(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を照射する励起光源と、
該励起光源から照射される励起光の強度を調節する調光手段と、
該調光手段により調節された励起光を標本上に照射する照射光学系と、
標本上において発生した蛍光を検出する検出光学系と、
該検出光学系により検出された蛍光から標本の画像を生成する画像生成部と、
該画像生成部により生成された複数の画像を合成する画像合成部と、
前記調光手段により、前記標本上の同一の観察位置に照射される励起光の強度を高強度から低強度の順に調節させて、前記画像生成部により前記標本上の同一の観察位置における蛍光強度の異なる複数の画像を生成させ、前記画像合成部により前記標本上の同一の観察位置における前記複数の画像を合成させる制御部とを備える蛍光観察装置。
【請求項２】
前記検出光学系が、蛍光の検出感度および／または露光時間を調節可能である請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記調光手段により調光された励起光を標本上で走査する走査手段を備え、
前記画像生成部が、該走査手段による走査位置と前記検出光学系により検出された蛍光とを対応づけて標本の画像を生成する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
標本を前記照射光学系の光軸に直交する方向に移動させるステージを備え、
前記画像生成部が、該ステージの位置と前記検出光学系により検出された蛍光とを対応づけて標本の画像を生成する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
前記照射光学系が、標本を互いに異なる複数の領域に分けるとともに、これら領域に励起光を順次照射して、
前記調光手段が、前記照射光学系が全ての領域に励起光の照射を終了した時点で、励起光の強度を低強度に切り替える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
前記画像生成部により生成された各前記領域の画像が所定の輝度値の範囲内であることを判定する判定部を備え、
該判定部により所定の輝度値の範囲外と判定された領域の画像について、前記調光手段により励起光の強度を調節して前記画像生成部により再度画像を生成する請求項５に記載の蛍光観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば細胞等を観察するための蛍光観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞等を観察する観察装置において、撮像対象の視野内における高輝度領域と低輝度領域との輝度差が大きい場合、高輝度領域が飽和しないように、レーザ光の強度や露出時間や検出感度を調整すると、低輝度領域の明るさが不十分となる。一方、低輝度領域の明るさが十分になるように、レーザ光の強度や露出時間や検出感度を調整すると、高輝度領域の明るさが飽和する現象が発生する。これは、撮像対象のダイナミックレンジが検出装置よりも大きいために発生する問題である。
【０００３】
この問題に対し、露光時間を変更して明るさの異なる複数の画像を取得し、これらの画像を合成することで、広ダイナミックレンジで撮像対象を観察することを図った観察装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−３０１３３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示されている観察装置では、例えば蛍光顕微鏡を用いて蛍光物質で染色した細胞を観察する場合、露光時間が長くなると蛍光が褪色してしまい、細胞の観察精度が低下するという不都合がある。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、蛍光の褪色による観察精度の低下を抑制しつつ、広ダイナミックレンジで撮像対象を観察することができる蛍光観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、励起光を照射する励起光源と、該励起光源から照射される励起光の強度を調節する調光手段と、該調光手段により調節された励起光を標本上に照射する照射光学系と、標本上において発生した蛍光を検出する検出光学系と、該検出光学系により検出された蛍光から標本の画像を生成する画像生成部と、該画像生成部により生成された複数の画像を合成する画像合成部と、前記調光手段により、前記標本上の同一の観察位置に照射される励起光の強度を高強度から低強度の順に調節させて、前記画像生成部により前記標本上の同一の観察位置において蛍光強度の異なる複数の画像を生成させ、前記画像合成部により前記標本上の同一の観察位置における前記複数の画像を合成させる制御部とを備える蛍光観察装置である。
【０００８】
本発明によれば、励起光源により照射された励起光が、照射光学系により標本上に照射され、標本上において発生した蛍光が、検出光学系により検出される。そして、検出された蛍光から、画像生成部により標本の画像が生成され、生成された複数の画像が画像合成部により合成される。
【０００９】
