(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在を試験するために、バッファとともに使用するための試験システムであって、
（ａ）第１の組の検出分子であって、
各々、１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）フルオロフォアに対して固定化された１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）を含み、各々の前記ＢＲＭは、前記試験サンプル中に標的分子が存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は１つ以上の複合体型を含み、各々は前記標的型のうちの特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応する、第１の組の検出分子と、
（ｂ）マイクロ流体チップであって、
（ｉ）マイクロ流体チップ内の１つ以上の細長いサンプルチャンネルであって、前記複合体の流路が通過することを可能にするようにサイズ決定された、前記細長いサンプルチャネルと、
（ｉｉ）バッファの動作可能な流路が通過するための、マイクロ流体チップ内の１つ以上の流れ集束チャネルであって、前記１つ以上の流れ集束チャネルは、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続し、前記流れ集束チャネルから出る前記バッファが前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて、縦一列の流れの前記複合体を動作可能に方向付ける、１つ以上の流れ集束チャネルと、
を画定するように成形されたチップ基板部を備える、マイクロ流体チップと、
（ｃ）前記縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに沿った照射位置において、電磁波（ＥＭＦ）放射線を動作可能に送達する照射装置であって、前記複合体は、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に蛍光を放出し、前記複合体の前記蛍光は、各々前記複合体型の１つに対する弁別的蛍光スペクトルを含む、照射装置と、
（ｄ）前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する検出装置であって、各々の前記複合体型の１つの前記弁別的な蛍光スペクトルに関して監視することによって、前記複合体の存在を同定する、検出装置と、
を備え、
前記複合体が約１０マイクロメートル（μｍ）未満のサイズであり、
各々の前記検出分子は、前記ＢＲＭおよび前記ＢＲＭフルオロフォアに対して固定化され、かつ前記ＢＲＭと前記ＢＲＭフルオロフォアとの間に実質的に配置された、マイクロビーズをさらに含み、前記複合体の各々が標的分子のそれぞれ１つに結合した標的マーカーフルオロフォアをさらに含み、各前記複合体について、前記ＢＲＭフルオロフォアは、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に、前記弁別的な蛍光スペクトルの前記蛍光の少なくともＢＲＭ部分を放出し、前記標的マーカーフルオロフォアがＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分を放出し、前記ＢＲＭフルオロフォアおよび前記標的マーカーフルオロフォアがともに、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に前記弁別的な蛍光スペクトルの蛍光を放出し、
前記ＢＲＭフルオロフォアは、１つ以上の量子ドット型の１つ以上の量子ドットを含み、前記量子ドットはともに、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に、前記弁別的な蛍光スペクトルの前記蛍光の少なくとも前記ＢＲＭ部分を放出し、
それによって、前記試験サンプル中の前記標的分子の存在を同定する、
試験システム。
【請求項２】
量子ドットが前記量子ドット型のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の試験システム。
【請求項３】
複合体が約１μｍ未満のサイズである、請求項１または２に記載の試験システム。
【請求項４】
検出装置は、前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する、少なくとも２つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）を備え、第１の前記ＡＰＤの１つは、前記各々の複合体に対する前記弁別的蛍光スペクトルの前記蛍光の前記ＢＲＭ部分の存在を受信および同定するように適合され、第２の前記ＡＰＤの１つは、前記各々の複合体に対する前記弁別的蛍光スペクトルの前記蛍光の前記標的部分の存在を受信および同定するように適合される、請求項１に記載の試験システム。
【請求項５】
生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対して試験するための試験システムであって、
バッファと、
第１の組の検出分子であって、各々の前記検出分子は、１つ以上のＢＲＭフルオロフォアに対して固定化された１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）を備え、各々の前記ＢＲＭは、前記試験サンプル中に標的分子が存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように、前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は、１つ以上の複合体型を含み、各々は、前記標的型のうちのその特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応する、前記検出分子は電磁波（ＥＭＦ）放射線を吸収後に蛍光を放出し、
前記複合体が約１０マイクロメートル（μｍ）未満のサイズであり、各々の前記検出分子は、前記ＢＲＭおよび前記ＢＲＭフルオロフォアに対して固定化され、かつ前記ＢＲＭと前記ＢＲＭフルオロフォアとの間に実質的に配置された、マイクロビーズをさらに含み、前記複合体の各々が標的分子のそれぞれ１つに結合した標的マーカーフルオロフォアをさらに含み、各前記複合体について、前記ＢＲＭフルオロフォアは、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に、前記弁別的な蛍光スペクトルの前記蛍光の少なくともＢＲＭ部分を放出し、前記標的マーカーフルオロフォアがＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分を放出し、前記ＢＲＭフルオロフォアおよび前記標的マーカーフルオロフォアがともに、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に前記弁別的な蛍光スペクトルの蛍光を放出し、
前記ＢＲＭフルオロフォアは、１つ以上の量子ドット型の１つ以上の量子ドットを含み、前記量子ドットはともに、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に、前記弁別的な蛍光スペクトルの前記蛍光の少なくとも前記ＢＲＭ部分を放出する、前記第１の組の検出分子、とともに使用され、
（ａ）マイクロ流体チップであって、
（ｉ）試験分子が通過することを可能にするようにサイズ決定された１つ以上の細長いサンプルチャネルと、
（ｉｉ）バッファの動作可能な流路が通過するための１つ以上の流れ集束チャネルであって、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続し、前記流れ集束チャネルから出る前記バッファが前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて縦一列の流れの前記複合体を動作可能に方向付ける、１つ以上の流れ集束チャネルと、
を画定するように成形されたチップ基板部を備える、マイクロ流体チップと、
（ｂ）前記縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに沿った照射位置において前記ＥＭＦ放射線を動作可能に送達する照射装置であって、前記複合体の蛍光が各々前記複合体型の１つに対する弁別的な蛍光スペクトルを含む、照射装置と、
（ｃ）前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する検出装置であって、各々の前記複合体型の１つの前記弁別的な蛍光スペクトルについて監視することによって、前記複合体の存在を同定する、検出装置と、
を備え、
サンプルチャネルの少なくとも１つを通じた前記複合体の流れが動電学的流動によって促進され、
それによって、前記試験サンプル中の前記標的分子の存在を同定する、試験システム。
【請求項６】
生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対して試験するための試験システムであって、
バッファと、
第１の組の検出分子であって、各々、１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）フルオロフォアに対して固定化された１つ以上のＢＲＭを備え、前記ＢＲＭのそれぞれは、前記試験サンプル中に標的分子が存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように、前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は、１つ以上の複合体型を含み、各々、前記標的型のうちのその特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応し、
前記複合体が約１０マイクロメートル（μｍ）未満のサイズであり、
各々の前記検出分子は、前記ＢＲＭおよび前記ＢＲＭフルオロフォアに対して固定化された、かつ前記ＢＲＭと前記ＢＲＭフルオロフォアとの間に実質的に配置された、マイクロビーズをさらに含み、前記複合体の各々が標的分子のそれぞれ１つに結合した標的マーカーフルオロフォアをさらに含み、各前記複合体について、前記ＢＲＭフルオロフォアは、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に、前記弁別的な蛍光スペクトルの前記蛍光の少なくともＢＲＭ部分を放出し、前記標的マーカーフルオロフォアがＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分を放出し、前記ＢＲＭフルオロフォアおよび前記標的マーカーフルオロフォアがともに、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に前記弁別的な蛍光スペクトルの蛍光を放出し、
前記ＢＲＭフルオロフォアは、１つ以上の量子ドット型の１つ以上の量子ドットを含み、前記量子ドットはともに、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に、前記弁別的な蛍光スペクトルの前記蛍光の少なくとも前記ＢＲＭ部分を放出する、前記第１の組の検出分子、および、
前記複合体による吸収のために電磁波（ＥＭＦ）放射線を送達することができる照射および検出装置であって、前記複合体が前記ＥＭＦ放射線の吸収後に蛍光を放出し、前記複合体の前記蛍光が各々前記複合体型の１つに対する弁別的な蛍光スペクトルを含み、各々の前記複合体型に対する前記弁別的なスペクトルの存在によって前記複合体を監視および同定することができる照射および検出装置と、
ともに使用され、
（ａ）前記複合体の流路が通過することを可能にするようにサイズ決定された、その中の１つ以上の細長いサンプルチャネルと、
（ｂ）前記バッファの流路が動作可能に通過するための１つ以上の流れ集束チャネルであって、前記１つ以上の流れ集束チャネルは前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続し、前記流れ集束チャネルから出る前記バッファが前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて、縦一列の流れの前記複合体を動作可能に方向付ける、１つ以上の流れ集束チャネルと、
を画定するように成形されたチップ基板部を備える、マイクロ流体チップを備え、
前記マイクロ流体チップは、前記縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに沿った照射位置において、前記照射および検出装置から前記ＥＭＦ放射線を動作可能に受信するように適合され、
前記マイクロ流体チップは、前記照射および検出装置が、前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視することを可能にするように適合され、
サンプルチャネルの少なくとも１つを通じた前記複合体の流れが動電学的流動によって促進され、
それによって、前記複合体が前記複合体型のそれぞれに対する前記弁別的な蛍光スペクトルの存在によって動作可能に同定可能であり、前記試験サンプル中の前記標的分子の存在が、前記試験システムによって動作可能に同定可能である、
試験システム。
【請求項７】
流れ集束チャネルがサンプルチャネルと流体連通し、チップ基板部が流れ集束チャネルのそれぞれのバッファ開始点に接続したバッファウェルと、前記流れ集束チャネルの上流にある前記サンプルチャネルのサンプル開始点に接続したサンプルウェルと、前記流れ集束チャネルの下流にある前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つの終点に接続した末端ウェルとを画定するようにさらに成形され、試験システムが、前記サンプルウェルに動作可能に配設されるサンプルウェル電極と、各前記バッファウェルに動作可能に配設されるバッファウェル電極と、前記末端ウェルに動作可能に配設される末端ウェル電極とをさらに備え、前記サンプルウェル電極は第１の極性の第１の電位を動作可能に供給され、前記末端ウェル電極は反対の第２の極性の第２の電位を動作可能に供給され、各前記バッファウェル電極は前記第１の極性の第３の電位を動作可能に供給される、請求項６記載の試験システム。
【請求項８】
第３の電位が第１の電位よりも高い、請求項７に記載の試験システム。
【請求項９】
第１の電位に対する前記第３の電位の比率が約１．８：１である、請求項８に記載の試験システム。
【請求項１０】
試験流速が毎分約５００個の複合体である、請求項９に記載の試験システム。
【請求項１１】
生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対する試験を容易にする方法であって、
マイクロ流体チップのチップ基板部に形成される１つ以上の細長いサンプルチャネルを通じて検出分子を通過させる、サンプル流動ステップであって、
前記検出分子のそれぞれは、１つ以上のＢＲＭフルオロフォアに対して固定化された１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）を含み、各々の前記ＢＲＭのそれぞれは、前記試験サンプル中に標的分子が存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように、前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は、１つ以上の複合体型を含み、各々、前記標的型のうちのその特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応する、サンプル流動ステップと、
前記マイクロ流体チップの前記チップ基板部に形成される１つ以上の流れ集束チャネルを通じてバッファを通過させる、バッファ流動ステップであって、前記流れ集束チャネルは、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、バッファ流動ステップと、
前記バッファ流動ステップ後に、前記流れ集束チャネルから前記１つ以上の細長いサンプルチャネルへ前記バッファを通過させることによって、前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて、縦一列の流れの前記複合体を方向付ける、サンプル集束ステップと、を含み、
さらに、
サンプル流動ステップの前に、ＢＲＭを試験サンプル中に導入することによって複合体を形成し、前記標的分子が前記試験サンプル中に存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の前記複合体を形成する、複合体形成ステップであって、前記複合体が約１０マイクロメートル（μｍ）未満のサイズであり、標的型のうちの１つ以上と結合可能な標的マーカーフルオロフォアが導入され、前記標的マーカーフルオロフォアが、前記複合体に対して固定化される、前記複合体形成ステップと、
サンプル集束ステップ後に、縦一列の流れにおける前記複合体に電磁波（ＥＭＦ）放射線を送達する、照射ステップと、
前記照射ステップ後に、前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される蛍光に関して監視する、蛍光検出ステップであって、前記複合体のそれぞれが前記ＥＭＦ放射線の吸収後に前記複合体型のそれぞれに対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光を放出する、蛍光検出ステップと、
前記試験サンプル中の前記標的分子の存在を同定するように、前記照射ステップ後に、前記複合体型のそれぞれの前記弁別的な蛍光スペクトルについて監視する、複合体同定ステップ、とを含み、
複合体形成ステップにおいて、標的マーカーフルオロフォアは、標的分子のそれぞれと結合し、蛍光検出ステップにおいて、前記標的マーカーフルオロフォアが、複合体型のそれぞれに対する異なる蛍光スペクトルの標的部分を放出し、前記ＢＲＭフルオロフォアが、前記複合体型のそれぞれに対する異なる蛍光スペクトルのＢＲＭ部分を放出する、
前記方法。
【請求項１２】
複合体形成ステップにおいて、複合体が約１マイクロメートル（μｍ）未満のサイズである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル集束ステップにおいて、前記流れ集束チャネルのうちの少なくとも２つが、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つの上流において、その反対側から前記サンプルチャネルに接続する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル集束ステップにおいて、２つの流れ集束チャネルが共通交差部において前記サンプルチャネルに接続する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル集束ステップにおいて、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つを通じた前記縦一列の流れの複合体の流れが動電学的流動によって促進される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル集束ステップの前に、（ｉ）前記流れ集束チャネルの上流において、前記サンプルチャネルに第１の極性の第１の電位と、（ｉｉ）前記流れ集束チャネルの下流において前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに反対の第２の極性の第２の電位と、（ｉｉｉ）前記流れ集束チャネルのそれぞれに前記第１の極性の第３の電位とを供給する、動電学的ステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
動電学的ステップにおいて、第３の電位が第１の電位よりも高い、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
動電学的ステップにおいて、第１の電位に対する第３の電位の比率が約１．８：１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
蛍光検出ステップにおいて、複合体によって放出される蛍光が少なくとも２つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）によって受信され、第１の前記ＡＰＤの１つが各々の複合体に対する異なる蛍光スペクトルの蛍光のＢＲＭ部分の存在を受信および同定し、第２のＡＰＤの１つが各々の複合体に対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分の存在を受信および同定する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体工学の分野に関する。具体的には、本発明は、蛍光マイクロビーズを読み取るためのマイクロ流体チャネル構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去１０年間、マイクロテクノロジーおよびナノテクノロジーの分野において多くの進歩が見られた。これらの進歩によって生じた課題の１つは、発見された科学現象に対する実用的用途の開発である。
【０００３】
生体分子またはウイルス検出のためにナノテクノロジーをマイクロテクノロジーと統合する試みに関するいくつかの公開報告が説明されている［Ｗ．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，５，１３２７（２００５）、Ｋ．Ｙｕｎ，Ｄ．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｋｉｍ，Ｅ．Ｙｏｏｎ，Ｍｅａｓ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，３１７８（２００６）、Ｊ．Ｓｔｅｉｇｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＬＡ，１０，３３１（２００５）］。これらの研究において、研究者らは、検出のためにナノ粒子、マイクロビーズ、およびマイクロ流体工学の組み合わせを使用した。すべての例において、検出感度は、生産可能な商品に対して望ましい感度よりも低かった。さらに、分析は、血液成分からの干渉によって感度を減少される可能性がある血清中で行われなかった［Ｅ．Ｄ．Ｇｏｌｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，６，１２９３（２００６）］。
