(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象が第２のグループの対象よりも前癌期の精巣癌を有する危険性が高く、
ａ）該対象の精巣由来の生物学的材料を含む早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法。
【請求項２】
該サンプルが精液または精巣由来の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前癌期の精巣癌がｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌である、請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
精巣癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良く、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法。
【請求項５】
精巣癌を有する哺乳動物対象の処置の強度のレベルを決定するための方法であって、
ａ）該対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象は第１の強度の処置を与えられるべきであると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象は第２の強度の処置を与えられるべきであると結論づける
工程を含み、
第２の強度が第１の強度よりも高い方法。
【請求項６】
該処置が白金を用いた処置を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）のサンプル値が、サンプルにおける検出可能なＲＢＭ３タンパク質の存在に対応する１、またはサンプルにおける検出可能なＲＢＭ３タンパク質の非存在に対応する０として決定され、参照値が０である、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）が
ａＩ）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は、サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施し、
ａＩＩ）該サンプルに結合したアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含む、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前癌期の精巣癌に対する診断マーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質のインビトロでの使用。
【請求項１０】
精巣癌に対する予後診断マーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質のインビトロでの使用。
【請求項１１】
前癌期の精巣癌に対する診断薬、または精巣癌に対する予後診断薬としての、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドのインビトロでの使用。
【請求項１２】
アフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：５からなるペプチド、または、２０以下のアミノ酸からなり、配列番号：８、１６および１７から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、精巣癌の分野に関する。さらに、前癌期の精巣癌を含む精巣障害の検出、ならびに精巣癌患者に対する予後の確立に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
癌
癌は、西欧諸国において最も一般的な疾患の１つ、および死の主な原因である。一般的に、発生率は、癌の多数の形態に対して年齢とともに増加する。一般健康状態の増加によってヒト集団が長生きし続けるため、癌はより多くの個体に影響し得る。多数の一般的な癌型の原因は、未だほとんど知られていないが、環境因子（食生活、タバコの煙、ＵＶ放射など）ならびに遺伝因子（ｐ５３、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＸＰなどのような「癌遺伝子」の生殖細胞株変異）と癌の発症の危険性の関連を提供する知識体系が増加している。
【０００３】
癌は本質的に細胞疾患であり、網状の細胞増殖および反社会的行動を有する形質転換細胞集団として定義されるという事実にもかかわらず、細胞生物学的観点から完全に満足する癌の定義がない。悪性転換は、不可逆性遺伝子変化に基づく悪性表現型への移行を示す。これは正式に証明されていないが、悪性転換は１つの細胞に起こり、次に、これから腫瘍が生じると考えられている（「癌のクローン」ドグマ）。発癌は、癌が産生することによるプロセスであり、一般的に、最終的に悪性腫瘍の増殖を生じる多数の事象を含むことが認められる。この多工程プロセスは、いくつかの律速工程、例えば、変異の付加および恐らくエピジェネティック事象を含み、前癌性増殖の工程の後の癌形成を引き起こす。工程的変化は、細胞分裂、反社会的行動および細胞死を決定する生命維持に必要な調節経路における誤り（変異）の蓄積を含む。これらそれぞれの変化は、周囲細胞と比較して、増殖においてダーウィン的な選択優位性利点が与えられ、腫瘍細胞集団の網状の増殖をもたらし得る。悪性腫瘍は、必ずしも形質転換された腫瘍細胞それら自体だけからならず、支持的基質として作用する周囲正常細胞からもなる。この動員された癌の基質は、形質転換された腫瘍細胞に継続している腫瘍増殖のために必要なシグナルを提供するために共同する結合組織、血管および種々の他の正常細胞、例えば、炎症性細胞からなる。
【０００４】
癌の最も一般的な形態は、体細胞で生じ、主に上皮性起源、例えば、前立腺、乳房、大腸、尿路上皮および皮膚、次に造血系起源の癌、例えば、白血病およびリンパ腫、神経外胚葉、例えば、悪性神経膠腫、および軟組織腫瘍、例えば、肉腫である。
【０００５】
癌診断および予後診断
疑わしい腫瘍由来の生検材料の顕微鏡的評価は、癌診断に対するすばらしい標準を維持している。確定診断を得るために、腫瘍組織をホルマリンに固定し、組織処理し(histo-processed)、パラフィン包埋する。得られるパラフィンブロックから、組織切片を生産し、組織化学的な、すなわち、ヘマトキシリン−エオシン染色、および免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法の両方を使用して染色することができる。次に、外科的標本を肉眼的および顕微鏡分析を含む病理学的技術で評価する。この分析は、しばしば、特定の診断への割り当て、すなわち、腫瘍型の分類および悪性腫瘍、腫瘍の程度の等級付けの基礎を形成する。
【０００６】
悪性腫瘍は、それぞれの癌型に対して特異的な分類体系にしたがって、いくつかの期に分類することができる。固形腫瘍に対する最も一般的な分類系は、腫瘍−リンパ節−転移（ＴＮＭ）病期分類システムである。Ｔ期は、原発性腫瘍の局所程度、すなわち、腫瘍が周囲組織へ増殖が侵入および浸潤している程度を示し、Ｎ期およびＭ期は、リンパ節への腫瘍の広がりを示すＮ期および他の遠隔臓器における腫瘍の増殖を示すＭ期で、腫瘍が転移を発症しているかどうかを示す。初期癌期は、陰性リンパ節で限局性腫瘍を示すＴ０−１、Ｎ０、Ｍ０を含む。さらに進行した癌期は、より広い増殖を含む限局性腫瘍を示すＴ２−４、Ｎ０、Ｍ０、およびリンパ節へ転移した腫瘍を示すＴ１−４、Ｎ１−３、Ｍ０、および遠隔臓器において検出される転移を有する腫瘍を示すＴ１−４、Ｎ１−３、Ｍ１を含む。腫瘍の病期分類は、しばしば、外科的、放射線学的および組織病理学的分析を含む検査のいくつかの形態に基づく。病期分類に加えて、多数の腫瘍型に対して、また、悪性腫瘍のレベルを等級付けするための分類系がある。評点方式は、腫瘍組織サンプルの形態学的評価に頼り、所定の腫瘍において見られる顕微鏡的特徴に基づく。これらの評点方式は、腫瘍細胞の分化、増殖および非典型的な外観の程度に基づき得る。一般的に使用される評点方式の例は、前立腺癌腫に対するグリーソン分類および乳房癌腫に対するノッティンガム組織学的グレード（ＮＨＧ）等級付けを含む。
【０００７】
正確な病期分類および等級付けは、正しい診断のために重要であり、予後を予測するための道具を提供し得る。特異的な腫瘍に対する診断および予後診断情報は、次に、所定の癌患者に対する十分な治療戦略を決定する。腫瘍に関するさらなる情報を得るために、組織切片の組織化学的染色に加えて、一般的に使用される方法は、免疫組織化学的染色である。ＩＨＣは、特異的抗体を使用して、組織および細胞におけるタンパク質発現パターンの検出を可能にする。臨床診断におけるＩＨＣの使用は、組織化学的に染色された腫瘍組織切片から評価される組織構造学および細胞形態学に関する情報に加えて、異なる細胞集団における免疫反応の検出を可能にする。ＩＨＣは、原発性腫瘍の正確な診断、例えば、病期分類および等級付けのサポートに、ならびに未知の起源の転移の診断に関与することができる。今日、臨床診療において最も一般的に使用される抗体は、細胞型「特異的な」タンパク質に対する抗体、例えば、ＰＳＡ（前立腺）、ＭｅｌａｎＡ（メラニン細胞）およびサイログロブリン（甲状腺）および中間径フィラメントを認識する抗体（上皮性、間葉性、グリア）、分化の一群（ＣＤ）の抗原（造血、リンパ細胞の下位分類）ならびに悪性度のマーカー、例えば、Ｋｉ６７（増殖）、ｐ５３（一般的に変異した腫瘍抑制遺伝子）およびＨＥＲ−２（増殖因子受容体）を含む。
【０００８】
ＩＨＣを除いて、遺伝子増幅を検出するためのインサイチュハイブリダイゼーションおよび変異分析のための遺伝子シーケンシングの使用は、癌診断の発展している科学技術である。加えて、転写産物、タンパク質または代謝産物のグローバル分析を関連情報に加える。しかしながら、多数のこれらの分析は未だ基礎研究であり、臨床医学における使用に対して評価され、標準化されていない。
【０００９】
精巣癌
精巣癌は、全男性の癌の約１％を占めるだけであるが、２０から４０歳の男性の最も一般的な癌である。発生率は地域間で変化する。アジアおよびアフリカにおいて、該疾患は約１／１００，０００の年齢標準化発生率とあまり一般的でないが、北欧諸国において、発生率は世界の残りと比較して比較的高く、デンマーク、ノルウェーおよびスウェーデンは全て世界の発生率のトップテンである。デンマークは、約１０／１００，０００の最も高い発生率を有し、ノルウェーは、少し低い約９／１００，０００であり、スウェーデンにおいて対応する率は約５／１００，０００である。この３０年間に、西欧諸国における発症率の実質的な増加があり、いくつかの国において多数の場合で２倍である。
【００１０】
大多数の精巣癌は胚細胞腫瘍であり、これらの腫瘍の分類のための２つの主な系の英国の精巣腫瘍パネル式（ＢＴＴＰ）およびＷＨＯ分類系がある。ＷＨＯ系がわずかにより包括的であるため、多数の病理学者がＷＨＯ系を使用する。両方の系にしたがって、２つの主なクラスは精上皮腫および非精上皮腫性胚細胞腫瘍（ＮＳＧＣＴ）である。精上皮腫は、約５０％の胚細胞腫瘍を占める最も一般的な純粋な胚細胞腫瘍である。これらの腫瘍は一般的に放射線療法および化学療法の両方に非常に感受性であるため、治癒率が高く、限局性疾患に対して９５％以上、転移性疾患に対して８５から９５％である。
【００１１】
ＮＳＧＣＴは、胚性癌腫、卵黄嚢腫瘍、絨毛癌腫および奇形腫に分類することができる。ＮＳＧＣＴは、一般的に精上皮腫と同様に放射線に感受性でないが、奇形腫を除いて、多数のＮＳＧＣＴは白金を用いた化学療法に非常に感受性である。腫瘍特異的１０年生存は、ＮＳＧＣＴに対して約９０％である。
【００１２】
腫瘍マーカー
日常的に測定される予後診断腫瘍マーカーには、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）がある。
【００１３】
ＨＣＧは、胎盤において生産される糖タンパク質であり、成体において非常に少量のみ存在する。それは、他のホルモンといくつかの類似性を共有しており、したがって、偽陽性が起こり得る。ＨＣＧレベルの上昇は、ＮＳＧＣＴを有する患者の６０−７０％において、精上皮腫を有する患者の１５−２０％において見ることができる。わずかなレベルの上昇は、いくつかの他の癌においても見ることができる。
【００１４】
ＡＦＰは、成体において少量のみ存在する別の糖タンパク質であり、それは、特定の胎児組織において通常、生産される。腫瘍組織において、それは、ＮＳＧＣＴにおける卵黄嚢細胞により生産されるが、これらの細胞は、精上皮腫に存在しない。血清におけるＡＦＰレベルの上昇は、ＮＳＧＣＴを有する患者の６０−７０％において見ることができる。レベルのわずかな上昇は、他の癌を有する患者においても見ることができる。
【００１５】
いずれかの（または両方の）マーカーのレベルの上昇がＮＳＧＣＴ患者の６０−８０％において見ることができ、両方のマーカーは、進行した疾患における予後診断値を有する。
【００１６】
ＬＤは、全てのヒト細胞に存在する酵素であり、したがって、ＨＣＧおよびＡＦＰよりも低い特異的ではないマーカーである。しかしながら、それは、とりわけ他の測定可能な腫瘍マーカーがない患者において臨床値となり得る。
【００１７】
前癌期の精巣癌の診断マーカーは、胎盤型アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、オクタマー−３／４（ＯＣＴ３／４）およびＲＮＡ結合モチーフタンパク質Ｙ（ＲＢＭＹ）を含む。
【００１８】
精巣癌の診断
精巣癌は、通常、超音波診断で診断される。癌を排除することができないとき、睾丸摘出（精巣の外科的除去）が通常、実施され、生検材料を分析する。生検は、また、対側精巣から得ることができる。しばしば、腫瘍マーカーのレベルも測定される。
【００１９】
精巣癌の病期分類は、いくつかの系にしたがって行うことができ、１つの例は、王立マーズデン病院（ＲＭＨ）系である。ＲＭＨ系において、第Ｉ病期は限局性疾患を示し、第Ｉ  Ｍｋ＋病期は腫瘍マーカーのレベルの上昇を示し、第ＩＩ（Ａ−Ｄ）病期において、腹部リンパ節が関与する。第Ｉ−ＩＩＢ病期に対する生存は、ほぼ１００％である。第ＩＩＩ病期において、横隔膜上のリンパ節が関与し、第ＩＶ病期において、リンパ系の外側に存在する転移（通常、肺転移）がある。
【００２０】
予後診断因子
患者は、国際胚細胞腫瘍予後分類（ＩＧＣＣＣＧ）により開発された分類体系に基づく３つの予後診断グループ、低い危険性、中程度の危険性および高い危険性に分類することができる。ＮＳＧＣＴにおいて、良い予後グループに対して５年全生存は世界の一部において９０％以上であり、中程度の予後グループに対してそれは約７５％であり、悪い予後グループに対してそれは約４８％である。精上皮腫において、悪い予後グループが存在せず、良い予後グループは約９０％の５年全生存を有する患者の９０％を含む。精上皮腫の中程度の予後グループは、７２％の５年全生存を有する。
【００２１】
多くの危険因子は、例えば、腫瘍マーカーの増加（上記参照）、転移のサイズおよび数、転移部の数および型、原発性腫瘍の組織病理学的、ならびに患者の年齢により特定されている。
【００２２】
精巣癌の処置
第Ｉ病期の精上皮腫において、放射線療法をアジュバントとして与えられ得る。さらに進行した癌期において、化学療法が通常、適用される。
【００２３】
ＮＳＧＣＴを有する患者には、通常、一次処置として化学療法を与える。頻繁に適用される処置は、ブレオマイシン、エトポシドおよびシスプラチン（ＢＥＰ）からなる組合せ処置である。この処置で、進行性ＮＳＧＣＴを有する患者の８０％は治癒するが、残りの２０％は治癒的処置に失敗する。
【発明の概要】
【００２４】
発明の概要
本発明の局面の目的は、精巣障害、例えば、前癌期または初期癌期の精巣癌の診断を提供することである。
【００２５】
さらに、本発明の局面の目的は、精巣癌に対する予後の確立を提供することである。
【００２６】
また、本発明の局面の目的は、精巣癌処置の個人化(personalization)を提供することである。
【００２７】
したがって、哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象が第２のグループの対象よりも精巣障害を有する危険性が高い方法を提供する。さらに、精巣癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良い方法、ならびに精巣癌を有する哺乳動物対象の処置の強度のレベルを決定するための方法を提供する。上記方法は、対象由来のサンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質の量の評価に基づく。
【００２８】
また、上記方法を実施するためのキット、ＲＢＭ３タンパク質フラグメント、ＲＢＭ３タンパク質の使用、ＲＢＭ３を標的化することが可能であるアフィニティーリガンド、および、このようなアフィニティーリガンドの使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、抗−ＲＢＭ３、１Ｂ５および６Ｆ１１に対するウエスタンブロット結果を示す。
【図２】図２は、精巣癌患者におけるＲＢＭ３タンパク質発現を示す。患者を、不良な予後、中度の予後、良好な予後および精上皮腫の４つの異なる予後グループに分けた。
【図３】図３は、精巣癌患者におけるＲＢＭ３タンパク質発現を示す。患者を、疾患または生存の２つの異なるグループに分けた。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
説明
本明細書の第１の局面として、哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象が第２のグループの対象よりも精巣障害を有する危険性が高く、
ａ）該対象の精巣由来の生物学的材料を含む早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法を提供する。
【００３１】
この本明細書の第１の局面は、ＲＢＭ３タンパク質が一般的にｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌の組織において高度に発現されるが、正常精巣組織におけるＲＢＭ３タンパク質発現は一般的に低いという本発明者らの見出したことに基づく。したがって、本発明者らは、精巣由来の生物学的材料におけるＲＢＭ３タンパク質の存在が、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌、または精巣癌の続発に対する危険性の上昇と関連する他の状態のマーカーであると結論づける。本明細書の見出したことの一部、および他の研究者らにより確立されたデータの一部に基づいて、本発明者らは、さらに、ＲＢＭ３タンパク質が前癌期の精巣癌のみでなく、一般的に精巣障害に対するマーカーである可能性が高いと結論づける。他の精巣障害の例は、不妊症または癌の危険性と関連する萎縮症およびセルトリ細胞のみの症候群である。あらゆる特定の科学理論により限定されることなく、本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質が精巣障害に対する保護に関する癌遺伝子であり得ると考えている。
