(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が尿路感染症を有するか否かを同定するための測定方法であって、前記個体から採取されたサンプルにおいてヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）を測定することを含む、上記方法。
【請求項２】
前記サンプル中のＨＢＰの濃度が１５ｎｇ／ｍｌ超であるか否かを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプル中のＨＢＰの濃度が２５ｎｇ／ｍｌ超であるか否かを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中のＨＢＰの濃度が３５ｎｇ／ｍｌ超であるか否かを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプル中のＨＢＰの濃度が５０ｎｇ／ｍｌ超であるか否かを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中のＨＢＰのレベル又は濃度が、ＨＢＰのベースラインレベル又は濃度を基準として、少なくとも３倍又は４倍増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記個体が尿路感染症を有することが疑われる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記個体が哺乳類である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類がヒトである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＢＰ特異的抗体を活性成分として含む、個体が尿路感染症を有するか否かを決定するための、診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿路感染症の診断及び治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿路感染症（ＵＴＩ）は、子供及び成人の両方において重篤な合併症をもたらしうる、よく見られる診断である。腎不全のリスク及び抗生物質の過剰使用を低減させるために、効率的な診断及び治療が重要である。細菌培養の代わりとして、迅速且つ安全な診断方法が必要とされる。早期治療は尿路感染症の予後を改善し、したがって、早期診断は極めて重要である。個体が尿路感染症を有するか否かをできるだけ早く判定するための信頼できる生物学的又は臨床的マーカーが必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ、ＣＡＰ３７、アズロシジン）は、ヒト好中球エラスターゼと４４％の配列同一性を示す、グリコシル化された一本鎖の正電荷を有する３７ｋＤａ不活性セリンプロテアーゼホモログである。ＨＢＰの３次元構造は、公表されている（Ｉｖｅｒｓｅｎら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ａｐｒ；４（４）：２６５〜８ページ）。ＨＢＰは、ヒト好中球のアズール顆粒及び分泌胞に含まれる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９９；６６（４）：６３４〜４３ページ及びＴａｐｐｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９６：２３２９〜２３３７ページ）。ＨＢＰは、血管細胞骨格のＣａ２＋バランスを変更することによって血管漏出を誘発することが示された多機能タンパク質である（Ｇａｕｔａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００１；７（１０）：１１２３〜７ページ）。フィブリノーゲンと複合体形成したＡ群連鎖球菌（ＧＡＳ）のＭ−タンパク質は、好中球のＢ２−インテグリン受容体を刺激することによってＨＢＰ放出を誘発することが示されている（Ｈｅｒｗａｌｄら、Ｃｅｌｌ  ２００４；１１６（３）：３６７〜７９ページ）。ＬＰＳも、未知のメカニズムによってＨＢＰ放出を誘発することができる（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９６；３９０（１）：１０９  １２ページ）。ＨＢＰの配列は、公表されており（例えば、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００１６９１  ＲＥＧＩＯＮ：２７．．２４８として）、以下に配列番号１として複製される。
【化１】