【０００４】
同様に、ゲノムまたはプロテオーム診断法における用途に関して、金ナノ粒子を使用したバイオバーコードが示されている［Ｊ．Ｔａｔｅ，Ｇ．Ｗａｒｄ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２５，１０５（２００４）、Ｓ．Ｉ．Ｓｔｏｅｖａ，Ｊ．Ｌｅｅ，Ｃ．Ｓ．Ｔｈａｘｔｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４５，３３０３（２００６）、Ｐ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，２２５（２００２）］）。これらの方法において、検出戦略は、分析検出を達成するための複数のステップ、および良好な感度を達成するための増幅を必要とする。したがって、少数のステップのみを必要とし、かなり高レベルの感度を達成することができる検出システムの必要性がある。
【０００５】
Ｓｔａｖｉｓらの米国特許出願公報第ＵＳ２００７／００２０７７９号は、サブマイクロメートル流体チャネルにおける量子ドット複合体を検出する方法を開示する。Ｓｔａｖｉｓにおいて使用されるチャネルの断面寸法は、約５００ｎｍであり、検出された複合体は、約５〜１０ｎｍである。さらに、単一複合体検出を達成するために、サンプルの濃度はフェムトモルレベルまで低下され、これによりサンプル調製の困難および検出システムの制限が増加した。理想的には、より容易に扱われる微小分子とともに使用することを目的とした、代替的かつより効率的な単一複合体検出システムおよび方法が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的が達成されることが好ましいが、必ずしも記載される通りではない場合があり、すべての目的が、本発明の単一の実施形態によって達成される必要もない。本明細書に記載されないさらなる目的が、達成され得る。
【０００７】
試験分子の縦一列の流れからの蛍光放出を照射し、かつ検出することによって、１つ以上の標的型の標的分子の多重検出を可能にすることが、本発明の一目的である。
感染性疾病に対する生物学的サンプルの試験を可能にすることが、本発明の一目的である。血液、血清、唾液および／または尿の具体的な生物学的サンプルの試験を可能にすることが、さらなる目的である。
生物学的サンプル中の感染性疾病に対する多重試験を可能にすることが、本発明の一目的である。Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＨＩＶに対する任意の組み合わせの多重試験を可能にすることが、さらなる目的である。
チャネルを通じた流動を容易にする改善されたマイクロ流体チャネル構造を提供することが、本発明の一目的である。
試験システムにおける照射装置として、４８８ｎｍレーザー等の固定波長ＥＭＦ放射装置を提供し、放出された蛍光が検出装置に入る前に、入射ＥＭＦ放射線および標的分子から放出された蛍光が、同一の光学経路に沿って移動するようにすることが、本発明の一目的である。
【０００８】
上記の目的のうちの１つ以上を部分的にまたは完全に達成し、先行技術のいずれかの不利点を緩和および／または改善することが本発明の一目的であるが、そのような不利点のいずれかが本明細書に記載されるかどうかは問わない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によると、生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在を試験するために、バッファを伴う使用を目的とした試験システムが開示される。該試験システムは、第１の組の試験分子と、マイクロ流体チップと、照射装置と、検出装置とを含む。第１の組の試験分子は、試験サンプル中にある場合、生体認識分子（ＢＲＭ）および、ＢＲＭと標的分子との複合体を含む群から選択される。ＢＲＭは、１つ以上のＢＲＭ型である。各々のＢＲＭ型はそれぞれの標的型の１つと結合可能である。複合体は、１つ以上の複合体型であり、各々の複合体型はそれぞれの標的型の１つと結合しているＢＲＭ型の異なる１つに対応する。マイクロ流体チップは、その中に１つ以上の細長いサンプルチャネルと１つ以上の流れ集束チャネルとを画定するように成形されるチップ基板部を含む。サンプルチャネルは、試験分子の流路がその中を通過することを可能にするようにサイズ決定される。流れ集束チャネルは、動作可能なバッファの流路がその中を通過することを目的とする。１つ以上の流れ集束チャネルは、１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する。バッファは、流れ集束チャネルから出て、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて試験分子の縦一列の流れを動作可能に方向付ける。照射装置は、縦一列の流れにおける試験分子による吸収のために、サンプルチャネルのうちの上記の少なくとも１つに沿った照射位置において、電磁波（ＥＭＦ）放射線を動作可能に送達する。試験分子は、ＥＭＦ放射線の吸収後に蛍光を放出する。試験分子の蛍光は、各々の複合体型に対して弁別的な蛍光スペクトルを含む。検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する。検出装置は、複合体型のそれぞれの弁別的な蛍光スペクトルを監視することによって、第１の組の試験分子における複合体の存在を同定する。このようにして、試験システムは、試験サンプル中の標的分子の存在を同定する。
【００１０】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、各々のＢＲＭは、そのマイクロビーズと結合した１つ以上のＢＲＭフルオロフォアで標識されたマイクロビーズを含む。ＢＲＭフルオロフォアは、ＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の少なくともＢＲＭ部分を放出する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、ＢＲＭフルオロフォアは、１つ以上の量子ドット型の１つ以上の量子ドットを含む。量子ドットはともに、ＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の少なくともＢＲＭ部分を放出する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、量子ドットは、量子ドット型のうちの２つ以上である。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、ＢＲＭフルオロフォアは、１つ以上の蛍光色素型の１つ以上の蛍光色素を含む。蛍光色素はともに、ＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の少なくともＢＲＭ部分を放出する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、複合体は、約１０マイクロメートル（μｍ）未満、好ましくは約５μｍ未満、より好ましくは約１μｍ未満のサイズである。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、各々の複合体は、それぞれの標的分子の１つに結合した標的マーカーフルオロフォアをさらに含む。標的マーカーフルオロフォアは、ＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分を放出する。
【００１１】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、各々のＢＲＭは、そのマイクロビーズと結合した１つ以上のＢＲＭフルオロフォアで標識されたマイクロビーズを含む。各々の複合体は、それぞれの標的分子の１つに結合した標的マーカーフルオロフォアをさらに含む。各々の複合体に対して、ＥＭＦ放射線の吸収後に、ＢＲＭフルオロフォアは、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光のＢＲＭ部分を放出し、標的マーカーフルオロフォアは、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分を放出する。したがって、ＢＲＭフルオロフォアおよび標的マーカーフルオロフォアはともに、ＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光を放出する。
【００１２】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する、少なくとも２つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）を含む。第１のＡＰＤの１つは、前記各々の複合体に対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光のＢＲＭ部分の存在を受信および同定するように適合され、第２のＡＰＤの１つは、前記各々の複合体に対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分の存在を受信および同定するように適合される。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、各々の複合体に対する異なる蛍光スペクトルの蛍光の標的部分は、ＢＲＭ部分よりも低い強度を有する。第２のＡＰＤの１つは、第１のＡＰＤの１つを上回る感度を有する。
【００１３】
本発明によると、生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対して試験するための、バッファを伴い使用することを目的とした別の試験システムが開示される。本発明のこの実施形態によると、試験システムはまた、試験サンプル中にある場合、生体認識分子（ＢＲＭ）、およびＢＲＭと標的分子との複合体を含む群から選択される、第１の組の試験分子とともに使用することを目的とする。ＢＲＭは、１つ以上のＢＲＭ型である。各々のＢＲＭ型は、それぞれの標的型の１つと結合可能である。試験分子は、ＥＭＦ放射線の吸収後に蛍光を放出するものなどである。複合体は、１つ以上の複合体型であり、各々の複合体型はそれぞれの標的型の１つと結合しているＢＲＭ型のうちの異なる１つに対応する。本発明のこの実施形態によると、試験システムは、マイクロ流体チップと、照射装置と、検出装置とを含む。マイクロ流体チップは、１つ以上の細長いサンプルチャネルと１つ以上の流れ集束チャネルとをその中に画定するように成形されるチップ基板部を含む。サンプルチャネルは、試験分子の流路がその中を通過することを可能にするようにサイズ決定される。流れ集束チャネルは、動作可能なバッファの流路がその中を通過することを目的とする。流れ集束チャネルは、サンプルチャネルに接続する。バッファは、流れ集束チャネルから出て、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて試験分子の縦一列の流れを動作可能に方向付ける。照射装置は、縦一列の流れにおける試験分子による吸収のために、サンプルチャネルのうちの上記の少なくとも１つに沿った照射位置において、電磁波（ＥＭＦ）放射線を動作可能に送達する。試験分子の蛍光は、各々の複合体型に対して弁別的な蛍光スペクトルを含む。検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する。検出装置は、各々の複合体型の弁別的な蛍光スペクトルを監視することによって、第１の組の試験分子における複合体の存在を同定する。このようにして、試験システムは、試験サンプル中の標的分子の存在を同定する。
【００１４】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つは、チップ基板部の１つ以上の細長いチャネル壁によって画定される。チャネル壁は、２つの対向する側面チャネル部を含む。流れ集束チャネルから出るバッファは、少なくとも上記の２つの対向する側面チャネル部から離間した関係にあるサンプル経路に沿って、試験分子の縦一列の流れを動作可能に方向付ける。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、マイクロ流体チップは、チップ基板部を下に置くスライドガラスをさらに含む。スライドガラスは、サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つの底部チャネル部を画定する。チャネル壁は、頂部チャネル部をさらに含む。サンプル経路は、動作可能に、底部チャネル部および頂部チャネル部の両方から上記の離間した関係にある。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプルチャネルのうちの上記の少なくとも１つは、サンプル集束チャネルを含む。サンプルチャネルはまた、サンプル集束チャネルと流体連通しているサンプル供給チャネルを含む。サンプル集束チャネルは、流れ集束チャネルの下流にある。したがって、流れ集束チャネルから出るバッファおよび試験分子の縦一列の流れは、サンプル集束チャネルを通じて動作可能に流動する。
【００１５】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプル集束チャネルを通じて動作可能に流動するバッファのバッファ流速は、縦一列の流れにおける試験分子の試験流速よりも高い。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、流れ集束チャネルは、少なくとも２つの流れ集束チャネルを含み、サンプルチャネルのうちの上記の少なくとも１つの上流にあるサンプルチャネルに接続する。２つの流れ集束チャネルは、上記少なくとも１つのサンプルチャネルの反対側からサンプルチャネルに接続する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、２つの流れ集束チャネルは、共通交差部においてサンプルチャネルに接続する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、流れ集束チャネルから出るバッファは、共通交差部の下流において、約１０マイクロメートル（μｍ）未満で、試験分子を縦一列の流れに動作可能に集束する。
【００１６】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、各々の流れ集束チャネルは、約９０度の接続角度でサンプルチャネルに接続する。
本発明の別の好適な実施形態の態様によると、各々の流れ集束チャネルは、約４５度の接続角度でサンプルチャネルに接続する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、チップ基板部は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から製造される。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプルチャネルのうちの上記の少なくとも１つを通じた試験分子の通過は、動電学的流動により促進される。
【００１７】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、流れ集束チャネルは、サンプルチャネルと流体連通している。チップ基板部は、バッファウェルと、サンプルウェルと、末端ウェルとを画定するようにさらに成形される。各バッファウェルは、各々の流れ集束チャネルのバッファ開始点に接続する。サンプルウェルは、流れ集束チャネルの上流にあるサンプルチャネルのサンプル開始点に接続する。末端ウェルは、流れ集束チャネルの下流にあるサンプルチャネルのうちの上記の少なくとも１つの終点に接続する。試験システムはまた、サンプルウェル電極と、バッファウェル電極と、末端ウェル電極とを含む。サンプルウェル電極は、サンプルウェルに動作可能に配設される。各バッファウェル電極は、１つの上記のバッファウェルに動作可能に配設される。末端ウェル電極は、末端ウェルに動作可能に配設される。サンプルウェル電極は、第１の極性の第１の電位を動作可能に供給される。末端ウェル電極は、反対の第２の極性の第２の電位を動作可能に供給される。各バッファウェル電極は、第１の極性の第３の電位を動作可能に供給される。
【００１８】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、第３の電位は、第１の電位よりも高い。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、第１の電位に対する第３の電位の比率は、約１．８：１（９：５）である。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、縦一列の流れにおける試験分子の試験流速は、毎分少なくとも約３０個の試験分子、好ましくは毎分少なくとも約６０個の試験分子、より好ましくは毎分少なくとも約５００個の試験分子である。
【００１９】
本発明によると、生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在を試験するための、さらなる試験システムも開示される。本発明のこの実施形態によると、試験サンプル中に存在する場合、試験システムは、生体認識分子（ＢＲＭ）および、ＢＲＭと標的分子との複合体(conjugate)を含む群から選択される、第１の組の試験分子とともに使用することを目的とする。ＢＲＭは、１つ以上のＢＲＭ型である。各々のＢＲＭ型は、それぞれの標的型の１つと結合可能である。複合体は、１つ以上の複合体型であり、各々、その上記の標的型のそれぞれの１つと結合している異なるＢＲＭ型の１つに対応する。試験システムはまた、１つ以上の細長いサンプルチャネルをその中に画定するように成形されるチップ基板部を含む、マイクロ流体チップとともに使用することを目的とする。サンプルチャネルは、試験分子の流路がその中を通過することを可能にするようにサイズ決定される。試験分子の縦一列の流れは、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通過する。本発明のこの実施形態によると、試験システムは、照射装置と検出装置とを含む。照射装置は、縦一列の流れにおける試験分子による吸収のために、サンプルチャネルのうちの上記の少なくとも１つに沿った照射位置において、電磁波（ＥＭＦ）放射線を動作可能に送達する。試験分子は、ＥＭＦ放射線の吸収後に蛍光を放出する。試験分子の蛍光は、各々の複合体型に対する弁別的な蛍光スペクトルを含む。検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する。検出装置は、各々の複合体型の弁別的な蛍光スペクトルについて監視することによって、第１の組の試験分子における複合体の存在を同定する。このようにして、試験システムは、試験サンプル中の標的分子の存在を同定する。
【００２０】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、照射装置は、縦一列の流れにおける試験分子による吸収のために、ＥＭＦ放射線を動作可能に放出するＬＥＤを含む。
本発明の別の好適な実施形態の態様によると、照射装置は、縦一列の流れにおける試験分子による吸収のために、ＥＭＦ放射線を動作可能に放出するレーザーを含む。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、レーザーは、約２ミリワット（mＷ）から約５０ミリワット（mＷ）の間、より好ましくは約２０ミリワット（mＷ）から約２５メガワット（ＭＷ）の間の動作電力を有する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、照射装置によって動作可能に送達されるＥＭＦ放射線は、約４８８ｎｍのＥＭＦ波長を有する。
【００２１】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する、少なくとも３つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）を含む。各々のＡＰＤは、試験分子によって放出される蛍光における異なる波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、第１のＡＰＤの１つは、緑色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。第２のＡＰＤの１つは、黄色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。第３のＡＰＤの１つは、赤色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。
本発明の別の好適な実施形態の態様によると、上記の少なくとも３つのＡＰＤは、少なくとも４つのＡＰＤを含む。第１のＡＰＤの１つは、緑色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。第２のＡＰＤの１つは、黄色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。第３のＡＰＤの１つは、オレンジ色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。第４のＡＰＤの１つは、赤色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。
本発明のさらに別の好適な実施形態の態様によると、少なくとも３つのＡＰＤは、少なくとも４つのＡＰＤを含む。第１のＡＰＤの１つは、青色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。第２のＡＰＤの１つは、緑色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。第３のＡＰＤの１つは、黄色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。第４のＡＰＤの１つは、赤色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。
