(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状葉緑体ゲノムを組み立てる方法であって、
全体で光合成の実施に必要とされる全ての葉緑体遺伝子を含む、複数のベクターを取得する工程；
ここで前記複数のベクター中の各ベクターが、前記複数のベクターの１つ又は２つの他のベクターと相同組換えを行うための相同な領域を共有し、
ここで前記複数のベクターの１つ以上のベクターが、１つの酵母ＤＮＡ複製要素を含み、ここで前記複数のベクターの１つ以上のベクターが、１つの細菌ＤＮＡ複製要素を含み、且つ
ここで前記複数のベクターの１つ以上のベクターが、１つ以上の酵母選択マーカーを含む１つの酵母安定要素を含む；
前記複数のベクターを酵母に導入して、相同組換えで前記複数のベクターを組み立てることにより、組み立てられた環状葉緑体ゲノムを作製する工程；並びに
前記１つ以上の安定要素の存在を選別することにより、前記環状葉緑体ゲノムの完全な組み立てを選別する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記複数のベクターが、２つのベクターを含み、当該各ベクターが、他方のベクターと組換えを行うための相同な領域を共有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母ＤＮＡ複製要素が、酵母動原体、酵母自己複製配列、又はそれらの両方である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌ＤＮＡ複製要素が、Ｐ１複製配列又はＦ因子複製配列である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記組み立てられた環状葉緑体ゲノムが、単一の酵母動原体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記酵母ＤＮＡ複製要素及び前記細菌ＤＮＡ複製要素が、同一のベクター中に含まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記組み立てられた環状葉緑体ゲノムが、１４０ｋｂ以上のＤＮＡを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターの１つ以上が、合成されたＤＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターの１つ以上が、光合成生物由来のゲノム葉緑体ＤＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記光合成生物が藻類である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記藻類が微細藻である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微細藻が、クラミドモナス種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、クロレラ種（Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、ドゥナリエラ種（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、ヘマトコッカス種（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、セネデスムス種（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）のいずれかである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記光合成生物由来のゲノム葉緑体ＤＮＡが修飾される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記修飾が、非相同または相同ポリヌクレオチドの挿入によって、１個以上の核酸塩基の欠失によって、１個以上の核酸塩基の突然変異によって、１個以上のポリヌクレオチドの再配列によって、またはそれらの組み合わせによってなされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵母安定要素が、１対の酵母選択マーカーを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１対の選択マーカーが、ＵＲＡ３遺伝子及び追加の酵母選択マーカーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記追加のマーカーがＡＤＥ２遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子又はＧ４１８遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
酵母安定要素を含む各ベクターにおいて、当該酵母安定要素が、異なる対の酵母選択マーカーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組み立てられた環状葉緑体ゲノムを宿主生物に導入する工程を更に含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主生物が、真核生物、酵母又は藻類である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記環状葉緑体ゲノムの完全な組み立てを選別する工程の後に、前記１つ以上の酵母安定要素を除去する工程を更に含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
全ての手順が終了した後に、前記酵母及び細菌複製要素を除去する工程を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
組み立てられた環状葉緑体ゲノムであって、
全体で光合成に必要とされる全ての葉緑体遺伝子を含む、複数のベクター；
を含み、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により組み立てられる、前記ゲノム。
【請求項２４】
組み立てられた環状葉緑体ゲノムであって、
全体で光合成の実施に必要とされる全ての葉緑体遺伝子を含む、複数のベクター；
前記複数のベクター中の各ベクターが、前記複数のベクターの１つ又は２つの他のベクターと相同組換えを行うための相同な領域を共有し、
前記複数のベクターの１つ以上のベクターが、１つの酵母ＤＮＡ複製要素を含み、ここで前記複数のベクターの１つ以上のベクターが、１つの細菌ＤＮＡ複製要素を含み、かつ
前記複数のベクターの１つ以上のベクターが、１つ以上の酵母選択マーカーを含む１つの酵母安定要素を含む；
を含む、当該環状葉緑体ゲノム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
相互参照
本出願は、米国仮出願番号第６０／９７８１２４号（２００７年１０月５日出願）の優先権および利益を主張し、この仮出願は、参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
多くの遺伝子の機能的分析のために、研究者は、大きなＤＮＡフラグメントを単離および操作する必要がある。ゲノミクスの出現およびＤＮＡのゲノム領域の研究は、大きなＤＮＡ領域を担持することができるベクターの必要性を生み出している。
【０００３】
一般的に、２つのタイプの酵母ベクター系が、現在利用可能である。第１のタイプのベクターは、酵母と細菌との間で小さな挿入ＤＮＡを移動させることができるベクターである。第２のタイプのベクターは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）において中間部欠失または末端部欠失をもたらす分断ベクターである。小さな挿入シャトルベクターは、相同配列を組換えおよび回復することができる。それらは、動原体ベースであり、酵母において安定してかつ自律的に複製し、さらに細菌プラスミドとして維持するための高コピーの複製起点を含有する。しかしながら、これらのベクターは、それらの小さな挿入容量によって限定される。（分断ベクターとしても知られる）第２のタイプのベクターは、組換え誘導配列を有するが、ＤＮＡの大きな調製物のために回復された挿入ＤＮＡを細菌に移動させることはできない。
【０００４】
研究者らは、ＹＡＣにおける目的の領域を絞るためにフラグメント化技術を使用する。しかしながら、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションのためにアガロースゲルからＹＡＣ  ＤＮＡの十分な量を単離することは、依然としてやっかいである。精製は、ＹＡＣが内因性染色体と共に移動する（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）ときに依然として問題である。さらに、ＹＡＣはキメラであり得、すなわち特定の機能研究に必要とされないさらなるＤＮＡ領域を含有し得る。
【０００５】
細菌において大きなフラグメントをクローニングするのに利用可能なベクターのタイプは、コスミド、Ｐ１、および細菌性人工染色体（ＢＡＣ）である。これらのベクターは細菌に限定され、相同組換えによる修飾のために酵母に往復されることができない。細菌ベクターはまた、植物および藻類を形質転換するための使用に限定される。例えば、葉緑体は、真核宿主への光合成細菌の内部共生に由来すると考えられるが、葉緑体の翻訳はより複雑である。植物および藻類を遺伝的に操作する複雑性に加わるのは、葉緑体ゲノムの複数コピーを有する複数の葉緑体の存在である。したがって、植物および藻類の葉緑体においてＤＮＡの大きなフラグメントからタンパク質を発現するための方法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、細菌および葉緑体の全ゲノムを含む、大きなＤＮＡを単離、特徴付け、および／または修飾する組成物および方法に関する。組成物は、標的ＤＮＡがその中に挿入され得るシャトルベクターを含む。方法は、一部を除去すること、加えること、または再配列すること、および修飾されたＤＮＡを宿主に導入することによって標的ＤＮＡを修飾または操作することを含む。
【０００７】
本発明の１つの態様は、酵母要素、細菌性複製起点、および少なくとも２０ｋｂのゲノムＤＮＡを含む単離されたベクターを提供する。いつくかのベクターにおいて、酵母要素は、酵母動原体、酵母自己複製配列、酵母栄養要求性マーカー、またはそれらの組み合わせである。ＤＮＡは、非維管束光合成生物、例えば、大型藻（ｍａｃｒｏａｌｇａｅ）、微細藻（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓに由来し得る。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、例えば、非相同または相同ポリヌクレオチドの挿入によって、１個以上の核酸塩基の欠失によって、１個以上の核酸塩基の突然変異によって、１個以上のポリヌクレオチドの再配列によって、またはそれらの組み合わせによって修飾される。場合によっては、修飾は合成修飾である。本発明のベクターは、宿主細胞に形質転換される場合に、宿主細胞によって本来は生成されない生成物の生成をもたらし得る。そのような生成物のいくつかの例は、バイオマス分解酵素、脂肪酸、テルペン、またはテルペノイドを含む。いくつかの宿主細胞において、ベクターの発現は、前記宿主細胞によって本来生成される生成物、例えば、バイオマス分解酵素、テルペン、またはテルペノイドの生成の増加をもたらす。本発明のベクターは、１種以上の選択マーカー、例えば、酵母マーカー、酵母抗生物質耐性マーカー、酵母栄養素要求性マーカー、細菌マーカー、細菌抗生物質耐性マーカー、細菌栄養素要求性マーカー、藻類マーカー、藻類抗生物質耐性マーカー、藻類栄養素要求性マーカー、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。本発明のベクターは、１）１〜２００個の遺伝子；２）全ての本質的な葉緑体遺伝子；および／または３）３０〜４００ｋｂを含む葉緑体ゲノムＤＮＡもまた含有し得る。
【０００８】
また、本明細書中に記載されるのは、本明細書中に記載されるベクターを含む宿主細胞である。例示的な宿主細胞は、本来は非光合成細胞であっても光合成細胞であっても良く、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓを含む。
【０００９】
本発明の別の態様において、ベクターを製造するための方法が提供され、その方法は、標的ＤＮＡを、酵母動原体、酵母自己複製配列、および細菌性複製起点を含むベクター中に挿入すること、生物をそのベクターで形質転換すること、および葉緑体ゲノムの一部を捕捉することを含み、したがって、葉緑体ゲノムの一部を有するベクターを製造する。場合によっては、標的ＤＮＡは、葉緑体ゲノムＤＮＡである。この方法は、長さ１０〜４００ｋｂの、ゲノムの一部を捕捉するために使用され得る。場合によっては、捕捉工程は、組換えによって起こる。葉緑体ゲノムの捕捉された部分は、ベクターを有する生物中に同時形質転換され得、したがって、組換え工程がインビボで起こり得る。本明細書中に開示される方法を実施するために使用される生物は、真核生物および／または光合成生物であり得る。場合によっては、生物は、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓである。本明細書中に開示される方法を実施するために使用される生物はまた、非光合成生物、例えば酵母であり得る。場合によっては、非光合成生物は、外因性の葉緑体ＤＮＡを含有し得る。いくつかの実施形態において、葉緑体ゲノムの一部を修飾するさらなる工程が利用される。修飾は、相同組換えによって達成され得る。そのような組換えは、生物、例えば、真核生物および／または光合成生物において起こり得る。場合によっては、生物は、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓである。他の例において、生物は、非光合成生物、例えば、酵母であり得る。修飾工程を有する実施形態において、その工程は、ポリヌクレオチドの付加、１個以上の核酸塩基の欠失、１個以上の核酸塩基の突然変異、ポリヌクレオチドの再配列、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００１０】
本明細書中にさらに開示されるのは、本質的な葉緑体遺伝子、選択可能マーカー、およびベクター中の１個以上の核酸の操作を含む、単離されたベクターである。場合によっては、本質的な葉緑体遺伝子は、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓのような非維管束光合成生物からクローニングされる。本明細書中に記載されるベクターにおける使用のための本質的な葉緑体遺伝子は、合成遺伝子であり得る。本明細書中に記載されるベクターは、発現カセットをさらに含み得、それは、標的ＤＮＡ、例えば、オルガネラＤＮＡ中への組込みのための領域をさらに含み得る。本明細書中に記載されるベクターはまた、１種以上の選択マーカー、例えば、栄養素要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、葉緑体マーカー、またはそれらの組み合わせを含有し得る。場合によっては、本質的な葉緑体遺伝子は、葉緑体機能、光合成、炭素固定、１種以上の炭化水素の生成、またはそれらの組み合わせに必要とされる遺伝子である。本質的な葉緑体遺伝子は、２００個までの遺伝子を含み、および／または４００ｋｂまでからなり得る。本明細書中に記載されるベクターのうちのいくつかにおいて、１個以上の核酸の操作は、付加、欠失、突然変異、または再配列である。場合によっては、宿主細胞におけるベクターの発現は、前記宿主細胞によって本来は生成されない生成物を生成する。他の例において、本発明のベクターの発現は、前記宿主細胞によって本来生成される生成物の増加された生成をもたらす。そのような生成物の例は、バイオマス分解酵素、脂肪酸、テルペン、またはテルペノイドである。
【００１１】
本明細書中に記載されるように、本発明の１つの態様は、本発明のベクターを含む単離された葉緑体である。別の態様において、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。本発明において有用な宿主細胞は、本来は非光合成細胞であっても良いし、本来光合成細胞であっても良い。本発明のために有用な生物の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓを含む。
【００１２】
本発明の別の態様において、細胞または生物を形質転換するための方法が提供され、その方法は、前記細胞または生物中に、全ての本質的な葉緑体遺伝子、および任意選択的に前記細胞または生物において本来は存在しない１個以上の遺伝子を含むベクターを挿入することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、前記細胞または生物において実質的に全ての葉緑体ゲノムを除去する工程をさらに含む。この方法のために有用な細胞または生物は、光合成細胞または生物、非光合成細胞または生物、および／または真核細胞または生物であり得る。この方法のために有用な細胞または生物は非維管束細胞または生物であり得る。場合によっては、この方法における使用のためのベクターはまた、発現カセットを含み得、その発現カセットは、非核ＤＮＡ中に組み込まれることができ得る。１つの実施形態において、その細胞または生物において本来は存在しない１個以上の遺伝子は、イソプレノイド経路、ＭＶＡ経路、またはＭＥＰ経路における遺伝子である。別の実施形態において、本質的な葉緑体遺伝子は、葉緑体機能、光合成、炭素固定、１つ以上の炭化水素の生成、またはそれらの組み合わせに必要とされる遺伝子である。
【００１３】
本明細書中にさらに提供されるのは、生物を、葉緑体機能を行うのに十分な１個以上のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換する工程を含む、生物を修飾するための方法である。場合によっては、この方法のために有用なベクターは、前記生物から化合物を生成または分泌するための配列をさらに含む。場合によっては、化合物はイソプレノイドである。他の例において、ベクターは、全ての本質的な葉緑体遺伝子を含む。さらに他の例において、本質的な葉緑体遺伝子は、再配列または突然変異される。いくつかの実施形態のために有用な生物は、形質転換の前に本質的に葉緑体ゲノムを含まない。
【００１４】
本明細書中で提供されるさらに別の方法は、生物から生成物を作製するための方法であって、少なくとも２０ｋｂのゲノムＤＮＡ、および、（ｉ）前記生物において本来は存在しない遺伝子；（ｉｉ）前記生物において本来存在する遺伝子の欠失；（ｉｉｉ）前記生物において本来存在する遺伝子の再配列；および（ｉｖ）前記生物において本来存在する遺伝子における突然変異のうちの１つ以上を含むベクターで生物を形質転換する工程を含む方法である。場合によっては、生物は、本来光合成生物である。他の例において、さらなる遺伝子は、イソプレノイド経路、ＭＶＡ経路、またはＭＥＰ経路における酵素をコードする。さらに別の実施形態において、本開示は、葉緑体および、全ての本質的な葉緑体遺伝子を含むベクターを細胞または生物中に挿入することを含む、細胞または生物を形質転換するための方法を提供する。
【００１５】
本開示はまた、（ａ）１個以上の本質的な葉緑体遺伝子を含むベクターを提供する工程；（ｂ）前記ベクターにＤＮＡフラグメントを付加する工程；（ｃ）工程（ｂ）によって生成されたベクターで細胞または生物を形質転換する工程；および（ｄ）前記付加されたＤＮＡフラグメントと共に葉緑体機能が存在するかどうか決定する工程を含む、人工葉緑体ゲノムを生成する方法を提供する。場合によっては、付加されたＤＮＡフラグメントは、イソプレノイド経路、ＭＶＡ経路、またはＭＥＰ経路における酵素のための１個以上のコード領域を含む。
【００１６】
本開示はまた、葉緑体ゲノムを含むシャトルベクターを提供する。ゲノムは、修飾され得る。また、本明細書中で提供されるのは、単離された機能的葉緑体ゲノムを含むベクターである。そのようなベクターにおいて有用な葉緑体ゲノムは、修飾され得る。
【００１７】
本明細書中でさらに提供されるのは、（ａ）全ての本質的な葉緑体遺伝子を含むベクターを提供する工程；および（ｂ）葉緑体ゲノムからＤＮＡを、除去、付加、突然変異、または再配列する工程を含む、人工葉緑体ゲノムを生成する方法である。そのような方法は、（ｃ）編集されたゲノムを宿主生物に形質転換する工程；および（ｄ）宿主生物における葉緑体機能を決定する工程をさらに含み得る。場合によっては、工程（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は繰り返され得る。さらに他の例において、葉緑体ゲノムは、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓからなる群から選択される生物に由来する。他の例において、宿主生物は、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓからなる群から選択される。いくつかの実施形態について、その方法は、葉緑体ゲノムから重複ＤＮＡを除去する工程をさらに含み得る。他の実施形態において、ベクターは、全てまたは実質的に全ての葉緑体ゲノムを含む。本発明において有用な葉緑体ゲノムは、光合成生物からクローニングされ得るか、または合成葉緑体ゲノムであり得る。場合によっては、ベクターは、宿主細胞において本来は存在しない遺伝子、例えば、イソプレノイド経路、ＭＶＡ経路、またはＭＥＰ経路由来の遺伝子をさらに含む。
【００１８】
本明細書中で提供されるさらに別の方法は、（ａ）全葉緑体ゲノムを含むベクターを提供する工程；（ｂ）前記全葉緑体ゲノムの一部を欠失させる工程；および（ｃ）前記欠失された部分無しで葉緑体機能が存在するかどうか決定する工程を含む、人工葉緑体ゲノムを生成する方法である。本発明の別の態様において、単離された機能的葉緑体ゲノムを含む組成物が提供される。場合によっては、組成物は、前記葉緑体ゲノムへの修飾を含む。
【００１９】
本明細書中でさらに提供されるのは、葉緑体ゲノムの少なくとも約１０％を含む核酸、およびベクターにおける１個以上の核酸の操作を含むエキソビボベクターである。場合によっては、核酸は、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓからクローニングされる。場合によっては、核酸は、合成核酸である。本発明のベクターは、発現カセットをさらに含み得、発現カセットは、標的ＤＮＡ中への組込みのための領域をさらに含み得る。場合によっては、標的ＤＮＡは、オルガネラＤＮＡである。本発明において有用なベクターは、１種以上の選択マーカー、例えば、栄養素要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、葉緑体マーカー、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターにおける１個以上の核酸の操作は、付加、欠失、突然変異、または再配列であり得る。ベクターの発現は、宿主細胞によって本来は生成されない生成物の生成、および／または宿主細胞によって本来生成される生成物の増加された生成をもたらし得る。本発明のいくつかの生成物の例は、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、またはバイオマス分解酵素を含む。
【００２０】
また、本明細書中で提供されるのは、葉緑体ゲノムの少なくとも約２０キロベースを含む核酸、および前記ベクターにおける１個以上の核酸の操作を含むエキソビボベクターである。場合によっては、核酸は、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓからクローニングされる。場合によっては、核酸は、合成核酸である。本発明のベクターは、発現カセットをさらに含み得、発現カセットは、標的ＤＮＡ中への組込みのための領域をさらに含み得る。場合によっては、標的ＤＮＡは、オルガネラＤＮＡである。本発明において有用なベクターは、１種以上の選択マーカー、例えば、栄養素要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、葉緑体マーカー、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターにおける１個以上の核酸の操作は、付加、欠失、突然変異、または再配列であり得る。ベクターの発現は、宿主細胞によって本来は生成されない生成物の生成、および／または宿主細胞によって本来生成される生成物の増加された生成をもたらし得る。本発明のいくつかの生成物の例は、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、またはバイオマス分解酵素を含む。
【００２１】
本明細書中でさらに提供されるのは、再構築されたゲノムを含有するベクターを製造する方法であって、ゲノムのフラグメントを含む２つ以上のベクターを宿主細胞に導入すること、そのベクターをゲノムの少なくとも約９０％を含む単一のベクター中に組み換えることを含み、それによって再構築されたゲノムを含有するベクターを製造する方法である。場合によっては、宿主細胞は、真核細胞、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。他の例において、ゲノムは、オルガネラゲノムである。オルガネラは、葉緑体、例えば、藻類、特にＣｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓのような微細藻からの葉緑体であり得る。場合によっては、２つ以上のベクターは、選択可能マーカーを含む。他の例において、前記フラグメントの少なくとも１つは、合成フラグメントである。さらに他の例において、ゲノムの一部を修飾することを含むさらなる工程が、この方法において有用である。そのような修飾は、付加、欠失、突然変異、または再配列を含み得る。他の実施形態において、修飾は、外因性の核酸の付加であり、それは、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、またはバイオマス分解酵素の生成または増加された生成をもたらす。
【００２２】
参照による援用
本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が、参照によって援用されるべきであることが具体的かつ個別に示されたのと同じ程度まで、参照によって本明細書中に援用される。
【００２３】
