(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンにおける上記カルボキシル基を活性エステル化させた後、上記チロキシンとアルブミンとを反応させて、チロキシンとアルブミンとの結合体を調製する工程（ａ）；及び、
上記のアルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンが溶解し、かつアルブミンが沈殿しない酸性の水性混合溶媒を用いて、前記結合体を精製する工程（ｂ）
を含む、チロキシンとアルブミンとの結合体を製造する方法であって、
工程（ｂ）において、工程（a）で得られた反応産物を前記水性混合溶媒中で透析することにより、前記結合体を精製し、
前記酸性の水性混合溶媒が、水、酸、及び有機溶媒から構成され、酸がトリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸、酢酸又はトリクロロ酢酸であり、有機溶媒がアセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド又はメタノールであり、水と有機溶媒との比率は３０：７０〜７０：３０であり、水性混合溶媒中の酸の濃度は０．００１〜５重量％であり、前記酸性の水性混合溶媒のｐＨは１〜３である、上記の方法。
【請求項２】
前記水性混合溶媒が、水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）を、中性又は塩基性の条件下で行う、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロキシンとアルブミンとの結合体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロキシン（Ｔ４）とは、甲状腺から分泌される甲状腺ホルモンの一種であり、下記の構造式で表される。一般に、チロキシン（Ｔ４）は、全身の細胞に作用して細胞の代謝率を上昇させる働きを有する。甲状腺ホルモンとしては、チロキシンのほか、トリヨードチロニン（Ｔ３）が知られるが、血中を循環する甲状腺ホルモンのほとんどはチロキシン（Ｔ４）である。
【０００３】
【化１】
0005713602.tif 000002
【０００４】
チロキシンと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）との結合体（以下、Ｔ４−ＢＳＡ）は、チロキシン抗体を作成するためのポリハプテン等として利用されている。また、Ｔ４−ＢＳＡはＴ４の競合アッセイ等において応用される。本発明者らは、Ｔ４の競合アッセイ等において、Ｔ４−ＢＳＡの性能は、Ｔ４のＢＳＡへの標識率に依存するものではなく、Ｔ４−ＢＳＡの精製純度が高いことに依存することを示す結果を得ている。しかしながら、Ｔ４−ＢＳＡの製造の際に、過剰にＴ４誘導体を使用するため、未反応のＴ４誘導体を除去することは、水系の溶媒を用いた透析やゲル濾過等の従来方法では限界がある。
【０００５】
これまで、指示薬成分に連結されたハプテンを使用するイムノアッセイにおけるハプテントレーサーの不安定性およびその非特定的結合による分析結果への悪影響を排除する技術として、一方では直接またはスペーサー基を介して指示薬成分に連結するハプテンを含有し、他方では特異的に指示薬成分と結合可能な抗体を含有するハプテントレーサー複合体が知られている（特許文献１参照）。該複合体の製造方法では、指示薬成分に対する抗体を、指示薬成分に連結されたハプテンと水溶液中で混合し、指示薬成分に連結されたハプテンの溶解性を改良するために、該水溶液中にアセトニトリル等の有機溶媒が添加され得る。
【０００６】
しかしながら、これまで、Ｔ４−ＢＳＡの精製するために、アセトニトリル等の有機溶媒を用いる技術は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−２３３８１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、より精製度の高いチロキシンとアルブミンとの結合体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、所定の酸性の水性混合溶媒を用いて、チロキシンとアルブミンとの結合体を精製すると、未反応のチロキシン誘導体をより効率的に除去できることを発見した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
（１）  アルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンにおける上記カルボキシル基を活性エステル化させた後、上記チロキシンとアルブミンとを反応させて、チロキシンとアルブミンとの結合体を調製する工程（ａ）；及び、
上記のアルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンが溶解し、かつアルブミンが沈殿しない酸性の水性混合溶媒を用いて、前記結合体を精製する工程（ｂ）
を含む、チロキシンとアルブミンとの結合体を製造する方法。
