(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールを生産するための方法において：
ｉ）リグノセルロース含有材料を前処理するステップ；
ｉｉ）前処理したリグノセルロース含有材料を加水分解するステップ；
ｉｉｉ）酵母を用いて発酵するステップ；
ｉｖ）発酵後にエタノールを回収するステップ；
を含む方法であって、
前記加水分解と発酵のステップが、分離型加水分解発酵として実施され；該発酵が、発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で１０〜５０ｇの酵母の酵母濃度で開始及び実施され；そして、Ｃ６及びＣ５糖が同時に発酵される場合、該発酵がフェッドバッチ発酵として実施されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
不溶性の固体が発酵の前に又はその途中で除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
不溶性の固体が、ステップｉ）でリグノセルロース含有材料を前処理した後に除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
不溶性固体が、ステップｉｉ）で前処理済みリグノセルロース含有材料を加水分解した後に除去される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
酵母が発酵後に回収され再利用される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
加水分解中にキシロースイソメラーゼが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リグノセルロース含有材料が発酵又は加水分解の前に無毒化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
発酵培地内に導入されるリグノセルロース含有材料が洗浄されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前処理が、希酸蒸気爆発ステップとして実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
リグノセルロース含有材料が、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、広葉樹材、針葉樹材、穀物の藁、スイッチグラス、すすき（Miscanthus）、もみ殻、都市固形廃棄物、有機産業廃棄物、事務用紙又はそれらの混合物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
リグノセルロース含有材料が、１つ以上のセルラーゼ又はヘミセルラーゼ酵素又はそれらの組合せを用いた処理によって加水分解される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
加水分解のために用いられるセルラーゼが、トリコデルマ（Trichoderma）菌株に由来するセルロース分解性調製物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
トリコデルマ（Trichoderma）菌株がトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）の菌株である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、加水分解中、セルロース分解増強活性を有する１つ以上のポリペプチドが存在している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
発酵が、Ｃ６又はＣ５酵母を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
酵母が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、及びカンジダ（Candida）属の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・アルビノフェルメンタンス（Candida arabinofermentans）、カンジダ・ジデンシイ（Candida diddensii）、カンジダ・ソノレンシス（Candida sonorensis）、カンジダ・シェハタエ（Candida shehatae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、及びカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）の群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
発酵中のｐＨが３〜７の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
発酵が１〜４８時間実施される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上の発酵生物を使用してリグノセルロース含有材料から発酵製品を生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化石燃料の埋蔵量に限界があること、そして温室効果ガスの排出に関する懸念のため、再生可能なエネルギー源を使用することに増々焦点があてられるようになっている。
【０００３】
リグノセルロース含有材料からの発酵製品の生産は、当該技術分野において公知であり、リグノセルロース含有材料の前処理、加水分解及び発酵を含む。
【０００４】
発酵ステップは、発酵可能な糖を所望の発酵製品に転換することのできる発酵生物を用いて実施される。発酵生物が発酵培地に接種された後、この生物は数多くの段階を通過する。初期段階は、「遅延期」と呼ばれ、有意な量の発酵製品が全く生産されない適応期間である。成長が増大する「対数期」及び最大の成長後の段階である「静止期」と呼ばれる次の２つの段階の間、有意な量の発酵製品が生産される。発酵サイクルは典型的に最長９６時間継続する可能性があり、各サイクルを時間と費用のかかるものにしている。
【０００５】
リグノセルロース含有材料又はセルロース性「バイオマス」から発酵製品を生産するためのプロセスは、発酵プロセスにおいて使用される粗製加水分解物の中に見られる数多くの毒素に対する発酵生物の寛容性によっても制限される。加水分解物からの毒素の除去は、困難で、時間及び費用のかかるものである。費用の高い毒素除去ステップを回避するために、加水分解物中の固体百分率は、従来、総固体の１０％未満に保たれ、かくして発酵生物に対する毒素の効果を最小限におさえている。残念なことに、総固体濃度の制限は、利用可能な発酵基質が少なく、バッチあたりの発酵製品の収量が低いことを意味している。
【０００６】
かくして、高い総固体濃度をもつ粗製加水分解物を利用し、リグノセルロース含有材料から所望の発酵製品を生産するのに必要な発酵時間を短縮することがきわめて望ましい。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、１つ以上の発酵生物を用いてリグノセルロース含有材料から発酵製品を生産するための方法に関する。
【０００８】
本発明は、リグノセルロース含有材料から発酵製品を生産するための方法において：
ｉ）リグノセルロース含有材料を前処理するステップ；
ｉｉ）前処理したリグノセルロース含有材料を加水分解するステップ；
ｉｉｉ）発酵生物を用いて発酵するステップ；
を含む方法であって、
ａ）発酵培地１Ｌあたり１０〜２５０×１０10個の細胞という範囲内の発酵生物細胞計数、又は
ｂ）発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で２〜２９ｇの発酵生物という範囲内の発酵生物濃度、
で発酵が開始され実施される方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】９６時間後の２つの異なる酵母菌株内のバッチ発酵エタノール生産に対する、さまざまな量の糖溶液及び濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物の効果を実証している。
【図２】さまざまな初期酵母細胞濃度での濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物のエタノールバッチ発酵に対するＲＥＤ  ＳＴＡＲTMの高い細胞密度の効果を実証している。
【図３】さまざまな初期酵母細胞濃度での前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物のエタノールバッチ発酵に対する酵母ＲＷＢ２１８の高細胞密度の効果を実証している。
【図４】４０ｇ／Ｌの初期酵母細胞濃度での、濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物のバッチ発酵エタノール生産に対する、ＲＥＤ  ＳＴＡＲTMの高い細胞密度及びｐＨ５での細胞再循環の効果を実証している。
【図５】４０ｇ／Ｌの初期酵母細胞濃度での、濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物のバッチ発酵エタノール生産に対する、ＲＥＤ  ＳＴＡＲTMの高い細胞密度及びｐＨ６での細胞再循環の効果を実証している。
【図６ａ】２０ｇ／Ｌの酵母細胞濃度での、遠心分離された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物のフェッドバッチ発酵エタノール生産に対する、酵母ＲＷＢ２１８の高い細胞密度及び細胞再循環の効果を実証している。
【図６ｂ】０〜２４時間、２０ｇ／Ｌの酵母細胞濃度での、遠心分離された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物のフェッドバッチ発酵エタノール生産に対する、酵母ＲＷＢ２１８の高い細胞密度の効果を実証している。
【図７】さまざまな初期酵母細胞濃度での、前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物についてのさまざまな前処理方法で前処理されたトウモロコシ茎葉（ＣＳ）からのバッチ発酵エタノール生産に対する、酵母ＲＷＢ２１８の高い密度の効果を実証している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、１つ以上の発酵生物を用いてリグノセルロース含有材料から発酵製品を生産するための方法に関する。
【００１１】
本発明によると、発酵全体を通して非常に高い細胞計数で発酵を実施することにより、発酵時間を著しく短縮することができる。発酵生物あたりの発酵速度は従来の発酵プロセスの場合ほど高くはないかもしれないが、発酵全体を通して発酵生物の絶対数が多いという事実は、所望の発酵製品の生産が速くなるという結果をもたらす（これは時間単位あたりの発酵製品の絶対数として決定される）。
【００１２】
さらに、本発明によると、発酵生物は、以下で記述されている通りに回収して再利用することができる。短縮された発酵時間及び発酵生物の任意の再利用により、本発明の方法の全体的コストは従来の方法に比べ削減される。
【００１３】
したがって本発明は、リグノセルロース含有材料から発酵製品を生産するための方法において：
ｉ）リグノセルロース含有材料を前処理するステップ；
ｉｉ）前処理したリグノセルロース含有材料を加水分解するステップ；
ｉｉｉ）発酵生物を用いて発酵するステップ；
を含む方法であって、
ａ）発酵培地１Ｌあたり１０〜２５０×１０10個の細胞という範囲内の発酵生物細胞計数、又は
ｂ）発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で２〜２９ｇの発酵生物という範囲内の発酵生物濃度、
で発酵が開始され実施される方法に関する。
【００１４】
好ましい実施形態においては、不溶性の固体（リグニン及び未転換多糖類を含む）が発酵の前に除去される。例えば、不溶性の固体は、ステップｉ）でリグノセルロース含有材料を前処理した後に除去されてよい。不溶性固体が除去された前処理済みリグノセルロース由来材料を、次に、本発明にしたがって発酵させることができる。別の実施形態においては、不溶性固体は、ステップｉｉ）で、前処理済みリグノセルロース含有材料を加水分解した後に除去されてよい。不溶性固体が除去された、加水分解された前処理済みリグノセルロース由来材料を、次に、本発明にしたがって発酵させることができる。
【００１５】
発酵させるべきリグノセルロース由来の発酵性糖は、前処理又は加水分解ステップｉ）又はｉｉ）から、又はステップｉ）及びｉｉ）の両方に由来する母液（例えばろ液）の形をしている。好ましい実施形態においては、ステップｉｉ）の加水分解及びステップｉｉｉ）の発酵は、分離型加水分解発酵ステップ（ＳＨＦ）として、ハイブリッド加水分解発酵ステップ（ＨＨＦ）として、又は同時加水分解発酵ステップ（ＳＳＦ）として実施される。ＳＳＦ、ＨＨＦ及びＳＨＦステップは当該技術分野において周知である。
【００１６】
１つの好ましい実施形態においては、発酵は、発酵培地１Ｌあたり２０〜２５０×１０10個の細胞という範囲内、より好ましくは発酵培地１Ｌあたり５０〜２５０×１０10個の細胞という範囲内、より好ましくは、発酵培地１Ｌあたり１００〜２５０×１０10個の細胞という範囲内、より好ましくは、発酵培地１Ｌあたり１５０〜２５０×１０10個の細胞という範囲内、例えば発酵培地１Ｌあたり２００〜２５０×１０10個の細胞という範囲内の発酵生物細胞計数で実施されてよい。
【００１７】
１つの好ましい実施形態において、発酵は、発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で３〜９０ｇの発酵生物という範囲内、発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で３〜５０ｇの発酵生物という範囲内、好ましくは発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で４〜５０ｇの発酵生物という範囲内、好ましくは発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で５〜５０ｇの発酵生物という範囲内、より好ましくは発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で１０〜５０ｇの発酵生物という範囲内、より好ましくは発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で１０〜４０ｇの発酵生物という範囲内、特に発酵培地１Ｌあたり乾燥重量で１０〜３０ｇの発酵生物という範囲内の発酵生物濃度で実施されてよい。
【００１８】
本発明にしたがうと、発酵生物は固定化されてよい。例えば、発酵生物は、発酵させるべき加水分解された及び／又は前処理済みのリグノセルロース由来材料を供給する時に通る発酵タンク／容器内に懸垂される不活性で大表面積の支持体上に固定化されてよい。本発明にしたがって、あらゆる固定化技術を使用することができる。発酵生物を固定化するための技術は、当該技術分野において周知である。適切な固定化技術の実施例は、Kesavaら、１９９６年、「連続流膨張床生物反応器及び連続流撹拌タンク生物反応器内でのZymomonas mobilisの固定化された全細胞によるエタノール生産」、Journal of Industrial Microbiology、１７号：１１〜１４頁；Goughら、１９９８年、「アルギン酸カルシウムゲル及びポリ（ビニル）アルコール冷却ゲル中で固定化されたKluyveromyces marxianus IMB3を用いた４５℃での糖蜜からのエタノール生産」、Bioprocess Engineering、第１９号：８７〜９０頁；Loveら、１９９８年、「アルギン酸カルシウム及びKissiris中で固定化されたKluyveromyces marxianus IMB3を用いた４５℃での連続的エタノール発酵」、Bioprocess Engineering、第１８号：１８７〜１８９頁；Abbiら、１９９６年「Candida shehatae (NCL-3501)の遊離及び固定化細胞によるペントース糖の生物転換：発酵挙動」Process Biochemistry、第３１号：５５５〜５６０頁；Krishnanら、２０００年、「固定化されたZymomonas mobilis CP4 (pZB5)によるグルコース及びキシロースからのエタノール生産」、Applied Biochemistry And Biotechnology、第８４号−６：５２５〜５４１頁；Chibataら、１９８１年、Ann. Rev. Microhys. Bioeng、第１０号：１９７〜２１６頁；Fukuiら、Ann. Rev. Microbial、第３５号；１４５〜１７２頁；John F. Kennedy、１９８２年、Nature、第２９９号；７７７〜７７８頁（全ての参考文献は本発明に参照により援用される）の中に見い出すことができる。