本発明の新規な特徴は、添付の請求項において詳細に記載される。本発明の特徴および利点のより良好な理解が、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付随する図面を参照することによって得られるだろう。
【００２４】
図において、以下の略語が使用される：ＨＩＳ３：酵母ＨＩＳ３遺伝子；ＴＲＰ１：酵母ＴＲＰ１遺伝子；ＵＲＡ３：酵母ＵＲＡ３遺伝子；ＡＤＥ２：酵母ＡＤＥ２遺伝子；ＬＹＳ２：酵母ＬＹＳ２遺伝子；ＴＥＬ：酵母テロメア；ＣＥＮ：酵母動原体；ＡＲＳ：自己複製配列，酵母複製起点；５ＦＯＡ：５−フルオロオロチン酸；Ｋａｎ：カナマイシン耐性遺伝子；Ｐ１プラスミドｒｅｐ：Ｐ１プラスミドレプリコン；ｐ１細胞溶解ｒｅｐ：ｐ１細胞溶解レプリコン。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】本発明のハイブリッドベクターの概要を提供する。本図はベクター概略図を示す。
【図１Ｂ】本発明のハイブリッドベクターの概要を提供する。本図は、生物間を往復するＤＮＡを示す。
【図２】ハイブリッドベクターの構築を示す概略図である。
【図３】葉緑体ゲノムＤＮＡにおける組込みの部位を示す概略図である。丸数字は、修飾のための標的部位を示す。囲みは、ハイブリッドギャップ充填ベクターによって標的化される部位を示す。
【図４Ａ】修飾および／または安定化のための選択可能マーカーの概略図である。
【図４Ｂ】修飾および／または安定化のための選択可能マーカーの概略図である。
【図４Ｃ】修飾および／または安定化のための選択可能マーカーの概略図である。
【図５】葉緑体ゲノムＤＮＡ中へのハイブリッドベクターの導入についての概略図である。
【図６】藻類におけるハイブリッドベクター（および安定化ベクター）の組込みを示すＰＣＲデータである。
【図７Ａ】捕捉されたＤＮＡの分析を示す。この図は、葉緑体を含有する単離されたベクターのＥｃｏＲＩでの制限消化（Ｌ、ラダー；Ｃ、親ハイブリッドベクター；１、クローン１；２、クローン２）を示す。
【図７Ｂ】捕捉されたＤＮＡの分析を示す。この図は、酵母を通って通過されたクローン１のＥｃｏＲＩでの制限消化（Ｌ、ラダー；Ｃ；１、クローン１；およびＡ−Ｍ；酵母分離株）を示す。
【図７Ｃ】捕捉されたＤＮＡの分析を示す。この図は、ＥｃｏＲＩで消化されて、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉからの、放射性のＨｉｎｄＩＩＩで消化された全ＤＮＡで調べられたクローン１および２のサザン分析を示す。
【図８Ａ】葉緑体ゲノムＤＮＡを含有する単離されたエキソビボベクターの構造を示す概略図である。
【図８Ｂ】葉緑体ゲノムＤＮＡを含有する単離されたエキソビボベクターの構造を示す概略図である。
【図９】種々の選択条件下での親藻細胞および形質転換された藻細胞の増殖を示す。
【図１０Ａ】操作ベクターについての制限分析の概略図である。この図はベクター構造の概略図を示す。
【図１０Ｂ】操作ベクターについての制限分析の概略図である。この図は、ＥｃｏＲＩでの制限分析によって修飾されたベクターの分析を示す。
【図１０Ｃ】明細書に記載なし。
【図１１Ａ】バイオマス分解酵素を生成するための葉緑体ゲノムの修飾を示す。この図は、単離された形質転換体のＰＣＲスクリーンを示す。
【図１１Ｂ】バイオマス分解酵素を生成するための葉緑体ゲノムの修飾を示す。この図は、単離された形質転換体からのエンドキシラナーゼ活性を示す。
【図１２Ａ】部位３に標的化されたＦＰＰシンターゼ発現カセットを用いてイソプレノイドを生成するために修飾された、単離された形質転換体のＰＣＲスクリーンを示す。
【図１２Ｂ】部位４に標的化されたＦＰＰシンターゼ発現カセットを用いてイソプレノイドを生成するために修飾された、単離された形質転換体のＰＣＲスクリーンを示す。
【図１３】酵母における組換えを使用する部分的な葉緑体ゲノムの捕捉を示す概略図である。
【図１４】酵母における組換えを使用する全葉緑体ゲノムの捕捉を示す概略図である。
【図１５】酵母における組換えを使用する全葉緑体ゲノムの再組立てを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に示され、かつ説明されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者に明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多くの変更、変化、および置換は、当業者に明らかであろう。本明細書中に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替案が、本発明の実施において利用され得ることは理解されるべきである。添付の請求項が本発明の範囲を定義すること、およびこれらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの均等物が本発明によってカバーされることが意図される。
【００２７】
本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、そうでないことが定義されていない限り、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。当業者に公知の種々の材料および方法論に対する参照が本明細書中でなされる。組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を記載する標準的な参考文献としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｋａｕｆｍａｎら編、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１が挙げられる。本発明の選択された態様について有用な、酵母遺伝学の一般的な方法論および原理を教示する標準的な参照文献としては、Ｓｈｅｒｍａｎら、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６およびＧｕｔｈｒｉｅら、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１が挙げられる。
【００２８】
当業者に公知の任意の好適な材料および／または方法が、本発明を実行することにおいて利用されることができる。本発明を実施するための材料および／方法が記載される。以下の説明および実施例において参照される材料、試薬などは、そうでない断りがない限り、商業的供給源から入手可能である。本発明は、ＤＮＡの大きな断片を捕捉および修飾するための方法を教示し、そのためのツールを記載する。それは、生物またはオルガネラの全ゲノム、またはその一部を含む、ゲノムＤＮＡを修飾するために特に有用である。本発明の新規な予言的使用もまた記載される。本発明は、大きな核酸の操作および送達に関する。本発明は、組換えクローニングベクターおよび組換えクローニング系、ならびにその使用方法にさらに関する。
【００２９】
ゲノム（例えば、葉緑体ゲノム）を遺伝的に操作する現代の方法は、時間がかかり（＞１カ月）、かつ同時に限られた数の操作しか可能にしない。もし標的ゲノムに対する複数の修飾が所望されるなら、プロセスは反復されねばならず、これは所望の株を生成するために必要とされる時間をさらに増大する。代謝工学および／または合成生物学は、ゲノムに対する多くの修飾を必要とするので、これらの技術は、ゲノムへの修飾の急速な導入に従わない。したがって、短い期間で葉緑体ゲノムの複数の修飾を可能にする新しい技術が、葉緑体ゲノムへの代謝工学および／または合成生物学の適用を可能にするだろう。本明細書中の開示は、そのような技術を記載する。
【００３０】
本発明は、標的細胞およびオルガネラ（例えば、葉緑体）からの大きな核酸の、捕捉、クローニング、および操作のための用途の広い組換えアプローチを提供する。本発明の１つの態様は、組換えクローニング系を提供する。より具体的には、本発明は、いくつかの実施形態において大きな核酸セグメントの単離および操作を調節するために相同組換え技術に依存するベクターを提供する。本発明の別の態様は、大きな核酸をクローニングするために、操作するために、および標的細胞および／または葉緑体のようなオルガネラに送達するために、そのような組換えクローニングベクターを使用するための方法を提供する。
【００３１】
１つの好ましい実施形態において、相同組換えはインビトロで実施される。本発明の特に好ましい実施形態において、相同組換えはインビボで実施される。より好ましい実施形態において、相同組換えは藻細胞において発生する。別のより好ましい実施形態において、相同組換えは酵母細胞において発生する。１つの好ましい実施形態において、相同組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅにおいて発生する。酵母において、有効な組換えプロセスと多くの選択可能マーカーの利用可能性との組み合わせは、標的ＤＮＡ配列の急速かつ複雑な操作を提供する。いったん、修飾の全てが葉緑体ゲノムＤＮＡを含有するエキソビボベクターに対してなされると、全ベクターが単一の形質転換工程において葉緑体中に導入されることができる。したがって、酵母技術を利用することは、葉緑体ゲノムへの代謝工学および／または合成生物学の適用を可能にするだろう。本発明の１つの態様は、酵母要素、細菌性複製起点、および少なくとも２０ｋｂのゲノムＤＮＡを含む単離されたベクターを提供する。いつくかのベクターにおいて、酵母要素は、酵母動原体、酵母自己複製配列、またはそれらの組み合わせである。ＤＮＡは、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓに由来し得る。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、例えば、非相同または相同ポリヌクレオチドの挿入によって、１個以上の核酸塩基の欠失によって、１個以上の核酸塩基の突然変異によって、１個以上のポリヌクレオチドの再配列によって、またはそれらの組み合わせによって修飾される。場合によっては、修飾は合成修飾である。本発明のベクターは、宿主細胞に形質転換される場合に、宿主細胞によって本来は生成されない生成物の生成をもたらし得る。そのような生成物のいくつかの例は、バイオマス分解酵素、脂肪酸、テルペン、またはテルペノイドを含む。いくつかの宿主細胞において、ベクターの発現は、前記宿主細胞によって本来生成される生成物、例えば、バイオマス分解酵素、テルペン、またはテルペノイドの増加された生成をもたらす。本発明のベクターは、１種以上の選択マーカー、例えば、酵母マーカー、酵母抗生物質耐性マーカー、細菌マーカー、細菌抗生物質耐性マーカー、藻類マーカー、藻類抗生物質耐性マーカー、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。本発明のベクターは、１）１〜２００個の遺伝子；２）全ての本質的な葉緑体遺伝子；および／または３）３０〜４００ｋｂを含む葉緑体ゲノムＤＮＡもまた含有する。
【００３２】
また、本明細書中に記載されるのは、本明細書中に記載されるベクターを含む宿主細胞である。例示的な宿主細胞は、本来は非光合成細胞であっても光合成細胞であっても良く、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓを含む。
【００３３】
本発明の別の態様において、ベクターを製造するための方法が提供され、その方法は、標的ＤＮＡを、酵母動原体、酵母自己複製配列、および細菌性複製起点を含むベクターに挿入すること、生物をそのベクターで形質転換すること、および、葉緑体ゲノムの一部を捕捉することを含み、したがって、葉緑体ゲノムの一部を有するベクターを製造する。場合によっては、標的ＤＮＡは、葉緑体ゲノムＤＮＡである。この方法は、長さ１０〜４００ｋｂの、ゲノムの一部を捕捉するために使用され得る。場合によっては、捕捉工程は、組換えによって起こる。葉緑体ゲノムの捕捉された部分は、ベクターを有する生物中に同時形質転換され得、したがって、組換え工程がインビボで起こり得る。本明細書中に開示される方法を実施するために使用される生物は、真核生物および／または光合成生物であり得る。場合によっては、生物は、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓである。本明細書中に開示される方法を実施するために使用される生物はまた、非光合成生物、例えば酵母であり得る。場合によっては、非光合成生物は、外因性の葉緑体ＤＮＡを含有し得る。いくつかの実施形態において、葉緑体ゲノムの一部を修飾するさらなる工程が利用される。修飾は、相同組換えによって達成され得る。そのような組換えは、生物、例えば、真核生物および／または光合成生物において起こり得る。場合によっては、生物は、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓである。他の例において、生物は、非光合成生物、例えば、酵母である。修飾工程を有する実施形態において、その工程は、ポリヌクレオチドの付加、１個以上の核酸塩基の欠失、１個以上の核酸塩基の突然変異、ポリヌクレオチドの再配列、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００３４】
本明細書中にさらに開示されるのは、本質的な葉緑体遺伝子、選択可能マーカー、およびベクター中の１個以上の核酸の操作を含む、単離されたベクターである。場合によっては、本質的な葉緑体遺伝子は、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓのような非維管束光合成生物からクローニングされる。本明細書中に記載されるベクターにおける使用のための本質的な葉緑体遺伝子は、合成遺伝子であり得る。本明細書中に記載されるベクターは、発現カセットをさらに含み得、それは、標的ＤＮＡ、例えば、オルガネラＤＮＡ中への組込みのための領域をさらに含み得る。本明細書において記載されるベクターはまた、１種以上の選択マーカー、例えば、栄養素要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、葉緑体マーカー、またはそれらの組み合わせを含有し得る。場合によっては、本質的な葉緑体遺伝子は、葉緑体機能、光合成、炭素固定、１種以上の炭化水素の生成、またはそれらの組み合わせに必要とされる遺伝子である。本質的な葉緑体遺伝子は、２００個までの遺伝子を含み、および／または４００ｋｂまでからなり得る。本明細書中に記載されるベクターのうちのいくつかにおいて、１個以上の核酸の操作は、付加、欠失、変異、または再配列である。場合によっては、宿主細胞におけるベクターの発現は、前記宿主細胞によって本来は生成されない生成物を生成する。他の例において、本発明のベクターの発現は、前記宿主細胞によって本来生成される生成物の増加された生成をもたらす。そのような生成物の例は、バイオマス分解酵素、脂肪酸、テルペン、またはテルペノイドである。
【００３５】
本明細書中に記載されるように、本発明の１つの態様は、本発明のベクターを含む単離された葉緑体である。別の態様において、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。本発明において有用な宿主細胞は、本来は非光合成細胞であっても良いし、本来は光合成細胞であっても良い。本発明のために有用な生物の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓを含む。
【００３６】
本発明の別の態様において、細胞または生物を形質転換するための方法が提供され、その方法は、前記細胞または生物中に、全ての本質的な葉緑体遺伝子、および任意選択的に前記細胞または生物において本来は存在しない１個以上の遺伝子を含むベクターを挿入することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、前記細胞または生物において実質的に全ての葉緑体ゲノムを除去する工程をさらに含む。この方法のために有用な細胞または生物は、光合成細胞または生物、非光合成細胞または生物、および／または真核細胞または生物であり得る。この方法のために有用な細胞または生物は非維管束細胞または生物であり得る。場合によっては、この方法における使用のためのベクターはまた、発現カセットを含み得、その発現カセットは、非核ＤＮＡ中に組み込まれることができ得る。１つの実施形態において、その細胞または生物において本来は存在しない１個以上の遺伝子は、イソプレノイド経路、ＭＶＡ経路、またはＭＥＰ経路における遺伝子である。別の実施形態において、本質的な葉緑体遺伝子は、葉緑体機能、光合成、炭素固定、１つ以上の炭化水素の生成、またはそれらの組み合わせに必要とされる遺伝子である。
【００３７】
本明細書中にさらに提供されるのは、生物を、葉緑体機能を行うのに十分な１個以上のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換する工程を含む、生物を修飾するための方法である。場合によっては、この方法のために有用なベクターは、前記生物から化合物を生成または分泌するための配列をさらに含む。場合によっては、化合物はイソプレノイドである。他の例において、ベクターは、全ての本質的な葉緑体遺伝子を含む。さらに他の例において、本質的な葉緑体遺伝子は、再配列または突然変異される。いくつかの実施形態のために有用な生物は、形質転換の前に本質的に葉緑体ゲノムを含まない。
【００３８】
本明細書中で提供されるさらに別の方法は、生物から生成物を作製するための方法であって、少なくとも２０ｋｂのゲノムＤＮＡ、および、（ｉ）前記生物において本来は存在しない遺伝子；（ｉｉ）前記生物において本来存在する遺伝子の欠失；（ｉｉｉ）前記生物において本来存在する遺伝子の再配列；および（ｉｖ）前記生物において本来存在する遺伝子における突然変異のうちの１つ以上を含むベクターで生物を形質転換する工程を含む方法である。場合によっては、生物は、本来は光合成生物である。他の例において、さらなる遺伝子は、イソプレノイド経路、ＭＶＡ経路、またはＭＥＰ経路における酵素をコードする。さらに別の実施形態において、本開示は、葉緑体および、全ての本質的な葉緑体遺伝子を含むベクターを細胞または生物中に挿入することを含む、細胞または生物を形質転換するための方法を提供する。
【００３９】
本開示はまた、（ａ）１個以上の本質的な葉緑体遺伝子を含むベクターを提供する工程；（ｂ）前記ベクターにＤＮＡフラグメントを付加する工程；（ｃ）工程（ｂ）によって生成されたベクターで細胞または生物を形質転換する工程；および（ｄ）前記付加されたＤＮＡフラグメントと共に葉緑体機能が存在するかどうか決定する工程を含む、人工葉緑体ゲノムを生成する方法を提供する。場合によっては、付加されたＤＮＡフラグメントは、イソプレノイド経路、ＭＶＡ経路、またはＭＥＰ経路における酵素のための１個以上のコード領域を含む。
【００４０】
本開示はまた、葉緑体ゲノムを含むシャトルベクターを提供する。ゲノムは、修飾され得る。また、本明細書中で提供されるのは、単離された機能的葉緑体ゲノムを含むベクターである。そのようなベクターにおいて有用な葉緑体ゲノムは、修飾され得る。
【００４１】
本明細書中でさらに提供されるのは、（ａ）全ての本質的な葉緑体遺伝子を含むベクターを提供する工程；および（ｂ）葉緑体ゲノムからＤＮＡを、除去、付加、突然変異、または再配列する工程を含む、人工葉緑体ゲノムを生成する方法である。そのような方法は、（ｃ）編集されたゲノムを宿主生物に形質転換する工程；および（ｄ）宿主生物における葉緑体機能を決定する工程をさらに含み得る。場合によっては、工程（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は繰り返され得る。さらに他の例において、葉緑体ゲノムは、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓからなる群から選択される生物に由来する。他の例において、宿主生物は、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓからなる群から選択される。いくつかの実施形態について、その方法は、葉緑体ゲノムから重複ＤＮＡを除去する工程をさらに含み得る。他の実施形態において、ベクターは、全てまたは実質的に全ての葉緑体ゲノムを含む。本発明において有用な葉緑体ゲノムは、光合成生物からクローニングされ得るか、または合成葉緑体ゲノムであり得る。場合によっては、ベクターは、宿主細胞において本来は存在しない遺伝子、例えば、イソプレノイド経路、ＭＶＡ経路、またはＭＥＰ経路由来の遺伝子をさらに含む。
【００４２】
本明細書中で提供されるさらに別の方法は、（ａ）全葉緑体ゲノムを含むベクターを提供する工程；（ｂ）前記全葉緑体ゲノムの一部を欠失させる工程；および（ｃ）前記欠失された部分無しで葉緑体機能が存在するかどうか決定する工程を含む、人工葉緑体ゲノムを生成する方法である。本発明の別の態様において、単離された機能的葉緑体ゲノムを含む組成物が提供される。場合によっては、組成物は、前記葉緑体ゲノムへの修飾を含む。
【００４３】
本明細書中でさらに提供されるのは、葉緑体ゲノムの少なくとも約１０％を含む核酸、およびベクターにおける１個以上の核酸の操作を含む生体外ベクターである。場合によっては、核酸は、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓからクローニングされる。場合によっては、核酸は、合成核酸である。本発明のベクターは、発現カセットをさらに含み得、発現カセットは、標的ＤＮＡ中への組込みのための領域をさらに含み得る。場合によっては、標的ＤＮＡは、オルガネラＤＮＡである。本発明において有用なベクターは、１種以上の選択マーカー、例えば、栄養素要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、葉緑体マーカー、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターにおける１個以上の核酸の操作は、付加、欠失、突然変異、または再配列であり得る。ベクターの発現は、宿主細胞によって本来は生成されない生成物の生成、および／または宿主細胞によって本来生成される生成物の増加された生成をもたらし得る。本発明のいくつかの生成物の例は、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、またはバイオマス分解酵素を含む。
【００４４】
また、本明細書中で提供されるのは、葉緑体ゲノムの少なくとも約２０キロベースを含む核酸、および前記ベクターにおける１個以上の核酸の操作を含む生体外ベクターである。場合によっては、核酸は、非維管束光合成生物、例えば、大型藻、微細藻、Ｃｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓからクローニングされる。場合によっては、核酸は、合成核酸である。本発明のベクターは、発現カセットをさらに含み得、発現カセットは、標的ＤＮＡ中への組込みのための領域をさらに含み得る。場合によっては、標的ＤＮＡは、オルガネラＤＮＡである。本発明において有用なベクターは、１種以上の選択マーカー、例えば、栄養素要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、葉緑体マーカー、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターにおける１個以上の核酸の操作は、付加、欠失、突然変異、または再配列であり得る。ベクターの発現は、宿主細胞によって本来は生成されない生成物の生成、および／または宿主細胞によって本来生成される生成物の増加された生成をもたらし得る。本発明のいくつかの生成物の例は、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、またはバイオマス分解酵素を含む。
【００４５】
本明細書中でさらに提供されるのは、再構築されたゲノムを含有するベクターを製造する方法であって、ゲノムのフラグメントを含む２つ以上のベクターを宿主細胞に導入すること、そのベクターをゲノムの少なくとも約９０％を含む単一のベクター中に組み換えることを含み、それによって再構築されたゲノムを含有するベクターを製造する方法である。場合によっては、宿主細胞は、真核細胞、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。他の例において、ゲノムは、オルガネラゲノムである。オルガネラは、葉緑体、例えば、藻類、特にＣｈ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｓ．ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓのような微細藻からの葉緑体であり得る。場合によっては、２つ以上のベクターは、選択可能マーカーを含む。他の例において、前記フラグメントの少なくとも１つは、合成フラグメントである。さらに他の例において、ゲノムの一部を修飾することを含むさらなる工程が、この方法において有用である。そのような修飾は、付加、欠失、突然変異、または再配列を含み得る。他の実施形態において、修飾は、外因性の核酸の付加であり、それは、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、またはバイオマス分解酵素の生成または増加された生成をもたらす。
【００４６】
大きなＤＮＡのクローニングおよび内容物
【００４７】
本発明の利点は、本発明が、最大で全ての葉緑体遺伝子（または配列）からなる葉緑体ゲノムＤＮＡを含有するベクターのクローニング、操作、および送達を提供することである。ベクター中に含有される葉緑体ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡの１つの隣接フラグメントでのハイブリッドクローニングベクターの組換えによって、または、ＤＮＡの２つ以上の隣接フラグメントの組換えによって得られることができる。
【００４８】
