(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの１７番染色体の２４９２６１０１番目の塩基であるＣ／Ｔが存在するＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型部位を含む塩基配列部位と相補的な配列を有するプローブ、及び／または前記一塩基多型部位を含む塩基配列部位の増幅のためのプライマーを含む、注意欠陥多動性障害の診断用組成物。
【請求項２】
１）毛、血液、組職、細胞、血清、血漿、唾液、喀痰及び尿からなる群から選択される何れか一つの生物学的試料から核酸試料を分離する段階と、
２）段階１）で分離した核酸試料で、ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型塩基をヒト染色体１７番の２４９２６１０１番目の塩基位置で確認する段階と、
３）前記段階２）で確認されたｒｓ５５０８１８一塩基多型の対立遺伝子型がＣ／Ｔである場合、注意欠陥多動性障害の発病危険度が高いと判定する段階と、を含む注意欠陥多動性障害の危険度の予測方法。
【請求項３】
前記段階２）は、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）によるプローブハイブリダイゼーション法、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション法（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、対立遺伝子特異的増幅法（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、配列決定法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、５’ヌクレアーゼ分解法（５’ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）、分子ビーコンアッセイ法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ａｓｓａｙ）、オリゴヌクレオチド結合アッセイ法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、サイズ分析法（ｓｉｚｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）及び一本鎖高次構造多型法（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）からなる群から選択される一つ以上の方法により行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型部位の配列を含むプローブ、または前記一塩基多型部位の増幅のためのプライマーを含み、重合酵素連鎖反応により増幅してポリヌクレオチドを決定する段階を含むことを特徴とする注意欠陥多動性障害の危険度の予測方法。
【請求項５】
前記重合酵素連鎖反応は、リアルタイム重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはＰＮＡプローブを用いた重合酵素連鎖反応であることを特徴とする請求項４に記載の予測方法。
【請求項６】
ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型塩基のＣ／Ｔとハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドまたはその相補的なポリヌクレオチドを含む、注意欠陥多動性障害の危険度の診断用マイクロアレイ。
【請求項７】
前記注意欠陥多動性障害の診断用マイクロアレイを構成するポリヌクレオチドは、アミノ−シラン、ポリ−Ｌ−リジン及びアルデヒドからなる群から選択される一つ以上の活性基がコーティングされた基板に固定されることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
前記基板は、シリコンウェハ、ガラス、石英、金属、ナイロン膜、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、及びプラスチックからなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項７に記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項に記載のマイクロアレイを含む注意欠陥多動性障害の危険度の診断用キット。
【請求項１０】
前記マイクロアレイは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合物質（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、化学蛍光物質（ｃｈｅｍｉｆｌｕｒｏｒｅｎｓｃｅ）及び化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）からなる群から選択される何れか一つをさらに含んでハイブリダイゼーションすることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記ハイブリダイゼーションに用いられる緩衝溶液、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及びｒＮＴＰ（事前混合型または分離供給型）、標識試薬、及び洗浄緩衝溶液からなる反応試薬群から選択される何