0005818916.tif 000002
【０００４】
尿路感染症を有することが疑われる患者における尿ＨＢＰレベルは、これまで調査されていなかった。本発明者らは、ＨＢＰレベルが尿路感染症を有する個体において増加していることを初めて示した。こうして本発明によれば、個体が尿路感染症を有するか否かを同定する方法であって、該個体においてＨＢＰを測定し、それによって該個体が尿路感染症を有するか否かを決定することを含む上記方法が提供される。
【０００５】
本発明はさらに、
−  個体が尿路感染症を有するか否かを決定することにおける使用のための、ＨＢＰの検出用の作用物質；
−  個体が尿路感染症を有するか否かを決定する方法における使用のための試験キットであって、個体におけるＨＢＰの検出用の作用物質を含む上記試験キット；
−  個体の尿路感染症を治療する方法であって、
（ｉ）本発明の方法を用いて、個体が尿路感染症を有するか否かを決定するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）においてリスクを有すると同定された個体に、尿路感染症の治療に好適な少なくとも一種の作用物質の治療的有効量を投与するステップと
を含む上記方法
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ＨＢＰ、Ｕ−ＷＢＣ及びＩＬ−６の尿レベルを示す。各点は、ＨＢＰ（Ａ及びＢ）、ＷＢＣ（Ｃ及びＤ）並びにＩＬ−６（Ｅ及びＦ）の個体尿サンプル中濃度を表す。方法の項において４つの患者群が記載される。バーは、値の中央値を表す。推奨されるカットオフ値は、ＨＢＰに関して３２ｎｇ／ｍｌ、ＷＢＣに関して２ＷＢＣ／μＬ及びＩＬ−６に関して１０ｐｇ／ｍＬにマークされる。
【図２】図２は、尿中の細菌濃度に相関するＨＢＰ及びＩＬ−６の尿レベルを示す。各点は、ＨＢＰ（Ａ）及びＩＬ−６（Ｂ）の個体尿サンプル中濃度を表す。バーは、値の中央値を表す。
【図３】図３は、尿中のＨＢＰ及びＷＢＣの間、並びに尿中のＩＬ−６及びＵ−ＷＢＣの間の相関を示す。スピアマンの順位相関係数（ｒｈｏ）＝０．７９は、尿中のＨＢＰとＷＢＣレベルの間に相関関係があることを示す（Ａ）。ＩＬ−６に関するスピアマンの順位相関係数は、０．３３８である。各点は、個体尿サンプル中のＨＢＰ、ＷＢＣ及びＩＬ−６濃度を表す。
【図４】図４は、ＵＴＩと非ＵＴＩを鑑別する、尿中ＨＢＰ及びＷＢＣの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＨＢＰに関して０．９４２（９５％信頼区間、０．８８９〜０．９９６）、ＩＬ−６に関して０．８０８（９５％信頼区間、０．６７５〜０．９４１）、ＷＢＣに関して０．８５８（９５％信頼区間、０．７４２〜０．９７４）であった。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
診断
本発明は、対象が尿路感染症を有するか否かを同定する方法に関する。したがって、本発明は、尿路感染症の診断に関する。
【０００８】
本発明者らは、尿路感染症を有することが疑われる患者における尿ＨＢＰのレベルを最初に調査した。本発明者らは、尿路感染症を有さない患者に比べて、尿路感染症患者において尿ＨＢＰレベルが上昇していることを実証した。
【０００９】
被験個体は、典型的に、尿路感染症を有することが疑われる。個体は、典型的に哺乳類である。哺乳類は、典型的にヒト、又はウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ若しくはネコなどの家畜哺乳類である。個体は、好ましくはヒトである。
【００１０】
被験個体は、例えば、典型的に３７．５℃を超える発熱、腹痛若しくは背痛、及び／又は陽性の亜硝酸塩試験を含む、尿路感染症に関連した１つ又は複数の症状を有しうる。
【００１１】
ＨＢＰのレベルは、典型的に、個体から得られたサンプル中でインビトロで測定される。サンプルは典型的に、個体の体液を含む。体液サンプルは、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液又は関節滑液のサンプルであってよい。サンプルは、尿サンプルであることが好ましい。
【００１２】
本発明に従って、ベースラインレベル又は濃度に比べて増加したＨＢＰのレベル又は濃度は、個体が尿路感染症を有することを示す。ベースラインレベルは、典型的に、尿路感染症を有さない、又は尿路感染症を有することが疑われるが、その後、尿路感染症を有さないと確認される個体におけるＨＢＰレベルである。したがって、本発明による方法は、サンプル中のＨＢＰレベルのベースラインレベルへの比較を含んでよい。
【００１３】
