(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも４個の正荷電アミノ酸残基を含む分岐ペプチドを含む化合物であって、前記ペプチドが少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結しており、かつ前記ＴＬＲリガンドが脂質、又はペプチドグリカン、又はリポタンパク質、又はリポ多糖を含む、化合物。
【請求項２】
前記ＴＬＲリガンドがＴＬＲ−２か又はＴＬＲ−６のいずれかに結合する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ＴＬＲリガンドがパルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイル、又はデカノイルを含む、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ＴＬＲリガンドがＰａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２Ｃｙｓ、及びＯｃｔ２Ｃｙｓからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記ＴＬＲリガンドがＴＬＲ−２に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
核酸及び少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連絡した正荷電基を含む化合物を含む複合体であって、前記核酸と前記正荷電基との間の静電相互作用によって前記核酸が前記化合物と会合している、複合体。
【請求項７】
少なくとも１個のＴＬＲを発現する細胞を、請求項６に記載の複合体に接触させる（ヒトの体内において該複合体に接触させることを除く）段階を含む、トランスフェクション方法。
【請求項８】
抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、請求項６に記載の複合体をヒトを除く対象に投与する段階を含み、前記核酸が前記抗原又はそのエピトープをコードする、方法。
【請求項９】
抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、請求項６に記載の複合体をトランスフェクションされた細胞（ヒトの体内において該複合体をトランスフェクションされた細胞を除く）をヒトを除く対象に投与する段階を含み、前記核酸が前記抗原又はそのエピトープをコードする方法。
【請求項１０】
ＴＬＲを発現する細胞で遺伝子の発現を抑圧する方法であって、請求項６に記載の複合体をヒトを除く対象に投与する段階を含み、前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡからなる群より選択され、かつ前記ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが前記遺伝子をターゲットとする、方法。
【請求項１１】
対象における免疫応答の誘導のためのワクチンの製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は複合体の使用。
【請求項１２】
遺伝子異常又は遺伝子欠損をもつ対象の処置のための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は複合体の使用。
【請求項１３】
遺伝子の異常な発現又は望ましくない発現を患っている対象の処置のための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は複合体の使用。
【請求項１４】
細胞のトランスフェクションのための試薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、一般的に、細胞生物学分野に関する。より具体的には、本発明は、細胞、特に、樹状細胞をトランスフェクションする方法、及び免疫応答を誘発する方法に向けられる。この目的を達成するために、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーの１つ又は複数のメンバーと相互作用する能力がある部分に連結した、核酸を結合する能力がある少なくとも１個の正荷電基を含む化合物を提供する。
【０００２】
［発明の背景］
本明細書に用いられる場合、用語「由来する」は、特定された完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）が、特定の供給源から得ることができるが、ただし、必ずしもその供給源から直接というわけではないことを示すものと解釈されるべきである。
【０００３】
本明細書を通して、文脈が別な意味を必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語尾変化は、述べられた段階若しくは要素若しくは完全体、又は段階若しくは要素若しくは完全体の群を包含するが、ただし、いかなる他の段階若しくは要素若しくは完全体、又は要素若しくは完全体の群も排除するものではないことを意味するように理解されるだろう。
【０００４】
本明細書に記載された本発明が、具体的に記載されたもの以外に変形及び改変を受ける余地があることを当業者は理解しているだろう。本発明が全てのそのような変形及び改変を含むことは理解されるべきである。本発明はまた、本明細書に、個々に又は集合的に、参照された又は示された段階、特徴、組成物、及び化合物の全部、並びに前記段階又は特徴のありとあらゆる組合せ又は任意の２つ以上を含む。
【０００５】
本発明は、本明細書に記載された特定の例によって範囲が限定されるべきではない。機能的等価の生成物、組成物、及び方法は明らかに、本明細書に記載された本発明の範囲内である。
【０００６】
本出願に引用された全ての参考文献は、本明細書に参照により明確に組み入れられている。
【０００７】
本発明は、他に規定がない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡテクノロジー、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成、及び免疫学の通常の技術を用いて、過度の実験なしに実施される。そのような手順は、例えば、参照により組み入れられている以下のテキスト、すなわち、
１．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第２版（１９８９）、Ｉ巻、ＩＩ巻、及びＩＩＩ巻の全体、
２．ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキストの全体、
３．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキストの全体、並びに特に、Ｇａｉｔ、１〜２２ページ；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、３５〜８１ページ；Ｓｐｒｏａｔら、８３〜１１５ページ；及びＷｕら、１３５〜１５１ページによるその中の論文
に記載されている。
【０００８】
本明細書中のいかなる先行技術への言及も、この先行技術がオーストラリアにおける共通一般知識の部分を形成するという認識でも、いかなる形の示唆でもなく、そのように解釈されるべきではない。
【０００９】
脂質、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、多糖、及び／又はそれらの組合せ（例えば、リポ多糖、リポタンパク質）などの分子の、細胞内への送達は、多数の研究及び臨床の目的にとって有用である。例えば、研究者が遺伝子制御及び遺伝子発現、ＤＮＡ−タンパク質相互作用又はタンパク質−タンパク質相互作用などの細胞内過程を研究するために、分子を細胞へ導入することが不可欠であることが多く、できる限り高効率でそのように行うことが望ましい。現在、研究者は、細胞への分子の送達、すなわち、細胞のトランスフェクションを、様々な効率をもつ様々な手段によって行う。細胞のトランスフェクション効率は、細胞型、細胞分裂の速度及び時期、並びにトランスフェクションされることになっている分子及び（１つ又は複数の）トランスフェクション試薬の両方の個々の性質を含むいくつかの因子に依存している。
【００１０】
ＤＮＡワクチンは、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞によるＤＮＡの取り込みを介して免疫応答を誘発すると考えられており、樹状細胞が、その後、内部移行したＤＮＡにコードされる抗原を発現し、ＭＨＣ分子との関連でペプチドとして免疫系に抗原を提示する。小動物モデルにおいて、ＤＮＡの投与は、防御免疫応答を誘導することに成功しているが、ただし、ヒト臨床試験において効力の低さが報告されており、免疫応答を誘導するのに高用量のＤＮＡを必要とすることが多い（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．及びＷｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．２００４  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１１４（９）、１２４１〜１２４４）。アデノウイルス及びレトロウイルスは、遺伝子送達のためのベクターとして用いられているが、ヒトに用いるためのこれらのベクターの安全性に関して懸念が存在する（Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．２００２  Ｌａｎｃｅｔ、３６０（９３４１）、１１８５〜１１８６）。今までのところ、比較的安全な非ウイルスベクターを用いる、ＤＣのトランスフェクションは困難であることが証明されている。
【００１１】
ＤＮＡは、正味の負電荷を帯びた分子である。より具体的には、ＤＮＡのバックボーン内のリン酸基が負電荷をもつ。したがって、正味の正電荷を有するカチオン性分子は、静電相互作用を介してＤＮＡを吸着することができ、ＤＮＡの有望な担体である。そのようなカチオン性分子として、微粒子（Ｍｉｎｉｇｏ，Ｇら  ２００７  Ｖａｃｃｉｎｅ、２５（７）、１３１６〜１３２７；Ｍｏｌｌｅｎｋｏｐｆ，Ｈ．Ｊ．ら  ２００４  Ｖａｃｃｉｎｅ、２２（２１〜２２）、２６９０〜２６９５）、ペプチド（Ｇｒａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．ら  ２００３  Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９（３）、３５７〜３６２；Ｒｉｅｄｌ，Ｐ．ら  ２００６  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、１２７、１５９〜１６９）、又はリポソーム（Ｊｉａｏ，Ｘら  ２００３  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３７（２）、４５２〜４６０；Ｅｗｅｒｔ，Ｋ．ら  ２００２  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、４５（２３）、５０２３〜５０２９）が挙げられる。
