(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２９のヌクレオチド配列によってコードされるアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａの内在性発現を抑制するｓｉＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡをインビボでヒトの肺細胞に送達するための医薬組成物であって、ｓｉＲＮＡが、配列番号４４に示す配列、配列番号４７に示す配列、配列番号５０に示す配列及び配列番号５３に示す配列からなる群から選択される一つの配列を標的する、鼻腔内に投与される、医薬組成物。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号４５及び４６に示す配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号４８及び４９に示す配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号５１及び５２に示す配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号５４及び５５に示す配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記肺細胞内における配列番号２９のヌクレオチド配列によってコードされるアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａの前記内在性発現抑制が、当該細胞に対して、その細胞内でのアポトーシス抑制、その細胞内でのｐ５３の発現低下、その細胞内で産生されるサイトカインのレベル低下、その細胞内でのＢｃｌ−２の発現増大、その細胞内で産生されるミエロペルオキシダーゼのレベル低下、その細胞内での活性なＮＦκＢのレベル低下、その細胞内でのＴＬＲ４のレベル低下、その細胞内でのＴＮＦＲ−１のレベル低下、及びその細胞内でのｉＮＯＳのレベル低下からなる群より選ばれる効果を当該細胞に対して及ぼす、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
【０００２】
本出願は、2003年3月10日に出願された米国出願シリアル番号第10/383,614号の一部継続出願である。この一部継続出願は2002年10月23日に出願された米国出願シリアル番号第10/277,969号の一部継続出願であり、この一部継続出願は2002年7月23日に出願された米国出願シリアル番号第10/200,148号の一部継続出願であり、この一部継続出願は2002年5月7日に出願された米国出願シリアル番号第10/141,647号の一部継続出願であり、この一部継続出願は2001年7月23日に出願された米国出願シリアル番号第9/909,796号の一部継続出願である。なおこれらの出願はすべて、その全体が本明細書に組み込まれているものとする。本出願は、2003年6月6日に出願された米国仮出願第60/476,194号；2003年9月22日に出願された米国仮出願第60/504,731号；2003年12月10日に出願された米国仮出願第60/528,249号；2004年3月21日に出願された米国仮出願第60/557,671号；2004年6月2日に出願された米国仮出願第60/（番号通知待ち）の優先権も主張する。なおこれらの出願はすべて、その全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、アポトーシス特異的真核生物開始因子（“eIF-5A”）（“アポトーシス特異的eIF-5A”または“eIF-5A1”とも呼ばれる）と、デオキシハイプシン・シンターゼ（DHS）に関する。本発明は、アポトーシス特異的eIF-5AとDHSの核酸およびポリペプチド、ならびにアポトーシス特異的eIF-5AとDHSの発現を阻止する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
アポトーシスは遺伝的にプログラムされた細胞イベントであり、明確な形態的特徴（例えば細胞の収縮、クロマチンの凝縮、核の断片化、膜の泡状突起化）を有する。Kerr他（1972年）、Br. J. Cancer、第26巻、239〜257ページ；Wyllie他（1980年）、Int. Rev. Cytol.、第68巻、251〜306ページ。アポトーシスは、正常な組織の増殖とホメオスタシスに関する重要な役割を担っており、アポトーシス・プログラムの欠陥は、ヒトのさまざまな疾患（神経変性疾患や自己免疫疾患から腫瘍まで）に関係していると考えられている。Thompson（1995年）、Science、第267巻、1456〜1462ページ；Mullauer他（2001年）、Mutat. Res.、第488巻、211〜231ページ。アポトーシス細胞の形態的特徴はよくわかっているが、そのプロセスを調節する分子経路は解明され始めたばかりである。
【０００５】
アポトーシスで重要な役割を果たしていると考えられている一群のタンパク質は、カスパーゼと呼ばれるシステイン・プロテアーゼのファミリーである。カスパーゼは、アポトーシスのほとんどの経路に必要とされるように見える。CreaghとMartin（2001年）、Biochem. Soc. Trans.、第29巻、696〜701ページ；Dales他（2001年）、Leuk. Lymphoma、第41巻、247〜253ページ。カスパーゼは、アポトーシス刺激に応答してさまざまな細胞タンパク質を開裂させることによってアポトーシスを開始させ、その結果として古典的なアポトーシス（例えば、細胞の収縮、膜の泡状突起化、DNAの断片化）が起こる。ChangとYang（2000年）、Microbiol. Mol. Biol. Rev.、第64巻、821〜846ページ。
【０００６】
アポトーシス促進タンパク質（例えばBax、Bak）も、カスパーゼ活性化分子（例えばミトコンドリアのシトクロムc）を放出することによってアポトーシス経路で重要な役割を果たし、アポトーシスを通じた細胞死を促進している。MartinouとGreen（2001年）、Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.、第2巻、63〜67ページ；Zou他（1997年）、Cell、第90巻、405〜413ページ。抗アポトーシス・タンパク質（例えばBcl-2）は、アポトーシス促進タンパク質（Bax、Bak）の活性と拮抗することによって細胞の生存を促進している。Tsujimoto（1998年）Genes Cells、第3巻、697〜707ページ；Kroemer（1997年）、Nature Med.、第3巻、614〜620ページ。比Bax：Bcl-2は、細胞の運命を決定する1つの因子であると考えられている。Baxが過剰だとアポトーシスが促進され、Bcl-2が過剰だと細胞の生存が促進される。Salomons他（1997年）、Int. J. Cancer、第71巻、959〜965ページ；Wallace-BrodeurとLowe（1999年）、Cell Mol. Life Sci.、第55巻、64〜75ページ。
【０００７】
アポトーシスに関係する別の重要なタンパク質は、腫瘍抑制遺伝子p53によってコードされているタンパク質である。このタンパク質は、細胞の増殖を調節するとともに、損傷した細胞や、おそらくBaxのアップレギュレーションによって遺伝的に不安定になったりした細胞でアポトーシスを誘導する転写因子である。Bold他（1997年）、Surgical Oncology、第6巻、133〜142ページ；Ronen他（1996年）；SchulerとGreen（2001年）、Biochem. Soc. Trans.、第29巻、684〜688ページ；Ryan他（2001年）、Curr. Opin. Cell Biol.、第13巻、332〜337ページ；Zoernig他（2001年）、Biochem. Biophys. Acta、第1551巻、F1〜F37ページ。
【０００８】
アポトーシス経路における変化は、がんを含む多数の疾患プロセスにおいて重要な役割を果たしていると考えられている。Wyllie他（1980年）、Int. Rev. Cytol.、第68巻、251〜306ページ；Thompson（1995年）、Science、第267巻、1456〜1462ページ；SenとD'Incalci（1992年）、FEBS Letters、第307巻、122〜127ページ；McDonnell他（1995年）、Seminars in Cancer and Biology、第6巻、53〜60ページ。がんの増殖と進行に関する研究では、伝統的に細胞の増殖に焦点が当てられてきた。しかし腫瘍形成においてアポトーシスが重要な役割を果たしていることが、最近明らかになってきた。実際、アポトーシスについて現在わかっていることの多くは、腫瘍モデルを用いて学習されたことである。なぜならアポトーシスの制御状態は、腫瘍細胞において必ず変化するからである。Bold他（1997年）、Surgical Oncology、第6巻、133〜142ページ。
【０００９】
サイトカインもアポトーシス経路に関係する。生物系は、調節のためには細胞相互作用を必要とし、細胞間のクロストークには一般に多数のサイトカインが関与する。サイトカインは、さまざまなタイプの細胞が多彩な刺激に応答して産生するメディエータである。サイトカインは、さまざまなタイプの細胞に多くの異なった効果を及ぼすことのできる多面発現分子であるが、免疫応答と、造血細胞の増殖および分化の調節で特に重要である。サイトカインが標的細胞に作用すると、そのサイトカインが何であるか、そのサイトカインの相対的濃度、他のメディエータが存在しているかどうかに応じ、細胞の生存、増殖、活性化、分化、アポトーシスが促進される。
【００１０】
抗サイトカインを用いて自己免疫疾患（例えば乾癬、関節リウマチ、クローン病）を治療することが一般的になりつつある。炎症性サイトカインIL-1とTNFは、こうした慢性疾患の病状に関して重要な役割を果たしている。これら2つのサイトカインの生物活性を低下させる抗サイトカイン療法により、うまく治療を行なうことができる（DinarelloとAbraham、2002年）。
【００１１】
インターロイキン1（IL-1）は、局所的、全身的な炎症反応を媒介する重要なサイトカインであり、多くの疾患（例えば脈管炎、骨粗鬆症、神経変性疾患、糖尿病、ループス腎炎、自己免疫疾患（関節リウマチなど））が発症する際にTNFと相乗的に作用する可能性がある。黒腫細胞を注入したIL-1βノックアウト・マウスが転移と血管新生に対して抵抗力を持っていることから、腫瘍の血管新生と侵襲におけるIL-1βの重要性も最近明らかにされた（Voronov他、2003年）。
【００１２】
インターロイキン18（IL-18）は、IL-1ファミリーの最近発見されたメンバーであり、構造、受容体、機能に関してIL-1と関連性がある。IL-18は、インターフェロンγ（IFN-γ）、TNF-α、IL-1を誘導する能力を持っているため、炎症性疾患と自己免疫疾患に関係する中心的なサイトカインである。IL-1βとIL-18は両方とも、心筋虚血の間の心不全に関係することが知られているサイトカインであるTNF-αの産生を誘導できる（Maekawa他、2002年）。IL-18結合タンパク質を用いた中和によってIL-18を阻害すると、過融解ヒト心房心筋層の虚血／再灌流モデルにおいて虚血によって誘導される心不全が減ることがわかった（Dinarello、2001年）。マウスのIL-18結合タンパク質を用いてIL-18を中和しても、IFN-γ、TNF-α、IL-1βの転写産物のレベルを低下させることができ、コラーゲンによって誘導される関節炎モデル・マウスの関節の損傷を減らすことができた（Banda他、2003年）。IL-18結合タンパク質を黒腫モデル・マウスに注入すると転移がうまく阻止されたため、IL-18の産生または利用可能性が低下すると、転移性がんの制御にも好ましいことが証明される可能性がある（Carrascal他、2003年）。炎症性サイトカインとしてのIL-18の重要性を示すさらに別の証拠として、慢性肝臓疾患の患者でIL-18の血漿レベルが上昇し、そのレベル上昇は、その疾患の程度と相関していたことが挙げられる（Ludwiczek他、2002年）。同様に、腎症を抱えている糖尿病患者でIL-18とTNF-αが上昇した（Moriwaki他、2003年）。外傷性脳障害の後の神経炎も炎症性サイトカインが媒介となって起こるため、IL-18結合タンパク質によってIL-18が阻止されると、脳に外傷を受けたマウスで神経の回復状態が改善する（Yatsiv他、2002年）。
【００１３】
サイトカインのTNFファミリーのメンバーであるTNF-αは炎症性サイトカインであり、造血細胞を同時に分化させる効果から、炎症応答の誘導や、多くのタイプの細胞における細胞死の誘導まで、多面的な効果を有する。TNF-αは、通常は、細菌のリポ多糖、寄生虫、ウイルス、腫瘍細胞、サイトカインによって誘導され、感染やがんから細胞を保護するという好ましい働きを一般に持っている。しかしTNF-αの不適切な誘導は、急性や慢性の炎症（例えば自己免疫疾患）を原因とする疾患の主要な因子となり、がん、エイズ、心疾患、敗血症へと至る可能性もある（総説がAggarwalとNatarajan、1996年；SharmaとAnker、2002年にある）。疾患（すなわち敗血症と関節リウマチ）の実験的モデル動物とヒトの疾患（すなわち炎症性腸疾患と急性移植片対宿主病）により、TNF-αを阻害することの好ましい効果が明らかにされた（Wallach他、1999年）。TNF-αを阻害すると、自己免疫疾患を患っている患者の症状が緩和されるという効果もある（クローン病（van Deventer、1999年）、関節リウマチ（Richard-MiceliとDougados、2001年））。TNF-αがBリンパ球の生存と増殖を促進する能力もB細胞慢性リンパ性白血病（B-CLL）の発症においてある役割を果たしており、B-CLLにおいてT細胞が発現するTNF-αのレベルは、腫瘍の大きさおよびステージと正の相関があった（Bojarska-Junak他、2002年）。インターロイキン-1β（IL-1β）は、TNF-αの産生を誘導するサイトカインとして知られている。
【００１４】
したがって、いろいろなサイトカインとTNF-αが過剰に蓄積すると身体に悪い影響（細胞死など）があるため、体内のサイトカインのレベルを低下させるとともに、アポトーシスの阻止または減少を起こす方法が必要とされている。本発明はこの要求を満たす。
【００１５】
デオキシハイプシン・シンターゼ（DHS）とハイプシン含有真核生物翻訳開始因子5A（eIF-5A）は、多くの細胞プロセス（例えば細胞の増殖や分化）で重要な役割を果たしていることが知られている。ユニークなアミノ酸であるハイプシンは、これまでに調べられたすべての真核生物と古細菌で見いだされているが、真正細菌では見つかっておらず、eIF-5Aは、知られている唯一のハイプシン含有タンパク質である。Park（1988年）、J. Biol. Chem.、第263巻、7447〜7449ページ；SchuemannとKlink（1989年）、System. Appl. Microbiol.、第11巻、103〜107ページ；Bartig他（1990年）、System. Appl. Microbiol.、第13巻、112〜116ページ；Gordon他（1987年a）、J. Biol. Chem.、第262巻、16585〜16589ページ。活性なeIF-5Aは、2つの翻訳後ステップで形成される。第1のステップでは、デオキシハイプシン・シンターゼを触媒としてスペルミジンの4-アミノブチル部分をeIF-5A前駆体の特定のリシンのαアミノ基に移すことにより、デオキシハイプシンを形成する。第2のステップは、この4-アミノブチル部分をデオキシハイプシン・ヒドロキシラーゼでヒドロキシル化してハイプシンを形成する操作を含んでいる。
【００１６】
eIF-5Aのアミノ酸配列は種間でよく保存されており、しかもeIF-5A内のハイプシン残基のまわりのアミノ酸配列は厳密に保存されている。これは、この修飾が生存にとって重要である可能性のあることを示唆している。Park他（1993年）、Biofactors、第4巻、95〜104ページ。この仮定は、酵母でこれまでに見つかったeIF-5Aの2つのアイソフォームの不活化によって、またはそのアイソフォームが活性化される第1ステップの触媒となるDHS遺伝子の不活化によって細胞分裂が阻止されるという観察結果によっても支持される。Schnier他（1991年）、Mol. Cell. Biol.、第11巻、3105〜3114ページ；Sasaki他（1996年）、FEBS Lett.、第384巻、151〜154ページ；Park他（1998年）、J. Biol. Chem.、第273巻、1677〜1683ページ。しかし酵母では、eIF-5Aタンパク質が欠乏すると、全タンパク質の合成がわずかに減少するだけであった。これは、eIF-5Aが、タンパク質の全体的な合成ではなく、一部の特別なmRNAを翻訳するのに必要とされることを示唆している。Tuite, M.（編）、『酵母におけるタンパク質の合成とターゲティング』、NATOシリーズHの中のKang他（1993年）、「開始因子eIF-5Aの欠乏が細胞の増殖とタンパク質の合成に及ぼす効果」。eIF-5Aに結合するリガンドが非常によく保存されたモチーフを共有しているという最近の知見も、eIF-5Aの重要さを支持している。XuとChen（2001年）、J. Biol. Chem.、第276巻、2555〜2561ページ。さらに、修飾されたeIF-5Aのハイプシン残基は、RNAに対する配列特異的結合に不可欠であることが見いだされたが、結合によってRNAがリボヌクレアーゼから保護されることはなかった。
【００１７】
さらに、細胞内にeIF-5Aが欠乏していると、核の中に特定のmRNAがかなり蓄積することになる。これは、eIF-5Aが、特別なクラスのmRNAを核から細胞質に移す際に重要である可能性があることを示している。LiuとTartakoff（1997年）、Molecular Biology of the Cellの増刊号、第8巻、426aページ。予稿集第2476号、第37回アメリカ細胞生物学学会年会。核孔に付随する核内フィラメントにeIF-5Aが蓄積して一般的な核外輸送受容体と相互作用するという事実は、eIF-5Aが、ポリソームの一要素ではなく、核細胞質間シャトル・タンパク質であることをさらに示唆している。Rosorius他（1999年）、J. Cell Science、第112巻、2369〜2380ページ。
【００１８】
eIF-5Aに関する最初のcDNAは、Smit-McBrideらによって1989年にヒトからクローニングされた。それ以来、eIF-5AのcDNAまたは遺伝子は、さまざまな真核生物（例えば酵母、ラット、ニワトリの胚、アルファルファ、トマト）でクローニングされている。Smit-McBride他（1989年）、J. Biol. Chem.、第264巻、1578〜1583ページ；Schnier他（1991年）（酵母）；Imahori, M.他（編）、『ポリアミン、基礎と臨床』、VNUサイエンス出版社、オランダ国、の中のSano, A.（1995年）、81〜88ページ（ラット）；RinaudoとPark（1992年）、FASEB J.、第6巻、A453ページ（ニワトリの胚）；Pay他（1991年）、Plant Mol. Biol.、第17巻、927〜929ページ（アルファルファ）；Wang他（2001年）、J. Biol. Chem.、第276巻、17541〜17549ページ（トマト）。
【００１９】
ヒトのさまざまな組織と哺乳動物の細胞系でeIF-5AのmRNAの発現が調べられてきた。例えば血清を除去してから血清を添加するとeIF-5Aの発現が変化することが、ヒト線維芽細胞で観察されている。PangとChen（1994年）、J. Cell Physiol.、第160巻、531〜538ページ。年齢とともにデオキシハイプシン・シンターゼの活性が低下し、eIF-5A前駆体が豊富になることも、老化した線維芽細胞で観察されている。しかしこのことが、アイソフォームごとに異なる変化の平均を反映しているかどうかははっきりしていない。ChenとChen（1997年）、J. Cell Physiol.、第170巻、248〜254ページ。
【００２０】
いろいろな研究により、eIF-5Aは、ウイルスのタンパク質（例えばヒト免疫不全ウイルス1型Revタンパク質や、ヒトT細胞白血病ウイルス1型Rexタンパク質）の細胞標的となる可能性のあることがわかった。Ruhl他（1993年）、J. Cell Biol.、第123巻、1309〜1320ページ；Katahira他（1995年）、J. Virol.、第69巻、3125〜3133ページ。予備的な研究によると、eIF-5Aは、他のRNA結合タンパク質（例えばRev）と相互作用してRNAを標的とする可能性がある。これは、ウイルスのこのようなタンパク質がウイルスRNAプロセッシングにeIF-5Aを採用している可能性があることを示唆している。Liu他（1997年）、Biol. Signals、第6巻、166〜174ページ。
【００２１】
したがって、eIF-5AとDHSが知られているとはいえ、これらのタンパク質がアポトーシス経路とサイトカインの刺激にいかに関与してアポトーシスとサイトカイン発現を変化させうるかを理解することが、まだ必要とされている。本発明は、この要求を満たす。
【発明の開示】
【００２２】
発明の概要
本発明は、アポトーシス特異的真核生物開始因子5A（eIF-5A）（“アポトーシス特異的eIF-5A”または“eIF-5A1”とも呼ばれる）に関する。本発明は、アポトーシス特異的eIF-5Aの核酸およびポリペプチドと、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止するためのアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNAを用いて細胞内アポトーシスを阻止または抑制する方法にも関する。本発明は、siRNAをin vivoで哺乳動物の肺細胞に送達する方法に関する。本発明は、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止することによる炎症性サイトカインの発現の抑制または阻止にも関する。本発明はさらに、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止することによるp53の発現の阻止または抑制にも関する。本発明は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNAを用いてアポトーシス因子5Aの発現を阻止または抑制することによってBcl-2の発現を増大させる方法にも関する。本発明により、サイトカイン（特にヒト上皮細胞におけるTNF-α）の産生を阻止する方法も提供される。本発明の別の一実施態様では、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的としたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いてアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抑制することにより、緑内障になった目における網膜神経節細胞の細胞死を阻止する方法が提供される。
【００２３】
発明の詳細な説明
真核生物開始因子5A（“eIF-5A”）のアイソフォームがいくつかこれまでに単離されており、公開データバンクに存在している。そのアイソフォームは機能が互いに重複していると考えられていた。本発明者らは、アポトーシスが誘導される直前に1つのアイソフォームがアップレギュレートされることを見いだし、そのアイソフォームをアポトーシス特異的eIF-5AまたはeIF-5A1と名づけた。本発明の目的は、アポトーシス特異的eIF-5Aと、eIF-5Aの活性化に関与するDHSである。
【００２４】
アポトーシス特異的eIF-5Aは、アポトーシス経路に関与する下流のエフェクターと転写因子の翻訳後調節のレベルで作用するため、アポトーシスが引き起こす疾患状態に介入する際の適切な標的であるように思われる。より具体的には、アポトーシス特異的eIF-5Aは、下流のアポトーシス・エフェクターと転写因子をコードしているmRNAが核から細胞質に移されてそこで翻訳されるのを選択的に促進するように見える。アポトーシスの開始は、内部と外部のアポトーシス促進シグナルと抗アポトーシス・シグナルの間の複雑な相互作用によって最終的に決定されているように見える。LoweとLin（2000年）、Carcinogenesis、第21巻、485〜495ページ。アポトーシス特異的eIF-5Aは、下流のアポトーシス・エフェクターと転写因子の翻訳を促進する能力を通じてこれらのシグナル間のバランスを狂わせ、アポトーシスの方向に向かわせているように見える。
【００２５】
したがって本発明により、アポトーシス特異的eIF-5AまたはDHSの発現を阻止する薬剤または減少させる薬剤を投与することによって細胞内のアポトーシスを抑制する方法または減少させる方法が提供される。DHSの発現を減少させることにより、アポトーシス特異的eIF-5Aの活性化に利用できるDHSタンパク質が少なくなる。アポトーシス特異的eIF-5AまたはDHSの発現を阻止すること、または減少させることのできる1つの薬剤は、アポトーシス特異的eIF-5AまたはDHSのアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。アポトーシス特異的eIF-5Aの活性化を減らすこと、またはアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止することにより、細胞のアポトーシスを遅延させること、または阻止することができる。
【００２６】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いることで、試験管内と生体内の両方で遺伝子特異的抑制をうまく実現できている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは合成して作った短いDNA（またはDNAアナログ）、RNA（またはRNAアナログ）、DNA/RNAハイブリッドの鎖であり、特定のDNA標的またはRNA標的にとってアンチセンス（または相補的）になっている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標的mRNAに結合して転写、翻訳、スプライシングのレベルで発現を停止させることにより、DNA標的またはRNA標的によってコードされているタンパク質の発現を阻止するように設計されている。骨格を修飾して分解に対する抵抗力を持たせた（例えばオリゴヌクレオチド内のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換することによってヌクレアーゼによる分解を遅延させる（MatzuraとEckstein、1968年））アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いることにより（Blake他、1985年）、細胞培養物と疾患のモデル動物の両方で実験が成功している（Hogrefe、1999年）。アンチセンス・オリゴヌクレオチドをより安定かつより抵抗力のあるようにする別の修飾が当業者に知られており、それがどのようなものであるかも理解されている。この明細書で用いるアンチセンス・オリゴヌクレオチドには、二本鎖または一本鎖のDNA、二本鎖または一本鎖のRNA、DNA/RNAハイブリッド、DNAアナログ、RNAアナログ、塩基を有するオリゴヌクレオチド、糖鎖を有するオリゴヌクレオチド、骨格が修飾されたオリゴヌクレオチドなどが含まれる。これらのオリゴヌクレオチドを当業者に知られている方法で修飾することで、安定性を大きくしたり、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗力を大きくしたりすることができる。これらの修飾は当業者に知られており、例えば、オリゴヌクレオチドの骨格の修飾、糖部分の修飾、塩基の修飾などがある。
【００２７】
本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、アポトーシス特異的eIF-5AポリペプチドまたはDHSポリペプチドのコード配列の一部または全体をコードしているヌクレオチド配列を有することが好ましい。発明者らは、さまざまな細胞系に、以下に説明するアポトーシス特異的eIF-5Aポリペプチドの一部をコードしているアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトし、アポトーシスを起こした細胞の数を測定した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞集団は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった同様の細胞集団と比べてアポトーシスを起こした細胞の数が少なかった。図54〜図58は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞と比べてアポトーシスを起こした細胞の割合が少ないことを示している。
【００２８】
本発明では、アポトーシス特異的eIF-5AポリペプチドまたはDHSポリペプチドをコードしている適切な多数の核酸配列を用いることを考える。例えば本発明により、アポトーシス特異的eIF-5Aの核酸配列（配列番号1、3、4、5、11、12、15、16、19、20、21）とDHS配列（配列番号6、7、8）のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが提供される。本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ここに示した配列番号の全長を必要とはせず、mRNAに結合できてそのmRNAの発現を阻止するだけの長さがあれば十分である。“発現の阻止または減少”または“発現の抑制”は、標的遺伝子（例えばアポトーシス特異的eIF-5A）からのタンパク質および／またはmRNA産物が存在しないか、そのレベルの減少が検出可能であることを意味する。
【００２９】
コード配列全体を含まないアポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの具体例は、配列番号35、37、39を有するアポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。
【００３０】
“アポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・オリゴヌクレオチド”には、アポトーシス特異的eIF-5Aと配列が実質的に一致するか実質的に相同なオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によるアポトーシス特異的eIF-5Aの別のアンチセンス・オリゴヌクレオチドとしては、上記の配列と実質的に一致する配列を持つもの（すなわち90％の相同性）、または高緊縮条件下で上記の配列番号とハイブリダイズする配列を持つものなどがある。この明細書では、“実質的に配列が一致”または“実質的に相同”という表現は、ある配列と別の配列で構造または機能が実質的に同じであることを意味する。実質的に配列が一致する配列同士の間、または実質的に相同な配列同士の間に存在する構造または機能の何らかの違いは些細なものであろう。すなわち、その配列が望む用途において上記のように機能する能力にその違いが影響を与えることはなかろう。違いは、異なる種の間でコドンの利用の仕方が元々異なっていることに起因している可能性がある。異なる2つ以上の配列の間に有意な量の重なりや類似性が存在している場合、あるいは異なる配列が、長さや構造が異なるにもかかわらず似たような物理的性質を示す場合には、構造上の違いは些細であると考えられる。そのような性質としては、例えば、所定の条件下でハイブリダイズする能力が挙げられ、タンパク質の場合には、免疫学的交差反応性、類似した酵素活性などが挙げられる。当業者であれば、公知の方法でこれらの性質のそれぞれを容易に測定することができよう。
【００３１】
さらに、2つのヌクレオチド配列が“実質的に相補的”であるのは、配列同士が少なくとも約70％以上一致している場合である。一致は、80％以上であることがより好ましく、約90％以上であることがさらに好ましく、約95％以上であることが最も好ましい。2つのアミノ酸配列が実質的に相同であるのは、ポリペプチドの活性な部分または機能上関連のある部分の間に少なくとも70％の相同性がある場合である。相同性は、少なくとも80％であることがより好ましく、少なくとも90％であることがさらに好ましく、少なくとも95％であることが最も好ましい。
【００３２】
2つの配列のパーセント一致を明らかにするため、配列をアラインメントさせて最適な比較を行なう（例えば、最適なアラインメントにするため、第1と第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較のため、相同でない配列を捨てることができる）。好ましい一実施態様では、比較のため、参照配列の長さの少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上をアラインメントさせる。そして対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のある位置が、第2の配列の対応する位置に存在しているのと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合には、それらの分子はその位置が一致している（この明細書では、アミノ酸または核酸の“一致”は、アミノ酸または核酸の“相同”と同じ意味である）。2つの配列間のパーセント一致は、その2つの配列の最適なアラインメントを得るために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮したときに、それらの配列が共有している一致する位置の数の関数である。
【００３３】
配列の比較と、2つの配列間のパーセント一致および類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現することができる。（『計算分子生物学』、Lesk, A.M.編、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、1988年；『バイオコンピューティング：インフォマティックスとゲノム計画』、Smith, D.W.編、アカデミック出版、ニューヨーク、1993年；『配列データのコンピュータ分析、パート1』、Griffin, A.M.とGriffin, H.G.編、ヒューマナ出版、ニュー・ジャージー、1994年；『分子生物学における配列分析』、von Heinje, G.、アカデミック出版、1987年；『配列分析用プライマー』、Gribskov, M.とDevereux, J.編、Mストックトン出版、ニューヨーク、1991年）。
