(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精原幹細胞(SSC)の維持及び濃縮のための培地を事前調整する方法であって、培地を、ウシ胚性線維芽細胞及び/又はウシ精巣から単離されたウシ体細胞の系統由来の細胞と接触させることを含む、上記方法。
【請求項２】
a)培地を、ウシ胚性線維芽細胞及び/又はウシ精巣体細胞からなる群から選択されるフィーダー細胞と接触させるステップと、
b)前記培地において前記細胞を増殖させるステップと、その後に、
c)前記フィーダー細胞を除去し培地を回収するステップと
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも1の精原幹細胞(SSC)を含有する精巣由来細胞の集団からSSCを濃縮する方法であって、
a)請求項1に記載の方法に従って培地を事前調整して、調整された培地を用意するステップと、
b)SSC細胞の維持及び濃縮に適した条件下で、前記精巣由来細胞の集団を前記事前調整された培地と接触させるステップと
c)前記事前調整された培地との前記接触によって維持及び濃縮されたSSCを回収するステップと
を含む方法。
【請求項４】
前記SSCがウシ細胞である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記事前調整された培地が、DMEM/F12培地である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記培地に、血清代替物サプリメントが補充されている、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記培養が、プラスチック培養ウェルにおいて維持される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスチック培養ウェルが、精原細胞が付着して長期培養において維持されるようMatrigel（登録商標）でコーティングされている、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記培地に、GDNF、FGF2、SDF-1及びCSF-1が挙げられるがこれらに限定されない成長因子が補充されている、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも1の非ヒト哺乳類後代を作成する方法であって、
a)請求項3に記載の方法に従って少なくとも1のSSCを含む精巣由来細胞の集団からSSCを濃縮して、SSCが濃縮された集団を産生するステップと、
b)前記SSCが濃縮された集団を雄レシピエント非ヒト哺乳類の精巣に投与するステップであって、フィーダー細胞を前記集団から除去する必要がない上記ステップと、
c)前記レシピエント非ヒト哺乳類において、前記濃縮されたSSCに精子形成コロニーを生成させるステップと、
d)前記レシピエント非ヒト哺乳類を、前記レシピエント非ヒト哺乳類と同一の種の雌哺乳類と交配するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記濃縮されたSSCの集団が、前記レシピエント非ヒト哺乳類の精細管の管腔に投与される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記レシピエント非ヒト哺乳類が、不妊である、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記レシピエント非ヒト哺乳類が、齧歯類、霊長類、イヌ、乳牛(又はウシ)、及びブタからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
前記レシピエント非ヒト哺乳類が、乳牛又はウシである、請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
幹細胞は、2種の顕著な特性、即ち自己再生及び1種以上の異なる細胞系列へと分化する能力を保有する未分化細胞である。自己再生の過程は、幹細胞の自己複製に関与し、幹細胞が未分化状態のままでの増殖（propagation and expansion）を可能にする。前駆細胞も未分化細胞であり、これは1種以上の細胞系列へと分化する能力を有するが、自己再生する能力が限られている又はその能力がない。培養において維持されると、幹細胞又は前駆細胞等の未分化細胞は、自発的分化を行い、これにより所望の未分化細胞表現型を失い得る。よって、未分化幹細胞又は前駆細胞状態を維持するために自発的分化を最小化する培養方法が必要とされている。
【０００２】
未分化細胞の主たる科学的及び治療的有用性は、科学研究のため又は患者の細胞若しくは組織の損傷を修復するために、必要に応じて更に増殖又は成熟細胞へと分化することができる均質集団へと増殖するその能力にあるため、未分化細胞を未分化状態に保つことは、例えば、産業及び医学におけるその使用にとって重要である。細胞培養において自発的に分化すると、細胞は、増殖性が低くなり、必要に応じて異なる種類の細胞へと分化する能力が低くなる。したがって、未分化幹細胞の均質培養は、研究科学者及び産業に大いに追い求められていながら未だ実現していない目標である。
【０００３】
未分化細胞(例えば、様々な種類の幹細胞)を培養するための現在の方法は、線維芽細胞成長因子2(FGF2)を細胞培養物に毎日又は毎日よりも低頻度で送達することにより、このような自発的分化の最小化を試みるものであり、この操作は「フィーディング(feeding)」として公知である。FGF2は、幹細胞の分化を阻害することにより、幹細胞の自己再生を促進することが示されている。しかし、この阻害は不完全であり、幹細胞培養物は、徐々に分化する傾向があり、これにより幹細胞培養の有用性を減じる。更に、胚性又は精原幹細胞等の幹細胞は、典型的には、マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞上における成長を必要とする。これは、除去することが望ましい厄介なステップであり、様々な受精プロトコール及び配偶子の産生に用いることのできない、フィーダー細胞が混入した幹細胞の細胞集団を生じる。
【０００４】
配偶子の産生のためにin vitroにおいて精子形成過程を経た幹細胞株の発達を条件的に誘導する能力は、生物医学的研究に及び特にこのようなプロトコールが多様な種に確立できた場合は動物育種に対し、長きに亘り追い求められてきた技術を提供する。今日までに最も成功が達成されたのは、ラット及びマウスのみであり、ウシ(bovine)等のより大型の哺乳類にはこのような進歩は見られない。
【０００５】
分離したマウス及びラット精巣細胞の画分内に存在する幹細胞が、レシピエントマウスの精巣における精子形成を再生するその能力を維持しているという発見は、このような培養系の確立に必須であった。Brinsterら、Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:11303〜11307;Brinsterら、Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:11298〜11302;Clothierら、Nature 1996; 381:418〜421;Kanatsu-Shinoharaら、Biol Reprod 2003; 69:612〜616;及びNaganoら、Tissue Cell 1998; 30:389〜397を参照されたい。これらの幹細胞を単離し実験操作する能力は、精子発達、補助繁殖、細胞療法及び遺伝学における研究の新たな門戸を開いた。Naganoら、Biol Reprod 1999; 60:1429〜1436;Mahanoyら、Endocrinology 2000; 141:1273〜1276;Mahatoら、Mol Cell Endocrinol 2001; 178:57〜63;Ogawaら、Nat Med 2000; 6:29〜34;Shinoharaら、Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:13624〜13628;Zhangら、J Cell Physiol 2007; 211:149〜158;Kazukiら、Gene Ther 2008; 15:617〜624;Kanatsu-Shinoharaら、Cell 2004; 119:1001〜1012;Kanatsu-Shinoharaら、Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:8018〜8023;及びNaganoら、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:13090〜13095を参照されたい。この可能性を考慮して、培養において完全に機能的なラット及びマウス精原幹細胞を単離、増殖及び遺伝子改変するためのプロトコールが確立された。Ryuら、Dev Biol 2004; 274:158〜170;Hamraら、Dev Biol 2004; 269:393〜410;Hamraら、Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:14931〜14936;Hamraら、Methods Mol Biol 2008; 450:163〜179;Hamraら、Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:17430〜17435;Ryuら、Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:14302〜14307;Orwigら、Biol Reprod 2002; 67:874〜879;及びKanatsu-Shinoharaら、Biol Reprod 2008を参照されたい。マウス及びラットは、ヒトの健康及び疾患研究の実験動物モデルとして広く受け入れられているため、また、培養物からクローン的に増殖させた幹細胞を用いてラット生殖系列を遺伝子改変するためのプロトコールを欠くため、これらの研究のための種として選んだ。Hamraら、Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:14931〜14936を参照されたい。研究モデルとしての実験用ラットの多くの潜在的用途を考慮して、in vitroにおける初代ラット精原幹細胞株の誘導及び継続的増殖のための、費用対効果が高く調製が簡単な培養培地が、本研究において求められた。
【０００６】
