(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対数増殖期の藻類細胞を凍結させる工程を含む、藻類細胞を用いた遅延発光による化学物質の毒性評価方法であって、
前記凍結させる藻類細胞がＰｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａである、方法。
【請求項２】
前記凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、４．５μｍ以上の大きさの粒子径を有する藻類細胞の数が５０％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凍結させる藻類細胞の粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記凍結させる藻類細胞は、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、
前記粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、前記凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、５５％以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記凍結させる藻類細胞は、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、
前記粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、５０％以上である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結させる藻類細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、
前記粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、前記凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、４６％以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結させる藻類細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、
前記粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、３７％以上である、請求項３又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記対数増殖期の藻類細胞を凍結させる工程の前に、
対数増殖期の藻類細胞を培養液中で培養する工程と、
該藻類細胞を含む培養液を遠心分離する工程と、
遠心分離によって分離した培養上清を藻類細胞から完全に除去する工程と、をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
凍結された前記対数増殖期の藻類細胞を、−８０℃以下の温度で維持する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
凍結された対数増殖期の藻類細胞を含む、藻類細胞を用いた遅延発光による化学物質の毒性評価用キットであって、
前記凍結された藻類細胞がＰｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａである、キット。
【請求項１１】
前記凍結された藻類細胞の数を１００％としたときに、４．５μｍ以上の大きさの粒子径を有する藻類細胞の数が５０％以上である、請求項１０に記載の化学物質の毒性評価用キット。
【請求項１２】
前記凍結された藻類細胞の粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示す、請求項１０又は１１に記載の化学物質の毒性評価用キット。
【請求項１３】
前記凍結された藻類細胞は、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、
前記粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、前記凍結された藻類細胞の数を１００％としたときに、５５％以上である、請求項１２に記載の化学物質の毒性評価用キット。
【請求項１４】
前記凍結された藻類細胞は、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、
前記粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、５０％以上である、請求項１２又は１３に記載の化学物質の毒性評価用キット。
【請求項１５】
前記凍結された藻類細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、
前記粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、前記凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、４６％以上である、請求項１２に記載の化学物質の毒性評価用キット。
【請求項１６】
前記凍結された藻類細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、
前記粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、３７％以上である、請求項１２又は１５に記載の化学物質の毒性評価用キット。
【請求項１７】
前記凍結された藻類細胞は、
対数増殖期の藻類細胞を培養液中で培養する工程と、
該藻類細胞を含む培養液を遠心分離する工程と、
遠心分離によって分離した培養上清を藻類細胞から完全に除去する工程と、
残った藻類細胞を凍結する工程と、を含む方法により調製された藻類細胞である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の化学物質の毒性評価用キット。
【請求項１８】
前記藻類細胞が、−８０℃以下の温度で維持されている、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の化学物質の毒性評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類細胞の調製方法及び化学物質の毒性評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
藻類を用いた化学物質の毒性を評価する場合、液体培養や寒天培地等で維持されている細胞をもとに初代培養及び継代培養を行って藻類細胞を調製し、調製した藻類細胞に被検物質を添加して試験を行う必要がある。しかし、藻類細胞を維持することや、試験のたびに継代培養を行うことは、煩雑で不便である。
【０００３】
