(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体由来のサンプル中のマーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムであって、該マーカー物質は、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体のうち少なくとも１種を含み、該認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、システム。
【請求項２】
前記システムは、前記マーカー物質に特異的に相互作用する因子をさらに備え、該因子は、核酸分子、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記因子は、抗体である、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記因子は、標識されるか、または標識可能である、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー、免疫学的手段、生化学的手段、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法、同位体標識法、タンデムアフィニティ精製法、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
さらに、前記マーカー物質の標準を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
さらに、前記サンプルを精製する手段を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記被験体は、哺乳動物を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記被験体は、齧歯類を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記被験体は、ヒトを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記手段は、前記マーカー物質の定量をする能力を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカー物質が正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記判定手段は、コンピュータである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
マーカー物質に特異的に相互作用する因子を含む被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための組成物であって、該マーカー物質は、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体のうち少なくとも１種を含み、該因子は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する抗体である、組成物。
【請求項１６】
前記トランスサイレチン誘導体は、Ｓ−システイニルトランスサイレチン、グルタチオン化トランスサイレチン、Ｓ−Ｓ結合形成トランスサイレチン、酸化トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、アセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付加トランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチンおよびこれらの複合誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記トランスサイレチン誘導体は、Ｓ−システイニルトランスサイレチンである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記トランスサイレチン誘導体は、Ｓ−システイニルトランスサイレチンであり、前記認識する手段は抗体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とに対して示差的に反応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
前記手段は、トランスサイレチンまたはトランスサイレチン誘導体のいずれか一方としか実質的に反応しない、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病の進展の程度、または将来の発症リスクの高さの指標となる、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記トランスサイレチンは、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列の先頭の２０アミノ酸が切除されたアミノ酸配列を有するか、あるいは、これらの改変配列を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記トランスサイレチン誘導体は、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、３０位のシステインまたはそれに対応するシステインのシステインがシステイニル化されている誘導体であるか、または、配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、３０位のシステインまたはそれに対応するシステインのシステインがシステイニル化されている誘導体の先頭の２０アミノ酸が切除されたものである、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記手段は、トランスサイレチンの単量体と四量体との区別をする能力を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２６】
前記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する抗体を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２８】
前記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを認識し、かつ、前記システムはトランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを識別する手段をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項２９】
前記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを認識し、前記システムはトランスサイレチンの分子量とＳ−システイニルトランスサイレチンの分子量とを識別する手段、およびトランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの相対比を測定する手段をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項３０】
マーカー物質に特異的に相互作用する因子を含む被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための診断薬であって、該マーカー物質は、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体のうち少なくとも１種を含み、該因子は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する抗体である、診断薬。
【請求項３１】
被験体が糖尿病であるかどうか事前に検出もしくは検出するため、または該事前診断もしくは診断を支援するために、該被験体由来のサンプル中のマーカー物質を測定する方法であって、
該方法は、
Ａ）該被験体由来のサンプル中のマーカー物質を測定し、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する工程；および
Ｂ）該測定結果から、該被験体が糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程、
を包含し、
該マーカー物質は、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体のうち少なくとも１種を含む、
方法。
【請求項３２】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病の進展の程度、または将来の発症リスクの高さの指標となる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
被験体由来のサンプル中のマーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための医薬の製造における、使用であって、該マーカー物質は、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体のうち少なくとも１種を含み、該認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、使用。
【請求項３５】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病の進展の程度、または将来の発症リスクの高さの指標となる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
被験体由来のサンプル中のマーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための使用であって、該マーカー物質は、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体のうち少なくとも１種を含み、該認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、使用。
【請求項３８】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病の進展の程度、または将来の発症リスクの高さの指標となる、請求項３７に記載の使用。
【請求項４０】
前記サンプルは、血液であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプルを、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法であって、
ａ）糖尿病を発症している非ヒト動物または将来の発症リスクが高い非ヒト動物に被験物質を摂取させる工程；および
ｂ）該非ヒト動物の体液中におけるマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する工程であって、該マーカー物質は、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体のうち少なくとも１種を含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病の進展の程度、または将来の発症リスクの高さの指標となる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記基準値は、糖尿病を発症している非ヒト動物または将来の発症リスクが高い非ヒト動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該非ヒト動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記体液または体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項４４〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４４〜５２のいずれかに記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾病の事前診断および診断のための方法、物質の評価方法、および物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、被検者の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標として、糖尿病の有無または将来の発症リスクを判定（事前診断）する疾病の診断方法、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標して、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する物質の評価方法、および、該評価方法を用いて糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法、に関する。【０００２】
本発明は、血液中のマーカー物質の濃度を測定し、その値を健常値と比較する糖尿病の診断方法、および糖尿病の診断に用いるためのキットに関する。【０００３】
本発明は、特に、健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカー物質とを示差的に識別することができる手段に関する。
【背景技術】
【０００４】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満，糖尿病，動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発症、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。これらの生活習慣病の中でも糖尿病は、知覚麻痺、失明、動脈硬化等との合併症を引き起こすことも多く、日常生活に多大な障害をもたらす病気として特に問題視されている。【０００５】
糖尿病はインスリンの作用不足による高血糖が引き起こす複合疾患である。糖尿病は１型と２型に分類される。１型糖尿病は、膵臓のランゲルハンス島が炎症を起こした結果、インスリン分泌能が低下または枯渇してしまい、高血糖に至るものである。一方、２型糖尿病はそれ以外の原因によってインスリンの作用不足が起こり、高血糖に至るものである。この２型糖尿病は日本人の糖尿病の大部分を占めるものであり、特に問題視されている。２型糖尿病の発病メカニズムはまだ不明の点があるが、主に環境因子が引き金になって発病するとされ、過食や肥満が大きな原因の一つである。例えば、肥満のために膵臓のインスリン分泌量が激増した結果、膵臓が疲労して逆にインスリン分泌量が減少し、結局インスリンの作用不足となり高血糖となる。あるいは、脂肪の増加によってインスリン受容体が減少し、その結果、インスリンの作用不足となり高血糖となる。一方、逆に、インスリンの作用不足から生まれる余剰のグルコースが脂肪となって蓄えられて肥満が進むこともあり、糖尿病はその発症メカニズムにおいて肥満と密接に関係している。また、２型糖尿病は発症初期に自覚症状がないことが多く、発見時にはかなり進行していて治療が困難となることもある。すなわち、２型糖尿病の予備軍は相当に多いと予想される。【０００６】
現在、糖尿病の診断に用いられている臨床検査項目としては、尿糖、空腹時血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、血中インスリン値、血中・尿中Ｃ−ペプチド値（ＣＰＲ）などがある。その他、グルコースを経口摂取した後の血中グルコース濃度をモニターし、そのクリアランス能力をみる経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）も行われている。また、新たな臨床マーカーの例としては、血中レチノイン酸が提案されている（特許文献１）。【０００７】
しかし、インスリンの増減は、必ずしも糖尿病の明確な指標にならない。そこで、このほかに、遺伝子産物として有用な糖尿病のマーカー、特に、事前診断が可能なマーカーの報告はこれまでになされていない。【０００８】
また、ヒトは他因子の病態が絡み合っているが、因子が純粋なモデル動物で同様の診断指標となるかどうかは不明である。【０００９】
また、健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカー物質とを示差的に識別することができる手段はいまだに提供されていない。
【特許文献１】特開２００４−１６３３７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
２型糖尿病のように発症初期に自覚症状が少ない疾患の場合は、予防をすることが特に大事である。そのためには、糖尿病の発症前の段階を検出する、いわゆる事前診断の技術が必要である。そうすれば、糖尿病が発症する前に食事制限や運動等の処置を行うことができ、糖尿病を予防することが可能になる。しかしながら、従来の臨床検査では糖尿病を発症前の段階で検出することは難しく、予防という観点ではほとんど無力であるのが現状である。一方、マルチマーカーシステムと称し、複数のマーカー物質を指標にして臨床検査の診断精度を上げる方法がすでに提案されている。したがって、糖尿病の診断にもマルチマーカーシステムを適用して診断精度を上げることが考えられる。しかし、マルチマーカーシステムによって糖尿病の診断を行うには、複数の有用なマーカー物質が必要となるが、現在のところそのような複数のマーカー物質は存在せず、マルチマーカーシステムによって糖尿病を検出した例は報告されていない。このように、糖尿病の予防や早期発見に有用で、マルチマーカーシステムにも適用可能な糖尿病の診断方法が求められている。【００１１】
２型糖尿病のように発症初期に自覚症状が少ない疾患の場合は、予防をすることが特に大事である。そのためには、糖尿病の発症の有無に加えて、糖尿病の将来の発症リスクを判定する診断技術が求められる。そうすれば、糖尿病が発症する前に、生活習慣の是正、食事制限、運動等の処置を行うことができ、当該疾病の発症を予防することが可能になる。さらに、当該疾病の発症リスクを低減させるような効果を有する食品素材等があれば、そのような食品素材を含む食品を日常的に摂取することで、糖尿病を容易に予防することができる。【００１２】
しかし、糖尿病の将来の発症リスクを判定する診断技術は確立しておらず、物質が有する当該疾病の改善効果や発症リスクを低減させる効果を評価する方法、および、当該疾患の改善効果や発症リスクを低減させる効果を有する物質をスクリーニングする方法も開発されていない。【００１３】
本発明の目的は、糖尿病の有無または将来の発症リスクを判定する診断方法を提供し、さらに、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する方法、および、該評価方法を用いて糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。【００１４】
本発明はまた、特に、健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカー物質とを示差的に識別することができる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、糖尿病の予防のための事前診断や早期発見に有用な糖尿病の新たなマーカー物質を検索すべく、糖尿病患者と健常者の血液中のタンパク質を質量分析計スペクトルにより網羅的に比較し、糖尿病患者に特異的な、遺伝子産物であるタンパク質を検索した。その結果、糖尿病患者と健常者の間で統計的に有意差のある複数のタンパク質を見出した。さらに、それらのタンパク質を同定したところ、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、および血清アルブミンならびにそれらの誘導体（たとえば、酸化物、システイニル化物、グリコシル化物等）と同定された。すなわち、本発明者らは、糖尿病の被験体および糖尿病予備群においては血液中のトランスサイレチンおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩは健常者より高く、アポリポタンパク質ＣＩＩおよび血清アルブミンについては健常者より低い値を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。【００１６】
本発明者らはまた、上記課題を解決すべく、糖尿病を発症する前の段階から、発症と未発症の境界、そして発症している段階、に至る種々の動物の体液サンプルを調製した。そして、当該体液サンプルを質量分析計によるプロテオーム解析により網羅的に解析した。その結果、糖尿病の有無に加え、将来の発症リスクと関連する（すなわち、事前診断を可能にする）タンパク質を複数見出した。そして、被検者の体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、糖尿病の有無または将来の発症リスクの判定（すなわち、事前診断）する系を構築した。さらに、動物の体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する系を構築した。さらに、当該評価方法を用いて、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質のスクリーニングする系を構築した。本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステム。
（２）  上記マーカー物質が、上記被験体の体液中に存在する、項目１に記載のシステム。
（３）  上記マーカー物質が、上記被験体の血液中に存在する、項目１に記載のシステム。
（４）  上記マーカー物質が、遺伝子産物である、項目１に記載のシステム。
（５）  上記マーカー物質が、トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質からなる群より選択される、１またはそれより多い物質を含む、項目１に記載のシステム。
（６）上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目１に記載のシステム。
（７）上記因子は、タンパク質または上記複合分子である、項目１に記載のシステム。
（８）上記因子は、抗体である、項目１に記載のシステム。
（９）上記因子は、標識されるか、または標識可能である、項目１に記載のシステム。
（１０）上記手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー、免疫学的手段、生化学的手段、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法、同位体標識法、タンデムアフィニティ精製法、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載のシステム。
（１１）さらに、上記マーカー物質の標準を含む、項目１に記載のシステム。
（１２）さらに、上記サンプルを精製する手段を備える、項目１に記載のシステム。
（１３）上記被験体は、哺乳動物を含む、項目１に記載のシステム。
（１４）上記被験体は、齧歯類を含む、項目１に記載のシステム。
（１５）上記被験体は、ヒトを含む、項目１に記載のシステム。
（１６）上記因子または上記手段は、上記マーカー物質の定量をする能力を有する、項目１に記載のシステム。
（１７）上記マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える、項目１に記載のシステム。
（１８）上記定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して上記マーカー物質が正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む、項目１７に記載のシステム。
（１９）上記判定手段は、コンピュータである、項目１８に記載のシステム。
（２０）上記システムは、上記マーカー物質または上記マーカー物質に特異的に相互作用する上記因子を含む組成物である、項目１に記載のシステム。
（２１）  上記マーカー物質が、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含み、上記トランスサイレチン誘導体は、Ｓ−システイニルトランスサイレチン、Ｓ−システイニルトランスサイレチン、グルタチオン化トランスサイレチン、Ｓ−Ｓ結合形成トランスサイレチン、酸化トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、アセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付加トランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチンおよびこれらの複合誘導体からなる群より選択される、項目１に記載のシステム。
（２２）  上記トランスサイレチンの減少および上記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目２１に記載のシステム。
（２３）  上記トランスサイレチンの減少および上記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目２１に記載のシステム。
（２４）  上記トランスサイレチンは、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、先頭の２０アミノ酸が切除されているか、あるいは、これらの改変配列を有する、項目２１に記載のシステム。
（２５）  上記トランスサイレチン誘導体は、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、３０位のシステインまたはそれに対応するシステインのシステインがシステイニル化されている誘導体であるか、または、先頭の２０アミノ酸が切除されている、項目２１に記載のシステム。
（２６）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンの単量体と四量体との区別をする能力を有する、項目１に記載のシステム。
（２７）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する、項目１に記載のシステム。
（２８）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する抗体を含む、項目１に記載のシステム。
（２９）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを認識し、かつ、上記システムはトランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを識別する手段をさらに備える、項目１に記載のシステム。
（３０）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを認識し、上記システムはトランスサイレチンの分子量とＳ−システイニルトランスサイレチンの分子量とを識別する手段、およびトランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの相対比を測定する手段をさらに備える、項目１に記載のシステム。
（３１）  上記マーカー物質が、アポリポタンパク質ＣＩＩまたはアポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体を含み、上記アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体は、プロ体である、項目１に記載のシステム。
（３２）  上記アポリポタンパク質ＣＩＩの減少および上記アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体の変動からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目３１に記載のシステム。
（３３）  上記アポリポタンパク質ＣＩＩの減少および上記アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体の変動からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目３１に記載のシステム。
（３４）  上記アポリポタンパク質ＣＩＩは、配列番号５もしくは配列番号７に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、あるいは、これらの改変配列を有する、項目３１に記載のシステム。
（３５）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩを選択的に識別する能力を有する、項目３１に記載のシステム。
（３６）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩを選択的に識別する能力を有する抗体を含む、項目３１に記載のシステム。
（３７）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩを選択的に識別する能力を有し、かつ、上記システムは上記アポリポタンパク質ＣＩＩを定量する手段を備える、項目３１に記載のシステム。
（３８）  上記マーカー物質が、アポリポタンパク質ＣＩＩＩまたはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体を含み、上記アポリポタンパク質ＣＩＩＩはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ０であり、上記アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２からなる群より選択される、項目１に記載のシステム。
（３９）  上記アポリポタンパク質ＣＩＩＩの増加、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１の増加およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目３８に記載のシステム。
（４０）  上記アポリポタンパク質ＣＩＩＩの増加、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１の増加およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目３８に記載のシステム。
（４１）  上記アポリポタンパク質ＣＩＩＩは、配列番号９もしくは配列番号１１に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号１０もしくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、あるいは、これらの改変配列を有する、項目３８に記載のシステム。
（４２）  上記アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体は、配列番号９もしくは配列番号１１に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号１０もしくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、それぞれ、７４位スレオニンに糖鎖を有する誘導体である、項目３８に記載のシステム。
（４３）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを区別する能力を有する、項目３８に記載のシステム。
（４４）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２のうち少なくとも２つを区別する能力を有する、項目３８に記載のシステム。
（４５）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ１とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２とをすべて区別する能力を有する、項目３８に記載のシステム。
（４６）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを区別する能力を有する抗体を含む、項目３８に記載のシステム。
（４７）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２のうち少なくとも２つを区別する能力を有する抗体を含む、項目３８に記載のシステム。
（４８）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ１とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２とをすべて区別する能力を有する抗体の組み合わせを含む、項目３８に記載のシステム。
（４９）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを認識し、上記システムは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを識別する手段をさらに備える、項目３８に記載のシステム。
（５０）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを認識し、上記システムは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２のうち少なくとも２つを識別する手段をさらに備える、項目３８に記載のシステム。
（５１）  上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを認識し、上記システムは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ１とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２とをすべて識別する手段をさらに備える、項目３８に記載のシステム。
（５２）  上記マーカー物質が、血清アルブミンまたは血清アルブミン誘導体を含む、項目１に記載のシステム。
（５３）  上記血清アルブミンの減少および上記血清アルブミン誘導体の変動からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目５２に記載のシステム。
（５４）  上記血清アルブミンの減少および上記血清アルブミン誘導体の変動からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目５２に記載のシステム。
（５５）  上記血清アルブミンは、配列番号１３もしくは配列番号１５に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号１４もしくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列、あるいは、これらの改変配列を有する、項目５２に記載のシステム。
