(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患の危険性、又は該疾患の進行を予測するためのインビトロ方法であって、患者の試料においてヒト染色体２２ｑ１２．１上のＣＨＫ２遺伝子のプロモーター領域で１つ以上の遺伝子変化が探索され、かつ遺伝子変化は多型−７１６１Ｇ＞Ａ、多型−７２３５Ｃ＞Ｇ、多型−１０５３２Ｇ＞Ａ及び多型−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９から選択されること、及び前記多型−７１６１Ｇ＞Ａおよび多型−７２３５Ｃ＞Ｇの少なくとも１つは、結腸癌発症の危険性又は進行の予測に用いられ、前記多型−７１６１Ｇ＞Ａ、多型−７２３５Ｃ＞Ｇ、および多型−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９の少なくとも１つは、グリア芽細胞腫発症の危険性又は進行の予測に用いられ、前記多型−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９は、乳がん発症の危険性又は進行の予測に用いられ、前記−７２３５Ｃ＞Ｇは、喉頭癌発症の危険性又は進行の予測に用いられることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
患者の試料において、−７１６１Ｇ＞Ａ、−７２３５Ｃ＞Ｇ、−１０５３２Ｇ＞Ａ及び−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９の多型のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つが探索されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多型−７１６１Ｇ＞Ａ又は多型−７２３５Ｃ＞Ｇは、結腸癌発症の危険性又は進行の予測に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多型−７１６１Ｇ＞Ａ、多型−７２３５Ｃ＞Ｇ、又は多型−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９は、グリア芽細胞腫発症の危険性又は進行の予測に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多型−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９は、乳がん発症の危険性又は進行の予測に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記−７２３５Ｃ＞Ｇは、喉頭癌発症の危険性又は進行の予測に用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌疾患を治療するための適切な療法を決定するための診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌療法の必須の側面は、まず第一に、正確な診断を確立することである。診断は、疾患の実際の病期についての知識を提供し、これは続いて使用されるべき療法の種類、例えば腫瘍の外科的除去、並びに任意に放射線及び薬物療法、また場合により物理的方法（例えば、温熱療法）の使用に関しても重要である。古典的な診断方法には、いわゆる「病期分類」("staging")及び「グレーディング」("grading")が含まれる。病期分類では、腫瘍の大きさ及びその侵襲性が記述され、リンパ節が影響を受けているか、及び遠隔転移があるかが検査される（例えば、ＴＮＭ病期分類システム(TMN stagin system)）。グレーディングは、低い悪性度は低分化又は脱分化細胞よりも高分化腫瘍細胞に起因すると言う、腫瘍細胞の組織学的検査である。この分類は、個々の患者のための予測について限定されたものであり、臨床経験から、同じ腫瘍病期を有する患者が明確に異なる疾患経過及び療法に対する異なる反応を示すことが示されており、このことは顕著に異なる生存期間によって最終的に明らかである。
【０００３】
このため、診療には、癌疾患について向上した個別の予後を可能にする、追加のより正確なマーカーの提供が必要である。このことは、乳癌の場合におけるエストロゲンレセプター発現の分析のような組織化学的マーカーを使用することによって、実現することができる。
【０００４】
代替的手法は、遺伝子欠損、例えば腫瘍抑制遺伝子における体細胞変異の探求である。新たな手法は、遺伝子発現プロファイルにより疾患の経過を予測しようと試みる。癌治療における別の問題としては、制癌剤の有効性、個別の最適投与量又は療法の継続期間に関する予測だけでなく、重篤で危険な副作用の発生に関する予測もある。例えば、イリノテカンによる治療処置を受けている数人の患者が重篤な有害作用に苦しむという事実は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の遺伝子多型が原因であり得る。事前の遺伝子分析は、治療を開始する前にそのような患者を同定し、投与量を調整することを可能にする。
【０００５】
更に、生物工学的方法により製造された薬剤を使用する療法は高価であり、将来的には、治療の効力が個人的素因により見込みがあると思われる患者に限定されるであろう。
【０００６】
悪性腫瘍の基本的特性
癌細胞は、接触阻害の欠失及び非制御的細胞増殖によって特徴付けられる。そのような変化は、自発的に、又は病原性毒素、いわゆる、ゲノムに損傷を与える発癌性物質により引き起こされる。そのような有害物質には、多くの化学物質、タバコの煙のみならず、ＵＶ光線も含まれる。更に、遺伝因子は、癌の発症において大きな役割を果たす。非制限的増殖とは別に、他の臓器に「娘腫瘍」（転移）を形成する傾向は、癌細胞の特徴である。転移は、血管又はリンパ管を介して規則的に拡散する。大多数の場合において、癌疾患は、不治であり、致死的である。治療手段は、原発性腫瘍及び転移の外科的除去を目的とする。更に、腫瘍を放射線で治療することが可能である。いわゆる細胞増殖抑制剤、特定のタンパク質若しくは表面マーカーに対する抗体又は免疫調節物質（サイトカイン、インターフェロン）が、急速に増殖する細胞を死滅させること又はアポトーシスを誘発することを試みるために使用される。
【０００７】
特定の形態の療法に対する反応についての情報を提供し、或いは転移の発生、腫瘍進行及び生存に関する一般的な予測を可能にする、癌疾患の経過のための予後因子を定義することは大きな関連性がある。
【０００８】
明らかに、病期分類及びグレーディングとは無関係に腫瘍疾患の経過を決定する、複数の、個別で未発見の生物学的変数が存在する。これらの因子には、宿主遺伝因子が含まれる。腫瘍の発生に関する予測を可能にする遺伝子マーカーを開発することが、更に望ましい。この種類のマーカーは、やがて更なるスクリーニング測定（血清学、Ｘ線撮影、超音波検査、ＭＲＴなど）が考慮される人を含む目的に役立つ。これは、初期の癌疾患を診断及び治療することを可能にし、回復及び生存の機会は、進行期の腫瘍よりも初期の腫瘍において有意に高い。
【０００９】
ＤＮＡ修復機構の意義
ＤＮＡ修復機構により、細胞は、ＤＮＡ構造の欠損修飾を排除することができる。ＤＮＡにおけるそのような損傷は、ＤＮＡ複製の際に自発的に又は変異原物質、超高温若しくは電離放射線の影響により生じ得る。ＤＮＡ損傷は、誤った形態で生じる有糸分裂のＤＮＡ複製、もはや合成されない若しくは誤った形態で合成されるタンパク質又は二本鎖切断後に切断される必須染色体領域を生じ得る。細胞の複雑な修復機構が成功しない場合、増殖及び休眠体細胞に蓄積している多数の欠損は、正常な細胞機能が欠損するほどの量まで増加する。生殖細胞において、娘細胞はもはや生存することができず、それは細胞株：細胞又は第二から第三継世代それぞれの不活性化をもたらし、細胞分裂の能力を失わせ、死滅させる。細胞周期の制御内において、制御タンパク質は細胞又はそのＤＮＡが欠損していることを認識し、細胞周期の停止又はプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導することができる。
【００１０】
チェックポイントキナーゼ２の意義
細胞の最も重要な機能は、ゲノムの完全性を維持することである。このため、細胞周期内の全てのプロセスが正確に終了することを確実にする、多様な制御機構が存在する。これらの制御機構は、「チェックポイント[1]」と呼ばれる。これらは、用語が意味するように十分に画定されたポイントではなく、特定の条件化で開始されうる反応カスケードである。
【００１１】
