(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一のまたは異なる液体クロマトグラフィーに複数の被検査物質をそれぞれ含む複数の溶液を流して、当該各溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する濃度勾配生成工程と、
前記濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記被検査物質の各成分について、各溶液毎に、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る測定工程と、
前記測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、ある質量電荷について、各溶液の保持時間データを並列に並べた２次元画像データに展開するデータ展開工程と、
前記２次元画像データに基づいて、保持時間データの同一ピークを抽出する同一ピーク抽出工程と、
を備えたことを特徴とするデータ分析方法。
【請求項２】
同一のまたは異なる液体クロマトグラフィーに複数の被検査物質をそれぞれ含む複数の溶液を流して、当該各溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する濃度勾配生成工程と、
前記濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記被検査物質の各成分について、各溶液毎に、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る測定工程と、
を備えた液体クロマトグラフィー方法のためのデータ分析装置であって、
前記測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、ある質量電荷について、各溶液の保持時間データを並列に並べた２次元画像データに展開するデータ展開装置と、
前記２次元画像データに基づいて、保持時間データの同一ピークを抽出する同一ピーク抽出装置と、
を備えたことを特徴とするデータ分析装置。
【請求項３】
少なくとも１台のコンピュータを含むコンピュータシステムによって実行されて、前記コンピュータシステムに請求項２に記載のデータ分析装置を実現させるプログラム。
【請求項４】
少なくとも１台のコンピュータを含むコンピュータシステム上で動作する第２のプログラムを制御する命令が含まれており、
前記コンピュータシステムによって実行されて、前記第２のプログラムを制御して、前記コンピュータシステムに請求項２に記載のデータ分析装置を実現させるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオーム解析における液体クロマトグラフィーのデータ処理方法、特には、超低流量液体クロマトグラフィーのデータ処理方法に関している。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーは、カラムに装填された樹脂と溶液中の物質との特異的な親和性を利用して、溶液の段階的な濃度勾配を作り出すことにより、ある特定の溶液濃度で樹脂から物質を遊離させる方法である。
【０００３】
濃度勾配は、時間の関数として表されるように（時間の長さに対応して変化するように）作り出される。このため、物質が遊離されてくる保持時間（retention time ）を把握することによって、当該物質の同定（特定）が可能である。従って、液体クロマトグラフィーにおける物質の同定は、保持時間の再現性が最も重要である。ここで、カラムへの溶液の流量が多い場合には、比較的よい再現性が得られるが、カラムへの溶液の流量が少ない場合には、再現性はよくないといわれている。
【０００４】
また、質量分析器を用いたプロテオミクスの手法によれば、生物が有するたんぱく質を、定量的に同定することができる。このため、プロテオミクスの手法は、医学及び生物学の分野において広く応用され始めている。プロテオミクスの手法の中で、超低流量液体クロマトグラフィーと精密質量分析装置とを組み合わせたnanoLC/MSシステムという装置が、最近注目を集めている。当該装置によれば、微量のサンプルから、莫大な量のたんぱく質を同定することが可能である。より具体的には、超低流量液体クロマトグラフィーにより細かく分離された物質について、精密質量分析装置によってそれぞれの質量を正確に測定することによって、当該物質の同定が行われるものである。
【０００５】
しかしながら、超低流量液体クロマトグラフィーから得られる保持時間データに基づいてたんぱく質同定を行う方法は、未だ実用段階にはない。例えば、nanoLC/MSシステムから得られる保持時間データと質量データとを２次元に展開し、その座標からたんぱく質地図を作るという試み自体は、２００２年に既に発表されているが (Lipton MS, et al. Proceeding of the National Academy of Sciences. 99:11049, 2002)、そのような試みを実用段階にまで発展させた論文は未だに現れていない。
【０００６】
また、Zhang H, et al.による「Molecular & Cellular Proteomics. 4:144, 2005」 には、２次元展開された保持時間データと質量データとに「修正」がなされたという記載があるが、具体的にとのような修正がなされたのかについては、何ら記載がない。
【０００７】
そして、２次元展開された保持時間データと質量データとについて、複数のサンプル溶液間での比較を如何にして行うことが好ましいか、という点については、何らの論文も発表されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Proceeding of the National Academy of Sciences. 99:11049, 2002（Lipton MS, et al）
