(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞と被験物質とをインキュベートし、該細胞の感作性マーカーの発現量を測定する工程、該発現量を、被験物質を添加していない対照細胞における該感作性マーカーの発現量と比較する工程、及び該比較結果に基づいて被験物質の感作性を評価する工程を含む、被験物質の感作性を評価する方法であって、
該感作性マーカーが、（１）ＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）、及び（２）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ２３、インターフェロン誘導タンパク質ｐ７８（ＭｘＡ）、およびＧＲＯαから選択される１種または２種以上のマーカーの組み合わせであることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
ＩＬ−１０Ｒに加えて、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡ−Ｒ）、血小板由来成長因子α（ＰＤＧＦα）、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、及びインターフェロン制御因子−１（ＩＲＦ−１）から選択される１種または２種以上のマーカーの発現量を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞が、血液、骨髄、リンパ節、及び／又は皮膚由来であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物細胞が、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＫＧ−１、ＭＵＴＺ−１、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔから１種以上選択される培養細胞であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感作性物質の評価方法及び感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体において、アレルギーを誘発する物質（感作性物質）を正当に評価及び検出することは、極めて重要である。これまでに、感作性物質を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、その皮膚等に生じる反応を観察する方法が知られている（非特許文献１、２、３）。しかしながら、これらの方法は、被験物質を評価する試験期間が長く、また、動物愛護等の見地からも動物を用いない感作性物質評価方法の開発が望まれている。
【０００３】
【非特許文献１】Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９６９，５２，２６８−２７６
【非特許文献２】Ｓａｔｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，１９８１，７，２５５−２５７
【非特許文献３】Ｂｕｅｈｌｅｒ  Ｅ．Ｖ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １９６５，９１，１７１−１７７
【０００４】
化学物質等によりアレルギーが成立する過程は、複数の段階からなる（非特許文献４、５）。まず、最初の段階では、感作性物質が生体内のタンパク質と結合し、本来生体内に存在しない物質へと修飾される。次に、抗原提示細胞は、このような物質を抗原として認識すると、細胞内で様々なシグナルが伝達され、細胞膜表面タンパク質の発現変化等を経て、活性化する。活性化した抗原提示細胞は、所属リンパ節へと移動し、その細胞表面に抗原を結合したＭＨＣＩＩタンパク質を発現し、共刺激分子と呼ばれるタンパク質を介してＴ細胞と結合し、抗原提示を行う。また、この際、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γなどの多くのサイトカインやケモカインを産生する。このような抗原提示細胞としては、血液中の樹状細胞及び単球、皮膚中のランゲルハンス細胞等が知られている。活性化した抗原提示細胞により、抗原提示を受けたＴ細胞は、記憶Ｔ細胞となり、アレルギーが成立する。さらに、皮膚におけるケラチノサイトのように、抗原提示に直接関わっていないが、感作性物質に反応して様々なサイトカインを分泌することで、アレルギーの成立を促進する細胞も存在する。したがって、アレルギーの成立過程は、複数の細胞が関与し、さらに多くのサイトカインが様々な効果を発揮することで成り立っており、極めて複雑な生体反応である。
【０００５】
【非特許文献４】多田富雄，免疫学イラストレイテッド  原書第５版，南江堂
【非特許文献５】Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９２，２４５−２５２
【０００６】
アレルギーの成立過程は複雑であるが、この過程に関わる様々な因子が明らかとなりつつある。抗原により活性化された抗原提示細胞は、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫなどのリン酸化酵素が活性化され（非特許文献６）、細胞膜表面上にＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１−ａ、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｅ−カドヘリン、ＣＣＲ７などのレセプターを発現し（非特許文献７）、さらに、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βなどのサイトカインを分泌すると報告されている（非特許文献４、８）。しかし、アレルギーに関わる因子が非常に多く、多岐にわたっており、それらの相互関係には不明な点が多く、現在のところ、そのメカニズムは解明されていない。
【０００７】
【非特許文献６】Ａｉｂａ  Ｓ．，ＡＡＴＥＸ，２００５，１１，４９−５８
【非特許文献７】Ｓｔａｑｕｅｔ  Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，２００４，１８，４９３−５００
【非特許文献８】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１３９８−１４０２
【０００８】
このように、幾つかのアレルギーに関わる因子が同定されてはいるものの、アレルギー反応の複雑さから、動物を用いない感作性物質の評価方法の開発は困難であった。そのため、現在のところ、有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ感作性物質評価方法は確立されていない。
【０００９】
