(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の反応マイクロチャネルを含むマイクロ流体チップにより複数の試料に対する複数の異なるアッセイを実施する方法であって、
Ａ．試料の連続フローを複数の反応チャネルの各々に供給することと、
Ｂ．ある量の試薬物質及び緩衝液物質を各チャネルの試料の連続フローに交互に導入し、各チャネルの全長に沿って、担体流体の塊と交互に逐次的に流れる検査溶液の塊を含む連続フローを形成することであって、検査溶液が、試料及び試薬物質の混合物を含み、担体流体が、試料及び緩衝液物質の混合物を含むことと、
Ｃ．各チャネル内の連続フロー中における検査溶液に対して増幅手順を実施することと、
Ｄ．各チャネル内の増幅された検査溶液に対して熱融解手順を実施することと、
Ｅ．熱融解手順中において検査溶液の各塊により発せられるシグナルを検出することと、
Ｆ．検出されたシグナルを解析して、検査溶液の塊中における対象ヌクレオチドの存在又は不在を確認することと、
Ｇ．解析するステップの結果を、１又は０と表すことによりデジタル・フォーマットに変換することであって、対象ヌクレオチドの存在を示す結果を１と表し、対象ヌクレオチドの不在を示す結果を０と表すか、又は、この逆とすることと
を含む方法。
【請求項２】
Ｈ．同じアッセイ特異的な試薬溶液により、ステップＢ〜Ｇを少なくとも１回反復して、対象のＤＮＡ配列変化の存在又は不在の判定に対する信頼性を向上させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｉ．診断又は予測に関わる、異なるＤＮＡ配列変化を同定するように適合させた、異なるアッセイ特異的な試薬溶液により、ステップＢ〜Ｈを少なくとも１回反復することと、
Ｊ．ステップＢ〜Ｉの結果に対して統計学的解析を実施して、解析の結果、及び、解析の結果に対する信頼水準を導出し、診断又は予測を助けることと
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
熱融解手順のステップに関するデータを収集することが、熱融解手順を実施する間に検査混合物から蛍光プロファイル・データを収集することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップＤが、検査溶液の塊の温度を上昇させることを含み、ステップＥが、シグナル強度対温度の相関を生成することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップＦが、相関を予め決定された予想相関と比較することと、相関の予想相関からの偏差から結果を評価することとを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
蛍光プロファイルが、検査溶液の塊により発せられる蛍光を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
シグナル強度対温度の相関を生成することが、検査溶液各塊について蛍光対温度曲線をプロットすることを含み、比較するステップが、各蛍光対温度曲線の形状を、蛍光対温度
曲線の予想形状と比較することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
シグナル強度対温度の相関を生成することが、検査溶液の各塊について蛍光対温度曲線をプロットすることを含み、比較するステップが、予め決定したレベルに蛍光が低下する温度を、予め決定したレベルに蛍光が低下する予想温度と比較することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
マイクロ流体チップが、
各反応チャネルの対向する端部における試料ウェル及び廃物ウェルと、
シッパーと、
シッパーより発し、シッパーを前記複数の各反応チャネルに接続し、シッパーにより吸引された物質を各反応チャネルに分配するよう構成されたチャネル・ネットワークと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
信頼水準が、実施される異なるアッセイ数の関数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
信頼水準が、各アッセイが反復される回数の関数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ配列変化の存在又は不在を確認することが、一塩基多型の存在又は不在を確認することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
検出するステップが、シグナル強度対温度の相関を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
検出するステップが、生成された相関を予め決定された予想相関と比較することと、生成された相関の予想相関からの偏差から結果を評価することとをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検出されたシグナルが、検査溶液の塊により発せられた蛍光である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シグナル強度対温度の相関を生成することが、検査溶液の各塊について蛍光対温度曲線をプロットすることを含み、比較するステップが、各蛍光対温度曲線の形状を、蛍光対温度曲線の予想形状と比較することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
シグナル強度対温度の相関を生成することが、検査溶液の各塊について蛍光対温度曲線をプロットすることを含み、比較するステップが、予め決定したレベルに蛍光が低下する温度を、予め決定したレベルに蛍光が低下する予想温度と比較することを含む、請求項１
６に記載の方法。
【請求項１９】
対象のヌクレオチドが一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
反応物質及び緩衝液物質が、シッパーを介して各チャネルに導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
複数のアッセイを実施するシステムであって、
複数の反応マイクロチャネルと、
各反応マイクロチャネルの対向する端部における試料ウェル及び廃物ウェルと、
シッパーと、
シッパーより発し、シッパーを前記複数の各反応マイクロチャネルに接続し、シッパーにより吸引された物質を各反応チャネルに分配するよう構成されたチャネル・ネットワークと
を含むマイクロ流体チップと、
マイクロ流体チップと一体をなすか又はこれと近接し、各マイクロチャネルの所定の区間に沿って内容物を熱循環させ、内容物の熱融解を実施するよう構成された温度制御システムと、
マイクロ流体チップと一体をなすか又はこれと近接し、各チャネルを照らし、各マイクロチャネルに沿う複数の地点で、各マイクロチャネルの内容物により発せられる蛍光シグナルを検出するように構成された光学画像システムと、
システムに、
