(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定方法において、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー及び特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用いた、下記の工程からなる測定方法であり、ここで第一又は第二のプライマーのいずれか一方はその５'末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーであり、また（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１２又は配列番号１３で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２５で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、測定方法。
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程
【請求項２】
前記（６）の工程（ＲＮＡ転写産物量を測定する工程）が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３６に示された塩基配列、又は当該相補配列からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記（１）の工程（ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によって特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程）の前に、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、（ｉ）前記特定塩基配列中の、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複した領域、及び当該部位から５’側に隣接する領域に対し相補的な配列を有する、切断用オリゴヌクレオチド、及び、（ｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、を用いて、前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を行なうことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定方法。
【請求項６】
前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１又は配列番号２で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
配列番号１２又は配列番号１３に示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２５に示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを少なくとも含むことを特徴とする、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）ｍＲＮＡの測定方法に関する。より正確には、本発明は４０から６０℃の範囲内の一定温度で、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを増幅し測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の進歩により、遺伝的疾患のみならず様々な疾患と遺伝子の因果関係について研究が進み、特定の疾患を発症したときに特異的に発現量が変化する遺伝子（マーカー遺伝子）が次々と明らかになってきている。これらの情報は、診断や治療という形で医療に応用されている。マーカー遺伝子の発現量を測定する遺伝子検査もその一つであり、癌をはじめ神経変性疾患や生活習慣病などで遺伝子検査は新しい診断法として導入されつつある。
マーカー遺伝子の発現量の変動を調べるには、常に一定量発現している遺伝子の発現量をリファレンスとして同時に測定し、リファレンスの発現量で補正する必要がある。これによって試料（検体）の採取やサンプル調製における差異といったことに影響されることなく、正確にマーカー遺伝子の発現量を測定することが可能となる。
リファレンスとする遺伝子としては、細胞機能を維持するために不可欠なタンパク質、例えば、ＧＡＰＤＨ、ＰＢＧＤ（ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ＨＰＲＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β２Ｍ（β−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、Ｇ６ＰＤＨ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ＡＬＡＳ（５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、βアクチン（ｂｅｔａ ａｃｔｉｎ）等をコードする、いわゆるハウスキーピング遺伝子や、１８ＳｒＲＮＡ等が考えられる。中でもＧＡＰＤＨをコードする遺伝子は、組織や細胞内の発現量が高く、組織間での発現量の差が小さい（非特許文献１）ことから、そのｍＲＮＡ（以下、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡと称することがある）はＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるマーカー遺伝子の発現量の定量においてリファレンス遺伝子としてよく用いられている（非特許文献２から６）。
【０００３】
ところで、一定温度でＲＮＡを増幅する核酸増幅法として、いわゆるＮＡＳＢＡ法（特許文献１及び２）やＴＭＡ法（特許文献３）が知られている。これらのＲＮＡ増幅方法は、測定されるべきＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）を使用してプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって測定されるべきＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡを引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とすることによって連鎖反応を行なうものである。また、増幅された核酸を測定する方法としては、例えばＲＮＡ増幅の過程で、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる方法が知られている（特許文献４及び非特許文献７）。このインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、増幅されたＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとそのインターカレーター性蛍光色素部分がこの相補的２本鎖部分にインターカレートし、結果として蛍光特性が変化するものである。そこで、かかる核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するという簡便な操作により、一定温度で、しかも増幅と測定に必要な全ての試薬を密閉容器内に投入する一段階の操作のみで、ＲＮＡ増幅及び測定を実施して迅速に結果を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献５】特開平７−５９５７２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，３，Ｒｅｓｅａｒｃｈ００３４（２００２）
【非特許文献２】Ｍｕｒｐｈｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，９，１４（２０１０）
【非特許文献３】Ｂａｒｂａｎｙ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４６，９１３−９２０（２０００）
【非特許文献４】Ｍｅｄｅｉｒｏｓ  Ｌ．  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｄ．Ｐａｈｏｌ．，１５，５５６−５６４（２００２）
【非特許文献５】Ｉｋｅｇｕｃｈｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，９５，１９３８−１９４５（２００２）
【非特許文献６】Ｍｉｙａｎａｋａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１３，２９３９−２９４４（２００７）
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したようなＲＮＡを増幅し測定する方法は、４０から６０℃という比較的低い範囲内の一定温度でＲＮＡを増幅し測定できる一方で、一般にｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡは高次構造を形成しやすいことから、測定されるべきｍＲＮＡが形成する高次構造が増幅や測定に使用するプライマー又はプローブのｍＲＮＡへの結合を阻害し、その増幅、測定に影響を与える可能性がある。