幾つかの細胞周期チェックポイントが今まで特徴決定されてきた。哺乳類において最も調査されたチェックポイントを図１に示す。一方、細胞周期の異なる段階でのＤＮＡに対する損傷により活性化され得る、ＤＮＡ損傷チェックポイントが存在する。この損傷は、放射線のような外因的な原因、並びに内因的な事象、例えば自然突然変異により誘発され得る。他方、複製チェックポイントは、不完全な又は欠損したＤＮＡ複製により活性される。紡錘体チェックポイント（スピンドルチェックポイント;spindle checkpoint）は、双極性紡錘体の形成、動原体（キネトコア）の付着及びセントロメア構造の形成を制御する。
【００１２】
これらのプロセスが完全に終了しないか、或いは損傷が修復されない限り、細胞周期の次の段階への細胞の移行は、細胞のゲノム完全性が維持されることを確実にするために阻害される。
【００１３】
チェックポイントキナーゼ２は、娘細胞への誤りの伝達が最小限になることを確実にする、細胞周期における必須の制御機構に関与する。異なるチェックポイントで活性化される関連するＣＨＫ２反応カスケードを図２に示す。ＤＮＡ損傷によって、ＡＴＭ（ataxia-telangiectasia, mutated;血管拡張性失調症変異）は、リン酸化され、したがって活性化される。次にＡＴＭは、アミノ酸位置６８のトレオニン（Ｔｈｒ）におけるリン酸化を介してＣＨＫ２を活性化する。このリン酸化は、ＣＨＫ２が自己リン酸化することができる、二量体形成の能力にとっての前提条件である。ＣＨＫ２が、完全に活性化された形態で存在することができ、かつＧ１−、Ｓ−又はＧ２／Ｍ期の間の細胞周期停止、ＤＮＡ修復系の活性化又はアポトーシスが欠損細胞において誘導され得る、そのエフェクターを活性化することができるのは、唯一この方法である。
【００１４】
ＣＨＫ２のエフェクターには、ｐ５３（腫瘍タンパク質５３;tumor protein 53）が含まれ、p53はセリン（Ｓｅｒ）２０においてＣＨＫ２によりリン酸化され、それによって安定化する。続いて、ｐ５３は、ＤＮＡ損傷、アポトーシス及び細胞周期の制御に関与する因子を正に調節する。ＢＲＣＡ１（乳癌１遺伝子;breast cancer 1 gene）も、ＣＨＫ２基質に属する。これは、Ｓｅｒ９８８においてＣＨＫ２によりリン酸化され、それによって、ＣＨＫ２との複合体から放出され、次にこれにより、損傷を受けたＤＮＡを修復するために細胞周期の停止に至る。ＣＤＣ２５Ｃ（細胞分裂周期２５Ｃ;cell division cycle 25C）も、Ｓｅｒ２１６においてＣＨＫ２によりリン酸化され、それによって自己のホスファターゼ活性が阻害され、それは細胞質様式で分解される。この場合、Ｃｄｋ１（サイクリン依存性キナーゼ１;cyclin-dependent kinase 1）は活性化することができず、したがって、損傷を受けたＤＮＡを有する細胞が有糸分裂を開始するのが回避される。更に、ＣＤＣ２５Ａは、Ｓｅｒ１２３においてＣＨＫ２によりリン酸化され、それよってユビキチン化し、プロテアソーム依存的な様式で分解される。このタンパク質は、細胞周期における細胞の進行に関して重要な役割を果たすが、分解によって阻害される。
【００１５】
ＣＨＫ２は、ＤＮＡ損傷により開始されるシグナル伝達において重要な役割を果たす。ＣＨＫ２の生理学的な重要性は、ノックアウトマウスを作製することによって解析した。Ｃｈｋ２-/+とＣｈｋ２-/-のマウスが生存した。しかし、亜致死用量（８Ｇｙ）の放射線照射の後では、異なる長さの生存期間を示し、野生型及びＣｈｋ２-/+マウスの生存期間中央値は、Ｃｈｋ２-/-マウスよりも有意に短かった。このように、Ｃｈｋ２-/-マウスは、放射線誘導アポトーシス速度の低減により引き起こされた放射線抵抗性を示した。Ｇ２／ＭチェックポイントはＣｈｋ２-/-マウスにおいて影響を受けなかったが、Ｇ１／Ｓチェックポイントは、誘導することは可能であったが、維持することができなかった。これは、ｐ５３の転写活性の低減に対して引き起こされる。更に、腫瘍は、少なくとも１つの機能するＣｈｋ２対立遺伝子を有するマウスと対照的に、Ｃｈｋ２-/-マウスにおいてのみ発症した。
【発明の概要】
【００１６】
したがって、本発明の根底をなす課題は、癌疾患の自然歴及び任意の形態の療法に対する反応の予後の改善を可能にする方法を提供することにある。特に、当該方法は、ＤＮＡ修復機構の増大が癌療法を困難にする患者を同定することも可能にすべきである。
【００１７】
この課題は、癌疾患を発症する危険性、疾患の経過、薬剤の有効性及び癌疾患の治療における薬剤に関連した危険性を予測するためのインビトロ方法であって、患者の試料においてヒト染色体２２ｑ１２．１上のＣＨＫ２遺伝子のプロモーター領域で１つ以上の遺伝子変化が探索され、かつ遺伝子変化は多型−７１６１Ｇ＞Ａ、多型−７２３５Ｃ＞Ｇ、多型−１０５３２Ｇ＞Ａ及び多型−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９から選択される、上記方法により解決される。
【００１８】
上記目的のための上記多型の使用も、本発明の主題である。
【００１９】
したがって、本発明は、以下を目的とする：
ａ．タンパク質発現の変化若しくはスプライシング変異体の発現の変化のいずれかをもたらすか、又は
ｂ．ＣＨＫ２遺伝子において更なる多型若しくはハロタイプをそれぞれ見出す及び／若しくは確認するのに適している、
ＣＨＫ２遺伝子のプロモーターにおける機能修飾ゲノム多型を提供すること、
ｃ．一般的な危険性及び疾患の経過を予測するのに適している多型を提供すること、
ｄ．医薬品及び癌療法、特にＣＨＫ２阻害剤に対する反応、並びに副作用を一般に予測するのに適している多型を提供すること、
ｅ．他の形態の療法（例えば、放射線、温熱、寒冷）の効果を一般に予測するのに適している多型を提供すること。
【００２０】
ゲノム完全性の維持におけるＣＨＫ２の本来の意義によって、この種類の多型は、癌疾患の場合において疾患の危険性及び／又は疾患の経過を一般に予測すること、並びに／或いは療法に対する反応／療法の失敗又は全ての医薬品若しくは非薬物療法に対する望ましくない副作用を予測することに適している。
【００２１】
ＣＨＫ２遺伝子のプロモーターにおける多型の検出
ＣＨＫ２遺伝子のプロモーター領域における３つの多型が知られており、これらは一般に利用可能なデータベースにおいて見出すことができる。これらの３つの多型が検出され、かつ確認されたのは、ヒトのＤＮＡ試料の系統的な塩基配列決定によってであった：−７１６１Ｇ＞Ａ（ｒｓ２２３６１４１）、−７２３５Ｃ＞Ｇ（ｒｓ２２３６１４２）及び−１０５３２Ｇ＞Ａ（ｒｓ５７６２７６７）（図５）。この目的のために、ＣＨＫ２のプロモーター領域の遺伝子配列をＰＣＲ反応により増幅し、サンガーによる方法を使用して塩基配列の決定をした。この目的に必要な方法、例えば、ＰＣＲ反応に必要となるプライマー対を誘導すること、及び配列決定用プライマーを選択することは、当業者に周知である。この関係において、２９塩基対の欠失である新たな多型が見出された（−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９、ｄｂＳＮＰ  ＩＤなし）（図５）。これらのＳＮＰの番号付けは、番号＋１が開始コドンＡＴＧのヌクレオチドＡに割り当てられたものである。番号０は存在しないと理解されるので、番号−１は、開始コドンＡＴＧのＡの前のヌクレオチドに割り当てられる。
【００２２】
本発明の使用によるこの多型の検出は、当業者に既知の任意の方法、例えば、直接的な塩基配列決定、後続の切断解析(restriction analysis)を伴うＰＣＲ、リバース・ハイブリダイゼーション、ドットブロット又はスロットブロット法、質量分析法、タックマン(Taqman)（登録商標）又はライトサイクラー(LightCycler)（登録商標）技術、パイロシーケンス(Pyrosequencing)（登録商標）、インベーダー(Invader)（登録商標）技術、ルミネックス法により実施することができる。更に、これらの遺伝子多型を、ＤＮＡチップに対する多重ハイブリダイゼーション（multiplex hybridisation）及びハイブリダイゼーションにより、同時に検出することができる。
【００２３】
原則として、人体の全ての細胞は悪性状態を生じる可能性があり、癌疾患をもたらす可能性がある。ここでの及び下記における説明は、腫瘍進行、転移及び療法に対する反応についての一般的な機構を記述するものである。この点に関して、本明細書及び請求項に記載される機構は、全てのヒト腫瘍に関連する。以下は、例としてのみ提示される。
【００２４】
腎細胞癌、前立腺癌及び精上皮腫のような尿生殖器の腫瘍；乳癌、子宮体癌、卵巣癌、子宮頸癌などの女性生殖器系の腫瘍；口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、膵癌、結腸癌、直腸癌などの胃腸管の腫瘍；喉頭癌、気管支癌などの気道の腫瘍；悪性黒色腫、基底細胞腫及びｔ細胞リンパ腫などの皮膚の腫瘍；ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、急性及び慢性白血病、形質細胞種などの造血系の腫瘍疾患；グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜肉腫、星状細胞腫などの脳及び神経組織それぞれの腫瘍疾患、並びに肉腫及び頭頸部腫瘍などの軟組織の腫瘍。
