(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）：
【化１】
0005818199.tif 000012
［式中、R1は、-CN、-CONH2を表し、R2〜R5は、それぞれ独立して、水素原子、又はC1-4アルキル基を表す］
で示される化合物、その塩又はそれらの水和物を基質として用いた、ニトリル関連酵素の酵素活性検出方法。
【請求項２】
ニトリル関連酵素が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式（I）中、R1が-CNであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
式（I）中、R1が-CONH2であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
下記式（I）：
【化２】
0005818199.tif 000013
［式中、R1は、-CN、-CONH2を表し、R2〜R5は、それぞれ独立して、水素原子、又はC1-4アルキル基を表す］
で示される化合物、その塩又はそれらの水和物を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用試薬。
【請求項６】
ニトリル関連酵素が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
式（I）中、R1が-CNであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
式（I）中、R1が-CONH2であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、請求項６に記載の試薬。
【請求項９】
被検物質のニトリル関連酵素の酵素活性検出方法であって、以下の工程：
(a) 被検物質と請求項５〜８のいずれか一項に記載の試薬とを反応させる工程、及び
(b) 工程(a)における反応により生じた生成物から生じる蛍光の強度を測定する工程
を含む、前記方法。
【請求項１０】
被検物質のニトリル関連酵素の酵素活性検出方法であって、以下の工程：
(a) 被検物質と請求項５〜８のいずれか一項に記載の試薬とを反応させる工程、
(b) 試薬から生じる蛍光の強度、及び／又は、工程(a)における反応により生じた生成物から生じる蛍光の強度を、反応開始時および反応開始から一定時間経過後に測定する工程、及び
(c) 試薬から生じる蛍光の強度及び／又は生成物から生じる蛍光の強度の変化に基づいて、酵素活性を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の試薬を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光を利用したニトリル関連酵素の酵素活性検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、化学品の原料となる化合物の製造工程においては、転換率や選択率の高さ、光学活性化合物の場合には立体選択性の高さから、酵素反応が利用されている。例えば、種々の化学品の原料となるニトリル化合物（アクリルアミド、アクリル酸等）の製造には、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ等による酵素反応が用いられている。ニトリラーゼは、ニトリル基を加水分解してカルボン酸基に変換する酵素であり、ニトリルヒドラターゼは、ニトリル基を水和しアミド基に変換する酵素であり、アミダーゼはアミド基を加水分解してカルボン酸基に変換する酵素である。
【０００３】
これらの酵素を有する微生物は、土壌をはじめとする自然界よりスクリーニングされている。スクリーニング方法としては、一般に、ニトリル化合物などを唯一の窒素源または炭素源として生育する微生物を濃縮し、得られた微生物の中から酵素活性を有するものを取得する方法が採用されている。酵素活性は、ニトリル化合物やアミド化合物と微生物とを反応させ、生成物を高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの機器により解析する。
【０００４】
一方で、自然界に存在する微生物のうち、現在の技術で単離・培養可能であるものは1%未満にすぎないという研究結果が報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
そこで、従来法のように微生物を単離するのではなく、自然界から遺伝子（環境DNA又はメタゲノム）を直接単離し、その中から有用な酵素遺伝子をスクリーニングするという手法（メタゲノムスクリーニング）が行われるようになってきた。この手法を用いるためには、メタゲノムを利用した極めて多数の組換え体を作製し、これらの中から活性ある組換え体を効率よく選別する技術が求められる。しかしながら、高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの機器を用いる方法は、ハイスループット性に欠ける。そこで、ハイスループットスクリーニングを可能とする新規な技術が求められるようになった。
【０００６】
他方、蛍光物質に関連する発明として、蛍光プローブ又は蛍光ラベル化剤の発明が知られている（特許文献１、２）。しかしながら、ニトリル関連酵素活性の検出に有用な蛍光基質は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報 WO2004/005917
【特許文献２】国際公開公報 WO2006/019105