【０００７】
更にＧＡＰＤＨは、ほぼ全ての生物に見られる生体内グルコース代謝過程である解糖系に関与し、しかもそれをコードする遺伝子の塩基配列は多くの真核生物の間で高く保存されている。参考のため、ヒト、ブタ、ウシ、ニワトリ及び大腸菌のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの塩基配列の一部を図１に示すが、ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）の配列は真核生物でない大腸菌をも含めて高い相同性を有している。この高い相同性ゆえに、例えばＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのＯＲＦ内の部分（配列）をリファレンス遺伝子とし、ヒト由来の試料中の特定の遺伝子を測定する場合に、試料又は測定に使用する試薬にヒト以外の生物由来のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが混入していると、その生物のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡをも増幅し測定してしまい、測定対象である特定の遺伝子の測定結果に影響を与えてしまう可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明の発明者らは、上記課題を解決し、（ア）測定されるべきｍＲＮＡが高次構造を形成したとしても、その増幅、測定に影響を与えないＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定方法、そして（イ）ヒトのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのみを特異的に増幅し測定可能であり、ヒト以外の生物由来のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが混入しても測定結果に影響を与えないＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定方法、を提供すべく鋭意検討した結果、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、試料中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定方法において、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー及び特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用いた、下記の工程からなる測定方法であり、ここで第一又は第二のプライマーのいずれか一方はその５'末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーであり、また（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号９又は配列番号１０で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２０又は配列番号２１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであるか、又は、（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号１１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２２又は配列番号２３で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、測定方法。
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程。
また本発明は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを特異的に増幅し又は測定するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号９から配列番号１１、配列番号２０から配列番号２３、配列番号３４、配列番号３７及び配列番号３８に示されたいずれかの塩基配列中又は当該相補配列中の、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチド含むことを特徴とする。更に本発明は、かかるオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含むことを特徴とする、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定試薬である。
そして本発明は、ヒトのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを特異的に増幅し又は測定するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号３４に示されたいずれかの塩基配列中又は当該相補配列中の、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチド含むことを特徴とする。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の試料とは、ＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明は、ヒト細胞、ヒト組織、体液、血液、尿、便、リンパ液、乳管液又は腹腔や胸腔の洗浄液等を材料として、例えば特許文献５などに記載された方法に基づいて調製した試料を使用し、当該試料を直接的に測定することで、当該試料の由来元であるヒト細胞や組織などに含まれるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定を行なうものである。
【００１１】
本発明の特定塩基配列とは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡ又はＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ上で、第一のプライマーは特定塩基配列の５’末端から３’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相同的であり、第二のプライマーは特定塩基配列の３’末端から５’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相補的である。これにより、本発明では前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。本発明の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、当該部位は後述する切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。
【００１２】
本発明のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位である。種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が知られており、本発明は特にプロモーターを限定するものではないが、分子生物学的実験などで通常用いられている、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター等が好ましい。また前記配列に転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明の相補的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。高ストリンジェントな条件の一例として、本発明の実施例に記載の核酸増幅反応液組成をあげることができる。また、本発明の相同的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列の完全相補配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう相補的又は相同的な配列は、高ストリンジェントな条件においてハイブリダイゼーションの特異性及び効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能であることはいうまでもない。さらに、ハイブリダイゼーションの特異性及び効率に影響を与えない範囲で、１から数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いてもよい。
【００１４】
