(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる各種物質を分離用パラメータに従って分離した後に分取・分画して調製された複数の分画試料に対し、ＭＳn分析（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することが可能な質量分析装置であって、
a)全ての分画試料に対するＭＳ1分析をそれぞれ実行して得られたＭＳ1スペクトルデータに基づいて、分離用パラメータ及び質量電荷比を２軸とする２次元平面を形成し、該平面に直交する軸に信号強度をとった仮想的な３次元グラフを作成し、該３次元グラフ中で信号強度が最大であるピークの信号強度を基準とした相対的な値である第１閾値と該第１閾値よりも小さな第２閾値とを定め、該３次元グラフにおいて信号強度が前記第１閾値以上であるピークを抽出し、該ピークのピークトップが現れる前記２次元平面上の位置に対応した分画試料をＭＳn分析対象の分画試料として選択する分画試料選択手段と、
b)前記３次元グラフにおいて信号強度が前記第２閾値以上であって前記分画試料選択手段により選択された分画試料に対応する前記分離用パラメータにピークトップが存在するピークを抽出し、該ピークのピークトップに対応した質量電荷比をプリカーサイオンの候補として選択するプリカーサイオン候補選択手段と、
c)前記分画試料選択手段により選択された分画試料に対し、前記プリカーサイオン候補選択手段により該分画試料に対応して選択されたプリカーサイオン候補のうちの１つをプリカーサイオンに設定したＭＳn分析を実行するＭＳn分析実行手段と、
d)前記ＭＳn分析実行手段によるＭＳn分析実行結果に基づいてその分画試料に含まれる物質の同定を行う同定手段と、
を備えることを特徴とする質量分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析装置であって、
前記同定手段により当該分画試料に含まれる物質が同定できない場合に、前記ＭＳn分析実行手段は、該分画試料に対し前記プリカーサイオン候補選択手段により選択されたプリカーサイオン候補のうちの別の１つをプリカーサイオンに設定したＭＳn分析を実行し、前記同定手段は、その異なるプリカーサイオンに対するＭＳn分析実行結果に基づいて該分画試料に含まれる物質の同定を試みることを特徴とする質量分析装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の質量分析装置であって、
前記分画試料選択手段により選択された全ての分画試料に対する物質同定が終了した後に、該分画試料選択手段は、第１閾値を第２閾値よりも大きい範囲で減少させた上でピークを抽出し、新たに抽出されるピークのピークトップが現れる前記２次元平面上の位置に対応した分画試料をＭＳn分析対象の分画試料として選択し、その選択された分画試料について、前記プリカーサイオン候補選択手段、前記ＭＳn分析実行手段、及び前記同定手段による処理を実行することを特徴とする質量分析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の質量分析装置であって、
前記第１閾値を第２閾値よりも大きい範囲で減少させる毎に、前記分画試料選択手段、前記プリカーサイオン候補選択手段、前記ＭＳn分析実行手段、及び前記同定手段による処理を繰り返し、同定される物質の数が飽和した段階、又は新たに同定される物質の数の増加の程度がそれ以前に比較して大きく減じた段階で、繰り返しを打ち切ることを特徴とする質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）、キャピラリ電気泳動装置（ＣＥ）などによって各種物質が分離されて分画された試料に対し、質量分析を行って各物質を同定する質量分析装置に関し、さらに詳しくは、ＭＳn分析（ｎは２以上の整数）を行うことが可能な質量分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学の研究や医療、医薬品開発などの分野においては、生体試料を対象として、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖など様々な物質を網羅的に同定することがますます重要になってきている。特にタンパク質やペプチドを対象とするこうした網羅的な解析手法はショットガン・プロテオミクス（Shotgun Proteomics）と呼ばれている。こうした解析のために、ＬＣやＧＣ、或いはＣＥなどのクロマトグラフィと、タンデム型質量分析装置（ＭＳn型質量分析装置）とを組み合わせた分析手法が非常に威力を発揮している。
【０００３】