本発明によれば、ＨＢＰの濃度は、サンプル中、１５ｎｇ／ｍｌ超、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ超、より好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ超、より好ましくは３２ｎｇ／ｍｌ超、より好ましくは３５ｎｇ／ｍｌ超、そして、最も好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ超である。かかるレベルは、個体が尿路感染症を有することを示すために使用可能である。
【００１４】
別の態様において、上記方法は、ベースラインレベル又は濃度に比較した、サンプル中のＨＢＰの相対レベル又は濃度を評価することを含んでよい。典型的に、サンプル中のＨＢＰのレベル又は濃度が、ＨＢＰのベースラインレベル又は濃度を基準として少なくとも３倍又は４倍増加する方法は、尿路感染症の指標となる。
【００１５】
白血球数（ＷＢＣ）、特に尿ＷＢＣ、及び／又はＩＬ−６などの他のマーカーも、分析に含まれてよい。ＨＢＰは、亜硝酸塩試験と組み合わせて使用されてもよい。
【００１６】
ＨＢＰの検出
本発明は、典型的に、個体から得られたサンプル中のＨＢＰレベルをインビトロで測定することによって実施される。サンプルは、典型的に個体の体液を含む。体液サンプルは、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液又は関節滑液であってもよい。サンプルは好ましくは、尿サンプルである。
【００１７】
サンプルは、アッセイされる前に、遠心分離などによって処理されてよい。サンプルは、典型的に、アッセイ前に、好ましくは−７０℃未満で貯蔵されてもよい。
【００１８】
本分野で知られた標準的方法が、ＨＢＰレベルのアッセイに使用されてよい。これらの方法は、典型的にＨＢＰの検出用の作用物質を用いることを含む。この作用物質は、典型的にＨＢＰに特異的に結合する。この作用物質は、ＨＢＰ特異的な抗体、ＨＢＰに結合するアプタマー、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９３；２７１〜９ページに記載されたアプロチニンなどのセリンプロテイナーゼ阻害剤、又は例えば、Ｃａｉ及びＷｒｉｇｈｔ、Ｓ．Ｄ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６；１８４：２１３〜２３ページに記載されたインテグリンの可溶性断片であってもよい。特異的によって、この作用物質又は抗体が、任意の他の分子、特に任意の他のタンパク質に対するいかなる有意な交差反応性もなく、ＨＢＰに結合することが理解されるであろう。例えば、ＨＢＰに対して特異的な作用物質又は抗体は、ヒト好中球エラスターゼとのいかなる有意な交差反応性も示さない。交差反応性は、任意の好適な方法によって評価されることができる。
【００１９】
本発明の方法において使用される抗体は、ＨＢＰに結合可能な全抗体又はその断片のいずれであってもよい。抗体はモノクローナルであってもよい。かかる全抗体は、典型的に、本分野で知られた任意の好適な方法によって作製される抗体である。例えば、ポリクローナル抗体は、哺乳類、典型的にはウサギ又はマウスを好適な条件下でＨＢＰにより免疫化し、哺乳類の血清などから抗体分子を単離することによって得ることができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ又は組換え法によって得ることができる。
【００２０】
ハイブリドーマ法は、哺乳類、典型的にはウサギ、ラット又はマウスを好適な条件下でＨＢＰにより免疫化し、次いで、哺乳類の脾細胞を採取し、それらを骨髄腫細胞と融合させることを含む。次いで、融合細胞の混合物は、希釈され、クローンが単一の親細胞から培養される。異なるクローンにより分泌される抗体が、ＨＢＰに結合するそれらの能力に関して試験され、最も繁殖能力があり、安定なクローンが大量に培地中で培養される。分泌された抗体が集められて、精製される。
【００２１】
組換え法は、ファージ又は酵母中に、異なるイムノグロブリン遺伝子断片をクローニングして、わずかに異なるアミノ酸配列を有する抗体のライブラリーを作製することを含む。ＨＢＰに結合する抗体を生じさせる配列が選択されることができ、該配列は、産生のために、例えば、細菌細胞系中にクローニングされる。
【００２２】
抗体は、典型的に哺乳類の抗体、例えば、霊長類、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマ又はラクダ抗体である。抗体は、ラクダ科動物又はサメの抗体であってもよい。抗体はナノ体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）であってもよい。抗体は、抗体の任意のクラス又はアイソタイプ、例えば、ＩｇＭ、であってもよいが、好ましくは、ＩｇＧである。
