(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム複合体を製造する方法であって、
（１）カチオン性リポソーム、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質を含む中空ナノ粒子、及び核酸を液中にて混合する工程１、及び
（２）前記工程１にて得られた混合物を密度に基いて分離する工程２を含み、
工程１における混合工程を、ｐＨが５以下又は１０以上の液中で行うことを特徴とする、
リポソーム複合体の製造方法。
【請求項２】
前記工程２において、１．０７〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有するリポソーム複合体を分離することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
中空ナノ粒子が、脂質膜を構成要素とし、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム複合体、その製造方法、その細胞への導入、及び個体の組織への導入を目的とした使用に関する。特に、リポソーム、バイオナノカプセル、及び細胞導入物質を含むリポソーム複合体、その製造方法、及びその細胞への導入を目的とした使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオナノカプセル（ＢＮＣ）は「膜透過活性（膜融合活性と同義）を有するタンパク質を提示する生物由来中空ナノ粒子及びその改変体」のことであり、その代表例としてＢ型肝炎ウイルスの感染機構と、細胞及び臓器認識機構を有する非ウイルス性ベクターとして開発されたＢ型肝炎ウイルス表面抗原Ｌタンパク質粒子がある（その他の例として、インフルエンザ外皮タンパク質、センダイウイルス外皮タンパク質が想定される）。このＢＮＣ（以降はＢ型肝炎ウイルス表面抗原Ｌタンパク質粒子を指す）を用いて遺伝子や薬剤等を送達するＤＤＳ技術が開発されている（特許文献１、非特許文献１）。このＢＮＣへの遺伝子等の物質の封入は、エレクトロポレーション法を用いてＢＮＣ内部にプラスミドＤＮＡを導入する方法が開発されていた。しかしこの方法は、遺伝子導入が非効率的であることや、遺伝子等の封入によるＢＮＣ粒子の巨大化により生体内投与に不向きであること、また医薬品をとして生産する上で巨大なエレクトロポレーション材料を製造するのが困難であるといった問題があった。
【０００３】
そこでエレクトロポレーション法に代わる新たな遺伝子等の物質封入法として、カチオン性リポソームと遺伝子の複合体（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）に上記ＢＮＣを融合させる方法が確立された（特許文献２、非特許文献２）。また、ＢＮＣには抗体提示型ＢＮＣ（特許文献３）、レクチン提示型ＢＮＣ（特許文献４）、成長因子提示型ＢＮＣ（特許文献５）も開発されており、種々の細胞乃至組織に対して特異的な標的化能を付与することも可能となっている。
【０００４】
カチオン性リポソームは、カチオン性を有する脂質と、膜を安定化させる補助脂質とで構成されたリポソームであり、比較的遺伝子導入効率の高い非ウイルス性ベクターとして応用研究が盛んにおこなわれている。カチオン性リポソームは、静電的相互作用により遺伝子と複合体を形成し、さらに非特異的に細胞膜へ集積し、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。ＢＮＣは、その膜融合活性によりｌｉｐｏｐｌｅｘと膜融合し、ＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体を形成する。ＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体は、ＢＮＣを構成するタンパク質であるＨＢｓＡｇ Ｌのｐｒｅ−Ｓ１領域に存在するヒト肝臓特異的レセプターの働きにより、肝臓細胞特異的に作用し、またＨＢｓＡｇ Ｌのアミノ末端側に存在する膜透過ペプチドの働きにより、後期エンドソームからの脱出がさらに速やかに行われると考えられる（非特許文献３）。
【０００５】
これまでに、細胞への物質導入を目的としたＢＮＣ−リポソーム複合体について、その複合体のＤＤＳとしての働きを高めるために、所定の粒径とする技術（特許文献２）や、生体内での複合体の安定性に鑑みてゼロに近い表面電荷とする技術（特許文献６）が開示されているが、細胞への物質導入能自体を高める技術は何ら開発されていない。また上述のように、ＢＮＣは高い特異性で物質を導入する対象を選択することが可能であるため、高い特異性を有しつつも、細胞への物質導入能が向上したＢＮＣ−リポソーム複合体の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−３１６２９８号公報
【特許文献２】特開２００７−１０６７５２号公報
【特許文献３】ＷＯ２００５／０４９８２４
【特許文献４】特開２００９−１２０５３２号公報
【特許文献５】特開２００３−２８６１９８号公報
【特許文献６】特開２０１０−０７７０９１号公報
【非特許文献１】Nature Biotechnology 21 (2003) 885-890.  Nanoparticles for the Delivery of Genes and Drugs to Human Hepatocytes.  Yamada, T., Iwasaki, Y., Tada, H., Iwabuki, H., Chuah, M. K. L., VandenDriessche, T., Fukuda, H., Kondo, A., Ueda, M., Seno, M., Tanizawa, K., and Kuroda, S.
