(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）
【化１】
0005780775.tif 000005
で示されるベラプロストナトリウムを、金属イオンにより疎水化し、これをポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られるベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を有効成分とする肺高血圧症治療薬。
【請求項２】
さらに、塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする請求項１に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を有効成分とする肺高血圧症治療薬。
【請求項３】
粒子の直径が２０〜３００ｎｍである請求項１または２に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を有効成分とする肺高血圧症治療薬。
【請求項４】
金属イオンが、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン又はコバルトイオンの１種又は２種以上である請求項１又は２に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を有効成分とする肺高血圧症治療薬。
【請求項５】
ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体の重量平均分子量が３，０００〜３０，０００である請求項１又は２に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を有効成分とする肺高血圧症治療薬。
【請求項６】
塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである請求項２に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を有効成分とする肺高血圧症治療薬。
【請求項７】
請求項１〜６に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を有効成分とする、静脈注射用製剤または局所注射用製剤の形態にある非経口投与用製剤である肺高血圧症治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランジンＩ２誘導体含有ナノ粒子に関し、詳しくは、本発明は、プロスタグランジンＩ２誘導体であるベラプロストナトリウムを含有するナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺高血圧症は、心臓から肺に血液を送る血管（肺動脈）の末梢における肺最小動脈の内腔の狭窄によって血液の流れに障害を来し、肺動脈の血圧（肺動脈圧）が高くなることによって生じる疾患である。
その治療にあたっては、肺血管拡張剤の投与により、血液の流れを確保し、肺動脈圧を下げ、これにより拡張した心臓や太くなった肺血管への負担を軽減させることが行われており、各種プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）誘導体が臨床的に使用されている。
【０００３】
最初に臨床応用が可能となった薬剤として、プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）、エポプロステノールがある。エポプロステノールは、本来、生体内に存在する肺血管拡張作用を持つ物質を生合成したものであり、プロスタサイクリンは血管平滑筋のプロスタサイクリン受容体を介してアデニルサイクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰ濃度を増加させることによって、血管平滑筋の弛緩をもたらし、肺血管の拡張作用を発揮する。
また本薬剤は、抗血小板作用、平滑筋増殖抑制作用も併せ持つとされており、これまでの検討では、未治療の原発性肺高血圧症の３年生存率が約４０％であるのに対し、エポプロステノール治療群では約７０％と、生命予後の著明な改善が証明されており、本薬剤の治療効果はほぼ確立しているといってよい。
【０００４】
このエポプロステノールは、血中半減期が２〜３分程度と極めて短く、また化学的安定性の目安となる化学的半減期も１０分程度でしかない。したがって、安定した治療効果を得るためには、エポプロステノールを、持続的に静脈内投与を行うことが必要である。また、その投与にあたっても、用溶解液を用いて溶解し、中心静脈に挿入する特殊なカテーテルと、エポプロステノールとして１分間当り２ｎｇ／ｋｇの投与速度を確保し得るインフュージョンポンプ（薬剤注入用の小型精密ポンプ）の組み合わせにより、持続的静脈内投与を行わなければならず、患者にとって極めてＱＯＬに負担のかかる薬剤である。
【０００５】
しかしながら、エポプロステノールの肺高血圧症に対する治療効果は極めて顕著なものであることから、最近、各種のプロスタサイクリン誘導体の開発が行われ、より安定性に優れたプロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）誘導体の開発検討が行われてきており、その一つとして、比較的半減期の長い、ベラプロストナトリウムが登場するに至った。
このベラプロストナトリウムは、日本で開発されたプロスタサイクリン誘導体であって、生体内半減期も１．１時間程度、また化学的半減期も１０日程度と長く、経口投与が可能な点で、他のプロスタサイクリン誘導体と比較して、大きな長所を持っているものである。
ベラプロストナトリウムは、当初閉塞性動脈硬化症の治療薬として認可されていたが、その後、原発性肺高血圧症と膠原病に合併する肺高血圧症を対象とした臨床試験が行われ、ベラプロストナトリウムの３ヶ月間の投与・治療で、肺血管抵抗は有意に低下を来し、その結果、原発性肺高血圧症に対する治療薬として認可されるに至り、現在では、ベラプロストナトリウムが肺高血圧症に対する第一次選択薬として広く用いられている。