タンデム型質量分析装置を用いた生体試料中の各種物質の網羅的同定手法として、従来知られている一つの手法の手順は次のとおりである（非特許文献１参照）。
［ステップ１］ 分析対象である試料に含まれる各種物質をＬＣ、ＣＥ等により分離し、その溶出液を分取・分画して多数のサンプルを調製する（ここでは、分取・分画により得られた１つ１つのサンプルを「分画試料」と呼ぶこととする）。なお、試料を分取・分画する際には、予め決めた一定の時間間隔で分画を行う又は一定量の試料液を採取するように分画を行うことにより、全ての物質が漏れなくいずれかの分画試料に含まれるようにする（例えば特許文献１参照）。
【０００４】
［ステップ２］各分画試料に対するＭＳ1スペクトルをそれぞれ取得し、該ＭＳ1スペクトル上で同定対象の物質群に由来すると考えられるピークを選択する。
［ステップ３］上記ステップ２で選択したピークをプリカーサイオンに設定して当該分画試料に対しＭＳ2分析を実行し、その結果に基づいてデータベース検索やデノボシーケンスサーチを行い、分画試料に含まれる物質を同定する。
［ステップ４］十分な確度で特定の物質が同定されなかった場合には、ＭＳ1スペクトル上で見つけた別のピークをプリカーサイオンに設定してＭＳ2分析を実行するか、或いは、さらに高次（つまりｎが３以上）のＭＳn分析を実行し、その結果に基づくデータベース検索やデノボシーケンスサーチなどにより、分画試料に含まれる物質を同定する。
［ステップ５］上記ステップ２〜４の処理を複数の分画試料それぞれに対して行い、元の試料に含まれていた様々な物質を網羅的に同定する。
【０００５】
ＬＣやＧＣなどのカラムを用いた分離手法では、試料中の各種物質はカラムを通過するに要する時間（保持時間、以下「ＲＴ」と称す）の大きさによって分離される。この場合、ＭＳ1分析で検出されたイオン強度の総和を保持時間の経過に沿って表したプロファイルは一般にＴＩＣ（トータルイオンクロマトグラム）と呼ばれ、特定の質量電荷比m/zに着目し、その質量電荷比のイオン強度を保持時間の経過に沿って表したプロファイルはＭＣ（マスクロマトグラム）と呼ばれる。
【０００６】
上記のような網羅的同定のための分析手法において、高い確度で以て物質を同定するには、同一の分画試料に含まれる物質の種数が少ない（できれば１種類のみである）ことが望ましい。そのためには１つの分画試料を分取する時間を短くすればよいが、その場合、分画数が多くなる。元の試料に含まれていた物質を網羅的に同定するために全ての分画試料を対象としてＭＳn分析及び同定処理を行う場合、分画数が増えるほど分析や処理に掛かる手間や時間が膨大なものとなる。特に、異なる分画試料を分析する場合には、機械的に試料を交換したり分析対象の試料を分析位置まで搬送したりする必要があるため、分析に要する時間が長くなり、分析対象である分画試料の数が増えると分析効率の低下が顕著である。
【０００７】
一般に、全ての分画試料に有意な物質が含まれているというわけではないため、実際には、網羅的同定であっても、必ずしも全ての分画試料を分析する必要はない。そこで、元の試料に含まれていた物質を網羅的且つ効率的に同定するには、同定すべき物質が含まれる可能性が高い分画試料を優先的に選択してＭＳn分析することが重要である。そのための一つの手法として、各分画試料に含まれる物質の総量に対応するＴＩＣをモニタリングし、ＴＩＣに現れるピークの保持時間に対応した分画試料を優先的にＭＳn分析することが考えられる。しかしながら、同定対象である物質の質量電荷比におけるＭＣとＴＩＣとを比較したとき、両者のピークの発生位置（つまりは保持時間）が必ずしも一致するとは限らない。
【０００８】
図６は、或る試料に対するＴＩＣと該試料に含まれるm/z1956である物質のＭＣとの測定結果例を示す図である。この例では、ＭＣではＲＴ＝6100付近で大きなピークが生じているのに対し、ＴＩＣでは同ＲＴにピークが現れておらず、両者のピークの発生位置は一致しない。このような場合には、ＴＩＣ上で現れるピークの保持時間に対応した分画試料をＭＳ2分析の対象として選択したとしても、その分画試料には同定対象である物質が十分な濃度で含まれていない可能性がある。一方、同定対象である物質が十分な濃度で含まれる分画試料を選択するには、その物質に対するＭＣにおいて現れるピークの保持時間に対応した分画試料を選択すればよい。しかしながら、分画試料に含まれる物質が未知である状態においては、いずれの質量電荷比に対応するＭＣを用いればよいのか判断することはできないため、ＭＣを用いて分画試料を選択することはできない。
【０００９】