【００３２】
この見出したことは、種々の適用を見出し得る。第１に、精巣において高いＲＢＭ３タンパク質発現を示す対象は、注意深くモニタリングされ、および／または、さらに試験されてよく（例えば、超音波で）、恐らく、癌の発症および転移を避けるために問題の精巣を外科的に除去され得る。さらに、対象が一方の精巣において癌と診断されたとき、ＲＢＭ３測定は、もう一方の精巣が、また、癌を発症する危険性があるか否かを示し得る。また、このような対象は、すでに癌を発症する高い危険性を有するため、本明細書のＲＢＭ３タンパク質測定で、停留睾丸症を有する対象をモニタリングすることと特に関連し得る。
【００３３】
第１の局面の工程ａ）のサンプルの生物学的材料は、精液または精巣由来の細胞を含み得る。さらに、例えば、該細胞は精巣由来の組織材料の一部であり得る。該組織材料は、以前に実施されている精巣生検から得ることができる。このような生検は、しばしば、対象が精巣障害の症状を示すとき、または生殖能力検査中に実施される。精液の回収は、精巣由来の生物学的材料を得るより便利な方法であり得、また、対象を生検の不快から助ける。
【００３４】
第１の局面の態様において、工程ａ）の評価は、セルトリ細胞以外の細胞に限定され得る。本発明者らは、正常精巣組織のセルトリ細胞はいくつかのＲＢＭ３タンパク質を発現し、したがって、第１の局面の方法の精度は、セルトリ細胞が工程ａ）の評価から除外されるとき、増加し得ることを見出した。評価に関連し得るセルトリ細胞以外の細胞の例は、精原細胞またはそのさらに分化した形態である。
【００３５】
さらに、本発明者らは、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌の細胞が、主に（限らないが）核においてＲＢＭ３タンパク質を発現することを見出した。第１の局面の態様において、工程ａ）の評価は、したがって、該サンプルの細胞核に限定され得る。
【００３６】
第１の局面の１つの態様にしたがって、第１および第２のグループ間の違いは、第１のグループの対象が第２のグループの対象よりもｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌を有する危険性が高いことであり得ることが上記から得られる。
【００３７】
同様の態様において、第１および第２のグループ間の違いは、第１のグループの対象が、第２のグループの対象よりも精巣癌、例えば、精巣胚細胞腫瘍を発症する危険性がより高いことであり得る。
【００３８】
癌を発症する対象の危険性を評価する医師は、工程ｃ）および所望によりｂ）を医師自身で実施するが、第１の局面の方法の工程ａ）および所望により工程ｂ）を実施することを他の誰か、例えば、研究員に割り当ててもよい。
【００３９】
背景の部において示されているとおり、精巣癌と診断された対象の治癒率は、比較的に高い。したがって、本発明者らは、低い危険性グループにおいて過剰な処置を避け、より強度の処置戦略をそれらを非常に必要としている患者に合わせるための患者のより良い層化における利益をもたらすと結論づける。
【００４０】
本明細書の第２の局面として、したがって、精巣癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良く、
ａ）対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法を提供する。
【００４１】
この本明細書の第２の局面は、高レベルのＲＢＭ３タンパク質発現を示す精巣癌対象は、一般的に低レベルのＲＢＭ３タンパク質発現を示すかかる対象よりもより良い生存率を有するという本発明者らの見出したことに基づく。精巣障害（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌）の診断マーカーであることに加えて、ＲＢＭ３タンパク質は、したがって、精巣癌に対する予後診断マーカーである。
【００４２】
ＲＢＭ３タンパク質の示唆される保護役割（上記参照）は、なぜ前癌期の精巣癌および精巣癌の良好な予後において上方調節されるかを説明し得る。したがって、不良な予後の精巣癌における低いＲＢＭ３タンパク質レベルは、癌に対する不良な保護の指標であり得る。
【００４３】
予後診断適応は多くの利益を伴う。例えば、予後診断情報は、対象の処置に関する医師の決定の基礎を形成し得る。精巣癌対象に対する予後は通常、癌の攻撃性のレベルを反映し、特に癌の侵襲性形態が特定されたとき、通常避けられる苦痛なまたは他の何らかの不快な処置がどのみち考慮され得る。さらに、乏しい侵襲性形態が特定することができたとき、過剰処置が避けられ得る。さらなる例として、発現の特定のレベルが疾患進行の特定のパターンと相関しているマーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質は、例えば、予測または予後の作成または処置レジメンの選択のために良い可能性を有する。
【００４４】
第２の局面の方法において、精巣癌対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定することであって、第１のグループの対象が、一般的に、第２のグループの対象よりもより良い予後を有すると決定する。精巣癌対象の２つのグループへの分配は、対象由来のサンプル値を参照値と比較することにより決定される。したがって、該参照値は、それぞれのグループのサイズに対する決定因子であり、参照値をより高くすると、第１のグループにおける対象がより少なくなり、試験される対象が第１のグループに属する可能性がより小さくなる。一般的に、サンプル値が増加すると予後は改善するため、場合によっては、特に良好な予後を有する対象を同定するために高い参照値が選択され得る。本明細書により導かれると、当業者は、過度の負荷なしに関連参照値を選択し得る。これは、さらに以下に記載されている。
【００４５】
第１および第２のグループは、もっぱら、試験される対象と同じまたは同様の段階、分化段階および／または亜型の精巣癌を有する対象からなり得る。さらに、該グループは、同じまたは同様の年齢、人種、地理的所在、遺伝的特性または医学的状態または病歴、例えば、精巣癌歴を有する対象のみからなり得る。
【００４６】
結果として、医師は、同様に最も適当な処置レジメンを選択するための手助けとなり得る精巣癌対象の予後に関してさらなる情報を得るために、第２の局面の方法を使用し得る。例えば、第２の局面の方法を使用して第１のグループに属することが示される対象は、さもなければ考慮されるであろうものよりもあまり積極的でない処置を与えられ得る（逆もまた同様）。
【００４７】
本明細書の第３の局面として、したがって、精巣癌を有する哺乳動物対象の処置の強度のレベルを決定するための方法であって、
ａ）該対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、該量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ｂ）において得られたサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象は第１の強度の処置を与えられるべきであると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象は第２の強度の処置を与えられるべきであると結論づける
工程を含み、
第２の強度は第１の強度よりも高い方法を提供する。
【００４８】
強度のレベルは、例えば、対象に与えられる治療剤の平均１日または１週用量として測定され得る。したがって、第２の強度の処置は、第１の強度の処置よりもより頻繁に、または高い個々の用量で適用され得る。第２の強度の処置は、また、第１の強度の処置より積極的な治療の適用を含み得る。例えば、第２の強度の処置は組合せ処置であり得るが、第１の強度の処置は単剤療法である。さらなる可能性は、第２の強度の処置が第１の強度の処置よりも長い期間に適用されることである。
【００４９】
第３の局面の態様において、したがって、ｃ１）は該対象が第１の期間、処置を受けるべきであると結論づけ得、ｃ２）は該対象が第２の期間、処置を受けるべきであると結論づけ得る（第２の期間が第１の期間よりも長い）。
【００５０】
白金を用いた処置は、頻繁に精巣癌対象に適用される。白金を用いた処置は、白金を用いた治療剤の適用を含む。パラプラチンを含むカルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチンおよびシスプラチンは、今日、試験され、病院において使用されているいくつかの白金を用いた治療剤である。
【００５１】
第３の局面の態様において、白金を用いた処置は、したがって、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチンおよびシスプラチンから選択される薬物の適用であり得る。
【００５２】
第１の強度の処置は、例えば、ブレオマイシン、エトポシドおよびシスプラチンの組合せの適用であってよいが、第１の強度の処置は、これらの薬物の１つまたは２つのみの適用であり得る。
【００５３】
本明細書の文脈において、「予後」は、疾患の経過または結果およびその処置の予測を示す。例えば、予後は、また、疾患からの生存率または回復率の決定、ならびに対象の予期される生存時間の予測を示し得る。予後は、特に、将来の期間、例えば、３年、５年、１０年または他のあらゆる期間の対象の生存の可能性を確立することを含み得る。さらに、予後は、単一の値または広範な値により示され得る。
【００５４】
態様において、予後は生存の可能性であり得る。「生存」を測定するためにいくつかの方法がある。本明細書の生存は、例えば、全生存、無進行生存または精巣癌特異的生存であり得る。さらに、「生存」は、異なる期間、例えば、５、１０または１５年にわたって測定され得る。したがって、生存は、５年、１０年または１５年生存であり得る。
【００５５】
以下の実施例のサンプルは、精巣胚細胞癌由来である。第２または第３の局面の態様において、精巣癌は、したがって、精巣胚細胞癌である。
【００５６】
一般的に、精上皮腫精巣癌を有する対象は、非常に良好な予後を有する。したがって、非精上皮腫性精巣癌を有する対象に対する予後を確立するためにさらに関連し得る。さらに、ＲＢＭ３は、以下の実施例において、このような対象と予後診断的に関連することを示す。第２または第３の局面の態様において、精巣癌は、したがって、非精上皮腫性であり得る。
【００５７】
第２または第３の局面の方法の態様において、サンプルは体液サンプルであり得る。例えば、体液サンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、精漿、精液、リンパ液および滲出液からなる群から選択され得る。あるいは、サンプルは、細胞学的サンプルまたは糞便サンプルであり得る。
【００５８】
ＲＢＭ３タンパク質発現のレベルは、好ましくは、細胞内的に測定される。したがって、体液、細胞学的または糞便サンプルは、例えば、細胞、例えば、対象の精巣由来の腫瘍細胞を含み得る。
【００５９】
第２または第３の局面の方法のさらなる態様において、サンプルは、例えば、精巣の早期外科的除去由来の精巣腫瘍組織サンプルであり得る。
【００６０】
さらに、本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質の核発現が、特に、予後の決定または処置の選択に関連することについて述べている。
【００６１】
したがって、第２または第３の局面の工程ａ）の評価は、該サンプルの腫瘍細胞の核に限定され得る。結果として、組織サンプルが試験されるとき、腫瘍細胞の核のみが考慮され得る。このような試験は、例えば、免疫組織化学的染色により補助され得る。
【００６２】
本明細書の方法の工程ａ）に関して、ＲＢＭ３タンパク質の量の増加は、一般的に、サンプル値の増加をもたらし、反対にはならない。しかしながら、いくつかの態様において、評価された量は、別々のサンプル値の任意のあらかじめ決められた数のいずれかに対応し得る。このような態様において、第１の量および第２の増加した量は、同じサンプル値に対応し得る。とにかく、ＲＢＭ３タンパク質の量の増加は、本明細書の文脈においてサンプル値の減少をもたらさない。
【００６３】
しかしながら、不便なことに、同等の様式において、工程ｂ）とｃ）間の制限が逆であるとき、評価された量はサンプル値と逆に関連し得る。例えば、句「サンプル値が参照値よりも高いとき」が「サンプル値が参照値よりも低いとき」と置き換えられると、工程ｂ）とｃ１）間の制限は逆になる。
【００６４】
一般的に、精巣癌を有する患者に対する適当な処置戦略を決定するとき、処置に関与する医師は、いくつかのパラメーター、例えば、免疫組織化学的評価の結果、患者年齢、腫瘍亜型、癌期および程度、全身状態および病歴、例えば、精巣癌歴を考慮し得る。決定に導くために、該医師は、第２または第３の局面にしたがって、試験を実施するか、または実施される試験を指示し得る。さらに、該医師は、工程ｃ）および所望によりｂ）を医師自身で実施するが、工程ａ）および所望により工程ｂ）を実施することを他の誰か、例えば、研究員に割り当ててもよい。
【００６５】
さらに、本明細書の方法の文脈において、「早期に得られた」は、該方法が実施される前に得られることを示す。結果として、対象由来の早期に得られたサンプルが方法において使用されるとき、該方法は対象由来のサンプルを得ることを含まない、すなわち、該サンプルは該方法から離れている工程において該対象からあらかじめ得た。
他に記載のない限り、本明細書のすべての方法および使用は、完全にインビトロで実施され得る。
【００６６】
さらに、本明細書の文脈において、「精巣癌を有する哺乳動物対象」は、精巣腫瘍を有する哺乳動物対象または精巣腫瘍が除去されている哺乳動物対象を示し、腫瘍の除去は手術または治療のあらゆる適当な型により腫瘍を殺すか、または除去することを示す。本明細書の方法および使用局面において、「精巣癌を有する哺乳動物対象」は、また、哺乳動物対象が使用または方法の実施時に精巣癌を有することが疑われ、精巣癌診断が後に確立される場合を含む。
【００６７】
さらに、本明細書の文脈において、「参照値」は、対象に対する診断、予後または適当な処置戦略に関して、決定の作成または結論の引き出しに関連することが見出されているあらかじめ決められた値を示す。
【００６８】
上記局面の方法の工程ａ）は、サンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価すること、および該量に対応するサンプル値を決定することを含む。「サンプルの少なくとも一部」は、適当な処置に関して、診断または予後の確立または結論の引き出しのためのサンプルの関連部分を示す。当業者は、方法を実施するときに、環境下で関連するどの部分が存在するか理解している。
【００６９】
さらに、工程ａ）において、量が評価され、量に対応するサンプル値が決定される。結果として、ＲＢＭ３タンパク質の量の正確な測定は、サンプル値を得るために必要でない。例えば、ＲＢＭ３タンパク質の量は、染色された組織サンプルの目視検査により評価され得、次に、サンプル値は、例えば、評価された量に基づいて「高い」または「低い」として分類され得る。
【００７０】
当業者は、このような評価および決定を実施する方法を理解している。さらに、本明細書は助言を提供する。
【００７１】
工程ａ）の評価および決定は、サンプルの何らかの処理または操作を必要とする。単なる検査によりサンプル値を決定することが可能でない。このような評価および決定のためにいくつかが以下に挙げられている種々の技術は、当業者によく知られている。したがって、本明細書の方法は、工程ａ）の実施のために何ら特定の技術に限定されない。
【００７２】
上記局面の方法を実施するとき、このような場合において、工程ａ）において、ＲＢＭ３タンパク質がサンプルに存在するか否かのみを確立させるべきであるため、参照値として０を使用することが便利であり得る。
【００７３】
したがって、上記局面の方法の態様において、工程ａ）のサンプル値は、サンプルにおける検出可能なＲＢＭ３タンパク質の存在に対応する１、またはサンプルにおける検出可能なＲＢＭ３タンパク質の非存在に対応する０のいずれかであり得る。結果として、このような態様において、サンプルの評価はデジタルであり、すなわち、ＲＢＭ３タンパク質が存在するか否かのいずれかを考える。本明細書の文脈において、「検出可能なＲＢＭ３タンパク質がない」は、通常の操作可能な状況中に工程ａ）を実施する者または装置により検出可能でないごく少量であるＲＢＭ３タンパク質の量を示す。「通常の操作可能な状況」は、当業者が本明細書の方法を実施するために適当であると認める実験室的方法および技術を示す。
【００７４】
したがって、本明細書の方法の態様において、工程ｂ）の参照値は０であり得る。本明細書の方法のさらなる態様において、工程ｂ）の参照値が検出可能なＲＢＭ３タンパク質を有さない参照サンプルに対応し得るということになる（以下参照）。
【００７５】
本明細書の文脈において、「サンプル値」および「参照値」なる用語は、広く解釈するべきである。これらの値を得るためのＲＢＭ３タンパク質の定量化は、自動方法を介して、サンプルの視覚的または顕微鏡的検査に基づく採点システムを介して、またはそれらの組合せを介して行われ得る。しかしながら、また、例えば、ＲＢＭ３タンパク質発現のために調製され染色された組織スライドの検査によりサンプルおよび参照値を決定することが、当業者、例えば、組織病理学的の当業者に可能である。したがって、サンプル値が参照値よりも高いことの決定は、サンプル組織スライドが参照組織スライドよりもより密に染色されていることの視覚的または顕微鏡的検査での決定に対応し得る。サンプル値は、また、文献参照により得られる参照値、例えば、言葉において記載されている、または参照図による参照値と比較され得る。結果として、サンプルおよび／または参照値は、いくつかの場合において、当業者が検査および比較時に決定する精神的な(mental)値であり得る。
【００７６】
本明細書の方法の１つ以上の工程は、装置において実行し得る。例えば、工程ａ）および所望により工程ｂ）は、自動分析装置において実施され得、このような装置は、免疫組織化学的分析のために適合させた基盤に基づき得る。一例として、問題の対象由来の１つ以上の組織サンプルは、免疫組織化学的な分析のために手動的に調製され、次に工程ａ）のサンプル値を与え、また所望により工程ｂ）の参照値との比較を行う自動分析装置に負荷され得る。次に、分析を実施するオペレーター、分析を指示する医師または装置それ自体は、工程ｃ）の結論を引き出し得る。結果として、工程ｃ）の結論を引き出すために適合させたソフトウェアは、装置を実行させ得る。
【００７７】
対象由来のサンプル値との比較としての使用のための、診断もしくは予後の確立または処置決定の作成に関連することが見出されている参照値は、種々の方法において提供され得る。本明細書の教示の知識で、当業者は、過度の負荷を強いることなく、本明細書の方法を実施するための関連参照値を提供することができる。