【０００６】
しかしながら、エポプロステノールの持続静注療薬の経験からみて、プロスタサイクリン系統の薬剤は、比較的濃度依存的に血管拡張作用が見られる傾向がある。したがって、十分な治療効果を得るためには、可能な限り高濃度の安定したベラプロストナトリウムの血中濃度を維持することが必要である。
従来の経口投与によるベラプロスト製剤の１００μｇ投与後の最高血中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１．４２時間、最高血中濃度（Ｃｍａｘ）は４４０ｐｇ／ｍＬと発表されており、このためベラプロストナトリウム服薬後は、比較的急速に本薬剤の血中濃度は増加し、血管拡張作用を発揮するものの、血中濃度半減期は、１．１時間でしかなく、急速にその薬効が消失してしまう問題点があった。また本薬剤の血中濃度の増加は、血圧低下などの副作用を導くため、有効性が期待される静脈内投与は可能ではなかった。
そのため、長時間にわたる、十分なベラプロストナトリウムの持続的な血中濃度を維持できる製剤の開発が急務である。
【０００７】
ところで本発明者等は、これまで、乳酸・グリコール酸共重合体（以後、「ＰＬＧＡ」と記す場合もある）、または乳酸重合体（以後、「ＰＬＡ」と記す場合もある）のマイクロ粒子ないしナノ粒子に薬物を封入する研究を種々行ってきている。
【０００８】
例えば、本発明者等は、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これをポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体、及びポリ乳酸又はポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体と作用させることにより得られるナノ粒子に封入することにより、患部ターゲッティング及び徐放性に優れ、なおかつ肝臓集積を低減し、血中滞留性を高めた薬物含有ナノ粒子について特許出願している（特許文献１）。
さらに本発明者等は、この技術を更に改良し、陰荷電基を持つ低分子薬物を患部に効率的にターゲッティングし、薬物徐放性に優れ、かつ肝臓集積を低減することにより副作用を軽減させた、徐放性に優れた陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を提供している（特許文献２）。
【０００９】
本発明者等は、かかる特許文献に記載の技術を、プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）誘導体に応用してナノ粒子化してやれば、かかるナノ粒子製剤は、薬物の徐放性に優れ、持続的な薬物の血中濃度の維持が図れるものと考え、プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）誘導体についてのナノ粒子化を検討した。
【００１０】
その結果、初期の肺高血圧症の治療薬であるエポプロステノールについては、ナノ粒子化することができなかったが、ベラプロストナトリウムについては、極めて効率よくナノ粒子化を行うことができ、得られたナノ粒子は、粒子中に封入されたベラプロストナトリウムの徐放性に優れ、血中滞留性があることから、持続的な薬理効果の発現が得られることを確認し、本発明を完成させるに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０７４６０４ Ａ１号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００８／１３９８４０ Ａ１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明は、肺高血圧症の治療薬であるプロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）誘導体のなかでも、ベラプロストナトリウムを含有するナノ粒子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
かかる課題を解決する本発明は、具体的には以下の態様からなる。
（１）すなわち、その基本的態様は、次式（Ｉ）：
【００１４】
【化１】
0005780775.tif 000002
【００１５】
で示されるベラプロストナトリウムを、金属イオンにより疎水化し、これをポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られるベラプロストナトリウム含有ナノ粒子である。
【００１６】
より具体的には、本発明は、以下の構成からなる。
（２）さらに、塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする上記（１）に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子；
（３）粒子の直径が２０〜３００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである上記（１）または（２）記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子；
（４）金属イオンが、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン又はコバルトイオンの１種又は２種以上である上記（１）または（２）に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子ナノ粒子；
（５）ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体の重量平均分子量が３，０００〜３０，０００である上記（１）または（２）に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子；