各反応マイクロチャネル内で試料物質の連続フローを発生させ、
ある量の試薬物質及び緩衝液物質を、シッパーを介して各マイクロチャネルに交互に導入させ、各マイクロチャネルの全長に沿って、担体流体と交互に逐次的に流れる検査溶液の塊を含む連続フローを形成させ、ただし、検査溶液は、試料及び試薬物質の混合物を含み、担体流体は、試料及び緩衝液物質の混合物を含む、
温度制御システムにより各反応チャネルの内容物を熱循環させて、各マイクロチャネル内の連続フロー中における検査溶液に対する増幅手順を実施させ、
温度制御システムにより検査溶液に対する熱融解を実施させ、
熱融解手順の実施後に、検査溶液の各塊により発せられたシグナルを、光学画像システムにより検出させ、
検出されたシグナルを解析させて、検査溶液の塊内における対象ヌクレオチドの存在又は不在を確認させ、
解析するステップの結果を、１又は０と表すことによりデジタル・フォーマットに変換させる、ただし、対象ヌクレオチドの存在を示す結果を１と表し、対象ヌクレオチドの不在を示す結果を０と表すか、又は、この逆とするようにプログラムされた制御装置と
を含むシステム。
【請求項２２】
制御装置が、温度制御システムが、検査溶液の塊の温度を上昇させるように構成された、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
制御装置が、相関を予め決定された予想相関と比較し、シグナル強度対温度の相関の予想相関からの偏差から結果を評価するようプログラムされた、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
多数の反応マイクロチャネルを含むマイクロ流体チップにより複数の試料に対する複数の異なるアッセイを実施する方法であって、
Ａ．試料を各反応チャネルに通じて供給し、試料の塊をそれぞれの反応チャネルにロードすること、ただし試料は担体流体によって多数の試料の塊に分離され、各チャネルは異なる試料と通じている、
Ｂ．アッセイ特異的な試薬を各試料の塊に導入し、各試料の塊は異なるアッセイ特異的
に試薬を受け取ることと、
Ｃ．各試料の塊の検査溶液に対して増幅手順を実施することと、
Ｄ．各チャネル内の増幅された検査溶液に対して熱融解手順を実施することと、
Ｅ．熱融解手順中において検査溶液の各塊により発せられるシグナルを検出することと、
Ｆ．検出されたシグナルを解析して、検査溶液の塊中における対象ヌクレオチドの存在又は不在を確認すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２００６年１１月２９日に出願された特許仮出願第６０／８６７，４５９号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、連続フロー・マルチプレックス・アッセイを用いる過程、及び、より具体的には、結果がデジタル・フォーマットに変換される連続フロー・マルチプレックス・アッセイを用いる過程に関する。多数の患者試料の各々に対して多角的アッセイを行うことができ、これにより、高レベルの多重化及び柔軟性が可能となる。
【背景技術】
【０００３】
現在のところ、マルチプレックス・ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）アッセイは、各反応が個別の試験管、毛細管、又はマルチウェルプレートのウェル内で完了する静態的フォーマットで実施されている。全ての場合において、実施しうるＰＣＲ反応の数は、固定フォーマット内の地点数により限定される。もっとも一般的には、例えば、一例の患者ＤＮＡ試料を最大９６の異なるＰＣＲアッセイにより調べることを可能とする、９６ウェル・フォーマットが用いられる。このフォーマットでは、調べる患者ＤＮＡ試料数を増加させうるが、代償として、実施しうる異なるＰＣＲアッセイ数が減少する。例えば、９６ウェル・フォーマットでは、２４例の異なる患者ＤＮＡ試料を調べうるが、４つのＰＣＲアッセイのみによる。より近年では、実施しうる患者−アッセイの組合せ数を増加させる３８４ウェルプレート・フォーマットが導入されているが、このフォーマットでも、１００の異なるＰＣＲアッセイが必要である場合は、３例を超える患者ＤＮＡ試料には対応していない。
【０００４】
数千の遺伝子座の精査を可能とするＤＮＡマイクロアレイは、プレートベースのアッセイの限界に対する代替法であるが、出力データの信頼性に対する制約、高額な費用、及び、こうしたアッセイに必要とされる膨大な時間のほか、マイクロアレイが、末端使用者がアッセイを必要に応じて変化させることを許容しない固定フォーマットであるという事実が重大な欠点である。
【０００５】
多くの新規の診断的ＰＣＲアッセイは、患者の疾患状態を診断し、疾患を発症する危険性を診断し、又は、各種の治療剤に対する患者の応答を予測する、一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することを目的とする。多くの場合、正確な診断又は治療反応の正確な予測には、多角的なＳＮＰ判定が必要である。ヒトゲノム中の全てのＳＮＰをマップする努力がなされるようになって、特定の疾患状態又は治療結果と関連するＳＮＰ数が増加しつつある。数十のアッセイを一度に実施するマルチプレックス解析は、現在のところ、多くの診断的応用及び治療予測への応用に必要とされている。新規の標的に必要に応じて対応する、高度の多重化及び柔軟性を有するフォーマットを可能とするＰＣＲアッセイ・フォーマットに対する必要は現在のところ満たされていない。
【０００６】
ＰＣＲ法に基づくアッセイにおいてＳＮＰを識別するのに、現在のところ当技術分野では、熱融解解析が用いられている。Ｗｉｔｔｗｅｒは、蛍光分子を用いて、核酸の熱融解プロファイルを決定し、熱融解プロファイルに基づいてＳＮＰを識別する方法及び機器を開示している（米国特許第６，１７４，６７０号、同第６，１４０，０５４号、同第６，４７２，１５６号、同第６，７５３，１４１号、同第６，５６９，６２７号、並びに米国特許出願公開第２００３−０２２４４３４Ａ１号及び同第２００５−０２３３３３５Ａ１号を参照されたい）。しかし、これらの方法及び機器は、上述と同じ限界を克服していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許仮出願第６０／８６７，４５９号
【特許文献２】米国特許第６，１７４，６７０号
【特許文献３】米国特許第６，１４０，０５４号
【特許文献４】米国特許第６，４７２，１５６号
【特許文献５】米国特許第６，７５３，１４１号
【特許文献６】米国特許第６，５６９，６２７号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３−０２２４４３４Ａ１号
【特許文献８】米国特許出願公開第２００５−０２３３３３５Ａ１号
【特許文献９】米国特許出願第１１／８５０，２２９号、「Ｃｈｉｐ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏ−Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ａｓｓａｙｓ」