本発明のヌクレオチドもしくは核酸とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシド（ＲＮＡ及びＤＮＡの双方を含む）のことをいい、そのオリゴマー（オリゴヌクレオチド、例えば、２から１００塩基程度）及びポリマー（ポリヌクレオチド、例えば、１００塩基以上）を含む総称である。本発明のヌクレオチド又は核酸は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子、及び放射性同位体で標識されたモノマー、更にはこれらを含むオリゴマー又はポリマーなども含む。
【００１５】
本発明のプライマーとは、核酸増幅反応において鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応（核酸の伸長反応）を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいい、核酸増幅反応において増幅を所望する鋳型を基に、その鋳型とハイブリダイズし、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法といった核酸増幅反応により、鎖長又は配列において特異的な生成物が得られるように、好ましくはプライマー自身がその鋳型に特異的な配列を含むよう設計される。プライマーの長さは、通常１５から１００塩基、好ましくは１５から３５塩基の鎖長を有するように設計されるが、当該鎖長に限られるものではない。従って本発明の第一及び第二のプライマーは、本発明に記載する塩基配列の範囲内で、少なくとも連続する１５塩基以上の任意の配列の中から選定することができる。すなわち、本発明におけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ測定のための好適な第一及び第二のプライマーの組み合わせとしては、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号９又は配列番号１０で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号２０又は配列番号２１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、又は、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号１１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２２又は配列番号２３で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、を例示することができる。
【００１６】
本発明におけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ検出のためのより好適な第一及び第二のプライマーの組み合わせとしては、
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１２から配列番号１６で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２４から配列番号２９で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、又は、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号１７から配列番号１９で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３０から配列番号３３で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、を例示することができる。
【００１７】
本発明の測定方法においては、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定核酸配列の前記５’末端部位で切断することができる。特定核酸配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法を例示できる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。好適な切断用オリゴヌクレオチドとして、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号１から配列番号で示されたいずれかの配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチドが例示できる。
【００１８】
本発明の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同又は相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、本発明の特定塩基配列の一部と相補的、又は相同的な配列となる。好適なインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとして、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３４、配列番号３７及び配列番号３８に示されたいずれかの配列に対して相同的、又は相補的な配列の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブが挙げられる。また他の好適なインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとして、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３５から配列番号３８に示されたいずれかの配列に対して相同的、又は相補的な配列の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブが挙げられる。
【００１９】
本発明におけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ測定のための好適な切断用オリゴヌクレオチド、第一のプライマー、第二のプライマー及びインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの好適な組み合わせとしては、
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５に示されたいずれかの配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号９又は配列番号１０に示された配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１から５に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号２０又は配列番号２１に示された配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３４に示された配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、又は、
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号６から配列番号８に示されたいずれかの配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号１１に示された配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号６から配列番号８に示されたいずれかの配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号２２又は配列番号２３に示された配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３７又は配列番号３８に示された配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、を例示することができる。なお、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの相補配列と、第一のプライマーの相同配列及び第二のプライマーの相補配列とは重複しないように設計する。
【００２０】
また本発明におけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ測定のためのより好適な切断用オリゴヌクレオチド、第一のプライマー、第二のプライマー及びインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの好適な組み合わせとしては、
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１２に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２４から配列番号２９に示されたいずれかの配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３５又は配列番号３６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１３に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２４から配列番号２９に示されたいずれかの配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３５又は配列番号３６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、
（ｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号３に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１４に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２４から配列番号２９に示されたいずれかの配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３５又は配列番号３６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、
（ｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号４に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１５に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２４から配列番号２９に示されたいずれかの配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３５又は配列番号３６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、
（ｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号５に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１６に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２４から配列番号２９に示されたいずれかの配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３５又は配列番号３６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、
（ｖｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号６に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１７に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３０又は配列番号３３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３７又は配列番号３８に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、
（ｖｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号７に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１８に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３０から配列番号３３に示されたいずれかの配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３７又は配列番号３８に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、又は、
（ｖｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号８に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１９に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３０から配列番号３３に示されたいずれかの配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３７又は配列番号３８に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、を例示することができる。
本発明におけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ測定の中でも、ヒトのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを特異的に測定するためのより好適な切断用オリゴヌクレオチド、第一のプライマー、第二のプライマー及びインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの好適な組み合わせとしては、切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１又は配列番号２に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１２又は配列番号１３に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２４から配列番号２９に示されたいずれかの配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３５又は配列番号３６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、を例示することができる。
【００２１】
本発明のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定方法では、種々の酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素）を使用する。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性、及び１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するのみだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素をさらに添加してもよい。前記逆転写酵素は、分子生物学的実験などで汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素又はこれらの誘導体が好ましく、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、及びこれらの誘導体を例示できる。
【００２２】
本発明の一態様では、試料中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに切断用オリゴヌクレオチドを添加し、逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性により特定塩基配列の５’末端部位でＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として第一及び第二のプライマーの存在下で逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、逆転写酵素のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行なわれる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖は逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーがｃＤＮＡに結合する。引き続いて、逆転写酵素のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で、かつ５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、第一及び第二のプライマーによる２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００２３】
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必要な要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を使用する。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することもできる。また測定を実施する反応温度については、例えばＡＭＶ逆転写酵素及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から６０℃の範囲で設定することがより好ましく、さらに好ましくは４３℃に設定する。このように逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することで、前記ＲＮＡ増幅工程を一定温度で進行させることが可能である。
【００２４】
