(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定時において、マウスの一方の耳に被験物質を塗布し、一定期間後に、同じマウスの他方の耳に同じ被験物質を塗布したＡ群のケージと、前記所定時において、マウスの一方の耳に前記被験物質を塗布し、前記一定期間後に、同じマウスの他方の耳に前記被験物質の塗布をしなかったＢ群のケージと、前記所定時において、マウスの一方の耳に前記被験物質の塗布をせず、前記一定期間後に、同じマウスの他方の耳に前記被験物質を塗布したＣ群のケージとを用意し、Ａ〜Ｃ群のケージの反応結果に基づいて、被験物質の皮膚感作性、皮膚刺激性を同時に識別する方法。
【請求項２】
所定時において、マウスの一方の耳に被験物質を塗布し、一定期間後に、同じマウスの他方の耳に同じ被験物質を塗布したＡ群のケージと、前記所定時において、マウスの一方の耳に前記被験物質を塗布し、前記一定期間後に、同じマウスの他方の耳に前記被験物質の塗布をしなかったＢ群のケージと、前記所定時において、マウスの一方の耳に前記被験物質の塗布をせず、前記一定期間後に、同じマウスの他方の耳に前記被験物質を塗布したＣ群のケージとを用意し、Ａ〜Ｃ群のケージの反応結果に基づいて、皮膚感作性物質を検出する方法。
【請求項３】
所定時において、マウスの一方の耳に被験物質を塗布し、一定期間後に、同じマウスの他方の耳に同じ被験物質を塗布したＡ群のケージと、前記所定時において、マウスの一方の耳に前記被験物質を塗布し、前記一定期間後に、同じマウスの他方の耳に前記被験物質の塗布をしなかったＢ群のケージと、前記所定時において、マウスの一方の耳に前記被験物質の塗布をせず、前記一定期間後に、同じマウスの他方の耳に前記被験物質を塗布したＣ群のケージとを用意し、Ａ〜Ｃ群のケージの反応結果に基づいて、皮膚刺激性物質を検出する方法。
【請求項４】
前記一定期間が７日以上２週間以内である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ａ〜Ｃ群のマウスの左右の耳介リンパ節の重量の測定によって惹起反応を検出する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ａ〜Ｃ群のマウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量の測定によって惹起反応を検出する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
Ａ〜Ｃ群のマウスの左右の耳介の厚みの測定によって惹起反応を検出する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ａ〜Ｃ群のマウスの左右の耳介リンパ節のＤＮＡ量の測定によって惹起反応を検出する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ａ〜Ｃ群のマウスの左右の耳介の重量の測定によって惹起反応を検出する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便に、皮膚感作性物質を検出し、なおかつ、皮膚感作性物質と皮膚刺激性物質との識別を同時に行う新規な手法に関する。
【０００２】
また本発明は、皮膚感作性物質の新規な検出方法、ならびに、皮膚刺激性物質の新規な検出方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
化粧品、洗剤などの開発において、その主成分の原料、添加剤などとして材料を選択する場合、その材料に触れた消費者などにおいて皮膚免疫応答が惹起される性質を有する（「皮膚感作性」を有する）、皮膚に一過性の刺激を与える性質を有する（「皮膚刺激性」を有する）かを判別する必要がある。特に、皮膚感作性を有する物質（皮膚感作性物質）は、消費者の感受性によっては重篤なアレルギー反応を引き起こしてしまう場合もあり、皮膚感作性の有無の検出は特に重要である。
【０００４】
天然物、化学物質の皮膚感作性を検出する方法としては、従来、モルモット、マウスなどの動物を用いる方法、培養細胞を用いる方法、さらには、ペプチドとの結合性を調べる方法などが開発されている。これらの方法は、いずれも、ヒトにおける皮膚感作性と８０％程度の相関があることが明らかにされており、天然物、化学物質の皮膚感作性の検出に有効であることが示されている。
【０００５】
化学物質などによる感作の成立には、大きく分けて、２つの段階があることが知られている。第一の段階は、化学物質が体内に入って、生体内のタンパク質などと結合し、これを樹状細胞が異物として認識し、一連の免疫応答を開始する「感作段階」である。第二の段階は、感作されたリンパ球が全身に広がり、再び、同一の化学物質などが体内に入ったときに、よりすばやく、より激しい応答を呈する「惹起段階」である。すなわち、上述した従来の皮膚感作性を検出する手法は、感作の成立のいずれかの段階を検出することを目的としている。
【０００６】
たとえば、アジュバントを用いるＧＰＭＴ（Guinea Pig Maximisation Test）法、アジュバントを用いないビューラー法は、「惹起段階」を検出する手法であり、これらの試験で陽性であるということは、原理的かつ原則的に感作が成立していると判断することができる（たとえば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４０６  皮膚感作性、［平成２３年９月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/ghs/tgj/tg406j.pdf＞（非特許文献１）を参照。）。ただし、これらの試験は、惹起を確認するために、試験期間としては、４週間以上の時間を必要としてしまう。また、これらの方法はモルモットを用いる方法であり、動物愛護の観点から代替し得る方法を見出すことが課題とされていた。
