(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１のコヘシンドメインＣ１及び少なくとも１のコヘシンドメインＣ２を含む骨格蛋白質と、
当該骨格蛋白質の前記コヘシンドメインＣ１の一部又は全部に結合した、ＡＣＣ合成酵素及び前記コヘシンドメインＣ１と結合するドックリンドメインＤ１を含むＡＣＣ合成酵素サブユニットと、
当該骨格蛋白質の前記コヘシンドメインＣ２の一部又は全部に結合した、ＡＣＣ酸化酵素及び前記コヘシンドメインＣ２と結合するドックリンドメインＤ２を含むＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、
を含む人工酵素複合体を産生するように形質転換したことを特徴とする光合成生物。
【請求項２】
前記人工酵素複合体に含まれるＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率（ＡＣＣ酸化酵素サブユニット数／ＡＣＣ合成酵素サブユニット数）が１を超えることを特徴とする請求項１に記載の光合成生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光合成生物に関する。詳しくは、エチレン産生に有用な人工酵素複合体を産生する光合成生物に関する。また、当該光合成生物の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気などへのエネルギー変換やポリマー材料の調製等、石油等の化石資源の使用用途は多様であり、化石資源は幅広く利用されている。
【０００３】
一方で、化石資源の枯渇とともに化石資源の使用による環境への負荷が問題となっている。例えば、化石資源の採掘による化石資源産出地の汚染、化石資源の使用による温室効果ガスの発生等がある。
【０００４】
化石資源の使用により発生する二酸化炭素（ＣＯ２）は地球温暖化を引き起こすとされるが、近年ではアジア等で急速に排出量が増加している。そして、化石資源の使用量の増加に対し、二酸化炭素を固定できる植物、微生物は減少しており、地球規模で砂漠化が進行している。
【０００５】
このような状況に鑑み、多様な生物から物質循環のメカニズムを見出して利用する試みが進められている。例えば、微生物の発酵を利用して資源を生産／廃棄物を無毒化する方法や、光合成系を利用してエネルギーや有用物質を取得する方法、酵素を利用して難分解性廃棄物から資源を得る方法等が開発されている。
【０００６】
難分解性廃棄物から資源を得る方法の一つに、植物細胞壁であるセルロースの分解がある。セルロース分解性嫌気性細菌が細胞表層や菌体外にセルロソームというセルロース分解蛋白質複合体を備えることが知られている。セルロソームはドックリン、コヘシンという非常に強い結合親和性と高い結合特異性を有するドメインを含む。コヘシンとドックリンはカルシウム依存的に結合することが知られている。セルロソームはドックリン及びコヘシンを利用してセルラーゼ及びヘミセルラーゼを配向させ逐次的な反応が行えるようになっている。また、下記の特許文献に開示されているように、セルロソームを応用する技術が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１４２１２５号公報  上記特許文献１はセルロース分解酵素−骨格蛋白質複合蛋白質を細胞表層に保持する酵母を開示する。セルロースを分解し、グルコースを得ることができる。
【特許文献２】特開２０１０−２５２７８９号公報  上記特許文献２はビオチン結合部位を有するストレプトアビジン等のキャリアと、複数のビオチン化されたセルロース分解酵素を備える複合体を開示する。
【特許文献３】特表２０１１−５１６０２９号公報  上記特許文献３は、光合成にフォーカスし、核酸を操作した光合成細胞について開示する。
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sakai et al. Photosynthetic Conversion of Carbon Dioxide to Ethyleneby the Recombinant Cyanobacterium, Synechococcus sp. PCC 7942, Which Harbors aGene for the Ethylene-Forming Enzyme of Pseudomonas syringae１９９７年  上記非特許文献１では、シャトルベクター（プラスミド）を用いて、シアノバクテリアを形質転換させた組換え体でエチレンを発生させた。プロモーター（転写制御系）にシアノバクテリアのゲノム由来産物を使用したため、その制御下に置かれた微生物由来のｅｆｅ（エチレンフォーミングエンザイム）遺伝子が欠損あるいは遺伝子置換されてしまう問題がある。結果的に２０世代目で１０分の１以下の活性になってしまった。また、プラスミドのコピー数が多く、そのためｅｆｅ遺伝子の転写量が多く、生育に影響が出てしまった。
【非特許文献２】Talahama et al. ２００３年Construction and Analysis of a Recombinant Cyanobacterium Expressinga Chromosomally Inserted Gene for an Ethylene-Forming Enzyme at the psbAILocus  上記非特許文献２は、微生物由来のｅｆｅ遺伝子をゲノムに組み込み、クエン酸回路中の重要な中間体のα−ケトグルタル酸を基質に用いる、微生物由来のエチレン合成プロセスを開示する。しかし、当該「クエン酸回路中の重要な中間体のα−ケトグルタル酸を基質に用いる、微生物由来のエチレン合成プロセス」が上記非特許文献１と同様にシアノバクテリアに生育阻害を引き起こす程の代謝ストレスを与え、３世代目でエチレン生成活性を失ってしまう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以下、１−アミノシクロプロパンカルボン酸をＡＣＣとも称する。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンをＳＡＭとも称する。
【００１０】
上記したセルロースの分解は、難分解性の植物細胞壁から糖であるグルコースを得ることができる点で有用である。しかし、グルコースは酸素を多く含んでおり（即ち、一定程度酸化が進んでいる。）エネルギー変換への応用には必ずしも好適でないこと、また、化石資源を利用したポリマー材料分野への応用がしにくいこと等、物質循環の観点から改善すべき点があった。
【００１１】
化石資源を利用したポリマー材料として、エチレン（Ｃ２Ｈ４）を利用するポリマーがある。光合成により二酸化炭素を固定できる点に着目し、微生物由来のｅｆｅを利用し、シアノバクテリアにエチレンを産生させる試みが行われてきたが、改善の余地があった。
【００１２】
第一に、α−ケトグルタル酸を利用するため、エチレンを産生するように形質転換されたシアノバクテリアの継代が困難であるという課題があった。従来の技術では、継代を重ねるにつれてエチレン産生能力が大幅に低下したり、エチレン産生能力が失われた。更には、エチレン産生能力を維持したまま形質転換体を継代するには、エチレン産生にどのような物質を利用することが有用であるか不明であった。
【００１３】
本願発明者は、光合成による二酸化炭素固定とエチレン産生の両立、及び、エチレン合成の手間の観点から、細胞内に存在する基質を利用することが有用であると考えた。更に、植物においてエチレンは植物ホルモンであり、植物が生産可能な物質であることにも着目した。鋭意研究を重ねた結果、本願発明者は、細胞内でメチル基供与体として働くＳＡＭが有用な基質であることを見出した。基質となるＳＡＭは光合成生物内の存在比は大きくはないと考えられるが、効率的な酵素反応の実現のため、エチレン産生に関わる酵素をセルロソーム同様に局在化させればよいと考えた。鋭意研究を重ねた結果、ドックリン及びコヘシンを利用してエチレン合成に関わる酵素を複合体化することが有用であることを見出した。更には当該複合体をシアノバクテリアに産生させることに成功し、当該シアノバクテリアを培養してエチレンを得た。即ち、光合成生物を用い、二酸化炭素からエチレンを産生するという物質循環を構築したと考えられる。
【００１４】
後述する実施例では、セルロソームシステム実現に必須なドックリンとコヘシンは大腸菌では可溶性に発現した。よって、異物として認識された結果であるところの封入体にはなっていないと考えられた。そして大腸菌の生育がドックリンとコヘシンの発現中にも確認できることから毒性は無いと考えられた。したがって、過剰に発現させてもドックリンとコヘシンは組換え体への細胞毒性を示さないものと考えられた。代謝ストレスを引き起こす原因となる、クエン酸回路中の中間体を利用する代わりに、細胞内でメチル基供与体として働くＳＡＭを基質に用いる植物由来のエチレン合成プロセスをシアノバクテリアに導入することに成功した。
【００１５】
この点、上記特許文献３では、例えば請求項３６にＳＡＭ利用オキシゲナーゼをエチレンの合成でなくクロロフィルの生合成に利用することが記載されている。請求項５５には炭素ベース産物としてエチレンが記載されているが、多くの物質が列挙された中の選択肢の１つに過ぎない。特許文献３の実施例には光合成細胞によるエチレンの合成試験の開示がなく、具体的にどのような光合成細胞、どのような培養条件でエチレンが得られるか開示がない。
【００１６】
よって、有用な光合成生物を提供することを本発明が解決すべき課題とする。更には、当該光合成生物の有効な利用方法を提供することを本発明が解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、
少なくとも１のコヘシンドメインＣ１及び少なくとも１のコヘシンドメインＣ２を含む骨格蛋白質と、
当該骨格蛋白質の前記コヘシンドメインＣ１の一部又は全部に結合した、ＡＣＣ合成酵素及び前記コヘシンドメインＣ１と結合するドックリンドメインＤ１を含むＡＣＣ合成酵素サブユニットと、
当該骨格蛋白質の前記コヘシンドメインＣ２の一部又は全部に結合した、ＡＣＣ酸化酵素及び前記コヘシンドメインＣ２と結合するドックリンドメインＤ２を含むＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、
を含む人工酵素複合体を産生するように形質転換した光合成生物である。
【００１８】
