(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結された免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列の同族対のライブラリーを生成する方法であって、
ａ）げっ歯類ドナー由来のリンパ球を含んでなる細胞画分を提供すること、
ｂ）前記細胞画分由来の細胞の富化された集団を個々に複数の容器に分配することにより、単離された単一細胞を入手すること、ここに、前記富化された集団は、ＣＤ４３＋ＣＤ１３８＋細胞について富化されており、
ｃ）工程ｂ）の単離された単一細胞に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順で、免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を増幅し、そして増幅されたヌクレオチド配列の連結を行うことによって、連結された免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列の同族対のライブラリーを生成すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程ｃの増幅および連結を実施する前に、前記単離された単一細胞が、同遺伝子型細胞の集団に拡大培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リンパ球を含んでなる細胞画分が、脾細胞、全血液、骨髄、単核細胞、および白血球細胞からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リンパ球を含んでなる細胞画分が骨髄から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
リンパ球を含んでなる細胞画分が脾細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記富化された集団が、形質細胞または形質芽細胞について富化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
複数の非隣接ヌクレオチド配列を無作為に連結する方法であって、ここに、前記ヌクレオチド配列が免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、連結が、連結された免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列の対のコンビナトリアルライブラリーを生じるものであり、
ａ）げっ歯類ドナー由来のリンパ球を含んでなる細胞画分に由来する細胞の富化された集団を提供すること、ここに、前記細胞の富化された集団は、遺伝的に多様であり、かつ、ＣＤ４３＋ＣＤ１３８＋細胞について富化されており、
ｂ）前記細胞の富化された集団に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順で、前記免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を増幅すること、および
ｃ）工程ｂ）で増幅したヌクレオチド配列の連結を行うこと
を含んでなる、方法。
【請求項８】
細胞の富化された集団がＭＨＣＩＩ＋Ｂ２２０＋である細胞について富化されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞の富化された集団が、リンパ球を含んでなる細胞画分に関してＣＤ１３８高／ＣＤ４３高またはＣＤ１３８中／ＣＤ４３高である細胞について富化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
富化された集団が、磁気ビーズ細胞選別（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）であってもよい自動選別手順によって得られる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ドナーがマウスである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ドナーがヒトイムノグロブリンを発現するトランスジェニックマウスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多重分子増幅手順が多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、多重ＰＣＲ増幅の前の個別の逆転写（ＲＴ）工程を含んでなる２工程プロセスであるか、または前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、逆転写（ＲＴ）および多重ＰＣＲ増幅の両方を実施するのに必要なすべての成分を単一の容器に添加することを含んでなる単一の工程において実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列の連結が、多重分子増幅と同じ容器において実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド配列の連結が、多重重複伸長プライマー混合物を利用して、多重ＰＣＲ増幅に関連して行われる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
連結された核酸配列を増幅するために適応されたプライマー混合物を利用して、さらなる分子増幅が実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
多重重複伸長プライマー混合物が、
ａ）免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列のセンス鎖に相補的な少なくとも１つのｍＫａｐｐａ１またはｈｍＪＫプライマー、および
ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列または軽鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつ工程ａ）におけるプライマーと共にプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのｍＶＫプライマー、および
ｃ）免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列のセンス鎖に相補的な少なくとも１つのｍＣＨｒｅｖ１、ｍＨＣｒｅｖ１−ｅｘｔ、またはｍＪＨプライマー、および
ｄ）免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列または重鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつ工程ｃ）におけるプライマーと共にプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのｍＶＨプライマー
を含んでなる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記連結されたヌクレオチド配列をベクターに挿入することをさらに含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記連結されたヌクレオチド配列が、１つもしくはそれ以上の免疫グロブリン定常領域ドメインまたはそれらのフラグメントをコードする配列を含むベクターにインフレームで挿入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
目的の標的特異性を伴う免疫グロブリンをコードする連結された免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列のサブセットを選択することによってサブライブラリーを作製し、それにより、標的特異的な連結された免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列のライブラリーを作製することをさらに含んでなる、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターが哺乳動物発現ベクターである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物発現ベクターが、ヒト免疫グロブリンクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、κ軽鎖およびλ軽鎖からなる群から選択された１つもしくはそれ以上の定常領域ドメインをコードする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程、
ａ）前記ベクターを宿主細胞に導入すること
ｂ）発現のために適応された条件下で、前記宿主細胞を培養すること、
ｃ）前記宿主細胞に導入されたベクターから発現されるタンパク質産物を入手すること
をさらに含んでなる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質産物が、重鎖可変領域と会合した軽鎖可変領域の同族対を含んでなる抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト定常領域およびげっ歯類可変領域を伴うキメラ抗体をコードするベクターを作製するための方法であって、
ａ）げっ歯類ドナー由来のリンパ球を含んでなる細胞画分を提供すること、
ｂ）前記細胞画分由来の細胞の富化された集団を個々に複数の容器に分配することにより、単離された単一細胞を入手すること、ここに、前記富化された集団は、ＣＤ４３＋ＣＤ１３８＋細胞について富化されており、
ｃ）前記単離された単一細胞または前記単離された単一細胞から拡大培養された同遺伝子型細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順で、免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を増幅し、そして増幅された免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列の連結を行うこと、
ｄ）前記増幅された免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列の、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするヌクレオチド配列への連結を行うこと、次いで、
ｅ）工程ｄ）において得られたヌクレオチド配列をベクターに挿入して新規なベクターを作成すること、ここに、前記新規なベクターが、ヒト定常領域およびげっ歯類可変領域を有するキメラ抗体をコードする、
を含んでなる、方法。
【請求項２７】
前記多重分子増幅手順が多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、多重ＰＣＲ増幅の前の個別の逆転写（ＲＴ）工程を含んでなる２工程プロセスであるか、または前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、最初に、逆転写（ＲＴ）および多重ＰＣＲ増幅の両方を実施するのに必要なすべての成分を単一の容器に添加することを含んでなる単一の工程において実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレオチド配列の連結が、多重分子増幅と同じ容器において実施される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヌクレオチド配列の連結が、多重重複伸長プライマー混合物を利用して、多重ＰＣＲ増幅に関連して行われる、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
非ヒト可変軽鎖への連結を提供することが可能な重複を伴うヒト定常軽鎖またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、マウスＶＨ鎖、リンカー、マウスＶＬ鎖、およびヒト定常軽鎖をこの順序で含んでなる構築物の増幅が可能なプライマーセットと共に、ＰＣＲ混合物に添加される増幅工程、または
非ヒト可変重鎖への連結を提供することが可能な重複を伴うヒト定常重鎖またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、ヒト定常重鎖、マウスＶＨ鎖、リンカー、およびマウスＶＬ鎖をこの順序で含んでなる構築物の増幅が可能なプライマーセットと共に、ＰＣＲ混合物に添加される増幅工程をさらに含んでなる、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
連結された免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列の単一の同族対を生成する方法であって、
ａ）げっ歯類ドナー由来のリンパ球を含んでなる細胞画分を提供すること、
ｂ）前記細胞画分を個々に複数の容器に分配することにより、単離された単一のＣＤ４３＋ＣＤ１３８＋細胞を得ること、
ｃ）工程ｂ）の単離された単一のＣＤ４３＋ＣＤ１３８＋細胞に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順で、免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を増幅し、そして増幅されたヌクレオチド配列の連結を行うことによって、連結された免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列の単一の同族対を生成すること
を含んでなる、方法。
【請求項３３】
リンパ球を含んでなる細胞画分が、脾細胞、全血液、骨髄、単核細胞、および白血球細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記単離された単一のＣＤ４３＋ＣＤ１３８＋細胞が、リンパ球を含んでなる細胞画分に関してＣＤ１３８高／ＣＤ４３高またはＣＤ１３８中／ＣＤ４３高である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ドナーがマウスである、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の表面抗原マーカーにおいて富化された細胞の集団由来のＶＨおよびＶＬをコードする配列の同族対を連結するための手順に関する。連結手順は、増幅、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（多重ＰＣＲ）に関連して、目的のヌクレオチド配列を連結することが可能な多重分子増幅手順に関与する。本方法は、同族対ライブラリー、ならびに免疫グロブリン由来の可変領域をコードする配列のコンビナトリアルライブラリーの作製に特に有利である。本発明はまた、キメラヒト／非ヒト抗体の作製のための方法、およびそのような方法によって作製される発現ライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１（Symphogen）は、重複分子手順を使用して、目的のヌクレオチド配列、特に、ＶＨおよびＶＬをコードする配列の同族対を連結するための方法について開示している。目的の配列は、好ましくは、制限希釈または他の細胞分離技術に従って、単離された単一細胞から増幅および連結される。参考文献は、リンパ球を含有する細胞集団を富化して、多重分子増幅手順に特に安定な形質細胞の細胞集団を入手する様々な方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 2005/042774
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、非ヒト動物から免疫グロブリンをコードする配列のライブラリーを作製するための方法、ならびにハイスループットクローニングおよびスクリーニングのために適応された少数の工程で、ヒト定常領域および非ヒト可変領域を含んでなるキメラ抗体をコードするベクターのライブラリーを作製するための方法に焦点を当てている。
【０００５】
第１の態様では、本発明は連結された可変領域をコードするコーディング配列を含んでなる同族対のライブラリーを生成する方法に関し、前記方法は、
ａ）ドナー由来のリンパ球を含んでなる細胞画分を提供すること、
ｂ）単離された単一細胞の集団を入手すること、該入手は、前記細胞画分由来の細胞を、個々に複数の容器に分配することを含んでなり、細胞の少なくともサブ集団は、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原を発現するものであり、次いで、
ｃ）単離された単一細胞または同遺伝子型細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順で目的のヌクレオチド配列を増幅し、そして増幅された目的のヌクレオチド配列の連結を行うことによって、単離された単一細胞の前記集団に含有される可変領域をコードする配列の増幅および連結を行うこと
を含んでなる。
【０００６】
この方法は、同族対抗体または抗体フラグメントのライブラリーを提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、複数の目的の非隣接ヌクレオチド配列を無作為に連結する方法に関し、前記方法は、
ａ）遺伝的に多様な細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順でヌクレオチド配列を増幅すること、
ｂ）遺伝的に多様な細胞は、ドナー由来のリンパ球を含んでなる細胞画分に由来するものであり、
ｃ）細胞の少なくともサブ集団は、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原を発現するものであり、次いで、
ｄ）工程ａ）において増幅した目的のヌクレオチド配列の連結を行うこと
を含んでなる。
【０００８】
この方法は、無作為に組み合わされた重鎖および軽鎖可変ドメインのコンビナトリアルライブラリーを提供する。
【０００９】
本出願において提供される実験的証拠は、マウス脾細胞から単離され、そして列挙した表面抗原についてポジティブである細胞集団が、多重分子増幅方法を使用する抗体をコードする配列のクローニングのための良好な出発物質を提供することを確立する。本発明の方法は、ＣＤ４３およびＣＤ１３８またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０のオーソログを発現する他の種に容易に適用することができ、特に、本方法は、ラットのような他のげっ歯類に適用することができる。
【００１０】
本方法は、代替物、換言すると、ハイブリドーマの作製に優るいくらかの利点を提供する。免疫したマウスからハイブリドーマを調製する場合、樹立された細胞系統は、異なる抗体アイソタイプのレパートリーをコードする。ハイブリドーマ細胞系統は、続いて、機能（例えば、特異的抗原への結合性、病原体を中和する効力）および抗体アイソタイプの両方についてスクリーニングしなければならない。それ故、それは、特定の抗体アイソタイプおよび機能アッセイにおける特定の効果を伴うハイブリドーマを選択するための２工程スクリーニング手順を必要とする。最終的に、産生細胞系統を作製するために、選択されるハイブリドーマによって分泌される抗体は、それを産生細胞系統に移行し得る前に、クローニングおよび配列決定する必要がある。
【００１１】
本発明の方法を使用すれば、抗体アイソタイプは、多重分子増幅に使用したプライマーによって決定されるため、従って、この先これを決定する必要がない。抗体アイソタイプはまた、定常ドメインのクローニングされた可変配列への以後の連結またはスプライシングによって、決定してもよい（そして変更することができる）。さらに加えて、本発明の方法は、一旦、特定の抗体が選択されたら、それは既にクローニングされており、その配列は既に既知であり、そしてそれは抗体の産生のために適切な発現ベクターに容易に移行させることができるような、容易に配列決定し、および／または発現、移行、ディスプレイもしくはシャトルベクターのようなベクターに挿入することができるポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
【００１２】
提供されたプロトコルに従って選別された細胞は、ピコモル範囲のアフィニティーを伴う高アフィニティー抗体の供給源を提供することが予想される。ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は、ピコモル範囲のアフィニティーを所有せず、そしてこれらのアフィニティーに到達するように、合成的にアフィニティー変異させる必要がある。
【００１３】
一実施形態に従えば、これらの方法は、多重分子増幅の前に、リンパ球を含んでなる細胞の集団が、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原、好ましくは、ＣＤ４３およびＣＤ１３８を発現することを評価することをさらに含んでなる。また、本方法は、多重分子増幅の前に、前記リンパ球を含んでなる細胞画分を、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０を発現するリンパ球集団について富化することを含んでもよい。
【００１４】
好ましくは、本方法は、多重分子増幅の前に、前記リンパ球を含んでなる集団から、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原を発現する細胞を単離することをさらに含んでなる。好適な実施形態では、単離された細胞または細胞のサブ集団は、リンパ球を含んでなる細胞画分に関してＣＤ１３８高／ＣＤ４３高またはＣＤ１３８中／ＣＤ４３高である。より好ましくは、単離された細胞または細胞のサブ集団は、リンパ球を含んでなる細胞画分に関してＣＤ１３８高／ＣＤ４３高である。
【００１５】
富化または単離は、好ましくは、ＭＡＣＳもしくはＦＡＣＳのような自動選別手順を含んでなる。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、ヒト定常領域および非ヒト可変領域を伴うキメラ抗体をコードするベクターを作製するための方法に関し、前記方法は、
ａ）非ヒト動物由来のリンパ球を含んでなる細胞画分を提供すること、
ｂ）単離された単一細胞の集団を入手すること、該入手は、前記細胞画分由来の細胞を、個々に複数の容器に分配することを含んでなること、
ｃ）単離された単一細胞または同遺伝子型細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、前記核酸を多重分子増幅手順で増幅し、そして重鎖および軽鎖の可変領域をコードする増幅された核酸の連結を行うことによって、単離された単一細胞の前記集団に含有される可変領域をコードする核酸の増幅および連結を行うこと、
ｄ）増幅された可変領域のヒト定常領域への連結を行うこと、次いで、
ｅ）得られた核酸をベクターに挿入すること
を含んでなる。
【００１７】
好ましくは、非ヒト動物はマウスである。本発明の方法がマウス細胞に適用される点で、本方法は、マウス−SymplexTMまたはmSymplexTMと命名される。
【００１８】
本発明のこの態様によって、キメラヒト／非ヒト抗体のライブラリーの作製のための新規の方法が提供される。これは、多重分子増幅、ならびにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのライゲーションおよび／またはスプライシングを伴うベクター骨格への以後のクローニングを組み合わせることによって、可能にされる。伝統的に、キメラヒト／非ヒト抗体を作製するための方法では、キメラ化は、ハイブリドーマが樹立およびスクリーニングされ、そしてコードされた抗体がクローニングされた後の最後の工程であった。キメラ化は、結合特異性および／または抗体のアフィニティーに影響を及ぼし得、それ故、良好なモノクローナルマウス抗体がヒト／マウス抗体にキメラ化される場合、その効力を消失する危険性が存在する。