これまでに、動物を用いない感作性物質の評価方法に関しては、細胞を感作性物質と培養し、特定の遺伝子又はタンパク質の発現増加を指標とした方法が一般的であった。例えば、株化された培養細胞であるＴＨＰ−１において、ＣＤ８６及びＣＤ５４について（特許文献１）、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βについて（特許文献２）、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、及びＡＴＦ−３（特許文献３）について、それぞれ発現増加を指標としているものがある。その他には、ケラチン細胞とランゲルハンス細胞の共培養系において、感作性物質によるＭＨＣＩＩ、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ２、ＴＮＦ−α、インターフェロン誘発タンパク質１０（ＩＰ１０）、及びＩＮＦ−γの発現増加を指標とした方法も報告されている（特許文献４）。しかし、いずれの方法においても、感作性の指標となるマーカー（感作性マーカー）遺伝子及びタンパク質の発現が低いことや、感度又は精度が低いことが知られていた。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２２２５８２号
【特許文献２】特開２００５−２７８６２８号
【特許文献３】特開２００６−１３６２１５号
【特許文献４】第２８２１４５７号
【００１１】
さらに、感作性物質には、感作性が強い物質と、感作性が弱い物質があるため、それらの性質を見極め、より詳細な感作性物質の情報を得ることが出来る動物を用いない感作性物質の評価方法に関しては皆無であった。
【００１２】
以上より、動物を用いない感作性物質の評価方法の開発において、感作性物質を正確に評価するために、複雑なアレルギーの成立過程を再現するとともに、感度及び精度を向上させ、さらに、感作性物質における感作性の強弱をも検出できる新たな感作性マーカーの発見が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、哺乳動物細胞を用い、高い感作性物質の検出感度及び精度を備え、さらに、感作性の強弱についても検出可能な、新たな感作性マーカーを探索し、より感度の高い感作性物質評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このような事情により、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、感作性物質に対するヒト細胞の反応を詳細に解析し、高い感作性物質の検出感度及び精度を備え、さらに、感作性の強弱についても検出可能な優れた感作性マーカーを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１６】
哺乳動物細胞と被験物質とをインキュベートし、当該細胞の感作性マーカーの発現を測定することを特徴とする、被験物質の感作性を評価する方法であって、該感作性マーカーが、（１）から１種又は２種以上選択されたマーカー、又は（２）から１種又は２種以上選択されたマーカーであることを特徴とする、被験物質の感作性を評価する方法。
（１）感作性マーカー群Ａ：ＩＬ−１０  受容体（ＩＬ−１０Ｒ）、ＣＤ４４、ＮＦ−κＢ、ＩκＢα、ＩκＢε、フーリン（ｆｕｒｉｎ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡ−Ｒ）、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、インターフェロン制御因子−１（ＩＲＦ−１）、血小板由来成長因子α（ＰＤＧＦα）、ｖ−Ｊｕｎ、インシュリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、チオレドキシン還元酵素−１（ＴＲ−１）、クラスＩＩ主要組織適合抗原（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８６、マクロファージ炎症タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ１β、ケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）。
（２）感作性マーカー群Ｂ：ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、メタロチオネイン−１（ＭＴ−１）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、シトクロームＰ４５０還元酵素（Ｐ４５０）、ケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ２３、ティッシュインヒビターオブＭＭＰ−３（ＴＩＭＰ３）、ＴＧＦ−β  タイプＩＩ受容体（ＴＧＦＲＩＩ）、インターフェロン誘導タンパク質ｐ７８（ＭｘＡ）、アネキシンＡ５（ＡｘＡ５）、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＦｏｓＢ、アクチビンＡ受容体（ＡＡＲ）、シスタチンＢ（ＣＴＢ）、インテグリンβ５（ＩＴβ５）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＤ５４。
【００１７】
哺乳動物細胞と被験物質とをインキュベートし、当該細胞の感作性マーカーの発現を測定することを特徴とする、被験物質の感作性を評価する方法であって、該感作性マーカーが、（１）から１種又は２種以上選択されたマーカー、及び（２）から１種又は２種以上選択されたマーカーであることを特徴とする、被験物質の感作性を評価する方法。
（１）感作性マーカー群Ａ：ＩＬ−１０  受容体（ＩＬ−１０Ｒ）、ＣＤ４４、ＮＦ−κＢ、ＩκＢα、ＩκＢε、フーリン（ｆｕｒｉｎ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡ−Ｒ）、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、インターフェロン制御因子−１（ＩＲＦ−１）、血小板由来成長因子α（ＰＤＧＦα）、ｖ−Ｊｕｎ、インシュリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、チオレドキシン還元酵素−１（ＴＲ−１）、クラスＩＩ主要組織適合抗原（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８６、マクロファージ炎症タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ１β、ケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）。