【非特許文献２】Molecular & Cellular Proteomics. 4:144, 2005（Lipton MS, et al）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような点を考慮してなされたものであり、検査ごと（測定ごと）に異なり得る保持時間のデータを補正して、実質的に高い再現性を確認することができるような液体クロマトグラフィーのデータ補正方法、特には、超低流量液体クロマトグラフィーの補正方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、複数の検査対象溶液についてのデータ比較を高精度に実現することができる液体クロマトグラフィーのデータ分析方法、特には、超低流量液体クロマトグラフィーの分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、液体クロマトグラフィーに被検査物質を含む溶液を流して、当該溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する濃度勾配生成工程と、前記濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記被検査物質の各成分について、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る測定工程と、前記測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、予め求めてあった標準２次元データと相関させることによって補正する補正工程と、を備えたことを特徴とするデータ補正方法である。
【００１２】
本件発明者によれば、液体クロマトグラフィー方法では、測定される保持時間データに関して、後述するように、例えば平均で７９秒、最大で１９２秒ものずれが生じ得る。しかしながら、本発明によれば、２つの２次元データを相関させることによって、実質的に高い再現性を確認することが可能である。すなわち、２つの２次元データを相関させることによって、両者の特徴を重ね合わせて評価することが可能となるため、測定データ自体の絶対値の相違の存在に関わらず、測定データを評価する上で高い再現性を確認することができるのである。これにより、例えば異なる試料間での発現差異さえも識別することが可能となる。従って、本発明は、今後の発展が強く期待されているプロテオミクスの分野において、極めて重要な貢献をもたらすであろう。
【００１３】
測定によって得られた２次元データを相関させる対象は、予め求めてあった標準２次元データに限定されない。例えば、測定によって得られた２つの２次元データを相関させることも勿論可能である。
【００１４】
すなわち、本発明は、液体クロマトグラフィーに第１被検査物質を含む第１溶液を流して、当該第１溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する第１濃度勾配生成工程と、前記第１濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記第１被検査物質の各成分について、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る第１測定工程と、前記液体クロマトグラフィーに第２被検査物質を含む第２溶液を流して、当該第２溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する第２濃度勾配生成工程と、前記第２濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記第２被検査物質の各成分について、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る第２測定工程と、前記第２測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、前記第１測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データと相関させることによって補正する補正工程と、を備えたことを特徴とするデータ補正方法である。
【００１５】
本発明においても、２つの２次元データを相関させることによって、実質的に高い再現性を確認することが可能である。すなわち、２つの２次元データを相関させることによって、両者の特徴を重ね合わせて評価することが可能となるため、測定データ自体の絶対値の相違の存在に関わらず、測定データを評価する上で高い再現性を確認することができる。
【００１６】
更に、相関される２つの２次元データは、異なる液体クロマトグラフィーを用いて得られたものであってもよい。
【００１７】
すなわち、本発明は、第１液体クロマトグラフィーに第１被検査物質を含む第１溶液を流して、当該第１溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する第１濃度勾配生成工程と、前記第１濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記第１被検査物質の各成分について、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る第１測定工程と、第２液体クロマトグラフィーに第２被検査物質を含む第２溶液を流して、当該第２溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する第２濃度勾配生成工程と、前記第２濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記第２被検査物質の各成分について、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る第２測定工程と、前記第２測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、前記第１測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データと相関させることによって補正する補正工程と、を備えたことを特徴とするデータ補正方法である。
【００１８】
本発明においても、２つの２次元データを相関させることによって、実質的に高い再現性を確認することが可能である。すなわち、２つの２次元データを相関させることによって、両者の特徴を重ね合わせて評価することが可能となるため、測定データ自体の絶対値の相違の存在に関わらず、測定データを評価する上で高い再現性を確認することができる。
【００１９】
