(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢＣＬ−２ファミリーの別の何れかのメンバーよりＭＣＬ−１に対して少なくとも２倍高い親和性でＭＣＬ−１に特異的に結合するペプチドであって、ここでペプチドは、ＢＣＬ−２ファミリーＢＨ３ドメインのＭＣＬ−１安定化α螺旋（ＳＡＨＢ）ペプチド、及びＮＯＸＡ ＳＡＨＢペプチドからなる群から選ばれるポリペプチド配列から誘導される、相対位置、ｉ及びｉ＋４の間に位置している炭化水素架橋を含有してなる、非天然のアミノ酸を有する安定化α螺旋を含有してなるペプチドであり、かつ下記のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド；
（１）配列番号３２に示されるＬＲＸＶＧＤＸＶ（ここで、Ｘは何れかのアミノ酸である）の配列を含むアミノ酸配列、
（２）配列番号６５に示されるＬＥＶＥＳＸＴＱＬＸＲＦＧＤＫＬＮＦ（ここで、Ｘは何れかのアミノ酸である）の配列を含むアミノ酸配列、
（３）（１）又は（２）から選択されたアミノ酸配列のＮ末端にＲが付加されているアミノ酸配列。
【請求項２】
前記（１）のアミノ酸配列が、配列番号１８〜１９，２１〜２５，２６〜２８，３０〜３４、３５〜３９，４８〜５５，５７〜５８に示されるいずれかのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列におけるＬＲＸＶＧＤＸＶ（ここで、Ｘは何れかのアミノ酸である）以外の配列において、少なくとも７０％以上同一のアミノ酸配列である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記（１）のアミノ酸配列が、ＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＸＲＮＨＸＴＡＦ、ＫＸＬＥＴＸＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＫＡＬＥＴＬＲＸＶＧＤＸＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＫＡＬＸＴＬＲＸＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、及びＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＸＨＥＴＸＦ（式中のＸは何れかのアミノ酸である）からなる群から選ばれる配列である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記（２）のアミノ酸配列が、配列番号６４もしくは６５に示されるいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号６４のうちＬＥＶＥＳＸＴＱＬＸＲＦＧＤＫＬＮＦ（ここで、Ｘは何れかのアミノ酸である）以外の配列において、少なくとも７０％同一の配列を含有してなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記（３）のアミノ酸配列が、ＲＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＸＲＮＨＸＴＡＦ、ＲＫＸＬＥＴＸＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＲＫＡＬＥＴＬＲＸＶＧＤＸＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＲＫＡＬＸＴＬＲＸＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、及びＲＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＸＨＥＴＸＦ（式中のＸは何れかのアミノ酸である）からなる群から選ばれる配列である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つのＸが炭化水素架橋である、請求項１から５の何れか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載のペプチドを、選択的ＭＣＬ−１阻害剤として含有してなる、医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物が、ＭＣＬ−１関連疾患を治療又は予防するためのものである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＢＣＬ−２阻害剤を更に含有してなる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
当該ＢＣＬ−２阻害剤が、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロへキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド；Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド；ゴシポール；及びオバトクラクスからなる群から選ばれる、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
医薬組成物が、難治性癌を治療するためのものである、請求項７から１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
当該難治性癌が、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロへキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド；Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド；ゴシポール；及びオバトクラクスからなる群から選ばれる薬剤の投与に耐性であり、ＭＣＬ−１を過剰発現する、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
（１）あらかじめ請求項１から６の何れか一項に記載のペプチドとＭＣＬ−１ポリペプチドを結合させる工程、
（２）試験化合物を、当該試験化合物と前記ＭＣＬ−１ポリペプチドとの相互作用に適切な条件下で、前記ペプチドとＭＣＬ−１ポリペプチドとの結合体と接触させる工程、
（３）前記ペプチドの前記ＭＣＬ−１ポリペプチドからの解離を検出する工程、及び
（４）前記（３）における解離が検出された試験化合物を、選択的ＭＣＬ−１結合剤として同定する工程、
を含有してなる、選択的ＭＣＬ−１結合剤を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００８年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６１／１２０，９８８号の優先権を主張し、その全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【０００２】
（政府の研究支援）
本発明は、Ｎ．Ｉ．Ｈ．助成金５ＰＯ１ ＣＡ９２６２５−０６に基づく政府研究支援によってなされた。合衆国政府は本発明においてある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
２０年以上前のＢＣＬ−２の発見は、癌生物学の新たなパラダイム、すなわち癌の発生及び持続が細胞死への天然の経路に沿った分子障害によって決定されることを明らかにした（Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar, 1985; Tsujimoto et al., 1985）。それに続くＢＣＬ−２タンパク質の広範のファミリーの同定は、これら細胞死の重要な調節因子の間の相互作用の徹底的な調査を誘発した。明らかになったことは、それぞれに細胞の運命を決定する分子挙動に関与している、保護因子と執行因子のネットワークであった（Danial and Korsmeyer, 2004）。ＢＣＬ−２の時代の１０年で、アンチアポトーシスタンパク質の表面上の疎水性の溝にそのα螺旋ＢＨ３ドメインを捕捉することによって、如何にアンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリータンパク質が、プロアポトーシスタンパク質と結合して封鎖しているかが構造研究により明らかになった（Sattler et al., 1997）。癌のアポトーシスを再活性化することが望ましい治療ゴールであるので、ＢＣＬ−２ファミリーの溝の分子標的化が薬物探求になってきた。ＢＣＬ−２ファミリーメンバーを効果的に標的にする小分子及びペプチドは、細胞死への障害を除去することが癌患者への医学的な突破口をもたらすことを明らかにし始めている（Oltersdorf et al., 2005; Perez-Galan et al., 2007; Walensky et al., 2004）。
【０００４】
ＭＣＬ−１はミトコンドリアの外膜で作用し、そこでＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＩＭ及びＢＡＫのようなプロアポトーシスタンパク質を無効にする。ＭＣＬ−２の過剰発現は、多発性骨髄腫の病因（Derenne et al., 2002; Zhang et al., 2002）、急性骨髄性白血病細胞の化学療法耐性（Konopleva et al., 2006）、及び乳癌における高い腫瘍悪性度及び予後不良（Ding et al., 2007）に関連している。実際、癌細胞のＡＢＴ−７３７に対する過敏症はＭＣＬ−１の細胞レベルと逆相関していて（van Delft et al., 2006）；そしてｓｉＲＮＡが誘発するＭＣＬ−１レベルの減少はＡＢＴ−７３７に対して癌細胞を再感作することが示されている（Konopleva et al., 2006）。多様なアンチアポトーシスタンパク質に対する特異的な阻害剤の開発は、それらのＢＨ３-結合ポケットの多様性のために手ごわい難題のままである。しかしながら、このような化合物の同定は、特定の疾患を治療してより広い標的の潜在的な毒性を避けるきめ細かな治療法をもたらすだろう。加えて、このような化合物は、個々のＢＣＬ−２ファミリータンパク質相互作用の生物学的機能を探査するための貴重なリサーチツールとして役立つだろう。ＭＣＬ−１を標的とする明確な治療根拠はあるが、今日まで、選択的小分子ＭＣＬ−１阻害剤には未だ手が届いていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、少なくともその一部が、高い親和性及びかつてない選択性をもって生存タンパク質ＭＣＬ−１を標的にするとして本明細書において同定された一連の架橋ＢＣＬ−２ファミリーペプチド螺旋を提供する。特に、本明細書に記載されているＭＣＬ−１阻害剤ＳＡＨＢは、ＭＣＬ−１の標準的なＢＨ３溝を標的にし、ＭＣＬ-１／ＢＡＫ相互作用を除外し、そしてＭＣＬ−１依存性癌細胞をミトコンドリア性アポトーシスに感作する。このような化合物を含有する組成物及びキット、及び例えば、このような化合物の治療、研究及びスクリーニング使用を包含する、このような化合物の使用が記載されている。
【０００６】
本発明は、ヒトＢＣＬ−２ファミリーの他の何れのメンバーに対するよりもＭＣＬ−１に対して少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、又は２０倍大きい親和性でＭＣＬ−１と特異的に結合するペプチドを提供し、このペプチドは１つ又はそれ以上の（例えば１，２、３、４つの）架橋によって連結された非天然アミノ酸を有する安定化したα螺旋である。このようなペプチドをＭＣＬ−１特異的結合剤と称すことができる。１つ又はそれ以上の架橋の末端は、ＢＣＬ−２ファミリーＢＨ３ドメインＭＣＬ−１安定化α螺旋（ＳＡＨＢ）ペプチド、ＮＯＸＡ ＳＡＨＢポリペプチド、ＢＯＫ ＳＡＨＢペプチド、改変したＢＩＭ ＳＡＨＢペプチド、ＢＡＫ ＳＡＨＢペプチド、及びＭＵＬＥ ＳＡＨＢペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチド配列に由来する、相対位置、ｉとｉ＋３、ｉとｉ＋４、又はｉとｉ＋７の間に位置している。
【０００７】
ある特定の実施態様では、ペプチドはＬＲＸＶＧＤＸＶの配列と少なくとも８０％同一の配列を包含していて、ここでＸは何れかのアミノ酸である。ペプチドは配列ＲＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の連続するアミノ酸と少なくとも７０％、８０％、又は９０％同一の配列を包含できる。
ある特定の実施態様では、置換は同類置換である。
ある特定の実施態様では、置換は非同類置換である。
ある特定の実施態様では、置換は同類と非同類置換の混合である。
置換は、架橋を含んで、天然及び非天然アミノ酸を包含できる。
ある特定の実施態様では、ペプチド配列は、ＲＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＸＲＮＨＸＴＡＦ、ＲＫＸＬＥＴＸＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＲＫＡＬＥＴＬＲＸＶＧＤＸＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＲＫＡＬＸＴＬＲＸＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＲＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＸＨＥＴＸＦ、ＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＸＲＮＨＸＴＡＦ、ＫＸＬＥＴＸＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＫＡＬＥＴＬＲＸＶＧＤＸＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、ＫＡＬＸＴＬＲＸＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ、及びＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＸＨＥＴＸＦを包含し、ここでＸ’は何れかのアミノ酸であって、ある特定の実施態様では、少なくとも１つのＸは架橋位置である。
【０００８】
本発明は、配列ＬＲＲＦＧＤＫＬと少なくとも６０％同一、７０％同一、又は８０％同一の配列を包含するペプチドを提供する。
ある特定の実施態様では、ペプチドは、配列ＬＥＶＥＳＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の連続するアミノ酸と少なくとも７０％、８０％、又は９０％同一の配列を包含できる。
置換は同類置換、非同類置換又はこられの混合であってよい。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドは、配列
ＬＥＶＥＳＡＴＱＬＲＸＦＧＤＸＬＮＦＲＱＫＬ；
ＬＥＶＸＳＡＴＸＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬ；
ＬＥＶＥＸＡＴＱＸＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬ；
ＬＥＶＥＳＸＴＱＬＸＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱＫＬ；
ＬＥＶＥＳＸＴＱＬＸＲＦＧＤＫＬＮＦ；
ＬＥＶＥＳＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＸＦＲＱＸＬを包含し、ここでＸ’は何れかのアミノ酸であって、ある特定の実施態様では、少なくとも１つのＸは架橋位置である。
【０００９】
本発明は、配列ＬＬＸＬＧＤＸＬ；ＬＸＲＦＧＤＫＦ；ＬＸＲＦＧＤＫＩ；及びＬＱＸＭＧＤＸＹを包含するペプチドを提供し、ここでＸ’は何れかのアミノ酸であって、ある特定の実施態様では、少なくとも１つのＸは架橋位置である。
【００１０】
本発明は、配列ＲＬＡＥＶＳＡＶＬＬＸＬＧＤＸＬＥ；ＩＷＩＸＱＥＬＸＲＦＧＤＫＦＮＡＹＹＡＲ；ＩＷＩＸＱＥＬＸＲＦＧＤＫＦＮＡＹＹＡＲ；  ＱＶＸＲＱＬＸＲＦＧＤＫＩＮＲＲＹＤ；及びＶＧＱＬＬＱＸＭＧＤＸＹＱＱＹＲＳＬＴＲと７０％、８０％、又は９０％同一の配列を包含するペプチドを提供し、ここでＸ’は何れかのアミノ酸であって、ある特定の実施態様では、少なくとも１つのＸは架橋位置である。
【００１１】
本発明は本質的には何れかの長さの、しかし好ましくは、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸である、ペプチドを提供する。
【００１２】
本発明によって提供されるペプチドは、ＭＣＬ−１に対して少なくとも５０μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭの親和性を有している。
【００１３】
本発明は、ＭＣＬ−１、とりわけヒトＭＣＬ−１のＢＨ３ドメインに特異的に結合するペプチドを提供する。
ある特定の実施態様では、ペプチドは、ヒトＢＣＬ−１ファミリーの他の何れのメンバーと結合するよりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、又は２０倍大きい親和性でＭＣＬ−１と結合する。
ある特定の実施態様では、ヒトＢＣＬ−１ファミリーは、ヒト型のＢＩＭ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＯＫ、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ-ＸＬ、ＢＣＬ−Ｗ、及びＢＦＬ−１／Ａ１を包含すると理解されている。
ある特定の実施態様では、ヒトＢＣＬ−１ファミリーは、ヒト型のＢＣＬ−２、ＢＣＬ-ＸＬ、ＢＣＬ−Ｗ、及びＢＦＬ−１／Ａ１を包含すると理解されている。
ある特定の実施態様では、ペプチドはＸＸＬＸＴＬＲＸＶＧＤＸＶＸＲＸＨＸＴＸＸの配列を含有し、ここで３アミノ酸分離れた２つのＸの１対が架橋によって連結して、残りのＸ’は何れかのアミノ酸である。
ある特定の実施態様では、ペプチドはＸＸＬＸＴＬＲＸＶＧＤＸＶＸＲＸＨＸＴＸＸの配列を含有し、ここで３アミノ分離れた２つのＸの１対が架橋によって連結して、残りのＸ’は配列ＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦからの同類アミノ酸置換を包含することができる。
ある特定の実施態様では、ペプチドはＫＡＬＥＴＬＲＸＶＧＤＸＶＱＲＮＨＥＴＡＦの配列を含有し、ここでＸ’は架橋によって連結している。
ある特定の実施態様では、ペプチドはＫＡＬＸＴＬＲＸＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦの配列を含有し、ここでＸ’は架橋によって連結している。
ある特定の実施態様では、ペプチドはＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＸＲＮＨＸＴＡＦの配列を含有し、ここでＸ’は架橋によって連結している。
ある特定の実施態様では、ペプチドはＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＸＨＥＴＸＦの配列を含有し、ここでＸ’は架橋によって連結している。
【００１４】
一態様では、本発明は、選択的ＭＣＬ−１阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を対象へ投与することによる、対象の疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。
一実施態様では、ＭＣＬ−１阻害剤はＢＨ３ドメインポリペプチド、随意には架橋ＢＨ３ドメインポリペプチドを包含する。
別の実施態様では、選択的ＭＣＬ−１阻害剤は、以下のポリペプチド：ＮＯＸＡ ＢＣＬ−２ファミリーＢＨ３ドメインの安定化α螺旋（ＳＡＨＢ）ポリペプチド、ＢＯＫ ＳＡＨＢペプチド、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢペプチド、野生型或いは改変(tailored)ＢＩＭ ＳＡＨＢ或いはＢＡＫ ＳＡＨＢペプチド、又はＭｕｌｅ ＳＡＨＢペプチド：の１つ又はそれ以上を包含する。
一実施態様では、ＮＯＸＡ ＳＡＨＢペプチドは、配列番号７、或いは６３〜６８に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
別の実施態様では、ＢＯＫ ＳＡＨＢペプチドは、配列番号１１に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
追加の実施態様では、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢペプチドは、配列番号１２、或いは１７〜６０に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
更なる実施態様では、ＢＩＭ  ＳＡＨＢペプチドは、配列番号６１或いは６２に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
別の実施態様では、ＢＡＫ ＳＡＨＢペプチドは配列番号６９に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
追加の実施態様では、Ｍｕｌｅ  ＳＡＨＢペプチドは配列番号７０に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
一実施態様では、当該ＳＡＨＢペプチドの配列は、ＮＯＸＡ、ＢＯＫ、ＢＩＭ、ＢＡＫ、及びＭｕｌｅ  ＳＡＨＢポリペプチド配列よりなる群から選ばれる配列(複数も)を包含しているキメラ配列である。
【００１５】
一実施態様では、方法は更に、ＢＣＬ−２阻害剤の有効量を対象に投与することを包含する。随意に、ＢＣＬ−２阻害剤は、選択的ＢＣＬ−２阻害剤である。
一実施態様では、ＢＣＬ−２阻害剤は、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロへキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（「ＡＢＴ−２６３」）又はＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（「ＡＢＴ−７３７」）である。
【００１６】
一実施態様では、病気又は障害は、過剰増殖性障害、炎症性疾患又は障害、伝染性疾患又は障害、細胞周期調節疾患又は障害、自己貧食調節疾患又は障害、自己免疫疾患又は障害である。随意に、過剰増殖性疾患又は障害は、リンパ腫、白血病、癌（例えば、肝臓癌、乳癌、肺癌）、多発性骨髄腫、又は肉腫である。
一実施態様では、白血病はＡＭＬ又はＡＬＬである。
関連する実施態様では、過剰増殖性障害は、耐性過剰増殖性疾患で、ＢＣＬ−２阻害剤耐性のものであってよい。
別の実施態様では、過剰増殖性障害は再発性又は難治性の癌である。
【００１７】
別の実施態様では、方法は更に、化学療法剤の有効量を対象に投与することを含んでいる。随意に、化学療法剤は、アルキル化剤（例えば、カルボプラチン）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン）、抗体（例えば、リツキサン）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、標的療法（例えば、ＴＲＡＩＬ、ボルテザミブ、ＡＢＴ−２６３）、又はその他の細胞傷害性或いは細胞増殖抑制剤である。
【００１８】
一実施態様では、細胞周期調節疾患又は障害は、癌、自己免疫疾患又はリンパ増殖性疾患である。随意に、細胞周期調節疾患又は障害は、細胞増殖抑制又は細胞傷害性治療に耐性である。
【００１９】
一態様では、本発明は、細胞を架橋ＢＨ３ドメインを含有するポリペプチドと接触させて細胞のＭＣＬ−１活性を調節する方法を提供する。
一実施態様では、ＭＣＬ−１活性が阻害される。
別の実施態様では、ポリペプチドは選択的ＭＣＬ−１阻害剤である。
更なる実施態様では、細胞におけるアポトーシスが増強される。
【００２０】
一態様では、本発明は、選択的ＭＣＬ−１阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を対象に投与することによる対象における難治性の癌を治療する方法を提供する。
一実施態様では、難治性の癌は、化学療法剤の投与又はＢＣＬ−２阻害剤の投与に耐性である。随意に、難治性の癌は、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロへキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドの投与に耐性、Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドの投与に耐性、ゴシポール（gossypole）の投与又はオバトクラクス（obatoclax）の投与に耐性である。
追加の実施態様では、難治性の癌はＭＣＬ−１を過剰発現する。
更なる実施態様では、選択的ＭＣＬ−１阻害剤は、架橋ＢＨ３ドメインを保持しているポリペプチドを包含する。
別の実施態様では、選択的ＭＣＬ−１阻害剤は、ＮＯＸＡ ＢＣＬ−２ ＢＨ３ドメインの安定化α螺旋（ＳＡＨＢ）ポリペプチド、ＢＯＫ ＳＡＨＢポリペプチド、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢドメインポリペプチド、改変ＢＩＭ ＳＡＨＢポリペプチド、改変ＢＡＫ ＳＡＨＢポリペプチド、又はＭｕｌｅ ＳＡＨＢポリペプチドである、ポリペプチドを包含する。
【００２１】
一態様では、本発明は、選択的ＭＣＬ−１阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を対象に投与することを含有している対象における癌を治療する方法を提供し、ここで、この癌は、Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（「ＡＢＴ−７３７」）の投与又はＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロへキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（「ＡＢＴ−２６３」）の投与に耐性であって；癌はＭＣＬ−１を過剰発現してもよい。
【００２２】
一態様では、本発明は、選択的ＭＣＬ−１阻害剤を細胞と接触させて、非ＭＣＬ−１選択的ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド阻害剤に対する細胞のアポトーシス応答を増強する方法を提供する。
一実施態様では、非ＭＣＬ−１選択的ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド阻害剤は選択的ＢＣＬ−２阻害剤である。
別の実施態様では、非ＭＣＬ−１選択的ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド阻害剤は、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロへキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（「ＡＢＴ−２６３」）；Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（「ＡＢＴ−７３７」）；ゴシポール；又はオバトクラクスである。
【００２３】
一態様では、本発明は、細胞を選択的ＭＣＬ−１阻害剤と接触させることによる、細胞における自己貧食性細胞死を増強するか、又は細胞におけるＭＣＬ−１の多量体化を阻害する方法を提供する。
【００２４】
一態様では、本発明は、細胞を選択的ＭＣＬ−１活性剤と接触させることによる、細胞におけるＭＣＬ−１の多量体化を誘発する方法を提供する。
【００２５】
一態様では、本発明は、細胞を選択的ＭＣＬ−１活性剤の有効量と接触させて、ＭＣＬ−１がＢＡＸ又はＢＡＫと結合することを阻害するか、或いはＢＡＸ又はＢＡＫをＭＣＬ−１から移動することによって、細胞におけるＭＣＬ−１のプロアポトーシスＢＡＸ又はＢＡＫとの相互作用を阻害する方法を提供する。
【００２６】
一態様では、本発明は、試験化合物とＭＣＬ−１ポリペプチドの相互作用に適している条件下でＭＣＬ−１ポリペプチドを試験化合物と接触させること；及びＭＣＬ−１ポリペプチドの活性の調節を検出すること（ここで、このような調節の検出はＭＣＬ−１調節化合物を同定する）を含有してなる、ＭＣＬ−１ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
一実施態様では、試験化合物は小分子又はポリペプチドである。随意に、ポリペプチドは架橋ＢＨ３ドメインを有する。
一実施態様では、ポリペプチドの配列は、図１３に挙げられているＳＡＨＢ配列に少なくとも８０％同一である。
別の実施態様では、本発明は、本発明の方法で同定されたＭＣＬ−１調節化合物又は選択的ＭＣＬ−１結合剤を提供する。
【００２７】
一態様では、本発明は、試験化合物とＭＣＬ−１ポリペプチドの相互作用に適している条件下でＭＣＬ−１ ＳＡＨＢに結合するＭＣＬ−１ポリペプチドを試験化合物と接触させること；及びＭＣＬ−１ポリペプチドからＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの解離を検出すること（ここでこのような解離の検出は試験化合物を選択的ＭＣＬ−１結合剤として同定する）による、選択的ＭＣＬ−１結合剤を同定する方法を提供する。
一実施態様では、試験化合物は小分子又はポリペプチドである。
別の実施態様では、ＭＣＬ−１結合剤はＭＣＬ−１阻害剤である。
更なる実施態様では、ＭＣＬ−１ポリペプチド、又は、随意に、ＭＣＬ ＳＡＨＢは標識化されている。
一実施態様では、標識はＦＩＴＣである。
【００２８】
一態様では、本発明は、選択的ＭＣＬ−１阻害剤を包含している医薬組成物を提供する。
一実施態様では、選択的ＭＣＬ−１阻害剤は、ＮＯＸＡ ＢＣＬ−２ファミリーＢＨ３ドメインの安定化α螺旋（ＳＡＨＢ）ポリペプチド配列、ＢＯＫ ＳＡＨＢペプチド配列、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢペプチド配列、野生型又は改変ＢＩＭ ＳＡＨＢ或いはＢＡＫ ＳＡＨＢペプチド配列、又はＭｕｌｅ ＳＡＨＢペプチド配列と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を包含している。
別の実施態様では、選択的ＭＣＬ−１阻害剤は、ＮＯＸＡ ＢＣＬ−２ファミリーＢＨ３ドメインの安定化α螺旋（ＳＡＨＢ）ポリペプチド、ＢＯＫ ＳＡＨＢペプチド、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢペプチド、野生型又は改変ＢＩＭ ＳＡＨＢ或いはＢＡＫ ＳＡＨＢペプチド又はＭｕｌｅ ＳＡＨＢペプチドである、ポリペプチドを包含している。
一実施態様では、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢポリペプチドは配列番号１６に記載の配列又はそれらの誘導体を包含している。
別の実施態様では、ＢＩＭ ＳＡＨＢポリペプチドは配列番号３１、３２に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含している。
更なる実施態様では、ＢＡＫ ＳＡＨＢドメインポリペプチドは配列番号４０に記載の配列を包含している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１（Ａ）は、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーの３つのサブグループが如何に互いに相互作用してアポトーシスを調節するシグナルネットワークを形成するかを説明している。図１（Ｂ）は、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーのアラインメントを表し、タンパク質サブグループが共有している保存ＢＣＬ−２相同ドメインを強調している。
【図２】図２は、アンチアポトーシスタンパク質のＢＨ３結合ポケットが如何に結合して死亡螺旋を隔離するかを示している。
【図３】図３は、生物活性ＢＨ３螺旋が炭化水素架橋によって如何に再構築されて、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質を標的にできる、螺旋性、プロテアーゼ耐性で、細胞透過性の化合物を生ずるかを示している。
【図４】図４は、ヒトＭＣＬ−１（長）（配列番号１）及び選択的にスプライスされたＭＣＬ−１（短）の一次アミノ酸配列を示している。ＢＨ３領域に下線を付し、ＭＣＬ−１（短）の選択的Ｃ末端をイタリック体にしてある。ＭＣＬ−１（長）の分解生成物であると考えられる核内低分子ＭＣＬ−１も報告されている（配列番号７２）。最後に、発現及び結合検討に用いられるＭＣＬ−１ＮＣタンパク質を示している（配列番号７３）。
【図５】図５は、ヒトＮＯＸＡの一次アミノ酸配列を示している。ＢＨ３領域に下線が付されている。
【図６】図６は、ヒトＢＯＫの一次アミノ酸配列を示している。ＢＨ３領域に下線が付されている。
【図７】図７は、プロ及びアンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーのＢＨ３ドメインに基づいて設計された、ＢＣＬ−２ドメインの安定化α螺旋（ＳＡＨＢ）のパネルを示している。架橋結合した非天然アミノ酸の１対（Ｘ）を非相互作用螺旋表面のｉ、ｉ＋４位で置換して、ルテニウム触媒オレフィンメタセシスによって「架橋」した。グラブスのルテニウム触媒の活性を最適化するために、硫黄を含有しているメチオニンをノルロイシンに置換し、これを文字Ｂで表した。
【図８】図８は、蛍光標識されたＳＡＨＢのＭＣＬ−１ΔＮΔＣへの結合に対する解離定数を蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）及び非線回帰分析で確認するためのグラフを示している。（Ａ〜Ｄ）は、蛍光偏光がＦＩＴＣ誘導化ＳＡＨＢ並びに組み換えＭＣＬ−１タンパク質、及び非結合剤由来の顕著なＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢをアッセイすることを説明している。（Ｅ）は、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ及びＮＯＸＡ ＳＡＨＢを包含する親和性の高いＭＣＬ−１結合剤のサブセットの結合等温線を明示していて、これはＭＣＬ−１に選択的であるが、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、又はＢＦＬ１／Ａ１とは結合しなかった。ＢＯＫ ＳＡＨＢは、その他のアンチアポトーシスよりもＭＣＬ−１に対して有意な選択性を示した。
【図９】図９は、ＦＩＴＣ誘導化ＳＡＨＢｓ及び高い親和性でＭＣＬ−１を標的とする化合物であることが明らかにされている組み換えアンチアポトーシスタンパク質（Ａ）、を選択的ＭＣＬ−１相互作用を示しているサブセットと共に（Ａ、Ｂ）用いる蛍光偏光アッセイを示す。（Ａ）は、ＭＣＬ−１特異的及び汎−アンチアポトーシス結合ＳＡＨＢｓのＫＤ値の表を示す。（Ｂ）は、ＭＣＬ−１に選択的でＢＣＬＸ１、ＢＣＬ−ｗ、又はＢＦＬ１／Ａ１と結合しなかった、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ及びＮＯＸＡ ＳＡＨＢを包含する、高親和性ＭＣＬ−１結合剤のサブセットの結合等温線を明らかにしている。ＢＯＫ ＳＡＨＢは、その他のアンチアポトーシスよりもＭＣＬに対して有意な選択性を示した。
【図１０】図１０は、ＭＣＬ−１に対するＭＣＬ−１ＢＨ３螺旋の特異性決定基を説明している。ＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの連続アラニン変異体（アラニンスキャン）のパネルは、高親和性ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ結合に必要なコアＢＨ３配列内の主要残基を明らかにする、ＦＰＡ結合分析のために作成した。ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ結合への天然のアラニン及びグリシン残基の寄与を評価するために、グルタミン酸変異も行った。
【図１１】図１１は、疎水性結合界面に位置している、Ｇ２１７〜Ｑ２２１架橋（ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＣ）のみによるＭＣＬ−１ΔＮΔＣ結合の断裂を明らかにした、螺旋表面に沿った各種架橋位置のサンプリングを示す。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは、親のＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＡより４倍改善されて、最も強い結合活性（ＫＤ，１０ｎＭ）を示した。（Ａ）は、ＭＣＬ−１  ＢＨ３配列の長さに沿った炭化水素架橋の異なった配置を明らかにしている、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの「架橋スキャン」を説明し；（Ｂ）は疎水性結合界面に位置している、Ｇ２１７〜Ｑ２２１架橋（ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＣ）のみによるＭＣＬ−１ΔＮΔＣ結合の断裂を明らかにした、螺旋表面に沿った各種架橋位置のサンプリングを示す。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは、親のＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＡより４倍改善されて、最も強い結合活性（ＫＤ，１０ｎＭ）を示した。
【図１２】図１２は、円偏光二色性が、対応する非改変ペプチドと比較してＭＣＬ−１ ＳＡＨＢについてα螺旋の顕著な増強を明らかにしたことを示す。炭化水素架橋は、圧倒的に非螺旋性のＭＣＬ−１ ＢＨ３鋳型ペプチドを安定化されたα螺旋構造に、５５〜１００％範囲の螺旋パーセントを示す異なった架橋のＳＡＨＢで、変換する。
【図１３】図１３は、ＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＡと同様に、ＦＩＴＩＣ ＳＡＨＢＤは、アンチアポトーシス標的の広いパネルに対して行われたＦＰＡから明らかなように、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣとの強力で排他的な相互作用を見せることを示している。
【図１４】図１４（Ａ）では、選択ＢＨ３ドメインの配列アラインメントが、アンチアポトーシスタンパク質の標準的なＢＨ３ポケットと結合する疎水性残基の主要な相違を明らかにした。ＭＣＬ−１ ＢＨ３は固有のＬＸＸＶＸＸＸＶモチーフを含んでいる。ＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬ選択的ＢＡＤ ＢＨ３ドメインと汎-アンチアポトーシス結合ＢＩＭ ＢＨ３ドメインの両方はＭＣＬ− ＢＨ３内のＶａｌ２２０（下線付加）に対応する位置にＰｈｅを含んでいる。興味深いことに、ＭＣＬ−１に対して選択性を示す、ネズミのＮＯＸＡ ＢＨ３及びＮＵＬＥ ＢＨ３（示していない）ドメインの両方は、この位置にＶａｌを含んでいる。（Ｂ）は、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＡの部位特異的突然変異がＭＣＬ−１への特異性を変えることを示す。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＡ Ｖ２２０ＦはＭＣＬ−１とＢＣＬ−ＸＬの両方と結合し、ＦＰＡによって明らかにされたように、Ｖ２２０が、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣとＢＣＬ−ＸＬΔＣの両方に結合するＭＣＬ−１ＳＡＨＢＡに対する主要な特異性決定基であることを明らかにする。
【図１５】図１５は、部位特異的アミノ酸突然変異が汎−アンチアポトーシス結合剤、ＢＩＭ ＳＡＨＢを選択的ＭＣＬ−１結合剤に変換したことを示している。非選択的ＳＡＨＢの部位特異的突然変異によってＭＣＬ−１に対する特異性も得られた。ＢＩＭ ＳＡＨＢＤにおけるＩｌｅ６５及びＧｌｕ６８の、ＢＩＭ ＳＡＨＢの架橋変異体であるＰｈｅ及びＬｙｓへのそれぞれの突然変異は、蛍光偏光アッセイにより確認されるように、ＭＣＬ−１の選択的阻害をもたらした。
