(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均直径が０．３μｍより大きく、膜を含む多層ベシクル（ＭＬＶ）であるリポソームを含む関節潤滑用の医薬組成物であって、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、又はＤＭＰＣと１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）との混合物を含み、秩序固体（ＳＯ）から無秩序液体（ＬＤ）への相転移が生じる相転移温度を有し、当該相転移温度が２０℃ないし３９℃の温度内にあり、前記関節が前記相転移温度より高い関節温度を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
平均直径が０．３μｍより大きく、膜を含む多層ベシクル（ＭＬＶ）であるリポソームの使用であって、前記リボソームが、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、又はＤＭＰＣと１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）との混合物を含む膜を含み、秩序固体（ＳＯ）から無秩序液体（ＬＤ）への相転移が生じる相転移温度を有し、当該相転移温度は、２０℃ないし３９℃の温度内にあり、相転移温度より高い関節温度を有する関節への投与用の医薬組成物を調製するためのリポソームの使用。
【請求項３】
前記リポソームが０．３μｍないし１０μｍの間の平均直径を有することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記多層ベシクル（ＭＬＶ）が軟骨の摩耗を予防するために関節に投与されることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記リポソームが０．３μｍないし１０μｍの間の平均直径を有することを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記関節の温度が前記相転移温度より１ないし１５℃高いことを特徴とする、請求項１又は３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記リポソームが、関節内注射、関節鏡を用いた投与、又は外科的投与用に製剤化されることを特徴とする、請求項１、３、又は６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
関節疾患又は関節疾患から生じる症状の治療用であることを特徴とする、請求項１、３、６，又は７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記関節疾患が、関節炎、骨関節炎、リウマチ性関節炎患者の骨関節炎、外傷性関節損傷、関節固着、スポーツ外傷、ならびにその後の関節穿刺術、関節鏡手術、開き継手手術および関節置換術から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
関節の潤滑を促進し、関節の摩耗を予防することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
関節固着、スポーツ外傷、骨関節炎（ＯＡ）に関する外傷性損傷又はリウマチ性関節炎に続発する疾患、及び乾癬性関節炎の治療、処置または悪化の予防のための請求項１、３、又は６ないし１０いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
関節温度を有し、生理学的に許容される賦形剤と平均直径が０．３μｍより大きく、多層ベシクル（ＭＬＶ）であるリポソームとを含む関節の関節潤滑のための医薬組成物であって、前記リポソームが少なくとも１つのリン脂質（ＰＬ）を含有する膜を含み、前記リン脂質がジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、又はＤＭＰＣと１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）との混合物であり、前記膜が秩序固体（ＳＯ）から無秩序液体（ＬＤ）へと相転移が生じる相転移温度を有し、当該相転移温度が２０℃ないし３９℃内にあり、かつ前記関節温度よりも低いことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
前記生理学的に許容される賦形剤がヒスチジン緩衝液であることを特徴とする請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
関節内注射、関節鏡を用いた投与または外科的投与による投与用の形状であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記リポソームはヒアルロン酸を含んでいないことを特徴とする、請求項１、３、又は６ないし１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームおよびその治療上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の分野の状況を示していると考えられる以下に先行文献のリストを挙げる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，１３３，２４９号、「リン脂質およびプロピレングリコールベースの潤滑剤」Ｈｉｌｌｓ  Ｂ．Ａ．１９９８年
【特許文献２】米国特許第５，４０３，５９２号、「リウマチの潤滑剤組成物」Ｈｉｌｌｓ  Ｂ．Ａ．１９９０年
【特許文献３】米国特許第６，８００，２９８号、「生物学的潤滑剤組成物およびその投与方法」、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hills, B. A.; Monds, M. K., Enzymatic identification of the load- bearing boundary lubricant in the joint. Br. J, Rheumatol. 1998, 37, (2), 137-142.
【非特許文献２】Oloyede, A., Gudimetla, P., Crawford, R., Hills, B. A., Biomechanical responses of normal and delipidized articular cartilage subjected to varying rates of loading. Connective Tissue Research 2004, 45, (2), 86-93.
【非特許文献３】Ethell, M. T.; Hodgson, D. R.; Hills, B. A., The synovial response to exogenous phospholipid (synovial surfactant) injected into the equine radiocarpal joint compared with that to prilocaine, hyaluronan and propylene glycol. New Zealand Veterinary Journal 1999, 47, (4), 128-132.
【非特許文献４】Pickard, J. E.; Fisher, J.; Ingham, E.; Egan, J., Investigation into the effects of proteins and lipids on the frictional properties of articular cartilage. Biomaterials 1998, 19, (19), 1807-1812.
【非特許文献５】Kawano, T.; Miura, H.; Mawatari, T.; Moro-Oka, T.; Nakanishi, Y.; Ffigaki, H.; Iwamoto, Y., Mechanical effects of the intraarticular administration of high molecular weight hyaluronic acid plus phospholipid on synovial joint lubrication and prevention of articular cartilage degeneration in experimental osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2003, 48, (7), 1923-1929.