【００１２】
しかしながら、単にＤＮＡを抗原提示細胞に運ぶだけでは、その結果トランスフェクションが生じるには十分ではなく、抗原特異的応答を作動させるために、ＤＮＡの取り込みもまた存在しなければならない。免疫系の抗原提示細胞は、それらの細胞表面上にＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を発現しており、そのＴＬＲは、主として微生物に由来する様々なリガンドに結合する。例えば、ＴＬＲ−２は細菌リポタンパク質を結合することが知られており、ＴＬＲ−４は細菌リポ多糖を結合することが知られており、ＴＬＲ−６は、ＴＬＲ−１と共同して、脱アシル化細菌脂質を結合することが知られており、ＴＬＲ−９は、ＣｐＧ  ＤＮＡに結合する。樹状細胞サブセットは、９個以上のそのようなＴＬＲを発現することが示されている。ＤＣの表面上の１個又は複数のＴＬＲの会合が、細胞シグナル伝達経路を誘導し、それが、防御免疫の誘導に必要とされる、ＤＣの成熟及び活性化をもたらすことができる。
【００１３】
脂質部分、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）は、マイコプラズマ  ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の細胞膜由来のＭＡＬＰ−２として知られた細菌リポタンパク質の合成類似体である。Ｐａｍ２Ｃｙｓは、ＴＬＲ−２及びＴＬＲ−６の両方のリガンドである（Ｏｋｕｓａｗａ，Ｔら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００４、７２（３）、１６５７〜１６６５）。ペプチドエピトープに結合したＰａｍ２Ｃｙｓを含むワクチンは、強い体液性応答及び細胞性応答を誘導することができる。ペプチドエピトープに結合したＰａｍ２ＣｙｓによるＴＬＲ−２の会合の結果として、ＤＣ成熟、ＮＦ−κＢなどの転写因子の活性化と、炎症誘発性サイトカインの分泌と、最終的にはエピトープ特異的ナイーブＴ細胞を活性化する、流入領域リンパ節へのＤＣの遊走とが生じる（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．ら  ２００４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１（４３）、１５４４０〜１５４４５；Ｚｅｎｇ，Ｗら  ２００２  Ｊ  Ｉｍｍｕｏｌ、１６９（９）、４９０５〜４９１２；Ｃｈｕａ，Ｂ．Ｙ．ら  ２００７  Ｖａｃｃｉｎｅ、２５（１）、９２〜１０１）。
【００１４】
［発明の概要］
本発明に繋がる研究において、本発明者らは、細胞に核酸をトランスフェクションする効率的な手段を生み出そうとした。それはまた、対象において、抗原提示細胞、特に樹状細胞をターゲットにし、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を誘発する、ＤＮＡワクチン候補を作製しようとすることでもあった。
【００１５】
第１態様において、本発明は、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物を提供する。
【００１６】
第２態様において、本発明は、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体であって、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物と会合している、複合体を提供する。
【００１７】
第３態様において、本発明は、トランスフェクション方法であって、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体に、ＴＬＲを発現する細胞を接触させる段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合している、方法を提供する。
【００１８】
第４態様において、本発明は、抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、かつ上記核酸が上記抗原又はそのエピトープをコードする、方法を提供する。
【００１９】
第５態様において、本発明は、抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体をトランスフェクションされた細胞を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、かつ上記核酸が上記抗原又はそのエピトープをコードする、方法を提供する。
【００２０】
第６態様において、本発明はまた、ＴＬＲを発現する細胞において遺伝子の発現を抑圧する方法であって、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、上記核酸がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡからなる群より選択され、かつ上記遺伝子をターゲットとする、方法を提供する。
【００２１】
さらには、対象における免疫応答の誘導のためのワクチンの製造、遺伝子異常又は遺伝子欠損をもつ対象の処置のための医薬の製造、遺伝子の異常な発現又は望ましくない発現を患っている対象の処置のための医薬の製造、及び細胞のトランスフェクションのための試薬の製造における、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】様々な合成された蛍光ペプチド構築物の図表示である。略語；Ｒ、アルギニン；Ｋ、リシン；Ｌ、直鎖；ＦＬ、フルオレセイン又はカルボキシルフルオレセイン。
【図２】Ｒ４とＤＮＡの相互作用のアガロースゲル分析の写真表示である。様々な量（１０μｇ、１μｇ、０．５μｇ、又は０．１μｇ）のＲ４を、１μｇの（Ａ）ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドか又は（Ｂ）ｐＣＩ−ＨＡプラスミドのいずれかと３７℃で３０分間、インキュベートした。その後、ＤＮＡをＵＶ光下で可視化することができるようにＳＹＢＲ−Ｓａｆｅ  ＤＮＡゲル染色を含む１％アガロースゲル上で試料を泳動した。
【図３】Ｒ４及びＤＮＡを含む溶液の２６０ｎｍでの吸光度測定値を示す図である。漸増量のＲ４を１０μｇのｐＣＩ−ＨＡプラスミドと、総容量１００μｌの水中で３７℃、３０分間、インキュベートした。（Ａ）試料を９３００ｇで遠心分離して、いかなる不溶性複合体もペレットにし、収集された上清の吸光度測定値を２６０ｎｍで測定した（薄灰色の棒）。ペレット化試料を１００μｌの水で再懸濁した後の洗浄上清の吸光度測定値もまた測定した（濃灰色の棒）。（Ｂ）上清及び洗浄上清もまた、ＳＹＢＲ−Ｓａｆｅ  ＤＮＡゲル染色を含む１％アガロースゲル上で泳動して、これらの試料中のＤＮＡの存在を検出した。
【図４】Ｄ１細胞のｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドでのトランスフェクション、及びＤ１細胞上のＭＨＣクラスＩＩ発現の上方制御のグラフ表示である。３μｇのＲ４若しくはＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）と３７℃で３０分間、又はＦＵＧＥＮＥのプラスミドＤＮＡに対する比が３：１である混合物と室温で４５分間、あらかじめインキュベートした、１μｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドと共にＢＡＬＢ／ｃ脾細胞由来のＤ１細胞（４×１０５個）を５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で培養した。２日後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって緑色蛍光を測定した（Ａ）。細胞をまた、フローサイトメトリーによる分析の前に、蛍光色素結合抗マウスＭＨＣクラスＩＩ（ＩＡ／Ｅ）抗体で染色した（Ｂ）。高レベルのＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞は、成熟であるとみなされ（ヒストグラムの陰影部）、低レベルを発現する細胞は未熟とみなされる（陰影なし）。このカテゴリーにおける細胞のパーセンテージはまた、三連の試料を分析することによって得られた平均及び標準偏差として各パネル内に示されている。
【図５】トランスフェクション試薬対ＤＮＡ比の異なる混合物を用いたＤ１細胞のトランスフェクションのグラフ表示である。異なる比率のＲ４若しくはＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）と３７℃で３０分間、又は異なる比率のＦＵＧＥＮＥと室温で４５分間、あらかじめインキュベートした、１μｇのｐＣＩ−ＨＡプラスミドと共にＢＡＬＢ／ｃ脾細胞由来のＤ１細胞（４×１０５個）を５％ＣＯ２中、３７℃で４８時間、培養した。その後、細胞を収集し、抗ＨＡ抗体（クローンＥ２．６）で染色し、この抗体を、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体で検出した。
【図６】プラスミド、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１及びｐＣＩ−ＨＡでのヒト単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）のトランスフェクションのグラフ表示である。３μｇのＲ４若しくはＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）と３７℃で３０分間、又はＦＵＧＥＮＥのプラスミドＤＮＡに対する比が３：１である混合物と室温で４５分間、あらかじめインキュベートした、１μｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドと共に単球由来樹状細胞（２×１０５個）を５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で培養した。２日後、細胞を収集し、ｐＥＦＧＰ−Ｎ１プラスミドをトランスフェクションされた細胞における緑色蛍光をフローサイトメトリーによって測定した（Ａ）。ｐＣＩ−ＨＡプラスミドをトランスフェクションされた細胞について、蛍光色素結合抗ＨＡ抗体を用いてＨＡタンパク質の表面発現を検出した（Ｂ）。
