(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シート状細胞培養物の折れ重なりまたは皺の存在を、シート状細胞培養物を透過する光の透過率を測定することによって検出することを特徴とする、シート状細胞培養物の状態を判定する方法。
【請求項２】
さらに光の透過率分布を測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２の方法により検出したシート状細胞培養物の重なりまたは皺を、シート状細胞培養物が浸漬している液を振動させることにより、シート状細胞培養物に保護液を滴下することにより、またはこれらを組み合わせることにより解消する、シート状細胞培養物状態を改善する方法。
【請求項４】
保護液を滴下する場合は、光透過率が変化している箇所に向けて滴下するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
シート状細胞培養物が円形である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
シート状細胞培養物を透過する光を発生する光源と、シート状細胞培養物を透過してきた光の強度を検出する検出器と、検出結果から透過率が所定の条件を満たしているかどうかを判定する判定装置とを含む、シート状細胞培養物の重なりまたは皺を検出するシステム。
【請求項７】
請求項６に記載のシステムに、シート状細胞培養物の伸展を促す手段をさらに含む、シート状細胞培養物の状態を改善するシステム。
【請求項８】
伸展を促す手段は、シート状細胞培養物の浸潤する液位を高くする手段、シート状細胞培養物を振動させる手段、シート状細胞培養物に保護液を滴下する手段、保護液を噴射する手段またはそれらの組み合わせである、請求項７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート状細胞培養物が、皺や一部の折れ重なり等の、シート状細胞培養物の不適切な状態にあるかどうかを検出する方法、その状態を修正する方法およびそのためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全に対する治療法として、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われ、重症化した心不全（重症心不全）には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療が行われる。
【０００３】
しかし、重症心不全に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫制御、合併症の発症など解決すべき課題が多く、多くの重症心不全患者に対する普遍的な治療法とは言い難い状況である。
【０００４】
そのような中、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
【０００５】
例えば、重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の繊維化が進行し、心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害され、アポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し、心機能の低下もさらに進む。
【０００６】
このような重症心不全患者に対する心機能回復戦略として、細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
【０００７】
しかし、実際に細胞移植法により臨床的に心機能を十分に向上させるためには、直接心筋内注入による方法では、移植細胞の７０〜８０％が失われ、その効果を十分に発揮できない点や、不整脈等の副作用の問題、大量かつ安全な細胞源の確保などの問題点の解決が不可欠である。また、細胞注入局所へ炎症を惹起するとともに局所的な細胞移植しか行えず、例えば、拡張型心筋症のように心臓全体の心機能が低下した場合に限界がある。
【０００８】
近年、これらの問題に対し、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いた３次元組織構造物としての細胞シートと、その製造方法が提供された（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