【非特許文献６】Forsey, R. W.; Fisher, J.; Thompson, J.; Stone, M. H.; Bell, C; Ingham, E., The effect of hyaluronic acid and phospholipid based lubricants on friction within a human cartilage damage model. Biomaterials 2006, 27, (26), 4581-4590.
【非特許文献７】Klein, J., Molecular mechanisms of synovial joint lubrication. J. Proc. Inst. Mech Eng., Part J: J. Eng. Tribology 2006, 220, (8), 691-710.
【０００５】
以下の文章中で随時参照している完全な先行技術リストは、添付の特許請求の範囲の前の詳細な説明の最後に記す。出版物との照合は、完全な参考文献リストの数字を示すことによって行う。
【０００６】
ジョイント部の機能不全は、大多数の人に影響を及ぼす。十分な生物学的潤滑剤は、適正なジョイント可動性に不可欠であり、分解性のジョイント変形の予防および改善に重要である（１）。
【０００７】
一般的なジョイント部の機能不全は、骨関節炎（ＯＡ）であり、有病者は、米国だけで２千万人を超える（２）。ＯＡの原因は、炎症、代謝および機械的原因を含む多くの要素からなる（３−５）。リスク因子のリストの中には、年齢、性別、肥満、仕事、トラウマ、アテローム血管疾患および運動不足（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が含まれる（１，３−７）。ＯＡは、関節軟骨の損傷の結果として生じる。あるいは逆に、肋軟下骨硬化症（ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ  ｂｏｎｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）は、実際に、軟骨分解および損失を進行させる（８，９）。関節軟骨が一度損傷すると、ダメージは進行する（１０）。
【０００８】
現在の治療は、通常、薬剤の全身または関節内投与によって、ジョイント部の過負荷の低減、痛みおよび炎症の緩和に焦点を当てている（１１）。
【０００９】
関節軟骨は、滑らかで強靱であり、弾力性および可撓性のある表面を形成し、骨の動きを促進する。骨液空間は、ヒアルロン酸（ＨＡ）および糖タンパク質ルーブリシン（ｌｕｂｒｉｃｉｎ）を含有する粘性のある骨液（ＳＦ）で満たされている（１２−１４）。ＨＡ（ヒアルロン酸）は、極めて不安定でＯＡ（骨関節炎）の炎症条件下で分解する、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンのポリマである（１５，１６）。ルーブリシンは、約４４％のタンパク質、約４５％の炭水化物および約１１％のリン脂質（ＰＬ）（１２−１４）からなり、リン脂質の約４１％は、ホスファチジルコリン（ＰＣｓ）、約２７％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および約３２％スフィンゴミエリン（１７−１９）である。これらのＰＬは、「界面活性リン脂質（ＳＡＰＬ）」と呼ばれている。ＳＡＰＬのＰＥおよびＰＣは、２つの炭化水素鎖を含み、その一方は不飽和モノオレイン酸（１８：１）である。
【００１０】
潤滑分子の相が対向する面を離間している境界潤滑は、関節のジョイント部の負荷において生じる（１７，１８，２０）。いくつかの異なる物質が、関節軟骨における天然の境界潤滑として提案されてきた。過去には、ヒアルロン酸は、主な潤滑剤と考えられていたが（２１）、しかしながら、近年の摩擦学研究は、ヒアルロン酸自体は、「関節軟骨中に見られるほぼ摩擦のない境界生物学的潤滑の要因ではない」が、耐荷力および摩耗保護に役立つことを報告している（２２）。多くのレポートは、ルーブリシンが、骨液の潤滑特性における主な役割を果たすことを示していることを示している（１２，１４，１９，２０，２３，２４）。Ｐｉｃｋａｒｄ等（２５）およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＨｉｌｌｓ（１９）は、ルービリシンの界面活性リン脂質（ＳＡＰＬ）として規定されるリン脂質は、関節軟骨のジョイント部の潤滑を促進することを実証した。Ｈｉｌｌおよびその共同研究者は、ＯＡ関節がＳＡＰＬ欠陥を有し、界面活性リン脂質１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を骨関節炎患者のジョイント部に注射したところ、副作用なく、可動性の改善が１４週間続いたことを実証した。他の研究においては、Ｗａｔａｎａｂｅ等は、独自の極低温軟骨予防技術を用いて、潤滑において主な役割を果たすと仮定される健康な軟骨表面の脂質性球状ベシクルを観察した（２８）。Ｋａｗａｎｏ等（２９）およびＦｏｒｓｅｙ等（３０）は、動物モデルを用いて、高分子量ＨＡ（約２０００ｋＤａ）をＤＰＰＣと組み合わせて使用することで後者の潤滑能力が改善されたことを示した。
【００１１】
米国特許第６，８００，２９８号は、特に、哺乳類ジョイント部の潤滑に関するリン脂質など、脂質を含有するデキストランベースのヒドロゲル組成物を開示している。
【００１２】
近年、Ｋｅｌｉｎと共同研究者は、分子レベルでジョイント部の潤滑の各種問題をまとめた。彼らは、軟骨潤滑に対する主な要因として、軟骨表面での高度に水和されたブラシ状にチャージされたマクロ分子の潜在的な役割を指摘している（３１−３３）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ジョイント部の潤滑に関してリポソームシステムの発見と、関節のジョイント部をまねている軟骨−軟骨器具（ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｏｎ−ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｐｐａｒｔｕｓ）を用いた、ジョイント摩擦に関する様々なＰＬ組成物、寸法および層（ｌａｍｅｌｌａｒｉｔｙ）に関する研究と、に基づいている。
【００１４】
従って、本発明によれば、ジョイント可動性を改善または維持するために骨液ジョイントに注入するための、リン脂質（ＰＬ）を具えるリポソームシステムに基づいた新規な潤滑剤が提案される。
【００１５】
従って、第１の側面によれば、２つの同一または異なるＣ１２−Ｃ１６の炭化水素鎖を有するスフィンゴ脂質（ＳＰＬ）と、Ｃ１２−Ｃ１８の炭化水素鎖を有するグリセロリン脂質（ＧＰＬ）と、からなる群の少なくとも１つのリン脂質（ＰＬ）を含んだ１またはそれ以上の膜を具えたリポソームの使用を提供し、１又はそれ以上の膜は、秩序固体（ＳＯ）から無秩序液体（ＬＤ）へと転移する相転移温度を有し、この相転移温度は約２０℃乃至３９℃の温度内にあり、上記使用は、相転移温度より高いジョイント部の温度を有するジョイント部の潤滑に適している。
【００１６】
本発明の別の側面によれば、２つの同一または異なるＣ１２−Ｃ１６の炭化水素鎖を有するスフィンゴ脂質（ＳＰＬ）と、Ｃ１２−Ｃ１８の炭化水素鎖を有するグリセロリン脂質（ＧＰＬ）と、からなる群の少なくとも１つのリン脂質（ＰＬ）を含んだ１またはそれ以上の膜を具えるリポソームの使用を提供し、１又はそれ以上の膜は、秩序固体（ＳＯ）から無秩序液体（ＬＤ）へと転移する相転移温度を有し、この相転移温度は約２０℃乃至３９℃の温度内にあり、医薬組成物の調整に関して、前記相転移温度より高いジョイント部の温度を有するジョイントへの投与に適している。
【００１７】
他の側面によれば、哺乳類のジョイント部を潤滑する方法が提供され、この方法は、ジョイント部温度を有するジョイント部のキャビティ内にリポソームの治療有効量を投与するステップを具え、このリポソームは、２つの同一または異なるＣ１２−Ｃ１６の炭化水素鎖と、Ｃ１２−Ｃ１８の炭化水素鎖を有するスフィンゴ脂質（ＳＰＬ）と、からなる群の少なくとも１つのリン脂質（ＰＬ）を含んだ１又はそれ以上の膜を具え、１又はそれ以上の膜は、秩序固体（ＳＯ）から無秩序液体（ＬＤ）へと相変化が生じる相転移温度を有し、相転移温度は約２０℃乃至３９℃の温度であり、相転移温度はジョイント部の温度よりも低い。
【００１８】