【特許文献１０】米国特許出願第１１／６０６，００６号、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Weiss、「Introductory Statistics」、第7版、マサチューセッツ州、リーディング、Addison−Wesley社、2004年
【非特許文献２】Weiss、「Elementary Statistics」、第5版、マサチューセッツ州、リーディング、Addison−Wesley社、2001年
【非特許文献３】Berinstein、「Finding Statistics Online: How to Locate the Elusive Numbers You Need」、ニュージャージー州、メッドフォード、Information Today社、1998年
【非特許文献４】Everitt、「The Cambridge Dictionary of Statistics」、ニューヨーク、Cambridge University Press社、1998年
【非特許文献５】Kotz、「Encyclopedia of Statistical Sciences」、第1〜9巻及び補遺、ニューヨーク、Wiley社、1988年
【非特許文献６】Dillon及びGoldstein、「Multivariate Analysis: Methods and Applications」、ニューヨーク、Wiley社、1984年
【非特許文献７】Tabachnick及びFidell、「Using Multivariate Statistics」、ニューヨーク、Harper Collins College Publishers社、1996年
【非特許文献８】Boxら、「Statistics for Experimenters」、ニューヨーク、Wiley社、1978年
【非特許文献９】Cornell、「Experiments with Mixtures」、ニューヨーク、Wiley社、1990年
【非特許文献１０】John、「Statistical Design and Analysis of Experiments」」、フィラデルフィア、SIAM社、1998年
【非特許文献１１】Gibas及びJambeck、「Bioinformatics Computer Skills」、カリフォルニア州、セバストポール、O'Reilly社、2001年
【非特許文献１２】Pevzner、「Computational Molecular Biology and Algorithmic Approach」、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、The MIT Press社、2000年
【非特許文献１３】Durbinら、「Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids」、英国、ケンブリッジ、Cambridge University Press社、1998年
【非特許文献１４】Rashidi及びBuehler、「Bioinformatic Basics: Applications in Biological Science and Medicine」、フロリダ州、ボカ・ラトン、CRC Press LLC社、2000年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書に記載の本発明は、熱融解解析を連続フローＰＣＲマイクロ流体チップにおけるＳＮＰ検出に用いることを可能とし、マルチプレックス検査からのデジタル出力を生成する。
【００１０】
連続フロー・フォーマットは、熱融解アッセイを伴うマルチプレックスＰＣＲ法の個々のＰＣＲ反応及び熱融解が、マルチプレックス・アッセイにおける他のＰＣＲ反応及び熱融解の影響なしに、個々別々にモニターされることを可能とする。連続フロー・フォーマットは、複雑な薬理遺伝学的アッセイに必要な、９６ウェル・フォーマット及び３８４ウェル・フォーマットにおける多重化よりも高度の多重化を可能とする。連続フロー・フォーマットは、静態的フォーマット、固定フォーマットよりも柔軟である。さらに、使用者は、用いるアッセイ数及びそれらが実施される順序を定めることができる。デジタル出力（例えば、肯定的結果を「１」と称し、否定的結果を「０」と称するか、又は、この逆とする）は、結果の解釈を簡素化し、データのデジタル媒体への容易な転送を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の態様は、多数の反応チャネルを含むマイクロ流体チップにより、多数の試料に対する多角的なアッセイを実施する方法において具体化される。該方法は、試料の連続フローを複数の各反応チャネル内に供給するステップと、ある量の試薬物質及び緩衝液物質を各チャネルに交互に導入し、各チャネルの全長に沿って、担体流体と交互に逐次的に流れる、検査溶液の塊を含む連続フローを形成するステップとを含む。検査溶液は、試料及び試薬物質の混合物を含み、担体流体は、試料及び緩衝液物質の混合物を含む。各チャネル内の連続フローに対して増幅手順が実施され、次いで、増幅手順の実施後に、検査物質の各塊により発せられるシグナルが検出される。検出されたシグナルを解析して、試料物質の塊中における対象ヌクレオチドの存在又は不在を確認する。解析するステップの結果は、結果を１又は０と表すことによりデジタル・フォーマットに変換されるが、ここで、対象ヌクレオチドの存在を示す結果を１と表し、対象ヌクレオチドの不在を示す結果を０と表すか、又は、この逆とする。
【００１２】
上述の過程を実施するシステムに具体化される本発明の態様は、複数の反応チャネルを含むマイクロ流体チップと、各反応チャネルの対向する端部における試料ウェル及び廃物ウェルと、シッパーと、シッパーから発し、シッパーを前記複数の各反応チャネルに接続し、シッパーにより吸引された物質を各反応チャネルに分配するように構成されたチャネル・ネットワークとを含む。システムは、検査溶液中においてリアルタイムＰＣＲ法を実施する各チャネルの所定の区間に沿って検査溶液を熱循環させるよう構成された温度制御システムと、マイクロ流体チップと一体をなすか又はこれと近接し、各チャネルを照らし、各チャネルに沿う複数の地点で蛍光シグナルを検出するように構成された光学画像システムとをさらに含む。システムは、システムにデジタル式のマルチプレックスＰＣＲアッセイを実施させるようプログラムされた制御装置をさらに含む。
【００１３】
作業法並びに構造要素及び機能要素の機能及び相互関係を含む、本発明の他の態様は、その全てが本開示の一部をなし、同じ参照番号が各図中の対応する部分を指し示す付属の図面を参照しながら、以下の説明及び付属の特許請求の範囲を検討する際に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】それにより本発明が実装されうるリアルタイムＰＣＲアーキテクチャーのブロック・ダイアグラムである。
【図２】（Ａ）はそれにより本発明が実装されうるマイクロ流体チップの側面図であり、、（Ｂ）は（Ａ）のマイクロ流体チップの上面図であり、（Ｃ）は（Ｂ）のマイクロ流体チップのマイクロ流体チャネルの拡大図である。