この煩雑さを解消するため、凍結した藻類細胞（非特許文献１及び２など）を利用することが可能である。試験の直前に、凍結した藻類細胞を解凍し、解凍した藻類細胞を利用することで、藻類細胞を継代培養することなく、迅速に試験に供することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０６２０２７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】桑野和可、２００２年「藻類の凍結保存」、堀輝三・大野正夫・堀口健雄編「２１世紀初頭の藻学の現況」、日本藻類学会、山形、１０８−１１１頁
【非特許文献２】森史ら、「国立環境研究所微生物系統保存施設の藍藻と緑藻の凍結保存」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｃｕｌｔ．  Ｃｏｌｌ．，  Ｊｕｎｅ  ２００２，  ｐ．４５−５５
【非特許文献３】Ｊ．Ｇ．Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ”，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．３８，  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｐ．８１−８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
凍結する藻類細胞としては、定常期の細胞が通常用いられる。解凍して生存能力のある細胞に調製する時間を少なくでき、さらに脂質等の細胞内物質が細胞保護剤として働くためである（非特許文献３）。
【０００７】
本発明者らは、藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法において、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）テストガイドラインＴＧ２０１に規定されている増殖阻害試験よりも迅速且つ簡便な方法として、藻類の遅延発光を利用した方法を既に開発している（特許文献１）。しかしながら、定常期の藻類細胞を凍結して解凍し培養すると、凍結前の細胞に比べて生長が不良になることを本発明者らは見出した。細胞の生長は遅延発光による毒性評価に影響するため、定常期の藻類細胞を凍結する藻類細胞として使用すると、凍結前の藻類細胞を使用した場合と同等の毒性評価を行うことができないという問題が生ずる。したがって、解凍後の生長が良好な藻類の凍結細胞を調製する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねたところ、凍結する藻類細胞として、対数増殖期の細胞を用いることで、解凍後の藻類細胞が順調に生育することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、対数増殖期の藻類細胞を凍結させる工程を含む、遅延発光による化学物質の毒性評価に用いる藻類細胞の調製方法を提供する。対数増殖期の細胞を凍結させると、解凍後の藻類細胞の生長が良好となり、かつ、凍結前と同等の強さの遅延発光による発光量が得られる。
【００１０】
凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、４．５μｍ以上の大きさの粒子径を有する藻類細胞の数が５０％以上であることが好ましい。また、凍結させる藻類細胞の粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示すことが好ましい。このような藻類細胞を用いることで、解凍後の藻類細胞の生長がさらに良好となり、遅延発光についても凍結前と同等の強さの発光量が得られやすくなる。
【００１１】
また、凍結させる藻類細胞として、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）を用いる場合、バイモーダルな分布を示す粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、５５％以上であることが好ましい。また、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻を用いる場合、バイモーダルな分布を示す粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、５０％以上であることが好ましい。株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻を用いる場合、上記のような粒子径分布の藻類細胞を用いることで、さらに解凍後の藻類細胞の生長が良好となる。
【００１２】
また、凍結させる藻類細胞として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）を用いる場合、バイモーダルな分布を示す粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、４６％以上であることが好ましい。また、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻を用いる場合、バイモーダルな分布を示す粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、３７％以上であることが好ましい。ＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻を用いる場合、上記のような粒子径分布の藻類細胞を用いることで、さらに解凍後の藻類細胞の生長が良好となる。
【００１３】
また、本発明の方法は、対数増殖期の藻類細胞を凍結させる工程の前に、対数増殖期の藻類細胞を培養液中で培養する工程と、該藻類細胞を含む培養液を遠心分離する工程と、遠心分離によって分離した培養上清を藻類細胞から完全に除去する工程と、をさらに含むことが好ましい。培養上清を藻類細胞から完全に除去することで、凍結、解凍による遅延発光パターンへの影響を低減させ、凍結前の細胞と同等の遅延発光パターンが得られやすくなる。
【００１４】
さらに、本発明の方法は、凍結させた前記対数増殖期の藻類細胞を、−８０℃以下の温度で維持する工程を含むことが好ましい。−８０℃以下の温度で維持することにより、凍結中の細胞の損傷を防ぐことができ、解凍後の藻類細胞の生長がより良好となる。
【００１５】
また、本発明は、凍結された対数増殖期の細胞を含む、遅延発光による化学物質の毒性評価用キットを提供する。このようなキットを用いることで、遅延発光による化学物質の毒性評価を簡易迅速に行うことができる。
【００１６】
前記凍結された藻類細胞の数を１００％としたときに、４．５μｍ以上の大きさの粒子径を有する藻類細胞の数が５０％以上であることが好ましく、また、藻類細胞の粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示すことが好ましい。
【００１７】
また、上記毒性評価キットに含まれる凍結された藻類細胞は、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、バイモーダルな分布を示す粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、凍結された藻類細胞の数を１００％としたときに、５５％以上であることが好ましく、バイモーダルな分布を示す粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、５０％以上であることが好ましい。
【００１８】