【０００７】
近年では、皮膚感作性を検出する方法として、モルモットではなくマウスを用いたＬＬＮＡ（Local Lymph Node Assay、局所リンパ節試験）が主流となっている（たとえば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４２９  皮膚感作：局所リンパ節試験、［平成２３年９月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/ghs/tgj/tg429j.pdf＞（非特許文献２）を参照。）。ＬＬＮＡは、「感作段階」を検出する手法であり、試験開始１日目、２日目、３日目に、マウスの両耳に被験物質を塗布した後、６日目に、マウスから耳介リンパ節を採取する。被験物質が皮膚感作性物質であれば、耳介リンパ節においてリンパ球の増殖を惹起する。リンパ球の増殖は適用された用量（アレルゲンの効力）に比例するため、ＬＬＮＡでは、短い試験期間で、客観的かつ定量的に簡単に皮膚感作性を検出することができる。
【０００８】
しかしながら、上述のＬＬＮＡは、感作性の検出にラジオアイソトープ（ＲＩ）である３H-thymidineを用いることから、日本においては実施できる施設に制限があるという実情があった。このため、その改良法として、放射性物質を用いずに、生物発光によりＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を定量することで、リンパ球の増殖の指標とする、ＬＬＮＡ：ＤＡ（modified LLNA of Daicel based on ATP）が提案されている（たとえば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４４２Ａ  皮膚感作性：局所リンパ節試験：ＤＡ、［平成２３年９月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/ghs/tgj/tg442aj.pdf＞（非特許文献３）を参照。）。
【０００９】
ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡのいずれの場合でも、一部の皮膚刺激性物質、界面活性剤などを試験に供した場合に、偽陽性（ある試験法で、被験物質が実際は陰性または非活性であるにもかかわらず、誤って陽性または活性と判定されること）になることが報告されている（たとえば、Christine Garcia et al., "Comparative testing for the identification of skin-sensitizing potentials of nonionic sugar lipid surfactants", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 58, 2010, p301-307（非特許文献４）を参照）。したがって、マウスを用いて皮膚刺激性物質や界面活性剤を評価するときには、試験濃度と皮膚刺激性の関係や、構造情報も含めて、総合的な判断が必要とされている（たとえば、David Basketter et al., "Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets:Implications for REACH", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 55, 2009, p90-96（非特許文献５）を参照）。
【００１０】
また、たとえば、G. Frank Gerberick et al., "Use of a B Cell Marker(B220) to Discriminate between Allergens and Irritants in the Local Lymph Node Assay", Toxicological Sciences, 68, 2002, p420-428（非特許文献６）には、マウスを用いた試験法として、フローサイトメーターを用いて、細胞表層抗原を検出することにより、皮膚感作性物質と皮膚刺激性物質とを識別する手法が提案されている。しかしながら、このような非特許文献６に記載された手法を実施するためには、特別な装置が必要となってしまう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４０６  皮膚感作性、［平成２３年９月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/ghs/tgj/tg406j.pdf＞
【非特許文献２】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４２９  皮膚感作：局所リンパ節試験、［平成２３年９月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/ghs/tgj/tg429j.pdf＞
【非特許文献３】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４４２Ａ  皮膚感作性：局所リンパ節試験：ＤＡ、［平成２３年９月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/ghs/tgj/tg442aj.pdf＞