【００２５】
ＣＨＫ２遺伝子
ヒトＧＨＫ２遺伝子は、染色体２２ｑ１２．１（ジーンバンク・アクセション番号：ＮＭ＿００７１９４）上に位置しており、核で発現する６５ｋＤの大きさのタンパク質をコードする。本文脈において、遺伝子は、「ＣＨＫ２」及び「ＣＨＥＫ２」と称されることが指摘される。以下では、「ＣＨＫ２」の名称が使用される。遺伝子構造の模式図は図３で見られる。ＣＨＫ２の活性プロモーター領域の特徴は、既に決定されている。プロモーター配列は、転写因子ＳＰ１の多数の結合部位を含有し、その結合は転写活性を増強する。ＣＨＫ２の正の調節も、ＣＣＡＡＴボックスへのＮＦ−Ｙ結合の際に観察された。
【００２６】
ＣＨＫ２における体細胞変異
ＣＨＫ２は、ＤＮＡ損傷後のチェックポイント停止において重要な役割を果たし、かつ様々な腫瘍サプレッサー遺伝子がＣＨＫ２の基質であるので、潜在的な腫瘍サプレッサー遺伝子であると考えられている。今まで、散在性腫瘍、例えば、結腸直腸腫瘍、肺癌、前立腺癌、乳癌を有する一部の患者において、並びに複数腫瘍表現型であるリー・フラウメニ症候群(Li-Fraumeni syndrome)を有する患者において、この遺伝子における体細胞変異を検出することが可能であった。一塩基多型（ＳＮＰ）と対照的に、これらの変異は、例えば、関連する患者の抹消血細胞では見出されない。
【００２７】
ＣＨＫ２における変化による腫瘍疾患の危険性
今まで、幾つかのケースにおいて、異なる腫瘍疾患によるＣＨＫ２における遺伝子変化を検出すること及びこれらを疾患の発症の危険性と関連づけることが可能であった。これらは、頻繁な遺伝子変異体ではないが、希な変異であり（頻度＜１％）、健康な対照群よりも患者の大集団において多く検出され得た。現在まで、これらの希な変異のみならず、頻繁に発生するＳＮＰも解析した研究は、１つしか発表されていない。この関係で、プロモーター多型−７１６１Ｇ＞Ａ（ｒｓ２２３６４１）も、乳癌の発症の危険性に関して解析された。しかしながら、関連性を検出することはできなかった（ベイネス（Baynes）ら、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２及びＴＰ５３癌感受性遺伝子における一般的な変異は乳癌の危険性を増大する可能性は低い(Common variants in the ATM, BRCA1, BRCA2, CHEK2 and TP53 cancer susceptibility genes are unlikely to increase breast cancer risk.)、2007、ブリースト・キャンサー・リサーチ(Breast Cancer Res) 9:R27）。
【００２８】
化学療法剤としてのＣＨＫ２阻害剤
チェックポイントが多くの調節カスケードに関与しているので、それらは制癌剤の適した標的である。チェックポイントタンパク質の特定の性質がこのことを説明する：（１）チェックポイントの複雑なシグナル伝達系は、攻撃のための複数の標的を提供する、（２）健常な細胞において、チェックポイントのいくつかは重要性が低いと考えられ、それは阻害剤の毒性を著しく低減する、（３）欠損チェックポイントの回復は、細胞増殖の減速をもたらす場合がある、（４）シグナル伝達系としてのチェックポイントは、中断され得る適応に付される、及び（５）損なわれたチェックポイントの回復は、癌細胞のアポトーシス速度を増加し、したがって特定の物質に対する感受性を増加し得る。
【００２９】
遺伝子療法の手法を使用しておそらく最も容易に達成されるであろう、これらの目的に反して、チェックポイントの他の２つの特性は、達成することがより容易な標的である。欠損チェックポイントを有する細胞は、放射線及び細胞毒性物質に対して増加した感受性又は増加した抵抗性のいずれかを示す。ＣＨＫ２の阻害は、ＤＮＡ損傷剤に関して特にｐ５３欠損細胞を感作すると考えられ、同時に、正常組織を損傷から、したがって副作用から保護する。このため、ＣＨＫ２の阻害は、新たな抗癌薬を開発する有望な手法の一部である。
【００３０】
様々なＣＨＫ２阻害剤が、それぞれ既に知られており、或いは既に開発されている。現在、多少非特異的な阻害剤であるＵＣＮ−０１及びＤＢＨ（デブロモヒメニアルジシン）の他に、特定の強力なＣＨＫ阻害剤も利用可能である。これらには、ＣＨＫ２阻害剤２（２−（４−（４−クロロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ベンゾ（ｄ）イミダゾール−５−カルボキサミド）、ＶＲＸ０４６６６１７（５−（４−（４−ブロモフェニルアミノ）フェニル−アミノ）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（１−ヒドロキシプロパン−２−イル）イソチアゾール−４−カルボキシミドアミド）及びＮＳＣ１０９５５５（（２Ｅ，２′Ｅ）−２，２−（１，１′−（４，４′−カルボニル−ビス（アザンジイル）ビス（４，１−フェニレン））ビス（エタン−１−イル−１−イリデン））ビス（ヒドラジンカルボキシイミドアミド））が含まれ、これらは放射線療法の際に副作用の低減に寄与することができる（図４）。
【００３１】
化学療法剤としてのＣＨＫ２活性化剤
しかしながら、ＣＨＫ２活性化剤は癌療法において代替案となり得る。ＣＨＫ２は、腫瘍形成の抑制において役割を果たし、その活性化は、ＤＮＡ損傷剤が存在しない場合、腫瘍細胞が増殖状態から離れ、かつ死滅することを誘導することができる。更に、これは、強力なＧ２停止を誘導する。活性化戦略は、阻害剤の短所を補うことができる場合があり、腫瘍は非常に異質であり、このため、１つのシグナルカスケードのみを不活性化することが必ずしも十分と言うわけではない。多くの種類の腫瘍細胞に共通する維持された細胞周期機構の過剰活性化によって、この異質性は中和させることができる。
【００３２】
−７１６１Ｇ＞Ａ、−７２３５Ｃ＞ＧＴ、−１０５３２Ｇ＞Ａ及び−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ−２９多型の分布、ハロタイプの検出、並びに更なる関連多型及びハロタイプを見出すためのこれらの遺伝子型の使用
このために、白人の異なるＤＮＡ試料の遺伝子型を決定した。結果を以下の表に示す。
【表１】
0005688379.tif 000002
Ｉ＝挿入、Ｄ＝欠失
【００３３】
更なる分析は、健常な白人のこれらのＤＮＡ試料において、特定の多型の間に連鎖不均衡があることを示した。連鎖不均衡という用語は、その頻度に関して予想されうるよりも、統計的に明確に頻繁又は希に組み合わせとして生じる対立遺伝子の組合せ（ハロタイプ）の発生を意味する。この関係において、多型−７１６１Ｇ＞Ａ及び−１０５３２Ｇ＞Ａが互いに完全に連鎖することが観察された。対照的に、多型−７２３５Ｃ＞Ｇ及び−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９は、互いに連鎖せず、他の二つの変異に対しては限定された程度でのみ連鎖する（図６Ａ及びＢ）。連鎖の品質は、値Ｄ′及びｒ2により表される。Ｄ′＝１及びｒ2＝１は、有意な連鎖として参照される。これらの値が１に近づくほど、連鎖不均衡に近づく。これらの４つの多型から構成することができるハロタイプの計算は、７つの異なる対立遺伝子の組合せをもたらした。これらのプロモーター変異から生じる優先的なハロタイプは存在しない（図６Ｃ）。全ての可能な組合せを決定するために、４つの多型のうち少なくとも３つを検出する必要がある。
【００３４】
これらの新たな多型を使用して、ＣＨＫ２、又はＧＨＫ２遺伝子における遺伝子型と例えば連鎖不均衡にある隣接遺伝子における更なる関連するゲノム遺伝子変化を検出及び確認できることが、本発明の１つの主題である。しかしながら、これらは、ＣＨＫ２遺伝子から遠く離れている染色体２２に配置されている遺伝子でもありうる。このため、以下の手法が使用される。
１．特定の表現型（例えば、細胞特性、疾患の状態、疾患の経過、医薬組成物に対する反応）について、多型−７１６１Ｇ＞Ａ、−７２３５Ｃ＞Ｇ、−１０５３２Ｇ＞Ａ及び−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９との関連性が確立され、これらの関連性は、それぞれの遺伝子型に対して個別に、又はハロタイプの全ての順列を使用して、確立することができる。
２．ＣＨＫ２又は隣接遺伝子において新たに検出された遺伝子変化に関して、既に存在する関連性が、上記遺伝子型又はハロタイプを用いることにより増強又は低減されるかを試験する。
