレイデータに適用することができる。この方法からの出力は、罹患組織におけるのと同様に、末梢血においても発現された、いくつかの遺伝子を含みうる最適化された遺伝子群であるであろう。もし試験方法において用いられたサンプルが末梢血から得られ、がんの例において差異がある発現をする特定の遺伝子がまた、末梢血においても差異がある発現をすることがあるならば、ヒューリスティクスなルールを適用することができる。そのヒューリスティクスなルールにおいて、ポートフォリオは、末梢血において差異がある発現をするものを除いた有効フロンティアから選択される。もちろん、そのルールは、例えば、データの事前選択の間にそのルールを適用することによって、有効フロンティア形成に先立って適用することができる。
【００６５】
必ずしも問題の生物学と関連がある必要がない他のヒューリスティクスなルールが適用されうる。例えば、所定の割合のポートフォリオのみが、特定の遺伝子もしくは遺伝子群によって示されうる、というルールを適用することができる。Wagner Softwareのような市販のソフトウェアは、容易にこれらのタイプのヒューリスティクスと適合する。このことは、例えば、確度および精度以外の要因（例えば、期待されたライセンス料）が１つ以上の遺伝子を含むことの望ましさに対して影響力がある場合、有用でありうる。
【００６６】
本発明の遺伝子発現プロファイルはまた、がんの診断、予後、もしくは、治療観察において有用な、他の非遺伝子的診断法とともに用いられることが可能である。例えば、いくつかの状況下では、前記の遺伝子発現に基づいた方法の診断力を、血清タンパク質マーカー［例えば、がん抗原２７．２９（「ＣＡ２７．２９」）］のようなよく用いられるマーカーからのデータと組み合わせることが有用である。このようなマーカーの範囲は、ＣＡ２７．２９のような分析物を含んで存在する。１つのこのような方法において、血液は治療される患者から定期的に採取され、それから前記の血清マーカーのうちの１つに対する酵素免疫測定を受ける。マーカーの濃度が、腫瘍の再発もしくは治療の失敗を示唆する場合、遺伝発現分析を受けることが可能なサンプル源を採取する。疑わしい腫瘤が存在する場合、細針吸引法（ＦＮＡ）を採り、それから腫瘤から採取した細胞の遺伝子発現プロファイルを前記のように分析する。あるいは、組織サンプルは、以前に腫瘍を除去した組織に近い領域から採取されてもよい。このアプローチは、他の試験があいまいな結果を示すときに特に有用である。
【００６７】
本発明にしたがって作られたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するためにフォーマット化された解析を含む。これらは、バイオマーカーを解析する試薬および指示書、ならびに、媒体のような、解析を実施するのに必要な材料のうちすべて、もしくは、一部を含むことができる。
【００６８】
本発明に係る物品は、病気を治療し、診断し、予示し、判定するために有用な遺伝子発現プロファイルの説明を含む。これらのプロファイルの説明は、コンピュータが読み込み可能な媒体（磁気的、光学的、および、同様の媒体）のような、自動的に機械によって読み込み可能な媒体へ変換される。この物品はまた、このような媒体における遺伝子発現プロファイルを判定するための命令を含むことができる。例えば、この物品は、前記遺伝子に係るポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ命令を有するＣＤ−ＲＯＭを含んでもよい。物品はまた、患者サンプル由来の遺伝子発現データと比較することができるように、電子的に記録された遺伝子発現プロファイルを有してもよい。あるいは、プロファイルを、別の表現フォーマットで記録することができる。図示された記録はそのようなフォーマットの１つである。前述のPartek, Inc.の「DISCOVERY」および「INFER」ソフトウェアに組み込まれたアルゴリズムのようなクラスタリングアルゴリズムは、このようなデータを視覚化することにおいて、最もよい支援になりうる。
【００６９】
本発明にしたがった別の種類の製品は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために用いられる媒体、もしくは、フォーマット化された解析である。これらは、例えば、相補配列もしくはプローブが、目的遺伝子を示す配列が結合したマトリックスに対して貼り付けられたマイクロアレイを含むことができ、それらの存在の読み取り可能な決定要因を生み出す。あるいは、本発明に係る物品は、がんを検出するための目的遺伝子の発現量を示すハイブリダイゼーション、増幅、および、シグナル生成を実施するための試薬キットへと作られることができる。
【００７０】
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された発明について説明するために提供されるものであるが、その発明を限定するものではない。本明細書に引用されたあらゆる参照文献は、参照により本明細書中に組み入れる。
【００７１】
〔実施例１〕
材料と方法
＜すい臓がんマーカー遺伝子の発見＞
すい臓腫瘍、正常すい臓組織、肺組織、結腸組織、乳房組織、および卵巣組織から、トリゾールを用いて、ＲＮＡを単離した。増幅され、標識されたＲＮＡを生成するために、ＲＮＡを用い［Lipshutz他（１９９９年）参照］、その後、標識ＲＮＡをAffymetrix U133A array上にハイブリダイゼーションした。その後、データを２つの方法で分析した。
【００７２】
＜組織サンプル＞
１番目の方法では、データ群全体にわたり、少なくとも２つの存在コールを有する遺伝子のみを保有するように、このデータ群をふるいにかけた。このようなふるいにかけた結果、１４，５４７個の遺伝子が残った。２，７３６個の遺伝子は、すい臓がんでは、正常すい臓に対して、０．０５未満のｐ値で過剰発現していることがわかった。また、２，７３６個の遺伝子のうちの４５個の遺伝子は、肺および結腸組織で見られた最大強度と比して、少なくとも２倍過剰発現していた。最終的に、６つのプローブ群が見出され、そのプローブ群は、肺組織、結腸組織、乳房組織、および、卵巣組織で観察された最大強度と比べて、少なくとも２倍過剰発現していた。
【００７３】
２番目の方法では、乳房組織、結腸組織、肺組織、および、卵巣組織において、わずか２つの存在コールしか有さない遺伝子のみを保有するように、このデータ群をふるいにかけた。このようなふるいにかけた結果、４，６５４個の遺伝子が残った。４，６５４個の遺伝子のうちの１６０個の遺伝子が、すい臓の（正常な、および、がん）組織において、少なくとも２つの存在コールを有することがわかった。最終的に、８つのプローブ群が選択され、そのプローブ群は、すい臓がん組織とすい臓正常組織との間で、最も差異のある発現を示した。
【００７４】
全体で２６０個のＦＦＰＥ転移性組織および原発組織を、さまざまな業者から入手した。試験サンプルには、３０個の乳がん転移、３０個の結腸直腸がん転移、５６個の肺がん転移、４９個の卵巣がん転移、４３個のすい臓がん転移、１８個の前立腺原発腫瘍、および、２個の前立腺がん転移、ならびに、３２個のその他の原発巣（６個の胃がん、６個の腎臓がん、３個の喉頭がん、２個の肝臓がん、１個の食道がん、１個の咽頭がん、１個の胆管がん、１個の胸膜がん、３個の膀胱がん、５個のメラノーマ、３個のリンパ腫）が含まれた。
【００７５】
＜ＲＮＡ抽出＞
パラフィン組織切片からのＲＮＡ単離は、以下の修正を伴うHigh Pure RNA Paraffin Kit manual（Roche）に記載された方法、および、試薬に基づいた。パラフィン包埋組織サンプルを、包埋された転移の大きさにしたがって切断し（大きさが２〜５ｍｍの場合９×１０μｍ、６〜８ｍｍの場合６×１０μｍ、８〜１０ｍｍ以上の場合３×１０μｍ）、１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中のＲＮＡ分解酵素／ＤＮＡ分解酵素の中に静置した。切片は、１０〜２０秒撹拌した後、室温で２〜５分間、１ｍＬのキシレン中でインキュベーションすることで、脱パラフィン化した。その後、チューブを遠心分離し、上澄みを除去し、そして、脱パラフィン化の工程をくり返した。上澄みを除去した後、１ｍＬのエタノールを加え、サンプルを１分間撹拌し遠心分離し、上澄みを除去した。この過程をもう一度くり返した。残存しているエタノールを除去し、ペレットを５５℃のオーブンで５〜１０分間乾燥させ、１００μＬの組織溶解バッファー、１６μＬの１０％ＳＤＳ、および、８０μＬのタンパク質分解酵素Ｋに再懸濁した。サンプルを、４００回転／分に設定したサーモミキサー内で、５５℃、２時間にわたり撹拌およびインキュベーションした。３２５μＬの結合バッファー、および、３２５μＬのエタノールを各々のサンプルに加え、そのサンプルをかき混ぜ、遠心分離し、そして、上澄みをフィルターカラムに加えた。フィルターカラムを収集チューブとともに、８０００回転／分で１分間遠心分離し、流出物（flow through）を廃棄した。一連の洗浄を行った（５００μＬの洗浄バッファーＩ→５００μＬの洗浄バッファーＩＩ→３００μＬの洗浄バッファーＩＩ）。洗浄では、各々の溶液をカラムに加え、遠心分離し、そして、流出物を廃棄した。カラムをその後、最大速度で２分間遠心分離し、新しい１．５ｍＬチューブに入れ、そして、９０μＬの溶出バッファーを加えた。室温で１分間のインキュベーション、および、その後の８０００回転／分で１分間の遠心分離を行った後、ＲＮＡを得た。サンプルを、１０μＬのＤＮＡ分解酵素インキュベーションバッファー、２μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉを加えることによって、ＤＮＡ分解酵素処理し、そして３７℃、３０分間、インキュベーションした。２０μＬの組織溶解バッファー、１８μＬの１０％ＳＤＳおよび４０μＬのタンパク質分解酵素Ｋを加えた後に、ＤＮＡ分解酵素を不活化した。再び、３２５μＬの結合バッファー、および、３２５μＬのエタノールを各々のサンプルに加え、そのサンプルをかき混ぜ、遠心分離し、そして、上澄みをフィルターカラムに加えた。一連の洗浄、および、ＲＮＡの溶出は、ＲＮＡを溶出するために５０μＬの溶出バッファーが用いられたことを除いては、前述のとおり行われた。カラムから持ち越されるガラス繊維による汚染を排除するために、ＲＮＡを最大速度で２分間遠心分離し、上澄みを新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。分光光度計によって得られたＯＤ２６０／２８０の示度により、サンプルを定量し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。単離されたＲＮＡを、使用するまで、ＲＮＡ分解酵素の含まれない水中に−８０℃で保管した。
【００７６】
＜TaqMan（登録商標）プライマーおよびプローブ設計＞
TaqMan（登録商標）ＣＵＰ解析［肺がんマーカー：human surfactant, pulmonary-associated protein B（ＳＰ−Ｂ）、thyroid transcription factor 1（ＴＴＦ１）、desmoglein 3（ＤＳＧ３）、結腸直腸がんマーカー：cadherin 17（ＣＨＤ１７）、乳がんマーカー：mammaglobin（ＭＧ）、prostate-derived ets transcription factor（ＰＤＥＦ）、卵巣がんマーカー：Wilm's tumor 1（ＷＴ１）、すい臓がんマーカー：prostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）、coagulation factor V（Ｆ５）、前立腺マーカー：kallikrein 3（ＫＬＫ３）］、および、ハウスキーピング解析［beta actin（β-actin）、hydroxymethylbilane synthase（ＰＢＧＤ）］を開発するために、適当なｍＲＮＡ参照配列アクセッション番号を、Oligo 6.0とともに用いた。各解析のためのプライマー、および、加水分解プローブを、表２に列記する。エキソン−イントロンスプライシング部位周辺に解析を設計することで、ゲノムＤＮＡ増幅を除去した。加水分解プローブを、５’末端のヌクレオチドにおいてＦＡＭ（レポーター染料）で、３’末端のヌクレオチドにおいてＢＨＱ１−ＴＴ（インターナルクエンチング染料）で標識した。
【００７７】
＜定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応＞
