(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性遺伝物質を取り込ませたエキソソームを含む組成物であって、
前記エキソソームが、前記エキソソームの表面に発現し、標的となる細胞上に存在する部分に結合する、ターゲティング部分を含み、
前記ターゲティング部分が、エキソソーム膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現される、
組成物。
【請求項２】
前記エキソソームが樹状細胞に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記外因性遺伝物質が、治療用タンパク質又は免疫原をコードしているＤＮＡプラスミドである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記外因性遺伝物質がｓｉＲＮＡである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記プラスミドが、遺伝子療法の方法において使用される治療用タンパク質をコードする、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記プラスミドが、免疫原に対する免疫応答を引き起こす方法において使用される、前記免疫原をコードする、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記エキソソーム膜貫通タンパク質が、Ｌａｍｐ−１、Ｌａｍｐ−２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン−３から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記エキソソーム膜貫通タンパク質がＬａｍｐ−２ｂである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
個体における遺伝子サイレンシングの方法において使用される、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
ヒト以外の動物モデルにおける遺伝子サイレンシングの方法であって、請求項４に記載の組成物を前記動物に投与するステップを含み、前記ｓｉＲＮＡが、サイレンシングされる遺伝子を対象とする方法。
【請求項１１】
エキソソーム膜貫通タンパク質と融合したターゲティング部分を含む融合タンパク質を発現する細胞を提供するステップと、エキソソームを前記細胞から単離するステップと、エレクトロポレーションによって前記エキソソームに遺伝物質を取り込ませるステップとを含む、請求項１に記載の組成物を製造する方法。
【請求項１２】
エレクトロポレーションが２０ｖ／ｃｍ〜１００ｖ／ｃｍの間の電圧で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
エキソソーム膜貫通タンパク質と融合したターゲティング部分を含む融合タンパク質を発現する細胞を提供するステップと、エキソソームを前記細胞から単離するステップと、カチオン性リポソームトランスフェクション剤を使用して、トランスフェクションによって前記エキソソームに核酸を取り込ませるステップとを含む、請求項１に記載の組成物を製造する方法。
【請求項１４】
前記エキソソームが樹状細胞に由来する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、核酸又は遺伝物質の送達用の組成物に関する。特に、本発明は、遺伝物質を取り込ませたエキソソーム、及びそれらを作製する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
核酸は、機能しない遺伝子を置換するために［１］、並びに例えばｍｉＲＮＡ［２］、ｓｈＲＮＡ［３］及びｓｉＲＮＡ［４］などのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）エフェクター分子を介する病原性変異の中和のために、遺伝子療法において日常的に使用される。裸のＤＮＡ及びＲＮＡは、急速なクリアランス［５］、ヌクレアーゼ［６］、臓器特異的な分布の欠如及び細胞の取り込みの低効率のためにｉｎ  ｖｉｖｏでの送達が困難であるので、通常、特別な遺伝子送達ビヒクルが送達に使用される。
【０００３】
ウイルスベクター及びカチオン性リポソームは、最先端の送達ビヒクル技術であり、すでに臨床試験においてこれらの送達ビヒクルの多くが比較的成功している［７］。これらの成功にもかかわらず、多くの用途を限定する顕著な制限が残っており、中でも極めて顕著なのは、ほとんどのウイルスベクターにおける免疫認識［８、９、１０］及びレンチウイルスなどのウイルスにおける変異原性組込み［１１］；並びにリポソームにおける炎症性の毒性及び急速なクリアランス［１２、１３、１４、１５］である。先天性免疫系による認識は急性炎症応答をもたらし、このことは、現在の戦略の取込み及び再投与の問題［１６、１７、１８］を克服するため、患者を日和見感染の不当なリスクにさらす可能性がある免疫抑制戦略の使用を必要とし得る。送達ビヒクルに対して産生された抗体も、後続の投与における導入遺伝子の発現を劇的に低下させる［１９］。
【０００４】
現在の戦略は、これらの特有のリスク及び制限により、一般的には、重症複合免疫不全［２０］のように療法の利益がリスクを明らかに上回る致命的な疾患、眼などの免疫特権部位［１］のように特別な環境にある疾患、又は遺伝子ワクチン［２１］に限定されている。しかし、筋緊張性ジストロフィーのように、慢性的で衰弱性であるが致命的ではない遺伝的疾患の場合、治癒的な介入には、はるかに低いリスク特性と、数年ではなく、何十年もの間、矯正的な遺伝子療法を維持する能力とが必要とされる。この種の疾患の潜在的な許容できないリスクの例は、上記の免疫抑制戦略であり、近年の関節リウマチのためのＡＡＶ遺伝子療法試験において、試験管理者に知られずに被験者によって服用された免疫抑制薬によって引き起こされた日和見感染による健常な患者の死亡［２２］によって強調される。肥満、心疾患及び精神医学的疾患を含む、遺伝的要素を有することが示される疾患の数の増加と共に、早期の（ｐｒｅｅｍｐｔｉｖｅ）遺伝的解決法のために、感受性遺伝子の修飾には非常に大きな可能性があるが、リスクがさらに低下され、長期の持続性が実現される場合に限定される。したがって、致死疾患以外にも遺伝子療法の使用を拡大させるために、良好な送達効率を維持すると同時に、免疫認識及び炎症を回避することができる技術を開発することが必須である。
【０００５】
この解決法のうちの１つは、遺伝子送達用におけるエキソソームの使用にあり得る。エキソソームは、多小胞体と原形質膜との融合後に細胞外環境に放出される、エンドサイトーシス由来の小さな膜結合小胞（３０〜１００ｎｍ）である。エキソソームの生成は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）などの多くの免疫細胞について記載されている。Ｂリンパ球及び成熟ＤＣに由来するエキソソームは、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ８６及びＩＣＡＭ−１を発現し［２３、２４］、実験モデル及び臨床試験において、特異的な抗腫瘍性のＴ細胞傷害性応答及び抗腫瘍性免疫を誘導するために使用されてきた［２４、２５］。エキソソームを介した遺伝子送達の可能性は、ヒトの肥満細胞に対するネズミ科動物のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの送達［２６］で示されており、神経膠腫に由来するエキソソーム［２７］は、外因性ＤＮＡプラスミドによって生成されるｍＲＮＡを異種の細胞に移入することが実証されている。しかし、外因性ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び他の修飾オリゴヌクレオチドの取り込み及び送達については、まだ実証されていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、エキソソームに外因性遺伝物質、及び特に、外因性プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び修飾オリゴヌクレオチドを取り込ませることに成功した。したがって、本発明は、エキソソームに外因性遺伝物質を取り込ませる方法、こうした外因性遺伝物質を取り込ませたエキソソーム、並びに遺伝子療法及び遺伝子サイレンシングのための核酸の送達におけるこれらの使用に関する。
【０００７】
また、本発明者らは、エキソソームが選択した組織を標的できるように、エキソソーム中にターゲティング部分を導入することにも成功した。したがって、本発明は、エキソソームの表面で発現されるターゲティング部分を有するエキソソーム、及びエキソソーム膜貫通タンパク質とターゲティング部分とを含む融合タンパク質、並びにこうした融合タンパク質をコードする核酸構築物に関する。エキソソームは、外因性遺伝物質を取り込ませることができ、遺伝子療法及び遺伝子サイレンシングのための核酸の送達において使用することができる。
【０００８】
本発明の一態様によれば、外因性遺伝物質を取り込ませたエキソソームを含む組成物が提供される。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝物質を送達する方法において使用される、遺伝物質を包含するエキソソームを含む組成物であって、該エキソソームが未成熟樹状細胞に由来する、組成物を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、エキソソームに遺伝物質を取り込ませる方法であって、エキソソームの組成物を用意するステップと、エレクトロポレーションによって該エキソソームに遺伝物質を取り込ませるステップとを含む、方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、エキソソームに遺伝物質を取り込ませる方法であって、エキソソームの組成物を用意するステップと、カチオン性リポソームトランスフェクション剤を使用して、トランスフェクションによってエキソソームに核酸を取り込ませるステップとを含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、エキソソームを含む組成物が提供され、前記エキソソームは、エキソソームの表面で発現されるターゲティング部分を含む。
【００１３】
別の態様において、本発明は、エキソソーム膜貫通タンパク質を含むポリペプチド、及び異種のターゲティングペプチドを提供し、ターゲティングペプチドは、標的となる細胞の表面に存在する部分に結合し、ポリペプチドがエキソソーム中に存在する場合には、ターゲティングペプチドがエキソソームの表面に存在する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド構築物を提供し、該構築物は、例えば、本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに有効に連結される小胞体−ターゲティングシグナルペプチドなどの、５’エキソソーム膜貫通シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、エキソソームが選択した組織又は細胞種を標的させる方法であって、本発明に従って宿主細胞にポリヌクレオチド構築物をトランスフェクトするステップと、宿主細胞において構築物を発現させるステップと、構築物が発現されている宿主細胞からエキソソームを得るステップとを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】未成熟樹状細胞由来のエキソソームの特徴解析：（ａ）２％酢酸ウラニルで染色されたエキソソーム（ネガティブ染色されたエキソソーム）の電子顕微鏡写真；（ｂ）エキソソームに存在する膜タンパク質であるＬａｍｐ２の抗体でプローブされたエキソソームのウエスタンブロット；（ｃ）５種の異なる精製により精製した樹状細胞エキソソームのＰＢＳ中での動的光散乱粒径測定