【００３４】
本発明による核酸とタンパク質の配列をさらに“照会配列”として利用して配列データベースの検索を行なうことにより、例えば同じファミリーの他のメンバーや関連する配列を同定することができる。このような検索は、Altschul他（1990年）、J. Mol. Biol.、第215巻、403〜410ページのNBLASTプログラムとXBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて実行することができる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラムを用いて行なうことができる。XBLASTプログラムを用いてBLASTタンパク質検索を実行し、本発明のタンパク質と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップ付きアラインメントを得るには、ギャップ付きBLASTを、Altschul他（1997年）、Nucleic Acids Res.、第25巻(17)、3389〜3402ページに記載されているようにして用いることができる。BLASTプログラムとギャップ付きBLASTプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えばXBLASTとNBLAST）のデフォルト・パラメータを用いることができる。
【００３５】
“アポトーシス特異的eIF-5A”という用語には、その機能性誘導体が含まれる。核酸の“機能性誘導体”という用語は、この明細書では、遺伝子配列またはヌクレオチド配列のホモログまたはアナログを意味する。機能性誘導体は、与えられた遺伝子の機能を維持できるため、本発明において役立てることができる。この明細書に記載したアポトーシス特異的eIF-5Aの“機能性誘導体”、またはアポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの機能性誘導体は、アポトーシス特異的eIF-5A活性を保持しているか、アポトーシス特異的eIF-5Aに対して特異的な免疫学的交差活性を保持しているアポトーシス特異的eIF-5Aの断片、変異体、アナログ、化学的誘導体である。アポトーシス特異的eIF-5Aポリペプチドの断片は、その分子のあらゆる部分を意味する。
【００３６】
機能性変異体は、機能をまったく変化させなかったり、顕著には変化させなかったりする似たアミノ酸による置換も含むことができる。機能にとって不可欠なアミノ酸は、公知の方法で同定することができる。方法としては、例えば部位指定突然変異誘発やアラニン走査突然変異誘発がある（Cunningham他（1989年）、Science、第244巻、1081〜1085ページ）。後者の方法では、分子内のすべてのアラニン残基だけに突然変異を導入する。次いで、得られた突然変異分子について、生物活性（例えばキナーゼ活性）を調べたり、試験管内増殖活性などのアッセイを行なったりする。結合パートナー／基質の結合に不可欠な部位は、構造分析（例えば結晶化、核磁気共鳴、ホトアフィニティ・ラベリング）によって調べることもできる（Smith他（1992年）、J. Mol. Biol.、第224巻、899〜904ページ；de Vos他（1992年）、Science、第255巻、306〜312ページ）。
【００３７】
“変異体”は、1個の遺伝子の全体またはその断片と実質的に類似している分子を意味する。それは、例えば、1個以上のヌクレオチドが置換されているが、特定の遺伝子とハイブリダイズする能力、または元のDNAとハイブリダイズするmRNA転写産物をコードする能力は保持しているヌクレオチド置換変異体である。“ホモログ”は、異なる属または種の動物からの断片配列または変異配列を意味する。“アナログ”は、分子全体と実質的に似ているか、分子全体と関連する機能を持つ、自然には存在しない分子、変異体、その断片を意味する。
【００３８】
変異ペプチドには、天然の変異体と、従来技術でよく知られている方法で製造した変異体とが含まれる。このような変異体は、この明細書に開示した分子技術と配列情報を利用すると、容易に同定／作製することができる。さらに、このような変異体は、本発明のeIF-5Aタンパク質またはDHSタンパク質との配列および／または構造の類似性に基づき、他のタンパク質から容易に識別することができる。存在する相同性／一致の程度は、主として、そのタンパク質が機能性変異体であるか非機能性変異体であるかや、パラログ・ファミリーに存在する違いの量、オルトログ間の進化的距離に基づくことになろう。
【００３９】
本発明によるeIF-5AポリヌクレオチドまたはDHSポリヌクレオチド、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、タンパク質の自然には存在しない変異体は、組み換え技術を利用して容易に作り出すことができる。そのような変異体としては、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に付加や置換あるものが挙げられる。例えば置換の1つのクラスは、保存されたアミノ酸置換である。そのような置換は、タンパク質中のあるアミノ酸が似た性質を持つ別のアミノ酸で置き換えられている置換である。保存されている置換と一般に見なされているのは、脂肪族アミノ酸であるアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンの間での置換；ヒドロキシル残基であるセリンとトレオニンの入れ代わり；酸性残基であるアスパラギン酸とグルタミン酸の交換；アミド残基であるアスパラギンとグルタミンの間の置換；塩基性残基であるリシンとアルギニンの入れ代わり；芳香族残基であるフェニルアラニンとチロシンの間の置換である。どのアミノ酸変化が表現型に関してサイレントであるかに関する説明は、Bowie他、Science、第247巻、1306〜1310ページ、1990年に見いだすことができる。
【００４０】
この明細書では、“ハイブリダイゼーション”という用語は、当業者には明らかなように、一般に、プローブ配列と標的配列の性質に応じた適切な厳しい条件下における核酸のハイブリダイゼーションを意味するのに用いる。ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、従来技術においてよく知られており、どの程度の緊縮を望むかに応じてインキュベーションの時間、温度、溶液のイオン強度を変えることにより、条件を容易に調節することができる。例えばSambrook, J.他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第2版、コールド・スプリング・ハーバー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年を参照のこと。
【００４１】
条件の選択は、ハイブリダイズさせる配列の長さ（特にプローブ配列の長さ）、核酸の相対的G-C含有量、許容されるミスマッチの量によって決まる。低緊縮条件は、相補性の程度が少ない鎖同士の部分的ハイブリダイゼーションが望ましいときに好ましい。完全な相補性またはほぼ完全な相補性を望むときには、高緊縮条件が好ましい。高緊縮条件とは、ハイブリダイゼーション溶液が、6×SSC、0.01MのEDTA、1×デンハルト溶液、0.5％のSDSを含んでいることを意味する、ハイブリダイゼーションは、約68℃にて、クローニングしたDNAの場合には約3〜4時間にわたって実施し、真核生物の全DNAの場合には約12〜16時間にわたって実施する。低緊縮の場合には、ハイブリダイゼーションの温度が二本鎖の融点（Tm）よりも約42℃低くなる。Tmは、G-C含有量、二本鎖の長さ、ならびに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００４２】
この明細書では、DNA分子またはRNA分子の“対応する部分にハイブリダイズする”という表現は、例えばオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、または（センス方向またはアンチセンス方向の）任意のヌクレオチド配列とハイブリダイズする分子が、サイズがほぼ同じで配列が十分に似ているために、適切な条件下で、ハイブリダイズする別の核酸分子の配列を認識したり、その別の核酸分子の配列とハイブリダイズしたりすることを意味する。例えば2つの配列の間に約70％以上の類似性がある限り、ヌクレオチドが100個の長さのセンス分子は、あるヌクレオチド配列の約100ヌクレオチドの部分を認識したり、その部分とハイブリダイズしたりする。“対応する部分”のサイズの中には、ハイブリダイゼーションにおけるある程度のミスマッチも許容されることを理解する必要がある。そのため“対応する部分”は、その部分にハイブリダイズする分子よりも、例えば20〜30％、好ましくは約12〜15％以下の範囲で短くても長くてもよい。
【００４３】
さらに、ポリペプチドの機能性変異体は、機能をまったく変化させなかったり、顕著には変化させなかったりする似たアミノ酸による置換も含むことができる。機能にとって不可欠なアミノ酸は、公知の方法で同定することができる。方法としては、例えば部位指定突然変異誘発やアラニン走査突然変異誘発がある（Cunningham他（1989年）、Science、第244巻、1081〜1085ページ）。後者の方法では、分子内のすべてのアラニン残基だけに突然変異を導入する。次いで、得られた突然変異分子について、生物活性を調べたり、アッセイを行なったりする。
【００４４】
本発明により、アポトーシス特異的eIF-5AまたはDHSの発現を阻止すること、または減少させることが可能な他の薬剤も提供される。そのような薬剤の1つとして、短い阻害RNA（“siRNA”）がある。siRNA技術は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドに代わる方法として登場してきた。なぜなら、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いて実現できるのと同等以上の抑制レベルを実現するのに必要とされる濃度がより低いからである（Thompson、2002年）。多彩な生物（例えば植物、線虫、ショウジョウバエ）において特定の遺伝子の発現を沈黙させるのに、長い二本鎖RNAが用いられてきた。ダイサーと呼ばれるRNアーゼIIIファミリーの酵素は、その長い二本鎖RNAを処理して21〜23ヌクレオチドの短い干渉RNAにする。その短い干渉RNAは、今度はRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に組み込まれる。siRNAがほどけるとRISCが活性化され、一本鎖siRNAが塩基対を形成することによってそのRISCを内在性mRNAへと導くことができる。RISCが内在性mRNAを認識すると、mRNAが開裂し、その結果としてそのmRNAを翻訳に利用できなくなる。長い二本鎖RNAを哺乳動物の細胞に導入すると強力な抗ウイルス反応が生じるが、siRNAを利用するとそれを回避することができる（Elbashir他、2001年）。siRNAは細胞培養物で広く使用されており、特定の遺伝子の発現を90％以上減らすことを日常的に実現している。
【００４５】
疾患のモデル動物で遺伝子の発現を阻止するのにsiRNAを用いることも一般的になってきている。最近の研究により、ルシフェラーゼに対するsiRNAが、出生後のマウスの多彩な器官に同時にトランスフェクトしたプラスミドからのルシフェラーゼの発現を阻止できることが明らかにされた（Lewis他、2002年）。TNFファミリーの受容体であるFasに対するsiRNAをマウスの尾の静脈に流体力学的に注入すると、80％を超える造血細胞にトランスフェクトすることができ、最後に注入してから10日後までに肝臓におけるFasの発現を90％減らすことができた（Song他、2003年）。Fas siRNAは、マウスを肝臓線維症と劇症肝炎から保護することもできた。致死量のリポ多糖で処理したマウスにおける敗血症の進展は、TNF-αに対するsiRNAを用いることによって阻止された（Sφrensen他、2003年）。siRNAは、細胞培養物の中で効果が長続きすること、生体内の細胞にトランスフェクトできること、生体内の血清中での分解に対する抵抗力があることを考慮すると、生体内で特定の遺伝子の発現を阻止するための非常に強力な薬剤となる可能性がある（Bertrand他、2002年）。
【００４６】
本発明の発明者は、細胞にアポトーシス特異的eIF-5AのsiRNAをトランスフェクトし、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現に及ぼす効果を研究した。図64は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞ではアポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の産生が減少したことを示している。図65〜図67は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞では、カンプトテシンとTNA-αに曝露した後にアポトーシスを起こす細胞の割合が、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしなかった細胞と比べて少なかったことを示している。そこで本発明の一実施態様では、アポトーシス特異的eIF-5AのsiRNAを含むベクターを細胞にトランスフェクトすることにより、その細胞内におけるアポトーシス特異的eIF-5Aの発現が阻止される。
【００４７】
アポトーシス特異的eIF-5Aの好ましいsiRNAとしては、配列番号30、31、32、33を持つものが挙げられる。別のsiRNAとしては、これらの配列番号と配列が実質的に一致するもの（すなわち90％の相同性）、または高緊縮条件下でこれらの配列番号とハイブリダイズする配列を持つものがある。実質的な配列一致、実質的に相同とは、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドに関して上に説明したことを意味する。“アポトーシス特異的eIF-5AのsiRNA”という表現には、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドに関して上に説明した機能性変異体または誘導体が含まれる。
【００４８】
siRNAを送達する方法と、siRNAを含む発現構造体／ベクターを送達する方法は、当業者に知られている。米国出願第2004/106567号と第2004/0086884号（その内容は、参考としてこの明細書に組み込まれている）には、多数の発現構造体／ベクターと、送達メカニズムが提示されている。送達メカニズムをいくつか例示すると、ウイルス・ベクター、非ウイルス・ベクター、リポソーム送達ビヒクル、プラスミド注入系、人工ウイルス・エンベロープ、リシン共役体などがある。
【００４９】
当業者であれば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む発現構造体／ベクターにおいて有用な調節配列が何であるかを知っているであろう。例えば調節配列としては、構成的プロモータ、誘導的プロモータ、組織特異的プロモータ、あるいはこれらの組み合わせが可能である。
【００５０】
ヒトで重要な多くの疾患は、アポトーシスの異常によって生じる。そのような異常は、病因となる細胞（例えばがん）の数の増大や、ダメージとなるほどの細胞の喪失（例えば変性疾患）の結果として起こる可能性がある。本発明の方法と組成物を利用して予防または治療できるアポトーシス関連疾患としては、例えば、神経／神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化症（ルー・ゲーリック病）、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（DMD）、運動ニューロン疾患、虚血、心筋虚血、慢性心不全、脳卒中、小児脊髄性筋萎縮、心停止、腎不全、アトピー性皮膚炎、敗血症、敗血症性ショック、エイズ、肝炎、緑内障、糖尿病（1型と2型）、喘息、色素性網膜炎、骨粗鬆症、異種移植拒絶、火傷などがある。
【００５１】
アポトーシスの制御異常によって生じるそのような疾患の1つが緑内障である。さまざまな視覚組織におけるアポトーシスは、緑内障患者が失明するに至る決定的な1つの因子である。緑内障は、視神経に対する損傷から生じる一群の眼の疾患であり、失明へと進む。アポトーシスは、この視神経の損傷の直接的な原因であることがわかっている。
【００５２】
緑内障の分野における初期の研究により、眼内圧（“IOP”）が上昇することで篩板（孔の開いたコラーゲン性結合組織）のレベルでの軸索輸送が妨げられ、網膜神経節細胞が死ぬことがわかった。QuigleyとAnderson（1976年）、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.、第15巻、606〜616ページ；Minckler、Bunt、Klock（1978年）、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.、第17巻、33〜50ページ；AndersonとHendrickson（1974年）、Ophthalmol. Vis. Sci.、第13巻、771〜783ページ；Quigley他（1980年）、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.、第19巻、505〜517ページ。緑内障の動物モデルと死んだヒトの組織での研究は、緑内障における網膜神経節細胞の死がアポトーシスによって起こることを示している。Garcia-Valenzuela他（1995年）、Exp. Eye Res.、第61巻、33〜44ページ；Quigley他（1995年）、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.、第36巻、774〜786ページ；Haefliger I.O.、Flammer J.（編）、『緑内障の病因における一酸化窒素とエンドセリン』、ニューヨーク、ニューヨーク州、リピンコット-レイヴン社（1998年）の中のMonard、213〜220ページ。IOPが上昇する結果として軸索輸送が妨げられると、栄養因子が欠乏して網膜神経節細胞が死ぬ可能性がある。Quigley（1995年）、Aust. N.Z. J. Ophthalmol.、第23巻(2)、85〜91ページ。緑内障になった目の視神経頭部星状細胞も、いくつかの神経毒性物質のレベルを増大させることが見いだされている。例えば腫瘍壊死因子（TNF-α）の産生増大（Yan他（2000年）、Arch. Ophthalmol.、第118巻、666〜673ページ）と、一酸化窒素を発生させる酵素である一酸化窒素シンターゼの産生増大（Neufeld他（1997年）、Arch. Ophthalmol.、第115巻、497〜503ページ）が、緑内障になった目の視神経頭部で見られている。さらに、活性化した網膜神経節細胞による一酸化窒素シンターゼ（iNOS）とTNF-αの誘導形態の発現増大が、遺伝性網膜疾患のモデル・ラットで観察されている。Cotinet他（1997年）、Glia、第20巻、59〜69ページ；de Kozak他（1997年）、Ocul. Immunol. Inflamm.、第5巻、85〜94ページ；Goureau他（1999年）、J. Neurochem.、第72巻、2506〜2515ページ。緑内障の視神経頭部では、過剰な一酸化窒素が、網膜神経節細胞の軸索の変性と関係づけられている。ArthurとNeufeld（1999年）、Surv. Ophthalmol.、第43巻(補1)、S129〜S135ページ。最後に、虚血または静水圧の上昇という刺激に応答して網膜神経節細胞によるTNF-αの産生が増大すると、同時に培養した網膜神経節細胞においてアポトーシスが誘導されることがわかっている。TezelとWax（2000年）、J. Neurosci.、第20巻(23)、8693〜8700ページ。
【００５３】
網膜神経節細胞をアポトーシスによる変性から保護することが、緑内障による失明を防ぐ可能性のある新しい治療法として研究されている。眼疾患のモデル動物においてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いることで、成功が見られている。一過性の全体的網膜虚血のモデルでは、主に網膜の内部核と神経節細胞層において、虚血の間にカスパーゼ2の発現が増大した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いてカスパーゼを抑制すると、電位網膜図において顕著な組織病理学的改善と機能改善が見られた。Singh他（2001年）、J. Neurochem.、第77巻(2)、466〜475ページ。別の研究では、視神経にトランスフェクションを行なうと、網膜神経節細胞がアポトーシス促進タンパク質Baxをアップレギュレーションしてアポトーシスが起こることが明らかにされている。Baxアンチセンス・オリゴヌクレオチドをラットの側頭上部網膜に繰り返して注入したとき、視神経へのトランスフェクションの後にBaxの局所的発現が阻止され、生き残る網膜神経節細胞の数が増えた。Isenmann他（1999年）、Cell Death Differ.、第6巻(7)、673〜682ページ。
【００５４】
網膜神経節細胞へのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの送達は、そのアンチセンス・オリゴヌクレオチドをリポソームの中に包み込み、それを、融合により、不活化した二本のヘマグルチニン化用ウイルス（HVJ；センダイ・ウイルス）のエンベロープでコーティングする（HVJリポソーム）ことで改善される。FITCで標識したアンチセンス・オリゴヌクレオチドをHVJリポソームの中に包み込んだものをマウスの硝子体内に注入すると、神経節層の44％以内の細胞が強い蛍光を3日間にわたって出し続けたのに対し、FITCで標識した裸のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの蛍光は1日後に消えた。Hangai他（1998年）、Arch. Ophthalmol.、第116巻(7)、976ページ。
【００５５】
アポトーシスの予防または減少を実現する本発明の1つの方法は、目の細胞内や組織内（例えば星状細胞、網膜の神経節、網膜グリア細胞、篩板）のアポトーシスを予防したり減少させたりすることを目的としている。緑内障における網膜神経節細胞の死はアポトーシスによって起こり、その結果として失明する。そこで、網膜神経節細胞をアポトーシスによる変性から保護することによって網膜神経節細胞におけるアポトーシスの阻止または減少を実現する方法があると、緑内障が原因の失明を予防する新しい治療法になる。
【００５６】
本発明により、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抑制することによって緑内障になった目における網膜神経節細胞の死を予防または阻止する方法が提供される。アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止するとアポトーシスが減る。アポトーシス特異的eIF-5Aは、アポトーシス・プロセスの全体を調節しているように見える強力な遺伝子である。したがって視神経頭部でアポトーシスを制御するということは、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止することによる緑内障の治療法が提供されることを意味する。
【００５７】
アポトーシス特異的eIF-5Aの発現抑制は、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNAを目の細胞（例えば篩板、星状細胞、網膜神経節細胞、網膜グリア細胞など）に投与することによって実現される。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとsiRNAは、上に定義したものである。すなわち、アポトーシス特異的eIF-5Aの少なくとも一部をコードしているヌクレオチド配列を有する。本発明のこの点に関して有用な具体的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、配列番号26または27を含むか、非常に厳しい条件下で配列番号26または27と相補的な配列と結合してアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止するオリゴヌクレオチドを含んでいる。
【００５８】
本発明の別の一実施態様により、篩板、星状細胞、網膜神経節細胞、網膜グリア細胞においてアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抑制する方法が提供される。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNA（例えば配列番号26や27）を、篩板細胞、星状細胞、網膜神経節細胞、網膜グリア細胞に投与する。これらの細胞は、ヒト起源のものが可能である。
【００５９】
eIF-5Aは、アポトーシスにおける役割に加え、免疫応答でもある役割を果たしている可能性がある。本発明の発明者は、アポトーシス特異的eIF-5Aのレベルが、虚血の心臓組織において2つのサイトカイン（インターロイキン1β“IL-1β”とインターロイキン18“IL-18”）と相関していることを発見し、したがって虚血の心臓組織に見られるようにアポトーシス特異的eIF-5Aが細胞死に関与していることも証明した。このアポトーシス特異的eIF-5A／インターロイキンの相関は、虚血でない心臓組織では見られない。図50A〜図50Fと図51を参照のこと。PCRを利用し、アポトーシス特異的eIF-5A、増殖eIF-5A（“eIF-5A2”、別のアイソフォーム）、IL-1β、IL-18のレベルを、虚血になったさまざまな心臓組織（冠状動脈バイパス移植の患者や弁（僧帽弁と心房弁）を置換した患者からの組織）で測定して比較した。
【００６０】
強力なこれらインターロイキンとアポトーシス特異的eIF-5Aが関係していることは、虚血における炎症経路とアポトーシス経路が、アポトーシス特異的eIF-5Aのレベル制御を通じて制御されている可能性のあることを示唆している。アポトーシス特異的eIF-5Aが免疫応答に関与していることの別の証拠は、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）でのeIF-5Aの発現レベルは通常は低いが、Tリンパ球特異的な刺激で刺激するとアポトーシス特異的eIF-5Aの発現が劇的に増大するという事実である（Bevec他、1994年）。これは、T細胞の増殖および／または活性化においてアポトーシス特異的eIF-5Aがある役割を担っていることを示唆している。活性化されたT細胞は多彩なサイトカインを産生できるため、サイトカインのmRNAのための核細胞質間シャトルとしてアポトーシス特異的eIF-5Aが必要とされている可能性がある。上記論文の著者は、HIV-1患者のPBMCにおいてeIF-5Aのレベルが上昇し、その細胞における効率的なHIVの複製に貢献している可能性があることも見いだした（Ruhl他、1993年）。なぜならeIF-5AはHIV Revタンパク質の細胞結合因子であり、HIVの複製に必要とされることがわかっているからである。
【００６１】
より最近になって、樹状細胞が成熟する間にeIF-5Aの発現が増大することが見いだされた（Kruse他、2000年）。樹状細胞は、ヘルパーT細胞とキラーT細胞を刺激してT細胞を媒介とした免疫化を誘導する抗原提示細胞である（Steinman、1991年）。未熟な樹状細胞はT細胞を刺激する能力が欠けており、T細胞を活性化できる成熟細胞にするには適切な刺激（すなわち炎症性サイトカインおよび／または細菌の生成物）を必要とする。eIF-5Aの活性化に必要とされる酵素であるデオキシハイプシン・シンターゼの阻害剤が、樹状細胞の表面でCD83が発現するのを妨げることにより、樹状細胞によるTリンパ球の活性化を阻止することが見いだされた（Kruse他、2000年）。したがってeIF-5Aは、CD83のmRNAのための核細胞質間シャトルとして作用することにより、樹状細胞の成熟を促進している可能性がある。
【００６２】
免疫系におけるeIF-5Aの役割に関するこれら2つの研究（Bevec他、1994年；Kruse他、2000年）のどちらでも、著者は、eIF-5Aのどのアイソフォームを調べているのかを明らかにしておらず、その理由も明確にしていない。上に説明したように、ヒトは、eIF-5Aのアイソフォームを2つ持っている。それは、アポトーシス特異的eIF-5A（“eIF-5A1”）と、増殖eIF-5A（“eIF-5A2”）であり、それぞれ別の染色体上にコードされている。本発明の発明者が発見する以前は、これらアイソフォームの両方で機能が重複していると考えられていた。刺激したPBMCにおいてeIF-5AのmRNAを検出するのに使用されたBevecらが記載しているオリゴヌクレオチドは、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aと100％相同であり、この研究は、増殖eIF-5Aのクローニングがなされるよりも前であった。同様に、樹状細胞が成熟している間のeIF-5Aを逆転写酵素連鎖反応によって検出するのに使用されたKruseらが記載しているプライマーは、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aと100％相同であった。
【００６３】
本発明は、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を制御して樹状細胞の成熟速度とPBMCの活性化を制御し、そのことによって今度はT細胞を媒介とした免疫化の速度を制御できるようにすることに関する。U-937細胞がeIF-5AのmRNAを発現することが知られているため、発明者らは、U-937細胞を用い、単球が接着性マクロファージに分化する際のアポトーシス特異的eIF-5Aの役割を研究した（Bevec他、1994年）。U-937細胞は、懸濁状態で増殖するヒト単球細胞系であり、PMAで刺激すると接着性になってマクロファージへと分化する。培地を交換してPMAを除去すると、細胞は不活性になり、その後サイトカインを産生できるようになる（Barrios-Rodiles他、J. Immunol.、第163巻、963〜969ページ、1999年）。マクロファージは、リポ多糖（LPS：多数の細菌の外膜で見いだされていて、一般に炎症性応答を誘導することが知られている）に応答し、TNF-αとIL-1βの両方を産生する（Barrios-Rodiles他、1999年）。幹細胞の分化と、その結果産生されるサイトカインを示してある図78を参照のこと。U-937細胞は、LPSで刺激するとIL-6とIL-10も産生する（Izeboud他、J. Receptor & Signal Transduction Research、第19巻(1〜4)、191〜202ページ、1999年）。
【００６４】
U-937細胞を利用し、単球の分化とTNF-αの分泌が起こっている間にアポトーシス特異的eIF-5Aがアップレギュレーションされることを示した。図77を参照のこと。したがって本発明の1つの特徴により、サイトカインの産生を阻止するため、または減少させるためにマクロファージの成熟を阻止する方法または遅延させる方法が提供される。この方法は、DHSまたはアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を減らすことのできる薬剤を投与する操作を含んでいる。DHSの発現を減らすかなくすことにより、アポトーシス特異的eIF-5Aの活性化が少なくなるか、なくなる。アポトーシス特異的eIF-5Aは、単球の分化とTNF-αの分泌が起こっている間にアップレギュレーションされるため、これらのイベントが起こるのにアポトーシス特異的eIF-5Aが必要であると考えられている。そこでアポトーシス特異的eIF-5Aの活性化を減らすかなくすことにより、あるいはアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を直接的に減らすかなくすことにより、単球の分化とTNF-αの分泌を減らすかなくすことができる。DHSまたはアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を減らすことのできる任意の薬剤を用いることができる。そのような薬剤は、例えば、この明細書に記載したアンチセンス・オリゴヌクレオチドとsiRNAである。
【００６５】
発明者らは、特定の刺激に応答してサイトカインを産生すると考えられている細胞系を利用し、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを、試験管内でサイトカインのmRNAのための核細胞質間シャトルとして機能させることにより、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aがサイトカインの翻訳を促進する能力を研究した。最近のいくつかの研究では、ヒト肝細胞系が、サイトカインの刺激に対し、他のサイトカインの産生を誘導することによって応答する可能性のあることが見いだされている。HepG2は、特徴がよくわかっているヒト肝細胞がん細胞系であり、サイトカインに対する感受性があることが見いだされている。HepG2細胞は、IL-1βに応答し、TNF-αのmRNAとTNF-αタンパク質を投与量に依存した形で急速に産生する（Frede他、1996年；Rowell他、1997年；Wordemann他、1998年）。そこでHepG2細胞を、TNF-αの産生調節を研究するためのモデル系として使用した。本発明の発明者は、アポトーシス因子5Aに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドをHepG2細胞にトランスフェクトすると、その細胞おいてヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aが阻止されることにより、その細胞が産生するTNF-αが少なくなることを示した。
【００６６】
そこで本発明の一実施態様では、サイトカインのレベルを低下させる方法が提供される。この方法は、アポトーシス因子5A1の発現を減少させることのできる薬剤を投与する操作を含んでいる。アポトーシス因子5A1の発現が減少すると、サイトカインの発現も減少し、その結果として細胞が産生するサイトカインの量も少なくなる。サイトカインは炎症性サイトカインであることが好ましく、例えばIL-1、IL-18、IL-6、TNF-αなどが挙げられる。
