(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i) キャリア部分;
ii) 抗アテローム応答を誘発することができる第一のエピトープ；ここで、該第一のエピトープは、アポリポタンパク質(Apo)、血小板由来増殖因子(PDGF)、熱ショックタンパク質(HSP)、酸化型 LDL、コレステリルエステル転送タンパク質(CETP)およびβ2-糖タンパク質 I からなる群から選択されるポリペプチドに対する免疫応答を誘発することができるものであるか、または該第一のエピトープは、ヒト サイトメガロウイルス(hCMV)、クラミジア・ニューモニエ、ポルフィロモナス・ジンジバリスまたはストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される病原体に対する免疫応答を誘発することができるものである；および
iii) 抗アテローム応答を誘発することができる第二のエピトープ；ここで、該第二のエピトープは、熱ショックタンパク質(HSP)、血小板由来増殖因子(PDGF)、酸化型 LDL、β2-糖タンパク質 I、コレステリルエステル転送タンパク質(CETP)およびアポリポタンパク質(Apo)からなる群から選択されるポリペプチドに対する免疫応答を誘発することができるものであるか、または該第二のエピトープは、ヒト サイトメガロウイルス(hCMV)、クラミジア・ニューモニエ、ポルフィロモナス・ジンジバリス、ストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される病原体に対する免疫応答を誘発することができるものである
を含み、該第一および第二のエピトープが互いに異なることを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項２】
該アポリポタンパク質(Apo)が、ApoB1 または ApoB2 である、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項３】
該 Apob1 に対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 25 のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２の組換えタンパク質。
【請求項４】
該 Apob2 に対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 38 のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２の組換えタンパク質。
【請求項５】
該熱ショックタンパク質(HSP)が、HSP 60 または HSP 65 である、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項６】
該 HSP 60 が、ヒトの HSP 60 またはマイコバクテリウム・ボビスの HSP である、請求項５の組換えタンパク質。
【請求項７】
該 HSP 60 に対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 9 から 21、26、28、29 または 33 のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項５または６の組換えタンパク質。
【請求項８】
該血小板由来増殖因子(PDGF)に対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 1 から 9 または 22 のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項９】
該コレステリルエステル転送タンパク質(CETP)に対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 39 のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項１０】
該ヒト サイトメガロウイルス(hCMV)に対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 30 または 24 のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項１１】
クラミジア・ニューモニエが、Cpn1 または Cpn2 である、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項１２】
該 Cpn1 に対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 36 のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１１の組換えタンパク質。
【請求項１３】
該 Cpn2 に対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 37 のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１１の組換えタンパク質。
【請求項１４】
該ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 32 または 34 のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項１５】
該ストレプトコッカス・ニューモニエに対する応答を誘発することができるエピトープが、配列番号 23のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項１６】
該第一のエピトープが ApoB1 に対する免疫応答を誘発することができるものであり、かつ、該第二のエピトープがヒト サイトメガロウイルスに対する応答を誘発することができるものである、請求項１の組換えタンパク質。
【請求項１７】
該キャリアタンパク質が、デンドロアスピン足場である、請求項１から１６のいずれかの組換えタンパク質。
【請求項１８】
該第一のエピトープがデンドロアスピンのループ II の中に挿入されており、かつ、該第二のエピトープがデンドロアスピンのループ III の中に挿入されている、請求項１７の組換えタンパク質。
【請求項１９】
該デンドロアスピン足場が、PDGF ループ I ペプチドに対する応答を誘発することができる第一のエピトープおよびサイトメガロウイルス pp65 ペプチドに対する応答を誘発することができる第二のエピトープを含む、請求項１７の組換えタンパク質。
【請求項２０】
該デンドロアスピン足場が、デンドロアスピンのループ II の中に挿入された配列番号 22 およびデンドロアスピンのループ III の中に挿入された配列番号 27 を含む、請求項１９の組換えタンパク質。
【請求項２１】
該デンドロアスピン足場が、PDGF ループ I ペプチドに対する応答を誘発することができる第一のエピトープおよびマイコバクテリウム・ボビスの hsp60 ペプチドに対する応答を誘発することができる第二のエピトープを含む、請求項１７の組換えタンパク質。
【請求項２２】
該デンドロアスピン足場が、デンドロアスピンのループ II の中に挿入された配列番号 22 およびデンドロアスピンのループ III の中に挿入された配列番号 9 から 21 のいずれか１つを含む、請求項２１の組換えタンパク質。
【請求項２３】
該デンドロアスピン足場が、デンドロアスピンのループ II の中に挿入された配列番号 22 およびデンドロアスピンのループ III の中に挿入された配列番号 26 を含む、請求項１７の組換えタンパク質。
【請求項２４】
該キャリアタンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)である、請求項１から１６のいずれかの組換えタンパク質。
【請求項２５】
抗アテローム応答を誘発することができる第三のエピトープを含み、該第三のエピトープが、該第一および第二のエピトープとは異なる、請求項１から２４のいずれかの組換えタンパク質。
【請求項２６】
抗アテローム応答を誘発することができる第四のエピトープを含み、該第四のエピトープが、該第一、第二および第三のエピトープとは異なる、請求項２５の組換えタンパク質。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれかの組換えタンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項１から２６のいずれかの組換えタンパク質および免疫原性の疎水性複合体を含む免疫原性組成物。
【請求項２９】
該免疫原性の疎水性複合体が、単離されたミクロソームを含む、請求項２８の免疫原性組成物。
【請求項３０】
さらに MHC タンパク質を含む、請求項２８または２９の免疫原性組成物。
【請求項３１】
該ミクロソームが、反転ミクロソームである、請求項２９または３０の免疫原性組成物。
【請求項３２】
ゲル、口腔粘膜ペースト、練り歯磨きまたは洗口液として製剤化されている、請求項２８から３１のいずれかの免疫原性組成物を含む医薬組成物。
【請求項３３】
ゼラチン、ペクチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレン樹脂および流動パラフィンからなる群から選択される１以上の成分をさらに含む、請求項３２の医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１から２６のいずれかの組換えタンパク質、請求項２７のベクターまたは請求項２８から３１のいずれかの免疫原性組成物を含む医薬組成物。
【請求項３５】
医薬としての使用のための、請求項１から２６のいずれかの組換えタンパク質または請求項２７のベクター。
【請求項３６】
哺乳類において抗アテローム応答を誘発するための、またはアテロームを治療または予防するための、請求項１から２６のいずれかの組換えタンパク質、請求項２７のベクター、請求項２８から３１のいずれかの免疫原性組成物または請求項３２から３４のいずれかの医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１から２６のいずれかの組換えタンパク質または請求項２７のベクターを含む抗アテロームワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、様々な抗原からの挿入されたエピトープを提示する組換え分子を含む免疫原性組成物およびワクチン組成物に関する。特に、本発明は、心血管疾患の発生(development)に関与する抗原および病原体に対する免疫応答を誘発するためのかかる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
心血管疾患(CVD)は、全ての死のほぼ 50% を占め、死および身体障害の遍在する原因となっている。心臓発作(CHD)および脳卒中がその最も重要な症状のうちの２つであり、他には閉塞性末梢血管疾患(PVD)および静脈血栓塞栓症がある。CVD は現在、全ての死の 51%、即ち全ての型の癌を合わせた(21%)よりも２．５倍多くを占めている。
【０００３】
アテロームは、American Heart Association's Committee on Vascular Lesions によって作成された疾患の分類に従って最も良く記述された進行性の疾患である(Stary et al. Arterioscler Thromb. 1994、14、840-856; Stary et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995、15、1512-1531)。最初の同定可能な病変(タイプ I)は、常在性マクロファージの増加を生じさせるのに十分な蓄積したリポタンパク質および散在する脂質を含有するマクロファージ(泡沫細胞)の形成という目に見える証拠を有する。タイプ II の病変は、脂質を含む(lipid-laden)増殖する平滑筋細胞の間に挟まれたマクロファージ泡沫細胞のより大きな蓄積からなる - これらは、若年齢から動脈壁において観察され得る脂肪線条としばしば称される病変である。タイプ III の病変は、細胞外の脂肪滴および異常に増殖する内膜平滑筋細胞の層の協調した行動(coordinated behaviour)を妨げ得る他の粒子を含む。タイプ IV の病変(症状が生じ得るため、ここからアテロームとして知られる)において、この細胞外の脂質は癒着して、ますます破壊的な(disruptive)浮遊性(free-floating)脂質のコアとなる。中年において、これらは線維性結合組織の厚い層を含み始め(タイプ V の病変)、亀裂(fissuring)、血腫および血栓の形成という証拠を示し始める(タイプ VI の病変)。タイプ V の病変には大いに石灰化したものもあり(タイプ Vb)、また、主に線維性結合組織からなり、脂質およびカルシウムの蓄積がほとんど無いかまたは全く無いものもある(タイプ Vc)。
【０００４】
早くも1973年には、平滑筋細胞の増殖 - 新生内膜の肥厚 - がアテローム性動脈硬化における鍵となる現象の一つであること、およびそれが内皮の構造および機能を変化させる内皮細胞傷害の結果として始まることが示された (Ross & Glomset、Science 1973、180、1332-1339)。1974年には、平滑筋細胞の異常増殖および動脈病変の内膜への遊走を刺激するものとして、血小板由来増殖因子(PDGF)が同定された (Ross et al、Proc Natl Acad Sci U S A. 1974、71、1207-1210)。その後、PDGF は創傷の修復に関与する血小板以外の細胞(マクロファージ、線維芽細胞)によって合成されることが見出された。1991年には、PDGF に対する抗体が実験動物の動脈に対する介入的傷害(interventional injury)後の平滑筋細胞蓄積の過程を減弱し、それにより、そうでなければ生じる“再狭窄”病変の重症度を減少させることが示された(Ferns et al、Science. 1991、253、1129-1132)。
【０００５】
傷害に対する応答の理論から生じる２つの相補的な理論が、現在のところアテローム性動脈硬化の研究の分野における思考の中心となっている; すなわち、炎症性メカニズム (Raines、Cytokine Growth Factor Rev 2004、15、237-254; Levitzki、Cytokine Growth Factor Rev 2004、15、229-235) および免疫学的メカニズム (Paoletti et al、Circulation. 2004、109(23 Suppl 1):III20-6; Ludewig et al、J Leukoc Biol. 2004、76、300-306; Wick et al、Annu Rev Immunol. 2004、22、361-403)。現在、多くの証拠により、血管壁内の炎症過程が病変の形成に寄与することが示されている。アテローム性動脈硬化の進行の縦断的(longitudinal)血管造影研究において、疾患の証拠は段階的に進行し、そこでは不完全な治癒が血管の変化の発現の後に続いた (Bruschke et al、Am Heart J. 1989、117、296-305）。別の研究において、感染が小児期における内膜の肥厚とおそらく関連するであろうことが示された (Willerson & Ridker、Circulation、2004、109、II2-110)。
【０００６】
アテローム血栓症の各段階において、炎症が役割を果たすことが示されている (Pesonen et al、Atherosclerosis. 1999、142、425-429)。ox-LDL または他の物質による傷害に続いて、単球が発達中の病変の部位に結合する。接着した単球は血管壁の中へ移動し、そこで、それがマクロファージへと分化し、最終的に泡沫細胞となるのと同様に、修飾された(modified)脂質およびリポタンパク質を取り込み続ける - マクロファージ細胞は成熟したプラークの破裂から放出され得る全ての細胞のうち半分より多くを構成する。T 細胞およびマスト細胞もまた、病変内に蓄積する。血管壁 SMC は遊走を始め、コラーゲンを合成し、一方でさらなる単球を動員する因子を産生する。マクロファージ、T-リンパ球および SMC の活性化は、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子の放出をもたらす。特に、フィブリノーゲン、PAI-1 および C反応性タンパク質ならびに組織因子の血中レベルの増大を刺激する IL-6 が合成される (Paoletti et al、Circulation. 2004、109(23 Suppl 1): III 20-6)。他の炎症性サイトカイン、例えば IL-1 および TNF は、内皮への白血球のさらなる接着を刺激する細胞接着分子の発現を誘導する。常在性マクロファージによって合成されるメタロプロテイナーゼは、プラークの線維性キャップを消化して破裂の危険を増大させ、また、これらの酵素は損傷を受けた内皮からの接着分子の切断にも関与し得る - その可溶型がアテローム性動脈硬化の患者の血中において増大する (E-selectin、VCAM and ICAM) (Roldan et al,Thromb Haemost. 2003、90、1007-1020)。傷害を受けた内皮による NO 生産の減少は、さらなる血小板の粘着性および凝集をもたらす。炎症過程の最終フェーズはプラークが破裂する時に生じ、その結果起こる血栓症を伴って大量の血栓形成促進性物質を血液中に放出する。
【０００７】
アテローム性動脈硬化において生じる慢性の炎症状態は、繰り返されるおよび/または慢性の感染によって最も維持されやすいというのが最近の趨勢である (Epstein et al、Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000、20、1417-1420)。近年の前向き研究により、感染性の負担(burden)、アテローム性動脈硬化の程度および臨床予後の間の直接的関係が示され (Ferns et al、Science. 1991、253、1129-1132)、その見識は他の研究によっても得られた (Espinola-Klein et al、Circulation. 2002、105、15-21; Georges et al、Am J Cardiol. 2003、92、515-521; Huittinen et al、Circulation. 2003、107、2566-2570)。多くの細菌性およびウイルス性生物に対する血清反応性は、進行したアテローム性動脈硬化と関連した。慢性の感染は、増大した死と有意に関連した (Zhu et al、Circulation. 2001、103、45-51)。
【０００８】
クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)は、ありふれた呼吸器の病原体である。それは病変において見出される主要な細胞型に感染することができ、動脈内膜切除および再狭窄バイパス(restenotic bypass)から得られたアテローム性の組織において見出されている (Gaydos et al、Infect Immun. 1996、64、1614-1620; Chiu et al、Circulation. 1997、96、2144-2148;  Maass et al、J Am Coll Cardiol. 1998、31、827-832)。その感染に対する関連は、急性または慢性の冠動脈疾患を有する患者においてクラミジア・ニューモニエ(C. pneumoniae)-血清特異的(serospecific) IgG を測定した Saiku et al によって最初に観察された (Saikku et al、Lancet. 1988、2、983-986)。近年の血清疫学的研究により、陽性血清抗体と心血管疾患との間の弱い相関が示されているが(Danesh、Eur Heart J. 2002、23、371-375)、組織病理学的研究においてはより説得力のある相関が存在する(Bartels et al、Circulation. 2000、101、137-141)。
【０００９】
ヒトの胃の上皮に常在するヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)は、アテローム性動脈硬化疾患との有意な関連性を示すいくつかの血清学的研究によって、関連が示唆されている (Espinola-Klein et al、Circulation. 2002、105、15-21; Georges et al、Am J Cardiol. 2003、92、515-521; Huittinen et al、Circulation. 2003、107、2566-2570)。
【００１０】
ヒト サイトメガロウイルス (HMCV) は、そのいくつかのメンバーが心血管系との強い関連を示すヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。いくつかの血清疫学的研究により、アテローム性動脈硬化との関連が示された (Zhou et al、N Engl J Med. 1996、335、624-630; Adam et al Lancet. 1987、2、291-293)。さらに、患者からの動脈における該ウイルスの直接的な証拠が存在する (Hendrix et al、Am J Pathol. 1989、134、1151-1157)。HMCV は、血管壁における全てのタイプの細胞型に感染することができ、ケモカインおよびサイトカインの合成を刺激する (Jarvis & Nelson、Opin Microbiol. 2002、5、403-407)。
【００１１】
Toll様受容体のファミリーのメンバー（その一つは LPS 受容体 CD14 とシグナル伝達複合体を形成する）は、サイトカインおよびケモカインの合成を開始させる NF-カッパ B 経路の活性化を介して(Muroi et al、J Biol Chem. 2002、277、42372-42379)感染後の炎症反応を媒介すると考えられている(Kiechl et al、Ann Med. 2003、35、164-171; Arroyo-Espliguero et al、Heart. 2004、90、983-988; Pasterkamp et al、Eur J Clin Invest. 2004、34、328-334)病原体パターン認識受容体である。興味深いことに、Toll 受容体の特定の多型が、増大した疾患のリスクと関連する (Kiechl et al、N Engl J Med. 2002、347、185-192; Ameziane et al、Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003、23、61-64)。