れか一つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記化学蛍光物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（ｐｏｌｙ Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）及びローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、注意欠陥多動性障害の発病と有意の相関関係を有する特定の一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）を選別し、これをマーカーとして利用して注意欠陥多動性障害の発病危険性を予測する技術に関し、より具体的には、ヒトの１７番染色体の２４９２６１０１番目の塩基であるＣ／Ｔを含むポリヌクレオチド、ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型の塩基を確認して、注意欠陥多動性障害の発病危険性を予測する方法に関する。また、前記一塩基多型を検出するためのプローブまたは前記染色体部位を増幅するためのプライマーを含む注意欠陥多動性障害の発病危険性を診断するための組成物及び前記プローブを表面に固定させた検診用キットに関する。
【０００２】
従って、本発明による予測方法、診断用組成物及びキットは、簡便且つ高感度で注意欠陥多動性障害の発病危険群を分類することができ、これらの危険群を予め予防したり早期発見できるようにする有用な技術である。
【背景技術】
【０００３】
注意欠陥多動性障害（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｔ／Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＡＤＨＤ）は児童期に多く発症する障害であり、持続的な注意力の低下による注意散漫、活動過多、衝動性を症状とする障害である。これらの症状を治療せずに放置すると、児童期の全体に亘って持続的に生活が困難であり、一部の場合は青少年期及び成人期になっても症状が続くようになる（Ｂａｒｋｅｙ  ＲＡ、Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｔ  Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００６）。
【０００４】
注意欠陥多動性障害の発病原因としては、神経化学的要因、遺伝的要因及び環境的要因が報告されている。特に、神経伝達物質であるドーパミンと注意欠陥多動性障害との連関性が知られているが（Ｓｗａｎｓｏｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ．Ｒｅｖ．１７：３９−５９、２００７）、既に行われた注意欠陥多動性障害の感受性関連遺伝子の探索研究では、ドーパミン輸送体などのドーパミン関連遺伝子が含まれていなかった（Ｆｒａｎｋｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１２６：１３−５０、２００９）。従って、本疾病の発病原因には、多様な遺伝的素因があると判断される。
【０００５】
注意欠陥多動性障害に係って、最近行われたゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）ワイド関連解析の結果として、ヒトゲノム上１７ｐ１２、１７ｐ１１及び１７ｑ１１領域に疾患感受性関連遺伝変異が存在する可能性が報告された（Ｏｇｄｉｅ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：６６１−６６８、２００４；Ｏｇｄｉｅ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７２：１２６８−１２７９、２００３；Ａｃｒｏｓ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：９９８−１０１４、２００４）。この領域に存在する遺伝子から発現されるタンパク質の一つであるＧＩＴ１タンパク質は、ＧＴＰａｓｅ−活性タンパク質ドメインを有するアダプタータンパク質の一つであり、β２−アドレナリン受容体を始め、多様なＧタンパク質−関連受容体を調節すると知られている（Ｐｒｅｍｏｎｔ  ＲＴ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４０８２−１４０８７、１９９８；Ｃｌａｉｇ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１１１９−１１２４、２０００）。齧歯類の脳でＧＩＴ１タンパク質は、シナプスの形成を始め、多様な神経機能に影響を及ぼすと知られており、特にGit1遺伝子が除去されたマウス（Git1−／−）では、神経細胞樹状突起の成長障害、脊椎密度の減少、恐怖反応障害及び新しい環境への適応力の減少などの症状が確認された（Ｍｅｎｏｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １３１７：２１８−２２６、２０１０；Ｓｃｈｍａｌｚｉｇａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．４５８：７９−９３、２００９）。
【０００６】
従って、ＧＩＴ１タンパク質のこのような機能に注目した本発明者らは、患者−対照群の研究によりＧＩＴ１遺伝子の注意欠陥多動性障害の感受性との関連性を分析し、ＧＩＴ１遺伝子内のイントロンに位置する一塩基多型が疾患感受性と有意味に関連していることを最初に見い出した。