【００１９】
１つの実施形態においては、発酵生物は有利には、回収され再利用されてよい。例えば、発酵生物は、発酵タンク／容器内の発酵培地からこれらを分離することによって、回収可能である。代替的には、発酵生物を発酵後の発酵培地から分離することによって回収してもよい。発酵製品を含有する発酵培地の画分を、例えば蒸留などによりさらに処理又は回収してもよい。回収した発酵生物を同じ発酵タンク／容器又は１つ以上のその他の発酵タンク／容器まで再循環してよい。換言すると、発酵生物を回収し発酵培地まで再循環させ、このようにして、本発明にしたがって１つ以上の付加的な発酵サイクルにおいて再利用してもよい。再循環された発酵生物を使用できる発酵サイクル数は、ｐＨ、発酵生物のタイプ、発酵製品濃度例えばエタノール濃度又は総固体（ＴＳ）濃度を含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）一定数の要因により左右され得る。当業者であれば、再循環事象の数を最適化するために本発明にしたがってこれらの要因を改変することができる。
【００２０】
別の実施形態においては、発酵生物を回収し再循環させるプロセスに増殖ステップを付加してよい。例えば、回収された発酵生物を、後続する発酵サイクル内でそれを再循環又は再利用する前に一定の時限の間増殖させてもよい。
【００２１】
発酵生物を回収するためには、あらゆる技術を使用してよい。当該技術分野において周知の適切な技術としては、例えばフィルタプレス又は遠心分離を用いる濾過が含まれる。
【００２２】
好ましい実施形態にしたがうと、キシロースをキシルロースに転換することのできる酵素が、加水分解物及び／又は発酵中に存在してよい。かかるキシロース−キシルロース転換酵素は、好ましい一実施形態においては、キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼと呼ばれることもある）であってよい。適切なキシロースイソメラーゼの実施例は以下の「キシロースイソメラーゼ」の項で見ることができる。キシロースからキシルロースへの転換は、Saccharomyces cerevisiaeといったような一般に用いられるＣ６発酵生物が、特にグルコースなどの発酵用Ｃ６糖と同時に、キシルロースをエタノールなどの所望の発酵製品へと転換させることを可能にするため有利である。
【００２３】
１つの実施形態においては、Ｃ６及びＣ５発酵性糖の発酵は、同時に実施される。Ｃ５及びＣ６糖の同時発酵は、以下の通りに実施される：
【００２４】
発酵ステップｉｉｉ）はさらに、
ａ）前処理ステップｉ）又は加水分解ステップｉｉ）に由来するＣ５及びＣ６糖の同時発酵を含み；
ｂ）発酵生物は回収され再循環される。
【００２５】
代替的には、別の実施形態において、加水分解ステップｉｉ）及び発酵ステップｉｉｉ）はさらに、
１）前処理ステップｉ）に由来するＣ５及びＣ６糖の同時加水分解及び同時発酵、
を含む。
【００２６】
別の実施形態おいては、加水分解ステップｉｉ）及び発酵ステップｉｉｉ）はさらに、
１）前処理ステップｉ）に由来するＣ５及びＣ６糖の同時に行われる加水分解及び発酵を含み；
２）発酵生物は回収され再循環される。
【００２７】
代替的には、別の実施形態において、Ｃ５発酵性糖の発酵は、Ｃ６発酵性糖の発酵に後続して実施される。Ｃ６及びＣ５糖の後続する発酵は、以下のように実施されてよい：
【００２８】
発酵ステップｉｉｉ）はさらに、
ａ）前処理ステップｉ）又は加水分解ステップｉｉ）に由来するＣ６糖の発酵を含み；
ｂ）Ｃ６発酵生物は回収され再循環され；
ｃ）Ｃ５糖は発酵され；
ｄ）Ｃ６発酵生物は回収され再循環される。
【００２９】
代替的には、別の実施形態において、加水分解ステップｉｉ）及び発酵ステップｉｉｉ）がさらに、
１）前処理ステップｉ）に由来するＣ６糖の同時に行われる加水分解及び発酵を含み；
２）Ｃ５糖は発酵される。
【００３０】
代替的には、別の実施形態において、加水分解ステップｉｉ）及び発酵ステップｉｉｉ）はさらに、
１）前処理ステップｉ）に由来するＣ６糖の同時に行われる加水分解及び発酵を含み；
２）不溶性固体は除去され；
３）Ｃ５糖は発酵され；
４）発酵生物は回収され再循環される。
【００３１】
一実施形態において、リグノセルロース含有材料は無毒化されていてよい。一実施形態において、材料は、加水分解及び／又は発酵の前に洗浄される。別の実施形態においては、リグノセルロース含有材料は、未洗浄のままといったように無毒化されていなくてよい。
【００３２】
リグノセルロース含有材料
「リグノセルロース」又は「リグノセルロース含有材料」というのは、主としてセルロース、ヘミセルロース及びリグニンからなる材料である。かかる材料は、「バイオマス」と呼ばれることが多い。
【００３３】
リグノセルロースバイオマスは、リグニン及びヘミセルロース葉梢内に包み込まれたセルロース繊維の複雑な構造である。リグノセルロースの構造は、酵素加水分解が起こり得ないような構造である。酵素加水分解を増強するためには、リグニンシール（lignin seal）を破り、ヘミセルロースを可溶化し、セルロースの結晶構造を分断するべく適切な圧力及び温度条件下での酸加水分解などによりリグノセルロースを前処理されなくてはならない。このとき、セルロースを例えばセルロース分解酵素処理により酵素で加水分解して、炭水化物ポリマーを、エタノールなどの所望の発酵製品へと発酵され得る発酵性糖に転換させることができる。前処理済みバイオマス中の残留ヘミセルロースをことごとく加水分解するために、ヘミセルロース分解酵素処理を利用してもよい。
【００３４】
リグノセルロース含有材料は、リグノセルロースを含有するあらゆる材料であってよい。好ましい実施形態においては、リグノセルロース含有材料は、少なくとも３０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、さらに一層好ましくは少なくとも９０重量％のリグノセルロースを含有する。リグノセルロース含有材料がその他の構成成分例えばタンパク質性材料、デンプン及び糖、例えば発酵性又は非発酵性糖又はその混合物も含み得るということを理解すべきである。
【００３５】
リグノセルロース含有材料は一般に、例えば植物の茎、葉、殻、外皮又は穂軸又は木の葉、枝及び木材の中に見出される。リグノセルロース含有材料としては、草本材料、農業廃棄物、林業廃棄物、都市固形廃棄物、古紙及びパルプ及び製紙工場廃棄物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。リグノセルロース含有材料は、混合型マトリクス内にリグニン、セルロース及びセルロースを含有する植物細胞壁材料の形をしていてよい。
【００３６】
好ましい実施形態においては、リグノセルロース含有材料は、トウモロコシ繊維、稲藁、松材、木材チップ、ポプラ材、バガス及び紙そしてパルプ加工廃棄物のうちの１つ以上から選択される。
【００３７】
適切なリグノセルロース含有材料のその他の例としては、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ穂軸、ポプラ及びカバノキなどの広葉樹材、針葉樹材、穀物の藁、例えば麦かん、スイッチグラス、すすき（Miscanthus）、もみ殻、都市固形廃棄物（ＭＳＷ）、有機産業廃棄物、事務用紙又はそれらの混合物が含まれる。
【００３８】
好ましい一実施形態において、リグノセルロース含有材料は、トウモロコシ茎葉又はトウモロコシ穂軸である。別の好ましい実施形態においては、リグノセルロース含有材料はトウモロコシ繊維である。別の好ましい実施形態においては、リグノセルロース含有材料はスイッチグラスである。別の好ましい実施形態においては、リグノセルロース含有材料はバガスである。
【００３９】
前処理
リグノセルロース含有材料は、任意の適切な形で前処理されてよい。
【００４０】
前処理は、加水分解又は発酵の前に実施される。前処理の目的は、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを分離又は放出することにあり、こうして加水分解の速度又は効率を改善する。湿式酸化及びアルカリ前処理を含めた前処理方法は、リグニン放出を標的とし、一方希酸処理及び自己加水分解は、ヘミセルロース放出を標的とする。蒸気爆発がセルロース放出を標的とする前処理の一例である。
【００４１】
本発明によると、前処理ステップは、当該技術分野において周知の技術を用いた従来の前処理ステップである。好ましい一実施形態において、前処理は、水性スラリー中で発生する。リグノセルロース含有材料は、前処理中、１０〜８０重量％の間、好ましくは２０〜７０重量％の間、特に３０〜６０重量％の間、例えば５０重量％前後の量で存在し得る。
【００４２】
化学的、機械的及び／又は生物学的前処理
本発明によると、リグノセルロース含有材料は、化学的、機械的、生物学的に又はこれらのあらゆる組合せにより、加水分解の前又はその間に前処理され得る。
【００４３】
好ましくは、化学的、機械的又は生物学的前処理は、加水分解に先立って実施される。代替的には、化学的、機械的又は生物学的前処理を加水分解と同時に、例えば１つ以上のセルロース分解酵素又はその他の酵素活性の添加と同時に実施して、例えばグルコース又はマルトースなどの発酵性糖を放出させてもよい。
【００４４】
本発明の一実施形態において、前処理済みリグノセルロース含有材料を洗浄するか又は別の形で無毒化してよい。しかしながら、洗浄又は無毒化は必ずしも必要なわけではない。好ましい一実施形態において、前処理済みリグノセルロース含有材料は洗浄も無毒化もされない。
【００４５】
化学的前処理
「化学的前処理」という語句は、セルロース、ヘミセルロース又はリグニンの分離又は放出を促進するあらゆる化学的前処理を意味する。適切な化学的前処理の例としては、例えば希酸、石灰、アルカリ、有機溶媒、アンモニア、二酸化硫黄、又は二酸化炭素での処理が含まれる。さらに、湿式酸化及びｐＨ制御型熱水分解も同様に、化学的前処理とみなされる。
【００４６】
好ましい実施形態においては、化学的前処理は酸処理、より好ましくは連続的希酸又は弱酸処理例えば硫酸又は別の有機酸例えば酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、塩化水素、又はそれらの混合物での処理である。その他の酸を使用してもよい。弱酸処理というのは、処理ｐＨがｐＨ１〜５、好ましくはｐＨ１〜３の範囲内にあることを意味する。１つの具体的実施形態においては、酸濃度は、０．１〜２．０重量％の酸という範囲内にあり、好ましくは硫酸である。酸をリグノセルロース含有材料と接触させてよく、混合物を１６０〜２２０℃例えば１６５〜１９５℃の範囲内の温度で、分から秒単位の範囲、例えば１〜６０分、例えば２〜３０分又は３〜１２分の範囲内の時間保ってよい。硫酸などの強酸の添加は、ヘミセルロースを除去するために適用可能である。このような強酸の添加は、セルロースの可消化性を増強させる。
【００４７】
本発明によると、その他の化学的処理技術も企図されている。セルロース溶媒処理は、約９０％のセルロースをグルコースに転換させることが示されてきた。同様に、リグノセルロース構造が分断されると、酵素加水分解を大幅に増強させることができるということも同様に示されてきた。アルカリ性Ｈ2Ｏ2、オゾン、オルガノソルブ（水性アルコール中でルイス酸、ＦｅＣｌ3、（Ａｌ）2ＳＯ4を使用）、グリセロール、ジオキサン、フェノール又はエチレングリコールなどが、セルロース構造を分断し加水分解を促進するものとして知られた溶媒に入る（Mosierら、２００５年、Bioresource Technology、第９６号：６７３〜６８６頁）。
【００４８】
塩基、例えばＮａＯＨ、Ｎａ2ＣＯ3及びアンモニアなどでのアルカリ化学前処理もまた、本発明にしたがって企図されている。アンモニアを用いた前処理は、例えば本発明に参照により援用されている、国際公開第２００６／１１０８９１号（WO 2006/110891）、国際公開第２００６／１１８９９（WO 2006/11899）、国際公開第２００６／１１９００号（WO 2006/11900）、国際公開第２００６/１１０９０１号（WO 2006/110901）中に記述されている。
【００４９】
湿式酸化技術には、亜硫酸塩ベースの酸化剤などといった酸化剤の使用が関与する。溶媒前処理の例としては、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などでの処理が含まれる。化学的前処理は一般に、１〜６０分、例えば５〜３０分間実施されるが、前処理すべき材料に応じてより短い又はより長い時限実施してもよい。
【００５０】
適切な前処理方法のその他の例は、各々本発明に参照により援用されているSchellら、２００３年、Appl. Biochem and Biotechn.、１０５〜１０８巻、６９〜８５頁、及びMosierら、２００５年、Bioresource Technology、第９６号：６７３〜６８６頁、及び米国特許出願公開第２００２／０１６４７３０号（U.S. Application Publication No. 2002/0164730）によって記述されている。
【００５１】
機械的前処理
「機械的前処理」という語句は、リグノセルロース含有材料からのセルロース、ヘミセルロース又はリグニンの分離又は放出を促進するあらゆる機械的又は物理的前処理を意味する。例えば、機械的前処理には、さまざまなタイプの製粉、照射、蒸気処理／蒸気爆発そして熱水分解が含まれる。
【００５２】
機械的前処理には、粉砕すなわち機械的なサイズ縮小が含まれる。粉砕には、乾式製粉、湿式製粉及び振動ボールミル粉砕が含まれる。機械的前処理には、高圧及び／又は高温（蒸気爆発）が関与してよい。本発明の一実施形態において、高圧とは、３００〜６００ｐｓｉ、好ましくは４００〜５００ｐｓｉの範囲内、例えば４５０ｐｓｉ前後の圧力を意味する。本発明の一実施形態において、高温とは、約１００〜３００℃、好ましくは約１４０〜２３５℃の範囲内の温度を意味する。好ましい実施形態において、機械的前処理は、以上で定義された通りの高圧高温を用いるバッチプロセススチームガン加水分解装置システムである。このために、Sunds Hydrolyzer（Sunds Defibrator AB（スウェーデン）より入手可）を使用してよい。
【００５３】
組合せ型化学的及び機械的前処理
好ましい実施形態においては、リグノセルロース含有材料は化学的及び機械的の両方の形で前処理される。例えば、前処理ステップには、希酸又は弱酸処理及び高温及び／又は高圧処理が関与していてよい。化学的前処理及び機械的前処理は、望まれる通り、逐次的又は同時に実施されてよい。
【００５４】
したがって、好ましい実施形態においては、リグノセルロース含有材料は、セルロース、ヘミセルロース又はリグニンの分離又は放出を促進するべく化学的及び機械的の両方の前処理に付される。
【００５５】
好ましい一実施形態において、前処理は、希酸又は弱酸蒸気爆発ステップとして実施される。別の好ましい実施形態においては、前処理は、アンモニア繊維爆発ステップ（又はＡＦＥＸ前処理ステップ）として実施される。
【００５６】
生物学的前処理
「生物学的前処理」という語句は、リグノセルロース含有材料からのセルロース、ヘミセルロース又はリグニンの分離又は放出を促進するあらゆる生物学的前処理を意味する。生物学的前処理技術には、リグニン可溶化用微生物の適用が関与し得る。例えばHsu, T.-A.、１９９６年、「バイオマスの前処理」、Handbook on Bioethanol: Production and Utilization中、 Wyman, C.E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, １７９〜２１２頁；Ghosh, P., 及びSingh, A.、１９９３年、「リグノセルロースバイオマスの酵素／微生物変換のための物理化学的及び生物学的処理」、Adv. Appl. Microbiol.、第３９号：２９５〜３３３頁；McMillan, J.D.、１９９４年、「リグノセルロースバイオマスを前処理する：精査」、Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production中、Himmel, M.E., Baker, J.O., and Overend, R.P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC、第１５章；Gong, C.S., Cao, N.J., Du, J.,及びTsao, G.T.、１９９９年、「再生可能な資源からのエタノール生産」、Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology中、Scheper, T., ed., Springer-Veriag Berlin Heidelberg, Germany、第６５号：２０７〜２４１頁；Olsson, L, 及びHahn-Hagerdal, B.、１９９６年、「エタノール生産のためのリグノセルロース系加水分解物の発酵」、Enz. Microb. Tech.、第１８号：３１２〜３３１頁；ならびにVallander, L., 及びEriksson, K -E. L.、１９９０年、「リグノセルロース材料からのエタノールの生産：技術的現状」、Adv. Biochem. Eng./Biotechnol.、第４２号：６３〜９５頁を参照のこと。