【図３】多角的アッセイの曲線を示し、ヘテロ接合型及び野生型の曲線を示す、蛍光対温度プロットである。
【図４】３０例の患者ＤＮＡ試料及び２例の対照に対して実施された、８つのマルチプレックス・アッセイ（各々２回ずつ実施）のアッセイ結果の配列を示す表である。
【図５】連続的なデジタル式マルチプレックス・アッセイを用いて診断又は予測を行う本発明の態様を実施する過程を示すフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
別段に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施において用いることができるが、本明細書では、好ましい材料及び方法が説明される。
【００１６】
図１は、それにより本発明が実装されうるリアルタイムＰＣＲアーキテクチャーのブロック・ダイアグラムを示す。システムは、多数の検査溶液、例えば、検査試料を含有する容器でありうる、検査溶液容器１０１を含む。システムは、担体流体容器１０２をさらに含む。検査流体容器及び／又は担体流体容器は、その開示が参照により本明細書に組み込まれ、本発明の譲受人に譲渡された、米国特許出願第１１／８５０，２２９号に記載のカートリッジなど、マイクロ流体機器に連結されるカートリッジ内のチャンバーを含みうる。検査溶液は、必要な全てのリアルタイムＰＣＲ試薬を含む点を除き、担体流体と実質的に同一でありうる。リアルタイムＰＣＲ試薬混合物は、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ酵素、塩、緩衝液、表面保護剤などを含みうる。加えて、リアルタイムＰＣＲ試薬混合物は、非特異的蛍光ＤＮＡ検出分子、配列特異的蛍光ＤＮＡプローブ、又はマーカーを含みうる。担体流体は、非混合性流体（油、フッ素化液、又は他の非水溶性若しくは疎水性溶媒など）でありうる。担体流体の目的は、１つの検査塊から別の検査塊への材料の移動を阻止することである。担体流体の別の目的は、チャネル内の流体フローを追跡するのに用いうる塊間の識別可能な移行を提供することである。担体流体は、マーカーを含みうる。
【００１７】
検査溶液及び担体流体は、例えば、スイッチ１０４を介して、マイクロチャネル１０３内に導入される。マイクロチャネルの大きさは、検査溶液中に元から存在する単一のＤＮＡ分子の増幅及び検出を可能とする程度に小さい。本発明において、マイクロチャネル１０３は、マイクロ流体機器（図２に示されるなどの）の一部である複数のマイクロチャネルの１つである。スイッチ１０４は、担体流体及び検査溶液が、マイクロチャネル１０３内に逐次的に交互に導入されるよう、主制御及び処理コンピュータ１０５の制御下にある。マイクロチャネル１０３内に導入される検査溶液及び担体流体の容量は、マイクロチャネル１０３を介する移動中におけるそれらの間の混合が最小であるように選択される。
【００１８】
或いは、試料物質は、マイクロチャネル１０３中の連続的な流れとして提供され、アッセイ特異的な試薬及び緩衝液物質が、以下により詳細に記載されるように、シッパーを介して、試料物質の連続的な流れの中に交互に導入されてもよい。
【００１９】
こうして、多数の一連の反応（又は逐次的な反応）が、各々が担体流体によって分離されマイクロチャネル１０３を介する異なる検査溶液の連続的な移動の結果として、同じマイクロチャネル１０３内で実施される。本発明における通り、マイクロチャネル１０３がマイクロ流体機器内の複数のマイクロチャネルの１つである場合、多数の反応はまた、マイクロ流体機器のマイクロチャネル内で並行して実施することもできる。マイクロチャネル１０３を介する担体流体及び検査溶液の流速は、ポンプ機構１０６により制御される。ポンプ機構１０６は、マイクロチャネル１０３内における検査溶液及び担体流体の流速を調節するために、主制御及び処理コンピュータ１０５の制御下にある。流速は、検査溶液がマイクロチャネル１０３を通過するのに応じて、所望の数のＰＣＲサイクルが実施されるように調節される。
【００２０】
ポンプ機構１０６は、マイクロチャネル１０３の上流側若しくは注入口における陽圧、又は、マイクロチャネル１０３の下流側若しくは排出口における陰圧により、検査溶液及び担体流体の流速を調節しうる。一実施形態において、圧力差は約１ｐｓｉであるが、他の圧力差も用いてよい。マイクロチャネル１０３の全長は、検査溶液がマイクロチャネル１０３の反応域を移動するのに応じて、例えば、１０〜５０サイクル又はその間の任意のサイクル数のＰＣＲなど、所望の数のＰＣＲサイクルの完了に適する。マイクロチャネル１０３の反応域とは、ＰＣＲサイクルを実施するために温度を循環させるマイクロチャネルの領域である。通例、標準の増幅反応には、２５〜３０、２５〜３５、２５〜４０、３０〜３５、３０〜４０、又は３５〜４０のＰＣＲサイクルが実施される。所望の数のＰＣＲサイクルを達成するマイクロチャネル１０３の全長はまた、マイクロチャネル１０３を逐次的に交互に移動する検査溶液及び担体流体の容量にも依存する。例えば、反応域が４０ｍｍである場合、検査溶液の最小容量は、マイクロチャネル１０３の反応域中の１ｍｍを占め、検査溶液の最大容量は、マイクロチャネル１０３の反応域中の２０ｍｍを占める。こうして、この非限定的な例では、検査溶液がマイクロチャネル１０３の反応域を移動するのに応じて、最小で１試料及び最大で２０試料を増幅しうるであろう。当然ながら、マイクロチャネル長及び試料容量は、任意の数の試料を増幅するように選択することができる。
【００２１】
システム内に温度制御システム１０７を組み入れて、温度を制御及び循環させ、検査溶液がマイクロチャネル１０３を移動するのに応じて、ＰＣＲサイクルに適する温度を生成する。ＰＣＲサイクルに適する温度は当業者によく知られており、約８５℃〜約１００℃の範囲にある第１の温度、約２０℃〜約７０℃の範囲にある第２の温度、約５５℃〜約８０℃の範囲にある第３の温度を含みうる。温度制御システム１０７は、マイクロ流体機器のマイクロチャネル１０３又は複数のマイクロチャネルと一体であるか又はこれに近接する。温度制御システム１０７は、加熱装置１０８、冷却装置１０９、温度センサー１１０、及び温度制御装置１１１を含む。温度制御装置１１１は、温度センサー１１０から温度情報を収集し、温度情報に基づいて制御シグナルを生成する。制御シグナルは、加熱装置１０８又は冷却装置１０９に送られ、所望のＰＣＲサイクルに応じてマイクロチャネル１０３内の温度を循環させる。温度制御装置１１１は、検査溶液がマイクロチャネル１０３を移動するのに応じて、所望の数のＰＣＲサイクルが実施されるように温度を循環させるよう、主制御及び処理コンピュータ１０５の制御下にある。異なる検査溶液中の異なるＰＣＲ反応は、マイクロチャネル１０３内の連続フローにより、マイクロチャネル１０３内において連続的に次々と継起する。
【００２２】