【０００７】
一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）は、ヒトゲノムに約０．１％（約１０００塩基に１塩基）の比率で存在するもっとも頻度の高い多型である。即ち、この一塩基多型とは、ゲノム遺伝子で一つの塩基が異なる塩基に置換することにより、例えば野生型がＧ／Ｃ塩基対であることに対し、多型ではＡ／Ｔ塩基対となっている状態を意味する。また、二本鎖染色体の夫々の対立遺伝子が多型の形態である場合（同型接合多型）と、一方が野生型で他方が多型である場合（異型接合多型）が存在する。このような一つの塩基の変異は、コドン変異による変異アミノ酸の合成（ミスセンス変異）や終止コドンの生成による不完全タンパク質の合成（ナンセンス変異）を発生させる場合がある。従って、一塩基多型の有無が様々な疾病にも関連していることが明らかになっており（特許文献１；韓国登録特許１０−１０１２６０１、特許文献２；韓国登録特許１０−１０５７２６２）、診断や遺伝的治療などを目的に、一塩基多型の有無を正確に判定すること（ＳＮＰタイピング）の重要性が強く認識されている。また、この一塩基多型は、疾患にかかりやすい性質や薬剤反応性に係る遺伝子を探索する際の有用な多型マーカーでもあり、テーラーメイド（ｔａｉｌｏｒ−ｍａｄｅ）医療のための重要な遺伝子情報としても注目されている。
【０００８】
そこで、本発明者らは、ＧＩＴ１遺伝子内のイントロンに位置する一塩基多型が注意欠陥多動性障害の遺伝的素因を予測するために用いられることができるということを確認し、本発明に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許１０−１０１２６０１：乳癌の発病危険性を検診するための組成物、登録日：２０１１年０１月２７日、出願人：マクロジェン・インコーポレーテッド
【特許文献２】韓国登録特許１０−１０５７２６２：アスピリン過敏症の診断用バイオマーカー、その製造方法及びそれを利用したアスピリン過敏症の診断方法、登録日：２０１１年０８月０９日、出願人：スンチュンヒャンユニバーシティインダストリーアカデミーコオペレーションファウンデーション
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｗａｎｓｏｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ．Ｒｅｖ、１７：３９−５９、２００７。
【非特許文献２】Ｆｒａｎｋｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ、１２６：１３−５０、２００９。
【非特許文献３】Ｏｇｄｉｅ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：６６１−６６８、２００４。
【非特許文献４】Ｏｇｄｉｅ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７２：１２６８−１２７９、２００３。
【非特許文献５】Ａｃｒｏｓ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：９９８−１０１４、２００４。
【非特許文献６】Ｐｒｅｍｏｎｔ  ＲＴ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４０８２−１４０８７、１９９８。
【非特許文献７】Ｃｌａｉｇ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１１１９−１１２４、２０００。
【非特許文献８】Ｍｅｎｏｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １３１７：２１８−２２６、２０１０。
【非特許文献９】Ｓｃｈｍａｌｚｉｇａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．４５８：７９−９３、２００９。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ヒトの１７番染色体の２４９２６１０１番目の塩基であるＣ／Ｔを含むポリヌクレオチド、ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型または一塩基多型の周辺を含む注意欠陥多動性障害の診断用組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、注意欠陥多動性障害の発病と有意の相関関係を有する所定の一塩基多型を含む染色体部位と相補的な配列を有するプローブまたは前記染色体部位の増幅のためのプライマーを含む注意欠陥多動性障害の診断用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、ヒト被検体から採取した遺伝子試料に対して、注意欠陥多動性障害の発病と有意の相関関係を有する所定の一塩基多型の塩基を確認し、注意欠陥多動性障害の発病危険性を予測する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、マイクロアレイを含む、注意欠陥多動性障害の危険度を診断するためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によると、注意欠陥多動性障害の患者群と正常群とのＧＩＴ１遺伝子内の一塩基多型を確認することにより、注意欠陥多動性障害と有意の相関関係を有する一塩基多型を選別し、後で前記一塩基多型の情報に基づいて注意欠陥多動性障害の発病危険性を測定する予測方法が提供される。