【００１９】
キメラ抗体の抗体を直接作製する方法によれば、前臨床および臨床開発前に、さらに改変する必要がない産物に対するスクリーニングを行うことができる。
【００２０】
定常ヒト領域は、分子増幅工程で提供することができるか、またはそれらは、分子増幅後に可変領域がクローニングされるベクター骨格として提供することができる。好適な実施形態では、本方法は、可変軽鎖への連結を提供することが可能な重複を伴うヒト定常軽鎖またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、マウスＶＨ鎖、リンカー、マウスＶＬ鎖、およびヒト定常軽鎖をこの順序で含んでなる構築物の増幅が可能なプライマーセットと共に、ＰＣＲ混合物に添加されるさらなる増幅工程を含んでなる。
【００２１】
別の実施形態では、本方法は、可変重鎖への連結を提供することが可能な重複を伴うヒト定常重鎖またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、ヒト定常重鎖、マウスＶＨ鎖、リンカー、およびマウスＶＬ鎖をこの順序で含んでなる構築物の増幅が可能なプライマーセットと共に、ＰＣＲ混合物に添加されるさらなる増幅工程を含んでなる。
【００２２】
結果的に、キメラ抗体をコードするベクターのライブラリーであって、各抗体メンバーは、非ヒト免疫グロブリン可変領域をコードする配列、ならびにヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖定常領域からなる、ライブラリーもまた提供される。
【００２３】
好ましくは、ベクターは、以後のスクリーニングのためのライブラリーの抗体メンバーの発現を可能にする発現ベクターである。より好ましくは、発現ベクターは、哺乳動物発現のためのものである。
【００２４】
ライブラリーのベクターは、本発明の方法によって入手してもよい。
【００２５】
一実施形態では、軽鎖定常領域はκ定常領域である。
【００２６】
非ヒト配列は、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、または免疫プロトコルが説明されている、適切なプライマーの設計を可能にするための配列情報が入手可能である、および可変領域配列の同族対を連結するために、適切な細胞選別技術が、単一細胞超服分子増幅のための形質細胞の選別を可能にする他の適切な動物由来であってもよい。一実施形態では、非ヒト配列は、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー、またはマクァク（ｍａｑａｑｕｅ）のような非ヒト霊長類由来である。好ましくは、非ヒト配列は、マウスまたはラットのようなげっ歯類である。別の実施形態では、非ヒト配列はウサギ配列である。
【００２７】
好ましくは、抗体の可変領域は同族対である。
【００２８】
もう１つの態様では、本発明は、本発明に従うライブラリーから選択される特定の標的に対する所望の結合特性を示す抗体をコードするサブライブラリーに関連する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】マウス−mSymplexTMＰＣＲ：単一細胞由来の重鎖および軽鎖抗体遺伝子の増幅ならびに同族連結のための多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ。ＲＴ−ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲに使用される例示的プライマーについては、表２および表３（または表５）において詳細に説明する。
【図２】マウスレパートリークローニング：重複伸長によるスプライシングによって、単一の形質細胞由来のＶＨ／ＶＬ遺伝子対をコードするmSymplexTMＰＣＲ産物のプールをスプライシングして、ヒトκ定常軽鎖をコードする遺伝子を得た。完全なヒト−マウスキメラ抗体をコードする遺伝子のプールを、発現ベクターに挿入し、続いて、両方向性プロモーターカセット（２×ＣＭＶ）を挿入した。ヒトκスプライシングに使用されるプライマー混合物については、表６において詳細に説明する。
【図３Ａ】マウス脾細胞の選別。（Ａ）ＣＤ４３高、ＣＤ１３８高として定義された形質細胞を単離するために、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）ポジティブまたは死細胞を、左下パネルにおいて排除した（非Ｐ１）。次いで、形質細胞を、右下パネルにおいて、ＣＤ４３高、ＣＤ１３８高としてゲートした（Ｐ２）。最後に、右上パネルのＳＳＣ−Ｈ、ＳＳＣ−Ｗプロットにおいて、ダブレットを排除した（Ｐ３）。３つのすべてのゲートについてポジティブな細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに選別した。
【図３Ｂ】マウス脾細胞の選別。（Ｂ）ＭＨＣＩＩ中、Ｂ２２０中として定義された形質芽細胞を単離するために、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）ポジティブまたは死細胞を、左下パネルにおいて排除した（非Ｐ１）。次いで、形質芽細胞を、ＭＨＣＩＩ中、Ｂ２２０中としてゲートした、右下パネル（Ｐ２）。右上パネルのＳＳＣ−Ｈ、ＳＳＣ−Ｗプロットにおいて、ダブレットを排除し（Ｐ３）、最後に、左上パネルにおいて、細胞をサイズについてゲートした（Ｐ４）。４つのすべてのゲートについてポジティブな細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに選別した。
【図４】マウス脾細胞の選別。最初に、左下パネルにおいて、ＰＩポジティブまたは死細胞を排除した（Ｐ１）。右上のドットプロットでは、ＣＤ１３８ＰＥおよびＣＤ４３ＦＩＴＣを示す。４つのゲートを、異なる表現型の細胞集団に対して設定した。Ｐ２は、ＣＤ１３８中、ＣＤ４３高である。Ｐ３はＣＤ１３８高、ＣＤ４３高である。Ｐ４はＣＤ１３８高、Ｃｄ４３ネガティブである。Ｐ５は、ＣＤ１３８中、ＣＤ４３低である。Ｐ１および４つのゲートのそれぞれについてポジティブな１０，０００個の細胞を、試験チューブに選別し、そしてsymplexによる評価のために凍結した。
【図５】４つの選別された画分由来の細胞ライセートのSymplexＰＣＲ滴定由来のＰＣＲ産物のゲル電気泳動。Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５を、図４に従ってゲート選別する。Ｍは分子量マーカーである。
【図６】哺乳動物の全長抗体発現ベクター００−ＶＰ−００２の略図。ＡｍｐおよびＡｍｐ  ｐｒｏ、アンピシリン耐性遺伝子およびそのプロモーター；ｐＵＣ起点、ｐＵＣの複製開始点；ＣＭＶ、軽鎖および重鎖の発現を誘導する哺乳動物プロモーター；ＩＧＨＶリーダー、ゲノムヒト重鎖リーダー、Ｈスタッファー、重鎖可変領域をコードする配列のために交換される挿入物；ＩＧＨＧ１、ゲノム免疫グロブリンアイソタイプＧ１重鎖定常領域（配列を、付録１に示す）をコードする配列；ウサギβ−グロビンＡ、ウサギβ−グロビンポリＡ配列；ＩＧＫＶリーダー、マウスκリーダー；Ｌスタッファー、軽鎖をコードする配列のために交換される挿入物；ＳＶ４０ｔｅｒｍ、シミアンウイルス４０ターミネーター配列；ＦＲＴ、Ｆｌｐ認識標的部位；Ｎｅｏ、ネオマイシン耐性遺伝子；ＳＶ４０ポリＡ、シミアンウイルス４０ポリＡシグナル配列。
【図７】キメラ抗−ｈＥＧＦＲ抗体のレパートリーの解析。４５０〜６２０ｎｍにおける吸光度差のクラスター分析。クローン番号の後の数字（１〜４）によって示される反応性によって、上清をクラスター化する。暗灰色は、代謝活性細胞の数の増加を示すが、一方、明灰色は、代謝活性細胞の数の増加を示す。黒色は、代謝活性細胞の数に影響を及ぼさない上清を示す。
【００３０】
本発明は、非ヒト動物由来の抗体ベクターのコレクションを提供するためにWO 2005/042774において開示された増幅および連結方法を使用するさらなる可能性を提供する。これらの改善は、ハイスループット形式に適合すべき可変領域の同族対を伴うヒト／非ヒトキメラ抗体をコードする配列のクローニングを可能にする。これは、増幅および連結プロセスのための新たな出発物質を提供することによって、および可変領域の同族対を伴うキメラヒト／非ヒト抗体のライブラリーの作製のための方法を提供することによって、基本的に達成される。
【００３１】
本発明の一態様は、単離された単一細胞、同遺伝子型細胞の集団または遺伝的に多様な細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順で関連ヌクレオチド配列を増幅し、そして増幅された配列の以後の連結を行うことを含んでなる、重鎖および軽鎖可変配列を連結する方法である。
【００３２】
定義
用語「同族対」（cognate pair）は、単一細胞内に含有されるか、またはそれに由来する目的の非隣接核酸の本来の対をいう。好適な実施形態では、同族対は、結合タンパク質可変ドメインを共にコードする可変領域をコードする２つの配列を含んでなり、そしてその遺伝子配列は、同じ細胞に由来する。それ故、完全な結合タンパク質またはその安定なフラグメントとして発現される場合、それらは、この細胞から本来発現される結合タンパク質の結合アフィニティーおよび特異性を保存する。同族対は、例えば、同じ細胞由来の可変軽鎖をコードする配列と会合した抗体可変重鎖をコードする配列、または同じ細胞由来のβ鎖をコードする配列と会合したＴ細胞受容体α鎖をコードする配列からなり得る。同族対のライブラリーは、そのような同族対のコレクションである。
【００３３】
用語「ホットスタートポリメラーゼ」は、不活性であるか、または逆転写に使用される温度において極めて低い活性を有するポリメラーゼをいう。そのようなポリメラーゼは、機能的にするために高温（９０〜９５℃）で活性化する必要がある。これは、逆転写酵素反応によるポリメラーゼの干渉を阻止するため、これは、例えば、単一工程ＲＴ−ＰＣＲ手順において有利である。
【００３４】
用語「細胞の同遺伝子型集団」は、遺伝的に同一な細胞の集団をいう。特に、単離された単一細胞のクローンの拡大によって誘導される細胞の同遺伝子型集団は、本発明において興味深い。
【００３５】
用語「単離された単一細胞」は、「単一の容器において単一の細胞」に対応する細胞の集団から物理的に分離されている細胞をいう。複数の容器の間で細胞の集団を個々に分配する場合、単離された単一細胞の集団が得られる。表題「テンプレート供給源」のセクションにおいて指摘するように、単一細胞を伴う容器の割合は、単一細胞の集団と呼ばれるためには必ずしも１００％である必要はない。
【００３６】
増幅に関して「連結（ｌｉｎｋ）」または「連結（ｌｉｎｋａｇｅ）」から派生する用語は、目的の核酸配列をコードする増幅された核酸配列の単一セグメントへの会合をいう。同族対に関して、セグメントは、可変ドメイン、例えば、同じ細胞から誘導された抗体軽鎖可変領域をコードする配列と会合した抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列を含んでなる。連結は、増幅と同時か、または増幅直後の工程のいずれかとして、達成することができる。セグメントの形態または機能性に対する要件はなく、それは、線状、環状、一本鎖または二本鎖であってもよい。連結は必ずしも恒久的でなくてもよく、所望であれば、目的の核酸配列の１つは、セグメントから単離してもよく、可変領域をコードする配列の１つは、例えば、同族対セグメントから単離してもよい。しかし、同族対を構成する本来の可変領域が、他の可変領域とスクランブリングされない限り、共に単一のセグメントに連結されていなくても、それらはなお同族対と考えられる。連結は、好ましくは、ヌクレオチドホスホジエステル連結である。しかし、連結はまた、異なる化学交差連結手順によって得ることができる。
【００３７】
用語「多重分子増幅」は、同じ反応における２つもしくはそれ以上の標的配列の同時増幅をいう。適切な増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)(U.S. 4,683,202）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、（Wu and Wallace, 1989, Genomics 4, 560-9）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）技術（Walker et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20, 1691-6）、自己支持配列複製（Guatelli et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 87, 1874-8）および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃompton J., 1991, Nature 350, 91-2）が挙げられる。後者の２つの増幅方法は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を産生する等温転写に基づく等温反応に関与する。
【００３８】
用語「多重ＰＣＲ」は、同じ反応におけるプライマーの２つ以上のセット、例えば、同じＰＣＲ反応における重鎖可変領域の増幅に適応された１つのプライマーセットおよびκ鎖可変領域の増幅に適応された１つのプライマーセットを含むことによって、２つもしくはそれ以上の標的配列が同時に増幅されるＰＣＲの変種をいう。さらに、または代替的に、λ鎖可変領域の増幅に適応されるプライマーセットを、これらのプライマーと組み合わせてもよい。
【００３９】
用語「多重ＲＴ−ＰＣＲ」は、逆転写（ＲＴ）工程より先に行われる多重ＰＣＲ反応をいう。多重ＲＴ−ＰＣＲは、多重ＰＣＲの前の個別のＲＴ工程による２工程プロセスとしてか、または単一工程プロセスのいずれかとして実施することができ、ＲＴおよび多重ＰＣＲの両方のすべての成分が単一のチューブに組み合わされる。
【００４０】
用語「多重重複伸長ＰＣＲ」および「多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ」は、多重ＰＣＲまたは多重ＲＴ−ＰＣＲを、多重重複伸長プライマー混合物を利用して行い、標的配列を増幅し、それによって、標的配列の同時増幅および連結を可能にすることを意味する。
【００４１】
用語「複数の容器」は、細胞の集団からの単一細胞の物理的分離を可能にする任意の物体（または物体のコレクション）をいう。これは、チューブ、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェル、３８４ウェル、マイクロタイタープレートまたは他のマルチウェルプレート）、アレイ、マイクロアレイ、マイクロチップ、ゲル、またはゲルマトリックスであってもよい。好ましくは、物体はＰＣＲ増幅に適用可能である。
【００４２】
本明細書において使用する用語「ポリクローナルタンパク質」または「多クローン性」は、異なるが相同なタンパク質分子を含んでなるタンパク質組成物を指し、好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される。それ故、それぞれのタンパク質分子は、組成物の他の分子に相同であるが、しかしまた、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバー間のアミノ酸配列の差異によって特徴付けられる可変ポリペプチド配列の１つもしくはそれ以上のストレッチを含有する。そのようなポリクローナルタンパク質の既知の例として、抗体または免疫グロブリン分子、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体が挙げられる。ポリクローナルタンパク質は、所望される標的に対する共有された結合活性、例えば、所望される標的抗原に対して結合特異性を示すポリクローナル抗体のような共通の特徴によって定義されているタンパク質分子の定義されたサブセットよりなり得る。
【００４３】
本明細書において使用する用語「遺伝的に多様な細胞」は、集団における個々の細胞が、ゲノムレベルで相互に異なる細胞集団を指す。そのような遺伝的に多様な細胞の集団は、例えば、ドナーに由来する細胞の集団、またはそのような細胞の画分、例えば、Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球を含有する細胞画分である。
【００４４】
用語「プライマーセット」は、用語「プライマー対」と交換可能に使用され、そして共に、目的のヌクレオチド配列（即ち、同族対の一方のメンバー）の増幅をプライムすることが可能である２つもしくはそれ以上のプライマーをいう。本発明のプライマーセットは、可変領域をコードする配列を含有するヌクレオチド配列のファミリーをプライムするために設計され得る。異なるファミリーの例には、抗体κ軽鎖、λ軽鎖、重鎖可変領域、およびα、β、γまたはδ−Ｔ細胞受容体可変領域がある。可変領域をコードする配列を含有するヌクレオチド配列のファミリーの増幅のためのプライマーセットは、しばしば、複数のプライマーを構成し、いくらかのプライマーは縮重プライマーであり得る。
【００４５】
用語「配列同一性」は、２つの配列の最も短い長さにおける核酸配列間の同一性の程度を示す百分率として表される。それは、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）×１００％／Ｎｒｅｆ［式中、Ｎｒｅｆは、短い方の配列の残基の数であり、そして式中、Ｎｄｉｆは、２つの配列間で最適に整列されたＮｒｅｆ長における非同一残基の合計数である］として計算することができる。従って、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣ（配列番号３２）は、配列ＴＡＡＴＣＡＡＴＣＧＧ（配列番号３３）（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）（下線は、最適なアラインメントを示し、そして太字は８残基のうちの非同一残基を示す）と７５％の配列同一性を有する。
【００４６】
連結に関する用語「無作為に」または「無作為」は、同じ細胞から誘導されてはいないが、遺伝的に多様な細胞の集団の間を横切って連結されるヌクレオチド配列の連結を指す。目的のヌクレオチド配列が可変領域をコードする配列である場合、これは、連結された配列のコンビナトリアルライブラリーを生じる。これに対し、目的のヌクレオチド配列が非多様性ヘテロマータンパク質をコードする場合、無作為に連結された配列は、単一細胞から連結された配列に類似するようである。
【００４７】
逆転写に関する用語「単離された単一細胞に由来するテンプレート」は、そのような単離された細胞内の核酸に関する。核酸は、例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの形態であり得る。核酸は、細胞から単離してもよく、または細胞の残りの含有物と共になお存在し得、細胞は、無傷（ｉｎｔａｃｔ）な形態または溶解された形態である。
【００４８】
用語「ＣＤ４３」は、３Ｅ８抗原、Ａ６３００１４Ｂ０１Ｒｉｋ、Ｂ細胞分化抗原ＬＰ−３、Ｃｄ４３、ＣＤ４３抗原、Ｇａｌｇｐ、白血球シアロ糖タンパク質、ロイコシアリン、ロイコシアリン前駆体、Ｌｙ４８、Ｌｙ−４８、シアロホリンを含む多数の同義語下で公知のマウス表面抗原、ならびに他の動物由来のオーソロガスな表面マーカーを指す。
【００４９】
用語「ＣＤ１３８」は、シンデカン−１、ＡＡ４０８１３４、ＡＡ４０９０７６、ＣＤ１３８、ｓｙｎ−１、Ｓｙｎｄ、Ｓｙｎｄ１、ＳＹＮＤ１、Ｓｙｎｄ−１、シンデカン−１前駆体を含む多数の同義語下で公知のマウス表面抗原、ならびに他の動物由来のオーソロガスな表面マーカーを指す。
【００５０】
用語「ＭＨＣＩＩ」は、ＣＤ７４抗原、ＣＬＩＰ、ＤＨＬＡＧ、Ｈ−２クラスＩＩ組織適合性抗原γ鎖、ＨＬＡＤＧ、ＨＬＡ−ＤＲ−γ、Ｉａ抗原関連インバリアント鎖、Ｉａ−γ、Ｉｉ、ＭＨＣクラスＩＩ関連インバリアント鎖を含む多数の同義語下で公知のマウス表面抗原、ならびに他の動物由来のオーソロガスな表面マーカーを指す。
【００５１】
用語「Ｂ２２０」は、Ｂ２２０、Ｃｄ４５、ＣＤ４５、ＣＤ４５抗原、ＣＤ４５Ｒ、Ｌ−ＣＡ、白血球共通抗原前駆体、ｌｏｃ、Ｌｙ−５、リンパ球共通抗原Ｌｙ−５、Ｌｙｔ−４、Ｔ２００を含む多数の同義語下で公知のマウス表面抗原、ならびに他の動物由来のオーソロガスな表面マーカーを指す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
増幅および連結プロセス
本発明の１つの特徴は、プライマーの２つ以上のセット、例えば、同じ反応において可変領域をコードする配列を増幅するのに必要なすべてのプライマーを含むことによって、同じチューブにおいて２つもしくはそれ以上の標的配列が同時に増幅されるＰＣＲの変種を利用して、目的のヌクレオチド配列を増幅するのに必要なチューブの数を減少する。一般的に、このアプローチは、多重ポリメラーゼ連鎖反応（多重ＰＣＲ）として公知である。
【００５３】
本発明のさらなる特徴は、多重ＰＣＲによって増幅される２つもしくはそれ以上の標的配列が増幅プロセスの極近傍で連結されることである。特に、可変領域をコードする配列の同族対が、このプロセスによって連結される。
【００５４】
本発明の一実施形態は、多重プライマー混合物を、多重伸長ＰＣＲ手順において作用するように設計し、目的のヌクレオチド配列の同時増幅および連結を生じ得ることを活用する。この多重重複伸長ＰＣＲ技術は、目的のヌクレオチド配列、特に、連結された可変領域の同族対を単離および連結するのに必要な反応の数を減少する役割を果たす。
【００５５】
本発明の他の実施形態は、多重重複伸長ＰＣＲによる連結に対する代替物として、ライゲーションまたは組み換えによる連結を適用する。これらの手順では、連結は、多重ＰＣＲ増幅と同時には実施されないが、増幅直後の工程として実施される。しかし、連結は、多重ＰＣＲが実施された同じチューブにおいてやはり実施することができる。
【００５６】
多重重複伸長ＰＣＲは、２つもしくはそれ以上のプライマーセット（多重プライマー混合物）の存在を必要とし、各セットの少なくとも１つのプライマーに重複伸長テイルが備え付けられる。重複伸長テイルは、増幅中のプライマーセットのそれぞれによって作製される産物の連結を可能にする。そのようなプライマー混合物は、多重重複伸長プライマー混合物と呼ばれる。多重重複伸長ＰＣＲは、連結しようとする配列が同じチューブにおいて同時に作製され、それによって、何ら中間的精製を伴わずに、増幅中に標的配列の即時連結を提供する点で、従来の重複伸長ＰＣＲと異なる。
【００５７】
本発明のさらなる特徴は、単離された細胞または同遺伝子型細胞の集団に由来するテンプレートを利用する多重ＰＣＲまたは多重重複伸長ＰＣＲ増幅より前の逆転写（ＲＴ）工程である。
【００５８】
本発明のさらなる特徴は、多重ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして単離された細胞または同遺伝子型細胞の集団に由来するヌクレオチド配列の使用である。好ましくは、単一細胞由来のＲＮＡが、多重ＰＣＲの前にｃＤＮＡに逆転写される。目的のいくつかの核酸配列の増幅のために、ゲノムＤＮＡを、ｍＲＮＡの代替物として使用してもよい。テンプレートの供給源として、単離された単一細胞のクローンの拡大によって誘導される単離された単一細胞または同遺伝子型細胞の集団を使用することによって、細胞の集団内の異なる細胞に由来するヌクレオチド配列による目的のヘテロマータンパク質をコードするヌクレオチド配列のスクランブリングを回避することが可能である。目的の配列の本来の組成物を入手することを所望する場合、これは重要である。特に、可変領域をコードする配列の同族対の作製では、テンプレートの供給源としての単離された細胞または同遺伝子型細胞の集団の使用は、重要な特徴である。