【００３５】
以下において図を簡潔に説明する。
図１：最も重要なチェックポイントを有する細胞周期の概略図。
図２：ＣＨＫ２調節チェックポイントでの反応カスケードのグラフ図。
図３：ヒトＣＨＫ２遺伝子のイントロン／エクソン構造（忠実な尺度ではない）。
図４：幾つかのＣＨＫ２阻害剤の構造式。
図５：ＣＨＫ２遺伝子における多型の概略図（忠実な尺度ではない）。
図６：ハプロビュー(Haploview)プログラムを用いたＣＨＫ２のプロモーター多型の連鎖分析；Ａ−多型の互いの連鎖のグラフ図。黒色四角形はｒ2＝１を示し；灰色四角形はｒ2＜０．５を示し；明灰色四角形はｒ2＜０．１を示す。Ｂ−個別の対立遺伝子の頻度及び連鎖の可能性；Ｃ−構成されたハロタイプの頻度；三角形で示された対立遺伝子は、いわゆるハロタイプ標識対立遺伝子(haplotype-tagging alleles)と呼ばれ、すなわちこれらの対立遺伝子は、ハロタイプを決定するために決定される必要がある。
図７:ＣＨＫ２遺伝子のプロモーターにおける転写因子の推定結合部位;赤色で示されている塩基は、関連する多型の対立遺伝子を表す。
図８:ＣＨＫ２の−７２３５Ｃ＞Ｇ多型の異なる対立遺伝子を含有する構築物を用いた電気泳動度移動アッセイ（Electrophoretic Mobility Shift Assay(ＥＭＳＡ)）の結果。細胞核抽出物の添加の後、Ｃ対立遺伝子への核タンパク質の結合の増加が観察される。結合は、置換しているオリゴヌクレオチドの存在により特異的に阻害される。
図９:ＣＨＫ２の−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型の異なる対立遺伝子を含有する構築物を用いた電気泳動度移動アッセイ（Electrophoretic Mobility Shift Assay(ＥＭＳＡ)）の結果。細胞核抽出物の添加の後、両方の対立遺伝子が、第２対立遺伝子が競合することができる転写因子の結合をもたらすことが観察される。しかし、転写因子はこの場合では異なる。
図１０：ｆＳＥＡＰレポーターアッセイにより決定された、−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型に依存するＣＨＫ２プロモーター活性；**：ｐ＜０．０１。
図１１：−７１６１Ｇ＞Ａ多型に依存するＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現。ＣＨＫ２−／βアクチンｍＲＮＡの割合を示す。Ａ：乳癌、Ｂ：ＣＬＬ；**：ｐ＜０．０１；*：ｐ＜０．０５。
図１２：−７２３５Ｃ＞Ｇ多型に依存するＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現。ＣＨＫ２−／βアクチンｍＲＮＡの割合を示す。Ａ：乳癌、Ｂ：ＣＬＬ；**：ｐ＜０．０５。
図１３：乳癌を罹患している女性患者の−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型に依存するＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現。ＣＨＫ２−／βアクチンｍＲＮＡの割合を示す。
図１４：−７１６１Ｇ＞Ａ多型の遺伝子型に依存する結腸直腸癌に罹患する患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)。
図１５：−７２３５Ｃ＞Ｇ多型の遺伝子型に依存する慢性リンパ性白血病に罹患する患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)；*：ｐ＜０．０５。
図１６：病期（ステージ）３及び４の腎細胞癌に罹患している患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)。Ａ：−７１６１Ｇ＞Ａ多型の遺伝子型に依存する生存、Ｂ：−７１６１Ｇ＞Ａ多型の遺伝子型に依存する無進行生存、Ｃ：−７２３５Ｃ＞Ｇ多型に依存する生存；***：ｐ＜０．００１；*：ｐ＜０．０５。
図１７：−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型の遺伝子型に依存する乳癌に罹患する患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)。
図１８：グリア芽細胞腫を罹患している患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)。Ａ：生存、Ｂ：−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型の遺伝子型に依存する無再発生存、Ｃ：生存、Ｄ：−７２３５Ｃ＞Ｇ多型に依存する無再発生存；**：ｐ＜０．０１；*：ｐ＜０．０５。
図１９：−７１６１Ｇ＞Ａ多型の遺伝子型に依存する前立腺癌に罹患する患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)；**：ｐ＜０．０１。
【００３６】
ＣＨＫ２遺伝子におけるプロモーター多型の機能的意義
どの機能修飾がＣＨＫ２遺伝子におけるプロモーター多型に寄与しうるかについての分析を実施した。プロモーターの遺伝子型及びハロタイプそれぞれに依存したＣＨＫ２タンパク質の選択的スプライシング、組織特異的発現又は過剰発現との相関が考えられる。この関係において、先ず、観察されたヌクレオチド置換が転写因子の結合に影響し得るかを見出すために、コンピュータープログラムを使用して解析を実施した。転写因子は、特定のコンセンサス配列に結合し、かつプロモーター活性を増加又は減少させる場合があり、その結果、このことは遺伝子の転写の増加又は低減をもたらし、コードするタンパク質の発現が増加又は低減する。図７に示されるように、全ての上記プロモーターＳＮＰは、異なる転写因子（例えば、ｐ５３、ＮＦ−ｋＢ又はＭｅｆ２）の結合部位のコンセンサス配列に位置しており、その結合は多型により損なわれる場合がある。特定の遺伝子型の発生は、これらの結合部位が欠失する、又はこれらがコンセンサス配列の変化により新たに形成されるという作用を有する。この作用の実験分析のために、いわゆるＥＭＳＡ（電気泳動度移動アッセイ;electrophoretic mobility shift assay）を実施した。このアッセイでは、関連する多型を含有する短核酸セグメントを、細胞核抽出物と共にインキュベートする。次に、これらの抽出物に含有される転写因子タンパク質が、異なる強度で核酸セグメントと結合する。続いて、ＤＮＡへの結合を、Ｘ線フィルムを使用して可視化する。強力な結合は強いバンドを生じる。図８は、−７２３５Ｃ＞Ｇ多型のＣ又はＧ対立遺伝子のいずれかを含有する特定の構築物によるこのアッセイの結果を示す。Ｃ−構築物のバンドの存在は、この領域への転写因子の結合を示す。Ｇ−構築物はこのバンドを有さず、これはこの対立遺伝子に結合する転写因子がないことを示す。特定のオリゴヌクレオチドによるバンド強度の減少は、結合転写因子が特異的に結合することを示す。図９は、−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型の挿入対立遺伝子又は欠失対立遺伝子のいずれかを含有する特定の構築物によるこのアッセイの結果を示す。対立遺伝子は両方とも、第２対立遺伝子が競合し得る転写因子の結合をもたらす。しかしながら、この場合では転写因子は異なる。図１０は、欠失対立遺伝子への転写因子の結合が、欠失対立遺伝子におけるものよりも増加したプロモーター活性をもたらすことを更に示す。
【００３７】
続いて、ｍＲＮＡレベルでのＣＨＫ２の発現を、リアルタイムＰＣＲによりヒト組織において解析した。このため、乳癌手術で得たヒト組織から、並びに白血病に罹患している患者の血液細胞からｍＲＮＡを採取し、逆転写酵素によりｃＤＮＡに転写した。この方法は当業者に知られている。続いて発現レベルを、リアルタイムＰＣＲ（タックマン(Taqman)法）を使用して決定し、ハウスキーピング遺伝子βアクチンの発現レベルと比較した。
【００３８】
結果を図１１〜１３に示す。図１１Ａは、−７１６１Ｇ＞Ａ  ＳＮＰのＧＧ遺伝子型が乳癌においてＧＡ遺伝子型よりも有意に高いｍＲＮＡ発現を有することを示す。図１１Ｂも、ＣＬＬ患者におけるＧＧ遺伝子型のｍＲＮＡ発現の増加を示す。多型−７２３５Ｃ＞Ｇも、遺伝子発現において対立遺伝子依存性の差を示す。図１２Ａ及び１２Ｂに表される通り、Ｃ対立遺伝子保有者は、ＧＧ遺伝子型の保有者よりも有意に少ないＣＨＫ２  ｍＲＮＡを有する。このことは、乳癌に罹患している患者及びＣＬＬ患者に当てはまる。図１３は、乳癌に罹患している患者におけるホモ接合体欠失のｍＲＮＡ発現の増加を表す。ホモ接合体挿入は、最小の発現を有する。ヘテロ接合体遺伝子型は、中間値を示す。この関係において、遺伝子量効果を観察することができる。
