(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を標識化する方法において、
0005713923.tif 000023
［上式中、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択される］
から選択される標識用試薬を反応させることを含み、
タンパク質が抗体、インターフェロン、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン又は増殖因子から選択され、
それによって標識されたタンパク質が形成される方法。
【請求項２】
標識用試薬が、
0005713923.tif 000024
である請求項１記載のタンパク質の標識方法。
【請求項３】
標識用試薬が、
0005713923.tif 000025
である請求項１記載のタンパク質の標識方法。
【請求項４】
標識用試薬が、
0005713923.tif 000026
である請求項１記載のタンパク質の標識方法。
【請求項５】
タンパク質が遊離システインチオールを含む請求項１記載のタンパク質の標識方法。
【請求項６】
タンパク質の遊離システインチオールが標識用試薬と反応する請求項１記載のタンパク質の標識方法。
【請求項７】
0005713923.tif 000027
から選択される標識されたタンパク質を調製する方法であって、
0005713923.tif 000028
から選択されるアルキン試薬を、抗体、インターフェロン、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、又は増殖因子から選択されるタンパク質と反応させて、
0005713923.tif 000029
から選択されるアルキン−タンパク質を形成し、該アルキン−タンパク質を、銅触媒の存在下で、式：
0005713923.tif 000030
を有する１８Ｆ−ＰＥＧ−アジド試薬と反応させることを含み、
ここで、ｎ及びｍが独立して２から１２の整数から選択され；
それによって、標識されたタンパク質が形成される方法。
【請求項８】
0005713923.tif 000031
から選択される標識されたタンパク質を調製する方法であって、
0005713923.tif 000032
から選択されるアジド試薬を、抗体、インターフェロン、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、又は増殖因子から選択されるタンパク質と反応させて、
0005713923.tif 000033
から選択されるアジド−タンパク質を形成し、該アジド−タンパク質を、銅触媒の存在下で、式：
0005713923.tif 000034
［上式中、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択される］
を有する１８Ｆ−ＰＥＧ−アルキン試薬と反応させることを含み、
それによって標識されたタンパク質が形成される方法。
【請求項９】
タンパク質が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体から選択される抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がＦａｂ断片である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｆａｂ断片が４Ｄ５チオＦａｂである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
銅触媒がＣｕ(ＭｅＣＮ)４ＰＦ６又はＣｕＳＯ４である請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
0005713923.tif 000035
から選択され、ここで、ｎ及びｍが独立して２から１２の整数から選択される標識用試薬。
【請求項１４】
式：
0005713923.tif 000036
を有する請求項１３に記載の標識用試薬。
【請求項１５】
式：
0005713923.tif 000037
を有する請求項１３に記載の標識用試薬。
【請求項１６】
式：
0005713923.tif 000038
を有する請求項１３に記載の標識用試薬。
【請求項１７】
0005713923.tif 000039
［上式中、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択され；タンパク質は抗体、インターフェロン、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、及び増殖因子から選択される］
から選択される、標識されたタンパク質。
【請求項１８】
標識されたタンパク質と一又は複数の薬学的に許容可能な担体、流動促進剤、希釈剤、又は賦形剤を含有し、
ここで、標識されたタンパク質が、
0005713923.tif 000040
［上式中、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択される］から選択され；タンパク質は抗体、インターフェロン、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、及び増殖因子から選択される、薬学的組成物。
【請求項１９】
標識されたタンパク質を動物（ヒトを除く）に投与し；
標識されたタンパク質の存在をインビボにおいてイメージングによって検出することを含んでなり、
ここで、標識されたタンパク質が
0005713923.tif 000041
［上式中、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択される］から選択され；タンパク質は抗体、インターフェロン、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、及び増殖因子から選択される、イメージング方法。
【請求項２０】
標識されたタンパク質が抗原に結合する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物が腫瘍異種移植マウスモデルである請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
標識されたタンパク質を含むイメージング剤であって、
標識されたタンパク質を動物に投与し；
標識されたタンパク質の存在をインビボにおいてイメージングによって検出することを含んでなり、
ここで、標識されたタンパク質が
0005713923.tif 000042
［上式中、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択される］から選択され；タンパク質は抗体、インターフェロン、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、及び増殖因子から選択される、イメージング剤。
【請求項２３】
標識されたタンパク質が抗原に結合する請求項２２に記載のイメージング剤。
【請求項２４】
動物が腫瘍異種移植マウスモデルである請求項２２に記載のイメージング剤。
【請求項２５】
式：
0005713923.tif 000043
［上式中、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択される］
を有する標識用試薬を作製する方法であって、
式：
0005713923.tif 000044
を有するマレイミド−ＰＥＧ−アルキン試薬を、式：
0005713923.tif 000045
［上式中、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択される］
を有する１８Ｆ−ＰＥＧ−アジド試薬と銅触媒の存在下で反応させることを含み、それによって標識用試薬が形成される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
米国特許法施行規則第３７条１．５３（ｂ）に基づき出願されたこの非仮出願は、出典明示により全体が援用される２００９年２月２７日出願の米国仮出願第６１／１５６１６５号の米国特許法第１１９条第（ｅ）項の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般にタンパク質に基をコンジュゲートし又は標識する方法に関する。本発明はまた新規な治療薬及び診断試験の研究及び臨床開発のための標識タンパク質、標識タンパク質を調製するために有用な中間体及び試薬にも関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質及びペプチドは細胞表面バイオマーカーの分子イメージングのために利用できる医療設備の大部分を占める。遺伝子操作により製造される標的タンパク質はＰＥＴイメージング剤として非常に魅力的であるが、一般的な１８Ｆベースの補欠分子族での標識化は、長い合成時間、乏しい放射化学的収率、低い比活性のため問題がある。「理想的な」イメージング剤の開発は重要な目標であるが、実際には、多くのイメージング剤が、最初は潜在的な治療剤として又は標的のバイオロジーを探求するために開発されている既存のタンパク質、例えばモノクローナル抗体（Ｍａｂ）及びその遺伝子操作断片から開発されている。ＰＥＴイメージング剤は、診断アッセイ又はバイオマーカー試験において機能し、患者の選択を可能にし、治療剤候補に対する効能選択についての決定を知らせ、同じレセプター又は疾患経路を標的とする治療剤の臨床的恩恵を最大にしうる。予測バイオマーカー試験は特定の治療が有効である見込みがあるかどうかを予測するために治療前に実施される。予後バイオマーカーは疾患の結果に相関し、臨床試験計画及び治療、及びデータ解釈信頼レベルを改善しうる。
【０００４】
Ｍａｂ鋳型（イムノＰＥＴ）からの陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）イメージング剤の開発は、分子標的を局在化させ、定量するツールとしての見込みがあり、病理状態の非侵襲的臨床診断を増強しうる（van Dongen 等(2007) Oncologist 12;1379-89；Williams等(2001) Cancer Biother Radiopharm 16:25-35；Holliger 等(2005) Nat Biotechnol 23:1126-36）。ＰＥＴイメージングシステムは、患者の組織中の陽電子放出同位体の分布に基づいて画像を作り出す。同位体は、典型的には、体内で容易に代謝されるかもしくは局在化される分子（例えば、グルコース）又は体内のレセプター部位に化学的に結合する分子に共有結合される陽子放射同位体元素、例えば、Ｆ−１８、Ｃ−１１、Ｎ−１３、又はＯ−１５等を含むプローブ分子を注射することにより、患者に投与される。ある場合には、同位体はイオン溶液として又は吸入により患者に投与される。小さな免疫ＰＥＴイメージング剤、例えばＦａｂ抗体断片（５０ｋＤａ）又はダイアボディ、Ｍａｂの共有的に結合されるＶＨ−ＶＬ領域のペアード二量体５５ｋＤａ（Shively等(2007) J Nucl Med 48:170-2）は、短い循環半減期を示し、組織への透過性が高く、注射から２から４時間後に最適な腫瘍集積比（tumor to background ratio）に達し、汎用性のある１８Ｆ（１０９．８分）のような短い半減期の同位体の使用を容易にするので、特に有用でありうる。
【０００５】
遺伝子操作により作られた標的タンパク質はＰＥＴイメージング剤として非常に魅力的であるが、従来の１８Ｆベース補欠分子族での標識化は、長い合成時間、悪い放射化学的収率、低い比活性のため、１８Ｆをタンパク質中に効率的に導入させ得る様々な水溶性補欠分子族の迅速な調製のためのモジュラープラットホームには問題がある。これらの抗体断片の高特異性での１８ＦベースＰＥＴイメージングによってもたらされる感度と高分解能を組み合わせることは、新規な診断アッセイ及び治療薬の研究及び臨床開発に特に魅力的な方策である。現在の方法による１８Ｆ標識タンパク質の生産は、比較的マイルドな水性反応条件が殆どのタンパク質の機構を保存するために必要とされるから、不十分である。タンパク質コンジュゲーションに使用される既存の１８Ｆ標識された補欠分子族は、低い放射化学的収率、長い合成時間、及び低い比活性の幾つかの組み合わせによってしばしば制限される。１８Ｆ標識タンパク質の作製方法の改善は、ヒトの分子イメージングの促進において、標的発現のレベル、不均一性及び発現経過のような臨床開発プロセスに取り組むのに貴重である。
【０００６】
部位特異的コンジュゲーションは、結合部位から離れた部位の化学修飾を可能とし、生物学的活性の完全な維持を促進し、加えられる補欠分子族の可能な数についての制御を可能にするので、ランダムなアミノ修飾よりも望ましい。選択位置にシステインを含む遺伝子操作されたタンパク質が、部位特異的コンジュゲーションの開発のために研究されてきている（Junutula, J.R.等(2008) J Immunol Methods 332:41-52；米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号）。補欠分子族による操作システイン残基上のチオール基の放射性核種標識化は、非反応性ジスルフィド型が優性であるプロテオーム内にシステインの存在が限定されるため、部位特異的な方法として有利である（Olafsen 等(2004) Protein Eng Des Sel 17:21-7；Tait 等(2006) J Nucl Med 47:1546-53；Li 等(2008) Bioconjug Chem 19:1684-8）。タンパク質工学法のＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲは、システイン置換に最適なアミノ酸位置を選択するためのファージディスプレイライブラリーを用いる（Junutula等 (2008) Nat Biotechnol 26:925-32；Junutula 等(2008) J Immunol Methods 332:41-52；米国特許出願第２００７／００９２９４０号）。ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ法を使用して、タンパク質安定性及び結合親和性が維持される一方、望まれないジスルフィド結合の形成が最小化され、最適なコンジュゲーション効率が得られる。この方法は、利用できるシステイン（チオＭａｂ）を含む修飾されたＭａｂを製造するのに使用され、それから反応性チオール基を有するＦａｂ断片（チオＦａｂ）が簡便に産生される。
【０００７】
［１８Ｆ］ＦＢＥＭ（Cai 等(2006) J Nucl Med 47:1172-80）、［１８Ｆ］ＦＢＡＭ（Berndt等(2007) Nucl Med Biol 34:5-15）、［１８Ｆ］ＦＢＡＢＭ（Li等(2008) Bioconjug Chem 19:1684-8;Toyokuni等(2003) Bioconjug Chem 14:1253-9）、［１８Ｆ］ＦＢＯＭ（Wuest等(2009)Amino Acids 36:283-295）、［１８Ｆ］ＦＤＧ−ＭＨＯ（Wuest等(2008)Bioconjug Chem 19:1202-10）、及び［１８Ｆ］ＦＰｙＭｅ（de Bruin等(2005)Bioconjug Chem 16:406-20）のようなマレイミド基を含む補欠分子族は、チオール担持タンパク質に１８Ｆを部位特異的に導入するため使用されてきた。これらの標識用試薬［１８Ｆ］ＦＢＥＭ、［１８Ｆ］ＦＢＡＭ、［１８Ｆ］ＦＢＡＢＭ、及び［１８Ｆ］ＦＢＯＭは、芳香族前駆体１８Ｆ−フルオロベンズアルデヒド（［１８Ｆ］ＦＢＡＬＤ）がアミノオキシ担持マレイミド前駆体にカップリングされる共通のプラットフォームから開発されている。しかし、芳香族及び（［１８Ｆ］ＦＢＯＭを除く）脂肪族部分の存在は、これら補欠分子族の親油性を高め、潜在的に親水性環境内に存在するタンパク質チオール基とのコンジュゲーション効率を潜在的に制限する。更に、これらの補欠分子族は長い合成時間を必要とし、典型的には１８Ｆ標識タンパク質の比較的低い放射化学的収率をもたらす。
【発明の概要】
【０００８】
タンパク質中に１８Ｆを効率的に導入することが可能な様々な水溶性補欠分子族の迅速な調製のためのモジュラープラットフォームが提供される。
本発明の一態様は、標識用試薬とタンパク質を反応させて標識されたタンパク質を形成することを含むタンパク質の標識方法を含む。標識用試薬には、
0005713923.tif 000002
が含まれ、ここで、ｎ及びｍは独立して２から１２の整数から選択される。
【０００９】
本発明の一態様には、標識用試薬の作製方法が含まれる。
本発明の一態様には、
0005713923.tif 000003
0005713923.tif 000004
から選択される標識されたタンパク質が含まれる。
【００１０】
本発明の一態様には、標識されたタンパク質と一又は複数の薬学的に許容可能な担体、流動促進剤、希釈剤、又は賦形剤を含有する薬学的組成物が含まれる。
