(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の足場材となるゲルが収容される培養室を備えた細胞培養デバイスにおいて、
前記培養室の内壁側面はゲルに濡れない素材で形成された部分とゲルに濡れる素材で形成された部分とを備え、
前記ゲルに濡れない素材は、前記内壁側面において前記培養室の底面から所定の間隔をもって、かつ上方から見て環状に配置されており、
前記ゲルに濡れない素材と前記底面との間の前記内壁側面は前記ゲルに濡れる素材によって形成されていることを特徴とする細胞培養デバイス。
【請求項２】
前記ゲルに濡れない素材はＰＴＦＥ又はフッ素樹脂である請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項３】
前記ゲルに濡れない素材は多孔質のものである請求項１又は２に記載の細胞培養デバイス。
【請求項４】
前記ゲルに濡れる素材はＰＤＭＳ又はシリコーンゴムである請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
【請求項５】
前記培養室は、少なくとも下層側ＰＤＭＳシート、ＰＴＦＥシート、上層側ＰＤＭＳシートが下層側からその順に積層された積層体に対して積層方向に形成された貫通孔と、前記下層側ＰＤＭＳシートの前記ＰＴＦＥシートとは反対側の面に配置された底板によって形成された空間を備えており、
前記培養室内壁に露出した前記ＰＴＦＥシートの部分によって前記ゲルに濡れない素材で形成された部分が構成され、
前記培養室内壁に露出した前記下層側ＰＤＭＳシートの部分によって前記ゲルに濡れる素材で形成された部分が構成されている請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の足場となるゲルが収容される培養室を備えた細胞培養デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は、一般的にシャーレ等の容器に細胞及び液体状の培地を収容した状態で行なわれる。しかし、近年、半導体製造分野での微細加工技術の進歩に伴って、医療やバイオテクノロジーの研究分野でも微細加工技術によって製造されたマイクロデバイスの応用が進められている。そして、マイクロデバイスを用いた細胞培養が行われるようになっている（例えば、特許文献１を参照。）。
【０００３】
細胞培養用のマイクロデバイス（細胞培養デバイス）は、平板状基材の内部に培養室と微小流路が形成されて成るものである。その培養室に細胞及び培地が収容されて細胞培養が行なわれる。
【０００４】
ところで、近年、人工臓器の開発に期待が寄せられている。生体の化学工場にたとえられる肝臓は、判明しているだけで５００種類以上の代謝反応を行なっているとされる。このような肝臓の機能を人工的な装置で全て補うことは中長期的にみても極めて困難であると考えられている。そこで、生体の肝細胞を利用することが提案されている。このような技術は肝細胞と人工装置の組み合わせであることからハイブリッド型の人工肝臓と呼ばれる。
【０００５】
従来の人工肝臓システムでは、ブタなどから取り出した肝組織を用いて肝機能を補助することを目的としている。
肝臓は生体内では肝実細胞の他に、類洞内皮細胞などが規則正しく配列され、細胞間のシグナル伝達や体液の循環が正常な機能を維持するために重要な役割を果たしていると考えられる。特に、肝実質細胞と類洞内皮細胞は並行して並んでおり、それらの細胞列間は直接接触していない。それらの間にはディッセ腔と呼ばれる細胞外マトリックスがある。
【０００６】
それぞれの細胞列の外側は、肝実質細胞側は胆管、類洞内皮細胞側は血管となっている。肝機能を有する人工肝システムを確立するためには、これらの細胞種の規則正しい配置と細胞外マトリックスの構築が重要である。薬物や栄養物は血管側から供給され、胆管側に排出される。培養した細胞を用いた人工肝システムヘの取り組みもなされているが、安定したシステムは構築できていない。
【０００７】
また、肝細胞の培養そのものが難しく、その上、生体内の肝臓に近い組織を形成することはさらに困難である。このような理由から、長期間にわたって安定な肝機能を維持できる人エシステムは構築できていない。
【０００８】