【図７】ＤＮＡに対するトランスフェクション試薬の異なる比の混合物を用いる２つの異なる細胞系における緑色蛍光タンパク質のトランスフェクションレベルのグラフ表示である。ヒト肺上皮細胞系Ａ５４９（Ａ）又はマウス肺胞マクロファージ細胞系ＭＨ−Ｓ（Ｂ）を、異なる希釈度のＲ４、Ｒ４Ｐａｍ２Ｃｙｓ、又はＦＵＧＥＮＥと複合体を形成した、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドの非存在下又は存在下において２×１０５個の細胞／ｍｌの濃度で、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間、培養した。トランスフェクション効率は、フローサイトメーターで細胞の蛍光を測定することによって決定した。
【図８】非免疫処置マウス、及びＲ４Ｐａｍ２ＣｙｓとＤＮＡの複合体か又はインフルエンザウイルスかのいずれかで免疫処置されたマウスにおけるＨＡ特異的抗体レベルのグラフ表示である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（週齢６〜８週間）に、単独か、又は１：３若しくは１：５のモル比でＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）と複合体を形成したかのいずれかの、インフルエンザ血球凝集素をコードするＤＮＡを含む５０μｇのＤＮＡプラスミドを０日目及び２８日目に尾の付け根に皮下接種した。陽性対照として、マウスをまた、スプリットＰＲ８ウイルス（３μｇ／マウス）で鼻腔内に免疫処置した。非免疫処置マウスは陰性対照としての役割を果たした。最後の接種後１４日目にマウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡを行って、インフルエンザＰＲ８ウイルスに特異的な抗体の存在を検出した。
【図９】Ｒ４Ｐａｍ２ＣｙｓとＤＮＡの複合体で免疫処置されたマウスの脾臓（Ａ）及び鼠径リンパ節（Ｂ）における誘導された抗原特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数のグラフ表示である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（週齢６〜８週間）に、単独か、又は１：１、１：２、若しくは１：５のＮＨ３＋：ＰＯ４−モル比でＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）と複合体を形成した、インフルエンザ核タンパク質をコードする２０μｇのＤＮＡプラスミドを尾の付け根に皮下接種した。Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）を含む溶液の１０μｌのアリコートをＤＮＡの溶液に２分間ごとに合計１時間、ゆっくり加えることによって、複合体形成を達成した。全ての接種材料を０．７ＭのＮａＣｌに溶解した。免疫処置後７日目又は１０日目にマウスから脾臓及び鼠径リンパ節を摘出し、細胞内サイトカイン染色を行って核タンパク質１４７〜１５５に特異的なＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞の存在を検出した。それぞれの棒は２匹のマウスからの平均及び標準誤差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
驚くべきことに、本発明者らは、本発明の化合物が、ＤＮＡと安定な複合体を形成することを見出した。ＤＮＡは、上記化合物のカチオン性部分に結合し、この複合体が、上記化合物のＴＬＲリガンド部分を介して、上記リガンドを認識する受容体を発現する細胞、例えば、ＤＣなどの抗原提示細胞にターゲットされる。
【００２４】
本発明の化合物によって提供される一つの利点は、それらがＴＬＲ発現細胞をターゲットする能力があることである。ＴＬＲへの結合の結果として、本発明の化合物は、内部に取り入れられ、そしてまた、ＴＬＲ媒介性シグナル伝達経路を誘導する。特定の実施形態において、本発明の化合物のＰａｍ２Ｃｙｓ部分によるＴＬＲ−２の結合は、ＤＣ成熟を引き起こし、その結果として、ＤＣのリンパ節への遊走及びＴリンパ球への効率的な抗原提示をもたらす。
【００２５】
第１態様において、本発明は、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに共有結合した正荷電基を含む。
【００２６】
第２態様において、本発明は、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体であって、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物と会合している、複合体を提供する。
【００２７】
第３態様において、本発明は、トランスフェクション方法であって、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体に、ＴＬＲを発現する細胞を接触させる段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合している、方法を提供する。
【００２８】
第４態様において、本発明は、抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、かつ上記核酸が上記抗原又はそのエピトープをコードする、方法を提供する。
【００２９】
第５態様において、本発明は、抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体をトランスフェクションされた細胞を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、かつ上記核酸が上記抗原又はそのエピトープをコードする、方法を提供する。
【００３０】
第６態様において、本発明はまた、ＴＬＲを発現する細胞で遺伝子の発現を抑圧する方法であって、核酸と、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、上記核酸がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡからなる群より選択され、かつ上記遺伝子をターゲットとする、方法を提供する。
【００３１】
追加の態様において、本発明はまた、対象における免疫応答の誘導のためのワクチンの製造、遺伝子異常又は遺伝子欠損をもつ対象の処置のための医薬の製造、遺伝子の異常な発現又は別なふうに望ましくない発現を患っている対象の処置のための医薬の製造、及び細胞のトランスフェクションのための試薬の製造における、少なくとも１個のＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物の使用を提供する。
【００３２】
本発明は、ＴＬＲリガンド、すなわち、細胞表面ＴＬＲに結合する部分に連結した正荷電基を含む化合物を提供する。ＴＬＲリガンドのＴＬＲへの結合の結果として、ＴＬＲを発現する細胞による上記化合物の取り込み、及び／又はＴＬＲ媒介性シグナル伝達経路を介するシグナル伝達が生じる。
【００３３】
本明細書に用いられる場合、用語「ＴＬＲ」は、１個又は複数のＴｏｌｌ様受容体を意味し、微生物由来の、構造的に保存された分子に結合する１クラスの膜結合型受容体として定義することができる。これまで、１３個のＴＬＲ、ＴＬＲ−１〜ＴＬＲ−１３が同定されており、たいていの哺乳動物種は、１０個〜１５個の型のＴｏｌｌ様受容体を有すると推定されている（Ｄｕ，Ｘ．ら  ２０００  Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．１１：３６２〜３７１；Ｃｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｈ．及びＵｌｅｖｉｔｃｈ，Ｒ．Ｊ．２０００  Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．１１：３７２〜３７８；Ｔａｂｅｔａ，Ｋ．ら  ２００４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：３５１６〜３５２１）。ＴＬＲは、一種のパターン認識受容体（ＰＲＲ）であり、それらのリガンドは、集合的に、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として知られている。
【００３４】
本明細書に用いられる場合、「ＴＬＲリガンド」は、ＴＬＲに選択的又は優先的に結合する分子を意味する。ＴＬＲリガンドの例は、病原体における保存された特徴を含み、細菌細胞表面リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタンパク質、リポペプチド、及びリポアラビノマンナン；細菌鞭毛由来のフラゲリンなどのタンパク質；ウイルスの二本鎖ＲＮＡ、又は細菌及びウイルスのＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフ；並びに特定の他のＲＮＡ及びＤＮＡが挙げられる。ＴＬＲの内因性リガンドもまた同定されており、それらには、フィブリノーゲン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、及びＤＮＡが挙げられる。
【００３５】
表１は、現在、樹状細胞上に発現していることが知られているＴＬＲを、それらの対応するリガンドと共に列挙する。
【００３６】
【表１】
0005743315.tif 000002
【００３７】
本発明の例示的化合物は、リポペプチド「Ｐａｍ２Ｃｙｓ」に連結したカチオン性ペプチドである。当業者は、用語「リポペプチド」が、コンジュゲートしている、１つ又は複数の脂質部分及び１つ又は複数のアミノ酸配列を含む物質の任意の組成物を意味することを理解するであろう。「Ｐａｍ２Ｃｙｓ」（ジパルミトイル−Ｓ−グルセリル−システイン、又はＳ−［２，３ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システインとしても知られている）が合成されており（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら  １９９５  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  １：１８４）、マイコプラズマ  ファーメンタンスから単離されたマクロファージ活性化リポペプチドであるＭＡＬＰ−２の脂質部分に対応する（Ｓａｃｈｔ，Ｇら  １９９８  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４２０７：Ｍｕｈｉｒａｄｔ，Ｐ．Ｆ．ら  １９９８  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６６：４８０４；Ｍｕｈｉｒａｄｔ，Ｐ．Ｆ．ら  １９９７  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１８５：１９５１）。Ｐａｍ２ＣｙｓはＴＬＲ−２のリガンドであることが知られている。