（２）  工程（ｂ）において、未反応のアルブミンと結合するためのカルボキシル基を有する未反応のチロキシンを前記水性混合溶媒に溶出させることにより、前記結合体を精製する、（１）に記載の方法。
（３）  工程（ｂ）において、工程（a）で得られた反応産物を前記水性混合溶媒中で透析することにより、前記結合体を精製する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  工程（ｂ）において、ゲル濾過法により前記結合体を精製する、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）  前記水性混合溶媒が、水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混合物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）  工程（ａ）を、中性又は塩基性の条件下で行う、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）  （１）〜（６）のいずれかに記載の方法により得られる、チロキシンとアルブミンとの結合体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の製造方法によれば、より純度の高いチロキシンとアルブミンとの結合体を製造することが可能である。本発明により製造した結合体は、ＥＬＩＺＡ、競合アッセイ等のアプリケーションにおいて、より高いシグナル感度を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例における蛍光粒子法の評価結果を示す図である。
【図２】実施例における蛍光粒子法の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の製造方法は、アルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンにおける上記カルボキシル基を活性エステル化させた後、上記チロキシンとアルブミンとを反応させて、チロキシンとアルブミンとの結合体を調製する工程（ａ）；及び、上記のアルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンが溶解し、かつアルブミンが沈殿しない酸性の水性混合溶媒を用いて、前記結合体を精製する工程（ｂ）を含むことを特徴とする。
本発明の酸性の水性混合溶媒において、「アルブミンが沈殿しない」とは、言い換えると、「アルブミンが溶解又は懸濁する」ことを意味する。
【００１４】
本発明において、チロキシンとアルブミンとの結合体を調製するために用いることができる、アルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシン（以下、チロキシン誘導体と称することがある）の構造は、アルブミンと結合体を形成し得る限り、特に限定されるものではなく、種々の修飾を受けたチロキシンを含む。例えば、カルボキシル基を予めエステル化したチロキシンのアミノ基に、末端がカルボキシル基となるリンカーを導入して得られる誘導体を用いることができる。リンカー部分は、例えば、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、低級アルキレンから選ばれる基の組合せであってもよい。このようなチロキシン誘導体のカルボキシル基末端を活性エステル化し、アルブミンのアミノ基と結合させることにより、チロキシンとアルブミンとの結合体を調製することができる。チロキシン誘導体のカルボキシル基を活性エステル化するためには、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）等を用いることができる。
なお、本明細書で言うチロキシンとアルブミンとの結合体とは、好ましくは、チロキシンとアルブミンとが共有結合により結合している結合体である。
【００１５】
本発明のアルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンは、具体的には、下記一般式（１）で表されることが好ましい。
【化２】
0005713602.tif 000003
［式中、Ｘは、低級アルキル基、好ましくは、メチル基又はエチル基を表し；Ｌはリンカーを示す。］
Ｌが示すリンカーは好ましくは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、及び低級アルキレン（好ましくは、炭素数１〜４のアルキレン）から選ばれる基の組合せからなる。
上記一般式（１）で表される化合物のカルボキシル基を活性エステル化した後、該化合物とアルブミンとを反応させて、本発明のチロキシンとアルブミンとの結合体を調製することができる。
【００１６】