【００１１】
本発明の一態様には、標識されたタンパク質を動物に投与し、標識されたタンパク質の存在をイメージングによってインビボで検出することを含むイメージング方法が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡを使用してＦａｂ断片を放射標識するための例示的な合成経路を示す。ＰＥＧ＝２−１２エチルオキシ単位
【図２】［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡを使用してＦａｂ断片を放射標識するための例示的な合成経路を示す。
【図３】中間体２及び４の合成を示す。試薬：ｉ．ＮａＨ、臭化プロパルギル；ｉｉ．マレイミド、ＰＰｈ３、ＤＩＡＤ；ｉｉｉ．ＴｓＣｌ、ピリジン；ｉｖ．ＴＢＡＨＣＯ３、［１８Ｆ］フッ化物
【図４】［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５の合成及び［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ−チオ４Ｄ５Ｆａｂ６を得るためのチオＦａｂの放射標識を示す。試薬：ｖ．ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ＢＰＤＳ、アスコルビン酸ナトリウム；ｖｉ．リン酸緩衝液ｐＨ８
【図５】（ａ）コントロール動物（下段）と比較した１７−ＡＡＧ治療（上段）前（１日目）及び後（１日目）での動物の代表的なマイクロＰＥＴ画像（腫瘍の冠状切片）を示す。（ｂ）処置前後の腫瘍組織中での１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂの取り込みを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（例示的な実施態様の詳細な説明）
本発明のある実施態様を詳細に参照するが、その例を添付の構造及び式で例証する。本発明を列挙する実施態様に関連して説明するが、それらは本発明をその実施態様に限定することを意図するものではないことは理解されよう。それどころか、本発明は特許請求の範囲によって定まる本発明の範囲に含まれうるあらゆる代替例、変形例、及び均等物を包含することが意図される。当業者であれば、本発明の実施において使用されうるここに記載のものと同様な又は均等な多くの方法及び材料が分かるであろう。本発明は記載された方法及び材料に決して限定されるものではない。
【００１４】
特に別に定義しない限り、ここで使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有し、Singleton等, (1994)“Dictionary of Microbiology and Molecular Biology”, 2版, J. Wiley & Sons, New York, NY；及びJaneway, 等(2001) “Immunobiology”, 5版, Garland Publishing, New Yorkに従っている。商品名がここで使用される場合、本出願人は商品名の製剤、ジェネリック医薬品、及び商品名の製品の活性な薬学的成分を独立に含むものである。
【００１５】
定義
他の記載がなければ、次の用語及び語句は次の意味を有するものである：
「タンパク質」は直鎖状に配置され、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル及びアミノ基間のペプチド結合によって互いに接合されたアミノ酸から構成される有機化合物である。タンパク質は生物学的な巨大分子であり、酵素及び抗体を含む。多くのタンパク質は代謝、細胞シグナル伝達、免疫反応、細胞接着、細胞周期作用に非常に重要であり、又は筋肉及び細胞骨格におけるように、構造的な又は機械的な機能を有している。例示的なタンパク質の機能的クラスには、抗体、非抗体代替結合タンパク質(Binz 等(2005) Nature Biotechnology 23(10):1257-1268；Skerra, A. (2007) Current Opin. in Biotech. 18:295-304)、インターフェロン、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、又は増殖因子が含まれる。
【００１６】
「抗体」は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、二重作用Ｆａｂｓ、及び他の抗体断片を包含する。抗体はマウス、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種由来でありうる。抗体は特定の抗原を認識し結合することができる免疫系によって産生されるタンパク質である。（Janeway等 (2001) "Immunobiology", 5版, Garland Publishing, New York）。標的抗原は、一般に、複数の抗体のＣＤＲによって認識されるエピトープとも呼ばれる数多くの結合部位を有している。異なったエピトープに特異的に結合する各抗体は異なった構造を有している。よって、一つの抗原は一を越える対応の抗体を有しうる。抗体は、また、完全長免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり、対象の標的の抗原又はその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含み、かかる標的は、限定しないが、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチド、つまり腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、抗体ベース療法を介して破壊の目的で癌細胞を特異的にターゲティングすることを可能にする。ここに開示された免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブラスでありうる。免疫グロブリンは、如何なる種からも誘導されうる。しかし、一態様では、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、又はウサギ由来を含む任意の種から誘導されうる。
【００１７】
本発明の方法に有用な治療用モノクローナル抗体には、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）, Genentech社, Carter 等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285-4289；米国特許第５７２５８５６号）；抗ＣＤ２０抗体、例えばキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」（米国特許第５７３６１３７号）；リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、オクレリズマブ、２Ｈ７抗体（米国特許第５７２１１０８号；国際公開第０４／０５６３１２号）又はトシツモマブ（ベキサール（登録商標））のキメラ化又はヒト化変異体；抗ＩＬ−８(St John等(1993)Chest, 103:932,及び国際公開第９５／２３８６５号）；抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化及び／又は親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）,Genentech社, Kim等(1992)Growth Factors 7:53-64,国際公開第９６／３００４６号、国際公開第９８／４５３３１号)；抗ＰＳＣＡ抗体（国際公開第０１／４０３０９号）；抗ＣＤ４０抗体、例えばＳ２Ｃ６及びそのヒト化変異体（国際公開第００／７５３４８号）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５６２２７００号；国際公開第９８／２３７６１号;Steppe等(1991)Transplant Intl. 4:3-7；Hourmant等(1994) Transplantation58:377-380)；抗ＩｇＥ(Presta等(1993) J. Immunol. 151:2623-2632；国際公開第９５／１９１８１号）；抗ＣＤ１８（米国特許第５６２２７００号；国際公開第９７／２６９１２号）；抗ＩｇＥ、例えばＥ２５、Ｅ２６及びＥ２７（米国特許第５７１４３３８号；米国特許第５０９１３１３号；国際公開第９３／０４１７３号；米国特許第５７１４３３８号）；抗Ａｐｏ−２レセプター抗体（国際公開第９８／５１７９３号）；抗ＴＮＦ−α抗体、例えばｃＡ２（レミケード（登録商標））、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ−１９５（米国特許第５６７２３４７号；Lorenz等(1996)J. Immunol. 156(4):1646-1653；Dhainaut等(1995) Crit. Care Med. 23(9):1461-1469)；抗組織因子（ＴＦ）(欧州特許０４２０９３７Ｂ１号)；抗ヒトα４β７インテグリン（国際公開第９８／０６２４８号）；抗ＥＧＦＲ、キメラ化又はヒト化２２５抗体（国際公開第９６／４０２１０号）；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（米国特許第４５１５８９３号）；抗ＣＤ２５又は抗ｔａｃ抗体、例えばＣＨＩ−６２１シムレクト（登録商標）及びゼナパックス（登録商標）（米国特許第５６９３７６２号）；抗ＣＤ４抗体、例えばｃＭ−７４１２抗体(Choy等(1996)Arthritis Rheum 39(1):52-56)；抗ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ(Riechmann等(1988) Nature 332:323-337)；抗Ｆｃレセプター抗体、例えばGraziano等(1995)J. Immunol. 155(10):4996-5002におけるようなＦｃガンマＲＩに対するＭ２２抗体；抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体、例えばｈＭＮ−１４(Sharkey等(1995) Cancer Res. 55(23Suppl):5935s-5945s;乳房上皮細胞に対して検出される抗体、ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３及びＣＨＬ６(Ceriani等(1995)Cancer Res. 55(23):5852s-5856s;and Richman等(1995)Cancer Res. 55(23 Supp)が含まれる:5916s-5920s);結腸癌細胞に結合する抗体、例えばＣ２４２(Litton等(1996) Eur J. Immunol.26(1):1-9）；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ１３／５(Ellis等(1995) J. Immunol. 155(2):925-937)；抗ＣＤ３３抗体、例えばＨｕ Ｍ１９５(Jurcic等(1995)Cancer Res55(23 Suppl):5908s-5910s及びＣＭＡ−６７６又はＣＤＰ７７１；抗ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２又はＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ(Juweid 等(1995) Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s); 抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７−１Ａ（パノレックス（登録商標））；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばアブシキシマブ又はｃ７Ｅ３Ｆａｂ（レオプロ（登録商標））；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ−４９３（シナジス（登録商標））；抗ＣＭＶ抗体、例えばプロストビル（ＰＲＯＴＯＶＩＲ）（登録商標）；抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；抗肝炎抗体、例えば抗ＨｅｐＢ抗体オスタビル（ＯＳＴＡＶＩＲ）（登録商標）；抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプのＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗αｖβ３抗体ビタキサン（ＶＩＴＡＸＩＮ）（登録商標）；抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ−Ｇ２５０；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平細胞癌（ＳＦ−２５）；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔ ＩＤ１０及び抗ＨＬＡＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）がある。
【００１８】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般には、その抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ、線状抗体、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、ＥＣＤ（細胞外ドメイン）、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原又は微生物抗原、単鎖抗体分子に免疫特異的に結合する上記の何れかのエピトープ結合断片；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００１９】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合もまた知られている。
【００２０】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対してのものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対したものである。それらの特性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体で汚染されないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産することを必要としていると解されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等(1975) Nature 256:495に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製されうる（米国特許第４８１６５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」は、また、例えばClackson等(1991) Nature, 352:624-628；Marks等(1991) J. Mol.biol.,222:581-597に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００２１】
「システイン操作抗体」は、一又は複数の遊離システインアミノ酸を導入することにより野生型又は親抗体を操作した抗体である。「遊離システインアミノ酸」は、親抗体中に操作されたシステインアミノ酸残基であり、チオール官能基（−ＳＨ）を持ち、分子間又は分子内ジスルフィド架橋として対とならないか又は一部とならない。遊離アミノ酸は抗体の重鎖、軽鎖又はＦｃ領域中にありうる。操作されたシステイン残基（「遊離システインチオール」）はチオール反応性標識用試薬と反応性である。システイン操作抗体はＦＡＢ抗体断片（チオＦａｂ）及び発現された完全長ＩｇＧモノクローナル（チオＭａｂ）抗体（米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号；国際公開第２００８／１４１０４４号、これらの内容は出典明示により援用される）を含む。チオＦａｂ及びチオＭａｂ抗体を、新たに導入されたシステインチオールにおいてチオール反応性リンカー試薬及び薬剤リンカー試薬とコンジュゲートさせ、抗体薬剤コンジュゲートを調製する。
【００２２】
「ＰＥＧ」は、エチレンオキシドのポリマーであるポリ(エチレングリコール)の断片を意味し、２又はそれ以上のエチレンオキシ単位(-ＣＨ２ＣＨ２Ｏ-)を含む。
【００２３】