【００１２】
分子擬態の考え方は、外来性物質からの抗原と自己タンパク質との間の交差反応性がいかにして自己免疫疾患を引き起こし得るのかについて、的確な枠組み(elegant framework)を提供する。例えばウイルスとヒトのようにそれらの起源が進化的側面として分離され得るとしても、分子またはその立体構造上の適合度(conformational fit)のいずれかが共有され得る。宿主およびウイルスによって共有されるエピトープに対する免疫応答は、細胞および組織の破壊を誘発することができると考えられている組織特異的免疫応答を誘起することができる。これは、標的細胞上の特異的決定基を認識する細胞傷害性の交差反応性エフェクターリンパ球または抗体の生成によってもたらされる。相補的なメカニズムによって、微生物は細胞傷害を誘導することができ、自己抗原を放出させ、これが遺伝的に異なるさらなる自己抗原と交差反応する免疫応答を生み出す。
【００１３】
血管壁における細胞の感染は、炎症反応のカスケードを開始し得、かつ、直接的な細胞壊死性を介して細胞の破壊をもたらし得る。高コレステロール血症の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)マウスにおけるアテローム性動脈硬化は、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)の非存在下(Gu et al、Mol. Cell 1998、2、275-281)または P- および E-セレクチンの両方の非存在下(Dong、et al、J. Clin. Invest. 1998、102、145-152)において有意に減少することが報告されている。感染性物質またはその抗原が二次リンパ器官に到達すると、病原体特異的免疫応答が誘導される(Karrer et al、J. Exp. Med. 1997、185、2157-2170)。微生物抗原および自己抗原を認識する交差反応性 Th 細胞は、ウイルス性および細菌性感染の間に生成され得る (Oldstone、Cell 1987、50、819-820)。組織常在性の APC によって提示される自己抗原を認識する、病原体に誘導される Th 細胞の末梢性活性化は、さらなる T 細胞およびマクロファージを血管病変へと誘引するサイトカイン、例えば IFN-γ およびケモカインの放出をもたらし得る。内皮細胞または平滑筋細胞からの自己抗原の放出ならびにその後のそれらの二次リンパ器官への取り込みおよび輸送は、真の(genuine)自己免疫応答を誘発する。エピトープ拡散(epitope spreading)は、抗原-抗体複合体の形成および自己反応性 Th 細胞の局所的活性化による炎症性応答の永続化をもたらし得る。免疫複合体および/または Th 細胞由来可溶性因子によって活性化されたマクロファージは、酸化的中間体、サイトカインまたはメタロマトリックスプロテアーゼ(metallo-matrix protease)(MMP)を分泌し得る(図 2c)。病原体特異的 Th 細胞によって分泌されるケモカインおよびサイトカインは、T 細胞受容体から独立した様式で自己反応性の“傍観者(bystander)”Th 細胞を誘引し、これを刺激し得る。自己免疫性 Th 細胞および活性化されたマクロファージを生み出す IFN-α は、局所的炎症性応答の永続化に寄与する。
【００１４】
分子擬態は、構造的に関連するヒトおよびクラミジアの熱ショックタンパク質(HSP60/65)がアテローム性動脈硬化の病変において見出され得るように、アテローム発生において重要な役割を果たし得る (Kol et al、Circulation 1998、98、300-307)。例えば、高コレステロールの食餌を与えられたマウスにおいて、組換えの細菌性 HSP65 を用いたマウスの免疫化が初期の病変を増大させたこと (George et al、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1999、19、505-510)、および HSP65 特異的な T 細胞または抗体が LDLR 欠損マウスにおいて脂肪線条の形成を促進し得ること (George et al、J. Am. Coll. Cardiol. 2001、38、900-905) が報告されている。交差反応性 T 細胞 (Kiechl et al、N Engl J Med. 2002、347、185-192) および HSP60 の直接的マクロファージ刺激機能 (Xu et al、J. Clin. Invest. 1993、91、2693-2702) は、マクロファージによるサイトカイン、MMP および NO の分泌をもたらし得、それによって、Th 細胞の活性化を抑制することにより、内皮細胞上における誘導された主要組織適合性複合体クラス II の発現における炎症反応を増幅させる (Kwak et al、Nat. Med. 2000、6、1399-1402)。冠動脈疾患を有する 40 人の男性患者における最近の前向き二重盲検プラセボ対照試験により、マクロライド系抗生物質のアジスロマイシンが内皮の機能に対して好ましい効果を有することが明らかとなった (Parchure et al、Circulation 2002,105、1298-1303)。同様に、抗生物質処置は、急性冠症候群(Stone et al、Circulation 2002、106、1219-1223)または急性非Q波冠症候群(Sinisalo et al、Circulation 2002、105、1555-1560)を示す患者において有害な心イベント(cardiac event)を有意に減少させることができる。
【００１５】
急性クラミジア・ニューモニエ(C. pneumoniae)感染のマウスモデルにおいて防御免疫を誘導するいくつかのクラミジア・ニューモニエ(C. pneumoniae)抗原が同定された(Murdin、J. Infect. Dis. 2000、181 (Suppl. 3)、S544-S551)。さらに、実験動物における、自己抗原、例えば oxLDL (Palinski et al、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995、92、821-825; Zhou et al、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001、21、108-114) または HSP60/65 (Maron et al、Circulation 2002、106、1708-1715) を用いたワクチン接種のアプローチは、いくつかの有益な効果を示した。従って、今後の大きな挑戦は、有望な実験段階における結果を臨床試験へとつなげることである。
【００１６】
外来性物質からの抗原と自己タンパク質との間の交差反応性が自己免疫疾患を引き起こし得ることが示唆されている。共有されるエピトープに対する免疫応答は、細胞および組織の破壊を誘発し得ると考えられている組織特異的免疫応答を誘起することができる。これは、標的細胞上の特異的決定基を認識する細胞傷害性の交差反応性エフェクターリンパ球または抗体の生成によってもたらされる。相補的なメカニズムによって、微生物は細胞傷害を誘導することができ、自己抗原を放出させ、これが遺伝的に異なるさらなる自己抗原と交差反応する免疫応答を生み出す。
【００１７】
血管壁における細胞の感染は、炎症反応のカスケードを開始させ得、直接的な細胞壊死性を介して細胞の破壊をもたらし得る。高コレステロール血症の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)マウスにおけるアテローム性動脈硬化は、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)の非存在下(Gu et al、Mol. Cell 1998、2、275-281)または P- および E-セレクチンの両方の非存在下(Dong、et al、J. Clin. Invest. 1998、102、145-152)において有意に減少する。感染性物質またはその抗原が二次リンパ器官に到達すると、病原体特異的免疫応答が誘導される(Karrer et al、J. Exp. Med. 1997、185、2157-2170)。微生物抗原および自己抗原を認識する交差反応性 Th 細胞は、ウイルス性および細菌性感染の間に生成され得る (Oldstone、Cell 1987、50、819-820)。組織常在性の APC によって提示される自己抗原を認識する、病原体に誘導される Th 細胞の末梢性活性化は、さらなる T 細胞およびマクロファージを血管病変へと誘引するサイトカイン、例えば IFN-γ およびケモカインの放出をもたらし得る。急性クラミジア・ニューモニエ(C. pneumoniae)感染のマウスモデルにおいて防御免疫を誘導するいくつかのクラミジア・ニューモニエ(C. pneumoniae)抗原が同定されている (Murdin、J. Infect. Dis. 2000、181 (Suppl. 3)、S544-S551)。
【００１８】
さらに、実験動物における、自己抗原、例えば oxLDL (Palinski et al、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995、92、821-825; Zhou et al、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001、21、108-114) または HSP60/65 (Maron et al、Circulation 2002、106、1708-1715) を用いたワクチン接種のアプローチは、いくつかの有益な効果を示した。従って、今後の大きな挑戦は、有望な実験段階における結果を臨床試験へとつなげることである。
【００１９】
加えて、自己抗原、特に脂質代謝に関連する抗原を基に抗アテロームワクチンを開発する他の多数のアプローチがこれまでに研究されてきた。ヒトのアテローム性動脈硬化のプラークから抽出された T 細胞が酸化低密度リポタンパク質(oxLDL)を認識することが示され、マロンジアルデヒド(molondialdehyde)修飾された LDL による LDL欠損ウサギの免疫化はアテローム性動脈硬化を減少させることが示された (Palinski et al、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995、92、821-825)。国際出願 WO 01/68119 は、かかる修飾された LDL または apoB100 免疫原に基づく抗原性組成物を開示する。かかるアプローチの別の標的は、その活性の調節がアテローム発生の進行を妨げるのに有益であり得るコレステロールエステル転送タンパク質(cholesterol ester transferase protein)(CETP)である。国際出願 WO 97/41227 は、様々な T および B 細胞 CETP エピトープをコードするプラスミドを用いる DNA ワクチンのアプローチを開示している。コレステロールを直接的に標的とする試みもなされている(WO 92/10203)。
【００２０】
二特異性抗体は、その結合性アームの各々において異なる免疫原に結合するよう設計された抗体である。本明細書において用いる場合、‘二特異性’との用語は、２つの異なるエピトープに結合することができる２つの特異的抗原結合部位を有する抗体をいう。かかる抗体は‘二官能性’と称されることもあるが、これは２つの別々の機能を厳密に意味するため多義的であり、天然の単一特異性抗体は抗原結合/中和機能および Fc 依存性エフェクター機能の両方を有すると言うことができる (Hudson & Souriau、Nature Medicine 2003、9:129-134)。二官能性抗体は、１つの免疫原に結合する一方で別の免疫原を一緒に“運ぶ”等、２つの別々の免疫原に同時に結合するために用いることができる。常套の化学的方法によって生産される二特異性モノクローナル抗体は、癌、アテローム性動脈硬化および他の疾患の免疫診断および免疫療法において有用であることが明らかとなった。遺伝子工学技術によって生産される組換え抗体も、前臨床および臨床試験における使用のために利用することが可能となった。さらに、遺伝子工学を介して、２以上の所望の機能を有するデザイナー(designer)抗体分子を作成するために、重要なタンパク質ドメインを除去または付加することが可能である。
【００２１】
常套の方法で調製された二特異性および二官能性モノクローナル抗体は既に臨床試験において見込みを示しており、組換え二特異性抗体の前臨床試験の結果は有望である。抗体自身に対する宿主の免疫応答を最小化するためにモノクローナル抗体をヒト化または CDRドラフティング(CDR drafting)する技術は、当該技術分野において周知である(Hudson & Souriau、Nature Medicine 2003、9:129-134)。合成ヒト抗体 V 領域のランダム化された組合せを用いる合成のファージライブラリーが作成されている。抗原上での選択によって、V 領域が事実上ヒトと同じであると考えられるいわゆる‘完全ヒト抗体’を作成することができる。ヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子セグメントのレパートリーを有するトランスジェニックマウスが作出されている。これらのマウスは、免疫されるとヒト様抗体を作る。
【００２２】
多くの理由により、常套のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と比較した有意性のため、組換えヒトモノクローナル抗体の使用はますます一般的になってきている。例えば、組換え抗体の生産によって動物の使用は回避される。また、組換え抗体の生産は常套の抗体の生産と比較してずっと速く、かつ、莫大な数の抗原に対して作成することができる。対照的に、常套の方法においては、多くの抗原は非免疫原性であるかまたは非常に毒性が強いことが判明しており、そのため、動物において抗体を産生させるために用いることができない。さらに、組換え抗体の親和性成熟(affinity maturation)(即ち、親和性および特異性を増大させること)は、非常に単純かつ比較的迅速である。最後に、特異的抗原に対する多数の異なる抗体を、１つの選抜手順において作成することが可能である。異なる抗原認識部位を有する抗体のライブラリーは、いくつかの方法で作成することができる: (a) 重鎖生殖系列遺伝子のプールにおいて合成の CDR3 領域をクローニングすることによる合成レパートリーの作成。これは、そこから様々な特異性を有する組換え抗体断片を選択し得る幅広い抗体レパートリーを作成することができる (Nissim et al、EMBO J. 1994、13、692-698)。(b) 
【００２３】
最新の(かつ最大の; 1012 のエピトープ)合成抗体ライブラリーを検索すること。(c) ヒトのリンパ球のプールを、抗体ライブラリーの構築のための出発物質として用いること。ヒト IgM 抗体の天然のレパートリーを構築することが可能であり、その結果、大きな多様性を有するヒトライブラリーを作成することができる(Marks et al、J. Mol. Biol. 1991、222、581-597)。(d) 別の可能性として、いわゆる患者ライブラリーを調製することも挙げられる。最初に、個体(例えば、自己免疫の患者)の血清を、対象とする抗原に対する特異的抗体の存在について試験する。陽性の個体のリンパ球プールから、高い特異性および高い親和性を有する抗体を含む IgG ライブラリーを作成することができる。かかる特殊化されたライブラリーの構築は、特定の生体分子を研究するための抗体を生成することを可能にし、例えばマーカーの選抜のためのアテローム性動脈硬化を有する患者からのライブラリーまたは特定の分子、例えば糖残基に対する抗体の生成に適応させたライブラリーが挙げられる。
【００２４】
一旦ライブラリーが作成されれば、対象とする抗原を固定化し、適当なファージディスプレイライブラリーを用いて様々な選択のラウンドを適用することにより、該ライブラリーを様々な抗原に対する組換え抗体の選択のために用いることができる。
【００２５】
最も選択的な抗原エピトープを得るため、各個々のファージがタンパク質 g3p または g8p のいずれかの中にランダム配列ペプチドインサートを提示する M13 ファージのライブラリーへ標的タンパク質が添加されるファージディスプレイスクリーニング法を採用することができる。6-15 アミノ酸残基を有する数千のペプチドを、例えばランダムペプチドがコアタンパク質 g8p 中に挿入された 9-mer のライブラリーから開始して、ライブラリーから選択することができる。かかるライブラリーは多量体結合(数百コピーのペプチドが各ファージ上に提示される)の利点をもたらし、結合性ファージから同定されるペプチド配列は、標的タンパク質に結合するコンセンサス配列を狭めることを容易にする配列テーマをしばしば明らかにする。標的タンパク質の性質に応じて、関連するペプチド結合物質(binder)を提示するファージの同定のために様々な技術を用いることができる。標的タンパク質に結合するファージの同定の後、それらは DNA 配列決定の前にサブクローン化され、増幅される。DNA 配列および対応するペプチドインサートのリストが得られる。標準的なアプローチは、標的タンパク質を磁性ビーズ上に固定化し、その後標的タンパク質に結合するファージを吸着させることである。ビーズを慎重に洗浄した後、結合しているファージを溶出し、大腸菌(E. coli)において増幅する。結合性ファージを濃縮するため、該手順を２〜３回繰り返してもよい。次いで、結合性ファージは大腸菌の菌叢上で増幅され、得られたプラークがニトロセルロース膜上にブロットされる。該膜は標的タンパク質の希釈と共にインキュベートされ、適切な検出系、例えば酵素標識された抗体を用いて、またはビオチン化された標的に対して酵素標識されたストレプトアビジンを用いることによって、結合が確認される。
【００２６】
DNA ワクチン接種は、特定のペプチドエピトープをコードする DNA のみが注入されるという点において、伝統的なワクチンとは異なる (Locher et al、Curr Opin Mol Ther 2004、6、34-39; Boyd et al、2003、6,1155-1164; Karin、Curr Opin Mol Ther 2004、6、27-33)。DNA は、皮下針を通して注入される生理食塩水中において、または遺伝子銃を用いて体の中へ推進される DNAで被覆された金粒子によって、投与することができる。ワクチン接種された宿主において、免疫化するタンパク質の生産が実際に起こる。免疫を維持するために複数の接種を必要とする常套のワクチンとは異なり、DNA ワクチン接種は寿命の長い免疫応答を提供する。単一の接種において複数の抗原に対するワクチンを与えることも可能である。一般的な生産方法を用いる能力は、ワクチンの開発および生産工程を大いに単純化する。DNA ワクチンは極めて安定であり、非常に広い条件下において保存することができ、配布の間ワクチンを維持するための冷蔵庫の必要性を除去する。
【００２７】
血小板由来増殖因子: 構造および機能
血小板由来増殖因子(PDGF)は、ジスルフィド結合した A および B ポリペプチド鎖からなるホモ二量体およびヘテロ二量体タンパク質のファミリーを含む (Waterfield et al、Nature 1983、304、35-39; Uutela et al、Circulation 2001、103、2242-2247)。いくつかの細胞型は PDGF 遺伝子の協調した発現を示すが、一般的には、各々の発現は独立している (Heldin et al,Physiol Rev 1999、79、1283-1316)。広範囲の細胞外の刺激が各々の発現に影響を与えるため、合成レベルは細胞特異的でありうると考えられる。
【００２８】
構造的には、PDGF は、VEGF を含むサイトカインのシステインノット(cysteine knot)ファミリーの一つである(Sun & Davies、Annu Rev Biophys Biomol Struct 1995、24、269-291)。２つのシステイン残基が２つのサブユニット間の結合を形成する一方、他の６つの残基は鎖内のジスルフィド結合に関与している。PDGF の結晶構造は、該２つのサブユニットが逆平行の様式で並び、固い結び目様(knot like)の構造を形成していることを示した。β-シートの相互作用によって安定化される２つの大きなループ(1 および 3)がこの結び目(knot)から一つの方向に伸長し、別の短いループ 2 が反対の方向に伸長する (Oefner et al、EMBO J 1992、11、3921-3926)。二量体において、一方のサブユニットのループ 1 および 3 は他方の PDGF アイソフォームのループ 2 に近接しており、２つの構造的に関連するタンパク質チロシンキナーゼを活性化することによって標的細胞にその影響を及ぼす。αおよびβ-受容体は、180 kDa 前後の分子量を有し、細胞内チロシンキナーゼドメインに連結した５つの免疫グロブリン様ドメインからなる (Heldin & Westermark、Rev 1999、79、1283-1316)。該受容体との結合に関与するエピトープは部位特異的突然変異誘発を用いて研究されており、結合にとって最も重要なアミノ酸残基はループ 1 および 3 の中に位置決定されている(程度は小さいが、ループ 2 も関与する)(Clements et al、EMBO J 1991、10、4113-4120; Andersson et al、Growth Factors 1995、12、159-164; Fenstermaker et al. J Biol Chem 1993、268、10482-10489)。
【００２９】
３つのアイソフォームのうち、PDGF-BB のみが、等しい親和性で両方の受容体と相互作用する。PDGF による細胞の活性化は、単一の二量体 PDGF 分子との結合による２つの受容体の二量体化に続いて起こる。PDGFαおよびβ受容体ホモ二量体の各々の活性化によって引き起こされる表現型の変化は、いくつかの差異を示す(Heldin et al、Physiol Rev 1999、79、1283-1316)。
【００３０】
PDGFの生理学的機能
PDGF は、胚発生において基礎的な機能を有している(ノックアウトマウスにおいて周産期死亡が起こる)。PDGF-B 鎖ノックアウトマウスモデルにおいては、例えば、心臓の欠陥ならびに不完全な腎臓および血管が見出された(Leveen et al、Genes Dev 1994、8、1875-1887)。結合組織を生産する細胞型は、特に PDGF に依存している。結合組織の形成における PDGF の重要な役割は、成人の創傷治癒においても重要である(Werner & Grose、Physiol Rev 2003、83、835-870)。