【００２２】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する電荷結合素子を含む。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する、少なくとも２つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）を含む。各々のＡＰＤは、試験分子によって放出される蛍光における異なる波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する電荷結合素子をさらに含む。さらに、検出装置は、ＡＰＤまたは電荷結合素子のいずれかを使用した前記縦一列の流れの監視を切り替えるための切り替え手段を含む。
【００２３】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、検出装置は、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視する、少なくとも１つのトリップセンサを含む。各上記のトリップセンサは、蛍光の強度に対応するデジタル信号を生成する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、各上記のトリップセンサは、蛍光の強度が最小強度を超えた場合のみデジタル信号を生成する。各上記のトリップセンサは、異なる所定の前記最小強度を有する。
【００２４】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験システムはまた、上記少なくとも１つのサンプルチャネルに沿った照射位置の実質的に近傍から、検出装置に蛍光を送達する光ファイバーケーブルを含む。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験システムはまた、照射装置および検出装置を包納する筐体を含む。筐体は、可搬用および臨床現場診断用途のためにサイズ決定および適合される。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、筐体は、携帯型用途のためにサイズ決定および適合される。
【００２５】
本発明によると、生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対して試験するために、バッファを伴う使用を目的としたさらに別の試験システムがさらに開示される。本発明のこの実施形態によると、試験システムはまた、試験サンプル中に存在する場合、生体認識分子（ＢＲＭ）および、ＢＲＭと標的分子との複合体を含む群から選択される、第１の組の試験分子を伴う使用を目的とする。ＢＲＭは、１つ以上のＢＲＭ型である。各々のＢＲＭ型は、それぞれの標的型の１つと結合可能である。複合体は、１つ以上の複合体型であり、各々の複合体型は上記の標的型のそれぞれの１つと結合している異なるＢＲＭ型の１つに対応する。試験システムはさらに、試験分子による吸収のために、電磁波（ＥＭＦ）放射線を送達することができる照射および検出装置を伴う使用を目的とする。試験分子は、ＥＭＦ放射線の吸収後に、蛍光を放出するようなものである。試験分子の蛍光は、各々の複合体型に対する独特な蛍光スペクトルを含む。照射および検出装置はまた、各々の複合体型に対する独特な蛍光スペクトルの存在によって、複合体を監視および同定することができる。本発明のこの実施形態によると、試験システムは、１つ以上の細長いサンプルチャネルと１つ以上の流れ集束チャネルとをその中に画定するように成形されるチップ基板部を有する、マイクロ流体チップを含む。サンプルチャネルは、試験分子の流路がその中を通過することを可能にするようにサイズ決定される。流れ集束チャネルは、バッファがその中を通過する動作可能な流路を目的とする。流れ集束チャネルは、サンプルチャネルに接続する。バッファは、流れ集束チャネルから出て、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて、試験分子の縦一列の流れを動作可能に方向付ける。マイクロ流体チップは、縦一列の流れにおける試験分子による吸収のために、上記少なくとも１つのサンプルチャネルに沿った照射位置において、照射および検出装置からＥＭＦ放射線を動作可能に受信するように適合される。マイクロ流体チップは、照射および検出装置が、縦一列の流れを試験分子によって放出される蛍光に関して監視することを可能にするように適合される。このようにして、複合体は、各々の複合体型に対する弁別的な蛍光スペクトルの存在によって、動作可能に同定可能である。したがって、試験サンプル中の標的分子の存在は、試験システムによって動作可能に同定可能である。
【００２６】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験システムは、血液、尿、唾液、および血清から成る群から選択される、１つ以上の生物学的試験サンプルでの使用に特に適合される。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験システムは、細菌性疾病状態、ウイルス性疾病状態、真菌性疾病状態、およびベクター誘導性疾病状態から成る群から選択される疾病状態の診断のために使用され得る。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験システムは、１つ以上の感染性疾病の診断のために使用され得る。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験システムは、ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶから成る群から選択される症状の診断のために使用され得る。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験システムは、ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶから成る群から選択される症状のうちの２つ以上の同時診断のために使用され得る。
【００２７】
本発明によると、生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対する試験を容易にするために、分子を集束する方法も開示される。該方法は、サンプル流動ステップと、バッファ流動ステップと、バッファ流動ステップ後のサンプル集束ステップとを含む。サンプル流動ステップにおいて、試験分子は、マイクロ流体チップのチップ基板部に形成される、１つ以上の細長いサンプルチャネルを通過する。バッファ流動ステップにおいて、バッファは、マイクロ流体チップのチップ基板部に形成される、１つ以上の流れ集束チャネルを通過する。流れ集束チャネルは、１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する。サンプル集束ステップにおいて、試験分子の縦一列の流れは、流れ集束チャネルから１つ以上の細長いサンプルチャネルへのバッファの流路によって、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて方向付けられる。
【００２８】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、該方法はまた、サンプル流動ステップの前に試験分子形成ステップを含む。試験分子形成ステップにおいて、試験分子は、１つ以上のＢＲＭ型の生体認識分子（ＢＲＭ）を導入することによって形成される。各々のＢＲＭ型は、標的型のそれぞれの１つと結合可能である。したがって、試験分子は、ＢＲＭおよび標的分子（試験サンプル中に存在する場合）の複合体を含む。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験分子形成ステップにおいて、複合体は、約１０マイクロメートル（μｍ）未満、好ましくは約５μｍ未満、より好ましくは約１μｍ未満のサイズである。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験分子形成ステップにおいて、標的マーカーフルオロフォアが導入される。標的マーカーフルオロフォアは、標的型のうちの１つ以上と結合可能である。したがって、試験分子は、ＢＲＭ、標的マーカーフルオロフォア、および標的分子（試験サンプル中に存在する場合）の複合体を含む。
【００２９】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプル集束ステップにおいて、試験分子の縦一列の流れは、上記少なくとも１つのサンプルチャネルの、少なくとも２つの対向する側面チャネル部から離間した関係にある、サンプル経路に沿って方向付けられる。
本発明の別の好適な実施形態の態様によると、サンプル集束ステップにおいて、試験分子の縦一列の流れは、上記少なくとも１つのサンプルチャネルの少なくとも頂部チャネル部および底部チャネル部から離間した関係にある、サンプル経路に沿って方向付けられる。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプル集束ステップにおいて、バッファは、縦一列の流れにおける試験分子の試験流速よりも高いバッファ流速で、上記少なくとも１つのサンプルチャネルに流入する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプル集束ステップにおいて、少なくとも２つの流れ集束チャネルは、上記少なくとも１つのサンプルチャネルの上流において、その対向する側からサンプルチャネルに接続する。
【００３０】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプル集束ステップにおいて、２つの流れ集束チャネルは、共通交差部においてサンプルチャネルに接続する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプル集束ステップにおいて、１つ以上の流れ集束チャネルの各々は、約９０度の接続角度でサンプルチャネルに接続する。
本発明の別の好適な実施形態の態様によると、サンプル集束ステップにおいて、１つ以上の流れ集束チャネルの各々は、約４５度の接続角度でサンプルチャネルに接続する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、サンプル集束ステップにおいて、上記の少なくとも１つのサンプルチャネルを通じた試験分子の縦一列の流れの流路は、動電学的流動によって促進される。
【００３１】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、該方法はまた、サンプル集束ステップの前に動電学的ステップを含む。動電学的ステップにおいて、第１の極性の第１の電位は、流れ集束チャネルの上流においてサンプルチャネルに供給される。動電学的ステップにおいて、反対の第２の極性の第２の電位は、流れ集束チャネルの下流において上記少なくとも１つのサンプルチャネルに供給される。動電学的ステップにおいて、第１の極性の第３の電位は、各々の流れ集束チャネルに供給される。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、動電学的ステップにおいて、第３の電位は、第１の電位よりも高い。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、動電学的ステップにおいて、第１の電位に対する第３の電位の比率は、約１．８：１（９：５）である。
【００３２】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験分子形成ステップにおいて、複合体は、１つ以上の複合体型であり、各々の複合体型は前記それぞれの標的型の１つと結合している異なるＢＲＭ型の１つに対応する。該方法はまた、サンプル集束ステップ後の照射ステップと、照射ステップ後の蛍光検出ステップと、照射ステップ後の複合体同定ステップとを含む。照射ステップにおいて、電磁波（ＥＭＦ）放射線は、縦一列の流れにおける試験分子に送達される。蛍光検出ステップにおいて、縦一列の流れは、試験分子によって放出される蛍光に関して監視される。複合体のそれぞれは、ＥＭＦ放射線の吸収後に、各々の複合体型に対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光を放出する。複合体同定ステップにおいて、試験サンプル中の標的分子の存在は、各々の複合体型の弁別的な蛍光スペクトルに関して監視することによって同定される。
【００３３】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、試験分子形成ステップにおいて、標的マーカーフルオロフォアは、それぞれの標的分子の１つに結合する。したがって、蛍光検出ステップにおいて、標的マーカーフルオロフォアは、各々の複合体型に対する弁別的な蛍光スペクトルの標的部分を放出する。該方法は、試験分子形成ステップの前に、マイクロビーズと結合した１つ以上のＢＲＭフルオロフォアでそのマイクロビーズを標識する、ＢＲＭ形成ステップをさらに含む。したがって、蛍光検出ステップにおいて、ＢＲＭフルオロフォアは、各々の複合体型に対する弁別的な蛍光スペクトルのＢＲＭ部分を放出する。
【００３４】
本発明の好適な一実施形態の態様によると、蛍光検出ステップにおいて、複合体によって放出される蛍光は、少なくとも２つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）によって受信される。第１のＡＰＤの１つは、前記各々の複合体に対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光のＢＲＭ部分の存在を受信および同定し、第２のＡＰＤの１つは、前記各々の複合体に対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分の存在を受信および同定する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、照射ステップにおいて、約２ミリワット（mＷ）から約５０ミリワット（mＷ）の間の動作電力を有するレーザーは、縦一列の流れにおける試験分子にＥＭＦ放射線を送達する。より好ましくは、動作電力は、約２０ミリワット（mＷ）から約２５ミリワット（mＷ）の間である。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、照射ステップにおいて、ＥＭＦ放射線は、約４８８ｎｍのＥＭＦ波長を有する。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、蛍光検出ステップにおいて、複合体によって放出される蛍光は、電荷結合素子によって受信される。
本発明の好適な一実施形態の態様によると、蛍光検出ステップにおいて、複合体によって放出される蛍光は、電荷結合素子および１つ以上のアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）のうちの少なくとも１つによって選択的に受信される。
【００３５】
本発明の他のさらなる利点および特徴は、添付図面と併せた、その以下の発明を実施するための形態から、当業者には明らかとなろう。
ここで、本発明を、同様の番号が同様の要素を意味する添付図面を参照して、ほんの一例としてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】本発明に従った第１の複合体の図解である。
【図１Ｂ】本発明に従った第２の複合体の図解である。
【図１Ｃ】本発明に従った第３の複合体の図解である。
【図２Ａ】本発明に従ったマイクロ流体チップの斜視図である。
【図２Ｂ】本発明に従った代替のマイクロ流体チップの斜視図である。
【図２Ｃ】図２Ｂのマイクロ流体チップの交差点の拡大上面図である。
【図３Ａ】本発明に従った試験システムの概略図である。
【図３Ｂ】図３Ａの照射装置の概略図である。
【図３Ｃ】図３Ａの検出装置の概略図である。
【図４Ａ】システム筐体の斜視図である。
【図４Ｂ】筐体が取り外されたシステムの斜視図である。
【図４Ｃ】サンプルハッチが閉じているマイクロチッププラットフォームおよび照射装置の斜視図である。
【図４Ｄ】サンプルハッチが開いているマイクロチッププラットフォームの上面図である。
【図４Ｅ】レンズ、モーター、およびマイクロチッププラットフォームの側面図である。
【図４Ｆ】図４Ｅの線４Ｆ−４Ｆに沿った、レンズおよびマイクロ流体チッププラットフォームの断面概略図である。
【図４Ｇ】図４Ｆの指示された箇所および図２Ｃの線４Ｇ−４Ｇに沿った断面の拡大概略図である。
【図５Ａ】蛍光性量子ドットの図解である。
【図５Ｂ】蛍光性量子ドットの図解である。
【図６Ａ】本明細書に記載する実験で使用する量子ドットおよびバンドパスフィルタのスペクトルである。
【図６Ｂ】図５Ｂの量子ドットのスペクトルである。
【図７Ａ】図１ＡのＢＲＭ複合体に対する生および近似された蛍光放出波長データのグラフである。
【図７Ｂ】図１ＢのＢＲＭ複合体に対する生および近似された蛍光放出波長データのグラフである。
【図７Ｃ】図１ＣのＢＲＭ複合体に対する生および近似された蛍光放出波長データのグラフである。
【図８Ａ】図１ＡのＢＲＭ複合体に対する強度対時間の測定のグラフである。
【図８Ｂ】図１ＢのＢＲＭ複合体に対する強度対時間の測定のグラフである。
【図８Ｃ】図１ＣのＢＲＭ複合体に対する強度対時間の測定のグラフである。
【図９】図８Ａの指示された箇所の拡大図である。
【図１０Ａ】図１ＡのＢＲＭ複合体に対する強度対濃度の測定のグラフである。
【図１０Ｂ】図１ＡのＢＲＭ複合体に対する強度対濃度の測定のグラフである。
【図１０Ｃ】図１ＡのＢＲＭ複合体に対する強度対濃度の測定のグラフである。
【図１１Ａ】図１ＡのＢＲＭ複合体に対するＲ／Ｙ信号比のヒストグラムである。
【図１１Ｂ】図１ＢのＢＲＭ複合体に対するＲ／Ｙ信号比のヒストグラムである。
【図１１Ｃ】図１ＣのＢＲＭ複合体に対するＲ／Ｙ信号比のヒストグラムである。
【図１１Ｄ】図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃの統合ヒストグラムである。
【図１２】使用する実験サンプルの表である。
【図１３Ａ】２病原体多重結果のグラフである。
【図１３Ｂ】３病原体多重結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ここで図１Ａから図４Ｇを参照すると、本発明の好適な実施形態に従った試験システム１００が示される。試験システム１００は、生物学的試験サンプル４０における１つ以上の標的型の標的分子４６ａ、４６ｂ、４６ｃ（４６ａ〜ｃ）の存在に対して試験するために、バッファ５０を伴う使用を目的とする。試験システム１００は、好ましくは、第１の組の試験分子１０２と、マイクロ流体チップ２００と、照射装置３００と、検出装置４００とを含む。試験システム１００はまた、好ましくは、照射装置３００および検出装置４００を包納する筐体５００を含み、筐体５００は、可搬用、携帯型、および臨床現場診断用途のためにサイズ決定および適合される。
【００３８】
システムについて
好ましくは、第１の組の試験分子１０２は、(i)検出分子１０６ａ、１０６ｂ、１０６ｃ（１０６ａ〜ｃ）と、（ｉｉ）試験サンプル４０中に存在する場合、検出分子１０６ａ〜ｃおよび標的分子４６ａ〜ｃの複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃとを含み得る。
【００３９】
図１Ａから図１Ｃに最もよく見られるように、検出分子１０６ａ〜ｃは、１つ以上の検出分子型である。各々の検出分子型は、それぞれの標的型の１つと結合可能である。各々の検出分子１０６ａ〜ｃは、好ましくは、好ましくは、カルボン酸１１８によってマイクロビーズ１０８の表面に結合した１つ以上の、好ましくは複数の生体認識分子１１６（ＢＲＭ１１６）を含む。ＢＲＭ１１６のそれぞれは、標的分子４６ａ〜ｃの標的型のうちの１つに特異的である。各々のマイクロビーズ１０８は、好ましくは複数のＢＲＭ１１６に結合している。マイクロビーズ１０８に結合した複数のＢＲＭ１１６は、２つ以上の標的型と集合的に複合体化可能であり得るが、好ましくは、標的型のうちの１つのみと集合的に複合体化可能である。各々のマイクロビーズ１０８は、好ましくは、マイクロビーズ１０８と結合した１つ以上のＢＲＭフルオロフォア１１２ａ〜ｂで標識されるマイクロビーズ１０８を含む。ＢＲＭフルオロフォア１１２ａ〜ｂは、好ましくは、１つ以上の量子ドット型の、１つ以上の量子ドット１１２ａ、１１２ｂを含む。場合によっては、また図１Ｃに最もよく見られるように、量子ドット１１２ａ、１１２ｂは、例えば、赤色量子ドット１１２ｂおよび黄色量子ドット１１２ａ等の、２つ以上の量子ドット型であってもよい。あるいは、ＢＲＭフルオロフォア１１２ａ〜ｂは、１つ以上の蛍光色素型の１つ以上の蛍光色素（図示せず）を含み得る。
【００４０】
図１Ａから図１Ｃに最もよく見られるように、複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃは、１つ以上の複合体型であり、各々の複合体型は対応する標的型と結合している検出分子型のうちの異なる１つに対応する。複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃは、好ましくは、約１０マイクロメートル（μｍ）未満のサイズである。一部の実施形態においては、複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃは、約５μｍ未満、または約１μｍ未満のサイズでさえあってもよい。好ましくは、また図１Ａから図１Ｃに最もよく見られるように、各々の複合体のそれぞれ１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃはまた、標的分子４６ａ、４６ｂ、４６ｃの１つにそれぞれに結合した標的マーカーフルオロフォア１３０を含む。
【００４１】
図２Ａおよび図２Ｂに最もよく見られるように、マイクロ流体チップ２００は、好ましくは、チップ基板部２０２と、チップ基板部２０２を下に置くスライドガラス２５０を含む。チップ基板部２０２は、好ましくは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から製造され、１つ以上の細長いサンプルチャネル２０４と１つ以上の流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂとをその中に画定するように成形される。流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂは、少なくとも１つのサンプルチャネル２０４と流体連通している。好ましくは、チップ基板部２０２は、サンプルウェル２４２と、２つのバッファウェル２４４ａ、２４４ｂと、末端ウェル２４６とをその中に画定するようにさらに成形される。
【００４２】