【００１６】
本発明によると、注意欠陥多動性障害の患者群に特異的で有意の相関関係を有する一塩基多型であるヒト染色体１７番の２４９２６１０１番目の塩基位置（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．３）に存在するｒｓ５５０８１８の１個の一塩基多型が選別された。野生型の場合は前記位置に塩基Ｃを有するが、変異が起こりＴに変わると変異されたＴは注意欠陥多動性障害の発病において優性として作用するため、二つの対立遺伝子のうち一つでもＴを含むＣ／Ｔ型である場合、注意欠陥多動性障害の発病危険性が有意に高くなる可能性がある。
【００１７】
このように、本発明における一塩基多型に関する情報に基づいて、注意欠陥多動性障害が発病していない個体の全体遺伝子のうち前記一塩基多型の塩基を確認して、注意欠陥多動性障害の発病危険性が高い場合に該当するか否かを決定し、前記個体の注意欠陥多動性障害の発病危険性を予測することができる。
【００１８】
そのために、本発明におけるヒトの１７番染色体の２４９２６１０１番目の塩基に位置するＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８の１個の一塩基多型は、注意欠陥多動性障害の発病危険性を診断するための組成物に提供される。
【００１９】
一方、連鎖不平衡（Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ、以下ＬＤという）部位は、ゲノム上の特定領域が世代を経ていくうちにｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒが殆ど起こらないほど短いかまたは遺伝子が密集しているため生じる部分である。従って、この領域に存在するゲノム情報（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は殆ど同一であり、世代を経ても殆ど保存される。本発明における注意欠陥多動性障害の発病危険性と有意の相関関係を有する一塩基多型は、ゲノム上の特定位置に存在する変異である。また、注意欠陥多動性障害と連関を示した一塩基多型ｒｓ５５０８１８と相関係数（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒ−二乗（ｒ−ｓｑｕａｒｅ））が０．９５以上である多型部位を探索する段階と、注意欠陥多動性障害と連関を示した一塩基多型ｒｓ５５０８１８と連鎖不平衡係数（ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｄ−プライム（Ｄ'））が０．９５以上である多型部位を探索する段階と、を含む。従って、前記ＧＩＴ１遺伝子内の一塩基多型の周辺にＬＤ領域が形成されている場合、そのＬＤ領域に位置する遺伝子も前記一塩基多型と同一のゲノム情報を有するようになるため、前記ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型の周辺の連鎖不平衡部位も注意欠陥多動性障害の診断用組成物に提供されることができる。
【００２０】
このような内容に基づき、本発明における前記注意欠陥多動性障害の診断用組成物で各被検体の遺伝子を分析することができる。前記遺伝子分析は、注意欠陥多動性障害と有意の相関関係を有する所定の一塩基多型を含む染色体部位と相補的な配列を有するプローブ及び／または前記染色体部位の増幅のためのプライマーを含む。
【００２１】
このような遺伝子分析の具体的な方法は、特に制限されず、この発明が属する技術分野において公知された全ての遺伝子検出方法を利用することができる。前記遺伝子試料は、被検体から分離した全ての生体試料を含み、例えば、毛、血液、組職、細胞、血清、血漿、唾液、喀痰及び尿からなる群から選択される何れか一つであることが好ましく、血液であることがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００２２】
前記方法において、前記被検体は、ヒト、サル、イヌ、ヤギ、ブタ、またはマウスなどの全ての動物を意味する。
【００２３】
本発明によると、１）被検体由来の生物学的試料から核酸試料を分離する段階と、２）段階１）で分離した核酸試料で、ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型塩基をヒト染色体１７番の２４９２６１０１番目の塩基位置で確認する段階と、３）前記段階２）で確認されたｒｓ５５０８１８一塩基多型の対立遺伝子型がＣ／Ｔである場合、注意欠陥多動性障害の発病危険度が高いと判定する段階と、を含む注意欠陥多動性障害の危険度の予測方法が提供される。
【００２４】
