(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
維芽細胞増殖因子１（以下、ＦＧＦ１という）と、 それぞれ、配列番号１１〜２９で表される、線維芽細胞増殖因子１１〜１４（以下、それぞれＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３及びＦＧＦ１４という）のＣ末端領域に存在する膜透過ドメインのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換され、且つ１番目：  プロリン、又はロイシン２番目：  イソロイシン、又はロイシン３番目：  グルタミン酸、又はリジン４番目：  バリン５番目：  システイン、又はアラニン６番目：  メチオニン、又はバリン７番目：  チロシン８番目：  アルギニン、リジン、又はグルタミン９番目：  グルタミン酸１０番目：プロリンのアミノ酸配列を含む膜透過ペプチド（以下ＣＰＰ−Ｃという）とを含む、キメラタンパク質； 該キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、或いは 該キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、ベクターを含有する、悪性腫瘍の増殖又は転移を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
前記ＦＧＦ１は、以下のアミノ酸配列の何れかを含み、且つＦＧＦ１活性が維持されている、請求項１に記載の医薬組成物：
１）配列番号１〜５の何れかによって表されるアミノ酸配列、
２）配列番号１によって表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、且つ該アミノ酸配列の２２〜２８、及び１３３のアミノ酸が維持されているアミノ酸配列、
３）配列番号２によって表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、且つ該アミノ酸配列の２２〜２８、及び１３３のアミノ酸が保持されているアミノ酸配列、
４）配列番号３によって表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、且つ該アミノ酸配列の２２〜２８、及び１３３のアミノ酸が保持されているアミノ酸配列、
５）配列番号４に表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、且つ該アミノ酸配列の２２〜２８、及び１３３のアミノ酸が保持されているアミノ酸配列、並びに
６）配列番号５に表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、且つ該アミノ酸配列の２２〜２８、及び１３３のアミノ酸が保持されているアミノ酸配列。
【請求項３】
前記ＦＧＦ１は、配列番号１〜５の何れかによって表される１〜１５０のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する、請求項２に記載の医薬用組成物。
【請求項４】
前記ＣＰＰ−Ｃは、４０以下のアミノ酸からなる請求項１〜３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＣＰＰ−Ｃは、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３及びＦＧＦ１４の何れかに由来する連続する２５以下のアミノ酸からなる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＣＰＰ−Ｃは、前記ＦＧＦ１のＣ末端領域に、直接又は連結部を介して結合又は挿入されている、請求項１〜５の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記キメラタンパク質は、配列番号３０〜３３の何れかに表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記キメラタンパク質は、配列番号３０〜３３の何れかに表されるアミノ酸配列の２２〜２８、及び１３３のアミノ酸を維持している、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性の線維芽細胞増殖因子に関する。より具体的には、線維芽細胞増殖因子（以下、ＦＧＦと略称する）に細胞膜透過ペプチド（以下、ＣＰＰと略称する）を融合したキメラタンパク、又はその医薬用途又は細胞培養用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＧＦは、哺乳動物の細胞増殖を刺激する生理活性物質であり、現在７つのサブファミリーに分類される２３のメンバーが同定されている。ＦＧＦの多くのメンバーは、線維芽細胞増殖因子受容体（以下、ＦＧＦＲと略称する）と相互作用し細胞内ドメインでチロシンキナーゼを活性化することで生じるシグナル伝達を通じて生理活性を発揮する（非特許文献１乃至２４のイントロダクションなどを参照）。ＦＧＦＲファミリーは、ＦＧＦＲ１乃至ＦＧＦＲ４の４種類を含み、ＦＧＦＲ１乃至ＦＧＦＲ３は、それぞれ、ＦＧＦＲ１ａ、ＦＧＦＲ１ｂ及びＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ａ、ＦＧＦＲ２ｂ及びＦＧＦＲ２ｃ、並びにＦＧＦＲ３ａ、ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃのサブグループを有する（例えば、非特許文献１及び１７）。また、ｂサブグループは、上皮組織等で発現し、ｃサブグループは、間葉組織等で発現していることが知られている（例えば、非特許文献１及び１７）。【０００３】
ＦＧＦ１（酸性線維芽細胞増殖因子と称されることもある）は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子と称されることもある）と同じサブファミリー（ＦＧＦ１サブファミリー）に属し、ＦＧＦ２と類似の生理活性を有する。しかし、ＦＧＦ２は、上皮細胞に特異的に発現しているＦＧＦＲ２ｂとの相互作用が弱いのに対して、ＦＧＦ１は、総てのＦＧＦＲと相互作用し得るという特徴を有する（非特許文献１）。また、ＦＧＦ１は、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＣＳＮＫ２Ａ２、ＨＳＰＡ９、Ｓ１００Ａ１３、カゼインキナーゼ２、及びＦＩＢＰとも相互作用することが知られている（非特許文献２５〜２９）。このため、ＦＧＦ１は、発生期だけでなく、成人においても、脳、眼、腎臓、胎盤及び副腎組織などさまざまな中胚葉由来組織及び神経外胚葉組織で、様々な生理学的活性に関与している可能性があり、虚血性心疾患の治療（非特許文献１１）、重症下肢虚血での血管新生（非特許文献１２）、糖尿病マウスにおける皮膚潰瘍の治癒（非特許文献１３）、鼓膜穿孔の治療（非特許文献１４）、放射線による腸管障害の予防及び治療（非特許文献２）、放射線による毛包の障害の予防（非特許文献１５）、幹細胞の維持（非特許文献１６）、並びにがん細胞の遊走や浸潤の抑制（非特許文献１７）などについて検討が行われている。【０００４】
一方、ＦＧＦ１は、ＦＧＦ２と異なり、ヘパリンやヘパラン硫酸（ＨＳ）と複合体を形成しないと不安定であり、生理活性を発揮できない。このような特性を改善するために、ＦＧＦ１のアミノ酸の一部を置換して、構造を安定化する試みがなされている（非特許文献９、１０及び１９）が、実際に医薬品として上市されているのは、現在のところ、ＦＧＦ２を有効成分とする創傷治癒薬（一般名トラフェルミン）と、ＦＧＦ７を有効成分とする放射線化学療法における口腔粘膜炎の予防及び治療薬（一般名パリフェルミン）である。【０００５】
ＦＧＦ１の作用機序について幾つかの詳細な報告がなされており、ＦＧＦ１により細胞分裂及び増殖などの生物学的活性を発揮するには、ＦＧＦＲとの相互作用によるシグナル伝達と共にＦＧＦ１が核内に移行することが必要であると報告されている（非特許文献３〜５）。例えば、Ｗｉｅｄｌｏｃｈａ等は、ＣＡＡＸで標識したＦＧＦ１を使用する実験で、ＦＧＦ１が核内に移行してＤＮＡ合成を刺激すること、並びにＦＧＦ１の細胞内への移行は、ＦＧＦ１のＦＧＦＲへの結合が必要であることを報告している（非特許文献３）。また、今村等は、核移行配列を欠くＦＧＦ１及び核移行配列を回復したＦＧＦ１をＦＧＦＲとの相互作用可能な条件でＬＥ−ＩＩ細胞に加えたところ、核移行配列を欠くＦＧＦ１は細胞分裂活性を発揮しなかったが、核移行配列を有するＦＧＦ１では細胞分裂活性を有することを報告する（非特許文献５）。また、Ｗｉｅｄｌｏｃｈａ等は、ジフテリア毒素ＡをＦＧＦ１に融合させたキメラタンパク質を作成し、このキメラタンパク質をジフテリア毒素Ａ受容体を介して細胞内に移行させたところ、ＤＮＡ合成が促進されたことを報告している（非特許文献４）。この報告は、ＦＧＦ１の核内移行が、細胞分裂活性又は細胞増殖と何らかの関連を持つことを示唆するが、ＦＧＦＲを介さずに、ＦＧＦ１を細胞内に移行させた場合には、ＤＮＡの合成に止まることを示すものでもある。Ｗｉｅｄｌｏｃｈａ等は、この報告で、細胞分裂及び増殖に係わる他のプロセスでＦＧＦＲでのチロシンキナーゼの活性化が要求されているだろうと結論付けている。
【０００６】
Ｗｉｅｄｌｏｃｈａ等はまた、ＣＰＰの１種であるジフテリア毒素ＡをＦＧＦ１に融合させたキメラタンパクは、へパリンを欠く条件では、ジフテリア毒素Ａ受容体を介して細胞内に移行するが、へパリンの存在下では細胞内に移行しないことを報告しており、ＣＰＰを融合させたキメラタンパクではヘパリンによって細胞膜の通過が妨げられることを教示する（非特許文献４及び２４）。
ＦＧＦ２の作用機序については、非特許文献２３などにおいて、ＦＧＦ１と同様に、ＦＧＦＲを介したシグナル伝達及び細胞内移行、並びに細胞内での作用について報告されている。【０００７】
ＦＧＦ１又はＦＧＦ２の薬理学的又は生物学的活性に関するこれまでの検討は、このようなＦＧＦ１又はＦＧＦ２の作用機序を前提にする。すなわち、病巣部又は障害を受けた組織の細胞がＦＧＦＲを発現していることを前提に、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２をＦＧＦＲと相互作用させて、ＦＧＦＲを介したシグナル伝達及びＦＧＦ１又はＦＧＦ２の細胞内移行を通じて所望の活性を発生させようとするものである。もっとも、抗アポトーシス効果の作用機序は明らかになっていないというのが現状である。【０００８】
例えば、Ｍｅｙｅｒ等は、ＦＧＦＲ１及び２を欠くケラチノサイトでは、ケラチノサイトの遊走が遅滞して創傷皮膚の治癒が遅くなることを報告し、ＦＧＦＲ１又はＦＧＦＲ２の存在が、創傷皮膚の治癒に必須であると結論付けている（非特許文献２２）。
【０００９】
萩原等は、放射前後における空腸でのＦＧＦＲ発現のプロファイルとの関連において、ＦＧＦ１が、他のＦＧＦファミリーメンバーに対して、放射線による腸管の障害の予防及び治療に関して優位性を有することを報告する（非特許文献２）。【００１０】
Ｐａｌｍｅｎ等は、虚血性心疾患での機能回復にＦＧＦ１が有効であり、この作用は、ＦＧＦＲを介する細胞内シグナル伝達系によることを報告する（非特許文献１１）。また、Ｎｉｋｏｌ等は、重症虚血肢を有する患者にＮＶ１ＦＧＦを筋肉投与し局所発現させたところ、切断リスクが有意に減少したことを報告する（非特許文献１２）。ただし、潰瘍の治癒に関しては、投与群は非投与群に対して優位差がなかったと報告されている。【００１１】
Ｇｏｌｄｍａｎ等は、穿孔した鼓膜にＦＧＦ１を投与した試験結果を報告する（非特許文献１４）。【００１２】
Ｍｅｌｌｉｎ等は、糖尿病マウスにおける皮膚潰瘍へのＦＧＦ１の投与が投与量に依存して創傷治癒を促進したことを報告する（非特許文献１３）。【００１３】
Ｃｈｅｎ等は、ＦＧＦによるＦＧＦＲの活性化を示すＥＲＫ１／２リン酸化及び多能性を示すＮＡＮＯＧ発現を指標に、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、及びＨ９３Ｇの３つのアミノ酸置換を導入した熱安定性の変異ＦＧＦ１によって、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の自己増殖能及び多能性が維持されることを報告する（非特許文献１６）。【００１４】
Ｌｉｕ等は、腫瘍細胞では、ＦＧＦＲ１ｃが支配的に発現されるがＦＧＦＲ１ｂの発現は低い点に着目し、膵臓癌細胞株でＦＧＦＲ１ｂを強制的に過剰発現させてからＦＧＦ１等を投与することにより癌細胞の増殖、遊走及び浸潤が抑制されることを報告する（非特許文献１７）。【００１５】
中山等は、抜毛により毛包を成長期へと誘導したＢＡＬＢ／ｃマウスの脱毛した皮膚に、ＦＧＦ１を投与した後に、放射線の照射による毛包細胞のアポトーシスを誘発したところ、アポトーシスが抑制されたことを報告する（非特許文献１５）。また、Ｆｕ等は、動物モデルにＦＧＦ１又は核内移行ドメインを欠くＦＧＦ１（２８−１５４）等を注入したところ、核内移行ドメインを欠くＦＧＦ１の方が、同ドメインを有するＦＧＦ１より、抗アポトーシス効果が増大したことを報告する（非特許文献２１）。一方、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ等は、ＰＣ１２細胞にＦＧＦ１発現ベクターを導入し、デキサメタゾンでＦＧＦ１を細胞内で発現させた試験で、ＦＧＦ１の核内移行が認められると、神経分化、及び抗アポトーシス能が増加したと報告している（非特許文献２０）。
このように、抗アポトーシス効果については、ＦＧＦＲとの相互作用に関わらずＦＧＦ１が核内に移行することで生じるとの報告がある一方で、ＦＧＦＲとの相互作用によりＦＧＦ１が細胞内に移行した後は、むしろ核内に移行しない方が増大するという報告もある。従って、ＦＧＦ１の抗アポトーシス効果の作用機序については、明らかになっていないというのが現状である。もっとも、ＦＧＦ１による抗アポトーシス効果を確認する試験でも、ＦＧＦ１とＦＧＦＲとの相互作用を前提とする条件でなされるのが通常である。【００１６】
ＦＧＦ１１サブファミリーメンバーは、ＦＧＦ１及び２を含む他のＦＧＦファミリーメンバーと異なり、ＦＧＦＲと相互作用しないというユニークな特性を有する。ＦＧＦ１１〜１４がこのサブファミリーに属し、そのアミノ酸配列も知られている（特許文献１〜６）。しかし、これらＦＧＦが、どのように細胞内移行できるのか、或いは細胞内で何らかの生理作用に関与するのかはよく分かっていなかった（非特許文献２４）。
本発明者らは、ＦＧＦ１２が細胞外からＦＧＦＲに依存せずに細胞内に移行でき、その細胞内移行を担う細胞膜透過ペプチドドメイン（以下、ＣＰＰドメインと略称することがある）が、中央部（以下、ＣＰＰ−Ｍドメインということがある）とＣ末端部（以下、ＣＰＰ−Ｃドメインということがある）の２か所に存在することを報告した（非特許文献８）。この報告では、ＦＧＦ１１サブファミリーの他のメンバーにも類似のドメインが存在するが、ＦＧＦ１にはＣＰＰ−Ｃドメインが存在せず、このドメインが、ＦＧＦ１２の細胞内移行を促進していることを示した。この報告ではまた、ＦＧＦ１２のＣＰＰ−ＣドメインからなるペプチドをＦＧＦ１に融合し、得られたキメラタンパクがＦＧＦＲに依存せずに細胞内に移行できることも示した。【００１７】
本発明らは、ＦＧＦ１２自体が抗アポトーシス活性を有することも示し、更に１４０−１８１アミノ酸残基を欠くＦＧＦ１２フラグメントが、細胞内移行特性及び抗アポトーシス活性を欠くが、これにＴＡＴを付加して細胞内移行特性を回復させると、放射線誘導アポトーシスも顕著に低減することも示した（非特許文献８）。また、その後の研究で、本発明者らは、ＣＰＰ−Ｍドメイン又はＣＰＰ−Ｃドメインの何れかを含むＦＧＦ１２由来の３０のアミノ酸からなるペプチドが、細胞内発現により、小腸上皮細胞を増殖分化し、アポトーシスを抑制したことを報告した（非特許文献１８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特表２０００−５０９９６５
【特許文献２】特表２００１−５０７５６１
【特許文献３】特表平１１−５０８１２５
【特許文献４】特表２００１−５０５５２６
【特許文献５】特表平１１−５０６９１７
【特許文献６】特表２０００−５１７１８７
【特許文献７】特表２００３−５１８９４４
【特許文献８】特表平１１−５０７５０４
【特許文献９】特表２００３−０５２３８７
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ornitz DM, Xu J, Colvin JS, McEwen DG, MacArthur CA, Coulier F, Gao G, Goldfarb M. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family. J. Biol. Chem. 1996;271:15292-15297.