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、
前記人工酵素複合体に含まれるＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率（ＡＣＣ酸化酵素サブユニット数／ＡＣＣ合成酵素サブユニット数）が１を超える第１発明に記載の光合成生物である。
【００１９】
（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、
第１発明又は第２発明に記載の光合成生物を培養する工程を含むことを特徴とするエチレン産生方法である。
【００２０】
（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、
前記光合成生物の培養において、二酸化炭素（ＣＯ２）を排出する設備の排気を利用する第３発明に記載のエチレン産生方法である。
【００２１】
（第５発明）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、
前記光合成生物の培養において、光合成生物を担体に担持する第３発明又は第４発明に記載のエチレン産生方法である。
【００２２】
（第６発明）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、
前記光合成生物の培養において、培地が海水を含む第３発明〜第５発明のいずれかに記載のエチレン産生方法である。
【発明の効果】
【００２３】
（第１発明）
上記第１発明により、有用な光合成生物が提供される。当該光合成生物は、エチレン産生に有用な人工酵素複合体を産生する。当該光合成生物は、二酸化炭素を取り込み、ＳＡＭを産生し、光合成生物の体内に存在する前記人工酵素複合体によってエチレン（Ｃ２Ｈ４）を産生すると考えられる。よって、光合成可能な細菌や藻類に化石資源の使用等により排出された二酸化炭素を有用な資源であるエチレンに変換させるという、環境への負荷を軽減する物質循環を構築したと考えられる。
【００２４】
コヘシンとドックリンの非常に強い結合親和性と高い結合特異性を利用することで、人工酵素複合体に含まれるＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素を逐次的な反応に適した配向とすることが可能であると考えられる。逐次的な反応に適した配向とすることで、少ないＳＡＭ量であっても効率よくエチレンを産生することができると考えられる。また、ＳＡＭからエチレンまでの反応が逐次的に起こると考えられるので、光合成生物の体内でＡＣＣが過剰に蓄積されないと考えられる。即ち、光合成生物の恒常的な代謝系統が維持可能であると考えられ、従来の光合成生物の培養方法が利用可能であると考えられる。
【００２５】
発現ベクターの構築の段階でＡＣＣ合成酵素／ＡＣＣ酸化酵素へのドックリンドメインの結合部位を決定できるので、触媒部位の配向制御が簡便かつ確実である点、リンカーを用いた場合等に酵素の自由度が確保できる点で有利であると考えられる。
【００２６】
本発明の光合成生物は、安価な培地で大量培養させることが可能であると考えられえる。また、世代を重ねてもエチレンを生産できると考えられる。
【００２７】
（第２発明）
上記第２発明により、エチレン産生により有用な光合成生物が提供される。本発明の人工酵素複合体に含まれる「ＡＣＣ酸化酵素サブユニット／ＡＣＣ合成酵素サブユニット」の比率を「１を超える」とすることで、効率的なエチレン産生を実現することができると考えられる。
【００２８】
（第３発明）
上記第３発明により、上記光合成生物の有効な利用方法が提供される。上記光合成生物の培養は、エチレンの産生を伴う。よって、上記光合成生物の培養は、有用なエチレン産生方法である。
【００２９】
（第４発明）
上記第４発明により、より有用なエチレン産生方法が提供される。発電所や化学プラントなど二酸化炭素排出設備の排気を、バブリング等の方法で上記光合成生物の培養に利用することで、環境への負荷を低減しつつ有用な資源であるエチレンを得ることが可能となる。
【００３０】
（第５発明）
上記第５発明により、より有用なエチレン産生方法が提供される。上記光合成生物は一定の間隔を持って世代が交代する。よって、継続的なエチレンの産生（継続的な上記光合成生物の培養）を行う場合、上記光合成生物を培地から取り除く作業が必要となる場合がある。菌体が担体に担持されていれば、培地からの菌体の除去作業は当該担体を取り除くことでよく、集菌作業等の手間・時間を省略できる。即ち、コスト面で優れたエチレン産生方法とすることができると考えられる。
【００３１】
（第６発明）
上記第６発明により、より有用なエチレン産生方法が提供される。海水は容易に取得できるので、培地調製の手間・時間を軽減できる。
培地を海水とした場合は、エチレン産生のために培地を特段に調製しなくてよい。よって、従来の培地に使用される物質の合成・精製等の作業が不要となり、より環境への負荷が少ないエチレン産生方法とすることができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例で使用した人工酵素複合体Ａの概念図を示す。
【図２】実施例で使用した大腸菌形質転換ベクターの概念図を示す。
【図３】Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのエチレン合成試験の結果を示す。
【図４】シアノバクテリア発現用ベクターの概念図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下に、本発明を実施するための形態を、最良の形態を含めて説明する。
【００３４】
＜人工酵素複合体＞
光合成生物に産生させる本発明の人工酵素複合体は、骨格蛋白質と、当該骨格蛋白質に結合するＡＣＣ合成酵素サブユニット及びＡＣＣ酸化酵素サブユニットを含む。当該人工酵素複合体は、光合成生物の体内に存在するＳＡＭを利用してエチレンを産生すると考えられる。
【００３５】
〔骨格蛋白質〕
本発明の人工酵素複合体に含まれる骨格蛋白質は少なくとも１のコヘシンドメインＣ１及び少なくとも１のコヘシンドメインＣ２を含む。本発明の光合成生物によるエチレンの産生が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
【００３６】
当該骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインの数は、本発明の光合成生物によるエチレンの産生が阻害されない限り特に限定されないが、２〜１０であることが好ましく、２〜７であることがより好ましく、２〜５であることが更に好ましく、２〜３であることが特に好ましい。骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣ１とコヘシンドメインＣ２の組み合わせは適宜選択可能である。コヘシンドメインＣ２数がコヘシンドメインＣ１数より多いことが好ましい。また、後述するＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の好ましい比率を実現するコヘシンドメインＣ１及びコヘシンドメインＣ２の組み合わせも好ましい。
【００３７】
コヘシンドメインはセルロソームのスキャホールディンに含まれているドメインとして知られており、上述のように、コヘシンとドックリンは非常に強い結合親和性と高い結合特異性を有する。よって、例えば、異なる属や種の菌のセルロソームに由来するコヘシンドメインを組み合わせて利用するなどして、コヘシンドメインＣ１とドックリンドメインＤ１の結合特異性、コヘシンドメインＣ２とドックリンドメインＤ２の結合特異性を実現可能である。当該コヘシンドメインＣ１とコヘシンドメインＣ２の配列の態様が、ＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素による逐次的な反応の実現に寄与すると考えられる。
【００３８】
本発明のコヘシンドメインは特に限定されず、公知のセルロソームに由来するもの、将来明らかにされるセルロソームに由来するもの、及びこれらの修飾／改変体であってコヘシン−ドックリンの特異的結合性を維持する物を利用することができる。嫌気性細菌、嫌気性糸状菌が生産するセルロソームに由来するコヘシンドメインが好ましい。嫌気性細菌として、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｐａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを例示することができる。嫌気性糸状菌としてＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｒｉｘ  ｆｒｏｎｔａｌｉｓ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｒｉｘ  ｐａｒｔｉｃｉａｒｕｍ、Ｏｒｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．を例示することができる。嫌気性細菌が生産するセルロソームに由来するコヘシンドメインがより好ましく、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓが生産するセルロソームに由来するコヘシンドメインが特に好ましい。
【００３９】
各コヘシンドメインは直接連結されて良いし、各コヘシンドメイン間にリンカーを介在させても良い。リンカーを介在させる場合、リンカーは、人工酵素複合体によるＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素の逐次的な反応を維持できる物であることが好ましい。例えば、アミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、骨格蛋白質の一部としてコヘシンドメインと共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は４〜２０個であることが好ましく、７〜１３個であることがより好ましく、９〜１１個であることが特に好ましい。
【００４０】
〔ＡＣＣ合成酵素サブユニット〕
本発明の人工酵素複合体に含まれるＡＣＣ合成酵素サブユニットはＡＣＣ合成酵素（以下、ＡＣＣＳとも称する。）及び前記コヘシンドメインＣ１と結合するドックリンドメインＤ１を含む。本発明の光合成生物によるエチレンの産生が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