また、上記毒性評価キットに含まれる凍結された藻類細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）であって、バイモーダルな分布を示す粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、前記凍結された藻類細胞の数を１００％としたときに、４６％以上であることが好ましく、バイモーダルな分布を示す粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、３７％以上であることが好ましい。
【００１９】
また、上記毒性評価キットに含まれる凍結された藻類細胞は、対数増殖期の藻類細胞を培養液中で培養する工程と、該藻類細胞を含む培養液を遠心分離する工程と、遠心分離によって分離した培養上清を藻類細胞から完全に除去する工程と、残った藻類細胞を凍結する工程と、を含む方法により調製された藻類細胞であることが好ましい。
【００２０】
また、上記毒性評価キットに含まれる藻類細胞が−８０℃以下の温度で維持されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の藻類細胞の調製方法によれば、凍結し、解凍した後の藻類細胞の生育が良好であるため、遅延発光による化学物質の毒性評価に際し凍結前の藻類細胞と同様に使用することができる。さらに、本発明の遅延発光による化学物質の毒性評価用キットによれば、簡易迅速に化学物質の毒性評価を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】対数増殖期の緑藻細胞（実施例１）の凍結・解凍後の生長曲線を示すグラフである。
【図２】定常期の緑藻細胞（比較例１）の凍結・解凍後の生長曲線を示すグラフである。
【図３】対数増殖期の凍結・解凍した緑藻細胞（実施例１）及び凍結していない緑藻細胞の遅延発光の発光パターンを表したグラフである。
【図４】対数増殖期の凍結・解凍した緑藻細胞（実施例２）及び凍結していない緑藻細胞の遅延発光の発光パターンを表したグラフである。
【図５】ＮＩＥＳ−３５株の細胞（Ａ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図６】ＮＩＥＳ−３５株の細胞（Ｂ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図７】ＮＩＥＳ−３５株の細胞（Ｃ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図８】ＮＩＥＳ−３５株の細胞（Ｄ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図９】ＮＩＥＳ−３５株の細胞（Ａ）〜（Ｄ）の生細胞を培養した後のそれぞれの粒子数を表すグラフである。
【図１０】ＮＩＥＳ−３５株の細胞（Ａ）〜（Ｄ）の生細胞を培養した後のそれぞれの遅延発光の発光量を表すグラフである。
【図１１】ＡＴＣＣ−２２６６２株の細胞（Ｈ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図１２】ＡＴＣＣ−２２６６２株の細胞（Ｉ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図１３】ＡＴＣＣ−２２６６２株の細胞（Ｊ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図１４】ＡＴＣＣ−２２６６２株の細胞（Ｋ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図１５】ＡＴＣＣ−２２６６２株の細胞（Ｌ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図１６】ＡＴＣＣ−２２６６２株の細胞（Ｍ）の粒子径分布曲線を示したグラフである。
【図１７】ＡＴＣＣ−２２６６２株の細胞（Ｈ）〜（Ｍ）の生細胞を培養した後のそれぞれの粒子数を表すグラフである。
【図１８】ＡＴＣＣ−２２６６２株の細胞（Ｈ）〜（Ｍ）の生細胞を培養した後のそれぞれの遅延発光の発光量を表すグラフである。
【図１９】凍結・解凍した緑藻（比較例２）及び凍結していない緑藻の粒子数を表すグラフである。
【図２０】凍結・解凍した緑藻（比較例２）及び凍結していない緑藻のコロニー生残率を表すグラフである。
【図２１】凍結・解凍した緑藻（比較例２）及び凍結していない緑藻の遅延発光の発光パターンを表したグラフである。
【図２２】凍結・解凍した緑藻（比較例２）及び凍結していない緑藻の発光量（積算値）を表したグラフである。
【図２３】凍結・解凍した緑藻（実施例５）及び凍結していない緑藻の遅延発光の発光パターンを表したグラフである。
【図２４】凍結・解凍した緑藻（実施例５）及び凍結していない緑藻の発光量（積算値）を表したグラフである。
【図２５】比較例２に係る藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法を説明するフローチャートである。
【図２６】実施例５に係る藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、適宜添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。
【００２４】
本発明の調製方法では、対数増殖期の藻類細胞を凍結させることを含む。より具体的に言えば、藻類細胞を対数増殖期まで培養し、培養した藻類細胞を回収し、回収した藻類細胞を凍結して保存する。凍結保存された藻類細胞は解凍され、遅延発光による化学物質の毒性評価に用いられる。
【００２５】
本明細書において「対数増殖期」とは、藻類細胞が一定時間ごとに二分して増殖し、時間に対して細胞数が対数的に増殖する時期をいう。また、「定常期」とは、分裂率と死滅率がほぼ平衡に達し、細胞数がほぼ一定となる時期をいう。
【００２６】
本発明に使用できる藻類細胞としては、例えば、緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ（旧名Ｓｅｌｅｎａｓｔｒｕｍ  ｃａｐｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ  ｓｕｂｓｐｉｃａｔｕｓ（旧名  Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｕｂｓｐｉｃａｔｕｓ））、藍藻（Ａｎａｂａｅｎａ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｏｐｏｌｉｅｎｓｉｓ）、珪藻（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）等の藻類の細胞を用いることができる。一例として緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）は、国立環境研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（以下、場合により「ＮＩＥＳ−３５株」と称する）やアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻（以下、場合により「ＡＴＣＣ−２２６６２株」と称する）を用いることができる。これらの機関に保存されている株は個体間に性質のばらつきが少なく安定しているため好ましい。