【非特許文献２】Hagiwara A, Nakayama F, Motomura K, Asada M, Suzuki M, Imamura T, Akashi M. Comparison of expression profiles of several fibroblast growth factor receptors in the mouse jejunum: suggestive evidence for a differential radioprotective effect among major FGF family members and the potency of FGF1. Radiat. Res. 2009;172:58-65.
【非特許文献３】Wiedlocha A, Falnes PO, Rapak A, Klingenberg O, Munoz R, Olsnes S. Translocation of cytosol of exogenous, CAAX-tagged acidic fibroblast growth factor. J. Biol. Chem. 1995;270:30680-30685.
【非特許文献４】Wiedlocha A, Falnes PO, Madshus IH, Sandvig K, Olsnes S. Dual mode of signal transduction by externally added acidic fibroblast growth factor. Cell 1994;76:1039-1051.
【非特許文献５】Imamura T, Engleka K, Zhan X, Tokita Y, Forough R, Roeder D, Jackson A, Maier JA, Hla T, Maciag T. Recovery of mitogenic activity of a growth factor mutant with a nuclear translocation sequence. Science 1990;249:1567-1570.
【非特許文献６】Klingenberg O, Widlocha A, Rapak A, Munoz R, Falnes P, Olsnes S. Inability of the acidic fibroblast growth factor mutant K132E to stimulate DNA synthesis after translocation into cells. J. Biol. Chem. 1998;273:11164-11172.
【非特許文献７】Olsen SK, Garbi M, Zampieri N, Eliseenkova AV, Ornitz DM, Goldfarb M, Mohammadi M. Fibroblast growth factor (FGF) homologous factors share structural but not functional homology with FGFs. J. Biol. Chem. 2003;278:34226-34236.
【非特許文献８】Nakayama F, Yasuda T, Umeda S, Asada M, Imamura T, Meineke V, Akashi M. Fibroblast growth factor-12 (FGF12) translocation into intestinal epithelial cells is dependent on a novel cell-penetrating peptide domain: involvement of internalization in the in vivo role of exogenous FGF12. J. Biol. Chem. 2011;286:25823-25834.
【非特許文献９】Zakrzewska M, Krowarsch D, Wiedlocha A, Olsnes S, Otlewski J. Highly stable mutants of human fibroblast growth factor-1 exhibit prolonged biological action. J. Mol. Biol. 2005;352:860-875.
【非特許文献１０】Zakrzewska M, Wiedlocha A, Szlachcic A, Krowarsch D, Otlewski J, Olsnes S. Increased protein stability of FGF1 can compensate for its reduced affinity for heparin. J. Biol. Chem. 2009;284:25388-25403.
【非特許文献１１】Palmen M, Daemen MJ, De Windt LJ, Willems J, Dassen WR, Heeneman S, Zimmermann R, Van Bilsen M, Doevendans PA. Fibroblast growth factor-1 improves cardiac functional recovery and enhances cell survival after ischemia and reperfusion: a fibroblast growth factor receptor, protein kinase C, and tyrosine kinase-dependent mechanism. J. Am. Coll. Cardiol. 2004;44:1113-1123.
【非特許文献１２】Nikol S, Baumgartner I, Van Belle E, Diehm C, Visona A, Capogrossi MC, Ferreira-Maldent N, Gallino A, Wyatt MG, Wijesinghe LD, Fusari M, Stephan D, Emmerich J, Pompilio G, Vermassen F, Pham E, Grek V, Coleman M, Meyer F. Therapeutic angiogenesis with intramuscular NV1FGF improves amputation-free survival in patients with critical limb ischemia. Mol. Ther. 2008;16:972-978.
【非特許文献１３】Mellin TN, Cashen DE, Ronan JJ, Murphy BS, DiSalvo J, Thomas KA. Acidic fibroblast growth factor accelerates dermal wound healing in diabetic mice. J. Invest. Dermatol. 1995;104:850-855.
【非特許文献１４】Goldman SA, Siegfried J, Scoleri P, Aydogen LB, Cass SP. The effect of acidic fibroblast growth factor and live yeast cell derivative on tympanic membrane regeneration in a rat model. Otolaryngol. Head Neck Surg. 1997;117:616-621.
【非特許文献１５】Nakayama F, Hagiwara A, Kimura M, Akashi M, Imamura T. Evaluation of radiation-induced hair follicle apoptosis in mice and the preventive effects of fibroblast growth factor-1. Exp. Dermatol. 2009;18:889-892.
【非特許文献１６】Chen G, Gulbranson DR, Yu P, Hou Z, Thomson JA. Thermal stability of fibroblast growth factor protein is a determinant factor in regulating self-renewal, differentiation, and reprogramming in human pluripotent stem cells. Stem Cells 2012;30:623-630.
【非特許文献１７】Liu Z, Neiss N, Zhou S, Henne-Bruns D, Korc M, Bachem M, Kornmann M., Identification of a fibroblast growth factor receptor 1 splice variant that inhibits pancreatic cancer cell growth, Cancer Res. 2007; 67:2712-2719.
【非特許文献１８】中山  文明、梅田貞子、安田武嗣、浅田眞弘  鈴木理、今村亨、今井高志、第54回放射線影響学会抄録、ＰＥ−２  ＦＧＦ１２の小腸に対する放射線防護効果について  2011年
【非特許文献１９】Fumiaki Nakayama et al., Structural Stability of Human Fibroblast Growth Factor-1 Is Essential for Protective Effects Against Radiation-Induced Intestinal Damage, International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, pp.1-7, 2012.
【非特許文献２０】Aida Rodriguez-Enfedaque et al., FGF1 nuclear translocation is required for both its neurotrophic activity and its p53-dependent apotosis protection, Biochimica et Biophysica Acta, 1793(2009) 1710-1727.
【非特許文献２１】Xiao-Bing Fu et al., Enhanced anti-apoptosis and gut epithelium protection function of acidic fibroblast growth factor after cancelling of its mitogenic activity, World J Gastroenterol 2004;10(24):3590-3596.
【非特許文献２２】Michael Meyer et al., FGF receptors 1 and 2 are key regulators of keratinocyte migration in vitro and in wounded skin, Journal of Cell Science, 2012.
【非特許文献２３】生化学、第81巻、第7号、第592頁〜第596頁、2009年7月
【非特許文献２４】Slur Olsnes, et al., Transport of Exogenous Growth Factors and Cytokines to the Cytosol and to the Nucleus, Physiol Rev, Vol.83, January 2003.
【非特許文献２５】Skjerpen, Camilla Skiple; Nilsen Trine, Wesche Jorgen, Olsnes Sjur, "Binding of FGF-1 variants to protein kinase CK2 correlates with mitogenicity". EMBO J. (England) 21 (15): 4058-69, August 2002.
【非特許文献２６】Mizukoshi, E; Suzuki M, Loupatov A, Uruno T, Hayashi H, Misono T, Kaul S C, Wadhwa R, Imamura T (October 1999). "Fibroblast growth factor-1 interacts with the glucose-regulated protein GRP75/mortalin". Biochem. J. (ENGLAND) 343 (2): 461-6.
【非特許文献２７】Mouta Carreira, C; LaVallee T M, Tarantini F, Jackson A, Lathrop J T, Hampton B, Burgess W H, Maciag T (August 1998). "S100A13 is involved in the regulation of fibroblast growth factor-1 and p40 synaptotagmin-1 release in vitro". J. Biol. Chem. (UNITED STATES) 273 (35): 22224-31.
【非特許文献２８】Landriscina, M; Bagala C, Mandinova A, Soldi R, Micucci I, Bellum S, Prudovsky I, Maciag T (July 2001). "Copper induces the assembly of a multiprotein aggregate implicated in the release of fibroblast growth factor 1 in response to stress". J. Biol. Chem. (United States) 276 (27): 25549-57.