（６）  塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである上記（２）記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子；
（６）  上記（１）〜（５）に記載のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を有効成分とする、静脈注射用製剤または局所注射用製剤の形態にある非経口投与用製剤；
である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明が提供するベラプロストナトリウムを含有するナノ粒子（以下、ベラプロストナノ粒子という場合もある）は、有効成分であるベラプロストナトリウムを患部ターゲッティングし、有効効成分の徐放性に優れ、副作用を軽減し、さらにまた血中滞留性にも優れており、特に薬効の持続性において、極めて顕著なものである。
したがって、半減期の比較的短いベラプロストナトリウムについて、ナノ粒子化することにより、その薬効の持続性に優れると共に、血中滞留性が良好なものであり、患者のＱＯＬに配慮した肺高血圧症の治療薬を提供できるものであり、その産業上の利用可能性は多大なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例２における、本発明のベラプロストナトリウムナノ粒子における平均粒子径の分布を示した図である。
【図２】実施例３における、塩化第二鉄の存在下におけるベラプロストナトリウムの残存率を示した結果である。
【図３】実施例３における、塩化第二鉄の非存在下におけるベラプロストナトリウムの残存率を示した結果である。
【図４】実施例４における、ベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の、in vitroにおける安定性の結果を示す図である。
【図５】実施例５における、血中滞留性評価の結果を示す図である。
【図６】実施例６における、ベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の投与による持続的なｃＡＭＰ上昇の結果を示す図である。
【００１９】
【図７】実施例７における、ＭＣＴ病態モデルを用いた、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の薬効評価（生存率）の結果を示す図であり、ベラプロストナトリウムの経口投与並びにVehicleの結果を示した図である。
【図８】実施例７における、ＭＣＴ病態モデルを用いた、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の薬効評価（生存率）の結果を示す図であり、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の投与の結果を示した図である。
【図９】実施例８のＭＣＴ病態モデルを用いた、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の薬効評価における右心室リモデリングの結果を示した図である。
【図１０】実施例８のＭＣＴ病態モデルを用いた、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の薬効評価における肺血管肥厚の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明が提供するベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、ベラプロストナトリウムを金属イオンにより疎水化することにより不溶性の沈殿物（コンプレックス）として調製でき、この不溶性コンプレックスをポリＬ−乳酸、又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られる。また、界面活性剤を配合してもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化することができる。
【００２１】
本発明が提供するベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、ナノ粒子を形成するために使用する生分解性高分子として、Ｌ異性体であるポリＬ−乳酸、またはポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体を使用することも、またひとつの特徴である。
ポリ−Ｌ−乳酸はポリ−ＤＬ−乳酸に比し、有機溶媒への溶解性が異なり、また結晶性が高いことが知られている。本発明では、ポリ−Ｌ−乳酸を、ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と共に混合しナノ粒子を形成させることにより、ポリ−Ｌ−乳酸の水相での結晶化を抑止し、安定に分散可能なナノ粒子を調製することができる。
ポリ−Ｌ−乳酸は、アセトンに不溶性であるため、その溶解性を上げるために、アセトン／ジオキサンあるいはアセトン／テトラヒドロフランの混合液を使用して、ナノ粒子を調製した。
【００２２】
上記のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、界面活性剤を配合していてもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化し、粒子間の凝集を抑止することができる。
【００２３】
上記により提供される本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、静脈注射用製剤、局所注射用製剤などの非経口投与用製剤とすることにより、投与することができる。
特に、静脈内投与が可能なものであり、これまでのベラプロストナトリウムが経口投与製剤でしかなく、その持続的な投与ができなかった点を改良するものとして、極めて特異的なものである。