本発明において用いられるアルブミンとしては、卵アルブミン、血清アルブミン、乳アルブミンが挙げられる。好ましくは血清アルブミンが用いられ、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、マウス血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン等が市販品として入手可能であり、より好ましくは牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が用いられる。
【００１７】
本発明において、チロキシンとアルブミンとの結合体の調製は、特に限定させるものではないが、チロキシン誘導体のカルボキシル基を活性エステル化した後、例えば、過剰量の該チロキシン誘導体と、アルブミンとをリン酸緩衝液中に溶解し、所定の時間インキュベートすることにより行うことができる。チロキシンとアルブミンとの結合体を調整する工程は、中性または塩基性の条件下で行うことが好ましい。反応溶液のｐＨは、例えば、６．５〜１１、好ましくは６．５〜９、より好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは７．０である。得られた反応液は、本発明による精製工程に先立って、遠心分離、濾過等により粗精製することもできる。
【００１８】
本発明は、上記により得られたチロキシンとアルブミンとの結合体を含む反応物から、チロキシン誘導体が溶解し、かつアルブミンが沈殿しない酸性の水性混合溶媒を用いて、該結合体を精製することを特徴とする。上記反応物には、未反応のチロキシン誘導体が多量に含まれているため、本発明の精製工程により、これら未反応のチロキシン誘導体をより効率的に除去する。また、アルブミンに疎水結合したチロキシン誘導体も効率的に除去することが可能となる。
【００１９】
本発明で用いられる酸性の水性混合溶媒は、水、酸、及び所定の有機溶媒から実質的に構成される。酸としては、トリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸、酢酸、トリクロロ酢酸等が挙げられ、トリフルオロ酢酸を用いることが好ましい。有機溶媒としては、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール等が挙げられ、アセトニトリルを用いることが好ましい。
【００２０】
水、酸、所定の有効溶媒の混合割合は、チロキシン誘導体が溶解し、かつアルブミンが沈殿しない酸性の水性混合溶媒となる限り、特に限定されるものではない。例えば、水と有機溶媒との比率は、３０：７０〜７０：３０、好ましくは３５：６５〜６５：３０、より好ましくは４０：６０〜６０：４０、特に好ましくは４５：５５〜５５：４５とすることができる。水性混合溶媒中の酸の濃度は、例えば、０．００１〜５重量％、好ましくは、０．０１〜２重量％とすることができる。本発明の水性混合溶媒の酸性度（ｐＨ）は、ｐＨ試験紙で測定した場合に、好ましくは０〜６、より好ましくは０〜４、最も好ましくは１〜３である。水性混合溶媒を酸性にすることにより、アルブミンのコンフォメーションが徐々に変化して、アルブミンに内包されていたチロキシン誘導体が、水性混合溶媒中に溶出される。また、酸性下では、フェノール性水酸基やカルボキシル基を有するチロキシン誘導体は水に溶解しにくくなるが、酸性の水性混合溶媒を用いることでチロキシン誘導体の溶出性を確保することができる。
【００２１】
上記の通り調製した酸性の水性混合溶媒を用いて、結合体の精製を行うと、より効率的に未反応のチロキシン誘導体を該水性混合溶媒中に分離することができ、より純度の高い本発明の結合体を得ることができる。精製の具体的な形態としては、酸性の水性混合溶媒を用いて、透析、ゲル濾過等により、未反応のチロキシン誘導体と、本発明の結合体とを分離することができる。透析による場合には、適切な透析膜中に、チロキシン誘導体とアルブミンとの反応産物を添加し、本発明の酸性の水性混合溶媒中に該透析膜を投入して、透析膜中の反応物溶媒を酸性の水性混合溶媒で置換することにより、透析膜中から外側の酸性の水性混合溶媒へ未反応のチロキシン誘導体を溶出させる。本発明において用いられる透析膜の分画分子量は、未反応のチロキシン誘導体と本発明の結合体とを分離できる限り、特に限定されるものではないが、例えば、分画分子量が１０，０００程度の透析膜を用いることができる。ゲル濾過による場合には、適切なゲル濾過用担体をカラムに充填し、該カラム中を本発明の酸性の水性混合溶媒で置換した後、チロキシン誘導体とアルブミンとの反応産物をゲル濾過カラムに注入し、さらに、本発明の酸性の水性混合溶媒を該ゲル濾過カラムに注入して、未反応のチロキシン誘導体と、本発明の結合体を分離することができる。本発明において使用できるゲル濾過用担体の具体例としては、有機溶媒耐性のある、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０（ＧＥ社製）を挙げることができる。本発明の精製工程において用いられる水性混合溶媒の好ましい量は、出発材料として用いるＢＳＡ５００ｍｇに対して、好ましくは５００ｍＬ〜５０Ｌ、より好ましくは１Ｌ〜３０Ｌ、最も好ましくは２Ｌ〜１５Ｌである。
