(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0005818990.tif 000064
（式中、
Ｇ１とＧ２とＧ３のそれぞれが、Ｇ１とＧ２とＧ３の少なくとも１つが独立して共役基であるという条件にて、ｉ）共役基とｉｉ）単結合から独立して選ばれ；
Ｒ１とＲ２とＲ３のそれぞれが、ｉ）生体特異的結合反応体の標識化を容易にする反応性基Ｚ、ｉｉ）親水性基、およびｉｉｉ）水素から独立して選ばれるか、あるいは反応性基Ｒ１とＲ２とＲ３が存在せず；
Ａ１とＡ２のそれぞれが、ｉ）反応性基Ｚ、ｉｉ）親水性基、およびｉｉｉ）水素もしくはＣ１−６アルキルから独立して選ばれ；
ここでＲ１とＲ２とＲ３とＡ１とＡ２の少なくとも１つが反応性基Ｚであり
Ｌｎ３＋がランタニドイオンであり、
共役基が、互いに共役するように配置された１つ、２つ、または３つの部分からなり、それぞれの部分が、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、および（ヘテロ）芳香環もしくは（ヘテロ）芳香環系のビラジカル（−Ｈｅｔ／Ａｒ−）から選ばれ、そして
親水性基が単糖類または二糖類である）
の発光ランタニドキレート。
【請求項２】
共役基が、フェニレン、ビフェニレン、ナフチレン、ピリジレン、ピラジニレン、ピリミジニレン、ピリダジニレン、フリレン、チエニレン、ピロリレン、イミダゾリレン、ピラゾリレン、チアゾリレン、イソチアゾリレン、オキサゾリレン、イソオキサゾリレン、フラザニレン、１，２，４−トリアゾール−３，５−イレン、およびオキサジアゾリレンよりなる群から選ばれ、それぞれは、未置換であっても、あるいはモノ−Ｒ４−置換、ジ−Ｒ４，Ｒ５−置換、トリ−Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６−置換、テトラ−Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７−置換、またはペンタ−Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８−置換されていてもよく、ここでこのような可能な置換基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８のそれぞれは、Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）０−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）０−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）０−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）０−６ＳＯ３−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、−ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ１０、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、ヒドロキシル（−ＯＨ）、メルカプト（−ＳＨ）、−ＯＲ９、−ＳＲ９、および親水性基から選ばれ、Ｒ９は、−ＣＦ３、−Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、−ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ１０、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０、−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、および親水性基から選ばれ、Ｒ１０は、Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、および親水性基から選ばれ、親水性基が単糖類または二糖類である、請求項１に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項３】
Ｇ１とＧ２とＧ３の少なくとも２つが独立して共役基である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項４】
Ｇ１とＧ２とＧ３のそれぞれが独立して共役基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項５】
反応性基Ｚが、アジド基（−Ｎ３）；アルキニル基（−Ｃ≡ＣＨ）；アルキレン基（−ＣＨ＝ＣＨ２）；アミノ基（−ＮＨ２）；アミノオキシ基（−Ｏ−ＮＨ２）；カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）；アルデヒド基（−ＣＨＯ）；メルカプト基（−ＳＨ）；マレイミド基；またはイソシアナート（−ＮＣＯ）、イソチオシアナート（−ＮＣＳ）、ジアゾニウム（−Ｎ＋Ｎ）、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ピリジル−２−ジチオ、６−置換−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ；である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項６】
反応性基Ｚが、距離を形成する形成ビラジカルであるスペーサーを含み、該スペーサーが１〜５部分から形成されていて、各部分が、フェニレン、１〜１０個の炭素原子を有するアルキレン、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ３−、および−ＮＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオウレア（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）、およびトリアゾールからなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項７】
共役基が、フェニルエチニル、フェニル、チエニル、およびフリルから独立して選ばれ、それぞれが置換されていてもよい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項８】
親水性基が、距離を形成する形成ビラジカルであるスペーサーを含み、該スペーサーが１〜５部分から形成されていて、各部分が、フェニレン、１〜１０個の炭素原子を有するアルキレン、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ３−、および−ＮＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオウレア（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）、およびトリアゾールからなる群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項９】
（ｉ）Ｇ１とＧ３のそれぞれが３，５−ビス（カルボキシメトキシ）フェニルエチニルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基である；あるいは
（ｉｉ）Ｇ１とＧ２とＧ３のそれぞれがフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが親水性基であり、そしてＲ２が反応性基である；あるいは
（ｉｉｉ）Ｇ１とＧ２とＧ３のそれぞれがフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２の一方が−Ｈであり、−Ａ１と−Ａ２の他方がスペーサーを含む反応性基であり、そしてＲ１とＲ２とＲ３のそれぞれが親水性基である；あるいは
（ｉｖ）Ｇ１とＧ３のそれぞれが４−（カルボキシメチルチオ）フェニルエチニルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基である；あるいは
（ｖ）Ｇ１とＧ３のそれぞれが２，４−ビス（カルボキシメチルチオ）フェニルエチニルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基である；あるいは
（ｖｉ）Ｇ１とＧ３のそれぞれが２，４，６−トリス（カルボキシメトキシ）フェニルエチニルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基である；あるいは
（ｖｉｉ）Ｇ１とＧ３のそれぞれがフラン−２−イルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基である；あるいは
（ｖｉｉｉ）Ｇ１とＧ３のそれぞれがチエン−２−イルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基である；あるいは
（ｉｘ）Ｒ１−Ｇ１とＲ３−Ｇ３のそれぞれが（２，４−ジ（ＮａＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−）フェニル）エチニルであり、Ｇ２が（２−（ＮａＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−）フェニル）エチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基である；
請求項１〜８のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項１０】
ランタニドイオンＬｎ３＋が、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、およびサマリウム（ＩＩＩ）から選ばれる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項１１】
ランタニドイオンＬｎ３＋が、ユーロピウム（ＩＩＩ）である、請求項１０に記載の発光ランタニドキレート。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合反応体を含む検出可能分子。
【請求項１３】
生体特異的結合反応体が、抗体、抗原、受容体配位子、特異的結合タンパク質、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、タンパク質、オリゴ糖類、多糖類、リン脂質、ＰＮＡ、ステロイド、ハプテン、薬剤、受容体結合配位子、およびレクチンから選ばれる、請求項１２に記載の検出可能分子。
【請求項１４】
生体特異的結合反応体が抗体である、請求項１２または１３にいずれかに記載の検出可能分子。
【請求項１５】
式（ＩＩ）
【化２】
0005818990.tif 000065
（式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ａ１、およびＡ２のそれぞれは、請求項１〜９のいずれか一項に定義の基Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ａ１、およびＡ２を示す）
のランタニドキレート配位子。
【請求項１６】
ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載のランタニドキレートによって標識付けされた生体特異的結合反応体と検体との間のバイオ複合体を形成させる工程；
ｂ）励起波長を有する放射線で該バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成させる工程；および
ｃ）該励起バイオ複合体から放出される発光放射線を検出する工程；
を含む、生体特異的結合アッセイの実施方法。
【請求項１７】
固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を利用する特異的生物親和性ベースの結合アッセイにおける、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の検出可能分子の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれかに記載の式（Ｉ）の発光ランタニドキレートまたは請求項１５に記載の式（ＩＩ）のランタニドキレート配位子と共役した固体担体物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体特異的反応体に結合しようとする、３つの発色団を含有する新規ランタニドキレート、および種々のアッセイにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
長寿命の発光ランタニドキレートを使用する時間分解蛍光光度法は（ＴＲＦ）が、多くの特異的結合アッセイ〔例えば、調べようとする検体（wanted analyte）を極めて低い濃度で測定するイムノアッセイ、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、バイオイメージングアッセイ（例えば、免疫細胞化学的アッセイや免疫組織化学的アッセイ）、または細胞ベースアッセイ〕において使用されている。ランタニドキレートはさらに、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）や陽電子エミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）においても使用されている。
【０００３】
ＴＲＦでの利用に際し、最適な標識は幾つかの要件を満たさなければならない。第一に、基底状態と励起状態のどちらにおいても光化学的に安定で、且つ速度論的・化学的に安定でなければならない。励起波長はできるだけ高くなければならない（好ましくは３００ｎｍ超）。最適標識は、効率的なカチオン発光を、すなわち高いルミネセンス効率（励振係数×量子収率、εΦ）を示すものでなければならない。観察される蛍光減衰時間が長くなければならず、またキレートが良好な水溶性を有していなければならない。標識化のために、最適標識は、生体特異的結合反応体への共有結合を可能にする反応性基を有していなければならず、また標識化生体分子の親和性と非特異的結合特性が保持されなければならない。
【０００４】
難題は、１つの分子で全ての要件を満たすキレート標識を作製することであり、したがって一般には、適切な標識の開発においてある程度の妥協がなされる。このため、時間分解蛍光光度測定の用途に適したキレート標識の光物理的特性を最適化すべく多くの試み〔例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０（２００９）４０４中の概説を参照〕がなされている。
【０００５】