前記方法において、被検体の生物学的試料から核酸を分離する方法は、当業界において公知された方法を利用して行われることができる。例えば、目的の核酸が細胞にある際、純粋な核酸を得るために、まず細胞の抽出物を得た後、示差沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、カラムクロマトグラフィー、有機溶媒の抽出などをさらに行うことができる。抽出物は、該当技術分野の標準技術、例えば細胞の化学的または機械的溶解を利用して得られることができる。次に、抽出物は、如何なる汚染及び干渉タンパク質を無くすために、例えば、ろ過及び／または遠心分離により、及び／またはグアニジウムイソチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）または尿素（ｕｒｅａ）などのカオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ  ｓａｌｔ）、若しくはフェニル及び／またはクロロホルムなどの有機溶媒により、さらに処理されることができる。カオトロピック塩が用いられる場合、核酸を含む試料から前記塩を除去することが好ましい。これは、沈殿、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィーなどのような該当技術分野の標準技術を利用して行われることができる。上記のような方法により細胞または組職から分離された核酸は、直接精製したり、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ）のような増幅方法を利用して特定領域を特異的に増幅し、これを分離することによりなることができるが、これに限定されるものではない。前記核酸とは、ＤＮＡだけでなくｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡも含む意味である。また、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは、個体の全体核酸配列に対して行われることもできるが、一塩基多型と知られている部位の周辺のみに対して行われることもできる。
【００２５】
前記方法において、分離された核酸の塩基配列の決定は、当業界において公知された多様な方法によって行われることができる。例えば、ジデオキシ法によって直接的に核酸のヌクレオシド配列を決定する方法や、一塩基多型部位の配列を含むプローブまたはそれに相補的なプローブを前記ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせて、それから得られるハイブリダイゼーションの程度を測定することにより多型部位のヌクレオシド配列を決定する方法などが利用されることができる。前記ハイブリダイゼーションの程度は、例えば、検出可能な標識を標的ＤＮＡに標識して、ハイブリダイゼーションされた標的ＤＮＡのみを特異的に検出することによりなされることができるが、その他に電気的信号の検出方法などが用いられることができる。具体的には、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）によるプローブハイブリダイゼーション法、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション法（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、対立遺伝子特異的増幅法（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、配列決定法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、５’ヌクレアーゼ分解法（５’ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）、分子ビーコンアッセイ法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ａｓｓａｙ）、オリゴヌクレオチド結合アッセイ法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、サイズ分析法（ｓｉｚｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）及び一本鎖高次構造多型法（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）からなる群から選択される一つ以上の方法によって行われることができるが、これに限定されない。
【００２６】
前記方法において、前記一塩基多型部位の配列を含むポリヌクレオチドを決定する段階は、前記ポリヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイに前記核酸試料をハイブリダイゼーションさせる段階と、前記ハイブリダイゼーションの結果を検出する段階と、を含むことができる。
【００２７】
また、前記一塩基多型部位の配列を含むプローブとしては、多様なＤＮＡ類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）のうち一つであるＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）が含まれることができる。前記ＰＮＡは、ＤＮＡのホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合がペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）に代替されており、ＤＮＡと同様なアデニン、チミン、グアニンとシトシンを有しているため、塩基特異的にＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイゼーション反応を起こすことができる。特に、負電荷を帯びるリン酸結合の骨格のため互いに電気的に反発する天然核酸と異なって、ペプチド結合からなる骨格は電荷を帯びないため、ハイブリダイゼーション反応でＰＮＡはＤＮＡより天然核酸により強く結合し、この結合は塩濃度（sａｌt  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に影響を受けない。また、ＰＮＡは核酸加水分解酵素、タンパク質分解酵素などの生分解酵素に分解されないため、ＤＮＡやＲＮＡより安定性が非常に高い。このように天然核酸を相補的に認識することができ、ハイブリダイゼーション結合力と安定性に優れたＰＮＡは、蛍光物質で標識され、標的核酸と反応してハイブリダイゼーション反応がなされると、ミスマッチされた部分は核酸加水分解酵素により分解除去され、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）で一塩基多型が分析される方法に利用されることができる。