【非特許文献４】Christine Garcia et al., "Comparative testing for the identification of skin-sensitizing potentials of nonionic sugar lipid surfactants", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 58, 2010, p301-307
【非特許文献５】David Basketter et al., "Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets:Implications for REACH", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 55, 2009, p90-96
【非特許文献６】G. Frank Gerberick et al., "Use of a B Cell Marker(B220) to Discriminate between Allergens and Irritants in the Local Lymph Node Assay", Toxicological Sciences, 68, 2002, p420-428
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、簡便に、かつ特別な機器を用いることなく、皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質を検出でき、これらを同時に識別することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、マウスの一方の耳介に被験物質を塗布するステップと、一定期間後に、他方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップと、前記他方の耳介における惹起反応を検出するステップとを含む、皮膚感作性物質の検出および皮膚感作性物質と皮膚刺激性物質との識別を同時に行う方法を提供する（以下、当該方法を「第１の方法」と呼称する。）。
【００１４】
本発明はまた、マウスの一方の耳介に被験物質を塗布するステップと、一定期間後に、他方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップと、前記他方の耳介における惹起反応を検出するステップとを含む、皮膚感作性物質の検出方法を提供する（以下、当該方法を「第２の方法」と呼称する。）。
【００１５】
本発明はさらに、マウスの一方の耳介に被験物質を塗布するステップと、一定期間後に、他方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップと、前記他方の耳介における惹起反応を検出するステップとを含む、皮膚刺激性物質の検出方法も提供する（以下、当該方法を「第３の方法」と呼称する。）。
【００１６】
上述した本発明の第１の方法、第２の方法、第３の方法（以下、これらを「本発明の方法」と総称する。）における一定期間は、７日以上２週間以内であることが好ましい。
【００１７】
また本発明の方法は、惹起反応の検出を、以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくともいずれかの方法によって行うことが好ましい。
【００１８】
（ａ）マウスの左右の耳介リンパ節の重量を測定する、
（ｂ）マウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定する、
（ｃ）マウスの左右の耳介の厚みを測定する、
（ｄ）マウスの左右の耳介リンパ節のＤＮＡ量を測定する、
（ｅ）マウスの左右の耳介の重量を測定する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、マウスを用いて、簡便かつ短期間で、特別な装置を必要とせずに、被験物質が皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質であるか否かを検出でき、また、皮膚感作性物質の検出および皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質の同時識別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の方法を模式的に示す図である。
【図２】実験例での各ケージにおける測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図１は、本発明の方法を模式的に示す図である。本発明の皮膚感作性物質の検出および皮膚感作性物質と皮膚刺激性物質との識別を同時に行う方法（第１の方法）、皮膚感作性物質の検出方法（第２の方法）、ならびに、皮膚刺激性物質の検出方法（第３の方法）は、いずれも、以下のステップを共通して含む。
【００２２】
（１）マウス１の一方の耳介２に被験物質を塗布するステップ（ステップＳ１）、
（２）一定期間後に、他方の耳介３に同じ被験物質を塗布するステップ（ステップＳ２）、
（３）前記他方の耳介３における惹起反応を検出するステップ（ステップＳ３）。
【００２３】