また、臨床への適用に障害となり得る製造工程由来不純物成分を含まないシート状細胞培養物、およびその製造方法が提供された（例えば、特許文献２参照）。
【００１０】
このような細胞培養物を、目的とする患部（移植部位）に移植するには、例えば、細胞培養物の端部をピンセット等で摘んで、細胞培養物を包装容器から取り出し、患部まで移送し、その患部に移植（貼付）するといった一連の操作が必要となるが、細胞培養物は、絶対的な物理的強度が低く、皺、破れ、破損などが生じ易いことから、この一連の操作には高度な技術が要求され、かつ細心の注意を払う必要がある。
【００１１】
例えば、特許文献３には、細胞付着部を有する培養細胞移動治具を用い、細胞接着性タンパク質、細胞接着性ポリマー、親水性ポリマーなどからなる細胞付着部に細胞培養基材上の培養細胞を付着させることで培養細胞を細胞培養基材上から剥離させ、その後、その培養細胞移動治具の細胞付着部と培養細胞との付着力を弱めることで、剥離させた培養細胞を特定の場所へ再び付着させることが記載されている。
【００１２】
また、特許文献４には、細胞培養物を、目的とする患部に移植する際に用いる運搬投与器具が記載されている。この運搬投与器具は、内部に供給される流体圧の変化によって、平面状の展開形状と筒状の収納形状への変形動作と、基端部の曲げ動作とを行わせる治療用器具であり、具体的には、細胞培養物を患部に移植する際に細胞培養物を保持し、患部まで移送し、その患部に貼り付けるものが記載されている。
【００１３】
また、特許文献５には、円筒状の外筒と、該外筒内に軸線方向へ摺動可能に支持されたスライド部材と、シート状の治療用物質を支持してスライド部材の先端部に設けられ、外筒の先端部から突出された自由状態では平面状の展開形状に保たれ、スライド部材の摺動移動に応じて外筒の内部方向に移動されたときに該外筒の先端部に当接して筒状に変形しながら外筒内に収納されるシート支持部材とを有するものが記載されている。
【００１４】
しかしながら、これら従来技術において、シート状細胞培養物が適切な状態にあるかどうか、すなわち、折れ重なりや皺が発生したりしていないか、を検出する方法およびシステムは、存在していなかった。
更に、シート状細胞培養物を製造する際の移送や製品検査等においても、シート状細胞培養物を取り扱う際に、折れ重なりや皺を検出し、修正するシステムが必要とされるが、従来そのようなシステムはなかった。
また、シート状細胞培養物を製造し製品として保存する際にも、シート状細胞培養物が折れ重なりや皺の無い適正な状態で保存される必要があるため、適正な状態に在るかどうかを確認し、適正でない場合は適正な状態となるように修正する必要があるが、従来そのようなことを簡便迅速におこなう方法やシステムはなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２０１０−８１８２９号公報
【特許文献３】特開２００５−１７６８１２号公報
【特許文献４】特開２００８−１７３３３３号公報
【特許文献５】特開２００９−５１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、単離したシート状細胞培養物が、端部の折れ重なりや皺の発生等、本来あるべき状態にないことを検出する方法およびシステムと、検出のみならず適切な状態となるように皺や端部の折れ重なりを解消する操作をおこなう方法およびそのためのシステムとを提供することである。
単離状態のシート状細胞培養物は、通常、シート状細胞培養物の性状に悪影響を与えない水等の保護液が浸潤している状態で取り扱う。その取り扱い時において、性状が折れ重なりや皺があるという不適切な状態でないようにするためには、シート状細胞培養物を保存状態にする前や、患部に適用する前に、性状を検出し不具合を解消する必要がある。
保存状態にする直前や、患部適用直前においては、単離したシート状細胞培養物を浸潤している保護液の液量が少なく、従ってシート状細胞培養物が自身の弾力や重力によって自ら伸展して、端部の折れ重なりや皺が消滅することは期待できないのが通常である。したがって、端部の折れ重なりや皺が発生した状態で保管したり、患部に適用したりすることを防止するには、事前にシート状細胞培養物の状態を検出する必要があり、また状態が不適切な場合には、状態を改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の発明者は、単離状態のシート状細胞培養物の、端部が折れて重なっている、皺が発生してシートの一部が重なっているなどのシート状細胞培養物の状態の不適切さが、厚さに応じた減衰を示す光の透過率を測定することによって検出できることを見出し、さらには、重なり状態や皺の解消が、シート状細胞培養物を浸漬する保護液の量を増加させる操作すなわち、液位を高めることや保護液の滴下によって浸潤液量が増えれば伸展し易くなる性質があるために可能であることを見出し、本発明に至ったものである。