上記課題を解決するために、従来、非特許文献２に記載の方法が知られている。即ち、まず、各ＲＴでのピークリスト（又はＭＳ1スペクトル）を並べた連結ピークリストを作成する。図５はこの連結ピークリストを３次元グラフ化した図であり、保持時間（ＲＴ）と質量電荷比とが紙面上の２軸であり、各ピークの信号強度は色とその濃淡という別の軸で示される。なお、この図５中の横方向の２本の点線で挟まれた保持時間範囲が図６に示したＴＩＣ及びＭＣの時間範囲であり、図５中の縦方向の点線がm/z1956のＭＣに対応したピークデータである。
【００１０】
次に、この３次元グラフに対し２次元平面上でピーク検出を行う。以下、このピーク検出を「２Ｄピーク検出」といい、これにより検出されたピークを「２Ｄピーク」ということとする。図７に示すように、或る分画に対応するＲＴ（図７中に横方向の点線で示すＲＴ）には、幾つかの質量電荷比において２Ｄピークが観測される。このように分画された分画試料には同定対象である物質の少なくとも１つが含まれている可能性が高いと判断できるので、この分画試料をＭＳ2分析の対象として選択する。さらに、このときに見つかった２Ｄピーク（図７中に○囲みで示した点で示されるピーク）は、当該分画に含まれていた物質を同定するためのＭＳ2分析のプリカーサイオン候補となり、その分画に含まれる物質が同定されるまで順次ｎの数を増加させる（開裂の段数を増加させる）ＭＳn分析を行う対象となる。
【００１１】
上述した２Ｄピーク検出に基づく分画試料の選択処理においては、予め定めた閾値を超えるような信号強度を有する２ＤピークがＭＳ2分析のプリカーサイオン候補として抽出される。そのため、抽出される２Ｄピークの数は閾値によって変化し、結果として、選択される分画試料の数やリストアップされるプリカーサイオン候補の数も閾値によって増減することになる。閾値が小さい場合には信号強度が比較的小さな２Ｄピークも選出されるため、プリカーサイオン候補のリストアップ漏れを軽減することができる。その反面、ＭＳn分析の対象とされる分画試料の数も多くなるため、分析や処理の手間が増大し、分析効率の低下に繋がる。一方、閾値を大きくした場合には、ＭＳn分析の対象として選択される分画試料の数を抑えることができるものの、プリカーサイオン候補の数も少なくなるため、選択された分画試料において物質同定に失敗する可能性が高まる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１０−１４５５９号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】エドワード・エム・マーコッテ（Edward M Marcotte）、「ハウ・ドゥー・ショットガン・プロテオミクス・アルゴリズムズ・アイデンティファイ・プロテインズ？（How do shotgun proteomics algorithms identify proteins?）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology） 25、2007年、p.755-757
【非特許文献２】ユルゲン・コックス（Jurugen Cox）、ほか１名、「マックスクァント・イネーブル・ハイ・アイデンティフィケイション・レイツ、インディビデュアライズド・ピーピービー-レンジ・マス・アキュラサイズ・アンド・プロテオーム-ワイド・プロテイン・クォンティフィケイション（MaxQuant enable high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification ）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology） 26、2008年、p.1367-1372
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、例えば保持時間と質量電荷比とを２軸とする２次元平面上で上記のような２Ｄピーク検出によりＭＳn分析の対象とする分画試料とＭＳn分析のプリカーサイオン候補とを抽出する場合に、分析対象とする分画試料の数をできるだけ抑えることによって分析の手間や時間の節約を図りつつ、プリカーサイオン候補の漏れをなくして、同定の失敗を少なくしたり同定の正確性を向上させたりすることができる質量分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために成された本発明は、試料に含まれる各種物質を分離用パラメータに従って分離した後に分取・分画して調製された複数の分画試料に対し、ＭＳn分析（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することが可能な質量分析装置であって、