マイクロチャネル１０３の加熱及び冷却は、適切な温度の空気をふきかけることにより達成することができる。或いは、加熱及び冷却は、循環水若しくは流体浴又は当業者によく知られるペルチエ効果エレメントにより達成することができる。電流が横断する異なる金属の接点は、小表面の冷却又は加熱を可能とする。ペルチエ・エレメント上の温度プローブは、電界強度に比例する電力の調節を可能とし、これにより、温度の調節を可能とする。金属ブロックを熱移送エレメントとして用いることができ、これは、金属ブロックと接触する熱電式冷却装置を含む。この金属ブロックは、例えば、アルミニウムなどの適切な熱移送特性を有する任意の金属（又は合金）から作製することができる。金属ブロックからの光の後方散乱を低減するため、黒色に塗装するか又は陽極酸化処理することが好ましい。ＰＣＲサイクル温度は、この熱移送ユニットに適する時間間隔で平衡化させることができる。例えば、ＰＣＲサイクル温度は、約１〜２秒以内又はさらに速く平衡化させることができる。
【００２３】
温度制御システム１０７は、マイクロチャネル１０３の所定の全区間、すなわち、ＰＣＲサイクルが実施されるマイクロチャネル１０３の区間内における温度を循環させる。マイクロチャネル１０３のこの所定の区間はまた、反応域としても知られる。こうして、恒温域を用いて熱循環を提供する。適切にプログラムされたコンピュータが、熱移送エレメントの温度循環を制御する。さらに、その温度が経時的なＰＣＲプロファイルに従うよう、チャネルの全長（反応域）に加熱及び冷却を施す。検査塊は、塊が反応ゾーンの上流端から下流端へと流れる時間中に、必要とされる数のＰＣＲサイクルが達成されるよう、ある流速（速度）でこの反応域全体にポンプ注入される。
【００２４】
或いは、温度制御システム１０７は、マイクロチャネル１０３に沿って空間的な温度域を適用し、ポリメラーゼ連鎖反応を達成する。一態様では、マイクロ流体機器のマイクロチャネル１０３又は複数のマイクロチャネルの部分に沿って、熱移送エレメントを用いて温度を循環させる。別の態様では、熱移送エレメントが、マイクロチャネル１０３の部分において、温度を循環させる。適切にプログラムされたコンピュータが、熱移送エレメントの温度循環を制御する。この実施形態では、ＰＣＲ温度プロファイルに従うよう、チャネルの部分に加熱及び冷却を施す。検査塊は、これが反応ゾーンの上流端から下流端へと流れる時間中に、必要とされる数のＰＣＲサイクルが達成されるよう、ある流速（速度）でこの反応域全体にポンプ注入される。
【００２５】
光学画像システム１１２は、ＳＮＰ又は他の対象核酸（すなわち、増幅産物）の存在―及びおそらくはその量―を示す発光（例えば、蛍光又は化学発光）を検出し、マイクロチャネル１０３中の検査溶液の流速をモニターする。一実施形態において、光学画像システム１１２は、１つ又は複数の励起源１１３、１つ又は複数の光学素子／フィルター１１４、及び、１つ又は複数の検出器１１５を含むことが好ましい蛍光画像システムである。励起源１１３は、所望の波長で光を発生させ、リアルタイムＰＣＲ中における増幅産物を検出するのに用いる標識を励起させ、且つ／又は、マイクロチャネル１０３内における検査溶液の流速をモニターするのに存在しうるマーカーを検出する。光学素子／フィルター１１４は、光のビームを形成し、且つ／又は、励起源１１３からマイクロチャネル１０３上の適切な位置に光を導くのに用いる。光学素子／フィルター１１４はまた、光をろ過して、望ましくない波長の光を除外する、又は、後方散乱が検出器１１５に到達することを抑制するのにも用いる。リアルタイムＰＣＲで用いられる標識を励起する所望の波長は、用いられる的確な標識及び／又はマーカー、例えば、挿入染料、分子ビーコン、量子ドット、又はＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに依存し、その波長は当業者によく知られている。同様に、的確な標識及び／又はマーカーの発光波長も、当業者によく知られている。検出器１１５は、励起された標識及び／又はマーカーの発光波長を検出し、発せられた光の強度を測定する。光学画像システム１１２は、マイクロ流体機器中の多数のマイクロチャネル間を識別する能力を有する。
【００２６】
光学画像システム１１２は、光学／蛍光画像システム１１２を導いて、例えば、マイクロ流体機器のマイクロチャネル１０３又は複数のマイクロチャネル内の複数の地点において各ＰＣＲサイクル中に少なくとも１回など、所望の時間間隔で発せられた光の強度を測定させる、主制御及び処理コンピュータ１０５の制御下にある。検出器１１５は、発せられた光の強度のシグナル又は画像を発生させ、それを主制御及び処理コンピュータ１０５に送信し、増幅産物の解析及び検査溶液の流速のモニタリングを行う。検出器１１５は、多重ピクセル・アレイ検出器（ＣＣＤ検出器など）及び／又は離散型単一ピクセル検出器若しくは非画像式検出器を含みうる。検出器１１５は、マイクロ流体機器のマイクロチャネル１０３又は複数のマイクロチャネルと一体であるか又はこれに近接してよい。検出器１１５は、固定型であっても走査型であってもよい。検出器１１５は、特に、流体がマイクロチャネル１０３内を連続的に移動しつつあるので、有意味な結果を得、マイクロチャネル１０３内における流体フローをモニターするのに適切な解像度を有するべきである。
【００２７】
上述の通り、リアルタイムＰＣＲ混合物は、非特異的蛍光ＤＮＡ検出分子（挿入染料など）、配列特異的な蛍光ＤＮＡプローブ（分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、又は量子ドット・プローブ）、又はフロー・マーカー（量子ドットなど）を含むことができ、担体流体は、フロー・マーカーを含むことができる。一実施形態では、光学画像システム１１２を用いて、ＤＮＡ検出分子若しくはプローブからの蛍光強度（すなわち、蛍光シグナル強度）を検出し、且つ／又は、マーカーの蛍光を検出する。マーカーの蛍光を用いて、担体流体から検査溶液を区別することができ、また、これを用いて、検査溶液又は担体流体の流速を決定又はモニターすることができる。蛍光シグナル強度を用いて、増幅された産物を検出する、増幅された産物の量を決定する、検査溶液中に存在する元の分子数を決定するなど、リアルタイムＰＣＲの当業者に同様に知られることを行うことができる。蛍光シグナル強度はまた、検査溶液の流速を決定及びモニターするのにも用いることができる。
【００２８】
ＰＣＲの温度サイクル中における特定の時点及び／又は温度において、蛍光シグナル強度を測定することができる（例えば、蛍光シグナルの画像を収集する）。或いは、蛍光シグナル強度は、各ＰＣＲサイクル中に１回測定することができる。本発明の一態様により、発光は、ＰＣＲ手順に続く熱融解手順中に測定することができる。
【００２９】
画像を取り込む最適の時点は、用いられる化学反応に依存する。例えば、挿入染料を用いて増幅された産物を検出する場合、画像は、ＰＣＲサイクルの伸長段階の終わりに取り込むべきである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて増幅された産物を検出する場合、画像は、ＰＣＲサイクル中の任意の時点で収集しうる。主制御及び処理コンピュータ１０５をプログラムして、所望の時点及び温度において画像を収集することができる。光学画像システム１１２は、複数の地点における蛍光シグナル強度を測定するように構成することができる。蛍光シグナル強度が測定される複数の地点は、マイクロチャネルの異なる区間でありうる。蛍光シグナル強度が測定される複数の地点は、マイクロチャネルの所定の全区間（すなわち、反応域）でありうる。或いは、チャネルの全長に沿って、少なくとも１つの蛍光シグナル画像が作成される。さらなる実施形態において、画像の取り込みは、継起的な温度サイクル周期において繰り返し実施される。多重ピクセル・アレイ検出器（ＣＣＤ画像センサー又はＣＭＯＳ画像センサーなど）又は単一ピクセル検出器を用いて、画像を作成するか、又は、蛍光シグナル強度を測定しうる。ファイバー光学素子／レンズの組合せなど、大視野の画像作成光学素子、及び／又は、小視野の光学素子を用いて、蛍光発光を収集することができる。固定型機構若しくは走査型機構、又はその両方を用いて画像を取り込むことができる。蛍光シグナル強度に関するデータは、適切にプログラムされたコンピュータにより処理される。