【００４１】
ＡＣＣ合成酵素サブユニットに含まれるＡＣＣ合成酵素の数は本発明の光合成生物によるエチレンの産生が阻害されない限り特に限定されないが、１〜３であることが好ましく、１〜２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。また、ＡＣＣ合成酵素サブユニットに含まれるドックリンドメインＤ１は１つである。
【００４２】
本発明のＡＣＣ合成酵素は、ＳＡＭを基質とし、ＡＣＣを生成する酵素である限り特に限定されない。公知のＡＣＣ合成酵素、将来明らかにされるＡＣＣ合成酵素、及びこれらの修飾／改変体であってＳＡＭを基質とし、ＡＣＣを生成する酵素を利用することができる。また、ＳＡＭを基質としＡＣＣを生成する反応以外の反応を触媒する多機能酵素も利用することができる。植物に由来するＡＣＣ合成酵素が好ましく、トマト、ポプラ、ヤエナリ、シロイヌナズナ、イネ、ジャガイモ、エンドウ、コムギ、タバコ、メロン、セイヨウナシ、キウイフルーツ、カーネーション、ゼラニウム、ラン、ペチュニア又はヒマワリに由来するＡＣＣ合成酵素がより好ましく、トマトに由来するＡＣＣ合成酵素が特に好ましい。
【００４３】
本発明のドックリンドメインＤ１は前記コヘシンドメインＣ１と特異的に非共有結合にて結合する。ドックリンドメインはセルロソームに含まれているドメインとして知られている。コヘシンドメインＣ１とドックリンドメインＤ１の結合特異性を実現するために、ドックリンドメインＤ１としてコヘシンドメインＣ１と同種の菌等に由来するドックリンドメインを採用することが好ましい。公知のセルロソームに由来するもの、将来明らかにされるセルロソームに由来するもの、及びこれらの修飾／改変体であってコヘシン−ドックリンの特異的結合性を維持する物を利用することができることは、上述のコヘシンドメインと同様である。更に、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓに由来するドックリンドメインを採用することが特に好ましい。
【００４４】
ＡＣＣ合成酵素サブユニットにおける、ＡＣＣ合成酵素とドックリンドメインＤ１は直接連結されて良いし、ＡＣＣ合成酵素−ドックリンドメインＤ１間にリンカーを介在させても良い。ＡＣＣ合成酵素サブユニットにＡＣＣ合成酵素が複数含まれる場合、ＡＣＣ合成酵素どうしはリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることでＡＣＣ合成酵素の自由度が確保できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、人工酵素複合体のＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素の逐次的な反応を維持できる物であることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、ＡＣＣ合成酵素サブユニットの一部としてＡＣＣ合成酵素及びドックリンドメインＤ１と共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は５〜１５個であることが好ましく、６〜１２個であることがより好ましく、７〜９個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるドックリンネイティブのリンカーを使用することも好ましい。また、ＡＣＣ合成酵素がＮ末端側となっても良いし、ドックリンドメインＤ１がＮ末端側となっても良いが、ＡＣＣ合成酵素がＮ末端側となることが好ましく、ドックリンドメインＤ１がＣ末端側となることが好ましい。
【００４５】
本発明のＡＣＣ合成酵素サブユニットは上記骨格蛋白質が供えるコヘシンドメインＣ１の一部又は全部に結合してよい。コヘシンドメインＣ１の全部にＡＣＣ合成酵素サブユニットが結合していることは必ずしも必要でなく、本発明の人工酵素複合体がＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素の逐次的な反応を実現できるようにＡＣＣ合成酵素サブユニットが骨格蛋白質に結合していることが重要である。
【００４６】
〔ＡＣＣ酸化酵素サブユニット〕
本発明の人工酵素複合体に含まれるＡＣＣ酸化酵素サブユニットはＡＣＣ酸化酵素（以下、ＡＣＣＯとも称する。）及び前記コヘシンドメインＣ２と結合するドックリンドメインＤ２を含む。本発明の光合成生物によるエチレンの産生が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
【００４７】
ＡＣＣ酸化酵素サブユニットに含まれるＡＣＣ酸化酵素の数は本発明の光合成生物によるエチレンの産生が阻害されない限り特に限定されないが、１〜３であることが好ましく、１〜２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。また、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットに含まれるドックリンドメインＤ２は１つである。
【００４８】
本発明のＡＣＣ酸化酵素は、ＡＣＣを基質とし、エチレンを生成する酵素である限り特に限定されない。公知のＡＣＣ酸化酵素、将来明らかにされるＡＣＣ酸化酵素、及びこれらの修飾／改変体であってＡＣＣを基質とし、エチレンを生成する酵素を利用することができる。また、ＡＣＣを基質としエチレンを生成する反応以外の反応を触媒する多機能酵素も利用することができる。植物に由来するＡＣＣ酸化酵素が好ましく、トマト、キュウリ、バナナ、パッションフリーツ、カーネーション、又はセイヨウナシナシに由来するＡＣＣ酸化酵素がより好ましく、トマトに由来するＡＣＣ酸化酵素が特に好ましい。
【００４９】
本発明のドックリンドメインＤ２は前記コヘシンドメインＣ２と特異的に非共有結合にて結合する。ドックリンドメインはセルロソームに含まれているドメインとして知られている。コヘシンドメインＣ２とドックリンドメインＤ２の結合特異性を実現するために、ドックリンドメインＤ２としてコヘシンドメインＣ２と同種の菌等に由来するドックリンドメインを採用することが好ましい。公知のセルロソームに由来するもの、将来明らかにされるセルロソームに由来するもの、及びこれらの修飾／改変体であってコヘシン−ドックリンの特異的結合性を維持する物を利用することができることは、上述のコヘシンドメインと同様である。更に、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓに由来するドックリンドメインを採用することが特に好ましい。
【００５０】
ＡＣＣ酸化酵素サブユニットの構成に関して、リンカー、及びＮ末端側からの配列順序についての好ましい構成は、上述のＡＣＣ合成酵素サブユニットと同様である。
【００５１】
本発明のＡＣＣ酸化酵素サブユニットは骨格蛋白質が供えるコヘシンドメインＣ２の一部又は全部に結合してよい。コヘシンドメインＣ２の全部にＡＣＣ酸化酵素サブユニットが結合していることは必ずしも必要でなく、人工酵素複合体がＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素の逐次的な反応を実現できるようにＡＣＣ酸化酵素サブユニットが骨格蛋白質に結合していることが重要である。効率的なエチレンの産生を実現するために、人工酵素複合体に含まれるＡＣＣ酸化酵素サブユニット数はＡＣＣ合成酵素サブユニット数より多いことが好ましい。
【００５２】
〔ＤＢの参照〕
既に、多数のセルロソーム生産微生物においてコヘシンドメイン及びドックリンドメインのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が決定されている。また、多数のＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素においてアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が決定されている。それらの配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＢＩ、ＤＤＢＪ等で確認することができる。解読された配列についてはライブラリークローンを利用することができるものもある。
【００５３】
〔改変体〕
本発明の人工酵素複合体に含まれるコヘシンドメイン、ドックリンドメイン、ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素は、公知の天然由来の物の他、上述した本発明の人工酵素複合体に必要な機能を維持した改変体を含む概念である。当該改変体はアミノ酸配列の改変体を含む。例えば、後述の実施例で使用したコヘシンドメイン、ドックリンドメイン、ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素と比較して８０％配列が保持された改変体であり、好ましくは９０％配列が保持された改変体であり、より好ましくは９５％配列が保持された改変体であり、更に好ましくは９９％配列が保持された改変体である。当該改変体は、糖鎖などによって修飾されて良い。
【００５４】
アミノ酸配列の保持率は、種々の方法により算出され得るが、本願においてはアラインメントを利用するＢＬＡＳＴの配列相同性検索により算出する。ＢＬＡＳＴの設定はデフォルトとする。
【００５５】
〔ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率〕
本発明の人工酵素複合体に含まれる、ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率は限定されないが、１を超えることが好ましい。言い換えれば、ＡＣＣ酸化酵素サブユニット数を（Ａ）とし、ＡＣＣ合成酵素サブユニット数を（Ｂ）とした場合、（Ａ）／（Ｂ）＞１であることが好ましい。より好ましくは１．３以上であり、更に好ましくは１．５以上であり、更に好ましくは２以上であり、特に好ましくは３以上である。
【００５６】