（５６）  上記因子または上記手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有する、項目５２に記載のシステム。
（５７）  上記因子または上記手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有する抗体を含む、項目５２に記載のシステム。
（５８）  上記因子または上記手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有し、かつ、上記システムは上記血清アルブミンを定量する手段を備える、項目３１に記載のシステム。
（５９）診断薬である、項目１に記載のシステム。
（６０）被験体が糖尿病であるかどうか事前診断もしくは診断するため、または上記事前診断もしくは診断を支援するための方法であって、
Ａ）上記被験体由来のサンプル中のマーカー物質を測定する工程；および
Ｂ）上記測定結果から、上記被験体が糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（６１）項目２〜５９のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目６０に記載の方法。
（６２）  被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための医薬の製造における、使用。
（６３）  項目２〜５９のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目６２に記載の使用。
（６４）  被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための使用。
（６５）  項目２〜５９のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目６４に記載の使用。
（６６）
項目６０に記載の方法であって、血液中のマーカー物質の濃度を測定し、その値を健常値と比較し、上記マーカー物質がトランスサイレチン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、血清アルブミンの群から選択される１または２以上のタンパク質であることを特徴とする、方法。
（６７）
上記アポリポタンパク質ＣＩＩＩは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の群から選択される１または２以上のタンパク質であることを特徴とする項目６６に記載の糖尿病の診断方法。
（６８）
下記工程（１）〜（４）： 
（１）被検者の血液から血清または血漿を調製する工程；
（２）工程（１）で得られた血清または血漿中のトランスサイレチンの濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程；
（３）工程（２）で糖尿病が検出されなかった場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程；および
（４）工程（３）で糖尿病が検出されなかった場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ1の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程、
を含む、項目６７に記載の方法。
（６９）
下記工程（５）〜（８）：
（５）被検者の血液から血清または血漿を調製する工程、
（６）工程（５）で得られた血清または血漿中の血清アルブミンの濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程、
（７）工程（６）で糖尿病が検出された場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程、
（８）工程（７）で糖尿病が検出されなかった場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ1の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程；
を含む、項目６７に記載の診断方法。
（７０）
上記工程（４）で糖尿病が検出された場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出することを特徴とする項目６８に記載の方法。
（７１）
上記工程（８）で糖尿病が検出された場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出することを特徴とする項目６９に記載の方法。
（７２）
項目６０に記載の方法であって、血液中のマーカー物質の濃度を測定し、その値を健常値と比較し、上記マーカー物質が下記（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）７．０以下のｐＨで陽イオン交換体に補足される、分子量が約１３８００であるタンパク質；
（ｂ）７．０以下のｐＨで金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約８７００であるタンパク質；
（ｃ）７．０以下のｐＨで陽イオン交換体に捕捉される、分子量が約９４００であるタンパク質または、ｐＨ７．０で金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約９４００であるタンパク質；
（ｄ）７．０以下のｐＨで陽イオン交換体に補足される、分子量が約９７００であるタンパク質、または、ｐＨ７．０で金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約９７００であるタンパク質；および
（ｅ）７．０以下のｐＨで陽イオン交換体に補足される、分子量が約６６０００であるタンパク質、または、ｐＨ７．０で金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約６６０００であるタンパク質、
の群から選択される１または２以上のタンパク質であることを特徴とする、方法。
（７３）
項目６０に記載の方法であって、血液中のマーカー物質の濃度を測定し、その値を健常値と比較し、上記マーカー物質が下記：
（ａ）トリプシンで消化すると、分子量が約１２７０、約１３７０、約１３９０、約１５２０、約２４５０、約２６４０、および約３１４０のポリペプチドを生じる、分子量約１３８００のタンパク質；および／または
（ｂ）トリプシンで消化すると、分子量が約９００、約１２００、約１３９０、約１７１０、約１９４０、および約２０８０のポリペプチドを生じる、分子量約８７００〜９７００のタンパク質、
のタンパク質であることを特徴とする、方法。
（７４）
上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に血清または血漿を接触させて、マーカー物質を捕捉し、上記マーカー物質の濃度を測定することを特徴とする項目６６乃至７３のいずれかに記載の方法。
（７５）
上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記マーカー物質に特異的な抗体であることを特徴とする項目７４に記載の方法。
（７６）
上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換基を有するものであることを特徴とする項目７４に記載の糖尿病の診断方法。
（７７）
上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は上記平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする項目７４〜７６のいずれかに記載の方法。
（７８）
上記抗体は、担体に固定化されていることを特徴とする項目１に記載のシステム。
（７９）
項目６０に記載の方法であって、上記被験体の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｎ）：
（ａ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質。
（ｄ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｅ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９２６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｆ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９４５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｇ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｈ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７６４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｉ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｊ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｋ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３５６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｌ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｍ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２８００のイオンピークを生じるタンパク質；
（ｎ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５７００のイオンピークを生じるタンパク質；および
（ａ）〜（ｎ）のタンパク質に対応するタンパク質または改変体
からなる群より選択される少なくとも１つタンパク質の濃度を健常値と比較し、糖尿病の発症の有無または将来の糖尿病の発症リスクを判定することを特徴とする、方法。
（８０）
上記体液は、血液であることを特徴とする項目７９に記載の方法。
（８１）
上記体液または体液成分を、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の上記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉 された上記マーカー物質の量に基づいて体液中の上記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする項目７９または８０に記載の疾病の診断方法。
（８２）
上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする項目８１に記載の方法。
（８３）
上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする項目８１または８２に記載の方法。
（８４）被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法であって、
ａ）糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させる工程；および
ｂ）上記動物の体液中における上記マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する工程、
を包含する、方法。
（８５）  項目２〜５９のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目８４に記載の方法。
（８６）
項目８４に記載の方法であって、上記マーカー物質が、下記マーカー物質（ａ）〜（ｎ）：
（ａ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質。
（ｄ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｅ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９２６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｆ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９４５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｇ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｈ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７６４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｉ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｊ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｋ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３５６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｌ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｍ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２８００のイオンピークを生じるタンパク質；
（ｎ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５７００のイオンピークを生じるタンパク質；および
（ａ）〜（ｎ）のタンパク質に対応するタンパク質または改変体
からなる群より選択される少なくとも１つタンパク質である、方法。
（８７）
上記基準値は、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、上記動物の体液中における上記マーカー物質の濃度であることを特徴とする項目８６に記載の方法。
（８８）
上記体液は、血液であることを特徴とする項目８６または８７に記載の方法。
（８９）
上記被検物質は、食品素材であることを特徴とする項目８６〜８８のいずれかに記載の方法。
（９０）
上記体液または体液成分を、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の上記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された上記マーカー物質の量に基づいて体液中の上記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする項目８６〜８９のいずれかに記載の方法。
（９１）
上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする項目９０に記載の方法。
（９２）
上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする項目９０または９１に記載の方法。
（９３）
項目８４〜９２のいずれかに記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
（９４）項目９３に記載の方法によって得られた物質。
（１０１）  被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムであって、上記認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、システム。
（１０２）上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目１０１に記載のシステム。
（１０３）上記因子は、タンパク質または上記複合分子である、項目１０１に記載のシステム。
（１０４）上記因子は、抗体である、項目１０１に記載のシステム。
（１０５）上記因子は、標識されるか、または標識可能である、項目１０１に記載のシステム。
（１０６）上記手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー、免疫学的手段、生化学的手段、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法、同位体標識法、タンデムアフィニティ精製法、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１０１に記載のシステム。
（１０７）さらに、上記マーカー物質の標準を含む、項目１０１に記載のシステム。
（１０８）さらに、上記サンプルを精製する手段を備える、項目１０１に記載のシステム。
（１０９）上記被験体は、哺乳動物を含む、項目１０１に記載のシステム。
（１１０）上記被験体は、齧歯類を含む、項目１０１に記載のシステム。
（１１１）上記被験体は、ヒトを含む、項目１０１に記載のシステム。
（１１２）上記因子または上記手段は、上記マーカー物質の定量をする能力を有する、項目１０１に記載のシステム。
（１１３）上記マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える、項目１０１に記載のシステム。
（１１４）上記定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して上記マーカー物質が正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む、項目１１３に記載のシステム。
（１１５）上記判定手段は、コンピュータである、項目１１４に記載のシステム。
（１１６）上記システムは、上記マーカー物質または上記マーカー物質に特異的に相互作用する上記因子を含む組成物である、項目１０１に記載のシステム。
（１１７）  上記トランスサイレチン誘導体は、Ｓ−システイニルトランスサイレチン、グルタチオン化トランスサイレチン、Ｓ−Ｓ結合形成トランスサイレチン、酸化トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、アセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付加トランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチンおよびこれらの複合誘導体からなる群より選択される、項目１０１に記載のシステム。
（１１８）  上記トランスサイレチン誘導体は、Ｓ−システイニルトランスサイレチンである、項目１０１に記載のシステム。
（１１９）  上記トランスサイレチン誘導体は、Ｓ−システイニルトランスサイレチンであり、上記識別する手段は抗体である、項目１０１に記載のシステム。
（１２０）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とに対して示差的に反応する、項目１０１に記載のシステム。
（１２１）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンまたはトランスサイレチン誘導体のいずれか一方としか実質的に反応しない、項目１０１に記載のシステム。
（１２２）  上記トランスサイレチンの減少および上記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目１０１に記載のシステム。
（１２３）  上記トランスサイレチンの減少および上記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目１０１に記載のシステム。
（１２４）  上記トランスサイレチンは、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するか、先頭の２０アミノ酸が切除されているか、あるいは、これらの改変配列を有する、項目１０１に記載のシステム。
（１２５）  上記トランスサイレチン誘導体は、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、３０位のシステインまたはそれに対応するシステインのシステインがシステイニル化されている誘導体であるか、または、先頭の２０アミノ酸が切除されている、項目１０１に記載のシステム。
（１２６）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンの単量体と四量体との区別をする能力を有する、項目１０１に記載のシステム。
（１２７）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する、項目１０１に記載のシステム。
（１２８）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する抗体を含む、項目１０１に記載のシステム。
（１２９）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを認識し、かつ、上記システムはトランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを識別する手段をさらに備える、項目１０１に記載のシステム。
（１３０）  上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを認識し、上記システムはトランスサイレチンの分子量とＳ−システイニルトランスサイレチンの分子量とを識別する手段、およびトランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの相対比を測定する手段をさらに備える、項目１０１に記載のシステム。
（１３１）診断薬である、項目１０１に記載のシステム。
（１３２）被験体が糖尿病であるかどうか事前診断もしくは診断するため、または上記事前診断もしくは診断を支援するための方法であって、
Ａ）上記被験体由来のサンプル中のマーカー物質を測定する工程；および
Ｂ）上記測定結果から、上記被験体が糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（１３３）項目１０２〜１３０のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目３２に記載の方法。
（１３４）  被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための医薬の製造における、使用であって、上記認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、使用。
（１３５）  項目１０２〜１３０のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目１３４に記載の使用。
（１３６）  被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための使用であって、上記認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、使用。
（１３７）  項目１０２〜１３０のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目１３４に記載の使用。
（１３８）  上記サンプルは、血液であることを特徴とする項目１３２に記載の方法。
（１３９）  上記サンプルを、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の上記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された上記マーカー物質の量に基づいて体液中の上記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする項目１３２に記載の疾病の診断方法。
（１４０）  上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする項目１３９に記載の方法。
（１４１）  上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする項目１３９または１４０に記載の方法。
（１４２）被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法であって、
ａ）糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させる工程；および
ｂ）上記動物の体液中における上記マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する工程、
を包含する、方法。
（１４３）  項目１０２〜１３０のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目８４に記載の方法。
（１４４）  上記基準値は、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、上記動物の体液中における上記マーカー物質の濃度であることを特徴とする項目１４２に記載の方法。
（１４５）  上記体液は、血液であることを特徴とする項目１４２〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
（１４６）  上記被検物質は、食品素材であることを特徴とする項目１４２〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
（１４７）  上記体液または体液成分を、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の上記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された上記マーカー物質の量に基づいて体液中の上記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする項目１４２〜１４６のいずれかに記載の方法。
（１４８）  上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする項目４７に記載の方法。
（１４９）  上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする項目１４６または１４７に記載の方法。
（１５０）  項目１４２〜１４９のいずれかに記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
（１５１）項目１５０に記載の方法によって得られた物質。【００１７】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１８】
トランスサイレチン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、および血清アルブミンは既知物質でかつある種の臨床的意義は知られているが、糖尿病のマーカー物質となり得ることは本発明により初めて明らかとなった。【００１９】
本発明の糖尿病の診断および事前診断のための方法およびそのためのシステムもしくは組成物（診断薬）によれば、糖尿病の診断および事前診断をより確実かつ精度よく行うことができる。また、複数のマーカー物質を組み合わせることによってマルチマーカーシステムによる糖尿病の診断および事前診断を行うことができる。【００２０】
本発明の糖尿病診断用キットによれば、より簡便かつ高精度で糖尿病の診断および事前診断をすることができる。【００２１】
本発明の疾病の診断および事前診断のための方法、組成物（診断薬）およびシステムによれば、糖尿病の有無に加え、糖尿病の将来の発症リスクを判定（すなわち事前診断）することができる。【００２２】
本発明の物質の評価方法によれば、被検物質が有する糖尿病の改善効果に加え、糖尿病の将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。【００２３】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、糖尿病の改善効果を有する物質に加え、糖尿病の将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることができる。【００２４】
本発明は、特に、健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカー物質とを示差的に識別することができ、効率よい診断を可能とした。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の糖尿病の診断方法をマルチマーカーシステムに応用した例の手順を表すフローチャートである。
【図２】本発明の糖尿病の診断方法をマルチマーカーシステムに応用した別の例の手順を表すフローチャートである。
【図３】ｍ／ｚが１３８６７のピークについての測定結果を表し、図３（ａ）は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図３（ｂ）は図３（ａ）の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図３（ｃ）はＲＯＣ曲線を示すグラフである。
【図４】ｍ／ｚが８６９０のピークについての測定結果を表し、図４（ａ）は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図４（ｂ）は図４（ａ）の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図４（ｃ）はＲＯＣ曲線を示すグラフである
【図５】糖尿病患者の血清を２次元電気泳動に供した結果を表す写真である。
【図６】ｍ／ｚが６６２１６のピークについての測定結果を表し、図６（ａ）は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図６（ｂ）は図６（ａ）の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図６（ｃ）はＲＯＣ曲線を示すグラフである。
【図７】質量／電荷比が７０４３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が８３２５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】質量／電荷比が８５３２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１０】質量／電荷比が９０６２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１１】質量／電荷比が９２５５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１２】質量／電荷比が９４４５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１３】質量／電荷比が１３７２０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１４】質量／電荷比が７６４０４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１５】質量／電荷比が７９０８５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１６】質量／電荷比が３４９７（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１７】質量／電荷比が３５５９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１８】質量／電荷比が４１８４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１９】質量／電荷比が１２７８６（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２０】質量／電荷比が６５７００（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２１】図２１には、健常人由来S-cysteinylated TTRを示す。測定値：M/Z= 13874.7480。
【図２２】図２２には、還元処理後の健常人由来S-cysteinylated TTRを示す。測定値：M/Z= 13759.7393。
【図２３】図２３には、糖尿病患者由来S-cysteinylated TTRを示す。測定値：M/Z= 13871.3320。
【図２４】図２４には、還元処理後の糖尿病患者由来S-cysteinylated TTRを示す。測定値：M/Z= 13755.6494。
【図２５】図２５には、TTRの４量体構造とモノマーのアミノ酸配列を示す。このように、トランスサイレチンは、通常４量体構造をとっており、これが崩れていくと糖尿病になると仮定される。
【図２６】図２６には、ヒトTTRα-ドメインの３次元構造（上）と２次構造配列（下）が示される。
【図２７】図２７は、ラットアポリポタンパク質ＣＩＩＩと同定したバンドのゲル写真と、そのバンドのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによる分析を示す。
【図２８】図２８は、ラットアポリポタンパク質ＣＩＩＩと同定したバンドのゲル写真と、そのバンドのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによる分析を示す。
【図２９】図２９には、ヒトアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（０〜２）のスポットであると考えられる二次元電気泳動上のスポットを示す。
【図３０】図３０には、図２９の各スポットの質量分析の結果を示す。
【図３１】図３１には、各スポットのＳＥＬＤＩ−ＭＳの結果を示す。
【図３２】図３２には、ＣＭ１０の検討結果を示す。
【図３３】図３３には、Ｑ１０の検討結果を示す。
【図３４】図３４は、至適条件検討結果を示す。これらの結果から、得られたスポットが、ヒトアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（０〜２）のスポットであることが明らかになる。
【図３５】図３５には、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８６３，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係を示す。
【図３６】図３６には、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８７４，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係が示される。
