(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂生産能を有するリポミセス属酵母を培養し、細胞外多糖の生産量が少ない株を選抜することを含む、油脂生産能の高いリポミセス属酵母の候補株の選抜方法。
【請求項２】
リポミセス属酵母を変異処理し、次いで細胞外多糖の生産量が少ない株を選抜する請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法により、油脂生産能の高いリポミセス属酵母の候補株を選抜し、選抜された株を増殖させることを含む、油脂生産能の高いリポミセス属酵母株の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の方法を１次スクリーニングとして実施し、さらに２次スクリーニングを実施することを含む、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油脂生産能の高い微生物株の選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油に依存していたエネルギーについての代替燃料の開発が行われている。その中でも再生可能なバイオマスを原料とするエネルギー物質の生産が注目されている。バイオ燃料にはさまざまあり、バイオディーゼル燃料（BDF）と呼ばれるディーゼル燃料の代替燃料もそれらのうちの１つである。通常、BDFの原料は植物油脂からなるトリグリセライドであり、パーム油、大豆油、菜種油、ひまわり油などが使用される。また、使用済みの廃油などもその原料として使われる。
【０００３】
現在、木質系のバイオマスを利用した液体燃料の醗酵生産は主にエタノールへの変換が盛んに行われている。ここで生産されるエタノールはガソリン代替燃料として使用される。木質系バイオマスを利用した液体燃料代替原料の生産を行うとき、多くの場合ヘミセルロースの未利用問題がある。特に酵母サッカロマイセス・セレビジエを用いたエタノール醗酵では、その問題は顕著である。
【０００４】
一方、ディーゼル代替燃料であるBDFの生産は主に植物油からの生産であり、微生物による醗酵生産は行われてない。しかし、微生物による油脂の生産が可能となれば、植物による油脂生産に比べ莫大な量のBDF原料が1年間に生産されることは想像に難くない。従って、これらBDF原料を微生物発酵により生産することで、木質系のバイオマスから多くの油脂原料を生産することが期待できる。
【０００５】
酵母による油脂の生産については、培養法の最適化などで油脂生産効率を向上する事ができる（特許文献１）。
【０００６】
一方、油脂を高含有する酵母のうち、リポミセス属酵母は、菌体外に大量の多糖を生産する事が知られている。これら多糖は土壌改良剤として有効である事が知られており（特許文献２）、その高生産に関わる取組みも行われている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１５８２１９号公報
【特許文献２】特許第３０４２５６４号公報
【特許文献３】特許第３５５３１２８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】バイオマスハンドブック、平成14年9月20日、オーム社発行、第１３８〜１４３頁
【非特許文献２】バイオマスハンドブック、平成14年9月20日、オーム社発行、第１５７〜１６５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、微生物油脂の生産効率を向上させることができる新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、油脂生産能のある微生物において、細胞外多糖を油脂生産の副産物として捉えた。酵母が摂取した糖類が大量に菌体外多糖に変換される事は、油脂生産効率に好ましくなく、多糖を作らないことで油脂の生産が増えるのではないかと考えた。この考えに基づいて鋭意研究した結果、変異処理した酵母から細胞外多糖の生産量が少ない株を選抜することで、親株よりも油脂生産効率が向上した菌株を得ることができることを見出し、本願発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、油脂生産能を有するリポミセス属酵母を培養し、細胞外多糖の生産量が少ない株を選抜することを含む、油脂生産能の高いリポミセス属酵母の候補株の選抜方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により、油脂生産能の高いリポミセス属酵母の候補株を選抜し、選抜された株を増殖させることを含む、油脂生産能の高いリポミセス属酵母株の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、油脂生産能の高い微生物を取得できる新規な手段が提供された。本発明の選抜方法で取得された微生物株は、沈降性にも優れるため、微生物油脂の回収にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】グルコースを炭素源とする培地中で変異株101-2及び親株を培養したときの油脂生産量を示すグラフである。