【００３１】
アテローム性動脈硬化における PDGF
腫瘍増殖および線維性疾患における PDGF の関与の報告が続いているが、アテローム性動脈硬化は研究的興味の主要な的である。
【００３２】
PDGF は健康な成人の動脈においては低いレベルでしか生じないが、血管に対する炎症性-線維増殖性の媒介される変化(inflammatory-fibroproliferative mediated change)が存在する状況においてはその発現が増大する。その結果、自然に生じるアテローム性動脈硬化(Wilcox et al、J Clin Invest 1988、82、1134-1143; Rubin et al、Lancet 1988、1、1353-1356; Ross et al、Science 1990、248、1009-1012; Libby et al、N Engl J Med 1988、318、1493-1498; Uchida et al、Atherosclerosis 1996、124、9-23)およびアテローム性動脈硬化の実験モデル(Ross et al、Science 1990、248、1009-1012; Golden MA、Au YP、Kirkman TR、et al. J Clin Invest 1991、87、406-414)において、ならびに PTCA 後の患者の冠動脈において(Kanzaki et al、Eur J Clin Invest 1994、24、377-381; Ueda et al、Am J Pathol 1996、149、831-843; Ueda et al、Heart 1996、75、549-556; Misiakos et al. Eur Surg Res 2001、33、264-269)、PDGF および PDGF 受容体の発現の増大が報告されている。血管壁における PDGF のレベルの上昇は、血小板血栓の放出される産物から、およびマクロファージ、SMC または内皮細胞によって合成されるタンパク質から、生じると思われる(Bohm et al、Zentralbl Pathol 1994、140、357-362)。そこで、PDGF は血管の中膜から内膜層への SMC の遊走ならびにマトリックス分子の合成を刺激すると考えられる。
【００３３】
多くの研究が、内膜の肥厚における PDGF の直接的関与を証明している。ラットの動脈のバルーンカテーテル法の後の内膜過形成は、中和 PDGF 抗体の注入によって遮断され得る (Ferns et al、Science 1991、253、1129-1132)。コレステロールを与えられたウサギにおける大動脈病変の発生は、PDGF-BB を用いた事前の免疫化によって阻害される (Rutherford et al、Int J Exp Pathol 1997、78、21-32)。加えて、低分子量 PDGF 受容体 キナーゼ阻害剤は、新生内膜形成を阻害することが示されている。さらに、さらなる PDGF BB の投与は、動物モデルにおける内膜の肥厚を増強する (Jawien et al、J Clin Invest 1992、89、507-511)。受容体に対する中和抗体はまた、ヒヒおよびラットのモデルにおいて内膜の肥厚を阻害することが示されている。さらに、受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、肥厚を減少させることが示されている (Lin et al、J Vasc Res 2004、41、305-313; Deguchi et al. Gene Ther 1999、6、956-965; Sirois et al、Circulation 1997、95、669-676)。かかる知見は、血管形成術後の再狭窄を制御するのに PDGF 経路の遮断が有用であり得ることを示唆している。PDGF の低分子量ブロッカーを用いた臨床試験は有望な結果をもたらしている (Lassila et al. Thromb Vasc Biol 2004、24、935-942; Levitzki、Growth Factor Rev 2004、15、229-235; Sihvola et al. Transplantation 2003、75、334-339; Bilder et al. Circulation 1999、99、3292-3299; Fishbein et al、Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000、20、667-676; Yamasaki et al、Circ Res 2001、88、630-636)。
【００３４】
HSP65: 構造および機能についての現時点の理解
HSP の一般的バックグラウンド: 熱ショックタンパク質は、他のタンパク質の組立て(assembly)、フォールディングおよび転位置を助ける一群のタンパク質である。さらに、それらは熱傷または他の形態のストレスから細胞を保護する。原核および真核の全ての細胞は、これらのタンパク質を合成することによって様々な細胞ストレスに応答することができる。熱ショックタンパク質は高度に保存され、普遍的に分布し、かつ、ウイルス性および細菌性感染の重要な側面、自己免疫疾患および癌免疫に関与する。
【００３５】
HSP は、分子サイズが 10 から 150 kDa の範囲であり、全ての主要な細胞内コンパートメントにおいて見出される多重遺伝子族である。分子量によって、それらは以下のファミリーに分けられる: HSP10、スモール HSP (small HSP)、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90 および HSP110。HSP は、クラミジアおよびヒトを含む事実上全ての生物において広く分布する。
【００３６】
HSP の構造: HSP65 は HSP60 と相同であり、メンバーに HSP58、HSP65 および Grp58(グルコース関連タンパク質58(glucose-related protein58))を含む分子シャペロンである HSP60 ファミリーのメンバーとして分類することができる。Hsp60-シャペロニンファミリーは、細菌の GroEL (大腸菌の HSP)、葉緑体のルビスコ結合タンパク質、ミトコンドリアの HSP60、および真核生物サイトゾルの t-コンプレックスポリペプチド 1 を含む。大腸菌の GroEL および GroES は、原型的シャペロニンおよびコシャペロニン(co-chaperonin)である。
【００３７】
最も研究されている HSP60-様タンパク質は、大腸菌において見出される GroEL である。この特定のシャペロニンの構造は、2.8A の分解能の X 線結晶学によって解明された。その構造は、二個一対の対称性を有し背中合わせに積み重なった、ほぼ 7回回転対称の２つのリングで作られる 14 個のサブユニットの多孔質のシリンダーからなる。各サブユニットは３つのドメインからなる: その腰部分(waist)において組立ての基礎を形成し、リングをまとめる大きな赤道ドメイン; シリンダーの端を形成する大きな構造のゆるい頂点(apical)ドメイン; および該２つを接続する小さな細い中間ドメイン (Braig & Otwinowski、Nature、1994、371、578-584)。GroEL はまた、ポリペプチドと結合するために用いられ得る中心の空洞またはチャネルの広さよりも少し背が高い。大きな中心の空洞は、障害物なくシリンダーの全長を横切っていると考えられる。これは、各リングの頂点および赤道両方のレベルにおいて完全にチャネルを塞ぐ密度を示す電子顕微鏡再構築とは対照的である。ペプチド結合における頂点ドメインの機能についての結論を考えると、チャネル開放に近い電子顕微鏡の密度は、中空のシリンダーの内側部分に結合したポリペプチドに由来する可能性がある。Hsp60 タンパク質は、２つの積み重なった 7-員環状に並んだ 14 個のサブユニットで構成されている。折り畳まれていないタンパク質は、中心の空洞の内側の大きな疎水性表面に結合する。ATP の結合は、疎水性表面が隣接する Hsp60 サブユニットの方を向くよう、Hsp60 サブユニットの回転を引き起こす。
【００３８】
HSP60 の機能: 頸動脈のアテローム性動脈硬化は、炎症誘発性過程の活性化におけるその役割が初期の血管病態に関連する血清可溶性の HSP60 と関連することが報告されている (Nagiano M、et al.、Immunol. 2005; 174: 6509-6517; Xiao Q、et al.、Stroke 2005; 36: 2571-2576)。hsp60 ファミリーの 60-kDa のメンバーに対する高レベルの自己抗体は、アテローム硬化性血管疾患と関連した(Xu Q、et al.、Lancet. 1993; 341: 255-259; Xu Q、et al. Circulation. 1999; 100: 1169-1174; Birnie DH、et al. Lancet. 1994; 344: 1443; Hoppichler F、et al. Atherosclerosis. 1996; 126: 333-338)。Bason らは、冠動脈疾患を有するほとんどの患者によって認識される HSP60 の 11 アミノ酸の配列を同定した (Bason C、et al.、Lancet. 2003; 362:1971-7)。
【００３９】
HSP65 の機能: Hsp は、タンパク質が膜、例えば核およびミトコンドリアの膜を通過する時に、タンパク質をほどき、その後再び折りたたむよう、順番に機能する。細菌性感染の間、宿主細胞は、細菌の外表面上に分泌または発現された細菌性シャペロニン 60 タンパク質によって活性化される。Hsp60 は、平滑筋細胞を含む多数の骨髄および血管の細胞型からの炎症誘発性サイトカインの分泌ならびに該細胞型上における接着分子の発現の誘導を含むいくつかの免疫学的効果を有することが示されている。これは、宿主細胞がサイトカインまたは他の細胞間シグナルを産生するのを誘導する。それはまた、宿主細胞にそれら自身のシャペロニンを放出させ得、該シャペロニンが今度は他の宿主細胞を活性化する。細菌のまたは宿主のシャペロニンは、主要組織適合性複合体(MHC)上における該シャペロニンの一部の提示を介して、宿主によって同定される。これが、T 細胞受容体(TCR)を介して T 細胞を活性化する。さらに、B 細胞がシャペロニンによって活性化されて抗体を産生する。この応答における誤りは、自己シャペロニン分子の認識を原因とする自己免疫疾患のいくつかの形態をもたらし得る。HSP65 は、頸動脈のアテローム性動脈硬化(Lassila et al、Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004、24、935-942)、冠動脈心疾患(Hoppichler et al、atherosclerosis 1996、126、333-338)および境界型高血圧(Frostegard et al、1997、29、40-44)において役割を有することが報告されている。高レベルの HSP65 に対する抗体を含有する血液を有する患者は、その後の心血管イベントのリスクが高いことが見出された (Veres et al、Circulation  2002、106、2775-2780)。HSP65 はまた、１型糖尿病(Elias et al、Proc Natl Acad Sci U S A. 1990、87、1576-1580)および関節炎(Durai et al、J Immunol、2004,173,181-188)における標的抗原として提案されている。ヒト HSP60 と交差反応する抗マイコバクテリア HSP65 抗体のレベルの上昇は、臨床上健康な集団(clinical health population)における頸動脈アテローム性動脈硬化の発生率、有病率、重症度および進行の予後マーカーとして機能することが実証されている。微生物の HSP60/65 に対する抗体は、ヒト HSP60 上の特定のエピトープを認識する。これらの交差反応性エピトープは、初期のアテローム性動脈硬化における免疫標的として機能することが示され、初期のアテローム性動脈硬化のメカニズムについてのさらなる見識を提供する可能性がある(Perschinka et al、Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003、23,1060-1065)。
【００４０】
他の標的
酸化型 LDL (OxLDL): OxLDL は、それがコレステロールを有するマクロファージのロード(loading)を説明することからアテローム性動脈硬化のシグナル伝達に関与すると当初は考えられていたが、oxLDL が潜在的にアテローム生成誘発性の(pro-atherogenic)他の多くの性質を有することがすぐに明らかとなった。興味は、(a) 最小限に(minimally) oxLDL がマクロファージ化学誘引物質(Cushing et al、Proc Natl Acad Sci USA. 1990、87,5134-518)、接着分子(Berliner et al、J Clin Invest. 1990、85、1260-1266)およびサイトカイン(Rajavashisth et al、Nature. 1990、344、254-257)の内皮性発現を刺激すること、ならびに (b) 大いに(extensively) oxLDL が、細胞コレステロール含量によって調節されない様式でマクロファージのスカベンジャー受容体によって取り込まれること(Henriksen et al、Proc Natl Acad Sci USA. 1981、78、6499-6503; Witztum JL. Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis. Br Heart J. 1993、69、S12-S8)を実証したインビトロの研究に部分的に基づいている。
【００４１】
大いに oxLDL は、細胞毒性、ならびに内皮細胞によるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１の発現、平滑筋細胞(SMC)による血小板由来増殖因子 A 鎖の発現、マクロファージによるインターロイキン-1β、インターロイキン-8 およびストレスタンパク質の発現の誘導; ならびに T リンパ球の活性化を含む、多くの他の潜在的にアテローム生成誘発性の効果を有する。Toshima らは近年、代替のモノクローナル抗体を用いて、対照と比較して、確立された冠動脈心疾患を有する患者において oxLDL がより高いことを示した(Toshima et al、Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000、20、2243-2247; Suzuki et al、Clin Biochem. 2002、35、347-353)。従って、OxLDL はアテローム性動脈硬化の病変において提示される抗原である可能性がある。ヒト単球抗原 CD36、および密接に関連するスカベンジャー受容体であり、CD68 と相同な 94-97 kDa のタンパク質である SR-BI(Ramprasad et al、Proc Natl Acad Sci USA. 1995、92、9580-9584)を含むいくつかのマクロファージの膜タンパク質は、oxLDL と結合することが示されている。
【００４２】
胎児および小児の初期のヒトアテローム性動脈硬化の病変は、修飾されたリポタンパク質、特に、酸化型低密度リポタンパク質(oxLDL)を含む(Napoli C、Palinski W. Eur. Heart J. 2001; 22: 4-9)。実質的な証拠が、oxLDL および oxLDL の突出した構成成分である酸化ホスファチジルコリン(PtC、PC含有リン脂質)が多くの炎症誘発性およびアテローム生成誘発性の性質を有することを示唆している(Napoli C、et al.、J. Clin. Invest. 1997; 100:2680-90; Nishi K、et al.、Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002; 22: 1649-1654.)。最近の報告により、アポリポタンパク質 B-100 (apoB-100) から取得されたいくつかのアルデヒド修飾されたペプチド配列が免疫応答の主要な標的となり得ることが示されている(Hulthe J. Clin Chim Acta. 2004; 348:1-8)。
【００４３】
リン脂質結合性タンパク質であるβ2-糖タンパク質 I (β2-GP I)は、抗リン脂質抗体に対する最も一般的なエピトープを有しており、リポタンパク質から分けられる。このタンパク質は、アポリポタンパク質 H (Apo H) とも称される。ヒトβ2-GP I は 326 アミノ酸残基および 5 糖鎖からなる一本鎖分子であり、およそ 55 kDa の分子量を有する。該タンパク質は、Sushi ドメイン 118 として知られる、各々が 2 つの内部ジスルフィド結合を有する 60 アミノ酸残基の 5 つの内部反復単位を含有している (Bouma et al、EMBO J. 1999、18、5166-5174; Schwarzenbacher et al、EMBO J. 1999、18、6228-6239)。抗リン脂質(aPL)抗体は、酸化型 LDL に対して交差反応性を示し(Witztum & Horkko、Ann. NY Acad. Sci. 1997、811、88-96; Horkko et al、J. Clin. Invest. 1996、98、815-825)、それによってアテローム性動脈硬化のリスクの増大と関連し得る(Vaarala、Lupus、1996、5、442-447)。
【００４４】
酸化ホスファチジルコリン
OxLDL は、タンパク質部分および脂質部分の両方の上に様々な酸化ネオエピトープ(oxidation neoepitope)を含有する。かかるエピトープの生成において特に興味深いものは、ホスファチジルコリン(PC)の反応性分解産物、例えば LDL タンパク質および脂質を修飾して共有結合付加体を形成させることができる 1-パルミトイル-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホリルコリン(POVPC)である。POVPC およびマロンジアルデヒド(malonodialdehye)等の物質による修飾は、ネオ自己エピトープ(neo-self epitope)の形成をもたらすと考えられる。これらの修飾は、ホスホリルコリン含有酸化リン脂質それ自体と共に、スカベンジャーおよび Toll 受容体との LDL の相互作用に寄与すると考えられる。
【００４５】
サイトメガロウイルス:
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)は、世界中の人口の大部分に感染する種特異的ベータヘルペスウイルスである(Stern、J.lL.et al.、The Journal of Immunology、2008; 180: 6577-6585)。CMV 感染はまた、後期の移植片不全(graft failure)の根底にある慢性の同種移植脈管障害(移植血管の動脈硬化によって特徴付けられる)の発生を促進する (Grattan MT、et al.、JAMA 1989; 261: 3561-3566; Everett JP、et al.、J. Heart Lung Transplant. 1992; 11: S133-S137)。インテグリン αvβ6 による TGF-β1 の活性化は病理学的変化に寄与し、慢性的に CMV に感染している組織における内皮細胞の機能を障害し得る (Tabata T、et al.、American Journal of Pathology. 2008;172:1127-1140)。マウス CMV(MCMV)の単回高容量による感染は、apoE-/- マウスにおいて、循環するインターフェロン-γ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子-αのレベルの初期の上昇に続いてアテローム性動脈硬化の病変の進行を悪化させることが実証されている (Hsich E、et al.、Atherosclerosis 2001;156: 23-8; Burnett MS、et al.、J Infect Dis 2001;183: 226-31)。動物モデルによって、CMV による感染が動脈硬化を加速させ得ることが確認されている(Stassen FR、et al.、J Clin Virol 2006; 35:349-353)。
【００４６】
クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)(Cpn):
Cpn 感染とアテローム性動脈硬化とをつなぐ最初の証拠は、冠動脈心疾患および急性心筋梗塞を有する個人が、心血管疾患を有さない個人よりも有意に高い Cpn 特異的 IgG 抗体の力価を有することが見出された、という知見から得られた (Saikku P、et al.、Lancet. 1988; 2: 983-986)。その後の研究により、Cpn 感染は、動脈の脂肪線条ならびに進行したアテローム性動脈硬化のプラークにおいて常在することが見出された(Shor A、et al.、S Afr Med. J. 1992; 82: 158-161; Kuo CC、et al.、J Infect Dis. 1993; 167: 841-849)。Cpn はアテローム性の組織のおよそ 50% から 60% において存在すると推定された一方、アテローム性動脈硬化の証拠を有さない患者からのサンプルにおける有病率は 5% 未満である (Shor A、Phillips JI. JAMA. 1999; 282: 2071-2073)。アテローム性動脈硬化の病変から該細菌を単離および培養することも可能であり(Ramirez JA. Ann Intern Med. 1996; 125: 979-982)、該病原体が生存可能なだけでなく活発に複製することもできることが示される。したがって、現在の主な証拠は、アテローム性動脈硬化における Cpn 感染の因果的役割を大いに示唆している。症例対照研究によって、特定の抗 Cpn 抗体のレベルが対照患者よりも CVD を有する患者において有意に高いことが明らかにされ、追跡研究によって、Cpn に対する高い抗体力価が臨床イベントのリスクの増大と関連することが示された (Virok D、et al.、Stroke 2001; 32:1973-6)。
【００４７】