これらの進歩にもかかわらず、ラット種であっても、手順は複雑なままで、かつ大部分が不成功なままであった。例えば、in vitroにおける齧歯類精原幹細胞の長期増殖のための培地は、調製が相対的に複雑で、費用がかかり、時間がかかり、加えて、線維芽細胞のフィーダー層と組み合わせて適用する場合に最も効果的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Brinsterら、Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:11303〜11307
【非特許文献２】Brinsterら、Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:11298〜11302
【非特許文献３】Clothierら、Nature 1996; 381:418〜421
【非特許文献４】Kanatsu-Shinoharaら、Biol Reprod 2003; 69:612〜616;
【非特許文献５】Naganoら、Tissue Cell 1998; 30:389〜397
【非特許文献６】Naganoら、Biol Reprod 1999; 60:1429〜1436
【非特許文献７】Mahanoyら、Endocrinology 2000; 141:1273〜1276
【非特許文献８】Mahatoら、Mol Cell Endocrinol 2001; 178:57〜63
【非特許文献９】Ogawaら、Nat Med 2000; 6:29〜34
【非特許文献１０】Shinoharaら、Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:13624〜13628
【非特許文献１１】Zhangら、J Cell Physiol 2007; 211:149〜158
【非特許文献１２】Kazukiら、Gene Ther 2008; 15:617〜624
【非特許文献１３】Kanatsu-Shinoharaら、Cell 2004; 119:1001〜1012
【非特許文献１４】Kanatsu-Shinoharaら、Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:8018〜8023
【非特許文献１５】Naganoら、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:13090〜13095
【非特許文献１６】Ryuら、Dev Biol 2004; 274:158〜170
【非特許文献１７】Hamraら、Dev Biol 2004; 269:393〜410
【非特許文献１８】Hamraら、Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:14931〜14936
【非特許文献１９】Hamraら、Methods Mol Biol 2008; 450:163〜179
【非特許文献２０】Hamraら、Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:17430〜17435
【非特許文献２１】Ryuら、Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:14302〜14307
【非特許文献２２】Orwigら、Biol Reprod 2002; 67:874〜879
【非特許文献２３】Kanatsu-Shinoharaら、Biol Reprod 2008
【非特許文献２４】Hamraら、Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:14931〜14936
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、特にウシ等のより大型の哺乳類の精原幹細胞を培養する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、精原幹細胞を培養するための組成物及び方法を含む。本発明において、本出願人は、培養精原幹細胞を長期間の培養において未分化状態のままに保ち且つ生存可能なままに保つことを可能にするフィーダーフリー培養系を開発した。本発明の更に別の態様は、精巣組織から未分化精原細胞を単離するための手順、in vitroにおける未分化精原細胞の生存を支持する特異的無血清培地の同定、未分化精原細胞が接着するプラスチック培養ウェルをコーティングするための基材を包含し、最後に、本出願人は、ウシ未分化精原細胞の維持及び成長を促進するフィーダー細胞調整培地の補充のための特異的成長因子を同定した。本方法及び実施例は、ウシ細胞を開示しているが、本発明は、そのようには限定されず、ブタを包含するあらゆる家畜種に適用できる。
【００１０】
本発明において、本出願人は、ウシ胚性線維芽細胞細胞株及びウシ精巣から単離されたウシ体細胞株を包含する、特定の所有権のある(proprietary)細胞株を同定した。これらの特定の細胞株は、いずれかのSSCの培養に先立ち培養培地を調整するるためのフィーダー支持細胞として用いられる。本前培養技術は、移植又は他の使用のための推定ウシSSCの純粋な集団の生成を可能にするフィーダーフリー培養を可能にする。本出願人の培養細胞は、他のフィーダー細胞株の混入並びにその有害効果、例えば潜在的宿主免疫応答、コロニー形成能力の限定及び経時的な最終的分化等がない。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、精原幹細胞(SSC)がその構成成分である未分化精原細胞を、少なくとも1のSSCを含有する精巣組織から単離する方法を特徴とする。本方法は、少なくとも1のSSCを包含するウシ精巣組織を得るステップと、前記組織をコラゲナーゼと接触させるステップと、他の細胞型から精細管を分離するステップと、その後に、前記精細管をトリプシンと接触させて、精原細胞及びセルトリ細胞が濃縮された細胞懸濁液を得るステップとを包含する。本方法は、SSCになるよう操作された人工多能性幹細胞又は更には胚性幹細胞から生成されたSSCに適用することもできる。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも1のSSCを含有する未分化精原細胞の純粋な培養物を濃縮及び維持する方法であって、血清代替物による特異的無血清培地を用意するステップと、Matrigelで予めコーティングされた培養細胞ウェルを更に用意するステップと、全てが1体に作用する特異的成長因子であるGDNF、FGF2、SDF-1及びCSF-1を事前調整された(pre-conditioned)培地に加えて、精原細胞、好ましくは、ウシ精原細胞のフィーダーフリー培養物を初めて用意するステップとを包含する方法を特徴とする。
【００１３】
一実施形態において、本発明はまた、未分化のままであり、自己再生及び分化の能力を保有し、培養において生存可能であり、本質的に純粋な、即ち、フィーダーフリーである精原幹細胞の推定集団を特徴とする。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、開発された、フィーダーフリー培養法を提供するための培地の事前調整を可能にする新規支持細胞株を包含する。本細胞株は、35日齢の雄ホルスタイン(Holstein)胎仔に由来する細胞株、ウシ胚性線維芽細胞1(又はBEF1、以前にはBEF)と、第2に、4カ月齢のホルスタイン雄ウシの精巣から単離された体細胞に由来する細胞株、ウシ体細胞1(又はBSC1、以前にはBSC)を包含する。これらの細胞株は共に、培養培地のプレインキュベートに用いることができ、SSCが導入された後にフィーダー細胞を加えることなくSSCの生存及び増殖に必要な分泌性可溶性因子を提供する。本発明において、培地は先ず、これらの細胞により事前調整され、十分な期間の後、フィーダー事前調整細胞が除去されて、次に、SSC細胞を培養することができる。
【００１５】
本発明の一態様において、SSCは、ウシSSCである。別の態様において、SSCは、マウス、ラット、サル、ヒヒ、ヒト、ブタ及びイヌからなる群から選択される生物に由来する。
【００１６】
本発明の別の態様において、細胞は、野生型成体精巣、仔ウシ又は子供の(pup)精巣、新生仔精巣、及び停留精巣の成体精巣からなる群から選択される供給源を包含する、精原幹細胞のあらゆる供給源に由来する。
【００１７】
本発明の別の態様において、本細胞は、精原幹細胞になる人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞に由来し、これらはその後、本発明に従って用いられる精原幹細胞の供給源となり得る。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、SSC維持を支持するためのフィーダーフリー培養系であって、濃縮されたSSCと、無血清限定培養培地と、フィーダー細胞により事前調整された培地とを含む系を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、少なくとも1のSSCと、所有権のある線維芽細胞細胞株BEF1及び所有権のあるBSC1フィーダー細胞により事前調整された、血清代替物サプリメント(StemPro)による無血清限定培養培地とを含む、SSC増殖を支持するためのフィーダーフリー培養系を特徴とする。
【００１９】
本発明の一態様において、培養系は、成長因子であるGDNF、FGF2、SDF-1及びCSF-1を更に含む。別の態様において、培養培地は、ダルベッコのMEM:Hamの栄養混合物(Nutrient Mixture)F-12(DMEM/F12)及びStemPro血清代替物サプリメントからなる群から選択される少なくとも1種の培地を含む。
【００２０】
本発明の別の態様において、培養系は、Matrigel(成長因子低下バージョン)等の市販のマトリックスで予めコーティングされた成長プラスチック培養ウェルを更に含む。このようなコーティングなしでは、細胞は、プラスチックウェルに付着せず、培養において長期間維持することができない。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、純粋な濃縮されたSSCの集団を含む組成物であって、SSCの濃縮された集団が、胚性線維芽細胞又は他の種類のフィーダー細胞を含まない上記組成物を特徴とする。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、未分化精原細胞の特異的マーカー及び培養SSC細胞と同様の形態を示す、濃縮されたSSCの集団を含む組成物を特徴とする。一態様において、SSCの集団は、SSCが実質的に均質である。
【００２３】