（２）感作性マーカー群Ｂ：ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、メタロチオネイン−１（ＭＴ−１）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、シトクロームＰ４５０還元酵素（Ｐ４５０）、ケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ２３、ティッシュインヒビターオブＭＭＰ−３（ＴＩＭＰ３）、ＴＧＦ−β  タイプＩＩ受容体（ＴＧＦＲＩＩ）、インターフェロン誘導タンパク質ｐ７８（ＭｘＡ）、アネキシンＡ５（ＡｘＡ５）、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＦｏｓＢ、アクチビンＡ受容体（ＡＡＲ）、シスタチンＢ（ＣＴＢ）、インテグリンβ５（ＩＴβ５）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＤ５４。
【００１８】
哺乳動物細胞が、血液、骨髄、リンパ節、及び／又は皮膚由来であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の被験物質の感作性を評価する方法。
【００１９】
哺乳動物細胞が、培養細胞（ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＫＧ−１、ＭＵＴＺ−１、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ）から１種以上選択される培養細胞であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の被験物質の感作性を評価する方法。
【００２０】
哺乳動物細胞と感作性物質と被験物質とをインキュベートし、当該細胞の感作性マーカーの発現を測定することを特徴とする、感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価する方法であって、該記感作性マーカーが、（１）から１種又は２種以上選択されたマーカー、及び／又は（２）から１種又は２種以上選択されたマーカーであることを特徴とする、感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価する方法。
（１）感作性マーカー群Ａ：ＩＬ−１０  受容体（ＩＬ−１０Ｒ）、ＣＤ４４、ＮＦ−κＢ、ＩκＢα、ＩκＢε、フーリン（ｆｕｒｉｎ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡ−Ｒ）、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、インターフェロン制御因子−１（ＩＲＦ−１）、血小板由来成長因子α（ＰＤＧＦα）、ｖ−Ｊｕｎ、インシュリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、チオレドキシン還元酵素−１（ＴＲ−１）、クラスＩＩ主要組織適合抗原（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８６、マクロファージ炎症タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ１β、ケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）。
（２）感作性マーカー群Ｂ：ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、メタロチオネイン−１（ＭＴ−１）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、シトクロームＰ４５０還元酵素（Ｐ４５０）、ケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ２３、ティッシュインヒビターオブＭＭＰ−３（ＴＩＭＰ３）、ＴＧＦ−β  タイプＩＩ受容体（ＴＧＦＲＩＩ）、インターフェロン誘導タンパク質ｐ７８（ＭｘＡ）、アネキシンＡ５（ＡｘＡ５）、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＦｏｓＢ、アクチビンＡ受容体（ＡＡＲ）、シスタチンＢ（ＣＴＢ）、インテグリンβ５（ＩＴβ５）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＤ５４。
【００２１】
以下に、本発明において見出された感作性マーカーについて説明する。
【００２２】
ＩＬ−１０Ｒ
ＩＬ−１０をノックアウトしたマウスにおいて、アレルギー性喘息が緩和されることから、そのレセプターであるＩＬ−１０Ｒのアレルギーへの関与が推測される（非特許文献９）。
【００２３】
【非特許文献９】Ｊｕｓｔｉｃｅ  Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００１，２８０，Ｌ３６３−Ｌ３６８
【００２４】
ＩＬ−４Ｒ
ヒト単球において、ＩＬ−４はＩＬ−１、ＴＮＦ−αの産生を抑制することから、ＩＬ−４Ｒは、マクロファージなどの多くの機能に関わっていると考えられている（非特許文献１０）。
【００２５】
【非特許文献１０】Ｅｓｓｎｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８９，１４２，３８５７
【００２６】
ＣＤ４４
ＣＤ４４は、ランゲルハンス細胞や樹状細胞の遊走に関わっていると考えられている（非特許文献１１）。
【００２７】
【非特許文献１１】Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９７，５，１１３７−１１４７
【００２８】
ＭＣＰ−１
ＭＣＰ−１は、活性化した抗原提示細胞によって産生され、獲得免疫のエンハンサーとして機能すると推察されている（非特許文献１２）。
【００２９】
【非特許文献１２】Ｔｅｋｓｔｒａ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１０１，７７−８５
【００３０】
ＭＭＰ−９
ＭＭＰ−９は、樹状細胞の遊走及びケモカインの産生に関わっていると考えられている（非特許文献１３）。
【００３１】
【非特許文献１３】Ｋａｒｉｍ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，１７１，１０１６−１０２２
【００３２】
ＭＴ−１
ＭＴ−１は、感作性物質により、表皮において発現が亢進すると考えられている（非特許文献１４）。
【００３３】
【非特許文献１４】Ｓａｎｔｕｓｓｉ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，２０００，４３，１０３−１０６
【００３４】
ＮＦ−κＢ
ＮＦ−κＢは、樹状細胞が成熟する際に活性化すると考えられている（非特許文献１５）。
【００３５】