【００２３】
上記方法において使用されうる全抗体の断片は、抗原結合部位、例えば、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ）２断片又はＳｃＦＶを含む。全抗体又は断片は、２つ以上の断片又は抗体をつなぎ合わせるために使用されうるリンカーなどの他の部分と結合させることもできる。かかるリンカーは、化学的リンカーであってもよく、又は断片若しくは全抗体との融合タンパク質の形態で存在することもできる。したがって、リンカーは、同じ又は異なる結合特異性を有する全抗体又は断片、例えば、同じ又は異なる多型を結合可能なものをつなぎ合わせるために使用することもできる。抗体は、２つの異なる抗原、典型的には、本明細書中で言及される多型の任意の２つに結合可能な二重特異性抗体であってもよい。抗体は、２つの可変ドメインを連続してつなぐことにより形成される「二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」であってよい。上記方法において使用される抗体が、異なる特異性の異なる抗原結合部位を有する上記の形態のいずれかで存在する場合、これらの異なる特異性は、典型的に異なる位置又は異なるタンパク質における多型に対する。一実施態様において、抗体は、異なる自然抗体由来の配列を含むキメラ抗体、例えば、ヒト化抗体である。
【００２４】
ＨＢＰレベルを評価する方法は、典型的に、ＨＢＰに特異的に結合可能な作用物質又は抗体とサンプルを接触させることを含む。かかる方法は、ディップスティックアッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含みうる。典型的に、ディップスティックはＨＢＰに特異的に結合する一種又は複数種の抗体又はタンパク質を含む。一種又は複数種の抗体が存在する場合、該抗体は、それらが同時にＨＢＰに結合しうるように、異なる重複しない決定基を有することが好ましい。
【００２５】
ＥＬＩＳＡは、試薬の分離を必要とする不均一な固相アッセイである。ＥＬＩＳＡは、典型的にサンドイッチ技術又は競合技術を用いて実施される。サンドイッチ技術は、二種の抗体を必要とする。第一のものは、ＨＢＰを特異的に結合し、固相支持体に結合される。二次抗体は、マーカー、典型的には、酵素コンジュゲートに結合する。酵素の基質は、ＨＢＰ−抗体複合体、したがって、サンプル中のＨＢＰの量を定量するために使用される。抗原競合阻害アッセイも、典型的、支持体に結合したＨＢＰ特異的抗体を必要とする。ＨＢＰ−酵素コンジュゲートが、アッセイされるべき（ＨＢＰを含む）サンプルに添加される。ＨＢＰ−酵素コンジュゲートと非標識ＨＢＰの間の競合阻害は、サンプル中のＨＢＰ量の定量を可能とする。ＥＬＩＳＡ反応のための固相支持体は、ウエルを含むことが好ましい。
【００２６】
本発明は、表面プラズモン共鳴、表面音響波、水晶振動子マイクロバランス、微小熱量測定、又は電気化学的インピーダンス分光法に基づくものを含むが、これらに限定されない直接検知技術において、ＨＢＰに対する抗体を使用してもよい。
【００２７】
本発明は、抗体を含まないＨＢＰの測定方法も使用してよい。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分離及び蛍光検出が、ＨＢＰレベルの決定方法として使用されることが好ましい。先に記載されたＨＰＬＣの装置及び方法が使用されてよい（Ｔｓｉｋａｓ  Ｄら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ  １９９８；７０５：１７４〜６ページ）。ＨＰＬＣの間の分離は、典型的にサイズ又は電荷に基づいて行われる。典型的には、ＨＰＬＣの前に内因性アミノ酸及び内部標準−ホモアルギニンがアッセイサンプルに添加され、これらはＣＢＡカートリッジで相分離抽出される（Ｖａｒｉａｎ、Ｈａｂｏｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。サンプル内のアミノ酸は、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）で誘導体化されることが好ましい。アッセイの正確度及び精度は、すべてのアミノ酸に関する品質管理サンプル内で決定されることが好ましい。
【００２８】