【００５９】
さらに、本発明は、目的の連結された核酸配列のライブラリー、特に、コンビナトリアルライブラリー、および可変領域の同族対のライブラリーの作製を容易にする。さらに、本発明は、好ましくは、それをテンプレートとして利用し得る前に、残存する細胞内容物から単離する必要がないＲＮＡの形態で、単一細胞に由来する核酸を利用する。
【００６０】
本発明の一実施形態は、目的の複数の非隣接ヌクレオチド配列の連結を包含する。本方法は、単離された細胞または同遺伝子型細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、多重ＰＣＲまたは多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅手順で目的のヌクレオチド配列を増幅し、そして目的の増幅されたヌクレオチド配列の連結を行うことを含んでなる。さらに、本方法は、連結された産物のさらなる増幅を実施する随意的工程を含んでなる。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態は、連結された可変領域をコードする配列を含んでなる同族対のライブラリーを生成する方法を包含する。本方法は、場合により、前記細胞画分から特定のリンパ球集団について富化されているか、または特定のリンパ球集団が前記細胞画分から単離されているドナー由来のリンパ球を含有する細胞画分を提供することを含んでなる。さらに、単離された単一細胞の集団は、リンパ球を含有する細胞画分、または富化された細胞画分由来の細胞を複数の容器の間で個々に分配することによって得られる。単離された単一細胞の集団に含有される可変領域をコードする配列の多重分子増幅（多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅）が実施され、そして可変領域をコードする配列の対の連結が行われ、可変領域配列の個々の対は、単離された単一細胞の集団内の単一細胞に由来する。さらに、技術は、２つの随意的工程を含んでなる。第１の工程では、単一細胞の集団における個々の単離された単一細胞を、多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施する前に、同遺伝子型細胞の集団に拡大培養する。それによって、同遺伝子型細胞の多様な集団を伴う複数の容器（１つの容器に１つの同遺伝子型細胞の集団）を入手する。第２の随意的工程は、連結された可変領域をコードする配列のさらなる増幅を実施することを含んでなる。
【００６２】
本発明の好適な実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列からなる同族対の前記ライブラリーの個々のメンバーは、β鎖可変領域と会合したα鎖可変領域、もしくはδ鎖可変領域と会合したγ鎖可変領域から構成される、同じ細胞由来、またはＴ細胞受容体結合ドメインをコードする配列の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列と会合され、会合された可変領域は同じ細胞由来である。
【００６３】
本発明の多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、２工程プロセス（ここで、逆転写（ＲＴ）は、多重ＰＣＲ増幅（もしくは代替的多重分子増幅）から個別に実施される）としてか、または単一工程プロセス（ここで、ＲＴおよび多重ＰＣＲ増幅工程は、１つのチューブにおいて同じプライマーで実施される）のいずれかとして実施することができる。
【００６４】
逆転写（ＲＴ）は、逆転写酵素活性を含有する酵素によって実施され、単離された単一細胞由来の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは標的特異的ＲＮＡのｃＤＮＡの作製を生じる。逆転写に利用することができるプライマーは、例えば、オリゴｄＴプライマー、ランダムヘキサマー、ランダムデカマー、他のランダムプライマー、または目的のヌクレオチド配列に特異的なプライマーである。
【００６５】
２工程多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅手順は、ＲＴ工程において作製されたｃＤＮＡが２つ以上の容器に分配されることを可能にし、増幅が進行する前のテンプレート画分の貯蔵を許容する。さらに、ｃＤＮＡの２つ以上のチューブへの分配は、同じテンプレートに由来する核酸の１回を超える多重ＰＣＲ増幅の実施を可能にする。これは、個別の反応の増加を生じるが、これを所望すべきである場合、それは、多重プライマー混合物の複雑性を減少する可能性を開く。この２つの工程アプローチは、例えば、同じテンプレートを利用して、１つのチューブにおける重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域をコードする配列、ならびに異なるチューブにおける重鎖可変領域およびλ軽鎖可変領域をコードする配列を増幅および連結ために適用することができる。単一の細胞は、通常、軽鎖のうちの１つのみを発現する。しかし、しばしば、一方の反応の結果を待ってから他方を実施するのではなく、反応を同時に実施する方が容易である。さらに、κまたはλのみが単一細胞から増幅することが予想されるため、κおよびλの両方の増幅は、内部ネガティブコントロールとして役立つ。
【００６６】
単一工程多重ＲＴ−ＰＣＲ手順では、逆転写および多重ＰＣＲ増幅は、同じ容器において行われる。最初に、単一工程において逆転写および多重ＰＣＲの両方を実施するのに必要なすべての成分を容器に添加し、そして反応を実施する。一般的に、一旦、反応が開始したら、さらなる成分を添加する必要はない。単一工程多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅の利点は、それが、本発明の連結されたヌクレオチド配列をなおさらに作製するのに必要な工程の数を減少することである。単一細胞のアレイにおいて多重ＲＴ−ＰＣＲを実施する場合、これは特に有用であり、同じ反応を複数の容器において行う必要がある。単一工程多重ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写のためのプライマーとして多重ＰＣＲ増幅に必要な多重プライマー混合物に存在する逆方向プライマーによっても実施される。一般的に、単一工程多重ＲＴ−ＰＣＲに必要な組成物は、核酸テンプレート、逆転写酵素活性を伴う酵素、ＤＮＡポリメラーゼ活性を伴う酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含んでなるｄＮＴＰ混合物）ならびに多重プライマー混合物を含んでなる。核酸テンプレートは、好ましくは、精製された形態で、細胞のライセートとして、またはなお無傷な細胞内のいずれかにおける単離された単一細胞に由来する全ＲＮＡまたはｍＲＮＡである。一般的に、反応混合物の正確な組成は、本発明によって使用すべき各多重プライマー混合物に対するいくつかの最適化を必要とする。これは、２工程および単一工程多重ＲＴ−ＰＣＲ手順の両方に当てはまる。
【００６７】
いくつかの単一工程多重ＲＴ−ＰＣＲ反応では、反応中にさらなる成分を添加することは有利であり得る。例えば、ＲＴ工程後のポリメラーゼの添加。他の成分は、例えば、ｄＮＴＰ混合物、またはおそらく異なるプライマー組成を伴う多重プライマー混合物であり得る。次いで、これは、１チューブ多重ＲＴ−ＰＣＲと考えることができ、それはまた、所望される連結された産物を得るのに必要なチューブの数を制限するため、一般的に、単一工程多重ＲＴ−ＰＣＲと同じ利点を有する。
【００６８】
多重ＲＴ−ＰＣＲによって増幅される目的のヌクレオチド配列は、異なる多重プライマー混合物を使用する多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ、ライゲーションまたは組み換えのようないくらかの方法によって、相互に連結させることができる。好ましくは、多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅および連結プロセスは、単一工程または２工程プロセスである。しかし、連結プロセスはまた、例えば、ＰＣＲ、ライゲーションまたは組み換えのいずれかによって目的の核酸配列を連結させるためのスタッファーフラグメントを使用して、多工程プロセスとして実施してもよい。そのようなスタッファーフラグメントは、ｃｉｓ−エレメント、プロモーターエレメントまたは関連コーディング配列もしくは認識配列を含んでもよい。好適な実施形態では、プロセスの連結は、多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅として同じ容器において実施される。
【００６９】
本発明の一実施形態では、目的の複数の非隣接ヌクレオチド配列の連結は、多重重複伸長プライマー混合物を利用する多重ＰＣＲ増幅と関連して実施される。これは、標的配列の組み合わされた増幅および連結を生じる。一般的に、多重重複伸長ＰＣＲに必要な組成物は、核酸テンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ活性を伴う酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含んでなるｄＮＴＰ混合物）ならびに多重重複伸長プライマー混合物を含んでなる。
【００７０】
本発明の特定の実施形態では、目的の複数の非隣接ヌクレオチド配列の連結は、単離された細胞または同遺伝子型細胞の集団に由来するテンプレートを使用する多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲを使用することによって、実施される。さらに、本方法は、連結された産物のさらなる分子増幅を実施する随意的工程を含んでなる。好ましくは、多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲは、単一工程／１チューブ反応として実施される。
【００７１】
本発明の多重重複伸長プライマー混合物は、少なくとも２つの可変領域をコードする配列の増幅および連結、例えば、κまたはλ軽鎖可変領域ファミリーを伴う免疫グロブリン重鎖可変領域ファミリー由来の配列の増幅および連結、またはＴ細胞受容体ファミリーα、β、γもしくはδ由来の配列の増幅および連結を許容することが可能な少なくとも２つのプライマーセットを含んでなる。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、多重ＲＴ−ＰＣＲによって増幅される目的の複数のヌクレオチド配列は、ライゲーションによって連結される。これを達成するために、多重ＲＴ−ＰＣＲに使用される多重プライマー混合物は、増幅された標的配列を適切な制限酵素で切断することができ、そしてＤＮＡライゲーションによる共有結合を実施することができるように設計される（プライマーの設計については、「プライマー混合物および設計」のセクションで説明する）。そのような多重プライマー混合物による多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅後、標的配列の適合可能な末端を形成するのに必要な制限酵素を、リガーゼと共に混合物を添加する。この工程の前にＰＣＲ産物を精製する必要はないが、精製を実施してもよい。組み合わせられた制限切断およびライゲーションのための反応温度は、約０〜４０℃の間である。しかし、多重ＰＣＲ反応由来のポリメラーゼがなお混合物に存在する場合、室温未満のインキュベーション温度が好適であり、４〜１６℃の間の温度が最も好適である。
【００７３】
本発明のなお別の実施形態では、多重ＲＴ−ＰＣＲによって増幅される目的の複数のヌクレオチド配列は、組み換えによって連結される。このアプローチでは、増幅される標的配列は、同一の組み換え部位を使用して、接続することができる。次いで、連結は、組み換えを容易にするリコンビナーゼを添加することによって実施される。いくつかの適切なリコンビナーゼ系は、多様なＦＲＴ部位を伴うＦｌｐリコンビナーゼ、多様なｌｏｘ部位を伴うＣｒｅリコンビナーゼ、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の組み換えを行うインテグラーゼφＣ３１、β−リコンビナーゼ−シックス（ｓｉｘ）システム、ならびにＧｉｎ−ｇｉｘシステムである。組み換えによる連結については、２つのヌクレオチド配列（ＶＬと連結したＶＨ）が例示されている（Chapal, N. et al. 1997 BioTechniques 23, 518-524）。
【００７４】
本発明の好適な実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、可変領域をコードする配列を含んでなり、そして連結は可変領域をコードする配列の同族対を生じる。そのような同族対は、可変領域に加えて、１つもしくはそれ以上の定常領域をコードする配列を含んでなり得る。好ましくは、定常領域はヒト由来であり、そして可変領域同族対は、マウス、ラット、またはウサギのような異なる起源由来である。
【００７５】
本発明のなおさらに好適な実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、免疫グロブリン可変領域をコードする配列を含んでなり、そして連結は軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする配列の同族対を生じる。そのような同族対は、可変領域に加えて、１つもしくはそれ以上の定常領域をコードする配列を含んでなり得る。さらに、そのような同族対は、全血、単核細胞または白血球細胞のようなリンパ球を含有する細胞画分から富化されるBリンパ球系統の細胞に由来するテンプレートから単離してもよい。
【００７６】
本発明の別の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、ＴｃＲ可変領域をコードする配列を含んでなり、そして連結は、α鎖可変領域およびβ鎖可変領域をコードする配列またはγ鎖可変領域およびδ鎖可変領域をコードする配列の同族対を生じる。そのような同族対は、可変領域に加えて、１つもしくはそれ以上の定常領域をコードする配列を含んでなり得る。さらに、そのような同族対は、全血、単核細胞または白血球細胞のようなリンパ球を含有する細胞画分から富化されるＴリンパ球系統の細胞に由来するテンプレートから単離してもよい。
【００７７】
本発明の別の態様は、テンプレートの供給源として遺伝的に多様な細胞の集団を伴う多重ＲＴ−ＰＣＲを利用することである。ヘテロマータンパク質をコードする配列の大部分は、結合タンパク質由来の可変領域をコードする配列の場合と同様に、細胞によって変動しない。それ故、そのような非可変ヘテロマータンパク質をコードする配列のコーディングのために本発明を利用する場合、単一細胞の最初の単離を実施する必要はない。
【００７８】
本発明のこの実施形態では、目的の複数の非隣接ヌクレオチド配列は、遺伝的に多様な細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、目的のヌクレオチド配列の多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施し、そして目的の増幅されたヌクレオチド配列の連結を行うことを含んでなる方法によって、無作為に連結される。さらに、本方法は、連結された産物のさらなる増幅を実施する工程の随意的工程を含んでなる。単一細胞アプローチの場合と同様に、連結は、増幅のための多重重複伸長プライマー混合物を利用するか、あるいはライゲーションまたは組み換えのいずれかによって、実施することができる。好ましくは、細胞の集団に由来するテンプレートは、厳密には細胞内に含有されない。細胞の集団は、例えば、溶解してもよい。
【００７９】
変種の結合タンパク質を発現する細胞の集団に対する無作為連結のプロセスの応用は、可変領域をコードする配列のコンビナトリアルライブラリーの単純化された作製を可能にする。好ましくは、細胞の集団は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ハイブリドーマ細胞、形質細胞、形質芽細胞、またはこれらの細胞の混合物のような可変領域結合タンパク質を発現する細胞を構成する。
【００８０】
上記の実施形態における細胞の集団は、例えば、さらなる精製を伴わずに透過性にするか、もしくは溶解することができ、またはテンプレート核酸は、標準的な手順によって細胞から単離することができる。単一工程重複ＲＴ−ＰＣＲ手順が好適である。しかし、２工程手順もまた、実施形態において使用され得る。
【００８１】
多重ＲＴ−ＰＣＲ−連結プロセスの特異性、感度、および収量を増加するための効率的方法は、多重ＲＴ−ＰＣＲから得られる連結されたヌクレオチド配列のさらなる分子増幅、続いて、ライゲーションもしくは組み換えによる連結、または多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲを使用する連結を実施することによる。このさらなる増幅は、好ましくは、目的の連結された核酸配列を増幅するために適応されたプライマー混合物を利用して、ＰＣＲ増幅によって実施される。利用されるプライマー混合物は、多重プライマー混合物または多重重複伸長プライマー混合物のアウタープライマーであってもよく、これは、連結された可変領域をコードする配列のセンス鎖の最も外側の５’末端および３’末端にアニールし、それによって連結された産物全体の増幅を可能にするプライマーを意味する。アウタープライマーはまた、重複伸長テイルを含有しない多重重複伸長プライマー混合物のプライマーとして説明することができる。あるいは、ネステッドまたはセミネステッドプライマーセットを、連結されたヌクレオチド配列のさらなる増幅のために使用することができる。そのようなネステッドＰＣＲは、特に、方法の特異性を増加する、ならびに連結された産物の量を増加する役割を果たす。本発明では、セミネステッドＰＣＲ（プライマー混合物および設計と表題されたセクションにおいて説明している）は、ネステッドＰＣＲと同程度に良好に機能すると考える。それ故、本発明のために必ずしも必要というわけではないが、多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ由来の連結された産物、またはライゲーションもしくは組み換えによって、好ましくは、ネステッドＰＣＲもしくはセミネステッドＰＣＲを使用して連結された産物のさらなるＰＣＲ増幅を実施することが所望される。
【００８２】
さらなる増幅は、直接、画分もしくは多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ反応産物全体もしくはライゲーション産物もしくは組み換え産物、もしくはこれらの産物のいずれか１つの画分を使用してか、またはこれらの反応のうちのいずれか１つから部分的に精製された連結された産物を使用するかのいずれかで、例えば、連結された産物のアガロースゲル電気泳動を実施し、そして連結された可変領域をコードする配列の予想されるサイズに対応するフラグメントを切り出すことによって、実施することができる。多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲによって連結された産物では、これは、第１の反応において連結しなかった個々の標的配列の連結を支援するため、さらなる増幅は、好ましくは、多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ反応由来の画分に対して直接実施される。
【００８３】
目的の配列
本発明の目的のヌクレオチド配列は、発現される場合、タンパク質もしくはタンパク質の部分を形成する異なるサブユニットまたはドメインをコードする配列から選択することができる。少なくとも２つの同一でないサブユニットからなるそのようなタンパク質は、ヘテロマータンパク質として公知である。ヘテロマータンパク質は、すべての種類の種において共通である。そのようなタンパク質が属するクラスのいくつかは、例えば、酵素、インヒビター、構造タンパク質、毒素、チャンネルタンパク質、Ｇタンパク質、受容体タンパク質、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質、輸送タンパク質などである。そのようなヘテロマータンパク質をコードするヌクレオチド配列は非隣接的であり、これは、例えば、それらが異なる遺伝子、または異なるｍＲＮＡ分子由来であることを意味する。しかし、本発明において使用する非隣接はまた、同じタンパク質のドメインをコードするヌクレオチド配列を意味してもよく、ドメインは、興味の対象ではないヌクレオチド配列によって分離される。
【００８４】
本発明の一実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、免疫グロブリン（抗体）、Ｂ細胞受容体およびＴ細胞受容体（ＴｃＲ）のような免疫グロブリンスーパーファミリー由来の可変領域をコードする配列を含有する。特に、免疫グロブリン由来の可変領域をコードする配列は興味深い。そのような可変領域をコードする配列は、全長抗体、ならびにＦａｂ’、Ｆｖ’、ｓｃＦｖ’および可変領域をコードする配列のフラグメントの組み合わせ、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）、連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）遺伝子もしくはＶ−遺伝子またはこれらの組み合わせを含んでなる。一般的に、本発明は、可変領域をコードする配列およびそれらのフラグメントの任意の組み合わせで適用することができる。本出願は、ＦｖまたはｓｃＦｖをコードする配列を生じる重鎖および軽鎖の可変ドメインのみの連結を可能にする。または、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２を生じる重鎖可変領域＋定常領域ドメインＣＨ１＋ヒンジ領域の部分を伴う軽鎖全体の連結。さらに、重鎖定常領域ドメインの任意の領域を可変重鎖に付加し、それによって、全長抗体をコードする配列または短縮された抗体をコードする配列を生じさせることが可能である。本発明の一態様では、非ヒト可変配列は、ヒト定常領域に連結されて、完全なキメラヒト/非ヒト抗体、好ましくは、ヒト定常領域を伴うキメラ抗体が作製される。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態では、可変領域をコードする配列は、１つのタイプの免疫グロブリン軽鎖（κまたはλ）をコードする配列および１つの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列を含んでなる。これは、軽鎖および重鎖のただ１つのアイソタイプを増幅するプライマーを選択することによって、達成される。アイソタイプはまた、重鎖および軽鎖の１つもしくはそれ以上の特定のアイソタイプ由来のヒト定常領域を連結またはスプライシングすることによっても決定することができる。
【００８６】
Ｔ細胞受容体(ＴｃＲ)に由来する可変領域をコードする配列もまた興味深い。そのようなＴｃＲをコードするコーディング配列は、全長αおよびβ鎖またはγおよびδ鎖、ならびに可溶性ＴｃＲまたはこれらの鎖の唯一の可変ドメインまたはそれらの単一鎖融合タンパク質（例えば、単一鎖αβもしくは単一鎖γδ）のコーディング配列を含んでなる。
【００８７】
テンプレート供給源