【００６７】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは上に説明したものである。ヒトの具体的なアポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、配列番号35、37、39からなる群から選択したものであるか、配列番号35、37、39からなる群から選択した配列と高緊縮条件下でハイブリダイズするアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。
【００６８】
薬剤は、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5AのsiRNAを含むこともできる。そのsiRNAは、上に説明したものである。具体的なsiRNAは、配列番号30、31、32、33からなる群から選択した配列を有するか、配列番号30、31、32、33からなる群から選択した配列と高緊縮条件下でハイブリダイズするsiRNAである。図65〜図67から、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞は、カンプトテシンとTNA-αに曝露した後にアポトーシスを起こす細胞の割合が、トランスフェクトしなかった細胞と比べて少なかったことがわかる。
【００６９】
本発明は、p53の発現を減少させる方法にも関する。この方法は、アポトーシス因子5Aの発現を減少させることのできる薬剤（例えば上記のアンチセンス・オリゴヌクレオチドやsiRNA）を投与する操作を含んでいる。アポトーシス特異的eIF-5Aの発現が減少すると、図52と実施例10に示したように、p53の発現が減少する。
【００７０】
本発明は、Bcl-2の発現を減少させる方法にも関する。この方法は、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を減少させることのできる薬剤を投与する操作を含んでいる。好ましい薬剤としては、上記のアンチセンス・オリゴヌクレオチドやsiRNAがある。アポトーシス特異的eIF-5Aの発現が減少すると、図63と実施例13に示したように、Bcl-2の発現が増大する。図63から、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞では、アポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の産生が少なくなり、Bcl-2タンパク質の産生が増えることがわかる。アポトーシス特異的eIF-5Aの発現減少は、BCL-2の発現増加と相関している。
【００７１】
本発明により、TNF-αのレベルを低下させる必要のある患者のTNF-αのレベルを低下させる方法であって、その患者に、上記のようなアポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNAを投与する操作を含む方法も提供される。図69と実施例14からわかるように、本発明のアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞では、IL-1で誘導した後のTNF-αの産生が、そのアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞よりも少なくなった。
【００７２】
さらに、本発明により、IL-1、TNF-α、IL-6、IL-18のレベルの上昇を特徴とする病的状態の治療方法であって、その病的状態を有する哺乳動物に、上記のようにしてアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を減少させる薬剤（アンチセンス・オリゴヌクレオチドやsiRNA）を投与する操作を含む方法が提供される。
【００７３】
IL-1、TNF-α、IL-6のレベルの上昇を特徴とすることが知られている病的状態としては、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、アレルギー、動脈炎、クローン病、炎症性腸疾患（ibd）、潰瘍性大腸炎、冠状動脈性心疾患、嚢胞性線維症、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、グレーブス病、歯周炎、緑内障、黄斑変性、目の表面（例えば円錐角膜）の疾患、臓器の虚血（心臓、腎臓）、再灌流傷害、敗血症、多発性骨髄腫、臓器移植の拒絶、乾癬、湿疹などがある。そこで本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド、siRNA、方法を用いてアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を減少させると、これらの病的状態から解放することができる。
【００７４】
本発明により、siRNAを哺乳動物の肺にin vivoで送達する方法も提供される。アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを（水と混ぜて）マウスの鼻腔内に投与した。アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを投与した24時間後、リポ多糖（LPS）をマウスの鼻腔内に投与した。さらに24時間後、右肺を取り出し、ミエロペルオキシダーゼを測定した。マウスのアポトーシス特異的eIF-5A siRNAは、対照siRNAと比べてミエロペルオキシダーゼをほぼ90％抑制した。この実験では、各群、マウス5匹とした。この実験結果は、siRNAが、哺乳動物の肺組織にin vivoでうまく送達されたことと、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAがアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止し、その結果としてミエロペルオキシダーゼの産生を抑制したことを示している。ミエロペルオキシダーゼ（“MPO”）は、好中球で見つかったリソソーム酵素である。ミエロペルオキシダーゼは、水素ペルオキシダーゼを利用して塩化物を次亜塩素酸に変換する酵素である。次亜塩素酸は細菌と反応してその細菌を破壊する。ミエロペルオキシダーゼは、動脈が炎症を起こしているときにも産生される。したがって、ミエロペルオキシダーゼが好中球および炎症応答と関係していることは明らかである。本発明の発明者は、siRNAを用いてアポトーシス特異的eIF-5Aをダウンレギュレーションすることにより、（通常はミエロペルオキシダーゼの産生を含む炎症応答を起こさせる）LPSに曝露した後の肺組織でミエロペルオキシダーゼが顕著に減少することを明らかにした。したがって本発明の発明者は、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAが、肺組織におけるミエロペルオキシダーゼの量を低下させること、または抑制することができ、その結果として炎症応答を低下させたり抑制したりできる。
【００７５】
LPSは、細菌の巨大分子細胞表面抗原であり、生体内に投与すると、炎症応答のネットワークを始動させる。LPSを鼻腔内に供給すると、肺で好中球の数が増加する。主要なイベントの1つは、受容体を媒介とするプロセスを通じた単核食細胞の活性化であり、その結果として多数のサイトカイン（例えばTNF-α）が放出される。そして今度はTNF-αに誘導されて内皮細胞に接着する好中球が増大すると、肺空間への大量の浸潤が起こる。
【００７６】
そこで本発明の発明者は、アポトーシス特異的eIF-5Aと免疫応答が相関していることを示しただけでなく、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAがミエロペルオキシダーゼの産生を抑制すること（すなわち炎症応答の一部）も示した。本発明の発明者は、単なる鼻腔内送達によって生体内の肺組織にsiRNAを送達できることも示した。siRNAは、水にだけ混合した。これは、大きな突破口かつ大きな発見である。なぜなら他の当業者は、許容できるsiRNAの送達法を設計しようとこれまで試みてきたからである。
【００７７】
炎症を少なくする能力は、多くの疾患において直接的に重要である。MPOのレベルは、心筋梗塞や、自己免疫疾患が原因となってサイトカインによって誘導される炎症の極めて重要な予測因子である。炎症応答の低下または抑制をもたらすこの能力は、自己免疫疾患などの炎症関連疾患の治療に役立つ可能性がある。さらに、MPOを低下させる能力は、患者を虚血や心筋梗塞から保護する手段ともなりうる。
【００７８】
別の実験では、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを用いてマウスを同様に処理した。リポ多糖（LPS）をマウスに投与し、炎症と免疫系の応答を誘導した。制御条件下で、LPSは胸腺細胞を殺す。胸腺細胞というのは、胸腺で作り出される免疫系の重要な前駆体細胞であり、感染から保護してくれる。しかしアポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを用いると、LPSの存在下で胸腺細胞の約90％が生存することができた。胸腺細胞はT細胞の前駆体であるため、胸腺細胞が破壊されるとT細胞が作られないことで身体の自然免疫が弱められ、その結果として細菌感染などを防ぐことができない。したがってアポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを用いると、（第1の実施例でMPOのレベルが低下することからわかるように）身体の自然免疫防御システムを破壊することなく、炎症を減らすことができる。
【００７９】
本発明の一実施態様は、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とするsiRNAを用いてアポトーシス特異的eIF-5Aを阻害することにより、NKFベータ（“NFκB”）のレベルを低下させることに関する。NFκBは、炎症に関する主要な細胞シグナル伝達分子である。NFκBが活性化されるとCOX-2の発現が誘導され、その結果として組織の炎症が起こる。炎症部位における大量のプロスタグランジンの産生にとって重要であると考えられているCOX-2をコードしている遺伝子の発現は、NFκBによって転写レベルで制御されていると考えられている。NFκBは、細胞の細胞質に存在しており、その阻害剤と結合している。傷害または炎症による刺激があると、その阻害剤からNFκBが解放される。NFκBは核の中に移動し、COX-2の発現に関わる遺伝子を活性化する。したがってNFκBのレベルを低下させることにより、炎症を減らすことができる。
【００８０】
1つの実験では、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とするsiRNAを用いて上皮細胞（HT-29細胞）を処理する。その後、TNFまたはインターフェロンγとLPSとを1時間にわたって添加すると、NFκBによって炎症が誘導された。この実験の結果から、siRNAを用いてアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止すると、インターフェロンγとLPSによって活性化されたNFκBのレベルが低下したことがわかる。図74を参照のこと。
【００８１】
本発明の一実施態様により、細胞内で内在性アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止する方法が提供される。発現の阻止は、すでに説明した本発明によるアポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・ポリヌクレオチドまたはsiRNAを用いて行なうことが好ましい。内在性アポトーシス特異的eIF-5Aが発現すると、細胞にさまざまな効果が及ぶ。例えばさまざまなタンパク質、因子、受容体、サイトカインの発現が減少することが観察される（p53；炎症性サイトカイン（図112、図113、図114を参照のこと）；ミエロペルオキシダーゼ；活性なNFκB；TLR4（図109）；TNFR-1（図111）；iNOS）。内在性アポトーシス特異的eIF-5Aの発現が減少すると、細胞内でのBcl-2の発現レベルが増大する。
【００８２】
本発明のアンチセンス核酸siRNAは、予防または治療を目的として動物で使用するときには、薬理学的に許容される基剤も含む組成物の形態で投与されることを理解されたい。薬理学的に許容される適切な基剤としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどのうちの1つ以上、またはこれらの組み合わせがある。薬理学的に許容される基剤には、結合タンパク質の商品寿命を長くしたり効果を増大させたりするため、少量の助剤として、湿潤剤、乳化剤、保存剤、緩衝液がさらに含まれていてもよい。注射用組成物は、従来技術でよく知られているように、哺乳動物に投与した後、活性成分の放出が直ちに起こるように、または長時間にわたって起こるように、または遅延して起こるように製剤化することができる。
【００８３】
本発明の組成物は、さまざまな形態にすることができる。例えば、固体、半固体、液体の投与形態がある。具体的には、錠剤、ピル、粉末、溶液、分散液、懸濁液、リポソーム、座薬、注射可能な溶液、輸液可能な溶液などである。好ましい形態は、想定している投与経路と、どのような治療を行なうかによって異なる。
【００８４】
このような組成物は、医薬分野でよく知られている方法で調製することができる。組成物を作るとき、活性成分は、通常、基剤と混合するか、基剤で希釈するか、基剤の中に閉じ込める。基剤は、例えば、カプセル、サッシェ、紙、または他の容器の形態にすることが可能である。基剤が希釈剤として機能する場合には、固体、半固体、液体が可能であり、活性成分のビヒクル、賦形剤、溶媒として機能する。したがって組成物の形態としては、錠剤、ロゼンジ、カシェ、エリキシル、懸濁液、（固体としての、または液体媒体に含まれた）アエロゾル、活性化合物を例えば10重量％まで含む軟膏、軟ゼラチン・カプセル、ゼラチン・カプセル、座薬、注射溶液、懸濁液、殺菌包装した粉末、局所的パッチが可能である。
【００８５】
これで本発明の全体を説明し終えたため、具体例として示した以下の実施例を参照することにより、本発明がさらに理解しやすくなろう。実施例は本発明の理解を助けるためのものであり、本発明の範囲がいかなる意味でもこれら実施例に限定されることは想定しておらず、そう考えてもならない。実施例には、従来法に関する詳しい説明は含まれていない。そのような方法は当業者にはよく知られており、多数の出版物に記載されている。従来法（例えば、ベクターやプラスミドを構成する際に利用する方法、ポリペプチドをコードしている核酸をそのようなベクターやプラスミドに挿入する際に利用する方法、プラスミドを宿主細胞に導入する際に利用する方法、その宿主細胞による遺伝子や遺伝子産物の発現や測定を行なう際に利用する方法）の詳しい説明は、多数の出版物から知ることができる。例えば、Sambrook, J.他、1989年、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版。この明細書で言及したあらゆる参考文献は、その全体がこの明細書に組み込まれている。
【実施例】
【００８６】
実施例１
DNAラダーリングによるラットの黄体におけるアポトーシスの可視化
アポトーシスの程度をDNAラダーリングによって調べた。QIAamp DNA血液キット（キアジェン社）を製造会社の指示に従って使用し、分散させた黄体細胞、または切除した黄体組織からゲノムDNAを単離した。黄体組織は、PGF-2αを用いた処理によってアポトーシスを誘導する前と、アポトーシスを誘導してから1時間後および24時間後に切除した。単離した500ngのDNAの末端への標識を、0.2μCiの[α-32P]dCTP、1mMのトリス、0.5mMのEDTA、3単位のクレノウ酵素、0.2pMのdATP、0.2pMのdGTP、0.2pMのdTTPとともに室温にて30分間にわたってインキュベートすることによって実現した。組み込まれなかったヌクレオチドは、Sambrookらに従ってサンプルを1mlのセパデックスG-50カラムを通過させることによって除去した。次に、トリス-酢酸塩-EDTA（1.8％）ゲル電気泳動によってサンプルを分離した。ゲルを室温にて真空下で30分間にわたって乾燥させ、-80℃にて24時間にわたってX線フィルムに露出した。
【００８７】
1つの実験では、PGF-2αを注射した0時間後、1時間後、24時間後に、ラットの過排卵した黄体におけるアポトーシスの程度を調べた。0時間の対照では、PGF-2αを注射せずに卵巣を取り出した。アポトーシスに付随するヌクレアーゼ活性を反映している低分子量DNA断片のラダーリングは、PGF-2αで処理する前に切除した対照の黄体組織では明らかでないが、アポトーシスを誘導してから1時間以内に識別できるようになり、アポトーシスを誘導してから24時間経過するまでには顕著になる。その様子が図16に示してある。この図にある最上部の写真は、ラット黄体アポトーシス特異的DHSのcDNAの3'非翻訳領域を32P-dCTPで標識したものを用いて調べたノーザン・ブロットの放射能写真である。下方の写真は、全RNAを臭化エチジウムで染色したゲルである。各レーンには、RNAが10μg含まれている。このデータから、血清を除去した後にアポトーシス特異的eIF-5Aの転写産物がダウンレギュレーションされていることがわかる。
【００８８】
別の実験では、対応する対照ラットを、PGF-2αではなく生理食塩水で処理した。生理食塩水またはPGF-2αで処理してから15分後、黄体をラットから取り出した。ラットから黄体組織を取り出してから3時間後と6時間後、ゲノムDNAを黄体から単離した。DNAラダーリングと、ゲノムDNA末端標識の増大が、PGF-2αで処理したラットから組織を取り出してから6時間後には明らかであったが、組織を取り出してから3時間後にはそうでなかった。図17を参照のこと。アポトーシスを反映しているDNAラダーリングは、PGF-2αで処理してから15分後に黄体を切除してEBSS（ギブコ社）内で試験管内条件を6時間にわたって維持するときにも明らかである。アポトーシスに関係するヌクレアーゼ活性は、ゲノムDNAの末端標識がより広範に起こることからも明らかである。
【００８９】
別の実験では、500μgのPGF-2αを皮下注射することによって過排卵を誘導した。対照ラットを同じ体積の生理食塩水で処理した。15〜30分後、卵巣を取り出し、コラゲナーゼを用いて細分化した。その分散させたラット由来の細胞をPGF-2αで処理し、次いで、10mmのグルタミン+10mmのスペルミジンの中で1時間にわたってインキュベートした後、スペルミジンなしの10mmのグルタミンの中でさらに5時間にわたってインキュベートする（レーン2）か、10mmのグルタミン+10mmのスペルミジンの中で1時間にわたってインキュベートした後、10mmのグルタミン+1mmのスペルミジンの中でさらに5時間にわたってインキュベートした（レーン3）。生理食塩水で処理したラットからの対照細胞をコラゲナーゼで分散させ、1時間にわたってインキュベートした後、グルタミンの中だけでさらに5時間にわたってインキュベートした（レーン1）。各サンプルからの500ngのDNAをクレノウ酵素を用いて[α-32P]dCTPで標識し、1.8％アガロース・ゲル上で分離し、24時間にわたってフィルムに露出した。結果を図18に示してある。
【００９０】
さらに別の実験では、過排卵したラットに、体重100gにつき1mgの割合でスペルミジンを皮下注射した後、500μgのPGF-2αを皮下注射した。ただしスペルミジンは三等分し、体重100gにつき0.333mgの割合で、PGF-2αを皮下注射する24時間前、12時間前、2時間前に皮下注射した。対照ラットを3つのグループに分けた。すなわち、注射しないグループ、スペルミジンを3回注射するがPGF-2αは注射しないグループ、同じ量の生理食塩水を3回注射した後にPGF-2αで処理するグループである。プロスタグランジンで処理してから1時間35分後または3時間後にラットから卵巣を取り出し、DNAを単離した。各サンプルからの500ngのDNAをクレノウ酵素を用いて[α-32P]dCTPで標識し、1.8％アガロース・ゲル上で分離し、24時間にわたってフィルムに露出した。レーン1は注射なし（レーン3〜5と同時にラットを安楽死させた）；レーン2はスペルミジンを3回注射（レーン3〜5と同時にラットを安楽死させた）；レーン3は生理食塩水を3回注射した後、PGF-2αを注射（PGF-2αで処理した1時間35分後にラットを安楽死させた）；レーン4はスペルミジンを3回注射した後、PGF-2αを注射（PGF-2αで処理した1時間35分後にラットを安楽死させた）；レーン5はスペルミジンを3回注射した後、PGF-2αを注射（PGF-2αで処理した1時間35分後にラットを安楽死させた）；レーン6はスペルミジンを3回注射した後、PGF-2αを注射（PGF-2αで処理した3時間45分後にラットを安楽死させた）；レーン7はスペルミジンを3回注射した後、PGF-2αを注射（PGF-2αで処理した3時間45分後にラットを安楽死させた）。結果を図19に示してある。
【００９１】
RNAの単離
PGF-2αでアポトーシスを誘導した後のさまざまな時期にラットから取り出した黄体組織から、全RNAを単離した。簡単に説明すると、組織（5g）を液体窒素の中ですりつぶした。すりつぶした粉末を30mlのグアニジニウム緩衝液（4Mのイソチオシアン酸グアニジニウム、2.5mMのNaOAc（pH8.5）、0.8％のβ-メルカプトエタノール）と混合した。この混合物を4層のミラクロースで濾過し、4℃にて30分間にわたって10,000×gで遠心分離した。次いで上清に対して11,200×gで20時間にわたって塩化セシウム勾配遠心分離を行なった。ペレット化したRNAを75％エタノールで洗浄し、DEPC処理した水600mlの中に再び懸濁させ、95％エタノールを1.5mlと、3MのNaOAcを60ml用いて-70℃でRNAを沈澱させた。
【００９２】
ゲノムDNAの単離とラダーリング
QIAamp DNA血液キット（キアジェン社）を製造会社の指示に従って使用し、分散させた黄体細胞、または切除した黄体組織からゲノムDNAを単離した。500ngのDNAの末端への標識を、0.2μCiの[α-32P]dCTP、1mMのトリス、0.5mMのEDTA、3単位のクレノウ酵素、0.2pMのdATP、0.2pMのdGTP、0.2pMのdTTPとともに室温にて30分間にわたってインキュベートすることによって実現した。組み込まれなかったヌクレオチドは、Maniatisらが記載している方法に従ってサンプルを1mlのセパデックスG-50カラムを通過させることによって除去した。次に、トリス-酢酸塩-EDTA（2％）ゲル電気泳動によってサンプルを分離した。ゲルを室温にて真空下で30分間にわたって乾燥させ、-80℃にて24時間にわたってX線フィルムに露出した。
【００９３】
プラスミドDNAの単離、DNAのシークエンシング
Sambrookら（上記文献）が記載しているアルカリ溶解法を利用し、プラスミドDNAを単離した。ジデオキシ配列決定法を利用して完全長ポジティブcDNAクローンのシークエンシングを行なった。Sanger他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第74巻、5463〜5467ページ。オープン・リーディング・フレームをコンパイルし、BLAST検索により分析し（GenBank、ベセスダ、メリーランド州）、BCM検索ランチャー（多重配列アラインメント・パターン誘導式多重アラインメント法（F. Corpet、Nuc. Acids Res.、第16巻、10881〜10890ページ、1987年を参照のこと））を用いて配列のアラインメントを実現した。配列と、配列のアラインメントを図5〜図11に示してある。
【００９４】
ラット黄体のRNAのノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション
1％非変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上で、さまざまな段階のアポトーシス状態にあるラットの黄体から全RNAを20mg分離し、ナイロン膜上に固定化した。ランダム・プライマー・キット（ベーリンガー社）を用いて32P-dCTPで標識したラット・アポトーシス特異的eIF-5Aの完全長cDNA（配列番号1）を用い、膜を調べた（7×107cpm）。あるいはランダム・プライマー・キット（ベーリンガー社）を使用して32P-dCTPで標識したラットDHSの完全長cDNA（配列番号6）を用い、膜を調べた（7×107cpm）。膜を、1×SSC、0.1％SDSを用いて室温にて1回洗浄し、0.2×SSC、0.1％SDSを用いて65℃にて3回洗浄した。膜を乾燥させ、-70℃にて一晩にわたってX線フィルムに露出した。
【００９５】
アポトーシス特異的eIF-5AとDHSの両方とも、アポトーシスを起こしている黄体組織においてアップレギュレーションされたことがわかる。アポトーシス特異的eIF-5Aの発現は、PGF-2αで処理することによってアポトーシスを誘導した後に顕著に増大した。時間0の時点では少なく、処理してから1時間以内にかなり増大し、処理してから8時間以内にそれ以上増大し、処理してから24時間以内にわずかに増大した（図14）。DHSの発現は、時間0の時点では少なく、処理してから1時間以内にかなり増大し、処理してから8時間以内にそれ以上増大し、処理してから24時間以内に再びわずかに増大した（図15）。
【００９６】
酵母、真菌、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aの配列に基づくプライマーを用いた、アポトーシスを起こすラット黄体RT-PCR産物の生成
遺伝子の3'末端に対応する部分長アポトーシス特異的eIF-5A配列（配列番号11）を、アポトーシスするラット黄体RNA鋳型から、RT-PCRによって作製した。そのとき、酵母、真菌、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aの配列から設計したオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた。ラット・アポトーシス特異的eIF-5A遺伝子の3'末端を単離するのに用いた上流プライマーは、20ヌクレオチド縮重プライマー：5'TCSAARACHGGNAAGCAYGG3'（配列番号9）である。ただしSは、CまたはGであり、RはAまたはGであり、HはA、T、Cのいずれかであり、YはCまたはTであり、Nは任意の核酸である。ラットeIF-5A遺伝子の3'末端を単離するのに用いた下流プライマーは、ヌクレオチドを42個含んでいる：5GCGAAGCTTCCATGG CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'（配列番号10）。逆転写酵素連鎖反応（RT-PCR）を実施した。簡単に説明すると、5mgの下流プライマーを使用し、cDNAの第1の鎖を合成した。次に、上流プライマーと下流プライマーの両方を用いたRT-PCRにおいて、この第1の鎖を鋳型として利用した。
【００９７】
RT-PCR産物をアガロース・ゲル上で分離すると、900bpの断片が存在していることが明らかになったため、それをサブクローニングし、平滑末端連結を利用してpBluescript（登録商標）（ストラタジーン・クローニング・システムズ社、ラジョラ、カリフォルニア州）に組み込み、シークエンシングした（配列番号11）。3'末端のcDNA配列は配列番号11であり、3'末端のアミノ酸配列配列は配列番号12である。図1〜図2を参照のこと。
【００９８】
遺伝子の5'末端に対応していて3'末端と重なっている部分長アポトーシス特異的eIF-5A配列（配列番号15）を、アポトーシスするラット黄体RNA鋳型から、RT-PCRによって作製した。5'プライマーは、ヒトeIF-5A配列のために設計した5'CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3'（配列番号13）という配列を持つ24量体であった。3'プライマーは、3'末端RT-PCR断片に従って設計した5'ATATCTCGAGCCTT GATTGCAACAGCTGCC3'（配列番号14）という配列を持つ30量体であった。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を実施した。簡単に説明すると、5mgの下流プライマーを使用し、cDNAの第1の鎖を合成した。次に、上流プライマーと下流プライマーの両方を用いたRT-PCRにおいて、この第1の鎖を鋳型として利用した。
【００９９】
RT-PCR産物をアガロース・ゲル上で分離すると、500bpの断片が存在していることが明らかになったため、それをサブクローニングし、それぞれ上流プライマーと下流プライマーに存在しているXbaIクローニング部位とXhoIクローニング部位を利用してpBluescript（登録商標）（ストラタジーン・クローニング・システムズ社、ラジョラ、カリフォルニア州）に組み込み、シークエンシングした（配列番号15）。5'末端のcDNA配列は配列番号15であり、5'末端のアミノ酸配列は配列番号16である。図2を参照のこと。
【０１００】
ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの3'末端と5'末端の配列（それぞれ配列番号11と配列番号15）は重複しているため、完全長cDNA配列（配列番号1）が得られた。この完全長配列とGeneBankデータベース内の配列のアラインメントを作って比較した。図1〜図2を参照のこと。cDNAクローンは、154個のアミノ酸からなるポリペプチド（配列番号2）をコードしており、分子量の計算値は16.8kDaである。RT-PCRによって得られたラットのアポトーシス特異的黄体eIF-5A遺伝子の完全長cDNAのヌクレオチド配列（配列番号1）は図3に示してあり、それに対応するアミノ酸配列は配列番号9である。得られたeIF-5Aの完全長アミノ酸配列と、ヒトおよびマウスのeIF-5A配列のアラインメントを作った。図7〜図9を参照のこと。
【０１０１】
ヒトDHS配列に基づくプライマーを用いた、アポトーシスを起こすラット黄体RT-PCR産物の生成
遺伝子の3'末端に対応する部分長DHS配列（配列番号6）を、アポトーシスするラット黄体RNA鋳型から、RT-PCRによって作製した。そのとき、ヒトDHS配列から設計した一対のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた。5'プライマーは、5'GTCTGTGTATTATTGGGCCC3'（配列番号17）という配列を持つ20量体であり；3'プライマーは、5'GCGAAGCTTCCATGGC TCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'（配列番号18）という配列を持つ42量体である。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を実施した。簡単に説明すると、5mgの下流プライマーを使用し、cDNAの第1の鎖を合成した。次に、上流プライマーと下流プライマーの両方を用いたRT-PCRにおいて、この第1の鎖を鋳型として利用した。
【０１０２】
RT-PCR産物をアガロース・ゲル上で分離すると、606bpの断片が存在していることが明らかになったため、それをサブクローニングし、平滑末端連結を利用してpBluescript（登録商標）（ストラタジーン・クローニング・システムズ社、ラジョラ、カリフォルニア州）に組み込み、シークエンシングした（配列番号6）。RT-PCRによって得られたラット・アポトーシス特異的黄体eIF-5A遺伝子の部分長cDNAのヌクレオチド配列（配列番号6）は図4に示してあり、それに対応するアミノ酸配列は配列番号7である。
【０１０３】
ゲノムDNAの単離とサザン分析
サザン・ブロッティングを行なうため、ラットから切除した卵巣からゲノムDNAを単離した。約100mgの卵巣組織を小さな断片に分割し、15mlの試験管に入れた。その組織懸濁液を軽く揺すりながら組織を1mlのPBSで2回洗浄した後、ピペットを用いてPBSから取り出した。組織を2.06mlのDNA緩衝液（0.2Mのトリス-HCl（pH8.0）と0.1mMのEDTA）の中に再び懸濁させ、240μlの10％SDSと100μlのプロテイナーゼK（ベーリンガー・マンハイム社；10mg/ml）を添加した。振盪している水浴の中に組織を入れ、一晩にわたって45℃にした。翌日、プロテイナーゼK（10mg/ml）をさらに100μl添加し、組織懸濁液を45℃の水浴の中でさらに4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、組織懸濁液を、一度は同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）で、一度は同量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）で抽出した。抽出後、1/10の体積の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と2倍の体積のエタノールを添加した。ブンゼン・バーナーを用いて密封してフックの形態にしたガラス製ピペットを使用し、溶液からDNAの紐を引っ張り出し、そのDNAを清潔な遠心分離管に移した。DNAを70％エタノールの中で1回洗浄し、大気中で10分間にわたって乾燥させた。DNAペレットを10mMのトリス-HCl（pH8.0）500μlの中に溶かし、10μlのRNアーゼA（10mg/ml）を添加し、37℃にて1時間にわたってインキュベートした。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）用いてDNAを1回抽出し、1/10の体積の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と2倍の体積のエタノールを添加してDNAを沈澱させた。4℃にて13,000×gで10分間にわたって遠心分離することにより、DNAをペレット化した。このDNAペレットを70％エタノールの中で1回洗浄し、4℃にて一晩にわたってDNAを撹拌することにより、10mMのトリス-HCl（pH8.0）200μlの中にDNAを溶かした。
【０１０４】
サザン・ブロット分析を行なうため、ラットの卵巣から単離したゲノムDNAを、さまざまな制限酵素を用いて消化させた。酵素は、内在性遺伝子を切断しないもの、または1回だけ切断するものである。10μgのゲノムDNAと、20μlの10×反応緩衝液と、100Uの制限酵素を、全反応体積200μlの中で5〜6時間にわたって反応させた。消化されたDNAを0.7％アガロース・ゲル上に載せ、40ボルトで6時間にわたって、あるいは15ボルトで一晩にわたって電気泳動を実施した。電気泳動の後、0.2NのHClの中でゲルの脱プリン化を10分間にわたって行なった後、変性溶液（0.5MのNaOH、1.5MのNaCl）の中で15分間ずつ2回洗浄し、中和緩衝液（1.5MのNaCl、0.5Mのトリス-HCl（pH7.4））の中で15分間ずつ2回洗浄した。DNAをナイロン膜に移し、その膜をハイブリダイゼーション溶液（40％ホルムアミド、6×SSC、5×デンハルト溶液（1×デンハルト溶液は、0.02％のフィコール、0.02％のPVP、0.02％のBSAを含む）、0.5％のSDS、1.5mgの変性したサケ精子DNA）の中であらかじめハイブリダイズさせた。ラットeIF-5AのcDNAの3'UTRの700bp PCR断片（650bpが3'UTR、コード部が50bp）に、ランダム・プライマー法で[α-32P]dCTPを標識し、1×106cpm/mlの割合で膜に添加した。