【図２】寒天プレート上での変異株及び親株の形態を示す写真である。
【図３】キシロースを炭素源とする培地中で変異株8-4及び親株を培養した時の油脂生産量を示すグラフである。
【図４】実施例３で行なった沈降性試験の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の選抜方法に供される微生物は、油脂生産能を有する微生物であって、本来的に細胞外多糖を生産する微生物である。そのような微生物の代表例として酵母を挙げることができる。より具体的には、例えば、リポミセス（Lipomyces）属、オイディウム（Oidium）属、エンドミセス（Endomyces）属、カンディダ（Candida）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属及びロドスポリディウム（Rhodosporidium）属に属する酵母を挙げることができる。その中でも本発明ではポミセス属酵母が用いられる。これらの酵母は、トリアシルグリセロール（中性脂肪）を生産し菌体内に蓄積する。構成脂肪酸はオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、パルミトレン酸、ステアリン酸で、オレイン酸の比率が高く続いてパルミチン酸比率が高いことが知られている。
【００１５】
本発明の方法では、微生物を培養し、細胞外多糖の生産量が少ない株を選抜する。寒天培地に微生物を播種してコロニーを形成させれば、細胞外多糖の生産量を目視で確認できる。細胞外多糖を多量に生産する株は、粘稠性のあるコロニーを形成するので（図２左参照）、粘稠性のない又は少ないシングルコロニー（図２右参照）を選抜すればよい。
【００１６】
自然界から取得した微生物をそのまま本発明の選抜方法に供してもよいが、本発明の方法では、油脂生産能を有する野外分離株や公知の微生物株を変異処理し、細胞外多糖の生産量が低下した変異株を選抜することが好ましい。変異処理は特に限定されず、微生物の突然変異誘発に通常用いられるいずれの方法でも用いることができる。変異原の具体例としては、紫外線、エックス線、イオンビーム、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、使用する変異原の種類に応じて適宜処理条件を選択し、容易に実施することができる。
【００１７】
例えば、下記実施例では、リポミセス属酵母であるリポミセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）を紫外線処理し、細胞外多糖の生産の少ない変異株を選抜している。使用した酵母株は、野外の土壌から分離されたものであり、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに２０１１年２月２４日付で受領番号NITE AP-1070で寄託されている。
【００１８】
細胞外多糖の生産量を指標に選抜した後、選抜後の各株について、液体培地中で培養して実際に油脂生産能を調べ、これに基づいてさらに選抜を加えてよい。例えば、下記実施例では、プレート上での選抜の後、グルコースを炭素源とする液体培地を用いて２次選抜を行なうことで、グルコース培地中での油脂生産能が親株の約２倍に向上する変異株101-2が得られている。油脂生産能は、例えば、微生物株による油脂生産量及び消費した糖量を調べ、消費した糖量（g）当たりの油脂生産量（g）すなわち糖変換率として評価することができる。あるいは、微生物株による油脂生産量及び培地中の乾燥菌体重量を測定し、油脂含有率を算出して評価することができる。糖変換率及び油脂含有率は、下記の式で算出することができる。
糖変換率＝（油脂生産量／消費糖量）
油脂含有率＝（油脂生産量／乾燥菌体重量）
【００１９】
微生物の培養に用いる培地は特に限定されず、微生物の種類に応じて適当な培地を選択できる。通常、炭素源となる糖類と、微生物の培養に一般に用いられる微量成分を補足する栄養分、例えば酵母エキス、牛肉エキス及び麦芽エキス等の栄養分を含有する培地を用いる。糖類としては特に限定されず、例えばグルコース、キシロース、キシリトール、キシルロース、アラビノース、マンノース、ソルビトール、スクロース、フラクトース、マルトース等の単糖類及び二糖類を用いることができる。さらに、これらが重合した多糖類、すなわちセルロース、デンプン、キシラン、アラビナン、アラビノキシラン等を用いることもできる。これらの糖類は単独で使用してもよいし、また２種以上を混合して用いてもよい。また、木材の糖化液を利用することもできる。糖類濃度は適宜選択でき、特に限定されないが、通常、単糖類の場合で概ね１％〜２０％程度である。