【００７８】
上記局面の方法を実施する者は、例えば、参照値を所望の情報に適合させ得る。第２の局面に関して、参照値は、例えば、生存に関して非常に重要な情報を得るために適合され得る。
【００７９】
第１の局面の方法の態様において、参照値は、正常精巣組織の参照サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３タンパク質の量に対応し得る。参照サンプルのタンパク質発現の量は、以前に確立されていてもよい。
【００８０】
第２または第３の局面の方法の態様において、参照値は、腫瘍細胞を含む参照サンプル、例えば、腫瘍組織の参照サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３タンパク質の量に対応し得る。参照サンプルのタンパク質発現の量は、好ましくは以前に確立されていてもよい。
【００８１】
結果として、該参照値は、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を発現する細胞を含む参照サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３タンパク質の量により提供され得る。
【００８２】
さらに、参照値は、例えば、あらかじめ決められた、または制御されたＲＢＭ３タンパク質の量を発現する細胞株、例えば、癌細胞株を含む参照サンプルにおいて測定されたＲＢＭ３タンパク質の量により提供され得る。当業者は、例えば、Rhodes et al. (2006) The biomedical scientist, p 515-520の記載により導かれて、このような細胞株を提供する方法を理解している。
【００８３】
結果として、本明細書の方法の態様において、参照値は、参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質の量に対応するあらかじめ決められた値であり得る。
【００８４】
しかしながら、以下にさらに記載されているとおり、参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質の量は、参照値に直接対応しなくてもよい。参照サンプルは、また、種々の参照値を評価するための方法を実施する者を手助けするＲＢＭ３タンパク質の量を提供し得る。例えば、該参照サンプルは、「陽性」参照値および／または「陰性」参照値を提供することにより、参照値の心像(mental image)の創造において手助けとなり得る。
【００８５】
サンプル、例えば、対象由来の早期に得られたサンプルまたは参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質発現の定量化のための別の方法は、特定のレベルを越えるＲＢＭ３タンパク質発現を示すサンプルにおける細胞の画分の決定である。画分は、例えば、全細胞のＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞画分」、細胞の細胞質のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞質画分」、または細胞の核のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「核画分」であり得る。核または細胞質画分は、例えば、関連細胞集団の免疫反応細胞が＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５として分類され得る。「細胞質画分」は、細胞質において陽性染色を示すサンプルにおける関連細胞のパーセントに対応し、細胞質における中位の、またははっきりとしたおよび強い免疫反応は陽性と考え、細胞質における存在しない、またはわずかな免疫反応は陰性と考える。「核画分」は、核において陽性染色を示すサンプルにおける関連細胞のパーセントに対応し、核における中位の、またははっきりとしたおよび強い免疫反応は陽性と考え、核における存在しない、またはわずかな免疫反応は陰性と考える。病理学的の当業者は、方法を実施するとき、条件と関連するどの細胞が存在するか理解しており、一般知識および本明細書の教示に基づいて細胞質または核画分を決定し得る。さらに、当業者は、「細胞画分」を使用して対応する測定を実施する方法を理解している。
【００８６】
サンプル、例えば、対象由来の早期に得られたサンプルまたは参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質発現の定量化のための別の方法は、サンプルの全染色強度の決定である。強度は、例えば、全細胞のＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞強度」、細胞の細胞質のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞質強度」、または細胞の核のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「核強度」であり得る。細胞質および核強度は、臨床的組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価される。細胞質強度決定の結果は、存在しない＝サンプルの関連細胞の細胞質において全免疫反応がない、弱い＝サンプルの関連細胞の細胞質においてわずかな全免疫反応、中程度＝サンプルの関連細胞の細胞質において中位の全免疫反応、または強い＝サンプルの関連細胞の細胞質においてはっきりとしたおよび強い全免疫反応として分類され得る。核強度決定の結果は、存在しない＝サンプルの関連細胞の核において全免疫反応がない、弱い＝サンプルの関連細胞の核においてわずかな全免疫反応、中程度＝サンプルの関連細胞の核において中位の全免疫反応、または強い＝サンプルの関連細胞の核においてはっきりとしたおよび強い全免疫反応として分類され得る。いくつかの態様において、弱いおよび中程度の値は、弱い／中程度の値に組み合わされ得る。当業者は、方法を実施するとき、条件と関連するどの細胞が存在するか理解しており、一般知識および本明細書の教示に基づいて核または細胞質強度を決定し得る。さらに、当業者は、「細胞強度」を使用して対応する測定を実施する方法を理解している。
【００８７】
ＲＢＭ３タンパク質は、精巣細胞の核および細胞質の両方において発現されるが、本発明者らは、核発現が特に関連し得ることを見出した。上記局面の方法の態様において、参照値は、したがって、核画分、核強度またはそれらの組合せであり得る。したがって、サンプル値は、核画分、核強度またはそれらの組合せであり得る。
【００８８】
図面に示されているとおり、種々の画分および強度は、関連参照値として機能し得る。
【００８９】
したがって、上記局面の方法の態様において、工程ｃ）における結論の基準は、サンプル値が０％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％の核または細胞質画分よりも高いことである。
【００９０】
上記局面の方法の別の、または相補的態様において、工程ｂ）の参照値は、９５％以下、例えば、９０％以下、例えば、８５％以下、例えば、８０％以下、例えば、７５％以下、例えば、７０％以下、例えば、６５％以下、例えば、６０％以下、例えば、５５％以下、例えば、５０％以下、例えば、４５％以下、例えば、４０％以下、例えば、３５％以下、例えば、３０％以下、例えば、２５％以下、例えば、２０％以下、例えば、１５％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下、例えば、２％以下、例えば、１％以下、例えば、０％の核または細胞質画分である。
【００９１】
さらに、上記局面の方法の態様において、工程ｃ）における結論の基準は、存在しない細胞質または核強度より高い、例えば、弱い細胞質または核強度より高い、例えば、中程度の細胞質または核強度より高いサンプル値であり得る。上記局面の方法の別の、または相補的態様において、工程ｂ）の参照値は、ＲＢＭ３タンパク質発現の中程度の細胞質または核強度またはそれ未満、例えば、ＲＢＭ３タンパク質発現の弱い細胞質または核強度またはそれ未満、例えば、存在しない細胞質または核強度であり得る。
【００９２】
また、上記局面の方法の態様において、参照値は、画分値および強度値の組合せまたは相関関係であり得る。したがって、参照値は、２つ以上の基準でさえ含み得る。
【００９３】
一般的に、参照値としての強度値および／または画分値の選択は、染色処理、例えば、使用される抗体の型および量／濃度ならびに染色試薬の型および濃度に依存し得る。
【００９４】
本発明者らは、比較的低い参照値が、とりわけ、モノクローナル抗体１Ｂ５（以下参照）が使用されるとき、第１の局面の診断を結論づけるために特に関与し得ることを見出した。ここで、「比較的低い」参照値は、２５％以下、例えば、１０％以下の核または細胞質画分、弱い核または細胞質強度またはそれ未満、例えば、非存在の核または細胞質強度、または１以下、例えば、０の染色スコア（ＳＳ、実施例の部８ａ参照）を示す。
【００９５】
実施例の部８において、ＲＢＭ３タンパク質発現の最も高いレベルを示す精巣癌対象の１００％が生存したこと、実施例の部９において、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌と診断されたすべての対象がＲＢＭ３タンパク質発現の最も高いレベルを示したことを示している。したがって、比較的高い参照値は、また、上記局面の診断または予後診断を結論づけるために特に関与し得る。ここで、「比較的高い」参照値は、５０％以上の核または細胞質画分、中程度の核または細胞質強度、または２の染色スコア（ＳＳ、実施例の部８Ａ参照）を示す。
【００９６】
本明細書により導かれると、当業者、例えば、病理学者は、画分、例えば、細胞、細胞質または核画分、または、強度、例えば、細胞、細胞質または核強度を得て、評価を行う方法を理解している。例えば、当業者は、特定の画分または強度の外観を確立するために、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を含む参照サンプルを使用し得る。
【００９７】
しかしながら、参照サンプルは、実際の参照値の提供のために使用されるだけでなく、参照値に対応する量より高いＲＢＭ３タンパク質の量を有するサンプルの例の提供のためにもまた使用され得る。一例として、組織化学的染色において、例えば、免疫組織化学的染色において、当業者は、高い量のＲＢＭ３タンパク質を有する染色されたサンプルの外観を確立するための参照サンプル、例えば、陽性参照を使用し得る。次に、当業者は、より少ない量のＲＢＭ３タンパク質を有するサンプルの外観、例えば、参照値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を有するサンプルの外観を評価し得る。言い換えれば、当業者は、参照サンプルを使用して、参照サンプルのＲＢＭ３タンパク質の量よりも少ないＲＢＭ３タンパク質の量に対応する参照値の心像を創造し得る。あるいは、または相補的に、このような評価において、当業者は、このようなサンプルの外観を確立するために少量のＲＢＭ３タンパク質を有する、または検出可能なＲＢＭ３タンパク質を欠いている別の参照サンプル、例えば、「陰性参照」を使用し得る。
【００９８】
例えば、中程度の核強度が参照値として使用されるとき、以下の２つの参照サンプルを使用し得る。検出可能なＲＢＭ３タンパク質を有さず、したがって、参照値よりも低い、存在しない核強度に対応する第１の参照サンプル、および、参照値よりも高く、強い核強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を有する第２の参照サンプル。
【００９９】
結果として、評価において、当業者は、高い量のＲＢＭ３タンパク質を有するサンプルの外観を確立するために参照サンプルを使用し得る。このような参照サンプルは、高い量のＲＢＭ３タンパク質を発現する組織を含むサンプル、例えば、以前に確立されている高い発現のＲＢＭ３タンパク質を有する組織を含むサンプルであり得る。
【０１００】
したがって、参照サンプルは、強い核強度（ＮＩ）の一例を提供し得る。強いＮＩを有するサンプルの外観が分かると、次に当業者はサンプルをＮＩカテゴリー、存在しない、弱い、中程度および強いに分け得る。この分配は、さらに、検出可能なＲＢＭ３タンパク質を欠いている参照サンプル（陰性参照）、すなわち、存在しない核強度を提供する参照サンプルにより補助され得る。また、参照サンプルは、７５％以上の核画分（ＮＦ）を有するサンプルの一例を提供し得る。７５％以上の陽性細胞を有するサンプルの外観が分かると、次に、当業者は、例えば、より低いパーセントの陽性細胞を有する他のサンプルのＮＦを評価し得る。この分配は、さらに、本質的にＲＢＭ３タンパク質を欠いている参照サンプル（陰性参照）、すなわち、低いＮＦ（例えば、＜５％、例えば、＜２％）、または０のＮＦを提供する参照サンプルにより補助され得る。
【０１０１】
上記のとおり、制御された量のＲＢＭ３タンパク質を発現する細胞株は、参照、特に陽性参照として使用され得る。
【０１０２】
１つ以上の図(picture)は、また、「参照サンプル」として提供され得る。例えば、このような図は、特定の条件で特定の抗体で染色され、特定の核強度および／または画分を示す組織スライドの一例を示し得る。「参照サンプル」に対する上記載は、図に変更すべきところは変更して適用する。
【０１０３】
細胞株または図は、また、本明細書のキットの一部を形成し得る（以下参照）。
【０１０４】
さらに、当業者は、タンパク質が関連遺伝子によってコードされ、発現の関連パターンを示す限り、上記局面の方法の有用性が問題の対象に存在するＲＢＭ３タンパク質の特定の変異体の定量化に限定されないことを認識すべきである。非限定的な例として、ＲＢＭ３タンパク質は
ｉ）配列番号：１、および
ｉｉ）配列番号：１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含み得る。
【０１０５】
いくつかの態様において、上記配列ｉｉ）は、配列番号：１と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０１０６】
別の非限定的な例として、ＲＢＭ３タンパク質は、
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなり得る。
【０１０７】
いくつかの態様において、上記配列ｉｉ）は、配列番号：２と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０１０８】
本明細書の文脈において使用される「％同一」なる用語は、以下のとおりに計算される。質問(query)配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  アルゴリズム（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）を使用して、標的配列にアラインされる。それぞれの位置でアミノ酸残基を比較し、標的配列において同一一致を有する質問配列における位置のパーセントを％同一として報告する。また、標的配列は、比較される位置の数を決定する。結果として、本明細書の文脈において、標的配列よりも短い質問配列は、標的配列と１００％同一であり得ない。例えば、８５個のアミノ酸の質問配列は、１００個のアミノ酸の標的配列と最大で８５％同一であり得る。
【０１０９】
いくつかの態様において、上記局面の方法の工程ａ）は、対象由来の生物学的材料を得て、生物学的材料の関連部分を切除または選択し、該サンプルを得て、所望によりサンプルを固相上に配置し、工程ａ）の評価を容易にすることを含み得る。工程ａ）は、したがって、一例として、対象由来の組織材料を得て、所望によりパラフィンまたはホルマリンにおいて組織材料を固定し、該組織材料を組織処理し、該サンプルを構成する切片を得て、所望により透明なスライド、例えば、顕微鏡のスライドガラス上に該サンプルを置くことを含み得る。
【０１１０】
上記局面の方法の態様において、ＲＢＭ３タンパク質は、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である検出可能および／または定量化可能なアフィニティーリガンドのサンプルへの適用を介して、検出および／または定量され得る。アフィニティーリガンドの適用は、サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施される。
【０１１１】
具体化するために、上記局面の方法の態様において、工程ａ）は
ａ１）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は該サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質への該アフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施され、
ａ２）非結合アフィニティーリガンドを除去し、
ａ３）該サンプルと共に残っているアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含み得る。
【０１１２】
「サンプルと共に残っているアフィニティーリガンド」は、工程ａ２）において除去されなかったアフィニティーリガンド、例えば、サンプルへ結合したアフィニティーリガンドを示す。ここで、結合は、例えば、抗体と抗原間の相互作用であり得る。
【０１１３】
しかしながら、いくつかの態様において、ａ２）の非結合アフィニティーリガンドの除去、例えば、洗浄は、いつも必要ではない。したがって、上記局面の方法のいくつかの態様において、工程ａ）は
ａＩ）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は該サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質への該アフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施され、
ａＩＩ）該サンプルに結合したアフィニティーを定量し、該量を評価する
ことを含み得る。
【０１１４】
本明細書の文脈において、例えば、その標的または抗原とアフィニティーリガンドの、「特異的」または「選択的」相互作用は、相互作用が、特異的と非特異的、または選択的と非選択的の相互作用間の区別が意味を成すということであることを意味する。２つのタンパク質間の相互作用は、ときどき、解離定数により測定される。解離定数は、２つの分子間の結合（またはアフィニティー）の強度を示す。一般的に、抗体とその抗原間の解離定数は、１０−７から１０−１１Ｍである。しかしながら、高い特異性／選択性は、必ずしも高いアフィニティーを必要としない。その対応物に対して低いアフィニティー（モル範囲において）を有する分子は、さらに高いアフィニティーを有する分子と同程度の選択的／特異的を示している。本明細書の場合において、特異的または選択的相互作用は、特定の方法が、組織サンプルまたは天然の、または処理された生物学的液体の液体サンプルにおける他のタンパク質の存在における所定の条件下で特異的タンパク質、標的タンパク質の存在および／または量を決定するために使用することができる程度を示す。言い換えれば、特異性または選択性は、関連タンパク質間で区別する能力である。特異的および選択的は、ときどき本説明において互換的に使用される。例えば、抗体の特異性または選択性は、以下の実施例の部２において決定され、分析は、それぞれタンパク質アレイ設定、懸濁液ビーズアッセイおよび多重競合アッセイを使用して実施され得る。特異性および選択性決定は、また、Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337に記載されている。