ABI Prism 7900HT sequence detection system（Applied Biosystems）の３８４ウェルプレートにおいて、遺伝子特異的ＲＮＡの定量を実行した。各サーモサイクラーの実行のために、キャリブレーターおよび標準曲線を増幅した。各マーカーためのキャリブレーターは、in vitro転写産物中の標的遺伝子から成り、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡに、１×１０５コピーで希釈したものであった。ハウスキーピングマーカーための標準曲線は、in vitro転写産物中の標的遺伝子から成り、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡに、１×１０７、１×１０５、１×１０３コピーで連続希釈したものであった。標的遺伝子を含まない対照も、環境汚染がないことを確かめるために、各解析の実行に含まれた。すべてのサンプルおよび対照について、繰り返し実行した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、１０μＬの反応物で、一般的な研究室で用いられる試薬により実行された。１０μＬの反応物には、ＲＴ−ＰＣＲバッファー（５０ｎＭビシン／ＫＯＨ ｐＨ８．２、１１５ｎＭ ＫＡｃ、８％グリセロール、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．５ｍＭ ＭｎＳＯ４、各０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰ）、添加物（２ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８、０．２ｍＭウシアルブミン、１５０ｍＭトレハロース、０．００２％ Tween20）、酵素混合液［２Ｕ Tth（Roche）、０．４ｍｇ／μＬAb TP6-25］、プライマーおよびプローブ混合液（０．２μＭプローブ、０．５μＭプライマー）が含まれた。その後のサイクリングパラメータは、９５℃、１分間を１サイクル；５５℃、２分間を１サイクル；温度上昇５％；７０℃、２分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクルであった。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
【００７８】
＜１段階反応対２段階反応＞
第一鎖合成を、１反応あたり、１００ｎｇのランダムヘキサマー、もしくは、遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて実行した。第１段階目では、１１．５μＬの混合液１（プライマー、および、１μｇの全ＲＮＡ）を６５℃まで５分間加熱し、その後、氷上で冷却した。８．５μＬの混合液２［１×バッファー、０．０１ｍＭＤＴＴ、各０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを混合したもの）、０．２５Ｕ／μＬ RNasin（登録商標）、１０Ｕ／μＬ Superscript III］を混合液１に添加し、５０℃、６０分間、インキュベーションした後、９５℃、５分間、インキュベーションした。ｃＤＮＡを、使用できる状態になるまで、−２０℃で保管した。２段階反応の第２段階目のｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のサイクリングパラメータで、前述のとおり実行した。そのサイクリングパラメータは、９５℃、１分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクルである。１段階反応のためのｑＲＴ−ＰＣＲを、以前の段落に記載のとおり、正確に実行した。１段階および２段階反応をともに、１００ｎｇの鋳型（ＲＮＡ／ｃＤＮＡ）に対して実行した。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
【００７９】
＜ヒートマップの生成＞
各サンプルのΔＣｔを、各々のＣＵＰマーカーのＣｔ値の平均値をとり、平均のハウスキーピングマーカーのＣｔ値の平均値を引くことにより計算した［ΔＣｔ＝Ｃｔ（ＣＵＰマーカー）−Ｃｔ（平均のハウスキーピングマーカー）］。各々の原発巣組織（肺、乳房、前立腺、結腸、卵巣、およびすい臓）マーカー群の最小のΔＣｔを、サンプルごとに決定した。全体の最小ΔＣｔを有する原発巣組織には得点１を与え、他のすべての原発巣組織には得点０を与える。データを病理学上の診断にしたがって分類した。Partek Proには修正された実現可能性データを投入し、強度プロットを生成した。
【００８０】
結果
＜新規のすい臓原発巣腫瘍およびがん状況マーカーの発見＞
まず、５つのすい臓マーカー候補が解析された。それらのマーカー候補は、prostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）、serine proteinase inhibitor, clade A member 1（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、cytokeratin 7（ＫＲＴ７）、matrix metalloprotease 11（ＭＭＰ１１）、および、mucin 4（ＭＵＣ４）［Varadhachary他（２００４年）；Fukushima他（２００４年）；Argani他（２００１年）；Jones他（２００４年）；Prasad他（２００５年）；および、Moniaux他（２００４年）参照］であり、ＤＮＡマイクロアレイ、ならびに、１３個のすい臓管腺がん、５個の正常すい臓組織、および、９８個のサンプル（乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、および、卵巣腫瘍に由来する）に係るパネルを用いて解析された。ＰＳＣＡのみが、適度な感度（１３個中６個、すなわち、すい臓腫瘍のうち４６％を検出した）を、高い特異度（９８個のサンプル中９１個、すなわち、９３％が、すい臓が原発巣でないと正確に同定された）で示した（図４Ａ）。これに対して、ＫＲＴ７、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＭＭＰ１１、および、ＭＵＣ４は、それぞれ３８％、３１％、８５％および３１％の感度を、それぞれ６６％、９１％、８２％および８１％の特異度で示した。これらのデータは、２７個のすい臓原発巣の転移、および、３９個の非すい臓原発巣の転移で、ＭＭＰ１１を除くすべてのマーカーについて実行したｑＲＴ−ＰＣＲと十分一致した。ＭＭＰ１１は、ｑＲＴ−ＰＣＲおよび転移に対して、より低い感度とより低い特異度を示した。結論として、急速冷凍した原発組織におけるマイクロアレイデータは、ＦＦＰＥ転移がすい臓原発巣であることをｑＲＴ−ＰＣＲによって同定することのできるマーカーの能力に対する良い指標として役立つ。しかし、更なるマーカーが最適な効果のために有用であるかもしれない。
【００８１】
すい臓管腺がんは、すべてのすい臓細胞（大部分が腺房状細胞および膵島細胞）のうちのほんのわずかな割合を含む管上皮細胞から発達するため、また、すい臓腺がん組織は隣接する正常組織のうち相当量を含むため［Prasad他（２００５年）；および、Ishikawa他（２００５年）］、器官群からこの器官を識別することもできるすい臓がんマーカー（すなわち、がんにおいてアップレギュレートされたマーカー）を同定することは難しいことであった。ＣＵＰパネルにおける使用のために、このような識別は必要なことである。第１のクエリ方法（材料と方法参照）によって、６つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、coagulation factor V（Ｆ５）、hypothetical protein FLJ22041 similar to FK506 binding proteins（ＦＫＢＰ１０）、β6 integrin（ＩＴＧＢ６）、transglutaminase 2（ＴＧＭ２）、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A0（ＨＮＲＰＡ０）、および、BAX delta（ＢＡＸ）であった。第２のクエリ方法（材料と方法参照）によって、８つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、Ｆ５、ＴＧＭ２、paired-like homeodomain transcription factor 1（ＰＩＴＸ１）、trio isoform mRNA（ＴＲＩＯ）、mRNA for p73H（ｐ７３）、an unknown protein for MGC:10264（ＳＣＤ）、および、claudin 18についての２つのプローブ群であった。Ｆ５、および、ＴＧＭ２はクエリ結果の両方に存在し、この２つのうち、Ｆ５が最も有望なもののように思われた（図４Ｂ参照）。
【００８２】
＜ＦＦＰＥ組織を用いたサンプル準備およびｑＲＴ−ＰＣＲの最適化＞
次に、マーカーパネル性能を検査する前に、固定組織を用いて、ＲＮＡ単離法、および、ｑＲＴ−ＰＣＲ法を最適化した。まず、タンパク質分解酵素Ｋのインキュベーション時間を１６時間から３時間に短縮した効果を分析した。収率にはまったく影響はなかった。しかし、いくつかのサンプルで、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋ工程を用いたときに、より長いＲＮＡ断片を示すものがあった（図５）。例えば、ＲＮＡを１年前の組織ブロック（Ｃ２２）から単離したとき、電気泳動図にはまったくちがいは見られなかった。しかし、ＲＮＡを５年前の組織ブロック（Ｃ２３）から単離したときには、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋ消化を用いた場合に、肩のこぶ（hump in the shoulder）によって解析されると、より高分子量のＲＮＡの区画がより多く観察された。この傾向は一般的に、ＦＦＰＥ転移の原発巣器官にかかわらず、他のサンプルを処理する際にも保持された。結論として、タンパク質分解酵素Ｋ消化時間の短縮は、ＲＮＡ収量を犠牲にしないし、そして、より長く、あまり分解されていないＲＮＡを単離する助けになるかもしれない。
【００８３】
次に、３つの異なる逆転写法を比較した。その３つの方法とは、ｑＰＣＲが後に続く、ランダムヘキサマーによる逆転写（２段階）；ｑＰＣＲが後に続く、遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階）；遺伝子特異的プライマーを用いた１段階のｑＲＴ−ＰＣＲ；である。ＲＮＡは１１個の転移から単離され、この３つの方法すべてにわたって、β-actin、human surfactant protein B（ＨＵＭＳＰＢ）、および、thyroid transcription factor（ＴＴＦ）（図６）に対するＣｔ値を比較した。すべての比較において、統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）があった。３つの遺伝子すべてについて、ｑＰＣＲが後に続くランダムヘキサマーによる逆転写（２段階反応）が最も高いＣｔ値を示し、一方、ｑＰＣＲが後に続く遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階反応）は、対応する１段階反応よりも、わずかに（しかし統計的には有意な）低いＣｔ値を示した。しかし、遺伝子特異的プライマーを用いた２段階のＲＴ−ＰＣＲは、より長い逆転写段階を有した。各サンプルについて、ＨＵＭＳＰＢおよびＴＴＦのＣｔ値を、対応するβ-actinの値に対して標準化した場合、３つの方法すべてにわたって、標準化されたＣｔ値には、まったくちがいが見られなかった。結論として、ＲＴ−ＰＣＲ反応条件の最適化により、より低いＣｔ値を生じることができ、これは、より古いパラフィンブロックを分析する手助けになるかもしれない［Cronin他（２００４年）参照］。そして、遺伝子特異的プライマーを用いた、１段階のＲＴ−ＰＣＲ反応は、対応する２段階反応において生ずるＣｔ値に匹敵するＣｔ値を生ずることができる。
【００８４】
＜ＣＵＰ ｑＲＴ−ＰＣＲ解析の診断能＞
次に、１２個のｑＲＴ−ＰＣＲ反応（１０個のマーカー、および、２個のハウスキーピング遺伝子）を、２３９個のＦＦＰＥ転移に対して実行した。その解析に用いられたマーカーを表２に示す。肺がんマーカーは、human surfactant pulmonary-associated protein B（ＨＵＭＰＳＰＢ）、thyroid transcription factor 1（ＴＴＦ１）、および、desmoglein 3（ＤＳＧ３）であった。結腸直腸がんマーカーは、cadherin 17（ＣＤＨ１７）であった。乳がんマーカーは、mammaglobin（ＭＧ）、およびprostate-derived Ets transcription factor（ＰＤＥＦ）であった。卵巣がんマーカーは、Wilm's tumor 1（ＷＴ１）であった。すい臓がんマーカーは、prostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）、および、coagulation factor V（Ｆ５）であり、前立腺マーカーは、kallikrein 3（ＫＬＫ３）であった。遺伝子の説明については、表２８参照のこと。
【表２−１】
0005666136.tif 000003
【表３−２】
0005666136.tif 000004
【００８５】
ヒートマップにおける標準化されたＣｔ値の分析は、乳がんマーカー、および、前立腺がんマーカーの高い特異度、結腸がんマーカー、肺がんマーカー、および、卵巣がんマーカーの中程度の特異度、ならびに、すい臓がんマーカーの幾分より低い特異度を明らかにした。標準化されたｑＲＴ−ＰＣＲデータをコンピュータによる修正と組み合わせることにより、マーカーパネルの性能が改良される。線形判別分析と組み合わされた標準化されたｑＲＴ−ＰＣＲデータから結果が得られ、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析の確度が決定された。
【００８６】
議論