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)(p. gingivalis):
アテローム性動脈硬化と主要な歯周病病原体であるポルフィロモナス・ジンジバリスとの間の有意な関連が示されている (Ford et al.、J Dent Res. 2007; 86: 35-40)。ポルフィロモナス・ジンジバリスは、高脂血症の動物においてアテローム性動脈硬化の病変の発生を加速することが示されている (Koizumi et al.、Infect Immun. 2008; 76: 2958-65)。
【００４８】
免疫療法の開発における細胞特異的ペプチド/HSP 複合体の使用
HSP は、タンパク質合成の間ならびにタンパク質の細胞内分解および除去の間に細胞内において生成される多数のペプチドと非共有結合性に結合する本来的な能力を有している。これらのペプチド/HSP 複合体のいくつかは表現型特異的であり、異常な細胞に対する免疫応答の生成のために用いられ得る (Xu、Thromb Vasc Biol 2002、22、1547-1559)。実際に、HSP の免疫学的機能は、特定の HSP (hsp70、hsp90 および gp96) が腫瘍から精製された場合に、その特定の腫瘍に対する免疫学的反応を誘発し得ることが観察された時に初めて発見された (Blachere et al、J Immunother 1993、14、352-356; Nieland et al、Proc Natl Acad Sci U S A 1996、93、6135-6139)。その後の研究により、免疫原性は HSP と複合体化した腫瘍特異的抗原性ペプチドに起因することが示された。提示のために抗原性ペプチドを保持することに加えて、HSP/抗原複合体はマクロファージおよび樹状細胞による炎症誘発性サイトカインの分泌ならびに樹状細胞の成熟を刺激した。これらの免疫学的特性は、癌および感染性疾患に対する免疫増強剤(immuno-adjuvant)としての HSP の使用における大きな興味を生み出した(Nieland et al、Proc Natl Acad Sci U S A 1996、93、6135-6139; Pockley、Expert Rev Mol Med、2001、1-21; Manjili、Front Biosci 2002、7、d43-52; Lamb、Atherosclerosis 2003、167、177-185; Lewis、Proc Natl Acad Sci U S A、2004、101、14653-14656)。HSP/抗原性ペプチドは切除された腫瘍組織から単離し、免疫化(自己免疫化)のために用いることができるため、これは個々の腫瘍に対して適用できるアプローチである。
【００４９】
より最近において、熱ショックタンパク質(特に Hsp70、Hsp90 およびカルレティキュリン)が、細胞内の自己ペプチドと非常に高い親和性で結合し、溶解によって細胞から放出され、Hsp 受容体 CD91 を発現する抗原提示細胞と結合することによって、潜在的に抗原性のペプチドを抗原提示細胞へと送達することが明らかとなった (Basu et al、2001 Immunity 14: 303-313)。溶解前の細胞ストレスは熱ショックタンパク質のレベルを増大させ、それによりこの効果を増大させる。細胞内の抗原に対する免疫応答の刺激がアポトーシス性またはプログラム細胞死ではなく壊死性細胞死に関連すること、およびこれが少なくとも部分的には抗原提示細胞のレベルで制御されていることが提案されている (Matzinger、1994 Annu Rev Immunol 12: 991-1045)。抗腫瘍応答に対して特異的に適用する場合、腫瘍細胞の非アポトーシス性(即ち壊死性)細胞死がより高いレベルの Hsp70 を誘導し、免疫原性の増大、炎症性の細胞内容物の放出、炎症誘発性の Th1-型サイトカインの分泌の増大およびマクロファージの活性化と関連することが示されている (Gough et al、2001 Cancer Research 61: 7240-7247)。他方、細胞内の巨大分子が細胞外の環境に曝される前に分解され、Hsp70、Hsp90 およびカルレティキュリンが有意な量では放出されないアポトーシス性細胞死(Basu et al、2000 Int Immunol. 12: 1539-1546.)は通常、炎症性応答および免疫応答を開始することができない。アポトーシス性ではなく壊死性の細胞溶解物は、免疫応答の開始においてナイーブ(naive) T 細胞を活性化するために重要な抗原提示細胞である樹状細胞の成熟を引き起こす(Galucci et al、1999 Nat Med 5: 1249-1255; Sauter et al、2000. J Exp Med 191: 423-434)。Hsp70 自身は、樹状細胞のための成熟因子であることが示されている (Kuppner、et al、2001 Eur J Immunol 31:1602-1609; Gastpar et al、欧州特許出願 EP1209226)。さらに、アポトーシス性細胞は、例えばフォスファチジルセリン受容体を介して、特定の抗炎症性および免疫抑制的シグナルを抗原提示細胞へ直接的に送達し得る(Fadok et al、2000 Nature 405: 85-90)。
【００５０】
本発明者らはこれまでに、タンパク質足場、例えばデンドロアスピン(dendroaspin)を用いていくつかの二官能性分子を開発している(WO 01/57210)。デンドロアスピンは、Dendroaspis jamesonii の毒液から単離された RGD含有毒液タンパク質である。デンドロアスピンは、良く定義された折りたたみ(fold)を有する３つのループを有する構造である。RGDを含有するループ III の配向は、他の短鎖神経毒、例えばエラブトキシン b における配向とは完全に異なっており、他の 2 つのループからずれている (図 1)。ループ II および III は様々なタンパク質ドメインの挿入のために用いられ、構造的調節に伴って様々な機能的特徴を示した。
【００５１】
口腔病理学および心血管疾患
ヒトおよび動物モデルについての疫学的研究により、冠動脈疾患(CAD)と口腔感染、特に歯周炎との間の関連の証拠が示されている (Matilla、BMJ 1989、779; de Stefano、BMJ 1993、306、Beck、J. Periodontol、1996 1123; Scannapeco、Ann. Periodontal 2003、38)。歯周炎は、歯肉膨張(gum inflation)(歯肉炎)および歯肉の進行性脱離(重度の歯周炎)から、歯の喪失につながる歯槽骨(bone alveolar)の密度の減少までの範囲を含む、慢性の破壊的炎症状態である。口腔の細菌、例えばポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、タンネレラ・フォーサイセンシス(Tannerella forsythensis)、トレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)およびカンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)は、該疾患の原因と関係づけられている。したがって、歯周組織の感染は、アテローム形成に寄与するサイトカインおよびリポ多糖のような炎症メディエーターの慢性的な貯蔵所を提供する。CAD の発病における伝統的な危険因子の役割は良く確立されているが、先進国および発展途上国の両方における該疾患の高い発生率および世界的な有病率を完全には説明できない。炎症は CAD において中心的役割を果たし、病原体は宿主における慢性の組織的炎症性応答を誘発することが伝統的に知られている(Danesh、Lancet 1997、350; Hoffmeister、J. Am Coll Cardiol、2000; 35-112)。
【００５２】
初期の疫学的研究は、血清学的サンプル(5-10)上で病原体を探すことによって、および歯肉下のバイオフィルムを用いる病原体ロード(load)の直接評価(Sphar、Arch Intern Med 2006; 166:554)または無菌キュベットを用いて回収した歯周の微生物叢の直接評価(Desvarieux、Circulation 2005; 11:576)によって、関連の直接的な実験的証拠に道を開いた。Fiehn J. Periodontal 2005;76:731 は、歯周病原体、特にプレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)の DNA の存在を検出したが、培養状態で生存している病原体を得ることはできなかった。FINRISK コホートからの 6051 人の個人の包括的な１０年間の追跡において(Pussinen、Atherosclerosis 2007;193:222)、細菌(リポ多糖-LPS)に誘導される内毒血症と CVD のリスクの増大をもたらす全身性の炎症との間の直接的関連が示されている。無症状の内毒血症は、e倍(e-fold)上昇した偶発的アテローム性動脈硬化および CVD のリスクを有することがこれまでに示されている。
【００５３】
南アメリカ(S. American)および日本の集団についての２つの独立した研究は、PCT に基づく検出法を用いて、同じ対象から得られた歯垢および心血管標本の両方におけるアクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス(A actinomycetemcomitans)の存在を示した一方(Padilla、J. Periodontal Res 2006;41:350; Nakano Oral Microniol Immunol 2007; 78:677)、口腔の病原体はアテローム性動脈硬化の冠動脈組織において検出されたが、バイパス手術の間に得られた内胸の生検サンプルにおいては検出されなかった (Pucar、2007 J. Periodontol 78:677)。男性および若年成人における虚血性脳卒中(Grau 2004; Stroke;U35:496)、頸動脈のアテローム性動脈硬化(Engerbretson 2005; Stroke; 36:561)ならびに偶発的脳卒中(Pussinen et al 2007)と、歯周炎との有意な関連についての報告がいくつか存在する。
【００５４】
関連は、B モード超音波技術を用いて評価される頸動脈の内中膜複合体厚(intima-media thickness)を測定する方法によって、口腔の生物、特にカンピロバクター・レクタスに対する IgG 抗体力価のレベルと初期の無症状のアテローム性動脈硬化の変化との間にも示されている (Beck 2005; circulation; 112:19; Mustapaha 2007; J. Perodontol; 78:2289)。有意な関連は、頸動脈のプラークとＸ線撮影によって評価された歯槽骨喪失との間にも観察された(Engebretson SP)。
【００５５】
口腔の病原体に対する免疫応答は、少なくとも初めは粘膜の免疫系によって媒介される。関与する主要な免疫グロブリンは、分泌型 IgA である(Underdown and Mestecky、1994)。抗体を形成する形質細胞は、翻訳後に J 鎖と結合する二量体の IgA を放出する。J 鎖は２つの IgA 分子を結びつけ、上皮細胞の基底(遠位の)面上に発現する ポリ-Ig 受容体への結合を促進する。該複合体はエンドソーム中において上皮細胞の管腔側まで輸送され、放出されて分泌される。分泌された IgA に保持されるポリ-Ig 受容体の部分は、分泌成分と呼ばれる。
【００５６】
分泌型 IgA は、粘膜へのウイルス、細菌および毒素の接着を阻止することによってそれらの吸収を妨げ、病原体が分泌液の流れまたは呼吸器の粘液線毛エスカレーター(mucociliary escalator)において流し出されることを可能にする。抗原特異的 IgA はまた、そうでなけば非分解性のエンドソーム輸送が病原体を宿主へと送達する可能性があるパイエル板の“M”細胞を横切る輸送の間、ウイルス性病原体を中和する (Owen and Jones、1974; Neutra and Kraehenbuhl、1994、Mazanec、1992)。
【００５７】
IgA は体によって合成される主要な免疫グロブリンであり、体の中で抗体を産生する細胞である形質細胞の７５パーセントが IgA を作り、そのほとんどは胃腸液、唾液、涙、尿および他の分泌物中へ連続的に放出される。
【００５８】
腸疾患を標的とする経口ワクチン接種の戦略は、1950年代におけるセービン(Sabin)経口ポリオワクチンの開発以来、周知である。原則として、粘膜経路を介した免疫原性形態の抗原の投与は、全身性耐性の発生の有無にかかわらず、抗原特異的分泌型 IgA の産生をもたらす。伝統的に、ワクチンは、死滅させた全病原体もしくは弱毒化した生きた生物の形態、または精製もしくは半精製された抗原であるいわゆるサブユニットワクチンの形態の抗原を含有する。各々の場合において、免疫原性を増大させるために、アジュバントまたは他の免疫刺激性成分を該抗原性調製物と併用し得る。
【００５９】
クラス I およびクラス II 主要組織適合性複合体(MHC)経路を介した T 細胞への抗原提示の分子的基盤の解明に続いて、ペプチド抗原を送達するより特異的な方法が探求されてきた。これらの中には、原理的に、膜に関連する MHC結合ペプチドを適切な T 細胞へ直接的に送達することができる、抗原パルスされた(antigen-pulsed)抗原提示細胞からのミクロソーム調製物の使用がある。このアプローチに伴うひとつの困難性は、一般的な方法によって調製される場合と同様、かかるミクロソームが通常、外側に面するのでなくミクロソームの内腔に面するよう配向した MHC 分子を含有することである。これを克服するため、ミクロソーム調製物の凍結融解のサイクルを繰り返すことによって調製される‘反転した’または‘裏返しの’ミクロソームが示唆されている (国際出願 WO2005/011730)。
【００６０】
様々なヘビ毒からの多くのタンパク質が、血小板凝集およびインテグリン依存性細胞接着の強力な阻害剤として同定されている。いわゆる“ディスインテグリン”ファミリーに属するこれらタンパク質の大多数は、高いレベルの配列相同性を共有し、小さく(4-8 kDa)、システインリッチであり、かつ、配列 RGD (Gould R J et al (1990) Proc Soc Exp Biol Med 195: 168-171) または KGD (Scarborough R M et al (1991) J Biol Chem 266: 9359-9362)を含む。ディスインテグリンファミリーに加えて、同様の阻害活性、高い程度のジスルフィド結合および小さなサイズを有する多数の非ディスインテグリン RGD タンパク質が、コブラ科のヘビの毒液(McDowell R S et al (1992) Biochemistry 31: 4766-4772; Williams J A et al (1992) Biochem Soc Trans 21: 73S) およびヒルのホモジネート(Knapp A et al (1992) J Biol Chem 267: 24230-24234)の両方から単離されている。これらのタンパク質は全て、単純な直鎖状 RGD ペプチドよりもおよそ 1000 倍強力な、糖タンパク質リガンドとインテグリン受容体との相互作用の阻害剤である; これは、タンパク質足場内に保持される RGD モチーフの最適に好ましいコンフォーメーションに起因する特徴である。キストリン(kistrin)(Adler M et al (1991) Science 253: 445-448; Adler M and Wagner G (1992) Biochemistry 31: 1031-1039; Adler M et al (1993) Biochemistry 32: 282-289)、フラボリジン(flavoridin)(Senn H and Klaus W (1993) J Mol Biol 234: 907-925)、エキスタチン(Saudek V et al (1991) Biochemistry 30: 7369-7372; Saudek V et al (1991) Eur J Biochem 202: 329-328; Cooke R M et al (1991) Eur J Biochem 202: 323-328; Cooke R M et al (1992) Protein Eng 5: 473-477)、アルボラブリン(albolabrin)(Jaseja M et al (1993) Eur J Biochem 218: 853-860)、デコルシン(decorsin)(Krezel A M et al (1994) Science 264: 1944-1947)およびデンドロアスピン(Jaseja M et al (1994) Eur J Biochem 226: 861-868; Sutcliffe M J et al (1994) Nature Struct Biol 1: 802-807)を含むいくつかの阻害剤の NMR 構造が報告されており、これまでに解明された唯一の共通する構造的特徴は、それらの阻害作用に対する主要な重要性の特徴である、溶媒に曝露されているループの末端に RGD モチーフが位置していることである。
【００６１】
RGD 配列を含む短鎖の神経毒類縁体であるデンドロアスピンと、全体的な配列相同性はほとんど示さないが RGD 配列に隣接する類似のアミノ酸(PRGDMP)を有するディスインテグリンのキストリンとは、どちらもフィブリノーゲンへの血小板の接着の強力な阻害剤であるが、固定化されたフィブロネクチンへの血小板の結合の弱いアンタゴニストである(Lu X et al (1994) Biochem J 304: 929-936)。対照的に、キストリンと 65% の配列相同性を有するが RGD の周囲において顕著に異なるアミノ酸(ARGDNP)を有するエレガンチン(elegantin)は、フィブリノーゲンではなくフィブロネクチンへの血小板の接着を優先的に阻害し、αIIbβ3 コンプレックス上のアロステリック的に異なる(allosterically distinct)部位と結合する。
【００６２】
Smith J W et al (1995) Journal of Biological Chemistry 270: 30486-30490 は、血小板インテグリンαIIbβ3 と結合する組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA)の変異体を構築するために、タンパク質“ループ移植(loop grafting)”実験を試みた。t-PA の上皮増殖因子(EGF)ドメインの表面のループにおけるアミノ酸が、接着性インテグリン受容体αIIbβ3に対して反応性のモノクローナル抗体の１つの CDR を形成する相補性決定領域(CDR)からの残基で置換された。得られた t-PA の変異体(ループ移植 t-PA)は、ナノモルの親和性でαIIbβ3と結合し、合成および天然の両方の基質に対して完全な活性を有した。ループ移植の効果および適用性は、全く予測できず、かつ不確かなものである。
【００６３】
デンドロアスピン足場は、修飾に役立つ。さらなる機能的アミノ酸配列、例えば凝固カスケードにおける因子のアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の活性の部分もしくはモチーフを取り込むためにデンドロアスピン(RGD モチーフを含む)が修飾される場合、得られる分子は抗凝血剤として特に有用であり、現存する抗凝血剤に付随する欠点に悩まされることがない(国際出願 WO 01/57210 を参照されたい)。かかるハイブリッドポリペプチドは、RGD モチーフを含み、かつデンドロアスピンの活性を付与する第１のアミノ酸配列、およびデンドロアスピンの活性以外の活性を付与するさらなるアミノ酸配列を含み得る。このようにして、該ハイブリッドデンドロアスピンに基づく分子は、例えば血小板凝集、ならびに凝固カスケードにおける１以上のさらなる構成要素(例えばトロンビン活性)または細胞内情報伝達カスケードにおける１以上のさらなる構成要素(例えば増殖因子)に対して活性であるよう、多機能性を付与され得る。
【００６４】
練り歯磨きとして製剤された、微生物感染を処置するための経口組成物が、US2003014909 に開示されている。
【発明の概要】
【００６５】
発明の開示
第１の側面において、本発明は、
i) キャリア部分;
ii) 抗アテローム応答を誘発することができる第一のエピトープ; および
iii) 抗アテローム応答を誘発することができる第二のエピトープ
を含み、該第一および第二のエピトープが互いに異なることを特徴とする組換えタンパク質を提供する。
【００６６】
好ましくは、該第一のエピトープは、以下からなる群から選択されるポリペプチドに対する免疫応答を誘発することができる: アポリポタンパク質、血小板由来増殖因子、熱ショックタンパク質、酸化型 LDL、コレステリルエステル転送タンパク質および β2-糖タンパク質 I。あるいは、該第一のエピトープは、以下からなる群から選択される病原体に対する免疫応答を誘発することができる: ヒト サイトメガロウイルス、クラミジア・ニューモニエ(chlamydia pneumonia)、ポルフィロモナス・ジンジバリスまたはストレプトコッカス・ニューモニエ(streptococcus pneumoniae)。
【００６７】
好ましくは、該第二のエピトープは、以下からなる群から選択されるポリペプチドに対する免疫応答を誘発することができる: 熱ショックタンパク質、血小板由来増殖因子、酸化型 LDL、β2-糖タンパク質 I、コレステリルエステル転送タンパク質およびアポリポタンパク質。あるいは、該第二のエピトープは、以下からなる群から選択される病原体に対する免疫応答を誘発することができる: ヒト サイトメガロウイルス、クラミジア・ニューモニエ、ポルフィロモナス・ジンジバリス、ストレプトコッカス・ニューモニエ。
【００６８】
好ましくは、該アポリポタンパク質(Apo)は ApoB1 または ApoB2 である。より好ましくは、該 Apob1 に対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 25 のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。好ましくは、該 Apob2 に対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 38 のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６９】