【非特許文献２】Journal of Controlled Release 126 (2008) 255-264  Bio-nanocapsule conjugated with liposomes for in vivo pinpoint delivery of various materials  Joohee Jung, Takashi Matsuzaki, Kenji Tatematsu, Toshihide Okajima, Katsuyuki Tanizawa, Shun'ichi Kuroda
【非特許文献３】Methods in Enzymology 464 (2009)147-166.  Bio-nanocapsule-liposome conjugates for in vivo pinpoint drugs and gene delivery．  Kasuya, T., Jung, J., Kinoshita, R., Goh, Y., Matsuzaki, T., Iijima, M., Yoshimoto, N., Tanizawa, K., and Kuroda, S.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な課題は、細胞への物質導入を目的とするＢＮＣ−リポソーム複合体の、細胞への高い特異性を有しつつも、物質導入効率を上昇させる技術を開発する点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の範囲の密度を有するリポソーム、バイオナノカプセル、及び細胞導入物質を含むリポソーム複合体が、高効率で、且つ高い特異性を持って、特定の細胞へ所望の物質を導入できることを見出した。さらに、特定の環境下にて製造した前記リポソーム複合体は、特に高い物質導入効率を示すことを見出した。本発明は、係る知見に基いて完成されたものであり、下記の態様を含むものである。
【０００９】
項１  リポソーム及びバイオナノカプセルを含むリポソーム複合体、又はリポソーム、バイオナノカプセル、及び細胞導入物質を含むリポソーム複合体であって、該リポソーム複合体の密度が１．０７〜１．１９ｍｇ／ｍｌであるリポソーム複合体。
項２  前記バイオナノカプセルが、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質、又はその改変体を含む中空ナノ粒子である、上記項１に記載のリポソーム複合体。
項３  前記細胞導入物質が、核酸、タンパク質、薬剤、糖質、脂質、及び標識物質からなる群より選ばれる少なくとも一種である上記項１又は２に記載のリポソーム複合体。
項４  前記リポソームが、カチオン性リポソームであり、前記細胞導入物質が核酸である上記項３に記載のリポソーム複合体。
項５  前記リポソームが、アニオン性リポソームであり、前記細胞導入物質が薬剤又は標識物質である上記項３に記載のリポソーム複合体。
項６  前記リポソーム複合体の表面電荷が、−３０〜＋１０ｍＶである上記項１に記載のリポソーム複合体。
項７  前記リポソーム複合体の粒径が、５０〜５００ｎｍである上記項１に記載のリポソーム複合体。
項８  上記項１に記載のリポソーム複合体と細胞を接触させ、前記細胞導入物質を細胞に導入する方法。
項９  リポソーム複合体を製造する方法であって、
（１）リポソーム、及びバイオナノカプセルを液中にて混合する工程１及び
（２）前記工程１にて得られた混合物を密度に基いて分離する工程２
を含む、リポソーム複合体の製造方法。
項１０  前記工程２において、１．０７〜１．１９ｍｇ／ｍｌの密度を有するリポソーム複合体を分離することを特徴とする上記項９に記載の製造方法。
項１１  前記工程１における混合工程を、ｐＨが５以下、又は１０以上の液中で行う上記項９又は１０に記載の方法。
項１２  前記バイオナノカプセルが、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質、又はその改変体を含む中空ナノ粒子である、上記項９〜１１のいずれかに記載の製造方法。
項１３  前記工程１にて、更に細胞導入物質を混合する、上記項９〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
項１４  前記工程２の後に、更に細胞導入物質を混合する工程３が含まれる、上記項９〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
項１５  前記細胞導入物質が、核酸、タンパク質、薬剤、糖質、脂質、及び標識物質からなる群より選ばれる少なくとも一種である上記項１３又は１４に記載の製造方法。
項１６  前記リポソームが、カチオン性リポソームであり、前記細胞導入物質が核酸である上記項１５に記載の製造方法。
項１７  前記リポソームが、アニオン性リポソームであり、前記細胞導入物質が薬剤又は標識物質である上記項１５に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のリポソーム複合体は、高効率で、且つ高い特異性にて細胞に物質を導入することができる。また、カチオニックリポソーム複合体に対してはゼータ電位を０ｍＶ前後からマイナスに下げるとともに、粒子径を３００ｎｍ以下に抑える働きがあり、生体内投与にも向いている複合体を生成できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のリポソーム複合体の製造に関する図。ｐＨが２、４、６、８、１０及び１２の条件下で作製したリポソーム複合体を分画し、各フラクションが呈する蛍光強度を示している。
【図２】本発明のリポソーム複合体の製造に関する図。ｐＨが３、５、７、９及び１１の条件下で作製したリポソーム複合体を分画し、各フラクションが呈する蛍光強度を示している。