本発明のさらに別の側面においては、ジョイント部温度を有するジョイント部を潤滑する医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、生理学的に許容される賦形剤およびリポソームを具え、このリポソームは、２つの同一または異なるＣ１２−Ｃ１６炭化水素鎖を有するグリセロリン脂質（ＧＰＬ）と、Ｃ１２−Ｃ１８の炭化水素鎖を有するスフィンゴリン脂質（ＳＰＬ）と、からなる群の少なくとも１つのリン脂質（ＰＬ）を有する１又はそれ以上の膜を具え、１又はそれ以上の膜は、秩序固体（ＳＯ）から無秩序液体（ＬＤ）へと相転移が生じる相転移温度を有し、この相転移温度は、約２０℃乃至３９℃の温度内にあり、前記ジョイント部の温度よりも低い。
【００１９】
一実施例において、前記Ｃ１２−１６またはＣ１２−１８炭化水素鎖は飽和している。
【００２０】
ＧＰＬ、ＳＰＬまたはこれらを混合物は、好ましくは、約０．３μｍより大きく、通常では、約０．５μｍより大きく、場合によっては、約０．８μｍより大きい平均直径のリポソームを形成する。リポソームの平均直径は、通常、約１０μｍよりも小さく、典型的には、約８、７、６または５μｍよりも小さく、場合によっては、３．５μｍよりも小さい。リポソームは、単一の膜リポソームでもよく、一実施例によれば、多層状ベシクル（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ、ＭＬＶ）でもよい。他の実施例によれば、リポソームは、大きな多層状ベシクル（ＬＭＶＶ）または脱水再水和ベシクル（ＤＲＶ）リポソームでもよい。
【００２１】
本発明のリポソーム組成物は、関節内注射、関節鏡を用いた投与、外科的投与、および、ジョイント骨液内またはジョイント軟骨に製剤などを染みこませるために使用可能な一般的な投与形態を介して、痛みのあるジョイント部に投与されてもよい。本発明によれば治療可能な痛みのあるジョイント部は、関節炎、リウマチ様関節炎、骨関節炎（リウマチ様関節炎患者の骨関節炎）、外傷性ジョイント障害、スポーツ障害、固定されたジョイント部（側頭下顎接合部（ＴＭＪ））、ならびに、関節穿刺、関節鏡手術、関節形成、膝および股関節置換術などの外科処置後の状態、など各種症状と対応している。本発明によって、治療すべき、または、予防すべき好適な症状は、第一次または第二次骨関節症である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明を理解し、実際にどのように実行されているかを理解するためには、実施例は、添付の図面を参照しながら、非限定的な例によって説明される。
【図１】図１は、炎症性骨液（ＩＳＦ）；ヒスチジン緩衝液（ＨＢ、５ｍＭ）、多層状ベシクルを具える分散剤（ＭＬＶ、５ｍＭ  ＨＢ中に保持され、この液体は、３５〜１４０ｍＭの濃度範囲である）を含む各種潤滑媒体を得るための（静および動）摩擦係数を示す棒グラフであり、リン脂質はＤＭＰＣであり、ＭＬＶは、ＤＭＰＣまたはＤＭＰＣコレステロールまたはＤＭＰＣの混合物を具え、２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥ  ＤＭＰＣ、または、ＤＭＰＣおよびＤＰＰＣの混合物、あるいは、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）は、ＤＭＰＣを具える。全ての測定は、２．４ＭＰａ（３０Ｎ  ｌｏａｄ）の一定圧力および１ｍｍ／ｓの滑り速度の下、３７℃で行った。食塩水をコントロールとして用いた。
【図２】図２は、各種潤滑剤の存在下で、同様の摩擦試験を行った後、健康な個人の軟骨試験片において、リン脂質総濃度に関する各種潤滑剤および媒体の効果を示す。コントロールは摩擦試験を行わなかった。
【図３】図３は、軟骨内の垂直方向の深度の関数としてＰＣ濃度を示すグラフであり、ここで、５ｍＭ  ＨＢ中のＤＭＰＣ−ＭＬＶ（直径０．８〜３．５μｍ）１４１ｍＭ（■）；５ｍＭ  ＨＢ中のＤＭＰＣ−ＳＵＶ（直径約１００ｎｍ）１４１ｍＭ（▲）；または５ｍＭ  ＨＢのみ（ｘ）；の存在下で軟骨の試験片を同様の摩擦検査を行い、ディスク状にスライスし、軟骨深度の関数としてのＤＭＰＣ濃度を試験した。
【図４】図４Ａ−Ｆは、潤滑媒体および摩擦試験の有無による軟骨試験片の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。コントロール用の試験片のＳＥＭ電子顕微鏡写真は、摩擦試験なしである。図４Ａは、表面において自然に生じた液体ベシクル構造を示している健康な軟骨の電子顕微鏡写真であり（×３０００）；図４Ｂは、関節軟骨の電子顕微鏡写真であり（×３０００）；健康な軟骨を以下に挙げる潤滑剤の存在下で摩擦試験した：食塩水（×６０００、図４Ｃ）；ＩＳＦ（×８００、図４Ｄ）；ＤＭＰＣ−ＳＵＶ（×８００、図４Ｅ）；およびＤＭＰＣ−ＭＬＶ（×６０００、図４Ｆ）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、（ｉ）ヒト軟骨−軟骨器具（Ｍｅｒｋｈｅｒ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（４０））を用いた摩擦係数測定、（ｉｉ）電子顕微鏡（ＳＥＭ）に基づいた軟骨の形態学的研究、（ｉｉｉ）軟骨の定量的リン脂質およびホスファチジルコリン（ＰＣ）の決定、および（ｉｖ）様々なＰＣベースリポソームの物理化学的特性、の組み合わせの結果に基づいており、ＳＯ（秩序固体）からＬＤ（無秩序液体）への相転移温度よりわずかに高い（例えば、約１℃、２℃、３℃、５℃、８℃、１１℃、および、場合によっては約１５℃まで）温度まで、効果的な軟骨潤滑剤および摩擦低減剤として、低イオン強度のＨＢで拡散させた、ＤＭＰＣ−ＭＬＶおよびＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ−ＭＬＶ（モル比０．６／１．０）など、大きな多層状ベシクル（直径が０．３μｍより大きい）のポテンシャルを示している。
【００２４】
最初に、完全に飽和させるか、または、不飽和度を変化させた、１４〜２２個の炭素からなる２つの炭化水素鎖を有する各種ＰＣから構成された多層状リポソームの潤滑効率を、好適な長さに示されているＣ１２−Ｃ１６炭化水素鎖と比較した。
【００２５】
次いで、最も効率的な単一の組成潤滑剤を用いて、ＤＭＰＣ、リポソーム寸法の効果、層構造、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥまたは付加的なＰＬをＤＭＰＣリポソームの脂質二重層に組み込むことの効果を調査した。ＳＯからＬＤへの相転移温度よりわずかに高い温度で潤滑剤として使用されるとき、ＤＭＰＣ−ＭＬＶまたはＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ−ＭＬＶ（直径が０．８−３．５μｍ）などＭＬＶは、最も効率がよかったことを上記調査は示した。このことは、２４℃（ＳＯ相）での性能と比べて、ＳＯからＬＤへの相転移温度の範囲、すなわち、Ｔｍ＝約３４℃よりわずかに高い、３７℃でのＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ−ＭＬＶの性能によって裏付けられた。
【００２６】
以下に提示する結果によって、さらに、次のことが示される：
【００２７】
リポソーム性生物活性剤組成物の１つの好適な成分として特定されているＤＭＰＣ（単独で、あるいは、ＤＰＰＣと組み合わせた場合）は、Ｔｍが生理学的温度（ＤＭＰＣ−ＭＬＶのＴｍ＝２３．２℃、ＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ（モル比が０．６／１．０）のＴｍ＝約３４℃を使用）よりもわずかに低い、長さが中程度の飽和アシル鎖を有し、従って、両方のＰＬ組成物は、３７℃で無秩序液体（ＬＤ）相中のリポソームを提供し、ここで、その極性頭部器は高度に水和されている（ＳＯ相中でＴｍより低い場合、１頭部基あたり＜４．３水分子と比較して、約９．７水分子／ＤＭＰＣまたはＤＰＰＣ頭部基）（５３）；
【００２８】