【００５７】
加水分解
前処理済みリグノセルロース含有材料が発酵される前に、この前処理済みリグノセルロース含有材料を加水分解してセルロース及びヘミセルロースを発酵性糖へと分解することができる。好ましい一実施形態において、前処理済み材料は、発酵前に好ましくは酵素により加水分解される。
【００５８】
加水分解中の乾燥固体含有量は、５〜５０重量％、好ましくは１０〜４０重量％、好ましくは２０〜３０重量％の範囲内にあってよい。加水分解は、好ましい実施形態においては、前処理済みリグノセルロース含有材料（すなわち基質）が漸進的に例えば酵素含有加水分解溶液中に供給されるフェッドバッチプロセスとして実施されてよい。
【００５９】
好ましい一実施形態において、加水分解は、酵素により実施される。本発明によると、前処理済みリグノセルロース含有材料は、例えばセルラーゼ又はヘミセルラーゼ又はそれらの組合せなどの１つ以上のセルロース分解酵素によって加水分解されてよい。
【００６０】
好ましい一実施形態において、加水分解は、セルロース分解増強活性を有する１つ以上のポリペプチドを含むセルロース分解酵素調製物を用いて実施される。好ましい一実施形態において、セルロース分解増強活性を有する１つ又は複数のポリペプチドは、ファミリーＧＨ６１Ａ由来のものである。セルロース分解増強活性を有する適切な及び好ましいセルロース分解酵素調製物及びポリペプチドの例は、以下の「セルロース分解酵素」の節及び「セルロース分解増強ポリペプチド」の節で記述されている。
【００６１】
リグノセルロース含有材料は、リグニン、セルロース及びヘミセルロース以外の構成成分を含有し得ることから、ステップｉｉ）及びｉｉｉ）の加水分解及び／又は発酵は、付加的な酵素活性例えばプロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、炭水化物生成酵素活性及びエステラーゼ活性例えばリパーゼ活性の存在下で実施されてよい。
【００６２】
酵素加水分解は好ましくは、当業者であれば容易に決定できる条件の下で適切な水性環境内で実施される。好ましい実施形態においては、加水分解は問題の１つ又は複数の酵素のための適切な、好ましくは最適な条件の下で実施される。
【００６３】
適切なプロセス時間、温度及びｐＨ条件は、当業者であれば容易に決定できる。好ましくは、加水分解は２５〜７０℃の間、好ましくは４０〜６０℃の間、特に５０℃前後の温度で実施される。このステップは、好ましくはｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜６の間、特にｐＨ５前後のｐＨで実施される。加水分解は、典型的には、１２〜９６時間、好ましくは１６〜７２時間、より好ましくは２４〜４８時間の間、実施される。
【００６４】
発酵
本発明によると、前処理及び／又は加水分解されたリグノセルロース含有材料由来の発酵性糖は、糖例えばグルコース、キシロース、マンノース及びガラクトースを直接的に又は間接的に所望の発酵製品へと発酵することのできる１つ以上の発酵生物により発酵されてよい。発酵条件は、所望の発酵製品及び発酵生物により左右され、当業者であれば容易に決定できる。
【００６５】
特にエタノール発酵の場合、発酵は、１〜４８時間、好ましくは１〜２４時間継続されてよい。１つの実施形態においては、発酵は、２０〜４０℃、好ましくは２６〜３４℃の間、特に３２℃前後の温度で実施される。１つの実施形態においては、ｐＨは５超である。別の実施形態においては、ｐＨは、ｐＨ３〜７、好ましくは４〜６である。ただし、一部の、例えば細菌の発酵生物は、より高い発酵温度最適条件を有する。したがって、１つの実施形態においては、発酵は、４０〜６０℃の間、例えば５０〜６０℃の間の温度で実施される。当業者であれば、適切な温度条件を容易に決定できる。
【００６６】
発酵は、バッチ、フェッドバッチ又は連続反応装置内で実施可能である。フェッドバッチ発酵は、固定体積又は可変体積のフェッドバッチであってよい。１つの実施形態においては、フェッドバッチ発酵が利用される。フェッドバッチ発酵の体積及び速度は、例えば発酵生物、発酵性糖のアイデンティティ及び濃度そして所望の発酵製品によって左右される。かかる発酵速度及び体積は、当業者であれば容易に決定できる。
【００６７】
ＳＳＦ、ＨＨＦ及びＳＨＦ
本発明の一実施形態において、加水分解及び発酵は、同時加水分解発酵ステップ（ＳＳＦ）として実施される。一般に、このことはすなわち、組合せ型／同時加水分解発酵が、問題の１つ又は複数の発酵生物についての適切な、好ましくは最適な条件（例えば温度及び／又はｐＨ）で実施される、ということを意味している。
【００６８】
別の実施形態においては、加水分解ステップ及び発酵ステップは、ハイブリッド加水分解発酵（ＨＨＦ）として実施される。ＨＨＦは、典型的に分離した部分的加水分解ステップで始まり、同時に行われる加水分解及び発酵ステップで終る。分離した部分的加水分解ステップは典型的には、問題の１つ又は複数の加水分解用酵素のための適切な、好ましくは最適の条件（例えばより高い温度）で実施される。後続する同時加水分解発酵ステップは、典型的には、１つ又は複数の発酵生物のための適切な条件（多くの場合、分離した加水分解ステップよりも低い温度）で実施される。
【００６９】
別の実施形態においては、加水分解及び発酵ステップを、発酵の開始前に加水分解が完了させる分離型加水分解発酵として実施してもよい。これを多くの場合「ＳＨＦ」と呼ぶ。
【００７０】
回収
発酵の後で、発酵製品は、任意には、あらゆる適切な要領で発酵培地から分離されてよい。例えば、培地を蒸留して発酵製品を抽出してもよいし、或いは、精密濾過又は膜濾過技術により発酵培地から発酵製品を抽出してもよい。代替的には、発酵製品をストリッピングによって回収してもよい。回収方法は、当該技術分野において周知である。
【００７１】
発酵製品
本発明は、あらゆる発酵製品の生産に用いることができる。好ましい発酵製品としては、アルコール（例えばエタノール、メタノール、ブタノール）；有機酸（例えばクエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸）；ケトン（例：アセトン）；アミノ酸（例：グルタミン酸）；気体（例えばＨ2及びＣＯ2）；抗生物質（例えばペニシリン及びテトラサイクリン）；酵素；ビタミン（例えばリボフラビン、Ｂ１２、ベータ−カロテン）及びホルモンが含まれる。
【００７２】
その他の製品としては、消費用アルコール産業製品例えばビール及びワイン；乳業製品、例えば発酵乳製品；皮革工業製品及びタバコ産業製品が含まれる。好ましい実施形態においては、発酵製品はアルコール、特にエタノールである。本発明にしたがって得られるエタノールといったような発酵製品は、好ましくは燃料用アルコール／エタノールとして使用されてよい。しかしながら、エタノールの場合、それは、飲用アルコールとしても使用可能である。
【００７３】
発酵生物
「発酵生物」という語句は、所望の発酵製品を生産するのに適した細菌及び真菌生物を含めたあらゆる生物を意味する。発酵生物は、Ｃ６又はＣ５発酵生物又はその組合せであってよい。Ｃ６及びＣ５発酵生物は、当該技術分野において周知である。
【００７４】
適切な発酵生物は、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、マンノース及び／又はアラビノースといった発酵性糖を直接又は間接的に所望の発酵製品へと発酵すなわち転換させることができる。
【００７５】
発酵生物の例としては、酵母といった真菌生物が含まれる。好ましい酵母としては、Saccharomyces属の菌株、特にSaccharomyces cerevisiae又はSaccharomyces uvarumの菌株；Pichiaの菌株、好ましくはPichia stipitis例えばPichia stipitis CBS 5773又はPichia pastoris ; Candida属の菌株、特にCandida utilis、Candida arabinofermentans、Candida diddensii、Candida sonorensis、Candida shehatae、Candida tropicalis又はCandida boidiniiの菌株が含まれる。その他の発酵生物にはHansenula、特にHansenula polymorpha又はHansenula anomala；Kluyveromyces、特にKluyveromyces fragilis又はKluyveromyces marxianus；及びSchizosaccharomyces、特にSchizosaccharomyces pombeの菌株が含まれる。
【００７６】
好ましい発酵生物には、Escherichiaの菌株、特にEscherichia coli、Zymomonasの菌株、特にZymomonas mobilis、Zymobacterの菌株、特にZymobactor palmae、Klebsiellaの菌株、特にKlebsiella oxytoca、Leuconostocの菌株、特にLeuconostoc mesenteroides、Clostridiumの菌株、特にClostridium butyricum、Enterobacterの菌株、特にEnterobacter aerogenes及びThermoanaerobacterの菌株、特にThermoanaerobacter BG1L1（Appl. Microbiol. Biotech.、第７７号：６１〜８６頁）及びThermoanarobacter ethanolicus、Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum又はThermoanaerobacter mathranii.が含まれる。Corynebacterium glutamicum R、Bacillus thermoglucosidaisus、及びGeobacillus thermoglucosidasiusの菌株のように、Lactobacillusの菌株も同様に想定されている。
【００７７】
一実施形態において、発酵生物はＣ６糖発酵生物例えばSaccharomyces cerevisiaeの菌株である。
【００７８】
リグノセルロース由来材料の発酵に関しては、Ｃ５糖発酵生物が企図されている。大部分のＣ５糖発酵生物は同様に、Ｃ６糖も発酵させる。Ｃ５糖発酵生物の例には、Pichiaの菌株、例えばPichia stripitis種が含まれる。Ｃ５糖発酵用細菌も同様に公知である。同様に、一部のSaccharomyces cerevisiae菌株は、Ｃ５（及びＣ６）糖を発酵させる。例としては、例えばHoら、１９９８年、「Applied and Environmental Microbiology」、１８５２〜１８５９頁及びKarhumaaら、２００６年、Microbial Cell Factories、第５号：１８頁、及びKuyperら、２００５年、FEMS Yeast Research、第５号、９２５〜９３４頁に関与しているものを含めたＣ５糖を発酵させる能力をもつSaccharomyces sppの遺伝子組換えされた菌株がある。
【００７９】
一部の発酵生物の発酵能は、発酵培地内に阻害物質が存在することによって阻害され得、かくしてエタノール生産能力が低下する。バイオマス加水分解物中の化合物及び高濃度のエタノールは、一部の酵母細胞の発酵能力を阻害することがわかっている。予備適応又は適応方法がこの阻害効果を削減し得る。典型的には酵母細胞の予備適応又は適応には、酵母の発酵能を増大しエタノール生産を増大させるために、発酵前に酵母細胞を逐次的に成長させることが関与している。酵母予備適応及び適応方法は、当該技術分野において公知である。かかる方法には例えば、粗製バイオマス加水分解物の存在下で酵母細胞を成長させること；フェノール化合物、フラルデヒド及び有機酸などの阻害物質の存在下で酵母細胞を成長させること；非阻害量のエタノールの存在下で酵母細胞を成長させること；及びアセトアルデヒドで酵母培養を補足することが含まれていてよい。１つの実施形態において、発酵生物は、発酵に先立ち１つ以上の予備適応又は適応方法にさらされる酵母菌株である。
【００８０】
酵母といった一部の発酵生物は、増殖及び発酵のための適切な窒素源を必要とする。数多くの窒素源を使用することができ、かかる窒素源は当該技術分野において周知である。１つの実施形態においては、低コストの窒素源が用いられる。かかる低コスト供給源は、例えば尿素、ＤＤＧ、ウェットケーク又はマッシュコーンといった有機物質、あるいは、例えばアンモニア又は水酸化アンモニウムといった無機物質であり得る。
【００８１】
エタノール生産に適した市販の酵母としては、例えばETHANOL REDTM酵母（Fermentis / Lesaffre, USAより入手可）、FALITM （Fleischmann's Yeast、USAより入手可）、SUPERSTART及びTHERMOSACCTM 生イースト（Ethanol Technology、Wl、USAより入手可）、BIOFERM AFT 及び XR（NABC - North American Byproducts Corporation、GA、USAより入手可）、GERT STRAND（Gert Strand AB、Swedenより入手可）、及びFERMIOL（DSM Specialtiesより入手可）が含まれる。
【００８２】
発酵培地
「発酵培地（fermentation media又はfermentation medium）」という語句は、中で発酵が行なわれる環境を意味し、発酵基質すなわち１つ又は複数の発酵生物により代謝される炭水化物源を含み、１つ又は複数の発酵生物を含んでいてよい。
【００８３】
発酵培地は、１つ又は複数の発酵生物のための栄養物及び１つ又は複数の成長刺激物質を含んでいてよい。栄養物及び成長刺激物質は、発酵の技術分野で広く使用され、アンモニアなどの窒素源；ビタミン及びミネラル又はそれらの組合せを含む。
【００８４】
発酵後、発酵培地はさらに発酵製品を含み得る。
【００８５】
酵素
本発明の方法又はプロセスに関係して具体的に言及されていなくても、１つ又は複数の酵素ならびにその他の化合物が有効量で使用されることを理解すべきである。
【００８６】
セルロース分解活性
本明細書中で使用される「セルロース分解活性」という語句は、セロビオヒドロラーゼ活性を有する酵素（ＥＣ３．２．１．９１）例えばセロビオヒドロラーゼＩ及びセロビオヒドロラーゼＩＩ、ならびにエンド−グルカナーゼ活性を有する酵素（ＥＣ３．２．１．４）及びベータグルコシダーゼ活性を有する酵素（ＥＣ３．２．１．２１）を含むものとして理解される。
【００８７】
セルロースを発酵性糖に転換するためには少なくとも３つのカテゴリの酵素が重要である：すなわち、セルロース鎖を無作為に切断するエンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）；セルロース鎖末端からセロビオシル単位を分割するセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）及びセロビオース及び可溶性セロデキストリンをグルコースに転換するベータグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．，２１）である。セルロースの生分解に関与するこれら３つのカテゴリの酵素の中でも、セロビオヒドロラーゼが、天然結晶セルロースを分解するための鍵酵素であると思われる。
【００８８】
セルロース分解活性は、好ましい一実施形態において、真菌由来の酵素の調製物、例えばTrichoderma属の菌株、好ましくはTrichoderma reesei菌株；Humicola属の菌株、例えばHumicola insolensの菌株；又はChrysosporiumの菌株、好ましくはChrysosporium lucknowenseの菌株からの酵素調製物の形をしていてよい。
【００８９】
好ましい実施形態においては、セルロース分解酵素調製物は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルロース分解酵素増強活性、ベータグルコシダーゼ活性、エンドグルカナーゼ、セルビオヒドロラーゼ又はキシロースイソメラーゼという活性のうちの１つ以上を含む。
【００９０】