【図２】樹状細胞のトランスフェクション：（ａ）樹状細胞内へのトランスフェクション用のＬａｍｐ−２ｂの改変。（ＳＰ＝シグナルペプチド；ＴＰ＝ターゲティングペプチド；ＴＭ＝膜貫通；ＣＴ＝細胞質尾部）；（ｂ）トランスフェクトしていない樹状細胞（ＣＴＲＬ）又はｐＬａｍｐ２ｂ−ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧ−Ｌａｍｐ２ｂ）でトランスフェクトした細胞及びこれらの細胞から回収したエキソソームにおける抗−ＦＬＡＧ又は抗−Ｌａｍｐ２を用いたウエスタンブロット；（ｃ）ＭＳＰ及びＲＶＧの配列に特異的なプライマーを使用した、ｐＬａｍｐ２ｂ−ＭＳＰ、ｐＬａｍｐ２ｂ−ＲＶＧ、又は何もなしでトランスフェクトした樹状細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ；（ｄ）エキソソームプルダウンアッセイにおける、正常エキソソーム及びＦＬＡＧエキソソームと抗−ＦＬＡＧビーズ又は抗−ＡＧＯ１ビーズ（非結合対照）とのインキュベート後の抗−Ｌａｍｐ１でのウエスタンブロット；（ｅ）精製したＭＳＰ−エキソソームの動的光散乱粒径測定。
【図３】エキソソームとのプラスミドのエレクトロポレーション及びそれに続くＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ）保護アッセイ：（ａ）エキソソーム及びｐＥＧＦＰ−ＮＡＤプラスミドの様々な処理についてのＤＮアーゼ保護アッセイ。線状ＤＮＡは、ｐＥＧＦＰ−ＮＡＤをＥｃｏＲＩで切断することによって作製した。（前＝プラスミドの添加前に予めエレクトロポレーションを行ったエキソソーム）（ｂ）異なるエレクトロポレーション設定におけるＤＮアーゼによるＤＮアーゼ分解と環状プラスミドにとの比較（ｃ）異なるトランスフェクション試薬でのｐＥＧＦＰ−ＮＡＤのトランスフェクション後のＤＮアーゼ保護アッセイ（ｄ）トランスフェクション試薬１〜３及びｐＥＧＦＰ−ＮＡＤでのエキソソームのトランスフェクション後のＤＮアーゼ保護アッセイ（材料及び方法を参照されたい）。
【図４】エキソソームを介した、細胞内へのｐＥＧＦＰ−ＮＡＤの送達：（ａ）ＤＮアーゼ処理後の、野生型エキソソーム、ｐＥＧＦＰ−ＮＡＤでトランスフェクトして、ＲＶＧ−Ｌａｍｐ２ｂ（ＲＶＧ−エキソソーム）を発現しているエキソソーム、及びプラスミド単独と比較した、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション。（ｂ及びｃ）トランスフェクション試薬単独に対する、正常エキソソーム、ＲＶＧ−エキソソーム又はＭＳＰ−エキソソームでのトランスフェクション後のｅＧＦＰの倍率変化のｑＲＴ−ＰＣＲ定量。
【図５】エキソソームを介したｓｉＲＮＡ送達を用いたＧＡＰＤＨのノックダウン：（ａ、ｂ）正常エキソソーム又は修飾エキソソームを用いた、Ｎｅｕｒｏ２Ａ（ａ）及びＣ２Ｃ１２（ｂ）細胞に対して適用されるＣｙ５標識ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡの代表的な画像。エレクトロポレーションを行っていないエキソソーム及びｓｉＲＮＡを、対照として加えた。（ｃ、ｄ）ｓｉＲＮＡ単独（ｓｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡとリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｓｉＲＮＡ＋ＬＰ）、正常エキソソーム（エキソソーム）、ＭＳＰエキソソーム（ＭＳＰエキソ）及びＲＶＧエキソソーム（ＲＶＧエキソ）でのトランスフェクションの２日後に回収したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞及びＣ２Ｃ１２細胞におけるＧＡＰＤＨレベルについてのｑＰＣＲ。（＊ｐ＜０．０５）（ｅ、ｆ）同様のトランスフェクション後のＧＡＰＤＨレベルについての代表的なウエスタンブロット。
【図６】エキソソームを介したｓｉＲＮＡ送達を用いたシクロフィリンＢのノックダウン：（ａ、ｂ）ｓｉＲＮＡ単独（ｓｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡとリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｓｉＲＮＡ＋ＬＰ）、正常エキソソーム（エキソソーム）、ＭＳＰエキソソーム（ＭＳＰエキソ）及びＲＶＧエキソソーム（ＲＶＧエキソ）でのトランスフェクションの２日後に回収したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞及びＣ２Ｃ１２細胞におけるシクロフィリンＢレベルについてのｑＰＣＲ。（＊ｐ＜０．０５）（ｃ、ｄ）同様のトランスフェクション後のシクロフィリンＢレベルについての代表的なウエスタンブロット。
【図７】エキソソームとのエレクトロポレーション後のＣｙ３及びＣｙ５で標識されたｓｉＲＮＡの保持。ａ、蛍光は、ｓｉＲＮＡ重量と直線的に相関している。ｂ及びｃ、以下のｂ及びｃの後に保持された標識ｓｉＲＮＡの絶対重量、ｂ、３μｇのｓｉＲＮＡを、例えば３μｇのＲＶＧ−エキソソームを用いて、２００μｌの緩衝液中、ｘ軸上に示している設定でエレクトロポレーションした；ｃ、３μｇのｓｉＲＮＡを、例えば３μｇのＲＶＧ−エキソソームを用いて、ｘ軸上に示している量の緩衝液中、４００Ｖ  １２５μＦでエレクトロポレーションした。全ての試験を二重で実施した。
【図８】正常エキソソームを用いた２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチド及びモルホリノの送達：エキソソームを用いた場合と用いない場合の、Ｃｙ３標識した（ａ）２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチド又は（ｂ）ＰＭＯのトランスフェクションから２４時間後のＣ２Ｃ１２細胞の蛍光画像。
【図９】標的化エキソソームを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達は、ＣＮＳ特異的な遺伝子ノックダウンをもたらすこと：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、未処理の対照（１００％）に対して標準化した、１５０μｇの裸のＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ又は未改変エキソソーム、ＭＳＰ−エキソソーム若しくはＲＶＧ−エキソソーム中に封入されたｓｉＲＮＡの静脈内注射から３日後のマウスの線条体、中脳、皮質、四頭筋、脾臓、肝臓、腎臓及び心臓におけるＧＡＰＤＨ  ｑＰＣＲ。ｅ、未処理のマウス（対照）、又は空のＲＶＧ−エキソソームを１日目及び８日目に２回静脈内注射し、次いで、ＲＶＧ−エキソソームに封入されたＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（１５０μｇ）を２２日目に注射し、その後、２５日目に屠殺したマウス（３回注射）の線条体、皮質及び中脳から抽出したＲＮＡのＧＡＰＤＨ  ｑＰＣＲ。ｆ、ｇ、屠殺する６日前及び３日前の別々の２回でＲＶＧ−エキソソームに封入されたｓｉＲＮＡ（１５０μｇ）を注射したマウスのＧＡＰＤＨ  ｑＰＣＲ及び代表的なウエスタンブロット。１５０μｇのＲＶＧ−エキソソーム中に封入されたそれぞれ１５０μｇの２種類のＢＡＣＥ−１  ｓｉＲＮＡを、屠殺する３日前にマウスに静脈内注射し、皮質切片を、ｉ、ＢＡＣＥ−１  ｑＰＣＲ、ｈ、ＢＡＣＥ−１ウエスタンブロット及びｊ、β−アミロイド１〜４２  ＥＬＩＳＡでアッセイした。ｑＰＣＲは全て、１８Ｓ  ＲＮＡ値に対して標準化した。＊は、未処理の対照に対し、ｐ＜０．０５であることを示している。各試料群において３匹のマウスに注射を行い、全てのエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を反映している。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本発明は、エキソソーム、及び遺伝子送達ビヒクルとしてのその使用を目的とする。エキソソームは、多小胞体と原形質膜との融合後に細胞外環境に放出される、エンドサイトーシス由来の小さな膜結合小胞である。したがって、本出願は、こうしたエキソソームを含む組成物を目的とする。典型的には、エキソソームは、直径が３０と１００ｎｍとの間であるが、２００ｎｍまでの同様な由来の膜粒子を含むことができる。本明細書中で使用される場合、エキソソームとは、多胞体から分泌される、エンドソーム由来のナノ粒子を指す。
【００１８】
エキソソームは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）及び肥満細胞などの免疫細胞を含む多様な種類の細胞によって生成される。エキソソームは、例えば、神経膠腫細胞、血小板、網状赤血球、ニューロン、腸上皮細胞及び腫瘍細胞によっても生成される。本出願に従って使用されるエキソソームは、上記で特定した細胞を含む、任意の好適な細胞から得ることができる。エキソソームは、血漿、尿、羊水及び悪性浸出液のような、生理液からも単離されている。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、エキソソームは、ＤＣ、好ましくは未成熟ＤＣ由来である。未成熟ＤＣから生成されるエキソソームは、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−Ｉ又はＣＤ８６を発現しない。したがって、こうしたエキソソームは無感作（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞を有意な程度まで刺激せず、混合リンパ球反応において応答を誘導することができない。したがって、未成熟樹状細胞から生成されるエキソソームは、遺伝物質の送達において、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用、例えば遺伝子療法において、使用するのに理想的な候補である。
【００２０】
したがって、本発明の第１の態様によれば、樹状細胞由来のエキソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝物質の送達における使用のために提供される。
【００２１】
本発明の代替の態様において、エキソソームは、エキソソームが送達される患者における免疫応答の発生を低減又は回避するように、患者由来の自己の細胞、ハプロタイプ適合の異種の細胞、又は異種の幹細胞のいずれからも得ることができる。この特定の目的のために、任意のエキソソーム生成細胞を利用することができる。
【００２２】
上記に概説したように、エキソソームは、多様な型の細胞によって生成され、生理液からも単離されている。したがって、本発明によれば、エキソソームは、上述のように、任意の好適な細胞型から、又は生理液からの単離によって、得ることができる。典型的には、本発明の方法は、細胞培地又は組織上清からのエキソソームの単離を含む。
【００２３】
細胞から生成されたエキソソームは、任意の好適な方法によって培地から回収することができる。典型的には、エキソソームの調製物は、細胞培養物又は組織上清から、遠心分離、濾過又はこれらの方法の組合せによって調製することができる。例えば、エキソソームは、分画遠心法、すなわち、より大きな粒子をペレット化する低速（＜２００００ｇ）の遠心分離に続くエキソソームをペレット化する高速（＞１０００００ｇ）の遠心分離、適切なフィルター（例えば、０．２２μｍのフィルター）を用いた大きさによる濾過、勾配超遠心分離（例えば、ショ糖勾配での）又はこれらの方法の組合せによって調製することができる。
【００２４】
本発明によれば、エキソソームには外因性遺伝物質が取り込まれる。特に、本発明によれば、エキソソームは調製され、次いで、所望の送達用遺伝物質を取り込ませる。
【００２５】
好適な送達用遺伝物質としては、外因性ＤＮＡプラスミド及びｓｉＲＮＡなどが挙げられる。好適な遺伝物質としては、修飾オリゴヌクレオチド並びに例えばｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのような他のＲＮＡ干渉エフェクター部分なども挙げられる。本発明の一態様によれば、エキソソーム中に取り込ませる遺伝物質は、エキソソームと典型的に関連している遺伝物質ではなく、例えば、核酸は、細胞から産生されてエキソソーム中に組み込まれるｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡではないことが好ましい。特に、本発明は、遺伝物質を、すでに細胞から単離されているエキソソーム調製物の中に取り込ませる能力に関する。したがって、外因性遺伝物質とは、エキソソームと通常は関連していない核酸を含む遺伝物質を指す。特に好ましい実施形態において、核酸物質は、エキソソーム中に典型的には見出されない、プラスミドＤＮＡ、又はｓｉＲＮＡ及び修飾オリゴヌクレオチドのような他の核酸である。
【００２６】