本発明によれば、測定される保持時間のずれを補正工程によって補正することが可能であるため、従来は実用されていなかった超低流量の液体クロマトグラフィーのデータを利用することが現実的となる。具体的には、前記濃度勾配生成工程において、液体クロマトグラフィーに被検査物質を含む溶液を、５００ｎｌ／ｍｉｎ以下の流量、特に好ましくは２００ｎｌ／ｍｉｎ程度の流量、で流すことができる。
【００２０】
また、好ましくは、前記補正工程では、２つの２次元データのサイクル番号（保持時間に対する昇順番号）を各軸とした２次元の格子座標を用いて最適対応位置を探索する動的アルゴリズムが用いられるようになっている。
【００２１】
より具体的には、前記動的アルゴリズムは、例えば、一方の２次元データのｎサイクル目における質量電荷比（マススペクトル）Ａ（ｎ）と、他方の２次元データのｍサイクル目における質量電荷比Ｂ（ｎ）と、の間のピアソン積率相関係数をＲ（Ａ（ｎ），Ｂ（ｍ））とし、ギャップペナルティをｇとし、一方の２次元データの総サイクル数をＮとし、他方の２次元データの総サイクル数をＭとした時、２つの２次元データのサイクル番号を各軸とした２次元の格子座標Ｌ（ｉ，ｊ）を、
Ｌ（ｉ，ｊ）＝ｍａｘ（Ｌ（ｉ−１，ｊ）    ＋ｇ、
Ｌ（ｉ，    ｊ−１）＋ｇ、
Ｌ（ｉ−１，ｊ−１）＋Ｒ（Ａ（ｎ），Ｂ（ｍ）））
によって求め（ｉ＝１，・・・，Ｎ、ｊ＝１，・・・，Ｍ）、最適対応位置に対応するように、Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（ｋ，ｌ），（（ｋ＝Ｎ、ｌ＝１，・・・，Ｍ）及び（ｋ＝１，・・・，Ｎ、ｌ＝Ｍ））を与える座標（ｋ，ｌ）＝Ｖ０  を始点として、
Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（Ｖｉ  ），（Ｖｉ  ＝Ｖｉ−１  −（１，１），Ｖｉ−１  −（０，１），Ｖｉ−１  −（１，０））
で表される座標配列を決定するようになっている。
【００２２】
更に好ましくは、前記動的アルゴリズムは、Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（Ｖｉ  ）のうちで  Ｖｉ＋１  ＝Ｖｉ  ＋（１，１）を満たす座標のみを抽出した後、サイクル番号を保持時間に変換し、スプライン補完または多項式回帰により得られる曲線を補正関数として決定するようになっている。
【００２３】
また、本発明は、複数の被検査物質（または第２被検査物質）をそれぞれ含む複数の溶液（または第２溶液）の各々について、前記のいずれかの特徴を有するデータ補正方法を実施するデータ補正工程と、前記データ補正方法によって補正された保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、ある質量電荷について、各溶液（または各第２溶液）の保持時間データを並列に並べた２次元画像データに展開するデータ展開工程と、前記２次元画像データに基づいて、保持時間データの同一ピークを抽出する同一ピーク抽出工程と、を備えたことを特徴とするデータ分析方法である。
【００２４】
本発明によれば、複数の被検査物質（または第２被検査物質）をそれぞれ含む複数の溶液（または第２溶液）から保持時間データの同一ピークを抽出することにより、当該複数の溶液（または第２溶液）のデータ特性を効果的に分析することができる。これにより、腫瘍マーカー等の疾患マーカーの開発を著しく促進することが期待できる。
【００２５】
例えば、第１群に属する複数の被検査物質（または第２被検査物質）をそれぞれ含む複数の溶液（または第２溶液）について、及び、第２群に属する複数の被検査物質（または第２被検査物質）をそれぞれ含む複数の溶液（または第２溶液）について、前記のデータ分析方法を実施し（データ分析工程）、第１群の複数の溶液（または第２溶液）から得られた保持時間データの同一ピークと、第２群の複数の溶液（または第２溶液）から得られた保持時間データの同一ピークと、を比較して、両者に有意な差があるか否かを検証し（検定工程）、有意な差が認められるならば、それらの差を「マーカー」として利用することができるのである。
【００２６】
ここで、通常、前記同一ピーク抽出工程は、各溶液（または各第２溶液）の保持時間データについてのピークを検出するピーク検出工程と、前記ピーク検出工程で検出された各溶液（または各第２溶液）のピーク同士の対応関係を特定する同一ピーク特定工程と、を含んでいる。
【００２７】
そして、好ましくは、前記同一ピーク特定工程は、所定の保持時間幅内に含まれる候補ピークを抽出する候補ピーク抽出工程と、ある溶液（または第２溶液）において前記候補ピーク抽出工程で抽出された候補ピークが一つ以上ある場合には、当該溶液（または第２溶液）についての候補ピークを一つ選択し、ある溶液（または第２溶液）において前記候補ピーク抽出工程で抽出された候補ピークが無い場合には、当該溶液（または第２溶液）についての候補ピークは無いものとして、前記候補ピークの選択の全組合せの各々について、選択された候補ピークのスコア（総強度）を計算するスコア計算工程と、前記スコア計算工程で得られたスコアのうち、最大のスコアを提供する候補ピークの選択の組み合わせを、互いに対応する同一ピークとして特定するピーク特定工程と、を有している。
【００２８】
この場合、より好ましくは、前記同一ピーク特定工程は、前記ピーク特定工程の後に、前記ピーク特定工程において特定された同一ピークによって保持時間データを区間分割するデータ分割工程を更に含んでおり、前記データ分割工程において区間分割された保持時間データについて、前記候補ピーク抽出工程、前記スコア計算工程、前記ピーク特定工程、及び、前記データ分割工程を再帰的に繰り返すようになっている。
【００２９】
また、例えば、前記候補ピーク抽出工程は、各ピークを基準にして、当該ピークからの許容ずれ範囲幅を所定の保持時間幅として行われるようになっている。例えば、前記許容ずれ範囲幅は、＋側に０．７ｍｉｎである。
【００３０】
この場合、計算数（演算負担）低減のために、前記候補ピーク抽出工程で抽出された候補ピークが無い溶液（または第２溶液）の割合が、所定の最小検出率を下回った場合には、当該ピークを基準にした前記同一ピーク特定工程の実施が終了されるようになっていることが好ましい。この場合、好ましくは、前記最小検出率は、０．１〜０．４に設定される（０．５を越えると、二群間での有意な差を特定し難くなる）。
【００３１】