本実施例において、転移に用いるための候補マーカーを同定するために、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析を原発腫瘍に対して用いた。転移に対する原発巣腫瘍マーカーを発見するために原発腫瘍を用いることができるという事実は、最近のいくつかの発見と一致する。例えば、Weigeltと同僚は、原発性乳房腫瘍の遺伝子発現プロファイルは、遠隔転移においても維持されるということを示した。Weigelt他（２００３年）参照。Italianoと共同研究者は、ＩＨＣによって判定されるＥＧＦＲの状態が、８０個の原発性結腸直腸がん腫瘍、および、８０個の関係する転移においても同様であることを発見した。Italiano他（２００５年）参照。その８０個のうち５個のみが、ＥＧＦＲの状態において不一致を示した。Italiano他（２００５年）参照。Backusと同僚は、乳房組織およびその他の組織のゲノム規模遺伝子発現解析を用いて、乳がん転移を検出するための推測上のマーカーを同定し、そして、mammaglobinおよびＣＫ１９が、９０％の感度と９４％の特異度で、乳房センチネルリンパ節における臨床上有効な転移を検出したことを明らかにした。Backus他（２００５年）参照。
【００８７】
マイクロアレイに基づいた原発組織の研究は、既知のマーカーの特異度および感度を確認した。結果として、Ｆ５は例外であるが、用いられたマーカーすべてが、本発明で調べられた組織に対して高い特異度を有する。Argani他（２００１年）；Backus他（２００５年）；Cunha他（２００５年）；Borgono他（２００４年）；McCarthy他（２００３年）；Hwang他（２００４年）；Fleming他（２０００年）；Nakamura他（２００２年）；および、Khoor他（１９９７年）参照。最近の研究は、ＩＨＣを用いると、ＰＳＣＡは前立腺がん転移において過剰発現されることを明らかにした。Lam他（２００５年）参照。Dennis他（２００２年）はまた、ＰＳＣＡがすい臓がんおよび前立腺がんに対する原発巣腫瘍マーカーとして用いられることができることを明らかにした。本明細書において示すように、ＰＳＣＡの強い発現は、いくつかの前立腺組織においても、ＲＮＡレベルで見出されるが、その解析にＰＳＡを含むことによって、前立腺がんとすい臓がんとを直ちに分離することができる。本研究で新規に発見されたことは、すい臓原発巣組織の（ＰＳＣＡに対して）補足的なマーカーとして、Ｆ５を用いるということである。原発組織のマイクロアレイデータ群、および、ＦＦＰＥ転移を用いたｑＲＴ−ＰＣＲデータ群両方において、Ｆ５はＰＳＣＡを補足することがわかった（図４および表３）。
【表４】
0005666136.tif 000005
【００８８】
従来の研究者たちは、ＩＨＣ、もしくは、マイクロアレイを用いたＣＵＰ解析を生み出してきた。Su他（２００１年）；Ramaswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照。さらに最近では、ＳＡＧＥ法が、小規模のｑＲＴ−ＰＣＲマーカーパネルと組み合わされてきた。Dennis（２００２年）；および、Buckhaults他（２００３年）参照。本研究は、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析を、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析の小規模のパネルと組み合わせた最初のものである。原発組織に対するマイクロアレイ研究は、これまでにＳＡＧＥ法によって同定されたのと同一の原発巣組織マーカーのうちの、すべてではないが、一部を同定した。いくつかの研究は、ＳＡＧＥ法に基づいたプロファイル解析データとＤＮＡマイクロアレイに基づいたプロファイル解析データとが適度に一致することを示してきたし、そして、その相互関係がより高い発現量を伴う遺伝子に対して向上することを示してきた。van Ruissen他（２００５年）；および、Kim（２００３年）参照。例えば、Dennisと同僚は、ＰＳＡ、ＭＧ、ＰＳＣＡ、および、ＨＵＭＳＰＢを同定し、一方Buckhaultsと共同研究者［Dennis他（２００２年）参照］はＰＤＥＦを同定した。ｑＲＴ−ＰＣＲを用いたＣＵＰ解析の実施は、それが強固な技術であるために、また、ＩＨＣ以上の性能優位性を有するかもしれないために、好まれている。Al-Mulla他（２００５年）；および、Haas他（２００５年）参照。本明細書に示したように、ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルは、１段階反応で遺伝子特異的プライマーを用いることにより改良された。これは、ＦＦＰＥ組織での１段階ｑＲＴ−ＰＣＲ反応に、遺伝子特異的プライマーを用いた最初の例である。他の研究者は、２段階ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲが後に続く１反応でのｃＤＮＡ合成）を行ったか、または、ランダムヘキサマーもしくは先端を切った遺伝子特異的プライマーを用いたかのいずれかである。Abrahamsen他（２００３年）；Specht他（２００１年）；Godfrey他（２０００年）；Cronin他（２００４年）；および、Mikhitarian他（２００４年）参照。
【００８９】
〔実施例２〕
ＣＵＰ ＦＦＰＥ全ＲＮＡ単離プロトコル
（Highpure kit カタログ番号３２７０２８９）
目的：
ＦＦＰＥ組織からの全ＲＮＡの単離
【００９０】
手順：
＜希釈標準溶液の準備＞
（１）キットのタンパク質分解酵素Ｋ（ＰＫ）
凍結乾燥物を４．５ｍＬの溶出バッファーに溶解する。等分し、−２０℃で保管すれば、１２ヶ月間安定である。
ＰＫ−４×２５０ｍｇ（カタログ番号３１１５８５２）
凍結乾燥物を１２．５ｍＬの溶出バッファー［１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．４〜７）］に溶解する。等分し、−２０℃で保管する。
（２）洗浄バッファーＩ
洗浄バッファーＩに、６０ｍＬの無水エタノールを加え、室温で保管する。
（３）洗浄バッファーＩＩ
洗浄バッファーＩＩに２００ｍＬの無水エタノールを加え、室温で保管する。
（４）ＤＮＡ分解酵素Ｉ
凍結乾燥物を４００μＬの溶出バッファーに溶解する。等分して、−２０℃で保管すれば、１２ヶ月間安定である。
【００９１】
＜パラフィンブロックを１２個のブロックに切り出す（１２ブロック×２チューブ＝２４チューブ）  〜３０〜４５分間＞
ブロックから切り取られた切片は、ＲＮＡ抽出のために即座に処理されなければならない。
（１）ミクロトーム上の清潔で鋭利なかみそり刃を用い、切り出された組織ブロック（３〜４×５〜１０ｍｍのサイズ）から６×１０ミクロン厚さの切片を切り出す。
注意：新たなブロック‐組織切片が得られるまでワックス切片を廃棄する。使用されたブロック‐最初の３つの組織切片を廃棄する。
（２）切られた組織をすぐさま１．５ｍＬのマイクロ遠心機のチューブに入れ、水分を最小限にするためにかたくふたを閉める。
（３）腫瘍の大きさに基づいて推奨される切片数を表４に示す。
【表５】
0005666136.tif 000006
【００９２】
＜脱パラフィン化  〜３０〜４５分間＞
（１）１．０ｍＬのキシレンを各サンプルに加え、１０〜２０秒間激しく撹拌し、室温で２〜５分インキュベーションする。最大速度で２分間遠心分離する。上澄みを注意深く取り除く。
注意：もし組織が浮かんでくるようであれば、さらに２分間遠心分離する。
（２）工程（１）をくり返す。
（３）最大速度で２分間遠心分離する。上澄みを取り除く。
（４）１ｍＬの無水エタノールを加え、１分間激しく撹拌する。最大速度で２分間遠心分離する。上澄みを取り除く。
（５）工程（４）をくり返す。
（６）チューブを一時的にペーパータオルの上にブロットし、残りのエタノールを除去する。
（７）組織ペレットを５５℃のオーブンで５〜１０分間乾燥させる。
注意：エタノールは完全に取り除き、ペレットを十分に乾燥させることが重要である。残留したエタノールはＰＫによる消化を阻害する可能性がある。
注意：もしＰＫが−２０℃中にあるならば、室温で２０〜３０分間あたためる。
【００９３】
＜ＲＮＡ抽出  〜２．５〜３時間＞
（１）１つの組織ペレットに、１００μＬの組織溶解バッファー、１６μＬの１０％ＳＤＳ、および、８０μＬのタンパク質分解酵素Ｋ希釈標準溶液を加え、適当な間隔で簡単に撹拌し、そして、４００回転／分で振り混ぜながら５５℃で２時間インキュベーションする。
（２）３２５μＬの結合バッファーと３２５μＬの無水エタノールを加える。ピペッティングで上下させることによりやさしく混和する。
（３）溶解物を最大速度で２分間遠心分離する。
（４）フィルターチューブと収集チューブ（１２チューブ分）を組み合わせ、溶解物の上澄みをフィルターにピペットで入れる。
（５）８０００回転／分で３０秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
注意：もしＲＮＡをさらに２つの組織ペレット準備物から集める必要がある場合、工程（４）〜（５）をくり返すことができる。
（６）８０００回転／分で３０秒間の遠心分離を繰り返し、フィルターを乾燥させる。
（７）５００μＬの洗浄バッファーＩ希釈標準溶液をカラムに加え、８０００回転／分で１５〜３０秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
（８）５００μＬの洗浄バッファーＩＩ希釈標準溶液を加える。８０００回転／分で１５〜３０秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
（９）３００μＬの洗浄バッファーＩＩ希釈標準溶液を加え、８０００回転／分で１５〜３０秒間遠心分離し、流出物は廃棄する。
（１０）High Pure filterを最大速度で２分間遠心分離する。
（１１）High Pure filterを新しい１．５ｍＬチューブの中に入れ、９０μＬの溶出バッファーを加える。室温で１〜２分インキュベーションする。８０００回転／分で１分間遠心分離する。
【００９４】
＜ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理  〜１．５時間＞
（１２）溶出物に１０μＬの１０×ＤＮＡ分解酵素インキュベーションバッファー、および、１．０μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉ希釈標準溶液を加え、混和する。３７℃で４５分間（２．０μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉに対しては、３０分間）インキュベーションする。
（１３）２０μＬの組織溶解バッファー、１８μＬの１０％ＳＤＳ、および、４０μＬのタンパク質分解酵素Ｋ希釈標準溶液を加える。軽く撹拌する。５５℃で３０分間（３０〜６０分間）インキュベーションする。
（１４）３２５μＬの結合バッファー、および、３２５μＬの無水エタノールを加える。混和し、収集チューブと組み合わせた新しいHigh Pure filter tubeにピペットで入れる（１２チューブ分）。
（１５）８０００回転／分で３０秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
（１６）８０００回転／分で３０秒間の遠心分離を繰り返し、フィルターを乾燥させる。
（１７）カラムに５００μＬの洗浄バッファーＩ希釈標準溶液を加える。８０００回転／分で１５秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
（１８）５００μＬの洗浄バッファーＩＩ希釈標準溶液を加える。８０００回転／分で１５秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
（１９）３００μＬの洗浄バッファーＩＩ希釈標準溶液を加える。８０００回転／分で１５秒間遠心分離し、流出物を廃棄する。
（２０）High Pure filterを最大速度で２分間遠心分離する。
（２１）High Pure filterチューブを新しい１．５ｍＬチューブ中に入れる。５０μＬの溶出バッファーを加え；室温で１〜２分間インキュベーションする。８０００回転／分で１分間遠心分離し、溶出されたＲＮＡを収集する。
（２２）溶出物を最大速度で２分間遠心分離し、底にあるガラス繊維をかき乱すことなしに、上澄みを新しいチューブに移す。
（２３）ＯＤ２６０／２８０の示度を採り、５０ｎｇ／μＬに希釈する。−８０℃で保管する。
【００９５】
＜ＣＵＰ ＡＳＲ分析プロトコル（ＡＢＩ７９００）＞
目的：ＣＵＰサンプルの原発巣組織を決定するためにｑＲＴ−ＰＣＲを用いる。
対照設定：
（１）陽性対照（表５、および、図７のプレート設定におけるプレートＣを参照。）
【表６】
0005666136.tif 000007
ストリップチューブ当たり１０μＬの分割量（２プレート分）；使用できる状態になるまで混合液を−８０℃で静置する。
【００９６】
（２）標準曲線（表６、および、図７のプレート設定におけるプレートＣを参照。）
工程１：標準曲線を、表６に示すように正確に設定した。
【表７】
0005666136.tif 000008
ストリップチューブ当たり１０μＬに分割し（２プレート分）；使用できる状態になるまで混合液を−８０℃で静置する。
【００９７】
酵素混合液：
（１）マスター混合液：酵素（Tth）／抗体（TP6-25）。表７参照のこと。
【表８】
0005666136.tif 000009
チューブ当たり５００μＬに分割し、−２０℃で凍結する。