以下に提示する断熱圧縮データは、秩序固体（ＳＯ）相（Ｋ値が低い）のＰＣとＬＤ相（Ｋ値がより高い）のＰＣとの差異、および、ＬＤ相の優位性を示している。温度転移型の挙動とよく相関する（５４）、部分的に断熱性のある液体二重層の圧縮性（Ｋ）は、水和、物理状態、液体二重層のキャビティ体積（自由体積）のレベルに影響を与えることがわかった（４５）。ＰＣ頭部基と相互作用する結合水分子によって、二重層のキャビティ総体積に影響がでて、従って、分子間相互作用および断熱圧縮性に影響を与えることが考えられる。特に、ＤＯＰＣおよびＤＭＰＣの両方は、２４℃および３７℃のＬＤ相にある。しかしながら、ＤＭＰＣリポソームの潤滑能力はＤＯＰＣのものより実質的に優れている。理論に拘束されなければ、ＤＭＰＣとＤＯＰＣの挙動の違いは、生理学的条件、すなわち３６℃乃至４３℃の温度で、ＤＭＰＣはＴｍよりもわずかに高いという事実のみにあると考えられる。さらに、手の骨液ジョイントに関する温度は、約２８℃程度でもよい。このような条件下でも、ＤＭＰＣはＴｍよりわずかに高い。さらに、ＤＭＰＣは、安定なリポソームを形成できる極めて短いアシル鎖を有するＰＣであり、従って、本明細書で実験した全ての単一成分ＰＣ二重相の中から機械的に「最も柔軟（ｓｏｆｔ）」な二重層を具えることができる（４４）。
【００２９】
ＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ（０．６：１．０モル／モル）混合物からなるＭＬＶの潤滑能力は、混和性（ｍｉｓｃｉｂｉｌｉｔｙ）およびほぼ理想的な混合特性を有し、混合ＳＯ相ＬＤ相転移温度は約３４℃である。ＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ−ＭＬＶは、３７℃の高い潤滑効率を示した（静摩擦係数および動摩擦係数がそれぞれ０．０１７および０．００８３）が、２４℃（それぞれ０．０４２および０．０２１）では示さず、比較としてＤＰＰＣ−ＭＬＶ単独（Ｔｍは４１．４℃）では、３７℃では劣っていた（静摩擦係数および動摩擦係数はそれぞれ０．０２９および０．０２２であった）；
【００３０】
ＤＭＰＣ−ＭＬＶの「柔軟性」および水和レベルは、軟骨潤滑における上記特徴の変化の影響を受ける。製剤中の第１の変更は、約３３モル％のコレステロールをリポソーム膜内に注入することを含む。下記に示されるように、これによって、ＬＤ相から秩序液体（ＬＯ）相への物理的転移となる（３４）。このような変化は、液体二重層を「ドライ」することとして知られており（５６）、断熱圧縮性の低下に影響を与え、従って、二重層の柔軟性にも影響を与える。従って、ＤＭＰＣ／コレステロール−ＭＬＶを用いた軟骨の潤滑は、実質的に、ＤＭＰＣ−ＭＬＶを用いた軟骨の潤滑よりも実質的劣っていた（図１）。他の変更においては、５モル％のリポポリマｍＰＥＧ−ＤＳＰＥをＤＭＰＣ−ＭＬＶの脂質二重層に導入した。リポソーム表面から４−１０ｎｍ伸長しているＰＥＧ部分（ポリマ鎖の状態に応じて、マッシュルームまたはブラシ構成で存在する（３９））は、とてもフレキシブルであり、高度に水和している（エチレンの酸素基あたり３〜４の水分子）（４５）。しかしながら、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥをＤＭＰＣリポソームに添加することで潤滑は改善せず（図１）、このことは、潤滑における水和の役割とは矛盾しないと考えられる。このことは、極性が高くてもＰＥＧ部分は非イオン性であるので、その水和は、イオン性のＰＣ頭部基水和とは異なるという事実によって説明できる。これらのグラフトＰＥＧ部分は、ＨＡの軟骨保護作用と同様に、リポソームが間質液（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）のマクロ分子と相互作用するのを防ぐことができるので、インビボにおいて有益であることに留意されたい（２２）。
【００３１】
種々の媒体（食塩水、ＩＳＦおよび低イオン強度のＨＢ）によって得られる摩擦係数は、ＨＢが食塩水およびＩＳＦよりも優れていたことを示した（図１）。さらに、ＨＢを用いて潤滑した軟骨試験片の総ＰＬ濃度は、ＩＳＦを用いて潤滑した軟骨のものよりもほぼ２倍であり、食塩水を用いて潤滑下軟骨のものよりも実質的に高かった（図２）。ＨＢは天然の軟骨ＳＡＰＬをより良く保持することができ、従って、潤滑を改善することができることが示唆されている。食塩水よりもＨＢの方が優れていることは（図１）、脂質二重層においてより小型のＰＬパッケージングを誘導する、より低い低イオン性強度によって説明でき、従って、摩擦イベント後に迅速に二重層を回復することができる（３４，５７）。このことは、さらに、有効な潤滑に主な役割を果たすものとして二重層の柔軟性の重要度を支持する。これらのことから、ＨＢは、潤滑剤としてリポソーム用の有効で支持的な（ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ）媒体であることが明らかとなった。
【００３２】
大きな多層ＤＭＰＣ−ＭＬＶは、小さな単層リポソームよりも優れていることがわかった（＜１００ｎｍ）。理論に拘束されなければ、このことは本発明の創作に必要ではないので、この優位性は、前者が軟骨表面付近に保持されることに由来すると考えられ、大きなＭＬＶ寸法（直径が０．８−３．５μｍ）により、軟骨深度に沿ったＰＣ分配（図３）によって証明される。Ｍａｒｏｕｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．は、軟骨中のコラーゲンファイバ間の１００ｎｍギャップの存在を報告している（５０）。ＳｔｏｃｋｗｅｌｌおよびＢａｒｎｅｔｔ（５１）、ならびに、ＢａｒｎｅｔｔおよびＰａｌｆｒｅｙ（５２）は、これらのファイバは、大きな粒子が軟骨を侵入するのに対してバリアとして作用することを記載しており、小さな銀のタンパク質化合物粒子が、大きな粒子よりも深く軟骨に侵入することを報告している。ここに提示されたこれらの結果は、より小さなＤＭＰＣ−ＳＵＶは、軟骨により深く侵入し、これに対して、ＤＭＰＣ−ＭＬＶは表面付近で保持される（図３）。このことは、ＨＢ中のＤＭＰＣ−ＳＵＶを用いて潤滑した軟骨から得られる摩擦レベルと同様であることと一致し（図１）、ＤＭＰＣ−ＳＵＶは、軟骨に深く侵入し、潤滑の効果は、主に、媒体（すなわち、ＨＢ）によるものです。
【００３３】
天然の球状構造は、摩擦試験を実行する前に、ＤＭＰＣ−ＭＬＶの寸法範囲において、健康的な非潤滑軟骨の表面に存在し（図４Ａ）、食塩水またはＩＳＦを用いて潤滑した健康な軟骨の摩擦試験後には存在しない（それぞれ図４Ｃおよび４Ｄ）と考えられることがＳＥＭによる形態研究からわかった。摩擦試験の実行後、ＤＭＰＣ−ＭＬＶを用いて潤滑した軟骨試験片は、その表面に球状脂質構造を保持すると考えられる（図４Ｆ）。
【００３４】
これらの結果を考慮すると、グリセロリン脂質（ＧＰＬ）およびスフィンゴリン脂質（ＳＰＬ）から選択されるリン脂質（ＰＬ）は、摩擦を低減することができ軟骨の摩耗を防ぐ天然の脂質球状構造の潜在的な代替物であることがわかった。
【００３５】
さらに、ＧＰＬ、ＳＰＬまたはこれらの混合物を具えるリポソームが、軟骨表面付近にある場合、リポソーム形成リン脂質は、軟骨表面をコーティングする保護脂質二重層を貯める貯蔵（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）として機能し、従って、他の潤滑剤および媒体を用いて潤滑した軟骨と比べて、ＤＭＰＣ−ＭＬＶを用いて潤滑した軟骨で、より高いＰＬ総濃度によって示唆されるように、天然のＰＬの貯蔵を支援することがわかった（図２）。
【００３６】
本発明のいくつかの実施例によれば、ＧＰＬは、ホスホコリン頭部基（ホスファチジルコリン、ＰＣベースの脂質）またはホスホグリセロール頭部基（ホスファチジルグリセロール、ＰＧベースの脂質）を保持し、ＳＰＬは、Ｎアシルスフィンゴシル−ホスホコリンとも呼ばれる、ホスホコリン頭部基を保持するセラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン）である（ＳＭベースの脂質）。
【００３７】
脂質ベースの技術に熟達した者ならば理解されるように、ＰＣおよびＳＭは、双極性リン脂質であり、陽イオン性のコリンおよび陰イオン性のリン酸ジエステルの部分（ホスホコリン頭部基を構成する）は、実質的な電荷がなく（ゼータ電位＝０ｍＶ）、幅広いｐＨ範囲を超えて、完全にイオン化される（３４）。ＰＧは、負のゼータ電位から明らかなように、広いｐＨ範囲に亘って、負に荷電される。ＰＣおよびＰＧの疎水性部分は、２つの炭化水素鎖（アシルおよびアルキル）を含む。ＳＭは、さらに、２つの疎水性の炭化水素鎖を有し、これらの一方は、スフィンゴベース自体の鎖であり、他方は、Ｎアシル鎖である。炭化水素鎖が１２炭素原子以上であるＰＣ、ＳＭおよびＰＧは、すべて、形状がシリンダー状であり、そのパッケージングパラメータは、０．７４−１．０の範囲である。これらは、ＳＯからＬＤへの相転移より上で、高度に水和する脂質二重層を形成し、ベシクル化して脂質ベシクル（リポソーム）を形成する（３４，３５）。ＰＣおよびＰＧリポソーム二重層は、秩序固体（ＳＯ）相（ゲルまたは固体相として既に呼んでいる）、または、無秩序液体（ＬＤ）相（液晶または流体相として既に呼んでいる）でもよい（３４）。ＳＯ相からＬＤ相へのトランスフォーメーションは、主な相転移として呼ばれる、吸熱的一次相転移を含む。Ｔｍは、ＳＯからＬＤ相転移が生じる間、熱容量の最大変化が変化する温度である。ＰＣのＳＯからＬＤ相転移のＴｍおよびその温度範囲は、特に、ＰＣの炭化水素鎖の組成物に関連している。ＬＤ相において（ＳＯ相ではなく）、荷電したホスファチジルコリンおよびホスホグリセロール頭部基は高度に水和する。