【図１６】図１６（Ａ）は、競合ＦＰＡ（ＦＩＴＣ−ＢＡＫ ＳＡＨＢ／ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ ＩＣ５０、０．２７＋０．０６μＭ）により明らかなように、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢは、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣによるＢＡＫ ＢＨ３螺旋の隔離を効果的に阻害することを示している。（Ｂ）は、野生型及びＢＡＫ−／−ミトコンドリア上で実施したチトクロームｃ放出アッセイで測定されるように、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは、ＢＩＤ ＢＨ３誘発及びＢＡＫ依存性ミトコンドリアアポトーシスを用量依存的に感受性にすることを示している。（Ｃ）は、ＭＣＬ−１免疫沈降法及びＢＡＫウェスタン分析によって評価すると、ＢＡＫとＭＣＬ−１の間の天然の相互作用が、ＯＰＭ２多発性骨髄腫細胞とＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの処理によって用量依存的に分断されたことを示している。
【図１７】図１７（Ａ）は、ＭＣＬ−１免疫共沈降法で明らかにされたように、ＮＯＸＡ ＳＡＨＢはin situのＭＣＬ−１を標的にして、ＭＣＬ／ＢＡＫ相互作用を分断することを示している。（Ｂ）は、ＮＯＸＡ ＳＡＨＢが、化学療法耐性Ｕ９３７ＡＭＬ細胞を低用量のプロアポトーシスＢＩＭ ＳＡＨＢに対して用量依存的に感受性にすることを説明している。
【図１８】図１８は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ)及びＯＰＭ２細胞をＴＲＡＩＬ及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）の漸増用量で処理して、細胞の生存を２４時間目にＭＴＴアッセイで測定したことを示している。ＴＲＡＩＬはジャーカット及びＯＰＭ細胞の両方にアポトーシスを誘発したが、ジャーカット細胞のみがＦａｓＬに感受性があった（Ａ）。これらのデータは図１９〜２１で実施した実験に対する基礎研究を示す。
【図１９】図１９は、ジャーカット（Ｔ−細胞白血病）及びＯＰＭ２細胞を、汎−カスパーゼ阻害剤、ｚ−ＶＡＤの存在下又は非存在下に、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤ単独に及び、低用量の死受容体作動薬ＴＲＡＩＬ及びＦａｓリガンドとの組み合わせに曝露したことを示す。２４時間目にＭＴＴアッセイで測定した細胞の生存は、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤによる、ジャーカット（ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬ）及びＯＰＭ２（ＴＲＡＩＬ）細胞の用量反応性及びカスパーゼ依存性増感を明らかにした（Ａ）。ＤＥＶＤ開裂基質の発光で測定すると、ジャーカット及びＯＰＭ２細胞を死受容体刺激に対して感受性にするＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの能力は、カスパーゼ３／７の用量反応活性化と相関していた（Ｂ）。
【図２０】図２０は、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ及びＢＦＬ−１／Ａ１ΔＣの両方と結合するＮＯＸＡ ＳＡＨＢＡと対照的に、選択的な架橋位置を含有しているＮＯＸＡ ＳＡＡＢＢは、ＦＰＡにより測定されるように、強力で排他的なＭＣＬ−１ΔＮΔＣ結合活性を表すことを示している。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤと同様に、ＮＯＸＡ ＳＡＡＢＢは、２４時間目にＭＴＴアッセイで測定されるように、ジャーカット細胞のアポトーシス応答をＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬに対して感受性にした。
【図２１】図２１は、ＢＦＬ−１ ＳＡＨＢＡは、ＦＰＡによるアンチアポトーシスタンパク質に対して結合活性を示さず、それに対応して、低用量のＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬで処理したジャーカット細胞に増感活性を表さなかったことを示している。
【図２２】図２２は、短縮ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ変異体は高い親和性でＭＣＬ−１ΔＮΔＣと結合することを示している。
【図２３】図２３は、ＭＣＬ−１結合特異性及び選択的標的ＭＣＬ−１を評価するために作出した架橋ＢＨ３ペプチド（ＳＡＨＢｓ）の組成を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
高い親和性及びかつてない選択性で生存タンパク質ＭＣＬ−１を標的にする一連の架橋ＢＣＬ−２ファミリー螺旋がここに同定されている。本明細書に記載されているＭＣＬ−１阻害剤ＳＡＨＢｓはＭＣＬ−１の標準的なＢＨ３溝を標的にして、インビトロ及びin situでＭＣＬ−１／ＢＡＫ相互作用を駆逐して、ＭＣＬ−１依存性癌細胞をミトコンドリアアポトーシスに対して感受性にする。
【００３１】
定義
本明細書で用いられる用語「炭化水素架橋」又は「架橋」は、ポリペプチドの天然の二次構造を配座的に与えるのに役立つ少なくとも２つの改変アミノ酸を有するポリペプチドを安定に架橋結合するプロセスを示す。炭化水素架橋は、α螺旋二次構造を有する傾向にある、ポリペプチドをその本来のα螺旋構造を維持できるようにする。この二次構造はポリペプチドのタンパク分解的切断及び熱に対する耐性を増大して、標的結合親和性、疎水性、及び細胞透過性も増大する。従って、本明細書に記載されている炭化水素「架橋された」（架橋結合した）ポリペプチドは、対応する非炭化水素架橋（架橋結合していない）ポリペプチドと比べて生物活性が改善されている。例えば、架橋結合したポリペプチドはＢＨ３ ＢＣＬ−２相同ドメインのα螺旋ドメインを包含することができて、これは、少なくとも典型的なＮＯＸＡ、ＢＯＫ及びＭＣＬ−１ ＢＨ３ドメインの場合に、ＭＣＬ−１タンパク質の天然リガンドとの相互作用（例えば、ＭＣＬ−１二量体及び／又は多量体及び／又はＭＣＬ−１／ＢＡＫヘテロ二量体の形成を包含する）を競合的に妨害することができて、これにより、細胞中のＭＣＬ−１活性を調節できる。ＭＣＬ−１活性の調節は、例えば、細胞におけるアポトーシスの促進、細胞における細胞周期制御の調節、細胞における自食作用の調節、細胞の炎症応答の調節、細胞の自己免疫応答の調節、及びＲＮＡスプライシングの調節を包含する、多くの効果をもたらすことができる。本明細書に記載されている架橋結合したポリペプチドは、予防的に又は治療的に、例えば、癌のような、過剰増殖性疾患を治療又は予防するために、用いることができる。
【００３２】
炭化水素架橋されたポリペプチドは、２つの非天然アミノ酸の間に１つ又はそれ以上の鎖（連鎖）を包含していて、その鎖はポリペプチドのα螺旋二次構造を有意に増強する。一般に、鎖は１つ又はそれ以上の螺旋旋回（すなわち、約３．４又は７アミノ酸）の長さにわたり広がる。従って、ｉ及びｉ＋３、ｉ及びｉ＋４、又はｉ及びｉ＋７に位置しているアミノ酸は化学修飾及び架橋結合の理想的な候補である。従って、例えば、ペプチドが配列．．．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有している場合は、Ｘ１とＸ４の間、又はＸ１とＸ５の間、又はＸ１とＸ８の間の架橋結合が、また同様にＸ２とＸ５の間、Ｘ２とＸ６の間、又はＸ２とＸ９の間、等の架橋結合が有用であり、ペプチドの炭化水素架橋形態を示す。複数の架橋結合（例えば、２、３、４又はそれ以上の）の使用も意図されている。複数の架橋結合の使用は、ペプチドを安定化して最適化するのに、特にペプチドの長さを増大するのに非常に有効である。従って、本発明は、配列を更に安定化するためか、或いは構造安定性、タンパク質分解耐性、酸安定性、熱安定性、細胞透過性及びより長いペプチド伸長の生物活性増強を促進するためにポリペプチド配列内の一つ以上の架橋結合の取り込みを包含している。炭化水素架橋されたポリペプチドの作成及び使用に関する更なる記載は、例えば、米国特許出願第６１／１２４，２２１号に見出すことができて、この内容は参照によりその全てが本明細書に取り込まれている。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「架橋された」及び「炭化水素架橋された」は、同じ意味で用いられる。
【００３４】
本明細書でポリペプチドに関して用いられる用語「安定な」又は「安定化」は、それらの天然のα螺旋構造を保持する及び／又はプロテアーゼ耐性を改善する及び／又は酸安定性を改善する及び／又は熱安定性を改善する及び／又は細胞透過性を改善する及び／又は標的結合親和性を改善する及び／又は生物活性を改善するために炭化水素架橋されたポリペプチドを示す。
【００３５】
用語ＭＣＬ−１の「活性部位」は、その形状、アミノ酸含量、及び帯電電位の結果として、他の物質（これに限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、分子、化合物、抗生物質、薬剤、及び／又は核酸を包含する）と、多種の共有及び／又は非共有結合力を介して有利に相互作用又は結合する、ＭＣＬ−１ポリペプチド又はＭＣＬ−１相互作用ポリペプチドの領域を示す。ＢＣＬ−２ファミリーメンバーは、最近報告されたように（Gavathiotis et al. Nature, 455: 1076, 2008）、１つ以上の活性部位を有してよい。ＭＣＬ−１上で確定された１つの「活性部位」の例は、疎水性の溝、及びヒト炭化水素架橋ＭＣＬ−１ ＢＨ３（配列番号１、１２、１７〜６０）、ＮＯＸＡ ＢＨ３（配列番号２、７，６３〜６８）、ＢＯＫ ＢＨ３（配列番号３、１１）又は野生型或いはＭＣＬ−１特異性改変ＢＩＭ ＢＨ３（配列番号４、６１、６２）又はＢＡＫ ＢＨ３（配列番号９、６９）、のような、又はＭＵＬＥ ＢＨ３、ＢＨ３相同ドメインを含有している非ＢＣＬ−２ファミリーメンバー（配列番号７０）のような、ＢＣＬ−２相同ドメインの安定化α螺旋と結合できる円周の荷電／親水性残基を包含して、これは螺旋３のＶ２１６、Ｖ２２０、Ｈ２２４、Ａ２２７及びＭ２３１残基、螺旋４のＶ２４９、Ｖ２５３及びＤ２５５残基及び螺旋５のＧ２６２、Ｔ２６６及びＦ２７０残基を包含している、ＭＣＬ−１（ＰＤＢ＃２ｐｑｋ及び配列番号１）のα螺旋３、４及び５の並置によって形成されているか、又は螺旋３のＶ２０１、Ｈ２０５及びＭ２１２残基、螺旋４のＳ２２６、Ｈ２３３及びＶ２３４残基及び螺旋５のＲ２４４、Ｔ２４７、Ｌ２４９及びＦ２５１残基を包含している、ＭＣＬ−１（ＰＤＢ＃２ｊｍ６）の螺旋３、４及び５の並置によって形成されている。
一実施態様では、活性部位は、Ｇ２６２及びＦ２７０（ＰＤＢ＃２ｐｑｋ、配列番号１）に対応する２つ又はそれ以上のアミノ酸を包含している。
【００３６】
用語「ＭＣＬ−１ポリペプチド変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸を天然又は非天然のアミノ酸に付加、から削除又はと置換して、参照のＭＣＬ−１ファミリーペプチドを変化させたポリペプチド又はそれらの模倣物質を示す。以下に記載するように、あるアミノ酸をさほど違わない性質を有する他のものにポリペプチドの活性の本質を変えずに、変更することができる（例えば、グルタミンをグルタミン酸に又は疎水性を疎水性に又は正荷電を正荷電にのような、同類置換）ということは、当該技術分野において良く理解されている。従って、本明細書で用いられるＭＣＬ−１ポリペプチド変異体は、プロ又はアンチアポトーシス活性を有するポリペプチドを包含する。用語「変異体」は、タンパク質又はその他のその機能的ドメイン内の参照ＭＣＬ−１ ＢＣＬ−２相同ドメイン（例えば、ＭＣＬ−１ ＢＨ３ドメイン）と少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを示す。より詳細には、用語「変異体」は、これに限定されないが、螺旋３のＶ２１６、Ｖ２２０、Ｈ２２４、Ａ２２７及びＭ２３１残基、螺旋４のＶ２４９、Ｖ２５３及びＤ２５５残基及び螺旋５のＧ２６２、Ｒ２６３、Ｔ２６６及びＦ２７０残基を包含している、ＭＣＬ−１（ＰＤＢ＃１ｐｑｋ及び配列番号１）のα螺旋３、４及び５、又は螺旋３のＶ２０１、Ｈ２０５及びＭ２１２残基、螺旋４のＳ２２６、Ｈ２３３及びＶ２３４残基及び螺旋５のＲ２４４、Ｔ２４７、Ｌ２４９及びＦ２５１残基を包含している、ＭＣＬ−１（ＰＤＢ＃２ｊｍ６、配列番号１）の螺旋３、４及び５の相対構造座標を含有している三次元構造によって特徴付けられる活性部位を含有しているＭＣＬ−１ポリペプチドを包含し、それぞれの場合に、これらの残基の同類骨格原子からの標準偏差＋／−は、１．１オングストローム未満、ある特定の実施態様では１．０オングストローム未満、そして更なる特定の実施態様では０．５オングストローム未満である。
【００３７】
「ＭＣＬ−１ポリペプチド変異体」は更に、ＭＣＬ−１ ＢＣＬ−２相同ドメイン（例えば、ＢＨ３ドメイン）のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上類似しているアミノ酸配列を含有している、ポリペプチド、又はそれらの生物活性断片を包含する。ある特定の実施態様では、ＢＣＬ−２相同ドメインは、ＭＣＬ−１（配列番号１）のＬ２１３、Ｇ２１７、及び／又はＤ２１８に対応するアミノ酸残基のような、１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基又はそれらの同類置換を含有している。
【００３８】
用語「疎水性アミノ酸」は、相対的に水に不溶性である、非荷電で非極性の側鎖を有している天然又は非天然のアミノ酸又はそれらの模倣物質を意味する。天然由来疎水性アミノ酸の例は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンである。
【００３９】
用語「親水性アミノ酸」は、相対的に水溶性である、非荷電で極性の側鎖を有している天然又は非天然のアミノ酸又はそれらの模倣物質を意味する。天然由来親水性アミノ酸の例は、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、及びシステインである。
【００４０】
用語「負に荷電したアミノ酸」は、通常の生理学的条件下で負に荷電する側鎖を有している天然由来又は非天然のアミノ酸又はそれらの模倣物質を包含する。負に荷電している天然由来アミノ酸の例はアスパラギン酸及びグルタミン酸である。
【００４１】
用語「正に荷電したアミノ酸」は、通常の生理学的条件下で正に荷電する側鎖を有している天然由来又は非天然のアミノ酸又はそれらの模倣物質を包含する。正に荷電している天然由来アミノ酸の例はアルギニン、リジン及びヒスチジンである。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド」は、わずか１つから４つもの保存性ＢＣＬ−２相同ドメイン（ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及び／又はＢＨ４）を有しているタンパク質の進化的に保存されているファミリーを示す。ＢＨドメインはα螺旋セグメントであって、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のアンチアポトーシス及びプロアポトーシスポリペプチドの両方に存在していて、多くの種に渡って、配列レベルで及び機能的にの両方で保存されている（例えば、マウスＢＣＬ−２ファミリータンパク質はヒトＭＣＬ−１と結合する）。ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドは、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−Ｂ、Ａ１／ＢＦＬ−１、ＢＯＯ／ＤＩＶＡ、Ｎｒ−１３、ＣＥＤ−９、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫ／ＭＴＤ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＥＧＬ−１、及びウィルス性同族体を包含する。機能的ＢＣＬ−２ファミリー相同ドメインは、Ｂｅｃｌｉｎ−１（Oberstein et al. J Biol Chem, 282: 13123, 2007）及びＭＵＬＥ（Zhong et al. Cell, 121:1085, 2005）のような非ＢＣＬ−２ファミリータンパク質にも見出され、これはＢＨ３ドメインを含有する非ＢＣＬ−２ファミリータンパク質である。このような非ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドも本発明の組成物、方法及びキットで用いることができるということを当業者は理解できるだろう。ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを調節する方法及び組成物は米国特許出願第６０／９９５，５４５号に記載されていて、この内容は参照によりその全てが本明細書に取り込まれている。
【００４３】
用語「アンチアポトーシスポリペプチド」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸相同ドメイン、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及び／又はＢＨ４を有し、アポトーシスを弱力化又は阻害して細胞の生存を促進するこによって特徴付けられる、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを示す。「アンチアポトーシスポリペプチド」は更に、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド内のアンチアポトーシスＢＣＬ−２相同ドメインとアミノ酸配列が少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上類似している、タンパク質、又はそれらの生物活性断片を包含する。
ある特定の実施態様では、ＢＣＬ−２相同ドメインは、ＭＣＬ−１のＢＨ３ドメイン（ＰＤＢ＃１ｐｑｋ、配列番号１）のＬ２１３、Ｇ２１７、及び／又はＤ２１８残基に対応するアミノ酸残基のような、１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を含有している。アンチ(抗)アポトーシスポリペプチドは、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｘ１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、Ａ１／ＢＦＬ−１、ＢＯＯ／ＤＩＶＡ、Ｎｒ−１３、ＣＥＤ−９、及びウィルス性同族体を包含する。
【００４４】
用語「プロアポトーシスポリペプチド」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸相同ドメイン、ＢＨ１、ＢＨ２及び／又はＢＨ３を有し、アポトーシスを活性化して細胞死を促進することによって特徴付けられる、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを示す。「プロアポトーシスポリペプチド」は更に、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド内のプロアポトーシスＢＣＬ−２相同ドメインとアミノ酸配列が少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上類似している、タンパク質、又はそれらの生物活性断片を包含する。
ある特定の実施態様では、ＢＣＬ−２相同ドメインは、ＮＯＸＡのＢＨ３ドメイン（PubMed RefSeq:ＮＰ＿０６６９５０．１、配列番号２、５）のＬ２９及びＧ３３残基又はＢＯＫのＢＨ３ドメイン（PubMed RefSeq:ＮＰ＿１１５９０４．１、配列番号３、９）のＬ７０及びＧ７５残基に対応するアミノ酸残基のような、１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を含有している。プロアポトーシスポリペプチドは、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫ／ＭＴＤ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＥＧＬ−１、及びウィルス性同族体を包含する。標的化分解によってＭＣＬ−１レベルを制御して、それによって生理的ストレス中でプロアポトーシスとなる非ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の例は、ＢＨ３ドメインを含有しているユビキチンリガーゼＭＵＬＥである。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「アポトーシス」は、エンドヌクレアーゼ活性、染色体移動、細胞核内の辺縁趨向、アポトーシス小体の形成、ミトコンドリアの膨張、ミトコンドリア稜の拡大、ミトコンドリア透過性転移孔の開口及び／又はミトコンドリアプロトン勾配の消失に関連していても関連していなくてもよい、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の断片化、クロマチンの凝縮などの、容易に観察可能な形態学的及び生化学的な変化によって特徴づけられる細胞死の選択的形態を誘導する、生化学的事象の制御されたネットワークを示す。
【００４６】
用語「化合物」は、化学化合物、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせ、又は化学化合物及び／又はポリペプチド及び／又は核酸（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ誘導体）の混合物、それらの塩及び溶媒和物、等を示すように本明細書で用いられている。
ある特定の実施態様では、本発明の化合物は、ＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位に結合する。
「モジュレータ」はＭＣＬ−１ポリペプチドの活性を変える（例えば、増強／促進又は阻害／抑制する）化合物である。
【００４７】
用語「候補化合物」又は「試験化合物」は、本発明の方法で試験されて、ＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位と結合することが見出され、それによりＭＣＬ−１ポリペプチドの活性を調節すると考えられる、化学化合物、ペプチド、核酸又はそれらの組み合わせ、又は化学化合物及び／又はポリペプチド及び／又は核酸の混合物、それらの塩及び溶媒和物、等を示すように本明細書で用いられている。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「小分子」は、２，０００ダルトン以下、より好ましくは３００〜１，０００ダルトン、更により好ましくは４００〜７００ダルトンの分子量を有する化学化合物を示すと考えられている。これらの小分子が有機分子であることが好ましい。
ある特定の実施態様では、「小分子」はペプチド又は核酸分子を包含しない。
【００４９】
化合物に関連して本明細書で用いられている用語「調節する」は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチアポトーシス又はプロアポトーシス活性の活性化又は阻害、又はＢＣＬ−２ファミリーメンバー又はＢＣＬ−２相同ドメインとの結合を標的にしているその他のタンパク質が関連するタンパク質−タンパク質相互作用に影響して、それにより生化学的経路（例えば、変性タンパク質応答、グルコース刺激性インスリン分泌、アポトーシス）を制御することを示す。アンチアポトーシス、プロアポトーシス及びその他の生化学的活性（例えば、変性タンパク質応答、グルコース刺激性インスリン分泌、アポトーシス）の両方をアッセイする方法は当該技術分野で周知であって、本明細書に記載されている。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「相互作用する」又は「結合する」は、化合物又はそれらの部分と、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又はそれらの部分の活性部位との間の近接の状態を示す。相互作用は、化合物上の１つ又はそれ以上の部分と、活性部位のアミノ酸上の１つ又はそれ以上の部分との間にある。結合は、非共有（ここで、並置が、水素結合、又はファン・デル・ワールス若しくは静電的相互作用によってエネルギー的に有利である）であっても、共有であってもよい。
例えば、螺旋３のＶ２１６、Ｖ２２０、Ｈ２２４、Ａ２２７及びＭ２３１残基、螺旋４のＶ２４９、Ｖ２５３及びＤ２５５残基、及び螺旋５のＧ２６２、Ｒ２６３、Ｔ２６６及びＦ２７０残基を包含する、ＭＣＬ−１ポリペプチドのα螺旋３、４及び５の疎水性及び親水性アミノ酸残基は、 ＭＣＬ−１ＢＨ３ドメイン（PubMed RefSeq: NP_068779.1、配列番号１，１６）の残基Ｔ２１２、Ｌ２１３、Ｒ２１４、Ｖ２１６、Ｇ２１７、Ｄ２１８及びＶ２２０、ＮＯＸＡ ＢＨ３ドメイン（PubMed RefSeq: NP_066950.1、配列番号２，５）の残基Ａ２６、Ｌ２９、Ｇ３３及びＬ３６、及びＢＯＫ ＢＨ３ドメイン（PubMed RefSeq: NP_115904.1、配列番号３、９）残基Ｖ６６、Ｖ６９、Ｌ７０、Ｇ７５及びＬ７９と相互作用すると予測されている。
【００５１】
用語「活性化する」は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチアポトーシス又はプロアポトーシス活性、或いはタンパク質−タンパク質又はタンパク質−核酸の相互作用に基づくその他の定義された生化学的な活性の増大を示す。
プロアポトーシス活性を活性化する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位と結合して、その化合物を欠如している対照と比較したときに、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのプロアポトーシス活性の、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上の増大をもたらすだろう。
別の実施態様では、アンチアポトーシス活性を活性化する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位と結合して、その化合物を欠如している対照と比較したときに、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチポトーシス（生存）活性の例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上の増大をもたらすだろう。
別の実施態様では、生化学的な活性（例えば、細胞周期、自食作用）を調節する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又は標的タンパク質と結合するその他のＢＣＬ−２相同ドメインの活性部位と結合して、その化合物を欠如している対照と比較したときに、標的タンパク質の生化学的活性の、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上の増大をもたらすだろう。
アンチアポトーシス又はプロアポトーシス活性の活性化、又は生化学的活性（例えば、自食作用の誘発、細胞周期停止の誘発）の調節を評価するためのアッセイは当該技術分野で公知であって、本明細書に記載されている。
【００５２】
用語「阻害する」は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチアポトーシス又はプロアポトーシス活性、又はタンパク質−タンパク質相互作用に基づく別に定義された生化学的活性を減少又は遮断することを示す。例えば、プロアポトーシス活性を阻害する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位に結合して、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性化を阻止するか或いは活性を減少するだろう。従って、この化合物はプロアポトーシス活性の効果を阻害又は減少するだろう。従って、プロアポトーシス活性、例えば、細胞死が、化合物が存在していない対照の細胞集団と比較すると、阻害剤が存在している細胞の集団において、例えば、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満に少なくなるだろう。
別の実施態様では、アンチアポトーシス活性を阻害する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位と結合して、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチアポトーシス活性を阻止又は減少するだろう。従って、アンチアポトーシス活性、例えば、生存率が、化合物が存在していない対照の細胞集団と比較すると、阻害剤が存在している細胞の集団において、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満に少なくなるだろう。
更に別の実施態様では、生化学的活性（例えば、細胞周期、自食作用）を調節する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又は標的タンパク質を結合するその他のＢＣＬ−２相同ドメインの活性部位と結合して、標的タンパク質の生化学的活性を阻止又は減少するだろう。従って、生化学的活性（例えば、自食作用、細胞周期停止）が、化合物が存在していない対照の細胞集団と比較すると、阻害剤が存在している細胞の集団において、例えば、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満に少なくなるだろう。
【００５３】
本明細書で用いられている用語「ＢＨ３ ＳＡＨＢ」は、安定化したα螺旋を形成するために炭化水素架橋されている、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド及び／又はＢＨ３ドメインを含有しているポリペプチド（例えば、ＭＵＬＥ）のＢＣＬ-２相同ドメイン３を示す。多くのＢＨ３ドメインのアミノ酸配列が本明細書に記載されている（例えば、図７、９、及び１５）。ＢＨ３ ＳＡＨＢを作る方法は当該技術分野において公知であって、２００４年１１月５日に出願された、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２５０６８０号（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に記載されている。
【００５４】
本明細書で用いられている用語「ＮＯＸＡ ＢＨ３ポリペプチド」は、ＮＯＸＡのＢＣＬ−２相同ドメイン３を有しているポリペプチドを示す。
一実施態様では、ＮＯＸＡ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号２（図５）に記載の配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号２のＬ２９、Ｇ３３、及び／又はＤ３４に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含している。随意に、ＮＯＸＡ ＢＨ３ポリペプチドのＮＯＸＡ ＢＨ３ドメインは、配列番号２に記載のＢＨ３ドメインの配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していてもよい。
ある特定の実施態様では、ＮＯＸＡ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号７、及び配列番号６３〜６８に記載のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、用語「ＮＯＸＡ ＢＨ３ポリペプチド」の範囲は、配列番号２の生物活性断片を包含していて、一方「ＮＯＸＡ ＢＨ３ドメイン」の範囲は同様に、配列番号２のＢＨ３ドメインの生物活性断片を包含する。
【００５５】
本明細書で用いられている用語「ＢＯＫ ＢＨ３ポリペプチド」は、ＢＯＫのＢＣＬ−２相同ドメイン３を有しているポリペプチドを示す。
一実施態様では、ＢＯＫ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号３（図６）に記載の配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号３のＬ７０、Ｇ７５、及び／又はＤ７６残基に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含する。
随意に、ＢＯＫ ＢＨ３ポリペプチドのＢＯＫ ＢＨ３ドメインは、配列番号３に記載のＢＨ３ドメインの配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、ＢＯＫ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、用語「ＢＯＫ ＢＨ３ポリペプチド」の範囲は、配列番号３の生物活性断片を包含していて、一方「ＢＯＫ ＢＨ３ドメイン」の範囲は同様に、配列番号３に記載の配列のＢＨ３のドメインの生物活性断片を包含する。
【００５６】
本明細書で用いられている用語「ＭＣＬ−１ ＢＨ３ポリペプチド」は、ＭＣＬ−１のＢＣＬ−２相同ドメイン３を有しているポリペプチドを示す。
一実施態様では、ＭＣＬ−１ ＢＨ３ポリペプチドは配列番号１に記載の配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号１（図４）のＬ２１３及びＧ２１７に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含する。
随意に、ＭＣＬ−１ ＢＨ３ポリペプチドのＭＣＬ−１ ＢＨ３ドメインは、配列番号１に記載のＢＨ３ドメインの配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、ＭＣＬ−１ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号１２、１７〜６０に記載のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、用語「ＭＣＬ−１ ＢＨ３ポリペプチド」の範囲は、配列番号１の生物活性断片を包含していて、一方「ＭＣＬ−１ ＢＨ３ドメイン」の範囲は同様に、配列番号１に記載の配列のＢＨ３のドメインの生物活性断片を包含する。
【００５７】
本明細書で用いられている用語「ＭＣＬ−１特異性改変ＢＨ３ポリペプチド」は、その結合活性をＭＣＬ−１選択的にするように突然変異されている、ＢＣＬ−２ファミリーメンバー（図１Ｂ、７）のＢＣＬ−２相同ドメインを有しているポリペプチドを示す。
一実施態様では、配列番号４に記載のＢＩＭ ＢＨ３の配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号４（NCBI#NP_619527に基づいて列挙）のＬ１５２及びＧ１５６に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含するが、ＭＣＬ−１特異性をもたらすために、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基の突然変異、例えば、配列番号３のＩ１５５のＦへの及び／又はＥ１５８のＫへの変換、又はそれらの同類置換も包含する。
ある特定の実施態様では、ＭＣＬ−１特異性改変ＢＩＭ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有している。
別の実施態様では、ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号９に記載のＢＡＫ ＢＨ３の配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号６（NCBI#NP_619527に基づいて列挙）のＬ７４及びＧ７８に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含するが、ＭＣＬ−１特異性をもたらすために、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基の突然変異、例えば、配列番号６９のＩ７７のＦへの及び／又はＤ８４のＫへの変換（NCBI#NP_001179に基づいて列挙)、又はそれらの同類置換も包含する。
【００５８】
本明細書で用いられている用語「非ＢＣＬ−２ファミリーメンバーＢＨ３ポリペプチド」は、ＢＣＬ−２相同ドメイン３を有しているが、それ以外には従来ＢＣＬ−２ファミリーメンバー又は同族体に分類されない、ポリペプチドを示す。
一実施態様では、非ＢＣＬ−２ファミリーメンバーＢＨ３ポリペプチドは、配列番号７０に記載の配列と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号７０（図１３）のＬ１９８０及びＧ１９８４（NCBI#AAY98258に基づいて列挙）に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含する。
【００５９】
用語「薬理学的有効量」、「治療有効量」、「薬理学的有効用量」又は単に「有効量」は、意図する薬理学的、治療的又は予防的結果を生じるのに有効な薬剤の量を示す。薬理学的有効量は、疾患の１つ又はそれ以上の症状の改善をもたらし、又は疾患の進行を防ぎ、或いは疾患の退行をもたらし、又は疾患を予防する。
例えば、過剰な細胞生存又は増殖の障害の治療に関しては、治療有効量は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％まで、腫瘍成長の速度を減少し、腫瘍の大きさを減少し、転移の数を減少し、腫瘍進行の時間を増大し、或いは生存時間を増大する、治療薬剤の量を示すことが好ましい。
【００６０】
例えば、増大する細胞死に関連する疾患、例えば虚血、の治療に関しては、治療有効量は、治療を行わなかった場合に起こるであろう組織及び／又は細胞の損傷を阻止又は制限する治療薬剤の量を示すことが好ましい。治療薬剤は、組織及び／又は細胞の損傷を、本発明の治療薬剤の投与なしで起こる損傷と比較すると、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％まで減少する。
【００６１】
疾患（例えば、過剰増殖性疾患、過剰な細胞生存又は増殖）に関連して本明細書で用いられる用語「治療する」、及び「治療すること」は、動物又はヒトにおける病的細胞（例えば、過剰増殖性又は腫瘍性細胞）の発生の減少を示す。阻止は完全、例えば対象における病的細胞の皆無、であってよい。阻止は、対象における病的細胞の発生を、本発明なしで発生するであろうよりも少なくするような、部分的であってもよい。
ある実施態様では、このような用語は、１つ又はそれ以上の治療法の投与によって：（１）癌細胞集団の安定化、減少又は除去、（２）寛解期間の増大、（３）癌の再発率の減少、（４）癌の再発時間の増大、及び（６）患者の生存率の増大：の１つ、２つ、３つ又はそれ以上の結果を示す。
【００６２】
増大した細胞死に関連する疾患、例えば虚血、に関して本明細書で用いられる用語「治療する」、及び「治療すること」は、動物又はヒトにおいて組織及び／又は細胞の損傷の発生を減少することを示す。阻止は完全、例えば、対象における組織損傷が皆無であってよい。阻止は、対象における組織損傷が、治療薬無しで発生するものよりも少ないように、部分的であってもよい。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、対象における疾患の発生を減少すること、又は疾患又はその関連症状に罹る危険性を減少することを示すものとする。予防は、例えば対象において疾患又は病的細胞が皆無であるように、完全であってよい。予防は、患者における疾患又は病的細胞の発生が、本発明なしで発生するであろうよりも少ないというように、部分的であってもよい。
【００６４】
用語「対象」は、動物又はヒト、或いは動物又はヒト由来の１つ又はそれ以上の細胞を示す。好ましくは、対象はヒトである。対象は非ヒト霊長類を包含できる。細胞は、これに限定されないが、組織に保持されている細胞、細胞集合、不死化した、トランスフェクトされた又は形質転換された細胞、及び物理的に又は表現型的に変化した動物由来の細胞を包含する、何れの形態であってもよい。ヒト対象は患者であることが分かる。
【００６５】
用語「抗腫瘍活性」は、物質又は組成物と相互作用する腫瘍細胞の増殖を阻止するか、或いは腫瘍細胞の死を誘導する、物質又は組成物の能力を示す。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「ＭＣＬ−１関連疾患」は、無秩序なＭＣＬ−１ポリペプチド、特にＭＣＬ−１の増大した発現に関連している疾患を示す。ＭＣＬ−１関連疾患は、正常対照細胞、好ましくは同一対象由来の正常対照細胞と比較して、ＭＣＬ−１発現のレベルが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上増大しているＭＣＬ−１を有していることによって特徴付けられる。ＭＣＬ−１関連疾患は、過剰な細胞生存及び／又は増殖、例えば癌、又は細胞周期の脱制御、又は自食経路の脱制御、又は対象の細胞自己免疫或いは炎症性応答の脱制御、又はＲＮＡスプライシングの脱制御と関連している。ＭＣＬ−１関連疾患は無秩序なＭＣＬ−１の同定によって診断される必要はない。その代わり、この疾患は、標準的な方法、例えば、画像解析、診察、生検、血液分析で初期診断でき、そして組織学的分析、ＰＣＲ、又は当該技術分野で公知のその他の方法によってＭＣＬ−１関連疾患であると確認できる。ＭＣＬ−１関連疾患は本明細書に記載されているようなものを包含する。