【０１０５】
同様に、ラットDHSのcDNAの606bp PCR断片（コード部が450bp、156bpが3'UTR）に、ランダム・プライマー法で[α-32P]dCTPを標識し、1×106cpm/mlの割合で第2の同じ膜に添加した。ブロットを42℃にて一晩にわたってハイブリダイズさせた後、42℃にて2×SSCと0.1％SDSで2回洗浄し、42℃にて1×SSCと0.1％SDSで2回洗浄した。次にブロットを3〜10日間にわたってフィルムに露出した。
【０１０６】
制限酵素を用いてラットの黄体ゲノムDNAを図20に示したように切断し、32P-dCTPで標識したeIF-5A完全長cDNAを用いて調べた。高緊縮条件下でのハイブリダイゼーションにより、完全長cDNAプローブが、それぞれの制限酵素で消化させたDNAサンプルのいくつかの制限断片とハイブリダイズすることが明らかになった。これは、eIF-5Aにいくつかのアイソフォームが存在していることを示している。特に注目すべきなのは、アポトーシス特異的eIF-5Aのオープン・リーディング・フレーム内に制限部位を1つ有するEcoRVでラットのゲノムDNAを消化させると、eIF-5Aのアポトーシス特異的アイソフォームの制限断片が2つ、サザン・ブロットで検出できたことである。この2つの断片を、図20に2本の矢印で示してある。eIF-5Aのアポトーシス特異的アイソフォームに対応する制限断片は、EcoR1およびBamH1と表記したレーンに1本の矢印で示してある。EcoR1とBamH1は、オープン・リーディング・フレーム内に切断される制限部位が存在しない制限酵素である。この結果は、アポトーシス特異的eIF-5Aが、ラットにおけるコピーが1つだけの遺伝子であることを示唆している。図5〜図13に示してあるように、eIF-5A遺伝子は、種間で非常によく保存されているため、どの種でもアイソフォーム同士でかなりの量の保存部が存在していることが予想されよう。
【０１０７】
図21は、32P-dCTPで標識したラット黄体DHSの部分長cDNAをプローブとして調べたラットのゲノムDNAのサザン・ブロットである。このゲノムDNAはEcoRVを用いて切断された。EcoRVは、プローブとして使用した部分長cDNAを切断しない酵素である。2つの制限断片が明らかに存在している。これは、この遺伝子にコピーが2つあること、またはこの遺伝子がEcoRV部位を有するイントロンを含んでいることを示している。
【０１０８】
実施例２
この実施例では、アポトーシス特異的eIF-5Aを投与した後の変化を示す（センス方向のアポトーシス特異的eIF-5Aを用いたアポトーシスの増大）。
【０１０９】
COS-7細胞の培養とRNAの単離
トランスフェクションに基づくすべての実験で、COS-7細胞（野生型T抗原をコードしているSV40の突然変異体で形質転換した、アフリカミドリザルの腎臓線維芽細胞様細胞系）を使用した。0.584g/lのL-グルタミンと、4.5g/lのグルコースと、0.37％の炭酸水素ナトリウムを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の中で、COS-7細胞を培養した。この培地に、10％ウシ胎仔血清（FBS）と、100単位のペニシリン／ストレプトマイシンとを補足した。細胞は、CO2が5％で空気が95％の湿潤な環境の中で37℃にて増殖させた。接着する細胞を0.25％のトリプシンと1mMのEDTAを含む溶液を用いて剥がすことにより、細胞を3〜4日ごとに継代培養した。剥がした細胞は、新鮮な培地を含む新しい培養皿の中に分離比1：10で入れた。
【０１１０】
RNAの単離に使用するCOS-7細胞は、組織培養物で処理した150mmの皿（コーニング社）の中で増殖させた。トリプシン-EDTAを含む溶液を用いてこの細胞を剥がして回収した。剥がした細胞を遠心分離管の中に入れ、3000rpmで5分間にわたって遠心分離することによって細胞をペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを液体窒素の中で瞬間凍結させた。GenElute哺乳動物全RNAミニプレップ・キット（シグマ社）を製造会社の指示に従って使用し、凍結した細胞からRNAを単離した。
【０１１１】
組み換えプラスミドの構成と、COS-7細胞へのトランスフェクション
ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの完全長コード配列をセンス方向で含み、ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの3'非翻訳領域（UTR）をアンチセンス方向で含む組み換えプラスミドを、哺乳動物のエピトープ・タグ発現ベクターであるpHM6（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社）を用いて構成した。このベクターを図21に示してある。このベクターは、CMVプロモータ（ヒト・サイトメガロウイルス極初期プロモータ／エンハンサー）と、HA（インフルエンザのヘマグルチニンに由来するノナペプチド・エピトープ・タグ）と、BGH pA（ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナル）と、f1 ori（f1起点）と、SV40 ori（SV40の初期プロモータと起点）と、ネオマイシン（ネオマイシン抵抗（G418）遺伝子）と、SV40 pA（SV40ポリアデニル化シグナル）と、Col E1（ColE1起点）と、アンピシリン（アンピシリン抵抗遺伝子）とを含んでいる。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの完全長コード配列と、ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの3'UTRは、pBluescript（配列番号1）に含まれる元のラットeIF-5A RT-PCR断片からPCRによって増幅した。完全長eIF-5Aを増幅するため、以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー5'GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG3'（配列番号59）（Hind3）とリバースプライマー5'CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG3'（配列番号60）（EcoR1）。3'UTRラット・アポトーシス特異的eIF-5Aを増幅するため、以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー5'AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC3'（配列番号61）（EcoR1）とリバースプライマー5'GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT（配列番号62）（Hind3）。
【０１１２】
アガロース・ゲル電気泳動の後に単離したラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5A PCR産物は長さが430bpであったのに対し、3'UTRラット・アポトーシス特異的eIF-5A PCR産物は長さが697bpであった。両方のPCR産物をサブクローニングしてpHM6のHind3部位とEcoR1部位に入れ、pHM6-完全長アポトーシス特異的eIF-5Aと、pHM6-アンチセンス3'UTReIF-5Aを作った。ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5A PCR産物をサブクローニングし、多重クローニング部位の上流に存在するインフルエンザのヘマグルチニン（HA）に由来するノナペプチド・エピトープ・タグと同じフレームの中に入れ、抗[HA]ペルオキシダーゼ抗体を用いて組換えタンパク質を検出できるようにした。ヒト・サイトメガロウイルス極初期プロモータ／エンハンサーによって発現を促進させ、哺乳動物の細胞系で発現が高レベルになるようにする。このプラスミドは、安定なトランスフェクタントの選択を可能にするネオマイシン耐性（G418）遺伝子と、SV40の大きなT抗原を発現する細胞（例えばCOS-7）内でエピソームの複製を可能にするSV40の初期プロモータおよび起点も含んでいるという特徴がある。
【０１１３】
トランスフェクション実験に使用するCOS-7細胞は、タンパク質の抽出に使用するときには24ウエルの培養プレート（コーニング社）で培養し、染色に使用するときにはチェンバーが4つある細胞培養スライド（ファルコン社）で培養した。細胞は、10％FBSを補足したがペニシリン／ストレプトマイシンは欠いたDMEMの中で、集密度が50〜70％になるまで増殖させた。0.32μgのプラスミドDNAを42.5μlの無血清DMEMの中に希釈し、この混合物を室温にて15分間にわたってインキュベートすることにより、24ウエルのプレートの1つのウエルにとって、または培養スライドにとって十分なトランスフェクション培地を調製した。トランスフェクション試薬であるリポフェクトアミン（ギブコ-BRL社）1.6μlを42.5μlの無血清DMEMの中に希釈し、室温にて5分間にわたってインキュベートした。5分後、リポフェクトアミン混合物をDNA混合物に添加し、室温にて30〜60分間にわたってインキュベートした。トランスフェクトされる細胞を無血清DMEMで1回洗浄した後、トランスフェクション培地の上に載せ、細胞を再び増殖チェンバーの中に4時間入れた。
【０１１４】
インキュベーションの後、0.17mlのDMEM+20％FBSを細胞に添加した。細胞をさらに40時間にわたって培養した後、アポトーシスを誘導してから染色するか、回収してウエスタン・ブロット分析を行なった。対照として、モック・トランスフェクションも実施した。そのとき、プラスミドDNAをトランスフェクション培地から取り除いた。
【０１１５】
タンパク質の抽出とウエスタン・ブロッティング
ウエスタン・ブロッティングを行なうため、トランスフェクトされた細胞をPBS（8g/lのNaCl、0.2g/lのKCl、1.44g/lのNa2HPO4、0.24g/lのKH2PO4）の中で2回洗浄した後、150μlの温かいSDSゲル-ローディング用緩衝液（50mMのトリス-HCl（pH6.8）、100mMのジチオトレイトール、2％SDS、0.1％ブロモフェノール・ブルー、10％グリセリン）を添加することにより、その細胞からタンパク質を分離した。細胞ライセートをマイクロ遠心管に入れ、10分間にわたって95℃に加熱した後、13,000×gで10分間にわたって遠心分離した。上清を新しいマイクロ遠心管に移し、使用する準備が整うまで-20℃で保管した。
【０１１６】
ウエスタン・ブロッティングを行なうため、12％SDS-ポリアクリルアミド・ゲル上で全タンパク質を2.5μgまたは5μg分離した。分離されたタンパク質をポリジフッ化ビニリデン膜に移した。次いでこの膜をブロッキング溶液（5％のスキムミルク粉末と0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBS）の中で1時間にわたってインキュベートし、PBS-T（PBS+0.05％ツイーン20）の中で15分間ずつ3回洗浄した。膜をPBS-Tの中で4℃にて一晩保管した。翌日、膜を室温まで温めた後、1μg/mlのポリビニルアルコールの中で30秒間ブロックした。膜を脱イオン水の中で5回洗浄した後、5％のミルクを含むPBS溶液の中で30分間にわたってブロックした。一次抗体を、5％のミルクを含むPBS溶液の中で30分間にわたってあらかじめインキュベートした後、膜とともにインキュベートした。
【０１１７】
一次抗体をいくつか使用した。抗[HA]ペルオキシダーゼ抗体（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社）を5000倍に希釈して使用し、組換えタンパク質の発現を検出した。この抗体はペルオキシダーゼと共役しているため、二次抗体は必要なかった。ブロットを洗浄し、化学発光によって現像した。使用した別の一次抗体はがん遺伝子由来のモノクローナル抗体であり、p53（Ab-6）、Bcl-2（Ab-1）、c-Myc（Ab-2）を認識する。p53に対するモノクローナル抗体は、0.1μg/mlの希釈度で使用し、Bcl-2とc-Mycに対するモノクローナル抗体は、両方とも0.83μg/mlの希釈度で使用した。膜を一次抗体とともに60〜90分間にわたってインキュベートした後、PBS-Tの中で15分間ずつ3回洗浄した。次に、1％のミルクを含むPBSの中に二次抗体を希釈し、膜とともに60〜90分間にわたってインキュベートした。p53（Ab-6）を一次抗体として使用したときには、使用した二次抗体は、ヤギ抗マウスIgGが共役したアルカリホスファターゼ（ロックランド社）を1000倍に希釈したものであった。Bcl-2（Ab-1）とc-Myc（Ab-2）を一次抗体として使用したときには、ウサギ抗マウスIgGが共役したペルオキシダーゼ（シグマ社）を5000倍に希釈して用いた。膜を二次抗体とともにインキュベートした後、PBS-Tの中で3回洗浄した。
【０１１８】
2通りの検出法を利用し、ブロットを現像した。その方法とは、比色測定法と、化学発光法である。比色測定法は、p53（Ab-6）を一次抗体として、アルカリホスファターゼが共役した二次抗体とともに使用したときだけ利用した。結合した抗体は、0.33mg/mlのニトロブルーテトラゾリウムと、0.165mg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートと、100mMのNaClと、5mMのMgCl2と、100mMのトリス-HCl（pH9.5）とからなる溶液の中でブロットを暗所にてインキュベートすることによって可視化した。ブロットを2mMのEDTAを含むPBSの中でインキュベートすることによって着色反応を停止させた。化学発光検出法は、他のすべての一次抗体（抗[HA]ペルオキシダーゼ、Bcl-2（Ab-1）、c-Myc（Ab-2））で使用した。ECLプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社）を使用し、ペルオキシダーゼが共役した結合抗体を検出した。簡単に説明すると、膜をわずかにブロットして乾燥させた後、試薬Aと試薬Bが40：1になった混合物を用いて暗所で5分間にわたってインキュベートした。膜をブロットして乾燥させ、アセテート製シートの間に挟み、10秒間〜10分間にわたってX線フィルムに露出した。
【０１１９】
COS-7細胞におけるアポトーシスの誘導
2通りの方法を利用し、トランスフェクトされたCOS-7細胞でアポトーシスを誘導した。それは、血清の欠乏と、アクチノマイシンD（ストレプトミセス属、カルバイオケム社）での処理である。どちらの方法で処理する場合にも、トランスフェクションから40時間後に培地を除去した。血清欠乏実験を行なうときには、培地を無血清かつ無抗生物質のDMEMと交換した。10％FBSを補足した無抗生物質DMEMの中で増殖した細胞を対照として使用した。アクチノマイシンDでアポトーシスを誘導するときには、培地を、10％FBSと、1μg/mlのアクチノマイシンDが溶けたメタノールとを補足した無抗生物質DMEMと交換した。対照細胞は、10％FBSと、上と同量のメタノールとを補足した無抗生物質DMEMの中で増殖させた。両方の方法において、ヘキストまたはアネクシンV-Cy3で染色することにより、アポトーシスを起こした細胞の割合を48時間後に測定した。アポトーシスの誘導は、図22に示したようにノーザン・ブロット分析でも確認した。
【０１２０】
ヘキスト染色
トランスフェクトされたCOS-7細胞の核に核染料ヘキストを使用して標識し、形態的特徴（例えば核の断片化や凝縮）に基づいてアポトーシスを起こした細胞を同定した。定着剤として、無水メタノールと氷酢酸が3：1になった混合物を使用の直前に調製した。培養スライド上で増殖しているCOS-7細胞の培地に同量の定着剤を添加し、2分間にわたってインキュベートした。培地／定着剤の混合物を細胞から取り出して廃棄し、定着剤1mlを細胞に添加した。5分後、定着剤を廃棄し、新鮮な定着剤1mlを細胞に添加し、5分間にわたってインキュベートした。定着剤を廃棄し、細胞を大気中で4分間乾燥させた後、ヘキスト染色剤（0.5μg/mlのヘキスト33258を含むPBS）を1ml添加した。暗所で10分間にわたってインキュベートした後、染色溶液を廃棄し、スライドを脱イオン水で1分間ずつ3回洗浄した。洗浄後、1mlのマッキルベン緩衝液（0.021Mのクエン酸、0.058MのNa2HPO4・7H2O；pH5.6）を細胞に添加し、暗所で20分間にわたってインキュベートした。緩衝液を廃棄し、細胞を暗所で大気中にて5分間乾燥させ、培養スライドのウエルを隔てているチェンバーを除去した。蛍光のためのベクタシールド・マウンティング媒体（ヴェクター・ラボラトリーズ社）を数滴スライドに添加し、カバーガラスを上から被せた。染色された細胞を、UVフィルタを使用して蛍光顕微鏡で観察した。明るく染色された細胞または断片化された核をアポトーシスとした。
【０１２１】
アネクシンV-Cy3染色
アネクシンV-Cy3アポトーシス検出キット（シグマ社）を使用し、アポトーシスを起こした細胞上の外部化したホスファチジルセリンに蛍光標識した。このキットを製造会社のプロトコルに従って使用したが、以下の変更を行なった。簡単に説明すると、4枚のチェンバー培養スライド上で増殖しているトランスフェクトされたCOS-7細胞をPBSで2回洗浄し、1×結合緩衝液で3回洗浄した。150μlの染色溶液（1μg/mlのAnnCy3を含む1×結合緩衝液）を添加し、細胞を暗所で10分間にわたってインキュベートした。次に染色溶液を除去し、細胞を1×結合緩衝液で5回洗浄した。チェンバーの壁を培養スライドから除去し、1×結合緩衝液を数滴細胞の上に載せ、カバーガラスを上から被せた。染色された細胞を、緑色のフィルタを使用して蛍光顕微鏡で観察し、ポジティブ染色された（アポトーシス）細胞の赤い蛍光を視覚化した。全細胞数は、可視光下で細胞の数をカウントすることによって測定した。
【０１２２】
実施例３
この実施例では、アポトーシス特異的eIF-5Aを投与した後の変化を明らかにする。
【０１２３】
図23は、前2つの実施例に記載した一般的な手続きと方法を利用してCOS-7細胞に対する一過性トランスフェクションを行なう手続きを示したフロー・チャートである。無血清培地の中にある細胞を、プラスミドDNAを含むリポフェクタミンとともに4時間にわたってインキュベートし、血清を添加し、さらに40時間にわたってインキュベートした。次いで細胞の分析を、血清を含む通常の培地の中でさらに48時間にわたってインキュベートした後に（つまりそれ以上処理しない）、または血清を48時間にわたって欠乏させてアポトーシスを誘導した後に、またはアクチノマイシンDで48時間にわたって処理してアポトーシスを誘導した後に行なった。
【０１２４】
図22は、pHM6をトランスフェクトした後のCOS-7細胞における外来タンパク質の一過性発現を示すウエスタン・ブロットである。COS-7細胞からのタンパク質の単離は、モック・トランスフェクションを行なってから48時間後、またはpHM6-LacZ、pHM6-アンチセンス3'rF5A（pHM6-アンチセンス3'UTRラット・アポトーシス特異的eIF-5A）又はpHM6-センスrF5A（pHM6-完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5A）のいずれかをトランスフェクトしてから48時間後に行なった。各サンプルからの5μgのタンパク質をSDS-PAGEで分画し、PVDF膜に移し、抗[HA]ペルオキシダーゼを用いてウエスタン・ブロットを実施した。結合した抗体を化学発光によって検出し、X線フィルムに30秒間にわたって露出した。LacZの発現（レーン2）とラットのセンス・アポトーシス特異的eIF-5Aの発現（レーン4）が、はっきりと見られる。
【０１２５】
すでに説明したように、COS-7細胞に対し、モック・トランスフェクションを行なうか、pHM6-センスrF5A（pHM6-完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5A）をトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後、血清を48時間にわたって除去した状態にすることによって細胞のアポトーシスを誘導した。トランスフェクトされた細胞抽出液に含まれるカスパーゼのタンパク質分解活性を、蛍光測定均一カスパーゼ・アッセイ・キット（ロッシュ・ディアグノスティックス社）を用いて測定した。FragEL DNA断片化アポトーシス検出キット（オンコジーン社）を用いてDNAの断片化も測定した。このキットは、DNA断片の露出した3'-OH末端を、フルオレセインで標識したデオキシヌクレオチドで標識する。
【０１２６】
別のCOS-7細胞に、モック・トランスフェクションを行なうか、pHM6-センスrF5A（pHM6-完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5A）をトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後、血清を含む通常の培地の中で細胞をさらに48時間にわたって増殖させる（それ以上処理しない）か、血清を48時間にわたって除去した状態にすることによって細胞のアポトーシスを誘導するか、0.5μg/mlのアクチノマイシンDで48時間にわたって処理することによって細胞のアポトーシスを誘導した。細胞を、ヘキスト33258またはアネクシンV-Cy3で染色した。ヘキスト33258で染色されるというのは、アポトーシスに伴って核が断片化されたことを示す。アネクシンV-Cy3で染色されるというのは、アポトーシスに伴ってホスファチジルセリンが露出したことを示す。染色した細胞を、緑色のフィルタを使用して蛍光顕微鏡でも観察し、カウントすることによってアポトーシスを起こした細胞の割合を決定した。細胞の合計数は、可視光でカウントした。
【０１２７】
図25は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときのカスパーゼ活性の増大に反映されることを示している。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aが発現することにより、カスパーゼの活性が60％増大した。
【０１２８】
図26は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときのDNA断片化の増大に反映されることを示している。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aが発現することにより、DNAの断片化が273％増大した。図27は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときの核の断片化の増大によってアポトーシスが検出されることを示している。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aを発現している細胞では、断片化した核がより多くなっている。図28は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときの核の断片化増大に反映されることを示している。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aが発現することにより、核の断片化が、血清を欠乏させていないサンプル中の対照と比べて27％増大し、血清を欠乏させたサンプル中の対照と比べて63％増大した。
【０１２９】
図29は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときのホスファチジルセリンの露出によってアポトーシスが検出されることを示している。図30は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときのホスファチジルセリンの露出増大に反映されることを示している。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aが発現することにより、ホスファチジルセリンの露出が、血清を欠乏させていないサンプル中の対照と比べて140％増大し、血清を欠乏させたサンプル中の対照と比べて198％増大した。
【０１３０】
図31は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときの核の断片化増大に反映されることを示している。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aが発現することにより、核の断片化が、処理しないサンプル中の対照と比べて115％増大し、処理したサンプル中の対照と比べて62％増大した。図32は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションを行なったCOS-7細胞をそれ以上は処理しない場合と、さらに処理してアポトーシスを誘導した場合のアポトーシスの増大を比較した図である。
【０１３１】
実施例４
この実施例では、アポトーシス特異的eIF-5Aを投与した後の変化を明らかにする。
【０１３２】
COS-7細胞に、モック・トランスフェクションを行なうか、pHM6-センスrF5A（pHM6-完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5A）をトランスフェクトし、40時間にわたってインキュベートした。各サンプルからのタンパク質抽出液のサンプル5μgをSDS-PAGEで分画化し、PVDF膜に移し、Bcl-2を認識するモノクローナル抗体を用いてウエスタン・ブロットを実施した。ウサギ抗マウスIgGが共役したペルオキシダーゼを二次抗体として使用し、結合した抗体を化学発光によって検出し、X線フィルムに露出した。結果を図33に示してある。pHM6-センスrF5Aをトランスフェクトした細胞では、pHM6-LacZをトランスフェクトした細胞よりも検出されるBcl-2が少ない。したがって、Bcl-2がpHM6-センスrF5A構造体によってダウンレギュレーションされていることがわかる。
【０１３３】
別のCOS-7細胞に、モック・トランスフェクションを行なうか、pHM6-アンチセンス3'rF5A（pHM6-アンチセンス3'UTRラット・アポトーシス特異的eIF-5A）またはpHM6-センスrF5A（pHM6-完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5A）をトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後、血清を48時間にわたって除去した状態にすることによって細胞のアポトーシスを誘導した。各サンプルからのタンパク質抽出液のサンプル5μgをSDS-PAGEで分画化し、PVDF膜に移し、Bcl-2を認識するモノクローナル抗体を用いてウエスタン・ブロットを実施した。ウサギ抗マウスIgGが共役したペルオキシダーゼを二次抗体として使用し、結合した抗体を化学発光によって検出し、X線フィルムに露出した。
【０１３４】
さらに、COS-7細胞に、モック・トランスフェクションを行なうか、pHM6-LacZまたはpHM6-センスrF5A（pHM6-完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5A）をトランスフェクトし、40時間にわたってインキュベートした。各サンプルからのタンパク質抽出液のサンプル5μgをSDS-PAGEで分画化し、PVDF膜に移し、p53を認識するモノクローナル抗体を用いてウエスタン・ブロットを実施した。ヤギ抗マウスIgGが共役したアルカリホスファターゼを二次抗体として使用し、結合した抗体を比色測定によって検出した。
【０１３５】
最後に、COS-7細胞に、モック・トランスフェクションを行なうか、pHM6-LacZまたはpHM6-センスrF5A（pHM6-完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5A）をトランスフェクトし、40時間にわたってインキュベートした。各サンプルからのタンパク質抽出液のサンプル5μgをSDS-PAGEで分画化し、PVDF膜に移し、p53を認識するモノクローナル抗体を用いて調べた。対応するタンパク質のブロットを抗[HA]ペルオキシダーゼを用いて調べ、ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの発現レベルを明らかにした。ヤギ抗マウスIgGが共役したアルカリホスファターゼを二次抗体として使用し、結合した抗体を化学発光によって検出した。
【０１３６】
図33は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6をCOS-7細胞に一過性のトランスフェクションを行なったときのBcl-2のダウンレギュレーションを示している。上の写真は、クマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットであり；下の写真は、対応するウエスタン・ブロットである。pHM6-センスrF5Aをトランスフェクトした細胞では、pHM6-LacZをトランスフェクトした細胞よりも検出可能なBcl-2が少ない。
【０１３７】
図34は、アポトーシス特異的eIF-5Aの3'末端をアンチセンス方向で含むpHM6をCOS-7細胞に一過性のトランスフェクションを行なったときのBcl-2のアップレギュレーションを示している。上の写真は、クマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットであり；下の写真は、対応するウエスタン・ブロットである。pHM6-アンチセンス3'rF5Aをトランスフェクトした細胞では、モックをトランスフェクトした細胞またはpHM6-センスrF5Aをトランスフェクトした細胞よりも検出可能なBcl-2が多い。
【０１３８】
図35は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6をCOS-7細胞に一過性のトランスフェクションを行なったときのc-Mycのアップレギュレーションを示している。上の写真は、クマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットであり；下の写真は、対応するウエスタン・ブロットである。pHM6-センスrF5Aをトランスフェクトした細胞では、pHM6-LacZをトランスフェクトした細胞またはモックをトランスフェクトした対照よりも高レベルのc-Mycが検出される。
【０１３９】
図36は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6をCOS-7細胞に一過性のトランスフェクションを行なったときのp53のアップレギュレーションを示している。上の写真は、クマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットであり；下の写真は、対応するウエスタン・ブロットである。pHM6-センスrF5Aをトランスフェクトした細胞では、pHM6-LacZをトランスフェクトした細胞またはモックをトランスフェクトした対照よりも高レベルのp53が検出される。
【０１４０】
図37は、p53のアップレギュレーションが、COS-7細胞におけるpHM6-完全長アポトーシス特異的eIF-5Aの発現に依存していることを示している。1回目のトランスフェクションのほうが、2回目のトランスフェクションよりも多くのラット・アポトーシス特異的eIF-5Aが検出されている。抗p53を用いて調べたウエスタン・ブロットと、対応する、クマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、p53を用いたウエスタン・ブロットが示してある。1回目のトランスフェクションに関しては、pHM6-センスrF5Aをトランスフェクトした細胞において、pHM6-LacZをトランスフェクトした細胞またはモックをトランスフェクトした対照よりも多くのp53が検出される。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの発現がより少なかった2回目のトランスフェクションでは、pHM6-センスrF5Aをトランスフェクトした細胞、pHM6-LacZをトランスフェクトした細胞、モックをトランスフェクトした対照でp53のレベルに違いは検出されなかった。
【０１４１】
実施例５
図47は、心臓組織でヒトの心臓の鼓動を模倣し、次いで心筋梗塞を誘導する実験を示している。図49は、実験室の様子である。弁置換手術の間に取り出したヒト心臓組織の切片を電極に引っかけた。その心臓組織に小さな重りを取り付け、心拍の強度測定が容易になるようにした。電極から電気的な刺激を与え、その組織に拍動を開始させた。アポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの両方の遺伝子発現レベルを心臓組織で測定した後、虚血を誘導した。図46を参照のこと。虚血前の心臓組織では、アポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの両方の産生が低レベルであり、両者はほぼ同程度であった。この間、酸素と二酸化炭素をそれぞれ92.5％と7.5％の割合で含む緩衝液を心臓に供給した。その後、酸素レベルを下げて窒素レベルを上昇させることによって虚血を誘導し、最終的に“心筋梗塞”に至らせた。心臓組織は拍動を停止した。そこで酸素レベルを通常の状態に回復させて電気的刺激を与えると、心臓組織は再び拍動し始めた。“心筋梗塞”後、アポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの発現レベルを再度測定した。今度は、アポトーシス特異的eIF-5Aのレベルが顕著な上昇を示したのに対し、増殖eIF-5Aの発現レベルの上昇はそれよりもはるかに少なかった。図46を参照のこと。
【０１４２】
“心筋梗塞”の後、心臓は以前ほど強くは拍動しなかった。そのことは、取り付けた重りの加圧／運動がより少なくなったことからわかる。これは、アポトーシス特異的eIF-5Aが存在するために心臓組織細胞が急速に死につつあったことを示している。
【０１４３】
EKGの結果を図48に示してある。図の左側には、正常な心臓の鼓動を示してある（虚血前の心臓組織）。“心筋梗塞”の後（直線）と心臓が拍動を再開した後のEKGは、筋肉細胞が死んだために活性が低下していることを示している。このEKGは、心臓の拍動が相対的に弱くなったことを示している。