好ましくは、該熱ショックタンパク質(HSP)は HSP 60 または HSP 65 である。より好ましくは、該 HSP 60 はヒトの HSP 60 またはマイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)の HSP である。より好ましくは、該 HSP 60 に対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 9 から 21、26、28、29 または 33 のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００７０】
好ましくは、該血小板由来増殖因子(PDGF)に対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 1 から 9 または 22 のいずれか１つのアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００７１】
好ましくは、該コレステリルエステル転送タンパク質(CETP)に対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号39のアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００７２】
好ましくは、該ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)に対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 30 または 24 のいずれか１つのアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００７３】
好ましくは、該クラミジア・ニューモニエ(chlamydia pneumonia)は Cpn1 または Cpn2 である。より好ましくは、該 Cpn1 に対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 36 のアミノ酸を含むポリペプチドである。好ましくは、該 Cpn2 に対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 37 のアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００７４】
好ましくは、該ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 32 または 34 のいずれか１つのアミノ酸を含むポリペプチドである。好ましくは、該ストレプトコッカス・ニューモニエに対する応答を誘発することができるエピトープは、配列番号 23 のいずれか１つのアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００７５】
より好ましくは、該第一のエピトープは ApoB1 に対する免疫応答を誘発することができ、かつ、該第二のエピトープはヒト サイトメガロウイルスに対する応答を誘発することができる。
【００７６】
好ましくは、該キャリアタンパク質はデンドロアスピン足場である。あるいは、該キャリアタンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)である。
【００７７】
好ましくは、該第一のエピトープがデンドロアスピンのループ II の中に挿入され、かつ、該第二のエピトープがデンドロアスピンのループ III の中に挿入される。
【００７８】
好ましくは、該デンドロアスピン足場は、PDGF ループ I ペプチドに対する応答を誘発することができる第一のエピトープおよびサイトメガロウイルス pp65 ペプチドに対する応答を誘発することができる第二のエピトープを含む。より好ましくは、該デンドロアスピン足場は、デンドロアスピンのループ II の中に挿入された配列番号 22 およびデンドロアスピンのループ III の中に挿入された配列番号 27 を含む。あるいは、該デンドロアスピン足場は、PDGF ループ I ペプチドに対する応答を誘発することができる第一のエピトープおよびマイコバクテリウム・ボビス hsp60 ペプチドに対する応答を誘発することができる第二のエピトープを含む。好ましくは、該デンドロアスピン足場は、デンドロアスピンのループ II の中に挿入された配列番号 22 およびデンドロアスピンのループ III の中に挿入された配列番号 9-21 のいずれか１つを含む。より好ましくは、該デンドロアスピン足場は、デンドロアスピンのループ II の中に挿入された配列番号 22 およびデンドロアスピンのループ III の中に挿入された配列番号 26 を含む。あるいは、該デンドロアスピン足場は、PDGF ループ III ペプチドに対する応答を誘発することができる第一のエピトープおよびストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜多糖類(capsular polysaccharide)のペプチドミモトープ(mimotope)に対する応答を誘発することができる第二のエピトープを含む。好ましくは、該ペプチドミモトープは、タイプ 8 のストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類のペプチドミモトープである。より好ましくは、該デンドロアスピン足場は、デンドロアスピンのループ II の中に挿入された配列番号 1 およびデンドロアスピンのループ III の中に挿入された配列番号 23 を含む。
【００７９】
さらに好ましくは、本発明の組換えタンパク質は、該第一および第二のエピトープとは異なる、抗アテローム応答を誘発することができる第三のエピトープを含む。より好ましくは、該組換えタンパク質は、該第一、第二および第三のエピトープとは異なる、抗アテローム応答を誘発することができる第四のエピトープを含む。
【００８０】
さらなる側面において、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターが提供される。
【００８１】
さらなる側面において、本発明の組換えタンパク質および免疫原性の疎水性複合体を含む免疫原性組成物が提供される。好ましくは、該免疫原性の疎水性複合体は、単離されたミクロソームを含む。好ましくは、該免疫原性組成物は、MHC タンパク質を含む。好ましくは、該ミクロソームは反転ミクロソーム(inverted microsome)である。
【００８２】
さらなる側面において、ゲル、口腔粘膜ペースト(oromucosal paste)、練り歯磨きまたは洗口液(mouthwash)として製剤された、本発明の免疫原性組成物を含む医薬組成物が提供される。
【００８３】
好ましくは、医薬組成物は、ゼラチン、ペクチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレン樹脂および流動パラフィン(liquid paraffin)からなる群から選択される１以上の成分を含む。
【００８４】
さらなる側面において、本発明の組換えタンパク質、本発明のベクターまたは本発明の免疫原性組成物を含む医薬組成物が提供される。
【００８５】
さらなる側面において、医薬としての使用のための本発明の組換えタンパク質または本発明のベクターが提供される。
【００８６】
さらなる側面において、本発明の組換えタンパク質、本発明のベクター、本発明の免疫原性組成物または本発明の医薬組成物を投与することを含む、哺乳類において抗アテローム応答を誘発する方法が提供される。
【００８７】
さらなる側面において、治療上許容される量の本発明の組換えタンパク質、本発明のベクター、本発明の免疫原性組成物または本発明の医薬組成物を、それを必要としている個体に投与することを含む、アテロームを治療または予防する方法が提供される。
【００８８】
さらなる側面において、本発明の組換えタンパク質または本発明のベクターを含む抗アテロームワクチンが提供される。
【００８９】
さらなる側面において、哺乳類またはヒトに本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳類またはヒトの粘膜表面上における分泌型免疫グロブリンを誘導する方法が提供される。好ましくは、該投与は、免疫原性組成物の経時的な複数回投与(multiple dosages)を含む。
【００９０】
さらなる側面において、以下の工程を含む、対象とする１以上のエピトープに対する免疫応答を誘発する方法が提供される：
a. 該対象とする１以上のエピトープを含むデンドロアスピン足場タンパク質を構築し、該タンパク質を発現させる工程、
b. 真核細胞を該デンドロアスピン足場タンパク質と共にインキュベートする工程、
c. 該真核細胞を用いてミクロソームを調製する工程、
d. 該ミクロソームおよびデンドロアスピン足場タンパク質を１以上の医薬上許容される成分と組み合わせて、経口投与可能な(orally administerable)調製物を生産する工程、
e. 該調製物を哺乳類またはヒトに経口投与する工程。
【００９１】
本発明の詳細な説明
本発明を、以下の図を参照して詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図 1 は、デンドロアスピンのペプチド骨格およびその露出した３つのループの模式的構造を示す。
【図２】図 2 は、クローン 26、41、65、72 および 87 (10μM) ならびに 200μM の環状 PDGF ループ 1 ペプチド(cPDGF)を比較する細胞遊走阻害アッセイの結果を示し、全てが 20 ng ml-1 において PDGF と競合している。結果、セクション 3-a を参照されたい。
【図３】図 3 は、PDGF に誘導された細胞増殖に対する、(100μM および 40μM における)クローン 26、41、65、72 および 87 ならびに環状 PDGF ループ 1 ペプチド(cPDGF)の阻害効果を示す。セクション 3-b を参照されたい。
【図４】図 4 は、様々なコンストラクトの免疫反応性を示す。図 4A は、組換えタンパク質コンストラクト V1、2、3、4 および 6 を、抗 PDGF BB ポリクローナル抗体に対して滴定する。図 4B は、コンストラクト V1、2 および 7 を、(ストレプトコッカス・ニューモニエ ワクチンによって生産された)抗ストレプトコッカス・ニューモニエポリクローナル抗体に対して滴定する。セクション 3-c を参照されたい。
【図５】図 5 は、アジュバント対照マウス(A) ならびに Apo B (B)、hHSP (C) および Apo B+HSP (D) ペプチドで免疫化したマウスからの大動脈における、エラスチン・ファン・ギーソン(elastin/van Gieson)染色を用いて解析したアテローム性動脈硬化の病変を示す。(A、スケールバーは 20 μm を示す)。アジュバント対照と比較して、Apo B または HSP を用いた免疫化は、アテローム性動脈硬化の病変を減少させた(それぞれ 14.66% および 22.15%)。Apo B プラス HSP を用いた免疫化は、アテローム性動脈硬化の病変を有意に減少させた (41.34%、p = 0.0254)。
【図６】図 6 は、HSP、ApoB、HSP+ApoB およびアジュバント単独で免疫化したマウスのアテローム性動脈硬化の病変における CD68+ 細胞の総数(細胞/mm2)を示す。
【図７】図 7 は、注入から 9 週間後の免疫化されたマウスの抗血清を用いた抗原-抗体力価を示す。0 の時点において、最初の接種 10 μg タンパク質 + ミョウバン; 3 週間の時点において、２回目の接種 10 μg タンパク質 + 完全フロイントアジュバント; 5 週間の時点において、３回目の接種 10 μg タンパク質 + 不完全。
【図８】12800 倍希釈における抗原-抗体力価。抗原(41、65 および 72)をプレート上にコートし、各抗原の抗血清を滴定のためのポリクローナル抗体として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
１つの側面において、本発明は、本明細書に記載される組換えタンパク質の１つをコードする発現可能な核酸を含む発現ベクターを提供する。該ベクターは、DNA を細胞へ導入することができるあらゆるベクターであり得る。好ましくは、該ベクターは組み込みベクター(integrating vector)またはエピソームベクターである。
【００９４】
好ましい組み込みベクターとしては、組換えレトロウイルスベクターが挙げられる。組換えレトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノムの少なくとも１つの部分の DNA を含み、該部分は標的細胞に感染する能力がある。“感染”の用語は、ウイルスがその宿主または標的細胞へと遺伝物質を移入する過程を意味するために用いられる。好ましくは、本発明のベクターの構築において用いられるレトロウイルスは、ウイルスの複製の影響を標的細胞から除去するため、複製欠損性を付与される。かかる場合において、該複製欠損ウイルスゲノムは、常套の手法に従い、ヘルパーウイルスによってパッケージすることができる。一般的に、感染性および機能的遺伝子移入の能力という上記の基準を満たすあらゆるレトロウイルスを、本発明の実行において用いることができる。
【００９５】
適当なレトロウイルスベクターとしては、これらに限定されないが、当業者に周知の pLJ、pZip、pWe および pEM が挙げられる。複製欠損レトロウイルスのための適当なパッケージングウイルス株としては、例えば、ΨCrip、ΨCre、Ψ2 および ΨAm が挙げられる。特に適するレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり、特に HIV、SIV および FIV である。
【００９６】
本発明において有用な他のベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40 ウイルス、ワクシニアウイルス、HSV およびポックスウイルスベクターが挙げられる。好ましいベクターは、アデノウイルスである。アデノウイルスベクターは当業者に周知であり、気道上皮、骨格筋、肝臓、脳および皮膚を含む多くの細胞型(Hitt et al、1997 Advances in Pharmacology 40: 137-206; Anderson、1998 Nature 392: (6679 Suppl): 25-30) および腫瘍(Mountain、2000 Trends Biotechnol 18: 119-128) へと遺伝子を送達するために用いられている。
【００９７】
さらなる好ましいベクターは、アデノ随伴(AAV)ベクターである。AAV ベクターは当業者に周知であり、遺伝子治療適用のためにヒト T-リンパ球、線維芽細胞、鼻茸(nasal polyp)、骨格筋、脳、赤血球および造血幹細胞へ安定に形質導入するために用いられている (Philip et al、1994 Mol Cell Biol 14: 2411-2418; Russell et al,1994 Proc Natl Acad Sci USA 91: 8915-8919; Flotte et al、1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 10613-10617; Walsh et al、1994 Proc Natl Acad Sci USA 89 :7257-7261; Miller et al,1994 Proc Natl Acad Sci USA 91:10183-10187.; Emerson,1996 Blood 87、3082-3088)。国際特許出願 WO 91/18088 には、特定の AAV に基づくベクターが記載されている。
【００９８】
好ましいエピソームベクターとしては、一過性の非複製性エピソームベクターならびにウイルスの複製開始点、例えば EBV、ヒトパポバウイルス(BK) および BPV-1 からの複製開始点に由来する機能を有する自己複製性エピソームベクターが挙げられる。かかる組み込みベクターおよびエピソームベクターは当業者に周知であり、当業者に周知の文献において十分に記載されている。特に、適当なエピソームベクターは WO98/07876 に記載されている。
【００９９】
哺乳類の人工染色体も、本発明においてベクターとして用いることができる。哺乳類の人工染色体の使用は、Calos (1996 Trends in Genetics 12: 463-466) において考察されている。
【０１００】
好ましい態様において、本発明のベクターはプラスミドである。該プラスミドは、非複製性の非組み込みプラスミドであってもよい。
【０１０１】
本明細書において用いる場合、“プラスミド”の用語は、発現可能な遺伝子をコードするあらゆる核酸をいい、直鎖状または環状の核酸および二本鎖または一本鎖の核酸を含む。核酸は DNA または RNA であり得、修飾されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得、メチル化または保護基またはキャップもしくはテール構造の包含等の手段によって化学的に修飾され得る。
【０１０２】
非複製性の非組み込みプラスミドは、宿主細胞に移入された場合に複製せず、宿主細胞のゲノムへ特異的に組み込まれない(即ち、高頻度で組み込まれず、特定の部位へ組み込まれない)核酸である。
【０１０３】
複製性のプラスミドは、Ustav et al (1991 EMBO J 10: 449-457) の標準的複製アッセイを含む標準的なアッセイを用いて同定することができる。
【０１０４】
本発明はまた、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、あらゆる哺乳類細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、げっ歯類または哺乳類の細胞である。
【０１０５】
核酸縮合剤、エレクトロポレーション、アスベストとの複合体化、ポリブレン、DEAE セルロース、デキストラン、リポソーム、カチオン性リポソーム、リポポリアミン(lipopolyamine)、ポリオルニチン、微粒子銃(particle bombardment)および直接マイクロインジェクション(Kucherlapati and Skoultchi (1984 Crit. Rev. Biochem 16: 349-379); Keown et al (1990 Methods Enzymol 185:527-37)によって概説されている)の使用を含む多数の手法が知られており、本発明において本明細書に記載されるベクターを細胞へと送達するために有用である。
【０１０６】
本発明のベクターは、ウイルス性または非ウイルス性の送達手段を介して、非特異的または特異的に(即ち、宿主細胞の指定されたサブセットへ)宿主細胞へ送達し得る。好ましいウイルス起源の送達方法としては、ウイルスのパッケージングシグナルが操作された本発明のベクターのトランスフェクションレシピエントとしての、ウイルス粒子を生産するパッケージング細胞株が挙げられ、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびパポバウイルスのものが挙げられる。好ましい非ウイルス性遺伝子送達手段および方法も本発明において用いることができ、直接ネイキッド(naked)核酸注入、核酸縮合ペプチドおよび非ペプチド、カチオン性リポソームならびにリポソーム中への封入が挙げられる。
【０１０７】
組織へのベクターの直接送達が記載されており、短期間の遺伝子発現が達成されているものがいくつかある。筋肉(Wolff et al,1990 Science 247: 1465-1468)、甲状腺(Sikes et al、1994 Human Gene Therapy 5: 837-844)、メラノーマ(Vile et al、1993 Cancer Res 53: 962-967)、皮膚(Hengge et al (1995. Nature Genet 10: 161-166)、肝臓(Hickman et al (1994 Human Gene Therapy 5: 1477-1483) および露出後の(after exposure)気道上皮(Meyer et al、1995)へのベクターの直接送達が、先行技術において明確に記載されている。
【０１０８】
ウイルスのエンベロープタンパク質のアミノ酸配列に由来する様々なペプチドが、ポリリジン DNA 複合体と共に投与される場合の遺伝子導入において用いられており(Plank et al、1994 J Biol Chem 269: 12918-12924; Trubetskoy et al、1992 Bioconjugate Chem 3: 323-327; WO 91/17773; WO 92/19287; and Mack et al、1994 Am J Med Sci 307: 138-143)、ポリリジン複合体とカチオン性脂質との共縮合(co-condensation)が遺伝子導入効率の改善をもたらし得ることが示唆される。国際特許出願 WO 95/02698 は、カチオン性脂質遺伝子導入の効率を増大させる試みのためのウイルスの構成成分の使用を開示している。
【０１０９】
本発明において有用な核酸縮合剤としては、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、カチオン性ペプチド、カチオン性非ペプチド、例えばポリエチレンイミン(PEI)およびポリリジンが挙げられる。‘スペルミン誘導体’とは、スペルミンの類縁体および誘導体をいい、国際特許出願 WO 93/18759(1993年9月30日公開)において示される化合物を含む。
【０１１０】
ジスルフィド結合が、送達媒体のペプチド性構成成分を連結するために用いられている(Cotten et al,1992 Meth Enzymol 217: 618-644)。Trubetskoy et al.(前掲)も参照されたい。 
【０１１１】
細胞への DNA コンストラクトの送達のための送達媒体は、当該技術分野において公知であり、例えば Wu and Wu (1988 J Biol Chem 263:14621)、Wilson et al (1992. J Biol Chem 267:963-967) および米国特許第5,166,320号に記載される、細胞表面の受容体に特異的な DNA/ポリカチオン複合体が挙げられる。
【０１１２】