エキソソーム中に組み込むための核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよい。一本鎖核酸としては、ホスホジエステルに、２’Ｏ−メチル、２’メトキシ−エチル、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、及び／又はホスホロチオエート骨格化学を有するものなどが挙げられる。典型的には、例えばプラスミドＤＮＡ及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む二本鎖核酸が導入される。
【００２７】
エキソソーム中に取り込ませる遺伝物質は、それを送達しようとする細胞内でのその遺伝物質の望ましい効果及びその効果が達成される機構に基づいて選択される。例えば、核酸は、遺伝子療法において、例えば、細胞又は細胞群において所望の遺伝子を発現させるために、有用となり得る。こうした核酸は、典型的には、所望の遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ又はウイルスベクターの形態であり、治療する細胞に送達されるとプラスミドＤＮＡが発現されるように、プロモーター、エンハンサーなどの適切な制御配列に有効に連結される。遺伝子療法の影響を受けやすい疾患の例としては、Ｂ型血友病（第ＩＸ因子）、嚢胞性線維症（ＣＴＦＲ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＮ−１）などが挙げられる。
【００２８】
核酸は、例えば、免疫応答を引き起こすことが望まれるものに対する１種又は複数の抗原を発現させるために予防接種にも使用することができる。したがって、エキソソーム中に取り込ませる核酸は、腫瘍抗原、例えばウイルス、細菌又は真菌の病原体などの病原体からの抗原を含むがこれらに限定されない、免疫応答を引き起こすことが望まれるものに対する１種又は複数の抗原をコードしていてもよい。
【００２９】
核酸は、遺伝子サイレンシングにおいても使用することができる。こうした遺伝子サイレンシングは、療法において異常な遺伝子発現のスイッチを切るために、又は動物モデルの試験において単一又は複数の遺伝的なノックアウトを作製するために有用となり得る。典型的には、こうした核酸は、ｓｉＲＮＡの形態で提供される。例えば、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子を使用して、筋緊張性ジストロフィーの治療のために筋肉細胞において複数のＣＵＧリピートを有するＤＭＰＫをノックダウンすることができる。他の例では、ハンチントン病の原因となる変異体のハンチントン遺伝子（ｈｔｔ）を低下させるｓｈＲＮＡを発現しているプラスミドを、ニューロン特異的エキソソームを用いて送達することができる。他の標的遺伝子としては、アルツハイマー病の治療のためのＢＡＣＥ−１などが挙げられる。ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ及びＶＥＧＦＲ−２のように、いくつかの癌遺伝子も、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡで標的され得る。脳を標的としたｓｉＲＮＡを取り込ませたエキソソームは、アルツハイマー病におけるＢＡＣＥ−１のサイレンシング、パーキンソン病におけるアルファ−シヌクレインのサイレンシング、ハンチントン病におけるｈｔｔのサイレンシング及び虚血性の損傷を減少させるために脳卒中の治療において使用されるニューロンのカスパーゼ−３のサイレンシングにおいて特に有用となり得る。
【００３０】
２’−Ｏ−Ｍｅ化合物を含むアンチセンス修飾オリゴヌクレオチド及びＰＮＡを使用することができる。例えば、こうしたオリゴヌクレオチドは、、例えば、変異体のジストロフィン遺伝子を、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のために筋肉細胞に送達する、ヘアピンループを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、筋緊張性ジストロフィーの治療において、及びトランススプライシングオリゴヌクレオチドを、例えば、脊髄性筋萎縮の治療のために、エキソンスキッピングを誘導することができるように設計ことができる。
【００３１】
外因性遺伝物質は、いくつかの異なる技術によってエキソソーム中に導入することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、エレクトロポレーション又はトランスフェクション試薬の使用によって、エキソソームに取り込ませる。本発明者らは、エキソソームは大きさが小さいにもかかわらず、エレクトロポレーションを使用してエキソソームに外因性遺伝物質を取り込ませることが依然として可能であることを同定した。これは、エキソソームの大きさが細胞と比較して小さいことからみて驚くべきことである。エキソソームの大きさを考慮に入れて細胞のエレクトロポレーションに使用される電圧の推定は、エキソソームのエレクトロポレーションに過度に高い電圧が必要とされるであろうと示唆していた。しかし、驚いたことに、発明者らは、エレクトロポレーションを使用してエキソソームにプラスミドＤＮＡ及びｓｉＲＮＡを取り込ませることが可能であることを同定した。典型的な電圧は、例えば２０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍのように、２０Ｖ／ｃｍ〜１０００Ｖ／ｃｍの範囲内であり、この場合の静電容量は、例えば２５μＦと１２５μＦとの間のように、典型的には２５μＦと２５０μＦとの間である。
【００３２】
本発明の代替の態様において、本発明者らは、トランスフェクション剤を使用してエキソソームに取り込ませることが可能であることも同定した。エキソソームの大きさが小さいにもかかわらず、従来のトランスフェクション剤を、遺伝物質を用いたエキソソームのトランスフェクションに使用することができる。本発明に従って使用される好ましいトランスフェクション試薬としては、カチオン性リポソームを含む。
【００３３】
ターゲティング
【００３４】
本発明は、所望の細胞型又は組織に対するエキソソームのターゲティングにも関する。このターゲティングは、標的化する細胞の表面で発現される細胞表面部分に結合するターゲティング部分をエキソソームの表面で発現させることによって達成される。典型的には、ターゲティング部分は、エキソソームの表面で典型的に発現される膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現されるペプチドである。
【００３５】
より詳細には、エキソソームは、ペプチドなどのターゲティング部分をその表面で発現させることによって、特定の細胞型又は組織を標的することができる。好適なペプチドは、標的となる細胞の細胞表面に見出されるレセプター又はそのリガンドのような細胞表面部分に結合するものである。適なターゲティング部分の例は、ターゲティング部分が、エキソソームの表面で発現させることが可能で、エキソソーム中への膜タンパク質の挿入を妨げない限り、短いペプチド、ｓｃＦｖ及び完全なタンパク質である。典型的には、ターゲティングペプチドは、膜貫通エキソソームタンパク質に対して異種のものである。ペプチドターゲティング部分は、典型的には、１００アミノ酸未満の長さであってもよく、例えば、５０アミノ酸未満の長さ、３０アミノ酸未満の長さ、最小の長さの１０、５又は３アミノ酸までである。
【００３６】
ターゲティング部分は、例えば筋肉、脳、肝臓、膵臓及び肺などの特定の組織型を標的となるように、又は腫瘍のような患部組織を標的となるように選択することができる。本発明の特に好ましい実施形態において、エキソソームは脳組織を標的とする。
【００３７】
ターゲティング部分の特定の例としては、骨格筋を標的とするための、ファージディスプレイによって発見された筋肉特異的ペプチド［３３］、ニューロンを標的とするための、アセチルコリンレセプターに結合する狂犬病ウイルス糖タンパク質の２９アミノ酸断片［３６］又は神経成長因子レセプターを標的とする神経成長因子の断片［３７］などが挙げられ、また、セクレチンレセプターに結合するセクレチンペプチドを使用して、胆管及び膵臓上皮を標的とすることができる［３８］。代替として、ｓｃＦｖ抗体を含む、免疫グロブリン及びそれらの誘導体も、癌遺伝子療法のために、ＶＥＧＦＲのような特異的抗原を標的とする融合タンパク質として発現させることができる。代替として、ＮＧＦＲに結合してニューロン特異的ターゲティングを与えるＮＧＦのように、レセプターの天然のリガンドを,特異性を与える融合タンパク質として発現させることもできる。
【００３８】
該ペプチドターゲティング部分は、エキソソーム膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現させることによってエキソソームの表面で発現される。いくつかのタンパク質は、エキソソームと関連していることが知られている；すなわち、それらは、形成されるとエキソソーム中に組み込まれる。本発明に従って使用される好ましいタンパク質は、膜貫通タンパク質であるものである。例としては、Ｌａｍｐ−１、Ｌａｍｐ−２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン−３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ−１、インテグリンアルファ４、ＬｉＣＡＭ、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、Ｖｔｉ−１Ａ、Ｖｔｉ−１Ｂ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ−ＤＭ（ＭＨＣ  ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩの構成要素、ＴＣＲベータ及びテトラスパニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特に好ましい実施形態において、膜貫通タンパク質は、Ｌａｍｐ−１、Ｌａｍｐ−２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン−３から選択される。特に好ましい一実施形態において、膜貫通タンパク質はＬａｍｐ−２である。Ｌａｍｐ−２の配列については、配列番号１に記載している。
【００３９】
以下の節は、本発明の全てのポリペプチドの一般的な特徴に関し、特に、本発明のポリペプチド内に含まれるアミノ酸配列の変動、変化、修飾又は誘導体化に関する。本明細書に記載のポリペプチドのこうした変動、変化、修飾又は誘導体化は、ポリペプチドが、本開示の後続の節に明記するようないずれかのさらに必要とされる活性又は特徴を保持するのに必要であることが理解されるであろう。
【００４０】
本発明のポリペプチドの異型は、本開示の後節でさらに詳細に説明している特定レベルのアミノ酸同一性によって定めることができる。アミノ酸同一性は、任意の好適なアルゴリズムを使用して算出することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜１０に記載されているように、例えば、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムは（典型的には、これらの初期設定に基づいて）相同性を算出すること又は配列を並べること（例えば、同等の配列又は対応する配列を特定することなどに使用することができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して一般公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントしたときに一致するか又はいくらかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、調べる配列中で、長さがＷである、短いワードを特定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前掲）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを包含するHSPの検索を開始するシードとして機能する。このワードヒットは、累積アライメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合に終了する：累積アライメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘだけ低下したとき；１つ又は複数の負のスコアの残基アライメントが蓄積したために、累積スコアがゼロ又はゼロ未満になったとき；又はいずれかの配列が末端に到達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワードの長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５〜１０９１９を参照されたい）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。