【０１４４】
実施例６
以下の実施例で細胞培養条件を示す。
ヒトの篩板細胞と星状細胞の培養
ヒトの一対の眼球をカナダのアイ・バンク（オンタリオ分室）から死後48時間以内に取得した。（極の付いた）視神経頭部を取り出し、抗生物質／抗真菌剤と、グルタミンと、10％FBSとを補足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の中に3時間入れた。視神経頭部（ONH）のボタンを各組織サンプルから回収し、細断用のハサミで小片にした。移植片を、12.5cm2のプラスチック製培養フラスコに入れたDMEMの中で培養した。1ヶ月以内の期間、生きている移植片の増殖を観察した。細胞の集密度が90％に達したとき、トリプシンで処理し、分別継代培養を行なって篩板（LC）細胞と星状細胞の集団を生成させた。具体的に説明すると、LC細胞は、ゲンタマイシンと、グルタミンと、10％FBSとを補足したDMEMを入れた25cm2のプラスチック製培養フラスコの中で継代培養したのに対し、星状細胞は、FBSを含まないEBM完全培地（クロネティックス社）を入れた25cm2のフラスコの中で増殖させた。継代培養の10日後、星状細胞培養物の中にFBSを添加した。このプロトコルに従って細胞を維持し、継代培養した。
【０１４５】
8ウエルの培養スライド上での蛍光抗体分染法を利用し、分別継代培養によって得た細胞集団のが何であるかと集団の純度を調べた。細胞を10％ホルマリン溶液の中に固定し、ダルベッコ・リン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）で3回洗浄した。2％の脱脂乳を含むDPBSを用いて反応をブロックした後、1％のBSAを含むDPBSで抗体を希釈し、6つのウエルの細胞に添加した。残る2つのウエルは、対照として1％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液だけで処理し、一次抗体は使用しなかった。細胞を一次抗体とともに室温にて1時間にわたってインキュベートした後、DPBSで3回洗浄した。1％のBSAを含むDPBSで適切な二次抗体を希釈し、各ウエルに添加し、1時間にわたってインキュベートした。DPBSで洗浄した後、培養スライドのウエルを隔てているチェンバーをスライドから除去し、そのスライドを二回蒸留した水に浸した後、大気中で乾燥させた。フルオロマウント（ヴェクター・ラボラトリーズ社）を各スライドに添加し、22×60mmのカバーグラス・スリップを上から被せた。
【０１４６】
適切なフィルタを備えた蛍光顕微鏡で免疫蛍光染色を観察し、一次抗体で処理しなかった対照ウエルと比較した。特に断わらない限り、一次抗体はすべてシグマ社から入手した。二次抗体はすべて、モレキュラー・プローブズ社から購入した。LC細胞を同定するのに用いた一次抗体は、抗コラーゲンI、抗コラーゲンIV、抗ラミニン、抗細胞フィブロネクチンであった。星状細胞を同定するのに用いた一次抗体は、抗ガラクトセレブロシド（ケミコン・インターナショナル社）、抗A2B5（ケミコン・インターナショナル社）、抗NCAM、抗ヒト・フォンビルブラント因子であった。両方の細胞集団で用いた別の抗体としては、抗グリア繊維（GFAP）と抗α平滑筋アクチンがある。細胞集団が、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニン、細胞フィブロネクチン、α平滑筋アクチンに対してポジティブ染色され、グリア繊維（GFAP）に対してネガティブ染色された場合に、その細胞集団にLC細胞が含まれていることが明らかになった。細胞集団が、NCAM、グリア繊維（GFAP）に対してポジティブ染色され、ガラクトセレブロシド、A2B5、ヒト・フォンビルブラント因子、α平滑筋アクチンに対してネガティブ染色された場合に、その細胞集団に星状細胞が含まれていることが明らかになった。
【０１４７】
この予備実験では、ヒトの3組の眼球を用いて培養を開始した。LC細胞系#506、#517、#524を、それぞれ83歳の男性、17歳の男性、26歳の女性の視神経頭部から樹立した。どのLC細胞系でも完全にキャラクタリゼーションを行ない、LC細胞が90％を超える割合で含まれていることを見いだした。
【０１４８】
RKO細胞の培養
野生型p53を発現するヒト大腸がん細胞系RKO（アメリカ基準培養物コレクションCRL-2577）を用い、アンチセンス・オリゴヌクレオチドがアポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の発現を抑制する能力を調べた。RKOを、最少必須イーグル培地（MEM）の中で、非必須アミノ酸、アール塩、L-グルタミンとともに培養した。この培地に10％ウシ胎仔血清（FBS）と100単位のペニシリン／ストレプトマイシンを補足した。細胞は、5％のCO2と95％の空気からなる湿潤な環境の中で37℃にて増殖させた。細胞を3〜4日ごとに継代培養し、接着する細胞を0.25％のトリプシンと1mMのEDTAを含む溶液を用いて剥がした。剥がした細胞は、新鮮な培地を含む新しい培養皿の中に分割比1：10〜1：12で入れた。
【０１４９】
HepG2細胞の培養
ヒト肝細胞がん細胞系であるHepG2を使用し、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドが、IL-1βを用いた処理に応答してTNF-αの産生を阻止する能力を調べた。HepG2細胞は、ゲンタマイシンと、グルタミンと、10％FBSとを補足したDMEMの中で培養し、5％のCO2と95％の空気からなる湿潤な環境の中で37℃にて増殖させた。
【０１５０】
実施例７
アポトーシスの誘導
RKO細胞にはアクチノマイシンDとRNAポリメラーゼ阻害剤を用いてアポトーシスを誘導し、篩板細胞にはカンプトテシンとトポイソメラーゼ阻害剤を用いてアポトーシスを誘導した。アクチノマイシンDは0.25μg/mlの濃度で使用し、カンプトテシンは、20、40、50μMの濃度で使用した。篩板細胞ではカンプトテシン（50μM）とTNF-α（10ng/ml）の組み合わせも用いてアポトーシスを誘導した。カンプトテシンとTNF-αの組み合わせは、カンプトテシンまたはTNF-αを単独で用いるよりもアポトーシスを誘導するのにより効果的であることがわかった。
【０１５１】
アンチセンス・オリゴヌクレオチド
ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする3組のアンチセンス・オリゴヌクレオチドをモレキュラー・リサーチ・ラブズ社が設計したので、同社から購入した。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする第1のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列（#1）は、5'CCT GTC TCG AAG TCC AAG TC3'（配列番号63）であった。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする第2のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列（#2）は、5'GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC3'（配列番号64）であった。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする第3のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列（#3）は、5'CTC GTA CCT CCC CGC TCT CC3'（配列番号65）であった。対照オリゴヌクレオチドの配列は、5'CGT ACC GGT ACG GTT CCA GG3'（配列番号66）であった。イソチオシアン酸フルオレセイン（FITC）で標識したアンチセンス・オリゴヌクレオチド（モレキュラー・リサーチ・ラブズ社）を用いてトランスフェクション効率を調べた。そのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列は、5'GGA CCT TGG CGT GGC CGT GCX3'（配列番号67）であった（XはFITC標識）。すべてのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを完全にホスホロチオ化した。
【０１５２】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドのトランスフェクション
アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドがアポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の発現を阻止する能力をRKO細胞で調べた。オリゴフェクタミン（インヴィトロジェン社）というトランスフェクション試薬を用い、RKO細胞にアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間前に、細胞を24ウエルのプレートに分配した。そのとき、ウエル1つにつき、10％FBSを補足したがペニシリン／ストレプトマイシンは欠いているMEM培地の中に細胞が157,000個含まれるようにした。24時間後、細胞は多くの場合約50％の集密度に達していた。RKO細胞に対し、モック・トランスフェクションを行なうか、100nMまたは200nMのアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの20μMのストック0μl、または1.25μl、または2.5μlを無血清MEMの中に希釈して最終体積を42.5μlにし、この混合物を室温にて15分間にわたってインキュベートすることにより、24ウエルのプレートの1つのウエルにとって十分なトランスフェクション培地を調製した。1.5μlのオリゴフェクタミンを6μlの無血清MEMの中に希釈し、室温にて7.5分間にわたってインキュベートした。5分後、希釈したオリゴフェクタミン混合物をDNA混合物に添加し、室温にて20分間にわたってインキュベートした。細胞を無血清MEMで1回洗浄した後、200μlのMEMを細胞に添加し、その上から50μlのトランスフェクション培地を添加した。細胞を増殖チェンバーの中に戻して4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、125μlのMEM+30％FBSを細胞に添加した。細胞をその後さらに48時間にわたって培養し、0.25μg/mlのアクチノマイシンDで24時間にわたって処理した後、細胞抽出液を回収してウエスタン・ブロット分析を行なった。
【０１５３】
RKO細胞に関して記載したのと同じ手続きに従い、アンチセンス・オリゴヌクレオチドとオリゴフェクタミン100nMと200nMを用いて篩板細胞へのトランスフェクションも調べた。しかし篩板細胞への効果的なトランスフェクションは、無血清培地に希釈して1μM〜10μMにしたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを細胞に24時間にわたって添加した後、培地を、新鮮なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを希釈した血清含有培地と24時間ごとに交換する操作を合計で2〜5日間にわたって行なうことによって実現した。
【０１５４】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドのトランスフェクション効率は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号64）と同じ配列だが3'末端がFITCと共役しているFITC標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトすることによって最適化し、モニターした。8ウエルの培養スライド上で、RKO細胞と篩板細胞にFITC標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。48時間後、細胞をPBSで洗浄し、3.7％のホルムアルデヒドを含むPBSの中に10分間かけて固定した。ウエルを取り出し、封入剤（ヴェクタシールド社）を添加した後、カバーガラスを被せた。次に、フルオレセイン・フィルタ（グリーンH546、フィルタ・セット48915）を利用し、UV光のもとで蛍光顕微鏡によって細胞の核が見えるようにした。明るい緑色の蛍光を発している細胞が、オリゴヌクレオチドを取り込んだと判断した。
【０１５５】
アポトーシスの検出
篩板細胞にいろいろなアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトし、カンプトテシンでアポトーシスを誘導した後、対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞、またはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド（配列番号26）で処理した細胞のうちで、アポトーシスを起こした細胞の割合を調べた。アポトーシスを起こした篩板細胞を検出するのに2つの方法を利用した。すなわち、ヘキスト染色法と、デッドエンド（登録商標）蛍光測定TUNEL法である。核染料ヘキストを使用して篩板細胞の核に標識し、形態的特徴（例えば核の断片化や凝縮）に基づいてアポトーシスを起こした細胞を同定した。定着剤として、無水メタノールと氷酢酸が3：1になった混合物を使用の直前に調製した。培養スライド上で増殖しているCOS-7細胞の培地に同量の定着剤を添加し、2分間にわたってインキュベートした。培地／定着剤の混合物を細胞から取り出して廃棄し、定着剤1mlを細胞に添加した。5分後、定着剤を廃棄し、新鮮な定着剤1mlを細胞に添加し、5分間にわたってインキュベートした。定着剤を廃棄し、細胞を大気中で4分間乾燥させた後、ヘキスト染色剤を1ml（0.5μg/mlのヘキスト33258を含むPBS）添加した。暗所で10分間にわたってインキュベートした後、染色溶液を廃棄し、スライドを脱イオン水で1分間ずつ3回洗浄した。洗浄後、数滴のマッキルベン緩衝液（0.021Mのクエン酸、0.058MのNa2HPO4・7H2O；pH5.6）を細胞に添加し、カバーガラスを上から被せた。染色された細胞を、UVフィルタを使用して蛍光顕微鏡で観察した。明るく染色された細胞または断片化された核をアポトーシスとした。ウエル1つにつき最低で200個の細胞がカウントされた。
【０１５６】
デッドエンド（登録商標）蛍光測定TUNEL（プロメガ社）を利用し、アポトーシスを起こした細胞の1つの特徴であるDNAの断片化を検出した。ヘキスト染色の後、培養スライドを蒸留水で軽く洗浄し、スライドをPBS（137mMのNaCl、2.68mMのKCl、1.47mMのKH2PO4、8.1mMのNa2HPO4）の中に5分間ずつ2回浸すことによってさらに洗浄し、洗浄と洗浄の間にスライドを紙タオルにブロッティングした。0.2％のトリトンX-100を含むPBSの中に細胞を5分間にわたって浸すことにより、細胞を浸透性にした。次にスライドを5分間ずつ2回PBSの中に浸すことによって細胞を再び洗浄し、洗浄と洗浄の間にスライドを紙タオルにブロッティングした。ウエル1つにつき25μlの平衡用緩衝液（200mMのカコジル酸カリウム（pH6.6）、25mMのトリス-HCl（pH6.6）、0.2mMのジチオトレイトール、0.25mg/mlのウシ血清アルブミン、2.5mMの塩化コバルト）を添加し、5〜10分間にわたってインキュベートした。平衡させている間、平衡用緩衝液とヌクレオチド混合物（50μMのフルオレセイン-12-dUTP、100μMのdATP、10mMのトリス-HCl（pH7.6）、1mMのEDTA）とターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ酵素（Tdt、25U/μl）を45：5：1の比で混合することにより、各ウエル用の反応混合物を30μl調製した。平衡用緩衝液の中でインキュベートした後、ウエル1つにつき反応混合物を30μl添加し、カバーガラスを上から被せた。反応は、暗所で37℃にて1時間にわたって行なわせた。スライドを2×SSC（0.3MのNaCl、30mMのクエン酸ナトリウム（pH7.0））の中に浸すことによって反応を終了させた後、15分間にわたってインキュベートした。次に、スライドを、PBSの中に5分間ずつ3回浸すことによって洗浄した。キム・ワイプを用いてウエルのまわりをぬぐうことによってPBSを除去し、封入剤（オンコジーン・リサーチ・プロジェクト社、JA1750-4ML）を各ウエルに添加し、スライドにカバーガラスを被せた。UVフィルタ（UV-G365、フィルタ・セット487902）を用いて細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ヘキスト染色した核をカウントした。明るく染色された核または断片化した核はすべて、アポトーシスと判断した。同じ視野において、フルオレセイン・フィルタ（グリーンH546、フィルタ・セット48915）を用いて細胞を観察した。明るい緑色の蛍光を発している細胞はすべて、アポトーシスと判断した。その視野においてアポトーシスを起こした細胞の割合は、フルオレセイン・フィルタを用いてカウントした明るい緑色の核を、UVフィルタのもとでカウントした核の合計数で割ることによって計算した。ウエル1つにつき、最低で200個の細胞がカウントされた。
【０１５７】
図54〜図57に、これらの実験の結果を示してある。アポトーシス特異的eIF-5Aをトランスフェクトしたサンプル中のアポトーシス細胞の割合は、対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞で見られるよりも明らかにはるかに小さい。
【０１５８】
タンパク質の抽出とウエスタン・ブロッティング
トランスフェクトされたRKO細胞をPBSで洗浄し、ウエル1つにつき40μlの温かい溶解用緩衝液（0.5％SDS、1mMのジチオトレイトール、50mMのトリス-HCl（pH8.0））を添加することによってその細胞からタンパク質を回収し、ウエスタン・ブロット分析を行なった。細胞を剥がし、得られた抽出液をマイクロ遠心管に移し、5分間にわたって煮沸し、-20℃で保管した。バイオ-ラド・タンパク質アッセイ（バイオ-ラド社）を製造会社の指示に従って使用し、タンパク質を定量した。
【０１５９】
ウエスタン・ブロットを行なうため、12％SDS-ポリアクリルアミド・ゲル上で全タンパク質5μgを分離した。分離したタンパク質をポリジフッ化ビニリデン膜に移した。次に、この膜をブロッキング溶液（5％のスキムミルク粉末を含むPBS）の中で1時間にわたってインキュベートし、0.05％ツイーン-20／PBSの中で15分間ずつ3回洗浄した。膜をPBS-Tの中で4℃にて一晩保管した。翌日、膜を室温に温めた後、1μg/mlのポリビニルアルコールの中で30秒間にわたってブロックした。膜を脱イオン水の中で5回洗浄した後、5％のミルクを含む0.025％ツイーン-20／PBS溶液の中で30分間にわたってブロックした。5％のミルクを含む0.025％ツイーン-20／PBS溶液の中で一次抗体を30分間にわたってあらかじめインキュベートした後、膜とともにインキュベートした。
【０１６０】
一次抗体をいくつか使用した。それは、p53を認識するオンコジーン社からのモノクローナル抗体（Ab-6）と、ヒト・アポトーシス特異的eIF-5AのC末端と相同な合成ペプチド（アミノ-CRLPEGDLGKEIEQKYD-カルボキシ）（配列番号68）に対するポリクローナル抗体（ギャラス・イムノテック社）である。このポリクローナル抗体はニワトリで生成させた。タンパク質が同じ量ローディングされていることを確認するため、抗β-アクチン抗体（オンコジーン社）も使用した。p53に対する上記モノクローナル抗体は、0.05μg/mlに希釈して使用し、アポトーシス特異的eIF-5Aに対する抗体は、1000倍に希釈して使用し、アクチンに対する抗体は、20,000倍に希釈して使用した。膜を一次抗体とともに60〜90分間にわたってインキュベートした後、膜を0.05％ツイーン-20／PBSの中で15分間ずつ3回洗浄した。次に、1％のミルクを含む0.025％ツイーン-20／PBSの中に二次抗体を希釈し、膜とともに60〜90分間にわたってインキュベートした。p53（Ab-6）を一次抗体として使用した場合には、使用する二次抗体は、ウサギ抗マウスIgGが共役したペルオキシダーゼ（シグマ社）を5000倍に希釈したものであった。抗アポトーシス特異的eIF-5Aを一次抗体として使用した場合には、ウサギ抗ニワトリIgYが共役したペルオキシダーゼ（ギャラス・イムノテック社）を5000倍に希釈して使用した。アクチンとともに使用した二次抗体は、ヤギ抗マウスIgMが共役したペルオキシダーゼ（カルバイオケム社）を5000倍に希釈したものであった。膜を二次抗体とともにインキュベートした後、PBS-Tの中で3回洗浄した。
【０１６１】
ECLプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）を使用してペルオキシダーゼが共役した結合抗体を検出した。簡単に説明すると、膜を軽くブロットして乾燥させた後、試薬Aと試薬Bが40：1の割合になった混合物とともに暗所で5分間にわたってインキュベートした。膜をブロットして乾燥させた後、アセテート・シートの間に挟み、X線フィルムに10秒間〜30分間にわたって露出した。膜をストリッピング緩衝液（100mMの2-メルカプトエタノール、2％SDS、62.5mMのトリス-HCl（pH6.7））の中に浸すことによって剥がし、50℃にて30分間にわたってインキュベートした。次に膜を脱イオン水の中で洗浄し、大量の0.05％ツイーン-20／PBSの中で10分間ずつ2回洗浄した。膜を剥がし、3回までブロットした。
【０１６２】
実施例８
siRNAの構成
ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対する短い阻害RNA（siRNA）を用い、RKO細胞と篩板細胞におけるアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を特異的に抑制した。サイレンサー（登録商標）siRNA構成キット（アンビオン社）を用いて試験管内で転写を行なうことにより、6つのsiRNAを作った。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを4つ作った（siRNA #1〜#4）（配列番号30〜33）。2つのsiRNAを対照として使用した。1つは、キットに含まれているGAPDHに対するsiRNAであり、もう1つは、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1（配列番号30）の逆配列を持つが、それ自身はアポトーシス特異的eIF-5Aを標的としないsiRNA（siRNA #5）（配列番号34）である。これらのsiRNAは、製造会社のプロトコルに従って作った。簡単に説明すると、望むsiRNA鎖をコードしているDNAオリゴヌクレオチドをT7 RNAポリメラーゼの鋳型として用いてT7プロモータ・プライマーをアニーリングし、クレノウ・フラグメントとフィル-イン(fill-in)反応させることにより、siRNAの個々の鎖を作製した。センス鎖とアンチセンス鎖の両方について転写反応を行なわせた後、反応物をまとめ、2本のsiRNA鎖をアニールし、DNアーゼとRNアーゼで処理し、カラムで精製した。siRNAを作るのに使用したDNAオリゴヌクレオチド（T7プライマーのアニーリング部位に下線）の配列は以下の通りであった。siRNA #1アンチセンス5'AAAGGAATGACTTCCAGCTGACCTGTCTC3'（配列番号69）とsiRNA #1センス5'AATCAGCTGGAAGTCATTCCTCCTGTCTC3'（配列番号70）；siRNA #2アンチセンス5'AAGATCGTCGAGATGTCTACTCCTGTCTC3'（配列番号71）とsiRNA #2センス5'AAAGTAGACATCTCGACGATCCCTGTCTC3'（配列番号72）；siRNA #3アンチセンス5'AAGGTCCATCTGGTTGGTATTCCTGTCTC3'（配列番号73）とsiRNA #3センス5'AAAATACCAACCAGATGGACCCCTGTCTC3'（配列番号74）；siRNA #4アンチセンス5'AAGCTGGACTCCTCCTACACACCTGTCTC3'（配列番号75）とsiRNA #4センス5'AATGTGTAGGAGGAGTCCAGCCCTGTCTC3'（配列番号76）；siRNA #5アンチセンス5'AAAGTCGACCTTCAGTAAGGACCTGTCTC3'（配列番号77）とsiRNA #5センス5'AATCCTTACTGAAGGTCGACTCCTGTCTC3'（配列番号78）。
【０１６３】
サイレンサー（登録商標）siRNA標識キット-FAM（アンビオン社）を用いてGAPDH siRNAにFAMを標識し、RKO細胞および篩板細胞へのsiRNAの取り込みをモニターした。8ウエルの培養スライド上で細胞にトランスフェクトした後、その細胞をPBSで洗浄し、3.7％ホルムアルデヒドを含むPBSの中で10分間にわたって固定した。ウエルを除去し、封入剤（ヴェクタシールド社）を添加し、カバーガラスを被せた。フルオレセイン・フィルタを用い、FAMで標識したsiRNAの取り込みが、UV光のもとで蛍光顕微鏡で見られるようにした。GAPDH siRNAは、製造会社のプロトコルに従って標識した。
【０１６４】
siRNAのトランスフェクション
同じトランスフェクション・プロトコルに従い、RKO細胞と篩板細胞にsiRNAをトランスフェクトした。8ウエルの培養スライドまたは24ウエルのプレートに、RKO細胞をウエル1つにつきそれぞれ46,000個と105,800個の割合で植え、その翌日にトランスフェクションを行なった。篩板細胞には、細胞の集密度が40〜70％になったときにトランスフェクションを行なった。篩板細胞は、一般に、8ウエルの培養スライド上に、ウエル1つにつき7500〜10,000個の割合で植え、その3日後にトランスフェクションを行なった。8ウエルの培養スライドの1つのウエルにとって十分なトランスフェクション培地を調製するため、25.5ピコモルのsiRNAストックをオプティ-メム（シグマ社）で希釈して最終体積を21.2μlにした。0.425μlのリポフェクタミン2000をオプティ-メムで希釈して最終体積を21.2μlにした後、室温にて7〜10分間にわたってインキュベートした。次に、希釈したリポフェクタミン2000混合物を希釈したsiRNA混合物に添加し、室温にて20〜30分間にわたってインキュベートした。細胞を無血清培地で1回洗浄した後、無血清培地135μlを細胞に添加し、トランスフェクション培地42.4μlをその上から添加した。細胞を増殖チェンバーに戻して4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、65μlの無血清培地+30％FBSを細胞に添加した。ウエスタン・ブロット分析に用いる細胞へのsiRNAのトランスフェクションを、24ウエルのプレートで実施した。そのとき、体積を2.3倍にした以外は8ウエルのスライドにおけるトランスフェクションと同じ条件にした。
【０１６５】
トランスフェクション後、RKO細胞と篩板細胞を72時間にわたってインキュベートし、細胞抽出液を回収してウエスタン・ブロット分析を行なった。アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAがアポトーシスを阻止する効率を調べるため、トランスフェクションの48時間後または72時間後に篩板細胞を50μlのカンプトテシン（シグマ社）と10ng/mlのTNF-α（レインコ・テクノロジーズ社）で処理し、アポトーシスを誘導した。24時間後または48時間後に細胞をヘキストで染色し、アポトーシスを起こした細胞の割合を測定した。
【０１６６】
実施例９
HepG2細胞によって産生されるTNF-αの定量
48ウエルのプレートに、HepG2細胞をウエル1つにつき20,000個の割合で植えた。72時間後、培地を除去し、2.5μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含むか、2.5μMのアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2を含む新鮮な培地を細胞に添加した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地は、24時間後に添加した。オリゴヌクレオチドとともに合計で48時間インキュベートした後、培地を、インターロイキン1β（IL-1β、1000pg/ml；レインコ・テクノロジーズ社）を含む培地と交換し、6時間にわたってインキュベートした。培地を回収して凍結させ（-20℃）、TNF-αの定量を行なった。処理していない細胞（アンチセンス・オリゴヌクレオチドもIL-1βもなし）と、IL-1βだけで処理した細胞のインキュベーションを並行して行ない、対照として利用した。どの処理も2回実施した。ELISAアッセイ（アッセイ・デザイン社）を製造会社のプロトコルに従って利用し、培地に放出されたTNF-αを測定した。
【０１６７】
実施例１０
以下の実験は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現をp53と同様に阻止できたことを示している。
【０１６８】
RKO細胞に対し、トランスフェクションを行なわないか、モックをトランスフェクトするか、200nMのアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#1、#2、#3（配列番号25、26、27）をトランスフェクトした。RKO細胞には、100nMのアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号26）もトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を0.25μg/mlのアクチノマイシンDで処理した。24時間後、細胞抽出液を回収し、各サンプルからの5μgのタンパク質をSDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に移し、アポトーシス特異的eIF-5Aに対する抗体を用いてウエスタン・ブロットを行なった。化学発光を検出した後、膜を剥がし、p53に対する抗体を用いて再度調べた。化学発光を検出した後、膜を剥がし、アクチンに対する抗体を用いて再度調べた。図52は、（アポトーシス特異的eIF-5Aの）アンチセンス・オリゴヌクレオチド1、2、3（それぞれ配列番号25、26、27）で処理した後にRKO細胞が産生するタンパク質のレベルを示している。RKO細胞では、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした後、アポトーシス特異的eIF-5Aとp53の産生が低下した。
【０１６９】
実施例１１
以下の実験は、アポトーシス特異的eIF-5Aヌクレオチドがアポトーシスを減らせることを示している。
【０１７０】
1つの実験では、篩板細胞系#506に、（A）オリゴフェクタミン・トランスフェクション試薬を用い、FITCで標識した100nMのアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトするか、（B）FITCで標識した10μMの裸のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを無血清培地の中に直接希釈したものをトランスフェクトした。24時間後、10％FBSと、10μMに希釈した新鮮なアンチセンス・オリゴヌクレオチドとを含む新鮮な培地を細胞に添加した。合計で48時間後に細胞（A）と（B）を固定し、フルオレセイン・フィルタを用いることでUV光のもとで蛍光顕微鏡で見えるようにした。図53は、蛍光標識したアンチセンス・オリゴヌクレオチドの取り込み状態を示している。
【０１７１】
別の実験では、篩板細胞系#506に、10μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号26）を、合計で4日間トランスフェクトした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた処理を開始してから48時間後、細胞を20μMまたは40μMのカンプトテシンで48時間にわたって処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとカンプトテシンを含む培地は毎日交換した。アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストとTUNELを用いて細胞を標識して調べた。図54を参照のこと。
【０１７２】
別の実験では、篩板細胞系#506に、10μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号26）をトランスフェクトした。24時間後、培地を交換し、新鮮なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを添加した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた処理を開始してから48時間後、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを除去し、細胞を20μMのカンプトテシンで3日間にわたって処理した。カンプトテシン含有培地は毎日交換した。アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストとTUNELを用いて細胞を標識して調べた。図55を参照のこと。
【０１７３】
さらに別の実験では、篩板細胞系#517に、1μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号26）を、合計で5日間トランスフェクトした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた処理を開始してから48時間後、細胞を20μMのカンプトテシンで3日間または4日間にわたって処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとカンプトテシンを含む培地は毎日交換した。アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストとTUNELを用いて細胞を標識して調べた。図56を参照のこと。
【０１７４】
