(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により前記抽出されたＲＮＡを検出する際に、前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出するために前記試料に添加されるＲＮＡ検出用試薬であって、
動物糞の水溶性抽出液を含むことを特徴とするＲＮＡ検出用試薬。
【請求項２】
ｐＨが５〜９である請求項１に記載のＲＮＡ検出用試薬。
【請求項３】
ＲＮＡウイルスを含む試料からＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ反応工程とを実施するＲＮＡ検出方法において、
前記抽出工程において、前記試料に請求項１または請求項２に記載のＲＮＡ検出用試薬を添加してからＲＮＡの抽出を行うことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によってウイルスＲＮＡを検出する方法において使用されるＲＮＡ検出用試薬、およびこれらの試薬を用いてＰＣＲ法によってＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、感染性ウイルスのスクリーニングや、疾患患者のウイルス感染の有無を判断する場合にウイルス中のＲＮＡを検出する方法として、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ）を含むＰＣＲ法（以下、単にＰＣＲ法と記載する）が広く用いられている。
ＰＣＲ法によって試料中のウイルスのＲＮＡを検出するには、フェノール・クロロホルム法などによって試料から抽出されたＲＮＡを逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させてその増幅産物を測定する事で、試料中にウイルスが含まれていたかどうかを検出するものである。
ＰＣＲ法の中でも、リアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲ法では、ＲＮＡの増幅を蛍光色素存在下で行い蛍光増幅をリアルタイムで測定しながら増幅率を測定するために高感度の検出が行うことができる。
【０００３】
このようにリアルタイムＰＣＲ法は通常のＰＣＲ法に比べるとＲＮＡを高感度で検出できるが、それでも、例えば感染初期の患者から試料を採取してＲＮＡの検出を行った場合には、ウイルスの量が少ないため、ＲＮＡを検出できず、実際には感染していたとしても陰性と判断されることがある。
また、ＲＮＡはＲＮＡ分解酵素で分解されやすいため、少量の場合には特に検出が困難になる。
さらには、ＤＮＡを検出する場合と比べてＲＮＡを逆転写する工程が増えるため試料のロスも生じやすい。
従って、感染の初期における病原性ウイルス等、少量のＲＮＡウイルスのＲＮＡ検出についてはさらに高感度の検出方法が望まれている。
【０００４】
従来、ＲＮＡの検出感度を向上させるためには、試料中のＭｇイオン濃度を調整することなどが行われているが、十分ではなかった。
あるいは、微量のＲＮＡを確実に沈殿させるために、ＲＮＡの抽出工程においてＲＮＡの沈殿を促す共沈剤を添加することで、抽出効率を向上させることが特許文献１乃至７に記載されている。
【０００５】
しかしながら、前記のような共沈剤を用いるいずれの方法においても、核酸、特にウイルスＲＮＡのＲＮＡ検出感度を十分に向上させうるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２３８１０１号公報
【特許文献２】特開平７−５９５７２号公報
【特許文献３】特開２００１−１７１７３号公報
【特許文献４】特開２００３−２４８号公報
【特許文献５】特開２００６−８７３９４号公報
【特許文献６】特許第４２６４１３３号公報