【００４１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を行う；例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２種のポリヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間で偶然に一致が生じるであろう確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、ある配列が別の配列と類似していると考えられるのは、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合である。これに対して、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、その初期設定に基づいて使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、３８７〜３９５）。
【００４２】
本発明のポリペプチドの異型は、置換異型も含むことが理解されるであろう。置換異型は、好ましくは、１個又は複数のアミノ酸を同数のアミノ酸で置換して、保存的なアミノ酸置換を作製する置換を含む。例えば、アミノ酸は、同様の特性を有する代替のアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸又は別の脂肪族アミノ酸で置換されてもよい。好適な置換基を選択するために使用できる２０種の主要アミノ酸のいくつかの特性は、以下の通りである：
【００４３】
【表１】
0005713325.tif 000002
【００４４】
本発明において使用されるポリペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在しない化学的性質を含むように又は化合物の安定性及びターゲティング特異性を増大させるように改変されてもよい。合成の方法によってポリペプチドを作製する場合には、こうしたアミノ酸を作製中に導入することもできる。また、合成又は組換えによる作製後に、ポリペプチドを改変することもできる。
【００４５】
いくつかの側鎖修飾は、当技術分野において知られており、ポリペプチドの側鎖に対して行い、本明細書に明記され得るような、任意のさらに必要とされる活性又は特徴をポリペプチドに保持させることができる。
【００４６】
本節に記載の異型ポリペプチドは、アミノ酸配列は配列番号１にあるものとは異なるが、エキソソームの膜内に挿入される能力を保持するものである。
【００４７】
異型配列は、典型的には、少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、１００個又はより多くの変異（アミノ酸の置換、欠失又は挿入であってもよい）によって異なる。例えば、改変ポリペプチドがエキソソームの膜内に挿入されるのであれば、１〜１００、２〜５０、３〜３０又は５〜２０アミノ酸の置換、欠失又は挿入を行うこともできる。
【００４８】
典型的には、Ｌａｍｐ−２の異型であるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と、約５０％、５５％又は６５％を超える同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の同一性を有する。配列番号１の異型の同一性は、シグナル配列を除き、配列番号１に示している配列の少なくとも３０、５０、１００、２００、２５０、３００、３５０又はそれ以上連続したアミノ酸の領域にわたって、又はより好ましくは配列番号１の全長にわたって評価することができる。
【００４９】
本発明において使用されるＬａｍｐ−２ポリペプチドの断片は、典型的には長さが、少なくとも５５アミノ酸、１００、１５０、２００、又は２５０アミノ酸である。
【００５０】
エキソソーム膜貫通タンパク質は、ターゲティング部分を組み込むように改変される。したがって、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ターゲティング部分を含む融合タンパク質として発現される。ターゲティング部分は、エキソソームの表面に存在する膜貫通タンパク質の部分に配置されるよう膜貫通タンパク質中に組み込まれる。本発明の好ましい態様において、エキソソーム膜貫通タンパク質はＬａｍｐ−２であり、ターゲティング部分は融合タンパク質として発現され、ターゲティング部分は、Ｌａｍｐ−２タンパク質のＮ末端付近に存在し、例えば、シグナル配列を含めずに、Ｌａｍｐ−２のＮ末端アミノ酸から３０、又は２０アミノ酸の範囲内にある。
【００５１】
ターゲティング部分と残りの膜貫通タンパク質の部分との間には、例えば、膜貫通タンパク質のフォールディングの際にターゲティング部分からの干渉を回避するために、スペーサー配列又はリンカー配列が備えられていてもよい。
【００５２】
リンカー配列又はスペーサー配列は、典型的には１〜１０アミノ酸の長さであり、典型的には１〜８アミノ酸の長さであり、例えば２、３又は４アミノ酸の長さである。リンカー中に組み込むのに好適なアミノ酸は、アラニン、アルギニン、セリン又はグリシンである。好適なリンカーとしては、Ａｌａ−Ａｒｇ及びＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙなどが挙げられる。
【００５３】
本発明の特に好ましい態様において、膜貫通タンパク質はＬａｍｐ−２であり、ターゲティング部分はタンパク質のＮ末端又はその近くに存在し、リンカー配列でＬａｍｐ−２から分離される。
【００５４】
本発明の実施において、ターゲティング部分は、ターゲティング部分とエキソソーム膜貫通タンパク質とを含む融合タンパク質を、エキソソームを生成するために使用する細胞内で発現させることによってエキソソーム中に導入する。細胞内でのこの融合タンパク質の発現は、融合タンパク質が細胞から生成されるとエキソソーム中に組み込まれることを可能にする。
【００５５】
例えば、融合タンパク質を発現させた、ＤＮＡプラスミドなどのポリヌクレオチド構築物を細胞内にトランスフェクトする。細胞内へのポリヌクレオチド構築物の導入には、任意の好適な方法を使用することができる。ポリヌクレオチド構築物は、コードする融合タンパク質が細胞内で発現されるように、好適なプロモーター配列を含む。タンパク質が生成されると小胞体の膜内に組み込まれるように、シグナルペプチド配列も含まれる。次いで、膜タンパク質は、エキソソーム中に組み込まれる前に、エキソソーム／リソームの区画に続いて輸出される。シグナル配列は、典型的には、エキソソーム膜貫通タンパク質のシグナルペプチド配列である。例えば、シグナルペプチド配列は、例えば実施例に示すように、Ｌａｍｐ−２由来であることが好ましい。
【００５６】
エキソソームの生成に好ましい細胞については、上記でさらに詳細に述べている。典型的には、好ましい細胞、例えば未成熟樹状細胞などを、上記のようなポリヌクレオチド構築物でトランスフェクトし、それによって本発明の融合タンパク質が細胞内で発現されるようになる。細胞によって生成されるエキソソームは、その後、回収することができる。こうしたエキソソームは、エキソソームがターゲティング部分を通して所望の組織又は細胞型に標的化されるように、膜内に挿入される融合タンパク質を有する。
【００５７】
細胞から生成されたエキソソームは、任意の好適な方法によって培地から回収することができる。典型的には、エキソソームの調製物は、細胞培養物又は組織上清から、遠心分離、濾過又はこれらの方法の組合せによって調製することができる。例えば、エキソソームは、分画遠心法、すなわち、より大きな粒子をペレット化する低速（＜２００００ｇ）の遠心分離に続くエキソソームをペレット化する高速（＞１０００００ｇ）の遠心分離、適切なフィルター（例えば、０．２２μｍのフィルター）を用いた大きさによる濾過、（例えば、スクロース勾配での）勾配超遠心分離（例えば、ショ糖勾配での）又はこれらの方法の組合せによって調製することができる。
【００５８】
本発明の好ましい一態様によれば、標的化されたエキソソームに外因性遺伝物質を取り込ませる。特に、本発明によれば、エキソソームを、本明細書に記載のターゲティング部分を用いて調製し、次いで、所望の送達用遺伝物質又は上記のものを取り込ませる。
【００５９】
本発明の他の実施形態では、特定のターゲティング部分がエキソソーム中に含まれている必要性はない。例えば、エキソソームは、療法が必要とされる部位に直接投与することもできる。これに対して、例えば、エキソソームが免疫原をコードする遺伝物質を包含する場合には、特異的部位を直接標的とする必要はないこともあり、送達、例えば、皮内又は筋肉の送達は、いかなる特定の細胞型にもエキソソームを標的化することなく、所望の免疫応答を引き起こすために十分なこともある。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態では、エキソソームの表面にターゲティング部分が含まれていない。しかし、エキソソームは、特定の組織型を標的とする可能性がより高いように選択される。例えば、例えば成熟樹状細胞由来のエキソソームのＴ細胞に対するよく立証された親和性のように、異なる細胞由来のエキソソームは、それらの生理学的機能によって必要とされるような、特定の細胞サブタイプに対する天然の親和性を有してもよい。この親和性は、上記の積荷を組織に特異的に送達するために利用することができる。
【００６１】
送達／投与
【００６２】
本発明の構築物は、任意の好適な方法によって投与することができる。ヒト又は動物の対象に対する投与は、非経口、筋肉内、脳内、血管内、皮下、又は経皮の投与から選択することができる。典型的には、送達の方法は、注射によるものである。注射は、筋肉内又は血管内（例えば、静脈内）が好ましい。医師は、個々の患者ごとに必要とされる投与経路を決定することができるであろう。
【００６３】
構築物は、組成物として送達されることが好ましい。組成物は、非経口、筋肉内、脳内、血管内（静脈内を含む）、皮下、又は経皮の投与用に製剤化することができる。非経口投与用の組成物は、緩衝液、希釈剤及び他の好適な添加物を包含し得る無菌水溶液を含んでいてもよい。本発明の構築物は、薬学的に許容される担体、濃化剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、及び他の薬学的に許容される担体又は賦形剤などをエキソソームに加えて含み得る、医薬組成物として製剤化されてもよい。
【００６４】
「薬学的に許容される担体」（賦形剤）とは、１種又は複数の核酸を対象に送達するための薬学的に許容される溶剤、懸濁化剤又は他の任意の薬理学的に不活性なビヒクルである。典型的な薬学的に許容される担体としては、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、乳糖及び他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書に記載の組成物は、医薬組成物中に従来通り見出される他の補助成分をさらに包含していてもよい。したがって、例えば、組成物は、さらなる適合可能な薬学的に活性な物質を包含していてもよく、又は本発明の組成物の多様な剤形を物理的に調製する際に有用なさらなる物質、例えば、色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などを包含していてもよい。しかし、こうした物質は、添加する場合には、本明細書に記載の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げてはならない。
【００６６】