好ましい一実施形態において、セルラーゼは、本発明に参照により援用されているＰＣＴ／米国特許第２００８／０６５４１７号（PCT/US2008/065417）中で定義されている通りの組成物であってよい。具体的には、１つの実施形態においては、セルラーゼ組成物は、以下で記述される実施例１（セルラーゼ調製物Ａ）の中で使用されており、好ましい一実施形態において、セルロース分解酵素調製物は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチド、好ましくはファミリーＧＨ６１Ａポリペプチド、好ましくは国際公開第２００５／０７４６５６号（WO 2005/074656）(Novozymes)中で開示されているものを含む。セルロース分解酵素調製物はさらに、国際公開第２００８／０５７６３７号（WO 2008/057637）中で開示されているベータグルコシダーゼ活性を有する融合タンパク質を含む、Trichoderma, Aspergillus又はPenicillium属の菌株に由来するベータグルコシダーゼなどのベータグルコシダーゼを含み得る。好ましい一実施形態において、セルロース分解酵素調製物は同様に、ＣＢＨＩＩ酵素、好ましくはThielavia terrestris cellobiohydralase II CEL6Aをも含んでいてよい。別の好ましい実施形態においては、セルロース分解酵素調製物は同様に、セルロース分解酵素好ましくは、Trichoderma reesei又はHumicola insolens由来のものを含んでいてもよい。
【００９１】
セルロース分解酵素調製物は同様に、国際公開第２００５／０７４６５６号（WO 2005/074656）中に開示されているセルロース分解増強活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１Ａ）；ベータグルコシダーゼ（国際公開第２００８／０５７６３７号（WO 2008/057637）に開示されている融合タンパク質）及びTrichoderma reeseiに由来するセルロース分解酵素をも含んでいてよい。
【００９２】
１つの実施形態においては、セルロース分解酵素は市販の製品、すなわちNovozymes A/S、デンマークから入手可能なCELLUCLAST（登録商標）１．５Ｌ又はCELLUZYMETM又はACCELERASETM1000（Genencor Inc. USA製）である。
【００９３】
前処理済みリグノセルロース含有材料を加水分解するために、セルロース分解酵素を添加してよい。セルロース分解酵素は、総固体（ＴＳ）１グラムあたり０．１〜１００ＦＰＵ、好ましくはＴＳ１グラムあたり０．５〜５０ＦＰＵ、特にＴＳ１グラムあたり１〜２０ＦＰＵの範囲内で秤量されてよい。別の実施形態においては、総固体（ＴＳ）１グラムあたり少なくとも０．１ｍｇのセルロース分解酵素、好ましくはＴＳ１グラムあたり少なくとも３ｍｇのセルロース分解酵素、例えばＴＳ１グラムあたり５〜１０ｍｇの間の１つ又は複数のセルロース分解酵素が、加水分解のために用いられる。
【００９４】
エンドグルカナーゼ（ＥＧ）
「エンドクルカナーゼ」という用語は、セルロース、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース）、リケニン、混合型ベータ−１，３グルカン例えば穀物ベータ−Ｄ−グルカン又はキシログルカン中のベータ−１，４結合、及びその他のセルロース成分含有植物材料の中で１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合のエンド型加水分解の触媒として作用するエンド−１，４−（１，３；１，４）−ベータ−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．３．２．１．４）を意味する。エンドグルカナーゼ活性は、Ghose、１９８７年、Pure and Appl. Chem.、第５９号：２５７〜２６８頁の手順にしたがって、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）加水分解を用いて決定され得る。
【００９５】
好ましい一実施形態において、エンドグルカナーゼは、Trichoderma属の菌株、好ましくはTrichoderma reeseiの菌株；Humicola属の菌株、例えばHumicola insolensの菌株；又はChrysosporiumの菌株、好ましくはChrysosporium lucknowenseの菌株に由来していてよい。
【００９６】
セロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ）
「セロビオヒドラーゼ」という用語は、セルロース、セロオリゴ糖又は、あらゆるベータ−１，４−連結グルコース含有ポリマーの中で１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解の触媒として作用して鎖の還元又は非還元末端からセロビオースを放出する、１，４−ベータ−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）を意味する。
【００９７】
セロビオヒドロラーゼの例は、Trichoderma reseei由来のＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩ；Humicola insolens及びThielavia terrestrisセロビオヒドロラーゼ（ＣＥＬＬ６Ａ）由来のＣＢＨＩＩを含め、以上で言及されている。
【００９８】
セロビオヒドロラーゼ活性は、Leverら、１９７２年、Anal. Biochem.、第４７号：２７３〜２７９頁及び van Tilbeurgh ら、１９８２年、FEBS Letters、第１４９号：１５２〜１５６頁；van Tilbeurgh及びClaeyssens、１９８５年、FEBS Letters、第１８７号：２８３〜２８８頁により記述されている手順にしたがって決定されてよい。Leverらの方法は、トウモロコシ茎葉内のセルロースの加水分解を査定するのに適しており、van Tilbeurghらの方法は、蛍光二糖誘導体上でセロビオヒドロラーゼ活性を決定するのに適している。
【００９９】
ベータグルコシダーゼ
１つ以上のベータグルコシダーゼが、加水分解中に存在してよい。
【０１００】
「ベータグルコシダーゼ」という用語は、ベータ−Ｄ−グルコースの放出を伴う末端非還元ベータ−Ｄ−グルコース残基の加水分解の触媒として作用するベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）を意味する。本発明に関しては、ベータグルコシダーゼ活性は、本明細書中で記述されている通り異なる条件が利用されたという点を除いて、Venturiら、２００２年、J. Basic Microbiol.、第４２号：５５〜６６頁により記述された基本的手順にしたがってベータグルコシダーゼ活性が決定される。ベータグルコシダーゼ活性の１単位は、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中で基質としての４ｍＭのｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドからｐＨ５、５０℃で１分あたりに生産される１．０μｍｏｌｅのｐ−ニトロフェノールとして定義づけされる。
【０１０１】
好ましい一実施形態において、ベータグルコシダーゼは真菌由来、例えばTrichoderma、Aspergillus又はPenicillium属の菌株のものである。好ましい一実施形態において、ベータグルコシダーゼは、ｂｇｌ１遺伝子によりコードされたベータグルコシダーゼなどの、Trichoderma reeseiに由来するものである（欧州特許第５６２００３号（EP 562003）の図１参照）。別の好ましい実施形態においては、ベータグルコシダーゼは、Aspergillus oryzae（国際公開第２００２／０９５０１４号（WO 2002/095014）にしたがってAspergillus oryzae中で組換えにより生産される）、Aspergillus fumigatus（国際公開第２００２／０９５０１４号（WO 2002/095014）の実施例２２にしたがってAspergillus oryzae中で組換えにより生産される）又はAspergillus niger（１９８１年、J. Appl.、第３巻、１５７〜１６３頁）に由来する。
【０１０２】
ヘミセルラーゼ
ヘミセルロースはヘミセルラーゼ及び／又は酸加水分解により分解されてその５及び６炭糖成分を放出することができる。
【０１０３】
本発明の一実施形態において、リグノセルロース由来材料は、１つ以上のヘミセルラーゼにより処理されてよい。
【０１０４】
ヘミセルロースを好ましくはキシロースへと加水分解する上で使用するのに適したあらゆるヘミセルラーゼを使用してよい。好ましいヘミセルラーゼとしては、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フエルロイルエステラーゼ、グルクロニダーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、マンナーゼ、エンド又はエキソアラビナーゼ、エキソ−ガラクタナーゼ及びそれらのうちの２つ以上のものの混合物が含まれる。好ましくは、本発明において使用するためのヘミセルラーゼは、エキソ作用性ヘミセルラーゼであり、より好ましくは、ヘミセルラーゼは、ｐＨ７未満、好ましくはｐＨ３〜７の酸性条件下でヘミセルロースを加水分解する能力を有するエキソ作用性ヘミセルラーゼである。本発明で使用するのに適したヘミセルラーゼの例としてはＶＩＳＣＯＺＹＭＥTM（Novozymes A/S、デンマークより入手可）がある。
【０１０５】
１つの実施形態においては、ヘミセルラーゼはキシラナーゼである。一実施形態において、キシラナーゼは、好ましくは、微生物由来例えば真菌由来（例えばTrichoderma、Meripilus、Humicola、Aspergillus、Fusarium）又は細菌（例えばBacillus）由来のものである。好ましい一実施形態において、キシラナーゼは、糸状菌由来、好ましくはAspergillus例えばAspergillus aculeatusの菌株、又はHumicola好ましくはHumicola lanuginosaの菌株由来のものである。キシラナーゼは好ましくは、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ、より好ましくはＧＨ１０又はＧＨ−１１のエンド−１，４−ベータ−キシラナーゼであってよい。市販のキシラナーゼの例としては、Novozymes A/S、デンマーク製のＳＨＥＲＺＹＭＥTM及びＢＩＯＦＥＥＤ  ＷＨＥＡＴTMが含まれる。
【０１０６】
ヘミセルラーゼは、ヘミセルロースを加水分解するのに有効な量、例えば、総固体（ＴＳ）の約０．００１〜０．５重量％、より好ましくはＴＳの約０．０５〜０．５重量％の量で添加されてよい。
【０１０７】
キシラナーゼは、ＤＭ（乾物）基質１ｋｇあたり０．００１〜１．０ｇ、好ましくは０．００５〜０．５ｇ、そして最も好ましくは０．０５〜０．１０ｇの量で添加されてよい。
【０１０８】
キシロースイソメラーゼ
キシロースイソメラーゼ（Ｄ−キシロースケトイソメラーゼ）（Ｅ．Ｃ．５．３．１．５．）は、Ｄ−キシロースからＤ−キシルロースへの可逆的異性化反応の触媒として作用する酵素である。一部のキシロースイソメラーゼは同様に、Ｄ−グルコースの可逆的異性化をＤ−フルクトースへと転換させる。したがって、キシロースイソメラーゼは時として「グルコースイソメラーゼ」と呼ばれる。
【０１０９】
本発明の方法又はプロセスにおいて使用されるキシロースイソメラーゼは、キシロースイソメラーゼ活性を有するあらゆる酵素であってよく、好ましくは糸状菌又は酵母などの細菌又は真菌由来であるあらゆる供給源に由来していてよい。細菌性キシロースイソメラーゼの例としては、Streptomyces、Actinoplanes、Bacillus 及び Flavobacterium,属及びT. neapolitana（Vieilleら、１９９５年、Appl. Environ. Microbiol.第６１号（５）、１８６７〜１８７５頁）及びT. maritimeを含めたThermotoga属に属するものが含まれる。
【０１１０】
真菌性キシロースイソメラーゼの例は、Basidiomycetesの派生種である。
【０１１１】
好ましいキシロースイソメラーゼは、酵母Candida属の菌株、好ましくはCandida boidiniiの菌株に由来し、特に例えばVongsuvanlert ら、１９８８年、Agric. Biol. Chem.、第５２号（７）：１８１７〜１８２４頁により開示されたCandida boldiniiキシロースイソメラーゼである。キシロースイソメラーゼは好ましくは、Ogataら、Agric. Biol. Chem、第３３号、１５１９〜１５２０頁又はVongsuvanlertら、１９８８年、Agric. Biol. Chem、第５２号（２）、１５１９〜１５２０頁に開示されている、ＤＳＭ７００３４及びＡＴＣＣ４８１８０として寄託されたCandida boldiniiの菌株（Kloeckera 2201）に由来してよい。
【０１１２】
１つの実施形態においては、キシロースイソメラーゼは、Streptomycesの菌株に由来し、例えばStreptomyces murinus（米国特許第４，６８７，７４２号（U.S. Patent No. 4,687,742）)；全て米国特許第３，６１６，２２１号（U.S. Patent No. 3,616,221）中に公開されているS. flavovirens、S. albus、S. achromogenus、S. echinatus、S. wedmorensis菌株に由来する。その他のキシロースイソメラーゼは、米国特許第３，６２２，４６３号（U.S. Patent No. 3,622,463）、米国特許第４，３５１，９０３号（U.S. Patent No. 4,351 ,903）、米国特許第４，１３７，１２６号（U.S. Patent No. 4,137,126）、米国特許第３，６２５，８２８号（U.S. Patent No. 3,625,828）、ハンガリー特許第１２，４１５号（HU patent no. 12,415）、独国特許第２，４１７，６４２号（DE patent 2,417,642）、日本特許第６９，２８，４７３（JP patent no. 69,28,473）及び国際公開第２００４／０４４１２９号（WO 2004/044129）の中で開示されている。
【０１１３】
キシロースイソメラーゼは、固定化又は液体形態のいずれかであってよい。液体形態が好ましい。
【０１１４】
市販のキシロースイソメラーゼの例としては、Novozymes A/S、デンマーク製のＳＷＥＥＴＺＹＭＥTMＴが含まれる。
【０１１５】
キシロースイソメラーゼは、総固体１グラムあたり０．０１〜１００ＩＧＩＵの範囲内の活性レベルを提供するように添加される。
【０１１６】
セルロース分解増強活性
「セルロース分解増強活性」という語句は、本明細書では、セルロース分解活性を有するタンパク質によるリグノセルロース由来材料の加水分解を増強する生物活性として定義づけされる。本発明に関しては、セルロース分解増強活性は、セルロース分解増強活性をもたない等しい総タンパク質負荷（ＰＣＳ中セルロース１ｇあたり１〜５０ｍｇのセルロース分解性タンパク質）での対照加水分解と比べて５０％で１〜７日間、総タンパク質がＰＣＳ中セルロース１ｇあたり８０〜９９．５％ｗ／ｗのセルロース分解性タンパク質とセルロース分解増強活性をもつ２０％ｗ／ｗのタンパク質で構成されているものとして、ＰＣＳ中セルロース１ｇあたり１〜５０ｍｇの総タンパク質（前処理済みトウモロコシ茎葉）という条件下でセルロース分解性タンパク質により例えば前処理済みリグノセルロース含有材料などのリグノセルロース由来材料の加水分解からのセロビオースとグルコースの合計の増加又は還元糖の増大を測定することによって、決定される。
【０１１７】
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、同程度の加水分解に達するのに必要とされるセルロース分解酵素の量を好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、さらにより好ましくは少なくとも３０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍、そしてさらに最も好ましくは少なくとも１００倍削減することによって、セルロース分解活性を有するタンパク質を触媒とするリグノセルロース由来材料の加水分解を増大させる。
【０１１８】
好ましい一実施形態において、加水分解及び／又は発酵は、増強活性を有するポリペプチドと組合せた状態でセルロース分解酵素が存在する中で行なわれる。好ましい一実施形態において、増強活性を有するポリペプチドは、ファミリーＧＨ６１Ａのポリペプチドである。国際公開第２００５／０７４６４７号（WO2005/074647）は、Thielavia terrestris由来のセルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチド及びそのポリヌクレオチドを開示している。国際公開第２００５／０７４６５６号（WO2005/074656）は、Thermoascus aurantiacus由来のセルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドとそのポリヌクレオチドを開示している。米国特許出願公開第２００７／００７７６３０号（U.S. Application Publication No. 2007/0077630）は、Trichoderma reesei由来のセルロース分解増強活性を有する単離ポリペプチドとそのポリヌクレオチドを開示している。