【００９８】
ＣＵＰマスター混合液：
（１）２．５×ＣＵＰマスター混合液（表８〜１１）：
【表９】
0005666136.tif 000010
１５分超の間、試薬を十分混和する。
【表１０】
0005666136.tif 000011
１５分超の間、試薬を十分混和し；滅菌容器の中で上記の混合液を組み合わせ、表１０にある以下のものを加える。
【表１１】
0005666136.tif 000012
１５分超の間、試薬を十分混和し；チューブ当たり１．８ｍＬに分割し、−２０℃で凍結する。
【表１２】
0005666136.tif 000013
【００９９】
プライマーおよびプローブ混合液：
チューブ当たり２５０μＬに分割し、−２０℃で凍結させる。
【０１００】
反応混合液：
（１）ＣＵＰマスター混合液（ＣＭＭ）：（表１２〜１４、および、図７のプレート設定におけるプレートＡを参照。）
【表１３】
0005666136.tif 000014
好ましくは、プレート当たりの各実行数は、３５６反応のみである。すなわち、１２個のマーカーによる１２個のサンプル（各々２回で２８８反応）＋２回の１０個の標準曲線対照（２０反応）＋各マーカーの２個の陽性対照および２個の陰性対照（４×１２＝４８反応）である。
最大で４．３μＬのサンプルになるように、サンプル容量の水を調整して、よく混和する。
【表１４】
0005666136.tif 000015
（２）ＴｏＯマーカー：よく混和する。
【表１５】
0005666136.tif 000016
（３）β-actinおよびＰＢＧＤマーカー：よく混和する。
【０１０１】
サンプル設定：
【表１６】
0005666136.tif 000017
（１）ＣＵＰサンプル：９６ウェルプレートに１２サンプル：Ａ１〜Ａ１２（表１６、および、図７のプレート設定におけるプレートＢを参照。）；５０ｎｇ／μＬを５０μＬに分割する（２μＬ／ｒｘｎ）。
【０１０２】
プレートへの充填：
（１）３８４ウェルプレート設定：（図７のプレート設定におけるプレートＤを参照。）
２μＬのサンプルおよび８μＬのＣＭＭをプレートに充填する（サンプル＝５０ｎｇ／μＬ）。
４μＬのサンプルおよび６μＬのＣＭＭをプレートに充填する（サンプル＝２５ｎｇ／μＬ）。
プレートに封をして、ラベルをはる。２０００回転／分で１分間遠心分離する。
【０１０３】
ABI 7900 HT設定：ABI 7900の中に置く。プログラム「CUP384」を選び、スタートボタンを押す。
【表１７】
0005666136.tif 000018
データを分析し、Ｃｔ値を抽出し、分類ツリーに挿入する。
【０１０４】
〔実施例３〕
分類ツリー
図８に分類ツリーを示す。
【０１０５】
〔実施例５〕
ＣＵＰ解析の限界
図９は、ＣＵＰ解析の限界を決定するために、実施例１〜３に記載された方法を用いて得られた結果を示している。解析性能は、ＲＮＡ濃度の範囲にわたって試験され、ＣＵＰ解析は１００〜１２．５ｎｇのＲＮＡの範囲で効果的であることがわかった。
【０１０６】
〔実施例６〕
ｑＲＴ−ＰＣＲ解析
材料と方法
＜マイクロアレイ解析のための凍結組織サンプル＞
遺伝子発現マイクロアレイプロファイル解析のために、全体で７００個のヒト凍結原発組織を用いた。さまざまな学術機関［Washington University（米国ミズーリ州セントルイス）、Erasmus Medical Center（オランダ国ロッテルダム）を含む］および、民間の組織バンク会社［Genomics Collaborative, Inc（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）、Asterand（米国ミシガン州デトロイト）、Oncomatrix（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、Clinomics Biosciences（米国マサチューセッツ州ピッツフィールド）を含む］から、サンプルを入手した。各々の標本に対して、患者の人口学上の情報、臨床上の情報、および、病理学上の情報も同様に収集した。診断を確認するために、ならびに、サンプルの保存状態および腫瘍の内容を推定するために、各々のサンプルの組織病理学的特徴を再検査した。
【０１０７】
＜ＲＮＡ抽出およびAffymetrix Gene Chipハイブリダイゼーション＞
７０％を超える腫瘍細胞、良性サンプル、および、正常サンプルを有する凍結がんサンプルを細断し、トリゾール試薬（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド）中で、機械的なホモジェナイザー（UltraTurrex T8、ドイツ国）によって均質化した。凍結組織からＲＮＡを単離するための標準的なトリゾールプロトコルに従って、トリゾール試薬中で組織を均質化した（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド）。遠心分離後、上液相を収集し、−２０℃でイソプロピルアルコールによって全ＲＮＡを沈降させた。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、水中に溶解して、使用するまで−８０℃で保管した。
【０１０８】
ＲＮＡの品質を、Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano Assay（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州パロアルト）によって検査した。標識されたｃＲＮＡを準備し、全体で２２，０００個のプローブ群を含む高密度オリゴヌクレオチドアレイHu133A Gene Chip（Affymetrix、米国カリフォルニア州サンタクララ）により、メーカー標準プロトコルにしたがって、ハイブリダイゼーションさせた。Affymetrixプロトコルおよびスキャナーを用いて、アレイをスキャンした。その後の解析のため、各プローブ群は、別々の遺伝子であると考えられた。Affymetrix Gene Chip analysis software MAS 5.0を用いて、各遺伝子の発現量を計算した。すべてのチップは、以下の３つの品質管理基準を満たしていた。すなわち、アレイに対する「存在」コールの割合が３５％を超えており；広範囲の標的強度を６００としたときにスケール係数は１２未満であり；平均のバックグラウンドレベルは１５０未満であった。
【０１０９】
＜マーカー候補の選択＞
肺組織、結腸組織、乳房組織、卵巣組織、および、前立腺組織に対する原発巣組織（ＴｏＯ）マーカー候補を選択するために、全体で６８２個の、乳房、結腸、肺、卵巣、前立腺由来の正常組織、良性組織、および、がん性組織に及ぶＲＮＡサンプルにおいて、プローブ群の発現量を測定した。組織特異的マーカー候補を、統計的クエリの数に基づいて選択した。
【０１１０】
すい臓がんマーカー候補を生み出すために、１３個の原発性すい臓管腺がん、５個の正常すい臓組織、ならびに、９８個の肺がん標本、結腸がん標本、乳がん標本、および、卵巣がん標本における遺伝子発現プロファイルを用い、すい臓腺がんマーカーが選択された。２つのクエリを実行した。第１のクエリでは、すい臓サンプルにおいて、少なくとも２つの「存在」コールを有する１４，５４７個の遺伝子を含むデータ群を作り上げた。すい臓がんにおいて、正常組織と比較して過剰発現していることがＴ検定（ｐ＜０．０５）によって特定された、全体で２７３６遺伝子を同定した。１１パーセンタイルのすい臓がんにおいて、最小の発現が、結腸がん、および、肺がんにおける最大値よりも、少なくとも２倍高い遺伝子を選択し、４５個のプローブ群を作った。最終工程として、結腸がん、肺がん、乳がん、および、卵巣がんにおける最大発現よりも、少なくとも２倍高い最大発現をする６つの遺伝子が選ばれた。第２のクエリでは、すべての乳房標本、結腸標本、肺標本、および、卵巣標本において、多くとも２つの「存在」コールを有する４，６５４個のプローブ群のデータ群が作り出された。すい臓正常サンプル、および、すい臓がんサンプルにおいて、少なくとも２つの「存在」コールを有する、全体で１６０個の遺伝子が選択された。１６０個の遺伝子のうち１０個の遺伝子が、すい臓がん組織と正常組織との間での発現量を比較した後に選択された。２つのすい臓に対するクエリ両方の結果を結合した。
【０１１１】
遺伝子発現プロファイル解析に加えて、いくつかのマーカーを文献から選択した。各々の組織の種類に対するＴｏＯマーカー候補の簡単な一覧を作成するために、すべてのクエリの結果を組み合わせた。各マーカーの感度および特異度を推定した。マーカーの重複およびその相補性に基づいたＲＴ−ＰＣＲ試験のために、組織をその原発巣によって識別する最も高い能力を示したマーカーを指定した。
【０１１２】
＜原発巣のわかっているＦＦＰＥ転移性がん、およびＣＵＰ組織＞
さまざまな業者［Proteogenex（米国カリフォルニア州ロサンゼルス）、Genomic Collaborative, Inc.（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）、Asterand（米国ミシガン州デトロイト）、Ardais（米国マサチューセッツ州レキシントン）、および、Oncomatrix（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を含む］から、全体で３８６個の既知の原発巣のＦＦＰＥ転移性がん（ステージＩＩＩ〜ＩＶ）、および、２４個のＦＦＰＥ原発性前立腺腺がんを入手した。４８個の既知の原発腫瘍の転移性がん、および、ＣＵＰ組織の独立した群については、Albany Medical College（米国ニューヨーク州オールバニー）から手に入れた。各々の標本に対して、患者の人口学上の情報、臨床上の情報、および病理学上の情報も収集した。診断を確認するために、ならびに、サンプルの保存状態および腫瘍の内容を推定するために、各々のサンプルの組織病理学的特徴を再検査した。転移サンプルについて、患者の病歴、および、転移性がんを対応する原発腫瘍と比較することによる組織学的な評価に基づいて、転移性がんおよび原発巣組織の診断を明確に確立した。
【０１１３】
＜ＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡ単離＞
以下の修正を伴うHigh Pure RNA Paraffin Kit manual（Roche）に記載されたとおり、パラフィン組織切片からＲＮＡ単離した。パラフィン包埋組織サンプルは、包埋された転移の大きさにしたがって切断された（大きさが２〜５ｍｍの場合９×１０μｍ、６〜８ｍｍの場合６×１０μｍ、８〜１０ｍｍ以上の場合３×１０μｍ）。キットマニュアルに記載のとおり、切片を脱パラフィン化し、組織ペレットを５５℃のオーブンで５〜１０分間乾燥させ、１００μＬの組織溶解バッファー、１６μＬの１０％ＳＤＳ、および、８０μＬのタンパク質分解酵素Ｋ中に再懸濁した。５５℃、４００回転／分、２時間に設定したサーモミキサー内で、サンプルを撹拌およびインキュベーションした。その後のサンプル処理を、High Pure RNA Paraffin Kit manualにしたがって実行した。分光光度計によって得られたＯＤ２６０／２８０示度により、サンプルを定量し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。単離されたＲＮＡを、使用するまでＲＮＡ分解酵素の含まれない水中に−８０℃で保管した。
【０１１４】
＜マーカー候補のプレスクリーニングのためのｑＲＴ−ＰＣＲ＞
業者（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド）の取扱説明書にしたがって、各サンプル由来の１μｇの全ＲＮＡを、Superscript II逆転写酵素を用いて、ランダムヘキサマーで逆転写した。試験される遺伝子マーカー候補および対照遺伝子ＡＣＴＢのための、プライマーおよびＭＧＢ−プローブは、Primer Express software（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて設計し、ABI Assay-on-Demand（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）も用いた。社内で設計されたプライマー、および、プローブはいずれも、９０％を超える最適な増幅効率で試験された。ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、２０ｍＬの反応混合液［２００ｎｇの鋳型ｃＤＮＡ、２×TaqMan（登録商標）universal PCR master mix（１０ｍＬ）（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）、５００ｎＭフォワードプライマー、および、リバースプライマー、ならびに、２５０ｎＭプローブを含む］中で実行された。ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）上で、反応を行った。サイクリング条件は、５０℃、２分間のAmpErase UNGの活性化；９５℃、１０分のポリメラーゼの活性化；ならびに９５℃、１５秒間、および、アニーリング温度（６０℃）、６０秒間を５０サイクルである。各々の解析において、「鋳型を含まない」対照が、鋳型ｃＤＮＡとともに、目的の遺伝子と対照遺伝子両方に対して、２つずつ含まれた。各標的遺伝子の相対的な発現は、標的遺伝子のＣｔ値から対照遺伝子（ＡＣＴＢ）のＣｔ値を差し引いた値に等しいΔＣｔとして表された。