【特許文献７】特許第３１０８１０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、ＰＣＲ法によるＲＮＡ検出方法において、検出感度を向上させることのできるＲＮＡ検出用試薬、およびＲＮＡ検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために、ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により前記抽出されたＲＮＡを検出する際に、前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出するために前記試料に添加されるＲＮＡ検出用試薬であって、動物糞の水溶性抽出液を含むことを特徴とするＲＮＡ検出用試薬を提供する。
【０００９】
また、本発明にかかるＲＮＡ検出用試薬は、ｐＨが５〜９であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明者らは、前記課題を解決するために、ＲＮＡウイルスを含む試料からＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ反応工程とを実施するＲＮＡ検出方法において、前記抽出工程において、前記試料に請求項１または請求項２に記載のＲＮＡ検出用試薬を添加してからＲＮＡの抽出を行うことを特徴とするＲＮＡ検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るＲＮＡ検出用試薬を、ウイルスＲＮＡを含む試料中に所定量添加して試料からＲＮＡを抽出し、その後ＰＣＲ法によりＲＮＡ検出を行うと、ＲＮＡの検出感度を向上させることができる。
従って、微量のウイルスが含まれる試料からもＲＮＡを検出することができ、ウイルス検査等において微量のウイルスの有無を判定することができる。
また、本発明に係るＲＮＡ検出用試薬は、動物糞の抽出液を含むため、廃棄物である家畜糞等の動物糞を原料とすることができ、製造コストが安価である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ア）豚糞由来のＲＮＡ検出試薬の分画時間とウイルス量の関係、（イ）豚糞由来のＲＮＡ検出試薬の分子量とウイルス量の関係
【図２】（ア）鶏糞由来のＲＮＡ検出試薬の分画時間とウイルス量の関係、（イ）鶏糞由来のＲＮＡ検出試薬の分子量とウイルス量の関係
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬およびこれらの試薬を用いたＰＣＲ法によるＲＮＡ検出方法について具体的に説明する。
【００１４】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、ＲＮＡウイルスを含む試料から前記ＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により前記抽出されたＲＮＡを検出するために用いられるＲＮＡ検出用試薬であって、動物糞の抽出液を含むものである。
前記動物糞としては、家畜糞（鶏糞、豚糞、牛糞など）、やペット（イヌ、ネコ、ウサギ、ネズミ、カメ）等の糞等の動物糞に抽出用の液体を添加して遠心分離した上澄み液から作製される。
家畜糞としては、養鶏、養豚場などから回収されてくる一般的な家畜飼養場からの廃棄物を利用することができる。
【００１５】
尚、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬において、前記動物糞に含まれるどのような成分がＲＮＡ検出の検出感度を向上させるのに有効なのかについては、詳細は不明であるが、各試験結果より、一般的な動物糞を水溶性の抽出液で抽出した成分中に有効成分が含まれていることは明らかである。
また、それらの有効成分は一般的なたんぱく質が変性する温度（１００℃）程度ではその活性を失わないことも明らかである。
【００１６】
動物糞に含まれるＲＮＡ検出の検出感度を向上させる有効成分の一つは、多糖類の一種であると考えられる。
ヒトを含む哺乳類、鳥類、爬虫類などの動物の糞であって、エサ由来の多糖類を含む糞であれば、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬の材料として用いることが可能であると考えられる。