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。かかる測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などが例示できる。しかしながら、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の可能性があるため、標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを用いることが好ましい。そのようなオリゴヌクレオチドプローブとしてモレキュラービーコン等のＦＲＥＴを利用したプローブを使用することができるが、プローブ設計やプローブ合成の容易性から、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定することが特に好ましい（特許文献４及び非特許文献７参照）。
【００２５】
インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、及びこれらの誘導体などが利用できる。インターカレーター性蛍光色素の蛍光特性の変化としては、蛍光強度の変化がある。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが知られている。インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドで、末端、リン酸ジエステル部又は塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合されている。オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の結合は、既知の方法や市販されているＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いてでオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させれば良い（特許文献４及び非特許文献７参照）。
なお、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記ＲＮＡ増幅反応を阻害しないため、その存在下で前記特定塩基配列の増幅を実施して、特定塩基配列の増幅の様子をモニタリングすることが可能である。なお、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で特定塩基配列の増幅を行なう場合には、そのプローブ部分が伸長反応のプライマーとして機能しないよう、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端グリコール酸やビオチンを付加するなどの適当な修飾をしておくことが好ましい。そして増幅反応中にこのインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが特定塩基配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出器によって測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、特定塩基配列の存在の有無の確認、又は増幅された特定塩基配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定核酸配列の量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定することができる。
【００２６】
また、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、前記ＲＮＡ増幅に要する全ての試薬、当該プローブ及び試料を単一の容器に封入可能となる。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを測定することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいればよく、試料を分注した後に密閉することが可能であるため、コンタミネーションを防止する上で特に好ましい。
【００２７】
本発明の測定方法の一態様について説明すると、試料に対し、少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号３９）を有する第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ、切断用オリゴヌクレオチド、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度４０から６０℃、好ましくは４３℃の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法が例示できる。この態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅及び測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。この態様は、ＲＮＡ増幅と測定を一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適している。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下で、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを一段階の操作により、特異的かつ迅速・高感度に増幅し、増幅産物を直接的に測定することができる。本発明では、試料中の測定すべきＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を５’末端を有する２本鎖ＤＮＡが合成され、前記ＤＮＡを鋳型に多量の１本鎖ＲＮＡが生成され、さらに生成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することにより蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便、かつ迅速に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。本発明のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ測定方法は、核酸増幅及び測定の時間が３０分以内であり、これは既存のＲＴ−ＰＣＲ法（通常２時間以上）、ＮＡＳＢＡ法（９０分以上）、ＴＭＡ法（９０分以上）による測定と比較して同等以上に迅速である。
【００２９】
また本発明によれば、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを増幅し測定するためのオリゴヌクレオチド、特にＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを一段階操作で増幅し測定するためのオリゴヌクレオチドが提供される。その結果、本発明のオリゴヌクレオチドを利用することにより、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを増幅し測定する簡便、迅速かつ高感度な測定を実現すること、ならびにＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの簡便、迅速かつ高感度な定量試薬を提供することが可能となる。特に本発明は、ヒトのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの特異的な測定を実現し、そのための定量試薬を提供することを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒト、ブタ、ウシ、ニワトリならびに大腸菌のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの塩基配列の一部を示す。それぞれの配列の相同性検索の結果、相同性が５０％以上一致している塩基を黒地に白抜きで表している。また、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）よりも上流のＵＴＲ（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ）、及び翻訳開始コドン意向のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）を表示してある。
【図２】ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの検量線を示す。（ａ）表１のオリゴヌクレオチドの組み合わせ[２]、（ｂ）組み合わせ[１８]、（ｃ）組み合わせ[２８]、（ｄ）組み合わせ[３１]、（ｅ）組み合わせ[３９]、（ｆ）組み合わせ[４７]。縦軸は蛍光強度比が１．２を超えた時間（検出時間、分）であり、横軸は測定に用いた初期の標準ＲＮＡ量（コピー数）をｌｏｇで表したものである。また、各点から求めた線形一次曲線の式及びＲ２の値を記載してある。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施の態様について、実施例に基づいて説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。。
【実施例】
【００３２】
実施例１  標準ＲＮＡの調製
ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと称する）は、（１）から（２）に示す方法で調製した。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＧＡＰＤＨの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２０４６、１３１０塩基）のうち、２６から１３１０番目の塩基（１２８５塩基）の２本鎖ＤＮＡをクローニングした。
（２）（１）で調製した２本鎖ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写を実施した。引き続きＤＮａｓｅ  Ｉ処理によりその２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。当該ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００３３】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを、非特許文献７を参照して作製した。配列番号３５に記載の配列の５’末端から１４番目のＡ、配列番号３６に記載の配列の５’末端から１５番目のＡ、配列番号３７に記載の配列の５’末端から１１番目のＡ、配列番号３８に記載の配列の５’末端から１１番目のＣの位置にＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、さらに３’末端をビオチンで修飾した。前記アミノ基にインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３５から配列番号３８）を調製した。
【００３４】
実施例３  ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの測定（その１）
表１に示す本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち［１］から［６５］に示す、切断用オリゴヌクレオチド、第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ（以後、ＩＮＡＦプローブと称する）を用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお表１のうち、配列番号１２から配列番号１３は配列番号９の部分配列、配列番号１４から配列番号１６は配列番号１０の部分配列、配列番号１７から配列番号１９は配列番号１１の部分配列、配列番号２４から配列番号２５は配列番号２０の部分配列、配列番号２６から配列番号２９は配列番号２１の部分配列、配列番号３０から配列番号３１は配列番号２２の部分配列、配列番号３２から配列番号３３は配列番号２３の部分配列、配列番号３５から３６は配列番号３４の部分配列である。
【００３５】
【表１】
0005782704.tif 000002
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼ  インヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用い、２．５×１０５コピー／５μＬになるように希釈し、これをＲＮＡ試料として使用した。
（２）以下の組成の反応液２０．０μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＰＣＲ  ｔｕｂｅ  ｗｉｔｈ  ｄｏｍｅ  ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００３６】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
６０．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．０ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１．０ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
１．０μＭ  第一のプライマー（当該プライマーには、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号３９）が付加されている。）
１．０μＭ  第二のプライマー
０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチド（当該オリゴヌクレオチドの３’末端の
水酸基はアミノ化されている。）
２０．０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ
６．０Ｕ  リボヌクレアーゼ  インヒビター（タカラバイオ社製）
１３．０％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μＬを添加した。
【００３７】
酵素液の組成（反応時（３０μＬ中）の最終濃度）
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス社製）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に２０分間測定した。酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、その時の時間を検出時間とした。表２には、その検出時間ならびに反応時間２０分後の反応液の蛍光強度比を示した。
【００３８】
【表２】
0005782704.tif 000003
表１の組み合わせのうち、（ｉ）第一のプライマーが配列番号９又は配列番号１０の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号２０又は配列番号２１の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［１］から［６］、［１０］から［１９］、［２４］から［３２］、［３６］から［４１］）、及び、（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号１１の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号２２又は配列番号２３の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［４２］から［６５］）では、いずれも２．５×１０５コピー／５μＬの標準ＲＮＡを１５分以内に検出した。なお、コントロール試験区（標準ＲＮＡの代わりにＲＮＡ希釈液を反応液に添加して測定）では、反応開始から２０分後においても蛍光強度比１．２を超えることはなかった。さらには、上記（ｉ）又は（ｉｉ）以外の組み合わせ（組み合わせ［７］から［９］、［２０］から［２３］、［３３］から［３５］）では、検出時間が１５分以降と遅いか、もしくは反応開始から２０分後においても蛍光強度比１．２を超えることはなかった。
この結果から、（ｉ）第一のプライマーが配列番号９又は配列番号１０に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号２０又は配列番号２１に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、又は、（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号１１に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号２２又は配列番号２３に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、のいずれかを用いてＲＮＡ増幅反応を行なうことにより、従来技術で最も汎用されるＲＴ−ＰＣＲ法によるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの検出方法（通常２時間以上）と比較してＧＡＰＤＨ  ＲＮＡを迅速に検出することが示された。
【００３９】
組み合わせ［２］と［１０］は、第二のプライマー及びＩＮＡＦプローブは同じで、切断用オリゴヌクレオチドがそれぞれ配列番号１と配列番号２、第一のプライマーがそれぞれ配列番号１２と配列番号１３である組み合わせである。配列番号１と配列番号２は、５’末端から５番目の塩基のみが、配列番号１２と配列番号１３は、５’末端から７番目の塩基のみが異なる配列である。ヒトのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ配列において、この一塩基違いに相当する塩基箇所は、変異が入りやすい箇所と考えられている。しかし、表２に示したように検出時間も蛍光強度比も同じ結果であった。よって、配列番号１で示す切断用オリゴヌクレオチドと配列番号１２で示す第一のプライマーを使用する組み合わせと、配列番号２で示す切断用オリゴヌクレオチドと配列番号１３で示す第一のプライマーを使用した組み合わせは、第二のプライマー及びＩＮＡＦプローブは同じ配列が同じであれば、同じ性能を有することが分かった。すなわち、ヒトの組織や細胞などに含まれるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定において、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ中に該一塩基変異がある場合においても、測定結果に影響がないことが分かった。