【００２７】
藻類細胞を対数増殖期まで培養するには、標準的な方法を用いることができる。例えば、藻類細胞として緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）を用いる場合、温度２５±０．５℃、照度５０〜５５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の条件下で、Ｃ（７５）培地、ＯＥＣＤ培地等の培養液を用い、定常期の細胞を初期細胞密度１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製して７０〜７３時間程度培養することにより、対数増殖期の細胞を得ることができる。対数増殖期の細胞であることは、得られた細胞を一定期間内に３回以上粒子計測装置（ＣＤＡ−５００）を用いて細胞数を計測し、培養時間に対する細胞数を対数表示することにより作成した生長曲線が、ほぼ直線になることにより、確認できる。
【００２８】
培養した対数増殖期の藻類細胞の中でも、本発明の方法に用いる細胞集団として好ましい細胞集団を、細胞の粒子径を指標として判断することができる。本発明の方法には、細胞の粒子径が大きい細胞を凍結させることが好ましい。具体的には、凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、４．５μｍ以上の大きさの粒子径を有する藻類細胞の数が５０％以上であることが好ましく、５３％以上であることがより好ましく、５７％以上であることがさらに好ましい。なお、本明細書において、藻類細胞の「粒子径」とは、電気的検知帯方式粒度分布測定装置により算出される藻類細胞の直径のことをいう。また、凍結させる藻類細胞の粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示すことが好ましい。バイモーダルな分布とは、大きなピークが２つ現れる２相性の分布のことを指す。このような凍結させるのに好ましい細胞は、細胞数計測によって得られたデータから確認できる。
【００２９】
このようにバイモーダルな粒子径分布の藻類細胞を用いることには、以下のような意義があると考えられる。凍結する際の細胞の状態は、解凍後の細胞生長に大きく影響する。凍結保存状態から解凍した細胞が迅速に対数増殖するためには、凍結させる細胞集団が細胞分裂前の大きな細胞集団と、細胞分裂直後の小さな細胞集団の２集団に分かれている状態が好ましい。すなわち、２集団に分かれているということは、細胞分裂が活発に行われている状態であることを示している。
【００３０】
さらに、バイモーダルな粒子径分布を示す藻類細胞の中でもより好ましい細胞集団を、バレー値の粒子径を指標に判断することができる。なお、本明細書において、「バレー値の粒子径」とは、バイモーダルな分布の粒子径分布曲線における２つのピークの間の、細胞数が極小となる粒子径のことをいう。バレー値の粒子径は大きすぎないことが好ましい。バレー値が大きいということは、粒子径の大きさが小さな方の細胞集団の割合が大きい、すなわち、細胞集団の細胞生長が低下した状態であることを示している。その原因として、バイオマス生産に必須である栄養塩、光エネルギー、二酸化炭素等が細胞の増加と共に不足、枯渇すること等が挙げられる。細胞生長が低下した状態で凍結しても、解凍後に細胞がすぐには対数増殖しにくい傾向がある。したがって、バレー値の粒子径は大きすぎないことが好ましい。具体的には、バレー値の粒子径は、約４μｍ〜５μｍであることが好ましい。
【００３１】
藻類細胞としてＮＩＥＳ−３５株を用いる場合も、粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示すことが好ましい。さらに、バイモーダルな粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、５５％以上であることが好ましく、７６％以上であることがより好ましい。また、藻類細胞としてＮＩＥＳ−３５株を用いる場合、バイモーダルな粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、５０％以上であることが好ましく、７２％以上であることがより好ましい。なお、本明細書において、「ピークにおける細胞数」とは、ピークの粒子径をＰμｍとしたときに、Ｐ±０．０２μｍの大きさの粒子径を有する細胞の数のことをいう。また、ＮＩＥＳ−３５株を用いる場合、バレー値は４．５２μｍ未満が好ましく、４．４０μｍ以下であることがより好ましく、４．１２μｍ以下であることがさらに好ましい。
【００３２】
藻類細胞としてＡＴＣＣ−２２６６２株を用いる場合も、粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示すことが好ましい。さらに、バイモーダルな粒子径分布曲線におけるバレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数が、凍結させる藻類細胞の数を１００％としたときに、４６％以上であることが好ましく、４８％以上であることがより好ましい。また、藻類細胞としてＡＴＣＣ−２２６６２株を用いる場合、バイモーダルな粒子径分布曲線の粒子径が大きい方のピークにおける細胞数が、粒子径が小さい方のピークにおける細胞数と粒子径が大きい方のピークにおける細胞数との合計を１００％としたときに、３７％以上であることが好ましく、４１％以上であることがより好ましい。また、ＡＴＣＣ−２２６６２株を用いる場合、バレー値は４．８７μｍ未満が好ましく、４．７８μｍ以下であることがより好ましい。
【００３３】
なお、藻類細胞としてＮＩＥＳ−３５株を用いる場合も、ＡＴＣＣ−２２６６２株を用いる場合も、本発明の方法に用いるのに好ましい細胞集団であるかどうかを、上記で説明した以外の様々な方法で判断できる。
【００３４】
例えば、粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示す場合、バレー値の粒子径より大きい細胞を「細胞大」、バレー値より小さい細胞を「細胞小」として二集団に分け、所定の粒子径と該所定の粒子径における細胞数とを積算した値（粒子径×細胞数）の一集団あたりの積分値（以下、「特徴量」と称する）を、「細胞大」と「細胞小」とで比較し、好ましい細胞集団であるかどうかを判断できる。なお、「所定の粒子径における細胞数」とは、所定の粒子径をＱμｍとしたときに、Ｑ±０．０２μｍの大きさの粒子径を有する細胞の数のことをいう。「細胞大」と「細胞小」の特徴量の合計を１００％としたときに、「細胞大」の特徴量がＮＩＥＳ−３５株の場合は、６４％以上、ＡＴＣＣ−２２６６２株の場合は、５３％以上であることが好ましい。
【００３５】
また、同様に、粒子径分布曲線がバイモーダルな分布を示す場合、バレー値の粒子径より大きい細胞を「細胞大」、バレー値より小さい細胞を「細胞小」と二集団に分け、ピークの粒子径と該ピークにおける細胞数との積算値（ピーク粒子径×細胞数、以下、「特徴量代表値」と称する）を、「細胞大」と「細胞小」とで比較し、好ましい細胞集団であるかどうかを判断できる。「細胞大」と「細胞小」の特徴量代表値比の合計を１００％としたときに、「細胞大」の特徴量代表値比がＮＩＥＳ−３５株の場合は、６１％以上、ＡＴＣＣ−２２６６２株の場合は、４３％以上であることが好ましい。
【００３６】