【０１１５】
適当なアフィニティーリガンドを選択または製造する、および検出および／または定量化のための適当な形式および条件を選択することは当業者の能力の範囲内と考えられる。それにもかかわらず、有用であることが認められ得るアフィニティーリガンドの例、ならびに検出および／または定量化のための形式および条件の例は、説明のために以下に挙げられている。
【０１１６】
したがって、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、抗体、そのフラグメントおよびその誘導体、すなわち、免疫グロブリン骨格に基づくアフィニティーリガンドからなる群から選択され得る。抗体およびそのフラグメントまたは誘導体は単離され得る。抗体は、マウス、ウサギ、ヒトおよび他の抗体、ならびに異なる種由来の配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的ヒト化抗体、例えば、部分的ヒト化マウス抗体を含む、あらゆる起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体は、選択した抗原で動物の免疫化により生産される。ポリクローナル抗体は単一特異的であり得る。定義された特異性のモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (Koehler G and Milstein C (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519)により開発されたハイブリドーマ科学技術を使用して生産することができる。本明細書の抗体フラグメントおよび誘導体は、フラグメントまたは誘導体である抗体と同じ抗原（例えば、ＲＢＭ３タンパク質）と選択的相互作用が可能である。抗体フラグメントおよび誘導体は、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＭ）、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）からなるＦａｂフラグメント；２つの可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖフラグメント(Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240:1038-1041)；フレキシブルな(flexible)ペプチドリンカーにより一緒に連結された２つのＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）(Bird RE and Walker BW (1991) Trends Biotechnol. 9:132-137)；ベンズ・ジョーンズ(Bence Jones)ダイマー(Stevens FJ et al. (1991) Biochemistry 30:6803-6805)；ラクダ重鎖ダイマー(Hamers-Casterman C et al. (1993) Nature 363:446-448)および単一可変ドメイン(Cai X and Garen A (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6280-6285; Masat L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:893-896)、および単一ドメイン骨格、例えば、テンジクザメ由来の新規抗原受容体（ＮＡＲ）(Dooley H et al. (2003) Mol. Immunol. 40:25-33)および可変重鎖ドメインに基づくミニボディー（minibody）(Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240:1038-1041)を含む。
【０１１７】
いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、配列番号：１のアミノ酸配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である。以下の実施例の部１ｂの下に記載されるとおり、配列番号：１のＲＢＭ３フラグメントは、成熟型タンパク質において開裂されるため、大腸菌において効率的な発現を保証するために膜貫通領域を欠くように、任意のシグナルペプチドを欠くように設計された。したがって、配列番号：１は、免疫化のために設計された。加えて、タンパク質フラグメントは、他のヒトタンパク質と低い相同性を有するユニークな(unique)配列からなり、産生されたアフィニティー試薬の交差反応性を最小限にし、立体構造エピトープの形成やさらには細菌系における効率的なクローニングおよび発現を可能にするのに適当なサイズであるように設計された。したがって、アフィニティーリガンドが抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体である場合において、アフィニティーリガンドは、アミノ酸配列が配列番号：１の配列からなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる。例えば、免疫化工程は、フロイント完全アジュバント中のタンパク質での一次免疫化を含み得る。また、免疫化処理は、さらに、２−６週間の間隔をおいてフロイント不完全アジュバント中のタンパク質で少なくとも２回の追加免役を含み得る。所定の標的に対する抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の生産の工程は、当分野で知られている。
【０１１８】
さらに、以下の実施例の部４の下に記載されるとおり、２つのエピトープ領域（配列番号：４および配列番号：５）は、配列番号：１内に同定されている。したがって、アフィニティーリガンドは、アミノ酸配列が配列番号：４または配列番号：５からなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる。また、抗体またはフラグメントは、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる。
【０１１９】
配列番号４−１９についてさらなる議論のために、以下を参照。
本明細書の文脈において「単一特異的抗体」は、それ自体の抗原におけるアフィニティー精製され、それにより、他の抗血清タンパク質および非特異的抗体からこのような単一特異的抗体を分離されたポリクローナル抗体の１つまたは集団である。このアフィニティー精製は、その抗原に選択的に結合する抗体をもたらす。本明細書の場合において、ポリクローナル抗血清は、２工程免疫アフィニティーに基づくプロトコールにより精製され、標的タンパク質に対して選択的な単一特異的抗体を得る。抗原フラグメントの一般的なアフィニティータグに対する抗体は、捕獲剤として固定されたタグタンパク質を使用する第１の枯渇工程において除去される。第１の枯渇工程後、血清を捕獲剤として抗原を有する第２のアフィニティーカラムに負荷し、抗原に対して特異的な抗体を豊富にする（Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337も参照）。
【０１２０】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体は、選択的生体分子認識を必要とする適用における、例えば、上記方法の局面のＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化におけるアフィニティーリガンドの従来の選択性を示す。しかしながら、当業者は、選択的結合リガンドのハイスループット産生および低コスト生産系の要求の増加によって、新規生体分子多様性科学技術がこの１０年間に開発されていることを知っている。これは、免疫グロブリンならびに生体分子認識適用における結合リガンドとして有用であることが認められ、免疫グロブリンの代わりに、または一緒に使用することができる非免疫グロブリン起源の両方のアフィニティーリガンドの新規型の産生を可能にしている。
【０１２１】
アフィニティーリガンドの選択性に必要な生体分子の多様性は、複数の可能性ある骨格分子の１つの組み合わせ操作により産生され得、次に、特異的／選択的アフィニティーリガンドは、適当な選択基盤を使用して選択される。骨格分子は、免疫グロブリンタンパク質起源(Bradbury AR and Marks JD (2004) J. Immunol. Meths. 290:29-49)、非免疫グロブリンタンパク質起源(Nygren PA and Skerra A (2004) J. Immunol. Meths. 290:3-28)、またはオリゴヌクレオチド起源(Gold L et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:763-797)のものであり得る。
【０１２２】
多くの非免疫グロブリンタンパク質骨格は、新規結合タンパク質の開発における支持構造として使用されている。本明細書の使用のためにＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンドを産生するために有用なこのような構造の非限定的な例は、ブドウ球菌タンパク質Ａおよびそのドメインおよびこれらのドメインの誘導体、例えば、タンパク質Ｚ(Nord K et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:772777)；リポカリン(Beste G et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:18981903)；アンキリン反復ドメイン(Binz HK et al. (2003) J. Mol. Biol. 332:489503)；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）(Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332; Lehtio J et al. (2000) Proteins 41:316-322)；γ結晶(Fiedler U and Rudolph R, W001/04144)；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Peelle B et al. (2001) Chem. Biol. 8:521-534)；ヒト細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）(Hufton SE et al. (2000) FEBS Lett. 475:225-231; Irving RA et al. (2001) J. Immunol. Meth. 248:31-45)；プロテアーゼ阻害剤、例えば、ノッティン(Knottin)タンパク質(Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183:7273-7284; Baggio R et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134)およびクニッツ(Kunitz)ドメイン(Roberts BL et al. (1992) Gene 121:9-15; Dennis MS and Lazarus RA (1994) J. Biol. Chem. 269:22137-22144)；ＰＤＺドメイン(Schneider S et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:170-175)；ペプチドアプタマー、例えば、チオレドキシン(Lu Z et al. (1995) Biotechnology 13:366-372; Klevenz B et al. (2002) Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998)；ブドウ球菌ヌクレアーゼ(Norman TC et al. (1999) Science 285:591-595)；テンダミスタット(McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479; Li R et al. (2003) Proteins Eng. 16:65-72)；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくトリネクチン(Koide A et al. (1998) J. Mol. Biol. 284:11411151; Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9:933-942)；および亜鉛フィンガー(Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247:154-160; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293:215218; Segal DJ et al. (2003) Biochemistry 42:2137-2148)である。
【０１２３】
非免疫グロブリンタンパク質骨格の上記の例は、新規結合特異性の産生のために使用される単一の無作為化ループを提供する骨格タンパク質、タンパク質表面から突出している側鎖が新規結合特異性の産生のために無作為化されている強固な二次構造を有するタンパク質骨格、および新規結合特異性の産生のために使用される非連続の超可変ループ領域を示す骨格を含む。
【０１２４】
非免疫グロブリンタンパク質に加えて、オリゴヌクレオチドは、また、アフィニティーリガンドとして使用され得る。アプタマーまたはデコイと呼ばれる一本鎖核酸は、明確に定義された三次元構造に折りたたまれ、高いアフィニティーおよび特異性を有するその標的に結合する（Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359)。オリゴヌクレオチドリガンドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってよく、広範な標的分子クラスに結合することができる。
【０１２５】
任意の上記骨格構造の変異体のプールから所望のアフィニティーリガンドの選択性のために、多くの選択基盤が、選択された標的タンパク質に対する特異的新規リガンドの単離のために利用できる。選択基盤は、ファージディスプレイ(Smith GP (1985) Science 228:1315-1317)、リボソームディスプレイ(Hanes J and Pluckthun A (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942)、酵母ツーハイブリッド系(Fields S and Song O (1989) Nature 340:245-246)、酵母ディスプレイ(Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473)、ｍＲＮＡディスプレイ(Roberts RW and Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-12302)、細菌ディスプレイ(Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17:474-480, Kronqvist N et al. (2008) Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BR et al. (2004) PNAS 101(25):913-9198)、ミクロビーズディスプレイ(Nord O et al. (2003) J Biotechnol 106:1-13、W001/05808)、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法(System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)）(Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505-510)およびタンパク質フラグメント相補性アッセイ（ＰＣＡ）(Remy I and Michnick SW (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5394-5399)を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
したがって、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、任意の上記タンパク質骨格由来の非免疫グロブリンアフィニティーリガンド、またはオリゴヌクレオチド分子であり得る。
【０１２７】
上記のとおり、配列番号：１のＲＢＭ３タンパク質フラグメントは、他のヒトタンパク質と低い相同性を有するユニークな配列からなり、産生されたアフィニティー試薬の交差反応性を最小限にするように設計された。結果として、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、配列番号：１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと選択的相互作用が可能であり得る。
【０１２８】
以下の実施例の部４の下に記載されるとおり、配列番号：４および５のエピトープ領域は、配列番号：１の範囲内に同定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、配列番号：４および５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である。
【０１２９】
さらに、実施例の部５の下に記載されているとおり、別の４つのエピトープ領域（配列番号：６−９）が特定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
【０１３０】
また、実施例の部６の下に記載されているとおり、別の１０個のエピトープ領域（配列番号：１０−１９）が特定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：１０−１９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