本発明の方法および組成物は、捕捉および／または修飾されたＤＮＡの大きな断片を含み得、ミトコンドリアＤＮＡまたは色素体ＤＮＡ（例えば、葉緑体ＤＮＡ）のようなオルガネラからのＤＮＡを含み得る。捕捉および／または修飾されたＤＮＡの大きな断片はまた、オルガネラのゲノム、例えば、葉緑体ゲノムの全体を含み得る。他の実施形態において、捕捉および／または修飾されたＤＮＡの大きな断片は、葉緑体ゲノムの一部を含む。葉緑体ゲノムは、藻類、苔植物類（例えば、コケ、シダ）、裸子植物類（例えば、針葉樹）、および被子植物類（例えば、顕花植物、樹木、草、草本、低木）を含む、任意の維管束植物または非維管束植物に由来し得る。葉緑体ゲノム、またはその本質的な部分は、合成ＤＮＡ、再配列されたＤＮＡ、欠失、付加、および／または突然変異を含み得る。葉緑体ゲノム、またはその一部は、１個以上の欠失、付加、突然変異、および／または再配列を含み得る。欠失、付加、突然変異、および／または再配列は、生物において自然に見出される、例えば自然に起こる突然変異であっても良いし、本来は自然に見出されないものであっても良い。多くの生物の葉緑体ゲノムまたは色素体ゲノムは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｓｔａｔｉｃ／ｅｕｋ＿ｏ．ｈｔｍｌで利用可能なＮＣＢＩのＯｒｇａｎｅｌｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅｓセクションからの公開データベースにおいて広く利用可能である。
【００４９】
本明細書中に記載される標的ＤＮＡ配列は、コントロール配列（天然に存在する配列）と比べて、少なくとも１個、２個、３個、４個、または５個の欠失、付加、突然変異、および／または再配列を含み得る。いくつかの実施形態において、突然変異は、機能的または非機能的であり得る。例えば、機能的突然変異は、突然変異のないコントロール細胞と比べて、突然変異が宿主細胞中に存在するときに、細胞の機能に対して影響を有し得る。非機能的突然変異は、機能において影響しない場合があり、例えば、突然変異を有する細胞と比べて、突然変異のない宿主細胞の表現型において識別可能な差異は存在しない。
【００５０】
捕捉および／または修飾されたＤＮＡの大きな断片（例えば、標的ＤＮＡ）は、最小の葉緑体ゲノムまたは最小化された葉緑体ゲノム（例えば、葉緑体の機能性に必要とされる、最小の数の遺伝子および／またはＤＮＡフラグメント）を含み得る。捕捉および／または修飾されたＤＮＡは、本質的な葉緑体遺伝子を含み得、それは、一部または全て、または実質的に全ての本質的な葉緑体遺伝子を含み得る。本質的な遺伝子は、１つ以上の代謝プロセスまたは生化学的経路に不可欠な遺伝子であり得る。本質的な遺伝子は、光合成、炭素固定、または炭化水素生成のような葉緑体機能に必要とされる遺伝子であり得る。本質的な遺伝子はまた、転写、翻訳、または遺伝子発現に影響する他のプロセスのような遺伝子発現に不可欠な遺伝子であり得る。本質的な遺伝子は、突然変異または再配列を含み得る。本質的な遺伝子はまた、機能を実施するための遺伝子の最小限の機能的セットを含み得る。例えば、特定の機能（例えば、光合成）は、遺伝子／遺伝子産物のセットによって非効率的に実施されるかもしれないが、しかしながら、機能がそれでも実施されているので、このセットは、本質的な遺伝子をそれでも含むだろう。
【００５１】
修飾されたＤＮＡは、少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、または５０個の本質的な遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、長さ１５０ｋｂまでの本質的な葉緑体ゲノム配列を含み得る。ＤＮＡは、本質的な葉緑体遺伝子、ならびに非本質的な葉緑体遺伝子配列を含み得る。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖、線状または環状、弛緩または超らせんであり得る。ＤＮＡはまた、発現カセットの形態であり得る。例えば、発現カセットは、宿主細胞において発現されるべき本質的な遺伝子を含み得る。発現カセットは、１個以上の本質的な遺伝子、ならびに本質的な遺伝子の発現を促進するＤＮＡ配列を含み得る。発現カセットはまた、宿主の標的ＤＮＡへの組み込みのための領域を含み得る。発現カセットはまた、１個以上の本質的な遺伝子、および発現カセットを含む宿主細胞において本来は存在しない１個以上の遺伝子を含み得る。当業者は、発現カセットの上述の態様の種々の組み合わせを容易に確認するだろう。
【００５２】
他の例において、捕捉および／または修飾されたＤＮＡの断片は、色素体またはオルガネラの全ゲノムを含み得る。例えば、色素体ゲノムの約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上。１つの実施形態において、捕捉および／または修飾されたＤＮＡの大きな断片は、色素体または細胞の全ゲノムの１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、または９０〜１００％を含み得る。
【００５３】
さらに他の例において、捕捉および／または修飾されたＤＮＡの大きな断片は、約１０ｋｂ、約１１ｋｂ、約１２ｋｂ、約１３ｋｂ、約１４ｋｂ、約１５ｋｂ、約１６ｋｂ、約１７ｋｂ、約１８ｋｂ、約１９ｋｂ、約２０ｋｂ、約２１ｋｂ、約２２ｋｂ、約２３ｋｂ、約２４ｋｂ、約２５ｋｂ、約２６ｋｂ、約２７ｋｂ、約２８ｋｂ、約２９ｋｂ、約３０ｋｂ、約３１ｋｂ、約３２ｋｂ、約３３ｋｂ、約３４ｋｂ、約３５ｋｂ、約３６ｋｂ、約３７ｋｂ、約３８ｋｂ、約３９ｋｂ、約４０ｋｂ、約４１ｋｂ、約４２ｋｂ、約４３ｋｂ、約４４ｋｂ、約４５ｋｂ、約４６ｋｂ、約４７ｋｂ、約４８ｋｂ、約４９ｋｂ、約５０ｋｂ、約５１ｋｂ、約５２ｋｂ、約５３ｋｂ、約５４ｋｂ、約５５ｋｂ、約５６ｋｂ、約５７ｋｂ、約５８ｋｂ、約５９ｋｂ、約６０ｋｂ、約６１ｋｂ、約６２ｋｂ、約６３ｋｂ、約６４ｋｂ、約６５ｋｂ、約６６ｋｂ、約６７ｋｂ、約６８ｋｂ、約６９ｋｂ、約７０ｋｂ、約７１ｋｂ、約７２ｋｂ、約７３ｋｂ、約７４ｋｂ、約７５ｋｂ、約７６ｋｂ、約７７ｋｂ、約７８ｋｂ、約７９ｋｂ、約８０ｋｂ、約８１ｋｂ、約８２ｋｂ、約８３ｋｂ、約８４ｋｂ、約８５ｋｂ、約８６ｋｂ、約８７ｋｂ、約８８ｋｂ、約８９ｋｂ、約９０ｋｂ、約９１ｋｂ、約９２ｋｂ、約９３ｋｂ、約９４ｋｂ、約９５ｋｂ、約９６ｋｂ、約９７ｋｂ、約９８ｋｂ、約９９ｋｂ、約１００ｋｂ、約１０１ｋｂ、約１０２ｋｂ、約１０３ｋｂ、約１０４ｋｂ、約１０５ｋｂ、約１０６ｋｂ、約１０７ｋｂ、約１０８ｋｂ、約１０９ｋｂ、約１１０ｋｂ、約１１１ｋｂ、約１１２ｋｂ、約１１３ｋｂ、約１１４ｋｂ、約１１５ｋｂ、約１１６ｋｂ、約１１７ｋｂ、約１１８ｋｂ、約１１９ｋｂ、約１２０ｋｂ、約１２１ｋｂ、約１２２ｋｂ、約１２３ｋｂ、約１２４ｋｂ、約１２５ｋｂ、約１２６ｋｂ、約１２７ｋｂ、約１２８ｋｂ、約１２９ｋｂ、約１３０ｋｂ、約１３１ｋｂ、約１３２ｋｂ、約１３３ｋｂ、約１３４ｋｂ、約１３５ｋｂ、約１３６ｋｂ、約１３７ｋｂ、約１３８ｋｂ、約１３９ｋｂ、約１４０ｋｂ、約１４１ｋｂ、約１４２ｋｂ、約１４３ｋｂ、約１４４ｋｂ、約１４５ｋｂ、約１４６ｋｂ、約１４７ｋｂ、約１４８ｋｂ、約１４９ｋｂ、約１５０ｋｂ、約１５１ｋｂ、約１５２ｋｂ、約１５３ｋｂ、約１５４ｋｂ、約１５５ｋｂ、約１５６ｋｂ、約１５７ｋｂ、約１５８ｋｂ、約１５９ｋｂ、約１６０ｋｂ、約１６１ｋｂ、約１６２ｋｂ、約１６３ｋｂ、約１６４ｋｂ、約１６５ｋｂ、約１６６ｋｂ、約１６７ｋｂ、約１６８ｋｂ、約１６９ｋｂ、約１７０ｋｂ、約１７１ｋｂ、約１７２ｋｂ、約１７３ｋｂ、約１７４ｋｂ、約１７５ｋｂ、約１７６ｋｂ、約１７７ｋｂ、約１７８ｋｂ、約１７９ｋｂ、約１８０ｋｂ、約１８１ｋｂ、約１８２ｋｂ、約１８３ｋｂ、約１８４ｋｂ、約１８５ｋｂ、約１８６ｋｂ、約１８７ｋｂ、約１８８ｋｂ、約１８９ｋｂ、約１９０ｋｂ、約１９１ｋｂ、約１９２ｋｂ、約１９３ｋｂ、約１９４ｋｂ、約１９５ｋｂ、約１９６ｋｂ、約１９７ｋｂ、約１９８ｋｂ、約１９９ｋｂ、約２００ｋｂ、約２０１ｋｂ、約２０２ｋｂ、約２０３ｋｂ、約２０４ｋｂ、約２０５ｋｂ、約２０６ｋｂ、約２０７ｋｂ、約２０８ｋｂ、約２０９ｋｂ、約２１０ｋｂ、約２１１ｋｂ、約２１２ｋｂ、約２１３ｋｂ、約２１４ｋｂ、約２１５ｋｂ、約２１６ｋｂ、約２１７ｋｂ、約２１８ｋｂ、約２１９ｋｂ、約２２０ｋｂ、約２２１ｋｂ、約２２２ｋｂ、約２２３ｋｂ、約２２４ｋｂ、約２２５ｋｂ、約２２６ｋｂ、約２２７ｋｂ、約２２８ｋｂ、約２２９ｋｂ、約２３０ｋｂ、約２３１ｋｂ、約２３２ｋｂ、約２３３ｋｂ、約２３４ｋｂ、約２３５ｋｂ、約２３６ｋｂ、約２３７ｋｂ、約２３８ｋｂ、約２３９ｋｂ、約２４０ｋｂ、約２４１ｋｂ、約２４２ｋｂ、約２４３ｋｂ、約２４４ｋｂ、約２４５ｋｂ、約２４６ｋｂ、約２４７ｋｂ、約２４８ｋｂ、約２４９ｋｂ、約２５０ｋｂ、約２５１ｋｂ、約２５２ｋｂ、約２５３ｋｂ、約２５４ｋｂ、約２５５ｋｂ、約２５６ｋｂ、約２５７ｋｂ、約２５８ｋｂ、約２５９ｋｂ、約２６０ｋｂ、約２６１ｋｂ、約２６２ｋｂ、約２６３ｋｂ、約２６４ｋｂ、約２６５ｋｂ、約２６６ｋｂ、約２６７ｋｂ、約２６８ｋｂ、約２６９ｋｂ、約２７０ｋｂ、約２７１ｋｂ、約２７２ｋｂ、約２７３ｋｂ、約２７４ｋｂ、約２７５ｋｂ、約２７６ｋｂ、約２７７ｋｂ、約２７８ｋｂ、約２７９ｋｂ、約２８０ｋｂ、約２８１ｋｂ、約２８２ｋｂ、約２８３ｋｂ、約２８４ｋｂ、約２８５ｋｂ、約２８６ｋｂ、約２８７ｋｂ、約２８８ｋｂ、約２８９ｋｂ、約２９０ｋｂ、約２９１ｋｂ、約２９２ｋｂ、約２９３ｋｂ、約２９４ｋｂ、約２９５ｋｂ、約２９６ｋｂ、約２９７ｋｂ、約２９８ｋｂ、約２９９ｋｂ、約３００ｋｂ、約３０１ｋｂ、約３０２ｋｂ、約３０３ｋｂ、約３０４ｋｂ、約３０５ｋｂ、約３０６ｋｂ、約３０７ｋｂ、約３０８ｋｂ、約３０９ｋｂ、約３１０ｋｂ、約３１１ｋｂ、約３１２ｋｂ、約３１３ｋｂ、約３１４ｋｂ、約３１５ｋｂ、約３１６ｋｂ、約３１７ｋｂ、約３１８ｋｂ、約３１９ｋｂ、約３２０ｋｂ、約３２１ｋｂ、約３２２ｋｂ、約３２３ｋｂ、約３２４ｋｂ、約３２５ｋｂ、約３２６ｋｂ、約３２７ｋｂ、約３２８ｋｂ、約３２９ｋｂ、約３３０ｋｂ、約３３１ｋｂ、約３３２ｋｂ、約３３３ｋｂ、約３３４ｋｂ、約３３５ｋｂ、約３３６ｋｂ、約３３７ｋｂ、約３３８ｋｂ、約３３９ｋｂ、約３４０ｋｂ、約３４１ｋｂ、約３４２ｋｂ、約３４３ｋｂ、約３４４ｋｂ、約３４５ｋｂ、約３４６ｋｂ、約３４７ｋｂ、約３４８ｋｂ、約３４９ｋｂ、約３５０ｋｂ、約３５１ｋｂ、約３５２ｋｂ、約３５３ｋｂ、約３５４ｋｂ、約３５５ｋｂ、約３５６ｋｂ、約３５７ｋｂ、約３５８ｋｂ、約３５９ｋｂ、約３６０ｋｂ、約３６１ｋｂ、約３６２ｋｂ、約３６３ｋｂ、約３６４ｋｂ、約３６５ｋｂ、約３６６ｋｂ、約３６７ｋｂ、約３６８ｋｂ、約３６９ｋｂ、約３７０ｋｂ、約３７１ｋｂ、約３７２ｋｂ、約３７３ｋｂ、約３７４ｋｂ、約３７５ｋｂ、約３７６ｋｂ、約３７７ｋｂ、約３７８ｋｂ、約３７９ｋｂ、約３８０ｋｂ、約３８１ｋｂ、約３８２ｋｂ、約３８３ｋｂ、約３８４ｋｂ、約３８５ｋｂ、約３８６ｋｂ、約３８７ｋｂ、約３８８ｋｂ、約３８９ｋｂ、約３９０ｋｂ、約３９１ｋｂ、約３９２ｋｂ、約３９３ｋｂ、約３９４ｋｂ、約３９５ｋｂ、約３９６ｋｂ、約３９７ｋｂ、約３９８ｋｂ、約３９９ｋｂ、約４００ｋｂ、またはそれ以上のゲノム（例えば、核またはオルガネラの）ＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、捕捉および／または修飾されたＤＮＡの大きな断片は、約１０〜４００ｋｂ、約５０〜３５０ｋｂ、約１００〜３００ｋｂ、約１００〜２００ｋｂ、約２００〜３００ｋｂ、約１５０〜２００ｋｂ、約２００〜２５０ｋｂのゲノムＤＮＡを含み得る。
【００５４】
さらに他の例において、捕捉および／または修飾されたＤＮＡの大きな断片は、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約５１個、約５２個、約５３個、約５４個、約５５個、約５６個、約５７個、約５８個、約５９個、約６０個、約６１個、約６２個、約６３個、約６４個、約６５個、約６６個、約６７個、約６８個、約６９個、約７０個、約７１個、約７２個、約７３個、約７４個、約７５個、約７６個、約７７個、約７８個、約７９個、約８０個、約８１個、約８２個、約８３個、約８４個、約８５個、約８６個、約８７個、約８８個、約８９個、約９０個、約９１個、約９２個、約９３個、約９４個、約９５個、約９６個、約９７個、約９８個、約９９個、約１００個、約１０１個、約１０２個、約１０３個、約１０４個、約１０５個、約１０６個、約１０７個、約１０８個、約１０９個、約１１０個、約１１１個、約１１２個、約１１３個、約１１４個、約１１５個、約１１６個、約１１７個、約１１８個、約１１９個、約１２０個、約１２１，１２２個、約１２３個、約１２４個、約１２５個、約１２６個、約１２７個、約１２８個、約１２９個、約１３０個、約１３１個、約１３２個、約１３３個、約１３４個、約１３５個、約１３６個、約１３７個、約１３８個、約１３９個、約１４０個、約１４１個、約１４２個、約１４３個、約１４４個、約１４５個、約１４６個、約１４７個、約１４８個、約１４９個、約１５０個、約１５１個、約１５２個、約１５３個、約１５４個、約１５５個、約１５６個、約１５７個、約１５８個、約１５９個、約１６０個、約１６１個、約１６２個、約１６３個、約１６４個、約１６５個、約１６６個、約１６７個、約１６８個、約１６９個、約１７０個、約１７１個、約１７２個、約１７３個、約１７４個、約１７５個、約１７６個、約１７７個、約１７８個、約１７９個、約１８０個、約１８１個、約１８２，約１８３個、約１８４個、約１８５個、約１８６個、約１８７個、約１８８個、約１８９個、約１９０個、約１９１個、約１９２個、約１９３個、約１９４個、約１９５個、約１９６個、約１９７個、約１９８個、約１９９個、約２００個、約２０１個、約２０２個、約２０３個、約２０４個、約２０５個、約２０６個、約２０７個、約２０８個、約２０９個、約２１０個、約２１１個、約２１２個、約２１３個、約２１４個、約２１５個、約２１６個、約２１７個、約２１８個、約２１９個、約２２０個、約２２１個、約２２２個、約２２３個、約２２４個、約２２５個、約２２６個、約２２７個、約２２８個、約２２９個、約２３０個、約２３１個、約２３２個、約２３３個、約２３４個、約２３５個、約２３６個、約２３７個、約２３８個、約２３９個、約２４０個、約２４１個、約２４２個、約２４３個、約２４４個、約２４５個、約２４６個、約２４７個、約２４８個、約２４９個、約２５０個、約２５１個、約２５２個、約２５３個、約２５４個、約２５５個、約２５６個、約２５７個、約２５８個、約２５９個、約２６０個、約２６１個、約２６２個、約２６３個、約２６４個、約２６５個、約２６６個、約２６７個、約２６８個、約２６９個、約２７０個、約２７１個、約２７２個、約２７３個、約２７４個、約２７５個、約２７６個、約２７７個、約２７８個、約２７９個、約２８０個、約２８１個、約２８２個、約２８３個、約２８４個、約２８５個、約２８６個、約２８７個、約２８８個、約２８９個、約２９０個、約２９１個、約２９２個、約２９３個、約２９４個、約２９５個、約２９６個、約２９７個、約２９８個、約２９９個、約３００個、またはそれ以上のオープンリーディングフレーム、部分的オープンリーディングフレーム、偽遺伝子、および／または繰り返し配列を含み得る。
【００５５】
本発明はまた、カセットにすることができる葉緑体ゲノムまたはその一部（例えば、葉緑体ゲノムまたはその機能的部分を含む除去可能なＤＮＡフラグメント）を含むベクターを提供する。本発明のベクターは、機能的葉緑体ユニット（例えば、代謝プロセス、光合成、遺伝子発現、光化学系Ｉ、光化学系ＩＩに不可欠なユニット）を含み得る。本発明のベクターは、移植可能な葉緑体ゲノムまたはその一部を含み得る。さらに、本発明のベクターは、転移可能な葉緑体ゲノムまたはその一部を含み得る。他の実施形態において、ベクターは、１）１個以上の修飾されたＤＮＡの大きな断片；２）光合成を実行するのに必要な全ての遺伝子；３）葉緑体の生存および／または機能に必要な全ての遺伝子；４）本質的な葉緑体遺伝子；および／または５）光合成のような１つ以上の葉緑体機能を実施するのに十分な、本来存在するかまたは修飾された葉緑体遺伝子を含む。ベクターは、一部、実質的に全て、または全ての本質的な葉緑体遺伝子を含み得る。ベクターは、少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、またはそれ以上の本質的な遺伝子を含み得る。
【００５６】
ベクターは、長さ１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、１５０ｋｂ、１６０ｋｂ、１７０ｋｂ、１８０ｋｂ、１９０ｋｂ、２００ｋｂ、２１０ｋｂ、２２０ｋｂ、２３０ｋｂ、２４０ｋｂ、２５０ｋｂ、またはそれ以上の葉緑体ＤＮＡを含み得る。ベクターは、本質的な葉緑体遺伝子、ならびに非本質的な葉緑体遺伝子配列を含み得る。ベクターは、１個以上、または全ての本質的な葉緑体遺伝子、および／または１個以上の、ベクターを含む宿主細胞において本来は存在しない遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、葉緑体遺伝子、および葉緑体には本来存在しない遺伝子を含み得る。ベクターは、１個以上の本質的な葉緑体遺伝子、および／または葉緑体機能、光合成、炭素固定、および／または炭化水素生成に関わる１個以上のＤＮＡ配列または遺伝子を含み得る。例えば、ベクターは、光合成に必要な配列、ならびにテルペンシンターゼ、またはテルペンまたはイソプレノイドのような炭化水素を生成する他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のような、イソプレノイド生成、ＭＶＡおよび／またはＭＥＰ経路に関わる配列を含み得る。本発明はさらに、大きな標的核酸をクローニング、操作、および細胞、あるいは、例えば酵母または細菌のような粒子に送達するための方法をさらに提供する。この方法の特定の実施形態は、ハイブリッド酵素−細菌クローニング系を利用する（例えば、米国特許第５８６６４０４号および同第７０８３９７１号、ならびにＨｏｋａｎｓｏｎら、（２００３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．：１４：３２９−３３９を参照のこと）。本明細書中（例えば、クローニング系）のベクターは、酵母および細菌の両方における機能および複製のための要素を含有するシャトルベクターからなり、それがいずれの生物においても安定して機能および複製することを可能にする。この、機能的かつ複製的要素の組成は、両方の遺伝子工学系の利益を享受するハイブリッド系を産出する。酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝学はよく理解されており、分子生物学ツールの強力な取り合わせが酵母における遺伝子工学のために存在する。
【００５７】
本発明の別の態様は、２つのアームおよび標的核酸の間の相同組換えによってギャップ充填ベクターを製造する。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのアームは、複製起点をさらに含む。本発明の別の実施形態において、各アームは、希少制限エンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含む。相同組換えは、インビトロまたはインビボで、例えば、真菌細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｚ．ｐｏｍｂｅ、またはＵ．ｍａｙｄｉｓ）において実施され得る。本発明はまた、本発明による組換えクローニング系またはベクターを、例えば、真菌細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｚ．ｐｏｍｂｅ、またはＵ．ｍａｙｄｉｓ）において含む真核宿主細胞を提供する。
【００５８】
ギャップ充填線状ベクターは、（例えば、Ｔ４リガーゼを使用して）インビトロで、またはインビボで、例えば細菌において、環状ベクターに変換され得る。目的の環状ベクターは、増幅、精製、切断、および使用されて、直接的に細胞中に、またはその後の標的細胞への送達のための好適な送達系中にのいずれかで導入されるべき十分な量のＤＮＡを回収することができる。その方法は、いかなる大きな細菌性ゲノムまたは非細菌性ゲノムもクローニングおよび修飾し、そして組換えベクターとしてのその使用を容易に促進するための大きな多用途性を提供する。細胞中へのギャップ充填ベクターの直接送達は、当該分野において周知の方法、例えば、リン酸カルシウム形質転換法またはエレクトロポレーション（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）によって実施され得る。
【００５９】
したがって、本発明は、（ａ）標的配列を含有するギャップ充填ベクターを製造する工程；（ｂ）任意選択的に、本発明のギャップ充填ベクターセグメントを環状にする工程；（ｃ）そのベクターを増殖させる工程；および（ｄ）そのギャップ充填ベクターを送達ユニット中に導入する工程を含む、組換え送達ユニットを製造するための方法を提供する。
【００６０】
細菌系は、ＤＮＡを増殖および精製するため、ならびに遺伝的修飾および経路でのその効果を機能的に試験するために有用である。本発明の１つの実施形態は、任意の大きなゲノムのクローニングおよび修飾を助け、そして経路のクローニングおよび導入を容易に促進するクローニング系を提供する。全経路を送達する能力により、本発明の特定の実施形態は、問題解決のための生物学的アプローチを系に可能にさせる。
【００６１】
一般的に、標的ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、ベクターにおいて相同組換えを可能にする部位を作成することによって捕捉され得る。例えば、そのような部位は、限定されないが、ギャップがベクターにおいて、酵母への形質転換の前の制限酵素消化によって通常は作成されるギャップ修復クローニングによって作成され得る。標的ＤＮＡがベクターと混合される場合、標的ＤＮＡはベクター中に組換えられる。この操作は「ギャップ充填」と呼ばれる。この組換えは、細菌、酵母、元の宿主生物、別の生物、またはインビトロで起こることができる。いくつかの実施形態において、相同組換えの高い確率のために、組換えは酵母で実施される。いったん捕捉されると、標的ＤＮＡは、ＤＮＡ配列を付加、変更、または除去することを含む多くの方法で修飾されることができる。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。他の実施形態において、標的ＤＮＡはオルガネラ（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体）ＤＮＡである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡは、遺伝子、コード配列、部分コード配列、調節要素、陽性および／または陰性選択マーカー、組換え部位、制限部位、および／またはコドンバイアス部位を、付加、変更、または除去することによって修飾される。例えば、標的ＤＮＡ配列は、形質転換される生物における発現のためにコドンに偏りがあり得る。当業者は、所定のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンを使用する特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分理解している。理論に束縛されないが、宿主細胞の好むコドンを使用することによって、翻訳の確率が高くなり得る。したがって、宿主細胞における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい場合がある。本発明のコドンは、Ａ／Ｔリッチ、例えば、コドンの第３ヌクレオチド位置においてＡ／Ｔリッチであり得る。典型的には、Ａ／Ｔリッチコドンバイアスは、藻類に対して使用される。いくつかの実施形態において、コドンの第３ヌクレオチド位置の少なくとも５０％がＡまたはＴである。他の実施形態において、コドンの第３ヌクレオチド位置の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％がＡまたはＴである（米国出願公開第２００４／００１４１７４号も参照のこと）。
【００６３】
そのような操作は当該分野においてよく知られており、多くの方法で実施されることができる。いくつかの実施形態において、修飾は、クローニングされた配列を使用して実施され得る。他の実施形態において、修飾は、合成ＤＮＡを使用して実施され得る。
【００６４】
遺伝子操作は、標的ＤＮＡの大きな断片（例えば、染色体、ゲノム）をクローニングすること、ならびに／または遺伝子間の機能的関係、例えば、代謝経路またはオペロンに基づいて標的ＤＮＡを分割および再編成することを含む。遺伝子操作はまた、代謝経路を導入および除去すること、ＤＮＡを機能的ユニット（例えば、代謝経路、合成オペロン）に組み換えること、および／またはＤＮＡの大きな断片における不安定な部位（例えば、天然または非天然の宿主がＤＮＡの配列を欠失または組換えする傾向にある部位）を決定することを含む。
【００６５】
標的ＤＮＡは、原核生物からのＤＮＡであり得る。標的ＤＮＡはまた、真核生物からのゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または葉緑体ＤＮＡであり得る。そこからのゲノムＤＮＡおよび／またはオルガネラＤＮＡが標的ＤＮＡとなり得るそのような生物の例は、限定されないが、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、藻類（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのような微細藻または大型藻）、紅藻、緑藻、珪藻、黄緑藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ類、ハプト藻、クリプトモナド、渦鞭毛藻、または植物プランクトンを含む。当業者は、これらの生物が単に例として列挙されること、および本明細書中に開示される方法が細菌、植物、真菌、原生生物、および動物を含むいかなる生物からの大きなＤＮＡにも適用可能であることを認識するだろう。本発明の遺伝子操作は、形質転換された細胞に、ＤＮＡの特定の配列を保存させ、そしてその配列をその子孫に安定的に維持させる配列を除去または挿入することによって、ＤＮＡの大きな断片を安定化させることを含み得る。遺伝子操作または、標的ＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡのコドンを変更して、宿主生物の任意のコドンバイアスを反映することを含み得る。さらに、本発明の遺伝子操作は、生物が生存するために必要な遺伝子の最小限のセットを決定することを含み得る。別の実施形態において、本発明の遺伝子操作は、特定の代謝経路が作成されて維持されるのに必要な遺伝子の最小限のセットを決定することを含む。
【００６６】
本発明の遺伝子操作は、ゲノム内および２つのゲノム間の両方の重複遺伝子（例えば、核ゲノムと葉緑体ゲノムとの間の重複）を決定することを含み得る。さらに、本発明の遺伝子操作は、人工的に合成されることができるＤＮＡの機能的配列（例えば、特定の代謝経路における遺伝子、機能的ゲノムの遺伝子）を決定することを含み得る。別の実施形態において、本発明の遺伝子操作は、カセット（例えば、遺伝子が容易に挿入または除去されることができるベクター内の部位）中にパッケージ化されたＤＮＡおよびゲノムを作成することを含む。本発明の遺伝子操作はまた、複数の種で生存可能な核ゲノムまたはオルガネラゲノム（例えば、移植可能な葉緑体ゲノム）を作成することを含み得る。さらに、本発明の遺伝子操作は、これらの操作または作成のいずれかの実現性を試験するための方法（例えば、シャトルベクターを宿主系に戻して、生存についてアッセイすること）を含み得る。