この場合において、制御部により制御されて、調光手段により励起光の強度が高強度から低強度の順に調節され、画像生成部により蛍光強度の異なる複数の画像が生成される。このように生成された蛍光強度の異なる複数の画像は、画像合成部により合成される。
【００１０】
このようにすることで、広いダイナミックレンジの標本の画像（合成画像）を取得することができ、標本の高輝度領域と低輝度領域の両方を精度よく観察することができる。また、励起光の強度を高強度から低強度の順に調節することで、蛍光が褪色してしまう前に標本の細部についての画像を取得することができ、この画像を合成に用いることで、標本の観察精度を向上することができる。
【００１１】
上記発明において、前記検出光学系が、蛍光の検出感度および／または露光時間を調節可能であることとしてもよい。
このようにすることで、検出光学系により蛍光の検出感度および／または露光時間を調節することによって、画像生成部により生成される画像の蛍光強度の範囲を広げることができる。このような広範囲な蛍光強度の画像を画像合成部により合成することで、標本の画像（合成画像）のダイナミックレンジをさらに広げることができる。
【００１２】
上記発明において、前記調光手段により調光された励起光を標本上で走査する走査手段を備え、前記画像生成部が、該走査手段による走査位置と前記検出光学系により検出された蛍光とを対応づけて標本の画像を生成することとしてもよい。
このようにすることで、画像生成部により、走査手段による走査位置と検出光学系により検出された蛍光とを対応づけて、詳細な標本の画像を生成することができる。このような詳細な画像から合成画像を生成することで、標本の観察精度を向上することができる。
【００１３】
上記発明において、標本を前記照射光学系の光軸に直交する方向に移動させるステージを備え、前記画像生成部が、該ステージの位置と前記検出光学系により検出された蛍光とを対応づけて標本の画像を生成することとしてもよい。
このようにすることで、画像生成部により、ステージの位置と検出光学系により検出された蛍光とを対応づけて、標本の画像を容易に生成することができ、装置構成を簡略化することができる。なお、ステージを照射光学系の光軸に沿う方向に移動可能な構成とすることで、標本の３次元画像を生成することができる。
【００１４】
上記発明において、前記照射光学系が、標本を互いに異なる複数の領域に分けるとともに、これら領域に励起光を順次照射して、前記調光手段が、前記照射光学系が全ての領域に励起光の照射を終了した時点で、励起光の強度を低強度に切り替えることとしてもよい。
【００１５】
このようにすることで、互いに異なる複数の領域に対して照射光学系により励起光が順次照射され、これら全ての領域に励起光の照射を終了した時点で、調光手段により励起光の強度が低強度に切り替えられる。これにより、複数の領域のうち或る領域において、一度励起光が照射されてから、その強度が低強度に切り替えられて再び照射されるまでに、タイムラグが生じることとなる。このタイムラグの間に、前述の或る領域において、蛍光物質の拡散現象が生じるため、蛍光がより鮮明な画像を取得することができる。このような鮮明な画像から合成画像を生成することで、標本の観察精度を向上することができる。
【００１６】
上記発明において、前記画像生成部により生成された各前記領域の画像が所定の輝度値の範囲内であることを判定する判定部を備え、該判定部により所定の輝度値の範囲外と判定された領域の画像について、前記調光手段により励起光の強度を調節して前記画像生成部により再度画像を生成することとしてもよい。
【００１７】
このようにすることで、複数の領域のうち、所定の輝度値の範囲外と判定された領域の画像については、調光手段により励起光の強度が調節されて再度画像が取得される。これにより、標本の全ての領域について適切な輝度を有する画像を取得することができ、これら画像を合成することで、標本の観察精度を向上することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、蛍光の褪色による観察精度の低下を抑制しつつ、広ダイナミックレンジで撮像対象を観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】第１の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成図である。
【図２】図１の蛍光観察装置における画像合成時の動作を説明する図である。
【図３】図１の蛍光観察装置により実行される処理を示すフローチャートである。
【図４】図１の蛍光観察装置の効果を説明する図であり、（ａ）は撮像初期の画像、（ｂ）は撮像後期の画像、（ｃ）は合成画像をそれぞれ表わしている。
【図５】従来の蛍光観察装置の画像合成を説明する図であり、（ａ）は撮像初期の画像、（ｂ）は撮像後期の画像、（ｃ）は合成画像をそれぞれ表わしている。
【図６】第２の実施形態に係る蛍光観察装置におけるレーザ強度と撮像枚数との関係を示すグラフである。
【図７】第２の実施形態に係る蛍光観察装置における光検出器の検出感度と撮像枚数との関係を示すグラフである。
【図８】第２の実施形態に係る蛍光観察装置により実行される処理を示すフローチャートである。
【図９】第３の実施形態に係る蛍光観察装置により実行される処理を示すフローチャートである。