【非特許文献１５】Ｓａｎｄｉｐ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，ＢＬＯＯＤ，２００４，１０４，１１００−１１０９
【００３６】
ｆｕｒｉｎ
ｆｕｒｉｎは、抗原提示細胞がウィルススーパー抗原をＴ細胞に提示する際に必要であると考えられている（非特許文献１６）。
【００３７】
【非特許文献１６】Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，７４，８２６２−８２６７
【００３８】
ＯＰＮ
ＯＰＮは、ＣＤ４４のリガンドの１つであり、細胞の遊走に関わっていると考えられている（非特許文献１７）。
【００３９】
【非特許文献１７】Ｇｏｏｄｉｓｏｎ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｈｏｌ．：Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９９９，５２，１８９−１９６
【００４０】
Ｐ４５０
Ｐ４５０は、炎症により、発現が亢進すると考えられている（非特許文献１８）。
【００４１】
【非特許文献１８】Ｌｉｍ  Ｈ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，１９９８，２５，６３５−６４４
【００４２】
ｕＰＡ−Ｒ
ｕＰＡ−Ｒは、細胞外マトリックスの分解や細胞の接着に関与し、細胞の遊走に必要であると考えられている（非特許文献１９）。
【００４３】
【非特許文献１９】Ｊａｎ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９５，１８１，１３８１−１３９０
【００４４】
ＣＣＬ５
ＣＣＬ５は、炎症により、細胞外マトリックスの分解を促進し、細胞の遊走に関わると考えられている（非特許文献２０）。
【００４５】
【非特許文献２０】Ｃｈａｂｏｔ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，２００６，７９，７６７−７７８
【００４６】
ＣＣＬ２３
ＣＣＬ２３は、ケモカイン受容体１のリガンドであると考えられる。（非特許文献２１）
【００４７】
【非特許文献２１】Ｒｏｂｅｒｔ  Ｄ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７４，７３４１−７３５１
【００４８】
ＴＩＭＰ３
ＴＩＭＰ３は、細胞の遊走に関わっており、ヒト成熟樹状細胞において発現していると考えられている（非特許文献２２）。
【００４９】
【非特許文献２２】Ｏｓｍａｎ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，１０５，７３−８２
【００５０】
ＴＧＦＲＩＩ
ＴＧＦＲＩＩは、ＴＧＦ−βのシグナルを細胞内に伝達し、細胞の遊走に関わると考えられている（非特許文献２３）。
【００５１】
【非特許文献２３】Ｈｅｉｎｆｒｉｅｄ  Ｈ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７４，２７７８−２７８６
【００５２】
Ａ２０
Ａ２０は、ＮＦ−κＢの活性に伴い発現が亢進し、樹状細胞の成熟に関わると考えられる（非特許文献２４）。
【００５３】
【非特許文献２４】Ｍｉｎｇ−Ｑｉｎｇ  Ｘ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２００３，９，１２９６−１３０１
【００５４】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、アポトーシスに関わるレセプターであり、樹状細胞に発現していると考えられている（非特許文献２５）。
【００５５】
【非特許文献２５】Ｍａｒｔｉｎ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ＢＬＯＯＤ，２０００，９６，２６２８−２６３１
【００５６】
ＭｘＡ
ＭｘＡは、即時性喘息患者におけるウィルスの感染時に発現が亢進すると考えられている（非特許文献２６）。
【００５７】
【非特許文献２６】Ｉｍａｍｕｒａ  Ｈ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，２００１，５６，８９５−８９８
【００５８】
ＡｘＡ５
ＡｘＡ５は、ＩＮＦ−γによるシグナル伝達を介した細胞の応答を調節すると考えられている（非特許文献２７）。
【００５９】
【非特許文献２７】Ｌｅｏｎ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６，１７６，５９３４−５９４２
【００６０】
ＩＲＦ−１
ＩＲＦ−１は、ＭＨＣＩＩの発現に関わると考えられている（非特許文献２８）。
【００６１】
【非特許文献２８】Ｂａｒｂａｒｏ  Ａ．Ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｕｕｎｏｌ．，２００２，３２，１３０９−１３１８
【００６２】
ＰＤＧＦα
ＰＤＧＦαは、ＩＦＮ−γによって活性化された細胞を遊走させると考えられている（非特許文献２９）。
【００６３】
【非特許文献２９】Ｍｏｒｅｌｌｉ  Ｐ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２００６，１８４，３９−４７
【００６４】
ＧＲＯα
ＧＲＯαは、ヒト単球において、ＬＰＳによって誘導されると考えられている（非特許文献３０）。
【００６５】
【非特許文献３０】Ｉｎｎｏｃｅｎｔｉ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２００１，６９，３８００−３８０１
【００６６】
ＧＲＯβ
ＧＲＯβは、炎症部位における活性化した単球及び好中球において産生されると考えられている（非特許文献３１）。
【００６７】
【非特許文献３１】Ｎａｏｋｏ  Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，１０，５５９６−５５９９
【００６８】
ＦｏｓＢ、ｖ−Ｊｕｎ
ＦｏｓやＪｕｎは、転写因子Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１の構成因子であり、ＭＭＰの発現を制御していると考えられている（非特許文献３２）。
【００６９】
【非特許文献３２】Ｍａｒｉｎａ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００３．３６９，４８５−４９６
【００７０】
ＡＡＲ
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するＡｃｔｉｖｉｎ  Ａのレセプターであり、アレルギーにおける炎症過程に関与していると考えられている（非特許文献３３）。
【００７１】
