(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iにしたがって架橋されたヒアルロン酸の架橋誘導体であって：
0005818969.tif 000024
式中，独立してＲ１及びＲ２は同一であるか，又は異なっており，３〜１２個の炭素を含み，場合によりヘテロ原子Ｏも含む脂肪族，芳香族，アリール脂肪族及び脂環式部分から成る群より選択され，１００個の糖二量体当たりの置換二量体の数として定義される誘導体のＤＳは１〜２８％である架橋誘導体。
【請求項２】
Ｒ１はメチル及びフェニルから成る群より選択され，Ｒ２はプロピル，フェニル及び３，６，９‐トリオキサウンデカンから成る群より選択される請求項１記載の架橋誘導体。
【請求項３】
ＤＳが１０％である請求項１又は２記載の架橋誘導体。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に開示された誘導体の調製プロセスであって，以下の工程：
i）第２級アミン基を介して結合したアルキニル基を有し，Ｒ１は請求項１で定義したものである式IIにしたがって化学修飾されたヒアルロナン誘導体を調製する工程：
0005818969.tif 000025
ii）第２級アミン基を介して結合したアジジル基を有し，Ｒ１は請求項１で定義したものである式IIIにしたがって化学修飾されたヒアルロナン誘導体を調製する工程：
0005818969.tif 000026
iii）式（II）にしたがって化学修飾された誘導体と式（III）にしたがって化学修飾された誘導体とを混合する工程：及び
iｖ）一般式（I）にしたがって架橋されたヒアルロン酸の架橋誘導体を得るため，ＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムの存在下で式（II）にしたがって化学修飾された誘導体及び式（III）にしたがって化学修飾された誘導体を付加環化反応させる工程：
を含むプロセス。
【請求項５】
工程i）がａ）Ｃ‐６位でヒアルロナンを化学選択的に酸化する工程，ｂ）末端アルキニル基を有する第１級アミンと酸化ヒアルロナンとをカップリングし，アルキニル‐イミンヒアルロナンを形成する工程，ｃ）アルキニル‐イミンヒアルロナンを還元し，第２級アルキニル‐アミンヒアルロナンを形成する工程を含む請求項４記載のプロセス。
【請求項６】
工程ａ）の次に酸化ヒアルロナンの単離を行う請求項５記載のプロセス。
【請求項７】
ａ）〜ｃ）の各工程がワンポット法で行われる請求項５記載のプロセス。
【請求項８】
工程ii）がａ）Ｃ‐６位でヒアルロナンを化学選択的に酸化する工程，ｂ）末端アジジル基を有する第１級アミンと酸化ヒアルロナンとをカップリングし，アジドアルキル‐イミンヒアルロナンを形成する工程，ｃ）アジドアルキル‐イミンヒアルロナンを還元し，第２級アジドアルキルアミンヒアルロナンを形成する工程を含む請求項４〜７のいずれか１項記載のプロセス。
【請求項９】
工程ａ）の次に酸化ヒアルロナンの単離を行う請求項８記載のプロセス。
【請求項１０】
ａ）〜ｃ）の各工程がワンポット法で行われる請求項８記載のプロセス。
【請求項１１】
末端アルキニル基を有する第１級アミンがプロパルギルアミン及びエチニルアニリンから成る群より選択され，末端アジジル基を有する第１級アミンが３‐アジドプロパン‐アミン，１１‐アジド‐３，６，９‐トリオキサウンデカン‐１‐アミン及びアジド‐アニリンから成る群より選択される請求項５〜１０いずれか１項記載のプロセス。
【請求項１２】
工程ａ）のヒアルロナン酸化が，酸化系２，２，６，６，‐テトラメチルピペリジン‐１‐オキシル基（ＴＥＭＰＯ）／次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）を使用し，かつ，添加剤としてＮａＸ：式中Ｘ＝Ｂｒ又はＣｌ：を使用するか，或いはデス-マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）を使用して行われる請求項５〜１１いずれか１項記載のプロセス。
【請求項１３】
温度０〜６０℃の範囲で行う請求項４〜１２いずれか１項記載のプロセス。
【請求項１４】
温度５〜３７℃の範囲で行う請求項１３記載のプロセス。
【請求項１５】
工程iｖ）で得られた架橋誘導体がゲルの形態であり，その後凍結乾燥する請求項４〜１４いずれか１項記載のプロセス。
【請求項１６】
前記凍結乾燥が液体窒素又は氷により行われる請求項１５記載のプロセス。
【請求項１７】
工程iii）が生物学的に活性な物質を反応混合液に添加する工程を更に含み，前記物質が薬物，タンパク質，酵素，バイオポリマー及び生物学的適合性の合成ポリマーから成る群より選択される請求項４〜１４いずれか１項記載のプロセス。
【請求項１８】
前記薬物が鎮痛剤，抗生剤，抗菌剤，細胞増殖抑制剤，抗癌剤，抗炎症物質，創傷治療剤及び麻酔薬から成る群より選択される請求項１７記載のプロセス。
【請求項１９】
工程iｖ）の後に，形成された架橋誘導体に成長因子を播種する請求項４〜１６いずれか１項記載のプロセス。
【請求項２０】
成長因子が軟骨細胞である請求項１９記載のプロセス。
【請求項２１】
ゲル又はスカフォールドの形態の請求項１〜３いずれか１項記載の式（I）にしたがって架橋されたヒアルロン酸の架橋誘導体。
【請求項２２】
薬物，タンパク質，成長因子，酵素，バイオポリマー及び生物学的適合性の合成ポリマーから成る群より選択される封入された生物活性物質を更に含む請求項２１記載のヒアルロン酸の架橋誘導体。
【請求項２３】
ゲルの形態であり，長期放出手段を含む請求項２１又は２２記載のヒアルロン酸の架橋誘導体。
【請求項２４】
組織工学，創傷ドレッシング材又は組織再生のための放出制御システムの製造のための請求項１〜３又は請求項２１〜２３のいずれか１項記載のヒアルロン酸の架橋誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は架橋ヒアルロン酸ベースの新規な両性材料，及び前記材料の調製法を説明している。更に，本発明はまた，活性剤（例えば薬物，成長因子等）を封入した材料及びその調製法に関する。更に，本発明は組織工学，創傷ドレッシング材又は組織再生における放出制御システムの製造のための前記材料の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は特異的なヒアルロン酸である化学修飾したポリアニオン性多糖から形成された生体適合性材料又はハイドロゲルに関する。ヒアルロン酸又はヒアルロナン（ＨＡ）は，ベータ１‐３‐グルクロン酸及びベータ１‐４‐グルコサミン結合を高分子量の直鎖ポリマーに改変することにより連結された改変Ｄ‐グルクロン酸及びＮ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンから成る天然のムコ多糖である。ＨＡは細胞外マトリックスで生じ，組織完全性の維持に極めて重要な役割を担う。ＨＡは炎症，創傷治癒及び胚発生中の細胞の接着及び分化を促進する。動物モデルでは，局所塗布したＨＡはラットやハムスターの皮膚創傷治癒を促進し，線維症及び瘢痕形成を減少させた。保水容量が高く，生分解性が良好であることからＨＡは創傷治癒薬，化粧品配合剤及びドラッグデリバリーの担体として使用されている。ＨＡは腫瘍形成，形態形成，炎症及び損傷への宿主応答といった多様な生物学的プロセスと関連している。
【０００３】
天然ヒアルロン酸は以下のような重大な欠点を有する：分解が速い。ヒアルロナン分解はその粘弾特性及び機械的特性を改変し，上述の用途を制限する。近年，分解，酵素攻撃及び温度変化に対して感受性の低いＨＡの化学修飾誘導体に関心が高まってきている。化学修飾形態のＨＡは外科的助剤として有用であり，術後期の体組織の接着を防止する。
【０００４】
本発明は，放出制御（Pal,Paulson,Rousseau,Stefan,Ian及びJohan，２００９年）組織工学及び創傷ドレッシング材といった生物医学用途に必要な生分解性及び生体適合性などの要件を満たすハイドロゲルを調製するためのヒアルロン酸の新規な両性誘導体の設計及び合成を説明している。環境ｐＨの変化の応答として，ヒアルロン酸の超多孔不溶性誘導体は様々な輸送システム（拡散），フィックの輸送，特異な輸送及びスーパーケースII輸送(super case II transport)を示す。
【０００５】
ｐＨ反応性ハイドロゲルは環境ｐＨの変化に反応し，それにしたがって体積を変えることが可能な材料の一種である。胃腸管，膣及び血管などいくつかの身体部位においてｐＨに差があることから，ハイドロゲルは制御ドラッグデリバリーシステム（ＣＤＤＳ）に特に適している（Gupta,Vermani及びGarg，２００２年）。近年，正電荷も負電荷も有し，よって酸性媒体及び塩基性媒体の両方で膨潤し得る両性ｐＨ感受性ハイドロゲルに特に関心が寄せられている（Yao,Chen，Liu及びDe Yao，２００３年）。本発明では，膨潤‐収縮の切り替えにより，徐放量のマトリックスに適した一定の放出速度が可能となった。本発明にしたがった手段の調製プロセスは，クリック化学を介して架橋できる直鎖ポリマー骨格に担持されたアジド又はアルキン部分を担持する第二級アミンを誘導するために酸化還元アミノ化プロセスによってヒアルロン酸ナトリウム（又はヒアルロナン）を化学修飾することにある。本発明で報告されたヒアルロン酸ナトリウムの化学的に安定的なこれらの第二級アミンはヒアルロン酸のグルクロン酸中の部分修飾された第一級アルコールである。
【０００６】
現在のところ，特異的細胞及び器官を標的にするには非常に特異的である送達の配備が必須である。パルス放出プロセスにはバースト放出及び持続放出が必要なものもあり，したがって有効成分は放出を開始する環境条件が変化して急速かつ高効率に送達できる。発表された研究のほとんどが有効成分を完全には放出できない製剤を報告している。
【０００７】
以前に記載した反応条件は多糖の第一級アルコールを化学的に修飾しており，これは反応が化学選択的ではないことを意味する。Crescenziらはヒアルロナンをベースにしたハイドロゲルを得るための「クリック化学」法の使用を記述している（Crescenzi,Cornelio,Di Meo,Nardecchia及びLamanna，２００７年；Testaら，２００９年）。著者らは１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）でのカルボン酸基活性化によって実行されたヒアルロン酸の化学修飾を記述している。
【０００８】
文献から分かるように，カルボジイミド活性化の主な欠点の１つは反応副産物としてのＮ‐アシル‐Ｎ‐Ｎ’ジ‐置換尿素の形成である。ＥＤＣＩは水中で即時に分解され，化学修飾を得るための大量の試薬が必要となるが，これは生産コストを増加させる。置換度を増加させるには，ＥＤＣIでは反応条件は最適化できない。Crescenziらはこのようにあまり良好に組成された構造ではないハイドロゲルを生成している。組成された壁及び多孔性は応用に重要である。天然構造に似ている相互連結ネットワークは高速の拡散及び高い生体適合性が特徴的であり，Crescenziの材料にはこの特性が欠如している。Crescenziらの主な欠点は放出効率が低いことである。不十分な放出は治療薬の生体適合性を低下させ，全体的な送達プロファイルを変えることが知られている。最初のバーストの後，最も強く架橋したハイドロゲルが緩徐な放出を確実にすると著者らは主張しているが，著者らはこの主張の実験的証拠を示していない；しかしCrescenziの研究では架橋度が大幅に増加することはなかった。
【０００９】
他方，国際特許出願公開第２００８／０３５２５に記載された材料では，最大量の塩酸ベンジダミンが約３．５時間で８８％に相当する量が放出されたことが報告されている。しかし，両性誘導体を使用した本願に記載の材料は同じ量の塩酸ベンジダミンを８時間持続させることが可能である。したがって，本発明のハイドロゲルは放出を緩徐にし，制御できるマトリックス構造を有する。
【００１０】