別の実験では、篩板細胞系#517に、2.5μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号26）を、合計で5日間トランスフェクトした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた処理を開始してから48時間後、細胞を40μMのカンプトテシンで3日間にわたって処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとカンプトテシンを含む培地は毎日交換した。アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストを用いて細胞を標識して調べた。図57を参照のこと。
【０１７５】
別の実験では、篩板細胞系#517に、1μMまたは2.5μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号26）を、合計で5日間トランスフェクトした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた処理を開始してから48時間後、細胞を40μMのカンプトテシンで3日間にわたって処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとカンプトテシンを含む培地は毎日交換した。アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストを用いて細胞を標識して調べた。図58を参照のこと。
【０１７６】
別の実験では、篩板細胞系#517を処理しないままにするか、篩板細胞系#517を、10ng/mlのTNF-αで、または50μMのカンプトテシンで、または10ng/mlのTNF-α+50μMのカンプトテシンで処理した。アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストを用いて細胞を標識して調べた。図59を参照のこと。
【０１７７】
別の実験では、篩板細胞系#506と#517に、2.5μMまたは5μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号26）を、合計で2日間トランスフェクトした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地を24時間後に添加した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた処理を開始してから48時間後、細胞を50μMのカンプトテシンと10ng/mlのTNF-αで2日間にわたって処理した。アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストを用いて細胞を標識して調べた。図60を参照のこと。
【０１７８】
別の実験では、篩板細胞系#506、#517、#524に、2.5μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2（配列番号26）を、合計で2日間トランスフェクトした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地を24時間後に添加した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた処理を開始してから48時間後、細胞を50μMのカンプトテシンと10ng/mlのTNF-αで2日間にわたって処理した。アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストを用いて細胞を標識して調べた。図61を参照のこと。
【０１７９】
実施例１２
以下の実験は、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とするsiRNAをトランスフェクトした細胞ではアポトーシス特異的eIF-5Aの発現がより少ないことを示している。この実験は、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とするsiRNAがアポトーシスを減らせることも示している。
【０１８０】
1つの実験では、（A）血清を含むリポフェクタミン2000トランスフェクション試薬、または（B）血清を含まないリポフェクタミン2000トランスフェクション試薬をトランスフェクションの間に使用し、篩板細胞系#517に、FAMで標識した100nMのsiRNAをトランスフェクトした。合計で24時間後に細胞（A）と（B）を固定し、フルオレセイン・フィルタを用いてUV光のもとで蛍光顕微鏡で見えるようにした。図62を参照のこと。
【０１８１】
別の実験では、トランスフェクションの間に血清が存在した状態、または不在の状態で、RKO細胞に100nMのsiRNAをトランスフェクトした。6つのsiRNAをトランスフェクトした。2つの対照siRNA（siRNA #5（配列番号34）と、GAPDHを標的とするsiRNA）と、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする4つのsiRNA（siRNA #1〜#4）（配列番号30〜33））である。トランスフェクションの72時間後、細胞抽出液を回収し、各サンプルからの5μgのタンパク質をSDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に移し、アポトーシス特異的eIF-5Aに対する抗体を用いてウエスタン・ブロットを行なった。化学発光を検出した後、膜を剥がし、bcl-2に対する抗体を用いて再度調べた。化学発光を検出した後、膜を剥がし、アクチンに対する抗体を用いて再度調べた。図63を参照のこと。
【０１８２】
別の実験では、篩板細胞系#506と#517に、100mMのsiRNAをトランスフェクトした。6つのsiRNAをトランスフェクトした。2つの対照siRNA（siRNA #5（配列番号34）と、GAPDHを標的とするsiRNA）と、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする4つのsiRNA（siRNA #1〜#4）（配列番号30〜33））である。トランスフェクションの72時間後、細胞抽出液を回収し、各サンプルからの5μgのタンパク質をSDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に移し、アポトーシス特異的eIF-5Aに対する抗体を用いてウエスタン・ブロットを行なった。化学発光を検出した後、膜を剥がし、bcl-2に対する抗体を用いて再度調べた。化学発光を検出した後、膜を剥がし、アクチンに対する抗体を用いて再度調べた。図64を参照のこと。
【０１８３】
別の実験では、篩板細胞系#506に、100mMのsiRNAをトランスフェクトした。6つのsiRNAをトランスフェクトした。2つの対照siRNA（siRNA #5（配列番号34）と、GAPDHを標的とするsiRNA）と、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする4つのsiRNA（siRNA #1〜#4）（配列番号30〜33））である。トランスフェクションの48時間後、培地を、50μMのカンプトテシンと10ng/mlのTNF-αを含む培地と交換した。24時間後、アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストを用いて細胞を標識して調べた。図65を参照のこと。
【０１８４】
別の実験では、篩板細胞系#506に、100mMのsiRNAをトランスフェクトした。6つのsiRNAをトランスフェクトした。2つの対照siRNA（siRNA #5（配列番号34）と、GAPDHを標的とするsiRNA）と、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする4つのsiRNA（siRNA #1〜#4）（配列番号30〜33））である。トランスフェクションの72時間後、培地を、50μMのカンプトテシンと10ng/mlのTNF-αを含む培地と交換した。24時間後、アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストを用いて細胞を標識して調べた。図66を参照のこと。
【０１８５】
別の実験では、篩板細胞系#506を処理しないままにするか、篩板細胞系#506に100mMのsiRNAをトランスフェクトした。6つのsiRNAをトランスフェクトした。2つの対照siRNA（siRNA #5（配列番号34）と、GAPDHを標的とするsiRNA）と、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする4つのsiRNA（siRNA #1〜#4）（配列番号30〜33））である。トランスフェクションの72時間後、培地を、50μMのカンプトテシンと10ng/mlのTNF-αを含む培地と交換した。トランスフェクトしておらず、処理もしていない対照細胞には、新鮮な培地も添加した。48時間後、アポトーシスを起こした細胞の割合を、ヘキストを用いて細胞を標識して調べた。図67を参照のこと。
【０１８６】
図67と実施例13に示した実験で、siRNAをトランスフェクトした後にカンプトテシンとTNF-αで処理してからヘキストで染色した篩板細胞系#506の写真を図68に示してある。
【０１８７】
実施例１３
この実施例は、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドでヒト細胞系を処理すると、細胞が産生するTNF-αが少なくなることを示している。
【０１８８】
2.5μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2を用い、HepG2細胞を合計で2日間にわたって処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地を24時間後に添加した。別の細胞は、2日間にわたって処理しないままにした。処理を開始してから48時間後、細胞を、IL-1β（1000pg/ml）を含む新鮮な培地で6時間にわたって処理した。実験の終了時に培地を回収して凍結させ（-20℃）、TNF-αを定量した。培地に放出されたTNF-αは、アッセイ・デザインズ社から購入したELISAアッセイを利用して測定した。図69を参照のこと。アポトーシス特異的eIF-5Aのアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトされた細胞は、TNF-αの産生がより少なかった。
【０１８９】
実施例１４
HT-29細胞（ヒト大腸腺がん）に、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAをトランスフェクトするか、逆配列を有する対照siRNAをトランスフェクトした。使用したsiRNAは、以下のものであった：
位置690（3'UTR）％G/C=48
5'AAGCUGGACUCCUCCUACACA3'（配列番号79）。
使用した対照siRNAは、以下のものであった：
％G/C=39
5'AAACACAUCCUCCUCAGGUCG3'（配列番号80）。
【０１９０】
48時間後、細胞をインターフェロンγ（IFN-γ）で16時間にわたって処理した。16時間後、細胞を新鮮な培地で洗浄し、リポ多糖（LPS）で8時間または24時間にわたって処理した。それぞれの時点（8時間または24時間）で細胞培地から細胞を取り出し、凍結させ、培地に存在しているTNF-αをELISAで定量した。細胞ライセートも回収し、タンパク質を定量し、（異なるウエルの細胞数の違いを調節するため）TNF-αの値をタンパク質1mg当たりのpg数にした。ウエスタン・ブロットの結果を図74Aに、ELISAの結果を図74Bに示してある。図75は、同じ実験を細胞の密度をより大きくして行なった場合の結果である。
【０１９１】
実施例１５
U-937細胞系の組織培養条件
U-937は、懸濁液の中で増殖するヒト単球細胞系であり、接着性になり、PMA（この細胞をATCCから直接得ることはできない）で刺激したときにマクロファージに分化する（ATCC番号CRL-1593.2）。細胞を、CO2が5％含まれている37℃のインキュベータの中で、2mMのL-グルタミンと、1.5g/lの炭酸水素ナトリウムと、4.5g/lのグルコースと、10mMのヘペスと、1.0mMのピルビン酸ナトリウムと、10％ウシ胎仔血清とを含むRPMI1640培地の中に維持した。細胞を、一週間に2回、新鮮な培地に分割し（分割比は1：4または1：5）、細胞密度を常に1ml当たり105〜2×106個に維持した。組織培養物で処理したプラスチック製T-25フラスコに入れた懸濁液の中で細胞を培養し、24ウエルのプレートの中で実験を行なった。
【０１９２】
経時変化を調べる実験
実験を開始する2日前、細胞密度を培地1mlにつき3×105個に調節した。実験の当日、対数増殖期の細胞を回収した。細胞懸濁液を15mlの試験管に移し、室温にて400×gで10分間にわたって遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地の中に再び懸濁させた。細胞を再び400×gで10分間にわたって遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを最終的に新鮮な培地に再び懸濁させた。同じ体積の細胞懸濁液とトリパン・ブルー溶液（0.4％のトリパン・ブルー染料を含むPBS）を混合し、血球計数器と顕微鏡を用いて生きた細胞をカウントした。細胞を1ml当たり4×105個に希釈した。
【０１９３】
PMAまたはDMSO（対照ビヒクル）を各ウエルに添加した24ウエルのプレートを用意した。細胞懸濁液1mlを各ウエルに添加し、各ウエルに、細胞が400,000個と、0.1％DMSO+162nMのPMA、または0.1％DMSOだけが含まれるようにした。CO2が5％含まれている37℃のインキュベータの中に細胞を維持した。時間が0、24時間、48時間、72時間、96時間、99時間、102時間の時点で、別々のウエルから細胞を回収した。実験の各時点と添加物のまとめに関しては、図76を参照のこと。
【０１９４】
培地を72時間後に交換した。一部の細胞が接着し、他の細胞は懸濁状態だったため、接着した細胞を乱さないように注意した。各ウエルからの培地を、対応するマイクロ遠心管に注意深く移し、その管を14,000×gで3分間にわたって遠心分離した。マイクロ遠心管を吸引し、細胞ペレットを新鮮な培地（1ml、(-)DMSO、(-)PMA）に再び懸濁させ、元のウエルに戻した。細胞は、PMAなしのこの新鮮な培地で不活性になる。96時間の時点でLPS（100ng/ml）を添加し、細胞をその3時間後（99時間経過）と6時間後（102時間経過）の時点で回収した。
【０１９５】
上記の各時点で懸濁細胞と培地を各ウエルからマイクロ遠心管に移した。細胞を14,000×gで3分間にわたって遠心分離することによってペレット化した。培地（上清）を清潔な試験管に移し、ELISA／サイトカイン分析を行なうために保管した（-20℃）。ウエルに残っている細胞をPBS（1ml、37℃）で洗浄し、このPBSを、対応するマイクロ遠心管の中にある細胞ペレットの洗浄にも用いた。細胞を14,000×gで3分間にわたって遠心分離することによって再びペレット化した。沸騰している溶解用緩衝液（50mMのトリス（pH7.4）と2％SDS）を用いて細胞を溶解させた。各ウエルからの接着細胞と懸濁細胞をプールした。サンプルを煮沸した後、-20℃で保管した。
【０１９６】
ウエスタン・ブロッティング
各細胞サンプル中のタンパク質の濃度は、BSA（ウシ血清アルブミン）を標準タンパク質として使用したBCA（ビシンコニン酸）法によって測定した。タンパク質サンプル（合計でタンパク質が5μg）を12％SDS-PAGE電気泳動で分離し、PVDF膜に移した。ポリビニルアルコール（1μg/ml、30秒間）と、5％のスキムミルクを含むPBS-t（1時間）とでその膜をブロックした。ヒトeIF-5Aに対するマウス・モノクローナル抗体（BDバイオサイエンシーズ社、カタログ番号611976；5％スキムミルクの中に20,000倍に希釈、1時間）を用いて膜を調べた。膜をPBS-tで10分間ずつ3回洗浄した。二次抗体は、セイヨウワサビのペルオキシダーゼが共役した抗マウス抗体（シグマ社、1％スキムミルクの中に5000倍に希釈、1時間）であった。膜をPBS-tで10分間ずつ3回洗浄した。タンパク質のバンドを化学発光によって可視化した（ECL検出システム、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）。
【０１９７】
各ゲル・レーンに同じ量のタンパク質がローディングされたことを確かめるため、膜を剥がし、アクチンに関して調べた。膜を剥がし（100mMの2-メルカプトエタノール、2％SDS、62.5mMのトリス-HCl（pH6.7）；50℃で30分間）、洗浄し、上記のようにしてブロックした。膜をアクチン一次抗体（マウスの体内で生成させたアクチン・モノクローナル抗体；オンコジーン社、Ab-1；5％スキムミルクの中に20,000倍に希釈）で調べた。二次抗体、洗浄、検出は、上に説明したのと同じにした。
【０１９８】
図77は、単球（U-937）が分化し、その後にTNF-αが分泌されている間にeIF-5Aがアップレギュレーションされることを示している。
【０１９９】
実施例１６
インターフェロンγに応答したIL-8産生の、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAによる抑制
HT-29（ヒト大腸腺がん）細胞に、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの約48時間後、培地を交換した。そのとき、テスト・サンプルの一部にはインターフェロンγが含まれ、サンプルの別の一部にはインターフェロンγが含まれないようにした。インターフェロンγを添加してから16時間後、細胞を洗浄し、TNF-αを含む培地と含まない培地を細胞に添加した。培地（IL-8をELISAで検出するのに用いる）と細胞ライセートを8時間後または24時間後に回収した。
【０２００】
図79と図80は、TNF-αとインターフェロンに応答して産生されたIL-8を示している。細胞をインターフェロンγで処理した後にTNFで処理すると、細胞は、いずれかの処理単独の場合よりもIL-8を多く産生する。TNF受容体1はインターフェロンに応答してアップレギュレーションされることが知られているため、これはそのことが原因である可能性がある。細胞はより多くの受容体を持った状態になっているため、細胞をインターフェロンで“処理”すると、TNFによりよく応答させることができる。アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAは、TNFだけに応答して産生されるIL-8（前の実験）には影響を及ぼさなかったが、そのsiRNAは、インターフェロンに応答して産生されるIL-8をほぼすべてブロックするとともに、インターフェロンとTNFを組み合わせて処理した結果として産生されるIL-8のかなりの量をブロックした。この結果は、発明者らが、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを用いることにより、TNFではなくインターフェロンを通じたシグナル伝達でIL-8に至る経路を手にしたことを示している。図81は、HT-29細胞においてインターフェロンγに応答してアポトーシス特異的eIF-5Aがアップレギュレーションされたこと（8時間で4倍）を示すウエスタン・ブロットである。
【０２０１】
実施例１７
ヒト篩板細胞の培養
ヒトの一対の眼球をカナダのアイ・バンク（オンタリオ分室）から死後48時間以内に取得した。（極の付いた）視神経頭部を取り出し、抗生物質／抗真菌剤と、グルタミンと、10％FBSを補足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の中に3時間入れた。視神経頭部（ONH）のボタンを各組織サンプルから回収し、細断用のハサミで小片にした。移植片を、12.5cm2のプラスチック製培養フラスコに入れたDMEMの中で培養した。1ヶ月以内の期間、生きている移植片の増殖を観察した。細胞の集密度が90％に達したとき、トリプシンで処理し、分別継代培養を行なって篩板（LC）細胞と星状細胞の集団を生成させた。LC細胞は、ゲンタマイシンと、グルタミンと、10％FBSとを補足したDMEMを入れた25cm2のプラスチック製培養フラスコの中で継代培養することによって増やした。このプロトコルに従って細胞を維持し、継代培養した。
【０２０２】
8ウエルの培養スライド上での蛍光抗体分染法を利用し、分別継代培養によって得た細胞集団のが何であるかと集団の純度を調べた。細胞を10％ホルマリン溶液の中に固定し、ダルベッコ・リン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）で3回洗浄した。2％の脱脂乳を含むDPBSを用いて反応をブロックした後、1％のBSAを含むDPBSで抗体を希釈し、6つのウエルの細胞に添加した。残る2つのウエルは、対照として1％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液と二次抗体だけで処理した。細胞を一次抗体とともに室温にて1時間にわたってインキュベートした後、DPBSで3回洗浄した。1％のBSAを含むDPBSで適切な二次抗体を希釈し、各ウエルに添加し、1時間にわたってインキュベートした。スライドをDPBSで洗浄した後、水の中で洗浄し、大気中で乾燥させ、フルオロマウント（ヴェクター・ラボラトリーズ社）をその上に添加した。適切なフィルタを備えた蛍光顕微鏡で免疫蛍光染色を観察し、一次抗体で処理しなかった対照ウエルと比較した。特に断わらない限り、一次抗体はすべてシグマ社から取得した。二次抗体はすべて、モレキュラー・プローブズ社から購入した。LC細胞を同定するのに用いた一次抗体は、抗コラーゲンI、抗コラーゲンIV、抗ラミニン、抗細胞フィブロネクチン、抗グリア繊維酸性タンパク質（GFAP）、抗α平滑筋アクチンであった。細胞集団が、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニン、細胞フィブロネクチン、α平滑筋アクチンに対してポジティブ染色され、グリア繊維（GFAP）に対してネガティブ染色された場合に、その細胞集団にLC細胞が含まれていることが明らかになった。この実験では、2組のヒトの眼球を用いて培養を開始した。83歳の男性と17歳の男性の視神経頭部から、それぞれLC細胞系#506と#517を樹立した。どのLC細胞系でも完全にキャラクタリゼーションを行ない、LC細胞が90％を超える割合で含まれていることを見いだした。
【０２０３】
LC細胞の処理
50μMのカンプトテシン（シグマ社）と10ng/mlのTNF-α（レインコ・テクノロジーズ社）を組み合わせて篩板細胞にアポトーシスを誘導した。カンプトテシンとTNF-αの組み合わせは、カンプトテシンまたはTNF-α単独の場合よりもアポトーシスを誘導するのに効果的であることがわかった。
【０２０４】
siRNAの構成とトランスフェクション
ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対する短い阻害RNA（siRNA）を用い、篩板細胞においてeIF-5Aの発現を特異的に抑制した。サイレンサー（登録商標）siRNA構成キット（アンビオン社）を用いて試験管内で転写を行なうことにより、6つのsiRNAを作った。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを4つ作った（siRNA #1〜#4）。2つのsiRNAを対照として使用した。1つは、キットに含まれているGAPDHに対するsiRNAであり、もう1つは、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1（配列番号30）の逆配列を持つが、それ自身はアポトーシス特異的eIF-5Aを標的としないsiRNA（siRNA #5）である。これらのsiRNAは、製造会社のプロトコルに従って作った。eIF-5Aを標的するsiRNAと対照siRNAは、以下の配列であった。siRNA #1 5'AAAGGAATGACTTCCAGCTGA3'（配列番号81）；siRNA #2 5'AAGATCGTCGAGATGTCTACT3'（配列番号82）；siRNA #3 5'AAGGTCCATCTGGTTGGTATT3'（配列番号83）；siRNA #4 5'AAGCTGGACTCCTCCTACACA3'（配列番号84）；siRNA #5 5'AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA3'（配列番号85）。リポフェクタアミン2000を用い、篩板細胞にsiRNAをトランスフェクトした。
【０２０５】
篩板細胞には、細胞の集密度が40〜70％になったときにトランスフェクションを行なった。篩板細胞は、一般に、8ウエルの培養スライド上に、ウエル1つにつき7500〜10,000個の割合で植え、その3日後にトランスフェクションを行なった。8ウエルの培養スライドの1つのウエルにとって十分なトランスフェクション培地を調製するため、25.5ピコモルのsiRNAをオプティ-メム（シグマ社）で希釈して最終体積を21.2μlにした。0.425μlのリポフェクタミン2000をオプティ-メムで希釈して最終体積を21.2μlにした後、室温にて7〜10分間にわたってインキュベートした。次に、希釈したリポフェクタミン2000混合物を希釈したsiRNA混合物に添加し、室温にて20〜30分間にわたってインキュベートした。細胞を無血清培地で1回洗浄した後、無血清培地135μlを細胞に添加し、トランスフェクション培地42.4μlをその上から添加した。細胞を増殖チェンバーに戻して4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、65μlの無血清培地+30％FBSを細胞に添加した。ウエスタン・ブロット分析に用いる細胞へのsiRNAのトランスフェクションを、24ウエルのプレートで実施した。そのとき、体積を2.3倍にした以外は8ウエルのスライドにおけるトランスフェクションと同じ条件にした。トランスフェクションの後、篩板細胞を72時間にわたってインキュベートし、次いで50μMのカンプトテシン（シグマ社）と10ng/mlのTNF-α（レインコ・テクノロジーズ社）で処理してアポトーシスを誘導した。次に、細胞ライセートを回収してウエスタン・ブロットを行なった。あるいは細胞のアポトーシスを調べた。
【０２０６】
アポトーシス細胞の検出
トランスフェクトされた細胞をTNF-αとカンプトテシンで24時間にわたって処理した後、ヘキスト33258で染色し、アポトーシスを起こしている細胞の割合を調べた。簡単に説明すると、無水メタノールと氷酢酸が3：1になった混合物を用いて細胞を固定した後、ヘキスト染色剤（0.5μg/mlのヘキスト33258を含むPBS）とともにインキュベートした。暗所で10分間にわたってインキュベートした後、染色溶液を廃棄し、培養スライドのウエルを隔てているチェンバーを除去し、スライドを脱イオン水で1分間ずつ3回洗浄した。洗浄後、数滴のマッキルベン緩衝液（0.021Mのクエン酸、0.058MのNa2HPO4・7H2O；pH5.6）を細胞に添加し、カバーガラスを上から被せた。染色された細胞を、UVフィルタを使用して蛍光顕微鏡で観察した。明るく染色された細胞または断片化された核をアポトーシスとした。ウエル1つにつき最低で200個の細胞がカウントされた。デッドエンド（登録商標）蛍光測定TUNEL（プロメガ社）を利用し、アポトーシスを起こした細胞の1つの特徴であるDNAの断片化を検出した。ヘキスト染色の後、培養スライドを蒸留水で軽く洗浄し、スライドをPBS（137mMのNaCl、2.68mMのKCl、1.47mMのKH2PO4、8.1mMのNa2HPO4）の中に5分間ずつ2回浸すことによってさらに洗浄し、洗浄と洗浄の間にスライドを紙タオルにブロッティングした。0.2％のトリトンX-100を含むPBSの中に細胞を5分間にわたって浸すことにより、細胞を浸透性にした。次にスライドを5分間ずつ2回PBSの中に浸すことによって細胞を再び洗浄し、洗浄と洗浄の間にスライドを紙タオルにブロッティングした。ウエル1つにつき25μlの平衡用緩衝液（200mMのカコジル酸カリウム（pH6.6）、25mMのトリス-HCl（pH6.6）、0.2mMのジチオトレイトール、0.25mg/mlのウシ血清アルブミン、2.5mMの塩化コバルト）を添加し、5〜10分間にわたってインキュベートした。平衡させている間、平衡用緩衝液とヌクレオチド混合物（50μMのフルオレセイン-12-dUTP、100μMのdATP、10mMのトリス-HCl（pH7.6）、1mMのEDTA）とターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ酵素（Tdt、25U/μl）を45：5：1の比で混合することにより、各ウエルに反応混合物を30μl調製した。平衡用緩衝液の中でインキュベートした後、ウエル1つにつき反応混合物を30μl添加し、カバーガラスを上から被せた。反応は、暗所で37℃にて1時間にわたって行なわせた。反応は、スライドを2×SSC（0.3MのNaCl、30mMのクエン酸ナトリウム（pH7.0））の中に浸して15分間にわたってインキュベートすることによって終了させた。次に、スライドをPBSの中に5分間ずつ3回浸すことによって洗浄した。キム・ワイプを用いてウエルのまわりをぬぐうことによってPBSを除去し、封入剤（オンコジーン・リサーチ・プロジェクト社、JA1750-4ML）を各ウエルに添加し、スライドにカバーガラスを被せた。UVフィルタ（UV-G365、フィルタ・セット487902）を用いて細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ヘキスト染色した核をカウントした。明るく染色された核または断片化した核はすべて、アポトーシスと判断した。同じ視野において、フルオレセイン・フィルタ（グリーンH546、フィルタ・セット48915）を用いて細胞を観察した。明るい緑色の蛍光を発している細胞はすべて、アポトーシスと判断した。その視野においてアポトーシスを起こした細胞の割合は、フルオレセイン・フィルタを用いてカウン���した明るい緑色の核を、UVフィルタのもとでカウントした核の合計数で割ることによって計算した。ウエル1つにつき、最低で200個の細胞がカウントされた。
【０２０７】
タンパク質の抽出とウエスタン・ブロット分析
ウエスタン・ブロッティングを行なうため、24ウエルのプレート上で増殖している篩板細胞をPBS（8g/lのNaCl、0.2g/lのKCl、1.44g/lのNa2HPO4、0.24g/lのKH2PO4）の中で2回洗浄した後、50μlの溶解用緩衝液（2％SDS、50mMのトリス-HCl（pH7.4））を添加することにより、その細胞からタンパク質を単離した。細胞ライセートをマイクロ遠心管に入れ、5分間にわたって煮沸した後、使用する準備が整うまで-20℃で保管した。ビシンコニン酸キット（BCA；シグマ社）を用いてタンパク質の濃度を決定した。ウエスタン・ブロッティングを行なうため、12％SDS-ポリアクリルアミド・ゲル上で全タンパク質を5μg分離した。分離されたタンパク質をポリジフッ化ビニリデン膜に移した。次いでこの膜を1時間にわたってインキュベートし、溶液（5％のスキムミルク粉末と0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBS）をブロックし、PBS-T（PBS+0.05％ツイーン20）の中で15分間ずつ3回洗浄した。膜をPBS-Tの中で4℃にて一晩保管した。翌日、膜を室温まで温めた後、1μg/mlのポリビニルアルコールの中で30秒間ブロックした。膜を脱イオン水の中で5回洗浄した後、5％のミルクを含むPBS溶液の中で30分間にわたってブロックした。5％のミルクを含むPBS溶液の中で一次抗体を30分間にわたってあらかじめインキュベートした後、膜とともにインキュベートした。使用した一次抗体は、抗eIF-5A（BDトランスダクション・ラボラトリーズ社）を20,000倍に希釈したものと、抗β-アクチン（オンコジーン社）であった。膜をPBS-Tの中で3回洗浄し、1％のミルクを含むPBSの中に適切なHRP共役二次抗体を希釈したものとともに、1時間にわたってインキュベートした。ブロットを洗浄し、ECLプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）を使用してペルオキシダーゼ共役結合抗体を検出した。
【０２０８】
結果
年齢が83歳（#506）〜17歳（#517）の男性ドナーから採取した視神経頭部から、2つの篩板（LC）細胞系を樹立した。ヒト篩板細胞から単離した細胞は、他の研究（Lambert他、2001年）で観察されたのと同様、広がっていて平坦な形状であり、目立つ核を持っていた。他のグループで行なわれたキャラクタリゼーションの結果と同様、LC細胞は、免疫活性を、α平滑筋アクチンに対して（図82a）と、多数の細胞外マトリックスタンパク質、例えば細胞フィブロネクチン（図82b）、ラミニン（図82c）、コラーゲンIとコラーゲンIV（データは示さず）に対して示した（Clark他、1995年；Hernandez他、1998年；HernandezとYang、2000年；Lambert他、2001年）。グリア繊維酸性タンパク質（GFAP）に対するLC細胞の負の免疫活性も観察されたが、これは以前の知見と一致している（図82d）（Lambert他、2001年）。これらの知見は、単離された細胞が、視神経頭部の星状細胞であるというよりは、LC細胞であることを支持している。
【０２０９】
TNF-αは緑内障になるプロセスにおいて重要な役割を果たしていると考えられているため、TNF-αの細胞傷害効果に対するLC細胞の感受性を調べた。集密なLC細胞を、カンプトテシンに、またはTNF-αに、またはカンプトテシンとTNF-αの組み合わせに、48時間にわたって曝露した（図83）。ヘキスト染色により、単独のTNF-αは、LC細胞にとって細胞傷害性ではないことがわかった。カンプトテシンで処理すると、LC細胞の約30％が細胞死した。しかしLC細胞をカンプトテシンとTNF-αの両方で処理したとき、アポトーシスの相乗的な増加が観察され、この処理によって48時間以内にLC細胞の45％が死んだ。これらの結果は、アポトーシスを起こすためにLC細胞をカンプトテシンで処理したとき、LC細胞はTNF-αの細胞傷害効果に反応できるようになることを示している。
【０２１０】
eIF-5Aは、細胞分裂に必要であることが知られている核細胞質間シャトル・タンパク質であり、最近、アポトーシスにも関与していることが示唆された。カンプトテシン、またはカンプトテシン+TNF-αを用いると、LC細胞においてアポトーシス特異的eIF-5Aの発現が誘導されてアポトーシスに至る。アポトーシス特異的eIF-5Aの発現は、カンプトテシンで処理しても、わずかな減少を除いて顕著には変化しなかった（図84A）。しかしカンプトテシン+TNF-αで処理した8時間後と24時間後には、アポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の顕著な上方調節が観察された（図84B）。これらの結果は、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現がTNF-αへの曝露によってだけ誘導され、しかもその発現がアポトーシスの誘導と相関していることを示している。これは、TNF-α受容体が結合するよりも下流にあるアポトーシス経路において、アポトーシス特異的eIF-5Aがある役割を果たしていることを意味している。