【非特許文献３３】Ｓｅｏｎｇ  Ｈ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，１７０，４０４５−４０５２
【００７２】
ＣＴＢ
シスタチンは、ＩＦＮ−γによって活性化されたマクロファージにおいて、ＮＯの産生を促進すると考えられている（非特許文献３４）。
【００７３】
【非特許文献３４】Ｌｕｄｏｖｉｃ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，２８０７７−２８０８１
【００７４】
ＩＧＦＢＰ３
ＩＧＦＢＰ３は、アレルギー患者において発現が亢進すると考えられている（非特許文献３５）。
【００７５】
【非特許文献３５】Ｈａｕａｃｈｅ  Ａ．Ｇ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ａｌｌｅｒｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，１３，２６６−２７１
【００７６】
ＩＴβ５
ＩＴβ５は、細胞の移動や接着に関与すると考えられている（非特許文献３６）。
【００７７】
【非特許文献３６】Ｍａｒｋ  Ｏ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，２５１７−２５２１
【００７８】
ＨＯ−１、ＴＲ−１
ＨＯ−１は、マクロファージにおいて、チオレドキシンによって誘導されると考えられている。また、ＴＲ−１が阻害されると、このＨＯ−１の誘導が抑制されると考えられている（非特許文献３７）。
【００７９】
【非特許文献３７】Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５，２４８４０−２４８４６
【００８０】
したがって、本発明は、ヒト又は哺乳動物細胞において、感作性マーカー群Ａ、Ｂから選抜された、１種又は２種以上の感作性マーカーの発現を検出することを特徴とする、感作性物質の評価方法、及び感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤の評価方法を提供する。
＜感作性マーカー群Ａ＞
ＩＬ−１０Ｒ、ＣＤ４４、ＮＦ−κＢ、ＩκＢα、ＩκＢε、ｆｕｒｉｎ、ｕＰＡ−Ｒ、Ａ２０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩＲＦ−１、ＰＤＧＦα、ｖ−Ｊｕｎ、ＩＧＦＢＰ３、ＨＯ−１、ＴＲ−１、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＲ７。
＜感作性マーカー群Ｂ＞
ＩＬ−４Ｒ、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ−９、ＭＴ−１、ＯＰＮ、Ｐ４５０、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２３、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＲＩＩ、ＭｘＡ、ＡｘＡ５、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＦｏｓＢ、ＡＡＲ、ＣＴＢ、ＩＴβ５、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＤ５４。
【００８１】
本発明で用いる哺乳動物細胞は、本発明の目的に沿うものであれば、哺乳動物から採取した血液、骨髄、リンパ節、及び／又は皮膚組織の細胞を用いることができる。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物から得られた血液、骨髄、リンパ節、及び／又は皮膚組織の細胞を用いることができる。
この場合、上記哺乳動物細胞の中でも、血液、骨髄細胞を用いることが好ましい。
【００８２】
また、本発明で用いる哺乳動物細胞が、培養細胞である場合、本発明の目的に沿うものであれば、細胞バンクから入手可能な培養細胞や市販されている培養細胞を入手して用いることができる。例えば、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＫＧ−１、ＭＵＴＺ−１、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ等の培養細胞から１種以上選択し、用いることができる。
この場合、上記培養細胞の中でも、ＴＨＰ−１及び／又はＵ−９３７を用いることが好ましい。
【００８３】
これらの哺乳動物細胞を用いて、以下の培養方法及び解析方法により、被験物質の感作性を評価、又は、感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価することができる。
【００８４】
本発明の哺乳動物細胞を培養するための培地としてはこれらの細胞を培養することができる常用の任意の培地を用いることができるが、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ等が挙げられる。これらの培地には、５〜２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加することが好ましい。
【００８５】
感作性物質の評価においては、培地中の哺乳動物細胞に被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下にて、０．５〜７２時間、好ましくは２〜２４時間培養する。また、感作性物質を活性化又は抑制する物質の評価においては、培地中の哺乳動物細胞に既知の感作性物質と被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下にて、０．５〜７２時間、好ましくは２〜２４時間培養する。
【００８６】
培養終了後、感作性マーカー遺伝子の発現量を測定する方法として、マイクロアレイ法、セルアレイ法、組織アレイ法、定量的又は定性的ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法等を用いることができる。また、感作性マーカータンパク質の発現量を測定する方法としては、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、セルアレイ法、組織アレイ法等が挙げられる。
【発明の効果】
【００８７】
本発明は、哺乳類細胞を用いて、被験物質の感作性を評価、又は、感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価する方法であり、従来の方法に比べて感度及び／又は精度を向上させ、さらに、感作性の強弱についてと、感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８８】
以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００８９】