【００３０】
検査溶液は、マイクロチャネル１０３を移動し、所望の回数のＰＣＲサイクルを完了した後、場合によって、ＰＣＲ後解析装置１１６に移送してよい。ＰＣＲ後解析装置１１６は、ＰＣＲ増幅産物に対して用いうる任意の分析法を含みうる。こうした技法は、配列決定、電気泳動、プロービング、融解曲線解析などを含むがこれに限定されない。
【００３１】
連続フローＰＣＲチップ機器の一例は、その開示が参照により組み込まれる、本発明の譲受人に譲渡された、米国特許出願第１１／８５０，２２９号、「Ｃｈｉｐ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏ−Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ａｓｓａｙｓ」に記載されている。前記１１／８５０，２２９号出願に記載のチップにおいて、ＤＮＡ試料は、チップの上部に取り付けられた試料保持チャンバーを有するカートリッジを介して、チップの上部に導入される。各カートリッジは、試料ウェルと通じ、各チャネルを単一の患者ＤＮＡ試料の連続的な流れとする。マイクロ流体チップの外側にある容器から試薬を吸引するシッパーを介して、試薬がこの流れの中に導入される。本発明の態様は、最大１００回ＰＣＲ反応を必要とする薬理遺伝学的アッセイなどのマルチプレックスＰＣＲアッセイを、各ＰＣＲ反応に対する個別のデジタル出力を伴う連続フロー・フォーマットで実施することを可能とする、第１１／８５０，２２９号出願に記載の構成など、マイクロ流体チップ構成に関する適用を含む。連続フローＰＣＲチップ機器の別の例は、その開示が参照によりその全体において組み込まれる、本発明の譲受人に譲渡された、米国特許出願第１１／６０６，００６号、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」に記載されている。
【００３２】
図２（Ａ）〜（Ｃ）は、一般に、図１に示され、上述され、本発明の態様を実装するように構成されるアーキテクチャーを有するシステム内で加工される、マルチチャネルマイクロ流体チップ１２０を示す。図２（Ａ）は、マイクロ流体チップ１２０の側面図を示し、図２（Ｂ）は、マイクロ流体チップ１２０の上面図を示す。図２（Ｃ）は、マイクロ流体チップ１２０の単一チャネル１０３を流れる連続フローによる多重アッセイを、拡大された形で示す。
【００３３】
図２（Ｂ）に示す通り、マイクロ流体チップ１２０は、各ウェル１２２から伸びるチャネル１０３内に患者試料物質が導入される患者試料ウェル１２２を含む。図２に示す例示的な実施形態では、患者試料用に３２のウェル１２２及び３２の関連するチャネル１０３が存在する。図２（Ｂ）に示される実施形態は非限定的な例であり、チップは、３２より多い又は３２より少ない試料ウェル及び関連するチャネルを有しうる。
【００３４】
図２（Ａ）に示す例示的な実施形態において、マイクロ流体チップ１２０はまた、各アッセイ用の試薬カクテル（溶液）（特定のＳＮＰに対して特異的なＰＣＲプライマー、二重鎖結合染料、任意選択のプローブ、緩衝液など）を吸い上げる単一のシッパー１２６も含む。
【００３５】
マイクロ流体チップ１２０はまた、アッセイが完了した後に物質が保管される廃物ウェル１２４も含む。或いは、物質は、アッセイが完了した後に廃物ウェル１２４から外部の廃物コンパートメント（図示しない）に導いてもよい。
【００３６】
図２（Ｃ）を参照すると、各チャネル１０３内のフローは、左から右であり、フローは廃物ウェル１２４で終わる。各患者ＤＮＡ試料は、３２のウェル１２２の１つにプレロードされ、試料物質の連続フローは、例えば、チャネル１０３の対向する端部に真空を適用することにより、ウェル１２２からチャネル１０３を介して吸引される。アッセイ特異的な試薬物質（すなわち、「試薬カクテル」）は、所望の試薬カクテルを保持する容器と緩衝液を保持する容器との間でシッパー１２６を動かすことにより、緩衝液吸引物と交互にシッパー１２６を介して吸引される。各試薬カクテル及び緩衝液吸引物は、チャネル・ネットワーク１２８内で複数回分配され、患者ＤＮＡを含有する各チャネル１０３内に同じ試薬カクテル及び緩衝液を分注する。こうして、各チャネルは、チャネル１０３に沿って特異的試薬のセット又は「液滴」若しくは「塊」１３２及び緩衝液１３０が間隔を置いて配置される患者ＤＮＡの連続的な流れを含有する。各試薬セット１３２が、異なるＰＣＲアッセイを実施し異なるＳＮＰを同定する、異なるアッセイ特異的試薬を含有してもよく、２つ以上の試薬セット１３２が、同じアッセイ特異的試薬を含有してもよい。
【００３７】
シッパーの別の選択肢として、加熱式（バブルジェット（登録商標）式）印字機構又は圧電式印字機構など他の手段により、試薬及び染料をチャネル内に導入することができる。
【００３８】
熱循環は、主制御及び処理コンピュータ１０５の制御下にある温度制御システム１０７によりチャネル１０３の全長に沿って実施され、流れがチャネル１０３に沿って移動するのに応じて、試薬セット１３２内でＰＣＲ反応が進行する。チャネル１０３の端部において、廃物ウェル１２４に入る前に、なお且つ移動する間、各試薬液滴１３２の温度を上昇させ、液滴１３２内でＤＮＡの熱融解を生じさせる一方、主制御及び処理コンピュータ１０５の制御下にある光学画像システム１１２を用いて、適切な蛍光プロファイルをモニターする。各液滴のデータ出力は、温度の関数としての蛍光プロファイルであり、これが、以下に述べる通りにデジタルシグナルに変換される。
【００３９】
ＰＣＲアッセイは、各チャネル１０３に沿って連続的に実施し、患者ＤＮＡ試料は、異なるチャネル１０３にわたって並行して調べる。
【００４０】
【表１】
0005743403.tif 000002
【００４１】
表１は、解析を要する異なる数の患者及びＳＮＰに基づき、状況を多重化させる異なる可能なアッセイを示す。各々が１０個ずつのＳＮＰの同定を要する１０例の患者試料に対しては、計１００回の検査（ＰＣＲアッセイ）を行わなければならず、２５個ずつのＳＮＰを要する１０例の患者試料に対しては、２５０回の検査を行わなければならないなどである。
【００４２】
図２（Ｂ）に示した例示的なチップ１２０は、表１に列挙した任意の検査条件に対応しうる。すなわち、チップ１２０は、最大３２例の異なる患者試料に対応することができ、チャネル１０３の全長に沿って連続的に配置される試薬セット１３２中で実施しうる検査数は、入手可能な試料物質の量のみによって制約され、１０〜１００以上の逐次的に配置された検査でありうる。
