(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、抗GM-CSF抗体：
(a) 配列RQRFPYYFDY(SEQ ID NO:15)またはRDRFPYYFDY(SEQ ID NO:16)を有するCDR3、配列NYYIH(SEQ ID NO:25)を有するCDR1、および配列WINAGNGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO:27)を有するCDR2を含むVH領域；並びに
配列QQFN(K/R)SPLT(SEQ ID NO:17)を有するCDR3、配列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)A(SEQ ID NO:39)を有するCDR1、および配列STSSRAT(SEQ ID NO:33)を有するCDR2を含むVL領域；または
(b) 配列RDRFPYYFDY(SEQ ID NO:16)を有するCDR3、配列GYYMH(SEQ ID NO:24)を有するCDR1、および配列WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:26)を有するCDR2を含むVH領域；並びに
配列QQFN(K/R)SPLT(SEQ ID NO:17)を有するCDR3、配列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)A(SEQ ID NO:39)を有するCDR1、および配列STSSRAT(SEQ ID NO:33)を有するCDR2を含むVL領域。
【請求項２】
VH領域がCDR3配列RQRFPYYFDY(SEQ ID NO:15)、CDR1配列NYYIH(SEQ ID NO:25)、およびCDR2配列WINAGNGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO:27)を含み；並びに、VL領域がCDR3配列QQFN(K/R)SPLT(SEQ ID NO:17)、CDR1配列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)A(SEQ ID NO:39)、およびCDR2配列STSSRAT(SEQ ID NO:33)を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
VL領域CDR3が配列QQFNKSPLT(SEQ ID NO:18)を有する、請求項1または2記載の抗体。
【請求項４】
VH領域FR4配列がWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)である、請求項1、2または3記載の抗体。
【請求項５】
VL領域FR4配列がFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:34)である、請求項1から4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
VH領域がSEQ ID NO:1、2、3、4または5のV-領域のVセグメント配列を有する、請求項1から5のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
VHがSEQ ID NO:1、2、3、4または5の配列を有する、請求項6記載の抗体。
【請求項８】
VL領域がSEQ ID NO:6、7、8または9のV-領域のVセグメント配列を有する、請求項1から7のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
VL領域が、SEQ ID NO:6、7、8または9の配列を有する、請求項8記載の抗体。
【請求項１０】
以下から選択される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を有する、請求項1記載の抗体：
a) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:8；
b) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:8；
c) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:6；
d) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:9；
e) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:7；
f) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6；並びに
g) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7。
【請求項１１】
SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を有する、請求項10記載の抗体。
【請求項１２】
SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:6、または、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:8の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を有する、請求項10記載の抗体。
【請求項１３】
IgGである、請求項1から12のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１４】
SEQ ID NO:11において記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む、請求項13記載の抗体。
【請求項１５】
SEQ ID NO:10において記載されるアミノ酸配列を有するカッパ軽鎖定常領域を含む、請求項1から14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１６】
SEQ ID NO:11において記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および、SEQ ID NO:10において記載されるアミノ酸配列を有するカッパ軽鎖定常領域を含む、請求項11記載の抗体。
【請求項１７】
SEQ ID NO:11において記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および、SEQ ID NO:10において記載されるアミノ酸配列を有するカッパ軽鎖定常領域を含む、請求項12記載の抗体。
【請求項１８】
VH領域もしくはVL領域、またはVHおよびVL領域アミノ酸配列の双方がN-末端でメチオニンを含む、請求項1から17のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１９】
請求項1から18のいずれか一項記載の抗体を含む、GM-CSFが治療標的である疾患を有する患者を処置するための薬学的組成物であって、疾患が、骨減少、リウマチ性関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、特発性血小板減少性紫斑病、心不全、虚血事象による心損傷、または糖尿病である、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その出願が参照により本明細書に組み入れられる、2008年4月28日に提出された米国特許仮出願第61/048,522号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
「顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）」は、造血環境および末梢炎症部位に存在する細胞によって多数の炎症メディエータに応答して産生される低分子糖タンパク質である。GM-CSFは、骨髄細胞からの好中球性顆粒球、マクロファージ、および混合顆粒球-マクロファージコロニーの産生を刺激することができ、胎児肝前駆細胞からの好酸球コロニーの形成を刺激することができる。GM-CSFはまた、成熟顆粒球およびマクロファージにおけるいくつかの機能的活性も刺激することができ、顆粒球およびマクロファージのアポトーシスを阻害する。
【０００３】
GM-CSFは、多数の疾患の病因において役割を果たすと提唱されている。ゆえに、GM-CSFを標的とする追加の治療が必要である。本発明は、たとえばGM-CSFが病原機序の一部である疾患を処置するための改善された抗GM-CSF抗体を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の簡単な概要
1つの局面において、本発明は、抗GM-CSF抗体、たとえばヒト化操作（humaneered）抗体、およびGM-CSF受容体シグナル伝達を阻害することが望ましい疾患を処置するためにそのような抗体を用いる方法を提供する。このように、いくつかの態様において、本発明は、Jセグメントが、ヒトJH4（YFDYWGQGTLVTVSS; SEQ ID NO: 14）に対して少なくとも95％の同一性を含み、Vセグメントが、ヒト生殖系列VH1 1-02またはVH1 1-03配列に対して少なくとも90％の同一性を含む、CDR3結合特異性決定基RQRFPY（SEQ ID NO: 12）もしくはRDRFPY（SEQ ID NO: 13）、Jセグメント、およびVセグメントを含む重鎖可変領域；またはRQRFPY（SEQ ID NO: 12）を含むCDR3結合特異性決定基を含む重鎖可変領域、を含む抗GM-CSF抗体を提供する。いくつかの態様において、Jセグメントは、YFDYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 14）を含む。いくつかの態様において、CDR3は、RQRFPYYFDY（SEQ ID NO: 15）またはRDRFPYYFDY（SEQ ID NO: 16）を含む。いくつかの態様において、重鎖可変領域CDR1またはCDR2は、ヒト生殖系列VH1配列でありうるか、またはCDR1およびCDR2の双方がヒト生殖系列VH1でありうる。いくつかの態様において、抗体は、図1に記載されるVH領域において示されるように、重鎖可変領域CDR1もしくはCDR2、またはCDR1およびCDR2の双方を含む。いくつかの態様において、本発明の抗体は、図1において示されるVH V-セグメントを有するV-セグメントとしてである。いくつかの態様において、本発明の抗体は、図1に記載されるVH#1、VH#2、VH#3、VH#4、またはVH#5の配列を有するVHを含む。
【０００５】
本発明はまた、たとえばCDR3結合特異性決定基FNKまたはFNRを含む軽鎖可変領域を含む、先の段落において記述された重鎖可変領域を有する抗GM-CSF抗体を提供する。いくつかの態様において、そのような抗体はヒト生殖系列JK4領域を含む。いくつかの態様において、抗体VL領域CDR3は、QQFN(K/R)SPLT（SEQ ID NO: 17）、たとえばQQFNKSPLT（SEQ ID NO: 18）を含む。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、図1に示されるVL領域のCDR1もしくはCDR2、またはCDR1とCDR2の双方を含む。いくつかの態様において、VL領域は、図1に示されるVKIIIA27 V-セグメント配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVセグメントを含む。いくつかの態様において、VL領域は、図1に記載されるVK#1、VK#2、VK#3、またはVK#4の配列を有する。