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】M.S. Rappe and S.J. Giovannoni, Annu. Rev. Microbiol., 57, 369 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するのみならず、同一反応系において残存基質と生成物を蛍光により検出するための蛍光基質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ニトリル関連酵素の作用により、シアノ基を有するある種の蛍光物質の励起波長および蛍光波長がシフトすることを見出した。また、当該蛍光物質を含む溶液の蛍光波長および蛍光強度を測定することにより、溶液中に含まれる基質および生成物を簡便に検出し得ること、その結果、ニトリル関連酵素の酵素活性を簡便に検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１１】
（１）ニトリル関連酵素の作用により蛍光波長の特性が変化する化合物を基質として用いた、ニトリル関連酵素の酵素活性検出方法。
（２）ニトリル関連酵素の作用により、さらに励起波長の特性も変化する化合物を基質として用いた、上記（１）に記載の方法。
（３）化合物が、下記式（I）： 
【化１】
0005818199.tif 000002
［式中、R1は、-CN、-CONH2を表し、R2〜R5は、それぞれ独立して、水素原子、又はC1-4アルキル基を表す］
で示される化合物、その塩又はそれらの水和物である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）ニトリル関連酵素が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）式（I）中、R1が-CNであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、上記（３）に記載の方法。
（６）式（I）中、R1が-CONH2であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、上記（３）に記載の方法。
（７）下記式（I）： 
【化２】
0005818199.tif 000003
［式中、R1は、-CN、-CONH2を表し、R2〜R5は、それぞれ独立して、水素原子、又はC1-4アルキル基を表す］
で示される化合物、その塩又はそれらの水和物を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用試薬。
（８）ニトリル関連酵素が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（７）に記載の試薬。
（９）式（I）中、R1が-CNであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、上記（７）に記載の試薬。
（１０）式（I）中、R1が-CONH2であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、上記（７）に記載の試薬。
（１１）被検物質のニトリル関連酵素の酵素活性検出方法であって、以下の工程：
(a) 被検物質と上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の試薬とを反応させる工程、及び
(b) 工程(a)における反応により生じた生成物から生じる蛍光の強度を測定する工程
を含む、前記方法。
（１２）被検物質のニトリル関連酵素の酵素活性検出方法であって、以下の工程：
(a) 被検物質と上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の試薬とを反応させる工程、
(b) 試薬から生じる蛍光の強度、及び／又は、工程(a)における反応により生じた生成物から生じる蛍光の強度を、反応開始時および反応開始から一定時間経過後に測定する工程、及び
(c) 試薬から生じる蛍光の強度及び／又は生成物から生じる蛍光の強度の変化に基づいて、酵素活性を検出する工程
を含む、前記方法。
（１３）上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の試薬を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の試薬を用いることにより、ニトリル関連酵素の酵素活性を簡便に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、蛍光基質および生成物の蛍光測定の結果を示す図である。
【図２】図２は、ニトリルヒドラターゼ活性による、蛍光基質の蛍光強度の低下および生成物の蛍光強度の増加を検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１５】
１．概要
本発明は、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質に関する。
【００１６】
本発明者らは、これまでに、ニトリル関連酵素の作用により蛍光を発するようになる無蛍光（低蛍光）の基質化合物を開発し、また、該基質化合物を用いてニトリル関連酵素の酵素活性を簡便に検出し得る方法を開発した（特願2010-119431）。しかしながら、これらの化合物においては、基質はほぼ無蛍光または低蛍光であって、基質と生成物の励起光及び蛍光の波長の特性は変わらない。従って、反応液中の基質及び生成物の量比を蛍光検出により調べることは困難であった。
【００１７】
そこで、本発明者らは、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための基質として、ニトリル関連酵素と反応することにより蛍光波長の特性が変化する蛍光基質の探索を行ったところ、ニトリル関連酵素の作用により、シアノ基を有するある種の蛍光物質の励起波長および蛍光波長がシフトすることを見出した。さらに、当該蛍光を含む溶液の蛍光波長および蛍光強度を測定することにより、溶液中に含まれる基質および生成物をそれぞれ簡便に検出し得ること、その結果、ニトリル関連酵素の酵素活性を簡便に検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１８】