ルミネセンス強度を改良するための、一般的に使用されている１つの方法は、種々の分子構造設計（これにより高い安定性とミネセンス量子収率がもたらされる）にて組み合わされた幾つかの独立した発色団部分を有するキレート配位子を作製することである。２つ又は３つの別々の４−（フェニルエチニル）ピリジンを含むキレートが、"Ｔａｋａｌｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，７９，７８９"によって報告されている。ランタニドキレートとキレート配位子のより最近の例が、例えば、欧州特許第１４４７６６６号、国際公開第２０１０／０５５２０７号、国際公開第２０１０／００６６０５号、及び国際公開第２００８／０２０１１３号に開示されている。環状アザマクロサイクル（例えばＤＯＴＡ）に関するキレート安定性の研究に基づいて、開鎖キレート（例えばＤＰＴＡ）を凌ぐ高い安定性が観察されており、したがって３つの発色団を有する開示キレートに関する主要な関心は、種々の発色団につながれるアザマクロサイクルに注がれている。
【０００６】
最近、幾つかの１−ヒドロキシ−２−ピリジノン基とサリチルアミド基を利用する開鎖配位子を使用することで、ランタニドキレートの高い安定性が観察されている。これらの開示キレートは、通常は八配位座であって、ランタニドイオンへの配位のためのカルボン酸を含有しないけれども、高いルミネセンスと高い安定性が得られている。しかしながら、それらのランタニドキレートは、適度な全モル吸光係数（すなわち、４発色団で２７，０００ｃｍ−１）を有しているにすぎない。しかるに、例えばフェニルエチニルピリジンサブユニットを１つだけ有するキレートは通常、発色団中の置換基に応じて２５，０００〜３５，０００ｃｍ−１の吸光係数を有する（Ｌａｔｖａ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，７５，１４９）。
【０００７】
多くの発色団を有するキレートや配位子に関してよく知られている課題は、高い水溶性をもたらすと同時に、起こりうるバイオプロセスに対して不活性となるような、適切な構造設計を見出すことである。周知のように、発色団を組み込むと、配位子とキレートの水に対する溶解性が低下し、標識プロセス時における生体特異的結合反応体凝集物の形成が増大し、標識生体分子の非特異的結合特性が強まる。こうした凝集物は、標識物質の精製上の問題や収率低下を引き起こす。さらに、標識生体分子の非特異的結合が増えると、生体特異的アッセイのバックグラウンドルミネセンスが強まり、したがってアッセイ感度が低下する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第１４４７６６６号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０５５２０７号
【特許文献３】国際公開第２０１０／００６６０５号
【特許文献４】国際公開第２００８／０２０１１３号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０（２００９）４０４
【非特許文献２】Ｔａｋａｌｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，７９，７８９
【非特許文献３】Ｌａｔｖａ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，７５，１４９
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、発光ランタニドイオンの周りに３つの独立した発色団を有していて、極めて高いシグナルレベルをもたらす新規標識キレート設計物質（a novel label chelate design）に関する。
【００１１】
本発明のキレートの場合、シグナルを失うことなく標識化の程度を下げることができ、このとき同時に、標識化の程度がより低くなると、生体分子の親和性が向上し、アッセイ時の非特異的結合が減少する。したがって、より速い反応速度論が可能となり、全体的なアッセイ感度を向上させることもできるより低いバックグラウンドが認められる。
【００１２】
本発明の第１の態様は、式（Ｉ）の発光ランタニドキレートに関する。
【００１３】
【化１】
0005818990.tif 000002
【００１４】
本発明の第２の態様は、上記式（Ｉ）の発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合反応体を含む検出可能分子に関する。
【００１５】
本発明の第３の態様は、式（ＩＩ）の発光ランタニドキレート配位子に関する。
【００１６】
【化２】
0005818990.tif 000003
【００１７】
本発明の第４の態様は、ａ）上記のランタニドキレートによって標識化生体特異的結合反応体と検体とのバイオ複合体を形成させる工程；ｂ）励起波長を有する放射線で該バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成させる工程；およびｃ）該励起バイオ複合体から放出される発光輻射線を検出する工程；を含む、生体特異的結合アッセイの実施方法に関する。
【００１８】
本発明の第５の態様は、固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を利用する、特異的生物親和性をベースとする結合アッセイにおいて上記検出可能分子を使用することに関する。
【００１９】
本発明の第６の態様は、上記式（Ｉ）の発光ランタニドキレートと共役した固体担体物質に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、スキーム１を示す。
【図２】図２は、スキーム２を示す。
【図３】図３は、スキーム３および４を示す。
【図４】図４は、スキーム５を示す。
【図５】図５は、スキーム６を示す。
【図６】図６は、スキーム７を示す。
【図７】図７は、スキーム８を示す。
【図８】図８は、スキーム９を示す。
【図９】図９は、スキーム１０〜１２を示す。
【図１０】図１０は、スキーム１２を示す。
【図１１】図１１は、スキーム１３を示す。
【図１２】図１２は、スキーム１４を示す。
【図１３】図１３は、スキーム１５〜１７を示す。
【図１４】図１４は、スキーム１８を示す。
【図１５】図１５のFigure 1は、キレート４６、４８、および７５の励起極大を示し、Figure 2は、キレート１９、４７、５９、および６０の励起極大を示す。
【発明を実施するための態様】
【００２１】
本発明の目的は、特異的生物親和性をベースとする結合アッセイ〔例えば、固有ルミネセンスの蛍光光度測定または時間分解蛍光光度測定を使用するイムノアッセイ（均一系イムノアッセイと不均一系イムノアッセイ）、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、および細胞ベースアッセイ〕において使用される改良されたランタニドキレート標識を得るための手段を提供することである。本発明のキレートは、例えば、アッセイ感度、反応速度論、およびバックグラウンドに関連する、生物親和性をベースとする改良された結合アッセイを得るための手段を提供する。
【００２２】
発光ランタニドキレート
本発明の１つの態様は、式（Ｉ）
【００２３】
【化３】
0005818990.tif 000004
【００２４】
（式中、Ｇ１とＧ２とＧ３のそれぞれが、Ｇ１とＧ２とＧ３の少なくとも１つが独立して共役基であり、特にＧ１とＧ２とＧ３の２つもしくは３つ全部が独立して共役基であるという条件にて、ｉ）共役基とｉｉ）単結合から独立して選ばれ；Ｒ１とＲ２とＲ３のそれぞれが、ｉ）反応性基Ｚ、ｉｉ）親水性基、およびｉｉｉ）水素から独立して選ばれるか、あるいは反応性基Ｒ１とＲ２とＲ３が存在せず；Ａ１とＡ２のそれぞれが、ｉ）反応性基Ｚ、ｉｉ）親水性基、およびｉｉｉ）水素もしくはＣ１−６アルキルから独立して選ばれ、ここでＲ１とＲ２とＲ３とＡ１とＡ２の少なくとも１つが反応性基Ｚであり；そしてＬｎ３＋がランタニドイオンである）の発光ランタニドキレートに関する。
【００２５】
基Ｇ１とＧ２とＧ３の少なくとも１つが共役基である。このような場合、こうした共役基Ｇ１、Ｇ２、及び／又はＧ３はピリジンと共役している基である。これらの基は、水溶性を高めるために、及び／又は励起波長をシフトさせるために、及び／又はモル励振係数を増大させるために種々の基で置換することができる。Ｇ１とＧ２とＧ３のうちの、共役基ではないいずれかの基は単に、ピリジンと、それぞれＲ１、Ｒ２、またはＲ３との間の単結合を表わす。
【００２６】
１つの興味ある実施態様では、Ｇ１とＧ２とＧ３の少なくとも２つが、独立して共役基である。
【００２７】
現在最も興味ある実施態様では、Ｇ１とＧ２とＧ３のそれぞれが独立して共役基である。
【００２８】
幾つかの実施態様では、共役基は、１つ、２つ、または３つの部分からなり、それぞれの部分は、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、および（ヘテロ）芳香環もしくは（ヘテロ）芳香環系のビラジカル（−Ｈｅｔ／Ａｒ−）（例えば、フェニレン、ビフェニレン、ナフチレン、ピリジレン、ピラジニレン、ピリミジニレン、ピリダジニレン、フリレン、チエニレン、ピロリレン、イミダゾリレン、ピラゾリレン、チアゾリレン、イソチアゾリレン、オキサゾリレン、イソオキサゾリレン、フラザニレン、１，２，４−トリアゾール−３，５−イレン、およびオキサジアゾリレン）から選ばれる。
【００２９】
これらの基は、互いに共役するように配置されており、共役基がピリジンと共役するような仕方で個々のピリジンに結合している。
【００３０】
（ヘテロ）芳香環もしくは（ヘテロ）芳香環系のビラジカル（−Ｈｅｔ／Ａｒ−）のそれぞれは、未置換であっても、あるいはモノ−Ｒ４−置換、ジ−Ｒ４，Ｒ５−置換、トリ−Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６−置換、テトラ−Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７−置換、またはペンタ−Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８−置換されていてもよく、ここでこのような可能な置換基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８のそれぞれは、Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）０−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）０−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）０−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）０−６ＳＯ３−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、−ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ１０、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、ヒドロキシル（−ＯＨ）、メルカプト（−ＳＨ）、−ＯＲ９、−ＳＲ９、および親水性基から選ばれ、Ｒ９は、−ＣＦ３、−Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、−ＮＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＣＨ３Ｒ１０、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１０、−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、および親水基から選ばれ、Ｒ１０は、Ｃ１−１２アルキル、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ３−、および親水性基から選ばれる。
【００３１】
Ｒ基が異なると、励起波長をより長い波長にシフトさせることができ、このことは、モル吸光係数（ε）が高くなると共に、現在使用されている高価な装置の代わりに安価で小型のＬＥＤによって標識を励起させることができる、ということを意味している。
【００３２】
１つの興味ある実施態様では、Ｇ１とＧ２とＧ３のうちの２つ（特に３つ全部）が、フェニルエチニル（Ｃ６Ｈ５−Ｃ≡Ｃ−）、フェニル、チエニル、およびフリル（例えば、フェニルエチニル、フェニル、チエニル、およびフリル）から、特にフェニルエチニルから独立して選ばれ、このときそれぞれが置換されていてもよい〔（ヘテロ）芳香環もしくは（ヘテロ）芳香環系のビラジカルに関して前述したことを参照〕。
【００３３】
Ｒ１とＲ２とＲ３のそれぞれは、ｉ）反応性基Ｚ、ｉｉ）親水性基、およびｉｉｉ）水素から独立して選ばれる。Ｇ１とＧ２とＧ３、またはＧ１とＧ２とＧ３の一部を構成する（ヘテロ）芳香環もしくは（ヘテロ）芳香環系のビラジカルが十分に置換されている場合は、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３というそれぞれの基は存在しない。
【００３４】
Ａ１とＡ２のそれぞれは、ｉ）反応性基Ｚ、ｉｉ）親水性基、およびｉｉｉ）水素もしくはＣ１−６アルキルから、特にｉ）反応性基Ｚ、ｉｉ）親水性基、およびｉｉｉ）水素から独立して選ばれる。
【００３５】
キレート分子中には少なくとも１つの反応性基が必要とされる。キレート分子中のＺ基の数は、一般には１、２、または３であり、特に１または２であり、さらに好ましくは単に１である。
【００３６】
反応性基Ｚの機能は、生体特異的結合反応体の標識化を容易にすること、あるいは固体担体物質に対する共有結合の形成を容易にすることである。キレートが重合基を反応性基として有する場合は、粒子の作製と同時に、キレートを固体担体（例えば粒子）中に導入することができる。
【００３７】
反応性基の例としては、アジド基（−Ｎ３）、アルキニル基（−Ｃ≡ＣＨ）、アルキレン基（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アミノ基（−ＮＨ２）、アミノオキシ基（−Ｏ−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、メルカプト基（−ＳＨ）、マレイミド基、またはこれらの活性化誘導体〔イソシアナート（−ＮＣＯ）、イソチオシアナート（−ＮＣＳ）、ジアゾニウム（−Ｎ＋Ｎ）、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、反応性エステル、ピリジル−２−ジチオ、および６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノを含む〕から選ばれる基が挙げられる。２つの実施例では、反応性基はイソチオシアナート（−ＮＣＳ）基を含む。