核酸縮合ペプチドを用いる本発明のベクターの送達が考慮される。ベクターを縮合させ、該ベクターを細胞へ送達するために特に有用な核酸縮合ペプチドは、国際特許出願 WO 96/41606 に記載されている。WO 96/41606 に記載される通り、官能基を、本発明のベクターの送達に有用なペプチドへ結合させ得る。これらの官能基としては、特定の細胞型を標的とするリガンド、例えばモノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質または糖が挙げられる。こうして該リガンドは、非特異的様式または細胞型に関して制限される特異的様式において、細胞を標的とし得る。
【０１１３】
官能基はまた、脂質、例えばパルミトイル、オレイルまたはステアロイル; 中性親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)またはポリビニルピロリジン(polyvinylpyrrolidine)(PVP); 融合ペプチド、例えばインフルエンザウイルスの HA ペプチド; またはリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含み得る。官能基はまた、細胞内輸送タンパク質、例えば核局在化配列(NLS)、エンドソームエスケープシグナル(endosome escape signal)、例えば膜破壊(membrane disruptive)ペプチド、またはタンパク質を直接細胞質へ向けるシグナルを含み得る。
【０１１４】
また、本明細書に記載される組換えタンパク質または発現ベクターを投与することを含む哺乳類において抗アテローム免疫応答を誘発する方法、ならびに該タンパク質または発現ベクターを含む抗アテロームワクチンが提供される。
【０１１５】
また、処置を必要としている個体に治療上有効量の本明細書に記載される組換えタンパク質または発現ベクターを投与することを含む、アテロームを治療または予防する方法が提供される。
【０１１６】
本発明は、組換えタンパク質足場/キャリア分子を提供する。好ましくは、該足場は１以上の挿入された非キャリア/足場エピトープ、つまり、他のタンパク質からのアミノ酸配列を含む。かかる配列は、組換え DNA 技術によって、または人工ペプチド合成を通して、都合良く挿入し得る。好ましくは、該キャリア/足場分子は、２以上の挿入された非キャリア/足場エピトープ、あるいは３以上、または４以上の挿入された非キャリアエピトープを含む。好ましくは、該キャリアはデンドロアスピン足場である。
【０１１７】
１つの側面において、本発明の免疫原性組成物は、ヒトの hsp60、マイコバクテリウム・ボビス(M bovis)の hsp 60、hsp65、ポルフィロモナス・ジンジバリスの hsp、PDGF、oxLDL、サイトメガロウイルスのタンパク質 pp65、ApoB および CETP からなる群のタンパク質からの１以上のエピトープまたはストレプトコッカス・ニューモニエの多糖のペプチドミモトープを含むデンドロアスピン分子を含む。好ましくは、該デンドロアスピン分子は、配列番号 1 から 33 のうちの１以上を含み、好ましくは配列番号 1、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32 または 33 のうちの１以上を含み; より好ましくは表 3 に示されるコンストラクトのうちの１つを含む。
【０１１８】
また、上記の免疫原性組成物のいずれかを１以上の医薬上許容される賦形剤と共に含むワクチン組成物が提供される。好ましくは、該ワクチン組成物は、経口ワクチン組成物である。
【０１１９】
アテロームおよびアテローム性動脈硬化に対する効果的なワクチンは、アテローム性動脈硬化に関連する自己免疫抗原(感染性物質または新生抗原(neoantigen)の分子擬態)に対して反応性の抗体と、増殖因子および PDGF の走化性作用を中和することができる抗体とを組み合わせることによって開発することができる。特に、熱ショックタンパク質と、アテロームに関連する分子、例えば PDGF、または泡沫細胞特異的抗原との両方に結合するタンパク質の部分は、抗アテローム免疫応答を増強するよう機能する。原理的に、かかる二特異性の結合が可能なあらゆる分子を、かかる治療的または予防的な免疫応答を増強または開始する基礎として用いることができるが、１つの簡便なアプローチは、熱ショックタンパク質とアテロームに関連する抗原との両方に結合することができるタンパク質結合ドメインを有する組換えタンパク質を設計することである。この概念の１つの特に有用な態様は、両方の標的に結合することができる組換え二特異性抗体分子である。かかる二特異性抗体は、当然、精製された別々の単一特異性抗体の直接的化学結合によっても生産することができる。
【０１２０】
いかなる理論またはメカニズムにもとらわれることなく、いくつかの熱ショックタンパク質は抗アテローム標的抗原、二特異性結合タンパク質および熱ショックタンパク質の複合体を、特異的受容体(CD91)への結合によって抗原提示細胞、特に樹状細胞へ標的化するよう作用する可能性があり、そのため、かかる二特異性結合タンパク質または抗体は、抗アテローム免疫応答を誘発するのに特に効果的である。
【０１２１】
熱ショックタンパク質に結合することができる第一の部分および抗アテローム免疫応答を誘発することができる第二の部分を含む組換えタンパク質もまた、本発明に包含される。好ましくは、該第二の部分は抗 PDGF 免疫応答を誘発することができ、より好ましくは、該第二の部分は PDGF 結合ドメインを含む。あるいは、該第二のドメインは抗泡沫細胞免疫応答を誘発することができ、好ましくは泡沫細胞抗原結合ドメインを含む。好ましくは、該タンパク質の第一の部分は hsp60 または hsp65 に結合することができる。特に好ましい態様において、タンパク質は、二特異性抗体またはその二特異性機能性断片を含む。
【０１２２】
熱ショックタンパク質に結合することができる第一の部分および PDGF 由来の免疫原性エピトープを含む第二の部分を含む組換えタンパク質もまた、本発明に包含される。あるいは、該第二の部分は泡沫細胞抗原からの免疫原性エピトープを含む。好ましくは、該組換えタンパク質は、熱ショックタンパク質に特異的な１以上の抗原結合部位を含み、かつ、抗体のいくつかの他の非抗原結合性の部分においてコードされる、アテロームに関連する抗原、例えば PDGF または泡沫細胞特異的抗原に特異的な１以上のエピトープをも含む、抗体またはその機能性断片である。
【実施例】
【０１２３】
二特異性ワクチンの開発
1) PDGF エピトープの選択
1-a) Atherovax の開発において用いたペプチド配列
PDGF-BB のループ I および III における残基に対応する一連のペプチドを、研究所において、 Atherovax の開発において抗原として調製した (Oefner et al、EMBO J 1992、11、3921-3926; Sun et al、Annu Rev Biophys Biomol Struct 1995、24、269-291; LaRochelle et al、J Biol Chem 1992、267,17074-17077; Brennand et al、FEBS Lett 1997、413、70-74; Patel et al、J Pept Res、1999、53、68-74)。さらに、該ペプチドのうち特定のものは、真皮の線維芽細胞において DNA 合成を刺激することが示された。これらに基づいて一連の環状ペプチドをも調製し、そのうちの１つは PDGF に誘導される DNA 合成を阻害することができ、かつ、アポトーシスを誘導することができた。該環状ペプチドは、その細胞増殖を阻害する能力と細胞上における PDGF 受容体の存在との間の相関を示した。
【０１２４】
1-b) ペプチド合成のための一般的方法
ペプチドは、Fmoc ストラテジーを用い、連続フロー固相合成によって合成される。切断および脱保護の前に、N,N-ジメチルホルムアミド中の 45% 無水酢酸を用いて 30 分間、N-末端の封鎖を行う。アリルに基づく Glu の保護を用いて、線上で(on line)ペプチドの環化を行う。N-Fmoc 基の除去の後、製造者の説明書に従い、O-(7 アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェートおよび 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(azabenzotrizole)を用いて頭-尾(head to tail)の環化を行う。0.1% トリフルオロ酢酸中の 10-60% アセトニトリルの 30 分の勾配を用いる Vydac C18 カラム(22×250 mm)上での逆相 HPLC によって、ペプチドを精製する。精製されたペプチドの同定および性質決定は、分析的逆相 HPLC および ESI 質量分析を用いて行う。ペプチド配列の例および定めた合成ペプチドの番号を、表 1 に示す。
【０１２５】
【表１】
0005654446.tif 000002
【０１２６】
2) HSP65 エピトープの選択
Wick および同僚による先駆的な研究(Wick et al、Immunol Today. 1995、16、27-33)によって、ヒトおよび実験的アテローム性動脈硬化における、HSP65/60 に対する抗体応答および細胞媒介性(cell-mediated)免疫反応性が明らかにされた。oxLDL とは対照的に、HSP65 による非経口の免疫化はアテローム性動脈硬化を悪化させ(Xu et al、Arterioscl Thromb. 1992、12、789-799)、HSP65-反応性の細胞の移植も、高コレステロール血症の動物モデルにおいて疾患を加速する (Shoenfeld et al、J Autoimmun. 2000、15、199-202)。近年の研究により、ヒト HSP60 および bovis HSP65 (Uray et al、Int Immunol. 2003、15、1229-1236)が病原性の原因であるエピトープを有し得、かつ、例えば関節炎(Ulmansky et al、J Immunol. 2002、168、6463-6469)およびアテローム性動脈硬化(Perschinka et al、Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003、23、1060-1065)において疾患誘導に対する抵抗性を与えることが示唆されている。ヒト HSP60 および bovis HSP65 のエピトープは、その抗原性について試験されている。エピトープ選択は、β-ターン二次構造の高い可能性および疎水性の低い可能性を有するタンパク質セグメントに基づいていた(Uray et al、Int Immunol. 2003,15,1229-1236)。ペプチド配列の例および定義した合成されるペプチドの番号を、表 2 に示す。
【０１２７】
【表２】
0005654446.tif 000003
【０１２８】
3) ワクチンコンストラクトの最初の結果
3-a) 組換えデンドロアスピン足場免疫原の発現
PDGF および/またはストレプトコッカス・ニューモニエ 、CMV、ApoB または M bovis hsp60 由来のペプチドがループ 2 および/または 3 の中に移植されたデンドロアスピン足場を含む多数の組換え免疫原(表 3 に示す)を作成した。該デンドロアスピン分子は、その上へペプチド配列を移植するのに有用な足場を提供する。それは、移植されたペプチド配列の発現および提示を可能にする３つの露出したループを有する(図 1 参照)。かかる組換えキメラデンドロアスピンコンストラクトは、標準的な方法によって、原核生物の発現系においてグルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質として都合良く発現される。
【０１２９】
タンパク質の発現
組換えタンパク質の発現を、先に記載した通りに行った(Lu et al、2001; BJ)。簡潔には、500 ml の培養液(2YT 培地プラス終濃度 100 μg/ml のアンピシリン)に 1 ml の種培養を接種した。該培養を、37℃において振盪しながら(250 rpm)終夜増殖させた。1 リットルの新鮮な 2YTamp を添加し、該培養を 37℃においてさらに 3 時間インキュベートした。IPTG を 0.1 mM の終濃度まで添加し、該培養を、Sorvall (GS-3) ローター中における 4℃での沈降(6000 rpm 15 分)の前に、30℃においてさらに 4 時間インキュベートした。ペレットを -20℃において保管した。
【０１３０】
タンパク質の精製
親和性精製: GST-組換えタンパク質を、グルタチオン-セファロース 4B カラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、遠心分離後に超音波処理した細胞の上清から精製した。グルタチオンセファロース 4B は、グルタチオン S-トランスフェラーゼの組換え誘導体または他のグルタチオン依存性タンパク質の迅速な一段階精製のために設計されている。細胞を、以下の阻害剤を有する PBS 中に溶解した: トリプシン阻害剤 (50 mg/ml)、ペプスタチン (10 mg/ml)、アプロチニン (10 ml ストック)、EDTA (0.5 M) および PMSF (EtOH 中における 100 mM)。超音波処理の後(氷上で 4 回超音波処理、30 ml 容量の細胞混合物に対し、各回 50 秒)、10 % の Triton-X 100 溶液を添加し、氷上に 10 分間置いた。Sorvall RC-5B 遠心機においてローター SS-34 を用い、16,000 x g で 30 分間遠心分離を行った。次いで上清を回収し、精製カラム上にロードした。該カラムを、PBS およびトリス-HCl(pH 8.0)バッファーで洗浄した。50 μM のグルタチオンを含有するバッファーを用いて、タンパク質を溶出した。タンパク質産物のピークレベルを回収し、プールし、4 ℃における 12 時間の第Xa因子による消化(1:300、w/w、第Xa因子：融合タンパク質)によって、突然変異体-ADAM を GST-融合タンパク質から遊離させた。産物を、逆相 HPLC によって精製した。
【０１３１】
HPLC 精製: 
第Xa因子切断の後、画分を Vydac C18 逆相 HPLC 分析カラム(TP104)上にロードし、0.1 % TFA を含有する 0-26 % のアセトニトリルの勾配(毎分 1.78 %)およびその後の 0.1 % TFA 中の 26-36 % アセトニトリルの勾配(毎分 0.25 %)を用いて溶出した。活性な画分を機能アッセイによって同定し、均一性のために再度クロマトグラフに供した。精製されたタンパク質を、最初に質量分析によって確認した。
【０１３２】
【表３−１】
0005654446.tif 000004
【表３−２】
0005654446.tif 000005
【表３−３】
0005654446.tif 000006
【０１３３】
3-b) 細胞遊走アッセイにおける、組換え免疫原の PDGF と競合する能力
細胞遊走阻害アッセイ: 
孔径が 8 μm、インサートの直径が 6.5 mm の Transwell プレート(Corning Life Sciences)を用いて、細胞遊走阻害アッセイを行った。コンフルエントな細胞を、実験の前に 0.5 % BSA を有する無血清 DMEM 培地中で 24 時間維持した。プレートも、24 時間前に 100 μg/ml の Invitrogen の溶液 100 μl を用いてコートした。トリプシンを用いて細胞を回収し、細胞数を決定し、遠心し、1 x 10 6 細胞/ml の密度で再懸濁した。次いで、細胞の添加の前に、両方のチャンバーを 30 分間プレインキュベートした。100 μl の容量の細胞を上部チャンバーに置き、化学誘引物質 PDGF (A15 を伴うまたは伴わない)を下部チャンバーに添加した。37℃、5 % CO2 における 16 時間のインキュベーション期間の後、膜の上面からの細胞を除去し、下面からの遊走した細胞をメタノール中で固定し、Diff-Quik 溶液を用いて染色した。次いで、膜を顕微鏡スライド上に乗せ、5 つのランダムな視野において 40 x の倍率で計数した。
【０１３４】
結果: 
図 2 は、20ng ml-1 の PDGF 単独(100%)と比較した、遊走する細胞のパーセンテージとして表される細胞遊走阻害アッセイの結果を示す。したがって、低い値は、PDGF 受容体結合ドメインを提示する組換えタンパク質(10μM)による PDGF の効果の競合的阻害の成功を示す。効果的であることが知られている環状 PDGF ループ I ペプチド(TROM と称する)を、より高い濃度(200μM)で比較している。
【０１３５】
3-c) PDGF 様の増殖効果
細胞増殖アッセイ-MTT アッセイ: 
黄色のテトラゾリウム MTT (3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド) は、代謝的に活性な細胞によって、部分的には脱水素酵素の作用によって還元されて、還元当量(reducing equivalent)、例えば NADH および NADPH を生成する。その結果得られる細胞内の紫色のホルマザンは可溶化することができ、分光光度的手段によって定量することができる。このプロトコールは、MTT アッセイキットのためのマニュアルではあるが、一般的な用途に用いることができる。MTT ストック溶液: フェノールレッドを含まない RPMI-1640 中における 5mg/ml の MTT (Promega)。この溶液は、0.2 mm のフィルターを通して濾過し、2-8℃において保管する。MTT 使用溶液: 該 5mg/ml ストック(フェノールレッドを含まない RPMI 中の MTT)の 1:10 希釈。1. 培養細胞を、フェノールレッドを含まない温かい RPMI-1640 で洗浄する。 2. MTT 使用溶液を調製する。 3. MTT 使用溶液をアッセイされるウェルに添加する、例えば 12-ウェルプレートの各ウェルに対し 1.0 ml。37℃において 30 分から 3 時間(この時間は細胞密度および細胞型に依存する)インキュベートする。 4. 付着した細胞を扱う場合には、インキュベーション期間の終わりに、培地を除去することができる。 5. 変換された色素を、1ml の酸性イソプロパノール(無水イソプロパノール中における 0.04 M HCl)を用いて可溶化する。ピペットで数回上下させて、変換された色素を完全に溶解させる。 6. 細胞を伴う該色素溶液を 1.5 ml のエッペンドルフチューブへ移し、13,000 rpm で 2 分間遠心する。 7. 上清を新しいエッペンドルフチューブへ移す。変換された色素の吸光度を、650nm のバックグラウンド減算を用いて、570nm の波長において測定する。測定には、分光光度計および使い捨てのプラスチックキュベットを用いる。
【０１３６】
結果:
図 3 は、cPDGF と比較した、5 つの免疫原コンストラクトの、PDGF に誘導される増殖に対する阻害効果を比較する。高い値は、最大の競合的阻害を示す。
【０１３７】
3-d) コンストラクトの免疫反応性
抗体および抗原の力価アッセイ: 
本発明者らは、組換えタンパク質(抗原)の特性決定のために、抗体および抗原の ELISA に基づくアッセイを用いる。ELISA アッセイを行うため、親和性カラムの後に GST-タンパク質を透析してトリスおよび NaCl を除去した。GST-タンパク質は、高濃度の塩(NaCl)を含有するため、凍結乾燥することができない。ELISA アッセイは、以下の工程を含む： 1. 予め決定した最大濃度の抗原を、マイクロタイタープレートへ吸収させる。コーティングバッファー中において希釈し、ウェルあたり 100 μl を 4℃において終夜インキュベートする。 2. 抗原溶液を吸引し、ウェルあたり 100 μl のブロッキング溶液で 15 分間インキュベートすることによってプラスチック上の非結合部位をブロッキングする。 3. 結合していない抗原を洗い流し、洗浄バッファーを用いてタンパク質を３回ブロックする。100倍希釈の抗体をプレートに添加する。 4. 結合していない抗体を、洗浄バッファーを用いて３回洗い流す。 5. HRP 標識二次抗体を推奨されたまたは予め決定した希釈において添加する。ウェルあたり 100 μl を周囲温度(ambient temperature)において１時間インキュベートする。 6. 結合していない標識を、洗浄バッファーを用いて３回洗い流す。 7. 酵素および基質を添加する。ウェルあたり 100 μl を、周囲温度において色が十分に発生するまでインキュベートする(理想的にはおよそ 30 分)。 8. 洗浄は行わない。50 μl の適切な停止溶液を添加し、マイクロタイタープレートを読み取るよう設計された分光光度計において視覚的または定量的に評価する。
【０１３８】
結果: 
図 4 A は、PDGF ループ I コンストラクト(表 3 に示すコンストラクト V2、V3、V4 および V6)の、抗 PDGF BB ポリクローナル抗体との飽和可能な(saturable)反応性を示す。PDGF ループ III コンストラクトである V1 は非反応性である。
【０１３９】
図 4B は、(肺炎レンサ球菌(Streptococca pneumoniae)ワクチンによって生成された)抗レンサ球菌ポリクローナル抗体を用いた同様のアッセイを示す。レンサ球菌の決定基を保有するコンストラクト V2 および V7 は反応性であり、V1 は陰性対照である。
【０１４０】
4) 多特異性ワクチンの生成
4-a) エピトープの選択
一連のエピトープを、アテローム性動脈硬化のタンパク質抗原(oxLDL および HSP)およびアテローム性動脈硬化の病原体(HCMV、Cpn およびポルフィロモナス・ジンジバリス(p. gingivalis))から得た。該エピトープの例を表 4 に示す。該エピトープを、上記セクション 1-b に記載した通りに調製した。
【０１４１】
【表４−１】
0005654446.tif 000007
【表４−２】
0005654446.tif 000008
【０１４２】
4-b) 多特異性ワクチンの調製
試験したエピトープの組み合わせの例を、表 5 に示す。
【０１４３】
【表５−１】
0005654446.tif 000009
【表５−２】
0005654446.tif 000010
【０１４４】