治療有効量の組成物を投与する。その用量は、多様なパラメータによって、特に、治療する患者の状態の重症度、年齢、及び体重；投与の経路；並びに必要とされるレジメンによって、決定することができる。医師は、いかなる特定の患者に必要とされる投与の経路及び用量を決定することができるであろう。最適用量は、個々の構築物の相対的な効力によって変化してもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルにおいて有効であることが見出されているＥＣ５０に基づいて一般的に推定することができる。一般的に、用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。典型的な日用量は、特定の構築物の効力、治療する対象の年齢、体重及び状態、疾患の重症度並びに投与の頻度及び経路により、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与が筋肉内注射又は全身（静脈内又は皮下）注射によるものであるかどうかによって、異なる用量の構築物を投与することができる。好ましくは、単回筋肉内注射の用量は、約５〜２０μｇの範囲内である。好ましくは、単回又は反復の全身注射の用量は、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。
【００６７】
構築物のクリアランス（及びいずれかの標的分子の分解）のために、患者は、繰り返し、例えば、１日１回若しくはそれ以上、週１回、月１回又は年１回、治療を受けなければならないこともある。当業者は、体液又は体組織における測定された構築物の滞留時間及び濃度に基づいて、投与の繰り返しの速度を容易に推定することができる。成功した治療の後に、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、このとき、構築物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に及ぶ維持量で、１日１回又はそれ以上から、２０年毎に１回まで、投与する。
【００６８】
以下の実施例によって本発明を以下でさらに詳細に説明している。
【実施例】
【００６９】
本発明者らは、ネズミ科動物の骨髄から採取した樹状細胞からエキソソームが再現性よく生成され得るかどうかを決定することを目的とした。Ｑｕａｈら［２８］から改変したプロトコルを使用して、骨髄細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨から採取され、穏やかにすり潰して分離され、前駆細胞の増殖を刺激する、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含むＤＣ培地（材料及び方法を参照されたい）の存在下で培養した。４日後に、非接着細胞が除去され、樹状細胞が培養物中に残された。７日後に、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、ＧＭ−ＣＳＦを含まない新しいＤＣ培地を、単離したエキソソームに添加した。次の２日間にわたり１日ごとに、細胞残屑を除去するためにまず１０，０００ｇで、次いで、エキソソームをペレット化するために１２０，０００ｇで、培養上清を遠心分離することによってエキソソームを回収した。次いで、これらのエキソソームを、適切な量の０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中に再懸濁した。
【００７０】
生成されるエキソソームは、電子顕微鏡、エキソソームタンパク質（Ｌａｍｐ２ｂ）に対する抗体を用いたウエスタン（図１ｂ）及び動的光散乱（図１ｃ）によって決定されたように（図１ａ）、直径が８０ｎｍでピークに達している粒径分布を有し、一貫性があり、物理的に均質であった。。
【００７１】
ターゲティングリガンドのトランスフェクションは、所望の細胞型を効果的に標的とするために、エキソソームの特異性を変更することを必要とする。図２ａは、ターゲティングリガンドがどのようにＬａｍｐ２ｂ中に挿入されるかを図示している。これは、エキソソームの外に突出すると予測されるＮ末端を有するＩ型膜タンパク質なので、ターゲティングリガンドは、シグナルペプチドの後のＮ末端に結合される必要がある。シグナルペプチドは、膜挿入に必要であるが、成熟タンパク質では切り離される。さらに、ターゲティングペプチドがＬａｍｐ２ｂタンパク質のフォールディングに影響を及ぼすのを防ぐために、ターゲティングペプチドの両側にリンカーが配置される（Ａｌａ−Ａｒｇ−｛ターゲティングペプチド｝−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）。最終的に、ターゲティングペプチドは、エキソソームの外表面上に位置していなければならず、それにより、エキソソームにターゲティング能力を与える。３種の異なるペプチド−ニューロン特異的狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）ペプチド（ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ）［３２］、ｉｎ  ｖｉｖｏでのファージディスプレイによって同定された筋特異的ペプチド（ＭＳＰ）（ＡＳＳＬＮＩＡ）［３３］、及びＦＬＡＧエピトープ−を、Ｌａｍｐ２ｂ中に別々にクローニングし、エキソソーム精製の４日前に樹状細胞内にトランスフェクトした。ＭＳＰ及びＲＶＧはいずれも器官特異性のために選択したのに対して、ターゲティングリガンド部位におけるＦＬＡＧエピトープは改変したＬａｍｐ２ｂと未改変の外因性Ｌａｍｐ２ｂとを識別するために使用した。エキソソームの表面でターゲティングリガンドを発現させる能力に対する主な障害は、初代培養の樹状細胞はトランスフェクトされ難く、トランスフェクション後に分化する可能性があることである。樹状細胞は、ウイルスによって活性化される可能性が高く［３０］、それにより、結果として生じたエキソソーム中に組み込まれるであろう免疫賦活性分子が生じるので、ウイルスベクターでの感染も理想的ではない。したがって、いくつかのトランスフェクション試薬を試験して、Ｍｉｒｕｓ  ＢｉｏのＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１試薬は、ｅＧＦＰ発現プラスミドであるｐＥＧＦＰ−ＮＡＤによるトランスフェクション試薬なしでの単独での添加に比べて、ネズミ科動物のＧＡＰＤＨに対して標準化したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡにおいて４９９００倍上昇して、効率よく樹状細胞を形質導入するようであったので、これを選択した。さらに重要なことには、このトランスフェクションは、細胞の形態の観察に基づき、樹状細胞を有意に活性化しないようである。未成熟樹状細胞は、体積に対する表面積の比率が低いコンパクトな丸い細胞であるのに対し、活性化した樹状細胞は、特徴的な樹状突起の伸長を有し、体積に対する表面積の比率が高い［３１］。
【００７２】
一方、ＦＬＡＧリガンドに対するウエスタンブロットは、ｐＬａｍｐ２ｂ−ＦＬＡＧのトランスフェクション後に、ＦＬＡＧ−Ｌａｍｐ２ｂ（１１５ｋＤａ）が樹状細胞及び対応するエキソソームにおいて発現されるが、正常細胞及びエキソソームにおいては発現されないことを明らかに実証している（図２ｂ）。ＭＳＰ及びＲＶＧの配列に特異的なプライマーを使用した、ｐＬａｍｐ２ｂ−ＭＳＰ及びｐＬａｍｐ２ｂ−ＲＶＧでトランスフェクトした樹状細胞のｑＲＴ−ＰＣＲで、ＭＳＰ−Ｌａｍｐ２ｂ及びＲＶＧ−Ｌａｍｐ２ｂの発現を検証した（図２ｃ）。
【００７３】
エキソソーム上でのＬａｍｐ２ｂのトポロジーは知られていなかったので、抗−ＦＬＡＧビーズを用いたプルダウンアッセイを設計して、ターゲティングエピトープの方向性を確立した。抗−ＦＬＡＧ抗体又は非特異的抗体（Ａｇｏ１）を、プロテイン−Ａセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）に結合させた。次いで、これらのビーズを、未改変エキソソーム又はＦＬＡＧ−エキソソームと共にインキュベートし、その後、結合していないものを除去するために３回洗浄した。ＦＬＡＧエピトープが内側のみにあり、抗体が近づくことができない場合には、未改変エキソソームもＦＬＡＧ−エキソソームも、ビーズ上に保持されないはずである；ＦＬＡＧエピトープが外側にある場合には、ＦＬＡＧ−エキソソームは保持されるが、未改変エキソソームは保持されないであろう。プルダウン後、保持されたエキソソームを、変性させ、エキソソームの存在のマーカーの役目を果たす別のエキソソームタンパク質であるＬＡＭＰ−１に対するウエスタンブロットによって検出した。別のエキソソーム特異的タンパク質であるＬａｍｐ１のウエスタンブロットにより、抗−ＦＬＡＧビーズによってＦＬＡＧ−エキソソームの保持が増加するが、対照の抗−Ａｇｏ−１（非特異的）ビーズによっては増加しないことが示された（図２ｄ）。この結果は、ターゲティング部分が外側のエキソソーム表面に局在し、そのターゲティングの可能性のあることが実証される。これらの改変は、ＭＳＰ−エキソソームの動的光散乱に基づき、改変したエキソソームの物理的特性に影響を及ぼさないようである（図２ｅ）。
【００７４】
プロトコル：樹状細胞のトランスフェクション
【００７５】
採取後４日目に、５μｇのｐＥＧＦＰ−ＮＡＤ又はｐＬａｍｐ２ｂ誘導体及び５μｌのＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を用いて、６穴プレート中、１０６細胞で、樹状細胞のトランスフェクションを行った。７日目に、培地を交換し、８日目に、培養上清からエキソソームを単離する。
【００７６】
プロトコル：エキソソームを用いたトランスフェクション及びエレクトロポレーション並びにＤＮアーゼ保護アッセイ
【００７７】
以下の試験には、ＥＧＦＰ発現プラスミドであるｐＥＧＦＰ−ＮＡＤをＤＮＡの積荷として使用し、Ｃｙ５で標識された抗−ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ及び標識されていない抗−マウスシクロフィリンＢをＲＮＡの積荷として使用し、ｍｄｘマウスにおけるエキソンスキッピング用に設計された、Ｃｙ３で標識された２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチド及びＣｙ３で標識されたモルホリノ（Ｈａｉｆａｎｇ  Ｙｉｎからの寄贈）を使用した。
【００７８】
環状及び線状のｐＥＧＦＰ−ＮＡＤをエキソソームと共にエレクトロポレーションし、次いで、ＤＮアーゼＩに１０分間曝露した。ＤＮＡをエキソソーム中に取り込ませるのに成功した場合、ＤＮアーゼは、エキソソームの内側に接近できず、ＤＮＡを消化することができなくなる；逆に、ＤＮＡがエキソソーム中に局在しない場合には、ＤＮアーゼの存在は、ＤＮＡの分解及びプラスミドシグナルの損失を引き起こす。プラスミドＤＮＡに対してＤＮアーゼ保護アッセイを行ったとき、エキソソームと共に行ったエレクトロポレーションは、環状ＤＮＡプラスミドを分解から保護するようであるが、線状ＤＮＡは保護しないようであり（図３ａ）、また、より低い電気容量は、エキソソーム中へのＤＮＡの取り込みを増加させるようである（図３ｂ）。エレクトロポレーションされたエキソソームから放出された因子がＤＮアーゼ活性を阻害したという可能性を排除するために、対照として、予めエレクトロポレーションを行ったエキソソームにＤＮＡを添加した。これに加えて、スーパーコイル状の画分は選択的に保護されるようである（より上のバンド）。この理由としては、エキソソームはそれ自身が２０〜３０ｎｍであるが、長さが１８６８ｎｔの開環状プラスミドは直径で１００ｎｍを超えることもあり、一方、スーパーコイル状プラスミドはよりコンパクトでかなり少ない体積を占め［３４］、それゆえに、スーパーコイル状プラスミドが選択的に保護されたのであろう。
【００７９】
好適なエレクトロポレーションのプロトコルに伴う問題点は、一貫性のない結果、及び成功した場合であっても低いレベルの保護であることが多いこと（結果は示していない）によって取り上げられる。スペルミンでＤＮＡを人工的に凝縮することは、結果としてＤＮアーゼ保護の減少を引き起こし（結果は示していない）、これはおそらく、使用するスペルミンの濃度が正しい大きさの凝縮を引き起こすのに極めて重大であるからであろう［３５］。少なすぎて凝縮が起こらなくても、あまりに多く大きな凝集体が形成されたことも、スペルミンの添加が実際にはＤＮアーゼ保護のレベルを低下させた原因である可能性がある。
【００８０】