文献に見られる両性ハイドロゲルの様々な報告は，ポリ（アクリル酸）及びその誘導体を主成分とする合成ハイドロゲルに関連している（Luo,Peng,Wu,Sun及びWang）。これら材料は生分解性ではない。グルタルアルデヒドと架橋したキトサン系のような天然の両性ハイドロゲルは生分解性かつ生体適合性である。しかし，組成物は制御不能であり，特性はバッチ間で変わることも多い（El‐Sherbiny及びSmyth;Chen,Tian及びDu,２００４年；Shang,Shao及びChen，２００８年）。合成及び天然ポリマーの両方を含有するハイブリッドハイドロゲルは合成及び天然ポリマーの長所を合わせ持つように試みることが提唱されてきている。しかし，それらは完全に生分解性ではない（Ferruti,Bianchi,Ranucci,Chiellini及びCaruso，２００５年）。
【００１１】
様々な材料がクリック化学を使用して生成され，特許取得もしており，例えば国際特許出願公開第２００７／０３５２９６は付加環化反応性である二機能又は多機能リンカーと架橋した親水性ポリマーから形成されているハイドロゲルを開示している。同様に，（Malkochら，２００６年）は四機能アジド架橋物質を使用してクリック化学により合成されたポリエチレングリコールをベースにしたハイドロゲルを提供した。これらのハイドロゲルの大きな欠点には未知の生体適合性の小型二機能又は多機能高反応性架橋剤を信頼していることもあり，それによってこれらのハイドロゲルの使用，例えばハイドロゲルを生体組織と接触し得る反応物から調製するインサイツ施用が制限される。特許出願，欧州特許公開第２０９０５９２号Ａ１でDuPrezらにより「クリック化学」を介した架橋も適用された。そこでは，カルボニルジイミダゾール活性化を使用してデキストランを修飾している。したがってデキストラン‐アジドプロピルカーボネート及びデキストラン‐プロパルギルカーボネート誘導体は化学的ハイドロゲルに架橋することが可能である。著者らはクリック架橋した炭酸エステルも生理学的条件下でハイブリダイズすることができると予測した；しかし，この特許では任意の生物学的適合性，細胞毒性及び生分解性が示されなかった。他の著者らは，多様な機能的付加物を含む（１→３）‐［ベータ］‐Ｄ‐グルカンを開発するための一般的なアプローチとして多糖にクリック化学を使用してきた（Hasegawaら，２００６年）。
【００１２】
Ｎ‐ベンジルトリアゾール誘導デンプンを作成するには，デンプンのプロパルギルエーテルが，ベンジルアジドによる１，３‐両性付加環化（「クリック化学」）で使用するための機能的多糖の調製用の貴重な中間体となることをTankamらは報告している。（Tankam,Muller,Mischnick及びHopf，２００７年）。
【００１３】
発明の概要
したがって，以前から公知の材料にある利点をより多く発揮し，特に前述の欠点を克服したハイドロゲルを発見することが本発明の目的である。更に具体的には，薬物放出特性が改善され，ＨＡをベースにした非細胞毒性かつ生体適合性の材料を得ることが本発明で解決する課題である。この課題は，大幅に増加させて組成された多孔性，相互連結した多孔，高い吸収性及び保湿性，一定な薬物放出速度，ならびに封入された薬物の高レベルな放出を示す本発明にしたがった両性材料により解決するものである。更に目的は以下の記述及び特許請求の範囲に基づいて明らかになる。
【００１４】
式Iにしたがって架橋されたヒアルロン酸の架橋誘導体であって：
0005818969.tif 000002
式中，独立してＲ１及びＲ２は同一であるか，又は異なっており，場合によりヘテロ原子Ｏも含む脂肪族，芳香族，アリール脂肪族及び脂環式部分であり，３〜１２個の炭素を含む架橋誘導体により従来技術の短所は解消し，問題は解決する。Ｒ１の非限定的な例はメチルであり，Ｒ２の非限定的な例はプロピルである。
【００１５】
更に，本発明は以下の工程：
i）アルキニル基を有する式IIにしたがって化学修飾された第２級アミンヒアルロナン誘導体を調製する工程：
0005818969.tif 000003
ii）アジジル基を有する，式IIIにしたがって化学修飾された第２級アミンヒアルロナン誘導体を調製する工程：
0005818969.tif 000004
iii）式（II）にしたがって化学修飾された誘導体と式（III）にしたがって化学修飾された誘導体とを混合する工程：及び
iｖ）ヒアルロン酸の架橋誘導体を得るため，ＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムの存在下で式（II）にしたがって化学修飾された誘導体及び式（III）にしたがって化学修飾された誘導体を付加環化反応させる工程：
を含む前記誘導体の調製プロセスに関する。
【００１６】
工程i）が好ましくは，ａ）Ｃ‐６位でヒアルロナンを化学選択的に酸化する工程，ｂ）末端アルキニル基を有する第１級アミンと酸化ヒアルロナンとをカップリングし，アルキニル‐イミンヒアルロナンを形成する工程，ｃ）アルキニル‐イミンヒアルロナンを還元し，第２級アルキニル‐アミンヒアルロナンを形成する工程を含み，工程ａ）の次に酸化ヒアルロナンの単離を行ってもよく，或いは，ａ）〜ｃ）の全工程がワンポット法で行われる。
【００１７】
同様に，工程ii）が好ましくはａ）Ｃ‐６位でヒアルロナンを化学選択的に酸化する工程，ｂ）末端アジジル基を有する第１級アミンと酸化ヒアルロナンとをカップリングし，アジドアルキル‐イミンヒアルロナンを形成する工程，ｃ）アジドアルキル‐イミンヒアルロナンを還元し，第２級アジドアルキルアミンヒアルロナンを形成し，工程ａ）の次に酸化ヒアルロナンの単離を行ってもよく，或いは，ａ）〜ｃ）の全工程がワンポット法で行われる。
【００１８】
末端アルキニル基を有する第１級アミンが，例えばプロパルギルアミン又はエチニルアニリンであり得て，末端アジジル基を有する第１級アミンが，例えば３‐アジドプロパン‐アミン，１１‐アジド‐３，６，９‐トリオキサウンデカン‐１‐アミン又はアジド‐アニリンであり得る。
【００１９】
工程i)及びii)のいずれかの工程ａ）で使用する酸化剤が，ＮａＢｒ又はＮａＣｌ或いはデス-マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）の存在下で，系２，２，６，６，‐テトラメチルピペリジン‐１‐オキシル基（ＴＥＭＰＯ）／次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）であり得る。
【００２０】
工程iｖ）で得られた架橋誘導体がゲルの形態であり得て，その後，好ましくは液体窒素又は氷により凍結乾燥する。
【００２１】
工程iii）が生物学的に活性な物質を反応混合液に添加する工程を更に含んでもよく，前記物質が薬物，タンパク質，酵素，バイオポリマー及び生物学的適合性の合成ポリマーから成る群より選択される。前記薬物が例えば鎮痛剤，抗生剤，抗菌剤，細胞増殖抑制剤，抗癌剤，抗炎症剤，創傷治療剤及び麻酔薬から成る群より選択され得る。
【００２２】
工程iｖ）の後に，形成された架橋誘導体に軟骨細胞などの成長因子を播種し得る。
【００２３】
式（I）にしたがって架橋されたヒアルロン酸の架橋誘導体が例えばゲル又はスカフォールドの形態であってもよく，更に，薬物，タンパク質，成長因子，酵素，バイオポリマー及び生物学的適合性の合成ポリマーから成る群より選択される封入された生物活性物質を更に含んでもよい。
【００２４】
本発明は更に，組織工学，創傷ドレッシング材又は組織再生のための放出制御システムの製造のためのヒアルロン酸の架橋誘導体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】式１にしたがった本発明のヒアルロン酸の架橋誘導体及びその両性ネットワークについての化学的表現。
【図２】Ｄ２Ｏにおけるプロパルギル２‐アミン‐ヒアルロナン（ＨＡ‐ＣＡＰｒ）の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトル（５００MHz）。
【図３】Ｄ２Ｏにおけるアジドプロピル‐２‐アミン‐ヒアルロナン（ＨＡ‐ＣＡＰＡ）の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトル（５００MHz）。
【図４】架橋材料の赤外線スペクトル（薄膜）。
【図５】異なるイオン強度（１ＭのＮａＣｌ，０．１ＭのＮａＣｌ，０．０１ＭのＮａＣｌ，０．００１ＭのＮａＣｌ及び０．０００１ＭのＮａＣｌ）の溶液におけるハイドロゲルIの水分吸収を表す。曲線は媒体のイオン強度の増加に伴って膨潤度が高くなっていることを表していた。
【図６】イオン強度の機能としての水分吸収の写真；左から右に向かって，１ＭのＮａＣｌ，０．１ＭのＮａＣｌ，０．０１ＭのＮａＣｌ，０．００１ＭのＮａＣｌ及び０．０００１ＭのＮａＣｌ。
【図７】ｐＨの関数としての架橋材料（I）の膨潤速度を表す。
【図８】イオン強度の関数としての架橋材料（I）の膨潤速度を表す。
【図９】水中のベンジダミンの累積放出を表す。
【図１０】ＰＢＳ中のベンジダミンの累積放出を表す。
【図１１】緩衝液ｐＨ＝６．０中のベンジダミンの累積放出を表す。
【図１２】水中のドキソルビシンの累積放出である。
【図１３】経時的に３Ｔ３細胞で試験した誘導体プロパルギル２‐アミン‐ヒアルロナンの有効性。
【図１４】経時的に３Ｔ３線維芽細胞で試験した誘導体アジドプロピル‐２‐アミンヒアルロナンの有効性。
【図１５】経時的に３Ｔ３細胞で試験した実施例９で得られた架橋材料の細胞毒性。
【図１６ａ】クリック化学をベースにしたハイドロゲルから構築されたスカフォールドに播種した軟骨細胞の生／死細胞分析を表す。顕微鏡画像は培養６日目又は培養開始時に撮影したスカフォールド表面である。
【図１６ｂ】クリック化学をベースにしたハイドロゲルから構築されたスカフォールドに播種した軟骨細胞の生／死細胞分析を表す。顕微鏡画像は培養１５日目に撮影したスカフォールド表面である。
【図１６ｃ】クリック化学をベースにしたハイドロゲルから構築されたスカフォールドに播種した軟骨細胞の生／死細胞分析を表す。培養６日目に撮影した：スカフォールドの中央部の顕微鏡画像である。
【図１６ｄ】クリック化学をベースにしたハイドロゲルから構築されたスカフォールドに播種した軟骨細胞の生／死細胞分析を表す。培養１５日目に撮影したスカフォールドの中央部の顕微鏡画像である。
【図１７】時間の関数としての軟骨細胞で試験した材料の生物学的利用能。軟骨細胞は２１日間培養した。
【図１８】材料の表面画像，ならびに液体Ｎ２による凍結乾燥後の膨潤状態にある材料の横断面を表す。本材料は２００kDaの化学修飾ＨＡを使用して得た。
【図１９】当該材料の表面画像，ならびに氷による凍結乾燥後の膨潤状態にある材料の横断面を表す。本材料は１００kDaの化学修飾ＨＡを使用して得た。
【図２０】凍結乾燥後の膨潤状態にあるゲルのＳＥＭ顕微鏡写真（横断面）。緩衝液ｐＨ＝９．０中，２５℃で３０日間，ハイドロゲルをインキュベートした。
【図２１】低分子量の修飾ＨＡ（１８kDa）を使用して得て，液体Ｎ２（左）又は氷（右）で凍結乾燥したハイドロゲルのＳＥＭ顕微鏡写真を表す。
【００２６】
本明細書では，特定の表現は特徴又は実施態様の重要な技術的態様に関連していることからむしろ多用している。これらのいくつかの表現では，その表現が使用される具体的な文脈が異なる解釈を必要としない限り，以下の定義を使用することが好ましい。
【００２７】
ヒアルロン酸は，本願の範囲のように，ポリカルボン酸の形態の多糖も，ナトリウム，カリウム，マグネシウム及びカルシウム塩といったその塩をも意味する。本発明で使用したヒアルロン酸はどのような原料からでも得られ；例えばニワトリのとさかからの抽出（欧州特許第１３８５７２号Ｂ１）又は発酵（欧州特許第７１６６８８号Ｂ１）により得られ，平均分子量は５０，０００〜３，０００，０００Ｄａである。
【００２８】
置換度：多糖骨格の場合，通常使用されている置換度（ＤＳ）は１００個の糖二量体，この場合ヒアルロン酸当たりの反応部分と定義されており，すなわち化学修飾した二量体の数を意味している。
【００２９】
架橋材料は，本明細書で使用しているように，１つ以上の親水性ポリマーを化学的に架橋することで形成された３次元ポリマーネットワークである。この誘導体は膨潤可能であるが，水との接触で溶解することはない。
【００３０】
リンカーは，本明細書で使用しているように，共有又は非共有結合で２つ以上のポリマーに結合している二機能化学構造（分子又は一部）である。この出願では，シントンＡ‐Ｒ‐Ｘ：式中，Ａ＝ＮＨ２，ＮＨ及びＲ＝炭素数３〜１２の脂肪族，芳香族，アリール脂肪族，脂環式及び複素環式置換基である：を含有する脂肪族又は芳香族アミンの付加を記載している。Ｘは付加環化又はシグマトロピー反応を付与することが可能な基である。