a)全ての分画試料に対するＭＳ1分析をそれぞれ実行して得られたＭＳ1スペクトルデータに基づいて、分離用パラメータ及び質量電荷比を２軸とする２次元平面を形成し、該平面に直交する軸に信号強度をとった仮想的な３次元グラフを作成し、該３次元グラフ中で信号強度が最大であるピークの信号強度を基準とした相対的な値である第１閾値と該第１閾値よりも小さな第２閾値とを定め、該３次元グラフにおいて信号強度が前記第１閾値以上であるピークを抽出し、該ピークのピークトップが現れる前記２次元平面上の位置に対応した分画試料をＭＳn分析対象の分画試料として選択する分画試料選択手段と、
b)前記３次元グラフにおいて信号強度が前記第２閾値以上であって前記分画試料選択手段により選択された分画試料に対応する前記分離用パラメータにピークトップが存在するピークを抽出し、該ピークのピークトップに対応した質量電荷比をプリカーサイオンの候補として選択するプリカーサイオン候補選択手段と、
c)前記分画試料選択手段により選択された分画試料に対し、前記プリカーサイオン候補選択手段により該分画試料に対応して選択されたプリカーサイオン候補のうちの１つをプリカーサイオンに設定したＭＳn分析を実行するＭＳn分析実行手段と、
d)前記ＭＳn分析実行手段によるＭＳn分析実行結果に基づいてその分画試料に含まれる物質の同定を行う同定手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１６】
試料に含まれる各種物質を分離する手段がＬＣやＧＣなど、カラムを用いたものである場合には、上記分離用パラメータとは時間（保持時間）である。また、試料に含まれる各種物質を分離する手段がＣＥである場合には、上記分離用パラメータとは移動度である。即ち、試料に含まれる各種物質を分離する手段が例えばＬＣである場合には、複数の分画試料はそれぞれ異なる保持時間（厳密には所定の保持時間範囲）において採取（分取）された試料である。
【００１７】
本発明に係る質量分析装置において、分画試料選択手段及びプリカーサイオン候補選択手段はいずれも、分離用パラメータ、質量電荷比、及び信号強度を３つの軸にとった仮想的な３次元グラフに対し、信号強度が閾値以上であるか否かを判定することによりピークを検出する。ただし、多数の分画試料の中からＭＳn分析対象の分画試料を選択するために利用されるピークを検出するための第１閾値は、ＭＳn分析のプリカーサイオン候補を選択するために利用されるピークを検出するための第２閾値よりも大きい。即ち、前者は後者よりも、より厳しい基準で以てピークを検出することになるから、ＭＳn分析の対象となる分画試料は比較的高い濃度で何らかの物質を含む分画試料に限られる。一方、プリカーサイオン候補となるピークを検出する基準は相対的に緩いから、１つの分画試料に対して挙げられるプリカーサイオン候補の数は比較的多くなる傾向にある。
【００１８】
即ち、一般的に、ＭＳn分析の対象となる分画試料の数が少ない段階でも、各分画試料中の物質の同定に有益であるプリカーサイオンの候補がそれぞれ複数挙げられる可能性が高くなる。一般に、ＭＳ1スペクトル中のピークの中で信号強度が最大であるピークをプリカーサイオンとしてＭＳ2分析を行った結果を利用して含有物質の同定に成功しない場合であっても、同じＭＳ1スペクトル中で信号強度が最大ではないピークをプリカーサイオンとしてＭＳ2分析を行った結果を利用して含有物質の同定に成功することもある。したがって、或る１つの分画試料に対し複数のプリカーサイオン候補を挙げておくことにより、該分画試料の含有物質を同定できる確率を高めることができる。
【００１９】
また本発明に係る質量分析装置において好ましくは、前記同定手段により当該分画試料に含まれる物質が同定できない場合に、前記ＭＳn分析実行手段は、該分画試料に対し前記プリカーサイオン候補選択手段により選択されたプリカーサイオン候補のうちの別の１つをプリカーサイオンに設定したＭＳn分析を実行し、前記同定手段は、その異なるプリカーサイオンに対するＭＳn分析実行結果に基づいて該分画試料に含まれる物質の同定を試みる構成とするとよい。
【００２０】
上述したように、通常、１つの分画試料に対して複数のプリカーサイオン候補が挙げられ、或る１つのプリカーサイオンを設定したＭＳn分析結果から物質同定ができない場合でも、別のプリカーサイオンを設定したＭＳn分析結果から物質同定ができる可能性は十分にある。そのため、上記好ましい構成によれば、分画試料に含まれる物質を同定できる確率を一層高めることができる。
【００２１】
また本発明に係る質量分析装置では、前記分画試料選択手段により選択された全ての分画試料に対する物質同定が終了した後に、該分画試料選択手段は、第１閾値を第２閾値よりも大きい範囲で減少させた上でピークを抽出し、新たに抽出されるピークのピークトップが現れる前記２次元平面上の位置に対応した分画試料をＭＳn分析対象の分画試料として選択し、その選択された分画試料について、前記プリカーサイオン候補選択手段、前記ＭＳn分析実行手段、及び前記同定手段による処理を実行する構成とするとよい。