【００６７】
ベクター、マーカー、および形質転換
【００６８】
ベクターまたは他の組換え核酸分子は、選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列を含み得る。用語「選択可能マーカー」または「選択マーカー」は、検出可能な表現型を付与するポリヌクレオチド（またはコードされたポリペプチド）を意味する。選択可能マーカーは、一般的に、検出可能なポリペプチド、例えば、適当な因子（それぞれ、特定の波長の光またはルシフェリン）と接触した場合に目によって、または適当な器具を使用することによって検出されることができるシグナルを生成する、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼのような酵素をコードする（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１６：５９−７２，１９９６；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１２１，１９９６；Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９：４４−４７，１９９６；また、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１−３９０７，１９９７，ｆｌ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅも参照のこと）。選択可能マーカーは、一般的に、細胞において存在または発現される場合に選択的な利益（または不利益）、例えば、その他の場合その細胞を殺しかねない因子の存在下で増殖する能力を、マーカーを含有する細胞に提供する分子である。
【００６９】
選択可能なマーカーは、マーカーを発現する原核細胞または植物細胞あるいはその両方を得る手段を提供することができ、したがって、本発明のベクターの構成要素として有用であることができる（例えば、Ｂｏｃｋ（前出）２００１を参照のこと）。選択マーカーの例は、限定されないが、代謝拮抗剤耐性を付与するもの、例えば、メトトキサレートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３：１４３−１４９，１９９４）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン、およびパロマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７−９９５，１９８３）、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロ（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ  ３２：４８１−４８５，１９８４）、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用すること可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用すること可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：８０４７，１９８８）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤に対する耐性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ；ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編）；およびブラストサイジン  Ｓに対する耐性を付与する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：２３３６−２３３８，１９９５）を含む。さらなる選択可能マーカーは、除草剤耐性を付与するもの、例えば、ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するホスフィノシリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｗｈｉｔｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１０６２，１９９０；Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７９：６２５−６３１，１９９０）、グリホセート耐性を付与する変異ＥＰＳＰＶシンターゼ（Ｈｉｎｃｈｅｅら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９１：９１５−９２２，１９９８）、イミダゾリノンまたはスルホニルウレア耐性を付与する変異アセト乳酸シンターゼ（Ｌｅｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１−１２４８，１９８８）、アトラジンに対する耐性を付与する変異ｐｓｂＡ（Ｓｍｅｄａら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：９１１−９１７，１９９３）、または変異プロトポルフィノゲンオキシダーゼ（米国特許第５７６７３７３号を参照のこと）、またはグルホシネートのような除草剤に対する耐性を付与する他のマーカーを含む。選択可能マーカーは、真核細胞に対してジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはネオマイシン耐性を付与し、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物に対してテトラサイクリン；アンピシリン耐性を付与し；そして植物において、ブレオマイシン、ゲンタマイシン、グリホセート、ハイグロマイシン、カナマイシン、メトトキサレート、フレオマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、およびスルホニルウレア耐性を付与するポリヌクレオチドを含む（例えば、Ｍａｌｉｇａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，３９頁を参照のこと）。
【００７０】
核および色素体の形質転換のための方法はありふれたものであり、ポリヌクレオチドを植物細胞葉緑体中に導入するためによく知られている（米国特許第５４５１５１３号、同第５５４５８１７号、および同第５５４５８１８号；ＷＯ９５／１６７８３；ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５，１９９４を参照のこと）。いくつかの実施形態において、葉緑体形質転換は、所望のヌクレオチド配列に隣接する葉緑体ＤＮＡの領域を導入することを含み、標的葉緑体ゲノム中への外因性ＤＮＡの相同組換えを可能にさせる。場合によっては、葉緑体ゲノムＤＮＡの１〜１．５ｋｂの隣接ヌクレオチド配列が使用され得る。この方法を使用して、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与する、葉緑体１６Ｓ  ｒＲＮＡおよびｒｐｓ１２遺伝子における点変異が、形質転換についての選択可能マーカーとして利用されることができ（Ｓｖａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０，１９９０）、そして、１００回の照射につきおよそ１回の目標レベルの頻度で、安定した同質細胞質性形質転換をもたらすことができる。
【００７１】
マイクロプロジェクタイル媒介形質転換もまた、ポリヌクレオチドを植物細胞葉緑体中に導入するために使用されることができる（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３，１９８７）。この方法は、金またはタングステンのようなマイクロプロジェクタイルを使用し、それは、塩化カルシウム、スペルミジン、またはポリエチレングリコールでの沈降によって所望のポリヌクレオチドでコーティングされる。マイクロプロジェクタイル粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＤ−１０００粒子銃（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｃａｌｉｆ．）のような装置を使用して、植物組織中に高速で加速される。微粒子銃法を使用する形質転換のための方法は、当該分野においてよく知られている（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：４２３−４３１，１９９６を参照のこと）。マイクロプロジェクタイル媒介形質転換は、例えば、綿、タバコ、トウモロコシ、ハイブリッドポプラ、およびパパイヤを含む種々の植物種を産生するために使用されている。コムギ、オートムギ、オオムギ、モロコシ、およびコメのような重要な穀物もまた、マイクロプロジェクタイル媒介送達を使用して形質転換されている（Ｄｕａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：４９４−４９８，１９９６；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：１５８−１６２，１９９４）。大半の双子葉植物の形質転換は、上記に記載される方法により可能である。単子葉植物の形質転換もまた、例えば、上記に記載されるような微粒子銃法、プロトプラスト形質転換、部分的に透過化された細胞のエレクトロポレーション、ガラス繊維を使用するＤＮＡの導入、ガラスビーズ撹拌法などを使用して形質転換されることができる。
【００７２】
形質転換頻度は、劣性のｒＲＮＡまたはタンパク質抗生物質耐性遺伝子を、限定されないが、細菌性ａａｄＡ遺伝子を含む優性の選択可能マーカーで置換することによって増大され得る（ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７，１９９３）。ホモプラスティジック（ｈｏｍｏｐｌａｓｔｉｄｉｃ）状態に達するために、形質転換後におよそ１５〜２０回の細胞分裂サイクルが一般的に必要とされる。葉緑体がそのゲノムの複数のコピーを含有し得、したがって、用語「同質細胞質」または「ホモプラスミー」は、目的の特定の遺伝子座の全てのコピーが実質的に同一であることは当業者に理解される。各植物細胞に存在する環状色素体ゲノムの数千コピーの全ての中に遺伝子が相同組換えによって挿入される色素体発現は、核発現される遺伝子に勝る膨大なコピー数の利点を利用して、全ての可溶性植物タンパク質の１０％を容易に超えることができる発現レベルを可能にする。
【００７３】
本発明のベクター上の標的ＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、または合成ＤＮＡのヌクレオチド配列のいずれかは、形質転換された生物におけるヌクレオチド配列の発現のために偏ったコドンをさらに含むことができる。場合によっては、ヌクレオチド配列におけるコドンは、コドンの第３ヌクレオチド位置がＡ／Ｔリッチである。例えば、コドンの第３ヌクレオチド位置の少なくとも５０％はＡまたはＴである。他の例において、コドンはＧ／Ｃリッチであり、例えば、コドンの第３ヌクレオチド位置の少なくとも５０％はＧまたはＣである。
【００７４】
本発明のシャトルベクターのヌクレオチド配列は、葉緑体発現に適応されることができる。例えば、本明細書中のヌクレオチド配列は、葉緑体特異的プロモーターまたは葉緑体特異的調節制御領域を含むことができる。ヌクレオチド配列はまた、核発現のために適応されることもできる。例えば、ヌクレオチド配列は、核特異的プロモーターまたは核特異的調節制御領域を含むことができる。核配列は、葉緑体標的タンパク質（例えば、葉緑体輸送ペプチド）をコードする標的配列を有するタンパク質、または小胞体または原形質膜における堆積のための細胞内膜系にタンパク質を向けるシグナルペプチドをコードすることができる。
【００７５】
ベクターが燃料生成可能な遺伝子をコードする実施形態において、燃料生成物は、細胞の酵素含有量を変更することによって生成されて、特定の燃料分子の生合成を増大する。例えば、生合成酵素をコードするヌクレオチド配列（例えば、外因性の供給源から単離されたＯＲＦ）は、光合成生物の葉緑体中に導入されることができる。燃料生合成酵素をコードするヌクレオチド配列はまた、光合成生物の核ゲノム中に導入されることができる。核ゲノム中に導入されたヌクレオチド配列は、細胞の細胞質における生合成酵素の蓄積を支配することができ、または光合成生物の葉緑体における生合成酵素の蓄積を支配し得る。
【００７６】
本明細書中のヌクレオチド配列のいずれかは、調節制御配列をさらに含み得る。調節制御配列は、以下のうちの１つ以上を含むことができる：プロモーター、イントロン、エクソン、プロセシング要素、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、ＲＮＡ安定要素、または翻訳エンハンサー。プロモーターは、生物における発現に適応されたプロモーター、藻類プロモーター、葉緑体プロモーター、および核プロモーターのうちの１つ以上であり得、それらのいずれかは天然または合成のプロモーターであり得る。調節制御配列は、誘導可能または自己調節可能であることができる。調節制御配列は、自己配列および／または異種配列を含むことができる。いくつかの場合において、制御配列は、第１の相同配列および第２の相同配列によって隣接されることができる。第１および第２の相同配列は、それぞれ少なくとも長さ５００ヌクレオチドであることができる。相同配列は、遺伝子発現を促進するために、相同組換え、または異種配列を隔離するように作用することができることのいずれかを可能にすることができる。
【００７７】
ベクターはまた、限定されないが、抗体（その機能的部分を含む）、インターロイキン、および他の免疫調節剤、および抗生物質のような生物医薬品として有用な生成物の生成に関わる配列を含む。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄら、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：１００（４３８−４２）および米国出願公開第２００４／００１４１７４号を参照のこと。
【００７８】
本発明のベクターは、カセット化可能な細菌性ゲノムまたはその一部（例えば、細菌性ゲノムまたはその機能的部分を含む除去可能なＤＮＡフラグメント）を含み得る。さらに、本発明のベクターは、機能的ゲノムユニットを含み得る（例えば、代謝プロセス、生化学的経路、遺伝子発現のために不可欠なユニット）。本発明のベクターは、移植可能な細菌性ゲノムまたはその一部を含み得る。本発明のベクターは、転移可能な細菌性ゲノムまたはその一部を含み得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡの大きな断片は修飾される。修飾されたＤＮＡは、エタノール生成を実行するのに必要な全ての遺伝子、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｕｏｄｏｒｆｆ経路、グルコース耐性経路、エタノール耐性経路、カルボン酸副生成物耐性経路、酢酸耐性経路、糖輸送経路、糖発酵経路、および／またはセルロースおよびヘミセルロース消化経路に必要とされる全ての遺伝子を含み得る。
【００８０】
本発明のハイブリッドクローニング系および方法は、所定の核酸の捕捉および操作のための系としての酵母の高い多用途性と、そのような核酸の増幅のための細菌系の高い有効性とを組み合わせる。大きな核酸フラグメントの単離、操作、および送達を媒介するために相同組換えに頼る組換えベクターが構築された。本明細書中で記載される発明はまた、大きな核酸を、クローニング、操作、および送達するためにそのような組換えクローニングベクターを使用するための方法も提供する。最後に、本発明は、生化学経路分析、オルガネラ分析、および合成葉緑体構築の増強剤としてそのような組換えクローニング系を使用するための方法を提供する。
【００８１】
本発明のベクターは、酵母中に導入され得る。酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの好適な株であり得るが、他の酵母モデルも利用され得る。酵母中へのベクターの導入は、ベクターの遺伝子操作を可能にし得る。酵母ベクターは、文献において広く記載され、その操作方法もまた、以下で議論されるようによく知られている（例えば、Ｋｅｔｎｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：６１８６  ６１９０を参照のこと）。
【００８２】
遺伝子操作の後、クローニング系は、大量の核酸の調製に好適な細菌環境への移行を可能にし得る。細菌型ベクターの代表的な例は、限定されないが、Ｐ１人工染色体、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、および単コピープラスミドＦ因子を含む（Ｓｈｉｚｕｙａら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：８７９４  ８７９７）。同様に、細菌ベクターは当該分野において周知である（例えば、Ｉｏａｎｎｏｕら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ６：８４  ８９）。本発明はまた、酵母選択可能マーカー、細菌性選択可能マーカー、テロメア、動原体、酵母複製起点、および／または細菌性複製起点を含むシャトルベクターを提供する。
【００８３】
本発明のシャトルベクターは、酵母における相同組換えを可能にして、目的のベクターにおける目的の標的核酸を捕捉および組み込み得る。シャトルベクターは、ベクターが導入されることができる宿主のいずれかにおいて標的ＤＮＡの操作を可能にし得る。いくつかの実施形態において、所望の操作の後、シャトルベクター構成要素は除去され、修飾された標的ＤＮＡのみが残り得る。そのようなベクター配列の抽出は、標準的な方法を使用して実施されることができ、そして任意の宿主細胞において生じ得る。目的の標的核酸は、大きな核酸であることができ、そして例えば、ウイルスベクターのような、その中に含有される目的の外来遺伝子を含むベクターを含むことができる。標的核酸はまた、細菌（古細菌および真正細菌を含む）ゲノム、ウイルスゲノム、真菌ゲノム、原生生物ゲノム、植物または動物のゲノム、あるいはそれらの一部であることができる。例えば、本発明の１つの実施形態の標的核酸は、全原核生物ゲノムを含む。さらなる例として、本発明の標的核酸は、真核生物の葉緑体ゲノムを含み得る。
【００８４】
本発明によるシャトルベクターは、酵母におけるテロメアおよび動原体として機能する適当に配向されたＤＮＡを含み得る。任意の好適なテロメアが使用され得る。好適なテロメアは、限定されないが、多くの生物由来のテロメア反復を含み、それは酵母においてテロメア機能を提供することができる。ヒトにおける末端反復配列（ＴＴＡＧＧＧ）Nは、トリパノソーマにおける末端反復配列と同一であり、そして、酵母（（ＴＧ）1-3）Nおよびテトラヒメナ（ＴＴＧＧＧ）Nの末端反復配列と類似である（Ｓｚｏｓｔａｋ  ＆  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９：２４５  ２５５；Ｂｒｏｗｎ（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：２３７７  ２３８５；およびＭｏｙｚｉｓら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：６６２２  ６６２６）。
【００８５】
用語「動原体」は、減数分裂時および有糸分裂時に本発明のベクターの安定な複製および正確な分割を媒介し、それによって娘細胞への適切な分離を確実にする核酸を特定するために本明細書中で使用される。好適な動原体は、限定されないが、大きな線状プラスミドに対して有糸分裂および減数分裂の安定性を付与する酵母動原体ＣＥＮ４を含む（Ｍｕｒｒａｙ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：１８９  １９３；Ｃａｒｂｏｎ（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：３５１  ３５３；およびＣｌａｒｋら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８７：５０４  ５０９）。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明による環状ベクターの２つのセグメントのうちの少なくとも１つは、最適な宿主細胞／粒子において機能的な少なくとも１つの複製系を含む。以下で明らかになるように、当業者は、最適な標的核酸の操作、増幅、および／または送達が１つより多い宿主細胞／粒子の使用を必要とし得ることを理解するだろう。したがって、各々の最適な宿主細胞／粒子において機能的な１つより多い複製系が含まれ得る。
【００８７】
宿主細胞が原核生物、特にＥ．ｃｏｌｉである場合、複製系は、例えば、Ｐ１プラスミドレプリコン、ｏｒｉ、Ｐ１細胞溶解レプリコン、ＣｏｌＥ１、ＢＡＣ、単コピープラスミドＦ因子などのような原核生物において機能的なものを含む。片方または両方のセグメント、および／または環状ベクターのいずれかは、大きな核酸の複製を支援することが可能な酵母複製起点をさらに含み得る。本発明による複製領域の非限定的な例は、自己複製配列または「ＡＲＳ要素」を含む。ＡＲＳ要素は、高頻度の形質転換が付与された酵母配列として同定された。テトラヒメナＤＮＡ末端は、ＡＲＳ１およびＡＲＳ４と共に酵母においてＡＲＳ要素として使用されてきた（Ｋｉｓｓら（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：５３５  ５４３；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９；およびＢａｒｔｏｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：２３５４）。各セグメント（例えば、ギャップ充填シャトルベクターの酵母要素および細菌要素に対応するセグメント）について、２つ以上の複製起点が存在し得る。
【００８８】
本発明の態様による第１および／または第２のセグメントは、環状化ベクター形態（例えば、プラスミド形態）に結合され得る。環状化は、目的のセグメントを使用してインビボまたはインビトロで生じることができる。あるいは、目的の環状ベクターが使用されることができる。本明細書で使用される用語「ベクター」は、その中にＤＮＡまたは他の核酸がクローニングされ得るプラスミドまたはファージＤＮＡを示す。ベクターは、宿主細胞において自律的に複製し得、そして、１個または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によってさらに特徴付けられ得、そこで、そのような核酸が特定可能な様式で切断されて、その中に核酸フラグメントが挿入され得る。ベクターは、ベクターで形質転換された細胞の特定に適した選択可能マーカーをさらに含み得る。
【００８９】
本発明の標的核酸は、複雑性においてかなり異なり得る。標的核酸は、ウイルスＤＮＡ、原核生物ＤＮＡ、または真核生物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、エクソン（コード）配列、および／またはイントロン（非コード）配列を含み得る。したがって、本発明の標的核酸は、１個以上の遺伝子を含み得る。標的核酸は、染色体、ゲノム、またはオペロン、および／または染色体、ゲノム、またはオペロンの一部であり得る。標的核酸は、経路における全ての遺伝子に対するコード配列、オルガネラの生存に必要な遺伝子の最小限の相補体、および／または生物の生存に必要な遺伝子の最小限の相補体含み得る。標的核酸は、限定されないが、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓのＤＮＡ配列を含み得る。標的核酸は、限定されないが、葉緑体ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む、真核生物葉緑体ＤＮＡ配列を含み得る。標的核酸は、限定されないが、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む、シアノバクテリアＤＮＡを含み得る。標的核酸はまた、いかなる起源および／または性質のものでもあり得る。
【００９０】
効果的に転写を促進するために、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターもまた含むことは遺伝子にとって望ましい場合がある。エンハンサー、リプレッサー、および他の調節配列もまた、当該分野においてよく知られているように、遺伝子の活性を調節するために含まれ得る。本明細書中に提供される遺伝子は、個々の宿主細胞のゲノムにおいて見出される（すなわち、内因性の）遺伝子、または個々の宿主細胞のゲノムにおいて見出されない（すなわち、外因性の、または「外来遺伝子」）遺伝子を意味することができる。外来遺伝子は、宿主と同じ種または異なる種に由来し得る。細胞において発現される目的の遺伝子を含有するＤＮＡを使用する細胞のトランスフェクションのために、ＤＮＡは、発現のために必要とされる配向で遺伝子の発現のために必要な任意の制御配列を含有し得る。本明細書で使用される用語「イントロン」は、タンパク質に翻訳されず、かつ一般的にエクソンの間に見出される、所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を意味する。
【００９１】
遺伝要素、あるいはポリペプチドをコードする領域、または転写または翻訳、または宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを調節する領域を含むポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドをコードする領域および発現を制御するそれに作動可能に連結された領域の両方を含むポリヌクレオチド。遺伝要素は、ベクター内に含まれ得、それは、エピソーム要素として、すなわち宿主細胞ゲノムから物理的に独立した分子として複製する。それらは、真核細胞におけるメトトキサレート選択によってトランスフェクトされたＤＮＡの増幅時に生じるもののような、ミニ染色体内に含まれ得る。遺伝要素はまた、宿主細胞ゲノム内に、それらの自然な状態ではなく、むしろ単離、クローニング、および精製されたＤＮＡの形態での、または特にベクターにおける宿主細胞への導入などのような操作の後で含まれ得る。