【図３】本発明のリポソーム複合体の細胞導入効率を示す図。ｐＨが２、４、６、８、１０及び１２の条件下で作製した各々のリポソーム複合体の細胞導入効率を、ルシフェラーゼアッセイによって示している。各細胞に導入しているＤＮＡ量はすべて均一である。
【図４】本発明のリポソーム複合体の細胞導入効率を示す図。ｐＨが３、５、７、９、及び１１の条件下で作製した各々のリポソーム複合体の細胞導入効率を、ルシフェラーゼアッセイによって示している。各細胞に導入しているＤＮＡ量はすべて均一である。
【図５】本発明のリポソーム複合体の製造に関する図。ｐＨが３、５、７、及び９の条件下で作製したリポソーム複合体を分画し、各フラクションが呈する蛍光強度を示している。図中□（白抜き四角）はＣｙ３の蛍光強度を示し、●（黒丸）はＮＢＤの蛍光強度を示す。
【図６】本発明のリポソーム複合体の細胞導入効率を示す図。ｐＨが３の条件下で作製したリポソーム複合体の細胞導入効率を、複合体が取り込まれた細胞が呈す蛍光強度によって示している。
【００１２】
本発明のリポソーム複合体
本発明のリポソーム複合体は、リポソーム及びバイオナノカプセルを含むリポソーム複合体、又はリポソーム、バイオナノカプセル、及び細胞導入物質を含むリポソーム複合体であって、該リポソーム複合体の密度が１．０７〜１．１９ｍｇ／ｍｌであるリポソーム複合体である。
【００１３】
本発明のリポソーム複合体の表面電位は、特に限定はされないが、通常は−３０〜＋１０ｍＶ程度となる。このような範囲の表面電位を有するリポソーム複合体は、ＤＤＳとして生体に投与された際に有効に機能することが可能である。
【００１４】
本発明のリポソームは、アニオン性リポソーム、中性リポソーム、カチオン性リポソームのいずれであってもよく、特に限定はされない。
【００１５】
リポソームは一枚膜リポソームであっても、多重層リポソームであってもよく、通常４０〜３００ｎｍ程度の大きさである。好ましくは５０〜２００ｎｍ程度であり、更に好ましくは６０〜１５０ｎｍ程度である。リポソームの大きさは、中空ナノ粒子の０．５〜２倍程度の大きさであるのが好ましい。リポソームがナノ粒子に対して大きすぎても小さすぎても円滑な複合粒子の形成が妨げられる。
【００１６】
リポソームは超音波処理法、逆相蒸発法、凍結融解法、脂質溶解法、噴霧乾燥法等により製造することができる。
【００１７】
リポソームの構成成分としては、リン脂質、コレステロール類、脂肪酸等が挙げられ、具体的にはホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを常法によって水素添加したものの他、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質が挙げられる。リン脂質は様々な飽和度を有する脂質を組み合わせて使用するのが望ましい。その他、コレステロール類としては、コレステロール、フィトステロール等が挙げられ、脂肪酸としてはオレイン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、或いはこれら不飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物が挙げられる。側鎖の小さい不飽和脂肪酸を含むリポソームは曲率の関係から小さいリポソーム作製に有効である。
【００１８】
リポソームの製造法の例を具体的に説明すると、例えば前記したリン脂質、コレステロール等を適当な有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリン脂質膜を形成し、これに導入物質を含む水溶液、好ましくは緩衝液を加えて攪拌して、導入物質を内包したリポソームを得ることができる。該リポソームを直接、又はいったん凍結乾燥した後に、凍結乾燥処理された本発明のナノ粒子と混合することにより、リポソームとナノ粒子の複合粒子を得ることができる。
【００１９】
本発明のバイオナノカプセルは、膜透過活性を有するタンパク質を提示する生物由来中空ナノ粒子又はその改変体と、脂質膜を構成要素であり、例として、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒子、インフルエンザ外皮タンパク質、センダイウイルス外皮タンパク質等が挙げられる。中でも粒子径性能を有するＢ型肝炎ウイルスＬ（ＨＢｓＡｇ Ｌ）タンパク質を構成要素とする中空ナノカプセルが好ましい。
【００２０】
ＨＢｓＡｇＬタンパク質は、ｐｒｅ−Ｓ１領域に存在するヒト肝臓特異的レセプターの働きにより肝臓細胞特異的に作用し、またＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のアミノ末端側に存在する膜透過ペプチドの働きにより、後期エンドソームからの脱出がさらに速やかに行われる。
【００２１】
ＨｂｓＡｇ発明のタンパク質の改変体としては、特許文献１に記載された抗原性を減少させたＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質、特許文献３に記載された抗体結合領域を有するＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質などが挙げられる。
【００２２】
本発明の細胞導入物質とは、例えば細胞が有する機能を変化させる目的、細胞を標識する目的、細胞に新たな機能を付与する目的を達成させるための物質である。これらの物質として、核酸、タンパク質、脂質、糖鎖、薬剤、標識物質等が挙げられる。
【００２３】