【０１１５】
＜最適化された１段階ｑＲＴ−ＰＣＲ＞
TaqMan（登録商標）ＣＵＰ解析［肺がんマーカー：human surfactant, pulmonary-associated protein B（ＳＰ−Ｂ）、thyroid transcription factor 1（ＴＴＦ１）、desmoglein 3（ＤＳＧ３）、結腸直腸がんマーカー：cadherin 17（ＣＨＤ１７）、乳がんマーカー：mammaglobin（ＭＧ）、prostate-derived ets transcription factor（ＰＤＥＦ）、卵巣がんマーカー：Wilm's tumor 1（ＷＴ１）、すい臓がんマーカー：prostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）、coagulation factor V（Ｆ５）、前立腺マーカー：kallikrein 3（ＫＬＫ３）］、および、ハウスキーピング解析［beta actin（β-Ａｃｔｉｎ）、hydroxymethylbilane synthase（ＰＢＧＤ）］を開発するために、適当なｍＲＮＡ参照配列アクセッション番号を、Oligo 6.0とともに用いた。最適化された１段階ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のための、遺伝子特異的プライマー、および、加水分解酵素プローブを、表２（配列番号１１〜５８）に列記する。エキソン−イントロンスプライシング部位周辺に解析を設計することで、ゲノムＤＮＡ増幅を除外した。加水分解プローブを、５’末端のヌクレオチドにおいてＦＡＭ（レポーター染料）で、３’末端のヌクレオチドにおいてＢＨＱ１−ＴＴ（インターナルクエンチング染料）で標識した。
【０１１６】
ABI Prism 7900HT sequence detection system（Applied Biosystems）の３８４ウェルプレートにおいて、遺伝子特異的ＲＮＡの定量を実行した。各サーモサイクラーの実行のために、キャリブレーターおよび標準曲線を増幅した。各マーカーためのキャリブレーターは、in vitro転写産物中の標的遺伝子から成り、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡに、１×１０５コピーで希釈したものであった。ハウスキーピングマーカーための標準曲線は、in vitro転写産物中の標的遺伝子から成り、それらはラットの腎臓由来のキャリアＲＮＡに、１×１０７、１×１０５、１×１０３コピーで連続希釈したものであった。標的遺伝子を含まない対照も、環境汚染がないことを確かめるために、各解析の実行に含まれた。すべてのサンプルおよび対照について、繰り返し実行した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、１０μＬの反応物中で、一般的な研究室で用いられる試薬により実行された。その１０μＬの反応物には、ＲＴ−ＰＣＲバッファー（５０ｎＭビシン／ＫＯＨ ｐＨ８．２、１１５ｎＭ ＫＡｃ、８％グリセロール、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．５ｍＭ ＭｎＳＯ４、各０．５ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、添加物（２ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８、０．２ｍＭウシアルブミン、１５０ｍＭトレハロース、０．００２％ Tween20）、酵素混合液［２Ｕ Tth（Roche）、０．４ｍｇ／μＬ Ab TP6-25］、プライマーおよびプローブ混合液（０．２μＭプローブ、０．５μＭプライマー）を含んだ。その後のサイクリングパラメータは、９５℃、１分間を１サイクル；５５℃、２分間を１サイクル；温度上昇５％；７０℃、２分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクル；であった。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
【０１１７】
＜１段階反応対２段階反応＞
２段階反応を１段階反応のＲＴ−ＰＣＲと比較するために、２段階反応の第一鎖合成は、１反応あたり、１００ｎｇのランダムヘキサマー、もしくは、遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて実行した。第１段階目では、１１．５μＬの混合液１（プライマー、および、１μｇの全ＲＮＡ）を６５℃まで５分間加熱し、その後、氷上で冷却した。８．５μＬの混合液２［１×バッファー、０．０１ｍＭ ＤＴＴ、各０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２５Ｕ／μＬ RNasin（登録商標）、１０Ｕ／μＬ Superscript III］を混合液１に添加し、５０℃で、６０分間インキュベーションした後、９５℃で、５分間インキュベーションした。ｃＤＮＡを、使用できる状態になるまで、−２０℃で保管した。２段階反応の第２段階目のｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のサイクリングパラメータを用いて、前述のとおり実行した：９５℃、１分間を１サイクル；９５℃、１５秒間、５８℃、３０秒間を４０サイクル。１段階反応のためのｑＲＴ−ＰＣＲを、以前の段落に記載のとおり、正確に実行した。１段階および２段階反応をともに、１００ｎｇの鋳型（ＲＮＡ／ｃＤＮＡ）に対して実行した。ＰＣＲ反応が完了した後、基準および閾値をABI 7900HT Prism softwareで設定し、計算したＣｔ値をMicrosoft Excelに取り込んだ。
【０１１８】
結果
本発明の最終目的は、転移性がん原発巣組織を予測するためのｑＲＴ−ＰＣＲ解析を開発することであった。実験的な作業は２つの主要な部分から成った。１番目の部分には、組織特異的なマーカー候補の指定、ＦＦＰＥ転移性がん組織上でのそれら候補の確認、および、解析のための１０個のマーカーの選択が含まれた（図１０Ａ）。２番目の部分には、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析の最適化の後に、ＦＦＰＥ転移性がんの他の群に対する解析の実行、分類ツリーの構築、および、独立したサンプル群に対する確認が含まれた（図１０Ｂ）。
【０１１９】
＜サンプルの特徴＞
遺伝子発現プロファイル解析、および、組織の種類特異的な遺伝子の同定に、全体で７００個の凍結原発組織サンプル由来のＲＮＡを用いた。サンプルには、５４５個の原発がん（２９個の肺がん、１３個のすい臓がん、３１５個の乳がん、１２８個の結腸直腸がん、３８個の前立腺がん、２２個の卵巣がん）、３７個の良性病変（１個の肺病変、４個の結腸直腸病変、６個の乳房病変、２６個の前立腺病変）、および、１１８個の正常組織（３６個の肺組織、５個のすい臓組織、３６個の結腸直腸組織、１４個の乳房組織、３個の前立腺組織、２４個の卵巣組織）が含まれた。
【０１２０】
本研究において、全体で３７５個の既知の原発巣の転移性がん（ステージＩＩＩ〜ＩＶ）、および、２６個の前立腺原発性腺がんのサンプルを用いた。転移性がんは、肺がん、すい臓がん、結腸直腸がん、卵巣がん、前立腺がんから生じ、同様に、他のがんからも生じた。「その他」のサンプルカテゴリーは、肺、すい臓、結腸、乳房、卵巣および前立腺以外の組織由来の転移から成った。患者の特徴は表１７にまとめられている。
【表１８】
0005666136.tif 000019
【０１２１】
サンプルを２つの群に分けた。それらは、マーカー候補の組織特異的な差異のある発現を確認するために用いられた確認群（２０５個の標本）、および、最適化された１段階ｑＲＴ−ＰＣＲ手法を試験し、分類ツリーを訓練するために用いられた訓練群（２６０個の標本）である。２０５個のサンプルからなる１番目の群には、２５個の肺がん、４１個のすい臓がん、３１個の結腸直腸がん、３３個の乳がん、３３個の卵巣がん、１個の前立腺がん、２３個のその他のがんの転移、および、１８個の前立腺原発性がんが含まれた。２６０個のサンプルから成る２番目の群には、５６個の肺がん、４３個のすい臓がん、３０個の結腸直腸がん、３０個の乳がん、４９個の卵巣がん、３２個のその他のがんの転移、および、２０個の前立腺原発性がんが含まれた。１６個の肺がん、２１個のすい臓がん、１５個のその他の転移性がん、および、１２個の前立腺原発性がんを含む６４の標本が、両方の群において同一の患者由来であった。
【０１２２】
Albany Medical Collegeから入手した独立のサンプル群は、３３個のＣＵＰ標本（うち２２個が原発腫瘍が示唆された）、および、１５個の既知の原発巣の転移性がんから構成された。示唆された原発腫瘍を有するＣＵＰに対して、形態学上の特徴、および／もしくは、ＩＨＣマーカーパネルで試験された結果に基づいて診断がなされた。患者の人口学上の特徴、臨床上の特徴、および、病理学上の特徴を、表１７に示す。
【０１２３】
＜マーカー候補の選択＞
５つの原発組織の種類（肺、結腸、乳房、卵巣、前立腺）の遺伝子発現プロファイルの分析の結果、ｑＲＴ−ＰＣＲ試験のための１３個の組織特異的マーカー候補が指定された。上位の候補はin situの従来のがん研究において同定されてきたものであった。Argani他（２００１年）；Backus他（２００５年）；Cunha他（２００５年）；Borgono他（２００４年）；McCarthy他（２００３年）；Hwang他（２００４年）；Fleming他（２０００年）；Nakamura他（２００２年）；および、Khoor他（１９９７年）参照。マイクロアレイデータの分析に加えて、２つのマーカーを文献から選択した。それらには、補足的な肺扁平上皮がんマーカーＤＳＧ３、および、乳がんマーカーＰＤＥＦが含まれる。Backus他（２００５年）参照。マイクロアレイデータにより、これらのマーカーの高い感度、および、特異度が確認された。
【０１２４】
すい臓特異的なマーカーを同定するために、特別なアプローチを用いた。まず、５つのすい臓マーカー候補を解析した。それらのマーカー候補は、prostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）、serine proteinase inhibitor, clade A member 1（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、cytokeratin 7（ＫＲＴ７）、matrix meralloprotease 11（ＭＭＰ１１）、および、mucin 4（ＭＵＣ４）［Varadhachary他（２００４年）；Argani他（２００１年）；Jones他（２００４年）；Prasad他（２００５年）；および、Moniaux他（２００４年）参照］であり、ＤＮＡマイクロアレイ、ならびに、１３個のすい臓管腺がん、５個の正常すい臓組織、および、９８個のサンプル（乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、および、卵巣腫瘍に由来する）に係るパネルを用いて解析された。ＰＳＣＡのみが、適度な感度（１３個中６個、すなわち、すい臓腫瘍のうち４６％を検出した）を、高い特異度（９８個のサンプル中９１個、すなわち、９３％が、すい臓が原発巣でないと正確に同定された）で示した。これに対して、ＫＲＴ７、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＭＭＰ１１、および、ＭＵＣ４は、それぞれ３８％、３１％、８５％および３１％の感度を、それぞれ６６％、９１％、８２％および８１％の特異度で示した。これらのデータは、２７個のすい臓原発巣の転移、および、３９個の非すい臓原発巣の転移で、ＭＭＰ１１を除くすべてのマーカーについて実行したｑＲＴ−ＰＣＲと、十分一致した。ＭＭＰ１１は、ｑＲＴ−ＰＣＲおよび転移に対して、より低い感度とより低い特異度を示した。結論として、急速冷凍した原発組織におけるマイクロアレイデータは、ＦＦＰＥ転移がすい臓原発であることをｑＲＴ−ＰＣＲによって同定することのできるマーカーの能力に対する良い指標として役立つ。しかし、更なるマーカーが最適な効果のために有用であるかもしれない。
【０１２５】
すい臓管腺がんは、正常なすい臓において、すべてのすい臓細胞（大部分が腺房状細胞および膵島細胞）のうちのほんのわずかな割合を含む管上皮細胞から発生する。さらに、すい臓腺がん組織は、隣接する正常組織を相当量含む［Prasad他（２００５年）；および、Ishikawa他（２００５年）］。このため、すい臓腺がんにおいて、正常なすい臓細胞と比較して遺伝子が増加しているため、候補すい臓がんマーカーは濃縮されていた。第１のクエリ方法によって、６つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、coagulation factor V（Ｆ５）、hypothetical protein FLJ22041 similar to FK506 binding proteins（ＦＫＢＰ１０）、β6 integrin（ＩＴＧＢ６）、transglutaminase 2（ＴＧＭ２）、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A0（ＨＮＲＰＡ０）、および、BAX delta（ＢＡＸ）であった。第２のクエリ方法（詳しくは、材料と方法の節を参照）によって、８つのプローブ群が得られた。そのプローブ群は、Ｆ５、ＴＧＭ２、paired-like homeodomain transcription factor 1（ＰＩＴＸ１）、trio isoform mRNA（ＴＲＩ０）、mRNA for p73H（ｐ７３）、unknown protein for MGC:10264（ＳＣＤ）、および、claudin 18についての２つのプローブ群であった。