【００２２】
またこうした構成においては、第１閾値を第２閾値よりも大きい範囲で減少させる毎に、前記分画試料選択手段、前記プリカーサイオン候補選択手段、前記ＭＳn分析実行手段、及び前記同定手段による処理を繰り返し、同定される物質の数が飽和した段階、又は新たに同定される物質の数の増加の程度がそれ以前に比較して大きく減じた段階で、繰り返しを打ち切るようにするとよい。もちろん、同定される物質の数とは無関係に、繰り返しの回数の制約や処理の時間の制約などに基づいて、上記繰り返しを打ち切るようにしてもよい。
【００２３】
上記構成では、多数の分画試料の中からＭＳn分析対象の分画試料を選択するために利用されるピークを検出するための第１閾値が徐々に引き下げられるため、選択される分画試料の総数（累計数）が増加してゆく。つまり、同定対象である物質が含まれる可能性が高い分画試料から、その可能性が低い分画試料にＭＳn分析及び同定処理の適用範囲が拡げられてゆく。このため、当初の第１閾値の設定に対して求まった分画試料だけでは十分な数の物質同定がなされなかった場合でも、比較的少ない繰り返し回数で以て、つまりは、ＭＳn分析対象の分画試料の数をそれほど増やすことなく、元の試料に含まれる物質の大部分を同定することが可能となる。
【００２４】
なお、本発明に係る質量分析装置では、ｎを２に固定し、ＭＳn分析としてＭＳ2分析のみを実行するようにしてもよいが、対象物質によっては、１回の解離操作だけではデータベース検索等の同定処理が可能な程度の小さな断片にならないことがある。そこで、ＭＳ2分析結果から物質同定ができない場合に、ＭＳ2分析により得られるＭＳ2スペクトルの中で例えば信号強度の最大のピークをプリカーサイオンとしてＭＳ3分析を実行し、ＭＳ3分析結果から物質同定を行う、というようにｎが３以上であるＭＳn分析を行ってそのＭＳn分析結果から物質を同定するようにしてもよい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る質量分析装置によれば、元の試料を分取・分画することで得られた多数の分画試料の中で、比較的少数の分画試料に対するＭＳn分析を行うことにより、元の試料に含まれる多数の物質を正確に同定することが可能となる。それにより、分析に要する手間や時間を節約して効率のよい分析を行いつつ、同定漏れを少なくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施例によるＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳの概略構成図。
【図２】本実施例のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおけるＭＳ2分析対象分画試料を選択する際の処理の概念図。
【図３】本実施例のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいて、サンプルプレート上の各ウェルに調製された分画試料に含まれる物質を網羅的に同定する際の処理及び制御動作を示すフローチャート。
【図４】ＭＳ2分析の対象である選択ウェル数と同定されたペプチド数との関係の実験結果を示す図。
【図５】連結ピークリストを３次元グラフ化した図。
【図６】或る試料に対するＴＩＣと該試料に含まれるm/z1956である物質のＭＣとの測定結果例を示す図。
【図７】検出される２Ｄピークと分画との関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の一実施例であるＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳについて、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳの概略構成図である。
【００２８】
本実施例のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、液体試料中の各種物質を保持時間に応じて分離するＬＣ部１と、ＬＣ部１で分離された物質を含む試料を分取・分画してそれぞれ異なる分画試料を調製する分取分画部２と、複数の分画試料のうちの１つを選択して質量分析に供する試料交換部３と、分画試料に対する質量分析（ＭＳ1分析、及びｎが２以上であるＭＳn分析）を実行するＭＳ部４と、ＭＳ部４により得られたデータを処理するデータ処理部５と、ＬＣ部１や分取分画部２等の各部の動作を制御するとともにデータ処理部５による処理結果に基づいて試料交換部３やＭＳ部４の動作を制御する分析制御部６と、分析条件等を設定するための入力部７、分析結果などを表示する表示部８、を備える。