【００３８】
６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ中の置換基は、水素、ハロゲン、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、置換アミノ、または置換チオエーテルからなる群から選ぶことができ、クロロ、フルオロ、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ、またはエトキシカルボニル−チオメトキシからなる群から選ぶのが好ましい。置換アミノまたは置換チオエーテルは、モノ置換またはジ置換であるのが好ましく、各置換基は、１〜６個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルコキシ、フェニル、カルボニル、またはカルボキシルからなる群から独立して選ばれるのが好ましい。
【００３９】
反応性基Ｚは、生体特異的結合反応体（詳細は下記参照）と反応すると、例えば下記タイプ〔チオウレア（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＣＨ３−ＣＯ−、および−ＣＯ−ＮＨ３−）、脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン、
【００４０】
【化４】
0005818990.tif 000005
【００４１】
（式中、ｎ＝１〜６）、およびトリアゾール〕のうちの１つの前記生体特異的結合反応体への結合を確立する（例えば、いわゆる"クリック化学"によって形成される）、と考えられている。
【００４２】
任意の親水性基が存在する場合、親水性基は、例えばキレートの水溶性を向上させるために存在する。
【００４３】
親水性基の例としては、単糖類やオリゴ糖類（例えば、単糖類や二糖類）、および例えば１〜２０の反復構造単位を有するオリゴアルキレングリコール（例えば、オリゴエチレングリコールやオリゴプロピレングリコール等）などが挙げられる。
【００４４】
１つの実施態様では、親水性基は、単糖類、二糖類、−（ＣＨ２）１−３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）０−５−Ｈ、−（ＣＨ２）１−３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）０−５Ｃ１−４アルキル、−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−６−Ｈ、および−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−６−Ｃ１−４アルキルから選ばれ、特に単糖類から選ばれる。
【００４５】
本明細書の文脈では、"単糖類"という用語は、Ｃ５−Ｃ７炭水化物（環状であろうと非環式であろうと）を意味するように意図されている。単糖類の例としてはＣ６炭水化物、例えば
【００４６】
【化５】
0005818990.tif 000006
【００４７】
から選ばれる炭水化物が挙げられる。
【００４８】
本発明の文脈では、"二糖類"という用語は、２つの単糖類（上記参照）が好ましくはグリコシド結合によって連結したものを意味するように意図されている。
【００４９】
理解しておかねばならないことは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ａ１、およびＡ２のいずれかが反応性基Ｚを示す場合は、反応性基Ｚが、（必要ならば又は好ましいならば）生体特異的結合反応体との反応が起きやすい位置に反応性基Ｚが配置されるようにスペーサー〔すなわち、距離を形成するビラジカル（a distance-making biradical）〕を含んでよい、という点である。同様に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ａ１、およびＡ２のいずれかが親水性基を示す場合は、親水性基がスペーサーを含んでよい。どちらの場合も、スペーサーは、配位子またはキレートの合成の過程で容易に導入することができる。簡単に一般化できる例として（且つ実施例３を参照して）、化合物４とグリシンエチルエステルとの間の反応では、スペーサーが組み込まれた反応性基または親水性基を確実に得るべくスペーサーの一部が供給されるよう、官能性側鎖を有する別のα−アミノ酸〔例えば、（保護された）グルタミン酸もしくはアスパラギン酸、あるいは保護されたオルニチンもしくはリシン〕を使用することができる。１つの例をスキーム９に示す。
【００５０】
"スペーサー"という用語は、例えば、共役基もしくはコア構造のピリジン部分と、例えば、反応性基Ｚもしくは親水性基との間の間隔形成基（a distance-making group）を意味するように意図されている。スペーサーは通常、結合個所と反応性基（もしくは親水性基）との間に、例えば１〜２０結合（例えば、３〜１５結合または５〜１２結合）の長さを有する。該スペーサーは１〜５部分から形成されており、各部分は、フェニレン、１〜１０個の炭素原子を有するアルキレン、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ３−、および−ＮＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオウレア（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）、およびトリアゾールからなる群から選ばれる。１１結合を有するこうしたスペーサーの一例をスキーム９に示す。
【００５１】
１つの実施態様では、親水性基（存在する場合）が間隔形成基であるスペーサーを含み、このときスペーサーは上記したとおりである。
【００５２】
他の実施態様では、反応性基Ｚがスペーサーを含み、このときスペーサーは上記したとおりである。
【００５３】
幾つかの実施態様では、−Ａ１と−Ａ２の少なくとも一方が−Ｈであり、特に−Ａ１と−Ａ２の両方が−Ｈである。
【００５４】
他の実施態様では、−Ａ１と−Ａ２の少なくとも一方が−Ｈではなく、特に−Ａ１と−Ａ２の一方が、スペーサー〔例えば、−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ６Ｈ４−ＮＣＳ〕を介して結合した反応性基（Ｚ）である。
【００５５】
さらに他の実施態様では、−Ａ１と−Ａ２の少なくとも一方が−Ｈではなく、特に−Ａ１と−Ａ２の一方が、必要に応じてスペーサーを介して結合した親水性基である。
【００５６】
"ランタニドイオン"または"Ｌｎ３＋"という用語は、元素周期表のランタニド系列の三価イオン〔例えば、ユーロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、およびジスプロシウム、すなわち、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、またはＤｙ３＋〕を意味するように意図されている。多くの実施態様では、ユーロピウム（ＩＩＩ）（Ｅｕ３＋）とテルビウム（ＩＩＩ）（Ｔｂ３＋）が好ましい。
【００５７】
理解しておかねばならないことは、式（Ｉ）のランタニドキレート（ならびに式（ＩＩ）のランタニドキレート配位子；あとの説明を参照）の基本構造は、少なくとも４負電荷を含み、幾つかの置換基が−ＣＯＯ−または−ＳＯ３−のタイプである場合は、さらなる負電荷を含む、という点である。したがって理解しておかねばならないことは、ランタニドキレートとランタニドキレート配位子はそれぞれ、式（Ｉ）および式（ＩＩ）に記載されているもののほかに、対イオンとしての１つ以上のカチオンとさらに結び付く、という点である。このような対イオンの例としては、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、およびＫ＋等が挙げられる。特に好ましいのはＮａ＋とＫ＋である。対イオンは、元素周期表の第ＩＡ族と第ＩＩＡ族からのものであるのが好ましい。
【００５８】
本発明はさらに、多標識の可能性をもたらす、全てのランタニドに対する高度に発光性の標識を提供する。
【００５９】
ランタニドキレート配位子
したがって本発明の他の態様は、式（ＩＩ）
【００６０】
【化６】
0005818990.tif 000007
【００６１】
（式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ａ１、およびＡ２のそれぞれは、式（Ｉ）に関して定義した基Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ａ１、およびＡ２を示す）のランタニドキレート配位子に関する。
【００６２】
該配位子を、ペプチド合成もしくはオリゴヌクレオチド合成において、標識ペプチドまたは標識オリゴヌクレオチドを作製するための手段として使用する場合は（米国特許出願第２００５／０１８１３９３号に記載）、合成時に配位子をペプチド骨格もしくはオリゴヌクレオチド骨格に結び付けるための、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ａ１、またはＡ２中の１つの官能基を使用するのが好ましい。
【００６３】
好ましい実施態様
幾つかの好ましい実施態様では、キレート分子は、特に置換基Ｒ２として単一の反応性基Ｚ（例えば−ＮＣＳ）を含む。
【００６４】
さらなる実施態様では、−Ｇ２−Ｒ２は−エチレン−フェニレン−Ｒ２であり、ここでＲ２は反応性基（例えば−ＮＣＳ）である。
【００６５】
幾つかの好ましい実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３のそれぞれがフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが親水性基〔例えば
【００６６】
【化７】
0005818990.tif 000008
【００６７】
等の単糖類〕であり、そしてＲ２が反応性基（例えば−ＮＣＳ）である、という場合のランタニドキレートである。
【００６８】
他の実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｇ１とＧ３のそれぞれが３，５−ビス（カルボキシメトキシ）フェニルエチニルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基（例えば−ＮＣＳ）である、という場合のランタニドキレートである。
【００６９】
さらに他の実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３のそれぞれがフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２の一方が−Ｈであり、−Ａ１と−Ａ２の他方がスペーサーを含む反応性基〔例えば−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ６Ｈ４−ＮＣＳ〕であり、そしてＲ１、Ｒ２、およびＲ３のそれぞれが親水性基〔例えば
【００７０】
【化８】
0005818990.tif 000009
【００７１】
等の単糖類〕である、という場合のランタニドキレートである。
【００７２】
さらに他の実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｇ１とＧ３のそれぞれが４−（カルボキシメチルチオ）フェニルエチニルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基（例えば−ＮＣＳ）である、という場合のランタニドキレートである。
【００７３】
さらに他の実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｇ１とＧ３のそれぞれが２，４−ビス（カルボキシメチルチオ）フェニルエチニルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基（例えば−ＮＣＳ）である、という場合のランタニドキレートである。
【００７４】
さらに他の実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｇ１とＧ３のそれぞれが２，４，６−トリス（カルボキシメトキシ）フェニルエチニルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基（例えば−ＮＣＳ）である、という場合のランタニドキレートである。
【００７５】
さらに他の実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｇ１とＧ３のそれぞれがフラン−２−イルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基（例えば−ＮＣＳ）である、という場合のランタニドキレートである。
【００７６】
さらに他の実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｇ１とＧ３のそれぞれがチエン−２−イルであり、Ｇ２がフェニルエチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、Ｒ１とＲ３のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基（例えば−ＮＣＳ）である、という場合のランタニドキレートである。
【００７７】
さらに他の実施態様では、式（Ｉ）のランタニドキレートは、Ｒ１−Ｇ１とＲ３−Ｇ３のそれぞれが（２，４−ジ（ＮａＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−）フェニル）エチニルであり、Ｇ２が（２−（ＮａＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−）フェニル）エチニルであり、−Ａ１と−Ａ２のそれぞれが−Ｈであり、そしてＲ２が反応性基（例えば−ＮＣＳ）である、という場合のランタニドキレートである。
【００７８】
これらの実施態様では、ランタニドイオン（Ｌｎ３＋）は、Ｓｍ３＋とＥｕ３＋から選ばれるのが好ましく、特に好ましいのはＥｕ３＋である。
【００７９】
式（ＩＩ）の対応するランタニドキレート配位子も、同様に興味ある物質である。ランタニドキレート配位子は、ペプチド合成やオリゴヌクレオチド合成において使用するのに、または固体担体用に特に適している。
【００８０】
検出可能分子
本発明のさらに他の態様は、上記の発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合体を含む検出可能分子に関する。共役は通常、当該キレートの反応性基によって得られる。
【００８１】
生体特異的結合反応体は、あるサンプル中の検体を定量もしくは定性分析するために、当該検体と特異的に結合できなければならない。
【００８２】
