(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）それぞれ長さが１５〜４０核酸塩基である順方向および逆方向プライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対により試料由来の核酸を増幅するステップであって、順方向プライマーが、該核酸の第１の保存配列領域内でハイブリダイズするように構成され、逆方向プライマーが、該核酸の第２の保存配列領域内でハイブリダイズするように構成され、第１および第２の保存配列領域が、ＳＴＲ遺伝子座を含む可変核酸領域に隣接し、該増幅ステップが、長さが４５〜２００ヌクレオチドである少なくとも１つの増幅産物を生成する、ステップ、
（ｂ）質量分析によって、前記少なくとも１つの増幅産物の少なくとも１つの鎖の分子量を決定するステップ、
（ｃ）前記決定された分子量を使用して、前記少なくとも１つの増幅産物の前記少なくとも１つの鎖の塩基組成を計算するステップであって、前記塩基組成により、配列決定することなく、Ａ残基、Ｃ残基、Ｔ残基及びＧ残基の数が同定される、ステップ、および、
（ｄ）前記計算された塩基組成を、前記オリゴヌクレオチドプライマー対、および前記ＳＴＲ遺伝子座に対応する参照対立遺伝子に対してインデックスされた、ＳＴＲを同定する増幅産物の複数の塩基組成を含む塩基組成データベースと比較するステップであって、前記塩基組成により、配列決定することなく、Ａ残基、Ｃ残基、Ｔ残基及びＧ残基の数が同定され、前記計算された塩基組成と塩基組成データベースに含まれる塩基組成との間の一致により、試料におけるＳＴＲ対立遺伝子が同定される、ステップ
を含む、ＳＴＲタイピングのための方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）で一致が同定されない場合に
（ｅ）前記決定された分子量を使用して、前記少なくとも１つの増幅産物の前記少なくとも１つの鎖の塩基組成を計算するステップであって、前記計算された塩基組成により、前記ＳＴＲ遺伝子座のこれまで未知であった対立遺伝子が同定される、ステップ、および、
（ｆ）前記計算された塩基組成を、データベースにおいて、前記オリゴヌクレオチドプライマー対、前記これまで未知であった対立遺伝子、前記決定された分子量、および前記試料に対してインデックスするステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可変核酸領域が核酸配列において異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
可変核酸領域が、同じ数の反復単位を含む前記ＳＴＲ遺伝子座の２つ以上の対立遺伝子間の核酸配列において異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
可変核酸領域が、前記ＳＴＲ遺伝子座の２つ以上の同じ長さの対立遺伝子間の核酸配列において異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｇ）前記試料が前記ＳＴＲ遺伝子座においてヘテロ接合性であることを決定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、前記ＳＴＲ遺伝子座に関してホモ接合性であると既に特徴付けられている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記同定されたＳＴＲ対立遺伝子が、少なくとも１つのＳＮＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＳＴＲ遺伝子座がＤ５Ｓ８１８であり、前記少なくとも１つのＳＮＰが、前記データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＧからＴまたはＡからＣへの変化を含み、
ＳＴＲ遺伝子座がＤ８Ｓ１１７９であり、前記少なくとも１つのＳＮＰが、前記データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＧからＡまたはＴからＣへの変化を含み、
ＳＴＲ遺伝子座がｖＷＡであり、前記少なくとも１つのＳＮＰが、前記データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＧからＴ、ＡからＧ、ＣからＴ、またはＡからＣへの変化を含み、
ＳＴＲ遺伝子座がＤ１３Ｓ３１７であり、前記少なくとも１つのＳＮＰが、前記データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＡからＴへの変化を含み、かつ／または、
ＳＴＲ遺伝子座がＤ７Ｓ８２０であり、前記少なくとも１つのＳＮＰが、前記データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＴからＡへの変化を含む、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＴＲ遺伝子座がＴＨ０１であり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：６１、９：６１、８：６２、９：６３、９：６４、９：６５、９：６６、および１０：６７から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＴＰＯＸであり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：５６、５：５７、５：５８、５：５９、６：５６、６：５７、６：５８、６：５９、および７：６０から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＤ８Ｓ１１７９であり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８：８５、２９：８６、３０：８７、および３１：８８から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＤ５Ｓ８１８であり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６：９４、３７：９５、３８：９６、３９：９７、および４０：９８から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＣＳＦ１ＰＯであり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３：１０２、４４：１０３、４５：１０３、４６：１０４、４６：１０３、および４７：１０４から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＤ７Ｓ８２０であり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２：８９、３２：９０、３３：９１、３４：９０、３４：９２、および３５：９３から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＤ１３Ｓ３１７であり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：７９、２３：８０、２４：８１、２５：８２、２６：８３、および２７：８４から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＤ１６Ｓ５３９であり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：７４、１８：７５、１９：７６、２０：７７、および２１：７８から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がｖＷＡであり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：５２、２：５３、３：５４、および４：５５から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＦＧＡであり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：６８、１１１：１１９、１１２：１２０、および１２：６９から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＤ２１Ｓ１１であり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：７０、１０９：１１７、１１０：１１８、および１４：７１から成る群より選択されるプライマー対を含み、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＤ１８Ｓ５１であり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５：７２、１５：７３、１１３：１２１、１１４：１２２、１６：７２、および１６：７３から成る群より選択されるプライマー対を含み、かつ／または、
前記ＳＴＲ遺伝子座がＤ３Ｓであり、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１：９９、４２：１００、１１５：１２３、１１６：１２４、および４２：１０１から成る群より選択されるプライマー対を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＶＷＡ、ＴＰＯＸ、ＴＨ０１、ＦＧＡ、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ３Ｓ、およびＣＳＦ１ＰＯから成る群より選択されるＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存領域にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して、前記ステップを反復することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップを反復することが多重反応において行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対により前記増幅ステップを反復することをさらに含む方法であって、該少なくとも１つの追加のプライマーのうち少なくとも１つが、ＡＭＥＬ遺伝子座の保存領域にハイブリダイズするように構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
増幅ステップを反復することが多重反応において行われる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の声明
本出願は、それぞれ参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２００７年２月２３日出願の米国仮特許出願第６０／８９１，４７９号、および２００７年６月１日出願の米国仮特許出願第６０／９４１，６４１号に対する優先権を主張する、特許協力条約の下における国際出願である。
【０００２】
政府支援の声明
本発明は、ＮＩＪ助成金２００６−ＤＮ−ＢＸ−Ｋ０１１の下において、米国政府支援により行われた。米国政府は、本発明において特定の権限を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、電子形式での配列表とともに出願されている。配列表は、２００８年２月２２日に作成された、サイズ２４ＫｂのＤＩＢＩＳ００９１ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔという表題のファイルとして提供される。電子形式での配列表の情報は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
技術分野
本発明は、遺伝地図作成、ならびに法医学的試験および実父確定検査を含む、遺伝的同一性試験の分野に関連する。本発明は、特に、ＤＮＡのタンデム反復領域を使用するＤＮＡ分析における増幅および質量分析の使用に関連する。本発明は、質量分析を使用する迅速で正確な法医学的分析により、ＤＮＡの情報領域を特徴付けることを可能とする。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
ＤＮＡ分析による人物特定の工程は、法医学検査の共通の目的である。本明細書において使用されるように、「法医学的」は、例えば、後に裁判所で使用される犯罪または事故現場において発見した証拠の研究である。「法医科学」は、例えば、刑事事件および裁判における裁判所で使用するための公平な科学的証拠を提供する、特に、刑事または民事司法制度における法体制に対する対象の問題を解決するために使用される任意の科学である。法医科学は、主に化学および生物学を含む総合的分野であるが、例えば、物理学、地質学、心理学および社会学も利用する分野でもある。ヒト科学捜査である法医学的ＤＮＡタイピングの一態様の目的は、法医学的試料、例えば、犯罪現場からの証拠または個体からのＤＮＡ試料から得たＤＮＡの同一性または遺伝子型を判断することである。そのようなＤＮＡ鑑定の典型的なソースとしては、髪、骨、歯、ならびに唾液、精液および血液等の体液を含む。しばしば、多数の人、人骨および／または生体試料の迅速同定の必要性が存在する。そのような人骨または試料は、例えば、戦争に関連する犠牲者、航空機の墜落、およびテロ行為に関連する場合がある。
【０００６】
ヒトゲノムによく見られ、個体間で高度なばらつきを示す、タンデムＤＮＡ反復領域は、ヒト科学捜査および個体識別鑑定、遺伝地図作成、および連鎖分析連鎖解析を含む、いくつかの分野において使用される。様々な種類のＤＮＡ反復領域は、真核生物のゲノム内に存在し、それらのコア反復領域の長さに基づいて分類することができる。単純配列反復（ＳＳＲ）、またはマイクロサテライトとも称される短鎖タンデム反復（ＳＴＲ）は、長さ２〜６個のヌクレオチドのコア単位を有する反復領域である。特定のＳＴＲ遺伝子座に関して、集団の個体は、これらのコア反復単位の数が異なる。
【０００７】
ＳＴＲタイピングは、反復数が異なる、ヒト個体群における対立遺伝子の集合を提示する複数のＳＴＲ  ＤＮＡ遺伝子座の増幅を伴う。一般に、そのような増幅反応の産物は、蛍光検出法を使用するポリアクリルアミドゲルまたはキャピラリー電気泳動、およびその後に行われる、増幅産物の長さに基づく異なる対立遺伝子間での識別によって分析される。典型的なＳＴＲタイピング分析は、遺伝的に連結していない複数のＳＴＲ遺伝子座を使用するため、集団対立遺伝子頻度が各遺伝子座に対して特徴付けられている任意のＳＴＲプロファイルと無作為に一致する可能性を予測するために、積法則を適用することができ（Ｈｏｌｔ  ＣＬ，ｅｔ．ａｌ．（２０００）Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．Ｉｎｔ．１１２（２−３）：９１−１０９（非特許文献１）；Ｈｏｌｌａｎｄ  ＭＭ，ｅｔ．ａｌ．（２００３）Ｃｒｏａｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．４４（３）：２６４−７２（非特許文献２））、ヒト個体において無作為に一致する可能性が低くても極めて高い識別能力がもたらされる。ＳＴＲ反復の短さ、および集団における個体のいくつかの反復における高度なばらつきのため、ＳＴＲタイピングは、十分な核ＤＮＡを利用できるヒト科学捜査における基準となっている。
【０００８】
いくつかのテトラヌクレオチドＳＴＲおよびＳＴＲタイピングの方法は、ヒト科学捜査における適用に対して探求されている。共通集合の遺伝子座を含む、異なるＳＴＲ遺伝子座を標的とする市販のＳＴＲタイピングキットが入手可能である。ＦＢＩ研究所は、統合ＤＮＡインデックスシステム（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＤＮＡ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＣＯＤＩＳ）として周知の国家法医学的ＤＮＡデータベースに含まれる、１３の全国的に承認されたコアＳＴＲ遺伝子座を確立している。１３のＣＯＤＩＳコア遺伝子座は、ＣＳＦ１ＰＯ、ＦＧＡ、ＴＨ０１、ＴＰＯＸ、ＶＷＡ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、およびＤ２１Ｓ１１である。これらの遺伝子座の配列情報は、ＳＴＲＢａｓｅから利用可能である。これらのＣＯＤＩＳ１３遺伝子座に対する報告された対立遺伝子の反復単位数の範囲は、それぞれ、６〜１６、１５〜５１．２、３〜１４、６〜１３、１０〜２４、９〜２０、７〜１６、６〜１５、８〜１９、５〜１５、５〜１５、７〜２７、および２４〜３８である（Ｂｕｔｌｅｒ，ＪＭ，２００１  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ＤＮＡ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（非特許文献３））。１３のすべてのこれらのコアＳＴＲ遺伝子座の対立遺伝子情報とともに、プロファイルが利用可能な場合、無作為に一致する可能性の平均は、無関係の個体間において、１兆分の１より低い。ＤＮＡ塩基配列決定法によるＳＴＲタイピングは、時間的制約があり、労働集約的であるため、あまり望ましくない。
【０００９】
１３の区別できるＣＯＤＩＳ対立遺伝子から得られる統合された情報が、１０億分の１の統計的有意性に対する個体のＤＮＡシグニチャを一意的に同定するための十分な情報を提供するため、ＳＴＲマーカーを使用するＳＴＲタイピングは、ヒト法医学的な「究極の判断基準」となっている。通常、増幅および電気泳動的大きさの判断を使用して個々の対立遺伝子を解析する、標準的または従来のＳＴＲタイピング方法には、一定の制限が存在する。低いＳＴＲコピー数では、対立遺伝子の１つが検出されないためにヘテロ接合性個体がホモ接合体とタイプされている、対立遺伝子「脱落」を見ることは稀ではない。さらに、高度に分解されたか、または低コピーＤＮＡ試料の場合、マーカーの全体は、ＤＮＡプロファイルを抽出する少数のＳＴＲを残して脱落する場合がある。特定の場合においては、例えば、大規模な災害の犠牲者同定など、様々なＤＮＡの量と質の多数の試料が存在し得、その多くは、部分的ＳＴＲプロファイルのみを生成する。場合によっては、部分的プロファイルを使用して、可能性がある被疑者または同一性を含むか、または除外することができるが、従来のＳＴＲタイピング方法は、部分的プロファイルの場合、時折、利用可能な遺伝子座で十分な分解能を提供しない。そのため、法医学的共同体内において、一連の不完全なＳＴＲマーカーを作成する分解したＤＮＡ試料、および一連の完全なＳＴＲの検出が不可能な別の試料から付加的情報を得ることができるように、ＳＴＲタイピング方法の分解能を増加させる必要性が存在する。
【００１０】
迅速性、および高性能タイピングの手順を自動化する能力等の増幅に基づく技術の利点を維持しながら、対立遺伝子の塩基配列多型を決定することにより、いくつかの共通ＳＴＲ遺伝子座に対して観察された対立遺伝子変異を増加させることができる技術が有用である。そのため、標準技術と比較して高度な分解能を提供するＳＴＲタイピング方法の必要性が存在する。また、大規模な災害または戦争等の場合、同時または短期間で生成される多数の試料の分析を可能にするために、高性能試料処理を行うことができる自動化された基盤を開発する必要性が存在する。
【００１１】
質量分析は、高い質量精度を含む、分析される分子に関する詳細な情報を提供する。それは、簡単に自動化することができる工程でもある。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、自動試料処理を行うことができる基盤を提供し、ＳＴＲ対立遺伝子間の配列多型を解析することができる（Ｅｃｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．（２００６）ＪＡＬＡ．１１：３４１−５１（非特許文献４））。
【００１２】
マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ）は、ＳＴＲ、ＳＮＰ、およびＹ染色体マーカーを分析するために使用されてきた（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｔｏ  ＮＩＪ  ２００１，ＮＣＪ  １８８２９２，Ｏｃｔｏｂｅｒ；Ｍｏｎｆｏｒｔｅ，Ｊ．Ａ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７，３，３６０−３６２（非特許文献５）；Ｔａｒａｎｅｎｋｏ，Ｎ．Ｉ．；Ｇｏｌｏｖｌｅｖ，Ｖ．Ｖ．；Ａｌｌｍａｎ，Ｓ．Ｌ．；Ｔａｒａｎｅｎｋｏ，Ｎ．Ｖ．；Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｈ．；Ｈｏｎｇ，Ｊ．；Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｙ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １９９８，１２，４１３−４１８（非特許文献６）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ｓｈａｌｅｒ，Ｔ．Ａ．；Ｍｏｎｆｏｒｔｅ，Ｊ．Ａ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｌｅｇａｌ  Ｍｅｄ  １９９９，１１２，４５−４９（非特許文献７）；Ｒｏｓｓ，Ｐ．Ｌ．；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｐ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７，６９，３９６６−３９７２（非特許文献８））。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳを使用して、日常的に必要な質量精度および分解能を得るためには、アンプリコン（amplicon）の大きさは１００塩基対未満でなければならず、しばしば、酵素消化およびネスト化線形増幅等の戦略を必要とする。ＭＡＬＤＩ方法では、ＰＣＲアンプリコンは、質量分光分析の前に徹底的に脱塩し、適切なマトリクスで共結晶化しなければならない。挙げた報告におけるＳＴＲおよびＳＮＰ分析に使用された縮小スキームおよび浄化スキームは、ＰＣＲアンプリコンの１つの鎖のみを質量分光分析する結果となった。アンプリコンの１つの鎖のみの質量を測定することにより、明確な塩基組成を決定することは困難であり得、対立遺伝子の長さのみが得られる。縮小スキームを使用しても、１２〜６０ダルトン（Ｄａ）の質量測定誤差が、１５０００〜２５０００Ｄａのサイズ範囲にある産物に対して見られる。これは、８００〜２４００ｐｐｍの質量測定誤差に相当する。一報告において３個のＳＴＲ遺伝子座の多重化が成功しているが、ＭＡＬＤＩに特有である低い質量精度および質量分解能のため、ＳＴＲの多重化は困難であり、日常的なものではない。対立遺伝子バランスの問題は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに基づくアッセイに関して対処されていない。
【００１３】
米国特許第６，７６４，８２２号（特許文献１）および同第６，０９０，５５８号（特許文献２）は、質量分析（ＭＳ）を使用するＳＴＲタイピングの方法に関する。ＳＴＲ対立遺伝子を解析するためのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−ＭＳの使用が報告されている（Ｈａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｄｄｉｍａｎ，２００１，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１５（５）：３４８−５０（非特許文献９）；Ｈａｎｎｉｓ  ｅｔ．ａｌ，２０００，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，３９２６：１０１７−２６６１（非特許文献１０））。ＥＳＩ−ＭＳは、自動試料処理を行うことができる基盤、および配列多型を解析することができる分析を提供する（Ｅｃｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．（２００６）ＪＡＬＡ．１１：３４１−５１（非特許文献４））。
【００１４】
いくつかのグループは、高分解能エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＥＳＩ−ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ）を使用したＰＣＲ産物の検出に関して記載している。少なくとも１つのヌクレオチドの数の知識を併用した正確な質量の正確な測定により、約１００塩基対のＰＣＲ二重鎖産物に対する全塩基組成の計算が可能となった（Ａａｓｅｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．，１９９６，７，１２６６−１２６９（非特許文献１１）；Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６９，１５４３−１５４９（非特許文献１２）；Ｗｕｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，１２０３−１２０７（非特許文献１３）；Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，１７，１−６８（非特許文献１４））。エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン抵抗（ＥＳＩ−ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳは、平均分子量によって、二本鎖の５００塩基対のＰＣＲ産物の質量を決定するために使用することができる（Ｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．１９９６，１０，３７７−３８２（非特許文献１５））。
【００１５】
増幅断片内に包含される相当量の変異をスキャンすることができ、さらに、迅速で自動化が可能であり、広範囲に及ぶ手動データ解釈の負担なく当該情報を提供することができる、配列決定によって得られる分解能のレベルに接近するＤＮＡ法医学的マーカーの分析のための方法および組成に関して、満たされていない要求が存在する。好ましくは、そのような方法は、分析を行うために、試料内の潜在的に情報を有する部位に関する推測的知識を要しない。そのような方法は、例えば、配列または塩基組成のわずかな相違に基づいて同等または同じ長さの対立遺伝子の識別を可能にすることができる配列多型の分解能を可能にすることによって、解析されたＤＮＡの場合や比較的低量のＤＮＡでの法医学的分析のために、相当の解析能力を提供することができることが好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６，７６４，８２２号