標識用試薬の合成
本発明は、１８Ｆをタンパク質に効率的に導入することができる様々な水溶性補欠分子族の迅速な調製のためのモジュラープラットホームを含む（Gill等(2009)Jour. Med. Chem. 52(19):5816-5825）。このプラットホームの有用性は、２工程のワンポット合成で迅速に製造される標識用試薬［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５とチオール特異的補欠分子族とによって実証される（図１）。加えて、水溶解度とその結果の水性条件下でのタンパク質との［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡのコンジュゲーション効率を促進させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの「構築ブロック」を使用した。［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５は４Ｄ５チオＦａｂでの補欠分子族として評価され、得られたコンジュゲート（１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂ）は、Ｈｓｐ９０阻害剤によって調節されるヒト腫瘍異種移植マウスモデルでのＨＥＲ２発現レベルの造影剤としてインビボで確認された（Smith-Jones等(2006) J Nucl Med 47:793-6；Smith-Jones等(2004)Nat Biotechnol 22:701-6）。
【００２４】
例示的な実施態様［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５の有用性は、チオール特異的ブロモアセトアミド化合物［１８Ｆ］ＦＰＥＧＢＡ、アミノ特異的Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化合物［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳ、アジド特異的化合物［１８Ｆ］ＦＰＥＧ−プロパルギル、及びアルキン特異的化合物［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮ３を含む、考えられうる（図３）様々な１８Ｆ標識された補欠分子族及び標識用試薬を実証している。例えばマイケル付加のアクセプターとしてのビニルスルホン、更なる硫黄アルキル化試薬としてのクロロ−及びヨードアセトアミドのような、他のチオール特異的官能性を１８Ｆ標識された補欠分子族及び標識用試薬に利用しうる。リジン及びタンパク質の他のアミノ基を標識するためのアミノ特異的官能基は、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、及びスルホヒドロキシサクシンイミドのような様々な活性化カルボン酸エステルを含む。
【００２５】
有用な合成手順は、しばしば「クリックケミストリー」とも称される１,３-双極子環化付加反応によりアジド及びアルキン中間体から標識用試薬を調製する銅（Ｉ）触媒アジド-アルキン環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）である。タンパク質のような生体分子に見出されるものを含む殆どの官能基へのＣｕＡＡＣの速やかな反応速度及び直交性は、生成物の１,２,３-トリアゾリル基を形成する高い収率と安定性を促進する。よって、ＣｕＡＡＣは、アジド及びアルキン官能基を含むヘテロ二官能性前駆体をカップリングさせる強力な方法を提供する。
【００２６】
クリックケミストリーは、その生物学的な標的に対して極めて高い親和性を示す、ＰＥＴイメージング用トレーサーとしてのタンパク質にコンジュゲートする標識用試薬を設計する機会を提供する。クリックケミストリーは、図１、２及び４で例示される化学合成へのモジュラーアプローチである。クリックケミストリー技術は、例えばその全体が出典明示によりここに援用される次の文献に記載されている：Kolb 等(2001) Angew. Chem. Int. Ed. 40:2004-2021；Kolb 等(2003) Drug Discovery Today 8:1128-1137；Rostovtsev 等(2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599；Tornoe 等(2002) Jour. of Org. Chem. 67:3057-3064；Wang 等(2003) Jour. of the Am. Chem. Soc. 125:3192-3193；Lee 等(2003) Jour. of the Am. Chem. Soc. 125:9588-9589；Lewis 等(2002) Angew. Chem., Int. Ed. 41:1053-1057；Manetsch 等(2004) Jour. of the Am. Chem. Soc. 126:12809-12818；Mocharla 等(2005) Angew. Chem. Int. Ed. 44:116-120；Whiting 等(2006) Angew. Chem. 118:1463-1467；Whiting 等(2006) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 45:1435-1439。
【００２７】
一例は、銅触媒Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６（実施例５）を用いた２工程のワンポット合成（図１）で素早く製造されたマレイミド担持補欠分子族［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５である。ＣｕＳＯ４、ＣｕＩ、ＣｕＢｒ、ＣｕＯＴｆ（米国特許第７３７５２３４号）を含む様々な他の銅触媒をトリアゾールの形成に用いることができる。銅触媒は水和又は溶媒和形態でありうる。使用される銅試薬は、アスコルビン酸ナトリウムのような還元試薬の存在下でのＣｕ０種、例えば銅ワイヤー、ＣｕＩ塩、又はＣｕＩＩ塩でありうる。ＰＥＧが２から１２のエチレンオキシ基(-ＣＨ２ＣＨ２Ｏ-)のポリエチレンオキシ単位である二官能性のアジド-トシレート中間体Ｎ３-ＰＥＧ-ＯＴｓ、例えば、２３-アジド-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコス-１-イルｐ-トルエンスルホネート３（実施例３）は、１８Ｆアニオンでフッ素化され、２３-アジド-１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコサン４（実施例４）によって例示される放射化学中間体Ｎ３-ＰＥＧ-１８Ｆを生成する。加えて、水溶解度と、その結果得られる水性条件下でのタンパク質との［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５のコンジュゲーション効率を促進するため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースとする「構築ブロック」を使用した。［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５は４Ｄ５チオＦａｂとの補欠分子族として評価し、得られたコンジュゲート（１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂ６）は、Ｈｓｐ９０阻害剤によって調節されるヒト腫瘍異種移植マウスモデル中におけるＨＥＲ２発現レベルのイメージング剤としてインビボで実証された（Smith-Jones等(2006)J Nucl Med 47:793-6；Smith-Jones 等(2004) Nat Biotechnol 22:701-6）。
【００２８】
［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡの合成に対しての考慮事項は、ＰＥＧ鎖を持つ水溶性構築ブロックの使用、マイクロ波によって促進する加熱、ＣｕＡＡＣ系を介した反応物質のカップリング、及び続く確認と共に４Ｄ５チオＦａｂのようなタンパク質への［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５の部位特異的な反応の最適化を含む。親水性補欠分子族は４Ｄ５チオＦａｂ及び他の親水性タンパク質と優れたコンジュゲーション動態と効率をもたらす。従って、ＰＥＧ鎖を持つ構築ブロックを、それらが１８Ｆの求核性取込みに必要とされる有機溶媒中における溶解度を損なわずに水への溶解性を改善するので、研究した。本発明の補欠分子族は［１８Ｆ］ＦＢＡＬＤプラットフォームから得られた化合物より更に水溶性である。例えば、計測された［１８Ｆ］５（−２．４１±０．０９）のｌｏｇＰは、［１８Ｆ］ＦＢＯＭに対して報告された値から３単位で、［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡから５単位を越える（Wuest等(2009)AminoAcids36:283-295）。４Ｄ５チオＦａｂ及びおそらく一般には親水性タンパク質へのコンジュゲートにおける水溶性補欠分子族の利点は、匹敵する条件下で［１８Ｆ］ＦＢＡＭと比較して［１８Ｆ］５は優れたコンジュゲーション効率をもたらしたという知見により実証された。
【００２９】
マイクロ波加熱は［１８Ｆ］４の収率を改善し、一般的な加熱条件と比較して［１８Ｆ］５の総合成時間を低減した。溶媒加熱の有意な促進が、３の１８Ｆフッ素化、ＴＢＡＨＣＯ３又はＫ２２２／Ｋ２ＣＯ３溶離液からの水の共沸除去、及び方法Ａ及びＢに対する［１８Ｆ］のアルミナ処理後のアセトニトリルの蒸発中に観察された。一般の放射化学に使用されるマイクロ波加熱のそのような利点は一般的であろう。しかしながら、重要な警告は、高いマイクロ波電力（５０Ｗ以上）又は温度（１００℃以上）が使用される場合、共沸による水の除去の間に、Ｋ２２２／Ｋ２ＣＯ３分解が観察されたことである。従って、一般的な加熱条件と比較してそれに匹敵する蒸発時間と匹敵するかより優れた１８Ｆフッ素化収率をもたらす穏やかなマイクロ波加熱条件が、Ｋ２２２／Ｋ２ＣＯ３溶離剤から水を共沸的に除去するために必要とされる。
【００３０】
アジド及びアルキン担持前駆体試薬をカップリングし標的用試薬［１８Ｆ］５を製造するのに使用されるＣｕＡＡＣ法は、観察された反応速度、転換効率、及び純度に基づいて選択した（実施例５）。方法Ａで観察される［１８Ｆ］５の低い純度は、２０分の反応時間にわたる水性条件下におけるマレイミドベース化合物の不安定に起因する場合がある。ＣｕＡＡＣ反応速度とタンパク質コンジュゲーションでの直交性を改善するための触媒として確立された２つの二座配位子ＢＰＤＳ及びＴＢＴＡを使用した（Lewis等(2004)J Am Chem Soc 126:9152-3；Rodionov等(2007)J Am Chem Soc 129:12705-12;Rodionov等(2007)J Am Chem Soc 129:12696-704）。ＢＰＤＳを方法Ａの反応系に加えたときに［１８Ｆ］５に対して観察される純度の劇的な改善は、水性条件下での［１８Ｆ］５の分解を制限する方法Ｂの短い反応時間から生じうる。これは、［１８Ｆ］５の経時的な分解が方法Ａと方法Ｂの間で一般に比較できたという知見によって補強される。方法Ａ及びＢにおいて、ＴＢＡＨＣＯ３はＫ２２２／Ｋ２ＣＯ３よりも１８Ｆ標識分解産物を有意に減少させたが、これは水性条件下における塩基性試薬に対するマレイミドの感受性に起因する。ＣｕＡＡＣの前にアルミナ処理が含められた場合に観察された［１８Ｆ］５の改善された純度は、生成物の塩基への感受性を更に示している。
【００３１】
方法Ｂにおいて観察された反応時間及び純度の改善にもかかわらず、有機溶媒中で実施されたＣｕＡＡＣ反応は［１８Ｆ］５の安定性を促進するであろう。これは方法Ｃの研究を促し、方法Ｃを無水アセトニトリル中で実施したが、そこでは［１８Ｆ］５は安定であり、２，６−ルチジンのような塩基性試薬に耐えさえした。しかしながら、続く［１８Ｆ］５の分解を防ぐために、ＣｕＡＡＣ反応を、０．０１％のトリフルオロ酢酸を含む水でクエンチした。この例では、方法Ｃは方法Ａに比べて有意に高い純度と、方法Ｂに匹敵する純度をもたらす。更に、［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳのようなより水性の不安定な補欠分子族では、方法Ｃは方法Ａ及びＢに比べて有意に高い純度をもたらした。
【００３２】
方法Ｂ及びＣでは匹敵する収率が［１８Ｆ］４又は［１８Ｆ］ＦＰＥＧ４Ｎ３を使用して得られた。［１８Ｆ］ＦＰＥＧ２Ｎ３に対して観察された限られた水溶解性は方法Ｃを区別した。加えて、方法Ｃは１８Ｆフッ素化及びＣｕＡＡＣ反応工程の間にアルミナ処理を必要としない。従って、方法Ｃは、様々な１８Ｆで標識された補欠分子族の製造のための一貫した放射化学プロセスの開発を容易にする一般的な放射化学用途によく適応しうる。これは自動化に対して強い意味を持ち得、［１８Ｆ］ＳＦＢでの場合のように、特定の補欠分子族に対して合成モジュールをとっておく必要性を排除しうる。
【００３３】
方法Ｃの緻密化は［１８Ｆ］５の最適化及び４Ｄ５チオＦａｂの検証の後になされたので、方法Ｂを主として［１８Ｆ］５の生産のために用いた。しかしながら、方法Ｃでは、方法Ｂに匹敵する収率で［１８Ｆ］５と１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂを提供することが確認された。よって、方法Ｂ及びＣは共に［１８Ｆ］５を用いた１８Ｆ標識タンパク質の調製に有用であり、他の放射性核種を使用する広範囲の放射化学の用途に適している場合がある。
【００３４】
ＣｕＡＡＣ反応の直交性は共通の反応プラットフォームからの様々な１８Ｆ標識された補欠分子族の開発を容易にする。官能基選択性及び中間体鎖構造のような特定の性質を改変することによって、幾つかの補欠分子族はタンパク質及び潜在的にはペプチド中に１８Ｆを導入することが可能である（図５）。［１８Ｆ］５に加えて、方法Ｃを用いて、商業的に入手可能な前駆体Ｎ３-ＰＥＧ４-ＮＨＳからアミノ特異的補欠分子族［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳ１３を４Ｄ５チオＦａｂにコンジュゲートした。安定性を確保し、［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳの収率を促進することに加えて、本発明の標識は、ランダムなアミノ特異的修飾の免疫反応特性の減少を制限しうる。例えば、タンパク質結合部位内の［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳの立体障害は、より小さい中間体鎖を持つ構築ブロックを使用することによって減少されうる。従って、［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳは、アミノ特異的コンジュゲーションを実施するための［１８Ｆ］ＳＦＢの代替である。更に、チオール特異的ブロモアセトアミドアナログ［１８Ｆ］ＦＰＥＧＢＡは、方法Ｂを使用するタンパク質の標識に有用である。
【００３５】
チオール特異的ブロモアセトアミド化合物［１８Ｆ］ＦＰＥＧＢＡ、アミノ特異的Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）化合物［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳ、アジド特異的化合物［１８Ｆ］ＦＰＥＧ−プロパルギル、及びアルキン特異的化合物［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮ３を含む様々な１８Ｆ標識された補欠分子族が利用可能である。
【００３６】
詳細な合成プロトコル及び分析データは実施例に提示される。図３及び実施例は、１８Ｆ標識された補欠分子族の製造に一般的に有用である標識用中間体ＴｓＯ−ＰＥＧ８−Ｎ３３、ＴｓＯ−ＰＥＧ４−Ｎ３７、及びＴｓＯ−ＰＥＧ２−Ｎ３８、及び［１８Ｆ］５（［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ）の合成に特異的な前駆物質プロパルギル−ＰＥＧ６−マレイミド２の調製の概要を示す。化合物３は商業的に入手できるピリジン中のＨＯ-ＰＥＧ８-Ｎ３及び塩化トシルから２５％の収率で合成した。化合物７及び８は、ＤＭＦ中で等量モルのＮａＮ３及び適切なＰＥＧ-ジトシレートを１１０℃に加熱することによって、それぞれ収率３０％及び１９％で合成した。ヘキサエチレングリコールからの２の合成は２つの工程が必要とした；ウィリアムソンエーテル合成を、等量モルのＮａＨ及び臭化プロパルギルを使用して用い、５４％の収率のプロパルギル-ＰＥＧ６-ＯＨ１を得、過剰のマレイミドとのＰＰｈ３／ＤＩＡＤ媒介光延反応によって２５％の収率で２を得た。
【００３７】