【００４３】
図３は、異なる８例の試料に対する単一の熱融解ＳＮＰアッセイ結果の例示的な蛍光対温度プロファイルを示す。実際の蛍光対温度プロファイルの予め決定された予想プロファイルとの比較により、結果が「野生型」（すなわち、正常）又はヘテロ接合型（すなわち、異常）のいずれであるかを示すことができる。蛍光対温度曲線には、比較に用いうる多数の特徴が存在する。例示的な例では、予め決定したレベルに蛍光が低下する温度が用いられる。例えば、例示的な実施形態では、蛍光が７０％に低下する温度を比較することができる。上の４つの曲線は、約８４．７℃で蛍光が７０％に低下し、正常であると予め決定された特性を示し、したがって、野生型を示し、下の４つの曲線は、約８３．６℃で蛍光が７０％に低下し、予め決定された正常以外の特性を示し、したがって、ヘテロ接合型を示す。傾き、曲線の形状又は滑らかさ、曲線下面積など、曲線の他の特徴を比較に用いることができる。次いで、例えば、ヘテロ接合遺伝子型を「１」と表し、野生型を「０」と表すことにより、ＳＮＰ検査の結果をデジタルシグナルに変換する。或いは、ヘテロ接合型を「０」と表し、野生型を「１」と表してもよい。
【００４４】
他の適用では、本発明の方法を用いて、ＳＮＰ以外の対象のＤＮＡ配列変化を検出することができる。ＤＮＡ配列変化の例は、挿入、欠失、点変異及び再配列を含むがこれらに限定されない。加えて、適切な融解曲線を選択すれば、ＤＮＡ配列変化の野生型とホモ接合型との間のほか、ＤＮＡ配列変化の野生型、ヘテロ接合型とＤＮＡ配列変化のホモ接合型との間でも識別が可能である。
【００４５】
図４は、３０例の患者ＤＮＡ試料及び２例の対照ＤＮＡ試料に対して実施された８つのＳＮＰマルチプレックス・アッセイ（Ａ〜Ｈ）からの例示的なデジタル出力を示す。８つのＰＣＲ反応及び熱融解の各々を２回ずつ実施する。各列は、３０例の患者試料及び２例の対照の各々に対して実施された単一のＳＮＰアッセイの結果を示し、各行は、単一の患者又は対照に対して各々２回ずつ実施された全てのＳＮＰアッセイ（Ａ〜Ｈ）の結果を示す。
【００４６】
特定の患者試料に対する任意の所与のＳＮＰアッセイの観察された結果に対する信頼性を上昇させるには、同じＳＮＰアッセイを２回以上実施することができ、アッセイの各追加の実施が、観察された結果に対する信頼性を上昇させる。多数のＳＮＰが特定の診断又は予測に関わりうる場合、診断又は治療反応予測に対する信頼性を上昇させるには、該患者試料に対して２つ以上の適切なＳＮＰ検査を実施することができる。しかし、全ＳＮＰより少ないＳＮＰにより診断又は予測の十分な信頼性が達成されうるならば、特定の診断又は予測に関わる、全ての可能なＳＮＰを解析する必要はない場合がある。
【００４７】
一実施形態において、本発明は、診断又は予測に対する信頼水準を導出する１つ又は複数の検査から得られるアッセイ結果の１つ又は複数の統計学的解析又は確率論的解析を実施する、統計学的又は確率論的システムのソフトウェアを場合によって含む。例えば、統計学的解析又は確率論的解析は、ポアソン解析、モンテ・カルロ解析、遺伝アルゴリズムの適用、ニューラル・ネットワーク・トレーニング、マルコフ・モデリング、隠れマルコフ・モデリング、多次元スケーリング、部分最小二乗（ＰＬＳ）解析、及び／又は主成分分析（ＰＣＡ）を含みうる。統計学的又は確率論的解析は、診断又は予測の信頼水準を定量的に決定することを場合によって含む。
【００４８】
データの生成及び解析方法のほか、他の重要な概念を理解するのに有用な一般的参考文献は、Weiss、「Introductory Statistics」、第7版、マサチューセッツ州、リーディング、Addison−Wesley社、2004年；Weiss、「Elementary Statistics」、第5版、マサチューセッツ州、リーディング、Addison−Wesley社、2001年；Berinstein、「Finding Statistics Online: How to Locate the Elusive Numbers You Need」、ニュージャージー州、メッドフォード、Information Today社、1998年；Everitt、「The Cambridge Dictionary of Statistics」、ニューヨーク、Cambridge University Press社、1998年；Kotz、「Encyclopedia of Statistical Sciences」、第1〜9巻及び補遺、ニューヨーク、Wiley社、1988年；Dillon及びGoldstein、「Multivariate Analysis: Methods and Applications」、ニューヨーク、Wiley社、1984年；Tabachnick及びFidell、「Using Multivariate Statistics」、ニューヨーク、Harper Collins College Publishers社、1996年；Boxら、「Statistics for Experimenters」、ニューヨーク、Wiley社、1978年；Cornell、「Experiments with Mixtures」、ニューヨーク、Wiley社、1990年；John、「Statistical Design and Analysis of Experiments」、フィラデルフィア、SIAM社、1998年；Gibas及びJambeck、「Bioinformatics Computer Skills」、カリフォルニア州、セバストポール、O'Reilly社、2001年；Pevzner、「Computational Molecular Biology and Algorithmic Approach」、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、The MIT Press社、2000年；Durbinら、「Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids」、英国、ケンブリッジ、Cambridge University Press社、1998年；並びにRashidi及びBuehler、「Bioinformatic Basics: Applications in Biological Science and Medicine」、フロリダ州、ボカ・ラトン、CRC Press LLC社、2000年を含む。これら参考文献の各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
上記で注意した統計学的関数もまた、システム・ソフトウェアに組み込む、例えば、主制御及び処理コンピュータ１０５又はＰＣＲ後解析装置１１６、コンピュータのメモリ、又はコンピュータで読み取り可能な媒体中に組み込むことができる。
【００５０】