ここで、本発明の方法に用いるマウスについては特に限定されないが、これまで世界的に多くの統計データが蓄積されてきたＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡとの相関性が高ければ、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡと試験結果を照合しやすくなることから、たとえばＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスなど、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡに従来よりよく用いられているマウスを用いることが好ましい。
【００２４】
本発明の方法におけるステップＳ１では、まず、マウス１の一方の耳介２に被験物質を塗布する。ここで、「耳介」は、マウスの外耳のうち外側に張り出している部分を指す。被験物質を塗布する部分は耳介に含まれるいずれの領域であってもよいが、塗布のしやすさ、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡで蓄積されたデータと比較しやすいなどの観点から、耳背部の領域が好ましい。
【００２５】
本発明において用いられる「被験物質」は、溶媒または分散媒に溶解または分散させることでマウスの耳介に塗布可能となる被験物質塗布液に調製できるものであればよく、皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質、その他皮膚感作性、皮膚刺激性のいずれも示さない物質など、未知の材料、公知の材料のいずれもを包含する。なお、被験物質は、非特許文献３に記載された定義に沿って、単一の化合物であってもよく、また、多成分（最終製品、調製物など）からなるものであってもよい。溶媒、分散媒などは、当分野において用いられている公知の溶媒、分散媒を被験物質に応じて用いればよく、たとえば、アセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メチルエチルケトン、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。中でも、陽性対照（ＰＣ）として用いた場合に一貫した応答を示すことから、アセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）が好ましい。
【００２６】
「皮膚感作性物質」とは、個体が誘導性アレルゲンに局所的に曝露された際に生じる免疫学的過程によって皮膚免疫応答を惹起し、その結果、接触感作性の発現に至る性質（皮膚感作性）を有する物質を指す。このような皮膚感作性物質としては、たとえば、α−ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）、イソオイゲノール、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）、オイゲノール、パラフェニレンジアミン、コバルトクロライド、シトラル、イミダゾイルウレアなどが知られている。また、「皮膚刺激性物質」とは、皮膚に対し一過性の刺激を与える性質（皮膚刺激性）を有する物質を指し、このような皮膚刺激性物質として、たとえば、塩化ベンザルコニウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどが知られている。なお、上記に例示したイソオイゲノール、ＤＮＣＢなどのように、皮膚感作性を有し、かつ、皮膚刺激性を有するものも知られている。
【００２７】
本発明の方法において、ステップＳ１で一方の耳介２に塗布する被験物質の量（投与量）は、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡで採用される基準（非特許文献２、３などを参照）で調製されることが好ましいが、これに限定されるものではない。被験物質塗布液中の被験物質の濃度についても特に制限されるものではないが、耳介が欠損するなどの著しい毒性、腐食性を示さない濃度であれば、０．０１〜１００％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましく、また、たとえば、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡなどで求めたＥＣ３の値の、０．２倍から５０倍の範囲内であることがより好ましい。これは、化学物質などの、刺激性及び感作性にはばらつきがあるが、本試験法では、感作の判定に影響を与える刺激性の影響を無視して、感作性を評価できるためであると共に、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡで得られた結果を有効に活用できるためである。
【００２８】
また本発明において、ステップＳ１における被験物質塗布液の塗布回数は、１回の塗布量、被験物質塗布液中の被験物質の濃度、感作性の強さにも依存するが、１〜１０回であることが好ましく、１〜３回であることが好ましく、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡとの相関性を高めることができる観点からは３回であることが特に好ましい。なお、被験物質を塗布する耳介の領域は、複数回の塗布ごとに（たとえば１回目の塗布と２回目の塗布とで）同じであってもよいし、同じ側の耳介であれば異なっていてもよい。また、ステップＳ１における塗布の間隔についても特に制限されないが、ＬＬＮＡとの相関性を高めることができることから、ＬＬＮＡで採用されているように１日目、２日目、３日目に塗布することが好ましい。この場合、各塗布の間に少なくとも１２時間以上の間隔をあけることが好ましく、同一の時刻に塗布するようにすることが特に好ましい。
【００２９】