更にまた別の実施形態において、本発明は、フィーダーフリーSSCの集団を、雄レシピエント哺乳類の精巣に投与するステップと、レシピエント哺乳類において、濃縮されたSSCに精子形成コロニーを生成させるステップと、レシピエント哺乳類をレシピエント哺乳類と同一の種の雌哺乳類と交配するステップとを含む、少なくとも1の哺乳類後代を作成する方法を特徴とする。一態様において、濃縮されたSSCの集団は、レシピエント哺乳類の精細管の管腔に投与される。別の態様において、レシピエント哺乳類は、不妊である。
【００２４】
本発明の一実施形態において、レシピエント哺乳類は、齧歯類、霊長類、イヌ、ウシ、ブタ及びヒトからなる群から選択される。別の実施形態において、齧歯類は、マウス及びラットからなる群から選択される。更にまた別の態様において、霊長類は、ヒヒである。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを維持するためのキットを特徴とする。本キットは、無血清限定培養培地並びに培養培地を事前調整するための所有権のあるBSC1及びBEF1細胞(又はこれらにより既に事前調整された培地)を含む培養系と、アプリケーター(applicator)と、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを維持するためのキットの使用のための説明書を含む説明用材料とを包含する。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、本発明の方法に従って産生された後代動物を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、本発明の方法に従って生産された後代動物であって、後代動物の生産に用いた濃縮されたSSCが、少なくとも1個の遺伝的突然変異を含有する上記後代動物を特徴とする。一態様において、遺伝的突然変異は、組換え技術を用いて作製される。
【００２７】
請求項に係る発明は、一部には、特定の天然の又はトランスジェニックにより(「遺伝学的に」)生成された雄性不稔ウシの、該動物に免疫適合性（immuno-compatible）でもあるドナー精原幹細胞のためのレシピエントとしての使用を包含する。したがって、移植された精原幹細胞は、機能的精子へと自由に発達し、レシピエント雄が稔性であれば産生されたであろう精子と競合することなく雌を受精させる。この方法で、ドナー細胞ハプロタイプの100%生殖系列伝達は、相対的に少数の移植された精子幹細胞から達成することができる。
【００２８】
よって、本発明の一態様に従って、ドナーハプロタイプの生殖系列伝達をもたらすための方法論が提供される。本発明に関する方法は、(A)哺乳類精巣、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞に由来する精原幹細胞株であって、所定の遺伝的背景を具体化する細胞株の細胞を用意するステップと、続いて、(B)移植された細胞が受精能のある半数体雄性配偶子へと発達するように、該細胞の1個以上を雄性不稔レシピエントに移植するステップとを含む。
【００２９】
本発明の別の態様に従って、哺乳類精巣又は人工多能性幹細胞若しくは胚性(embryoiniuc)幹細胞に由来する精原幹細胞株の細胞のライブラリーが提供される。本発明のライブラリーは、複数の遺伝子ノックアウト又は「ノックイン」突然変異体幹細胞を含有する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】フィーダーフリー培養におけるウシ未分化精原細胞の維持を示す図である。左の画像は、BEF1調整培地を含むMatrigelコーティングされた培養ウェルにおけるフィーダーフリー培養において形成された生殖細胞凝集塊の一例である。中央の画像は、個々の細胞の核を標識するためにDAPIで染色された凝集塊である。右の画像は、未分化精原マーカーPLZFの免疫染色である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書において他に定義がない限り、本発明に関連して用いられている科学及び技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものである。更に、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は、複数形を包含するものであり、複数形の用語は、単数形を包含するものである。一般に、本明細書に記載されている生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して用いられている命名法並びに技術は、本技術分野において周知のものであり、一般に用いられている。これらの方法及び技術は一般に、他に断りがなければ、本技術分野において周知の従来の方法に従って、また、本明細書を通じて引用及び議論されている様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されている通りに行われる。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989);Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1992、及び補遺版2002);Harlow and Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1990);Taylor and Drickamer、Introduction to Glycobiology、Oxford Univ. Press(2003);Worthington Enzyme Manual、Worthington Biochemical Corp.、Freehold、N.J.;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins、I巻、CRC Press(1976);Handbook of Biochemistry:Section A Proteins、II巻、CRC Press(1976);Essentials of Glycobiology、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)を参照されたい。
【００３２】
以下の用語は、他に断りがなければ、以下の意味を有するものと理解されたい。
【００３３】
本明細書において、語句「精原幹細胞」は、精巣から単離された、又は人工多能性幹細胞若しくは胚性幹細胞から作製された、又は斯かる細胞を得るための他のあらゆる方法による幹細胞を意味する。例えば、皮膚細胞から作製された哺乳類人工多能性幹細胞は、生殖細胞の作製に用いられた。Easley CA 4thら、Cell Rep. 2012 Sep 27;2(3):440〜6、「Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells」を参照されたい。精原幹細胞は、卵細胞に受精することができないが、精子へと発達する細胞を生じ、よって、生存可能な子孫を産生することができる。単離された精原幹細胞は、その特性を失わずに長期間培養することができ、例えば、Oatley J. M.ら、Methods Enzymol. 419:259(2006)に記載されている通り、適したレシピエント雄動物の精巣を効率的に再増殖(repopulate)させることができる。
【００３４】
冠詞「a」及び「an」は、本明細書において、該冠詞の文法上の対象の1個又は2個以上(即ち、少なくとも1個)を指すように用いられている。例として、「要素(an element)」は、1個の要素又は2個以上の要素を意味する。
【００３５】
本明細書において、用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような天然の対立遺伝子変異は、典型的には、所与の遺伝子のヌクレオチド配列において1〜5%の差異を生じ得る。代替的な対立遺伝子は、多数の異なる個体において、対象とする遺伝子を配列決定することによって同定することができる。これは、多様な個体において同遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いることによって容易に実施することができる。天然の対立遺伝子変異の結果生じ、機能的活性を変更しないありとあらゆる斯かるヌクレオチド変異及びそれから生じるアミノ酸多型又は変異は、本発明の範囲内であることが企図されている。
【００３６】
更に、本明細書に記載されているタンパク質のものとは異なるヌクレオチド配列を有する、他の種に由来するタンパク質をコードする核酸分子(ホモログ)は、本発明の範囲内である。本発明のcDNAの天然の対立遺伝子変異体及びホモログに対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における標準ハイブリダイゼーション技術に従い、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトcDNA又はその一部を用いることにより、核酸分子に対するその同一性に基づき単離することができる。
【００３７】
本明細書における用語使用において、生物学的過程の「モジュレーション」は、該生物学的過程の正常な経過の変更を指す。例えば、精原幹細胞の活性のモジュレーションは、細胞の活性の増加となり得る。或いは、精原幹細胞の活性のモジュレーションは、細胞の活性の減少となり得る。
【００３８】
本明細書における用語使用において、「濃縮」は、あるものの濃度、数又は活性が、前の状態から増加する過程を指す。例えば、100個の精原幹細胞の集団は、該集団が以前に50個の精原幹細胞のみを含有していた場合、精原幹細胞が「濃縮」されたと考慮される。同様に、100個の精原幹細胞の集団は、該集団が以前に99個の精原幹細胞を含有していた場合にも、精原幹細胞が「濃縮」されたと考慮される。同様に、100個の精原幹細胞の集団は、該集団が以前にゼロ個の精原幹細胞を含有していた場合であっても、精原幹細胞が「濃縮」されたと考慮される。
【００３９】
本明細書における用語使用において、「集団」は、2個以上の細胞を指す。
【００４０】
本明細書における用語使用において、「から実質的に分離される」又は「実質的に分離する」は、第2の物質の集団の近くから除去された第1の物質の集団の特徴を指し、ここで第1の物質の集団は必ずしも第2の物質を欠いている必要はなく、第2の物質の集団は必ずしも第1の物質を欠いている必要はない。しかしながら、第2の物質の集団「から実質的に分離」されている第1の物質の集団は、第1及び第2の物質の非分離混合物と比較して、測定可能な程度に低い含有量の第2の物質を有する。
【００４１】