本発明の１つの特徴は、単離された単一細胞、同遺伝子型細胞の集団、または単一の容器に分離されていない細胞の遺伝的に多様な集団から誘導されたヌクレオチド配列に連結する能力である。
【００８８】
本発明の好適な特徴は、目的の核酸配列、特に、可変領域をコードするコーディング配列のスクランブリングが回避されるため、テンプレート供給源としての単離された単一細胞または同遺伝子型細胞の集団の使用である。例えば、可変領域をコードする配列の本来の対を入手することを所望する場合、これは重要である。
【００８９】
本発明の別の好適な特徴は、リンパ球、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、形質細胞および／または様々な発達段階のこれらの細胞系統を含んでなる細胞画分から単一細胞または単一細胞の集団を得ることである。免疫グロブリンスーパーファミリー由来の結合タンパク質を発現する細胞の１つ集団もまた、単一細胞を獲るために使用され得る。ハイブリドーマ細胞のような細胞系統、Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球系統の細胞系統またはウイルス不死化細胞系統、または免疫応答に参加するドナー由来の細胞もまた、本発明に適用可能である。ドナー由来のリンパ球を含有する細胞画分は、天然の組織もしくはそのような細胞において富化される液体、例えば、血液、骨髄、リンパ節、脾臓組織、扁桃組織、または腫瘍中および周辺の浸潤もしくは炎症組織浸潤から入手され得る。好ましくは、非ヒト動物の場合、脾臓組織または骨髄が使用される。ドナーは、所望される標的に関して生来または高度免疫のいずれかであり得る。所望される標的に対して結合特異性を伴う抗原結合タンパク質の単離では、高度免疫性ドナーが好適である。そのような高度免疫性ドナーは、標的、もしくは標的のフラグメントで免疫されたドナーのいずれかであり得、あるいはそれは、回復期の患者、または標的、例えば、自己免疫患者、癌患者、感染性疾患を伴う患者、例えば、ＨＩＶ患者、Ａ、ＢもしくはＣ型肝炎患者、ＳＡＲＳ患者など、または慢性疾患を伴う患者に対して天然の免疫応答を稼動している非健康個体であり得る。しかし、特に好適な実施形態では、ドナーは、ＥＧＦＲのような癌に関与するヒトタンパク質のようなヒト自己抗原で免疫されている非ヒト動物である。
【００９０】
本発明に使用するために、細胞ドナーは、本発明の連結されたヌクレオチド配列から入手可能な産物で処置しようとする種と同じ種であってもよい。好ましくは、細胞ドナーは、家畜、ペット、ヒトである。本発明の特定の特徴は、それが、ヒトの治療に使用するためのキメラ抗体の作製のためのキメラヒト／非ヒト抗体ライブラリーの作製を可能にすることである。抗体がいわゆる自己抗原、即ち、ヒト抗原に対する場合、そのようなアプローチが好適である。
【００９１】
ドナーはまた、トランスジェニック動物、特に、トランスジェニックマウスであってもよい。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を担持するトランスジェニック動物については、U.S. Patent No. 6,111,166およびKuroiwa, Y. et al. Nature Biotechnology; 2002; 20: 889-893に記載されている。そのようなトランスジェニック動物は、ヒト免疫グロブリンを産生することが可能である。それ故、特定の標的に対する完全なヒト抗体を、そのようなトランスジェニック動物の通常の免疫化技術によって惹起させることができる。これは、天然のヒト抗体応答の存在が認められないか、または制限されているヒト抗原のようなより困難な標的に対して特異性を伴う結合タンパク質をコードするライブラリーの作製を可能にする。同様に、そのようなトランスジェニック動物を開発して、ヒトＴ細胞受容体を産生させることもできる。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態では、リンパ球を含有する細胞画分は、ドナーから得られる全血、骨髄、単核細胞、または白血球細胞より構成される。単核細胞は、血液、骨髄、リンパ節、脾臓、癌細胞周辺の浸潤、および炎症性浸潤から単離することができる。単核細胞は、密度遠心分離技術、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によって単離することができる。単核細胞が組織からなるサンプルから単離される場合、組織は、勾配遠心分離が実施される前に崩壊される。崩壊は、例えば、粉砕、エレクトロポレーションのような機械的方法によっておよび／または酵素処置のような化学的方法によって実施することができる。白血球細胞の単離は、白血球除去を使用して、ドナーから直接実施することができる。例えば、リンパ球を含有する骨髄または組織の生の調製物もまた、本発明において使用することができる。そのような調製物は、単一細胞分布を容易にするために、例えば、上記のように崩壊させる必要がある。
【００９３】
本発明のさらなる特徴は、Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球系統由来の細胞のような特定のリンパ球集団に関するリンパ球を含有する細胞画分、例えば、全血、単核細胞、白血球細胞または骨髄の富化である。Ｂリンパ球の富化は、例えば、磁気ビーズ細胞選別（ＭＡＣＳ）または  蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用し、ＣＤ１９のような系統特異的細胞表面マーカータンパク質、またはＢ２２０のような他のＢ細胞系統−特異的マーカーを利用して、実施することができる。Ｔリンパ球の富化は、例えば、ＣＤ３または他のＴ細胞系統−特異的マーカーのような細胞表面マーカーを利用して、実施することができる。
【００９４】
本発明の好適な特徴は、細胞を複数の容器の間で個々に分配する前に、形質細胞を獲得するために、富化されたＢリンパ球にさらに選別することである。形質細胞の単離は、一般的に、ＭＡＣＳ選別またはＦＡＣＳ選別によって、ＣＤ１９のような表面マーカーを利用して、実施される。他の形質細胞−特異的表面マーカーまたはそれらの組み合わせ、例えば、ＣＤ１３８、ＣＤ４３、ＣＤ１９、ＭＨＣ−ＩＩも利用することができ、マーカーの正確な選択は、形質細胞供給源、例えば、脾臓、扁桃、血液または骨髄に依存する。もちろん、表面マーカーの正確な選択はまた、細胞が単離される種に依存する。
【００９５】
本発明の一態様では、細胞の選別および／または選択に使用されるマーカーは、ＣＤ４３およびＣＤ１３８もしくはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０またはオーソログである。好ましくは、マーカーの組み合わせはＣＤ４３およびＣＤ１３８であり、そして好ましくは、選択された細胞は、それらが選択または単離されるリンパ球を含んでなる細胞集団と比べてこれらのマーカーの中程度もしくは高い発現を有する。より好ましくは、ＣＤ４３およびＣＤ１３８の発現のレベルは、それらが選択または単離されるリンパ球を含んでなる細胞集団と比べて高い。
【００９６】
形質細胞はまた、これらの供給源のいずれかから単離された富化されていないリンパ球を含有する細胞集団から入手することができる。血液から単離される形質細胞は、時々、前駆形質細胞または形質芽細胞と呼ばれる。本発明では、これらの細胞はまた、形質細胞とも称される。より高い頻度のこれらの細胞は、所望される抗原に対して獲得された免疫を反映する抗原−特異的抗体を産生し、そして細胞のほとんどは、体細胞超変異を経験し、従って、高いアフィニティー抗体をコードするため、形質細胞は、免疫グロブリンをコードする配列の同族対の単離に所望される。さらに、形質細胞のｍＲＮＡレベルは残留するＢリンパ球集団と比較して高く、それ故、逆転写産生は、単一の形質細胞を使用する場合より効率的である。形質細胞単離に対する代替物として、メモリーＢ細胞を、ＣＤ２７およびＩｇＧのような細胞表面マーカーを利用して、リンパ球を含有する細胞画分から単離してもよい。
【００９７】
本発明の代替的特徴は、細胞を複数の容器の間で分配する前に、抗原特異性について富化されたＢリンパ球を選択することである。抗原−特異的Ｂリンパ球の単離は、富化されたＢリンパ球と、抗原の表面暴露免疫グロブリンへの結合を可能にする所望される抗原または抗原とを接触させ、続いて、バインダーを単離することによって、実施される。これは、例えば、所望される抗原または抗原のビオチン化、それに続く適切な細胞選別技術によって行うことができる。抗原特異性に関して、これを所望するのであれば、形質細胞ならびにＢリンパ球、富化されていない単核細胞、白血球細胞、全血、骨髄または組織調製物を、単離に供することができる。
【００９８】
本発明の別の特徴は、メモリーＴ細胞の機能を入手するために、例えば、ＣＤ２７のような表面マーカーを使用して、富化されたＴリンパ球（例えば、ＣＤ３ポジティブ細胞）を選別することである。Ｔリンパ球はまた、ＭＨＣ−ペプチド複合体を使用して、ＭＨＣ−抗原特異性について選択することができる（例えば、Callan, M.F. et al. 1998. J. Exp. Med. 187, 1395-1402；Novak, E.J. et al. 1999. J. Clin. Invest 104, R63-R67)。
【００９９】
所定の表面マーカーを発現する細胞を選別するための代替物、即ち、ポジティブ選択として、マーカーを発現しない細胞を細胞の組成物から枯渇させ、実際にマーカーを発現する細胞を後に残すことが考えられる。
【０１００】
本発明のさらなる特徴は、上記の単離された細胞画分（例えば、Ｂリンパ球、形質細胞、メモリー細胞またはＴリンパ球）のいずれかの不死化である。不死化は、細胞分配の前に、例えば、エプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルスで実施してもよい（Traggiai, E., et al., 2004. Nat Med 10, 871-875）。あるいは、単離された単一細胞を、逆転写の前に不死化および拡大培養してもよい。Traggiai et al., Nat Med. 2004 Aug;10(8):871-5。
【０１０１】
本発明のさらなる特徴は、単離された単一細胞の集団を得るための所望される細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞、Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球系統の細胞系統、全血細胞、骨髄細胞、単核細胞、白血球細胞、Ｂリンパ球、形質細胞、抗原−特異的Ｂリンパ球、メモリーＢ細胞、Ｔリンパ球、ペプチド／ＭＨＣ−特異的Ｔリンパ球、またはメモリーＴ細胞）の個々の集団の複数の容器への分配である。単一細胞のこのような単離は、単一の容器が単一細胞を含有するか、またはマイクロアレイ、チップ、もしくはゲルマトリックスが、単一細胞を生じる様式で充填されるような様式での細胞の集団からの細胞の物理的分離を指す。細胞は、限界希釈による単一の容器のアレイのような多数の容器に直接分配してもよい。本発明において利用した単一の容器は、好ましくは、ＰＣＲにおいて利用可能なもの（例えば、ＰＣＲチューブおよび９６ウェルもしくは３８４ウェルＰＣＲプレートまたは容器のより大きなアレイ）である。しかしまた、他の容器を使用してもよい。単一細胞を多数の単一の容器（例えば、３８４ウェルプレート）に分配する場合、単一細胞の集団が得られる。例えば、平均で１、０．５もしくは０．３個の細胞の細胞濃度を包含する単一の容器に容積を分配し、それにより、平均で単一の細胞もしくはそれ未満を含有する容器を入手することによって、そのような分配を達成してもよい。限界希釈による細胞の分配は統計的事象であるため、容器の画分は空であり、大部分の画分は単一の細胞を含有し、そして少数の画分は２つもしくはそれ以上の細胞を含有する。２つもしくはそれ以上の細胞が容器に存在する場合、可変領域をコードする配列のいくつかのスクランブリングが、容器に存在する細胞間で生じ得る。しかし、それは少数の事象であるため、それは本発明の全体的な有用性に影響を及ぼさない。さらに、所望される結合アフィニティーおよび特異性を所有しない可変領域をコードする配列の組み合わせは、おそらく選択されず、従って、スクリーニングプロセス中に排除される。従って、スクランブリングの少数の事象は、本発明の最終的ライブラリーに有意には影響を及ぼさない。
【０１０２】
例えば、単一細胞を単一の容器に正確に分配するようにプログラムすることができるＦＡＣＳ機器またはロボットのようなセルソーターを使用する限界希釈による細胞分配に対する代替物が存在する。それらは、単一細胞の単一の容器への分配を一様に入手するのに労力が少なくかつより効率的であるため、これらの代替物は好適である。
【０１０３】
上記の富化、選別および単離手順は、大部分の細胞が無傷を保持されるように実施される。富化および選別中の細胞の破壊は、可変領域をコードする配列のスクランブリングを生じ得る。しかし、破壊の頻度は低いと予想されるため、これは問題ではないと予想される。単一の容器への分配の前の細胞の洗浄および可能なＲＮＡｓｅ処置は、プロセス中に漏出したＲＮＡを取り出す。
【０１０４】
さらに、単一の容器の集団において単一細胞の集団を入手するために細胞を分配する仕方について上記の説明を考慮すると、すべての容器が単一細胞を含有しなければならないことが絶対的に必要な特徴として解釈されるべきではない。むしろ、それは、大部分の容器が単一の細胞を含有し、例えば、２つもしくはそれ以上の細胞を伴う容器の数が分配された細胞の合計数の２５％未満であるか、またはなお良好には、それは１０％未満であることを示す。
【０１０５】
本発明のさらなる特徴は、複数の容器の間に個々に分配された細胞に由来するテンプレートを使用する逆転写の実施である。
【０１０６】
逆転写（ＲＴ）の目的のために、本発明に従って、ＲＴのテンプレート供給源として役割を果たすべき単一細胞内の核酸は、単一細胞に由来すると考えられるが、それらは、単一細胞の残りの内容物から必ずしも分離されている必要はない。
【０１０７】
単一細胞のそれらの単一の容器への最終的分配が実施された場合、逆転写の前に同遺伝子型細胞の集団を得るために、単一細胞を拡大培養してもよい。このプロセスは、稀な標的を増幅および連結すべきである場合、重要であり得るテンプレートとして使用すべきより多くのｍＲＮＡを産出する。しかし、細胞は、拡大培養中の標的遺伝子に関して遺伝的同一を保持すべきである。単離された細胞または同遺伝子型細胞の集団は、逆転写のためのテンプレートが設計されない限り、無傷を保持するかまたは溶解されるかのいずれかであり得る。好適には、以下の逆転写およびＰＣＲ増幅を容易にするために、細胞が溶解される。
【０１０８】
本発明の異なる実施形態では、開示された多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ方法または多重ＲＴ−ＰＣＲ、それに続く、ライゲーションもしくは組み換えによる連結もまた、単一の容器に分離されていないが、すべて細胞のプールとして共に残存する細胞の遺伝的に多様な集団に由来するテンプレートに対して利用してもよい。この方法は、コンビナトリアルライブラリーの作製のために使用してもよい。そのようなアプローチは、単一細胞の分配を必要としない。しかし、このアプローチにおいて使用され得る細胞は、単一細胞アプローチについて記載のもの、例えば、選別されたＢリンパ球またはＴリンパ球の集団（プール）と同じである。単一工程多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲまたは単一工程重複ＲＴ−ＰＣＲ、それに続く、細胞のそのような集団に対するライゲーションまたは組み換えによる連結を実施する場合、反応の前に細胞を溶解することが好適であり、そして所望であれば、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡをライセートから単離してもよい。
【０１０９】
本発明の単一工程多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲの感度は、極めて低い量のテンプレート、例えば、単一細胞のライセートに対応するテンプレートの量の使用を可能にする。
【０１１０】
プライマー混合物および設計
本発明のプライマー混合物は、少なくとも２つの異なる目的の標的配列を増幅することが可能なプライマーセットを２×２で形成する少なくとも４つのプライマーを含んでなる。２つもしくはそれ以上のそのようなプライマーセットの混合物は、多重プライマー混合物を構成する。好ましくは、多重混合物は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０もしくは１５０のプライマーセット（プライマー対）を含んでなる。特に、可変領域をコードする配列の増幅では、多重プライマー混合物内の個々のプライマーセットは、２を超えるいくらかのプライマーを構成し得る。好ましくは、個々のプライマーセットは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０もしくは３００のプライマーを含んでなる。好ましくは、多重プライマー混合物におけるプライマーの合計数は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０もしくは２００および多くても２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５もしくは４００のプライマーである。
【０１１１】
本発明のすべてのプライマーは、遺伝子特異的領域を含んでなり、そして好ましくは、すべてのプライマーには、プライマーの５’末端にプライマーテイルがさらに備え付けられ、即ち、５’非コーディング配列が遺伝子特異的プライマー部の３’末端に融合される。そのようなプライマーテイルは約６〜５０ヌクレオチド長であるが、所望であれば、それはまたより長くてもよい。増幅時、プライマーテイルは、標的配列に付加される。
【０１１２】
本発明のプライマーテイルは、例えば、ライゲーションによる連結に適応されたテイル、組み換えによる連結に適応されたテイルまたは重複伸長テイルのようなクローニングおよび連結テイルである。
【０１１３】
クローニングテイルは、６〜２０ヌクレオチド長かもしくはそれより長くてもよく、そして制限部位および／または組み換え部位を含んでなり、それらは、連結された産物の適切なベクターへの挿入に有用である。
【０１１４】
ライゲーションによる連結を可能にするために、第１のプライマーセットの１つの部分（順方向もしくは逆方向プライマー）に、切断時に第２のプライマーセットの一方の部の連結テイルに局在する制限部位と適合可能な制限部位を含有する連結テイルが備え付けられるように、多重プライマー混合物のプライマーセットが設計される。２つを超える標的配列の連結のために、第２のプライマーセットの第２の部分に、切断時に第３のプライマーセットの１つの部分に局在する制限部位と適合可能な制限部位が備え付けられる。第２のプライマーセットに局在するこの第２の制限部位は、第１のプライマーセットのそれに適合可能であるべきではない。この方法でプライマーセットを設計することによって、かなりの数の標的配列を連結することができる。標的配列において低い頻度でまたは全く認められない制限部位を選択すべきである。さらに、ライゲーションの部位が使用する特定の制限酵素に対して切断耐性になるように、適合可能な制限部位が同一ではないことが好ましい。同一の標的配列間の連結が制限酵素によって切断可能であるため、これは、標的配列１と標的配列２の連結に対する反応を誘導する。制限部位の適切な対は、例えば、ＳｐｅＩとＸｂａＩ（代替的に、ＮｈｅＩまたはＡｖｒＩＩがこれらのうちの一方もしくは両方の代わりになり得る）、ＮｃｏＩとＢｓｐＨＩ、ＥｃｏＲＩとＭｆｅＩあるいはＰｓｔＩとＮｓｉＩである。連結について、ＳｐｅＩは、例えば、標的配列１に局在することができ、ＸｂａＩは、標的配列２に局在することができ、ＮｃｏＩは、標的配列２の他の末端に局在することができ、そして標的配列３におけるＢｓｐＨＩなどである。プロセスをさらに簡単にするために、制限酵素が同じ緩衝液において機能する場合が有利である。
【０１１５】
組み換えによる連結を可能にするために、多重プライマー混合物のプライマーセットは、例えば、Chapal（1997 BioTechniques 23, 518-524）（本明細書において参考として援用される）による記事において例示されるように、設計することができる。
【０１１６】
多重ＰＣＲ増幅と同じ工程における目的のヌクレオチド配列の連結を可能にするために、重複伸長ＰＣＲに適応されたテイルが、多重プライマー混合物の各プライマーセットの少なくとも１つのプライマーに付加され、それによって、多重重複伸長プライマー混合物を生じる。
【０１１７】
重複伸長テイルは、典型的に、さらに長く、８〜７５ヌクレオチド長の範囲であり、そしてプロモーターのような調節エレメント、リボソーム結合部位、終結配列、またはｓｃＦｖにおけるようなリンカー配列の以後の挿入を可能にする制限部位または組み換え部位を含有してもよい。重複伸長テイルはまた、それが所望される場合、終止コドンを含有してもよい。一般的に、WO 2005/042774の図１に例示されるような３つのタイプの重複伸長テイルが存在する。タイプＩでは、２つのプライマーセットの重複伸長テイルは、相互にのみ重複する。２つの重複伸長テイルのすべてのヌクレオチドが必ずしも相互に相補的である必要はない。本発明の一態様では、相補的ヌクレオチドは、重複伸長テイルのうちの６０〜８５％の間を表す。タイプＩＩの重複伸長テイルでは、５’ヌクレオチドの４〜６が、隣接する標的配列の遺伝子特異的領域に相補的である。タイプＩＩＩの重複伸長テイルでは、重複全体が、隣接する標的配列に相補的である。調節エレメントなどが後に連結された標的配列の間に挿入される場合、タイプＩおよびＩＩの重複伸長テイルが好適である。ｓｃＦｖにおいて認められるような定義されたリンカーによって標的配列を連結しようとする場合、タイプＩＩの重複伸長テイルが好適である。標的配列をインフレームで相互に連結しようとする場合、タイプＩＩＩの重複伸長テイルが好適である。
【０１１８】
重複伸長テイルの設計は、長さ、相対的ＧＣ含有量（ＧＣ％）、制限部位の存在、回文構造、融解温度、それらが結合する前の遺伝子特異的部分などのような配列特徴に依存する。重複伸長テイルの長さは、８〜７５ヌクレオチド長の間であるべきであり、好ましくは、それらは１５〜４０ヌクレオチド長である。なおより好適には、それらは２２〜２８ヌクレオチド長である。極めて長い重複伸長テイル（５０〜７５ヌクレオチド）の使用は、各プライマーセットによって産生される産物の連結に好都合であり得る。しかし、重複伸長テイルの長さと遺伝子特異的領域との間の割合は、極めて長い重複伸長テイルを使用する場合、おそらく、調整する必要がある。ＧＣ％の選好は、重複伸長テイルの長さに依存する。テイルが短いほど、それらが相補的である領域は短いため、より長いテイルよりも相互作用を強化するために、それらはより高いＧＣ％を必要とする。プライマー設計の他の原理も同様に観察すべきであり、例えば、プライマーの二量体化およびヘアピン形成を最小限にすべきである。それらはいずれも誤ったプライミングに係わるべきではない。さらに、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、しばしば、新たに合成されたＤＮＡ鎖の３’末端においてアデノシン（Ａ）を付加し、そしてこれは重複伸長テイルが３’非テンプレートＡ付加を収容することを可能にすることによって、重複伸長テイル設計に収容され得ることが公知である。
【０１１９】