また、好ましくは、前記データ展開工程は、単位質量電荷ごとに、各溶液（または各第２溶液）の保持時間データを並列に並べた２次元画像データに展開するようになっており、前記同一ピーク抽出工程は、前記２次元画像データに基づいて、単位質量電荷ごとに、保持時間データの同一ピークを抽出するようになっている。
【００３２】
また、本発明は、液体クロマトグラフィーに被検査物質を含む溶液を流して、当該溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する濃度勾配生成工程と、前記濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記被検査物質の各成分について、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る測定工程と、を備えた液体クロマトグラフィー方法のためのデータ補正装置であって、前記測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、予め求めてあった標準２次元データと相関させることによって補正するようになっており、２つの２次元データのサイクル番号（保持時間に対する昇順番号）を各軸とした２次元の格子座標を用いて最適対応位置を探索する動的アルゴリズム（ソフトウェア）が用いられるようになっていることを特徴とするデータ補正装置である。
【００３３】
前記補正装置あるいは当該補正装置の各要素手段は、コンピュータシステムによって実現され得る。
【００３４】
また、コンピュータシステムにそれらを実現させるためのプログラム及び当該プログラムを記録したコンピュータ読取り可能な記録媒体も、本件の保護対象である。
【００３５】
ここで、記録媒体とは、フレキシブルディスク等の単体として認識できるものの他、各種信号を伝搬させるネットワークをも含む。
【００３６】
また、本発明は、同一のまたは異なる液体クロマトグラフィーに複数の被検査物質をそれぞれ含む複数の溶液を流して、当該各溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する濃度勾配生成工程と、前記濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記被検査物質の各成分について、各溶液毎に、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る測定工程と、前記測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、ある質量電荷について、各溶液の保持時間データを並列に並べた２次元画像データに展開するデータ展開工程と、前記２次元画像データに基づいて、保持時間データの同一ピークを抽出する同一ピーク抽出工程と、を備えたことを特徴とするデータ分析方法である。
【００３７】
本件出願の時点では、本願において優先権主張の基礎とする「特願２００５−１７７５４７」にて提案されたデータ補正方法を利用しなければ、前記２次元画像データに基づいて保持時間データの同一ピークを抽出するという同一ピーク抽出工程を、事実上実施することができない（図１６に示すように、ピーク同士の対応を特定することができない）。しかしながら、将来においてデータ測定方法の精度が向上した場合には、「特願２００５−１７７５４７」にて提案されたデータ補正方法を用いることなく、本願において提案するデータ分析方法が単独で利用され得る。すなわち、本発明によれば、複数の被検査物質（または第２被検査物質）をそれぞれ含む複数の溶液（または第２溶液）から保持時間データの同一ピークを抽出することにより、当該複数の溶液（または第２溶液）のデータ特性を効果的に分析することができ、腫瘍マーカー等の疾患マーカーの開発を著しく促進することが期待できる。
【００３８】
また、本発明は、同一のまたは異なる液体クロマトグラフィーに複数の被検査物質をそれぞれ含む複数の溶液を流して、当該各溶液の濃度勾配を所定時間かけて生成する濃度勾配生成工程と、前記濃度勾配生成工程中に分離溶出した前記被検査物質の各成分について、各溶液毎に、保持時間データと質量電荷比データとを対応付けて得る測定工程と、を備えた液体クロマトグラフィー方法のためのデータ分析装置であって、前記測定工程にて得られた保持時間データと質量電荷比データとの２次元データを、ある質量電荷について、各溶液の保持時間データを並列に並べた２次元画像データに展開するデータ展開装置と、前記２次元画像データに基づいて、保持時間データの同一ピークを抽出する同一ピーク抽出装置と、を備えたことを特徴とするデータ分析装置である。
【００３９】
前記データ分析装置あるいは当該データ分析装置の各要素手段は、コンピュータシステムによって実現され得る。
【００４０】
また、コンピュータシステムにそれらを実現させるためのプログラム及び当該プログラムを記録したコンピュータ読取り可能な記録媒体も、本件の保護対象である。
【００４１】
ここで、記録媒体とは、フレキシブルディスク等の単体として認識できるものの他、各種信号を伝搬させるネットワークをも含む。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の一実施の形態の概略を示すフロー図。
【図２】本発明の一実施の形態の動的アルゴリズムの概念を示す概略図。
【図３】本発明の一実施の形態の動的アルゴリズムの概念を示す概略図。
【図４】本発明の一実施の形態の動的アルゴリズムの作用を説明する概略図。
【図５】本発明の一実施の形態の動的アルゴリズムの作用を説明する概略図。
【図６】本発明の一実施の形態の動的アルゴリズムの作用を説明する概略図。
【図７】測定データの補正の例（相違の例）を示すグラフ。
【図８】補正されたデータの再現性を示すグラフ。
【図９】本発明の第２の実施の形態の概略を示すフロー図。
【図１０】各サンプルの保持時間データを縦軸方向に並べた２次元画像データの例。
【図１１ａ】ベースライン補正工程の概念を示すグラフ。
【図１１ｂ】スムージング工程の概念を示すグラフ。
【図１１ｃ】ピーク検出工程の概念を示すグラフ。
【図１２ａ】２次元画像データの例。
【図１２ｂ】図１２ａの２次元画像データから検出されたピークを示す画像データ。
【図１３】本実施の形態の同一ピーク抽出工程（同一ピーク抽出アルゴリズム）を示す概略フロー図。
【図１４ａ】有意差が認められた同一ピークを含む２つの２次元画像の例。
【図１４ｂ】図１４ａのＲＯＣ曲線。
【図１４ｃ】図１４ａのピーク強度分布図。
【図１５ａ】有意差が認められた２つの同一ピークを含む２組の２次元画像の例。