【００１７】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、前記動物糞に緩衝液などの液体を添加して得られる抽出液から作製される。前記抽出するための液体としては緩衝液の他、水、酸、アルカリ水溶液、その他の液体を用いてもよい。
前記緩衝液を抽出液とした場合には液のｐＨを調整可能であり好ましい。
前記抽出液のｐＨを調整する場合、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８に調整することが好ましい。
この範囲であれば生体材料に対する影響が少なく且つ後で行うＰＣＲ反応への影響も少ない。
【００１８】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬には、さらに抗生物質などを添加して、雑菌を除去してもよい。使用可能な抗生物質としては、例えば、ペニシリンやストレプトマイシンなどが挙げられる。
さらには、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬には、抽出性を高めるために界面活性剤などが添加されていてもよい。
【００１９】
前記のような本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、ＰＣＲ法においてＲＮＡを抽出する前の試料に添加することで、ＰＣＲ法によるウイルスＲＮＡの検出感度が１０〜１０００倍向上する。
以下に、本実施形態のＲＮＡ検出用試薬を用いてＰＣＲ法でウイルスＲＮＡの検出を行う手順を説明する。
本実施形態のＲＮＡ検出方法は、ＲＮＡウイルスを含む試料からＲＮＡウイルスのＲＮＡを抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出されたＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ反応工程とを実施するＲＮＡ検出方法において、前記抽出工程の前に、前記試料に前記ＲＮＡ検出用試薬を添加してＲＮＡの検出を行うものである。
【００２０】
（１）試料の準備
血液などのＲＮＡ検出用の試料を準備する。前記試料は、通常の検出方法で使用する場合と同様に必要に応じて適当な倍率に希釈されたものでもよい。
また、前記試料としては、血液の他、咽頭ぬぐい液や気管吸引液（例：インフルエンザウイルス）、血清（例：Ｃ型肝炎ウイルス）、組織、細胞の他に、尿・便（例：ノロウイルス）等の排泄物、環境試料（下水、河川水等）を用いることが可能である。
【００２１】
（２）ＲＮＡの抽出工程
前記試料からＲＮＡを抽出する工程を実施する。
まず、前記試料に前記のＲＮＡ検出用試薬を添加する。
試料に対するＲＮＡ検出用試薬の添加量は、試料の濃度や、ウイルスの種類などによって適宜調整可能である。
例えば、家畜糞を用いた前記試薬であれば、家畜糞１ｇに対して水溶性抽出液５〜２０ｍｌに混合し、遠心分離した上澄み液を採取したものを、試料１ｍｌに対して０．１〜１６０μｌ程度、好ましくは、１〜８０μｌ、さらに好ましくは、５〜５０μｌ程度、添加することが好ましい。
尚、前記ＲＮＡ検出用試薬の添加量は、ＲＮＡ検出用試薬の原料の糞の種類によっても異なる。
例えば、前記家畜糞のうち鶏糞を用いたものの場合には、試料１ｍｌに対して０．１〜４０μｌ、好ましくは１〜２０μｌ程度、さらに好ましくは５〜２０μｌ程度添加することが好ましく、豚糞を用いたものの場合には、試料１ｍｌに対して０．５〜１６０μｌ、好ましくは５〜８０μｌ程度、さらに好ましくは１０〜５０μｌ程度添加することが好ましい。
さらに他の動物糞を用いたものの場合には、試料１ｍｌに対して０．２〜３００μｌ、好ましくは、２〜１００μｌさらに２０〜１００μｌ程度添加することが好ましい。
【００２２】
前記ＲＮＡ検出用試薬を添加した試料からＲＮＡを抽出するには、公知の手法、例えばフェノール・クロロホルム抽出法によって行うことができる。
ＲＮＡ抽出には市販のＲＮＡ抽出用試薬キット、例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン社製）等を、添付のプロトコールに従って使用することができる。