【図１０】第４の実施形態に係る蛍光観察装置の画像取得時の動作を説明する図であり、（ａ）は撮像初期の画像、（ｂ）は撮像中期の画像、（ｃ）は撮像後期の画像をそれぞれ表わしている。
【図１１】第４の実施形態に係る蛍光観察装置により生成された合成画像を示す図である（飽和領域の置き換え前）。
【図１２】第４の実施形態に係る蛍光観察装置により生成された合成画像を示す図である（飽和領域の置き換え後）。
【図１３】第４の実施形態に係る蛍光観察装置により実行される処理を示すフローチャートである。
【図１４】第４の実施形態に係る蛍光観察装置により実行される処理を示すフローチャートである。
【図１５】第１の変形例に係る蛍光観察装置の概略構成図である。
【図１６】第２の変形例に係る蛍光観察装置の概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置５１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置５１は、レーザ走査型顕微鏡であり、図１に示すように、レーザ光を照射するレーザ光源（励起光源）１と、標本１５を載置するＸＹＺステージ１６と、レーザ光源１からのレーザ光を標本１５に照射する照射光学系４１と、標本１５からの光を検出する検出光学系４２と、これらを制御するとともに画像を生成する制御装置３と、制御装置３により生成された画像を表示する画像表示部４とを主な構成要素として備えている。
【００２１】
標本１５は、例えば細胞群であり、その内の観察対象とする細胞に特異的に付着または発現する蛍光物質が投与されている。
レーザ光源１は、標本１５中の蛍光物質を励起させる励起光を発し、レーザ制御部（調光手段）１１により制御されるようになっている。具体的には、レーザ制御部１１は、制御装置３からの指令に基づいて、レーザ光源１から発せられるレーザ光の強度を調節するようになっている。
【００２２】
ＸＹＺステージ１６は、標本１５を載置するとともに、後述する対物レンズ１４に対して、対物レンズ１４の光軸に沿う方向（Ｚ方向）および対物レンズ１４の光軸に直交する方向（ＸＹ方向）に相対移動できるようになっている。このような構成とすることで、標本１５におけるレーザ光の焦点位置を３次元方向（ＸＹＺ方向）に変化させ、その焦点位置からの蛍光を検出することで、標本１５の３次元画像を生成することができるようになっている。
【００２３】
照射光学系４１は、レーザ光源１からのレーザ光を標本１５に照射する光学系であり、ダイクロイックミラー８と、走査光学ユニット（走査手段）９と、リレーレンズ１０と、ミラー１２と、結像レンズ１３と、対物レンズ１４とを備えている。
検出光学系４２は、標本１５からの蛍光を検出する光学系であり、測光フィルタユニット７と、レンズ６と、ピンホール５と、光検出器２と、検出器制御部２１とを備えている。
【００２４】
対物レンズ１４は、標本１５（ＸＹＺステージ１６）に対向して配置されている。対物レンズ１４は、レーザ光源１から発せられたレーザ光を標本１５に照射するとともに、標本１５からの光を集めるようになっている。ここで、レーザ光が標本１５に照射されることで、レーザ光の焦点位置において標本１５内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。したがって、対物レンズ１４は、標本１５からの光として、標本１５から発生した蛍光を集めるようになっている。
【００２５】
ダイクロイックミラー８は、レーザ光源１からのレーザ光を透過する一方、対物レンズ１４により集められた標本１５からの蛍光を光検出器２に向けて反射するようになっている。これにより、ダイクロイックミラー８は、レーザ光源１からのレーザ光と、標本１５からの蛍光とを分岐するようになっている。
【００２６】
走査光学ユニット９は、一対のガルバノミラー９１，９２を有しており、これらガルバノミラー９１，９２の揺動角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、レーザ光源１からのレーザ光を標本１５上において２次元的（ＸＹ方向）に走査させることができるようになっている。
【００２７】
測光フィルタユニット７は、ダイクロイックミラー８により反射された標本１５からの光のうち、蛍光以外の光（例えばレーザ光源１からのレーザ光）を遮断するようになっている。
レンズ６は、測光フィルタユニット７を通過してきた標本１５からの蛍光をピンホール５に集光するようになっている。
【００２８】
ピンホール５は、標本Ａにおけるレーザ光の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させるようになっている。すなわち、対物レンズ１４により集められた蛍光は、ピンホール５を通過することによりレーザ光の焦点位置（測定点）から光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。これにより、光軸方向に焦点位置と同一な面からの蛍光だけを光検出器２に入射させるようになっている。
【００２９】
光検出器２は、例えば光電子増倍管（Photomultiplier Tube）であり、検出した標本１５からの蛍光を光電変換して、得られた電気信号を制御装置３に出力するようになっている。