【図１５ｂ】図１５ａのピーク強度分布図。
【図１６】データ補正を行わない場合の２次元画像の例。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照して説明する。
【００４４】
まず、本実施の形態で使用された被検査物質及び溶液について説明する。
【００４５】
被検査物質としては、テトラサイクリンで発現コントロールできるアクチニン４（ACTN4 ）を遺伝子導入したＤＬＤ１ヒト大腸癌細胞株（Honda et al. Gastroenterology 2005; 128: 51-62）が用いられた。通常培養ではＡＣＴＮ４が発現されるが（DLD1 Tet-off ACTN4 ）、０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのドキソサイクリン（Dox）により、ＡＣＴＮ４の発現は抑制される（DLD1 Tet-on ACTN4 ）。DLD1 Tet-off ACTN4 及びDLD1 Tet-on ACTN4 のそれぞれの細胞溶液を３ｍｇ／ｍｌの濃度で調整した。
【００４６】
次に、DLD1 Tet-off ACTN4 及びDLD1 Tet-on ACTN4 のそれぞれの細胞溶液を１００μｌ採って、アセトン沈殿にて蛋白濃縮を行った。そして、５ＭのＵＲＥＡを１０μｌ、１ＭのＮＨ４  ＨＣＯ３  を２．５μｌ、トリプシンを３．３μｇ加えた後、精製水にて５０μｌとした。
【００４７】
そして、３７℃で２０時間消化反応させた後、アセトニトリル５０μｌを添加し、１７４００Ｇで１０分間遠心し、上清を他のチューブに移し、スピードバックを用いて乾燥した。そして、０．１％蟻酸５０μｌで溶解して、測定用のサンプル（溶液）とした（図１：ＳＴＥＰ１）。
【００４８】
一方、超低流量液体クロマトグラフィーとして、Splitless Nano HPLC System （ＫＹＡ，東京）が用いられた。粒子径３μｍ、ポアサイズ１２０Åの高純度シリカゲルに、オクタデシル基を導入後、残存シラノール基を極限までエンドキャッピングした内径０．１５ｍｍ、長さ５０ｍｍの逆相カラムが分離カラムに、内径０．５ｍｍ、長さ１ｍｍのものがトラップカラムに、それぞれ用いられた（ＨｉＱ  ｓｉｌ，ＫＹＡ，東京）。
【００４９】
そして、前記サンプルを１０μｌ採って、２００ｎｌ／ｍｉｎという超低流量で、０．１％蟻酸から０．１％蟻酸８０％アセトニトリルまで、６０分間かけて、連続濃度勾配を生成した（図１：ＳＴＥＰ２）。その間に、各成分が分離溶出した（図１：ＳＴＥＰ３）。
【００５０】
各成分の質量分析には、QTOF Ultima（Waters, MA, USA）が用いられ、２５０〜１６００Ｍ／Ｚまでの範囲で、スキャン時間を１秒として、セントロイド形式で、６０分間測定が行われた。DLD1 Tet-off ACTN4 及びDLD1 Tet-on ACTN4 のそれぞれについて、duplicate でデータが採取された（２回データが採取された）（図１：ＳＴＥＰ４）。
【００５１】
データの２次元表示では、質量電荷比が１ｍ／ｚ（mass to charge ratio ）の範囲ごとの最大値に変換されて、ｗｉｆｆ形式で出力された。なお、解析対象範囲は、質量電荷比が５００〜１０００ｍ／ｚ、保持時間（ＲＴ）が１〜１８００ｓｅｃ、に限定され、強度（Intensity）＜２００の値が、１〜２５５のグレースケールに置換されて表示された。
【００５２】
そして、本実施の形態では、２つのサンプルから採取された各２回（計４回）のデータを相関させることで、データ補正が行われた（図１：ＳＴＥＰ５）。
【００５３】
まず、本実施の形態において採用された、データ補正のために用いられる補正関数の求め方（アルゴリズム）を説明する。
【００５４】
本実施の形態では、参照される側の（標準とされる）２次元データをＡ、補正対象となる２次元データをＢとし、各保持時間におけるマススペクトル相関係数の和が最大になるような補正関数が導出される。
【００５５】
まず、実行速度の向上と質量計測誤差に対しての冗長性の確保のため、各ＲＴ（保持時間）におけるマススペクトルのイオン強度が１ｍ／ｚ区間毎の代表値に変換される。
【００５６】
次に、２つの２次元データＡ、Ｂのサイクル番号（各ＲＴに対する昇順番号）を各軸とした２次元の格子座標を用いて、以下に説明するような動的アルゴリズムにより、最適対応位置を与える経路探索が行われる。
【００５７】
本実施の形態の動的アルゴリズムは、一方の２次元データのｎサイクル目における質量電荷比（マススペクトル）Ａ（ｎ）と、他方の２次元データのｍサイクル目における質量電荷比Ｂ（ｎ）と、の間のピアソン積率相関係数をＲ（Ａ（ｎ），Ｂ（ｍ））とし、ギャップペナルティをｇとし（典型的には、−０．５）、一方の２次元データの総サイクル数をＮとし、他方の２次元データの総サイクル数をＭとした時、２つの２次元データのサイクル番号を各軸とした２次元の格子座標Ｌ（ｉ，ｊ）を、
Ｌ（ｉ，ｊ）＝ｍａｘ（Ｌ（ｉ−１，ｊ）    ＋ｇ、
Ｌ（ｉ，    ｊ−１）＋ｇ、
Ｌ（ｉ−１，ｊ−１）＋Ｒ（Ａ（ｎ），Ｂ（ｍ）））
によって求める（ｉ＝１，・・・，Ｎ、ｊ＝１，・・・，Ｍ）。
【００５８】
そして、最適対応位置に対応するように、Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（ｋ，ｌ），（（ｋ＝Ｎ、ｌ＝１，・・・，Ｍ）及び（ｋ＝１，・・・，Ｎ、ｌ＝Ｍ））を与える座標（ｋ，ｌ）＝Ｖ０  を始点として、
Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（Ｖｉ  ），（Ｖｉ  ＝Ｖｉ−１  −（１，１），Ｖｉ−１  −（０，１），Ｖｉ−１  −（１，０））
で表される座標配列が決定される。
【００５９】
更に、本実施の形態の動的アルゴリズムは、Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（Ｖｉ  ）のうちで  Ｖｉ＋１  ＝Ｖｉ  ＋（１，１）を満たす座標のみを抽出した後、座標系をサイクル番号からＲＴへ変換して、スプライン補完または多項式回帰により得られる曲線を補正関数とする。
【００６０】
以上のアルゴリズムについて、図面を用いて説明すると、以下のようになる。
【００６１】
図２に示すように、参照データ「Ａ」に対して、対象データ「Ａ」はＹ軸方向に歪んだ図形（データ列）である。この場合、本アルゴリズムは、ｆ−１（ｙ’）を求めるアルゴリズムに相当するものである。