【００３８】
ＰＧおよびＳＭは、対応するＰＣのＴｍと同様のＴｍを有する（置換炭化水素鎖の長さが同じ）ことも留意されたい。例えば、ＤＭＰＧのＴｍは、ＤＭＰＣのものと同一であり、すなわち２３℃であり、ＤＰＰＧまたはＮ−パルミトイルＳＭはＤＰＰＣのものと同一であり、すなわち、４１℃である。従って、以下の実験例では、ＰＣベースの脂質を使用する一方で、本発明によるＰＬは、ＰＧまたはＳＭベースの脂質でもよい。
【００３９】
本発明によれば、インサイチュウの場合（健康なジョイントまたは機能不全なジョイントの関節領域において）、２又はそれ以上のＰＬの混合物（例えば、２つの異なるＰＣ、ＰＣとＰＧ、２つの異なるＰＧ、２つのＳＭ、ＰＣとＳＭまたはＰＧとＳＭなど）を利用することができるが、ただし、形成される混合物がＬＤ状態であり、脂質頭部基が高次に水和している場合に限る。
【００４０】
上述したことを考慮すると、本発明者らは、化学的に安定で、酸化耐性があり、ＨＡのないジョイント部の潤滑用のリポソームシステムを開発した。
【００４１】
従って、本発明の側面によれば、ジョイント部の潤滑用の、グリセロリン脂質（ＧＰＬ）またはスフィンゴ脂質（ＳＰＬ）をから選択される少なくとも１つのＰＬを具えるリポソームの使用を提供する。
【００４２】
本発明の別の側面によれば、ジョイント部の潤滑用の医薬組成物を調製するための、グリセロリン脂質（ＧＰＬ）またはスフィンゴ脂質（ＳＰＬ）から選択される少なくとも１つのＰＬを具えるリポソームの使用を提供する。
【００４３】
２つの側面によるリポソームが特徴付けられるのは、リポソームが、２つの、同一または異なるＣ１２−Ｃ１６炭化水素鎖を有するグリセロリン脂質（ＧＰＬ）と、Ｃ１２−Ｃ１８の炭化水素鎖を有するスフィンゴ脂質（ＳＰＬ）と、からなる群の少なくとも１つのリン脂質（ＰＬ）を有する１又はそれ以上の膜を具える点である。秩序固体（ＳＯ）から無秩序液体（ＬＤ）へと相転移が生じる相転移温度は、約２０℃乃至３９℃の温度範囲内にある。リポソームは、相転移温度よりも幾分高いジョイント部の温度を有するジョイント部を潤滑するために使用される。従って、リポソームは、ジョイント部内のＬＤ相である。ジョイント部の温度は、通常、相転移温度よりもわずかに高い（例えば、詳述したように、約１℃乃至１５℃の範囲内）。
【００４４】
一実施例において、前記Ｃ１２−Ｃ１６またはＣ１２−Ｃ１８疎水性鎖は飽和している。
【００４５】
上記条件は、累積的であり、すなわち、リポソームに含まれるＰＬ（単一のＰＬまたはＰＬと付加的なＰＬとの混合物）の選択であり、リポソームは、約２０℃乃至３９℃のＳＯ−ＬＤ相転移温度を有する。
【００４６】
本発明の付加的な実施例によれば、前記ＧＰＬまたはＳＰＬを使用するリポソームシステムは、１又はそれ以上の次のものを包含する：
【００４７】
ＧＰＬまたはＳＰＬは、アルキル、アルケニルまたはアシルＣ１２−Ｃ１６の炭化水素鎖を有する。ＧＰＬの場合、２つの鎖は、同一又は異なっていてもよい。
【００４８】
一実施例は、少なくとも１つのＣ１４アシル鎖を有するＧＰＬまたはＳＰＬを保持したリポソームの使用に関する。
【００４９】
他の実施例は、Ｃ１４およびＣ１６アシル鎖を有するＧＰＬの使用に関する。
【００５０】
他の実施例は、Ｃ１６アシル鎖を有するＳＰＬを保持したリポソームの使用に関する。
【００５１】
他の実施例は、上記リポソームの混合物の使用に関する。
【００５２】
いくつかのＧＰＬまたはＳＰＬはイオン性頭部基を有し、本発明の実施例によれば、この頭部基は、広いｐＨ範囲にて高度にイオン化されている。広い範囲は、ｐＨ３乃至１４によって規定される。
【００５３】
ＧＰＬならびにＳＰＬは高次に水和されており、すなわち、１脂質頭部基あたりの水分子の数が少なくとも約６、７、場合によっては、少なくとも８水分子であり、これらの水分子は、ＧＰＬまたはＳＰＬのイオン化頭部基と複合体を形成している。
【００５４】
ＧＰＬまたはＳＰＬは、ＭＬＶ（ならびに、上述した他のタイプのリポソーム）、好ましくは平均直径が０．３μｍより大きいＭＬＶを形成することができる。一実施例によれば、ＭＬＶは、０．３乃至５μｍの範囲の平均直径によって規定される。他の実施例によれば、ＭＬＶは、０．８乃至３．５μｍの範囲の平均直径によって規定される。
【００５５】
コレステロールは、本明細書で規定されるように、ＧＰＬ、ＳＰＬまたはその混合物から形成されるＭＬＶの潤滑特性を低減することが知られているので、本発明に従って使用できるＭＬＶまたは他の種類のリポソームは、コレステロールなど、その二重層中に膜活性ステロールを含むべきではない。膜活性ステロールは、膜内の短い脂質および長い脂質に影響を与え、体積を最小化し、膜透過性を減少させるものとして規定する。特に、ステロールは、１）フラットな融合環系、２）３位におけるヒドロキシまたはその他の極性の小さな基、３）「コレステロール様」テール部、４）１分子あたりの小さな面積（１２ｍＮ／ｍの表面圧力での空気／水インタフェースに集成する場合、＜４０Å２）を保持する。
【００５６】
本発明の組成物は、好ましくは、プロピレングリコールを含有しないことに留意されたい。
【００５７】
本発明の組成物は、好ましくは、デキストランを含まないことに留意されたい。
【００５８】
１又はそれ以上の上記の実施例に包含されるＧＰＬの特定の群は、ホスホコリン頭部基を保持するＧＰＬ（ＰＣベースの脂質またはＳＭベースの脂質）を具える。本発明によれば、１つの好ましいＰＣは、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）である。
【００５９】
本発明に従って使用されるＰＣベースの脂質の非限定的な例は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ，Ｔｍ  ４１．４℃）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１５，Ｔｍ３３．０℃）を具える。本発明によるＳＰＬは、ホスホコリン頭部基を保持するスフィンゴミエリン（ＳＭ）を具え、非限定的な例は、Ｎ−パルミトイルＳＭ（Ｔｍ４１．０℃）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ＰＣを具える。各種ＰＣベースの脂質のＴｍ値は、Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｓｉｌｖｉｕｓ「モデル膜における純脂質の温度相転移、および、膜タンパク質による修飾」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｊｏｈｎ「脂質−タンパク質相互作用（Ｌｉｐｉｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２、および、脂質温度相転移データベース−ＬＩＰＩＤＡＴおよびＭａｒｓｈ（１９９０）（３６）に記載されている。
【００６０】
本発明によれば、ＭＬＶリポソーム（または本発明による有用なその他のリポソーム）は、ＳＯからＬＤへの相転移のオフセット温度（上限）を有し、約２０乃至３９℃の範囲内において、インサイチュウ、すなわちジョイント部の温度から１５℃以上高くない。本発明によれば、ＭＬＶリポソームは、ＧＰＬ、ＳＰＬまたはその組み合わせから形成され、従って、上述したＳＯからＬＤへの相転移温度は、ＧＰＬ、ＳＰＬおよびその組み合わせから形成されるＭＬＶリポソームに関し、ＰＬまたはその混合物がＬＤ相であるリポソームを提供することができる。
【００６１】
本発明によれば、特定の実施例において、天然の軟骨ＰＬ置換物の調製、すなわち、軟骨潤滑剤および摩擦低減剤として、ＤＭＰＣ−ＭＬＶまたはＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ−ＭＬＶの使用に関する。これらのＭＬＶには実用的な利点もある。これらは、単純かつ低コストで調製できる。ＤＭＰＣおよびＤＰＰＣの双方は、酸化ダメージに耐性があり、長時間安定である。さらに、これらのＰＣは、ヒトに使用できることが既に立証されている。一実施例によれば、ＤＭＰＣおよびＤＰＰＣの混合物を用いて、ＤＭＰＣとＤＰＰＣとのモル比は、ジョイント部の温度に関連しており、混合物のＴｍがＬＤ相中にＭＬＶを提供できるように設計される。適宜な比の一例は、３５乃至３９℃のジョイント部の温度でＬＤ相中にＭＬＶを提供する、約０．６／１．０である。