【０１２６】
転移性がんＦＦＰＥ組織上の更なるＲＴ−ＰＣＲ確認のために、全体で２３個の組織特異的なマーカー候補がｑＲＴ−ＰＣＲによって選ばれた。肺、すい臓、結腸、乳房、卵巣、前立腺、および、前立腺原発性がん由来の２０５個のＦＦＰＥ転移性がんに対して、マーカー候補を試験した。表１８は、ＲＴ−ＰＣＲ確認のために選ばれた組織特異的マーカーの遺伝子記号を提供し、そしてまた、これらのマーカーで実行された試験結果をまとめている。
【表１９】
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【０１２７】
２３個の試験マーカーのうちの１３個が、それらの交差反応性、対応する転移性組織における低い発現量、もしくは、重複に基づいて棄却された。１０個のマーカーが最終的な解析のために選ばれた。肺がんマーカーは、human surfactant pulmonary-associated protein B（ＨＵＭＰＳＰＢ）、thyroid transcription factor 1（ＴＴＦ１）、および、desmoglein 3（ＤＳＧ３）であった。すい臓がんマーカーは、prostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）、および、coagulation factor V（Ｆ５）、そして、前立腺がんマーカーは、kallikrein 3（ＫＬＫ３）であった。結腸直腸がんマーカーは、cadherin 17（ＣＤＨ１７）であった。乳がんマーカーは、mammaglobin（ＭＧ）、および、prostate-derived Ets transcription factor（ＰＤＥＦ）であった。卵巣がんマーカーは、Wilm's tumor 1（ＷＴ１）であった。異なる転移性組織において選択されたマーカーの相対的な発現値を標準化した平均値を、図１１に示している。
【０１２８】
＜ＦＦＰＥ組織を用いたサンプル準備およびｑＲＴ−ＰＣＲの最適化＞
次に、マーカーパネルの性能を検査する前に、固定組織を用いて、ＲＮＡ単離法、および、ｑＲＴ−ＰＣＲ法を最適化した。まず、タンパク質分解酵素Ｋのインキュベーション時間を１６時間から３時間に短縮した効果を分析した。収率にはまったく変化はなかった。しかし、いくつかのサンプルで、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋ工程を用いたときに、より長いＲＮＡ断片を示すものがあった（図１２Ａ、図１２Ｂ）。例えば、ＲＮＡを１年前の組織ブロック（Ｃ２２）から単離したとき、電気泳動図にはまったくちがいは見られなかった。しかし、ＲＮＡを５年前の組織ブロック（Ｃ２３）から単離したときには、より短い時間のタンパク質分解酵素Ｋ消化を用いた場合に、肩のこぶによって解析されると、より高分子量のＲＮＡの区画がより多く観察された。この傾向は一般的に、ＦＦＰＥ転移の原発巣器官にかかわらず、他のサンプルを処理する際にも保持された。結論として、タンパク質分解酵素Ｋ消化時間の短縮は、ＲＮＡ収量を犠牲にしないし、そして、より長く、あまり分解されていないＲＮＡを単離する助けになるかもしれない。
【０１２９】
次に、３つの異なる逆転写法を比較した。その３つの方法とは、ｑＰＣＲが後に続く、ランダムヘキサマーによる逆転写（２段階）；ｑＰＣＲが後に続く、遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階）；遺伝子特異的プライマーを用いた１段階のｑＲＴ−ＰＣＲ；である。ＲＮＡは１１個の転移から単離され、この３つの方法すべてにわたって、β-actin、ＨＵＭＳＰＢ（図１２Ｃ、図１２Ｄ）、および、ＴＴＦに対するＣｔ値を比較した。その結果は、すべての比較において、統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示した。両方の遺伝子について、ｑＰＣＲが後に続くランダムヘキサマーによる逆転写（２段階反応）が最も高いＣｔ値を示し、一方、ｑＰＣＲが後に続く遺伝子特異的プライマーによる逆転写（２段階反応）は、対応する１段階反応よりも、わずかに（しかし統計的には有意な）低いＣｔ値を示した。しかし、遺伝子特異的プライマーを用いた２段階のＲＴ−ＰＣＲは、より長い逆転写段階を有した。各サンプルについて、ＨＵＭＳＰＢのＣｔ値を、対応するβ-actinの値に対して標準化した場合、３つの方法すべてにわたって、標準化されたＣｔ値には、まったくちがいが見られなかった。結論として、ＲＴ−ＰＣＲ反応条件の最適化により、より低いＣｔ値を生じることができ、これは、より古いパラフィン組織ブロックを分析する助けになる［Cronin他（２００４年）参照］。そして、遺伝子特異的プライマーを用いた、１段階のＲＴ−ＰＣＲ反応は、対応する２段階反応において生ずるＣｔ値に匹敵するＣｔ値を生ずることができる。
【０１３０】
＜最適化されたｑＲＴ−ＰＣＲ解析の診断能＞
２６０個のＦＦＰＥ転移の新たな群に対して、１２個のｑＲＴ−ＰＣＲ反応（１０個のマーカー、および、２個のハウスキーピング遺伝子）を実行した。２１個のサンプルがハウスキーピング遺伝子に対して高いＣｔ値を示したため、２３９個のサンプルのみを、ヒートマップ分析に用いた。ヒートマップにおける標準化されたＣｔ値の分析は、乳がんマーカー、および、前立腺がんマーカーの高い特異度、結腸がんマーカー、肺がんマーカー、および、卵巣がんマーカーの中程度の特異度、ならびに、すい臓がんマーカーの幾分より低い特異度を明らかにした（図１３）。標準化されたｑＲＴ−ＰＣＲデータを、コンピュータによる修正と組み合わせることにより、マーカーパネルの性能が改良される。
【０１３１】
２個のハウスキーピング遺伝子の発現の平均に対して標準化された発現値を用いて、転移性原発巣組織を予測するための線形判別分析が、標準化されたｑＲＴ−ＰＣＲデータを分類ツリーと組み合わせることによって開発され、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析の確度が７４％であることを決定した。
【表２０】
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【０１３２】
議論
本研究において、転移に用いるための候補マーカーを同定するために、原発腫瘍におけるマイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析を用いた。転移に対する原発巣腫瘍マーカーを発見するために原発腫瘍を用いることができるという事実は、最近のいくつかの発見と一致する。例えば、Weigeltと同僚は、原発性乳房腫瘍の遺伝子発現プロファイルは、遠隔転移においても維持されるということを示した。Weigelt他（２００３年）参照。Backusと同僚は、乳房組織およびその他の組織のゲノム規模遺伝子発現解析を用いて、乳がん転移を検出するための推測上のマーカーを同定し、そして、mammaglobinおよびＣＫ１９が、９０％の感度と９４％の特異度で、乳房センチネルリンパ節における臨床上有効な転移を検出したことを明らかにした。Backus他（２００５年）参照。
【０１３３】
本解析の開発中、ＣＵＰの中で最も一般的な肺がん、すい臓がん、および、結腸がん［Ghosh他（２００５年）；および、Pavlidis他（２００５年）］、ならびに、治療が患者にとって最も有益である可能性がある乳がん、卵巣がん、および、前立腺がんを含む、６つのがんの種類に対して、選択の焦点を当ててきた。Ghosh他（２００５年）参照。しかし、解析の全体の確度に欠陥が生じない限り、また、もし適用可能ならば、ＲＴ−ＰＣＲ反応のロジスティクスが妨げられない限り、更なる組織の種類、および、マーカーをパネルに追加することができる。
【０１３４】
マイクロアレイに基づいた原発組織の研究は、既知のマーカーの特異度および感度を確認した。結果として、組織特異的マーカーの大部分が、本発明で調べられた組織に対して高い特異度を有する。最近の研究では、ＩＨＣを用いると、ＰＳＣＡが前立腺がん転移において過剰発現されることがわかった。Lam他（２００５年）参照。Dennis他（２００２年）はまた、ＰＳＣＡがすい臓がんおよび前立腺がんに対する原発腫瘍マーカーとして用いることができることを明らかにした。ＰＳＣＡの強い発現は、一部の前立腺組織において、ＲＮＡレベルで見出されるが、その解析にＰＳＡを含むために、前立腺がんとすい臓がんとを直ちに分離することができる。本研究で新規に発見されたことは、すい臓原発巣組織の（ＰＳＣＡに対して）補足的なマーカーとして、Ｆ５を用いるということであった。原発組織のマイクロアレイデータ群、および、ＦＦＰＥ転移のｑＲＴ−ＰＣＲデータ群両方において、Ｆ５はＰＳＣＡを補足することが見出された。
【０１３５】
従来の研究者たちは、ＩＨＣ［Brown他（１９９７年）；De Young他（２０００年）；および、Dennis他（２００５年ａ）参照］、もしくは、マイクロアレイ［Su他（２００１年）；Ramswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照］を用いたＣＵＰ解析を生み出してきた。さらに最近では、ＳＡＧＥ法が、小規模のｑＲＴ−ＰＣＲマーカーパネルと組み合わされてきた。Dennis他（２００２年）；および、Buckhaults他（２００３年）参照。本研究は、マイクロアレイに基づいた発現プロファイル解析を、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析の小規模のパネルと組み合わせた最初のものである。原発組織に対するマイクロアレイ研究は、これまでにＳＡＧＥ法によって同定されたのと同一の原発巣組織マーカーのうちのすべてではないが、一部を同定した。ＳＡＧＥ法に基づいたプロファイル解析データとＤＮＡマイクロアレイに基づいたプロファイル解析データとが適度に一致すること、また、その相互関係が、より高い発現量を伴う遺伝子に対して向上することを示してきた研究を考慮すれば、この発見は驚くほどのことではない。van Ruissen他（２００５年）；および、Kim他（２００３年）参照。例えば、Dennisと同僚は、ＰＳＡ、ＭＧ、ＰＳＣＡ、および、ＨＵＭＳＰＢを同定し、一方、Buckhaultsと共同研究者［Buckhaults他（２００２年）参照］はＰＤＥＦを同定した。ＣＵＰ解析の実施はｑＲＴ−ＰＣＲによるものであるのが好ましい。というのは、それが強固な技術であり、ＩＨＣ以上の性能優位性を有するかもしれないからである。Al-Mulla他（２００５年）；および、Haas他（２００５年）参照。さらに、本明細書に示したように、ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルは、１段階反応において遺伝子特異的プライマーを用いることにより改良されてきた。このことは、ＦＦＰＥ組織での１段階ｑＲＴ−ＰＣＲ反応に、遺伝子特異的プライマーを用いた最初の証明である。他の研究者は、２段階ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲが後に続く１反応でのｃＤＮＡ合成）を行ったか、または、ランダムヘキサマーもしくは先端を切った遺伝子特異的プライマーを用いたかのいずれかである。Abrahamsen他（２００３年）；Specht他（２００１年）；Godfrey他（２０００年）；Cronin他（２００４年）；および、Mikhitarian他（２００４年）参照。
【０１３６】
要約すると、６つの組織の種類に対する７８％の総体的解析確度は、他の研究と比較して優れている。Brown他（１９９７年）；De Young他（２０００年）；Dennis他（２００５年ａ）；Su他（２００１年）；Ramaswamy他（２００１年）；および、Bloom他（２００４年）参照。
【０１３７】
〔実施例７〕
本研究において、遺伝子マーカーポートフォリオを用いる分類器が、ＭＶＯから選ぶことによって、また、原発巣組織、および、乳がん、結腸がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がんを含む５つの主要ながんの種類に対するがんの状態を予測するためにこの分類器を用いることによって構築された。３７８個の原発がん、２３個の良性増殖上皮病変、および、１０３個の急速冷凍された正常なヒト組織標本を、Affymetrix human U133A GeneChipを用いて分析した。白血球サンプルもまた、白血球バックグラウンド細胞における共発現によって、潜在的に隠される遺伝子発現を差し引くために分析した。新規のＭＶＯに基づくバイオインフォマティクスの手法を、原発巣組織およびがんの状態に対する遺伝子マーカーポートフォリオを選択するために開発した。そのデータによって、２６個の遺伝子のパネルを、５つのがんの種類間の原発巣組織、および、がんの状態を正確に予測するための分類器として用いることができるということがわかった。このように、さまざまながんの分類法を、かなり少ない数の遺伝子マーカーの遺伝子発現プロファイルを決定することによって得ることができる。