上記のエピトープの組み合わせを有するキャリアタンパク質を含む多数の組換え免疫原を、該エピトープの組み合わせをキャリアタンパク質の中へ組み込むことによって作成した。該エピトープの組み合わせは、N-末端または C-末端のいずれかに連結させるか、または(上記セクション 3-a、Lu et al.、Thromb Haemost. 2006、96、642-651 に記載される通りに)デンドロアスピン足場のループ 2 および/または 3 の中へ移植するか、または(ペプチドおよび小さな組換え分子については)通常は N-末端に位置している Cys 残基を介して Megathura crenulata のキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)へ結合させた。ペプチドエピトープをコードする遺伝子コードを含有する各々の組換え免疫原の遺伝子を、フォワードおよびリバースプライマーの両方を用いて１ランまたは複数ランの PCR によって合成し、完全な遺伝子配列を作成した。GST 結合組換え分子を用いる場合、これらの分子をイオン交換カラム(DE52、陰イオン交換樹脂)によって精製し、pH 7.25 の 100 mM NaCl、50 mM トリス-HCl を用いて 4℃において溶出し、4℃において透析して塩を除去した。GST を有さない組換え分子は、上記セクション 3-a) に記載される通りに精製した。小さなペプチドエピトープの結合のために KLH を用いた。
【０１４５】
5) 多特異性ワクチンの活性
5-a) 動物モデルにおける免疫応答
組換え免疫原の、BALB/C マウスモデル、C57/BL6 マウスモデルおよび Apobtm2Sgy Ldlrtm1Her/J KO-マウスモデルにおいて免疫応答を生み出す能力。マウスを、反復性の複数部位免疫化ストラテジー(repetitive, multiple site immunization strategy)(RIMMS)を用いて免疫化した。10 頭の 6-8 週齢の BALB/c マウスの群に、それぞれ 5 回、フロイントアジュバントと混合された 4 μg の組換え免疫原を接種した。免疫化は、0、2、5、7 および 9 日目に、8 つの部位へ、皮下に行った。12 および 21 日目に、抗体応答を試験するために血液サンプルを回収する。組換え分子を最初に Balb/C または C57/BL6 マウスにおいて試験して免疫応答を観察し、その後、それらの免疫応答に基づいて、該分子を KO マウスにおいてさらに試験し、アテローム性動脈硬化に対するこれらのペプチドの効果を調査した。
【０１４６】
免疫化されたマウスおよび未処理のマウスの血清サンプルを、抗原でコートされた ELISA プレート上において 1:100(または200)の希釈における OD 値を用いて、IgG 抗体について試験した。陽性のカットオフ値は、未処理マウスの血清の平均 OD + 3xSD として算出した。対照抗原よりも高い OD を示す血清サンプルを陽性とみなし、他のものは、(450 nmにおける) OD 読み取りが≧1となる血清の最高希釈によって決定される。この点に関し、力価は、非免疫反応性 (＜ 200)、低免疫反応性 (200 ≦ 力価 ＜ 800)、良好な免疫反応性 (800 ≦ 力価 ＜ 3200) および非常に良好な免疫反応性 (力価 ≧ 3200)として評価できる。
【０１４７】
RIMMS の結果を、以下の表 6 に示す。
【０１４８】
【表６】
0005654446.tif 000011
【０１４９】
5-b) ApoB および Hhsp60 二特異性ワクチンの活性
ApoB-100 を発現する LDL 受容体欠損マウスを、ApoB1(IEIGLEGKGFEPTLEALFGK、配列番号25)および hHSP60(AELKKQSKPVT、配列番号26)に由来する２つのペプチドの組み合わせを用いて免疫化した。二特異性組換え免疫原を用いる免疫化は、アテローム性動脈硬化の病変の進行からの相乗的な保護を提供することが示された。
【０１５０】
5-c) 免疫応答
Apobtm2SgyLdlrtm1Her/J マウスを、キャリアタンパク質としてのキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と結合した ApoB および hHSP エピトープの組み合わせを用いて免疫化した。該ペプチドは、組み合わせて二特異性免疫原として、または完全/不完全フロイントアジュバントと共に単一の形態において、与えた。マウスに高脂肪の食餌を 7 週間与え、その後屠殺した。ELISA によって、ペプチド-特異的抗体応答を血清中において検出した。以下の表 7 に示す通り、両方のペプチドの組み合わせを用いる免疫化によって誘導された抗体レベルは、ApoB または hHSP ペプチドのいずれかを用いる免疫化によって得られた値と同様の OD 値を示した。
【０１５１】
【表７−１】
0005654446.tif 000012
【表７−２】
0005654446.tif 000013
【０１５２】
5-d) 抗アテローム性動脈硬化効果
図 5A-D に示される通り、大動脈の組織を組織学的に解析した。結果: 組織学的解析により、大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化の病変は、対照マウス(図 5A)におけるよりも、２つのペプチドの組み合わせを用いて免疫化したマウス(図 5D)において、サイズが 41.34% 小さいことが明らかとなった。病変は、ApoB1 ペプチド単独での免疫化の後では対照マウスよりも 14.66% 小さく(図 5B)、hHSP60 ペプチド単独での免疫化の後では対照マウスよりも 21.15% 小さかった(図 5C)。
【０１５３】
これらの結果は、二特異性免疫原における ApoB1 および hHSP ペプチド抗原の組み合わせが相乗効果を生み出し、このマウスモデルにおいてアテローム性動脈硬化の病変を減少させることができることを実証する。
【０１５４】
5-e) マクロファージのレベル
Apobtm2SgyLdlrtm1Her/J マウスにおけるアテローム性動脈硬化の病変へのマクロファージの浸潤を、抗 CD68 を用いる染色によって定量した。組織サンプルの切片(厚さ 5 μm)をヘマトキシリン・エオシン(H.E.)を用いて染色し、光学顕微鏡で観察した。マクロファージのレベルを、アジュバントのみを用いて免疫化したマウス(対照)、ApoB のみを用いて免疫化したマウス、hHSP60 のみを用いて免疫化したマウスおよび二特異性 ApoB1 + hHSP60 免疫原を用いて免疫化したマウスから得たサンプルにおいて比較した。
【０１５５】
各マウス群からのアテローム性動脈硬化の病変において見出されたマクロファージの相対数を、図 6 に示す。組織免疫学的解析の結果は、アテローム性動脈硬化の病変内において見出されるマクロファージ(CD68+ 細胞)の数が、HSP60 または apoB1 のいずれか単独で免疫化したマウスにおいて見られるマクロファージの数よりも HSP60 および apoB1 の二特異性免疫原を用いて免疫化したマウスにおいて少ないことを実証している。これにより、二特異性免疫原を用いて免疫化した動物は、HSP60 または apoB1 のいずれか単独で免疫化したマウスよりもアテローム性動脈硬化の病変の形成が少ないことが示唆された。
【０１５６】
5-f) ApoB1、Hhsp60、cpn 1 および cpn 2 の四重特異性(tetra-specific)ワクチンの活性
BALB/c マウス(雌、6 週齢)を、デンドロアスピン足場中に ApoB1 ペプチド1、hHSP60、cpn 1 および cpn 2 を含む四重特異性 GST 結合免疫原を用いて免疫化した。
【０１５７】
該四重特異性免疫原をコードする核酸コンストラクトを PCR によって合成し、PGEX-3X ベクター中にクローニングした。該タンパク質を GST 融合タンパク質として大腸菌において発現させ、親和性およびイオン交換カラムによって精製した。該 GST-四重特異性免疫原を、フロイントアジュバントと組み合わせて、BALB/C マウスの免疫化のために用いた。ペプチド特異的抗体のレベルを ELISA によって明らかにし、その結果を以下の表 8 に示した。
【０１５８】
【表８】
0005654446.tif 000014
【０１５９】
免疫化した全てのマウスにおいて、高レベルの ApoB 特異的および Cpn 特異的抗体応答が検出されたが、一方、hHSP60 特異的抗体応答はいくぶん低かった。これらの知見は、該四重特異性免疫原が複数の抗原活性および特異性を有し、アテローム性動脈硬化に対する多価ワクチンの開発のために使用できることを示している。
【０１６０】
5-g) CETP + ポルフィロモナス・ジンジバリス(p.gingivalis) 二特異性ワクチンの活性
BALB/c マウス(雌、6 週齢)を、デンドロアスピン足場中に CETP ペプチド + ポルフィロモナス・ジンジバリス(p.gingivalis)からの選択されたエピトープを含む二特異性 GST 結合組換え免疫原を用いて免疫化した。
【０１６１】
該二特異性免疫原をコードする核酸コンストラクトを PCR によって合成し、PGEX-3X ベクター中へクローニングした。該タンパク質を GST 融合タンパク質として大腸菌において発現させ、親和性およびイオン交換カラムによって精製した。該 GST-二特異性免疫原を、フロイントアジュバントと組み合わせて、BALB/C マウスの免疫化のために用いた。 
【０１６２】
BALB/c マウスを、4 μg の該二特異性免疫原を用いて各々 5 回、免疫化した。免疫化は、0、2、5、7 および 9 日目に、8 つの部位へ、皮下に行った。7 頭のマウスの群に、フロイントアジュバントと混合した該タンパク質を与えた。12 および 21 日目に、それぞれ、各々の免疫化群からの２頭のマウスを血液回収のために安楽死させ、その脾臓をホモジナイズし、さらなる試験のために凍結保存した。
【０１６３】
表は、異なる ELISA 抗原に対して測定した個々のマウスのサンプルの OD 値を示す。ペプチド特異的抗体のレベルを ELISA によって明らかにし、その結果を以下の表 9 に示した。OD 0,100 のカットオフ値を超える OD 値を、太字で示す。
【０１６４】
【表９】
0005654446.tif 000015
【０１６５】
これらの結果は、ポルフィロモナス・ジンジバリス(P. gingivalis)に対する二特異性免疫原が、相同な B-細胞タイプ1 の hHSP60 および B-細胞タイプII の hHSP60 のポリペプチドに対する免疫応答をも生み出すことができることを示す。
【０１６６】
6) ワクチンの開発
6-a) アプローチの概要
ワクチンの開発の広い特徴は以下の通りである。抗原を用いてマウスを免疫化し、生じた抗体を親和性カラムによって精製する。結合に関与する可変領域内の配列を、ハイブリドーマから単離された mRNA または単離された抗体の可変領域の mRNA をシークエンスすることによって同定する。これらの配列を、組換え抗体発現系へ組み込む。該抗体のアテローム性動脈硬化を阻止する能力を、動物モデルにおいて試験する。一揃えの HSP60 ペプチド(直鎖状または環状)を用いて BalbC マウスを免疫化する。最も高い阻害力価を生み出すペプチドを、その後マウスを免疫化するために用いる。必要であれば、組換え抗体ライブラリーをこの段階で用いる。上記の通り、抗体の親和性に関与する主要な配列を、DNA ワクチンの開発において用いる。上記の両方の組み合わせから、二特異性ワクチンを開発する。
【０１６７】
6-b-i) Fab / scFv の生産
二特異性分子を生成するために用いられる単鎖抗体(single chain variable fragment)(scFv) および Fab 組換え抗体の生産のために、融合が用いられる。ScFvs は、そのサイズの小ささに起因する、モノクローナル抗体を超えるいくつかの利点、例えば少ない腎臓取り込み、迅速な血液クリアランスおよびヒト免疫系による負の応答の低さを提供する。
【０１６８】
6-b-ii) モノクローナル細胞株からの scFv の構築
これは、高い親和性および選択性を有する抗体を発現するハイブリドーマからの mRNA の単離を含む。mRNA の単離は、単一のチューブにおいて、ポリアデニル化された RNA を、組織ライセートから直接、オリゴ(dT)25 結合磁性粒子へハイブリダイズさせることによって行う。MPG(登録商標) Direct mRNA Purification Kit (MDRK1010) または MPG(登録商標) Guanidine Direct mRNA Purification Kit (MGRK1010) のいずれかを、製造者の説明書に従って使用する。次いで、単離された mRNA を、分光光度法、ゲル電気泳動および完全溶液相(ultimately solution phase)RT-PCR によって、収量、純度および完全性(integrity)について解析する。モノクローナルからの mRNA をクローニングして、可変重鎖(Vh)および軽鎖(Vl)がその後そこから発現ベクターへとサブクローン化される cDNA ベクターを作成する。
【０１６９】
6-b-iii) 科学界(scientific community)によって、抗体ライブラリーからの scFv の構築が可能になった。一定のライブラリーが科学界によって利用可能になっており、これらを上記の手順に従って使用する。ライブラリーをスクリーニングし、特異性の高いモノクローナル抗体の同定の後、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を Vl および Vh 断片の源として用いる。上記の標準的方法を用いてハイブリドーマ mRNA を細胞から単離し、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いる逆転写(RT) PCR によって cDNA コピーを調製する。
【０１７０】
6-b-iv) 逆転写 PCR (RT-PCR) およびインビトロ転写
供給者の説明書に従い、Superscript 逆転写酵素(GIBCO/BRL)を用いて逆転写を行う。5%(vol/vol)のジメチルスルホキシドの存在下で、Taq DNA ポリメラーゼ(GIBCO/BRL)を用いて PCR を行う (94℃において 4 分、次いで、94℃で30秒、37℃で30秒および 72℃で2分の 3 サイクル、次いで、60℃において同様のサイクルを 10 回、72℃における伸長が１サイクル毎に 15 秒ずつ延長される、37℃の代わりに 60℃における同様のサイクルを 20 回、および 72℃における 10 分、で終了する)。
【０１７１】
6-b-v) インビトロの共役した(coupled)転写-翻訳
５巡目のリボソームディスプレイの後、PCR 産物を適当なベクター(例えば pTFT74)へクローニングした。S-30 大腸菌系におけるインビトロの共役した転写-翻訳を、50 μg/ml のプラスミド DNA および以下の改変を伴う上記と同様の条件を用いて行う。共役した転写-翻訳は 37℃において 30 分間行い、反応混合物には 2000 単位/ml の T7 RNA ポリメラーゼおよび 0.5 mM の UTP および TTP を補充する。混合物は、[35S]メチオニンを 50 αCi/ml (1 αCi = 37 kBq) で含み、メチオニンを除く各アミノ酸を 0.35 mM で含んだ。翻訳の後、反応混合物を PBS を用いて 4 倍に希釈し、マイクロタイターウェル中において、固定化された抗原ペプチドと結合させる。穏やかな振盪を伴う 60 分のインキュベーションの後、0.1% Tween 20 を含有する PBS を用いてマイクロタイターウェルを５回洗浄し、結合した放射性タンパク質を 0.1 M のトリエチルアミンを用いて溶出させる。溶出したタンパク質(抗体)を、シンチレーションカウンターにおいて定量する。
【０１７２】
6-b-vi) 抗体の発現
ラージスケールのタンパク質発現のために、選択された抗体配列を pGEX-3X または pET32b ベクター中にクローニングし、大腸菌を形質転換する。標準的な方法に従って、GST 融合タンパク質の発現および精製を行う。抗体を、真核細胞発現ベクター中にもクローニングし、真核細胞、例えば酵母において発現させる。
【０１７３】
6-c-i) ファージディスプレイによる CDR ライブラリーの作成
ファージディスプレイは、ヒトの抗体タンパク質をその表面上に‘提示’するよう、ファージを作る方法である。ヒトの抗体遺伝子ライブラリーからの遺伝子を、ファージの集団へ挿入する。各々のファージは異なる抗体の遺伝子を保有し、それにより、異なる抗体をその表面上に提示する。これらの遺伝子は回収することができ、抗体治療薬の前向きの開発および潜在的な製造における使用のために利用することができる。
【０１７４】
6-c-ii) リボソームディスプレイシステムによるエピトープの生産
“リボソームディスプレイ”により、無細胞系において、いかなる細胞、ベクター、ファージまたは形質転換をも用いずに、機能的全タンパク質をその結合機能について濃縮することができる新規な方法が開発された。この技術は、mRNA およびタンパク質産物の両方がリボソームから離れないインビトロの翻訳に基づいている。この技術は、リボソームディスプレイライブラリーの構築、抗体ライブラリーの一本鎖断片 scFv のインビトロの翻訳、リボソーム複合体の親和性による選択および RNA の単離、抗体の一本鎖断片の ELISA、修正された(corrected)突然変異体の存在についてのライブラリーの PCR 解析、タンパク質の発現、抗原のアフィニティークロマトグラフィー、ウエスタンブロット、競合 BIAcore による溶液中における抗原解離定数の決定等を含む。
【０１７５】
6-d-i) DNA ワクチン接種
選択されたエピトープまたは適切な抗体(二官能性抗体を含む)を発現させるために、DNA ワクチン接種を用いる。実験的には、これは哺乳類細胞トランスフェクションキットプロトコール(www.SpecialtyMedia.com)を用いて行う。ヒトの HSP65 またはマイコバクテリアの HSP65 および PDGF をコードする pcDNA (Invitrogen) ベクターを構築し、抗原の発現および DNA ワクチン接種のために用いる。トランスフェクションを、DNA を CaCl2 およびリン酸緩衝液と直接混合して微細な沈殿を形成させ、それを培養細胞上に分散させることを含むリン酸カルシウム媒介法によって行う。該リン酸カルシウムトランスフェクションのプロトコールは、様々な細胞型の一過性のおよび安定なトランスフェクションの両方のために、日常的に用いられる。
【０１７６】
6-d-ii) DNA ワクチン接種
裸の(naked) DNA の遺伝子銃または筋肉内(i.m.)注入プロトコールは、筋肉内の免疫化のために用いられる。
【０１７７】
7) 抗体の試験
7-a) ELISA: 各々の抗体の特性の追跡および定量を、標準的な ELISA の技法を用いて、各々の抗原に対してチェックする。
【０１７８】
7-b) 競合による、溶液中における抗原解離定数の決定
15,000 共鳴単位(resonance unit)の BSA-抗原複合体または対照としての BSA のみによってコートされたセンサーチップ CM5 (Pharmacia) を用いて、質量輸送(mass-transport)下において BIAcore 解析を行う。各々の結合-再生サイクルを、HBST(20 mM Hepes、pH 7.2/150 mM NaCl/0.005% Tween 20)を用い、25 μl/分の一定の流速を用いて行う。様々な量の抗原を含有する、HBST 中における 250 μl の抗体のサンプルを、該システムのサンプルループを用いて注入し、その後、HBST 中の 6 M の塩化グアニジウムを 20 μl 注入することによって表面を再生する。注入前における、4℃での、少なくとも 1 時間の、一連の濃度における抗体と抗原ペプチドとの共インキュベーションによって阻害試験を行う。データを、BIAEVALUATION ソフトウェア (Pharmacia) および KALEIDAGRAPH (Synergy Software、Reading、PA) を用いて評価する。直線状センソグラム(sensogram)の結合相の傾きを、対応する全抗原濃度に対してプロットする。
【０１７９】
7-c) 抗体の、アテローム性動脈硬化の病変形成を阻害する能力の決定
通常飼料における 10 週齢の雄の LDL 受容体(LDLR)欠損マウスを、適切な量の熱ショックタンパク質-PDGFペプチド複合体(前のセクションに記載した免疫原性実験から決定される)を用いて免疫化する。これらの動物の応答を、ペプチド単独、HSP 単独または緩衝液単独で免疫化した動物と比較する。２回目の免疫化を、1 週間後に行う。その後、動物を２つの群に分け、一方に通常の飼料を与え、他方に高コレステロールの食餌(1.25% コレステロール、0% コール酸塩(cholate); Research Diets)を与える。14 週間後に、マウスを殺し、血液を採取し、大動脈を除去し、0.9% NaCl を用いて灌流する。大動脈を 3 つの部分に解剖する - 基部および弓部はクライオスタット切片作成のために Tissue-Tek(登録商標) OCT Compound 中において急速凍結させ、腹部は 2% パラホルムアルデヒド中で固定する。定量化をコンピューター画像解析(Zeiss software)によって行う標準化された方法に従い、大動脈基部および胸腹部大動脈においてアテローム性動脈硬化の程度を評価する。これは、大動脈基部における互いに 50 μm 離れた 6 つの切片中の病変の平均領域の算出; およびこの脂質沈着の領域(スーダン IV によって染色される)を全弁表面で除算することを含む。スーダン IV を用いた標本において病変領域を染色し、腹側正中線に沿った縦方向の切開によって胸腹部大動脈を試験する。スーダン IV で染色された領域を全胸腹部表面で除算することによって、脂質沈着のパーセンテージを算出する。
【０１８０】
複数の群を含むデータセットを ANOVA によって解析する。分散の均一性についての F 検定を行った後、スチューデントの両側 t 検定によって 2 群間の平均値を比較する。データがパラメトリック t 検定の使用のための要件を満たさない場合には、マンホイットニー(Mann-Whitney)の U 検定を用いる。差異は、P<0.05 の値において統計的に有意であるとみなされる。
【０１８１】
8) 泡沫細胞を標的とすることができる二官能性ワクチンを生成するために用いられる、泡沫細胞によって生産される特定の HSP-ペプチド複合体の同定
8-a) インビトロの泡沫細胞モデル
これは、脂質がロードされた、ホルボールエステルによって分化した THP-1 マクロファージ (0.1μM/24h) および J774 マウスマクロファージ細胞株を用いる Kellner-Weibel らの方法に基づいている(Kellner-Weibel et al、Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998、18、423-431)。ヒト LDL を遠心分離によって血漿から分画し、Basu らの方法 (Basu et al、Proc Natl Acad Sci U S A 1976、73、3178-3182) によってアセチル化する。いくつかの実験において、単核白血球を調製するために、採取したばかりの(freshly drawn)血液から密度勾配を用いて単球画分を単離し、そこから磁性ビーズを用いるリンパ球のネガティブ除去(negative depletion)によって単球を分離する。細胞を、細胞における遊離コレステロールの迅速な蓄積をもたらすアシル補酵素 A:コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤(ACAT 阻害剤、58035)の存在下で培養する。