上記の核酸は、ＤＮＡ（例えば、プラスミド、タンパク質又はペプチドが結合したＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はこれらの断片等）、ＲＮＡ（例えば、ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、合成ＲＮＡ又はこれらの断片）、アデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルを有する核酸アナログ等が挙げられる。これらの核酸は、細胞に導入されることによって、遺伝子の発現の調整の機能を発揮するという目的が達成される。
【００２４】
タンパク質としては、特に限定はされないが、抗体、成長因子、ホルモン等のように、外部から細胞に刺激を与えて、細胞が有する機能を変化させるもの、細胞内部で機能を発揮するものなどであればよい。また本発明におけるタンパク質とは、アミノ酸重合度の低いペプチドであってもよい。
【００２５】
脂質及び糖鎖においても、上記タンパク質と同様に、細胞外部から細胞に刺激を与えて、差し棒が有する機能を変化させるもの、細胞乃部にて機能を発揮するものであればよく、特に限定はされない。
【００２６】
薬剤としては、低分子化合物を示し、特に限定はされないが、本発明のリポソーム複合体は、ＤＤＳとしての機能を有することから、組織に特異的に送達する必要のある薬剤、又は徐放性が要求される薬物等が好適に用いられる。
【００２７】
標識物質とは、細胞を外部から認識可能とする物質であり、一般的に標識物質と呼ばれるものであれば特に限定はされない。認識するための方法は、特に限定されず、例えば、体外から特定の部位の細胞を認識するための周知の手段であればよい。このような標識物質として、具体的には蛍光物質、放射性物質、磁性物質等を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明のリポソーム複合体は、その用途によって適宜粒子径を調整することも可能である。例えば、生体内への投与を目的とするのであれば、２００ｎｍ以下の粒径に調整することが好ましい。具体的な粒子径の調整方法は、エクストルーダーを用いて、孔径の小さいフィルターを通過させることによって、粒子径の調節が可能である。
【００２９】
本発明のリポソーム複合体は、上記リポソームとバイオナノカプセルが、各々が有する脂質膜等を介して結合して複合体を形成する。また、上記リポソーム、バイオナノカプセル及び細胞導入物質を含むリポソーム複合体の場合、前記細胞導入物質は、前記リポソーム又はバイオナノカプセルの内部に包含されていてもよく、リポソーム、及び／又はバイオナノカプセルの表面に結合若しくは脂質膜中に介在した形態であってもよい。
【００３０】
本発明のリポソーム複合体を構成する上記リポソームとバイオナノカプセルの重量比は、通常リポソーム：バイオナノカプセル＝１：０．２〜１．５程度である。高い細胞導入効率得る観点から、１：０．７〜１．５程度とすることがより好ましい。
【００３１】
本発明において特に好ましいリポソーム複合体は、リポソームとしてカチオン性リポソーム、バイオナノカプセルとしてＢ型肝炎ウイルスタンパク質を含む中空ナノ粒子、及び細胞導入物質としてＤＮＡを含むリポソーム複合体があげられる。このようなリポソーム複合体の密度は、通常１．０７〜１．１５ｇ／ｍｌ程度である。
【００３２】
また、リポソームとしてアニオン性リポソーム、バイオナノカプセルとしてＢ型肝炎ウイルスタンパク質を含む中空ナノ粒子を含むリポソーム複合体も、本発明における特に好ましいリポソーム複合体である。このようなリポソーム複合体の密度は通常１．１７〜１．１９ｇ／ｍｌ程度である。
【００３３】
本発明のリポソーム複合体の製造方法
本発明のリポソーム複合体の製造方法は、下記の２つの工程を含むものである。
（１）リポソーム、及びバイオナノカプセルを液中にて混合する工程１。
（２）前記工程１にて得られた混合物を密度に基いて分離する工程２。
【００３４】
＜工程１について＞
工程１では、リポソームとバイオナノカプセルを液中にて混合する工程である。リポソーム、及びバイオナノカプセルは、上述したものを用いればよい。混合する時間は、特に限定されないが、通常は１０〜３０分程度とすればよい。また、混合する際の温度も特に限定はされず、通常は、１５〜３７℃程度の室温とすればよい。
【００３５】
得られるリポソーム複合体の、細胞導入効率を上昇させることを目的として、ｐＨが５以下、又は１０以上の液中で混合することが好ましい。更に細胞導入効率を向上させるためには、ｐＨは１〜５程度又は１０〜１４程度が好ましい。このとき、上述の範囲のｐＨの液中にリポソーム又はバイオナノカプセルを調整して、その後混合してもよいが、リポソームとバイオナノカプセルを、適当なｐＨの液中で混合した後、直ぐに上記範囲のｐＨを有する液体を加えてもよい。
【００３６】
このような液体は、特に限定されるものではないが緩衝液を用いることが好ましく、特に比較的広いｐＨにて緩衝能を有するＢｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｂｕｆｆｅｒが好ましい。
【００３７】
工程１では、リポソームとバイオナノカプセルの混合と同時に、上述した細胞導入物質を混合してもよい。若しくは、予め細胞導入物質と複合体を形成しているリポソームとバイオナノカプセルを混合してもよく、予め細胞導入物質と複合体を形成しているバイオナノカプセルとリポソームを混合してもよい。ここで、細胞導入物質とリポソーム、及び細胞導入物質とバイオナノカプセルの複合体とは、リポソーム或いはバイオナノカプセルの中に、細胞導入物質が内包される形態であってもよく、リポソーム或いはバイオナノカプセルの表面に結合若しくは脂質膜中に介在した形態であってもよい。
【００３８】
＜工程２について＞
工程２では、工程１にて得られる混合物を、密度に基いて分離する工程である。すなわち工程１にて得られる複合体は様々な組成にて形成される混合物となっているので、それらの混合物を各々の複合体が有する密度によって分ける工程である。
【００３９】