【０１３１】
単一のエピトープ領域に対する選択性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、より長いペプチド配列（例えば、ＰｒＥＳＴまたは全長タンパク質）に対して産生された抗体と比較して、検出分析における再現性が高いため提供され得る。単一のエピトープ領域に対して選択的な抗体は、また、免疫組織化学的分析における染色を明瞭に、および強くするために提供され得る。これらの利益は、独立して、または共同で、本明細書の処置に関して処置予測または決定するときに重要であり得る。図１において、ポリクローナル抗体と比較しての本明細書のモノクローナル抗体の利益（選択性の増加）を説明している。
【０１３２】
モノクローナル抗体６Ｆ１１および１Ｂ５は、特に有益であると考えられる。図１において、６Ｆ１１および１Ｂ５の両方は、ポリクローナル抗−ＲＢＭ３抗体よりもさらに選択的であることを示す。さらに、１Ｂ５は、６Ｆ１１よりもさらに選択的であることを示す。１Ｂ５は、また、以下の実施例の部８および９において使用されている。
【０１３３】
１Ｂ５が実施例の部６において結合することが示されている配列番号：１７は、配列番号：５の範囲内である。本明細書の好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、したがって、配列番号：５からなるＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能であり、本明細書の特に好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：１７の配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
【０１３４】
６Ｆ１１は、配列番号：８および配列番号：１６に結合することを示す。本明細書の他の好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、したがって、２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：８および１６から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。配列番号：８および１６が重複しており、このようなフラグメントが配列番号：８および１６の両方の配列を含み得ることに注意すること。
【０１３５】
ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドの検出および／または定量化は、生物学的相互作用に基づくアッセイにおける結合試薬の検出および／または定量化のための当業者に知られている任意の方法において成し遂げられ得る。したがって、上記のあらゆるアフィニティーリガンドが、ＲＢＭ３タンパク質の存在を定量的および／または定性的に検出するために使用され得る。これらの「一次」アフィニティーリガンドは、それ自体を種々のマーカーで標識させてもよく、また、検出、視覚化および／または定量化を可能にする標識化された二次アフィニティーリガンドにより同様に検出され得る。これは、ＲＢＭ３タンパク質との相互作用が可能であるアフィニティーリガンドへ、または任意の二次アフィニティーリガンドへ接合することができる任意の１つまたはそれ以上の多数の標識を使用して、任意の１つまたはそれ以上の多数の当業者に既知の技術を使用して、それ自体何ら過度の実験を必要とせず成し遂げることができる。
【０１３６】
一次および／または二次アフィニティーリガンドに接合することができる標識の非限定的な例は、蛍光色素または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン）、発色色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）を含む。種々の他の有用な蛍光剤および発色団は、Stryer L (1968) Science 162:526-533およびBrand L and Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。アフィニティーリガンドは、また、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）および粒子（例えば、金）で標識化することができる。本明細書の文脈において、「粒子」は、分子の標識化のために適当な粒子、例えば、金属粒子を示す。さらに、アフィニティーリガンドは、また、蛍光半導体ナノ結晶（量子ドット）で標識化され得る。量子ドットは、上位の量子収量を有し、有機フルオロフォアと比較してさらに光安定であり、したがってさらに容易に検出される（Chan et al. (2002) Curr Opi Biotech. 13: 40-46）。異なる型の標識は、種々の化学、例えば、アミン反応またはチオール反応を使用してアフィニティーリガンドに接合することができる。しかしながら、アミンおよびチオール以外の反応基は、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンを使用することができる。
【０１３７】
上記の方法の局面は、限定されない選択が以下に記載されているいくつかの知られている形式および設定のいずれかにおいて使用され得る。
【０１３８】
組織学に基づく設定において、そのＲＢＭ３タンパク質標的に結合する標識化されたアフィニティーリガンドの検出、局在化および／または定量化は、視覚化技術、例えば、光学顕微鏡検査または免疫蛍光顕微鏡検査に関連し得る。他の方法は、フローサイトメトリーまたはルミノメトリーを介する検出に関連し得る。
【０１３９】
対象由来の生物学的材料は、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のためのサンプルを得るために使用され得る。したがって、該サンプルは早期に得られたサンプルであり得る。方法において早期に得られたサンプルを使用するとき、方法の工程はヒトまたは動物体で実施されない。
【０１４０】
アフィニティーリガンドは、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のためのサンプルに適用され得る。この処理は、ＲＢＭ３タンパク質の検出を可能にするだけでなく、加えて、その発現の分布および相対レベルを示し得る。
【０１４１】
該アフィニティーリガンドにおける標識の視覚化の方法は、蛍光、発光および／または酵素技術を含むが、これらに限定されない。蛍光は、蛍光標識を特定の波長の光に暴露することにより検出および／または定量され、その後、特定の波長領域の放射光が検出および／または定量される。発光的にタグを付けたアフィニティーリガンドの存在は、化学反応中に生じた発光により検出および／または定量され得る。酵素反応の検出は、化学反応を生じるサンプルにおける色の変化による。当業者は、種々の異なるプロトコールを適当な検出および／または定量化のために修飾することができることを知っている。
【０１４２】
上記局面の方法の態様において、サンプルは、固相支持体または担体、例えば、ニトロセルロースまたは適用される生物学的サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質を固定することが可能であるあらゆる他の固体支持体マトリックス上に固定され得る。本発明において有用ないくつかのよく知られている固体支持材は、ガラス、炭水化物（例えば、セファロース）、ナイロン、プラスチック、ウール、ポリスチレン、ポリエテン、ポリプロピレン、デキストラン、アミラーゼ、フィルム、樹脂、セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、アルミナ、斑糲岩および磁鉄鉱を含む。生物学的サンプルの固定化後、ＲＢＭ３タンパク質に対して選択的な一次アフィニティーリガンドは、例えば、本明細書の実施例の８および９に記載されているとおりに適用され得る。一次アフィニティーリガンドがそれ自体標識化されていないとき、支持マトリックスは、当分野で知られている１つ以上の適当なバッファーで洗浄され、次に標識化された二次アフィニティーリガンドへ暴露され、再びバッファーで洗浄され、結合していないアフィニティーリガンドを除去され得る。その後、選択的アフィニティーリガンドは、慣用の方法で検出および／または定量され得る。アフィニティーリガンドに対する結合特性は、１つの固体支持体から他のものへ変化し得るが、当業者は、日常の実験によりそれぞれの決定のための機能的な、および最適なアッセイ条件を決定することができるはずである。
【０１４３】
結果として、上記局面の方法の態様において、ａ１）またはａＩ）の定量化可能なアフィニティーリガンドは、該定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である二次アフィニティーリガンドを使用して検出され得る。したがって、ａ３）またはａＩＩ）の定量化は、定量化可能なアフィニティーリガンドに対するアフィニティーを有する二次アフィニティーリガンドの手段により実施され得る。一例として、二次アフィニティーリガンドは、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体であり得る。
【０１４４】
一例として、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のための１つの利用できる方法は、アフィニティーリガンドを、次に酵素免疫測定法（例えば、ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）において後に検出および／または定量することができる酵素に連結させることによるものである。このような技術はよく確立されており、それらの実現には当業者に何ら過度の困難性が存在しない。このような方法において、生物学的サンプルを、固体材料、または、次に酵素的に標識化された二次アフィニティーリガンドで検出および／または定量される、ＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンドへ接合した固体材料と接触させる。この後、適当な基質を、例えば、分光光度計、蛍光光度計、照度計を使用して、または視覚化手段により検出および／または定量される化学部分を生産するように適当なバッファー中で酵素標識と反応させるために提供する。
【０１４５】
上記のとおり、一次およびあらゆる二次アフィニティーリガンドは、検出および／または定量化を可能にするために放射性同位体で標識化することができる。本明細書における適当な放射性同位体の非限定的な例は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉである。標識化されたアフィニティーリガンドの比活性は、放射性同位体の半減期、同位体純度、および標識がアフィニティーリガンドに組み込まれているかどうかに依存する。アフィニティーリガンドは、好ましくは、よく知られている技術（Wensel TG and Meares CF (1983) in: Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy (Burchiel SW and Rhodes BA eds.) Elsevier, New York, pp 185-196）を使用して標識化される。したがって、放射性標識されたアフィニティーリガンドは、インビボまたはインビトロにおいて放射能の検出によりＲＢＭ３タンパク質を可視化するために使用することができる。例えば、ガンマカメラを有する放射性核種スキャン、磁気共鳴分光学または放出断層撮影は、インビボおよびインビトロにおいて機能するが、ガンマ／ベータカウンター、シンチレーションカウンターおよびＸ線撮影は、インビトロにおいて使用される。
【０１４６】
第１の局面に関連して上記のとおり、ＲＢＭ３タンパク質はｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌に対する診断マーカーである。胎盤型アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、オクタマー−３／４（ＯＣＴ３／４）および（ＲＮＡ結合モチーフタンパク質Ｙ）ＲＢＭＹは、前癌期の精巣癌の他のマーカーである。正確な診断を提供するために、本発明者らは、単一のキットにおけるＲＢＭ３タンパク質を標的化するアフィニティーリガンドおよび少なくとも１つの他の診断マーカーを組み合わせた値を理解している。
【０１４７】
本明細書の第４の局面のとおり、したがって、第１の局面の方法を実施するためのキットであって、
ａ）ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンド、および
ｂ）該定量化可能なアフィニティーリガンドの量を定量するために必要な試薬、
ｃ）胎盤型アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、オクタマー３／４（ＯＣＴ３／４）および（ＲＮＡ結合モチーフタンパク質Ｙ）ＲＢＭＹから選択されるタンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンド、および
ｄ）ｃ）の定量化可能なアフィニティーリガンドの量を定量するために必要な試薬
を含み、ｂ）およびｄ）の試薬が同じであるか、または異なっているキットを提供する。
【０１４８】
さらに、第１の局面に関連して上記のとおり、ＲＢＭ３タンパク質は精巣癌に対する予後診断マーカーである。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）は、精巣癌における他の予後診断マーカーである。正確な予後を提供するために、本発明者らは、単一のキットにおけるＲＢＭ３タンパク質を標的化するアフィニティーリガンドおよび少なくとも１つの他の予後診断マーカーを組み合わせた値を理解している。
【０１４９】
本明細書の第５の局面として、したがって、第２または第３の局面の方法を実施するためのキットであって、
ａ）ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンド、および
ｂ）該定量化可能なアフィニティーリガンドの量を定量するために必要な試薬、
ｃ）ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）から選択されるタンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンド、および
ｄ）ｃ）の定量化可能なアフィニティーリガンドの量を定量するために必要な試薬
を含み、ｂ）およびｄ）の試薬が同じであるか、または異なっているキットを提供する。
【０１５０】
したがって、同じ試薬、例えば、同じ二次抗体が、抗ＲＢＭ３タンパク質アフィニティーリガンドおよび他のマーカーを標的化するアフィニティーリガンドの両方を定量するために使用され得る。
【０１５１】
キットの種々の成分は、本明細書の方法の局面に関連して上記されているとおりに選択され、特定され得る。
【０１５２】
したがって、第４および第５の局面のキットは、ＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンド、別のマーカーに対するアフィニティーリガンド、ならびに、それらそれぞれの標的に特異的および／または選択的に結合した後に特異的および／または選択的アフィニティーリガンドを定量する手助けをする他の手段を含む。例えば、キットは、標的およびアフィニティーリガンドにより形成される複合体を検出する、および／または定量するための二次アフィニティーリガンドを含み得る。また、該キットは、キットを容易および効率的に使用することができるように、アフィニティーリガンド以外の種々の補助物質を含み得る。補助物質の例は、キットの凍結乾燥されたタンパク質成分を溶解または再構成するための溶媒、洗浄バッファー、酵素を標識として使用する場合において酵素活性を測定するための基質、パラフィンまたはホルマリン固定された組織サンプルを使用する場合において、抗原への接近性を増強するための標的回復溶液(target retrieval solution)、および物質、例えば、免疫測定試薬キットにおいて一般的に使用される、染色対比を増加させるために背景染色および／または対比染色溶液を減少させるための反応防止剤、例えば、内因性酵素遮断溶液を含む。
【０１５３】
キットの局面のキットは、また、有利には、サンプル値と比較するために使用される参照値を提供する、またはもたらすための参照サンプルを含み得る。例えば、参照サンプルは、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を含み得る。このような参照サンプルは、例えば、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を含む組織サンプルにより構成され得る。次に、該組織参照サンプルは、参照組織サンプルおよび対象サンプルにおける発現レベルの手動、例えば、肉眼的、または自動比較により、試験されるサンプルにおけるＲＢＭ３発現状態の決定において使用され得る。別の例として、参照サンプルは、あらかじめ決められた、または制御されたＲＢＭ３タンパク質の量を発現する細胞株、例えば、癌細胞株を含み得る。当業者は、例えば、Rhodes et al. (2006) The biomedical scientist, p 515-520の記載により導かれる、このような細胞株を提供する方法を理解している。一例として、細胞株はホルマリン固定されていてもよい。また、このようなホルマリン固定された細胞株は、パラフィン包埋されていてもよい。
【０１５４】
「参照値の提供のための参照サンプル」なる用語は、本明細書の文脈において広く解釈されるべきである。該参照サンプルは、参照値に実際に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得るが、また、参照値よりも高い値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。後者の場合は、「高い」値は、方法を実施する者により、例えば、「高い」値より低い参照値の外観を評価するために上位の参照（陽性参照）として使用され得る。免疫組織化学の当業者は、このような評価の仕方を理解している。さらに、別の、または相補的な例として、当業者は、このような評価において「低い」値の提供のために少量のＲＢＭ３タンパク質を含む別の参照サンプルを、例えば、陰性参照として使用し得る。これは、方法の局面に関連してさらに上記されている。
【０１５５】