本発明の人工酵素複合体には、ＡＣＣ合成酵素サブユニット及び／又はＡＣＣ酸化酵素サブユニットが２以上含まれてもよい。例えば、人工酵素複合体に含まれるＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率を２とした場合、当該人工酵素複合体はＡＣＣ合成酵素サブユニット１個及びＡＣＣ酸化酵素サブユニット２個を含んでも良いし、ＡＣＣ合成酵素サブユニット２個及びＡＣＣ酸化酵素サブユニット４個を含んでも良い。即ち、上記比率を維持するように複数のＡＣＣ合成酵素サブユニット及びＡＣＣ酸化酵素サブユニットを含んでよい。
【００５７】
また、本発明の人工酵素複合体に含まれるＡＣＣ合成酵素サブユニットとＡＣＣ酸化酵素サブユニットの配列順序は特に限定されない。人工酵素複合体に含まれる各サブユニットの個数にあわせ、順列組み合わせを利用してさまざまな配列順序を採用することができる。
【００５８】
一例を示すと、上記比率が２でありＡＣＣ合成酵素サブユニット２個及びＡＣＣ酸化酵素サブユニット４個を含む場合において、ＡＣＣ合成酵素サブユニット１個とＡＣＣ酸化酵素サブユニット２個の単位を２つ並べても良いし、ＡＣＣ合成酵素サブユニット２個の単位とＡＣＣ酸化酵素サブユニット４個の単位を並べても良いし、ＡＣＣ酸化酵素サブユニット２個の単位をＡＣＣ合成酵素サブユニット２個の単位を挟むように並べても良い。
【００５９】
＜光合成生物＞
本発明において形質転換され得る光合成生物は、光合成細菌及び藻類である。
【００６０】
本発明の光合成生物は上述した本発明の人工酵素複合体を産生するように形質転換したものである。好ましくは、発現ベクター等を用いて上述した本発明の人工酵素複合体を産生するように形質転換した光合成生物である。
【００６１】
上述した本発明の人工酵素複合体を産生するように形質転換され得る光合成細菌として、シアノバクテリア、紅色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、ヘリオバクテリア等を例示することができる。当該光合成細菌はシアノバクテリアであることが好ましい。シアノバクテリアとして、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ，Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ，Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ，Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ，Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ，Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ，Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ，Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ，Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ，Ｇｏｍｐｈｏｓｐｈａｅｒｉａ，Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ，Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ，Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ，Ｌｙｎｇｂｙａ，Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ，Ａｎａｂａｅｎａ，Ａｎａｂｅｎｏｐｓｉｓ，Ｎｏｓｔｏｃ，Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ，Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ，Ｇｌｏｅｏｔｒｉｃｈｉａ，Ｄｉｃｈｏｔｈｒｉｘ，Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ，Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ，Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ等に属する菌を例示することができ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属の菌が好ましい。
【００６２】
上述した本発明の人工酵素複合体を産生するように形質転換され得る藻類として、原核生物であるシアノバクテリア（藍藻）（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）から、真核生物である灰色植物門（灰色藻）（Ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（紅藻）（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑色植物門（クロレラ、緑藻を含む）（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（クリプト藻）（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、ハプト植物門（ハプト藻）（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（珪藻を含む不等毛藻）（Ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、渦鞭毛植物門（渦鞭毛藻）（Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ植物門（ユーグレナ藻）（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物門（クロララクニオン藻）（Ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔａ）に分類される様々な単細胞生物及び多細胞生物を例示することができる。好ましくはシアノバクテリア、緑藻、紅藻、灰色藻であり、より好ましくはシアノバクテリアである。好ましいシアノバクテリアは上述と同様である。
【００６３】
本発明において、従来の分類の通り、シアノバクテリアは光合成細菌に該当し、かつ、藻類にも該当する。
【００６４】
上述した本発明の人工酵素複合体の産生は光合成生物が備える蛋白質生産機能を利用することで実現される。上述した本発明の人工酵素複合体を産生するように光合成生物を形質転換する方法は特に限定されず、公知の方法を利用できる。例えば、ファージやプラスミド等のベクターを用いる方法、ヒートショック法、パーティクルガン法、エレクトロポーレーション法等を利用することができる。形質転換は、例えば、ゲノムに上記人工酵素複合体をコードする遺伝子を導入しても良い。本発明の光合成生物を、エチレン産生能力を維持したまま継代できるように形質転換することが好ましい。生物由来のＤＮＡ配列、上記した改変体をコードするＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ等を適宜使用することができる。ベクターを使用する場合、その種類は特に限定されないが、ｐＮＳ２ベクターが好ましい。
【００６５】
形質転換の際、例えば、骨格蛋白質、ＡＣＣ合成酵素サブユニット、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットをコードする遺伝子を一連に連結して光合成生物に導入しても良いし、骨格蛋白質、ＡＣＣ合成酵素サブユニット、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットをコードする各遺伝子を独立したプロモーター配置下、あるいは別々の手法やベクターを利用してそれぞれ導入しても良い。形質転換における導入する遺伝子と手法の組み合わせは限定されない。
【００６６】
〔光合成生物の培養〕
本発明の光合成生物は、二酸化炭素を取り込み、エチレンを産生する。即ち、本発明の光合成生物を培養することでエチレンを産生することができる。
【００６７】
上記形質転換され得る光合成生物は原核生物、真核生物の別を問わず自らの代謝においてＳＡＭを生産すると考えられる。よって、当該光合成生物は本願発明者が発案した物質循環を実現するのに適切な生物である。本発明の光合成生物の体内に存在するＳＡＭを利用し、人工酵素複合体によってエチレンが産生されると考えられる。
【００６８】
本発明の光合成生物の培養においては、上記形質転換され得る光合成生物について公知の各種の培地、培養方法を採用することができる。培地形状としては液体培地が好ましい。培地としては、例えば、ＢＧ−１１培地、海水が好ましい。淡水を培地とする場合、排水等から転用される無機栄養素を含む培地でもよい。
【００６９】
また、培地への添加物として、例えば、アスコルビン酸、ＡＣＣ、ＳＡＭ、メチオニンが好ましい。
【００７０】
例えば、培地のｐＨは６．５〜９．５であることが好ましく、７．０〜８．５であることが好ましく、７．０〜８．０であることがより好ましい。
【００７１】
例えば、本発明の光合成生物の培養においては、二酸化炭素を培地に供給することが好ましい。供給の態様は培地の形状に合わせて適宜選択可能であり限定されないが、気体又は二酸化炭素を含有する液体による供給が好ましく、バブリングによる供給がより好ましい。二酸化炭素を排出する設備からの排気を用いることも好ましい。二酸化炭素を排出する設備として例えば化学プラント、発電所等がある。
【００７２】
継続的に本発明の光合成生物を培養する場合、当該光合成生物の継代には公知の各種の手法を採用することができる。
【００７３】
また、本発明の光合成生物の古い世代を培地から回収する場合、当該光合成生物が担体に担持されていると回収が容易となる。当該担体として、例えば、鉄鋼スラグ、ハニカム、ビーズ等を使用することができる。担体への本発明の光合成生物の担持は、当該担体と光合成生物の組み合わせに応じて公知の各種の手法を採用することができる。
【実施例】
【００７４】