【００６７】
本明細書で用いられる「過剰増殖性障害」は、癌、腫瘍性生育、肥厚又は増殖性生育、異常細胞発達又は生存の病的状態を意味して、固形癌、非固形癌、及び白血病に見られるような何れかの異常細胞増殖又は蓄積を包含する。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「抗癌剤」及び「抗癌薬」は、癌のような過剰増殖性疾患の治療で用いられている、何れかの治療薬（例えば、化学療法化合物及び／又は分子治療化合物）、アンチセンス治療薬、抗体治療薬、ペプチド治療薬、核酸治療薬（例えば、ＲＮＡｉ）、放射線治療薬、又はこれらの組み合わせを示す。
一実施態様では、本発明は、抗癌剤と、本明細書に記載されているようにＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位に結合する化合物との有効用量を投与することを含有してなる、ＭＣＬ−１関連疾患を治療する方法を対象にしている。
【００６９】
アミノ酸の位置、例えば、配列番号１に記載の配列のＬ２１３及びＧ２１７に関して本明細書で用いられている、用語「に対応している」は、第１ポリペプチドと参照ポリペプチドの配列が相同性又は別のアルゴリズム（例えば、構造比較）によって整列しているときに、参照ポリペプチド配列、例えばＮＯＸＡ、の所定のアミノ酸と整列される第１ポリペプチド配列、例えばＭＣＬ−１、のアミノ酸を示す。アラインメントは、この目的のためにデザインされたソフトウェア、例えば、このバージョン用のデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２を用いて、当業者によって実行される。対応するアミノ酸は、第１ポリペプチド配列及び第２ポリペプチド配列の構造比較によっても同定できる。このような構造比較は当該技術分野において公知であって、本明細書に記載されている。例えば、Petros et al. Biochimica et Biophysica Acta 1644; 83-94 (2004) 及びSuzuki et al., Cell. 103; 645-654 (2000) は、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーのＢＣＬ−２相同ドメイン間の構造アラインメントを説明している。
【００７０】
用語アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基の両方を含有している分子を示す。適切なアミノ酸は、限定されないで、ペプチド中で見出される２０個の通常の天然アミノ酸（例えば、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ（１文字略号として知られている））、更に有機合成又はその他の代謝経路で製造される天然又は非天然のアミノ酸（例えば、ノルロイシン、ペプチド架橋を可能にする改変アミノ酸、ペプチド結合以外の結合で結合するアミノ酸）のＤ−及びＬ−異性体の両方を包含する。
【００７１】
「非−必須」アミノ酸残基は、そのリガンド結合能力を無効に或いは実質的に変えることなく、又はその反対にポリペプチドの活性に著しく影響を与え、特にこれを減少して（例えば、ペプチドの活性を４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満減少する）、ポリペプチド（例えば、ＭＣＬ−１ ＢＨ３）の野生型配列から変えることができる残基である。
ある特定の実施態様では、非−必須アミノ酸の改変によってペプチドの活性を増大することができる。
「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変えたときに、ＭＣＬ−１活性部位に対するポリペプチドの結合活性の無効化又は実質的な消失をもたらすか、或いはそれと反対にポリペプチドの活性を劇的に変える（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％まで活性を減少する）残基である。
ある特定の例では、「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変えたときに、ポリペプチドの結合活性の無効化又は実質的な消失をもたらす残基に限定される。
例えば、ＭＣＬ−１、ＮＯＸＡ、ＢＯＫ又はその他のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのＢＨ３ドメインの必須及び非−必須アミノ酸残基は、当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている方法によって容易に確認できる。本明細書で用いる用語「必須」アミノ酸残基は必須アミノ酸の同類置換を包含する。一般に、「必須」アミノ酸残基は、ＢＨ３ポリペプチドとＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位との相互作用面で見出される。
【００７２】
本明細書で用いられる「相互作用面」は、他のタンパク質又は結合パートナと相互作用するタンパク質の面であると理解される。本発明のペプチドは実質的にα螺旋である。α螺旋は、回転当たり３．６個のアミノ酸を包含し、すなわち、螺旋ペプチド中のアミノ酸の位置は、螺旋の長さに対してａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇ．．．の位置にあると考えられる。従って、α螺旋の「面」は、ａとｄ、ｂとｅ、ｃとｆ等の位置にあるアミノ酸で形成され、これは互いの上に「積み重なって」１つの「面」を形成している。この「面」は単一のアミノ酸より幅広くでき、ここで、ａ、ｂ、ｄ及びｅの全ての位置が面を形成し、或いはｃ、ｄ、ｇ及びａが面を形成し；又は面の幅は面に沿って変化するが、螺旋中の近接及び／又は「積み重なった」アミノ酸からなっている。
本発明のペプチドでは、架橋が結合タンパク質（例えば、ＭＣＬ−１）と直接相互作用するアミノ酸と結合していないことが好ましい。本明細書におけるアラニンスキャン及び架橋スキャンによって明らかにされたように、ペプチドは一般に、α螺旋の非相互作用面上での突然変異又は改変に対してより耐性であり、そしてα螺旋の相互作用面上での突然変異に対して耐性がより少ない。相互作用タンパク質と相互作用する螺旋の部分のＮ末端又はＣ末端の何れかに近接した相互作用面に作出すると、架橋及び突然変異は耐性となり、ある時は有利である。例えば、螺旋の相互作用面に隣接した架橋の配置がペプチドの標的タンパク質に対する増大した親和性をもたらすということが知られている。本発明のペプチドの相互作用及び非相互作用面上のアミノ酸の同定は十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７３】
「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有する天然の又は非天然のアミノ酸残基で置換されているということである。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。その他の同類アミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修正するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーを越えて生じることもある。従って、ＢＨ３ドメインポリペプチド中の予想される非必須アミノ酸残基を、例えば、同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置き換える又はファミリーを越える同族体由来の別のアミノ酸残基と置き換える（例えば、アスパラギンをアスパラギン酸へ、グルタミンをグルタミン酸へ）ことが好ましい。更に、コードされる配列における単一アミノ酸又はアミノ酸の数パーセントを変更、付加又は欠失する個々の置換、削除又は付加も「同類置換」と考えられる。
適切な同類アミノ酸置換は、同じタンパク質を発現する別の動物由来のタンパク質アイソフォームとのアラインメントによって同定することもできる。
好ましい実施態様では、可能な同類アミノ酸変更を確認するために、ヒトの配列を別の哺乳動物の配列と比較する。配列比較のための別の哺乳動物は、これに限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウサギ、及び非ヒト霊長類を包含する。配列アラインメントを実施する方法は、本明細書で検討するように周知である。
【００７４】
２つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列に関連している用語「同一の」又は「同一パーセント」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定されるように、又は目視検査によって、比較及び最大一致整列したときに、同一であるか或いは同一であるヌクレオチド又はアミノ酸を特定の割合で有している２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列を示す。
【００７５】
２つ又はそれ以上のポリペプチド配列に関連している用語「相同」又は「相同パーセント」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定されるように、又は目視検査によって、比較及び最大一致整列したときに、同一であるか、又は同一であるアミノ酸残基或いはその同類置換を特定の割合で有している、２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列を示す。例としては、第１領域のアミノ酸配列が、第１領域中に含有されている数と等しいアミノ酸の数の第２タンパク質の配列と比較したとき、又は以下に検討するような、当該技術分野で公知のコンピューター相同性プログラムによって整列されているＭＣＬ−１及びそれらの同族体（例えば、アンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバータンパク質）のアラインメントと比較したとき、第２ＭＣＬ−１タンパク質又はその他のタンパク質（例えば、ＮＯＸＡタンパク質）の領域と、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、或いはさらに９５％も同一である、又は保存的に置換されている場合に、第１タンパク質領域はアンチアポトーシスＭＣＬ−１タンパク質の領域と相同であると考えられる。第１タンパク質及び第２タンパク質のポリペプチド領域が１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基、例えば図１、７、及び１５に説明されているもののような、を包含していることが好ましい。
【００７６】
本明細書で用いられる用語「同一性」又は「同一性パーセント」は、２つのポリマー分子間、例えば２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド間のサブユニット配列類似性を示す。２つの分子の両方のサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められているとき、例えば、２つのペプチドのそれぞれの位置がセリンで占められているなら、これらはその位置で同一である。２つの配列の同一性は、一致位置数又は同一位置数の一次関数である。例えば、２つのペプチド又は化合物配列の位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリマーの５つの位置）が同一なら、２つの配列は５０％同一である；位置の９０％、例えば、１０のうち９が一致していれば、２つの配列は９０％の配列同一性を共有している。２つの配列間の同一性は、一致又は同一位置数の一次関数である。従って、特定のペプチドにおいて参照配列の一部が欠失している場合は、配列同一性を算出する目的では、欠失部分を数えない。同一性は多くの場合、配列分析ソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰ (www.ncbi.nih.gov/BLAST/)を用いて測定する。ＢＬＡＳＴＮによる（ヌクレオチド配列に対して）２配列比較（例えば、２つの配列を互いに「ブラスト」する）のためのデフォルトパラメータは、一致に対する報酬＝１、不一致に対する罰則＝−２、オープンギャップ＝５、拡張ギャップ＝２である。タンパク質配列に対してＢＬＡＳＴＰを用いる場合のデフォルトパラメータは、一致に対する報酬＝０、不一致に対する罰則＝０、オープンギャップ＝１１、拡張ギャップ＝１である。さらに、同一性を測定するコンピュータプログラムは当該技術分野で公知である。
【００７７】
２つ又はそれ以上のポリペプチド配列に関する「類似性」又は「類似性パーセント」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定されるように、又は目視検査によって、比較及び最大一致整列したときに、同一であるか、又は同一であるアミノ酸残基或いはその同類置換を特定の割合で有している、２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列を示す。例として、第１ポリペプチドのアミノ酸配列が、当該技術分野で公知であって本明細書で検討されているコンピュータ類似性プログラムで整列して、第１ポリペプチドに含まれている数と同じ数のアミノ酸の何れかの配列と比較したときに、ＭＣＬ−１のＢＨ３ドメインの領域と、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又はさらに９５％も又はそれ以上も同一、或いは保存的に置換されているなら、第１ポリペプチドはＭＣＬ−１のＢＨ３ドメインと類似していると考えられる。第１タンパク質のポリペプチド領域及び第２タンパク質が１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を有していることが好ましい。
【００７８】
用語「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸のα−炭素に結合している部分を示す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖はメチルであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖フェニルメチルであり、システインのアミノ酸側鎖はチオメチルであり、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシメチルであり、チロシンのアミノ酸側鎖は４−ヒドロキシフェニルメチル等である。その他の非天然アミノ酸側鎖、例えば、天然に発生するもの（例えば、アミノ酸代謝）又は合成で作られるもの（例えば、α−ジ置換アミノ酸）も包含する。
【００７９】
用語「ポリペプチド」は、共有結合（例えば、アミド結合）によって結合している２つ又はそれ以上の天然の又は合成されたアミノ酸を包含している。本明細書に記載されているポリペプチドは、全長のタンパク質（例えば、十分に成熟したタンパク質）を、更により短いアミノ酸配列（例えば、天然のタンパク質のスプライス変異体、天然のタンパク質の断片又は合成ポリペプチド断片）も包含する。
【００８０】
本明細書で用いる用語「選択的ＭＣＬ−１結合剤」は、非ＭＣＬ−１アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質（例えば、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−Ｂ，ＢＣＬ−ｗ及びＢＦＬ／Ａ１）と結合できるよりもＭＣＬ−１と結合するより大きい能力を有している物質を示す。「選択的ＭＣＬ−１結合剤」は、物質が非ＭＣＬ−１ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドと結合できるより、少なくとも１．５倍大きくＭＣＬ−１ポリペプチドと結合できる物質である。
ある特定の実施態様では、選択的ＭＣＬ−１結合剤は、選択的ＭＣＬ−１結合剤が非ＭＣＬ−１ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドと結合できるよりも、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍又はそれ以上強くＭＣＬ−１ポリペプチドと結合できる。随意に、選択的ＮＣＬ−１阻害剤は、選択的ＭＣＬ−１結合剤がその他の何れかのＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドと結合できるよりも、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍又はそれ以上強くＭＣＬ−１ポリペプチドと結合できる。
ある特定の実施態様では、「選択的ＭＣＬ−１結合剤」は、１、２、５、１０、２０、５０、１００、１５０又は２００ｎＭにほぼ等しいか又はそれ以下のＫＤでＭＣＬ−１と結合するのに対して、非ＭＣＬ−１ＢＣＬ２ファミリーポリペプチド（又は全ての非ＭＣＬ−１ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド）はほぼ３００、４００又は５００ｎＭ以上のＫＤで結合する。
ある薬剤の「選択的ＭＣＬ−１結合剤」としての同定及び評価は、薬剤のＭＣＬ−１ポリペプチドのドメインとの物理的相互作用を、非ＭＣＬ−１アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質のそのようなドメインとのその薬剤の相互作用と比較して直接評価する（例えば、薬剤のＢＣＬ−２の活性部位と結合する能力と比較した、試験薬剤がＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位と結合する能力をモニタリングする）か、又は非ＭＣＬ−１アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質の活性と比較してＭＣＬ−１活性を間接的に評価、例えば、薬剤（例えば、試験薬剤）によるＭＣＬ−１活性の調節をモニタリングして、の何れかで実施できる。
このような「ＭＣＬ−１結合剤」のＭＣＬ−１ポリペプチドへの結合は、結合薬剤の同一性に応じて、ＭＣＬ−１ポリペプチド活性を阻害し、ＭＣＬ−１ポリペプチド活性を活性化し、或いはＭＣＬ−１ポリペプチドの活性を調節してよく、又はＭＣＬ−１ポリペプチド活性に変化をもたらさなくてよい。
【００８１】
本明細書で用いられる用語「選択的ＭＣＬ−１阻害剤」は、非ＭＣＬ−１アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質（例えば、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−Ｂ，ＢＣＬ−ｗ及びＢＦＬ／Ａ１）の活性を阻害するよりも、ＭＣＬ−１活性を阻害する、より大きい能力を有している薬剤を示す。「選択的ＭＣＬ−１阻害剤」は、小分子、ペプチド、抗体、アンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）、マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）系の化合物又はそれらの組み合わせを包含する、何れのタイプの治療化合物であってもよい。本発明方法は、公知の又は今後開発されるあらゆる選択的ＭＣＬ−１阻害剤にとって有用である。
「選択的ＭＣＬ−１阻害剤」は、薬剤が非ＭＣＬ−１ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を阻害する能力よりも少なくとも１．５倍大きい有効性又は効力でＭＣＬ−１活性を阻害できる薬剤である。
ある特定の実施態様では、選択的ＭＣＬ−１阻害剤は、選択的ＭＣＬ−１阻害剤が、非ＭＣＬ−１ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を阻害できるよりも、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍又はそれ以上ＭＣＬ−１活性を阻害できる。随意に、選択的ＭＣＬ−１阻害剤は、ＭＣＬ−１阻害剤がその他のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの何れかの活性を阻害できるよりも、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍又はそれ以上ＭＣＬ−１活性を阻害できる。
ある特定の実施態様では、「選択的ＭＣＬ−１阻害剤」は、１、２、５、１０、２０、５０、１００、１５０又は２００ｎＭとほぼ同一又はそれ以下のＫＤでＭＣＬ−１と結合するのに対して、非ＭＣＬ−１ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド（又は全ての非ＭＣＬ−１ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド）は約３００、４００又は５００ｎＭ以上のＫＤで結合する。
薬剤の「選択的ＭＣＬ−１阻害剤」としての同定及び評価は、非ＭＣＬ−１アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質の活性と比較して、ＭＣＬ−１活性を評価して、例えば、薬剤（例えば、試験薬剤によるＭＣＬ−１活性の調節をモニタリングして、又は薬剤の非ＭＣＬ−１アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質のこのようなドメインとの相互作用と比較した薬剤のＭＣＬ−ポリペプチドのドメインとの物理的相互作用を評価して（例えば、薬剤がＢＣＬ−２の活性部位と結合する能力と比較して試験薬剤がＭＣＬ−１の活性部位と結合する能力をモニタリングして）、直接的又は間接的に実施できる。
【００８２】
本明細書で用いられる用語「非ＭＣＬ−１選択的ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド阻害剤」は、別のアンチアポトーシスマルチドメインタンパク質（例えば、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−Ｂ、ＢＣＬ−ｗ及びＢＦＬ−１／Ａ１）の何れかを阻害するよりもＭＣＬ−１活性を阻害するより大きい能力を何ら有していない薬剤を示す。このような化合物は、「ＢＣＬ−２阻害剤」を包含し、用語「ＢＣＬ−２阻害剤」としては、ＢＣＬ−２核酸又はポリペプチドと結合して、ＢＣＬ−２関連核酸又はポリペプチドの活性と拮抗する、小分子、抗体、アンチセンス、ペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）、又はマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮ」）系の化合物を包含する、何れかのタイプの治療化合物を示す。
典型的なＢＣＬ−２阻害剤は、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、及びＢＣＬ−ｗのそれぞれと結合する、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（｛ＡＢＴ−２６３」；Tse et al., Shoemaker et al. 及びLock et al.を参照されたい)及びＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド（「ＡＢＴ−７３７」）を包含する。典型的な「ＢＣＬ−２阻害剤」化合物の同一性及び使用は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１４６５７２号、米国特許出願公開第２００８／０１６０５４５号及び米国特許出願公開第２００８／０１９３９４３号に開示されていて、これらは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている。
その他のＢＣＬ−２阻害剤の構造は当該技術分野で公知であって、例がWalensky, L.D., Cell Death and Differ, 13: 1339, 2006 に要約されている。特定の追加例は、ゴシポール（細胞を通過していくつかのデヒドロゲナーゼ酵素の阻害剤として作用する、ポリフェノールアルデヒド；２，２′−ビス−（ホルミル−１，６，７−トリヒドロキシ−５−イソプロピル−３−メチルナフタレン）; 例えば、Tripathki et al. Eur J Biochem. 2004 271(17):3488-502; Conners et al. Mol Biochem Parasitol. 2005 142(2):137-48; 及びChoi et al. J. Med. Chem. 2007, 3841-3850 を参照されたい）及びオバトクラクス（オバトクラクスメシレート又は「ＧＸ１５−０７０」とも称される。オバトクラクスは小分子のインドールビピロール薬剤化合物である。例えば、Trudel et al. Blood. 2007 109(12):5430-8; O’Brien et al. Blood. 2008 Oct 17 を参照されたい）。
【００８３】
用語「炎症性疾患又は障害」は、物理的、化学的、又は生物学的作用因子によって引き起こされる損傷又は異常刺激に応答して冒された血管及び隣接組織に生じる細胞学的及び組織学的反応の動的複合からなる基本的な発病過程を示す。本発明の枠内における炎症性疾患の例は、関節リウマチ（ＲＡ）、痛風、急性又は慢性の突発性炎症性関節炎、乾癬、慢性皮膚疾患、筋炎、脱髄性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺疾患、糸球体腎炎、間質性腎炎、慢性活動性肝炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アテローム性動脈硬化症におけるプラーク形成、多発性硬化症（ＭＳ）、関節又は神経系の変性疾患、変形性関節症、等を包含する。
【００８４】
アポトーシス介在疾患又は障害の例は、これに限定されないが、感染性疾患又は障害（Rajalingam et al.; Sly et al.; Cheng et al.; Hasan et al.）、免疫疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、肝細胞障害又は損傷（例えば、ウィルス誘発の急性及び慢性肝臓障害）及び自己免疫性肝炎を包含する肝臓障害又は損傷を引き起こす疾患又は障害、線維症、急性及び慢性肝不全を包含する免疫関連肝疾患、肝炎（例えば、ＨＢＶ，ＨＣＶ、劇症肝炎、アルコール誘発肝炎、胆汁鬱滞性肝炎、ウィルソン病、及び自己免疫性肝炎）のような、各種肝疾患、及び移植拒絶反応（例えば肝臓移植拒絶）を包含する。
【００８５】
炎症性又は免疫系疾患又は障害は、この種に限定されないが、敗血症、播種性血管内凝固、ウィルス感染、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、白血球接着不全症ＩＩ症候群、腹膜炎、慢性閉塞性肺疾患、肺の炎症、喘息、急性虫垂炎、腎炎、アミロイド症、慢性気管支炎、サルコイドーシス、強皮症、紅斑性狼瘡、多発性筋炎、ライター症候群、乾癬、骨盤内炎症性疾患、炎症性乳房疾患、眼窩炎症性疾患、免疫不全疾患（例えば、ＨＩＶ、分類不能型免疫不全症、先天性Ｘ連鎖性小児性低ガンマグロブリン血症、一過性低ガンマグロブリン血症、選択性ＩｇＡ欠損症、慢性粘膜皮膚カンジダ症、重症複合免疫不全）、及び自己免疫疾患及び障害を包含する。
【００８６】
自己免疫疾患又は障害の例は、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、関節炎（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、変形性関節症）、重症筋無力症、心筋炎、ギラン・バレー症候群、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳髄膜炎、壊死性出血性脳症、突発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球性貧血、突発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫、慢性活動性肝炎、スティブンス・ジョンソン症候群、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症、サルコイドーシス、肝硬変、例えば、原発性両側性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症を包含する。
【００８７】
本明細書で用いられる用語「感染性疾患又は障害」は、何れかの感染性因子による感染によって引き起こされたか或いはこれに関連している何れかの疾患、障害、又は感染であると定義される。例えば、感染性疾患又は障害は、ウィルス性感染因子、細菌性感染因子、真菌性感染因子、又は原虫性感染因子による感染によって引き起こされたか或いはこれに関連している疾患又は障害を包含する。感染性疾患又は障害の例は、これに限定されないが、ウィルス性感染因子、例えば、ＨＩＶによって引き起こされたか或いはこれに関連する疾患又は障害；ＡＩＤＳによる認知症；カポシ肉腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、及び浸潤性扁平上皮癌のようなＡＩＤＳ関連の癌；ＡＩＤＳ関連の疾患又は障害；これに限定されないが、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＨＳＶ、黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、マリーバレー脳炎ウィルス、ポリオウィルス、インフルエンザ、ライノウィルス、西ナイルウィルス、エボラウィルス、口蹄疫ウィルス、サイトメガロウィルス（特にヒトの）、ロタウィルス、エプスタイン・バー・ウィルス、水痘帯状疱疹ウイルス、パラミクソウィルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、又はインフルエンザウィルスを包含するウィルス性感染因子によって引き起こされるか或いはこれに関連する疾患；ヒトパピローマウィルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６等）、これに限定されないが、肝炎、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＧＶ、及びヘルペス（ＨＳＶ−２））のような、その他の性感染症を包含する。
【００８８】
アポトーシス介在疾患及び障害の別の例は、肺線維症、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、及びヘリコバクター・ピロリによる慢性胃炎である。
【００８９】
別の実施態様では、アポトーシスが介在する疾患又は障害、例えば、癌は、１つ又はそれ以上のアンチアポトーシス遺伝子が介在していて、そこではアポトーシスを増大或いは増強するアンチアポトーシス遺伝子の発現の阻害が有用である。
【００９０】
アポトーシスが介在する疾患及び障害は、これに限定されないが、細胞の増殖、生育、分化又は移動障害、及び減少したアポトーシス又は細胞死が存在する疾患又は障害を包含する、アンチアポトーシス遺伝子に関連している疾患又は障害も包含する。このような疾患は、癌、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫又は白血病（この例は、これに限定されないが、卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、子宮癌、肝癌、胃腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝臓癌及び脳腫瘍を包含する）、腫瘍の血管新生及び転移；骨格形成異常；及び造血性及び／又は骨髄増殖性障害を包含する。
用語「新生物」、「過形成」、及び「腫瘍」は通常「癌」と言われていて、これは細胞の無制御で異常な生育によって特徴付けられる１００を越える疾患に対する一般名である。
本明細書で用いられる「腫瘍」も、正常、良性、又は悪性の組織塊を包含する。
【００９１】
「難治性癌」又は「難治性リンパ腫」を有する対象は、初回の化学療法に対して完全な寛解を達成するのに失敗したもの、又はそれに続く化学療法に対して完全な或いは部分的な寛解を達成するのに失敗した患者である。「原発性難治性」の患者は最初の治療に対しても完全な寛解を決して達成しないものである。
【００９２】
「再発した癌」又はリンパ腫は、以前の治療に応える以前の完全な又は部分的な寛解の後に再発した癌又はリンパ腫を示す。再発は、形態はどうであれ、臨床的、放射線学的、又は生物学的なアッセイによって、或いは癌マーカーの増大したレベルによって検出される、腫瘍の再現又は再生を包含していると定義できる。以前の治療は、これに限定されないが、化学療法、放射線治療、及び骨髄移植を包含できる。
【００９３】
本明細書で用いられる用語「細胞周期調節の疾患」は、根底にある原因が細胞周期の異常な調節に起因している疾患又は障害を示す。典型的な細胞周期調節の疾患は、ホジキン病及びＢ細胞慢性リンパ球性白血病のような、癌を、更に網膜芽細胞腫タンパク（ＲＢ）、ｐ５３等のような、細胞周期阻害剤（例えば、腫瘍抑制タンパク質）の突然変異に起因する癌も包含する。
【００９４】
用語「細胞周期停止」は、細胞分裂停止又はその他の細胞生育停止（細胞毒性であろうとなかろうと）及び細胞の老化を包含する。
【００９５】
用語「自食作用」は、生存のための適応メカニズムとして、又はプログラム細胞死の形態の発現としての細胞のその成分を分解する異化過程を包含する。
【００９６】
用語「スプライシング」は、細胞がＲＮＡを交互に接合して、変化したＲＮＡ転写物をもたらす、ＲＮＡスプライシングを包含する。
【００９７】
本明細書で用いられる「対照の参照サンプルと比較して変化した」は、検出すべき検体のレベル又は活性、或いは疾患の身体特性又は兆候又は症状の全体的な組織変化が、正常な、非処理の、又は対照のサンプル由来のサンプルよりも統計的に異なっているレベルを有していると理解される。対照サンプルを選択及び試験するための方法は、当業者の能力の範囲内である。対照サンプルは通常、活性薬剤と接触させていないか又は特定の処理に曝されておらず、そして随意に担体と接触させるか又は偽処理に曝されていてもよい、同じタイプの細胞又は動物を含有している。対照サンプルは特定の疾患又は状態を誘発する薬剤又は処理に曝されていない細胞又は動物も含有している。
【００９８】
語句「と併用して」は、第１薬剤を、第２阻害核酸分子又は化学療法剤のような、第２薬剤と共に提供するとういう投与の全ての形態を示すように意図されていて、ここで２つは同時に又は何れかの順序で連続して投与される。互いに併用して投与すべき２つ又はそれ以上の薬剤については、薬剤を同時に又は同じ製剤中で投与する必要はない。互いに組み合わせて投与される薬剤は、薬剤が送達される対象において生物活性を同時に示すか又は有する。対象内に薬剤が存在していることの判定は、実験に基づいたモニタリングによって、又は薬剤の公知の薬物動態特性を用いて計算して、容易に確認できる。
【００９９】
本開示における、「含有する」、「含有している」、「含んでいる」及び「有している」等は、米国特許法でこれに帰している意味を有することができて、「包含する」、「包含している」等を意味することができる；「本質的にから成っている」又は「本質的にから成る」等は、米国特許法で見なされている意味を有していて、この用語は、列挙されているものを越えるものの存在によって列挙されているものの基本的な或いは新規な特性が変わらない限り、但し先行技術の態様を除外して、列挙されているものを越えるものの存在を許容して、制約がない。
【０１００】
「検出する」は、検出すべき目的物の存在、欠如又は量を同定することを示す。検出された量は無くても検出水準未満でもよい。
【０１０１】
「有効量」と言うのは、治療していない患者と比較して疾患の症状を改善するのに必要な薬剤の量を示す。新生物を治療処置するための本発明の実施に用いられる活性薬剤（複数も）の有効量は、投与の方法、対象の年齢、体重及び全体的な健康状態によって変化する。最終的には、主治医又は獣医が適切な量及び投与計画を決定するだろう。このような量を「有効」量と言う。
【０１０２】
本明細書で用いられる用語「単離された」又は「精製された」は、ポリペプチドに関連して用いられる場合に、天然ポリペプチドがその正常な生理環境から取り出された（例えば、血漿又は組織から単離されたタンパク質）こと、又は非天然環境で合成される（例えば、異種系で人工的に合成される）ことを意味する。従って、「単離された」又は「精製された」ポリペプチドは、無細胞溶液に入れることも又は異種細胞環境に入れる（例えば、異種細胞型に発現させる）こともできる。
用語「精製された」は、ポリペプチド又は細胞が存在する唯一のポリペプチド又は細胞であることを暗示するのではなく、ポリペプチド又は細胞が、天然にはそれと関連している細胞又は生物物質を基本的に含んでいない（約８０から９０％、又は約９０〜９５％、最大９９〜１００％まで純粋な）こと、そのため天然のポリペプチドとは区別されることを暗示する。
「単離された」は、細胞に関連して用いる場合には、初代細胞又は細胞株の、細胞培養又は臓器培養の何れかの、培養物中の細胞（すなわち、動物内のものではない）を意味する。細胞は、正常動物、トランスジェニック動物、自然に発生した遺伝子変化を有する動物、及び／又は遺伝的及び／又は誘導性疾患又は症状を有する動物から単離できる。
【０１０３】
「得ること」と言うのは、阻害核酸分子を合成すること、購入すること、或いは入手することを意味する。
「提供すること」は、例えば、細胞、ポリペプチド、薬物、ポリヌクレオチド、プローブ等を、例えば、購入又は作成することによって、得ることを示す。提供される物質は、あらゆる公知の又は後に開発される生物学的又はその他の技術によって、作成することができる。
【０１０４】
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される賦形剤」は、ヒトに投与するのに適している、１つ又はそれ以上の適合性のある固体又は液体の増量剤、希釈剤又は封入剤を意味する。
【０１０５】
本明細書で用いられる「サンプル」は、その環境（例えば、動物由来の血液又は組織、細胞、又は組織培養由来の馴化培地）から単離されて、被分析物質又はその他の目的物質を含有していると予想されるか或いは含有が公知である、生体物質を示す。サンプルは、組織又は体液（例えば特定の疾患又は症状を有する対象由来）の部分的に精製された画分であってもよい。参照サンプルは、疾患又は症状を有していない提供者由来の、「正常」サンプルでよい。参照サンプルは、処置されていない提供者由来、又は活性薬剤で処置されていないか（例えば、処置されていないか、或いは賦形剤のみを投与されている）又は病状を誘発する条件に曝されていない細胞培養物由来であってもよい。参照サンプルは、細胞を試験する薬剤と接触させる前の「０時点」に採取してもよい。
【０１０６】
「特異的に結合する」と言うのは、別の分子、例えば、本発明のタンパク質又は核酸分子を認識して結合するが、サンプル、例えば、本発明のタンパク質をもともと含有している生体サンプル中の他の分子を認識して結合しない、分子を意味する。第２分子と特異的に結合する第１分子が、非特異的結合パートナー（例えば、タンパク質に対するＢＳＡ、ランダム核酸配列）に対するよりも又は構造類似タンパク質よりも、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０〜７５倍、１００倍、５００倍、、１０００倍、５０００倍、又は１０，０００倍優先して、第２分子と結合することが好ましい。
【０１０７】
本明細書に挙げてある範囲は、範囲内の全ての値を省略して表していると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０を包含する群からの何れの数、数の組み合わせ、又はサブ範囲を包含していると理解される。
【０１０８】
「少なくとも」特定値は、その値又はそれ以上を意味すると理解される。例えば、「少なくとも２」は、「２又はそれ以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、等と同じであると理解される。
【０１０９】
「〜未満」又は「最大〜まで」等は、ゼロから最大で提供値まで及び提供値を含む範囲であると解される。例えば、「１０未満」又は「最大１０まで」は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０と解される。
【０１１０】
特に言明しない限り又は文脈から明白ではない限り、本明細書で用いる用語「又は」は包括的であると理解される。
【０１１１】
特に言明しない限り又は文脈から明白ではない限り、本明細書で用いる用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は単数又は複数であると理解される。