【００３１】
選択的酸化とは，バイオポリマーに担持されたジェミナルジオール又はアルデヒド部分を取得するためのヒアルロナン骨格におけるＣ‐６位の化学選択的酸化のプロセスである。
【００３２】
ワンポット法での酸化還元アミノ化は，アルデヒド又はジェミナルジオール中の多糖に担持された第１級アルコールの変換，第１級又は第２級アミノリンカーの付加，及びポリマー骨格に付着した第２級又は第３級アミンを得るための，反応におけるどのような化合物も単離せずに行うイミン中間体の還元のプロセスである。
【００３３】
付加環化反応：本発明によると，ポリマーは付加環化反応を付与することが可能な部分又は官能基を有する。特に興味深い付加環化反応は，所謂「クリック化学」，具体的には所謂ヒュスゲン反応（シャープレス「クリック」反応ともいう）の概念で最近注目が多く集まっている（Huisgen,R.,１９６３年）。アジド／アルキンクリック反応は，修飾後プロセスによりリンカーをポリマーに固定するための多くの要件を満たす近年再発見された反応であり，この要件には，ａ）定量収率；ｂ）官能基の高許容性及び溶媒に対する反応の非感受性が挙げられる。現在，シャープレス型クリック反応の名の下にまとめられた本研究記載の基本的な反応は，２００２年にRostovtsevにより，また同時にTornoeにより開発されたＣ‐Ｃ三重結合，Ｃ‐Ｎ三重結合及びアルキル‐／アリール‐又はスルホニルアジド間のヒュスゲン１，３双極性環状付加反応の変法である（Rostovtsev,Green,Fokin及びSharpless，２００２年；Tornoe,Christensen及びMeldal，２００２年）。
【００３４】
薬物放出のメカニズム：膨潤可能なマトリックスから放出された薬物のメカニズムはいくつかの物理的‐化学的現象により判定される。とりわけ，ポリマーの水分吸収，ゲル層形成及びポリマー鎖弛緩は主に薬物放出の調節に関与していると考えられている。主要なメカニズムを分類するため，薬物放出プロセスの分析に式（１）が現在使用されている（Korsmeyerら，１９８３年）。
Ｍｔ／Ｍ∞＝Ｋｔｎ        ・・・式（１）
Ｍｔ／Ｍ∞比はｔ時点で放出された薬物の割合であり，ｋは速度定数であり，指数ｎは放出メカニズムの指標となることが提起されている。この定数では，ｎ＝０．５はフィックの放出（拡散制御放出）を示し，ｎ＝１はケースII輸送と呼ばれる単に弛緩制御した送達を示す。中間値は特異な挙動を示す（非フィック動態は拡散／ポリマー弛緩の組み合わせに相当する）（Ritger及びPeppas，１９８７年ａ）。時にｎ＞１の値が観察され，これはスーパーケースIIの動態と考えられている。
【００３５】
徐放剤形は，所定の速度で薬物を放出すること，或いは特定の期間，薬物レベルを一定に保つことが特徴的な医療手段である。それは初めに身体に所望の治療応答を生じさせ，その後，特定の時間，活性を維持するため薬物を一定放出させために利用可能な量の薬物を提供するものである。徐放とは，特定の時間，薬物を緩徐に放出させることを意味している；それは制御された放出である場合もあり，或いは必ずしもそうである必要はない。徐放とは，一次動態で放出されるか，或いは反応パラメータとは無関係に放出されることを意味する。
【００３６】
放出制御剤形：は完全にゼロ次放出であり；その後，薬物はその濃度と無関係に経時的に放出される。
【００３７】
両性材料（ＡＭ）：所定の環境条件下で正及び負荷電基の両方を形成する特性を含むか，又はそれを有する活性材料である。それらは，徐放性及び特別な膨潤特性などの特別な特性を製剤に与えることができる。それら性質により材料は生物学的接触を必要とする用途に特に有用となり得る。研究した両性ハイドロゲルのほとんどは３つのカテゴリー：合成，天然及びハイブリッド：のうちの１つに当てはまる。
【００３８】
分子量カットオフは，材料中の比較的紆曲した拡散経路をゲストが通り抜けたことから拡散阻害に起因する現象であり，このことは材料が内部小分子量成分を保持し得る複雑なネットワーク構造を有していることを意味している。
第１の態様では，本発明は式Iにしたがったヒアルロン酸の架橋誘導体に関する：
0005818969.tif 000005
式中，独立してＲ１及びＲ２は同一であるか，又は異なっており，炭素数３〜１２の脂肪族，芳香族，アリール脂肪族，脂環式及び複素環式部分である。
【００３９】
本発明は，化学的に安定しており，高度に多孔性であり，非毒性で，生分解性であることを特徴とし，当業者に公知の様々な用途に使用することが可能な新種の材料を提供する。当該材料の特徴付けとして，物質の徐放及び制御放出の鍵となる高結合性及び高拡散の根拠を提供してきた。生体活性的であり，生物学的又は薬理学的に活性的な分子又は巨大分子が架橋の前後で物理的に取り込まれることが可能な材料を本出願は記載している。これらの種のハイドロゲルは生物学的微環境の変化にしたがって徐放される。これらの材料の応用は，初期のバースト放出とその後の薬物減少が必要とされる創傷治療に特に有利であり得る。本出願で報告された材料は特別な利点をもたらす特定の酸‐塩基相互作用を確立することが可能である。
【００４０】
第２の態様では，本発明は化学修飾したＨＡをベースにした水不溶性の両性材料を生成するためのプロセスに関する（図１）；このプロセスには２段階の酸化還元アミノ化ならびにスキーム：１，２，４及び５に示された反応，又は下記のワンポット法（スキーム３及び６）によるヒアルロン酸の化学修飾が含まれる。このプロセスにより，少なくとも１つの多糖鎖が１，３双極性環状付加を介して架橋されたヒアルロン酸から構成されるポリアニオン性多糖の両性誘導体が生成される。第２級アミンを介してリンカーは微孔性形態及び適合する微細構造を有するアニオン性多糖に共有結合する（図１）。
【００４１】
更に具体的には，本発明にしたがったプロセスには，i）アルキニル基を有する第２級アミンヒアルロナン誘導体を調製する工程；ii）アジジル基を有する第２級アミンヒアルロナン誘導体を調製する工程；iii）工程i）の誘導体及び工程ii）の誘導体を混合する工程；ならびにiｖ）前記混合された誘導体を触媒存在下で環状付加反応させ，ヒアルロン酸の架橋誘導体を得る工程が含まれる。
【００４２】
親双極子とも言われるアルキニル基（工程i）），アルケン及びアルキンを有する第２級アミンヒアルロナン誘導体，ならびに式II：
0005818969.tif 000006
にしたがった関連するヘテロ原子官能基を有する分子の調製は，還元アミノ化が起こる前に酸化した中間体を単離する２工程か，或いはワンポット法で実行してもよい。２工程調製はスキーム１又は２（使用する酸化剤の種類による）に対応しており：
0005818969.tif 000007
0005818969.tif 000008
以下の工程を含む：ａ）Ｃ‐６位のヒアルロナンを化学選択的に酸化する工程，ｂ）末端アルキニル基を有する第１級アミンを酸化ヒアルロナンに結合させ，アルキニル‐イミンヒアルロナンを形成する工程，ｃ）アルキニル‐イミンヒアルロナンを還元し，第２級アルキニル‐アミンヒアルロナンを形成する工程。スキーム１はＣ‐６を選択的に酸化するために水又は緩衝液中でＴＥＭＰＯ，臭化ナトリウム及びＮａＣｌＯを使用して実行する酸化反応を示している。反応生成物は単離し，精製した。第２の工程はアルキニル基を有する第１級アミンを付加し，第２級アミンへと還元するイミンを形成する工程から成る。スキーム２はＣ‐６を選択的に酸化するためにＤＭＳＯ中でデス-マーチンペリオジナンを使用して実行する酸化反応を示している。反応生成物は単離し，精製した。第２の工程はアルキニル基を有する第１級アミンを水中で付加し，第２級アミンへと還元されるイミンを形成する工程から成る。
【００４３】
単離が必要ないワンポット法の場合，反応スキームは下記のとおりである：
0005818969.tif 000009
スキーム３はIIと名付けたアルキニル基を有するＣ‐６を選択的に修飾するためにワンポット法で実行する酸化還元アミノ化の手順を示している。
【００４４】
下記の工程ii），すなわちアジジル基を有する第２級アミンヒアルロナン誘導体，又は１種以上のヘテロ原子を含み，帯電した双極子を表す少なくとも１つのメソメリー構造を有すると記述され，式III：
0005818969.tif 000010
で表わすことが可能な１，３‐双極化合物の調製は，還元アミノ化が起こる前に酸化した中間体を単離する２工程か，或いはワンポット法で再度実行してもよい。２工程調製はスキーム４又は５（使用する酸化剤の種類による）に対応しており：
0005818969.tif 000011
0005818969.tif 000012
以下の工程を含む：ａ）Ｃ‐６位のヒアルロナンを化学選択的に酸化する工程，ｂ）末端アジジル基を有する第１級アミンを酸化ヒアルロナンに結合させ，アジドアルキル‐イミンヒアルロナンを形成する工程，ｃ）アジドアルキル‐イミンヒアルロナンを還元し，第２級アジドアルキルアミンヒアルロナンを形成する工程。スキーム４はＣ‐６を選択的に酸化するために水又は緩衝液中でＴＥＭＰＯ，臭化ナトリウム及びＮａＣｌＯを使用して実行する酸化反応を示している。反応生成物は単離し，精製した。第２の工程はアジジル基を有する第１級アミンを付加し，第２級アミン又はIIIと名付けた誘導体へと還元するイミンを形成する工程から成る。スキーム５はＣ‐６を選択的に酸化するためにＤＭＳＯ中でデス-マーチンペリオジナンを使用して実行する酸化反応を示している。反応生成物は単離し，精製した。第２の工程はアジジル基を有する第１級アミンを水中で付加し，第２級アミン又は誘導体（III）へと還元されるイミンを形成する工程から成る。
【００４５】
単離が必要ないワンポット法の場合，反応スキームは下記のとおりである：
0005818969.tif 000013
スキーム６はアジジル基（III）を有するＣ‐６を選択的に修飾するためにワンポット法で実行する酸化還元アミノ化反応を示している。
【００４６】
スキーム３及び６に記載のプロセスは以下の方法で実行することが好ましい：ヒアルロン酸をｐＨ９〜１２で１５分間酸化剤と反応させ，ｐＨを５から８に変えるか，或いは第１級アルコールを添加して反応を停止し，その後，アジジル又はアルキニル部分を有する第１級アミンと反応させ，平均分子量１００〜２００kDaのヒアルロン酸の化学修飾誘導体を生成した。
【００４７】
ＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムの存在下，式（II）の誘導体及び式（III）の誘導体を環状付加反応させると，反応スキーム７にしたがったヒアルロン酸の架橋誘導体が生成される：
0005818969.tif 000014
【００４８】
スキーム７は誘導体プロパルギル‐２‐アミンヒアルロナン（II）及びアジドプロピル‐２‐アミンヒアルロナン（III）の環状付加反応を示す。
【００４９】
スキーム７の環状付加反応により得られたマクロ多孔性材料を図１８〜２１に示す。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により得られた画像から，材料が高度に組成された構造を有していることが明らかになった。
【００５０】
第１工程又は酸化では，２，２，６，６，‐テトラメチルピペリジン‐１‐オキシル基（ＴＥＭＰＯ）／次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の系など様々な酸化剤を使用してもよく，また添加物としてスキーム１，３，４及び６に示すＮａＢｒ又はＮａＣｌ，又はスキーム２及び５に示すデス-マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）を使用してもよい。酸化の化学選択性はヒアルロナン骨格上のＣ‐６を修飾した。形成されたジェミナルジオール又は「アルデヒド」は様々な第１級アミン，末端アルキン又はアジド基を有する脂肪族又は芳香族と反応することが可能である。最初に，プロパルギル置換基などのアルキニル基を有する部分を，酸化‐単離‐還元アミノ化工程（スキーム１及び２）又は１工程法の酸化‐還元アミノ化工程（スキーム３）としてＣ‐６の化学選択的酸化の配列により，スキーム１，２及び３の記載どおりに導入する。