例えば、下記のような手順でＲＮＡ抽出を行なう。
まず、試料をＴＲＩＺＯＬ試薬に溶解する。試料が血清など溶液の場合や、血液や培養細胞などの細胞浮遊液の場合には、適宜希釈した液を、また試料が組織などの場合には予めホモジナイズしておいたものを、ＴＲＩＺＯＬ試薬に混合して溶解する。
ＴＲＩＺＯＬ試薬に試料を溶解した液を１５分間静置して、クロロホルムを添加し、チューブに入れ遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）する。
遠心分離後、ＲＮＡを含む上澄みと、その他の成分（タンパク質、炭水化物など）を含む沈殿とに分離し、前記上澄みを取り出すことでＲＮＡ成分を含む水溶液を抽出する。
さらに、前記上澄みを別のチューブにいれて、イソプロパノールを添加し、１０分間静置した後、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）した上澄みを除去するとＲＮＡの沈殿が生成される。その沈殿にエタノール（７５％）を添加しさらに遠心分離（７５００×ｇ、５分間、４℃）することでＲＮＡを洗浄する。
沈殿・洗浄したＲＮＡを乾燥後、ＲＮａｓｅフリー水（ＤＥＰＣ処理水）に再溶解させることで、ＲＮＡを抽出する。
【００２３】
（３）逆転写工程
前記のように試料から抽出されたＲＮＡを用いて、逆転写によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する逆転写工程を実施する。
逆転写は、市販の逆転写酵素用試薬キット、例えば、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社製）等を、添付のプロトコールに従って使用して行なうことができる。
例えば、逆転写酵素、ランダムプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、付属のバッファーおよびＲＮａｓｅ−フリー水をプロトコールに従って調製し（１試料あたり全量で１０μｌとなるように調製）、前記抽出したＲＮＡを前記調製した試薬に同量（１０μｌ）添加してピペッティングで混合する。
混合後、１０分間室温で静置し、３７℃で２時間逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成する。
逆転写反応後のｃＤＮＡは、８５℃で１０秒保温することで、酵素を不活化させておく。
【００２４】
（４）ＰＣＲ反応工程
次に、前記逆転写工程で生成されたｃＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅させて検出を行うＰＣＲ反応工程を実施する。
ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの検出は、公知のＰＣＲ法を用いたＰＣＲ装置を適宜用いて行うことができる。
ＰＣＲ装置で検出されるデータはｃＤＮＡの量であるため、これを元の試料中に含まれるＲＮＡ量に換算することで、試料中に含まれていたＲＮＡ量およびＲＮＡウイルスの検出が可能となる。
尚、ＲＮＡ量とｃＤＮＡ量とは同量となるが、生データとして得られるｃＤＮＡ量は、最終的にＰＣＲ反応させたｃＤＮＡ量であるため、元の試料中に含まれるＲＮＡ量に換算する場合には、試料の希釈を考慮して換算する。
【００２５】
前記のようなＰＣＲ法において試料中に含まれるウイルスＲＮＡを検出する場合、血液などの試料に含まれている不純物が残存物質として各工程における酵素反応などを阻害している可能性があり、これらの残存物質が、最終的なウイルスＲＮＡの検出感度に悪影響を及ぼしていると考えられる。
本発明のＲＮＡ検出用試薬が実際にどのような作用でＲＮＡ検出の感度を向上させているのか、その詳細な原理は不明だが、おそらく、前記ＲＮＡ抽出工程における抽出効率を向上させること、または、各工程における残存物質の阻害作用を低下させること等に効果があると思われる。
【００２６】