【００９２】
本発明のベクターは、十分に線状の、作製されたかまたは遺伝子、転写制御要素、または遺伝子内ＤＮＡのような標的核酸の一部にハイブリダイズする能力を有する同一性または類似性（相同性）を含有し得る。理論に束縛されないが、そのようなハイブリダイゼーションは、通常、相補的な鎖間の、好ましくはワトソン・クリック塩基対を形成する塩基特異的な水素結合の結果である。実際問題として、そのような相同性は、相同組換え事象の観察から推論されることができる。いくつかの実施形態において、そのような相同性は、線状核酸の約８個〜約１０００個の塩基である。他の実施形態において、そのような相同性は、約１２個〜約５００個の塩基である。当業者は、相同性は、核酸の広がりにより長く拡大し得ることを理解するだろう。
【００９３】
相同組換えは、遺伝子組み換えの１つのタイプであり、ＤＮＡの二本鎖の間で起こる物理的再配列のプロセスである。相同組換えは、類似配列の配置、配置されたＤＮＡ鎖の交差、およびＤＮＡの破壊および修復に関連して、鎖間の物質の交換を生じる。相同組換えのプロセスは、生物において自然に発生し、そしてまた、生物に遺伝的変化を導入するための分子生物学技術としても利用される。
【００９４】
本発明のベクターは、標的配列以外の機能的構成要素をさらに含むように修飾され得、それは構築物の調製、増幅、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクション、そして該当する場合、宿主細胞への組み込みにおける使用を見出し得る。例えば、ベクターは、宿主ＤＮＡ中への組み込みのための領域を含み得る。組込みは、宿主細胞の核ＤＮＡ中へのものであり得る。いくつかの実施形態において、組込みは、葉緑体ＤＮＡのような非核ＤＮＡ中へのものであり得る。ベクターの他の機能的構成要素は、限定されないが、マーカー、リンカー、および制限部位を含み得る。
【００９５】
標的核酸は、調節核酸を含み得る。調節核酸は、複製、転写および／または、それによって制御される核酸の発現を（直接的または間接的に、そして上方または下方のいずれかに）調節する任意の配列または核酸を意味する。そのような調節核酸による制御は、核酸を構造的または誘導的に、転写および／または翻訳させ得る。本明細書中のヌクレオチド配列のいずれかは、調節制御配列をさらに含み得る。調節制御配列の例は、限定されないが、以下のうちの１つ以上を含むことができる：プロモーター、イントロン、エクソン、プロセシング要素、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、ＲＮＡ安定要素、または翻訳エンハンサー。プロモーターは、生物（例えば、細菌、真菌、ウイルス、植物、哺乳動物、または原生生物）における発現に適応されたプロモーター、藻類プロモーター、葉緑体（または他の色素体）プロモーター、ミトコンドリアプロモーター、および核プロモーターのうちの１つ以上であり得、それらのいずれかは天然または合成のプロモーターであり得る。調節制御配列は、誘導可能または自己調節可能であることができる。調節制御配列は、自己配列および／または異種配列を含むことができる。いくつかの場合において、制御配列は、第１の相同配列および第２の相同配列によって隣接されることができる。第１および第２の相同配列は、それぞれ少なくとも長さ５００ヌクレオチドであることができる。相同配列は、遺伝子発現を促進するために、相同組換え、または異種配列を隔離するように作用することができることのいずれかを可能にすることができる。
【００９６】
場合によっては、本発明のシャトルベクターに存在する標的ＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、または他のＤＮＡは、ポリペプチド産物の生成をもたらさず、むしろ細胞からの産物の分泌を可能にする。これらの場合において、ヌクレオチド配列は、生物から外部環境への生成物の分泌を高め、または開始し、または速度を速めるタンパク質をコードし得る。したがって、本発明のベクターのセグメントおよび／またはベクターは、例えば、転写開始領域のような転写調節領域を含み得る。当業者は、多くの転写開始配列が単離されて利用可能であり、チミジンキナーゼプロモーター、βアクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、およびＳＶ４０プロモーターを含むことを理解するだろう。
【００９７】
本発明の１つの実施形態は、ギャップ充填ベクターを製造する方法を提供する。ギャップ充填ベクターは、標的核酸の５’領域および３’領域に相同な配列間の領域（ギャップ）を充填することによって、本発明による標的核酸の相同組換えおよび挿入を経験し得る。したがって、いくつかの実施形態において、本クローニング系は、相同組換え可能な条件下で標的核酸と接触され得る。
【００９８】
別の方法は、（ｉ）標的核酸の５’末端に相同な第１の核酸を含む第１のセグメント、第１の選択可能マーカー、および第１の環化要素；（ｉｉ）標的核酸；および（ｉｉｉ）標的核酸の３’末端に相同な第２の核酸を含む第２のセグメント、第２の選択可能マーカー、および第２の環化要素を、相同組換え可能な条件下で組み合わせる。本発明の１つの実施形態は、２つのアームおよび標的核酸の間の相同組換えによってギャップ充填ベクターを製造する。アームおよび標的核酸において見出される相同領域間の交換は、相同核酸の間の任意の点における相同組換えによって行われる。本発明の環状ベクターに関して、「ギャップ充填」は、本質的には、ベクター中への標的核酸の挿入（すなわち、サブクローニング）である。
【００９９】
相同組換えは、当該分野において周知の方法に従ってインビトロで行われ得る。例えば、本発明の方法は、酵母溶解物の調製物を使用して実施されることができる。相同組換えは、インビボで行われ得る。したがって、本発明の方法は、相同組換え事象を支持することが可能な任意の宿主、例えば、細菌、酵母、および哺乳動物細胞を使用して実施され得る。当業者は、好適な宿主の選択が方法のクローニング系において使用される選択可能マーカーの特定の組み合わせに依存することを理解するだろう。
【０１００】
目的の宿主細胞中にベクターを導入するために使用され得る技術は、カルシウムリン酸／ＤＮＡ共沈、エレクトロポレーション、細菌原形質融合、核へのＤＮＡのマイクロインジェクションなどを含む。当業者は、多くのプロトコルが、例えば、Ｋｅｏｗｎら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：５２７  ５３７，１９９０）に記載されるように、例えば哺乳動物細胞をトランスフェクトするために、事実上交換可能に使用され得ることを理解するだろう。
【０１０１】
形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのような土壌菌を使用することによって達成され得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、遺伝子操作されたプラスミドベクター、または選択された余分な遺伝子のキャリアを担持し得る。葉のような植物組織は、小片、例えば１０×１０ｍｍに切断され、懸濁されたアグロバクテリウムを含有する液体中に１０分間浸される。切断された一部の細胞は、細胞中にそのＤＮＡを挿入する細菌によって形質転換される。選択可能な発根および発芽培地上に置かれると、植物は再生するだろう。一部の植物種は、花をアグロバクテリウムの懸濁液中に浸漬し、次いで、種を選択的培地に播種することによるだけで形質転換されることができる。
【０１０２】
別の方法は、「遺伝子銃」アプローチの使用である。遺伝子銃は、微粒子銃法（また、生物弾道法としても知られる）と呼ばれる方法の一部であり、特定の条件下で、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）が「ねばねば」になり、金属原子（通常、タングステンまたは金）のような生物学的に不活性な粒子に接着する。このＤＮＡ−粒子複合体を不完全真空化で加速し、標的組織を加速経路内に置くことによって、ＤＮＡが効果的に導入される。コーティングされていない金属粒子はまた、細胞を囲むＤＮＡを含有する溶液を介して照射され、したがって、遺伝物質を取り出して、生細胞に進入することができ得る。有孔プレートはシェルカートリッジを止めるが、反対側の生細胞に金属の薄片を通過させて進入させる。所望のＤＮＡを入手する細胞は、マーカー遺伝子の使用によって特定され（植物におけるＧＵＳの使用が最も一般的）、次いで、遺伝子を複製するために培養され、場合によりクローニングされる。微粒子銃法は、遺伝子を殺虫剤耐性または除草剤耐性のような植物細胞中に挿入するために最も有用である。粒子を加速するために、様々な方法が使用されてきた：これらの方法は、空気圧装置；機械的インパルスまたはマクロプロジェクタイル（ｍａｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を利用する機器；求心力、磁力、または静電気力；スプレーガンまたはワクチン接種銃；および放電のような衝撃派による加速に基づく装置を含む（例えば、ＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＭｃＣａｂｅ，１９９２，Ａｇｒａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｐｌａｎｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  （ＡＣＣＥＬＬ（商標）  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を参照のこと）。
【０１０３】
形質転換は、例えば、宿主が細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）である場合、Ｃｏｈｅｎらの方法  （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９））、またはコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１））、宿主がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである場合、Ｈｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２７（１９７８））、またはリチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３（１９８３））、宿主が動物細胞である場合、Ｇｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３））、および宿主細胞が昆虫細胞である場合、Ｓｕｍｍｅｒｓらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２１５６−２１６５（１９８３））に従って実施されることができる。典型的には、形質転換事象の後に、潜在的な形質転換体は、選択および／または培養のために栄養培地に培養される。
【０１０４】
栄養培地は、好ましくは、宿主細胞（形質転換体）の増殖に必要な炭素供給源、無機窒素供給源、または有機窒素供給源を含む。炭素供給源の例は、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、およびスクロースであり、そして、無機窒素または有機窒素の供給源は、アンモニウム塩、硝酸塩、アミノ酸、トウモロコシ浸出液、ペプトン、カゼイン、肉抽出物、ダイズケーキ、およびジャガイモ抽出物である。所望される場合、培地は、他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、および塩化マグネシウム）、ビタミン、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシンなど））を含み得る。光合成独立栄養生物であり得、したがって、彼ら自身の炭素供給源を生成することができる生物のような、いくつかの光合成生物のための培地は、炭素供給源を必要としない場合がある。
【０１０５】
培養および／または選択は、当該分野において公知の方法によって実施される。温度、培地のｐＨ、および培養時間のような培養および選択の条件は、ベクター、宿主細胞、および本発明の方法にふさわしく選択される。当業者は、宿主細胞（形質転換体）のタイプおよびベクターの性質（例えば、選択可能マーカーが存在する）に依存して、多くの特異的培地および培養／選択条件が使用されることができることを認識するだろう。本明細書における培地は、単に例示のために記載されており、限定されない。
【０１０６】
宿主が細菌、放線菌、酵母、または糸状の真菌である場合、上記で言及される栄養供給源を含む培地が適当である。宿主がＥ．ｃｏｌｉである場合、好ましい培地の例はＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら  Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１（１９７２））などである。宿主が酵母である場合、培地の例はＢｕｒｋｈｏｔｅｒ最少培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４５０５（１９８０））である。
【０１０７】
酵母におけるベクターの選択は、酵母選択可能マーカーの使用によって達成され得る。例は、限定されないが、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＡＤＥマーカーを含む。本発明のいくつかの実施形態において、ベクターまたはそのセグメントは、２つ以上の選択可能マーカーを含み得る。したがって、１つの実施形態において、本発明のベクターのセグメントは、標的核酸との相同組換えの際に失われるＡＤＥマーカーおよびＨＩＳ３マーカーを含み得る。他方のセグメントは、ＴＲＰ１マーカーを含み得る。選択は、形質転換された細胞を好適なドロップアウト培地上で増殖させることによって達成される（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。例えば、ＨＩＳ３は、第１のセグメントを含有する細胞の選択を可能にする。ＴＲＰ１は、第２のセグメントを含有する細胞の選択を可能にする。ＡＤＥは、総合組換えが起こったクローンのスクリーニングおよび選択を可能にする。ＡＤＥは、色の選択（赤）を可能にする。
【０１０８】
組換え酵母細胞は、当該分野において公知の方法に従って、本明細書中に記載される選択可能マーカーを使用して選択され得る。したがって、当業者は、本発明のギャップ充填ベクターを含む組換え酵母細胞が、その中に含まれる選択可能マーカーに基づいて選択され得ることを理解するだろう。例えば、ＨＩＳ３およびＴＲＰ１を担持する組換えベクターは、ヒスチジンおよびトリプトファンを欠くドロップアウト選択培地の存在下で形質転換された酵母細胞を増殖することによって選択され得る。単離された陽性クローンは、さらに精製され、例えば、制限分析、電気泳動法、サザンブロット分析、ポリメラーゼ鎖反応などによって、本発明の組換えベクターの存在および構造を確認するために分析され得る。本発明は、本発明の方法によって遺伝子操作されたギャップ充填ベクターをさらに提供する。そのようなベクターは、本発明のセグメントまたはベクターと、最適な標的核酸との間の相同組換えの産物である。本発明はまた、本発明によるクローニング系またはベクターを含む原核細胞および／または真核宿主細胞を提供する。生物は、単細胞性または多細胞性であることができる。生物は、本来は光合成生物であっても良いし、本来は非光合成生物であっても良い。形質転換されることができる生物の他の例は、維管束生物および非維管束生物を含む。植物細胞、酵母細胞、動物細胞、藻細胞、または昆虫細胞のような宿主が使用される場合、本発明のベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および終止コドンを含有し得る。本発明のベクターはまた、必要とされる場合、通常使用される遺伝子増幅のためのポリヌクレオチド（マーカー）を含有し得る。
【０１０９】
生成物
【０１１０】
本発明のベクターは、ベクター含む生物において本来生成される、または本来は生成されない生成物の生成をもたらす配列を含み得る。場合によっては、ベクター上の１つ以上の配列によってコードされる生成物は、例えば、酵素である。本発明の実施において利用され得る酵素は、細菌、植物、真菌、および動物を含む任意の生物に由来するヌクレオチド配列によってコードされ得る。ベクターはまた、生物からの生成物の生成または分泌に影響するヌクレオチド配列を含み得る。場合によっては、そのようなヌクレオチド配列は、イソプレノイド生合成経路において機能する１種以上の酵素をコードする。イソプレノイド生合成経路におけるポリペプチドの例は、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ３０、およびＣ４０シンターゼのようなシンターゼを含む。場合によっては、酵素は、イソプレノイド生成酵素である。場合によっては、イソプレノイド生成酵素は、２つのリン酸基を有するイソプレノイドを生成する（例えば、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ＤＭＡＰＰシンターゼ）。他の例において、イソプレノイド生成酵素は、０個、１個、３個またはそれ以上のリン酸を有するイソプレノイドを生成するか、あるいは、他の官能基を有するイソプレノイドを生成し得る。本発明において有用な酵素および他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されないが、クローニング、サブクローニング、およびＰＣＲを含む当該分野において公知の任意の手段によって単離および／または合成され得る。
【０１１１】
本発明における使用のためのイソプレノイド生成酵素はまた、ボトリオコッセンシンターゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−ｅｐｉ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニルジホスフェートシンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロホスフェートシンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレネシンターゼ、ｓｙｎ−コパリルジホスフェートシンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、エント−サンダアラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル（ｓｔｅｒｎｅｒ）−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベサトリエン（ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｔｒｉｅｎｅ）シンターゼ、サンダロール（ｓａｎｄａｌｏｌ）シンターゼ、パチュロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼ、またはマノオールシンターゼであり得る。
【０１１２】
本発明のベクターによって生成され得る他の酵素は、バイオマス分解酵素を含む。バイオマス分解酵素の非限定的な例は、セルロース分解酵素、ヘミセルロース分解酵素、ペクチン分解酵素、キシラナーゼ、リグニン分解酵素、セルラーゼ、セロビアーゼ、軟化酵素（例えば、エンドポリガラクトロナーゼ）、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素、イヌリナーゼ、溶解酵素、ホスホリパーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、エンドキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、α−ガラクトシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、およびフェルロイルエステラーゼを含む。そのような酵素をコードする遺伝子の例は、限定されないが、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ（例えば、β−グルコシダーゼ、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ）、エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、およびキシラナーゼ（エンドキシラナーゼおよびエキソキシラナーゼ）を含む。リグニン分解酵素の例は、限定されないが、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｏｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のリグニンペロキシダーゼおよびマンガネーゼペロキシダーゼを含む。当業者は、これらの酵素が本発明において使用されることのできる酵素の部分的な列挙にすぎないことを理解するだろう。
【０１１３】
本発明は、宿主細胞（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓのような藻細胞、およびシアノバクテリア細胞）および／または１種以上の異なる酵素をコードする核酸を有する宿主細胞を含む生物による脂肪酸、脂質、または油の生成に寄与する酵素を作製することを意図する。いくつかの実施形態において、脂肪酸、脂質、または油の生成に寄与する酵素は、同化酵素である。脂肪酸の生成に寄与する同化酵素のいくつかの例は、限定されないが、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ケトレダクターゼ、チオエステラーゼ、マロニルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡリガーゼ、ケトアシルシンターゼ、エノイルレダクターゼ、およびデサチュラーゼを含む。いくつかの実施形態において、酵素は、異化酵素または生分解酵素である。いくつかの実施形態において、単一の酵素が生成される。
【０１１４】
いくつかの宿主は、１種以上の酵素をコードする複数の遺伝子で形質転換され得る。例えば、単一の形質転換された細胞は、全脂肪酸合成経路を作り出す酵素をコードする外因性核酸を含有し得る。経路の１つの例は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニルトランスフェラーゼ、ケトアシルシンターゼ、およびチオエステラーゼをコードする遺伝子を含み得る。全経路および／またはそれらから抽出される酵素で形質転換された細胞は、完全な脂肪酸または脂肪酸の中間体の合成経路を合成することができる。いくつかの実施形態において、構築物は、同じ遺伝子の複数コピー、および／または異なる生物由来の同じ酵素をコードする複数の遺伝子、および／またはコード配列の１つ以上の部分に変異を有する複数の遺伝子を含有し得る。
【０１１５】
場合によっては、生成物（例えば、燃料、香料、殺虫剤）は、炭化水素の豊富な分子、例えば、テルペンである。（イソプレノイドユニットの数によって分類される）テルペンは、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、またはテトラテルペンであることができる。特定の実施形態において、テルペンはステロイドまたはカロテノイドのようなテルペノイド（別名イソプレノイド）である。カロテノイドのサブクラスは、カロテンおよびキサントフィルを含む。特定の実施形態において、燃料生成物は、リモネン、１，８−シネオール、α−ピネン、カンフェン、（＋）−サビネン、ミルセン、タキサジエン、ファルネシルピロホスフェート、アモルファジエン、（Ｅ）−α−ビサボレン、βカロテン、αカロテン、リコピン、またはジアポフィトエンである。これらのテルペンの一部は、純粋な炭化水素（例えば、リモネン）であり、他のものは炭化水素誘導体（例えば、シネオール）である。
【０１１６】
燃料生成物の例は、石油化学製品およびそれらの前駆物質、ならびに石油化学産業において有用であり得る他の全ての物質を含む。燃料生成物は、例えば、石油生成物および石油の前駆物質、ならびにその石油化学製品およびその前駆物質を含む。燃料生成物は、石油生成物および石油化学製品を含む、石油化学産業において有用な物質または材料を生産するために使用され得る。燃料または燃料生成物は、ボイラー、窯、乾燥機、火炉のような燃焼器において使用され得る。燃焼器の他の例は、ガソリンエンジン、ディーゼルエンジン、ジェットエンジンなどを含む、自動車エンジンまたは発電機のような内燃機関である。燃料生成物はまた、プラスチック、樹脂、繊維、エラストマー、潤滑剤、およびゲルを製造するためにも使用され得る。
【０１１７】
本明細書中で意図される生成物の例は、炭化水素生成物および炭化水素誘導体生成物を含む。炭化水素生成物は、水素分子および炭素分子からなる生成物である。炭化水素誘導体生成物は、１個以上のヘテロ原子を有する炭化水素生成物であって、ここで、ヘテロ原子は水素または炭素ではない任意の原子である。限定されないが、ヘテロ原子の例は、窒素、酸素、硫黄、およびリンを含む。一部の生成物は、炭化水素が豊富であり、生成物の少なくとも５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、または９５重量％は炭素および水素から作られる。
【０１１８】
炭素水素のような燃料生成物は、液化石油ガス、ナフサ（リグロイン）、ガソリン、ケロセン、ディーゼル、潤滑油、重質気体、コークス、アスファルト、タール、およびワックスのような、従来は原油または石油に由来する前駆物質または生成物であり得る。例えば、燃料生成物は、メタン、エタン、プロパン、またはブタンのような小さいアルカン（例えば、１個〜およそ４個の炭素）を含み得、それはプラスチックを（例えば、調理において）加熱または製造するために使用され得る。燃料生成物はまた、ナフサまたはリグロイン、またはその前駆物質のような、およそ５個〜およそ９個の炭素原子の炭素骨格を有する分子も含み得る。他の燃料生成物は、ガソリンまたはモーター燃料として使用される、約５個〜約１２個の炭素原子またはシクロアルカンであり得る。ケロセンまたはその前駆物質のような、およそ１０個〜およそ１８個の炭素の分子および芳香族化合物もまた、燃料生成物であり得る。燃料生成物はまた、潤滑油のために使用されるような、１２個以上の炭素を有する分子またはその前駆物質も含み得る。他の燃料生成物は、典型的には、およそ２０個〜およそ７０個の炭素のアルカン、シクロアルカン、および芳香族化合物を含有する、重質気体または燃料油、またはそれらの前駆物質を含む。燃料生成物はまた、一般的には、約７０個以上の炭素を有する複数の環およびそれらの前駆物質を含有するコークス、アスファルト、タール、およびワックスのような原油からの他の残留物も含む。