【特許文献２】米国特許第６，０９０，５５８号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｈｏｌｔ  ＣＬ，ｅｔ．ａｌ．（２０００）Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．Ｉｎｔ．１１２（２−３）：９１−１０９
【非特許文献２】Ｈｏｌｌａｎｄ  ＭＭ，ｅｔ．ａｌ．（２００３）Ｃｒｏａｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．４４（３）：２６４−７２
【非特許文献３】Ｂｕｔｌｅｒ，ＪＭ，２００１  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ＤＮＡ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献４】Ｅｃｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．（２００６）ＪＡＬＡ．１１：３４１−５１
【非特許文献５】Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｔｏ  ＮＩＪ  ２００１，ＮＣＪ  １８８２９２，Ｏｃｔｏｂｅｒ；Ｍｏｎｆｏｒｔｅ，Ｊ．Ａ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７，３，３６０−３６２
【非特許文献６】Ｔａｒａｎｅｎｋｏ，Ｎ．Ｉ．；Ｇｏｌｏｖｌｅｖ，Ｖ．Ｖ．；Ａｌｌｍａｎ，Ｓ．Ｌ．；Ｔａｒａｎｅｎｋｏ，Ｎ．Ｖ．；Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｈ．；Ｈｏｎｇ，Ｊ．；Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｙ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １９９８，１２，４１３−４１８
【非特許文献７】Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ｓｈａｌｅｒ，Ｔ．Ａ．；Ｍｏｎｆｏｒｔｅ，Ｊ．Ａ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｌｅｇａｌ  Ｍｅｄ  １９９９，１１２，４５−４９
【非特許文献８】Ｒｏｓｓ，Ｐ．Ｌ．；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｐ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７，６９，３９６６−３９７２
【非特許文献９】Ｈａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｄｄｉｍａｎ，２００１，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１５（５）：３４８−５０
【非特許文献１０】Ｈａｎｎｉｓ  ｅｔ．ａｌ，２０００，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，３９２６：１０１７−２６６１
【非特許文献１１】Ａａｓｅｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．，１９９６，７，１２６６−１２６９
【非特許文献１２】Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６９，１５４３−１５４９
【非特許文献１３】Ｗｕｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，１２０３−１２０７
【非特許文献１４】Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，１７，１−６８
【非特許文献１５】Ｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．１９９６，１０，３７７−３８２
【発明の概要】
【００１８】
本明細書において提供される方法、組成、およびキットは、明確な塩基組成（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの数）を産出するために十分な精度を有するＤＮＡ法医学的マーカーを「量る」ための質量分析の使用に基づく、法医学的分析および個体識別鑑定を対象とし、これは、個体に対するＤＮＡプロファイルを得るために使用することができる。重要なことに、これらの塩基組成プロファイルは、ＳＴＲから得られた既存の法医学的データベース、または別の法医学的マーカープロファイルに対して参照することができる。本開示は、高性能の方法で、塩基組成によって測定された長さ、および配列多型に基づいて、ＳＴＲ遺伝子座を使用してヒト法医学的ＤＮＡ試料を解析することができる方法、プライマー対組成およびキットを提供する。
【００１９】
本発明は、ＤＮＡの法医学的分析の方法を対象とする。一部の実施形態においては、該方法は、個体識別鑑定を含む。一部の実施形態においては、それらは、ＳＴＲタイピングを含む。本明細書において提供した方法は、従来の増幅に基づくＳＴＲタイピングと異なる場合がある。例えば、本明細書において提供した方法は、質量によって決定された大きさに基づいて、ＳＴＲ遺伝子座に対して、対立遺伝子指定を割り当てる能力を提供する。加えて、本明細書において提供した方法は、質量、または遺伝子座内の付加的対立遺伝子をカバーしていない塩基組成によって測定された遺伝子座ヌクレオチド配列から情報を得ることによって、ホモ接合性と考えられる対立遺伝子をさらに解析することができる。
【００２０】
一部の実施形態においては、該方法は、それぞれ、長さが１３〜４０核酸塩基である順方向および逆方向プライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対により、試料からの核酸を増幅するステップであって、順方向プライマーが、核酸の第１の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計され、逆方向プライマーが、核酸の第２の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計され、第１および第２の保存配列領域が、ＳＴＲ遺伝子座を含む介在可変核酸領域に隣接し、該増幅ステップが、長さが約４５〜約２００ヌクレオチドである少なくとも１つの増幅産物を生成する、ステップと、質量分析を使用して、該少なくとも１つの増幅産物の少なくとも１つの鎖の分子量を決定するステップと、決定された分子量を、それぞれ、該オリゴヌクレオチドプライマー対と、該ＳＴＲ遺伝子座に対応する参照対立遺伝子に対してインデックスされた複数のＳＴＲを同定するアンプリコンの複数の分子量を含む分子量データベースと比較するステップであって、決定された分子量と分子量データベースに含まれる分子量との間の一致が、該試料におけるＳＴＲ対立遺伝子を同定するステップとを含む。
【００２１】
別の実施形態においては、該方法は、決定された分子量を使用して、少なくとも１つの増幅産物の少なくとも１つの鎖の塩基組成を計算するステップと、計算された塩基組成を、それぞれ、該オリゴヌクレオチドプライマー対と、該ＳＴＲ遺伝子座に対応する参照対立遺伝子に対してインデックスされたＳＴＲを同定するアンプリコンの複数の塩基組成を含む塩基組成データベースと比較するステップであって、計算された塩基組成と塩基組成データベースに含まれる塩基組成との間の一致が、該試料におけるＳＴＲ対立遺伝子を同定するステップとをさらに含む。
【００２２】
好ましい実施形態においては、該方法は、それぞれ、長さが１３〜４０核酸塩基である順方向および逆方向プライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対により、試料から核酸を増幅するステップであって、順方向プライマーが、該核酸の第１の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計され、逆方向プライマーが、該核酸の第２の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計され、第１および第２の保存配列領域は、ＳＴＲ遺伝子座を含む介在可変核酸領域に隣接し、該増幅ステップが、長さが約４５〜約２００ヌクレオチドである少なくとも１つの増幅産物を生成するステップと、質量分析を使用して、該少なくとも１つの増幅産物の少なくとも１つの鎖の分子量を決定するステップと、決定された分子量を使用して、該少なくとも１つの増幅産物の少なくとも１つの鎖の塩基組成を計算するステップと、計算された塩基組成を、それぞれ、該オリゴヌクレオチドプライマー対と、該ＳＴＲ遺伝子座に対応する参照対立遺伝子に対してインデックスされたＳＴＲを同定するアンプリコンの複数の塩基組成を含む塩基組成データベースと比較するステップであって、計算された塩基組成と塩基組成データベースに含まれる塩基組成との間の一致が、該試料におけるＳＴＲ対立遺伝子を同定するステップとを含む。好ましい態様においては、該核酸は、ＤＮＡを含み、分子量の決定および塩基組成の計算およびデータベースの比較は、増幅産物の両方の鎖上で行われる。該方法は、質量分析および／または塩基組成によって決定されたＳＴＲを同定するアンプリコンの長さに基づいて、ＳＴＲ遺伝子座に対して、対立遺伝子コール、または反復数を割り当てる付加的ステップを任意で含むこともできる。
【００２３】
別の実施形態においては、上記のステップでＳＴＲを同定する塩基組成との一致が得られない場合、該方法は、決定された分子量を使用して、少なくとも１つの増幅産物の塩基組成を計算するステップであって、計算された塩基組成が該ＳＴＲ遺伝子座のこれまで未知であった対立遺伝子を同定するステップと、計算された塩基組成を、データベースにおいて、該オリゴヌクレオチドプライマー対、これまで未知であった対立遺伝子、決定された分子量および試料に対してインデックスするステップとをさらに含むことができる。
【００２４】
一実施形態においては、可変核酸領域は、核酸配列において異なる。一態様においては、可変核酸領域は、同じ数の反復単位を含む該ＳＴＲ遺伝子座の２つ以上の対立遺伝子間の核酸配列において異なる。別の態様においては、可変核酸領域は、該ＳＴＲ遺伝子座の２つ以上の同じ長さの対立遺伝子間の核酸配列において異なる。一態様においては、核酸配列における変異は、従来の増幅に基づくＳＴＲタイピング方法によって解析可能ではない。
【００２５】
別の実施形態においては、該方法は、試料がＳＴＲ遺伝子座においてヘテロ接合性であることを決定するステップを含む。一態様においては、試料は、ＳＴＲ遺伝子座に対してホモ接合性であると既に特徴付けられている。別の態様においては、決定されたヘテロ接合性は、従来の増幅に基づくＳＴＲタイピング方法によって解析可能ではない。
【００２６】
別の実施形態においては、特定されたＳＴＲ対立遺伝子は、少なくとも１つのＳＮＰを含む。一態様においては、ＳＴＲ遺伝子座はＤ５Ｓ８１８であり、ＳＮＰは、データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＧからＴまたはＡからＣへの変化を含む。別の態様においては、ＳＴＲ遺伝子座はＤ８Ｓ１１７９であり、ＳＮＰは、データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＧからＡまたはＴからＣへの変化を含む。別の態様においては、ＳＴＲ遺伝子座はｖＷＡであり、ＳＮＰは、データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＧからＴ、ＡからＧ、ＣからＴ、またはＡからＣへの変化を含む。別の態様においては、ＳＴＲ遺伝子座はＤ１３Ｓ３１７であり、ＳＮＰは、データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＡからＴへの変化を含む。別の態様においては、ＳＴＲ遺伝子座はＤ７Ｓ８２０であり、ＳＮＰは、データベースに含まれる該ＳＴＲ遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、ＴからＡへの変化を含む。しかしながら、任意のＳＴＲ遺伝子座の任意の対立遺伝子における任意のＳＮＰは、本明細書に提供する方法およびプライマー対を使用して同定され得る。
【００２７】
一実施形態においては、該方法は、ＶＷＡ、ＴＰＯＸ、ＴＨ０１、ＦＧＡ、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ３Ｓ、およびＣＳＦ１ＰＯから成る群より選択されるＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存領域にハイブリタイズするように設計されている少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対の順方向および逆方向プライマーである少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して、ステップを反復することをさらに含む。一態様においては、該少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対により該ステップを反復することは、第１のオリゴヌクレオチドプライマー対により該ステップを行うことと同時に行われる。一態様においては、該ステップを反復することは、多重反応において行われる。
【００２８】
別の実施形態においては、該方法は、少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対により増幅ステップを反復することをさらに含み、ここで、該少なくとも１つの追加のプライマーの少なくとも１つは、ＡＭＥＬ遺伝子座の保存領域にハイブリダイズするように設計される。一態様においては、該増幅ステップを反復することは、該第１のオリゴヌクレオチドプライマー対により該増幅ステップを行うことと同時に行われる。一態様においては、該増幅ステップを反復することは、多重反応において行われる。
【００２９】
一実施形態においては、質量分析は、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）である。別の実施形態においては、ＥＳＩ−ＭＳは、ＭＳ−ＴＯＦおよびＦＴＣＩＲ−ＭＳより選択される。
【００３０】
本明細書において提供される方法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマー対を含む化合物も、本明細書において提供される。実験的またはコンピュータによって、本明細書において提供される方法により生成される増幅産物（アンプリコン）およびＳＴＲタイピングアンプリコンまたはＳＴＲを同定するアンプリコンも提供される。該オリゴヌクレオチドプライマー対等の該化合物を含むキットも提供される。
【００３１】
一実施形態においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、長さが約４５〜約２００ヌクレオチドであり、それぞれ、長さが１３〜４０核酸塩基である順方向および逆方向プライマーを含み、順方向プライマーは、核酸の第１の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計され、逆方向プライマーは、該核酸の第２の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計され、第１および第２の保存配列領域は、ＳＴＲ遺伝子座を含む介在可変核酸領域に隣接する。
【００３２】
一実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＶＷＡ、ＴＰＯＸ、ＴＨ０１、ＦＧＡ、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ３Ｓ、およびＣＳＦ１ＰＯから成る群より選択される。しかしながら、本明細書において提供されるプライマーは、任意のＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存領域にハイブリダイズするように設計することができる。実施形態においては、プライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００３３】
一実施形態においては、プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1:52, 2:53, 3:54, 4:55, 5:56, 5:57, 5:58, 5:59, 6:56, 6:57, 6:58, 6:59, 7:60, 8:61, 9:61, 8:62, 9:63, 9:64, 9:65, 9:66, 10:67, 11:68, 12:69, 13:70, 14:71, 15:72, 15:73, 16:72, 16:73, 17:74, 18:75, 19:76, 20:77, 21:78, 22:79, 23:80, 24:81, 25:82, 26:83, 27:84, 28:85, 29:86. 30:87, 31:88, 32:89, 32:90, 33:91, 34:90, 34:92, 35:93, 36:94, 37:95, 38:96, 39:97, 40:98, 41:99, 42:100, 42:101, 43:102, 44:103, 45:103, 46:104, 46:103, 47:104, 109:117, 110:118, 111:119, 112:120, 113:121, 114:122, 115:123, or 116:124で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーに対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。
【００３４】
一実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＴＨ０１である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：６１、９：６１、８：６２、９：６３、９：６４、９：６５、９：６６、または１０：６７で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：６７で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：６７で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。一実施形態においては、ＴＨ０１を標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００３５】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＴＰＯＸである。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：５６、５：５７、５：５８、５：５９、６：５６、６：５７、６：５８、６：５９、または７：６０で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：６０で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：６０で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。ある一つの実施形態においては、ＴＰＯＸを標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００３６】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ８Ｓ１１７９である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８：８５、２９：８６、３０：８７、または３１：８８で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１：８８で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１：８８で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。ある一つの実施形態においては、Ｄ８Ｓ１１７９を標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００３７】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ５Ｓ８１８である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６：９４、３７：９５、３８：９６、３９：９７、および４０：９８で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０：９８で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０：９８で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。ある一つの実施形態においては、Ｄ５Ｓ８１８を標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００３８】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＣＳＦ１ＰＯである。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３：１０２、４４：１０３、４５：１０３、４６：１０４、４６：１０３、または４７：１０４で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７：１０４で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７：１０４で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。ある一つの実施形態においては、ＣＳＦ１ＰＯを標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００３９】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ７Ｓ８２０である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２：８９、３２：９０、３３：９１、３４：９０、３４：９２、または３５：９３で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５：９３で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５：９３で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。ある一つの実施形態においては、Ｄ７Ｓ８２０を標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４０】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ１３Ｓ３１７である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２：７９、２３：８０、２４：８１、２５：８２、２６：８３、または２７：８４で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７：８４で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７：８４で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。ある一つの実施形態においては、Ｄ１３Ｓ３１７を標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４１】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ１６Ｓ５３９である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７：７４、１８：７５、１９：７６、２０：７７、または２１：７８で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１：７８で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１：７８で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。ある一つの実施形態においては、Ｄ１６Ｓ５３９を標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４２】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ｖＷＡである。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：５２、２：５３、３：５４、または４：５５で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：５５で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：５５で表されるオリゴヌクレオチドプライマー対である。ある一つの実施形態においては、ｖＷＡを標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４３】