【０００６】
いくつかの態様において、たとえば図1におけるVH領域配列から選択されるVH領域配列、および図1におけるVL領域配列から選択されるVL領域を有する本発明の抗体は、37℃で行われた表面プラズモン共鳴分析によって決定した場合に、約10 nMよりよい、しばしば約500 pMよりよい（より悪い）、または約50 pMよりよい一価の親和性を有する。このように、いくつかの態様において、本発明の抗体は、50 pM未満の親和性（表面プラズモン共鳴を用いて測定した場合に）、典型的に約25 pM未満、またはさらに10 pM未満の親和性を有する。いくつかの態様において、本発明の抗GM-CSFは、37℃で表面プラズモン共鳴分析によって決定した場合に、GM-CSFとの一価の相互作用に関しておよそ10-4 s-1未満、好ましくは5×10-5 s-1未満、および最も好ましくは10-5 s-1未満の解離速度定数（kd）で遅い解離を有する。いくつかの態様において、本発明の抗体は、同じ条件でアッセイした参照キメラc19/2モノクローナル抗体より少なくとも2〜3倍遅い解離速度を有するが、GM-CSF活性を測定する細胞に基づくアッセイにおけるGM-CSF活性の中和において参照抗体より少なくとも6〜10倍大きい効力を有する。
【０００７】
いくつかの態様において、本明細書において記述される重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を有する本発明の抗体は、IgGである。いくつかの態様において、重鎖は、SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する定常領域を有する。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、SEQ ID NO:10において記載される配列を有するカッパ軽鎖である。いくつかの態様において、本発明の抗体は、SEQ ID NO:11において記載される重鎖定常領域、SEQ ID NO:10において記載される配列を有する軽鎖カッパ定常領域、ならびに図1に示される重鎖および軽鎖可変領域から選択される重鎖および軽鎖可変領域を有し、たとえば抗体重鎖および抗体軽鎖領域は、図1に記載される配列からの以下の組み合わせの1つを含む：a）VH#2、VK#3；b）VH#1、VK#3；c）VH#3、VK#1；d）VH#4、VK#3；e）VH#4、VK#4；f）VH#4、VK#2；g）VH#5、VK#1；h）VH#5、VK#2；i）VH#3、VK#4；またはj）VH#3、VL#3。当業者は、本発明の抗体が、本明細書における教示と共に図1に記載されるVHおよびVL領域の任意の組み合わせから選択されうることを認識するであろう。
【０００８】
いくつかの態様において、VH領域配列、もしくはVL領域配列、またはVHおよびVL領域アミノ酸配列の双方は、N-末端でメチオニンを含む。
【０００９】
追加の局面において、本発明は、先行請求項のいずれか一項記載の抗体を治療的有効量で患者に投与する段階を含む、GM-CSFを阻害することが望ましい疾患を有する患者を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、患者は、骨減少、リウマチ性関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、特発性血小板減少性紫斑病、アルツハイマー病、心不全、虚血事象による心損傷、または糖尿病を有する。
[請求項1001]
以下を含む、抗GM-CSF抗体：
JセグメントがヒトJH4（YFDYWGQGTLVTVSS）に対して少なくとも95％の同一性を含み、およびV-セグメントがヒト生殖系列VH1 1-02もしくはVH1 1-03配列に対して少なくとも90％の同一性を含む、CDR3結合特異性決定基RQRFPYもしくはRDRFPY、J-セグメント、およびV-セグメントを含むVH領域；または
CDR3結合特異性決定基RQRFPYを含むVH領域。
[請求項1002]
JセグメントがYFDYWGQGTLVTVSSを含む、請求項1001記載の抗体。
[請求項1003]
CDR3がRQRFPYYFDYまたはRDRFPYYFDYを含む、請求項1001または1002記載の抗体。
[請求項1004]
VH領域CDR1がヒト生殖系列VH1 CDR1であり；VH領域CDR2がヒト生殖系列VH1 CDR2であり；またはCDR1およびCDR2の双方がヒト生殖系列VH1配列に由来する、先行請求項のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1005]
図1に記載されるVH領域において示されるVH CDR1、若しくはVH CDR2、またはVH CDR1およびVH CDR2の双方を含む、先行請求項のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1006]
VH領域CDR1が配列NYYIHまたはGYYMHを有する、請求項1001〜1005のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1007]
VH領域CDR2が、配列
0005688363.tif 000002
を有する、請求項1001〜1005のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1008]
VH領域CDR1が配列NYYIHまたはGYYMHを有し；およびVH領域CDR2が配列
0005688363.tif 000003
を有する、請求項1001〜1005のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1009]
V-セグメント配列が図1に示されるVH Vセグメント配列を有する、先行請求項のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1010]
VHが図1に記載されるVH#1、VH#2、VH#3、VH#4、またはVH#5の配列を有する、請求項1009記載の抗体。
[請求項1011]
アミノ酸配列FNKまたはFNRを含むCDR3を含むVL領域を含む、先行請求項のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1012]
ヒト生殖系列JK4領域を含む、請求項1011記載の抗体。
[請求項1013]
VL領域CDR3がQQFN(K/R)SPLTを含む、請求項1011または請求項1012記載の抗体。
[請求項1014]
VL領域CDR3がQQFNKSPLTを含む、請求項1013記載の抗体。
[請求項1015]
VL領域が、図1に示される配列VL領域のCDR1、若しくはCDR2、またはCDR1およびCDR2の双方を含む、請求項1011〜1014のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1016]
VL領域CDR1が配列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)Aを有する、請求項1015記載の抗体。
[請求項1017]
VL領域CDR2が配列STSSRATを有する、請求項1015記載の抗体。
[請求項1018]
VL領域CDR1が配列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)Aを有し；かつVL領域CDR2が配列STSSRATを有する、請求項1015記載の抗体。
[請求項1019]
VL領域が図1に示されるVKIIIA27 V-セグメント配列に対して少なくとも95％の同一性を有するVセグメントを含む、請求項1011〜1018のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1020]
VL領域が、図1に記載されるVK#1、VK#2、VK#3、またはVK#4の配列を有する、請求項1019記載の抗体。
[請求項1021]
IgGである、先行請求項のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1022]
SEQ ID NO:11において記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む、請求項1021記載の抗体。
[請求項1023]
SEQ ID NO:10において記載されるアミノ酸配列を有するカッパ軽鎖定常領域を含む、先行請求項のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1024]
VH領域、若しくはVL領域、またはVHおよびVL領域アミノ酸配列の双方がN-末端でメチオニンを含む、先行請求項のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1025]
QQFNKSPLTを含むCDR3を含むVL領域を含む、抗GM-CSF抗体。
[請求項1026]
VH領域、若しくはVL領域、またはVHおよびVL領域アミノ酸配列の双方がN-末端でメチオニンを含む、請求項1025記載の抗体。
[請求項1027]
図1に記載されるVH領域と図1に記載されるVL領域とを含む抗体。
[請求項1028]
IgGである、請求項1027記載の抗体。
[請求項1029]
SEQ ID NO:11において記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む、請求項1027または請求項1028記載の抗体。
[請求項1030]
SEQ ID NO:10において記載されるアミノ酸配列を有するカッパ軽鎖定常領域を含む、請求項1027〜1029のいずれか一項記載の抗体。
[請求項1031]
SEQ ID NO:11において記載される重鎖定常領域と、
SEQ ID NO:10において記載される軽鎖カッパ定常領域と、
図1に記載される、a）VH#2、VK#3；b）VH#1、VK#3；c）VH#3、VK#1；d）VH#4、VL#3；e）VH#4、VK#4；f）VH#4、VK#2；g）VH#5、VK#1；h）VH#5、VK#2；i）VH#3、VK#4；およびj）VH#3、VL#3からなる群より選択される重鎖と軽鎖可変領域の組み合わせと
を有する、請求項1027記載の抗体。
[請求項1032]
先行請求項のいずれか一項記載の抗体を治療的有効量で患者に投与する段階を含む、GM-CSFが治療標的である疾患を有する患者を処置する方法。
[請求項1033]
疾患が、骨減少、リウマチ性関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、特発性血小板減少性紫斑病、心不全、虚血事象による心損傷、または糖尿病である、請求項1032記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】抗GM-CSF抗体の例示的なVH（SEQ ID NO: 2〜5）およびVL（SEQ ID NO: 6〜9）配列を提供する。VH1 1-02 = SEQ ID NO:19; VH1 1-03 = SEQ ID NO:20; VKIII A27 = SEQ ID NO:21。