【００６２】
本発明の付加的な側面によれば、ヒトジョイント部を潤滑する方法を提供し、この方法は、骨液を含むジョイント部のキャビティに、潤滑効果を得るのに有効量のリポソームを投与するステップを具える。
【００６３】
一実施例において、前記Ｃ１２−Ｃ１６またはＣ１２−Ｃ１８疎水性鎖は未飽和である。
【００６４】
骨関節炎などのジョイント部の温度の低減またはジョイント摩耗に苦しむ患者のジョイント部の温度は、病気の進行と共に変化することに留意されたい（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｌ．；Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．，「ヒドロコルチゾン注射に対する関節内温度応答を用いた骨関節炎の研究」Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．１９５６、１５、（４）、３２０−３２６）。実際、このような温度変化を骨関節炎の炎症を評価するために治療ツールとして使用した（Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．；Ａｎｓｅｌｌ，Ｂ．Ｍ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｓ．；Ｉｓａａｃｓ，Ｒ．Ｊ．，サーミスタ示差温度計を用いたひざのジョイント部の温度測定、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  １９８０，１９，（１）、８−１３）。骨関節炎患者の手のジョイント部の温度は、約２８から約３３℃で変化することが示されており（Ｖａｒｊｕ，Ｇ．；Ｃ．Ｆ．；Ｒｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｂ．；Ｋｒａｕｓ，Ｖ．Ｂ．，「手の骨関節炎の評価：サーモグラフィック法とラジオグラフィック法の相関」Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ２００４、４３、９１５−９１９）、健康な側頭下顎骨のジョイント部（ＴＭＪ）の温度は、約３５から３７℃で変化する（Ａｋｅｒｍａｎ，Ｓ．；Ｋｏｐｐ，Ｓ．，ヒト側頭下顎骨ジョイント部の関節内および皮膚表面温度。Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．１９８７、９５、（６）、４９３−４９８）。
【００６５】
従って、本発明によれば、ＧＰＬまたは付加的ＰＬとの混合物は、これらを用いて潤滑されるジョイント領域であるインサイチュウで、ＬＤ相であることは必須であり、実際、必要条件である。
【００６６】
本発明の方法は、ジョイント機能不全に関連した関節障害または症状を治療、軽減、抑制、阻止、管理または治癒するために使用することができる。開示を目的とするために、用語「関節障害（ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、あらゆる苦痛（先天的、自己免疫またはその他）、創傷、または、ジョイントの変性、痛み、可動性の減少、炎症または生理学的崩壊および機能不全を生じさせる関節領域の疾患を意味する。この障害は、ジョイント分泌および潤滑の低減、ならびに、膝および股関節の置換術の合併症に関連している。
【００６７】
本発明によればジョイント部は、膝、臀部、くるぶし、肩、肘、足根骨、手根骨、指節間および椎間の１つでもよい。
【００６８】
特定の関節障害は、限定するものではないが、リウマチ様関節炎、骨関節炎、リウマチ患者の骨関節炎、外的障害性ジョイント障害（スポーツ障害を含む）、固定されたジョイント（側頭下顎骨ジョイントなど（ＴＭＪ））、関節穿刺、関節鏡手術、オープンジョイント外科手術、哺乳類、好ましくはヒトの接合（ｊｏｉｎｔ）（例えば、膝または股関節置換術）後の状態を含む、関節炎から生じるジョイント分泌および／または潤滑の欠失、を含む。
【００６９】
本発明の方法は、将来、損傷したり変性するのを防ぐために、予防の手段として使用することができる。例えば、ＰＬベースのＭＬＶリポソームは、アスリートのそのキャリアにおいて断続的に関節内に投与し、損傷または軟骨の変性に関連したストレスの危険性を最小限にすることができる。
【００７０】
本発明の方法は、抗炎症剤、鎮痛剤、筋弛緩剤、抗うつ剤、または、関節炎など、ジョイント硬化に関連した障害の治療に一般的に使用されるジョイント部の潤滑を促進する薬剤を排除して、あるいは、添加剤として使用することができる。複合型の治療手段は、ジョイント部潤滑の低減に関連した骨関節炎など、障害を予防、管理または治療するために一般的に使用される非ステロイド、抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）など、薬剤に関連した副作用を低減するのに有効である。安全性を向上させるのに加えて、複合型の治療手段は、治療効率の向上に有利である。
【００７１】
患者の関節キャビティへのリポソームの投与は、関節内注射、関節鏡を用いた投与または外科的投与からなる群から選択される方法によってなされる。
【００７２】
さらに、本発明は、本発明の他の側面によって、薬学的に許容される賦形剤と、本発明で規定したＧＰＬまたはＳＰＬから選択される少なくとも１つのＰＬを含むリポソームと、を具えるジョイント部の潤滑用の医薬組成物を提供する。
【００７３】
一実施例によれば、生理学的に許容される賦形剤は、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはヒスチジン緩衝液（ＨＢ）である。組成物は、Ｋｌｅｉｎ、２００６（３１）などに記載されているポリマを含むことができる。
【００７４】
本発明による組成物は、好ましくは、関節内注射、関節鏡を用いた投与または外科的投与から選択されるルートによる投与に適した形態である。
【００７５】
組成物中のリポソームの量は、リポソームのＰＬ組成物、疾患、重症度、および、治療する哺乳類の年齢、体重などに関連した治療措置、に相関して変化する。ここでの目的の量は、当分野で周知なように、検討することによって決定される。この量は、治療されたジョイント部の潤滑が改善するのに有効な量でなければならず、すなわち、ジョイント部を形成する軟骨間の摩擦を低減し、この改善は、臨床検査ならびに前記治療を受ける健康な対象における改善によって示される（例えば、痛みのあるジョイント部において痛みが軽減し、可動性が改善する）。有効量は、通常、大まかに設計した臨床試験（投与量範囲の研究）および当分野の当業者であれば、有効量を決定するために、どのような試験を適正に行えばよいか理解されるであろう。
【００７６】
本明細書の記載および請求項に亘り、単数を示す、１つ、これ（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、特段の指定がない限り、複数も含む。従って、例えば、１つのＰＬ（「ａ  ＰＬ」）は、１又はそれ以上のＰＬを意味し、「リポソーム」は、１又はそれ以上のリポソームを意味する。本明細書の記載および請求項に亘り、複数を示す単語は、特段の指定のない限り、単数を意味することも含む。
【００７７】
さらに、本明細書の記載および請求項に亘り、「具える」および「含む」およびこれらの単語の変形、例えば「具えている」、「具えた」は、「限定するものではないが具える」、および、その他の部分、添加物、成分、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）またはステップを除外することを意図しない（除外しない）こと、を意味する。
【００７８】
本発明は、非限定的な例によって説明される。
【００７９】
非限定的な例の説明
材料および方法
脂質：この研究で使用される脂質およびその供給源を図１に記載する；全てが純度＞９８％である。
【００８０】
水：ＷａｔｅｒＰｒｏ  ＰＳ  ＨＰＬＣ／限外ろ過ハイブリッドシステム（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、カンザスシティ、ミズーリ州）を用いて水を精製し、炭素および無機イオンの総量が低レベルで、発熱物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）のない水を得た（１８．２ＭΩ）。
【００８１】
試薬：使用する全ての試薬は、  分析用のグレードまたはそれ以上のものである。