アジド試薬Ｎ-(２０-アジド-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサイコシル)-２-ブロモアセトアミド９及びＮ-(２０-アジド-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサイコシル)-２-ヨードアセトアミド９ａは、２０-アジド-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサイコサン-１-アミン（ＮＨ２−ＰＥＧ７−Ｎ３）から調製した。９及び９ａのブロモアセチル及びヨードアセチル基は各々システインチオール基のようなタンパク質の所定の求核性官能基と反応性であり、アジドタンパク質中間体を形成する。アジドタンパク質中間体は、式：
0005713923.tif 000005
（上式中、ｎは２から１２の整数である）
を持つ１８Ｆ−ＰＥＧ−アルキン試薬と、銅触媒の存在下で反応し、標識されたタンパク質を形成しうる。
【００３８】
マイクロ波促進求核性１８Ｆフッ素付加。  テトラブチルアンモニウム炭酸水素塩（ＴＢＡＨＣＯ３）を［１８Ｆ］ＦＰＥＧ２Ｎ３、［１８Ｆ］ＦＰＥＧ４Ｎ３、及び［１８Ｆ］ＦＰＥＧ８Ｎ３（［１８Ｆ］４）の求核性フッ素付加のための相間移動触媒としてＫｒｙｐｔｏｆｉｘ２２２及びＫ２ＣＯ３（Ｋ２２２／Ｋ２ＣＯ３）に対して選択した。ＴＢＡＨＣＯ３はＫ２２２／Ｋ２ＣＯ３と比較して高い熱安定性を示したので、高温でのマイクロ波加熱で水の供沸除去を５分以内促進した。加えて、マイクロ波加熱は、アセトニトリル中の［１８Ｆ］４に対して３分の高い１８Ｆフッ素付加効率（８９．０±１．４％、ｎ＝５）をもたらし、収率は［１８Ｆ］ＦＰＥＧ４Ｎに対して観察されたものに匹敵した。しかしながら、フッ素付加及び蒸発加熱工程において使用された温度での化合物の揮発性のために、［１８Ｆ］ＦＰＥＧ２Ｎ３の収率の僅かな減少が見られたが、再封可能な反応容器の蓋を使用することにより解消される問題である。
【００３９】
［１８Ｆ］５の調製。  ３つの触媒系を、ＣｕＡＡＣ反応（表１）を用いて［１８Ｆ］４及び２のコンジュゲーションに対して評価した。ＣｕＩの供給源としてＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ及びアスコルビン酸ナトリウム(Glaser等(2007)Bioconjug Chem 18:989-93)を用いる方法Ａ（実施例５）は、７９．３％の転換効率及び６５．７％の純度で所望の生成物を２０分で生じせしめた。観察された長い反応時間及び限られた純度は、ＣｕＡＡＣ反応を加速することのできるリガンドの研究を促した。方法Ｂは、ＣｕＩリガンド、バソフェナントロリンジスルホネート（ＢＰＤＳ）を方法Ａに加え、これが反応時間を１分まで劇的に減らし、転換効率を９６．５％まで増加させ、純度を８８．７％まで改善した。方法Ａ及びＢでは、［１８Ｆ］４の合成をＫ２２２／Ｋ２ＣＯ３と比較してＴＢＡＨＣＯ３によって触媒し、また［１８Ｆ］４をＣｕＡＡＣ反応前にアルミナＮライトカートリッジで精製した場合に１８Ｆ標識された分解産物の形成が減少した。
【００４０】
方法Ｃは、例えばＣｕＩの供給源としてＣｕ(ＭｅＣＮ)４ＰＦ６、ＣｕＩリガンドとしてトリス[(１-ベンジル-１Ｈ-１,２,３-トリアゾ-ル-４-イル)メチル]アミン（ＴＢＴＡ）、塩基触媒として２,６-ルチジン(Lewis等(2004)J.Am.Chem.Soc.126:9152-9153;Chan等(2004)Org.Lett.6:2853-2855)のようなアセトニトリル互換性試薬を用いる。方法Ｃを使用して、反応時間（５分未満）、１８Ｆ標識された分解産物の形成（１０％）、及び転換効率（１００％）は方法Ｂに匹敵していた。更に、ＣｕＡＡＣ反応前の［１８Ｆ］４のアルミナ精製は［１８Ｆ］５の純度に影響せず、結果として、方法Ｃには含まれなかった。
【００４１】
ＳＰＥ処理後、方法Ｂは、［１８Ｆ］５を、５９±４％の収率、９４％の放射化学純度、４７±１分（ｎ＝５）における５．１±１．５Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性（１９Ｆ標識された５のＨＰＬＣ標準曲線に対して決定）でもたらした。１９Ｆ標識された標準とのＨＰＬＣ共溶出と分解産物のＬＣ／ＭＳ分析によって、［１８Ｆ］５の同一性を確認した。［１８Ｆ］５の親油性（ｌｏｇＰ）（−２．４１±０．０９）は、発表された方法(Rodionov等(2007) J Am Chem Soc 129:12705-12)に一致してｐＨ７．４で測定した。
【００４２】
0005713923.tif 000006
【００４３】
標識されたタンパク質の合成
ペプチド標識法はよく知られている。Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2；Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazer 等(1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work及びE. Work編) American Elsevier Publishing Co., New York；Lundblad, R. L.及びNoyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York；Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York；及びWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)；De Leon-Rodriguez 等(2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155；Lewis 等(2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324；Li 等(2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115；Mier 等(2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237を参照のこと。
【００４４】
記述された方法は迅速で効率的であり、１８Ｆ放射標識されたタンパク質（１８Ｆ−４Ｄ５ＴチオＦａｂ）を８２分で総収率が１１±３％及び比活性２．０±０．２Ｃｉ／μｍｏｌで生じせしめる（Gill等(2009)Jour. Med. Chem. 52(19):5816-5825）。１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂは天然タンパク質の生物学的活性を保持し、Ｈｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧによって調節される異種移植腫瘍担持マウスモデル中のＨＥＲ２発現のマイクロＰＥＴイメージングでインビボで成功裏に確認した。［１８Ｆ］５及び４Ｄ５チオＦａｂのコンジュゲーション効率を、タンパク質濃度、ｐＨ、及び時間の関数として試験した（表２）。タンパク質濃度及びｐＨが増加するにつれて、減少したコンジュゲーション時間と増加した効率が観察された。［１８Ｆ］５の分解又は４Ｄ５チオＦａｂの凝集における有意な増加はｐＨ６．５に対してｐＨ８では観察されなかった。
【００４５】
本発明のタンパク質は、野生型又は親抗体の何れかの形の一又は複数のアミノ酸がシステインアミノ酸で置換されたシステイン操作抗体を含む。操作システインアミノ酸は遊離システイン酸であり、分子内又は分子間ジスルフィド単位の一部ではない。抗体の何れかの形態はそのように操作されうる、つまり変異される。例えば、親Ｆａｂ抗体断片は、「チオＦａｂ」とここでは称されるシステイン操作Ｆａｂを形成するよう操作されうる。同様に、親モノクローナル抗体は「チオＭａｂ」を形成するように操作されうる。単一部位の変異がチオＦａｂにおいて単一操作システイン残基を生じせしめる一方、ＩｇＧ抗体の二量体という性質から、単一部位の変異はチオＭａｂにおいて２個の操作システイン残基を生じせしめることに留意されなければならない。本発明のシステイン操作抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体、抗体の抗原結合断片、融合ポリペプチド及び細胞関連ポリペプチドに優先的に結合するアナログを含む。システイン操作抗体は、その野生型の親抗体対応物の抗原結合能を保持している。
【００４６】
１８Ｆ−チオＦａｂの精製を、ＮＡＰ−５脱塩カラム及びＢｉｏ−Ｓｅｐ Ｓ−２０００ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム（システムＤ）で実施した。ＮＡＰ−５法は、特に低コンジュゲーション効率での反応に対して、４Ｄ５チオＦａｂとの未コンジュゲート［１８Ｆ］５の有意な共溶出をもたらした。Ｂｉｏ−Ｓｅｐ Ｓ−２０００ ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂを１８Ｆ標識された凝集物及び［１８Ｆ］５（及び１８Ｆ標識された分解産物）から分離した。精製された最終精製物１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂをＨＰＬＣシステムＡ、システムＣ及びＴＯＦ ＬＣ／ＭＳで分析した。最適化されたコンジュゲーション法は、１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂを、２６±７％の収率、９０％以上の放射化学純度、及び２．０±０．２Ｃｉ／μｍｏｌ（ｎ＝５）の比活性で得た。総合成時間は合成開始から８２±４分であり、総崩壊補正収率は１１±３％であった。
0005713923.tif 000007
【００４７】
［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡの合成に対する前駆体であることに加えて（図１）、［１８Ｆ］ＦＰＥＧ−プロパルギル及び［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮ３はＣｕＡＡＣ反応を介して直接タンパク質にコンジュゲートされうる（図２）。このアプローチ法は、１８Ｆ標識されたタンパク質の合成を２つの放射化学の工程まで低減させ、部位特異的コンジュゲーションを実施する代替法を提供する。プロパルギル−ＰＥＧ−マレイミド（２）のチオＦａｂへの事前コンジュゲーションの後にＢＰＤＳ／Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４ＯＴｆ系（３：１，３ｍＭ ＢＰＤＳ）を使用する［１８Ｆ］４及びプロパルギル−ＰＥＧ−チオＦａｂ間の直接のＣｕＡＡＣを続け、１５％までのコンジュゲーション効率が観察された。同様の方法を用いて、［１８Ｆ］ＦＰＥＧ３−プロパルギルをアジド−ＰＥＧ修飾された架橋デキストラン酸化鉄（ＣＬＩＯ）ナノ粒子にカップリングさせ、多数のアジド部位が存在する結果として高いコンジュゲーション効率となった（Devaraj等(2009)"18F Labeled Nanoparticles for in Vivo PET-CT Imaging" Bioconjug Chem 10.1021/bc8004649)。［１８Ｆ］４が安定であり、複数のアジド又はアルキン基を、交差反応性を潜在的に欠くタンパク質上に選択的に位置させうるため、この技術は、高比活性の１８Ｆ標識されたタンパク質をもたらしうる。しかしながら、アスコルビン酸の存在下ではＣｕＩＩがタンパク質を分解させる傾向があるため（Devaraj等(2009)"18F Labeled Nanoparticles for in Vivo PET-CT Imaging"Bioconjug Chem 10.1021/bc8004649）、この方法は、酸素の厳格な除去、還元剤の使用、又はタンパク質切断を制限するためＢＰＤＳのようなＣｕＩ安定化リガンドの使用を必要とする。最後に、［１８Ｆ］ＦＰＥＧ−プロパルギル及び［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮ３は、１８Ｆ標識されたペプチド開発のための１８Ｆ標識された補欠分子族である。実際、プロパルギル担持補欠分子族［１８Ｆ］ＦＰｙ５ｙｎｅ（Inkster等(2008) Journal of Labelled compounds and Radiopharmaceuticals 51:444-452）は、最近、方法Ｃに類似したアジド修飾ペプチドを用いて評価されている。
【００４８】
［１８Ｆ］５の４Ｄ５チオＦａｂへの部位特異的コンジュゲーションは反応速度及び反応物安定性に対して最適化された。ｐＨ及びタンパク質濃度が増加するにつれて一般に減少するチオール担持タンパク質の安定性に関しては、表２を作成するために使用されたｐＨ（６．５−８）及びタンパク質濃度（１−２ｍｇ／ｍＬ）の範囲にわたる４Ｄ５チオＦａｂの二量体化及び凝集の増加は観察されなかった。しかしながら、チオール担持タンパク質の望まれないジスルフィド結合の形成はチオール基の接近性に依存するようである。４Ｄ５チオＦａｂでは、最適なシステイン置換位置を選択するＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ法は、長い時間にわたる高いｐＨ及びタンパク質濃度の使用を可能にするチオール安定性を促進しうる。コンジュゲーション反応の間の［１８Ｆ］５の安定性がｐＨに依存しないことが表２で試験された範囲にわたって観察され、これは、ＨＰＬＣカラム又はＳＰＥカートリッジから析出したシリカのような外部反応物質がコンジュゲーション反応系に入り、濃度依存的な形で［１８Ｆ］５を分解させうることを意味している。従って、ガラス製品を洗浄し、適切な溶媒、ＨＰＬＣカラム、及びＳＰＥカートリッジを選択する場合には、十分な注意がなされなければならない。４Ｄ５チオＦａｂ及び［１８Ｆ］５安定性の観察されたｐＨ非依存性を考慮し、［１８Ｆ］５の完全な分解が生じる前に高いコンジュゲーション効率を促進するために塩基性反応条件（ｐＨ８）が選択された。
【００４９】
［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ５の安定性は、コンジュゲーション効率及び比活性に有意な影響を有している。［１８Ｆ］５の４Ｄ５チオＦａｂへのコンジュゲーション効率は、（各チオＦａｂが一つの接近可能なチオール基を有しているので）４Ｄ５チオＦａｂの全量に対するインタクトな５（１８Ｆ及び１９Ｆで標識された）の全量に依存する。インタクトな５の全量は、［１８Ｆ］５の全活性、比活性、及び画分分解から計算される。例えば、さしあたりは［１８Ｆ］５の分解がないと仮定すると、［１８Ｆ］５に対する５Ｃｉ／ｍｍｏｌ及び２００ｍＣｉの報告された値は４０ｎｍｏｌの全５を与える。従って、４０ｎｍｏｌのチオール基（約２ｍｇの４Ｄ５チオＦａｂ）が最大コンジュゲーション効率を得るために必要とされる；しかしながら、常套的な生産では１ｍｇの４Ｄ５チオＦａｂが使用されているため、予想されるコンジュゲーション効率は約５０％である。２６．７％の観察されたコンジュゲーション効率は、全４Ｄ５チオＦａｂのうち約半分のみがコンジュゲートしたことを示しており、これは崩壊した１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂの質量分析によって得られる未変性及びコンジュゲートされたピークの積分によって一般に確認される。予想されるコンジュゲーション効率から観察された偏差は、チオＦａｂとのコンジュゲーションの間の制限試薬として使用される、［１８Ｆ］５の分解の結果である。コンジュゲーション効率と比活性の更なる改善は、より高いタンパク質濃度、又はより安定なマレイミド構築ブロックの使用から達成しうる。
【００５０】
１８Ｆ標識されたタンパク質のイメージング