【非特許文献２９】Kolpakova, E; Wiedlocha A, Stenmark H, Klingenberg O, Falnes P O, Olsnes S (November 1998). "Cloning of an intracellular protein that binds selectively to mitogenic acidic fibroblast growth factor". Biochem. J. (ENGLAND) 336 (Pt 1): 213-22.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
上記の通り、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２は、基本的に、ＦＧＦＲとの相互作用を介するシグナル伝達及び細胞内移行を通じてその生理活性を発揮するものと考えられ、その相互作用の相手である細胞表面のＦＧＦＲの発現レベル及び発現プロファイル等の要因によって、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２の生理活性も影響を受けることとなる。従って、ＦＧＦＲの発現が元来少ないリンパ球等の血液系細胞や、熱傷、放射線、血流障害、感染などさまざまな要因によりＦＧＦ受容体の発現が低下した組織では、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２は生理作用を十分に発揮できない。【００２１】
この点に関し、萩原等は、γ線の全身照射後にマウスの空腸でのＦＧＦＲ２ｂの発現レベルが一時的に低下することを報告し（非特許文献２）、Ｍｅｌｌｉｎ等は、糖尿病性皮膚潰瘍モデルでＦＧＦＲの転写レベルが低下し、これが創傷治癒の遅れる原因であることを指摘するが（非特許文献１３）、いずれの報告でも、ＦＧＦＲの低発現に伴う問題に対する解決策を提示していない。従って、腫瘍細胞にＦＧＦＲを強制的に発現させた以外に（非特許文献１７）、この問題の根本的な解決手段を提示する報告は現在のところ見当たらない。また、リンパ球、顆粒球などＦＧＦＲの発現の低い血液系細胞では、ＦＧＦ１は効果を発揮できないが、上記の報告ではこの問題自体についても何ら触れていない。【００２２】
また、腫瘍細胞の増殖や転移を、ＦＧＦＲを強制的に発現させずに抑制する手段が提供できれば、従来技術に対して優位性を持つことは明らかである。また、細胞表面にＦＧＦＲが発現している場合には、ＦＧＦＲを介してＦＧＦ１又はＦＧＦ２を細胞内に移行させ、ＦＧＦＲを介してシグナル伝達を行うことができるため、他の経路によりＦＧＦ１等を細胞内に移行させる必要性はないと考えられる。しかし、もしＦＧＦＲを介するＦＧＦ１又はＦＧＦ２の生理活性をより増強できる手段が提供できれば有益である。また、放射線照射や化学療法等による影響から幹細胞を保護する手段としてＦＧＦ１又はＦＧＦ２を利用する報告は、現在までのところないように思われる。従って、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２によって、このような処置が可能になれば、放射線治療や化学療法による治療後における回復を促進したり、副作用を軽減する新たな選択肢を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者等は、ＦＧＦ１２のＣＰＰ‐ＣをＦＧＦ１に融合させたキメラタンパク質を、ＦＧＦＲを発現しない細胞と接触させて細胞内に移行させたところ、予想外にも、ＦＧＦ１の種々の生物学的又は薬理学的活性が発現されることを見出した。また、本発明者等は、このようなキメラタンパク質が、ＦＧＦＲの強制的な発現無しで腫瘍細胞の増殖及び転移を抑制できることを見出した。また、本発明者等は、ＦＧＦＲを発現している細胞と、このキメラタンパク質を接触させたところ、予想外にも、天然のＦＧＦ１より高い生物学的又は薬理学的活性を発揮することを見出した。更には、このようなキメラタンパク質は、放射線照射や化学療法から幹細胞を防護できることを見出した。これらの知見は、ＦＧＦ１と同じサブファミリーに属するＦＧＦ２にも同様に当て嵌まると考えられるところ、本発明は、このような知見に基づくものである。【００２４】
すなわち、本発明は、その一の実施形態において、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２に、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３及びＦＧＦ１４の何れかのＣＰＰ−Ｃドメインを含むＣＰＰを融合したキメラタンパクを提供する。
また、本発明は、他の実施形態において、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２をコードするＤＮＡ配列と、ＣＰＰ−ＣをコードするＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ分子、或いはこれらのＤＮＡ配列を含むベクターを提供する。
また、本発明は、更に他の実施形態において、上記キメラタンパク質、ＤＮＡ分子、又はベクターを有効成分とする、医薬用組成物を提供する。【００２５】
本発明はまた、更に他の実施の形態において、上記キメラタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター又は組成物の治療有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２が関与する生理現象に起因する種々の疾患又は症状の予防又は治療方法を提供する。
本発明はまた、更に他の実施の形態において、上記キメラタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター又は組成物の医薬又は細胞培養培地を調製するための使用を提供する。【００２６】
本発明による方法、医薬組成物、キメラタンパク等は、これらに限定されるものではないが、例えば、細胞の維持又は増殖のため、幹細胞の防護のため、細胞のアポトーシスを抑制するため、細胞の遊走を促進するため、腫瘍細胞の増殖又は転移を抑制するため、又は虚血性組織の機能回復のために使用することができる。より具体的には、本発明の方法、医薬組成物又はキメラタンパクは、例えば、創傷治癒の促進、放射線や化学療法による腸管の障害の予防又は治療、放射線や化学療法による脱毛症の予防又は治療、下肢虚血性疾患の治療、糖尿病性皮膚潰瘍や糖尿病性壊疽の治療、虚血性冠動脈疾患の予防及び治療、鼓膜穿孔の治療、並びに悪性腫瘍の増殖及び転移の抑制等で有効である。
【００２７】
本発明で有効成分として使用されるＣＰＰ−ＦＧＦ１又はＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパクは、天然のＦＧＦ１又はＦＧＦ２より高い効率で細胞内に移行することができるが、この高効率での細胞内への移行は、ＦＧＦＲを介さないものと考えられる。従来、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２による各種生物学的又は薬理学的活性は、単にＦＧＦ１等を核内に移行させただけでは発現せず、ＦＧＦＲを介したＦＧＦ１等の細胞内移行とＦＧＦＲを介するシグナル伝達が必要と考えられていたが、本発明で有効成分として使用されるＣＰＰ−ＦＧＦ１又はＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパクは、ＦＧＦＲを介さずに細胞内に移行するにも拘らず、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２による種々の生物学的又は薬理学的活性を発揮することができる。従って、本発明による医薬組成物は、治療対象となる病巣又は障害を受けた組織の細胞がＦＧＦＲの全部又は一部を発現しない又は低いレベルでしか発現しない症状又は疾患、或いは何らかの理由でＦＧＦ１又はＦＧＦ２が細胞内に移行できない症状又はＦＧＦ１等がＦＧＦＲと相互作用できない症状の治療又は予防に特に有益である。このような症状では天然のＦＧＦ１等はその生物学的又は薬理学的活性を十分に発揮できないが、本発明は、この問題に対する根本的な解決手段を提供し得る。【００２８】
また、本発明は、腫瘍細胞の増殖や転移を抑制する新たな手段を提供する。腫瘍細胞は、ＦＧＦＲ１ｂの発現レベルが低く天然ＦＧＦ１又はＦＧＦ２を用いる処置では、十分な治療効果が得られない。このため、これまでのＦＧＦを用いる処置は、ＦＧＦＲ１ｂを腫瘍細胞に強制発現させた後にＦＧＦ１を投与するものであった。しかし、本発明によれば、ＦＧＦＲ１ｂを腫瘍細胞に強制発現させる必要はなく、本発明の医薬組成物を投与するだけで治療効果を得ることができる。なお、このような効能は、ＣＰＰ−ＦＧＦ１又はＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパク質がＦＧＦＲ１ｂに依存せずに細胞内に移行できるという作用機序に起因すると考えられるため、広範囲の腫瘍細胞の増殖や転移を抑制できると考えられる。【００２９】
本発明はまた、病巣又は障害を受けた組織の細胞がＦＧＦＲを発現している症状又は疾患に対し、従来のＦＧＦ１又はＦＧＦ２を用いる方法より効能の大きな手段を提供する。細胞表面にＦＧＦＲが発現している症状又は疾患では、ＦＧＦＲを介してＦＧＦ１又はＦＧＦ２を細胞内に移行させ、ＦＧＦＲを介してシグナル伝達を発生させることができるため、他の経路によりＦＧＦ１又はＦＧＦ２を細胞内に移行させる必要性はないと考えられるが、ＣＰＰ−ＦＧＦ１又はＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパク質は、予想外にも天然のＦＧＦ１又はＦＧＦ２より高い生物学的又は薬理学的活性を発揮する。【００３０】
ＣＰＰ−ＦＧＦ１又はＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパクはまた、放射線照射や化学療法から幹細胞を防護できる作用を奏する。このため、本発明は、放射線治療や化学療法による治療後における回復を促進したり、副作用を軽減する新たな選択肢を提供する。【００３１】
ここで、本明細書で用いる略称及び用語の意味をまとめて以下に示す。
ＦＧＦ：線維芽細胞増殖因子（ただし、本明細書においては、後述する変異体やキメラタンパク質を含めて総称することがある）
ＦＧＦ１：線維芽細胞増殖因子１（ただし、本明細書においては、後述する変異体を含めて総称することがある）
ＦＧＦ２：線維芽細胞増殖因子２（ただし、本明細書においては、後述する変異体を含めて総称することがある）
ＦＧＦ１１：線維芽細胞増殖因子１１（ただし、本明細書においては、後述する変異体を含めて総称することがある）
ＦＧＦ１２：線維芽細胞増殖因子１２（ただし、本明細書においては、後述する変異体を含めて総称することがある）
ＦＧＦ１３：線維芽細胞増殖因子１３（ただし、本明細書においては、後述する変異体を含めて総称することがある）
ＦＧＦ１４：線維芽細胞増殖因子１４（ただし、本明細書においては、後述する変異体を含めて総称することがある）
変異体：配列番号１〜５に示すアミノ酸配列の何れかによって表わされるＦＧＦ１、配列番号６〜１０に示すアミノ酸配列の何れかによって表わされるＦＧＦ２、又は配列番号１１〜２９に示すアミノ酸配列の何れかによって表わされる細胞膜透過ペプチドのアミノ酸の一部を置換若しくは削除又は１以上のアミノ酸を付加したタンパク質又はペプチド、或いは、既知の他のＦＧＦ１、ＦＧＦ２又は細胞膜透過ペプチドのアミノ酸の一部を置換若しくは削除又は１以上のアミノ酸を付加したタンパク質又はペプチドをいう。
ＣＰＰ：細胞膜透過ペプチド
ＣＰＰ−Ｃドメイン：ＦＧＦ１１サブファミリーメンバーのＣ末端領域に存在する細胞膜透過ペプチドドメイン
ＣＰＰ−Ｍドメイン：ＦＧＦ１１サブファミリーメンバーの中央部に存在する細胞膜透過ペプチドドメイン
ＣＰＰ−Ｃ：特に言及しない限り、ＦＧＦ１１サブファミリーＣＰＰ−Ｃドメイン又はその一部のアミノ酸が置換又は欠失しているアミノ酸配列を含み且つ膜透過能を有するペプチド
ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質：ＣＰＰ−ＣをＦＧＦ１に融合したキメラタンパク質
ＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパク質：ＣＰＰ−ＣをＦＧＦ２に融合したキメラタンパク質。なお、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質とＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパク質とを総称して単にキメラタンパク質と言うことがある。
ＦＧＦＲ：線維芽細胞増殖因子受容体
ＦＡＣＳ：フローサイトメトリー
親水性アミノ酸：本明細書で用いる際、少なくともアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、及びリジンが含まれる。
疎水性アミノ酸：本明細書で用いる際、少なくともアラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、プロリン、及びグリシンが含まれる。
中性アミノ酸：本明細書で用いる際、少なくともアスパラギン、グルタミン、チロシン、トレオニン、及びセリンが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａは、本願の実施例で調製され使用されたＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の構造を模式的に示す概略図である。図１Ｂは、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３およびＦＧＦ１４のＣＰＰ−Ｃドメイン間のアライメントを示す図である。図１Ｂ中の斜体で示すアミノ酸は、ＦＧＦ１２の対応するアミノ酸と異なるアミノ酸である。図１Ｃは、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３およびＦＧＦ１４のＣＰＰ−Ｃドメイン間のアライメントを、アミノ酸の配列パターンを強調して示す図である。図１Ｃ中で枠で囲まれているアミノ酸は親水性又は中性アミノ酸を示し、斜体で示すアミノ酸は親水性アミノ酸を示し、下線で示すアミノ酸は中性アミノ酸を示し、その他のアミノ酸は疎水性アミノ酸を示す。
【図２】図２は、蛍光標識した各ＦＧＦを添加する前と添加した後のＩＥＣ６細胞株の蛍光強度をＦＡＣＳで測定して得られたヒストグラムである。図２Ａは、ＦＧＦ１２Ｂ及びその一部を切断した各フラグメントに関するヒストグラムであり、図２Ｂは、ＦＧＦ１及び各ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質に関するヒストグラムである。