また、用いる藻類細胞の表面積や藻類細胞の体積からも、本発明の方法に好ましい細胞集団であるかどうかを判断することができる。例えば、藻類細胞の表面積がわかる場合、
【数１】
0005731776.tif 000002
により粒子径の概算値が算出され、上述のように粒子径を指標として、本発明の方法に用いるのに好ましい細胞集団であるかどうかを判断することができる。また、藻類細胞の体積がわかる場合、
【数２】
0005731776.tif 000003
により粒子径の概算値が算出され、上述のように粒子径を指標として、本発明の方法に用いるのに好ましい細胞集団であるかどうかを判断することができる。
【００３７】
培養した細胞を、公知の方法により回収することができる。例えば、遠心して細胞を沈殿させ、沈殿した細胞を培養液と共に回収することができる。対数増殖期の細胞を維持するため、及び、回復培養後の遅延発光パターンを凍結前の細胞と同等にするためには、沈殿させた後の培養上清を完全に除去し、新たな培養液に懸濁することが好ましい。なお、培養上清を完全に除去するには、アスピレーター等で培養上清を吸引し、吸引後、培養上清が目視で確認できない程度に除去すればよい。この後の工程で凍害保護剤を使用する場合、培養液が凍害保護剤液で希釈されるため、細胞を懸濁する培養液は、対数増殖期まで培養するのに用いた培養液よりも少なくすることができる。例えば、対数増殖期まで培養するのに用いた培養液の１００分の１の量の新たな培養液に懸濁することができる。このようにして、解凍後の遅延発光による化学物質の毒性評価に用いる際の対照試料や暴露試料調製時、凍害保護剤の含有割合をより小さくすることが可能となる。凍害保護剤を用いない場合、凍結前に培養した細胞が対数増殖期で維持されていればよく、細胞懸濁液を直接その後の凍結に用いてもよい。
【００３８】
凍結用の細胞懸濁液には、凍害保護剤を添加することができる。凍害保護剤としては、公知の凍害保護剤、例えば、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を用いることができ、凍結前の培養液に５〜１０％、より好ましくは５％の濃度で含有させることができる。適当な濃度の凍害保護剤液を調製し、細胞懸濁液と混合することで、凍害保護剤を添加できる。
【００３９】
調製した細胞懸濁液を適宜室温に放置した後、ディープフリーザー等で徐冷凍結する。細胞懸濁液をクライオチューブ等に入れ、保護材付きフリーザーコンテナに収容したものを緩衝材等で包み、ディープフリーザー等で冷却する。冷却速度は毎分およそ１℃が好ましく、−８０℃以下の温度まで冷却することが好ましい。このように徐冷凍結することが、冷却する過程で細胞の損傷を防ぐことができることから好ましい。−８０℃以下の温度まで冷却した後、そのまま−８０℃以下の温度で維持することが好ましい。−８０℃以下の温度で維持することにより、凍結中の細胞の損傷を防ぐことができ、解凍後の細胞の生長がより良好となる。
【００４０】
凍結した藻類細胞は、その後長期間に渡ってそのまま凍結保存することができ、使用する際には解凍し、遅延発光による化学物質の毒性評価に用いることができる。本発明により調製した藻類細胞を用いて化学物質の毒性評価をするには、例えば、後述する方法により実施することができる。
【００４１】
また、本発明は遅延発光による化学物質の毒性評価用キットを提供する。本発明の遅延発光による化学物質の毒性評価用キットは、凍結された対数増殖期の藻類細胞を含む。凍結された対数増殖期の細胞は、上記で説明した方法により調製された藻類細胞であることが好ましい。また、キット中、藻類細胞が−８０℃以下の温度で維持されていることが好ましい。本発明のキットはさらに、培養液、安定化剤、試薬、細胞培養容器、試料採取器具、緩衝材、コンテナ、取扱説明書、添付文書等を、適宜備えることができる。本発明のキットを使用することで、遅延発光による化学物質の毒性評価を簡易迅速に行える。
【００４２】
続いて、本発明の方法により調製した藻類細胞を用いた遅延発光による化学物質の毒性評価方法について説明する。
【００４３】
本発明は、
藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法であって、
（ａ）凍結した藻類細胞を加温して解凍し、得られた細胞懸濁液に培地を加えて希釈する、解凍ステップと、
（ｂ）解凍ステップ（ａ）で得た藻類細胞を培養して藻類細胞を凍結及び解凍の影響から回復させる、回復培養ステップと、
（ｃ）回復培養ステップ（ｂ）後の藻類細胞を一部採取し、培地を加えて希釈し、藻類細胞の遅延発光を測定し、得られた発光量を初期値データとする、確認ステップと、
（ｄ）確認ステップ（ｃ）後の藻類細胞と被検物質を含む溶液とを混ぜて暴露試料を作製し、暴露試料を培養する、暴露ステップと、
（ｅ）暴露ステップ（ｄ）後の暴露試料の遅延発光を測定し、得られた発光量を暴露データとする、計測ステップと、
（ｆ）初期値データ及び暴露データに基づいて評価値を算出し、評価値に基づいて被検物質の毒性を評価する、評価ステップと、
を備える方法、
を提供する。
【００４４】
上記方法において、より正確な評価を行うために、確認ステップ（ｃ）で得られた初期値データが所定の値に達するまで回復培養ステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことが好ましい。
【００４５】
また、上記方法において、より正確な評価を行うために、暴露ステップ（ｄ）において、さらに、確認ステップ（ｃ）後の藻類細胞と被検物質溶液の溶媒とを混ぜて対照試料を作製し、対照試料を培養し、計測ステップ（ｅ）において、さらに、対照試料の遅延発光を測定し、対照データとし、評価ステップ（ｆ）において、初期値データ、暴露データ及び対照データに基づいて評価値を算出し、評価値に基づいて被検物質の毒性を評価することが好ましい。
【００４６】
本発明の、藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法によれば、凍結しない藻類細胞と同じ発光パターンが得られ、発光量も低下せず、凍結した藻類細胞を使用して迅速に毒性評価を行うことが可能である。
【００４７】
図２６は、本実施形態に係る藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法を説明するフローチャートである。本実施形態は、解凍ステップ（ａ）、回復培養ステップ（ｂ）、確認ステップ（ｃ）、暴露ステップ（ｄ）、計測ステップ（ｅ）及び評価ステップ（ｆ）を備える。
【００４８】
解凍ステップ（ａ）では、上記方法で凍結した藻類細胞を加温して解凍し、解凍により得られた細胞懸濁液に培地を加えて希釈する。
【００４９】
解凍は、例えば、３７℃のウォーターバス中にて、１２０〜１５０秒程度、凍結細胞を含むクライオチューブをゆっくり振ることで、行うことができる。
【００５０】
次に、解凍した細胞懸濁液に培地を加えて希釈を行う。凍結した細胞懸濁液には、上述の通り、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍害保護剤が含まれている場合があり、凍害保護剤の細胞毒性を緩和するために、解凍後すみやかに希釈を行う必要がある。希釈は、例えば、ＯＥＣＤ培地を用いて１０倍に希釈することができる。浸透圧の急激な変化を防ぐために、１分程度の時間をかけてゆっくりと培地を添加する。
【００５１】