【図３７】図３７には、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８８４，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係が示される。
【図３８】図３８は、糖尿病患者におけるＭ／Ｚ：１３，８６３の実測データを示す。
【図３９】図３９には、糖尿病ラット血清    8.3K   ( Apo CII) 箱髭図を示す。
【図４０】図４０には、上記の時系列データを示す。
【図４１】図４１は、ゲル上のバンドのＳＥＬＤＩ−ＭＳの結果を示す。
【図４２】図４２には、得られたバンドのウェスタンブロットによる確認を示す。
【図４３】図４３には、クロマトグラフィーによる分画において抗ＡｐｏＣ２抗体により増強される様子を示す。
【図４４】図４４は、ヒトにおけるアポリポタンパク質ＣＩＩもまた事前診断マーカーであることを示す。ここでは、健常人のアポリポタンパク質ＣＩＩの質量分析結果を示す。
【図４５】図４５は、ヒトにおけるアポリポタンパク質ＣＩＩもまた事前診断マーカーであることを示す。ここでは、糖尿病患者のアポリポタンパク質ＣＩＩの質量分析結果を示す。
【図４６】図４６は、別の画分を用いた場合でのヒトにおけるアポリポタンパク質ＣＩＩもまた事前診断マーカーであることを示す。ここでは、健常人のアポリポタンパク質ＣＩＩの質量分析結果を示す。
【図４７】図４７は、別の画分を用いた場合でのヒトにおけるアポリポタンパク質ＣＩＩもまた事前診断マーカーであることを示す。ここでは、糖尿病患者のアポリポタンパク質ＣＩＩの質量分析結果を示す。
【配列表の簡単な説明】
【００２６】
配列番号１−２  トランスサイレチン  ヒト（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号３−４  トランスサイレチン  ラット（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号５−６  アポリポタンパク質ＣＩＩ  ヒト（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）、
配列番号７−８  アポリポタンパク質ＣＩＩ  ラット（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号９−１０  アポリポタンパク質ＣＩＩＩ  ヒト（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号１１−１２  アポリポタンパク質ＣＩＩＩ  ラット（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号１３−１４  血清アルブミン  ヒト（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号１５−１６  血清アルブミン  ラット（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号１７−１８  血清アルブミン  マウス（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号１９−２０  血清アルブミン  イヌ（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号２１−２２  血清アルブミン  ウサギ（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号２３−２４  血清アルブミン  サル（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）
配列番号２５：ヒトのトランスサイレチンのシステイン残基のアミノ酸配列
配列番号２６：マウスのトランスサイレチンのシステイン残基のアミノ酸配列
配列番号２７：ラットのトランスサイレチンのシステイン残基のアミノ酸配列
配列番号２８：Ｇａｌｌｕｓ  Ｇａｌｌｕｓのトランスサイレチンのシステイン残基のアミノ酸配列
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。【００２８】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【００２９】
プロテインチップに関連する技術としては、例えば、サイファージェン社から入手可能な技術などを挙げることができる。【００３０】
（用語の説明）
以下に本明細書において使用される用語を説明する。【００３１】
（マーカー物質として同定された代表的な遺伝子産物）
本明細書において「マーカー物質」とは、ある状態（例えば、糖尿病などの疾患）に罹患しているかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカー物質としては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。【００３２】
本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。本明細書では、糖代謝に直接関連しない遺伝子産物（すなわち、インスリンなどの糖代謝に関連しないタンパク質など）が糖尿病の指標として使用可能であることが見出された。【００３３】
本明細書において「トランスサイレチン（ＴＴＲ）」とは、別名プレアルブミンともいい、同質のサブユニットからなる四量体を形成するタンパク質として知られており、血中ビタミンＡ輸送タンパク質であるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）とタンパク質複合体を形成し、チロキシン（Ｔ４）と結合することが知られている。ラットでは、主なＴ４輸送タンパク質として知られている。【００３４】
トランスサイレチンは、Ｒａｚ，Ａ．らにより単離精製され、神田らにより一次構造が同定された（Ｒａｚ，Ａ．＆  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｄ．Ｓ．，（１９６９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２４，３２３０−３２３７；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（１９７４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，６７９６−６８０５）。これまで、その異常がアルツハイマー性痴呆および家族性アミロイドーシスポリニューロパチーと関連していることが知られている。【００３５】
トランスサイレチンの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。【００３６】
トランスサイレチンのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。【００３７】
トランスサイレチンの代表的な配列は、配列番号１または配列番号３（核酸配列）および配列番号２または配列番号４（アミノ酸配列）において示される。【００３８】
ここで、トランスサイレチンの生物学的活性としては、例えば、四量体を形成するタンパク質として知られており、血中ビタミンＡ輸送タンパク質であるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）とタンパク質複合体を形成し、チロキシン（Ｔ４）と結合する能力を挙げることができる。【００３９】
トランスサイレチンは分子量約１４０００のサブユニット４個からなる複合タンパク質であり、肝臓で合成される。血液中のトランスサイレチンの臨床的意義としては、栄養状態および肝臓のタンパク質合成能を反映しているとされ、ネフローゼ症候群や急性肝炎の回復期等で高値を示すことが知られている。なお、本明細書では、トランスサイレチンというときは、４量体の複合タンパク質とサブユニット単体とを特に区別せず、両方を指すものとする。【００４０】
トランスサイレチンおよびその誘導体は、ヒト、ラットのほか、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ（本明細書において、「対応する」遺伝子またはタンパク質などという）が知られている。従って、本明細書においてトランスサイレチンおよびその誘導体は、通常、特に言及しない場合は、ヒト、ラットのほか、生物一般において存在するトランスサイレチンおよびその誘導体を指す。【００４１】
本明細書において「トランスサイレチン誘導体」とは、トランスサイレチンの任意の誘導体を指し、特に、翻訳後修飾などの生体内での代謝産物をいう。代表的なトランスサイレチン誘導体の改変を、以下に質量変動値とともに示す：【００４２】
【表１】
0005688829.tif 000002
【００４３】
。【００４４】
本明細書では、代表的な、トランスサイレチン誘導体としては、システイン化（システイニル）、グルタチオン化、Ｓ−Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などを挙げることができるがそれらに限定されない。【００４５】
本発明では、糖尿病の患者またはその危険が高い被験体において、トランスサイレチンの量が減少し、代わって、トランスサイレチンの特定の誘導体（例えば、システイニルトランスサイレチン、グルタチオン化トランスサイレチン、Ｓ−Ｓ結合形成したトランスサイレチン、酸化トランスサイレチン（例えば、メチオニン側鎖が酸化したトランスサイレチン）、ホルミル化トランスサイレチン、アセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付加トランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチン）が増加していることが明らかになった。従って、これらのトランスサイレチンの減少またはトランスサイレチン誘導体の増加を指標として、糖尿病またはその危険が高い被験体を診断または事前診断することが可能である。【００４６】
本明細書において「アポリポタンパク質」または「アポ脂質タンパク質」とは、脂質と結合して脂質タンパク質を形成するタンパク質をいい、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに大別される。ヒトの血漿乳び脂粒（カイロミクロン），ＨＤＬ，ＬＤＬ，およびＶＬＤＬなどの典型的な成分であるリポタンパク質複合体のタンパク質成分である。アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ（ＡＰＯＣ２と略することがある）は、ＶＬＤＬ，ＨＤＬやカイロミクロン中に存在するアポリポタンパク質である。リポタンパク質リパーゼの活性化因子である。このタンパク質の欠損により高カイロミクロン血症や高トリグリセリド血症が生じる。アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３と略することがある）は、ＶＬＤＬ，ＨＤＬやカイロミクロン中に存在するアポリポタンパク質であり、多数のリパーゼを抑制することが知られている。アポリポタンパク質Ｃなどについての概説は、Bondarenko，P．V．et al．J．Lipid Res．1999;40:543-555を参照のこと。【００４７】
アポリポタンパク質ＣＩＩの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５または配列番号７に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５または配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。【００４８】
アポリポタンパク質ＣＩＩのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５または配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。【００４９】
アポリポタンパク質ＣＩＩの代表的な配列は、配列番号５または配列番号７（核酸配列）および配列番号６または配列番号８（アミノ酸配列）において示される。【００５０】
アポリポタンパク質ＣＩＩの生物学的活性としては、例えば、ＶＬＤＬ，ＨＤＬやカイロミクロンを構成する能力などを挙げることができる。【００５１】
アポリポタンパク質ＣＩＩは、ヒト、ラットのほか、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ（本明細書において、「対応する」遺伝子またはタンパク質などという）が知られている。従って、本明細書においてアポリポタンパク質ＣＩＩは、通常、特に言及しない場合は、ヒト、ラットのほか、生物一般において存在するアポリポタンパク質ＣＩＩを指す。【００５２】
アポリポタンパク質は、プロ体として生成される。より詳細な判定をする場合には、プロ体と成熟体とを区別してみることが好ましい。【００５３】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号９または配列番号１１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号９または配列番号１１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。【００５４】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号９または配列番号１１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１０または配列番号１２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。【００５５】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩの代表的な配列は、配列番号９または配列番号１１（核酸配列）および配列番号１０または配列番号１２（アミノ酸配列）において示される。【００５６】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩの生物学的活性としては、例えば、ＶＬＤＬ，ＨＤＬやカイロミクロンを構成する能力などを挙げることができる。【００５７】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩは、ヒト、ラットのほか、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ（本明細書において、「対応する」遺伝子またはタンパク質などという）が知られている。従って、本明細書においてアポリポタンパク質ＣＩＩＩは、通常、特に言及しない場合は、ヒト、ラットのほか、生物一般において存在するアポリポタンパク質ＣＩＩＩを指す。【００５８】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩは、糖鎖の結合度合いにより、ＣＩＩＩ０、ＣＩＩＩ１、ＣＩＩＩ２の少なくとも３種類が存在することが知られている。【００５９】
このように、アポリポタンパク質ＣＩＩＩは３種のタンパク質の総称であり、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2に分類される。そして、本発明の糖尿病の診断方法においては、これら３種のアポリポタンパク質ＣＩＩＩの少なくとも１種の濃度を測定する。本発明の糖尿病の診断方法によれば、アポリポタンパク質ＣＩＩＩの濃度を細分化して測定するので、精度が高い。【００６０】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩは血液中に存在する１０種類以上のアポリポタンパク質の１種であり、肝臓で合成される。血液中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩの臨床的意義としては、閉塞性黄疸や抗脂血症で高値を示すことが知られている。また、アポリポタンパク質ＣＩＩＩは糖鎖の有無および構造の違いにより、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の３種にさらに分類される。アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0は糖鎖を持たないものであり、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1はアポリポタンパク質ＣＩＩＩ0に糖鎖が付加されたものであり、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2はアポリポタンパク質ＣＩＩＩ1にさらに複合的に糖鎖が付加されたものである。【００６１】
Bondarenko，P．V．et al．J．Lipid Res．1999;40:543-555によれば、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2は以下のような構造をしている。【００６２】
【化１】
0005688829.tif 000003
【００６３】
これらを識別するには、識別可能な抗体などの特異的因子を用いるか、またはこれら特定の糖鎖を選択的に切断する酵素を用いて処理し、分子量が減少するかどうかを判定することなどによって確認することができる。【００６４】
本明細書において「血清アルブミン」とは、血清中に含まれるアルブミンをいい、漿蛋白質中にもっとも多量に含まれ(100mlあたり約4g)で，全蛋白質の60％を占めるである。ヒトでは、分子量64000-68000，等電点pH4.7-4.9である。その役割はいくつかあり、血液の浸透圧の維持，様々な物質(イオン，色素，一部の水溶性ビタミン，薬剤など)を結合し運搬すること，組織へのアミノ酸の供給源となることなどである。血清アルブミンはアルブミンの１種であり、血清中で最も多量に存在するタンパク質である。血清アルブミンは、分子量約６９０００（アミノ酸１次構造からの計算値は６６４３９）の糖鎖を持たないタンパク質であり、肝臓で合成される。血液中の血清アルブミンの臨床的意義としては、栄養状態の悪化や肝障害の程度を反映して低値を示すことが知られている。【００６５】
血清アルブミンの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１３または配列番号１５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４または配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４または配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３または配列番号１５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１４または配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。【００６６】
血清アルブミンのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号１４または配列番号１６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１４または配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１３または配列番号１５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１４または配列番号１６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。【００６７】
血清アルブミンの代表的な配列は、配列番号１３または配列番号１５（核酸配列）および配列番号１４または配列番号１６（アミノ酸配列）において示される。【００６８】
血清アルブミンの生物学的活性としては、例えば、血液の浸透圧の維持，様々な物質(イオン，色素，一部の水溶性ビタミン，薬剤など)を結合し運搬すること，組織へのアミノ酸の供給源となる能力などを挙げることができる。【００６９】
血清アルブミンは、ヒト、ラットのほか、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ（本明細書において、「対応する」遺伝子またはタンパク質などという）が知られている。従って、本明細書において血清アルブミンは、通常、特に言及しない場合は、ヒト、ラットのほか、生物一般において存在する血清アルブミンを指す。血清アルブミンの他の動物の配列は、マウス（配列番号１７−１８）、イヌ（配列番号１９−２０）、ウサギ（配列番号２１−２２）、サル（配列番号２３−２４）を挙げることができる。【００７０】
（診断・事前診断（予防）因子）
本発明において、診断、または事前診断は、マーカー物質に特異的な因子または手段を用いて実現することができる。【００７１】
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。【００７２】
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。【００７３】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。【００７４】
本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。【００７５】
本明細書において「手段」とは、ある目的を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。このような能力については、ある対象（たとえば、トランスサイレチン）を他のもの（たとえば、システイニルトランスサイレチンのようなトランスサイレンチン誘導体）から本明細書において「識別する能力」ということもある。本明細書において用いる場合は、選択的に認識する手段としては、両方を認識するが、示差的に認識することができさえすればよく、片方のみを認識しもう片方は認識しないような手段である必要はない。ただし、好ましくは、片方のみを認識しもう片方は認識しないような手段であることが有利である。結果の解釈が効率よく行えるからである。【００７６】
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。【００７７】
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。【００７８】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。【００７９】
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。【００８０】
本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。【００８１】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされた複合体をさし得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）などが挙げられる。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。特に言及する場合、本発明の「ポリペプチド」は、マーカー物質を指すことがある。【００８２】
本明細書において「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。【００８３】
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。【００８４】
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、上述のＤ型アミノ酸、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。【００８５】
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。【００８６】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。【００８７】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。【００８８】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。【００８９】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、診断に関与する生物学的な活性性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。【００９０】
本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。【００９１】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。【００９２】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。【００９３】
本明細書ではアミノ酸および塩基配列の類似性、相同性および同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。【００９４】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、、グルタチオン化、Ｓ−Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。【００９５】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、マウス、ラットのアポリポタンパク質ＣＩＩ，アポリポタンパク質ＣＩＩＩ，トランスサイレチン、血清アルブミンは、それぞれ、ヒトにおいて、対応するアポリポタンパク質ＣＩＩ，アポリポタンパク質ＣＩＩＩ，トランスサイレチン、血清アルブミンを見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、アポリポタンパク質ＣＩＩ，アポリポタンパク質ＣＩＩＩ，トランスサイレチン、血清アルブミン）は、の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。【００９６】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。【００９７】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。【００９８】
本明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。【００９９】
本明細書において「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２、４、６などで表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。【０１００】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。【０１０１】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。【０１０２】
本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。【０１０３】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。【０１０４】
本明細書においてポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。【０１０５】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。【０１０６】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。【０１０７】
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。【０１０８】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。【０１０９】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。【０１１０】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。【０１１１】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。【０１１２】
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。【０１１３】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。【０１１４】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。【０１１５】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がリガンドである場合、その生物学的活性は、そのリガンドが対応するレセプターに結合する活性を包含する。【０１１６】
（トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質の検出）
体液などに含まれるトランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質を検出する際には、これらトランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質を特異的に認識する抗体（以下、トランスサイレチン抗体、トランスサイレチン誘導体抗体、アポリポタンパク質ＣＩＩ抗体、アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体抗体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ抗体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体抗体および血清アルブミン抗体ならびにこれらに対応するタンパク質の抗体などと呼ぶ）を作製する。このような抗体は、従来公知の手法を用いて作製することができる。なお、抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良い。他のマーカー物質（例えば、トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質など）についても、同様に抗体を作製することができる。【０１１７】
一例として、トランスサイレチンモノクローナル抗体の調製方法を以下に記載する。トランスサイレチンモノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからトランスサイレチンの活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。【０１１８】
動物の免疫に抗原として用いるトランスサイレチンタンパク質としては、組換えＤＮＡ法または化学合成により調製したトランスサイレチンタンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部のペプチドが挙げられる。例えば、配列番号２に示したトランスサイレチンタンパク質のアミノ酸配列における、２１〜１４７番目のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、成熟型）を抗原として使用することができる。また、細胞表面に存在するトランスサイレチンタンパク質を特異的に検出するためのトランスサイレチンモノクローナル抗体としては、配列番号２に示したトランスサイレチンタンパク質のアミノ酸配列における任意の１０以上からなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。他のトランスサイレチンの分子経路における任意の因子（例えば、トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質など）についても同様に抗原を設計することができる。【０１１９】
得られた抗原用トランスサイレチンをキャリアータンパク質（例えばサイログロブリン）に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。【０１２０】
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間隔で免疫する。【０１２１】
最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、例えば１００μｇ用いられる。【０１２２】
免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、または抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。抗体検出の方法としては、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。【０１２３】
抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。【０１２４】
ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１  （Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  （１９７６）８：４０５−４１５）、ＳＰ２／０  （Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７８）２７６：２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４  （Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３）、Ｒ２１０  （Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７９）２７７：１３１−１３３）等が好適に使用される。【０１２５】
抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出または採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をＰＢＳ  、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地または緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。【０１２６】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、ＭＥＭ  、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＥ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。【０１２７】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわ  ち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。【０１２８】
ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水または血清を採取する。【０１２９】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。【０１３０】
従って、抗原は、抗体と結合し、またはＢリンパ球、Ｔリンパ球などの特異的レセプターに結合して、抗体産生および／または細胞障害などの免疫反応をひきおこす物質（例えば、タンパク質、脂質、糖などが挙げられるがそれらに限定されない）である。ここで、抗体またはリンパ球レセプターとの結合性を、「抗原性」（ａｎｔｉｇｅｃｉｔｙ）という。抗体産生などの免疫応答を誘導する特性を「免疫原性」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）という。抗原として使用される物質は、例えば、その目的とする物質（例えば、タンパク質）を少なくとも１つ含む。含まれる物質は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。【０１３１】
エピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明していないとしても使用することができる。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。【０１３２】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは線状であってもコンフォメーション形態であってもよい。【０１３３】
近年より迅速に所望の抗体を獲得するための方法が知られている。例えば、特開２００６−１４９３８３号に記載される方法を用いることができる。この方法は、免疫グロブリン遺伝子座において体細胞組換えを誘発させ、種々のイムノグロブリン分子を産生しているＤＴ４０細胞集団（ＷＯ２００４／０１１６４４を参照）の中から、ストレプトアビジンに特異的に結合する抗体分子を選別することによって行う。【０１３４】
その手順は、多様化ライブラリー（例えば、細胞表面上に多様な抗体分子を提示することができるニワトリ由来のＤＴ４０細胞によって構成されるライブラリー）から、目的リガンドに特異的に結合する少なくとも一種のタンパク質を選択する方法である。この方法は、以下の工程を含む：（１）該ライブラリー中に存在する種々のタンパク質と目的リガンド（タンパク質と結合するものであれば如何なるものであってもよく、限定はしないが、例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖質、低分子化合物など）を接触させ、該タンパク質群と目的リガンドの混合物をインキュベートし、少なくとも一種のタンパク質と目的リガンドの複合体を回収する工程（２）工程（１）で選別された少なくとも数種のタンパク質と目的リガンドと接触させ、該タンパク質と目的リガンドの混合物をインキュベートし、該タンパク質と目的リガンドの結合性を確認する工程、（３）工程（１）で選別された少なくとも数種のタンパク質を１種類又は２種類の特定の対照リガンドと接触させ、該タンパク質と対照リガンドの混合物をインキュベートし、該タンパク質と対照リガンドが結合したかどうかを判別する工程、および、（４）工程（１）において目的リガンドとの結合性が確認され、かつ、工程（ｃ）において対照リガンドと結合しなかったタンパク質を選択する工程。目的リガンドと結合するタンパク質の選択は当該技術分野における通常の知識に基づいて行なうことができる。例えば、適当な担体に目的リガンドを結合させ、結合した目的リガンドを多様化ライブラリーに存在するタンパク質と接触させ、適切な条件下でインキュベートした後、生じた担体−目的リガンド−タンパク質 の複合体を遠心分離などにより回収し、目的リガンドと結合するタンパク質を選択することができる。【０１３５】
（改変体）
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、糖鎖結合領域、システイニル化領域、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。  【０１３６】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。【０１３７】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。【０１３８】
親水性指数もまた、本発明のアミノ酸配列を改変するのに有用である。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。【０１３９】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。【０１４０】
本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。【０１４１】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。【０１４２】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。【０１４３】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。【０１４４】
本明細書において「誘導体」は、上記のような「改変体」に対しても存在し得る。【０１４５】
（診断方法）
本明細書において「診断」とは、被検体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被検体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「事前診断
を含む。【０１４６】
本明細書において特に、「事前診断」とは、糖尿病について言及する場合、糖尿病の発症前の段階を検出することをいい、将来の発症リスクを判定すること、糖尿病の予防を目的として糖尿病に罹患するおそれの有無を判定することを含む。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を事前に調べることができ、そのような情報を用いて、被検体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。【０１４７】
本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができることから、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「事前診断もしくは診断を支援」すると称することがある。【０１４８】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいう。【０１４９】
本発明の糖尿病の診断方法においては、糖尿病のマーカー物質として、血液中のこれら３種のタンパク質のうちの少なくとも１種の濃度を測定する。そして、その測定値を健常値と比較することにより、糖尿病の診断を行う。ここで、「糖尿病の診断」とは、糖尿病に罹患しているか否かを判定することのみではなく、糖尿病の予防を目的として糖尿病に罹患するおそれの有無を判定することや、糖尿病の改善状態や再発のモニタリングを行うことも含む。本発明の糖尿病の診断方法においては、３種のマーカー物質の一部だけの濃度を測定してもよいし、３種全部の濃度を測定してもよい。特に、全部のマーカー物質の濃度を測定する場合は、マルチマーカーシステムを組んで多方面から糖尿病の診断を行うことができ、診断の精度が高い。また、これら３種のタンパク質はいずれも健常者の血液中にも存在しているので、その濃度の変動をモニタリングすることにより、健常者が糖尿病を発病する兆候を検出することもできる。【０１５０】
本発明の疾病の診断方法は、被検者の体液中における上記マーカー物質（例えば、（ａ）〜（ｎ））の少なくとも１つの濃度を健常値と比較し、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定するものである。本発明の疾病の診断方法では、血糖を直接指標とするのではなく、別のマーカー物質を指標とするので、血糖値が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、糖尿病の有無に加え、糖尿病の将来の発症リスクを判定することができる。なお、「糖尿病の事前診断」および「糖尿病の将来の発症リスクを判定する」とは、交換可能に使用され、糖尿病を発症していない時点において、将来、糖尿病に罹患する可能性（危険性）の有無またはその可能性（危険性）の程度を判定することをいう。【０１５１】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「Ｍ／Ｚ」と略記することもある。）の「約７０４０」、「約８３３０」、「約８５３０」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約７０４０は概ね７０４０±０．２％、約８３３０は概ね８３３０±０．２％、約８５３０は概ね８５３０±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、被検者が糖尿病を発症している場合または糖尿病の将来の発症リスクが高い場合、体液中のマーカー物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）の濃度はより高値を示し、マーカー物質（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）および（ｎ）の濃度はより低値を示す。【０１５２】
本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液または体液成分を接触させて、体液または体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の疾病の診断方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清または血漿が挙げられる。【０１５３】
本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。【０１５４】
本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体、金属キレート体または抗体を用い、イオン交換体、金属キレート体または抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体または金属キレート体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。【０１５５】
（システム）
本明細書において、「システム」とは、診断するための任意の系をいい、一般に、１または複数の構成要素からなり、複数の構成要素がある場合それらの要素は互いに作用・関連し合っており、全体として調和のとれた挙動・機能を示すという３条件を満足する系をいう。システムは、装置、組成物、診断薬など任意の形態であり得る。従って、システムは、例えば、測定装置を備える大掛かりなシステムから、クロマトグラフィーを備えるシステム、免疫反応を利用したキット、抗体を含む組成物（すなわち、マーカー物質のモノクロナール抗体を含む、体外医薬品である診断薬）などを包含することが理解される。【０１５６】
（スクリーニング）
本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。【０１５７】
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。【０１５８】
１実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはこれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。【０１５９】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３７：１２３３。【０１６０】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、上記）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。【０１６１】
本発明は、他の実施形態において、本発明の活性成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸）と同等に有効な因子をスクリーニングするための道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物もまた、本発明に包含される。ここで、コンピュータ技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ  ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｉｅｌｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ＆  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。【０１６２】
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ  ｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ  ａｎｄ  Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物を設計することができる。【０１６３】
（投与・注入・医薬）
本発明のスクリーニング方法によって得られた物質を含む組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。【０１６４】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、抗体、標識など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、抗体の使い方などを記載した指示書などが含まれる。【０１６５】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法を医師、患者など投与を行う人に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、骨格筋に投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。【０１６６】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。【０１６７】
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ  ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。【０１６８】
本明細書において「インビトロ」とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。【０１６９】
本明細書において「エキソビボ」とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子または因子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。【０１７０】
本発明において使用されるポリペプチド、核酸、医薬ならびにそのようなポリペプチドまたは核酸によって調製された組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。本発明の組成物および医薬は、全身投与されるとき、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当業者の技術範囲内である。【０１７１】
本発明において医薬の処方のために使用される溶媒は、水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度、または臭いを改変または維持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、本発明の組成物は、有効成分の放出速度を改変または維持するため、または有効成分の吸収もしくは透過を促進するための他の処方物材料を含み得る。【０１７２】
本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべき量を決定することができる。【０１７３】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【０１７４】
（診断システム）
１つの局面において、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムを提供する。【０１７５】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムまたは組成物を提供する。【０１７６】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質に特異的に相互作用する因子を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムまたは組成物を提供する。【０１７７】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムを提供する。【０１７８】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質を含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムまたは組成物を提供する。【０１７９】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質に特異的に相互作用する因子を含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムまたは組成物を提供する。【０１８０】
ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムを提供する。【０１８１】
これらの組成物またはシステムは、上記マーカー物質を同定することができる限り、任意の被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。【０１８２】
１つの実施形態において、使用されるマーカー物質は、前記被験体の体液、好ましくは血液中に存在するものであることが特徴である。理論に束縛されることを望まないが、体液であれば、取り出した後処理が簡便であり、大量の診断または診断支援が可能であるからである。理論に束縛されることを望まないが、血液が好ましいのは、本発明のマーカー物質の挙動が顕著に反映されるからである。【０１８３】
１つの実施形態では、本発明において使用されるマーカー物質は、遺伝子産物であることが特徴である。特に、この遺伝子産物は、糖代謝に直接関連することがこれまで知られていなかったものであることが好ましい。なぜなら、糖代謝に直接関連することが知られていないマーカーでも、糖尿病のマーカー物質として診断または事前診断が可能になることは、これまで知られておらず、簡便、早期に糖尿病の診断を行うことが可能になるからである。また、本発明において同定されたマーカー物質は、モデル動物においてもマーカーとなることが示されており、ヒトにおいて経験的に見出されてきたマーカーのように、多数の病因によって変動し得、従って、糖尿病であればその疾患のみに起因するかどうかが不明であったものが多いところ、本発明のマーカー物質では、そのような不明確性は無い。なぜなら、本発明のマーカー物質は、プロテインチップによる網羅解析の結果見出されたものであり、かつ、モデル動物における確認も行っているからである。【０１８４】
具体的な実施形態では、本発明において用いられるマーカー物質は、トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質からなる群より選択される、１またはそれより多い物質を含む。好ましくは、２以上、３以上、あるいはそれより多い数のマーカー物質（特に、各々、誘導体と対を成しているものを１群とみなしたとき、異なる群から選択される複数のマーカー物質）を含むことが有利である。マルチマーカーシステムとして、より精確な診断を行うことが可能であり、確定診断をも可能にするからである。【０１８５】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子（例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）である。好ましくは、因子は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。【０１８６】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。【０１８７】
本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ）、生化学的手段（例えば、ｐＩ電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（２ＤＥ−ＤＩＧＥ）、同位体標識法（ＩＣＡＴ）、タンデムアフィニティ精製法（ＴＡＰ法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。【０１８８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムは、さらに、マーカー物質の標準を含む。このような標準は、マーカー物質の検出手段（該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。【０１８９】
好ましい実施形態では、本発明では、対象となるサンプルを精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。【０１９０】
本発明において、被験体は、哺乳動物を含み、１つの実施形態では、被験体は、齧歯類を含む。このような齧歯類（例えば、ラット、マウスなど）は、モデル動物、特に、糖尿病のモデル動物が作製されていることから好ましい。好ましい実施形態では、被験体は、ヒトを含む。【０１９１】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマーカー物質の定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える。【０１９２】
１つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカー物質が正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。【０１９３】
１つの実施形態では、本発明のシステムは、マーカー物質またはマーカー物質に特異的に相互作用する前記因子を含む組成物である。【０１９４】
（トランスサイレチン関連）
１つの局面では、本発明のシステムにおいて対象となるマーカー物質は、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含み、該トランスサイレチン誘導体は、Ｓ−システイニルトランスサイレチン、グルタチオン化トランスサイレチン、Ｓ−Ｓ結合形成トランスサイレチン、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、アセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付加トランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチンなどを挙げることができる。特に、Ｓ−システイニルトランスサイレチンであることが好ましい。また、本発明は、トランスサイレチンと、トランスサイレチン誘導体（特に、酸化還元経路において登場する代謝産物）との量比を検討することによって、糖尿病の悪化度または危険度を決定することができることを見出した点に顕著性があるというべきである。【０１９５】
従って、１つの実施形態では、トランスサイレチンの減少およびトランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象は、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である。【０１９６】
好ましくは、トランスサイレチンの減少およびトランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象は、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標であり得る。このような指標は、本明細書の記載に基づいて当業者が決定することができることが理解される。【０１９７】
具体的な実施形態では、本発明において対象となるトランスサイレチンは、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、あるいは、これらの改変配列を有する。【０１９８】
別の実施形態では、本発明において対象となるトランスサイレチン誘導体は、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、３０位（成熟形態では１０位）のシステインまたはそれに対応するシステインがシステイニル化されている誘導体であるか、あるいは、これらの改変配列を有し得る。【０１９９】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、トランスサイレチンの単量体と四量体との区別をする能力を有する。【０２００】
別の実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する（例えば、抗体）。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、トランスサイレチンまたはＳ−システイニルトランスサイレチンのいずれか一方に特異的に（好ましくは、選択的に）反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２０１】
好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを認識し、かつ、本発明のシステムはトランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを識別する手段をさらに備える。例えば、抗体＋電気泳動などの分子量等での識別手段の組み合わせを提供することによって、トランスサイレチン類は同定するが、誘導体とそれ以外とを識別するために電気泳動または質量分析などを利用することで識別を達成することができることが理解される。このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２０２】
好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを認識し、本発明のシステムはトランスサイレチンの分子量とＳ−システイニルトランスサイレチンの分子量とを識別する手段、およびトランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとの相対比を測定する手段をさらに備える。このようなシステムを提供することによって、本発明は、糖尿病の悪化度、発症確率の判定することができる。【０２０３】
（アポリポタンパク質ＣＩＩ）
好ましい局面では、本発明のシステムにおいて用いられるマーカー物質は、アポリポタンパク質ＣＩＩまたはアポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体を含み、該アポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体は、プロアポリポタンパク質ＣＩＩなどを挙げることができる。【０２０４】
１つの実施形態では、アポリポタンパク質ＣＩＩの減少およびアポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体の変動からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標であり得る。【０２０５】
１つの実施形態では、アポリポタンパク質ＣＩＩの減少およびアポリポタンパク質ＣＩＩ誘導体の変動からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標であり得る。【０２０６】
具体的な実施形態では、本発明において対象となるアポリポタンパク質ＣＩＩは、配列番号５もしくは配列番号７に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、あるいは、これらの改変配列を有する。【０２０７】
別の実施形態では、本発明において対象となるプロアポリポタンパク質ＣＩＩは、上記配列においてリード配列が結合したものであり得る。【０２０８】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩを選択的に識別する能力を有する（例えば、抗体）。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、アポリポタンパク質ＣＩＩを特異的に（好ましくは、選択的に）反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２０９】
好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩを選択的に識別する能力を有し、かつ、システムは該アポリポタンパク質ＣＩＩを定量する手段を備える。このようなシステムを提供することによって、本発明は、糖尿病の悪化度、発症確率の判定することができる。【０２１０】
特に好ましい局面では、本発明は被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムであって、該認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、システムを提供する。ここで、マーカー物質、相互作用する因子、選択的に認識する手段等の実施形態としては、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有することが担保される限り、上記（診断システム）において例示されている任意の形態を採り得ることが理解される。【０２１１】
好ましい実施形態では、本発明のシステムにおいて使用されるトランスサイレチンは、Ｓ−システイニルトランスサイレチンである。【０２１２】
好ましい実施形態では、本発明のシステムにおいて使用される選択的に認識する手段は、抗体である。この抗体は、トランスサイレチンとＳ−システイニルトランスサイレチンとを示差的に認識することができる限り、どのような性質を有していてもよい。好ましくは、トランスサイレチンまたはＳ−システイニルトランスサイレチンのいずれか一方のみを反応し、他方とは実質的に反応しない抗体であることが有利であり、より好ましくは、前者のみと反応する抗体と後者のみと反応する抗体の両方のセットを備えていてもよい。【０２１３】
本明細書において「実質的に反応しない」とは、通常使用するアッセイシステム（例えば、ＥＬＩＳＡ等）において、検出限界以下であることをいう。したがって、そのような「実質的に反応しない」状態は、使用するアッセイシステムにより異なるが、標準的には、ビオチン−ストレプトアビジンを用いたＥＬＩＳＡアッセイ系における検出限界を想定する。当業者は、実際のアッセイにおいて、検出を阻止しない濃度・限界値を設定することができ、これらは、実質的に反応しないということができる。【０２１４】
（アポリポタンパク質ＣＩＩＩ）
好ましい局面では、本発明のシステムにおいて用いられるマーカー物質は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩまたはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体を含み、該アポリポタンパク質ＣＩＩＩはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ０であり、該アポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２からなる群より選択される。また、本発明は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２の量比を検討することによって、糖尿病の悪化度または危険度を精確に決定することができることを見出した点に顕著性があるというべきである。【０２１５】
従って、１つの実施形態では、アポリポタンパク質ＣＩＩＩの増加、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１の増加およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である。【０２１６】
好ましくは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩの増加、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１の増加およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標であり得る。このような指標は、本明細書の記載に基づいて当業者が決定することができることが理解される。【０２１７】
具体的な実施形態では、本発明において対象となるアポリポタンパク質ＣＩＩＩは、配列番号９もしくは配列番号１１に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号１０もしくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、あるいは、これらの改変配列を有する。【０２１８】
別の実施形態では、本発明において対象となるアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体は、配列番号９もしくは配列番号１１に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号１０もしくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、それぞれ、配列番号１０および１２のそれぞれ７３位および７４位またはそれに対応するスレオニンに糖鎖を有する誘導体である。【０２１９】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを区別する能力を有する。【０２２０】