生体特異的結合反応体の例としては、抗体、抗原、受容体配位子、特異的結合タンパク質、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、（例えばＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド）、修飾ポリヌクレオチド（例えばＬＮＡ修飾ポリヌクレオチド）、タンパク質、オリゴ糖類、多糖類、リン脂質、ＰＮＡ、ステロイド、ハプテン、薬剤（drug）、受容体結合配位子、およびレクチンから選ばれる反応体が挙げられる。
【００８３】
好ましい実施態様では、生体特異的結合反応体は抗体〔例えばトロポニンＩ抗体（抗Ｔｎ１）〕から選ばれる。
【００８４】
生体特異的結合アッセイの実施方法
本発明のさらなる態様は、ａ）上記のランタニドキレートによって標識付けされた生体特異的結合反応体と検体との間のバイオ複合体を形成させる工程；ｂ）励起波長を有する放射線で該バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成させる工程；およびｃ）該励起バイオ複合体から放出される発光放射線を検出する工程；を含む、生体特異的結合アッセイの実施方法に関する。
【００８５】
本発明の方法は、当業者にとって周知の従来のアッセイ手順に従う。
【００８６】
本発明のさらなる態様は、上記の検出可能分子を、固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を使用する、特異的生体親和性に基づく結合アッセイにおいて使用することに関する。１つの実施態様では、特異的生体親和性に基づく結合アッセイは、不均一系イムノアッセイ、均一系イムノアッセイ、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、または免疫組織化学的アッセイである。
【００８７】
固体担体
本発明のさらに他の態様は、上記の発光ランタニドキレートと共役した固体担体物質に関する。発光ランタニドキレートは通常、固体担体物質に共有結合的あるいは非共有結合的に固定化される。
【００８８】
幾つかの興味ある実施態様では、固体担体物質は、ナノ粒子、マイクロ粒子、スライド、プレート、および固相合成樹脂から選ばれる。
【００８９】
新規の九座ランタニドキレート配位子、対応する発光ランタニドキレート、および標識化生体特異的結合反応体は、３つの発色団を有する開鎖の（すなわち非環式の）配位子構造に基づいており、こうした配位子構造により、キレート化ランタニドイオンの驚くほどに効率的な励起がもたらされる。同時に、さらなる凝集体形成や精製上の問題を起こすことなく、発光ランタニドキレートおよび標識化生体特異的結合反応体の重要な特徴を全て保持することができる。
【００９０】
本発明のキレートは、（ａ）適切な波長（好ましくは３００ｎｍ超）にて高い吸光係数（好ましくは５０，０００ｃｍ−１）；（ｂ）反応体の高い吸光係数を可能にする、同じ配位子構造中に３つの別個のＵＶ吸収部分（発色団、三重項増感剤）；（ｃ）発色団からランタニドイオンへの効果的なエネルギー伝達；（ｄ）９配位座キレート化、キレート化イオンの完全な保護、およびよく知られている水分子のルミネセンス消光（a nine dentate chelating completely protection of the chelated ion against and the well-known luminescence quenching of water molecules）；（ｅ）ｉ）標識化反応体を長期間にわたって貯蔵するのに必要とされる熱力学的安定性、およびｉｉ）標識化反応体を、競争金属イオンまたはキレート化剤が存在することのある条件において使用できるようするための高い速度論的安定性、をつくり出すための強力キレート化部分；（ｆ）高い水溶性を可能にするための、生体分子の標識付け時および標識化生体分子の非特異的結合時における凝集体の形成を防ぐための、そして３００ｎｍ超でのＵＶ励起と高い吸光係数を可能にするための官能基；（ｇ）発光ランタニドイオンのすぐ近くの最適量のＣＨ２基（したがって、Ｃ−Ｈ結合の振動エネルギーマニホルドを介してのイオンルミネセンスの非放射消光は、高められたルミネセンスをもたらす上でそれほど重要ではない）；および（ｈ）ユーロピウムキレートを使用すると、本発明のキレートを含む配位子場は、高められたルミネセンスをもたらすよう、他の輝線より上の約６１５ｎｍにて輝線強度を強める；等の幾つかの重要な特徴を単一の標識にて組み合わせることを目指している。
【実施例】
【００９１】
下記の実施例は、本発明をさらに詳細に説明することを目的としており、これによって実施例が限定されることはない。構造と使用される合成経路をスキーム１〜１９に示す。１つの重要な合成段階は、共役三重結合構造を作製するのにいわゆるＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａ反応を使用することである。本発明による、例えばフェニル、チエニル、もしくはフリルをベースとするランタニドキレートを作製するのに、当業者が、例えば"Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０（２００９）４０４"とその引用文献中に記載の、周知のＳｔｉｌｌ  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ合成法を使用するのは明らかである。
【００９２】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＤＲＸ５００ＭＨｚを使用して記録した。テトラメチルシランを内部標準として使用した。質量スペクトルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＱＳＴＡＲ  ＸＬ  ＥＳＩ−ＴＯＦ機器またはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器により、α−シアノ−４−ケイ皮酸を使用して記録した。ＵＶ−ＶｉｓスペクトルはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３３００ｐｒｏにより記録した。蛍光収率は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｐｌａｔｅ蛍光光度計を使用して測定した。ルミネセンス減衰時間、励起スペクトル、発光スペクトル、および蛍光寿命は、Ｖａｒｉａｎ社のＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計を使用して測定した。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ社）を充填したカラムを使用して行った。
【００９３】
実施例１．  ２，６−ビス（ヒドロキシメチル）−４−ヨードピリジン（２）の合成
４−ヨード−２，６−ピリジンジカルボン酸ジエチル（１）（５．５７ｇ，１７．３ミリモル）をエタノール（１３０ｍｌ）中に懸濁させた。撹拌状態の溶液に、ホウ水素化ナトリウム（２．９５ｇ，７８ミリモル）を少量ずつ１５分で加えた。混合物を１．５時間還流してから室温に自然冷却した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、残留物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（３５ｍｌ）中に懸濁させた。懸濁液を速やかに沸騰させ、自然冷却し、そして溶媒を蒸発除去した。残留物をＤＭＦとジクロロメタンの混合物（１：１，６５ｍｌ）中に懸濁させ、懸濁液をセライトパッドを介して濾過し、濾液から溶媒を蒸発除去した。生成物を水から結晶化させ、減圧デシケーター中にてシリカゲル上で乾燥した。収量３．３７ｇ（６０％）。
【００９４】
【化９】
0005818990.tif 000010
【００９５】
化合物１は、"Ｔａｋａｌｏ  Ｈ．ａｎｄ  Ｋａｎｋａｒｅ  Ｊ．，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ  Ｂ  ４１，１９８７，２１９−２２１"に記載のように作製した。
【００９６】
実施例２．  ２，６−ビス（ブロモメチル）−４−ヨードピリジン（３）の合成
三臭化リン（２．４５ｍｌ，２６ミリモル）を無水ＤＭＦ（１９．５ｍｌ）に０℃にて滴下して半固体の混合物を得た。本混合物に２，６−ビス（ヒドロキシメチル）−４−ヨードピリジン（２）（３．３６ｇ，１２．７ミリモル）を少量ずつ加えた。添加中に固体混合物が溶解した。本混合物を室温にまで温め、室温で４時間撹拌した。反応混合物を、炭酸水素ナトリウムの５％水溶液１００ｍｌに注いだ。沈殿した生成物を濾過によって捕集し、水で洗浄し、減圧デシケーター中にてシリカゲル上で乾燥した。収量４．５１ｇ（９１％）。
【００９７】
【化１０】
0005818990.tif 000011
【００９８】
実施例３．  エチル２−（（４−ブロモ−６−（カルボキシエチル）−ピリジン−２−イル）メチレンニトリロ）アセテートの合成
無水アセトニトリル（１２５ｍｌ）とジ−イソプロピルエチルアミン（１６．５ｍｌ）との混合物中に、４−ブロモ−６−ブロモメチル−２−カルボキシエチルピリジン（４）（２．９９ｇ，９．３ミリモル）とグリシンエチルエステル塩酸塩（６．５２ｇ，４６．７ミリモル）を溶解した。本混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、シリカを固定相として、そしてジクロロメタン：メタノール（９７：３）を溶離液として使用して、得られた生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した。収量２．７８ｇ（８６％）。
【００９９】
【化１１】
0005818990.tif 000012
【０１００】
化合物４は、"Ｔａｋａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９６，７９，７８９−８０２"に記載のように作製した。
【０１０１】
実施例４．  ジエチル６，６’−（（（（４−ヨードピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−ブロモピコリネート）（６）の合成
化合物３（０．９４ｇ，２．４ミリモル）と化合物５（１．６６ｇ，４．８ミリモル）を無水アセトニトリル（８０ｍｌ）中に溶解した。無水炭酸カリウム（１．６７ｇ，１２ミリモル）を加え、本混合物を５５〜６０℃で４時間撹拌した。反応混合物を室温に自然冷却し、セライトパッドを介して濾過した。濾液から溶媒を蒸発除去し、シリカを固定相として、そしてジクロロメタン：メタノール（９５：５）を溶離液として使用して、得られた生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した。収量１．５７ｇ（７１％）。
【０１０２】
【化１２】
0005818990.tif 000013
【０１０３】
実施例５．  ジエチル６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−ブロモピコリネート）（７）の合成
化合物６（４１２ｍｇ，０．４５ミリモル）を無水ジクロロメタン（６ｍｌ）中に溶解した。トリエチルアミン（２ｍｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（３．２ｍｇ，０．０１７ミリモル）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（９．５ｍｇ，０．０１４ミリモル）、および４−エチニルアニリン（５２．５ｍｇ，０．４５ミリモル）を加えた。反応混合物をアルゴンで脱気し、室温で３時間撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、得られた生成物を、シリカを固定相として、そしてジクロロメタン：メタノール（９０：１０）を溶離液として使用してカラムクロマトグラフィーで精製した。収量１９３ｍｇ（４７％）。
【０１０４】
【化１３】
0005818990.tif 000014
【０１０５】
実施例６．  ジエチル６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（（４−（４−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−ガラクトピラノキシ）フェニル）エチニル）ピコリネート）（９）の合成
化合物７（１９０ｍｇ）と化合物８（２４０ｍｇ，０．５４ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（３ｍｌ）中に溶解した。トリエチルアミン（３ｍｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２．３ｍｇ，０．０１２ミリモル）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（４．３ｍｇ，０．００６ミリモル）、および（６３．８ｍｇ，０．５４ミリモル）を加えた。反応混合物をアルゴンで脱気し、５５〜６０℃で一晩撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、シリカを固定相として、そしてジクロロメタン：メタノール（９０：１０）を溶離液として使用して、得られた生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した。収量１５５ｍｇ（４４％）。
【０１０６】
【化１４】
0005818990.tif 000015
【０１０７】
実施例７．  ６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（カルボキシラートメチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（（４−（４−α−ガラクトピラノキシ）フェニル）エチニル）ピコリネートユーロピウム（１０）の合成
化合物９（１５２ｍｇ，０．０９２ミリモル）をＫＯＨの０．５Ｍエタノール溶液（７．７ｍｌ）中に溶解し、水（３．６ｍｌ）を加えた。本混合物を室温で２時間撹拌した。本混合物から溶媒を蒸発除去し、残留物を水（２．５ｍｌ）中に溶解し、塩酸（６Ｍ）を加えることによってｐＨを６．５に調整した。塩化ユーロピウム（３４ｍｇ，０．０９２ミリモル）を水（９２０μｌ）中に溶解して得た溶液を反応混合物に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、炭酸水素ナトリウムまたは塩酸を反応混合物に加えることによってｐＨを６．３〜６．５に保持した。反応混合物から沈殿した生成物を遠心分離によって単離した。生成物を、減圧デシケーター中にてシリカゲル上で一晩乾燥した。収量１１５ｍｇ。
【０１０８】
【化１５】