【００２２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
［実施例］
＜チロキシン及び牛血清アルブミンの結合体の調製＞
以下、スキーム１に従って、Ｔ４誘導体１からＴ４誘導体２を合成した。
【００２４】
【化３】
0005713602.tif 000004
【００２５】
Ｔ４誘導体１（米国特許公報第４０４０９０７に合成法は記載）２７０ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、室温で攪拌した。その後、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ；同仁化学社製）２８５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；和光純薬社製）１７４ｍｇを加え、室温で２時間攪拌し、Ｔ４誘導体２を合成した。
【００２６】
次いで、スキーム２に示す通り、得られたＴ４誘導体２と、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）との結合体（Ｔ４−ＢＳＡ）を調製した。
【００２７】
【化４】
0005713602.tif 000005
【００２８】
ＢＳＡ５００ｍｇを１００ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、上記で得られたＴ４誘導体２を含むＤＭＦ溶液を該緩衝液中に添加した。その後、室温で終夜静置した。
反応終了後、白色の沈殿物を、遠心分離（3,300g、30 min、４℃）により除去し、上清を回収した。回収した上清を０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液を、以下に説明の通り、透析による精製に供した。
【００２９】
＜透析による精製＞
上記得られた濾液を透析膜チューブ（品名：SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing, 10,000 MWCO, 22 mm×35フィート乾燥直径；プロダクト#:68100；Thermo Scientific社製）に投入した。５Ｌビーカーに０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するイオン交換水（Ｈ２Ｏ）及びアセトニトリル（ＡＲ）（１：１）の混合溶媒５Ｌを投入した。テックジャム社製リール式pH試験紙(カタログ番号：商品コードNO：KN3138095)を用いて上記混合溶媒のpHを測定したところ１であった。上記濾液の入った透析膜チューブを該混合溶媒中に投入して、室温でゆっくりと攪拌した。
【００３０】
透析後、透析チューブ内の水溶液を回収した。回収した水溶液を、５００ｍＬのナス型フラスコへ注いで、液体窒素で凍結し、凍結乾燥を行い、本発明のＴ４とアルブミンとの結合体として、白色固体約４００ｍｇを得た。
【００３１】
＜Ｔ４／ＢＳＡ値の分析＞
ＢＳＡ一分子当たりに結合しているＴ４分子の数を、Ｔ４／ＢＳＡ値として測定した。
測定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定により行った。マトリックスとしてシナピン酸（シグマアルドリッチ社製）を用いた。０．１％ＴＦＡを含む水及びアセトニトリル（１：１）の混合液に、シナピン酸を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解してマトリックス溶液を調製した。該マトリックス溶液とＴ４−ＢＳＡ水溶液（精製水）とを、１：１（各５μＬ）で混合し、マイクロチューブ中で十分ピペッテインングした。その後、ＭＳの基盤プレート上に、該混合液を５μＬ滴下し、室温で自然乾燥させ、ＭＳ測定を行った。測定モードは、liner mode、positive modeで行い、分子量６０，０００〜１００，０００で測定した。
【００３２】
＜残存Ｔ４量の定量＞
上記で得られたＴ４-ＢＳＡ試料（凍結乾燥品）中に残存する未反応のＴ４誘導体を、以下に説明の通り、高速液体クロマトグラフィー法により測定した。以下、測定した値をＴ４残量（ｗｔ％）とする。
【００３３】
まず、上記得られた凍結乾燥品を７ｍｇ程度採取し、５ｍＬのアセトニトリル及び水（１：１）の混合溶媒に溶解し、０．４５μｍフィルターで濾過し、カラムへインジェクトした。
測定条件は以下の通りである。
【００３４】
（測定条件）
・カラム：東ソー社製  ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１００Ｚ（４．６＊２５０ｍｍ；ロット番号：Ｐ０１０３）
・ガードカラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８
・溶離液Ａ：Ｈ２Ｏ＝１００（０．１％ＴＦＡ）
溶離液Ｂ：アセトニトリル＝１００（０．１％ＴＦＡ）
※ＴＦＡは揮発性であるため、溶離液は用時調製した。
・リンス液：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝９／１ vol.