別の実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２のうち少なくとも２つを区別する能力を有する。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２のうち少なくとも２つを特異的に（好ましくは、選択的に）反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２２１】
好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ１とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２とをすべて区別する能力を有する（例えば、抗体）。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ１とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２とをすべて区別するように特異的に（好ましくは、選択的に）反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２２２】
従って、１つの実施形態では、因子または前記手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを区別する能力を有する抗体を含み、好ましくは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２のうち少なくとも２つを区別する能力を有する抗体を含み、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ１とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２とをすべて区別する能力を有する抗体の組み合わせを含む。【０２２３】
好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを認識し、前記システムは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを識別する手段をさらに備える。例えば、抗体＋電気泳動などの分子量等での識別手段の組み合わせを提供することによって、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ類は、同定するが、誘導体とそれ以外とを識別するために電気泳動または質量分析などを利用することで識別を達成することができることが理解される。このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２２４】
好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを認識し、本発明のシステムは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ１およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２のうち少なくとも２つを識別する手段をさらに備える。例えば、抗体＋電気泳動などの分子量等での識別手段の組み合わせを提供することによって、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ類は、同定するが、誘導体とそれ以外とを識別するために電気泳動または質量分析などを利用することで識別を達成することができることが理解される。このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２２５】
好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩとアポリポタンパク質ＣＩＩＩ誘導体とを認識し、前記システムは、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ０とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ１とアポリポタンパク質ＣＩＩＩ２とをすべて識別する手段をさらに備える。このようなシステムを提供することによって、本発明は、糖尿病の悪化度、発症確率の判定することができる。【０２２６】
（血清アルブミン）
別の局面において、本発明のシステムにおいて用いられるマーカー物質は、血清アルブミンまたは血清アルブミン誘導体を含み、該血清アルブミン誘導体は、酸化された血清アルブミン、フラクション化された血清アルブミンなどが挙げられる。【０２２７】
従って、１つの実施形態では、血清アルブミンの減少および血清アルブミン誘導体の変動からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である。アルブミンは、種々の疾患の指標として測定されているが、糖尿病の指標であることはこれまで知られていなかった。特に、トランスサイレチン、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＩＩＩなどと組み合わせたときに、診断の精度を上昇させることは初めて見出されたことは特筆に価する。【０２２８】
好ましくは、血清アルブミンの減少および血清アルブミン誘導体の変動からなる群より選択される少なくとも１つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である。このような指標は、本明細書の記載に基づいて当業者が決定することができることが理解される。【０２２９】
具体的な実施形態では、本発明において対象となる血清アルブミンは、配列番号１３もしくは配列番号１５に示される核酸配列によってコードされるか、または配列番号１４もしくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列、あるいは、これらの改変配列を有する。あるいは、本明細書において記載されるか他に公知の血清アルブミン配列を有していても良い。【０２３０】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有する（例えば、抗体）。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、血清アルブミンに特異的に（好ましくは、選択的に）反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２３１】
好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有し、かつ、前記システムは該血清アルブミンを定量する手段を備える。例えば、抗体＋電気泳動などの分子量等での識別手段の組み合わせを提供することによって、血清アルブミン類は同定するが、血清アルブミン自体とそれ以外とを識別するために電気泳動または質量分析などを利用することで識別を達成することができることが理解される。このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。【０２３２】
１つの局面において、本発明のシステムは、好ましくは、診断薬として使用され得る。【０２３３】
（診断方法）
１つの局面において、本発明は、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断もしくは診断するため、または該事前診断もしくは診断を支援するための方法であって、Ａ）該被験体由来のサンプル中のマーカー物質を測定する工程；およびＢ）該測定結果から、該被験体が糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程、を包含する、方法を提供する。ここで、サンプルの取得は、どのような手段であっても良い。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程は、正常値と比べて、各々のマーカー物質に比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。【０２３４】
本発明の方法において、使用されるマーカー物質などは、上記（システム）、（トランスサイレチン）、（アポリポタンパク質ＣＩＩＩ）、（アポリポタンパク質ＣＩＩ）および（血清アルブミン）の項において記載される任意の１または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。【０２３５】
（使用）
１つの局面において、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための医薬の製造における、使用を提供する。ここで、サンプルの取得は、どのような手段であっても良い。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程は、正常値と比べて、各々のマーカー物質に比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。【０２３６】
本発明の方法において、使用されるマーカー物質などは、上記（システム）、（トランスサイレチン）、（アポリポタンパク質ＣＩＩＩ）、（アポリポタンパク質ＣＩＩ）および（血清アルブミン）の項において記載される任意の１または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。【０２３７】
別の局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための使用を提供する。ここで、サンプルの取得は、どのような手段であっても良い。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程は、正常値と比べて、各々のマーカー物質に比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。【０２３８】
本発明の方法において、使用されるマーカー物質などは、上記（システム）、（トランスサイレチン）、（アポリポタンパク質ＣＩＩＩ）、（アポリポタンパク質ＣＩＩ）および（血清アルブミン）の項において記載される任意の１または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。【０２３９】
（さらなる説明）
本発明の糖尿病の診断方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。【０２４０】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することが出来る。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的または間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。【０２４１】
質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。さらに、２台の質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳによれば、より正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。【０２４２】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。【０２４３】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。【０２４４】
本発明の糖尿病の診断方法は、（ａ）７．０以下のｐＨで陽イオン交換体に補足される、分子量が約１３８００であるタンパク質、（ｂ）７．０以下のｐＨで金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約８７００であるタンパク質、（ｃ）７．０以下のｐＨで陽イオン交換体に捕捉される、分子量が約９４００であるタンパク質、または、ｐＨ７．０で金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約９４００であるタンパク質、（ｄ）７．０以下のｐＨで陽イオン交換体に補足される、分子量が約９７００であるタンパク質、または、ｐＨ７．０で金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約９７００であるタンパク質、（ｅ）７．０以下のｐＨで陽イオン交換体に補足される、分子量が約６６０００であるタンパク質、または、ｐＨ７．０で金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約６６０００であるタンパク質、をマーカー物質とし、その血液中の量を健常値と比較する方法も含む。なお、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の物性は、それぞれ、トランスサイレチンサブユニット、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2、血清アルブミンと一致する。【０２４５】
本発明の糖尿病の診断方法は、（ａ）トリプシンで消化すると、分子量が約１２７０、約１３７０、約１３９０、約１５２０、約２４５０、約２６４０、および約３１４０のポリペプチドを生じる、分子量約１３８００のタンパク質、および／または、（ｂ）トリプシンで消化すると、分子量が約９００、約１２００、約１３９０、約１７１０、約１９４０、および約２０８０のポリペプチドを生じる、分子量約８７００〜９７００のタンパク質をマーカー物質とし、その血液中の量を健常値と比較する方法も含む。なお、ＰｒｏＦｏｕｎｄデータベースを用いてペプチドマスフィンガープリンティングを行うと、（ａ）はトランスサイレチンと同定される。また、ＭＳ−Ｆｉｔデータベースを用いてペプチドマスフィンガープリンティングを行うと、（ｂ）はアポリポタンパク質ＣＩＩＩと同定される。【０２４６】
本発明の糖尿病の診断方法における好ましい実施形態の一つは、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質の濃度を測定することである。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお「親和性」の例としては、抗原と抗体、酵素と基質、ホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティの他、イオン結合、疎水性相互作用等の化学的な作用が挙げられる。【０２４７】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。【０２４８】
一方、本実施形態においてマーカー物質の測定方法に質量分析を用いる場合は、抗体の他、イオン結合や疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉することもできる。イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がなく、マーカー物質以外の物質も捕捉されるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間質量分析（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行えば、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、金属イオン基板が好ましく用いられる。【０２４９】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陰イオン交換体、陽イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体のいずれも用いることができる。例えば、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。一方、疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。さらに、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃａ2+、Ｃｏ2+、Ｍｇ2+等の金属イオンを固定化した担体にマーカー物質を捕捉することもできる。【０２５０】
本実施形態において用いる担体の例としては、ビーズ、マイクロタイタープレート、樹脂等の公知のものを使用することができる。特に、ビーズとマイクロタイタープレートは、イムノアッセイにおいて従来から用いられており、測定系の構築が容易である。一方、
基板のような、平面部分を有する担体を用いることもできる。この場合は、平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基盤としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に特異的な抗体を固定化した担体が挙げられる。【０２５１】
本発明の糖尿病の診断方法においては、被験者から採取した血液を検体とし、その血液から調製した血清または血漿を検査材料とすることが好ましい。血清または血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。【０２５２】
本発明の糖尿病の診断方法における好ましい実施形態の一つとして、マルチマーカーシステムによる糖尿病の診断が挙げられる。本発明の糖尿病の診断方法をマルチマーカーシステムに応用する例を、図１および図２を参照しながら説明する。図１は、マルチマーカーシステムによる本発明の糖尿病の診断方法の手順を示すフローチャートである。図１のフローチャートの方法によれば、まず、血液中のトランスサイレチンの濃度を指標として１次判定をする。そして、トランスサイレチンの濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、トランスサイレチンの濃度が健常値以下である場合は、血液中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の濃度を指標として２次判定をする。そして、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の濃度が健常値以下である場合は、血液中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ1の濃度を指標として３次判定をする。そして、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1の濃度が健常値以下である場合は、正常（糖尿病ではない）と判定する。一方、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1の濃度が健常値よりも高い場合は、血液中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の濃度を指標として４次判定をする。そして、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の濃度が健常値以下である場合は、正常（糖尿病ではない）と判定する。【０２５３】
図２は、別のマルチマーカーシステムによる本発明の糖尿病の診断方法の手順を示すフローチャートである。図２のフローチャートの方法によれば、まず、血液中の血清アルブミンの濃度を指標として１次判定をする。そして、血清アルブミンの濃度が健常値以上である場合は、正常（糖尿病ではない）と判定する。一方、血清アルブミンの濃度が健常値よりも低い場合は、血液中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の濃度を指標として２次判定をする。そして、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の濃度が健常値以下である場合は、血液中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ1の濃度を指標として３次判定をする。そして、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1の濃度が健常値以下である場合は、正常（糖尿病ではない）と判定する。一方、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1の濃度が健常値よりも高い場合は、血液中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の濃度を指標として４次判定をする。そして、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の濃度が健常値以下である場合は、正常（糖尿病ではない）と判定する。【０２５４】
なお、本発明で糖尿病マーカーとして使用するトランスサイレチン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、および血清アルブミンと、従来から知られているＨｂＡ１ｃやＣＰＲ等の臨床マーカーを組み合わせることによってもマルチマーカーシステムを構築することは可能である。【０２５５】
上記のようなマルチマーカーシステムによる糖尿病の診断方法によれば、多方面から判定できるので、かなりの高精度で糖尿病の診断をすることができる。さらに、従来の糖尿病の診断方法では困難であった、糖尿病の発病前の段階の検出、すなわち糖尿病予備軍の診断にも好適である。また、マルチマーカーシステムによれば、糖尿病の検出のみでなく、糖尿病予備軍の検出、糖尿病の改善状態のモニターも高精度に行うことができる。【０２５６】
本発明の糖尿病診断用キットは、トランスサイレチン等のマーカー物質に特異的な抗体を含むものである。キットに含まれる抗体は単独の試薬としてもよいし、担体にあらかじめ固定化された状態でもよい。単独の試薬の場合は、その形状は溶液でもよいし凍結乾燥物でもよい。また、複数の抗体を含めてもよく、例えば、イムノアッセイで使用する標識抗体を２次抗体として含めてもよい。また、本発明の糖尿病診断用キットには他の試薬類を含めてもよく、例えばＥＩＡを行うためのキットであれば、ビーズ等の担体、ブロッキング液、ＰＢＳ等の緩衝液、発色基質等を含むものでもよい。【０２５７】
本発明の疾病の診断方法は、被検者の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｎ）の少なくとも１つの濃度を健常値と比較し、糖尿病の有無または将来の発症リスクを判定するものである。
（ａ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質。
（ｄ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｅ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９２６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｆ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９４５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｇ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｈ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７６４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｉ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｊ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｋ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３５６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｌ）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｍ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２８００のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｎ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５７００のイオンピークを生じるタンパク質。【０２５８】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、被検者が糖尿病を発症している場合または糖尿病の将来の発症リスクが高い場合、体液中のマーカー物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）の濃度はより高値を示し、マーカー物質（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）および（ｎ）の濃度はより低値を示す。以下、マーカー物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）からなるグループを「グループ１」、マーカー物質（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）および（ｎ）からなるグループを「グループ２」と称することがある。【０２５９】
本発明の疾病の診断方法で使用する健常値は、例えば、糖尿病を発症していないと確定診断された健常人における上記マーカー物質（ａ）〜（ｎ）の体液中の濃度データを収集し、その濃度値を元に設定することができる。糖尿病の将来の発症リスクを判定する場合も、当該健常人における濃度値を元に健常値を設定することができる。なお、健常値を段階的に複数設定し、糖尿病の有無または将来の発症リスクを定量的に判定することもできる。【０２６０】
本発明の疾病の診断方法において使用する体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、被検者から採取した血液から調製した血清または血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清または血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。【０２６１】
（評価方法）
１つの局面において、本発明は物質の評価方法を提供し、この方法は、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中におけるマーカー物質（例えば、（ａ）〜（ｎ）の１４種）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。本発明の物質の評価方法では、血糖を直接指標とするのではなく、別のマーカー物質を指標とするので、動物における血糖値が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、被検物質が有する糖尿病の改善効果に加え、糖尿病の将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。なお、「動物」には、ラット等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。【０２６２】
かかる構成により、より正確に、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。【０２６３】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。【０２６４】
かかる構成により、機能性食品の開発を目的として、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。【０２６５】
上記した本発明の疾病の診断方法と同様に、本発明の物質の評価方法においても、前記体液または体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する構成（請求項１０）、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている構成、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体である構成が推奨される。【０２６６】
本発明の物質の評価方法では、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物における上記マーカー物質（ａ）〜（ｎ）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。なお、被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する場合、体液中におけるグループ１に属するマーカー物質の濃度はより低値を示し、グループ２に属するマーカー物質の濃度はより高値を示す。【０２６７】
好ましい実施形態では、上記基準値として、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被検物質を摂取させた上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。【０２６８】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、糖尿病を発症していない動物または糖尿病の発症リスクが低い動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）糖尿病を発症していない動物または糖尿病の発症リスクが低い動物に、普通食または被検物質を摂取させる群（正常値を示す群）、（２）糖尿病を発症している動物または糖尿病の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させる群（異常値を示す群）、および、（３）糖尿病を発症している動物または糖尿病の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させる群、の３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、被検物質に糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果があれば、（３）において血糖値が正常値に維持され、マーカー物質の濃度が正常値である（１）に近い値をとる。【０２６９】
さらに、基準値として、（４）糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質を摂取させる群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）および（４）に近い側）である場合に、当該被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被検物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。【０２７０】
上記した「糖尿病を発症している動物、または糖尿病の発症リスクが高い動物」は、例えば、遺伝的に必ず糖尿病を発症する動物を用いることで、実現できる。より具体的には、例えば、大塚製薬（株）徳島研究所から供給されているＯＬＥＴＦ（Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty）ラットを用いることができる。ＯＬＥＴＦラットは肥満を伴う２型糖尿病を自然発症するモデルラットであり、雄では２５週齢におけるＯＧＴＴでほぼ全例が糖尿病と診断される。同様に、「糖尿病を発症していない動物、または糖尿病の発症リスクが低い動物」は、例えば、遺伝的に全く糖尿病を発症しないモデル動物を用いることで、実現できる。より具体的には、例えば、大塚製薬（株）徳島研究所から供給されているＬＥＴＯ（Long-EvansTokushima Otsuka）ラットを用いることができる。ＬＥＴＯラットは、糖尿病を全く発症しないコントロールラットであり、遺伝的にＯＬＥＴＦラットと近縁である。【０２７１】
本発明の物質の評価方法に使用する動物としては、特に限定はなく、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ等を使用することができる。特に、ラットとマウスはその飼育が容易であるので、本発明の評価方法に好ましくに用いられる。動物の飼育方法としては特に限定はなく、例えば、飼料を自由摂取させて、３〜２０日程度飼育すればよい。さらに、動物としてヒトを用いることもできる。ヒトを用いる場合は、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。【０２７２】
本様相の物質の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清または血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清または血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。【０２７３】
本発明の物質の評価方法における被検物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。【０２７４】
本発明の物質の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、銅イオン等の金属キレート体、あるいはマーカー物質に対する抗体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳや抗体チップによるイムノアッセイを簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。【０２７５】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の物質の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。さらに、上記した評価用キットと同様の構成からなるスクリーニング用キットを構築することもできる。【０２７６】
本発明はまた、本発明に記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。【０２７７】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中におけるマーカー物質（例えば、（ａ）〜（ｎ）の１４種）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法では、血糖を直接指標とするのではなく、別のマーカー物質を指標とするので、動物における血糖値が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、糖尿病の改善効果を有する物質に加え、糖尿病の将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることができる。特に、被検物質が食品素材の場合は、糖尿病の改善効果を有する機能性食品または将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。【０２７８】