この問題の対策として、本願発明者らは、ＥＨＳ−ｇｅｌ（Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma-derived matrix）上でネットワーク構造を構築した類洞内皮細胞に肝実質細胞が組み込まれていくことを見いだし（非特許文献１）、生体内に近い構造の肝組織デバイスを提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−５１９５９８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】藤山陽一、田川陽一、他５名、「管化内皮細胞培養システムを用いた肝実質細胞との共培養における肝機能の解析」、第３０回日本分子生物学会年会予稿集、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、細胞培養デバイスの培養室にＥＨＳ−ｇｅｌを塗布すると、ゲルが培養室の内壁側面に引っ張られて凹型のメニスカスが形成され、ゲル表面の平坦な部分が中央部に限られてしまうという問題があった。内皮細胞がネットワーク構造を形成するのはゲルが平坦な部分のみである。したがって、上記問題は培養室の小容量化や肝機能の十分な発現を妨げる。
【００１２】
本発明は、細胞の足場材となるゲルが収容される培養室を備えた細胞培養デバイスにおいて、ゲル表面の平坦な部分の面積を大きくすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明にかかる細胞培養デバイスは、細胞の足場材となるゲルが収容される培養室を備えた細胞培養デバイスであって、上記培養室の内壁側面はゲルに濡れない素材で形成された部分とゲルに濡れる素材で形成された部分とを備え、上記ゲルに濡れない素材は、上記内壁側面において上記培養室の底面から所定の間隔をもって、かつ上方から見て環状に配置されており、上記ゲルに濡れない素材と上記底面との間の上記内壁側面は上記ゲルに濡れる素材によって形成されていることを特徴とする細胞培養デバイスである。
ここで、「ゲルに濡れない素材」とは固体状になる前の流動性をもつ状態のゲルとの接触角が９０度以上の素材である。「ゲルに濡れる素材」とは固体状になる前の流動性をもつ状態のゲルとの接触角が９０度未満の素材である。
【００１４】
本発明の細胞培養デバイスでは、培養室の内壁側面はゲルに濡れない素材で形成された部分とゲルに濡れる素材で形成された部分とを備えている。ゲルに濡れない素材は、培養室の底面から所定の間隔をもって、かつ上方から見て環状に配置されている。さらに、ゲルに濡れない素材と培養室の底面との間の培養室の内壁側面はゲルに濡れる素材によって形成されている。固体化する前の流動性をもつ状態のゲルが培養室内に注入される際、ゲルの表面が濡れない素材で形成された部分とゲルに濡れる素材で形成された部分の境界の高さになるように、所定量のゲルが培養室内に注入される。これにより、従来の細胞培養デバイスを用いた場合に比べて、ゲル表面に形成されるメニスカスは小さくなる又は形成されない。
【００１５】
本発明の細胞培養デバイスにおいて、上記ゲルに濡れない素材の例としてＰＴＦＥ（polytetrafluoroethylene）又はフッ素樹脂が挙げられる。ただし、本発明の細胞培養デバイスにおいて、ゲルに濡れない素材はこれらに限定されない。
【００１６】
また、上記ゲルに濡れない素材は多孔質のものである例を挙げることができる。ただし、本発明の細胞培養デバイスにおいて、ゲルに濡れない素材は多孔質のものに限定されない。
【００１７】
また、上記ゲルに濡れる素材の例としてＰＤＭＳ（polydimethylsiloxane）又はシリコーンゴムが挙げられる。ただし、本発明の細胞培養デバイスにおいて、ゲルに濡れる素材はこれらに限定されない。
【００１８】
本発明の細胞培養デバイスにおいて、上記培養室は、下層側ＰＤＭＳシート、ＰＴＦＥシート、上層側ＰＤＭＳシートが下層側から順に積層された積層体に対して積層方向に形成された貫通孔と、上記下層側ＰＤＭＳシートの上記ＰＴＦＥシートとは反対側の面に配置された底板によって形成された空間を備えており、上記培養室内壁に露出した上記ＰＴＦＥシートの部分によって上記ゲルに濡れない素材で形成された部分が構成され、上記培養室内壁に露出した上記下層側ＰＤＭＳシートの部分によって上記ゲルに濡れる素材で形成された部分が構成されている例を挙げることができる。ただし、本発明の細胞培養デバイスにおいて、培養室の構成はこれに限定されない。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の細胞培養デバイスは、培養室の内壁側面に関し、ゲルに濡れない素材で形成された部分とゲルに濡れる素材で形成された部分とを備えている。