回復培養ステップ（ｂ）では、解凍ステップ（ａ）で得た藻類細胞を培養して藻類細胞を凍結及び解凍の影響から回復させる。後述の比較例で示すように、回復培養ステップを行わないと、藻類細胞が凍結及び解凍のダメージから十分回復せず、凍結していない藻類細胞と比較して遅延発光の発光パターンが変化し、発光量が低下する。凍結・解凍した藻類細胞でも、凍結していない藻類細胞と同じ発光パターン・発光量を示されなければ、化学物質の毒性を適正に評価することができなくなる。後述の実施例で示すように、解凍ステップ（ａ）に回復培養ステップ（ｂ）を行うと、凍結・解凍した藻類細胞が、凍結していない藻類細胞と同じ発光パターン・発光量を示すようになり、この問題点を解消することができる。回復培養は、例えば、温度２５±０．５℃、照度５０〜５５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の条件で１〜２時間培養する。
【００５２】
確認ステップ（ｃ）では、回復培養ステップ（ｂ）後の藻類細胞を一部採取し、培地を加えて希釈し、藻類細胞の遅延発光を測定し、得られた発光量を初期値データとする。このステップにおいて、回復培養ステップ（ｂ）により藻類細胞が凍結及び解凍の影響から十分回復したことを確認するとともに、後の毒性評価の際に使用する初期値データを取得する。
【００５３】
藻類細胞をさらに培地で希釈するのは、凍害保護剤の毒性を緩和するためである。凍害保護剤は、凍結した細胞懸濁液に５〜１０％程度含まれている場合がある。その場合、解凍ステップ（ａ）で、１０倍程度の希釈を行うと、凍害保護剤の濃度は０．５〜１％程度となるが、この濃度の凍害保護剤存在下でも回復ステップが可能であることを見出している。しかし、化学物質毒性評価に影響を及ぼさないために、培養後さらに１０倍希釈を行い、凍害保護剤の濃度を低下させる必要がある。
【００５４】
遅延発光の測定は、公知の装置及び方法、例えば、国際公開第２００５／０６２０２７号に記載の装置及び方法により、行うことができる。
【００５５】
確認ステップ（ｃ）で測定した発光量が所定の値であった場合は、その数値を初期値データとして、次の暴露ステップ（ｄ）に進むことができる。この判断基準となる所定の値は、あらかじめ設定された値を利用したり、凍結細胞に個別に設定された値を利用したりすることができる。例えば、凍結細胞の製造時に製造者が値を設定することができる。所定の値とは、例えば、凍結していない藻類細胞の発光量の９０％以上の値である。この値以下では発光量が不十分であり、藻類細胞が十分回復していないと判断できる。
【００５６】
確認ステップ（ｃ）で測定した発光量が所定の値に達しない場合は、回復培養ステップ（ｂ）を継続し、所定の時間（例えば、３０分）経過後に、再び確認ステップを行い、所定の値に達しているか否かを確認する。
【００５７】
暴露ステップ（ｄ）では、確認ステップ（ｃ）により凍結及び解凍の影響から十分回復したことを確認できた藻類細胞に、被検物質を含む溶液と混ぜて暴露試料を作製し、暴露試料を培養する。
【００５８】
暴露試料の作製は、例えば、藻類細胞１容量に対して、被検物質を含む溶液９容量を加える。この操作により藻類細胞は１０倍に希釈されるが、上述の通り、凍害保護剤の化学物質毒性評価への影響を回避するためである。また、被検物質を含む溶液を多量に添加することができるため、水に溶け難い化学物質でも評価することができる。被検物質の濃度を様々にし、複数の暴露試料を調製してもよい。また、被検物質を溶かした溶媒のみと藻類細胞を混ぜることで、対照試料を作製しても良い。対照試料を用いて対照データを測定し、評価値を算出することで、より正確に被検物質の毒性を評価することができる。
【００５９】
暴露試料の培養は、例えば、温度２５±０．５℃、照度５０〜５５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の条件で行う。培養時間は、被検物質が藻類細胞に影響を及ぼす程度の時間であれば特に限定されないが、例えば、８時間、好ましくは２４時間である。遅延発光の測定を容易にするために、暴露試料の培養容器として、遅延発光の測定にそのまま使用できる試験管を使用することができる。この場合、試験管ごとの照度のばらつきを最小限にし、撹拌効率を上げ、藻類の細胞増殖率を上げるために、ローテーター及びオービタルシェーカーを併用した回転培養を行うことが好ましい。
【００６０】
計測ステップ（ｅ）では、暴露ステップ（ｄ）後の暴露試料の遅延発光を測定し、得られた発光量を暴露データとする。上述の通り、遅延発光の測定は、公知の装置及び方法、例えば、国際公開第２００５／０６２０２７号に記載の装置及び方法により、行うことができる。より具体的には、試料に対して励起光（６８０ｎｍ、２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）を１秒照射した後に、試料から検出される遅延発光を光電子増倍管により検出し、該遅延発光量を励起完了後から６０秒間１００ミリ秒間隔で記録し、励起完了後１．１秒から６０秒までの該遅延発光量の総和を暴露データとする。
【００６１】
評価ステップ（ｆ）では、初期値データ及び暴露データに基づいて評価値を算出し、評価値に基づいて被検物質の毒性を評価する。遅延発光は、藻類細胞の生長阻害と相関して発光量が低下することが知られている。暴露データが初期値データよりも低下している場合、被検物質に毒性があると評価することが可能である。より具体的には、暴露試料として評価対象となる有害物質を含む試料（Ｘ）と、有害物質を含まない試料（Ｙ）について計測を行い、それぞれの下式１より算出される増加率を算出し、Ｘの増加速度とＹの増加速度を比較し、Ｙに対するＸの低下量を下式２により算出して毒性の指標とする。
（式１）増加速度＝（ｌｎ（暴露データ）−ｌｎ（初期値データ））÷（培養時間）
（式２）低下率＝（Ｙの増加速度−Ｘの増加速度）÷Ｙの増加速度×１００
【実施例】
【００６２】
以下に、藻類細胞の調製方法について比較例と実施例を示す。なお、各実験はｎ＝３で行った。
【００６３】
（定常期の細胞と対数増殖期の細胞の比較）
（実施例１）
凍結する細胞として、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（ＮＩＥＳ−３５株）の、対数増殖期の細胞（細胞密度１８０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を用いた。緑藻を培養する培養液としては、ＯＥＣＤ培地を、１００ｍＬ用いた。細胞が入った培養液を遠心（１０００Ｇ、５分）し、アスピレーターで上清を完全に除去し、新しい培養液数ｍＬに再懸濁し、一部をとって細胞数を計数した。その後、培養液を加えて４０００×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。さらに、添加した培養液と等量の１０％ＤＭＳＯ液（凍害保護剤液）と混合し、最終細胞密度を２０００×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、ＤＭＳＯ最終密度を５％に調製した。１５分間室温で保存後、クライオチューブに分注し、緩衝材で包み、保護材つきフリーザーコンテナに収納し、−８０℃で最大１８０日間保存した。解凍し、培養して生長試験を行ない、遅延発光を測定した。生長曲線を図１に示す。また、培養した細胞の遅延発光のパターンを非凍結細胞の遅延発光のパターンと共に図３に示す。
【００６４】