【０１１２】
特に言明しない限り又は文脈から明白ではない限り、本明細書で用いる用語「約」は、当該技術分野における正常な許容誤差の範囲、例えば、平均値の２標準偏差範囲内であると理解される。約は、表示した値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解される。  文脈から明白ではない限り、本明細書に挙げてある全ての数値は用語、約で修飾できると理解される。
【０１１３】
本明細書の可変基の何れかの定義中の、化学基リストの列挙は、単一の基又は記載されている基の組み合わせの何れかとしての可変基の定義を包含している。可変基に対する実施態様又は本明細書の態様の列挙は、何れかの単一の実施態様又は他の何れかの実施態様或いはそれらの部分との組み合わせとしての実施態様を包含している。
【０１１４】
本明細書で参照している全ての、参考文献、特許、特許出願、及び優先出願の出願日時点での受入番号は、参照により明確に取り込まれている。
【０１１５】
詳細な説明
病的細胞生存に関わる個々のアンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリータンパク質に対する選択的阻害剤の開発は、未だ厄介だが緊急な課題である。精密に目的に合わせた化合物は、特異的なアンチアポトーシス遮断によって促進されるヒトの疾患をそれぞれに研究又は治療するための分子プローブ又は標的治療の両方として役立つだろう。我々は先に、治療効果（Danial et al., Nat Med 14, 144. 2008; Walensky et al., Science 305, 1466. 2004、共に参照により取り込まれている）及びメカニズムの解明（Gavathiotis et al., Nature 455, 1076.2008; Walensky et al., Mol Cell 24, 199. 2006、共に参照により取り込まれている）の両方のために、変性ＢＩＤ、ＢＡＤ、及びＢＩＭ ＢＨ３ペプチドを、それらの細胞間標的と噛み合ってこれを調節する、プロテアーゼ耐性で細胞透過性のα螺旋に形質転換するために炭化水素架橋を適用した。広範囲にわたるヒトの癌における主要な耐性因子としてＭＣＬ−１が浮かび上がってきた。ＢＣＬ−２ドメインの安定化α螺旋（ＳＡＨＢｓ）のライブラリーをスクリーニングして、ＭＣＬ−１それ自体のＢＨ３螺旋、更に別のＢＣＬ−２ファミリータンパク質由来のその他のＳＡＨＢｓが強力で排他的なＭＣＬ−１阻害剤であることを確認した。Ｘ線結晶学及び突然変異誘発検討で、ＭＣＬ−１結合溝のＭＣＬ−１ ＢＨ３と噛み合う主要な決定因子を明確にした。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢは、ＭＣＬ−１を直接標的とし、そのプロアポトーシスＢＡＫとの阻害性相互作用を無効にし、そしてＭＣＬ−１依存性癌細胞をカスパーゼ依存性アポトーシスに対して感受性にする。従って、リガンド選択性に対する自然の解決法（Nature's solution）を利用することにより、細胞透過性ＭＣＬ−１特異的薬剤を作出して標的とするＭＣＬ−１阻害の構造及び機能特性を明らかにした。
【０１１６】
ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、ＭＣＬ−１、及びＢＦＬ１／Ａ１を包含する一連のアンチアポトーシスタンパク質は、プロアポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーの重要なアポトーシス誘発ＢＣＬ−２相同ドメイン３（ＢＨ３）α螺旋を捕捉して、細胞生存を促進する（Sattler et al., Science 275, 983. 1997）。癌細胞は、アンチアポトーシスタンパク質の過剰発現を介してその生理的生存メカニズムを利用し、それらの不死を確保するアポトーシス遮断を確立する。
【０１１７】
アンチアポトーシスタンパク質は、その表面にＢＨ３α螺旋と噛み合う結合ポケットを含んでいる（Sattler et al., 1997; Muchmore et al., Nature 381, 335. 1996）。アンチアポトーシス標的化についての自然の解決法は、ＢＨ３死ドメインとアンチアポトーシスポケットの間の選択的相互作用に関連している（Chen et al., Mol Cell 17, 393. 2005; Zhai et al., J Biol Chem 283, 9580. 2008）ので、ＢＨ３α螺旋の分子擬態が、アンチアポトーシスタンパク質の小分子阻害剤を開発する基礎を形成した。それぞれが３つ又はそれ以上のアンチアポトーシスタンパク質を標的としている、ＡＢＴ−２６３（Tse et al., Cancer Res 68, 3421. 2008）、オバトクラクス（Nguyen et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19512. 2007）、及びＡＴ−１０１（Wang et al., J Med Chem 49, 6139. 2006）（全てが参照により取り込まれている）のような、有望な化合物が臨床評価の段階にある。個々のアンチアポトーシスタンパク質を標的にする明確な阻害剤の開発は、ＢＨ３結合ポケット間の微妙な差のために、未だ重要な課題である。キナーゼ治療の長期目標のように、選択性に目的を合わせたアンチアポトーシス阻害剤は、不要な副作用を避ける可能性がある一方で、異なった疾患を治療する細かく調整された治療をもたらすだろう。このような特異性を有する化合物が本明細書に提供されている。さらに、このような化合物は、アンチアポトーシスタンパク質の異なった生物学的機能を分析するための貴重な研究材料として役立つだろう。
【０１１８】
アンチアポトーシスタンパク質のＢＨ３ドメインに対する特異性は、標準的な結合溝のトポグラフィー及び相互作用するＢＨ３螺旋の典型的なアミノ酸組成によってもたらされる。プロアポトーシスＢＩＭのもののような、いくつかのＢＨ３ドメインは、全てのアンチアポトーシスポッケトと強固に噛み合うのに対して、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、及びＢＣＬ−ｗに結合するＢＡＤ ＢＨ３、並びにＭＣＬ−１及びＢＦＬ−１／Ａ１を標的にするＮＯＸＡ ＢＨ３のように、他のものはより選択的である（Chen et al., Mol Cell 17, 393. 2005）。ＢＨ３ドメインとそれらの模倣薬の異なる結合能力は、阻害剤結合スペクトルと生物活性との間の密接な関係によって実証されたように、臨床的に意義がある。例えば、ＢＡＤのＢＨ３ドメインに倣って作られたプロトタイプ小分子ＢＨ３模倣薬である、ＡＢＴ−７３７は、ＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬを特異的に標的にするように設計されて、これらのタンパク質によって促進される選択的な癌にアポトーシスを誘発する（Oltersdorf et al., Nature 435, 677. 2005）。このことは所望の標的に対する特異的な阻害剤を製造することの難しさを明らかにしている。更に、ＡＢＴ−７３７は、このアンチアポトーシスが分子の結合スペクトル外にあるので、ＭＣＬ−１を過剰発現する癌細胞に対して効果を示さない（Konopleva et al., Cancer Cell 10, 375. 2006; Delft et al., Cancer Cell 10, 389. 2006）。比較的大きくてより複雑な相互作用面を選択的に標的にする精密な小分子を設計するという課題を克服する目的で、本発明者らは、天然のＢＨ３ドメインがアンチアポトーシス特異性についての薬理学的解決策をもたらすか否かを検討した。
【０１１９】
ヒトの癌において重要な耐性因子としてのその新しい役割のために、ＭＣＬ−１を本検討のテンプレートとして選択した。ＭＣＬ−１の過剰発現は、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、メラノーマ、及び予後不良の乳癌を包含する、多様な難治性癌の発症と関連付けられているので、本明細書で提供されるＭＣＬ−１阻害剤、特にＭＣＬ−１特異的阻害剤が、このような癌の治療に対して有用であろうということが期待されている。ＭＣＬ−１はミトコンドリア外膜でその生存促進活性を発揮し、そこでＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＩＭ、及びＢＡＫのような、プロアポトーシスタンパク質を無効にする。選択的アポトーシス耐性におけるＭＣＬ−１の重要な役割は、ＭＣＬ−１タンパク質レベルを下方制御する低分子干渉ＲＮＡの感受性効果によって強調されている（Lin et al., Oncogene 26, 3972. 2007; Taniai et al., Cancer Res 64, 3517. 2004、両者は参照により本明細書に取り込まれている）。ＭＣＬ−１を標的とする治療的な根拠を前提として、本発明者らは生物試験のために選択的ＭＣＬ−１阻害剤の開発に努めた。本明細書で明らかにされたように、本願の特異的ＭＣＬ−１阻害剤は、ＭＣＬ−１を下方制御するｓｉＲＮＡと同様な効果を示し、本発明のＭＣＬ−１阻害剤がＭＣＬ−１関連疾患、特に癌における治療効果を有していることを明らかにした。
【０１２０】
ＢＣＬ−２タンパク質は、多くのタンパク質ファミリーと同様に、高い割合の配列同一性及び機能的相同性を共有している多数のメンバーからなっていて、特異的阻害剤の開発を困難にしている。しかしながら、これらの相同タンパク質の間は微妙に異なっていて、それらの固有の相互作用及び活性のスペクトルを引き起こしている。病的なタンパク質相互作用に関与しているときは、疾患の本質及び重症度によって決定された薬物の選択プロファイルと共に、全てのアンチアポトーシスファミリーメンバー又は個々のサブセットを無効にすることが望ましい。無秩序な細胞生存を引き起こすアンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリータンパク質を標的にする場合は、理想的な薬理学的ツールボックスは、個々の、サブセット、そして全てのメンバーを標的にする薬剤を含んでいるべきである。この目標の達成は、アンチアポトーシス標的とのＢＨ３の相互作用の固有な要素とと共通な要素の両方を注意深く構造解体する必要がある。天然のＢＨ３の結合選択性を手掛かりにして、本発明者らはそれ自体のＢＨ３ドメインのペプチド配列に基づいて、ＭＣＬ−１の強力で排他的な阻害剤を同定した。標的化ＭＣＬ−１がその結合能力を崩壊してプロアポトーシスパートナーを隔離することを見出した。選択的ＭＣＬ阻害に対する重要な結合及び特異性決定因子の同定によって、構造機能データが、病的なＭＣＬ−介在細胞生存によって促進される疾患におけるアポトーシスを再活性化する新しい治療法の開発のための青写真をもたらした。
【０１２１】
アポトーシス調節因子としてのＢＣＬ−２ファミリータンパク質
ＢＣＬ−２ファミリーは、細胞の運命を決定するチェックとバランスの複雑なネットワークを形成するプロ−及びアンチ−アポトーシスタンパク質の両方を包含している（Danial and Korsmeyer, 2004）（図１Ａ）。このファミリーは、その全てがα螺旋セグメントを包含している、最大４つまでの保存「ＢＣＬ−２相同」（ＢＨ）ドメインの存在によって構造上定義される(Adams and Cory, 1998; Reed, 1998）（図１Ｂ）。アンチアポトーシスタンパク質は全てのＢＨドメインにおいて配列保存を表示するのに対して、プロアポトーシスタンパク質は、「マルチＢＨドメイン」メンバーとＢＨ３α螺旋ドメインと配列類似性のみを表示する「ＢＨ３オンリー」メンバーに分けられる。「ＢＨ３オンリー」サブグループは多様性があって、異種刺激で生じた死の促進シグナルをミトコンドリアにある核アポトーシス機構へ送達する。アポトーシス刺激及び細胞状況の特質に基づいて、ＢＨ３オンリータンパク質の死のシグナルはアンチアポトーシスタンパク質によって無効にされるか或いはミトコンドリア殺執行因子ＢＡＸ及びＢＡＫへ、直接に又は間接的に送達される。活性化されると、これらのプロアポトーシスマルチＢＨドメインメンバーはミトコンドリア外膜の浸透性上昇を誘導し、放出されたミトコンドリア因子がカスパーゼを活性化できるようにして、不可逆的に死のプログラムを実行する（Green, 2005）。
【０１２２】
上記のように、進化的に保存されたＢＣＬ−２ファミリーのメンバーは、アポトーシス細胞死及び生存の重要な調節因子である。タンパク質ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−Ｗ、ＢＦＬ−１／Ａ１、ＢＣＬ−Ｂ、及びＭＣＬ−１は死のアンタゴニストであり、一方ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、ＢＣＬ−ＸＳ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、及びＢＩＫは死のアゴニストである（Kroemer et al., Nature Med. 6:614 20 (1997)）。
【０１２３】
ＢＣＬ−２ファミリーは、全てがα螺旋セグメントを包含している、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４と称される、最大４つまでの保存「ＢＣＬ−２相同」（ＢＨ）ドメインの存在によって規定される（Chittenden et al. 1995 EMBO 14:5589; Wang et al. 1996 Genes Dev. 10:2859）（図１）。ＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬのような、アンチアポトーシスタンパク質は、全てのＢＨドメインにおいて配列保存を示す。プロアポトーシスタンパク質は、ＢＨ１、ＢＨ２、及びＢＨ３ドメインに相同性を有する、「マルチドメイン」メンバー（例えば、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＯＫ）と、ＢＨ３両親媒性α螺旋セグメントに排他的に配列相同性を含有している「ＢＨ３ドメインオンリー」メンバー（例えば、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＭ ＳＡＨＢ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ）に分けられる。ＢＣＬ−２ファミリーメンバーはホモ−及びヘテロ−ダイマーを形成する能力を有していて、競合結合及びプロ−とアンチ−アポトーシスタンパク質のレベル間の比が、死の刺激に対する感受性を決定することを示唆している。アンチアポトーシスタンパク質は、プロアポトーシス過剰、すなわち、過剰なプログラム細胞死から細胞を保護するよう機能する。ある特定の細胞タイプでは、細胞膜で受信した死のシグナルがミトコンドリア経路を介してアポトーシスを誘発する。ミトコンドリアは、カスパーゼ９を活性化する細胞質複合体の重要な成分であるチトクロームｃを隔離することによって細胞死の管理者としての機能を果たすことができ、致命的な下流タンパク質分解事象を誘導する。ＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬ及びＢＡＫ／ＢＡＸのようなマルチドメインタンパク質は、ＢＣＬ−２ファミリーの上流ＢＨ３オンリーメンバーによって更に制御されたそれらの活性によって、ミトコンドリア膜で保護者及び死刑執行人の２つの役割をはたす。例えば、ＢＩＤは、プロアポトーシスタンパク質の「ＢＨ３ドメインオンリー」サブセットのメンバーであって、細胞膜で受信した死のシグナルをミトコンドリア膜のエフェクタープロアポトーシスタンパク質に送達する。ＢＩＤ及びＢＩＭのような、選択的ＢＨ３オンリーメンバーは「活性化因子」と呼ばれて（Letai, A., et al.  Cancer Cell  2, 183. 2002）、プロ−及びアンチ−アポトーシスタンパク質の両方と相互作用する固有の能力を有している（Walensky Mol Cell  24, 199. 2006）。カスパーゼ８の活性化により、ＢＩＤは開裂して、切断付加物、ｔ−ＢＩＤがチトクロームｃ放出及びＢＣＬ−２ファミリータンパク質の関与を介するミトコンドリアアポトーシスを誘導する。
【０１２４】
欠失及び突然変異誘発検討は、プロアポトーシスファミリーメンバーの両親媒性α螺旋ＢＨ３断片が死のドメインとして機能することによって、マルチドメインアポトーシスタンパク質と相互作用するための重要な構造モチーフを示すことを確認した。構造検討は、ＢＨ３螺旋がＢＨ１、２及び３ドメインの界面で形成される疎水性の溝に挿入することによってアンチアポトーシスタンパク質と相互作用することを明らかにした。ｔＢＩＤとＢＩＭは結合して、アンチアポトーシスタンパク質（例えば、ＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬ）によって隔離でき、そしてチトクロームｃ放出及びミトコンドリアアポトーシスプログラムを誘導する、プロアポトーシスタンパク質ＢＡＸ及びＢＡＫの活性化を誘発できる。
【０１２５】
ＢＣＬ−２関連卵巣キラー（ＢＯＫ）はプロアポトーシスマルチドメインサブグループの３番目のメンバーであって、ＢＩＤ及びＢＩＭ ＳＡＨＢｓのような、活性化因子ＳＡＨＢリガンドによっても拘束される。ＢＯＫは、卵巣ｃＤＮＡライブラリーからクローン化されて、卵巣、子宮、及び精巣中で高度に発現されていることが見出された。ＢＯＫ ｍＲＮＡ種がその後、心臓、腎臓、肝臓、結腸、肺、腸、甲状腺、副腎、膵臓、及び骨髄を包含する広く分布する組織及び選択的な癌細胞株中で同定された。
【０１２６】
ＢＣＬ−２ファミリータンパク質（ＢＣＬ−ＸＬ）の最初のＸ線及びＮＭＲ構造は１９９６年に報告された。ＢＣＬ−ＸＬは８つのα螺旋からなり、そのうちの２つが、孔形成ジフテリア毒素及びコリシンの膜挿入ドメインと類似している、中央疎水性コアを形成する。この構造類似性は、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーが、コア螺旋５及び６に基づいている活性である、リポソーム及びミトコンドリア系における孔形成を調節できるということの実験的実証をもたらした。
【０１２７】
プロアポトーシスに関しては、ＢＨ−３オンリーＢＩＤ及びマルチドメインプロアポトーシスＢＡＸのＮＭＲ構造が、細胞死の促進因子と制御因子間の類似性を開示した。ＢＩＤ及びＢＡＸは同様に、６つ又は７つの両親媒性螺旋によって、それぞれ囲まれている２つの中央コア螺旋を保有している。ＢＩＤ及びＢＡＸのアミノ末端部分はＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬのようなアンチアポトーシスタンパク質を選択するように、非構造ループを含有している。
【０１２８】
ＢＣＬＸＬ、ＢＣＬ−２、ＢＩＤ、ＢＡＸ、ＢＣＬ−ｗ、ＭＣＬ−１、ＢＡＸを包含する、多くのＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの構造は当該技術分野において公知であって、容易に利用できる。例えば、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドは Protein Data Bank (「PDB」) (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics; http://www. rcsb.org)から入手できる。例えば、公知のＢＣＬ−２ファミリーの構造座標は、ＢＡＸ（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．１ｆ１６）、ＢＡＫ（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．２ｉｍｓ）、ＢＣＬ−２（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．１ｇ５ｍ）、ＢＣＬ−ＸＬ（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．１ｌｘｌ）、更に本発明に関連して：ＢＩＭ ＢＨ３−ＢＡＸ（ＰＤＢ ＩＤ  Ｎｏ．２ｋ７ｗ）、更に当該技術分野で公知のその他のものを包含する。
【０１２９】
アンチアポトーシスの治療標的化
癌細胞はプロアポトーシスタンパク質を抑制するためにアンチアポトーシスタンパク質を過剰に発現して、それらの生存を確保するアポトーシス遮断を開始する（図２）。特異的ＢＣＬ−２ファミリータンパク質相互作用の薬理的な混乱は癌細胞におけるアポトーシスを誘発できる。例えば、ＢＨ３オンリータンパク質ＢＡＤに倣った小分子ＢＨ３模倣薬、ＡＢＴ−７３７は、ＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬを特異的に標的にして（Oltersdorf et al., 2005）、これらのタンパク質によって引き起こされる選択的な癌においてアポトーシスを誘発する（Kline et al., 2007; Konopleva et al., 2006; van Delft et al., 2006）ように設計された。ＡＢＴ−７３７の経口用形態、ＡＢＴ−２６３（Lock et al., 2008; Shoemaker et al., 2008; Tse et al., 2008）は現在、第Ｉ／ＩＩａフェーズの癌治験で評価されている。ＡＢＴ化合物は、このアンチアポトーシスがこれらの結合スペクトルの外にあるので、ＭＣＬ−１を過剰発現する癌細胞に対して効果を示さない（Deng et al., 2007; Konopleva et al., 2006; van Delft et al., 2006）。ＭＣＬ−１と様々な形態の癌（例えば、ＡＭＬ、乳癌及び多発性骨髄腫）の間の関連性を記載している更なる参照文献は、Darenne et al., Zhang et al., Lin et al., Kim et al., Schulze-Bergkamen et al., Hussain et al. 及びThallinger et al.（完全な参照文献は以下に）を包含する。
【０１３０】
選択的ＭＣＬ−１阻害剤としての架橋ＢＨ３ペプチド
ＢＣＬ−２ドメインの安定化α螺旋（Stabilized Alpha-Helices of BCL-2 domains）、又はＳＡＨＢは、インビトロ及びインビボにおけるＢＣＬ−２ファミリー相互作用を精査及び調節するために開発された（図３）。例えば、天然のプロアポトーシスＢＩＤ ＢＨ３ペプチド配列に挿入された、全ての炭化水素架橋は首尾よく、（１）α螺旋構造を再構築して安定化した、（２）ペプチドの半減期を増進した、（３）細胞透過性もたらした、（４）標的のアポトーシスタンパク質と特異的に結合した、そして（５）白血病異種移植モデルにおいて細胞アポトーシスを再活性化したことを明らかにした（Walensky et al., 2004）。ＳＡＨＢはその後、個々のＢＣＬ−２ファミリータンパク質相互作用を分析して調節するために用いられた（Danial et al., 2008; Gavathiotis et al., 2008; Walensky et al., 2006）。本明細書に記載されているように、一連の架橋ＢＣＬ−２ファミリーペプチド螺旋は、生存タンパク質ＭＣＬ−１を高い親和性及び前例のない選択性で標的とすることが確認された。ＭＣＬ−１阻害剤ＳＡＨＢは、ＭＣＬ−１の標準的なＢＨ３溝を標的として、インビトロ及in situでＭＣＬ−１／ＢＡＫ相互作用を置き換え、そしてＭＣＬ−依存性の癌をミトコンドリアアポトーシスに対して感受性にする。
【０１３１】
ＭＣＬ−１活性部位
本発明は、少なくとも一部が、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ及びＮＯＸＡ ＳＡＨＢのような、炭化水素架橋及びそれによって構造強化されたＢＨ３ポリペプチドがＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位と結合してＭＣＬ−１のアンチアポトーシス（生存）活性の阻害をもたらすという発見に基づいている。本研究は、このような阻害性ＳＡＨＢ薬剤（例えば、ＢＣＬ−２ファミリーＢＨ３ドメイン（ＳＡＨＢ）ポリペプチドのＮＯＸＡ安定化α螺旋、ＢＯＫ ＳＡＨＢペプチド、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢペプチド、野生型又は改変ＢＩＭ ＳＡＨＢ又はＢＡＫ ＳＡＨＢ、Ｍｕｌｅ ＳＡＨＢペプチド）と分子相互作用してこのポリペプチドを阻害することに関わっているＭＣＬ−１ポリペプチドの領域を同定することを可能にする構造情報も提供し、そのような方法によって、対応する活性部位を含有している別のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド（又は別の種類のポリペプチド）にも適用できる、特異的阻害及び／又は結合剤を同定するこのような方法と共に、ＭＣＬ−１のその他の特異的調節因子を同定する方法を提供する。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは、安定化（例えば架橋された）α螺旋ドメインを有していてよい。ある特定の実施態様では、ポリペプチドは炭化水素架橋されている。炭化水素架橋は米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号に記載されており、これは参照により本明細書に取り込まれている。
【０１３３】
炭化水素架橋ポリペプチドは、２つの非天然アミノ酸の間に１つ又はそれ以上の鎖（連鎖）を包含していて、この鎖はポリペプチドのα螺旋二次構造を有意に強化する。一般に、この鎖は１つ又は２つの螺旋回旋（すなわち、約３．４又は約７アミノ酸）の長さにわたる。従って、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；又はｉとｉ＋７に位置するアミノ酸は化学修飾及び架橋のための理想的な候補である。従って、例えば、ペプチドが配列．．．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有している場合は、Ｘ１とＸ４の間、又はＸ１とＸ５の間、又はＸ１とＸ８の間の架橋は、Ｘａ２とＸ５の間、又はＸ２とＸ６の間、又はＸ２とＸ９の間、等と同様に有用である。複数の架橋（例えば、２、３、４又はそれ以上）の使用も意図されている。複数の架橋の使用はペプチドを安定化して最適化するのに、特にペプチドの長さを増大して、非常に有用である。従って、本発明は、更に配列を安定化するために、又は構造安定性、タンパク質分解耐性、酸安定性、熱安定性、及び長く伸びるペプチドの生物活性増強を促進するためにポリペプチド配列内に１つ以上の架橋の組み込みを包含している。炭化水素架橋する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号に十分に記載されており、これは参照により本明細書に取り込まれている。
【０１３４】
一実施態様では、ＳＡＨＢポリペプチドは式（Ｉ）を有している。
【０１３５】
【化１】
0005731986.tif 000002
【０１３６】
式中の、それぞれのＲ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルである。
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、［Ｒ４−−Ｋ−−Ｒ４］ｎ、であって、それぞれが０〜６個のＲ５で置換されている。
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、又は放射性同位元素である。
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、又は
【０１３７】
【化２】
0005731986.tif 000003
【０１３８】
である。
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、又は治療薬剤である。
ｎは、１〜４の整数である。
ｘは、２〜１０の整数である。
それぞれのｙは、独立して０〜１００の整数である。
ｚは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）である。  それぞれのＸａａは、独立して１つのアミノ酸である。
ＳＡＨＢポリペプチドは本明細書に記載されているアミノ酸配列を包含していてよい。
【０１３９】
鎖はアルキル、アルケニル、又はアルキニル部分（例えば、Ｃ５、Ｃ８或いはＣ１１アルキル又はＣ５、Ｃ８或いはＣ１１アルケニル、又はＣ５、Ｃ８或いはＣ１１アルキニル）を包含できる。連結したアミノ酸はαジ置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ３又はメチル）されていてもよい。
【０１４０】
ある場合には、ｘが２、３、又は６である。
ある場合には、それぞれのｙが、独立して３〜１５の整数である。
ある場合には、それぞれのｙが、独立して１〜１５の整数である。
ある場合には、Ｒ１とＲ２が、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルである。
ある場合には、Ｒ１とＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。
ある場合には、少なくともＲ１とＲ２の一方が、メチルである。例えば、Ｒ１とＲ２の両方がメチルである。
ある場合には、Ｒ３がアルキル（例えば、Ｃ８アルキル）であって、ｘが３である。
ある場合には、Ｒ３がＣ１１アルキルであって、ｘが６である。
ある場合には、Ｒ３がアルケニル（例えば、Ｃ８アケニル）であって、ｘが３である。
ある場合には、ｘが６であって、Ｒ３がＣ１１アルケニルである。
ある場合には、Ｒ３が、直鎖のアルキル、アルケニル又はアルキニルである。
ある場合には、Ｒ３が、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ＝ＣＨ−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−である。
【０１４１】
ある特定の実施態様では、２つのα、αジ置換立体中心は共にＲ配置又はＳ配置（例えば、ｉ、ｉ＋４架橋）であるか、又は一方の立体中心がＲで他方がＳ（例えば、ｉ、ｉ＋７架橋）である。従って、ここでは式（Ｉ）が、
【０１４２】
【化３】
0005731986.tif 000004
【０１４３】
のように表される。
例えば、Ｘが３のときは、Ｃ’及びＣ”ジ置換立体中心の両方がＲ配置であるか、或いはこれら両方がＳ配置になる。ｘが６のときは、Ｃ’ジ置換立体中心がＲ配置にあって、Ｃ”ジ置換立体中心がＳ配置にある。Ｒ３二重結合はＥ又はＺ立体化学配置にある。
【０１４４】
ある実施態様では、Ｒ３が［Ｒ４−−Ｋ−−Ｒ４］ｎ；でＲ４が直鎖のアルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
【０１４５】
ある実施態様では、ＳＡＨＢポリペプチドは、ＢＨ３ドメインの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０個又はそれ以上の連続したアミノ酸を含んでいる。
それぞれの［Ｘａａ］ｙは、独立してＢＨ３ドメインの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個又はそれ以上の連続したアミノ酸を包含することができる。
［Ｘａａ］ｘは、ＢＨ３ドメインの３個又は６個の連続したアミノ酸を含有することができるペプチドである。
【０１４６】
ＳＡＨＢポリペプチドはＢＨ３ドメインの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０この連続したアミノ酸を包含することができ、ここでは、２つ、３つ又は６つのアミノ酸で隔てられている２つのアミノ酸をＲ３を介して結合しているアミノ酸置換で置き換えることができる。従って、少なくとも２つのアミノ酸を連結アミノ酸又は連結アミノ酸置換によって置き換えることができる。従って、ここでは式（Ｉ）が、
【０１４７】
【化４】
0005731986.tif 000005
【０１４８】
のように表される。
［Ｘａａ］ｙ’及び［Ｘａａ］ｙ”はそれぞれ、同一又は異なったＢＨ３ドメイン由来の連続ポリペプチド配列を包含できる。
【０１４９】
本発明は、ＢＨ３ドメインの１０個（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれ以上）の連続したアミノ酸を含有している架橋されたポリペプチドを特徴としていて、ここでは２、３、又は６個のアミノ酸で隔てられた２つのアミノ酸のα炭素が、Ｒ３を介して結合し、２つのα炭素のうちの１つがＲ１で、他方がＲ２で置換され、そしてそれぞれがペプチド結合によって更なるアミノ酸と結合している。
【０１５０】
別の実施態様では、本発明のＳＡＨＢポリペプチドは式（ＩＩ）を有している。
【０１５１】
【化５】
0005731986.tif 000006
【０１５２】
式中のそれぞれのＲ１及びＲ２は独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルである。
それぞれのｎは独立して、１〜１５の整数である。
ｘは、２、３、又は６である。
それぞれのｙは独立して、０〜１００の整数である。
ｚは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）である。
それぞれのＸａａは、独立して１個のアミノ酸である。
【０１５３】
改変ポリペプチドは、α螺旋を形成して、本明細書に開示されているアミノ酸配列と３０％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有することができる。
【０１５４】
更に別の実施態様では、本発明のＳＡＨＢポリペプチドは式（ＩＩＩ）を有している。
【０１５５】
【化６】
0005731986.tif 000007
【０１５６】
式中のそれぞれのＲ１及びＲ２は独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルである。
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、［Ｒ４−−Ｋ−−Ｒ４］ｎ、又は天然アミノ酸の側鎖であって、これらのそれぞれは、０〜６個のＲ５で置換されている。
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、又は放射性同位元素である。
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、又は
【０１５７】
【化７】
0005731986.tif 000008
【０１５８】
である。
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、又は治療薬剤である。
Ｒ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル、［Ｒ４−−Ｋ−−Ｒ４］ｎ、又は天然アミノ酸の側鎖であって、これらのそれぞれは、０〜６個のＲ５で置換されている。
ｎは、１〜４の整数である。
ｘは、２〜１０の整数である。
それぞれのｙは独立して、０〜１００の整数である。
ｚは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）である。
それぞれのＸａａは独立して、１つのアミノ酸である。
【０１５９】
ポリペプチドはα螺旋を形成して、本明細書に記載されているアミノ酸配列と約３０％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を包含している。
【０１６０】
炭化水素鎖が記載されているが、その他の鎖も想定されている。例えば、この鎖は１つ又はそれ以上のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン或いはアミド、又はトリアゾール部分を包含できる。ある場合では、天然のアミノ酸側鎖を鎖に取り込むことができる。例えば、鎖は、セリンのヒドロキシル、システインのチオール、リジンの１級アミン、アスパラギン酸又はグルタミン酸の酸、或いはアスパラギン又はグルタミンのアミドのような官能基と結合させることができる。従って、２つの非天然アミノ酸を結合して作成した鎖を用いるよりはむしろ、天然アミノ酸を用いる鎖を作成する方が可能である。１つの非天然アミノ酸を天然のアミノ酸と共に用いることも可能である。
【０１６１】
更に、鎖の長さを変えることができるということも想定されている。例えば、二次α螺旋構造に比較的高度の拘束を与えることが望ましい場合に長さがより短い鎖を用いることができ、一方、ある場合には、二次α螺旋構造により少ない拘束を与えることが望ましいために、より長い鎖が望ましいこともある。
【０１６２】
更に、主にα螺旋の単一面上にある鎖を供給するために、アミノ酸ｉからｉ＋３、ｉからｉ＋４及びｉからｉ＋７にわたる鎖の例が記載されているが、鎖はアミノ酸の番号のあらゆる組み合わせにわたるように合成でき、複数の鎖を組み込めるように組合わせて用いることもできる。
【０１６３】
当業者に理解されるように、本明細書に記載されている化合物を合成する方法は当業者には明らかだろう。更に、所望の化合物を得るために多様な合成の工程を交互に連続して又は順番に実施できる。本明細書に記載されている化合物を合成するのに有用な合成化学変換及び保護基手法（保護及び脱保護）は当該技術分野で公知であって、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、及びこれらの続編に記載されているようなものを包含する。
【０１６４】
当業者に分かるように、ＭＣＬ−１を結合する（汎結合剤及び選択的結合剤の両方）配列に由来する洞察は、ＭＣＬ−１を標的にする必須結合残基を明確にするために用いられている。このような洞察は、同様に、突然変異誘発、別の非天然アミノ酸の取り込み、等のような方法によって、最適化結合剤の開発のために用いられている。
【０１６５】
薬物設計
当業者に分かるように、ＭＣＬ−１に特異的に結合して、ＭＣＬ−１活性の調節をもたらすとして本明細書で同定されたもののような、ＳＡＨＢのＭＣＬ−１と特異的に結合する要素に似せた、小分子の開発に、コンピュータを利用する薬剤設計方法を用いることができる。
【０１６６】
特に、ＭＣＬ−１の活性部位、及びＭＣＬ−１ＢＨ３ドメインに選択的に結合できる特異的ＳＡＨＢ薬剤の同定は、ＭＣＬ−１及び対応する活性部位を有している別のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを調節できる化合物の開発及び同定を支援する。例えば、当業者は、この情報を用いて、三次元コンピューターで処理するＭＣＬ−１の相互作用テンプレートを作成でき、そしてＭＣＬ−１の活性部位に特異的な活性剤及び阻害剤を設計するために用いることができる。別の実施態様では、当業者は、他のＢＣＬ−２ファミリーメンバーの、又は保存ドメイン、例えばＭＵＬＥタンパク質のＢＨ３ドメイン、を有している他の非ＢＣＬ−２ファミリーメンバーの、対応する活性部位を同定するために、ＭＣＬ−１の活性部位を適用することができる。この情報は次いで、他のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド及び／又はＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドが保存しているドメインを有しているポリペプチドを調節できる化合物を同定／開発するために用いることができる。
【０１６７】
ＭＣＬ−１ポリペプチド及び特異的活性部位の三次元構造の確認は、ＭＣＬ−１ポリペプチド活性のモジュレーターとして作用可能な薬剤の合理的な同定及び／又は開発には絶対不可欠である。これは、そのような薬剤を同定するための唯一の方法が、数千の化合物を、標的の化合物に対する所望の阻害効果を有する薬剤が同定されるまでスクリーニングすることである、従来の薬物アッセイ技術より有利である。必然的に、このような従来のスクリーニング方法は、費用がかかり、時間がかかり、そして同定された薬剤の標的化合物に対する作用方法を解明しない。このような三次元構造を用いて、研究者は推定結合部位を同定した後、これらの結合部位と相互作用する薬剤を同定又は設計する。次いでこれらの薬剤を標的分子に対する調節効果についてスクリーニングする。この方法では、所望の活性についてスクリーニングすべき薬剤の数が非常に減少するばかりでなく、標的化合物に対する作用の機序がよりよく理解される。
【０１６８】
ＭＣＬ−１の活性部位の同定が、ＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位の１つ又はそれ以上の領域の全て又は一部に結合可能な化合物について小分子データベースをコンピュータでスクリーニングするために用いることができるということも意図される。
この方法の一実施態様では、活性部位の領域に対して同定された化合物の質又は適合性を、形状の相補性によって或いは推定相互作用エネルギーの何れかによって評価することができる（Meng et al., J. Comp. Chem. 13:505-524, 1992）。
【０１６９】
更なる実施態様では、本発明の方法によって分析できる可能性のあるモジュレーターを、当該技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数の手法の何れかを用いて得ることができる。