光検出器２は、検出器制御部２１により制御されるようになっている。具体的には、検出器制御部２１は、制御装置３からの指令に基づいて、光検出器２の検出感度と露光時間を調節するようになっている。なお、光検出器２の検出感度と露光時間は、両方を同時に調節することとしてもよく、いずれか一方のみを調節することとしてもよい。
【００３０】
制御装置３は、画像生成部３１と、メモリ３２と、画像合成部３３とを機能として備えている。
画像生成部３１は、光検出器２から出力された電気信号を取り込んで、標本１５の画像を生成するようになっている。具体的には、画像生成部３１は、光検出器２により検出された標本１５からの蛍光の強度と、走査光学ユニット９による標本１５における走査位置とを対応付けて、標本１５の蛍光画像を生成する。
【００３１】
メモリ３２には、標本１５の蛍光画像を取得するための各種の条件や、各種の処理を行うためのプログラム等が記録されている。
画像合成部３３は、画像生成部３１により生成された複数の画像を合成するようになっている。
【００３２】
また、制御装置３は、前述の各部を制御するようになっている。具体的には、制御装置３は、レーザ制御部１１を制御して、レーザ光源１から発するレーザ光の強度を高強度から低強度の順に調節させる。また、制御装置３は、上記のようにレーザ光の強度を調節させていく際に、画像生成部３１により蛍光強度の異なる複数の画像を生成させる。そして、制御装置３は、このように生成された蛍光強度の異なる複数の画像を画像合成部３３により合成させる。
【００３３】
上記の制御装置３による制御について、具体例を挙げて以下に説明する。
図２に示すように、制御装置３は、レーザ光源１から発するレーザ光が３０％、２５％、２０％、１５％、１０％の強度となるように、レーザ光の強度を高強度から低強度の順に調節させ、画像生成部３１により蛍光強度の異なる５枚の画像を生成させる。そして、制御装置３は、このように生成された蛍光強度の異なる５枚の画像を画像合成部３３により合成させる。
このようにすることで、広ダイナミックレンジの標本１５の画像（合成画像）を取得することができ、標本１５の高輝度領域と低輝度領域の両方を精度よく観察することができる。
【００３４】
上記構成を有する蛍光観察装置５１の作用について以下に説明する。
レーザ光源１を作動させると、レーザ光源１から射出されたレーザ光は、照射光学系４１に導光される。照射光学系４１に導光されたレーザ光は、ダイクロイックミラー８を透過して、走査光学ユニット９により標本１５上において２次元的に走査され、対物レンズ１４により標本１５上に照射される。
【００３５】
標本１５では、レーザ光の焦点位置において蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。標本１５において発生した蛍光は、対物レンズ１４により集められ、走査光学ユニット９を通過して、ダイクロイックミラー８により反射される。反射された標本１５からの蛍光は、測定フィルタユニット７およびレンズ６を透過し、ピンホール５を通過してきた蛍光だけが光検出器２により検出される。
【００３６】
光検出器２では標本１５からの蛍光が光電変換され、制御装置３に出力される。制御装置３では、光検出器２から出力された蛍光の強度情報と、走査光学ユニット９によるレーザ光の走査位置とから、標本１５の２次元的な蛍光画像が生成される。
【００３７】
上記のように生成される複数の標本１５の蛍光画像が、画像合成部３３により合成され、その合成画像が画像表示部４に表示される。
上記の画像合成時における詳細な処理について、図３に示すフローチャートに従って以下に説明する。
【００３８】
まず、画像の明るさが上限値と下限値との略中央付近になるように、基準とするリファレンス画像を撮像する（ステップＳ１）。なお、リファレンス画像は、画像内において観察対象（細胞）を認識できればよい。したがって、リファレンス画像を取得する際には、蛍光の褪色を抑えるために極力低い強度のレーザ光を照射して撮像することが好ましい。
【００３９】
次に、上記のリファレンス画像の撮像条件（例えば、レーザ光の強度、露光時間、光検出器の感度）を最適条件として記憶する（ステップＳ２）。
次に、レーザ光の変化量、すなわち、レーザ光の強度を低下させていく際の調節範囲を指定する（ステップＳ３）。この際に指定する変化量として、例えば、具体的に調節範囲の上限値と下限値とを指定してもよく、リファレンス画像を取得した際のレーザ光の強度に対する比率として指定してもよい。
【００４０】
次に、ユーザにより撮像開始ボタン（図示略）が押されると（ステップＳ４）、レーザ光の強度が指定した調節範囲における最大強度となるように、レーザ光源１を制御する（ステップＳ５）。
【００４１】
この撮像条件において撮像が行われ（ステップＳ６）、予め設定された規定回数、すなわち、合成する画像の枚数分撮像されたか否かが判断される（ステップＳ７）。
ステップＳ７において規定回数まで達してない場合には、レーザ光の変化量を規定回数で除算した数値、すなわち、レーザ光の強度を低下させていく際における１回の調節量の分だけ、レーザ光の強度を低下させ（ステップＳ８）、再度撮像を行う（ステップＳ６）。これにより、蛍光強度の異なる複数の画像が取得される。
【００４２】
そして、ステップＳ７において、規定回数の撮像が完了した場合には、ステップＳ６において撮像された蛍光強度の異なる複数（規定回数分）の画像が、画像合成部３３により合成される（ステップＳ９）。これにより、広ダイナミックレンジな標本１５の画像（合成画像）が取得される。