0005818990.tif 000016
【０１０９】
実施例８．  ６，６’−（（（（４−（（４−イソチオシアナートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（カルボキシラートメチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（（４−（４−α−ガラクトピラノキシ）フェニル）エチニル）ピコリネートユーロピウム（１１）の合成
チオホスゲン（４２μｌ，０．５５ミリモル）、ＮａＨＣＯ３（５２ｍｇ，０．６１ミリモル）、およびクロロホルム（１．６５ｍｌ）の混合物に化合物１０（１０８ｍｇ，０．０８ミリモル）の水溶液を加えた。室温で１時間撹拌した後、水相をクロロホルムで洗浄した（３×１ｍｌ）。次いでｐＨを１Ｍ酢酸で６．８〜７．２に調整し、アセトン（３３ｍｌ）を使用して生成物を沈殿させた。生成物を遠心分離によって捕集し、沈殿物をアセトンで洗浄し（３×３０ｍｌ）、減圧デシケーター中にてシリカゲル上で一晩乾燥した。
【０１１０】
【化１６】
0005818990.tif 000017
【０１１１】
実施例９．  １−ブロモ−３，５−ジヒドロキシベンゼン（１３）の合成
１−ブロモ−３，５−ジメトキシベンゼン（１２）（１．００ｇ，４．６０ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（４０ｍｌ）中に溶解し、氷浴にて冷却した。三臭化ホウ素（１．３３ｍｌ，１３．８２ミリモル）を加え、混合物を２時間撹拌した。本混合物を室温にまで自然加温し、一晩撹拌した。メタノール（１．４ｍｌ）を滴下して反応を終了させ、本混合物を水（５０ｍｌ）中に注ぎ込み、室温で２時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３で中和し、酢酸エチル（３０ｍｌ）で２回抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そしてメタノール：ジクロロメタン（５：９５）を溶離液として使用して、得られた生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。得られた生成物は白色固体であった。収量０．７１ｇ（８１％）。
【０１１２】
【化１７】
0005818990.tif 000018
【０１１３】
実施例１０．  ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２，２’−（（５−ブロモ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ジアセテート（１４）の合成
化合物１３（０．４９ｇ，２．５９ミリモル）をＤＭＦ（１０ｍｌ，乾燥）中に溶解した。無水Ｋ２ＣＯ３（２．１５ｇ，１５．５６ミリモル）とブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．１５ｍｌ，７．７８ミリモル）を加え、混合物を、アルゴン雰囲気下にて５０℃で一晩撹拌した。水（１７ｍｌ）を加え、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせてＮａＨＣＯ３上で乾燥し、溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そしてジクロロメタンを溶離液として使用して、粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。得られた生成物は白色固体であった。収量０．９５ｇ（８７％）。
【０１１４】
【化１８】
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【０１１５】
実施例１１．  ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２，２’−（（５−（（トリメチルシリル）エチニル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ジアセテート（１５）の合成
化合物１４（２．００ｇ，４．７９ミリモル）をＤＭＦ（４ｍｌ，乾燥）中に溶解し、本溶液をマイクロ波反応バイアル中に入れた。ジエチルアミン（１２ｍｌ，乾燥）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１６８ｍｇ，０．２４ミリモル）、ＣｕＩ（４６ｍｇ，０．２４ミリモル）、およびＰＰｈ３（２５１ｍｇ，０．９６ミリモル）を加え、バイアルをアルゴン雰囲気中に密閉した。セプタムを介してトリメチルシリルアセチレン（９９６μｌ，７．１９ミリモル）を加え、マイクロ波加熱を使用して混合物を１２０℃で３０分撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、ジクロロメタン中に溶解し、シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（１０：９０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって精製した。収量１．３６ｇ（６５％）。
【０１１６】
【化１９】
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【０１１７】
実施例１２．  ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２，２’−（（５−エチニル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ジアセテート（１６）の合成
化合物１５（１．２９ｇ，２．９８ミリモル）をジクロロメタン（４０ｍｌ，乾燥）中に溶解した。フッ化テトラブチルアンモニウム（０．９３４ｇ，３．５７ミリモル）を加え、混合物をアルゴン雰囲気中にて室温で４５分撹拌した。本混合物を、１０％クエン酸溶液（２０ｍｌ）で、そして水（４×４０ｍｌ）で４回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（１０：９０）を溶離液として使用して、粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。得られた生成物は黄色固体であった。収量８９５ｍｇ（８３％）。
【０１１８】
【化２０】
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【０１１９】
実施例１３．  テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル２，２’，２”，２”’−（（（（６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（２−（エトキシカルボニル）ピリジン−６，４−ジイル））ビス（エチン−２，１−ジイル））ビス（ベンゼン−５，３，１−トリイル））テトラキス（オキシ））テトラアセテート（１７）の合成
化合物１６（０．１６７ｇ，０．４５９ミリモル）と化合物７（０．１６７ｇ，０．１８４ミリモル）を、無水テトラヒドロフラン（４ｍｌ）とトリエチルアミン（２．５ｍｌ）との混合物中に溶解した。二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（３．８ｍｇ，０．００５４ミリモル）とヨウ化銅（Ｉ）（２．３ｍｇ，０．０１２ミリモル）を加え、混合物を、アルゴン雰囲気下にて５５〜６０℃で一晩撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、シリカゲルを固定相として、そしてメタノール：ジクロロメタン（１０：９０）を溶離液として使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量７１ｍｇ（２７％）。
【０１２０】
【化２１】
0005818990.tif 000022
【０１２１】
実施例１４．  ６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（カルボキシラートメチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−（（３，５−ビス（カルボキシメトキシ）フェニル）エチニル）ピコリネートユーロピウム（ＩＩＩ）（１８）の合成
化合物１７（６８ｍｇ，０．０４８ミリモル）をトリフロロ酢酸（１ｍｌ，１３．５ミリモル）中に溶解し、混合物を室温で１．５時間撹拌した。加熱することなく、反応混合物から溶媒を蒸発除去した。残留物にジエチルエーテル（２．５ｍｌ）を加え、混合物を１５分撹拌した。混合物から沈殿した生成物を遠心分離によって単離した。沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄してから、減圧デシケーター中にてシリカゲル上で乾燥した。乾燥した沈殿物（６４ｍｇ，０．０５１ミリモル）を、水酸化カリウムの０．５Ｍエタノール溶液（４ｍｌ）と水（１．８ｍｌ）との混合物中に溶解した。本混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物から溶媒を蒸発除去し、残留物を水（１．７ｍｌ）中に溶解した。塩酸（６Ｍ）を加えることによってｐＨを６．５に調整した。塩化ユーロピウム（２０ｍｇ，０．０５５ミリモル）を水（４８５μｌ）中に溶解して得た溶液を反応混合物に滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、炭酸水素ナトリウムを加えることによってｐＨを６．３〜６．５に維持した。水酸化ナトリウムを加えることでｐＨを８．５〜９．０に調整することによって混合物から過剰のユーロピウムを沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって除去した。生成物をアセトン（２５ｍｌ）で沈殿させ、遠心分離によって単離した。沈殿物をアセトン（３×１０ｍｌ）で洗浄し、減圧デシケーター中にシリカゲル上で一晩乾燥させた。収量１８０ｇ。
【０１２２】
【化２２】
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【０１２３】
実施例１５．  ６，６’−（（（（４−（（４−イソチオシアナートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（カルボキシラートメチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（（４−（（３，５−ビス（カルボキトメトキシ）フェニル）エチニル）ピコリネートユーロピウム（ＩＩＩ）（１９）の合成
化合物１８（１７５ｍｇ，０．１４３ミリモル）の水溶液を、クロロホルム（２．８５ｍｌ）、チオホスゲン（７４μｌ，０．９７ミリモル）、および炭酸水素ナトリウム（９１ｍｇ，１．０９ミリモル）の混合物に滴下した。反応混合物を室温で４５分撹拌した。２つの相を分離し、水相をクロロホルム（３×６ｍｌ）で洗浄した。１Ｍ酢酸でｐＨを７に調整し、生成物をアセトン（５７ｍｌ）で沈殿させ、遠心分離によって分離した。沈殿物をアセトン（３×１５ｍｌ）で洗浄し、減圧デシケーター中にてシリカゲル上で一晩乾燥した。収量２１６ｍｇ。
【０１２４】
【化２３】
0005818990.tif 000024
【０１２５】
実施例１６．  本発明のＥｕ−キレートと従来の九配位座α−ガラクトースＥｕ−キレートとのルミネセンスの比較
炭酸水素ナトリウム水溶液（２ｍｌ，５０ｍＭ，ｐＨ９．８）とＤＭＦ（２００μｌ）との混合物に化合物１１（５．３ｍｌ）と従来の九配位座α−ガラクトースＥｕキレート（２１）（５．５ｍｇ）を溶解させることによって、これら出発物質をタウリン（それぞれの反応に対して５ｍｇ）に結合させた。本混合物を室温で一晩インキュベートした。生成物（２０と２２）を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８カラム）を使用することによって精製した。溶媒は、Ａ：酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７）およびＢ：酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中５０％アセトニトリル（２０ｍＭ，ｐＨ７）であった。勾配を５％の溶媒Ｂからスタートし、２５分にて溶媒Ｂの量を１００％まで直線的に上げた。１６．７分（２０）時点と１５．１分（２２）時点にて、生成物がカラムから溶離した。生成物を含有するフラクションを捕集し、プールし、溶媒を蒸発除去した。
【０１２６】
従来の九配位座α−ガラクトースＥｕ−キレート（２１）は、"ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１"に従って作製した。
【０１２７】
精製した生成物を水中に溶解し、ＵＶスペクトル、Ｅｕ標準物質と突き合わせたときのＤＥＬＦＩＡ（登録商標）のＥｕ含量、およびＶｉｃｔｏｒ（商標）Ｐｌａｔｅ蛍光光度計による水中でのルミネセンスシグナルに関して分析した。ルミネセンスの測定においては、化合物２０と２２の濃度を、Ｅｕ含量に基づいて等モルに調整した。
【０１２８】
【表１】
0005818990.tif 000025
【０１２９】
これらの結果から、化合物２０は、対照標準化合物と比較して驚くほど高い（３００％以上高い）ルミネセンス効率をもたらすことがわかる。抗体に結合した九配位座α−ガラクトースＥｕ−キレート（化合物２１）に対する、従来報告されているルミネセンス効率（εΦ）は４，７８７である（ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１）。化合物２２に対するルミネセンス効率が同じであると仮定することによって、化合物２０に対するルミネセンス効率を、εΦ＝６３３，０００／１９５，０００×４，７８７＝約１５，５００であると推定することができる。この値は、生体分子を標識付けするための反応性基をさらに有するキレートに対しこれまで報告された最も高いルミネセンス効率の１つである。
【０１３０】
実施例１７．  化合物１９による抗体の標識付け
Ｔｎ１抗体の標識付けは、９０倍過剰の化合物１９を使用することによって、"ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１"に記載のように行った。反応は室温で一晩行った。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いてトリス−食塩水−アジド緩衝液（５０ｍＭトリス，０．９％ＮａＣｌ，ｐＨ７．７５）を溶離液として使用することにより、標識付け抗体を過剰の化合物１９から分離した。抗体を含有するフラクションをプールし、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）Ｐｌａｔｅ蛍光光度計を使用して、ユーロピウムの濃度を、Ｅｕ標準物質と突き合わせて測定した。１．６Ｅｕ／ＩｇＧの標識化度が得られた。