さらに、単に浸潤液量を増加させるだけでなく、振動を与えること等によって、シート状細胞培養物の機械的運動を促せばさらに伸展促進効果が高いことを見出した。しかしながら、機械的刺激が過大であると、シート状細胞培養物にダメージを与えるおそれがあるため、伸展促進操作は、最も適切なものを採用すべきであって、小規模の不適切状態の解消には、滴下のみにて伸展可能であることも見出して、本発明に至ったものである。
【発明の効果】
【００１８】
従来、単離した一枚のシート状細胞培養物の状態が、端部が折れ曲がって重なっている状態や皺が発生している状態では、そのまま保管、使用できず、この不適切な状態を検出する必要があるが、この検出をどのようにして行うかは明確に認識されていなかったところ、本発明により、この不適切な状態の検出および解消が簡便・迅速・確実となり、たとえば自動的に実行することも可能となる。
例えばシート状細胞培養物を製品として製造し、保管する際に本発明を使用すれば、包装した製品としての不良品の発生を防止することができ、シート状細胞培養物の臨床的使用の際に本発明を使用すれば、不適切なシート状細胞培養物の使用を防止することができる。
また、規模が大きい折り重なりの解消には振動を、規模の小さな折り重なりには保護液の滴下というシート状細胞培養物全体への影響の多寡を考慮した最適の修正方法が使用されるため、無用なシート状細胞培養物へのダメージを防止し、最適な性状改善を提供することができる。
したがって本発明は、シート状細胞培養物の状態判定を高速化・確実化し、シート状細胞培養物の製造・使用における状態検査、状態修正等を高速化・自動化等することも可能になるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、重なり状態および皺の発生している状態の概念図である。
【図２】図２は、透過度測定による不適切状態の判定およびシート状細胞培養物の伸展操作の概念を説明する図である。
【図３】図３は、本発明の方法を実施したシート状細胞培養物の重なり状態検出および修正方法を示すフローチャートである。
【図４】図４はシート状細胞培養物の重なりの無いもの（シート１）および重なりのあるもの（シート２、３、４）の実例である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１の細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
【００２１】
本発明において、シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、またはポリグリコール酸（ＰＧＡ）製の膜のような合成ポリマーのスキャフォールド等が知られているが、本発明の細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本発明における細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００２２】
本発明における、シート状細胞培養物の重なり検知・解消操作は、シート状細胞培養物の製造後の製品検査時、移送用のデバイスにセッティングする際、使用の前の状態検査時等、単離した一枚のシート状細胞培養物が、皺や重なりのない、適切な状態にあるべきことを検査し、不適切な場合状態を改善する必要のある各種段階において実行される。
【００２３】
シート状細胞培養物の折れ重なりや皺は、図１に示すようにシートが二重になった箇所を有している。この二重になった箇所においては、光の透過率が低くなることを利用するのが本願発明である。
【００２４】
重なりの検出結果が、重なりありとなった場合には、重なり修正の手順が実行される。
重なりの修正は、具体的には、シート状細胞培養物が伸展可能となるように保護液中に重なりを検出されたシート状細胞培養物を持ち来たし、振動を加えることによって、重なっている二枚のシート状細胞培養物が分離するように機械的刺激を加える、重なっているシートの重なり部に保護液を滴下することにより、シート状細胞培養物の伸展が起きるように浸潤保護液量を部分的に増加させる、およびこれらを組み合わせて実行する等により行う。ここでいう保護液とは、生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩液、細胞培養液、水などの液体またはそれらの混合物であってよい。