【００６２】
図３は、図２に対応して形成されたｙとｙ’とを軸とする平面を示している。図３において、四角印を結んだ線が、この場合のｙ−ｙ’対応位置を示す線である。本アルゴリズムは、このｙ−ｙ’対応位置（経路）を求めるものである。
【００６３】
図４は、図２及び図３の例に対応して、各格子点についてピアソン積率相関係数Ｒ（Ａ（ｎ），Ｂ（ｍ））を求め、ギャップペナルティを−０．５として、実際に本アルゴリズムを用いてＬ（ｉ，ｊ）を求めていく過程を示している。
【００６４】
全ての（ｉ，ｊ）に対するＬ（ｉ，ｊ）が求められたら、図５に示すように、Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（ｋ，ｌ），（（ｋ＝Ｎ、ｌ＝１，・・・，Ｍ）及び（ｋ＝１，・・・，Ｎ、ｌ＝Ｍ））を与える座標（ｋ，ｌ）＝Ｖ０  が始点として特定され、Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（Ｖｉ  ），（Ｖｉ  ＝Ｖｉ−１  −（１，１），Ｖｉ−１  −（０，１），Ｖｉ−１  −（１，０））で表される座標配列が決定される。
【００６５】
最後に、図６に示すように、Ｌ＝ａｒｇｍａｘ（Ｖｉ  ）のうちで  Ｖｉ＋１  ＝Ｖｉ  ＋（１，１）を満たす座標のみを抽出した後、サイクル番号を保持時間に変換し、スプライン補完または多項式回帰により曲線を得る。当該曲線が求めるべき補正関数である。
【００６６】
以上のようなアルゴリズムにより、本実施の形態において２つのサンプルから得られた４つの２次元データのうちの３つが補正された。
【００６７】
データ補正にあたっては、まず、RollingBall Algorithm （from ”NIH Image J”）（Radius = 50）を用いて、バックグラウンドが計算された。そして、各ポイントでの閾値を（バックグラウンド値＋データ値）／２として、閾値以上の値を持つ隣接するスポットを統合し、peak intensity = Intensity総和、peak mz = MZ重心、peak rt = RT重心として、ピークの検出がなされた。そして、検出されたピークが、液体クロマトグラフィーの補正されたデータ（前記アルゴリズムにより得られた補正関数をかけた後の保持時間のデータ）に当て嵌められ、得られた（補正された）同一サンプルの２つの２次元データが重ね合わされ、「統合」された（平均化された）。この「統合」処理では、質量電荷比、溶出時間（保持時間）の変動の許容範囲が、それぞれ、±２、±２０とされた。また、その中に複数のピークが存在する時には、Intensityのより高い方を採用し、ＭＺ，ＲＴは平均値とした。このようにして得られた各サンプルのデータから、pairを検出し、pairが検出された場合に、それぞれのpeak intensityの比が算出された（図１：ＳＴＥＰ６）。
【００６８】
結果を以下にまとめて示す。
【００６９】
前記のように、DLD1 Tet-off ACTN4 及びDLD1 Tet-on ACTN4 のそれぞれに対して、duplicateでデータが採取されたが（以下、Ｏｆｆ１、Ｏｆｆ２、Ｏｎ１、Ｏｎ２とする）、これら４つのデータのうち、DLD1 Tet-off ACTN4の一方のデータ（Ｏｆｆ１）がマスターデータ（標準データ）とされ、他の３つのデータが上記アルゴリズムにより得られた補正関数によって補正された。
【００７０】
図７に示すように、Ｏｆｆ１データを基準とすると、補正前のＯｆｆ２は、最大で１９０ｓｅｃ、平均で７１．９ｓｅｃの相違（変動）があり、補正前のＯｎ１は、最大で１９２ｓｅｃ、平均で１３０．２ｓｅｃの相違（変動）があり、補正前のＯｎ２は、最大で８０ｓｅｃ、平均で３６．３ｓｅｃの相違（変動）があった（図７において、Ｘ軸方向のずれが相違（変動）である）。ところが、上記アルゴリズムにより得られた補正関数による補正の結果、図８に示すように、同一サンプルのDLD1 Tet-off ACTN4 （Ｏｆｆ１、Ｏｆｆ２）では、０．９２という高い相関係数を得ることができ、また同様に、同一サンプルのDLD1 Tet-on ACTN4（Ｏｎ１、Ｏｎ２）でも、０．９４という高い相関係数を得ることができた。
【００７１】
なお、Ｏｆｆ１と補正されたＯｆｆ２とを平均化して得られた値をDLD1 Tet-off ACTN4の代表値とし、補正されたＯｎ１と補正されたＯｎ２とを平均化して得られた値をDLD1 Tet-on ACTN4の代表値として、それら２群間で、強い発現があるほうのpeak intensityが１０以上で一方に発現がないもの、あるいは、peak intensityの比が３以上であるもの、が２０３peak認められた（DLD1 Tet-off ACTN4優位が１０７peak、DLD1 Tet-on ACTN4優位が９６peak）。これらのpeakはアクチニン４（ACTN4 ）の発現によって変動するものと認められ、すなわち、アクチニン４（蛋白）の同定が可能であった。
【００７２】
このように、測定データ自体には再現性を見出すことが困難な同一種のサンプルの複数回の測定データ（Ｏｆｆ１とＯｆｆ２、あるいは、Ｏｎ１とＯｎ２）を相関させて補正することにより、ある程度の再現性を有する同一種のデータ群とみなすことができ、それらを平均化して得られる値を代表値とすることで、より高精度の同定ないし診断を行うことが可能となる。すなわち、２つ以上の２次元データを相関させることによって、それらの特徴を重ね合わせて評価することが可能となり、測定データ自体の相違の存在に関わらず測定データを評価する上で高い再現性を認めることができ、多くの検体、たとえば患者血清で比較検討すること等が可能となる。これにより、今までとは異なる病気に関するマーカーを開発できる可能性が顕著に高められる。
【００７３】
なお、前記のデータ補正の処理は、通常、各種のコンピュータシステムによって構成され得るデータ補正装置によって実施され得る。ここで、当該データ補正装置をコンピュータシステム上に実現させるためのプログラム及び当該プログラムを記録したコンピュータ読取り可能な記録媒体も、本件の保護対象である。
【００７４】
さらに、データ補正装置が、コンピュータシステム上で動作するＯＳ等のプログラム（第２のプログラム）によって実現される場合、当該ＯＳ等のプログラムを制御する各種命令を含むプログラム及び当該プログラムを記録した記録媒体も、本件の保護対象である。