以下、本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されない。万が一、以下の実施例の記載と配列表で配列の記載に齟齬が生じる場合、本実施例の配列の記載が優先する。ＤＮＡ配列は５’末端から３’末端に向けて記載する。アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向けて記載する。
図１に、後述する人工酵素複合体Ａの概念図を示す。
【００７５】
＜大腸菌用ベクターの構築法と形質転換＞
〔実施例１：Ｈｉｓタグ＋ＡＣＣ合成酵素＋リンカー部＋ドックリンＲｆの発現ベクター（ｐＥＴ−ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃ）の構築〕
トマト（Solanum lycopersicum）由来ｃＤＮＡクローン〔アクセッション番号ＡＫ３２３７４０：ＧｅｎＢａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）、ＥＢＩ（http://www.ebi.ac.uk/）、ＤＤＢＪ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）において同じアクセッション番号で登録。）〕をテンプレートＤＮＡとし、下記配列番号１及び配列番号２に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりＡＣＣ合成酵素を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号１：AATGGGTCGCGGATCCGGATTTGAGATTGCAAAGAC（以下、ACCS-RfAdoc-Fwd1とも称する。）
配列番号２：CGAGCTTTGTGCCGGGACGAACTAATGGTGAGG（以下、ACCS-RfAdoc-Rev2とも称する。）
【００７６】
ＰＣＲ条件は、ホットスタート９６℃２分１サイクル、その後、熱変性９６℃１５秒、アニーリング５２℃３０秒、伸長反応７２℃２分を２５サイクルとした（ＰＣＲ条件１）。
【００７７】
Ruminococcus flavefaciens strain 17株由来ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとし、下記配列番号３及び配列番号４に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりリンカー配列＋ドックリンを含む遺伝子断片（アクセッション番号ＡＪ２７８９６９：ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＢＩ、ＤＤＢＪ）を増幅させた。このドックリンは、上記Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓにおいて、スキャフォルディンタンパク質Ａ（ＳｃａＡ）という唯一のタンパク質がもっている唯一のドックリンである。
配列番号３：CCTCACCATTAGTTCGTCCCGGCACAAAGCTCG（以下、ACCS-RfAdoc-Fwd2とも称する。）
配列番号４：GCTCGAATTCGGATCCTTACGCTTGAGGAAGTGTGATG（以下、ACCS-RfAdoc-Rev1とも称する。）
【００７８】
ＰＣＲ条件は、ホットスタート９６℃２分１サイクル、その後、熱変性９６℃１５秒、アニーリング５５℃３０秒、伸長反応７２℃３０秒を２５サイクルとした（ＰＣＲ条件２）。
【００７９】
上記によって得られた２つの遺伝子断片（すなわち、ＡＣＣ合成酵素を含む遺伝子断片とリンカー配列＋ドックリンを含む遺伝子断片）とACCS-RfAdoc-Fwd1およびACCS-RfAdoc-Rev1を用いて、ＰＣＲ法により当該２つの遺伝子断片をＡＣＣ合成酵素遺伝子が５’側になるように結合（キメラ化）、増幅させた。キメラ化ＰＣＲ条件は、ＡＣＣ合成酵素を含む遺伝子断片とリンカー配列＋ドックリンを含む遺伝子断片を連結させるため上記プライマー抜きで、ホットスタート９６℃２分１サイクル、その後、熱変性９６℃１５秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長反応７２℃２分を５サイクル行った（当該キメラ化ＰＣＲでは、互いに、一方の遺伝子断片が他方の遺伝断片のプライマーとなった）。続いて、ACCS-RfAdoc-Fwd1およびACCS-RfAdoc-Rev1を加え、上記ＰＣＲ条件１によりキメラ化したＤＮＡ断片を増幅した。
【００８０】
当該キメラ化したＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ部位へＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＴ−ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃを得た。
【００８１】
ｐＥＴ−ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃから発現する蛋白質（以下、キメラＡＣＣ合成酵素とも称する。本発明のＡＣＣ合成酵素サブユニットに該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号２４の通りであった。Ｎ末端側の最初の下線部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列、続く下線なしの部分がＡＣＣ合成酵素、続く第２の下線部分がリンカー、続く第２の下線なしの部分（Ｃ末端まで）がドックリンを示す。
配列番号２４：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSGFEIAKTNSILSKLATNEEHGENSPYFDGWKAYDSDPFHPLKNPNGVIQMGLAENQLCLDLIEDWIKRNPKGSICSEGIKSFKAIANFQDYHGLPEFRRAIAKFMEKTRGGRVRFDPERVVMAGGATGANETIIFCLADPGDAFLVPSPYYPAFNRDLRWRTGVQLIPIHCESSNNFKITSKAVKEAYENAQKSNIKVKGLILTNPSNPLGTTLDKDTLKSVLSFTNQHNIHLVCDEIYAATVFDTPQFVSIAEILDEQEMTYCNKDLVHIVYSLSKDMGLPGFRVGIIYSFNDDVVNCARKMSSFGLVSTQTQYFLAAMLSDEKFVDNFLRESAMRLGKRHKHFTNGLEEVGIKCLKNNAGLFCWMDLRPLLRESTFDSEMSLWRVIINDVKLNFSPGSSFECQEPGWFRVCFANMDDGTVDIALARIRRFVGVEKSGDKSSSMEKKQQWKKNNLRLSFSKRMYDESVLSPLSSPIPPSPLVRPGTKLVPTWGDTNCDGVVNVADVVVLNRFLNDPTYSNITDQGKVNADVVDPQDKSGAAVDPAGVKLTVADSEAILKAIVELITLPQA*
配列末尾の「*」はストップコドンの位置を表す。下記配列番号２５及び配列番号２７においても同様である。
【００８２】
〔実施例２：Ｈｉｓタグ＋ＡＣＣ酸化酵素＋リンカー部＋ドックリンＡｃの発現ベクター（ｐＥＴ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃ）の構築〕
トマト（Solanum lycopersicum）由来ｃＤＮＡクローン（アクセッション番号ＡＫ３２４４１１：ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＢＩ、ＤＤＢＪ）をテンプレートＤＮＡとし、下記配列番号５及び配列番号６に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりＡＣＣ酸化酵素を含む遺伝子断片を増幅させた。ＰＣＲ条件は、上記ＰＣＲ条件１とした。
配列番号５：AATGGGTCGCGGATCCGAGAACTTCCCAATTATCAAC（以下、ACCO-AcBdoc-Fwd1とも称する。）
配列番号６：TGGCGGTGTTATTAAAGCACTTGCAATTTGATCAAC（以下、ACCO-AcBdoc-Rev2とも称する。）
【００８３】
Acetivibrio cellulolyticus由来ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとし、下記配列番号７及び配列番号８に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりリンカー配列＋ドックリンを含む遺伝子断片（アクセッション番号ＡＹ２２１１１２：ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＢＩ、ＤＤＢＪ）を増幅させた。このドックリンは、上記Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏにおいて、スキャフォルディンタンパク質Ｂ（ＳｃａＢ）という唯一のタンパク質がもっている唯一のドックリンである。
配列番号７：CAAATTGCAAGTGCTTTAATAACACCGCCAGGTACC（以下、ACCO-AcBdoc-Fwd2とも称する。）
配列番号８：GCTCGAATTCGGATCCTTATTCTTCTTTCTCTTCAACAGG（以下、ACCO-AcBdoc-Rev1とも称する。）
【００８４】
ＰＣＲ条件は、ホットスタート９６℃２分１サイクル、その後、熱変性９６℃１５秒、アニーリング５３℃３０秒、伸長反応７２℃３０秒を２５サイクルとした（ＰＣＲ条件３）。
【００８５】
上記によって得られた２つの遺伝子断片（すなわち、ＡＣＣ酸化酵素を含む遺伝子断片とリンカー配列＋ドックリンを含む遺伝子断片）とACCO-AcBdoc-Fwd1およびACCO-AcBdoc-Rev1を用いて、ＰＣＲ法によりＡＣＣ酸化酵素遺伝子が５’側になるように結合（キメラ化）、増幅させた。キメラ化ＰＣＲ条件は実施例１に記載のキメラ化ＰＣＲ条件とし、ＡＣＣ酸化酵素を含む遺伝子断片とリンカー配列＋ドックリンを含む遺伝子断片を連結させるため上記プライマー抜きで行った。続いて、ACCO-AcBdoc-Fwd1およびACCO-AcBdoc-Rev1を加え、上記ＰＣＲ条件１によりキメラ化したＤＮＡ断片を増幅した。
【００８６】