２．式（I）で示される化合物
本発明の試薬は、以下の式（I）で示される化合物を含む。
【化３】
0005818199.tif 000004
［式中、R1は、-CN又は-CONH2を表し、R2〜R5は、それぞれ独立して、水素原子、又はC1-4アルキル基を表す］
【００１９】
式（I）において、R1で表される置換基としては、ニトリル関連酵素と反応する置換基であれば限定されるものではなく、-CN又は-CONH2が挙げられる。
【００２０】
R2〜R5で表される置換基としては、それぞれ独立して、水素原子、又はC1-4アルキル基が挙げられる。
【００２１】
本発明において、「C1-4アルキル基」とは、炭素数が１〜４個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基などが挙げられるが、好ましくはメチル基である。
【００２２】
式(I)で示される化合物の代表例を以下に示す。
【化４】
0005818199.tif 000005
【００２３】
上記式（I）で示される化合物は、その塩又は水和物を形成してもよい。塩は、本発明の効果を有する限り特に限定されるものではなく、酸との塩を形成しても塩基との塩を形成してもよい。
【００２４】
酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸との塩、蟻酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩などを挙げることができる。
【００２５】
塩基との塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩（有機アミン塩）、あるいはアンモニウム塩などを挙げることができる。
【００２６】
また、本発明の試薬に含まれる化合物としては、塩を形成しない、いわゆるフリー体を選択することもできる。
【００２７】
式（I）で示される化合物は、例えば以下の方法により製造することができる。
【化５】
0005818199.tif 000006
【００２８】
出発物質である化合物(a)は、和光純薬株式会社より購入することにより取得することができる。次に、化合物(a)をH2O中にてシアン化カリウムと２２時間加熱還流した後、２M塩酸中にて塩化鉄（III)と９０℃で１４時間反応させることにより化合物１を得ることができる。
【００２９】
【化６】
0005818199.tif 000007
化合物１を濃硫酸中６０℃で８７時間反応させた後、０℃でアンモニア水にて中和することにより化合物２を得ることができる。
【００３０】
化合物１は６５４ｎｍに励起光の極大を持ち、６７１ｎｍに蛍光の極大を持つ。よって、化合物１の励起波長は６０５〜７０５ｎｍ、好ましくは６２５〜６８５ｎｍ、より好ましくは６４５〜６６５ｎｍとすることができ、蛍光波長は６２０〜７２０ｎｍ、好ましくは６４０〜７００ｎｍ、より好ましくは６６０〜６８０ｎｍとすることができる。化合物２は５６８ｎｍに励起光の極大を持ち、６０４ｎｍに蛍光の極大を持つ。よって、化合物２の励起波長は５２０〜６２０ｎｍ、好ましくは５４０〜６００ｎｍ、より好ましくは５６０〜５８０ｎｍとすることができ、蛍光波長は５０５〜６０５ｎｍ、好ましくは５７５〜６３５ｎｍ、より好ましくは５９５〜６１５ｎｍとすることができる。
【００３１】
３．蛍光基質
上記式（I）で示される化合物、その塩又はそれらの水和物は、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として用いることができる。
【００３２】
式（I）で示される化合物はニトリル関連酵素の基質となり、当該酵素との反応により生成物に変換されるところ、式（I）で示される化合物と生成物とは、励起波長の特性および蛍光波長の特性が異なる。よって、ニトリル関連酵素との反応により、式（I）で示される化合物を含む試料の励起波長の特性及び蛍光波長の特性が変化する。本明細書において、「励起波長の特性」とは、励起スペクトルの励起波長および蛍光強度をいい、「蛍光波長の特性」とは、蛍光スペクトルの蛍光波長および蛍光強度をいう。
【００３３】
本発明において、ニトリル関連酵素としては、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、及びアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
また、式（I）で示される化合物において、R1が-CNである場合は、ニトリル関連酵素はニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼであることが好ましく、R1が-CONH2である場合は、ニトリル関連酵素はアミダーゼであることが好ましい。
【００３５】
４．酵素活性の検出方法
本発明は、酵素活性の検出方法を提供する。具体的には、被検物質のニトリル関連酵素の酵素活性を検出する方法であって、(a) 被検物質と (I)で示される化合物を含む試薬とを反応させる工程； 及び(b) 工程(a)における反応により生じた生成物から生じる蛍光の強度を測定する工程を含む。
【００３６】
また、本発明の別の態様として、被検物質のニトリル関連酵素の酵素活性検出方法であって、以下の工程：
(a) 被検物質と式(I)で示される化合物を含む試薬とを反応させる工程、
(b) 試薬から生じる蛍光の強度、及び／又は、工程(a)における反応により生じた生成物から生じる蛍光の強度を、反応開始時および反応開始から一定時間経過後に測定する工程、及び
(c) 試薬から生じる蛍光の強度及び／又は生成物から生じる蛍光の強度の変化に基づいて、酵素活性を検出する工程
を含む、前記方法も提供する。
【００３７】
一定時間とは、ニトリル関連酵素の作用により、基質が生成物に変換されるのに十分な時間をいい、特に限定するものではないが、１分〜２４時間程度、好ましくは５分〜５時間程度である。