【００２８】
前記一塩基多型部位の配列を含むポリヌクレオチドを決定するさらに他の段階としては、ターゲット遺伝子と相補的な一塩基多型塩基をプローブの中央（ｃｅｎｔｒａｌ）に位置させ、その左右に５〜６個の比較的短い塩基が位置するようにプローブを考案して、塩基の置換、挿入、欠失に対する検出弁別力と特異度を向上させた分析方法を含むが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を利用することが好ましい。前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、マトリックス分子を分析しようとする生物高分子に混合し、パルスレーザーを照射して生物高分子をイオン化させる方法を含む。
【００２９】
前記マトリックス分子、例えば３−ヒドロキシピコリン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）及び分析物質にレーザーを照射すると、マトリックスがレーザーに吸収され、前記分析物質にエネルギーとプロトンを伝達してイオン化される機能をすることができる。前記物質は、イオン化されたマトリックスとともに飛行して、真空状態で反対側の検出器まで飛んでいくのにかかる時間を計算して質量を分析する原理により作動する。前記質量が小さい物質は検出器に速く到逹し、このように得られる質量の差及び既に分かっている一塩基多型の配列に基づいて、標的ＤＮＡ内の一塩基多型配列が決定されることができるのである。
【００３０】
一方、本発明によると、注意欠陥多動性障害の発病危険度を予測するためのマイクロアレイが提供される。
【００３１】
前記マイクロアレイとは、基板表面の区分された領域に前記ポリヌクレオチドが高い密度に固定化されていることを意味し、前記領域は、例えば４００／ｃｍ２以上、１０３／ｃｍ２、または１０４／ｃｍ２の密度で基板上に配列されていることができる。
【００３２】
本発明における前記マイクロアレイは、ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型塩基のＣ／Ｔとハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００３３】
本発明における前記マイクロアレイは、前記プローブを探針ＤＮＡ分子として利用してマイクロアレイの基板上に固定化させるために、ピエゾエレクトリック（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ）方式を利用したマイクロピペット法（ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）またはピン（ｐｉｎ）形態のスポッター（ｓｐｏｔｔｅｒ）を利用した方法などを利用することが好ましいが、これに限定されない。前記マイクロアレイの基板は、アミノ−シラン（ａｍｉｎｏ−ｓｉｌａｎｅ）、ポリ−Ｌ−リジン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）及びアルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）からなる群から選択される一つ以上の活性基がコーティングされることが好ましいが、これに限定されない。また、前記基板は、シリコンウェハ、ガラス、石英、金属、ナイロン膜、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、及びプラスチックからなる群から選択される一つ以上であることを特徴とするが、これに限定されない。これにより、本発明における前記マイクロアレイは、注意欠陥多動性障害の発病危険度を予測するためのキットを提供することができる。
【００３４】
前記キットは、前記ポリヌクレオチドをプライマーとして含むとともに、増幅に必要な試薬を含むことができる。
【００３５】
前記キットは、ハイブリダイゼーションに用いられる緩衝溶液、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及びｒＮＴＰ（事前混合型または分離供給型）、標識試薬、及び洗浄緩衝溶液からなる反応試薬群から選択される何れか一つをさらに含むことができ、好ましくは、ＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型塩基を増幅させるプライマーを含むものを提供する。
【００３６】
本発明における前記プライマーは、標的部位である前記多型部位を増幅することができ、サイズ及び鋳型に結合する位置は制限されず、当業者であれば通常のプライマー選定用ソフトウェアを利用してプライマーを容易に考案することができる。
【００３７】
前記プライマーは、例えば、一塩基多型部位に該当するヌクレオシド配列がプライマーの３’末端ヌクレオシドを形成し、前記３’末端ヌクレオシドは前記一塩基多型部位のヌクレオシドに相補的であるもの（特異的プライマー）または相補的でないもの（非特異的プライマー）からなることができる。前記非特異的プライマーは、前記３’末端ヌクレオシドだけでなく、他の部位にも相補的でない配列を含むことができる。