本実施形態のＲＮＡ検出用試薬は、種々のＲＮＡウイルスから抽出されるＲＮＡの検出に有用であるが、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、デングウイルス等のエンベロープを有するウイルス、ノロウイルスの実験室での代替ウイルスとして用いられることが多いネコカリシウイルス等のエンベローブを有しないウイルス等のウイルスＲＮＡの検出感度の向上に効果が高い。これらのウイルスの中でも、特に前記エンベロープを有する各ウイルスに対する検出感度向上効果が高い。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例および比較例を用いて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
〔１〕  ＲＮＡ検出感度試験
（ＲＮＡ検出用試薬）
乳鉢で粉砕した家畜糞（鶏糞、豚糞等）１ｇ（鶏糞の含水率：２８％，豚糞の含水率：２３％）に対して、抗生物質（製品名：ペニシリン・ストレプトマイシン）０．１ｍｌおよび緩衝液（トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）９．９ｍｌを添加した液を、遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間  ４℃  ）後、上澄み液をとり、これをＲＮＡ検出用試薬とした。
尚、前記含水率は、各家畜糞を試料としておよそ１ｇ採取したものを１０５℃で１時間保持し、質量の減少から算出した。以下の各試験で用いた糞の含水率については同様に算出した。
【００２９】
（試料の調整）
各ウイルス液５μｌ、前記ＲＮＡ検出用試薬２．５μｌ、ＭＥＭ培地、ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及び炭酸水素ナトリウム（ｐＨ調整用）からなる培養液２４２．５μｌを混合した実施例の液と、各ウイルス液５μｌと培養液２４５μｌとからなる比較例の液を２５０μｌずつ準備した。
尚、前記培養液の成分のうちウシ胎児血清は、下記実施例１、４および比較例１、４にのみ使用した。
【００３０】
本実施例で使用したウイルスは下記の４種類であり、ウイルス液の濃度を、２５０μl中に１．０×１０4、１．０×１０3、１．０×１０2、１．０×１０1、１．０×１０0、１．０×１０-1ＰＦＵとなるように６段階の濃度段階に調整した（初期調整ウイルス量）。
実施例１および比較例１：ネコカリシウイルス（株：ＦＣＶ−２２８０）
実施例２および比較例２：Ｂ型インフルエンザウイルス（株：Ｂ／Ｌｅｅ／４０）
実施例３および比較例３：Ａ型インフルエンザウイルス（株：Ａ／ＰＲ／８／３４）
実施例４および比較例４：デングウイルス（株：Ｎｅｗ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｃ）
【００３１】
（抽出工程）
各実施例および比較例２５０μｌに対し、ＴＲＩＺＯＬ（商品名、インビトロジェン社製）を７５０μｌ添加する。
この溶液をよく混合し、１５分間室温で静置した後、２００μｌのクロロホルムを添加して、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）する。
その後、水層を回収する。
回収した水層約７００μｌあたり５００μｌのイソプロパノールを添加して、１０分間室温で静置し、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、４℃）して、ＲＮＡ成分を沈殿させ、上澄みを除去する。
残ったＲＮＡ沈殿物に、７５％エタノールを  1ｍｌ添加し、ボルテックス後、５分間室温で静置し、さらに遠心分離（９０００×ｇ、５分間、４℃）することによってＲＮＡ沈殿を洗浄する。
一度、上澄みを除去した後、さらに遠心分離（９０００×g、２分間、４℃）し、残存している上澄みを除去する。上澄み除去後のＲＮＡ沈殿物を、１５分間風乾させ、エタノールを除去する。
【００３２】
（逆転写工程およびＰＣＲ反応工程）
前記抽出されたＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリー水（ＤＥＰＣ処理水）１５μｌで溶解し、そのうちの１０μｌのＲＮＡを用いて、２０μｌのｃＤＮＡを合成する（逆転写工程）。