【００３８】
本発明において、被検物質としては、ニトリル関連酵素の酵素活性を有するタンパク質又は当該タンパク質をコードするDNAを含むと予測されるものであれば限定されるものではないが、例えば、自然界から取得したメタゲノムライブラリー又は変異酵素遺伝子ライブラリーなどに含まれる物質が挙げられる。
【００３９】
さらに、被検物質には、DNA及びタンパク質だけでなく、当該タンパク質を産生する細胞も含まれる。このような細胞としては、細菌、真菌（酵母、糸状菌など）、植物細胞、動物細胞などが挙げられる。さらに、前記細胞には、ニトリル関連酵素の酵素活性を有するタンパク質を発現するように形質転換された細胞が含まれる。前記細胞としては、限定されるものではないが、例えば、宿主ベクター系の開発されているエシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属等の細菌、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等の酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属等の糸状菌、などが挙げられる。
【００４０】
メタゲノムライブラリーとは、自然環境中に存在する多様な微生物のDNAから構築されたゲノムライブラリーであり、微生物の培養を行うことなく環境試料から直接DNAを抽出し、ライブラリー化したものである。変異酵素遺伝子ライブラリーとは、既知の酵素をコードするDNAにランダムに変異を導入し、ライブラリー化したものである。
【００４１】
メタゲノムライブラリーの作製方法については、例えば特開2007-159417に記載され、変異酵素遺伝子ライブラリーの作製方法については、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y., 1989.や、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons（1987-1997） などに記載されており、当業者であればこれらの文献に基づいて前記ライブラリーを作製することができる。
【００４２】
本発明の検出方法は、具体的には、例えば以下のような方法で行うことができる。
メタゲノムライブラリー又は変異酵素遺伝子ライブラリーを被検物質として用いる場合、これらのライブラリーに含まれるDNAを細胞に形質導入し、形質転換体のライブラリーを作製する。次に、形質転換体に基質として式（I)で示される化合物を含む試薬を導入することにより、形質転換体中で産生されたタンパク質と基質とを反応させる。その後、前記反応により生じた生成物の蛍光の強度を測定する。蛍光強度の測定には、蛍光検出機器である蛍光分光光度計やイメージャー等を用いることができる。
【００４３】
形質転換体中で産生されたタンパク質と基質との反応開始時および反応開始から一定時間経過後における基質および生成物の蛍光の強度を測定し、これらの蛍光の強度の変化に基づいて酵素活性を検出することもできる。また、基質および生成物の蛍光の強度の比を求め、当該比に基づいて酵素活性を検出することもできる。基質および生成物の蛍光の強度のどちらを分母として、比を求めてもよい。
【００４４】
以上の方法により、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出することができる。
【００４５】
また、蛍光を発した細胞をFACS（Fluorescence-activated cell sorting）システムを用いて分取することができる。これにより、酵素活性の高い酵素のハイスループットスクリーニングが可能となる。
【００４６】
５．キット
本発明は、上記式（I）で示される化合物を含む試薬を含有する、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用キットを提供する。本発明のキットは、本発明の試薬の他に、溶解液、緩衝液、使用説明書など、ニトリル関連酵素の酵素活性の検出に必要な他の任意の構成要素を適宜含めることができる。
【００４７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
１．式（I）で示される化合物
式(I)で示される化合物の代表例を以下に示す。
【化７】
0005818199.tif 000008
【００４９】
２．式（I）で示される化合物の合成
化合物１はJournal of the American Chemical Society 129, 7313-7318 (2007)の記載に従い、以下のスキーム１により合成した。
【化８】
0005818199.tif 000009
出発物質である化合物(a)は、和光純薬株式会社より購入することにより取得した。次に、化合物(a)をH2O中にてシアン化カリウムと２２時間加熱還流した後、２M塩酸中にて塩化鉄（III)と９０℃で１４時間反応させることにより化合物１を得た。
【００５０】
【化９】
0005818199.tif 000010
化合物１を濃硫酸中６０℃で８７時間反応させた後、０℃でアンモニア水にて中和することにより化合物２を得た。
【００５１】
化合物１は６５４ｎｍに励起光の極大を持ち、６７１ｎｍに蛍光の極大を持つ。化合物２は５６８ｎｍに励起光の極大を持ち、６０４ｎｍに蛍光の極大を持つ。
【実施例２】
【００５２】
ニトリルヒドラターゼによる反応
１．ニトリルヒドラターゼ粗酵素液（細胞抽出液）の調製