【００７５】
ここで、記録媒体とは、フレキシブルディスク等の単体として認識できるものの他、各種信号を伝搬させるネットワークをも含む。
【００７６】
次に、本発明の第２の実施の形態を、図面を参照して説明する。
【００７７】
まず、本実施の形態で使用された被検査物質及び溶液について説明する。
【００７８】
本実施の形態では、被検査物質として、膵臓癌患者１８例の血漿（第１群）と非担癌者１９例の血漿（第２群）を、それぞれ１０μｌ用いた。そして、これらから、１００μｌのconcanavalin Aに吸着する糖タンパク分画を抽出した（この処理は、必須の処理では無いが、感度調整という点で実施することが好ましい）。
【００７９】
そして、当該糖タンパク分画の各々に、５ＭのＵＲＥＡを１０μｌ、１ＭのＮＨ４  ＨＣＯ３  を２．５μｌ、トリプシンを３．３μｇ加えた後、精製水にて５０μｌとした。
【００８０】
そして、３７℃で２０時間消化反応させた後、アセトニトリル５０μｌを添加し、１７４００Ｇで１０分間遠心し、上清を他のチューブに移し、スピードバックを用いて乾燥した。そして、０．１％蟻酸５０μｌで溶解して、測定用のサンプル（溶液）とした（図９：ＳＴＥＰ２１）。
【００８１】
一方、超低流量液体クロマトグラフィーとして、Splitless Nano HPLC System （ＫＹＡ，東京）が用いられた。粒子径３μｍ、ポアサイズ１２０Åの高純度シリカゲルに、オクタデシル基を導入後、残存シラノール基を極限までエンドキャッピングした内径０．１５ｍｍ、長さ５０ｍｍの逆相カラムが分離カラムに、内径０．５ｍｍ、長さ１ｍｍのものがトラップカラムに、それぞれ用いられた（ＨｉＱ  ｓｉｌ，ＫＹＡ，東京）。
【００８２】
そして、前記サンプルを１０μｌ採って、２００ｎｌ／ｍｉｎという超低流量で、０．１％蟻酸から０．１％蟻酸８０％アセトニトリルまで、６０分間かけて、連続濃度勾配を生成した（図９：ＳＴＥＰ２２）。その間に、各成分が分離溶出した（図９：ＳＴＥＰ２３）。
【００８３】
各成分の質量分析には、QTOF Ultima（Waters, MA, USA）が用いられ、２５０〜１６００Ｍ／Ｚまでの範囲で、スキャン時間を１秒として、セントロイド形式で、６０分間測定が行われた。各サンプル（溶液）について、triplicate でデータが採取された（３回データが採取された）（図９：ＳＴＥＰ２４）。
【００８４】
データの２次元表示では、質量電荷比が１ｍ／ｚ（mass to charge ratio ）の範囲ごとの最大値に変換されて、ｗｉｆｆ形式で出力された。なお、解析対象範囲は、質量電荷比が５００〜１０００ｍ／ｚ、保持時間（ＲＴ）が１〜１８００ｓｅｃ、に限定され、強度（Intensity）＜２００の値が、１〜２５５のグレースケールに置換されて表示された。
【００８５】
そして、本実施の形態では、３７例のサンプルから採取された各３回（計１１１回）のデータを相関させることで、データ補正が行われた（図９：ＳＴＥＰ２５）。
【００８６】
本実施の形態でも、前記実施の形態に関して説明されたアルゴリズムに従って、参照される側の（標準とされる）２次元データをＡ、補正対象となる２次元データをＢとし、各保持時間におけるマススペクトル相関係数の和が最大になるような補正関数が導出され、得られた補正関数が各サンプルの保持時間のデータに掛けられた。ここでは、ある非担癌者の血漿に基づくデータが、参照される側の（標準とされる）２次元データＡとして用いられた。
【００８７】
このようにして得られた補正後の２次元データ（保持時間データ−質量電荷比データ）について、本実施の形態では、コンピュータシステムにより構成されたデータ分析装置によって、１ｍ／ｚ毎に、各サンプルデータの保持時間データを並列に並べた２次元画像データに展開された（図９：ＳＴＥＰ２６）。
【００８８】
２次元画像データの例を図１０に示す。図１０において、横軸方向が保持時間（ＲＴ：２０〜３０ｍｉｎ）であり、縦軸方向に各サンプルデータが並べられている。図１０は、８６３ｍ／ｚについての２次元画像データである。
【００８９】
そして、前記データ分析装置によって、新規に開発された同一ピーク抽出アルゴリズムに従って、２次元画像データ中の保持時間データの同一ピークが抽出された（図９：ＳＴＥＰ２７）。
【００９０】
ここで、本実施の形態の同一ピーク抽出アルゴリズムは、各サンプルデータの保持時間データに対する、ベースライン補正工程（図１１（ａ））と、スムージング工程（図１１（ｂ））と、ピーク検出工程（図１１（ｃ））と、を含んでいる。
【００９１】
ベースライン補正とは、試料の光散乱の影響などでスペクトル波形に生じるベースラインの傾きやうねりを矯正するための処理である。スムージングとは、ガウス関数による加重平均をとることでノイズを除去する処理である（数１参照）。これらの処理は、データ分析のための処理手法として、従前からよく利用されているものである。
【数１】
0005760253.tif 000002
【００９２】
また、本実施の形態のピーク検出工程では、データポイント毎に信号／ノイズ比を算出することによって、ピーク検出精度を高めている。
【００９３】
検出されたピークを示す画像の例を、図１２（ｂ）に示す。図１２（ａ）が２次元画像データの例であり、図１２（ｂ）が図１２（ａ）のデータから検出されたピークを示す画像データである。
【００９４】
そして、本実施の形態の同一ピーク抽出アルゴリズムは、ピーク検出工程で検出された各サンプルデータのピーク同士の対応関係を特定する同一ピーク特定工程を含んでいる。
【００９５】
この同一ピーク特定工程は、図１３に示すように、各ピークを基準にして、当該ピークからの許容ずれ範囲幅を所定の保持時間幅とし、当該保持時間幅内に含まれる候補ピークを抽出する候補ピーク抽出工程を有している（図１３：ＳＴＥＰ３１）。許容ずれ範囲幅は、例えば、＋側に０．７ｍｉｎである。
【００９６】
そして、同一ピーク特定工程は、あるサンプルデータにおいて前記保持時間幅内に抽出された候補ピークが一つ以上ある場合には、当該サンプルデータについての候補ピークを一つ選択し、あるサンプルデータにおいて前記保持時間幅内に抽出された候補ピークが無い場合には、当該サンプルデータについての候補ピークは無いものとして、前記候補ピークの（全サンプルデータに亘る）選択の全組合せの各々について、選択された候補ピークのスコア（総強度）を計算するスコア計算工程を有している（図１３：ＳＴＥＰ３２）。