【００３８】
本発明における前記キットは、前記ポリヌクレオチドまたはそれに由来したプローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、そのハイブリダイゼーションの結果から個体の注意欠陥多動性障害の発病危険を診断するためのキットであることができる。この場合、前記キットは、前記プローブ及びハイブリダイゼーションに必要な試薬を含むことができる。ハイブリダイゼーションに必要な試薬とは、例えば、ハイブリダイゼーションバッファーが含まれることができる。前記核酸は、増幅または増幅されていないものであることができる。従って、前記キットは核酸の増幅に必要な試薬をさらに含むことができる。前記核酸は検出可能な標識で標識されることができる。このような前記検出可能な標識は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合物質（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、化学蛍光物質（ｃｈｅｍｉｆｌｕｒｏｒｅｎｓｃｅ）及び化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）からなる群から選択される何れか一つをさらに含むことができるが、これに限定されない。
【００３９】
従って、本発明における前記キットは、前記ポリヌクレオチドに完全に相補的なプローブ（ｐｅｒｆｅｒｃｔ  ｍａｔｃｈ  ｐｒｏｂｅ）または前記ポリヌクレオチドにおいて、一塩基多型部位を除いた全ての部位で相補的なミスマッチプローブ（ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｒｏｂｅ）を含むことができる。前記プローブは、基板上の複数個に区分された領域に固定されているマイクロアレイの形態であることができる。前記完全に相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応で標的配列が検出され、前記ミスマッチプローブを用いたハイブリダイゼーション反応で標的配列が検出されない場合、試料中に注意欠陥多動性障害に係る配列が存在すると決定され、その結果から個体の注意欠陥多動性障害の発病危険が決定される。
【００４０】
前記キットにおいて、蛍光物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（ｐｏｌｙ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）及びローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００４１】
このような結果により、本発明による注意欠陥多動性障害の発病危険性の予測方法は、ヒト被検体から得た遺伝子試料の塩基配列を分析して、１７番染色体の２４９２６１０１塩基がＣ／Ｔである場合に該当すると、注意欠陥多動性障害の発病危険性が高い危険群に分類されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４２】
本発明のＧＩＴ１遺伝子内のｒｓ５５０８１８一塩基多型マーカーは、注意欠陥多動性障害の感受性と有意の関連性を有するため、一塩基多型を分析して注意欠陥多動性障害の発病を予測、診断するための組成物及びキットで構成して提供することができる。
【００４３】
また、本発明の注意欠陥多動性障害の発病危険性の予測方法は、上記のような遺伝情報（一塩基多型）の分析の他に、性別及びＩＱ指数などのような臨床的変数に対する調査を並行実施して、正確性をより増進させることができる。
【発明を実施するための具体的な内容】
【００４４】
以下、本発明を具体的な実施例を挙げてより詳細に説明する。しかし、本発明は下記実施例によって限定されるものではなく、本発明の思想と範囲内で様々な変形または修正が可能であることは、当分野に従事する業者にとって明白である。
【００４５】
この際、用いられる技術用語及び科学用語について他に正義されない限り、この発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が一般的に理解する意味を有する。
【００４６】
また、従来と同一の技術構成及び作用についての重複説明は省略する。
【００４７】
実施例１．研究対象
本発明は、韓国人からなる注意欠陥多動性障害の患者群と対照群との連関性を研究するために、総３８８人のゲノムＤＮＡを利用した。対象人の血液はソウル大学病院の内部倫理委員会の承認の元収集された。１９２人の注意欠陥多動性障害の患者群と、患者群と年齢を合わせた疾病が発病していない１９６人の対照群とに基き、連関分析を行った。具体的には、前記研究対象から得た血液試料から、ＰｕｒｅｇｅｎｅＴＭ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡのみを特異的に定量するＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）蛍光染料を用いて濃度を測定した後、遺伝子型解析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）に適する２．５１０ｎｇ／μｌの濃度で保管した。
【００４８】
実施例２
＜２−１＞遺伝子多型の選定