本発明はさらに、個体におけるＨＢＰレベルを測定し、それによって該個体が尿路感染症を有するか否かを決定する手段を含む診断キットを提供する。該キットは、典型的に特異的にＨＢＰに結合する一種又は複数種の抗体を含む。例えば、該キットは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−グラフト化抗体又はヒト化抗体を含んでよい。抗体は、完全なイムノグロブリン分子、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦｖ断片などのその断片であってよい。一種超の抗体が存在する場合、該抗体は、それらが同時にＨＢＰに結合しうるように、異なる重複しない決定基を有することが好ましい。
【００２９】
上記キットは、さらに、他の実験的又は臨床的パラメータの測定手段を含んでよい。例えば、該キットは、個体におけるＷＢＣ数及び／又は尿中亜硝酸塩、ＩＬ−６、グルコース、タンパク質及び血漿Ｃ反応性タンパク質のうちの１つ若しくは複数のレベル若しくは濃度を測定するための手段を含んでよい。
【００３０】
上記キットは、さらに、上記の方法の任意の実施態様が実施されることを可能とする他の試薬又は機器の１つ又は複数を含んでよい。かかる試薬又は機器は、好適な緩衝液（単数又は複数）（水溶液）、サンプルからＨＢＰを単離する手段、（針を含む容器又は機器などの）個体からサンプルを得る手段、又はそこで定量的反応が行われうるウエルを含む支持体のうちの１つ又は複数を含む。該キットは、場合により、該キットが本発明の方法において使用されることを可能とする指示書又は上記方法がどの個体において実施されうるかについての詳細を含んでよい。
【００３１】
治療
本発明は、本発明の方法によって尿路感染症を有することが同定された個体の治療にも関する。したがって、尿路感染症の治療における使用のための物質は、本発明の方法によって尿路感染症を有することが同定された個体の治療における使用のための医薬品の製造において使用されてよい。したがって、本発明の方法によって尿路感染症を有することが同定された個体の状態は、かかる物質の投与によって改善されることができる。尿路感染症の治療のために有用な物質の治療的有効量が、本発明の方法によってそれを必要とすることが同定された個体に与えられてよい。尿路感染症の治療に好適な物質は、典型的に、一種又は複数種の抗生物質を含む。
【００３２】
以下の実施例は、本発明を例示する：
【実施例】
【００３３】
方法
試験対象母集団
この前向き試験は、ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ｔｈｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｇｂｏｒｇ、スウェーデンに、２００９年３月から６月の間に入院した、７８個体（２６人の男性及び５２人の女性）を含んだ。該試験の患者の組み入れ基準は、年長の個体における発熱（体温≧３７．５℃）又は尿路感染症を示唆する症状、腹痛又は背痛、及び低年齢の小児における易刺激性又は摂食困難などの非特異的徴候であった。尿路感染症には、下部尿路感染症及び腎盂腎炎の両方を含んだ。好中球減少症（好中球≦０．５×１０９／Ｌ）の患者又は先行する７２時間中に抗生物質を投与された患者は除外した。プロジェクトプロトコールはＬｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会により承認され、同意をすべての患者から彼らの親によって得た。患者を以下の群に分けた：１）細菌培養、単一種の微生物を１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ以上含む尿サンプル、及び典型的な臨床症状に基づき、最終的に尿路感染症と診断された患者。２）臨床的特徴又は単一種の微生物を１０３ＣＦＵ／ｍｌ以上含む尿サンプル、又は陽性の亜硝酸塩試験に基づき、尿路感染症が疑われる患者。細菌尿に関する下部カットオフ値は、Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌの推奨に基づく。３）発熱しているが、尿路感染症でない患者。４）発熱しておらず、尿路感染症ではない患者。
【００３４】
臨床及び臨床試験評価
体温を記録し、血漿ＣＲＰを分析した。中間サンプル（７５サンプル）又は恥骨上膀胱穿刺（２サンプル）によって尿を集めた。１人の患者では、該技術を記録しなかった。尿サンプルの分析を、細菌培養、並びに亜硝酸塩、白血球（ＷＢＣ）、アルブミン、赤血球及びグルコースに関する試験を含むディップスティック試験により行った。ディップスティック（Ｍｕｌｔｉｓｔｉｃｋｓ（登録商標）７、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を、Ｃｌｉｎｉｔｅｋ  Ｓｔａｔｕｓ（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）において分析した。