分離工程は、密度に依存した分離方法を用いればよく、例えば密度勾配遠心分離法を挙げることができる。密度勾配に用いる密度勾配液として、塩化セシウム溶液、蔗糖溶液、硫酸セシウム溶液、ＯｐｔｉＰｒｅｐ，Ｐｅｒｃｏｌ等挙げることができ、各々の用途に応じて適宜選択して用いればよい。密度勾配液は、段階的密度勾配であっても、直線的密度勾配であってもよく、適宜選択して用いればよい。
【００４０】
本発明のリポソーム製造方法において、工程１にて細胞導入物質をリポソーム、バイオナノカプセルと共に混合していない場合、工程２にて得られたリポソーム複合体と細胞導入物質を混合して、リポソーム、バイオナノカプセル及び細胞導入物質を含むリポソーム複合体を製造してもよい。混合時の条件等は、特に限定されるものではなく、例えば１５〜３７℃で１０〜３０分程度混合すればよい。混合の後に、複合体を形成しなかった工程２にて得られるリポソーム複合体、又は細胞導入物質は、ゲル濾過カラム等を用いて、適宜分離してリポソーム、バイオナノカプセル、及び細胞導入物質を含むリポソーム複合体を精製してもよい。
【００４１】
工程２の後に得られるリポソーム複合体は、その使用目的に応じて透析処理等を行ってもよい。
【００４２】
本発明のリポソーム複合体の使用
本発明のリポソーム複合体は、細胞導入能を有する。また、本発明のリポソーム複合体が上述の細胞導入物質を含む場合は、該細胞導入物質を細胞へ導入することができる。「細胞導入」なる用語は、細胞の中にリポソーム複合体の全体が侵入すること、細胞膜とリポソーム複合体が脂質膜融合等によって結合し、リポソーム複合体の一部が細胞に侵入すること、又は細胞膜の近傍にリポソーム複合体が接触して、前記細胞導入物質複合体を形成する成分の一部が細胞に侵入することを意味する。
【００４３】
本発明のリポソーム複合体は、例えばＤＤＳの用途に用いることができる。即ち、生体内に本発明のリポソーム複合体を投与した場合、生体内の組織を構成する細胞にリポソーム複合体が導入される。また、本発明のリポソーム複合体は、培養細胞等に対する遺伝子導入試薬として用いることも可能である。
本発明のリポソーム複合体をＤＤＳとして用いることによって、病気に対する治療、若しくは診断に用いることが可能となる。
【００４４】
例えば、ドキソルビシン等の抗がん剤を細胞導入物質としたリポソーム複合体は、細胞に対して抗がん剤を導入することが可能である。
【実施例】
【００４５】
＜バイオナノカプセル（ＢＮＣ）の作製＞
本実施例にて用いるＢＮＣは、ＢＮＣ発現プラスミドｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴを保有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２Ｒ−株から、特開２００７−２０９３０７号公報に記載された、バイオナノカプセルの効率的な精製法に従って作製した。なお、ＢＮＣは凍結乾燥処理を施して保存した。
【００４６】
作製した１ｍＬのＢＮＣ（タンパク質量として１ｍｇ／１ｍＬ）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ（登録商標）  Ｃｙ３  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ.  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ  ＵＫ）１ｔｕｂｅに全量添加し、室温にて遮光して６０分間静置した後、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．４−７．５）を５０μｌ添加し、５分間の静置によって、その反応を停止させた。この工程によって、Ｃｙ３によって標識されたＢＮＣ（Ｃｙ３−ＢＮＣ）が作製された。
【００４７】
引き続いて、上記の反応物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、及びＰＢＳを用いたゲルろ過クロマトグラフィーに供して、Ｃｙ３−ＢＮＣの精製を行った。
【００４８】
得られたＣｙ３−ＢＮＣ溶液は、分光光度計によりタンパク質の吸光度（Ａ２８０）及びＣｙ３の吸光度（Ａ５５２）を測定し、タンパク質濃度としてのＢＮＣ濃度を定量した。具体的には、Ｃｙ３−ＢＮＣ溶液のＡ２８０からＡ５５２の８％（Ｃｙ３によるバックグラウンド）を差し引いた値をタンパク質の吸光度とし、あらかじめ測定しておいた未標識のＢＮＣ（タンパク質量として１ｍｇ／ｍｌ）のＡ２８０の値をＳｔａｎｄａｒｄとしてＢＮＣ濃度を算出した。
【００４９】
この定量結果に基づいて、Ｃｙ３−ＢＮＣ溶液をＢＮＣ量が１００μｇ／ｔｕｂｅ（タンパク質量として）になるように凍結乾燥用チューブに分注し、２５０ｍｇ／ｍｌスクロース溶液を２０μｌ／ｔｕｂｅ添加し、液体窒素で５分から１０分間凍結させた後、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社）に連結した角型ドライチャンバー（東京理化器械株式会社）内で４８時間凍結乾燥させた。
【００５０】
＜カチオン性リポソームの作製＞
３．３ｍＭのＤＣ−６−１４（相互薬工株式会社）を８０１．８μＬ、３．３ｍＭのＤＯＰＥ（日油）を６０１．４μＬ、３．３ｍＭのＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を５８１．３μＬ、２ｍｇ／ｍＬの濃度の２２−（Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ａｍｉｎｏ）−２３，２４−ｂｉｓｎｏｒ−５−ｃｈｏｌｅｎ−３β−ｏｌを１６．４μＬ準備し、これら全てを５０ｍＬのナスフラスコに入れ、減圧乾固した後に蒸留水２ｍＬで水和した。
【００５１】