【図２】37℃での表面プラズモン共鳴分析（Biacore 3000）によって決定したAb1（A）またはAb2（B）に対するGM-CSFの結合。Ab1およびAb2を、Biacoreチップ上に固定した抗Fabポリクローナル抗体上で捕捉した。GM-CSFの異なる濃度を、表示されるように表面上に注入した。Scrubber2ソフトウェアを用いて1：1相互作用を仮定して、グローバルフィット分析を行った。
【図３】グリコシル化および非グリコシル化GM-CSFに対するAb1およびAb2の結合。ヒト293細胞から発現されたグリコシル化GM-CSF、または大腸菌（E. coli）において発現された非グリコシル化GM-CSFに対する結合を、ELISAによって決定した。1つの実験からの代表的な結果を示す（実験1）。1500 ng/mlから開始するAb1およびAb2の2倍希釈液をGM-CSFコーティングウェルに適用した。各点は、1試料あたり3回ずつの決定に関する平均値±標準誤差を表す。シグモイド曲線のフィットは、Prism 5.0ソフトウェア（Graphpad）を用いて行われた。
【図４】共有されるエピトープに対するAb1およびAb2の結合を証明する競合ELISA。組み換え型GM-CSF 50 ng/ウェルをコーティングしたELISAプレートを、様々な濃度の抗体（Ab2、Ab1、またはアイソタイプ対照抗体）と共に50 nMビオチニル化Ab2と共にインキュベートした。ビオチニル化抗体の結合をニュートラビジン-HRPコンジュゲートを用いてアッセイした。GM-CSFに対する結合の競合は1時間（A）または18時間（B）であった。各点は、1試料あたり3回決定の平均値±標準誤差を表す。シグモイド曲線のフィットは、Prism 5.0ソフトウェア（Graphpad）を用いて行われた。
【図５】GM-CSF誘導IL-8発現の阻害。各抗体の様々な量を、0.5 ng/ml GM-CSFと共にインキュベートして、U937細胞と共に16時間インキュベートした。培養上清に分泌されたIL-8を、ELISAによって決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書において用いられるように、「抗体」は、結合タンパク質として機能的に定義され、抗体を産生する動物の免疫グロブリンコード遺伝子のフレームワーク領域に由来するとして当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むと構造的に定義されるタンパク質を指す。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなりうる。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子のみならず、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、次に、これらはそれぞれ、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。
【００１２】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。各々の四量体は、各々の対が1つの「軽鎖」（約25 kD）および1つの「重鎖」（約50〜70 kD）を有するポリペプチド鎖の2つの同一の対で構成される。各々の鎖のN-末端は、抗原認識の主な原因である約100個〜110個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００１３】
本明細書において用いられる「抗体」という用語にはまた、結合特異性を保持する抗体断片が含まれる。たとえば、多数の十分に特徴付けされた抗体断片が存在する。このように、たとえばペプシンはヒンジ領域においてジスルフィド連結に対してC-末端の抗体を消化して、それ自身がジスルフィド結合によってVH-CH1に接合された軽鎖であるFabの二量体であるF(ab')2を産生する。F(ab')2は、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結を切断するために軽度の条件下で還元されて、それによって(Fab')2二量体をFab'単量体に変換してもよい。Fab'単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有するFabである（他の抗体断片に関するより詳細な記述に関しては、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい）。様々な抗体断片が無傷の抗体の消化に関連して定義されているが、当業者は、組み換えDNA方法論を利用してまたは化学的に、断片をデノボで合成できることを認識するであろう。このように、本明細書において用いられる「抗体」という用語には、抗体全体の改変によって産生された、または組み換えDNA方法論を用いて合成された抗体断片が含まれる。
【００１４】
本明細書において用いられる抗体には、その中で可変重鎖および可変軽鎖領域が共に接合されて（直接またはペプチドリンカーを通して）連続したポリペプチドを形成する一本鎖抗体（1つのポリペプチド鎖として存在する抗体）、たとえば一本鎖Fv抗体（sFvまたはscFv）が含まれる様々なVH-VL対フォーマットが含まれる。一本鎖Fv抗体は、直接接合された、またはペプチドコードリンカーによって接合されたVH-およびVL-コード配列が含まれる核酸から発現されてもよい共有的に連結されたVH-VLである（たとえば、Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988）。VHおよびVLは、各々が1つのポリペプチド鎖として接続されるが、VHおよびVLドメインは、非共有的に会合する。抗体はまた、ジスルフィド安定化Fv（dsFv）などのもう1つの断片型でありうる。他の断片も同様に、たとえば組み換え技術を用いて可溶性タンパク質として、またはディスプレイ法から得られた断片として生成されうる。抗体にはまた、二抗体（diantibody）およびミニ抗体が含まれうる。
【００１５】
本発明の抗体にはまた、ラクダからの抗体などの重鎖二量体が含まれる。ラクダにおける重鎖二量体IgGのVH領域は、軽鎖との疎水性相互作用を行う必要がないことから、軽鎖に通常接触する重鎖の領域はラクダにおいて親水性アミノ酸残基に変化している。重鎖二量体IgGのVHドメインは、VHHドメインと呼ばれる。本発明において用いるための抗体には、加えて、単ドメイン抗体（dAb）およびナノボディ（たとえば、Cortez-Retamozo, et al, Cancer Res. 64:2853-2857, 2004を参照されたい）が含まれる。
【００１６】
本明細書において用いられるように、「V-領域」は、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、ならびにCDR3およびフレームワーク4が含まれるフレームワーク3のセグメントを含む抗体可変領域ドメインを指し、これらのセグメントは、B-細胞分化の際の重鎖および軽鎖V-領域遺伝子の再配列の結果としてV-セグメントに付加される。本明細書において用いられる「V-セグメント」は、V遺伝子によってコードされるV-領域（重鎖または軽鎖）の領域を指す。重鎖可変領域のV-セグメントは、FR1-CDR1-FR2-CDR2およびFR3をコードする。本発明の目的に関して、軽鎖可変領域のV-セグメントは、FR3の中をCDR3まで伸長すると定義される。
【００１７】
本明細書において用いられるように、「J-セグメント」という用語は、CDR3およびFR4のC-末端部分を含むコードされる可変領域のサブ配列を指す。内因性のJ-セグメントは免疫グロブリンJ-遺伝子によってコードされる。
【００１８】
本明細書において用いられるように、「相補性決定領域（CDR）」は、軽鎖および重鎖可変領域によって確立される4つの「フレームワーク」領域を中断する各々の鎖における3つの超可変領域を指す。CDRは、主に抗原のエピトープに対する結合の原因である。各々の鎖のCDRは、N-末端から開始して順に番号をつけられてCDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれ、同様に典型的に特定のCDRが位置する鎖によって同定される。このように、たとえばVH CDR3は、それが見いだされる抗体の重鎖の可変ドメインに位置するが、VL CDR1はそれが見いだされる抗体の軽鎖の可変ドメインからのCDR1である。
【００１９】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種において比較的保存される。構成成分である軽鎖と重鎖の複合フレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、三次元空間においてCDRを配置して整列させるように作用する。
【００２０】
CDRおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、当技術分野において様々な周知の定義、たとえばKabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database (IMGT)、およびAbM（たとえば、Johnson et al、前記；Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917；Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883；Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817；Al-Lazikani et al, J. Mol. Biol 1997, 273(4)を参照されたい）を用いて決定されうる。抗原複合部位の定義はまた、以下：Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000)；およびLefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(l):207-9 (2001)；MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol, 262 (5), 732-745 (1996)；およびMartin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989)；Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991)；Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992)；およびRees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)において記述される。
【００２１】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、近接アミノ酸、またはタンパク質の三次元フォールディングによって近位に配置される非近接アミノ酸の双方から形成されうる。近接アミノ酸から形成されたエピトープは典型的に、変性溶媒に曝露しても保持されるが、三次元フォールディングによって形成されたエピトープは、変性溶媒による処置によって典型的に失われる。エピトープには典型的に、独自の空間的コンフォメーションにおいて少なくとも3個、より通常少なくとも5個、または8〜10個のアミノ酸が含まれる。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法には、たとえば、x-線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。たとえば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。