本発明は、このようなスクリーニング方法によって得られた物質も提供する。【０２７９】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。【０２８０】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２８１】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
[実施例１]【０２８２】
１．プロテインチップを用いた糖尿病マーカー候補タンパク質の検索
糖尿病患者１０名分、健常者１０名分、計２０名分の血清サンプルを収集した。各血清サンプルについて、変性緩衝液（９Ｍ  尿素、２％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えて前処理を行い、一部の夾雑タンパク質を除去した。次に、前処理した各血清サンプルを強陰イオン交換樹脂に吸着させた後、ｐＨの異なる溶出液で順に溶出させ、画分１（素通り）、画分２（ｐＨ７．０で溶出）、画分３（ｐＨ５．０で溶出）、画分４（ｐＨ４．０で溶出）、画分５（ｐＨ３．０で溶出）、画分６（有機溶媒で溶出）の６つの画分を得た。それぞれの画分に対して、プロテインチップを用いてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、糖尿病患者の血清に特異的なタンパク質を網羅的に検索した。プロテインチップは、金属イオン（Ｃｕ2+）、弱陽イオン交換体（ＣＭ）、強陰イオン交換体（Ｑ）、逆相（Ｃ１６アルキル鎖）の４種（いずれもサイファージェン社製）について検討した。エネルギー吸収物質（ＥＡＭ）は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）とシナピン酸（ＳＰＡ）の２種を検討した。その結果、プロテインチップの種類、画分の種類、チップの洗浄条件（ｐＨ）、ＥＡＭの種類等の組み合わせによって多数のピークが検出された。これらのピークから、糖尿病患者と健常者との間で有意に強度が異なるピークを検索した。
２．候補ピークの検索（１）
弱陽イオン交換体を固定化したプロテインチップを用い、画分４について洗浄ｐＨを７．０とした場合に、質量／電荷比（ｍ／ｚ）が１３８６７，１４０４９，１３８８５，１４０８７，および１３７６１の５個のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定化したプロテインチップを用い、画分５について洗浄ｐＨを４．０とした場合に、ｍ／ｚが１３８８５のピークが検出された。これら６個のピークから、分子量１３８００〜１４１００の範囲付近に候補となるタンパク質（以下、「候補タンパク質（１）」と称する。）が存在することが示唆された。【０２８３】
各ピークについて、糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットし、ＲＯＣ曲線を作成し、さらに、カットオフ値を設定した。一例として、図３（ａ）〜（ｃ）にｍ／ｚが１３８６７のピークについての例を示す。図３（ａ）は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、水平線はカットオフ値である。図３（ｂ）は図３（ａ）の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフである。図３（ｃ）はＲＯＣ曲線であり、ＲＯＣ面積が１に近いほど（曲線が左上に寄るほど）その測定系の精度が高いことを示す。他の５個のピークについても同様のグラフ（図示せず）を作成した。各ピークについて、Ｐ値、ＲＯＣ面積、使用チップ、チップの洗浄条件、画分、および使用ＥＡＭをまとめた表を以下の表２に示す。【０２８４】
【表２】
0005688829.tif 000004
【０２８５】
３．候補タンパク質（１）の精製
糖尿病患者の血清から、以下の手順により候補タンパク質（１）を精製した。まず、糖尿病患者の血清５０μＬに変性緩衝液（９Ｍ  尿素、２％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））７５μＬを加え、４℃で２０分間処理した。さらに、洗浄／結合緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））１．５ｍＬを加えて希釈した後、洗浄／結合緩衝液で平衡化したＱ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（バイオセプラ社）にアプライした。そのまま４℃で３０分間攪拌した後、５００μＬの洗浄／結合緩衝液で２回洗浄した。次に、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、または２５０ｍＭのＮａＣｌを含む５種類の５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μＬで順に溶出して分画した。各画分についてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて分析したところ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、および２５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した画分に、候補タンパク質（１）と同様の分子量約１３８００〜１４１００のピークが検出された。なお、アルブミンは溶出前の洗浄工程で全て溶出されており、この条件で候補タンパク質（１）とアルブミンは完全に分離された。
４．候補タンパク質（１）の同定
ＮａＣｌ濃度が１７５ｍＭ、２００ｍＭ、および２５０ｍＭの画分を混合した（９０μＬ×３）。混合した画分をＶｉｖａＳｐｉｎ  ５０００  Ｃｕｔ  Ｏｆｆ（ザルトリウス社）にて遠心濃縮し、さらに１０倍量の５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて最終液量５０μＬまで濃縮し、緩衝液交換した。次に、濃縮したサンプルをゲル濃度１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）にてゲルを染色した。その結果、分子量約１３８００の位置に目的のバンドが検出された。次に、目的のバンドに０．０２μｇ／μＬのトリプシン溶液（２５ｍＭ  炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプルについてＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ分析をしたところ、少なくとも７個のピークが検出され、それらの分子量は、「１２６６．９６０」、「１３６６．３００」、「１３９４．２７０」、「１５２２．１４０」、「２４５１．７９０」、「２６４６．０３０」、および「３１４１．３１０」と算出された。これらのデータを元にＰｒｏＦｏｕｎｄデータベースによって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、目的のタンパク質は９９％以上の確率でトランスサイレチンのサブユニットと同定された。従来知られているトランスサイレチンのサブユニットの分子量は１３８９０、等電点は５．３であるのに対し、今回単離したタンパク質の分子量は約１３８００、予想される等電点は５．３であり、両者の物理化学的性質はほぼ一致した。【０２８６】
なお、トランスサイレチンは同一のサブユニット４個からなる４量体であることが知られているが、本実施例の結果によれば、トランスサイレチンは４量体の形ではなくサブユニット単体で検出された。
[実施例２]【０２８７】
１．候補ピークの検索（２）
実施例１と同様にして別の候補ピークを検索した。その結果、弱陽イオン交換体を固定化したプロテインチップを用い、画分６について洗浄ｐＨを４．０とした場合に、ｍ／ｚが９２７９，９７０５の２個のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定化したプロテインチップを用い、画分５について洗浄ｐＨを４．０とした場合に、ｍ／ｚが９２８５，９４１５の２個のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定化したプロテインチップを用い、画分６について洗浄ｐＨを７．０とした場合に、ｍ／ｚが９２８９，９６３８，９７１２の３個のピークが検出された。また、金属イオン（Ｃｕ2+）を固定化したプロテインチップを用い、画分６について洗浄ｐＨを７．０とした場合に、ｍ／ｚが８６９０，９２８９，９６３８、９７１２の４個のピークが検出された。これら１１個のピークから、分子量８６００〜９８００の範囲付近に候補となるタンパク質（以下、「候補タンパク質（２）」と称する。）が存在することが示唆された。【０２８８】
実施例１と同様にして、各ピークについて、糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットし、ＲＯＣ曲線を作成し、さらに、カットオフ値を設定した。一例として、図４（ａ）〜（ｃ）にｍ／ｚが８６９０のピークについての例を示す。図４（ａ）は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図４（ｂ）は図４（ａ）の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図４（ｃ）はＲＯＣ曲線である。他の１０個のピークについても同様のグラフ（図示せず）を作成した。各ピークについて、Ｐ値、ＲＯＣ面積、使用チップ、チップの洗浄条件、画分、および使用ＥＡＭをまとめた表を以下の表３に示す。【０２８９】
【表３】
0005688829.tif 000005
【０２９０】
２．候補タンパク質（２）の精製
糖尿病患者の血清から、以下の手順により候補タンパク質（２）を精製した。まず、糖尿病患者の血清５０μＬに変性緩衝液７５μＬを加え、４℃で２０分間処理した。さらに、洗浄／結合緩衝液（５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０））１．５ｍＬを加えて希釈した後、洗浄／結合緩衝液で平衡化したＱ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎにアプライした。そのまま４℃で３０分間攪拌した後、５００μＬの洗浄／結合緩衝液で２回洗浄した。次に、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、または２５０ｍＭのＮａＣｌを含む３種類の５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００μＬで順に溶出して分画した。各画分についてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて分析したところ、候補タンパク質（２）と同様の分子量約８６９０、９４１５、９７１２のピークが検出された。なお、アルブミンは溶出前の洗浄工程で全て溶出されており、この条件で候補タンパク質（２）とアルブミンは完全に分離された。
３．候補タンパク質（２）の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製した目的のバンドに０．０２μｇ／μＬのトリプシン溶液（２５ｍＭ  炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプルについてＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ分析をしたところ、少なくとも５個のピークが検出され、それらの分子量は、「８９８」、「１１９７」、「１７１７」、「１９３９」、「２０７６」と算出された。これらのデータを元にＭＳ−Ｆｉｔデータベースによって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、目的のタンパク質は３種のアポリポタンパク質ＣＩＩＩ、すなわち、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2と同定された。従来知られているアポリポタンパク質ＣＩＩＩ0、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ2の分子量はそれぞれ８７６５、９４２１、９７１３、等電点はそれぞれ４．９５、４．８０、４．６５であるのに対し、今回単離した３種のタンパク質の分子量はそれぞれ８６９０、９４１５、９７１２、予想される等電点はいずれも４．５〜５．０であり、両者の物理化学的性質はほぼ一致した。
４．２次元電気泳動による糖尿病患者血清の分析
糖尿病患者の血清を、１次元目（水平方向）がＩＥＦ、２次元目（垂直方向）がＳＤＳ−ＰＡＧＥの２次元電気泳動に供したところ、分子量６．５〜１４．４ｋＤａ、等電点（ｐI）５付近に３個のバンドＡ、Ｂ、Ｃが検出された（図５）。これらのバンドは健常者の血清からは検出されなかった。これらのバンドＡ、Ｂ、Ｃについて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析したところ、Ａ、Ｂ、Ｃの分子量は、それぞれアポリポタンパク質ＣＩＩＩ2、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ1、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ0の分子量と一致した。この結果は、上記のプロテインチップを用いた候補タンパク質（２）の検索結果と一致した。
[実施例３]【０２９１】
候補ピークの検索（３）
実施例１と同様にしてさらに別の候補ピークを検索した。その結果、弱陽イオン交換体を固定化したプロテインチップを用い、画分３について洗浄ｐＨを７．０とした場合に、ｍ／ｚが６６４１８，６６４４９の２個のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定化したプロテインチップを用い、画分５について洗浄ｐＨを４．０とした場合に、ｍ／ｚが６６４４９のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定化したプロテインチップを用い、画分６について洗浄ｐＨを７．０とした場合に、ｍ／ｚが６６５７２のピークが検出された。また、金属イオン（Ｃｕ2+）を固定化したプロテインチップを用い、画分４について洗浄ｐＨを７．０とした場合に、ｍ／ｚが６６２１６のピークが検出された。また、金属イオン（Ｃｕ2+）を固定化したプロテインチップを用い、画分６について洗浄ｐＨを７．０とした場合に、ｍ／ｚが６６５７２，６６５８２の２個のピークが検出された。また、金属イオン（Ｃｕ2+）を固定化したプロテインチップを用い、画分５について洗浄ｐＨを７．０とした場合に、ｍ／ｚが６６５９６のピークが検出された。なお、これらのピークは候補タンパク質（１）や候補タンパク質（２）とは異なり、糖尿病患者において低値を示した。これら８個のピークから、分子量６６０００〜６７０００の範囲付近に候補となるタンパク質（以下、「候補タンパク質（３）」と称する。）が存在することが示唆された。この分子量の値は、公知のヒト血清アルブミンの分子量（６６４３９）の値に極めて近く、かつｍ／ｚが６６４４９というヒト血清アルブミンの分子量とほとんど同じ値のピークも検出されたことから、候補タンパク質（３）は血清アルブミンであると同定した。【０２９２】
実施例１および２と同様にして、各ピークについて、糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットし、ＲＯＣ曲線を作成し、さらに、カットオフ値を設定した。一例として、図６（ａ）〜（ｃ）にｍ／ｚが６６２１６のピークについての例を示す。図６（ａ）は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図６（ｂ）は図６（ａ）の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図６（ｃ）はＲＯＣ曲線である。なお、本ピークは糖尿病患者の方が低値を示すので、図６（ｃ）のＲＯＣ曲線は右下に傾き、かつ右下に寄るほど精度が高いことを示す。他の７個のピークについても同様のグラフ（図示せず）を作成した。各ピークについて、Ｐ値、ＲＯＣ面積、使用チップ、チップの洗浄条件、画分、および使用ＥＡＭをまとめた表を以下の表４に示す。【０２９３】
【表４】
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[実施例４]【０２９４】
以下の構成の糖尿病検出用キット（１）を構築した。本キットは抗体を固定化した基板を含むものであり、基板上にマーカー物質を捕捉し、サンドイッチＥＩＡの系でトランスサイレチン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、および血清アルブミンを測定するためのものである。検出は蛍光標識ストレプトアビジンで行う。【０２９５】
【表５】
0005688829.tif 000007
[実施例５]【０２９６】
以下の構成の糖尿病検出用キット（２）を構築した。本キットは、マイクロタイタープレートを用いたサンドイッチＥＩＡによって、トランスサイレチン、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、および血清アルブミンを測定するためのものである。【０２９７】
【表６】
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[実施例６]【０２９８】
１．ラットを用いた動物実験
２型糖尿病自然発症モデルラットとしてＯＬＥＴＦラットを、該モデルラットと同じ系統（遺伝的に近縁）の２型糖尿病を発症しないラットとしてＬＥＴＯラットを準備した。ＯＬＥＴＦラットとＬＥＴＯラットはいずれも大塚製薬（株）徳島研究所より提供された。ＬＥＴＯラットの群（第１群）とＯＬＥＴＦラットの群（第２群）とを設定し、各ラットを飼育した。飼料にはＣＲＦ−１（オリエンタルバイオサイエンス社）を用い、各群とも自由摂取とした。各群とも５週齢から試験を開始し、５０週または６２週まで飼育した。５（飼育開始時），９，１３，１７，２１，２５，２９，３３，３７，４１，４５，および４９の各週齢時にＯＧＴＴを行ない、血液をサンプリングした。これらの各血液サンプルから血清を調製した。飼育終了後、特に異常が見られなかったラットから、第１群から４匹、第２群から７匹を選択した。それらのラットにおけるＯＧＴＴの評価を、常法に従い、正常（○）、境界（△）、糖尿病（●）の３段階で評価した。ＯＧＴＴの結果を第１表に示す。表中、１−１から１−４はそれぞれ第１群のラット（計４匹）、２−１から２−７は第２群の各ラット（計７匹）の結果であり、５〜４９の整数はラットの週齢である。すなわち、第１群のラットでは糖尿病を発病しなかったが、第２群のラットでは、２１週齢あたりから徐々に糖尿病を発症していた。次に、第１表で特に示した２１サンプルを、以下の解析に供した。【０２９９】
【表７】
0005688829.tif 000009
【０３００】
各血清サンプル２０μＬに、変性緩衝液（９Ｍ  尿素、２％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各血清サンプルを強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、バイオセプラ社）にアプライした。次に、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ７．０の緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ４．０の緩衝液（１００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、および有機溶媒（３３．３％イソプロピルアルコール、１６．７％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸からなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ７．０で溶出）、画分３（ｐＨ５．０で溶出）、画分４（ｐＨ４．０で溶出）、画分５（ｐＨ３．０で溶出）、画分６（有機溶媒）の６つの粗分画画分を得た。【０３０１】
得られた各画分１０μＬをｐＨ４．０のプロテインチップ結合緩衝液（１００ｍＭ  酢酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、陽イオン交換チップＣＭ１０（サイファージェン社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ７．０のプロテインチップ結合緩衝液（１００ｍＭ  リン酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で１０倍希釈した後、銅修飾チップＩＭＡＣ３０（サイファージェン社）に添加した。各プロテインチップを各結合緩衝液で３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ）またはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ  ＰＢＳ  ＩＩｃ（サイファージェン社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（Ｍ／Ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、Ｍ／Ｚの平均値を算出した。データ解析は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓ  Ｄａｔａ  Ｍａｇｎａｇｅｒ、およびＢｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（いずれもサイファージェン社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析および数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。これらのピークの中から、第１群と第２群のサンプル間で有意差があったピークを１４個選抜した。
２．マーカー物質（ａ）の特定
画分５において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が７０４３（平均値）のイオンピークが検出された。図７に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（以下の図も同じ）。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７０４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ａ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ａ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ａ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ａ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７０４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
３．マーカー物質（ｂ）の特定
画分６において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が８３２５（平均値）のイオンピークが検出された。図８に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８３３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｂ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｂ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｂ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｂ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８３３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
４．マーカー物質（ｃ）の特定
画分６において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が８５３２（平均値）のイオンピークが検出された。図９に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８５３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｃ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｃ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｃ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｃ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８５３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
５．マーカー物質（ｄ）の特定
画分１において、銅修飾チップＩＭＡＣ３０を用いた場合に、質量／電荷比が９０６２（平均値）のイオンピークが検出された。図１０に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９０６０ピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｄ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｄ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｄ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｄ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９０６０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
６．マーカー物質（ｅ）の特定
画分６において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が９２５５（平均値）のイオンピークが検出された。図５に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９２６０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｅ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｅ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｅ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｅ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９２６０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
７．マーカー物質（ｆ）の特定
画分６において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が９４４５（平均値）のイオンピークが検出された。図１２に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。２以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９４５０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｆ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｆ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｆ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｆ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９４５０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
８．マーカー物質（ｇ）の特定
画分４において、銅修飾チップＩＭＡＣ３０を用いた場合に、質量／電荷比が１３７２０（平均値）のイオンピークが検出された。図１３に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。２以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００ピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｇ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｇ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｇ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｇ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
９．マーカー物質（ｈ）の特定
画分３において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が７６４０４（平均値）のイオンピークが検出された。図１４に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。２以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７６４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｈ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｈ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｈ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｈ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７６４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。【０３０２】
１０．マーカー物質（ｉ）の特定
画分４において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が７９０８５（平均値）のイオンピークが検出された。図１５に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７９１００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｉ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｉ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｉ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｉ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７９１００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。【０３０３】
１１．マーカー物質（ｊ）の特定
画分６において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が３４９７（平均値）のイオンピークが検出された。図１６に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で高値を示し、第２群で低値を示した。２以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３５００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｊ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｊ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｊ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｉ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３５００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。【０３０４】
１２．マーカー物質（ｋ）の特定
画分１において、銅修飾チップＩＭＡＣ３０を用いた場合に、質量／電荷比が３５５９（平均値）のイオンピークが検出された。図１７に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で高値を示し、第２群で低値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３５６０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｋ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｋ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｋ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｋ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３５６０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。【０３０５】
１３．マーカー物質（ｌ）の特定