ロドコッカス属細菌においてロドコッカス  ロドクロウスＪ１株由来ニトリルヒドラターゼを構成的に発現させるためのプラスミドｐＳＪ０３４をロドコッカス  ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株に導入した。ｐＳＪ０３４は、プラスミドｐＳＪ０２３から特開平１０−３３７１８５号明細書記載の方法により作製したものである。ｐＳＪ０２３は、形質転換体  R. rhodochrous  ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３２）として産業総合技術研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００５３】
プラスミドｐＳＪ０３４によりロドコッカス  ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株を形質転換し、ＡＴＣＣ１２６７４株／ｐＳＪ０３４株を作製した。ベクターｐＫ４を導入した１２６７４株を対照実験に用いた。
【００５４】
ＡＴＣＣ１２６７４株の形質転換は次のようにして行った。ＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記のプラスミド溶液１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。これを遺伝子導入装置Gene Pulser（ＢＩＯ  ＲＡＤ）用キュベットに移し、同装置を用いて２．０ＫＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置後、３７℃で１０分間インキュベートし、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌ  を加え、３０℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養した。得られたコロニーを培養し、プラスミドが導入されていることを確認した。
【００５５】
培養は、次のように行った。カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＹＫ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃にて２４時間前培養を行った。培養液を１ｍｌ取り１００ｍｌの同培地に加え、３０℃にて４８時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ  リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。
【００５６】
得られた菌体懸濁液から１ｍｌを用い、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロ−ル４、DUTY CYCLE  ４０％、PULS、TIMER＝Ｂモ−ド１０ｓの条件で氷冷しながら３分間破砕した。次に遠心分離を行い（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液として採取した。
【００５７】
２．酵素反応
化合物１は、ニトリルヒドラターゼにより、化合物２に変換される。
【００５８】
【化１０】
0005818199.tif 000011
【００５９】
化合物１は６５４ｎｍに励起光の極大を持ち、６７１ｎｍに蛍光の極大を持つ。化合物２は５６８ｎｍに励起光の極大を持ち、６０４ｎｍに蛍光の極大を持つ。
【００６０】
３．酵素反応の蛍光計による検出
２０μＬリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２，６８５μＬ滅菌水および１５μＬの１．９６ｍＭニトリル蛍光基質（化合物１：１０％ＤＭＳＯに溶解）を混合し、３０℃でプレインキュベーションを行った。上記のように調製した細胞抽出液３００μＬを加えることにより反応を開始した。１時間ごとにサンプリングを行い、F-4500形分光蛍光光度計（日立ハイテクノロジーズ）を用いて蛍光を測定した。生成物の検出の際は、５６８ｎｍで励起し、基質の検出の際は、６５４ｎｍで励起した。
【００６１】
結果を図１に示した。時間経過とともに基質の減少が見られ、同時に生成物の増加を確認することができた。
【００６２】
４．酵素反応の蛍光イメージャーによる検出
２０μＬリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０μＬ滅菌水および１０μＬの１ｍＭニトリル蛍光基質（化合物１：１０％ＤＭＳＯに溶解）を混合し、３０℃でプレインキュベーションを行った。上記のように調製した細胞抽出液２０μＬを加えることにより反応を開始した。３０℃で２４時間反応後、９６穴マイクロプレートに移し、蛍光イメージャー（ＢｉｏＲａｄ社  Pharos FX molecular Imager）により蛍光を検出した。用いた検出機器の関係から、生成物の検出は、「励起５３２ｎｍ、検出６０５ｎｍ」で行い、基質の検出は「励起６３５ｎｍ、検出６９５ｎｍ」で行った。
【００６３】
結果を図２に示した。生成物を検出する条件では、対照サンプルであるベクターｐＫ４を導入した組換え体より得られた細胞抽出液では蛍光強度に変化が無かったのに対し、ニトリルヒドラターゼを発現させた組換え体を用いた場合には、顕著な蛍光強度の増加が認められた。一方、基質を検出する条件では、対照サンプルであるベクターｐＫ４を導入した組換え体より得られた細胞抽出液では蛍光強度に変化が無かったのに対し、ニトリルヒドラターゼを発現させた組換え体を用いた場合には、顕著な蛍光強度の減少が認められた。
【００６４】
これらの結果により、化合物１が、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
式（I)で示される化合物を基質として用いることにより、蛍光により簡便にニトリル関連酵素の酵素活性を検出することが可能となる。さらに、FACSなどを併用すれば、ハイスループットな酵素活性検出システムを構築することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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