図２Ｃに最もよく見られるように、サンプルチャネル２０４は、試験分子１０２の流路がその中を通過することを可能にするようにサイズ決定される。図２Ａから図２Ｃに最もよく見られるように、サンプルチャネル２０４は、サンプル供給チャネル２０６と、サンプル供給チャネル２０６と流体連通しているサンプル集束チャネル２０８とを含む。サンプルウェル２４２は、サンプル供給チャネル２０６のサンプル開始点２１２、すなわち、流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂの上流（すなわち、矢印「Ａ」に概して反対方向）に接続される。サンプル集束チャネル２０８は、流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂの下流（矢印「Ａ」によって概して表示される方向）にある。末端ウェル２４６は、サンプル集束チャネル２０８の終点２１６、すなわち、流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂの下流（矢印「Ａ」によって概して表示される方向）に接続される。図４Ｇに最もよく見られるように、サンプル集束チャネル２０８は、チップ基板部２０２の１つ以上の細長いチャネル壁２８４によって画定される。チャネル壁２８４は、頂部チャネル部２８２ａと２つの対向する側面チャネル部２８２ｃとを含む。図４Ｇに最もよく見られるように、スライドガラス２５０は、サンプル集束チャネル２０８の底部チャネル部２８２ｂを画定する。
【００４３】
流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂは、その中を通過するバッファ５０の動作可能な流路を目的とする。図２Ｃに最もよく見られるように、好ましくは、２つの流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂがあり、サンプル集束チャネル２０８の上流（すなわち、矢印「Ａ」に概して反対方向）において、サンプル集束チャネル２０８の対向する側壁２８２ｃ、２８２ｃからサンプルチャネル２０４に接続する。図２Ａに示すように、各バッファウェル２４４ａ、２４４ｂは、流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂのそれぞれのバッファ開始点２１４ａ、２１４ｂの１つに接続する。各々の流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂは、約９０度（図２Ａに示す通り）、約４５度（図２Ｃに最もよく見られる通り）、または別の潜在的に有利な接続角度「Ｅ」の接続角度（図２Ａおよび図２Ｃにおいて矢印「Ｅ」によって概して表示される通り）で、サンプルチャネル２０４に接続し得る。図２Ａおよび図２Ｂに示すように、２つの流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂは、好ましくは、共通交差部２３０においてサンプルチャネル２０４に接続する。
【００４４】
図２Ｃに示すように、バッファ５０は、好ましくは、共通交差部２３０の約１０マイクロメートル（μｍ）未満「Ａ」方向の下流において、流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂから出て、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つ（すなわち、サンプル集束チャネル２０８）を通じて、試験分子１０２の縦一列の流れ１４０を動作可能に方向付ける。バッファ５０はまた、サンプル集束チャネル２０８を通じて動作可能に流動する。図２Ｃに矢印「Ｂ」、「Ｄ１」、および「Ｄ２」の相対的長さによって概して表示されるように、バッファ５０のバッファ流速（矢印「Ｄ１」、「Ｄ２」によって概して表示される通り）は、典型的には、縦一列の流れ１４０における試験分子１０２の試験流速（矢印「Ｂ」によって概して表示される通り）よりも高い。縦一列の流れ１４０は、好ましくは、対向する側面チャネル部２８２ｃ、２８２ｃ（図２Ｃに最もよく見られる通り）から、かつ底部チャネル部２８２ｂおよび頂部チャネル部２８２ａ（図４Ｇに最もよく見られる通り）から離間した関係にある、サンプル経路（矢印「Ｂ」によって概して表示される通り）に沿って方向付けられる。
【００４５】
サンプル集束チャネル２０８の中の試験分子１０２の流路は、好ましくは、動電学的流動によって促進される。したがって、また図４Ｄに最もよく見られるように、試験システム１００はまた、好ましくは、サンプルウェル電極２６２と、２つのバッファウェル電極２６４ａ、２６４ｂと、末端ウェル電極２６６とを含む。電極２６２、２６４ａ、２６４ｂおよび２６６の位置決定は、図４Ｄおよび図４Ｅの方策から最もよく理解されることができる。サンプルウェル電極２６２は、サンプルウェル２４２内に動作可能に配設される。各バッファウェル電極２６４ａ、２６４ｂは、バッファウェル２４４ａ、２４４ｂのうちの１つ内に動作可能に配設される。末端ウェル電極２６６は、末端ウェル２４６内に動作可能に配設される。
【００４６】
サンプルウェル電極２６２は、第１の極性の第１の電位を持って動作可能に供給される。末端ウェル電極２６６は、反対の第２の極性の第２の電位を持って動作可能に供給される。各バッファウェル電極２６４ａ、２６４ｂは、第１の極性の第３の電位を持って動作可能に供給される。好ましくは、第３の電位は、第１の電位よりも高く、第１の電位に対する第３の電位の比率は、約１．８：１（９：５）である。
【００４７】
好ましくは、縦一列の流れ１４０における試験分子１０２の試験流速「Ｂ」は、毎分少なくとも約３０個の試験分子１０２である。より好ましくは、試験流速「Ｂ」は、毎分少なくとも約６０個の試験分子１０２であり得る。好ましくは、さらに高い試験流速「Ｂ」、例えば、毎分約５００個の試験分子１０２は、さらに有利な有用性を提供し得る。
【００４８】
図３Ａおよび図３Ｂに最もよく見られるように、照射装置３００は、縦一列の流れ１４０における試験分子１０２による吸収のために、サンプル集束チャネル２０８に沿った照射位置２１０（図２Ａおよび図２Ｂに最もよく見られる通り）において、電磁波（ＥＭＦ）放射線３０２を動作可能に送達する。照射装置３００は、ＥＭＦ放射線３０２を動作可能に放出するための、ＬＥＤ３１２（図４Ｅおよび図４Ｆに最もよく見られる通り）および／またはレーザー３１０（図３Ａおよび図３Ｂに最もよく見られる通り）を含み得る。好ましくは、レーザー３１０は、約２ミリワット（mＷ）から約５０mＷの間、より好ましくは、約２０mＷから約２５mＷの間の動作電力を有する。好ましくは、ＥＭＦ放射線３０２は、約４８８ｎｍのＥＭＦ波長を有し得る。
【００４９】
図３Ａから図３Ｃに最もよく見られるように、試験分子１０２は、ＥＭＦ放射線３０２の吸収後に、蛍光３０４を放出する。試験分子１０２の蛍光３０４は、各々の複合体型に対する弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃ（図７Ａから図７Ｃに最もよく見られる通り）を含む。好ましくは、また図６Ａから図７Ｃに最もよく見られるように、ＥＭＦ放射線３０２の吸収後に、量子ドット１１２ａ、１１２ｂであるかまたは蛍光色素（図示せず）であるかにかかわらず、ＢＲＭフルオロフォア１１２ａ〜ｂは、弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの蛍光３０４の少なくともＢＲＭ部分６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃを放出し、標的マーカーフルオロフォア１３０は、ＥＭＦ放射線３０２の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの蛍光３０４の標的部分６０４ｄを放出する。（標的部分６０４ｄは、各々の複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃに対する独自の蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの蛍光３０４のＢＲＭ部分６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃよりも低い強度を有し得る。）ＢＲＭフルオロフォア１１２ａ、１１２ｂおよび標的マーカーフルオロフォア１３０はともに、ＥＭＦ放射線３０２の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの蛍光３０４を放出する。
【００５０】
図面に示されないが、試験システム１００は、照射位置２１０の実質的に近傍から（すなわち、サンプル集束チャネル２０８に沿って）、検出装置４００に蛍光３０４を送達する光ファイバーケーブルを代わりに含み得る。
【００５１】
図３Ａ、図３Ｃ、図６Ａ、および図７Ａ〜図９の方策から最もよく理解されることができるように、検出装置４００は、縦一列の流れ１４０を試験分子１０２によって放出される蛍光３０４に関して監視する。一般的に言うと、検出装置４００は、各々の複合体型の独特な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃ（図７Ａから図７Ｃに最もよく見られる通り）について監視することによって、第１の組の試験分子１０２における複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃの存在を同定する。
【００５２】
図３Ｃに最もよく見られるように、検出装置４００は、好ましくは、縦一列の流れ１４０を試験分子１０２によって放出される蛍光３０４に関して監視するための、アバランシェ光検出器４１０ａ、４１０ｂ、４１０ｃ、４１０ｄ（ＡＰＤ４１０ａ〜ｄ）、電荷結合素子４２０、および／または１つ以上のトリップセンサ（図示せず）を含み得る。好ましくは、検出装置４００は、縦一列の流れ１４０を試験分子１０２によって放出される蛍光３０４に関して監視する、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＡＰＤ４１０ａ〜ｄを含む。ＡＰＤ４１０ａ〜ｄの各々は、好ましくは、例えば、波長範囲が青色（図示せず）、緑色６０２ｄ、黄色６０２ａ、オレンジ色の６０２ｃ、または赤色６０２ｂ等の異なる波長範囲の存在を受信および同定するように適合される。
【００５３】
本発明の一部の実施形態においては、第１のＡＰＤ４１０ａ〜ｄの中の１つは、好ましくは、複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃの各々に対する弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの蛍光３０４のＢＲＭ部分６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃの存在を受信および同定するように適合され得、第２のＡＰＤ４１０ａ〜ｄの中の１つについては、複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃの各々に対する弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの蛍光３０４の標的部分６０４ｄの存在を受信および同定するように適合される。そのような実施形態においては、第２のＡＰＤ４１０ａ〜ｄの中の１つは、第１のＡＰＤ４１０ａ〜ｄの中の１つを上回る感度を有し得る。検出装置４００が、電荷結合素子４２０をさらに含む場合、それはまた、ＡＰＤ４１０ａ〜ｄまたは電荷結合素子４２０のいずれかを使用した縦一列の流れ１４０の監視を切り替えるための、切り替え手段４６４（図３Ｃに最もよく見られる通り）を含み得る。
【００５４】
上記のように、また図面には図示されないが、検出装置４００は、一連の１つ以上のトリップセンサを含み得る。各々のそのようなトリップセンサは、好ましくは、蛍光３０４の強度８０２ａ、８０２ｂ、８０２ｃ（図８Ａ〜図９に最もよく見られる通り）に対応するデジタル信号を生成し得るが、蛍光３０４の強度が、最小トリップ強度を超えた場合のみである。一連の各トリップセンサは、好ましくは、異なる所定の最小トリップ強度により提供され得る。一連のトリップセンサは、好ましくは、最小トリップ強度の昇順または降順に配列され得る。
【００５５】
このようにして、試験システム１００は、試験サンプル４０中の標的分子４６ａ、４６ｂ、４６ｃの存在を同定する。好ましくは、試験システム１００は、血液、尿、唾液、および血清試験サンプルでの使用に特に好適である。それは、感染性疾病、ならびに／または細菌性疾病状態、ウイルス性疾病状態、真菌性疾病状態、および／もしくはベクター誘導性疾病状態の診断に使用されることを目的とする。特に、試験システム１００は、生命体がＨＩＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶに感染しているかどうかの同時診断に特に有用であり得る。
【００５６】
この段階において、本発明の範囲内に入る一部の実施形態においては、試験システム１００は、その上記の構成部品のうちの１つ以上がなくても（それでもなおともに使用されることが好ましいが）提供され得ることに特に留意することは、有意義であり得る。つまり、例えば、試験システム１００は、試験分子１０２なしで提供され得るが、それでもなお試験分子１０２を用いて使用することを意図する。同様に、試験システム１００は、マイクロ流体チップ２００、照射装置３００、および検出装置４００のうちの１つ以上なしで提供され得るが、当然のことながら、それでもなお、それらとの使用を目的とし得る。例えば、試験システム１００が、照射装置３００も検出装置４００もなしで提供される場合、複合型の照射および検出装置３００、４００との使用が意図される場合がある。
【００５７】
方法について
本発明によると、特に、生物学的試験サンプル４０中の１つ以上の標的型の標的分子４６ａ、４６ｂ、４６ｃの存在に対する試験を容易にするために、とりわけ、分子を集束する方法が開示される。該方法は、好ましくは、
検出分子形成ステップ、
検出分子形成ステップ後の複合体形成ステップ、
動電学的ステップ、
複合体形成ステップ後のサンプル流動ステップ、
バッファ流動ステップ、
動電学的ステップおよびバッファ流動ステップ後のサンプル集束ステップ、
サンプル集束ステップ後の照射ステップ、
照射ステップ後の蛍光検出ステップ、および／または
照射ステップ後の複合体同定ステップ、
を含む。
【００５８】
検出分子形成ステップにおいて、マイクロビーズ１０８は、マイクロビーズ１０８と結合した１つ以上のＢＲＭフルオロフォア１１２ａ、１１２ｂで標識される。複合体形成ステップにおいて、複合体１２６ａ〜ｃは、好ましくは、生物学的試験サンプル中に標的マーカーフルオロフォア１３０および（１つ以上の検出分子型の）検出分子１０６ａ〜ｃを導入することによって形成される。各々の検出分子型は、それぞれ１つの標的型と結合可能であり、標的マーカーフルオロフォア１３０は、好ましくは、標的型のうちの１つ以上の（および／またはすべて）と抱合可能／結合可能である。したがって、標的分子４６ａ、４６ｂ、４６ｃが試験サンプル中に存在する場合、試験分子１０２は、好ましくは検出分子１０６ａ〜ｃの複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃ、標的マーカーフルオロフォア１３０、および標的分子４６ａ、４６ｂ、４６ｃを含み得る。好ましくは、複合体形成ステップにおいて形成される複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃは、約１０マイクロメートル（μｍ）未満のサイズである。一部の実施形態においては、形成される複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃは、約５μｍ未満、または約１μｍ未満のサイズでさえあってもよい。そのように形成される複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃは、１つ以上の複合体型であり、各々の複合体型は対応する標的型と結合している検出分子型のうちの異なる１つに対応する。
【００５９】
動電学的ステップにおいて、（ｉ）第１の極性の第１の電位は、サンプル供給チャネル２０６、すなわち、流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂの上流（すなわち、矢印「Ａ」に概して反対方向）に供給され、（ｉｉ）反対の第２の極性の第２の電位は、サンプル集束チャネル２０８、すなわち、流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂの「Ａ」方向の下流に供給され、（ｉｉｉ）第１の極性の第３の電位は、流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂのそれぞれに供給される。第３の電位は、好ましくは、第１の電位よりも高い。第１の電位に対する第３の電位の比率は、好ましくは、約１．８：１（すなわち約９：５）である。サンプル流動ステップにおいて、試験分子１０２は、サンプル供給チャネル２０６を通過する。バッファ流動ステップにおいて、バッファ５０は、サンプルチャネル２０４に接続した流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂを通過する。
【００６０】
サンプル集束ステップにおいて、試験分子１０２の縦一列の流れ１４０は、接続する共通交差部２３０を介した２つの流れ集束チャネル２２０ａ、２２０ｂからサンプル集束チャネル２０８へバッファ５０の流路によって、サンプル集束チャネル２０８を通じて方向付けられる。縦一列の流れ１４０は、サンプル集束チャネル２０８の対向する側面チャネル部２８２ｃ、２８２ｃから、頂部チャネル部２８２ａから、および底部チャネル部２８２ｂから離間した関係にある、サンプル経路「Ｂ」に沿って方向付けられる。典型的には、バッファ５０は、縦一列の流れ１４０における試験分子１０２の試験流速「Ｂ」よりも高いバッファ流速「Ｄ１」、「Ｄ２」で、サンプル集束チャネル２０８に流入する。サンプル集束ステップにおいて、バッファ５０は、約９０度（図２Ａに示す通り）の接続角度「Ｅ」、約４５度（図２Ｃに最もよく見られる通り）の接続角度「Ｅ」、または別の潜在的に有利な接続角度「Ｅ」の接続角度から、サンプル集束チャネルに流入し得る。好ましくは、サンプル集束ステップにおいて、サンプル集束チャネル２０８の中の試験分子１０２の縦一列の流れ１４０の流路は、動電学的ステップによって促進される。
【００６１】
照射ステップにおいて、電磁波（ＥＭＦ）放射線３０２は、好ましくは、約２ＭＷから約５０ＭＷの間の動作電力を有するレーザー３１０によって、縦一列の流れ１４０における試験分子１０２に送達される。より好ましくは、動作電力は、約２０ＭＷから約２５ＭＷの間であってもよい。好適な一実施形態においては、ＥＭＦ放射線３０２は、約４８８ｎｍのＥＭＦ波長を有する。
【００６２】
ＥＭＦ放射線３０２の吸収後に、各々の複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃ（すなわち、各複合体型の）は、弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの蛍光３０４を放出する。標的マーカーフルオロフォア１３０は、各複合体型に対する弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの標的部分６０４ｄを放出し、ＢＲＭフルオロフォア１１２ａ、１１２ｂは、各複合体型に対する弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃのＢＲＭ部分６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃを放出する。
【００６３】
蛍光検出ステップにおいて、縦一列の流れ１４０は、試験分子１０２によって放出される蛍光３０４について監視される。複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃによって放出される蛍光３０４は、好ましくは、２つ以上のＡＰＤ４１０ａ〜ｄによって受信され、第１および第２のＡＰＤ４１０ａ〜ｄは、各々の複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃに対する弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃの蛍光３０４のＢＲＭ部分６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃおよび標的部分６０４ｄのそれぞれを受信および同定する。あるいは、複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃによって放出される蛍光３０４は、電荷結合素子４２０によって受信され得る。さらに、蛍光検出ステップにおいて、複合体１２６ａ、１２６ｂ、１２６ｃによって放出される蛍光３０４は、ＡＰＤ４１０ａ〜ｄ、電荷結合素子４２０、または両方によって選択的に受信され得る。
【００６４】
最後に、複合体同定ステップにおいて、複合体型の弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、７２６ｃが検出された場合、試験サンプル４０中の標的分子４６ａ、４６ｂ、４６ｃの存在が同定される。
【００６５】
システムの詳細
ここで、本発明に従った試験システム１００を、非常に詳細に説明する。
【００６６】
試験システム１００は、サンプルを提供した宿主における種々の症状および感染性疾病に対して、生物学的試験サンプル（すなわち、血液、唾液、血清、尿等）を試験するように設計されている。試験された感染性疾病は、細菌性疾病状態、ウイルス性疾病状態、真菌性疾病状態、ベクター誘導性疾病状態、およびそれらの組み合わせを含むことができるが、それらに限定されない。試験は、試験サンプル４０を形成するために、検出分子１０６ａ〜ｃを生物学的サンプルと混合することによって実行される。
【００６７】
試験分子１０２は、好ましくは、図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃに図示されるような複合体１２６ａ〜ｃを含み得る。各々の複合体１２６ａ〜ｃは、好ましくは検出分子１０６ａ〜ｃを含む。検出分子１０６ａ〜ｃは好ましくは、各検出分子１０６ａ〜ｃに関連する固有のスペクトルパターンまたは「バーコード」を生成する量子ドット１１２ａ〜ｃ等の埋め込みＢＲＭフルオロフォアを有する、ポリママイクロビーズ１０８を含む。検出分子１０６ａ〜ｃは好ましくは、カルボン酸１１８によってマイクロビーズ１０８の表面に結合したBRM１１６をさらに含む。したがって、その標的マーカーフルオロフォア１３０を有する標的分子４６ａ〜ｃは、複合体１２６ａ〜ｃを形成するために、ＢＲＭ１１６を通じてマイクロビーズ１０８の外側に結合する。