一実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＦＧＡである。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：６８、１１１：１１９、１１２：１２０、または１２：６９で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。ある一つの実施形態においては、ＦＧＡを標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４４】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ２１Ｓ１１である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：７０、１０９：１１７、１１０：１１８、または１４：７１で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。ある一つの実施形態においては、Ｄ２１Ｓ１１を標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４５】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ１８Ｓ５１である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：７２、１５：７３、１１３：１２１、１１４：１２２、１６：７２、または１６：７３で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。ある一つの実施形態においては、Ｄ１８Ｓ５１を標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４６】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ３Ｓである。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１：９９、４２：１００、１１５：１２３、１１６：１２４、または４２：１０１で表されるプライマーの対の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を含む。ある一つの実施形態においては、Ｄ３Ｓを標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４７】
一部の実施形態においては、プライマーは、性決定に使用されるアメロゲニン（ＡＭＥＬ）内の保存配列領域にハイブリダイズする。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８：１０５、４９：１０６、５０：１０７、および５１：１０８のいずれか１つ以上で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。ある一つの実施形態においては、ＡＭＥＬを標的とするプライマー対は、精製されたプライマー対である。
【００４８】
一実施形態においては、オリゴヌクレオチドプライマー対は、少なくとも１つの改変された核酸塩基を含む。一態様においては、改変された核酸塩基は、質量改変核酸塩基である。一態様においては、質量改変核酸塩基は、５−ヨード−Ｃである。別の態様においては、質量改変核酸塩基は、分子量改変タグを含む。一態様においては、改変された核酸塩基は、ユニバーサル核酸塩基である。一態様においては、ユニバーサル核酸塩基は、イノシンである。
【００４９】
別の実施形態においては、順方向プライマーおよび逆方向プライマーのうち少なくとも１つは、その５’末端に非鋳型Ｔ残基を含む。
【００５０】
別の実施形態においては、順方向プライマーおよび逆方向プライマーのうち少なくとも１つは、その５’末端にＧまたはＣ残基を含む。
【００５１】
一実施形態においては、キットは、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドプライマー対および少なくとも１つの追加のプライマー対を含み、少なくとも１つの追加のプライマー対のそれぞれは、ＶＷＡ、ＴＰＯＸ、ＴＨ０１、ＦＧＡ、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ３Ｓ、またはＣＳＦ１ＰＯより選択されるＳＴＲ遺伝子座を含む核酸の介在可変核酸領域に隣接する核酸の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計された順方向および逆方向プライマーを含む。一態様においては、該キットは、ＡＭＥＬ遺伝子座に隣接する配列内において、または配列に対してハイブリダイズするように設計された別の追加のオリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含む。
【００５２】
一実施形態においては、キットは、それぞれ、長さが約４５〜約２００ヌクレオチドである増幅産物を生成するように設計されており、順方向および逆方向プライマーを含む、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対を含む法医学的分析用キットを含み、該少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対の第１の対は、核酸の第１の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計された第１の順方向プライマー、および該核酸の第２の保存配列領域内でハイブリダイズするように設計された第１の逆方向プライマーを含み、第１および第２の保存配列領域は、ＳＴＲ遺伝子座を含む介在可変核酸領域に隣接し、該ＳＴＲはｖＷＲであり、該少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対の第２の対は、ＡＭＥＬ遺伝子座に隣接する配列内において、または配列に対してハイブリダイズするように設計される。一態様においては、該キットは、ＴＰＯＸ、ＴＨ０１、Ｄ８Ｓ１１７９およびＤ５Ｓ８１８より選択されるＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存配列領域にハイブリダイズするように設計された少なくとも１つの追加のプライマー対をさらに含む。別の態様においては、該キットは、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、およびＤ１６Ｓ５３９より選択されるＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存配列領域にハイブリダイズするように設計された少なくとも１つの追加のプライマー対をさらに含む。
【００５３】
追加の実施形態においては、本明細書に記載されるキットおよび方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うためのすべての構成要素を含むか、または使用する。これらの構成要素は、各核酸塩基に対するデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲを行う際に有用な緩衝剤を含むが、これらに限定されない。ある一つの実施形態においては、少なくとも１つのｄＮＴＰは、質量改変されている。ある一つの実施形態においては、該質量改変ｄＮＴＰは、１３Ｃに富むｄＧＴＰである。
[請求項1001]
(a)それぞれ長さが13〜40核酸塩基である順方向および逆方向プライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対により試料由来の核酸を増幅するステップであって、順方向プライマーが、該核酸の第1の保存配列領域内でハイブリダイズするように構成され、逆方向プライマーが、該核酸の第2の保存配列領域内でハイブリダイズするように構成され、第1および第2の保存配列領域が、STR遺伝子座を含む可変核酸領域に隣接し、該増幅ステップが、長さが約45〜約200ヌクレオチドである少なくとも1つの増幅産物を生成する、ステップ、
(b)質量分析によって、少なくとも1つの増幅産物の少なくとも1つの鎖の分子量を決定するステップ、および、
(c)該分子量を、該オリゴヌクレオチドプライマー対、およびSTR遺伝子座に対応する参照対立遺伝子に対してインデックスされた、複数のSTRを同定する増幅産物の複数の分子量を含む分子量データベースと比較するステップであって、決定された分子量と分子量データベースに含まれる分子量との間の一致により、試料におけるSTR対立遺伝子が同定される、ステップ
を含む、STRタイピングのための方法。
[請求項1002]
(d)決定された分子量を使用して、少なくとも1つの増幅産物の少なくとも1つの鎖の塩基組成を計算するステップ、および、
(e)計算された塩基組成を、前記オリゴヌクレオチドプライマー対、およびSTR遺伝子座に対応する参照対立遺伝子に対してインデックスされた、STRを同定する増幅産物の複数の塩基組成を含む塩基組成データベースと比較するステップであって、計算された塩基組成と塩基組成データベースに含まれる塩基組成との間の一致により、試料におけるSTR対立遺伝子が同定される、ステップ
をさらに含む、請求項1001に記載の方法。
[請求項1003]
(d)決定された分子量を使用して、少なくとも1つの増幅産物の少なくとも1つの鎖の塩基組成を計算するステップであって、計算された塩基組成が、STR遺伝子座のこれまで未知であった対立遺伝子を同定する、ステップ、および、
(e)計算された塩基組成を、データベースにおいて、前記オリゴヌクレオチドプライマー対、これまで未知であった対立遺伝子、決定された分子量、および試料に対してインデックスするステップ
をさらに含む、ステップ(c)で一致が同定されない場合における、請求項1001に記載の方法。
[請求項1004]
可変核酸領域が核酸配列において異なる、請求項1001に記載の方法。
[請求項1005]
可変核酸領域が、同じ数の反復単位を含むSTR遺伝子座の2つ以上の対立遺伝子間の核酸配列において異なる、請求項1001に記載の方法。
[請求項1006]
可変核酸領域が、STR遺伝子座の2つ以上の同じ長さの対立遺伝子間の核酸配列において異なる、請求項1001に記載の方法。
[請求項1007]
核酸配列における変異が、従来の増幅に基づくSTRタイピング方法によって解析可能でない、請求項1006に記載の方法。
[請求項1008]
(f)試料がSTR遺伝子座においてヘテロ接合性であることを決定するステップをさらに含む、請求項1001に記載の方法。
[請求項1009]
試料が、STR遺伝子座に関してホモ接合性であると既に特徴付けられている、請求項1008に記載の方法。
[請求項1010]
決定されたヘテロ接合性が、従来の増幅に基づくSTRタイピング方法によって解析可能でない、請求項1008に記載の方法。
[請求項1011]
同定されたSTR対立遺伝子が少なくとも1つのSNPを含む、請求項1001に記載の方法。
[請求項1012]
STR遺伝子座がD5S818であり、少なくとも1つのSNPが、データベースに含まれる該STR遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、GからTまたはAからCへの変化を含む、請求項1011に記載の方法。
[請求項1013]
STR遺伝子座がD8S1179であり、少なくとも1つのSNPが、データベースに含まれる該STR遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、GからAまたはTからCへの変化を含む、請求項1011に記載の方法。
[請求項1014]
STR遺伝子座がvWAであり、少なくとも1つのSNPが、データベースに含まれる該STR遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、GからT、AからG、CからT、またはAからCへの変化を含む、請求項1011に記載の方法。
[請求項1015]
STR遺伝子座がD13S317であり、少なくとも1つのSNPが、データベースに含まれる該STR遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、AからTへの変化を含む、請求項1011に記載の方法。
[請求項1016]
STR遺伝子座がD7S820であり、少なくとも1つのSNPが、データベースに含まれる該STR遺伝子座に関する参照対立遺伝子と比較して、TからAへの変化を含む、請求項1011に記載の方法。
[請求項1017]
順方向プライマーおよび逆方向プライマーのうち少なくとも1つが、少なくとも1つの改変された核酸塩基を含む、請求項1001に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1018]
STR遺伝子座がTH01である、請求項1001に記載の方法。
[請求項1019]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:8:61、9:61、8:62、9:63、9:64、9:65、9:66、または10:67から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1018に記載の方法。
[請求項1020]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:10:67のオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1019に記載の方法。
[請求項1021]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:10:67である、請求項1020に記載の方法。
[請求項1022]
STR遺伝子座がTPOXである、請求項1001に記載の方法。
[請求項1023]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:5:56、5:57、5:58、5:59、6:56、6:57、6:58、6:59、または7:60から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1022に記載の方法。
[請求項1024]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:7:60のオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1023に記載の方法。
[請求項1025]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:7:60である、請求項1024に記載の方法。
[請求項1026]
STR遺伝子座がD8S1179である、請求項1001、1002、または1003のいずれか一項記載の方法。
[請求項1027]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:28:85、29:86、30:87、または31:88から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1026に記載の方法。
[請求項1028]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:31:88のオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1027に記載の方法。
[請求項1029]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:31:88である、請求項1028に記載の方法。
[請求項1030]
STR遺伝子座がD5S818である、請求項1001に記載の方法。
[請求項1031]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:36:94、37:95、38:96、39:97、または40:98から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1030に記載の方法。
[請求項1032]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:40:98に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1031に記載の方法。
[請求項1033]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:40:98である、請求項1032に記載の方法。
[請求項1034]
STR遺伝子座がCSF1POである、請求項1001に記載の方法。
[請求項1035]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:43:102、44:103、45:103、46:104、46:103、または47:104から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1034に記載の方法。
[請求項1036]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:47:104に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1035に記載の方法。
[請求項1037]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:47:104である、請求項1036に記載の方法。
[請求項1038]
STR遺伝子座がD7S820である、請求項1001に記載の方法。
[請求項1039]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:32:89、32:90、33:91、34:90、34:92、または35:93から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1038に記載の方法。
[請求項1040]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:35:93に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1039に記載の方法。
[請求項1041]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:35:93である、請求項1040に記載の方法。
[請求項1042]
STR遺伝子座がD13S317である、請求項1001に記載の方法。
[請求項1043]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:22:79、23:80、24:81、25:82、26:83、または27:84から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1042に記載の方法。
[請求項1044]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:27:84に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1043に記載の方法。
[請求項1045]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:27:84である、請求項1044に記載の方法。
[請求項1046]
STR遺伝子座がD16S539である、請求項1001に記載の方法。
[請求項1047]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:17:74、18:75、19:76、20:77、または21:78から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1046に記載の方法。
[請求項1048]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:21:78に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1047に記載の方法。
[請求項1049]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:21:78である、請求項1047に記載の方法。
[請求項1050]
STR遺伝子座がvWAである、請求項1001に記載の方法。
[請求項1051]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:1:52、2:53、3:54、または4:55から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1050に記載の方法。
[請求項1052]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:4:55に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1051に記載の方法。
[請求項1053]
オリゴヌクレオチドプライマー対がSEQ ID NO:4:55である、請求項1052に記載の方法。
[請求項1054]
STR遺伝子座がFGAである、請求項1001に記載の方法。
[請求項1055]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:11:68、111:119、112:120、または12:69から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1054に記載の方法。
[請求項1056]
STR遺伝子座がD21S11である、請求項1001に記載の方法。
[請求項1057]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:13:70、109:117、110:118、または14:71から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1056に記載の方法。
[請求項1058]
STR遺伝子座がD18S51である、請求項1001に記載の方法。
[請求項1059]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:15:72、15:73、113:121、114:122、16:72、または16:73から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1058に記載の方法。
[請求項1060]
STR遺伝子座がD3Sである、請求項1001に記載の方法。
[請求項1061]
オリゴヌクレオチドプライマー対が、SEQ ID NO:41:99、42:100、115:123、116:124、または42:101から成る群より選択されるプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1060に記載の方法。
[請求項1062]
VWA、TPOX、TH01、FGA、D21S11、D18S51、D16S539、D13S317、D8S1179、D7S820、D5S818、D3S、およびCSF1POから成る群より選択されるSTR遺伝子座に隣接する保存領域にハイブリダイズするように構成された少なくとも1つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して、前記ステップを反復することをさらに含む、請求項1001に記載の方法。
[請求項1063]
少なくとも1つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対により前記ステップを反復することが、第1のオリゴヌクレオチドプライマー対により前記ステップを行うことと同時に行われる、請求項1062に記載の方法。
[請求項1064]
前記ステップを反復することが多重反応において行われる、請求項1062に記載の方法。
[請求項1065]
少なくとも1つの追加のオリゴヌクレオチドプライマー対により増幅ステップを反復することをさらに含む方法であって、該少なくとも1つの追加のプライマーのうち少なくとも1つが、AMEL遺伝子座の保存領域にハイブリダイズするように構成されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1066]
増幅ステップを反復することが、第1のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて増幅ステップを行うことと同時に行われる、請求項1065に記載の方法。
[請求項1067]
増幅ステップを反復することが多重反応において行われる、請求項1065に記載の方法。
[請求項1068]
少なくとも1つの改変された核酸塩基が、質量改変された核酸塩基である、請求項1017に記載の方法。
[請求項1069]
質量改変された核酸塩基が13Cに富むdGTPである、請求項1068に記載の方法。
[請求項1070]
質量改変された核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項1068に記載の方法。
[請求項1071]
質量改変された核酸塩基が分子量改変タグを含む、請求項1068に記載の方法。
[請求項1072]
少なくとも1つの改変された核酸塩基のうち少なくとも1つがユニバーサル核酸塩基である、請求項1017に記載の方法。
[請求項1073]
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項1072に記載の方法。
[請求項1074]
順方向プライマーおよび逆方向プライマーのうち少なくとも1つが、その5'末端に非鋳型T残基を含む、請求項1001のいずれかに記載の方法。
[請求項1075]
順方向プライマーおよび逆方向プライマーのうち少なくとも1つが、その5'末端にGまたはC残基を含む、請求項1001のいずれかに記載の方法。
[請求項1076]
質量分析がエレクトロスプレー質量分析(ESI-MS)である、請求項1001のいずれかに記載の方法。
[請求項1077]
ESI-MSがMS-TOFおよびFTICR-MSから成る群より選択される、請求項1076に記載の方法。
[請求項1078]
長さが約45〜約200ヌクレオチドである増幅産物を生成するように構成され、それぞれ長さが13〜40核酸塩基である順方向および逆方向プライマーを含む、精製されたオリゴヌクレオチドプライマー対であって、
順方向プライマーが、核酸の第1の保存領域内でハイブリダイズするように構成され、逆方向プライマーが、該核酸の第2の保存領域内でハイブリダイズするように構成され、
第1および第2の保存領域が、VWA、TPOX、TH01、FGA、D21S11、D18S51、D16S539、D13S317、D8S1179、D7S820、D5S818、D3S、およびCSF1POから成る群より選択されるSTR遺伝子座を含む可変核酸領域に隣接し、
該プライマー対が、SEQ ID NO:1:52、2:53、3:54、4:55、5:56、5:57、5:58、5:59、6:56、6:57、6:58、6:59、7:60、8:61、9:61、8:62、9:63、9:64、9:65、9:66、10:67、11:68、12:69、13:70、14:71、15:72、15:73、16:72、16:73、17:74、18:75、19:76、20:77、21:78、22:79、23:80、24:81、25:82、26:83、27:84、28:85、29:86、30:87、31:88、32:89、32:90、33:91、34:90、34:92、35:93、36:94、37:95、38:96、39:97、40:98、41:99、42:100、42:101、43:102、44:103、45:103、46:104、46:103、109:117、110:118、111:119、112:120、113:121、114:122、115:123、116:124、または47:104から成る群より選択されるオリゴヌクレオチドプライマー対に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、