【００２０】
本発明の方法で選抜された微生物株を培養し、細胞内に蓄積した油脂を回収することで、微生物油脂を効率よく製造することができる。細胞内からの油脂の回収方法は特に限定されず、例えばガラスビーズによる物理的破砕や有機溶媒による抽出により回収することができる。本発明の微生物株は、培養液の粘度が低く、沈降性にも優れているので、低速の遠心分離で容易に微生物体を回収できる。あるいは、微生物株が生産した油脂を体外に排出する性質を有する場合には、培養液から遠心分離等の簡便な操作により効率良く油脂を回収することができる。
【００２１】
２次選抜工程を経て取得された微生物株を油脂の製造に用いるときは、培地の炭素源として、２次選抜時の培地に用いたのと同じ糖類を使用することが望ましい。例えば、下記実施例で取得された変異株101-2を用いて微生物油脂を製造する場合であれば、該変異株はグルコースを炭素源として含む培地で培養するとその高い油脂生産能を好ましく発揮できるため、グルコースを含む培地で培養して油脂を回収することが望ましい。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
野外から分離したLipomyces starkeyi（受領番号NITE AP-1070）を液体YM培地（1% Glucose, 0.5% peptone, 0.3% Yeast extract, 0.3% malt extract）で２５℃、３日間、L字管（５mL）で振とう培養後、集菌して蒸留水で洗浄した。これを蒸留水に懸濁し、撹拌下、生存率約10％のUV処理条件（すなわち、Sanyo社製クリーンベンチ(MCV-710ATS)UV殺菌等下(50cm)で90秒）でUV処理を行なった。処理後の菌体をYM寒天プレート（1% Glucose, 0.5% peptone, 0.3% Yeast extract, 0.3% malt extract, 1.5% agar）上に播種して２５℃、約７日間培養し、生育したコロニーの中から多糖の少ない株を取得した。完全に分離されていないコロニーについては、数回寒天培地に継いだ後、明らかに菌体外多糖形成の見られないコロニーを候補株として単離した。約１２０枚のプレートから５２株を取得した。これら菌株をL字管(5mL)にて培養してOD・乾燥菌体重量・油脂生産量・残糖量を測定し、油脂含有率・糖変換率を算出した。油脂生産能力が高い株をさらに選抜するため、候補菌株数を絞り２次スクリーニングを行なった。
【００２４】
２次スクリーニングでは、選抜した変異株および変異前の親株の前培養液をグルコースを炭素源とする培地（YD培地；Glucose10%, Yeast extract1%）75 mlに初期OD660=0.1になるように殖菌し、150 rpm、25℃で培養した。撹拌振とう器はTAITEC Bio-Shaker BR-300LFを使用した。その結果、親株と比較して油脂生産効率の向上が期待できる株を4株選抜した。
【００２５】
特に変異株101-2については最も油脂生産効率の向上が認められたため、再度同じ条件で培養して親株と油脂生産量の比較を行なった。その結果、親株に比べ約２倍の油脂生産量を示した（図１）。また、取得した変異株は親株と比べ著しく菌体外多糖の形成が減少している事が寒天プレート培養でも明らかであった（図２）。
【００２６】
実施例２
実施例１で選抜した変異株及び親株について、キシロースを炭素源とする培地（YX培地；Xylose10%, Yeast extract1%)75 mlで培養し（150 rpm、25℃）、油脂生産能力を変異前の親株と比較した。その結果、変異株8-4で最も油脂生産効率の向上が認められた。同じ条件で培養した親株との油脂生産量の比較を図３に示す。
【００２７】
実施例３
実施例１で選抜した変異株および親株の培養液の遠心分離後の上清の粘度を、小型振動式粘度計CJV5000 (株式会社  エー・アンド・デイ) を用いて測定したところ、変異株の培養液上清の粘度は著しく低下していた。そこで、それぞれの培養液を遠沈管に入れ、3000rpm（1200G）、20分の条件で遠心分離したところ、親株の培養液では沈殿がほとんど見られないのに対し、変異株はほぼ全ての菌体が沈殿した（図４）。変異株の沈降性が著しく向上していることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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