【００３９】
このように、癌腫組織においてＣＨＫ２の発現の変化を引き起こす、ＣＨＫ２遺伝子における遺伝子変化が存在することが証明された。これらは、上記プロモーター多型、又はＳＮＰに対して連鎖不均衡を示す多型であってもよい。したがって、本発明の主題には、ＣＨＫ２の発現を定量化すること、ＣＨＫ２の既知の多型にそれを関連付けること、並びに新たなより良好に適した多型を発見し、かつ確認することも含まれる。
【００４０】
本明細書に示されるヒト癌腫組織におけるＣＨＫ２の遺伝子型依存性発現に関する知見は極めて重要であり、それは、ＣＨＫ２活性の低減が、マイクロサテライトの不安定性及び染色体不安定性（両方ともゲノムの不安定性の特徴の一部である）を引き起こす場合があり、したがって、腫瘍形成に好都合であり、腫瘍進行に対して負の効果を有すからである（アン(Ahn)ら、CHK2タンパク質キナーゼ(The CHK2 protein kinase.) 2004、DNAリペアー(DNA Repair) 3: 1039-1047）。更に、ＣＨＫ２の当該遺伝子型依存性遺伝子発現は、ＣＨＫ２阻害剤を用いる療法への反応に対して効果を有し得る。特定の遺伝子型、例えば−７２３５Ｃ＞Ｇ多型のＣＣ遺伝子型により素因が与えられた低い遺伝子発現が、他の遺伝子型よりもＣＨＫ２阻害剤に対してより強力な反応を示すことが予想される。したがって、例えば反応者と非反応者とを区別するために、ＣＨＫ２遺伝子における遺伝子変化を用いて癌療法に対する反応を予測することができる。
【００４１】
これらの遺伝子変化を、用量設定及び／又は薬剤の望ましくない副作用の発生の予測に使用することもできる。そのような癌療法は、広義には薬剤に基づくものであることができ、すなわち、物質を体に供給することであるか、又はこれらの癌療法の手段は、物理的効果（例えば、放射線、温熱、寒冷）を有することができる。
【００４２】
したがって、我々は、特に腫瘍疾患の場合において、疾患の経過に対する効果、並びにＣＨＫ２の調節カスケードに影響を及ぼす物質に対する、又はＣＨＫ２を直接阻害する物質に対する変化した反応を想定する。
【００４３】
疾患の危険性及び疾患の経過の予測のためのＣＨＫ２における遺伝子変化の使用
細胞周期の調節におけるチェックポイントキナーゼ２の主要な役割によって、本発明の必須の主題は、ＣＨＫ２における遺伝子変化を用いることにより一般的な疾患の危険性及び疾患の経過を予測する可能性である。
【００４４】
癌の多段階の進展は、正常細胞から癌細胞への形質転換、並びに正常細胞から良性及び場合により悪性の浸潤性腫瘍への形質転換を引き起こす遺伝子変化の蓄積を反映している。腫瘍抑制遺伝子及び癌原遺伝子における変化の蓄積は、腫瘍発生を加速し、放射線療法並びに化学療法に影響し得る。しかしながら、チェックポイントと同様に損なわれたＤＮＡ修復機構も腫瘍のゲノム不安定化の増加の原因であることが、ますます明確になってきている。チェックポイントがゲノム完全性の維持において中心的な役割を果たすので、多様で非常に異なる腫瘍疾患の経過は、遺伝子により決定された低下したチェックポイントの活性化能により影響を受ける。このことは、人体の全細胞で発現し、かつＤＮＡ損傷に対して細胞を保護するタンパク質の発現変化が、全ての生理学的及び病態生理学的過程に決定的な影響を有するか又は少なくともこれらを調節する細胞機能を調節することを意味する。更に、医薬品に対する反応は、特定の様式で影響を受ける。このことは、望ましい薬剤効果に当てはまるが、望ましくない薬剤効果にも当てはまる。
【００４５】
チェックポイントタンパク質の機能修飾は、これらが高度に系統学的に維持されている経路であることから、多様な疾患に対する及び多様な疾患の経過に対する持続的な効果を有することが、科学文献において繰り返し仮定されてきた。この種類の遺伝子変化は、例えばリン酸化によりタンパク質の活性化を低減するか又は基質を選択的に低減する、チェックポイントタンパク質における構造改変変異であることができる。更に、発現レベルを変化させることができ、それによって、例えばアポトーシスを誘導する後続の反応カスケードの開始が低減され、或いは修飾機能を有するスプライシング変異体が発生し得る。これらの全ての変化は、癌に対する遺伝的素因であると考えられる。
【００４６】
記載される例から、以下は明らかである。
１．偏在的に発現するタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変化は、多様な疾患及び疾患の多様な危険性に影響し、或いはそれらの原因となること、並びに
２．チェックポイントタンパク質は、人体におけるゲノム完全性の維持のための複雑なネットワークの一部であること。
【００４７】
ＣＨＫ２遺伝子における遺伝子変化を伴う疾患及び例えばＣＨＫ２タンパク質の変化した発現レベルによって決定される疾患は、例えば、任意の患者組織の良性及び悪性の新生物である。
【００４８】
結果として、本発明の必須の主題は、全てのヒト癌疾患の予後因子としての、ＣＨＫ２遺伝子における診断に関連する遺伝子変化を提供することにある。このことは、選択された例を使用して以下に説明される。
【００４９】
結腸直腸癌−結腸直腸癌は、胃腸管における最も一般的な腫瘍型であり、世界中の腫瘍関連死の主な原因の一つである（癌総死亡率の１２〜１５％）。腫瘍切除後の５年生存率の中央値は、僅か５０％である。疾患の経過を予測する標準的な方法は、ＴＮＭ又はＵＩＩＣＣ病期(ステージ)システムである。ＵＩＣＣ病期ＩＩＩ又はＩＶの患者は、ＵＩＣＣ病期Ｉ又はＩＩの患者よりも一般に悪い予後を有する。補助的化学療法が、転移性結腸直腸癌（ＵＩＣＣ病期ＩＩＩ及びＩＶ）の場合に適用され、放射線療法の局所効果を増強することができる。これらの患者の大多数は、再発及び転移を生じ、集中的な追跡治療が必要である。したがって、疾患の更なる経過を予測することができる適切なマーカーを同定し、かつ確立することが重要である。本発明の別の主題は、結腸直腸癌の更なる病歴を予測することができるように、ＣＨＫ２における遺伝子変化を使用することである。
【００５０】
図１４は、ＵＩＣＣの病期ＩＩＩ及びＩＶの結腸直腸腫瘍を罹患している患者における、−７１６１Ｇ＞Ａ多型に依存する生存に関する差を示す。ＧＧ遺伝子型を有する患者は、ヘテロ接合体ＧＡ遺伝子型を有する患者よりも長く生存する。
【００５１】
慢性リンパ性白血病−慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の特徴は、多数の変性リンパ球である。全ての白血病疾患の合計３０％が慢性リンパ性白血病である。発症の平均年齢は６５歳である。ＣＬＬは、２０年までは良性であり得、すなわち患者は、腫大したリンパ節、疲労及び食欲不振の他には何も症状を有さない。治療は、リンパ球の数が著しく増加し、赤血球及び血小板の比率が減少し、或いは他の合併症が生じた場合にのみ開始される。初期治療は、疾患の経過に対して何も効果を有さない。最も重要な治療手段は化学療法である。疾患が進展するほど、臓器系の変化に起因する健康障害が重要になる。疾患のビネー(Binet)病期に応じて、医師は予後の推定を確立することができる。ＣＬＬの病期は、とりわけ、血中及び骨髄中のリンパ球の数、脾臓及び肝臓の大きさ、並びに貧血の存在によって特徴付けられる。ＣＬＬは、免疫系に変化をもたらし、それによってこの疾患を罹患しているヒトは、他の種類の癌を発症するより大きな危険性を有する。しかしながら、患者は、ビネー系の同じ病期において非常に異なる疾患経過を示す。本発明の根底をなす課題は、ＣＨＫ２遺伝子における遺伝子変化が、疾患の経過を予測するのに適していることを示すことである。
【００５２】
このため、ＣＬＬ患者では、ＣＨＫ２における記載された遺伝子変化に関して遺伝子型を決定し、遺伝子状態を無進行生存と相関させた。図１５は、−７２３５Ｃ＞Ｇ多型に依存する生存を示す。ＣＣ／ＧＣ遺伝子型の保有者である患者は、ホモ接合体ＧＧである患者よりも長期間生存する。
【００５３】
腎細胞癌−腎臓細胞の場合、回復のチャンスは、腫瘍の大きさ及び腫瘍の増殖によって左右される。転移のない患者は、８０％まで１０年生存率を有するが、有意な個人間の変動がある。現在一般的である超音波技術の使用によって、多くの腫瘍が初期非転移病期において検出され、間に合うように治療することができる。遠隔転移が存在する場合、腎臓の外科的除去を、それに続くインターロイキン−２又はインターロイキン−アルファによる免疫療法と組み合わせることが可能である。このことは、身体の腫瘍細胞に対する防御を改善する。転移腎細胞癌の場合、インターフェロン、インターロイキン−２及び５−フルオロウラシルの組合せが、研究において３６％の反応率を達成することができる。現在、腎細胞癌に罹患している患者の生存のための予測マーカーは存在しない。