精製されたオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1079]
SEQ ID NO:10:67に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1080]
プライマー対がSEQ ID NO:10:67である、請求項1079に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1081]
SEQ ID NO:7:60に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1082]
プライマー対がSEQ ID NO:7:60である、請求項1081に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1083]
SEQ ID NO:31:88に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1084]
プライマー対がSEQ ID NO:31:88である、請求項1083に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1085]
SEQ ID NO:40:98に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1086]
プライマー対がSEQ ID NO:40:98である、請求項1085に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1087]
SEQ ID NO:47:104に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1088]
プライマー対がSEQ ID NO:47:104である、請求項1087に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1089]
SEQ ID NO:35:93に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1090]
プライマー対がSEQ ID NO:35:93である、請求項1089に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1091]
SEQ ID NO:27:84に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1092]
プライマー対がSEQ ID NO:27:84である、請求項1091に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1093]
SEQ ID NO:21:78に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1094]
プライマー対がSEQ ID NO:21:78である、請求項1093に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1095]
SEQ ID NO:4:55に対する、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%の配列同一性を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1096]
プライマー対がSEQ ID NO:4:55である、請求項1095に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1097]
少なくとも1つの改変された核酸塩基を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1098]
少なくとも1つの改変された核酸塩基が、質量改変された核酸塩基である、請求項1097に記載のオリゴヌクレオチド。
[請求項1099]
質量改変された核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項1098に記載のオリゴヌクレオチド。
[請求項1100]
質量改変された核酸塩基が分子量改変タグを含む、請求項1098に記載のオリゴヌクレオチド。
[請求項1101]
少なくとも1つの改変された核酸塩基のうち少なくとも1つがユニバーサル核酸塩基である、請求項1097に記載のオリゴヌクレオチド。
[請求項1102]
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項1101に記載のオリゴヌクレオチド。
[請求項1103]
順方向プライマーおよび逆方向プライマーのうち少なくとも1つが、その5'末端に非鋳型T残基を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1104]
順方向プライマーおよび逆方向プライマーのうち少なくとも1つが、その5'末端にGまたはC残基を含む、請求項1078に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
[請求項1105]
請求項1078に記載のプライマー対、および、
VWA、TPOX、TH01、FGA、D21S11、D18S51、D16S539、D13S317、D8S1179、D7S820、D5S818、D3S、およびCSF1POから成る群より選択されるSTR遺伝子座を含む核酸の可変核酸領域に隣接する該核酸の保存領域内でハイブリダイズするように構成された順方向および逆方向プライマーを含む、少なくとも1つの追加のプライマー対
を含む、キット。
[請求項1106]
AMEL遺伝子座内において、または、AMEL遺伝子座に隣接する領域に対してハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含む、請求項1105に記載のキット。
[請求項1107]
長さが約45〜約200ヌクレオチドである1つまたは複数の増幅産物を生成するように構成されており、順方向および逆方向プライマーを含む、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対を含む法医学的分析用キットであって、該少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対の第1の対が、核酸の第1の保存領域内でハイブリダイズするように構成された第1の順方向プライマー、および該核酸の第2の保存領域内でハイブリダイズするように構成された第1の逆方向プライマーを含み、第1および第2の保存領域が、vWRを含む可変核酸領域に隣接し、該少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対の第2の対が、AMEL遺伝子座内において、またはAMEL遺伝子座に隣接する領域に対してハイブリダイズするように構成されている、キット。
[請求項1108]
TPOX、TH01、D8S1179およびD5S818から成る群より選択されるSTR遺伝子座に隣接する保存領域にハイブリダイズするように構成された少なくとも1つの追加のプライマー対をさらに含む、請求項1107に記載のキット。
[請求項1109]
CSF1PO、D7S820、D13S317、およびD16S539から成る群より選択されるSTR遺伝子座に隣接する保存配列領域にハイブリダイズするように構成された少なくとも1つの追加のプライマー対をさらに含む、請求項1107に記載のキット。
[請求項1110]
多重反応が、10個の遺伝子座を標的とするプライマー対を含む2つの6重反応である、請求項1067に記載の方法。
[請求項1111]
10個の遺伝子座が、D5S818、D8S1179、TH01、TPOX、AMEL、vWA、CSF1PO、D13S317、D16S539およびD7S820である、請求項1110に記載の方法。
[請求項1112]
多重反応が5つの3重反応である、請求項1067に記載の方法。
[請求項1113]
14個の遺伝子座を標的とするプライマー対を含む、5つの3重反応および3つの1重反応をさらに含む、請求項1112に記載の方法。
[請求項1114]
1重反応が、D21S11、FGAおよびD18S51を標的とするプライマー対を含む、請求項1113に記載の方法。
[請求項1115]
3重反応が、TPOX、TH01、D8S1179、D5S818、vWA、AMEL、CSF1PO、D7S820、D13S317、D3S1358およびD16S539を標的とするプライマーを含む、請求項1113に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１ａ】本明細書において提供されるプライマー選択およびＳＴＲタイピング方法の例を示すフローチャートである。
【図１ｂ】ＦＢＩの１３種のコアＣＯＤＩＳ  ＳＴＲ遺伝子座、および性識別のために使用されるアメロゲニン（ＡＭＥＬ）の説明図である。各遺伝子座の名称は、それが見られる染色体の中心に描かれる。参照対立遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋより、遺伝子座に対して利用可能である。
【図２】ＴＨ０１遺伝子座に対するＳＴＲタイピングプライマー対の選択を図示した例を示す。プライマー対は、ここで反復領域として指定され、この例では、ＳＴＲ反復領域を表す可変領域に近接するか、または極めて接近する領域にハイブリダイズするように選択される。
【図３】ＴＨ０１遺伝子座の保存領域にハイブリダイズするように設計されたプライマー対に対して構成されたデータベースの例である。特徴付けられた対立遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋから得られた。各対立遺伝子に対して、ＳＴＲを同定するアンプリコンは、対立遺伝子に対する反復遺伝子座、および対のプライマーが結合する隣接配列を含む配列を構成することによって、コンピュータにより生成された。
【図４】すべてがＴＰＯＸ  ＳＴＲ遺伝子座を標的とする、数字（表５にも記載されている）で列挙されたプライマー対を使用し、試料（Ｓｅｒａｃａｒｅの血液試料Ｎ３１７７３）に対する本明細書において提供される方法を用いて生成された質量分析データの例である。見られる二対立遺伝子パターンは、異なるプライマー対間で一致し、各対が、試料における対立遺伝子の分子を解析できたことを示唆している。
【図５】試料（Ｓｅｒａｃａｒｅ血液試料Ｎ３１７７３）における１つの対立遺伝子に対する本明細書において提供されるプライマー対を使用して、ＳＴＲ遺伝子座Ｄ１３Ｓ３１７に関して見出された対立遺伝子変異の例を示す。図は、参照対立遺伝子１２と直接一致する１つの対立遺伝子を示す。別の対立遺伝子に対して、アンプリコンの塩基組成を計算し、試料、プライマー対、および遺伝子座に対してインデックスされたデータベースに追加した。
【図６】Ｓｅｒａｃａｒｅ血液試料Ｎ３１７７３に対して行われた初回ＳＴＲプライマー試験の要約である。
【図７】表５にも列挙されている、示されたプライマー対によるＳｅｒａｃａｒｅ血液試料Ｎ３１７７３に対するプライマー対の初回試験の間に実施された、ＰＣＲ増幅反応の４％アガロースゲル分離の写真である。
【図８】本明細書において提供される方法による、ＰＣＲ増幅およびＥＳＩ−ＭＳを使用した、示されたＡＦＤＩＬ血斑試料（試料番号は、一列目に記載される）のＳＴＲタイピングの要約である。各欄の数は、特定のＳＴＲ遺伝子座に対する特定の試料における各対立遺伝子に対して作成された対立遺伝子コールを指す。数は、正式名称と対応し、対立遺伝子における反復単位の数を示す。該方法によって同定されたＳＮＰは、塩基の変化とともに、括弧で記載される。例えば、Ｔ残基からＡ残基への変化であるＳＮＰは、（Ｔ→Ａ）として示される。１つの数のみが記載される試料は、同じ長さの２つの対立遺伝子を有する。
【図９】ｖＷＡ  ＳＴＲ遺伝子座からアンプリコンを生成するプライマー対１１８４によって、図８のＡＦＤＩＬ血液試料（Ｉ−００６６）のうち１つのＳＴＲタイピングの説明の例である。
【図１０ａ】Ｑｉａｇｅｎ多重緩衝剤、および元のプライマー対を使用した多重化によって生成された、アンプリコンの約５０％アデニル化を表す分裂アデニル化ピークを示す。
【図１０ｂ】５’末端上のＣまたはＧ残基を含む新規プライマー対による分割アデニル化ピークの損失を示す。
【図１１】図１１ａおよび１１ｂは、表７に記載されるプライマー対による、６重ＳＴＲ反応１および２の例をそれぞれ示す。実施例１１に記載されるように、すべての対立遺伝子は、両方の多重反応を使用して解析された。
【図１２】図８に示されるＡＦＤＩＬ試料および表７に記載される多重反応混合物を使用して解析された対立遺伝子の結果を示す。対立遺伝子およびＳＮＰは、図８に示される通りである。
【図１３ａ】表７に記載されるプライマー対、および２５の新規ＡＦＤＩＬ試料（一列目に示される）をタイピングするための、本明細書において提供される方法を使用した多重反応の結果を示す。同定された対立遺伝子およびＳＮＰは、図８に示される通りである。すべての対立遺伝子の数（反復単位の数を示す）は、従来の増幅に基づくＳＴＲタイピングのタイピング結果と一致した。
【図１３ｂ】表７に記載されるプライマー対、および２２の新規ＦＢＩ試料（一列目に示される）をタイピングするための、本明細書において提供される方法を使用した多重反応の結果を示す。同定された対立遺伝子およびＳＮＰは、図８に示される通りである。
【図１３ｃ】図１３ａおよび１３ｂの結果を要約した表である。
【図１４】ＮＩＳＴ試料のＳＴＲタイピングの結果を示す。白人および黒人の試料を示す。多型対立遺伝子は、下部の説明文で示されるように、セルの色によって示される。各ＳＮＰの性質は、塩基対立遺伝子コールの隣にある文字指定によって示される。
【図１５】ＮＩＳＴ試料のＳＴＲタイピングの結果を示す。ヒスパニック系の試料を示す。多型対立遺伝子は、下部の説明文で示されるように、セルの色によって示される。各ＳＮＰの性質は、塩基対立遺伝子コールの隣にある文字表示によって示される。
【図１６】例としてＤ１３Ｓ３１７を使用した、上に概説されるＳＴＲ対立遺伝子データベースに対する参照対立遺伝子エントリを生成する工程を示す。
【図１７】対立遺伝子ラダーの非存在下における対立遺伝子データベースの使用を示す。正確な対立遺伝子の割り当ては、産物の質量の直接測定、および続く産物の塩基組成の計算によって行うことができる。参照対立遺伝子に対する対立遺伝子における配列多型は、順方向および逆方向鎖の両方の質量の変化をもたらす。産物の塩基組成の計算により、多型が明らかとなる。その後、多型対立遺伝子をデータベースに戻すことができる。多型の位置は、対立遺伝子が配列決定されない限り、不明のままである。また、２つの消去多型性が存在する場合（例えば、同じアンプリコン内のＡ→Ｇ  ＳＮＰおよびＧ→Ａ  ＳＮＰ）、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳアッセイは、多型性を登録しない。
【図１８】ＰＣＲアンプリコンにおいて明確なＳＮＰ割り当てを行うための質量タグの使用を示す。上記の例は、Ｉｂｉｓプライマー対２８１８で増幅された、遺伝子座Ｄ８Ｓ１１７９、対立遺伝子１４を示す。Ａ）天然ｄＮＴＰで増幅する場合、対立遺伝子１４からのＧ→ＡおよびＴ→Ｃ変異は、質量が非常に近いアンプリコン（各産物の鎖において約１Ｄａの差異）を生成する。Ｂ）３つのＰＣＲ産物のそれぞれに対する順方向鎖質量の拡大図である。塩基対立遺伝子１４産物からＳＮＰが明確に検出されるが、Ｇ→ＡおよびＴ→Ｃ産物の順方向鎖に対する質量の間に１Ｄａの差異しかなく、ＳＮＰの正確な同一性を、２つの可能性の間において潜在的に不明瞭としている。Ｃ）ｄＧＴＰの代わりに１３Ｃに富むｄＧＴＰで増幅する場合、対立遺伝子１４からのＧ→ＡおよびＴ→Ｃ変異は、各ＳＮＰ変異の割り当てを明確にする、１１Ｄａ近くの差異があるアンプリコンを生成する。Ｄ）１３Ｃに富むｄＧＴＰで増幅された３つのＰＣＲ産物のそれぞれに対する順方向鎖質量の拡大図である。塩基対立遺伝子１４産物からＳＮＰが明確に検出され、ＳＮＰに関与する塩基交換の割り当てが明確である。塩基性対立遺伝子１４の産物は、約２６ＤａによってＧ→Ａ  ＳＮＰから、約１５ＤａによってＴ→Ｃ  ＳＮＰから分離される。２つのＳＮＰ変異は、約１１Ｄａによって分離される。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
実施形態の説明
本明細書において使用されるように、「試料」は、本明細書において提供される方法によって分析することが可能な任意のものを指す。好ましい実施形態においては、試料は、該方法による分析が可能な１つもしくは複数の核酸を含むか、または疑いのある１つもしくは複数の核酸である。該試料は、ＤＮＡを含むことが好ましい。試料は、法医学的試料であり得、例えば、犯罪現場、血液、血液染色、精液、精液染色、骨、歯、髪、唾液、尿、糞便、指の爪、筋組織、たばこ、切手、封筒、ふけ、指紋、および私物品からの証拠を含むことができる。一部の実施形態においては、試料は、２つ以上の対象物および個体からの核酸を含む、「混合」試料である。一部の実施形態においては、本明細書において提供される方法は、試料を精製するステップまたは試料由来の核酸を精製するステップを含む。一部の実施形態においては、試料は、精製された核酸またはＤＮＡである。
【００５６】
本明細書において使用されるように、「反復ＤＮＡ配列」、「タンデム反復遺伝子座」、「タンデムＤＮＡ反復」および「サテライトＤＮＡ」は、真核生物のゲノムに存在する反復ＤＮＡ配列を指す。「ＶＮＴＲ」（可変ヌクレオチドタンデム反復）または「ミニサテライト」は、長さ約１０〜１００個の連結したヌクレオチドである中型の反復単位を指す。「短鎖タンデム反復」、「ＳＴＲ」、「単純配列反復」、「ＳＳＲ」および「マイクロサテライト」は、長さ２〜６個のヌクレオチドのコア単位を有するタンデムＤＮＡ反復領域を指す。ＳＴＲは、コア反復単位におけるヌクレオチドの数によって特徴付けられる。ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、およびテトラヌクレオチドＳＴＲは、それぞれ２、３、および４のコア反復単位を有するＳＴＲを表す。
【００５７】
「ＳＴＲマーカー」とも称される「ＳＴＲ遺伝子座」は、短鎖タンデム反復の領域が位置する染色体上の特定の場所を指す。ＳＴＲ遺伝子座で見られる特定の配列変異（反復単位および配列多型の数）は、「ＳＴＲ対立遺伝子」と称される。しばしば、いかなる集団内にも、１つのＳＴＲ遺伝子座に対して複数のＳＴＲ対立遺伝子が存在する。個体は、既定のＳＴＲ遺伝子座に対して２つ以上のＳＴＲ対立遺伝子（母系および父系の各染色体上に１つ）を有することができる。そのような個体は、特定のＳＴＲ遺伝子座において「ヘテロ接合性」であると考えられる。両方の染色体上に同一の対立遺伝子を有する個体は、「ホモ接合性」であると考えられる。そのような遺伝子座の個体の変異は、対立遺伝子と称される。特定のＳＴＲ遺伝子座に対して、集団における個体は、これらのコア反復単位の数が異なる。特定のＳＴＲ遺伝子座における対立遺伝子は、そのＳＴＲ遺伝子座に対応すると考えられる。
【００５８】
本明細書において使用されるように、「同じ長さのＳＴＲ対立遺伝子」または「同じ長さの対立遺伝子」は、ＳＴＲ遺伝子座における連結したヌクレオチドの共通の数または配列の長さを共有する２つ以上の対立遺伝子を指すために使用される。同じ長さの対立遺伝子は、塩基組成または配列が異なる場合がある。「配列の長さ」は、既定の核酸、核酸配列またはそのような配列の一部または領域に対する、連結したヌクレオチドの数を指す。
【００５９】
特定のＳＴＲ遺伝子座に関して、一般的な対立遺伝子変異と１つもしくは複数の塩基対が異なるミクロ変異型対立遺伝子が、同定されている。これらの変異は、ヌクレオチド挿入、欠失またはヌクレオチド塩基の変化の形態であり得る。そのような１つの変異である「単一ヌクレオチド多型性」または「ＳＮＰ」は、参照配列または共通配列と比較して、単一のヌクレオチド変化を指す。一部の実施形態においては、本明細書において提供される方法は、１つもしくは複数のＳＮＰに基づいて対立遺伝子を識別することができ、ＳＴＲ遺伝子座におけるＳＮＰを同定することができる。
【００６０】
ＳＴＲ遺伝子座およびＳＴＲ対立遺伝子に対する一般的な命名法は、国際法医血液遺伝学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｈａｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＩＳＦＨ）（Ｂａｒ  ｅｔ  ａｌ，．Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｇａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９７，１０７，１５９−１６０）によって作成される。対立遺伝子は、コア反復単位の数に基づいて命名される。例えば、特定のＳＴＲ遺伝子座に対して１２と表示された対立遺伝子は、１２の反復単位を有する。不完全な反復単位は、整数に続く小数点、例えば、１２．２で表示される。
【００６１】
本明細書において使用されるように、「法医学的ＤＮＡタイピング」は、個体、核酸、試料、または証拠の任意の１つもしくは複数の遺伝子座の遺伝子型を決定するための法医学的方法を指す。「ＳＴＲタイピング」は、１つもしくは複数のＳＴＲ遺伝子座の遺伝子型を決定する方法を使用する、法医学的ＤＮＡタイピングまたはＤＮＡタイピングを指す。ＳＴＲタイピングは、科学捜査、個体識別鑑定、実父確定試験、および別の人物同定の手段といった目的のために使用することができる。しばしば、ＳＴＲタイピングは、検査される各遺伝子座に対する反復数が異なる、ヒト個体群における対立遺伝子の集合を示す複数のＳＴＲ  ＤＮＡ遺伝子座の増幅を伴う。
【００６２】
本明細書において使用されるように、「従来のＳＴＲタイピング」または「標準ＳＴＲタイピング」は、ＳＴＲタイピングのために使用される最も一般的に利用可能な方法を指す。具体的には、「従来の増幅に基づくＳＴＲタイピング」および「標準的な増幅に基づくＳＴＲタイピング」は、ＳＴＲ遺伝子座が増幅によって同定され、大きさ、または配列の長さに基づいて、対立遺伝子表示を割り当てることによって解析される、最も一般的な方法を指す。しばしば、そのような増幅反応の産物は、蛍光検出法を使用する電気泳動、およびその後の、増幅産物の長さに基づく異なる対立遺伝子間での識別によって分析される。本明細書において提供される方法は、従来の増幅に基づくＳＴＲタイピングと区別することができる。例えば、本明細書において提供される方法は、質量によって決定された大きさに基づいて、ＳＴＲ遺伝子座に対して対立遺伝子表示を割り当てる能力を提供する。加えて、本明細書において提供される方法は、質量、または遺伝子座内の付加的対立遺伝子をカバーしていない塩基組成によって測定された遺伝子座ヌクレオチド配列からの情報を得ることによって、明らかにホモ接合性の対立遺伝子をさらに解析することができる。ＳＴＲタイピングにおける「対立遺伝子コール」は、個体、核酸または試料に対するＳＴＲタイピング方法によって同定される遺伝子型、ＳＴＲ型または特定の対立遺伝子を指す。
【００６３】
本明細書において使用されるように、「プライマー」、「プライマー対」または「オリゴヌクレオチドプライマー対」は、標的核酸内の保存配列領域にハイブリダイズするように設計されるオリゴヌクレオチドであり、該保存配列領域は、２つ以上の核酸、対立遺伝子、または個体間で保存される。プライマー対は、一対のプライマーであるため、順方向および逆方向プライマーを含む。一部の実施形態においては、該保存配列領域（および、そのためにハイブリダイズされたプライマー）は、２つ以上の対立遺伝子または個体間で異なる介在可変核酸領域に隣接する。増幅後、該プライマー対は、２つ以上の個体または核酸間で塩基組成変動を含む増幅産物（アンプリコンとも称される）を産出する。塩基組成の変動は、アンプリコンおよびそれらの塩基組成の特質に基づいて、１つもしくは複数の個体、または１つもしくは複数の個体の遺伝子型の同定を可能にする。好ましい実施形態においては、プライマー対は、ＳＴＲ遺伝子座に直接隣接するか、ほぼ隣接する領域にハイブリダイズするように設計される。しかしながら、本明細書において提供されるプライマーの一部の変異は、所望の配列の効果的な増幅を提供する目的を果たすことが明らかである。そのような変異は、例えば、プライマーからの１つまたはいくつかの塩基の追加または削除、および／またはＳＴＲ遺伝子座または可変領域に対するプライマーの位置の変更を含むことができる。
【００６４】
本発明の一部の実施形態においては、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプライマー対は、精製することができる。本明細書において使用されるように、「精製されたオリゴヌクレオチドプライマー対」、「精製されたプライマー対」または「精製された」は、特定の配列および特定の数の連結したヌクレオシドを有するように、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドプライマー対を意味する。この用語は、それぞれ、無作為に生成された配列を有する、同じ長さの複数の化合物の混合物を産出するために、無作為に生成されるヌクレオチドを明確に除外することを意味する。
【００６５】
プライマー対は、分子量分析が可能なアンプリコンを生成するように設計される。標準的プライマー対命名法は、本明細書において使用され、参照配列、ハイブリダイゼーション座標、および別の同定情報の命名を含む。例えば、プライマー対番号２８２３に対する順方向プライマーは、ＶＷＡ＿Ｍ２５８５８＿１６５１＿１６８１＿Ｆと名付けられる。このプライマーの参照配列（名称において引用される）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２５８５８である。番号の範囲「１６５１＿１６８１」は、プライマーが、参照配列のこれらのヌクレオチド位置にハイブリダイズすることを示す。「Ｆ」は、この特定のプライマーは、対の順方向プライマーであることを意味する。プライマー名の始まりは、遺伝子座、遺伝子、またはプライマーが標的とするため、その中でハイブリダイズする別の核酸領域または特徴を指す。プライマー対番号２８２３の順方向プライマーの場合、名称は、特定のヒトＳＴＲであるＶＷＡを標的とすることを示す。しかしながら、プライマー対は、２つ以上の核酸、または２つ以上の個体由来の核酸にハイブリダイズするように選択され設計される。そのため、使用される命名法は、参照配列を提供するためのみに使用され、プライマーが、参照配列のみにハイブリダイズし、増幅産物を生成することを示すわけではない。さらに、プライマー対のプライマーメンバーの配列は、参照配列の保存領域に相補的である必要なない。むしろ、配列は、これらの保存された結合配列での複数の核酸の中で「最良適合」するように設計される。したがって、プライマー対のプライマーメンバーは、参照配列核酸を含む、核酸の保存領域との実質的な相補性を有する。
【００６６】