画分４において、銅修飾チップＩＭＡＣ３０を用いた場合に、質量／電荷比が４１８４（平均値）のイオンピークが検出された。図１８に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で高値を示し、第２群で低値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４１８０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｌ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｌ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｌ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｌ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４１８０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。【０３０６】
１４．マーカー物質（ｍ）の特定
画分５において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が１２７８６（平均値）のイオンピークが検出された。図１９に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で高値を示し、第２群で低値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１２８００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｍ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｍ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｍ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｍ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１２８００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。【０３０７】
１５．マーカー物質（ｎ）の特定
画分４において、陽イオン交換チップＣＭ１０を用いた場合に、質量／電荷比が６５７００（平均値）のイオンピークが検出された。図８０に、２１週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第１群で高値を示し、第２群で低値を示した。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６５７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｎ））が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｎ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｎ）の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｎ）の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６５７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
[実施例７]【０３０８】
上記実施例において、分子量から、Ｓ−システイニルトランスサイレチンであると予測されたマーカー物質について以下に同定するスキームを記載する。【０３０９】
糖尿病患者および、対照である健常人の血清由来S-cysteinylatedTTRの精製同定スキームを記す。【０３１０】
（Ａ．イオン交換による精製法）
糖尿病患者および、健常人の血清５００μＬを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０）にて５倍希釈を行い、２０ｋＧ，４℃，１０ｍｉｎ遠心分離処理後、強陰イオン交換カラムであるＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐＱ  ＨＰ  １ｍＬを用いて分画を行った。はじめに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０）にて５ＣＶ洗浄を行い、次いで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０），１６０ｍＭ  ＮａＣｌにて５ＣＶ洗浄を行った。溶出は５０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ４．０）を用いて２ＣＶ行った。溶出サンプルは５倍量のアセトンにてアセトン沈殿を行い、得られた沈殿物を６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ６．８），１％  ＳＤＳ，２０％グリセロール，０．００５％  ＢＰＢ混合溶液２００μＬに溶解しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとした。【０３１１】
（Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製法）
Ａ．の要領で作成した上記サンプルを２０μＬ使用し、ＤＲＣ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＮＴ  Ｇｅｌポリペプチド分析用を用い、定電圧  （１００Ｖ，２．５ｈｒ）にて分画を行った。泳動緩衝液は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ，０．１％  ＳＤＳを用いた。泳動終了後、１０％  ＡｃＯＨ  ｉｎ  ４０％  ＭｅＯＨにて固定化を行い、超純水にて洗浄後、ＣＢＢにて染色を行った。【０３１２】
（Ｃ．ウェスタンブロッティングによる同定法）
Ｂ．の要領でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＣＢＢで染色を行わず、下記の要領でＰＶＤＦ膜にブロッティングを行い、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにより検出を行った。【０３１３】
（１）試薬の調製
・陽極緩衝液
60mM Tris，40mMCAPS，0.1% SDS，pH9.6
・陰極緩衝液
60mM Tris，40mM CAPS，15% MeOH，pH9.6
・Tris - bufferedsaline (TBS)
20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5
・洗浄溶液(TTBS)
20mM    Tris-HCl，500mM NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.5
・ブロッキング緩衝液
ＴＢＳ中5%脱脂乾燥ミルク
・1次抗体溶液
抗human Transthyretin抗体(rabbit IgG 200μg/mL)をTTBSで1000倍希釈（終濃度0.2μg/mL）
・2次抗体溶液
Biotinylated Goat Anti Rabbit IgG(H+L)をTTBSで3000倍希釈
・ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ複合体
Streptavidin 10μLを30mLのTTBSに溶解し、更にビオチン化アルカリホスファターゼ 10μLを加え、2時間、室温でインキュベートする。
・AP発色溶液
25xストックを超純水にて25倍希釈し、AP発色緩衝液を作成する。AP発色緩衝液20mLに対し200μLのAP発色試薬A，200μLのAP発色試薬Bを添加しAP発色溶液とする。【０３１４】
（２）陽極板に陽極緩衝液を湿潤させたろ紙を重ね、その上にメタノールを５分間湿潤させたＰＶＤＦ膜（７×６ｃｍ）を重ね、更にゲルを乗せ、陰極緩衝液を湿潤させたろ紙を重ね、陰極板を乗せ、定電流１０５ｍＡで３０分通電した。
（３）通電後、ＰＶＤＦ膜は超純水に浸し、５分振とうした。
（４）ＰＶＤＦ膜は風乾後、ブロッキング緩衝液にてブロッキングを行った。ブロッキングは室温、にて１時間振とうの条件で行った。
（５）ブロッキング後、ＴＴＢＳに浸し室温にて５分×３回、振とうを行いブロッキング緩衝液の洗浄を行った。
（６）１次抗体溶液に浸し、室温で２時間、振とうを行った。
（７）１次抗体反応後、ＴＴＢＳに浸し室温にて５分×３回、振とうし洗浄を行った。
（８）２次抗体溶液に浸し、室温で２時間、振とうを行った。
（９）（８）の作業中、ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ複合体を作製した。
（１０）２次抗体反応後、ＴＴＢＳに浸し室温にて５分×３回、振とうし洗浄を行った。
（１１）ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ複合体溶液に浸し、室温で２時間、振とうを行った。
（１２）ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ複合体反応後、ＴＴＢＳに浸し室温にて５分×３回、振とうし洗浄を行った。
（１３）ＡＰ発色溶液に浸し、ヒトＴＴＲであることを確認した。【０３１５】
（Ｄ．ゲルからの抽出およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）
ゲルからの抽出は、メタノールと１００ｍＭ  重炭酸アンモニウムの等量混合溶液を用いて脱色を行い、超純水：１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム：ＭｅＣＮ＝２：５：３の比で混合した混合溶液  （１５μＬ）を用いて行った。【０３１６】
得られた抽出液２μＬを金属プレートに乗せ、マトリックスには飽和ＣＨＣＡ  ０．４μＬを用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒにて測定を行った。【０３１７】
（結果）
結果を図２１〜図２４に示す。【０３１８】
（ウエスタンブロッティングによるＴＴＲモノマーの確認）
上記方法にて、１３．８Ｋ付近のタンパク質がTTR抗体を用いて、ＴＴＲモノマーであることを確認した。各誘導体は、モノマー分画に含まれたことも見出した。【０３１９】
上記モノマー分画のＭＳスペクトルは以下の通りである。【０３２０】
理論値：S-cysteinylatedTTR  M/Z=13880.53
還元後TTR         M/Z=13761.41
図２１には、健常人由来S-cysteinylated TTRを示す。測定値：M/Z= 13874.7480。【０３２１】
図２２には、還元処理後の健常人由来S-cysteinylated TTRを示す。測定値：M/Z= 13759.7393。【０３２２】
図２３には、糖尿病患者由来S-cysteinylated TTRを示す。測定値：M/Z= 13871.3320。【０３２３】
図２４には、還元処理後の糖尿病患者由来S-cysteinylated TTRを示す。測定値：M/Z= 13755.6494。【０３２４】
図２５には、TTRの４量体構造とモノマーのアミノ酸配列を示す。このように、トランスサイレチンは、通常４量体構造をとっており、これが崩れていくと糖尿病になると仮定される。【０３２５】
図２６には、ヒトTTRα-ドメインの３次元構造と２次構造配列が示される。表１に示されるタンパク質やペプチドにおける代表的な翻訳後修飾とその質量変化を用いて、質量分析により、誘導体を分析することができる。
[実施例８]【０３２６】
上記実施例において、分子量から、アポリポタンパク質ＣＩＩＩであると予測されたマーカー物質について以下に同定するスキームを記載する。【０３２７】
以下にRat Apolipoprotein CＩＩＩの精製同定スキームを記載する。【０３２８】
（Ａ．イオン交換による精製法）
Ｒａｔ  Ｓｅｒｕｍ  ７５０μＬを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ６．０）にて５倍希釈を行い、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ（０．４５μｍ）フィルターユニットを用いてろ過したものをサンプルとした。得られたサンプルを強陰イオン交換カラムであるＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐＱ  ＨＰ  １ｍＬを用いて分画を行った。はじめに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）にて５ＣＶ洗浄を行い、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ  ＮａＣｌにて１２ＣＶ洗浄を行い、その後５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）にて５ＣＶ洗浄を行った。溶出は５０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅ  （ｐＨ３．０）を用いて２ＣＶ行った。溶出サンプルは１０倍量のアセトンにてアセトン沈殿を行い、得られた沈殿物を６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ６．８），１％  ＳＤＳ，２０％グリセロール，０．００５％  ＢＰＢ混合溶液１００μＬに溶解しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとした。【０３２９】
（Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製法）
Ａ．の要領で作成した上記サンプルを２０μＬ使用し、ＤＲＣ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＮＴ  Ｇｅｌポリペプチド分析用を用い、定電圧（１００Ｖ，２．５ｈｒ）にて分画を行った。泳動緩衝液は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ，０．１％  ＳＤＳを用いた。泳動終了後、１０％  ＡｃＯＨ  ｉｎ  ４０％  ＭｅＯＨにて固定化を行い、超純水にて洗浄後、ＣＢＢにて染色を行った。【０３３０】
（Ｃ．ゲルからの抽出およびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）
ゲルからの抽出は、メタノールと１００ｍＭ重炭酸アンモニウムの等量混合溶液を用いて脱色を行い、超純水：１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム：ＭｅＣＮ＝２：５：３の比で混合した混合溶液（１５μＬ）を用いて行った。【０３３１】
得られた抽出液１５μＬをＣＩＰＨＥＲＧＥＮ  Ｈ５０  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙに乗せ、０．１％  ＴＦＡ  ５μＬにて２回洗浄を行い、マトリックスには２５％  ＳＰＡ  ０．５μＬを２回乗せて測定を行った。【０３３２】
（Ｄ．ゲル内消化による同定法）
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて分子量を測定したサンプルについてゲル内消化を行い、同定を行った。  （下記プロトコールを参照）
（１）反応溶液の調整
還元溶液の調整＜用事調整＞
・ＤＴＴ  （１．５ｍｇ）を１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム（１ｍＬ）に溶解する。
アルキル化溶液の調整＜用事調整＞
・ヨードアセトアミド（１０ｍｇ）を１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム（１ｍＬ）に溶解する。
トリプシン溶液の調整＜用事調整＞
・トリプシン（２０μｇ）を５０ｍＭ  酢酸（０．１ｍＬ）に溶解し、トリプシン保存液とする。トリプシン保存液（２５μＬ）に超純水（２００μＬ），１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム（５００μＬ），ＭｅＣＮ（３００μＬ）を加え、トリプシン溶液とする。
（２）バンドを切り出し、５００μＬのチューブに入れる。
（３）メタノールと１００ｍＭ  重炭酸アンモニウムの等量混合溶液を１００μＬ加え脱色する。
（４）還元溶液を１００μＬ加え、３０分インキュベートする。
（５）アルキル化溶液を１００μＬ加え、３０分インキュベートする。
（６）トリプシン溶液を１５μＬ加え、３７℃で一晩インキュベートする。
（７）１／１０倍量の１％  ＴＦＡを加え、反応を停止する。【０３３３】
消化サンプル１μＬを金属プレートに乗せ、マトリックスには飽和ＣＨＣＡ  ０．４μＬを用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒにて測定を行った。【０３３４】
（得られたデータについて）
Ｍａｓｃｏｔ（http://www.matrixscience.com/search_form_select.html）のデータベースサーチを行い、ラットアポリポタンパク質ＣＩＩＩであると同定した。その結果を図２７および図２８に示す。【０３３５】
図２７は、同定したバンドのゲル写真と、そのバンドのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによる分析を示す。【０３３６】
図２８は、同定したバンドのゲル写真と、そのバンドのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによる分析を示す。【０３３７】
同様のマーカーがヒトにおいて存在することを以下のようにして確認した。【０３３８】
精製レジンの選択およびレジンへの至適吸着条件の検討を行った。【０３３９】
使用ProteinChips     Q10 及び CM10
検討pH       pH 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，7.0
使用Buffer
pH3.0   : 50mM Na-Citrate Buffer
pH3.5~5.5       : 50mM Na-Acetate Buffer
pH7.0   : 50mM HEPES Buffer
図２９には、ヒトアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（０〜２）のスポットであると考えられる二次元電気泳動上のスポットを示す。【０３４０】
図３０には、各スポットの質量分析の結果を示す。【０３４１】
図３１には、各スポットのＳＥＬＤＩ−ＭＳの結果を示す。【０３４２】
図３２から図３４には、上記至適吸着条件検討の結果を示す。図３２には、ＣＭ１０の検討結果を示し、図３３には、Ｑ１０の検討結果を示す。図３４は、至適条件検討結果を示す。これらの結果から、得られたスポットが、ヒトアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（０〜２）のスポットであることが明らかになる。
[実施例９]【０３４３】
（Ｓ−システイニル化トランスサイレチンは糖化ヘモグロビン（Ｓａｃｃｈａｒｉｃ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ；ＨｂＡ１ｃ）値による重症度評価においても相関する）
上記のようにして同定したＳ−システイニル化トランスサイレチンが糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）値による重症度評価においても相関性を示すことを本実施例において示した。ＨｂＡ１ｃは、現在最も信頼性のある糖尿病マーカーとして用いられている。【０３４４】
まず、上記実施例に記載されるプロトコールを用いて、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８６３，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係を確認した。【０３４５】
測定条件および統計値
ＩＭＡＣ３０：キレート金属（Ｃｕ）固定化チップ、
Ｆｒ４    ：図  血清の発現解析プロトコール参照。【０３４６】
ＣＨＣＡ：ＭＳ測定マトリックス
測定値  ：Ｍ／Ｚ：１３，８６３，
Ｐ−Ｖａｌｕｅ：  ０．０００４，ＲＯＣ  ａｒｅａ：０．８６。【０３４７】
結果を図３５に示す。図３５には、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８６３，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係を示す。縦軸：  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで測定したＳ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ  ＴＴＲのイオン強度；横軸：  Ｃ：コントロール（健常者）、Ｐ：糖尿病患者。【０３４８】
次に、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８７４，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係を測定した。【０３４９】
測定条件および統計値
ＩＭＡＣ３０：キレート金属（Ｃｕ）固定化チップ、
Ｆｒ４    ：図  血清の発現解析プロトコール参照。【０３５０】
ＭＳ測定マトリックス：ＳＰＡ−Ｈ
測定値  ：Ｍ／Ｚ：１３，８７４，
Ｐ−Ｖａｌｕｅ：  ０．００７，ＲＯＣ  ａｒｅａ：０．８２。【０３５１】
図３６に、その結果を示す。図３６には、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８７４，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係が示されており、縦軸：  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで測定したＳ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ  ＴＴＲのイオン強度；横軸：  Ｃ：コントロール（健常者）、Ｐ：糖尿病患者が記載されている。【０３５２】
次に、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８８４，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係を調べた。【０３５３】
測定条件および統計値
ＣＭ１０（ｐＨ７）：弱陽イオン交換チップ（洗浄条件）
Ｆｒ４：図  血清の発現解析プロトコール参照。【０３５４】
ＳＰＡ−Ｈ  ：：  ＭＳ測定マトリックス
測定値  ：Ｍ／Ｚ：  １３８８４，
Ｐ−Ｖａｌｕｅ：  ０．０００５，ＲＯＣ  ａｒｅａ：  ０．９０
その結果を図３７に示す。図３７には、糖尿病患者におけるＳ−システイニル化トランスサイレチン（測定値：Ｍ／Ｚ＝１３，８８４，理論値：  Ｍ／Ｚ＝１３８８０．５３）のイオン強度とＨｂＡ１ｃ値の関係が示される。縦軸：  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで測定したＳ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ  ＴＴＲのイオン強度；横軸：  Ｃ：コントロール（健常者）、Ｐ：糖尿病患者。【０３５５】
次に、糖尿病患者におけるＭ／Ｚ：１３，８６３の実測データを示す（図３８）。【０３５６】
このように、Ｓ−システイニル化トランスサイレチンの挙動は、糖尿病の指標であることが判明し、しかもその重症度に相関していることも明らかになった。
[実施例１０]【０３５７】
（アポリポタンパク質は良好な事前診断マーカーである。）
本実施例において、上記実施例において、予防(事前）マーカーと予測した8.3Kは、Apo CIIと同定した。【０３５８】
（ラットアポリポタンパク質Ｃ２の精製同定スキーム）
（A．イオン交換による精製法）
ラット血清７５０μＬを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ６．０）にて５倍希釈を行い、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ（０．４５μｍ）フィルターユニットを用いてろ過したものをサンプルとした。得られたサンプルを強陰イオン交換カラムであるＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐＱ  ＨＰ  １ｍＬを用いて分画を行った。はじめに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）にて５ＣＶ洗浄を行い、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ  ＮａＣｌにて１２ＣＶ洗浄を行い、その後５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）にて５ＣＶ洗浄を行った。溶出は５０ｍＭ  Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．０）を用いて２ＣＶ行った。溶出サンプルは１０倍量のアセトンにてアセトン沈殿を行い、得られた沈殿物を６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１％  ＳＤＳ，２０％グリセロール，０．００５％  ＢＰＢ混合溶液１００μＬに溶解しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとした。【０３５９】
（Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製法）
Ａ．の要領で作成した上記サンプルを２０・Ｌ使用し、ＤＲＣ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＮＴ  Ｇｅｌポリペプチド分析用を用い、定電圧（１００Ｖ，２．５ｈｒ）にて分画を行った。泳動緩衝液は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ，０．１％  ＳＤＳを用いた。泳動終了後、１０％  ＡｃＯＨ  ｉｎ  ４０％  ＭｅＯＨにて固定化を行い、超純水にて洗浄後、ＣＢＢにて染色を行った
（Ｃ．ゲルからの抽出およびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）
ゲルからの抽出は、メタノールと１００ｍＭ  重炭酸アンモニウムの等量混合溶液を用いて脱色を行い、超純水：１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム：ＭｅＣＮ＝２：５：３の比で混合した混合溶液（１５μＬ）を用いて行った。【０３６０】
得られた抽出液１５μＬをＣＩＰＨＥＲＧＥＮ  Ｈ５０  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙに乗せ、０．１％  ＴＦＡ  ５μＬにて２回洗浄を行い、マトリックスは２５％  ＳＰＡ  ０．５μＬを２回乗せて測定を行った。【０３６１】
（Ｄ．ゲル内消化による同定法）
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて分子量を測定したサンプルについてゲル内消化を行い、同定を行った。  （下記プロトコールを参照）
（１）反応溶液の調整
還元溶液の調整＜用事調整＞
・ＤＴＴ  （１．５ｍｇ）を１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム（１ｍＬ）に溶解する。
アルキル化溶液の調整＜用事調整＞
・ヨードアセトアミド（１０ｍｇ）を１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム（１ｍＬ）に溶解する。
トリプシン溶液の調整＜用事調整＞
・トリプシン（２０μｇ）を５０ｍＭ  酢酸（０．１ｍＬ）に溶解し、トリプシン保存液とする。トリプシン保存液（２５μＬ）に超純水（２００μＬ），１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム（５００μＬ），ＭｅＣＮ（３００μＬ）を加え、トリプシン溶液とする。
（２）バンドを切り出し、５００μＬのチューブに入れる。
（３）メタノールと１００ｍＭ  重炭酸アンモニウムの等量混合溶液を１００μＬ加え脱色する。
（４）還元溶液を１００μＬ加え、３０分インキュベートする。
（５）アルキル化溶液を１００μＬ加え、３０分インキュベートする。
（６）トリプシン溶液を１５μＬ加え、３７℃で一晩インキュベートする。
（７）１／１０倍量の１％  ＴＦＡを加え、反応を停止する。【０３６２】
消化サンプル１μＬを金属プレートに乗せ、マトリックスには飽和ＣＨＣＡ  ０．４μＬを用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒにて測定を行った。【０３６３】
得られたデータについて
Ｍａｓｃｏｔ（http://www.matrixscience.com/search_form_select.html）のデータベースサーチを行い、Ｒａｔ  Ｓｉｍｉｌｅｒ  ｔｏ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ２であると同定した。【０３６４】
（Ｅ．ウェスタンブロッティングによる同定法）
Ｂ．の要領でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＣＢＢで染色を行わず、下記の要領でＰＶＤＦ膜にブロッティングを行い、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，１７０−６４１２，Ｌｏｔ  ３００００２０８７により検出を行った。
（１）試薬の調製
・陽極緩衝液
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，４０ｍＭ  ＣＡＰＳ，０．１％  ＳＤＳ，ｐＨ９．６
・陰極緩衝液
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，４０ｍＭ  ＣＡＰＳ，１５％  ＭｅＯＨ，ｐＨ９．６
・Ｔｒｉｓ  -  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ  （ＴＢＳ）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５
・洗浄溶液（ＴＴＢＳ）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ  ７．５
・ブロッキング緩衝液
ＴＢＳ中５％  脱脂乾燥ミルク
・１次抗体溶液
Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｔｉ  Ａｐｏ  Ｃ２  （Ｑ−２０）  Ｇｏａｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ，ｓｃ−１９０１４，Ｌｏｔ  Ｃ１９０４をＴＴＢＳで１０００倍希釈（終濃度０．２μｇ／ｍＬ）
・２次抗体溶液
Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  Ｂｉｏｔｉｎ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，８１−１６４０，Ｌｏｔ  ５０４９４３２８をＴＴＢＳで３０００倍希釈
・ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ複合体
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  １０μＬを３０ｍＬのＴＴＢＳに溶解し、更にビオチン化アルカリホスファターゼ１０μＬを加え、２時間、室温でインキュベートする。
・ＡＰ発色溶液
２５ｘストックを超純水にて２５倍希釈し、ＡＰ発色緩衝液を作成する。ＡＰ発色緩衝液２０ｍＬに対し２００μＬのＡＰ発色試薬Ａ，２００μＬのＡＰ発色試薬Ｂを添加しＡＰ発色溶液とする。
（２）陽極板に陽極緩衝液を湿潤させたろ紙を重ね、その上にメタノールを５分間湿潤させたＰＶＤＦ膜（７×６ｃｍ）を重ね、更にゲルを乗せ、陰極緩衝液を湿潤させたろ紙を重ね、陰極板を乗せ、定電流１０５ｍＡで３０分通電した。
（３）通電後、ＰＶＤＦ膜は超純水に浸し、５分振とうした。
（４）ＰＶＤＦ膜は風乾後、ブロッキング緩衝液にてブロッキングを行った。ブロッキングは室温、にて１時間振とうの条件で行った。
（５）ブロッキング後、ＴＴＢＳに浸し室温にて５分×３回、振とうを行いブロッキング緩衝液の洗浄を行った。
（６）１次抗体溶液に浸し、室温で２時間、振とうを行った。
（７）１次抗体反応後、ＴＴＢＳに浸し室温にて５分×３回、振とうし洗浄を行った。
（８）２次抗体溶液に浸し、室温で２時間、振とうを行った。
（９）（８）の作業中、ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ  ｃｏｍｐｌｅｘ作成した。
（１０）２次抗体反応後、ＴＴＢＳに浸し室温にて５分×３回、振とうし洗浄を行った。
（１１）ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ  ｃｏｍｐｌｅｘ溶液に浸し、室温で２時間、振とうを行った。
（１２）ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ  ｃｏｍｐｌｅｘ反応後、ＴＴＢＳに浸し室温にて５分×３回、振とうし洗浄を行った。
（１３）ＡＰ発色溶液に浸し確認した。【０３６５】
（F．抗体チップ（CIPHERGENPS10/PS20 ProteinChipArray）を用いた同定法）
Cの要領により抽出したサンプルについて、抗体チップを用いて同定を行った。（下記プロトコールを参照）
（１）試薬の調整
ブロッキング緩衝液：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０  ＋  １４０ｍＭ  ＮａＣｌ
洗浄緩衝液１：０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ／  ＰＢＳ
洗浄緩衝液２：１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ／  ＰＢＳ  ＋  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ
（２）５０％  ＭｅＣＮ  ２００μＬを各スポットにａｐｐｌｙし、１ｍｉｎ，ＲＴ，静置する（ＰＳ１０のみ）。
（３）ＭｅＣＮを除去しＰＢＳ  ２００μＬを各スポットにａｐｐｌｙし、１ｍｉｎ，ＲＴ，静置する（ＰＳ１０のみ）。
（４）ＰＢＳを除去し１２５μｇ／ｍＬ  １００μＬのプロテインＡ溶液を各スポットにａｐｐｌｙし、４℃にて一晩静置する。