【０２１１】
TNF-αを用いてLC細胞においてアポトーシスを誘導している間のアポトーシス特異的eIF-5Aの重要さを調べるため、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする4つのsiRNA（siRNA #1〜#4）を設計し、試験管内転写によって合成した。siRNAがアポトーシス特異的eIF-5Aの発現抑制に有効であることを明らかにするため、LC細胞系#506と#517にそれぞれのsiRNAをトランスフェクトし、細胞ライセートにおけるアポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の発現を72時間後に調べた（図85）。比較のため、細胞には、GAPDHに対するsiRNA、および／またはsiRNA #1と同じ化学的組成を持つがアポトーシス特異的eIF-5Aを認識しない対照siRNA（siRNA #5）もトランスフェクトした。アポトーシス特異的eIF-5Aに対するどのsiRNAも、両方のLC細胞系でアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抑制することができた（図85）。GAPDHに対するsiRNAをもう1つの対照として使用した。なぜならこのsiRNAは、単にsiRNA #1の逆配列を持つだけで細胞標的がない対照siRNA #5とは異なり、標的タンパク質であるGAPDHの発現を抑制できる活性なsiRNAだからである（データは示さず）。アポトーシス特異的eIF-5Aに対する4つのsiRNAはどれも、トランスフェクトされたLC細胞（#506）を、TNF-αとカンプトテシンを用いた24時間にわたる処理によって誘導されるアポトーシスから保護することもできた（図86）。細胞死を検出するためにヘキスト染色を利用すると、siRNA（siRNA #1〜 #4）は、LC細胞のアポトーシスを、59％（siRNA #1）、35％（siRNA #2）、50％（siRNA #3）、69％（siRNA #4）減らせることがわかった。興味深いことに、GAPDHに対するsiRNAも、LC細胞のアポトーシスを42％減らせた（図86）。GAPDHは、解糖酵素としての役割以外の細胞機能として、例えば脳ニューロンがアポトーシスしている間に提案されている機能を有する（IshitaniとChuang、1996年；Ishitani他、1996年a；Ishitani他、1996年b）。同様の実験において、われわれも、siRNA #1が、TNF-αとカンプトテシンに応答してLC細胞系#517のアポトーシスを53％減らせることを示した（図87）。これは、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAが、さまざまな視神経頭部から単離したLC細胞を保護していることを示している。これらの結果は、アポトーシス特異的eIF-5Aがアポトーシスの間に確かに機能を持っており、LC細胞においてTNF-αによって誘導されてアポトーシスに至る経路で重要な媒介役を果たしている可能性があることを示している。
【０２１２】
TNF-αとカンプトテシンに曝露したLC細胞が古典的なアポトーシスで死んでいることを確認するため、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼdUTP-ジゴキシゲニン・ニック末端標識（TUNEL）法を利用し、DNAの断片化をその場で評価した。アポトーシス特異的eIF-5A siRNA（siRNA #1）または対照siRNA（siRNA #5）をトランスフェクトした3時間後に、LC細胞（#506）をTNF-αとカンプトテシンを用いて24時間にわたって処理した。細胞はヘキストでも染色し、核が見やすくなるようにした。対照siRNAをトランスフェクトしたLC細胞の46％がTUNEL染色に対してポジティブであったのに対し、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1をトランスフェクトしたLC細胞のほうはわずかに8％がポジティブであった（図88）。これは、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAによるアポトーシスからの保護が80％を超えることを示している。同様の結果がアポトーシス特異的eIF-5A siRNA #4で得られ、アポトーシスからの保護が対照siRNAと比べて60％以上増加した（データは示さず）。
【０２１３】
実施例１８
血液の採取とPBMCの調製
約10mlの血液を健康なそれぞれのドナーから採取した。その血液は静脈穿刺によって採取し、抗凝血剤としてクエン酸ナトリウムを含む真空容器に入れた。サンプルは、回収から24時間以内に処理した。
【０２１４】
60％SIP（パーコールが9部v/vと1.5MのNaClが1部v/v）を15mlの円錐形チューブの底部にクッションとして入れた。次に血液をその上に層にして入れ、血液とパーコールができるだけ混合しないようにした。サンプルを1000×gで合計30分間にわたって遠心分離した。最初の5分間はゆっくりと加速し、最後の5分間はゆっくりと減速した。得られた勾配の最上部に位置する純粋な血清を取り出し、PBMCの白いクッション（1〜2ml）を回収し、温かいRPMI+15％FBSを10ml入れた試験管に一滴ずつ添加した。PBMCをペレット化してカウントした。
【０２１５】
PBMC中でサイトカインの産生を誘導するための刺激を与える時間スケジュール
PBMCを単離し、ウエル1つにつき細胞が2×105〜5×105個となるように植えた。細胞をホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA；ウエル1つにつき100ng）で処理した。72時間経過した時点で培地を交換した。その培地は、刺激因子をまったく含んでいなかった。今度は96時間後、PBMCにPMAを添加した後、リポ多糖（LPS；ウエル1つにつき100ng；大腸菌の血清型0111からのもの）をウエルに添加した。サンプルの回収は、図91に示してあるように、LPSを添加する前（96時間）と、添加後のさまざまな時点で行なった。接着細胞（単球とマクロファージらしい）と浮遊細胞（リンパ球らしい）の両方を回収した。サンプルを回収してサイトカインの分泌を分析するため、各ウエルからの培地を清潔なマイクロ遠心管に移し、13,000×gで3分間にわたって遠心分離することにより、あらゆるゴミを除去した。得られたペレットを接着細胞とともに回収した。培地を-20℃で保管し、分析する前に200〜250μlのアリコートに分けた。細胞を37℃のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）1mlで洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液（50mMのトリス（pH7.2）、2％SDS；ウエル1つにつき100μl）の中で溶解させた。細胞ライセートを煮沸し、凍結させて-20℃で保管した。ウエスタン・ブロットを図92に、対応するELISAの結果を図93に示してある。
【０２１６】
PBMCを刺激することによるアポトーシス特異的eIF-5Aの発現誘導
PBMCを単離し、ウエル1つにつき細胞が2×105〜5×105個となるように植えた。どの刺激因子がアポトーシス特異的eIF-5Aを誘導するかを明らかにするためと、刺激因子同士が相乗作用するかどうかを知るため、PBMCをフィトヘマグルチニン（PHA；100ng/ml）、ホルボール 12-ミリステート13-アセテート（PMA；ウエル1つにつき100ng）、リポ多糖（LPS；100ng/ml）のいずれか、またはこれら3つのすべて（それぞれ100ng/ml）で刺激した。刺激してから12時間後と36時間後にサンプルを回収し、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を分析した（図94）。
【０２１７】
PBMCへのトランスフェクション
PBMCを調製した日にPBMCにトランスフェクションを行なった。ウエル1つにつき細胞が2×105〜5×105個となるように植えた（24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき150μl）。細胞は、各ウエルに個別にトランスフェクトする（ドナー77、78、79；図95と図96）か、すべてを一度に円錐形チューブに入れてから植えた（ドナー80、84；図96）。トランスフェクトされる細胞を含む各ウエル用に、15ピコモルのsiRNAを50μlのオプティ-メム（シグマ社）で希釈した。1μlのリポフェクタミン2000（インヴィトロジェン社）を49μlのオプティ-メム（シグマ社）で希釈し、7〜10分間にわたってインキュベートし、希釈したsiRNAに添加し、25分間にわたってインキュベートした。トランスフェクション培地を細胞の上に載せ、その細胞を37℃にした増殖チェンバーの中で4時間にわたってインキュベートした。最終的なトランスフェクション培地は、血清を9％含んでいた。インキュベーションの後、250μlの無血清RPMI+21％FBSを細胞に添加して最終血清濃度を15％にした。
【０２１８】
トランスフェクション後のPBMCにおいてサイトカインの産生を誘導するための刺激
上に大まかに説明したようにしてPBMCにトランスフェクションを行なってから72時間後、リポ多糖（LPS；ウエル1つにつき100ng；大腸菌の血清型0111からのもの）を、培地500μlの中に入れた細胞に添加した。刺激後24時間の時点でサンプルを回収した。LPSで処理したウエルと、トランスフェクションだけを行なったウエル（すなわち刺激なし）の両方を回収した。サンプルを回収してサイトカインの分泌を分析するため、各ウエルからの培地を清潔なマイクロ遠心管に移し、13,000×gで3分間にわたって遠心分離することにより、あらゆるゴミを除去した。得られたペレットを接着細胞とともに回収した。培地を-20℃で保管し、分析する前に200〜250μlのアリコートに分けた。細胞を37℃のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）1mlで洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液（50mMのトリス（pH7.2）、2％SDS；ウエル1つにつき100μl）の中で溶解させた。細胞ライセートを煮沸し、BCAでタンパク質の定量を行なうために凍結させて-20℃で保管した。
【０２１９】
実施例１９
細胞の培養
HT-29細胞（ヒト直腸大腸腺がん細胞系）を、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むRPMIの中に維持した。U937（組織球リンパ腫細胞系）を、10％FBSを含むRPMIの中に懸濁させて増殖させた。両方の細胞系を、CO2が5％の湿潤な環境の中で37℃に維持した。U937細胞を用いた実験を行なうため、細胞をカウントし、実験を開始する2日前に細胞を1mlにつき3×105個に調節した。実験の1日目、400×gで10分間にわたって遠心分離することによって細胞を回収し、得られた細胞ペレットを、10％FBSを含む新鮮なRPMI培地の中に再び懸濁させ、遠心分離をもう一度行ない、再びペレット化した細胞を、FBSを含まない新鮮なRPMI培地の中に再び懸濁させた。細胞をカウントし、1mlにつき2×106個に調節した。
【０２２０】
siRNA
ヒトのアポトーシス特異的eIF-5A配列に基づいてsiRNA配列を設計し、そのsiRNA配列をダルマコンRNA法によって合成した。アポトーシス特異的eIF-5A siRNA（h5A1）標的配列は、5'NNGCUGGACUCCUCCUACACA3'であった。対応する二本鎖siRNA配列は、
5'GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT3'
3'dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU5'であった。
対照siRNA（h対照）配列は、5'NNACACAUCCUCCUCAGGUCG3'であった。対応する二本鎖siRNA配列は、
5'ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT3'
3'dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC5'であった。
【０２２１】
HT-29細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションの前日、HT-29細胞を、24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき105,000個となるように植えた。トランスフェクトされる細胞を含む各ウエル用に、25.5ピコモルのsiRNAを50μlのオプティ-メム（シグマ社）で希釈した。1μlのリポフェクタミン2000（インヴィトロジェン社）を49μlのオプティ-メム（シグマ社）で希釈し、7〜10分間にわたってインキュベートし、希釈したsiRNAに添加し、25分間にわたってインキュベートした。トランスフェクトされる細胞を無血清RPMIで1回洗浄した後、300μlの無血清RPMIを添加し、その上に100μlのトランスフェクション培地を載せた。細胞を増殖チェンバーの中に戻して4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、300μlの無血清RPMI+30％FBSを細胞に添加した。
【０２２２】
U937細胞の電気穿孔
アポトーシス特異的eIF-5Aと対照siRNAをオプティ-メム培地（シグマ社）で希釈した。0.4mmの電気穿孔用キュベットの中で400μlの細胞（800,000個の細胞）と100ピコモルのsiRNAを混合した。ECM 830エレクトロスクエア穿孔装置（BTX社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）を用い、300V、10ミリ秒、1パルスで細胞に電気穿孔した。電気穿孔の後、細胞を穏やかに混合し、RPMIと濃縮FBSを含むウエルに添加し、FBSの最終濃度を10％にした。
【０２２３】
HT-29細胞の処理
スズキら（2003年）によって開発された方法に従い、HT-29細胞の中でTNF-αの産生を誘導した。トランスフェクションの48時間後、HT-29細胞を200単位/mlのインターフェロンγ（ロッシュ・ディアグノスティックス社）で刺激した。インターフェロンγ（IFN-γ）で刺激してから16時間後、細胞を培地で洗浄し、リポ多糖（LPS；100ng/ml；大腸菌の血清型0111からのもの）を100μg/mlの割合で添加した。LPSで刺激してから8時間後または24時間後、各ウエルからの培地をマイクロ遠心管に移し、ELISAでTNF-αを調べるために-20℃で保管した。細胞を、37℃に加熱した1mlのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液（50mMのトリス（pH7）、2％SDS）の中で溶解させた。細胞ライセートを沸騰させ、-20℃で凍結させて保管した。ウシ血清アルブミンを基準として用いたビシンコニン酸アッセイ（BCA）により、細胞ライセート中のタンパク質濃度を調べた。
【０２２４】
IFN-γを用いて処理することにより、HT-29細胞におけるIL-8の産生を誘導した。トランスフェクション後、HT-29細胞を200単位/mlのIFN-γで48時間にわたって処理した。処理した24時間後、各ウエルからの培地をマイクロ遠心管に移し、液相電気化学発光（ECL）法によってIL-8を調べるときまで-20℃で保管した。細胞を、37℃に加熱した1mlのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液（50mMのトリス（pH7）、2％SDS）の中で溶解させた。細胞ライセートを沸騰させ、-20℃で凍結させて保管した。ウシ血清アルブミンを基準として用いたビシンコニン酸アッセイ（BCA）により、細胞ライセート中のタンパク質濃度を調べた。
【０２２５】
U937細胞での分化誘導
U937細胞を回収し、電気穿孔の16時間後にカウントした。24ウエルのプレートの各ウエルに、培地1mlにつき細胞を200,000個添加した。ホルボール 12-ミリステート13-アセテート（PMA；100ng/ml）を添加することによってマクロファージの分化を促進した。PMAを添加してから48時間後、80％を超える単球が、懸濁した細胞（単球）から接着細胞（マクロファージ）へと変化していた。48時間の時点で培地と非接着細胞を取り出し、10％FBSを含む新鮮なRPMI培地（ウエル1つにつき1ml）を添加した。細胞を新鮮な培地の中に24時間放置すると不活性になった。
【０２２６】
U937細胞でサイトカインの産生を誘導するための刺激
U937細胞にPMAを添加してから72時間後、リポ多糖（LPS；100ng/ml；大腸菌の血清型0111からのもの）、またはインターフェロンγ（IFN-γ；100単位/ml）、またはLPSとIFN-γの組み合わせをウエルに添加した。サンプルの回収は、図108に示してあるように、刺激因子を添加する前（72時間）と、添加後のさまざまな時点で行なった。サンプルを回収してサイトカインの分泌を分析するため、各ウエルからの培地を清潔なマイクロ遠心管に移し、13,000×gで3分間にわたって遠心分離することにより、あらゆるゴミを除去した。培地を-20℃で保管し、分析する前に200〜250μlのアリコートに分けた。細胞を37℃のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）1mlで洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液（50mMのトリス（pH7.2）、2％SDS；ウエル1つにつき75μl）の中で溶解させた。同様のウエルをプールした。細胞ライセートを煮沸し、凍結させて-20℃で保管した。
【０２２７】
サイトカインの定量
すべての培地サンプルを-20℃で保管した。アッセイ・デザインズ社のELISAキットを製造会社の指示に従って用い、TNFαを定量した。そのとき、基準として1mlにつき0〜250pgのTNF-αを供給した。U937で実験を行なうため、TNFαのための培地サンプルをRPMI+10％FBSを用いて20倍（0時間、3時間LPS）または80倍（6時間、24時間、30時間LPS）に希釈した。液相電気化学発光（ECL）法によってIL-1β、IL-8、IL-6を定量した。HT-29での実験からの培地は希釈しなかった。サイトカイン測定の結果はすべて、ウエル1つ当たりの全細胞タンパク質の量で補正した。
【０２２８】
IL-8、IL-1β、IL-6を液相で調べた。簡単に説明すると、精製したモノクローナル・マウス抗ヒトIL-8、IL-6、IL-1β抗体（R&Dシステムズ社）にビオチン（アイジェン社、ゲーザーズバーグ、メリーランド州）を標識した。さらに、ヤギ抗ヒトIL-8、IL-6、IL-1β抗体（R&Dシステムズ社）にルテニウム（アイジェン社）を製造会社の指示に従って標識した。このビオチニル化した抗体を希釈し、0.25％のBSAと、0.5％のツイーン20と、0.01％のアジ化物とを含むPBS（pH7.4）（ECL緩衝液）中での最終濃度を1mg/mlにした。アッセイ用チューブ1つにつき、ビオチニル化した抗体25mlを、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズ（ダイナル社、レイク・サクセス、ニューヨーク州）が1mg/mlの割合で含まれた溶液25mlとともに、激しく振盪させながら室温にて30分間にわたってあらかじめインキュベートした。あらかじめRPMIまたは基準で希釈しておいたテスト・サンプル（25ml）をチューブに添加した後、25mlのルテニル化した抗体（ECL緩衝液で希釈して最終濃度が1mg/mlになっているもの）を添加した。次にチューブをさらに2時間にわたって振盪した。チューブ1本につき200mlのPBSを添加することによって反応を停止させ、オーリジェン分析器（アイジェン社）を用いて化学発光の量を測定した。
【０２２９】
SDS-PAGEとウエスタン・ブロッティング
ウシ血清アルブミンを基準として使用し、ビシンコニン酸アッセイ（BCA）によって細胞ライセート中のタンパク質の濃度を測定した。10％または14％SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）により、全細胞タンパク質5μgを分離した。50kDaを超えるタンパク質（TLR4、IFN-γ、TNF-R1、iNOS）の分析には10％ゲルを用いたのに対し、アポトーシス特異的eIF-5A（17kDa）の分析には14％ゲルを用いた。半乾燥トランスファー・ユニット（バイオ-ラド社）を利用し、トランスファー用緩衝液（48mMのトリス、39mMのグリシン、1.3mMのSDS、pH9.2；15Vで18分間）を用いてゲルをポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に移した。5％のスキムミルクを含むPBS-t（0.1％のツイーン20を含むPBS）を用いて膜を1時間にわたってブロックした。一次抗体をこのブロック溶液で希釈し、揺すりながらすべてのブロットを室温でインキュベートした。使用した一次抗体は、アポトーシス特異的eIF-5A（BDバイオサイエンシーズ社；1：20,000；1時間インキュベート；アポトーシス特異的eIF-5AとeIF-5A2の両方を認識）、TLR4（サンタ・クルス・バイオテクノロジー社；TLR4（H-80）：sc-10741；1：1000；2時間インキュベート）、IFN-γRα（サンタ・クルス・バイオテクノロジー社；IFN-γRα（C-20）：sc-700；1：1000；1時間インキュベート）、TNF-R1（サンタ・クルス・バイオテクノロジー社；TNF-R1（H-5）：sc-8436；1：200；3時間インキュベート）、iNOS（BDトランスダクション・ラボラトリーズ社：610431；1：10,000；1時間インキュベート）、β-アクチン（オンコジーン社；アクチン（Ab-1）；1：20,000；1時間インキュベート）であった。一次抗体とともにインキュベートした後、ブロットをPBS-tで5〜10分間ずつ3回洗浄した。セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（HRP）と共役した二次抗体を1％スキムミルクで希釈し、膜とともに1時間にわたってインキュベートした。使用した二次抗体は、抗マウスIgG-HRP（シグマ社；1：5000；アポトーシス特異的eIF-5AとTNF-R1用）、抗ウサギIgG-HRP（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社；1：2500；TLR4とIFN-γRα用）、抗マウスIgM-HRP（カルバイオケム社；1：5000；アクチン用）であった。二次抗体とともにインキュベートした後、ブロットをPBS-tで5〜10分間ずつ4回洗浄した。増強化学発光検出試薬（ECL；アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）を製造会社の指示に従って用いてブロットを現像し、バンドをX線フィルム（富士フィルム社）上で可視化した。
【０２３０】
RT-PCR
トランスフェクトされたHT-29細胞がIFN-γに応答してTLR4のmRNAの発現を変化させるのを観察するため、Medvedevら（2002年）に従ってRT-PCRを実行した。どのサンプルでも同量のcDNAが使用されていることを確認するため、GAPDHの発現を対照として利用した。PCRサイクルの数を増やしながら（20、25、30、35サイクル）、非飽和条件下で増幅産物が検出可能になる最適なサイクル数を決定した。PCR産物は、臭化エチジウムの組み込みによって検出し、アガロース・ゲル電気泳動によって分離した。siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞をIFN-γで6時間にわたって処理した後に、またはIFN-γで処理せずに単離した全mRNAのRT-PCRを利用し、TLR4転写産物とGAPDH転写産物を検出した。HT-29細胞には、すでに説明したようにしてsiRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を1ml当たり200単位のIFN-γで処理した。IFN-γで処理しなかった対照細胞は、培地を交換しただけであった。GenElute哺乳動物RNAミニプレップ・キット（シグマ社）を製造会社のプロトコルに従って使用し、接着細胞に関して全mRNAを単離した。培地を取り出し、細胞を温かいPBSで2回洗浄した。溶解用緩衝液を細胞に添加し、ライセートをマイクロ遠心管に移し、全RNAを製造会社のプロトコルに従って単離した。
【０２３１】
TLR4（NM_003266）のためのプライマーは以下のものであった：
順プライマー5'CGGATGGCAACATTTAGAATTAGT3'
逆プライマー5'TGATTGAGACTGTAATCAAGAACC3'
予想される断片のサイズ：674bp。
【０２３２】
GAPDH（BC023632）のためのプライマーは以下のものであった：
順プライマー5'CTGATGCCCCCATGTTCGTCAT3'
逆プライマー5'CCACCACCCTGTTGCTGTAG3'
予想される断片のサイズ：599bp。
【０２３３】
以下の条件で全RNAを逆転写した：
混合物：
RNA  2.5μg
ポリ(T)プライマー  6.25μl
Depc水  13.75μlになるまで
5分間にわたって70℃に加熱
5分間にわたって氷の上で冷却
添加物：
5×AMV緩衝液  5.0μl
dNTP（10mM）  2.5μl
RNアーゼ阻害剤  1.25μl
AMV RT  2.5μl
60分間にわたって42℃に加熱
10分間にわたって70℃に加熱。
【０２３４】
以下の条件でPCR反応を1回だけ実施した：
10×Tsg緩衝液  2.0μl
dNTP（10mM）  0.4μl
順プライマー（25ピコモル/μl）  0.4μl
逆プライマー（25ピコモル/μl）  0.4μl
MgCl2（15mM）  2.0μl
CDNA  0.8μl
H2O  13.88μl
Tsgポリメラーゼ  0.12μl。
【０２３５】
TLR4のPCR条件は以下の通りであった：
5分間にわたって95℃に加熱
95℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間を20サイクル、または25サイクル、または30サイクル、または35サイクル
72℃で10分間伸長
4℃に下げる。
【０２３６】
GAPDHのPCR条件は以下の通りであった：
5分間にわたって95℃に加熱
95℃で1分間、57℃で1分間、72℃で2分間を20サイクル、または25サイクル、または30サイクル、または35サイクル
72℃で10分間伸長
4℃に下げる。
【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】図1は、ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの3'末端のヌクレオチド配列（配列番号11）と、その配列をもとにしたアミノ酸配列（配列番号12）である。
【図２】図2は、ラットのアポトーシス特異的eIF-5AのcDNAの5'末端のヌクレオチド配列（配列番号15）と、その配列をもとにしたアミノ酸配列（配列番号16）である。
【図３】図3は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5Aの完全長cDNAのヌクレオチド配列（配列番号1）である。アミノ酸配列は配列番号2に示してある。
【図４】図4は、ラットのアポトーシス特異的DHSのcDNAの3'末端のヌクレオチド配列（配列番号6）と、その配列をもとにしたアミノ酸配列（配列番号7）である。
【図５】図5は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5AのcDNAの完全長ヌクレオチド配列（配列番号20）とヒトeIF-5Aのヌクレオチド配列（配列番号3）（登録番号BC000751またはNM_001970、配列番号3）のアラインメントである。
【図６】図6は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5AのcDNAの完全長ヌクレオチド配列（配列番号20）とヒトeIF-5Aのヌクレオチド配列（配列番号4）（登録番号NM_020390、配列番号4）のアラインメントである。
【図７】図7は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5AのcDNAの完全長ヌクレオチド配列（配列番号20）とマウスeIF-5Aのヌクレオチド配列（登録番号BC003889）のアラインメントである。マウスのヌクレオチド配列（BC003889）は配列番号5である。
【図８】図8は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5Aの導出された完全長アミノ酸配列（配列番号2）と、ヒトeIF-5Aの導出されたアミノ酸配列（配列番号21）（登録番号BC000751またはNM_001970）のアラインメントである。
【図９】図9は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5Aの導出された完全長アミノ酸配列（配列番号2）と、ヒトeIF-5Aの導出されたアミノ酸配列（配列番号22）（登録番NM_020390）のアラインメントである。
【図１０】図10は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5Aの導出された完全長アミノ酸配列（配列番号2）と、マウスeIF-5Aの導出されたアミノ酸配列（配列番号23）（登録番BC003899）のアラインメントである。
【図１１】図11は、ラットの黄体アポトーシス特異的DHSのcDNAの部分長ヌクレオチド配列（配列番号6の残基1〜453）と、ヒトDHSのヌクレオチド配列（配列番号8）（登録番BC000333、配列番号8）のアラインメントである。
【図１２】図12は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5AのcDNAの制限マップである。
【図１３】図13は、ラットのアポトーシス特異的DHSの部分長cDNAの制限マップである。
【図１４】図14は、ラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5AのcDNAの3'末端を32P-dCTPで標識したものをプローブとして調べた全RNAのノーザン・ブロット（上）と臭化エチジウムで染色したゲル（下）である。
【図１５】図15は、ラットの黄体アポトーシス特異的DHSのcDNAの3'末端を32P-dCTPで標識したものをプローブとして調べた全RNAのノーザン・ブロット（上）と臭化エチジウムで染色したゲル（下）である。
【図１６】図16は、PGF-2αを注入した後のラット過排卵黄体でアポトーシスの程度を調べたDNAラダーリング実験の図である。
【図１７】図17は、アポトーシスのあるラットの黄体からゲノムDNAを単離したときのアガロース・ゲルであり、ラットをPGF-2αで処理した後のDNAラダーリングを示している。
【図１８】図18は、ラットの過排卵黄体が分散した細胞におけるアポトーシスの程度を、スペルミジンで処理した後にPGF-2αに曝露したラットで調べたDNAラダーリング実験の図である。
【図１９】図19は、ラットの過排卵黄体におけるアポトーシスの程度を、スペルミジンおよび／またはPGF-2αで処理したラットで調べたDNAラダーリング実験の図である。
【図２０】図20は、32P-dCTPで標識したラットの黄体アポトーシス特異的eIF-5Aの部分長cDNAをプローブとして用いて調べたラットのゲノムDNAのサザン・ブロットである。
【図２１】図21は、哺乳動物エピトープ・タグ発現ベクターpHM6（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社）である。
【図２２】図22は、血清を取り出すことによってアポトーシスを誘導した後にCOS-7細胞から単離した全RNAを、ラットの黄体アポトーシス特異的DHSのcDNAの3'非翻訳末端を32P-dCTPで標識したものをプローブにして調べたノーザン・ブロット（上）と臭化エチジウムで染色したゲル（下）である。
【図２３】図23は、COS-7細胞に一過性トランスフェクションを行なう手続きを示すフロー・チャートである。
【図２４】図24は、pHM6をトランスフェクトした後のCOS-7細胞における外来タンパク質の一過性発現のウエスタン・ブロットである。
【図２５】図25は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときのカスパーゼ活性の増大に反映されることを示している。
【図２６】図26は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときのDNA断片化の増大に反映されることを示している。
【図２７】図27は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときの核の断片化の増大によってアポトーシスが検出されることを示している。
【図２８】図28は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときの核の断片化増大に反映されることを示している。
【図２９】図29は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときのホスファチジルセリンの露出によってアポトーシスが検出されることを示している。
【図３０】図30は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときのホスファチジルセリンの露出増大に反映されることを示している。
【図３１】図31は、アポトーシスの増大が、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときの核の断片化増大に反映されることを示している。
【図３２】図32は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときにアポトーシスが増大することを示している。