哺乳類細胞として、ＴＨＰ−１（ヒト単核球由来細胞株：ＡＴＣＣから購入）を用いて、感作性物質による遺伝子の発現変化について、マイクロアレイ解析を行った。
【００９０】
培地液の調製
ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社製）に１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペンシリン（Ｓｉｇｍａ社製）と１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ベーリンガー社製）を加えて調整した。
【００９１】
強い感作性物質の調製
強い感作性を示す物質として、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ，Ｓｉｇｍａ社製）とｐ−ベンゾキノンｅ（ＢＱ，Ｓｉｇｍａ社製）を用い、それぞれ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解し用いた。
【００９２】
弱い感作性物質の調製
弱い感作性を示す物質としては、硫酸ニッケル（Ｎｉ，Ｓｉｇｍａ社製）とオイゲノール（ＥＵ，Ｓｉｇｍａ社製）を用い、それぞれ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶解し用いた。
【００９３】
細胞と被験物質の培養
培地中のＴＨＰ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから分譲）に、それぞれの終濃度が、ＤＮＣＢは５．０μｇ／ｍＬ、ＢＱは６．０μｇ／ｍＬ、Ｎｉは２００μｇ／ｍＬ、ＥＵは１５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃にて８時間培養した。また、コントロールとして、被験物質を添加しない未適用対照を設けた。
【００９４】
マイクロアレイ解析
培養終了後、細胞よりＴＯＲＩＺＯＬ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて細胞を溶解することによって総ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡラベル化キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲ法にて、ＲＮＡから蛍光ラベル化されたｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをＩｎｔｅｌｉｇｅｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｈｉｐ  Ｖｅｒ３．１（Ｔａｋａｒａ社製）に、６０℃にて、１６時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズ終了後、蛍光スキャナ（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｇｘ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて各遺伝子の発現量を測定し、コントロールと各被験物質間の発現差を解析ソフト（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｒ３．０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により解析した。
【００９５】
解析ソフトより得られた遺伝子の発現量を用い、コントロールと比較した各遺伝子の相対発現量を、以下の式（１）を用いて算出した。
【００９６】
式（１）
各被験物質を添加した細胞における遺伝子発現量／コントロールの遺伝子発現量＝相対発現量
【００９７】
（比較例１）
比較例として、非感作性物質としてラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ，Ｓｉｇｍａ社製）を５．０ｍｇ／ｍＬにて生理食塩水に溶解し、５０μｇ／ｍＬとなるように細胞に添加し、実施例１と同様の実験を行った。
【００９８】
解析方法
実施例１及び比較例１により評価した遺伝子の中から、強い感作性物質（ＤＮＣＢ、ＢＱ）、弱い感作性物質（Ｎｉ、ＥＵ）及び非感作性物質（ＳＬＳ）に対して、コントロールと比較して発現が変化したものを解析した。
遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して２．０倍以上であった場合を「＋＋＋」、１．５倍以上２．０倍未満であった場合を「＋＋」、１．２倍以上１．５倍未満であった場合を「＋」、１．２倍未満であった場合を「−」とし、表１に示した。
【００９９】
（解析結果）
その結果、強い感作性物質（ＤＮＣＢ、ＢＱ）のみに対して、遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して１．５倍以上（「＋＋」、「＋＋＋」の変化）であった遺伝子について、１９種類（遺伝子Ｎｏ．１〜１９）を見出した。この遺伝子群を、感作性マーカー群Ａとし、表１に示した。また、弱い感作性物質（Ｎｉ、ＥＵ）のみに対して、遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して１．５倍以上（「＋＋」、「＋＋＋」の変化）であった遺伝子について、２５種類（遺伝子Ｎｏ．２０〜４４）を見出した。この遺伝子群を、感作性マーカー群Ｂとし、表１に示した。その他の変化しなかった遺伝子４種類（遺伝子Ｎｏ．４５〜４８）に関しては、反応なし群として表１に示した。
【０１００】
以上の結果より、感作性マーカー群Ａは、強い感作性物質に対して、特異的に増加する優れた感作性マーカー群であることを確認した。また、感作性マーカー群Ｂは、弱い感作性物質に対して、特異的に増加する優れた感作性マーカー群であることを確認した。
【０１０１】
【表１】
0005654531.tif 000002
【０１０２】
以上の結果から、特に感作性マーカー群Ａは、強い感作性物質を検出するのに優れており、これに対して感作性マーカー群Ｂは、弱い感作性物質を検出するのに優れていることを確認した。また、より多くの感作性マーカーを評価することで、未知の感作性物質の検出が可能となる。この場合、感作性マーカー群Ａ及びＢを組み合わせて検出することで、強い感作性物質と弱い感作性物質を同時に検出することができる。したがって、本発明において発見した感作性マーカーは、個々で感作性物質を検出し、その感作性の強弱を判断することが可能であり、さらに、複数の感作性マーカー又は感作性マーカー群を組み合わせることにより、今まで以上に、検出感度及び精度が向上し、さらに広い範囲で感作性物質を検出することができる優れた感作性マーカーであると言える。
【実施例２】
【０１０３】
（被験物質の感作性の有無及び強弱に関する評価方法）