本明細書において使用されるように、「実質的な相補性」という用語は、プライマー対のプライマーメンバーが、個体由来の核酸の保存された結合配列との、約７０％〜１００％、または約８０〜１００％、または約９０〜１００％、または約９５〜１００％、または約９９〜１００％の相補性を含むことを意味する。同様に、本明細書において提供されるプライマー対は、表５に開示されるプライマー対に対する、約７０％〜１００％、または約８０〜１００％、または約９０〜１００％、または約９５〜１００％の同一性、または約９９〜１００％の配列同一性を含むことができる。相補性および同一性のこれらの範囲は、挙げられる範囲の数内に包含されるすべての整数または小数点以下を含む数を含む。例えば、７５．６６７％、８２％、９１．２４３５％および９７％の相補性または配列同一性（これらに、限定されない）は、すべて、上記に挙げられる７０％〜１００％の範囲内に該当するすべての数であるため、この記載の一部を成す。一部の実施形態においては、任意のオリゴヌクレオチドプライマー対は、プライマー対が所望のＳＴＲを同定するアンプリコンに対応する増幅産物を生成する能力を有する場合、表５の任意のプライマー対の対応するメンバーに対する７０％未満の配列相同性を有する１つまたは両方のプライマーを有することができる。
【００６７】
一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、長さが１３〜４０核酸塩基である（１３〜３５個の連結したヌクレオチド残基）。これらの実施形態は、長さ１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、またはその中の任意の範囲を含む。本発明は、より長いか、またはより短いプライマーの両方を使用することを意図する。さらに、該プライマーは、類縁集団、リガンド、増幅される核酸に相補的ではない核酸の領域、標識等（これらに限定されない）を含む、１つもしくは複数の別の所望の部分に連結することもできる。別の実施形態においては、任意のオリゴヌクレオチドプライマー対は、プライマー対が、所望のＳＴＲを同定するアンプリコンに対応する増幅産物を生成する能力を有する場合、４０個の核酸塩基より大きい長さの１つまたは両方のプライマーを有することができる。
【００６８】
本明細書において使用されるように、「可変領域」という用語は、一部の実施形態においては、本明細書に記載されるプライマー対がハイブリダイズする保存領域の間にある領域を記載するために使用される。本明細書に記載されるプライマーは、標的にハイブリダイズする場合、可変領域に隣接するように設計することができる。可変領域は、少なくとも２つの対立遺伝子、少なくとも２つの個体由来の核酸、または少なくとも２つの核酸が、可変領域に隣接する配列領域と結合される、すなわち、結合する場合、そのような可変領域に隣接するプライマーによって生成されるアンプリコンの塩基組成を決定することによって、互いを分離することができるように、２つ以上の個体または対立遺伝子の間に区別できる塩基組成を有する。一実施形態においては、可変領域は、ＳＴＲ遺伝子座を含む。一態様においては、可変領域は、同じ数であるため、同じ長さであるヌクレオチドを含む２つの区別できる対立遺伝子から生成される２つ以上のアンプリコンの間に区別できる塩基組成を含む。一態様においては、可変領域の塩基組成は、２つ以上の対立遺伝子の間で、長さではなく、配列のみが異なる。
【００６９】
本明細書において使用されるように、「アンプリコン」および「増幅産物」という用語は、本明細書に記載されるプライマー対および方法を使用して、生成されるか、または生成が可能な核酸を指す。特に、「ＳＴＲタイピングアンプリコン」とも称される「ＳＴＲを同定するアンプリコン」、「ＳＴＲタイピング増幅産物」および「ＳＴＲを同定する増幅産物」は、ＳＴＲ遺伝子座での個々の核酸に対して遺伝子型を決定する（または、特定の対立遺伝子を特定する）ために使用することができるアンプリコンである。一部の実施形態においては、ＳＴＲタイピングアンプリコンは、電子ＰＣＲおよびプライマー対の電子表示を使用するコンピュータによる方法を使用して生成される。コンピュータによる方法を使用して生成されるアンプリコンは、データベースにデータを投入するために使用することができる。アンプリコンは、好ましくは、二本鎖ＤＮＡであるが、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ：ＲＮＡであり得る。アンプリコンは、保存領域／プライマー対および介在可変領域の配列を含む。本明細書において論じられるように、プライマー対は、２つ以上の対立遺伝子からアンプリコンを生成するように設計される。いかなるアンプリコンの塩基組成も、プライマー対、プライマー対の相補体、保存領域およびアンプリコンを生成するように増幅された核酸由来の可変領域を含む。当業者にとって当然のことながら、任意のアンプリコンへの設計されたプライマー対配列の組み込みは、プライマー結合部位にある天然配列、およびその相補体を置換する。プライマーを使用した標的領域の増幅後、プライマー配列を含む得られたアンプリコンは、分子量データを生成する。プライマー結合部位に任意の天然配列を有するアンプリコン、またはその相補体は、それらの低い存在度のため検出不可能である。それは、任意の特定のプライマー対を使用して１つもしくは複数の対立遺伝子から１つもしくは複数の核酸を同定する場合に考慮される。アンプリコンは、質量分析に適応する長さをさらに含む。ＳＴＲを同定するアンプリコン（ＳＴＲタイピングアンプリコン）は、好ましくは、ＳＴＲ対立遺伝子の同一性に特有の塩基組成シグニチャを生成する。
【００７０】
好ましくは、アンプリコンは、約４５〜約２００個の連続する核酸塩基を含む（すなわち、約４５〜約２００個の連結したヌクレオシド）。当業者にとって当然のことながら、この範囲は、明確に、長さ45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199,および２００個の核酸塩基の化合物を表す。さらに、当業者にとって当然のことながら、上述の範囲は、アンプリコンの長さに対する絶対的制限ではなく、その代わりに好ましい長さの範囲を表す。この範囲に該当しないアンプリコンの長さも、アンプリコンが、本明細書において開示される塩基組成シグニチャに対して計算可能である限り、本明細書に含まれる。本明細書において使用されるように、「約」という用語は、±１０％を包含することを意味する。例えば、約２００個のヌクレオチドは、１８０〜２２０個のヌクレオチドを包含する範囲を指す。
【００７１】
本明細書において使用されるように、「分子量」という用語は、質量分析を使用して決定される化合物の質量を指す。本明細書においては、化合物は、好ましくは、核酸、より好ましくは、二本鎖核酸、さらにより好ましくは、二本鎖ＤＮＡ核酸であり、最も好ましくは、アンプリコンである。核酸が二本鎖である場合、分子量は、両方の鎖に対して決定される。ここで、鎖は、質量分析計に導入される前に分離されるか、または質量分析計によって分離されるかのいずれかである（例えば、エレクトロスプレーイオン化は、ハイブリダイズした鎖を分離する）。各鎖の分子量は、質量分析計によって測定される。
【００７２】
本明細書において使用されるように、「塩基組成」という用語は、アンプリコンの鎖におけるこれらの残基の線状配列を考慮せずに、アンプリコンを含む各残基の数を指す。アンプリコン残基は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン、（Ｃ）、（デオキシ）チミジン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、イノシン（Ｉ）、５−ニトロインドールまたは３−ニトロピロール等のニトロインドール、ｄＰまたはｄＫ（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、５−ニトロインダゾールを含有する非環式ヌクレオシド類似体（Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，１０５３−１０５６）プリン類似体１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾール−４−カルボキサミド、２，６−ジアミノプリン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、Ｇ−クランプを含むフェノキサジン、５−プロピニルデオキシ−シチジン、デオキシ−チミジンヌクレオチド、５−プロピニルシチジン、５−プロピニルウリジン、および７−デアザ−２’−デオキシアデノシン−５−三リン酸、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、４−チオチミジン−５’−三リン酸、５−アザ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、Ｎ２−メチル−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、８−オキソ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸またはチオチミジン−５’−三リン酸を含む、それらの質量タグ改変バージョンを含む。一部の実施形態においては、質量改変核酸塩基は、１５Ｎまたは１３Ｃまたは１５Ｎおよび１３Ｃの両方を含む。好ましくは、本明細書において使用される非天然のヌクレオシドは、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシンおよびイノシンを含む。本明細書において、未改変ＤＮＡアンプリコンに対する塩基組成は、ＡｗＧｘＣｙＴｚとして記録され、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、アンプリコンにおけるヌクレオシド残基の数を表す整数である。改変されたヌクレオシドを含むアンプリコンに対する塩基組成は、同様に、アンプリコンにおける天然の改変されたヌクレオシドの数を示すように記録される。塩基組成は、以下に記載されるように、アンプリコンの分子量測定から計算される。その後、いかなるアンプリコンに対する計算された塩基組成も、塩基組成のデータベースと比較される。一実施形態においては、データベースは、ＳＴＲタイピングアンプリコンの塩基組成を含む。計算された塩基組成と単一のデータベースエントリとの間の一致は、個体の標的核酸または遺伝子型の同一性を明らかにする。
【００７３】
本明細書において使用されるように、「塩基組成シグニチャ」という用語は、任意の１つの特定のアンプリコンによって生成される塩基組成を指す。
【００７４】
本明細書において使用されるように、「データベース」という用語は、塩基組成または分子量データの集合を指すために使用される。データベースにおける塩基組成および／または分子量データは、特定の個体（対象）、対立遺伝子、または参照対立遺伝子および特定のＳＴＲを同定するアンプリコンおよびプライマー対に対してもインデックスされる。一実施形態においては、データは、特定のＳＴＲ遺伝子座に対してインデックスされる。本明細書において使用されるように、「参照対立遺伝子」は、特定の塩基組成、長さ、分子量、大きさおよび／または遺伝子型を有することを以前に決定されている、データベースに含まれる対立遺伝子である。参照対立遺伝子は、本明細書において提供されるプライマー対およびアンプリコンに対してインデックスすることができる。データベースにおいて報告される塩基組成データは、各プライマーを使用して各対立遺伝子または個体に対して生成されるアンプリコンにおける各ヌクレオシドの数を含む。データベースは、実験に基づいたデータを投入することができる。データベースにデータを投入するこの態様においては、特定の対立遺伝子を有するか、特定の個体からの核酸が選択され、アンプリコンを生成するためにプライマー対が使用される。アンプリコンの分子量は、質量分析計およびそれから計算された塩基組成を使用して決定される。データベースにおける任意のエントリは、塩基組成を、対立遺伝子または個体および使用したプライマー対と関連付けるために作成される。データベースは、対立遺伝子または個々の核酸情報を含む別のデータベースを使用してデータを投入することもできる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを使用して、プライマー対の電子表示を使用した電子ＰＣＲを行うことが可能である。データベースは、ＦＢＩデータベース等の別のデータベースからデータを投入することができる。このコンピュータによる方法は、データベースに保存された任意またはすべての選択された対立遺伝子および／または個体に対する塩基組成を提供する。その後、情報は、上に記載される塩基組成データベースにデータを投入するために使用される。塩基組成データベースは、コンピュータによる、書面の表、参考書、集計表または一般的にデータベースに適した任意の形態であり得る。好ましくは、コンピュータによるものである。
【００７５】
本明細書において使用されるように、「核酸塩基」という用語は、「ヌクレオチド」、「デオキシヌクレオチド」、「ヌクレオチド残基」、「デオキシヌクレオチド残基」、「ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）」、またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む、当技術分野での使用における別の用語と同意の語である。本明細書において使用されるように、核酸塩基は、本明細書に記載されるように、天然の改変された残基を含む。
【００７６】
本明細書において使用されるように、「ウォッブル塩基」は、ＤＮＡトリプレットの第３のヌクレオチド位置で見られるコドンの変異である。配列の保存領域における変異は、アミノ酸暗号における冗長のため、第３のヌクレオチド位置で、しばしば見られる。
【００７７】
「相同性」、「相同」および「配列同一性」という用語は、同一性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性がある場合がある。部分的な相同配列とは、別の配列との同一が１００％未満の配列である。配列同一性の決定は、次の例において説明する。他の点では別の２０個の核酸塩基のプライマーと同一であるが、２つの非同一の残基を有する、長さ２０個の核酸塩基のプライマーは、２０個のうち１８個の同一の残基を有する（１８／２０＝０．９または９０％の配列同一性）。別の例においては、すべての残基が長さ２０個の核酸塩基のプライマーの１５個の核酸塩基のセグメントと同一の、長さ１５個の核酸塩基のプライマーは、２０個の核酸塩基プライマーとの１５／２０＝０．７５または７５％の配列同一性を有する。本発明においては、配列同一性は、問合せ配列および対象配列が、両方とも記載され、５’から３’の方向に整列される場合、適切に決定されることを意図する。ＢＬＡＳＴ等の配列整列アルゴリズムは、２つの異なる整列方向に結果を返す。プラス／プラス方向では、クエリー配列および対象配列は、５’から３’の方向に整列される。一方、プラス／マイナス方向では、クエリー配列は、５’から３’の方向にあるが、対象配列は、３’から５’の方向にある。当然のことながら、本発明のプライマーに関して、配列同一性は、整列がプラス／プラスに指定される場合、適切に決定される。配列同一性は、増幅反応におけるハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長に対して、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの通常の核酸塩基と機能的に同様の様式で挙動する、代替または「改変された」核酸塩基を包含することもできる。限定されない例においては、５−プロピニルピリミジンプロピンＣおよび／またはプロピンＴが、１つのプライマーにおける１つもしくは複数のＣまたはＴ残基を置換し、さもなくばこのプライマーの配列および長さが別のプライマーと同一である場合、これら２つのプライマーは、互いに１００％の配列同一性を有する。別の限定されない例においては、イノシン（Ｉ）は、ＧまたはＴの代替として使用され、効果的にＣ、ＡまたはＵ（ウラシル）にハイブリダイズすることができる。そのため、イノシンが、１つのプライマーにおける１つもしくは複数のＣ、ＡまたはＵ残基を置換し、さもなくばこのプライマーの配列および長さが別のプライマーと同一の場合、これら２つのプライマーは、互いに１００％の配列同一性を有する。ハイブリダイゼーションおよび増幅反応に対して、機能的に同様の様式で挙動する、他のそのような改変された塩基、またはユニバーサル塩基が存在する場合があり、当然のことながら、それらの塩基は、配列同一性のこの定義に該当する。
【００７８】
本明細書において使用されるように、「三角同定」は、核酸または個体の同定またはタイピングに必要なアンプリコンを生成するための、１つよりも多いプライマー対、２つ以上のプライマー対、３つ以上のプライマー対、または複数のプライマー対の使用を意味する。２つ以上のプライマー対は、個々のウェルまたは多重ＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。「多重」アッセイにおいて、本明細書において提供される方法は、同時に２つ以上のプライマー対で行うことができる。代替として、ＰＣＲ反応は、各ウェルに異なるプライマーを含む単一ウェルにおいて行うことができる。増幅後、アンプリコンは、後に分子量分析に使用される単一ウェルまたは容器にプールする。プールされたアンプリコンの組み合わせは、個々のアンプリコンの分子量の予測された範囲が、重複せず、シグナルの同定を複雑にしないように、選択することができる。三角同定は、消去プロセスとしての役割を果たし、第１のプライマー対は、不明の対立遺伝子が、対立遺伝子群の１つであるかもしれないことを識別する。次のプライマー対は、前のプライマー対により生成された可能性のサブセット間にある対立遺伝子の同一性をさらに高めるために、三角同定において使用される。三角同定は、対立遺伝子の同一性が決定されると完了する。三角同定工程は、偽陰性および偽陽性シグナルを低減させるためにも使用される。代替として、２つ以上のプライマー対を、多重アッセイにおいて使用する場合、アンプリコンの組み合わせは、同時に生成され、同時に分析することができ、複数の得られた分子量または塩基組成を、多重アッセイにおいて使用した異なるプライマー対に対してインデックスされる、データベースにおける複数のアンプリコンと比較する。
【００７９】
アンプリコン、および質量および塩基組成を決定するためのＥＳＩ−ＭＳを使用した、核酸を含む試料のＳＴＲタイピングを含む、無作為法医学的分析および個体識別鑑定を対象とする方法および組成物が、本明細書において提供される。本明細書における方法は、個体に対するＤＮＡプロファイルを得るために、順々に使用することができる明確な塩基組成（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの数）を産出するための相当な精度を提供する。重要なことに、これらの塩基組成プロファイルは、ＳＴＲまたは別の法医学的マーカープロファイルから得られた既存の法医学的データベースに対して参考することができ、および／またはそのようなデータベースに追加することができる。本方法では、分子量および塩基組成を使用して特定の対立遺伝子を得るため、本明細書において提供される方法および組成は、従来の電気泳動的ＳＴＲタイピング分析によって検出不可能となる、ＳＴＲ領域内のＳＮＰを検出することが可能である。例えば、Ｄ５Ｓ８１８マーカーに対するすべての「対立遺伝子型１３」は、同等ではなく、中には、ＧからＴ（Ｇ→Ｔ）のＳＮＰを含有するものもあり、「通常の」対立遺伝子型１３を含有する個体からそれらを区別する。同様に、この対立遺伝子に対してホモ接合性としてタイプされる個体は、実際に、対立遺伝子１３および対立遺伝子１３G/T_ＳＮＰを含有する対立遺伝子１３を含有するヘテロ接合体であり得る。これらの種類の変化は、ＳＴＲ対立遺伝子を解析するための電気泳動による大きさの識別方法を使用する標準ＳＴＲタイピング方法およびキットによって検出されない。
【００８０】
好ましい実施形態においては、アンプリコンは、ＳＴＲを同定するアンプリコンまたはＳＴＲを同定する増幅産物である。この実施形態においては、プライマーは、増幅することができ、分子量の決定が可能なＳＴＲタイピングアンプリコンを産出するために、試料から得られた、可変核酸配列領域に隣接する核酸の保存配列領域にハイブリダイズするように選択される。塩基組成は、アンプリコンにおける各ヌクレオチドの数を示す分子量から計算される。その後、アンプリコンの分子量または対応する塩基組成または塩基組成シグニチャは、対立遺伝子および／または個体に対してインデックスされる分子量または塩基組成シグニチャ、およびアンプリコンを生成するために使用されたプライマー対を含むデータベースと比較される。決定された分子量または計算された塩基組成と、データベースにおける分子量または塩基組成との一致は、試料由来の核酸を、データベースにおいてインデックスされた対立遺伝子または個体と関連付ける。場合によっては、試料または特定の対立遺伝子からの核酸は、２つ以上の個体または同一性と関連する。これらの場合、１つもしくは複数の追加のプライマー対は、１つもしくは複数の追加のアンプリコンを生成するために、後または同時のいずれかに使用される。１つもしくは複数の追加のアンプリコンの質量および塩基組成は、決定／計算され、本明細書において提供される方法は、結果をデータベースと比較するために使用され、さらに試料を特徴付け、好ましくは同定する。この種類の分析は、三角同定、または多重アッセイを使用して、本明細書に記載するように実行することができる。本方法は、迅速な高性能の分析を提供し、試料由来の核酸の同定のための核酸配列を必要としない。
【００８１】
一実施形態においては、方法は、多重反応において、２つ以上のプライマー対で実行される。一態様においては、方法が、多重反応において実行される場合、高マグネシウム、例えば、３ｍＭ塩化マグネシウムを有するＰＣＲ試薬を使用することが有利である場合がある。当技術分野で周知のように、そのような試薬は、増幅産物のアデニル化を促進する。一実施形態においては、試料におけるごく少量の増幅産物のアデニル化、例えば、別の産物とわずかに異なる長さの少量の増幅産物の生成がある場合に生じることがある、分裂ピークの結果を最小化することが有利である。そのため、好ましい態様においては、完全またはほぼ完全なアデニル化を促進することが望ましい。一態様においては、プライマー対は、順方向および逆方向プライマーの１つまたは両方が、５’末端にＣまたはＧ核酸塩基を含むように、完全なアデニル化を促進するように構成される。サイクル反応における温度は、例えば、約６１℃のアニール温度を使用することによって、有効性を保持しながら、完全なアデニル化を促進するために調節することもできる。
【００８２】
一部の実施形態においては、本明細書に記載するプライマーによって生成される、分子量の決定が可能なアンプリコンは、分子量決定の特定の方法に対応する長さの予測可能な断片を得るために、分子量決定の特定の方法に対応するか、または予測可能なフラグメンテーションパターンを提供する手段に対応する長さ、大きさまたは質量のいずれかである。アンプリコンの予測可能なフラグメンテーションパターンを提供するそのような手段は、例えば、制限酵素または開裂プライマーでの開裂を含むが、これらに限定されない。そのため、一部の実施形態においては、アンプリコンは、２００核酸塩基より大きく、制限消化に続く分子量の決定が可能である。制限酵素および開裂プライマーを使用する方法は、当業者に周知である。
【００８３】
一部の実施形態においては、アンプリコンは、分子生物学分野における当業者にとって慣用の方法である、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得られる。一部の実施形態においては、ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して遂行され、ポリメラーゼ連鎖反応は、ポリメラーゼ酵素によって触媒され、その機能は、天然ポリメラーに対して改変される。一部の実施形態においては、改変されたポリメラーゼ酵素は、突出末端を有する消化産物を平滑末端消化産物に変換するために、突出末端を有する制限消化産物へのヌクレオチド残基の添加を触媒する、エキソ（−）Ｐｆｕポリメラーゼである。別の増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、低ストリンジェンシー単一プライマーＰＣＲ、および複数鎖置換増幅（ＳＤＡ）等を使用することができる。これらの方法も、当業者に周知である（Ｍｉｃｈａｅｌ，ＳＦ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９４），１６：４１１−４１２およびＤｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００２），９９，５２６１−５２６６）。
【００８４】
ＰＣＲ産物の質量分析（ＭＳ）に基づく検出は、複数の利点を有するＢＣＳの決定のための手段を提供する。すべての増幅産物はその分子量によって同定されるため、ＭＳは、本質的に、放射または蛍光標識の必要性がない並列検出スキームである。質量分析における分野の現状では、フェムトモル量未満の物質が、試料の分子含有量に関する情報を得るために容易に分析できる。物質の分子量の正確な評価は、試料の分子量が数百、または十万を超える原子質量単位（ａｍｕ）またはダルトンであるかどうかに関わらず、即座に得ることができる。無傷の分子イオンは、試料を気相に変換する多様なイオン化技術の１つを使用して、増幅産物から生成することができる。これらのイオン化方法は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳ）、マトリクス補助レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）および高速原子衝撃（ＦＡＢ）を含むが、これらに限定されない。例えば、核酸のＭＡＬＤＩにおける使用のためのマトリクスの例とともに、核酸のＭＡＬＤＩは、国際公開特許第ＷＯ９８／５４７５１号に記載されている。大きいＤＮＡに対する分子量の正確な測定は、各鎖に対するＰＣＲ反応由来の陽イオンの内転（ａｄｄｕｃｔｉｏｎ）、天然存在度１３Ｃおよび１５Ｎ同位体由来の同位体ピークの分解能、および任意のイオンに対する荷電状態の割り当てによって制限される。陽イオンは、流れに対して直角の電場勾配の存在下において、ＰＣＲ産物を含有する溶液を、酢酸アンモニウムを含有する溶液に接触させる、流水式チップを使用する直列透析によって除去される。後者２つの問題は、＞１００，０００の分解能で作用し、同位体的に枯渇したヌクレオチド三リン酸をＤＮＡに組み込むことによって対処される。器具の分解能も考慮される。１０，０００の分解能では、８４ｍｅｒのＰＣＲ産物の［Ｍ−１４Ｈ＋］１４の荷電状態からのモデル化されたシグナルは、十分に特徴付けられていなく、荷電状態または正確な質量の割り当ては、不可能である。３３，０００の分解能では、個々の同位体構成要素からのピークは、明らかである。１００，０００の分解能では、同位体ピークは、ベースラインまで解析され、イオンに対する荷電状態の割り当ては、単純である。［１３Ｃ，１５Ｎ］−除去三リン酸は、例えば、除去培地上に有機体を成長させ、ヌクレオチドを収集することによって得られる（Ｂａｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，４５１５−４５２３）。