合成したｃＤＮＡのうち５μｌを使用し、下記のＰＣＲ装置を用いてＲＮＡ量を測定する（ＰＣＲ反応工程）。
前記逆転写工程および、ＰＣＲ反応の手順は、以下の試薬またはキットの方法に準拠した。
【００３３】
尚、逆転写に必要な各ウイルスのプライマーおよびプローブは、実施例１〜実施例３（比較例１〜比較例３）の各ウイルスについては各ウイルス株の遺伝子配列を基に、遺伝子解析ソフトウエアＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０(アプライドバイオシステム社製)を用いて設計した。
実施例１及び２（比較例１及び２）のウイルスのプライマーおよびプローブは、アプライド社の設計ガイドラインに最も近くなり且つ前記Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０で示されるペナルティスコアが最も低くなるものを選定した。
実施例３については、Ａ型インフルエンザウイルス株を１４１株抽出し、その中で相同性の高い共通プライマー、プローブとなるように選定した。
実施例４（比較例４）のウイルスのプライマーおよびプローブは、デングウイルス２型用の高感度検出用プライマーおよびプローブ（アプライドバイオシステム社製)を用いた。
【００３４】
各ウイルスにおいて同様にリアルタイムＰＣＲ装置で測定した生データと、この生データから換算した２５０μｌ中のＲＮＡ量（ｃｏｐｙ）を表１〜表４に示した。
換算値は、生データを０．１６７で除した数値である。
０．１６７で除する理由は、前記抽出したＲＮＡ１５μｌのうち、１０μｌをｃＤＮＡ合成に使い、合成したｃＤＮＡ２０μｌのうち、５μｌをＰＣＲ装置にかけてＰＣＲ反応させたため、生データ（ｃＤＮＡ数）を０．１６７で除した値が２５０μｌの検査用試料に含まれるＲＮＡ量となるためである。
尚、今回のＰＣＲ測定条件において、リアルタイムＰＣＲ装置の検出限界値は、いずれのウイルスも１０ｃｏｐｙであった。
【００３５】
【表１】
0005743784.tif 000002
【００３６】
【表２】
0005743784.tif 000003
【００３７】
【表３】
0005743784.tif 000004
【００３８】
【表４】
0005743784.tif 000005
【００３９】
表１〜表４からわかるように、いずれのウイルスについても、本発明のＲＮＡ検出用試薬を添加した各実施例では、リアルタイムＰＣＲ結果より算出したｃｏｐｙ数（ウイルス量）が増加していた。
すなわち、実施例１では比較例１に比べ約１０〜１００倍、実施例２では、比較例２に比べ約１００〜１０００倍  実施例３では、比較例３に比べ約１０００倍、実施例４では、比較例４に比べ約１００倍にｃｏｐｙ数が増加した。
また、いずれのウイルスについても、本発明のＲＮＡ検出用試薬を添加した各実施例では、検出限界が向上していた。
すなわち、実施例１では比較例１に比べ約１０倍（１．０×１０2→１．０×１０1）、実施例２では比較例２に比べ１０００倍（１０×１０3→１０×１０0）、実施例３では比較例３に比べ１０００倍（１０×１０4→１０×１０1）、実施例４では比較例４に比べ１００倍（１０×１０3→１０×１０1）に検出限界が向上した。
尚、検出限界値は、リアルタイムＰＣＲの生データ値が１０ｃｏｐｙ以下となった濃度段階の１段階高濃度の濃度段階の初期調製ウイルス量（ＰＦＵ）とした。
【００４０】
〔２〕  糞の種類によるＲＮＡ検出感度の比較試験
次に、糞の種類を変えてＲＮＡ検出試薬を作製し、その効果を確認した。
乳鉢で粉砕した表５に記載の各動物糞を各１ｇ準備し、抗生物質（製品名：ペニシリン・ストレプトマイシン）０．１ｍｌおよび緩衝液（トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）９．９ｍｌを添加した液を、遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間  ４℃  ）後、上澄み液をとり、これをＲＮＡ検出用試薬する。
【００４１】