結果として、キットの局面の態様において、参照サンプルは、参照値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。一例として、参照サンプルは、９５％以下、例えば、９０％以下、例えば、８５％以下、例えば、８０％以下、例えば、７５％以下、例えば、７０％以下、例えば、６５％以下、例えば、６０％以下、例えば、５５％以下、例えば、５０％以下、例えば、４５％以下、例えば、４０％以下、例えば、３５％以下、例えば、３０％以下、例えば、２５％以下、例えば、２０％以下、例えば、１５％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下、例えば、２％以下、例えば、１％以下、例えば、０％の核または細胞質画分に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。
【０１５６】
あるいは、または相補的に、該参照サンプルは、中程度の核または細胞質強度またはそれ以下、例えば、弱い核または細胞質強度またはそれ以下、例えば、非存在の核または細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。
【０１５７】
画分値および強度値の提供は、方法の局面に関連して上記されている。
【０１５８】
キットの局面のさらに別の、または相補的態様において、該キットは、参照値よりも高い値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む参照サンプルを含み得る。これらの態様において、参照サンプルは、例えば、７５％以上の核または細胞質画分および／または強い核または細胞質強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含み得る。
【０１５９】
キットの局面のさらに別の、または相補的態様において、該キットは、参照値以下である値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量、例えば、非存在の核または細胞質強度および／または＜２％、例えば、０％の核または細胞質画分を含む参照サンプルを含み得る。
【０１６０】
したがって、該キットは、あらかじめ決められた参照値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む参照サンプル、あらかじめ決められた参照値よりも高い値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む参照サンプル、および／またはあらかじめ決められた参照値以下である値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を含む参照サンプルを含み得る。
【０１６１】
結果として、キットの態様は、あらかじめ決められた参照値よりも高いＲＢＭ３タンパク質の量を含む第１の参照サンプル、およびあらかじめ決められた参照値以下であるＲＢＭ３タンパク質の量を含む第２の参照サンプルを含み得る。
【０１６２】
キットの局面の態様において、該参照サンプルは、組織サンプル、例えば、肉眼的または顕微鏡的評価に適している組織サンプルであり得る。一例として、該組織参照サンプルは、パラフィンで固定されるか、またはホルマリンで緩衝され、および／または顕微鏡的スライドガラス上に乗せられる切片（例えば、μｍ−薄片）に組織処理され得る。組織参照サンプルは、ＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンド、例えば、抗体での染色にさらに適している可能性がある。
【０１６３】
結果として、キットの局面の態様において、該参照サンプルは、いずれかの関連参照値、例えば、上記いずれか１つの参照値を直接的または間接的に提供するために、適当であり得る。
【０１６４】
キットの局面の参照サンプルのさらなる態様は、方法の局面の参照値および参照サンプルに関連して上記されている。
【０１６５】
上記見出したことにしたがって、本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質およびそのフラグメントに対するいくつかの使用を十分に理解している。
【０１６６】
したがって、本明細書の第６の局面として、５０以下のアミノ酸からなり、配列番号４−１９から選択される配列を含む、ＲＢＭ３タンパク質フラグメントを提供する。
【０１６７】
第６の局面の態様において、該フラグメントは２９以下のアミノ酸からなる。
【０１６８】
第６の局面のさらなる態様において、該フラグメントは２０以下のアミノ酸、例えば、１５以下のアミノ酸からなり、配列番号：６−１９から選択される配列を含む。
【０１６９】
このようなフラグメントの可能な使用は以下に記載されている。
【０１７０】
本明細書の第７の局面の第１の構成として、精巣障害、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌に対する診断マーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質の使用を提供する。
【０１７１】
第１の構成の使用は、例えば、予め得られたサンプルにおいて、完全にインビトロであり得る。
【０１７２】
本明細書の文脈において、「診断マーカー」は、存在が医学的状態を示すあらゆる物質を示す。したがって、該マーカーはバイオマーカー、例えば、ヒトタンパク質であり得る。診断マーカーの存在または比較的高レベルのその存在は、精巣障害を有する比較的高い可能性を示すと理解されるべきである。ここで、「比較的高い可能性」は、このような高レベルの診断マーカーを発現しない対象と比較して高い。
【０１７３】
第７の局面の第２の構成として、精巣障害、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌に対する診断薬の生産、選択または精製のためのＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントの使用を提供する。
【０１７４】
「抗原的に活性なフラグメント」は、フラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドを産生することが可能である十分なサイズのフラグメントを示す。
【０１７５】
該選択および精製はインビトロであり得るが、生産はインビボであり得る。
【０１７６】
本明細書の文脈において、「診断薬」は、診断の確立において重要である少なくとも１つの特性を有する薬物を示す。例えば、該診断薬は、診断マーカーと選択的相互作用が可能であり得る。
【０１７７】
したがって、該診断薬は、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドであり得る。このようなアフィニティーリガンドの例は、方法の局面に関連して上記されている。
【０１７８】
本明細書の教示によって導かれると、当業者は、診断薬の生産、選択または精製におけるＲＢＭ３タンパク質またはフラグメントの使用の仕方を理解している。例えば、該使用は、ＲＢＭ３タンパク質またはそのフラグメントが固定されている固体支持体におけるアフィニティー精製を含み得る。例えば、該固体支持体はカラム中に配置され得る。さらに、該使用は、ＲＢＭ３タンパク質またはそのフラグメントが固定されている固体支持体を使用して、ＲＢＭ３タンパク質またはそのフラグメントに対する特異性を有するアフィニティーリガンドの選択性を含み得る。このような固体支持体は、ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）、電磁ビーズ、アガロースビーズまたはセファロースビーズであり得る。さらに、該使用は、例えば、デキストランマトリックス、または表面プラズモン共鳴装置、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ装置における使用して可溶性マトリックス上のアフィニティーリガンドの分析を含み、該分析は、例えば、固定されたＲＢＭ３タンパク質またはそのフラグメントに対する多くの可能なアフィニティーリガンドのアフィニティーをモニタリングすることを含み得る。
【０１７９】
また、診断薬の生産のために、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントは、動物、例えば、ウサギまたはマウスの免疫化において使用され得る。
【０１８０】
このような使用は
ｉ）抗原としてＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントを使用して動物を免疫化し、
ｉｉ）免疫化動物から診断薬を含む血清を得、所望により
ｉｉｉ）血清から診断薬を単離する
工程を含む方法を含み得る。
【０１８１】
あるいは、第１の工程の次の工程は
ｉｉ’）免疫化動物から診断薬をコードするＤＮＡを含む細胞を得、
ｉｉｉ’）細胞を骨髄腫細胞と融合し、少なくとも１つのクローンを得、
ｉｖ’）クローンにより発現される診断薬を得る
であり得る。
【０１８２】
本明細書の第８の局面の第１の構成として、精巣癌に対する予後診断マーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質またはそのフラグメントの使用を提供する。
【０１８３】
第１の構成の使用は、例えば、予め得られたサンプルにおいて、完全にインビトロであり得る。
【０１８４】
本明細書の文脈において、「予後診断マーカー」は、存在が予後を示すあらゆる物質を示す。したがって、該マーカーは、バイオマーカー、例えば、ヒトタンパク質であり得る。予後診断マーカーの存在または比較的高レベルのその存在は比較的良好な予後を示すと理解されるべきである。ここで、「比較的良好な予後」は、このような高レベルの予後診断マーカーを発現しない比較できる精巣癌対象と比較して良好である。
【０１８５】
第８の局面の第２の構成として、精巣癌に対する予後診断薬の生産、選択または精製のためのＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントの使用を提供する。
【０１８６】
該選択および精製はインビトロであり得るが、生産はインビボであり得る。
【０１８７】
本明細書の文脈において、「予後診断薬」は、予後、例えば、精巣癌を有する哺乳動物対象に対する予後の確立において重要である少なくとも１つの特性を有する薬物を示す。例えば、予後診断薬は、予後診断マーカーと選択的相互作用が可能であり得る。
【０１８８】
したがって、該予後診断薬は、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドであり得る。このようなアフィニティーリガンドの例は、方法の局面に関連して上記されている。
【０１８９】
第８の局面の精巣癌は、例えば、精巣胚細胞癌であり得る。さらに、別の、または相補的態様において、それは非精上皮腫性であり得る。
【０１９０】
第７の局面についての上記議論および態様は、変更すべきところは変更して、第８の局面に適用する。
【０１９１】
第７または第８の局面の態様において、ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列は
ｉ）配列番号：１、および
ｉｉ）配列番号：１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含み得る。
【０１９２】
いくつかの態様において、配列ｉｉ）は、配列番号：１と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０１９３】
さらに、第７または第８の局面の態様において、ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列は
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなり得る。
【０１９４】
いくつかの態様において、配列ｉｉ）は、配列番号：２と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
【０１９５】
第７または第８の局面の抗原的に活性なフラグメントは、例えば、第６の局面のフラグメントのいずれかであり得る。
【０１９６】
本明細書の第９の局面として、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドを提供する。
【０１９７】
このようなアフィニティーリガンドの異なる態様は、方法の局面に関連して上記されている。
【０１９８】
本明細書の第１０の局面の第１の構成として、精巣障害、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌に対する診断薬としての第９の局面のアフィニティーリガンドの使用を提供する。
【０１９９】
本明細書の第１０の局面の第２の構成として、精巣癌に対する予後診断薬としての第９の局面のアフィニティーリガンドの使用を提供する。精巣癌は、例えば、精巣胚細胞癌であり得る。また、それは、例えば、非精上皮腫性であり得る。
【０２００】
例えば、このような使用は、例えば、対象由来の早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量の決定を含むインビトロで実施され得る。
【０２０１】
同等の様式において、精巣障害、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌に対する診断薬、または精巣癌に対する予後診断薬の製造におけるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドの使用を提供する。
【実施例】
【０２０２】
実施例
単一特異的ポリクローナル抗体
１．抗原の産生
ａ）材料および方法
ＥｎｓＥＭＢＬ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳ００００００１０２３１７によってコードされる標的タンパク質の適当なフラグメントを、生物情報学的ツールを使用して鋳型としてヒトゲノム配列で選択した(Lindskog M et al (2005) Biotechniques 38:723-727, EnsEMBL、www.ensembl.org)。該フラグメントを、ＲＢＭ３タンパク質（配列番号：２；ＥｎｓＥＭＢＬエントリー番号ＥＮＳＰ０００００３６５９４６）のアミノ酸１８−１５１（配列番号：１）に対応する１３４アミノ酸長フラグメントの生産のために鋳型として使用した。
【０２０３】
ＥｎｓＥＭＢＬエントリー番号ＥＮＳＴ０００００３７６７５５（配列番号：３）のヌクレオチド２８１−６８２を含むＲＢＭ３遺伝子転写産物のフラグメントを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ（Invitrogen）および鋳型としてヒト全ＲＮＡプールパネル（Human Total RNA, BD Biosciences Clontech）で、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ増幅キットにより単離した。フランキング制限酵素認識部位ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを、発現ベクターへのインフレームクローニングが可能なＰＣＲ増幅プライマー（フォワードプライマー：ＧＡＣＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧ（配列番号：２０）、リバースプライマー：ＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＣ（配列番号：２１））を介してフラグメントに導入した。次に、下流プライマーを、以前に記載されているとおりに、固相クローニングを可能にするためにビオチン化し、得られたビオチン化ＰＣＲ産物をＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０  ストレプトアビジン（Dynal Biotech）（Larsson M et al (2000) J. Biotechnol. 80:143-157）上に固定化した。該フラグメントを、Ｎｏｔｌ−Ａｓｃｌ消化（New England Biolabs）により固体支持体から遊離させ、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製のためのヘキサヒスチジルタグおよび連鎖球菌タンパク質Ｇ由来の免疫強化アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）からなるデュアル(デュアル)アフィニティータグと共にインフレームにｐＡｆｆ８ｃベクター（Larsson M et al.（上記））へライゲートし（Sjolander A et al (1997) J. Immunol. Methods 201:115-123; Stahl S et al (1999) Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation (Fleckinger MC and Drew SW, eds) John Wiley and Sons Inc., New York, pp 49-63）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Novagen）へ形質転換した。クローンの配列は、製造業者の推奨にしたがってＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＤＮＡシーケンシング増幅キット（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を使用して、増幅したプラスミドＤＮＡのダイ・ターミネーターサイクルシーケンシングにより証明した。
【０２０４】
発現ベクターを含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、同じ培養培地における１ｍｌの一晩培養物の添加により、５ｇ／ｌの酵母抽出物（Merck KGaA）および５０ｍｇ／ｌのカナマイシン（Sigma-Aldrich）を補った１００ｍｌの３０ｇ／ｌのトリプシン大豆汁（Merck KGaA）に播種した。細胞培養物を、１リットル振とうフラスコにおいて、６００ｎｍの光学濃度が０．５−１．５に達するまで、３７℃および１５０ｒｐｍでインキュベートした。次に、１ｍＭの最終濃度にイソプロピル−Ｒ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Apollo Scientific）の添加により、タンパク質発現を誘導し、インキュベーションを２５℃および１５０ｒｐｍで一晩インキュベーションを続けた。細胞を２４００ｇで遠心分離により回収し、ペレットを５ｍｌの溶解バッファー（７Ｍの塩酸グアニジン、４７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール；ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、３７℃および１５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。３５３００ｇで遠心分離後、変性および可溶化タンパク質を含む上清を回収した。
【０２０５】