【００８５】
無傷の核酸領域の質量測定は、適切であると考えられるが、タンデム質量分析（ＭＳｎ）技術は、分子の同一性または配列に関するより決定的な情報を提供することができる。タンデムＭＳは、分離および検出ステップの両方が質量分析に基づく、質量分析の２つ以上の段階の連結した使用を伴う。第１の段階は、さらなる構造的情報が得られる、試料のイオンまたは構成要素を選択するために使用する。その後、選択されたイオンは、例えば、黒体放射、赤外多光子解離、または衝突活性化を使用してセグメント化する。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって生成されるイオンは、ＩＲ多光子解離を使用してセグメント化することができる。この活性化は、グリコシド結合およびリン酸骨格の解離を引き起こし、ｗ−系列（内部開裂に続く無傷の３’末端および５’リン酸塩を有する）およびａ−塩基系列（無傷の５’末端および３’フランを有する）と称される２系列の断片イオンを生成する。
【００８６】
その後、質量分析の第２の段階は、産物イオンのこれらの得られた断片の質量を検出し測定するために使用する。そのようなイオン選択およびその後のセグメンテーション方法は、試料の分子配列を本質的に完全に解離するために、複数回行うことができる。
【００８７】
同様な分子量の２つ以上の標的がある場合、または単一増幅反応が、２つ以上の参照標準と同じ質量を有する産物をもたらす場合、それらは、質量を改変する「タグ」を使用して区別することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、質量改変されたと考えられる。この実施形態においては、質量の区別を改善するために、未改変塩基と異なる分子量を有するヌクレオチド類似体または「タグ」は、増幅の間に組み込まれる（例えば、５−（トリフルオロメチル）デオキシチミジン三リン酸）。そのようなタグは、例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ９７／３３０００号に記載される。これは、任意の質量と一致する可能性のある塩基組成の数をさらに制限する。例えば、５−（トリフルオロメチル）デオキシチミジン三リン酸は、分離核酸増幅反応においてｄＴＴＰの代わりに使用することができる。従来の増幅産物とタグ付き産物の間の質量変化の測定は、各一本鎖におけるチミジンヌクレオチドの数を定量化するために使用する。鎖は相補的であるため、各鎖におけるアデノシンヌクレオチドの数も決定される。
【００８８】
質量タグ法とは対照的に、好ましい実施形態においては、質量改変されたｄＮＴＰは、塩基対の組み合わせの数をさらに制限し、未改変ｄＮＴＰを使用する場合に解析不可能なＳＮＰを解析するためにも使用される。本特許出願の方法において１３Ｃに富むｄＧＴＰが、どのように使用されるかは、図１８を参照すること。
【００８９】
別の増幅反応においては、各鎖のＧおよびＣ残基の数は、例えば、シチジン類似体５−メチルシトシン（５−ｍｅＣ）または５−プロリニルシトシン（ｐｒｏｌｙｎｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）．プロピンＣを使用して決定される。Ａ／Ｔ反応およびＧ／Ｃ反応の組み合わせ、その後の分子量の決定は、特有の塩基組成を提供する。この方法を表１に要約する。
【００９０】
（表１）
0005680304.tif 000002
【００９１】
表１に示される例においては、質量タグホスホロチオエートＡ（Ａ＊）を使用して炭疽菌クラスタを区別した。炭疽菌（Ａ１４Ｇ９Ｃ１４Ｔ９）は、１４０７２．２６の平均分子量を有し、炭疽菌（Ａ１Ａ＊１３Ｇ９Ｃ１４Ｔ９）は、１４２８１．１１の平均分子量を有し、ホスホロチオエートＡは、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって決定された、＋１６．０６の平均分子量を有した。
【００９２】
別の例においては、各鎖の測定された分子量は、それぞれ、３０，０００．１１５Ｄａおよび３１，０００．１１５Ｄａであり、ｄＴおよびｄＡ残基の測定された数は、（３０、２８）および（２８、３０）であるとする。分子量が、正確に１００ｐｐｍである場合、各鎖に対して可能なｄＧ＋ｄＣの７つの組み合わせが可能である。しかしながら、測定された分子量が、正確に１０ｐｐｍである場合、ｄＧ＋ｄＣの組み合わせは２つのみであり、１ｐｐｍの精度では、各鎖に対して可能な塩基組成は、１つのみである。
【００９３】
質量分析計からのシグナルは、レーダー信号処理等に広く使用される、最尤検出および分類アルゴリズムに入力することができる。処理は、観測されたシグナルおよび平均背景レベルに基づいて作成された対数尤度比を使用して、ベイズ識別器で終了することができる。背景シグナル強度は、推測され、後に控除されるシグニチャを形成するための整合フィルタとともに使用される。最尤処理は、整合フィルタおよびノイズが除去されたデータに対するノイズ共分散の累積合計の推測を使用する同様の方法でこの「ノイズが除去された」データに適用する。
【００９４】
一部の実施形態においては、ＤＮＡ分析は、法医学的試料、例えば、ヒトの唾液、髪、血液、または爪から得られるヒトＤＮＡである。
【００９５】
本明細書において提供される実施形態は、ＤＮＡの高度に保存された配列領域に結合するように設計されるプライマー対を含む。一部の実施形態においては、保存配列領域は、領域ＳＴＲ内で見られる可変部分等の介在可変領域に隣接し、理想的には、法医学的結論を提供するために十分な変動を提供し、分子量分析が可能な増幅産物を産出する。「高度に保存された」という用語は、配列領域が、約８０〜１００％、または約９０〜１００％、または約９５〜１００％の同一性、または約８０〜９９％、または約９０〜９９％、または約９５〜９９％の同一性を示すことを意味する。既定の増幅産物の分子量は、可変領域の変動によって法医学的結論を得る手段を提供する。そのため、プライマーの設計は、異なる個体のＤＮＡにおける最適な変動を有する可変部分の選択を伴う。
【００９６】
一部の実施形態においては、対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：５２、２：５３、３：５４、４：５５、５：５６、５：５７、５：５８、５：５９、６：５６、６：５７、６：５８、６：５９、７：６０、８：６１、９：６１、８：６２、９：６３、９：６４、９：６５、９：６６、１０：６７、１１：６８、１２：６９、１３：７０、１４：７１、１５：７２、１５：７３、１６：７２、１６：７３、１７：７４、１８：７５、１９：７６、２０：７７、２１：７８、２２：７９、２３：８０、２４：８１、２５：８２、２６：８３、２７：８４、２８：８５、２９：８６、３０：８７、３１：８８、３２：８９、３２：９０、３３：９１、３４：９０、３４：９２、３５：９３、３６：９４、３７：９５、３８：９６、３９：９７、４０：９８、４１：９９、４２：１００、４２：１０１、４３：１０２、４４：１０３、４５：１０３、４６：１０４、４６：１０３、４７：１０４、４８：１０５、４９：１０６、５０：１０７、１０９：１１７、１１０：１１８、１１１：１１９、１１２：１２０、１１３：１２１、１１４：１２２、１１５：１２３、１１６：１２４、および５１：１０８のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９７】
一部の実施形態においては、プライマー対がハイブリダイズするＤＮＡの保存配列領域は、ＳＴＲ遺伝子座に隣接する。ＳＴＲ遺伝子座は、コアＣＯＤＩＳ遺伝子座であることが好ましい。
【００９８】
一実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ｖＷＡを含む。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：５２、２：５３、３：５４、および４：５５のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【００９９】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＴＰＯＸである。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：５６、５：５７、５：５８、５：５９、６：５６、６：５７、６：５８、６：５９、および７：６０のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１００】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＴＨ０１である。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：６１、９：６１、８：６２、９：６３、９：６４、９：６５、９：６６、および１０：６７のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０１】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＦＧＡである。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：６８、１１１：１１９、１１２：１２０、および１２：６９のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０２】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ２１Ｓ１１である。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：７０、１０９：１１７、１１０：１１８、および１４：７１のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０３】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ１８Ｓ５１である。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：７２、１５：７３、１６：７２、１１３：１２１、１１４：１２２、および１６：７３のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０４】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ１６Ｓ５３９である。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７：７４、１８：７５、１９：７６、２０：７７、および２１：７８のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０５】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ１３Ｓ３１７である。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２：７９、２３：８０、２４：８１、２５：８２、２６：８３、および２７：８４のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０６】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ８Ｓ１１７９である。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８：８５、２９：８６、３０：８７、および３１：８８のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０７】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ７Ｓ８２０である。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２：８９、３２：９０、３３：９１、３４：９０、３４：９２、および３５：９３のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０８】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ５Ｓ８１８である。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６：９４、３７：９５、３８：９６、３９：９７、および４０：９８のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１０９】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、Ｄ３Ｓである。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１：９９、４２：１００、１１５：１２３、１１６：１２４、および４２：１０１のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１１０】
別の実施形態においては、ＳＴＲ遺伝子座は、ＣＳＦ１ＰＯである。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３：１０２、４４：１０３、４５：１０３、４６：１０４、４６：１０３、４７：１０４のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１１１】
一部の実施形態においては、プライマーは、性決定に使用されるアメロゲニン（ＡＭＥＬ）内の保存配列領域にハイブリダイズする。一態様においては、プライマー対の各メンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８：１０５、４９：１０６、５０：１０７、および５１：１０８のうちの任意の１つもしくは複数で表されるプライマー対の対応するメンバーの配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０１１２】
一実施形態においては、本方法は、複数のプライマー対を使用して行われる。一実施形態においては、プライマー対は、ＡＭＥＬ内の保存領域にハイブリダイズするように設計されたプライマー対、およびｖＷＡ  ＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存領域にハイブリダイズするように設計された別のプライマー対を含む。一態様においては、複数のプライマー対は、４つの追加のプライマー対をさらに含む。一態様においては、該４つの追加のプライマー対は、それぞれ、ＴＰＯＸ、ＴＨ０１、Ｄ８Ｓ１１７９およびＤ５Ｓ８１８  ＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存配列領域内でハイブリダイズするように設計される。別の態様においては、該４つの追加のプライマー対は、それぞれ、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、およびＤ１６Ｓ５３９  ＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存配列領域内でハイブリダイズするように設計される。
【０１１３】
さらなる実施形態においては、プライマー対は、組み合わされ、多重反応において使用される。この多重の実施形態の一態様は、２つの６重反応において１０の遺伝子座を分析するように構成される。この多重の実施形態の別の態様は、５つの３重反応、および３つの１重反応において１４の遺伝子座を分析するように構成される。この態様の好ましい実施形態は、１つの３重反応においてＤ３Ｓ１３５８、ｖＷＡおよびＤ１３Ｓ３１７を標的とするプライマー対、第２の３重反応においてＤ１６Ｓ５３９、ＣＳＦ１ＰＯおよびＴＨ０１を標的とするプライマー対、第３の３重反応においてＴＰＯＸ、ＡＭＥＬおよびＤ８Ｓ１１７９を標的とするプライマー対、第４の３重反応においてＡＭＥＬ、Ｄ７Ｓ８２０およびＤ５Ｓ８１８を標的とするプライマー対、第５の３重反応においてＤ１６Ｓ５３６、ｖＷＡおよびＤ５Ｓ８１８を標的とするプライマー対、第１の１重反応においてＤ２１Ｓ１１を標的とするプライマー対、第２の１重反応においてＦＧＡを標的とするプライマー対、および第３の１重反応においてＤ１８Ｓ５１を標的とするプライマー対で構成される。
【０１１４】
一実施形態においては、複数のプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：５５および５１：１０８で表されるプライマー対を含む。一態様においては、該プライマー対は、４つの追加のプライマー対をさらに含む。一態様においては、４つの追加のプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：６０、１０：６７、３１：８８、および４０：９８で表されるプライマー対を含む。別の態様においては、４つの追加のプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７：１０４、３５：９３、２７：８４、および２１：７８で表されるプライマー対を含む。
【０１１５】
理想的には、プライマーハイブリダイゼーション部位は、プライマーのハイブリダイゼーションを容易にするために高度に保存されている。配列の保存のレベルが低いために、プライマーハイブリダイゼーションがそれほど効率的ではない場合、本明細書において提供されるプライマーは、ハイブリダイゼーションの効率性を改善するために化学的に改変することができる。例えば、種の間でのこれらの保存領域におけるいかなる変異（第３の位置で揺動するコドンのため）もＤＮＡトリプレットの第３の位置で生じる可能性があるため、オリゴヌクレオチドプライマーは、この位置に対応するヌクレオチドが、本明細書において「ユニバーサル塩基」と称される、２つ以上のヌクレオチドと結合することができる塩基となるように、設計することができる。例えば、この「揺動」対合の下では、イノシン（Ｉ）は、Ｕ、ＣまたはＡに、グアニン（Ｇ）は、ＵまたはＣに、およびウリジン（Ｕ）は、ＵまたはＣと結合する。ユニバーサル塩基の別の例では、５−ニトロインドールまたは３−ニトロピロールなどのニトロインドール（Ｌｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，１００１−１００３）、縮退ヌクレオチドｄＰまたはｄＫ（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、５−ニトロインダゾールを含有する非環式ヌクレオシド類似体（Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，１０５３−１０５６）またはプリン類似体１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾール−４−カルボキサミド（Ｓａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９６，２４，３３０２−３３０６）を含む。
【０１１６】
別の実施形態においては、「揺動」塩基による多少弱い結合を補うために、オリゴヌクレオチドプライマーは、各トリプレットの第１および第２の位置が、未改変ヌクレオチドより高い親和性で結合するヌクレオチド類似体によって占められるように、設計される。これらの類似体の例としては、チミンと結合する２，６−ジアミノプリン、アデニンと結合するプロピンＴ（５−プロピニルウリジン）、Ｇと結合するＧ−クランプを含む、プロピンＣ（５−プロピニルシチジン）およびフェノキサジンを含むが、これらに限定されない。プロピニル化ピリミジンは、それぞれ、共同所有され、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号および同第５，４８４，９０８号に記載される。プロピニル化プライマーは、米国特許第１０／２９４，２０３号に特許請求され、共同所有され、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。フェノキサジンは、それぞれ、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５０２，１７７号、同第５，７６３，５８８号、および同第６，００５，０９６号に記載される。Ｇ−クランプは、それぞれ、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００７，９９２号および同第６，０２８，１８３号に記載される。そのため、別の実施形態においては、プライマー対は、５−プロピニルシチジンまたは５−プロピニルウリジン等の少なくとも１つの改変された核酸塩基を有する。
【０１１７】
本明細書において、任意の上述のプライマーによる、ＤＮＡの試料の増幅の工程によって生成される、単離されたＤＮＡアンプリコンも提供される。
【０１１８】
本明細書において提供される方法、化合物および組成物が、特定のその実施形態に従い、具体的に記載されているが、以下の例は、本発明を説明するためのみに役立ち、本発明を限定することを意図するものではない。提供した例は、例示のみであり、当業者にとって当然のことながら、当業者は、別の技術を使用することができ、そのような異なる技術は、本発明の精神から逸脱するものではない（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨ  Ｌａｂ．Ｎ．Ｙ．（２００１））。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：核酸単離および増幅
一般的なゲノムＤＮＡ試料前処理プロトコル：
原試料は、Ｓｕｐｏｒ−２００  ０．２μｍの膜シリンジフィルタ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、ろ過した。試料は、０．４５ｇの０．７ｍｍのジルコニアビーズを前もって充填した１．５ｍｌのエッペンドルフ型チューブに移し、その後、３５０μｌのＡＴＬ緩衝剤（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）を添加した。試料は、Ｒｅｔｓｃｈ  Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｌｌ（Ｒｅｔｓｃｈ）において、１９ｌ／秒の頻度で１０分間ビーズ破砕した。遠心分離の後、試料を、Ｓブロックプレート（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）に移動し、ＢｉｏＲｏｂｏｔ８０００核酸単離ロボット（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）により、ＤＮＡ単離を完了させた。
【０１２０】
血中ＤＮＡの単離
血中ＤＮＡは、メーカが推奨する手順（Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ（登録商標）ＭＤｘキット上での血液ＤＮＡの単離、Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）に従い、ＭＤｘ  Ｂｉｏｒｏｂｏｔを使用して単離した。場合によっては、血液パンチからのＤＮＡを、乾燥血斑に対するメーカが推奨するプロトコルを使用して、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキットで処理した。
【０１２１】
口腔スワブＤＮＡの単離
メーカは、完全なロボットスワブプロトコルを支持しないため、後にＭＤｘロボットのチューブホルダに搭載される１４ｍｌの丸底ファルコンチューブ中の４００ｍｌのＰＢＳ＋４００ｍｌのＱｉａｇｅｎ  ＡＬ緩衝剤＋２０μｌのＱｉａｇｅｎプロテアーゼ溶液に、各スワブをまず懸濁した後、血中ＤＮＡ単離プロトコルを使用した。
【０１２２】
爪および髪からのＤＮＡの単離
以下の手順は、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ（登録商標）組織キットと使用し、メーカが推奨する手順の改変を提示する。髪および爪を、消毒した鋏または剃刀で小切片に切り、１ｍｌの超音波処理用洗浄緩衝剤（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−Ｃｌ、ｐＨ８．０＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加した遠心管に配置した。溶液を２０分の超音波処理に供し、残骸を除去し、その後、１ｍｌ超高純度二重脱イオン水で２回洗浄し、１００μｌのＢｕｆｆｅｒ  Ｘ１（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−Ｃｌ、ｐＨ８．０＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ＋１００ｍＭ  ＮａＣｌ＋４０ｍＭ  ＤＴＴ＋２％ＳＤＳ＋２５０：ｇ／ｍｌ  ＱｉａｇｅｎプロテイナーゼＫ）を添加した。その後、２００μｌのＱｉａｇｅｎ  ＡＬ緩衝剤および２１０μｌのイソプロパノールを添加し、溶液をボルテックスによって混合した後、試料を、５５℃で１〜２時間インキュベートした。その後、試料を、２ｍｌの採血管に配置されたＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ小型回転カラムに添加し、６０００ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離にかけた。採血管および流水は、破棄した。スピンカラムは、新しい採血管に移動し、５００μｌの緩衝剤ＡＷ２を添加し、２０，０００ｇ（１４，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離にかけて膜を乾燥させた。溶出のために、５０〜１００μｌの緩衝剤ＡＥを、ピペットでＤＮｅａｓｙ膜上に直接加え、室温で１分間インキュベートした後、遠心分離（６０００ｇ〜８０００ｒｐｍ）で溶出した。
【０１２３】
ＰＣＲによる増幅