【００３８】
Ｐａｍ２Ｃｙｓは、式（Ｉ）すなわち
【化１】
0005743315.tif 000003
の構造を有する。
【００３９】
細胞表面ＴＬＲをターゲットするために用いることができる他の脂質部分には、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイル、又はデカノイルが挙げられる。好ましい基としては、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２Ｃｙｓ、及びＯｃｔ２Ｃｙｓが挙げられる。
【００４０】
本発明の正荷電基として、表２に列挙されたカチオン性化合物、並びに米国特許第６，６８９，４７８号明細書及び米国特許第４，０３５，５５８号明細書に記載されたポリカチオン性化合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００４１】
【表２】
0005743315.tif 000004
【００４２】
核酸は、核酸のバックボーン内のリン酸基により、正味の負電荷を帯びた分子であるため、それらは、本発明の化合物の正荷電基によって静電相互作用を介して結合され、安定な複合体を形成する。
【００４３】
一実施形態において、正荷電基は、アルギニン残基又はリシン残基を含む直鎖又は分岐ペプチドである。
【００４４】
「核酸」への言及は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）の両方への言及として理解されるべきであり、それらには、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、三重鎖、四重鎖、及び任意の多数本鎖（多重鎖）核酸分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの核酸ハイブリッド、デオキシリボ核酸塩基及びリボ核酸塩基を含む分子、並びに任意のヌクレオチド変異体が挙げられる。
【００４５】
一実施形態において、核酸分子は、「プラスミド」として提供される。「プラスミド」への言及は、宿主細胞へ伝達可能であり、かつ宿主細胞において複製を起こすことができる核酸分子への言及として理解されるべきである。しかしながら、核酸分子は、プラスミドに限定されるべきではなく、ウイルスＤＮＡ又はウイルスＲＮＡを含む任意の核酸分子であってもよい。
【００４６】
当業者は、細胞に核酸をトランスフェクションすることが、多くの研究及び臨床の適用に有用であることを理解しているであろう。「トランスフェクション」への言及は、核酸を含む外因性分子が細胞へ導入される過程への言及として理解されるべきである。
【００４７】
多くの研究適用は、細胞のトランスフェクションを必要とする。現在、研究者は、細胞への分子の導入、すなわち、細胞のトランスフェクションを、様々な効率をもつ様々な手段によって行う。いくつかのトランスフェクション試薬を、現在、研究者が利用でき、それらには、ＦＵＧＥＮＥが挙げられる。しかしながら、細胞のトランスフェクション効率は、例えば、細胞型、細胞分裂の速度及び時期、並びにトランスフェクションされることになっている分子及び（１つ又は複数の）トランスフェクション試薬の両方の個々の性質に依存する。
【００４８】
本発明の化合物は、ＴＬＲを発現する細胞のトランスフェクションに特に有用である。したがって、ＴＬＲを天然で発現する細胞か、又はＴＬＲ全体であろうと細胞内シグナル伝達ドメインを欠く改変受容体であろうと、ＴＬＲを発現するように安定にトランスフェクションされている細胞のいずれかに、本発明の化合物と複合体を形成した核酸をトランスフェクションすることができる。
【００４９】
「細胞」は、核酸分子が本発明の化合物によって送達される任意の細胞として理解されるべきである。細胞は、インビトロの細胞、インビボの細胞、又はエクスビボの細胞であってもよい。細胞は、単離されていてもよく、又は生きている動物の器官若しくは組織の一部を形成していてもよい。細胞はまた、細菌、酵母、真菌、カビ、寄生虫、藻類などの微生物であってもよい。細胞はまた、培養動物細胞若しくは細胞株、又は人工細胞であり得る。
【００５０】
本発明の特定の実施形態の細胞に関しての、「単離された」への言及は、その本来の環境（例えば、それが自然発生している場合には、自然環境）から取り出されている物質への言及として理解されるべきである。例えば、生きている生物体の組織に存在する細胞は単離されていないが、その同じ細胞が、自然系内に共存する細胞の一部又は全部から分離されている場合、単離されている。
【００５１】
本発明の一態様は、ＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物であって、正荷電基と負荷電核酸との間の静電相互作用によって核酸と安定な複合体を形成することができる、化合物を提供する。本発明の化合物は、ＴＬＲを発現する細胞に核酸をターゲットする手段を提供する。
【００５２】
一実施形態において、本発明は、ＴＬＲリガンドに連結したカチオン性ペプチドを含む化合物であって、カチオン性ペプチドと負荷電ＤＮＡとの間の静電相互作用によってＤＮＡと安定な複合体を形成することができる、化合物を提供する。そのような化合物は、ＴＬＲを発現する細胞、例えば、抗原提示細胞、より具体的にはＤＣに、ＤＮＡをターゲットする手段を提供する。
【００５３】
別の実施形態において、本発明は、トランスフェクション方法であって、核酸と、ＴＬＲに結合する少なくとも１個の部分に連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体に、ＴＬＲを発現する細胞を接触させる段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合している、方法を提供する。
【００５４】
さらなる実施形態において、本発明は、抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、核酸と、ＴＬＲに結合する少なくとも１個の部分に連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、かつ上記核酸が上記抗原又はそのエピトープをコードする、方法を提供する。
【００５５】
さらに別の態様において、本発明は、抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、核酸と、ＴＬＲに結合する少なくとも１個の部分に連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体をトランスフェクションされた細胞を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、かつ上記核酸が上記抗原又はそのエピトープをコードする、方法を提供する。
【００５６】
本発明の化合物をＤＣに接触させる段階は、結果として、細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ発現の増加によって示されるようなＤＣの成熟又は活性化を生じさせることができる。したがって、ＴＬＲリガンドを含む化合物は、ＤＣをターゲットするためだけでなく、ＴＬＲ及びＭｙＤ８８などの下流シグナル伝達分子を介してのＤＣの活性化のために有用であり得る。
【００５７】
それゆえに、本発明の化合物は、ＤＣを活性化するのに有用である。樹状細胞が免疫応答を誘導するために、樹状細胞はまず、それらがリンパ節に遊走し、かつＴリンパ球を活性化するために必要な接着分子及び共刺激分子を発現するように、活性化されなければならない。ＤＮＡと複合体を形成したＴＬＲリガンドを含む化合物は、ＤＣを活性化するのに特に有用であり、ＤＮＡがタンパク質をコードする場合、トランスフェクションされたＤＣは、翻訳された、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のペプチド断片を免疫細胞へ提示し、それによって、細胞性及び体液性免疫応答を呼び起こす。換言すれば、本発明の特定の実施形態の化合物は、ＤＮＡと複合体を形成した場合、ＤＮＡワクチン接種アプローチにとって有用である。
【００５８】
本明細書に用いられる場合、「ＤＮＡワクチン接種」への言及は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、対象へのＤＮＡの投与への言及を意味する。本発明の化合物は、限定されるわけではないが、静脈内、鼻腔内、筋肉内、経口、直腸などを含む任意の経路によって対象へ直接、投与されてもよい。
【００５９】
本明細書に用いられる場合、「免疫応答」への言及は、侵入した病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、癌性細胞、又は自己免疫若しくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞若しくは組織の選択的損傷、破壊若しくはヒト身体からの排除を結果として生じさせるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び上記の細胞又は肝臓によって産生される（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）可溶性高分子の協調作用への言及を意味する。
【００６０】
本明細書に用いられる場合、「Ｔリンパ球応答」への言及は、Ｔリンパ球に依存する免疫応答の構成要素（すなわち、ヘルパーＴリンパ球、細胞傷害性キラーＴリンパ球、又はサプレッサーＴリンパ球への、Ｔリンパ球の増殖及び／又は分化、抗体産生を引き起こすか又は阻止する、Ｂリンパ球へのヘルパーＴリンパ球によるシグナルの供給、細胞傷害性Ｔリンパ球による特定のターゲット細胞の殺害、並びに他の免疫細胞の機能を調節する、サイトカインなどの可溶性因子の放出）への言及を意味する。
【００６１】
「患者」、「対象」、又は「哺乳動物」は、交換可能に用いられ、ヒト患者及び非ヒト霊長類、加えてウサギ、ラット、及びマウスなどの実験動物、並びに他の動物などの哺乳動物を指す。動物には、全ての脊椎動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物が挙げられる。
【００６２】