一態様において、第1の物質の濃度対第2の物質の濃度の比が、約1を超える場合、第1の物質は、第2の物質から実質的に分離されている。別の態様において、第1の物質の濃度対第2の物質の濃度の比が、約2を超える場合、第1の物質は、第2の物質から実質的に分離されている。更にまた別の態様において、第1の物質の濃度対第2の物質の濃度の比が、約5を超える場合、第1の物質は、第2の物質から実質的に分離されている。別の態様において、第1の物質の濃度対第2の物質の濃度の比が、約10を超える場合、第1の物質は、第2の物質から実質的に分離されている。更なる別の態様において、第1の物質の濃度対第2の物質の濃度の比が、約50を超える場合、第1の物質は、第2の物質から実質的に分離されている。別の態様において、第1の物質の濃度対第2の物質の濃度の比が、約100を超える場合、第1の物質は、第2の物質から実質的に分離されている。更なる一態様において、第1の物質を含有する組成物中に検出可能なレベルの第2の物質が存在しない場合、第1の物質は、第2の物質から実質的に分離されている。
【００４２】
本明細書における用語使用において、「実質的に均質」は、主に該物質で構成された物質の集団及び不純物が最小化された集団を指す。
【００４３】
細胞又は細胞の集団の「維持」は、生細胞又は生細胞集団の細胞総数が、培養において増加も減少もしていない状態を指す。或いは、本明細書における用語使用において、細胞又は細胞の集団の「増殖」は、生細胞の数が、培養においてもとの細胞数に対して時間の関数として増加する状態を指す。
【００４４】
本明細書における用語使用において、「限定培養培地」は、公知の組成を有する細胞培養培地を指す。
【００４５】
本明細書における用語使用において、用語「アプリケーター」は、本発明の組成物を哺乳類に投与するための皮下注射用シリンジ、ピペット、気管支鏡、及びネブライザー等が挙げられるがこれらに限定されない、あらゆる装置を意味する。
【００４６】
本明細書において、「説明用材料」は、本明細書に列挙されているあらゆる組成物を維持、増殖又は投与するためのキットにおける、本発明の方法及び/又は組成物の有用性を伝えるために用いることのできる、刊行物、記録、図表又は他のあらゆる表現媒体を包含する。本発明のキットの説明用材料は、例えば、本発明の組成物を含有する容器に添付することができる、又は組成物を含有する容器と共に発送することができる。或いは、説明用材料及び化合物がレシピエントによって協同的に用いられることを企図して、説明用材料は、容器とは別々に発送することができる。
【００４７】
本明細書における用語使用において、細胞がもはや、細胞の集団又は培養培地に物理学的、生物学的又は化学的効果のうち1種以上を及ぼさない場合、細胞は、細胞の集団又は培養培地から「排除」されたと言われる。例えば、細胞は、FACSを用いて細胞を物理的に除去することにより、又は該細胞独自の細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いることにより、培養培地から排除することができる。細胞は、例えば、該細胞に特異的な中和抗体を用いる等、該細胞の生物活性を不活性にすることにより、培養培地から排除することもできる。
【００４８】
細胞は、斯かる細胞の総数の大部分(但し全てではない)がもはや、細胞の集団又は培養培地に物理学的、生物学的又は化学的効果のうち1種以上を及ぼさない場合、細胞の集団又は培養培地から「本質的に排除」される。例えば、特定の種類の細胞は、この種類の細胞の少なくとも75%が、該細胞独自の細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いて培養培地から除去される場合、培養培地から本質的に排除され得る。より好ましくは、細胞の少なくとも80%が、培養培地から排除され、更により好ましくは、細胞の少なくとも85%、より好ましくは、少なくとも90%、更により好ましくは、少なくとも95%が、培養培地から排除される。
【００４９】
本明細書における用語使用において、細胞が精巣に由来する場合、細胞は、「精巣由来」細胞である。非限定的な例として、精巣由来細胞として、精原幹細胞、体細胞及び生殖細胞が挙げられる。
【００５０】
精原幹細胞を濃縮する方法
本発明は、精原幹細胞(SSC)を濃縮する方法を特徴とする。本明細書において、長期生存によるフィーダーフリープロトコールにおいてSSCを培養して、細胞の集団を濃縮し得ることが初めて示された。本発明の一実施形態において、SSCは、ウシから得られる。幹細胞濃縮は、生物における細胞の再増殖のための幹細胞に基づく療法、並びに幹細胞の維持及び増殖の制御の原因である成長因子を同定するための実験室における研究並びに人工授精を包含する医学的処置、診断及び研究の分野における様々な目的に有用である。
【００５１】
本発明は、精原(spematogonial)幹細胞を培養するための組成物及び方法を含む。本発明において、本出願人は、長期間の培養において、単離された(或いは他の方法で得られた)ウシ精原幹細胞を未分化状態のままに保ち且つ生存可能のままに保つフィーダーフリー培養系を開発した。人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞を用いることもできる。本発明の更なる態様は、ウシ精巣組織から未分化精原細胞を単離する手順、in vitroにおけるウシ未分化精原細胞の生存を支持する特異的無血清培地の同定、培養されたウシ未分化精原細胞が接着するプラスチック培養ウェルのコーティングのための基材を包含し、最後に、本出願人は、ウシ未分化精原細胞(spermatogoinia)の維持及び成長を促進するフィーダー細胞調整培地の補充のための特異的成長因子を同定した。
【００５２】
本発明において、本出願人は、ウシ精巣から単離された又は他の方法で得られた、線維芽細胞ウシ胚性細胞株及びウシ体細胞株を包含する特定の所有権のある細胞株を同定した。これらの特定の細胞株は、いずれかのSSCの培養に先立ち培養培地を調整するためのフィーダー支持細胞として用いられる。本前培養技術は、他のフィーダー細胞株が混入せずその有害効果、例えば潜在的宿主免疫応答、SSCのコロニー形成能力の限定がない、移植又は他の用途のためのウシ精原SSCの純粋な集団の生成を可能にするフィーダーフリー培養を可能にする。
【００５３】
一実施形態において、本発明は、少なくとも1のSSCを含有するウシ精巣組織から精原幹細胞(SSC)を単離する方法を特徴とする。本方法は、少なくとも1のSSCを包含するウシ精巣組織を得るステップと、前記組織をコラゲナーゼと接触させるステップと、他の細胞型から精細管を分離するステップと、その後に、前記精細管をトリプシンと接触させて、精原細胞及びセルトリ細胞が濃縮された細胞懸濁液を得るステップとを包含する。
【００５４】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも1のSSCを含有する精巣由来集団、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞由来の精原幹細胞(SSC)の純粋な培養物を濃縮及び維持する方法であって、血清代替物による特異的無血清培地を用意するステップと、Matrigelで予めコーティングされた培養細胞ウェルを更に用意するステップと、全て1体に作用する特異的成長因子であるGDNF、FGF2、SDF-1及びCSF-1を事前調整された培地に加えて、精原細胞、好ましくは、ウシ精原細胞のフィーダーフリー培養物を初めて用意するステップとを包含する方法を特徴とする。
【００５５】
一実施形態において、本発明はまた、未分化のままであり、自己再生及び分化の能力を保有し、培養において生存可能であり、本質的に純粋な、即ちフィーダーフリーである精原幹細胞の集団を特徴とする。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、開発された、フィーダーフリー培養法を提供するための培地の事前調整を可能にする新規支持細胞株を包含する。本細胞株は、35日齢の雄ホルスタイン胎仔に由来する細胞株BEF1と、第2に、4カ月齢のホルスタイン雄ウシの精巣から単離された体細胞に由来する細胞株BSC1とを包含する。これらの細胞株は共に、培養培地のプレインキュベートに用いることができ、インキュベート中のSSCにフィーダー細胞を加えることなくSSCの生存及び増殖に必要な分泌因子を提供する。
【００５７】
本発明の一態様において、SSCは、ウシSSCである。別の態様において、SSCは、マウス、ラット、サル、ヒヒ、ヒト、ブタ及びイヌからなる群から選択される生物に由来する。
【００５８】
本発明の別の態様において、細胞は、野生型成体精巣、子供の精巣、新生仔精巣、人工多能性細胞、胚性幹細胞及び/又は停留精巣の成体精巣からなる群から選択される供給源に由来する。
【００５９】
一実施形態において、本発明は、SSC維持の支持のための無血清培養系であって、濃縮されたSSCと、無血清限定培養培地と、フィーダー細胞により事前調整された培地とを含む系を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、SSC増殖の支持のための無血清培養系であって、少なくとも1のSSCと、所有権のある線維芽細胞細胞株BEF1及び所有権のあるBSC1フィーダー細胞により事前調整された、血清代替物サプリメント(StemPro)による無血清限定培養培地とを含む上記系を特徴とする。
【００６０】
本発明の一態様において、培養系は、成長因子であるGDNF、FGF2、SDF-1及びCSF-1を更に含む。別の態様において、培養培地は、ダルベッコのMEM:Hamの栄養混合物F-12(DMEM/F12)及びStemPro血清代替物サプリメントからなる群から選択される少なくとも1種の培地を含む。
【００６１】
本発明の別の態様において、培養系は、Matrigel(成長因子低下バージョン)等の市販のマトリックスで予めコーティングされた成長プラスチック培養ウェルを更に含む。このようなコーティングがないと、細胞は、プラスチックウェルに付着せず、培養において長期間維持することができない。
【００６２】
一実施形態において、本発明は、純粋な濃縮されたSSCの集団を含む組成物であって、SSCの濃縮された集団が、胚性線維芽細胞又は他の種類のフィーダー細胞を含まない上記組成物を特徴とする。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、未分化精原細胞の特異的マーカー及び培養されたSSC細胞と同様の形態を示す濃縮されたSSCの集団を含む組成物を特徴とする。一態様において、SSCの集団は、SSCが実質的に均質である。
【００６４】
一実施形態において、本発明は、フィーダーフリーSSCの集団を、雄レシピエント哺乳類の精巣に投与するステップと、レシピエント哺乳類において、濃縮されたSSCに精子形成コロニーを生成させるステップと、レシピエント哺乳類をレシピエント哺乳類と同一の種の雌哺乳類と交配するステップとを含む、少なくとも1の哺乳類後代を作成する方法を特徴とする。一態様において、濃縮されたSSCの集団は、レシピエント哺乳類の精細管の管腔に投与される。別の態様において、レシピエント哺乳類は、不妊である。