（５）プロテインＡ溶液＜ＳＩＧＭＡ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｐ７８３７−５ＭＧ，Ｌｏｔ  ０７４Ｋ１０３２１＞を除去し、ブロッキング緩衝液  ２００μＬをａｐｐｌｙし、３０ｍｉｎ，ＲＴ（室温），静置する。
（６）ブロッキング緩衝液を除去し洗浄緩衝液１  ２００μＬをａｐｐｌｙし、５ｍｉｎ，ＲＴ，静置する（２ｔｉｍｅｓ）。
（７）洗浄緩衝液１を除去し、抗体溶液＜Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｔｉ  Ａｐｏ  Ｃ２  （Ｑ−２０）  Ｇｏａｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ，ｓｃ−１９０１４，Ｌｏｔ  Ｃ１９０４＞をＰＢＳにて終濃度３０μｇ／ｍＬになるように希釈し、抗体溶液  １００μＬをａｐｐｌｙし２ｈｒ，ＲＴ，振とうを行う。
（８）抗体溶液を除去し、洗浄緩衝液１  ２００μＬをａｐｐｌｙし、５ｍｉｎ，ＲＴ，振とうを行う（２ｔｉｍｅｓ）。
（９）洗浄緩衝液１を除去し、ＰＢＳ  ２００μＬをａｐｐｌｙし、５ｍｉｎ，ＲＴ，振とうを行う。
（１０）ＰＢＳを除去し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７．５）  ２００μＬをａｐｐｌｙし、３０ｓｅｃ，ＲＴ，振とうを行う。
（１１）ＨＥＰＥＳを除去し、抗原溶液２０μＬをａｐｐｌｙし、２ｈｒ，ＲＴ，振とうを行う。
（１２）抗原溶液を除去し、洗浄緩衝液２  ２００μＬをａｐｐｌｙし、３ｍｉｎ，ＲＴ，振とうを行う（２ｔｉｍｅｓ）。
（１３）洗浄緩衝液２を除去し、ＰＢＳ  ２００μＬをａｐｐｌｙし、３ｍｉｎ，ＲＴ，振とうを行う。
（１４）ＰＢＳを除去し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７．４）  ２００μＬをａｐｐｌｙ、３０ｓｅｃ，ＲＴ（室温），振とうを行う。
（１５）ＨＥＰＥＳを除去し、風乾後、ＥＡＭ  （５０％  ＳＰＡ  ０．５μＬ×２ｔｉｍｅｓ）をａｐｐｌｙし、測定を行う。【０３６６】
また、その結果を図３９および図４０に示す。【０３６７】
図３９には、糖尿病ラット血清    8.3K  (Apo CII) 箱髭図を示す。【０３６８】
図４０には、上記の時系列データを示す。アポＣＩＩが良好な事前診断マーカーであることが明らかになった。【０３６９】
図４１〜４３には、得られた血清が、ラットのアポリポタンパク質ＣＩＩであることを示す結果が示されている。図４１は、ゲル上のバンドのＳＥＬＤＩ−ＭＳの結果を示す。図４２には、得られたバンドのウェスタンブロットによる確認を示す。図４３には、クロマトグラフィーによる分画において抗ＡｐｏＣ２抗体により増強される様子を示す。【０３７０】
図４４から図４７は、ヒトにおけるアポリポタンパク質ＣＩＩもまた事前診断マーカーであることを実証する。
[実施例１１：スクリーニング]【０３７１】
まず、本発明において見出されたマーカー物質に変動（好ましくは、正常化）させる可能性のある物質を、スクリーニングする。【０３７２】
本実施例では、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における該マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する。
[実施例１２：ヒトでのスクリーニング]【０３７３】
実施例１１で動物モデルで糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果が見られた物質について、実際にヒト被験体においても効果があるかを評価する。これは、通常の治験と同様の手続に則って行う。【０３７４】
このようなスクリーニングにより、動物において実際に糖尿病を診断することができることが理解される。
[実施例１３：  健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカー物質とを示差的に識別することができる抗体の作製]
上述の実施例において、糖尿病のマーカー物質であることが明らかになったトランスサイレチンには、非修飾のものと、アミノ酸配列中に唯一存在するシステイン残基において修飾されたものがある。その修飾には、システイニル化の他に、スルホニル化やグルタチオン化、ホモシステイニル化等が知られているが、上記実施例において糖尿病のマーカーとして、システイニル化トランスサイレチンが見出された。【０３７５】
本実施例では、このシステイニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しないような系を作ることを目的とした。【０３７６】
抗原としているペプチド（特にＣｙｓ残基近傍）の配列はヒトと代表的な免疫動物との間でよく保存されており、トランスサイレチンは血清に多く含まれることから、普通に免役しても抗体はできにくいと考えられることから、Ｃｈｉｏｍｅ社のＡＤＬｉｂ（登録商標）の技術を用いることにした。システイン残基付近のアミノ酸配列のアライメントを以下に示す。
[Homo sapiens]        GPTGTGESKCPLMVK  （配列番号２５）
[Musmusculus]         GPAGAGESKCPLMVK  （配列番号２６）
[Rattusnorvegicus]    GPGGAGESKCPLMVK  （配列番号２７）
[GallusGallus]     APLVSHGSVDSKCPLMVK  （配列番号２８）
（材料および方法）
使用した抗原は以下のとおりである。抗体作製は、Ｃｈｉｏｍｅ社（東京、文京）に依頼して行った。【０３７７】
（抗原）
ペプチドの元となるタンパクの名前と由来：  トランスサイレチン（transthyretin, human）
長さ：  １５残基
ペプチド配列：  GPTGTGESKCPLMVK（トランスサイレチンのＮ末端の最初のアミノ酸残基から１５残基；配列番号２５）
修飾：ペプチド中のCys残基がジスルフィド結合によりフリーのシステインと結合している（システイニル化修飾されている）。【０３７８】
（抗原調製方法）
抗原は、常法に基づいて調製した。【０３７９】
以上の手法を行った結果、各ペプチド（Ｃｙｓ化ペプチド、非修飾ペプチド両方とも）が、約２０ｍｇ生成された。これを、ミリＱ（蒸留水）中に溶解し、この溶液を−８０℃で保存し、各４ｍｇ程度に分注した。【０３８０】
（抗体調製方法）
抗体セレクションプロセスの概略を以下に示す。【０３８１】
（磁気ビーズ作製）
まず、磁気ビーズへの抗原固定を行った。磁気ビーズにシステイニル化トランスサイレチン部分ペプチドを固定しセレクションを行った後、1週間後に培養上清を用いてシステイニル化トランスサイレチン部分ペプチドと非システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドに対してELISAを行った。【０３８２】
（ライブラリーからの抗体セレクション）
（抗体選抜方法）
抗体選抜方法は、原理的には、特開２００６−１４９３８３号に記載される方法に従った。手短には、免疫グロブリン遺伝子座において体細胞組換えを誘発させ、種々のイムノグロブリン分子を産生しているＤＴ４０細胞集団（ＷＯ２００４／０１１６４４を参照）の中から、ストレプトアビジンに特異的に結合する抗体分子を選別することによって行った。以下に詳細に説明する。【０３８３】
（ストレプトアビジンに特異的に結合する抗体の選別）
（培養細胞）
ＤＴ４０細胞は、５％のＣＯ２恒温槽にて５％のＣＯ２、３９．５℃で培養した。培地は、ＩＭＤＭ培地（Invitrogen社）を用い、１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ，２−メルカプトエタノール５５μＭを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、メタノールに５ｍｇ／ｍｌに溶解したものをストックとし、最終濃度が２．５ｎｇ／ｍｌとなるよぅに適宜培地で希釈して用いた。細胞濃度は１０５〜１０６個／ｍｌに保ちながら培養を続けた。【０３８４】
（ストレプトアビジン磁気ビーズの作製）
磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ(Dynal社)を、また磁気スタンドはＤｙｎａｌＭＰＣ(Dynal社)を用いた。ビーズ２００μｌを５００μｌの緩衝液Ａ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で３回洗った後、緩衝液Ａ、４００μｌ中で２４０μｇのストレプトアビジン（ナカライテスク社）と３７℃で２４時間、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズを緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ）５００μｌで２回洗浄した。その後緩衝液Ｄ（０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５，０．１％ＢＳＡ）５００μｌを加え、３７℃で４時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後５００μｌの緩衝液Ｃで２回洗浄した後、０．０２％アジ化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ、４００μｌに懸濁した。【０３８５】
（ウサギＩｇＧ磁気ビーズの作製）
磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ(Dynal社)を、また磁気スタンドはＤｙｎａｌＭＰＣ(Dynal社)を用いた。ビーズ２００μｌを５００μｌの緩衝液Ａ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で３回洗った後、緩衝液Ａ、２００μｌ中で１２０μｇのウサギＩｇＧ(SIGMA社)と３７℃で一晩、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズを緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ）２００μｌで２回洗浄した。その後緩衝液Ｄ（０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５，０．１％ＢＳＡ）２００μｌを加え、３７℃で４時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後５００μｌの緩衝液Ｃで２回洗浄した後、０．０２％アジ化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ、２００μｌに懸濁した。【０３８６】
（ストレプトアビジン磁気ビーズおよびウサギＩｇＧ磁気ビーズによるセレクション）
トリコスタチンＡ、２．５ｎｇ／ｍｌで７週間処理した野生型ＤＴ４０細胞約５×１０７個を洗浄緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）１０ｍｌで１回、さらに１ｍｌで一回洗浄したのち、１ｍｌの洗浄緩衝液中でストレプトアビジン磁気ビーズ（ウサギＩｇＧ磁気ビーズによるセレクションの場合はウサギＩｇＧ磁気ビーズ）５×１０６個と混合し、４℃で３０分間、穏やかに回転させつつインキュベートした。その後１ｍｌの洗浄緩衝液で５回洗浄した。最後に、磁気ビーズに結合した細胞を５００μｌに懸濁し、これを３０ｍｌの培地に加えたのち、９６穴プレートに３００μｌずつ分注し、３９．５℃で培養した。１週間後、培養上清でＥＬＩＳＡを行った。【０３８７】
（２枚のプレートによるＥＬＩＳＡ）
２枚の９６穴イムノプレート・マキシソープ（NalgeNunc社）を用意し、それぞれに５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ナカライテスク）およびオボアルブミン（Sigma社）（いずれもＰＢＳに溶解）を２００μｌ加え、室温で一晩放置してプレートに固定した（ウサギＩｇＧ磁気ビーズによるセレクションの場合は、ウサギＩｇＧ（SIGMA社）および卵白リゾチーム（SIGMA社）を用いた）。その後０．５％スキムルク２００μｌにより室温で１時間ブロッキングし、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。ここに細胞培養上清１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。なお、ここで培養上清は、同じものをストレプトアビジン固定プレートとオボアルブミン固定プレートの両方に（ウサギＩｇＧ磁気ビーズセレクションの場合はウサギＩｇＧ固定プレートと卵白リゾチーム固定プレート）１００μｌずつ分注した。その後ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液２００μｌで５回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ニワトリＩｇＭ抗体（Bethyl社）をＰＢＳにより２０００倍に希釈して１００μｌずつ加えた。室温で４５分間反応後、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で５回洗浄し、その後ＴＭＢ＋（Dako社）を１００μｌ加え、室温で４分間反応させた後、１Ｎ硫酸１００μｌにより反応を停止させた。定量は、mＱｕａｎｔＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Bio-TekInstruments社）により４５０ｎｍの吸光を測定して行った。【０３８８】
ＥＬＩＳＡの結果は、ストレプトアビジンに反応する抗体のＯ．Ｄ．値で示すと共に、同じクローンのオボアルブミンとの反応性に関するＥＬＩＳＡの結果を同時に示すことによって評価する。【０３８９】
ストレプトアビジンに対し高い親和性を示しているクローンはいずれもオボアルブミンに対しても強く反応しているため、ストレプトアビジンに対する親和性のみを指標に選別を行うと、どのようなリガンドにも非特異的に結合する抗体を選別する確率が極めて高いことが実験的に明らかになった。一方、この方法を用いれば、こうした非特異的な抗体を当初から効率的に除外できることが確認された。実際、ストレプトアビジン単独でアッセイを行うと２８クローンが候補として選別されるが、そのほとんどがオボアルブミンに対しても強く結合する。そのようなクローンを除外することにより、即座に１クローンに限定することが可能である。【０３９０】
（２．特異性の確認）
（ストレプトアビジン特異性検証のためのＥＬＩＳＡ用培養上清の作製）
さらなる特異性をＥＬＩＳＡにより解析するのに用いた培養上清は、血清由来のＩｇＭ等を除去するため、以下のようにして調製した培地を用いた。ニワトリ血清（Invitrogen社）から５０％飽和硫安によりイムノグロブリンを沈殿として除去し、上清をＰＢＳに透析した。透析により生じた体積増加をＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ（Amicon社）による濃縮で補正し、抗体除去ニワトリ血清とした。これをＡＩＭ−Ｖ無血清培地（Invitrogen社）に６％の濃度で加えた。ここに約１０６／ｍｌの濃度で細胞を加え、２日培養し、培養上清をとりＥＬＩＳＡを行った。【０３９１】
（ストレプトアビジン特異性検証のためのＥＬＩＳＡ）
９６穴イムノプレート・マキシソープに５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン、オボアルブミン、ヒトＩｇＧ（Sigma社）、また０．５％スキムミルク（Difco社）（いずれもＰＢＳに溶解）を２００μｌ加え、室温で一晩放置してプレートに固定した。その後０．５％スキムルク２００μｌにより室温で１時間ブロッキングし、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液２００μｌで３回洗浄した。ここに細胞培養上清を１倍から３，１２５倍まで、６段階に５倍ずつ希釈したものを１００μｌ加え、室温で１時間反応させた。なお、ここで用いたクローンは、さきのＳＤ１０を一度限界希釈して得られたクローンＳＤ１０−１を用いた。その後ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液２００μｌで５回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ニワトリＩｇＭ抗体をＰＢＳにより２，０００倍に希釈して１００μｌずつ加えた。室温で４５分間反応後、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で５回洗浄し、その後ＴＭＢ＋を１００μｌ加え、室温で４分間反応させた後、１Ｎ硫酸１００μｌにより反応を停止させた。定量は、mＱｕａｎｔ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒにより４５０ｎｍの吸光を測定して行った。【０３９２】
（結果）
（ELISAによる特異性検討）
システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドと非システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドへの反応性比較を行った。【０３９３】
その結果、システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドに対して反応するクローンの殆どは、非システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドに対しても同様に反応したが、そのうち2クローンに関して、両ペプチドに対する反応性が若干ことなるものが得られた。【０３９４】
さらに選抜を進めると、Ｃｙｓ化ペプチド特異的抗体を作製することができる。したがって、システイニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しない抗体を作製することができる。そのためには、本実施例において用いた抗原ペプチド（Ｃｙｓ化ペプチド）に反応し、非修飾の同じ配列のペプチドには反応しないようなものを選抜することによって得ることができることが見出された。
[実施例１４：Ａｓｐ修飾ＴＴＲペプチドを用いた抗体製造]【０３９５】
実施例１３において、抗原としてＡｓｐ修飾ＴＴＲペプチドを用いて同様の抗体製造を実施した。【０３９６】
使用した、抗原は以下のとおりである。【０３９７】
【化１】
0005688829.tif 000010
【０３９８】
これを、「ImjectImmunogen EDC Kit with BSA 」（PIERCE社）を用いてBSAへコンジュゲーションし、実施例１３に記載される手順に従って抗体を製造した。【０３９９】
実施例１３に記載されるようにその結果を調査することにより、Ｃｙｓ化ペプチド特異的抗体を作製することができる。したがって、システイニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しない抗体を作製することができる。
[実施例１５：ＨｕＣＡＬを用いた抗体製造]【０４００】
上述の実施例において、糖尿病のマーカー物質であることが明らかになったトランスサイレチンには、非修飾のものと、アミノ酸配列中に唯一存在するシステイン残基において修飾されたものがある。その修飾には、システイニル化の他に、スルホニル化やグルタチオン化、ホモシステイニル化等が知られているが、上記実施例において糖尿病のマーカーとして、システイニル化トランスサイレチンが見出された。【０４０１】
本実施例では、このシステイニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しないような別の系を作ることを目的とした。【０４０２】
抗原としているペプチド（特にＣｙｓ残基近傍）の配列はヒトと代表的な免疫動物との間でよく保存されており、トランスサイレチンは血清に多く含まれることから、普通に免役しても抗体はできにくいと考えられることから、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社（ドイツ）のＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（登録商標）、ＨｕＣＡＬ（登録商標）、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）、ＡｕｔｏＰａｎ（登録商標）、およびＡｕｔｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）技術を用いることとした。
システイン残基付近のアミノ酸配列のアライメントを以下に示す。
[Homosapiens]         GPTGTGESKCPLMVK  （配列番号２５）
[Musmusculus]         GPAGAGESKCPLMVK  （配列番号２６）
[Rattusnorvegicus]    GPGGAGESKCPLMVK  （配列番号２７）
[GallusGallus]     APLVSHGSVDSKCPLMVK  （配列番号２８）
（材料および方法）
使用した抗原は以下のとおりである。抗体作製は、ＧｅｎｅＦｒｏｎｔｉｅｒ社（東京、中央）に依頼して行った。【０４０３】
（抗原）
ペプチドの元となるタンパクの名前と由来：  トランスサイレチン（transthyretin, human）
長さ：  １５残基
ペプチド配列：  TGESKCPLMVK（トランスサイレチンのＮ末端の最初のアミノ酸残基から１５残基;配列番号２５のうち５位〜１５位）
修飾：ペプチド中のCys残基がジスルフィド結合によりフリーのシステインと結合している（システイニル化修飾されている）かあるいはビオチン化されている。【０４０４】
従って、以下の４種類の配列を作製した。【０４０５】
１）Ｂｉｏｔｉｎ−TGESK［C(Cys)]PLMVK-COOH
２）ＮＨ２−TGESK［C(Cys)]PLMVK（biotin）-COOH
３）Ｂｉｏｔｉｎ−TGESKCPLMVK-COOH
４）TGESKCPLMVK-COOH
１）および２）は抗原ペプチドであり、３）および４）はコントロールペプチドである。１）および２）は、純度は９５％以上とし、各々５ｍｇ使用した。コントロールは、純度９０％で、１ｍｇを使用した。【０４０６】
（抗原調製方法）
抗原は、常法に基づいて調製した。【０４０７】
以上の手法を行った結果、各ペプチド（Ｃｙｓ化ペプチド、非修飾ペプチド両方とも）が、約２０ｍｇ生成された。これを、ミリＱ（蒸留水）中に溶解し、この溶液を−８０℃で保存し、各４ｍｇ程度に分注した。【０４０８】
（抗体調製方法）
（一次スクリーニング）
原理的には、ＡｕｔｏＰａｎ（登録商標）を用いて一時スクリーニングを行った。【０４０９】
使用したファージライブラリーは、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）であり、これは、ヒト型Ｆａｂ抗体を表面に発現させたファージライブラリーである。１５０億種類を超える多様なＦａｂを持つファージが含まれている。ヒトのコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ；ＷＯ９７／０８３２０；Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５５、２０００）から得られる。この手法は、（ポリ）ペプチドライブラリーの作製に適当な１つまたは複数の（ポリ）ペプチド配列をコードする１つまたは複数の核酸配列を組み立てる方法であって、（ポリ）ペプチド配列がアミノ酸コンセンサス配列を含むものであり、以下の段階を含む方法：（ａ）少なくとも３つの相同蛋白質のコレクションから、少なくとも１つのアミノ酸コンセンサス配列を含む１つまたは複数の（ポリ）ペプチド配列を導き出す段階；（ｂ）選択的に、該（ポリ）ペプチド配列内、または該（ポリ）ペプチドもしくは他の（ポリ）ペプチド配列の間においてアミノ酸の間の好ましくない相互作用を除去するため修飾される、該（ポリ）ペプチド配列内のアミノ酸を同定する段階（ｃ）各々の該（ポリ）ペプチド配列の中で、少なくとも１つの構造的サブ要素を同定する段階；（ｄ）各々の該（ポリ）ペプチド配列を、対応する核酸コード配列に逆翻訳する段階；（ｅ）該サブ要素をコードするサブ配列の末端に隣接する領域または末端の間にある領域に切断部位を組み立てる段階で、該切断部位の各々が、（ｅａ）各々の該核酸コード配列内では唯一であり；（ｅｂ）すべての該核酸コード配列の対応するサブ配列に共通であるという特徴を有する。【０４１０】
このように得たライブラリーについて、抗原を固相化し、ＨｕＣＡＬ（登録商標）ライブラリーと反応させる。結合したファージの回収（溶出）は、独自のＣｙｓＤｉｓｐｌａｙを利用して行う。一次スクリーニングによって候補抗体を発現しているファージを数百〜数千種類にまで絞り込む。ここでは、特表２００３−５０５０２５に記載される手法に基づいた手法であるＣｙｃＤｉｓｐｌａｙＴＭを用いた。この技術では、ファージに発現される抗体（Ｆａｂ）をジスルフィド結合を解して発現させ、ファージ部分を還元剤により溶出する。そのため、親和性のみに依存した溶出方法に比べて、多くの特異的抗体の選択が可能となる。【０４１１】
あるいは、ファージミドのレスキュー、ファージの増幅および精製は以下のようにして行う。ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂを、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む２×ＴＹ培地（２×ＴＹ−ＣＧ）において増幅させた。ヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３）を３７℃、ＯＤ６００約０．５で感染させた後、２×ＴＹ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシンにおいて遠心および再懸濁した後、細胞を３０℃で一晩増殖させた。ファージを上清からＰＥＧ沈殿させた後（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８）、ＰＢＳ／２０％グリセロールに再浮遊させて、−８０℃で保存した。２回の選別ラウンドのあいだのファージ増殖は以下のように行った：溶出したファージを対数中期ＴＧ１細胞に感染させて、１％グルコースおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加したＬＢ−寒天に播種した。３０℃で一晩インキュベートした後、コロニーを掻き取ってＯＤ６０００．５に調節した。ヘルパーファージを上記のように添加した。【０４１２】
ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）のウェルを、ＰＢＳに溶解して５０μｇ／ｍｌに希釈した（２μｇ／ウェル）ラットまたはヒトＴＩＭＰ蛋白質  によってコーティングした。５％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液によってブロッキングした後、上記のように精製したＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂファージ１〜５×  １０１２個を２０℃で１時間加えた。数回の洗浄段階の後、結合したファージを１００  ｍＭトリエチルアミンによるｐＨ溶出によって放出した後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ  ７．０によって中和した。Ｋｒｅｂｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ２５４：６７、２００１を参照のこと。２〜３ラウンドの選別を行い、上記のように各ラウンドのあいだにファージの増殖を行った。【０４１３】
（二次スクリーニング）
次に、ＥＬＩＳＡによる二次スクリーニングを行う。これは、ＡｕｔｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）を用いて行う。一次スクリーニングで絞り込まれたファージをクローニングし、各々Ｆａｂ抗体を発現させ、抗原特異的なＥＬＩＳＡ陽性クローンを選定する。【０４１４】
選択したＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ１断片のＦａｂコードインサートを、可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×７ＦＳ（Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５５、２０００）にサブクローニングした。選択したＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ１クローンのＤＮＡ調製物を適切な制限酵素によって消化した後、Ｆａｂコードインサートを切り出した。精製したインサートを、ｓｃＦｖ−インサートを既に有する上記制限酵素切断ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×７にサブクローニングすると、Ｆａｂ発現ベクターが作製される。このベクターにおいて発現されたＦａｂは、検出および精製のために二つのＣ−末端タグ（ＦＬＡＧ（商標）およびＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）を有する。【０４１５】
これをＥＬＩＳＡにて選別する。【０４１６】
（候補抗体の生産および精製）
次に、配列決定によりＥＬＩＳＡ陽性クローンが単一クローンであることを確認した後、多量の抗体を生産する。えられたＦａｂ抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。【０４１７】
生産した抗体は、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×９ＦＳによってコードされるＦａｂ断片のＴＧ−１細胞における発現は、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した２×ＴＹ培地１Ｌと共に振とうフラスコ培養において行った。０．５ｍＭ  ＩＰＴＧによって誘導した後、細胞を２２℃で１６時間増殖させた。細胞沈降物のペリプラスム抽出物を調製して、Ｆａｂ断片をＳｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ（登録商標）クロマトグラフィー（ＩＢＡ社、ゲッティンゲン、ドイツ）によって単離した。見かけの分子量は、較正標準物質を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。濃度は、ＵＶ分光光度法によって決定した。【０４１８】
（２．特異性の確認）
（ストレプトアビジン特異性検証のためのＥＬＩＳＡ用培養上清の作製）
さらなる特異性をＥＬＩＳＡにより解析するのに用いた培養上清は、血清由来のＩｇＭ等を除去するため、以下のようにして調製した培地を用いた。ニワトリ血清（Invitrogen社）から５０％飽和硫安によりイムノグロブリンを沈殿として除去し、上清をＰＢＳに透析した。透析により生じた体積増加をＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ（Amicon社）による濃縮で補正し、抗体除去ニワトリ血清とした。これをＡＩＭ−Ｖ無血清培地（Invitrogen社）に６％の濃度で加えた。ここに約１０６／ｍｌの濃度で細胞を加え、２日培養し、培養上清をとりＥＬＩＳＡを行った。【０４１９】
（ストレプトアビジン特異性検証のためのＥＬＩＳＡ）
９６穴イムノプレート・マキシソープに５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン、オボアルブミン、ヒトＩｇＧ（Sigma社）、また０．５％スキムミルク（Difco社）（いずれもＰＢＳに溶解）を２００μｌ加え、室温で一晩放置してプレートに固定した。その後０．５％スキムルク２００μｌにより室温で１時間ブロッキングし、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液２００μｌで３回洗浄した。ここに細胞培養上清を１倍から３，１２５倍まで、６段階に５倍ずつ希釈したものを１００μｌ加え、室温で１時間反応させた。なお、ここで用いたクローンは、さきのＳＤ１０を一度限界希釈して得られたクローンＳＤ１０−１を用いた。その後ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液２００μｌで５回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ニワトリＩｇＭ抗体をＰＢＳにより２，０００倍に希釈して１００μｌずつ加えた。室温で４５分間反応後、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で５回洗浄し、その後ＴＭＢ＋を１００μｌ加え、室温で４分間反応させた後、１Ｎ硫酸１００μｌにより反応を停止させた。定量は、mＱｕａｎｔ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒにより４５０ｎｍの吸光を測定して行った。【０４２０】
評価基準としては、規定のＥＬＩＳＡ陽性（コントロールペプチド）に対して５倍以上のＥＬＩＳＡ比活性が得られるものを５つ選択し（各々２５−５０μｇ）、これらから選択された適切な抗体を生産する。Ｆａｂ抗体の形式化または二価Ｆａｂミニ抗体（Ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付）の形式を選択してもよい。【０４２１】
（結果）
（ELISAによる特異性検討）
システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドと非システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドへの反応性比較を行う。【０４２２】
その結果、システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドに対して反応するクローンの殆どは、非システイニル化トランスサイレチン部分ペプチドに対しても同様に反応するものと示差的に反応するものが得られる。【０４２３】
さらに選抜を進めると、Ｃｙｓ化ペプチド特異的抗体を作製することができる。したがって、システイニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しない抗体を作製することができる。そのためには、本実施例において用いた抗原ペプチド（Ｃｙｓ化ペプチド）に反応し、非修飾の同じ配列のペプチドには反応しないようなものを選抜することによって得ることができる。【０４２４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０４２５】
本発明は、医薬品産業等において利用性を有する。特に、診断薬の製造において産業上の利用可能性を有する。
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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