【０１８２】
8-b) 泡沫細胞からの精製された HSP の調製
20mM トリス-HCl (pH 7.9)、0.5 M NaCl、5mM イミダゾール、0.1% ノニデット(Nonidet) P-40 およびプロテアーゼ阻害剤を含有するバッファー中において超音波処理によって細胞を溶解し(100 ml の溶解バッファーあたり 109 細胞)、その後氷上で 0 分インキュベートする。ライセートを 10000xg で 1 時間遠心し、この工程からの上清を 100000g における 2 時間のさらなる遠心分離(Beckman Ti75 ローター)に供する。その後、個々の HSP の精製を上記の通りに行う (精製された熱ショックタンパク質)。
【０１８３】
8-c) 熱ショックタンパク質と結合する泡沫細胞特異的ペプチドの同定
精製の間、精製された HSP を洗浄して、ゆるく結合したあらゆるペプチドを除去する。次いで、結合したペプチドを、トリフルオロ酢酸を用いてタンパク質から溶離させ、表面増強レーザー脱離/イオン化(SELDI)質量分析を用いて解析する。(Ciphergen Biomarker System)。利用できるチップのタイプ(正または負の荷電、疎水性および金属キレート化を介する結合)の各々において、ペプチド画分を解析する。泡沫細胞の表現型において存在しない細胞と比較して増強したレベルを示すペプチドを、マトリックス支援レーザーによる一次構造の完全な同定のために選択する。切除された腫瘍組織から HSP/抗原性ペプチドを単離し、免疫化(自己免疫化)のために用いることができるため、これは個々の病変に適用できるアプローチである。
【０１８４】
8-d) アテローム性動脈硬化に対するワクチンとしての HSP-泡沫細胞特異的ペプチド複合体の調製
セクション中において PDGF ペプチドについて説明した手順に従い、HSP を、泡沫細胞に特異的であると同定されたペプチドの各々と複合体化する(酵素結合免疫吸着スポットアッセイ)。泡沫細胞の形成を阻止するかまたは確立された脂肪線条を逆行させる、泡沫細胞に対するワクチンとして作用するこれらの複合体の能力についても、上記と同様の方法(熱ショックタンパク質-PDGF 複合体の免疫原性の決定)によって決定する。
【０１８５】
8-e) HSP と PDGF または泡沫細胞の中和に特異的なペプチド抗原とを組み込むキメラ融合遺伝子に基づく DNA ワクチンの生産
DNA ワクチンの臨床の場への移行は、その限られた効力によって阻まれてきた。これは、プラスミド DNA の筋肉内または皮内注入の後、ミオサイトおよびケラチノサイトが優性にトランスフェクトされるためである。これらの細胞は、強い一次免疫応答を生み出す能力を欠いている。この欠点を克服するために提案された１つの方法は、骨髄由来の抗原提示細胞、特に樹状細胞を標的とすることである (Hauser et al、Gene Ther 2004、11、924-932; Liao et al、Mol Ther 2004; 9:757-64)。これは、抗原と HSP とのキメラ融合遺伝子を調製することによって可能であることが最近示された。このアプローチによって、強い T 細胞および B 細胞応答を生み出すことが可能であった。
【０１８６】
あるいは、その構造中に１以上の PDGF または泡沫細胞抗原エピトープを保有する特定の抗 Hsp 抗体をコードする、いわゆるトロイ体(troybody)コンストラクトを用い得る(Lauvrak et al、Biochem Soc Trans 2002、30: 500-506)。
【０１８７】
9) 経口ワクチン
抗原提示細胞(APC)、例えばマクロファージからのミクロソームは、その中でプロセスされた抗原 ペプチドが MHC と複合体化し、APC の表面上における最終的な提示のための他の因子と相互作用する細胞内コンパートメントである、細胞を含まない小胞体(ER)の膜小胞からなる。表面上に現れると、それらは T 細胞と相互作用し、該 T 細胞を刺激することができる。該技術の特に有用な点は、ER がインビトロにおいて既知の‘保護性’ペプチドを効率的に充填し、その結果、APC を模倣する、高レベルの、膜中に提示された正しく組立てられた MHC-ペプチド複合体を有するミクロソームをもたらすことである。ミクロソームは、レシピエントの中に注入することができ、そこにおいて直接的に T 細胞と相互作用し、該 T 細胞を刺激する。
【０１８８】
膜に結合した MHC-ペプチド複合体が、標準的な調製物における場合のように管腔側に向いているのではなく、ミクロソームの外表面上に提示される、反転または‘裏返しの’ミクロソームを生成することは特に有用である。かかる反転ミクロソームを生産するためのミクロソーム調製物の反復する凍結融解処理の使用は、当該技術分野において周知であり、以下において簡潔に要約される。
【０１８９】
9-a) バフィーコート(buffy coat)からの PBMC の精製
末梢血単核細胞(PBMC)を、健康な血液ドナーの新鮮なバフィーコートから、フィコール(Ficoll)密度遠心分離(Ficoll-Paque、Pharmacia、Uppsala、Sweden)によって調製する。バフィーコートを 0.9% NaCl において 1:2 に希釈し、35 ml を 15 ml のフィコールパック(Ficoll Paque)上に層状にし、400 g において 25 分間遠心した。細胞を、RPMI 1640 (Gibco、Grand Island、NY) 中において２回洗浄した。いくつかの実験のために、37℃における 2 時間のインキュベーションによって PBMC から接着性の細胞を枯渇させた。
【０１９０】
9-b) 樹状細胞の精製
樹状細胞(DC)を調製するため、PBMC を大きな細胞培養フラスコ中に移し、50 ml の RPMI 培地/3%/ヒト血清中において、加湿された細胞培養インキュベーター中で 37℃において 1 時間インキュベートする。1 時間後、懸濁状態の細胞をリンパ球画分として回収する一方、接着画分には単球が濃縮される。
【０１９１】
単球の DC への分化を達成するために、抗生物質を有し、800IU/ml の GM-CSF および 1000IU/ml の IL-4 が補充された新鮮な RPMI 培地/3%ヒト血清を単球へ添加し、3 日後に、培地を 1600IU/ml の GM-CSF および 1000IU/ml の IL-4 を含有する新鮮な培地に交換する。
【０１９２】
6 日目において、それぞれ抗原提示および DC の成熟を達成するために、抗原(ペプチドまたはタンパク質)および 10ng/ml の TNF-α の両方を添加する。9 日目において、成熟し、ロードされた(loaded)DC をその後の T 細胞刺激反応のために用いる。
【０１９３】
9-c) T 細胞の調製
抗-CD4-MACS(登録商標) 磁性ビーズカラムによって、リンパ球集団を CD4+ 細胞について濃縮する。MACS MicroBeads は、直径およそ 50 ナノメートルの超常磁性の粒子である。それは生分解性のマトリックスで構成されており、そのため、分離工程の後にそれを細胞から除去する必要がない。精製された CD4+ T 細胞を、20-50 IU/ml の組換えヒト IL-2 と共に培養状態に維持するか、またはさらなる使用の時まで凍結させる。成熟し、ロードされた DC を、T:DC が 10:1 の割合における自己 CD4+ T 細胞との共培養の前に、マイトマイシン C と共にインキュベートし、24 時間インキュベートする - その 4 日後、応答を媒介した細胞を、細胞内染色または Elispot によって測定される IFN-γ(Th1) および IL-4(Th2)についてのサイトカインプロファイル解析によって測定する。T 細胞の増殖を、CFSE 標識、BrdU 処理またはチミジン取り込みアッセイによって測定する。
【０１９４】
9-d) 免疫原性の試験
DC 培養の 9 日目において、ロードされた DC 群(T 細胞とのインキュベーションの前に 20ug/ml のマイトマイシン C と共にインキュベートされた DC)を、ロードされた生きた DC としての使用、またはロードされた DC の超音波処理物(ミクロソームおよび原形質膜)としての使用のために、2 つのさらなる群へ分ける。
【０１９５】
以下の DC の群を、96 ウェルプレートの３つ組ウェルにおいて T 細胞と共にインキュベートする:
1.  ロードされていない成熟 DC:T 細胞
2.  ロードされた成熟 DC:T 細胞
3.  ロードされていない DC の超音波処理物:T 細胞
4.  ロードされた DC の超音波処理物: T 細胞
5.  陰性対照としての T 細胞
6.  陽性対照としての、PHA と共にインキュベートされた T 細胞
7.  PBS
【０１９６】
1 x 105 のリンパ球を、以下の濃度の DC と共に; 1 x 104、5 x 103 および 5 x 103、および以下の濃度の超音波処理物と共に共培養する; 1 ul の OD 60、2.5 ul の OD 60、および 4 ul の OD 60。24 - 48 時間のインキュベーション共培養の後、IL-2(T 細胞活性化の尺度)、IFN-γ(Th1 応答) および IL-4(Th2 応答)についてのサイトカイン ELISA 測定のために、上清を回収する。
【０１９７】
T 細胞の増殖を測定するため、DC および超音波処理物とのインキュベーションの前に、リンパ球を CFSE (Cell Trace CFSE kit、Molecular Probes) を用いて標識する。陰性対照として、リンパ球を植物性凝集素(phytohaemoglutinin)(PHA)と共にインキュベートする。DC または超音波処理物との 3 - 5 日の培養の後、細胞を FACS 解析に供試する。
【０１９８】
9-e) DC からの超音波処理物の精製
超音波処理物の調製のために、以下の手順を用いる。
1.  H2O プラス PMSF(1mM)中に、細胞(2 x 108/ml)を再懸濁する
2.  微細な Dounce 中において 20 から 40 ストロークの間、ホモジナイズする
STKMM バッファー(250 mM のスクロース、pH 7.5 の 50 mM のトリエタノールアミン=HCl、50 mM の KAc、5 mM の MgAc2、0.1 % β-メルカプトエタノール。直前に終濃度 10 μg/ml まで PMSF を添加する)を添加し(108 細胞/ml)、ウェルをミキシングする
4.  JK-18 チューブ中において、4℃において 75000 rpm (10000 g) で 10 分間回転させて、核画分を除去する
5.  上清を新しいチューブへ回収し、超音波処理し、4℃において 100000 g で 60 分間回転させる
6.  ペレット(ER、原形質膜を含む)を、STKMM バッファーを用いて注意深く洗浄する
RM バッファー(pH 7.2 の 50 mM の HEPES、250 mM のスクロース、50 mM の酢酸カリウム、2 mM の酢酸マグネシウム)中においてペレットをホモジナイズし、再懸濁させる(200ul/108 細胞)
8.  280nm において OD をチェックし、OD 60 の終濃度を作る
9.  分注されたチューブを、液体窒素中で急速凍結させる
10.  超音波処理物を、液体窒素中または -80℃において保存する
【０１９９】
9-f) ミクロソームの精製
ミクロソーム画分は、細胞が破壊される際に小胞体から形成される、直径 20-200nm の不均一な小胞のセットを含む。該小胞は分画遠心によって単離され、３つの構造的特徴により構成される: 粗面小胞、滑面小胞およびリボソーム。多くの酵素活性が、ミクロソーム画分と関連する。ミクロソームは、操作上、低速の遠心分離によって核およびミトコンドリア画分が除去された後に、超遠心分離によって組織ホモジネートから得られる粒子状の画分として定義される。電子顕微鏡により、ミクロソームは、主として小胞と呼ばれる閉じた嚢状の膜によって構成されることが示されている。ほとんどの小胞は、粗面および滑面小胞体(ER)に由来する。ゴルジ体、ペルオキシソーム、エンドソーム、トランスゴルジ網(trans Golgi network)および他の中間コンパートメント(intermediate compartment)に由来する膜小胞は、ミクロソームのマイナーな構成成分を含む。肝臓のミクロソームは、粗面および滑面 ER 小胞をおよそ 2:1 の比で含有し、かつ、タンパク質分泌経路の構成成分に加えて、脂質/リポタンパク質の生合成および薬物代謝に関与する多数のタンパク質を含有する。該 ER は、代謝的に活性な細胞において圧倒的に豊富に存在する膜である。湿った組織１グラムあたり約 2-3 mg のミクロソームタンパク質を、肝臓から得ることができる。このように、ミクロソームは、酵素の構造、タンパク質-タンパク質および脂質-タンパク質の相互作用ならびに膜結合酵素の機能的特性の間の関係を研究するために理想的な調製物である。最も豊富なミクロソームタンパク質の多くが広く研究されてきたが、さらに多くのタンパク質が未だ単離および特徴付けされていないままである。
【０２００】
方法:
1.  全ての工程を氷上で行う
2.  細胞を、30 ml の、氷冷の pH 7.5 の 250 mM のリン酸緩衝液中においてインキュベートする
核(ミクロソームにゲノム DNA を混入させる)を溶解させることなく、ホモジナイザーを用いて細胞をホモジナイズする。顕微鏡下で、核が無傷であることを確認する。
4.  15 ml の、氷冷の pH 7.5 の 250 mM のリン酸緩衝液を添加する
7.  SS34 ローター中において、4℃において 11,000 rpm (14,500 X g)で 15 分間、遠心する
8.  上清を回収する
再度、SS34 ローター中において、4℃において 11,000 rpm (14,500 X g)で 15 分間遠心する
10.  ポリカーボネートの壁の厚いチューブまたは 70 Ti ローター中に上清を回収する
11.  70 Ti ローター中において、4℃において 33,000 rpm (105,000 X g)で 90 分間、遠心する。上清を除去する
12.  ペレットを、1 ml の氷冷の 250 mM リン酸緩衝液/20% グリセロール中に再懸濁する
13.  ガラスの Dounce を用いてホモジナイズする。
14.  分注し、液体窒素中または -80℃において保存する
【０２０１】
9-h) 反転ミクロソームの生成
研究のために組織を選択した後、ホモジナイズバッファーの組成物、ホモジナイズの方法、ならびに低速遠心分離工程の時間および強さが、ミクロソームの調製における主要な変数である。実験処理あたりおよそ 10 g の肝臓を、室温のホモジナイゼーションバッファー(0.125 M の塩化カリウムおよび 1.0 mM の EDTA を含む、pH 7.4 の 0.1 M のリン酸カリウム緩衝液)中において解凍した。25 ml の冷却したホモジナイゼーションバッファー(バッファーの実験においては 0.25 M のスクロースを添加または非添加)へ移した後、ハサミを用いて肝臓を完全に細かく刻み、テフロンガラス(Teflon-glass)のホモジナイザーを用いて 10 ストローク(ストローク実験においては 6、8、または 10 ストローク)によってホモジナイズした(870 rpm)。ガラスチューブの底にある物質に対してより大きな圧力および時間が費やされる最初の２ストロークを除き、通過の間およそ 15 秒続くストロークは、等しくかつ一定であった。全てのホモジナイゼーションの間、チューブを氷および水の小さなバケツ中に沈めた。ホモジネートを、サンプル重の 4 倍容量(およそ 40 ml)まで希釈した。次いで、サンプルを、Sorvall SA-600 ローターを備える Sorvall RC-5B 中において 12,000g(力の実験においては 9,000、10,500、または 12,000g)で 20 分間遠心した (Sorvall、Newton、CT)。最初の遠心分離からの上清を除去し、ミトコンドリアのペレットを 25 ml 中に再懸濁し、遠心分離を繰り返した。上清を合わせ、Sorvall T-1270 ローターを備える Sorvall Ultra Pro 80 中において 138,000g で 60 分間遠心した。上部の脂質層を除去し、サイトゾルの上清を回収した。ミクロソームのペレットを、３回のホモジナイゼーションストロークによって 0.125 M の KCl、0.1 M のトリス(pH 7.4)中に再懸濁させ、138,000g における 60 分間の遠心分離を繰り返した。ミクロソームのペレットを、６回のストロークによってインキュベーションバッファー中に再懸濁させ、最終容量を 26 ml とした。サンプルを -70℃において保存した。
【０２０２】
9-i) 必要な試薬
PBMC を精製するためのヒトのバフィーコート(buffy Coat)血液およびフィコール(Ficoll)
FACS 解析用の、CD86、HLA-DR、CD11c および CD3 のための、ヒト PE または FITC 複合体。
T 細胞によって分泌されたサイトカイン、IFN-γ および IL-4 を測定するための細胞内染色キット
MACS LS カラム、MACS 分離ユニット、MACS マルチスタンドおよび CD4 T 細胞単離ビーズを含む MACS 磁性細胞単離キット
タンパク質またはペプチド抗原に応答した T 細胞の増殖を測定するための CFSE キット
T 細胞の増殖についての陽性対照として用いる、マイトマイシン C および組換えヒト IL-2、ならびに PMA/イオノマイシン。
【０２０３】
9-j) 単球から DC への分化
単球の DC への分化は、外来性の IL-4 および GMCSF を用いて 7 日間、インビトロにおいて行う。得られる細胞集団を、細胞表面分子である CD11c、CD123、HLA-DR についての多色染色によって特性決定する。一般的に、培養状態の細胞の 90% が DC マーカーに関して陽性である一方、5% がリンパ球マーカーである CD3 および CD5 に関して陽性である。
【０２０４】
BCG (カルメット・ゲラン桿菌抗原) および TT (破傷風トキソイド)を用いて DC 調製物をパルス(pulse)し、細胞表面マーカーの活性化および分泌されるサイトカインおよび分泌の動態を決定する。
【０２０５】
活性化のマーカーとしての DC および HLA-DR および CD40 を同定するため、CD11c および CD123 についての細胞表面多色染色によって DC の活性化を決定する。一般的に、抗原を用いてパルスされた DC の約 75% が、活性化された表現型、即ち MHC クラスII (HLA-DR) および共刺激性(co-stimulatory)分子である CD40 の高発現を示す。
【０２０６】
活性化された DC によって産生される炎症性サイトカインを、サイトカインアレイによってアッセイする。24時間の培養において、大量(robust amount)の IL-6、中程度の量の TNF-α および少ない量の IL-10 が検出された。IL-12 は検出されず、タンパク質抗原について予測される Th2 経路へ向けた極性化効果が示唆される。抗原刺激後 17時間、24時間、92時間および 115時間においてサイトカイン産生の動態を決定し、最適な時間は抗原刺激後 24時間であった。
【０２０７】
抗原提示のための DC-リンパ球複合体の形成: 抗原を用いてパルスされた DC を、自己 T 細胞と共に 24時間培養する。BCG および TT への曝露後 24時間以内に、DC-リンパ球複合体を顕微鏡によって観察する。DC-リンパ球の形成を写真撮影し、単一の DC と複合体化したリンパ球の数を計数する。一般的に、抗原でパルスされた各々の DC は、最少で 25 個のリンパ球と結合することができる。
1)  単球から DC を得る
2)  抗原(65、41 および 72)を用いてパルスする
3)  上清を 18 時間の時点で回収し、サイトカインについてアッセイする 
4)  細胞を APC 活性化マーカーについて染色する
5)  APC に誘導された抗原特異的 T 細胞増殖およびサイトカインをモニターする
【０２０８】
9-k) 免疫応答試験
動物試験において、タンパク質 41、65、72 を用いて、皮下において、マウス(各群に 7 頭のマウス)を免疫化した。免疫化したマウスおよび未処理のマウスの血清サンプルを、以下の抗原でコートされた ELISA プレート上で 1:100 の希釈において試験した: タンパク質 41、65、72、デンドロアスピン、HSP60、およびプレベナー(prevenar)。図 7 および 8 を参照されたい。
【０２０９】
読者の注意は、本出願に関連して本明細書と同時にまたはそれ以前に提出され、本明細書と共に公衆の閲覧に付される全ての論文および文書に向けられ、かつ、かかる全ての論文および文書の内容は、引用により本明細書に取り込まれる。
【０２１０】
本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)に開示される全ての特徴、および/または同様に開示されるあらゆる方法または過程の全ての工程は、かかる特徴および/または工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、あらゆる組み合わせにおいて組み合わせることができる。
【０２１１】
本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)において開示される各々の特徴は、特に明記しない限り、同じ、等しいまたは類似の目的にかなう代替的な特徴によって置換し得る。したがって、特に明記しない限り、開示される各々の特徴は、包括的な一連の等しいまたは類似の特徴の１つの例にすぎない。
【０２１２】
本発明は、前述のいかなる態様の詳細にも限定されない。本発明は、本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)に開示される特徴のあらゆる新規なものもしくはあらゆる新規な組み合わせ、または同様に開示されるあらゆる方法もしくは過程の工程のあらゆる新規なものもしくはあらゆる新規な組み合わせにまで及ぶ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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