【００６５】
本発明の一実施形態において、レシピエント哺乳類は、齧歯類、霊長類、イヌ、ウシ、ブタ及びヒトからなる群から選択される。別の実施形態において、齧歯類は、マウス及びラットからなる群から選択される。更にまた別の態様において、霊長類は、ヒヒである。
【００６６】
一実施形態において、本発明は、フィーダーフリー濃縮されたSSCの集団を、雄レシピエント哺乳類の精巣に投与して、レシピエント哺乳類において、濃縮されたSSCに精子形成細胞のコロニーを生成させるステップと、レシピエント哺乳類をレシピエント哺乳類と同一の種の雌哺乳類と交配するステップとを含む、少なくとも1の後代哺乳類を作成する方法を特徴とする。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを維持するためのキットを特徴とする。本キットは、無血清限定培養培地並びに培養培地を事前調整するための所有権のあるBSC1及びBEF1細胞を含む培養系と、アプリケーターと、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを維持するためのキットの使用のための説明書を含む説明用材料とを包含する。
【００６８】
一実施形態において、本発明は、本発明の方法に従って産生された後代動物を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、本発明の方法に従って生産された後代動物であって、後代動物の生産に用いた濃縮されたSSCが、少なくとも1個の遺伝的突然変異を含有する上記後代動物を特徴とする。一態様において、遺伝的突然変異は、組換え技術を用いて作製される。
【００６９】
請求項に係る発明は、一部には、特定の天然の又はトランスジェニックにより(「遺伝学的に」)生成された雄性不稔ウシの、該動物と免疫適合性でもあるドナー精子幹細胞のためのレシピエントとしての使用を包含する。このような動物における精子形成は、重篤に妨害されている。したがって、移植された精子幹細胞は、機能的精子へと自由に発達し、レシピエント雄が稔性であれば産生されたであろう精子と競合することなく雌を受精させる。この方法で、ドナー細胞ハプロタイプの100%生殖系列伝達は、相対的に少数の移植された精子幹細胞から達成することができる。
【００７０】
よって、本発明の一態様に従って、ドナーハプロタイプの生殖系列伝達をもたらすための方法論が提供される。本発明に関する方法は、(A)哺乳類精巣に由来する、人工多能性幹細胞に由来する、又は胚性幹細胞から作製された精原幹細胞株であって、所定の遺伝的背景を具体化する細胞株の細胞を用意するステップと、続いて、(B)移植された細胞が受精能のある半数体雄性配偶子へと発達するように、該細胞の1個以上を雄性不稔レシピエントに移植するステップとを含む。
【００７１】
本発明の別の態様に従って、哺乳類精巣に由来する、多能性幹細胞から誘導された、又は胚性幹細胞から作製された精原幹細胞株の細胞のライブラリーが提供される。本発明のライブラリーは、複数の遺伝子ノックアウト又は「ノックイン」突然変異体幹細胞を含有する。
【００７２】
本発明の追加的な態様に従って、精原幹細胞を培養するための方法に加えて、精原幹細胞を成長させるための培地が提供される。
【００７３】
フィーダーフリー精原幹細胞培養系
本発明は、SSCのin vitro維持及び増殖のためのフィーダーフリー培養系を特徴とする。これは、SSCがその構成成分であるウシ未分化精原細胞を、フィーダー細胞により事前調整されたがフィーダー細胞を含有していない培地において、in vitroで維持及び増殖させることができることが本明細書において初めて示されたからである。本発明によって、ウシSSCのin vitro培養のための、最小規定条件を有する培養系が確立され、この系は、規定の方法でSSCの生物学を調査する能力と共に、SSCの維持及び増殖に必要な個々の因子を同定する能力をもたらす。好ましい一実施形態において、フィーダーフリー培養方法は、in vitro受精及び商業的なウシ生産の他の態様における使用のための、フィーダー細胞の混入がないSSC細胞の集団の生成を可能にする。
【００７４】
本発明の一実施形態において、フィーダーフリーSSC培養系は、事前調整されたフィーダー培地を包含する。本発明の一態様において、事前調整用のフィーダー細胞は、ウシ胚性線維芽細胞株BEF1及びウシ体細胞株BSC1を包含する、本出願人に所有権のある細胞株である。本発明の別の態様において、事前調整用のフィーダー細胞は、細胞及びその構成成分等を含むこれらの細胞株に由来する要素を包含し得るがこれに限定されない。
【００７５】
本出願人は、SSCの培養にとって重要な培地を同定した。本発明の一態様であるこの培養及び事前調整のための培地は、最小必須培地-α(MEMα)を包含する無血清限定培地である。本発明の別の態様において、無血清限定培地は、HamのF10培養培地を包含する。本発明の更にまた別の態様において、無血清限定培地は、ダルベッコのMEM:Hamの栄養混合物F-12(DMEM/F12)である。本開示を知った当業者であれば理解できようが、本発明の無血清限定培地は、そのうち1種がDMEM/F12である2種以上の培地の混合物も包含する。
【００７６】
したがって、本発明は、SSCの維持又は増殖のための1種以上のフィーダー細胞株によって事前調整された限定培地を包含する組成物を包含する。本明細書に記載の開示に基づき理解できようが、本発明の培養系は、SSCの維持又は増殖に有用である。本発明の一態様において、培養系において有用なSSCは、本発明の方法又は組成物を用いて濃縮されたSSCである。別の態様において、培養系において有用なSSCは、本発明の方法又は組成物に従って事前に濃縮されていないSSCである。
【００７７】
本発明の一実施形態において、フィーダーフリー限定培地は、SSCを更に包含する。当業者であれば、本開示に鑑み、いかなる供給源由来のSSCであっても、本発明のフィーダーフリー培養系を用いて維持又は増殖できることを理解できよう。即ち、精巣由来細胞の集団から得られるSSCは、ヒト精巣、ラット精巣、マウス精巣、好ましくは、乳牛(cow)又はウシ精巣が挙げられるがこれらに限定されないあらゆる哺乳類供給源に由来する精巣細胞からも得ることができる。SSCの供給源は、野生型成体精巣、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、1種以上の遺伝的突然変異を有する成体精巣、若年期精巣、新生仔精巣及び/又は停留精巣の成体精巣を更に包含する。SSC等の細胞におけるDNAに遺伝的突然変異を導入するための方法は、本技術分野において周知のものであり、本明細書においては更なる議論はしない。
【００７８】
本明細書に記載の開示に基づき、不稔雄が、SSCの供給源となり得ることも理解できよう。したがって、本発明の別の態様は、本発明のSSCの供給源として不稔雄を包含する。
【００７９】
本明細書の他の箇所で詳細に記載されている通り、本発明の基本のフィーダーフリー限定培地は、細胞の培養において有用であることが当業者に知られたあらゆる構成成分を更に包含することができる。一実施形態において、フィーダーフリー限定培地は、少なくとも1種の成長因子を包含する。本発明において有用な成長因子として、幹細胞因子(マウスSCFを包含)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、GDNFファミリー受容体(GFR.アルファ.1を包含)、白血病阻害因子(LIF)、塩基性線維芽細胞成長因子(ヒトbFGFを包含)、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)、コロニー刺激因子(CSF)、ストロマ由来因子1(SDF-1)、上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF-Iを包含)、血小板由来成長因子(PDGF)及びトランスフォーミング成長因子(TGF-β  IからIIIと、TGF  β.スーパーファミリーBMP-1から12、GDF 1から8、dpp、60A、BIP、OFを包含)が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、成長因子は、GDNF、FGF2及びCSF-1を包含する。
【００８０】
したがって、本発明は、フィーダーフリー限定培養培地においてSSCを維持又は増殖させる方法も包含する。一実施形態において、本発明は、フィーダーフリー培養系においてSSCを維持する方法を特徴とする。本方法は、本明細書の他の箇所に詳細に規定されているフィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを用意するステップを包含する。
【００８１】
培養培地における様々な時点においてSSCの活性を評価し、この活性を培養期間の開始時におけるSSCの活性と比較することにより、SSCは、フィーダーフリー限定培養系において「維持」されていると同定することができる。当業者であれば理解できようが、活性が殆ど又は全く失われていないことは、培養においてSSCが維持されたことの徴候である。SSCの活性を測定する方法は、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。
【００８２】
別の実施形態において、本発明は、フィーダーフリー培養系においてSSCを増殖させる方法を特徴とする。本方法は、本明細書の他の箇所に詳細に規定されているフィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを用意するステップを包含する。培養過程における様々な時点においてSSC活性を評価し、この活性を培養期間の開始時におけるSSCの活性と比較することにより、SSCは、フィーダーフリー限定培養系において「増殖」していると同定することができる。培養期間の開始時及びその後のいずれかの時点の間における活性の増加は、SSCが増殖したことの徴候である。SSCの活性を測定する方法は、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。本発明により増殖させることのできるSSCとして、ウシSSC、ヒトSSC、マウスSSC及びラットSSCが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
さらに、本発明のフィーダーフリー培養系におけるSSCの増殖の程度は、SSC細胞培養期間の特定の時点に存在する細胞数を計数し、この値を培養期間の開始時に存在する細胞数と比較することにより、評価することができる。本明細書に記載の開示に基づき、当業者は、SSC維持及び増殖を評価するこれらの及び他の方法を用い得ることを理解するだろう。このような方法として、FACS及びMACSが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８４】