・タイムプログラム：
【表１】
0005713602.tif 000006
・流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・波長：検出器Ａ  ２５４ｎｍ
・感度：ＡＵＸ  ２
・注入量：１０μＬ
・サンプル濃度：Ｔ４−ＢＳＡ（凍結乾燥品）１０ｍｇをＡＲ／Ｈ２Ｏ（１／１）の混合溶媒に溶解させた。
【００３５】
＜蛍光粒子法による評価＞
（プレートの作成）
１５０ｍＭ ＮａＣｌで、上記で得られた精製試料（凍結乾燥品）を５０μｇ／ｍＬに調製した。該溶液１００μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、９６ウェルプレートを、室温で、７００ｒｐｍ、１時間、振とうした。反応後、上澄み液を捨て、ブロッキング試薬Ｎ１０２（日油社製）を３５０μＬ添加し、９６ウェルプレートを、室温で、７００ｒｐｍ、１時間、振とうした。反応終了後、上澄み液を捨て、イムノアッセイスタビライザー（ＡＢＩ社製）を３５０μＬ添加し、９６ウェルプレートを、室温で、７００ｒｐｍ、０．５時間、振とうした。その後、上澄み液を捨て、乾燥させた。
【００３６】
（蛍光測定評価）
Ｔ４抗体標識蛍光粒子１％solid（１％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ水溶液）を１×ＰＢＳで０．００２５％に希釈した。この分散液を、上記９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ添加し、９６ウェルプレートを、室温で、７００ｒｐｍ、１時間、振とうした。反応終了後、上澄み液を捨て、ＰＢＳＴ３００μＬで４回洗浄し、蛍光プレートリーダーで測定（Ｅｘ＝６６０ｎｍ、Ｅｍ＝６８０ｎｍ）した。なお、「抗体標識蛍光粒子１％solid」とは、ラテックス粒子の固形分濃度が１ｗｔ％（１ｗｔ％＝１ｇラテックス粒子／１００ｍＬ水）を意味する。
【００３７】
［比較例］
上記実施例において、透析による精製において表２の精製条件に示す溶媒を用いた以外は、実施例と同様にして結合体を製造した。製造した結合体は、実施例と同様に、上記の各種分析に供試し、評価を行った。
【００３８】
［結果］
以下の表２及び表３に、実施例及び比較例において製造した結合体の各ロットについて、各種分析結果を示す。また、表２に示す各ロットについて、蛍光粒子法による評価の結果を図１に示す。なお、表２における蛍光粒子法における相対シグナル値（％）は、ロットＡを１００％とした相対値である。さらに、表３に示す各ロットについて、Ｔ４残量（ｗｔ％）と蛍光粒子法における平均シグナル値の相関関係を図２に示す。
【００３９】
【表２】
0005713602.tif 000007
【００４０】
【表３】
0005713602.tif 000008
【００４１】
上記各種分析結果から、実施例の各ロットのＴ４残量は比較例の各ロットのＴ４残量よりも低いことが判る。そして、実施例の各ロットの蛍光粒子法におけるシグナル値は、Ｔ４／ＢＳＡ値に関係なく、より高い値を示した。一方、比較例の各ロットでは、未反応のＴ４誘導体がより多く残存しており、蛍光粒子法における相対シグナル値は実施例と比較して低いものだった。
【図１】
0005713602.tif 000009
【図２】
0005713602.tif 000010