【図３】図３は、ＩＥＣ６細胞株を各ＦＧＦと共に培養した後でＸ線照射した際の細胞のアポトーシス率を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、ＦＧＦ１２Ｂの異なる領域に由来する３０アミノ酸からなる各ＦＧＦ１２Ｂフラグメントを示す。図４Ｂは、ＩＥＣ６細胞株を各ＦＧＦ１２Ｂフラグメントと共に培養した後でＸ線照射した際の細胞のアポトーシス率を示すグラフである。図４Ｃは、蛍光標識した各ＦＧＦ１２Ｂフラグメントを添加した後のＩＥＣ６細胞株の蛍光陽性率をＦＡＣＳで経時的に測定したグラフである。図４Ｄは、各ＦＧＦ１２Ｂフラグメント又は生理食塩水を腹腔に投与した際の各群のクリプト生存率の平均値を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、脱毛後に各ＦＧＦ又は生理食塩水を腹腔内投与し、その後γ線を全身に照射したマウスの毛包バルブ領域を、ＴＵＮＥＬアッセイにより免疫組織染色した顕微鏡写真（２００倍）である。図５Ｂは、ＴＵＮＥＬアッセイにより算出した各投与群の毛包バルブあたりのアポトーシス数の平均値を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、各ＦＧＦ又は生理食塩水を腹腔内投与し、その後γ線を全身に照射したマウスの小腸のクリプトをＴＵＮＥＬアッセイにより免疫組織染色した顕微鏡写真（２００倍）である。図６Ｂは、ＴＵＮＥＬアッセイにより算出した各投与群のクリプトあたりのアポトーシス数の平均値を示すグラフである。
【図７】図７Ａは、γ線を全身に照射し、その後各ＦＧＦ又は生理食塩水を腹腔内投与し、照射３．５日後にＢｒｄＵを腹腔内投与したマウスの小腸の横断切片を抗ＢｒｄＵにより免疫組織染色した顕微鏡写真（４００倍）である。図７Ｂは、各投与群におけるクリプト生存率の平均値を示すグラフである。
【図８】図８Ａは、γ線を全身に照射し、その後各ＦＧＦ又は生理食塩水を腹腔内投与し、照射３．５日後にＢｒｄＵを腹腔内投与したマウスの小腸上皮組織の横断切片を抗ＢｒｄＵにより免疫組織染色した顕微鏡写真（２００倍）である。図８Ｂは各投与群におけるクリプト長さの平均値を示すグラフである。
【図９】図９は、脱毛後に各ＦＧＦを腹腔内投与し、その後γ線照射したマウスの毛包バルブ領域の組織を抗Ｋｅｒａｔｉｎ１５抗体により免疫組織染色した顕微鏡写真（４００倍）である。
【図１０】図１０Ａは、蛍光標識した各ＦＧＦを添加する前後のヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１の蛍光強度をＦＡＣＳで測定して得られたヒストグラムである。図１０Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１の細胞増殖に伴い増加するフォルマザンの吸光度（コントロールに対する吸光度差）とＦＧＦ１及びＣＰＰＦ２の濃度との関係を示すグラフである。
【図１１】図１１Ａは、ＦＧＦを無添加の培地、又は各ＦＧＦを添加した培地においてＰＡＮＣ−１を培養した後、メチレンブルー/メタノールで固定染色した培地の写真である。図１１Ｂは、図１１Ａに示す固定染色により染色された各群のコロニー数の平均値を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＭＩＡＰａＣａ−２をマウス大腿に皮下移植し、その後各ＦＧＦ又は生理食塩水を腹腔内投与を行ったマウスにおいて、皮下の腫瘍体積の増加を経時的に示すグラフである。
【図１３】図１３Ａは、浸潤アッセイによりゲルへ浸潤した細胞をディフクイックで固定染色したフィルターの顕微鏡写真（５０倍）である。図１３Ｂは、浸潤アッセイにより求めた各群の浸潤細胞率の平均値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２にＦＧＦ１１サブファミリーメンバーのＣＰＰ−Ｃドメインを含むＣＰＰを融合させたキメラタンパク質、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２をコードするＤＮＡ配列及びＣＰＰ−ＣをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、或いは該ＤＮＡ配列を含むベクターを有効成分とする医薬用組成物、並びに当該キメラタンパク等の医療上の使用に関する。以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００３４】
１．キメラタンパク質
１−１．ＦＧＦ１
ＦＧＦ１は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ等の哺乳動物で知られる生理活性物質であり、ヒトＦＧＦ１としては、配列番号１によって表されるアミノ酸配列を有するものがあり、マウスＦＧＦ１としては、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を有するものがある。また、ラットＦＧＦ１としては、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を有するものがあり、ウシＦＧＦ１としては、配列番号４によって表されるアミノ酸配列を有するものがあり、ウマＦＧＦ１としては、配列番号５によって表されるアミノ酸配列を有するものがある。本発明では何れの哺乳動物に由来するＦＧＦ１でキメラタンパクを構成してもよく、例えば、治療対象となる動物に応じて選択することができる。
【００３５】
これらのＦＧＦ１の動物間におけるアミノ酸配列の同一性は、９０％以上であり、ヒトＦＧＦ１のアミノ酸配列に対する他の動物由来のＦＧＦ１のアミノ酸配列の配列同一性は、９２％以上である。従って、上記アミノ酸配列の一部のアミノ酸が異なる変異体であっても、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で構成される場合には、同様の生物学的又は薬理学的活性を有するものが存在すると理解される。この観点から、配列番号１〜５によって表される何れかのＦＧＦ１のアミノ酸配列に対して、好ましくは７０％以上の、より好ましくは８０％以上の、更に好ましくは９０％以上の、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で構成される変異体であれば、変異前のＦＧＦ１と同様の生理活性を有するか、それから機能性の変異体を容易に入手できると考えられる。同様の点で、ヒトを対象とする医療用途で使用されるＦＧＦ１の変異体は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列に対して、好ましくは７０％以上の、より好ましくは８０％以上の、更に好ましくは９０％以上の、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で構成される。
【００３６】
一方、完全ＦＧＦ１のＮ末端領域に存在するアミノ酸配列は、ＦＧＦ１の核内移行に寄与し、ＦＧＦ１の細胞増殖等の生物学的又は薬理学的活性の少なくとも１部については、ＦＧＦ１の核内移行が必要と考えられる（非特許文献３〜５）。従って、配列番号１〜５によって表されるアミノ酸配列の２２〜２８位のアミノ酸については維持することが好ましい。もっとも、このＦＧＦ１の核内移行配列は、他の起源に由来する核内移行配列に置き換えることが可能であり、例えば酵母ヒストン２Ｂ由来の核移行配列（ＭＧＫＫＲＫＳＫＡＫ）等で置き換えることができる（非特許文献５）。また、この核内移行配列は、１〜数個のアミノ酸を、同じ親水性又は疎水性のアミノ酸に置換しても核内移行活性は維持されるものと考えられる。
【００３７】
また、配列番号１〜５のアミノ酸配列の１２７Ｌｙｓ及び１３３Ｌｙｓの置換は、ＦＧＦ１のヘパリンへの結合、ＦＧＦＲの活性化又はＤＮＡ合成に影響を及ぼすと考えられるので（非特許文献６及び１０）、これらの位置のアミノ酸も維持することが好ましい。もっとも、本発明のキメラタンパク質は比較的安定であり、１２７Ｌｙｓを置換しても所望の活性を奏することができる。
【００３８】
ＦＧＦ１の立体構造の安定化又は至適化に寄与することが知られているアミノ酸置換を導入してもよく、例えば、配列番号１〜５に表されるアミノ酸配列の位置５５のＧｌｎをＰｒｏに、位置６２のＳｅｒをＩＩｅに、位置１０８のＨｉｓをＧｌｙに、位置１２７のＬｙｓをＡｓｎにそれぞれ置換することができる（非特許文献９、１０及び１９）。このような置換は１つのアミノ酸のみであっても又は複数のアミノ酸であってもよいが、すべての位置でこれらのアミノ酸を置換した方が安定性が向上する。もっとも、本発明で用いるキメラタンパク質は、後述する実施例で実証される通り、このようなアミノ酸置換を導入しなくとも比較的安定であり細胞内にも移行することができる。
このようなアミノ酸の置換に加え、上記で維持することが望ましいとされたアミノ酸以外については、上述した配列同一性を有する範囲で他のアミノ酸で置換してもよい。但し、置換されるアミノ酸の数は、好ましくは１０個未満であり、より好ましくは８個未満であり、更に好ましくは５個未満である。
【００３９】
完全ＦＧＦ１のＣ末端領域の全部又は一部欠けている変異体、或いは同領域の途中に他のアミノ酸配列が挿入されて同領域が分断されている変異体でもＦＧＦ１の活性は維持されると考えられる。従って、例えば、配列番号１〜５によって表されるアミノ酸配列の１５２〜１５５のＦＧＦ１Ｃ末端領域のアミノ酸の全部又は一部を欠く変異体であってもよく、このＦＧＦ１Ｃ末端領域のアミノ酸の途中に他のアミノ酸配列が挿入された変異体であってもよい。典型的な例としては、配列番号１〜５によって表されるアミノ酸配列の１５０と１５１の間に、例えばＣＰＰ等の他の起源由来のアミノ酸配列が挿入されてＣ末端領域が分断されているＦＧＦ１変異体を挙げることができる。一方、配列番号１〜５の何れかによって表される１〜１５０のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有することが好ましく、９５％以上の配列同一性を有することがより好ましい。
【００４０】
なお、ＦＧＦ１の一部のアミノ酸の置換及び削除については、例えば、非特許文献９、１０及び１９等で報告されており、本明細書では、それらの内容を参照により組み込む。
【００４１】
１−２．ＦＧＦ２
ＦＧＦ２も、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ等の哺乳動物で知られる生理活性物質であり、ヒトＦＧＦ２としては、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を有するものがあり、マウスＦＧＦ２としては、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を有するものがある。また、ラットＦＧＦ２としては、配列番号８によって表されるアミノ酸配列を有するものがあり、ウシＦＧＦ２としては、配列番号９によって表されるアミノ酸配列を有するものがあり、ウマＦＧＦ２としては、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列を有するものがある。本発明では何れの哺乳動物に由来するＦＧＦ２でキメラタンパクを構成してもよく、例えば、治療対象となる動物に応じて選択することができる。
【００４２】
これらＦＧＦ２の動物間におけるアミノ酸配列を比較すると、ヒトＦＧＦ２のＮ末端には、他の動物で見られない配列が存在する。一方、総ての動物間で９５〜９９％と極めて高い配列同一性を有する領域が存在し、この共通ドメインが、ＦＧＦ２の活性に関連すると考えられる。
【００４３】
具体的には、配列番号６によって表されるアミノ酸配列の１３４〜２８８のアミノ酸、及び配列番号７乃至１０によって表されるアミノ酸配列は、相互に９５％以上の配列同一性を有し、これらのアミノ酸配列の何れかに対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であれば、配列番号６〜１０の何れかによって表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換若しくは欠失し、又は他のアミノ酸が付加されてもＦＧＦ２活性を奏すると考えられる。
【００４４】
また、ＦＧＦ１と同様に、完全ＦＧＦ２のＣ末端領域の全部又は一部欠けている変異体、或いは同領域の途中に他のアミノ酸配列が挿入されて同領域が分断されている変異体でもＦＧＦ２の活性は維持されると考えられる。例えば、配列番号６によって表されるアミノ酸配列の２８３〜２８８のアミノ酸、配列番号７〜９によって表されるアミノ酸配列の１４９〜１５４のアミノ酸、又は配列番号１０によって表されるアミノ酸配列の１５０〜１５５のアミノ酸の全部又は一部を欠く変異体であってもよく、このＦＧＦ２Ｃ末端領域のアミノ酸の途中に他のアミノ酸配列が挿入された変異体であってもよい。典型的な例としては、配列番号６によって表されるアミノ酸配列の２８２と２８３の間、配列番号７〜９によって表されるアミノ酸配列の１４８と１４９の間、又は配列番号１０によって表されるアミノ酸配列の１４９と１５０の間に、例えばＣＰＰ等の他の起源由来のアミノ酸配列が挿入されてＣ末端領域が分断されているＦＧＦ２変異体を挙げることができる。
【００４５】
なお、これらＦＧＦ２における共通ドメインをＦＧＦ１（配列番号１〜５の１〜１５５のアミノ酸）と比較すると、５３〜５５％の配列同一性を有する。
【００４６】
１−３．ＣＰＰ
本発明で有効成分として使用されるキメラタンパクは、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２にＦＧＦ１１サブファミリーＣＰＰ−Ｃドメインを含むＣＰＰ（ＣＰＰ−Ｃ）を融合した構造を有する。ＣＰＰをＦＧＦ１等に融合させたキメラタンパク質としては、ジフテリア毒素ＡをＦＧＦ１に融合させたキメラタンパクが知られているが、このキメラタンパク質を投与してＦＧＦ１を細胞内に移行させてもＤＮＡの合成に止まり、細胞分裂及び増殖にはＦＧＦＲの関与が必要であると理解されていたところ（非特許文献４及び２４）、ＦＧＦ１にＣＰＰ−Ｃを融合させたキメラタンパク質では、ＦＧＦ１が種々の生理活性を発揮した。
【００４７】
ＣＰＰ−Ｃは、ヒト、マウス、ラット、ウシ及びウマ等の哺乳動物から得ることができ、キメラタンパク質の投与対象又は使用目的等に応じて適宜選択することができる。