本発明の化合物は、ＤＮＡワクチン接種に用いることに加えて、いくつかの他の臨床適用に有用である。例えば、自己免疫疾患又は癌の処置は、造血性幹細胞（ＨＳＣ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの自己細胞のトランスフェクションを必要とすることがある。そのような細胞を、対象から採取し、インビトロで培養し、任意で当技術分野においてよく知られた方法によってＤＣへ分化させ、かつ／又は核酸をトランスフェクションし、その後、対象へ注入して戻すことができる。いくつかの実施形態において、核酸はワクチン抗原をコードし、トランスフェクションされた細胞は、免疫応答を呼び起こすように意図されてもよい。他の実施形態において、核酸は、サイトカイン又は抗原性寛容原をコードしてもよい。
【００６３】
別の態様において、本発明は、ＴＬＲを発現する細胞で遺伝子の発現を抑圧する方法であって、核酸と、ＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物とを含む複合体を対象に投与する段階を含み、上記核酸が、核酸と正荷電基との間の静電相互作用によって上記化合物に会合しており、上記核酸がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡからなる群より選択され、上記ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが上記遺伝子をターゲットとする、方法を提供する。
【００６４】
「処置すること」又は「処置」は、疾患の症状、合併症、又は生化学的徴候の発生を予防し、又は遅らせて、疾患、状態、若しくは障害（例えば、感染性疾患、炎症、又は自己免疫疾患）の症状を軽減するか、若しくは寛解させ、又はそのさらなる発生を抑止若しくは阻害するための本発明の組成物、化合物、又は薬剤の投与を含む。「処置すること」はさらに、疾患、状態、又は障害（例えば、感染性疾患、炎症、又は自己免疫疾患）の処置又は寛解又は予防における任意の成功のきざしを指し、それらには、軽減、寛解、症状の減少若しくは疾患状態を患者にとってより許容できるものにすること、変性若しくは減退の速度を遅らせること、又は変性の最終点を衰弱がより少ないものにすることなどの任意の客観的又は主観的パラメーターが挙げられる。症状の処置又は寛解は、医師による検査の結果を含む、客観的又は主観的パラメーターに基づくことができる。したがって、用語「処置すること」は、感染性疾患、炎症、又は自己免疫疾患に関連した症状又は状態の発生を予防する若しくは遅延させるための、軽減するための、又は抑止若しくは阻害するための本発明の化合物又は薬剤の投与を含む。用語「治療効果」は、対象における疾患、疾患の症状、又は疾患の副作用の低減、排除、又は予防を指す。本発明の方法を用いる「処置すること」又は「処置」には、感染性疾患、炎症、又は自己免疫疾患のリスクの増加があり得るが、まだ症状を経験していない、又は現していない対象において症状の発生を予防すること、感染性疾患、炎症、又は自己免疫疾患の症状を阻害すること（その発生を遅らせること、又は抑止すること）、感染性疾患、炎症、又は自己免疫疾患の症状又は副作用からの解放を提供すること（対症療法を含む）、及び感染性疾患、炎症、又は自己免疫疾患の症状を軽減すること（退行を引き起こすこと）が挙げられる。処置は、疾患又は状態の顕在化後、症状の予防的（疾患の発生を予防し、若しくは遅延させるための、又はその臨床的若しくは潜在性症状の顕在化を予防するための）又は治療的抑制又は軽減であり得る。
【００６５】
追加の態様において、本発明は、対象における免疫応答の誘導のためのワクチンの製造、遺伝子異常又は遺伝子欠損をもつ対象の処置のための医薬の製造、遺伝子の異常な発現又は別なふうに望ましくない発現を患っている対象の処置のための医薬の製造、及び細胞のトランスフェクションのための試薬の製造における、ＴＬＲリガンドに連結した正荷電基を含む化合物の使用を提供する。
【００６６】
本明細書に示された化合物及び方法は、医学的適用及び獣医学的適用の両方に用いることができる。典型的には、生成物をヒトに用いるが、他の哺乳動物に用いてもよい。用語「患者」及び「対象」は、哺乳動物の個体を示すように意図され、本明細書を通じて、及び特許請求の範囲においてそのように用いられる。本発明の主要な適用は、ヒト患者又は対象に関係しているが、本発明は、実験動物、家畜、動物園動物、野生動物、ペット、又は競技用動物に適用してもよい。
【００６７】
当業者が、所望の適用に適するように、正荷電基とＴＬＲリガンドとの任意の組合わせを導入してもよいことは理解されているであろう。
【００６８】
これより、以下の非限定的実施例を参照して、本発明をさらに記載する。
【００６９】
実施例１
カチオン性ペプチドの合成
分岐ペプチド構築物については、リシン残基を用いて足場鋳型の分岐点を供給することによって合成した。足場内に存在する分岐点の数に依存して、ジカチオン性又はテトラカチオン性構造が生じた（図１）。これらの分岐構築物を、ＰＥＧ−Ｓ  ＲＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；置換係数（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。まず、等モル量のＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、及び１．５倍モル過剰のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；Ｓｉｇｍａ、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と共に、Ｆｍｏｃ−リシン（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を４倍過剰で、樹脂に結合させた。アシル化を４０分間行い、完全な反応をトリニトロベンジルスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）試験によって確認した（２１）。α−アミノ基上のＦｍｏｃ保護基の除去を２．５％ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で達成し、Ｆｍｏｃ−リシン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Ａｕｓｐｅｐ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、Ｆｍｏｃ基の除去後、２つの一級アミノ基を露出させて分岐点として働くように、結合させた。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；Ａｕｓｐｅｐ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、それぞれのアシル化段階と脱保護段階の間に樹脂を洗浄した。後続のアミノ酸を４倍過剰で結合させ、アシル化を６０分間行った。四価の構築物の組み立てについて、アシル化のさらなるラウンドを、Ｆｍｏｃ−リシン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを用いて６０分間行い、４つの分岐点を生じさせた。アミノ酸を含む基の四価アルギニン構築物（Ｒ４）への化学選択的ライゲーションを可能にするために、システインを構築物のＣ末端に挿入し、Ｒ４−Ｃｙｓを生じさせた。分岐ペプチド構築物上へのカルボキシフルオレセイン結合について、最後のアシル化反応後、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去しなかった。その代わり、Ｃ末端リシンのε−アミノ基上に存在するＭｔｔ保護基をジクロロメタン中１％ＴＦＡ（Ａｊａｘ  Ｆｉｎｅｃｈｅｍ、Ｓｅｖｅｎ  Ｈｉｌｌｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）での処理によって除去した。その後、等モル量のＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ、及び１．５倍モル過剰のＤＩＰＥＡの存在下で、５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕｋａ  ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を４倍過剰用いて、暗闇中１８時間、露出したε−アミノ基に結合させた。アシル化後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去した。全てのペプチドを同時に、固相支持体及び側鎖保護基から切断した。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）３  ＨＰＬＣクロマトグラフィーシステムに設置されたバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）又はＣ８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いて逆相分析クロマトグラフィーによってペプチ���の純度を評価した。限界溶媒としてＨ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ及びアセトニトリル中０．１％ＴＦＡを用いる１ｍｌ／分の流速を用いて、クロマトグラムを展開した。必要な場合、セミ分取用ウォーターズ又はＧＢＣ  ＨＰＬＣシステム及びセミ分取用バイダックＣ４カラム（１０ｍｍ×３００ｍｍ）を用いて２．５ｍｌ／分の流速でペプチドを精製した。ペプチド含有量の推定を、蛍光ペプチドの吸光度を４９６ｎｍで測定するＵＶ分光光度法によって測定し、８３，０００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて濃度を計算した。合成された蛍光分岐ペプチド構築物の模式図は、図１に示されている。
【００７０】
ペプチドの脂質付加について、ＤＭＦ中５０％ＤＣＭにおける等価量のＨＯＢｔ及びＤＩＣＩの存在下で、４倍過剰のＮ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−システイン（Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨ）をＣ末端リシンのε−アミノ基上に結合させることによって脂質部分を構築した。アシル化を４０分間行い、結合の成功がトリニトロベンゼンスルホン酸試験を用いて確認されるまで、繰り返した。樹脂結合Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチドの２つのヒドロキシ基の脂質付加を、等モル量のＤＭＡＰ、１０倍過剰の脂肪酸、及び１２倍過剰のＤＩＣＩを含む溶液を用いて一晩、行った。
【００７１】
実施例２
Ｒ４によるＤＮＡ移動の遅延