連結テイル、例えば、重複伸長テイル、ライゲーションによる連結に適応されたテイルまたは組み換えによる連結に適応されたテイルを担持するプライマーの選択は、標的配列の連結の順序および方向を定義する。結合テイルが備え付けられるのは、プライマーセットの順方向プライマーであるのか、もしくは逆方向プライマーであるのか、またはそれとも順方向および逆方向プライマーの両方であるのかという問題は、本発明には必須ではない。しかし、いずれにせよ、最終産物における標的配列の順序および方向は、例えば、プロモーターおよび終結配列のような調節エレメントの挿入または個々の標的配列のインフレームにおける連結に関連し得るため、これについてはいくつか考慮すべきである。
【０１２０】
目的の２つのヌクレオチド配列の連結では、連結テイルは、各標的配列のＰＣＲ増幅に使用される各プライマーセットの逆方向プライマーまたは順方向プライマーのいずれかに付加され得る。
【０１２１】
本発明は、重複伸長テイルおよびライゲーションによる連結に適応されたテイルの各セットのｍＶＨおよびｍＶＫ順方向プライマーへの付加を例示する。これは、５’−５’型（頭−頭型および両方向性）である産物の結合方向を生じる。しかし、結合テイルは、各セットの逆方向プライマーにも付加され得る。これは、３’−３’型（尾−尾型および両方向性）である産物の結合方向を生じる。第３の選択肢は、連結テイルを、第１のプライマーセットの逆方向プライマーおよび第２のプライマーセットの順方向プライマーに付加することか、またはその逆である。これは、３’−５’配向(頭−尾型および片方向性)を生じる。
【０１２２】
２つを超える目的のヌクレオチド配列を連結する場合、プライマーセットのいくつかは、一方のテイルが先方のプライマーセットのテイルに相補的であり、そして他方のテイルが後方のプライマーセットのプライマーのうちの１つに相補的であるような順方向および逆方向プライマーの両方に対して連結テイルを有する必要がある。この原理は、他の２つの標的配列の間で連結しようとする標的配列を増幅するすべてのプライマーセットで保たれる。
【０１２３】
遺伝子特異的プライマー部分の設計は、一般的に、プライマー二量体化、ヘアピン形成、および非特異的アニーリングを最小限にするような既知のプライマー設計規則を守るべきである。さらに、可能であれば、３’塩基としての複数のＧまたはＣヌクレオチドを回避すべきである。プライマーセットにおける遺伝子特異敵領域の融解温度（Ｔｍ）は、好ましくは、相互に等しい±５℃であるべきである。本発明では、４５℃〜７５℃の間のＴｍ値が望ましく、そして約６０℃のＴｍ値がほとんどのアプリケーションについて最適である。有利なことに、初期のプライマー設計は、この作業のために開発されたコンピュータプログラムによって支援され得る。しかし、プライマー設計は、一般的に、研究室での試験および日常的な最適化を必要とする。これは、例えば、サイズ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を分析し、そしてプライマーセットを使用する、得られた増幅産物の配列決定によって、行われ得る。可変領域を伴う配列を増幅する場合、またはタンパク質の指定されたクラスに属する新たなファミリーのメンバーを検索する場合、プライマー内の縮重位置（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の使用は、有用なアプローチである。縮重位置の数もまた、最適化を必要とし得る。
【０１２４】
本発明の１つの特徴は、増幅をプライムし、そして目的の少なくとも２つのヌクレオチド配列の連結を促進することが可能な少なくとも２つのプライマーセットからなるプライマー混合物である。本発明のプライマー混合物は、例えば、酵素、インヒビター、構造タンパク質、毒素、チャンネルタンパク質、Ｇタンパク質、受容体タンパク質、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質、輸送タンパク質など、好ましくは、免疫グロブリンのクラスに属するヘテロマータンパク質由来の少なくとも２つのサブユニットまたはドメインの増幅をプライムすることが可能である。
【０１２５】
本発明のさらなる特徴は、プライマーセットを含んでなる多重重複伸長プライマー混合物であって、各プライマーセットの少なくとも１つのプライマーセットメンバーは、第２のプライマーセットのプライマーセットメンバーの重複伸長テイルにハイブリダイズすることが可能な重複伸長テイルを含んでなる。
【０１２６】
重複伸長テイルは、プライマーセットから生じる各個々の産物に、相接する産物に相補的であるテイルを備え付けることによって、多重重複伸長ＰＣＲ増幅中の目的のヌクレオチドの即時連結を可能にする。しかし、これは、この第１のＰＣＲ増幅中に連結が必ずしも生じることを意味するものではない。反応設定に依存して、大部分の実際の連結は、第１のＰＣＲ増幅（多重ＰＣＲ増幅）のアウタープライマーによるさらなる増幅中に実施され得る。
【０１２７】
本発明のさらなる特徴は、可変領域をコードする配列を含有するヌクレオチド配列のファミリーを増幅するように設計されたプライマーセットである。そのようなファミリーの例には、免疫グロブリン由来のκ軽鎖（例えば、マウスのＶＫ１−１９）、λ軽鎖（例えば、マウスのＶＬ１−８）および可変重鎖（例えば、マウスのＶＨ１−１５）、ならびにα、β、γまたはδＴｃＲ可変領域がある。可変領域をコードする配列を含有するヌクレオチド配列のファミリーの増幅のためのプライマーセットは、しばしば、複数のプライマーを含んでなり、いくらかのプライマーは縮重プライマーであり得る。免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列のファミリーの増幅は、例えば、κ鎖（ｍＶＫプライマー）の可変領域もしくはκリーダー配列および／またはλ鎖もしくは定常領域κ（ｍＫａｐｐａｒ１プライマー）を伴うλリーダー配列（順方向プライマー）、ならびに／あるいはλプライマー（逆方向プライマー）もしくはそのような複数のプライマーの５’末端に相補的な複数のプライマーからなるプライマーセットを使用して、実施される。あるいは、軽鎖連結領域プライマーを、定常領域プライマー代わりに逆方向プライマーとして使用してもよい。あるいは、可変軽鎖のリーダー配列の前方にあるＵＴＲ領域においてアニーリングする順方向プライマーを使用してもよい。同様に、免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列のファミリーを、様々なプライマーの組み合わせを利用して、１つのプライマーセットで増幅することができる。例えば、重鎖可変領域(ｍＶＨプライマー)または複数の重鎖連結領域プライマーを伴うこの領域(順方向プライマー)のリーダー配列または重鎖定常領域プライマー(逆方向プライマー)の５’末端に相補的な複数のプライマー。ｍＣＨプライマーはアイソタイプ−特異的であってもよく、そして特に、任意のｍＣＨプライマーを利用することができ、また、それは全長重鎖を生じる。好ましくは、ヒト重鎖定常領域の付加を可能にするために完全長重鎖を増幅しないｍＣＨプライマーが使用される。あるいは、可変重鎖のリーダー配列の前方にあるＵＴＲ領域においてアニーリングする順方向プライマーを使用してもよい。
【０１２８】
可変領域プライマーについて、高い程度の配列類似性によるクロスハイブリダイゼーションが観察される場合、可変領域の５’末端の代わりにリーダー配列においてアニーリングする順方向プライマーの使用は、特に有用である。リーダー配列は、細胞内のタンパク質プロセシング中に切断除去されるため、リーダープライマーを使用するクロスハイブリダイゼーションによる変異は、最終タンパク質から排除される。
【０１２９】
本発明の１つの特徴は、可変領域をコードする配列より前方にあるリーダーをコードする配列の３’末端においてアニールするプライマー、および可変領域をコードする配列の増幅のためのそれらの使用である。
【０１３０】
本発明の一実施形態では、多重重複伸長ＰＣＲおよび逆転写工程にも利用され得る多重重複伸長プライマー混合物は、
ａ）免疫グロブリン軽鎖領域をコードする配列のセンス鎖に相補的な少なくとも１つのｍＫａｐｐａｒ１またはｈｍＪＫプライマー、
ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列または軽鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつ工程ａ）においてプライマーと共にプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのｍＶＫプライマー、
ｃ）免疫グロブリン重鎖ドメインをコードする配列のセンス鎖に相補的な少なくとも１つのｍＣＨｒｅｖ１、ｍＨＣｒｅｖ１−ｅｘｔ、またはｍＪＨプライマー、
ｄ）免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列または重鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつ工程ｃ）においてプライマーと共にプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのｍＶＨプライマー
を含んでなる。
【０１３１】
本発明の一実施形態では、軽鎖プライマーは、κおよびλ軽鎖可変領域をコードする配列の両方を増幅するために適応される。
【０１３２】
本発明のさらなる実施形態では、免疫グロブリンｍＶＫプライマーは、好ましくは、相補的重複伸長テイルの形態で連結テイルを担持する。これは、頭−頭型様式で連結される可変領域をコードする配列を生じる。頭−尾型様式における可変領域をコードする配列の連結では、ｍＫａｐｐａｒ１およびｍＶＨプライマーのいずれかは、連結テイルを含有するか、またはｍＶＫおよびｍＣＨｒｅｖ１プライマーは、好ましくは、相補的重複伸長テイルの形態で連結テイルを含有する。尾−尾型様式における可変領域をコードする配列の連結では、ｍＣＨおよびｍＫａｐｐａｒ１プライマーは、好ましくは、相補的重複伸長テイルの形態で連結テイルを含有する。
【０１３３】
好適には、本発明の多重重複伸長プライマー混合物を含む多重プライマー混合物は、２つのプライマーセットを含んでなる。それ故、多重プライマー混合物は、少なくとも４つの異なるプライマーを含んでなる。本発明のさらなる態様では、多重プライマー混合物は、４つを超える異なるプライマーを含んでなる。本発明の多重プライマー混合物は、単一の容器における標的配列の増幅に使用される。例えば、κ、λおよび重鎖可変領域は、同じ容器において増幅され得る。
【０１３４】
本発明はまた、多重ＲＴ−ＰＣＲ、それに続く、ライゲーションもしくは組み換えによる連結、または多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲによって得られる連結された産物のさらなるＰＣＲ増幅のためのプライマーを包含する。このさらなるＰＣＲ増幅は、連結された標的配列を増幅するために適応されたプライマー混合物を使用して、実施することができる。そのようなプライマー混合物は、多重プライマー混合物または多重重複伸長プライマー混合物のアウタープライマーを含んでなり、これは、連結されたヌクレオチド配列のセンス鎖の最も外側の５’末端および３’末端にアニールし、それによって連結された産物全体の増幅を選択的に可能にするプライマーを意味する。このプロセスは、一般的に、多重ＲＴ−ＰＣＲ、それに続く、ライゲーションもしくは組み換えによる連結からか、または多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲから得られる連結された産物の量を増加するのに役立つ。
【０１３５】
あるいは、一次多重ＲＴ−ＰＣＲまたは多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ反応で使用されるアウタープライマーと比較して、ネステッドされるプライマーセットは、連結されたヌクレオチド配列のさらなる増幅に使用することができる。本発明では、そのようなプライマーセットは、ネステッドプライマーセットと称される。ネステッドプライマーの設計は、一般的に、多重ＲＴ−ＰＣＲまたは多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されるアウタープライマーのアニーリング位置の３’側から部分的もしくは全体的にプライムすることを除き、先に記載の遺伝子特異的プライマーに対するものと同じ設計規則を守る。従って、ネステッドＰＣＲから生じる産物は、多重ＲＴ−ＰＣＲ、それに続く、ライゲーションもしくは組み換えによる連結、または多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲによって得られる連結された産物より短くてもよい。連結された産物の量を増加することに加えて、ネステッドＰＣＲは、特に、多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ技術の全体的な特異性を増加させるのにさらに役立つ。しかし、さらなる増幅実施する場合、先に記載されているすべての多重プライマー混合物／多重重複伸長プライマー混合物が、ネステッドプライマーセットとの組み合わせに適切であるわけではないことに留意すべきである。そのような場合では、多重プライマー混合物／多重重複伸長プライマー混合物のアウタープライマーをさらなる増幅に使用することができるか、またはセミネステッドＰＣＲを、後に記載のように適用することができる。
【０１３６】
本発明の一実施形態では、ＪＬおよびＪＨプライマーの混合物が、連結された免疫グロブリン可変領域をコードする配列のさらなる増幅のためのネステッドプライマーとして使用される。
【０１３７】
本発明のネステッドプライマーセットはまた、第１の多重プライマー混合物／多重重複伸長プライマー混合物由来の逆方向（または順方向）アウタープライマー、および第１の多重プライマー混合物／多重重複伸長プライマー混合物の順方向（または逆方向）アウタープライマーのアニーリング位置の３’側からプライムする第２のネステッドプライマーからなり得る。さらなるＰＣＲ増幅のためのそのようなプライマーセットの使用は、一般的に、セミネステッドＰＣＲとして公知である。そのようなプライマーは、相補性決定領域（ＣＤＲ）においてアニールする必要があるため、例えば、可変領域配列のための１つの特異敵領域におけるネステッドプライマーを設計することが困難である場合、例えば、セミネステッドＰＣＲを適用することができる。さらに、例えば、クローニング目的のために、連結された配列の１つの末端を無傷の状態で保持することが所望される場合、セミネステッドＰＣＲを使用することができる。
【０１３８】
多重重複伸長ＰＣＲの最適化
２工程および単一工程手順の両方の多重重複伸長ＰＣＲ工程のパラメータは、いくらかのパラメータに対して最適化することができる（例えば、Henegariu, O. et al. 1997. BioTechniques 23, 504-511；Markoulatos, P. et al. 2002. J. Clin. Lab. Anal. 16, 47-51を参照のこと）。一般的に、同じ最適化パラメータが多重ＲＴ−ＰＣＲに当てはまるが、アウタープライマーとインナープライマーとの間の比は、そのような反応にそれほど重要ではない。
【０１３９】
ａ．プライマー濃度
重複伸長テイルを担持するプライマー（例えば、ＶＨおよびＶＬプライマー）の濃度は、好ましくは、重複伸長テイルを伴わないアウタープライマー（例えばＪＨおよびκプライマー）の濃度より低い。
【０１４０】
標的配列の１つが、他より低い効率で、例えば、より高いＧＣ％の結果として増幅する場合、増幅効率を均一にすることが可能であり得る。これは、低い効率で増幅を仲介するより高い濃度のプライマーセットを使用するか、または他のプライマーの濃度を低下させることによって行われ得る。例えば、重鎖可変領域をコードする配列は、より高いＧＣ％を有する、従って、軽鎖可変領域より低い増幅効率を有する傾向がある。これは、ＶＨプライマーより低い濃度でＶＬプライマーを使用することを指摘している。
【０１４１】
さらに、多数のプライマーを使用する場合、全プライマー濃度は問題となり得る。上限は、滴定実験によって実験的に決定される。Applied Biosystemsの「AmpliTaq Gold」ＰＣＲシステムでは、上限は、１．１μＭ全オリゴヌクレオチド濃度であることが見出されたが、しかし、他のシステムでは、２．４μＭという高さであり得る。全オリゴヌクレオチド濃度のそのような上限は、個々のプライマーの最大濃度に影響を及ぼす。個々のプライマー濃度が低すぎる場合、不十分なＰＣＲ感度を生じる可能性がある。
【０１４２】
オリゴヌクレオチドプライマーの品質はまた、多重重複伸長ＰＣＲにも重要であることが見出されている。ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドは最良の結果を生じている。
【０１４３】
ｂ．ＰＣＲサイクリング条件：
好適には、サイクリング条件は以下のとおりである。
【０１４４】
【表１】
0005669397.tif 000002
【０１４５】
単一工程多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲでは、上記で概説した増幅サイクリングの前に、以下の工程をサイクリングプログラムに組み入れた。
【０１４６】
【表２】
0005669397.tif 000003
【０１４７】
これらのすべてのパラメータを最適化することが可能である。特に、アニーリング温度は重要である。それ故、最適アニーリング温度および時間、ならびに伸長および変性時間を同定するために、最初に、最終プライマー混合物を構成しようとするすべての個々のプライマーセットを、個別に試験すべきである。これにより、これらのパラメータを多重重複伸長プライマー混合物について最適化し得る時間枠（ｗｉｎｄｏｗ）についての得策が得られる。
【０１４８】
例えば、低いプライマー濃度またはテンプレート濃度による不十分なＰＣＲ感度の問題は、多数回の熱サイクルを使用することによって、克服することができる。多数回の熱サイクルは、３５〜８０サイクル、好ましくは、約４０サイクルである。
【０１４９】
さらに、伸長時間を長くすることによって、多重重複伸長ＰＣＲプロセスを改善することができる。長い伸長時間は、通常の１分間の伸長と比較して、１．５〜５分間×ＥＰＬである。
【０１５０】
ｃ．補助剤の使用
多重ＰＣＲ反応は、ＤＮＡを弛緩し、それ故、テンプレート変性を容易にするＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、またはベタインのようなＰＣＲ添加剤を使用することによって、有意に改善することができる。
【０１５１】
ｄ．ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ２
デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の品質および濃度は、多重重複伸長ＰＣＲにとって重要である。最良のｄＮＴＰ濃度は、２００〜４００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）であり、それを超えると、増幅は迅速に阻害される。より低いｄＮＴＰ濃度（１００μＭの各ｄＮＴＰ）は、ＰＣＲ増幅を達成するのに十分である。ｄＮＴＰストックは、融解／凍結サイクルに敏感である。３〜５回のそのようなサイクル後、多重ＰＣＲは、しばしば、十分に機能しない。そのような問題を回避するために、小さなアリコートのｄＮＴＰを作製し、−２０℃で凍結保存することができる。
【０１５２】
Ｍｇ２＋濃度の最適化は、ほとんどのＤＮＡポリメラーゼがマグネシウム依存性酵素であるため、極めて重要である。ＤＮＡポリメラーゼに加えて、テンプレートＤＮＡプライマーおよびｄＮＴＰがＭｇ２＋に結合する。従って、最適Ｍｇ２＋濃度は、ｄＮＴＰ濃度、テンプレートＤＮＡ、およびサンプル緩衝液の組成に依存する。プライマーおよび／またはテンプレートＤＮＡ緩衝液がＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのようなキレート剤を含有する場合、見かけのＭｇ２＋最適条件は、変更され得る。過剰のＭｇ２＋濃度は、ＤＮＡ二本鎖を安定化し、そして収量を減少するＤＮＡの完全な変性を防止する。過剰のＭｇ２＋はまた、不正確なテンプレート部位へのプライマーの擬似的アニーリングを安定化して、それによって特異性を減少することができる。これに対し、不適切なＭｇ２＋濃度は産物の量を減少させる。
【０１５３】
ｄＮＴＰとＭｇＣｌ２との間の良好な均衡は、１．５〜３ｍＭのＭｇＣｌ２に対して約２００〜４００μＭの（それぞれの）ｄＮＴＰである。
【０１５４】
ｅ．ＰＣＲ緩衝液濃度
一般的に、ＫＣｌに基づく緩衝液は、多重重複伸長ＰＣＲに十分であるが、しかし、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、またはそれらの組み合わせのような他の成分に基づく緩衝液もまた、多重重複伸長ＰＣＲによる機能に最適化することができる。より長い産物の増幅に関与するプライマー対はより低い塩濃度（例えば、２０〜５０ｍＭのＫＣｌ）でより良好に作用するが、一方、短い産物の増幅に関与するプライマー対は、より高い塩濃度（例えば、８０〜１００ｍＭのＫＣｌ）でより良好に作用する。緩衝液濃度を１倍の代わりに２倍に上昇させることにより、多重反応の効率を改善することができる。
【０１５５】
ｆ．ＤＮＡポリメラーゼ
本発明は、Ｔａｑポリメラーゼによって例示される。あるいは、例えば、Ｐｆｕ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｐｗｏ、Ｔｇｏ、Ｔｔｈ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ−ｖｅｎｔを含む他のタイプの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を伴わないまたは伴うポリメラーゼを、単独で、または相互に組み合わせて使用してもよい。
【０１５６】
ベクターおよびライブラリー
本発明に従う目的のヌクレオチド配列の連結は、免疫グロブリンの可変領域をコードする連結されたヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチドセグメントを生成する。さらに、そのような連結された核酸配列のライブラリー、特に、ヒト定常領域（重鎖および軽鎖）配列に連結またはスプライシングされた非ヒト可変領域をコードする配列のライブラリーが、本発明の方法によって生成される。
【０１５７】
本発明の１つの特徴は、本発明の方法によって作製される目的の連結されたヌクレオチド配列または目的の連結されたヌクレオチド配列のライブラリーを含有するセグメントの適切なベクターへの挿入である。ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリー、またはより好ましくは、可変領域をコードする配列の同族対のライブラリーであり得る。アウタープライマー、ネステッドプライマーまたはセミネステッドプライマーによって作製される制限部位は、好ましくは、選好されるベクターの適切な制限部位に一致するように設計される。セミネステッド、ネステッドプライマーまたはアウタープライマーの１つに適切な組み換え部位が備え付けられており、そして選好されるベクターがなおそれを含有する場合、目的の連結された核酸配列はまた、組み換えによってベクターに挿入することができる。
【０１５８】
基本的に、本発明の多重ＲＴ−ＰＣＲ連結方法の１つによって作製される産物のキャリアとして使用することができるベクターに制限はない。選好されるベクターは、例えば、細菌、酵母、他の真菌、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞を含む細胞における増幅および発現に適切なものであってよい。そのようなベクターを使用して、さらなるクローニング工程、ベクター系間のシャトリング、ベクターに挿入される産物のディスプレイ、挿入された産物の発現を容易にし、および／または宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