【０１３８】
表１９は、指定された原発巣組織について同定されたマーカーを示している。遺伝子の説明については表２８を参照のこと。
【表２１】
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【０１３９】
サンプル群には、全体で２９９個の転移性結腸がん、転移性乳がん、転移性すい臓がん、転移性卵巣がん、転移性前立腺がん、転移性肺がん、および、その他のがん、ならびに、原発性前立腺がんのサンプルが含まれた。組織学的な評価、対照遺伝子β-actinのＲＮＡ収量、および、その発現に基づく性質確認（ＱＣ）が行われた。他のサンプルカテゴリーには、胃がん（５個）、腎臓がん（６個）、胆管／胆のうがん（４個）、肝臓がん（２個）、頭頸部がん（４個）、回腸がん（１個）から生じた転移、および、１個の中皮種が含まれた。結果を表２０にまとめる。
【表２２】
0005666136.tif 000023
【０１４０】
上記サンプルを試験することによって、結果的に表２１のマーカー群にまで削減された。その結果を表２２に示す。
【表２３】
0005666136.tif 000024
【表２４】
0005666136.tif 000025
【０１４１】
その結果は、表２３のように、２０５個のパラフィン包埋転移性腫瘍のうち；１６６個のサンプル（８１％）が最終的な分析結果を有したことを示した。
【表２５】
0005666136.tif 000026
【０１４２】
表２４のように、偽陽性結果のうちの多くの誤りが、組織学的および発生学的に類似の組織に由来した。
【表２６】
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【０１４３】
以下のパラメータが、モデル開発のために検討された。
女性群、および、男性群におけるマーカーを分離し、男性患者、および、女性患者についてのＣＵＰ確率を別々に計算する。男性群には、ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３、ＰＳＣＡ、Ｆ５、ＰＳＡ、ＨＰＴ１が含まれ；女性群には、ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３、ＰＳＣＡ、Ｆ５、ＨＰＴ１、ＭＧＢ、ＰＤＥＦ、ＷＴ１が含まれた。バックグラウンドの発現（すなわち、肺：ＳＰ＿Ｂ、ＴＴＦ１、ＤＳＧ３；卵巣：ＷＴ１、および、結腸：ＨＰＴ１）は、解析結果から除外した。
【０１４４】
ＣＵＰモデルは、そのＣＵＰの罹患率（％）（すなわち、肺がん２３％、すい臓がん１６％、結腸直腸がん９％、乳がん３％、卵巣がん４％、前立腺がん２％、その他のがん４３％）に調整された。乳がんおよび卵巣がんに対する罹患率は、男性患者については０％に調整され、そして、前立腺がんの罹患率は、女性患者については０％に調整された。
【０１４５】
以下の工程が採用された。
マーカーを同様のスケール上に置く。
最小値を各組織特異的な群から選択することにより、変数の数を１２個から８個に減らす。
１個のサンプルを除く。残りのサンプルからモデルを構築する。除いたサンプルをテストする。１００％のサンプルが試験されるまで繰り返す。
サンプルのうち〜５０％（組織当たり〜５０％）をランダムに除く。残りのサンプルからモデルを構築する。サンプルのうち〜５０％のサンプルについて試験する。３つの異なるランダムな分割群について反復する。
【０１４６】
分類確度は、がんの種類の罹患率に調整された。
結果を表２５にまとめ、生データを表２６に示す。
【表２７】
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【表２８】
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【０１４７】
〔実施例８〕
原発巣組織を予測するための原発部位不明転移性がんＣＵＰの予想される遺伝子特徴についての研究
本研究の具体的なねらいは、１０個の遺伝子特徴の能力、すなわち、原発不明がん（ＣＵＰ）を有する患者における転移性がんの原発巣組織を予測する能力を決定することであった。
【０１４８】
第１の目標：ＣＵＰを有する継続患者のコア生検サンプルに由来する遺伝子解析の実現可能性を確認する。
第２の目標：１０個の遺伝子特徴のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果と、M. D. Anderson Cancer Center（ＭＤＡＣＣ）においてなされた診断上の精密検査とを相関させる。
第３の目標：解析により予測された６つのがんの種類の罹患率と、文献およびＭＤＡＣＣ実験に由来する罹患率とを相関させる。
【０１４９】
７００個の凍結原発がん、良性標本、および正常標本のマイクロアレイ遺伝子発現解析を実行するために、本明細書に記載された方法を用い、そして、肺がん、すい臓がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、および、卵巣がんに特異的な遺伝子マーカー候補を同定した。肺、すい臓、結腸、乳房、卵巣、および前立腺から生じた転移性がん（ステージＩＩＩ〜ＩＶ）ならびに特異度対照のための他のがんの種類から生じた転移のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）２０５個の標本のＲＴ−ＰＣＲによって、遺伝子マーカー候補を試験した。他の転移性がんの種類には、胃がん、腎臓細胞がん、肝細胞性がん、胆管／胆のうがん、および、頭頸部がんが含まれた。結果により、転移性がんの原発巣組織を予測し、全体で７６％の確度を示した１０個の遺伝子特徴を選ぶことができた。ＲＴ−ＰＣＲ実験でくり返された測定の平均のＣＶ値は、４つの複製時点に基づいて計算した結果、１．５％であった。β-actin（ＡＣＴＢ）をハウスキーピング遺伝子として用い、その中位の発現は異なる原発巣を有する転移性サンプルと同様であった（ＣＶ＝５．６％）。
【０１５０】
本研究に係る具体的なねらいは、１０個の遺伝子特徴の能力、すなわち、ＣＵＰ患者における転移性がん原発巣組織を予測する能力を、総合的な診断上の精密検査と比較して確認することであった。
【０１５１】
＜患者適格＞
ＥＣＯＧ一般状態０〜２を有する少なくとも１８歳の患者でなければならない。腺がん、もしくは、若干分化したがんを有すると診断された患者を採用した。腺がん患者のグループには、高分化の腫瘍、中分化の腫瘍、および、低分化の腫瘍が含まれる。
【０１５２】
患者はＣＵＰの基準を満たしていた。すなわち、完全な評価後にまったく原発腫瘍が検出されなかった。この評価とは、完全な病歴および身体的な検査、詳細な臨床検査、造影研究、ならびに、侵襲的研究を導く兆候もしくはサインとして定義される。本研究では、治療が行われていない患者のみを採用した。
【０１５３】
患者が化学療法、もしくは、放射線で治療されている場合、本研究への参加は、１０年以内に採取されたブロックとして（治療）以前の組織が手に入るのであれば、認められた。
【０１５４】
本研究への参加のために、患者から書面による承諾／許可が提出された。
【０１５５】
＜研究設計＞
本研究では、ＣＵＰと診断された患者を採用した。これらの患者は最も利用可能な転移性病変のコアニードル生検、もしくは切除生検を経験してきた者たちである。ＦＮＡ生検が行われた患者のみが適切ではなかった。試験対象患者基準に合致し、かつ、研究に同意した最初の６０名の継続患者が登録された。ＭＤＡＣＣにおいて治療のための診断の目的で、再度の生検が必要である場合、患者から同意が得られれば、更なる組織を本発明のために入手した。すべての参加者を、institutional Protocol Data Management System（ＰＤＭＳ）におけるプロトコルに登録した。
【０１５６】
登録された患者すべてに対して、ＭＤＡＣＣ基準にしたがって、臨床上および病理学上の判定を含む完全な診断上の精密検査を実行した。診断上の精密検査における病理学的な一部には、ＣＫ−７、ＣＫ−２０、ＴＴＦ−１、および病理学者によって指示されたと考えられる他のものを含むマーカーによる、免疫組織化学的（ＩＨＣ）解析が含まれてもよかった。これは、ＣＵＰが存在するすべての患者の日常的な精密検査の一部である。
【０１５７】
＜組織サンプル収集＞
本研究には、ＣＵＰ患者から収集したホルマリン固定パラフィン包埋転移性がん標本が含まれた。
【０１５８】
ＲＮＡ単離のために、６個の１０μｍ切片を用いたが、より小さな組織標本については、９個の１０μｍの切片が必要であろう。ヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）で染色された追加の切片上で、ＲＮＡ単離のために用いられたサンプルごとに、組織病理学的診断、および、腫瘍内容物を確認した。腫瘍サンプルは、ＨＥ切片において３０％を超える腫瘍内容物を有するべきであった。
【０１５９】
臨床データは匿名でVeridexへ提供された。そのデータには、患者の年齢、性別、光学顕微鏡による腫瘍組織構造、腫瘍段階（分化）、転移部位、標本収集日、個々の患者に対して行われた診断上の精密検査の説明が含まれる。
【０１６０】
＜組織処理およびＲＴ−ＰＣＲ実験＞
前述のプロトコルを用いて、各組織サンプルから全ＲＮＡを抽出した。標準量の組織から１μｇを超える全ＲＮＡを生ずるサンプルのみを、その後のＲＴ−ＰＣＲ試験のために用いた。ＲＮＡ収量のあまりないサンプルは劣化していると考えられ、その後の実験からは除外した。標準のVeridexの方法にしたがって、劣化したＲＮＡを有するサンプルを除外するために、ハウスキーピング発現に基づくＲＮＡの完全性対照を行った。
【０１６１】
ＲＮＡサンプルの解析のために、１０個の遺伝子、および、１〜２個の対照遺伝子のパネルを含むＲＴ−ＰＣＲ解析を用いた。前述のプロトコルを用いて、逆転写解析およびＰＣＲ解析を達成した。
【０１６２】
ΔＣｔとして表される各々の試験された遺伝子の相対的な発現値を計算し、原発巣組織の予測のために用いた。ΔＣｔとは、標的遺伝子のＣｔから対照遺伝子のＣｔを差し引いた値と等しい。
【０１６３】
＜サンプルサイズおよびデータ解釈＞
予備的研究の診査の本質のために、６０人の患者の限定されたサンプルサイズを研究した。これまでに、２２人の患者を試験した。ある患者サンプルは、ＲＴ−ＰＣＲ試験のための十分なＲＮＡを生成することができず、また、３個のサンプルが、対照遺伝子によるＲＴ−ＰＣＲによって判定されたＱＣ対照を通過できなかった。全体で１８人の患者が、患者の転移性病変の確率を決定するために用いられた。
【０１６４】
統計モデルは、以下の７つのカテゴリーの転移性がん原発巣組織の確率を決定するために用いられた。そのカテゴリーとは、肺がん、すい臓がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、および、非試験（その他）であった。それぞれのサンプルに対する各カテゴリーの確率は、線形的な分類モデルから計算される。解析結果を表２７にまとめる。
【０１６５】
患者（既知の原発巣を有する）の転移性病変が、これらの６つの部位（結腸、すい臓、肺、前立腺、卵巣、乳房）の１つに由来する確率は、約７６％である。この数は、さまざまながんの発症率、および、転移する可能性について記載された文献、および、M. D. Andersonにおける腫瘍登録から生じた未発表のデータから導き出される。試験されたサンプルについては、６つの部位の罹患率は６７％（１８個の試験されたサンプルのうち１２個）であり、従来の観察結果と非常によく一致した。
【表２９】
0005666136.tif 000030
【０１６６】
本発明は、理解を明確にする目的で、図および実施例の形である程度詳細に説明したが、その説明および実施例を、発明の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
なお、本発明の好ましい実施態様は以下の通りである。
（１）  原発不明転移の原発巣を同定する方法において、
（ａ）転移性細胞を含むサンプルを入手する工程と、
（ｂ）少なくとも２つの異なるがんに関連するバイオマーカーを評価する工程と、
（ｃ）前記バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて、線形判別分析にする工程であって、前記線形判別分析は、
（ｉ）前記バイオマーカーを基準に対して標準化し、
（ｉｉ）各々のバイオマーカーの感度および特異度を最適化し、前記がんの罹患率を重み付けし、原発巣組織を選択するようなカットオフを課す、
工程と、
（ｄ）前記線形判別分析によって決定された最も高い確率に基づいて原発巣を決定するか、もしくは、前記がんが特定のがん群に由来しないことを決定する工程と、
（ｅ）任意に、１つ以上の追加の異なるがんに特異的なバイオマーカーを評価し、前記追加のバイオマーカーに対して、工程（ｃ）および工程（ｄ）を反復する工程と、
を含む、方法。
（２）  実施態様１に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、
（ｉ）ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、もしくは、ＳＦＴＰＣ；
（ｉｉ）Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０；または、
（ｉｉｉ）ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、もしくは、ＦＡＢＰ１；