【００８２】
リポソーム：多層リポソーム（ＭＬＶ）を第３級ブタノール中の所望の液体に溶解することで調製し、次いで、凍結乾燥することでドライ「ケーキ」を形成する。これを、Ｔｍより少なくとも５℃高い温度で、ｐＨ６．７の低イオン性強度（５ｍＭ）のヒスチジン緩衝液（ＨＢ）中で水和した（３４）。必要であれば、ＭＬＶは、ポリカーボネート膜を介して段階的に押し出すことによって小型の単一層ベシクルを形成するようにダウンサイズすることができ（＜１００ｎｍ、ＳＵＶ）、Ｔｍより少なくとも５℃高く加熱した１０ｍＬの押し出しシステム（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ、バンクーバ、カナダ）を用いて、４００ｎｍから始めて、５０ｎｍポア寸法の膜とすることができる（３７）。
【００８３】
軟骨潤滑の最初のスクリーニングは、様々なＰＣ組成物−ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＨＳＰＣ、ＤＢＰＣ、ＤＯＰＣおよびＰＯＰＣのＭＬＶを用いて実行した。このスクリーニングにおいて、ＤＭＰＣリポソームが最も優れた摩擦低減剤として作用したことがわかった。従って、ＤＭＰＣベースのリポソームを、さらに、様々な寸法および層のＤＭＰＣのみ、ＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ（モル比が０．６：１．０）、ＤＭＰＣとコレステロール（モル比が２：１）、または、ＤＭＰＣとリポポリマｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（モル比が９５：５）からなるリポソームと比較して調査した。使用されるｍＰＥＧ−ＤＳＰＥは、第１級アミノ基のジステアロイルホスファチジルエタノールアミンに結合した２０００ダルトンのポリエチレングリコールからなる。
【００８４】
リポソームの特徴：リポソームは、
（ｉ）修正版バートレットアッセイを用いた（３７，３８）のリン脂質（ＰＬ）濃度、
（ｉｉ）サイズ分布であって、ＡＬＶ−ＮＩＢＳの高性能粒子寸法測定器（Ｌａｎｇｅｎ、ドイツ）を用いた１７３°の散乱角度の動的光散乱による１μｍ未満のリポソームと、４０ｎｍ〜２０００μｍの動的検出範囲となる偏光強度差散乱（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＰＩＤＳ））を備え付けたＢｄｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １３−３２０（フラートン、カリフォルニア州）を用いた光回析による、４００ｎｍより大きなリポソームと、のサイズ分布と、
（ｉｉｉ）部分特異的断熱圧縮性であって、Ｂａｒｂｕｚｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ（３９）に記載されているように（３９）、リポソーム散乱の密度（オーストリアのグラーツにあるＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ社のＤＭＡ５０００密度メータを用いる）と、リポソームを通過する５ＭＨｚの超音波の速度（イスラエルのエルサレムにあるＮＤＴ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＵＣＣ−１２超音波速度計を用いる）と、から計算した、部分特異的な断熱圧縮性と、
（ｉｖ）走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いた、構造と、
を特徴とする。
【００８５】
軟骨：健康なヒトまたは骨関節炎のヒト（６５歳から８６歳）の関節軟骨を、大腿骨頭骨折手術または総合股関節置換術から得た。軟骨のフルプラグ（直径が４および８ｍｍ、約１．５ｃｍ厚さ）を、大腿骨頭の負荷のかかる領域から取り外して、１３２０Ｌｅｉｃａ凍結マイクロトームを用いて、骨側面で実質的に除去し、厚さ２ｍｍのフラットな軟骨ディスクとなり、−２０℃で保管した。
【００８６】
摩擦および摩耗試験：ＨＢに分散させた、幅広く寸法および濃度を包含するリポソームを、２４℃および３７℃のヒト軟骨の２つのディスク間の摩擦および摩耗を低減する潜在的な潤滑剤としてスクリーニングした。摩擦測定は、軟骨−軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｏｎ−ｃａｒｔｉｌａｇｅ）器具を用いて行い（Ｍｅｒｋｈｅｒ，Ｙ．；Ｓｉｖａｎ，Ｓ．；Ｅｔｓｉｏｎ，Ｉ．；Ｍａｒｏｕｄａｓ，Ａ．；Ｈａｌｐｅｒｉｎ，Ｇ．；Ｙｏｓｅｆ，Ａ．，ヒト軟骨−軟骨器具を用いた合理的なヒトジョイント部摩擦試験。Ｔｒｉｂｏｌ．ｌｅｔｔ．２００６，２２，２９−３６、参照することでその全体を本明細書に組み込む。）、ＨＢ中に分散したリポソームに浸した軟骨の２つのディスクと、コントロールとして、ＨＢのみ、生理食塩水（０．９％重量／体積、ｐＨ５．０；Ｔｅｖａ  Ｍｅｄｉｃａｌ、イスラエル）、または、骨関節炎患者から得られる炎症性の骨液（ＩＳＦ）、を用いた。これらのディスクを、ジョイント部の生理学的圧力（０．０８乃至２．４ＭＰａ）に等しい負荷（１乃至３０Ｎ）の広い範囲に亘って、相対的すべり（ｓｌｉｄｉｎｇ）にかけた。各種すべり速度（０．５乃至２ｍｍ／ｓ）および静止時間（５乃至３００ｓ）を使用し、各種負荷とともに、生理学的可動範囲をシミュレーションした。
【００８７】
摩耗を評価するために、軟骨中のＰＬ総濃度および軟骨表面の構造の摩擦試験の結果を決定した。
【００８８】
ＰＬ抽出および定量化：総ＰＬを、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの抽出方法（４１，４２）を用いて、潤滑試験の前後に、軟骨試験片から抽出した。このために、軟骨試験片をクロロホルム−メタノール溶液（１：１  ｖ／ｖ）中で３７℃１時間培養した。水を加えて、最終的にクロロホルム−水−メタノール比が１：１：１として、この溶液を１分間ボルテックスして、次いで卓上遠心機を用いて遠心して、２相が形成された。ＰＬを含有するこのクロロホルムリッチな低い方の相を回収し、真空下（コセントレータ５３０１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で回収し、残り（液体を含む）を少量のクロロホルム−メタノール溶液（２：１  ｖ／ｖ）に再溶解し、次いで、低リン酸シリカゲルＴＬＣガラスプレートに充填した（ユニプレート、シリカゲルＧ、デラウェア州ニューアークにあるＡｎａｌｔｅｃｈ社）。クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４  ｖ／ｖ／ｖ）溶媒システムをＴＬＣに使用した（４１）。スフィンゴミエリン、ＰＣおよびＰＣの商業的入手可能なマーカーも、スポット識別用にプレートに充填した。ＵＶ検出可能なプリムリン（ｐｒｉｍｕｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）溶液（１ｍＬの水中溶解０．１％ｗ／ｖプリムリンを１００ｍＬのアセトン−水、４：１  ｖ／ｖに加えた）を用いて乾燥したＴＬＣプレートに噴霧した後、液体スポットを検出した。各ＰＬスポットをＴＬＣプレートからかきとり、そのＰＬ含有率を修正版バートレット法によって定量化した（３７，３８）。
【００８９】
軟骨深度の関数としてＰＬ濃度を定量化した。このために、軟骨表面内側から、軟骨面に平行に、軟骨試験片をミクロトームで切断して、厚さ２０または５０μｍのスライスにした。上述したように、修正版バートレット法によってＰＬを抽出した後、各スライスのＰＬ濃度を定量化した。
【００９０】
軟骨構造：軟骨構造を電子顕微鏡（ＳＥＭ）で試験した。試験片を液体窒素中で急速冷凍することによって保存し、４８時間真空下（約１５ｍｂａｒ）で保持し、過剰な水分を除去した。次いで、試験片をスタブ（ｓｔｕｂ）にとりつけ、Ｐｏｌａｒｏｎ  Ｅ５１００Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒ（Ｗａｒｆｏｒｄ、イギリス）中で金でスパッターコーティングした。３０ｋＶの加速電圧を使用し、ＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ２００スキャン電子顕微鏡システム（Ｐｏｌａｒｏｎ）を用いて試験片を試験した。
【００９１】
結果
試験した表面活性リン脂質（ＳＡＰＬ）は、軟骨および骨液に天然に存在するホスファチジルコリンだった。
【００９２】