【００２２】
本発明の状況において用いられる「結合特異性決定基」または「BSD」という用語は、抗体の結合特異性を決定するために必要なCDR領域内の最小の近接または非近接アミノ酸配列を指す。本発明において、最小結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のCDR3配列の一部または完全長の中に存在する。
【００２３】
本明細書において用いられるように、「抗GM-CSF抗体」または「GM-CSF抗体」は、互換的に用いられて、GM-CSFに結合して、GM-CSF受容体活性を阻害する抗体を指す。そのような抗体は、GM-CSFの結合および／または機能を査定する当技術分野において認識される任意の数のアッセイを用いて同定されてもよい。たとえばアルファ受容体サブユニットに対するGM-CSF結合の阻害を測定するELISAアッセイなどの結合アッセイを用いてもよい。GM-CSFの限定的な量に応答したGM-CSF依存的細胞株の増殖速度を決定するアッセイなどのGM-CSF受容体シグナル伝達に関する細胞に基づくアッセイも同様に、GM-CSF曝露に応答したサイトカイン産生量、たとえばIL-8産生量を測定するアッセイと同様に、簡便に使用される。
【００２４】
本明細書において用いられるように、「中和抗体」は、GM-CSFに結合して、GM-CSF受容体によるシグナル伝達を阻害する、またはGM-CSFのその受容体に対する結合を阻害する抗体を指す。
【００２５】
本明細書において用いられるように、「顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子」（GM-CSF）は、分子量およそ23 kDaを有する内部ジスルフィド結合を有する天然に存在する低分子糖タンパク質を指す。ヒトにおいて、これは、ヒト第5染色体上のサイトカインクラスタ内に位置する遺伝子によってコードされる。ヒトの遺伝子およびタンパク質の配列は公知である。タンパク質は、N-末端シグナル配列、およびC-末端受容体結合ドメインを有する（Rasko and Gough In: The Cytokine Handbook, A. Thomson, et al, Academic Press, New York (1994) pages 349-369）。その三次元構造は、インターロイキンの三次元構造と類似であるが、アミノ酸配列は類似ではない。GM-CSFは、造血環境および末梢炎症部位に存在する多数の炎症メディエータに応答して産生される。GM-CSFは、骨髄細胞からの好中球顆粒球、マクロファージ、および混合顆粒球-マクロファージコロニーの産生を刺激することができ、胎児肝前駆細胞から好酸球コロニーの形成を刺激することができる。GM-CSFはまた、成熟顆粒球およびマクロファージにおける何らかの機能的活性を刺激することができ、顆粒球およびマクロファージのアポトーシスを阻害する。
【００２６】
（KD）と省略される「平衡解離定数」または「親和性」は、結合速度定数（ka、時間-1M-1）によって除した解離速度定数（kd、時間-1）を指す。平衡解離定数は、当技術分野において任意の公知の方法を用いて測定されうる。本発明の抗体は高親和性抗体である。そのような抗体は、37℃で行った表面プラズモン共鳴分析によって決定すると、約10 nMよりよい（より悪い）、しばしば約500 pMよりよい、または約50 pMよりよい一価の親和性を有する。このように、いくつかの態様において、本発明の抗体は、50 pM未満、典型的に約25 pM未満、または10 pM未満でさえもの親和性を有する（表面プラズモン共鳴を用いて測定した場合）。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明の抗GM-CSFは、GM-CSFとの一価の相互作用に関して37℃で表面プラズモン共鳴分析によって決定した場合におよそ10-4 s-1未満、好ましくは5×10-5 s-1未満、および最も好ましくは10-5 s-1未満の解離速度定数（kd）で遅い解離を有する。
【００２８】
本明細書において用いられるように、「ヒト化（humanized）」抗体は、ドナー抗体からのCDRがヒトフレームワーク配列上に移植されている免疫グロブリン分子を指す。ヒト化抗体はまた、フレームワーク配列においてドナー起源の残基を含んでもよい。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含みうる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体に見いだされない、または取り込まれたCDRもしくはフレームワーク配列において見いだされない残基を含んでもよい。ヒト化は、「スーパーヒト化」抗体（Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002）および「リサーフェシング」（たとえば、Staelens et al,, Mol. Immunol. 43: 1243, 2006；およびRoguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994）などの技術が含まれる、当技術分野において公知の方法（たとえば、Jones et al., Nature 321:522-525;1986；Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992；米国特許第4,816,567号）を用いて行われうる。
【００２９】
本発明の状況における「ヒト化操作（humaneered）」抗体は、参照抗体の結合特異性を有する工学操作されたヒト抗体を指す。本発明において用いるための「ヒト化操作」抗体は、ドナー免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン分子を有する。典型的に、抗体は、参照抗体の重鎖のCDR3領域からの結合特異性決定基（BSD）をコードするDNA配列を、ヒトVHセグメント配列に接合することによって、および参照抗体からの軽鎖CDR3 BSDをヒトVLセグメント配列に接合することによって「ヒト化操作」される。「BSD」は、CDR3-FR4領域または結合特異性を媒介するこの領域の部分を指す。ゆえに、結合特異性決定基は、CDR3-FR4、CDR3、CDR3の最小必須結合特異性決定基（抗体のV領域に存在する場合に結合特異性を付与するCDR3より小さい任意の領域を指す）、Dセグメント（重鎖領域に関して）、または参照抗体の結合特異性を付与するCDR3-FR4の他の領域でありうる。ヒト化操作する方法は、米国特許出願公開第20050255552号および米国特許出願公開第20060134098号において提供される。
【００３０】
本明細書において用いられる「ヒト」抗体は、ヒト化およびヒト化操作抗体のみならず、公知の技術を用いて得られるヒトモノクローナル抗体を包含する。
【００３１】
核酸またはタンパク質の一部を参照して用いる場合の「ハイブリッド」という用語は、核酸またはタンパク質が、天然において互いに同じ関係で通常見いだされない2つまたはそれより多いサブ配列を含むことを示している。例として、2つまたはそれより多い配列を有する核酸は、たとえば新しい機能的核酸を作出するように整列させた無関係な遺伝子から典型的に組み換えによって産生される。同様に、ハイブリッドタンパク質は、天然において互いに同じ関係で通常見いだされない2つまたはそれより多いサブ配列を指す。
【００３２】
たとえば細胞または核酸、タンパク質、もしくはベクターを参照して用いる場合の「組み換え型」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入によって、または本来の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示している。このように、たとえば組み換え型細胞は、細胞の本来型（非組み換え型）内部で見いだされない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現される、過少発現される、もしくは全く発現されない本来の遺伝子を発現する。本明細書において「組み換え型核酸」という用語は、たとえばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて核酸を操作することによって、一般的に天然において通常見いだされない形でインビトロで独創的に形成された核酸を意味する。このようにして、異なる配列の機能的連結が達成される。このように、直線型の単離された核酸、または通常接合されないDNA分子をライゲーションすることによってインビトロで形成された発現ベクターはいずれも、本発明の目的にとって組み換え型であると見なされる。組み換え型核酸が作出されて宿主細胞または生物に再導入されると、それはすなわちインビトロ操作よりむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて非組み換え的に複製するであろうと理解される；しかし、一度組み換えによって産生されたそのような核酸は、その後非組み換え的に複製しても、なおも本発明の目的に関して組み換え型であると見なされる。同様に、「組み換え型タンパク質」は、組み換え技術を用いて、すなわち先に描写したように組み換え型核酸の発現を通して作出されたタンパク質である。
【００３３】
タンパク質またはペプチドを参照する場合の、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に免疫反応する」という句は、関心対象タンパク質に抗体が結合する結合反応を指す。本発明の状況において、抗体は関心対象抗原、たとえばGM-CSFに、他の抗原に対するその親和性より少なくとも100倍よい親和性で結合する。
【００３４】
2つまたはそれより多いポリペプチド（または核酸）配列の状況において、「同一」または％「同一性」という用語は、BLASTまたはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて、以下に記述されるデフォルトパラメータによって、または手動でのアラインメントおよび肉眼での検分（たとえば、NCBIウェブサイトを参照されたい）によって測定した場合に、同じである2つもしくはそれより多い配列もしくはサブ配列、または同じであるアミノ酸残基（またはヌクレオチド）の明記された百分率（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域に対して最大に対応するように比較および整列させた場合に、明記された領域にわたって約60％同一性、好ましくは70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれより高い同一性）を有する2つもしくはそれより多い配列もしくはサブ配列を指す。そのような配列は、「実質的に同一」であるといわれる。「実質的に同一」な配列にはまた、欠失および／または付加を有する配列のみならず、置換を有する配列と共に天然に存在する、たとえば多形または対立遺伝子変種および人工変種が含まれる。以下に記述されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を説明することができる。好ましくは、タンパク質配列同一性は、長さがアミノ酸少なくとも約25個である領域に対して、またはより好ましくは長さがアミノ酸50〜100個である領域に対して、またはタンパク質の長さにわたって存在する。