【図３３】図33は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性のトランスフェクションをCOS-7細胞に対して行なったときにBcl-2がダウンレギュレーションされることを示している。上の写真は、クマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットであり；下の写真は、対応するウエスタン・ブロットである。
【図３４】図34は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをアンチセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションを行なったCOS-7細胞を、Bcl-2をプローブとして調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロットである。
【図３５】図35は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションを行なったCOS-7細胞を、c-Mycをプローブとして調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロットである。
【図３６】図36は、ラットの完全長アポトーシス特異的eIF-5Aをセンス方向で含むpHM6の一過性トランスフェクションを行なったCOS-7細胞を、p53をプローブとして調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロットである。
【図３７Ａ】図37Aは、COS-7細胞におけるpHM6完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抗[HA]ペルオキシダーゼ・プローブを用いて調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロット。COS-7細胞におけるpHM6完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5Aの発現をp53プローブを用いて調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロット。
【図３７Ｂ】図37Bは、COS-7細胞におけるpHM6完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抗[HA]ペルオキシダーゼ・プローブを用いて調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロット。COS-7細胞におけるpHM6完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5Aの発現をp53プローブを用いて調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロット。
【図３７Ｃ】図37Cは、COS-7細胞におけるpHM6完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抗[HA]ペルオキシダーゼ・プローブを用いて調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロット。COS-7細胞におけるpHM6完全長ラット・アポトーシス特異的eIF-5Aの発現をp53プローブを用いて調べたときのクマシー-ブルーで染色したタンパク質のブロットと、対応するウエスタン・ブロット。
【図３８】図38は、RKO細胞から単離したヒトeIF-5A2（配列番号24）とヒトeIF-5A2（配列番号22）（GenBank受託番号XM_113401）のアラインメントである。コンセンサス配列を配列番号28に示してある。
【図３９】図39は、一過性トランスフェクションの後にRKO細胞とRKO-E6細胞で起こったアポトーシスの割合を示すグラフである。RKO細胞とRKO-E6細胞に、pHM6-LacZまたはpHM6-アポトーシス特異的eIF-5Aの一過性トランスフェクションを行なった。pHM6-アポトーシス特異的eIF-5AをトランスフェクトしてからアクチノマイシンDで処理したRKO細胞は、pHM6-LacZをトランスフェクトしたがアクチノマイシンDでは処理しなかった細胞と比べ、アポトーシスが240％増加した。pHM6-アポトーシス特異的eIF-5AをトランスフェクトしてからアクチノマイシンDで処理したRKO-E6細胞は、pHM6-LacZをトランスフェクトしたがアクチノマイシンDでは処理しなかった細胞と比べ、アポトーシスが105％増加した。
【図４０】図40は、一過性トランスフェクションの後にRKO細胞で起こったアポトーシスの割合を示すグラフである。RKO細胞に、pHM6-LacZ、pHM6-アポトーシス特異的eIF-5A、pHM6-eIF-5A2、pHM6の先端が切れたアポトーシス特異的eIF-5Aのいずれかをトランスフェクトした。pHM6-アポトーシス特異的eIF-5AをトランスフェクトしたRKO細胞は、pHM6-LacZをトランスフェクトした対照細胞と比べ、アポトーシスが25％増加した。この増加は、pHM6-eIF-5A2またはpHM6の先端が切れたアポトーシス特異的eIF-5Aをトランスフェクトした細胞では明らかでなかった。
【図４１】図41は、一過性トランスフェクションの後にRKO細胞で起こったアポトーシスの割合を示すグラフである。RKO細胞には、トランスフェクトしないか、pHM6-LacZまたはpHM6-アポトーシス特異的eIF-5Aの一過性トランスフェクションを行なった。トランスフェクション効率に関する補正を行なうと、pHM6-アポトーシス特異的eIF-5Aをトランスフェクトした細胞の60％がアポトーシスを起こしていた。
【図４２Ａ】図42Aは、一過性トランスフェクション後のRKO細胞のアポトーシスをフロー・サイトメトリーで分析した結果である。RKO細胞には、トランスフェクトしないか、pHM6-LacZ、pHM6-アポトーシス特異的eIF-5A、pHM6-eIF-5A2、pHM6の先端が切れたアポトーシス特異的eIF-5Aのいずれかの一過性トランスフェクションを行なった。表には、アポトーシスを起こした細胞の割合を示してある。この割合は、各ゲートのピークよりも下の部分の面積に基づいて計算した。バックグラウンドであるトランスフェクトしていない細胞でのアポトーシスに関する補正を行なうと、pHM6-アポトーシス特異的eIF-5Aをトランスフェクトした細胞の80％がアポトーシスを起こしていた。pHM6-LacZ、pHM6-eIF-5A2、pHM6の先端が切れたアポトーシス特異的eIF-5Aのいずれかをトランスフェクトされた細胞は、バックグラウンド・レベルのアポトーシスしか示さなかった。
【図４２Ｂ】図42Bは、一過性トランスフェクション後のRKO細胞のアポトーシスをフロー・サイトメトリーで分析した結果である。RKO細胞には、トランスフェクトしないか、pHM6-LacZ、pHM6-アポトーシス特異的eIF-5A、pHM6-eIF-5A2、pHM6の先端が切れたアポトーシス特異的eIF-5Aのいずれかの一過性トランスフェクションを行なった。表には、アポトーシスを起こした細胞の割合を示してある。この割合は、各ゲートのピークよりも下の部分の面積に基づいて計算した。バックグラウンドであるトランスフェクトしていない細胞でのアポトーシスに関する補正を行なうと、pHM6-アポトーシス特異的eIF-5Aをトランスフェクトした細胞の80％がアポトーシスを起こしていた。pHM6-LacZ、pHM6-eIF-5A2、pHM6の先端が切れたアポトーシス特異的eIF-5Aのいずれかをトランスフェクトされた細胞は、バックグラウンド・レベルのアポトーシスしか示さなかった。
【図４３】図43は、0.25μg/mlのアクチノマイシンDで0時間、3時間、7時間、24時間、48時間にわたって処理したRKO細胞から抽出したタンパク質のウエスタン・ブロットである。上の図は、一次抗体として抗p53を用いたウエスタン・ブロットである。中央の図は、一次抗体として抗アポトーシス特異的eIF-5Aを用いたウエスタン・ブロットである。下の図は、抗アポトーシス特異的eIF-5Aブロットに使用した膜をクマシー・ブルーで染色した後、化学発光を検出することにより同じ量がローディングされたことを確認した図である。p53とアポトーシス特異的eIF-5Aは、両方ともアクチノマイシンで処理することによって上方調節される。
【図４４】図44は、心臓組織においてアポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの両方が発現していることを示す棒グラフである。心臓組織は、冠状動脈バイパス移植（“CABG”）を受けた患者から採取した。pHM6-アポトーシス特異的eIF-5Aの遺伝子発現レベル（薄い灰色の棒）を増殖eIF-5A（濃い灰色の棒）と比較する。X軸は患者の識別番号である。Y軸は、1ngの18sに対するpg数である（メッセンジャーRNAのピコグラム数／リボソームRNA 18Sのナノグラム数）。
【図４５】図45は、心臓組織においてアポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの両方が発現していることを示す棒グラフである。心臓組織は、弁を交換した患者から採取した。アポトーシス特異的eIF-5Aの遺伝子発現レベル（薄い灰色の棒）を増殖eIF-5A（濃い灰色の棒）と比較する。X軸は患者の識別番号である。Y軸は、1ngの18sに対するpg数である（メッセンジャーRNAのピコグラム数／リボソームRNA 18Sのナノグラム数）。
【図４６】図46は、虚血前の心臓組織と虚血後の心臓組織におけるアポトーシス特異的eIF-5A（eIF5a）と増殖eIF-5A（eIF5b）の遺伝子発現レベルをリアルタイムPCRで測定した結果を示す棒グラフである。Y軸は、1ngの18sに対するpg数である（メッセンジャーRNAのピコグラム数／リボソームRNA 18Sのナノグラム数）。
【図４７】図47は、心臓組織で実施した実験の概略図である。心臓組織を通常の酸素レベルに曝露し、アポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの発現レベルを測定した。その後、心臓組織に供給する酸素の量を減らすことによって低酸素血症や虚血を誘導し、最終的に心臓組織に心筋梗塞を起こさせた。アポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの発現レベルを測定し、虚血による損傷を受ける前の心臓組織の発現レベルと比較した。
【図４８】図48は、虚血を誘導する前後の心臓組織の心電図（EKG）である。
【図４９】図49は、図47に示した実験装置を備える実験室の様子である。
【図５０Ａ】図50Aは、アポトーシス特異的eIF-5AのレベルがIL-1βおよびIL-18のレベルと相関していることを示す患者のデータを記載した表である。図50Aは、冠状動脈バイパス移植（CABG）を受けた患者から採取したデータである。
【図５０Ｂ】図50Bは、アポトーシス特異的eIF-5AのレベルがIL-1βおよびIL-18のレベルと相関していることを示す患者のデータを記載した表である。図50Bは、弁を置換した患者から採取したデータを記載した表である。
【図５０Ｃ】図50Cは、CABGを受けた患者においてアポトーシス特異的eIF-5AがIL-18と相関していることを示すグラフである。
【図５０Ｄ】図50Dは、CABGを受けた患者において増殖eIF-5AがIL-18と相関していることを示すグラフである。
【図５０Ｅ】図50Eは、弁を置換した患者においてアポトーシス特異的eIF-5AがIL-18と相関していることを示すグラフである。
【図５０Ｆ】図50Fは、弁を置換した患者において増殖eIF-5AがIL-18と相関していることを示すグラフである。
【図５１】図51は、患者のデータを記載した表であり、図50B〜図50Eで利用した患者のデータはこの表から得た。
【図５１Ａ】図51Aは、患者のデータを記載した表である。
【図５１Ｂ】図51Bは、患者のデータを記載した表である。
【図５１Ｃ】図51Cは、患者のデータを記載した表である。
【図５１Ｄ】図51Dは、患者のデータを記載した表である。
【図５２】図52は、（アポトーシス特異的eIF-5Aの）アンチセンス・オリゴヌクレオチド1、2、3（それぞれ配列番号35、36、37）で処理した後にRKO細胞が産生するタンパク質のレベルを示している。RKO細胞では、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした後にアポトーシス特異的eIF-5Aとp53の産生が低下した。
【図５３】図53は、蛍光標識したアンチセンス・オリゴヌクレオチドの取り込み状態を示す。
【図５４】図54は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシスを起こした細胞の割合が、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞と比べて減っていることを示す。
【図５５】図55は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシスを起こした細胞の割合が、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞と比べて減っていることを示す。
【図５６】図56は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシスを起こした細胞の割合が、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞と比べて減っていることを示す。
【図５７】図57は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシスを起こした細胞の割合が、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞と比べて減っていることを示す。
【図５８】図58は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシスを起こした細胞の割合が、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞と比べて減っていることを示す。
【図５９】図59は、篩板細胞をTNF-α+カンプトテシンで処理すると、アポトーシスを起こす細胞の数が増加したことを示している。
【図６０】図60は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシスを起こした細胞の割合が、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞と比べて減っていることを示す。
【図６１】図61は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシスを起こした細胞の割合が、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしなかった細胞と比べて減っていることを示す。
【図６２】図62は、篩板細胞による標識したsiRNAの取り込み状態を、血清が存在している場合と、血清なしの場合について示した写真である。
【図６３】図63は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞では、アポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の産生が減っていることと、Bcl-2タンパク質の産生が増えていることを示している。アポトーシス特異的eIF-5Aの発現低下は、BCL-2の発現増大と相関している。
【図６４】図64は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞では、アポトーシス因子5aタンパク質の産生が低下することを示している。
【図６５】図65は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞では、カンプトテシンとTNA-αに曝露した後にアポトーシスを起こす細胞の割合が、トランスフェクトしなかった細胞と比べて少なかったことを示している。
【図６６】図66は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞では、カンプトテシンとTNA-αに曝露した後にアポトーシスを起こす細胞の割合が、トランスフェクトしなかった細胞と比べて少なかったことを示している。
【図６７】図67は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトした細胞では、カンプトテシンとTNA-αに曝露した後にアポトーシスを起こす細胞の割合が、トランスフェクトしなかった細胞と比べて少なかったことを示している。
【図６８】図68は、図67と実施例13に示した実験で、siRNAをトランスフェクトし、カンプトテシンとTNA-αで処理した後にヘキストで染色した篩板細胞系#506の写真である。アポトーシスを起こした細胞は、より明るく染色された細胞となって見える。その細胞は、クロマチンが凝縮しているために核がより小さく、形状がより小さくて不規則である。
【図６９】図69は、アポトーシス特異的eIF-5AをトランスフェクトしてIL-1に曝露したHepG2細胞では、TNA-αの分泌が、トランスフェクトしなかった細胞と比べて少なかったことを示している。
【図７０】図70は、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aの配列（配列番号29）と、本発明による5つのsiRNAの配列（配列番号30、31、32、33、34）である。
【図７１】図71は、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aの配列（配列番号29）と、本発明による3つのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列（上から順番に配列番号35、37、39）である。
【図７２】図72は、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする3つのアンチセンス・オリゴヌクレオチド（上から順番に配列番号25〜27）の結合位置を示す。完全長ヌクレオチド配列は、配列番号19である。
【図７３Ａ】図73Aは、ヒト・アポトーシス特異的eIF-5Aとヒト増殖eIF-5Aのヌクレオチドのアラインメント（上から順番に配列番号41、42）を示す。
【図７３Ｂ】図73Bは、ヒト・アポトーシス特異的eIF-5Aとヒト増殖eIF-5Aのアミノ酸配列のアラインメント（上から順番に配列番号43、22）である。
【図７４】図74Aは、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAが、そのsiRNAをトランスフェクトされたHT-29細胞でTNA-αの産生を阻止しないまでも低下させたことを示すウエスタン・ブロットである。図74Bは、ELISAの結果である。
【図７５】図75は、ELISAの結果である。アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAで処理した細胞では、TNA-αの産生が対照細胞と比べて減っていた。
【図７６】図76は、U-937分化実験の時間スケジュールである。実施例16を参照のこと。
【図７７】図77は、ウエスタン・ブロットの結果であり、単球が分化した後にTNA-αが分泌されている間はアポトーシス特異的eIF-5Aが上方調節されていることを示している。
【図７８】図78は、幹細胞の分化と、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを用いたサイトカイン産生の阻止を示している。
【図７９】図79は、TNA-αとインターフェロンに応答してIL-8が産生されることを示す棒グラフである。このグラフは、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAが、インターフェロンに応答したIL-8の産生をほとんど完全に阻止したことと、インターフェロンとTNAを組み合わせて処理した結果としてIL-8がかなりの量産生されたことを示している。
【図８０】図80は、TNA-αとインターフェロンに応答してIL-8が産生されることを示す別の棒グラフである。このグラフは、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAが、インターフェロンに応答したIL-8の産生をほとんど完全に阻止したことと、インターフェロンとTNAを組み合わせて処理した結果としてIL-8がかなりの量産生されたことを示している。
【図８１】図81は、IFN-γで8時間と24時間にわたって処理したHT-29細胞のウエスタン・ブロットである。このブロットは、HT-29細胞においてアポトーシス特異的eIF-5AがIFN-γに応答して上方調節されたことを示している（8時間で4倍）。
【図８２】図82は、免疫蛍光による篩板細胞のキャラクテリゼーション。83歳の男性の視神経頭部から単離した篩板細胞（#506）の特徴を免疫蛍光によって明らかにした。一次抗体は、a）アクチン；b）フィブロネクチン；c）ラミニン；d）GFAPであった。どの写真も400倍の倍率で撮影した。
【図８３】図83は、カンプトテシンとTNF-αを用いた処理に応答してアポトーシスを起こした篩板細胞系#506の細胞の割合を示すグラフである。ウエルが8つある培養スライド上で、篩板細胞系#506の細胞をウエル1つにつき40,000個の割合で植えた。3日後、そのLC細胞を、10ng/mlのTNF-αで、または50μMのカンプトテシンで、または10ng/mlのTNF-α+50μMのカンプトテシンで処理した。カンプトテシンの対照ビヒクルである同量のDMSOを、処理していない対照細胞に添加した。処理してから48時間後に細胞をヘキスト33258で染色し、UVフィルタを用いて蛍光顕微鏡で観察した。凝縮した核または断片化した核が明るく染色されている細胞を、アポトーシスを起こした細胞としてカウントした。
【図８４】図84は、カンプトテシンまたはカンプトテシン+TNF-αで処理している間のアポトーシス特異的eIF-5Aの発現レベルである。24ウエルのプレートに、篩板細胞系#506の細胞をウエル1つにつき40,000個の割合で植えた。3日後、そのLC細胞を、50μMのカンプトテシンで、または10ng/mlのTNF-α+50μMのカンプトテシンで処理し、タンパク質ライセートを1時間後、4時間後、8時間後、24時間後に回収した。対照ビヒクルとして同量のDMSOを対照細胞に添加し、細胞ライセートを1時間後と24時間後に回収した。各サンプルからのタンパク質5μgをSDS-PAGEで単離し、PVDF膜に移し、抗アポトーシス特異的eIF-5A抗体を用いてウエスタン・ブロットを行なった。結合した抗体を化学発光によって検出し、X線フィルムに露出した。次に膜を剥がし、内部ローディング対照としての抗β-アクチンを用いて再度ブロッティングを行なった。
【図８５】図85は、siRNAをトランスフェクトした後の篩板細胞系#506と#517の細胞におけるアポトーシス特異的eIF-5Aの発現レベルを示している。24ウエルのプレートに、篩板細胞系#506と#517の細胞をウエル1つにつき10,000個の割合で植えた。3日後、そのLC細胞に対し、GADH siRNA、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1〜#4（配列番号30〜33）、対照siRNA #5（配列番号34）のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、タンパク質ライセートを回収し、各サンプルからのタンパク質5μgをSDS-PAGEで単離し、PVDF膜に移し、抗アポトーシス特異的eIF-5A抗体を用いてウエスタン・ブロットを行なった。結合した抗体を化学発光によって検出し、X線フィルムに露出した。次に膜を剥がし、内部ローディング対照としての抗β-アクチンを用いて再度ブロッティングを行なった。この図は、アポトーシス特異的eIF-5AのsiRNAで処理した細胞では、アポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の産生が減ることを示している。
【図８６】図86は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしてTNF-αとカンプトテシンで処理した篩板細胞系#506の細胞がアポトーシスを起こした割合を示している。ウエルが8つある培養スライド上で、篩板細胞系#506の細胞をウエル1つにつき7500個の割合で植えた。3日後、そのLC細胞に対し、GADH siRNA、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1〜#4（配列番号30〜33）、対照siRNA #5（配列番号34）のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、トランスフェクトされた細胞を10ng/mlのTNF-αと50μMのカンプトテシンで処理した。24時間後、細胞をヘキスト33258で染色し、UVフィルタを用いて蛍光顕微鏡で観察した。凝縮した核または断片化した核が明るく染色されている細胞を、アポトーシスを起こした細胞としてカウントした。このグラフは、独立したn=4回の実験の平均値を表わしている。この図は、カンプトテシンで処理したとき、アポトーシス特異的eIF-5AのsiRNAで処理した細胞では、アポトーシス特異的eIF-5AのsiRNAをトランスフェクトしていない細胞と比べてアポトーシスの割合が減ることを示している。
【図８７】図87は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1をトランスフェクトしてTNF-αとカンプトテシンで処理した篩板細胞系#517の細胞がアポトーシスを起こした割合を示している。ウエルが8つある培養スライド上で、篩板細胞系#517の細胞をウエル1つにつき7500個の割合で植えた。3日後、そのLC細胞に対し、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1（配列番号30）または対照siRNA #5（配列番号34）をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、トランスフェクトされた細胞を10ng/mlのTNF-αと50μMのカンプトテシンで処理した。24時間後、細胞をヘキスト33258で染色し、UVフィルタを用いて蛍光顕微鏡で観察した。凝縮した核または断片化した核が明るく染色されている細胞を、アポトーシスを起こした細胞としてカウントした。ここには2回の独立した実験の結果を示してある。この図は、siRNAで処理した細胞のほうがアポトーシスの割合が少なかったことを示している。
【図８８】図88は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしてTNF-αとカンプトテシンで処理した篩板細胞系#506の細胞にTUNELを標識した結果を示している。ウエルが8つある培養スライド上で、篩板細胞系#506の細胞をウエル1つにつき7500個の割合で植えた。3日後、そのLC細胞に対し、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1（配列番号30）または対照siRNA #5（配列番号34）をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、トランスフェクトされた細胞を10ng/mlのTNF-αと50μMのカンプトテシンで処理した。24時間後、細胞をヘキスト33258で染色し、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼdUTP-ジゴキシゲニン・ニック末端標識（TUNEL）法を利用してDNAの断片化をその場で評価した。写真Aは、アポトーシスを起こした細胞の断片化したDNAのTUNEL標識を可視化するため、フルオレセイン・フィルタを用いて蛍光顕微鏡で観察したスライドである。写真Bは、ヘキストで染色した核を可視化するため、UVフィルタを通して観察した同じスライドである。ここには、2回の独立した実験の結果を示してある。どの写真も400倍の倍率で撮影した。
【図８９】図89は、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAの設計図である。siRNAは、配列番号45、48、51、54、56を有する。完全長ヌクレオチド配列は、配列番号29に示してある。
【図９０】図90は、インターフェロンγとLPSの存在下では、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAによってNKkBの活性が低下するという実験結果である。
【図９１】図91は、PBMC実験の時間スケジュールである（実施例18を参照のこと）。
【図９２】図92は、2人のドナーから採取したPBMCからの細胞ライセートに関するウエスタン・ブロットの経時変化である。PBMCをPMAで処理した後にLPSで刺激すると、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現が増大した。
【図９３】図93は、PBMCをPMAで処理した後にLPSで刺激すると、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現が増大したことを示している。これは、TNFの産生増大と同時に起こる。
【図９４】図94は、PBMCが、PMA分化とは無関係にLPSに応答することを示している。
【図９５】図95は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトされたPBMCが、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抑制することを示している。
【図９６】図96は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしてからLPSで刺激したPBMCでは、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしていないPBMCよりもTNFの産生が少ないことを示している。
【図９７】図97は、インターフェロンγで処理したHT-29細胞とインターフェロンγで処理していないHT-29細胞からの細胞ライセートに関するウエスタン・ブロットである。
【図９８】図98は、対照siRNAまたはアポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞からの細胞ライセートに関するウエスタン・ブロットである。この図は、アポトーシス特異的eIF-5AのsiRNAがアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止することを示している。
【図９９】図99は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞ではTNFの産生レベルが低下することを示している。
【図１００】図100は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞におけるアポトーシスが対照細胞よりも少ないことを示している。対照細胞とsiRNAをトランスフェクトした細胞の両方とも、インターフェロンγで処理し、TNF-αでも処理した。
【図１０１】図101は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞では、対照細胞よりもTLR4タンパク質の発現が少ないことを示している。
【図１０２】図102は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞では、対照細胞よりもTNFR1タンパク質の発現が少ないことを示している。
【図１０３】図103は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞では、対照細胞よりもiNOSタンパク質の発現が少ないことを示している。
【図１０４】図104は、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞では、対照細胞よりもTLR4のmRNAの発現が少ないことを示している。
【図１０５】図105は、U937を処理する時間スケジュールである。
【図１０６】図106は、U937細胞では、アポトーシス特異的eIF-5AがPMAによって上方調節されることを示している。
【図１０７】図107は、U937細胞では、アポトーシス特異的eIF-5AがLPSによって上方調節されることを示している。
【図１０８】図108は、siRNAで処理してから何時間も経つとアポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の発現がさらに低下することを示している。
【図１０９】図109は、siRNAを媒介としたアポトーシス特異的eIF-5Aのダウンレギュレーションが、TLR4の減少と同時に起こることを示している。
【図１１０】図110は、U937細胞では、siRNAを媒介としたアポトーシス特異的eIF-5Aのダウンレギュレーションが、グリコシル化された形態のインターフェロンγ受容体がより少なくなることと同時に起こることを示している。
【図１１１】図111は、U937細胞では、siRNAを媒介としたアポトーシス特異的eIF-5Aのダウンレギュレーションが、TNFR1の減少と同時に起こることを示している。
【図１１２】図112は、U937細胞では、siRNAを媒介としたアポトーシス特異的eIF-5Aのダウンレギュレーションが、LPSによって誘導されるTNF-αの産生低下と同時に起こることを示している。
【図１１３】図113は、U937細胞では、siRNAを媒介としたアポトーシス特異的eIF-5Aのダウンレギュレーションが、LPSによって誘導されるIL-1βの産生低下と同時に起こることを示している。
【図１１４】図114は、U937細胞では、siRNAを媒介としたアポトーシス特異的eIF-5Aのダウンレギュレーションが、LPSによって誘導されるIL-8の産生低下と同時に起こることを示している。
【図１１５】図115は、U937細胞では、IL-6の産生が、siRNAを媒介としたアポトーシス特異的eIF-5Aのダウンレギュレーションとは独立であることを示している。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５１Ｄ】
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【図５２】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【配列表】
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