【０１５９】
クローニングおよびシャトルベクターは、好ましくは、細菌ベクターである。しかし、他のタイプのベクターもまた、クローニングおよびシャトル手順に適用され得る。
【０１６０】
ディスプレイベクターは、例えば、ファージベクター、またはｆｄ、Ｍ１３、もしくはｆ１糸状バクテリオファージのクラス由来のファージミドベクターであり得る。そのようなベクターは、例えば、結合タンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質の糸状バクテリオファージの表面上のディスプレイを容易にすることが可能である。リボソーム、ＤＮＡ、酵母細菌、または哺乳動物細胞でのディスプレイに適切なディスプレイベクターもまた、当該分野において公知である。これらは、例えば、ウイルスベクター、またはキメラタンパク質をコードするベクターを含んでなる。
【０１６１】
発現ベクターは、言及された種のすべてに存在し、選択すべきベクターは、発現されるタンパク質に完全に依存する。いくつかの発現ベクターは、さらに、適切な組み換え部位を利用する、無作為組み込み、または部位特異的組み込みのいずれかによって宿主細胞のゲノムへ組込むことが可能である。発現ベクターは、連結された産物がインフレームでこれらの配列に挿入される場合、適切な宿主細胞に導入された場合により大きなタンパク質、例えば、全長モノクローナル抗体の発現を可能にするさらなるコーディング配列を提供するように、設計してもよい、このインフレーム挿入はまた、糸状バクテリオファージまたは細胞の表面上でのディスプレイを容易にするキメラタンパク質の発現も容易にする。バクテリオファージディスプレイ系では、目的の連結されたヌクレオチド配列を、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩのようなコートタンパク質をコードする配列にインフレームで挿入してもよい（Barbas, C.F. et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982；Kang, A.S. et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4363-4366）。
【０１６２】
本発明の一実施形態では、目的の連結されたヌクレオチド配列の個々のセグメントは、１つの主由来の軽鎖可変領域をコードする配列と会合した免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列からなり、１つもしくはそれ以上のヒト免疫グロブリン定常ドメイン、好ましくは、ヒト軽鎖および重鎖定常領域の両方をコードする配列を含有するベクターに挿入される。挿入は、連結された重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする配列がインフレームで定常領域をコードする配列に挿入されるように操作される。そのような挿入により、例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２発現ベクター、全長抗体発現ベクターまたは全長抗体のフラグメントをコードする発現ベクターを作製することができる。好ましくは、そのようなベクターは、発現に適切な発現ベクター（例えば、大腸菌（E.coli）、ファージミド、または哺乳動物ベクター）であり、そして定常領域重鎖をコードする配列は、ヒト免疫グロブリンクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥから選択され、それによってＦａｂまたは完全長組み換え抗体の発現を可能にする。定常重鎖をコードする配列に加えて、ベクターはまた、ヒトλまたはκ鎖から選択される定常軽鎖をコードする配列を含有してもよい。これは、非ヒト種由来の免疫グロブリン可変領域をコードする配列（Ｆｖ’）のみをコードするこれらの場合において、連結されたヌクレオチド配列としてのキメラ抗体の作製に好適である。
【０１６３】
代替的実施形態では、非ヒト配列との重複を提供するヒト定常領域、ならびに可変および定常領域の両方のインフレームにおける増幅を保証する適切なプライマーを容器に添加することによって、ヒト定常領域は、分子増幅手順の工程において非ヒト可変領域にスプライシングまたは連結される。この方法では、ヒト定常κまたはλ鎖を添加してもよく、および／またはヒト定常重鎖を添加してもよい。この手順を使用することによって、コーディング配列内に制限部位を提供する必要がないという利点がある。
【０１６４】
本発明の別の実施形態において、連結されたヌクレオチド配列の個々のセグメントは、β鎖可変領域をコードする配列と会合したＴｃＲα鎖可変領域をコードする配列、またはδ鎖可変領域をコードする配列と会合したγ鎖可変領域をコードする配列でからなる。好ましくは、これらの連結された配列は、１つもしくはそれ以上のＴｃＲ定常ドメインをコードする配列を含有するベクターに挿入される。挿入は、挿入される連結された可変領域をコードする配列が、対応するＴｃＲ定常領域をコードする配列にインフレームであるように操作される。さらなる実施形態では、そのようなベクターは、ＴｃＲ定常領域にインフレームでロイシンジッパーをコードする配列を含んでなるキメラ発現ベクターである。そのような構築物は、可溶性ＴｃＲの安定性を増加することが示されている（Willcox, B.E. et al. 1999. Protein Sci 8, 2418-2423）。
【０１６５】
本発明の同族対のライブラリーは、２つの異なるアプローチによってベクターに導入され得る。第１のアプローチでは、単一の同族対が個々に適切なベクターへ挿入される。次いで、ベクターのライブラリーは、個別に保持してもよく、またはプールしてもよい。第２のアプローチでは、すべての同族対を、ベクター挿入の前にプールし、続いて、適切なベクターに一括して（ｉｎ−ｍａｓｓ）挿入して、ベクターのプールされたライブラリーを作製する。ベクターのそのようなライブラリーは、かなり多様な可変領域をコードする配列の対を含んでなる。
【０１６６】
本発明の一態様は、連結された可変領域をコードする配列の同族対を伴う抗体のライブラリーである。好ましくは、ライブラリーの個々の抗体は、１つの種およびヒト定常領域由来の重鎖可変領域をコードする配列と会合した免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列を含んでなる。
【０１６７】
同族対の別の好適なライブラリーは、連結されたＴｃＲ領域をコードする配列を含んでなり、各個々のＴｃＲ領域をコードする配列は、β鎖可変領域をコードする配列と会合したα鎖可変領域をコードする配列、および／またはδ鎖可変領域をコードする配列と会合したＴｃＲγ鎖可変領域をコードする配列を含んでなる。
【０１６８】
本発明の実施形態は、特定の標的に対して指向された所望される結合特異性をコードする連結された可変領域をコードする配列の同族対のサブライブラリーである。好ましくは、これらの同族対は、連結された免疫グロブリン軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする配列、ＴｃＲα鎖可変領域、およびβ鎖可変領域をコードする配列、ならびに／あるいはＴｃＲγ鎖可変領域、およびδ鎖可変領域をコードする配列を含んでなる。
【０１６９】
さらなる実施形態は、本発明の全体を通じて記載された可変領域をコードする配列の同族対の親ライブラリーから選択されるサブライブラリーである。
【０１７０】
本発明の好適な実施形態は、ヒト免疫グロブリンクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭから選択される全長キメラ免疫グロブリンの同族対をコードするライブラリーまたはサブライブラリーである。
【０１７１】
本発明の別の好適な特徴は、ＴｃＲの可溶性または安定な同族対をコードするライブラリーまたはサブライブラリーである。
【０１７２】
本発明の特徴は、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、または１０６の異なる同族対抗体からなる多様な前記ライブラリーである。
【０１７３】
本発明のさらなる実施形態では、連結された可変領域をコードする配列の同族対の前記ライブラリーは、本明細書に記載の工程を含んでなる方法によって得ることが可能である。このライブラリーは、親ライブラリーとも称される。
【０１７４】
スクリーニングおよび選択
本発明の方法の１つを利用するドナーから単離された連結された可変領域をコードする配列の対の親ライブラリーは、いくつかは関連性がない、すなわち、所望される標的、特にコンビナトリアルライブラリーに結合していない多様な結合タンパク質を示すことが予想される。従って、本発明は、特定の標的に対して指向された多様な結合特異性のサブセットをコードするサブライブラリーに対する富化およびスクリーニングを包含する。
【０１７５】
同族対のライブラリーについて、ライブラリーの多様性は、極少数の無作為に連結された可変領域を伴うドナー物質に存在する多様性を示すことが予想される。それ故、富化工程は、同族対からなるライブラリーにおける標的特異的結合アフィニティーのスクリーニング前に必ずしも必要としなくてよい。
【０１７６】
本発明のさらなる実施形態では、連結された可変領域をコードする配列の対のライブラリーを作製する方法は、所望される標的特異性を伴う結合タンパク質をコードする連結された可変領域配列の対のサブセットを選択することによってサブライブラリーを作製することをさらに含んでなる。連結された可変領域をコードする配列のそのような選択はまた、標的特異的同族対のライブラリーとも称される。
【０１７７】
本発明の好適な実施形態では、可変領域をコードする配列の標的特異的同族対のライブラリーは、発現ベクターに移行される。発現ベクターは、哺乳動物発現ベクター、酵母発現ベクター、真菌発現ベクター、植物発現ベクター、細菌発現ベクターであってもよく、スクリーニングに使用される細胞のタイプに依存する。好ましくは、発現ベクターは哺乳動物由来である。
【０１７８】
免疫学的アッセイは、一般的に、標的特異的免疫グロブリン可変領域をコードする配列の選択に適切である。そのようなアッセイは当該分野において周知であり、そして例えば、ＦＭＡＴ、ＦＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、膜アッセイ（例えば、ウエスタンブロット）、フィルター上のアッセイ、およびＦＡＣＳを構成する。アッセイは、免疫グロブリン可変領域をコードする配列から産生されるポリペプチドを利用する直接的な様式でいずれも実行され得る。あるいは、イムノアッセイは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌表面ディスプレイ、酵母ディスプレイ、真核生物ウイルスディスプレイ、ＲＮＡディスプレイもしくは共有結合ディスプレイのような富化方法と組み合わせて、またはそれらの後に実施され得る（FitzGerald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258においてレビューされた）。同族Ｆａｂ発現ライブラリーおよび同族全長抗体発現ライブラリーは両方とも、スクリーニングに供され、それによってポジティブなクローンのサブライブラリーを作製することができる。そのようなスクリーニングアッセイおよび富化手順はまた、連結された可変領域のＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメントまたはコンビナトリアルライブラリーにも適切である。
【０１７９】
免疫学的スクリーニングに加えて、特定の本発明の特徴は、それが、所望される特性を伴う抗体分泌クローンを選択するための様々なタイプの機能的スクリーニングの使用を可能にすることである。そのようなスクリーニングアッセイとして、増殖アッセイ、ウイルス不活化アッセイ、細胞死滅アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、機能アッセイは、本発明の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞由来の上清を使用して、ハイスループット形式で行うことができる。
【０１８０】
本発明の好適な実施形態では、可変領域をコードする配列の標的特異的同族対またはコンビナトリアル対のサブライブラリーの選択は、ハイスループットスクリーニングアッセイを使用することによって実行される。ハイスループットスクリーニングアッセイは、半自動または完全自動装置で実施されるＥＬＩＳＡアッセイであり得るが、これに限定されない。それはまた、細菌を無人操縦で選び出し、そして抗原結合分子を発現するコロニーのアレイを生じる寒天プレートの上部の適切な膜上で格子状に並べる（ｇｒｉｄｄｅｄ）膜アッセイでもあり得る。分子は、膜を介して第２の基本抗原被覆膜へ分泌され、これらは個別に展開され、所望される標的に対する抗原結合分子を分泌するクローンを同定するために使用され得る（de Wildt, R.M., et al. 2000. Nat. Biotechnol. 18, 989-994）。
【０１８１】
抗原結合クローンの同族対またはコンビナトリアル対のサブライブラリーが適切な技術によって選択されている場合、連結された免疫グロブリン軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする配列のＤＮＡ配列決定によってさらなる分析を実施することが可能である。まず第一に、そのようなＤＮＡ配列決定は、ＣＤＲ領域内の生殖細胞系起源、ファミリー分布、および成熟のようなライブラリーの多様性に関する情報を提供する。そのような分析は、広範な多様性を示すクローンの選択、および反復するクローンを取り除くことを可能にする。第２に、ＤＮＡ配列決定は単離プロセス中に導入された変異を示す。
【０１８２】
可変領域をコードする配列を分析する場合、変異が許容されるかどうか評価する際に考慮する３つのタイプの変異がある。ｉ）最も多いタイプの変異はクロスプライミングから生じ、配列類似性のため、Ｖ遺伝子プライマーが全体的に相同でない生殖細胞系配列をプライムする。導入される変更は、主に特定の位置での天然に存在するコドンの置換である。Ｖ遺伝子配列間の高い程度の配列相同性による。これらの変更のいくつかは有意であり得、時々、天然の対応物を伴わない。そのような変更は、新たなエピトープを作製することによって、潜在的に、可変領域の免疫原性に影響を及ぼし得る。そのような変更は容易に同定され、そしてその後に標準分子生物学的技術を使用して修復されるか、またはクローンがライブラリーから除外され得る、ｉｉ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって生じるエラーは定常領域をコードする配列で最も容易に同定され、かつ容易に排除され得る。しかし、Ｔａｑ誘導性変異は、もちろん可変領域をコードする配列にも存在し得、それらは、可変領域をコードする配列におけるランダム変異の結果でもある天然に存在する体細胞変異と区別ができない。変異が非系統的であり、かつ明確な方法で特定の対にのみ影響を及ぼすことを考慮すると、そのような変更を無視することは合理的であるようである。
【０１８３】
本発明のさらなる実施形態では、標的特異的かつおそらく配列分析された連結された免疫グロブリン軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする配列の対のサブライブラリーは、哺乳動物発現ベクターに移行される。そのような移行は、前のセクションに記載されたベクターのいずれかへ実施することができ、全長組み換え抗体の発現を可能にする。スクリーニングが哺乳動物の同族全長抗体発現ライブラリーで実施される場合、そのような移行は必要でない場合がある。
【０１８４】
本発明の別の実施形態では、親ライブラリーは、Ｔリンパ球について富化されているリンパ球を含有する細胞分画から作製される。親ライブラリーを構成する連結された可変領域をコードする配列の対が、同族対またはコンビナトリアル対のサブライブラリーを作製する所望される標的特異性を伴う結合タンパク質をコードするαおよびβならびに／あるいはγおよびδ鎖からなる連結された可変領域配列の対のサブセットをコードすることについて、選択され得る。抗原特異的Ｔ細胞受容体はその後に、四量体ＭＨＣペプチド複合体による染色（例えば、Callan, M.F. et al. 1998. J. Exp. Med. 187, 1395-1402；Novak, E.J. et al. 1999. J. Clin. Invest 104, R63-R67）のような標準的方法を使用するトランスフェクトされた細胞のプールから、ＩＬ−２放出の形で細胞応答を測定することによって、または酵母またはレトロウイルスディスプレイ技術のようなより洗練された手段によって同定され得る。
【０１８５】
宿主細胞および発現
本発明のライブラリーは、目的の連結された核酸配列、特に結合タンパク質またはそのフラグメントを含有する可変領域からコードされたタンパク質の発現および産生に適したベクターに移行させることができる。そのようなベクターは、ベクターおよびライブラリーのセクションに記載されており、例えば、選好される種の全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、膜結合もしくは可溶性ＴｃＲ、またはＴｃＲフラグメントの発現を提供する。
【０１８６】
本発明の１つの特徴は、増幅および／または発現のための、連結された可変領域をコードする配列の同族対のベクターまたは連結された可変領域をコードする配列の同族対をコードする単一クローンのライブラリーあるいはサブライブラリーの宿主細胞への導入である。宿主細胞は、細菌、酵母、他の真菌、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞から選択することができる。発現の目的のために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０細胞もしくはＮＳ０細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３、繊維芽細胞あるいはＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のような不死化ヒト細胞が好適である。
【０１８７】
ベクターの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、ＲＢＣゴースト融合、プロトプラスト融合、ウイルス感染などを含む、当業者に公知の多くの形質転換またはトランスフェクション法によって達成され得る。モノクローナル全長抗体、Ｆａｂフラグメント、ＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントの産生は周知である。
【０１８８】
治療に使用されるべき組み換えポリクローナル抗体の製造は極めて新しい分野である。組み換えポリクローナル製造技術については、WO 2004/061104に記載されている。簡単に説明すると、この技術は、細胞系統の製造として適した細胞のコレクションの作製を含む。技術の以下の説明は、同族対のライブラリーのために行われているが、しかし、当然、コンビナトリアルライブラリーに適用可能である。細胞のコレクションにおける個々の細胞は、例えば、同族対のライブラリーから組み換えポリクローナル結合タンパク質の個別のメンバーを発現することが可能である。個々の細胞が、単一同族対を発現し、ポリクローナル結合タンパク質のいくらかの同族対を発現しないことを確実にするために、同族対をコードする核酸配列を、各個々の細胞のゲノムにおける単一部位特異的部位に導入する。これは、各細胞から発現される重鎖および軽鎖のスクランブリングを防止するが、但しさらに、個々の同族対合の可変領域における小さな差異は例外として、互いに実質的に同一である細胞を作製するため、細胞のコレクションの重要な特徴である。この特質は、産生に必要な期間にわたって細胞のコレクションの不偏の増殖を可能にする。単一部位特異的組み込みを確実にするために、１つのみ組み込み部位を伴う宿主細胞系統が使用されるべきであり、これらは市販されており、例えば、単一ＦＲＴ部位を含有するInvitrogenのＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞である。この細胞系統のための適切なベクターは、対応するＦＲＴ部位を含有し、Ｆｌｐリコンビナーゼを使用してゲノムへ導入される。いくらかの他の公知のリコンビナーゼ、例えば、それらの対応する組み換え部位と組み合わせて使用され得るＣｒｅ、β−リコンビナーゼ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ、ＰｉｎＢ、ＰｉｎＤ、Ｒ／ＲＳ、λインテグラーゼ、またはファージΦＣ３１インテグラーゼがある。さらに、適切なベクターは、部位特異的組み込み体の選択を可能にする選択マーカーを含有する。
【０１８９】
ポリクローナル製造細胞系統の作製およびそのような細胞系統からの組み換えポリクローナルタンパク質の産生は、いくらかの異なるトランスフェクションおよび製造ストラテジーによって得ることができる。
【０１９０】
１つの方法は、細胞ごとに単一の組み込み部位を伴う宿主細胞系統のトランスフェクションのために単一組成物へ混合されたベクターのライブラリーを使用することである。この方法は、バルクトランスフェクションまたは一括トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｕｌｋ）と称される。一般的に、先に記載のベクターおよび宿主細胞の設計は、不偏増殖が可能なポリクローナル細胞系統が適切な選択次第で得られることを確実にする。ポリクローナル細胞系統の凍結ストックが、組み換えポリクローナルタンパク質製造の開始前に作製される。
【０１９１】
別の方法は、トランスフェクションのために組成物中ライブラリーの約５〜５０の個々のベクターを含有する分画に分割されたベクターのライブラリーを使用することである。好ましくは、ライブラリーの分画は、１０〜２０の個々のベクターを構成する。次いで、各組成物は宿主細胞のアリコートへトランスフェクトされる。この方法は半バルクトランスフェクション（ｓｅｍｉ−ｂｕｌｋ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）と称される。トランスフェクトされるアリコートの数は、ライブラリーのサイズおよび各分画中の個々のベクターの数に依存する。ライブラリーが、例えば、１００の個別の同族対を構成し、これらが組成物中に２０の個別のメンバーを含有する分画へ分割される場合、宿主細胞の５つのアリコートは、本来のライブラリーの個別の分画を構成するライブラリー組成物でトランスフェクトされる必要がある。宿主細胞のアリコートは、部位特異的組み込みについて選択される。好ましくは、個別のアリコートが別々に選択される。しかし、それらはまた、選択前にプールすることができる。アリコートを、それらのクローン多様性について分析することができ、そして十分な多様性を有するもののみを使用して、ポリクローナル同族対ライブラリーストックを作成する。製造のための所望されるポリクローナル細胞系統を得るために、アリコートは、凍結ストックを作製する前、それらがストックから回収された直後、または短い増殖および順応時間後に混合することができる。場合により、細胞のアリコートは産生の全体を通じて別々に保存され、そしてポリクローナルタンパク質組成物は、産生前の細胞のアリコートではなく各アリコートの産物を合わせることによって集成される。
【０１９２】