ウイルスとしてＡ型インフルエンザウイルス（株：Ａ／ＰＲ／８／３４）を用い、ウイルス液の濃度が、２５０μｌ中に１×１０4  ＰＦＵとなるように４段階の濃度段階に調整した（初期調整ウイルス量）。
前記ＲＮＡ検出用試薬２．５μｌ〜２５μｌと前記培養液とを合わせて２４５μｌとなるように混合した液と、前記各種ウイルス液５μｌとからなる試験例１〜２８を準備する。
比較する標準液としてはウイルス液５μｌと培養液２４５μｌとからなる液を２５０μｌ準備する。
【００４２】
前記ＲＮＡ検出感度試験と同様の方法で各試験例および標準液中のｃＤＮＡ量を測定し、そのＰＣＲ測定結果に基づき換算値を算出する。
結果を表５に示す。
【００４３】
【表５】
0005743784.tif 000006
【００４４】
各試験例では、検出されたＲＮＡ量（ｃｏｐｙ数）が、いずれのＲＮＡ検出試薬においても標準液よりも多い値であった。
すなわち各種動物糞を材料としたＲＮＡ検出用試薬を用いることでＲＮＡの検出感度が向上していた。
【００４５】
〔３〕  耐熱性試験
次に、本実施例のＲＮＡ検出用試薬の活性が加熱によって低下するかどうかの耐熱性試験を行った。
前記ＲＮＡ検出感度試験に用いたＲＮＡ検出用試薬をヒートブロック恒温槽で１００℃、１０分間加熱した。
デングウイルス（Ｎｏ．29〜31）とＡ型インフルエンザウイルス（Ｎｏ.32〜34）を用いて、デングウイルスは２５０μｌ中に１．０×１０4、Ａ型インフルエンザウイルスは１．０×１０3ＰＦＵ含まれるようにそれぞれ調整したウイルス液を作製した。
これらの各ウイルス液に、前記試薬を添加したもの、加熱処理（１００℃、１０分）した試薬を添加したもの、試薬無添加のものを用いて、前記ＲＮＡ検出感度試験と同様の方法で試料中のｃＤＮＡ量を測定し、そのＰＣＲ測定結果に基づき換算値を算出した。
結果を表６に示す。
【００４６】
【表６】
0005743784.tif 000007
【００４７】
表６の結果から、本実施例のＲＮＡ検出用試薬は、加熱しても活性は失われず、すなわち、試薬中の有効成分は前記条件の加熱によって変性しない成分であることがわかる。
【００４８】
〔４〕  不純物による影響
次に、本実施例のＲＮＡ検出用試薬が、雑多なＲＮＡが混入している場合でも、目的とするＲＮＡを高感度に検出させることが可能かどうかを試験した。
前記実施例１で使用したネコカリシウイルスを、単層に形成したネコ腎臓由来ＣＲＦＫ細胞（ＥＣＡＣＣ  ＮＯ．８６０９３００２）に、細胞１個あたり０．１ＰＦＵのウイルスが感染するように接種する。
これを、３７℃のインキュベーター内で１５分毎にロッキングしながら、ウイルスを吸着させ、１時間後に前記実施例１で使用したものと同様の培養液を入れ、３７℃で静置した。
翌日に細胞変性（ＣＰＥ）が見られたため、感染細胞の回収を行った。
スクレーパーで細胞をはがしとり、細胞浮遊液を全量回収し、回収した細胞浮遊液を遠心分離（１５００回転、５分）後、上澄みと細胞沈査に分離した。
上澄みを除去した後、細胞沈査に前記培養液を１ｍｌ添加し、ピペッティング後の細胞浮遊液を、２４７．５μｌ分取し測定液とした。
【００４９】
一方、前記実施例３で使用したＡ型インフルエンザウイルス（株：Ａ／ＰＲ／８／３４）を単層に形成したイヌ腎臓由来ＭＤＣＫ細胞（ＥＣＡＣＣ  ＮＯ．  ８５０１１４３５）に、細胞１個あたり０．０２ＰＦＵのウイルスが感染するように接種した。
これを、３７℃のインキュベーター内で１５分毎にロッキングしながら、ウイルスを吸着させ、１時間後にトリプシンと無血清培養液からなる維持培地を入れ、３７℃で静置した。接種後２日目にＣＰＥが確認できたため感染細胞の回収を行った。
上澄みを除去した後、細胞沈査に無血清培養液を１ｍｌ添加し、ピペッティング後の細胞浮遊液を、２４７．５μｌ分取し測定液とした。
【００５０】
前記細胞画分には、完全なウイルスの他に、不完全なウイルスまたは培養細胞自身のＲＮＡなど目的とするＲＮＡ以外の雑多なＲＮＡも混在している。
【００５１】
ＲＮＡ検出用試薬Ａとして鶏糞を使用したものと、試薬Ｂとして豚糞を使用したものを準備した。尚、ＲＮＡ検出用試薬の調整方法は前記ＲＮＡ検出感度試験と同様の方法で行った。