【００５１】
１工程法のＮａＣｌＯ／ＴＥＭＰＯ／ＮａＢｒ系を使用する酸化反応は，制御された緩衝ｐＨのリン酸又は炭酸緩衝液中又は水中で，５〜２５℃，好ましくは５℃，窒素雰囲気下で実行し，修飾ポリマーの変性を抑制した。酸化剤を非活性化するために，ｐＨを変更するか，或いはIＰＡ又はエタノールを添加して反応を停止した。ＤＭＰを使用する酸化はＤＭＳＯ中で実行した。酸化プロセスは多様な分子量（２０kDa〜２０００kDa）を有する天然ヒアルロン酸を使用して行う。酸化及び還元アミノ化のプロセスが十分であれば，最も安定的なハイドロゲルが得られる１８〜１０００kDa，好ましくは１８〜２００kDaの誘導体が生成される（図１９）。
【００５２】
第２に，アルキニル基を有する第２級アミンヒアルロナン誘導体，例えば３‐アジジルプロピル‐２‐アミン‐ヒアルロン酸を，１工程におけるＣ‐６の一連の化学選択酸化及び還元アミノ化（スキーム６）又は酸化‐単離‐還元アミノ化手順（スキーム４及び５）により，スキーム４，５及び６の記載どおりに調製した。制御緩衝（tampon）系ｐＨのリン酸又は炭酸緩衝液中又は水中で，５〜２５℃，好ましくは５℃，窒素雰囲気下で，酸化反応を実行した。ＤＭＰ酸化により得た誘導体も水又はリン酸緩衝液中で第１級アミンが付加される。ＤＭＰ酸化によりヒアルロン酸が大幅に分解されるが，生成されたハイドロゲルは安定している。
【００５３】
前記化学修飾ヒアルロン酸誘導体（II及びIII）の分子量は２〜１０００kDa，好ましくは１８〜２００kDaである。
【００５４】
第３に，付加環化反応を行う；それを実行するためには，ポリマーは１つの巨大分子当たり少なくとも１つのアジド又はアルキン基を有している必要がある。「酸化‐還元アミノ化」手順による化学修飾の程度は，反応条件により８〜３０％の範囲である。図１はプロパルギル部分を有し，ＤＳが１４％である化学修飾ＨＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。図２は３‐アジドプロピル２‐アミン部分を有し，ＤＳが１５％である化学修飾ＨＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。好ましい置換度は１工程法の反応で得られる１０〜１５％である。さらなる実施態様では，置換度は，５，１０，１５，２０，２５及び３０など２〜３０の範囲で選択し得る。
【００５５】
安定的な第２級アミン結合を含むリンカーにより，付加環化反応部分をポリマー骨格に結合する；その取得工程は上述した。本明細書で使用しているとおり，第２級アミンは式‐Ｃ‐ＮＨ‐Ｒと表わされている。このような部分を，第２級アミン又はイミンと結合した巨大分子に導入することが，本発明の第２の態様である。
【００５６】
ポリマーネットワーク（図１）に取り込まれた両性第２級アミンは材料内でネットワークの相互作用を強化し，これらは水素結合と疎水性を有し，したがって得られたハイドロゲルの安定性に影響を与えることができる（van Bommelら，２００４年）。このクリック化学ハイドロゲルにｐＨ感受性の基を導入すると，分子レベルで性質が調整され，ｐＨ変化の応答として収縮から膨張へと可逆的に切り替わる（図７）。この特性により放出制御製剤が生成され，これは（Qiu及びPark，２００１年）にしたがった経口投与用に，或いはバイオセンサー又は浸透性スイッチ(permeation switches)として使用可能である（Hoffman，１９９５年）。
【００５７】
この方式で調製した材料は多孔性が高く，壁の相互連結性が良好である。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によると，ハイドロゲル構造はハチの巣状である。材料の特性はヒアルロナンの分子量，置換度及びゲル化時間などの実験パラメータを変えて改変できる。図１８，１９及び２１に示す上述のパラメータを変えて様々な構造が得られる。
【００５８】
本出願で報告された両性材料を使用すれば，取り込まれた薬剤の放出が誘発され，得られた材料の多孔性及び安定性が調整できる。第２級アミン部分間の分子間水素結合により，ハイドロゲルの安定性が高まる。凍結乾燥材料（キセロゲル）のＦＴ‐IＲスペクトルから明らかになっているように，ＮＨシグナルは水素結合した第２級アミンの特徴であり（３３２０〜３２７０cm‐1），それに対してＣＯＯ−及びＮＨ２＋部分由来のシグナルはすべて１６７０〜１６１０cm‐1間にある（図４）。
【００５９】
Crescenziら（国際特許出願公開第２００８／０３１５２５‐Ａ１）に報告された材料と比較して，本出願に記載の材料はほぼ２倍の最大水分量が吸収できる。水分吸収により，ネットワークに強い２極‐２極相互作用が存在することが証明された。更に，その高い多孔性と壁構造により，II及びIIIにしたがった材料をベースにしたハイドロゲルは細胞培養の方が都合がよい。公知のとおり，組織成長を可能にするために，また栄養や老廃物の拡散を迅速にするために，スカフォールドのネットワーク内には隙間が必要である。
【００６０】
非毒性及び生分解性について材料を試験した（図１３，図１４及び図１５）。ハイドロゲルを軟骨細胞と共にインキュベートし，スカフォールド又は組織工学のさらなる用途に効果的なマトリックスであることを見出した（図１６ａ及び図１６ｂ）。ハイドロゲルが生分解性バイオポリマーであるヒアルロン酸から形成されていることは，生物学的試験により明らかになった生体適合性を実証している。
【００６１】
総孔数以外に，考慮しなければならない重要な要素は孔寸法及び相互連結性である。膨張したハイドロゲル内部の断面には平坦な相互連結した孔がある（図１８〜図２１）。反応条件により孔は不規則な形状を呈する場合もある。しかし，すべてのケースで壁は相互連結している。
【００６２】
隙間を有するヒアルロナンをベースにした材料には薬物及び成長因子を取り込む能力がある。孔形成が氷結晶形成及びハイドロゲルのバルク内に捕捉された水分子の排出の結果である凍結乾燥工程のため，ハイドロゲルは連続的な多孔構造にはならないことに注目することは重要である。
【００６３】
他方，この種の材料は天然のネットワーク（ハチの巣構造）に類似していた。孔径は平均２００〜３００μmと測定された。予備研究から加圧滅菌はスカフォールド形状を改変することも，変性を誘導することもないことが分かった。共有結合架橋の導入が三次元ネットワークを生成した。更に，in vitro分解の３０日後に表面電子顕微鏡によりハイドロゲル形態の変化を評価した。元の構造を維持するために液体窒素で標本を凍結乾燥させた。２か月後に異なるｐＨの緩衝液で変化が無かったことから，すべてのゲルで経時的に安定性が良好であった。ＳＥＭに基づいてこれらの結果について結論を出した。材料に導入された第２級アミンの安定性により構造が維持された（図２０）。
【００６４】
この新規なハイドロゲルの設計では，考慮しなければならない３つの重要な基準があり，これらは以下を満たしていることが実証された；
i）第２級アミン結合は分解に安定的である；
ii)ヒアルロニダーゼ及びＨＡ受容体の認識部位であることが分かっているヒアルロン酸のカルボン酸基において，本発明に記載の材料はいかなる化学修飾も示さなかった。したがって，実施例１５に記載の軟骨細胞培養で説明しているように，これらの材料は生体適合性である；
iii）架橋ヒアルロナン誘導体の構成は非毒性として試験し，よってそれらは生体適合性が良好であり，制御可能なハイドロゲル組成物であることが示された。
【００６５】
更に，本特許に記載の材料の両向性は長時間かつ完全な物質放出（制御された徐放）の手掛かりになると本発明者らは考える。このことはマイクロキャリアとして作用するハイドロゲルからの放出を制御する超分子相互作用の可能性により説明される。ハイドロゲルの相互作用及び形状はハイドロゲル全体にわたる分子の拡散を調節する（Kim及びPeppas，２００２年）。分子放出に対する薬物ポリマー相互作用の効果を研究した研究者も数人いるが，挙動を予測するための数学的モデルは報告されていない。更に，修飾ＨＡの両向性により自己集合及び分子間結合が起こり，ハイドロゲルの多孔性が高くなり組織化される。この種のハイドロゲルで説明した組織化された形態は特有であり，濃度には依存しないが自己集合の方に比較的依存し，これは静電気相互作用（２極‐２極）により説明される。開発の過程の中で，ネットワーク内での薬物の捕捉は架橋度にも薬物濃度にも制御されないが（Crescenziらの記述），両性の第２級アミン含有ハイドロゲルと様々な薬物の分子構造上にある双極子モーメントとのルイス酸‐塩基相互作用により制御されることが見出された。アミドは非常に弱い塩基であり，アミンの共役酸のｐＫａは約９．５であり；アミドの共役酸のｐＫａはおよそ−０．５であることが非常にうまく文献で実証されている。結果としてアミドは水中では酸‐塩基特性が低いことが分かる。塩基性のこのような欠如は，局在している電子の孤立電子対が共鳴により非局在化されるカルボニル基の電子求引特性で説明される。本特許に記載した材料は第２級アミンを含み；Ｎ‐Ｈ双極子の存在により，両性機能が供与体ならびに受容体との水素結合を形成することを可能にしている。
【００６６】
国際特許出願公開第２００８／０３１５２５‐Ａ１で以前に報告されたアミドと比較して本発明の方法には明確な利点がある。表１には，国際特許出願公開第２００８／０３１５２５「クリック化学架橋を介して得られたヒアルロン酸誘導体」において報告された材料と，多孔形態及び適合された微細構造を有する本発明にしたがったヒアルロン酸ベースの両性材料との特性比較データが示されている。更に具体的には，第２級アミンはアミド誘導体より活発に水との水素結合に関与し得る。このような酸‐塩基相互作用の結果として，生成された材料は比較的大量の水を吸収し，よって好適な保湿剤として作用することが可能である。更に，相互連結した多孔が拡散により高速の水分吸収を可能にした。本出願は高拡散能があることでガラス状ハイドロゲルへの遅い水分吸収を解消できるハイドロゲルの調製法を開示している。より具体的には，表１はクリック化学を介して架橋され，国際特許出願公開第２００８／０３１５２５で報告された材料，及び本出願で記載したヒアルロナンをベースにした両性材料からの塩酸ベンジダミンの放出を要約し，比較している。
【００６７】
（表１）
0005818969.tif 000015
ＡＭ＝本出願に記載された化合物（II）及び（III）をベースにした両性ハイドロゲル，式中Ｒ１はメチル，Ｒ２はプロピル；ＷＯ＝国際特許出願公開第２００８／０３１５２５にしたがった材料；ＮＤ＝検出なし；ｔ５０は塩酸ベンジダミンが５０％放出された時間（ｈ）を表す。ｔ７０は塩酸ベンジダミンが７０％放出された時間（ｈ）を表す。ｔ８８は最初に取り込まれた塩酸ベンジダミンが８８％放出された時間（ｈ）を表す。
【００６８】
国際特許出願公開第２００８／０３１５２５に報告された材料はゲル化前にゲルに取り込まれた最初の塩酸ベンジダミンをわずか１時間で５０％保持する。他方，両性材料では，放出媒体として水を使用して同じ薬剤が８時間で５０％保持され，これはスマートハイドロゲルを意味する。更に，水中で５時間後，ＷＯの材料から７０％のベンジダミンが放出され，それに対して本出願の発明の両性材料からは１５時間後に同量が放出され，このことはハイドロゲルがネットワーク内の帯電分子間に比較的強い静電相互作用を生じさせ得ることを意味している。ＰＢＳ中でＡＭ材料は同じ挙動を示し，保持時間はより長かった。表１から，Crescenziの材料（ＷＯ）は最初に取り込まれた薬物の８８％を３．５時間後に放出し，ＡＭ材料は８時間後であったことが分かる。両性ｐＨ感受性をハイドロゲルに付与できるペンダント‐ＣＯＯＨ基（組成された非修飾ヒアルロン酸二量体）及び骨格第２級アミン（‐Ｎ‐）の両方をポリマーネットワークが有するという事実は，本発明にしたがったハイドロゲルの重要な特性を構成している（図１）。本明細書では，本発明者らはII及びIII：式中Ｒ１はメチルでありＲ２はプロピルである：に基づいた両性ハイドロゲルの合成，特徴付け（図２，３及び４）及び膨潤挙動（図５，６及び７）を報告している。図５はII及びIII：式中Ｒ１はメチルでありＲ２はプロピルである：に基づいたハイドロゲルの水分吸収を説明するプロットである（物理的には図６に示される試料）。ゲル（初期乾燥なし）を様々な制御されたイオン強度の媒体中，室温で４８時間膨潤させ，その結果は図６にまとめてある。図５は，当該材料に吸収された最大水分量が初期重量の７００％になっていることを示している。例示にもかかわらず，ハイドロゲルは最大膨張度に達し，その時から，ゲルは生分解し始めた。