【００４３】
ここで、レーザ光の強度を高強度から低強度の順に調節させることの効果について、図４および図５を用いて以下に説明する。
図４は、本実施形態に係る画像取得方法、すなわち、レーザ光の強度を高強度から低強度の順に調節させて合成画像を生成する方法を示している。一方、図５は、比較例として示す従来の画像取得方法、すなわち、レーザ光の強度を低強度から高強度の順に調節させて合成画像を生成する方法を表わしている。また、図４および図５において、（ａ）は撮像初期の画像、（ｂ）は撮像後期の画像、（ｃ）は合成画像をそれぞれ表わしている。
【００４４】
本実施形態に係る画像取得方法によれば、撮像初期においてはレーザ光は高強度であるため、図４（ａ）に示すように、観察対象である細胞の低輝度領域Ｌまで鮮明に撮像することができる。ただし、細胞の高輝度領域Ｈについては明るさが飽和してしまっている。そして、撮像後期においてはレーザ光は低強度であるため、あるいは蛍光が褪色しているため、図４（ｂ）に示すように、細胞の低輝度領域Ｌについては撮像できないものの、細胞の高輝度領域Ｈについては鮮明に撮像することができる。
【００４５】
このように取得された、図４（ａ）に示す細胞の低輝度領域Ｌが鮮明に撮像された画像と、図４（ｂ）に示す細胞の高輝度領域Ｈが鮮明に撮像された画像とを合成することで、図４（ｃ）に示すように、細胞の低輝度領域から高輝度領域まで鮮明に撮像された広いダイナミックレンジの画像を取得することができる。
【００４６】
これに対して、従来の画像取得方法によれば、撮像初期においてはレーザ光は低強度であるため、図５（ａ）に示すように、観察対象である細胞の高輝度領域Ｈについては鮮明に撮像することができるものの、細胞の低輝度領域Ｌについては強度不十分のため鮮明な画像を得ることができない。そして、撮像後期においてレーザ光を高強度としても、細胞の低輝度領域については蛍光が褪色しているため、図５（ｂ）に示すように、細胞の低輝度領域については撮像できない。
【００４７】
このように取得された、図５（ａ）に示す画像と、図５（ｂ）に示す画像とを合成しても、図５（ｃ）に示すように、細胞の低輝度領域Ｌについては不鮮明な画像しか取得することができない。
上述のように、レーザ光の強度を調節する順序によって取得できる画像の画質が大きく異なり、本実施形態に係る画像取得方法によって初めて、蛍光観察装置において広いダイナミックレンジで鮮明な画像を取得することができる。
【００４８】
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置５１によれば、レーザ制御部１１によりレーザ光の強度が高強度から低強度の順に調節され、画像生成部３１により蛍光強度の異なる複数の画像が生成される。このように生成された蛍光強度の異なる複数の画像は、画像合成部３３により合成される。
【００４９】
このようにすることで、広いダイナミックレンジの標本１５の画像（合成画像）を取得することができ、標本１５の高輝度領域と低輝度領域の両方を精度よく観察することができる。また、レーザ光の強度を高強度から低強度の順に調節することで、蛍光が褪色してしまう前に標本１５の細部についての画像を取得することができ、この画像を合成に用いることで、標本１５の観察精度を向上することができる。
【００５０】
［第２の実施形態］
次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置について、主に図６から図８を参照して以下に説明する。以下、本実施形態に係る蛍光観察装置について、前述の実施形態に係る蛍光観察装置５１と共通する部分については同一の符号を付して説明を省略するとともに、前述の実施形態に係る蛍光観察装置５１と異なる部分について主に説明する。
【００５１】
本実施形態に係る蛍光観察装置は、前述の実施形態に係る蛍光観察装置５１と同様にレーザ光源１からのレーザ光の強度を高強度から低強度の順に調節することに加えて、光検出器２の検出感度を調節する。
具体的には、図６に示すようにレーザ光の強度を高強度から低強度の順に調節するに伴って、図７に示すように検出器制御部２１により光検出器２の検出感度を高感度から低感度の順に調節する。
【００５２】
本実施形態に係る蛍光観察装置の画像合成時における詳細な処理について、図８に示すフローチャートに従って以下に説明する。なお、図３に示すフローチャートと同様の処理については同一の符号を付して説明を簡略化する。
まず、画像の明るさが上限値と下限値との略中央付近になるように、基準とするリファレンス画像を撮像する（ステップＳ１）。
【００５３】
次に、上記のリファレンス画像の撮像条件（例えば、レーザ光の強度、露光時間、光検出器の感度）を最適条件として記憶する（ステップＳ２）。
次に、レーザ光の変化量、すなわち、レーザ光の強度を低下させていく際の調節範囲を指定する（ステップＳ３）。
次に、ゲインの変化量、すなわち、光検出器２の検出感度を低下させていく際の調節範囲を指定する（ステップＳ１１）。
【００５４】
次に、ユーザにより撮像開始ボタン（図示略）が押されると（ステップＳ４）、レーザ光の強度が指定した調節範囲における最大強度となるように、レーザ光源１を制御する（ステップＳ５）。