【００３５】
本明細書において用いられる「比較ウィンドウ」には、2つの配列を最適に整列させた後に、配列が近接する位置の同数の参照配列と比較される、典型的に20〜600、通常約50〜約200、より通常約100〜約150個からなる群より選択される近接位置の数の1つのセグメントに対する参照が含まれる。比較のために配列を整列させる方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、たとえばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または手動でのアラインメントおよび肉眼での検分（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照されたい）によって行われうる。
【００３６】
％配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例には、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)において記述されるBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムが含まれる。BLASTおよびBLAST 2.0は、本明細書において記述されるパラメータと共に本発明の核酸およびタンパク質に対する％配列同一性を決定するために用いられる。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N＝4、および双方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長3および期待値（E）10、およびBLOSUMスコア行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい）、アラインメント（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝-4、および双方の鎖の比較を用いる。
【００３７】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その本来の状態で見いだされる場合に通常それに伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物に存在する主な種であるタンパク質は実質的に精製されている。いくつかの態様において「精製された」という用語は、タンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを表示する。好ましくは、このことは、タンパク質が少なくとも85％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、および最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００３８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書においてアミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に用いられる。用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーのみならず、天然に存在するアミノ酸ポリマー、改変残基を含有するポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００３９】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するおよび合成アミノ酸のみならず、天然に存在するアミノ酸と類似のように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸のみならず、後に改変されるアミノ酸、たとえばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸エステル、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、たとえば水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合したα炭素を有する化合物、たとえばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は改変R基（たとえば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有してもよいが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似のように機能する化学化合物を指す。
【００４０】
アミノ酸は、本明細書において一般的に公知の三文字記号、または IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される一文字記号のいずれかによって呼ばれる。ヌクレオチドも同様にその一般的に許容される一文字コードで呼ばれてもよい。
【００４１】
「保存的に改変された変種」は、アミノ酸および核酸配列の双方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変種は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一のまたは関連する、たとえば本来近接する配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例として、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。このように、アラニンがコドンによって明記されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変更することなく、コドンを記述の対応するもう1つのコドンに変更することができる。そのような核酸変種は「サイレント変種」であり、保存的改変変種の1つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書において記述されるあらゆる核酸配列はまた、核酸のサイレント変種を記述する。当業者は、一定の状況において、核酸における各々のコドン（通常メチオニンに関する唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンに関する唯一のコドンであるTGGを除く）を、機能的に同一の分子を生じるように改変できることを認識するであろう。ゆえに、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変種はしばしば、発現産物に関して記述の配列において潜在的であるが、実際のプローブ配列に関しては潜在的ではない。
【００４２】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列における1つのアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、変更によって化学的に類似のアミノ酸とのアミノ酸の置換が起こる場合、「保存的改変変種」であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表およびBLOSUMなどの置換行列は当技術分野において周知である。そのような保存的改変変種は、それに加えて本発明の多形変種、種間相同体、および対立遺伝子を除外しない。典型的な互いの保存的置換には、1）アラニン（A）、グリシン（G）；2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；4）アルギニン（R）、リジン（K）；5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；7）セリン（S）、トレオニン（T）；および8）システイン（C）、メチオニン（M）が含まれる（たとえば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。
【００４３】
I．緒言
本発明は、GM-CSFに対して高い親和性で結合して、GM-CSFのアンタゴニストである抗体に関する。抗体は、ヒト生殖系列VHおよびVL配列に対して高い程度の同一性を有する可変領域を含む。好ましい態様において、本発明の抗体のCDRH3におけるBSD配列は、アミノ酸配列RQRFPY(SEQ ID NO:12)またはRDRFPY(SEQ ID NO:13)を含む。CDRL3におけるBSDはFNKまたはFNRを含む。
【００４４】
BSDがCDR3の一部を形成して、追加の配列を用いてCDR3を完成させて、FR4配列を付加する完全なV-領域を生成する。典型的に、BSDおよび完全なFR4を除くCDR3の部分は、ヒト生殖系列配列に含まれる。いくつかの態様において、BSDを除くCDR3-FR4配列は、ヒト生殖系列配列とは各々の鎖におけるアミノ酸がわずか2個異なるに過ぎない。いくつかの態様において、J-セグメントは、ヒト生殖系列J-セグメントを含む。ヒト生殖系列配列は、たとえば公共に入手可能な国際ImMunoGeneTicsデータベース（IMGT）およびV-base（全世界でのウェブvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk）を通して決定されうる。
【００４５】
ヒト生殖系列V-セグメントレパートリーは、51個の重鎖V-領域、40個のκ軽鎖V-セグメント、および31個のλ軽鎖V-セグメントからなり、全体で3,621個の生殖系列V-領域対を作出する。加えて、これらのV-セグメントのほとんどに関して安定な対立遺伝子変種が存在するが、生殖系列レパートリーの構造多様性に対するこれらの変種の関与は限定的である。全てのヒト生殖系列V-セグメント遺伝子の配列が公知であり、the MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdom（同様に、Chothia et al., 1992, J Mol Biol 227:776-798；Tomlinson et al., 1995, EMBO J 14:4628-4638；およびWilliams et al., 1996, J Mol Biol 264:220-232を参照されたい）によって提供されるV-baseデータベースにおいてアクセスされうる。
【００４６】
本明細書において記述される抗体または抗体断片は、原核細胞もしくは真核細胞微生物系において、または哺乳動物細胞などの高等真核動物の細胞において発現されうる。
【００４７】
本発明において使用される抗体は、任意のフォーマットでありうる。たとえば、いくつかの態様において、抗体は、定常領域、たとえばヒト定常領域が含まれる完全な抗体でありうるか、または完全な抗体の断片もしくは誘導体、たとえばFab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、またはナノボディもしくはラクダ抗体などの単ドメイン抗体でありうる。
【００４８】
II．重鎖
本発明の抗GM-CSF抗体の重鎖は、以下のエレメントを含む重鎖V-領域を含む：