【００２９】
ＭＳ部４は、ＭＡＬＤＩイオン源、イオンを保持するとともに質量電荷比に応じてイオンを分離する機能や衝突誘起解離（ＣＩＤ）によりイオンを解離させる機能を有するイオントラップ、イオントラップから放出された各種イオンを質量電荷比に応じて分離して検出する飛行時間型質量分析計、などを含み、ＭＳ1分析だけでなく、イオン選択とイオン解離とを繰り返すＭＳn分析が可能となっている。ただし、ＭＳ1分析及びＭＳ2分析のみを実行すればよい場合（ｎが３以上のＭＳn分析が不要である場合）には、三連四重極型質量分析計のような、より簡単な構成のＭＳn型質量分析装置を利用することができる。
【００３０】
また、データ処理部５は、スペクトルデータ収集部５１、２Ｄピーク検出部５２、ＭＳn分析制御情報生成部５３、同定処理部５４などの機能ブロックを備える。データ処理部５や分析制御部６は、例えばパーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該パーソナルコンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを実行することにより、上記のような各機能ブロックが具現化される構成とすることができる。
【００３１】
ＬＣ部１は注入された試料に含まれる各種物質を時間方向に分離する。したがって、ＬＣ部１から出てくる溶出液中に含まれる物質は時間経過に伴って変化する。分取分画部２はこの溶出液を所定の時間間隔で分画し、分画した溶出液をＭＡＬＤＩ用のサンプルプレート上に形成された異なるウェルに順次滴下し、それぞれのウェルに分画試料を調製する。即ち、各ウェルの分画試料は順次異なる保持時間、より厳密に言えば、保持時間が或る保持時間の範囲に入る物質を含む。もちろん、溶出液中で或る１つの物質が溶出してくる時間には幅があるから、１つの物質が複数の分画試料に含まれることもある。
【００３２】
分取分画部２において多数の分画試料が調製されたサンプルプレートは試料交換部３に搬送され、試料交換部３は分析制御部６の制御の下に、ＭＳ部４のＭＡＬＤＩイオン源でイオン化が行われる位置（つまりＭＡＬＤＩ用のレーザ光照射位置）に分析対象である分画試料が来るようにサンプルプレートを移動させる。これにより、多数の分画試料の中の任意の分画試料に対するＭＳ1分析やＭＳn分析が行われる。
【００３３】
上述したようにサンプルプレート上の各ウェルに調製された分画試料に含まれる物質を網羅的に同定する際の処理及び制御動作を図２、図３により説明する。図３はこの網羅的同定処理及び制御の動作手順を示すフローチャート、図２はＭＳ2分析対象である分画試料を選択する際の処理の概念図である。
【００３４】
まず、サンプルプレート上の各ウェルに調製された分画試料の１つ１つについてそれぞれ、ＭＳ部４によりＭＳ1分析を実行し、スペクトルデータ収集部５１はＭＳ1スペクトルデータを取得する（ステップＳ１）。スペクトルデータ収集部５１は、各ＭＳ1スペクトルに対してピーク検出処理を実行し、ピークの質量電荷比と信号強度とを含むピーク情報を収集してピークリストを作成する。そして、分画試料毎に得られたピークリストを連結し、この連結ピークリストに基づいて図５に示したような仮想的な３次元グラフを作成する（ステップＳ２）。この３次元グラフは、保持時間（ＲＴ）と質量電荷比（m/z）を直交する２軸とし、この２軸に直交する方向に信号強度をとったものである。図５では、この信号強度軸は色とその濃淡で示されることは前述したとおりである。
【００３５】
この仮想的な３次元グラフに対し、２Ｄピーク検出部５２は特徴的な２Ｄピーク検出を行う。まず、繰り返し変数Ｎを１にセットし、信号強度を判定する基準である閾値θ1、θ2、…、ωを適宜設定する（ステップＳ３）。これら閾値は仮想的３次元グラフ中で信号強度が最大であるピークの信号強度を１００％としたときの％値で示され、その大小関係はθ1＞θ2＞…＞θm＞…≧ωとする（図２（ｃ）参照）。このθ1、θ2、…が第１閾値であり、ωが第２閾値である。２Ｄピーク検出部５２は第１閾値としてθNを用い、上記仮想的３次元グラフにおいて信号強度が第１閾値θN以上である２Ｄピークを検出する（ステップＳ４）。ステップＳ３の直後にＳ４が実行されるときにはＮ＝１であるから、信号強度が第１閾値θ1以上である２Ｄピークが検出される。図２（ａ）、（ｂ）に示すように、θ1は十分に大きい（１００％に近い）ため、通常、信号強度がθ1以上であるピークは全ピークの中で僅かである。
【００３６】