Ｈｉｓ６−タグ融合タンパク質を、ＡＳＰＥＣ  ＸＬ４ＴＭ（Gilson）において自動化タンパク質精製処理（Steen J et al (2006) Protein Expr. Purif. 46:173-178）を使用して、１ｍｌのＴａｌｏｎ（登録商標）金属（Ｃｏ２＋）アフィニティー樹脂（BD Biosciences Clontech）を有するカラムにおける固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。樹脂を、２０ｍｌの変性洗浄バッファー（６Ｍの塩酸グアニジン、４６．６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３．４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０−８．２）で平衡化した。次に、浄化された細胞溶解物をカラムに加えた。その後、樹脂を最小量の３１．５ｍｌの洗浄バッファーで洗浄し、２．５ｍｌの溶離バッファー（６Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭの酢酸、７０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０）で溶離した。溶離した物質を５００、７００および１３００μｌの３つのプールに分画した。抗原を含む７００μｌの画分、ならびにプールした５００および１３００μｌの画分をさらなる使用のために保存した。
【０２０６】
抗原画分を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１．９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５４ｍＭのＮａＣＩ）で１Ｍのウレアの最終濃度に希釈し、次に７５００Ｄａの分子量カットオフでＶｉｖａｐｏｒｅ  １０／２０ｍｌ濃縮機（Vivascience AG）を使用してタンパク質濃度を増加させる濃度工程に付した。タンパク質濃度を、製造業者の推奨にしたがって、ウシ血清アルブミン標準でビシンコニン酸（ＢＣＡ）マイクロアッセイプロトコール（Pierce）を使用して決定した。タンパク質の質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ５０または２００アッセイ（Agilent Technologies）を使用してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置で分析した。
【０２０７】
ｂ）結果
ＲＢＭ３の全長転写産物（配列番号：３）のヌクレオチド２８１−６８２に対応する遺伝子フラグメントは、特異的プライマーを使用してヒトＲＮＡプールからＲＴ−ＰＣＲにより成功裏に単離した。フラグメントは、標的タンパク質ＲＢＭ３（配列番号：２）のアミノ酸１８から１５１をコードする。標的タンパク質（配列番号：２）の１３４個のアミノ酸フラグメント（配列番号：１）は、成熟型タンパク質において開裂されるため、大腸菌において効率的な発現を保証するために膜貫通領域を欠くように、任意のシグナルペプチドを欠くように設計された。加えて、タンパク質フラグメントは、他のヒトタンパク質と低い相同性を有するユニークな配列からなり、産生されたアフィニティー試薬との交差反応性を最小限にし、立体構造エピトープの形成やさらには細菌系における効率的なクローニングおよび発現を可能にするのに適当なサイズであるように設計された。
【０２０８】
正しいアミノ酸配列をコードするクローンを同定し、大腸菌における発現時に、正しいサイズの単一のタンパク質を生産し、次に、固定化金属イオンクロマトグラフィーを使用して精製した。溶離したサンプルを１Ｍの尿素の最終濃度に希釈、およびサンプルを１ｍｌに濃縮後、タンパク質フラグメントの濃度は１０．４ｍｇ／ｍｌであると測定され、純度分析によって９６．０％純度であった。
【０２０９】
２．抗体の産生
ａ）材料および方法
上記のとおりに得られた精製されたＲＢＭ３フラグメントを抗原として使用して、国の指針にしたがってウサギを免疫化した（スウェーデン許認可番号Ａ８４−０２）。ウサギを、一次免疫化としてフロイント完全アジュバント中の２００μｇの抗原で筋肉内投与して免疫化し、４週間の間隔をおいてフロイント不完全アジュバント中の１００μｇの抗原で３回追加免役した。
【０２１０】
免疫化動物由来の抗血清を、３工程の免疫アフィニティーに基づくプロトコールにより精製した（Agaton C et al (2004) J. Chromatogr. A 1043:33-40; Nilsson P et al (2005) Proteomics 5:4327-4337）。第１の工程において、７ｍｌの全抗血清を、１×ＰＢＳ（１．９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５４ｍＭのＮａＣＩ）の最終濃度に１０×ＰＢＳで緩衝し、０．４５μｍの細孔径フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）、Life Science）を使用して濾過し、ｐＡｆｆ８ｃベクターから発現されたデュアルアフィニティータグタンパク質Ｈｉｓ６−ＡＢＰ（ヘキサヒスチジルタグおよびアルブミン結合タンパク質タグ）と結合した、５ｍｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（GE Healthcare）を含むアフィニティーカラムに適用し、抗原タンパク質フラグメントに対して上記と同じ方法で精製した。第２の工程において、デュアルアフィニティータグＨｉｓ６−ＡＢＰに対する抗体が枯渇したフロースルーを、免疫化のための抗原として使用されるＲＢＭ３タンパク質フラグメント（配列番号：１）と結合した１ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐ  ＮＨＳ−活性化ＨＰカラム（GE Healthcare）に流速０．５ｍｌ／分で負荷した。Ｈｉｓ６−ＡＢＰタンパク質およびタンパク質フラグメント抗原を、製造業者により推奨されるとおりにＮＨＳ活性化マトリックスと結合させた。非結合物質を１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２５）で洗い流し、捕獲された抗体を低ｐＨのグリシンバッファー（０．２Ｍのグリシン、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ２．５）を使用して溶離した。第３の工程において、溶離した抗体画分を自動的に回収し、効率的なバッファー交換のために順番に接続した２つの５ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭ脱塩カラム（GE Healthcare）上に負荷した。第２および第３の精製工程を、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓＴＭ基盤（GE Healthcare）上で実施した。抗原選択的（単一特異的）抗体（ｍｓＡｂｓ）を、−２０℃での長期保存のために、それぞれ４０％および０．０２％の最終濃度にグリセロールおよびＮａＮ３を補ったＰＢＳバッファーで溶離した（Nilsson P et al (2005) Proteomics 5:4327-4337）。
【０２１１】
タンパク質アレイ設定において、アフィニティー精製された抗体画分の特異性および選択性を、抗原それ自体および９４の他のヒトタンパク質フラグメントに対する結合分析により分析した（Nilsson P et al (2005) Proteomics 5:4327-4337）。タンパク質フラグメントを０．１Ｍの尿素および１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４０μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれ５０μｌを９６ウェルのスポッティングプレートのウェルに移した。タンパク質フラグメントを、ピン・アンド・リング(pin-and-ring)のアレイヤー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４２７）を使用して、デュプリケート(duplicate)でスポットし、エポキシ製スライド（SuperEpoxy, TeleChem）上に固定した。スライドを１×ＰＢＳで洗浄し（５分）、次に表面を３０分間ブロックした（SuperBlock(登録商標)、Pierce）。接着性の１６ウェルシリコーンマスク（Schleicher & Schuell）を、単一特異的抗体を添加する（１×ＰＢＳＴにおいて１：２０００に希釈し、約５０ｎｇ／ｍｌにする）前にスライドガラスに適用し、６０分間、振とう器でインキュベートした。各スポットにおけるタンパク質の量を定量するために、アフィニティータグ特異的ＩｇＹ抗体を単一特異的抗体と共インキュベートした。スライドをそれぞれ１０分間で１×ＰＢＳＴおよび１×ＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体（Ａｌｅｘａ  ６４７と接合されたヤギ抗−ウサギ抗体およびＡｌｅｘａ  ５５５と接合されたヤギ抗−ニワトリ抗体、Molecular Probes）を、１×ＰＢＳＴで３０ｎｇ／ｍｌに１：６００００希釈し、６０分インキュベートした。第１のインキュベーションと同じ洗浄処理後、スライドを脱水し、スキャンし（G2565BA array scanner, Agilent）、その後、画像を画像分析ソフトウェア（GenePix 5.1, Axon Instruments）を使用して、定量した。
【０２１２】
加えて、アフィニティー精製された抗体の特異性および選択性をウエスタンブロットにより分析した。還元条件下で予め成形された１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（Bio-Rad Laboratories）上で選択されたヒト細胞株由来の全タンパク質抽出物を単離し、次に製造業者の推奨にしたがって、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad Laboratories）に電子移動することにより、ウエスタンブロットを実施した。膜を室温で１時間ブロックし（５％のドライミルク、１×ＴＢＳＴ；０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）、アフィニティー精製された一次抗体とインキュベートし（ブロッキングバッファーにおいて１：５００に希釈された）、ＴＢＳＴで洗浄した。ＨＲＰと接合された二次抗体（ブタ抗−ウサギ免疫グロブリン／ＨＲＰ、DakoCytomation）をブロッキングバッファーにおいて１：３０００に希釈し、化学発光検出を、製造業者のプロトコールにしたがって、ＣｈｅｍｉｄｏｃＴＭＣＣＤカメラ（Bio-Rad Laboratories）およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  基質（Pierce）を使用して実施した。
【０２１３】
ｂ）結果
ポリクローナル抗体調製物の質は、抗体精製におけるストリンジェンシーの程度に依存することが証明されており、標的タンパク質由来でないエピトープに対する抗体の枯渇が、他のタンパク質との交差反応性およびバックグラウンド結合を回避するために必要であることが以前に示されている（Agaton C et al (2004) J. Chromatogr. A 1043:33-40）。したがって、タンパク質マイクロアレイ分析によって、高い特異性の単一特異的ポリクローナル抗体がＨｉｓ６−タグに対する抗体ならびにＡＢＰ−タグに対する抗体の枯渇により産生されていることが確認された。
【０２１４】
タンパク質アレイの各スポットにおけるタンパク質の量を定量するため、一次および二次抗体を組み合わせて、二色の色素標識系を使用した。ニワトリにおいて産生されたＴａｇ−特異的ＩｇＹ抗体をＡｌｅｘａ  ５５５蛍光色素で標識した二次ヤギ抗ニワトリ抗体で検出した。アレイ上のその抗原へのウサギｍｓＡｂの特異的結合を、蛍光的にＡｌｅｘａ  ６４７で標識したヤギ抗−ウサギ抗体で検出した。それぞれのタンパク質フラグメントをデュプリケートでスポットした。タンパク質アレイ分析は、ＲＢＭ３に対するアフィニティー精製された単一特異的抗体が正しいタンパク質フラグメントに対して高度に選択的であり、アレイ上で分析される他のすべてのタンパク質フラグメントに対して非常に低いバックグラウンドを有することを示す。
【０２１５】
ウエスタンブロット分析の結果は、抗体が２つの乳房腫瘍細胞株、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７において約１６ｋＤａの単一バンドを特異的に検出することを示す。ＲＢＭ３の理論分子量は、１６ｋＤａ（配列番号：２のＲＢＭ３アミノ酸配列から計算される）であり、得られた結果に十分に対応している。
【０２１６】
モノクローナル抗体
３．モノクローナル抗体の産生
ａ）材料および方法
部１において得られた精製されたフラグメント（配列番号：１）を、モノクローナル抗体の生産のための抗原として使用した。抗原をAbSea Biotechnology Ltd (Beijing, China)に送り、簡潔には、抗原を３週間隔でＢＡＬＢ／ｃマウス（４−６週齢、メス）に皮下的に注射した。抗原を第１の注射のために完全フロイントアジュバントおよび後の注射のために不完全フロイントアジュバントと混合した。融合の３日前に、最後にマウスに静脈内的に抗原投与した。ハイブリドーマをＳｐ２／０骨髄腫細胞株とマウス脾細胞の融合により産生した。ＥＬＩＳＡを使用するいくつかの細胞株のスクリーニングにより、抗原（配列番号：１）に対して特異的な抗体を分泌する細胞を同定し、さらなる特性化のためにAtlas Antibodies ABに送達した。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット（ＷＢ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）において陽性結果を示す細胞株を、AbSea Biotechnology Ltdにより実施されるサブクローニングのために選択した。
【０２１７】
加えて、モノクローナル抗体の免疫組織化学的染色パターンを、部２において産生したポリクローナル抗−ＲＢＭ３抗体と比較した。このポリクローナル抗体は、ときどき、本明細書において「抗−ＲＢＭ３」と称される。
【０２１８】
ｂ）結果
抗原（配列番号：１）を認識するが、アフィニティータグＨｉｓ−ＡＢＰを認識しないモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生産する系を同定するために、細胞株をＥＬＩＳＡ（ＡｂＳｅａで）によりスクリーニングした。８つの細胞株は、ＥＬＩＳＡにおいて配列番号：１の抗原への特異的結合を示し、さらなる試験のために選択した。選択された８つのクローンのそれぞれに対して、１５０−３００μｌの上清を回収し、アジドを加え、上清を湿性氷上でAtlas Antibodies ABに送達した。上清を、ＡｂＳｅａの指示にしたがって到着時に＋４℃で保存した。細胞株のさらなる試験は、ウエスタンブロットおよびＩＨＣ分析の両方において陽性結果を与える３つの興味ある細胞株、クローン１Ｂ５、６Ｆ１１および７Ｇ３の同定をもたらした。これらのクローンを、AbSea Biotechnology Ltdにより実施されるサブクローニングおよび拡大のために選択した。
【０２１９】
エピトープマッピング
４．細菌ディスプレイＩを使用するエピトープマッピング
配列番号：１（すなわち、ＥＮＳＰ０００００３６５９４６のａａ１８−１５１またはＥＮＳＴ０００００３７６７５５のｂｐ２６１−６８２）に対応するＲＢＭ３  ＤＮＡを、鋳型としてベクターｐＡｆｆ８ｃを使用してＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡを、超音波処理により種々の長さ（約５０−１５０ｂｐ）に破砕し、次にブドウ球菌ディスプレイベクター（ｐＳＣＥＭ２）にライゲーションし、Ｓ．  Ｃａｒｎｏｓｕｓを形質転換し、約１０００００個の形質転換体を得た。インフレームのＤＮＡフラグメントがブドウ球菌表面上にペプチドとして示した。抗体（上記部２において得られる配列番号：１に対して選択的）および蛍光的に標識された二次試薬とインキュベーション後、陽性および陰性細胞をフローサイトメトリーを使用して別々に分類し、エピトープおよび非エピトープ提示細胞を単離した。単離された細胞をパイロシーケンシングによりシーケンシングし、最後にエピトープの同定のために配列をＲＢＭ３抗原とアラインした。
【０２２０】
表面発現レベルのリアルタイムモニタリングを有するデュアル標識戦略を使用した（Loefblom, J et al (2005) FEMS Microbiol Lett 248, 189-198）。それは、発現レベルで結合シグナルの標準化を可能にし、低い細胞間変動を提供し、異なるエピトープ集団の区別を可能にさせた。さらに、それは、また、表面上に示される非結合ペプチドを測定するための平行アッセイを可能にした。
配列番号：１内の２つのエピトープ領域、配列番号：４（ＲＧＦＧＦＩＴＦＴＮＰＥＨＡＳＶＡＭＲＡＭＮＧＥＳＬＤＧＲ）および配列番号：５（ＲＳＹＳＲＧＧＧＤＱＧＹＧＳＧＲＹＹＤＳＲＰＧＧ）を同定した。
【０２２１】
５．Ｌｕｍｉｎｅｘを使用するエピトープマッピング
ａ）合成ペプチド調製物
ＲＢＭ３におけるＰｒＥＳＴ  ＨＰＲＲ２３２６３１（配列番号：１）に対応する２５個のビオチン化ペプチドからなるＰＥＰスクリーンライブラリーをＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により合成した。これらのペプチドは、１０個のアミノ酸重複を有する１５アミノ酸長であり、共に全ＰｒＥＳＴ配列を含む。ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に８０％のＤＭＳＯに溶解させた。
【０２２２】
ｂ）ビーズ結合
ニュートラアビジン（Pierce, Rockford, IL）を、製造業者のプロトコールにしたがって、カルボキシル化ビーズ（COON Microspheres, Luminex-Corp., Austin, TX）上に固定した。１０６個のビーズの結合を、以前に記載されているとおりに（Larsson et al (2009) J Immunol Methods 15;34(1-2):20-32、Schwenk et al (2007) Mol Cell Proteomics 6(1) 125:32）、フィルター膜底マイクロタイタープレート（MultiScreen-HTS, Millipore, Billerica, MA）を使用して実施した。異なる色コードＩＤを有する２５個の異なるグループのビーズを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して活性化させた。ニュートラアビジン（ＭＥＳ中で１００μｇ／ｍｌ）をビーズに加え、振とう器で１２０分間インキュベートした。最後に、ビーズを洗浄し、再懸濁し、ＮａＮ３を補ったタンパク質含有バッファー（BRE, Blocking Reagent for ELISA, Roche, Basel, Switzerland）中で４℃で保存のために微小遠心管に移した。すべての結合したビーズ集団を５分間、超音波洗浄器（Branson Ultrasonic Corporation, Danbury, CT）において超音波処理で処理した。ビオチン化ペプチドを２０μＭの濃度にＢＲＥで希釈し、１００μｌのそれぞれのペプチドを結合反応に使用し、これを室温で６０分間振とうしながら行った。最後に、ビーズを３×１００μｌのＢＲＥバッファーで洗浄し、さらなる使用まで４℃で保存した。