【００５４】
図１６Ａは、−７１６１Ｇ＞Ａ多型に依存する生存を示す。ＧＧ遺伝子型を有する患者は、ＧＡ及びＡＡ遺伝子型を有する患者よりも有意に長期間生存する（ｐ＜０．０５）。死亡までの平均期間は、ＧＧ保有者では１１５ヶ月であるが、ＡＡ遺伝子型を有する患者では、僅か９ヶ月である。同様のデータが、−７１６１Ｇ＞Ａ多型と相関する無進行生存に当てはまる（図１６Ｂ）。また、この場合において、ＧＧ遺伝子型を有する患者は、観察期間にわたって最低の進行を示す。平均無進行生存は、ＧＧでは５２ヶ月であるが、ＡＡでは僅か２ヶ月である（ｐ＜０．００１）。−７２３５Ｃ＞Ｇ多型も生存と関連する（図１６Ｃ）。Ｇ対立遺伝子の保有者は、ＣＣ遺伝子型を有する患者よりも長い生存期間を示した（ｐ＜０．０５）。
【００５５】
乳癌−乳癌は、ヨーロッパ及び米国の女性人口において最も一般的な腫瘍である。全女性の７〜１０％が罹患し、女性癌総死亡率の２５％を占める。乳癌の原因は依然として不明であるが、家族的素因、放射線被爆又はエストロゲンの影響のような危険因子が言及されてきた。大多数の患者は浸潤癌を有する。幾つかの例外を除いて、あらゆる手術可能な乳癌は、遠隔転移が検出されたとしても外科的に治療される。多様な根治初期外科治療は、多様な局所領域再発率をもたらすが、長期生存の機会はもたらさない。更に、再発又は遠隔転移は、極めて多くの場合に僅か５年後か、或いは０年後でさえも現れる場合がある。このため、これらの病巣を早期に検出すること及び後治療において患者を注意深く監視することが重要である。
【００５６】
追跡検査は、暫定的な疑念がある場合、手術後１０年間までも一定間隔で実施される。今まで、疾患の更なる経過に関して予測的である有効なマーカーはほとんどない。したがって、当面は、腫瘍の大きさ、転移、リンパ節の関与、ホルモン受容体の状態などのような古典的な因子が、予後に使用される。生存確率及び療法に対する反応のための遺伝子マーカーは、乳癌に罹患している患者の治療を実質的に改善するであろう。本発明の根底をなす課題は、ＣＨＫ２における遺伝子変化の使用が、疾患の更なる経過を予測するのに適していることを示すことである。
【００５７】
図１７は、−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型と相関する乳癌を有する患者の生存を示す。ホモ接合体挿入を有する患者は、少なくとも１つの欠失対立遺伝子の保有者である患者と比較したとき、最高の生存率を示す。
【００５８】
グリア芽細胞腫−神経膠腫（グリオーマ）は主に成人に発生する。原因は不明である。神経膠腫の組織構造は、悪性進行、拡散浸潤及び高い異質性である。最も一般的な悪性神経膠腫は、グリア芽細胞腫（ＷＨＯグレードＩＶ）である。多くの場合、脳梁を介して脳の他の半球に広がる。治癒可能な外科療法は、グレードＩ神経膠腫（毛様細胞性星状細胞腫）の場合においてのみ可能である。他の神経膠腫は全て再発する。現在、これらは不治である。生存期間中央値は、グリア芽細胞腫では６〜８ヶ月である。術後放射線照射無しでは、生存期間中央値は僅か２〜３ヶ月である。現在、この重篤な疾患の経過に対して予測的であるマーカーはない。
【００５９】
生存及び療法に対する反応の予後のための遺伝子マーカーは、グリア芽細胞腫に罹患している患者の治療を実質的に改善するであろう。本発明の根底をなす課題は、ＣＨＫ２における遺伝子変化の使用が、疾患の更なる経過を予測するのに適していることを示すことである。
【００６０】
図１８Ａ及びＢは、−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型が、グリア芽細胞腫の場合、疾患の経過に対して効果を有することを示す。
【００６１】
挿入対立遺伝子を有する患者は、より長期間の生存を示し、より長期間の無再発生存も示す。平均では、挿入がホモ接合体である患者は、３９０日間再発がないが、欠失対立遺伝子を有する患者は、僅か２０６日間だけ再発がない。−７２３５Ｃ＞Ｇ多型も疾患の経過と相関する（図１８Ｃ及びＤ）。ＣＣ遺伝子型を有する患者は、ＧＧ遺伝子型を有する患者よりも長く生存し、ヘテロ接合体の被験者は、その中間の生存期間を有し、遺伝子量効果にとって好ましい。ＣＣ遺伝子型を有する患者の無再発期間も、Ｇ対立遺伝子の保有者である患者と比較したとき、最長である。
【００６２】
前立腺癌−前立腺癌は、男性患者にとって２番目に多い悪性腫瘍である。全ての腫瘍疾患の９〜１１％を占め、罹患率が増加している。症例の５０％超が７０歳を超える患者である。早期診断のために、前立腺特異抗原（prostate-specific antigen;ＰＳＡ）のレベルを測定することが可能である。この種類の早期診断検査は、５０歳を超え、かつ１０年を超える平均余命を有する男性に有用である。しかしながら、ＰＳＡ値の意義は争点となっている。ＰＳＡは、直腸検査の前に取る必要があるが、その理由はそうでなければＰＳＡ値が誤って高くなるからである。更に、ＰＳＡ値の増加は、良性の前立腺炎により生じ得る。初期段階において、前立腺癌は、尿道から離れた部位で発症するのでほぼ無症候性である。このため、早期診断の自己検査は不可能である。５年生存率は、フロックス(Flocks)病期Ｃの前立腺癌では６０％であるが、１０年後では、生存確率は僅か３０％であり、１５年後では僅か２０％である。今まで、疾患の更なる経過に対して予測的である有効なマーカーはほとんどない。
【００６３】
生存確率及び療法に対する反応のための遺伝子マーカーは、患者の治療を実質的に改善するであろう。図１９は、−７１６１Ｇ＞Ａ多型と相関する生存を示す。少なくとも１つのＧ対立遺伝子を有する患者は、ＡＡ遺伝子型を有する患者よりも良好な生存を示す。Ｇ対立遺伝子保有者の生存中央値は２６５０日であるが、ＡＡ遺伝子型の保有者は、僅か２２０日の生存を示す。これらの結果は、本明細書に記載されている目的においてＣＨＫ２遺伝子における遺伝子変化の有用性を疑い無く示す。先験的に、これらの疾患の間に関連性はない。
【００６４】
疾患の経過及び療法に対する反応を予測するためのＣＨＫ２遺伝子における遺伝子変化の使用
本発明の意義の範囲内にある薬理遺伝学は、医薬品の効能、医薬品の有効性及び性能、並びに望ましくない作用の発生の診断に関する。医薬品の効能及び／又は望ましくない副作用の発生の定義において、化学的に定義された製品の特定物質の特性に加えて、多様なパラメーターが用いられる。２つの重要なパラメーターである達成可能な血漿濃度及び達成可能な血漿半減期は、医薬品の効能若しくは無効能又は望ましくない作用の発生をかなりの程度まで決定する。血漿半減期の値は、とりわけ、特定の医薬品が肝臓又は身体の他の臓器において有効又は無効な代謝産物に代謝され、かつそれらが身体から排除される速度によって決定されるが、ここで排除は、腎臓、呼気、汗、精液、糞便又は他の身体分泌物を介して発生し得る。更に、経口投与の場合、効能は、いわゆる「初回通過効果」("first-pass effect")により制限されるが、その理由は、腸による医薬品の吸収の後、肝臓において特定量の医薬品が無効な代謝産物に代謝されるからである。
【００６５】
代謝酵素の遺伝子における変異又は多型は、アミノ酸組成が改変されるような態様で、これらの活性を変化させることができ、それによって、代謝される基質への親和性は増加又は減少し、したがって、代謝は加速又は減速し得る。同様に、トランスポータータンパク質における変異又は多型は、身体からの輸送、及びその結果排除が加速又は減速するように、アミノ酸組成を改変し得る。
【００６６】
患者に最適な基質の選択、最適な投与量、最適な投与形態及び望ましくない副作用（これらの一部は有害又は致死的である）の回避のために、遺伝子産物の変化をもたらす遺伝子多型又は変異の知識が極めて重要となる。
【００６７】
化学療法薬及び放射線療法のためのチェックポイントキナーゼ２の意義
遺伝子不安定性は全ての腫瘍において特徴的であり、腫瘍形成、進行及び医薬品に対する抵抗性の発生においても役割を果たす。大部分の腫瘍細胞は、それら腫瘍細胞に生存優位性をもたらす欠損Ｇ１−Ｓチェックポイントを有する。しかしながら、この欠損は、ゲノム完全性を脅かす刺激が存在する場合、腫瘍細胞がＧ２チェックポイントに高度に依存することを意味する。ＣＨＫ２は、ＤＮＡ損傷が生じる場合、Ｇ１チェックポイントの維持に関与する。したがって、ＣＨＫ２の活性化、ゆえにＧ１チェックポイントの回復は、治療抵抗性を回避する可能性をもたらす。ＣＨＫ２の欠失は、放射線に対する抵抗性を引き起こすことが既に示されている。この抵抗性をＣＨＫ２活性化剤により逆転し得る。ＣＨＫ２もＧ２チェックポイントに影響を及ぼすので、その阻害、及びしたがってＧ２チェックポイントの脱活性化は、遺伝毒性物質により引き起こされるＤＮＡ損傷及び変化が蓄積し得ること、及びそれらは腫瘍細胞の死を引き起こすと言うことの可能性を提供することができる。
【００６８】