本発明の標識されたシステイン操作抗体は、例えば（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴画像）；（ｉｉ）マイクロＣＴ（コンピュータ断層撮影）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）；（ｉｖ）ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影） Chen等(2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49；（ｖ）バイオルミネセンス；（ｖｉ）蛍光；及び（ｖｉｉ）超音波のような生物医学的及び分子イメージングの様々な方法及び技術によって、イメージング生物マーカー及びプローブとして有用である。免疫シンチグラフィーは放射性物質で標識された抗体を動物又はヒト患者に投与し、抗体が局在化している身体の部位の写真を撮るイメージング方法である（米国特許第６５２８６２４号）。イメージングバイオマーカーは客観的に測定され、通常の生物学的過程、病原性過程又は治療的介入への薬理学的応答の指標として評価されうる。バイオマーカーは幾つかのタイプでありうる：タイプ０は疾患の天然の履歴マーカーであり、既知の疾患の指標、例えば関節リウマチにおける関節滑膜炎症のＭＲＩ評価と長期的に相関する；タイプＩマーカーは、機序が臨床結果とは関係していない場合があるとしても、作用機序に従って介入の影響を捕らえる；タイプＩＩマーカーは、バイオマーカーの変化又はそれからのシグナルが、ＣＴにより関節リウマチにおいて測定された骨びらんのような、標的応答を「確証する」臨床的恩恵を予測する代替エンドポイントとして機能する。よって、イメージングバイオマーカーは、（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）治療薬の標的タンパク質への結合、つまり選択性、及び（ｉｉｉ）クリアランス及び半減期の薬物動態学的データについての薬物動力学（ＰＤ）的な治療上の情報を提供しうる。研究室ベースのバイオマーカーに対するインビボイメージングバイオマーカーの利点は、非侵襲的処置、数量化可能な、全身のアセスメント、反復投薬及びアセスメント、つまり複数時点、及び前臨床（小動物）から臨床（ヒト）結果への潜在的に伝達可能な効果を含む。幾つかの用途では、バイオイメージングは、前臨床研究における動物実験に取って代わり又はその数を最小にする。
【００５１】
Ｈｓｐ９０標的治療法及びマイクロＰＥＴイメージング。マウスを１７−ＡＡＧ処置の一日前に１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂによって決定した腫瘍取込み及び体積に従って２つの群に分けた（ｎ=４）（Gill 等(2009) Jour. Med. Chem. 52(19):5816-5825）。１７−ＡＡＧを０日目に処置群に投与した一方、コントロール群の動物は未処置のままにした。１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂでのＰＥＴイメージングを１日目（最後の１７−ＡＡＧの投与から１４時間後）、５日目、及び７日目に実施した。治療１日前と治療１日後のコントロール動物と１７−ＡＡＧ処置動物の腫瘍の冠状切片を図５ａに示す。コントロール及び１週間の期間にわたる治療群における平均腫瘍取込みを図５ｂに示し、選択組織と分泌臓器における取込みを表３に列挙する。１日目のＰＥＴイメージングは、コントロール群及び−１日目（Ｐ＝０．０００２５）に計測された取込みと比較して、５０％の腫瘍取込みの減少（Ｐ＝０．０００４６）を示した（表３）。１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂの腎クリアランスは、膀胱における有意な放射活性の蓄積及び腎皮質における高い取込みで優勢であった。肝胆道経路はまた大腸及び胆嚢での放射活性代謝物の蓄積に至るトレーサーの排出に寄与する一方、肝臓における放射活性の保持は比較的低かった。体重及び腫瘍サイズはイメージングの７日間、変化しなかった。
【００５２】
0005713923.tif 000008
【００５３】
［１８Ｆ］５から得た１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂに対して観察される高い比活性は、４Ｄ５チオＦａｂの総注射量を減少させることができ、これは特に低い細胞表面レセプター発現レベルの細胞に対するレセプター飽和及び標的取込みには重要であることが分かる。しかしながら、以下に検討される１７−ＡＡＧ調節の研究に対しては、腫瘍取込みは４Ｄ５チオＦａｂの総投与量（３０−１２０ｍｇ／動物）に依存しない。１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂの用量依存的な腫瘍取込みは、適用される投与量でのレセプター飽和の潜在性を制限するＢＴ４７４Ｍ１細胞株のＨＥＲ２発現レベルが高いことが原因でありうる。
【００５４】
４Ｄ５チオＦａｂに対する［１８Ｆ］５のコンジュゲーションの最適化後、得られた１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂの生物学的な活性をスキャッチャード分析によって確認し、天然の４Ｄ５チオＦａｂに比してコンジュゲートの親和性に有意な変化が観察されなかった。更に、ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ法によって設計され、チオール-タンパク質のモデルとして用いられる４Ｄ５チオＦａｂは、親４Ｄ５Ｆａｂの親和性（Ｋｄ＝０．１ｎＭ）を保持していた。更なる生物学的な確証には、ＨＳＰ９０阻害剤１７−ＡＡＧによって調節されるマウスモデルにおけるＨＥＲ２過剰発現腫瘍異種移植の治療応答研究を含めた。
【００５５】
ＨＥＲ２は膜貫通型レセプターの上皮由来増殖因子ファミリーのレセプターチロシンキナーゼであり、乳癌治療薬の開発のための重要な標的である。１７−ＡＡＧは、ＨＥＲ２を含む広範囲の腫瘍性タンパク質の正確な折り畳み、安定性及び機能の原因である分子シャペロンＨｓｐ９０を標的とする。ＨＥＲ２陽性腫瘍での１７−ＡＡＧの影響は記載されている（Solit等(2002) Clin Cancer Res 8:986-93）。６８Ｇａ−ＤＯＴＡコンジュゲートトラスツズマブ−Ｆ（ａｂ’）２（６８Ｇａ−ＤＣＨＦ）での乳癌異種移植（ＢＴ４７４）マウスモデル中のＨＥＲ２発現レベルに対する１７−ＡＡＧの影響が研究されている（Smith-Jones等(2006)J Nucl Med 47:793-6；Smith-Jones 等(2004)Nat Biotechnol 22:701-6）。５日継続するＨＥＲ２レベルの７０％減少が観察され、１２日後に処置前レベルに戻ったが、これは、６８Ｇａ−ＤＣＨＦが１８ＦＤＧ ＰＥＴより先に１７−ＡＡＧ処置に対する腫瘍応答をモニタリングできることを示唆している。しかしながら、６８Ｇａの短い半減期（６８分）は、Ｆ（ａｂ）’２の比較的長い血漿半減期とは理想的にはマッチせず、有意なシグナルの減少がＰＥＴ取得前に必要とされる３時間内に本来的なものである。１８Ｆとの組み合わせでの一価Ｆａｂ断片の比較的短い血漿半減期（１１０分）は改善されたイメージング特性をもたらしうる（Williams等(2001)Cancer Biother Radiopharm 16:25-35）。
【００５６】
ＨＥＲ２発現の観察された減少（図５）は、Ｆ（ａｂ’）２ベースのイメージング剤でのＳｍｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓによって観察されたものに広くは匹敵していた。６８Ｇａ−ＤＣＨＦを用いるＳｍｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ等によって観察された減少（７０％）と比較して、１７−ＡＡＧ治療の１日後の１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂ腫瘍取込みにおける低い減少（５０％）は、幾つかの原因に起因している。１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂの速い腎排出は改善された腫瘍集積比をもたらすが、一価Ｆａｂ断片は二価Ｆ（ａｂ’）２と比較して低いベースライン腫瘍取込みである。図５ａ（右側上段）に示されるトレーサーの非特異的取込み及び血管分布から生じる、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２に対して類似した処置後の腫瘍取込みを仮定すると、トレーサー取込みの割合の差は、処置前の低い大きさのシグナルで化合物に対してバイアスされうる。これは、１７−ＡＡＧ治療後（１日目）の平均腫瘍取込み０．６５±０．０９％ＩＤ／ｇが表３に示されるように皮膚取込み０．５０±０．０５％ＩＤ／ｇにほぼ匹敵していたという観察によって補強される。加えて、１７−ＡＧＧは水への溶解度が限られているため、製剤（超音波処理により調製される卵リン脂質ベースリポソームのエマルジョンからなる）は報告された作用強度を再現しない場合がある。これは実験でのＨＥＲ２発現のリバウンドの早さを説明しうる（５日目で１００％）。１７−ＡＡＧ処置後のシグナルの減少の大きさは以前観察されたものより僅かに少なかったが（Smith-Jones等(2006)J Nucl Med 47:793-6；Smith-Jones等(2004)Nat Biotechnol 22:701-6）、１８Ｆ−４Ｄ５チオＦａｂ（図５）で得られた画像の質は６８Ｇａ−ＤＣＨＦと比較して優れていた。Ｆａｂ断片の速い腎排出及びその結果の腫瘍集積比の向上は、Ｆ（ａｂ’）２断片に比して腫瘍取込みの絶対的大きさの減少に打ち勝つ。これは、６８Ｇａ−ＤＣＨＦでのイメージング前にほぼ３半減期より多いシグナルを与えたトレーサー投与後に、僅か２時間か又は約１半減期だけ、データの取得を容易にした。
【００５７】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物又は製剤は、本発明の標識されたタンパク質、及び一又は複数の薬学的に許容可能な担体、流動促進剤、希釈剤、又は賦形剤を含む。
【００５８】
薬学的組成物はバルク組成物と任意の薬学的に不活性な賦形剤、希釈剤、担体又は流動促進剤と共に標識されたタンパク質を含む一を越える（例えば２）薬学的に活性な薬剤からなる個々の投薬単位の両方を包含する。バルク組成物及びそれぞれ個々の投薬単位は、固定量の前述の薬学的に活性な役剤を含み得る。バルク組成物は個々の投薬単位に未だ形成されていない物質である。例示的な投薬単位は、錠剤、丸薬、カプセル等の経口投薬単位である。同様に、薬学的組成物を患者へ投与する方法は、バルク組成物及び個々の投薬単位の投与を包含することがまた意図される。
【００５９】
薬学的組成物は、また、ここに記載されたものと同一であるが、一又は複数の原子が天然に通常見出される原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子によって置換される本発明の同位体標識された化合物をまた包含する。特定された任意の特定の原子又は元素の全ての同位体が本発明の化合物、及びその用途の範囲にあると考えられる。本発明の化合物に導入することができる例示的な同位体は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、及びヨウ素の同位体、例えば２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、１２３Ｉ及び１２５Ｉを含む。ある種の同位体標識された本発明の化合物（例えば３Ｈ及び１４Ｃで標識されたもの）は化合物及び／又は基質組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム標識（３Ｈ）及び炭素−１４（１４Ｃ）同位体は、その調製及び検出性の容易性のために有用である。更に、重水素（２Ｈ）のようなより重い同位体との置換は、より大なる代謝安定性から生じる所定の診断上の利点（例えば、増加したインビボ半減期又は減少した投薬必要量）をもたらし得、よってある状況下では好ましい場合がある。陽電子放出同位体、例えば１５Ｏ、１３Ｎ、１１Ｃ及び１８Ｆは、基質レセプター占有率を調べるための陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）研究に有用である。同位体標識された本発明の化合物は、一般に、非同位体標識試薬を同位体標識試薬に置換することによって、ここでの実施例に開示されたものと同様の手順に従って調製することができる。
【００６０】
適切な担体、希釈剤、及び賦形剤は、当業者によく知られており、炭水化物、ロウ、水溶性及び／又は膨張性ポリマー、親水性又は疎水性物質、ゼラチン、油、溶媒、水等の物質を含む。使用される特定の担体、希釈剤又は賦形剤は、本発明の化合物が適用される手段及び目的に依存するであろう。溶媒は、一般的には、哺乳類に投与した際に安全（ＧＲＡＳ）であるように、当業者に認識されている溶媒に基づき選択される。一般的に、安全な溶媒は非毒性の水性溶媒、例えば水、及び水に溶解又は混和する非毒性の他の溶媒である。適切な水性溶媒には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、クレモホール（例えばＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（登録商標），ＢＡＳＦ）及びその混合物が含まれる。また製剤は、一又は複数のバッファー、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、抗酸化剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色料、甘味料、香料、フレーバー、及び薬物（すなわち、本発明の化合物又はその薬学的組成物）を見栄え良く提供するための又は薬学的製品（すなわち、医薬）の製造を補助する他の既知の添加剤を含みうる。
【００６１】
製剤は、常套的な溶解及び混合手順を使用して調製することができる。例えば、バルク薬剤物質（すなわち、本発明の化合物又は本化合物の安定化形態（例えばシクロデキストリン誘導体又は他の既知の錯化剤との複合体）を、上述した一又は複数の賦形剤の存在下で適切な溶媒に溶解させる。本発明の化合物は、典型的には薬学的投与形態に処方されることで、薬剤の投与量の制御、及び処方レジメンへの患者の薬剤服用順守が容易になる。
【００６２】
適用される製薬用組成物（又は製剤）は、薬剤の投与に使用される方法に応じて、多様な方法で包装することができる。一般的に、流通用の物品は、適切な形態の製薬用製剤をそこに付与する容器を含む。適切な容器は当業者によく知られており、ビン（プラスチック又はガラス）、小袋、アンプル、プラスチック袋、金属製シリンダー等の材料が含まれる。また容器は、包装の内容物への軽率な接近を防止するための、不正開封防止が施されたアセンブリを含みうる。また、容器には、容器の内容物を記載するラベルが、そこに付与されている。またラベルは適切な警告を含むこともできる。
【００６３】
本発明の化合物の薬学的製剤は、様々な投与経路及びタイプに対して調製されうる。例えば、所望の純度を有する標識されたタンパク質は、凍結乾燥された製剤、粉砕パウダー、又は水溶液において、場合によっては、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤又は安定剤と混合されうる（Remington's Pharmaceutical Sciences (1995) １８版, Mack Publ. Co., Easton, PA）。製剤化は、周囲温度、適切なｐＨ、及び所望の純度にて、生理的に許容可能な担体、すなわち使用される用量及び濃度でレシピエントに非毒性である担体と混合することにより、実施されうる。製剤のｐＨは、主として、化合物の特定の使用及び濃度に依存するが、約３から約８の範囲とすることができる。薬学的な製剤は滅菌されていることが好ましい。特に、インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。このような滅菌は、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。薬学的な製剤は通常、固体組成物、凍結乾燥製剤又は水溶液として保存することができる。
【００６４】
本発明の薬学的な製剤は、良好な医療行為と一致した様式によって、すなわち、量、濃度、スケジュール、過程、ビヒクル及び投与経路で、用量決定され、投与されるであろう。この文脈で考慮される要因には、診断され又は処置されている特定の疾患、処置される特定の哺乳動物、患者個人の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医者に知られている他の要因が含まれる。投与される化合物の「薬学的に有効な量」は、このような考慮により支配され、疾患を診断し、予防し、寛解し、又は処置するのに必要な最小量である。
【００６５】
一用量当たりに経口的に又は非経口的に投与される標識されたタンパク質の初期の薬学的に有効な量は、約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、つまり一日当たり約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲であり、使用される化合物の典型的な初期の範囲は、０．３から１５ｍｇ／ｋｇ／日である。標識されたタンパク質の投与量及び投与される化学療法剤の投与量は単位投与形態当たり各々約１ｍｇから約１０００ｍｇの範囲でありうる。標識されたタンパク質及び化学療法剤の投与量は重量比が約１：５０から約５０：１、又は重量比が約１：１０から１０：１で投与されうる。
【００６６】