当該キメラ化したＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａのＢａｍＨＩ部位へＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＴ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃを得た。
【００８７】
ｐＥＴ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃから発現する蛋白質（以下、キメラＡＣＣ酸化酵素とも称する。本発明のＡＣＣ酸化酵素サブユニットに該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号２５の通りであった。Ｎ末端側の最初の下線部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列、続く下線なしの部分がＡＣＣ酸化酵素、続く第２の下線部分がリンカー、続く第２の下線なしの部分（Ｃ末端まで）がドックリンを示す。
配列番号２５：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSENFPIINLENLNGDERAKTMEMIKDACENWGFFELVNHGIPHEVMDTVEKLTKGHYKKCMEQRFKELVASKGLEAVQAEVTDLDWESTFFLRHLPTSNISQVPDLDEEYREVMRDFAKRLEKLAEELLDLLCENLGLEKSYLKNAFYGSKGPNFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTDAGGIILLFQDDKVSGLQLLKDEQWIDVPPMRHSIVVNLGDQLEVITNGKYKSVMHRVIAQTDGTRMSLASFYNPGNDAVIYPAPSLIEESKQVYPKFVFDDYMKLYAGLKFQPKEPRFEAMKAMEANVELVDQIASALITPPGTKFIYGDVDGNGSVRINDAVLIRDYVLGKINEFPYEYGMLAADVDGNGSIKINDAVLVRDYVLGKIFLFPVEEKEE*
【００８８】
〔実施例３：Ｈｉｓタグ＋コヘシンＡｃ＋ＣｔＣｉｐＡ由来リンカー部＋コヘシンＲｆの発現ベクター（ｐＥＴ−Ｃｉｐ２）の構築〕
Ruminococcus flavefaciens strain 17株由来ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとし、下記配列番号９及び配列番号１０に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりコヘシンＲｆを含む遺伝子断片（アクセッション番号ＡＪ２７８９６９：ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＢＩ、ＤＤＢＪ）を増幅させた。このコヘシンＲｆは上記Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓにおいて唯一のタンパク質である、スキャフォルディンタンパク質Ｂ（ＳｃａＢ）に含まれるコヘシンドメイン１（Ｃｏｈ１）である。また、配列番号１０に記載のプライマーは、下記配列番号２６に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのスキャフォルディンタンパク質Ａ（ＣｉｐＡ）由来のリンカー配列を増幅できるように設計した。ＰＣＲ条件は、上記ＰＣＲ条件３とした。
配列番号９：AATGGGTCGCGGATCCGATTTACAGGTTGACATTGGAAG（以下、ScaAcRf-Fwd-InFとも称する。）
配列番号１０：CGGTGTGTTTGTCGGTGTGTTTGTCGGTACCGATGCAATTACCTCAA（以下、ScaAcRf-chimRevとも称する。）
配列番号２６：VPTNTPTNTP
【００８９】
Acetivibrio cellulolyticus由来ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとし、下記配列番号１１及び配列番号１２に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりコヘシンＡｃを含む遺伝子断片（アクセッション番号ＡＹ２２１１１３：ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＢＩ、ＤＤＢＪ）を増幅させた。このコヘシンＡｃは、上記Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏにおいて、スキャフォルディンタンパク質Ｃ（ＳｃａＣ）という唯一のタンパク質がもっているコヘシン３である。また、配列番号１１に記載のプライマーは、上記配列番号２６に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのスキャフォルディンタンパク質Ａ（ＣｉｐＡ）由来のリンカー配列を増幅できるように設計した。ＰＣＲ条件は、上記ＰＣＲ条件２とした。
配列番号１１：GTACCGACAAACACACCGACAAACACACCGGGAACAGTTGAATGGCTTAT（以下、ScaAcRf-chimFwdとも称する。）
配列番号１２：GCTCGAATTCGGATCCTTAGATAGCGCCATCAGTAAGAG（以下、ScaAcRf-Rev-InFとも称する。）
【００９０】
上記によって得られた２つの遺伝子断片（すなわち、コヘシンＲｆを含む遺伝子断片とコヘシンＡｃを含む遺伝子断片）とScaAcRf-Fwd-InFおよびScaAcRf-Rev-InFを用いて、ＰＣＲ法によりコヘシンＡｃ遺伝子が５’側になるようにし、コヘシンＡｃ＋ＣｔＣｉｐＡ由来リンカー部＋コヘシンＲｆとなるように結合（キメラ化）、増幅させた。キメラ化ＰＣＲ条件は、コヘシンＲｆを含む遺伝子断片とコヘシンＡｃを含む遺伝子断片を連結させるため上記プライマー抜きで、ホットスタート９６℃２分１サイクル、その後、熱変性９６℃１５秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長反応７２℃１分を５サイクル行った。続いて、ScaAcRf-Fwd-InFおよびScaAcRf-Rev-InFを加え、上記ＰＣＲ条件１によりキメラ化したＤＮＡ断片を増幅した。
【００９１】
当該キメラ化したＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａのＢａｍＨＩ部位へＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＴ−Ｃｉｐ２を得た。
【００９２】
当該ｐＥＴ−Ｃｉｐ２から発現する蛋白質（以下、キメラ骨格蛋白質Ｃｉｐ２とも称する。本発明の骨格蛋白質に該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号２７におけるＮ末端側の最初の下線部分（ｐＥＴ２８ａ由来の配列）及び第２の下線なし部分以降（コヘシンＡｃ＋リンカー部＋コヘシンＲｆ）に相当する。
【００９３】
以上、実施例１〜実施例３で作製したｐＥＴ−ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃ、ｐＥＴ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃ、及びｐＥＴ−Ｃｉｐ２の概念図を図２に示す。
【００９４】
〔実施例４：Ｈｉｓタグ＋コヘシンＡｃ＋リンカー部＋コヘシンＡｃ＋リンカー部＋コヘシンＲｆの発現ベクター（ｐＥＴ−Ｃｉｐ３）の構築〕
上記方法により作成したｐＥＴ−Ｃｉｐ２をテンプレートＤＮＡとして、下記配列番号１３及び配列番号１４に記載のプライマーを用いて上記ＰＣＲ条件１により、コヘシンＡｃ＋リンカー部を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号１３：CTAGCTAGCGATTTACAGGTTGACATTGGAAG（以下、pET-Cip3-Fwd3とも称する。）
配列番号１４：CTCGAGCGGTGTGTTTGTCGGTGTGT（以下、pET-Cip3-R-Int2とも称する。）
【００９５】
また、上記方法により作成したｐＥＴ−Ｃｉｐ２をテンプレートＤＮＡとして、下記配列番号１５及び配列番号１６に記載のプライマーを用いて上記ＰＣＲ条件１により、コヘシンＡｃ＋リンカー部＋コヘシンＲｆを含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号１５：CTCGAGGATTTACAGGTTGACATTGG（以下、pET-Cip3-F-Int2とも称する。）
配列番号１６：GGATCCTTAGATAGCGCCATCAGTAAG（以下、pET-Cip3-Revとも称する。）
【００９６】
上記によって得られた２種類のコヘシン遺伝子断片をＸｈｏＩで連結し、その後ｐＥＴ２８ａのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ部位へライゲーションし、発現ベクターであるｐＥＴ−Ｃｉｐ３を得た。
【００９７】
ｐＥＴ−Ｃｉｐ３から発現する蛋白質（以下、キメラ骨格蛋白質Ｃｉｐ３とも称する。本発明の骨格蛋白質に該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号２７の通りであった。Ｎ末端側の最初の下線部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列、続く下線なしの部分がコヘシンＡｃ、続く第２の下線部分がリンカー、続く第２の下線なしの部分がコヘシンＡｃ、続く第３の下線部分がリンカー、続く第３の下線なしの部分（Ｃ末端まで）がコヘシンＲｆを示す。
配列番号２７：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPTNTPTNTPLEDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPTNTPTNTPGTVEWLIPTVTAAPGQTVTMPVVVKSSSLAVAGAQFKIQAATGVSYSSKTDGDAYGSGIVYNNSKYAFGQGAGRGIVAADDSVVLTLAYTVPADCAEGTYDVKWSDAFVSDTDGQNITSKVTLTDGAI*
【００９８】
〔実施例５：形質転換体における組換えタンパク質発現と精製〕