1）FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3を含むヒト重鎖V-セグメント配列
2）アミノ酸配列R(Q/D)RFPY(SEQ ID NO:22)を含むCDRH3領域
3）ヒト生殖系列J-遺伝子セグメントによって与えられるFR4
相補的VL領域と共に先に記述したCDR3-FR4セグメントと共にGM-CSFに対する結合を支持するV-セグメント配列の例を図1に示す。V-セグメントはたとえば、ヒトVH1サブクラスのセグメントでありうる。いくつかの態様において、V-セグメントは、生殖系列セグメントVH1 1-02またはVH1 1-03に対して高い程度のアミノ酸配列同一性、たとえば少なくとも80％、85％、もしくは90％またはそれより大きい同一性を有するヒトVH1サブクラスセグメントである。いくつかの態様において、V-セグメントは、VH1 1-02またはVH1 1-03とは15残基以下、好ましくは7残基以下異なる。
【００４９】
本発明の抗体のFR4配列は、ヒトJH1、JH3、JH4、JH5、もしくはJH6遺伝子生殖系列セグメント、またはヒト生殖系列JHセグメントに対して高い程度のアミノ酸配列同一性を有する配列によって提供される。いくつかの態様において、Jセグメントはヒト生殖系列JH4配列である。
【００５０】
CDRH3もまた、ヒトJ-セグメントに由来する配列を含む。典型的にBSDを除くCDRH3-FR4配列は、ヒト生殖系列J-セグメントとアミノ酸2個以下異なる。典型的な態様において、CDRH3におけるJ-セグメント配列は、FR4配列に関して用いられるのと同じJ-セグメントに由来する。このように、いくつかの態様において、CDRH3-FR4領域は、BSDおよび完全なヒトJH4生殖系列遺伝子セグメントを含む。CDRH3およびFR4配列の例示的な組み合わせを以下に示し(SEQ ID NO:23)、この中でBSDを太字で示し、ヒト生殖系列J-セグメントJH4残基を下線で示す：
0005688363.tif 000004
【００５１】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、生殖系列セグメントVH 1-02もしくはVH1-03に対して、またはVH#1、VH#2、VH#3、VH#4、もしくはVH#5のV-セグメント部分などの図1において示されるVH領域のV-セグメントの1つに対して、少なくとも90％の同一性、または少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の同一性を有するV-セグメントを含む。
【００５２】
いくつかの態様において、VH領域のV-セグメントは、図1に示されるCDR1および／またはCDR2を有する。たとえば、本発明の抗体は、配列GYYMH(SEQ ID NO:24)もしくはNYYIH(SEQ ID NO:25)を有するCDR1、または配列
0005688363.tif 000005
を有するCDR2を有してもよい。
【００５３】
特定の態様において、抗体は、図1に示されるVH領域V-セグメントの1つからのCDR1およびCDR2の双方、ならびにR(Q/D)RFPY(SEQ ID NO:22)、たとえばRDRFPYYFDY(SEQ ID NO:16)、またはRQRFPYYFDY(SEQ ID NO:15)を含むCDR3を有する。このように、いくつかの態様において、本発明の抗GM-CSF抗体は、たとえば配列
0005688363.tif 000006
(SEQ ID NO:23)を有するCDR3-FR4、ならびに図1において示されるCDR1および／またはCDR2を有してもよい。
【００５４】
いくつかの態様において、本発明の抗体のVH領域は、結合特異性決定基 R(Q/D)RFPY(SEQ ID NO:22)を有するCDR3、ヒト生殖系列VH1セグメントからのCDR2、またはヒト生殖系列VH1からのCDR1を有する。いくつかの態様において、CDR1およびCDR2はいずれもヒト生殖系列VH1セグメントに由来する。
【００５５】
III．軽鎖
本発明の抗GM-CSF抗体の軽鎖は、以下のエレメントを含む軽鎖V-領域を含む：
1）FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3を含むヒト軽鎖V-セグメント配列
2）配列FNKまたはFNR、たとえばQQFNRSPLT(SEQ ID NO:28) またはQQFNKSPLT(SEQ ID NO:18)を含むCDRL3領域
3）ヒト生殖系列J-遺伝子セグメントによって与えられるFR4。
VL領域は、VラムダまたはVカッパV-セグメントのいずれかを含む。相補的VH領域と協力して結合を支持するVカッパ配列の例を、図1に提供する。
【００５６】
VL領域CDR3配列は、J-セグメント由来配列を含む。典型的な態様において、CDRL3におけるJ-セグメント配列は、FR4に関して用いられるのと同じJ-セグメントに由来する。このように、いくつかの態様における配列は、ヒトカッパ生殖系列V-セグメントおよびJ-セグメント配列とアミノ酸2個以下異なる可能性がある。いくつかの態様において、CDRL3-FR4領域は、BSDおよび完全なヒトJK4生殖系列遺伝子セグメントを含む。カッパ鎖に関する例示的なCDRL3-FR4の組み合わせを以下に示し、最小必須結合特異性決定基は太字で示され、JK4配列は下線で示される：
0005688363.tif 000007
【００５７】
Vカッパセグメントは典型的に、VKIIIサブクラスのセグメントである。いくつかの態様において、セグメントはヒト生殖系列VKIIIサブクラスに対して少なくとも80％の配列同一性、たとえばヒト生殖系列VKIIIA27配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、Vカッパセグメントは、VKIIIA27と18残基以下異なる可能性がある。他の態様において、本発明の抗体のVL領域V-セグメントは、図1に示されるVL領域のヒトカッパV-セグメント配列、たとえばVK#1、VK#2、VK#3、またはVK#4のV-セグメント配列に対して少なくとも85％同一性、または少なくとも 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一性を有する。
【００５８】
いくつかの態様において、VL領域のV-セグメントは、図1に示されるCDR1および／またはCDR2を有する。たとえば、本発明の抗体は、RASQSVGTNVA(SEQ ID NO:31)もしくはRASQSIGSNLA(SEQ ID NO:32)のCDR1配列、またはCDR2配列STSSRAT(SEQ ID NO:33)を有してもよい。
【００５９】
特定の態様において、本発明の抗GM-CSF抗体は、図1に記載されるVL領域のV-セグメントの1つに示されるようにCDR1とCDR2の組み合わせ、およびFNKまたはFNRを含むCDR3配列を有してもよく、たとえばCDR3はQQFNKSPLT(SEQ ID NO:18)またはQQFNRSPLT(SEQ ID NO:28)であってもよい。いくつかの態様において、そのようなGM-CSF抗体は、FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:34)であるFR4領域を含んでもよい。このように、本発明の抗GM-CSF抗体は、たとえば図1に示されるVL領域の1つからのCDR1およびCDR2の双方と、FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:34)であるCDR3-FR4領域を含みうる。
【００６０】
IV．GM-CSF抗体の調製
本発明の抗体は、図1に示されるVH領域VH#1、VH#2、VH#3、VH#4、またはVH#5のいずれを含んでもよい。いくつかの態様において、本発明の抗体は、図1に示されるVL領域VK#1、VK#2、VK#3、またはVK#4のいずれを含んでもよい。いくつかの態様において、抗体は、図1に示されるVH領域VH#1、VH#2、VH#3、VH#4、またはVH#5、および図1に示されるVL領域VK#1、VK#2、VK#3、またはVK#4を有する。
【００６１】
GM-CSF活性に拮抗する活性を抗体が保持することを確認するために、抗体を試験してもよい。アンタゴニスト活性は、増殖アッセイが含まれる任意の数のエンドポイントを用いて決定されうる。抗GM-CSF抗体は、GM-CSF機能を査定する任意の数のアッセイを用いて評価されてもよい。たとえば、限定的な量のGM-CSFに応答したGM-CSF依存的細胞株の増殖速度を決定するアッセイなどの、GM-CSF受容体シグナル伝達に関する細胞に基づくアッセイが簡便に用いられる。ヒトTF-1細胞株は、そのようなアッセイにおいて用いるために適している。Krinner et al, (2007) Mol. Immunolを参照されたい。GM-CSFを阻害することが望ましい疾患を処置するために投与される抗体は、好ましくは、マウスモノクローナル抗体LMM102の可変領域およびKabatによって定義されるCDRを有する、抗体キメラc19/2、たとえばWO03/068920のアンタゴニスト活性の少なくとも約50％、または少なくとも約75％、80％、90％、95％、もしくは100％を保持する：
0005688363.tif 000008
【００６２】
結合活性および親和性を決定するために周知のアッセイを用いて、高親和性抗体を同定してもよい。そのような技術には、ELISAアッセイのみならず、表面プラズモン共鳴または干渉法を使用する結合決定が含まれる。たとえば、親和性は、ForteBio（Mountain View, CA）Octetバイオセンサーを用いてバイオ層干渉法によって決定されうる。本発明の抗体は典型的に、GM-CSFのグリコシル化および非グリコシル化型の双方に対して類似の親和性で結合する。
【００６３】
本発明の抗体は、GM-CSFに対する結合に関してc19/2と競合する。本明細書において記述される抗体がGM-CSFに対する結合に関してc19/2を遮断するかまたはc19/2に競合することは、抗体が同じエピトープc19/2に結合するか、またはc19/2によって結合されるエピトープに近い、たとえば重なり合うエピトープに結合することを示している。他の態様において、本明細書において記述される抗体、たとえば図1に提供される表に示されるVHおよびVL領域の組み合わせを含む抗体を、GM-CSFに対する結合に関してもう1つの抗体が競合するか否かを査定するための参照抗体として用いることができる。試験抗体は、抗原に対する参照抗体の結合が、試験抗体の存在下で少なくとも30％、通常、少なくとも約40％、50％、60％、または75％、しばしば少なくとも約90％低減される場合、参照抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。結合を査定するために、ELISAのみならずイムノブロットなどの他のアッセイが含まれる多くのアッセイを使用することができる。
【００６４】
ヒト生殖系列配列に近いV-領域配列を有する抗体の単離法は、既に記述されている（米国特許出願公開第20050255552号および第20060134098号）。抗体ライブラリは、哺乳動物細胞、酵母細胞、または原核細胞が含まれる適した宿主細胞において発現されてもよい。いくつかの細胞系における発現に関して、細胞外培地への分泌を指示するために、N-末端にシグナルペプチドを導入することができる。抗体は、シグナルペプチドと共に、または伴わずに大腸菌などの細菌細胞から分泌されてもよい。大腸菌から抗体断片をシグナルなしで分泌させる方法は、米国特許出願公開第20070020685号において記述されている。