【０１１９】
アルファアミラーゼ
本発明によると、任意のアルファアミラーゼを使用することができる。好ましいアルファアミラーゼは、微生物例えば細菌又は真菌由来のものである。どのアルファアミラーゼが最も適しているかはプロセス条件により左右され、当業者であれば容易に決定できる。
【０１２０】
一実施形態において、好ましいアルファアミラーゼは、酸性アルファアミラーゼ、例えば真菌性酸性アルファアミラーゼ又は細菌性酸性アルファアミラーゼである。「酸性アルファアミラーゼ」という語句は、有効量で添加された場合に３〜７好ましくは３．５〜６又はより好ましくは４〜５の範囲内のｐＨで活性最適条件を有するアルファアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）を意味する。
【０１２１】
細菌性アルファアミラーゼ
別の好ましい実施形態においては、アルファアミラーゼはBacillus由来のものである。Bacillusアルファアミラーゼは好ましくは、B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis又はB. stearothermophilusの菌株に由来し得るが、他のBacillus sp.由来であってもよい。企図されているアルファアミラーゼの具体例としては、国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）中の配列番号４に示されているBacillus licheniformisアルファアミラーゼ、国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）中の配列番号５のBacillus amyloliquefaciensアルファアミラーゼ及び国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）中の配列番号３に示されているBacillus stearothermophilusアルファアミラーゼ（全ての配列が本発明に参照により援用されている）がある。本発明の一実施形態において、アルファアミラーゼは、国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）中でそれぞれ配列番号１、２又は３に示されている配列のいずれかに対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性度を有する酵素であってよい。
【０１２２】
Bacillusアルファアミラーゼは同様に、変異体及び／又はハイブリッド、特に国際公開第１９９６／２３８７３号（WO 1996/23873）、国際公開第１９９６／２３８７４号（WO 1996/23874）、国際公開第１９９７／４１２１３号（WO 1997/41213）、国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）、国際公開第２０００／６００５９号（WO 2000/60059）、及び国際公開第２００２／１０３５５号（WO 2002/10355）（全ての文書は本発明に参照により援用されている）のいずれかで記述されているものであってもよい。具体的に企図されているアルファアミラーゼ変異体は、米国特許第６，０９３，５６２号、第６，２９７，０３８号又は第６，１８７，５７６号（U.S. Patent No. 6,093,562、6,297,038 or 6,187,576）（本発明に参照により援用）の中で開示されており、Ｒ１７９〜Ｇ１８２の位置に１個又は２個のアミノ酸の欠失、好ましくは、国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）内で開示されている配列番号３に記された野生型ＢＳＧアルファアミラーゼアミノ酸配列に比べて好ましくはデルタ（１８１〜１８２）に対応する国際公開第１９９６／０２３８７３号（WO 1996/023873）（本発明に参照により援用されている）（例えば２０頁、１〜１０行目参照）の中で開示されている２重欠失、又は番号付けには国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）内の配列番号３を用いたアミノ酸Ｒ１７９及びＧ１８０の欠失（参考文献は本発明に参照により援用される）を有するBacillus stearothermophilusアルファアミラーゼ（ＢＳＧアルファアミラーゼ）変異体を含む。さらに一層好ましいのは、国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）に開示されている配列番号３に記された野生型ＢＳＧアルファアミラーゼアミノ酸配列に比べて、デルタ（１８１〜１８２）に対応する２重欠失を有しかつさらにＮ１９３Ｆ置換（｜１８１*＋Ｈ１８２*＋Ｎ１９４Ｆとも記される）を含むBacillusアルファアミラーゼ特にBacillus stearothermophilusアルファアミラーゼである。
【０１２３】
細菌性ハイブリッドアルファアミラーゼ
具体的に企図されているハイブリッドアルファアミラーゼは、（国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）の配列番号４で示されている）Bacillus licheniformisアルファアミラーゼの４４５のＣ末端アミノ酸残基及び（国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）の配列番号５に示されている）Bacillus amyloliquefaciensに由来するアルファアミラーゼの３７のＮ末端アミノ酸残基を、（国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）の配列番号４内のBacillus licheniformis番号付けを用いて）Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｉ２０１Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓという置換の１つ以上、特に全てを伴って、含んでいる。同様に好ましいのは、Ｈ１５４Ｙ、Ａ１８１Ｔ、Ｎ１９０Ｆ、Ａ２０９Ｖ及びＱ２６４Ｓという突然変異（又はその他のBacillusアルファアミラーゼ主鎖内の対応する突然変異）のうちの１つ以上、及び／又は１７６位と１７９位の間の２つの残基の欠失、好ましくはＥ１７８及びＧ１７９の欠失（国際公開第１９９９／１９４６７号（WO 1999/19467）の配列番号５の番号付けを使用）を有する変異体である。
【０１２４】
真菌性アルファアミラーゼ
真菌性アルファアミラーゼには、Aspergillus属の菌株例えばAspergillus oryzae、Aspergillus niger、及びAspergillus kawachiiアルファアミラーゼに由来するアルファアミラーゼが含まれる。
【０１２５】
好ましい酸性真菌性アルファアミラーゼは、Aspergillus oryzae由来のフンガミル様アルファアミラーゼである。本発明によると、「フンガミル様アルファアミラーゼ」は、国際公開第１９９６／２３８７４号（WO 1996/23874）内の配列番号１０に示されているアミノ酸配列の成熟部分に対して高い同一性すなわち７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超またさらには１００％の同一性を示すアルファアミラーゼを表わす。
【０１２６】
別の好ましい酸性アルファアミラーゼは、Aspergillus niger菌株に由来する。好ましい実施形態において、酸性真菌性アルファアミラーゼは、プライマリアクセッション番号第Ｐ５６２７１としてSwiss-prot/Te EMBLデータベース内で「ＡＭＹＡ−ＡＳＰＮＧ」として開示され、国際公開第１９８９／０１９６９号（WO 1989/01969）（実施例３）の中で記述されているA. niger由来のものである。Aspergillus nigerに由来する市販の酸性真菌性アルファアミラーゼはＳＰ２８８（Novozymes A/S、デンマークから入手可）である。
【０１２７】
その他の企図されている野生型アルファアミラーゼとしては、Rhizomucor及びMeripilus属の菌株、好ましくはRhizomucor pusillus（参照により援用されている国際公開第２００４／０５５１７８号（WO 2004/055178））又はMeripilus giganteusの菌株に由来するものが含まれる。
【０１２８】
好ましい一実施形態において、アルファアミラーゼはAspergillus kawachiiに由来し、Kanekoら、１９９６年、J. Ferment. Bioeng.、８１号：２９２〜２９８頁「Aspergillus kawachiiからの酸安定性アルファアミラーゼをコードする遺伝子の分子クローニング及びそのヌクレオチド配列の決定」によって、そしてさらにＥＭＢＬ＃ＡＢ００８３７０として開示されている。
【０１２９】
真菌性アルファアミラーゼは同様に、デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）及びアルファアミラーゼ触媒ドメインを含む野生型酵素（すなわちノンハイブリッド）又はその変異体でもあってよい。１つの実施形態においては、野生型アルファアミラーゼは、Aspergillus kawachiiの菌株に由来する。
【０１３０】
真菌性ハイブリッドアルファアミラーゼ
好ましい一実施形態において、真菌性酸性アルファアミラーゼはハイブリッドアルファアミラーゼである。真菌性アルファアミラーゼの好ましい例としては、本発明に参照により援用されている国際公開第２００５／００３３１１号（WO 2005/003311）又は米国特許出願公開第２００５/００５４０７１号（U.S. Application Publication No. 2005/0054071）又は米国特許出願第６０／６３８，６１４号（US patent application no. 60/638,614）（Novozymes）の中で開示されているものが含まれる。ハイブリッドアルファアミラーゼは、アルファアミラーゼ触媒ドメイン（ＣＤ）及び炭水化物結合ドメインモジュール（ＣＢＭ）例えばデンプン結合ドメインそして任意にはリンカーを含み得る。
【０１３１】
企図されているハイブリッドアルファアミラーゼの具体例としては、触媒ドメインＪＡ１１８及びAthelia rolfsii SBDを伴うフンガミル変異体（米国特許第６０／６３８，６１４号（US 60/638,614）中の配列番号１００）、Athelia rolfsii AMGリンカー及びＳＢＤを伴うRhizomucor pusillusアルファアミラーゼ（米国出願第６０／６３８，６１４号（US application no. 60/638,614）中の配列番号１０１）、Aspergillus nigerグルコアミラーゼリンカー及びＳＢＤを伴うRhizomucor pusillusアルファアミラーゼ（これは米国出願第１１／３１６，５３５号（US application no. 11/316,535）中でアミノ酸配列番号２０、配列番号７２及び配列番号９６の組合せとして表５中に又は国際公開第２００６／０６９２９０号（WO 2006/069290）中の表５中でＶ０３９として開示されている）及びAthelia rolfsiiグルコアミラーゼリンカー及びＳＢＤを伴うMeripilus giganteusアルファアミラーゼ（米国出願第６０／６３８，６１４号（US application no. 60/638,614）中の配列番号１０２）を含め、米国特許出願第６０／６３８，６１４号（US patent application no. 60/638,614）中の実施例の表１〜５中で開示されているものが含まれる。その他の具体的に企図されているハイブリッドアルファアミラーゼは、各々本発明に参照により援用されている米国出願第１１／３１６，５３５号（US application no. 11/316,535）及び国際公開第２００６／０６９２９０号（WO 2006/069290）中の実施例４で表３、４、５及び６に列挙されたものである。
【０１３２】
企図されたハイブリッドアルファアミラーゼのその他の具体例としては、Aspergillus kawachiiリンカー及びデンプン結合ドメインを伴うAspergillus nigerアルファアミラーゼなどの、１５頁の表３で開示されているものを含めた、米国特許出願公開第２００５／００５４０７１号（U.S. Application Publication no. 2005/0054071）中で開示されているものが含まれる。
【０１３３】
同様に企図されているのは、上述のアルファアミラーゼのいずれかに対する高い同一性、すなわち、成熟酵素配列に対して７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超またさらには１００％の同一性を示すアルファアミラーゼである。
【０１３４】
本発明によると、酸性アルファアミラーゼは、０．１〜１０ＡＦＡＵ／ｇＤＳ、好ましくは０．１０〜５ＡＦＡＵ／ｇＤＳ、特に０．３〜２ＡＦＡＵ／ｇＤＳの量で添加されてよい。
【０１３５】
市販のアルファアミラーゼ製品
アルファアミラーゼを含む好ましい市販の組成物としては、DSM製のMYCOLASE、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X及びSANTM SUPER、SANTM EXTRA L （Novozymes A/S）及びCLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA及びSPEZYMETM DELTA AA（Genencor Int.）及び、商標名ＳＰ２８８で販売されている酸性真菌アルファアミラーゼ（Novozymes A/S、デンマークより入手可）が含まれる。
【０１３６】
炭水化物源生成酵素
炭水化物生成源という語句は、グルコアミラーゼ（グルコース生成物質である）、ベータアミラーゼ及びマルトース生成アミラーゼ（マルトース生成物質である）を含む。炭水化物源生成酵素は、例えばエタノールなどの発酵製品を生産するためのプロセスにおいて用いられる場合に問題の１つ又は複数の発酵生物によってエネルギー源として使用可能である炭水化物を生産する能力をもつ。生成された炭水化物は直接的に又は間接的に所望の発酵製品好ましくはエタノールへと転換され得る。本発明によると、炭水化物源生成酵素の混合物が存在してもよい。特に企図されている混合物は、少なくともグルコアミラーゼとアルファアミラーゼ、特に酸性アミラーゼ、さらに一層好ましくは酸性真菌性アルファアミラーゼの混合物である。酸性真菌性アルファアミラーゼ活性（ＡＦＡＵ）とグルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）の間の比率（ＡＧＵあたりのＡＦＡＵ）は、本発明の実施形態において、少なくとも０．１、特に少なくとも０．１６例えば０．１２〜０．５０以上の範囲内であってよい。
【０１３７】
グルコアミラーゼ
本発明にしたがって使用されるグルコアミラーゼは、例えば微生物又は植物由来のあらゆる適切な供給源に由来するものであってよい。好ましいグルコアミラーゼは、Aspergillusグルコアミラーゼ特にA. niger Ｇ１又はＧ２グルコアミラーゼ（Boelら、１９８４年、EMBO J. 第３号（５）、１０９７〜１１０２頁及びその変異体、例えば国際公開第１９９２／００３８１号（WO 1992/00381）、国際公開第２０００／０４１３６号（WO 2000/04136）及び国際公開第２００１／０４２７３号（WO 2001/04273）で開示されたもの（Novozymes、デンマーク製）；国際公開第１９８４／０２９２１号（WO 1984/02921）中で開示されたA. awamoriグルコアミラーゼ；A. oryzaeグルコアミラーゼ（Agric. Biol. Chem.、１９９１年、第５５号（４）、９４１〜９４９頁）及びその変異体又はフラグメントからなる群から選択された真菌又は細菌由来のものである。その他のAspergillusグルコアミラーゼ変異体には、熱安定性の増強されたもの、すなわちＧ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ（Chenら、１９９６年、Prot. Eng.第９号、４９９〜５０５頁；Ｄ２５７Ｅ及びＤ２９３Ｅ／Ｑ（Chenら、１９９５年、Prot. Eng.、第８号、５７５〜５８２頁）；Ｎ１８２（Chenら、１９９４年、Biochem. J.、第３０１号、２７５〜２８１頁）；ジスルフィド結合、Ａ２４６Ｃ（Fierobeら、１９９６年、Biochemistry、第３５号、８６９８〜８７０４頁）；及びＡ４３５及びＳ４３６位でのＰｒｏ残基の導入（Liら、１９９７年、Protein Eng.、第１０号、１１９９〜１２０４頁）を伴う変異体が含まれる。
【０１３８】