亜硝酸塩は、陽性又は陰性のいずれかとして、ＷＢＣは、以下の：０＜１５白血球／μＬ尿、１≧１５白血球／μＬ尿、２≧７０白血球／μＬ尿、３≧１２５白血球／μＬ尿、４≧５００白血球／μＬ尿の段階スケールによる準定量値として表した。ＨＢＰレベルの決定のために、サンプリングの１時間以内に尿を遠心分離し、上清のアリコートを分析まで−７０℃で貯蔵した。ＨＢＰ濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定した。コーティング緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中ＨＢＰに対するマウスモノクローナル抗体でマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）をコーティングした。プレートをリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）でブロッキングした。尿サンプルをサンプル緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ）で１／４０に希釈し、二連でウエルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。各プレートは、既知濃度の組換えＨＢＰの較正サンプルも含んだ。洗浄後、プレートを、１／７０００に希釈したＨＢＰに対するポリクローナルウサギ抗血清とともにインキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼと結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（１／３０００）とともにインキュベートすることによって検出した。各患者サンプル中のＨＢＰのレベルを、二つ組の平均光学密度を計算し、これを標準曲線からの結果に相関させることによって決定した。製造者の説明に従って、サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ  Ｓｅｔｓ）により尿中ＩＬ−６のレベルを分析した。インキュベーションバッファーで尿サンプルを１／２に希釈し、二つ組で分析した。
【００３５】
統計解析
群間の比較を、歪んだ分布を有する連続変数のためのノンパラメトリックなクラスカル−ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定及びマン−ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定によって行った。スピアマンのノンパラメトリック検定により関係づけた。ＨＢＰ、ＩＬ−６、Ｕ−ＷＢＣ及び亜硝酸塩の能力を図示するために、受信者動作特性曲線下面積を使用した。ＨＢＰ、ＩＬ−６及びＵ−ＷＢＣに関して、感度、特異度、陽性及び陰性の予測値を計算した。統計的有意性のレベルを、両側Ｐ値＜０．０５として定義した。統計解析のためにＳＰＳＳ  １７．０  ソフトウエアシステム（ＳＰＳＳ）を使用した。
【００３６】
結果
患者の特徴及び臨床検査的徴候
７８人の個体が試験に参加した。患者の年齢は、１カ月齢〜１８歳（平均５．９６歳）の範囲にわたり、７５％は１歳より年長であった。１０人の患者が尿路感染症（下部尿路感染症を有する２人と腎盂腎炎を有する８人）と診断され、全員が尿培養中に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を有した（グループ１）。５人の患者は、尿路感染症を示す特徴的症状又は臨床検査結果に基づいて、尿路感染症の疑いを有した（グループ２）。これら５人の患者のうちの３人は、尿中の大腸菌又はＢ群β溶血性連鎖球菌（ｂｅｔａ−ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ）の弱い増殖（≧１０３〜≦１０５ＣＦＵ／ｍｌ）のみを有し、１人の患者は典型的な膀胱炎の臨床症状があったが、培養は行わず、ディップスティック試験陰性であり、１人の患者は腎盂腎炎の特徴的な徴候を有し、尿培養陰性且つ亜硝酸塩に関してディップスティック試験陽性であった。３０人の患者に発熱があったが、尿路感染症の臨床検査的又は臨床的徴候はなかった（グループ３）。彼らの尿培養は陰性又は細菌菌株混合物（サンプル汚染の指標）を含んでいた。３３人の患者に発熱はなく、尿路感染症の臨床検査的徴候もなかった（グループ４）。彼らの尿培養は陰性であった。これらのうちの何人かは（試験開始前に知られた）遺尿症、アルポート症候群、ヘノッホシェーンライン紫斑病及びネフローゼ症候群様などの診断を受けていた。
【００３７】
血漿及び尿からの結果の統計解析