次に、光検出器２の検出感度が指定した調節範囲における最大感度となるように、光検出器２を制御する（ステップＳ１２）。
【００５５】
この撮像条件において撮像が行われ（ステップＳ６）、予め設定された規定回数、すなわち、合成する画像の枚数分撮像されたか否かが判断される（ステップＳ７）。
ステップＳ７において規定回数まで達してない場合には、レーザ光の変化量を規定回数で除算した数値、すなわち、レーザ光の強度を低下させていく際における１回の調節量の分だけ、レーザ光の強度を低下させる（ステップＳ８）。そして、ゲインの変化量を規定回数で除算した数値、すなわち、光検出器２の検出感度を低下させていく際における１回の調節量の分だけ、光検出器２の検出感度を低下させる（ステップＳ１３）。
そして、この撮像条件において再度撮像を行う（ステップＳ６）。これにより、蛍光強度の異なる複数の画像が取得される。
【００５６】
そして、ステップＳ７において、規定回数の撮像が完了した場合には、ステップＳ６において撮像された蛍光強度の異なる複数（規定回数分）の画像が、画像合成部３３により合成される（ステップＳ９）。これにより、広ダイナミックレンジな標本１５の画像（合成画像）が取得される。
【００５７】
本実施形態に係る蛍光観察装置によれば、光検出器２の検出感度を調節することによって、画像生成部３１により生成される画像の蛍光強度の範囲を広げることができる。このような広範囲な蛍光強度の画像を画像合成部３３により合成することで、標本１５の画像（合成画像）のダイナミックレンジをさらに広げることができる。
【００５８】
なお、本実施形態に係る蛍光観察装置において、光検出器２の検出感度を調節することとして説明したが、これに代えて、光検出器２の露光時間を同様に調節することとしてもよい。また、光検出器２の検出感度および露光時間を同時に調節することとしてもよい。このようにすることで、本実施形態に係る蛍光観察装置と同様に、画像生成部３１により生成される画像の蛍光強度の範囲を広げることができ、標本１５の画像（合成画像）のダイナミックレンジをさらに広げることができる。
【００５９】
［第３の実施形態］
次に、本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置について、主に図９を参照して以下に説明する。以下、本実施形態に係る蛍光観察装置について、前述の実施形態に係る蛍光観察装置と共通する部分については同一の符号を付して説明を省略するとともに、前述の実施形態に係る蛍光観察装置と異なる部分について主に説明する。
【００６０】
本実施形態に係る蛍光観察装置は、ＸＹＺステージ１６を３次元方向（ＸＹＺ方向）に移動させることで、標本１５の３次元画像を生成する。
以下、本実施形態に係る蛍光観察装置の画像合成時における詳細な処理について、図９に示すフローチャートに従って説明する。
【００６１】
まず、レーザ光源１のレーザ光の強度を強めに設定する（ステップＳ２１）。
次に、ＸＹＺステージ１６を移動させ（ステップＳ２２）、光検出器２により検出された標本１５からの蛍光強度とＸＹＺステージ１６の位置（対物レンズ１４の焦点位置）とを対応付けることで、標本１５の画像を取得する（ステップＳ２３）。
【００６２】
次に、ステップＳ２２において決定したＸＹＺステージ１６の位置における全平面の撮像が完了したか否かが判断される（ステップＳ２４）。ステップＳ２４において未完了の場合には、次の移動先（ＸＹ平面）が決定され（ステップＳ２５）、決定された位置にＸＹＺステージ１６を移動させ（ステップＳ２２）、標本１５の画像を取得する（ステップＳ２３）。
【００６３】
ステップＳ２４において全平面の撮像が完了した場合には、これら全平面について、予め設定された規定回数、すなわち、合成する画像の枚数分撮像されたか否かが判断される（ステップＳ２６）。ステップＳ２６において規定回数まで達してない場合には、レーザ光の強度を弱く調節して（ステップＳ２７）、ＸＹＺステージ１６の移動先がＸＹ平面の開始位置、すなわちステップＳ２２におけるＸＹＺステージ１６の初期位置に決定される（ステップＳ２８）。そして、決定された位置にＸＹＺステージ１６を移動させ（ステップＳ２２）、標本１５の画像を取得する（ステップＳ２３）。これにより、蛍光強度の異なる複数の画像が取得される。
【００６４】
上記のようにして、ステップＳ２６において規定回数の撮像が完了した場合には、ステップＳ２３において撮像された蛍光強度の異なる複数（規定回数分）の画像が、画像合成部３３により合成される（ステップＳ２９）。これにより、広ダイナミックレンジな標本１５の画像（合成画像）が取得される。
【００６５】
次に、Ｚ方向について全数の画像取得が完了したか否かが判断される（ステップＳ３０）。ステップＳ３０において、未完了の場合には、ＸＹＺステージ１６をＺ方向に移動させ、ＸＹＺステージ１６のＺ位置を次の平面（スライス）へ移動させて（ステップＳ３１）、ステップＳ２８に戻り、以降の処理をＺ方向について全数の画像取得を完了するまで繰り返す。
【００６６】
本実施形態に係る蛍光観察装置によれば、画像生成部３１により、ＸＹＺステージ１６の位置と光検出器２により検出された標本１５からの蛍光強度とを対応づけて、標本１５の画像を容易に生成することができる。この場合において、ＸＹＺステージ１６を対物レンズ１４の光軸に沿う方向（Ｚ方向）に移動させることで、標本１５の３次元画像を生成することができる。