その他のグルコアミラーゼとしては、Athelia rolfsii（以前Corticium rolfsiiと記されたもの）グルコアミラーゼ（米国特許第４，７２７，０２６号（U.S. Patent No. 4,727,026）及び（Nagasakiら、１９９８年、「Corticium rolfsiiからの生デンプン分解性グルコアミラーゼの精製及び特性」、Appl. Microbiol. Biotechnol.、第５０号；３２３〜３３０頁を参照のこと）、特にTalaromyces emersonii（国際公開第１９９９／２８４４８号（WO 1999/28448））、Talaromycesleycettanus（米国特許第Ｒｅ．３２，１５３号（U.S. Patent No. Re. 32,153））、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus（米国特許第４，５８７，２１５号（U.S. Patent No. 4,587,215））に由来するTalaromycesグルコアミラーゼが含まれる。
【０１３９】
企図されている細菌性グルコアミラーゼには、Clostridium属、特にC. thermoamylolyticum（欧州特許第１３５，１３８号（EP 135,138））及びC. thermohydrosulfuricum（国際公開第１９８６／０１８３１号（WO 1986/01831））及び（本発明に参照により援用されている）国際公開第２００６／０６９２８９号（WO 2006/069289）中で開示されたTrametes cingulata由来のグルコアミラーゼが含まれる。
【０１４０】
本発明によるとハイブリッドグルコアミラーゼも同様に企図されている。ハイブリッドグルコアミラーゼの例は、国際公開第２００５／０４５０１８号（WO 2005/045018）中で開示されている。具体例としては、ハイブリッドグルコアミラーゼを教示しているかぎりにおいて本発明に参照により援用される国際公開第２００５／０４５０１８号（WO 2005/045018）の実施例１の表１及び４の中で開示されたハイブリッドグルコアミラーゼが含まれる。
【０１４１】
同様に企図されているのは、上述のグルコアミラーゼのいずれかに対する高い同一性、すなわち、成熟酵素配列に対して７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超またさらには１００％の同一性を示すグルコアミラーゼである。
【０１４２】
市販されているグルコアミラーゼを含む市販の組成物は、AMG 200L、AMG 300 L; SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETM FUEL、SPIRIZYMETM B34U及びAMGTM E（Novozymes A/S製)；OPTIDEXTM 300（Genencor Int.製）；AMIGASETM及びAMIGASETM PLUS（DSM製）；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM及びG990 ZR（Genencor Int.製）を含む。
【０１４３】
グルコアミラーゼは、一実施形態において、０．０２〜２０ＡＧＵ／ｇＤＳ、好ましくは０．１〜１０ＡＧＵ／ｇＤＳの量、特に１〜５ＡＧＵ／ｇＤＳ、例えば０．５ＡＧＵ／ｇＤＳの量で添加される。
【０１４４】
ベータ−アミラーゼ
「ベータ−アミラーゼ」（Ｅ．Ｃ ３．２．１．２）という用語は、アミロース、アミロペクチン及び関係するグルコースポリマにおいて１，４−アルファ−グルコシド結合の加水分解の触媒として作用するエキソ作用性マルトース生成アミラーゼに従来から与えられてきた名前である。マルトース単位は、分子が分解されるか又はアミロペクチンの場合には分岐点に到達するまで、段階的に非還元鎖末端から連続的に除去される。放出されたマルトースは、ベータアノマー配置を有し、このためベータ−アミラーゼという名で呼ばれる。
【０１４５】
ベータアミラーゼは、さまざまな植物及び微生物から単離された（W. M. Fogarty及びCT. Kelly、「Progress in Industrial Microbiology」、第１５巻、１１２〜１１５頁、１９７９年）。これらのベータアミラーゼは、４０℃〜６５℃の範囲内の最適な温度と４．５〜７の範囲内の最適なｐＨを有することを特徴とする。大麦由来の市販のベータアミラーゼは、Novozymes A/S、デンマーク製のNOVOZYMTMWBA及びGenenor Int., USA製のSPEZYMETMBBAである。
【０１４６】
マルトース生成アミラーゼ
アミラーゼは、マルトース生成アミラーゼであってもよい。マルトース生成アミラーゼ（グルカン１，４−アルファ−マルトヒドラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３）は、アミロース及びアミロペクチンを、アルファ配置のマルトースへ加水分解することができる。Bacillus stearothermophilus菌株ＮＣＩＢ１１８３７由来のマルトース生成アミラーゼは、Novozymes A/Sから市販されている。マルトース生成アルファアミラーゼについては、本発明に参照により援用されている米国特許第４，５９８，０４８号、第４，６０４，３５５号及び第6,162,628号（U.S. Patent Nos. 4,598,048、4,604,355 and 6,162,628,）の中で記述されている。
【０１４７】
マルトース生成アミラーゼは、好ましい一実施形態において、１ＤＳグラムあたり０．０５〜５ｍｇの総タンパク質又は０．０５〜５ＭＡＮＵ／ｇＤＳの量で添加されてよい。
【０１４８】
プロテアーゼ
プロテアーゼは、ステップｉｉ）の加水分解中、ステップｉｉｉ）の発酵中又は同時加水分解発酵中に添加され得る。プロテアーゼは、発酵中、発酵生物特に酵母を解膠する目的で添加されてよい。プロテアーゼは任意のプロテアーゼであり得、好ましい一実施形態において、プロテアーゼは微生物由来、好ましくは真菌又は細菌由来の酸性プロテアーゼである。酸性真菌性プロテアーゼが好ましいが、その他のプロテアーゼも使用可能である。
【０１４９】
適切なプロテアーゼには、微生物性プロテアーゼ例えば真菌性及び細菌性プロテアーゼが含まれる。好ましいプロテアーゼは酸性プロテアーゼ、すなわちｐＨ７未満の酸性条件下でタンパク質を加水分解する能力を特徴とするプロテアーゼである。
【０１５０】
企図されている真菌性プロテアーゼには、Aspergillus、Mucor、Rhizopus、Candida、Coriolus、Endothia、Enthomophtra、Irpex、Penicillium、Sclerotium及びTorulopsisに由来する真菌性プロテアーゼが含まれる。特に企図されているのは、Aspergillus niger（例えばKoazeら、１９６４年、Agr. Biol. Chem. Japan、第２８号、２１６頁を参照のこと）、Aspergillus saitoi（例えばYoshida、１９５４年、J. Agr. Chem. Soc. Japan、第２８号、６６頁を参照のこと）、Aspergillus awamori（Hayashidaら、１９７７年、Agric. Biol. Chem.、第４２号（５）、９２７〜９３３頁）、Aspergillus aculeatus（国際公開第１９９５／０２０４４号（WO 1995/02044））又はAspergillus oryzaeに由来するプロテアーゼ、例えばpep Aプロテアーゼ及びMucor pusillus又はMucor miehei由来の酸性プロテアーゼである。
【０１５１】
同じく企図されているのは、Bacillus菌株由来のプロテアーゼなどの中性又はアルカリ性プロテアーゼである。本発明のために企図されている特定のプロテアーゼは、Bacillus amyloliquefaciensに由来し、Swissprotにおいて登録番号ＰＯ６８３２として得ることのできる配列を有する。同様に企図されているのは、Swissprotにおいてアクセッション番号ＰＯ６８３２として得ることのできるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性例えば少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は特定的には少なくとも９９％の同一性を有するプロテアーゼである。
【０１５２】
さらに企図されているのは、国際公開第２００３／０４８３５３号（WO 2003/048353）の中で配列番号１として開示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は特に少なくとも９９％の同一性を有するプロテアーゼである。
【０１５３】
同様に企図されているのは、Ｅ．Ｃ．３．４．２２*（システインプロテアーゼ）、例えばＥＣ．３．４．２２．２．（パパイン）、ＥＣ３．４．２２．６（キモパパイン）、ＥＣ３．４．２２．７（アスクレパイン）、ＥＣ３．４．２２．１４（アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．１５（カテプシンＬ）、ＥＣ３．４．２２．２５（グリシルエンドペプチダーゼ）及びＥＣ３．４．２２．３０（カリカイン）内のプロテアーゼといったようなパパイン様プロテアーゼである。
【０１５４】
１つの実施形態においては、プロテアーゼは、Aspergillus oryzaeとなどのAspergillusの菌株に由来するプロテアーゼ調製物である。別の実施形態においては、プロテアーゼは、Rhizomucorの菌株、好ましくはRhizomucor meiheiに由来する。別の企図されている実施形態においては、プロテアーゼ調製物は、好ましくはAspergillusの菌株例えばAspergillus oryzaeに由来するタンパク質分解調製物と、Rhizomucorの菌株、好ましくはRhizomucor meiheiに由来するプロテアーゼとの混合物である。
【０１５５】
アスパラギン酸プロテアーゼは、例えば「タンパク質分解酵素ハンドブック」、A.J. Barrett、N D. Rawlings 及びJ F. Woessner編、Academic Press、San Diego、１９９８年、第２７０章）中で記述されている。アスパラギン酸プロテアーゼの適切な例としては、例えば、本発明に参照により援用されているR. M. Berkaら、Gene、第９６号、３１３頁（１９９０年）））；R.M. Berkaら、Gene、第１２５号、１９５〜１９８頁（１９９３年）；及びGomiら、Biosci. Biotech. Biochem. 第５７号、１０９５〜１１００頁（１９９３年）の中で開示されているものが含まれる。
【０１５６】
市販の製品としては、ALCALASER、ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、PROMIXTM、NEUTRASER、RENNILASER、NOVOZYMTM FM 2.0L及び NOVOZYMTM 50006（Novozymes A/S、デンマークより入手可）及びＧＣ１０６TM及びGenenor Inf. Inc, USA製のSPEZYMETMFANが含まれる。
【０１５７】
プロテアーゼは、ＤＳ１ｇあたり０．０００１〜１ｍｇの酵素タンパク質、好ましくはＤＳ１ｇあたり０．００１〜０．１ｍｇの酵素タンパク質という量で存在し得る。代替的には、プロテアーゼは、０．０００１〜１ＬＡＰＵ／ｇＤＳ、好ましくは０．００１〜０．１ＬＡＰＵ／ｇＤＳ及び／又は０．０００１〜１ｍＡＵ−ＲＨ／ｇＤＳ、好ましくは０．００１〜０．１ｍＡＵ−ＲＨ／ｇＤＳの量で存在していてよい。
【０１５８】
本明細書中で記述され特許請求されている発明は、本明細書中で開示されている具体的実施形態が本発明の複数の面の例証として意図されているという理由から、これらの実施形態により範囲が限定されるべきものではない。あらゆる同等の実施形態が、１つ以上の実施形態の組合せと同様、本発明の範囲内に入るよう意図されている。本明細書中に示され記述されているものに加えて本発明のさまざまな修正が、以上の記述から当業者には明らかとなるであろう。このような修正もまた、添付のクレームの範囲内に入るように意図されている。
【０１５９】
さまざまな参考文献が本明細書中で引用されており、その開示は全体が参照により援用される。本発明は以下の実施例によりさらに記述されるが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきものではない。
【０１６０】
材料及び方法
材料
セルラーゼ調製物Ａ：国際公開第２００５／０７４６５６号（WO 2005/074656）中で開示されているセルロース分解増強活性（ＧＨ６１Ａ）を有するポリペプチド；ベータグルコシダーゼ（国際公開第２００８／０５７６３７号（WO 2008/057637）で開示されている融合タンパク質）及びTrichoderma reeseiに由来するセルロース分解酵素を含むセルロース分解性組成物。セルラーゼ調製物Ａは、同時係属出願ＰＣＴ米国特許第２００８／０６５４１７号（PCT/US2008/065417）中で開示されている。
【０１６１】
酵母：
Red Star / Lesaffre, USAから入手可能なRED STARTM。
【０１６２】
ＲＷＢ２１８は、Royel Nedalco／オランダから重量したものであり、Kuyperら、２００５年、FEMS Yeast Research、第５号、９２５〜９３４頁の中で記述されている。
【０１６３】
未洗浄の前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）：National Renewable Energy Laboratory, Golden, COから得た、酸触媒作用と蒸気爆発済のもの。
【０１６４】
方法
同一性の決定
２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列の間の関係性は、「同一性」というパラメータによって記述される。
【０１６５】
２つのアミノ酸配列間の同一性度は、ギャップペナルティ１０及びギャップ長ペナルティ１０という多数のアラインメントパラメータ及び同一性表と共にLASERGENETMMEGALIGNTMソフトウェア（DNASTAR、Inc.、Madison、Wl）を使用してClustal方法（Higgins、１９８９年、CABIOS、第５号：１５１〜１５３頁）によって決定することができる。対合アラインメントパラメータはKtuple＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ＝５及びダイアゴナル＝５である。
【０１６６】
２つのヌクレオチド配列間の同一性度は、ギャップペナルティ１０及びギャップ長ペナルティ１０という多数のアラインメントパラメータ及び同一性表と共にLASERGENETM MEGALIGNTM ソフトフェア（DNASTAR、Inc.、Madison、Wl）を使用してWilbur-Lipman方法（Wilbur及びLipman、１９８３年、Proceedings of the National Academy of Science USA、第８０号：７２６〜７３０頁）によって決定することができる。対合アライメントパラメータは、Ktuple＝３、ギャップペナルティ＝３、及びウインドウ＝２０である。
【０１６７】
濾紙検定（ＦＰＵ検定）を用いたセルラーゼ活性の測定
１．  方法の情報源
１．１．  方法は、Adney、B.及びBaker、J.、１９９６年、「実験室分析手順、LAP-006」、National Renewable Energy Laboratory（NREL）による「セルラーゼ活性の測定」という題の文書の中で開示されている。それは、セルラーゼ活性を測定するためのＩＵＰＡＣ方法に基づいている（Ghose、T.K.、「細胞活性測定」、Pure & Appl. Chem.、第5９号、２５７〜２６８頁、１９８７年）。
【０１６８】
２．  手順
２．１．  以下で記述されている通り、着色の後吸光度値を読取るべく９６ウェルの平板を使用するという点を除いて、Adney及びBaker、１９９６年、上掲書によって記述されている通りに実施される。
【０１６９】
２．２．  酵素検定管：
２．２．１  巻いた濾紙片（＃１  Whatman；１×６ｃｍ；５０ｍｇ）を試験管（１３×１００ｍｍ）の底に置く。
【０１７０】
２．２．２  管に０．０５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８０）１．０ｍＬを添加する。
【０１７１】
２．２．３  濾紙と緩衝液が入った管を、循環水浴中で５０℃（±０．１℃）で５分間インキュベートする。
【０１７２】
２．２．４  インキュベーションの後、クエン酸緩衝液中の酵素希釈物０．５ｍＬを管に添加する。酵素希釈物は、２．０ｍｇのグルコースという目標値をわずかに上回る及び下回る値を生み出すように設計されている。
【０１７３】
２．２．５  管の中味を、３秒間穏やかにボルテックス処理することにより混合する。
【０１７４】