また、本発明においては有効成分であるベラプロストナトリウムは、ナノ粒子化するにあたって金属イオン、特に鉄イオンの存在が必須であり、鉄イオンの存在によって、不溶性コンプレックスを調製することができ、その結果ナノ粒子化が可能となった。
かかる点で、本発明は極めて特異的なものである。
【００２４】
本発明が提供するベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、以下のとおり作製することができる。
すなわち、ベラプロストナトリウムと金属イオン、好ましくは鉄イオンを、有機溶媒又は含水有機溶媒の溶媒中で混合して疎水性薬物とし、この混合液中にポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、さらにポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を加えて攪拌し、この溶液を水中に添加、拡散することにより調製することができる。
【００２５】
また、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、さらにポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を溶媒に溶解した溶液と、陰荷電基を持つ低分子薬物の水溶液、及び金属イオン水溶液を同時に加えて混合しても同様のナノ粒子を調製することができる。
【００２６】
ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体をナノ粒子の表面修飾剤として用いることで、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体の水相における結晶化を抑制し、その結果、粒子の大きさが均一で安定なナノ粒子を得ることができる。
【００２７】
使用される金属イオンとしては、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオンのいずれかであり、それらの水溶性金属塩の１種又は２種以上が使用される。そのなかでも好ましくは亜鉛イオン、鉄イオンであり、塩化亜鉛、塩化鉄などが好ましく使用できる。
特に、塩化鉄によって、ベラプロストナトリウムが初めて不溶性コンプレックス（沈殿物）が形成されることが判明した。
【００２８】
上記の反応に使用される溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの有機溶媒、あるいはこれらの含水溶媒であり、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒドロフランが好ましい。
【００２９】
ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＤＬ−体をＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ、Ｌ−体をＰＬＬＡ−ＰＥＧということもある）又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＤＬ−体をＰＤＬＬＧＡ−ＰＥＧ、Ｌ−体をＰＬＬＧＡ−ＰＥＧということもある）は、ポリＤＬ−乳酸（ＰＤＬＬＡということもある）若しくはポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡということもある）又はポリ（ＤＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体（ＰＤＬＬＧＡということもある）若しくはポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体（ＰＬＬＧＡということもある）（これらの重合体をブロックＡという）とポリエチレングリコール（ＰＥＧということもある）（ブロックＢという）とを、エチレンジメチルアミノプロピルカルボジイミドなどの縮合剤のもとで反応させることにより、生成することができるが、市販されている同様のブロック共重合体を使用してもよい。
【００３０】
ブロック共重合体の構成としてはＡ−Ｂタイプ、Ａ−Ｂ−Ａタイプ、Ｂ−Ａ−Ｂタイプのいずれであっても本発明の目的を達成することができる。また、これらのブロック共重合体の重量平均分子量は３，０００〜３０，０００であることが好ましい。
【００３１】
また、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体に対するポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体の混合比を高くすると、大きなナノ粒子が生成され、かつ薬物のナノ粒子への封入率が増加する傾向にある。
【００３２】
本発明が提供するベラプロストナトリウム含有ナノ粒子おいて、さらに塩基性低分子化合物を混合することによりベラプロストナトリウムのナノ粒子への封入率が増加し、１０％程度まで封入することができる。
このような塩基性低分子化合物としては（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン等を挙げることができ、好ましくは、２級又は３級アミン類であり、ジエタノールアミンが特に好ましい。
【００３３】
かくして調製されたベラプロストナトリウム含有ナノ粒子に界面活性剤を配合してもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化し、かつ粒子間の凝集を抑制することができる。したがって、ナノ粒子を含有する製剤の製剤化工程にとって好ましいものとなる。
【００３４】
使用される界面活性剤としては、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体等をあげることができ、これらの界面活性剤から選択される１種又は２種以上を使用するのが好ましい。