（比較例１）
凍結する細胞として、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（ＮＩＥＳ−３５株）の、定常期の細胞（細胞密度３３２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を用いた。対数増殖期の細胞の代りに、定常期の細胞を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で細胞を調製し、凍結し、解凍し、培養して生長試験を行なった。生長曲線を図２に示す。
【００６５】
凍結する細胞として対数増殖期の細胞を用いた場合、解凍後、培養した細胞は順調に生長し、対数増殖した（図１）。これに対し、凍結する細胞として定常期の細胞を用いた場合では、解凍後、培養した細胞の生育は不良となった（図２）。
【００６６】
（上清除去の有無の検討）
（実施例２）
凍結する細胞として、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（ＮＩＥＳ−３５株）の、対数増殖期の細胞（細胞密度１８０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を用いた。培養液は実施例１と同じ培養液を１００ｍＬ用いた。細胞が入った培養液を遠心し、上清を数ｍＬ残してこぼし、残った培養液に、沈殿した細胞を再懸濁した。さらに、ＤＭＳＯ溶液、新しい培地を添加して、最終細胞密度を２０００×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、ＤＭＳＯ最終濃度を５％に調製した。１５分間室温で保存後、クライオチューブに分注し、−８０℃で凍結・保存した。実施例１と同様に解凍し、培養して、遅延発光を測定した。培養した細胞の遅延発光のパターンを非凍結細胞の遅延発光のパターンとともに図４に示す。
【００６７】
凍結前の細胞の調製において、細胞を培養した培養液を遠心して細胞と分離し、分離した培養液上清を完全に除去した実施例１では、遅延発光のパターンは非凍結細胞の遅延発光のパターンと一致した。一方、培養液上清を完全には除去しなかった実施例２では、遅延発光のパターンが非凍結細胞の遅延発光のパターンと若干ずれ、凍結前の細胞の調製において、培養液上清を完全に除去することが好ましいことがわかった。
【００６８】
（細胞の粒子径の良否判断）
（実施例３）
用いる細胞として、国立環境研究所に株番号ＮＩＥＳ−３５として保存されている緑藻（ＮＩＥＳ−３５株）の細胞を用いた。緑藻細胞を対数増殖期から定常期まで培養し、対数増殖期の中でも培養時間が異なる以下のＡ〜Ｃの細胞及び定常期のＤの細胞の、４つの生長段階の細胞を用いた。
Ａ・・・培養時間７０時間（細胞密度１８０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｂ・・・培養時間７２時間（細胞密度２３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｃ・・・培養時間７４時間（細胞密度２８０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｄ・・・培養時間７６時間（細胞密度３３２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ａ〜Ｄの細胞の粒子径分布曲線をそれぞれ図５〜図８に示す。Ａ〜Ｄの細胞の粒子径分布曲線はそれぞれ明確にバイモーダルな分布を示した。図中、粒子径がバレー値である位置に直線を引いてある。下の表１には、Ａ〜Ｄの細胞粒子のそれぞれの粒子径分布におけるバレー値と、バレー値で２つに区分けした細胞の割合を記す。表１中、バレー値よりも粒子径が大きい細胞を「細胞大」、バレー値よりも粒子径が小さい細胞を「細胞小」としてＡ〜Ｄそれぞれの細胞における「細胞大」と「細胞小」の細胞数の割合を記している。
【００６９】
【表１】
0005731776.tif 000004
【００７０】
図５〜８及び表１に示されるように、細胞密度が大きくなるにつれて、粒子径が小さい細胞の数の割合が増え、ＡやＢでは粒子径が大きい細胞の方が多かったが、ＣやＤでは、粒子径が小さい細胞の方が多かった。ＡやＢの細胞では、バレー値が約４．４０μｍ以下であり、半数以上の細胞がこのバレー値以上の粒子径を有していた。具体的には、バレー値の粒子径以上の大きさの粒子径を有する細胞の数は、Ａでは７６％、Ｂでは５５％であった。
【００７１】
表２には、Ａ〜Ｄそれぞれのバイモーダルな粒子径分布曲線における２つのピーク（粒子径が大きい方のピークと小さい方のピーク）の粒子径を、粒子径が小さい方のピークを「ピーク１」、粒子径が大きい方のピークを「ピーク２」として示す。また、表２には、ピーク１における細胞数とピーク２における細胞数の合計を１００％としたときの、それぞれのピークにおける細胞数の割合（ピーク値比）を記している。なお、ここでは、ピークの粒子径±０．０２μｍの粒子径を有する細胞を、「ピークにおける細胞」として計測した。ピーク１の粒子径、ピーク２の粒子径、バレー値の粒子径は、電気的検知帯方式粒度分布測定装置により算出される粒子径データによって、決定した。
【００７２】
【表２】
0005731776.tif 000005
【００７３】
図５〜８及び表２に示されるように、細胞密度が小さいものほど粒子径が大きい方のピーク（ピーク２）のピーク値比が大きくなる傾向にあり、ＡやＢの細胞では、粒子径が大きい方のピーク（ピーク２）値比が、５０％以上であった。
【００７４】
Ａ〜Ｄのそれぞれの細胞を初期細胞密度２０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製して２４時間培養し、それぞれの緑藻細胞の粒子数と遅延発光を測定した。粒子数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）と、遅延発光で得られた発光量（ｃｏｕｎｔｓ）を、それぞれ図９、図１０に示す。
【００７５】
２４時間後の細胞粒子数はＡが最も多くて生長が良好であり、Ｂ、Ｃ、Ｄの順に低下した（図９）。また、遅延発光の発光量も、Ａが最も多くて、Ｂ、Ｃ、Ｄの順に低下していた（図１０）。
【００７６】
（実施例４）
用いる細胞として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ番号２２６６２として保存されている緑藻（ＡＴＣＣ−２２６６２株）の細胞を用いた。緑藻細胞を対数増殖期から定常期まで培養し、対数増殖期の中でも培養時間が異なる以下のＨ〜Ｊの細胞及び定常期のＫ〜Ｍの細胞の、６つの生長段階の細胞を用いた。