２．２．６  ボルテックス処理の後、管を、循環水浴中において５０℃（±０．１℃）で６０分間インキュベートする。
【０１７５】
２．２．７  ６０分間のインキュベーションの直後に、管を水浴から取り出し、３．０ｍＬのＤＮＳ試薬を各管に添加して反応を停止させる。管を３秒間ボルテックス処理して混合する。
【０１７６】
２．３  ブランク及び対照
２．３．１  １．５ｍＬのクエン酸緩衝液を試験管に添加して、試薬ブランクを調製する。
【０１７７】
２．３．２  試験管の底に巻いた濾紙片を入れ１．５ｍＬのクエン酸緩衝液を添加することにより、基質対照を調製する。
【０１７８】
２．３．３  適切な酵素希釈物０．５ｍＬと１．０ｍＬのクエン酸緩衝液を混合することにより各酵素希釈物について酵素対照を調製する。
【０１７９】
２．３．４  試薬ブランク、基質対照及び酵素対照を酵素検定管と同じ要領でかつこれらと同時に検定する。
【０１８０】
２．４  グルコース標準
２．４．１  グルコースの原液（１０．０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＬ調製し、５ｍＬのアリコートを凍結させる。使用前に、アリコートを解凍し、ボルテックス処理をして混合する。
２．４．２  原液の希釈物をクエン酸緩衝液中で以下のように作る：
Ｇ１＝１．０ｍＬの原液＋０．５ｍＬの緩衝液＝６．７ｍｇ／ｍＬ＝３．３ｍｇ／０．５ｍＬ
Ｇ２＝０．７５ｍＬの原液＋０．７５ｍＬの緩衝液＝５．０ｍｇ／ｍＬ＝２．５ｍｇ／０．５ｍＬ
Ｇ３＝０．５ｍＬの原液＋１．０ｍＬの緩衝液＝３．３ｍｇ／ｍＬ＝１．７ｍｇ／０．５ｍＬ
Ｇ４＝０．２ｍＬの原液＋０．８ｍＬの緩衝液＝２．０ｍｇ／ｍＬ＝１．０ｍｇ／０．５ｍＬ
【０１８１】
２．４．３  ０．５ｍＬの各希釈物を１．０ｍＬのクエン酸緩衝液に添加することにより、グルコース標準管を調製する。
【０１８２】
２．４．４  酵素検定管と同じ要領でこれと同時にグルコース標準管を検定する。
【０１８３】
２．５  着色
２．５．１  ６０分間のインキュベーション及びＤＮＳの添加後に、管を全て合わせて水浴中で５分間沸とうさせる。
【０１８４】
２．５．２  沸とう後、これらを氷／水浴中で急冷する。
【０１８５】
２．５．３  冷却した時点で、管を簡単にボルテックス処理し、パルプを沈降させる。その後、９６ウェルの平板中の２００マイクロＬのｄｄＨ２０に対して管からの５０マイクロＬを添加することによって各管を希釈させる。各ウェルを混合し、吸光度を５４０ｎｍで読取る。
【０１８６】
２．６  計算（例はＮＲＥＬ文書中に提供されている）
２．６．１  Ａ540に対する４つの標準（Ｇ１−Ｇ４）についてのグルコース濃度（ｍｇ／０．５ｍＬ）をグラフにすることにより、グルコース標準曲線を作成する。直線回帰（Prism Software）を用いてこれを適合させ、その線についての等式を用いて、各々の酵素検定管について生成されたグルコースを決定する。
【０１８７】
２．６．２  Ｙ軸（酵素希釈物）が対数スケール上にある状態で、合計酵素希釈物に対する生産されたグルコース（ｍｇ／０．５ｍＬ）のプロットを作成する。
【０１８８】
２．６．３  ２．０ｍｇを僅かに超えるグルコースを生産した酵素希釈物とそれを僅かに下回る量を生産した希釈物の間に１本の線を引く。この線から、ちょうど２．０ｍｇのグルコースを生産したはずの酵素希釈物を決定する。
【０１８９】
２．６．４  濾紙単位／ｍＬ（ＦＰＵ／ｍＬ）を以下の通りに計算する：
ＦＰＵ／ｍＬ＝０．３７／２．０ｍｇのグルコースを生産する酵素希釈物
【０１９０】
グルコアミラーゼ活性
グルコアミラーゼは、ＡＧＩ単位又はグルコアミラーゼ単位（ＡＧＵ）で測定することができる。
【０１９１】
グルコアミラーゼ活性（ＡＧＩ）
グルコアミラーゼ（アミログルコシダーゼと同義）はデンプンをグルコースに転換する。グルコースの量は、ここでは、活性決定のためのグルコースオキシダーゼ方法によって決定される。この方法は、米国穀物化学者学会、（２０００年）；ＩＳＢＮ；１−８９１１２７−１２−８からの「米国穀物化学者学会認可済み方法」第１〜２巻ＡＡＣＣ中の第７６−１１節デンプン−グルコースオキシダーゼを用いたグルコースの測定が後続するグルコアミラーゼ方法の中で記述されている。
【０１９２】
１グルコアミラーゼ単位（ＡＧＩ）というのは、この方法の標準条件下で１分間１マイクロモルのグルコースを形成することになる酵素の数量である。
【０１９３】
標準条件／反応条件：
基質：可溶性デンプン、濃度約１６ｇの乾物／Ｌ。
緩衝液：酢酸塩、約０．０４Ｍ、ｐＨ＝４．３
ｐＨ：４．３
インキュベーション温度：６０℃
反応時間：１５分
反応の終結：約０．２ｇ／Ｌ（ｐＨ約９）の濃度に至るまでＮａＯＨ
酵素濃度：０．１５〜０．５５ＡＡＵ／ｍＬ
【０１９４】
デンプンは、比色指標として実験室で使用される弱沸とう性デンプンであるLintnerデンプンでなくてはならない。Lintnerデンプンは、ヨウ素で青色に変色する能力を保つように天然デンプンの希塩酸処理によって得られる。
【０１９５】
グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）
ノボグルコアミラーゼ単位（ＡＧＵ）は、３７℃、ｐＨ４．３、基質：マルトース２３２．２ｍＭ、緩衝液：酢酸塩０．１Ｍ、反応時間５分という標準条件下で１分あたり１マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素の量として定義される。
【０１９６】
自動分析システムを使用してよい。存在するあらゆるアルファ−Ｄ−グルコースをベータ−Ｄ−グルコースに変えるようにグルコースデヒドロゲナーゼ試薬にムタロターゼが添加される。グルコースデヒドロゲナーゼは、上述の反応の中でベータ−Ｄ−グルコースと特異的に反応して、原初のグルコース濃度の尺度として３４０ｎｍで光度計を用いて決定されるＮＡＤＨを形成する。
【０１９７】
【表１】
0005731194.tif 000002
【０１９８】
【表２】
0005731194.tif 000003
【０１９９】
この分析方法をさらに詳述するフォルダー（ＥＢ−ＳＭ−０１３１−０２／０１）がNovozymes A/S、デンマークから依頼に応じて入手可能であり、このフォルダは本発明に参照により援用されている。
【０２００】
アルファアミラーゼ活性
アルファアミラーゼ活性（ＫＮＵ）
アルファアミラーゼ活性は、基質としてジャガイモデンプンを用いて決定可能である。この方法は、酵素による加工デンプンの分解に基づいており、反応後にはヨウ素溶液とデンプン／酵素溶液の試料との混合が続く。当初、黒っぽい青色が形成されるが、デンプンの分解中、青色は薄くなり、徐々に赤褐色となり、これを色ガラス標準と比較する。
【０２０１】
１キロノボアルファアミラーゼ単位（ＫＮＵ）は、標準条件（すなわち３７℃＋／−０．０５：０．０００３ＭＣａ2+及びｐＨ５．６）下で５２６０ｍｇのデンプン乾燥物質Merck Amylum solubileをデキストリン化する酵素の量として定義される。
【０２０２】
この分析方法をさらに詳述するフォルダー（ＥＢ−ＳＭ−０００９−０２／０１）がNovozymes A/S、デンマークから依頼に応じて入手可能であり、このフォルダは本発明に参照により援用されている。
【０２０３】
酸性アルファアミラーゼ活性
本発明にしたがって使用される場合、あらゆる酸性アルファアミラーゼの活性はＡＦＡＵ（酸性真菌性アルファアミラーゼ単位）で測定されてよい。代替的には、酸性アルファアミラーゼの活性を、ＡＡＵ（酸性アルファアミラーゼ単位）で測定してもよい。
【０２０４】
酸性アルファアミラーゼ単位（ＡＡＵ）
酸性アルファアミラーゼ活性は、絶対的方法であるＡＡＵ（酸性アルファアミラーゼ単位で測定可能である。１酸性アミラーゼ単位（ＡＡＵ）は、標準化された条件下で１時間あたり１ｇのデンプン（乾物１００％）を、色基準の１に等しい公知の強度をもつヨウ素溶液との反応後に６２０ｎｍの透過率を有する製品へと転換する酵素の量である。
【０２０５】
標準条件／反応条件：
基質：可溶性デンプン、濃度約２０ｇＤＳ／Ｌ
緩衝液：クエン酸塩、約０．１３Ｍ、ｐＨ＝４．２
ヨウ素溶液：４０．１７６ｇのヨウ化カリウム＋０．０６８ｇのヨウ素／Ｌ
水道水：１５°〜２０°ｄＨ（ドイツ式硬度）
ｐＨ：４．２
インキュベーション温度：３０℃
反応時間：１１分
波長：６２０ｎｍ
酵素濃度：０．１３〜０．１９ＡＡＵ／ｍＬ
酵素作用範囲：０．１３〜０．１９ＡＡＵ／ｍＬ
【０２０６】
デンプンは、比色指標として実験室で使用される弱沸とう性デンプンであるLintnerデンプンでなくてはならない。Lintnerデンプンは、ヨウ素で青色に変色する能力を保つように天然デンプンの希塩酸処理によって得られる。
【０２０７】
酸性アルファアミラーゼ活性（ＡＦＡＵ）
酸性アルファアミラーゼ活性は、酵素標準との関係において決定されるＡＦＡＵ（酸性真菌性アルファアミラーゼ単位）で測定されてよい。１ＡＦＡＵは、以下で言及する標準条件下で１時間あたり５２６０ｍｇのデンプン乾物を分解する酵素の量として定義される。
【０２０８】
エンド型アルファアミラーゼ（１，４−アルファ−Ｄ−グルカン−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）である酸性アルファアミラーゼは、デンプン分子の内部領域内でアルファ−１，４−グルコシド結合を加水分解して、異なる鎖長をもつオリゴ糖及びデキストリンを形成する。ヨウ素で形成される色の強度は、デンプンの濃度に正比例する。アミラーゼ活性は、規定の分析条件下でのデンプンの濃度の減少として、逆比色分析を用いて決定される。
【０２０９】
【化１】
0005731194.tif 000004
【０２１０】
標準条件／反応条件：
基質：可溶性デンプン、約０．１７ｇ／Ｌ
緩衝液：クエン酸塩、約０．０３Ｍ
ヨウ素（１２）：０．０３ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ2：１．８５ｍＭ
ｐＨ：２．５０±０．０５
インキュベーション温度：４０℃
反応時間：２３秒
波長：５９０ｎｍ
酵素濃度：０．０２５ＡＦＡＵ
酵素作用範囲：０．０１〜０．０４ＡＦＡＵ
【０２１１】
この分析方法をさらに詳述するフォルダー（ＥＢ−ＳＭ−０２５９−０２／０１）が、Novozymes A/S、デンマークへ依頼すれば入手可能であり、このフォルダは本発明に参照により援用されている。
【０２１２】
キシロース／グルコースイソメラーゼ検定（ＩＧＩＵ）
１ＩＧＩＵは、標準分析条件で１分あたり１マイクロモルの初期速度でグルコースをフルクトースに転換する酵素の量である。
【０２１３】
標準条件：
グルコース濃度：４５％ｗ／ｗ
ｐＨ：７．５
温度：６０℃
Ｍｇ2+濃度：９９ｍｇ／Ｌ（１．０ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏ）
活性剤、ＳＯ2濃度：１００ｐｐｍ（０．１８ｇ／Ｌ  Ｎａ2Ｓ2Ｏ5）
緩衝液、Ｎａ2ＣＯ9、濃度：２ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3
【０２１４】
プロテアーゼ活性
プロテアーゼ検定方法（ＬＡＰＵ）
１ロイシンアミノペプチダーゼ単位（ＬＡＰＵ）は、基質としてのＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド２６ｍＭ、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、３７℃、１０分の反応時間という条件で１分あたり１マイクロＭの基質を分解する酵素の量である。
【０２１５】
ＬＡＰＵは、依頼によりNovozymes A/S、デンマークから入手可能であるＥＢ−ＳＭ−０２９８．０２／０１の中で記述される。
【０２１６】
プロテアーゼ検定方法−ＡＵ（ＲＨ）
タンパク質分解活性は、基質として変性ヘモグロビンを用いて決定してよい。タンパク質分解活性の決定のためのアンソン−ヘモグロビン方法においては、変性ヘモグロビンが消化され、未消化のヘモグロビンはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて沈殿させられる。ＴＣＡ可溶性生成物の量は、フェノール試薬を用いて決定され、この試薬はチロシン及びトリプトファンで青色を示す。
【０２１７】
１アンソン単位（ＡＵ（ＲＨ））は、標準条件（すなわち２５℃、ｐＨ５．５及び１０分の反応時間）下で、１ミリグラム当量でチロシンと同じ色をフェノール試薬で示す量のＴＣＡ可溶性生成物を１分あたりに遊離させるような初期速度でヘモグロビンを消化する酵素量として定義される。
【０２１８】
ＡＵ（ＲＨ）は、依頼によりNovozymes A/S、デンマークから入手可能であるＥＡＬ−ＳＭ−０３５０の中で記述されている。
【０２１９】
マルトース生成アミラーゼ活性（ＭＡＮＵ）の決定
１ＭＡＮＵ（Maltogenic Amylase Novo Unit）は、３０分間３７℃でｐＨ５．０の０．１Ｍのクエン酸緩衝液１ｍｌあたり１０ｍｇのマルトトリオース（Sigma Ｍ８３７８）基質の濃度で１分につき１マイクロモルのマルトースを放出するのに必要とされる酵素の量として定義され得る。
【０２２０】
酵母乾燥重量の測定
乾燥酵母細胞顆粒を直接秤量することによりRED STARTMの乾燥重量を決定した。ＯＤ及び乾燥細胞重量の予め定められた相関関係を用いて、分光光度計により６００ｎｍで細胞の光学密度（ＯＤ）を測定することで、ＲＷＢ２１８の乾燥重量を決定した。１というＯＤは、乾燥細胞の０．２６ｇ／Ｌに相関している。
【実施例】
【０２２１】
実施例１
高細胞計数エタノール生産
エタノールの生産に対する高酵母ピッチ（yeast pitch）（細胞計数）及び細胞再循環の効果を、濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物をさまざまな初期酵母細胞濃度で接種することによってテストした。発酵開始から２４時間及び４８時間後に、細胞を遠心分離により再循環させ、使用済みの加水分解物を取り出し、新鮮な加水分解物を添加した。
【０２２２】
方法：
セルロース１ｇあたり１０ｍｇのセルラーゼ調製物Ａと２０％（ｗ／ｗ）の初期不溶性固体濃度を用いて、５０℃で７２時間、未洗浄のＰＣＳ（酸触媒作用、蒸気爆発を受けたもの、The National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO）を加水分解した。加水分解の後、３０００ｒｐｍでスラリーを１０分間遠心分離し、０．４５ミクロンのWhatmanフィルタを用いて濾過により上清を収集した。
【０２２３】
２４ウェルの細胞培養平板（Whatman International Ltd.、Florham Park、NJ）のウェル内に、１ｇの乾燥細胞／Ｌ〜５０ｇの乾燥細胞／Ｌの範囲内の可変的量のRED STARTM酵母を添加した。各々のウェルに、ｐＨ５．０のＰＣＳ酵素加水分解物を４ｍＬ添加し、細胞を穏やかに撹拌しながら再懸濁させた。平板を密封し、１５０ｒｐｍで撹拌しながら、３２℃で乾燥空気インキュベータ内においてインキュベートした。エタノール判定のために、０、４、８及び２４時間で試料を採取した。エタノール定量のためには、酵素カップリングしたマイクロタイター平板検定を使用した（試薬はDiagnostic Chemicals Ltd.、Prince Edward Island、Canada製）。２４時間後に、１２分間３０００ｒｐｍでの遠心分離により細胞を収集し、上清を廃棄した。次に４ｍＬの新鮮なＰＣＳ加水分解物を各ウェルに添加し、酵母細胞を撹拌用ガラス棒で再懸濁させた。試料を直後にそして３２℃で２４時間にわたる２回目のインキュベーションの後に収集し、その後、発酵平板を再度遠心分離し、上清を廃棄した。各ウェルに再び４ｍＬの新鮮なＰＣＳ加水分解物を添加し、細胞を再度懸濁させた。試料を直ちにそして発酵３日目の４、８及び２４時間目に収集した。発酵を開始から７２時間で終了させ、各ウェルを標準ＨＰＬＣ分析のために試料採取した。
【０２２４】
【表３】
0005731194.tif 000005
【０２２５】
実施例２
低細胞計数エタノール生産
異なる酵母菌株におけるバッチ発酵エタノール生産に対するさまざまな量の糖溶液及び濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物の効果をテストした。結果は図１にまとめられている。
【０２２６】
方法：
ＲＥＤ  ＳＴＡＲTM酵母及びＲＷＢ２１８（Nedalco）によりエタノールを生産するために、１０個の異なる培地をバッチ発酵させた。培地１〜５は、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物及び１％（ｗ／ｖ）のペプトンで補足したグルコース及びキシロース溶液であった。培地６〜１０は、異なる総固体レベルを有する濾過された未洗浄の前処理済みトウモロコシ茎葉（ｆｕｗＰＣＳ）酵素加水分解物であった。培地５〜９の糖レベルを調整して、キシロース及びグルコース濃度を、ｆｕｗＰＣＳ加水分解物の全固体２０％内に見られるものと同等にし、異なるレベルの阻害に対する菌株の耐性をテストした。全ての培地を濾過滅菌した。
【０２２７】
培地１：４０ｇ／Ｌでキシロースのみ