【００２５】
重なり検出および修正をおこなう際のシート状細胞培養物が保護液に浸漬している程度は、その工程の種類によってまちまちであるが、重なり検出は、検査工程であればシート状細胞培養物を検査状態においた状態で検出し、移送デバイスセッティングにおける重なりを検知する場合には、セット状態で検出をおこなう。シート状細胞培養物の製造から使用までの各種のいかなる段階においても、シートは通常保護液によって濡れている状態（湿潤している状態）で取り扱われる。
そして重なりを検知した場合の修正は、シートを浸潤する保護液の量を変更して、例えば液位を変更することにより、重なり部の伸展が可能となるように浸漬状態を変えることに特徴があり、シート状細胞培養物の重なり部が伸展可能な程度に十分に浸漬しているように、保護液の液位を調節することにより、シート状細胞培養物の伸展が可能となることによって修正がおこなわれる。
【００２６】
いずれにせよ伸展は、保護液による浸潤の程度が変更されることによって、重力による伸展動作、自己の弾性による伸展動作、振動による刺激等、なんらかの理由で発生し、それによりシート状細胞培養物の性状が改善するものである。
【００２７】
図２に、透過率測定による不適切状態の判定およびシート状細胞培養物の伸展操作の概念を説明する図を示す。たとえば保護液中に浮遊するシート状細胞培養物を、移送用デバイス上に載置した状態の正常判定をおこなう場合、状態の判定は、シート状細胞培養物が保護液により浸潤してはいるが、移送状態でシート状細胞培養物の性状が使用時のものとなっている状態で、シート状細胞培養物の光透過率を測定することにより行い、状態が不適切な場合、振動を加えるか、保護液を滴下するかして、性状の改善を図る。この操作は改善完了まで繰り返される。
【００２８】
光の透過率の測定は、光源たる光源を受光器からみてシート状細胞培養物の背面に設ける透過式でも、照明光源を受光器側に設け、シート状細胞培養物の背面には反射面を設ける反射式でもよい。さらに、透過式でも反射式でも、特別に光源を設けずに環境光を光源として、シート状細胞培養物を透過してきた光の強度を測定するようにしても良い。
シート状細胞培養物を対象とする場合、光は可視光を使用するのが通常であるが、シート状細胞培養物の厚さに応じて透過率が変化する放射であれば、使用可能である。透過率波長として４００〜８００ナノメートルが検出感度において最適である。
【００２９】
性状を検出すべき状態が、移送用デバイス等のシートの一面に保護液を介して密着してセットされるような状態である場合、デバイスの密着していない面側からの光たとえば環境光の存在下で、画像センサで画像データを取ると、厚みの違いが画像の違いとなって検出可能であるが、透過光が確実に得られるように、デバイスをその光に対して透明なものとすることも好都合である。投下光の強度増加のために、デバイス表面を反射性のものとすることもできる。
【００３０】
以下に説明するように、本発明においては、皺または重なり状態の判定と解消操作とを、皺または重なりが解消するまで繰り返す。
すなわち、透過率が所定の状態になるまで繰り返すことにより、適切な状態を実現するが、繰り返し回数が一定数に達した場合には操作を停止するようにして、シート状細胞培養物そのものが伸展によっては改善不可能な場合等に対応するようにしてもよい。
【００３１】
図３に、本発明をシート状細胞培養物の製造後の製品検査において実施した、重なり検知および重なり解消のフローチャートを示す。
（Ｈ０００）  重なり検査開始
（Ｈ００１）  保護液の液位をシート状細胞培養物の状態検出をする状態となるように調節する。
（Ｈ００２）  視野内のシート状細胞培養物を通過してきた光の強度測定を行う。画像処理によるシートの位置毎の透過率の分布をデータ取得する場合は、透過率の高い部分の面積比はデータ処理を行って計測する。画像処理のような複雑な処理をせずに、視野全体からの透過光強度を測定してもよい。透過率の高い部分が多ければ透過高強度は大きくなるので、視野全体からの透過光強度から透過率高面積比の大小を判定してもよい。
（Ｈ００３）  透過率の高い面積が合格状態であるかどうかを判定する。
（Ｈ００４）  透過率の高い面積が一定値以上かどうかを判定する。
不合格状態であっても、透過率が高い面積が全体に占める比率が小さければ、折り重なりは小規模であるから、状態改善には保護液滴下で足りると判断し、折り重なりが大規模であれば、より強力な伸展をおこなう振動操作に移る。