精原幹細胞の移植
本発明の一態様において、1個以上のSSCをレシピエント精巣に移植することができる。移植方法は、本技術分野において一般に公知のものであり、本明細書においてごく詳細には議論しない。精巣に関与する一般的な細胞移植方法に関しては、Kanatsu-Shinoharaら(PNAS、99:1383〜1388(2002))、Brinster(I)(米国特許第6,215,039号明細書)及びBrinster(II)(米国特許第5,858,354号明細書)を参照されたい。これら全ては、参照によりその全内容を本明細書に援用する。Brinster(I)及び(II)は、一部には、ドナーから免疫学的に寛容性のあるマウス又は他の適合性レシピエントに移植されたSSCが、レシピエントにおいて複製し、維持され得ることを実証する。フィーダー系を移植するためにはフィーダー細胞を除去する必要があるという点において、フィーダーフリー系は、伝統的なフィーダー系に優る大きな進歩である。フィーダー細胞フリーである本出願人の培養は、このような骨の折れる困難なステップを必要としない。
【００８５】
本発明の一実施形態において、1個以上のSSCが、精巣の細管に導入される。例えば、レシピエント雄哺乳類を麻酔し、精巣を外科的に露出することができる。一実施形態において、顕微操作方法を用いて、露出された細管に細いガラス針が次々に導入され、各細管に、細管のコロニー形成に用いられる原始細胞を含有する溶液が注射される。別の実施形態において、1個以上のSSCは、管系の他の部分、例えば、精巣網の管腔に注射することにより導入することもできる。当業者であれば理解できようが、注射部位の数を最小化し、レシピエント雄へのSSCの注射効率を増加させる注射方法を利用することができる。
【００８６】
注射のための1個以上のSSCの細胞懸濁液は、注射培地と、適した濃度の少なくとも1のSSCを含むことができる。非限定的な例として、注射培地は、NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4、EDTA、ピルビン酸塩、乳酸塩、グルタミン、グルコース、ウシ血清アルブミン及びDNAse Iのうち1種以上を含むことができる。注射培地のpHは、適切には、7.0〜7.7の範囲内であり、当業者であれば理解できるが、培地組成、細胞型及び/又は濃度、並びにレシピエント注射部位の微小環境に応じて、より塩基性又はより酸性となるよう調整することができる。
【００８７】
本発明の別の実施形態において、1個以上のSSCをレシピエント雄に導入するために、他の系を用いることができる。このようなものとして、輸精管及び精巣上体への注射又は胎仔若しくは若年期精巣における操作、最小の外傷で精巣被膜内部の精細管を切断するための技術(これにより注射された細胞は細管の切断端に進入することができる)が挙げられる。或いは、発達途中の新生仔精巣を用いることができる。
【００８８】
本明細書の他の箇所に記載されている通り、精巣細管に進入するSSCは、一般に、細管管腔内の免疫学的な特権を有する環境によって破壊から保護される。細管から漏出する細胞は、この動物にとって外来性であるため、典型的には、宿主の免疫系によって破壊される。
【００８９】
本発明の別の実施形態において、異なる種由来の動物系統を用いて、ドナー細胞が提供される(異種間移行)。SSCの供給源として、ヒト、ラット及びマウスを包含する齧歯類、ヒヒを包含する霊長類、乳牛並びにイヌが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
本発明は、雄が精巣を有する、ヒトを包含する動物のいずれの種にも適用でき、そのようなものとして、非ヒトトランスジェニック動物が挙げられるがこれに限定されない。本発明はまた、哺乳類種に限定されない。これは、単一又は多くの新規遺伝子改変又は新規特徴を備える、多くの種類の動物及び動物系列の提供に用いることができる。本発明を適用することのできる動物として、細胞診断又はアッセイにおけるその使用を可能にするよう改変することができる、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、サル、ヒヒ)、齧歯類(例えば、マウス、ラット等)等の実験動物、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ)、トリ(ニワトリやシチメンチョウ等)、野生動物(例えば、バッファロー、オオカミ)、絶滅危惧動物(例えば、ゾウ、ヒョウ)及び動物園の種(トラ、シマウマ、ライオン、パンダ、キリン、ホッキョクグマ、サル、ラッコ等)が挙げられる。本発明は、飼い慣らされた反芻動物及び家禽(例えば、牛、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、豚等)等の家畜に有利に適用して、有利な遺伝子改変(複数可)又は特徴(複数可)をこれらの動物に植え付けることもできる。
【００９１】
本発明の別の実施形態において、ドナー及びレシピエント哺乳類は、同一の哺乳類であり得る。一態様において、SSCを含む細胞の集団は、生殖細胞集団の破壊に先立ち哺乳類から収集され、次いでその後に再導入される。本実施形態は、例えば癌の処置において必要となり得る放射線療法の後に、この哺乳類の繁殖能力を保存する。或いは、精原幹細胞は、哺乳類から回収して、培養又は凍結において保つことができる。本発明の本態様において、後代を所望であれば、幹細胞は、レシピエント精巣に移植される。次に、ドナー哺乳類卵を、レシピエント精巣において発達した精子によって受精させることができる。幹細胞は絶えず自己再生を行うため、この手順に時間的制約はない。
【００９２】
卵及び後代の受精方法は、本技術分野において公知のものであり、本明細書においては詳細には議論しない。非限定的な例として、卵を受精させる方法として、卵細胞質内精子注入法(ICSI)及び円形精子細胞注入法(ROSI)等が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、非限定的な例として、後代を受精させる方法として、ICSI及びROSI等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９３】
最初の受精イベントが達成され、得られた子孫が稔性であれば、その新規遺伝子改変又は特徴を備える哺乳類系列が確立され、該新規遺伝子改変又は特徴は、雄及び雌子孫の両方に存在する。よって、本発明に従って、その精巣精細管を再増殖させることにより、その精巣においてのみ、該哺乳類にとって生得的ではない生物学的に機能的な生殖細胞を有する哺乳類を産生することができる。この(親)哺乳類は、後代を産生することができる。後代における全細胞は、親哺乳類と比較して、遺伝学的に非生得的である。
【００９４】
本発明によって提供される親哺乳類及びその後代の両方は、ヒト遺伝子療法を包含する農業及び生体医学における用途が挙げられるがこれらに限定されない複数の多様な用途を有する。本発明の実例的な農業用途は、有益な繁殖用動物の育種潜在力の増加に関する。本発明の別の態様において、生体医学又は農業のいずれかにおいて有用なキメラ動物が提供される。当業者であれば理解できるが、本適用を備える場合、本発明は、現存するトランスジェニック動物技術に対し有利な補完を提供する。
【００９５】
本発明は、発生学的トランスジェニック作業の現在の困難及び出費を軽減する。本発明の一実施形態において、精原幹細胞を遺伝子改変し、レシピエント精巣に移動させることができる。得られた生殖細胞に存在する有益な遺伝的形質は、レシピエント繁殖用動物の(トランスジェニック)後代に伝わることができる。本発明のこの特定の適用は、大型農業用動物の遺伝子工学に重要である。
【００９６】
本明細書に記載されている通り、本発明は、ヒト遺伝子療法を包含する遺伝子療法における適用も有する。非限定的な例として、有害な遺伝的形質を備える患者に、精巣生検を行うことができる。幹細胞を遺伝子改変して、有害な形質を補正することができる。続いて、例えば、精巣の特異的放射線照射により、精巣から残りの生殖細胞を除去するための処置を患者に行う。患者の精巣(この時点では生殖細胞を欠く)は、続いて、患者自身の遺伝学的に補正された幹細胞によって再コロニー形成され得る。次に、患者は、その後代に遺伝的疾患を伝え得るという心配がなく、後代の父親となることができる。或いは、補正された遺伝子を備える幹細胞をマウスに移植し、得られた精子を卵の受精に用いて、これにより幹細胞を本来のヒト精巣に再移植する必要に先んずることができる。
【００９７】
別の実施形態において、本発明は、ヒトが挙げられるがこれに限定されない雄哺乳類における稔性の確立、回復、又は増強における適用も有する。非限定的な例として、放射性同位体療法、化学療法又はその両方により処置することができる疾患又は障害を有する患者が、1個以上のSSCのドナーである。患者に放射性同位体療法、化学療法又はその両方を行った後、患者は、恐らく、SSCを欠くようになり得るか、又は不妊となり得る。本発明に係る患者のSSCの1個以上を使用、調製又は移植することにより、患者における稔性を確立、回復又は増強することができる。
【００９８】
不稔精巣補完