分岐ペプチドＲ４とＤＮＡの間の会合を調べるために、緑色蛍光タンパク質及びインフルエンザＨＡタンパク質をそれぞれコードするＤＮＡプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１又はｐＣＩ−ＨＡの一定量を、様々な量のＲ４とインキュベートし、アガロースゲル電気泳動によって分析した（図２）。
【００７２】
各試料中のＲ４の量を増加させることによって、ＤＮＡ移動に影響を及ぼすことができた。臭化エチジウム蛍光によって可視化されたように、陽極へのＤＮＡプラスミド移動の部分的遅延は、０．１〜０．５μｇのＲ４を用いた場合、明らかであり、より多い量のＲ４とインキュベートされたＤＮＡ試料はより遅い速度で動いた。開始点におけるＤＮＡのバンドの出現によって明らかなように、１０μｇのＲ４が存在した場合、ＤＮＡ移動の完全な遅延が達成された。しかしながら、このバンドは、全くかすかにしか見えず、この試料中にほとんどＤＮＡがないことを示唆した。これは、Ｒ４が臭化エチジウムのＤＮＡへの結合を阻害すること、及び／又はＲ４とＤＮＡの間の相互作用の結果として、アガロースゲル中で移動するよりむしろ電気泳動緩衝液中へ拡散する不溶性複合体の形成をもたらすことが原因である可能性がある。これらの結果は、Ｒ４の正荷電アミノ基及びグアニジン基がＤＮＡバックボーン内の負荷電リン酸基を中和して、陽極へ移動するその能力を遅延させ得ることを示唆する。
【００７３】
実施例３
Ｒ４−ＤＮＡ複合体の形成
Ｒ４のＤＮＡへの結合を確認するために、漸増量のＲ４及びＤＮＡを含む遠心分離した混合物の上清におけるＤＮＡの量を、２６０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって決定した（図３Ａ）。ＤＮＡをその電荷の中和によって溶液から沈殿させるＲ４の能力は、溶液中のＤＮＡの減少を生じさせ、それにしたがって、それら２つの間の会合を示すことになるだろう。遠心分離された上清におけるＤＮＡの量は、０．１μｇ〜５μｇのＲ４とインキュベートした場合、劇的には変化しなかった。しかしながら、７．５μｇのＲ４を用いた場合、わずかな減少が生じ、これより多い量を含む溶液中において、ＤＮＡは検出されなかった。この結果は、存在するＲ４の量がＤＮＡの溶液からの沈殿と比例することを示す。吸光度の測定値をまた、いかなる遠心分離された不溶性物質も再懸濁するために用いられた洗浄上清についても取った。これらの試料中にＤＮＡがほとんど存在しないことは、Ｒ４−ＤＮＡ沈殿物が安定であること、及びＤＮＡがこの複合体から解離する可能性は低いことを示唆する。
【００７４】
アガロースゲル分析（図３Ｂ）は、ＤＮＡバンドが、０．１〜７．５μｇのＲ４を含む上清試料においては明らかであったが、１０μｇ又は１５μｇのＲ４を含む試料においては明らかではなかったことを示す。ＤＮＡ移動の遅延はまた、１μｇ又はそれ以上のＲ４を含む試料において明らかである。
【００７５】
実施例４
Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−ＤＮＡでのＤＣのトランスフェクション
Ｒ４構築物又はＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）構築物がトランスフェクションされたＤＮＡの発現を誘導する能力があるかどうかを決定するために、マウスＤＣ系、Ｄ１にｐＥＧＦＰプラスミドをＲ４又はＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）を用いてトランスフェクションした（図４Ａ）。これらの細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現レベルを、市販されているトランスフェクション試薬ＦＵＧＥＮＥを用いてトランスフェクションしたＤ１細胞における緑色蛍光タンパク質の発現レベルと比較した。
【００７６】
未処理の細胞、ＤＮＡのみで処理された細胞、及びＤＮＡと共にＲ４で処理された細胞において、蛍光は観察されなかった。しかしながら、Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）及びＤＮＡをトランスフェクションされた細胞は、ｐＥＧＦＰ及びＦＵＧＥＮＥ試薬をトランスフェクションされた細胞において観察された発現レベルに匹敵するレベルでＧＦＰを発現した。
【００７７】
Ｄ１細胞培養物はまた、それぞれ未熟細胞及び成熟細胞に対応する、ＭＨＣクラスＩＩ低か又はＭＨＣクラスＩＩ高のいずれかである２つの別々の細胞集団で構成されることが見出された（図４Ｂ）。未処理のＤ１細胞の約４％はＭＨＣクラスＩＩ高であった。ＤＮＡ単独での処理又はＲ４とのＤＮＡでの処理は、Ｄ１細胞に関してＭＨＣクラスＩＩの発現を感知できるほどには変化させなかった。ＤＮＡ及びＦＵＧＥＮＥで処理されたＤ１細胞は、約３６％のＭＨＣクラスＩＩ高細胞を含み、Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）及びＤＮＡで処理されたＤ１細胞は、約８２％のＭＨＣクラスＩＩ高細胞を含んだ。
【００７８】
ＤＮＡに対するトランスフェクション試薬の比が異なるそれらの混合物を用いるトランスフェクション効率もまた、一定量（１μｇ）のｐＣＩ−ＨＡプラスミドとあらかじめインキュベートした漸増量（０．１μｇ、１μｇ、又は３μｇ）のＲ４、Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）、又はＦＵＧＥＮＥとＤ１細胞をインキュベートすることによって調べた（図５）。細胞表面インフルエンザＨＡタンパク質発現を、ＨＡ特異的抗体を用いて測定した。Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）又はＦＵＧＥＮＥを用いた場合、表面ＨＡタンパク質を発現する細胞のパーセンテージによって示されるように、トランスフェクション効率は、用いられるトランスフェクション剤の量と比例した。これの例外は、Ｒ４を用いた場合であった。この場合、ＨＡ発現レベルは、Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）又はＦＵＧＥＮＥを含むＤＮＡ混合物によって誘導されるＨＡ発現レベルより低かったが、ＤＮＡに対するＲ４の重量対重量比が同等である時、最適であるように思われた。しかしながら、より高い比率は、トランスフェクション効率にとって有害であることが見出された。
【００７９】
調べられた比率の全部において、Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）は、抗原の発現を誘導することにおいてＦＵＧＥＮＥより優れていることが見出された。Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）及びＤＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞の最大パーセンテージは、３：１比において６０％であった。相対的に、ＤＮＡに対するＥＵＧＥＮＥの等価比率を用いた時、約３０％のＨＡ陽性細胞だけが、検出された。
【００８０】
実施例５
ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）のトランスフェクション
ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）のトランスフェクションを増強するＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）の能力を調べた。ＭｏＤＣにｐＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションした実験において（図６Ａ）、Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）のみが、ＧＦＰの発現を誘導することにおいて効率的であった。ＦＵＧＥＮＥか又はＲ４のいずれかを加えたｐＥＧＦＰでの細胞のトランスフェクションは、相対的に非効率であり、これらの細胞におけるトランスフェクションレベルは、プラスミド単独で処理されたものと類似していた。この結果は、ＭｏＤＣに、各トランスフェクション試薬と共にｐＣＩ−ＨＡプラスミドをトランスフェクションした実験において、繰り返された（図６Ｂ）。
【００８１】
実施例６
Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−ＤＮＡでの非ＤＣ細胞系のトランスフェクション
ＤＮＡと複合体を形成した、Ｒ４構築物又はＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）構築物が非ＤＣ細胞系をトランスフェクションする能力があるかどうかを調べるために、ヒト肺上皮細胞系Ａ５４９及びマウス肺胞マクロファージ細胞系ＭＨ−Ｓに、Ｒ４又はＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）を用いてｐＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションした（図７Ａ及び７Ｂ）。ヒト肺上皮細胞系Ａ５４９（Ａ）又はマウス肺胞マクロファージ細胞系ＭＨ−Ｓ（Ｂ）を、異なる希釈度のＲ４、Ｒ４Ｐａｍ２Ｃｙｓ、又はＦＵＧＥＮＥと複合体を形成した、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドの非存在下又は存在下において２×１０５個の細胞／ｍｌの濃度で、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間、培養した。トランスフェクション効率については、フローサイトメーターで細胞の蛍光を測定することによって決定した。これらの細胞系の両方とも他の研究においてＴＬＲ−２を発現することが報告されている（Ｏｓｈｉｋａｗａ  ２００３、Ｓｌｅｖｏｇｔ  ２００７）。未処理のＡ５４９又はＭＨ−Ｓ細胞、及びＤＮＡと共にＲ４で処理された細胞において、皆無かそれに近い蛍光が観察された。しかしながら、Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）及びＤＮＡをトランスフェクションされたＡ５４９又はＭＨ−Ｓ細胞は、ｐＥＧＦＰプラスミド及びＦＵＧＥＮＥ試薬をトランスフェクションされた細胞において観察された発現レベルと、より高くはないにしても、匹敵するレベルでＧＦＰを発現した。
【００８２】
実施例７
Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−ＤＮＡで免疫処置されたマウスにおける特異的抗体産生