【０１１９】
宿主細胞および宿主生物
【０１２０】
本明細書中のベクターおよび方法を使用して形質転換されることができる生物の例は、維管束生物および非維管束生物を含む。生物は、原核生物または真核生物であることができる。生物は、単細胞生物または多細胞生物であることができる。
【０１２１】
真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅまたはＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）のような真核細胞は、本発明の方法および組成物を使用して形質転換され得る。真菌細胞／酵母細胞中に核酸を導入するための方法は、当該分野において周知である。したがって、そのような工程は、従来の形質転換方法によって達成され得る。好適な方法の非限定的な例は、エレクトロポレーション、アルカリカチオンプロトコル、およびスフェロプラスト形質転換を含む。
【０１２２】
非維管束光合成生物の例は、ゼニゴケ類またはツノゴケ類のような苔植物類を含む。場合によっては、生物はシアノバクテリアである。場合によっては、生物は藻類（例えば、大型藻または微細藻）である。藻類は、単細胞藻類または多細胞藻類であることができる。場合によっては、生物は、紅藻、緑藻、珪藻、黄緑藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ類、ハプト藻、クリプトモナド、渦鞭毛藻、または植物プランクトンである。
【０１２３】
本発明の方法は、微細藻のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを使用して例示される。本発明の方法によるポリペプチドまたはタンパク質複合体を発現するための微細藻の使用は、市販（Ｃｙａｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．；Ｋａｉｌｕａ−Ｋｏｎａ  ＨＩ）を含む、微細藻の大きな個体群が増殖することができる利益を提供し、したがって、大量の所望の生成物の生成、および所望される場合、単離を可能にする。しかしながら、例えば、タンパク質複合体を含む機能的ポリペプチドを任意の植物の葉緑体において発現する能力、および／または葉緑体または任意の植物を修飾する能力は、そのような植物の作物の生産を可能にし、したがって、大量のポリペプチドを都合よく生成する能力を可能にする。したがって、本発明の方法は、例えば、大型藻（例えば、海草および海藻）、ならびに、土壌で成長する植物、例えば、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アブラナ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種油のもととして有用なこれらのアブラナ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、カッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボガド（Ｐｅｒｓｅａ  ｕｌｔｉｌａｎｅ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、オートムギ、ウキクサ（Ｌｅｍｎａ）、オオムギ、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、サヤマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖ��ｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ならびにキュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）のようなキュウリ属のメンバーを含む、葉緑体を有する任意の植物を使用して実施されることができる。ツツジ（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、ラッパスイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキクのような観葉植物もまた含まれる。本発明の方法を実施するために有用なさらなる観葉植物は、ツリフネソウ属、ベゴニア、テンジクアオイ、スミレ、シクラメン、バーベナ、ツルニチソウ、マンジュギク、サクラソウ、セントポーリア、アゲラタム、ヒユ属、アンティリヌム、オダマキ、フウキギク、クローバー、コスモス、ササゲ、ダリア、ダチュラ、ヒエンソウ、ガーベラ、グラジオラス、グロキシニア、アマリリス、マツバギク、サルメンバナ、およびヒャクニチソウを含む。本発明を実施する際に使用され得る針葉樹は、例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）およびモンテレーマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）、ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）のようなマツ；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｕｌｔｉｌａｎｅ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）；アメリカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；シルバーファー（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムファー（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ）のようなトゥルーファー；ならびにウエスタンレッドシーダー（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカイエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）のようなシーダーを含む。
【０１２４】
本発明の方法を実施するために有用なマメ科の植物は、マメ類およびエンドウ類を含む。マメ類は、グアー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、ヤエナリ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメなどを含む。マメ科は、限定されないが、ラッカセイ属（例えば、ピーナッツ）、ソラマメ属（例えば、タマザキクサフジ、ヘアリーベッチ、アズキ、ヤエナリ、およびヒヨコマメ）、ルピナス属（例えば、ルピナス、シャジクソウ、）、インゲンマメ属（例えば、インゲンマメおよびライマメ）、エンドウ属（例えば、フィールドマメ）、シナガワハギ属（例えば、クローバー）、ウマゴヤシ属（例えば、アルファルファ）、ハス属（例えば、シャジクソウ）、レンズマメ属（例えば、レンズマメ）、およびクロバナエンジュを含む。本発明の方法における使用のための好ましい飼料および芝草は、アルファルファ、カモガヤ、ヒロハノウシノケグサ、ペレニアルライグラス、ハイコヌカグサ、およびコヌカグサを含む。本発明において有用な他の植物は、アカシア、アネット、チョウセンアザミ、ルッコラ、ブラックベリー、キャノーラ、コリアンダー、クレメンタイン、キクヂシャ、ユーカリ、フェンネル、グレープフルーツ、ハニーデュー、クズイモ、キウィフルーツ、レモン、ライム、マッシュルーム、ナッツ、オクラ、オレンジ、パセリ、カキ、オオバコ、ザクロ、ポプラ、ラジアータ、マツ、赤チコリ、サザンパイン、モミジバフウ、タンジェリン、ライコムギ、ツル、ヤムイモ、リンゴ、セイヨウナシ、マルメロ、サクランボ、アプリコット、メロン、アサ、ソバ、ブドウ、ラズベリー、アガサ、ブルーベリー、ネクタリン、モモ、プラム、イチゴ、スイカ、ナス、コショウ、カリフラワー、アブラナ属（例えば、ブロッコリー、キャベツ、ウルチランスプラウト（ｕｌｔｉｌａｎ  ｓｐｒｏｕｔ）、タマネギ、ニンジン、リーキ、ビート、ソラマメ、セロリ、ラディッシュ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、エンダイブ、ゴード、ニンニク、サヤマメ、ホウレンソウ、、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、カブ、ウルチラン（ｕｌｔｉｌａｎｅ）、チコリ、アピオス、およびズッキーニ）を含む。したがって、本明細書中で意図される組成物は、上記の核酸のいずれかを含む宿主生物を含む。宿主生物は、任意の葉緑体含有生物であることができる。
【０１２５】
用語「植物」は、本明細書において広く使用されて、色素体、特に葉緑体を含有する真核生物であり、かつ、成長の任意の段階の任意のそのような生物を含む真核生物、または、植物の挿し木、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官、植物の種子、および胚を含む、植物の一部を意味する。植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的単位および生理学的単位である。植物細胞は、単離された単一細胞または培養された細胞の形態であることができ、またはより高度に組織化された単位、例えば、植物組織、植物器官、または植物の一部であることができる。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または完全な植物に再生することができる細胞または細胞の集合であることができる。そのようなものとして、複数の植物細胞を含みかつ完全な植物に再生することができる種子は、本開示の目的のための植物細胞と判断される。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造的単位または機能的単位へと組織化される任意の他の植物細胞の群であることができる。植物の特に有用な部分は、採取可能な部分および子孫植物の増殖のために有用な部分を含む。植物の採取可能な部分は、植物の任意の有用な部分、例えば、花、花粉、苗、塊茎、葉、茎、果実、種子、根などであることができる。増殖のために有用な植物の部分は、例えば、種子、果実、挿し木、苗、塊茎、根茎などを含む。
【０１２６】
真核宿主細胞は、真菌細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｚ．ｐｏｍｂｅ、またはＵ．ｍａｙｄｉｓ）であり得る。原核宿主細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、シアノバクテリアおよび光合成細菌（例えば、シネコシスティス属またはシネココッカス属またはアースロスピラ属の種）を含む。宿主生物（または標的ＤＮＡの供給源）であり得る非維管束植物の例は、ゼニゴケ類またはツノゴメ類のような苔植物類を含む。場合によっては、生物は藻類（例えば、大型藻またはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｓｐ．のような微細藻）である。藻類は、単細胞藻類または多細胞藻類であることができる。場合によっては、生物は、紅藻、緑藻、珪藻、黄緑藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ類、ハプト藻、クリプトモナド、渦鞭毛藻、または植物プランクトンである。他の例において、当業者は、これらの生物が単に例として与えられており、かつ他の生物が適当な陽性および陰性の選択可能マーカーが利用可能である場合に置き換えられ得ることを理解するだろう。
【０１２７】
上述の発明は、実例としておよび理解を明確にする目的のための例として多少詳しく記載されてきたが、特定の変化および変更が添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなくそれに対してなされ得ることは、本発明の教示に鑑みて当業者に明らかである。
【実施例１】
【０１２８】
実施例１：ＤＮＡの精製および分析
ＤＮＡは、当該分野において公知の方法に従って単離および分析される。
【０１２９】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉからＤＮＡを調製してＰＣＲのためのテンプレートとして使用するために、（寒天プレートまたは液体培養からの）１０6個の藻細胞が１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に懸濁され、９５℃まで１０分間加熱され、次いで、２３℃近くまで冷却される。溶液は、ＰＣＲ混合物に直接的に添加される。
【０１３０】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉから精製された葉緑体ＤＮＡを調製するために、５×１０8個の藻細胞が３０００×ｇで１０分間の遠心分離によって液体培養から収集され、水で１回洗浄され、３０００×ｇで１０分間遠心分離され、１０ｍＬの溶解溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２％ＳＤＳ、２％サルコシル、および２５μｇ／ｍＬプロナーゼ（Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁され、そして３７℃で１時間インキュベートされる。溶解物は、次いで、フェノール／クロロホルムで徐々に抽出され、その後クロロホルムで２回洗浄される。全ＤＮＡがエタノール沈降および再懸濁緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１ｍｇ／ｍＬ  ＲＮＡ分解酵素）における再懸濁によって単離される。葉緑体ＤＮＡは、変性溶液（２００ｍＭ  ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ））の添加によって精製されることができ、再懸濁されたＤＮＡに添加されかつ数回逆方向にされる。中和溶液（３．０Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ＝５．５）が添加され、混合され、氷上で１０分間インキュベートされ、そして１５０００ＲＰＭで３０分間遠心分離される。上清は静かに移され、ＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００に適用され、そしてＤＮＡが、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔに従って単離される。
【０１３１】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉから精製された葉緑体ＤＮＡを調製するための代替的な方法は、ＤＮＡのせん断を防ぐために藻細胞または精製された葉緑体を低融点アガロースプラグ中に埋め込むことを含む。葉緑体は、窒素減圧チャンバにおいて完全な細胞を溶解し、パーコール密度勾配遠心分離によって無傷の細胞と破片を葉緑体から分離することによって単離される。細胞および／または葉緑体を溶解するために、プラグは溶解緩衝液（０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１％サルコシル、０．２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）において５５℃で３６時間インキュベートされる。溶解が完了されると、プラグはＴＥで３回洗浄され、次いで、保存緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で保存される。葉緑体ＤＮＡを溶液中に放出するために、プラグは３０ｍＭ  ＮａＣｌで３回洗浄され、６５℃で１０分間融解される。融解されたプラグは、４２℃に変えられ、β−アガラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で１時間処理される。ＤＮＡの溶液は、サンプルを濃縮するためのエタノール沈降または下流適用のために直接的に使用されることができる。
【０１３２】
酵母からＤＮＡを調製してＰＣＲのためのテンプレートとして使用するために、寒天プレートまたは液体培養からの）１０6個の藻細胞が溶解緩衝液（６ｍＭ  ＫＨＰＯ４、ｐＨ＝７．５、６ｍＭ  ＮａＣｌ、３％グリセロール、１Ｕ／ｍＬザイモリアーゼ）中に懸濁され、３７℃まで３０分間加熱され、９５℃まで１０分間、次いで、２３℃近くまで冷却される。溶液は、ＰＣＲ混合物に直接的に添加される。
【０１３３】
酵母からプラスミドＤＮＡを調製するために、所望のクローンが選択的液体培地（例えば、ＣＳＭ−Ｔｒｐ）において飽和まで３０℃で増殖される。細胞は、３０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集され、そして１５０μＬの溶解緩衝液（１Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、０．０６Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ＝７．０、１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および２．５ｍｇ／ｍＬザイモリアーゼ）において再懸濁される。溶液は、１時間３７℃でインキュベートされる。３００μＬの変性溶液（１％ＳＤＳおよび０．２Ｎ  ＮａＯＨ）が添加され、溶液は６０℃で１５分間インキュベートされる。１５０μＬの中和溶液（３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ＝４．８）が添加され、溶液は氷上で１０分間インキュベートされる。溶液は、１４，０００ＰＲＭで１０分間遠心分離され、そして上清が別の管に移される。１ｍＬのイソプロパノールが添加され、混合物は、徐々に混合され、１４，０００ＰＲＭで１０分間遠心分離される。ペレットは、１ｍＬの７０％エタノールで１回洗浄され、そして１４，０００ＰＲＭで１０分間遠心分離される。ＤＮＡペレットは風乾され、６０μＬの再懸濁緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１ｍｇ／ｍＬ  ＲＮＡ分解酵素）中に再懸濁される。
【０１３４】
細菌からプラスミドＤＮＡを調製するために、細胞は適当な抗生物質（ＫａｎまたはＡｍｐ）を含有するＬＢにおいて飽和まで３７℃で増殖される。もし目的のＤＮＡが標準的な複製要素を含有するならば、細胞は遠心分離によって採取される。もし目的のＤＮＡがＰ１複製要素を含有するならば、飽和された細胞培養物はＬＢ＋Ｋａｎ＋ＩＰＴＧにおいて１：２０に希釈され、そして３７℃で４時間増殖され、次いで、採取される。Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）は、細胞ペレットからプラスミドＤＮＡを調製するために使用される。
【０１３５】
例示的な目的のために、かつ、本発明を記載される特定の方法に限定することなく、藻類、酵母、または（プラグまたは溶液における）細菌から調製されたＤＮＡサンプルは、パルスフィールドゲル電気泳動法（ＰＦＧＥ）によって分析され、または適当な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｍａＩ）で消化され、そしてＰＦＧＥ、慣習的アガロースゲル電気泳動法、および／またはサザンブロットによって分析される。これらの目的のために有用な標準的プロトコルは、Ｇｅｍｍｉｌｌら（「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌ．１，「Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ」ｐｐ２１７  ２５１，Ｒａｍ  Ｓ．Ｖｅｒｍａ編）に十分に記載される。
【０１３６】
当業者は、当該分野において公知の多くの他の方法が、具体的に記載または参照される方法の代わりに置き換えられ得ることを理解するだろう。
【実施例２】
【０１３７】
実施例２：形質転換方法
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０ＢまたはＧｅｎｅｈｏｇは、０．７のＯＤ600まで細胞を増殖させることによってエレクトロコンピテントにされ、次いで、収集され、氷冷１０％グリセロールで２回洗浄され、ドライアイスエタノール浴において急速冷凍され、−８０℃で保存される。全酵母または藻類のＤＮＡが調製され、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓａｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒにおいて０．１ｃｍキュベットを１，８００Ｖ、２００オーム、および２５ｍＦで使用することによってＥ．ｃｏｌｉ中にエレクトロポレーションされる。細胞は回収され、クローンは、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（５１μｇ／ｍＬ）またはクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）のような１種以上の抗生物質を含有する寒天増殖培地上で選択される。
【０１３８】
酵母株ＹＰＨ８５７、ＹＰＨ８５８、またはＡＢ１３８０は、Ｓｈｅｉｓｔｌ＆Ｇｅｉｔｚ（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３３９  ３４６，１９８９）およびＳｈｅｒｍａｎら、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８６）に記載されるような酢酸リチウム法、またはＳｉｐｉｃｚｋｉら、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２（３）：１６９−１７３（１９８５）によって記載される方法のようなスフェロプラスト法によって形質転換され得る。酵母形質転換体は、トリプトファン、ロイシン、またはウラシルのようなアミノ酸および／または核酸を欠く寒天培地上で選択およびスクリーニングされる。酵母の増殖および表現型試験のための標準的な方法が、Ｓｈｅｒｍａｎら（前出）によって記載されるように利用される。
【０１３９】
藻株ｃｓｃ１３７ｃ（ｍｔ＋）、Ｗ１．１、またはＷ１−１は、粒子衝突によって形質転換され得る。細胞は、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上で４５０ルクスの連続照明下、２３℃で０．５ｍＭ  ５−フルオロデオキシウリジン（ＧｏｒｍａｎおよびＬｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５，これは参照によって本明細書中に援用される）の存在下または不在下でＴＡＰ培地において後期対数期まで（およそ７日間）増殖される。４，０００×ｇ、２３℃で５分間の遠心分離によって５０ｍｌの細胞が採取される。上清は静かに移され、細胞は、その後の粒子衝突（Ｃｏｈｅｎら（前出）、１９９８）による葉緑体形質転換のために４ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁される。
【０１４０】
当業者は、当該分野において公知の多くの他の形質転換方法が、本明細書において具体的に記載または参照される方法の代わりに置き換えられ得ることを理解するだろう。
【実施例３】
【０１４１】
実施例３：葉緑体ゲノムを捕捉するためのハイブリッドギャップ充填ベクター
この実施例において、系は葉緑体ＤＮＡを捕捉するためにハイブリッドギャップ充填ベクターを使用して確立される（図１）。ハイブリッドギャップ充填ベクターのバックボーンは、ベクターが酵母人工プラスミド（ＹＡＰ）として機能することを可能にする酵母要素、およびベクターがプラスミド人工染色体（ＰＡＣ）として機能することを可能にする細菌要素を含有する。酵母要素は、酵母選択マーカー配列（例えば、ＴＲＰ１またｈＬＥＵ２）、酵母動原体配列（ＣＥＮ）、および酵母自己複製ヌクレオチド配列（ＡＲＳ）を含む。細菌要素は、Ｐ１または細菌性複製起点配列、および細菌選択マーカー配列（例えば、Ｋａｎr）を含む。
【０１４２】
ハイブリッドギャップ充填ベクターを操作するために、ベクターｐＤＯＣＩ（配列番号１）が産生された。ｐＴＲＰ−ＡＵ（図２）の一部は、ＴＥＬ、ＡＤＥ２、およびＵＲＡ３を包含する領域を囲む部位にアニールするＰＣＲプライマー対を使用して増幅された。１つの対は、酵母要素（配列番号２１および２２）内の領域を増幅し、他方の対は細菌要素（配列番号２３および２４）内の領域を増幅する。ＰＣＲ産物は、単一のプライマー対（配列番号２１および２４）を使用するＰＣＲアセンブリによって単一のＤＮＡフラグメントへと組立てられた。組み立てられた産物は、ＮｏｔＩで消化され、ＮｏｔＩで消化されたｐＵＣ−ＳＥ（配列番号２）に連結されてｐＤＯＣＩ（配列番号１）を形成した。
【０１４３】
ハイブリッドギャップ充填ベクターを適合させて葉緑体ＤＮＡを捕捉するために、ベクターｐＤＯＣＩ−１０（配列番号３）が産生された。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体ゲノムの一部は、ｐｓｂＤ遺伝子座（図３；四角形によって囲まれた数字１０によって示される）近くの２つの隣接領域に特異的な２つのプライマー対（配列番号２５および２６、ならびに配列番号２７および２８）を使用してＰＣＲ増幅された。各ＰＣＲ産物は、ＮｏｔＩおよびＩ−ＳｃｅＩで消化され、Ｉ−ＳｃｅＩで消化されてｐＤＯＣＩ−１０（配列番号３）を形成したｐＤＯＣＩ（配列番号１）に連結された。
【０１４４】
ｐＤＯＣＩ−１０を適合させて、藻類に抗生物質耐性を付与するために、選択マーカーがクローニングされた。細菌由来のカナマイシン耐性コード遺伝子を含有し、５‘ＵＴＲおよびＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子のためのプロモーター配列およびＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子のための３’ＵＲ配列によって調節されるｐＳＥ−３ＨＢ−Ｋａｎ（配列番号４）は、カナマイシン耐性カセットを遊離させるＳｎａＢＩで消化された。カセットは、ＳｎａＢＩで消化されたｐＤＯＣＩ−１０に連結されて、ｐＤＯＣＩ−１０−Ｋａｎ（配列番号５）を形成した。