次に、ＭＳn分析制御情報生成部５３は、ステップＳ４で新たに検出された２Ｄピークのピークトップの保持時間に対応した分画試料をＭＳ2分析対象である分画試料として定める（ステップＳ５）。ステップＳ４で検出された複数の２Ｄピークが同一の分画試料に対応する場合もあるから、ＭＳ2分析対象とされる分画試料の数は検出された２Ｄピークの数、又はそれ以下となる。当初第１閾値θ1は高く設定されているため、このときにステップＳ４で検出される２Ｄピークの数は少なく、ステップＳ５で選択される分画試料の数も比較的少ない。一方、検出される２Ｄピークの信号強度は高いことから、ここで選択された分画試料には同定対象である何らかの物質が含まれる可能性が高いと推定される。
【００３７】
次いで、２Ｄピーク検出部５２はステップＳ５で選択された複数の分画試料のうちの１つについて、上記３次元グラフにおいて保持時間と質量電荷比との２軸が含まれる２次元平面上で、その分画試料にピークトップが存在し、且つ信号強度が第２閾値ω以上である２Ｄピークを検出する。そして、ＭＳn分析制御情報生成部５３は、ここで検出された２Ｄピークを、その１つの分画試料をＭＳ2分析する際のプリカーサイオン候補としてリストアップする（ステップＳ６）。図２（ａ）に示すように第２閾値ωは第１閾値θ1に比べると遙かに小さい（０％に近い）から、ステップＳ４に比べてステップＳ６では２Ｄピークは検出され易い。そのため、通常、ステップＳ４で検出された２Ｄピークのほかに、ステップＳ４では検出されなかった１乃至複数の２Ｄピークが１つの分画試料に対して抽出される。即ち、１つの分画試料に対して複数の、それも比較的多くの数のプリカーサイオン候補が挙げられることになる。これにより、その分画試料に含まれる物質由来のプリカーサイオンが候補漏れとなることを回避できる可能性が高くなる。
【００３８】
ステップＳ６で求まった分画試料とプリカーサイオン候補リストとは分析制御部６に与えられ、分析制御部６は、その分画試料に対しリストアップされたプリカーサイオン候補のうちの１つをプリカーサイオンに設定したＭＳ2分析を実行するように試料交換部３及びＭＳ部４を制御する。スペクトルデータ収集部５１はこのＭＳ2分析により得られるＭＳ2スペクトルデータを収集する（ステップＳ７）。同定処理部５４はＭＳ2分析結果、つまりＭＳ2スペクトルデータを用いＭＳ／ＭＳイオンサーチやデノボシーケシングなどの所定のアルゴリズムにより、その分画試料に含まれる物質の同定を行う（ステップＳ８）。
【００３９】
物質同定が成功した（例えばＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いた場合であれば、十分に高い信頼度を示すスコアや期待値で以て化合物が特定された）場合には、ステップＳ９からＳ１０へと進む。一方、同定に失敗した場合にはステップＳ９からＳ１４へと進み、ＭＳn分析制御情報生成部５３は同じ分画試料に対してリストアップされた他のプリカーサイオン候補があるか否かを判定する。他のプリカーサイオン候補があれば、同じ分画試料に対しプリカーサイオンのみを変更して（ステップＳ１５）ステップＳ７へと戻り、該プリカーサイオンを設定したＭＳ2分析を実行する。したがって、ＭＳ2分析結果から物質同定ができない場合には、ステップＳ７→Ｓ８→Ｓ９→Ｓ１４→Ｓ１５→Ｓ７…の繰り返しによって、物質同定がなされるか、或いはプリカーサイオン候補がなくなるまで、同一分画試料に対し異なるプリカーサイオンを解離させるＭＳ2分析を順次実行することになる。
【００４０】
或る１つの分画試料についてリストアップされた全てのプリカーサイオン候補についてのＭＳ2分析を実行しても物質同定ができない場合には、ステップＳ１４からＳ１６へと進み、ＭＳn分析制御情報生成部５３は、ステップＳ５で選択され、ＭＳ2分析及び同定処理が未だ行われていない他の分画試料があるか否かを判定する。他の分画試料があればステップＳ６へと戻り、未処理である他の１つの分画試料について上記と同様にＭＳ2分析と同定処理とを実行する。
【００４１】
或る分画試料に含まれる物質の同定に成功した場合には、ステップＳ９からＳ１０へと進み、それまでに同定された物質が十分な個数であるか否かを判定する。元の試料に含有される物質の種類の数が既知である場合や予め所定数以上の物質が同定されればＯＫであると定められている場合には、上記「十分」な個数を所定個数以上と定めておけばよいが、含有物質の種類の数が未知である場合には、個数の値で以て良否の判定することはできない。そこで、その場合には、同定される物質個数の累積値を順次求め、累積値の変化が小さくなったり変化しなくなったりしたとき、又は、新たに同定される物質個数を順次求め、その伸びが止まったときなどに、同定される物質個数が飽和した（つまり大部分の物質が同定された）と判断するとよい。
【００４２】