Ｈ・・・培養時間７２時間（細胞密度２３３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｉ・・・培養時間７４時間（細胞密度２５６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｊ・・・培養時間７６時間（細胞密度２８１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｋ・・・培養時間７８時間（細胞密度３１２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｌ・・・培養時間８０時間（細胞密度３５２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｍ・・・培養時間８２時間（細胞密度３９１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｈ〜Ｍの細胞の粒子径分布曲線をそれぞれ図１１〜図１６に示す。Ｈ、Ｉの細胞の粒子径分布曲線はそれぞれ明確にバイモーダルな分布を示した。図中、粒子径がバレー値である位置に直線を引いてある。下に示す表３には、Ｈ〜Ｍの細胞粒子のそれぞれの粒子径分布におけるバレー値と、バレー値で２つに区分けした細胞の割合を記した。表３中、バレー値よりも粒子径が大きい細胞を「細胞大」、バレー値よりも粒子径が小さい細胞を「細胞小」としてＨ〜Ｍそれぞれの細胞における「細胞大」と「細胞小」の細胞数の割合を記している。
【００７７】
【表３】
0005731776.tif 000006
【００７８】
図１１〜図１６及び表３に示されるように、細胞密度が大きくなるにつれて、粒子径が小さい細胞の数の割合が増えた。ＨやＩの細胞では、バレー値で区分けした細胞小と細胞大の割合は同等であった。なお、ＡＴＣＣ−２２６６２株においても、ＨやＩの細胞では、５０％以上の細胞が約４．５μｍ以上の粒子径を有していた。
【００７９】
表４には、Ｈ〜Ｍそれぞれのバイモーダルな粒子径分布曲線における２つのピーク（粒子径が大きい方のピークと小さい方のピーク）の粒子径を、粒子径が小さい方のピークを「ピーク１」、粒子径が大きい方のピークを「ピーク２」として示す。また、表４には、ピーク１における細胞数とピーク２における細胞数の合計を１００％としたときの、それぞれのピークにおける細胞数の割合（ピーク値比）を記している。なお、ここでは、ピークの粒子径±０．０２μｍの粒子径を有する細胞を、「ピークにおける細胞」として計測した。ピーク１の粒子径、ピーク２の粒子径、バレー値の粒子径は、実施例３と同様に、決定した。
【００８０】
【表４】
0005731776.tif 000007
【００８１】
図１１〜図１６及び表４に示されるように、ＡＴＣＣ−２２６６２株では、粒子径が小さい方のピーク（ピーク１）の方が、ピーク値比が大きい傾向にあった。また、細胞密度が大きいものほど粒子径が小さい方のピーク（ピーク１）のピーク値比が大きくなる傾向にあった。
【００８２】
Ｈ〜Ｍのそれぞれの細胞を初期細胞密度２０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製して２４時間培養し、それぞれの緑藻細胞の粒子数と遅延発光を測定した。粒子数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）と、遅延発光で得られた発光量（ｃｏｕｎｔｓ）を、それぞれ図１７、図１８に示す。
【００８３】
２４時間後の細胞粒子数はＨが最も多くて生長が良好であり、Ｈ〜Ｍの順に低下した（図１７）。また、遅延発光の発光量も、Ｈが最も多く、Ｈ〜Ｍの順に低下した（図１８）。
【００８４】
以下に、藻類細胞を用いた毒性評価方法について、比較例と実施例を示す。
（比較例２）
標準的な手順により、凍害保護剤（５％ＤＭＳＯ）を含み、細胞密度２０００×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、体積６５０μＬの条件で凍結された緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）を使用し、以下の方法により、遅延発光を測定した。希釈液にはＯＥＣＤ培地を用いた。
【００８５】
（ａ）解凍ステップ
（ａ−１）加温ステップ
３７℃ウォーターバスで、凍結した緑藻の入ったクライオチューブをゆっくり振りながら、１２０〜１５０秒程度で完全に解凍した。クリーンベンチ内にて、先太ピペットで軽くピペッティングして６２０μＬの細胞懸濁液をガラスチューブに取出した。
（ａ−２）希釈ステップ
５５８０μＬ（１０倍希釈）のＯＥＣＤ培地をガラスチューブ内にゆっくり入れた。浸透圧の急激な変化を防ぐため、１分程度時間をかけて少しずつ添加した。培地添加後、５〜１０分程度ベンチ内で静置した。
【００８６】
（ｃ）確認ステップ
（ａ−２）の希釈ステップが完了した試料の一部を採取し、１０倍に希釈して初期値サンプルを調製した。初期値サンプルの遅延発光を測定した。また、粒子計測により細胞数を計測した。さらに、コロニー法による生存細胞の計数を行った。他方、凍結していない緑藻を用いて、遅延発光の測定、粒子数の計測及びコロニー生残率の計測を行った。
【００８７】
図１９は、凍結・解凍した緑藻及び凍結していない緑藻の粒子数を表すグラフであり、図２０は、凍結・解凍した緑藻及び凍結していない緑藻のコロニー生残率を表すグラフである。図１９及び図２０から明らかなように、（ｃ）の確認ステップにおける、凍結・解凍した緑藻の粒子数及びコロニー生残率は、凍結していない緑藻のそれらとほとんど差が無く、凍結・解凍の影響から適正な状態に回復したようにみえる。
【００８８】
しかしながら、遅延発光の発光パターンを表したグラフである図２１から、凍結・解凍した緑藻と凍結していない緑藻とでは、発光パターンが異なることが分かる。発光パターンが異なると、その後の化学物質の毒性評価を行った場合、凍結していない藻類と同等の評価を行うことができない。図２２は、励起光消灯後１．１秒から６０秒までの発光量（積算値）を表したグラフであるが、凍結した緑藻の発光量は凍結していない緑藻の発光量と比べて低下しており、約７７％であった。遅延発光は、藻類の生長阻害と相関して発光量が低下することが知られているため、凍結・解凍によりすでに凍結前よりも発光量が低下している藻類細胞は、既に生長阻害が起きていることが予想され、評価対象となる化学物質を暴露しても毒性を適正に評価できない。したがって、上記比較例２の方法は、藻類の遅延発光を利用した化学物質の評価方法には適していない。
【００８９】
（実施例５）
（ａ）解凍ステップは、比較例２と同様の方法で行った。
【００９０】
（ｂ）回復培養ステップ
（ａ）解凍ステップで調製した試料を、温度２５±０．５℃、照度５０〜５５μｍｏｌｍ−２ｓ−１）にて、１時間又は２時間培養した。
【００９１】
（ｃ）確認ステップ
（ｂ）の回復培養ステップが完了した試料の一部を採取し、希釈して初期値サンプルを調整した。初期値サンプルの遅延発光を測定した。他方、凍結していない緑藻を用いて、遅延発光の測定を行った。
【００９２】
図２３は、遅延発光の発光パターンを表したグラフである。比較のために、凍結していない緑藻の遅延発光及び実施例の方法で得た初期値サンプルの遅延発光に加えて、比較例２の方法で得た初期値サンプルの遅延発光も含めている。図２３から明らかなように、１時間又は２時間の回復培養を行うことで、凍結していない緑藻の遅延発光と同じ発光パターンとなることが分かった。図２４は、発光量を表したグラフである。１時間又は２時間の回復培養を行うことで、凍結していない緑藻の発光量の約９３％、約１１２％となり、十分な発光量が得られた。したがって、上記実施例５の方法は、凍結していない緑藻を使用した場合と同等の評価を行うことができる。
【００９３】
尚、本明細書で使用する％数値は、小数点以下第一位を四捨五入した値を採用している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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