例えば、ヒトＦＧＦ１１乃至１４のＣＰＰ−Ｃドメインは、それぞれ、配列番号１１、１２、１３及び１４に示すアミノ酸配列で表わされる。マウスＦＧＦ１１乃至１４のＣＰＰ−Ｃドメインは、それぞれ、配列番号１５、１６、１７及び１８によって表されるアミノ酸配列で表わされる。また、ラットＦＧＦ１１乃至１４のＣＰＰ−Ｃドメインは、それぞれ、配列番号１９、２０、２１、及び２２に示すアミノ酸配列で表わされ、ウシＦＧＦ１１乃至１４のＣＰＰ−Ｃドメインは、それぞれ、配列番号２３、２４、２５、及び２６に示すアミノ酸配列で表わされ、ウマＦＧＦ１１、ＦＧＦ１３及び１４のＣＰＰ−Ｃドメインは、それぞれ、配列番号２７、２８、及び２９に示すアミノ酸配列で表わされる。
【００４８】
ＦＧＦ１１サブファミリーＣＰＰ−Ｃドメインの動物間での配列同一性は、ＦＧＦ１１で８０〜１００％、ＦＧＦ１２で１００％、ＦＧＦ１３で１００％、ＦＧＦ１４で１００％である。また、例えば、ヒトでのＦＧＦ１１サブファミリーＣＰＰ−Ｃドメイン間での配列の異同は、図１Ｂに示す通りであり、６０から８０％の配列同一性を有し、２〜４個のアミノ酸が相互に異なる。一方、図１Ｃに示すように、例えば、ヒトでのＦＧＦ１１サブファミリー間では、親水性アミノ酸又は中性アミノ酸と疎水性アミノ酸との配列パターンが共通し、ＣＰＰ−Ｃドメインを構成するアミノ酸配列のＮ末端側から３番目及び９番目のアミノ酸は親水性で、７番目のアミノ酸は中性で、８番目は親水性又は中性で、その他の部位はすべて疎水性となっている。
【００４９】
従って、配列番号１１〜２９の何れかによって表わされるＣＰＰ−Ｃドメインと親水性アミノ酸又は中性アミノ酸と疎水性アミノ酸との配列パターン、好ましくは親水性アミノ酸、中性アミノ酸及び疎水性アミノ酸の配列パターンが共通し、且つ６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有するＦＧＦ１１サブファミリーＣＰＰ−Ｃの変異体であれば、キメラタンパク質の細胞内移行を可能にすると考えられる。もっとも、極性がより近いアミノ酸間で置換することが好ましく、例えば以下に示すアミノ酸で構成されるＣＰＰ−Ｃドメインを含むペプチドが好ましい。
１番目：  プロリン、又はロイシン（好ましくは、プロリン）
２番目：  イソロイシン、又はロイシン（好ましくは、ロイシン）
３番目：  グルタミン酸、又はリジン（好ましくは、グルタミン酸）
４番目：  バリン
５番目：  システイン、又はアラニン（好ましくは、アラニン）
６番目：  メチオニン、又はバリン（好ましくは、メチオニン）
７番目：  チロシン
８番目：  アルギニン、リジン、又はグルタミン（好ましくは、アルギニン）
９番目：  グルタミン酸
１０番目：プロリン
【００５０】
キメラタンパク質を構成するＣＰＰは、ＣＰＰ−Ｃドメインを構成するアミノ酸配列の両端又はその一方に更に１以上のアミノ酸が付加されたものでもよく、例えば、１０より多く、４０以下のアミノ酸からなるＣＰＰ−Ｃとすることができる。また、例えば、全体が各種哺乳動物のＦＧＦ１１〜１４の何れかに由来するＣＰＰ−Ｃであって、連続する１０より多いアミノ酸からなるＣＰＰ−Ｃとすることができる。もっとも、このような追加のアミノ酸は少ない程細胞膜透過効果が大きい。従って、追加のアミノ酸を含むＣＰＰ‐Ｃは、好ましくは４０以下、より好ましくは２５以下、更に好ましくは２０以下、より更に好ましくは１５以下のアミノ酸残基で構成され、特に好ましくはＣＰＰ−Ｃドメインのみで構成される。同様の観点から、全体がヒトＦＧＦ１１〜１４に由来するＣＰＰ−Ｃとする場合には、配列番号１１〜１４の何れかで表されるアミノ酸配列を含み、且つ好ましくは連続する４０以下のアミノ酸、より好ましくは連続する２５以下のアミノ酸、更に好ましくは連続する２０以下のアミノ酸、より更に好ましくは連続する１５以下のアミノ酸で構成され、特に好ましくは配列番号１１〜１４の何れかで表されるアミノ酸配列のみで構成される。勿論、ＣＰＰを構成するアミノ酸配列は、上述したような、ＣＰＰ−Ｃドメインの疎水性アミノ酸又は中性アミノ酸と、親水性アミノ酸との配列パターンを維持しながら一部の、好ましくは数個以内のアミノ酸が置換されていてもよい。
【００５１】
なお、ＦＧＦ１１サブファミリーメンバー由来のＣＰＰについては、非特許文献８に詳細に記載されており、本明細書では、それらの内容を参照により組み込む。
【００５２】
１−４．ＣＰＰのＦＧＦ１との結合
本発明によるキメラタンパクは、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２に、ＣＰＰ−Ｃが融合されているものであるが、両者は、直接結合してもよく、ペプチドからなる連結部分を介して結合してもよい。ペプチドからなる連結部分としては、アスパラギン酸やグルタミン酸等の親水性アミノ酸で構成することが好ましい。また、立体構造の点から、１０個未満のアミノ酸からなる連結部分が好ましく、３個未満のアミノ酸からなる連結部分がより好ましい。
【００５３】
ＣＰＰ−Ｃは、他のペプチドを連結させない場合には、ＦＧＦ１のＮ末端側に結合させることができるが、通常は、Ｃ末端側に結合されるか、Ｃ末端領域のアミノ酸配列の途中に挿入される。より具体的には、例えば、配列番号１〜５に示すアミノ酸配列の１５１〜１５５の任意の位置でＣ末端側を切断して得られたＦＧＦ１変異体、或いは完全ＦＧＦ１又はＣ末端領域が完全に維持されているＦＧＦ１変異体のＣ末端に連結部分を介して又は介さずにＣＰＰを結合することができる。また、例えば、配列番号１〜５に示すアミノ酸配列の１５１〜１５５の任意の位置に、ＣＰＰ−Ｃを１つ又は２つの連結部分を介して又は介さずに挿入することができる。
【００５４】
同様に、配列番号６によって表されるアミノ酸配列の２８３〜２８８のアミノ酸、配列番号７〜９によって表されるアミノ酸配列の１４９〜１５４のアミノ酸、又は配列番号１０によって表されるアミノ酸配列の１５０〜１５５のアミノ酸の任意の位置でＣ末端側を切断して得られたＦＧＦ２変異体、或いは完全ＦＧＦ２又はＣ末端領域が完全に維持されているＦＧＦ２変異体のＣ末端に連結部分を介して又は介さずにＣＰＰを結合することができる。また、例えば、配列番号６によって表されるアミノ酸配列の２８３〜２８８のアミノ酸、配列番号７〜９によって表されるアミノ酸配列の１４９〜１５４のアミノ酸、又は配列番号１０によって表されるアミノ酸配列の１５０〜１５５のアミノ酸の任意の位置に、ＣＰＰ−Ｃを１つ又は２つの連結部分を介して又は介さずに挿入することができる。
【００５５】
このような構成は、元のＦＧＦ１又はＦＧＦ２のアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列としながらＣＰＰ−Ｃを導入することができるため、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２の本来の機能を維持する点で好ましい。
【００５６】
図１Ａは、本発明の好適な実施形態によるＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の構造を模式的に示す。この実施形態では、ＦＧＦ１のアミノ酸配列は、１５０と１５１の間で分断されており、ＦＧＦ１１サブファミリーメンバーのＣＰＰ−Ｃが、ＥｃｏＲＩ切断配列及びＳａｌＩ切断配列を介してその位置に挿入されている。この実施形態では、ＣＰＰ−Ｃは、ＣＰＰ−Ｃドメインを構成する１０個のアミノ酸のみで構成され、ＦＧＦ１の１〜１５０のアミノ酸配列は維持されている。従って、細胞膜透過能が高く、ＦＧＦ１の生物学的又は薬理学的活性が完全に維持されているものと考えられる。実際、後述する実施例で実証する通り、様々な薬理作用を高レベルで発揮することができる。このようなキメラタンパク質の具体的なアミノ酸配列を配列番号３０〜３３に示す。
【００５７】
１−５．キメラタンパク質の調製方法
上述したＣＰＰ−ＦＧＦ１又はＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパク質の調製方法の例を以下に示す。
【００５８】
ＦＧＦ１又はＦＧＦ２をコードするＤＮＡを合成又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で複製する。このＤＮＡの適当な部位に制限酵素切断部位を付加し、制限酵素で切断しておく。
【００５９】
一方、ＣＰＰをコードし、対応する制限酵素切断末端をも有する１本鎖ＤＮＡ断片を合成し、アニーリングにて２本鎖にする。その後、ＤＮＡリガーゼを用いてＦＧＦ１又はＦＧＦ２をコードするＤＮＡの切断部位にＣＰＰをコードするＤＮＡ断片を挿入、結合させる。制限酵素としては１種類又は２種類を用いることができる。
このキメラタンパク質をコードするＤＮＡを組み込むベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれのベクターも使用できる。例えば、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＥＴ−３）、枯草菌由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージやその誘導体、レトロウイルス、アデノウイルスやワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、昆虫ウイルスなどの発現ベクターが挙げられる。
【００６０】
キメラタンパク質の遺伝子は、その５’末端に翻訳開始コドンとしてＡＴＧを有してもよく、３’末端に翻訳終始コドンとしてＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＡＴＧを有してもよい。また、これら発現ベクターでは、ＣＰＰ−ＦＧＦキメラタンパク質のコード配列の上流にプロモーターを設け、その遺伝子を宿主で発現可能とすることが好ましい。プロモーターは、遺伝子の発現に用いる宿主にとって適切なものならば、いかなるものでもよい。
宿主としては、大腸菌（例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ）、枯草菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ３０５）、酵母（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物細胞（例えばＣＯＳ  ｃｅｌｌ，  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ、ＢＨＫ  ｃｅｌｌ、ＮＩＨ３Ｔ２  ｃｅｌｌ、ＨＵＶＥ  ｃｅｌｌ，  ＬＥＩＩ  ｃｅｌｌ）、昆虫細胞などが挙げられる。
【００６１】
形質転換は、それぞれの宿主に応じて適用可能な方法を選択すればよく、例えば、大腸菌が宿主の場合は、カルシウム法やその他の方法で作成したコンピータント細胞に、温度ショック法やエレクトロポレーション法にて組み換えＤＮＡ又はベクターを導入できる。
【００６２】
このようにして、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質をコードする組み換えＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換体が得られ、この形質転換体を培養することで、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質が産生される。形質転換体の培養には、宿主に応じて適切な培地を選択すればよく、例えば、大腸菌が宿主の場合、ＬＢ培地を用い、酵母の場合はＹＰＤ培地などを用いる。培養条件も、それぞれの宿主に応じて適宜適切な条件を選択すればよく、例えば、大腸菌が宿主の場合は、約３０〜３７℃で約３〜２４時間培養を行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることができる。
【００６３】
培養後、培養菌体若しくは培養細胞を破壊して、キメラタンパク質を溶出させる方法としては、例えば、ホモジナイザー、フレンチプレス、超音波、リゾチーム、凍結融解などがある。キメラタンパク質の精製は、可溶性分画から既知の分離法及び精製法を単独又は組み合わせて行うことができる。そのような分離法又は精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、及び等電点電気泳動などを挙げることができる。好適な一例として、キメラタンパク質のＦＧＦ１部分にヘパリン結合ドメインが保存されている場合に、そのヘパリン結合性を利用して単離する方法を挙げることができる。具体的には、例えば、ヘパリンセファロースクロマトグラフィにキメラタンパク質を吸着させ、塩化ナトリウムのグラジエントを用いて溶出させることで分離・精製できる。
【００６４】
以上のように得られたキメラタンパク質は、通常、４℃以下で冷蔵若しくは冷凍保存することが好ましい。また、活性が失われない限りにおいて透析を行い適当な溶媒に置換も可能である。さらに、凍結乾燥を行い乾燥粉末とすることもできる。
【００６５】
２．組換えＤＮＡ又はベクター
本発明では、上述したキメラタンパク質をコードする組換えＤＮＡ又はそのような組換えＤＮＡを有するベクターを有効成分として使用することもできる。この実施の形態では、例えば、このような組換えＤＮＡ又はベクターを用いて上述したキメラタンパク質を体内で発現させて目的の治療を行うこともできる。
【００６６】
組換えＤＮＡとしては、配列番号１〜５の何れかで表されるＦＧＦ１又は配列番号６〜１０の何れかで表されるＦＧＦ２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の配列同一性を有するDNA配列と、配列番号１１〜２９の何れかで表されるFGF11サブファミリーCPP-Cドメイン又はこれと疎水性アミノ酸又は中性アミノ酸と親水性アミノ酸との配列パターンが同じアミノ酸配列をコードするDNA配列とを含む組み換えＤＮＡを典型例として挙げることができる。
【００６７】
ベクターとしては、遺伝子治療用に一般的に用いられているものでよく、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス、プラスミド等が挙げられ、目的に応じて好適なものを選択することができる。特に、センダイウイルスが好ましい。
また、本発明によるキメラDNAを生体に導入し発現する方法としては、例えば、膜融合リポソーム、ナノ粒子等がある。
【００６８】
３．キメラタンパクの医薬用途
本発明によるＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質は、ＦＧＦ１を主要な構成部分とするため、天然のＦＧＦ１で予防若しくは治療可能な症状又は疾患に有効である。従って、発生期だけでなく成人において脳、中枢神経、腎臓、胎盤、副腎、皮膚、毛髪、鼓膜、眼、腸管などの消化管などさまざまな組織での細胞分裂、細胞増殖、抗アポトーシス、幹細胞の防護、血管新生等の生理作用が関与する種々の医学的用途に有効である。例えば、本発明のキメラタンパク質は、これらに限定されるものではないが、放射線、化学療法、物理的介入、アポトーシス又はその他の原因による、脳、中枢神経、腎臓、胎盤、副腎、皮膚、毛髪、鼓膜、眼、腸管等の消化管、卵巣等の生殖組織などの組織の脱落、変性、潰瘍、壊死、損傷又は障害、或いは下肢虚血性疾患又は虚血性冠動脈疾患等の虚血性症状又は疾患、或いは肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌、腎細胞癌、有棘細胞癌、悪性黒色腫、子宮体癌、卵巣癌、膀胱癌、尿管癌、血管肉腫等の腫瘍細胞の増殖又は転移等の予防又は治療に有効である。