【０１４５】
葉緑体ＤＮＡを捕捉するためのハイブリッドギャップ充填ベクターｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎ（配列番号６）は、酵母における組換えを使用して構築された（図２）。簡単には、ｐＤＯＣＩ−１０−ＫａｎはＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化されて、葉緑体ゲノム特異的要素をハイブリッドギャップ充填ベクター中に導入するカセットを遊離させた。このカセットは、酢酸リチウム法を使用して酵母株ＹＰＨ８５８中にｐＴＲＰ−ＡＵと共に形質転換された。相同組換えは、形質転換された酵母細胞においてインビボで起こる。カセットと正しく一体化された形質転換体は、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含有するＣＳＭ−Ｔｒｐ寒天培地上の増殖に基づいて、および赤色によって単離された。５−ＦＯＡは、機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠くクローンおよびＡＤＥ２遺伝子が除去される場合に生じる赤色を選択する。プラスミドＤＮＡは、ＣＳＭ−Ｔｒｐ液体培地において増殖され、かつＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ１０Ｂ）に形質転換された酵母クローンから単離された。大量のｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎを産生するために、ｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎを含むＤＨ１０Ｂ細胞が、ＬＢ＋Ｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）において３７℃で飽和まで増殖され、次いで、ＬＢ＋Ｋａｎ＋ＩＰＴＧにおいて１：２０に希釈され、３７℃で４時間増殖された。ＤＮＡは、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して細菌培養物から調製された。
【０１４６】
ベクターの組成は、全プラスミドのＤＮＡ配列決定によって確認された。
【実施例４】
【０１４７】
実施例４：外来栄養宿主における葉緑体ゲノムＤＮＡを安定および／または修飾するベクター
しばしば、非相同ＤＮＡの大きな断片は、酵母または細菌のような宿主生物において不安定である。これは、限定されないが、毒性遺伝子産物またはコドンバイアスの存在、および／または選択圧の欠如を含む、複数の因子のためであり得る。したがって、シャトルベクター内の標的ＤＮＡは、酵母または細菌内で変更され得る。例えば、標的ＤＮＡ配列の特定の部分（例えば、コード領域またはプロモーター）は、宿主生物内の組換えによって除去または移動され得る。同様に、標的ＤＮＡを担持するシャトルベクターが標的ＤＮＡを提供した生物（または近縁の種）に戻された場合、標的ＤＮＡは不安定になることができる。
【０１４８】
そのような不安定部位および感受性配列は、ゲノムＤＮＡのどの断片が捕捉を回避し、または時間とともに消失するかを決定することによって容易に発見される。これらの部位は、最初に単離されたギャップ充填標的ＤＮＡプラスミドと、プラスミドにコードされた選択可能マーカー（例えば、ＴＲＰ１）の存在を選択する条件下で実験室において連続的に継代されてきた形質転換された株から単離されたプラスミドとを比較することによって、または、天然の標的ＤＮＡ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体ＤＮＡ）との比較によって検出されることができる。そのような比較は、例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析または直接配列決定によって実施され得る。当業者は、そのような差異を決定するための複数の他のプロトコルおよび方法が存在することを認識するだろう。
【０１４９】
いったん特定されると、そのような部位および配列は、マーカーの選択の間残存させられることができる。図４は、ベクターの複数のクローニング部位における選択可能マーカーの配列の例を示す。
【０１５０】
酵母安定要素および藻類安定要素を含有する安定化ベクターを産生するために、ＡＤＥ２遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子を包含するｐＴｒｐ−ＡＵにおけるＤＮＡの領域は、ＳｆｉＩでの消化の後の所望のフラグメントのゲル精製によって遊離された。フラグメントは、平滑末端を作製するためにＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理され、ＰｍｌＩで消化されたｐＳＥ−３ＨＢ−Ｓｔｒｅｐ（配列番号７）に連結されて、ｐＳＥ−３ＨＢ−Ｓｔｒｅｐ−ＡＵを作製した（図４Ｂ）。ｐＳＥ−３ＨＢ−Ｓｔｒｅｐは、細菌由来のストレプトマイシン耐性コード遺伝子を、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体ゲノムの３ＨＢ遺伝子座に対して標的化するベクターであり、それは、５’ＵＴＲおよびＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子のためのプロモーター配列およびＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子のための３’ＵＴＲ配列によって調節される。
【０１５１】
葉緑体ゲノムの他の領域を標的化するベクターを産生するために、図３において丸数字によって示される部位（１−５’部位、配列番号２９および３０；１−３’部位、配列番号３１および３２；３−５’部位、配列番号３３および３４；３−３’部位、配列番号３５および３６；４−５’部位、配列番号３７および３８；４−３’部位、配列番号３９および４０；５−５’部位、配列番号４１および４２；５−３’部位、配列番号４３および４４；および７−５’部位、配列番号４５および４６；７−３’部位、配列番号４７および４８）に隣接する５’領域および３’領域にアニールするＰＣＲプライマー対を使用して８００〜１０００ｂｐの領域が増幅された。ＰＣＲ産物の各対は、ＮｏｔＩおよびＩ−ＳｃｅＩで消化され、混合され、そしてＮｏｔＩで消化されたｐＵＣ−ＳＥ（配列番号２）に連結されて、（それらの組込み位置に名前が由来する）プラスミドｐＵＣ１、ｐＵＣ３、ｐＵＣ４、ｐＵＣ５、およびｐＵＣ７を生成した。
【０１５２】
酵母選択マーカーの対は、複数の安定化部位が同時に利用されることができるように構築された（図４Ｂ）。各マーカー対は、ｐＲＳ４１６からＰＣＲ増幅されたＵＲＡ３遺伝子（配列番号８）を含有する。各マーカー対はまた、ｐＲＳ４１５から増幅されたＬＥＵ２遺伝子（配列番号９）、ｐＲＳ４１３から増幅されたＨＩＳ３遺伝子（配列番号１０）、ｐＴｒｐ−ＡＵから増幅されたＡＤＥ２遺伝子（配列番号１１）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡから増幅されたＬＹＳ２遺伝子（配列番号１２）、または、抗真菌剤Ｇ４１８に対する耐性を付与するｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ６からのｋａｎＭＸ６遺伝子（配列番号１３）を含有する。ＵＲＡ３遺伝子のために使用されるプライマーは、５’末端（配列番号４９）にＸｍａＩ制限部位を加え、３’末端（配列番号５０）にＳａｌＩおよびＳａｃＩＩを加える。ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＬＹＳ２、およびＧ４１８r遺伝子のために使用されるプライマーは、５’末端（ＬＥＵ２について配列番号５１、ＨＩＳ３について配列番号５２、ＡＤＥ２について配列番号５３、ＬＹＳ２について配列番号５４、およびＧ４１８rについて配列番号５５）にＸｍａＩ制限部位を加え、３’末端（ＬＥＵ２について配列番号５６、ＨＩＳ３について配列番号５７、ＡＤＥ２について配列番号５８、ＬＹＳ２について配列番号５９、およびＧ４１８rについて配列番号６０）にＳｐｅＩ部位を加える。各ＰＣＲ産物はＸｍａＩおよびＳａｌＩで消化され、対に混合され、所望の組込みベクター中に連結されて、ｐＵＣ１−ＵＲＡ３／ＡＤＥ２、ｐＵＣ３−ＵＲＡ３／ＬＥＵ２、ｐＵＣ４−ＵＲＡ３／ＨＩＳ３、ｐＵＣ５−ＵＲＡ３／ＡＤＥ２、およびｐＵＣ７−ＵＲＡ３／ＬＹＳ２を生じた。ＵＲＡ３は、陽性選択および陰性選択を可能にするので、各場合において使用される。マーカー対は、（単一修飾の場合において）各遺伝子、２つ以上の修飾の場合おいて非ＵＲＡ３遺伝子についての選択に基づいて導入さてることができる。次いで、マーカーは、マーカー対を囲む配列に相同な末端配列でＤＮＡを導入すること、および５−ＦＯＡを含有する最小培地上での増殖を選択することによって除去されることができる。
【０１５３】
細菌における配列安定性を促進するために、抗生物質耐性マーカーが酵母選択マーカー対中にクローニングされた。細菌安定マーカーは、限定されないが、ｐＥＴ−２１ａから増幅されたアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐr、配列番号１４）、ｐＢＲ３２２から増幅されたテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔr、配列番号１５）、ｐＥＴｃｏｃｏ−１から増幅されたクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍr、配列番号１６）、およびｐＪＱ２００から増幅されたゲンタマイシン耐性遺伝子（Ｇｅｎｔr、配列番号１７）を含む。各遺伝子について、５’末端および３’末端の両方にＸｍａＩ部位を加えるプライマー対（Ａｍｐrについて配列番号６１および６２、Ｔｅｔrについて配列番号６３および６４、Ｃａｍrについて配列番号６５および６６、ならびにＧｅｎｔrについて配列番号６７および６８）は、抗生物質耐性フラグメントをＰＣＲ増幅するために使用された。各ＰＣＲ産物はＸｍａＩで消化され、ＸｍａＩで消化されたｐＵＣ１−ＵＲＡ３／ＡＤＥ２、ｐＵＣ３−ＵＲＡ３／ＬＥＵ２、ｐＵＣ４−ＵＲＡ３／ＨＩＳ３、ｐＵＣ５−ＵＲＡ３／ＡＤＥ２、およびｐＵＣ７−ＵＲＡ３／ＬＹＳ２中に連結された。図４Ｃは、酵母安定マーカーおよび細菌安定マーカーの配列を示す。
【実施例５】
【０１５４】
実施例５：葉緑体ゲノム中へのハイブリッドベクターおよび安定化ベクターの導入
安定化ベクター有りまたは無しでハイブリッドベクターを含有するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体ゲノムを産生するために、ｐＴＲＰ−１０−ＫａｎおよびｐＳＥ−３ＨＢ−Ｓｔｒｅｐ−ＡＵは、藻細胞に形質転換された。ｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎは、葉緑体標的化要素が各末端にあるようにするためにベクターを線状にするためにＮｏｔＩで消化された（図５）。ｐＳＥ−３ＨＢ−Ｓｔｒｅｐ−ＡＵは、環状ＤＮＡとして形質転換された。
【０１５５】
これらの実験のために、全ての形質転換は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ株１３７ｃ（ｍｔ＋）上で実行される。細胞は、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上で４５０ルクスの連続照明下、２３℃で０．５ｍＭ  ５−フルオロデオキシウリジンの存在下でＴＡＰ培地（ＧｏｒｍａｎおよびＬｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５，これは参照によって本明細書中に援用される）において後期対数期まで（およそ７日間）増殖される。４，０００×ｇ、２３℃で５分間の遠心分離によって５０ｍｌの細胞が採取される。上清は静かに移され、細胞は、その後の粒子衝突（Ｃｏｈｅｎら（前出）、１９９８）による葉緑体形質転換のために４ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁される。全ての形質転換は、「Ｋａｎ」と標識された図５におけるセグメント（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によってコードされる遺伝子によって耐性が付与されるカナマイシン選択（１００μｇ／ｍｌ）下で実行される。
【０１５６】
ＰＣＲは、形質転換された株を特定するために使用される。ＰＣＲ分析のために、（寒天プレートまたは液体培養からの）１０6個の藻細胞が、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に懸濁され、９５℃まで１０分間加熱され、次いで、２３℃近くまで冷却される。反応緩衝液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、および水からなるＰＣＲカクテルが調製される。反応のためのテンプレートを提供するために、ＥＤＴＡ中の藻溶解物が添加される。添加される藻溶解物およびＥＤＴＡの量および濃度を補償するために、マグネシウム濃度が変えられる。特定のプライマー対について最適なアニーリング温度を決定するために、アニーリング温度勾配が利用される。
【０１５７】
図６は、ｐＳＥ−３ＨＢ−Ｓｔｒｅｐ−ＡＵ有りおよび無しでｐＴｒｐ−１０−Ｋａｎを含有する単離された藻株の例を示す。ｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎを組み込んだ株は、ベクターバックボーンにおける異なる領域を増幅するプライマー対のセットのいずれか（レーン１、配列番号６９および７０；レーン２、配列番号７１および７２；レーン３、配列番号７３および７４；レーン４、配列番号７５および７６；レーン５、配列番号７７および７８；レーン６、配列番号７９および８０；レーン７、配列番号８１および８２；レーン８、配列番号８３および８４；ならびにレーン９、配列番号８５および８６）、または、ｐＴｒｐ−１０−Ｋａｎ  ＤＮＡと葉緑体ゲノムＤＮＡとの間の接合を補うプライマー対（レーン１０、配列番号８７および８８；レーン１１、配列番号８９および９０）を使用して特定された。組み込まれたｐＳＥ−３ＨＢ−Ｓｔｒｅｐ−ＡＵを有する株を特定するために、ＡＤＥ２遺伝子内の領域を増幅するプライマー対（配列番号９１および９２）が使用された。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を得るクローンである。
【実施例６】
【０１５８】
実施例６：外来栄養宿主中への葉緑体ゲノムの捕捉
この実施例において、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体ゲノムは、上記に記載されるような標準的技術を使用して単離される。ｐＳＥ−３ＨＢ−Ｓｔｒｅｐ−ＡＵ有りまたは無しでｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎベクターを含有するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体ＤＮＡは、細菌を形質転換するために使用された。エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０ＢまたはＧｅｎｅｈｏｇは、形質転換され、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を有するＬＢ寒天増殖培地上で選択された。個々のクローンからのＤＮＡは、細胞を３７℃でカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を有するＬＢ液体増殖培地において飽和まで増殖させることによって単離された。飽和された細胞培養物は、ＬＢ＋Ｋａｎ＋ＩＰＴＧにおいて１：２０に希釈され、そして３７℃で４時間増殖される。Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）は、単離されたクローンからプラスミドＤＮＡを調製するために使用される。
【０１５９】
図７Ａは、親ハイブリッドベクター（クローンＣ）に比較される、細菌形質転換から得られた２つのタイプのクローン（クローン１およびクローン２）の制限分析を示す。クローン１および２は、＞１００ｋｂのＤＮＡからなるが、親ハイブリッドベクターは、２３ｋｂのＤＮＡのみからなり、ＤＮＡの大きな部分がハイブリッドベクターによって実際に捕捉されたことを実証する。制限マッピングは、クローン１が葉緑体ゲノムのおよそ半分を含むことを示す（図８Ａ）。ハイブリッドベクターに隣接する領域のＤＮＡ配列は、組換え事象がＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉカナマイシン耐性カセットの３’ＵＴＲ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるｒｂｃＬ遺伝子に由来する３’ＵＴＲである）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉストレプトマイシン耐性カセットの３’ＵＴＲ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるｒｂｃＬ遺伝子に由来する３’ＵＴＲである）との間で起こったことを示す。クローン１はＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉカナマイシン耐性カセットを保持したが、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉストレプトマイシン耐性カセットを失った。制限マッピングは、クローン２もまた葉緑体ゲノムのおよそ半分を含むことを示す（図８Ｂ）。しかしながら、ハイブリッドベクターに隣接する領域のＤＮＡ配列決定は、異なる組換え事象がクローン２を生じさせるために起こったことを示す。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉカナマイシン耐性カセットの５’ＵＴＲ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるａｔｐＡ遺伝子に由来する５’ＵＴＲ）は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体ゲノムにおけるａｔｐＡ遺伝子の５’ＵＴＲと逆方向反復Ａで（図８におけるＩＲ−Ａ）組換えられた逆方向反復Ｂ（図８におけるＩＲ−Ｂ）を組み換えた。クローン２は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉカナマイシン耐性カセットとＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉストレプトマイシン耐性カセットの両方を消失した。
【０１６０】
ハイブリッドベクターが酵母における安定した複製を支援し得ることを実証するために、クローン１は、酢酸リチウム法によって酵母株ＡＢ１３８０に形質転換され、形質転換体は、ＣＳＭ−Ｔｒｐ寒天培地上でた選択された。形質転換体は、クローン１の葉緑体ゲノムＤＮＡを有する領域を増幅するプライマー対（配列番号９７および９８）を使用してＰＣＲスクリーニングされた。所望されるクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を生じさせるクローンである。個々のＰＣＲ−陽性クローンは、分離株ごとに複数のクローンを産生するためにストリーキングされた。ＤＮＡは単離された酵母クローンから調製され、細菌に形質転換された。細菌は、クローン１の葉緑体ゲノムＤＮＡ内の領域を増幅するプライマー対（配列番号９７および９８）を使用してＰＣＲスクリーニングされた。所望されるクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された細菌クローンから調製され、ＥｃｏＲＩでの制限消化によって分析された。図７Ｂは、全ての単離されたクローンが、もともとの単離されたクローン１と同一の制限マップを有することを示す。したがって、ハイブリッドベクターは、酵母における安定した複製を支援する。
【０１６１】
捕捉されたＤＮＡが実際に葉緑体ゲノムＤＮＡであるかどうかを決定するために、サザンブロットが実施された。細菌から調製されたクローン１および２は、ＥｃｏＲＩで消化され、ゲル電気泳動法によって分離され、メンブレンに転移され、そして、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来の放射性のＨｉｎｄＩＩＩで消化された全ＤＮＡで調べられた。図７Ｃは、クローン１および２におけるＤＮＡがシグナルを生じさせ、したがって、捕捉されたＤＮＡが葉緑体ゲノムＤＮＡであることを示すことを示す。
【実施例７】
【０１６２】
実施例７：藻類への葉緑体ゲノムＤＮＡの再導入
これらの実験について、全ての形質転換は、内因性ｐｓｂＡ遺伝子座由来のＳＡＡを発現するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ株Ｗ１．１、または内因性ｐｓｂＡ遺伝子座由来のＬｕｘＡＢを発現するＷ１−１のいずれかで実行される。Ｗ１．１とＷ１−１の両方が、１６Ｓ  ｒＲＮＡにおいて変異を導入するｐ２２８の形質転換のおかげでスペクチノマイシンに対して耐性である。細胞は、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上で４５０ルクスの連続照明下、２３℃でＴＡＰ培地（ＧｏｒｍａｎおよびＬｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５，これは参照によって本明細書中に援用される）において後期対数期まで（およそ７日間）増殖される。４，０００×ｇ、２３℃で５分間の遠心分離によって５０ｍｌの細胞が採取される。上清は静かに移され、細胞は、その後の粒子衝突（Ｃｏｈｅｎら（前出）、１９９８）による葉緑体形質転換のために４ｍｌのＨＳＭ培地に再懸濁される。全ての形質転換は、ＨＳＭ寒天上で実行される。
【０１６３】
形質転換体は、ＨＳＭ上の増殖によって選択されて、ｐｓｂＡ遺伝子座の機能が回復されたことを示した。クローンはまたその後、ＴＡＰ上、スペクチノマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）を有するＴＡＰ上、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＴＡＰ上、ＨＳＭ上、およびカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＨＳＭ上での増殖について調べられた。図９は、クローン１で形質転換されたＷ１−１が全ての培地タイプ上で増殖することができることを示す。図９はまた、クローン２で形質転換されたＷ１−１が、カナマイシンを含有する培地上で増殖できないことを示し、それは、クローン２がＫａｎ耐性マーカーを含まないので予測される。
【実施例８】
【０１６４】
実施例８：バイオマス分解酵素を生成するための葉緑体の修飾
捕捉された葉緑体ゲノムＤＮＡをキシラナーゼの生成のために修飾するために、藻発現カセットが、実施例４に記載される酵母マーカーベクター中にクローニングされた。簡単には、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体発現ベクターは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＤ遺伝子について５’ＵＴＲによって調節され、そしてＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子について３’ＵＴＲで調節されるＴ．ｒｅｅｓｅｉからキシラーゼを有するＤＮＡのフラグメント（配列番号１８）を遊離するためにＳｐｅＩで消化された。フラグメントは、平滑末端を作製するためにＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理され、ｐＵＣ１−ＵＲＡ３／ＡＤＥ２、ｐＵＣ３−ＵＲＡ３／ＬＥＵ２、およびｐＵＣ４−ＵＲＡ３／ＨＩＳ３において酵母マーカー間でＳｍａＩ（ＸｍａＩ）部位中にクローニングされた。図１０Ａは、新しいベクターにおける種々の要素の配列を示す。
【０１６５】
葉緑体ゲノムＤＮＡは、修飾ベクターを、捕捉されたＤＮＡを含む酵母に形質転換することによって修飾された。形質転換のために、全ての修飾ベクターは、ＮｏｔＩでの消化によって線状にされた。（実施例６からの）クローン１を含む酵母は、３０℃でＣＳＭ−Ｔｒｐ培地において飽和まで増殖され、次いで、ＹＰＡＤにおいて１：２０に希釈され、そして３０℃で４時間増殖される。酵母は酢酸リチウム法を使用して形質転換され、形質転換体は、ＣＳＭ−Ｕｒａ培地上での増殖によって選択された。形質転換体は、ＣＳＭ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ培地上で増殖され、次いで、キシラナーゼ発現カセットについて特異的なプライマー（配列番号９５および９６）および葉緑体ゲノムＤＮＡ内の領域ついて特異的なプライマー（配列番号９７および９８）を使用してＰＣＲスクリーニングされた。所望されるクローンは、両方の反応について期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された酵母クローンから調製され、細菌内に形質転換された。細菌は、キシラナーゼ発現カセットについて特異的なプライマー（配列番号９５および９６）および葉緑体ゲノムＤＮＡ内の領域ついて特異的なプライマー（配列番号９７および９８）を使用してＰＣＲスクリーニングされた。所望されるクローンは、両方の反応について期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された細菌クローンから調製されて、ＥｃｏＲＩでの制限消化によって分析された。図１０Ｂは、単離されたクローンが所望の位置におけるキシラナーゼ発現カセットの組込みと一致する制限マップを含むことを示す。
【０１６６】