【００６９】
ｐＨ感受性試験では，乾燥ハイドロゲルを，膨潤平衡に達するまで３７℃で４８時間，様々なｐＨ値の媒体に入れた。ハイドロゲルを取り出し，湿った濾紙で拭き，平衡に達するまで２時間毎に秤量した。膨潤速度研究も行った。乾燥ハイドロゲル試料（キセロゲル）を，異なるｐＨ１．７３（ＨＡのｐＫａ未満），７．４及び９．０が特徴的な培地に３７℃で所定の時間，浸漬し，その後湿った濾紙で拭き，秤量した。欧州薬局方を参考にしてｐＨ値が可変な膨潤媒体を調製し，膨潤速度及びｐＨ感受性試験のために，両試験でＮａＣｌを使用し，I＝０．１Ｍでイオン強度を維持した（図７及び８）。上記実験はすべて３回行い，膨潤比を３回の別々の実験の平均±ＳＤ（ｎ＝３）として報告する。
【００７０】
蒸留水又は様々なイオン強度のＮａＣｌ溶液に対して十分に透析した後の膨潤ゲルの重量（Ｗｓ）と，乾燥ネットワークの重量との比として定義されたハイドロゲル（Ｑ）の膨潤許容度を研究し，図８にまとめた。平衡（一定となった重量）に到達するまで，試料を２５℃の蒸留水又は異なるイオン強度の溶液で膨潤させた。
【００７１】
ｐＨ感受性ハイドロゲルでは，センサー又は放出制御系としてハイドロゲルが機能するに先だって，ハイドロゲルへの水分輸送は第１の必須工程である。したがって，負荷するための適当な薬物を選択するには，また薬物放出及び速度を制御するには，ハイドロゲルでの水分輸送メカニズム及び導入後のハイドロゲル膨潤メカニズムの明確な知識が必要となる。図７はヒアルロン酸をベースにした両性ハイドロゲルの膨潤速度に対するｐＨ値の効果を説明するものであり，これはハイドロゲルの膨潤割合対浸漬時間の関数として表されている。異なる媒体ｐＨ＝１．７３（ＨＡのｐＫａ未満），リン酸塩‐生理食塩緩衝液ｐＨ＝７．４及びｐＨ＝９．０で，３７℃で，膨潤速度を調査した。これらの値でハイドロゲルが最大膨潤度を示したことから，特定のｐＨ値を選択した。体積測定により，本特許に記載されている膨潤度の計算の補助的重量を得た；本実験では，円筒の式を利用して，１％w/v濃度の液体１g当たりの体積を４７４±２０mm3として実験的に測定した。室温でＰＢＳ‐生理食塩水緩衝液中で膨潤させてから２４時間後に，ハイドロゲルの体積は６７７±４６mm3に増加した。同一の媒体で膨潤させてから９６時間後に，ハイドロゲルの体積は６３３±４４mm3であった。標準偏差から，ハイドロゲルの体積は減少し，これは生分解性によるもとの考えることができる。in vivoで当該材料を使用する場合，天然のヒアルロニダーゼでは分解工程が増えると本発明者らは考えた。
【００７２】
ハイドロゲルの膨潤速度は以下の式を使用して概算で表すことができる：
（Ｗｓ‐Ｗｄ）／（Ｗｅ‐Ｗｄ）＝ｋｔｎ                式（２）
Ｗｄ，Ｗｓ及びＷｅがそれぞれｔ時点での乾燥ハイドロゲル（ｄ），膨潤ハイドロゲル（ｓ），及び平衡に達したハイドロゲル（ｅ）である場合，ｋはハイドロゲルネットワーク構造に対して一定であり，ｎは膨潤メカニズムを示す膨潤指数である。ｎ≦０．５であれば，そのハイドロゲルは，水分輸送が単純な濃度勾配により調節されているフィックの拡散にしたがっていることになる。ｎ＝１であれば，水分吸収は対流に制御され，ここではハイドロゲルの弛緩は水分輸送の主要なメカニズムである。ｎが０．５と１との間にあれば，水分吸収が特異な拡散に適合し，水分拡散速度はポリマー弛緩速度と同等であるということになる。膨潤メカニズムについての見識を得るため，時間に対する膨潤度の曲線を対数目盛にプロットし（データの記載なし），ハイドロゲルへの水分輸送に関するPeppasの理論にしたがって，Ｗｓ／Ｗｅ≦６０％の初期相で線形フィッティングを行った（Ritger及びPeppas，１９８７年ａ，ｂ）。得られたｎ値及び測定の係数（Ｒ２）を表２にまとめてある。
【００７３】
（表２）
0005818969.tif 000016
【００７４】
表２は異なるｐＨでのｎ値をまとめている。初めにｐＨ＝７．４のリン酸塩‐生理食塩水緩衝液を評価した。それぞれ生理的ｐＨ及びｐＨ＝９．０で算出したｎ＝０．６及び０．７３から，膨潤が特異な拡散に伴っていることが示唆される。ｐＨ＝１．７での計算値ｎ＝０．４７はハイドロゲルがフィックの拡散に伴うことを意味する。図１に示すように，‐ＮＨ２＋‐カチオンも‐ＣＯＯ−アニオンもｐＨ＝７．４のハイドロゲルに存在しており，双極の存在にとってハイドロゲル内のハイドロゲル結合の付加的形成が有効であり，したがって水分拡散を妨げ，膨潤過程の速度を制限する。‐ＮＨ２＋‐カチオン及びＣＯＯＨがプロトン化されている比較的低いｐＨ＝１．７では，ハイドロゲルは収縮する。ハイドロゲル内の静電斥力が強いと膨潤したハイドロゲルが生成される（図７，ｐＨ＝９．０参照）。斥力が剛性を促進し，弛緩を減速させる。ゼロ次薬物放出を可能にするには，負荷する薬物の特性，ならびにハイドロゲルの寸法及び形状も考慮する必要がある。
【００７５】
本発明にしたがった生体材料は，細胞培養ではスカフォールドの形態，また組織工学又は再生における使用では細胞材料含有ゲルの形態としてもよい。
【００７６】
さらなる実施態様は，いくつかの主要な態様の発明を説明する以下の実施例から明らかになるが，発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
実施例１
酸化ヒアルロナン（ＨＡ‐Ｏｘ）の調製及び単離
モノマー単位の１２５モル当量に相当する異なる分子量のヒアルロナン１０gを，実験前の２４時間，室温で５０００mlの水中に可溶化させる。この溶液に１９．２gのＫＢｒ（１６．５mmol）及び１０gのＮａＨ２ＰＯ４を添加した。反応混合液を０℃に冷却した。反応器を排気し，窒素を再充填した。その後，１０．７mgの４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．０５mmol）を含有する水溶液を反応混合液に添加し，次いで既存のヒアルロン酸ナトリウムのモル比で１０％に相当する０．５８８mL（１．２５mmol）の次亜塩素酸ナトリウムを添加した。５℃で２時間，酸化反応を行う。その後溶液を５０００mlの水で希釈し，ｐＨを７．０に調整した。カットオフ分子量が１０kDaのセントラメイトカセット（Paal社）を使用して溶液を限外濾過した。生成物をIＰＡで沈殿させ，IＰＡ：水（１００：０，８０：２０，６０：４０）で３回洗浄した。６０℃のオーブン内で沈殿物を乾燥させる。
【００７８】
このように得られた反応生成物は分析法により十分に特徴を調べた。反応収率：９０〜９９％。得られた生成物の分子量は後述の化学修飾で使用したものと同様に下記にＭｗ（酸化ＨＡ）として表３及び表４に記述する。
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm‐1）：３４１９（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２９２３，２１６０，１６５２，１６１４，１４１３，１０８０，１０３９，６１１．
ＮＭＲ１Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：３．４〜４．０（m，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ），５．２（ｓ，１Ｈ）
ＤＯＳＹ：
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（５．２ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
【００７９】
実施例２  ＨＡ‐プロピルアジドアミン（II）の調製
最初に，リンカー３‐アジドプロパンアミンを以下の方法で合成した。３‐クロロ‐プロピルアミン塩酸塩（１．００g）及びアジ化ナトリウム（２．５０１６g，３eq）を水（１０mL）に溶解し，その後，触媒量のＫIを添加した。フラスコを水コンデンサーに設置し，反応混合液を９０℃で７２時間加熱した。室温まで冷却した後，ｐＨが１１になるまで水酸化ナトリウムを添加した。エーテルを使用した反応混合液から遊離アミンを抽出した。有機画分を硫酸ナトリウムで乾燥させ，完全に乾燥させないように真空下で濃縮した。短い炭素鎖のアミノ‐アジドは爆発性であると考えられる。１Ｈ  ＮＭＲから化合物の構造及び純度が確認された。ＮＭＲ（５００．１３  MHz，ＣＤＣｌ３）；１．４１（２Ｈ，ｂｓ，‐ＮＨ２），１．７６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８），２．８１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８），３．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８）．ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３３６３，２９４１（υ‐ＣＨ２），２１００（υ‐Ｎ≡Ｎ），１６５０，１５９３，１４６１，１２８６．
次に，リンカー（３‐アジドプロピルアミン）を酸化ヒアルロン酸に結合させて置換度１５％のＨＡ‐プロピルアジドアミン（ＨＡ‐２ＡＰＡ）を調製した。調製の詳細な条件は表３の実施例の数値に示す。通常どおり，酸化ヒアルロナンを丸底フラスコ内の酢酸塩緩衝液（ｐＨ＝６．０）５０ml中に室温で溶解した。２４時間攪拌した後，３‐アジドプロピルアミンを添加し，イミン形成に要する時間として表３に示す時間，室温で反応を進行させた。その後，反応混合液にピコリン‐ボランを添加し，還元に要する時間として表３に示す時間，反応を行い，５０mlの水で希釈し，ＮａＨＣＯ３／ＮａＣｌの５％溶液に対して透析し，凍結乾燥又は限外濾過し，６０℃のオーブン内で乾燥させた。反応収率は８０〜９５％である。誘導体の多分散性及び個々の分子量は表３にまとめてある。
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３３７９（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２８９４，２００８（υ，Ｎ３），１６１４，１４０７，１０７８，１６３．
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ），３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ）．
ＤＯＳＹ
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（２．７ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（３．０ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
【００８０】
（表３）
ＨＡ‐アジドプロピル‐２‐アミン（ＨＡ‐ＣＡＰＡ）の合成に使用する反応条件
0005818969.tif 000017
Ｍｗ＝分子量
ｍ＝重量
ｎ＝モル量
Ｔイミン＝イミン形成に要する時間
Ｔ還元＝イミン還元に要する時間
ＰＢ＝ピコリンボラン
ＢＣＮ＝シアノ水素化ホウ素ナトリウム
eqＨＡ＝ＨＡ二量体に対する当量
ＤＳ＝置換度
Ｐ＝多分散性
【００８１】
実施例３  ＨＡ‐プロパルギルアミンの調製（ＨＡ‐ＣＡＰｒ）
調製の詳細な条件をいくつかの例に挙げ，表４にまとめてある。通常どおり，実施例１で調製した酸化ヒアルロナンを室温で２４時間，４０mlの水中に溶解させた。表４に示す量のプロパルギルアミンを反応混合液に添加し，イミンを形成した。室温で反応溶液を攪拌しながら，表４に示す時間（Ｔイミン）をかけてイミンを形成した。この後，１％還元剤水溶液（表４）を反応混合液に添加し，Ｔ還元と表示している期間（表４），反応を進行させた。その後，反応混合液を５０mlの水で希釈し，水に対して十分に透析し，凍結乾燥又は限外濾過し，６０℃のオーブン内で乾燥させた（表４）。