【００６９】
本発明によるＣＰＰ−ＦＧＦ１又はＣＰＰ−ＦＧＦ２キメラタンパク質は、ＦＧＦＲに依存せずに細胞内に移行しＦＧＦ１又はＦＧＦ２による生物学的又は薬理学的活性を発揮することができる。このため、本発明のキメラタンパク質は、特に、ＦＧＦＲの発現が元来少ないリンパ球等血液系細胞や、熱傷、放射線、血流障害、感染などさまざまな要因によりＦＧＦＲの発現が低下した組織、ＦＧＦＲの発現プロファイルが正常組織と異なる腫瘍、或いは何らかの原因でＦＧＦ１若しくはＦＧＦ２が細胞内に移行できない又はＦＧＦＲと相互作用できない症状の予防又は治療に有効である。このような症状又は疾患では、ＦＧＦＲの低発現等が障害になり天然のＦＧＦ１等の投与では十分な予防又は治療効果が得られなかったため、本発明の組成物は、このような症状又は疾患に対し、より高い予防又は治療効果をもたらすことができる。このような疾患又は症状の例としては、例えば、熱傷による皮膚組織の障害、放射線若しくは化学療法による腸管等の組織の障害、放射線若しくは化学療法による脱毛症等の放射線等によって誘導されるアポトーシスに起因する組織の脱落、下肢虚血性疾患若しくは虚血性冠動脈疾患等の虚血性症状又は疾患、糖尿病性皮膚潰瘍若しくは糖尿病性壊疽、或いは肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌、腎細胞癌、有棘細胞癌、悪性黒色腫、子宮体癌、卵巣癌、膀胱癌、尿管癌、血管肉腫等の腫瘍細胞の増殖又は転移等の予防又は治療等がある。
【００７０】
本発明によるキメラタンパク質等を含む医薬組成物は、その他の成分については特に制限はなく、例えば、医薬的に許容できる溶剤、希釈剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って、液剤、注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤、坐剤、軟膏、腸溶剤又はカプセル剤などの剤型に調製することができる。本発明による医薬組成物は、投与ルートについても特に制限はなく、適応症や剤型等に応じて経口的に又は血管内、皮下、腹腔内、腫瘍内等の非経口的により投与することができる。本発明による医薬組成物の投与量は、剤型、投与ルート、及び症状により適宜変更されるが、例えばヒトを含む哺乳類に、経静脈的に投与する場合は、キメラタンパク質を１日あたり、０．００１〜１ｍｇ／体重ｋｇ程度とすることが好ましく、皮下注射により投与する場合は、キメラタンパク質を１日あたり、０．０１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ程度とすることが好ましい。
【００７１】
また、本発明の医薬組成物は、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質以外に、活性成分を含んでもよく、そのような追加の活性成分としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ等のサイトカインやＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ等の他の細胞増殖因子、あるいはそれらを標的とする分子標的薬等を挙げることができる。
このような併用される活性成分は、適応症に応じて選択され、例えば、腫瘍の治療の場合には、分子標的薬等を組み合わせることができ、放射線障害の予防又は治療においては、サイトカインや増殖因子等を組み合わせることができる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００７３】
試験方法及び試験材料
各実施例で利用した試験方法及び材料をここでまとめて示す。
１．ＦＧＦ１、ＦＧＦ１２Ｂ及びＦＧＦ１２Ｂフラグメント
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＦＧＦ１を非特許文献８に記載する方法に従って、調製した。ＦＧＦ１２Ｂ及びＦＧＦ１２Ｂフラグメントも非特許文献８に記載する手順で調製した。ＦＧＦ１２Ｂのアミノ酸配列を配列番号３４に示す。
２．キメラタンパク質
ＦＧＦ１１サブファミリーであるＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３及びＦＧＦ１４に由来する各ＣＰＰ−ＣをＦＧＦ１に融合したキメラタンパク質（以下、それぞれＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４と略称する）を、非特許文献８に記載する方法に従って調製した。非特許文献８の関連記載を参照によりここに組み込む。
各キメラタンパク質の構造を図１Ａに示し、キメラタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３０〜３３に示す。
３．ＦＡＣＳ
非特許文献８に記載する方法に従って、各ＦＧＦを蛍光標識し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社製）にて蛍光強度を測定した。
４．ＴＵＮＥＬアッセイ
非特許文献８に記載する方法に従って、マウス組織のパラフィン包埋切片よりアポトーシスを検出した。
５．実験マウス
各実施例でのマウスの処理は、放射線医学総合研究所動物実験委員会により事前に承認された動物実験計画に記載する動物倫理に基づき行われた。【００７４】
細胞内移行能の評価１
この試験では、ＦＧＦＲの発現が低い細胞に対するＣＰＰ‐ＦＧＦ１キメラタンパク質の細胞内移行能を評価した。【００７５】
この試験では、試験細胞として、ラット小腸細胞株ＩＥＣ６を用い、２４ウェルプレートにウェル当り１ｘ１０５個播種した。各ウェルに５％ＦＣＳ及び４μｇ／ｍｌインスリンを含有するＤＭＥＭ培地を加え、６時間培養してプレートに細胞を付着させた。その後、蛍光ラベルしたＦＧＦ１２Ｂ、Ｃ末端を１０残基ずつ追加的に削った各ＦＧＦ１２Ｂフラグメント（Δ１７０−１８１、Δ１６０−１８１、Δ１５０−１８１、及びΔ１４０−１８１）、ＦＧＦ１、ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４をそれぞれ１μｇ／ｍｌとなるようにプレートに添加し、２４時間培養後、トリプシンにて細胞をプレートより剥がし、ＦＡＣＳでその蛍光強度を測定して、細胞内に移行したＦＧＦの量を測定した。【００７６】
図２Ａは、ＦＧＦ１２Ｂ又は各ＦＧＦ１２Ｂフラグメントの添加前後のＦＡＣＳヒストグラムを示し、図２Ｂは、ＦＧＦ１又は各ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラ蛋白質の添加前後のＦＡＣＳヒストグラムを示す。点線が各ＦＧＦを添加前の細胞のＦＡＣＳヒストグラムであり、実線が各ＦＧＦを添加した後の細胞のＦＡＣＳヒストグラムである。【００７７】
図２Ａに示す通り、ＦＧＦ１２Ｂで培養した細胞は、実線の細胞集団の右への移動が大きく、細胞の蛍光強度が強いことが分る。ＦＧＦ１２ＢのＣ末端から１０残基ずつ欠損させても、アミノ酸残基１−１４９を維持しているＦＧＦ１２Ｂフラグメント（Δ１７０−１８１、Δ１６０−１８１、及びΔ１５０−１８１）では蛍光強度が殆ど変わらず強いままであった。但し、この中では最も短いアミノ酸残基１５０−１８１を切断したフラグメントで蛍光強度が最大となった。一方、アミノ酸残基１４０−１８１を切断したフラグメントでは蛍光強度が急激に弱まった。これらの結果から、ＦＧＦ１２Ｂのアミノ酸残基１４０−１４９が、ＣＰＰ−Ｃドメインであることが推認され、その一方で、このＣＰＰ−Ｃドメインの前後にアミノ酸が付加されても細胞内移行能が保持されることが示された。また、ＣＰＰ−Ｃドメインの前後に付加されるアミノ酸の数は、少ない方がより高い細胞内移行能を奏することも推察された。【００７８】
図２Ｂに示す通り、ＦＧＦ１で培養した細胞は、実線の細胞集団の右への移動が少なく、細胞の蛍光強度が弱いことが分る。一方、各キメラタンパク質（ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４）と共に培養した細胞ではＦＧＦ１と比較して実線の細胞集団の右への移動が大きく、細胞の蛍光強度が強いことが分る。４種のキメラタンパク質間では蛍光強度はほぼ同等であった。この結果から、ＦＧＦ１と比較して、ＣＰＰ‐ＦＧＦ１キメラタンパク質の方が、効率よく細胞内へ移行できることが実証された。【００７９】
アポトーシス抑制効果に関する評価１
この試験では、放射線により誘発される細胞のアポトーシスに対するＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の抑制効果を評価した。【００８０】
この試験でも、試験細胞としてＦＧＦＲを発現していないラット小腸細胞株ＩＥＣ６を用い、この細胞を、各３．５ｃｍディッシュに３ｘ１０４個まき、各ディッシュに５％ＦＣＳ及び４μｇ／ｍｌインスリンを含有するＤＭＥＭ培地を加えた。各ディッシュを、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気のインキュベータに入れ、１６時間培養した。次いで、５μｇ／ｍｌの濃度でヘパリンを各培地に加え、コントロール群では、ＦＧＦを添加せず、各試験群ではそれぞれＦＧＦ１、ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４を１００ｎｇ／ｍｌとなる濃度で添加し、さらに２４時間培養後、Ｘ線を２０Ｇｙ照射した。照射２４時間後に細胞を２％グルタルアルデヒドで固定し、２０μｇ／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８にて核染色を行い、倒立蛍光顕微鏡で１視野２００細胞以上を１０視野鏡検し、核凝縮を伴う細胞数を算出した。この核凝集細胞をＸ線照射によりアポトーシスを誘発された細胞とみなし、各視野で鏡検した全細胞数に対する核凝集細胞数の割合を、アポトーシス率として評価した。【００８１】
図３は、コントロール群及び各試験群のアポトーシス率の平均値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。図中＊＊は、コントロール群に対する多重検定によりＰ＜０．０１となった試験群を示し、＊＊＊は同検定でＰ＜０．００１となった試験群を示す。【００８２】
ＦＧＦを含まないコントロール群では、アポトーシス率は約４５％に達した。また、ＦＧＦ１を添加した試験群でもコントロール群に対して有意なアポトーシス率の減少は認められなかった。一方、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質（ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４）を添加した試験群では、何れも、コントロール群に対して有意にアポトーシス率が減少した。これにより、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲを発現していない細胞のアポトーシスを効果的に抑制し得ないが、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質は、そのような細胞であってもアポトーシスを抑制することができることが実証された。本来、ＦＧＦＲを介してアポトーシスを抑制することが期待されるＦＧＦ１が、コントロールに対して有意差を示さなかったことは、ＩＥＣ６細胞にＦＧＦＲの発現が確認されていないことと整合的である。一方、このような条件でも、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラ蛋白質がアポトーシスを抑制できることは、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラ蛋白質がＦＧＦＲの発現に依存せず細胞内へ移行できる特性に起因する可能性が高い。【００８３】
アポトーシス抑制効果に関する評価２
この試験では、放射線により誘発される細胞のアポトーシスに対するＦＧＦ１２Ｂ及びＦＧＦ１２フラグメントの抑制効果を評価した。【００８４】
この試験では、図４Ａに示すＦＧＦ１２Ｂ及び各ＦＧＦ１２フラグメントをＦＧＦとして用いた。Ｐ８のフラグメントはＣＰＰ−Ｍを含み、Ｐ１１及びＰ１２のフラグメントはＣＰＰ−Ｃを含んでいる。試験細胞としては、この試験でもラット小腸細胞株ＩＥＣ６を用いた。
試験手順は、上述のアポトーシス抑制効果に関する評価と同様である。図４Ｂは、コントロール群及び各試験群のアポトーシス率の平均値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。図中＊は、コントロール群に対する多重検定によりＰ＜０．０５となった試験群を示し、＊＊＊は同検定でＰ＜０．００１となった試験群を示す。【００８５】
ペプチドを含まないコントロール群では、アポトーシス率は約４５％に達した。また、Ｐ８、Ｐ１０、及びＰ１２を添加した試験群では、何れも、コントロール群に対して有意にアポトーシス率が減少した。一方、やはりＣＰＰ−Ｃを含んでいるＰ１１を添加した試験群では、コントロール群に対して有意にアポトーシス率が減少しなかった。これにより、ＣＰＰ−Ｃを含む３０アミノ酸からなるＰ１２はアポトーシスを抑制するが、１０アミノ酸からなるＣＰＰ−Ｃ自身はアポトーシスを抑制できないことが実証された。さらに、中央部のＣＰＰ−Ｍドメインを含むペプチドも、アポトーシスを抑制することが実証された。
【００８６】
図４Ｃは、ＦＧＦ１２ＢのＣ末端ペプチドの細胞内移行能を示す。蛍光標識した各ペプチドを１０μｇ／ｍｌとなる濃度で添加後のＩＥＣ６細胞株の蛍光陽性率をＦＡＣＳで経時的に測定したグラフである。２４時間をピークにＣＰＰ−Ｃを含むＰ１２は細胞内に移行した。同じくＣＰＰ−Ｃを含むＰ１１は、Ｐ１２よりも蛍光陽性率が低いものの、Ｐ１２と同様に２４時間をピークに細胞内に移行した。一方、Ｐ１０とＰ１３は２４時間後では蛍光陽性率は極めて低かった。【００８７】