一実施態様では、可能性のあるモジュレーターを最初に、本明細書に記載されているか当該技術分野で公知のインビトロアッセイ（例えば、蛍光偏光）を用いて、プロアポトーシス又はアンチアポトーシス活性について同定する。可能性のあるモジュレーターを同定して、それらの構造を確認すると、更に、本明細書に記載されているＭＣＬ−１活性部位の構造情報を用いるコンピュータ分析によって最適化を実施できる。
別の実施態様では、可能性のあるモジュレーターを最初に、ＭＣＬ−１活性部位の構造座標から作成した相互作用テンプレートを用いるスクリーニングで同定して、更に、追加のコンピュータ分析による最適化に付す。
また、本明細書に記載されている方法を用いて、可能性のあるモジュレーターとＭＣＬ−１活性部位との共複合体(co-complex)のＮＭＲ構造座標を確認して、さらなる最適化を実施できる。
【０１７０】
本発明の方法で用いることができる多くのコンビナトリアルライブラリーは、これに限定されないが、生物学ライブラリー；空間的にアクセス可能なパラレル固相又は溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；「ワンビーズ ワンコンパウンド（one-bead one-compound)」ライブラリー方法；親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法；を包含する。生物学ライブラリー方法はペプチドライブラリーに限定されるのに対して、他の４つの方法は化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー又は小分子のライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145）。
【０１７１】
一実施態様では、化合物のライブラリーはデジタルライブラリーである。結合相互作用は、三次元構造が公知の小分子のデータベースを活性部位に適合する候補化合物についてスキャンできるデータベース検索プログラムで実行する。適切なソフトウェアプログラムは、CATALYST (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA)、UNITY (Tripos Inc., St Louis, MO)、FLEXX (Rarey et al., J. Mol. Biol. 261: 470- 489 (1996))、CHEM-3-DBS (Oxford Molecular Group, Oxford, UK)、DOCK (Kuntz et al., J. Mol. Biol 161: 269-288 (1982))、及びMACCS-3-D (MDL Information Systems Inc., San Leandro, CA) 及びLUDI (Boehm, J. Comp. Aid. Mol. Des. 6:61-78 (1992))、CAVEAT (Bartlett et al. in “Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems”,The Royal Chem. Soc., 78:182-196 (1989)の特別出版)及びMCSS (Miranker et al. Proteins 11: 29-34 (1991))を包含する。
【０１７２】
更に、分子ライブラリーの合成に関する方法は当該技術分野で、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;及び Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見出せる。
【０１７３】
化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421）、又はビーズ（Lam (1991) Nature 354:82-84）、チップ（Fodor (1993) Nature 364:555-556)細菌（Ladner 米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ladner米国特許第’４０９号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）又はファージ上（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); Ladner 上記参照）に存在していてよい。
【０１７４】
化合物の潜在的なモジュレーター効果は、その実際の合成及び試験の前に、ＭＣＬ−１活性部位の構造座標を用いるコンピュータモデリング技術の使用によって更に分析することができる。コンピュータモデリングが相互作用を示唆したら、次いでこの分子を、化学技術分野の当業者に公知の標準的な方法を用いて合成して、その後本明細書で先に述べたアッセイを用いて、ＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドの活性を調節するその能力について試験することができる。
【０１７５】
ＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドのモジュレーター又は他の結合化合物は、化学物質又は断片を個々の活性部位と関連付けるそれらの能力について、スクリーニングして選択する、一連の工程方法により、コンピュータで評価及び設計できる。当業者に認識されているように、断片に基づいた薬剤設計は、ＭＣＬ−１ＢＨ３ドメインに対して選択性があるとして本明細書に記載されている薬剤のような、ＭＣＬ−１特異的ＳＡＨＢのＭＣＬ−１特異的結合要素を模倣した小分子を開発するために用いることができる。
【０１７６】
本発明方法の別の実施態様では、可能性のあるモジュレータ化合物を、ＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドの活性部位と結合する能力について試験することができる。この方法は、例えば、ＭＣＬ−１活性部位の構造座標に基づくコンピュータ画面上の活性部位の目視検査を包含できる。次いで、選択された化合物又は化学部分を、本明細書で定義されているような活性部位の個々の領域内で、様々な方向に配置するか、又はドッキングさせることができる。ドッキングは、Quanta 及び SYBYL のようなソフトウェアを用いて、続いてCHARMM 及び AMBER のような標準的な分子力学力場によってエネルギー最小化及び分子力学を用いて実行できる。
【０１７７】
ある実施態様では、本発明は、ＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドの構造座標を電子記憶媒体に入力して、ポリペプチドの三次元コンピュータモデルを作成することを包含している。一実施態様では、ＭＣＬ−１ポリペプチドの完全な構造座標を入力する。別の実施態様では、断片、又は完全構造座標には満たないが、活性部位を包含しているものを入力する。構造座標は当該技術分野において公知であっても相同性モデリングに基づいていてもよい。例えば、公知のＢＣＬ−２ファミリー構造座標は、ＢＡＸ（PDB ID No. 1f16）、ＢＡＫ（PDB ID No. 2ims）、ＢＣＬ−２（PDB ID No. 1g5m）、及びＢＣＬ−ＸＬ（PDB ID No. 1lxl）及びＢＩＭ  ＢＨ３−ＢＡＸ（PDB ID No. 2k7w）、更に本明細書に記載されているＭＣＬ−１構造座標（例えばＭＣＬ−１のＢＨ３ドメイン（PDB# 1pqk, 配列番号 1A）、及び当該技術分野で公知のその他のものを包含する。多くの公知ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドについての構造座標はタンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics; http://www.rcsb.org）から入手することができる。
【０１７８】
本発明は更に、本発明の構造座標が、分子又は分子複合体の未知の三次元構造を決定するために、標準的な相同性モデリング技術と共に用いることができるということを提供する。相同性モデリングは、１つ又はそれ以上の関連タンパク質分子、分子複合体又はそれらの部分（すなわち、活性部位）の構造座標を用いて、構造未知のモデルを構築することを包含する。その三次元構造を解明すべきタンパク質の共通又は相同部分を、公知分子の相同構造要素の三次元構造に適合させ）ることによって、特に関連する構造座標を用いて、相同性モデリングを実施することができる。相同性は、アミノ酸配列同一性、第二構造要素の相同性、及び／又は三次元折り畳みの相同性を用いて確認できる。相同性モデリングはアミノ酸残基（又はその他の成分）の解明すべき関連構造のそれとの置換を伴う三次元構造の部分又は全てを再構築することを包含できる。
【０１７９】
類似の方法は当業者に公知である（Greer, 1985, Science 228, 1055; Bundell et al 1988, Eur. J. Biochem. 172, 513; Knighton et al., 1992, Science 258:130-135, http://biochem.vt.edu/courses/modeling/homology.htm）。相同性モデリングにおいて使用できるコンピュータプログラムは、Insight II モデリングパッケージ（Accelrys, Inc., San Diego, CA）中のQuanta and the homology module 又はMODELLER (Rockefeller University, www.iucr.ac:uk/sinris- top/logical/prg-modeller.html, Sali’s Modeller also from Accelrys, Inc., San Diego, CA)を包含する。
【０１８０】
相互作用テンプレートが作成されると、ＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドの活性部位と結合する化合物を同定することができる。化合物又は化学物質を選択する方法でも用いることができる専門化されたコンピュータプログラムは以下のものを包含する。
1. Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USA から入手できるSYBYL
2. Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USA から入手できるUNITY
3. Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USA から入手できる FlexX
4. GRID (Goodford, P. J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules", J. Med. Chem., 28, pp. 849-857 (1985))、GRID はOxford University, Oxford, UK. から入手できる。
5. MCSS (Miranker, A. and M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure. Function and Genetics, 11, pp. 29-34 (1991))、MCSS  Molecular Simulations, Burlington, Mass. から入手できる。
6. AUTODOCK (Goodsell, D. S. and A. J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing", Proteins: Structure. Function, and Genetics, 8, pp. 195-202 (1990))、AUTODOCK は Scripps Research Institute, La Jolla, Calif. から入手できる。
7. DOCK (Kuntz, I. D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J. Mol. Biol., 161, pp. 269-288 (1982))、DOCK はUniversity of California, San Francisco, Calif. から入手できる。
【０１８１】
適切な化合物又は化学部分が選択されると、これらを単一の化合物又は阻害剤に組み立てることができる。組立は、コンピュータ画面上に、ＢＡＸ／ＢＩＭ−ＢＨ３のＮＭＲ結合検討の構造座標と関連して表示させた三次元画像上で化合物又は部分の互いの関連を目視検査して進めることができる。この後に、Quanta又はSYBYL のようなソフトウェアを用いて手動でモデルを構築する。
【０１８２】
個々の化合物又は化学物質を関連付けるために当業者の助けとなるその他の有用なプログラムは以下のものを包含する。
1. CAVEAT (Bartlett, P. A. et al, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules". In "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196 (1989))、CAVEATは the University of California, Berkeley, Calif. から入手できる。
2. MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, Calif.)のような３Ｄデータベースシステム。この領域はMartin, Y. C., "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154 (1992))に概説されている。
3. HOOK（Molecular Simulations, Burlington, Mass.から入手できる)。
【０１８３】
別の実施態様では、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのモジュレーター(複数も)は、空の活性部位又は随意に公知モジュレーター(複数も)のある部分を含んでいるものの何れかを用いて、全体として又は初めから（"de vono"として)設計することができる。これらの方法に役立つプログラムは以下のものを包含する。
1. LUDI (Bohm, H.-J., "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. Comp. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78 (1992))、LUDI はBiosym Technologies, San Diego, Calif. から入手できる。
2. LEGEND (Nishibata, Y. and A. Itai, Tetrahedron, 47, p. 8985 (1991))、LEGEND は Molecular Simulations, Burlington, Mass. から入手できる。
3. LeapFrog (Tripos Associates, St. Louis, Mo.から入手できる）。
【０１８４】
その他の分子モデリング技術も本発明に従って利用することができる。例えば、Cohen, N. C. et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33, pp. 883-894 (1990)を参照されたい。Navia, M. A. and M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210 (1992)も参照されたい。
【０１８５】
上記方法によって化合物が設計又は選択されたら、化合物がＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドを調節する効果を試験して、コンピューター評価によって最適化できる。有効なＭＣＬ−１ポリペプチドモジュレーター（又はＭＣＬ−１関連ポリペプチドのモジュレーター）は、望ましくは結合状態と遊離状態の間のエネルギーに相対的に少ない差（即ち、小さい結合変形エネルギー）を示さなければならない。
【０１８６】
ＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドのモジュレーターとして設計又は選択された化合物は、その結合状態において、好ましくは標的タンパク質と反発静電相互作用を欠如するように、コンピュータによって更に最適化することができる。このような非相補的な（例えば、静電的）相互作用は、反発する荷電−荷電、双極子−双極子及び荷電−双極子相互作用をを包含する。具体的には、モジュレーターがＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドと結合したときの、モジュレーターと酵素の間の静電相互作用の総合計が中性となるか又は結合のエンタルピーに好ましく寄与する。
【０１８７】
化合物の変形エネルギー及び静電相互作用を評価するための特定のコンピュータソフトウェアは、当該技術分野で入手できる。そのような使用のために設計されたプログラムの例は、Gaussian 92, revision C（M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa.）; AMBER, version 4.0（P. A. Kollman, University of California at San Francisco）; QUANTA/CHARMM（Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass.）; 及びInsight II/Discover （Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif.）を包含する。これらのプログラムは、例えば、Silicon Graphics ワークステーション、IRIS 4D/35又はIBM RISC/6000 ワークステーションモデル550を用いて実行することができる。その他のハードウェアシステム及びソフトウェアパッケージは当業者に公知である。
【０１８８】
更に、断片に基づく創薬は、ＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドの活性部位と相互作用する化合物を同定するために用いることができる。これらの方法は公知であって、コンピュータツール、例えば、「SAR by NMR」（Shukers, S. B., et al., Science, 1996, 274, 1531-1534）、「Fragments of Active Structures」（www.stromix.com; Nienaber, V. L., et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18, 1105-1108）、及び「Dynamic Combinatorial X-ray Crystallography」(e.g., permitting self-selection by the protein molecule of self-assembling fragments; Congreve, M. S., et al., Angew. Chem., Int. Ed., 2003, 42, 4479-4482)は市販されている。Bray et al.の文献 は、確立された断片に基づく手法を実行できることを記載した（Bray, B.L., Nature Reviews Drug Discovery, 2003. 2(7): P.587-593; MYUNG-CHOL KANG, B.B., et al., Methods and Composition for peptide synthesis, U.S.P.a.T. Office Editor. January 18 2000 USA）。この戦略では、ペプチドを３つの断片に分割して、Ｎ末端、中央、及びＣ末端部分をそれぞれ合成する。これらのポリペプチド断片は、固相Ｆｍｏｃ化学及び超酸開裂可能樹脂上でのルテニウム触媒オレフィンメタセシスを用いて作成され、これはＮ末端にＦｍｏｃ、そしてＣ末端アミド（Ｃ末端断片に）又は遊離のカルボン酸塩(中央及びＮ末端断片に）の何れかを有している十分に保護されているペプチドが得られるだろう。これらの十分に保護されている断片を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した後、脱保護、カップリング、及び精製を順次行うと全長の保護ポリペプチドが得られる。全てを脱保護した後、逆相高速液体クロマトグラフィーによって最終生成物が得られ、これをＬＣ／ＭＳ質量分析法及びアミノ酸分析を用いて特性化することができる。
【０１８９】
ＭＣＬ−１ポリペプチドモジュレーター（又はＭＣＬ−１関連ポリペプチドのモジュレーター）が、本明細書に記載のように、最適に選択又は設計されると次いで、修正に適する領域を同定するための相互作用及び特異的テンプレートによってもたらされる情報を再度用いて、結合特性を改善又は修正するためにその原子又は側鎖の幾つかを置換することができる。一般に、最初の置換は同類置換であり、すなわち、置換する基は、元の基とほぼ同じ大きさ、形状、疎水性及び荷電を有している。もちろん、立体配座を変えることが当該技術分野で知られている成分は避けるべきであるということは当然である。このように置換された化学化合物は次いで、上に詳細に述べられているのと同じコンピューター方法によって、ＭＣＬ−１又は関連ポリペプチドに適合する有効性について分析する。
【０１９０】
ある特定の実施態様では、モジュレーターはＭＣＬ−１ポリペプチドに対して（又は、随意に、ＭＣＬ−１関連ポリペプチドに対して）、少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも７５０μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも２５０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも３０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも３ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、又は少なくとも０．５ｎＭのＫｄを有している。
【０１９１】
設計されたモジュレーターは更に、当該技術分野で公知であって本明細書に記載されているインビトロ又はインビボアッセイを用いて評価することができる。
【０１９２】
ＭＣＬ−１ペプチド調節及び化合物結合を評価するインビトロアッセイ
コンピュータモデリング、ライブラリースクリーニング、及び／又は断片による創薬に基づいてＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位に結合することが見出された化合物の能力の確認は、直接結合試験をすることによってＭＣＬ−１ポリペプチド相互作用について更に評価できる。試験化合物のＭＣＬ−１ポリペプチドと結合する能力の確認は、例えば、複合体中の標識化されたＭＣＬ−１ポリペプチドを検出してＭＣＬ−１ポリペプチドの可能性のあるモジュレーターとの結合を確認できるように、ＭＣＬ−１ポリペプチド又は化合物を放射性同位元素又は酵素標識とカップリングさせて、実施できる。例えば、化合物を１２４Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで直接的又は間接的に標識化して、放射性放出を直接カウントして又はシンチレーションカウンティングによって放射性同位元素を検出する。それとは別に、化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで、酵素標識化して、適切な基質の生成物への変換を確認することによって酵素標識を検出することができる。更なる例としては、化合物をフルオロセインで標識化して、リガンドとＭＣＬ−１ポリペプチドの間の結合相互作用を、蛍光偏光アッセイを用いて定量できる。結合は、本明細書に記載されているように、ＨＳＱＣ ＮＭＲによっても測定できる。
【０１９３】
その他の実施態様では、モジュレーターのＭＣＬ−１ポリペプチドと結合する能力の確認は、下流事象（例えば、ポリペプチドの配座、オリゴマー化状態、又は細胞内局在の変化、アポトーシス、ミトコンドリアチトクロームｃの放出、等）の誘発を検出するか、或いはその他のＭＣＬ−１制御の細胞応答を検出することによって確認できる。
【０１９４】
別の実施態様では、このアッセイは、ＭＣＬ−１タンパク質又は活性部位を含んでいるそれらの生物的に活性な部分を試験化合物と接触させて、ＭＣＬ−１タンパク質又はそれらの生物活性部位の活性を調節する試験化合物の能力を測定するという、無細胞系のアッセイである。ＭＣＬ−１タンパク質の活性を調節する試験化合物の能力の確認は、例えば、ＭＣＬ−１タンパク質が、試験化合物の存在下で、別のＭＣＬ−１タンパク質及び／又は別のＢＣＬ−２ファミリー標的分子と結合する能力を測定することによって実施できる。
【０１９５】
標的分子と結合するＭＣＬ−１タンパク質の能力の確認は、リアルタイム生体分子相互作用分析（real-time Biomolecular Interaction Analysis (BIA)）のような技術を用いても実施できる。Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345及びSzabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書で用いられる、「BIA」は、何れの反応体も標識化せずに、生体特異的相互作用をリアルタイムに検討する技術である（例えば、BLAcore)。表面プラズモン共鳴（SPR）の光学現象変化を生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【０１９６】
これに代わる実施態様では、ＭＣＬ−１タンパク質の活性を調節する試験化合物の能力の確認は、下流ＭＣＬ−１標的分子の活性を調節するＭＣＬ−１タンパク質の能力を測定することによって実施できる。例えば、適切な標的上にあるエフェクタ分子の活性を測定することができ、或いはエフェクターの適切な標的との結合を既述のように測定することができる。
【０１９７】
更に別の実施態様では、無細胞系のアッセイは、ＭＣＬ−１又は活性部位を含有しているその生物活性部分をＭＣＬ−１タンパク質と結合する公知の化合物（例えば、ＢＡＸ又はＢＡＫ、例えば、炭化水素架橋ＢＡＸ又はＢＡＫ ＢＨ３ポリペプチド）と接触させて分析試料を形成して、ＭＣＬ−１タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含有して、ここで、ＭＣＬ−１タンパク質と相互作用する試験化合物の能力の確認は、試験化合物が優先的にＭＣＬ−１タンパク質と結合するか又はその活性を調節して及び公知化合物に取って代わる能力を測定することを含有している。
【０１９８】
本発明の上記アッセイ方法の２つ以上の実施態様では、一方又は両方のタンパク質の非複合形態から複合形態の分離を促進するために、更にはアッセイの自動化をもたらすためにも、ＭＣＬ−１ポリペプチド又は標的分子の何れかを固定化することが望ましい。試験化合物のＭＣＬ−１タンパク質への結合、又は候補化合物の存在下又は非存在下でのＭＣＬ−１タンパク質の標的分子との相互作用は、反応体を収容するのに適している何れかの容器中でも実行できる。このような容器の例は、マイクロタータープレート、試験管、及び微小遠心管を包含する。
一態様では、１つ又は両方のタンパク質をマトリックスに結合させるドメインを加えた融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＭＣＬ−１融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着でき、次いでこれを試験化合物と、又は試験化合物と非吸着標的タンパク質或いはＭＣＬ−１タンパク質の何れかと混合して、混合物を複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩及びｐＨに対する生理学的条件）で培養する。培養後に、ビーズ又はマイクロタイターのウェルを洗浄して非結合成分を除去して、ビーズの場合はマトリックスを固定化して、複合体を、例えば上記のようにして、直接的に或いは間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離して、ＭＣＬ−１の結合又は活性のレベルを標準的な技術を用いて測定することができる。
【０１９９】
タンパク質をマトリックス上に固定化する別の技術も本発明のアッセイに用いることができる。例えば、ＭＣＬ−１タンパク質又はＭＣＬ−１標的分子の何れかをビオチンとストレプトアビジンの共役を利用して固定化することができる。ビオチン化ＭＣＬ−１タンパク質又は標的分子は、ビオチンチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から、当該技術分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を用いて製造することができ、ストレプトアビジンを被覆した９６ウェルのプレート（Pierce Chemical）のウェウル中に固定化することができる。あるいは、ＭＣＬ−１タンパク質又は標的分子と反応するが、ＭＣＬ−１タンパク質のその標的分子との結合を阻害しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化することができ、結合していない標的又はＭＣＬ−１タンパク質を抗体共役によってウェル内に捕捉することができる。ＧＳＴ−固定化複合体について上記したものに加えて、このような複合体を検出する方法は、ＭＣＬ−１タンパク質又は標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出を包含して、更に、ＭＣＬ−１タンパク質又は標的分子に付随する酵素活性を検出することに依存している、酵素結合アッセイも包含する。
【０２００】
ＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位と結合する化合物は、当該技術分野で公知であるか、或いは本明細書に記載されている多様なアッセイを用いて、インビトロ又はインビボにおいて腫瘍細胞の数を抑制することが実証されるだろう。このようなアッセイは、目的の化合物の存在下又は非存在下で、癌細胞株の細胞又は患者由来の細胞を用いることができる。細胞が無秩序なＭＣＬ−１ポリペプチド経路を有していることが好ましい。本発明の化合物又はレジメンが癌細胞の数を減少するか又はそれらの増殖を阻害する能力は、当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている方法で評価することができる。
【０２０１】
本発明は、ＭＣＬ−１タンパク質の活性部位に結合して活性を調節する化合物を同定する方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも言う）を提供する。
【０２０２】
本明細書に記載されているポリペプチドの結合親和性は、例えば、用量設定結合アッセイを用いて測定できる。ＭＣＬ−１ポリペプチド又はＢＨドメインを含有しているポリペプチド（例えば、ＭＣＬ−１、等）は、ポリペプチド又はその断片を含有している蛍光標識化ＢＨ３（例えば、ＭＣＬ−１、等）のような基質の存在下に、種々濃度の候補化合物（すなわち、ポリペプチド、小分子）（例えば１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、及び１０ｍＭ）に曝露することができる。次いで、候補化合物の各濃度の効果を分析して、候補化合物の種々の濃度におけるＭＣＬ−１ポリペプチド結合活性に対する効果を確認でき、これを候補化合物のＫｉを計算するために用いることができる。候補化合物は競合的又は非競合的方式で、ＢＣＬ−２タイプの活性を調節することができる。直接結合アッセイも、結合相互作用に対するＫｄを決定するためにＭＣＬ−１タンパク質と蛍光標識化候補化合物の間で行うことができる。細胞透過性スクリーニングアッセイも想定されていて、そこでは蛍光的に又は別の方法で標識化した候補化合物を無傷細胞に適用し、次いで顕微鏡又はハイスループットの細胞蛍光検出によって細胞の蛍光性についてアッセイする。
【０２０３】
本発明の化合物、医薬組成物、又はレジメンは、ヒトで使用する前に、所望の治療又は予防の活性について、インビボ活性と相関しているアッセイを用いてインビトロで、次いでインビボで試験することが好ましい。例えば、特定化合物の投与が有効か否かを確認するために用いることができるアッセイは、細胞培養アッセイを包含し、そこでは患者の組織サンプル（例えば、癌細胞）が培養物中で生育し、本発明の化合物に曝露させるか、或いは接触させて、次いでこのような化合物の組織サンプルに対する効果を観察する。組織サンプルは、生検又は患者から血液／骨髄を採取することによって得ることができる。この試験は、一人一人の患者に対して治療的に最も有効な治療法（例えば、予防薬又は治療薬）の同定を可能にする。
【０２０４】
本明細書に記載されているアッセイは個々の候補化合物を用いて実施できるか、或いは複数の候補化合物を用いて実施できる。複数の候補化合物を用いてアッセイを実施する場合は、候補化合物の混合物を用いて実施できるか、或いは単一の候補化合物を有しているそれぞれの反応による平行反応を行うことができる。試験化合物又は薬剤は当該技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数の手法の何れのものを用いても得ることができる。
【０２０５】
好ましい実施態様では、細胞系のアッセイは、ＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位に結合することが知られている（例えば、コンピュータモデリング、直接結合アッセイ、ＮＭＲ、又は別の方法によって同定されている）化合物に対して、この化合物がＭＣＬ−１ポリペプチドの活性も調節するか否かを確認するために実施する。
【０２０６】
一実施態様では、アッセイは、ＭＣＬ−１タンパク質又はその生物活性部分を発現する細胞を候補化合物と接触させて、候補化合物の活性部位と結合してＭＣＬ−１タイプの活性を調節する能力を確認する（例えば、内因性又は外因性の細胞死経路を介して、ある場合はアポトーシスを増大して、別の場合はアポトーシスを減少する）、細胞系のアッセイである。細胞においてＢＣＬ−２タイプの活性を調節する試験化合物の能力の確認は、例えば、ミトコンドリアからのチトクロームｃの放出、又はその他の関連する生理学的な情報（アネキシンＶ染色、ＭＴＴアッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイ、ミトコンドリア膜電位の変化）をモニタリングすることによって実施できる。
【０２０７】
ＭＣＬ−１ポリペプチドの活性部位に結合することが見出された化合物のインビトロ抗腫瘍活性は、腫瘍細胞を殺傷する化合物の能力を測定することによってアッセイできる。細胞株の例は：ヒト肺（Ａ５４９）；低いｔｏｐｏＩＩ活性を有する耐性ヒト肺（Ａ５４９−ＶＰ）；ネズミメラノーマ（Ｂ１６）；ヒト結腸腫瘍（ＨＣＴ１１６）；上昇したｐ１７０レベルを有するヒト結腸腫瘍（ＨＣＴＶＭ）；低いｔｏｐｏＩＩ活性を有するヒト結腸腫瘍（ＨＣＴＶＰ）；Ｐ３８８ネズミリンパ性白血病細胞；及びヒト結腸癌細胞株（Moser）、並びに当該技術分野で公知の多くのその他のものを包含する。
【０２０８】
腫瘍阻害アッセイは、例えば、Kelly, et al., 米国特許第５，１６６，２０８号及びPandley, et al., J. Antibiot. 3(11):1389-401 (1981)に記載されている。あるアッセイでは、細胞を標準的な条件下で２４時間生育させる。細胞を２４時間プレートに付着させた後（例えば、９６ウェルの平底プレート）、ＭＣＬ−１モジュレーター化合物の連続希釈濃度で７２時間培養する。これらのデータから５０％の細胞が殺傷したか、又は生育が阻害された（ＩＣ５０）化合物の濃度を決定する。
【０２０９】
競合結合アッセイによるＭＣＬ−１特異的小分子のスクリーニング
ＭＣＬ−１特異的ＳＡＨＢ／ＭＣＬ−１複合体の特異性を、ＭＣＬ−１の小分子モジュレータを同定する競合的蛍光偏光結合アッセイスクリーニングを実施する目的で、活用することができる。このようなアッセイは、ＭＣＬ−１又はＭＣＬ−１関連ポリペプチドの標的化小分子モジュレーターを同定するために本明細書に記載されているようなＳＡＨＢ／ＭＣＬ−１複合体の特異性を利用する方法であるという利点を有している。
【０２１０】
例えば、ハイスループットな競合的蛍光偏光結合アッセイは、ＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１特異的ＳＡＨＢと組み換えＭＣＬ−１の間の相互作用を妨害する小分子をスクリーニングするために使用することができる。このようなアッセイでは、ＭＣＬ−１はＦＰＬＣによって発現及び精製されて、自動化液体ハンドラーによって小分子のライブラリーを含有している３８４ウェルのプレートに送達される。室温で培養した後、ＦＩＴＣリガンドを液体ハンドラーで各ウェルに添加して、平衡状態でＦＰを読む（例えば、３０分）。ヒットする小分子を、化合物の４連続希釈用いるこのアッセイで再試験して、ＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１特異的ＳＡＨＢ結合（例えば、ＭＣＬ−１、配列番号１２、１７〜６０、ＮＯＸＡ配列番号６３〜６８、ＢＯＫ配列番号１１）の用量反応性阻害を確認する。ヒットする小分子は結合活性及び特異性の正確な定量へと進める。小分子の３通りの連続希釈をＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１特異的ＳＡＨＢと混合した後、結合緩衝液（例えば、５０ｍＭトリスｐＨ７．４、１００ｎＭＮａＣｌ）で希釈した組み換えＭＣＬ−１を含有している３８４ウェルプレートに添加する。ＦＰ（ｍＰ単位）をマイクロプレートリーダー（例えば、Spectramax）によって平衡状態で測定して、Prism ソフトウェア（Graphpad）を用いる用量反応性曲線の非線形回帰分析によってＫｉ値を算出する。特異性分析については、ヒットした小分子の連続希釈を汎−アンチアポトーシス結合剤（例えば、ＦＩＴＣ−ＢＩＭ ＳＡＨＢ、２５ｎＭ）と混合する以外は同一の実験を実施した後、組み換えＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ又はＢＦＬ１／Ａ１の何れかを含有しているプレートに添加する。次いで、ＭＣＬ−１特異的小分子を一連の機能分析に付して、インビトロ並びにin situでのＭＣＬ−１／標的タンパク質相互作用（例えば、ＭＣＬ−１／ＢＡＫ）を阻害して、細胞におけるＭＣＬ−１機能を調節する（例えば、ＭＣＬ−１を阻害して癌細胞においてアポトーシスを感受性に又は活性化する）それらの能力を評価することができる。
【０２１１】
化合物のインビボ試験
本発明の化合物がインビボにおける腫瘍形成を阻害することも明らかにすることができる。本発明の化合物、医薬組成物、及びレジメンをヒトに用いる前に、適切な動物モデル系で試験することができる。このような動物モデル系は、これに限定されないが、遺伝子組み換え動物及びその他の動物疾患モデルを含む、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、霊長類等を包含する。当該技術分野で公知の何れかの動物系を用いることができる。手順の幾つかの態様を変えることができ；当該態様は、これに限定されないが、治療薬剤（例えば、予防及び／又は治療薬）投与の一時的投与計画、このような治療薬剤を別々に投与するか又は混合物としてして投与するか、及び治療薬剤の投与頻度を包含する。
【０２１２】
本発明のＭＣＬ−１モジュレーター化合物のインビボ抗腫瘍活性は、哺乳動物（例えば、マウス）の腫瘍細胞の減少、及び結果としてもたらされた治療していない担癌動物と比較した生存時間の増大によってアッセイすることができる。例えば、ＣＤＦＩマウスにＰ３８８ネズミリンパ性白血病細胞、エールリッヒ癌細胞、Ｂ１６メラノーマ細胞、又はメチルコラントレン誘発（Met-A）腺維肉腫細胞の上澄液を腹腔内注射することができる。次いで、注射されたマウスの一部を、本発明のＭＣＬ−１モジュレーター化合物で腹腔内処置して、その他のマウスを生理食塩水で処置する。次いで、化合物のインビボ活性を、生理食塩水処置群の平均生存時間１００に対する治療群の平均生存時間の比（×１００）である、Ｔ／Ｃ％に関して確認する。Yokoi, et al., 米国特許第４，５８４，３７７号；Kelly, et al.,米国特許第５，１５５，２０８号；Warnick-Pickle, et al., J. Antibiot. 34(11):1402-7 (1981)；及びPandley et al.,supra。
【０２１３】