エレクトロポレーションの代わりにトランスフェクションを利用した別々のアプローチは、開環状プラスミドについての有意なＤＮアーゼ保護の結果となった。１μｇのｐＥＧＦＰ−ＮＡＤプラスミドを、１μｌのトランスフェクション試薬、エキソソーム（３μｇ）と混合して、ＤＭＥＭで１００μｌにした。この溶液を、３７℃で３時間インキュベートし、次いで、１μｌのＲＱ  ＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び１０μｌのＲＱ  ＤＮアーゼ緩衝液を添加して、３７℃で１０分間のＤＮアーゼ処理を行った。ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ保護アッセイの前に、又は２４穴の型中のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞若しくはＣ２Ｃ１２細胞に全溶液を直接添加する前に、１０μｌのＳＴＯＰ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって不活化された。３種の異なるトランスフェクション試薬（１：リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；２：ＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）３：ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（Ｆｅｒｍａｎｔａｓ））を使用してエキソソーム中に開環状ｐＥＧＦＰ−ＮＡＤを送達し、予備的な結果により、試薬３は、有意なＤＮアーゼ保護をもたらすことが示唆され（図３ｄ）、これにより、トランスフェクション試薬を使用してエキソソーム中に遺伝的積荷を取り込ませることができることが示唆される。トランスフェクション試薬単独での対照実験は、トランスフェクション試薬がそれ自体によって保護を与えるわけではないことが示しされているようである（図３ｃ）。開環状プラスミドはエキソソームには大きすぎると予測されるという事実があるにもかかわらず、トランスフェクション試薬の添加は、エキソソームの大きさを増加させるさらなる疎水性分子を提供するだけでなく、プラスミドを凝縮するのにも貢献し得る。
【００８１】
ＤＮアーゼ保護アッセイ用に、エレクトロポレーションを行った溶液２０μｌを７０μｌの蒸留水、１０μｌのＲＱ  ＤＮアーゼ緩衝液及び１μｌのＲＱ  ＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加して、３７℃で１０分間インキュベートした後に、１０μｌのＳＴＯＰ緩衝液で反応を阻害した。１０μｌの各試料を、０．８％アガロースＴＡＥゲル中の各レーン上で泳動させた。
【００８２】
プロトコル：エキソソームによる、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞及びＣ２Ｃ１２細胞内への遺伝物質の送達
【００８３】
エレクトロポレーション及びトランスフェクションによってエキソソームが容易にＤＮＡプラスミドを取り込むことが見出されたので、本発明者らは、ｐＥＧＦＰ−ＮＡＤを取り込ませたエキソソームはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞をトランスフェクトすることができるであろうと仮定した。本発明者らは、トランスフェクション試薬３（図３ｃ）を、エキソソームなしで、野生型エキソソーム又はｐＬａｍｐ２ｂ−ＲＶＧ（ＲＶＧ−エキソソーム）若しくはｐＬａｍｐ２ｂ−ＭＳＰ（ＭＳＰ−エキソソーム）でトランスフェクトした樹状細胞から回収したエキソソームと共のｐＥＧＦＰ−ＮＡＤに添加し、ｐＥＧＦＰ−ＮＡＤ及びトランスフェクション試薬のみでの試料を含めて、インキュベート後混合物をＤＮアーゼ処理した。次いで、これらの細胞を、混合物で直接に２日間トランスフェクトし、その結果、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡレベル（図４ｂ及び４ｃ）及びＧＦＰ蛍光によるタンパク質レベル（図４ａ）のいずれにおいても、エキソソームは、標的細胞内へｐＥＧＦＰ−ＮＡＤを効率よく移入したことが示唆される。さらに、結果より、ＲＶＧ及びＭＳＰのペプチドは、特異的にＮｅｕｒｏ２Ａ細胞及びＣ２Ｃ１２細胞に対する親和性を増大させることによって、ｐＥＧＦＰ−ＮＡＤの取り込みを改良し、また、この現象は細胞型に依存していることが示唆される。
【００８４】
エキソソームはもとよりＤＮＡプラスミドを取り込み、ＲＮＡを包含することができること［２６］を考慮に入れると、ｓｉＲＮＡもエキソソームによって容易に取り込まれるはずである。本発明者らは、エキソソームは、ｓｉＲＮＡも送達することができるであろうと仮定した。それゆえに、よく特徴付けされ、Ｃｙ５で標識された、ＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を、野生型エキソソーム、ＲＶＧ−エキソソーム及びＭＳＰ−エキソソーム中にエレクトロポレーションして、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞及びＣ２Ｃ１２細胞に直接適用した。次いで、これらの細胞を、２日後に画像化し、ｓｉＲＮＡ及びエレクトロポレーションを行っていないエキソソームのみで処理した対照細胞と比較した場合に、より多い蛍光が示された（図５ａ及びｂ）。その後、エキソソームを用いた細胞のトランスフェクションのために同様なプロトコルを行い、１８ＳのＲＮＡに対して標準化したＧＡＰＤＨのｑＲＴ−ＰＣＲ（図５ｃ及びｄ）により、標的化したエキソソームにおいて、２日後に、対照と比較して有意なノックダウンが示され、これにより、トランスフェクション後にｓｉＲＮＡが細胞質中に放出されて内因性の標的を能動的に抑制すること、及びターゲティング部分がｓｉＲＮＡを所望の細胞型に、すなわち、ニューロン特異的ＲＶＧをニューロンＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に、筋肉特異的ＭＳＰをＣ２Ｃ１２筋芽細胞に、効果的に送達することが示唆された。このノックダウンを、ＧＡＰＤＨタンパク質のウエスタンブロットでさらに確認した（図５ｅ及びｆ）。
【００８５】
特異的送達のさらなる証拠として、ネズミ科動物のシクロフィリンＢに対する第２のｓｉＲＮＡ（ＰＰＩＢ）（Ａｍｂｉｏｎ）も同様にトランスフェクトし、ｑＰＣＲ及びウエスタンブロットによって測定されたように、同様なノックダウンパターンが示された（図６）。異なるエレクトロポレーションプロトコルの取り込ませる効率を定量化するために、いずれかの鎖上でＣｙ３フルオロフォア及びＣｙ５フルオロフォアで標識された、ネズミ科動物の３μｇのＰＰＩＢ  ｓｉＲＮＡを、例えば３μｇのＲＶＧ−エキソソームと混合し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｈｙｐｏｏｓｍｏｌａｒ  Ｂｕｆｆｅｒをベースとしたエレクトロポレーション緩衝液に添加して、Ｂｉｏｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓａｒ  ＩＩ上で４ｍｍキュベット中でエレクトロポレーションを行った。次いで、この混合物をＰＢＳで希釈し、１２０，０００ｇで６０分間スピンダウンしてエキソソームを精製する。結果として生じたペレットを１００μｌの再蒸留水に再懸濁し、これにより、浸透圧によってエキソソームを溶解させて封入されたｓｉＲＮＡがその中に放出されると予測される。次いで、５６０ｎｍの励起及び６１０ｎｍの発光で蛍光プレートリーダーを用いてｓｉＲＮＡ含有量を測定し、保持されたｓｉＲＮＡを、水中の純粋なｓｉＲＮＡの標準曲線に対して定量した。図７に示すように、最適なエレクトロポレーション設定である、４００Ｖ及び１２５μＦでのエレクトロポレーション後に、最初のｓｉＲＮＡのうちの２０％以上（０．７３μｇ）が保持された。さらに、エレクトロポレーション緩衝液の量を減らすことによって混合物を濃縮することは、取り込ませる量を一定のレベルまで増加させるようであった。
【００８６】
最後に、標識２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチド（１００ｐｍｏｌ）及びＰＭＯ（１００ｐｍｏｌ）の正常エキソソームを用いたトランスフェクションをＣ２Ｃ１２細胞において試み、適用の１日後に画像化した。２種の小さなオリゴヌクレオチド種のうち、２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチドは、Ｃ２Ｃ１２細胞内へ効果的に送達されるようであり（図８ａ）、一方、モルホリノ（ＰＭＯ）送達は、未修飾エキソソームを用いたエキソソームを介した送達によって改良されないようである（図８ｂ）。この試験から、本発明者らは、送達用のエキソソーム中に、２’−ＯＭｅ、モルホリノ、チオヌクレオチド、化学的に改変されたｓｉＲＮＡ及びペプチド核酸を含む多様な非天然オリゴヌクレオチドを取り込ませることが可能であると考える。
【００８７】
材料
【００８８】
他に明記しない限り、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＵＫから入手し、使用した全ての酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。
【００８９】
細胞培養
【００９０】
樹状細胞は、ＤＣ培地（ＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸＃及び抗生物質）中で培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞は、２０％ＦＢＳ及び抗生物質を補ったＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ中で培養した。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞は、１０％ＦＢＳを補ったＥＭＥＭ中で培養した。細胞は全て、５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。
【００９１】
プラスミド
【００９２】
Ｌａｍｐ２ｂはＣ２Ｃ１２細胞のｃＤＮＡを用いてクローニングされ、シグナルペプチド配列の後にグリシンリンカーと共にＸｈｏＩ及びＢｓｐＥＩの制限酵素認識部位を挿入した。次いで、完全な構築物を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター中にＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識部位でＣＭＶプロモーターの下流にクローニングし、この過程でｅＧＦＰを取り除いた。ＲＶＧ［３２］、ＭＳＰ［３３］及びＦＬＡＧタグをコードするように設計されたプライマーを使用して、Ｌａｍｐ２ｂのＮ末端のＸｈｏＩとＢｓｐＥＩとの間にターゲティングリガンドを導入した（図６ａ）。ペプチド用のプライマー配列は、
【００９３】
【化１】
0005713325.tif 000003
【００９４】
【化２】
0005713325.tif 000004
【００９５】
【化３】
0005713325.tif 000005
【００９６】
【化４】
0005713325.tif 000006
【００９７】
【化５】
0005713325.tif 000007
【００９８】
【化６】
0005713325.tif 000008
【００９９】
【化７】
0005713325.tif 000009
【０１００】
トランスフェクション
【０１０１】
採取後４日目に、５μｇのｐＥＧＦＰ−ＮＡＤ又はｐＬａｍｐ２ｂ誘導体及び５μｌのＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を用いて、６穴プレート中、１０６細胞で、樹状細胞のトランスフェクションを行った。また、８日目に、エキソソームの単離を行う。
【０１０２】
逆転写ｑＰＣＲ
【０１０３】
逆転写は、５００ｎｇのＲＮＡ及びランダムプライマーを用いて、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）を製造業者の説明に従って使用して行った。ｑＰＣＲ試験は、０．５ｎＭの各プライマー及び２μｌの各ｃＤＮＡ調製物を含む、２０μｌの反応物中で、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＡＢＩ７０００サーマルサイクラー上で行った。
【０１０４】
ｑＰＣＲプライマー配列
【０１０５】
【化８】
0005713325.tif 000010
【０１０６】
【化９】
0005713325.tif 000011
【０１０７】
【化１０】
0005713325.tif 000012
【０１０８】
【化１１】
0005713325.tif 000013
【０１０９】
【化１２】
0005713325.tif 000014
【０１１０】
マウスシクロフィリンＢ：Ｍｍ＿ＰＰＩＢ＿１＿ＳＧ＿Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）
【０１１１】
ウエスタンブロッティング
【０１１２】