【０１３１】
実施例１８．  トロポニンＩのイムノアッセイ
化合物１９で標識付けしたＴｎ１抗体を、心筋トロポニンＩ用のサンドイッチイムノアッセイにて試験した。対照標準化合物としては、化合物２１で標識付けしたＴｎ１抗体（標識化度１１Ｅｕ／ＩｇＧ）を使用した。１０μｌの希釈トレーサー抗体（５ｎｇ／μｌ）と２０μｌのＴｎ１標準溶液を、プレコートしたアッセイウェル（９６ウェルフォーマットにて単一ウェル、Ｔｎ１抗体に対してストレプタビジンとビオチニル化捕捉抗体でコーティングしたウェル、Ｉｎｎｏｔｒａｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）にピペットで入れた。反応混合物を、振とうしながら３６℃にて２０分インキュベートした。ウェルを６回洗浄し、乾燥させてからＶｉｃｔｏｒ（商標）Ｐｌａｔｅ蛍光光度計で測定した。得られた結果を表２に示す。対照標準ＡとＢは１２回の繰り返しにて、そして他の対照標準Ｃ〜Ｆは６回の繰り返しにて測定した。
【０１３２】
【表２】
0005818990.tif 000026
【０１３３】
これらの結果から、化合物１９は、対照標準化合物（２１）と比較したときに、１／１０量のキレート／ＩｇＧで同じシグナルレベルをもたらす、ということがわかる。言い換えると、本発明の化合物は、最新の対照標準化合物より一桁分高いルミネセンスシグナル／キレートをもたらす。
【０１３４】
見解
本発明のキレートは九座（ランタニドに対して最適）であり、３つの独立した発色団を有する。したがって、２つの独立した発色団を有する、現在使用されている九座キレートと比較して５０％高いルミネセンスをもたらすはずである。２つ又は３つの発色団を有する他の公知のキレート（例えば、ＮＯＴＡやＤＯＴＡをベースとする構造）と比較して、本発明のキレートは、発光イオンのすぐ近くにあるＣＨ２基がより少ない。したがって、Ｃ−Ｈ結合の振動エネルギーマニホルドを介してのイオンルミネセンスの非発光クエンチングがそれほど重大ではなく、このためルミネセンスがより強まるはずである。さらに、配位子は、非環式の九座キレートであるので、ランタニドイオンと錯体形成したときに全く立体障害がない。その場合には、発光ランタニドイオンとピリジン窒素との間の距離が、１）供与体ピリジン窒素からランタニドイオンへの効率的なエネルギー伝達のために、そして２）高い錯体安定性のために最適となり、したがってルミネセンスの増大をもたらす。本発明のキレートは、３つの発色団を有する他のＤＯＴＡベースのキレートと比較して合成がより簡単である。本発明のキレートの３つの発色団は、互いに全く異なっていてもよく、このことは、より多くのバリエーションが可能であること、および調整の適応性（例えば、種々の溶媒に対する溶解性、種々の励起波長、およびエネルギー伝達等）がより高いことを意味する。安価で小型のＬＥＤを使用して標識化生体分子を励起させることができる。したがって、より小型でより安価な工業向けのバイオアッセイ用機器を使用することができる。本発明のキレートによる配位子場は、約６１５ｎｍにて他の輝線を凌ぐ輝線強度をきわだたせ、したがって観察されるルミネセンスは、他のキレートと比較して改良されるはずである。発色団の対称性が高められているので、ルミネセンス効率が増大すると推定される。
【０１３５】
驚くべきことに、観察されたルミネセンスは、現在使用されているキレートと比較して約３００％高かった。想定していたのは約５０〜７０％の改良であった。このことは、現在のアッセイ感度と比較して、本発明者らのアッセイ感度を約３倍向上させることが可能である、ということを意味している。
【０１３６】
実施例１９．  トリエチル２，２’，２”−（（４−ヨード−１，３，５−フェニレン）トリス（オキシ））トリアセテート（２３）の合成
４−ヨード−１，３，５−トリヒドロキシベンゼン（３．４１ｇ，１３．５ミリモル；Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９９１，４５，５３９）、乾燥Ｋ２ＣＯ３（６．１７ｇ，４４．７ミリモル）、ブロモ酢酸エチル（４．９６ｍｌ，４４．７ミリモル）、および乾燥ＭｅＣＮ（１００ｍｌ）の混合物を５５℃で一晩撹拌した。混合物を濾過し、固体物質をＭｅＣＮで洗浄し、濾液から溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そしてＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（最初は０：１００、次いで２０：８０）を溶離液として使用して、生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量０．６４ｇ（９％）。
【０１３７】
【化２４】
0005818990.tif 000027
【０１３８】
実施例２０．  トリエチル２，２’，２”−（（４−（トリメチルシリル）エチニル−１，３，５−フェニレン）トリス（オキシ））トリアセテート（２４）の合成
この化合物２４は、実施例１１に記載の合成と類似の方法を使用して化合物２３から合成した。マイクロ波加熱を使用することによって、混合物を最初は１００℃で３０分、次いで１２０℃で２０分撹拌した。混合物をＥｔ２Ｏ（５０ｍｌ）で抽出し、Ｈ２Ｏ（２×２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、次いでシリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（最初は２０：８０、次いで３０：７０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率７０％。
【０１３９】
【化２５】
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【０１４０】
実施例２１．  トリエチル２，２’，２”−（（４−エチニル−１，３，５−フェニレン）トリス（オキシ））トリアセテート（２５）の合成
本化合物２５は、実施例１２に記載の合成と類似の方法を使用して化合物２４から合成した。１０％クエン酸とＨ２Ｏで洗浄した後、生成物（１００％）を、さらなる精製を行うことなく次の工程に使用した。
【０１４１】
【化２６】
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【０１４２】
実施例２２．  ジエチル２，２’−（１，３−フェニレンビス（スルファンジイル））ジアセテート（２６）の合成
ベンゼン−１，３−ジチオール（０．７６ｇ，４ミリモル）、乾燥Ｋ２ＣＯ３（２．２１ｇ，１６ミリモル）、ブロモ酢酸エチル（０．９３ｍｌ，８．４ミリモル）、および乾燥ＭｅＣＮ（２０ｍｌ）の混合物を、アルゴン雰囲気下にて５５℃で一晩撹拌した。本混合物を濾過し、固体物質をＭｅＣＮで洗浄し、濾液から溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そしてＣＨ２Ｃｌ２を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収量０．９６ｇ（７６％）。
【０１４３】
【化２７】
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【０１４４】
実施例２３．  ジエチル２，２’−（４−ブロモ−１，３−フェニレンビス（スルファンジイル））ジアセテート（２７）の合成
化合物２６（０．６４ｇ，２．０４ミリモル）とＮ−ブロモスクシンイミド（０．４７ｇ，２．６６ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）中に溶解して得た混合物を室温で４日撹拌した。溶媒を蒸発除去した後、シリカゲルを固定相として、そして石油エーテル：ＣＨ２Ｃｌ２（２０：８０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収量０．５０ｇ（６３％）。
【０１４５】
【化２８】
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【０１４６】
実施例２４．  ジエチル２，２’−（４−（トリメチルシリル）エチニル−１，３−フェニレンビス（スルファンジイル））ジアセテート（２８）の合成
本化合物２８は、実施例１１に記載の合成と類似の方法を使用して化合物２７から合成した。マイクロ波加熱を使用することによって、混合物を１００℃で３０分撹拌した。溶媒を蒸発除去した後、シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（最初は１０：９０、次いで２０：８０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率８２％。
【０１４７】
【化２９】
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【０１４８】
実施例２５．  ジエチル２，２’−（４−エチニル−１，３−フェニレンビス（スルファンジイル））ジアセテート（２９）の合成
本化合物２９は、実施例１２に記載の合成と類似の方法を使用して化合物２８から合成した。１０％クエン酸とＨ２Ｏで洗浄した後、シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（最初は１０：９０、そして最後は１５：８５）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率４１％。
【０１４９】
【化３０】
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【０１５０】
実施例２６．  エチル２−（（４−ブロモフェニル）チオ）アセテート（３０）の合成
４−ブロモチオフェノール（０．９５ｇ，５ミリモル）、乾燥Ｋ２ＣＯ３（１．３８ｇ，１０ミリモル）、ブロモ酢酸エチル（０．７２ｍｌ，６．５ミリモル）、および乾燥ＭｅＣＮ（２０ｍｌ）の混合物を、アルゴン雰囲気下にて室温で３日間撹拌した。混合物を濾過し、固体物質をＭｅＣＮで洗浄し、濾液から溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（最初は２：９８、次いで７：９３）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収量１．２２ｇ（８８％）。
【０１５１】
【化３１】
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【０１５２】
実施例２７．  エチル２−（（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）チオ）アセテート（３１）の合成
本化合物３１は、実施例１１に記載の合成と類似の方法を使用して化合物３０から合成した。
マイクロ波加熱を使用することによって、混合物を１２０℃で４０分撹拌した。溶媒を蒸発除去した後、シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（１０：９０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率８８％。
【０１５３】
【化３２】
0005818990.tif 000035
【０１５４】
実施例２８．  エチル２−（（４−エチニルフェニル）チオ）アセテート（３２）の合成
本化合物３２は、実施例１２に記載の合成と類似の方法を使用して化合物３１から合成した。１０％クエン酸とＨ２Ｏで洗浄した後、シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（最初は５：９５、次いで１０：９０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率６８％。
【０１５５】
【化３３】
0005818990.tif 000036
【０１５６】
実施例２９．  Ｎ−（４−エチニルフェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（３３）の合成
４−エチニルアニリン（１．３８ｇ，１１．８ミリモル）を、氷冷した（ＣＦ３ＣＯ）２Ｏ（６．６ｍｌ）中に少量ずつ加えた。氷浴中にて１０分撹拌した後、混合物を室温で２．５時間撹拌した。本混合物を氷水（１００ｍｌ）中に注ぎ込み、生成物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗浄した。得られた生成物（２．２９ｇ，９１％）を、さらなる精製を行うことなく次の工程に使用した。
【０１５７】
【化３４】
0005818990.tif 000037
【０１５８】
実施例３０．  Ｎ−（４−（（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イル）エチニル）フェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（３４）の合成
化合物３３（０．５５ｇ，２．５８ミリモル）と６−ブロモ−２，６−ジヒドロキシメチルピリジン（０．４７ｇ，２．１５ミリモル；Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９８８，Ｓｅｒ  Ｂ，４２，６１４）を乾燥トリエチルアミン（５ｍｌ）と乾燥テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）中に溶解して得た混合物をアルゴンで脱気した。ビス（トリフェニルホスフィン）−塩化パラジウム（ＩＩ）（３０ｍｇ，４３μモル）とＣｕＩ（１６ｍｇ，８６μモル）を加えた後、混合物を５５℃で１９時間撹拌した。溶媒を蒸発除去した後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）とＨ２Ｏ（２０ｍｌ）との低温混合物で処理し、濾過し、生成物（０．５６ｇ，７５％）を低温のＨ２Ｏ（１０ｍｌ）とＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）で洗浄した。収量０．５６ｇ（７５％）。
【０１５９】
【化３５】
0005818990.tif 000038
【０１６０】
実施例３１．  Ｎ−（４−（（２，６−ビス（ブロモメチル）ピリジン−４−イル）エチニル）フェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（３５）の合成
化合物３４（０．５６ｇ，１．６ミリモル）をＣＨＣｌ３（６５ｍｌ）中に混合して得た懸濁液にＰＢｒ３（２２５μｌ）を加えた。６０℃で２０時間撹拌した後、混合物を５％ＮａＨＣＯ３（３５ｍｌ）で中和した。水相をＣＨＣｌ３（４０ｍｌ）で抽出し、有機相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去した。得られた生成物を、さらなる精製を行うことなく次の工程に使用した。