ＤＮＡと複合体を形成したＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）の抗体を誘導する能力を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（週齢６〜８週間）に、単独か、又は１：３若しくは１：５のモル比でＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）と複合体を形成した、インフルエンザ血球凝集素をコードするＤＮＡを含む５０μｇのＤＮＡプラスミドを０日目及び２８日目に尾の付け根に皮下接種した。陽性対照として、マウスをまた、スプリットＰＲ８ウイルス（３μｇ／マウス）で鼻腔内に免疫処置した。非免疫処置マウスは陰性対照としての役割を果たした。最後の接種後１４日目にマウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡを行って、インフルエンザＰＲ８ウイルスに特異的な抗体の存在を検出した。血清抗ＨＡ抗体をＥＬＩＳＡによって測定した。非免疫処置マウス又は「ナイーブ」マウスにおいてＨＡ特異的抗体は検出されなかったが、１：３及び１：５のモル比で混合された２つの用量のＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）及びＤＮＡで免疫処置されたマウスにおいて、インフルエンザウイルスに結合することができる実質的レベルの抗体が検出された（図８）。
【００８３】
実施例８
Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）−ＤＮＡで免疫処置されたマウスにおけるインフルエンザ核タンパク質特異的ＩＦＮ−γ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導
ＤＮＡと複合体を形成したＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）の細胞性免疫応答を誘導する能力を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（週齢６〜８週間）に、単独か、又は１：１、１：２、若しくは１：５のＮＨ３＋：ＰＯ４−モル比でＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）と複合体を形成した、インフルエンザ核タンパク質をコードする２０μｇのＤＮＡプラスミドを尾の付け根に皮下接種した。Ｒ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）を含む溶液の１０μｌのアリコートをＤＮＡの溶液に２分間ごとに合計１時間、ゆっくり加えることによって、複合体形成を達成した。全ての接種材料を０．７ＭのＮａＣｌに溶解した。免疫処置後７日目又は１０日目にマウスから脾臓及び鼠径リンパ節を摘出し、細胞内サイトカイン染色を行って核タンパク質１４７〜１５５に特異的なＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を検出した。それぞれの棒は２匹のマウスからの平均及び標準誤差を表す。
【００８４】
ＤＮＡ単独で接種されたマウスの脾臓及び鼠径リンパ節では非常に低レベルの活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞しか検出されず（それぞれ、図９Ａ及び９Ｂ）、ナイーブマウスでは検出されなかった。しかしながら、異なる比率のＤＮＡに対するＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）を含む複合体の投与は、免疫処置後７日目、脾臓において検出可能なＮＰ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した（図９Ａ）。特に、１：１比のＲ４（Ｓ２Ｐａｍ２Ｃｙｓ）とＤＮＡを接種されたマウスのリンパ節及び脾臓の両方において、高レベルの活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された（図９Ａ及び９Ｂ）。
【００８５】
参考文献
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Ｂｕｓｃｈｌｅ  Ｍ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｗ，  Ｚａｕｎｅｒ  Ｗ，  Ｍｅｃｈｔｌｅｒ  Ｋ，  Ｔｒｓｋａ  Ｂ，  Ｋｉｒｌａｐｐｏｓ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｔｒａｎｓｌｏａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（７）：３２５６−３２６１
Ｃｈｏｗ  Ｊ．  Ｃ．，  Ｙｏｕｎｇ  Ｄ．  Ｗ．，  Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ  Ｄ．  Ｔ．，  Ｃｈｒｉｓｔ  Ｗ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｇｕｓｏｖｓｋｙ  Ｆ．  （１９９９）  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｊ−Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４  （１６）：  １０６８９−１０６９２
Ｃｈｒｉｓｔｉａｅｎｓ  Ｂ，  Ｇｒｏｏｔｅｎ  Ｊ，  Ｒｅｕｓｅｎｓ  Ｍ，  Ｊｏｌｉｏｔ  Ａ，  Ｇｏｅｔｈａｌｓ  Ｍ，  Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ  Ｊ，  Ｐｒｏｃｂｉａｎｔｚ  Ａ，  Ｒｏｓｓｅｎｅｕ  Ｍ．  （２００４）  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７１（６）；１１８７−１１９７
Ｆａｗｅｌｌ  Ｓ，  Ｓｅｅｒｙ  Ｊ，  Ｄａｉｋｈ  Ｙ，  Ｍｏｏｒｅ  Ｃ，  Ｃｈｅｎ  ＬＬ，  Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｔａｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｒａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（２）；６６４−  ６６８
Ｆｌａｃｈｅｒ  Ｖ，  Ｂｏｕｓｃｈｂａｃｈｅｒ  Ｍ，  Ｖｅｒｒｏｎｅｓｅ  Ｅ，  Ｍａｓｓａｃｒｉｅｒ  Ｃ，  Ｓｉｓｉｒａｋ  Ｖ，  Ｂｅｒｔｈｉｅｒ−Ｖｅｒｇｎｅｓ  Ｏ，  ｄｅ  Ｓａｉｎｔ−Ｖｉｓ  Ｂ，  Ｃａｕｘ  Ｃ，  Ｄｅｚｕｔｔｅｒ−Ｄａｍｂｕｙａｎｔ  Ｃ，  Ｌｅｂｅｃｑｕｅ  Ｓ，  Ｖａｌｌａｄｅａｕ  Ｊ．  （２００６）  Ｈｉｕｍａｎ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＬＲ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７（１１）：７９５９−７９６７
Ｆｕｔａｋｉ  Ｓ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，  Ｏｈａｓｈｉ  Ｗ，  Ｙａｇａｍｉ  Ｔ，  Ｔａｎａｋａ  Ｓ，  Ｕｅｄａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｒｇｉｎｉｎｅｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ａｎ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（８）：５８３６−５８４０
Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆ．，  Ｓｍｉｔｈ  Ｋ．  Ｄ．，  Ｏｚｉｎｓｋｙ  Ａ．，  Ｈａｗｎ  Ｔ．  Ｒ．，  Ｙｉ  Ｅ．  Ｃ．，  Ｇｏｏｄｌｅｔｔ  Ｄ．  Ｒ．，  Ｅｎｇ  Ｊ．  Ｋ．，  Ａｋｉｒａ  Ｓ．，  Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  Ｄ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．  （２００１）  Ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１０  （６８３２）：  １０９９−１１０３
Ｈｅｉｌ  Ｆ．，  Ｈｅｍｍｉ  Ｈ．，  Ｈｏｃｈｒｅｉｎ  Ｈ．，  Ａｍｐｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｆ．，  Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ  Ｃ．，  Ａｋｉｒａ  Ｓ．，  Ｌｉｐｆｏｒｄ  Ｇ．，  Ｗａｇｎｅｒ  Ｈ  ａｎｄ  Ｂａｕｅｒ  Ｓ．  （２００４）  Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｖｉａ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７  ａｎｄ  ８．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３  （５６６３）：  １５２６−１５２９
Ｈｅｍｍｉ  Ｈ．，  Ｋａｉｓｈｏ  Ｔ．，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ．，  Ｓａｔｏ  Ｓ．，  Ｓａｎｊｏ  Ｈ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ．，  Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｔ．，  Ｔｏｍｉｚａｗａ  Ｈ．，  Ｔａｋｅｄａ  Ｋ．  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ  Ｓ．  （２００２）  Ｓｍａｌｌ  ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＴＬＲ７  ＭｙＤ８８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３  （２）：  １９６−２００