許容できる希釈剤、担体、賦形剤及び安定剤は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。また、活性な薬学的成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセルに、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に封入されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 第１８版, (1995) Mack Publ. Co., Easton, PAに開示されている。
【００６７】
薬学的製剤はここに詳細に記載する投与経路に適したものを含む。製剤は簡便には単位投薬形態で提供され得、薬学の分野でよく知られている方法の何れかによって調製することができる。技術及び製剤は一般にRemington's Pharmaceutical Sciences １８版(1995) Mack Publishing Co., Easton, PAに見出される。かかる方法は、活性成分を、一又は複数の補助成分を構成する担体と混合する工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を、液状担体又は細かに分断された固形担体又はその双方と均一かつ密に混合し、ついで必要ならば生成物を成形することにより、調製される。
【００６８】
薬学的組成物は滅菌された注射用調製物の形態、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液でありうる。この懸濁液は、上に述べた適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、知られた技術に従って製剤化することができる。滅菌された注射用調製物はまた１,３-ブタンジオール溶液又は凍結乾燥粉末として調製したもののように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の溶液又は懸濁液でありうる。用いることができる許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌固定化油を溶媒又は懸濁媒質として常套的に用いることができる。この目的に対して、合成のモノ-又はジグリセリドを含む任意のブランドの固定化油を用いることができる。また、オレイン酸のような脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用することができる。
【００６９】
単一投薬形態をつくるために担体物質と組み合わされうる活性成分の量は宿主と特定の投与態様に応じて変わる。例えば、静脈注入を意図した水溶液は、約３０ｍＬ／時の割合で適した量の注入が生じうるようにするために溶液１ミリリットル当たり約３から５００μｇの活性成分を含みうる。
【００７０】
非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤及び意図したレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含みうる水性及び非水性滅菌注射用溶液；及び懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。
【００７１】
製剤は、単位用量又は複数用量容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに包装することができ、使用直前に注射用の滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。即時混合注射溶液及び懸濁液は既に記載された種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。好適な単位投薬製剤は、活性成分の、上に記載されたような毎日の投薬又は毎日の部分用量単位、又はその適切な画分を含むものである。
【００７２】
標識されたタンパク質の代謝産物
この発明の範囲にまた入るものはここに記載される標識されたタンパク質のインビボでの代謝産物である。そのような産物は、例えば投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、脱アミド化、エステル化、脱エステル化、酵素分解等々から生じうる。従って、本発明は、本発明の化合物を、その代謝産物を生じるのに十分な時間、哺乳動物に接触させることを含む方法によって産生される化合物を含む標識されたタンパク質の代謝産物を含む。代謝産物の構造は常套的な方法、例えばＭＳ、ＬＣ／ＭＳ又はＮＭＲ分析によって決定されうる。一般に、代謝産物の分析は当業者によく知られた一般的な薬剤代謝研究と同じ方法でなされる。代謝産物は、それらがインビボで見出される等がない限り、本発明の化合物の治療用投薬の診断アッセイにおいて有用である。
【００７３】
製造品
本発明の他の実施態様では、疾患及び障害の診断に有用な標識されたタンパク質を含む製造品、又は「キット」が提供される。一実施態様では、キットは標識されたタンパク質を含む容器を含む。該キットは容器上に又は容器に付随してラベル又はパッケージ挿入物を更に含みうる。「パッケージ挿入物」なる用語は、診断製品の商業的パッケージに常套的に含まれる説明書であって、用法、用量、投与法、禁忌及び／又はこのような治療製品の使用に関する警告についての情報を含むものを指すために使用される。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ブリスターパック等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、標識されたタンパク質又はその製剤を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも一種の活性剤は標識されたタンパク質である。一実施態様では、ラベル又はパッケージ挿入物は異常な細胞増殖に起因する疾患の診断に使用可能な標識されたタンパク質を含む。ラベル又はパッケージ挿入物はまた組成物が他の疾患を治療するのに使用できること示しうる。あるいは、又は加えて、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液等の薬学的に許容可能なバッファーを含む第２の容器を更に含んでいてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含みうる。キットには標識されたタンパク質の薬学的な製剤の投与のための指示書も更に含む。
【実施例】
【００７４】
Gill 等(2009) Jour. Med. Chem. 52(19):5816-5825 の方法及び試薬は出典明示によりここに明示的に援用する。
【００７５】
溶媒及び化学薬品は、特記していないものは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。ヘテロ二官能性ポリエチレングリコールはＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、Ｎ３−ＰＥＧ８−ＮＨＳをＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）から購入した。卵黄リン脂質をＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入し、１７-(アリルアミノ)-１７-デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。次の逆相ＨＰＬＣシステムを生成物の分析と精製に用いた。システムＡ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８３００Ａ（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）、０．０５％ＴＦＡ＋１０−９０％アセトニトリル、０−７分、２０−９０％アセトニトリル、７分、２ｍＬ／分；システムＢ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＬｕｎａＣ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ）０．０５％ＴＦＡ＋アセトニトリル、５ｍＬ／分；システムＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００（３００×４．６０ｍｍ、５μｍ）５０ｍＭのＰＢＳ０．５ｍｌ／分；システムＤ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００（３００×７．８０ｍｍ、５μｍ）２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）１．０ｍｌ／分；システムＥ：ＡｌｔｉｍａＣ−１８（１００×２２．０ｍｍ、５μｍ）０．０５％ＴＦＡ＋１０−６０％アセトニトリル、０−３０分、２４ｍＬ／分。放射化学において使用される分析的及び半分取ＨＰＬＣシステムは双方共、ＵＶ吸光及び放射能検出器（ＰＭＴ）を備えていた。［１８Ｆ］フッ化物はＰＥＴＮＥＴ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ＰｌｕｓカートリッジはＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。１８Ｆトラップ＆Ｒｅｌｅａｓｅカラム（８ｍｇ）はＯＲＴＧ，Ｉｎｃ．（Ｏａｋｄａｌｅ、ＴＮ）から購入した。低分子量生成物の質量分析はＯｎｙｘ ＭｏｎｏｌｉｔｈｉｃＣ１８カラムを装備したＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ １５０ＥＸ ＬＣＭＳシステムで実施した。タンパク質のＬＣ／ＭＳ分析は、拡張された質量範囲のＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍトリプル四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）で実施した。試料に７５℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓ、１０００Å、マイクロボアカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でクロマトグラフィーを施した。３０−４０％の線形勾配のＢ（溶媒Ａ、水中０．０５％のＴＦＡ；溶媒Ｂ、アセトニトリル中０．０４％のＴＦＡ）を使用し、溶離剤を、エレクトロスプレー源を用いて直接イオン化した。データをＸｃａｌｉｂｕｒデータシステムによって集め、デコンボリューションをＰｒｏＭａｓｓ（Novatia)を使用して実施した。ＮＭＲスペクトルは２９８ＫでＢｒｕｋｅｒ ＡｖａｎｃｅＩＩ５００又はＢｒｕｋｅｒ ＡｖａｎｃｅＩＩ４００分光計で記録した。１Ｈ及び１３Ｃの化学シフトはＴＭＳに対して報告し、１９Ｆ化学シフトは、−７８．５ｐｐｍに標準化した外部基準としてＴＦＡを使用して報告する。モデル５２１マイクロ波加熱器、共鳴装置（Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）���放射化学反応に使用した。トリス-(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン)としても知られているＴＢＴＡ(トリス-[(１-ベンジル-１Ｈ-１,２,３-トリアゾール-４-イル) メチル]アミンは、Ｃｕ（Ｉ）の安定化リガンドであるが、既に発表された手順に従って４０％の収率で合成した(Lewis等(2004) J Am Chem Soc 126:9152-3)。Ｓｔｒａｔａ ＳＤＢ−ＬカートリッジはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から購入した。
【００７６】
実施例１  ３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン-１-オール（１）
0005713923.tif 000009
水素化ナトリウムの鉱油中６０％分散液（０．８６ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）を少しずつ０℃の無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のヘキサエチレングリコール（５．５ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を０℃で１５分間攪拌した後、トルエン中８０％（２．４ｍＬ、２１．４ｍｍｏｌ）の臭化プロパルギルを滴下して加えた。混合物を室温まで温め、３時間攪拌した。形成された臭化ナトリウムを濾過によって除き、溶媒を蒸発させた。粗生成物をメタノール／ジクロロメタン勾配０−１００％を使用するＳｉＯ２カラムで精製し、３．４ｇ（５４％）の１を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４５（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．７４（ｂｓ，１Ｈ），３．６１−３．７１（ｍ，２４Ｈ），４．２１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５８．４，６１．７，６９．１，７０．３−７０．６，７２．５，７４．５，７９．７；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１５Ｈ２９Ｏ７に対する計算値，３２１．３８；実測値３２１．４。
【００７７】
実施例２  １-(３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン-１-イル)-２,５-ピロールジオン（２）
0005713923.tif 000010
アゾジカルボン酸ジイソプロピル（７３０μＬ、３．４３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン-１-オール１（１０００ｍｇ、３．１２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９００ｍｇ、３．４３ｍｍｏｌ）及びマレイミド（４５６ｍｇ、４．７０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に窒素雰囲気下で滴下して加えた（図３）。生じた茶色の溶液を室温まで温め、室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物をヘキサン／酢酸エチル勾配０−１００％を使用するＳｉＯ２カラムで精製して６５０ｍｇの黄色油を得、これを続いて半分取ＨＰＬＣ（システムＥ）で精製して、トリフェニルホスフィン酸化物を含まない２を無色の油として３１０ｍｇ（２５％）得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４３（ｔ，Ｊ＝２．３６Ｈｚ，１Ｈ），３．６０−３．７２（ｍ，２４Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝２．３７Ｈｚ，２Ｈ），６．７０（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３７．２，５８．４，６７．８，６９．１，７０．１，７０．４−７０．６，７４．５，７９．７，１３４．１，１７０．６；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１９Ｈ３０ＮＯ８に対する計算値，４００．１９；実測値４００．０
【００７８】
実施例３  ２３-アジド-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコス-１-イルｐ-トルエンスルホナート（３）
0005713923.tif 000011
ピリジン(４ｍＬ)中の２３-アジド-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリイコサン-１-オールの溶液（８００ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）中の塩化トルエンスルホニル（７７１ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）及び４-ジメチルアミノピリジン（１００ｍｇ）の溶液に室温で滴下して加えた。混合物を２４時間、室温で攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物を、ヘキサン／酢酸エチル０−１００％勾配と、続いて酢酸エチル／メタノール勾配０−１００％を使用するの勾配でＳｉＯ２カラムで精製し、ついで半分取ＨＰＬＣ（システムＥ）で精製し、２８０ｍｇ（２５％）の３を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４５（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｔ，Ｊ＝５．０２Ｈｚ２Ｈ），３．５８−３．７０（ｍ，２８Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２１．６，５０．７，６８．７，６９．２，７０．０，７０．５−７０．８，１２８．０，１２９．７，１３３．１，１４４．７；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ２３Ｈ３９Ｎ３Ｏ１０Ｓに対する計算値５４９．２４；実測値５４９．９。