【００６７】
［第４の実施形態］
次に、本発明の第４の実施形態に係る蛍光観察装置について、主に図１０から図１４を参照して以下に説明する。以下、本実施形態に係る蛍光観察装置について、前述の実施形態に係る蛍光観察装置と共通する部分については同一の符号を付して説明を省略するとともに、前述の実施形態に係る蛍光観察装置と異なる部分について主に説明する。
【００６８】
本実施形態に係る蛍光観察装置は、標本１５を互いに異なる複数の領域に分けるとともに、これら領域にレーザ光を順次照射して、これら領域の画像を生成する。そして、全ての領域についてレーザ光の照射を終了した時点で、レーザ光の強度を低強度に切り替えて、これら領域の画像を再び取得する。
【００６９】
具体的には、図１０（ａ）から図１０（ｃ）に示すように、標本１５を３×３の計９つの領域に分割する。
このように分割された領域に対して、まず、図１０（ａ）に示すように、高強度のレーザ光を照射して、これら領域の画像を取得する。そして、全ての領域についてレーザ光の照射を終了した時点で、図１０（ｂ）に示すように、レーザ光の強度を低強度に切り替えて、これら領域の画像を再び取得する。同様に、全ての領域についてレーザ光の照射を終了した時点で、図１０（ｃ）に示すように、レーザ光の強度を低強度に切り替えて、これら領域の画像を再び取得する。
【００７０】
この場合において、制御装置（判定部）３は、画像生成部３１により生成された各領域の画像が所定の輝度値の範囲内であることを判定する。そして、所定の輝度値の範囲外と判定された領域の画像については、レーザ制御部１１によりレーザ光の強度を調節して再撮影を行う。
【００７１】
具体的には、図１１に示すように、標本１５の合成画像において、明るさの飽和した領域Ａが発生した場合には、レーザ光の強度を低く調節して再撮影を行う。そして、図１２に示すように、再撮影により生成された領域Ｂの合成画像を、領域Ａの合成画像と置き換えて、標本１５全体の合成画像として生成する。
【００７２】
以下、本実施形態に係る蛍光観察装置の画像合成時における詳細な処理について、図１３および図１４に示すフローチャートに従って説明する。
まず、ＸＹＺステージ１６を移動させ（ステップＳ４１）、レーザ光源１のレーザ光の強度や光検出器２の露出時間および検出感度を強めに設定する（ステップＳ４２）。
【００７３】
このような撮影条件において、光検出器２により検出された標本１５からの蛍光強度とＸＹＺステージ１６の位置（対物レンズ１４の焦点位置）とを対応付けることで、標本１５の画像を取得する（ステップＳ４３）。この際、前述のように、標本１５を互いに異なる複数の領域に分けるとともに、これら領域にレーザ光を順次照射して、これら領域の画像を生成する。
【００７４】
次に、全ての領域について、予め設定された規定回数、すなわち、合成する画像の枚数分撮像されたか否かが判断される（ステップＳ４４）。
ステップＳ４４において規定回数まで達してない場合には、レーザ光源１のレーザ光の強度や光検出器２の露出時間および検出感度を弱く再設定して（ステップＳ４２）、再度標本１５の撮像を行う（ステップＳ４３）。これにより、蛍光強度の異なる複数の画像が取得される。
【００７５】
そして、ステップＳ４４において、規定回数の撮像が完了した場合には、ステップＳ４３において撮像された蛍光強度の異なる複数（規定回数分）の画像が、画像合成部３３により合成される（ステップＳ４５）。これにより、広ダイナミックレンジな標本１５の画像（合成画像）が取得される。
【００７６】
次に、上記のように生成された標本１５の合成画像を構成する全ての領域について、輝度値等が予め設定された条件内に入っているか否かが判断される（ステップＳ４６）。
ステップＳ４６において、輝度値等が予め設定された条件内に入っていない領域がある場合には、その領域のＸＹＺ方向の位置や輝度値等の情報を失敗画像リストに追加する（ステップＳ４７）。そして、次の移動先が決定され（ステップＳ４８）、決定された位置にＸＹＺステージ１６を移動させ（ステップＳ４１）、前述のように標本１５の合成画像を生成する（ステップＳ４２〜Ｓ４５）。
【００７７】
ステップＳ４６において、全ての領域について輝度値等が予め設定された条件内に入っている場合には、全ての位置での撮像が完了したか否かが判断される（ステップＳ４９）。全ての位置での撮像が未完了の場合には、次の移動先が決定され（ステップＳ４８）、決定された位置にＸＹＺステージ１６を移動させ（ステップＳ４１）、前述のように標本１５の合成画像を生成する（ステップＳ４２〜Ｓ４５）。
【００７８】
ステップＳ４９において、全ての位置での撮像が完了した場合には、前述の失敗画像リストが空か否かが判断される（ステップＳ５０）。
失敗画像リストが空ではない場合、すなわち失敗画像リストに登録された領域がある場合には、失敗画像リストの先頭データを参照し、その位置をＸＹＺステージ１６の移動先として決定する（ステップＳ５１）。
【００７９】
次に、失敗画像を撮像した時点から予め規定された時間（拡散時間）が経過したかが判断される（ステップＳ５２）。この拡散時間の間に、蛍光物質の拡散現象が生じることで、褪色した蛍光の強度が回復することが期待される。
次に、失敗画像リストに登録された輝度情報を参照し、レーザ光源１のレーザ光の強度が決定される（ステップＳ５３）。