Ｈｅｍｍｉ  Ｈ．，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ．，  Ｋａｗａｉ  Ｔ．，  Ｋａｉｓｈｏ  Ｔ．，  Ｓａｔｏ  Ｓ．，  Ｓａｎｊｏ  Ｈ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｍ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ．，  Ｗａｇｎｅｒ  Ｈ．，  Ｔａｋｅｄａ  Ｋ．  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ  Ｓ．  （２０００）  Ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８  （６８１３）：  ７４０−７４５
Ｈｕｓｅｂｙｅ  Ｈ，  Ｈａｌａａｓ  （，  Ｓｔｅｎｍａｒｋ  Ｈ，  Ｔｕｎｈｅｉｍ  Ｇ，  Ｓａｎｄａｎｇｅｒ  （，  Ｂｏｇｅｎ  Ｂ，  Ｂｒｅｃｈ  Ａ，  Ｌａｔｚ  Ｅ，  Ｅｓｐｅｖｉｋ  Ｔ．  （２００６）  Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｎｋ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２５（４）：６８３−６９２
Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＤＪ，  Ｋｉｍ  ＤＴ，  Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｌ，  Ｆａｔｈｍａｎ  ＣＧ，  Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ＪＢ．  （２０００）  Ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｓ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｈａｎ  ｏｔｈｅｒ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ  ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  ５６（５）：３１８−３２５
Ｍｏｒｒ  Ｍ．，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ．，  Ａｋｉｒａ  Ｓ．，  Ｓｉｍｏｎ  Ｍ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｍｕｈｌｒａｄｔ  Ｐ．  Ｆ．  （２００２）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔａｉｌｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２  （１２）：  ３３３７−３３４７
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Ｐｏｌｔｏｒａｋ  Ａ．，  Ｈｅ  Ｘ，  Ｓｍｉｒｎｏｖａ  Ｌ，  Ｌｉｕ  Ｍ．  Ｙ．，  Ｖａｎ  Ｈｕｆｆｅｌ  Ｃ．，  Ｄｕ  Ｘ．，  Ｂｉｒｄｗｅｌｌ  Ｄ．，  Ａｌｅｊｏｓ  Ｅ．，  Ｓｉｌｖａ  Ｍ．，  Ｇａｌａｎｏｓ  Ｃ．，  Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．，  Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ−Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ  Ｐ．，  Ｌａｙｔｏｎ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｂｅｕｔｌｅｒ  Ｂ．  （１９９８）  Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＬＰＳ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＣｒ  ｍｉｃｅ：  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｔｌｒ４  ｇｅｎｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２  （５３９６）：  ２０８５−２０８８
Ｐｏｏｇａ  Ｍ，  Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ  Ｍ，  Ｚｏｒｋｏ  Ｍ，  Ｌａｎｇｅｌ  Ｕ．  （１９９８）  Ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ．  Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １２（１）：６７−７７
Ｓｃｈｊｅｔｎｅ  Ｋ．  Ｗ．，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｋ．  Ｍ．，  Ｎｉｌｓｅｎ  Ｎ．，  Ｆｌｏ  Ｔ．  Ｈ．，  Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｂ．，  Ｉｖｅｒｓｅｎ  Ｊ．  Ｇ．，  Ｅｓｐｅｖｉｋ  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｂｏｇｅｎ  Ｂ．  （２００３）  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｕｌｄ  ｂｅ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔａｒｇｅｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３２−３６
Ｓｃｈｗａｎｄｎｅｒ  Ｒ．，  Ｄｚｉａｒｓｋｉ  Ｒ．，  Ｗｅｓｃｈｅ  Ｈ．，  Ｒｏｔｈｅ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ  Ｃ．  Ｊ．  （１９９９）  Ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ−  ａｎｄ  ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４  （２５）：  １７４０６−１７４０９
Ｓｌｅｖｏｇｔ  Ｈ，  Ｓｅｙｂｏｌｄ  Ｊ，  Ｔｉｗａｒｉ  ＫＮ，  Ｈｏｃｋｅ  ＡＣ，  Ｊｏｎａｔａｔ  Ｃ，  Ｄｉｅｔｅｌ  Ｓ，  Ｈｉｐｐｅｎｓｔｉｅｌ  Ｓ，  Ｓｉｎｇｅｒ  ＢＢ，  Ｂａｃｈｍａｎｎ  Ｓ，  Ｓｕｔｔｏｒｐ  Ｎ，  Ｏｐｉｔｚ  Ｂ．  （２００７）  Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ  ｉｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｌｉｋｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａ  ＴＬＲ２−  ａｎｄ  ｐａｒｔｌｙ  ＮＯＤ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９（３）：６９４−７０７
Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｆ，  Ｌｅｉｆｅｒ  ＣＡ，  Ｇｕｒｓｅｌ  Ｉ，  Ｉｓｈｉｉ  ＫＪ，  Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｓ，  Ｇｕｒｓｅｌ  Ｍ，  Ｋｌｉｎｍａｎ  ＤＭ．  （２００１）  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９  ｉｎ  ＣｐＧ  ＤＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７（７）：３５５５−３５５８
Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ．，  Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ａ．，  Ｇｒｏｔｅ  Ｋ，  Ｋａｗａｉ  Ｔ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ．，  Ｍｏｒｒ  Ｍ．，  Ｍｕｈｌｒａｄｔ  Ｐ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ  Ｓ．  （２０００）  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｔｈｅ  Ｒ−ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ−２  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２−  ａｎｄ  ＭｙＤ８８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４  （２）：  ５５４−５５７
Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ．，  Ｓａｔｏ  Ｓ．，  Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｔ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ．，  Ｔａｋｅｄａ  Ｋ．，  Ｄｏｎｇ  Ｚ．，  Ｍｏｄｌｉｎ  Ｒ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ  Ｓ．  （２００２）  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９  （１）：  １０−１４  ．
Ｗａｇｎｅｒ  Ｅ．，  Ｚｅｎｋｅ  Ｍ．，  Ｃｏｔｔｅｎ  Ｍ．，  Ｂｅｕｇ，  Ｈ．，  Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ  Ｍ．  Ｌ．  （１９９０）  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：３４１０−３４１４
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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