【０２２３】
ｃ）結合特異性の決定
すべての２５個のビーズＩＤを含むビーズ混合物を調製し、ＰＢＳで５０ｎｇ／ｍｌに希釈した４５μｌのそれぞれの抗体を５μのビーズ混合物と混合し、室温で６０分間インキュベートした。フィルター底マイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を洗浄および次のそれぞれのインキュベーションのために利用し、すべてのウェルを３×１００μｌのＰＢＳＴで洗浄した。５０μｌのＲ−フィコエリトリン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（０．５μｇ／ｍｌ、Jackson ImmunoResearch）または５０μｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ヤギ抗マウスＩｇＧを室温で６０分の最終インキュベーションのために加えた（０．４ｕｇ／ｍｌ）。
【０２２４】
測定を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＰＯＮＥＮＴ  ソフトウェアを備えたＬｕｍｉｎｅｘ  ＬＸ２００装置を使用して実施した。それぞれの実験のために、ビーズＩＤあたり５０個の事象をカウントし、中央蛍光強度（ＭＦＩ）を個々のビーズ集団への抗体結合の測定として使用した。
【０２２５】
ｄ）結果
モノ特異的ポリクローナル抗体（抗−ＲＢＭ３、ＨＰＡ００３６２４）およびモノクローナル抗体６Ｆ１１の特異性を、合成ビオチン化ペプチドと結合したビーズを使用して、アッセイで試験した。抗ＲＢＭ３は、３つの異なる領域、ＰｒＥＳＴ配列、コンセンサス配列、配列番号：６、７、８および９に対応する８個のペプチド、すなわち６、７、８、１４、１５、１６、２４および２５に強い結合を示した。特に、配列番号：９に対応するペプチド２４および２５は強いシグナルを生じた。モノクローナル抗体６Ｆ１１は、ＰｒＥＳＴ配列、コンセンサス配列、配列番号：８において１つの異なる領域に対応する２つのペプチド：１５および１６と反応した。抗−ＲＢＭ３および６Ｆ１１の両方がペプチド１５および１６に結合するため、これは、これらの抗体がこの領域内の１つ以上のエピトープを共有していることを示す。配列番号：６は配列番号：４内であり、配列番号：８は配列番号：５内とある程度重複していることに注目すべきである。
【０２２６】
６．細菌ディスプレイＩＩを使用するエピトープマッピング
配列番号：１（すなわち、ＥＮＳＰ０００００３６５９４６のａａ１８−１５１またはＥＮＳＴ０００００３７６７５５のｂｐ２６１−６８２）に対応するＲＢＭ３  ＤＮＡを、鋳型としてベクターｐＡｆｆ８ｃを使用してＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡを、超音波処理により種々の長さ（約５０−１５０ｂｐ）に破砕し、次にブドウ球菌ディスプレイベクター（ｐＳＣＥＭ２）にライゲーションし、Ｓ．  Ｃａｒｎｏｓｕｓを形質転換し、約１０００００個の形質転換体を得た。インフレームのＤＮＡフラグメントがブドウ球菌表面上にペプチドとして示した。抗体（部２において得られる抗−ＲＢＭ３および部３において得られるモノクローナル抗体）および蛍光的に標識された二次試薬とインキュベーション後、陽性および陰性細胞をフローサイトメトリーを使用して別々に分類し、エピトープおよび非エピトープ提示細胞を単離した。単離された細胞由来のプラスミドＤＮＡをＳａｎｇｅｒシーケンシングによりシーケンシングし、エピトープの同定のために配列をＲＢＭ３抗原とアラインした。
【０２２７】
表面発現レベルのリアルタイムモニタリングを有するデュアル標識戦略を使用した（Loefblom, J et al (2005) FEMS Microbiol Lett 248, 189-198）。それは、発現レベルで結合シグナルの標準化を可能にし、低い細胞間変動を提供し、異なるエピトープ集団の区別を可能にさせた。さらに、それは、また、表面上に示される非結合ペプチドを測定するための平行アッセイを可能にした。
【０２２８】
ポリクローナル抗体において、配列番号：１内の領域、配列番号：１０−１５を同定した。早期に同定された領域、配列番号：４内に見出されたため、特に、領域、配列番号：１１および配列番号：１２は興味があった。さらに、以前に同定された配列番号：６および７のそれぞれとかなりの程度重複しているため、領域配列番号：１３および１４は特に興味があった。
【０２２９】
モノクローナル抗体６Ｆ１１において、配列番号：１内の領域、配列番号：１６を同定し、この領域（配列番号：１６）は、早期に同定された領域、配列番号：５内において見出された。部７においてここで同定された６Ｆ１１のエピトープ領域は、部６において同定された６Ｆ１１エピトープ領域で１つのアミノ酸重複を有する。しかしながら、部６および７の結果は対照的ではない。部６において６Ｆ１１に結合することが見出された１つのペプチド（ペプチド１６）は配列番号：１６（および配列番号：１９）を含む。したがって、部６および７の結果は相補的であると考えられ得る。
【０２３０】
モノクローナル抗体１Ｂ５において、配列番号：１内の領域、配列番号：１７を同定し、この領域（配列番号：１７）は、また、早期に同定された領域、配列番号：５内において見出された。モノクローナル抗体７Ｇ３において、配列番号：１内の領域、配列番号：１８を同定した。この領域（配列番号：１８）は、また、早期に同定された領域、配列番号：５内において見出された。この領域（配列番号：１８）は、６Ｆ１１抗体（配列番号：１６）に対するエピトープと重複している。モノクローナル抗体９Ｂ１１において、配列番号：１内の領域、配列番号：１９を同定した。
【０２３１】
７．抗体特異性の評価
ａ）材料および方法
ポリクローナル抗体（抗ＲＢＭ３）および２つのモノクローナル抗体（６Ｆ１１および１Ｂ５）の特異性をウエスタンブロットにより分析した。還元条件下で１７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で選択されたヒト細胞株由来の全タンパク質抽出物を単離し、次に製造業者の推奨にしたがって、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad Laboratories）に電子移動することにより、ウエスタンブロットを実施した。膜を室温で１時間ブロックし（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を有する１×ＰＢＳ中の５％のＢＳＡ）、アフィニティー精製された一次抗体（ブロッキングバッファーで１：１０００に希釈された）とインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した。ＨＲＰと接合された二次抗体（ヒツジ抗マウス免疫グロブリン／ＨＲＰ、ＧＥ）をブロッキングバッファーにおいて１：１００００に希釈し、化学発光検出を、製造業者のプロトコールにしたがって、ＣｈｅｍｉｄｏｃＴＭＣＣＤカメラ（Bio-Rad Laboratories）およびWestern Blotting Luminol Reagent（Santa Cruz Biotechnologies, Inc）を使用して実施した。
【０２３２】
ｂ）結果
ウエスタンブロット分析の結果は、抗体が細胞株において約１６ｋＤａのバンドを特異的に検出することを示す。ＲＢＭ３の理論分子量は、１６ｋＤａ（配列番号：２のＲＢＭ３アミノ酸配列から計算される）であり、得られた結果に十分に対応している。さらなるバンドが抗−ＲＢＭ３および６Ｆ１１に対して観察された。概して、結果は、モノクローナル抗体がポリクローナル抗体よりもより特異的であり、１Ｂ５抗体が６Ｆ１１抗体よりもさらにより特異的であったことを示す（図１参照）。
【０２３３】
８．精巣ＴＭＡ−予後
ａ）材料および方法
腫瘍材料を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ＵＭＡＳ、１９９５から２００８年で精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）と診断された３０人の患者から回収した。５個のサンプルは純粋な精上皮腫であり、２５個は非精上皮腫性ＴＧＣＴであった。非精上皮腫性ＴＧＣＴは、国際胚細胞腫瘍予後分類（ＩＧＣＣＣ）にしたがって分類した。２５個のサンプルのうちの４個はＩＧＣＣＣの中度の予後として、５個のサンプルはＩＧＣＣＣの不良な予後として分類した。残りの１６個の非精上皮腫性ＴＧＣＴは、ＩＧＣＣＣの良好な予後として分類した。この試験のための許可は、Ethics Committee at Lund University; ref nr 447-07 and 493-09から得た。５人の患者はそれらの疾患で死に、その内４人はＩＧＣＣＣの不良、１人はＩＧＣＣＣの中度であった。すべての患者にシスプラチンを含む標準処置を施した。
【０２３４】
ＴＭＡ構築前に、それぞれの場合由来の、すべて利用できるヘマトキシリンおよびエオシン染色したスライドを、組織病理学的に再評価した。組織学的亜型の全数を表し、分類することが難しい領域を含むそれぞれの亜型を示す領域を表した。次に、それぞれの場合においてすべての異なる成分を包含するために必要とされる数の正面向きの(Full-face)切片を、ＳＯＸ−２（Ｒ＆Ｄ、クローン２４５６１０；１：１００）およびＣＤ３０（ＤＡＫＯ、クローンＢＥＲＨ２；１：２５）に対して染色し、さらに分類を精密化および再分類した。標準セットの４×１ｍｍ核を、最大３つの異なる成分を包含する比例形式においてそれぞれの浸潤性腫瘍から得た。半自動アレイ装置を使用した（TMArrayer; Pathology Devices, Inc, Westminster, MD, USA）。
【０２３５】
すべての免疫組織化学的染色を、自動前処理を含むＰＴ−リンク系(DAKO, Copenhagen, Denmark)において行った。スライドを、実施例の部３において得られるＲＢＭ３一次モノクローナル抗体１Ｂ５と室温で３０分間、次にヤギ抗マウスペルオキシダーゼ接合Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）と室温で３０分間インキュベートした。すべての工程間、スライドを洗浄バッファー(Dako)で濯いだ。最後に、ジアミノベンジジン(Dako)をクロモゲンとして使用し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン(Sigma-Aldrich)を対比染色のために使用した。スライドをＰｅｒｔｅｘ（登録商標）(Histolab)で固定した。
【０２３６】
免疫組織化学的に染色された組織の全てのサンプルを、顕微鏡下で手動で評価し、認定された病理学者により注釈を付けた(annotated)。それぞれのサンプルの注釈を、ＩＨＣ結果の分類のための簡易化スキームを使用して行った。それぞれの組織サンプルを、典型性(representativity)および免疫反応に関して試験した。
【０２３７】
基本注釈(annotation)パラメーターは、ｉ）細胞内局在性（核および／または細胞質／膜）、ｉｉ）染色強度（ＳＩ）およびｉｉｉ）染色された細胞の画分（ＦＳＣ）の評価を含んだ。染色強度を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を、存在しない＝免疫反応がない、弱い−中程度＝わずかなから中程度の免疫反応、または強い＝はっきりとしたおよび強い免疫反応として分類した。また、染色された細胞の画分を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を関連細胞集団の免疫反応細胞の＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％として分類した。当業者は、この注釈処理がＡｌｌｒｅｄスコアの計算と同様であることを理解する、例えば、Allred et al (1998) Mod Pathol 11(2), 155参照。
【０２３８】
グラフ表示のために、核および細胞質染色を組み合わせて０から３の範囲である染色スコア（ＳＳ）を得た。強度のみを考慮したが、多数の陽性腫瘍は＞５０％の画分レベルを有した。ＳＳ＝０は発現がないと定義し、ＳＳ＝１は弱い発現として定義し、ＳＳ＝２は中程度の発現として定義し、そして、ＳＳ＝３は強い発現として定義した。
【０２３９】
ｂ）結果
ＲＢＭ３発現を、３が最も高い染色スコア（ＳＳ）を示す０、１、２または３として注釈した。図２において見ることができるとおり、ＲＢＭ３タンパク質発現のレベルは、確立されている予後診断カテゴリーと相関関係である。それらの疾患で死んだ患者は、一貫して低いＲＢＭ３発現のレベルを示す。これは不良な予後カテゴリーに属する患者にも当てはまるが、高いＲＢＭ３発現を有する全ての患者は良好な予後カテゴリーにおいて見出すことができる。一般的に特に良好な予後を有する精上皮腫を有する全ての患者は、高いＲＢＭ３発現を有した。
【０２４０】
図３において見ることができるとおり、ＲＢＭ３タンパク質発現と生存間に相関関係があった。高いＲＢＭ３タンパク質発現を有するすべての患者は、観察期間の最後に生存していた。
【０２４１】
結果として、ＲＢＭ３が高いＴＧＣＴと診断された患者は、ＲＢＭ３が低いＴＧＣＴと診断された患者よりも長い生存を有する可能性が高い。
【０２４２】
９．精巣ＴＭＡ−診断
ａ）材料および方法
組織材料を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ＵＭＡＳ、ｂｅｔｗｅｅｎ  １９９５から２００８年で精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）と診断された３０人の患者から回収した。この材料から、１５個のサンプルを未分類管内胚細胞腫瘍の領域（ＩＴＧＣＮ）から回収し、２２個のサンプルを正常精巣組織から回収した。この試験のための許可は、Ethics Committee at Lund University; ref nr 447-07 and 493-09から得た。
【０２４３】
ＴＭＡ構築前に、それぞれの場合由来の、すべて利用できるヘマトキシリンおよびエオシン染色したスライドを、組織病理学的に再評価した。組織学的亜型の全数を表し、分類することが難しい領域を含むそれぞれの亜型を示す領域を表した。次に、正面向きの切片を、ＳＯＸ−２（Ｒ＆Ｄ、クローン２４５６１０；１：１００）およびＣＤ３０（ＤＡＫＯ、クローンＢＥＲ−Ｈ２；１：２５）に対して染色し、さらに分類を精密化および再分類した。標準セットの２×１ｍｍ核を、それぞれのＩＴＧＣＮおよび正常組織から得た。半自動アレイ装置を使用した(TMArrayer; Pathology Devices, Inc, Westminster, MD, USA)。
【０２４４】
すべての免疫組織化学的染色を、自動前処理を含むＰＴ−リンク系(DAKO, Copenhagen, Denmark)において行った。スライドを、実施例の部３において得られるＲＢＭ３一次モノクローナル抗体１Ｂ５と室温で３０分間、次にヤギ抗マウスペルオキシダーゼ接合Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）と室温で３０分間インキュベートした。すべての工程間、スライドを洗浄バッファー(Dako)で濯いだ。最後に、ジアミノベンジジン(Dako)をクロモゲンとして使用し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン(Sigma-Aldrich)を対比染色のために使用した。スライドをＰｅｒｔｅｘ（登録商標）(Histolab)で固定した。
【０２４５】
免疫組織化学的に染色された組織の全てのサンプルを、顕微鏡下で手動で評価し、認定された病理学者により注釈を付けた。それぞれのサンプルの注釈を、ＩＨＣ結果の分類のための簡易化スキームを使用して行った。それぞれの組織サンプルを、典型性および免疫反応に関して試験した。
【０２４６】
基本注釈パラメーターは、ｉ）細胞内局在性（核および／または細胞質／膜）、ｉｉ）染色強度（ＳＩ）およびｉｉｉ）染色された細胞の画分（ＦＳＣ）の評価を含んだ。染色強度を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を、存在しない＝免疫反応がない、弱い−中程度＝わずかなから中程度の免疫反応、または強い＝はっきりとしたおよび強い免疫反応として分類した。また、染色された細胞の画分を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を関連細胞集団の免疫反応細胞の＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％として分類した。当業者は、この注釈処理がＡｌｌｒｅｄスコアの計算と同様であることを理解する、例えば、Allred et al (1998) Mod Pathol 11(2), 155参照。
【０２４７】
免疫反応細胞の強度および画分の両方に基づいて、染色スコア（ＳＳ）を、０から３の範囲であるそれぞれの組織サンプルに対して得た。強度のみを考慮したが、多数の陽性腫瘍は＞５０％の画分レベルを有した。ＳＳ＝０は発現がないと定義し、ＳＳ＝１は弱い発現として定義し、ＳＳ＝２は中程度の発現として定義し、ＳＳ＝３は強い発現として定義した。
【０２４８】
ｂ）結果
ＲＢＭ３発現を、３が最も高い染色スコア（ＳＳ）を示す０、１、２または３として注釈した。すべての未分類ＩＴＧＣＮサンプルは、強いＲＢＭ３タンパク質発現（ＳＳ＝３）を示したが、正常精巣組織において、セルトリ細胞および精原細胞のみがＲＢＭ３タンパク質を発現した。ＩＴＧＣＮは精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）の前駆体であり、また、ｉｎ  ｓｉｔｕの癌（ＣＩＳ）と称される。全てのＩＴＧＣＮ細胞におけるＲＢＭ３の強い発現は、ＣＩＳにおけるＲＢＭ３に対する役割を示唆する。
【０２４９】
結果として、これらの結果は、ｉｎ  ｓｉｔｕの精巣癌をＲＢＭ３発現の検出により診断することができることを示す。
【図１】
0005669757.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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