なお、ＬＬＮＡ：ＤＡにおいて、被験物質を塗布する前に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを予め被験物質を塗布する耳介に塗布しておくことで、検出の感度が上昇することが知られており、本発明の方法においても、これを採用してもよい。ＳＤＳを用いる場合、その濃度は、０．０１〜１０％の範囲が好ましく、０．１〜１％の範囲がより好ましい。
【００３０】
続くステップＳ２では、一定期間後に、他方の耳介３に同じ被験物質を塗布する。この「一定期間」について特に制限するものではないが、被験物質が皮膚感作性物質である場合には、この一定期間が当該皮膚感作性物質による感作開始から惹起までの期間となることから、７日以上２週間以内であることが好ましく、９日以上１２日以内であることがより好ましい。一定期間が７日未満であると、被験物質が皮膚感作性物質であった場合に、感作されたリンパ球の伝播による全身の感作が未だ起こっていないか起こっていたとしても検出には不十分であると言う傾向にあり、また、２週間を超えても、感作性の検出、刺激との区別は可能であると考えるが、従来のモルモットを用いた試験と比較して、試験期間の短縮というメリットが薄れてしまう。
【００３１】
本発明の方法において、ステップＳ２で他方の耳介３に塗布する被験物質の量（投与量）、被験物質塗布液中の被験物質の濃度についても特に制限はされないが、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡの豊富なデータを活用するという理由からは、ステップＳ１において一方の耳介２に塗布した１回分の被験物質の量、濃度と同程度であることが好ましい。また、ステップＳ２における被験物質塗布液の塗布回数について特に制限されないが、１回であることが好ましい。
【００３２】
本発明の方法におけるステップＳ３では、ステップＳ２で被験物質を塗布した他方の耳介３における惹起反応を検出する。この惹起反応を検出する方法は、耳介リンパ節の増殖、皮膚反応を定量化できるのであれば特に制限されるものではなく、公知の方法を必要に応じて適宜組み合わせて行うことができるが、以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくともいずれかの方法によって行い、コントロール群と比較することが好ましい。
【００３３】
（ａ）マウスの左右の耳介リンパ節の重量を測定する、
（ｂ）マウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定する、
（ｃ）マウスの左右の耳介の厚みを測定する、
（ｄ）マウスの左右の耳介リンパ節のＤＮＡ量を測定する、
（ｅ）マウスの左右の耳介の重量を測定する。
【００３４】
上述した（ａ）〜（ｅ）の方法は、いずれも公知であり、たとえば非特許文献２、３を含めた公知文献を適宜参照することで当業者であれば容易に実施可能である。なお、（ａ）マウスの左右の耳介リンパ節の重量を測定することで惹起反応を検出する場合には、汎用されている安価な精密電子天秤が使用できるという利点があり、（ｂ）マウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定することで惹起反応を検出する場合には、ＬＬＮＡ：ＤＡのデータと比較することにより、感作の程度を類推できるという利点がある。また、（ｃ）マウスの左右の耳介の厚みを測定することで惹起反応を検出する場合には、２０１０年７月に改定されたＴＧ４２９、ＴＧ４４２Ａ、ＴＧ４４２Ｂの実施の過程で取得できる耳介厚のデータが活用できるという利点があり、（ｄ）マウスの左右の耳介リンパ節のＤＮＡ量を測定することで惹起反応を検出する場合には、豊富に市販されているＤＮＡ精製キットを用いることにより、施設間でばらつきの少ないデータが取得できるという利点がある。（ｅ）マウスの左右の耳介の重量を測定することで惹起反応を検出する場合には、汎用されている安価な精密電子天秤が使用でき、また、作業者の熟練度の差が生じにくい可能性が高いという利点がある。
【００３５】
上述したステップＳ１〜Ｓ３を含む本発明の方法によれば、マウスを用いて、簡便かつ短期間で、特別な装置を必要とせずに、従来、皮膚刺激性物質、界面活性剤についてＬＬＮＡを行った際に生じていた偽陽性の問題が起こることなく、被験物質が皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質であるか否かを検出でき、また、皮膚感作性物質の検出および皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質の同時識別が可能となる。なお、皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質の識別は、イソオイゲノール、ＤＮＣＢなどのように、皮膚感作性を有し、かつ、皮膚刺激性を有するものの場合には、その両方の性質を有することが検出できることを指す。
【００３６】
以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
＜実験例１＞
ＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスを各ケージごとに３匹または４匹（ケージ３では４匹、ケージ３以外のケージでは３匹）個体識別ができるように飼育し、試験開始時および終了時に体重を測定した。
【００３８】
また、溶媒としてアセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）を用い、被験物質としてα−ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）（皮膚感作性を有する）、イソオイゲノール（皮膚感作性、皮膚刺激性の両方を有する）、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）（皮膚感作性、皮膚刺激性の両方を有する）、塩化ベンザルコニウム（皮膚刺激性を有する）を用い、以下の被験物質塗布液を調製した。