細胞試料及びエキソソームを、０．１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤混合物及びＤＮアーゼを含有する１０ｍＭトリス  ｐＨ７．４緩衝液中に溶解した。試料を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離させて、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写した。次いで、この膜を、ＰＢＳ中の１０％ミルクで１時間ブロッキングして、抗−Ｌａｍｐ２抗体（Ａｂｃａｍ）については１：５０００、抗−ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ）及び抗−シクロフィリンＢ（Ａｂｃａｍ）については１：１００００の希釈率で、一次抗体と共に９０分間インキュベートした。膜を、１：５０００希釈率のＨＲＰ結合二次抗体と共に室温で４５分間インキュベートし、その後、フィルムの露光を行った。全てのステップの後に、ＰＢＳＴで３回、それぞれ１０分間の洗浄を行った。
【０１１３】
エキソソームを用いたトランスフェクション及びエレクトロポレーション並びにＤＮアーゼ保護アッセイ
【０１１４】
１μｇのｐＥＧＦＰ−ＮＡＤプラスミドを、１μｌのトランスフェクション試薬、３μｇのエキソソームと混合して、ＤＭＥＭで１００μｌにした。この溶液を、３７℃で３時間インキュベートし、次いで、１μｌのＲＱ  ＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び１０μｌのＲＱ  ＤＮアーゼ緩衝液を添加して、３７℃で１０分間のＤＮアーゼ処理を行った。ＤＮアーゼは、２４穴の型中のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に全溶液を直接添加する前に、１０μｌのＳＴＯＰ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって不活化した。
【０１１５】
エキソソームは、２００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（１．１５ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２１％  Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）中６μｇのタンパク質濃度まで取り込ませ、２μｇのｐＥＧＦＰ−ＮＡＤ又は１００ｐｍｏｌのシクロフィリンｓｉＲＮＡを加えて、混合し、４ｍｍキュベット中でエレクトロポレーションを行った。ＤＮアーゼ保護アッセイのために、エレクトロポレーションを行った溶液２０μｌを７０μｌの蒸留水、１０μｌのＲＱ  ＤＮアーゼ緩衝液及び１μｌのＲＱ  ＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加して、３７℃で１０分間インキュベートした後に、１０μｌのＳＴＯＰ緩衝液で反応を阻害した。１０μｌの各試料を、０．８％アガロースＴＡＥゲル中の各レーン上で泳動させた。
【０１１６】
エキソソームを用いた、細胞のトランスフェクション
【０１１７】
１００ｕｌ（エレクトロポレーション）又は全混合物（トランスフェクション）を完全培地中のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に添加した。ｓｉＲＮＡの場合、２４時間後に培地を交換する。エキソソームの添加の４８時間後に細胞を回収した。
【０１１８】
エキソソームプルダウンアッセイ
【０１１９】
２０μｌのプロテインＡセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ９４２４）を、５００μｌのＰＢＳ及び２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中、４℃で一晩インキュベートした。このプロトコルでは、ビーズを、１００ｇ、４℃で２分間の遠心分離によるステップ中にペレット化させる。ビーズを、１ｍｌのＰＢＳで、各洗浄につき５分間、続けて３回洗浄した。１μｌのウサギ抗−ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ２５５５）又は１μｌのウサギ抗−Ａｇｏ１（Ｕｐｓｔａｔｅ  ０７−５９９）を、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１００μｌのＰＢＳ中、４℃で４時間、ビーズ上にロードし、ビーズを上記のように続けて３回洗浄した。正常エキソソーム及びＦＬＡＧ−エキソソームを、２００ｇで１０分間遠心して混入している残屑を除去し、２００μｌのＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度となるようにビーズに添加した。インキュベーション後、ビーズを上記のように続けて３回洗浄し、次いで、０．１％のＳＤＳ中に溶出させ、全ての上清をポリアクリルアミドゲルにロードした。エキソソームタンパク質であるＬａｍｐ１に対するウエスタンブロットを用いて、抗体によってプルダウンされたエキソソームの存在を検出した。
【０１２０】
統計
【０１２１】
他に明記しない限り、全ての試験を三重で実施した。本報告書中で用いている全てのエラーバーは、標準偏差である。データの統計解析は、ＳＰＳＳプログラム１６．０を使用して、ノンパラメトリックＫｒｕｓｃｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ検定を用い、続いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いることによって行った。
【０１２２】
エキソソームを介した、脳に対するｓｉＲＮＡの標的化全身性送達
【０１２３】
上記のように、免疫学的に不活性なエキソソームをネズミ科動物の骨髄由来の樹状細胞から採取し、これらのエキソソームの組織特異性を変えるために、ターゲティング部分−筋特異的ペプチド（ＭＳＰ）及びニューロン特異的狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）、をエキソソーム膜タンパク質であるＬａｍｐ２ｂ上に遺伝子的に改変した。エキソソームを介した、ｉｎ  ｖｉｖｏでの全身性ｓｉＲＮＡ送達の可能性を調べ、組織分布の特性を決定するために、高発現される遍在性のハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子を標的として選択した。本発明者らは、１５０μｇの最適化したＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを、未改変のエキソソーム、ＲＶＧ−エキソソーム又はＭＳＰ−エキソソームのいずれかの１５０μｇと共にエレクトロポレーションし、次いで、これらのエキソソームを超遠心によって精製して、封入されていない上清中のｓｉＲＮＡを除去した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにお静脈注射する前に、エキソソームを８０μｌの５％グルコース中に再懸濁した。裸のｓｉＲＮＡ（１５０μｇ）の注射は、報告されている尾静脈送達後のｓｉＲＮＡ隔離［４２］と一致して、脾臓、肝臓及び腎臓における検出可能なＧＡＰＤＨのサイレンシングという結果をもたらした（図９ａ）。これに対して、エキソソームに封入されたｓｉＲＮＡは、これらの器官に対する天然の親和性を有していないようであり、非特異的な取り込みに対して耐性であった。未修飾のエキソソームの全身性投与は、解析したいずれの器官においても、ＧＡＰＤＨサイレンシングを誘導しなかった（図９ｂ）。ＭＳＰ−エキソソームの注射は、脳及び腎臓において、わずかな、しかし有意ではないＧＡＰＤＨのサイレンシングを生じたのに対し（図９ｃ）、ＲＶＧ−エキソソームの注射は、ＲＶＧリガンドの標的−ニコチン性アセチルコリンレセプターを発現させている組織［３２］であるいくつかの脳領域において、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの有意なノックダウンという結果をもたらした（図９ｄ）。また、本発明者らは、注射の３日後に、腎臓において、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルの有意ではない低下も認めた。ＭＳＰ−エキソソームではｉｎ  ｖｉｖｏでの組織特異性が認められなかったが、相対的に弱いＭＳＰのターゲティング能力［４３］及び筋肉組織の存在量の多さによって、筋肉細胞中で平均ｓｉＲＮＡ濃度がかなり低くなるため、それと一致してより低い遺伝子ノックダウンの結果となっている可能性もある。
【０１２４】
本発明者らは、次に、エキソソームの再投与が、ウイルス［４４、４５］及びリポソームにおいて以前に記載されている、導入遺伝子送達効率の低下につながるかどうかを調べた。本発明者らは、この疑問を評価するために、２つの異なる試験を設計した。第一に、本発明者らは、空のＲＶＧ−エキソソームを動物に予め接種することが、送達の効力を低下させるかどうかを調べた。これらの動物に、エレクトロポレーションを行った、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを含んでいるＲＶＧ−エキソソームの注射の３週間前及び２週間前に、同じ用量で空のＲＶＧ−エキソソームを注射した。次いで、これらの動物を３日後に屠殺し、脳のＧＡＰＤＨのノックダウンを評価した。結果より、未感作マウスと感作マウスとの間のサイレンシング効力における最低限の低下が示され（図９ｄ対９ｅ）、標的化エキソソームは送達効力を失うことなく複数回再投与することができることが実証された。最後に、結果を確認するために、本発明者らは、ＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡを同じ濃度で含んでいる２種類の用量のＲＶＧ−エキソソームを３匹のマウスに注射した。動物は、組織採取の７日前及び３日前に注射され、脳におけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ及びタンパク質のノックダウンを評価した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ（５０．２％±９．１％、ｐ＜０．０５）及び皮質内のタンパク質レベル（１９．６％±２．３％、有意でない）で、ノックダウンが認められた（図９ｆ、ｇ）。これらの試験より、前記の結果が実証され、ＲＶＧ−エキソソームは送達効力を失うことなく複数回再投与することができ、長期の標的サイレンシングを可能にすることが示された。
【０１２５】
ＧＡＰＤＨでのノックダウンの成功を考慮に入れて、アルツハイマー病（ＡＤ）の病因における重要な酵素であるＢＡＣＥ−１を、本技術の治療可能性を評価するための標的とした。ＡＰＰを過剰発現している遺伝子導入マウス［４６、４７］及び正常マウス［４８］における過去の試験により、ＢＡＣＥ−１は、抗−ＡＤの治療の介入に有力な候補であることが示唆されている。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで以前に実証されている、２種類のＢＡＣＥ−１  ｓｉＲＮＡを正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに送達した。１５０μｇのＲＶＧ−エキソソーム及び１５０μｇの各ＢＡＣＥ−１  ｓｉＲＮＡにエレクトロポレーションを行い、精製し、送達前に５％グルコース中に再懸濁した。投与３日後の皮質における有意なｍＲＮＡ（７２％±１８％）及びタンパク質（６０％±１３％）のノックダウン（図９ｈ、ｉ）。さらに、本発明者らは、アルツハイマーの病状におけるアミロイドプラークの主要成分である、β−アミロイド１〜４２の合計含有量における２０％の減少を示した（図９ｊ）。この結果は、ＢＡＣＥ−１阻害剤の脳室内注射後の正常マウスにおいて示されているβ−アミロイド１〜４０の減少と比較可能である［４８］。この試験は、神経変性疾患に関する遺伝子の長期サイレンシングに理想的には適している可能性のある、本技術の治療可能性を示した。
1 Smith AJ, Schlichtenbrede FC,Tschernutter M, Bainbridge JW, Thrasher AJ, Ali RR (2003), AAV-Mediated genetransfer slows photoreceptor loss in the RCS rat model of retinitis pigmentosa,Mol Ther 8(2):188-95.