【００３５】
本発明が提供するベラプロストナトリウム含有ナノ粒子にあっては、その粒子の平均粒子径は２０〜３００ｎｍの範囲内であり、好ましくは５０〜２００ｎｍであり、より好ましくは１２０ｎｍ前後である。
この粒径は、ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ若しくはＰＬＬＡ−ＰＥＧ又はＰＤＬＬＧＡ−ＰＥＧ若しくはＰＬＬＧＡ−ＰＥＧを溶解する溶媒、好ましくはアセトン又はジオキサンの量を調節することにより調整することができ、アセトン又はジオキサンの量を多くすることにより小さな粒径のナノ粒子が得られる。また、ナノ粒子の粒径が大きくなるほど薬物の封入率が高くなる傾向にある。
【００３６】
かくして調製した本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、ナノ粒子の溶液または懸濁液を、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、フィルター濾過、ファイバー透析などの操作により適宜精製した後、凍結乾燥して取得、保存される。
【００３７】
その際、凍結乾燥した製剤を再懸濁して投与できるようにするため安定化剤及び／又は分散化剤を加えて凍結乾燥されることが好ましく、そのような安定化剤、分散化剤としてはショ糖、トレハロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが好ましく使用される。
【００３８】
本発明が提供するベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、静脈注射用製剤、局所注射用製剤などの非経口投与用製剤の医薬品として使用され、なかでもこれまで経口投与されていたベラプロストナトリウムを静脈注射用製剤とすることが可能となり、当該ナノ粒子の特性、効果をより良く発揮することができる。
【００３９】
これらの非経口投与用製剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、製剤学的に許容され、使用されている各種基剤、成分を挙げることができる。具体的には、生理食塩水、単糖類、二糖類、糖アルコール類、多糖類などの糖類；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースなどの高分子添加剤；イオン性又は非イオン性界面活性剤；などが剤型に応じて適宜選択され、使用することができる。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：ポリＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＰＬＬＡ−ＰＥＧ）の合成
メトキシ−ＰＥＧ４０ｇ（Ｍｗ５２００、日本油脂社製）、Ｌ−ラクチド４０ｇ（プラーク社製）、オクチル酸スズ（４００ｍｇ）を二口丸底フラスコに入れ十分に混合した。油圧ポンプにて脱気後、オイルバスにて１１０℃で加熱し溶解した。溶解後１５５℃に昇温し、４時間反応させた。反応物（固形物）を冷却後、２５０ｍＬ程度のジクロロメタンに溶解し、氷冷したイソプロパノール２．５Ｌに徐添加で再沈精製し、凍結乾燥することでポリＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＰＬＬＡ−ＰＥＧ）を合成した。合成物は、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）あるいはプロトンＮＭＲにて評価した。
【００４２】
ＧＰＣから、メトキシ−ＰＥＧに比べ分子量の増大が認められ、またプロトンＮＭＲからポリ乳酸の存在が確認できたことから、ＰＬＬＡ−ＰＥＧが合成された。また、Ｌ−ラクチドの量を変えて上記と同様に操作し、分子量の異なるＰＬＬＡ−ＰＥＧを得た。
【００４３】
実施例２：ベラプロストナトリウムを封入したＰＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧからなるナノ粒子の製造法（溶媒拡散法による製造）
ＰＬＡ（多木化学社製）の２６ｍｇを３００μＬのジオキサンに溶解した。実施例１で合成したＰＬＬＡ−ＰＥＧの２４ｍｇをアセトン５００μＬに溶解し、前記のジオキサン溶液とともに混合した。
この混合液に、２．５ｍｇのベラプロストナトリウムを溶解したジオキサン／メタノール混液７００μＬを添加し、つづいて９．５ｍｇのジエタノールアミンを溶解した２００μＬのアセトン溶液を添加した。直ちに、２．４ｍｇの無水塩化第二鉄のアセトン２００μＬ溶液を加えて混和し、室温で１０分間放置した。
５０ｍＬのサンプル瓶に２５ｍＬの水を入れ２ｃｍのスターラーバーで攪拌しながら、そこに２６Ｇ注射針をつけた３ｍＬシリンジで上記の反応液を徐々に滴下した（スターラー回転数：１０００ｒｐｍ、注射針：２６Ｇ、シリンジ：ニプロ３ｍＬ、滴下速度：４８Ｌ／ｈｒ）。得られた懸濁液に５００ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ７）を２．５ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬのＴｗｅｅｎ８０［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート］水溶液を１２μＬ添加した。限外濾過（ＹＭ−５０、アミコン社製）にて濃縮後、５０ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ７）を添加し、再び濃縮を行った（これを２回繰返した）。得られた濃縮懸濁液を超音波照射３０秒後、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）にて凝集塊を除去し、動的光散乱測定装置で粒径測定及び粒子内のベラプロストナトリウムの封入量をＨＰＬＣにて定量した。
【００４４】