引き続いて液体窒素による凍結と融解を５回繰り返し、更にアントラソン超音波細胞破砕機（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．）を用いて超音波処理する工程を経て、最終濃度２ｍｇ／ｍｌのＮＢＤ標識カチオン性リポソームを得た。
【００５２】
＜カチオン性リポソーム複合体の作製＞
ＮＢＤで標識したカチオン性リポソームを、脂質量で２００μｇずつエッペンドルフチューブに分注し、ｐＣＡＧ−Ｌｕｃ３ベクター（ＣＡＧプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が配置された発現プラスミド）を４４．２μｇ添加し、１５分間室温静置して、ＤＮＡ−カチオン性リポソーム複合体（以後、ｌｉｐｏｐｌｅｘとする）を作製した。このとき、二者の重量比は、ｐＣＡＧ−Ｌｕｃ３ベクター：リポソーム＝１：４．５３であった。
【００５３】
次に、作製したｌｉｐｏｐｌｅｘと、既に作製した１００μｇのＣｙ３−ＢＮＣを混合し、ｐＨ３、５、７、及び９のＢｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍホウ酸、０．１Ｍ酢酸、０．１Ｍリン酸、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ調製）をそれぞれ加え、３０分間３７℃でインキュベートしてＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体を作製した。
【００５４】
引き続いて、得られたＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体を、塩化セシウム密度勾配遠心法に供して分画操作を行った。塩化セシウム密度勾配遠心法による分画は、１０％、１５％、２０％、３０%、及び４０%（ｗ／ｖ）の塩化セシウム溶液（このときの溶媒はＰＢＳ）を、各２ｍｌずつＰ４０ＳＴ用の遠心管に充填し、分離用超遠心機ＣＰ１００ＭＸ（日立工機）を用いて、室温のもと、回転数２４，０００ｒｐｍで１６時間、遠心分離処理を行った。
【００５５】
遠心分離の後、遠心管の上層から５００μｌずつ分取して各フラクションを得た。各フラクションは、Ｖａｒｉｏｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、リポソームを標識するＮＢＤ由来の蛍光（測定波長５３０ｎｍ）と、ＢＮＣを標識するＣｙ３由来の蛍光（測定波長５５２ｎｍ）を測定し、ＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体を最も多く含有するピークフラクションを分取した。各フラクションのＮＢＤ及びＣｙ３の蛍光強度を図１及び２にて示す。
【００５６】
本実施例において、ｐＨ２の条件下で作製したＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体は７及び８番目のフラクションを、ｐＨ４の条件下のものは８及び９番目のフラクションを、ｐＨ６の条件下のものは９番目のフラクションを、ｐＨ８の条件下のものは１０番目のフラクションを、ｐＨ１０の条件下のものは８、９及び１０番目のフラクションを、そしてｐＨ１２の条件下のものは５、６及び７番目のフラクションを回収した。また、ｐＨ３の条件下で作製したＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体は６、７及び８番目のフラクションを、ｐＨ５の条件下のものは８及び９番目のフラクションを、ｐＨ７の条件下のものは９番目のフラクションを、ｐＨ９の条件下のものは１０番目のフラクションを、そしてｐＨ１１の条件下のものは７番目のフラクションを回収した。回収したそれぞれのピークフラクションは、５００ｍｌのＰＢＳにて数回透析した後に４℃にて保存した。
【００５７】
これらのフラクションに含まれるＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の各種性状について測定した。ＢＮＣの定量（タンパク質量として）は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＢＣＡ  ａｓｓａｙにより評価した。また、複合体に含まれるＤＮＡの定量は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって行った。具体的には、マイクロチューブにＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸを１２．５μｌずつ、各１０μＭのＦｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１）及びＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）を各０．５μｌずつ添加し、そこにテンプレートをそれぞれ５μｌずつ加え、蒸留水で２５μｌにメスアップしたものを、ＲＴ−ＱＰＣＲ（Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）に供した。
【００５８】
テンプレートについては、２μｌのＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体と同量の２％（ｖ／ｖ）ＴＸ−１００を混合し、３０分室温で置いたものを２００倍希釈して用い、スタンダードであるｐＣＡＧ−Ｌｕｃ３は、濃度が０．０２５、０．２５、２．５、及び２５ｐｇ/μｌのものを使用した。なお、反応液中に混入するＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は５×１０-3％（ｖ／ｖ)以下とした。この濃度は、ＲＴ−ＱＰＣＲを阻害しないことを別途確認している。なお、ＰＣＲ反応のサーマルプログラムについては、上記システムのプロトコルに従って行った。