ＤＮＡの増幅のための例示的なＰＣＲ手順は、以下の通りである。総体積が５０μｌの反応混合物は、１Ｘ  ＧｅｎＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ緩衝剤II（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）−１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−Ｃｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４００ｍＭベタイン、２００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ２００４１５）、２５０ｎＭの各プライマー、および２．５〜５単位のＰｆｕエキソ（−）ポリメラーゼＧｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ６００１６３）、および少なくとも５０ｐｇの鋳型ＤＮＡを含有した。すべてのＰＣＲ溶液の混合は、ＨＥＰＡろ過陽圧ＰＣＲフード下で行った。プログラム可能なＰＣＲサイクルプロファイルの例は、以下の通りである。９５℃で１０分、その後、９５℃で２０秒、６２℃で２０秒、および７２℃で３０秒を８サイクル、但し、６２℃のアニールステップは、８サイクルの各連続サイクルに対して１℃下げ、その後、９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、および７２℃で３０秒を２８サイクル、その後、４℃で保持する。多重反応に関して、好ましい実施形態においては、ＰＣＲは、１つのＱｉａｇｅｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲキット、およびその中にある、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む緩衝剤（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）を使用して行う。１ｎｇ鋳型ＤＮＡおよび２００ｍＭの各プライマーは、４０μＬの反応体積に対して使用する。例示的な多重反応に対するサイクル条件は、以下の通りである。
１−９５℃で１５分
２−９５℃で３０秒
３−６１℃で２分（１〜３を３５サイクル）
４−７２℃で３０秒
５−７２℃で１０分
６−６０℃で３０分
７−４℃で保持
【０１２４】
ＰＣＲ反応の開発および最適化は、当業者にとって日常的なものであり、過度の実験をせずに遂行することができる。
【０１２５】
実施例２：核酸精製
市販されているＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）を使用した、ＰＣＲ混合物の半自動精製の手順
ＪｉａｎｇおよびＨｏｆｓｔａｄｌｅｒによって記載されるように（Ｙ．Ｊｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｓ．Ａ．Ｈｏｆｓｔａｄｌｅｒ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，３１６，５０−５７）、増幅された核酸混合物は、陰イオン交換樹脂を含有する、市販されているピペットチップで精製することができる。ＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、ベッドフォード、ＭＡ）の前処理に関して、以下のステップをプログラムし、９６ウェルプレート（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の個々のウェルの原液から取られた液体とともに、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（商標）Ｐ３液体処理器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって行った。ＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸのラックを搭載するステップ、１５μｌの１０％ＮＨ４ＯＨ／５０％メタノールでＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸを洗浄するステップ、１５μｌの水でＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸを８回洗浄するステップ、１５μｌの１００ｍＭのＮＨ４ＯＡｃでＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸを洗浄するステップ。
【０１２６】
ＰＣＲ混合物の精製に関して、２０μｌの粗ＰＣＲ産物は、ＢｉｏＨｉｔ（ヘルシンキ、フィンランド）多チャネルピペットを使用してＭＪ研究用プレートの個々のウェルに移した。９６ウェルプレートの個々のウェルは、３００μｌの４０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で充填した。９６ウェルプレートの個々のウェルは、３００μｌの２０％メタノールで充填した。ＭＪ研究用プレートは、１０μｌの４％ＮＨ４ＯＨで充填した。２つの容器は、脱イオン水で充填した。すべてのプレートおよび容器は、所定の順序で、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３（ＥＰ３）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ボストン、ＭＡ）分注ステーションの水平部分に配置した。以下のステップをプログラムし、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３分注ステーションによって行った。ＥＰ３Ｐ５０ヘッドへ２０μｌの空気を吸引するステップ、ＥＰ３Ｐ５０ヘッドへＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸの前処理されたラックを搭載するステップ、ＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸから２０μｌのＮＨ４ＨＣＯ３を分注するステップ、ＰＣＲ溶液の吸引／分注によって、ＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸへＰＣＲ産物を１８回搭載するステップ、１５μｌの４０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で、結合核酸を含有するＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸを８回洗浄するステップ、１５μｌの２０％メタノールで、結合核酸を含有するＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸを２４回洗浄するステップ、１５μｌの４％ＮＨ４ＯＨで、吸引／分注によってＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）ＡＸから精製された核酸を１８回溶出するステップ。ＥＳＩ−ＭＳによる分析のための最終調製に関して、各試料は、５０ｍＭピペリジンおよび５０ｍＭイミダゾールを含有する７０％メタノールで、１：１の体積に希釈した。
【０１２７】
イオン交換樹脂電磁ビーズを使用する質量分析のためのＰＣＲ産物の溶液捕捉精製
以下の手順は、共同所有され、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２００４年９月１７日出願の公開米国特許出願第ＵＳ２００５−０１３０１９６号に開示される。電磁ビーズに連結されたイオン交換樹脂での核酸の溶液捕捉に関して、２５マイクロリットルのＢｉｏＣｌｏｎｅアミン終端超電磁ビーズの２．５ｍｇ／ｍｌ懸濁液は、約１０ｐＭの典型的なＰＣＲ増幅産物を含有する２５〜５０マイクロリットルのＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応物に添加する。懸濁液は、液体を除去し、その後、電磁ビーズを分離する磁性分離器を使用した後、ボルテックス、ピペットでの取り出し、または振とうによって約５分間混合する。その後、増幅産物を含有する電磁ビーズは、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／５０％メタノールまたは１００ｍＭ重炭酸アンモニウム／５０％メタノールで３回洗浄し、その後、５０％メタノールで３回さらに洗浄する。結合ＰＣＲアンプリコンは、較正基準を含むこともできる、２５ｍＭピペリジン、２５ｍＭイミダゾール、３５％メタノールを含有するエレクトロスプレー適合の溶出緩衝剤で溶出する。この手順ステップは、マルチウェルプレート中で、および液体処理器、例えば、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（商標）Ｐ３液体処理器を使用して、および／またはロボットアームの制御の下で行うことができる。この条件において溶出された核酸は、ＥＳＩ−ＭＳによる分析が可能である。液体処理器を使用する、単一９６ウェルプレートにおける試料の精製に要する時間は約５分である。
【０１２８】
実施例３：質量分析
使用したＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量分析計は、能動的に遮蔽された７テスラ超電導磁石を使用する、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（ビルリカ、ＭＡ）のＡｐｅｘII７０ｅエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）である。能動的遮蔽は、超電導磁石からの縁を成す磁場の大部分を、比較的少ない容量へ制約する。そのため、ＣＲＴモニタ、ロボットの構成要素、および別の電子機器等の、浮遊磁場によって悪影響を受ける場合がある構成要素は、ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量分析計に極めて接近して操作することができる。パルス配列制御およびデータ取得のすべての態様は、ＢｒｕｋｅｒのＸｍａｓｓソフトウェアを実行する１．１ＧＨｚ  ＰｅｎｔｉｕｍIIデータステーション上で行う。２０μＬの試料アリコートは、データステーションによって引き起こされたＣＴＣ  ＨＴＳ  ＰＡＬ自動サンプラ（ＬＥＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、キャルボロ、ＮＣ）を使用して、９６ウェルのマイクロタイタープレートから直接抽出する。試料は、７５μＬ／時間の流速で、ＥＳＩ源に直接注入する。イオンは、ガラス脱溶媒和キャピラリーの金属化された末端から約１．５ｃｍに位置する軸外接地エレクトロスプレープローブを使用する、改変されたＡｎａｌｙｔｉｃａ（ブランフォード、ＣＴ）源において、エレクトロスプレーイオン化によって形成する。ガラスキャピラリーの気圧端は、データ取得の間、ＥＳＩ針に対して６０００Ｖでバイアスされる。乾燥Ｎ２／Ｏ２の逆流を使用して、脱溶媒和工程を援助する。イオンは、質量分析されるトラップ内のイオンセルへの注入の前に、ｒｆ−ｏｎｌｙ  ｈｅｘａｐｏｌｅ、スキマーコーン、および補助ゲート電極から成る外部イオン容器に蓄積する。
【０１２９】
スペクトル取得は、連続負荷サイクル方法で行い、それにより、トラップ内のイオンセルにおけるイオン検出と同時に、イオンは六重極イオン容器に蓄積する。イオンが、トラップ内のイオンセルに移動する、１．２ｍｓの移動イベントの後、イオンに、８０００〜５００ｍ／ｚに対応する１．６ｍｓのチャープ励起を行う。データは、５００〜５０００（２２５Ｋ  Ｈｚのバンド幅にわたる１Ｍデータ点）のｍ／ｚ範囲にわたって取得した。各スペクトルは、３２の過渡信号を補助添加した結果である。過渡信号は、マグニチュード法フーリエ変換および内部質量基準を使用する事後較正の前に、一度、ゼロ充填する。ＩＣＲ−２ＬＳソフトウェアパッケージ（Ｇ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｅ．Ｂｒｕｃｅ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ランドリッチ、ＷＡ、１９９５））は、質量スペクトルのノイズを除去し、ＤＮＡに対して改変された「平均化」フィッティング法（Ｍ．Ｗ．Ｓｅｎｋｏ，Ｓ．Ｃ．Ｂｅｕ，Ｆ．Ｗ．ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９５，６，２２９）を使用して、モノアイソトピック種の質量を計算するために使用する。この方法を使用して、モノアイソトピック分子量を計算する。
【０１３０】
使用されたＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＭｉｃｒｏＴＯＦ（商標）に基づく。ＥＳＩ源からのイオンは、直交イオン抽出し、検出の前にリフレクトロンに集中させる。このＴＯＦは、上記のＦＴＩＣＲに対して説明したものと同じ自動試料処理および流体工学を備える。イオンは、ＦＴＩＣＲ  ＥＳＩ源と同じ軸外噴霧器およびガラスキャピラリーを備える標準ＭｉｃｒｏＴＯＦ（商標）ＥＳＩ源において形成する。結果として、線源条件は、上述のものと同じである。外部イオン蓄積は、データ取得の間のイオン化負荷サイクルを改善するためにも使用する。ＴＯＦ上での各検出イベントは、７５μｓにわたってデジタル化された７５，０００データ点を含む。
【０１３１】
試料送達スキームにより、試料アリコートを高流速でエレクトロスプレー源に急速に注入し、その後、ＥＳＩ感度の改善のためにかなり低い流速でエレクトロスプレーすることが可能となる。試料を注入する前に、移送ラインおよび噴霧針を洗い流し、試料汚染／キャリーオーバーを回避するために、緩衝剤のボーラスを高流速で注入する。洗い流しステップの後、自動サンプラは、次の試料を注入し、流速は、低流に変換する。短い平衡遅延の後、データ取得を開始する。スペクトルが、補助添加されるにつれて、自動サンプラは、継続してシリンジを洗い流し、注射器および試料移送ラインを洗い流すための緩衝剤を補充する。概して、試料のキャリーオーバーを回避するために、２回のシリンジ洗浄および１回の注射器洗浄を要する。決められた選別プロトコルを行なう間、新しい試料混合物は、１０６秒ごとに注入する。より短い取得時間と併用する場合、１分当たり１スペクトルをほんの少し下回る割合で質量スペクトルの取得を容易にするシリンジ針用高速洗浄ステーションも実行した。
【０１３２】
原質量スペクトルは、内部質量基準で事後較正され、モノアイソトピック分子量に対してノイズを除去する。明瞭な塩基組成は、相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの正確な質量測定から得られる。定量的結果は、ピーク高さを、１ウェルにつき５００分子で各ＰＣＲウェルに存在する内部ＰＣＲ較正基準と比較することによって得られる。較正方法は、共同所有され、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６０／５４５，４２５号において開示される。
【０１３３】
実施例４：分子量改変されたデオキシヌクレオチド三リン酸塩を使用する、増幅産物の塩基組成の新たな決定
４つの天然ヌクレオチドの分子量は、比較的狭い分子量の範囲（Ａ＝３１３．０５８、Ｇ＝３２９．０５２、Ｃ＝２８９．０４６、Ｔ＝３０４．０４６、表２を参照）を有するため、塩基組成の割り当てにおける不明確性の持続する根源は、以下のように生じる場合がある。異なる塩基組成を有する２つの核酸鎖は、２つの鎖間での塩基組成の差異が、Ｃ←→Ｔ（＋１５．０００）と組み合わせたＧ←→Ａ（−１５．９９４）である場合、約１Ｄａの差異を有し得る。例えば、Ａ２７Ｇ３０Ｃ２１Ｔ２１の塩基組成を有する１つの９９ｍｅｒ核酸鎖は、３０７７９．０５８の理論的分子量を有するが、Ａ２６Ｇ３１Ｃ２２Ｔ２０の塩基組成を有する別の９９ｍｅｒ核酸鎖は、３０７８０．０５２の理論的分子量を有する。分子量における１Ｄａの差異は、分子量測定の誤差内にあり得るため、４つの天然ヌクレオチドの比較的狭い分子量の範囲は、不確実性因子を与える。
【０１３４】
本例は、１つの質量タグ付ヌクレオチドおよび３つの天然ヌクレオチドを有する核酸の増幅により、この理論的な１Ｄａの不確実性因子を排除するための手段を提供する。
【０１３５】
増幅反応、またはプライマー自体において、有効質量を４つのヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の１つに添加することにより、Ｃ←→Ｔと組み合わせたＧ←→Ａのイベント（表１）から発生する不明確性から生じる、得られた増幅産物の質量における有意差（有意に１Ｄａより大きい）が発生する。そのため、同じ、５−ヨード−Ｃ←→Ｔ（−１１０．９００）イベントと組み合わせたＧ←→Ａ（−１５．９９４）イベントにより、１２６．８９４の分子量の差異が発生する。塩基組成Ａ２７Ｇ３０５−ヨード−Ｃ２１Ｔ２１（３３４２２．９５８）の分子量を、Ａ２６Ｇ３１５−ヨード−Ｃ２２Ｔ２０（３３５４９．８５２）と比較する場合、理論的分子量の差異は、＋１２６．８９４となる。分子量測定の誤差は、この分子量の差異に関して有意ではない。さらに、該９９ｍｅｒ核酸の測定された分子量と一致する唯一の塩基組成は、Ａ２７Ｇ３０５−ヨード−Ｃ２１Ｔ２１である。対照的に、質量タグがない類似の増幅は、１８の可能性のある塩基組成を有する。
【０１３６】
（表２）天然ヌクレオチドおよび質量改変されたヌクレオチド５−ヨード−Ｃの分子量および塩基転位から生じる分子量の差異
0005680304.tif 000003
【０１３７】
実施例５：データ処理
増幅産物の質量スペクトルは、最尤処理、または、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００４０２０９２６０号において記載される、レーダー信号処理に広く使用されるもの等を使用して、独立に分析する。ＧｅｎＸと称されるこの処理装置は、まず、入力データに対して各塩基組成集合のための整合フィルタを実行することによって、各プライマーに対する質量分析計への入力の最尤の推測を行う。これは、各プライマーに対する検量体へのＧｅｎＸ反応を含む。
【０１３８】
該アルゴリズムは、パフォーマンス予測を強調し、天然由来有機体および環境汚染物といった複雑なバックグラウンドを伴う状態に関する、検出の可能性に対する偽陽性の可能性のプロットに至る。整合フィルタは、各病原体に対して使用される一連のプライマーを前提として、信号値の推測的予想から成る。ゲノム配列データベースは、質量塩基数整合フィルタを定義するために使用する。データベースは、周知の細菌性病原体の配列を含み、危険な有機体および良性のバックグラウンド有機体を含む。後者は、バックグラウンド有機体によって生成されるスペクトルの特徴を推測し控除するために使用する。周知のバックグラウンド有機体の最尤検出は、整合フィルタ、およびノイズ共分散の累積合計推定量を使用して行う。バックグラウンドシグナル強度は、推測され、その後控除される特徴を形成するために、整合フィルタとともに使用する。最尤処理は、有機体に対する整合フィルタ、およびノイズが除去されたデータに対するノイズ共分散の累積合計推定量を使用する同様の方法で、この「ノイズが除去された」データに適用する。
【０１３９】
各プライマーに対するアンプリコンを同定する病原体のすべての塩基組成の振幅を、較正し、１つの有機体当たりの最終最尤振幅推定量を、複数の単一プライマー推定量に基づいて作成する。すべてのシステムノイズのモデルは、この二段階最尤計算に組み込む。該処理装置は、スペクトルに含有される各塩基組成の分子数を報告する。適したプライマーセットに対応する増幅産物の量は、増幅反応の完了時に残るプライマーの量とともに報告する。
【０１４０】
当業者は、この実施例のシグナル処理法が、本明細書に記載されるＳＴＲ分析の方法の中で使用することができることを認識する。
【０１４１】
実施例６：同位体欠失ｄＮＴＰを有する核酸の増幅
１３Ｃおよび生体高分子における別の重同位体の天然存在度のため、正確な質量測定は、分子量が増えるにつれてより困難である。さらに、同位体分布の幅は、本質的に、高分子量でより広いため、正確なモノアイソトピック分子量測定を困難にする。単一のアンプリコンからのシグナルが、より多くの同位体ピークに拡大するにつれて、固有の感度損失も存在する。タンパク質のＥＳＩ−ＭＳ分析でも、類似する問題が生じる。
【０１４２】
ＰＣＲ反応での使用に対して適切な同位体欠失ｄＮＴＰは、主な炭素源が、１３Ｃ欠失グルコースおよび１５Ｎ欠失硫酸アンモニウムである、同位体欠失培地で成長する細菌から生成することができる。一旦細菌を、臨界密度まで増殖させ、同位体欠失ゲノムＤＮＡを抽出する。その後、ＤＮＡを、デオキシヌクレオチド三リン酸が酵素的に合成される元となるモノヌクレオチドに消化する。この方法により、わずかな費用で、同位体欠失試薬を製造することが可能となるはずである。この方法に対する原理証明は、近年、Ｔａｎｇおよび共同研究者らによって公開された（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，７４，２２６−２３１）。同位体欠失ＰＣＲ産物を生成することによって、感度が３〜５倍改善されることが期待される（シグナルが、より少数の同位体ピーク上で拡大するため）。より重要なことには、この方法は、質量スペクトルで見られるスペクトルの混雑を軽減し、同様の質量またはｍ／ｚの種が、重複ＭＳピークを生成する程度を低減させるはずである。
【０１４３】
実施例７：法医学的ＤＮＡタイピング／ヒト個体識別鑑定に対するプライマー対の設計
図１ａは、プライマー設計を含む、ＳＴＲアッセイの開発のための一般的方法を概説するフロー図である。プライマーは、この図に概説する手順に従って、１３のコアＣＯＤＩＳ遺伝子座およびアメロゲニン（図１ｂに示される）のそれぞれに対して設計した。対立遺伝子参照配列は、各ＳＴＲ遺伝子座に対して、公的に入手可能な短鎖タンデム反復インターネットデータベース（ＳＴＲＢａｓｅ）から得られ、複数のプライマーは、各ＳＴＲ遺伝子座に対して設計した。複数のプライマーは、ＳＴＲ反復に隣接するか、または（極めて接近して）ほぼ隣接する保存配列領域にハイブリダイズするように設計した。例えば、表３は、ＴＨ０１（ＨＵＭＴＨ０１とも称される）ＳＴＲ遺伝子座に隣接する保存領域内でハイブリダイズするように設計した（図２に示されるように）複数のプライマーを記載する。これらのプライマーは、表５にも記載する。表３は、対立遺伝子９をそれぞれのプライマー対で増幅する場合に予測したアンプリコンの長さ、および特徴付けられた対立遺伝子に基づくアンプリコンの予測した範囲を示す。
【０１４４】
（表３）ＨＵＭＴＨ０１ ＳＴＲ遺伝子座に対するプライマー対の選択
0005680304.tif 000004
【０１４５】
図３においてＴＨ０１に対して例示するように、各ＳＴＲ遺伝子座に対する反復構造（反復配列の単位）は、その後、予測質量、および、可変領域（反復配列）および特徴付けた各対立遺伝子に対してプライマーがハイブリダイズする隣接配列を含む、ＳＴＲを同定する予測アンプリコンの塩基組成を含むデータベースを構築するために使用した。塩基組成および分子量は、データベースにおけるプライマー対および対立遺伝子に対してインデックスした。
【０１４６】
表４は、対応するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号とともに、１３のＣＯＤＩＳ  ＳＴＲおよびＡＭＥＬ遺伝子座のそれぞれに対するプライマーを設計するために使用する参照対立遺伝子を示す。
【０１４７】
（表４）ＣＯＤＩＳＳＴＲ／ＡＭＥＬに対するプライマー対の設計のための参照対立遺伝子、および予測アンプリコンの長さ
0005680304.tif 000005
【０１４８】
１３のＣＯＤＩＳ  ＳＴＲ対立遺伝子およびＡＭＥＬに対して設計されたプライマー対を表５に記載する。この表における順方向および逆方向プライマーの名称は、上述の標準的プライマー対の命名に従う。
【０１４９】
（表５）ヒトＳＴＲ  ＤＮＡ分析における使用のために設計したプライマー対
0005680304.tif 000006
0005680304.tif 000007
0005680304.tif 000008
0005680304.tif 000009
0005680304.tif 000010
0005680304.tif 000011
0005680304.tif 000012
【０１５０】
実施例８：ＰＣＲおよび質量分析を使用する初回プライマー対試験
初回プライマー試験は、標準ＰＣＲ反応および本明細書に記載した方法を使用して行った。一例においては、初回試験に関して、鋳型は、内部標準Ｓｅｒａｃａｒｅ血液試料Ｎ３１７７３由来の１０〜２０ｎｇのＤＮＡであった。５０μＬ反応試料（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４００ｍＭベタイン、２００μＭ各ｄＮＴＰ、２５０μＭ各プライマーおよび４単位のＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標））を、５４℃のアニール温度による３５サイクル反応に供し、さらなる分析（図７に示す）のために選択した４％アガロースゲル上および好ましいプライマーにより解析した。
【０１５１】
プライマー有効性の初回検証の後、増幅産物の分子量を、ＦＴＩＣＲ−ＭＳおよびＴＯＦ−ＭＳの両方を使用して決定した。８つのＴＰＯＸプライマー対に対する分子量の決定の例を図４に示す。塩基組成は、本明細書において提供した方法を使用して分子量から計算した。分子量および塩基組成は、上述のコンピュータによって構築したプライマー対に対してインデックスした参照（事前に特徴付けられた）対立遺伝子のデータベースと比較した。対立遺伝子コール（ＳＴＲ型の同定）を、個別に各産物鎖を使用して作成し、両鎖を使用してコールを確証する。ほとんどの遺伝子座に対する対立遺伝子は、構築したデータベースから直接同定した。しかしながら、場合によっては、事前に特徴付けた対立遺伝子を使用して構築したデータベースにおいて、直接一致は見つからなかった。、ＳＴＲ対立遺伝子が単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）等の配列多型を含み、事前に特徴付けたか、または公知の対立遺伝子と同じ配列の長さを有するが、特徴付けた対立遺伝子と比較して異なる塩基組成を含む対立遺伝子を、本明細書において提供した方法によって解析した場合に、この一致の欠如が生じた。特徴付けた対立遺伝子１３と比較した、ＡからＴへの（Ａ→Ｔ）ＳＮＰを含んだＤ１３Ｓ３１７遺伝子座由来の対立遺伝子に対する、そのような一例を図５に示す。初回にデータ投入したデータベースとの一致が存在しない場合、長さおよび塩基組成は、アンプリコンの両鎖由来の分子量およびデータベースに追加された情報を使用して得た。初回試験においては、図６に示すように、５８のＳＴＲプライマー対を、内部陽性対照試料を使用して分析した。対立遺伝子は、１つのプライマー対を除くすべてのプライマー対に対してマップした。ＦＴＣＩＲ−ＭＳおよびＴＯＦ−ＭＳを使用して、同様の結果を得た。
【０１５２】
実施例９：種特異性、対照、感度、再現性および正確性試験
ヒトＳＴＲを標的とするように作成したすべてのプライマー対に関して、グラム陽性およびグラム陰性菌、酵母を含む、複数のヒト以外のＤＮＡ源、および２つのヒト以外の哺乳類（ネコおよびイヌ）由来のＤＮＡ源から単離したＤＮＡに対してアッセイを行うことにより、ヒトＤＮＡに対する特異性を試験する。ヒトＤＮＡの１０倍までの過剰量のヒト以外のＤＮＡを、ヒト標的プライミングまたは完全なデータ処理および分析の結果に干渉するその能力に対して試験する。血液および唾液から得た、複数の十分に特徴付けたＤＮＡ試料は、本明細書において提供した方法に対する陽性対照としての役割をし、核酸を有しない水は、陰性対照としての役割をする。
【０１５３】