下記表１に、上記の処方による各成分の配合量の一例を示した。なお、この処方に限定されないことはいうまでもない。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
＜ナノ粒子の平均粒子径、封入率、回収収率＞
得られたベラプロストナトリウム含有ナノ粒子における粒子径の分布、封入率、回収率を以下に示した。
図１に、ベラプロストナトリウム含有ナノ粒子における平均粒子径の分布を、下記表２に、ベラプロストナトリウム含有ナノ粒子におけるベラプロストナトリウムの封入率、回収率を示した。
【００４７】
【表２】
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本発明が提供するベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、平均粒子径１２０ｎｍを有し、封入率１％、回収率９％のナノ粒子を再現良く作成することが可能であった。
【００４８】
実施例３：塩化第二鉄の存在下での不溶性コンプレックスの形成
本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子においては、ベラプロストナトリウムは塩化第二鉄の存在下で初めて不溶性のコンプレックスを形成し、その結果、効率よくナノ粒子として作成されることが判明した。
すなわち、ベラプロストナトリウムは、塩化第二鉄との相互作用によってナノ粒子中に封入されているものであった。
その点を確認するため、塩化第二鉄の存在／非存在下において、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）の添加の変化による溶液のｐＨの変動と、その上清中におけるベラプロストナトリウムの残存率を検討した。
具体的には、一定濃度の鉄イオン（４５５ｍＭ）とベラプロストナトリウム（３２．５ｍＭ）の水溶液中に、ジエタノールアミンを添加することで溶液のｐＨを種々のｐＨになるように調整した。その溶液（懸濁液）を１６，５００ｇで１０分遠心し、上清に溶解しているベラプロストナトリウムの量を、ＨＰＬＣで定量した。また、その溶液のｐＨも測定した。
一方、一定濃度の鉄イオンの代わりに塩酸を用いて、ベラプロストナトリウム（３２．５ｍＭ）の水溶液中にジエタノールアミンを添加することで、溶液のｐＨを種々のｐＨになるように調整した。その溶液（懸濁液）を１６，５００ｇで１０分遠心し、上清に溶解しているベラプロストナトリウムの量を、ＨＰＬＣで定量した。また、その溶液のｐＨも測定した。
【００４９】
その結果を、図２及び図３に示した。
図２は、塩化第二鉄の存在下において、ジエタノールアミンの添加の変化による溶液のｐＨの変動と、その上清中におけるベラプロストナトリウムの残存率を示した結果であるが、不溶性コンプレックスが形成されている点が確認され、本発明のナノ粒子の調製には、塩化第二鉄の存在が重要なポイントであることが理解される。
一方、図３は塩化第二鉄の非存在下において、ジエタノールアミンの添加の変化による溶液のｐＨの変動と、その上清中におけるベラプロストナトリウムの残存率を示した結果であるが、不溶性コンプレックスは全く形成されていなかった。
【００５０】
実施例４：ベラプロストナトリウム含有ナノ粒子のin vitroにおける安定性
ベラプロストナトリウムナノ粒子の懸濁液４５μＬに、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５０μＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液を１μＬ、およびリン酸緩衝生理食塩水５μＬ加え、よく混合した後１００μＬをマイクロチューブに分注した。その後サンプル溶液を３７℃インキュベーター内に静置し、各日サンプリングを行った。
なお、ＦＢＳを用いたのは、生体内の環境を模倣するためである。
サンプリングは、サンプル溶液に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を９００μＬ加え、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）にかけた。超遠心後、上清を除去し、沈殿物に超純水１ｍＬを加え、同様に超遠心を行った。上清除去後の沈殿物をベラプロストナトリウム定量用のサンプルとした。
ベラプロストナトリウムの定量は、封入率測定法の項で述べた操作方法で行った。
【００５１】
その結果を図４に示した。
図中からの結果からも判明するように、約２週間にわたってナノ粒子中からベラプロストナトリウムが放出されていることが確認された。
ベラプロストナトリウムの生体内半減期１．１時間程度、また化学的半減期も１０日と比較すれば、本発明のナノ粒子とすることにより、封入されたベラプロストナトリウムが長期間にわたって安定的に放出され点で、本発明は極めて特異的なものである。
【００５２】
実施例５：血中滞留性評価
Ｗｉｓｔｅｒ系雄性ラット（５週齢：ｎ＝３）の尾静脈からベラプロストナトリウムナノ粒子、ベラプロストナトリウム（比較例）をそれぞれ静脈内投与した。投与後、各時間において投与部位とは異なる尾静脈をメスで切開し、採血管（ヘパリン処理済み）を用いて採血した。１，４−ジオキサン（１５０μＬ）入りのマイクロチューブに血液を５０μＬ添加し、サンプル溶液とした。サンプル溶液を遠心分離（１３，２００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した後、上清中に含まれるベラプロストナトリウムを、ＨＰＬＣを用いて定量した。
【００５３】
その結果を図５に示した。
図中に示した結果からも判明するように、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、静脈内投与後２４時間後でも血中に存在していることが判明するが、ベラプロストナトリウムは、投与後３時間後には血中には殆ど存在していないものであった。