実施例１の解析結果をもとに、感作性マーカー群Ａと感作性マーカー群Ｂから任意に感作性マーカーを選択し、既知の強い感作性物質と弱い感作性物質について感作性の有無、及び、感作性の強弱について判定した。
【０１０４】
強い感作性物質を検出する感作性マーカーとしては、感作性マーカー群ＡのＣＤ４４、ＮＦκ―Ｂ、ｕＰＡ−Ｒ、Ａ２０、ＩＲＦ−１、ＰＤＧＦα、ＨＯ−１、ＣＤ８６、ＭＩＰ−１α、ＣＣＲ７を選択した。また、弱い感作性物質を検出する感作性マーカーとしては、感作性マーカー群ＢのＭＣＰ−１、ＭＭＰ−９、ＯＰＮ、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２３、ＭｘＡ、ＧＲＯα、ＩＬ−１β、ＩＮＦ−γ、ＣＤ５４を選択した。
【０１０５】
強い感作性物質として、１，４−フェニレンジアミン（ＰＤＡ，Ｓｉｇｍａ社製）と、ホルムアルデヒド（ＦＡ，Ｓｉｇｍａ社製）を用い（非特許文献３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４）、弱い感作性物質としては、イソオイゲノール（ＩＥＵ，Ｓｉｇｍａ社製）と、２−メルカプトベンゾチアゾール（２−ＭＢＴ，Ｓｉｇｍａ社製）を用いた（非特許文献３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４）。ＰＤＡ、ＦＡともに、生理食塩水に溶解させ、最終濃度がＰＤＡは、１００μｇ／ｍＬ、ＦＡは、６．０μｇ／ｍＬとなるように調製し、ＩＥＵ、２−ＭＢＴは、ＤＭＳＯに溶解させ、最終濃度がＩＥＵは、１５０μｇ／ｍＬ、２−ＭＢＴは、１００μｇ／ｍＬとなるように調製し、実施例１と同様な方法で解析し、それぞれの感作性マーカーの発現量の変化を解析した。
【０１０６】
【非特許文献３８】Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｄ．Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃ．，１９９２，３０，６５−６９
【非特許文献３９】Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，２００２，４７，１−６
【非特許文献４０】Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｄ．Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃ．，１９９４，３２，５４３−５４７
【非特許文献４１】Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｄ．Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃ．，１９９６，３４，９８５−９９７
【非特許文献４２】Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ａ．，１９９８，５３，５６３−５７９
【非特許文献４３】皮膚，第３４巻，増刊第１４号
【非特許文献４４】Ｈｏｌｌｉｄａｙ  Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１９９６，１６，６５−７０
【０１０７】
（比較例２）
非感作性物質として塩化ベンズアルコニウム（ＢＡＣ，Ｓｉｇｍａ社製）を用い、生理食塩水に溶解させ、３．０μｇ／ｍＬとなるように調製し、実施例１と同様な方法で解析し、それぞれの感作性マーカーの発現量の変化を解析した。
【０１０８】
（評価方法）
実施例２及び比較例２の解析結果をもとに、以下の表２に示した判定基準により感作性の有無、及び、感作性の強弱に関して評価した。
【０１０９】
【表２】
0005654531.tif 000003
【０１１０】
（評価結果）
以上の判定基準により評価した、感作性マーカー群Ａ及びＢから任意に選択した感作性マーカーの相対発現量と評価結果を表３に示した。その結果、感作性物質（ＰＤＡ及びＦＡ）に対して、任意に選択した感作性マーカー群Ａは顕著な増加を示し、任意に選択した感作性マーカー群Ｂにおいては、いずれも変化しなかった。以上の結果から、ＰＤＡ及びＦＡは、本発明の評価基準から強い感作性物質であると判断した。
【０１１１】
また、感作性物質（ＩＥＵ及び２−ＭＢＴ）に対して、任意に選択した感作性マーカー群Ｂは顕著な増加を示し、任意に選択した感作性マーカー群Ａにおいては、いずれも変化しなかった。以上の結果から、ＩＥＵ及び２−ＭＢＴは、本発明の評価基準から弱い感作性物質であると判断した。
【０１１２】
これに対し、非感作性物質であるＢＡＣでは、いずれの感作性マーカー群においても変化はみられなかった。
【０１１３】
本発明における評価基準による、ＰＤＡ及びＦＡは強い感作性物質、ＩＥＵ及び２−ＭＢＴは弱い感作性物質、ＢＡＣは非感作性物質であるとの評価結果は、ヒトやモルモットを用いた感作性試験の評価結果と同じであり、感作性マーカー群ＡとＢを組み合わせることで、感作性の有無と感作性の強弱を、感度及び精度よく評価できることを確認した。
【０１１４】
【表３】
0005654531.tif 000004
【０１１５】
以上の結果より、感作性マーカー群Ａは強い感作性物質を、感作性マーカー群Ｂは弱い感作性物質を検出することが確認できた。また、いずれの感作性マーカー群にも反応しないものは非感作性物質であることが確認できた。これにより、感作性マーカー群ＡとＢを組み合わせることにより、感作性物質の強弱を特異的に評価できることを確認した。
【０１１６】
また、その他にも、感作性マーカー群Ａから任意のマーカー３種（遺伝子Ｎｏ．１、４、１５）を、感作性マーカー群Ｂから任意のマーカー３種（遺伝子Ｎｏ．２０、２９、４２）を選択して、同様な評価を行ったところ、実施例２と同様に評価できることを確認した。これにより、それぞれの感作性マーカー群より、３種ずつ選択した場合でも、感作性の有無及びその強弱を評価できることを確認した。
さらに、感作性マーカー群Ａから任意のマーカー１種（遺伝子Ｎｏ．１２）を、感作性マーカー群Ｂから任意のマーカー１種（遺伝子Ｎｏ．２６）を選択して、同様な評価を行ったところ、実施例２と同様に評価できることを確認した。これにより、それぞれの感作性マーカー群より、１種ずつ選択した場合でも、感作性の有無及びその強弱を評価できることを確認した。
以上より、感作性マーカー群ＡとＢから、それぞれ任意に１種又は２種以上を選択して、評価に用いることで、感作性物質の強弱を特異的に評価できることを確認した。
なお、実施例２と同様な評価を用いて、感作性の不明な物質の評価を行ったところ、感作性の有無及び、その強弱に関しても評価できることを確認した。
【０１１７】