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３３７９（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２８９４，２１３１（υ，Ｃ≡Ｃ），１６１４，１４０７，１０７８，１６３．
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ），３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ）．
ＤＯＳＹ
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（２．７ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（３．０ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
【００８２】
（表４）
ＨＡ‐ＣＡＰｒの合成に使用する反応条件（スキーム３）
0005818969.tif 000018
【００８３】
実施例４  ナトリウムを含まないヒアルロン酸の酸化，酸化還元アミノ化
簡単に説明すると，平均分子量１．２ＭＤａのヒアルロン酸５gを５００mlの蒸留水に溶解した。ＤＯＷＥＸ５０ＷＸ８樹脂カチオン樹脂交換剤（Ｈ型）を混合液に添加した。イオン交換後，５０００rpmで５分間遠心分離して樹脂を除去し，得られた溶液を−８０℃で凍結させ，凍結乾燥させた。カチオン交換後のポリマーの分子量及び多分散性をＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳにより測定した。
平均分子量１００kDaのヒアルロン酸（無ナトリウム）１．０gを６０℃で２４時間かけて１００mlのＤＭＳＯ中に溶解させる。ヒアルロン酸の０．８eqに相当するデス-マーチンペリオジナン０．３５gを反応混合液に添加した。反応を室温で６時間行う。反応混合物を沈殿により単離した。簡単に説明すると，反応混合液を２‐プロパノール（５００ml）にゆっくり注ぐ。沈殿物が形成され，これを濾過し，２００mlの２‐プロパノール／ＤＭＳＯ８０：２０で４回洗浄し，２‐プロパノール（１００ml）で３回洗浄した。生成物を６０℃で一晩，真空乾燥した。生成物を水に溶解し，一定に攪拌しながら２‐プロパノールにゆっくり注ぐ。沈殿物を単離し，特徴を調べた。本方法による置換度はＤＳ＝２８％と計算された（ＤＳ＝［ＣＨ３ＣＯＮＨ／ＮＨ‐ＣＨ／］）。
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３４１９（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２９２３，２１６０，１７１０，１６５２，１６１４，１４１３，１０８０，１０３９，６１１．
ＮＭＲ１Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ），５．２（ｓ，１Ｈ）
ＤＯＳＹ：
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（５．２ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
【００８４】
還元誘導体の取得
次に記載するように一般的な合成手技を行った。１gの酸化ヒアルロン酸を一晩かけて水中に溶解した（１００ml）。この溶液に，プロパルギルアミンを添加し，個々のアミンは反応中のヒアルロン酸の０．４６eqに相当するようにした。溶液を室温で４８時間，攪拌した。ＮａＢＨ３ＣＮの１％w/w水溶液を１eq調製し，反応混合液に添加した。混合液を室温で９６時間攪拌した。反応を完了した後，溶液を０．１％のＮａＣｌ及び０．１％のＮａＨＣＯ３の混合物に対して透析し，また水に対して十分に透析した。最終生成物を凍結乾燥により単離した。
【００８５】
還元生成物：プロパルギル誘導体
ＤＳ＝２８％（ＤＳ＝［ＣＨ３ＣＯＮＨ／ＮＨ‐ＣＨ／］．
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３３７９（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２８９４，２１３１（υ，Ｃ≡Ｃ），１６１４，１４０７，１０７８，６１３．
１Ｈ  ＮＭＲ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ），３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ）．
ＤＯＳＹ
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（２．７ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（３．０ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ＳＥＣ  ＭＡＬＳにより測定した単離生成物の分子量＝１５kDa，多分散性＝１．５
【００８６】
還元生成物：アジド誘導体
ＤＳ＝２８％（ＤＳ＝［ＣＨ３ＣＯＮＨ／ＮＨ‐ＣＨ／］．
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３４１５（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２９２１，２１１１（υ，Ｎ３），１６１４，１４０７，１３７７，１０７８，６１３．
１Ｈ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０（ｓ，３Ｈ），２．０１４（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｔ，２Ｈ  Ｊ＝１０．９５），３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．４５（ｄｄ，１Ｈ），４．５３（ｄｄ  １Ｈ）．
ＤＯＳＹ
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（２．７ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（３．０ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ＳＥＣ  ＭＡＬＳにより測定した単離生成物の分子量＝１５kDa，多分散性＝１．５
【００８７】
実施例５  プロパルギル誘導体を得るためのワンポット法でのヒアルロン酸酸化と還元アミノ化
調製の詳細な条件は，多数の例として表５に記載してある。通常どおり，ＭＷＨＡとして表５に記載している異なる分子量のヒアルロン酸ナトリウム１０．０gを９６０mlの水に溶解した。その溶液に，２．５７gの臭化ナトリウムを添加した（２．５mmol）。３８．８gのリン酸ナトリウムを反応混合液に添加し，ｐＨ＝９．０にした。以下の反応物を順に添加した：水（１ml）に事前に溶解させた５３．３mgの４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ，次いで３．０mlの次亜塩素酸ナトリウム。Ｔイミンで（表５）記述されている時間の間，攪拌しながら混合物を置いておいた。室温になるまで反応させた。このとき，酢酸を添加して電位差滴定でｐＨを調整し，ｐＨ＝５．５にした。その後，反応混合液にあるヒアルロン酸の０．３eqに相当するプロパルギルアミンをこの混合液に添加した。表５に記載の時間中，還元アミノ化を行った。このとき，ヒアルロン酸の０．３eqに相当する０．４２４gのピコリンボランを添加した。室温で一晩，反応を進行させた。生成物を限外濾過で精製した。一般的な分析技術によりプロパルギル修飾ＨＡ生成物の特徴を十分に調べた。ＨＡに結合したプロパルギルアミン部分の定量評価に使用するシグナルは，修飾多糖上のメチレンと比較したＨＡ上のメチルである。
ＤＳ＝［表５に記載，ＣＨ３ＣＯＮＨ／ＮＨ‐ＣＨ／］
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３３７９（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２８９４，２１３１（υ，Ｃ≡Ｃ），１６１４，１４０７，１０７８，６１３．
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ），３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ）．
ＤＯＳＹ
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（２．７ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（３．０ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
【００８８】
（表５）
ＨＡ‐ＣＡＰｒ合成で使用する反応条件（スキーム３）
0005818969.tif 000019
【００８９】
実施例６  プロパルギル誘導体（ＨＡ‐ＣＡＰｒ）を得るための４℃のワンポット法でのヒアルロナン酸化と還元アミノ化（低ＤＳ）
調製の詳細な条件は，多数の例として表５に記載してある。通常どおり，平均分子量１．８ＭＤａのヒアルロン酸ナトリウム１０．０gを９６０mlの水に溶解した。その溶液に，２．５７gの塩化ナトリウム（２．５mmol）を添加した。３８．８gのリン酸ナトリウムを反応混合液に添加し，ｐＨ＝９．０にした。以下の反応物を順に添加した：水（１ml）に事前に溶解させた５３．３mgの４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ，次いで３．０mlの次亜塩素酸ナトリウムを溶液に添加した。混合液を４℃で１５分間，攪拌しながら置いておいた。室温になるまで反応させた。このとき，酢酸を添加して電位差滴定でｐＨを調整し，ｐＨ＝５．５にした。その後この混合液に，反応混合液中のヒアルロン酸の０．３eqに相当するプロパルギルアミンを添加した。５時間，還元アミノ化を行った。このとき，ヒアルロン酸の０．３eqに相当する０．４２４gのピコリンボランを添加した。４℃で一晩，反応を進行させた。生成物を限外濾過で精製した。一般的な分析技術によりプロパルギル修飾ＨＡ生成物の特徴を十分に調べた。ＨＡに結合したプロパルギルアミン部分の定量評価に使用するシグナルは，修飾多糖上のメチレンと比較したＨＡ上のメチルである。ＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳで測定した分子量から，平均分子量は９００kDa，多分散性は１．７であることが明らかになった。
ＤＳ＝［約５％のＣＨ３ＣＯＮＨ／ＮＨ‐ＣＨ／］
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３３７９（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２８９４，２１３１（υ，Ｃ≡Ｃ），１６１４，１４０７，１０７８，６１３．
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ），３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ）．
ＤＯＳＹ
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（２．７ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（３．０ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
【００９０】
実施例７
ＨＡ‐アジドプロピル誘導体を得るための４℃のワンポット法でのヒアルロナン酸化と還元アミノ化