ゲルに濡れない素材は、培養室の内壁側面において培養室の底面から所定の間隔をもって、かつ上方から見て環状に配置されている。ゲルに濡れない素材と培養室の底面との間の培養室の内壁側面はゲルに濡れる素材によって形成されている。本発明の細胞培養デバイスにおいて、ゲルの表面が濡れない素材で形成された部分とゲルに濡れる素材で形成された部分の境界の高さになるように、所定量のゲルが培養室内に注入されことにより、従来の細胞培養デバイスを用いた場合に比べて、ゲル表面に形成されるメニスカスは小さくなる又は形成されない。これにより、培養室内に塗布されたゲルの表面の平坦な部分の面積は、従来の細胞培養デバイスを用いた場合に比べて大きくなる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の細胞培養デバイスの一実施例の断面図である。
【図２】同実施例の平面図である。
【図３】同実施例を構成する各部材を分解して示した平面図である。
【図４】本実施例の細胞培養デバイスに塗布されたゲルの写真である。
【図５】従来の細胞培養デバイスに塗布されたゲルの写真である。
【図６】本実施例の細胞培養デバイスで培養された内皮細胞のネットワーク形成状態を示す写真である。
【図７】従来の細胞培養デバイスで培養された内皮細胞のネットワーク形成状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図１は本発明の細胞培養デバイスの一実施例の断面図である。図２は同実施例の平面図である。図１の断面は図２のＡ−Ａ位置に対応している。図３は同実施例を構成する各部材を分解して示した平面図である。
【００２２】
細胞培養デバイス１は、大きく分けて本体３とカバー部材５から成る。本体３は、底板７、下層側ＰＤＭＳシート９、ＰＴＦＥシート１１、上層側ＰＤＭＳシート１３、流路形成用ＰＤＭＳシート１５及び封止用ＰＤＭＳ１７を備えている。
【００２３】
底板７は例えばガラス基板で形成されている。底板７の寸法は例えば長さが２０ｍｍ（ミリメートル）、幅が２０ｍｍ、厚みが１ｍｍである。底板７は例えば樹脂基板や細胞培養用ディッシュなど、ガラスとは異なる素材で形成されたものであってもよい。底板７は、後述するゲルに濡れる素材で形成されていることが好ましい。ただし、底板７の素材はゲルに濡れない素材であってもよい。
【００２４】
下層側ＰＤＭＳシート９、上層側ＰＤＭＳシート１３及び流路形成用ＰＤＭＳシート１５はＰＤＭＳ（東レ・ダウコーニング株式会社製、ＳＩＬＰＯＴ１８４）で形成されている。ＰＤＭＳシート９，１３，１５の寸法は例えば長さが１８ｍｍ、幅が１８ｍｍ、厚みが０.５ｍｍである。
【００２５】
ＰＴＦＥシート１１はＰＴＦＥ（日本ゴア株式会社製、ゴア（登録商標）ハイパーシート（登録商標）ガスケット）で形成されている。ＰＴＦＥシート１１の寸法は例えば長さが１８ｍｍ、幅が１８ｍｍ、厚みが約０.５ｍｍである。
【００２６】
カバー部材５は例えばシリコーンゴムで形成されている。カバー部材５の寸法は例えば長さが２０ｍｍ、幅が２０ｍｍ、厚みが３ｍｍである。
【００２７】
下層側ＰＤＭＳシート９、ＰＴＦＥシート１１、上層側ＰＤＭＳシート１３及び流路形成用ＰＤＭＳシート１５は、それらのシート９，１１，１３，１５の周囲に形成された封止用ＰＤＭＳ１７によって一体化されている。ＰＤＭＳ１７を用いて封止した後の平面寸法は例えば長さが２０ｍｍ、幅が２０ｍｍである。
【００２８】
シート９，１１，１３，１５の中央に、それぞれ直径６ｍｍの貫通孔９ａ，１１ａ，１３ａ，１５ａが形成されている。貫通孔９ａ，１１ａ，１３ａ，１５ａ及び底板７によって培養室３ａが形成されている。なお、培養室３ａの内壁に露出したＰＴＦＥシート１１の部分によって、本発明の細胞培養デバイスにおける「ゲルに濡れない素材で形成された部分」が構成されている。また、培養室３ａの内壁に露出した下層側ＰＤＭＳシート９の部分によって、本発明の細胞培養デバイスにおける「ゲルに濡れる素材で形成された部分」が構成されている。
【００２９】
流路形成用ＰＤＭＳシート１５の隅には直径１.５ｍｍの貫通孔１５ｂが形成されている。流路形成用ＰＤＭＳシート１５の下面（上層側ＰＤＭＳシート１３側の面）に深さ０.１ｍｍの凹部１５ｃが形成されている。凹部１５ｃは貫通孔１５ａの周縁部に設けられた幅１ｍｍのドーナツ状の溝と、その溝と貫通孔１５ｂを連結する幅２ｍｍの溝とで形成されている。
【００３０】