図４Ｄは、ペプチド又は生理食塩水腹腔投与群におけるクリプト生存率の平均値を示すグラフである。８週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスを使用し、コントロール群では、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水をマウスの腹腔に投与し、試験群では、それぞれ１００μｇのＰ８、Ｐ１０、Ｐ１２を、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水で希釈して、マウスの腹腔に投与した。その２４時間後に１０Ｇｙのガンマ線を０．５Ｇｙ／ｍｉｎの線量率で各群のマウスに全身照射した。照射３．５日後にマウスを安楽死させ、空腸を採取した。１０％ホルマリンで空腸を固定した後、パラフィン包埋切片を作成し、ＨＥで切片を染色した。顕微鏡により１０以上のクリプト細胞が存在するクリプトを生存と判断して１０個の腸横断面について横断面あたりのクリプト数を数え、その平均値を算出した。さらに、この平均値を、放射線非照射群の横断面あたりのクリプト数の平均値で割って相対値（クリプト生存率）を求めた。各群における３個体のマウスのクリプト生存率の平均値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示した。【００８８】
Ｐ８またはＰ１２を投与した群では、空腸のクリプト生存率は、コントロール群に対しても有意に高かったが、Ｐ１０を投与した群では空腸のクリプト生存率はコントロール群に対して有意に高くならなかった。【００８９】
毛包障害予防効果に関する評価
この試験では、放射線による脱毛・毛包障害に対するＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の予防効果を評価した。毛包は、成長期において細胞分裂を活発に行っており、この時期では放射線に対して高い感受性を有する。このため、この時期の毛包に放射線を照射するとアポトーシスが引き起こされ易いが、このアポトーシスは毛包障害の指標となる。
そこで、成長期のマウス毛包において放射線誘導性アポトーシスに対するＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の抑制効果を測定して、毛包障害予防効果を評価した。【００９０】
生後５１−５３日齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスの背部より抜毛を行い、休止期である毛包を成長期へと誘導した。抜毛後５日目に、コントロール群では、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水をマウスの腹腔に投与し、試験群では、それぞれ１００μｇのＦＧＦ１、ＦＧＦ１２、ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４を、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水で希釈して、マウスの腹腔に投与した。２４時間後、１２Ｇｙのガンマ線を０．５Ｇｙ／ｍｉｎの線量率で全身照射した。照射２４時間後にマウスを安楽死させ、皮膚を採取し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋切片を作成し、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞をアポトーシス細胞とみなし、３視野以上において毛包バルブ毎のアポトーシス数を算定した。【００９１】
図５Ａは、各群のマウスの毛包バルブ領域を、ＴＵＮＥＬアッセイにより免疫組織染色した顕微鏡写真（２００倍）であり、図中の矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（すなわち、アポトーシス細胞）を示す。図５Ｂは、各群における３視野以上の毛包バルブあたりのアポトーシス数の平均値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示し、図中の＊＊＊は、５％マウス血清入り生理食塩水を投与したコントロール群に対する多重検定によりＰ＜０．００１となった試験群を示す。
コントロール群では、１２Ｇｙの全身ガンマ線照射により、毛包バルブ領域にアポトーシスを示すＴＵＮＥＬ陽性細胞を、毛包バルブあたり約１１個検出した。ＦＧＦ１投与群及びＦＧＦ１２投与群では、コントロール群に対して毛包バルブあたりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数が有意に減少した。また、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質（ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４）を投与した群では、いずれも、コントロール群に対してのみならずＦＧＦ１投与群（Ｐ＜０．００１）及びＦＧＦ１２投与群（Ｐ＜０．０５）に対しても有意に毛包バルブあたりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数が減少した。これにより、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質が、ＦＧＦ１やＦＧＦ１２より、脱毛・毛包障害に対するより高い予防効果を示すことが実証された。【００９２】
放射線による小腸の障害に対する予防効果
本試験では、放射線による小腸の障害に対するＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の予防効果を評価した。放射線の被ばくにより障害を受けた小腸上皮の回復過程では、幹細胞が存在するクリプトが非常に重要な役割を担う。従って、放射線による障害の程度は、クリプトに存在するアポトーシス数と相関する。そこで、放射線を照射されたマウスのクリプトにおけるアポトーシス数を測定して、放射線による小腸の障害に対するＣＰＰ−ＦＧＦ１の予防効果を評価した。【００９３】
８週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスを使用し、コントロール群では、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水をマウスの腹腔に投与し、試験群では、それぞれ１００μｇのＦＧＦ１、ＦＧＦ１２、ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４を、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水で希釈して、マウスの腹腔に投与した。２４時間後、１２Ｇｙのガンマ線を０．５Ｇｙ／ｍｉｎの線量率で各マウスに全身照射した。照射２４時間後にマウスを安楽死させ、小腸を採取し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋切片を作成し、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞をアポトーシス細胞とみなし、１０視野でクリプト毎のアポトーシス数を算定した。【００９４】
図６Ａは、各群のマウスにおける小腸のクリプトをＴＵＮＥＬアッセイにより免疫組織染色した顕微鏡写真であり、図中の矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（すなわちアポトーシス細胞）を示す。図６Ｂは、各群における１０視野のクリプトあたりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数の平均値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示し、図中の＊＊＊は、５％マウス血清入り生理食塩水を投与したコントロール群に対する多重検定よりＰ＜０．００１となった試験群を示す。【００９５】
図６Ｂに示す通り、コントロール群では、１２Ｇｙの全身ガンマ線照射により、各クリプトにアポトーシス数が平均４．４１個検出された。しかし、ＦＧＦ１投与群では、アポトーシス数が平均３．６１個と有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、ＦＧＦ１２投与群でも、アポトーシス数が平均２．１８個と有意に減少した（Ｐ＜０．００１）。各ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質（ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４）を投与した群では、それぞれ平均１．５０個、１．６３個、１．５８個、及び１．５１個とアポトーシス数が著しく減少した。コントロール群と比較したアポトーシス減少率は、ＦＧＦ１投与群では１８．１％に過ぎなかったが、ＣＰＰＦ１投与群では６６％、ＣＰＰＦ２投与群では６３．１％、ＣＰＰＦ３投与群では６４．２％、ＣＰＰＦ４投与群では６５．８％と、６０％以上に達し、これらのＣＰＰ−ＦＧＦ１投与群はＦＧＦ１投与群に対しても有意にアポトーシスを減少させた（Ｐ＜０．００１）。また、コントロール群に対するＦＧＦ１２投与群のアポトーシス減少率は、５０．５％であり、ＦＧＦ１２群に対しても有意にアポトーシスを減少させた。
これにより、ＣＰＰ−ＦＧＦキメラタンパクが、ＦＧＦ１やＦＧＦ１２と比較して、放射線による小腸の障害に対する保護効果が高いことが実証された。【００９６】
障害を受けた小腸の回復促進効果に関する評価１
この試験では、放射線照射後に再生したクリプト数を指標にして、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の放射線による障害を受けた小腸の回復を促進させる効果を評価した。【００９７】
８週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスを使用し、最初に１０Ｇｙのガンマ線を０．５Ｇｙ／ｍｉｎの線量率で各群のマウスに全身照射した。その２４時間後に、コントロール群では、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水をマウスの腹腔に投与し、試験群では、それぞれ１０μｇのＦＧＦ１、ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４を、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水で希釈して、マウスの腹腔に投与した。照射３．５日後にＢｒｄＵラベリング液を腹腔注射し、細胞分裂している細胞にＢｒｄＵを取り込ませ、２時間後にマウスを安楽死させ、空腸を採取した。１０％ホルマリンで空腸を固定した後、パラフィン包埋切片を作成し、この切片を、抗ＢｒｄＵ抗体により免疫組織染色し、次いでヘマトキシリン染色した。【００９８】
図７Ａは、ＢｒｄＵを取り込み抗ＢｒｄＵ抗体が結合した細胞を有するクリプトを示す腸横断面の顕微鏡写真である。顕微鏡により１０以上の抗ＢｒｄＵ抗体陽性細胞が存在するクリプトを生存と判断して１０個の腸横断面について横断面あたりのクリプト数を数え、その平均値を算出した。さらに、この平均値を、放射線非照射群の横断面あたりのクリプト数の平均値で割って相対値（クリプト生存率）を求めた。図７Ｂは、各群における３個体のマウスのクリプト生存率の平均値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示し、図中の＊＊は、５％マウス血清入り生理食塩水を投与したコントロール群に対する多重検定により、Ｐ＜０．０１となった試験群を示し、＊＊＊は同検定によりＰ＜０．００１となった群を示す。
５％マウス血清入りの生理食塩水を投与したコントロール群では、１０Ｇｙの全身ガンマ線照射により、空腸のクリプト生存率は０．２６にすぎず、ＦＧＦ１投与群でも、有意に増加しなかった。一方、各ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質（ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３、及びＣＰＰＦ４）を投与した群では、空腸のクリプト生存率は、それぞれ０．４５、０．４８、０．４８、及び０．５１となり、コントロール群のみならずＦＧＦ１投与群に対しても有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。この結果によっても、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質は、ＦＧＦ１と比較して、放射線により障害を受けた小腸の回復促進効果が極めて高いことが実証された。【００９９】
障害を受けた小腸の回復促進効果に関する評価２
本試験でも、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の放射線による障害を受けた小腸の回復を促進させる効果を評価した。但し、この試験では、クリプトの長さを指標とする。クリプトの長さは、クリプトに存在する細胞数、すなわち上皮細胞の増殖能を反映するので、小腸の障害からの回復能力を評価するよい指標となる。【０１００】
８週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスを使用し、１０Ｇｙのガンマ線を０．５Ｇｙ／ｍｉｎの線量率で各群のマウスに全身照射した。その２４時間後に、コントロール群では、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水をマウスの腹腔に投与し、試験群では、それぞれ１０μｇのＦＧＦ１、ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４を、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水で希釈して、マウスの腹腔に投与した。照射３．５日後にＢｒｄＵラベリング液を腹腔注射し、細胞分裂している細胞にＢｒｄＵを取り込ませ、２時間後にマウスを安楽死させ、空腸を採取した。１０％ホルマリンで空腸を固定した後、パラフィン包埋切片を作成し、この切片を、抗ＢｒｄＵ抗体により免疫組織染色し、次いでヘマトキシリン染色した。【０１０１】
図８Ａは、各群において、ＢｒｄＵを取り込み抗ＢｒｄＵ抗体が結合した細胞を有するクリプトを示す免疫組織染色した小腸上皮の顕微鏡写真である。顕微鏡により各群の組織像を３画像撮影し、各画像で１０クリプトの長さを測定して群毎に平均値を求め、この平均値に基づき生理食塩水を投与したコントロール群に対する相対値を算出した。図８Ｂは、各群のクリプト長さの平均相対値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示し、図中＊＊＊は、コントロール群に対する多重検定により、Ｐ＜０．００１となった試験群を示す。【０１０２】