2 Ely A, Naidoo T, Mufamadi S, Crowther C,Arbuthnot P (2008), Expressed anti-HBV primary microRNA shuttles inhibit viralreplication efficiently in vitro and in vivo, Mol Ther 16(6):1105-12.
3 White MD, Farmer M, Mirabile I, BrandnerS, Collinge J, Mallucci GR (2008), Single treatment with RNAi against prionprotein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice withprion disease, Proc Natl Acad Sci USA 105(29):10238-43.
4 Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S,Marshall WS, Khvorova A (2004), Rational siRNA design for RNA interference, NatBiotechnol 22(3):326-30.
5 Takakura Y, Nishikawa M, Yamashita F,Hashida M (2001), Development of gene drug delivery systems based onpharmacokinetic studies, Eur J Pharm Sci 13(1):71-76.
6 Kawabata K, Takakura Y, Hashida M (1995),The fate of plasmid DNA after intravenous injection in mice: involvement ofscavenger receptors in its hepatic uptake, Pharm Res 12(6):825-30.
7 http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/Retrieved on 09-September-2008.
8 Lowenstein PR, Mandel RJ, Xiong WD,Kroeger K, Castro MG (2007), Immune responses to adenovirus and adeno-associatedvectors used for gene therapy of brain diseases: the role of immunologicalsynapses in understanding the cell biology of neuroimmune interactions, CurrGene Ther 7(5):347-60.
9 Alexander IE, Cunningham SC, Logan GJ,Christodoulou J (2008), Potential of AAV vectors in the treatment of metabolicdisease, Gene Ther.;15(11):831-9.
10 Hasbrouck NC, High KA (2008),AAV-mediated gene transfer for the treatment of hemophilia B: problems andprospects, Gene Ther 15(11):870-5.
11 Daniel R, Smith JA (2008), Integrationsite selection by retroviral vectors: molecular mechanism and clinicalconsequences, Hum Gene Ther 19(6):557-68.
12 Zhang JS, Liu F, Huang L (2005),Implications of pharmacokinetic behavior of lipoplex for its inflammatorytoxicity, Adv Drug Deliv Rev 57(5):689-98.
13 Ishida T, Masuda K, Ichikawa T, IchiharaM, Irimura K, Kiwada H (2005), Accelerated clearance of a second injection ofPEGylated liposomes in mice, Int J Pharm 255:167-74.
14 Ishida T, Ichihara M, Wang X, YamamotoK, Kimura J, Majima E, Kiwada H. (2006), Injection of PEGylated liposomes inrats elicits PEG-specific IgM, which is responsible for rapid elimination of asecond dose of PEGylated liposomes, J Control Release 112:15-25.
15 Ishida T, Ichihara M, Wang X, YamamotoK, Kimura J, Majima E, Kiwada H (2006), Injection of PEGylated liposomes inrats elicits PEG-specific IgM, which is responsible for rapid elimination of asecond dose of PEGylated liposomes, J Control Release 112:15-25.
16 Jiang H, Couto LB, Patarroyo-White S,Liu T, Nagy D, Vargas JA, et al (2006),  Effects of transientimmunosuppression on adenoassociated, virus-mediated, liver-directed genetransfer in rhesus macaques and implications for human gene therapy, Blood108(10):3321-8.
17 Wang Z, Kuhr CS, Allen JM, BlankinshipM, Gregorevic P, Chamberlain JS, et al (2007), Sustained AAV-mediateddystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy with abrief course of immunosuppression, Mol Ther 15(6):1160-6.
18 Li JZ, Li H, Hankins GR, Dunford B, HelmGA (2005), Local immunomodulation with CD4 and CD8 antibodies, but notcyclosporine A, improves osteogenesis induced by ADhBMP9 gene therapy, GeneTher 12(16):1235-41.
19 Zaiss AK, Muruve DA (2005), Immuneresponses to adeno-associated viral vectors, Curr Gene Ther 5(3):323-31.
20 Taylor N, Uribe L, Smith S, Jahn T, KohnDB, Weinberg K (1996), Correction of interleukin-2 receptor function in X-SCIDlymphoblastoid cells by retrovirally mediated transfer of the gamma-c gene,Blood 87(8):3103-7.
21 Oh YK, Sohn T, Park JS, Kang MJ, ChoiHG, Kim JA, et al (2004), Enhanced mucosal and systemic immunogenicity of humanpapillomavirus-like particles encapsidating interleukin-2 gene adjuvant,Virology 328(2):266-73.
22 Williams DA (2007), RAC reviews seriousadverse event associated with AAV therapy trial, Mol Ther 15(12):2053-4.
23 Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W,Liejendekker R, Harding CV, Melief DJ Geuze HJ (1996), B lymphocytes secreteantigen-presenting vesicles, J Exp Med 183:1161-1172.  
24 Zitvogel L, Regnault A, Lozier A,Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi-Castagnoli P, Raposo G, Amigorena S(1998), Eradication of established murine tumors using a novel cell-freevaccine: dendritic cell-derived exosomes, Nat Med 4:594-600.
25 Hao S, Moyana T, Xiang J (2007), Review:cancer immunotherapy by exosome-based vaccines, Cancer Biother Radiopharm22:692-703. 
26 Valadi H, Ekstrom K, Bossios A,Sjostrand M, Lee JJ, Lotvall JO (2007), Exosome-mediated transfer of mRNAs andmicroRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells, Nat Cell Biol9(6):654-9.
27 Skog J, Wurdinger T, van Rijn S, MeijerDH, Gainche L, Sena-Esteves M, Curry WT Jr, Carter BS, Krichevsky AM,Breakefield XO (2008), Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteinsthat promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers, Nat Cell Biol10(12):1470-6.
28 Quah BJ, O’Neill HC (2005), Theimmunogenicity of dendritic cell-derived exosomes, Blood Cells Mol Dis35:94-110.
29 Thery C, Zitvogel L, Amigorena S (2002),Exosomes: composition, biogenesis and function, Nat Rev Immunol 2(8):569-79.
30 Jooss K, Yang Y, Fisher KJ, Wilson JM(1998), Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immuneresponse to transgene products in muscle fibers, J Virol 72(5):4212-23.
31 Reis e Sousa C (2006), Dendritic cellsin a mature age, Nat Rev Immunol 6(6):476-83.
32 Kumar P, Wu H, McBride JL, Jung KE, KimMH, Davidson BL, Lee SK, Shankar P, Manjunath N (2007), Transvascular deliveryof small interfering RNA to the central nervous system, Nature 448(7149):39-43.
33 Flint PW, Li ZB, Lehar M, Saito K, PaiSI (2005), Laryngeal muscle surface receptors identified using random phagelibrary, Laryngoscope 115(11):1930-7.
34 Rippe K, Mucke N, Langowski J (1997),Superhelix dimensions of a 1868 base pair plasmid determined by scanning forcemicroscopy in air and in aqueous solution, Nucleic Acids Res 25(9):1736-44.
35 Vijayanathan V, Thomas T, Shirahata A,Thomas TJ (2001), DNA condensation by polyamines: a laser light scatteringstudy of structural effects, Biochemistry 40(45):13644-51.
36 Lentz, T. L. Rabies virus binding to anacetylcholine receptor alpha-subunit peptide (1990). J. Mol. Recognit. 3,82-88.
37 Zeng J , Too HP , Ma Y , Luo ESE , WangS . A synthetic peptide containing loop 4 of nerve growth factor for targetedgene delivery (2004). J Gene Med.;6:1247-1256.
38 McKay T , Reynolds P , Jezzard S ,Curiel D , Coutelle C . Secretin-mediated gene delivery, a specific targetingmechanism with potential for treatment of biliary and pancreatic disease incystic fibrosis (2002). Mol Ther;5:447-454.
39 C. Thery, S. Amigorena, G. Raposo, A.Clayton, Isolation and characterization of exosomes from cell culturesupernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol Ed. (Wiley, New York, April 2006) Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
40 V.R. Simhadri, K.S. Reiners, H.P.Hansen, D. Topolar, V.L. Simhadri et al., Dendritic cells releaseHLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killerfunction. PLoS One. 3(10), e3377 (2008), doi:10.1371/ journal.pone.0003377.
41 Y.C. Wang, X.B. Hu, F. He, F. Feng, L.Wang et al., Lipopolysaccharide-induced maturation of bone marrow-deriveddendritic cells is regulated by notch signaling through the up-regulation ofCXCR4. J Biol Chem. 284(23), 15993-6003 (2009).
42 S.D. Larson, L.N. Jackson, L.A. Chen,P.G. Rychahou, B.M. Evers, Effectiveness of siRNA uptake in target tissues byvarious delivery methods. Surgery. 142(2):262-9 (2007).
43 H. Yin, H.M. Moulton, C. Betts, Y. Seow,J. Boutilier et al., A fusion peptide directs enhanced systemic dystrophin exonskipping and functional restoration in dystrophin-deficient mdx mice. Hum MolGenet. 18(22):4405-14 (2009).
44 F.A. Nunes, E.E. Furth, J.M. Wilson,S.E. Raper, Gene transfer into the liver of nonhuman primates with E1-deletedrecombinant adenoviral vectors: safety of readministration. Hum Gene Ther.10(15), 2515-26 (1999).
45 S.C. Gonzalez, M.M. McMenamin, H.M.Charlton, J. Goodman, T. Lantos, Readministration of adenoviral gene deliveryto dopamine neurons. Neuroreport. 18(15), 1609-14 (2007).
46 F. M. Laird, H. Cai, A.V. Savonenko A.V. M.H. Farah, K. He et al., BACE1, a major determinant of selectivevulnerability of the brain to amyloid-beta amyloidogenesis, is essential forcognitive, emotional, and synaptic functions. J. Neurosci. 25(50), 11693-11709(2005).
47 O. Singer, R.A. Marr, E. Rockenstein, L.Crews, N.G. Coufal et al., Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimerdisease neuropathology in a transgenic model. Nat. Neurosci. 8(10), 1343-1349(2005).
48 K. Nishitomi, G. Sakaguchi, Y.Horikoshi, A.J. Gray, M. Maeda et al., BACE1 inhibition reduces endogenousAbeta and alters APP processing in wild-type mice. J.  Neurochem. 99(6),1555-63 (2006).
【図１】
0005713325.tif 000015
【図２】
0005713325.tif 000016
【図３】
0005713325.tif 000017
【図４】
0005713325.tif 000018
【図５】
0005713325.tif 000019
【図６】
0005713325.tif 000020
【図７】
0005713325.tif 000021
【図８】
0005713325.tif 000022
【図９】
0005713325.tif 000023
【配列表】
0005713325000001.app