本発明者らは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｐｍａｐデータベースに基き、ＧＩＴ１遺伝子が含まれた１７番染色体内の１９−キロベース領域で２７個の一塩基多型を分析対象として選定し、注意欠陥多動性障害の患者群−対照群に対する連関研究を分析した。
【００４９】
＜２−２＞遺伝子型解析（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）
本発明におけるＧＩＴ１遺伝子多型の遺伝子型は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）の質量分析器を利用したＭａｓｓＡＲＲＡＹＴＭ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を利用して分析した。前記分析に用いられた重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）用プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）と塩基延長反応（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー配列は、下記表１乃至表３に示されたように、遺伝子型解析に用いられたプライマーはＡｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３．１（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）プログラムを用いて設計された。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
0005662293.tif 000003
【００５２】
【表３】
0005662293.tif 000004
【００５３】
前記ＰＣＲ反応は、２．５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１×緩衝溶液、１ｍＭのＭｇＣl２、２００μＭのｄＮＴＰ混合物、０．１  ｕｎｉｔのＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ混合物に、２００ｎＭの表１のＰＣＲプライマーを添加した５μｌの溶液で行った。反応条件は、９４℃で１５分間初期変性化した後、９４℃２０秒、５６℃３０秒、７２℃１分の周期を４５回繰り返して、７２℃で３分間最終延長段階が行われた。ＰＣＲ反応後、０．３  ｕｎｉｔのＳＡＰ（ｓｈｒｉｍｐ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を添加し、３７℃２０分、８５℃５分間培養し、残余ｄＮＴＰを除去した。前記塩基延長反応は、上記の反応結果物に５０μＭのｄＮＴＰ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｍｉｘと６２５ｎＭのｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ、０．５  ｕｎｉｔのｔｈｅｒｍｏ  ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅを添加して行った。９４℃で３０秒間初期変性化を行った後、９４℃５秒、５２℃５秒、８０℃５秒の短い周期を４０回繰り返した。１６μｌの蒸溜水と３ｍｇのレジン（Ｃｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎ）を添加した後、最終反応産物をＳｐｅｃｔｒｏＣｈｉｐに移して、質量分析器で遺伝子型を決定した。前記実施例１の２７個の一塩基多型を確認した結果、下記表４では、８個の一塩基多型のみが患者群及び対照群の試料で多型を示したことが確認された。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
実施例３．統計分析
本発明の統計分析は、χ２独立性の検定（ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔｆｏｒ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）を利用してハーディ‐ワインベルク平衡（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ；ＨＷＥ）を分析し、後で注意欠陥多動性障害の患者群−対照群間の性別及びＩＱ指数の差を補正するために、ロジスティック回帰分析を利用して注意欠陥多動性障害の発病危険性と夫々の多型との関連性を分析した。全ての統計分析は、ＳＰＳＳ  １５プログラムを利用した。
【００５６】
実施例４．注意欠陥多動性障害の発病感受性との連関性
本発明のＧＩＴ１遺伝子内の２７個の一塩基多型の注意欠陥多動性障害の発病感受性との連関性分析を行った。
【００５７】
その結果、表５に示したように、ｒｓ５５０８１８一塩基多型でＣ／Ｔ異型接合体の遺伝子型を有する場合、Ｃ／Ｃ同型接合体の遺伝子型を有する場合より注意欠陥多動性障害の発病危険性が約２．６６倍高く示された（ＯＲ＝２．６６、９５％ＣＩ＝１．３３−５．３１、Ｐ＝０．００５６）。従って、前記一塩基多型を利用した注意欠陥多動性障害の疾患感受性との連関分析を行った結果、ｒｓ５５０８１８一塩基多型のＣ／Ｔ異型接合体が疾病危険の増加と強い関連性を有することが確認された。
【００５８】
【表５】
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【配列表】
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