【０１６１】
【化３６】
0005818990.tif 000039
【０１６２】
実施例３２．  ジエチル６，６’−（（（（４−（（４−トリフルオロアセトアミドフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−ブロモピコリネート）（３６）の合成
本化合物３６は、実施例４に記載の合成と類似の方法を使用して化合物３４から合成した。７０℃での反応時間は２７時間であった。シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（１：６９：３０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率６６％。
【０１６３】
【化３７】
0005818990.tif 000040
【０１６４】
実施例３３．  化合物３７の合成
化合物３６（１２０ｇ，０．１４８ミリモル）と化合物２５（１４５ｍｇ，０．３５５ミリモル）を乾燥トリエチルアミン（１ｍｌ）と乾燥テトラヒドロフラン（２ｍｌ）中に混合して得た混合物をアルゴンで脱気した。ビス（トリフェニルホスフィン）塩化パラジウム（ＩＩ）（１０ｍｇ，１４μｌ）とＣｕＩ（６ｍｇ，２８μモル）を加えた後、混合物を５５℃で２２時間撹拌した。溶媒を蒸発除去した後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（１：６９：３０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収量１１５ｍｇ（４７％）。
【０１６５】
【化３８】
0005818990.tif 000041
【０１６６】
実施例３４．  化合物３８の合成
本化合物３８は、実施例３３に記載の合成と類似の方法を使用して化合物３６と２９から合成した。シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（１：６９：３０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率８５％。
【０１６７】
【化３９】
0005818990.tif 000042
【０１６８】
実施例３５．  化合物３９の合成
本化合物３９は、実施例３３に記載の合成と類似の方法を使用して化合物３６と３２から合成した。シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（１：６９：３０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率８１％。
【０１６９】
【化４０】
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【０１７０】
実施例３６．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート４０の合成
化合物３７（１０５ｍｇ，６３μモル）とＫＯＨの０．５Ｍエタノール溶液（９ｍｌ）との混合物を室温で３０分撹拌し、水（２ｍｌ）を加えた。室温で３時間撹拌した後、ＥｔＯＨを蒸発除去し、残留物を室温で３０分撹拌し、６ＭのＨＣｌでｐＨを約６．５に調整した。塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）（２３ｍｇ，６３μモル）をＨ２Ｏ（０．１７ｍｌ）中に溶解して得た溶液を１０分以内に加え、固体ＮａＨＣＯ３でｐＨを５〜７に維持した。室温で一晩撹拌した後、１ＭのＮａＯＨでｐＨを８．５に上げ、沈殿物を遠心分離し、上澄み液をフェノールで抽出した（０．７５ｇで１回、そして０．５ｇで３回）。フェノール相を合わせてＨ２Ｏ（１ｍｌ）とＥｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で処理し、アセトンですりつぶした。沈殿物を遠心分離し、アセトンで洗浄した。生成物を、さらなる精製を行うことなく次の工程に使用した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１４．５分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３５９ｎｍ。
【０１７１】
実施例３７．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート４１の合成
本化合物４１は、実施例３６に記載の合成と類似の方法を使用して化合物３８から合成した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１７．３分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３１８，３２５および３５０（ｓｈ）ｎｍ。
【０１７２】
実施例３８．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート４２の合成
本化合物４２は、実施例３６に記載の合成と類似の方法を使用して化合物３９から合成した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２１．５分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３４９ｎｍ。
【０１７３】
実施例３９．  ユーロピウム（ＩＩＩ）標識付けキレート４３の合成
本化合物４３は、実施例１５に記載の合成と類似の方法を使用してキレート４０から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２０．９分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３２５（ｓｈ）、３４０、および３６２（ｓｈ）ｎｍ。
【０１７４】
実施例４０．  ユーロピウム（ＩＩＩ）標識付けキレート４４の合成
本化合物４４は、実施例１５に記載の合成と類似の方法を使用してキレート４１から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２３．３分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３０５（ｓｈ）、３１８、および３３５（ｓｈ）ｎｍ。
【０１７５】
実施例４１．  ユーロピウム（ＩＩＩ）標識付けキレート４５の合成
本化合物４５は、実施例１５に記載の合成と類似の方法を使用してキレート４２から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２７．９分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３３９ｎｍ。
【０１７６】
実施例４２．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート４６の合成
本化合物４６は、実施例１６に記載の合成と類似の方法を使用してキレート４３から合成した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１４．３分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３４９ｎｍ。
【０１７７】
実施例４３．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート４７の合成
本化合物４７は、実施例１６に記載の合成と類似の方法を使用してキレート４４から合成した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１７．２分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３４９および３２４（ｓｈ）ｎｍ。
【０１７８】
実施例４４．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート４８の合成
本化合物４８は、実施例１６に記載の合成と類似の方法を使用してキレート４５から合成した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２０．５分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３３６ｎｍ。
【０１７９】
実施例４５．  エチル２−（（４−（フラン−２−イル）−６−（カルボキシエチル）−ピリジン−２−イル）メチレンニトリロ−アセテート４９の合成
本化合物４９は、実施例３に記載の合成と類似の方法を使用して４−（フラン−２−イル）−６−ブロモメチル−２−カルボキシエチルピリジン（ＷＯ２００５／０２１５３８）から合成した。シリカゲルを固定相として、そしてメタノール：ＣＨ２Ｃｌ２（５：９５）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。
【０１８０】
【化４１】
0005818990.tif 000044
【０１８１】
実施例４６．  エチル２−（（４−（チオフェン−２−イル）−６−（カルボキシエチル）−ピリジン−２−イル）メチレンニトリロ−アセテート５０の合成
本化合物５０は、実施例３に記載の合成と類似の方法を使用して４−（チオフェン−２−イル）−６−ブロモメチル−２−カルボキシエチルピリジン（ＷＯ２００５／０２１５３８）から合成した。シリカゲルを固定相として、そしてメタノール：ＣＨ２Ｃｌ２（５：９５）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。
【０１８２】
【化４２】
0005818990.tif 000045
【０１８３】
実施例４７．  ジエチル６，６’−（（（（４−ブロモピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−フラン−２−イル）ピコリネート）５１の合成
化合物４９（０．１６ｇ，０．４８ミリモル）、２，６−ジブロモメチル−４−ブロモピリジン（８３ｍｇ，０．２４ミリモル；Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９８８，Ｓｅｒ  Ｂ，４２，６１４）、乾燥Ｋ２ＣＯ３（０．１３ｇ，０．９６ミリモル）、および乾燥ＭｅＣＮ（８ｍｌ）の混合物を５５℃で４．５時間撹拌した。反応混合物を濾過し、固体物質をＭｅＣＮで洗浄し、濾液から溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（１：６９：３０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収量０．１９ｇ（９５％）。
【０１８４】
【化４３】
0005818990.tif 000046
【０１８５】
実施例４８．  ジエチル６，６’−（（（（４−ブロモピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−チオフェン−２−イル）ピコリネート）５２の合成
本化合物５２は、実施例４７に記載の合成と類似の方法を使用して化合物５０から合成した。シリカゲルを固定相として、そしてエタノール：ＣＨ２Ｃｌ２（２：９８から１５：８５までの勾配）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収率５０％。
【０１８６】
【化４４】
0005818990.tif 000047
【０１８７】
実施例４９．  ジエチル６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−フラン−２−イル）ピコリネート）５３の合成
化合物５１（０．１８ｇ，０．２１ミリモル）と４−エチニルアニリン（３０ｍｇ，０．２６ミリモル）を乾燥トリエチルアミン（１ｍｌ）と乾燥テトラヒドロフラン（２ｍｌ）中に溶解して得た混合物をアルゴンで脱気した。ビス（トリフェニルホスフィン）塩化パラジウム（ＩＩ）（１０ｍｇ，１４μモル）とＣｕＩ（６ｍｇ，２８μモル）を加えた後、混合物を５５℃で２０時間撹拌した。溶媒を蒸発除去した後、シリカゲルを固定相として、そしてトリエチルアミン：酢酸エチル：石油エーテル（最初は１：６９：３０、次いで１：７９：２０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。収量０．１４ｇ（７４％）。
【０１８８】
【化４５】
0005818990.tif 000048
【０１８９】
実施例５０．  ジエチル６，６’−（（（（４−（（４−アミノフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−チオフェン−２−イル）ピコリネート）５４の合成
本化合物５４は、実施例４９に記載の合成と類似の方法を使用して化合物５２から合成した。収率５０％。
【０１９０】
【化４６】
0005818990.tif 000049
【０１９１】
実施例５１．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート５５の合成
化合物５３（０．１３ｇ，０．１４３ミリモル）とＫＯＨの０．５Ｍエタノール溶液（９ｍｌ）との混合物を室温で３０分撹拌し、水（１ｍｌ）を加えた。室温で３時間撹拌した後、ＥｔＯＨを蒸発除去した。Ｈ２Ｏ（３ｍｌ）を加えた後、混合物を室温で３時間撹拌し、６ＭのＨＣｌでｐＨを約６．５に調整した。塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）（５２ｍｇ，０．１４３ミリモル）をＨ２Ｏ（０．３９ｍｌ）中に溶解して得た溶液を１０分以内に加え、固体ＮａＨＣＯ３でｐＨを５〜７に維持した。室温で一晩撹拌した後、１ＭのＮａＯＨでｐＨを８．５に上げた。本溶液にテトラヒドロフランを入れてこすり、沈殿物を遠心分離し、テトラヒドロフランで洗浄した。得られた生成物を、さらなる精製を行うことなく次の工程に使用した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２４．９分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３２３および３５５（ｓｈ）ｎｍ。
【０１９２】
【化４７】
0005818990.tif 000050
【０１９３】
実施例５２．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート５６の合成
本化合物５６は、実施例５１に記載の合成と類似の方法を使用して化合物５４から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２６．３分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３２５および３５６（ｓｈ）ｎｍ。
【０１９４】
【化４８】
0005818990.tif 000051
【０１９５】