【００６８】
より具体的には、図１Ａを参照すると、マイクロビーズ１０８は、黄色量子ドット１１２ａとして示される埋め込みＢＲＭフルオロフォアを有する。図１Ｂおよび図１Ｃは、赤色（１１２ｂ）、赤色（１１２ｂ）、および黄色（１１２ａ）の別の種々の組み合わせを示す。また、図５Ａおよび図５Ｂに参照のために示すように、オレンジ色（１１２ｃ）、緑色（１１２ｄ）、および青色（１１２ｅ）量子ドットも使用されることができる。蛍光色素等の代替のフルオロフォアは、量子ドットの代わりに使用されることができる。各ＢＲＭフルオロフォアは、例えば、赤色量子ドットに対する弁別的な蛍光スペクトル６０４ｂ等の図６Ａに示すような、弁別的な蛍光スペクトルを生成する。標的型４６ａは、標的マーカーフルオロフォア１３０と共に複合体１２６ａを形成するために、検出分子１０６ａに抱合される。同様に、図１Ｂおよび図１Ｃにおいて、標的型４６ｂおよび４６ｃは、的マーカーフルオロフォア１３０と共に複合体１２６ｂおよび１２６ｃのそれぞれを形成するために、検出分子１０６ｂおよび１０６ｃに抱合される。
【００６９】
アセンブリ
図３Ａは、本発明のシステム１００の一実施形態の概略図を示す。試験システム１００は、概して、マイクロ流体チップ２００と、照射装置３００と、検出装置４００とから成る。
【００７０】
図２Ａおよび図２Ｂに最もよく示されるようなマイクロ流体チップ２００は、スライドガラス２５０上に取り付けられたチップ基板部２０２を備える。チップ基板は、多数のウェルおよび接続チャネルから成る。図２Ｂに示すように、例示的なチップ２００は、サンプルウェル２４２、２つのバッファウェル２４４ａおよび２４４ｂ、および末端ウェル２４６の４つのウェルを有する。サンプルウェル２４２は、サンプル開始点２１２において、サンプル供給チャネル２０６およびサンプル集束チャネル２０８の２つの部分を有するサンプルチャネル２０４に接続される。同様に、バッファウェル２４４ａおよび２４４ｂはそれぞれ、バッファ開始点２１４ａおよび２１４ｂにおいて、流れ集束チャネル２２０ａおよび２２０ｂに接続される。サンプル供給チャネル２０６は、共通交差点２３０において流れ集束チャネル２２０ｂおよび２２０ｂに連結し、得られた集束バッファ／サンプル流動は、サンプル集束チャネル２０８に入り、終点２１６で終端し、末端ウェル２４６に入る。サンプル集束チャネル２０８に沿って、照射装置３００のための照射位置２１０がある。
【００７１】
流れ集束チャネル２２０ａおよび２２０ｂの２つの変化形を、図２Ａおよび図２Ｂのそれぞれに示す。図２Ａにおいて、流れ集束チャネル２２０ａおよび２２０ｂは、サンプル供給チャネル２０６およびサンプル集束チャネル２０８に対して実質的に９０度の角度で交差点２３０に入る。図２Ｂにおいて、流れ集束チャネル２２０ａおよび２２０ｂは、サンプル供給チャネル２０６に対して実質的に４５度の角度で交差点２３０に入る。交差点２３０におけるチャネル２０４および角度の配置は、好ましくは、３０度から９０度の間の交差角度であるが、正確な角度は、試験サンプル４０およびバッファ５０、ならびに望ましい流速の特徴に基づいた経験的測定によって、最もよく決定される。
【００７２】
図２Ｂに基づいて、図２Ｃは、交差点２３０、ならびにサンプル４０およびバッファ５０の流動パターンの拡大断面概略図を提供する。末端ウェル２４６へ向かう流動の概略的な方向は、下流方向を表す矢印Ａによって示される。サンプル供給チャネル２０６に沿ったサンプル流動は、サンプル経路を表す矢印Ｂによって示される。流れ集束チャネル２２０ａおよび２２０ｂに沿ったバッファ流動は、矢印Ｃ２およびＣ１のそれぞれによって示される。サンプル集束チャネル２０８におけるバッファ流動は、矢印Ｄ２およびＤ１によって示される。流れ集束チャネル２２０ａおよび２２０ｂとサンプル供給チャネル２０６との間の入射角は、Ｅとして示される。
【００７３】
バッファ５０が流れ集束チャネル２２０ａおよび２２０ｂを出て交差点に入ると、流動しているバッファ５０の力によって、流動サンプル４０は、サンプル供給チャネル２０６から狭小化し、試験分子１０２を縦一列の流れ１４０へと押し入れる。図４Ｇは、サンプル集束チャネル２０８の断面を示し、サンプル４０へのバッファ５０の流れ集束効果が、チャネル壁２８４による拘束を受け、両方の方向に機能することを図示する。サンプル４０は、スライドガラス２５０によって画定される底部チャネル部２８２ｂまで延在するが、底部チャネル部２８２ｂへの試験分子１０２の接着を防止するために、狭小ではあることに留意されたい。バッファ５０およびサンプル４０の両方が、頂部チャネル部２８２ａを覆う一方で、バッファ５０は、対向する側面チャネル部２８２ｃを覆う。
【００７４】
マイクロ流体チップ２００は、図４Ｅおよび図４Ｆに詳細に最もよく示されるようなプラットフォーム２７０上に取り付けられる。サンプル４０およびバッファ５０に対する動電学的駆動力は、ウェルのそれぞれに挿入される電極によって提供される。したがって、示されるチップ２００に対して、サンプルウェル電極２６２と、２つのバッファウェル電極２６４ａおよび２６４ｂと、末端ウェル電極２６６とがある。それらのそれぞれのチャネルに沿ってサンプル４０およびバッファ５０を搬送する動電学的駆動力を生成するために、電圧差が電極を介して印加される。
【００７５】
マイクロ流体チップ２００は、既知の方法に従って製造される。そのような一方法は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロ流体チップを使用する。ＰＤＭＳマイクロ流体チップは、好ましくは、従来のソフトリソグラフィ微細加工技術を使用して製造される。望ましいマイクロチャネルパターンのフォトマスクは、透明スライド上で準備および印刷される。マスタは、フォトレジスト層でコーティングされたＳｉウエハ上に製造され、予備焼成される。次いで、各ウエハは、フォトレジスト上に、インク面を下向きにして、フォトマスクを配置し、短時間紫外線に曝露される。標準的な焼成後手技に従って、紫外線に曝露されていないいかなるフォトレジストも溶解除去するために、ウエハは、ナノ現像液に浸漬される。次いで、マスタは、イソプロパノールで洗浄され、圧縮Ｎ2ガスで乾燥される。
【００７６】
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、概して、２つの部分に分けられたプレポリマキットとして供給され、Ａ部分はプレポリマであり、Ｂ部分は、架橋剤を含有する。マスタを、パイレックス（登録商標）のシャーレに置き、混合プレポリマを、各々の上に注いだ。次いで、プレポリマのガス抜きをする（プレポリマから気泡を除去する）ために、サンプルは、真空下に配置される。次にオーブン内でインキュベーション期間をとる。オーブンから取り出されると、硬化したＰＤＭＳスラブを、マスタから剥離し、マイクロチャネルパターンの外側の周囲にある過剰なポリマは、除去される。１つのマスタは、２つのポリママイクロチャネルのためのパターンを保持する。次いで、ＰＤＭＳ基板およびガラスカバースリップの表面を、粘着テープを用いて清掃する。
【００７７】
次いで、ＰＤＭＳチャネルのプラズマ酸素事前処理を使用して、壁を親水性にすることができる。ＰＤＭＳ基板２０２およびスライドガラス２５０の両方は、プラズマクリーナーのチャンバ内に装填され、酸素プラズマに曝露される。直後に、２つの基板を組み合わせて不可逆的に密閉するように、ＰＤＭＳ２０２の表面およびスライド２５０の表面を接触させる。チャネル表面を親水性に保つために、再蒸留水をマイクロチャネル２０４内に添加する。最後に、水が蒸発することを防止し、チップ２００の長期間の保存を可能にするために、ガラスの小片を、チャネルウェル２４２、２４４ａ、２４４ｂ、および２４６の上に配置する。
【００７８】
図３Ｂにより詳細に示される照射装置３００は、上記に説明するようにサンプル集束チャネル２０８内を流動する試験分子１０２に照射するために、照射位置２１０に方向付けられるＥＭＦ（電磁波）放射線３０２の流れを放出する。示されるように、レーザー３１０は、ＥＭＦ放射線を生成するために使用されるが、ＬＥＤ等の代替の源を使用することもできる。ＬＥＤは、レーザー３１０と同一の位置か、またはＬＥＤ３１２によって示される位置に配設することができる。
【００７９】
図４Ｆに示すように、放出されたＥＭＦ放射線３０２は、照射位置２１０に光線を集束するために、対物レンズ３３０を通じたミラー３２０を介して方向付けられる。レンズの焦点距離は、放射線３０２を照射位置２１０と方向合わせするために、モーター２８０ａおよび２８０ｂを使用したチッププラットフォーム２７０の移動によって、ｘ、ｙ、およびｚ軸（図４Ｃおよび図４Ｄにも示される通り）に沿って調整されることができる。方向合わせは、自動的に、または手動で実行することができる。自動位置合わせは、ＬＥＤ３１２を駆動し、信号強度を測定し、サンプル集束チャネル２０８と照射位置２１０との適切な方向合わせのために、ｘおよびｚ軸でプラットフォームを調整することによって実行される。代替として、ｙ軸調整は、信号結果を最適化するために手動で行うことができる。手動の方向合わせは、調整ノブ５０６、入力インターフェース５０４、またはそれらの組み合わせによって、ユーザによって制御される。
【００８０】
レンズ３３０の方向合わせおよび焦点調整は、図４Ｇにより明確に示され、レンズ３３０と試験分子１０２との間のｚ軸焦点距離Ｆｚは、試験分子１０２が、ＥＭＦ放射線３０２によって十分に励起されることを確実にするために調整される。同様に、ｘ軸焦点距離Ｆｘを調節し、試験分子１０２のサイズ（幅）を考慮する。
【００８１】
図３Ｃにより詳細に示される検出装置４００は、概して、照射された試験分子１０２から放出された蛍光３０４を蛍光検出装置に方向付けるために、ミラーおよびフィルタの集合体を備える。図３Ｃに示すように、入射蛍光３０４は、一次ミラー４６２によって検出チャネル４５０に沿って方向付けられる。次いで、蛍光信号は、光線分割ミラー４６４によって分割される。分割された蛍光信号の一部は、強度チャネル４２２に沿って、全信号強度を決定する電荷結合素子（「ＣＣＤ」）４２０に方向付けられる。
【００８２】
分割された蛍光信号のもう一方の部分は、一連のバンドパスフィルタ４４０ａ〜ｄを通過する検出チャネル４５０に沿って方向付けられる。各フィルタ４４０ａ〜ｄは、試験分子１０２における各々のＢＲＭのフルオロフォア１１２ａ〜ｂおよび標的マーカーフルオロフォア１３０によって放出される蛍光信号３０４に対応する特定の波長を対象とする。フィルタリングされた信号４４２ａ〜ｄは各々、検出チャネル４５２ａ〜ｄに沿って、蛍光信号を電気信号に変換し、その後その電気信号を分析のために信号プロセッサ４９０に出力する、ＡＰＤ（アバランシェ光検出器）４１０ａ〜ｄに方向付けられる。
【００８３】
１つの信号を一例として挙げると、緑色の波長バンドパスフィルタ４４０ａを使用して、蛍光信号３０４のフィルタリングされた部分４４２ａを検出チャネル４５２ａ方向に方向転換する。このフィルタリングされた信号４４２ａは、ＡＰＤ４１０ａを打撃し、結果は、分析のための緑色の波長出力信号である。同様のプロセスが、黄色のバンドパスフィルタ４４０ｂ、オレンジ色のバンドパスフィルタ４４０ｃ、および赤色のバンドパスフィルタ４４０ｄを用いて行われ、対応するＡＰＤ４１０ｂ〜ｄは、黄色、オレンジ色、および赤色の波長に対する出力信号を生成する。組み合わされた信号は、蛍光を発している試験分子１０２の同定を決定するために解釈されるスペクトルを集合的に生成する。
【００８４】
標的フルオロフォア１３０は、概して、ＢＲＭフルオロフォア１１２ａ〜ｃよりも強度が低く、しばしば実質的に強度が低いため、ＢＲＭ複合体スペクトルの生成に関与するＡＰＤよりも高い感度で動作するために、標的フルオロフォアスペクトルの生成に関与するＡＰＤを有することは有利であり得る。示される概略図において、ＡＰＤ４１０ａは、標的フルオロフォア１３０のスペクトルの生成に関与し、ＢＲＭフルオロフォア１１２ａ〜ｃで使用されるＡＰＤ４１０ｂ〜ｄを上回る感度で動作する。示されるように、ＡＰＤ４１０ａは、ＡＰＤを冷却するためにヒートシンク４７０を使用するタイプであり、冷却されないＡＰＤ４１０ｂ〜ｄを上回る感度を提供する。ヒートシンク４７０の代用として、またはこれに加えて、ＡＰＤ４１０ａを周囲よりも低い一定温度に維持するために、温度制御システム４７２を実装することができる。
【００８５】
システム全体は、筐体５００に包納され、サンプル装填済みマイクロ流体チップ２００の挿入および取り外しのためのサンプルアクセスポート５０２と、好ましくは、ディスプレイとデータ入力装置としての二重機能を可能にする、タッチパネル装置である、ディスプレイ５０４とを含む。筐体はまた、チップ２００の位置の調整のための手動方向合わせを実行するために使用される、ノブ５０６を含む。
【００８６】
操作
使用に際して、生物学的試験サンプル（血液、唾液、血清、尿等）は、マイクロ流体チップ２００のサンプルウェル２４２への挿入のために調製される。生物学的試験サンプルは、試験の性質によって決定される、１つ以上の標的型の標的分子４６の存在に関して、システムによって試験される試験サンプル４０を形成するために、第１の組の検出分子と組み合わされる。１つ以上の検出分子型の検出分子１０６は標的分子のうちの１つと個々に結合可能である。検出分子および標的分子の異なる複合体は、異なる検出分子および標的分子に対応する。
【００８７】
非抱合サンプル分子等の分子の第２の組もまた、サンプル中に存在し得、第２の組の分子は、第１の組の試験分子（および検出分子）を有するサンプル流動内に移動するかもしれない。分子の第２の組は、別途の検出分子の多重試験、もしくはキャリブレーションおよびエラーチェック等のシステム試験に使用することができるか、または無関係として無視され得る。
【００８８】
次いで、マイクロ流体チップ２００は、筐体５００内のサンプルアクセスポート５０２を通じて、試験システム１００に挿入される。次いで、レンズ３３０と照射位置２１０との方向合わせは、上記に説明されたように実行される。操作パラメータは、ディスプレイ５０４によって入力され、サンプル４０およびバッファ５０の流動を開始するために、必要な電位は、電極２６２、２６４ａ、２６４ｂ、および２６６を通じて印加される。第１の電位は、サンプルウェル電極２６２に、第２の電位は、バッファウェル電極２６４ａおよび２６４ｂに、第３の電位は、末端ウェル電極２６６に印加される。
【００８９】
次いで、サンプル４０およびバッファ５０は、図２Ｃに示すように、サンプル供給チャネル２０６を、また流れ集束チャネル２２０ａおよび２２０ｂのそれぞれを通じて流動する。チャネル２０６、２２０ａおよび２２０ｂは、共通交差点２３０で交わり、サンプル４０の流動は、試験分子１０２の縦一列の流れ１４０に集束する。
【００９０】
次いで、試験分子１０２は、照射装置３００によって照射位置２１０において照射される。好ましくは、レーザー３１０またはＬＥＤ等の固定波長のＥＭＦ放射装置が使用される。次いで、試験分子は、それらの検出分子型および／または複合体型に応じて蛍光を放出し、各々、弁別的な蛍光スペクトルを有する。
【００９１】
次いで、蛍光は、上記に説明されたようにＡＰＤまたはＣＣＤ等の光検出装置によって検出され、得られた信号は、試験サンプル中の複合体型を同定するために、信号プロセッサに出力することができる。
【００９２】
実験結果
本明細書に記載する実施例において、３つの病原体（それぞれ図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃに図示されるような、Ｂ型肝炎ウイルス‐ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス‐ＨＣＶ、およびヒト免疫不全ウイルス‐ＨＩＶ）が、感染性疾病診断のための本統合装置の有用性を説明するために選択された。これらの３つの病原体は、すべて同様の感染ルートを使用する血液感染性ウイルスであり、ＩＤ罹患率および死亡率全体に著しい影響を及ぼす世界で最も流行している疾病に含まれている。例えば、世界中で、ＨＩＶは、４０００万人に感染し、ＨＢＶは、４億人に感染し、ＨＣＶは、１億７０００万人に感染し、推定罹患率は、ＨＩＶに対して３９５０万人、慢性ＨＢＶ感染に対して３億５０００万人、慢性ＨＣＶ感染に対して１億３０００万人である。これらの症例の大部分は、発展途上諸国にある。現在の診断計画は、３つの個々の試験、および病原体検出のための比較的大量の血液を必要とする。これらの必要条件は、分析の費用および分析の速さに著しい悪影響を生じる。発展途上諸国にとって、共通診断装置の実現は、多くの命を救う可能性がある。
【００９３】
量子ドット合成
従来技術の有機金属法を使用して、ＣｄＳｅのコアでＺｎＳでキャップされた量子ドット（「Ｑｄｏｔ」）を合成した。簡潔に、１２〜２０ｇのトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ、９８％純粋、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、三つ口フラスコ内で、Ａｒガス下で１５０℃まで加熱した。１６０μＬのジメチルカドミウム（９７％、Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ、ＭＡ）を注入し、約１５分間加熱したＴＯＰＯと混合した。真空下での３回のパージ後、三つ口フラスコの内容物を３５０℃まで加熱した。次いで、セレン（Ｓｅ粉末、９９．５％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）およびトリ−ｎ−オクチルホスフィン（ＴＯＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の２モルの前駆体溶液を三つ口フラスコに注入し、温度を３００℃まで急速に低下させた。１．５：１から２．５：１の範囲のＣｄ：Ｓｅ比を使用した。蛍光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ３、Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｈｏｒｉｂａ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）を使用して、三つ口フラスコ内の溶液の一定分量の放出プロファイルを測定することによって、増殖期の間、Ｑｄｏｔ放出を追跡記録した。望ましいピーク放出波長に到達すると、ジエチル亜鉛（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヘキサメチルジシラチアン（ＴＭＳ２（Ｓ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＴＯＰから成るキャッピング前駆体溶液を、約１ｍＬ／分の速度で三つ口フラスコに滴下添加した。
【００９４】
Ｑｄｏｔキャッピングに続いて、三つ口フラスコの温度を＜６０℃まで低下させ、クロロホルムを添加した。未反応前駆体からナノ粒子を沈殿させるために、メタノールおよびクロロホルム（２：１の比率）で数回洗浄した。最終ＴＯＰＯ被覆Ｑｄｏｔを使用するまでクロロホルム中に保存した。
【００９５】
量子ドットバーコード合成
既知の方法（Ｍ．Ｈａｎ，Ｘ．Ｇａｏ，Ｊ．Ｚ．Ｓｕ，Ｓ．Ｎｉｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９，６３１（２００１）、Ｘ．Ｇａｏ，Ｓ．Ｎｉｅ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７６，２４０６（２００４））を使用して、ＱｄｏｔバーコードまたはＢＲＭ部分（以下、「ＱｄｏｔＢ」）を調製した。簡潔に述べると、表面にカルボン酸官能基を有する直径５μｍのポリスチレンマイクロビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）をプロパノール中で膨張し、クロロホルム中のＴＯＰＯ被覆Ｑｄｏｔを添加した（１ｍＬのプロパノール中の約１．５×１０７のビーズ、およびクロロホルム中の＜１００μＬのＱｄｏｔ）。疎水性−疎水性相互作用によって、Ｑｄｏｔは、マイクロビーズ内部に拡散した。ＱｄｏｔＢ１（５７０ｎｍ放出Ｑｄｏｔのみ）およびＱｄｏｔＢ２（６１５ｎｍ放出Ｑｄｏｔのみ）サンプルに対して、インキュベーションは１時間続いたが、ＱｄｏｔＢ３に対しては、インキュベーションは２つのステップに分かれ、５７０ｎｍ放出Ｑｄｏｔを一時間のインキュベーションの全体の間添加し、６１５ｎｍ放出Ｑｄｏｔを後半３０分間のみ添加した。サンプルをプロパノールで数回（７〜１０回）洗浄し、アッセイのために使用するまで冷蔵庫で４℃で保存した。ビーズ調製からアッセイ開始までの時間間隔は、１２時間を超えなかった。
【００９６】
抗原サンプル調製
次いで、Ｎ−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）補助架橋結合を使用して、病原体抗原（ＢＲＭ１１６の例示的な型）をマイクロビーズ表面に共有結合した。使用した抗原は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＩＶのそれぞれに対して、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、非構造タンパク質４（ＮＳＰ4）、および糖タンパク質４１（ｇｐ４１）であった。
【００９７】
プロパノール中で調製したＱｄｏｔＢをボルテックスし、１０秒間超音波分解し、次いで、５ｍＬフィルタ（Ｆａｌｃｏｎ、ＶＷＲ）を通過させた。最初に１．５×１０７ビーズ／ｍＬの濃度で１ｍＬのプロパノール中に懸濁したサンプルを２５０μＬの一定分量に分け、８０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。浮遊物を吸引し、ＱｄｏｔＢを１００μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ５．５）中に再懸濁した。ＭＥＳバッファによるビーズのさらに２回の洗浄を完了し、次いで、サンプルを９０μＬのＭＥＳバッファ中に再懸濁した。１ｍＬのＭＥＳバッファ中に０．００９２ｇのＮ−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の原液を調製し、５μＬを各サンプルに添加した。次いで、１５分間、軽い振とうを生じさせながらサンプルをボルテックス上でインキュベーションした。
【００９８】