第３の方法は、同族対のライブラリーを構成する個々のベクターを使用して、宿主細胞が別々にトランスフェクトされるハイスループット法である。この方法は個別バルクトランスフェクション（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）と称される。個々にトランスフェクトされた宿主細胞は、好ましくは、部位特異的組み込みについて別々に選択される。選択時に作製される個々の細胞クローンが増殖時間に関して分析され得、そして好ましくは、同様の増殖速度を伴うものを使用して、ポリクローナル同族対ライブラリーストックを作製する。ストックを作製する前、それらがストックから回収された直後、または短い増殖および順応時間後に、個々の細胞クローンを混合して、所望される細胞系統を得ることができる。このアプローチは、トランスフェクション、組み込み、および選択中の可能な残留配列の偏りを除去し得る。あるいは、個々のトランスフェクト宿主細胞は、選択が実施される前に混合され、これはトランスフェクションによる配列の偏りの制御を可能にする。
【０１９３】
上記で概説した製造ストラテジーにおける共通の特徴は、組み換えポリクローナルタンパク質を構成する個々の同族対のすべてが、１つの、または限定された数のバイオリアクターにおいて産生され得ることである。唯一の差異は、ポリクローナル製造細胞系統を構成する細胞のコレクションを作製するために選択される段階である。
【０１９４】
本発明の一実施形態は、可変領域をコードする配列の連結対の同族ライブラリーまたはサブライブラリーを含んでなる宿主細胞の集団である。
【０１９５】
さらなる実施形態では、宿主細胞の集団が、リンパ球を構成する単離された単一細胞の集団から得られるライブラリーを含んでなり、多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅、それに続く、ライゲーションもしくは組み換えまたは本発明の多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ技術による連結を利用して、同族対を連結する。
【０１９６】
本発明の別の実施形態は、可変領域をコードする配列の連結対のコンビナトリアルライブラリーまたはサブライブラリーを含んでなる宿主細胞の集団である。
【０１９７】
本発明に従う宿主細胞の集団は、細胞が形質転換／トランスフェクトされている多様なライブラリーに対応する細胞の多様な細胞を含む。好ましくは、細胞の集団の各細胞は、同族対の全ライブラリーの１つの同族対のみを構成し、そして同族対のライブラリーの個々のメンバーが、宿主細胞の集団から発現される個々のメンバーの総数の５０％、より好ましくは２５％、または最も好ましくは１０％を超えることはない。
【０１９８】
本発明の好適な実施形態では、宿主細胞の集団は哺乳動物細胞である。
【０１９９】
上記の宿主細胞の集団は、集団の個々の細胞が異なる多様性の可変領域をコードする配列を構成するため、組み換えポリクローナル結合タンパク質の発現に利用することができる。
【０２００】
本発明の一実施形態は、連結された可変領域をコードする配列の多様な同族対をコードするベクターのライブラリーを含んでなる宿主細胞の集団から発現される組み換えポリクローナルタンパク質であり、そのようなライブラリーは、本発明の方法によって得ることが可能である。典型的に、本発明の組み換えポリクローナルタンパク質は、異なる同族対からなる少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、または１０６のタンパク質からなる。
【０２０１】
本発明の好適な実施形態は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする配列の多様な同族対をコードするベクターのライブラリーを含んでなる宿主細胞の集団から発現される組み換えポリクローナル免疫グロブリンである。
【０２０２】
本発明の別の好適な実施形態は、β鎖可変領域をコードする配列と連結されたＴｃＲα鎖可変領域および／またはδ鎖可変領域をコードする配列と連結されたＴｃＲγ鎖可変領域の多様な同族対をコードするベクターのライブラリーを含んでなる宿主細胞の集団から発現される組み換えポリクローナルＴｃＲである。
【０２０３】
本発明の別の実施形態は、モノクローナルタンパク質の集団に適切な宿主細胞である。特に、重鎖可変領域を伴う軽鎖可変領域の同族対合からなるモノクローナル抗体、またはβ可変領域を伴うα可変領域もしくはγ可変領域を伴うδ可変領域の同族対からなるモノクローナルＴｃＲである。好ましくは、そのようなモノクローナル産生細胞系統は、ハイブリドーマ細胞系統ではない。
【０２０４】
そのようなモノクローナル抗体またはＴｃＲは、目的の複数の非隣接ヌクレオチド配列を連結する方法に、次の工程、ａ）前記連結された核酸配列をベクターへ挿入すること、ｂ）前記ベクターを宿主細胞へ導入すること、ｃ）前記宿主細胞を発現に適切な条件下で培養すること、およびｄ）前記宿主細胞へ挿入されたベクターから発現されるタンパク質産物を得ること、を追加することによって作製することができる。好ましくは、宿主細胞に誘導されるベクターは、可変領域をコードする配列の個々の同族対をコードする。
【０２０５】
発明の用途
本発明の主な用途の１つは、同族対のライブラリーを作製するためのハイスループット法による、可変領域をコードする配列、特に、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域をコードする配列またはＴｃＲαおよびβ鎖またはγおよびδ鎖可変領域をコードする配列の同族対の連結である。同族対ライブラリーの作製に加えて、多重ＲＴ−ＰＣＲ、それに続く、ライゲーションまたは組換えまたは本発明の多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ技術による連結が、遺伝的に多様な細胞の集団、そのような細胞の集団からの細胞ライセート、または細胞のそのような集団から精製されたＲＮＡに対して技術を実施することによって、コンビナトリアルライブラリーの作製において利用され得る。ライブラリー、サブライブラリー、またはこれらのライブラリーの１つからの単一クローンは、ポリクローナルまたはモノクローナルタンパク質の発現を容易にする。特に、モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、本発明のライブラリーから入手され得る。
【０２０６】
診断、治療、および予防における組み換えモノクローナル抗体の使用は、周知である。本発明によって作製される組み換えモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、現存の技術によって作製される抗体産物と同じ用途を有する。特に、有効成分としてポリクローナル組み換え免疫グロブリンを含んでなる医薬組成物が、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わされて、本発明の手段によって生成され得る。ポリクローナル組み換え免疫グロブリンが可変領域をコードする配列の同族対からなる医薬組成物がより好適である。ポリクローナル組み換え免疫グロブリンのそのような医薬組成物は、医薬品として使用することができる。組成物のポリクローナル組み換え免疫グロブリンは、所定の疾患標的に対して特異的またはこれに対して反応性であり、それ故、組成物は、ヒト、家畜、またはペットのような哺乳動物における癌、感染、炎症性疾患、アレルギー、喘息および他の呼吸器系疾患、自己免疫疾患、免疫異常、循環器系疾患、中枢神経系の疾患、代謝および内分泌疾患、移植による拒絶反応、または望ましくない妊娠のような疾患の治療、改善、または防止に使用することができる。
【実施例】
【０２０７】
実施例１：
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中５０μｇ破傷風トキソイド（ＴＴ）で皮下において免疫した。マウスに対し、１４日目に、フロイント不完全アジュバント中５０μｇのＴＴでブーストした。さらに３０日間後、マウスに対し、フロイント不完全アジュバント中５０μｇのＴＴでブーストした。最後のブーストの３日後、マウスを屠殺し、そして脾臓を取り出し、そして４℃において３０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０ｗ／１０％ＦＣＳを含有するチューブに移した。組織を、１０ｃｍディッシュ中７４μｍセルストレーナー（Corning、１３６３５０−３４７９）に移した。シリンジプランジャーの背面により、脾臓を、フィルターを介して液体に浸した。フィルターを、１０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳ溶液で濯いだ。フィルターを取り出し、そしてディッシュを２０ｍｌ冷ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳで満たした。細胞を、５０ｍｌチューブに移し、そして３００×ｇ、２〜８℃で、５分間、遠心分離した。細胞を、５〜１０ｍｌの４℃のＲＰＭＩ  １６４０ｗ／１％ＦＣＳに再懸濁し、そして５０μｍシリンジフィルター（Becton Dickinson、３４０６０３）を介してろ過した。細胞をペレット化し、そしてＦＣＳ；１０％ＤＭＳＯに再懸濁して、２×１０７個の細胞／アンプルの細胞密度を得、そして凍結した。
【０２０８】
破傷風トキソイドで免疫したＢａｌｂ／ｃマウス由来の単一の細胞懸濁液中に脾細胞を伴う凍結バイアルを、３７℃で融解し、そしてなお存在する氷を伴う１５ｍｌチューブに移した。１０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳを、旋回させながら滴下でチューブに添加した。１０ｍｌのＦＡＣＳ  ＰＢＳにおいて１回洗浄後、５０μｍのFilcon（Becton Dickinsonカタログ番号３４０６０３）を介して細胞をろ過する前に、５ｍｌのＰＢＳ、２％ＦＣＳを添加した。細胞をペレット化し、そして１ｍｌのＰＢＳ、２％ＦＣＳ（最終容積）に再懸濁し、続いて、１ｍｌのＰＢＳ、２％ＦＣＳ中１：１００希釈した抗CD43 FITC（BDカタログ番号５５３２７０）および１：４０希釈した抗CD138 PE（BDカタログ番号５５３７１４）か、または１：４０希釈した抗B220 APC（BDカタログ番号５５３０９２）および１：２００希釈した抗MHCII FITC（BDカタログ番号５５３５４７）のいずれかで染色した。細胞を、４℃で、２０分間、暗所でインキュベートした。最後に、細胞を、２ｍｌのＰＢＳ、２％ＦＣＳで２回洗浄し、そして１５ｍｌまでのＰＢＳ、２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）に添加した。選別の直前、ＰＩを１：１００で添加し、そして細胞を、約１０００〜２０００個の細胞／秒の事象計数で選別した。両方の染色に対するゲーティングを図３に示す。
【０２０９】
図３Ａ：左下パネルにおいて、ＰＩポジティブ（死）細胞を排除した（Ｐ１）。次いで、形質細胞を、右下パネルにおいて、ＣＤ４３高、ＣＤ１３８高としてゲートした（Ｐ２）。最後に、右上パネルのＳＳＣ−Ｈ、ＳＳＣ−Ｗプロットにおいて、ダブレットを排除した（Ｐ３）。表１に従って、３つのすべてのゲートについてポジティブな細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに分別した。
【０２１０】
ＥＬＩＳＰＯＴ：
ＰＢＳ中１００μｌの２５μｇ／ｍｌ破傷風トキソイド（ＴＴ）またはヒツジ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immuno Research、カタログ番号５１５−００５−０６２）で被覆する前に、ニトロセルロース底９６ウェルプレート（HA plates, Millipore, Bedford, MA）を、予めＰＢＳで湿潤させた（ブロッキングウェルもまた同様）。同じ容積のＰＢＳがコントロールウェルに存在した。プレートを4℃で放置した。翌日、２００μｌのＲＰＭＩ＋２％脱脂乳でブロッキングする前に、ウェルをＰＢＳにおいて３回洗浄し、そして４℃で放置した。細胞の添加の１時間前に、プレートをインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度）に移した。完全ＲＰＭＩ中１００μｌの細胞をＴＴ−、抗ＩｇＧ被覆ウェルおよびブロッキングのみを施したウェルに添加した。細胞を伴わない培地をコントロールとして含めた。プレートを、インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度）に移した。翌日、プレートを６回洗浄して、細胞を取り出した（緩衝液：ＰＢＳ＋０．０１％Tween20において３×およびＰＢＳにおいて３×）。続いて、ウェルに、ＲＰＭＩ＋２％脱脂乳（１００μｌ／ウェル）中１：３０００で希釈したＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（カタログ番号Ｍ３０００７）を添加した。３７℃で２時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳ＋０．０１％tween 20において３回、続いて、ＰＢＳのみで３回洗浄した。次いで、スポットを、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．１中０．０１５％Ｈ２Ｏ２および０．３ｍｇ／ｍｌの３−アミノ−９−エチルカルバゾールからなる１００μｌの発色基質で展開させた。５分間後、流水（ｔａｐ  ｗａｔｅｒ）で洗浄することによって、発色を停止させた。
【０２１１】
表１の結果を判定すると、ＴＴに特異的な形質細胞（ＰＣ；ＣＤ４３高、ＣＤ１３８高、図３ＡにおけるゲートＰ３）が約２％認められるが、一方、ＴＴ特異的形質芽細胞（ＰＢ；Ｂ２２０およびＭＨＣＩＩポジティブ、図３ＢにおけるゲートＰ４）が約４％認められる。これは、ＴＴ免疫後の特異的抗体の産生においてＰＣの方がＰＢより優位であることを例示する。
【０２１２】
【表３】
0005669397.tif 000004
【０２１３】
実施例２
脾細胞の凍結バイアルを、実施例１に記載のように染色した。
【０２１４】
４つの異なる表現型を４つの経路で選別した。選別ゲートを図４に示す。最初に、左下パネルにおいて、ＰＩポジティブまたは死細胞を排除した（Ｐ１）。Ｐ２は、ＣＤ１３８中、ＣＤ４３高である。Ｐ３はＣＤ１３８高、ＣＤ４３高である。Ｐ４はＣＤ１３８高、Ｃｄ４３ネガティブである。Ｐ５は、ＣＤ１３８中、ＣＤ４３低である。Ｐ１および４つのゲートのそれぞれについてポジティブな１０，０００個の細胞を、試験チューブに選別し、そしてマウスsymplexによる評価のために凍結した。
【０２１５】
画分Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５を、それぞれ１０，０００個の細胞を含有するチューブにバルク選別（ｂｕｌｋ  ｓｏｒｔｅｄ）した。チューブを遠心分離し、そして２Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター（RNasin, Promogaカタログ番号Ｎ２５１１）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium）に、２５０個の細胞／μｌの濃度、１チューブあたり１０μｌで再懸濁し、そして−８０℃で凍結した。
【０２１６】
マウスSymplex増幅を、４組の選別されたリンパ球のそれぞれの希釈系列に対して実施して、ＩｇＧ−κ抗体ｍＲＮＡの含有量を比較した。反応の基本原理は以下のとおりである。
・第１に、ＲＴ反応が実施され、重鎖および軽鎖は、特異的定常領域プライマーによってプライムされる
・第２に、すべての可変領域を含み、そして重複バンドの形成を容易にする相補的オーバーハングが備え付けられたＶＨおよびＶＫ  ５’領域プライマーを使用して、多重反応が実施される。３’プライマーは、重鎖および軽鎖の定常領域に局在する。
最後に、ＪＨおよびＪＫプライマーを使用して、コンジュゲートされたＶＨおよびＶＫのみを増幅するネステッド反応が実施される。
最終反応産物は、５’末端−５’末端型でコンジュゲートされ、そしてリンカーに接続されたＶＨおよびＶＫからなる。サイズは、約７００ｂｐであるべきである。
【０２１７】
組み合わされた多重ＲＴ−ＰＣＲ反応では、本質的に製造者の指示に従い、Qiagen OneStep RT-PCRキットを用いて、表２に示すプライマーの組を使用した。凍結細胞を表情で融解し、再懸濁し、そして遠心分離した。各希釈系列において、１００、３２、１０、３．２、１、０．３２、０．１および０個の細胞に対応する細胞ライセートを使用した。全反応容積は２０μｌであった。サイクリング条件は以下のとおりである。
・５５℃、３０分間。
・９５℃、１５分間。
【数１】
0005669397.tif 000005
【０２１８】
本質的に製造者の指示に従い、FastStartポリメラーゼ（Roche）を使用する表３に示すプライマーの組および補充された試薬によって、ネステッド反応を実施した。２０μｌの全容積中、１回のネステッド反応あたり１μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応産物を使用した。反応条件は以下のとおりである。
【数２】
0005669397.tif 000006
【０２１９】
各最終反応産物の１０μｌを、最終的に１％アガロースゲル上で分析した。
【０２２０】
滴定された細胞ライセートに対するSymplexの結果（図５）から、本発明者らは、重鎖および軽鎖可変領域と、Ｐ３（約０．１個の細胞まで降下）由来、およびＰ２（約３．２個の細胞から開始）由来の細胞とを連結することができることが明らかである。他のゲートでは、効率がより低く、連結は、約３２個の細胞およびそれを超える場合にのみ可能であった。結果として、ＣＤ４３高ＣＤ１３８高（Ｐ３）が、単一細胞レベルでのSymplexTMで最も有用である一方、ＣＤ４３高ＣＤ１３８中は、使用し得るが、効率は低い。
【０２２１】
【表４】
0005669397.tif 000007
【０２２２】
【表５】
0005669397.tif 000008
【０２２３】
実施例３  抗ＥＧＦＲ抗体のクローニング
免疫化
雌性ＢＡＬＢ／ｃ、株Ａ、またはＣ５７Ｂ１６マウス（８〜１０週齢）を、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞に加えて、精製された異なるタンパク質の注入による免疫化に使用した。
【０２２４】
市販のＥＧＦＲタンパク質（R&D systemsカタログ番号１０９５−ＥＲまたはＳｉｇｍａ番号Ｅ３６４１）を、免疫化のいくつかに使用した。免疫化の他方では、ＥＧＦＲのＥＣＤまたはＥＧＦＲｖＩＩＩおよびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）よりなり、また、Ｈｉｓ−タグに加えてタバコＥｔｃｈウイルス（ＴＥＶ）−切断部位を含む融合タンパク質として産生される組み換えヒトＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩを使用した。いくつかの場合、ＥＧＦＲのＥＣＤを、ＴＥＶ−プロテアーゼ切断およびニッケルカラム上でのその後の精製によって単離した。
【０２２５】
約１０７の受容体／細胞を発現するヒト頭頚部癌細胞系統、ＨＮ５（Easty DM, Easty GC, Carter RL, Monaghan P, Butler LJ. Br J Cancer. 1981 Jun;43(6):772-85. Ten human carcinoma cell lines derived from squamous carcinomas of the head and neck.）を、細胞に基づく免疫化に使用した。細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、３ｍＭグリセロール、５ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地において培養した。各免疫化の前に、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、TrypLEでトリプシン処理し、そして増殖培地に再懸濁した。その後、細胞懸濁液を、２５０×ｇ、５分間の遠心分離によって、ＰＢＳ中で２回洗浄し、取り出し、そして１５ｍｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。
【０２２６】
細胞または抗原を、ＰＢＳ中に希釈し、次いで、フロイントのアジュバントと1：1で混合した。アジュバントを使用して、免疫応答を増強およびモジュレートした。一次免疫化のために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用したが、一方、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を、以後の免疫化に使用した。ＩＦＡは、鉱油からなる水中油型エマルジョンであり、そしてＣＦＡは、熱処理で死滅させ、乾燥したマイコバクテリウム（Mycobacterium）種が添加されるＩＦＡである。両方のアジュバントともデポー効果を有する。ＣＦＡは、免疫応答の長期間の持続を生じ、そして免疫応答をブーストするための一次免疫化に使用され、そしてＩＦＡは、以後の免疫化に使用される。水を伴うガラスの表面上に滴下することによって、エマルジョンを試験した。滴が１滴として保持される場合、エマルジョンは安定であり、そして注入を実施することができる。安定なエマルジョンのみを、マウスに投与した。
【０２２７】
スケジュール（表４を参照のこと）により、２５〜１００μｇの抗原または１０７個の細胞を、各注入に使用した。合計で、マウスに４回の注入を行った。すべてのマウスに、３００μｌまたは２００μｌのエマルジョンのいずれかを注入した。スケジュールにより、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）に注入を実施した。
【０２２８】
終了時、頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、そして脾臓を取り出し、そして７４μｍのセルストレーナー（Corning番号１３６３５０−３４７９）に移した。細胞を、フィルターを介して液体に浸し、１０％ＦＢＳを伴う冷RPMI 1640に再懸濁し、そして３００×ｇで５分間、遠心分離した。細胞ペレットを、１％ＦＢＳを伴うRPMI 1640に再懸濁し、５０μｍシリンジフィルター（BD番号３４０６０３）を介してろ過し、そして遠心分離により回収した。細胞ペレットを、１０％ＤＭＳＯを伴うＦＣＳへの再懸濁後、冷凍保存し、そして凍結した細胞を、ＦＡＣＳ選別まで−８０℃で保存した。
【０２２９】
マウス形質細胞のＦＡＣＳ選別
凍結した脾細胞をバイアルを３７℃で融解し、そしてなお存在する氷と共に１５ｍｌチューブに移した。１０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を、旋回させながら滴下でチューブに添加した。１０ｍｌのＦＡＣＳ  ＰＢＳにおいて１回洗浄後、５０μｍのＦｉｌｃｏｎを介して細胞をろ過する前に、５ｍｌのＦＣＳ  ＰＢＳを添加する。次いで、細胞をペレット化し、そして２％ＦＢＳを伴う１ｍｌのＰＢＳ（最終容積）に再懸濁し、そして約５μｇ／ｍｌの最終濃度までの特定の希釈に従って、抗−ＣＤ４３−ＦＩＴＣおよび抗−ＣＤ１３８−ＰＥで染色した。細胞を、４℃で、２０分間、暗所でインキュベートした。続いて、細胞を、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。１５ｍｌまでＦＡＣＳ  ＰＢＳを添加した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を、１：１００で添加し、そして続いて、細胞を、ＰＣＲ反応緩衝液を含有する９６ウェルのＰＣＲ−プレートに選別し（下記を参照のこと）、そしてプレートを−８０℃で凍結する前に、２分間、４００×ｇでスピンした。形質細胞をＣＤ４３−ポジティブ／ＣＤ−１３８ポジティブとしてゲートした。