このことから、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子とすることにより、ベラプロストナトリウムの血中滞留性が著しく向上する点が理解される。
【００５４】
実施例６：ベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の投与による持続的なｃＡＭＰ上昇
プロスタサイクリンは血管平滑筋のプロスタサイクリン受容体を介してアデニルサイクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰ濃度を増加させることによって、血管平滑筋の弛緩をもたらし、肺血管の拡張作用を発揮する。
そこで、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を投与し、持続的なｃＡＭＰの上昇を検討した。
Ｗｉｓｔｅｒ系雄性ラット（５週齢：ｎ＝２）の尾静脈からベラプロストナトリウム含有ナノ粒子、ベラプロストナトリウム（比較例）をそれぞれ静脈内投与した。投与後、各時間において投与部位とは異なる尾静脈をメスで切開し、採血管を用いて採血した。遠心分離（２，０００ｇ、４℃、１０分間）により血清（上清）を採取し、血清サンプルとした。これを適宜希釈し、ｃＡＭＰ  ＥＬＩＳＡキットを用いて、血清中に含まれるｃＡＭＰを定量した。測定方法は、assay design社のプロトコールに従った。
【００５５】
その結果を図６に示した。
図中に示した結果からも判明するように、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、２４時間後でも血漿中のｃＡＭＰ上昇が維持されている。
これに対して、ベラプロストナトリウムの静脈内投与ではｃＡＭＰ上昇の持続が観察されず、ベラプロストナトリウムは、ナノ粒子化することによって持続的な薬理効果が得られることが理解される。
【００５６】
実施例７：ＭＣＴ病態モデルを用いた、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の薬効評価（生存率）
ＭＣＴ（モノクロタニン）により、肺高血圧症誘発モデル動物を用いて、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の薬効を評価した。
ＭＣＴを、まず１Ｍ−塩酸水溶液に溶解させ、その後１Ｍ−水酸化ナトリウム水溶液で滴定し、中性としたものを用いた。
５週齢Ｗｉｓｔｅｒ系雄性ラット（体重：１２８〜１５０ｇ、ｎ＝８〜１２）にペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内投与）で麻酔をかけ、調整したＭＣＴ溶液を頸部に皮下注射した。ＭＣＴ投与後４週間の間、生存率の変化を検討した。
【００５７】
その結果を、図７及び８に示した。
図７は、ベラプロストナトリウムの経口投与並びにVehicleの結果を示した図であり、図８は、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の投与の結果を示した図である。
両図の対比から明らかなように、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を３日に１回静脈内投与することにより、生存率の顕著な改善が認められた。
【００５８】
実施例８：ＭＣＴ病態モデルを用いた、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の薬効評価（右心室利モデリング、肺血管肥厚）
ＭＣＴ（モノクロタニン）により、肺高血圧症誘発モデル動物を用いて、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子の薬効を評価した。
実施例７において、ＭＣＴ投与４週後（２８日後）に生存しているラットをサンプリングし、右心室重量、肺血管肥厚を定量した。
すなわち、ＭＣＴ投与から４週間後において生存しているラットに関して、体重を測定し、脱血屠殺後、心臓をおよび肺を摘出した。
摘出した心臓は、まず右心室を切り出し、左心室は中隔部分を除いて左室自由壁のみとし、それぞれの重量を測定した。右心室肥大の定量は、体重に対する右心室重量の割合で算出した。また、摘出した肺を用いて肺血管肥厚の定量を行った。肺摘出後１０％ホルマリンで浸漬固定した。パラフィン包埋し、約４μｍ厚の切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）した後、鏡検にて肺血管肥厚を評価した。Kayらの方法に従い、肺細動脈の中膜の厚さを評価した。評価対象とした血管は直径２０〜２００μｍの筋性動脈で、短軸断面で切断されているもののみを計測した。
各標本につき１０個の血管を計測し、血管壁厚／血管径を％で算出して中膜肥厚（％wall thickness）とした。
【００５９】
ＭＣＴ投与から４週間後において生存している動物をサンプリングし、右心室重量、肺血管肥厚を定量した。
その結果を、図９及び１０に示した。
図９は、右心室重量（対全体重）の結果を示した図であり、図１０は、肺血管肥厚を示した図である。
本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子を３日に１回静脈内投与することにより、顕著な病態改善効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上記載したように、本発明のベラプロストナトリウム含有ナノ粒子は、薬物の徐放性に優れ、さらに血中滞留性に優れているので、半減期の短いベラプロストナトリウムについて有効な製剤として極めて特異的なものであって、肺高血圧症の治療薬として、患者のＱＯＬに配慮したものであり、その産業上の利用可能性は多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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