ＥＤＣインキュベーションに続いて、サンプルを９０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、吸引した。９０００ｒｐｍでの再遠心分離を用いた、１００μＬのＭＥＳバッファによる洗浄が続いた。炭酸−重炭酸バッファ（ｐＨ９．４）中に３４．４μｇ／ｍＬの濃度で、抗原溶液を調製した。使用した抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のそれぞれに対して、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｌｏｎｇ  Ｂｅａｃｈ、ＣＡ）、非構造タンパク質４（ＮＳＰ４、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、および糖タンパク質４１（ｇｐ４１、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）であった。１００μＬの最終体積になるまで希釈された抗原原液をサンプルに添加し、次に、ボルテックス上で１５分間インキュベーションした。
【００９９】
抗原溶液を伴うインキュベーション後、６５００ｒｐｍで３分間サンプルを遠心分離し、次いで、吸引した。次いで、ＱｄｏｔＢを１００μＬのクエンチングバッファ（５０ｍＭグリシンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ）中に再懸濁し、ボルテックス上でさらに１５分間インキュベーションした。このインキュベーションに続いて、５５００ｒｐｍで３分間サンプルを遠心分離し、吸引し、リン酸バッファ食塩水（ＰＢＳ）中の１００μＬの３％ミルク中に再懸濁した。次の３０分間のボルテックス上でのインキュベーションは、乳タンパク質でＱｄｏｔＢを阻害する働きをする。最後に、５０００ｒｐｍでの遠心分離を使用して、ＴＲＩＳ洗浄バッファ（ｐＨ８．０）でＱｄｏｔＢをもう一度洗浄した。このサンプルは、必要であれば一晩乾燥保存することが可能である。
【０１００】
次いで、ヒト血清中に標的抗体溶液の原液を調製した。ＨＢＶに対して、クローンＸ１２  抗ＨＢｓＡｇ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）が使用され、ＨＣＶに対して、クローン８Ａ１  抗ＨＣＶ  ＮＳ−４（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｃｏ、ＭＥ）が使用され、ＨＩＶに対して、クローン５Ａ１  抗ＨＩＶ−１  ｇｐ４１（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）が使用された。１００μＬの最終体積になるまで、抗原被覆ＱｄｏｔＢをスパイクヒト血清サンプル中に再懸濁した。次いで、それらを１５分間ボルテックス上でインキュベーションし、続いて、ＴＲＩＳ洗浄バッファを使用して２回洗浄し、５０００ｒｐｍでサンプルを遠心分離した。
【０１０１】
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８色素結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）の原液をＴＲＩＳ洗浄バッファ中で１：３００に希釈した。各サンプルを再懸濁するために、１００μＬのこの溶液を使用した。（有機色素退色を防止するために）スズ箔でサンプルを被覆し、１５分間ボルテックス上に置いた。短期間の保存のために、サンプルを５００μＬのＴＲＩＳ洗浄バッファ中に再懸濁する前に、１００μＬのＴＲＩＳ洗浄バッファを使用した、ＱｄｏｔＢ複合体の２回の最終洗浄を完了した。
【０１０２】
アッセイ準備
多重アッセイのために、抗原被覆ＱｄｏｔＢを上に記載するように調製した。すべての実験は、抗体捕捉の間ほぼ同数の全ビーズを使用した。２つの種類の抗原ＱｄｏｔＢが使用されていた場合、サンプル中のマイクロビーズの半分が１つのコードに対応し、残りがもう一方に対応した。３つの異なるＱｄｏｔＢを使用したサンプルに対して、同一の方法を使用した。
【０１０３】
標的抗体スパイクヒト血清でのＱｄｏｔＢのインキュベーションのために、１００μＬの全体積をすでに使用した。したがって、２つの異なる標的抗体でサンプルをインキュベーションした場合、５０μＬの各スパイク血清溶液を添加した。同様に、３つの異なる標的抗体をインキュベーションした場合、３３μＬの各溶液を添加した。
【０１０４】
図１２は、どの抗原被覆ＱｄｏｔＢを、どの標的抗体スパイクヒト血清サンプルでインキュベーションするかを列挙する。対照（標的抗体なし）サンプルのために、標的抗体のないヒト血清を代わりに添加した。標的抗体捕捉アッセイの残りは、上に記載する方法に従った。
【０１０５】
マイクロチップ製造
上記に説明したように、マイクロチャネル製造は、標準的なソフトリソグラフィ技術（例えばＹ．Ｘｉａ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．，２８，１５３（１９９８）、Ｄ．Ｃ．Ｄｕｆｆｙ，Ｊ．Ｃ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｏ．Ｊ．Ａ．Ｓｃｈｕｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７０，４９７４（１９９８）、Ｍ．Ａ．Ｕｎｇｅｒ，Ｈ．Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｔｈｏｒｓｅｎ，Ａ．Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｑｕａｋｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，１１３（２０００）に記載されたように）に従った。
【０１０６】
ＡｕｔｏＣＡＤソフトウェア（Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ）を使用して、望ましいマイクロチャネルパターンのフォトマスクを準備し、Ｐｈｏｔｏｐｌｏｔ  Ｓｔｏｒｅ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）によって透明スライド上に印刷した。印刷解像度は、１．５９μｍ（２つの画素間の距離）であった。マスタ製造は、直径３．５インチのＳｉウエハ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｂｕｒｇ、ＶＩ）上に２０１５シリーズＳＵ８フォトレジスト（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）の厚さ１５μｍの層をスピンコーティングし、サンプルを予備焼成することから開始した。次いで、各ウエハは、フォトレジスト上に、インク面を下向きにして、フォトマスクを配置し、ＳＵＳＳ  ＭＡ６  マスクアライナ（ＳＵＳＳ  ＭｉｃｒｏＴｅｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＶＴ）を使用して、約４秒間の間３５ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で３６５ｎｍ紫外線に曝露した。標準的な焼成後手技に従って、紫外線に曝露されていないいかなるフォトレジストも溶解除去するために、ウエハをＳＵ８  Ｎａｎｏｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．）に約１分間浸漬した。次いで、マスタをイソプロパノールで洗浄し、圧縮Ｎ２ガスで乾燥した。
【０１０７】
使用したポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）プレポリマキット（ＲＴＶ６１５、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ、Ｗｉｌｔｏｎ、ＣＴ）は、２つの部分があり、Ａ部分はプレポリマであり、Ｂ部分は、架橋剤を含有する。プレポリマを１０Ａ：１Ｂの比率で混合した。マスタをパイレックス（登録商標）のシャーレに置き、２２ｇのプレポリマをそれぞれの上に注いだ。次いで、プレポリマのガス抜きをする（プレポリマから気泡を除去する）ために、サンプルを真空下に約２時間置いた。次に８０℃に設定したオーブンで、３時間のインキュベーションを行った。オーブンから取り出すと、硬化したＰＤＭＳスラブをマスタから剥離し、マイクロチャネルパターンの外側の周囲にある過剰なポリマを除去した。１つのマスタは、２つのポリママイクロチャネルのためのパターンを有する。次いで、ＰＤＭＳ基板およびガラスカバースリップ（１７０μｍ厚、ＶＷＲ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ）の表面を粘着テープを用いて入念に清掃した。ＰＤＭＳ基板およびガラスカバースリップの両方をプラズマクリーナー（Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）のチャンバ内に装填し、１分間酸素プラズマに曝露した。直後に、２つの基板を合わせて不可逆的に密閉するために、ＰＤＭＳの表面およびカバースリップの表面を接触させた。チャネル表面を親水性に保つために、再蒸留水をマイクロチャネルに添加した。最後に、水が蒸発することを防止し、サンプルの長期間の保存を可能にするために、ガラスの小片をチャネルウェル上に配置した。
【０１０８】
検出実験
最初に、５００μＬのＴＲＩＳ洗浄バッファ中のＱｄｏｔＢ複合体を４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、吸引した。次いで、それらを３０μＬの再蒸留水中に再懸濁した。
【０１０９】
バッファおよび廃棄ウェルを充填し、カスタムツールを使用してサンプルウェルにおいて吸引を行うことによって、使用前に一度、マイクロチャネルを再蒸留水で洗い流した。チップへのサンプルの導入前に、すべてのウェルから流体を除去した。２０μＬのサンプルをサンプルウェル内に装填し、続いて、各バッファおよび各廃棄ウェルに２０μＬの再蒸留水を添加した。次いで、倒立型落射蛍光顕微鏡（ＩＸ７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）の試料台上にマイクロ流体チップを方向を合わせて置き、６０Ｘ対物レンズ（１．３５ＮＡ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）に油浸した。対物レンズの焦点をサンプルウェルの入口に合わせた。
【０１１０】
ウェルのそれぞれに電極を配置し、リードは、電圧調節回路の出力に接続した（図Ｓ２を参照）。電圧調節回路の入力を高圧電源（ＣＺＥ１０００Ｒ、Ｓｐｅｌｌｍａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）に接続し、典型的な実験の間中、調節回路に３００Ｖおよび６０μＡを供給した。バッファチャネルとサンプルチャネルとの間の電圧比を１．８に設定した。
【０１１１】
ＱｄｏｔＢ複合体が、上に記載するようにマイクロチャネル２０６に流入し始めると、バッファチャネル２０８およびサンプルチャネル２０６の交差点２３０から下流に位置するサンプル集束流れと方向合わせするために、対物レンズの焦点を移動した。次いで、約１０μｍ幅の縦一列のサンプル流れ１４０に対して、約８μｍの直径であり、ＴＥＭ００モードのマルチラインＡｒ／Ｋｒガスレーザー（ＣＯＨＥＲＥＮＴ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）からの４８８ｎｍＡｒレーザー３１０のラインを使用した、レーザースポットの焦点を合わせるために、対物レンズ３３０を使用した。レーザー出力を一定の２５ｍＷに設定した。収集した蛍光３０４から励起光３０２を分離するために、二色性ミラー（Ｕ−Ｎ４１００１、Ｏｌｙｍｐｕｓ）および５００ｎｍロングパス放出フィルタ３２０（７５１２、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ、ＶＴ）を使用した。ソリッドステート光検出器４１０ａ〜ｄの活性領域に焦点を合わせる前に、二色性ミラー（ｑ５５５ｌｐおよび６１０ｄｌｐ、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）およびバンドパスフィルタ４４０ａ〜ｄを使用して、蛍光放出３０４をスペクトルバンドに分離した（図３Ａを参照）。
【０１１２】
使用されたＱｄｏｔおよびバンドパスフィルタのスペクトルを図６Ａに示す。赤色、黄色、およびオレンジ色のＱｄｏｔＢに対するスペクトルピークの比較を図６Ｂに示す。フィルタに対してピーク６０２ｄとして、および未加工の蛍光に対して６０４ｄとして示される、緑色の範囲の波長に対して、ＰＩＮフォトダイオード検出器４１０ａ（８１８Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）にこれらの放出を集束するために、５００〜５４０ｎｍバンドパスフィルタ４４０ａ（ＨＱ５２０／４０、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）を両凸レンズ（ＬＢ１７６１−Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）とともに使用した。この検出器を光強度測定器（１８３０−Ｃ、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐ．）に接続した。同様に、バンドパスフィルタ４４０ｂおよび４４０ｄ（ＨＱ５７５／３０およびＨＱ６３０／６０、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）とレンズ（それぞれＬＢ１８１１−ＡおよびＬＡ１０２７−Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）とを、２つのアバランシェフォトダイオード（黄色および赤色チャネルのそれぞれに対してＣ４７７７−０１およびＣ５４６０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）に使用した。黄色の波長範囲をフィルタに対してピーク６０２ａ、および未加工の蛍光に対して６０４ａとして示し、赤色の波長範囲をフィルタに対してピーク６０２ｂ、および未加工の蛍光に対して６０４ｂとして示す。３つの検出器すべてに対する電圧出力を、コンピュータに接続し、Ｌａｂｖｉｅｗソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して動作するデータ収集カード（ＮＩ  ＵＳＢ−６２５１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）のポートに接続した。データ収集カードの機能は、約１ＭＳ／ｓであるが、１ｋＨｚにおけるサンプリングを使用した。比較のために、図６Ａはまた、フィルタに対してピーク６０２ｃ（上記を参照）、および未加工のＱｄｏｔスペクトルに対して６０４ｃとして、オレンジ色の波長範囲を示す。赤色６１２ｂ、黄色６１２ａ、およびオレンジ色の６１２ｃのＱｄｏｔＢ複合体に対するスペクトルを、比較の目的で図６Ｂに重ね合わせた。
【０１１３】
典型的な実験を１５分間実施し、約３０ＭＢのデータおよび約１０００の検出事象の収集を可能にした。実験後、サンプルチャネル中に残っているＱｄｏｔＢ複合体を収集し、細胞計数器（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して計数したが、マイクロチャネルは破棄した。サンプルウェル中のＱｄｏｔＢ複合体濃度は、典型的な実験の間、１．５×１０7／ｍＬ（９×１０6標準偏差）であった。
【０１１４】
ＣＣＤアレイカメラを使用したスペクトル収集
図７Ａ〜図７Ｃに示すようなスペクトル収集は、上記のものと同様のステップを使用した。しかしながら、５０．０ｍｍ焦点距離レンズ（ＬＡ１１３１−Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、スペクトルグラフ（Ａｃｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）の入口スリットに蛍光放出を方向付け集束した。スペクトルグラフの内側で、熱電冷却されたＣＣＤカメラ（７４８１−０００２、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｒｅｎｔｏｎ、ＮＪ）の画素を照明する前に、波長による放出光を分散させるために、１ｍｍあたり１５０の溝を有する格子を使用した。この格子の選択により、５７０ｎｍの中心波長に対して方向合わせした場合、約４５０〜７００ｎｍのスペクトルの検査が可能になる。典型的な読み取り時間が約２５０ｍｓｅｃであった一方で、機械シャッターで設定されたＣＣＤアレイの積分時間は、５０ｍｓｅｃであった。カメラによって撮られたデータを、ＷｉｎＳｐｅｃソフトウェア（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって収集および分析した。複数の連続スペクトルを収集することによって、背景および検出信号を互いから区別することが可能であった。ＨＢＶ、ＨＩＶ、およびＨＣＶサンプルに対する生データは、それぞれ弁別的な蛍光スペクトル７２６ａ、７２６ｂ、および７２６ｃとしての生データに一致する近似曲線とともに、７２４ａ、７２４ｂ、および７２４ｃとしてそれぞれ示される。それぞれの近似曲線は、合わせてオレンジ色のピーク６０４ｃになる、黄色ピーク６０４ａ、赤色ピーク６０４ｂを示す。標的フルオロフォアに対する緑色ピーク６０４ｄも存在する。
【０１１５】
理論
サンプルおよびバッファチャネルの下流において、チャネルは、流れ集束を受ける。流動内のマイクロビーズが、Ｑｄｏｔバーコード測定値に大きな影響を及ぼす可能性があるＰＤＭＳに非特異的に吸着する傾向があるため、流れ集束は、本技術の重要な側面である。流れ集束によって、ＰＤＭＳ基板とのＱｄｏｔバーコード相互作用は、最小限に抑えられる。
【０１１６】
検出しているビーズおよび複合体のサイズによって、マイクロ流体チップ内のチャネルのサイズおよび形状は決定される。例えば、５μｍのビーズは、機能化および抱合後に約７〜８μｍの流動するための空間を必要とするため、１０μｍを超えない幅の集束流動チャネルは、一度に１つのビーズのみがチャネルを通過することを可能にすると同時に、ビーズの正常な流動を可能にする。
【０１１７】
集束流れマイクロビーズが、集塊化または凝集がないように流速を維持すると同時に、１つずつ検出点を通過することを可能にするために、チャネルの構成は最適化される。構成は、集束チャネルに印加される電圧、サンプルチャネルに印加される電圧、および種々のチャネルの長さ等のいくつかの要因に依存する。
【０１１８】
ビーズの速度は、
0005680303.tif 000002
によって決定される。
【０１１９】
式中、Ｅは、電場であり、εは、誘電率であり、ζeofは、チャネル壁のゼータ電位であり、μは、流体の粘度であり、ζephは、ビーズ表面のゼータ電位である。
【０１２０】
0005680303.tif 000003
は、流動性とも呼ばれる。
【０１２１】
流動性
0005680303.tif 000004
は、バッファおよびチャネル壁の材料によって決定され、ε、ξ、μは、バッファ溶液のｐＨ、温度、および別の特性と関係を有する。上記の方程式（１）から、マイクロビーズの速度は、安定した流動を構築するために＞０でなければならず、それは、バッファを選択するための基準を設定することが示される。
【０１２２】
（サンプルウェルにおける）サンプルチャネルに対する集束チャネルの電圧比率（絶対電圧ではない）、
0005680303.tif 000005
は、
α最少≦α≦α最大    (2)
を条件とする。
【０１２３】
α最小およびα最大は、チャネルの各部分の長さに関連する。
0005680303.tif 000006
0005680303.tif 000007
であり、ここで
0005680303.tif 000008
である。
Ｌo、Ｌi、Ｌfは、それぞれ出口、入口、および集束チャネルの長さである。好ましいチップ設計における集束チャネルが、Ｌ字型を有する場合、Ｌfは、チャネルの２つのアーム、Ｌf1およびＬf2の和として定義される。
【０１２４】
理論的には、チャネル（集束またはサンプル）のうちの１つに印加される電圧に対して制限はない。方程式（１）に示すように、より高い電圧がより大きい流速をもたらすように、流速は、電圧に比例する。しかしながら、方程式（２）に示すように、電圧比率に対しては制限がある。この範囲を超えて、流動は生成されることができない。
【０１２５】
したがって、サンプル流動の集束された幅、Ｗfの比率は、方程式、
Wf/W＝（1 + 2β-2βα)/(1 + 2γα）        (3)
に従って、入口チャネルの幅に関連する。
【０１２６】
使用されるサンプルチップにおいて、Ｌi＝８ｍｍ、Ｌo＝１０ｍｍ、Ｌf1＋Ｌf2＝１８ｍｍである。したがって、Ｗ＝１００μｍのチャネルに対して、αの種々の値は、
α＝１．５：Ｗf／Ｗ＝０．１９、Ｗf＝１９μｍ
α＝１．６：Ｗf／Ｗ＝０．１４、Ｗf＝１４μｍ
α＝１．７：Ｗf／Ｗ＝０．０９、Ｗf＝９μｍ
α＝１．８：Ｗf／Ｗ＝０．０４、Ｗf＝４μｍ
であり、α最大＝１．９３、α最小＝０．５９である。
【０１２７】
上記の式は、すべてのチャネルが、縮小および拡大を有さず一直線であり、高さが、すべての分岐に対して同一であるという仮定に基づいている。仮定が間違っている場合、式は変化するが、概説された同一の原理に従う。加えて、異なる長さの組み合わせは、単に集束された流体に対して異なる幅をもたらすに過ぎないため、各分岐の長さに対して制限はない。
【０１２８】
データ分析
図８Ａ〜図８Ｃは、検出器の出力電圧の大きな変動がリアルタイムで検出事象を示す実験の間に収集される生データの１０秒の間隔を示す。これらの実験に対して、図７Ａ〜図７Ｃにおいて６０４ｄとして示されるスペクトルの標的フルオロフォア部分に対応する、緑色（５００〜５４０ｎｍ）の波長８０２ａ〜ｃを試験するために、光強度測定器および増幅器と連結したＰＩＮフォトダイオードを使用した一方で、図７Ａ〜図７Ｃにおいて６０４ａ〜ｃとして示される、スペクトルのＢＲＭ部分に対応する、黄色８０４ａ〜ｃおよび赤色チャネル８０６ａ〜ｃ（それぞれ、５５０〜５９０ｎｍ、および６００〜６５０ｎｍ）に対して、ＡＰＤを使用した。３つの検出器すべてからの出力を、データ収集カードを使用してコンピュータにリンクし、Ｌａｂｖｉｅｗソフトウェアを使用して実行した。バーコードがレーザースポットを横断する速度が、検出器によって測定されるピーク強度に反比例するため、信号分析のために、時間に対する正規化電圧ピーク値を使用した。例えば、標的抗体検出を示す緑色チャネルは、測定基準Ｇ＝∫ピークＶ（ｔ）ｄｔ／∫ピークｄｔを使用し、式中Ｖ（ｔ）は、時間関数ｔとしての電圧信号である。図９は、電圧範囲を明示するために、一連のピークの拡大図を提供する。