【００７９】
実施例４  ２３-アジド-１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコサン（４）
0005713923.tif 000012
２３-アジド-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリイコサン-１-オール（５００ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させ、−１０℃に冷却した。ＤＡＳＴ（４８２μＬ、３．７８ｍｍｏｌ）を冷却溶液に徐々に加え、得られた混合物を−１０℃で３０分間攪拌した後、室温まで温め、更に２０時間攪拌した。過剰のＤＡＳＴをメタノール（５ｍＬ）でクエンチし、溶媒を続いて減圧下で蒸発させた。油性の残留物を水（３ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３を使用してｐＨを５に調節した。粗生成物を半分取ＨＰＬＣ（システムＥ）で精製し、１２２ｍｇ（２４％）の４を黄色油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．３９（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），３．６５−３．６８（ｍ，２６Ｈ），３．７５（ｄｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，２９．６Ｈｚ，２Ｈ），４．５６（ｄｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，４７．５Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５０．８，７０．１，７０．４，７０．５，７０．７−７０．８，７０．９，８３．２（ｄ，Ｊ＝１６９Ｈｚ）；１９Ｆ ＮＭＲ（４７０．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ−２２５．９；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ３３ＦＯ７Ｎ３に対する計算値，３９８．２；実測値３９８．０。
【００８０】
あるいは、［１８Ｆ］４を調製するため、［１８Ｆ］フッ化物を０．６ｍＬのアセトニトリル／水１：１（ｖ／ｖ）中の１０μＬの１．３Ｍ ＴＢＡＨＣＯ３を使用して４ｍＬのｖ−バイアルにＴ＆Ｒカートリッジから溶離させた。アルゴン流（６００ｃｃｍ）下で６０Ｗ、１２０℃にてマイクロ波加熱することによって水を共沸除去し、続いて無水アセトニトリル（４×０．７ｍＬ）を加えた。アセトニトリル（０．６ｍＬ）に溶解した２３-アジド-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコス-１-イルｐ-トルエンスルホナート３（２ｍｇ、３．６μｍｏｌ）を加え、混合物を隔膜シール容器中で４０Ｗ、１２０℃で３分間マイクロ波加熱し、[１８Ｆ]２３-アジド-１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコサン４を得た。
【００８１】
実施例５  １-(１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコス-２３-イル)-４-(１-(２,５-ピロリドン-１-イル)-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサノナデカ-１９-イル)-１,２,３-トリアゾール（５，ＦＰＥＧＭＡ）
0005713923.tif 000013
アセトニトリル（０．１ｍＬ）に溶解したＣｕ(ＭｅＣＮ)４ＰＦ６（７．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（０．２ｍＬ）中の１-(３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン-１-イル)-２,５-ピロールジオン２（８．０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、２３-アジド-１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコサン４（８．０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、２,６-ルチジン（２．５μＬ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＴＢＴＡ（２．０ｍｇ、０００４ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。生じた混合物を２２時間室温で攪拌した後、水で４ｍＬまで希釈し、形成された沈殿物を濾過により除去した。生成物を含む濾過物を半分取ＨＰＬＣ（システムＥ）で精製して、７．５ｍｇ（４７％）の５（ＦＰＥＧＭＡ）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．５８−３．８０（ｍ．５０Ｈ），３．８７（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），４．５５（ｄｔ，Ｊ＝４７．３，４．２Ｈｚ，２Ｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ），６．７０（ｓ，２Ｈ），７．７３（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３７．２，５０．３，６４．７，６７．９，６９．５，６９．７，７０．２，７０．６−７０．７，７０．９，８３．２（ｄ，Ｊ＝１６９Ｈｚ），１２３．８，１３４．２，１４５．０，１７０．７；１９ＦＮＭＲ（４７０．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ−２２５．８；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ３５Ｈ６２ＦＯ１５Ｎ７に対する計算値，７９７．４；実測値７９７．４；ＨＰＬＣ（システムＡ）保持時間２．９１分。
【００８２】
（方法Ａ）  別法では、［１８Ｆ］５を調製するために、[１８Ｆ]２３-アジド-１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコサン４をＳｅｐ−ＰａｋアルミナＮライトカートリッジ上を通過させ、アセトニトリル（０．５ｍＬ）ですすぎ、ほぼ蒸発乾固させ、３０℃まで冷却した。アセトニトリル（０．２ｍＬ）に溶解させた化合物２（４ｍｇ、１０．０μｍｏｌ）を［１８Ｆ］４に加え、続いて新たに調製した０．１ｍＬのトリスバッファー（ｐＨ８）中のアスコルビン酸ナトリウム（７．５ｍｇ、４０μｍｏｌ）及びトリスバッファー（ｐＨ８）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（２．２ｍｇ、８μｍｏｌ）の溶液を図４におけるように加えた。得られた褐色・オレンジ溶液を室温で２０分間攪拌し、続いてＨ２Ｏを０．１％のＴＦＡ（１ｍＬ）と共に加え、精製のためにＨＰＬＣループに移動させた。
【００８３】
（方法Ｂ）  別法では、［１８Ｆ］５を調製するために、［１８Ｆ］２３-アジド-１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコサン４をＳｅｐ−ＰａｋアルミナＮライトカートリッジ上に通過させ、アセトニトリル（０．５ｍＬ）ですすぎ、ほぼ蒸発乾固させ、３０℃まで冷却した。アセトニトリル（０．２ｍＬ）に溶解させた化合物２（４ｍｇ１０．０μｍｏｌ）を［１８Ｆ］４に加え、続いて０．１ｍＬのトリスバッファー（ｐＨ８）中の新たに調製したアスコルビン酸ナトリウム（７．５ｍｇ、４０μｍｏｌ）及びトリスバッファー（ｐＨ８）（０．２ｍＬ）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（２．２ｍｇ、８μｍｏｌ）及びバソフェナントロリンジスルホネート（ＢＰＤＳ）（４．４ｍｇ、８μｍｏｌ）の混合物を加えた。得られた褐色・オレンジ溶液を室温で１分間攪拌し、続いてＨ２Ｏを０．１％のＴＦＡ（１ｍＬ）と共に加え、精製のためにＨＰＬＣループに移動させた。
【００８４】
（方法Ｃ）  別法では、［１８Ｆ］５を調製するために、[１８Ｆ］２３-アジド-１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコサン４をほぼ蒸発乾固させ（アルミナ処理は不必要）、その後アセトニトリル（０．１ｍＬ）に溶解させた化合物２（４ｍｇ、１０．０μｍｏｌ）を加えた。次に、新たに調製したアセトニトリル（０．２ｍＬ）中のＣｕ(ＭｅＣＮ)４ＰＦ６（３ｍｇ、８μｍｏｌ）、ＴＢＴＡ（４．３ｍｇ、８μｍｏｌ）及び２５μＬの２,６-ルチジンの混合物を加えた。得られた淡黄色溶液を１０分間室温で攪拌し、１００μＬまで濃縮し、０．１％ＴＦＡ（１ｍＬ）と共にＨ２Ｏで希釈し、精製のためにＨＰＬＣループに移動させた。
【００８５】
粗生成物［１８Ｆ］５を半分取ＨＰＬＣ（システムＢ）により、保持時間１５−１８分で精製した。収集した画分をＨ２Ｏで２０ｍＬまで迅速に希釈し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｔｒａｔａ−Ｘ６０ｍｇＳＰＥカートリッジに充填し、生成物をカートリッジに捕捉させ、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄し、空気を流し、アセトニトリル（０．５ｍＬ）で１ｍＬのｖ−バイアル中に溶出させ、３０℃で６００ｃｃｍアルゴンを用いてほぼ蒸発乾固させた。ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ３５Ｈ６２ＦＯ１５Ｎ７に対する計算値７９７．４；実測値７９７．４；ＨＰＬＣ（システムＡ）保持時間２．９８分。
【００８６】
水性条件下で［１８Ｆ］５の分解を制限するために、放射化学工程の最適化をデザインしてＣｕＡＡＣ反応と固相抽出（ＳＰＥ）からの回収との間の合成時間を最小とした。ＣｕＡＡＣ反応系を０．１％のＴＦＡ水で迅速にクエンチし、ＨＰＬＣを高流量（８ｍＬ／分）で実施し、［１８Ｆ］５を迅速に充填し、ＳＰＥカートリッジから溶出させたときに［１８Ｆ］５の改善された収率が観察された。［１８Ｆ］５からの１８Ｆ標識された分解産物の形成は
ＳＰＥ樹脂床体積と共に増加し、長時間樹脂床上に該産物が残った場合に増加した。よって、［１８Ｆ］５は小体積のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｔｒａｔａ−Ｘ６０ｍｇカートリッジから速やかに溶出され、これが良好な回収率及び許容可能な不純物レベルをもたらした。
【００８７】
実施例６  ［１８Ｆ］ＦＰＥＧＭＡ−チオ４Ｄ５Ｆａｂ（６）
４Ｄ５−チオＦａｂを、過去に記載された手順（Junutula, J.R. 等(2008) J Immunol Methods 332:41-52；米国特許出願第２００７／００９２９４０号）と同様にして調製した。システイン置換を、部位特異的変異誘発によってトラスツズマブ（４Ｄ５、ハーセプチン）抗体コンストラクトの軽鎖のＶａｌ１１０位に導入した。発現されて精製された４Ｄ５−チオＭａｂを２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、酵素対抗体比が１：１０００（ｗｔ：ｗｔ）のＬｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ）を使用して３７℃で１時間酵素的に消化させた。５μＭのプロテアーゼ阻害剤トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）で消化を停止し、５０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー及び０−３００ｍＭのＮａＣｌ １０ＣＶ勾配を使用して５ｍＬのＨｉ−トラップＳＰ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。単離したチオＦａｂをついで還元及び酸化手順によるコンジュゲーションのために調製し、Ｃｙｓ１１０に結合したジスルフィド付加物を除去した。先ず、タンパク質を２５ｍのＭＭＥＳ，ｐＨ５．８、３００ｍＬのＮａＣｌ、及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファー中の２ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＥＣＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を加えることによって２４時間かけて還元した。還元後、タンパク質を５ｍＭのデヒドロアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）を添加して酸化させ、Ｓ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、及び２５ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ５．８、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び５ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファーを使用するゲル濾過によって精製した。単離したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によって分析し、タンパク質が適切に還元され、酸化されたことを確認した。
【００８８】
１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８）（２ｍｇ／ｍＬ）中の４Ｄ５チオＦａｂ（１．０ｍｇ、１２．６ｎｍｏｌ）を［１８Ｆ］５に加え、試験管ロッカー上で１０分間振とうさせた。粗生成物を半分取ＳＥＣ-ＨＰＬＣカラムによって精製し（システムＤ、１０−１２分の保持時間）、必要に応じて、アミコン１０ｋＤａ膜で注入のために濃縮した。ＨＰＬＣ（システムＡ）保持時間３．３分；ＳＥＣ ＨＰＬＣ（システムＣ）保持体積３．０ｍＬで、６を得た。
【００８９】
実施例７  ５-アジド-３-オキサ-ペンチルｐ-トルエンスルホネート（７）
0005713923.tif 000014
アジ化ナトリウム（０．４７ｇ、７．２４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中のジエチレングリコールジトシレート（３ｇ、７．２４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、生じた混合物を１１０℃で５時間加熱した。反応混合物を冷却水（１２５ｍＬ）に注ぎ、生成物を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出し、収集した有機抽出物を水（３×１００ｍＬ）、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。粗生成物をＳｉＯ２で溶離剤としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ０−１００％勾配で精製し、０．３４ｇ（１６％）の７を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４５（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２１．６，５０．６，６８．７，６９．１，７０．２，１２８．０，１２９．９，１３３．０，１４４．９；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１１Ｈ１５Ｎ３Ｏ４Ｓnに対する計算値，２８６．０８；実測値２８６．１
【００９０】
実施例８  １１-アジド-３,６,９-トリオキサ-ウンデカニルｐ-トルエンスルホネート（８）
0005713923.tif 000015