腫瘍形成及び転移拡散を包含する、過剰増殖性疾患の多数の動物モデルが当該技術分野で公知であって、本明細書に開示されている（Chapter 317, “Principals of Neoplasia,” in Harrison’s: Principals of Internal Medicine, 13th Edition, Isselbacher et al., eds., McGraw-Hill, New York, p. 1814, and Lovejoy et al., 1997, J. Pathol. 181:130-135 を参照されたい）。過剰増殖性疾患は、癌及び自己免疫疾患のような、細胞増殖又はアポトーシス遮断疾患を包含する。ＢＣＬ−２に関連する癌の例は、これに限定されないが、固形腫瘍、白血病、及びリンパ腫を包含する。一実施態様では、疾患は化学療法耐性の癌である。別の実施態様では、化学療法耐性の癌は、ＡＢＴ−７３７（Abbott; Abbott Park, Illinoisから入手できる）に耐性である。肺癌についての具体例は、腫瘍小結節のラットへの移植（Wang et al., 1997, Ann. Thorac. Surg. 64:216-219）又はＮＫ細胞枯渇ＳＣＩＤマウスにおける肺癌転移の確立（Yono and Sone, 1997, Gan To Kagaku Ryoho 24:489-494）；結腸癌については、ヒト結腸癌細胞のヌードマウスへの結腸癌移植（Gutman and Fidler, 1995, World J. Surg. 19:226-234）、ヒト潰瘍性大腸炎のワタボウシタマリン（cotton top tamarin）モデル（Warren, 1996, Aliment. Pharmacol. Ther. Supp 12:45-47）及び腺腫様ポリープ腫瘍抑制遺伝子の突然変異を有するマウスモデル（Polakis, 1997, Biochim. Biophys. Acta 1332:F127-F147）；乳癌については、乳癌のｋａｎ遺伝子モデル（Dankort and Muller, 1996, Cancer Treat. Res. 83:71-88; Amundadittir et al., 1996, Breast Cancer Res. Treat. 39:119-135）及びラットにおける腫瘍の化学誘発（Russo and Russo, 5 1996, Breast Cancer Res. Treat. 39:7-20）；前立腺癌については、化学的に誘発されて遺伝子を組み換えられた齧歯動物モデル、及びヒト異種移植モデル（Royal et al., 1996, Semin. Oncol. 23:35-40）、泌尿生殖器癌については、ラット及びマウスにおける誘発された膀胱腫瘍（Oyasu, 1995, Food Chem.  Toxicol 33:747-755）及びヒト移行上皮癌のヌードラットへの異種移植（Jarrett et al., 1995, J. Endourol. 9:1 -7）；及び造血器癌については、動物における移植された同種骨髄（Appelbaum, 1997, Leukemia 11 (Suppl. 4):S15- S17）を包含する。
更に、多種の癌に適用可能な一般的な動物モデルが記載されていて、これに限定されないが、ｐ５３欠損マウスモデル（Donehower, 1996, Semin. Cancer Biol. 7:269-278）、Minマウス（Shoemaker et al., 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332:F25-F48）及びラット１５における腫瘍に対する免疫応答（Frey, 1997, Methods, 12:173-188）を包含する。
【０２１４】
例えば、本発明の化合物を試験動物に投与することができて、一実施態様では、試験動物はあるタイプの腫瘍に罹りやすく、その後試験動物を、化合物を投与されなかった動物と比較して、腫瘍形成発生率の減少について検査することができる。或いは、腫瘍を有する試験動物（例えば、悪性、腫瘍性、又は形質転換細胞の導入によって、或い発癌性物資の投与によって腫瘍が誘発されている動物）に化合物を投与した後、化合物を投与しなかった動物と比較した腫瘍退縮について、試験動物の腫瘍を検査することができる。
本発明の化合物は、治療有効量を投与したとき、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％まで腫瘍進展時間を増大するか或いは生存時間を増大する場合に、過剰増殖性疾患の治療に有効であると考えられる。
同様に、本発明の化合物は、治療有効量を投与したとき、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％まで腫瘍生育速度を減少し、腫瘍量を減少し、転移数を減らす場合に、過剰増殖性疾患の治療に有効であると考えられる。このような結果は、当業者、例えば、癌専門医によって確認できる。
【０２１５】
架橋ペプチドのインビトロ及びインビボ安定性
構造的に拘束されているペプチドは、天然のペプチドと比較すると、インビトロにおいて顕著な熱安定性及びタンパク質分解安定性を有している。
【０２１６】
例えば、２２〜３６アミノ酸長の架橋ペプチドを、１〜９１℃の温度範囲で、熱変性、円偏光二色性試験に付した。ペプチドの選ばれた単一又は二重架橋が、顕著に熱耐性であるα螺旋安定性をもたらし、天然のペプチドと比較して９１℃においてでさえ、α螺旋性を最大２．３倍まで増強を維持した。
【０２１７】
更に、ペプチドの治療薬としての主な限界は、それらの急速なタンパク質分解に対する感受性である。長くて、折り畳まれていなくて、プロテアーゼ部位が豊富な生物学的に活性なペプチドは、特に脆弱である。ペプチドα螺旋を強化するための共有架橋戦略の可能性のある利点の１つは、脆弱なアミド結合をタンパク質分解から遮蔽することである。プロテアーゼは、ペプチドがアミド結合を加水分解するために伸びた構造を有していることを必要としているので、炭化水素架橋によって生じた構造性拘束が架橋ペプチドをプロテアーゼ耐性にする。炭化水素架橋、特に二重架橋が３６〜３７アミノ酸ペプチドを保護するか否かを確認するために、天然のペプチドと架橋ペプチドをインビトロでプロテアーゼに直接曝露した。架橋ペプチドを特に精査するために、複数の部位でペプチドを分解するプロテアーゼを選択した。
【０２１８】
プロテアーゼの存在下で、天然のペプチドは、１２及び１４分の半減期で、急速な分解を示した。それに対して、単一架橋ペプチドは２１〜２００分の範囲のより長い半減期を示した。大部分の二重架橋化合物は、選択された二重架橋ペプチドが最大１２７５分までの半減期を実現して、それらの単一架橋対応物を顕著に上回った。殆どの場合、二重架橋は、選択された二重架橋ペプチドが選択された単一架橋ペプチドより低いα螺旋性を有しているように、一般的にペプチドα螺旋性よりタンパク質分解安定性に対して影響を及ぼすが、それにしてもよりすぐれたプロテアーゼ耐性を示した。殆ど全ての架橋ペプチドは、対応する非改変ペプチドと同じ数のプロテアーゼ分解部位を有していて、観察されたプロテアーゼ耐性は、分解部位を除去したことよりむしろ、ペプチド架橋自体からもたらされたことを強調していた。
【０２１９】
非改変ペプチドは一般に、近位消化管内での急速な酸加水分解にある程度起因して、制限された経口バイオアベイラビリティーを有している。中性ｐＨにおける架橋ペプチドの強力なプロテアーゼ耐性が、酸性条件下におけるそれらの安定性の検討を促進した。それぞれの場合で、ペプチド溶液の酸性化は、ＣＤで測定して、それらのα螺旋含量を有意に増大した。ペプシンに曝露すると、天然のペプチドはそれぞれ４分及び１１分の半減期で、急速な分解を示した。選択された二重架橋ペプチドは非改変ペプチドより約８０〜８００倍大きい半減期を示し、その単一架橋対応物より一貫して上回った。特に、選択された二重架橋ペプチドは、１２時間以上ｐＨ２でペプシンに曝露された後に、８０％無傷を保持した。中性ｐＨでのプロテアーゼ耐性について観察されたように、二重架橋自体は、一般的なペプチドα螺旋性或いは開裂部位の数よりむしろ、ペプシン加水分解に対する優れた耐性と関連していた。これらの検討により、中性及び酸性ｐＨにおけるタンパク分解性加水分解に対する前例のない耐性を有する架橋ペプチドの能力が強調された。
【０２２０】
架橋ペプチドを更に、天然のペプチドと比較して、インビボにおける安定性及びバイオアベイラビリティーについて分析した。雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、二重架橋ペプチド又は対応する非改変ペプチドの何れか１０ｍｇ／ｋｇを、静脈内投与又は強制経口投与した。後眼窩採血によって回収した血液サンプルをＬＣ／ＭＳによる血液検査で定量した。血液中で測定された架橋ペプチドの濃度は対応する非改変ペプチドの測定された濃度より６倍を超えて高かった。連続採血によるノンコンパートメント薬理学的解析により、架橋ペプチドの濃度曲線下面積が天然のペプチドと比較して１０倍増大したことを明らかにした。際立って、経口投与３０分後に、無傷の架橋ペプチドが測定可能且つ用量反応性レベルで血液中に検出されたのに対して、非改変ペプチドは検出されなかった。ＡＵＣ及びクリアランスの両方が約１０倍まで改善された。
【０２２１】
これらのデータは、炭化水素架橋が、架橋されたペプチド配列に、それらのインビボ安定性を増大して、測定可能な経口バイオアベイラビリティーさえももたらす、固有の薬理学的特性をもたらすことを強調している。この実験は更に、架橋ペプチドの等量経口用量が、非改変ペプチドの静脈内投与からもたらされるものと同程度の血清濃度を生じたことを明らかにし、架橋ペプチドの治療有効用量を経口で投与できることを示唆している。
【０２２２】
ＭＣＬ−１標的ＳＡＨＢ化合物のインビボ試験
ＭＣＬ−１モジュレーターは、アポトーシス誘導、自食作用誘導、細胞周期停止、炎症応答の阻害、関連病原体、例えば結核菌、の生存機構の無効化等に対するこのようなモジュレーターの影響をアッセイする目的で、以下の実施例５に記載されているようにして、細胞系で評価してもよい。化合物を、以下により詳細に記載されている動物モデルような、関連疾患の動物モデル（例えば、癌異種移植、炎症モデル、感染疾患モデル）で試験することができる。
【０２２３】
ＭＣＬ−１結合と、天然複合体からのＳＡＨＢが介在する解離の暗示するものは、機能（例えばＭＣＬ−１を異なった標的（公知又は未知）と結合するように方向転換させる）の獲得を誘導できる。ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢを、これに関連して、ＭＣＬ−１の新規な標的及び機能（例えば、自食調節、細胞周期調節、ＲＮＡスプライシング）を同定するために用いることができる。例えば、以下の実験的手法を用いることができる。
【０２２４】
ＳＡＨＢ結合タンパク質及びタンパク質複合体の単離
細胞を、無血清培地中でＦＩＴＣ又はビオチン共役ＭＣＬ−１選択的ＳＡＨＢ（５〜２０μＭ）で処理した後、２〜４時間で血清を交換して、多時点（例えば、４、８、２４時間）培養した後、細胞を採取して溶解緩衝液で抽出する。ＳＡＨＢ結合タンパク質／タンパク質複合体を、記載（Walensky et al. Mol Cell, 2006; Pitter et al, Methods in Enzymology, 2008）のように実施する、抗ＦＩＴＣ破壊によって、又はストレプトアビジンアガロース捕獲（実施例５を参照されたい）によって単離する。溶解物をＳＤＳ／ＰＡＧＥ、Silver Stain Plus（Biorad）及びタンデム質量分析法で評価する。ＳＡＨＢに曝された溶解物に現れるが、賦形剤又はＳＡＨＢ点突然変異体で処理されたものには現れない、バンドをレーザーで切り取って細分化する。細分化しだバンドを水で１度、２５ｍＭの重炭酸アンモニウムで２度室温で１０分間洗浄する。バンドを２５ｍＭの重炭酸アンモニウム中の１％水酸化物と５分間培養して銀染色を除去する。ゲル切片が透明になったら、ゲルを水、１％ギ酸、水：アセトニトリル（５０：５０）と１％ギ酸、続いてアセトニトリル中で、それぞれ５分間洗浄する。次いで、ゲル切片をタンパク質分解消化、抽出及びタンデム質量分析（ＭＳＭＳ）に付す。Mascot Search エンジンソフトウェアを用いて同定された断片を公知のタンパク質配列にマッチさせる。
【０２２５】
幾つかのタンパク質相互作用物質は急いで通過するか或いは細胞溶解条件を乗り切れないので、別の共有架橋手法をＭＣＬ−１選択的ＳＡＨＢ架橋タンパク質及びタンパク質複合体を同定するために展開させることができる（参考、Danielの特許及びWalensky BAX の特許）。光活性化可能な架橋部分（例えば、ＢＰＡ）をＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢ配列（例えば、配列番号３４、７１、７２）に組み込んで、細胞処理又は細胞溶解液に直接曝露した後、ＵＶ照射がＳＡＨＢのその結合標的タンパク質内への共有挿入を誘発する。上記のようにして、抗ＦＩＴＣ又はストレプトアビジン−ビオチンよりなる捕獲を用いて、ＳＡＨＢ標的検索が達成される。
【０２２６】
ＳＡＨＢが誘導するＭＣＬ−１結合相互作用の変化を確認するためのＭＣＬ−１の免疫沈降
ＭＣＬ−１選択的ＳＨＡＢ（又は同定された小分子、上記を参照されたい）による標的化ＭＣＬ−１タンパク質相互作用の影響を評価するために、ＭＣＬ−１を過剰に発現する癌細胞（１０×１０６個）をＭＣｌ−１標的化ＳＡＨＢ、賦形剤、又は突然変異ＳＡＨＢと共に、無血清培地中３７℃で２４時間培養した後、血清に置き換えて６時間培養する。細胞溶解（例えば、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＣＨＡＰＳ及び完全プロテアーゼ阻害ペレット）した後、細胞残屑を４℃で１０分間１４，０００ｇでペレットにする。上澄液を前もって平衡化してあるタンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズと共に培養する。次いで、事前に除去した上澄液を４℃で１．５時間回転させて抗ＭＣＬ−１抗体で処理した後、タンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズに１時間曝す。ビーズをペレットにして溶解緩衝液で４℃、１０分間洗浄する。洗浄したビーズをペレットにして、ＳＤＳ充填緩衝液中で９０℃、１０分間加熱して、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析する。新規な相互作用物質を検索する（非処理及びＳＡＨＢ処理免疫沈降物由来の電気泳動したタンパク質を比較する）ために、免疫沈降物をSilver Stain Plus（Biorad）で評価して、ＳＡＨＢに曝露した免疫沈降物中には現れたり現れなかったりだが、賦形剤又はＳＡＨＢの点突然変異体で処理したものには現れないバンドを切り取って、次いで、タンデム質量分析及びMASCOT断片同定ソフトウェアで分析する。
【０２２７】
以下は、インビボ効力試験手法（癌治療モデル）の例である。主要なＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢをマウスで薬物動態（ＰＫ）解析する。血漿中の化合物濃度を検出して定量するためのＬＣ／ＭＳに基づく分析アッセイが開発されている。ＰＫ解析のために、ＳＡＨＢ（例えば、１０、５０、１００ｍｇ／ｋｇ）を雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスに尾静脈内又は腹腔内注入する。多時点に血液サンプルを後眼窩採血で採取して化合物を定量するために血漿を単離した後、血漿半減期、ピーク血漿濃度、総血漿クリアランス、及び分配の見掛け容量を計算する。ロバストＰＫプロファイルを示す分子をインビボ効力検討へ進める。
【０２２８】
化合物に感受性の血液癌細胞株をレトロウィルスで形質導入して安定なルシフェラーゼ発現（ｐＭＭＰ−ＬｕｃＮｅｏ）を達成して、既述（Armstrong et al., 2003; Walensky et al., 2004）のようにＳＣＩＤベージュマウスに移植する。最初の異種移植検討では、賦形剤のみ、低用量又は高用量のＳＡＨＢ、又はプロアポトーシス刺激剤（例えば、治療用量以下のＮＯＸＡ ＳＡＨＢ、ドキソルビシン、エトポシド、デキサメタゾン）と組み合わせた低／高用量ＳＡＨＢの何れかで処理した５つのマウス群（ｎ＝１０）を試験する。例えば、実験第１日に開始して、マウスに毎日１回ＳＡＨＢを（例えば、同時処置なし又は有りで、１０又は５０ｍｇ／ｋｇ）尾内注射する。１日おきのインビボ腫瘍画像化のために、マウスをイソフラン吸入で麻酔して、Ｄ−ルシフェリンの腹腔内注射と同時に処置する。Xenogen In Vivo Imaging System を用いて光放射を画像化（２分間露出）して、Xenogen's Living Image Softwareを用いて光流量（光子／秒）の積によって総体生物発光を定量する。Kaplan-Meier法を用いて、実験マウスの生存分布を確定して、ログランク検定を用いて比較する。フィッシャーの正確確立検定を用いて、治療が不成功のマウス（ここで治療不成功とは進行又は死亡と定義される）、と安定した疾患又は軽減としての成功の比率を比較する。特定のＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢで治療応答が観察される場合、賦形剤又はＳＡＨＢとアポトーシス同時刺激剤の有効な組み合わせの何れかで処置した、更なる２群を薬力学的検討のために用い、ＴＵＮＥＬ及び活性化カスパーゼ−３免疫組織化学的染色によって、組織のプロアポトーシス活性を評価する（Daniel et al., 2008）。
【０２２９】
更に、本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物の、過剰な細胞増殖又は細胞死に関連している疾患又はそれらの１つ又はそれ以上の症状に対する予防的及び／又は治療的有用性を評価するために、当業者に公知の何れのアッセイも用いることができる。
【０２３０】
治療方法
本発明の薬剤は、細胞死のシグナルが下方制御されていて、病的細胞が不適切に減少した細胞死の傾向を有している（本明細書では「減少したアポトーシス状態」であると称する）細胞を処置するのに有用である。本発明は更に、ウィルス感染又は自己抗体発現細胞のような、ある特定のタイプの細胞にアポトーシスを導入することが望ましい、アポトーシス関連疾患を治療するために、治療有効量の薬剤を対象に投与する方法を提供する。一般に、薬剤は投与前に実質的に精製されている。対象は、これに限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含む動物であってよく、一般に哺乳動物、そして特定の実施態様では、ヒトである。別の特定の実施態様では、非−ヒト哺乳動物が対象である。
【０２３１】
本発明は、異常な（例えば、不十分な又は過剰な）ＢＣＬ−２ファミリーメンバーの発現又は活性（例えば、外因性又は内因性アポトーシス経路の異常）に関連している疾患に罹る危険性がある（又は罹りやすい）又は疾患を有している対象を治療する、予防方法及び治療方法の両方を提供する。本明細書で用いられる用語「治療」は、疾患、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変える、是正する、改善する、改良する又は影響を及ぼす目的で、疾患、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を有している患者への治療薬剤の適用又は投与、患者から単離した組織又は細胞株への治療薬剤の適用又は投与であると定義される。治療薬剤は、これに限定されないが、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、その他の核酸組成物、及びこれらの組み合わせを包含する。
【０２３２】
ＢＣＬ−２タイプの疾患は、少なくとも一部が、１つ又はそれ以上のＢＣＬ−２ファミリーメンバーの異常な濃度（例えば、ＭＣＬ−１の過剰な或いは低い発現）によって、又は異常な活性を示す１つ又はそれ以上のＢＣＬ−２ファミリーメンバーの存在によって引き起こされる。このように、本発明は、疾患症状の改善をもたらす、ＭＣＬ−１又はＭＣＬ−１関連ポリペプチドの濃度及び／又は活性を減少すること、又はＭＣＬ−１又はＭＣＬ−１関連ポリペプチドの濃度及び／又は活性の増強を対象としている。例えば、ＭＣＬ−１のようなアンチアポトーシスタンパク質の過剰レベルによって保持されている腫瘍は、アポトーシス遮断を克服又は回避してアポトーシスを誘発するために、ＭＣＬ−１阻害化合物を用いて治療することができる。
【０２３３】
本発明の化合物は、癌及び腫瘍性の疾患を治療及び予防するために用いることができる。本明細書で用いられる用語「癌」、「過剰増殖性の」及び「腫瘍性の」は、自律的増殖及び不完全細胞死の能力を有している、すなわち、急速に増大する細胞増殖及び／又はアポトーシス遮断によって特徴付けられる異常な状態又は症状の細胞を示す。過剰増殖性又は腫瘍性の病態は、病理学的に、すなわち病状を特徴付けるか又は構成して分類できるか、又は非病理的に、すなわち、正常だが病態と関連していないものからの偏差で分類できる。この用語は、病理組織学的タイプ又は浸潤性の段階に関わらず、全てのタイプの癌生育又は腫瘍形成過程、転移性組織又は悪性形質転換した細胞、組織、又は臓器を包含するように意図されている。「病的な過剰増殖性」細胞は悪性腫瘍の生育によって特徴付けられる病態で生じる。病的ではない過剰増殖性細胞は創傷修復に関連している細胞の増殖を包含する。
【０２３４】
細胞増殖及び／又は分化障害の例は、癌、例えば、癌腫、肉腫、又は転移性疾患を包含する。本化合物は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、このような癌の転移等をコントロールするための新規な治療薬剤として使える。転移性の腫瘍は、これに限定されないが、乳房、肺結腸及び卵巣起源を包含する多くの原発性腫瘍タイプから生じる。
【０２３５】
癌又は悪性腫瘍疾患の例は、これに限定されないが、線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳腫瘍、扁平上皮癌、皮脂腺腫瘍、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、又はカポジ肉腫を包含する。
【０２３６】
増殖性障害の例は、造血系腫瘍性疾患を包含する。本明細書で用いられる用語「造血系腫瘍性疾患」は、造血系起源の、例えば、骨髄、リンパ、赤血球細胞又はこれらの前駆細胞由来の、増殖性／腫瘍性細胞に関連している疾患を包含する。疾患が、低分化型急性白血病、例えば、赤芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病に起因していることが好ましい。骨髄疾患の追加の例は、これに限定されないが、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97に概説されている）を包含し；リンパ性悪性疾患は、これに限定されないが、Ｂ系ＡＬＬ及びＴ系ＡＬＬを包含する急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を包含する。悪性リンパ腫の追加の形態は、これに限定されないが、非ホジキンリンパ腫及びその変形、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、及びリード・シュテンベルグ病（Reed-Stemberg disease）を包含する。
【０２３７】
胸部の細胞増殖性及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、増殖性胸部疾患、例えば、上皮過形成、硬化性腺症、及び小管乳頭腫；腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、及び肉腫のような間質性腫瘍、及び大管乳頭腫のような上皮腫瘍；上皮腺管癌（ぺージェット病を含む）及び小葉癌を含む上皮内（非浸潤性）腫瘍を包含する胸部の腫瘍、及びこれに限定されないが、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液性）癌、管状腺癌、及び浸潤性乳頭癌を包含する侵襲性(浸潤性）癌、及び混合型の悪性腫瘍を包含する。男性胸部の疾患は、これに限定されないが、女性化乳房及び癌を包含する。
【０２３８】
肺の細胞増殖性及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、腫瘍随伴性症候群、細気管支肺胞上皮癌、気管支カルチノイドのような神経内分泌癌、混合型腫瘍、及び転移性腫瘍を包含する気管支癌；炎症性胸腺滲出、非炎症性胸腺滲出、気胸、及び胸腺腫瘍（単発性線維性腫瘍（胸腺線維腫）及び悪性中皮腫を包含する）を包含する胸膜の疾患を包含する。
【０２３９】
結腸の細胞増殖性及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、非腫瘍性ポリープ、アデノーマ、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸癌及びカルチノイド腫瘍を包含する。
【０２４０】
肝臓の細胞増殖性及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、肝臓の原発性腫瘍及び転移性腫瘍を包含して、結節性過形成、アデノーマ、及び悪性腫瘍を包含する。
【０２４１】
卵巣細胞増殖性及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、体腔上皮の腫瘍、漿液腫瘍、粘液腫瘍、子宮内膜性腫瘍、透明細胞腺癌、嚢胞腺線維腫、ブレンナー腫瘍、表面上皮腫瘍のような、卵巣腫瘍；成熟（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫、未成熟悪性奇形腫、未分化胚細胞腫、内胚葉洞腫瘍、絨毛腫のような胚細胞腫瘍；卵胞膜顆粒膜細胞腫、卵胞膜細胞線維腫、アンドロブラストーマ、ヒル細胞腫、及び性腺芽細胞腫のような性索間質腫瘍；及びクルケンベルグ腫瘍のような転移性腫瘍を包含する。
【０２４２】
本明細書に記載されている化合物で治療できる免疫疾患の幾つかの例は、これに限定されないが、臓器移植拒絶、関節炎、尋常性狼瘡、ＩＢＤ、クローン病、喘息、多発性硬化症、糖尿病、等を包含する。
【０２４３】
本明細書に記載されているポリペプチドで治療できる神経疾患は、これに限定されないが、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型遺伝性脳出血アミロイドーシス、反応性アミロイドーシス、蕁麻疹及び難聴を伴う家族性アミロイド腎症、マックル・ウェルズ症候群、突発性骨髄腫、マクログロブリン血症関連骨髄腫、家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症、孤立性心アミロイドーシス、全身性老人性アミロイドーシス、成人発症型糖尿病、インスリノーマ、孤立性心房性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、家族性アミロイドーシス、アミロイド性脳出血、家族性アミロイド多発性神経障害、スクレピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、牛海綿状脳症、プリオン病、及びハンチントン病を包含する。
【０２４４】
本明細書に記載されているポリペプチドで治療できる内分泌疾患は、これに限定されないが、糖尿病、甲状腺機能低下症、下垂体機能低下症、副甲状腺機能低下症、性腺機能低下症、等を包含する。
【０２４５】
本発明の化合物及び方法で治療又は予防できる心血管疾患（例えば、炎症性疾患）は、これに限定されないが、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、血栓症、動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、突然心臓死、高血圧性心疾患；動脈硬化症、小血管疾患、腎症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧、肺気腫及び慢性肺疾患のような、非冠状動脈疾患；血管形成後の再狭窄、シャント、ステント、合成又は天然切除移植片、留置カテーテル、バルブ、又はその他の移植可能デバイスの留置などの、介入処置に関連する心血管疾患（「処置血管外傷」）を包含する。好ましい心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、動脈瘤、及び脳卒中を包含する。
【０２４６】
癌細胞のアポトーシス遮断／生存メカニズムの特異性により、ＭＣＬ−１特異的標的化薬剤を（例えば、細胞がＭＣＬ−１に極めて依存しているなら、すなわち、癌遺伝子依存性なら）アポトーシス誘発のための閾値を低下させて、それによって毒性の化学療法剤の必要な用量レベルを下げるように活用することが有利であろう。すなわち、本明細書に記載されているように、ＭＣＬ−１阻害剤は、その他の抗癌剤（化学療法剤）及びモダリティ（放射線照射）に対する感作剤、すなわち、標的療法の治療毒性を低下するだろう。別の状況においては、治療の標的にされる細胞は、複数のアンチアポトーシスタンパク質を過剰発現している可能性があり（すなわち、再発性で難治性の癌）ので、ＭＣＬ−１標的化に加えて、使用されるＳＡＨＢ化合物（又はこのようなＳＡＨＢ化合物に似せて設計／同定された化合物）は、別のアンチアポトーシスに加えてＭＣＬ−１を標的にするその広いアンチアポトーシス阻害活性に関して選択することができる。
【０２４７】
モジュレーターの投与
一実施態様では、本発明の化合物は、癌の予防、治療、及び／又は管理のために単剤療法として投与される。
【０２４８】
患者（例えば、ヒト患者）において癌を予防、治療、及び／又は管理する方法に関する本発明の一態様では、方法は患者に予防上有効なレジメン又は治療上有効なレジメンを投与することを含有してなり、レジメンは患者に本発明の化合物又は本発明の組成物を投与することを含有してなり、ここで患者は癌であると診断されている。癌の予防、治療、及び／又は管理に有効であり、予防及び／又は治療レジメンで用いられる本発明の化合物の量は、化合物の現在処方されている用量に基づくことができ、また本明細書に開示されている方法によって評価することができる。
【０２４９】
この態様の一実施態様では、患者は別の治療を受けていたか或いは受けている。この態様の別の実施態様では、患者は癌の予防、治療、及び／又は管理のために、以前に治療を受けていなかった。
【０２５０】
医師は、これに限定されないが、身体的診察（例えば、前立腺検査、胸部検査、リンパ節検査、腹部検査、皮膚監視）、目視方法（例えば、大腸内視鏡検査、気管支鏡検査、内視鏡検査）、ＰＡＰスメア検査（子宮頸癌）、便グアヤク試験、血液検査（例えば、全血球計数（ＣＢＣ）検査）、（肝機能検査、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）検査、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）検査、癌抗原（ＣＡ）−１２５検査、αヘトプロテイン（ＡＦＰ）検査を包含する）血液化学試験、核型分析、骨髄分析（例えば、悪性血液疾患の場合）、組織学、細胞学、喀痰検査及び画像方法（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、超音波、Ｘ線画像、マンモグラフ画像、骨のスキャン）を包含する従来の癌スクリーニング方法の何れを用いても患者を診断することができる。
【０２５１】
本発明の別の態様は、患者（例えば、ヒト患者）の固形癌を予防、治療、及び／又は管理する方法に関していて、その方法は、それを必要としている患者に予防上有効なレジメン又は治療上有効なレジメンを投与することを含有してなり、レジメンは患者に本発明の化合物又は組成物を投与することを含有してなり、ここで患者は固形癌を有していると診断されており、そしてここで患者は癌の大きさを減少するための初期治療を経験している。
【０２５２】
本発明の別の態様は、癌を予防、治療、及び／又は管理する方法に関していて、その方法はそれを必要としている患者に予防上有効なレジメン又は治療上有効なレジメンを投与することを含有してなり、そのレジメンは患者に、本発明の化合物（上記のような）、又はその薬学的に許容される塩を投与することを含有してなり、ここで患者は別の治療を受けた。ある実施態様では、先の治療は、例えば、化学療法、放射免疫療法、毒素療法、プロドラッグ活性化酵素療法、抗体療法、手術療法、免疫療法、放射線療法、標的療法又はこれらの何れかの組み合わせである。
【０２５３】
ある実施態様では、患者において先の治療は不成功に終わっている。ある実施態様では、治療上有効なレジメンは、患者が先の治療を受けた直ぐ後に本発明の化合物を患者に投与することを含有している。例えば、ある特定の実施態様では、先の治療の結果は、本発明の化合物を投与する前は不明であってもよい。
【０２５４】
本発明の別の態様は、患者（例えば、ヒト患者）における治療を予防、治療、及び／又は管理する方法に関していて、その方法はそれを必要としている患者に予防上有効なレジメン又は治療上有用なレジメンを投与することを含有してなり、レジメンは患者に本発明の化合物又は組成物を投与することを含有してなり、ここで本発明の化合物又は組成物は、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）のヒト相当用量（ＨＥＤ）より低い用量で、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年又はそれ以上の期間に渡って投与する。動物実験で確認されたような、ＮＯＡＥＬはヒト臨床試験に対する最大推奨開始用量を決定するために有用である。例えば、ＮＯＡＥＬをヒト相当用量を決定するために外挿することができる。一般に、このような種の間の外挿は、体表面積に対して正規化した用量（すなわち、ｍｇ／ｍ２）に基づいて実施する。特定の実施態様では、ＮＯＡＥＬはマウス、ハムスター、ラット、フェレット、モルモット、ウサギ、イヌ、霊長類、霊長類（サル、マーモセット、リスザル、ヒヒ）、マイクロブタ又はミニブタで確認する。ＮＯＡＥＬの使用及びそれらのヒト相当用量への外挿に関する考察については、Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Pharmacology and Toxicology, July 2005を参照されたい。
【０２５５】
ある特定の実施態様では、レジメンは予防上有効なレジメン及び／又は治療上有用なレジメンを投与することを含有してなり、レジメンは患者において癌細胞集団の減少をもたらす。一実施態様では、レジメンを受けている患者は、レジメンが患者において癌細胞集団の減少をもたらしているか否かを確認するために、モニタリングされる。
【０２５６】
一般に、癌細胞集団のモニタリングは、患者から抽出した試料中の癌細胞の数又は量を検出して実施する。試料中の癌細胞の数又は量の検出方法は当該技術分野で公知である。このモニタリングステップは一般に、患者がレジメンを受け始めた、少なくとも１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１４日、１５日、１６日、１８日、２０日、又は３０日後に実施する。
【０２５７】
ある実施態様では、試料は血液試料でよく、ここで単位容量（例えば、１ｍＬ）当たり又は別の測定単位当たり（例えば、組織学的分析の場合は単位区域当たり）の癌細胞数又は量を定量する。癌細胞集団は、ある特定の実施態様では、総血液細胞の百分率として測定される。
【０２５８】
別の実施態様では、患者から抽出される試料は組織試料（例えば、疑わしい癌組織から抽出した生検）であって、そこでは癌細胞の数又は量を、組織単位重量当たりの癌細胞の数又は量に基づいて測定することができる。
【０２５９】
抽出した試料中の癌細胞の数又は量を、参照サンプル中で測定された癌細胞の数又は量と比較して、レジメンの有効性及び治療を受けている癌の改善を評価することができる。一実施態様では、参照サンプルは、治療を受けている患者から抽出した試料であり、ここでは患者由来の試料は早い時点（例えば、参照サンプルの基準値として、レジメンを受ける前に、又は治療を受けている間のより早い時点に）に抽出される。別の実施態様では、参照サンプルは健常で、癌を発症していない患者から抽出される。
【０２６０】
別の実施態様では、抽出した試料中の癌細胞集団を所定の参照範囲と比較することができる。特定の実施態様では、所定の参照範囲は、治療をうけている患者と同じタイプの癌を患っている患者の集団(複数も)から得た癌細胞の数又は量に基づいている。
【０２６１】
治療受けている患者から抽出した試料中の癌細胞の数、量、又は百分率を参照試料と比較して、癌細胞集団の減少が非常に小さいと判断されたら、医師は治療レジメンを調節するための多数の選択肢を有する。例えば、医師は次いで、投与する本発明の化合物又は組成物の用量、投与頻度、投与期間、又はこれらの組み合わせの何れかを増大することができる。特定の実施態様では、決定がなされた後に、本発明の化合物又は組成物の第二有効量を患者に投与することができる。
【０２６２】
別の実施態様では、レジメンは本発明の化合物又は組成物を投与することを含有してなり、ここでレジメンは癌細胞の数、量、又は百分率の減少及び患者における癌細胞の数、量、又は百分率の減少をもたらす。
【０２６３】
癌の予防、治療、及び／又は管理に効果的であろう、予防及び／又は治療レジメンで用いられる本発明の化合物の量は、化合物の現在処方されている用量に基づいて、更に本明細書に記載されていて当該技術分野で公知の方法で評価することができる。頻度及び用量は、投与される特定の化合物、癌疾患の重症度、投与経路、更には、患者の年齢、身体、体重、応答、過去の病歴に基づく個々の患者に特異的な因子によっても変わる。例えば、癌の治療、予防、及び／又は管理に有効であろう本発明の化合物の用量は、例えば化合物を本明細書に開示されているか又は当業者に公知であるような、動物モデルに投与することによって決定することができる。更に、インビトロアッセイを、最適な用量範囲の確認に役立つように随意に用いることができる。
【０２６４】
ある実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、ある特定程度の治療有効性を達成できるように、患者に投与する用量を滴定をすることを含有してなる。このような程度は患者における癌細胞集団の減少を包含している。
【０２６５】
ある特定の実施態様では、予防及び／又は治療レジメンにおける本発明の化合物の用量は、予防及び／又は治療レジメンを受けた後に患者から抽出した試験試料中で見出される癌細胞の数又は量の、参照サンプルと比較した減少が達成できるように調節する。ここで、参照サンプルは治療を受けている患者から抽出する試料であって、試料はより早い時点で患者から抽出する。一実施態様では、参照サンプルは予防及び／又は治療レジメンを受ける前に、同じ患者から抽出された試料である。特定の実施態様では、試験試料中の癌細胞の数又は量は参照サンプル中よりも、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％少ない。
【０２６６】
ある実施態様では、予防及び／又は治療レジメンにおける本発明の化合物の用量は、癌細胞の数又は量が所定の参照範囲に入るように調節される。これらの実施態様では、試験試料中の癌細胞の数又は量を所定の参照範囲と比較する。
【０２６７】
別の実施態様では、予防及び／又は治療レジメンにおける本発明の化合物の用量は、予防及び／又は治療レジメンを受けた後の患者から抽出した試験試料に見出される癌細胞の数又は量が参照サンプルと比較して減少するように調節される。ここで参照サンプルは健常で、癌を発症していない患者から抽出される試料である。特定の実施態様では、試験試料中の癌細胞の数又は量は、参照サンプル中の癌細胞の数又は量の少なくとも６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、又は２％以内である。
【０２６８】
固形癌を有しているある特定のヒト患者の治療において、腫瘍の疑いのある部位から複数の組織試料を抽出することは実施不可能であるかもしれない。これらの実施態様では、ヒト患者のための、予防及び／又は治療レジメンにおける本発明の化合物の用量を、動物モデルにおける癌集団を減少するのに有効な動物モデルの用量から外挿する。この動物モデルでは、予防及び／又は治療レジメンを、予防及び／又は治療レジメンを受けた後の動物から抽出される試験試料中に見出される癌細胞の数又は量が、参照サンプルと比較して減少するように調節される。参照サンプルは、予防及び／又は治療レジメンを受ける前の、同じ動物から抽出される試料でよい。特定の実施態様では、試験試料中の癌細胞の数又は量が、参照サンプル中より、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％少ない。動物における癌細胞の数又は量を減少するのに有効な用量を体表面積に正規化して（例えば、ｍｇ／ｍ２）、相当ヒト用量をもたらすことができる。
【０２６９】
本明細書に開示されている予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物又はその医薬組成物を患者に単回用量又は複数回用量（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、又はそれ以上の用量）で投与することを含有してなる。
【０２７０】