【０１２９】
擬陽性は、診断の検出感度限界に近づく標的分子レベルにおいて実行されているアッセイに関する、臨床的に直面する日常的な問題である。したがって、プラットフォームの検出限界を評価することは重要であり、ＨＢＶ  ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ  ＮＳＰ4、およびＨＩＶ  ｇｐ４１標的抗体に対する連続希釈感度曲線を準備し、市販のＥＬＩＳＡキットと比較した。検出アルゴリズムは、最初に、ピークに対する緑色チャネルをスキャンし、次いで、検出事象が確認される前に、適切なピークが黄色および赤色チャネルにも存在したことを確認した。検出ピークに対する値を図１０Ａ〜図１０Ｃに示す。対数曲線１０００ａ、１０００ｂ、および１０００ｃはそれぞれ、ＨＢＶ、ＨＩＶ、およびＨＣＶに対するデータに近似し、拡大図１００２ａ、１００２ｂ、および１００２ｃはそれぞれ、曲線の末端におけるさらなる詳細を示す。ＨＢｓＡｇ抗体に対しては、フェムトモル（１０-13〜１０-15Ｍ）範囲で検出感度限界を測定したが、ＮＳＰ4およびｇｐ４１に対する限界は、ピコモル単位（１０-10〜１０-12Ｍ）で測定した。
【０１３０】
必要なビーズ濃度は、単一ビーズ信号を測定するための必要性に基づき、高いビーズ濃度は、より高速の検出器およびデータ収集システムを必要とする。ビーズ間相互作用は、ビーズ間の小さい分離によって要因となり、流動に影響を及ぼす。低いビーズ濃度に対しては、統計分析のために十分な総数（現在の実験において１０００を超える）を生成するために、より時間がかかる。平均ビーズ濃度は、１５×１０6ｍ／Ｌであり、標準偏差は、示される実施例において９×１０6ｍ／Ｌであり、＞１０００の総数を得るために約１５分かかる。したがって、許容可能な濃度範囲は、１５×１０7ｍ／Ｌから１５×１０5ｍ／Ｌの間と推定され、対応する時間変化が総数収集のために必要とされる。ビーズの実際のサイズは、１００ｎｍほどの小さいものから最大で５μｍの範囲であることができる。
【０１３１】
蛍光バーコードを使用する主な利点は、それらの多重検出能力、およびそれを病原体検出に適用できる能力である。図１１Ａ〜図１１Ｄ、図１２、および図１３Ａ〜図１３Ｂは、２つ（ＨＢＶおよびＨＩＶ）および３つの（ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＩＶ）病原体の多重実験の結果を示す。最初に、緑色チャネルピークがどこに存在したかを示すことによって検出器データを分析し、次いで、正規化された値の比率Ｒ／Ｙに基づいて、ＨＢＶ、ＨＣＶ、またはＨＩＶ検出事象として分類した。図１１Ａ〜図１１Ｃは、ＨＢＶ、ＨＩＶ、およびＨＣＶからの検出事象のヒストグラム１１００ａ、１１００ｂ、１１００ｃが、それぞれどのようにして、低、中、高と明確に区別できるＲ／Ｙ比の差異を有するのかを、図１１Ｄの３つすべての比較により示す。この方法を使用することによって、同一サンプル中の異なる病原体の検出事象を同定することが可能であり、アッセイが修飾されている間に標的分子が存在するとき、この変化が結果に反映された。
【０１３２】
図１２は、図１３Ａおよび図１３Ｂに対して使用される実験の表を示す。図１３Ａは、ＨＢＶおよびＨＩＶの２つの病原体の多重実験の結果を示す。図１３Ｂは、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＩＶの３つの病原体の多重実験の結果を示す。これらの結果は、これらの３つの病原体マーカーに対する無視できる程度の交差反応性を示す。この実験に対するＨＢＶ、ＨＩＶ、およびＨＣＶ抗体の濃度は、すべて４．７４×１０−９Ｍであった。示されるエラーバーは、１つの標準偏差を表す。
【０１３３】
マイクロ流体検出システムは、分子診断学でのナノテクノロジーおよびマイクロテクノロジーの、多重感染性疾病の生物分析ツールへの成功した統合を表す。システムを特定の分子の検出または特定の抗体での使用に適合するために、システムに特定の修正を行うことができる。マイクロ流体チップを組み込むシステム全体のサイズおよび構造を調整するために、他の修正を行うことができる。例えば、ＬＥＤまたは他の放射線放出要素は、分子を励起する目的でレーザーの代わりに使用され得る。すべてが当業者に容易に明らかとはならないが、さらなる開発および改良が想到され得る。
【０１３４】
上記の方法は、量子ドットに基づくバーコードに照らして示されてきたが、該方法は、蛍光色素および他の種類の発光粒子にも同様に適用できる。
【０１３５】
本発明のいくつかの具体的な実施形態を例示的に以下に列挙する。
（１）生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在を試験するために、バッファとともに使用するための試験システムであって、
（ａ）第１の組の検出分子であって、
各々、１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）フルオロフォアに対して固定化された１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）を含み、各々の前記ＢＲＭは、前記試験サンプル中に存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は１つ以上の複合体型を含み、各々は前記標的型のうちの特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応する、第１の組の検出分子と、
（ｂ）マイクロ流体チップであって、
（ｉ）マイクロ流体チップ内の１つ以上の細長いサンプルチャンネルであって、前記複合体の流路が通過することを可能にするようにサイズ決定された、前記細長いサンプルチャネルと、
（ｉｉ）バッファの動作可能な流路が通過するための、マイクロ流体チップ内の１つ以上の流れ集束チャネルであって、前記１つ以上の流れ集束チャネルは、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続し、前記流れ集束チャネルから出る前記バッファが前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて、縦一列の流れの前記複合体を動作可能に方向付ける、１つ以上の流れ集束チャネルと、
を画定するように成形されたチップ基板部を備える、マイクロ流体チップと、
（ｃ）前記縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに沿った照射位置において、電磁波（ＥＭＦ）放射線を動作可能に送達する照射装置であって、前記複合体は、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に蛍光を放出し、前記複合体の前記蛍光は、各々前記複合体型の１つに対する独特の蛍光スペクトルを含む、照射装置と、
（ｄ）前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する検出装置であって、各々の前記複合体型の１つの前記弁別的な蛍光スペクトルに関して監視することによって、前記複合体の存在を同定する、検出装置と、
を備え、
それによって、前記試験サンプル中の前記標的分子の存在を同定する、
試験システム。
（２）各々の前記検出分子は、前記ＢＲＭおよび前記ＢＲＭフルオロフォアに対して固定化された、かつ前記ＢＲＭと前記ＢＲＭフルオロフォアとの間に実質的に配置された、マイクロビーズをさらに含み、前記ＢＲＭフルオロフォアは、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に、前記弁別的な蛍光スペクトルの前記蛍光の少なくともＢＲＭ部分を放出する、（１）に記載の試験システム。
（３）ＢＲＭフルオロフォアは、１つ以上の量子ドット型の１つ以上の量子ドットを含み、前記量子ドットはともに、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に、前記弁別的な蛍光スペクトルの前記蛍光の少なくとも前記ＢＲＭ部分を放出する、（２）に記載の試験システム。
（４）量子ドットが前記量子ドット型のうちの２つ以上を含む、（３）に記載の試験システム。
（５）ＢＲＭフルオロフォアは、１つ以上の蛍光色素型の１つ以上の蛍光色素を含み、前記蛍光色素はＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の少なくともＢＲＭ部分を放出する、（２）に記載の試験システム。
（６）複合体が約１０マイクロメートル（μｍ）未満のサイズである、（１）から（５）のいずれかに記載の試験システム。
（７）複合体が約５μｍ未満のサイズである、（６）に記載の試験システム。
（８）複合体が約１μｍ未満のサイズである、（７）に記載の試験システム。
（９）各々の複合体が標的分子のそれぞれ１つに結合した標的マーカーフルオロフォアをさらに含み、前記標的マーカーフルオロフォアがＥＭＦ放射線の吸収後に、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分を放出する、（１）から（８）のいずれか１項に記載の試験システム。
（１０）各々の検出分子が、前記ＢＲＭおよび前記ＢＲＭフルオロフォアに対して固定化された、かつ前記ＢＲＭと前記ＢＲＭフルオロフォアとの間に実質的に配置されたマイクロビーズをさらに含み、各々の前記複合体は、前記標的分子のそれぞれに結合した標的マーカーフルオロフォアをさらに含み、各々の前記複合体に対して、ＥＭＦ放射線の吸収後に、ＢＲＭフルオロフォアが弁別的な蛍光スペクトルの蛍光のＢＲＭ部分を放出し、前記標的マーカーフルオロフォアは、弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分を放出し、これによって前記ＢＲＭフルオロフォアおよび前記標的マーカーフルオロフォアがともに、前記ＥＭＦ放射線の吸収後に前記弁別的な蛍光スペクトルの蛍光を放出する、（１）に記載の試験システム。
（１１）検出装置は、前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する、少なくとも２つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）を備え、第１の前記ＡＰＤの１つは、前記各々の複合体に対する前記独特の蛍光スペクトルの前記蛍光の前記ＢＲＭ部分の存在を受信および同定するように適合され、第２の前記ＡＰＤの１つは、前記各々の複合体に対する前記独特の蛍光スペクトルの前記蛍光の前記標的部分の存在を受信および同定するように適合される、（１０）に記載の試験システム。
（１２）標的部分が各々の複合体に対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の前記ＢＲＭ部分よりも低い強度を有し、前記第２のＡＰＤの１つが前記第１のＡＰＤの１つを上回る感度を有する、（１１）に記載の試験システム。
（１３）生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対して試験するための試験システムであって、
バッファと、
第１の組の検出分子であって、各々の前記検出分子は、１つ以上のＢＲＭフルオロフォアに対して固定化された１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）を備え、各々の前記ＢＲＭは、前記試験サンプル中に存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように、前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は、１つ以上の複合体型を含み、各々は、前記標的型のうちのその特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応する、前記検出分子は電磁波（ＥＭＦ）放射線を吸収後に蛍光を放出する第１の組の検出分子とともに使用され、
（ａ）マイクロ流体チップであって、
（ｉ）試験分子が通過することを可能にするようにサイズ決定された１つ以上の細長いサンプルチャネルと、
（ｉｉ）バッファの動作可能な流路が通過するための１つ以上の流れ集束チャネルであって、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続し、前記流れ集束チャネルから出る前記バッファが前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて縦一列の流れの前記複合体を動作可能に方向付ける、１つ以上の流れ集束チャネルと、
を画定するように成形されたチップ基板部を備える、マイクロ流体チップと、
（ｂ）前記縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに沿った照射位置において前記ＥＭＦ放射線を動作可能に送達する照射装置であって、前記複合体の蛍光が各々前記複合体型の１つに対する弁別的な蛍光スペクトルを含む、照射装置と、
（ｃ）前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する検出装置であって、各々の前記複合体型の１つの前記弁別的な蛍光スペクトルについて監視することによって、前記複合体の存在を同定する、検出装置と、
を備え、
それによって、前記試験サンプル中の前記標的分子の存在を同定する、試験システム。
（１４）サンプルチャネルのうちの少なくとも１つがチップ基板部の１つ以上の細長いチャネル壁によって画定され、前記チャネル壁は、２つの対向する側面チャネル部を備え、流れ集束チャネルから出るバッファが、少なくとも前記２つの対向する側面チャネル部から離間した関係にあるサンプル経路に沿って、前記縦一列の流れの複合体を動作可能に方向付ける、（１）から（１０）および（１３）のいずれかに記載の試験システム。
（１５）マイクロ流体チップが、チップ基板部を下に置くスライドガラスをさらに備え、前記スライドガラスは、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つの底部チャネル部を画定し、前記チャネル壁が頂部チャネル部をさらに備え、前記サンプル経路が、動作可能に、前記底部チャネル部および前記頂部チャネル部の両方から前記離間した関係におかれる、（１４）に記載の試験システム。
（１６）サンプルチャネルのうちの少なくとも１つがサンプル集束チャネルを備え、前記サンプルチャネルは、前記サンプル集束チャネルと流体連通しているサンプル供給チャネルをさらに備え、前記サンプル集束チャネルは前記流れ集束チャネルの下流にあり、前記流れ集束チャネルから出るバッファおよび縦一列の流れの複合体が、前記サンプル集束チャネルを通じて動作可能に流動する、（１）から（１０）および（１３）から（１５）のいずれかに記載の試験システム。
（１７）サンプル集束チャネルにおけるバッファのバッファ流速が前記縦一列の流れにおける前記複合体の試験流速よりも高い、（１６）に記載の試験システム。
（１８）流れ集束チャネルが少なくとも２つの流れ集束チャネルを備え、前記流れ集束チャネルは前記１つ以上の細長いサンプルチャネルの上流で前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続し、前記２つの流れ集束チャネルは、前記細長いサンプルチャネルのうちの少なくとも１つの反対側から、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、（１）から（１０）および（１３）から（１７）のいずれかに記載の試験システム。
（１９）２つの流れ集束チャネルが、共通交差部において前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、（１８）に記載の試験システム。
（２０）流れ集束チャネルから出る前記バッファが、共通交差部の約１０マイクロメートル（μｍ）未満下流において、複合体を縦一列の流れに動作可能に集束する、（１９）に記載の試験システム。
（２１）各々の１つ以上の流れ集束チャネルが、約９０度の接続角度で前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、（１）から（１０）および（１３）から（２０）のいずれかに記載の試験システム。
（２２）各々の１つ以上の流れ集束チャネルが、約４５度の接続角度で前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、（１）から（１０）および（１３）から（２０）のいずれかに記載の試験システム。
（２３）チップ基板部がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から製造される、（１）から（１０）および（１３）から（２２）のいずれかに記載の試験システム。
（２４）サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つを通じた前記複合体の流路が動電学的流動によって促進される、（１）から（１０）および（１３）から（２３）のいずれかに記載の試験システム。
（２５）流れ集束チャネルがサンプルチャネルと流体連通し、チップ基板部が前記流れ集束チャネルの各々１つずつのバッファ開始点に接続したバッファウェルと、前記流れ集束チャネルの上流にある、サンプル開始点に接続したサンプルウェルと、前記流れ集束チャネルの下流にある前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つの終点に接続した末端ウェルとを画定するようにさらに成形され、前記サンプルウェルに動作可能に配設されるサンプルウェル電極と、各前記バッファウェルに動作可能に配設されるバッファウェル電極と、前記末端ウェルに動作可能に配設される末端ウェル電極とをさらに備え、前記サンプルウェル電極は第１の極性の第１の電位を動作可能に供給され、前記末端ウェル電極は反対の第２の極性の第２の電位を動作可能に供給され、各前記バッファウェル電極は前記第１の極性の第３の電位を動作可能に供給される、（２４）に記載の試験システム。
（２６）第３の電位が第１の電位よりも高い、（２５）に記載の試験システム。
（２７）第１の電位に対する第３の電位の比率が約１．８：１である、（２６）に記載の試験システム。
（２８）縦一列の流れにおける複合体の試験流速が毎分少なくとも約３０個の複合体である、（１）から（１０）、（１３）から（１６）、および（１８）から（２７）のいずれかに記載の試験システム。
（２９）試験流速は、毎分少なくとも約６０個の複合体である、（２８）に記載の試験システム。
（３０）試験流速が毎分約５００個の複合体である、（２９）に記載の試験システム。
（３１）生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対して試験するための試験システムであって、
第１の組の検出分子であって、各々、１つ以上のＢＲＭフルオロフォアに対して固定化された１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）を含み、各々前記ＢＲＭは、前記試験サンプル中に存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように、前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は、１つ以上の複合体型を含み、各々が前記標的型のうちの特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応し、前記複合体は、電磁波（ＥＭＦ）放射線の吸収後に蛍光を放出する、第１の組の検出分子と、
前記複合体の流路が通過することを可能にするようにサイズ決定された１つ以上の細長いサンプルチャネルを画定するように成形されるチップ基板部を含み、縦一列の流れの前記複合体が前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通過するマイクロ流体チップと、
ともに使用され、
（ａ）前記縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに沿った照射位置において、前記ＥＭＦ放射線を動作可能に送達する照射装置であって、前記複合体は前記ＥＭＦ放射線の吸収後に蛍光を放出し、前記複合体の前記蛍光は、前記複合体型のそれぞれに対する弁別的な蛍光スペクトルを含む、照射装置と、
（ｂ）前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する検出装置であって、前記複合体型のそれぞれの前記弁別的な蛍光スペクトルについて監視することによって、前記複合体の存在を同定する、検出装置と、
を備え、
それによって、前記試験サンプル中の前記標的分子の存在を同定する、
試験システム。
（３２）照射装置が、縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、ＥＭＦ放射線を動作可能に放出する発光ダイオード（ＬＥＤ）を備える、（１）から（１０）および（１３）から（３１）のいずれかに記載の試験システム。
（３３）照射装置が、縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、ＥＭＦ放射線を動作可能に放出するレーザーを備える、（１）から（１０）および（１３）から（３１）のいずれかに記載の試験システム。
（３４）レーザーが約２ミリワット（mＷ）から約５０ミリワット（mＷ）の間の動作電力を有する、（３３）に記載の試験システム。
（３５）レーザーの動作電力が約２０ミリワット（mＷ）から約２５ミリワット（mＷ）の間である、（３４）に記載の試験システム。
（３６）照射装置によって動作可能に送達される前記ＥＭＦ放射線が、約４８８ｎｍのＥＭＦ波長を有する、（１）から（１０）および（１３）から（３５）のいずれかに記載の試験システム。
（３７）検出装置が、縦一列の流れを複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する３つ以上のアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）を備え、各々の前記ＡＰＤが前記複合体によって放出される前記蛍光における異なる波長範囲の存在を受信および同定するように適合される、（１）から（１０）および（１３）から（３６）のいずれかに記載の試験システム。