【００４０】
また、上記（i）と（ｉｉ）の組み合わせを比較すると、表２に示すように（i）の組み合わせの方が、蛍光強度比が高い傾向があることが分かった。組み合わせ（i）では、ＩＮＡＦプローブは配列番号３５又は配列番号３６を使用したが、蛍光強度比は両者でほとんど変わらなかった。
【００４１】
実施例４  ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの測定（その２）
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、様々な濃度の標準ＲＮＡを測定し、検出時間と初期標準ＲＮＡとの関係を、オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で測定した。
オリゴヌクレオチドの組み合わせとしては、表１に示す組み合わせのうち、表２に示す実施例３の結果より検出時間が９分未満で且つ蛍光強度比が２．０以上であった組み合わせの中から、［２］、［１８］、［２８］、［３１］、［３９］、及び［４７］を使用した。
ＲＮＡ試料としては、実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用したＲＮＡ希釈液を用い、それぞれ２．５×１０４コピー／５μＬ、２．５×１０５コピー／５μＬ、２．５×１０６コピー／５μＬ及び２．５×１０７コピー／５μＬに希釈したものを使用した。
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３に、表３の結果を基に検量線を作成した結果を図２に示す。また、２．５×１０５コピー／５μＬのＲＮＡ試料を測定したときの反応開始後２０分後における蛍光強度比も合わせて表３に記載した。
【００４２】
【表３】
0005782704.tif 000004
本実施例で検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、酵素添加後１０分以内に測定した全ての濃度の標準ＲＮＡを検出した。また、検出時間を縦軸に、初期の標準ＲＮＡ濃度量（コピー数をｌｏｇで表したもの）を横軸にしてプロットしたところ、本実施例で検討した全ての組み合わせにおいて、２．５×１０４コピーの低コピー領域から検出時間は初期ＲＮＡ量依存的であり、検量線は線形一次曲線で近似することができた。すなわち、未知試料について、本発明のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定を行ない、得られた検出時間を図２に示す検量線に当てはめることで、未知試料に含まれるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量を推測可能であることが示された。
【００４３】
なお、本実施例で検討した組み合わせの中でも組み合わせ［３９］は最も検出時間が早く、２．５×１０７コピー／５μＬの検出時間は５分未満であった。酵素液を添加しバックグラウンドの蛍光強度値を測定するのに数分間を要する場合、５分未満と検出時間が早すぎると測定結果の再現性が低下することがある。表２に示すように、配列番号５で示す切断用オリゴヌクレオチドと配列番号１６で示す第一のプライマーを使用する組み合わせ（組み合わせ［３６］から［４１］）は、いずれも検出時間が同程度に早く、高濃度のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを測定する場合、正確な測定が困難となる可能性がある。
【００４４】
実施例５  ヒト組織のＲＮＡ抽出物の測定
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ヒトの肺からの全ＲＮＡ抽出物（Ａｍｂｉｏｎ社から購入）中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定を、オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３を同様の方法で測定した。
【００４５】
オリゴヌクレオチドの組み合わせとしては、実施例４で検討した組み合わせのうち、［３９］を除く［２］、［１８］、［２８］、［３１］、及び［４７］を使用した。
ＲＮＡ試料としては、前記したＲＮＡ抽出試料を、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、５００ｎｇ／５μＬ、５０ｎｇ／５μＬ、５ｎｇ／５μＬに希釈したものを使用した。
【００４６】
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。その検出時間から、実施例４で得られた検量線（図２）を基に各ＲＮＡ試料中に含まれるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量を計算した結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
0005782704.tif 000005
検量線から求められた各ＲＮＡ試料中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量は、使用した全ＲＮＡ抽出物濃度にほぼ比例しており、本発明のオリゴヌクレオチドを用いたＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの増幅検出法により、ヒト組織中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量を測定できることが示された。
【００４８】
実施例６  ヒト以外の動物組織の抽出物の測定
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ヒト以外の動物（ブタ、ウシ、ニワトリの肝臓からの全ＲＮＡ抽出物、ＺＹＡＧＥＮ社から購入）及び大腸菌からの全ＲＮＡ抽出物（大腸菌ＨＢ１０１の培養液から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて調製）中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定を、オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更し、測定時間を３０分にした他は、実施例３を同様の方法で測定した。
オリゴヌクレオチドの組み合わせとしては、実施例５で検討した組み合わせのうち、［２］及び［２８］を使用した。
【００４９】
ＲＮＡ試料としては、実施例５及び前記したＲＮＡ抽出試料を、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、５００ｎｇ／５μＬに希釈したものを使用した。
【００５０】
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表５に示す。
【００５１】
【表５】
0005782704.tif 000006
組み合わせ［２］を使用した場合、ブタならびにニワトリのＲＮＡ抽出物を検出しなかったのに対し、組み合わせ［２８］を使用すると、ブタならびにニワトリのＲＮＡ抽出物を測定した結果、陽性判定となった。前述したように、ＧＡＰＤＨの遺伝子配列は多くの真核生物の間で高く保存されている。特に、図１に示すようにタンパク質をコードしているＯＲＦの配列は真核生物のみならず高い相同性を示し、ＯＲＦ以外の領域では相同性は比較的低いことが分かる。組み合わせ［２］及び［２８］の第二のプライマーならびにＩＮＡＦプローブは同一のオリゴヌクレオチドを使用しているが、組み合わせ［２］は、配列番号１で示す切断用オリゴヌクレオチドと配列番号１２で示す第一のプライマーを使用している。配列番号１及び配列番号１２は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのＯＲＦ上流である５’ＵＴＲ（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ）内の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。一方で、組み合わせ［２８］は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのＯＲＦ内の配列にハイブリダイズする配列番号４で示す切断用オリゴヌクレオチドと同じくＯＲＦ配列にハイブリダイズする配列番号１５で示す第一のプライマーを使用している。
すなわち、切断用オリゴヌクレオチドならびに第一のプライマーを５’ＵＴＲ内にハイブリダイズするように選択することで、他の動物由来のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを検出することなく、ヒトのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのみを特異的に増幅検出することが可能であることが示された。
【図１】
0005782704.tif 000007
【図２】
0005782704.tif 000008
【配列表】
0005782704000001.app