一実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物又はその医薬組成物を複数回投与で投与することを含有してなる。複数回投与する場合は、疾患を予防、治療、及び／又は管理するのに十分な頻度及び量で化合物又は医薬組成物を投与する。一実施態様では、投与の頻度は１日１回から最大約８週間に１回までの範囲である。別の実施態様では、投与の頻度は、約１週間に１回から最大約６週間に１回の範囲である。別の実施態様では、約３週間に１回から最大約４週間に１回の範囲である。
【０２７１】
一般に、癌を予防、治療、及び／又は管理するために対象に投与される本発明の化合物の用量は、対象の体重に対して、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲で、より一般的には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。一実施態様では、対象に投与される用量は、対象の体重に対して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より好ましくは、対象の体重に対して、０.１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０２７２】
特定の実施態様では、患者の癌を予防、治療、及び／又は管理するために対象に投与される本発明の化合物の用量は、患者の体重に対して５００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、好ましくは、２５０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、９５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、９０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、８５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、８０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、７５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、７０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、６５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、６０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、５５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、５０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、４５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、４０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、３５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、３０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、２５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、２０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、１５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、１０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、２．５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、２ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、１．５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、又は１ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下である。
【０２７３】
別の特定の実施態様では、患者の癌を予防、治療、及び／又は管理するために対象に投与される本発明の化合物の用量は、０．１〜５０ｍｇ、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１２ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜８ｍｇ、０．１ｍｇ〜７ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１ｍｇ〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５ｍｇ〜１５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜１２ｍｇ、０．２５ｍｇ〜１０ｍｇ、０．２５ｍｇ〜８ｍｇ、０．２５ｍｇ〜７ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜８ｍｇ、１ｍｇ〜７ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、又は１ｍｇ〜２．５ｍｇの単位用量である。
【０２７４】
特定の実施態様では、患者の癌を予防、治療、及び／又は管理するために対象に投与される本発明の化合物の用量は、対象の体表面積当たり、０．０１〜１０ｇ／ｍ２の範囲内で、より一般的には、０．１ｇ／ｍ２〜７．５ｇ／ｍ２の範囲である。一実施態様では、対象に投与される用量は、対象の体表面積当たり、０．５ｇ／ｍ２〜５ｇ／ｍ２、又は１ｇ／ｍ２〜５ｇ／ｍ２の範囲である。
【０２７５】
別の実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物の有効量の１回又はそれ以上の用量を患者に投与することを含有してなり、そこでは有効量の投与は、本発明の化合物の少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬ、少なくとも４００μｇ／ｍＬの血漿濃度を達成する。
【０２７６】
別の実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物の有効量の複数回用量を患者に投与することを含有してなり、ここでは複数回用量は、本発明の化合物の少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬ、少なくとも４００μｇ／ｍＬの血漿濃度を少なくとも１日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月又は３６ヶ月にわたって維持する。
【０２７７】
ある実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物を１つ又はそれ以上の追加の抗癌治療法と組み合わせて投与することを含有してなる。併用治療で用いられる１つ又はそれ以上の追加の抗癌治療法の用量は、癌を予防、治療、及び／又は管理するために用いられた或いは現在用いられている用量より低いことが好ましい。癌を予防、治療、及び／又は管理するために現在用いられている１つ又はそれ以上の追加の抗癌治療法の推奨用量は、これに限定されないが、Hardman et al., eds., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed., Mc-Graw-Hill, New York, 2001; Physician’s Desk Reference (60th ed., 2006)（これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）を包含する当該技術分野における何れかの参考文献から入手することができる。
【０２７８】
本発明の化合物と１つ又はそれ以上の追加の抗癌治療法は、別々に、同時に、又は連続して投与することができる。いくつかの実施態様では、本発明の化合物と追加の抗癌治療法は、少なくとも５分おいて、少なくとも３０分おいて、少なくとも１時間おいて、約１時間おいて、約１〜約２時間おいて、約２時間〜約３時間おいて、約３時間〜約４時間おいて、約４時間〜約５時間おいて、約５〜約６時間おいて、酪６時間〜約７時間おいて、約７時間〜約８時間おいて、約８時間〜約９時間おいて、約９時間〜約１０時間おいて、約１０時間約１１時間おいて、約１１時間〜約１２時間おいて、約１２時間〜１８時間おいて、１８時間〜２４時間おいて２４時間〜３６時間おいて、３６時間〜４８時間おいて、４８時間〜５２時間おいて、５２時間〜６０時間おいて、６０時間〜７２時間おいて、７２時間〜８４時間おいて、８４時間〜９６時間おいて、又は９６時間〜１２０時間おいて投与される。好ましい実施態様では、２つ又はそれ以上の抗癌治療法を同じ外来診察時に投与する。
【０２７９】
ある特定の実施態様では、本発明の化合物と追加の抗癌治療法を周期的に投与する。周期治療は、１つの抗癌治療法をある期間投与した後、第二の抗癌治療法をある期間投与して、この順次投与を繰り返すこと、すなわち、一方又は両方の抗癌治療法に対する耐性の進展を減少するため、一方又は両方の抗癌治療法の副作用を無効に又は減少するため、そして／又は治療法の効果を改善するための周期を包含する。
【０２８０】
好ましい実施態様では、抗癌治療法を別々の組成物で同時に対象に投与する。本発明の併用抗癌治療法を同一又は異なった投与経路によって対象に投与することができる。
【０２８１】
特定の実施態様では、周期治療は、第一の抗癌治療法をある期間投与した後、第二の抗癌治療法をある期間投与し、その後随意に第三の抗癌治療法をある期間投与するなどして、この順次投与を繰り返すこと、すなわち、１つの抗癌治療法に対する耐性の進展を減少するため、一方又は両方の抗癌治療法の副作用を無効に又は減少するため、そして／又は治療法の効果を改善するための周期を包含する。
【０２８２】
本発明の化合物と追加の抗癌治療法を対象に同時に投与する場合の、用語「同時に」は、全く同時点での抗癌治療法の投与に限定されるのではなく、むしろ、これらが共に作用できるように（例えば、これらを別の方法で投与した場合より増大した利益を相乗的にもたらすように）これらを順に及びある時間間隔以内に対象に投与することを意味している。例えば、抗癌治療法を同時に又は異なった時点で何れかの順序で順次投与できるが、しかし、同時点に投与しない場合は、望ましい治療効果（好ましくは相乗的な様式に）をもたらすように、十分に近い時点に投与すべきである。本発明の併用抗癌治療法は、あらゆる適切な経路によってあらゆる適切な形態で、別々に投与することができる。併用抗癌治療法の構成成分を同じ医薬組成物で投与しない場合は、これらを、それを必要としている対象に何れかの順序で投与できると理解できる。
例えば、本発明の化合物を、それを必要としている対象に、追加の抗癌治療法の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間又は１２週間前）に、それと同時に、又はそれに続いて（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間又は１２週間後）に投与することができる。
多様な実施態様では、抗癌治療法を、１分離して、１０分離して、３０分離して、１時間未満離して、１時間離して、１時間〜２時間離して、２時間〜３時間離して、３時間〜４時間離して、４時間〜５時間離して、５時間〜６時間離して、６時間〜７時間離して、７時間〜８時間離して、８時間〜９時間離して、９時間〜１０時間離して、１０時間〜１１時間離して、１１時間〜１２時間離して、２４時間まで離して、又は４８時間まで離して投与する。一実施態様では、抗癌治療法を同じ外来診察時に投与する。別の実施態様では、本発明の併用抗癌象（照）治療法を１分〜２４時間離して投与する。
【０２８３】
製剤
本発明は、家畜及び／又はヒトへの投与に適している組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明の医薬組成物は、組成物を対象に投与することを可能にする何れの形態であってもよく、当該対象は、これに限定されないが、ヒト、哺乳動物、又はウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの、非ヒト動物を包含する動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０２８４】
癌の予防、治療、及び／又は管理に有効であろう予防及び／又は治療のレジメンに用いられる本発明の化合物の製剤は、現在入手可能な製剤を基にすることができる。あるいは、化合物を当該技術分野の知見及び本明細書の教示に基づき再製剤化することができる。例えば、化合物を固体、液体又は気体（エアゾル）の形態にすることができる。投与の一般的な経路は、これに限定されないが、経口、局所、非経口、舌下、直腸内、膣内、眼内、皮内、腫瘍内、脳内、髄腔内、及び鼻腔内を包含できる。非経口投与は、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、胸骨内注射又は輸液手法を包含する。特定の実施態様では、組成物を非経口で投与する。より特定の実施態様では、組成物を静脈内に投与する。本発明の医薬組成物は、対象へ組成物を投与すると本発明の化合物が生体に吸収され利用されるように製剤化できる。組成物は１つ又はそれ以上の用量単位の形態を取ることができ、そこで、例えば、錠剤は単一用量単位であってよく、エアゾル形態の本発明の化合物の容器は複数の用量単位を保持することができる。
【０２８５】
医薬組成物の調製で用いられる物質は、用いられる量において毒性を示さないものでよい。医薬組成物中の有効成分（複数も）の最適な用量が多くの因子によって決まるということは当業者にとって明白なことであろう。関連のある因子は、これに限定されないが、対象のタイプ（例えば、ヒト）、対象の健康全般、対象が治療を必要としている癌のタイプ、多剤レジメンの１部としての組成物の使用、本発明の化合物の特定の形態、投与方法、及び用いられる組成物を包含する。
【０２８６】
薬学的に許容される担体又は賦形剤は、組成物を、例えば、錠剤又は粉末の形態にするために、微粒子でもよい。組成物を、例えば、経口用シロップ又は注射液又は局所用クリームとするために、担体（複数も）は液体でもよい。また、担体（複数も）は、例えば、吸入投与に有用なエアゾル組成物を提供するために、気体でもよい。
【０２８７】
用語「担体」は、これと共に本発明の化合物を投与する、希釈剤、補助剤又は賦形剤を示す。このような製薬用の担体は、水及び、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成由来のものを包含する、油などの、液体でよい。担体は、生理食塩水、アラビア・ゴム、ゼラチン、澱粉糊、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素等でよい。更に、助剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤及び着色剤を用いることができる。一実施態様では、対象に投与するとき、本発明の化合物及び薬学的に許容される担体は、殺菌されている。本発明の化合物を静脈内に投与するとき、水は好ましい担体である。生理食塩溶液並びに水性ブドウ糖及びグリセロール溶液も、特に注射溶液のための、液体担体として利用できる。適切な製薬用の担体は、澱粉、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等も包含する。本組成物は、所望により、少量の湿潤或いは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有することができる。
【０２８８】
組成物は、経口投与を意図としてよく、そしてそのような場合、組成物は固体又は液体の形態が好ましく、ここで、半固体状、半液体状、懸濁液及びゲル形態は、本明細書で液体又は固体の何れかと考えられている形態内に包含される。
【０２８９】
経口投与のための固形組成物として、組成物を粉末剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル、チューインガム、ウエハース又は同様の形態に製剤化することができる。このような固形組成物は一般に、１つ又はそれ以上の不活性希釈剤を含有している。さらに、以下のものの１つ又はそれ以上が存在していてもよい：エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロース、又はゼラチンなどの結合剤；澱粉、乳糖又はデキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル（Primogel）、コーンスターチ等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロテックス（Sterotex）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；蔗糖又はサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジエッセンスなどの着香料；及び着色剤。
【０２９０】
医薬組成物が、カプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態である場合は、上記種類の物質に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又は脂肪油などの液体の担体を含有できる。
【０２９１】
医薬組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁液であってよい。液体は経口投与に、又は局所投与に、或いは注射による送達に有用である。経口投与を意図としたときは、組成物は1つ又はそれ以上の甘味剤、保存剤、染料／着色料、及び香味料を含有できる。注射によって投与するための組成物では、1つ又はそれ以上の界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤及び等張剤も包含できる。
【０２９２】
本発明の液体組成物は、それらが溶液、懸濁液又はその他の類似形態であろうとなかろうと、1つ又はそれ以上の以下のものも包含できる：注射用蒸留水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、等張食塩水、溶媒又は懸濁媒体として働く合成モノ−又はジ−グリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコール又はその他の溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張力を調節する試薬。非経口組成物は、ガラス、プラスチック又はその他の素材で作られたアンプル、使い捨て注射筒、又は複数回投与用バイアルに封入できる。生理食塩水は好ましい補助剤である。注射用組成物は滅菌されていることが好ましい。
【０２９３】
医薬組成物は、適切な用量が得られるように、本発明の化合物の有効量を含有している。医薬組成物は、それらの個々の疾患に対して現在処方されているような化合物の公知有効量を含有できる。
【０２９４】
一般に有効量は、組成物の重量に対して本発明の化合物が、少なくとも０．０１％である。経口投与を意図する場合は、この量は組成物の０．１重量％と８０重量％の間で変化してよい。好ましい経口組成物は、組成物の４重量％と５０重量％の間の本発明化合物を含有できる。本発明の好ましい組成物は、非経口用量単位が０．０１重量％と２重量％の間の本発明化合物を含有できるように調製される。
【０２９５】
本発明の組成物は適当な何れの経路によっても、例えば、点滴又はボーラス注射によって、上皮層又は皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜等）を介する吸収によって、投与できる。投与は全身的又は局所的であってよい。多様な送達システム、例えば、微小粒子、マイクロカプセル、カプセル等は公知であって、本発明の化合物を投与するために有用である。ある特定の実施態様では、本発明の１つ以上の化合物を対象に投与する。投与方法は、これに限定されないが、経口投与及び非経口投与；これに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下を包含する非経口投与；鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、心室内、髄腔内、膣内、経皮、直腸内；耳、鼻、眼、又は皮膚へ吸入、又は局所的によって、を包含できる。投与の好ましい方法は、医師の裁量に委ねられ、一部は病状の部位（癌、癌性腫瘍又は前癌疾患の部位など）によって決まる。
【０２９６】
一実施態様では、本発明の化合物を非経口投与する。特定の実施態様では本発明の化合物を静脈内投与する。
【０２９７】
特定の実施態様では、１つ又はそれ以上の本発明の化合物を治療を必要とする領域（例えば、腫瘍又は虚血疾患の場所）に局所的に投与することが望ましい。これは、例えば、限定するのではないが、手術中の局所注入；局所塗布、例えば、手術後に創傷包帯と併用して、；注射によって；カテーテルの手段によって；坐薬の手段によって；又は移植の手段によって、実施でき、移植片は、シラスティック（silastic）膜などの膜又は繊維を包含している、多孔質の、無孔の、又はゲル状の材質である。一実施態様では、癌、癌性腫瘍、又は前癌組織の部位（又は以前の部位）に直接注射することによって投与できる。
【０２９８】
肺内投与も、例えば、吸入器又はネブライザー、及びエアロゾル化剤による製剤を用いて、又はフッ化炭素又は合成肺表面活性剤中でのかん流を介して、利用できる。ある特定の実施態様では、本発明の化合物を、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて、坐薬として製剤化できる。
【０２９９】
更に別の実施態様では、本発明の化合物を放出制御システムで送達できる。一実施態様では、ポンプを用いることができる（Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 1987, 14, 201; Buchwald et al., Surgery 1980, 88: 507; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574を参照されたい）。別の実施態様では、ポリマー物質を用いることができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FL, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 1983, 23, 61を参照されたい；Levy et al., Science 1985, 228, 190; During et al., Ann. Neurol., 1989, 25, 351; Howard et al., J. Neurosurg., 1989, 71, 105も参照されたい）。更に別の実施態様では、放出制御システムを本発明化合物の標的、例えば、脳に近接して設置し、それによって全身投与用量のごく一部のみを必要とすることができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, 1984, pp. 115-138を参照されたい）。Langer (Science 1990, 249, 1527-1533) による総説で説明されているその他の放出制御システムを用いることができる。
【０３００】
別の実施態様では、本発明化合物の制御放出又は持続放出を達成するために、ポリマー物質を用いることができる（例えば、米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０２５３号を参照されたい）。持続放出性製剤で用いられるポリマーの例は、これに限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシメタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルを包含する。好ましい実施態様では、持続放出性製剤で用いられるポリマーは、不活性で、滲出性不純物がなく、保存上安定で、無菌で、そして生物分解性である。
【０３０１】
固形、液体又は気体形態であろうとなかろうと、本発明の組成物は、これに限定されないが、追加の予防剤、追加の治療剤、制吐剤、造血コロニー刺激因子、補助治療剤、ワクチン又はその他の免疫刺激剤、抗体／抗体断片からなる薬剤、抗鬱剤及び鎮痛剤を包含するものから選ばれる、追加の活性薬を包含できる。例えば、特定の実施態様では、医薬組成物は、本発明の化合物、追加の抗癌薬、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有している。
【０３０２】
本発明は、本発明の医薬組成物の１つ又はそれ以上の成分を充填した１つ又はそれ以上の容器を含有している医薬パック又はキットも提供する。このような容器（複数も）は、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって規定された形式の通知書を随意に添付することができ、この通知書は、ヒトへの投与についての製造、使用又は販売に対する当局の認可を表示している。更に、このようなキット又は医薬パックはこのようなキット又はパックの使用説明書を随意に添付しているだろう。
【０３０３】
本発明の実施は、他に指示のない限り、当該技術の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及び遺伝子組み換え生物学の従来の技術を使用する。例えば、Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodic updates); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000)を参照されたい。
【０３０４】
他に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有している。本明細書に記述されているものに類似する又はこれと同等な方法及び物質を本発明の実施又は試験に用いることができるが、適切な方法及び物質が以下に記載されている。本願明細書に述べられている全ての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、それぞれに独立した刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献が参照により組み込まれていることが具体的に及び個々に指示されているような範囲まで、参照により本明細書に取り込まれている。矛盾する場合は、定義を包含している、本願明細書が統制するだろう。また、物質、方法、及び実施例は、例示的であるのみで、限定することを意図していない。
【０３０５】
以下の実施例は本発明の多様な態様を説明するためのみに提供されていて、決して発明を限定するように解釈されてはならない。
【実施例】
【０３０６】
実施例１：材料及び方法
ペプチド合成
ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のＢＨ３ドメインに対応する炭化水素架橋ペプチド及びそれらのＦＩＴＣ誘導体を、既述（例えば、Bird et al., Methods Enzymol 446, 369 (2008)及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／１０８２６１号公報を参照されたい。これは参照により本明細書に取り込まれている）のように、合成し、精製して、円偏光二色性によって特徴付けた。全てのペプチドを液体クロマトグラフィー−質量分析によって＞９５％純度に精製してアミノ酸分析で定量した。
【０３０７】
アンチアポトーシスタンパク質の生産
組み換え、非標識ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ、ＢＣＬ−２ΔＣ、ＢＣＬ−ＸＬΔＣ、ＢＣＬ−ｗΔＣ、及びＢＦＬ１／Ａ１ΔＣを、既述（Pitter et al., Methods Enzymol 446, 387 (2008)、参照により取り込まれている）のように、発現させて精製した。すなわち、形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリンを含有しているＬ培地（Luria Broth）中で培養して、０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）でタンパク質の発現を誘発した。細菌性のペレットを緩衝液（２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、完全プロテアーゼ阻害性の錠剤、ｐＨ７．２）に再懸濁して、４５，０００ｘｇで４５分間遠心分離した後、上澄液をグルタチオン−アガロース（Sigma）カラムに付して、ＰＢＳで洗浄した。ＧＳＴ標的タンパク質のビーズ上消化を、ＰＢＳ（３ｍＬ）中のトロンビン（７５単位）の存在下室温での１晩培養により達成して、切断されたタンパク質を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４緩衝液条件を用いる、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）で精製した。
【０３０８】
蛍光偏光結合アッセイ
結合アッセイを既述（Pitter et al., Methods Enzymol 446, 387 (2008)）のように実施した。すなわち、ＦＩＴＣ−ＳＡＨＢ（５０ｎＭ）を、結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中のＦＰＬＣ−精製組み換えタンパク質の連続希釈液に加えた。競合アッセイのために、アセチル化ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの連続希釈液をＦＩＴＣ−ＢＡＫ ＳＡＨＢ（２５ｎＭ）と混合した後、結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に希釈したＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（１００ｎＭ）を加えた。マルチウェルプレートを室温暗所で平衡に達するまで培養して、マイクロプレートリーダー（SpectraMax, Molecular Devices）によって蛍光偏光（ｍＰ単位）を測定した。直接結合実験のために、解離定数（ＫＤ）を、Prismソフトウェア（Graphpad）を用い用量反応曲線の非線形回帰解析によって算出した。競合実験のために、ワンサイト競合モデルを用い用量反応曲線の非線形回帰解析によってＫｉ値を測定した。
【０３０９】
チトクロームｃ放出アッセイ
【０３１０】
マウス肝臓ミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍＬ）を単離して、確立されている方法（Pitter et al., Methods Enzymol 446, 387 (2008)）に従いチトクロームｃ放出アッセイを実施した。すなわち、単離したミトコンドリアを、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの連続希釈液単独の存在下に又はＢＩＤ ＢＨ３ペプチドと組み合わせて、３７℃で４０分間培養した。ペレット及び上澄液画分を遠心分離で単離して、比色ＥＬＩＳＡアッセイ（R & D Systems）を用いてチトクロームｃを定量した。放出可能なミトコンドリアプールからの上澄液へ放出されたチトクロームｃの）パーセント（％ｃｙｔｏｃｓｕｐ）を以下の式に従って算出した：
％ｃｙｔｏｃ＝［（ｃｙｔｏｃｓｕｐ−ｃｙｔｏｃｂａｃｋｇｒ）／（ｃｙｔｏｃｔｏｔａｌ−ｃｙｔｏｃｂａｃｋｇｒ）]×１００
ここで、バックグランド放出（ｃｙｔｏｃｂａｃｋｇｒ）は賦形剤処理（１％ＤＭＳＯ）サンプルの上澄液で検出されたチトクロームｃを示し、総放出（ｃｙｔｏｃｔｏｔａｌ）は１％トリトンＸ１００で処理したサンプル中で測定されたチトクロームｃを示す。
【０３１１】
ＭＣＬ−１の免疫沈降アッセイ
ＯＰＭ２細胞（１×１０７）を、賦形剤又は表示される濃度のＭＣＬ−１ ＳＡＨＢとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Invitrogen）中、３７℃で４時間培養した。細胞を冷却したＰＢＳで１度洗浄して、冷却したＮＰ−４０溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５％のＮＰ４０、完全プロテアーゼ阻害性ペレット）５００μＬを用いて氷上で溶解した。細胞残屑を４℃で１０分間１４，０００ｇでペレット化して、上澄液を採取し、前もって平衡化したタンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズに暴露した。前もって澄明化した上澄液を抗ＭＣＬ−１抗体（Ｓ−１９、Santa Cruz Biotechnology）と４℃で１晩培養した後、タンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズを１時間かけて添加した。次いでビーズをペレットにし、ＮＰ−４０溶解緩衝液で３回４℃で１０分間洗浄して、ＳＤＳ負荷緩衝液中で９０℃に１０分間加熱することによりビーズからタンパク質サンプルを溶出した。免疫沈降物を電気泳動及びＮＴ抗ＢＡＫ抗体（CalBio Chem）を用いるうウェスタン分析に付した。
【０３１２】
細胞生存アッセイ
ＯＰＭ２多発性骨髄腫細胞及びジャーカット白血病Ｔ−細胞を継代培養して、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを補完したＲＰＭＩ １６４０培地（Invitrogen）中に保持した。生存能試験のために、ＯＰＭ２とジャーカット細胞（４×１０４個）を表示される薬剤でＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中、３７℃で、最終容量１００μＬに処理した。２４時間目にＭＴＴアッセイで細胞生存率を測定した、これは、細胞を２０μＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＤＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で４時間培養し、沈殿物を０．１ＮのＨＣｌイソプロパノール（１００μＬ）で可溶化して５７０ｎｍ及び６５０ｎｍで吸収を測定した。ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬとの相乗効果検討のために、プロアポトーシス剤で処理する３０分前に細胞に投与された、パンカスパーゼ阻害剤、ｚ−ＶＡＤ（５０μＭ）の存在下又は非存在下に、細胞をＭＣＬ−１ ＳＡＨＢと死受容体リガンドで同時に処理した。
【０３１３】
カスパーゼ３／７活性化アッセイ
ＯＰＭ２及びジャーカット細胞（２×１０４細胞）を表示される薬剤でＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中、３７℃で、最終容量５０μＬに処理した。４時間目にＡｐｏＯＮＥカスパーゼ３／７キットを用い、製造会社（Promega）の使用説明書に従ってカスパーゼ３／７活性化を測定した。ＴＲＡＩＬ及びＦＡＳＬとの相乗効果検討のために、細胞をＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ及び死受容体リガンドで同時に処理した。
【０３１４】
実施例２：ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢの設計、合成、及び最適化
マルチドメインアンチアポトーシス、アンチドメインプロアポトーシス、及びＢＨ３−オンリー（図７）を包含する、ＢＣＬ−２ファミリーサブグループ全てに渡るＢＣＬ−２相同ＢＨ３ドメインの第一アミノ酸配列に基づいて、ＢＣＬ−２ドメインの安定化α螺旋（Stabilized Alpha-Helices of BCL-2 domains；ＳＡＨＢｓ）のライブラリーを作り出した。既述（Walensky et al Science 2004, Bird et al Methods in Enzymology 2008）のようにして、オレフィン側鎖を含有している非天然アミノ酸を合成し、次いで標的ペプチド配列のｉ（ｉ＋４）位置に挿入した。固相Ｆｍｏｃ化学を用い、次いでGrubbs第１世代触媒を用いるルテニウム触媒化オレフィン複分解によってＳＡＨＢを合成した。ペプチドをアミノ末端でフルオレセインで誘導体化（結合及び画像検討のために）又はアミノ末端をアセチル化し、脱保護し、開裂してＬＣ／ＭＳで精製した。ＬＣ／ＭＳ及びアミノ酸分析をペプチド組成物及び純度の確認のために使用した。
【０３１５】
ＳＡＨＢのＭＣＬ−１に対する結合活性を測定するために、蛍光偏光結合アッセイを実施した（図８）。そのような結合検討に適している安定なＭＣｌ−１タンパク質（すなわち、組み換えＭＣＬ−１の公表されている全長のカルボキシ末端が欠損している形態は、急速に分解して、純粋なＭＣＬ−１タンパク質の均一な溶液を保持することを困難にしている）を作成するために、そのアミノ及びカルボキシ末端が欠損している（「ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ」）が、重要なＢＣＬ−２相同ドメイン及びＢＨ３結合裂隙を生じさせる隣接するタンパク質配列を保持しているＭＣＬ−１の組み換え形態（ｒＭＣＬ−１）を作出した（配列番号７２）。ＭＣＬ−１ΔＮΔＣのＧＳＴ融合タンパク質を作出するためにｐＧＥＸ−４Ｔベクターを用い、そしてグルタチオンセファロースクロマトグラフィー、室温で１晩トロンビンによるアフィニティー標識分解、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって精製を行った。５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ中の、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣの連続希釈液を固定濃度のＦＩＴＣ−誘導体化ＳＡＨＢ（１０〜５０ｎＭ）と、平衡に達するまで培養した。BMG POLARstar Optima又はSpectramax上で蛍光偏光を測定して、Prismソフトウェア４．０（Graphpad）を用いる非線形回帰分析によって解離定数を決定した（図８）。このアッセイはＭＣＬ−１結合剤を同定して、それらを非結合剤と区別した（図９Ａ）。
【０３１６】
高い親和性でＭＣＬ−１と結合した化合物を、組み換えＢＣＬ−ＸＬΔＣ、ＢＣＬ−ＷΔＣ及びＢＦＬ−１／Ａ１ΔＣに対するＳＡＨＢ親和性を測定して、ＭＣＬ−１選択性について分析した。組み換えカルボキシ末端欠損アンチアポトーシスタンパク質をｐＧＥＸ−４Ｔベクターを用いて発現して、ｒＭＣＬ−１について記載されているようにして精製した。精製したタンパク質をＦＩＴＣ−ＳＡＨＢと培養して、前記のように蛍光偏光アッセイによって結合親和性を分析した。ＳＡＨＢの別々のサブセットは、図９Ｂで明らかにされているように、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（例えば、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ、ＮＯＸＡ ＳＡＨＢ）に対して著しい選択性を示すことが確認された。ＢＯＫ ＳＡＨＢは、その他のアンチアポトーシスと比較して、ＭＣＬ−１に対して有意な選択性を示した。部位特異的アミノ酸突然変異誘発を、汎−アンチアポトーシス結合剤、ＢＩＭ ＳＡＨＢを選択的ＭＣＬ−１結合剤に変換するために容易に適用できることも明らかになった（図１５）。これらの結果は、高親和性汎−アンチアポトーシス結合剤（例えば、ＢＡＫ ＳＡＨＢ、ＢＩＭ ＳＡＨＢ）及びそれらのＭＣＬ−１特異的類縁体（例えば、それぞれ、配列番号６９及び配列番号６１〜６２）のような、所望のアンチアポトーシス選択性に基づく改変ＳＡＨＢの設計に対する基礎も確立した。アンチアポトーシス標的化についての改変ＳＡＨＢ化合物の設計及び最適化にコンピューターモデリングも随意に用いることができる。強力で特異的な化合物（例えば、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ）は、ペプチド配列の長さ方向にそって架橋位置をサンプリングして（図１１Ａ）、例えば、ＭＣＬ−１結合活性を最大６倍まで増強するＭＣＬ−１ ＳＡＨＢを作成することによっても（図１１Ｃ）、最適化された。
【０３１７】
実施例２：ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢは増強したα螺旋性、プロテアーゼ耐性、及び細胞浸透性を示した。
α螺旋性