伝子発現に影響を及ぼすＣＨＫ２における遺伝子変化が発生する場合、これは、これらのＣＨＫ２阻害剤の効力に対して作用を有する。遺伝子型依存性ＣＨＫ２発現の低い患者は、ＣＨＫ２発現の高い患者よりも阻害剤に対して良好な反応を示すことが予想される。更に、これは、化学療法剤及び免疫療法剤並びに／又は放射線を使用する、ＣＨＫ２阻害剤の併用療法に影響を及ぼす可能性があることを意味する。同じことが、ＣＨＫ２活性化剤にも当てはまる。遺伝子型依存性ＣＨＫ２発現の高い患者は、ＣＨＫ２発現の低い患者よりも阻害剤に対して良好な反応を示すことが予想される。これは、抗癌薬及び治療手段に対する反応の一般的な潜在性についての個別の診断の可能性、並びにこれらの療法の望ましくない作用の危険性に関する個別の予測の可能性をもたらす。
【００６９】
ＣＨＫ２発現の遺伝子型依存診断は、化学療法剤及び放射線の効力、これらの最適な投与量、並びに副作用の発生の一般的な診断を可能にする。
化学療法は、その損傷効果が特定の癌細胞に対して可能な限り正確に標的化されており、且つそれらを死滅させ、又はそれらの増殖を阻害する物質を使用する。特定の用量の細胞増殖抑制剤は、進行する療法によって不変のままでいる標的細胞の特定の割合しか死滅させることができない。このため、腫瘍がもはや検出されない場合でも、化学療法を治療の期間中に縮小してはならない。むしろ、縮小した治療は、耐性腫瘍細胞クローンを選択してしまうことが予想される。化学療法は、短い間隔で適用され、ほぼ全ての場合において、２つ以上の細胞増殖抑制剤が、効能を増加するために組み合わされる。このため、療法は、共通毒性基準(Common Toxicity Criteria)に従って分類される副作用も引き起こす。これらの基準には、白血球及び血小板の数、嘔気、嘔吐、下痢及び口内炎が含まれる。
【００７０】
放射線療法は、悪性腫瘍を治癒するための高エネルギー電離放射線の適用である。そのような悪性腫瘍は、多くの場合、化学療法と放射線療法の組合せにより治療される。多数の腫瘍疾患を、進行期であってもこの方法で治癒することができる。副作用を制限するために、放射線は、数多くの１日単一線量で分布され、数週間にわたって投与される。それにもかかわらず、発赤、嘔気、下痢又は脱毛のような副作用が、投与量、侵入度及び単一線量の数に応じて生じる。
【００７１】
本発明は、チェックポイントキナーゼ２の活性化能、及び故にＧ１及びＧ２チェックポイントの活性化能の診断に一般的に適している方法を開発することに基づいている。このため、ＣＨＫ２遺伝子における１つ以上の多型が解析される。高い発現は、チェックポイントの活性化能の予測通りの増加に関与し、したがって、損傷の後、ＤＮＡの修復機構を実施するのに十分な時間を提供する。ＣＨＫ２発現が低いと、チェックポイントは活性化能が低く、ＤＮＡ損傷は、全く修復されないか又は十分に修復されない。したがって、薬剤、特に細胞増殖抑制薬の効能及び望ましくない作用、並びに放射線のような腫瘍細胞のゲノムに損傷を与える他の治療形態の効力及び望ましくない作用についてのＣＨＫ２診断における多型の存在の検出である。更に、ＣＨＫ２におけるそのような多型を使用して、ＣＨＫ２阻害剤と組合せた医薬品の効果を診断することができる。加えて、ＣＨＫ２における対立遺伝子又はハロタイプの状態の診断を使用して、薬剤の個別の最適かつ許容可能な用量を決定することができる。
【００７２】
チェックポイントキナーゼ２及びチェックポイントの活性化能の増加又は低減の診断のために、特に、本明細書に記載されているＣＨＫ２多型の検出が、単独で又は考えられる全ての組合せにおいて使用される。
【００７３】
更に、これらの多型と連鎖不均衡にあり、及び／又は選択的スプライシングプロセス若しくは発現を増強若しくは阻害する、遺伝子ＣＨＫ２における他の全ての遺伝子変化を使用することができる。
【００７４】
遺伝子変化は、直接的な塩基配列決定、切断解析(restriction analysis)、リバース・ハイブリダイゼーション、ドットブロット又はスロットブロット法、質量分析法、タックマン(Taqman)（登録商標）又はライトサイクラー(LightCycler)（登録商標）技術、パイロシーケンシング(pyrosequencing)などの当業者に既知の任意の方法を使用して検出することができる。更に、これらの遺伝子多型を、ＤＮＡチップに対する多重ＰＣＲ及びハイブリダイゼーションにより、同時に検出することができる。Ｇタンパク質の活性化能の増加の診断のためには、ＣＨＫ２又はＣＨＫ２のスプライシング変異体の発現レベルの直接的な検出を可能にする他の方法を使用することもできる。
【００７５】
記述された方法は、腫瘍細胞のＤＮＡを損傷する物質の効果を診断するのに特に適している。これらの物質には、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、葉酸、イリノテカン、カペシタビン及びシスプラチンが含まれるが、これらリストは任意に拡大することができる。更に、免疫療法剤（例えば、インターフェロン若しくはインターロイキン）又は腫瘍細胞におけるシグナル伝達の阻害剤の効果を予測することが可能である。
【００７６】
更に、ガンマ線、Ｘ線、電子、中性子、陽子及び炭素イオンによる照射などの、放射線治療手段の効果を予測することが可能であるが、これらリストは任意に拡大することができる。より広い意味において、放射線療法は、マイクロ波及び熱波の医学的使用、光線及びＵＶ療法、並びに超音波照射による治療も意味する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】最も重要なチェックポイントを有する細胞周期の概略図である。
【図２】ＣＨＫ２調節チェックポイントでの反応カスケードのグラフ図である。
【図３】ヒトＣＨＫ２遺伝子のイントロン／エクソン構造（忠実な尺度ではない）を示す図である。
【図４】幾つかのＣＨＫ２阻害剤の構造式を示す図である。
【図５】ＣＨＫ２遺伝子における多型の概略図（忠実な尺度ではない）である。
【図６】ハプロビュー(Haploview)プログラムを用いたＣＨＫ２のプロモーター多型の連鎖分析の結果を示す図である。
【図７】ＣＨＫ２遺伝子のプロモーターにおける転写因子の推定結合部位を示す図である。
【図８】ＣＨＫ２の−７２３５Ｃ＞Ｇ多型の異なる対立遺伝子を含有する構築物を用いた電気泳動度移動アッセイ（Electrophoretic Mobility Shift Assay(ＥＭＳＡ)）の結果を示す図である。
【図９】ＣＨＫ２の−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型の異なる対立遺伝子を含有する構築物を用いた電気泳動度移動アッセイ（Electrophoretic Mobility Shift Assay(ＥＭＳＡ)）の結果を示す図である。
【図１０】ｆＳＥＡＰレポーターアッセイにより決定された、−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型に依存するＣＨＫ２プロモーター活性を示す図である。
【図１１】−７１６１Ｇ＞Ａ多型に依存するＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図１２】−７２３５Ｃ＞Ｇ多型に依存するＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図１３】乳癌を罹患している女性患者の−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型に依存するＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図１４】−７１６１Ｇ＞Ａ多型の遺伝子型に依存する結腸直腸癌に罹患する患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)を示す図である。
【図１５】−７２３５Ｃ＞Ｇ多型の遺伝子型に依存する慢性リンパ性白血病に罹患する患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)を示す図である。
【図１６】病期（ステージ）３及び４の腎細胞癌に罹患している患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)を示す図である。
【図１７】−１０６４９−（−１０６２１）ｄｅｌ２９多型の遺伝子型に依存する乳癌に罹患する患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)を示す図である。
【図１８】グリア芽細胞腫を罹患している患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)を示す図である。