【００３９】
・１５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液、
・５％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液、
・０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液、
・１％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液。
【００４０】
以下のように、各ケージごとに、操作を行った。なお、１回の塗布量は２５μｌとした。被験物質塗布液の塗布には、ピペットマンを用いた。
【００４１】
・ケージ１：１、２、３日目にマウスの右耳にＡＯＯを塗布し、１０日目に左耳にＡＯＯを塗布、
・ケージ２：１、２、３日目にマウスの右耳に１５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目に左耳に１５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布、
・ケージ３：１、２、３日目にのみマウスの右耳に１５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布（１０日目の左耳への塗布なし）、
・ケージ４：１０日目にのみマウスの左耳に１５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布（１、２、３日目の右耳への塗布なし）、
・ケージ５：１、２、３日目にマウスの右耳に５％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目に左耳に５％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布、
・ケージ６：１、２、３日目にのみマウスの右耳に５％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布（１０日目の左耳への塗布なし）、
・ケージ７：１０日目にのみマウスの左耳に５％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布（１、２、３日目の右耳への塗布なし）、
・ケージ８：１、２、３日目にマウスの右耳に０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目に左耳に０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布、
・ケージ９：１、２、３日目にのみマウスの右耳に０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布（１０日目の左耳への塗布なし）、
・ケージ１０：１０日目にのみマウスの左耳に０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布（１、２、３日目の右耳への塗布なし）、
・ケージ１１：１、２、３日目にマウスの右耳に１％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目に左耳に１％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液を塗布、
・ケージ１２：１、２、３日目にのみマウスの右耳に１％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液を塗布（１０日目の左耳への塗布なし）、
・ケージ１３：１０日目にのみマウスの左耳に１％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液を塗布（１、２、３日目の右耳への塗布なし）、
・ケージ１４：処置なし。
【００４２】
１１日目に、各ケージのマウスから左右両方の耳介リンパ節を摘出し、そのまま左右別々に２５ｍｍ径程度の細胞培養用ディッシュに移し、精密化学天秤で重量を測定した。図２は、各ケージにおける測定結果を示すグラフであり、縦軸は、測定されたリンパ節重量の平均値（ｍｇ）、横軸はケージの番号である。
【００４３】
被験物質塗布液を塗布したケージについて、１、２、３日目に右耳に被験物質を塗布し、１０日目に左耳に被験物質を塗布したＡ群（ケージ２、５、８、１１）、１、２、３日目にのみ右耳に被験物質を塗布し、１０日目に塗布しなかったＢ群（ケージ３、６、９、１２）、ならびに、１、２、３日目に塗布せず、１０日目のみに左耳に被験物質を塗布したＣ群（ケージ４、７、１０、１３）に大きく分けられる。図２に示す結果から、皮膚感作性を有するものについてはＡ群が反応し、皮膚刺激性を有するものについてはＡ群とＣ群が同程度反応し、皮膚感作性、皮膚刺激性の両方を有するものについてはＣ群が反応し、Ａ群の反応もさらに大きくなっていることが分かる。またＢ群の結果から、一方の耳介に皮膚感作性物質を塗布することで、試験期間中に、被験物質の種類に関係なく、他方の耳介のリンパ節が大きくならないことが確認された。
【００４４】
今回開示された実施の形態および実験例は全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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