【００９７】
ここで、前記保持時間幅内に抽出された候補ピークが無いサンプルデータの割合が、所定の最小検出率を下回った場合には、その時点で、当該保持時間幅での前記同一ピーク特定工程の実施が終了されるようになっていることが好ましい。そのような場合には、当該保持時間幅内において同一ピークを特定すべきでないからである。最小検出率は、通常、０．１〜０．４に設定される（０．５を越えると、二群間での有意な差を特定し難くなると考えられる）。
【００９８】
そして、スコア計算工程で得られたスコアのうち、最大のスコアを提供する候補ピークの選択の組み合わせが、互いに対応する同一ピークとして特定される（ピーク特定工程）（図１３：ＳＴＥＰ３３）。そして、対応する同一ピークが認められなかった（抽出されなかった）サンプルデータに対して、ピークを補完する処理が行われる（図１３：ＳＴＥＰ３４）。
【００９９】
その後、特定及び補完された同一ピークによって、保持時間データが区間分割される（データ分割工程）（図１３：ＳＴＥＰ３５）。そして、当該データ分割工程において区間分割された保持時間データ（の双方）について、前記候補ピーク抽出工程、前記スコア計算工程、前記ピーク特定工程、及び、前記データ分割工程が再帰的に繰り返される（図１３：ＳＴＥＰ３６）。
【０１００】
以上のような本実施の形態の同一ピーク抽出アルゴリズムによって、１０５４５７個の同一ピークが特定された。これらの同一ピークについて、膵臓癌患者１８例の血漿（第１群）に基づく同一ピークと、非担癌者１９例の血漿（第２群）に基づく同一ピークと、を比較し、両者に有意な差があるか否かを検証し、有意な差が認められるのであれば、それらの差を「マーカー」として利用することができる（図９：ＳＴＥＰ２８）。
【０１０１】
具体的には、本実施の形態の場合、膵臓癌患者群と非担癌者群とで、平均ピーク強度が１０以上であってＵ検定で０．０００１以下の有意差を示したものが、１０９ピーク認められた（膵臓癌患者群優位が８０ピーク、非担癌者群優位が２９ピーク）。また、ＲＯＣ曲線下面積が０．９以上であるピークが、３２認められた。
【０１０２】
これら３２のピークのうちの一つについて、図１４（ａ）乃至図１４（ｃ）に、２次元画像（図１４（ａ））と、ＲＯＣ曲線（図１４（ｂ））と、ピーク強度分布図（図１４（ｃ））と、を示す。
【０１０３】
また、前記３２のピークに対して、ＳＶＭを用いて、２因子での解析を行った。クロスバリデーションを行ったうえで、判別率が１００％（感度１００％、特異度１００％）であるピークの組み合わせが３つあり、判別率が９７％（感度１００％、特異度９５％、あるいは、感度９４％、特異度１００％）のピークの組み合わせが２８あった。図１５（ａ）に、組み合わせにより判別率が１００％（感度１００％、特異度１００％）となるピーク画像を示し、図１５（ｂ）に、そのピークを用いて分けられた膵臓癌患者と非担癌者とのピーク強度の分布を示す。
【０１０４】
このように、本実施の形態によれば、膵臓癌患者の血漿を含む溶液から保持時間データの同一ピークを抽出すると共に非担癌者の血漿を含む溶液から保持時間データの同一ピークを抽出し、両者を比較することによって、膵臓癌マーカーの開発を促進することができる。
【０１０５】
なお、前記のデータ分析の処理は、通常、各種のコンピュータシステムによって構成され得るデータ分析装置によって実施され得る。ここで、当該データ分析装置をコンピュータシステム上に実現させるためのプログラム及び当該プログラムを記録したコンピュータ読取り可能な記録媒体も、本件の保護対象である。
【０１０６】
さらに、データ分析装置が、コンピュータシステム上で動作するＯＳ等のプログラム（第２のプログラム）によって実現される場合、当該ＯＳ等のプログラムを制御する各種命令を含むプログラム及び当該プログラムを記録した記録媒体も、本件の保護対象である。
【０１０７】
ここで、記録媒体とは、フレキシブルディスク等の単体として認識できるものの他、各種信号を伝搬させるネットワークをも含む。
【０１０８】
なお、前記実施の形態は、膵臓癌マーカーの開発を意図したものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。複数の被検査物質をそれぞれ含む複数の溶液から保持時間データの同一ピークを抽出することにより、当該複数の溶液のデータ特性を効果的に特定（分析）することができるため、各種の疾患マーカーの開発を促進することが期待できる。
【０１０９】
また、本件出願の時点では、本願において優先権主張の基礎とする「特願２００５−１７７５４７」にて提案されたデータ補正方法を利用しなければ、各サンプルデータの保持時間データを並べた２次元画像データは図１６に示すような状態であるので、当該２次元画像データに基づいて保持時間データの同一ピークを抽出するという同一ピーク抽出工程を実施することは事実上不可能である。しかしながら、将来においてデータ測定方法の精度が向上した場合には、前記データ補正方法を用いることなく、前記データ分析方法のみが単独で利用されることもあり得る。
【図１】
0005760253.tif 000003
【図２】
0005760253.tif 000004
【図３】
0005760253.tif 000005
【図４】
0005760253.tif 000006
【図５】
0005760253.tif 000007
【図６】
0005760253.tif 000008
【図７】
0005760253.tif 000009
【図８】
0005760253.tif 000010
【図９】
0005760253.tif 000011
【図１１ａ】
0005760253.tif 000012
【図１１ｂ】
0005760253.tif 000013
【図１１ｃ】
0005760253.tif 000014
【図１３】
0005760253.tif 000015
【図１０】
0005760253.tif 000016
【図１２ａ】
0005760253.tif 000017
【図１２ｂ】
0005760253.tif 000018
【図１４ａ】
0005760253.tif 000019
【図１４ｂ】
0005760253.tif 000020
【図１４ｃ】
0005760253.tif 000021
【図１５ａ】
0005760253.tif 000022
【図１５ｂ】
0005760253.tif 000023
【図１６】
0005760253.tif 000024