ＦＧＦ１投与群は、コントロール群と比較して、１０Ｇｙの全身ガンマ線照射後３．５日後において空腸のクリプトは有意に長かった。一方、各ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質（ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３、及びＣＰＰＦ４）を投与した群では、空腸のクリプトは、コントロール群と比較して、２倍以上長かっただけでなく、ＦＧＦ１投与群と比較しても有意に長かった（Ｐ＜０．０１〜０．００１）。
この結果によっても、ＣＰＰ−Ｃ融合ＦＧＦは、ＦＧＦ１と比較して、放射線により障害を受けた小腸の回復促進効果がより高いことが実証された。【０１０３】
幹細胞防護効果に関する評価
この試験では、ＣＰＰ−ＦＧＦキメラタンパク質の毛包に存在する幹細胞を放射線から防護する効果について評価した。【０１０４】
生後５１−５３日齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスの背部より抜毛を行い、休止期である毛包を成長期へと誘導した。抜毛後５日目に、コントロール群では、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水をマウスの腹腔に投与し、試験群では、それぞれ１００μｇのＦＧＦ１、ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４を、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水で希釈して、マウスの腹腔に投与した。その２４時間後に１２Ｇｙのガンマ線を０．５Ｇｙ／ｍｉｎの線量率で全身照射した。照射２４時間後にマウスを安楽死させ、皮膚を採取し、１０％ホルマリンで固定した。パラフィン包埋切片を作成し、毛包幹細胞のマーカーであるＫｅｒａｔｉｎ１５に対する抗体で免疫組織化学染色を行った。【０１０５】
図９は、非照射群、５％マウス血清入り生理食塩水を投与したコントロール群及び各ＦＧＦ投与群の免疫組織化学染色した毛包バルジ領域の顕微鏡写真を示し、矢印は、Ｋｅｒａｔｉｎ１５陽性毛包幹細胞を示す。
５％マウス血清入り生理食塩水を投与し１２Ｇｙの全身ガンマ線照射したコントロール群では、非照射群に対して、毛包バルジ領域のＫｅｒａｔｉｎ１５陽性毛包幹細胞が減少した。また、ＦＧＦ１投与群でも、毛包幹細胞は照射により減少した。一方、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質（ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３、及びＣＰＰＦ４）を投与した群では、バルジ領域における毛包幹細胞数がコントロール群のみならずＦＧＦ１投与群に対しても有意に多く、毛包幹細胞数が非照射コントロール群以上のレベルまでに達した。この結果により、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質は、ＦＧＦ１と比較して、放射線に対して毛包幹細胞を保護・維持する効果がより高いことが実証された。【０１０６】
細胞内移行能に関する評価２
この試験では、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の癌細胞に対する細胞内移行能を評価した。【０１０７】
ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１を用い、この両細胞に対するＦＧＦ１、ＦＧＦ１２、及びＣＰＰＦ２の細胞内移行能を「細胞内移行能に関する評価１」で記述した手順と同様にして測定した。図１０Ａに示す通り、両細胞に対してＦＧＦ１は細胞内移行できず、ＦＧＦ１２も細胞内移行が少なかった。一方、ＣＰＰ−Ｃ融合ＦＧＦは、軽度細胞内へ移行できた。
癌細胞の増殖を抑制する効果に関する評価１
この試験では、ＷＳＴ−１の細胞による分解を利用して、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の癌細胞の増殖を抑制する効果を評価した。安定なテトラゾリウム塩であるＷＳＴ−１は、代謝活性を持つ細胞の表面で可溶性のフォルマザンに分解されるため、培養中の代謝活性を持つ細胞数と直接的に相関する。そこで、各ＦＧＦ投与前後のフォルマザン量を４５０ｎｍでの吸光度により測定して、腫瘍細胞増殖を抑制する効果を評価した。【０１０８】
９６穴プレートに１ｘ１０４個のヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１をそれぞれまき、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地で６時間培養した。その後、５μｇ／ｍｌの濃度でヘパリンを培養液に添加し、コントロール群では、ＦＧＦを添加せずに、試験群では更にそれぞれ０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦ１及びＣＰＰＦ２を培養液に添加して０．１ｍＬとした。試験は、各群に３穴割り当てて行った。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気のインキュベータに入れて１８時間培養した後、１０ｕＬのＷＳＴ−１試薬（ロッシュアプライドサイエンス社製）を培養液に添加し、さらに４時間培養した。その後、ＯＤ４５０の吸光度を測定して腫瘍細胞増殖を評価した。【０１０９】
図１０Ｂは、ＦＧＦ１及びＣＰＰＦ２の濃度と、細胞増殖に伴い増加するフォルマザン量との関係を示すグラフであり、縦軸はコントロールのＯＤ４５０値に対する吸光度差を示す。従って、数値が高い程、コントロール群に対して細胞増殖のレベルが高いことを意味する。【０１１０】
ＭＩＡＰａＣａ−２細胞では、ＦＧＦ１を加えると吸光度が増加し、コントロールよりも腫瘍細胞が増加したのに対して、ＣＰＰＦ２を加えると、１０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で細胞増殖はコントロールより減少した。一方、ＰＡＮＣ−１細胞では、０．１〜１ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１ではコントロールよりも細胞が増加するものの、１００ｎｇ／ｍＬ以上では、ＦＧＦ１添加でも細胞増殖がコントロールより減少した。ＣＰＰＦ２は、０．１ｎｇ／ｍＬでコントロールより細胞を著明に減少させ、１０００ｎｇ／ｍＬまで細胞増殖を抑制した。この結果により、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質は、膵臓癌細胞の増殖を抑制できることが実証された。【０１１１】
癌細胞の増殖を抑制する効果に関する評価２
この試験では、コロニー形成法により、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の癌細胞の増殖を抑制する効果を評価した。
【０１１２】
各６ｃｍディッシュに１００個のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１細胞をまき、１０％ＦＣＳ及び５μｇ／ｍｌヘパリンを含有するＤＭＥＭ培地をディッシュに加え、コントロール群ではＦＧＦを添加せずに、試験群では更に各ＦＧＦを１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した後、各群の培養液を１３日間培養した。その後、１％メチレンブルー／３０％メタノールで固定染色し、各群のディッシュで染色された５０細胞以上のコロニー数を算出することで、癌細胞の増殖能を評価した。
【０１１３】
試験は、各群に２ディッシュずつ割り当てて行い、各群の２ディッシュのコロニー数の平均値を求めた。図１１Ａは、コントロール群及び各ＦＧＦを添加した群の染色後の培地を示す写真である。図１１Ｂは、各群のコロニー数の平均値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示し、図中＊＊は、コントロール群に対する多重検定により、Ｐ＜０．０１となった試験群を示す。【０１１４】
ＦＧＦを添加しなかったコントロール群では、コロニー数（平均値）は１８．５個に達した。また、ＦＧＦ１を添加した群では、コントロール群に対して有意にコロニー数（平均値）が減少しなかった。一方、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質（ＣＰＰＦ１、ＣＰＰＦ２、ＣＰＰＦ３及びＣＰＰＦ４）を添加した群では、それぞれコロニー数が１１．５個、９．５個、１１個、及び１０個と、コントロール群に対して有意にコロニー数が減少した。コントロール群に対するコロニー減少率は、ＣＰＰＦ１添加群が３７．８％、ＣＰＰＦ２添加群が４８．６％、ＣＰＰＦ３添加群が４０．５％、ＣＰＰＦ４添加群が４５．９％と、いずれのＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質を添加した群でも約４０％コロニー数が減少した。ＦＧＦ１を添加した群と比べても、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質を添加した群では、コロニー数は有意に減少した（Ｐ＜０．０５〜０．０１）。この結果により、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質が、ＦＧＦ１よりも有意に癌の増殖を抑制し得ることが実証された。【０１１５】
癌細胞の増殖を抑制する効果に関する評価２
この試験では、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の癌細胞の腫瘤形成を抑制する効果をマウス移植モデルを用いて評価した。
マウスを用いた実験は、事前に承認された動物実験計画に基づき動物倫理に配慮しながら実施された。生後７週齢のオスＳＣＩＤマウスの右大腿部に、１ｘ１０６個のヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２を１０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁して皮下注射した。その１時間後、２４時間後、４８時間後、７日後、１４日後及び２１日後の合計６回、コントロール群では、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水をマウスの腹腔に投与し、試験群では、１０μｇのＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラ蛋白質（ＣＰＰＦ２）を、０．５ｍｌの５％マウス血清入り生理食塩水で希釈したものを投与した。癌細胞株皮下注射した後、皮下腫瘤の大きさを経時的にデジタルノギスで計測して、各群５匹の平均体積を算出した。
図１２は、コントロール群及び試験群における右大腿皮下腫瘍の経時的体積変化を示し、図中、矢印は腹腔内投与の時期を示す。ＣＰＰＦ２を投与した試験群では、腫瘍の平均体積が１８日以降、３１日までコントロール群よりも常に小さかった。この結果により、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質に、癌細胞の腫瘤形成を抑制する効果があることが示された。【０１１６】
癌細胞転移抑制効果に関する評価
この試験では、浸潤アッセイによりＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質による癌細胞の転移を抑制する効果を評価した。癌細胞は細胞転移を起こす際にプロテアーゼを分泌して基底膜を破壊して遊走する特性があり、この癌細胞の特性を利用する浸潤アッセイを使ってＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質の癌細胞浸潤抑制効果を評価した。【０１１７】
２４ウェルプレートのボイデンチャンバーのフィルターに６６μｇのマトリゲル２０μＬを被覆しゲル化した。その後、下部ウェルに６５０μＬの１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培養液を加えた。一方、１．５ｘ１０５個のＭＩＡＰａＣａ−２細胞又はＰＡＮＣ−１細胞を１００μＬの０．３５％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ培養液に懸濁し、この懸濁液を上部ウェルに加えた。
次いで、下部ウェル及び上部ウェルの培養液に５μｇ／ｍｌヘパリンを添加し、コントロール群のウェルではＦＧＦを無添加とし、試験群のウェルでは、更に１００ｎｇ／ｍＬになるようにそれぞれＦＧＦ１及びＣＰＰＦ２を加えた。３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気のインキュベータにプレートを入れて２４時間培養し、癌細胞のゲルへの浸潤を誘発させた。浸潤した細胞をチャンバーのフィルターごとディフクイック（Sysmex社製）で固定染色し、染色された細胞数を算出して浸潤細胞数とした。試験は、各群に４つのチャンバーを割り当てて行い、その平均値を求め、培養液に懸濁した細胞数に対する各群の浸潤細胞数の平均値の割合を求めて浸潤細胞率とした。
【０１１８】
図１３Ａは、ゲルへ浸潤した細胞をディフクイックで固定染色したフィルターの顕微鏡写真である。図１３Ｂは、各群の浸潤細胞率の平均値＋／−標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表し、図中、＊＊はコントロール群に対する多重検定により、Ｐ＜０．０１となった試験群を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１となった試験群を示す。【０１１９】
ＭＩＡＰａＣａ−２細胞は、コントロール群では２．３４％浸潤したが、ＦＧＦ１添加群では１．５２％、ＣＰＰＦ２添加群では１．０３％浸潤した。ＰＡＮＣ−１細胞は、コントロール群では１．２７％浸潤したのに対して、ＦＧＦ１添添加群では０．８１％、ＣＰＰＦ２添加群では０．２６％浸潤した。これをコントロール群に対する浸潤低下率でみると、ＦＧＦ１はＭＩＡＰａＣａ細胞で３５％、ＰＡＮＣ−１で３６％癌細胞の浸潤を抑制したのに対して、ＣＰＰ−Ｃ融合ＦＧＦ（ＣＰＰＦ２）はＭＩＡＰａＣａ細胞で５６％、ＰＡＮＣ−１で８０％と癌細胞の浸潤をより強力に抑制した。これにより、ＣＰＰ−ＦＧＦ１キメラタンパク質がＦＧＦ１と比較して癌細胞の浸潤能をより低下させ、癌の転移をより抑制することが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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