【０２３０】
同族ＶＨおよびＶＬ対の連結
ＶＨおよびＶＬコーディング配列の連結を、形質細胞としてゲートした単一細胞に対して実施し、ＶＨおよびＶＬコーディング配列の同族対形成を容易にした。手順は、１工程の多重重複−伸長ＲＴ−ＰＣＲ、それに続く、ネステッドＰＣＲに基づく２工程ＰＣＲ手順を利用した。本実施例で使用したプライマー混合物のみが、κ軽鎖を増幅した。しかし、λ軽鎖を増幅することが可能なプライマーは、所望であれば、多重プライマー混合物およびネステッドＰＣＲプライマーに添加し得る。λプライマーを添加する場合、選別手順は、λポジティブ細胞が排除されないように適応されるべきである。同族ＶＨおよびＶＬ配列の連結の原理を図１に示す。
【０２３１】
生成された９６ウェルＰＣＲプレートを融解し、そして選別した細胞は、多重重複−伸長ＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとしての役割を果たした。単一細胞選別前に各ウェルに添加した選別用緩衝液は、反応緩衝液（OneStep RT-PCR Buffer；Qiagen）、ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー（上記の表２を参照のこと）およびＲＮａｓｅインヒビター（RNasin、Promega）を含有した。これに、OneStep RT-PCR Enzyme Mix（２５×希釈；Qiagen）およびｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）を補充して、２０μｌ反応容積において所定の最終濃度を得た。プレートを、３０分間、５５℃でインキュベートして、各細胞由来のＲＮＡの逆転写を可能にした。ＲＴ後、プレートを、次のＰＣＲサイクルに供した：９４℃で１０分間、３５×（９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、７２℃で５分間）、７２℃で１０分間。
【０２３２】
ＰＣＲ反応を、２４枚の９６−ウェルプレート（ABgene）について、Peel Seal Basketを伴うH20BIT Thermal cyclerにおいて実施して、ハイ−スループットを容易にした。サイクリング後、ＰＣＲプレートを−２０℃で貯蔵した。
【０２３３】
ネステッドＰＣＲ工程では、９６−ウェルＰＣＲプレートを、各ウェル中次の混合物（２０μｌ反応液）で調製して、所定の最終濃度を得た：１×FastStart buffer（Roche）、ｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）、ネステッドプライマー混合物（表５を参照のこと）、Phusion DNA Polymerase（０．０８Ｕ；Finnzymes）およびFastStart High Fidelity Enzyme Blend（０．８Ｕ；Roche）。ネステッドＰＣＲのテンプレートとして、１μｌを、多重重複−伸長ＰＣＲ反応から移した。ネステッドＰＣＲプレートを、次のサーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｉｎｇ）に供した：３５×（９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で９０秒間）、７２℃で１０分間。
【０２３４】
無作為に選択された反応物を、１％アガロースゲル上で分析して、約８９０塩基対（ｂｐ）の重複−伸長フラグメントの存在について確かめた。
【０２３５】
ＰＣＲフラグメントのさらなるプロセシングまで、プレートを−２０℃で貯蔵した。
【０２３６】
ネステッドＰＣＲからの連結されたＶＨおよびＶＬコーディング対のレパートリーを、異なるドナー由来の対を混合せずにプールし、そして調製用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。ヒトκ定常軽鎖をコードする配列を、連結されたＶＨおよびＶＬコーディング対のプールされたＰＣＲ産物のＶＬコーディング領域に対する重複伸長によってスプライスした（図２）。ヒトκ定常軽鎖をコードする配列を、κ軽鎖を伴うヒト抗体のコーディング配列を含有するプラスミドから、次のものを含有する反応物において、増幅させた：５０μｌの全容積中Phusion Enzyme（２Ｕ；Finnzymes）、１×Phusion buffer、ｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）、ｈＫＣｆｏｒｗ−ｖ２プライマーおよびκ３’プライマー（表６）、ならびにプラスミドテンプレートｐＬＬ１３８（１０ｎｇ／μｌ）。反応物を、次のサーモサイクリングに供した：２５×（９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間）、７２℃で１０分間。得られたＰＣＲフラグメントを、調製用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０２３７】
各レパートリーのプールした精製されたＰＣＲフラグメントを、次のものを含有する重複伸長ＰＣＲ（５０μｌの全容積）による次のスプライシングによってスプライスして、ヒトκ定常部をコードする領域の増幅および精製されたＰＣＲフラグメント（付録１）とした：ヒトκ定常部をコードする領域フラグメント（１．４ｎｇ／μｌ）、プールした精製されたＰＣＲフラグメント（１．４ｎｇ／μｌ）、Phusion DNA Polymerase（０．５Ｕ；Finnzymes）およびFastStart High Fidelity Enzyme Blend（０．２Ｕ；Roche）、１×FastStart buffer（Roche）、ｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）、ｍｈＫＣｒｅｖプライマーおよびｍＪＨセットプライマー（表６を参照のこと）。反応物を、次のサーモサイクリングに供した：９５℃で２分間、２５×（９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間）、７２℃で１０分間。得られたＰＣＲフラグメント（約１０７０ｂｐ）を、調製用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０２３８】
同族ＶＨおよびＶＬコーディング対のスクリーニングベクターへの挿入
ＥＧＦＲに対する結合特異性を伴う抗体を同定するために、得られたＶＨおよびＶＬコーディング配列を、全長抗体として発現させた。これは、ＶＨおよびＶＬコーディング対のレパートリーの発現ベクターへの挿入および宿主細胞へのトランスフェクションに関与した。
【０２３９】
２段階のクローニング手順を、連結されたＶＨおよびＶＬコーディング対を含有する発現ベクターのレパートリーの作製に用いた。統計的に、発現ベクターのレパートリーが、スクリーニングレパートリーの作製のために使用された同族の対形成したＶＨおよびＶＬＰＣＲ産物の数の１０倍の数の組み換えプラスミドを含有する場合、すべての独特な遺伝子対が示される可能性は９９％である。それ故、４００の重複−伸長Ｖ−遺伝子フラグメントが入手された場合、少なくとも４０００個のクローンのレパートリーを、スクリーニングのために作製した。
【０２４０】
簡単に説明すると、ヒトκ定常コーディング領域にスプライスされた連結されたＶＨおよびＶＬコーディング対のレパートリーの精製されたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物の末端に導入された認識部位において、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ  ＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断した。切断および精製されたフラグメントを、標準的な連結手順によって、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化した哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター、ＯＯ−ＶＰ−００２に連結した（図６）。連結混合物を、大腸菌（E.coli）にエレクトロポレートし、そして適切な抗生物質を含有する２×ＹＴプレートに添加し、そして３７℃で１晩、インキュベートした。ベクターの増幅されたレパートリーを、標準的なＤＮＡ精製方法（Qiagen）を使用して、プレートから回収した細胞から精製した。プラスミドを、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩエンドヌクレアーゼを使用する切断によって、プロモーター−リーダーフラグメントのために調製した。これらの酵素のための制限部位は、ＶＨおよびＶＬコーディング遺伝子対の間に局在した。ベクターの精製後、ＡｓｃＩ−ＮｈｅＩ消化した両方向性哺乳動物プロモーター−リーダーフラグメントを、標準的な連結手順によって、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位に挿入した。連結されたベクターを、大腸菌（E.coli)において増幅させ、そして標準的な方法を使用して、プラスミドを精製した。スクリーニングベクターの作製されたレパートリーを、従来の手順によって大腸菌（E.coli）に形質転換した。得られたコロニーを３８４−ウェルマスタープレートに固化し、そして貯蔵した。整列されたコロニーの数は、インプットＰＣＲ（ｉｎｐｕｔ  ＰＣＲ）産物の数の少なくとも３倍を超え、それ故、得られたすべての独特なＶ−遺伝子対の存在について、９５％パーセントの可能性を示した。
【０２４１】
上記の選択されたクローンおよびFreeStyle CHO-S 細胞（Invitrogen）から調製したＤＮＡプラスミドを、（製造者の指示に従って）抗体の発現のために２ｍｌスケールでトランスフェクトした。上清を、トランスフェクションの９６時間後に回収した。
【０２４２】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合のためのスクリーニング
一般に、スクリーニングを、２段階の手順として作製した。抗体−ライブラリーを、ＥＬＩＳＡにおける組み換えＥＧＦＲタンパク質に対する反応性についてスクリーニングし、その後、ＦＭＡＴ（ＦＬＩＳＡ）を、細胞表面に発現されたＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲ−抗体の検出のために、ＮＲ６ｗｔＥＧＦＲ細胞系統（Batra et al, 1995, Cell Growth Differ, 6(10):1251-9）による細胞に基づくアプローチとして使用した。１０１および１０８／１０９ライブラリー（表４）について、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを示す組み換えＥＧＦＲによって、ＥＬＩＳＡを実施した。
【０２４３】
簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡでは、Nunc maxisorb plate（カタログ番号４６４７１８）を、１μｇ／ｍｌタンパク質（施設内で生成した）で被覆し、ＰＢＳに、４℃で１晩、希釈した。５０μｌの２％−ミルク−ＰＢＳ−Ｔにおける遮断の前に、プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Tween 20（ＰＢＳ−Ｔ）で１回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ−Ｔ、２０μｌの２％−ミルク−ＰＢＳ−Ｔで１回洗浄し、そしてFreeStyle CHO-Sトランスフェクタント由来の５μｌ上清（上記を参照のこと）を添加し、そしてＲ．Ｔで１時間半インキュベートし、その後、プレートを、ＰＢＳ−Ｔ（１ウェルあたり２０μｌ）で１回洗浄した。２％ミルク−ＰＢＳ−Ｔにおいて１：１００００希釈した第２の抗体（ＨＲＰ−ヤギ−抗ヒトＩｇＧ、Jackson、カタログ番号１０９−０３５−０９７）を添加して、ウェルに結合した抗体を検出し、そして１時間、室温でインキュベートした。５分間インキュベートした２５μｌ基質（Kem-en-tec Diagnostics、カタログ番号４３９０）の添加の前に、ＰＢＳ−Ｔにおいて、プレートを１回洗浄した。インキュベーション後、２５μｌの１Ｍ硫酸を添加して、反応を停止した。ＥＬＩＳＡリーダー上、４５０ｎｍにおいて、特定のシグナルを検出した。
【０２４４】
抗ＥＧＦＲ抗体の細胞に基づくＦＭＡＴ検出では、SKBR-3（ATCC番号ＨＴＢ−３０）またはNR6wtEGFR細胞を、増殖培地において保持した。細胞を計数し、そして１：４０，０００に希釈したAlexa-647コンジュゲートヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ−Ｌ）抗体（Molecular probes No. A21445、ロット番号３４６８６Ａ）で１２５，０００個の細胞／ｍｌに希釈した。合計で２０μｌのこの上清を、３８４ウェルの透明底Ｎｕｎｃプレートに移した。続いて、１０μｌトランスフェクション上清を細胞に添加した。反応物由来のＦＭＡＴシグナルを、６〜１０時間のインキュベーション後に測定した。
【０２４５】
スクリーニングからのデータは、全クローンのうち２２１個（４．８％）がＥＬＩＳＡにおいてポジティブであったことを示す。また、それらのクローンのうち９３個（２．０％）がＦＭＡＴにおいてポジティブであった。全体で、クローンのうち２２０個（４．８％）が、ＦＭＡＴにおいてポジティブであり、そしてそれらのうち１２７個（２２０−９３）が、細胞表面抗原について独自にポジティブであった。１１１のライブラリーを類似の様式でスクリーニングしたが、免疫化手順を行って、欠失変異ＥＧＦＲ受容体ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的な抗体を作製したため、ＥＬＩＳＡスクリーニングは、野生型ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を検出するためのアッセイを含んだ。ＥＬＩＳＡでは、７個のクローンが、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的であると同定され、そして、興味深いことに、それらのクローンは、ＦＭＡＴにおいてｗｔＥＧＦＲを発現する細胞の染色についてネガティブであった。１３個のコロニーが、ＦＭＡＴおよびＥＬＩＳＡにおいてｗｔＥＧＦＲついてポジティブであると同定されたが、ＥＧＦＲｖＩＩＩについてはポジティブでなく、これは、１０１および１０８／１０９のライブラリーと比較して、このライブラリーに独特であった。すべてのＥＬＩＳＡポジティブクローンを、さらなる分析のために選択した。
【０２４６】
配列分析およびクローン選択
ＥＬＩＳＡにおいてＥＧＦＲ特異的として同定されたクローンを、本来のマスタープレート（３８４ウェル形式）から回収し、そして新たなプレートに固化した。ＤＮＡをクローンから単離し、そしてＶ−遺伝子のＤＮＡ配列決定のために提出した。配列を整列しそしてすべての独特なクローンを選択した。得られた配列の複数のアラインメントは、各特定のクローンの独自性を表し、そして独特の抗体の同定を可能にした。２２０個のクローンの配列分析後、７０の一般的に個別の抗体配列クラスターを同定した。関連する配列の各クラスターは、おそらく、共通の前駆体クローンの体細胞超変異を介して誘導された。全体的に、配列および特異性のバリデーションのために、各クラスターから１〜２個のクローンを選択した。
【０２４７】
配列および特異性バリデーション
抗体をコードするクローンをバリデートするために、ＤＮＡプラスミドを調製し、そして２ｍｌスケールのFreeStyle CHO-S細胞（Invitrogen）のトランスフェクションを、発現のために実施した。上清を、トランスフェクションの９６時間後に回収した。発現レベルを、標準的な抗ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで評価し、そして特異性を、ＥＧＦＲ−およびＥＧＦＲｖＩＩＩ−特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。クローンの８５％が、正確な特異性および配列を有することが示された。
【０２４８】
抗増殖効果のスクリーニング
細胞損傷は、必然的に、代謝細胞機能および増殖のためのエネルギーを維持および提供するための細胞の能力の消失を生じる。代謝活動アッセイは、この前提に基づく。通常、それらは、ミトコンドリア活性を測定する。Cell Proliferation Reagent WST-1（Rocheカタログ番号１１６４４８０７００１）は、生細胞の代謝活動を測定する即使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）基質である。次いで、代謝活動は、生細胞の数に相関すると想定される。本実施例では、WST-1アッセイを使用して、異なる抗ＥＧＦＲ抗体を含有する細胞培養上清による処置後の代謝活性細胞の数を測定した。
【０２４９】
WST-1アッセイを実施する前に、異なる容積の２ｍｌ上清（０、１０、２５、５０および１５０μｌ）を、９６ウェルプレート中の適切なウェルに移した。
【０２５０】
次いで、ＨＮ５細胞を、１×ＰＢＳで洗浄し、そして３ｍｌトリプシン溶液によるトリプシン処理によって、脱離した。次いで、１７ｍｌの完全培地を添加し、そして細胞を、３００×ｇ（１２００ｒｃｆ）で５分間、スピンした。上清を取り出し、そして細胞を、ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳに再懸濁した。細胞を計数し、そしてそれらの濃度を調整し、そして各ウェルが合計で２００μｌの培地を含有するように、１５００個の細胞を添加した。プレートを、４日間、加湿インキュベータにおいて３７℃でインキュベートした。次いで、２０μｌのＷＳＴ−１試薬を、１ウェルあたり（ｐｒ．  ｗｅｌｌ）に添加し、そしてプレートを１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、プレートを、オービタルプレートシェーカーに移し、そしてさらに１時間、放置した。吸光度を、４５０および６２０ｎｍ（対照波長）において、ＥＬＩＳＡリーダー上で測定した。代謝活性細胞（ＭＡＣ）のレベルの差異を、以下のように、コントロール上清のパーセントとして計算した：
【数３】
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【０２５１】
次いで、これらの値を、フリーソフトウェアClusterおよびTreeViewを使用して実施される管理下の階層的クラスター分析（ＥＬＩＳＡにおける反応性に基づいてクラスター化される）の基礎として使用した。
【０２５２】
抗体選択プロセスの初期の段階において、機能的抗体についてスクリーニングすることが可能であることが好適である。８３の２ｍｌトランスフェクションからの培養上清を使用して、０．５％ＦＢＳにおいてＨＮ５細胞を使用して実施した増殖アッセイにおける増殖阻害機能についてスクリーニングした。結果を、簡単な階層的クラスター分析によって可視化した。クラスター分析（図７）において認められ得るように、多くの上清は、濃度依存的様式で代謝活性ＨＮ５細胞（暗灰色）の数を減少することが見出された（クラスター２）。同様に、いくつかの上清は、濃度依存的様式で代謝活性細胞ＨＮ５細胞（明灰色）の数を増加した（クラスター１、３および４）。代謝活性ＨＮ５細胞の数を減少した上清が反応性２（黒色矢印）を有したが、一方、代謝活性ＨＮ５細胞の数を増加した上清が反応性１（灰色矢印）を有したことは、興味深い観察である。反応性２を伴う上清は、ｗｔＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの両方のＥＬＩＳＡにおいてポジティブであった一方、反応性１を伴う上清は、ｗｔＥＧＦＲに対する反応性のみを有した。それ故、そのようなアッセイは、ＥＬＩＳＡにおける抗体反応性と細胞アッセイにおける機能性との間の関係を提供し得る。
【０２５３】
クローン修復
多重ＰＣＲアプローチを使用する場合、プライマー縮重および高程度の相同性のため、所定の程度のＶ−遺伝子ファミリー内およびＶ−遺伝子ファミリー間のクロスプライミングが予想される。クロスプライミングは、免疫グロブリンフレームワークにおいて天然に存在しないアミノ酸を導入し、いくらかの潜在的結果、例えば、構造変化および免疫原性の増加（すべて治療活性の減少を生じる）を伴う。
【０２５４】
これらの欠点を排除し、そして選択されたクローンが天然の体液性免疫応答を反映することを確実にするために、そのようなクロスプライミング変異は、クローン修復と呼ばれるプロセスで補正される。
【０２５５】
クローン修復手順の第１の工程では、目的のクローンの起源であるＶＨ−遺伝子に対応する配列を含有するプライマーセットで、ＶＨ配列をＰＣＲ増幅し、それによって、クロスプライミングによって誘導される任意の変異を補正した。ＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＡｓｃＩで消化し、そして従来の連結手順を使用して、ＸｈｏＩ／ＡｓｃＩ消化哺乳動物発現ベクターに連結して戻した（図６）。連結されたベクターを、大腸菌（E.coli)において増幅させ、そして標準的な方法によって、プラスミドを精製した。ＶＨ配列を、配列決定して、補正を確かめ、そしてベクターを、ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで消化して、軽鎖の挿入のために、それを調製した。
【０２５６】
クローン修復手順の第２の工程では、目的のクローンの起源であるＶＬ−遺伝子に対応する配列を含有するプライマーセットで、完全な軽鎖をＰＣＲ増幅し、それによって、クロスプライミングによって誘導される任意の変異を補正した。ＰＣＲフラグメントをＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで消化し、そして上記で調製したベクターを含有するＶＨに連結した。連結産物を、大腸菌（E.coli)において増幅させ、そして標準的な方法によって、プラスミドを精製した。続いて、軽鎖を配列決定して、補正を確かめた。
【０２５７】
選択されたクローンのκ定常領域が、遺伝子の増幅中に導入された変異を含有する場合、それは、非変異型定常領域によって置き換えられる。これは、修復されたＶＬ−遺伝子（定常領域を伴わずに増幅された）が、正確な配列（個別のＰＣＲにおいて得られた）を伴う定常領域に融合された重複ＰＣＲにおいて行われる。配列全体を増幅し、そして上記のベクターを含有するＶＨにクローニングし、そして修復された軽鎖を配列決定して、補正を確かめる。
【０２５８】
【表６】
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【０２５９】
【表７】
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【０２６０】
【表８】
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【０２６１】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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