培地２：４０ｇ／Ｌでグルコースのみ
培地３：キシロース２０ｇ／Ｌとグルコース２０ｇ／Ｌ（低用量）
培地４：キシロース６０ｇ／Ｌ及びグルコース８０ｇ／Ｌ（高用量）
培地５：キシロース４０ｇ／Ｌ及びグルコース７５ｇ／Ｌ中のＴＳ０％のｆｕｗＰＣＳ
培地６：キシロース４０ｇ／Ｌ及びグルコース７５ｇ／Ｌ中のＴＳ１％のｆｕｗＰＣＳ
培地７：キシロース４０ｇ／Ｌ及びグルコース７５ｇ／Ｌ中のＴＳ５％のｆｕｗＰＣＳ
培地８：キシロース４０ｇ／Ｌ及びグルコース７５ｇ／Ｌ中のＴＳ１０％のｆｕｗＰＣＳ
培地９：キシロース４０ｇ／Ｌ及びグルコース７５ｇ／Ｌ中のＴＳ１５％のｆｕｗＰＣＳ
培地１０：キシロース４０ｇ／Ｌ及びグルコース７５ｇ／ＬのＴＳ２０％のｆｕｗＰＣＳ。
【０２２８】
未洗浄のＰＣＳ（酸触媒作用、蒸気爆発を受けたもの。The National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO）を希釈し、ＮａＯＨでｐＨ５．０に調整した。加水分解に先立ち、ペニシリン、クエン酸緩衝液及びＹＰ培地（０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物及び１％（ｗ／ｖ）のペプトン）も添加した。試料を、２０％（ｗ／ｗ）の総固体濃度でセルラーゼ調製物Ａを用いて５０℃で９６時間加水分解した。加水分解の後、スラリーを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ｐＨ５．０の上清を無菌濾過により収集し、発酵に使用した。
【０２２９】
発酵を、９６時間３０℃で、加圧滅菌した２０ｍｌ入りのミニバイアル内で続行した。以上で列挙した通り１０個の発酵培地内で、両方の酵母をテストした。全ての試験はトリプリケートで実施した。０．２５ｇ／Ｌ前後の初期細胞密度で、２０ｍｌ入りのミニバイアルに入った５ｍｌの発酵培地に、前培養を接種した。その後、４日間１５０ｒｐｍで振とう機内でミニバイアルをインキュベートした。発酵の終了時点で試料をとり、ＨＰＬＣによりエタノール、グルコース、キシロース、酢酸及びグリセロールレベルを測定した。ＨＰＬＣ調製は、４０％のＨ2ＳＯ4の添加（１％ｖ／ｖ添加）により反応を停止させること、遠心分離することそして、０．２０マイクロメートルのフィルタを通して濾過することから成っていた。試料を、分析まで４℃で保管した。ＲＩ検出器と連結されたAgilentTM１１００ＨＰＬＣシステムを使用した。分離カラムは、Bio RadTM製のアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）であった。
【０２３０】
実施例３
高細胞計数エタノールの生産
さまざまな初期酵母細胞濃度で、濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物を接種することにより、バッチ発酵エタノール生産に対する高いＲＥＤ  ＳＴＡＲTM酵母ピッチ（細胞計数）の効果をテストした。結果は図２中にまとめられている。
【０２３１】
方法：
セルロース１ｇあたり５０ｍｇのセルラーゼ調製物Ａと２０％（ｗ／ｗ）の初期不溶性固体濃度を用いて、５０℃で１２０時間、未洗浄のＰＣＳ（The National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO製の酸触媒作用を受けた前処理済みトウモロコシ茎葉）を加水分解した。加水分解の後、Beckman-Coulter卓上遠心分離機を用いて３０００ｒｐｍで１０分間スラリーを遠心分離して固体を分離した。結果として得た液体加水分解物に栄養物すなわち酵母抽出物及びペプトンを各々５ｇ／Ｌのレベルで補足し、Red Star乾燥酵母の初期酵母細胞濃度を、２０ｇ／Ｌから９０ｇ／Ｌまで変動させることにより、１５０ｍＬの作用範囲をもつ２５０ｍＬ入りのナルゲンボトル内においてｐＨ５．０及び温度３２℃で２４時間振とう機インキュベータを用いて１５０ｒｐｍで発酵させた。３、７及び２４時間目に試料を収集し、ＨＰＬＣを用いてグルコース消費及びエタノール生産について分析した。
【０２３２】
実施例４
高細胞計数エタノールの生産
さまざまな初期酵母細胞濃度で、前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物を接種することにより、バッチ発酵エタノール生産に対する高いＲＷＢ２１８酵母ピッチ（細胞計数）の効果をテストした。結果は図３中にまとめられている。
【０２３３】
方法
未洗浄のＰＣＳ（酸触媒作用、蒸気爆発を受けたもの、The National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO）を水で希釈し、ＮａＯＨでｐＨ５．０に調整した。加水分解に先立ってペニシリン及びクエン酸緩衝液も添加した。２３％（ｗ／ｗ）の総固体濃度でセルラーゼ調製物Ａと共に５０℃で９５時間試料を加水分解した。加水分解後、スラリーを３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。発酵に先立ち、上清に、０．５％の酵母抽出物（ｗ／ｖ）及び０．５％（ｗ／ｖ）のペプトンを補足し、ＮＨ4ＯＨでｐＨを６．０に調整した。加水分解物の最終的総固体濃度を２０％（ｗ／ｗ）にするべく、一定量の水を添加した。
【０２３４】
１２５ｍｌ入りフラスコ内において３０℃で発酵を続行した。各フラスコに上述の加水分解物液体が５０ｍｌ入っており、これに１リットルあたり２、５、１０、２０、４０及び６０ｇの細胞という初期細胞密度でＲＷＢ２１８を接種した。フラスコを、２４時間振とう機内において１５０ｒｐｍでインキュベートした。ＨＰＬＣによりエタノール、グルコース、キシロース、酢酸及びグリセロールレベルを測定するため、０、２、４、６、８、１０、１２、２２、及び２４時間の発酵時点で試料を採取した。ＨＰＬＣ調製は、ＨＰＬＣ調製は、４０％のＨ2ＳＯ4の添加（１％ｖ／ｖ添加）により反応を停止させること、遠心分離することそして、０．２０マイクロメートルのフィルタを通して濾過することから成っていた。試料を、分析まで４℃で保管した。ＲＩ検出器と連結されたAgilentTM１１００ＨＰＬＣシステムを使用した。分離カラムは、Bio RadTM製のアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）であった。
【０２３５】
実施例５
再循環高細胞計数エタノールの生産
４０ｇ／Ｌという初期酵母細胞濃度で、濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物を接種することにより、バッチ発酵エタノール生産に対する高いＲＥＤ  ＳＴＡＲTM酵母ピッチ（細胞計数）及びｐＨ５での細胞再循環の効果をテストした。発酵開始から２４時間及び４８時間後に、遠心分離により細胞を再循環させ、使用済みの加水分解物を取り出し、新鮮な加水分解物を添加した。結果は図４中にまとめられている。
【０２３６】
方法：
セルロース１ｇあたり５０ｍｇのセルラーゼ調製物Ａと２０％（ｗ／ｗ）の初期不溶性固体濃度を用いて、５０℃で１２０時間、未洗浄のＰＣＳ（The National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO製酸触媒作用を受けた前処理済みトウモロコシ茎葉）を加水分解した。加水分解の後、Beckman-Coulter卓上遠心分離機を用いて３０００ｒｐｍで１０分間スラリーを遠心分離して固体を分離した。結果として得た液体加水分解物に栄養物すなわち酵母抽出物及びペプトンを各々５ｇ／Ｌのレベルで補足し、４０ｇ／Ｌという初期酵母細胞濃度で、１５０ｍＬの作用範囲をもつ２５０ｍＬ入りのナルゲンボトル内においてｐＨ５．０及び温度３２℃で２４時間、振とう機インキュベータを用いて１５０ｒｐｍで発酵させた。２４時間毎に、液体加水分解物及び酵母細胞の入ったナルゲンボトルを、Beckman-Coulter卓上遠心分離機を用いて１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。エタノールを含有する発酵した液体加水分解物を傾瀉させ、栄養物を含有する新鮮な加水分解物を添加し（１５０ｍＬの体積）、同じナルゲンボトル内で酵母細胞を再懸濁させ、先の通り振とう機インキュベータ内において３２℃、１５０ｒｐｍで再度インキュベートした。試料を、各発酵サイクルについて３、７及び２３．５時間の時点で収集し、ＨＰＬＣを用いてグルコース消費及びエタノール消費について分析した。
【０２３７】
実施例６
再循環高細胞計数エタノールの生産
４０ｇ／Ｌという初期酵母細胞濃度で、濾過された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物を接種することにより、バッチ発酵エタノール生産に対する高いＲＥＤ  ＳＴＡＲTM酵母ピッチ（細胞計数）及びｐＨ６での細胞再循環の効果をテストした。各発酵サイクルの開始から１２時間後に、遠心分離により細胞を再循環させ、使用済みの加水分解物を取り出し、新鮮な加水分解物を添加した。結果は図５中にまとめられている。
【０２３８】
方法：
セルロース１ｇあたり５０ｍｇのセルラーゼ調製物Ａと２０％（ｗ／ｗ）の初期不溶性固体濃度を用いて、５０℃で１２０時間、未洗浄のＰＣＳ（The National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO製酸触媒作用を受けた前処理済みトウモロコシ茎葉）を加水分解した。加水分解の後、Beckman-Coulter卓上遠心分離機を用いて３０００ｒｐｍで１０分間スラリーを遠心分離した。結果として得た液体加水分解物に栄養物すなわち酵母抽出物及びペプトンを各々５ｇ／Ｌのレベルで補足し、４０ｇ／Ｌという初期酵母細胞濃度で、１５０ｍＬの作用範囲をもつ２５０ｍＬ入りのナルゲンボトル内においてｐＨ６．０及び温度３２℃で２４時間振とう機インキュベータを用いて１５０ｒｐｍで発酵させた。ｐＨを６．０に調整するために、１０％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム溶液を使用した。１２時間毎に、液体加水分解物及び酵母細胞の入ったナルゲンボトルを、Beckman-Coulter卓上遠心分離機を用いて１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。エタノールを含有する発酵した液体加水分解物を傾瀉させ、栄養物を含有する新鮮な加水分解物を添加し（１５０ｍＬの体積）、同じナルゲンボトル内で酵母細胞を再懸濁させ、先の通り振とう機インキュベータ内において３２℃、１５０ｒｐｍで再度インキュベートした。試料を、各発酵サイクルの後、３、７及び１１．５時間の時点で収集し、ＨＰＬＣを用いてグルコース消費及びエタノール消費について分析した。同じ実験を、およそ２０ｇ／Ｌのグルコースが追加された培地中で１５％（ｗ／ｗ）の初期固体濃度で実施した。合計９回の発酵サイクルについて、細胞を８回再循環した。各々の発酵サイクルはおよそ３７ｇ／Ｌのエタノールを生産し、９回の発酵サイクルの後でさえ、再循環された酵母の発酵生産性の損失は全くみられなかった（データ示さず）。
【０２３９】
実施例７
再循環高細胞計数エタノールの生産
２０ｇ／Ｌという酵母細胞濃度で、遠心分離された前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物を接種することにより、フェッドバッチ発酵エタノール生産に対する高いＲＷＢ２１８酵母ピッチ（細胞計数）及び細胞再循環の効果をテストした。各発酵の開始から２４時間後に、遠心分離により細胞を再循環させ、使用済みの加水分解物を取り出し、新鮮な加水分解物を添加した。各発酵サイクルについての結果は図６ａ中に示され、最初の発酵サイクルの詳細は図６ｂに示されている。
【０２４０】
未洗浄のＰＣＳ（酸触媒作用、蒸気爆発を受けたもの、The National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO）を水で希釈し、ＮａＯＨでｐＨ５．０に調整した。加水分解に先立ってペニシリン及びクエン酸緩衝液も添加した。２３％（ｗ／ｗ）の総固体濃度でセルラーゼ調製物Ａと共に５０℃で９５時間試料を加水分解した。加水分解後、スラリーを３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。発酵に先立ち、上清に、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物及び０．５％（ｗ／ｖ）のペプトン又は０．１％（ｗ／ｖ）の尿素を補足し、ＮＨ4ＯＨでｐＨを６．０に調整した。加水分解物の最終的総固体濃度を２０％（ｗ／ｗ）にするべく、一定量の水を添加した。
【０２４１】
２５０ｍｌ入りのナルゲンボトル内において３０℃で発酵を実施した。１本のボトルには最初、酵母抽出物とペプトンで補足された上述の加水分解物液体４０ｍｌが入っており、もう１本のボトルには、尿素で補足された上述の加水分解物液体４０ｍｌが入っていた。両方のボトルに、（２００ｍｌという合計作用範囲に基づいて）１リットルあたり２０ｇの細胞という細胞密度でＲＷＢ２１８を接種した。その後ボトルを振とう機内において１５０ｒｐｍでインキュベートした。バッチと同じ加水分解物液体の補給を、２時間の発酵の後に開始させた。合計補給体積は１６０ｍｌであり、合計補給時間は２２〜４０時間であった。補給を完了した後、発酵ビールと酵母細胞の入ったナルゲンボトルを１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。１６０ｍｌの上清含有エタノールを傾瀉し、ボトルの中に残された残り４０ｍｌを酵母細胞と充分混合させた。ボトルを先の通り３０℃及び１５０ｒｐｍで再度インキュベートし、先のものと同じ加水分解物液体をさらに１６０ｍｌ補充した補給ボトルで補給を再度開始した。各発酵サイクル中試料を収集して、ＨＰＬＣによりエタノール、グルコース、キシロース、酢酸及びグリセロールレベルを測定した。ＨＰＬＣ調製は、４０％のＨ2ＳＯ4の添加（１％ｖ／ｖ添加）により反応を停止させること、遠心分離することそして、０．２０マイクロメートルのフィルタを通して濾過することから成っていた。試料を、分析まで４℃で保管した。ＲＩ検出器と連結されたAgilentTM１１００ＨＰＬＣシステムを使用した。分離カラムは、Bio RadTM製のアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）であった。
【０２４２】
実施例８
高細胞計数エタノールの生産
さまざまな初期酵母細胞濃度で、前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）酵素加水分解物を接種することにより、さまざまな前処理方法で前処理されたトウモロコシ茎葉（ＣＳ）からのバッチ発酵エタノール生産に対する高いＲＷＢ２１８酵母ピッチ（細胞計数）の効果をテストした。結果は図７中にまとめられている。
【０２４３】
方法
未洗浄の自己前処理済みトウモロコシ茎葉及び未洗浄の焼灼剤前処理済みトウモロコシ茎葉（The National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO）を水で希釈し、それぞれＮａＯＨ又はＨ2ＳＯ4のいずれかでｐＨ５．０に調整した。加水分解に先立ってペニシリン及びクエン酸緩衝液も添加した。２０％（ｗ／ｗ）の総固体濃度でセルラーゼ調製物Ａ及びSHEARSYMTMと共に５０℃で４８時間試料を加水分解した。加水分解後、スラリーを３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。発酵に先立ち、上清に、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物及び０．５％（ｗ／ｖ）のペプトンを補足した。
【０２４４】
１２５ｍｌ入りフラスコ内において３０℃で発酵を続行した。各フラスコに上述の加水分解物液体が５０ｍｌ入っており、これに１リットルあたり２、５、１０、２０及び４０ｇの細胞という初期細胞密度でＲＷＢ２１８を接種した。フラスコを２４時間、振とう機内において１５０ｒｐｍでインキュベートした。ＨＰＬＣによりエタノール、グルコース、キシロース、酢酸及びグリセロールレベルを測定するため、０、２、４、６、２０及び２４時間の発酵時点で試料を採取した。ＨＰＬＣ調製は、ＨＰＬＣ調製は、４０％のＨ2ＳＯ4の添加（１％ｖ／ｖ添加）により反応を停止させること、遠心分離することそして、０．２０マイクロメートルのフィルタを通して濾過することから成っていた。試料を、分析まで４℃で保管した。ＲＩ検出器と連結されたAgilentTM１１００ＨＰＬＣシステムを使用した。分離カラムは、Bio RadTM製のアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）であった。
【図１】
0005731194.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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