【図１９】−７１６１Ｇ＞Ａ多型の遺伝子型に依存する前立腺癌に罹患する患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)を示す図である。
【図２０】結腸直腸癌に関する−７２３５Ｃ＞Ｇ多型と生存との相関関係を調べた結果を示す図である。
【図２１】放射線化学療法を受けた喉頭癌患者の生存曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下の実施例は、疾患の危険性及び疾患の経過を予測するためのＣＨＫ２における遺伝子変化の使用を更に説明するためのものである。
【実施例】
【００７９】
ＣＨＫ２多型について異なる腫瘍集団及び健常対照で遺伝子型を決定し、遺伝子型及び／又は対立遺伝子の分布を比較した。この関係において、遺伝子型及び対立遺伝子の分布に有意な差が観察された。ＣＨＫ２の発現の増加が好都合であるか又は不都合であるかを一般的に予測することは可能ではない。したがって、ＣＨＫ２における多型は疾患の危険性を予測するのに適している。危険対立遺伝子又は危険遺伝子型（単独又は組合せ）による疾患の危険度は、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）及びｐ値と共に「オッズ比」（ＯＲ）として示される。
【００８０】
実施例１
結腸直腸癌の患者（ｎ＝１４３）対対照（ｎ＝２３５）
【表２】
0005688379.tif 000003
【００８１】
対立遺伝子又は遺伝子型分布は有意に異なる（それぞれ、ｐ＝０．０５及び０．０４８）；
ＯＲ Ａ対Ｇ＝１．５３４（９５％ＣＩ＝０．９９７〜２．３６１）ｐ＝０．０５；
ＯＲ  ＣＧ対ＣＣ＝２．４８６（９５％ＣＩ＝１．０５６〜５．８５１）ｐ＝０．０３４。
【００８２】
このように結腸癌を発症する危険性の増加は、−７１６１Ａ対立遺伝子の保有者に起因し得る。したがって、ＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現の低減は、疾患発症の危険性の増加と関連する。
【００８３】
実施例２
結腸直腸癌の場合における−７２３５Ｃ＞Ｇ多型と生存との相関関係
−７２３５Ｃ＞Ｇ多型の遺伝子型と結腸直腸癌を有する患者の生存との間に相関関係があるかを更に調査した。これを以下の図２０に示す。
【００８４】
この図から、−７２３５ＣＣ遺伝子型を有する患者の生存率が明らかに低いことが分かる。
【００８５】
したがって、結腸癌を発症する危険性の増加は、−７１６１Ａ対立遺伝子及び７２−７２３５ＣＧ遺伝子型それぞれの保有者に起因し得る。したがって、ＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現の低減は、疾患の危険性の増加と関連する。
【００８６】
実施例３
慢性リンパ性白血病の患者（ＣＬＬ、ｎ＝１６６）対対照（ｎ＝２３４）
【表３】
0005688379.tif 000004
【００８７】
遺伝子型分布は有意に異なる（ｐ＝０．０３９）。以下の危険度（ＯＲ）がＣＬＬについて計算され得る：
ＯＲ  ＣＧ対ＣＣ＝３．０４４（９５％ＣＩ＝１．２４６〜７．４３５）ｐ＝０．０１２；
ＯＲ ＧＧ＋ＣＧ対ＣＣ＝２．７（９５％ＣＩ＝１．２〜６．４）ｐ＝０．０２４。
【００８８】
実施例４
グリア芽細胞腫の患者（ｎ＝１９８）対対照（ｎ＝２３５）
【表４】
0005688379.tif 000005
【００８９】
対立遺伝子及び遺伝子型分布は有意に異なる（それぞれ、Ｐ＝０．０１７及びＰ＝０．０３９）。
以下の危険度が計算され得る：
ＯＲ Ａ対Ｇ：１．６１３（９５％ＣＩ＝１．０８８〜２．３９３）；ｐ＝０．０２１；
ＯＲ ＡＡ対ＧＧ：３．８９０（９５％ＣＩ＝１．２２９〜１２．３１）；ｐ＝０．０１９；
ＯＲ  ＡＡ＋ＡＧ対ＧＧ：３．７３（９５％ＣＩ＝１．２〜１１．８）；ｐ＝０．０２１。
【００９０】
したがって、グリア芽細胞腫を発症する危険性の増加は、−７１６１Ａ対立遺伝子及び−７１６１ＡＡ／ＡＧ遺伝子型それぞれの保有者に起因し得る。結果として、ＣＨＫ２  ｍＲＮＡの発現の低減は、疾患発症の危険性の増加と関連する。
【００９１】
実施例５
−７２３５Ｃ＞Ｇ多型に依存するグリア芽細胞腫を有する患者の生存のコックス回帰
以下の表は、全切除後のグリア芽細胞腫患者の腫瘍原因死の多変量コックス回帰モデルの結果を示す（ＨＲ＝危険率(ハザード比)、*＝基準、ＣＩ＝信頼区間、ＥＤ＝一次診断〔ドイツ語：最初の診断（Erstdiagnose）〕、ｍ＝男性、ｗ＝女性〔ドイツ語：：女性（weiblich）〕）。
【００９２】
【表５】
0005688379.tif 000006
一次診断時の年齢：５８．８４±１３．３８
性別分布：Ｍ：６５．４％；Ｗ：３４．６％
【００９３】
解析した−７２３５Ｃ＞Ｇ多型が、グリア芽細胞腫を有する患者の生存の独立した予後因子あることを確認するために、患者の生存における全ての潜在的危険因子を含む多変量コックス回帰を実施した。腫瘍原因死の危険性は、Ｃ対立遺伝子の保有者よりもホモ接合体ＧＧの保有者のほうが２．７倍高かった（ＣＩ：１．０５〜７．０３；Ｐ＝０．０４０）。
【００９４】
予期されたように、（放射線療法；放射線／化学療法）の種類の療法は、後に一次診断時の年齢（Ｐ＝０．００８）及び−７２３５Ｃ＞Ｇ多型が続く、最良の予後因子であること（Ｐ＝＜０．００１）、すなわち療法は死亡の危険性を低減することが証明された。
【００９５】
実施例６
グリア芽細胞腫の場合における−１０６２１ｄｅｌ２９多型及び生存に関して
以下の表は、全切除後のグリア芽細胞腫患者の腫瘍原因死の多変量コックス回帰モデルの結果を示す（ＨＲ＝危険率（ハザード比）、*＝基準、ＣＩ＝信頼区間、ＥＤ＝一次診断〔ドイツ語：最初の診断（Erstdiagnose）〕、ｍ＝男性、ｗ＝女性〔ドイツ語：：女性（weiblich）〕）。
【００９６】
【表６】
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一次診断時の年齢：５８．８４±１３．３８
性別分布：Ｍ：６５．４％；Ｗ：３４．６％
【００９７】
挿入対立遺伝子の保有者と比較すると、ホモ接合体欠失の保有者である患者は、この疾患の初期に死亡する、ほぼ３倍の高い危険性を有する（Ｐ＝０．００８）。予測されたように、この種類の療法は、後に一次診断時の年齢（Ｐ＝０．００５）及び解析された多型が続く、患者の生存における最良の予後因子（Ｐ＝＜０．００１）である。
【００９８】
実施例７
乳癌を有する女性患者（ｎ＝２４０）対女性対照（ｎ＝７８）
【表７】
0005688379.tif 000008
【００９９】
遺伝子型分布は有意に異なる（ｐ＝０．００３）。以下の危険度を計算することができる：ＯＲ  ＩＤ対ＩＩ：３．０８７（９５％ＣＩ＝１．５９０〜５．９９５）、ｐ＝０．００１。
【０１００】
実施例８
−７２３５Ｃ＞Ｇ多型の遺伝子型に依存する喉頭癌患者の生存
以下の図２１は、組合せの放射線化学療法を受けた喉頭癌患者の生存曲線を示す。
【０１０１】
この場合でも、カプラン・マイヤー曲線が有意に異なった（ｐ＝０．０４８）。放射線化学療法の適用後、ＣＣ遺伝子型を有する患者は、Ｇ対立遺伝子を保有する患者よりも有意に良好な生存を示した（Ｐ＝０．０４８）。５年後、およそ９０％のＣＣ保有者が生存したが、ほぼ７０％のＧ対立遺伝子の保有者は、その時点で死亡していた。これはコックス回帰により確認された。
【０１０２】
解析した多型が喉頭癌を有する患者の生存に関する独立した予後因子であることを確認するために、多変量コックス回帰を実施した。得られた結果を以下の表に示す。
【０１０３】
【表８】
0005688379.tif 000009
【０１０４】
ホモ接合体ＣＣ保有者との比較において、ヘテロ接合体ＧＣ保有者は、９倍高い腫瘍原因死の危険性を有し（ＣＩ：１．１７〜７１．３４；Ｐ＝０．０３５）、ホモ接合体ＧＧ遺伝子型は、７．８倍高い危険性を有した（ＣＩ：１．０１〜６０．７０；Ｐ＝０．０４９）。関連する多型は、唯一の独立した予後因子であることを証明している。患者の年齢に起因する危険性の変化はわずかである。したがって患者の年齢は、この場合では予後因子として関連性がない。
【０１０５】
放射線化学療法を受けた患者では、一次診断時の年齢が、後に−７２３５Ｃ＞Ｇ多型が続く、最良の予後因子であること（Ｐ＝０．０１３）が証明された。
【０１０６】
ＡＪＣＣの欄は、腫瘍病期（ステージ）を提示しており、治療の成功に関して、１は最も好ましい段階を示し、４は最も好ましくない段階を示す。グレード１は、親組織と高度に類似した高分化悪性組織（「低悪性度」"low grade"）を意味する。グレード３は、低分化悪性組織を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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