【００６５】
GM-CSF結合抗体を生成するために、たとえば図1に示される本発明のVH-領域の1つは、たとえば図1に示される本発明のVL-領域の1つと組み合わせて、適した発現系において多数のフォーマットのいずれかで発現される。このように、抗体は、原核または真核宿主細胞において、宿主細胞の内部でまたは分泌によって、scFv、Fab、Fab'（免疫グロブリンヒンジ配列を含有する）、F(ab')2（2つのFab'分子のヒンジ配列間のジスルフィド結合形成によって形成される）、全免疫グロブリン、もしくは切断型免疫グロブリンとして、または融合タンパク質として発現されてもよい。たとえば無シグナル発現系において産生されたポリペプチドにおいてN-末端にメチオニン残基が任意で存在してもよい。本明細書において記述されるVH領域の各々は、VL領域の各々と対を形成して、抗GM-CSF抗体を生成してもよい。重鎖と軽鎖の例示的な組み合わせを図1の表に示す。
【００６６】
本発明の抗体は、たとえば受容体に対するGM-CSF結合を阻害することによって、GM-CSF受容体活性化を阻害して、GM-CSF、たとえば500 pMに対する高親和性結合を示す。いくつかの態様において、抗体は、約10-4/秒またはそれ未満の解離定数を有する。理論に拘束されないが、より遅い解離定数を有する抗体は、改善された治療恩典を提供する。たとえば、c19/2より3倍遅いオフレートを有する本発明の抗体は、たとえばIL-8産生などの細胞に基づくアッセイにおいて10倍強力なGM-CSF中和活性を生じた（たとえば、実施例2を参照されたい）。
【００６７】
抗体は、原核細胞および真核細胞発現系が含まれる任意の数の発現系を用いて産生されてもよい。いくつかの態様において、発現系は、CHO細胞発現系などの哺乳動物細胞発現である。多くのそのような系が販売元から広く入手可能である。抗体がVHおよびVL領域の双方を含む態様において、VHおよびVL領域は、1つのベクターを用いて、たとえばジシストロニック発現単位で、または異なるプロモーターの制御下で発現されてもよい。他の態様において、VHおよびVL領域は、個別のベクターを用いて発現されてもよい。本明細書において記述されるVHまたはVL領域は任意で、N-末端でメチオニンを含んでもよい。
【００６８】
本発明の抗体は、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、またはdABとしてのフォーマットが含まれる任意の数のフォーマットで産生されてもよい。本発明の抗体にはまた、ヒト定常領域が含まれうる。軽鎖の定常領域は、ヒトカッパまたはラムダ定常領域であってもよい。重鎖定常領域はしばしば、ガンマ鎖定常領域、たとえばガンマ-1、ガンマ-2、ガンマ-3、またはガンマ-4定常領域である。他の態様において、抗体はIgAであってもよい。
【００６９】
本発明のいくつかの態様において、抗体VL領域、たとえば図1のVK#1、VK#2、VK#3、またはVK#4を、ヒトカッパ定常領域（たとえば、SEQ ID NO:10）と組み合わせて、完全な軽鎖を形成する。
【００７０】
本発明のいくつかの態様において、VH領域を、ヒトガンマ-1定常領域と組み合わせる。f-アロタイプなどの任意の適したガンマ-1fアロタイプを選ぶことができる。このように、いくつかの態様において、抗体は、VH#1、VH#2、VH#3、VH#4、またはVH#5から選択されるVHを有するf-アロタイプ定常領域、たとえばSEQ ID NO:11を有するIgGである（図1）。いくつかの態様において、抗体は、VK#1、VK#2、VK#3、またはVK#4から選択されるVLを有する（図1）。特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO:10に記載されるカッパ定常領域、およびSEQ ID NO:11において記載される重鎖定常領域を有し、重鎖および軽鎖可変領域は、図1に記載される配列からの以下の組み合わせの1つを含む：a）VH#2、VK#3；b）VH#1、VK#3；c）VH#3、VK#1；d）VH#3、VL#3；e）VH#4、VK#4；f）VH#4、VK#2；g）VH#5、VK#1；h）VH#5、VK#2；i）VH#3、VK#4；またはj）VH#3、VL#3。
【００７１】
たとえば抗体が断片であるいくつかの態様において、インビボで延長された半減期を提供するために、抗体は、もう1つの分子、たとえばポリエチレングリコール（PEG化）または血清アルブミンにコンジュゲートされうる。抗体断片のPEG化の例は、Knight et al. Platelets 15:409, 2004（アブシキシマブに関して）；Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994（抗-CEA抗体に関して）；Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999；およびHumphreys, et al., Protein Eng. Des. 20: 227,2007において提供される。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、Fab'断片の形である。完全長の軽鎖は、VL領域をヒトカッパまたはラムダ定常領域に融合させることによって生成される。いずれの定常領域を任意の軽鎖のために用いてもよいが、典型的な態様において、カッパ定常領域はVカッパ可変領域と組み合わせて用いられ、ラムダ定常領域はVラムダ可変領域と組み合わせて用いられる。
【００７３】
Fab'の重鎖は、本発明のVH領域と、ヒト重鎖定常領域配列、第一の定常（CH1）ドメインおよびヒンジ領域との融合によって生成されたFd'断片である。重鎖定常領域配列は、任意の免疫グロブリンクラスに由来しうるが、しばしばIgGに由来し、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4に由来してもよい。本発明のFab'抗体はまた、ハイブリッド配列であってもよく、たとえばヒンジ配列は1つの免疫グロブリンサブクラスに由来してもよく、CH1ドメインは異なるサブクラスに由来してもよい。
【００７４】
V．GM-CSFが標的である疾患を処置するための抗GM-CSF抗体の投与
本発明はまた、GM-CSF活性を阻害することが望ましい、すなわちGM-CSFが治療標的である、GM-CSFを伴う疾患を有する患者を処置する方法も提供する。いくつかの態様において、そのような患者は、慢性炎症疾患、たとえば関節炎、たとえばリウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、および関節の他の炎症疾患；炎症性腸疾患、たとえば潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット症候群、回腸炎、腸炎、およびグルテン感受性腸症；喘息、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー性鼻炎、ケイ肺症、慢性閉塞性肺疾患、過敏性肺疾患、気管支拡張症などの呼吸器系の炎症障害；乾癬、強皮症、ならびに湿疹、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、および掻痒症などの炎症性皮膚疾患が含まれる皮膚の炎症疾患；多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパシー、ギヤン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患が含まれる中枢および末梢神経系の炎症を伴う障害を有する。様々な他の炎症疾患を、本発明の方法を用いて処置することができる。これらには、全身性紅斑性狼瘡、免疫媒介腎疾患、たとえば糸球体腎炎、および脊椎関節症；ならびに全身硬化症、特発性炎症性ミオパシー、シェーグレン症候群、血管炎、サルコイドーシス、甲状腺炎、痛風、耳炎、結膜炎、副鼻腔炎、サルコイドーシス、ベーチェット症候群、肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎などの肝臓胆管疾患などの望ましくない慢性炎症成分を有する疾患が含まれる。いくつかの態様において、患者は、心血管系に対する損傷後に炎症を有する。様々な他の炎症疾患には、結核および慢性胆嚢炎が含まれる。追加の慢性炎症疾患は、たとえばHarrison's Principles of Internal Medicine, 12th Edition, Wilson, et al., eds., McGraw-Hill, Inc.において記述される。いくつかの態様において、抗体によって処置される患者は、GM-CSFが腫瘍または癌細胞の増殖に関与する癌、たとえば急性骨髄性白血病を有する。いくつかの態様において、本発明の抗体によって処置される患者は、たとえば虚血性心疾患、卒中、およびアテローム性動脈硬化症などの心血管系に対する虚血性の損傷により、心不全を有するまたは心不全のリスクを有する。いくつかの態様において、本発明の抗体によって処置される患者は喘息を有する。いくつかの態様において、本発明の抗体によって処置される患者は、アルツハイマー病を有する。いくつかの態様において、本発明の抗体によって処置される患者は、骨減少、たとえば骨粗鬆症を有する。いくつかの態様において、本発明の抗体によって処置される患者は血小板減少性紫斑病を有する。いくつかの態様において、患者はI型またはII型糖尿病を有する。いくつかの態様において、患者はGM-CSFが治療標的である1つより多い疾患を有してもよく、たとえば患者はリウマチ性関節炎と心不全、または骨粗鬆症とリウマチ性関節炎等を有してもよい。
【００７５】
本発明の方法は、疾患の処置にとって適した投与養生法を用いて、抗GM-CSF抗体を治療的有効量で薬学的組成物として患者に投与する段階を含む。組成物は、多様な薬物送達系において用いるために処方されうる。1つまたは複数の生理的に許容される賦形剤または担体も同様に適切な処方のために組成物に含めることができる。本発明において用いるために適した処方は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005において見いだされる。
【００７６】
抗GM-CSF抗体は、注射用滅菌等張水溶液などの、患者への注射にとって適した溶液中で提供される。抗体は、許容される担体において適した濃度で溶解または懸濁される。いくつかの態様において、担体は水溶性、たとえば水、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液等である。組成物は、pH調節および緩衝剤、等張性調節剤等などの生理的条件に近づくために必要であれば補助薬学物質を含有してもよい。
【００７７】
本発明の薬学的組成物は、患者、たとえば骨減少、喘息、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、多発筋炎、全身性紅斑性狼瘡、心不全、心損傷、たとえば心臓発作、血小板減少性紫斑病、または糖尿病後の心損傷を有する患者に、疾患、または疾患の症状およびその合併症を治癒するまたは少なくとも部分的に停止させるために十分な量で投与される。これを成就するために適切な量は「治療的有効量」として定義される。治療的有効量は、治療に対する患者の応答をモニターすることによって決定される。治療的有効量を示す典型的な基準には、患者における疾患の症状の改善が含まれる。この使用にとって有効な量は、年齢、体重、性別、投与経路等などの他の要因が含まれる、疾患の重症度および患者の全身健康状態に依存するであろう。必要に応じて、および患者によって認容される用量および回数に応じて、抗体の1回または複数回投与を投与してもよい。いずれにせよ、方法は、患者を有効に処置するために十分量の抗GM-CSF抗体を提供する。