グループ１（尿路感染症）とグループ２（尿路感染症の疑い）の間で、年齢、性別、体温、血漿中ＣＲＰ、尿中ＨＢＰ、尿中ＩＬ−６、尿中ＷＢＣ又は亜硝酸塩の中央値において有意差はなかった。どの群の間でも、血漿ＣＲＰと尿グルコースは有意差をもたらさなかった。尿アルブミンは、グループ１と３（発熱、非尿路感染症）、１と４（発熱なし、非感染）、２と３の間で有意差があったが、その他の間ではなかった。尿赤血球は、グループ１と３、１と４の間で有意差があったが、その他の間ではなかった。グループ１と３の間では、尿中ＨＢＰ、ＩＬ−６及びＷＢＣの中央値レベルに有意差があった。グループ１と４の比較でも、尿中ＨＢＰ、ＩＬ−６及びＷＢＣの中央値レベルに有意差があった。グループ１とグループ２を併せたものをグループ３とグループ４を併せたものに比較すると、ＨＢＰ、ＩＬ−６及びＷＢＣの尿レベルに有意差があった（図１Ａ〜Ｆ）。興味深い推測は、高濃度の細菌（≧１０５ＣＦＵ／ｍｌ）を含む尿が、より少ない細菌を含むか又は細菌を含まない尿に比べて、高レベルのＨＢＰ及びＷＢＣを含むようであったことである（図２Ａ〜Ｂ）。順位相関係数（ｒｈｏ）＝０．７９のスピアマンの検定は、尿中ＨＢＰとＷＢＣレベルの間の比較的強い相関を示した（図３）。ＩＬ−６は、尿中ＷＢＣとこの強い相関を有さなかった（ｒｈｏ＝０．３８）。
【００３８】
感度、特異度、陽性の予測値及び陰性の予測値の計算のために、グループ１及び２を併合し、尿路感染症群と称し、非尿路感染症と称する、併合したグループ３及び４と比較した。≧３２ｎｇ／ｍｌのＨＢＰのカットオフレベルを用いて、尿路感染症の診断における感度及び特異度は、それぞれ、９３．３％及び９０．３％であった。尿中ＨＢＰは、ＷＢＣ、亜硝酸塩及びＩＬ−６に比較して、最も高い感度を有した。尿中ＨＢＰはまた、ＷＢＣ及びＩＬ−６に比較して、最も高い特異度を有した（表２）。亜硝酸塩は他のマーカーに比較して、最も優れた特異度を有した。この試験における尿路感染症の有病率１９．２％に基づいて、尿路感染症の予測のためのＨＢＰの陽性及び陰性の予測値は、それぞれ、７０．０％及び９８．３％であった（表２）。ＲＯＣ曲線は、０．９４の曲線下面積（ＡＵＣ）によって、Ｕ−ＷＢＣ及びＩＬ−６に比較して尿中ＨＢＰが尿路感染症の最も優れた予測因子であることを実証した（図４）。
【００３９】
考察
尿路感染症は、深刻な結果となる可能性があり、抗生物質耐性は大きくなりつつある問題である。したがって、より感度及び特異度の高い試験が必要とされている。数回の先の試験では、尿路感染症の検出のために、ＩＬ−６、ラクトフェリン、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、エラスターゼ及びクララ細胞タンパク質などの尿中バイオマーカーを調査した。血漿中ＨＢＰは成人における敗血症のためのバイオマーカーとして研究されており、データは、感染の疑いのある熱性患者におけるＨＢＰの正常な血漿レベルは、高い確率で（陰性の予測値９４．５％）重篤な敗血症を発症するリスクを除外しうることを示唆した。本試験においては、尿中ＨＢＰ濃度を、尿ＩＬ−６、亜硝酸塩、ＷＢＣ、赤血球、アルブミン、グルコース及び血漿ＣＲＰと比較した。尿中ＨＢＰは、ＩＬ−６、亜硝酸塩及びＷＢＣよりも高いＡＵＣ値（０．９４）を有し、したがって、尿路感染症の最も優れた予測因子であった。尿中ＨＢＰは、高い陰性の予測値（９８．３％）を有し、したがって、高い確率で疾患を除外することができた。亜硝酸塩試験は、その低い感度により限界がある。スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）及び腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）などのいくつかの細菌種は、硝酸塩を亜硝酸塩に変換できない。偽陰性の亜硝酸塩の他の理由は、膀胱中の尿の短いインキュベーション時間及び高用量のビタミンＣの取り込みである。該試験においては外れ値が存在する。グループ２（尿路感染症の疑い）においては、腎盂腎炎の症状と尿培養中のＢ群β溶血性連鎖球菌（１０４〜１０５ＣＦＵ／ｍｌ）を有する１人の患者が、低いレベルのＨＢＰ（６．３ｎｇ／ｍｌ）を有した。この患者は、尿中亜硝酸塩及びＷＢＣに関する迅速試験においても陰性であった。尿ＨＢＰレベルは、尿路感染症患者において他の種類の感染を有する患者よりも高く、尿中へのＨＢＰの放出が、尿における細菌感染などによる白血球の活性化に依存することを示している。
【表１】
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【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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