例として、特定の疾患について、特定の遺伝的素因又は保因者状態（例えば、疾患又は疾患を発症する危険性）に対して診断を下すことに適切な１０個のＳＮＰが知られるとする。患者試料の診断は、患者試料上の１０個の適切なＳＮＰのうち５個を調べることにより開始することができる。各ＳＮＰ検査の結果は、１（ヘテロ接合型）又は０（野生型）である。各ＳＮＰ検査を多数回実施して、観察された結果である１又は０が正確である信頼水準を与えることができる。５回のＳＮＰ検査の結論において、５回全てにより、患者が疾患又は疾患を保有する危険性を保有する又は保有しないことが示される場合、該診断に対する妥当な水準の信頼性を得ることができ、さらなる検査は不要となりうる。他方、２回のＳＮＰ検査により、患者が疾患を保有する又は保有しないことが示され、３回の検査により反対の事柄が示される場合、最終的な診断に対する高水準の信頼性にはほとんど根拠がない場合があり、さらなるＳＮＰ検査（さらに５回までがなお実施可能である）が正当化される場合がある。
【００５１】
本発明では、各ＳＮＰ検査を実施するのに、ある量の適切なアッセイ特異的試薬がチャネル内に吸引されるマイクロ流体チャネルを介して、患者試料物質の連続フロー中において、多数の異なるＳＮＰ検査を実施することと、各ＳＮＰ検査を多数回実施することとが容易に促進される。診断又は予測に対する信頼水準を向上させるのに追加のＳＮＰ検査が望ましい場合（追加の異なるＳＮＰ検査が望ましかろうと、既に実施されたＳＮＰ検査を反復する必要があろうと）、これは、本発明によりリアルタイムで決定及び実行することができる。ＳＮＰ検査の結果は、単純且つデジタル式である、すなわち、１又は０であり、診断又は予測に関して検査結果の含意が知られる。こうして、多数の検査結果が観察された後、追加の検査が必要であると判定される場合、反復されるべき検査、又は追加の実施されるべき異なる検査に対応する追加のアッセイ特異的試薬を、マイクロ流体チャネルを介する患者試料の連続フロー中に導入することができる。
【００５２】
疾患、疾患を発症する危険性に関して診断を行う、又は、本発明の態様に従う治療剤による治療に関して予測を行う過程を示すフローチャートを、図５に示す。ステップ１４０では、試料物質―好ましくはゲノムＤＮＡ物質―が、反応チャネルに供給される。例えば、真空のチャネル１０３への適用時に試料物質がチャネル１０３内に流れ込むよう、マイクロ流体チップ１２０の試料ウェル１２２に試料物質を供給することができる。ステップ１４２では、例えば、上述の通り、シッパー１２６により試薬及び緩衝液流体を交互に吸引してチャネル１０３内に分配することにより、チャネル１０３内の試料物質にアッセイ特異的試薬を添加する。
【００５３】
ステップ１４４では、上述の通り、試薬セットがチャネル１０３を進むのに応じ、試薬／試料混合物、すなわち、試薬セット１３２に対してＰＣＲ手順が実施される。ステップ１４６では、試料がチャネル１０３を進むのに応じ、試料に対して熱融解手順が実施される。ステップ１５０では、試料物質に対する蛍光対温度プロファイルを得、ステップ１５２では、蛍光プロファイル・データを解析して、対象ＳＮＰの存在に関するデジタル式の結果（１又は０）を得る。検査結果が不明瞭な場合（ステップ１５４）、同じアッセイを１回又は複数回繰り返すことにより、より多くの検査結果を得るステップ（ステップ１５８）が、検査結果に対する信頼性を向上させうる。反復による検査データは、例えば、当業者に知られる任意の適切な統計学的解析法によりステップ１５６で統合され、不明瞭でない結果を達成する。
【００５４】
検査結果が不明瞭でない場合（ステップ１６０）、試料に対して追加の異なるアッセイを実施して（ステップ１６２）、診断又は予測に関わるより多くの「データ点」を得ることができる。異なる各アッセイを複数回実施して（ステップ１５４、１５６、１５８）、試料に対して実施された各アッセイに関する不明瞭でない結果を達成することができる。追加の検査データは、ステップ１６４において統合され、例えば、当業者に知られる任意の適切な統計学的解析法により解析され（ステップ１６６）、結果として得られる診断又は予測は、ステップ１６８において信頼水準と共に報告される（例えば、「検査は、９５％の信頼水準と共に、患者ジョーンズが疾患Ｘの保因者であることを示す」）。
【００５５】
図５の過程を実施するシステムは、自動化されコンピュータ制御されることが好ましく、システムにより生成されるデータは、各ＰＣＲ反応の結果を同定するビットの連続的な流れである。
【００５６】
本明細書に記載の特定の態様及び例示的実施形態は、蛍光を用いて熱融解過程をモニターすることを開示する。本発明は、これらの態様及び例示的な実施形態に限定されない。他の態様では、熱融解することを、ＵＶ吸光度又は非蛍光レポーター染料若しくは非蛍光レポーター分子の使用によるなど、二重鎖ＤＮＡの解離を検出する他の手段によりモニターすることができる。
【００５７】
本発明を記載する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示詞の使用は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を指すと解釈される。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別段の記載がない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「〜を含むがこれに限定されない」を意味する）として解釈される。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、該範囲内に収まる各個別の値を個別に指す簡便法として用いられることを意図するに過ぎず、各個別の値は、本明細書において個別に列挙されたと仮定して本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に提示される任意の例及び全ての例、又は、例示的な語（例えば、「〜など」）の使用は、本発明をより良好に説明することを意図するに過ぎず、別段の主張がなされない限り、本発明の範囲に対して制限を付与するものではない。本明細書中のいかなる語も、特許請求の範囲に記載されていない要素が、本発明の実施に必須であることを示すものとして解釈してはならない。
【００５８】
本発明の方法及び組成物は、本明細書においてそのごく一部が開示される各種の実施形態に組み込まれうることが理解されるであろう。これらの実施形態の変化は、前出の説明を読めば、当業者には明らかとなりうる。本発明者らは、当業者がこうした変化を適切なものとして用いることを期待し、本発明者らは、本発明が本明細書で具体的に説明された形とは別の形で実施されることを意図する。したがって、本発明は、本明細書に付属の特許請求の範囲に列挙された対象物の全ての改変及び同等物を、関係法により許容されるものとして組み入れる。さらに、上述のエレメントのその可能な全ての変化における任意の組合せは、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、本発明により包含される。
【図１】
0005743403.tif 000003
【図２】
0005743403.tif 000004
【図３】
0005743403.tif 000005
【図４】
0005743403.tif 000006
【図５】
0005743403.tif 000007