これらの実験について、全ての形質転換は、内因性ｐｓｂＡ遺伝子座由来のＳＡＡを発現するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ株Ｗ１．１、または内因性ｐｓｂＡ遺伝子座由来のＬｕｘＡＢを発現するＷ１−１のいずれかで実行されるＷ１．１とＷ１−１の両方が、１６Ｓ  ｒＲＮＡにおいて変異を導入するｐ２２８の形質転換のおかげでスペクチノマイシンに対して耐性である。細胞は、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上で４５０ルクスの連続照明下、２３℃でＴＡＰ培地（ＧｏｒｍａｎおよびＬｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５，これは参照によって本明細書中に援用される）において後期対数期まで（およそ７日間）増殖される。４，０００×ｇ、２３℃で５分間の遠心分離によって５０ｍｌの細胞が採取される。上清は静かに移され、細胞は、その後の粒子衝突（Ｃｏｈｅｎら（前出）、１９９８）による葉緑体形質転換のために４ｍｌのＨＳＭ培地に再懸濁される。全ての形質転換は、ＨＳＭ寒天上で実行される。
【０１６７】
形質転換体は、ＨＳＭ上の増殖によって特定されて、ｐｓｂＡ遺伝子座の機能が回復されたことを示した。ＰＣＲは、エンドキシラナーゼ発現カセットも含有する形質転換体を特定するために使用される。ＰＣＲ分析のために、（寒天プレートまたは液体培養からの）１０6個の藻細胞が、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に懸濁され、９５℃まで１０分間加熱され、次いで、２３℃近くまで冷却される。反応緩衝液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対（表２）、ＤＮＡポリメラーゼ、および水からなるＰＣＲカクテルが調製される。反応ためのテンプレートを提供するために、ＥＤＴＡ中の藻溶解物が添加される。添加される藻溶解物およびＥＤＴＡの量および濃度を補償するために、マグネシウム濃度は変えられる。特定のプライマー対について最適なアニーリング温度を決定するために、アニーリング温度勾配が利用される。
【０１６８】
エンドキシラナーゼ発現カセットを有する株を特定するために、エンドキシラナーゼ発現カセット内の領域を増幅するプライマー対（配列番号９５および９６）が使用された。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を得るクローンである。図１１Ａは、エンドキシラナーゼ発現カセット（アスタリスク付きで示されるＰＣＲ産物）を含有する複数の藻株が得られたことを示す。
【０１６９】
機能的キシラナーゼが発現されるかどうか決定するために、酵素活性が試験される。カナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＴＡＰ寒天プレートからの細胞（パッチごとにおよそ２ｍｇ）のパッチは、丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において５０μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）中に再懸濁された。再懸濁された細胞は、２０μｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の添加によって溶解され、そして室温で５分間振動された。細胞溶解物（５０μｌ）は、ブラック９６ウェルプレートに移され、生じたウェルのクロロフィル蛍光が、４４０ｎｍの励起波長および７４０ｎｍの発光波長で、６９５ｎｍのカットオフフィルターを備えるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において測定された。測定されたクロロフィルシグナル（ＲＦＵ：相対蛍光単位）は、反応物に添加されたバイオマスの量に対してキシラーゼ活性シグナルを正規化するために使用された。
【０１７０】
クロロフィル蛍光の測定後に、キシラナーゼ基質が添加された。ＥｎｚＣｈｅｃｋ  Ｕｌｔｒａ  Ｘｙｌａｎａｓｅ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、５０μｇ／ｍｌの濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐｈ４．８）中に溶解され、５０μｌの基質がマイクロプレートの各ウェルに添加された。蛍光シグナルは、３６０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長で、カットオフフィルターを備えず、かつ４２℃に設定されたプレートチャンバを備えるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において測定された。蛍光シグナルは１５分間測定され、酵素速度は、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で計算された。酵素速度は、ＲＦＵ／分として記録された。酵素の比活性度は、クロロフィル蛍光のＲＦＵあたりの、１分あたりのミリＲＦＵとして計算された。図１１Ｂは、部位１、３、および４においてキシラナーゼ発現カセットを含有する複数の藻株（図３および１０を参照のこと）が得られ、それが機能的キシラナーゼ酵素を生成することを示す。
【実施例９】
【０１７１】
実施例９：テルペンを生成するための葉緑体ゲノムの修飾
捕捉された葉緑体ゲノムＤＮＡをＦＰＰシンターゼの生成のために修飾するために、藻発現カセットが、実施例４に記載される酵母マーカーベクター中にクローニングされた。簡単には、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体発現ベクターは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＤ遺伝子について５’ＵＴＲによって調節され、そしてＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子について３’ＵＴＲで調節されるＧ．ｇａｌｌｕｓからＦＰＰシンターゼを有するＤＮＡのフラグメント（配列番号１９）を遊離するためにＳｐｅＩで消化された。フラグメントは、平滑末端を作製するためにＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理され、ｐＵＣ１−ＵＲＡ３／ＡＤＥ２、ｐＵＣ３−ＵＲＡ３／ＬＥＵ２、およびｐＵＣ４−ＵＲＡ３／ＨＩＳ３において酵母マーカー間でＳｍａＩ（ＸｍａＩ）部位中にクローニングされた。図１０Ａは、新しいベクターにおける種々の要素の配列を示す。
【０１７２】
葉緑体ゲノムＤＮＡは、修飾ベクターを、捕捉されたＤＮＡを含む酵母に形質転換することによって修飾された。形質転換のために、全ての修飾ベクターは、ＮｏｔＩでの消化によって線状にされた。（実施例６からの）クローン１を含む酵母は、３０℃でＣＳＭ−Ｔｒｐ培地において飽和まで増殖され、次いで、ＹＰＡＤにおいて１：２０に希釈され、そして３０℃で４時間増殖される。酵母は酢酸リチウム法を使用して形質転換され、形質転換体は、ＣＳＭ−Ｕｒａ培地上での増殖によって選択された。形質転換体は、ＣＳＭ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ培地上で増殖され、次いで、ＦＰＰシンターゼ発現カセットについて特異的なプライマー（配列番号９５および９６）および葉緑体ゲノムＤＮＡ内の領域ついて特異的なプライマー（配列番号９７および９８）を使用してＰＣＲスクリーニングされた。所望されるクローンは、両方の反応について期待される大きさのＰＣＲ産物を与えたクローンである。ＤＮＡは、単離された酵母クローンから調製され、細菌内に形質転換された。細菌は、ＦＰＰシンターゼ発現カセットについて特異的なプライマー（配列番号９５および９６）および葉緑体ゲノムＤＮＡ内の領域ついて特異的なプライマー（配列番号９７および９８）を使用してＰＣＲスクリーニングされた。所望されるクローンは、両方の反応について期待される大きさのＰＣＲ産物を与えたクローンである。ＤＮＡは、単離された細菌クローンから調製されて、制限消化によって分析された。図１０Ｃは、単離されたクローンが所望の位置におけるＦＰＰシンターゼ発現カセットの組込みと一致する制限マップを含むことを示す。
【０１７３】
これらの実験について、全ての形質転換は、内因性ｐｓｂＡ遺伝子座由来のＳＡＡを発現するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ株Ｗ１．１、または内因性ｐｓｂＡ遺伝子座由来のＬｕｘＡＢを発現するＷ１−１のいずれかで実行される。Ｗ１．１とＷ１−１の両方が、１６Ｓ  ｒＲＮＡにおいて変異を導入するｐ２２８の形質転換のおかげでスペクチノマイシンに対して耐性である。細胞は、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上で４５０ルクスの連続照明下、２３℃でＴＡＰ培地（ＧｏｒｍａｎおよびＬｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５，これは参照によって本明細書中に援用される）において後期対数期まで（およそ７日間）増殖される。４，０００×ｇ、２３℃で５分間の遠心分離によって５０ｍｌの細胞が採取される。上清は静かに移され、細胞は、その後の粒子衝突（Ｃｏｈｅｎら（前出）、１９９８）による葉緑体形質転換のために４ｍｌのＨＳＭ培地に再懸濁される。全ての形質転換は、ＨＳＭ寒天上で実行される。
【０１７４】
形質転換体は、ＨＳＭ上の増殖によって特定されて、ｐｓｂＡ遺伝子座の機能が回復されたことを示した。ＰＣＲは、ＦＰＰシンターゼ発現カセットも含有する形質転換体を特定するために使用される。ＰＣＲ分析のために、（寒天プレートまたは液体培養からの）１０6個の藻細胞が、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に懸濁され、９５℃まで１０分間加熱され、次いで、２３℃近くまで冷却される。反応緩衝液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、および水からなるＰＣＲカクテルが調製される。反応ためのテンプレートを提供するために、ＥＤＴＡ中の藻溶解物が添加される。添加される藻溶解物およびＥＤＴＡの量および濃度を補償するために、マグネシウム濃度は変えられる。特定のプライマー対について最適なアニーリング温度を決定するために、アニーリング温度勾配が利用される。
【０１７５】
ＦＰＰシンターゼ発現カセットを有する株を特定するために、エンドキシラナーゼ発現カセット内の領域を増幅するプライマー対が使用された。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を得るクローンである。ＦＰＰシンターゼ発現カセット（図１２、アスタリスク付きで示されるＰＣＲ産物）を含有する複数の藻株が得られた。
【実施例１０】
【０１７６】
実施例１１：部分的葉緑体ゲノムのギャップ充填
この実施例において、系は、酵母における組換えによって葉緑体ＤＮＡを捕捉するためにハイブリッドギャップ充填ベクターを使用して確立される（図１３）。ハイブリッドギャップ充填ベクターを葉緑体ＤＮＡを捕捉するように適合させるために、ベクターｐＤＯＣＩ−Ｂ５Ａ１０（配列番号２０）が産生された。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体ゲノムの一部が、ｐｓｂＤ遺伝子（Ａ１０、配列番号２７および２８）およびｐｓｂＨ遺伝子（Ｂ５、配列番号７８７および７８８）付近に隣接する領域に特異的な２つのプライマー対を使用してＰＣＲ増幅された。各ＰＣＲ産物は、ＮｏｔＩおよびＩ−ＳｃｅＩで消化され、Ｉ−ＳｃｅＩで消化されてｐＤＯＣＩ−Ｂ５Ａ１０（配列番号２０）を形成するｐＤＯＣＩ（配列番号１）に連結された。
【０１７７】
葉緑体ＤＮＡを捕捉するためのハイブリッドギャップ充填ベクターｐＴＲＰ−Ｂ５Ａ１０は、酵母における組換えを使用して構築された。簡単には、ｐＤＯＣＩ−Ｂ５Ａ１０（配列番号２０）が、葉緑体ゲノム特異的要素をハイブリッドギャップ充填ベクター中に導入するカセットを遊離するために、ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化された。このカセットは、酢酸リチウム法を使用して酵母株ＹＰＨ８５８中にｐＴＲＰ−ＡＵと共に形質転換された。相同組換えは、形質転換された酵母細胞においてインビボで起こる。カセットと正しく一体化された形質転換体は、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含有するＣＳＭ−Ｔｒｐ寒天培地上の増殖に基づいて、および赤色によって単離された。５−ＦＯＡは、機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠くクローンおよびＡＤＥ２遺伝子が除去される場合に生じる赤色を選択する。プラスミドＤＮＡは、ＣＳＭ−Ｔｒｐ液体培地において増殖され、かつＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ１０Ｂ）に形質転換された酵母クローンから単離された。大量のｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎを産生するために、ｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎを含むＤＨ１０Ｂ細胞が、ＬＢ＋Ｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）において３７℃で飽和まで増殖され、次いで、ＬＢ＋Ｋａｎ＋ＩＰＴＧにおいて１：２０に希釈され、３７℃で４時間増殖された。ＤＮＡは、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して細菌培養物から調製された。
【０１７８】
所望のゲノムＤＮＡは、標的ゲノムＤＮＡの領域に対して高い相同性を有するギャップ充填ベクターの部位（図１３においてＡ１０およびＢ５によって示される）を使用して捕捉される。線状化されたギャップ充填ベクターＤＮＡおよび葉緑体ゲノムＤＮＡは、実施例２に記載されるような酢酸リチウム法またはスフェロプラスト法を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換するために使用される。相同組換えは、形質転換された酵母細胞においてインビボで起こる。いったん、標的ＤＮＡが、相同組換えを介してベクターによって捕捉されると、ＤＮＡは酵母系および細菌系の両方において安定に複製されることができる。図１において示されるように、ギャップ充填ベクターは選択可能マーカーＴＲＰ１を含有する。したがって、酵母細胞は、陽性形質転換体をスクリーニングするために、トリプトファン不含培地上に培養される。トリプトファン不含培地上で増殖する形質転換された株は、ギャップ充填プラスミドにおける標的ＤＮＡ挿入部分の存在についてスクリーニングされる。そのようなスクリーニングは、当該分野における任意の公知の方法、例えば、制限酵素消化、ＰＣＲ、および／またはゲル電気泳動法によることができる。
【０１７９】
酵母形質変換体は、葉緑体ゲノムＤＮＡに特異的なプライマー（配列番号８９および９０）を使用してＰＣＲによってスクリーニングされる。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された酵母から調製され、細菌に形質転換される。細菌形質転換体は、葉緑体ゲノムＤＮＡに特異的なプライマー（配列番号８９および９０）を使用してＰＣＲスクリーニングされる。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された細菌クローンから調製され、そしてＥｃｏＲＩでの制限消化によって分析される。
【実施例１１】
【０１８０】
実施例１２：完全な葉緑体ゲノムのギャップ充填
この実施例において、系は、酵母における組換えによって完全な葉緑体ゲノムを捕捉するためにハイブリッドギャップ充填ベクターを使用して確立される（図１４）。葉緑体ＤＮＡを捕捉するためのギャップ充填ベクターｐＴＲＰ−１０は、酵母における組換えを使用して構築された。簡単には、ｐＤＯＣＩ−１０（実施例３に記載される配列番号３）が、葉緑体ゲノム特異的要素をハイブリッドギャップ充填ベクター中に導入するカセットを遊離するために、ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化された。このカセットは、酢酸リチウム法を使用して酵母株ＹＰＨ８５８中にｐＴＲＰ−ＡＵと共に形質転換された。相同組換えは、形質転換された酵母細胞においてインビボで起こる。カセットと正しく一体化された形質転換体は、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含有するＣＳＭ−Ｔｒｐ寒天培地上の増殖に基づいて、および赤色によって単離された。５−ＦＯＡは、機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠くクローンおよびＡＤＥ２遺伝子が除去される場合に生じる赤色を選択する。プラスミドＤＮＡは、ＣＳＭ−Ｔｒｐ液体培地において増殖され、かつＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ１０Ｂ）に形質転換された酵母クローンから単離された。大量のｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎを産生するために、ｐＴＲＰ−１０−Ｋａｎを含むＤＨ１０Ｂ細胞が、ＬＢ＋Ｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）において３７℃で飽和まで増殖され、次いで、ＬＢ＋Ｋａｎ＋ＩＰＴＧにおいて１：２０に希釈され、３７℃で４時間増殖された。ＤＮＡは、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して細菌培養物から調製された。
【０１８１】
所望されるゲノムＤＮＡは、標的ゲノムＤＮＡの隣接領域に対して高い相同性を有するギャップ充填ベクターにおける部位（図１４におけるＡ１０およびＢ１０によって示される）を使用することによって捕捉される。線状化されたギャップ充填ベクターＤＮＡおよび葉緑体ゲノムＤＮＡは、実施例２に記載されるような酢酸リチウム法またはスフェロプラスト法を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換するために使用される。相同組換えは、形質転換された酵母細胞においてインビボで起こる。いったん、標的ＤＮＡが、相同組換えを介してベクターによって捕捉されると、ＤＮＡは酵母系および細菌系の両方において安定に複製されることができる。図１において示されるように、ギャップ充填ベクターは選択可能マーカーＴＲＰ１を含有する。したがって、酵母細胞は、陽性形質転換体をスクリーニングするために、トリプトファン不含培地上に培養される。トリプトファン不含培地上で増殖する形質転換された株は、ギャップ充填プラスミドにおける標的ＤＮＡ挿入部分の存在についてスクリーニングされる。そのようなスクリーニングは、当該分野における任意の公知の方法、例えば、制限酵素消化、ＰＣＲ、および／またはゲル電気泳動法によることができる。
【０１８２】
酵母形質変換体は、葉緑体ゲノムＤＮＡに特異的なプライマー（配列番号８９および９０）を使用してＰＣＲによってスクリーニングされる。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された酵母から調製され、細菌に形質転換される。細菌形質転換体は、葉緑体ゲノムＤＮＡに特異的なプライマー（配列番号８９および９０）を使用してＰＣＲスクリーニングされる。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された細菌クローンから調製され、そしてＥｃｏＲＩでの制限消化によって分析される。
【実施例１２】
【０１８３】
実施例１３：完全な葉緑体ゲノム上での再組立て
【０１８４】
場合によっては、葉緑体ゲノムは、合計するとゲノムの全体を含む異なるプラスミド中へと分割され得る（図１５）。そのような場合において、より小さな部分の捕捉は、ゲノム内の複数の部分の急速かつ複雑な修飾を促進し得る。葉緑体ゲノムフラグメントは、次いで、組み合わせられて、完全な（そして場合によっては修飾された）葉緑体ゲノムを再形成する。
【０１８５】
この実施例において、葉緑体は２つのベクター間に分割される。１つのベクターは、それぞれ、（ＮＣＢＩ、ＮＣ＿００５３５３から入手可能な配列に従って）Ｂ５〜Ａ１０、またはヌクレオチド７６，４００位〜１７６，５００位までの葉緑体ゲノムからなる。このベクターは、実施例１１において記載される手順によって入手され得る。他方のベクターは、それぞれ、（ＮＣＢＩ、ＮＣ＿００５３５３から入手可能な配列に従って）Ｂ１０〜Ａ５、またはヌクレオチド１７６，５００位〜７６，４００位までの葉緑体ゲノムからなる。このベクターは、実施例６において記載されるクローン１と同じものであり、かつ、実施例６において記載される手順によって入手され得る。両ベクターは、ハイブリッドベクター配列を共有し、かつ、組換えのための相同な領域としてそれを使用することができる。この実施例において、組換え事象は、領域Ａ１０およびＢ１０の間にハイブリッドベクター配列を挿入する（図５）。しかしながら、領域Ａ５およびＢ５を結合する組換えを促進するのに十分な相同性は存在しない（図５）。したがって、Ａ５およびＢ５に相同な配列間の選択可能マーカーを有する第３のベクターが添加される。
【０１８６】
葉緑体ゲノムは、３つのベクターの全てを組み合わせること、および実施例２に記載されるような酢酸リチウム法またはスフェロプラスト法を使用しておよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換することによって再組立てされる。相同組換えは、形質転換された酵母細胞においてインビボで起こる。いったん、標的ＤＮＡが、相同組換えを介して作製されると、ＤＮＡは酵母系および細菌系の両方において安定に複製されることができる。図１５において示されるように、第３のベクターは、選択可能マーカーＵＲＡ３およびＡＤＥ２を含有する。したがって、酵母細胞は、陽性形質転換体をスクリーニングするために、トリプトファン不含培地上に培養される。ウラシルおよび／またはアデニン不含培地上で増殖する形質転換された株は、ギャップ充填プラスミドにおける標的ＤＮＡ挿入部分の存在についてスクリーニングされる。そのようなスクリーニングは、当該分野における任意の公知の方法、例えば、制限酵素消化、ＰＣＲ、および／またはゲル電気泳動法によることができる。
【０１８７】
酵母形質変換体は、葉緑体ゲノムＤＮＡに特異的なプライマー（配列番号８９および９０）を使用してＰＣＲによってスクリーニングされる。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された酵母から調製され、細菌に形質転換される。細菌形質転換体は、葉緑体ゲノムＤＮＡに特異的なプライマー（配列番号８９および９０）を使用してＰＣＲスクリーニングされる。所望のクローンは、期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された細菌クローンから調製され、そしてＥｃｏＲＩでの制限消化によって分析される。
【実施例１３】
【０１８８】
実施例１４：外来栄養宿主において葉緑体ゲノムＤＮＡの領域を除去するベクターおよび方法
葉緑体ゲノムＤＮＡの領域を除去するベクターを産生するために、葉緑体ゲノムＤＮＡの８００〜１０００ｂｐ領域が、図４において示される部位に隣接する５’領域および３’領域にアニールするＰＣＲプライマー対（１−５’部位、配列番号１０７９および１０８０；１−３’部位、配列番号１１２５および１１２６；３−５’部位、配列番号１０８３および１０８４；３−３’部位、配列番号１１２９および１１３０；４−５’部位、配列番号１０８７および１０８８；４−３’部位、配列番号１１３３および１１３４；５−５’部位、配列番号７８９および７９０；５−３’部位、配列番号７８７および７８８；ならびに７−５’部位、配列番号１０９１および１０９２；７−３’部位、配列番号１０８９および１０９０）を使用して増幅される。異なる部位に対する５’領域および３’領域からのＰＣＲ産物の対は、ＮｏｔＩおよびＩ−ＳｃｅＩで消化され、ＮｏｔＩで消化されたｐＵＣ−ＳＥ（配列番号２）に連結される。（実施例４に記載される）酵母選択マーカーの対は、ＳａｌＩを使用して５’フラグメントおよび３’フラグメント間でクローニングされる。
【０１８９】
葉緑体ゲノムＤＮＡの領域は、欠失ベクターを捕捉されたＤＮＡを含む酵母に形質転換することによって除去される。形質転換のために、全ての修飾ベクターは、ＮｏｔＩでの消化によって線状にされた。所望のクローンを含む酵母は、３０℃でＣＳＭ−Ｔｒｐ培地において飽和まで増殖され、次いで、ＹＰＡＤにおいて１：２０に希釈され、そして３０℃で４時間増殖される。酵母は酢酸リチウム法を使用して形質転換され、形質転換体は、ＣＳＭ−Ｕｒａ培地上での増殖によって選択された。形質転換体は、ＣＳＭ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ培地上で増殖され、次いで、標的領域および欠失ベクターによって標的化されていない葉緑体ゲノムＤＮＡの領域に特異的なプライマーを使用してＰＣＲスクリーニングされた。所望のクローンは、標的化領域のための産物を与えないが、標的化されていない領域のための期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された酵母から調製され、細菌に形質転換される。細菌は、標的化領域および欠失ベクターによって標的化されていない葉緑体ゲノムＤＮＡの領域に特異的なプライマーを使用してＰＣＲスクリーニングされた。所望のクローンは、標的化領域のための産物を与えないが、標的化されていない領域のための期待される大きさのＰＣＲ産物を与えるクローンである。ＤＮＡは、単離された細菌クローンから調製され、そして制限消化によって分析される。
【０１９０】
本明細書において適用可能であり得る種々の変更、プロセス、ならびに多くの構造は明らかであろう。種々の態様、特徴、または実施形態が、理解、信念、理論、基本的前提、および／または実施例もしくは予言的実施例に関して説明または記載されてきたが、いかなる特定の理解、信念、理論、基本的前提、および／または実施例もしくは予言的実施例も限定的ではないことが理解されるだろう。種々の態様および特徴が、本明細書において種々の実施形態および特定の実施例に関して記載されてきたが、それらのいずれも添付の請求項または本願に関連し得る他の請求項の全範囲に関して限定的ではないことが理解されるだろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0005666908.tif 000012
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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