実施例１〜実施例４にて構築した上記４種の各発現ベクターで発現用大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株を形質転換させた。形質転換はすべてのベクターにおいてヒートショック法で行った。
【００９９】
形質転換後、ＩＰＴＧによる組換えタンパク質の発現誘導を行い、集菌を行った。最終濃度５０μｇ／ｍｌになるようにカナマイシンを添加したＬＢ液体培地１５ｍｌに白金耳でかきとった複数のコロニーを植菌し３７℃、１２５ｒｐｍで一晩振とう培養した。ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）液体培地１．５Ｌに最終濃度５０μｇ／ｍｌになるようにカナマイシンを添加後、上記前培養液１５ｍｌを接種し３７℃、１２５ｒｐｍにて２時間半振とう培養し、本培養とした。その後、ＯＤ６００ｎｍ＝０．２５になったところでイソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を最終濃度０．１ｍＭになるように添加し、１６℃、１８０ｒｐｍで一晩振とう培養した。
【０１００】
超音波破砕後、遠心分離により得た上清画分を用いてＨｉｓタグアフィニティー精製をおこなった。即ち、遠心分離（４℃、５０００×ｇ、２０分間遠心分離）により得た菌体１ｇ当たりにｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）を４ｍｌ加え、ボルテックスにより懸濁し、−８０℃にて急速凍結後融解させた。超音波破砕機で菌体を破砕した後、４℃、１５０００×ｇ、１５分で遠心分離し可溶性画分を得た。０．５ｍＬのＮｉキレート  アガロースレジン（ＣＯＳＭＯＧＥＬ  Ｈｉｓ−Ａｃｃｅｐｔ）を当該可溶性画分に添加し、４℃、７０ｒｐｍ、一晩反応させた。そして、４℃、３０００×ｇ、５分間遠心分離し上清を素通り画分とした。５０ｍｌのｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｗ）グリセロール）を用いてペレットを再けん濁し、４℃、３０００×ｇ、５分間遠心分離した。上清は洗浄画分とした。これを４回繰り返し、レジンの洗浄を行った。最後にｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＷａｓｈＢｕｆｆｕｅｒに最終濃度３００ｍＭのイミダゾールを加えた物）を５００μｌ添加し懸濁後、４℃、３０００×ｇ、５分間遠心分離し上清を溶出画分とした。これを５回繰り返した。
【０１０１】
上記精製により各目的タンパク質が単一バンドとして精製されたことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ〔チューブに２×ＳＤＳサンプルＢｕｆｆｅｒ  １０μｌとサンプルを１０μｌ入れ撹拌後、９８℃で１０分間タンパク質を変性させた。アクリルアミドゲル濃度は９％（ｗ／ｖ）を用いた。滅菌水２．２５ｍｌ、セパレーティングｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．８）１．２５ｍＬ、３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド１．５ｍＬ、１０％ＡＰＳ  ２５．０μｌ、ＴＥＭＥＤ  ２．５μｌを混合後（Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｇｅｌ）ゲル板に添加し、純水にてゲルと空気を遮断した。３０分後、Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｇｅｌが固まっていることを確認し、Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｇｅｌ上の純水を取り除いた。次に、滅菌水１．８５ｍｌ、スタッキングｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）７５０μｌ、３０％（ｗ／ｖ）アクリル アミド４００μｌ、１０％ＡＰＳ  ２５μｌ、ＴＥＭＥＤ  ５μｌを混合し（Ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ）Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｇｅｌの上に添加後、コームを装着した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動用の緩衝液として１０×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液４５ｍｌを純水で４５０ｍｌに定容したものを用いた。上記調製したサンプル、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用分子量マーカーを各レーンに添加し、２００Ｖ定電圧、４０分間、電気泳動した。電気泳動後、ゲルを取り出し、タッパーにゲルを入れ、純水中で５分間振とうさせ洗浄した。これを３回繰り返し、クマシーブリリアントブルーＧ２５０を添加し１時間染色した。染色後純水で脱色、保存した。（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のプロトコールに従った。）〕および抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング解析により確認した。
【０１０２】
ｐＥＴ−ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃを導入した形質転換体から得たキメラＡＣＣ合成酵素は分子量６７．３ｋＤａであった。ｐＥＴ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃを導入した形質転換体から得たキメラＡＣＣ酸化酵素は分子量４８．４ｋＤａであった。ｐＥＴ−Ｃｉｐ２を導入した形質転換体から得たキメラ骨格蛋白質Ｃｉｐ２は分子量３３．１ｋＤａであった。ｐＥＴ−Ｃｉｐ３を導入した形質転換体から得たキメラ骨格蛋白質Ｃｉｐ３は分子量４８．８ｋＤａであった。
【０１０３】
＜エチレンガス合成試験＞
〔実施例６〕
キメラＡＣＣ合成酵素及びキメラＡＣＣ酸化酵素のみ（即ち、骨格蛋白質無し）、キメラＡＣＣ合成酵素、キメラＡＣＣ酸化酵素及びキメラ骨格蛋白質Ｃｉｐ２を供える人工酵素複合体Ａ、キメラＡＣＣ合成酵素１つ、キメラＡＣＣ酸化酵素２つ及びキメラ骨格蛋白質Ｃｉｐ３を供える人工酵素複合体Ｂを用いてエチレンガスの合成試験を行った。下記の条件のガスクロマトグラフィーにより合成されたエチレン量を測定した。なお、検量線はエチレン量０ｐｐｍ〜２．５ｐｐｍ（０〜１μｌ）まで良好な直線性（Ｒ２＝０．９９）を示した。
【０１０４】
−ガスクロマトグラフィー条件−
機器        ：  ＧＣ−１７Ａ（島津製作所）
検出器      ：  ＦＩＤ
検出器温度  ：  ２５０℃
カラム      ：  キャピラリーカラムＲｔ−Ｑ−ＢＯＮＤ（株式会社島津ジーエルシー社製）
カラム温度  ：  １００℃固定
注入口温度  ：  ２５０℃
線速度      ：  ４２ｃｍ／ｓｅｃ
キャリアガス：  Ａｒ
【０１０５】
（人工酵素複合体Ａの調製）
キメラＡＣＣ合成酵素、キメラＡＣＣ酸化酵素及びキメラ骨格蛋白質Ｃｉｐ２を下記人工酵素複合体形成用反応溶液に等モル比となるように加え、室温で１５分間インキュベートし結合させた。以上のように人工酵素複合体Ａを形成させた後、これを後述する酵素反応の反応溶液へ添加し酵素反応を観察した。
【０１０６】
（人工酵素複合体Ｂの調製）
キメラＡＣＣ合成酵素、キメラＡＣＣ酸化酵素及びキメラ骨格蛋白質Ｃｉｐ３を下記人工酵素複合体形成用反応溶液にモル比が１：２：１となるように加え、室温で１５分間インキュベートし結合させた。以上のように人工酵素複合体Ｂを形成させた後、これを後述する酵素反応の反応溶液へ添加し酵素反応を観察した。
【０１０７】
−人工酵素複合体形成用反応溶液の組成−
５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｗ）グリセロール、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む水溶液。
【０１０８】
（ＳＡＭを基質としたエチレンガスの合成）
キメラＡＣＣ合成酵素及びキメラＡＣＣ酸化酵素のみ（モル比換算で１：１になるようにした）又は人工酵素複合体Ａを、１０μｇ、２０μｇ、もしくは４０μｇを含む酵素溶液５０μｌ、又は、人工酵素複合体Ｂ５μｇもしくは１０μｇを含む酵素溶液５０μｌを、反応溶液９５０μｌ〔２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ  ピリドキサールリン酸、３０ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、２０ｍＭ  硫酸鉄（ＩＩ）、２０％（ｖ／ｗ）グリセロール、１ｍＭ  塩化カルシウム、５ｍＭ  Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（基質）〕と混合し２ｍｌバイアルビンに封入した。３０℃で１時間インキュベートした後、各バイアルビンのヘッドスペースからガスタイトシリンジを用いて５００μｌの気体を採取し、全量をインジェクトして上述の条件のガスクロマトグラフィーでエチレン量を測定した。各試験は３連行い、結果は平均値にて記載する。キメラＡＣＣ合成酵素及びキメラＡＣＣ酸化酵素のみの試験区、及び人工酵素複合体Ａの試験区のエチレン合成量の測定結果のグラフは図３に示す。
【０１０９】
キメラＡＣＣ合成酵素及びキメラＡＣＣ酸化酵素のみの試験区（図３中■のプロットで示す。）は、酵素量１０μｇで２８．６ｎｍｏｌｅ／ｍｌ、酵素量２０μｇで７７．６ｎｍｏｌｅ／ｍｌ、酵素量４０μｇで５０４．０ｎｍｏｌｅ／ｍｌであった。
【０１１０】
人工酵素複合体Ａの試験区（図３中◆のプロットで示す。）は酵素量１０μｇで７２．２ｎｍｏｌｅ／ｍｌ、酵素量２０μｇで１２９．４ｎｍｏｌｅ／ｍｌ、酵素量４０μｇで４６２．６ｎｍｏｌｅ／ｍｌであった。図示を省略した、人工酵素複合体Ｂの試験区は、酵素量５μｇ〜１０μｇで同量の人工酵素複合体Ａの約２．５倍量のエチレンを合成した。
【０１１１】