したがって、感作性マーカー群Ａ、Ｂに属するＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＣＤ４４、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ−９、ＭＴ−１、ＮＦ−κＢ、ＩκＢα、ＩκＢε、ｆｕｒｉｎ、ＯＰＮ、Ｐ４５０、ｕＰＡ−Ｒ、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２３、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＲＩＩ、Ａ２０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＭｘＡ、ＡｘＡ５、ＩＲＦ−１、ＰＤＧＦα、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＦｏｓＢ、ｖ−Ｊｕｎ、ＡＡＲ、ＣＴＢ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＴβ５、ＨＯ−１、ＴＲ−１、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＤ５４の発現を測定することにより、化学物質等の感作性を正当に評価及び検出することができ、さらに感作性の強度を評価できることから、本評価方法は、動物を用いない感作性物質の評価に大きく貢献できるものである。
【実施例３】
【０１１８】
（感作性物質に対する、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価方法）
感作性物質に対する、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価方法として、既知の感作性物質と評価したい被験物質を同時にインキュベーションすることで、感作性マーカー（感作性マーカー群Ａ、Ｂから任意に選択したもの）の発現量を実施例１と同様な方法で解析し、その増減により、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価を行った。
【０１１９】
感作性マーカー群Ａからとしては、ＣＤ４４、ＮＦκ―Ｂ、ＣＤ８６を選択した。また、感作性マーカー群Ｂからとしては、ＭＣＰ１、ＩＬ−１β、ＣＤ５４を選択した。
【０１２０】
強い感作性を示す物質として、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）を２．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解し、最終濃度が５．０μｇ／ｍＬになるように培養液に添加して用いた。弱い感作性を示す物質として、硫酸ニッケル（Ｎｉ）を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解し、最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるように培養液に添加して用いた。また、評価する被験物質として、現在、免疫抑制剤として使用されている、シクロスポリン（Ｓｉｇｍａ社製）を１０μｇ／ｍＬとなるように水溶液として用いた。これら、物質を同時にインキュベートし、実施例１と同様な方法で解析し、感作性マーカーの発現量の変化をもとに、被験物質の感作性抑制作用について評価した。
【０１２１】
以上の方法により評価した、感作性マーカー群Ａ又はＢから任意に選択した感作性マーカーの相対発現量の変化を表４に示した。その結果、強い感作性物質であるＤＮＣＢ及び弱い感作性物質であるＮｉに対して、それぞれシクロスポリンを同時にインキュベートすることで、任意に選択した感作性マーカーの相対発現量は、いずれも顕著に減少した。
【０１２２】
【表４】
0005654531.tif 000005
【０１２３】
以上の結果から、シクロスポリンは、感作性抑制作用を持つ物質であると評価できた。
また、その他にも、感作性マーカー群Ａから任意のマーカー３種（遺伝子Ｎｏ．１、４、１５）を、感作性マーカー群Ｂ（遺伝子Ｎｏ．２０、２９、４２）から任意のマーカー３種を選択して、同様な評価を行ったところ、実施例３と同様に評価できることを確認した。これにより、それぞれの感作性マーカー群より、３種ずつ選択した場合でも、感作性物質に対する、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価が可能であることを確認した。
さらに、感作性マーカー群Ａから任意のマーカー１種（遺伝子Ｎｏ．１２）を、感作性マーカー群Ｂから任意のマーカー１種（遺伝子Ｎｏ．２６）を選択して、同様な評価を行ったところ、実施例３と同様に評価できることを確認した。これにより、それぞれの感作性マーカー群より、１種ずつ選択した場合でも、感作性物質に対する、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価が可能であることを確認した。
なお、この他にも感作性の増強作用を示す物質（コンプリートアジュバンド、フナコシ社製）を用いて、同様な評価を行ったところ、感作性増強作用を持つ物質であることを確認できた。
【０１２４】
したがって、感作性マーカー群Ａ、Ｂに属するＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＣＤ４４、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ−９、ＭＴ−１、ＮＦ−κＢ、ＩκＢα、ＩκＢε、ｆｕｒｉｎ、ＯＰＮ、Ｐ４５０、ｕＰＡ−Ｒ、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２３、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＲＩＩ、Ａ２０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＭｘＡ、ＡｘＡ５、ＩＲＦ−１、ＰＤＧＦα、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＦｏｓＢ、ｖ−Ｊｕｎ、ＡＡＲ、ＣＴＢ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＴβ５、ＨＯ−１、ＴＲ−１、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＤ５４の発現を測定することにより、感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価することができることから、本評価方法は、免疫賦活剤や免疫抑制剤の開発への応用が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明の活用例として、化学物質等の安全性評価への応用が期待される。哺乳類の血液、骨髄及び培養細胞を用いることで、感作性マーカーの発現を指標に、動物を用いずに感作性の有無及び強弱の評価が可能になる。また、感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価することができることから、免疫賦活剤や免疫抑制剤の開発に有用である。