感度限界は、鋳型として少なくとも５つの異なるドナーＤＮＡ試料を使用して、希釈・消滅（ＤＴＥ）実験によって確立される。血液由来のＤＮＡ試料を、これらの研究に使用する。感度は、試験するすべての鋳型に関して、同じ鋳型に対する２回の再現性実験において完全で正確なプロファイルを産出するＤＮＡの最も低いインプットとして定義する。確実な感度は、アッセイに対する絶対感度限界より２〜１０倍のインプット鋳型の量として、保存的に定義する。感度は、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒアッセイ（Ｇｒｅｅｎ，Ｒ．Ｌ．；Ｒｏｉｎｅｓｔａｄ，Ｉ．Ｃ．；Ｂｏｌａｎｄ，Ｃ．；Ｈｅｎｎｅｓｓｙ，Ｌ．Ｋ．Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  ２００５，５０，８０９−８２５）によって決定される総ＤＮＡ質量インプット（例えば、ｐｇ）に対して表す。再現性は、５０回以上の３つの異なる鋳型の試験によって評価し、確実な範囲にあると判断したインプットＤＮＡ濃度で同等のタイピング結果を得る能力として定義する。
【０１５４】
アッセイは、ＦＢＩおよびＡＦＤＩＬ研究所によって供給された盲検試料のパネルにより、精度に対して試験されている。これらの研究所は、従来のＳＴＲタイピング方法によって既にタイプされている試料を提供する。口腔スワブ、血液パンチ、またはＤＮＡ抽出物から成る試料は、本明細書において提供した方法によって分析する。最低でも５０〜２５０の様々な試料を、この方法で分析する。
【０１５５】
実施例１０ａ：ＡＦＤＩＬ由来の２５の血斑の予備分析
エレクトロスプレーＴＯＦ−ＭＳを使用して、上述の方法および組成を使用するＳＴＲタイピングに対して、ＡＦＤＩＬから入手した２５の盲検血液試料を使用した。試料は、血液ろ紙パンチとして提供した。１つの試料につき、３つのパンチを試験した。血液パンチは、乾燥血斑に対するプロトコルを使用して、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットで処理した。１２のコアＣＯＤＩＳ  ＳＴＲ遺伝子座およびＡＭＥＬは、上記の方法を使用して分析した。ｖＷＡ、ＴＰＯＸ、ＴＨ０１、ＦＧＡ、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８、およびＤ３Ｓ１３５８に対する２つの別々のプライマー対を、対立遺伝子コールの二重検証のために分析した。ＰＣＲ産物を５３塩基短縮する、Ｄ２１Ｓ１１用に再設計されたプライマー対を使用した。ＡＭＥＬに対して、１つのプライマーのみを使用した。結果を図８に要約する。１つの試料、Ｉ−００６６に関する詳細な結果を図９に示す。図８に示すように、参照配列に対する複数のＳＮＰは、２５の試料において、複数のＳＴＲ遺伝子座に対して同定され、決められたＳＴＲタイピングにおいて使用された一部の遺伝子座が、本質的に、配列において多型であることを証明した。従来のＳＴＲタイピングＰＣＲ方法によってホモ接合性であると同定される個体由来のいくつかの試料は、多型性に基づいてヘテロ接合性であることが明らかとなった。表６は、２５のＡＦＤＩＬ試料および１つの内部陽性対照（Ｎ３１７７３）の、この分析において同定したＳＮＰの結果を要約する。
【０１５６】
（表６）２５のＡＦＤＩＬ試料において同定したＳＮＰ
0005680304.tif 000013
＊Ｄ１３Ｓ３１７対立遺伝子のほとんどは、参照（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇ０９０１７）配列と比較して、Ａ→Ｔ  ＳＮＰを有する。対立遺伝子１６は、Ａ→Ｔ  ＳＮＰを有さなかった。
＊＊Ｄ５Ｓ８１８対立遺伝子のほとんどは、参照（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇ０９０１７）配列と比較して、Ｔ→Ｃ  ＳＮＰを有する。対立遺伝子１７は、Ｔ→Ｃ  ＳＮＰを有さなかった。
【０１５７】
図８および表６で説明したように、各２５の盲検試料に関して、対立遺伝子表示（ＳＴＲ型）を、標準ＳＴＲ法を使用して事前に決定された長さの対立遺伝子データと一致した１３のＣＯＤＩＳ遺伝子座のうちの１２に対して決定した。さらに、ＳＮＰが、標準的方法によって解析不可能であった多数の試料において解析されたという点において、本方法は、以前の方法より高い分解能を提供した。Ｄ２１Ｓ１１の型は、２５の試料のうち１５の試料に対して決定した。１０６の明らかなＳＮＰを、特徴付けられた対立遺伝子に対して同定した。４つのＳＴＲ遺伝子座マーカー（Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、およびｖＷＡ）の場合、特定の試料に対して、従来のＳＴＲタイピングによってホモ接合性として以前に同定され、遺伝子座でヘテロ接合性であることが明らかとなったＳＮＰが見られた。すべての場合において、ＳＮＰは、１２２８で見られるＴ→Ｃ  ＳＮＰおよびＧ→Ａ  ＳＮＰを隠すプライマー対１２２７を例外として、各遺伝子座で使用した２つのプライマー対間で一致した。
【０１５８】
実施例１０ｂ：ＮＩＳＴから事前に抽出した９５の参照試料の予備分析
エレクトロスプレーＴＯＦ−ＭＳを使用して、上述の方法および組成を使用するＳＴＲタイピングに対して、ＮＩＳＴから事前に抽出した９５の参照試料を使用した。１３のコアＣＯＤＩＳ  ＳＴＲ遺伝子座およびＡＭＥＬは、上述の方法を使用して分析した。抽出した試料の分析は、本明細書に記載した多重反応において行った。
【０１５９】
実施例１１：多重ＳＴＲタイピングプライマーおよび方法の作成
同じ反応で２つ以上のＳＴＲ遺伝子座を解析する同じ反応混合物において、同時に２つ以上のプライマー対を使用して、本明細書において提供した方法を行うことが可能な多重反応を開発した。多重化は、エレクトロスプレーＭＳ−ＴＯＦを使用して行なった。初期研究で使用した２つ、３つ、４つおよび６つのプライマー対の組み合わせを、多重作成の初期段階で試験した。多重反応の改善のために、以下の条件を使用した。
２つの６重多重反応における１０遺伝子アッセイ（本明細書に記載したＦＢＩおよびＡＦＤＩＬ試料）
３ｍＭ  Ｍｇ＋＋を含むＱｉａｇｅｎ多重ＰＣＲキット
２００ｍＭの各プライマー
１反応当たり１ｎｇの鋳型
４０μＬ反応
サイクル条件：
１−９５℃で１５分
２−９５℃で３０秒
３−６１℃で２分
４−７２℃で３０秒（２〜４を３５サイクル）
５−７２℃で４分
６−６０℃で３０分
７−４℃で保持
５つの３重および３つの１重反応における１４遺伝子座アッセイ（本明細書に記載したＮＩＳＴ試料）
３ｍＭ  Ｍｇ＋＋を含むＱｉａｇｅｎ多重ＰＣＲキット
１８０ナノモル〜３００ナノモルの各プライマー
１反応当たり１ｎｇの鋳型
４０μＬ反応
１−９５℃で１５分
２−９５℃で３０秒
３−６１℃で２分
４−７２℃で２５秒（２〜４を４０サイクル）
５−７２℃で４分
６−６０℃で３０分
７−４℃で保持
【０１６０】
多重化に関して、ＰＣＲ反応は、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＱｉａｇｅｎ多重反応緩衝剤を使用して行い、好ましいアニール温度として６１℃を使用した。この高マグネシウム濃度（最適な多重化条件を提供する）は、初回試験において、上述の内部標準試料および本来のプライマー対を使用して得られた分裂（＋Ａおよび−Ａ）ピークを示すデコンボリューションされたスペクトルの単一ピーク図を示す図１０ａに示される、鋳型より長い、いくつかのＰＣＲ増幅産物を生じさせることができる、増幅産物の３’末端に対する非鋳型アデニル化に有利に働く。高マグネシウム濃度が望ましいため、ショルダーピークまたは分裂ピークを回避するために、完全なアデニル化に有利に働くように５’末端にＧまたはＣのいずれかを含む８つのＳＴＲ遺伝子座（ＴＨ０１、ＴＰＯＸ、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ５Ｓ８１８、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、およびＤ１６Ｓ５３９）に対して、新規のプライマーを設計した（表５に示す）。サイクル反応最後のステップ６（６０℃で３０分）も、アデニル化に有利に働く。
【０１６１】
図１０ｂは、完全なアデニル化に有利に働く、４つの新規に設計されたプライマー対（番号２８５６、２８２２、２８１８、２８１６）から成る４重反応（同時に使用される４つのプライマー対のセット）を使用して得られた、分裂ピークがない単一ピークスペクトルを示す。別の４つの新規に設計されたプライマー対（２８１５、２８１７、２８１９、および２８２０）を使用する第２の４重反応も試験し、同様の好ましい結果を提供した。そのため、それぞれ、４つの異なるＳＴＲ遺伝子座を解析できる２つの多重反応を作成した。
【０１６２】
それぞれ６つのプライマー対を有する多重反応を作成するために、２つの追加のプライマー対（２８２３−ｖＷＡおよび２８２４−ＡＭＥＬ、表５にも示される）を、各４重反応に添加した。表７は、これらの２つの共通プライマー対を共有する、２つの６重反応プライマー対の群（１および２）を示す。
【０１６３】
（表７）多重ＳＴＲプライマー対
0005680304.tif 000014
【０１６４】
図１１ａおよび図１１ｂは、デコンボリューションされたスペクトル、対立遺伝子の割り当て、および本明細書において提供した方法および各６重反応に対する内部標準試料を使用して生成された対立遺伝子プロットを示す。
【０１６５】
１４遺伝子座の多重反応は、以下の通りに構成した。
（表８）
0005680304.tif 000015
【０１６６】
実施例１２：盲検ＡＦＤＩＬ試料を使用した多重ＳＴＲタイピングプライマーの初回試験
上記の２５の盲検ＡＦＤＩＬ血液パンチ試料は、１反応当たり１ｎｇの鋳型ＤＮＡでの多重化に対する上述の条件を使用した多重反応において、２群の６重プライマーを使用して試験した。結果を図１２に要約する。
【０１６７】
示したように、表７に記載した多重プライマーで試験した遺伝子座に関し、１重タイピング反応で見られたすべてのＳＮＰを含み、１重ＳＴＲタイピングの間で事前に同定されたすべての対立遺伝子が確認された。１重反応において同定されなかったＳＮＰはなかった。そのため、６重プライマー対アッセイでの結果は、１重アッセイと一致した。
【０１６８】
実施例１３：多重プライマーセットを使用する２５の新規ＡＦＤＩＬ盲検試料のＳＴＲタイピング
ＡＦＤＩＬ由来の２５の新規盲検血液パンチを、Ｑｉａｇｅｎ血斑プロトコルを使用して上述のように精製した。ｑＰＣＲ、および６重の多重プライマー混合物および上述の方法を使用するＳＴＲタイピングのために１反応当たり使用した１ｎｇを使用して、ＤＮＡを定量化した。反応は、血液試料ＳＣ３５４９５を陽性対照として、水を陰性対照として使用して、マルチウェルプレートにおいて行った。結果を図１３ａに要約する。図１４に、１つの試料（ＡＦ−１）に対する例を示す。図１３ａに示されるように、ＡＦＤＩＬは、すべての対立遺伝子（長さ）が多重化方法によって同定されたことを確認した。さらに、ＳＮＰ（データベースにおける特徴付けられた対立遺伝子に対する）を、従来のＳＴＲタイピングを使用して検出されなかった２５の試料のうちの２３の試料において、少なくとも１つの遺伝子座で同定した。
【０１６９】
実施例１４：多重プライマーセットを使用する２２の新規ＦＢＩ盲検口腔スワブ試料のＳＴＲタイピング
ＦＢＩ由来の２２の盲検口腔スワブ試料を、ＡＦＤＩＬ試料に対して上述したように、２つの６重の多重プライマーを使用して試験した。試料は、二つ組とし、陰性対照は、水およびＤＮＡを含有しないＦＢＩ−１００とした。結果を図１３ｂに要約する。完全なＳＴＲプロファイル（試験した遺伝子座に対する）を、すべての試料において同定した。２２の試料のうちの２１の試料において、少なくとも１つのＳＮＰが、参照データベースに対して見られた。結果は、対立遺伝子コールの検証のために、ＦＢＩに送付する。
【０１７０】
実施例１５：多重プライマーセットでのＳＴＲタイピングを使用した４７の盲検試料において見られたＳＮＰ変異の概要
図１３ｃは、これらの４７の盲検試料（ＡＦＤＩＬ／ＦＢＩより）に対する、ＳＮＰを有する対立遺伝子の数、ＳＮＰを含有する対立遺伝子コールの割合、および上述の方法を使用して解析された同じ長さのヘテロ接合性遺伝子座の数を示す。本明細書において提供した方法を使用した６重反応で試験したこれらの試料に対する結果から、決められたＳＴＲタイピングにおいて使用した一部の遺伝子座は、配列（産物の塩基組成によって証明された）および長さにおいて本質的に多型であるため、本明細書において提供した方法を使用するＳＴＲタイピングは、法医学的および別のＤＮＡ同定の適用に有用な迅速な自動方法により、分解能の付加的レベルを提供することが証明される。
【０１７１】
実施例１６：ＮＩＳＴから得られた９５の試料の結果
ＮＩＳＴから得られた９５の試料において、多型は、１３のコアＣＯＤＩＳ遺伝子座のうちの１０において見られた。合計３６４の多型対立遺伝子が、１３３０の遺伝子型割り当て（１４遺伝子座でタイプされた９５の試料）において検出された。１３の区別できる変異対立遺伝子は、Ｄ２１Ｓ１１、ｖＷＡにおける１３、Ｄ３Ｓ１３５８における１１、Ｄ５Ｓ８１８における８つ、Ｄ８Ｓ１１７９における７つ、Ｄ１３Ｓ３１７における６つ、Ｄ７Ｓ８２０における４つ、Ｄ１８Ｓ５１における３つ、ＦＧＡにおける２つ、Ｄ１６Ｓ５３９における１つで同定された。表９は、参照対立遺伝子に対して存在するＳＮＰでアノテーションされた多型対立遺伝子とともに、３集団群それぞれに対して見られた各対立遺伝子の頻度を示す。Ｄ３Ｓ１３５８に対する、９５の試料において見られた対立遺伝子の６０％は、参照対立遺伝子に対して多型であった。この遺伝子座に関して、各対立遺伝子の長さは、集団において次の３つの多型変異を有すると考えられる：１塩基対立遺伝子（参照の選択は、多少任意である）、１つのＧ→Ａ  ＳＮＰを有する対立遺伝子、２つのＧ→Ａ  ＳＮＰを有する対立遺伝子。この遺伝子座の配列を報告する２つの過去の研究によって、ＴＣＴＡおよびＴＣＴＧ反復を有する複雑な反復構造が報告されている。これらの研究のうちの１つにおいて、複数の同じ長さの対立遺伝子対が、Ｄ３Ｓ１３５８、ｖＷＡおよびＦＧＡに関する異なる配列構造とともに報告されており、我々の結果と一致する。加えて、我々の結果は、Ｄ３Ｓ１３５８、ｖＷＡおよびＤ２１Ｓ１１における、複数の対立遺伝子の長さに関する、２つ以上の同じ長さの変異の存在を示す（我々は、これらの遺伝子座のそれぞれにおける複数の対立遺伝子長のそれぞれについて、３つの変異を観察した）。表９は、９５のＮＩＳＴ試料と組み合わた、４７のＦＢＩおよびＡＦＤＩＬ試料における多型対立遺伝子に対する観察の全体的な頻度を示す。
【０１７２】
（表９）パート１．ＮＩＳＴ由来の３１人の白人、３２人の黒人および３２人のヒスパニック系の試料における、集団ごとの各対立遺伝子の観察頻度
0005680304.tif 000016
【０１７３】
（表９）パート２．ＮＩＳＴ由来の３１人の白人、３２人の黒人および３２人のヒスパニック系の試料における、集団ごとの各対立遺伝子の観察頻度
0005680304.tif 000017
【０１７４】
したがって、別の実施形態は、質量分析および／または塩基組成分析により対立遺伝子を分析することによって、ＳＴＲ遺伝子座に関する同じ長さに基づく対立遺伝子を有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。したがって、追加の実施形態は、表９に記載されるそれらの多型性を含むが、それらに限定されない、同じ長さに基づく対立遺伝子内で、従来の長さ／大きさに基づくＳＴＲ分析によって解析されない１つもしくは複数の単一ヌクレオチド多型性を検出することによって、ＳＴＲ遺伝子座に関する同じ長さに基づく対立遺伝子を有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。本明細書に記載した各ＳＮＰは、法医学的試料が属する、例えば、白人、黒人またはヒスパニック系の集団に関する情報を提供することが可能である。
【０１７５】
追加の実施形態においては、２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法は、従来の長さ／大きさに基づくＳＴＲ分析が該２つ以上の法医学的試料を解析しない場合に行うことができる。追加の実施形態は、１つもしくは複数のＳＴＲ遺伝子座増幅産物を生成するために１つもしくは複数のＳＴＲ遺伝子座を増幅するステップ、質量分析によってＳＴＲ遺伝子座増幅産物の質量測定を得るステップ、質量測定からＳＴＲ遺伝子座塩基組成を計算するステップ、法医学的ＤＮＡ試料源を同定するために、２つ以上の試料のＳＴＲ遺伝子座塩基組成を、互いに比較する、および／または公知のＤＮＡ試料のＳＴＲ遺伝子座塩基組成のデータベースと比較するステップによって、２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。該方法は、対立遺伝子コールおよび／またはＳＮＰ表示を割り当てるステップをさらに含むことができる。
【０１７６】
別の実施形態は、Ｄ１３Ｓ３１７遺伝子座に対して、Ａ→ＴのＳＮＰに基づく９の対立遺伝子コール、Ａ→ＴのＳＮＰに基づく１０の対立遺伝子コール、Ａ→ＴのＳＮＰに基づく１１の対立遺伝子コール、Ａ→ＴのＳＮＰに基づく１２の対立遺伝子コール、Ａ→ＴのＳＮＰに基づく１２の対立遺伝子コール、Ａ→ＴのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コール、またはＡ→ＴのＳＮＰに基づいて１５の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１７７】
別の実施形態は、Ｄ１６Ｓ５３９遺伝子座に対して、Ｔ→ＣのＳＮＰに基づく９の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１７８】
別の実施形態は、Ｄ１８Ｓ５１遺伝子座に対して、Ｔ→ＣのＳＮＰに基づく１３．２の対立遺伝子コール、Ｔ→ＣのＳＮＰに基づく１５の対立遺伝子コール、またはＴ→ＣのＳＮＰに基づく２０の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１７９】
別の実施形態は、Ｄ２１Ｓ１１遺伝子座に対して、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく２７の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく２９の対立遺伝子コール、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく２９の対立遺伝子コール、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく２９．２の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく３０の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく３０．２の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく３１の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく３１．２の対立遺伝子コール、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく３２の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく３２．２の対立遺伝子コール、Ｔ→ＡのＳＮＰに基づく３４．１の対立遺伝子コール、２Ａ→２ＧのＳＮＰに基づく３６の対立遺伝子コール、または３Ａ→３ＧのＳＮＰに基づく３７の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１８０】
別の実施形態は、Ｄ３Ｓ１３５８遺伝子座に対して、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１４の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１５の対立遺伝子コール、２Ｇ→２ＡのＳＮＰに基づく１５の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１６の対立遺伝子コール、２Ｇ→２ＡのＳＮＰに基づく１６の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１７の対立遺伝子コール、２Ｇ→２ＡのＳＮＰに基づく１７の対立遺伝子コール、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく１７の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１８の対立遺伝子コール、または２Ｇ→２ＡのＳＮＰに基づく１８の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１８１】
別の実施形態は、Ｄ５Ｓ８１８遺伝子座に対して、Ｇ→ＴのＳＮＰに基づく８の対立遺伝子コール、Ｇ→ＴのＳＮＰに基づく９の対立遺伝子コール、Ｇ→ＴのＳＮＰに基づく１０の対立遺伝子コール、Ｇ→ＴのＳＮＰに基づく１１の対立遺伝子コール、Ｇ→ＴのＳＮＰに基づく１２の対立遺伝子コール、Ｇ→ＴのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コール、Ｇ→ＣのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コール、またはＧ→ＴのＳＮＰに基づく１４の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１８２】
別の実施形態は、Ｄ７Ｓ８２０遺伝子座に対して、Ｔ→ＡのＳＮＰに基づく１０の対立遺伝子コール、Ｔ→ＡのＳＮＰに基づく１１の対立遺伝子コール、Ｔ→ＡのＳＮＰに基づく１２の対立遺伝子コール、またはＴ→ＡのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１８３】
別の実施形態は、Ｄ８Ｓ１１７９遺伝子座に対して、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく１２の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コール、Ｃ→ＧのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１４の対立遺伝子コール、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく１５の対立遺伝子コール、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく１６の対立遺伝子コール、またはＧ→ＡのＳＮＰに基づく１７の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１８４】
別の実施形態は、ＦＧＡ遺伝子座に対して、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく２６１２の対立遺伝子コール、またはＴ→ＣのＳＮＰに基づく２８の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１８５】
別の実施形態は、ｖＷＡ遺伝子座に対して、Ｇ→ＡおよびＣ→ＴのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コール、Ｃ→ＴのＳＮＰに基づく１３の対立遺伝子コール、Ｔ→ＣのＳＮＰに基づく１４の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡおよびＣ→ＴのＳＮＰに基づく１４の対立遺伝子コール、Ａ→Ｇおよび２Ｃ→２ＴのＳＮＰに基づく１４の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１５の対立遺伝子コール、Ａ→ＧのＳＮＰに基づく１６の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１７の対立遺伝子コール、Ｇ→ＡのＳＮＰに基づく１８の対立遺伝子コール、２Ａ→２ＧのＳＮＰに基づく１８の対立遺伝子コール、２Ａ→２ＧのＳＮＰに基づく１９の対立遺伝子コール、Ｔ→ＡのＳＮＰに基づく２０の対立遺伝子コール、またはＡ→ＧのＳＮＰに基づく２０の対立遺伝子コールを有する２つ以上の法医学的ＤＮＡ試料を識別する方法である。
【０１８６】
（表１０）
0005680304.tif 000018
ＮＩＳＴ試料由来の対立遺伝子のサブセットは、検証のために配列した。これらの大部分は、ＳＮＰを検証、確認し、相対的位置を同定するために、塩基対立遺伝子−変異対立遺伝子対として行った。対立遺伝子配列によって、いずれの場合においても参照対立遺伝子に対する配列多型の存在を確認し、その位置の同定が可能となった。
【０１８７】
（表１１）ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳアッセイにおいて見られた多型の検証のための、ＮＩＳＴ試料から配列決定した選択した対立遺伝子（太字）
0005680304.tif 000019
【０１８８】
本明細書に記載した改変に加え、本発明の様々な改変は、当業者にとって、前述の説明から明らかである。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に該当することも意図される。本出願に挙げた各参考文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１ａ】
0005680304.tif 000020
【図１ｂ】
0005680304.tif 000021
【図２】
0005680304.tif 000022
【図３】
0005680304.tif 000023
【図４】
0005680304.tif 000024
【図５】
0005680304.tif 000025
【図６】
0005680304.tif 000026
【図７】
0005680304.tif 000027
【図８】
0005680304.tif 000028
【図９】
0005680304.tif 000029
【図１０ａ】
0005680304.tif 000030
【図１０ｂ】
0005680304.tif 000031
【図１１ａ】
0005680304.tif 000032
【図１１ｂ】
0005680304.tif 000033
【図１２】
0005680304.tif 000034
【図１３ａ】
0005680304.tif 000035
【図１３ｂ】
0005680304.tif 000036
【図１３ｃ】
0005680304.tif 000037
【図１４】
0005680304.tif 000038
【図１５】
0005680304.tif 000039
【図１６】
0005680304.tif 000040
【図１７】
0005680304.tif 000041
【図１８】
0005680304.tif 000042
【配列表】
0005680304000001.app