現在、男性における不妊症の具体的な原因は、症例の40〜60%において未解明のままである。Bhasinら、J Clin Endocrinol Metab 79、1525〜9(1994);Sadeghi-Nejadら、Urol J 4、192〜206(2007);及びMatzukら、Nat Med 14、1197〜213(2008)を参照されたい。総計で雄集団の>5%が不妊であり、全雄の>1%が、無精子症と呼ばれる精子産生における重篤な欠損を患う。Bhasinら、J Clin Endocrinol Metab 79、1525〜9(1994);Sadeghi-Nejadら、Urol J 4、192〜206(2007);Bartholdら、J Urol 170、2396〜401(2003);及びBleyer、W. A. CA Cancer J Clin 40、355〜67(1990)を参照されたい。本質的に、無精子症は、自然交配による繁殖を不可能にするため、ヒト集団においてなぜこの疾患がここまで蔓延し続けているかは謎に思われる。斯かる疫学的傾向は、精子産生(即ち、精子形成)過程を妨害する強力な環境因子、又はあるヒトを不稔にする一方他のヒトは健康なままである、一生涯の間に生じ得る相当数のde novo突然変異の存在を明らかに指摘する。Bhasinら、J Clin Endocrinol Metab 79、1525〜9(1994);Bleyer、W. A.、CA Cancer J Clin 40、355〜67(1990);Reijo、R.ら、Nat Genet. 10、383〜93(1995);Oatesら、Hum Reprod 17、2813〜24(2002)を参照されたい。実際に、斯かるde novo突然変異は、遺伝的レベルで既に規定された数種類の雄性要因の不妊症の原因となり、癌化学療法によりその小児期において不妊のままにされる雄の数が増加しつつあるため、これは数多くの症例において真実である。Sadeghi-Nejadら、Urol J 4、192〜206(2007);Reijoら、Nat Genet. 10、383〜93(1995);Bleyerら、CA Cancer J Clin 40、355〜67(1990);Oatesら、Hum Reprod 17、2813〜24(2002);Bhasin、S.、J Clin Endocrinol Metab 92、1995〜2004(2007);及びGeens、M.ら、Hum Reprod Update 14、121〜30(2008)を参照されたい。多くの無精子症の不妊男性に対する新たな希望として、生殖生物学及び遺伝的研究の間の強固なリンクを顕在化させた幹細胞生物学における先駆的ブレイクスルーは、マウス精巣が、単離及び別のマウスの精巣への移植後に完全に機能的な精子を生成することができる精原幹細胞を含有していたという発見であった。Brinster & Zimmermann、Proc Natl Acad Sci USA 91、11298〜302(1994)を参照されたい。ラットにおいて同様の実験がその直ぐ後に行われ、次に、単離されたマウス精原細胞は、数か月の培養の後にその再生潜在力を維持することが示された。Clouthierら、Nature 381、418〜21(1996);Naganoら、Tissue Cell 30、389〜97(1998)を参照されたい。in vitroにおける齧歯類精原系列の長期増殖を支持する新たな培養培地が処方され、現在科学者たちは、精巣生検由来のヒト精原系列の培養に必要な条件の確立の一歩手前にある。Kanatsu-Shinoharaら、Biol Reprod 69、612〜6(2003);Hamra、F. K.ら、Proc Natl Acad Sci USA 102、17430〜5(2005);Conrad、S.ら、Nature (2008);及びKossack、N.ら、「Isolation and Characterization of Pluripotent Human Spermatogonial Stem Cell-Derived Cells.」Stem Cells(2008)を参照されたい。表面上は、精原系列を用いて自分自身のドナーの精巣に戻し移植することにより機能的な精子を産生させる前に、培養において精原系列を増殖させる能力は、多くの現存する種類の男性不妊症を治癒するための明確な戦略を提示する。しかし、大部分は生殖系列幹細胞の多分化能性質のために、このようなブレイクスルーが、実務作業に置き換えられる前には、先ず、斯かる細胞療法の前臨床的詳細を、医学的関連性のあるより進歩した非ヒトレシピエントにおいて厳密に評価することが欠かせない。Geens、M.���、Hum Reprod Update 14、121〜30(2008);Conrad、S.ら、「Generation of pluripotent stem cells from adult human testis.」Nature(2008);Kossack、N.ら、「Isolation and Characterization of Pluripotent Human Spermatogonial Stem Cell-Derived Cells.」Stem Cells(2008);Hermann、B. P.ら、Stem Cells 25、2330〜8(2007);及びZhangら、J Cell Physiol 211、149〜58(2007)を参照されたい。
【００９９】
キット
本発明は、少なくとも1のSSCの維持又は増殖のためのフィーダーフリー培養系を含む様々なキットを包含する。例示的なキットを後述するが、本開示を踏まえると、他の有用なキットの内容は当業者に明らかである。これらキットのそれぞれは、本発明の範囲内に包含されている。
【０１００】
一態様において、本発明は、無血清限定培養培地並びに細胞株BEF1及び細胞株BSC1を包含する1種以上の所有権のある細胞株由来の事前調整フィーダー細胞を含む培養系と、アプリケーターと、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを維持するためのキットの使用のための説明書を含む説明用材料とを含む、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを維持するためのキットを特徴とする。別の態様において、本発明は、無血清限定培養培地及び事前調整フィーダー細胞、又は既に事前調整された培地を含む培養系と、アプリケーターと、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを増殖させるためのキットの使用のための説明書を含む説明用材料とを含む、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを増殖させるためのキットを特徴とする。
【０１０１】
本発明はまた、フィーダー細胞によって事前調整されたフィーダーフリー限定培養培地を含む培養系と、アプリケーターと、フィーダーフリー培養系において少なくとも1のSSCを増殖させるためのキットの使用及び哺乳類への濃縮されたSSCのアプリケーターに基づく投与のための説明書を包含する説明用材料とを含む、濃縮されたSSCの集団を哺乳類に投与するためのキットを特徴とする。
【０１０２】
キットに包含されている特定のアプリケーターは、例えば、細胞への濃縮されたSSCの集団の導入に用いられる方法及び/又は組成物に依存する。斯かるアプリケーターは、本技術分野において周知のものであり、とりわけ、膜、インプラント、及びシリンジ等を包含し得る。更に、キットは、キットの使用のための説明用材料を含む。このような説明書は、本明細書に提供されている開示を単純に具体化する。
【０１０３】
本キットは、薬学的に許容される担体も包含し得る。組成物は、本明細書の他の箇所に記載されている通りの適切な量で提供される。更に、投与経路として、所望の投与部位との直接的な接触、及び所望の投与部位に隣接する細胞又は組織との接触が挙げられるがこれらに限定するべきではない。
【０１０４】
本発明のキットに包含されている、SSCの単離、精製、濃縮、増殖及び維持のための組成物及び方法は、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。
【０１０５】
以下の実験例を参照しながら、本発明を更に詳細に説明する。このような実施例は、単なる例示目的のために提示されており、他に記述がなければ、限定されることは企図していない。よって、本発明は、決して以下の実施例に限定されていると解釈するべきではなく、寧ろ、本明細書に提示されている教示の結果明らかとなる、ありとあらゆるバリエーションを包含するものと解釈するべきである。
本発明の様々な態様をいかに示す。
１．
少なくとも1の精原幹細胞(SSC)を含有する精巣由来細胞の集団からSSCを濃縮する方法であって、
a)フィーダー細胞株によって事前調整された培地を用意するステップと、
b)SSC細胞の維持及び濃縮に適した条件下で、前記精巣由来細胞の集団を前記事前調整された培地と接触させるステップと
を含む方法。
２．
前記事前調整された培地が、前記培地を、ウシ胚性線維芽細胞及び/又はウシ精巣から単離されたウシ体細胞の系統由来の細胞又はその一部と接触させることにより作製される、上記1に記載の方法。
３．
前記細胞系統が、細胞株BEF1及び細胞株BSC1からなる群から選択される、上記2に記載の方法。
４．
事前調整が、a)培地を、ウシ胚性線維芽細胞及び/又はウシ精巣体細胞からなる群から選択されるフィーダー細胞と接触させるステップと、b)前記培地において前記細胞を増殖させるステップと、その後に、c)前記フィーダー細胞を除去するステップとを包含する、上記2に記載の方法。
５．
前記フィーダー細胞が、細胞株BEF1及び/又はBSC1に由来する、上記4に記載の方法。
６．
前記細胞が、ウシ細胞である、上記1に記載の方法。
７．
ATCC受託番号____として寄託された、ウシ精原幹細胞の培養のための培地を事前調整するためのウシ胚性線維芽細胞株BEF1。
８．
ATCC受託番号____として寄託された、ウシ精原幹細胞の培養のための培地を事前調整するためのウシ体細胞株BSC1。
９．
a.対象から精巣組織を得るステップと、
b.前記組織をコラゲナーゼとインキュベートして、精原細胞及びセルトリ細胞を分離するステップと、
c.他の細胞型から細管を分離するステップと、
d.細管をトリプシンで消化して、精原細胞及びセルトリ細胞の懸濁液を得るステップと、
e.前記懸濁液から精原細胞及びセルトリ細胞を分離するステップと
を含む、ウシ精巣組織から精原幹細胞を単離する方法。
１０．
他の細胞型から細管を分離する前記ステップが、重力沈降によるものである、上記9に記載の方法。
１１．
前記懸濁液から精原細胞及びセルトリ細胞を分離する前記ステップが、遠心分離と、セルトリ細胞が優先的に結合する培養皿におけるインキュベーションとによるものである、上記9に記載の方法。
１２．
前記事前調整された培地が、DMEM/F12培地である、上記1に記載の方法。
１３．
前記培地に、血清代替物サプリメントが補充されている、上記1に記載の方法。
１４．
前記血清代替物サプリメントが、StemProである、上記12に記載の方法。
１５．
前記培養が、プラスチック培養ウェルにおいて維持される、上記1に記載の方法。
１６．
前記プラスチック培養ウェルが、精原細胞が付着して長期培養において維持されるようMatrigelでコーティングされている、上記14に記載の方法。
１７．
前記培地に、GDNF、FGF2、SDF-1及びCSF-1が挙げられるがこれらに限定されない成長因子が補充されている、上記1に記載の方法。
１８．
前記細胞が、ウシ細胞である、上記9に記載の方法。
１９．
a.ATCC受託番号____として寄託された細胞株BEF1及びATCC受託番号____として寄託された細胞株BSC1を含む群から選択されるフィーダー細胞を、培地と共にインキュベートして、前記精原幹細胞の維持及び濃縮を支持するよう前記培地を事前調整するステップと、その後に、
b.前記培地から前記フィーダー細胞を除去するステップと
を含む、ウシ精原幹細胞の維持及び濃縮のための培地を作製するための方法。
２０．
a.前記培地に成長因子又はGDNF、FGF2、SDF-1及びCSF-1を加えるステップ