調製した測定液２４７．５μｌにＲＮＡ検出用試薬２．５μｌ添加したものと、ＲＮＡ検出用試薬の代わりに無血清培地を２．５μｌ添加したものについてＰＣＲ測定を実施した。
表７にネコカリシウイルスを用いた場合を、表８にＡ型インフルエンザウイルスを用いた試験結果について示す。
【００５２】
【表７】
0005743784.tif 000008
【００５３】
【表８】
0005743784.tif 000009
【００５４】
表７および８に示すように、いずれのウイルスを用いた場合も、ＲＮＡ検出用試薬を添加した場合には、添加しない場合よりも、ＲＮＡの検出感度が向上した。
【００５５】
〔５〕分子量の測定
次に、各家畜糞中の抽出液をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分画し、ＲＮＡ検出感度向上活性を示す分画液の平均重量分子量を測定した。
まず、各サンプルを準備した。豚糞および鶏糞（鶏糞の含水率：２８％，豚糞の含水率：２３％）をそれぞれ重量の１０倍の水で抽出した抽出液を準備した。抽出液作製後翌日に、抽出液をＧＰＣの測定範囲内となるよう鶏糞は１／１０、豚糞は１／２０に水で希釈し、後述するＧＰＣ法を用いて分画を行った。
尚、前記各サンプルの含水率は、豚糞および鶏糞を試料としておよそ１ｇ採取したものを１０５℃で１時間保持し、質量の減少から算出した。
【００５６】
これらのサンプルをＧＰＣ法によって測定した。
測定は下記条件で行った。
使用装置；
恒温槽：昭和電工製  Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＶＥＮ  ＡＯ−３０
送液ポンプ：昭和電工製  Ｓｈｏｄｅｘ  ＤＳ−４
検出器：昭和電工製  Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−１０１
デガッサー：昭和電工製  ＥＲＣ−３１１５α
解析ソフト：システムインスツルメンツ社製  ＳＩＣ  ４８０II  データステーション
使用カラム；ＳＢ−８０４ＨＱ（高分子量用カラム）昭和電工社製
流量；１ｍｌ／分
溶媒；イオン交換水
カラム温度；４０  ℃
ＧＰＣカラム用標準試料；ショウデックス社製
Ｐ８００（分子量  ７０８０００）、
Ｐ１００（分子量  １０７０００）、
Ｐ５０  （分子量  ４７１００）、
Ｐ２０  （分子量  ２１１００）、
Ｐ１０（分子量  ９６００）、
Ｐ５  （分子量  ５９００）、
ＤＥＧ  （分子量  １０６）
検出器；示差屈折率検出器
（Ａ）分画方法：鶏糞抽出液（冷蔵庫保管品）の２０倍希釈溶液、５〜１５分までの１分きざみで分画した（各１ｍｌ、計１０サンプル）。
（Ｂ）分画方法：豚糞抽出液（冷蔵庫保管品）の１０倍希釈溶液、５〜１５分までの１分きざみで分画した（各１ｍｌ、計１０サンプル）。
【００５７】
次に、各分画液を前記実施例３で使用したＡ型インフルエンザウイルス（株：Ａ／ＰＲ／８／３４）を用いて前記（ＰＣＲ法による測定）で行った方法と同様に、リアルタイムＰＣＲ測定を行った。
前記ＧＰＣによる測定で求めた各分画の保持時間あるいは重量平均分子量を横軸にとり、検出限界のウイルス量を縦軸にとったグラフを図１（ア）（イ）（豚糞由来のＲＮＡ検出試薬）および図２（ア）（イ）（鶏糞由来のＲＮＡ検出試薬）に示す。
【００５８】
鶏糞由来のサンプルではおよそ８分〜９分（プルランを較正曲線に用いた場合の換算平均重量分子量：８５０００〜２３０００）の分画で、豚糞由来のサンプルでは９分〜１０分（プルランを較正曲線に用いた場合の換算平均重量分子量：２３０００〜４８００）での分画でもっともＲＮＡの検出感度が向上していた。
【００５９】
前記耐熱性試験及び前記分子量の測定の結果より、豚糞および鶏糞中に含まれる１００℃程度の熱を加えても変性しない物質であって、且つ前記測定方法によって測定された平均重量分子量が数千から十万程度の高分子が、本実施例のＲＮＡ検出用試薬中の有効成分の一つであることがわかる。
【図１】
0005743784.tif 000010
【図２】
0005743784.tif 000011