表６（ＭＷＨＡ）に記載の平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム１０．０gを９６０mlの水に溶解した。溶液を４℃に冷却した。その溶液に２．５７gの臭化ナトリウム（２．５mmol）を添加した。反応混合液に３８．８gのＮａ２ＨＰＯ４を添加した。０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液で反応のｐＨを９．０に調整した。その後，以下の反応物を順に添加した：水（１ml）に事前に溶解させた５３．３mgの４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ，次いで３．０mlの次亜塩素酸ナトリウムを反応混合液に添加した。４℃で１５分，攪拌しながら反応物を置いておいた。４℃に維持した反応物を，酢酸の添加によりｐＨ６．０にした。その後その混合液に，表６（ｎリンカー）に記載の反応混合液中のヒアルロン酸ナトリウム二量体に対するモル比のアジドプロピルアミンを添加した。Ｔ（イミン）として表６に特定した時間中（ｈ），反応を行った。このとき，（ｎ還元剤）として表６に記載の割合に相当する量のピコリンボランを反応混合液に添加した。反応物を限外濾過で精製し，異なる混合物IＰＡ：Ｈ２Ｏを使用して再度沈殿させた。生成物を６０℃で乾燥させ，回収率は９５％であった。ＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳ分析により平均分子量は８００kDa，多分散性は１．６であることが分かる。
【００９１】
（表６）
ＨＡ‐ＣＡＰＡの合成で使用する反応条件
0005818969.tif 000020
【００９２】
実施例８
ワンポット法で１１‐アジド‐３，６，９‐トリオキサウンデカン‐２‐アミンを得るための４℃のワンポット法でのヒアルロナン酸化と還元アミノ化
数分子量（表７）のヒアルロン酸ナトリウム１０．０gを９６０mlの水に溶解した。溶液を４℃に冷却した。その溶液に，２．５７gの臭化ナトリウム（２．５mmol）を添加した。３８．８gのＮａ２ＨＰＯ４を反応混合液に添加した。０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液で反応物のｐＨを９．０に調整した。その後，以下の反応物を順に添加した：水（１ml）に事前に溶解させた５３．３mgの４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ，次いで３．０mlの次亜塩素酸ナトリウムを反応混合物に添加した。反応物を４℃で１５分間，攪拌しながら置いておいた。４℃に維持した反応物を，酢酸を添加してｐＨ６．０にした。その後その混合液に，反応混合液中のヒアルロン酸ナトリウム二量体に対してモル比で３０％の１１‐アジド‐３，６，９‐トリオキサウンデカン‐１‐アミンを添加した。５時間後，同じ温度で，ヒアルロン酸ナトリウム二量体の３０％molに相当する０．４２４gのピコリンボランを添加した。生成物を６０℃で乾燥し，回収率は９５％であった。ＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳ分析により表７に記載の分子量が得られたことが分かる
ＤＳ＝［約１０％のＣＨ３ＣＯＮＨ／ＮＨ‐ＣＨ／］
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３３７９（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２８９４，２００８（‐Ｎ３），１６１４，１４０７，１０７８，６１３．
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０１（ｓ，３Ｈ），２．８１（ｍ，２Ｈ），２．９９（ｍ，１Ｈ），３．３６〜３．９４（ｍ，１６Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ）．
ＨＳＱＣ（クロスピーク）：（２．８〜５０），（３．４〜５０），（３．７〜７０），（３．８〜７０）．
ＤＯＳＹ
ｌｏgＤ（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（２．７ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
ｌｏgＤ（３．０ppmの‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ）〜−１０．５m2/s
【００９３】
（表７）
ワンポット法での１‐アジド‐３，６，９‐トリオキサウンデカン‐１‐アミンとの反応（ＨＡ‐ＣＡＴＡ）
0005818969.tif 000021
【００９４】
実施例９  ワンポット法でのヒアルロナン酸化と還元アミノ化。３‐アジジルアニリン誘導体の取得
平均分子量が６１１kDaで，多分散性が１．９であり，アルデヒドに官能化されたヒアルロナン０．５gを室温で２４時間かけて５００mlの蒸留水中に溶解した。この溶液に，反応混合液中のヒアルロン酸ナトリウムの０．１eqに相当する０．３０８gのアジド‐アニリン塩酸塩を添加した。溶液を室温で５時間攪拌した。その後，水中に懸濁したピコリンボランを，ヒアルロン酸二量体の１０％molに相当する量で反応混合液に添加した。室温で一晩，反応を進行させて，ＨＡ‐アジジルアニリン誘導体を産生した。反応物を水に対して十分に透析した。得られたポリマーを一般的な分析技術により分析した。
電子的効果による架橋反応の有効性を評価するため，還元アミノ化に対する異なるアミンの反応性も評価するため，この化合物を合成した。
ＤＳ＝［１５％のＣＨ３ＣＯＮＨ／ＮＨ‐ＣＨ／］
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1）：３４１５（υ，‐Ｏ‐Ｈ），２８９４，２１２１（υ  ‐Ｎ≡Ｎ），１６６２，１６１４，１４０７，１３７７，１１５１，１０７８，６１５．
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ），３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ）．
ＤＯＳＹ
（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）＝７．９２×１０−１２）m2/s
（３．１ppmの‐４，２ポリマー）〜７．９２×１０−１２）m2/s
（６．８５ppmの‐ｏ‐Ａｒ）〜７．９２×１０−１２）m2/s
（６．９５ppmの‐ｍ‐Ａｒ）〜７．９２×１０−１２）m2/s
【００９５】
実施例１０  ワンポット法でのヒアルロナン酸化と還元アミノ化。３‐アルキニルアニリン誘導体の取得
平均分子量が６００kDaであり，アルデヒドに官能化されたヒアルロナン１．０gを室温で２４時間かけて１００mlの蒸留水中に溶解した。この溶液に，反応混合液中のヒアルロン酸ナトリウムの１０％molに相当する０．２５０gのエチニルアニリンを添加した。溶液を室温で５時間攪拌した。その後，水中に懸濁したピコリンボランを，ヒアルロン酸ナトリウムに対するモル比で１０％に相当する量で反応混合液に添加した。室温で８時間，反応を進行させて，ＨＡ‐エチニル誘導体を産生した。反応物を水で希釈し，水に対して十分に透析した。得られたポリマーを一般的な分析技術により分析した。
ＤＳ＝［１５％のＣＨ３ＣＯＮＨ／ＮＨ‐ＣＨ／］
ＦＴ‐IＲ（ＫＢｒ，cm-1):3415(υ,‐O‐H),2894,2121(υ ‐N≡Ｎ），１６６２，１６１４，１４０７，１３７７，１１５１，１０７８，６１５
ＮＭＲ  １Ｈ（５００MHz，ＮａＯＤ，δppm）：２．０（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），３．１（ｍ，２Ｈ），３．４〜４．０（ｍ，１０Ｈ），４．５（ｄ，２Ｈ）
ＤＯＳＹ
（２．０３ppmのＣＨ３‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）＝−７．９２×１０−１２）m2/s
（３．１ppmの‐４，２ポリマー）〜−７．９２×１０−１２）m2/s
（６．８５ppmの‐ｏ‐Ａｒ）〜−７．９２×１０−１２）m2/s
（６．９５ppmの‐ｍ‐Ａｒ）〜−７．９２×１０−１２）m2/s
【００９６】
実施例１１  水又はＰＢＳ中の修飾II及びIIIからのハイドロゲル形成
モル比で１：１のＤＳを有する１７kDa〜９００kDaの範囲の異なる分子量の誘導体（ＨＡ‐ＣＡＰr）及び（ＨＡ‐ＣＡＰＡ）の調製溶液を一晩かけて溶解した（全体積１．０ml）。ＤＳ＝１００％の場合に両試薬の最終濃度が２％（w/v）に維持されるように，置換度（ＤＳ）に基づいて試薬の正確な量を決定した。その後，様々なモル量の触媒ＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムを混合液に添加し，ゲル化速度を研究した（表８）。各化合物を添加した後，ボルテックスして十分な均質化を確実にした。その後，ゲルが形成されるまで数秒，反応溶液を攪拌した。バイアル傾斜法（vial tilting methodology）によりゲル化時間を測定した（Domszyら，１９８６年）。触媒を除去するため，蒸留水，又は０．０１％（w/v）ＥＤＴＡを含む生理食塩水リン酸緩衝液に対して４８時間，調製ゲルを透析した。ハイドロゲルを凍結乾燥し，凍結乾燥したネットワークの質量を測定した。ＳＥＭ実験では，元の構造を保持するたに液体窒素でゲルを冷凍し，乾燥させた。ＳＥＭ分析の前に，ゲル試料を金でスパッタリングした。
【００９７】
（表８）
異なる置換ＨＡ‐ＣＡＰＡ（ＤＳ＝８〜１５％）及びＨＡ‐ＣＡＰr（ＤＳ＝８〜１５％）の架橋反応条件の影響。反応は，総体積で１mlのＰＢＳ緩衝液中，２５℃で行った。すべてのゲル化実験は個々に５回ずつ行った。
0005818969.tif 000022
【００９８】
実施例１１で報告した異なるハイドロゲルでの膨潤試験
表８のエントリー番号３及び１１に記載された条件を使って，異なるゲルを調製した。すべての膨潤実験は個々に５回ずつ行った。膨潤比は媒体のイオン強度に依存していた。水中で膨潤比は最大に達する（７００％）。
【００９９】
実施例１２  実施例１１で得た架橋ヒアルロン酸をベースにした材料からの薬剤塩酸ベンジダミンの放出測定
膨潤‐平衡法及び物理的取り込みによりポリマーネットワークに薬物を負荷した。第１の工程では，架橋ポリマーを３７℃で２４，４８及び７２時間，既知の濃度の薬物溶液中で膨潤させた。その後，材料を乾燥させ，薬物負荷手段を得た。排出された溶液の濃度を測定し，ポリマーマトリックスに取り込まれた分の割合を計算した。しかし，ポリマーネットワークの吸収は非常に少なかった。第２の試験方法は物理的取り込みであった。放出実験では，ゲル化前に，既知の濃度のベンジダミン溶液を，最終濃度３，４及び５g／Ｌにしてリン酸生理食塩水緩衝液中に調製した。この調製溶液１mlを使用して化合物（表８，エントリー１１）をモル比１：１で溶解し，これを一晩水和させた（総体積１．０ml）。ＤＳ＝１００％の場合に両試薬の最終濃度が２％（w/v）に維持されるように，置換度（ＤＳ）に基づいてその正確な量を決定した。それぞれ触媒及びイニシエーターとしての硫酸銅及びアスコルビン酸ナトリウムの新たに調製した溶液を使用して，クリック化学により，架橋度１０％のハイドロゲルスラブを調製した（表８，エントリー１１）。速度測定を開始するに先だって，室温で２時間，ゲル化を進行させた。試料の膨潤平衡が最大に達したら，各ケースで放出された薬物の量を３０毎に２日間，分光光度法で測定した。架橋前に取り込まれた薬物の濃度を包含する濃度を使用して，較正曲線に基づいて塩酸ベンジダミンの累積放出を計算した。
【０１００】
本実施例はゲルから自由に放出される材料に捕捉された塩酸ベンジダミンの放出速度を説明するものである（薬物放出プロファイルはin vitroで評価し，図９，１０及び１１に示してある）。モデル非依存性の方法であるHiguchi及びRitger‐Korsmeyer‐Peppas式（Korsmeyer,Gurny,Doelker,Buri及びPeppas，１９８３年；Ritger及びPeppas，１９８７年ａ及びｂ）を使用し，物理特性に対する化合物の効果を分析した。モデル依存性の分析では，これら２つの理論モデルはポリマー系からの薬物放出に適している。取得した放出データの相関係数を計算するために，最初に，Korsmeyer‐Peppasモデルを使用した。そのモデルで説明された速度曲線の相関を表９に示しており，ここでは表９にまとめた異なるｐＨの媒体に放出される薬物モデルとして塩酸ベンジダミンを使用している。