【００５９】
ＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の粒子径とζ電位は、ゼータサイザーナノシリーズＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）を用いて測定した。具体的には、ブラウン運動中の粒子群にレーザー光を当て、その散乱光を光電子倍増管にて検出するＤＬＳ法（動的光散乱法）による粒子径測定と、Ｍ３（ｍｉｘｅｄ  ｍｏｄｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）測定技術と、ＰＡＬＳ（Ｐｈａｓｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）法をあわせたＭ３−ＰＡＬＳによるζ電位測定を行った。
【００６０】
各ｐＨ環境下にて製造しその後、密度勾配遠心にて分画した後に回収した上記各フラクションに含まれるＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の各種性状について、下記の表１に示す。
【００６１】
【表１】
0005713311.tif 000002
【００６２】
また、比較実験例として、上記のｌｉｐｏｐｌｅｘとＣｙ３−ＢＮＣを４．５３：７．４８の重量比で混合し、１０分間室温にて静置して作製し、塩化セシウム密度勾配遠心法に供さないサンプルを、後の細胞導入効率実験における比較実験例として用いた。
【００６３】
＜リポソーム複合体を用いた細胞導入効率実験＞
細胞への遺伝子導入効率は、細胞内のルシフェラーゼ活性を基にして測定した。
導入細胞として、Ｈｕｈ７（ヒト肝臓癌由来細胞）、及びＨＥＫ２９３細胞（ヒト腎臓由来細胞）を用いた。これらの細胞を、２４穴ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ（ＡＧＣテクノガラス）に５×１０４／ｗｅｌｌ播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２存在下で２４時間培養した。次に、上述の密度勾配遠心法に供した後のＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体を、ＤＮＡ量が３ｎｇ／ｗｅｌｌになるよう細胞に添加し、７２時間培養した。
【００６４】
また比較実験例として、ｌｉｐｏｐｌｅｘ、及び上述の密度勾配遠心法に供していないｌｉｐｏｐｌｅｘ−ＢＮＣ複合体を各Ｗｅｌｌ当り３ｎｇとなるように細胞へ添加した。ルシフェラーゼ活性は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。具体的には、ルシフェラーゼ発現細胞をＰＢＳで1回洗浄し、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１００  μｌ／ｗｅｌｌ加え、ＢｉｏＳｈａｋｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ）を用いて室温で５分間振とうさせ、その後細胞溶解液を回収した。次に、細胞溶解液５μｌにルシフェラーゼ基質１００μｌを加え、ルミノメーター（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７）を用いて１０秒間の発光量を測定し、ルシフェラーゼ活性を相対的発光量ユニット（ＲＬＵ）で表わした。
なお、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ）により、各サンプルのタンパク質濃度を定量し、細胞数を反映するとして換算し、ＲＬＵ値を補正した。結果を、図３、４に示す。測定は、６回ずつ行ってその平均値を算出して用いた。
【００６５】
密度勾配遠心法に供したＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の遺伝子導入効率は、全ての複合体作製時の全てのｐＨ条件において従来法よりも高くなった。中でも、低いｐＨ条件下又は高いｐＨ条件下にて作製したＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体は飛躍的に同効率が向上した。また,従来法のＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体は、ｌｉｐｏｐｌｅｘよりも低い遺伝子導入効率を示す傾向にあったのに対し、密度勾配遠心法に供したＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体は、ｌｉｐｏｐｌｅｘよりも遺伝子導入効率が高くなった。また、密度勾配遠心法に供したＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の肝臓細胞特異性は、従来法のＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体に比べて飛躍的に向上した。
【００６６】
具体的にＨｕｈ７細胞に対する実験において、ｌｉｐｏｐｌｅｘのみのＲＬＵ値は４２４３、従来の混合しただけで、密度勾配遠心法に供さないＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体のＲＬＵ値は２０５８であった。本実施例のように密度勾配遠心法に供したＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体のうち、ｐＨ２の条件下にて調整したもののＲＬＵ値は８４４５５９、ｐＨ４では４０５９３５、ｐＨ６では２７７４７０、ｐＨ８では１４７５９７、ｐＨ１０では２７９０６３、ｐＨ１２では３４２５８８であった。以上の結果から、中性以外のｐＨ環境下にて作製したＢＮＣ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体が、特に高い遺伝子導入能を有することが明らかとなった。