に対応する群のうちの少なくとも１つから選ばれる、方法。
（３）  実施態様２に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、ＤＳＧ３、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、もしくは、ＳＦＴＰＣである、方法。
（４）  実施態様３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ、および、ＤＳＧ３である、方法。
（５）  実施態様４に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣをさらに含むか、または、ＫＲＴ６Ｆ、ｐ７３Ｈ、および／もしくは、ＳＦＴＰＣによって置き換えられる、方法。
（６）  実施態様２に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、Ｆ５、ＰＳＣＡ、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、もしくは、ＦＫＢＰ１０である、方法。
（７）  実施態様６に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、Ｆ５、および、ＰＳＣＡである、方法。
（８）  実施態様７に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０をさらに含むか、または、ＩＴＧＢ６、ＫＬＫ１０、ＣＬＤＮ１８、ＴＲ１０、および／もしくは、ＦＫＢＰ１０によって置き換えられる、方法。
（９）  実施態様１に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１、もしくは、ＦＡＢＰ１である、方法。
（１０）  実施態様９に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＣＤＨ１７である、方法。
（１１）  実施態様１０に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１をさらに含むか、または、ＣＤＸ１、および／もしくは、ＦＡＢＰ１によって置き換えられる、方法。
（１２）  実施態様１〜１１のいずれか１項に記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号１１〜５８のうちの少なくとも１つを用いて、評価される、方法。
（１３）  実施態様２に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、性特異的マーカーからさらに選ばれ、
前記性特異的マーカーは、
（ｉ）男性患者の場合、ＫＬＫ３、ＫＬＫ２、ＮＧＥＰ、もしくは、ＮＰＹ；あるいは、
（ｉｉ）女性患者の場合、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−π；および／または、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２；
のうちの少なくとも１つから選ばれる、方法。
（１４）  実施態様１３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＫＬＫ２である、方法。
（１５）  実施態様１４に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＫＬＫ３である、方法。
（１６）  実施態様１５に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹをさらに含むか、または、ＮＧＥＰ、および／もしくは、ＮＰＹによって置き換えられる、方法。
（１７）  実施態様１３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＰＤＥＦ、ＭＧＢ、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πである、方法。
（１８）  実施態様１７に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＰＤＥＦ、および、ＭＧＢである、方法。
（１９）  実施態様１８に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πをさらに含むか、または、ＰＩＰ、Ｂ３０５Ｄ、Ｂ７２６、もしくは、ＧＡＢＡ−πによって置き換えられる、方法。
（２０）  実施態様１３に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＷＴ１、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２である、方法。
（２１）  実施態様２０に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＷＴ１である、方法。
（２２）  実施態様２１に記載の方法において、
前記マーカー遺伝子は、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２をさらに含むか、または、ＰＡＸ８、ＳＴＡＲ、もしくは、ＥＭＸ２によって置き換えられる、方法。
（２３）  実施態様１３〜２２のいずれか１項に記載の方法において、
遺伝子発現は、配列番号１１〜５８のうちの少なくとも１つの配列を用いて、評価される、方法。
（２４）  実施態様１もしくは２に記載の方法において、
がんの原発巣を決定するために、転移部位を含む、追加の臨床情報をさらに得る工程、
を含む、方法。
（２５）  がんに対する最適なバイオマーカー群を得る方法において、
既知の原発巣の転移を用いる工程と、
前記転移に対するバイオマーカーを決定する工程と、
前記バイオマーカーを、原発不明転移のバイオマーカーと比較する工程と、
を含む、方法。
（２６）  治療方針を提供する方法において、
実施態様１〜３のいずれか１項にしたがって、原発不明転移の原発巣を決定し、前記原発巣に対して適切な治療法を同定することによる、方法。
（２７）  予後を提供する方法において、
実施態様１〜３のいずれか１項にしたがって、原発不明転移の原発巣を決定し、前記原発巣に対して対応する予後を同定することによる、方法。
（２８）  バイオマーカーを発見する方法において、
特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現レベルを決定することと、
前記マーカー遺伝子の発現を決定するために前記マーカー遺伝子に対するバイオマーカーを評価することと、
実施態様１にしたがって、前記マーカー遺伝子の前記発現を分析することと、
前記マーカー遺伝子が原発腫瘍に対して効果的に特異的であるかどうかを決定することと、
を含む、方法。
（２９）  組成物において、
配列番号１１〜５８から選ばれる、少なくとも１つの単離された配列、
を含む、組成物。
（３０）  実施態様１〜３のいずれか１項にしたがって、解析を実施するためのキットにおいて、
バイオマーカー検出試薬、
を含む、キット。
（３１）  マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
実施態様１〜３のいずれか１項に記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
（３２）  診断／予後ポートフォリオにおいて、
実施態様２〜１１もしくは１３〜２２のいずれか１項に記載の遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、それらの部分配列、
を含み、
前記組み合わせは、異なるがん由来の細胞、もしくは、正常組織由来の細胞と比較して、転移性細胞を有する生物学的サンプルにおける遺伝子発現を評価するのに十分であるか、もしくは、前記遺伝子発現を特徴付けるのに十分である、診断／予後ポートフォリオ。
（３３）  実施態様２〜１１もしくは１３〜２２のいずれか１項に記載の方法において、
前記サンプルで構成的に発現する、少なくとも１つの遺伝子の発現を評価すること、
をさらに含む、方法。
【０１６７】
【表３０】
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【０１６８】
〔参照文献〕
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【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
【図２】原発不明転移の原発巣を同定する先行技術方法の図である。
【図３】本発明のＣＵＰ分類ツリーの図である。
【図４Ａ】組織パネルにおけるprostate stem cell antigen（ＰＳＣＡ）の発現強度を示しているマイクロアレイデータの図である。
【図４Ｂ】組織パネルにおけるcoagulation factor V（Ｆ５）の発現強度を示しているマイクロアレイデータの図である。
【図５Ａ】Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。３時間のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＲＮＡをＦＦＰＥ組織から単離した。
【図５Ｂ】は、Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。１６時間のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＲＮＡをＦＦＰＥ組織から単離した。
【図６Ａ】異なる３つのｑＲＴ−ＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。β-actinに対するＲＮＡ量を測定した。
【図６Ｂ】異なる３つのｑＲＴ−ＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。ＨＵＭＳＰＢに対するＲＮＡ量を測定した。
【図６Ｃ】異なる３つのｑＲＴ−ＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。ＴＴＦに対するＲＮＡ量を測定した。
【図７】ＣＵＰ解析プレートの図である。
【図８Ａ】単変量解析ツリーの図解である。
【図８Ｂ】単変量解析ツリーの図解である。
【図９Ａ】ＲＮＡ濃度範囲に渡る解析性能を示したグラフである。
【図９Ｂ】ＲＮＡ濃度範囲に渡る解析性能を示したグラフである。
【図９Ｃ】ＲＮＡ濃度範囲に渡る解析性能を示したグラフである。
【図１０Ａ】マーカー候補の指定および確認を示す実験作業の流れの図解である。
【図１０Ｂ】マーカー候補の指定および確認を示す実験作業の流れの図解である。
【図１１Ａ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｂ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｃ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｄ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｅ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｆ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｇ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｈ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｉ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１１Ｊ】ＦＦＰＥ転移性がんおよび前立腺原発性腺がんにおける組織特異的遺伝子マーカー候補の発現の図である。
【図１２Ａ】解析の最適化の図であり、Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。３時間のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＲＮＡをＦＦＰＥ組織から単離した。
【図１２Ｂ】解析の最適化の図であり、Agilent Bioanalyzerから得られた電気泳動図である。１６時間のタンパク質分解酵素Ｋの消化により、ＲＮＡをＦＦＰＥ組織から単離した。
【図１２Ｃ】解析の最適化の図であり、異なる３つのｑＲＴ−ＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。β-actinに対するＲＮＡ量を測定した。
【図１２Ｄ】解析の最適化の図であり、異なる３つのｑＲＴ−ＰＣＲ法から得られたＣｔ値の比較の図である。ＨＵＭＳＰＢに対するＲＮＡ量を測定した。
【図１３】２３９個のサンプルに係る１０個のマーカーパネルの相対的な発現量を示すヒートマップである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
0005666136.tif 000065
【図１１Ｊ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【配列表】
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