【０１０１】
（表９）
拡散指数（ｎ）を評価するために使用されたKorsmeyer‐Peppasモデル
0005818969.tif 000023
ｔ５０は最初に取り込まれた薬物の５０％が放出された時間を示す。
Ｒ２は線形回帰後の測定の係数を意味する。
【０１０２】
最適なモデルパラメータ値に基づいて，放出速度の依存性を説明する。本発明に記載の両性材料は特異な拡散メカニズムを示す；したがって薬物は濃度に関係なく経時的に放出し，放出媒体のｐＨに明確に依存している。他方，ｎ値は濃度によっては左程変化しないことが観察され，このことは輸送メカニズムがネットワークの不均質性により変化していないことを意味する。分子内相互作用が存在する場合の明確な拡散係数を決定するために一般的に適用されるフィックモデルを使用したところ，結果から，ハイドロゲル内部の明確な拡散係数には溶液中の拡散係数と有意な差があることが分かった。材料内の紆曲した拡散経路をゲストが沿って進むことから，その差はハイドロゲル内の拡散が妨害されたためと考えられる。本特許で報告された材料の輸送メカニズムは，非フィックの拡散にしたがっており，崩壊はしない。よって当該材料は分析時間中，安定的であると考えられる。ｐＨ＝４．０，６．０，８．０及び１０．０の放出媒体と比較して，ｐＨ＝２．０の緩衝液中に放出された薬物の量は少なかった。ｐＨ＝２．０の薬物は８０±１０分以内に総放出量が５０％になり；ｐＨ＝４．０，６．０及び８．０では１００±１０分以内；ならびにｐＨ＝１０．０では７２００±２０分以内であった。放出のための拡散指数の値を表９に示す。
【０１０３】
ｐＨ＝４，６及び８の拡散指数（ｎ）から，ベンジダミンを放出させるメカニズムは一定の放出速度の特異な輸送を示すことが示唆される。この種のメカニズムは，制御された徐放剤形に適している。
【０１０４】
実施例１３  実施例１０で得た架橋ヒアルロン酸をベースにした材料からの塩酸ドキソルビシンの放出測定
放出実験では，ゲル化前に，既知の濃度の塩酸ドキソルビシンを，最終濃度２g／Ｌにしてリン酸生理食塩水緩衝液中に調製した。この調製溶液１mlを使用し，化合物をモル比１：１で溶解し，これを一晩水和させた。ＤＳ＝１００％の場合に両試薬の最終濃度が２％（w/v）に維持されるように，置換度（ＤＳ）に基づいてその正確な量を決定した。表８，エントリー１１で報告された条件で架橋度１０％のハイドロゲルスラブを調製した。
各ケースで放出された薬物の量を１０時間毎に３０日間，分光光度法で測定した。架橋前に取り込まれた薬物量を包含する濃度を使用して，較正曲線に基づいてドキソルビシンの累積放出を計算し，図１２に示した。生理食塩水‐リン酸緩衝液の媒体を使用して４６６時間，最大量のドキソルビシンを放出し，これはハイドロゲルに負荷した初期量の１５％と同等である。一方，放出媒体として水を使用すると，放出されたドキソルビシンの最大量は，再度１５％となったが，このケースでは時間は短く，１８６時間であった。ドキソルビシンの場合，拡散指数はＰＢＳ媒体中の放出でのフィックの拡散やスーパーケースII輸送システムｎ＞１を示す。文献で以前に報告された他の種類の両性ハイドロゲルで同様の傾向が見られた（Ferrero,Munoz‐Ruiz及びJimenez‐Castellanos，２０００年；Rao,Devi及びBuri，１９９０年）。この種のメカニズムは弛緩している境界（ゲル層）での可塑化の増加が原因であると考えられる（Ritger及びPeppas，１９８７年ｂ）。ＳＥＭによると，ドキソルビシンは結晶化していなかった（データ記載なし）。
【０１０５】
実施例１４  化学修飾ヒアルロナン及び架橋材料上の細胞生存率，増殖及び分化
化学修飾ＨＡ
ＤＳ＝１００％の場合，表８，エントリー１１の両誘導体の溶液を調製した（１％w/v)。ＤＳ＝１０％の修飾ポリマーの場合，アジド又はプロパルギル結合基含有アセチルグルコサミン部分を含むように１０％のポリマーが修飾され，９０％のポリマーが非修飾アセチルグルコサミン部分を有する。したがって，ヒアルロン酸の各１０個の二量体では，９個の非修飾二量体と１個の修飾二量体が存在する。試薬の正確な量は常に置換度又はＤＳ（ＮＭＲによる測定）に基づいて測定する。したがって，ＨＡの修飾部分に基づいて試薬の濃度を計算するが，修飾部分は全巨大分子から離れる可能性は無いのでポリマー濃度は全ポリマーに対する％w/vで常に表さなければならない。調製溶液を濾過して滅菌溶液を生成し，生存率及び細胞毒性を見るために個別に試験した。２０００個の（３Ｔ３）細胞を９６ウェル試験プレートのウェルに播種した。試験溶液で処置する前に２４時間，細胞を培養した。その後，試験溶液を各ウェルに添加し，希釈剤として培養液を使用してウェル内の試験溶液の最終濃度が１００，５００，１０００μg／mLとなるようにした。処理から０，２４，４８，７２時間後に，臭化３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルトリアゾリウム（ＭＴＴ）アッセイにより細胞生存率を測定した。２０μLのＭＴＴ原液（５mg／ml）を，各ウェル内の２００μl細胞培養培地に添加した。アッセイ中，生細胞によりＭＴＴを青色ホルマザン塩へと還元し，その後，これは細胞から放出され，分光光度法で測定する。細胞培養インキュベーター中，３７℃で２．５時間，プレートをインキュベートした。その後，全ＭＴＴ溶液を除去し，２２０μlの溶解液を添加した。室温で３０分間，シェーカーで細胞を溶解し，その後，標準的な分析プロトコルにしたがい，５７０ｎｍでマイクロプレートリーダーＶＥＲＳＡｍａｘにより光学密度を測定した。処理していない一般的な培地で培養した一連の対照細胞や空試料を使用して実験計画を完了した。すべての実験は，個々に少なくとも６回反復して行った。
live/dead（Eukolight社）生存率キットを使用して蛍光顕微鏡により細胞生存率及び細胞接着を評価した。架橋材料に見られる多孔性構造は細胞濾過及び増殖のスカフォールドとして使用できる可能性を示唆している。したがって，架橋材料での生存率も試験した。
架橋材料試験
置換度ＤＳ＝１０％の誘導体の滅菌溶液をＰＢＳを使用して調製し，置換度１００％で最終濃度を２％（w/v）にした。ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ及びアスコルビン酸ナトリウムを添加して材料を架橋した（得られた溶液中，ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏの量は，その濃度が０．００２Ｍになるように，またアスコルビン酸ナトリウム濃度は０．０２Mになるようにする）。架橋誘導体は１０mlのＰＢＳで３回，細胞培養液で３回洗い流した。材料を完全にすり潰し，均質化した。その後，材料を滅菌凍結乾燥した。すり潰した材料１．０g（乾燥重量）を再度，８mlのＰＢＳで膨潤させた。各ウェル（すでに細胞が入っている）にこの溶液を０．５，１．０，１．３，２．０及び３．０ml添加し，細胞との直接接触による誘導体のケースと同じ方法で，生存率及び細胞毒性試験を行った。架橋材料「上での」細胞代謝及び増殖に関する基本情報を得るため，生存率試験ＭＴＴを利用した。本実験は３回反復した。光学密度を測定し，非処理細胞の光学密度値に対する光学密度値の比として対照に対する割合を計算し，各反復の回ごとに１００を乗じ，次いでその平均値を求めた。
結論
細胞生存率から得た結果に基づいて，表８，エントリー１１に開示された誘導体は全試験濃度（１００μg/ml，５００μg/ml及び１０００μg/ml）で細胞株３Ｔ３に毒性を示さなかった。対照に対する平均百分率及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算し，誘導体溶液の効果を，プロパルギル‐２‐アミン‐ＨＡについては図１３に；アジドプロピル‐２‐アミン‐ＨＡについては図１４に示した。架橋誘導体も細胞株３Ｔ３に非毒性であった（図１５）。異なる濃度の誘導体及び架橋誘導体を含有する媒体におけるインキュベーション後の細胞生存率は，全観察期間：処理後２４〜７２時間内で有意に変化することはなかった。
【０１０６】
実施例１５  軟骨細胞の生物学的利用能，ならびにII及びIIIをベースにしたスカフォールドへの播種
１５０mgのＨＡ‐プロパルギル‐２‐アミン及び１５０mgのＨＡ‐アジドプロピル‐２‐アミン（両方とも滅菌済）を３mlのＰＢＳに溶解し，ここに１０mMのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏを３μl，２．５Mのアスコルビン酸ナトリウムを４００μl混合した。この混合物を９６ウェル試験プレートに１００μlずつ分注した。３７℃で２時間，サーモボックス内でゲル化を行った。新たに形成したゲルを１mMのＮａ２ＥＤＴＡ（Sigma社）槽に浸漬し，旋回シェーカーで１時間，３回洗浄した。その後，ゲルを１時間かけてＰＢＳ緩衝液で洗浄し，次に噴射水で４回洗浄した。ゲルを−８０℃で冷凍し，滅菌条件下で凍結乾燥させた。各々凍結乾燥したスカフォールドシリンダーを２４ウェル試験プレートの個々のウェルに移すことによりゲル播種は有効になり，スカフォールド上に注いだ３Ｔ３細胞懸濁液（１×１０６細胞／ml）２００μlで播種した。３７℃のサーモボックス中で，乾燥スカフォールドに吸収させるため懸濁液を１時間静置し，その後，スカフォールドが入った全２４ウェル試験プレートを１２００rpmで１０分間スピンした。遠心分離後，各スカフォールドに１mlの培養媒体を添加し，３７℃，５％ＣＯ２下，加湿雰囲気のサーモボックス内に静置した。翌日，１mlの新たな培養液が入った新たなウェルに各スカフォールドを移した。２〜３日毎に培養液を交換した。４μlのカルセインＡＭ（Sigma社）及び１μlのエチジウムホモ二量体を含む５mlのＰＢＳ緩衝液中に各スカフォールドを入れ，旋回シェーカー中に２．５時間入れておいた。その後，各スカフォールドを２０mlのＰＢＳで３回洗浄し，蛍光顕微鏡で観察した（図１６ａ〜ｄ）。図１７は，スキーム７に記載された誘導体II及びIIIをベースにした架橋材料から成るスカフォールドの存在下におけるヒト軟骨細胞（６Ｐ）の生存率試験（ＡＴＰ）を示す。この試験では，濃度０．１及び１％w/v，ｎ＝５，±ＳＥＭの条件で２つの溶液を調製した。１ｃｍ２当たり５０００細胞の密度で細胞を播種し，６日間，前培養した。６日目後，及び１５日間の培養中，架橋材料を試験した。このグラフから，細胞活性が経時的に増加していることが示され，これは細胞が再生してスカフォールド内に増殖していることを意味する。
【０１０７】
他の実施態様は以下の特許請求の範囲内にある。例えば，本発明の組成物を商業的に生産するために，反応のスケールを拡大することも可能である。ポリアニオン性多糖の比率を変えると最終的な材料の性質が変わることは当業者にもよく理解されていると思われる。
【図１】
0005818969.tif 000027
【図２】
0005818969.tif 000028
【図３】
0005818969.tif 000029
【図４】
0005818969.tif 000030
【図５】
0005818969.tif 000031
【図６】
0005818969.tif 000032
【図７】
0005818969.tif 000033
【図８】
0005818969.tif 000034
【図９】
0005818969.tif 000035
【図１０】
0005818969.tif 000036
【図１１】
0005818969.tif 000037
【図１２】
0005818969.tif 000038
【図１３】
0005818969.tif 000039
【図１４】
0005818969.tif 000040
【図１５】
0005818969.tif 000041
【図１６ａ】
0005818969.tif 000042
【図１６ｂ】
0005818969.tif 000043
【図１６ｃ】
0005818969.tif 000044
【図１６ｄ】
0005818969.tif 000045
【図１７】
0005818969.tif 000046
【図１８】
0005818969.tif 000047
【図１９】
0005818969.tif 000048
【図２０】
0005818969.tif 000049
【図２１】
0005818969.tif 000050