【００７８】
抗体は単独で投与されてもよく、または関心対象疾患を処置するために他の治療と併用して投与されてもよい。
【００７９】
抗体は、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内経路が含まれるがこれらに限定されるわけではない任意の適した経路を通して注射または注入によって投与されうる。いくつかの態様において、抗体は吸入によって投与されてもよい。例示的な態様において、抗体は、4℃の注射用滅菌等張生理食塩液において10 mg/mlで保存されてもよく、患者に投与する前に注射用0.9％塩化ナトリウム100 mlまたは200 mlのいずれかにおいて希釈される。抗体は、0.2〜10 mg/kgの用量で1時間かけて静脈内注入によって投与される。他の態様において、抗体は、15分から2時間のあいだに静脈内注入によって投与される。なお他の態様において、投与技法は皮下ボーラス注射によってである。
【００８０】
抗体の用量は、患者の有効な治療を提供するように選ばれ、0.1 mg/kg体重未満〜約25 mg/kg体重、または1 mg〜2 g/患者の範囲である。好ましくは、用量は、1〜10 mg/kgの範囲、またはおよそ50 mg〜1000 mg/患者の範囲である。用量を、適切な回数繰り返してもよく、これは抗体の薬物動態（たとえば、循環中の抗体の半減期）および薬理学応答（たとえば、抗体の治療効果の期間）に応じて、1日1回から3ヶ月に1回までの範囲であってもよい。いくつかの態様において、約7〜約25日のあいだのインビボ半減期および抗体の投与を1週間に1回および3ヶ月に1回繰り返す。他の態様において、抗体はおよそ1ヶ月に1回投与される。
【００８１】
本発明のVH領域および／またはVL領域はまた、診断目的のために用いられてもよい。たとえば、VHおよび／またはVL領域は、患者におけるGM-CSFレベルの検出などの臨床分析のために用いられてもよい。本発明のVHまたはVL領域も同様に、たとえば抗Id抗体を産生するために用いられてもよい。
【実施例】
【００８２】
実施例
実施例1．工学操作されたヒト抗GM-CSF V領域の同定
ヒト化操作は、米国特許出願公開第20050255552号において記述されるように行った。エピトープを中心とするライブラリを、ヒト生殖系列J-セグメント配列と共にCDRH3およびCDRL3においてBSD配列を含有するCDR3-FR4領域に連結されたヒトV-セグメントライブラリ配列から構築した。重鎖に関して、ヒト生殖系列JH4配列を用いて、軽鎖に関して、ヒト生殖系列JK4配列を用いた。
【００８３】
組み換え型ヒトGM-CSFに対する結合を支持するVh1-拘束ライブラリからの完全長のヒト化操作V-領域を選択した。「完全長の」V-カッパライブラリを、米国特許出願公開第20060134098号において記述される「カセット」ライブラリを構築するための基礎として用い、この中でネズミc19/2 V-セグメントのごく一部が当初ヒト配列のライブラリに交換された。2つのタイプのカセットを構築した。V-カッパ鎖のカセットは、フレームワーク2領域内で重なりあう共通の配列とのブリッジPCRによって作出された。このようにして、ヒトV-カッパIIIイソ型に関して、「フロントエンド」および「ミドル」ヒトカセットライブラリを構築した。GM-CSFに対する結合を支持するヒトV-カッパIIIカセットを、コロニーリフト結合アッセイによって同定して、ELISAにおける親和性に従って序列化した。V-カッパヒト「フロントエンド」および「ミドル」カセットをブリッジPCRによって共に融合して、GM-CSF結合活性を支持する完全なヒトV-カッパ領域を再構築した。このように、ヒト化操作されたFabは、ヒトGM-CSFに対する結合を支持するヒト化操作V-重鎖およびV-カッパ領域からなる。
【００８４】
結合活性を表面プラズモン共鳴（spr）分析によって決定した。ビオチニル化GM-CSFをストレプトアビジンコーティングCM5バイオセンサーチップ上で捕捉した。大腸菌から発現させたヒト化操作Fab断片を、10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.1 mg/ml BSAおよび0.005％P20、pH 7.4において開始濃度30 nMに希釈した。各Fabを3倍希釈シリーズを用いて4回希釈して、各濃度を37℃で2回試験して、異なる密度の抗原表面について結合速度論を決定した。3つの表面全てからのデータを全体的に適合させて、解離定数を導出した。例示的なヒト化操作抗GM-CSF V領域を図1に示す。
【００８５】
実施例2．ヒト化操作GM-CSF抗体の評価
本実施例は、細胞に基づくアッセイにおいて、マウス抗体LMM102からの可変領域を有するキメラIgG1k抗体（Ab2）との比較によって、ヒト化操作抗GM-CSF抗体の生物活性および生物学的効力を評価する（Nice et al., Growth Factors 3:159, 1990）。Ab1は、Ab2に対して同一の定常領域を有するGM-CSFに対するヒト化操作IgG1k抗体である。
【００８６】
Ab1およびAb2に対するヒトGM-CSFの結合の表面プラズモン共鳴分析
表面プラズモン共鳴分析を用いて、Ab1およびAb2とグリコシル化ヒトGM-CSFとの相互作用に関する結合速度論および一価の親和性を、Biacore 3000機器を用いて比較した。Ab1またはAb2をポリクローナル抗ヒトF(ab')2を用いてBiacoreチップ表面上に捕捉した。ヒト293細胞から発現させたグリコシル化組み換え型ヒトGM-CSFを検体として用いた。速度論定数を、独立した2回の実験において決定した（図2および表1を参照されたい）。結果は、GM-CSFが本実験において比較可能な一価の親和性でAb1およびAb2に結合したことを示す。しかし、Ab1はAb2より2倍遅い「オンレート（on-rate）」を有したが、およそ3倍遅い「オフレート（off-rate）」を有した。
【００８７】
（表１）図2における表面プラズモン共鳴分析から決定された37℃での速度論定数
結合定数（ka）、解離定数（kd）および計算された親和性（KD）を示す。
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【００８８】
GM-CSFはN-連結およびO-連結グリコシル化部位の双方で天然にグリコシル化されているが、グリコシル化は生物活性にとって必要ではない。GM-CSFのグリコシル化がAb1またはAb2の結合に影響を及ぼすか否かを決定するために、異なる2つの起源からの組み換え型GM-CSFを用いてELISAにおいて抗体を比較した；大腸菌において発現させたGM-CSF（非グリコシル化型）およびヒト293細胞から発現させたGM-CSF（グリコシル化型）。図3および表2の結果は、双方の抗体がグリコシル化および非グリコシル化GM-CSFに対して同等の活性で結合することを示した。2つの抗体はまた、このアッセイにおいて同等のEC50を有することを証明した。
【００８９】
（表２）ELISAによって決定した異なる2つの起源からのヒトGM-CSFに対するAb2およびAb1の結合に関するEC50の要約
ヒト293細胞からの組み換え型GM-CSF（グリコシル化型）または大腸菌からの組み換え型GM-CSF（非グリコシル化型）に対する結合を、独立した2回の実験から決定した。実験1を図5に示す。
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【００９０】
Ab1はAb2に存在するマウス可変領域に由来したヒト化抗体である。Ab1を、競合ELISAによって重なり合うエピトープ特異性（Ab2）に関して試験した。
【００９１】
ビオチニル化Ab2を公知の技術を用いて調製した。ビオチニル化は、ELISAによって決定した場合にGM-CSFに対するAb2の結合に影響を及ぼさなかった。アッセイにおいて、Ab2またはAb1を、固定量のビオチニル化Ab2と共に様々な濃度で加えた。ビオチニル化Ab2の検出を、非標識AbまたはAb1競合物質の存在下でアッセイした（図4）。Ab1およびAb2はいずれもGM-CSFとの結合に関してビオチニル化Ab2と競合して、このように、同じエピトープに対する結合を示している。Ab1は、GM-CSFに対する結合に関してAb2より有効に競合し、表面プラズモン共鳴分析によってAb2と比較した場合に、Ab1に関してより遅い解離速度論と一貫した。
【００９２】
Ab1およびAb2によるGM-CSF活性の中和
GM-CSF活性の中和に関する細胞に基づくアッセイを使用して、生物学的効力を評価した。アッセイはGM-CSFによって誘導されたU937細胞からのIL-8分泌を測定する。培養上清に分泌されたIL-8を、0.5 ng/ml大腸菌由来GM-CSFによって16時間誘導後にELISAによって決定する。
【００９３】
このアッセイにおけるAb2およびAb1の中和活性の比較を、図5における代表的なアッセイにおいて示す。3つの独立した実験において、Ab1は、IC50を比較した場合に、Ab2より有効にGM-CSF活性を阻害した（表3）。
【００９４】
（表３）GM-CSF誘導IL-8発現の阻害に関するIC50の比較
図5に示される独立した3回の実験からのデータおよびIC50の平均値をng/mLおよびnMで表記する。
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【００９５】
要約
ヒト化操作Ab1は、計算された平衡結合定数（KD）25 pMでGM-CSFに結合した。Ab2は、30.5 pMのKDでGM-CSFに結合した。Ab2は、GM-CSFに関してAb1より2倍高い結合定数（ka）を示したが、Ab1は、Ab2より3倍遅い解離速度論（kd）を示した。Ab1およびAb2は、抗原結合ELISAにおいて、グリコシル化および非グリコシル化GM-CSFに関して類似の結合活性を示した。競合ELISAは、いずれの抗体も同じエピトープに関して競合することを確認した；Ab1は、Ab2より高い競合的結合活性を示した。加えて、Ab1は、GM-CSF誘導IL-8誘導アッセイにおいて、Ab2より高いGM-CSF中和活性を示した。
【００９６】
前述の本発明は、理解を明快にする目的で、例証および実施例によっていくぶん詳細に記述してきたが、一定の変化および改変をそれらに行ってもよく、それらも添付の特許請求の趣旨または範囲に含まれることは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００９７】
本明細書において引用した全ての刊行物、アクセッション番号、特許、および特許出願は、各々が具体的および個々に参照により本明細書に組み入れられるように、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９８】
本発明の抗GM-CSF抗体の例示的なVH領域配列：
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【００９９】
本発明の抗GM-CSF抗体の例示的なVL領域配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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