軟骨潤滑および摩耗低減用のリポソームのスクリーニングは、各種単一成分のＰＣからなるＭＬＶを用いて得られる静摩擦係数および動摩擦係数の比較を含んだ。例示したＰＣは、特にＴｍおよび物理状態など、リポソームの基本的特性を決定するアシル鎖が異なる。
【００９３】
種々のＰＣ組成物のリポソームのスクリーニング：種々のＰＣ（ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＨＳＰＣ、ＤＢＰＣ、ＤＯＰＣおよびＰＯＰＣ）からなるＭＬＶ（直径が０．８乃至３．５μｍ）をスクリーニングすることで、２４℃および３７℃の両方で、ＤＭＰＣが最も性能の良い軟骨潤滑剤だったことがわかった。リポソーム分散媒体に関して、ＨＢの潤滑効率は、食塩水またはＩＳＦ（図１）のものより優れていることがわかった。さらに、ＨＢに分散されたリポソームは、食塩水に分散されたリポソームよりも優れた潤滑剤だった（データは示さず）。
【００９４】
いつかのＤＭＰＣベースのリポソームを用いて潤滑した軟骨の摩擦および摩耗：リポソーム寸法および層の効果を研究するために、多層ＤＭＰＣリポソーム（ＤＭＰＣ−ＭＬＶ）の潤滑効率を、＜１００ｎｍの単層ＤＭＰＣリポソーム（ＤＭＰＣ−ＳＵＶ）のものと比較した。さらに、コレステロールやｍＰＥＧ−ＤＳＰＥなど、一般的なリポソーム成分であるが、リポソームを形成しない脂質の豊富なＤＭＰＣ−ＭＬＶの軟骨潤滑剤としての効率を実験した。約１．２のパッケージングパラメータ（３９）を有するコレステロールを、約３３モル％で加え、ＤＭＰＣ／コレステロール−ＭＬＶを形成し、従って、秩序固体相（ＳＯ、ＰＬがＴｍ以下のとき）または無秩序液体相（ＬＤ、ＰＬがＴｍ以上のとき）から、秩序液体（ＬＯ）と呼ばれる新しい物理的な相へと脂質二重層のトランスフォーメーションを生じさせた（４３，４４）。これにより、潤滑に関して、３つの異なる二重層、ＬＤ、ＳＯおよびＬＯで、リポソームの効果を比較することができた。ＤＭＰＣ−ＭＬＶに加えられた他の成分は、約０．５の比較的低いパッケージパラメータを有するリポポリマｍＰＥＧ−ＤＳＰＥであり、リポソームを囲む高度に水和して膨張した立体的バリアとなった（３９，４５）。ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを５モル％で加えて、ＤＭＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ−ＭＬＶを形成した。
【００９５】
ＨＢ中のＤＭＰＣ−ＭＬＶの静および動摩擦係数（それぞれ、０．０２０および０．０１１）は、図１に示されるように、ＨＢ中のＤＭＰＣ／コレステロール−ＭＬＶ（それぞれ、０．０４０および０．０３６）またはＨＢ中のＤＭＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ−ＭＬＶ（それぞれ、０．０２２および０．０２３）を用いて得られるものよりも低く、健康な骨液ジョイントに存在する摩擦係数の低さと同様だった（４６）。さらに、ＤＭＰＣ−ＭＬＶを用いて潤滑した軟骨の静および動摩擦係数は、ＨＢ単独のものよりもわずかに低い（それぞれ０．０５３および０．０３７）、ＤＭＰＣ−ＳＵＶを用いて潤滑した軟骨のもの（それぞれ、０．０４５および０．０３６）よりも低かった（図１）。
【００９６】
Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による静的評価は、このアッセイおよび媒体で試験した他のリポソーム製剤よりも、ＤＭＰＣ−ＭＬＶが優れていることを示した（ｐ＜０．００８）。
【００９７】
脂質二重層の圧縮性：部分特異的な断熱圧縮性、Ｋは、摩擦および摩耗低減剤としてリポソームの効率に重要な役割を果たすと仮定できる（４５）、脂質二重層の物理相（ＳＯ、ＬＤまたはＬＯ）と、その水和状態と、の両方の尺度（ｍｅａｓｕｒｅ）である。３７℃で決定されたＤＭＰＣ、ＤＰＰＣおよび水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）のＫ値は、それぞれ、５０．７、３１．２および３３．３×１０−６ｍＬ／（ｇ−ａｔｍ）であった。Ｋ値が幾分低い４６．４、２８．０および３０．３×１０−６ｍＬ／（ｇ−ａｔｍ）を有する同様のプロファイルは、それぞれ、２４℃でのＤＭＰＣ、ＤＰＰＣおよびＨＳＰＣに見られた。これらのＫ値は、ＤＭＰＣの相転移温度、Ｔｍ（２３．２℃）よりもＤＰＰＣおよびＨＳＰＣの相転移温度、Ｔｍ（４１．４、５２．５℃）がより高いことを反映している。５モル％のｍＰＥＧ−ＤＳＰＥをＨＳＰＣリポソーム（Ｔｍ、５３℃）に導入することで、２４℃および３７℃でのそれぞれの圧縮性が３２．８および３５．５×１０−６ｍＬ／（ｇ−ａｔｍ）に上昇した。一方、ＨＳＰＣ／コレステロールリポソーム（モル比２：１）においては、Ｋは、２４℃および３７℃で３０．０および３３．６×１０−６ｍＬ／（ｇ−ａｔｍ）に低下する。
【００９８】
理論に拘束されなければ、上述の結果は、ＭＬＶ二重層の物理相が、軟骨の生物学的潤滑に重要であり、潤滑に最適な条件は、ＳＯからＬＤ相への相転移温度（Ｔｍ）よりも高すぎないＬＤ相であることを示唆する。この仮説を更に検証するために、発明者らは、０．６／１．０（モル／モル）のＤＭＰＣ／ＤＰＰＣからなるＭＬＶを試験した。この組成物は、Ｔｍが約３４℃を有するリポソームを形成できるように選択した（４７）（２つのＰＣをほぼ理想的に混合することで可能となる）。これらのＭＬＶを２４℃および３７℃で実験した。これらの結果は、上記仮説を明確に指示しており、図１に示されるように、ＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ−ＭＬＶは、３７℃で最も有効な潤滑剤であるが（静および動摩擦係数はそれぞれ０．０１７および０．００８３）、２４℃では違った（静および動摩擦係数は、それぞれ０．０４２および０．０２１）。さらに、ＤＭＰＣ／ＤＰＰＣ−ＭＬＶは、３７℃で劣っていた（静および動摩擦係数がそれぞれ０．０２９および０．０２２）ＤＰＰＣ−ＭＬＶのみ（Ｔｍ＝４１．３）よりも優れていた。
【００９９】
潤滑した軟骨試験片のＰＬ濃度：健康な軟骨試験片（厚さが約１２００μｍ）のＰＬ総濃度（リポソームの天然のＳＡＰＬおよびＰＬを含む）を、種々の潤滑剤および媒体の存在下で摩擦試験を行う前と後で、測定した。ＤＭＰＣ−ＭＬＶで潤滑した軟骨中のＰＬ総濃度は、検査した全ての試験片中で最も高かった。健康な対象から得て、ＨＢを用いて潤滑した軟骨のＰＬ濃度は、食塩水又はＩＳＦを用いて潤滑した同様の軟骨の濃度よりも高く、後者（ＩＳＦ）は、骨関節症の患者から得た軟骨の濃度と同様のＰＬ濃度であった。
【０１００】
軟骨へ浸透するリポソーム寸法および層の効果：両方ともＨＢに分散させたＤＭＰＣ−ＭＬＶおよびＤＭＰＣ−ＳＵＶで潤滑した試験片、および、ＨＢのみ（コントロール）を用いて潤滑した試験片を摩擦試験した後に、軟骨深度の関数としてのＰＣ濃度（０乃至８００μｍ、インクリメントは２０乃至５０μｍ）を測定した。これらの試験片の中で、ＤＭＰＣ−ＭＬＶを用いて潤滑した軟骨は、軟骨表面付近で最も高いＰＣ濃度を有していた（図３）。ＰＣ濃度は、深度約１００μｍで最大に達し、それ以下では減少した。一方、ＤＭＰＣ−ＳＵＶを用いて潤滑した軟骨において、最も高いＰＣ濃度は、軟骨内のより深い深度（約６００μｍ）で生じ、表面でのＰＣ濃度は、コントロール（ＨＢで潤滑した軟骨）のものと同様だった。
【０１０１】
軟骨形態：ＳＥＭを使用して、軟骨表面の形態および摩耗を研究した（２８）。図４において、私達は、種々の処置を施した軟骨試験片のＳＥＭ画像を示している。２つのコントロール用試験片（図４Ａおよび４Ｂ）は摩擦検査をせずに、一方、軟骨の他の全ての試験片（図４Ｃ−図４Ｆ）を健康な人から得て、種々の潤滑剤の存在下で同一の摩擦検査を行った。図４Ａは、健康な軟骨を示しており、Ｏｈｎｏおよびその共同研究者によってラット軟骨の表面において既に示されるように（２４，４８）、天然の球状脂質構造が多孔性表面に分散している。他方、骨関節症の軟骨の表面にはこれらの構造は欠損しており（図４Ｂ）、食塩水（図４Ｃ）またはＩＳＦ（図４Ｄ）を用いて潤滑して摩擦試験した健康な軟骨を示しており、これらの潤滑による摩耗に対する保護が弱かったことを示している。ＤＭＰＣ−ＳＵＶで潤滑した軟骨の表面には（図４Ｅ）、極めてわずかな脂質構造が摩擦試験後に観察される。ＤＭＰＣ−ＭＬＶ（図４Ｆ）の場合、健康な軟骨のものと類似した大きな脂質構造が摩擦試験後に存在している。
【０１０２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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