【００６７】
また、比較実験として行った、一般的に遺伝子導入剤として用いられるＦｕｇｅｎｅのＲＬＵ値の結果は８４５７９であった。
【００６８】
＜アニオン性リポソームの作製＞
アニオン性リポソームは、下記のようにして作製した。ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；日油）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ；日油）、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロールナトリウム（ＤＰＰＧ−Ｎａ；日油）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ；ナカライテスク）を、クロロホルム／メタノール（４：１（ｖ／ｖ））混合液に溶解させ、ＤＰＰＣ：ＤＰＰＥ：ＤＰＰＧ−Ｎａ：Ｃｈｏｌが、モル比で１５：１５：３０：４０となるようにナス方フラスコに加え、後にロータリー式エバポレーターで減圧乾固して半球状の脂質フィルムを作製した。このフィルムに蒸留水を加え、引き続いてアントラソン超音波破砕機を用いて室温にて６分間超音波処理を行った。なお、ＮＢＤで標識されたアニオン性リポソームは、上述のＤＰＰＥ代えて、Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１,３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）−１,２−ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＮＢＤ−ＤＨＰＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【００６９】
＜ＢＮＣ−アニオン性リポソーム複合体の作製＞
上述のＮＢＤで標識したアニオン性リポソームと、上述のＣｙ３にて標識したＢＮＣをそれぞれ重量比で２：１となる量にてｐＨが３、５、７、及び９のＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。
【００７０】
後に、上述した＜カチオン性リポソーム複合体の作製＞と同様に、塩化セシウム密度勾配遠心法に供した。塩化セシウム密度勾配遠心法で得られた各フラクションが呈する蛍光強度を、複合体作製時のそれぞれのｐＨ条件下ごとに図５に示す。
【００７１】
ｐＨ３の条件下で作製したＢＮＣ−アニオン性リポソーム複合体は８番目のフラクションを、ｐＨ５の条件下のものは８番目のフラクションを、ｐＨ７の条件下のものは８番目のフラクションを、ｐＨ９の条件下のものは８番目のフラクションを回収した。回収したそれぞれのピークフラクションは、５００ｍｌのＰＢＳにて数回透析した後に４℃にて保存した。
【００７２】
得られたＢＮＣ−アニオン性リポソームのうち、ｐＨ３の条件下にて作製したものは、１．１８ｇ／ｍＬの密度を有することが明らかとなった。
【００７３】
＜ＢＮＣ−アニオン性リポソーム複合体の細胞への導入能＞
上述のＢＮＣ−アニオン性リポソーム複合体のうち、ｐＨ３の条件下にて作製し、塩化セシウム密度勾配遠心法にて分画したもの（タンパク質濃度で１０μｇ／ｍｌ）を、約１×１０４細胞のＨｕｈ７又はＨｅＬａ細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。比較実験として、同じタンパク質濃度のＣｙ３−ＢＮＣ、同じ脂質濃度のＮＢＤにて標識したアニオン性リポソームを上記細胞に添加して、同様にインキュベートした。その後細胞を冷ＰＢＳにて数回洗浄し、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドにて固定し、各測定サンプルとした。
【００７４】
各測定サンプルを、共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ−１０００Ｄ（オリンパス）にて観察し、Ｃｙ３及びＮＢＤの蛍光強度を測定した。それぞれの蛍光強度は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅｖｅｒｓｉｏｎ６．１ｒ２.を用いて解析した。なお、得られた蛍光強度値は細胞数にて標準化した。結果を図６に示す。
【００７５】
ＢＮＣ−アニオン性リポソーム複合体を細胞に作用させた場合、Ｈｅｌａ細胞に比べてＨｕｈ７細胞ではＣｙ３の蛍光強度を基にすると約４４倍もの量で、またＮＢＤの蛍光強度を基にすると約５９倍もの量で、ＢＮＣ−アニオン性リポソーム複合体が細胞内に吸着乃至取り込まれることが明らかとなった。またＨｕｈ７細胞に対して、ＢＮＣ−アニオン性リポソーム複合体は、ＢＮＣ単独と比較して約６倍、アニオン性リポソーム単独と比較すれば約２００倍もの量で、細胞に対して吸着乃至取り込まれることが判明した。
【図１】
0005713311.tif 000003
【図２】
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【図３】
0005713311.tif 000005
【図４】
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【図５】
0005713311.tif 000007
【図６】
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【配列表】
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