ステップＳ１０において物質の同定個数が不十分であると判定されたとき、或いは、ステップＳ１６においてＭＳ2分析する分画試料がなくなったと判定された場合には、変数Ｎをインクリメントする（ステップＳ１１）。そして、その変数Ｎが予め定めた上限値に達したか否かを判定し（ステップＳ１２）、変数Ｎが上限値に達していなければステップＳ４へと戻る。ステップＳ１２で変数Ｎの上限値を定める理由は、同定された物質の個数が不十分であっても分析時間が異常に長くなることを避けるためである。
【００４３】
ステップＳ１２からＳ４へと戻ったとき、変数Ｎはそれ以前より１だけ増加しているから、ステップＳ４の処理が２回目であるときには第１閾値としてθ2を用いた２Ｄピーク検出が行われる。図２（ｂ）、（ｃ）に示すように、θ2はθ1よりも小さいから、先に第１閾値がθ1であったときに検出されなかった新たな２Ｄピークが検出されるようになる。したがって、新たな２Ｄピークのピークトップの保持時間に応じて、ステップＳ５でも新たな分画試料が選択される。ただし、新たに検出された２Ｄピークのピークトップが既にＭＳ2分析済みの分画試料に存在している場合には、この分画試料は選択対象から外される。未だＭＳ2分析が実行されていない新たな分画試料が選択された場合には、該分画試料についてステップＳ６〜Ｓ８の処理を実行し、その新たな分画試料に含まれる物質を同定する。
【００４４】
ステップＳ１０において同定された物質の個数が十分であると判定されるまで、或いは、ステップＳ１２において変数Ｎが上限値に達するまで、ステップＳ１１→Ｓ１２→Ｓ４→…の処理が繰り返される。したがって、図２（ｃ）に示すように、分画試料を選択するための２Ｄピークを検出する第１閾値は徐々に引き下げられ、ＭＳ2分析対象となる分画試料の範囲は拡げられてゆく。ただし、ＭＳ2分析対象となる分画試料の範囲が拡げられるほど、新たな分画試料において物質が同定される可能性は低くなる。即ち、多くの物質は変数Ｎが比較的小さい間に同定される。そして、ステップＳ１０において同定された物質の個数が十分であると判定されるか、ステップＳ１２において変数Ｎが上限値に達したと判定されたならば、同定処理部５４は全ての同定結果を表示部８から出力し、処理を終了する。
【００４５】
なお、上記説明では、ＭＳ2分析結果から物質同定を行うことを前提としていたが、例えば翻訳後修飾されたタンパク質などを対象とする場合には、ｎが３以上であるＭＳn分析結果を利用しないと物質同定が的確に行えないことがある。そこで、ＭＳ2分析結果から物質同定ができない場合に、ＭＳ2分析により得られるＭＳ2スペクトルの中で例えば信号強度の最大のピークをプリカーサイオンとしてＭＳ3分析を実行し、ＭＳ3分析結果から物質同定を行う、というように、ｎが３以上であるＭＳn分析を行ってそのＭＳn分析結果から物質の同定を試みるようにしてもよい。
【００４６】
次に、上述したＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより、複数種のペプチドを含む試料を分析した実験例について説明する。図４は、上述した本発明による手法と従来法とを用いたときの、選択されたウェル（分画試料）の累積数と同定できたペプチド数との関係を示したものである。ここでいう従来法とは、図３中のステップＳ６における閾値ωでの２Ｄピーク検出を行わず、ステップＳ４で検出された２Ｄピークをそのままプリカーサイオン候補とする処理を行う方法である。また、この実験例におけるパラメータは、θ1＝１５、θ2＝１０、θ3＝９、θ5＝８、…、θ8＝４、θ9＝ω＝３である。さらに、図４中の点線は、２Ｄピーク検出を行わずランダムにＭＳ2分析対象のウェルを選択した場合に同定されると期待されるペプチド数を表わしている。
【００４７】
図４により、本発明法では従来法と比較して、少ないウェル選択数（この例では１５０個程度以下）において多くのペプチドが同定されていることが分かる。例えば、１８個中１５個のペプチドを同定するために、本発明法では６０個程度のウェルをＭＳ2分析すればよいのに対し、従来法では１００個程度のウェルをＭＳ2分析する必要がある。このように、本発明法によれば、同数のペプチドが同定されるまでの時間を削減することができる。
【００４８】
なお、上記実施例は本発明の一実施例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００４９】
１…ＬＣ部
２…分取分画部
３…試料交換部
４…ＭＳ部
５…データ処理部
５１…スペクトルデータ収集部
５２…２Ｄピーク検出部
５３…ＭＳn分析制御情報生成部
５４…同定処理部
６…分析制御部
７…入力部
８…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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