カバー部材５に、貫通孔１５ｂに対応する位置に直径１.５ｍｍの貫通孔５ｂが形成されている。カバー部材５には、貫通孔５ｂが設けられた隅と対向する隅に直径１.５ｍｍの貫通孔５ａも形成されている。カバー部材５の下面（本体３側の面）に深さ０.１ｍｍの凹部５ｃが形成されている。凹部５ｃはカバー部材５の中央部に設けられた直径６ｍｍの凹部と、その凹部と貫通孔５ａを連結する幅２ｍｍの溝とで形成されている。
【００３１】
本体３の製造工程の一例について説明する。
貫通孔１５ａ，１５ｂが形成されておらず、凹部１５ｃが形成されている流路形成用ＰＤＭＳシート１５に対して貫通孔１５ｂが形成される。貫通孔１５ｂが形成された流路形成用ＰＤＭＳシート１５と、貫通孔１３ａが形成されていない上層側ＰＤＭＳシート１３とが貼り合わせられる。その際、シート１３，１５の接合面にはプラズマ処理が施される。貼り合わせられたシート１３，１５の中央部に貫通孔１３ａ，１５ａが形成される。
【００３２】
貫通孔９ａが形成されていない下層側ＰＤＭＳシート９の上に、貫通孔１１ａが形成されていないＰＴＦＥシート１１が配置される。このときのＰＴＦＥシート１１の厚みは０.５ｍｍである。ＰＴＦＥシート１１の上に、シート１３，１５の積層体が配置される。
【００３３】
シート９，１１，１３，１５の積層体の周囲が封止用ＰＤＭＳ１７によって封止される。これにより、シート９，１１，１３，１５が一体化される。このとき、流路形成用ＰＤＭＳシート１５が下層側ＰＤＭＳシート９側に加圧された状態で封止処理が行なわれることにより、多孔質のＰＴＦＥシート１１の厚みが減少した状態で、一体化されたシート９，１１，１３，１５及び封止用ＰＤＭＳ１７が形成される。すなわち、流路形成用ＰＤＭＳシート１５への加圧の程度を調節することにより、シート９，１１，１３，１５の積層体の厚みを調節できる。なお、封止処理の際に、下層側ＰＤＭＳシート９が流路形成用ＰＤＭＳシート１５側に加圧されることによっても同じ作用及び効果が得られる。
【００３４】
一体化されたシート９，１１，１３，１５及び封止用ＰＤＭＳ１７のシート９，１１に対して、貫通孔１３ａ，１５ａの位置に合わせて貫通孔９ａ，１１ａが形成される。下層側ＰＤＭＳシート９の下面（ＰＴＦＥシート１１とは反対側の面）に底板７が貼り合わされる。これにより、貫通孔９ａ，１１ａ，１３ａ，１５ａ及び底板７で構成された培養室３ａが形成される。
【００３５】
このようにして形成された本体３の上面（流路用ＰＤＭＳシート１５の上層側ＰＤＭＳシート１３とは反対側の面）にカバー部材５が貼り付けられることにより、細胞培養デバイス１が形成される。本体３とカバー部材５は自己吸着によってある程度の液密を保てる。本体３とカバー部材５を固定具により固定すれば、より安定したデバイスを形成できる。
【００３６】
細胞培養デバイス１が使用されるときの動作について説明する。
本体３及びカバー部材５をオートクレーブやアルコール等によって滅菌処理する。カバー部材５を外した状態で培養室３ａの底面に細胞の足場材となるゲル１９を塗布する。ゲル１９としては、例えばＥＨＳ−ｇｅｌを好適に用いることができる。ＥＨＳ−ｇｅｌは、ＥＨＳマウス肉腫細胞から単離した基底膜調製物であり、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン及びプロテオグリカンを豊富に含んでいる。このＥＨＳ−ｇｅｌは低温で液状化し、常温で固体状となる。
【００３７】
本体３が冷却した板の上に置かれる。冷却されたＥＨＳ−ｇｅｌがマイクロピペットで１４μＬ（マイクロリットル）によって培養室３ａに流し込まれる。培養室３ａに収容されたＥＨＳ−ｇｅｌは、冷えて粘性の低いうちに培養室３内に均等になるように拡げられる。ここで、底板７はゲル１９（ＥＨＳ−ｇｅｌ）に濡れる素材で形成されていることが好ましい。底板７がゲル１９に濡れない素材で形成されている場合、ゲル１９と底板７との間に気泡が形成されることが懸念されるからである。
【００３８】
培養室３ａに収容されたゲル１９の厚みは均等になれば約０.５ｍｍである。培養室３ａの内壁側面において、最下層の下層側ＰＤＭＳシート９の厚みは０.５ｍｍである。下層側ＰＤＭＳシート９の上層にはＰＴＦＥシート１１が配置されている。ゲル１９と下層側ＰＤＭＳシート９の接触角は９０度未満である。ゲル１９とＰＴＦＥシート１１の接触角は９０以上である。すなわち、培養室３ａに収容されたゲル１９において、ＰＴＦＥシート１１で形成された培養室３ａの内壁側面の部分にはゲル１９が濡れないので、メニスカスが形成されない。これにより、培養室３ａに収容されたゲル１９の表面はほぼ平坦になる。