以上の実験結果より、骨格蛋白質を用いる人工酵素複合体において高効率でエチレンが合成された。特に、酵素量が低濃度である場合に効率よくエチレンが合成された。人工酵素複合体Ｂでは人工酵素複合体Ａに比べて多量のエチレンを合成した。
【０１１２】
また、実験結果は省略するが、ＡＣＣを基質とした場合でもエチレンの合成が確認された。ＡＣＣを基質とした場合は、ＳＡＭを基質とした場合よりもエチレン合成量が多かった。
【０１１３】
＜シアノバクテリアの形質転換＞
〔実施例７：シアノバクテリア用ベクターの構築〕
（イ）エチレンを産生する人工酵素複合体を構成する各キメラ酵素をコードする遺伝子およびキメラ骨格蛋白質遺伝子をＩＰＴＧによる誘導発現用のｔｒｃプロモーター下流に配置する。また、（ロ）３つのＯＲＦの各上流にはリボソーム結合部位を配置させる。以上を目的に、Ｐｔｒｃ：：ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃ−Ｃｉｐ２あるいはＰｔｒｃ：：ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃ−Ｃｉｐ３を含む２種のｐＢＲ３２２−ｐＴｒｃプラスミドを作製した。
【０１１４】
（１）既に作製したｐＥＴ−ＡＣＣＳ−ＲｆｄｏｃをテンプレートＤＮＡとして、下記配列番号１７及び配列番号１８に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりＨｉｓタグ＋ＡＣＣ合成酵素＋リンカー部＋ドックリンＲｆを含む遺伝子断片を増幅させた。
【０１１５】
ＰＣＲ条件は、ホットスタート９６℃２分１サイクル、その後、熱変性９６℃１５秒、アニーリング５４℃３０秒、伸長反応７２℃２分を２５サイクルとした（ＰＣＲ条件４）。
配列番号１７：GCATGTCATGAGCAGCAGCCATCATC（以下、ACCS-BsSa-FWDとも称する。）
配列番号１８：ACGCGTCGACTTACGCTTGAGGAAGTGTG（以下、ACCS-BsSa-REVとも称する。）
【０１１６】
（２）既に作成したｐＥＴ−ＡＣＣＯ−ＡｃｄｏｃをテンプレートＤＮＡとして、下記配列番号１９及び配列番号２０に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりＨｉｓタグ＋ＡＣＣ酸化酵素＋リンカー部＋ドックリンＡｃを含む遺伝子断片を増幅させた。ＰＣＲ条件は、上記ＰＣＲ条件４とした。
配列番号１９：ACGCGTCGACCACAGGAAACAGATCATGG（以下、ACCO-SaHi-FWDとも称する。）
配列番号２０：CCCAAGCTTTTATTCTTCTTTCTCTTCAACAGGG（以下、ACCO-SaHi-REV2とも称する。）
【０１１７】
（３）既に作成したｐＥＴ−Ｃｉｐ２をテンプレートＤＮＡとして、下記配列番号２１及び配列番号２２に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりＨｉｓタグ＋コヘシンＡｃ＋リンカー部＋コヘシンＲｆを含む遺伝子断片を増幅させた。
【０１１８】
ＰＣＲ条件は、ホットスタート９６℃２分１サイクル、その後、熱変性９６℃１５秒、アニーリング５４℃３０秒、伸長反応７２℃１分を２５サイクルとした（ＰＣＲ条件５）。
配列番号２１：CCCAAGCTTCACAGGAAACAGACCATGGGC（以下、Cip2-HiXb-FWDとも称する。）
配列番号２２：GCTCTAGATTAGATAGCGCCATCAGTAAG（以下、Cip2-HiXb-REVとも称する。）
【０１１９】
上記（１）、（２）及び（３）で得た遺伝子断片、並びにｐＢＲ３２２−ｐＴｒｃベクターを任意の制限酵素で消化後、連結させＰｔｒｃ：：ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃ−Ｃｉｐ２（以下、「ｐＢＲＴｒｃ−ＡＣＣＳ−ＡＣＣＯ−Ｃｉｐ２」とも称する。）を得た。
【０１２０】
ｐＢＲＴｒｃ−ＡＣＣＳ−ＡＣＣＯ−Ｃｉｐ２に含まれるＰｔｒｃプロモーターからターミネーターまでの領域をＢａｍＨＩと同じ突出末端を形成するＢｇｌＩＩ制限酵素消化した。また、Ｎｅｕｔｒａｌ  ＳｉｔｅＩＩを有するシアノバクテリア用発現ベクターｐＮＳ２ベクターをＢａｍＨＩで消化した。これらをライゲーションし、発現ベクターであるｐＮＳ２−ＳＯＣ２ベクターを構築し形質転換に用いた。１つの発現単位として構築した当該ベクターの概念図を図４に示す。
【０１２１】
ＰＣＣ７９４２Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｓｉｔｅ  ＩＩとは、外来のＤＮＡ断片を挿入しても、挿入自体の影響がみられないゲノム上の座位である。
【０１２２】
（４）既に作成したｐＥＴ−Ｃｉｐ３をテンプレートＤＮＡとして、下記配列番号２３に記載のプライマー及びCip2-HiXb-REVを用いてＰＣＲ法によりＨｉｓタグ＋コヘシンＡｃ＋リンカー部＋コヘシンＡｃ＋リンカー部＋コヘシンＲｆを含む遺伝子断片を増幅させた。ＰＣＲ条件は、上記ＰＣＲ条件５とした。
配列番号２３：CCCAAGCTTCACAGGAAACAGACCATGGGCAGCAGCCATCATC（以下、Cip3-HiXb-FWDとも称する。）
【０１２３】
上記（１）、（２）及び（４）で得た遺伝子断片、並びにｐＢＲ３２２−ｐＴｒｃベクターを任意の制限酵素で消化後、連結させ発現ベクターであるＰｔｒｃ：：ＡＣＣＳ−Ｒｆｄｏｃ−ＡＣＣＯ−Ａｃｄｏｃ−Ｃｉｐ３（以下、「ｐＢＲＴｒｃ−ＡＣＣＳ−ＡＣＣＯ−Ｃｉｐ３」とも称する。）を得た。ｐＮＳ２−ＳＯＣ２ベクターと同様の方法を用いて、発現ベクターであるｐＮＳ２−ＳＯＣ３ベクターを構築した。
【０１２４】
〔実施例８：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ７９４２の形質転換〕
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ７９４２（容易に入手可能な公知の藻株）の培養液（培地はＢＧ−１１培地）１０ｍＬを２５℃、５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を捨て、残渣を１．２５ｍＬの１０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。ボルテックスで撹拌後、２５℃、５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を捨て１ｍｌのＢＧ−１１培地を加えた。２μｇのｐＮＳ２−ＳＯＣ２ベクターを菌体懸濁液に加え、光を照射せず３０℃で一晩振とう培養した。その後菌体培養液をＢＧ−１１プレート（ＢＧ−１１培地に１％アガーを添加して作製した。）に塗布植藻し、形質転換効率を上げるために当該プレートをキムワイプで包み、３０℃、弱明条件下で約２４時間培養した。その後、最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるようにカナマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）を、１ｍｌずつプレート下に一様に流し込んだ。その後３０℃、通常の光条件下で培養した。当該培養開始から７日後、抗生物質を含む他のＢＧ−１１プレートに菌体の植え継ぎを行った。当該植え継ぎを３回繰り返したところで、プレートに生育している細胞を以降の実験に用いた。
【０１２５】
次に、抗生物質を含む液体ＢＧ−１１液体培地にて当該細胞の培養、植え継ぎを行い抗生物質耐性能の確認をした。即ち、上記抗生物質を含むＢＧ−１１プレートに生育したコロニーを１白金耳でかきとり、カナマイシン（最終濃度１２．５、２５．０又は５０．０μｇ／ｍｌ）を含んだ１００ｍＬのＢＧ−１１液体培地に植菌した。ＯＤ７３０ｎｍ＝１．０まで培養したところで当該培養液を１ｍｌとり、抗生物質を含んだ新しいＢＧ−１１液体培地に植藻した。
【０１２６】
当該ＢＧ−１１液体培地へのカナマイシンの添加量と吸光度の関係について述べる。形質転換体はカナマイシン１２．５μｇ／ｍｌで最も吸光度が大きくなった。この条件では、野生株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ７９４２の非形質転換体）のカナマイシン添加なしの培養とほぼ同様の増殖カーブを示した。菌体の増殖率はカナマイシン添加量１２．５μｇ／ｍｌの条件で最も良好であり、次いで２５．０μｇ／ｍｌの条件が良好であった。
【０１２７】
〔実施例９：エチレン合成試験〕
実施例８の操作により最終的に得た形質転換されたシアノバクテリアを含むＢＧ−１１液体培地を培養し、Ｏ．Ｄ．が０．４になったところでその液体培地を２ｍｌ、容積４ｍｌのガスクロマトグラフィー用のサンプルバイアルに移し密栓後、３０℃で一晩振とうさせながら反応させ、当該反応後上方の気相部から生成ガスを５００μｌをシリンジで抜き取り、実施例６に記載の条件のガスクロマトグラフィーにてエチレン生成活性を測定した。試験は３連行い、結果の平均値は０．００４５ｎｌ／ｍｌ／ｈｒであった。
【０１２８】
次に、ＢＧ−１１液体培地に終濃度１ｍＭとなるようにＡＣＣを添加し、その後の工程は上記と同じようにしてエチレン生成活性を測定したところ、約５倍のエチレン合成活性である０．０２２ｎｌ／ｍｌ／ｈｒであった。
【０１２９】
実施例８の操作により最終的に得た形質転換されたシアノバクテリアは、エチレン産生能力を維持して４代継代できた。継代するとき、植え継ぎの際、添加する前培養液の量を加減させることにより更に継代が可能であると考えられる。
【０１３０】
実施例８においてはｐＮＳ２−ＳＯＣ２ベクターを用いたが、実施例６の実験結果より、ｐＮＳ２−ＳＯＣ３ベクターを用いてもエチレン産生能力を有するシアノバクテリアが得られると合理的に推測された。また、当該シアノバクテリアはエチレン産生能力を維持して継代できると合理的に推測された。当該シアノバクテリアの培養条件を適宜調整することで、よりエチレン産生活性が上昇すると推測された。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明により有用な光合成生物が提供される。更には、当該光合成生物の有効な利用方法が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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