アジ化ナトリウムとテトラエチレングリコールジトシレートを実施例７ｐに従って反応させ、０．７ｇ（１９％）の８を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４４（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．５５−３．７０（ｍ，１２Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２１．６，５０．７，６８．７，６８．８，６９．２，７０．０，７０．６−７０．７，１２７．９，１２９．８，１３３．１，１４４．７ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１５Ｈ２４Ｏ６Ｎ３Ｓに対する計算値，３７４．２；実測値３７４．２
【００９１】
実施例９  Ｎ-(２０-アジド-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサイコシル)-２-ブロモアセトアミド(９,Ｎ３-ＰＥＧ６-ＢＡ)
0005713923.tif 000016
ＤＣＭ（５ｍＬ）中の２０-アジド-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサイコサン-１-アミン(ＮＨ２-ＰＥＧ６-Ｎ３（０．５ｇ、１．４３ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．２ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）の溶液をＤＣＭ（１０ｍＬ）中の臭化ブロモアセチル（０．１９０ｍＬ、２．１５ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に滴下して加えた。冷浴を取り除き、混合物を９０分間攪拌した。溶液を氷水（１０ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出した。収集した有機抽出物をブラインで洗浄し（２×１０ｍＬ）、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗生成物をＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィーを使用し溶離剤としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ上の０−１００％の勾配で精製して、０．６６ｇ（９８％）の９を黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．３９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．４７−３．５１（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．６３−３．６９（ｍ，２２Ｈ），３．８８（ｓ，１Ｈ），７．０７（ｂｓ，１Ｈ），１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２９．１，４０．０，５０．６，６９．４，７０．０，７０．４，７０．６−７０．７，１６５．８；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ３２ＢｒＯ７Ｎ４，４７１．１に対する計算値，４７３．１；実測値４７１．０，４７３．０
【００９２】
実施例９ａ  Ｎ-(２０-アジド-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサイコシル)-２-ヨードアセトアミド(９ａ,Ｎ３-ＰＥＧ６-ＩＡ)
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ＤＣＭ（５ｍＬ）中の２０-アジド-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサイコサン-１-アミン（ＮＨ２-ＰＥＧ７-Ｎ３，０．５ｇ，１．４３ｍｍｏｌ）及びヨード酢酸Ｎ-サクシニミジル（０．４ｇ，１．４３ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物を、０−１００％のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配を用いたＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して、０．４４ｇ（６０％）の９ａを黄色油として得た；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１６Ｈ３２ＩＯ７Ｎ４に対する計算値５１９．３４；実測値５１９．４．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．３９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．４４−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．６３−３．６９（ｍ，２２Ｈ），３．７４（ｓ，２Ｈ），７．１０（ｂｓ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２６．０，４０．９，５１．３，７０．０，７０．６−７１．３，１６８．５不明瞭
【００９３】
実施例１０  ３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン-１-イルｐ-トルエンスルホネート（１０，プロパルギル-ＰＥＧ６-ＯＴｓ）
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実施例３に従って３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン-１-オール１と塩化トルエンスルホニルを反応させ、０．５ｇ（４７％）の１０を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４２（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），３．５８−３．７０（ｍ，２２Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２１．６，５８．４，６８．７，６９．１，７０．４−７０．７，７４．５，７９．５，１２８．０，１２９．８，１３３．１，１４４．７；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ２２Ｈ３５Ｏ９Ｓに対する計算値，４７５．１９；実測値４７５．２。
【００９４】
実施例１１  ３,６,-ジオキサノン-８-イン-１-オール（１１，プロパルギル-ＰＥＧ２-ＯＨ）
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ジエチレングリコール（３．０ｇ、２８．１ｍｍｏｌ）と臭化プロパルギルを実施例１に従って反応させ、１．２ｇ（３０％）の１１を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．３８（ｂｓ，１Ｈ），２．４６（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），３．７１−３．７５（ｍ，６Ｈ），４．２２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ７Ｈ１３Ｏ３に対する計算値，１４５．０８；実測値１４５．３。
【００９５】
実施例１２  ３,６,-ジオキサノン-８-イン-１-イルｐ-トルエンスルホネート（１２，プロパルギル-ＰＥＧ２-ＯＴｓ）
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実施例３に従って３,６,-ジオキサノン-８-イン-１-オール１１（１．２ｇ、８．３ｍｍｏｌ）と塩化トルエンスルホニルを反応させ、１．７ｇ（６８％）の１２を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），３．６０−３．６５（ｍ．４Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１５−４．１８（ｍ，４Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２１．６，５８．４，６８．７，６９．０，６９．２，７０．６，７４．６，７９．５，１２８．０，１２９．８，１３３．１，１４４．８；ＭＳ ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１４Ｈ１９Ｏ５Ｓに対する計算値，２９９．０９；実測値２９９．１。
【００９６】
実施例１３  ［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳ（１３）の放射化学合成
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［１８Ｆ］フッ化物を、０．６ｍＬのアセトニトリル／水１：１（ｖ／ｖ）中の１０μＬの１．３ＭのＴＢＡＨＣＯ３（重炭酸テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）を使用してＴ＆Ｒカートリッジから４ｍＬのｖ−バイアル中に溶出させた。水をアルゴン流（６００ｃｃｍ）下で６０Ｗ、１２０℃でマイクロ波加熱によって共沸的に除去した後、無水アセトニトリル（４×０．７ｍＬ）を加えた。アセトニトリル（０．６ｍＬ）に溶解させた３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン-１-イルｐ-トルエンスルホネート（プロパルギル-ＰＥＧ６-ＯＴｓ）１０（２ｍｇ、４．２μｍｏｌ）を加え、混合物を隔膜シールした容器内で４０Ｗ、１２０℃で３分間マイクロ波加熱し、[１８Ｆ]１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン：
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を得た。
【００９７】
[１８Ｆ] １-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-インをほぼ蒸発乾固させ（アルミナ処理は不要）、その後アセトニトリル（０．１ｍＬ）中の４ｍｇ（１０．０μｍｏｌ）のＮ３-ＰＥＧ４-ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．）を加えた。次に、新たに調製したアセトニトリル（０．２ｍＬ）中のＣｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６（３ｍｇ、８μｍｏｌ）、ＴＢＴＡ（４．３ｍｇ、８μｍｏｌ）及び２５μＬの２,６-ルチジンを加えた。生じた淡黄色の溶液を室温で１０分間攪拌し、１００μＬまで濃縮し、Ｈ２Ｏと０．１％ＴＦＡ（１ｍＬ）で希釈し、精製のためにＨＰＬＣループに移送した。粗生成物を半分取ＨＰＬＣ（システムＢ）によって保持時間１５分で精製した。収集した画分を迅速に２０ｍＬまでＨ２Ｏで希釈し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｔｒａｔａ−Ｘ６０ｍｇＳＰＥカートリッジに充填し、カートリッジに捕捉した生成物をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）ですすぎ、空気を流し、１ｍＬのｖ−バイアル内にアセトニトリル（０．５ｍＬ）で溶出させ、６００ｃｃｍのアルゴンを用いて３０℃でほぼ蒸発乾固させ、［１８Ｆ］ＦＰＥＧＮＨＳ１３を得た。
【００９８】
実施例１４  ＣｕＡＡＣによるプロパルギル修飾された４Ｄ５チオＦａｂの直接の１８Ｆ標識化
５倍過剰の１-(３,６,９,１２,１５,１８-ヘキサオキサヘニコス-２０-イン-１-イル)-２,５-ピロールジオン２（０．４ｍｇ、１μｍｏｌ）を４Ｄ５チオＦａｂ（１０ｍｇ、０．２μｍｏｌ、５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２）に加え、３７℃で１時間インキュベートした。溶液を１０％酢酸でｐＨ４〜５に調節し、１００ｍＭの塩化ナトリウムと共に５０ｍＭのトリスバッファーｐＨ８を用いてＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。回収したプロパルギル修飾された４Ｄ５チオＦａｂ（１００ｕｇ）のアリコートを乾燥［１８Ｆ］２３-アジド-１-フルオロ-３,６,９,１２,１５,１８,２１-ヘプタオキサトリコサン４に加え、続いて脱気したバッファー（２５０ｕＬトリス（ｐＨ８））中の１．２ｍｇのＢＰＤＳ及び２０ｕＬのアセトニトリル中の０．２６ｍｇのＣｕ(ＭｅＣＮ)４ＰＦ６を加えた。大気中の酸素をアルゴンでの反応系から除外した。しかしながら、反応は１０分経過すると濃い茶色から無色へ変わり、これは反応が酸素によってクエンチされ、更に厳密な脱気条件が必要とされることを示している。
【００９９】
実施例１５  動物モデル
６〜８週齢のベージュヌードＸＩＤマウスをＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）から取得した。細胞播種の３日前に、マウス（皮下、左側腹部）に０．３６ｍｇの６０日の徐放性の１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を移植し、血清エストロゲンレベルを維持した。５０％のフェノールレッド非含有マトリゲル中、５×１０６のＢＴ４７４のサブクローンのＢＴ４７４Ｍ１細胞（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒから入手）をマウスの乳腺脂肪パッドに播種した。動物の世話及び処置は、国際実験動物管理公認協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって公認されたジェネンテック社のアニマルケア及び使用委員会によって承認されたプロトコルに従った。
【０１００】
実施例１６  １７−ＡＡＧ製剤及び投与
ＤＣＭ（５ｍＬ）中の卵黄リン脂質（０．５ｇ）を５００ｍＬの丸底フラスコに移し、溶媒を蒸発させ、残留物を減圧下で１６時間保存した。デキストロース（２５ｍＬ）の５％（ｍ／ｖ）溶液を乾燥リン脂質に加え、混合物を室温で６０分間超音波処理し、乳白色のエマルジョンを得た。１７−ＡＡＧ（２５ｍｇ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、そのアリコート（０．２５ｍＬ）を卵黄リン脂質エマルジョン（４．８ｍＬ）と混合し、室温で１５分間超音波処理した。生じたエマルジョンを、先に記載されたようにして（Smith-Jones等(2006) J Nucl Med 47:793-6；Smith-Jones等(2004) Nat Biotechnol 22:701-6）、２４時間の期間にわたって３回の１ｍＬ用量（各々５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射で、調製から３０分に投与した。１７−ＡＡＧは１７-Ｎ-アリルアミノ-１７-デメトキシゲルダナマイシンであり、あるタイプの白血病又は固形腫瘍を持つ特定の若年患者の癌治療において研究されている物質である。１７−ＡＡＧは、また[(３Ｓ,５Ｓ,６Ｒ,７Ｓ,８Ｅ,１０Ｒ,１１Ｓ,１２Ｅ,１４Ｅ)-２１-(アリルアミノ)-６-ヒドロキシ-５,１１-ジメトキシ-３,７,９,１５-テトラメチル-１６,２０,２２-トリオキソ-１７-アザビシクロ[１６．３．１]ドコサ-８,１２,１４,１８,２１-ペンタエン-１０-イル]カルバメート(ＣＡＳ登録番号７５７４７-１４-７)とも称される。
【０１０１】
実施例１７  マイクロＰＥＴイメージング
マウスを３％のセボフルランで麻酔し、等張液（５０−１００μＬ）中の０．３−０．４ｍＣｉの１８Ｆ−チオ４Ｄ５Ｆａｂを尾静脈カテーテルを介した静脈注射により接種させた。動物を通院まで温めたブランケット上で回復させた後、ケージに戻した。意識が回復して２時間後に、動物を３％のセボフルランで麻酔し、頭部を先に腹臥位でスキャナーベッドに置いた。体温を直腸プローブによって測定し、温かい空気で維持した。動的な６０分スキャンを取得した。全身の画像再構成を最大事後確率アルゴリズム（ＭＡＰ）を使用して得、最大値投影（ＭＩＰ）をＡＳＩＰｒｏソフトウェア（ＣＴＩ分子イメージング）を用いてつくり出した。ＭＡＰ再構成画像を使用し、ＡＳＩＰｒｏソフトウェア（ＣＴＩ分子イメージング）を用いて各対象臓器における定量的な活性レベルを得た。
【０１０２】
統計学的分析：  Ｒソフトウェア・バージョン２．４．１（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いてグラフを作成した。統計的有意性は両側スチューデントｔ検定を使用して決定し、０．０５未満のｐ値を有意であると考えた；データは、特に記載のない場合は、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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