炭化水素架橋したペプチドの二次構造改良を評価するために、先に報告されているように（Walensky et al Science, 2004; Bird et al. Methods in Enzymology, 2008）、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを記録してAviv Biomedicalスペクトロメータ（モデル４１０）上で分析した。一般に、短いペプチドは、配座拘束された構造を維持するためのエントロピー消費がペプチド骨格の水素結合から得られるエントロピーによって克服されないので、溶液中で有意なα螺旋構造を示さない。実際に、改変されていないＢＨ３ペプチドは２０％以下のα螺旋傾向を示すことが見出された（ＭＣＬ−１ ＢＨ３について１８％、図１２）のに対して、化学架橋の導入は一般に、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢが５５〜１００％の範囲の螺旋含有パーセントを示して、ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢのα螺旋性を少なくとも３〜５倍まで増強した。ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢのα螺旋性を、ＣＤによって、それらの非改変同等物と比較した。平均時間０．５秒で０．５ｎｍずつ増加する１９０〜２６０ｎｍからの総数５スキャンを一括平均化して、１ｍｍパス長のセルを用いて各スペクトルを得た。ＣＤ検討のための標的ペプチド濃度は５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）又はMilli-Q脱イオン水中で２５〜５０μＭであって、正確な濃度は２つのＣＤサンプル希釈液の定量アミノ酸分析で確認した。ＣＤスペクトルを最初に波長対ミリ度としてプロットした。正確なペプチド濃度を確認したら、平均残基楕円率［θ］（度・ｃｍ２・ｄｍｏｌ−１・残渣−１の単位で）を次の式から誘導した：θ＝ミリ度／分子濃度／アミノ酸残基の数。平均残基楕円率へ変換した後、次の式を用いてα螺旋パーセントを算出した：螺旋％＝１００×［θ］２２２／ｍａｘ［θ］２２２、ここでは、ｍａｘ［θ］２２２＝−４０，０００×［１−（２．５／アミノ酸残基の数）］である。曲線適合ＣＤＤＮソフトウェアも、α螺旋、平行及び逆平行βシート、β回転及びランダムコイルを包含する二次構造の相対比を算出するために用いた。
【０３１８】
プロテアーゼ耐性
以下のパラメータを用いるＬＣ／ＭＳ(Agilent 1200）でインビトロでのプロテアーゼ分解を測定した：注入量：２０μＬ、流速：０．６ｍＬ、実行時間：１５分（１０分にわたる水（０．１％ギ酸）から２０〜８０％アセトニトリル（０．０７５％ギ酸）までの勾配で構成される）、最初から勾配条件開始までの洗浄：４分、処理後時間：０．５分。ＤＡＤシグナルをバンド幅８ｎｍで２８０ｎｍにセットして、ＭＳＤを一方のチャンネルを（Ｍ＋２Ｈ）／２、±１質量単位に、他方を（Ｍ＋３Ｈ）／３、±１質量単位にして、スキャンモードにセットした。各ＭＳＤシグナルの積分が＞１０８カウントの濃度曲線下面積を生じた。反応サンプルはＤＭＳＯ（１ｍＭストック）及び２ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなる１９５μＬの緩衝液中の５μＬのペプチドからなっていた。０時間時点のサンプルを注入して、５０ｎｇ／μＬのキモトリプシン（Sigma）を２μＬ添加し、時間をかけて連続注入することにより無傷のペプチドの量を定量した。濃度１００μＭのアセチル化トリプトファンカルボキシアミドの内部対照を各ＭＳＤデータポイントを正規化するために用いた。時間に対するＭＳＤ領域のプロットが指数関数的減衰曲線を生じ、Prismソフトウェア（GraphPad）を用いる非線形回帰分析によって半減期を確定した。
【０３１９】
細胞透過性
フローサイトメリーによる検討を、ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢの細胞透過性を確認するために最初のハイスループットスクリーニングとして用いた。ＤＭＳＯで再構築したＦＩＴＣ−ＳＡＨＢを無血清培地で希釈した。ジャーカット細胞（５０，０００個）を無血清培地中で濃度１〜１０μＭのＳＡＨＢと１〜４時間３７℃で２通りに培養した。表示される時間後に、細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄しトリプシンで５分間処理して表面のタンパク質を分解し（これによって表面に結合しているあらゆるＦＩＴＣ−ＳＡＨＢを除去する）、そして最後に１０％ＦＢＳ培地でクエンチした。細胞をＰＢＳで洗浄して、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞の蛍光を、FACSCaliburフローサイトメータ（Becton Dickinson）を用いて測定して、FlowJoソフトウェア（Tree Star）で分析した。１０，０００事象について３通りに蛍光強度を測定して、ＦＩＴＣ−ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢで処理した細胞の強力な蛍光が明らかにされたが、対応するＦＩＴＣ非改変ペプチドには曝露したものには明らかにされなかった。
【０３２０】
ＦＡＣＳによる分析に加えて、ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢの細胞取込み及び細胞内局在性を可視化するためにライブ共焦点顕微鏡を用いた。ライブ共焦点顕微鏡検査のために、ジーカット細胞をＦＩＴＣ−ＳＡＨＢ及び生細胞小器官マーカー（例えば、ピノソームを標識するためのデキストラン、ミトコンドリアを標識するためのミトトラッカー（Mitotracker））と共に培養した。規定時点に（例えば４、８、１２、及び２４時間目）、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、共焦点顕微鏡で湿式標本化して、画像化した。ＦＩＴＣ−ＳＡＨＢ及びＦＩＴＣ−ＮＯＸＡ ＳＡＨＢで処理したジャーカット細胞は、例えば、早い時点にピノソームの著しい蛍光を、引き続きミトコンドリア外膜に取り込まれているアンチアポトーシスＭＣＬ−１のような、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の位置に、ミトトラッカーとの共局在化を示した。細胞透過性及び細胞内標的化は部位特異的突然変異によっても最適化でき；例えば、陰性に荷電している残基の中性又は陽性に感電している残基（例えば、配列番号３９）への変換は、既に報告されている（Bernal et al JACS, 2007）ように細胞取込みを増強できる。
【０３２１】
実施例３：ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ／ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ複合体のＸ線結晶解析は、ＭＣＬ−１結合界面の分子相互作用を詳細に説明した。
ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ／ＭＣＬ−１結合界面の構造を確認するために、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（６．３ｍｇ／ｍＬ）を１：１の比のＭＣＬ−１ ＳＡＨＢと培養して、結晶化状態をImnovadyne Technolpgy1によるScreenmarkerを用いて組み立てた９６ウェルのシッティングドロッププレート（Crystal Quick, Hampton Research）を用いてスクリーニングした。最初のスクリーニング条件は、HT Index Screen（Hamton Research）、JSCG+SUite（Qiagen）及びPro-Complex Suite(Quiagen）を用いた。最もよくヒットするあたりのスクリーニングを実施して結晶成長のための最適な条件を特定した。形成した結晶を取り出し、結晶化緩衝液中で洗浄して、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び質量分析で分析して結晶内にタンパク質及びペプチドの存在を検証した。共複合結晶を抗凍結剤中に浸し、急速冷凍して、液体窒素中で保管した。最初の回折パターンをMIT Department of Biology X-ray sourceで、続いてArgonne National Laboratory synchrotron facilityで測定した。分子置換、それに続くデータ分析及び精製（Phaser、Phenix、及びCootsソフトウェア）によって相を得た。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ／ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ構造を、他のＢＨ３ドメイン（例えば、ＮＯＸＡ、ＢＩＭ）を有するＭＣＬ−１の構造と比較及び対照して、選択的なＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ相互作用の固有の特徴を探し出した。ＭＣＬ−１特異性に影響する固有のＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ接触はＳＡＨＢ選択性を最適化するために利用できそして小分子ＭＣＬ−１モジュレーター（上記参照）を設計するための基礎を形成する。結合界面の特異性を確認するために、ＳＡＨＢ及び／又はＭＣＬ−１タンパク質において点突然変異を生成し、蛍光偏光で測定したように、結合相互作用に対する個々の残基変化の影響を評価した。不活性化ＳＡＨＢ点突然変異は、インビトロの細胞に基づいた検討及びインビボ検討に対する陰性対照として特に有用である（下記を参照されたい）。
【０３２２】
実施例４：ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢは、インビトロにおいて、組み換えＭＣＬ−１からＢＡＫ ＳＡＨＢを置き換えて、ミトコンドリアのアポトーシスを感受性にした。
選択的ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢのミトコンドリアのアポトーシスを感受性にする能力を検証するために３つのインビトロアッセイを用いた。第１に、競合的ＦＰアッセイにおいて、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣからＦＩＴＣ−ＢＡＫ ＳＡＨＢを解離するそれらの能力についてＳＡＨＢを試験した。そこでは、アセチル化した試験ＳＡＨＢの連続希釈液を、ＦＩＴＣ−ＢＡＫ ＳＡＨＢ（例えば、２５ｎＭ）の５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｎＭＮａＣＬの溶液に加えて、次いでそこにＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（例えば、２５０ｎＭ）を加えた。平衡時点にマイクロプレートリーダー（例えば、Spectrramax）でＦＰ（ｍＰ単位）を測定して、Prismソフトウェア(Graphpad)を用いて用量反応性曲線の非線形回帰解析によってＫｉ値を算出した。効果的な用量依存的ＭＣＬ−１ΔＮΔＣに対する競合がＭＣＬ−１ ＳＡＨＢのパネルに示さた（図１６）。ＢＡＫ ＳＡＨＢを首尾よく置き換えた化合物を、天然のＭＣＬ−１／ＢＡＫ複合体を分断する能力についてＭＣＬ−１免疫沈降によってモニタリングするミトコンドリアアッセイに進めた。野生型マウス肝臓ミトコンドリア（ＭＬＭ）を記述（Pitter et al. Methods in Enzymology, 2008）のように単離して、賦形剤、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ、又はＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ突然変異体で処理した後、タンパク質抽出、ＭＣＬ−１免疫沈降、及びＢＡＫウェスタン分析に用いた。共免疫沈降したＢＡＫの不在によって明らかにされたような、天然のＭＣＬ−１／ＢＡＫ相互作用を分断する化合物をミトコンドリのアチトクロームｃ放出アッセイに進めた。これは既刊行の方法（Pitter et al. Methods in Enzymology, 2008）に従って実施した。試験ＳＡＨＢの連続希釈液を、野生型のＭＬＭに単独で、或いはＢＩＤ ＢＨ３のような、ＢＡＫ活性剤の存在下に曝露した。賦形剤又は１％トリトン Ｘ−１００単独に曝露されたミトコンドリアは、それぞれ、陰性及び陽性の対照としての機能を果たした。実験する混合物を室温で４０分間培養し、次いでプレートを４℃で１０分間３００ｒｐｍで遠心分離してミトコンドリアをペッレト化した。上澄液中に放出されたチトクロームｃの相対量を、製造会社プロトコール（Roche（登録商標））によるＥＬＩＳＡアッセイにて定量した。全ての実験条件は、（１）野生型ミトコンドリアからの観察されたチトクロームｃ放出がＢＡＫの活性化に由来していることを保証するためのＢａｋ−１−ミトコンドリアについて、及び（２）分子の感受性活性がＭＣＬ−１標的に由来することを確認するためのＭＣＬ−１−／−ミトコンドリアについても試験した。野生型ＭＬＭを用量反応性にＢＩＤ ＢＨ３誘発ミトコンドリアアポトーシスに対して感受性にするが、Ｂａｋ−／−ＫＬＭを感受性にしない、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの能力が、図１６Ｂのヒストグラムに示されているように、明らかにされた。
【０３２３】
実施例５：ＭＣＬ−１標的ＳＡＨＢはＭＣＬ−１／ＢＡＫをｉｎ ｓｉｔｕで解離して、癌細胞をアポトーシス誘導に対して感受性にした。
ＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢ活性とそのｉｎ ｓｉｔｕでＭＣＬ−１を特異的に組み込む能力とを関連付けるために、Ｕ９３７ＡＭＬ細胞をＦＩＴＣ共役ＳＡＨＢで処理した後、細胞溶解して、（１）報告されたように（Walensky et al. Mol Cell, 2006; Pitter et al. Methods in Enzymology, 2008）実施する、抗ＦＩＴＣプルダウン、又は（２）ストレプトアビジンによるビオチン−ＳＡＨＢプルダウンによって、ＳＡＨＢを検索した。後者の手法では、癌細胞を無血清培地中でＳＡＨＢ（５〜２０μＭ）で処理した後、２〜４時間目に血清交換して、種々の時間（例えば、４、８、２４時間）の培養後に細胞を採取して溶解緩衝液で処理した。次いで溶解物をストレプトアビジンアガロースに曝露して４℃で１時間培養した。ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、ＳＤＳ充填緩衝液中、９０℃に１０分間加熱して、さまざまなアンチアポトーシスタンパク質についてウェスタン分析によって分析した。溶解物を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、Silver Stain Plus（Biorad）、及びタンデム質量分析によっても評価した。ＳＡＨＢに曝露した溶解物中に現れたが、賦形剤又はＳＡＨＢ点突然変異体で処理されたものに現れないバンドを、レーザーで切り取って、細分化した。細分化したバンドを水で１回、２５ｍＭの重炭酸アンモニウムで２回室温で１０分間洗浄した。バンドを２５ｍＭの重炭酸アンモニウムと５分間培養して銀色染色剤を除去した。ゲル切片を透明にしたら、ゲルを水、１％ギ酸、１％ギ酸水溶液：１％ギ酸アセトニトリル溶液（５０：５０）、次いでアセトニトリル中でそれぞれ５分間洗浄した。次いでこのゲル切片をプロテアーゼ消化、抽出、及びタンデム質量分析（ＭＳＭＳ）に付した。
【０３２４】
標的化ＭＣＬ−１タンパク質ｉｎ ｓｉｔｕ相互作用の影響を評価するために、ＯＰＭ２多発性骨髄腫及びＵ９３７ＡＭＬ細胞のような、ＭＣＬ−１過剰発現癌細胞（１０×１０６個）を賦形剤又はＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢ（例えば、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＥ、ＮＯＸＡ ＳＡＨＢＤ）と無血清培地中で３７℃で４時間培養した後、６時間血清交換した。５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＣＨＡＰＳ及び完全プロテアーゼ阻害性ペレット）中で細胞溶解した後、細胞破片を４℃で１０分間１４，０００ｇでペレット化した。上澄液を前もって平衡化したＡ／Ｇセファロースビーズと培養した。前もって澄明化した上澄液を抗ＭＣＬ−１抗体で、回転させて４℃で１．５時間処理した後、タンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズに１時間曝露した。ビーズをペレット化して溶解緩衝液で、４℃で１０分間洗浄した。洗浄したビーズをペレット化し、ＳＤＳ充填緩衝液中、９０℃に１０分間加熱し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析して、公知ＭＣＬ−１相互作用物質、ＢＡＫに対して免疫ブロットした。それぞれの場合に、細胞のＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢ、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＥ及びＮＯＸＡ ＳＡＨＢＤとの培養は、ＭＣＬ−１からＢＡＫの解離をもたらした（図１６Ｃ、１７Ａ）。ＭＣＬ−１／ＢＡＫのＳＡＨＢ誘発解離は、プロアポトーシス刺激によるＵ９３７細胞のアポトーシス誘導への感受性と関連があった（以下を参照されたい）。
【０３２５】
Ｕ９３７（組織球性リンパ腫）、パイファー（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、ＯＣＩ−ＡＭＬ３（急性骨髄性白血病）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）及びＯＰＭ−２（多発性骨髄腫）細胞を包含する、ＭＣＬ−１依存性血液癌細胞株におけるＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢのプロアポトーシス活性を評価するために、細胞によるスクリーニングを用いた。悪性血液疾患の代表例を示す、これらの細胞株はＭＣＬ−１を過剰発現して、ＭＣＬ−１レベルのｓｉＲＮＡ減少によってＡＢＴ−７３７を感受性にすることだけが以前に判っていた（Chen et al., 2007）。すなわち、この細胞は、ＭＣＬ−１選択的ＳＡＨＢ単独又はＢＩＭ ＳＡＨＢ（又は治療量以下のドクソルビシン、エトポシド、デキサメタゾンのような、その他のプロアポトーシス刺激剤）と組み合わせて処理され、次いで記載されているように（Pitter et al., 2008; Walensky et al., 2004）そして図１７Ｂに例示されているようにして細胞生存能を評価した。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＥ及びＮＯＸＡ ＳＡＨＢＤは単独で投与すると毒性効果を有さないのに対して、両方の化合物はＵ９３７ＡＭＬ細胞を、広範に作用するＢＣＬ−２ファミリーモジュレーターである、ＢＩＭ ＳＡＨＢによるアポトーシス誘発に対して感受性にした。次いで、プロアポトーシス刺激と組み合わせて細胞生存能を減少させたＭＣＬ−１選択的ＳＡＨＢを、アネキシンＶ結合及びＦＡＣＳ分析により、そして記載（Gavathiotis et al., 2008）のような、細胞分画化によるミトコンドリアのチトクロームｃ放出によって、細胞アポトーシス対する感受性についてスクリーニングした。
【０３２６】
実施例６：更なるＭＣＬ−１標的化ＳＡＨＢの設計、合成、及び最適化
上記実験の後、ＢＣＬ−１の強力で選択的な阻害剤を同定するために、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のＢＨ３ドメインをモデルとするＢＣＬ２ドメイン安定化α螺旋（ＳＡＨＢ）のライブラリーの更なるメンバーを作出した。ＢＨ３ドメインの天然α螺旋構造を、非相互作用面の（ｉ、ｉ＋４）位置に非天然アミノ酸含有オレフィン鎖を組み込んで補強した後、ルテニウム触媒化オレフィンメタセシスによって架橋ＢＨ３ドメインのパネルを作成した（図７）。蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を実施して、ＢＨ３結合ポケットを含有して、増強した発現、純度、及び安定性をもたらす、欠失構築物である、組み換えヒトＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（アミノ酸１７２〜３２０）に対する、蛍光標識されたＳＡＨＢの結合親和性を測定した。（１）ＢＨ３オンリータンパク質、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＩＤ、及びＢＩＭ、（２）マルチドメインプロアポトーシスＢＯＫ、ＢＡＸ及びＢＡＫ、及び（３）アンチアポトーシスＭＣＬ−１それ自体のＢＨ３ドメインに対応するＳＡＨＢは、ＭＣＬ−１に対して高い親和結合（Ｋｄ＜５０ｎＭ）を示した（図１４Ｂ）。ＭＣＬ−１選択的ＳＡＨＢを同定するために、最初に、ＰＵＭＡ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＯＫ、ＢＡＸ、及びＢＡＫ ＳＡＨＢを除去した、組み換えＢＣＬ−ＸＬΔＣ結合について、次いでＮＯＸＡ ＳＡＨＢを除去した組み換えＢＦＬ１／Ａ１ΔＣについてスクリーニングした。実際に、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ、ＢＣＬ−２ΔＣ、ＢＣＬ−ＸＬΔＣ、ＢＣＬ−ｗΔＣ及びＢＦＬ−１／Ａ１ΔＣを包含する、アンチアポトーシスタンパク質の拡張パネルを用いるＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの結合分析は、ＭＣＬ−１ＳＡＨＢがＭＣＬ−１単独に対して強力で選択的な結合親和性（ＫＤ、４３ｎＭ）を示すことを裏付けた（図９Ａ）。
【０３２７】
実施例７−ＭＣＬ−１特異的ペプチドの特性化
ＭＣＬ−１ ＢＨ３螺旋とＭＣＬ−１ΔＮΔＣの間の相互作用に対する結合及び親和性決定因子を明確にするために、アラニンスキャニング、部位特異的突然変異誘発、及び架橋スキャニングを実施した。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ内のアミノ酸残基を順にアラニンで置換して、対応する蛍光標識したＳＡＨＢをＦＰＡによってＭＣＬ−１ΔＮΔＣ結合について試験した。アラニンスキャンをアラニンのグルタミン酸突然変異誘発及びグリシン残基で補完した。Ｎ末端及びＣ末端の突然変異誘発はＭＣＬ−１ΔＮΔＣ結合親和性に対して皆無かほとんど影響を有さなかったのに対して、Ｌｅｕ２１３、Ａｒｇ２１４、Ｖａｌ２１６、Ｇｌｙ２１７、Ａｓｐ２１８及びＶａｌ２２０のアラニン突然変異生成はＭＣＬ−１ΔＮΔＣに対するＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの結合親和性を１０〜１００倍まで減少して、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ組み込みに対する主要なＭＣＬ−１ ＢＨ３残基を明らかにした（図１０）。ＢＨ３ドメイン配列の比較分析は、コア疎水性残基、Ｌｅｕ２１３、Ｖａｌ２１６、Ｖａｌ２２０の組み合わせがＭＣＬ−１ ＢＨ３に特有であって（図１０）、これら疎水性残基ののうちの何れかのアラニン突然変異誘発がＭＣＬ−１ΔＮΔ結合に著しく弊害をもたらすことを示した。興味深いことに、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ及びＢＣＬ-Ｗに対して拘束された結合プロファイルを示すＢＡＤ ＢＨ３、及びアンチアポトーシスタンパク質と広く結合するＢＩＭ ＢＨ３がＭＣＬ−１ ＢＨ３におけるＶＡＬ２２０に対応する位置にフェニルアラニンを有している（図１４Ａ）。ＢＩＭ ＢＨ３配列の突然変異スキャニングは既に、このフェニルアラニンのアラニン、グルタミン酸、又はリジンによる置換がＢＣＬ−ＸＬ結合を無効にするが、ＭＣＬ−１結合に対する影響を最小にすることが実証されている。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢにおける単一のＶ２２０Ｆ点突然変異が、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（ＫＤ、１９１ｎＭ）及びＢＣＬ−ＸＬΔＣ（ＫＤ、８９ｎＭ）の両方に結合活性を示して、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣに対する選択性を無効にすることを見出した（図１４Ｂ）。保存アミノ酸Ｌｅｕ２１３、Ａｒｇ２１４、Ｇｌｙ２１７、及びＡｓｐ２１８のような選択結合決定因子は多くのＢＨ３ドメイン間で共有されているのに対して、ＭＣＬ−１ ＢＨ３におけるＶａｌ２２０のような、アポトーシスに関するその他の不連続な残基が選択性を決定できる。
【０３２８】
（１）ＭＣＬ−１ＢＨ３螺旋に沿ったどの面がＭＣＬ−１ΔＮΔＣ組み込みに対して必須であるかを検討するために、そして（２）生物学的研究のために最適なα螺旋性及び結合活性を有する構築物を同定するための代替となる架橋位置をサンプリングするために、ＢＨ３配列内のアミノ酸残基対を架橋したノルロイシン様側鎖で効果的に置換する「架橋スキャン」を次に実施した。アラニンスキャンに従う、残基Ｅ２１１、Ｒ２１５、Ｇ２１９、Ｑ２２１、Ｎ２２３、及びＡ２２７の突然変異誘発、及びこれらの部位のｉ、ｉ＋４組み合わせにおける架橋の挿入は、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ相互作用を分断しなかった（図１１Ｃ）。しかしながら、Ｇ２１７〜Ｑ２１１位置における架橋の置換は、炭化水素架橋によるＭＣＬ−１ ＳＡＨＢとＭＣＬ−１ΔＮΔＣの間の臨界的な疎水性界面の分裂と一致して、結合活性を無効にした。作成したＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの中で、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは、２番目に高いα螺旋含量（９１％）及びもっとも高い結合活性（ＫＤ、１０ｎＭ）を示し、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ選択性を保持しつつ親のＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＡと比べて４倍増強したＭＣＬ−１ΔＮΔＣ親和性を達成した（図１１Ｂ、１３）。
【０３２９】
実施例８−結晶構造を考慮した突然変異生成データの分析
ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは、螺旋α２（ＢＨ３）及びα３、α４、α５（ＢＨ１）及びα８（ＢＨ２）の部分からなっている標準的なＢＨ３結合溝でＭＣＬ−１ΔＮΔＣを組み込むα螺旋であることを、三次元構造の分析が明らかにした。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの疎水性残基Ｌｅｕ２１３、Ｖａｌ２１６、Ｇｌｙ２１７、及びＶａｌ２２０は、これらのアミノ酸のアラニン突然変異生成の負の派生効果と一致して、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣの表面にある疎水性の溝と直接接触する（図１５Ａ）。疎水性の相互作用は、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤのＡｒｇ２１４及びＡｓｐ２１８のＭＣＬ−１ΔＮΔＣのＡｓｐ２５６及びＡｒｇ２６３、それぞれとの相補的な静電対合によって補強される。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤのこれらの荷電残基は、Ａｒｇ２１４に対するＭＣＬ−１ΔＮΔＣ  Ａｓｐ２５６、Ｖａｌ２５３、Ａｒｇ２６３及びＨｉｓ２５２、並びにＡｓｐ２１８に対するＭＣＬ−１ΔＮΔＣ  Ａｒｇ２６３及びＡｓｎ２６０からなる水素結合ネットワーク中に存在する。
【０３３０】
ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢ Ａ〜Ｅの特異的結合活性は、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤ／ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ複合体の構造と一致している。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＣは、乏しい結合活性を示して、その構造に基づいて、結合表面と立体的にぶつかり合う唯一の架橋位置（Ｇ２１７、Ｑ２２１）を有する、唯一の構築物である。興味深いことに、そのアルケン官能性がシス配座である、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの炭化水素架橋は、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ結合部位の周辺と不連続な疎水性接触を行う。α，α−ジメチル官能性のメチル基は、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣのＧｌｙ２６２、Ｐｈｅ３１８、及びＰｈｅ３１９からなる溝を占拠して、更なる接触も脂肪族側鎖を明らかにしている。従って、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの優れた結合親和性は、その増強されたα螺旋性（図１５Ｃ、１８）及び架橋自体による更なる疎水性接触の補充の両方から由来しているのだろう。実際に、これらの構造データは、それらの天然の生物学的特異性を保持しながら、ＳＡＨＢリガンドの効能を最適化するために架橋機能性を利用する能力を強調している。
【０３３１】
実施例９−インビトロにおけるミトコンドリアの感受性の分析
次に、インビトロ及び細胞において、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤが有効にＭＣＬ−１を標的にしてミトコンドリアアポトーシスを感受性にするか否かを確認するために、上記ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＥを試験するための方法などの方法を用いて、一連の機能検討を行った。最初に、ｉｎ ｓｉｔｕ機能に必要な置換活性をシミュレートして、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣからＢＡＫ ＢＨ３螺旋を解離するＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの能力を測定するために競合ＦＰＡを実施した。直接結合データ（図１３）と一致して、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは、ＦＩＴＣ−ＢＡＫ ＳＡＨＢとＭＣＬ−１ΔＮΔＣの間の相互作用を遮断するのに最も有効であった（図１６Ａ）。ＦＩＴＣ−ＢＡＫ  ＳＡＨＢ／ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ複合体を分離するＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの能力が、ＢＡＫ−誘発チトクロームｃ放出のＳＡＨＢ介在感受性に変換されるか否かを確認するために、記載のようにして、ミトコンドリアアッセイを実施した。
【０３３２】
ＢＡＫを含有している野生型マウス肝臓ミトコンドリアを、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの連続希釈液の存在下及び非存在下に、ＢＡＫの直接活性剤である、ＢＩＤ ＢＨ３に曝露した。ＢＩＤ  ＢＨ３の非存在下ではＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤはミトコンドリアに影響を及ぼさないのに対して、ＢＩＤ  ＢＨ３に曝露したミトコンドリアへＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤ又はＳＡＨＢＥの添加は、ＢＡＫ介在チトクロームｃ放出の用量反応性増強を引き起こした（図１６Ｂ、データは示していない）。チトクロームｃ放出がＢＡＫ活性化から特異的にもたらされることを確認するために、ＢＡＫ−／−ミトコンドリアを用いて同一の実験を実施して、放出は観察されなかった（図１６Ｂ）。これらの知見を細胞状況まで拡大適用するために、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの天然のＭＣＬ−１／ＢＡＫ複合体を解離する能力を試験した。ＯＰＭ２多発性骨髄腫細胞を賦形剤又は濃度を増大させているＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤで処理した後、細胞を抽出して抗ＭＣＬ−１免疫沈降を行った。ＢＡＫのウェスタン分析は、賦形剤で処理した細胞からの共免疫沈降を明らかにしたが、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤによるＭＣＬ−１／ＢＡＫ相互作用の用量反応性解離が明らかにされた（図１６Ｃ）。総合すると、これらのメカニズム的なデータは、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤがインビトロ及び細胞中で阻害性ＭＣＬ−１／ＢＡＫ相互作用を遮断して、ＢＡＫが介在するミトコンドリアのチトクロームｃ放出を感受性にすることを明らかにした。
【０３３３】
実施例１０−ＭＣＬ−１特異的ＳＡＨＢペプチドはカスパーゼ依存細胞アポトーシスを感受性にする。
重要なことは、ＭＣＬ−１からプロアポトーシスタンパク質の選択的遊離は、別のアンチアポトーシスが存在してこれらと結合して中和するならば、細胞アポトーシスを活性化できないということである。機能的観点から、選択的ＭＣＬ−１阻害剤は、それに代わってｓｉＲＮＡによるＭＣＬ−１ノックダウンのプロアポトーシス活性を表現型複写することが期待できる。例えば、ＭＣＬ−１活性の調節とは対照的に（これはＳＡＨＢによっても達成できるがｓｉＲＮＡによっては達成できない）、ＭＣＬ−１を削除するときに望ましい。従って、細胞におけるＭＣＬ−１の選択的な薬理学的遮断の機能的結果を検討するために、ｓｉＲＮＡ介在ＭＣＬ−１ノックダウンによって立証されたように、ＭＣｌ−１によって特異的に中和される、死の受容体アゴニストに対して癌細胞を感受性にするＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの能力を試験した。ジャーカットＴ細胞白血病及びＯＰＭ２細胞を最初にＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの連続希釈液並びに単剤として外因経路活性剤であるＴＲＡＩＬ及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）に曝露して、２４時間目のＭＴＴアッセイによって基準生存率の測定を行った（図１８Ａ、１８Ｂ）。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは、４０μＭ用量においてさえ細胞生存率に影響を及ぼさなかった。ジャーカット細胞はＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬの両方に応答して用量反応性の細胞毒性を示したのに対して、ＯＰＭ２細胞はＴＲＡＩＬに感受性を示したが、ＦａｓＬには示さなかった（図１９Ａ）。直接的で選択的なＭＣＬ−１遮断が細胞をＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬ誘発アポトーシスに対して感受性にするか否かを確認するために、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤの連続希釈液を低用量の死受容体リガンドと組み合わせた。ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは用量反応的にジャーカット細胞をＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬの両方に対して感受性にして、ＯＰＭ２細胞を選択的にＴＲＡＩＬに対して感受性にした（図１９）。ＦａｓＬ処理に対するＯＰＭ２細胞の観察された耐性に一致して、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤはＦａｓＬに曝露されたＯＰＭ２細胞に影響を及ぼさなかった（図１９Ａ）。
【０３３４】
ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤが誘発した感受性がカスパーゼ依存性であったことを確認するために、汎−カスパーゼ阻害剤である、ｚ−ＶＡＤの存在下でも細胞の生存能試験を実施した、これは細胞の生存能に対する負の効果を完全に無効にする（図１９Ａ）。試験データと一致して、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤは、ジャーカット細胞では低用量のＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬと組み合わせを用いた場合に、ＯＰＭ２細胞ではＴＲＩＬを用いるがＦａｓＬは用いない場合に、用量反応性のカスパーゼ３／７活性化を誘発した（図１９Ｂ）。重要なことは、アンチアポトーシスタンパク質に対して結合活性を示さなかった、ＢＥＬ−１ ＳＡＨＢＡが、ジャーカット細胞をＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬに対して感受性にしなかったことである（図２０）。更に、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤと異なる配列を有するがＭＣＬ−１ΔＮΔＣとも排他的に結合する架橋ＮＯＸＡ ＢＨ３螺旋である、ＮＯＸＡ ＳＡＨＢＢはこの感受性検討においてＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤと同じような応答をした（図２１Ｂ）。これらの細胞データは、ＭＣＬ−１ ＳＡＨＢＤが、ＭＣＬ−１によって抑制されるアポトーシス刺激に対して癌細胞を感受性にする、選択的な細胞透過性のＭＣＬ−１アンタゴニストであることを明らかにしている。従って、ＭＣＬ−１選択的ＳＡＨＢは、ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬ（図１７〜２１）のような多様なプロアポトーシス刺激剤、又は非ＭＣＬ−１選択活性を示すＳＡＨＢのようなＢＣＬ−２ファミリー標的薬剤（図２３、例えばＢＡＤとＭＣＬ−１ ＳＡＨＢの組み合わせ）と組み合わせて用いると、又はより広範なアポトーシスタンパク質標的化（図１７；例えばＮＯＸＡとＢＩＭ ＳＡＨＢの組み合わせ）とする場合に、効果的であることを明らかにしている。
【０３３５】
実施例１１：切断型ＭＣＬ−１ＳＡＨＢＡのＭＣＬ−１ΔＮΔＣへの結合の分析
切断型ＭＣＬ−１ＳＡＨＢＧ（ＬＲＸＶＧＤＸＶ、配列番号３１）を作成して、上記のように、蛍光偏光アッセイを用いてＭＣＬ−１ΔＮΔＣへの結合について試験した。９個のアミノ酸を架橋して安定化したペプチドがＭＣＬ−１ ＳＡＨＢと結合することが判った（図２２）。このことは、コアコンセンサス配列がＭＣＬ−１への結合を促進するのに十分であるということを明らかにしている。
【０３３６】
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【０３３７】
別の実施態様
前の記載から、多様な使用及び条件に適用するために本明細書に記載されている発明に変更及び修正を行うことができるということは明らかである。このような実施態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０３３８】
本明細書にある可変基の何れかの定義における要素のリストの列挙は、単一の要素又は列挙されている要素の結合（又は副結合）の何れかとして変動する定義を包含する。本明細書の実施態様の列挙は単一の実施態様又は別の実施態様或いはその部分との組み合わせの何れかとしての実施態様を包含する。
【図１】
0005731986.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0005731986.tif 000023
【図１６】
0005731986.tif 000024
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
0005731986.tif 000030
【図２３−１】
0005731986.tif 000031
【図２３−２】
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【配列表】
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