（Ｈ００５）  液位上昇させ保護液への更なる浸漬を行う。
（Ｈ００６）  振動による伸展操作を行う。
（Ｈ００７）  保護液滴下による伸展操作を行う。液位の上昇はごく僅かである。
この操作が合格するまで繰り返されるが、規定回数繰り返した場合は、動作を終了させるようにしてもよい。
（Ｈ００８）  終了
【００３２】
本実施例においては、保護液の滴下により重なり解消を行うか、振動による重なり解消を行うかの判断は、透過率が高い部分と低い部分の面積比に基づく。
透過光量の少ない部分の面積が透過光量の多い部分の面積より大きい場合は、重なりが大きいと判断して、振動による重なり解消操作を行い、小さい場合は重なりが小さいので、保護液滴下によるよりダメージの少ない伸展操作をおこなう。
【００３３】
保護液を滴下する場合、滴下場所を、最も有効な場所に選択することもできる。画像処理による透過率測定の場合には、透過率が変化している位置を特定可能なので、滴下装置の位置制御をおこなってそこに滴下する。透過率高面積比を全体透過光量のみで判定する場合は、例えばシート中央に滴下する等適切な方法をとる。
画像処理に複雑な装置を用いなくても、透過光量の分布測定精度がある程度あれば有効に解消操作が可能であり、たとえば視野を四分割してそのそれぞれの透過光量を測定し、規定値に満たない分割区分に対して保護液の滴下をおこなうようにしてもよい。
【００３４】
振動を与える場合は、シート状細胞培養物全体を設定状態まで保護液に浸った状態とし、全体を振動させるので、重なり位置を特定する必要性は少ない。
【００３５】
シート状細胞培養物の形状が円形であると、皺や重なりを保護液の量を増加させることによってシート状細胞培養物の伸展を促す効果が、より高いものとなり好適である。
【００３６】
好ましくは、シート状細胞培養物の重なり検出、重なり解消操作は、温度制御部を備えた収納庫内に保護液容器を収納して行い、収納庫内の温度をＴ１に制御するように設定してもよい。
【００３７】
光透過強度の測定は、シート状細胞培養物を透過してきた光の強度総量を測定してもよいし、画像センサを用いて光透過強度分布データを取得して、データ処理をおこない重なり具合の詳細な測定をおこなってもよい。
総量測定の場合は、透過総量が設定値を超えていれば重なりは無いと判定するが、透過総量が設定した範囲を超える場合は、異常値としてなんらかの異常の発生を検出することもできる。例えば、図４のシート４のような場合には、光量検出の際の検出値が異常となる。シート状細胞培養物の寸法が所定値に十分一致していれば、視野内にシート状細胞培養物を持ちきたして視野全体の光量を測定した場合に、全体光量が所定の値の範囲内であれば、重なりは無いと判断でき、所定値以下である場合に、重なり解消操作をおこない、全体光量が所定値になるまで繰り返す、ということも可能である。
透過強度分布の取得をすれば、２次元の厚み分布を測定したことになり、重なり具合の検出がより精緻となる。
【００３８】
重なりの解消操作は、シート状細胞培養物を保護液中に沈めて振動させる、保護液の量を、浸す程度に増やしてシート状細胞培養物を振動させる、シート状細胞培養物が浸漬している液を振動させる、シート状細胞培養物を振動させる、シート状細胞培養物の重なり部分に保護液を噴射する、保護液が浸潤している程度の状態におけるシート状細胞培養物の重なり部分に保護液を滴下するのみで、自然に伸展するのを促す等の、シート状細胞培養物への影響の程度の異なる各種の方式が可能である。
【００３９】
重なり箇所の検出は、画像センサを用いた通常の画像処理によって透過光強度分布急変位置の検出を行う他にも、機械的な受光部の運動をおこなわせ、受光量が急激に変動した時の受光部位置をもって重なり部分の輪郭線位置と判断することも可能である。
【００４０】
重なり解消操作が、振動を加えるという操作である場合には、振動はシート状細胞培養物全体に伝わることになるため、重なり位置の特定は格別重要ではない。振動によるシート状細胞培養物の伸展は、保護液中に完全に没した状態で行っても良いし、伸展動作を行うに足る程度の液位において行っても良い。
保護液の噴射により重なりの解消を行う場合は、液中に没していても、浸潤している程度でも可能であり、液の流動による機械的ダメージの少ない範囲で行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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