【００８０】
このように決定された撮影条件において、ＸＹＺステージ１６を移動させ（ステップＳ５４）、レーザ光源１のレーザ光の強度や光検出器２の露出時間および検出感度を設定し（ステップＳ５５）、標本１５の画像を取得する（ステップＳ５６）。
そして、失敗画像リストの先頭データを削除して（ステップＳ５７）、ステップＳ５０に戻り、失敗画像リストが空になるまで前述のステップＳ５１〜Ｓ５７までの処理を繰り返す。
【００８１】
本実施形態に係る蛍光観察装置によれば、互いに異なる複数の領域に対して照射光学系４１によりレーザ光が順次照射され、これら全ての領域にレーザ光の照射を終了した時点で、レーザ制御部１１によりレーザ光の強度が低強度に切り替えられる。これにより、複数の領域のうち或る領域において、一度レーザ光が照射されてから、その強度が低強度に切り替えられて再び照射されるまでに、タイムラグが生じることとなる。このタイムラグの間に、前述の或る領域において、蛍光物質の拡散現象が生じるため、蛍光がより鮮明な画像を取得することができる。このような鮮明な画像から合成画像を生成することで、標本１５の観察精度を向上することができる。
【００８２】
また、制御装置３が、画像生成部３１により生成された各領域の画像が所定の輝度値の範囲内であることを判定することで、複数の領域のうち、所定の輝度値の範囲外と判定された領域の画像については、レーザ制御部１１によりレーザ光の強度が調節されて再度画像が取得される。これにより、標本１５の全ての領域について適切な輝度を有する画像を取得することができ、これら画像を合成することで、鮮明な標本１５の合成画像を得ることができ、標本１５の観察精度を向上することができる。
【００８３】
［第１の変形例］
なお、上記の各実施形態に係る蛍光観察装置の第１の変形例として、図１５に示す構成としてもよい。
本変形例に係る蛍光観察装置５２は、レーザ光源１（図１参照）に代えて、水銀ランプ１００および回転ＮＤフィルタ１０１を備えている。
【００８４】
回転ＮＤフィルタ１０１は、複数の減光フィルタ（図示略）と、該減光フィルタを回転させる回転機構（図示略）とを有しており、制御装置３により指定された減光フィルタを水銀ランプ１００の射出光軸上に配置するようになっている。これにより、回転ＮＤフィルタ１０１は、水銀ランプ１００からの光の強度を調節できるようになっている。
【００８５】
また、照射光学系４１において走査光学ユニット９（図１参照）を省略するとともに、検出光学系４２において、光検出器２（図１参照）に代えて、ＣＣＤ１０３を備えている。また、ミラー１２を水銀ランプ１００からの光を反射する一方、標本１５からの蛍光を透過するダイクロイックミラーとし、ミラー１２とＣＣＤ１０３との間にレンズ１０２を備えている。
【００８６】
上記構成を有する本変形例に係る蛍光観察装置５２によれば、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と同様に、蛍光の褪色による観察精度の低下を抑制しつつ、広ダイナミックレンジで標本１５を観察することができるという効果を奏する。
【００８７】
［第２の変形例］
また、上記の各実施形態に係る蛍光観察装置の第２の変形例として、図１６に示すように、レーザ光源１（図１参照）に代えて、ＬＥＤ１０５を備えることとしてもよい。その他の相違点（ミラー１２、ＣＣＤ１０３、レンズ１０２）については、前述の第１の変形例と同様である。
【００８８】
上記構成を有する本変形例に係る蛍光観察装置５３によれば、前述の第１の変形例に係る蛍光観察装置５２と同様に、蛍光の褪色による観察精度の低下を抑制しつつ、広ダイナミックレンジで標本１５を観察することができるという効果を奏する。
【００８９】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【００９０】
１  レーザ光源（励起光源）
２  光検出器
３  制御装置（制御部、判定部）
４  画像表示部
８  ダイクロイックミラー
９  走査光学ユニット（走査手段）
１１  レーザ制御部（調光手段）
１４  対物レンズ
１５  標本
１６  ＸＹＺステージ（ステージ）
２１  検出器制御部
３１  画像生成部
３２  メモリ
３３  画像合成部
４１  照射光学系
４２  検出光学系
５１，５２，５３  蛍光観察装置
【図１】
0005669561.tif 000002
【図２】
0005669561.tif 000003
【図３】
0005669561.tif 000004
【図４】
0005669561.tif 000005
【図５】
0005669561.tif 000006
【図６】
0005669561.tif 000007
【図７】
0005669561.tif 000008
【図８】
0005669561.tif 000009
【図９】
0005669561.tif 000010
【図１０】
0005669561.tif 000011
【図１１】
0005669561.tif 000012
【図１２】
0005669561.tif 000013
【図１３】
0005669561.tif 000014
【図１４】
0005669561.tif 000015
【図１５】
0005669561.tif 000016
【図１６】
0005669561.tif 000017