（３８）第１の前記ＡＰＤの１つが緑色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、第２の前記ＡＰＤの１つが黄色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、第３の前記ＡＰＤの１つは、赤色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される、（３７）に記載の試験システム。
（３９）第１の前記ＡＰＤの１つが緑色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、第２の前記ＡＰＤの１つが黄色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、第３の前記ＡＰＤの１つがオレンジ色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、第４の前記ＡＰＤの１つが赤色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される、（３７）に記載の試験システム。
（４０）第１の前記ＡＰＤの１つが青色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、第２の前記ＡＰＤの１つが緑色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、第３の前記ＡＰＤの１つが黄色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、第４の前記ＡＰＤの１つが赤色の波長範囲の存在を受信および同定するように適合される、（３７）に記載の試験システム。
（４１）検出装置が、複合体によって放出される前記蛍光に対して前記縦一列の流れを監視する電荷結合素子を備える、（１）から（１０）および（１３）から（３６）のいずれかに記載の試験システム。
（４２）検出装置が、縦一列の流れを複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する、少なくとも２つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）を備え、各々の前記ＡＰＤは、前記複合体によって放出される前記蛍光において異なる波長範囲の存在を受信および同定するように適合され、前記検出装置が、前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する電荷結合素子をさらに備え、前記検出装置が、前記ＡＰＤまたは前記電荷結合素子のいずれかを使用した前記縦一列の流れの監視を切り替えるための切り替え手段をさらに備える、（１）から（１０）および（１３）から（３６）のいずれかに記載の試験システム。
（４３）検出装置が、縦一列の流れを複合体によって放出される前記蛍光に関して監視する、少なくとも１つのトリップセンサを備え、各前記トリップセンサは、前記蛍光の強度に対応するデジタル信号を生成する、（１）から（１０）および（１３）から（３６）のいずれかに記載の試験システム。
（４４）各トリップセンサが、蛍光の強度が最小強度を超えた場合のみ前記デジタル信号を生成し、各前記トリップセンサが異なる所定の前記最小強度を有する、（４３）に記載の試験システム。
（４５）光ファイバーケーブルをさらに備え、前記光ファイバーケーブルが、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに沿って、前記照射位置の実質的に近傍から前記検出装置に前記蛍光を動作可能に送達する、（１）から（４４）のいずれかに記載の試験システム。
（４６）照射装置および検出装置を包納する筐体をさらに備え、前記筐体は、可搬用および臨床現場診断用途のためにサイズ決定および適合される、（１）から（４５）のいずれか１項に記載の試験システム。
（４７）筐体が携帯型用途のためにサイズ決定および適合される、（４６）に記載の試験システム。
（４８）生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対して試験するための試験システムであって、
バッファと、
第１の組の検出分子であって、各々、１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）フルオロフォアに対して固定化された１つ以上のＢＲＭを備え、前記ＢＲＭのそれぞれは、前記試験サンプル中に存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように、前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は、１つ以上の複合体型を含み、各々、前記標的型のうちのその特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応する、第１の組の検出分子と、
前記複合体による吸収のために電磁波（ＥＭＦ）放射線を送達することができる照射および検出装置であって、前記複合体が前記ＥＭＦ放射線の吸収後に蛍光を放出し、前記複合体の前記蛍光が各々前記複合体型の１つに対する弁別的な蛍光スペクトルを含み、各々の前記複合体型に対する前記弁別的なスペクトルの存在によって前記複合体を監視および同定することができる照射および検出装置と、
ともに使用され、
（ａ）前記複合体の流路が通過することを可能にするようにサイズ決定された、その中の１つ以上の細長いサンプルチャネルと、
（ｂ）前記バッファの流路が動作可能に通過するための１つ以上の流れ集束チャネルであって、前記１つ以上の流れ集束チャネルは前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続し、前記流れ集束チャネルから出る前記バッファが前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて、縦一列の流れの前記複合体を動作可能に方向付ける、１つ以上の流れ集束チャネルと、
を画定するように成形されたチップ基板部を備える、マイクロ流体チップを備え、
前記マイクロ流体チップは、前記縦一列の流れにおける前記複合体による吸収のために、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに沿った照射位置において、前記照射および検出装置から前記ＥＭＦ放射線を動作可能に受信するように適合され、
前記マイクロ流体チップは、前記照射および検出装置が、前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される前記蛍光に関して監視することを可能にするように適合され、
それによって、前記複合体が前記複合体型のそれぞれに対する前記弁別的な蛍光スペクトルの存在によって動作可能に同定可能であり、前記試験サンプル中の前記標的分子の存在が、前記試験システムによって動作可能に同定可能である、
試験システム。
（４９）サンプルチャネルの少なくとも１つが前記チップ基板部の１つ以上の細長いチャネル壁によって画定され、前記チャネル壁が２つの対向する側面チャネル部を備え、前記流れ集束チャネルから出る前記バッファが少なくとも前記２つの対向する側面チャネル部から離間した関係にあるサンプル経路に沿って前記縦一列の流れの前記複合体を動作可能に方向付ける、（４８）に記載の試験システム。
（５０）マイクロ流体チップが前記チップ基板部の下に置くスライドガラスをさらに備え、前記スライドガラスは、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つの底部チャネル部を画定し記チャネル壁は、頂部チャネル部をさらに備え、サンプル経路が動作可能に前記底部チャネル部および前記頂部チャネル部の両方から離間した関係にされる、（４９）に記載の試験システム。
（５１）サンプルチャネルのうちの少なくとも１つがサンプル集束チャネルを備え、前記サンプルチャネルは前記サンプル集束チャネルと流体連通しているサンプル供給チャネルをさらに備え、前記サンプル集束チャネルは前記流れ集束チャネルの下流にあり、前記流れ集束チャネルから出るバッファおよび縦一列の流れの複合体がサンプル集束チャネルを通じて動作可能に流動する、（４８）から（５０）のいずれか１項に記載の試験システム。
（５２）流れ集束チャネルが少なくとも２つの流れ集束チャネルを備え、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルのうちの少なくとも１つの細長いサンプルチャネルの上流で前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続し、前記２つの流れ集束チャネルが、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つの反対側から、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、（４８）から（５１）のいずれかに記載の試験システム。
（５３）前記２つの流れ集束チャネルが共通交差部において前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、（５２）に記載の試験システム。
（５４）流れ集束チャネルから出るバッファが、前記共通交差部の下流約１０マイクロメートル（μｍ）未満において、複合体を縦一列の流れに動作可能に集束する、（５３）に記載の試験システム。
（５５）１つ以上の流れ集束チャネルの各々が約９０度の接続角度で前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、（４８）から（５４）のいずれかに記載の試験システム。
（５６）１つ以上の流れ集束チャネルの各々が約４５度の接続角度で前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、（４８）から（５４）のいずれかに記載の試験システム。
（５７）チップ基板部がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から製造される、（４８）から（５６）のいずれかに記載の試験システム。
（５８）サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じた複合体の流路が動電学的流動によって促進される、（４８）から（５７）のいずれかに記載の試験システム。
（５９）流れ集束チャネルがサンプルチャネルと流体連通し、チップ基板部が流れ集束チャネルのそれぞれのバッファ開始点に接続したバッファウェルと、前記流れ集束チャネルの上流にある、サンプル開始点に接続したサンプルウェルと、前記流れ集束チャネルの下流にある前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つの終点に接続した末端ウェルとを画定するようにさらに成形され、試験システムが、前記サンプルウェルに動作可能に配設されるサンプルウェル電極と、各前記バッファウェルに動作可能に配設されるバッファウェル電極と、前記末端ウェルに動作可能に配設される末端ウェル電極とをさらに備え、前記サンプルウェル電極は第１の極性の第１の電位を動作可能に供給され、前記末端ウェル電極は反対の第２の極性の第２の電位を動作可能に供給され、各前記バッファウェル電極は前記第１の極性の第３の電位を動作可能に供給される、（５８）に記載の試験システム。
（６０）第３の電位が第１の電位よりも高い、（５９）に記載の試験システム。
（６１）第１の電位に対する前記第３の電位の比率が約１．８：１である、（６０）に記載の試験システム。
（６２）縦一列の流れにおける複合体の試験流速が毎分少なくとも約３０個の複合体である、（６１）に記載の試験システム。
（６３）試験流速が毎分少なくとも約６０個の複合体である、（６２）に記載の試験システム。
（６４）試験流速が毎分約５００個の複合体である、（６３）に記載の試験システム。
（６５）サンプル集束チャネルにおけるバッファのバッファ流速が縦一列の流れにおける複合体の試験流速よりも高い、（１）から（３０）および（４８）から（６１）のいずれかに記載の試験システム。
（６６）血液、尿、唾液、および血清から成る群から選択される１つ以上の生物学的試験サンプルでの使用に特に適合される、（１）から（６５）のいずれかに記載の試験システム。
（６７）細菌性疾病状態、ウイルス性疾病状態、真菌性疾病状態、およびベクター誘導性疾病状態から成る群から選択される疾病状態の診断のための、（１）から（６６）のいずれかに記載の試験システムの使用。
（６８）１つ以上の感染性疾病の診断のための、（１）から（６６）のいずれかに記載の試験システムの使用。
（６９）ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶから成る群から選択される症状の診断のための、（１）から（６６）のいずれかに記載の試験システムの使用。
（７０）ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶから成る群から選択される症状のうちの２つ以上の同時診断のための、（１）から（６６）のいずれかに記載の試験システムの使用。
（７１）生物学的試験サンプル中の１つ以上の標的型の標的分子の存在に対する試験を容易にする方法であって、
マイクロ流体チップのチップ基板部に形成される１つ以上の細長いサンプルチャネルを通じて検出分子を通過させる、サンプル流動ステップであって、
前記検出分子のそれぞれは、１つ以上のＢＲＭフルオロフォアに対して固定化された１つ以上の生体認識分子（ＢＲＭ）を含み、各々の前記ＢＲＭのそれぞれは、前記試験サンプル中に存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の複合体を形成するように、前記標的型のうちの１つに特異的であり、前記複合体は、１つ以上の複合体型を含み、各々、前記標的型のうちのその特定の１つと結合している前記検出分子のうちの異なる１つに対応する、サンプル流動ステップと、
前記マイクロ流体チップの前記チップ基板部に形成される１つ以上の流れ集束チャネルを通じてバッファを通過させる、バッファ流動ステップであって、前記流れ集束チャネルは、前記１つ以上の細長いサンプルチャネルに接続する、バッファ流動ステップと、
前記バッファ流動ステップ後に、前記流れ集束チャネルから前記１つ以上の細長いサンプルチャネルへ前記バッファを通過させることによって、前記サンプルチャネルのうちの少なくとも１つを通じて、縦一列の流れの前記複合体を方向付ける、サンプル集束ステップと、
を含む、方法。
（７２）サンプル流動ステップの前に、
ＢＲＭを試験サンプル中に導入することによって複合体を形成し、前記試験サンプル中に存在する場合、前記ＢＲＭおよび前記標的分子の前記複合体を形成する、複合体形成ステップをさらに含む、（７１）に記載の方法。
（７３）複合体形成ステップにおいて、複合体が約１０マイクロメートル（μｍ）未満のサイズである、（７２）に記載の方法。
（７４）複合体形成ステップにおいて、複合体が約５マイクロメートル（μｍ）未満のサイズである、（７３）に記載の方法。
（７５）複合体形成ステップにおいて、複合体が約１マイクロメートル（μｍ）未満のサイズである、（７４）に記載の方法。
（７６）複合体形成ステップにおいて、標的型のうちの１つ以上と結合可能な標的マーカーフルオロフォアが導入され、前記標的マーカーフルオロフォアが、前記複合体に対して固定化される、（７２）に記載の方法。
（７７）サンプル集束ステップにおいて、縦一列の流れの前記複合体がサンプルチャネルのうちの少なくとも１つの少なくとも２つの対向する側面チャネル部から離間した関係でサンプル経路に沿って方向付けられる、（７１）から（７６）のいずれかに記載の方法。
（７８）サンプル集束ステップにおいて、縦一列の流れの前記複合体がサンプルチャネルのうちの少なくとも１つの少なくとも頂部および底部チャネル部から離間した関係にあるサンプル経路に沿って方向付けられる、（７１）から（７６）のいずれかに記載の方法。
（７９）サンプル集束ステップにおいて、バッファが縦一列の流れの複合体の試験流速よりも高いバッファ流速でサンプルチャネルのうちの少なくとも１つに流入する、（７１）から（７８）のいずれかに記載の方法。
（８０）サンプル集束ステップにおいて、前記流れ集束チャネルのうちの少なくとも２つが、サンプルチャネルのうちの少なくとも１つの上流において、その反対側から前記サンプルチャネルに接続する、（７１）から（７９）のいずれかに記載の方法。
（８１）サンプル集束ステップにおいて、２つの流れ集束チャネルが共通交差部において前記サンプルチャネルに接続する、（８０）に記載の方法。
（８２）サンプル集束ステップにおいて、それぞれ１つ以上の流れ集束チャネルが約９０度の接続角度で前記サンプルチャネルに接続する（７１）から（７９）のいずれかに記載の方法。
（８３）サンプル集束ステップにおいて、前記それぞれ１つ以上の流れ集束チャネルが約４５度の接続角度で前記サンプルチャネルに接続する、（７１）から（７９）のいずれかに記載の方法。
（８４）サンプル集束ステップにおいて、前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つを通じた前記縦一列の流れの複合体の流路が動電学的流動によって促進される、（７１）から（７９）のいずれかに記載の方法。
（８５）サンプル集束ステップの前に、（ｉ）前記流れ集束チャネルの上流において、前記サンプルチャネルに第１の極性の第１の電位と、（ｉｉ）前記流れ集束チャネルの下流において前記サンプルチャネルのうちの前記少なくとも１つに反対の第２の極性の第２の電位と、（ｉｉｉ）前記流れ集束チャネルのそれぞれに前記第１の極性の第３の電位とを供給する、動電学的ステップをさらに含む、（８４）に記載の方法。
（８６）動電学的ステップにおいて、第３の電位が第１の電位よりも高い、（８５）に記載の方法。
（８７）動電学的ステップにおいて、第１の電位に対する第３の電位の比率が約１．８：１である、（８６）に記載の方法。
（８８）サンプル集束ステップ後に、縦一列の流れにおける前記複合体に電磁波（ＥＭＦ）放射線を送達する、照射ステップと、
前記照射ステップ後に、前記縦一列の流れを前記複合体によって放出される蛍光に関して監視する、蛍光検出ステップであって、前記複合体のそれぞれが前記ＥＭＦ放射線の吸収後に前記複合体型のそれぞれに対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光を放出する、蛍光検出ステップと、
前記試験サンプル中の前記標的分子の存在を同定するように、前記照射ステップ後に、前記複合体型のそれぞれの前記弁別的な蛍光スペクトルについて監視する、複合体同定ステップと、
をさらに含む、（７２）に記載の方法。
（８９）複合体形成ステップにおいて、標的マーカーフルオロフォアは、標的分子のそれぞれと結合し、蛍光検出ステップにおいて、前記標的マーカーフルオロフォアが、複合体型のそれぞれに対する異なる蛍光スペクトルの標的部分を放出し、前記ＢＲＭフルオロフォアが、前記複合体型のそれぞれに対する異なる蛍光スペクトルのＢＲＭ部分を放出する、（８８）に記載の方法。
（９０）蛍光検出ステップにおいて、複合体によって放出される蛍光が少なくとも２つのアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）によって受信され、第１の前記ＡＰＤの１つが各々の複合体に対する異なる蛍光スペクトルの蛍光のＢＲＭ部分の存在を受信および同定し、第２のＡＰＤの１つが各々の複合体に対する弁別的な蛍光スペクトルの蛍光の標的部分の存在を受信および同定する、（８９）に記載の方法。
（９１）照射ステップにおいて、約２ミリワット（mＷ）から約５０ミリワット（mＷ）の間の動作電力を有するレーザーが、前記縦一列の流れにおける前記複合体に前記ＥＭＦ放射線を送達する、（８８）から（９０）のいずれかに記載の方法。
（９２）照射ステップにおいて、動作電力が約２０ミリワット（mＷ）から約２５ミリワット（mＷ）の間である、（９１）に記載の方法。
（９３）照射ステップにおいて、ＥＭＦ放射線が約４８８ｎｍのＥＭＦ波長を有する、（８８）から（９２）のいずれかに記載の方法。
（９４）蛍光検出ステップにおいて、複合体によって放出される前記蛍光が電荷結合素子によって受信される、（８８）から（９３）のいずれかに記載の方法。
（９５）蛍光検出ステップにおいて、複合体によって放出される前記蛍光が電荷結合素子および１つ以上のアバランシェ光検出器（ＡＰＤ）のうちの少なくとも１つによって選択的に受信される、（８８）記載の方法。
これで、本発明の現時点で好適な実施形態の説明を終了する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0005680303.tif 000010
【図１Ｃ】
0005680303.tif 000011
【図２Ａ】
0005680303.tif 000012
【図２Ｂ】
0005680303.tif 000013
【図２Ｃ】
0005680303.tif 000014
【図３Ａ】
0005680303.tif 000015
【図３Ｂ】
0005680303.tif 000016
【図３Ｃ】
0005680303.tif 000017
【図４Ａ】
0005680303.tif 000018
【図４Ｂ】
0005680303.tif 000019
【図４Ｃ】
0005680303.tif 000020
【図４Ｄ】
0005680303.tif 000021
【図４Ｅ】
0005680303.tif 000022
【図４Ｆ】
0005680303.tif 000023
【図４Ｇ】
0005680303.tif 000024
【図５Ａ】
0005680303.tif 000025
【図５Ｂ】
0005680303.tif 000026
【図６Ａ】
0005680303.tif 000027
【図６Ｂ】
0005680303.tif 000028
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0005680303.tif 000030
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
0005680303.tif 000032
【図８Ｂ】
0005680303.tif 000033
【図８Ｃ】
0005680303.tif 000034
【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
0005680303.tif 000038
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
0005680303.tif 000043
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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