本体３がインキュベーターの中に移動される。培養室３ａに収容されたゲル１９は固体化する。
【００３９】
図４は、本実施例の細胞培養デバイスに塗布されたゲルの写真である。図５は、従来技術の細胞培養デバイスに塗布されたゲルの写真である。図４及び図５において、白い部分がゲル表面の平坦な部分を示す。従来技術としては培養室の内壁側面がＰＤＭＳのみで形成されたものを用いた。
【００４０】
本実施例（図４）と従来技術（図５）を比較すると、本実施例のほうが従来技術に比べてゲル表面の平坦な部分の面積が大きいことがわかる。従来技術の細胞培養デバイスでは、培養室内に収容されたゲル１９に凹状のメニスカスが形成されているからである。
【００４１】
細胞培養デバイス１によって細胞培養を行なう際には、ゲル１９が塗布された培養室３ａに、カバー部材５を外した状態で培地及び細胞を収容し、その後、カバー部材５を本体３に取り付ける。このとき、カバー部材５を構成するシリコーンゴムの自己吸着性によりカバー部材５が本体３に密着する。なお、培養室３ａに収容される細胞は組織片の形で培養室３ａに収容してもよいし、個々の細胞に分離させた状態で収容してもよい。
【００４２】
図１中の矢印を参照して細胞培養デバイス１に供給される培地の流れを説明する。
貫通孔５ｂに培地が供給される。供給された培地は貫通孔１５ｂ及び凹部１５ｃを介して培養室３ａ内に導入される。培養室３ａへの培地の導入に伴い、培養室３ａ内の培地の一部は、凹部５ｃ及び貫通孔５ａを介して細胞培養デバイス１の外部へ排出される。
【００４３】
図６は、本実施例の細胞培養デバイスで培養された内皮細胞のネットワーク形成状態を示す写真である。図７は、従来の細胞培養デバイスで培養された内皮細胞のネットワーク形成状態を示す写真である。
【００４４】
従来技術（図７）では、培養室内に収容されたゲル１９に凹状のメニスカスが形成されているために、ゲル１９表面に平坦な部分が少なく、均一な内皮細胞２１のネットワークが形成されていない。
本実施例（図６）では、培養室内に収容されたゲル１９のメニスカスが小さいので、従来技術に比べてゲル１９表面の平坦な部分が大きく、比較的均一な内皮細胞２１のネットワークが形成されている。
【００４５】
以上の実施例は本発明の一例であり、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。例えば、上記細胞培養デバイスを構成する各部材の素材や寸法、配置などは、上記実施例に限らず、種々の変更が可能である。
【００４６】
例えば、ＰＤＭＳに替えてシリコーンゴムが用いられてもよい。また、ＰＴＦＥに替えて他のフッ素樹脂が用いられてもよい。
【００４７】
また、上記実施例では、培養室３ａの内壁側面は４層のシート９，１１，１３，１５によって形成されているが、本発明はこれに限定されない。本発明の細胞培養デバイスにおいて、培養室の内壁側面は、ゲルに濡れない素材で形成された部分とゲルに濡れる素材で形成された部分とを備え、ゲルに濡れない素材は、培養室の内壁側面において培養室の底面から所定の間隔をもって、かつ上方から見て環状に配置されており、ゲルに濡れない素材と培養室の底面との間の内壁側面はゲルに濡れる素材によって形成されている構成であれば、どのような構成であってもよい。
【００４８】
また、上記実施例において、流路（溝５ｃ，１５ｃ）の構成は種々の変更が可能である。例えば、カバー部材５に形成された溝５ｃは、流路用ＰＤＭＳシート１５の上面に形成されていてもよいし、流路用ＰＤＭＳシート１５の下面又は上層側ＰＤＭＳシート１３の上面に形成されていてもよい。また、流路用ＰＤＭＳシート１５に形成された溝１５ｃは上層側ＰＤＭＳシート１３の上面に形成されていてもよい。
【００４９】
また、カバー部材５とＰＤＭＳシート１５の間で貫通孔１５ａに対応する部分にフィルターを配置するようにしてもよい。これにより、ゲル１９による流路の詰まりを軽減することができる。
【符号の説明】
【００５０】
１  細胞培養デバイス
３ａ  培養室
７  底板
９  下層側ＰＤＭＳシート（ゲルに濡れる素材）
１１  ＰＴＦＥシート（ゲルに濡れない素材）
１３  上層側ＰＤＭＳシート
１９  ゲル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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