を更に含む、上記17に記載の方法。
２１．
前記培地が、DMEM/F12である、上記17に記載の方法。
２２．
前記培地が、血清代替物サプリメントStemProを包含する、上記19に記載の方法。
２３．
上記17に記載の方法によって作製されたウシ精原幹細胞の維持及び濃縮のための培地。
２４．
前記培地が、Matrigelで予めコーティングされたプラスチック培養ウェル内に含まれている、上記21に記載の培地。
２５．
上記1に記載の方法によって作製された、濃縮された精原幹細胞の集団。
２６．
前記細胞が、ウシ細胞である、上記25に記載の細胞の集団。
２７．
少なくとも1の哺乳類後代を作成する方法であって、
a)上記1に記載の方法によって産生された濃縮されたSSCの集団を、雄レシピエント哺乳類の精巣に投与するステップであって、フィーダー細胞を前記集団から除去する必要がない上記ステップと、
b)前記レシピエント哺乳類において、前記濃縮されたSSCに精子形成コロニーを生成させるステップと、
c)前記レシピエント哺乳類を、前記レシピエント哺乳類と同一の種の雌哺乳類と交配するステップと
を含む方法。
２８．
前記濃縮されたSSCの集団が、前記レシピエント哺乳類の精細管の管腔に投与される、上記24に記載の方法。
２９．
前記レシピエント哺乳類が、不妊である、上記24に記載の方法。
３０．
前記レシピエント哺乳類が、齧歯類、霊長類、イヌ、乳牛(又はウシ)、ブタ及びヒトからなる群から選択される、上記24に記載の方法。
３１．
前記哺乳類が、乳牛又はウシである、上記30に記載の方法。
３２．
フィーダーフリー培養系において少なくとも1のウシSSCを維持するためのキットであって、
a)フィーダー細胞株BEF1及びBSC1により事前調整された無血清培養培地を含む培養系と、
b)アプリケーターと、
c)前記フィーダーフリー培養系において少なくとも1のウシSSCを維持するための前記キットの使用のための説明書を含む説明用材料と
を含むキット。
【実施例】
【０１０６】
ウシ又はブタ未分化精原細胞の単離及び培養
1. コラゲナーゼ/DNaseインキュベーション溶液(1〜5mg/mlコラゲナーゼ、Worthington Biological及び5〜10mg/ml DNase、Sigma-Aldrich)を調製する。
【０１０７】
2. 100〜200mgの解剖したウシ又はブタ精巣実質を、マイクロピンセットを用いて手作業で裂き、コラゲナーゼ/DNase消化溶液中に置く。
【０１０８】
3. 周期的な間隔で穏やかに回旋させつつ、精細管が分離されるまで37℃でインキュベートする。
【０１０９】
4. 精細管断片を氷上で沈降させ、上清を除去し、Life Technologies、Inc.、米国92008カリフォルニア州カールスバッドから入手できるハンクス平衡塩溶液(HBSS)又は適した生理緩衝液において洗浄する。上清が相対的に清澄となるまで手順を反復する。
【０１１０】
6. 最後の沈降インキュベーション後に上清を除去し、トリプシン/DNase消化緩衝液(Invitrogen)に細管を再懸濁する。
【０１１１】
7. 37℃でインキュベートし、次に更なるDNase溶液を加え、続いてピペッティングして、生殖細胞及びセルトリ細胞からなる単一細胞懸濁液を生産する。
【０１１２】
8. ウシ胎仔血清又は他の適したタンパク質源を加えてトリプシン消化を停止し、細胞懸濁液を適した細胞濾し器に通して組織断片を除去し、これにより単一細胞懸濁液を得る。
【０１１３】
9. 600×gで7分間、4℃にて遠心分離して、細胞をペレット化する。
【０１１４】
10. 上清を吸引し、細胞をDPBS-S(1%FBS、10mM Hepes、1mMピルビン酸塩、1mg/mlグルコース、1×104u/mlペニシリン、1×104μg/mlストレプトマイシンを含むリン酸緩衝食塩水)又は他の適した生理緩衝液に再懸濁する。
【０１１５】
11. 5mlの細胞懸濁液につき2mlのパーコール溶液の密度で、細胞懸濁液を30%パーコール溶液上に重層する。その他の容量及び比のパーコール及び細胞懸濁液も適切であり得る。
【０１１６】
12. 600×gで8分間、4℃にて遠心分離する。
【０１１７】
13. 上清を除去して細胞ペレットを回収し、DPBS-S又は他の適した緩衝液に再懸濁する。
【０１１８】
14. 600×gで7分間、4℃にて遠心分離する。
【０１１９】
15. 上清を除去し、StemPro培養培地(後述するレシピ)に再懸濁する。
【０１２０】
16. 再度遠心分離し、StemProにおいて細胞を洗浄して、残存するウシ胎仔血清を除去する。
【０１２１】
17. 洗浄した細胞ペレットをStemProに再懸濁し、成長因子カクテル(GDNF 40ng/ml、FGF 10ng/ml、CSF-1 10ng/ml、SDF-1 10ng/ml)を加える。これら成長因子の他の濃度も適切であり得る。
【０１２２】
18. ウェル当たり2×106細胞の密度で、0.1%ゼラチンで予めコーティングされた6ウェル培養プレートへと細胞を加え、一晩37℃でインキュベートする。他の培養プレート型式、ゼラチン濃度及び細胞密度も適切であり得る。
【０１２３】
19. 翌日、HBSS又は他の適した生理的緩衝液を各ウェルに加え、ウェル中をまんべんなく穏やかにピペッティングして、非接着細胞を除去する。
【０１２４】
20. ウシ精原細胞が濃縮されている、非接着細胞の懸濁液を収集する。
【０１２５】
21. 生殖細胞を600×gで7分間、4℃にて遠心分離し、上清を除去し、BEF1又はBSC1フィーダー細胞で調整されたStemPro培地に再懸濁し、成長因子カクテルを加える。
【０１２６】
22. Matrigel(BD Biosciences)で予めコーティングされた24ウェルプレート内に細胞を置く。ラミニン及びフィブロネクチン等の他の基材もプラスチック培養ウェルのコーティングに適切であり得、96ウェル、48ウェル及び12ウェルを包含する他の培養プレート型式も適切であり得る。
【０１２７】
23. 細胞を37℃、空気中5%CO2雰囲気下にてインキュベートする。BEF1又はBSC1事前調整培地を1日おきに交換し、新しいマトリックスコーティングプラスチックプレートに7〜10日間の間隔で細胞を再播種する。
【０１２８】
細胞は、これらの条件において6カ月以上維持することができ、図1に示す形態の凝集塊を形成する。その上、細胞は、転写因子PLZFを包含する未分化精原細胞の分子マーカーの発現を保持する。
【０１２９】
StemPro培地の事前調整
1. Life Technologies、Inc.、米国92008カリフォルニア州カールスバッドから市販されているダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)成長培地においてBEF及びBSCフィーダーを維持し、80%コンフルエンスにおいて1:2〜1:5で継代培養する。
【０１３０】
2. StemProの事前調整は、培養される精原細胞に培地を加える24時間前に行う。
【０１３１】
3. DMEM成長培地を除去し、細胞をHBSS又は他の適した生理緩衝液で洗浄し、緩衝液を廃棄する。
【０１３２】
4. StemPro培地をフィーダーに加え、37℃で一晩インキュベートする。
【０１３３】
5. 事前調整されたStemPro培地を収集し、0.45μmシリンジフィルターを通して濾過し、成長因子カクテル(GDNF、FGF2、CSF-1及びSDF-1)を加える。
【０１３４】
6. Matrigel又は他の適したマトリックスでコーティングしたプラスチック培養ウェルにおいて維持されているウシ精原細胞に加える。
【０１３５】
ウシ胚性線維芽細胞(BEF)フィーダーの作製
1. 35日齢ウシ胚をPBS中に回収する。
【０１３６】
2. 頭部及び生殖腺を包含する内臓器官を除去する。
【０１３７】
3. 無菌かみそり刃を用いて、胚をさいの目に切って小片とする。
【０１３８】
4. 37℃のインキュベーションにより、トリプシン溶液において組織を消化する。
【０１３９】
5. 組織を氷上で沈降させ、続いて激しくピペッティングする。
【０１４０】
6. 更なるトリプシン溶液を加え、37℃でインキュベートする。
【０１４１】
7. 組織を氷上で沈降させ、上清を回収し、300×gで5分間遠心分離する。
【０１４２】
8. ペレット化した細胞をDMEM成長培地に再懸濁し、培養プレート内に置く。
【０１４３】
9. 細胞を37℃、空気中5%CO2雰囲気下で成長させる。
【０１４４】
10. テロメラーゼ過剰発現のための組換えDNAコンストラクトを遺伝子導入することにより、細胞を不死化させる。
【０１４５】
ウシ体細胞(BSC)フィーダーの作製
1. 精原細胞単離のための分別的プレーティング（differential plating）手順において、ゼラチンでコーティングした培養ウェルに接着するウシ精巣細胞を、精原細胞を除去した後に、DMEM成長培地において維持する。
【０１４６】
2. この細胞集団は、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞及び線維芽細胞を包含する、ウシ精巣由来の体細胞の混合物である。
【０１４７】
3. 37oC、空気中5%CO2雰囲気下で細胞を成長させ、テロメラーゼ過剰発現のための組換えDNAコンストラクトの遺伝子導入により不死化させる。
【表１】
0005782200.tif 000002
【０１４８】
寄託
細胞株BEF1及びBSC1の寄託は、本願の発明者によって維持されており、また本願の出願日以前から維持されていた。この寄託物へのアクセスは、本願の係属中に、要請に応じて、特許商標庁長官及び長官によってその権限があると決定された人物によって利用することができる。本願におけるいずれかの請求項の容認後に、本出願人は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)、20110バージニア州マナサスへの各細胞株の寄託を制限なしで公表する。ATCCに寄託された細胞株は、本発明者によって維持される上述の同一寄託物から採取される。さらに、本出願人は、寄託時の試料の生存徴候の提示を包含する、米国特許施行規則第1.801〜1.809条(37 C.F.R.§1.801〜1.809)のあらゆる要件を満たす。細胞株BEF1及びBSC1のこの寄託物は、公的な寄託機関であるATCC寄託機関において、最新の要求後30年間若しくは5年間の期間又は特許の法的強制力のある存続期間のいずれか長い方の期間に亘り維持され、該期間中に生存不能になった場合は交換される。本出願人は、ATCCからの寄託材料の入手可能性に制限を課さない。しかし、本出願人は、生物材料の移動又はその商業目的の輸送に法律によって課されたいかなる制限も撤回する権限がない。
【図１】
0005782200.tif 000003