実施例５３．  ユーロピウム（ＩＩＩ）標識付けキレート５７の合成
本化合物５７は、実施例１５に記載の合成と類似の方法を使用して化合物５５から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝３３．４分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３２５ｎｍ。
【０１９６】
【化４９】
0005818990.tif 000052
【０１９７】
実施例５４．  ユーロピウム（ＩＩＩ）標識付けキレート５８の合成
本化合物５８は、実施例１５に記載の合成と類似の方法を使用して化合物５６から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝３４．７分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３２５ｎｍ。
【０１９８】
【化５０】
0005818990.tif 000053
【０１９９】
実施例５５．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート５９の合成
本化合物５９は、実施例１６に記載の合成と類似の方法を使用してキレート５７から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２３．２分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３２１ｎｍ。
【０２００】
実施例５６．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート６０の合成
本化合物６０は、実施例１６に記載の合成と類似の方法を使用してキレート５８から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２４．９分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３２２ｎｍ。
【０２０１】
実施例５７．  ジエチル２，２’−（（４−ブロモ−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ジアセテート（６１）の合成
４−ブロモレゾルシノール（１．００ｇ，５．２９ミリモル）をＤＭＦ（２０ｍｌ，乾燥）中に溶解した。無水Ｋ２ＣＯ３（４．３９ｇ，３１．７４ミリモル）とブロモ酢酸エチル（２．３０ｍｌ，１５．８７モリモル）を加えた。混合物をアルゴン雰囲気下にて４０℃で一晩撹拌した。水（３０ｍｌ）を加え、混合物を酢酸エチル（１×２０ｍｌ，２×１０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせて水（２×１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。シリカゲルを固定相として、そしてジクロロメタンを溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収量１．７０ｇ（８９％）。
【０２０２】
【化５１】
0005818990.tif 000054
【０２０３】
実施例５８．  ジエチル２，２’−（（４−トリメチルシリル）エチニル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ジアセテート（６２）の合成
化合物６１（１．５６ｇ，４．３３ミリモル）をＤＭＦ（３ｍｌ，乾燥）中に溶解し、本溶液をマイクロ波反応バイアル中に入れた。ジエチルアミン（９ｍｌ，乾燥）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１５２．０ｍｇ，０．２１７ミリモル）、ＣｕＩ（４１．２ｍｇ，０．２１７ミリモル）、およびＰＰｈ３（１１３．６ｍｇ，０．４３３ミリモル）を加え、バイアルをアルゴン雰囲気にて密閉した。セプタムを介してトリメチルシリルアセチレン（９２５μｌ，６．５０ミリモル）を４加え、マイクロ波加熱を使用して混合物を１００℃で３０分撹拌した。ジクロロメタンを溶離液として使用して、シリカゲルを介して反応混合物を濾過し、濾液から溶媒を蒸発除去した。粗生成物をジクロロメタン中に溶解し、シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（１０：９０）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収量０．９９ｇ（６１％）。
【０２０４】
【化５２】
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【０２０５】
実施例５９．  ジエチル２，２’−（（４−エチニル−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ジアセテート（６３）の合成
化合物６２（３９８．９ｍｇ，１．０５４ミリモル）をジクロロメタン（１０ｍｌ，乾燥）中に溶解した。フッ化テトラブチルアンモニウム（３３０．７ｍｇ，１．２６５ミリモル）を加え、混合物を、アルゴン雰囲気中にて室温で１．５時間撹拌した。混合物を１０％クエン酸溶液（５ｍｌ）と水（４×１０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発除去した。シリカゲルを固定相として、そして酢酸エチル：石油エーテル（１５：８５）を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収量２５９．２ｍｇ（８０％）。
【０２０６】
【化５３】
0005818990.tif 000056
【０２０７】
実施例６０．  Ｎ−（４−ブロモ−３−メトキシフェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（６４）の合成
４−ブロモ−３−メトキシアニリン（２．００ｇ，９．９０ミリモル）をＴＨＦ（１５ｍｌ）中に溶解した。本溶液を氷冷したトリフルオロ酢酸無水物（１５ｍｌ，１０７．８ミリモル）に加え、混合物を氷浴にて２０分撹拌した。混合物を氷水中に注ぎ込み、撹拌を１０分続けた。混合物をジクロロメタン（２×２０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせて５％ＮａＨＣＯ３（５×４０ｍｌ）と水（３０ｍｌ）で洗浄した。洗浄した有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去した。本生成物（３．０８ｇ，＞９９％）を、さらなる精製を行うことなく使用した。
【０２０８】
実施例６１．  Ｎ−（４−ブロモ−３−ヒドロキシフェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（６５）の合成
本化合物６５は、実施例９に記載の合成と類似の方法を使用して化合物６４（３．０８ｇ，１０ミリモル）から合成した。収量０．５１ｇ（１７％）。
【０２０９】
【化５４】
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【０２１０】
実施例６２．  エチル２−（２−ブロモ−５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェノキシ）アセテート（６６）の合成
本化合物６６は、実施例１０記載の合成と類似の方法を使用して化合物６５（０．５１ｇ，１．７８ミリモル）から合成した。ＣＨ３ＣＮを溶媒として使用した。４０℃での反応時間は１８時間であった。収量０．４７ｇ（７１％）。
【０２１１】
【化５５】
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【０２１２】
実施例６３．  エチル２−（５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−２−（（トリメチルシリル）エチニル）フェノキシ）アセテート（６７）の合成
本化合物６７は、実施例１１に記載の合成と類似の方法を使用して化合物６６（０．４６ｇ，１．２４ミリモル）から合成した。マイクロ波加熱における１００℃での反応時間は３０分であった。収量０．３７ｇ（７７％）。
【０２１３】
【化５６】
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【０２１４】
実施例６４．  エチル２−（２−エチニル−５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェノキシ）アセテート（６８）の合成
本化合物６８は、実施例１２に記載の合成と類似の方法を使用して化合物６７（０．３７ｇ，０．９６ミリモル）から合成した。収量０．３０ｇ（９９％）。
【０２１５】
実施例６５．  エチル２−（２−（（２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン−４−イル）エチニル）−５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェノキシ）アセテート（６９）の合成
本化合物６９は、実施例３０に記載の合成と類似の方法を使用して化合物６８（０．３７ｇ，０．９６ミリモル）から合成した。収量０．１９ｇ（４４％）。
【０２１６】
実施例６６．  エチル２−（２−（（２，６−ビス（ブロモメチル）ピリジン−４−イル）エチニル）−５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェノキシ）アセテート（７０）の合成
本化合物７０は、実施例３１に記載の合成と類似の方法を使用して化合物６９（０．１９ｇ，０．４２ミリモル）から合成した。収量０．２２ｇ（９０％）。
【０２１７】
【化５７】
0005818990.tif 000060
【０２１８】
実施例６７．  ジエチル６，６’−（（（（４−（（２−（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）−４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジイル）ビス（メチレン））ビス（（２−エトキシ−２−オキソエチル）アザンジイル））ビス（メチレン））ビス（４−ブロモピコリネート）（７１）の合成
本化合物７１は、実施例４に記載の合成と類似の方法を使用して化合物７０（０．１９ｇ，０．４２ミリモル）と化合物５（０．２５ｇ，０．７３ミリモル）から合成した。５５℃での反応時間は２０時間であった。収量０．２３ｇ（５７％）。
【０２１９】
【化５８】
0005818990.tif 000061
【０２２０】
実施例６８．  化合物７２の合成
本化合物７２は、実施例３３記載の合成と類似の方法を使用して化合物７１（０．１１ｇ，０．１０ミリモル）と化合物６３（７５ｍｇ，０．２５ミリモル）から合成した。収量１４０ｍｇ（８７％）。
【０２２１】
実施例６９．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート７３の合成
本化合物７３は、実施例３６に記載の合成と類似の方法を使用して化合物７２（０．１４ｇ，０．０９ミリモル）から合成した。本生成物を、さらなる精製を行うことなく次の工程に使用した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１４．５分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３５０ｎｍ。
【０２２２】
実施例７０．  ユーロピウム（ＩＩＩ）標識付けキレート７４の合成
本化合物７４は、実施例１５に記載の合成と類似の方法を使用して化合物７３（０．１ｇ，０．０７ミリモル）から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１８．７分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３４０ｎｍ。
【０２２３】
実施例７１．  ユーロピウム（ＩＩＩ）キレート７５の合成
本化合物７５は、実施例１６に記載の合成と類似の方法を使用して化合物７４から合成した。ＨＰＬＣ実験に対する条件：実施例１６を参照。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１４．５分。ＵＶ／ＶＩＳ＝３５１ｎｍ。
【０２２４】
実施例７２．  タウリンと共役した新規キレート（キレート１９、４６、４７、４８、５９、および７５）の光物理的特性
作製したイソチオシアネート活性化キレート（１９、４３、４４、４５、５７、および７５）を、実施例１６に記載のようにタウリンと共役させた。生成物を半分取逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８カラム）で精製した。生成物フラクションから溶媒を蒸発除去し、残留物を５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中に溶解した。
【０２２５】
測定された光物理的特性〔５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．７５）中における新規キレート（１９、４６、４８、および５９）の励起波長（λｅｘｃ）、ルミネセンス減衰時間（τ）、モル吸光係数（ε）、および推定ルミネセンス効率（εΦ）〕を表３に示す。
【０２２６】
【表３】
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【０２２７】
励起エリアが広いことを示すために、キレート４６、４８、および７５の励起極大をFigure 1に、そしてキレート１９、４７、５９、および６０の励起極大をFigure 2に示す。これらの結果は、安価なＬＥＤをベースとする励起可能性（excitation possibilities）を使用できる可能性をもたらす。
【０２２８】
実施例７３．  キレート１９、４３、４５、および７４による抗体の標識付け
Ｔｎ１標識化抗体を実施例１７に記載のように作製した。
【０２２９】
測定された光物理的特性〔５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．７５）中における、キレート１９、４３、４５、および７４による標識化ｃＴｎ１の励起波長（λｅｘｃ）、ルミネセンス減衰時間（τ）、モル吸光係数（ε）、およびルミネセンス効率（εΦ）〕を表４に示す。
【０２３０】
乾燥測定値〔１９（乾燥）、４３（乾燥）、４５（乾燥）、および７４（乾燥）〕は、実施例１８に記載のように行われたドライイムノアッセイ後のシグナル測定値に基づいた推定ルミネセンス効率を示す。
【０２３１】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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