(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖及び軽鎖を含む、ヒトＯＸ４０に結合するアンタゴニスト性抗体であって、重鎖可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に関して配列番号１に提供する配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２に関して配列番号２または配列番号２０に提供する配列を有するＣＤＲ、およびＣＤＲ−Ｈ３に関して配列番号３に提供する配列を有するＣＤＲを含み、そして、軽鎖可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に関して配列番号４または配列番号２１に提供する配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して配列番号５に提供する配列、およびＣＤＲ−Ｌ３に関して配列番号６に提供する配列を含む、前記抗体。
【請求項２】
重鎖が配列番号９に提供する配列を含む、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
軽鎖が配列番号７に提供する配列を含む、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
抗体が：全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子あるいはその断片、例えばＦａｂ、修飾Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬまたはｓｃＦｖ断片からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載のアンタゴニスト性抗体。
【請求項５】
配列番号９に提供する配列を含む重鎖および配列番号７に提供する配列を含む軽鎖を有する、ヒトＯＸ４０に結合するアンタゴニスト性抗体。
【請求項６】
配列番号１５に提供する配列を含む重鎖および配列番号１１に提供する配列を含む軽鎖を有する、ヒトＯＸ４０に結合するアンタゴニスト性抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体、及びエフェクターまたはレポーター分子を有する、アンタゴニスト性抗体分子。
【請求項８】
エフェクター分子が１以上のポリマーを含む、請求項７記載のアンタゴニスト性抗体分子。
【請求項９】
１以上のポリマーが、場合によって置換された直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー、あるいは分枝または非分枝多糖である、請求項８記載のアンタゴニスト性抗体分子。
【請求項１０】
１以上のポリマーがメトキシポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレングリコール）である、請求項９記載のアンタゴニスト性抗体分子。
【請求項１１】
重鎖のＣ末端のシステイン残基の１つに付着したリジルマレイミドまたはリジルビスマレイミド基を有する請求項１０記載のアンタゴニスト性抗体分子であって、リジル残基の各アミノ基に、２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合している、前記抗体分子。
【請求項１２】
ヒトＯＸ４０に特異性を有するアンタゴニスト性抗体分子であって、配列番号１５に提供する配列を含む重鎖および配列番号１１に提供する配列を含む軽鎖を有し、そして重鎖の２２６位のシステインにリジルマレイミド基が付着し、リジル残基の各アミノ基に、２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合している、前記抗体分子。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体の重鎖（単数または複数）および／または軽鎖（単数または複数）をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１３記載の１以上のＤＮＡを含む、クローニングまたは発現ベクター。
【請求項１５】
配列番号１４および配列番号１８に提供する配列を含む、請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
配列番号１９に提供する配列を含む、請求項１４記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１４または請求項１５または請求項１６に記載される１以上のクローニングまたは発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１７の宿主細胞を培養し、そして抗体を単離する工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項の抗体を産生するための方法。
【請求項１９】
薬学的に許容されうる賦形剤、希釈剤またはキャリアーの１以上と組み合わされた、請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
他の活性成分をさらに含む、請求項１９記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
ＯＸ４０によって仲介されるか、またはＯＸ４０レベルの増加と関連する病理学的障害の治療または予防において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２２】
ＯＸ４０によって仲介されるか、またはＯＸ４０レベルの増加と関連する病理学的障害の治療または予防のための薬剤製造における、請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項２３】
ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン部分及び２つのドメイン抗体を含むＯＸ４０結合抗体融合タンパク質であって、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン部分が請求項１記載のアンタゴニスト性抗体である、前記融合タンパク質。
【請求項２４】
免疫グロブリン部分が、ＦａｂおよびＦａｂ’である、請求項２３記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
２つのドメイン抗体が、ジスルフィド結合によって連結された、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）対である、請求項２３又は２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
ＶＨ及びＶＬ対がアルブミンに結合する、請求項２５記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
病理学的障害が感染である、請求項２２の使用。
【請求項２８】
病理学的障害が移植片対宿主病又は移植拒絶である、請求項２２の使用。
【請求項２９】
病理学的障害が、アレルギー、ＣＯＰＤ、喘息、自己免疫疾患又は関節リウマチである、請求項２２の使用。
【請求項３０】
ＯＸ４０によって仲介されるか、またはＯＸ４０レベルの増加と関連する病理学的障害の治療または予防において使用するための、請求項１９または請求項２０記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＯＸ４０の抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子および該分子を含む組成物に関する。本発明はまた、抗体分子の療法的使用、前記抗体分子を産生するための組成物および方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５またはＴＸＧＰ１Ｌとしてもまた知られる）は、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ３０およびＣＤ４０を含むＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＯＸ４０の細胞外リガンド結合ドメインは、３つの全長システインリッチドメイン（ＣＲＤ）および部分的な４番目のＣ末端ＣＲＤで構成される（Ｂｏｄｍｅｒら，  ２００２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，  ２７，  １９−２６）。
【０００３】
ＯＸ４０のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、そして３コピーのＯＸ４０が三量体リガンドに結合して、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ複合体を形成する（ＣｏｍｐａａｎおよびＨｙｍｏｗｉｔｚ，  ２００６，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １４，  １３２１−１３３０）。ＯＸ４０は、膜結合性受容体である；が、可溶性アイソフォームもまた検出されてきている（ＴａｙｌｏｒおよびＳｃｈｗａｒｚ，  ２００１，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２５５，  ６７−７２）。可溶性型の機能的重要性は現在は未知である。ＯＸ４０は休止Ｔ細胞上では発現されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の連結後に活性化されたＴ細胞上で一過性に発現される。ＯＸ４０のリガンド、ＯＸ４０Ｌは、ＴＮＦファミリーのメンバーであり、そしてＢ細胞、マクロファージ、内皮細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含む、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現される。
【０００４】
ＯＸ４０は、主要な共刺激受容体であり、最適なＴ細胞増殖および生存には、ＣＤ２８およびＯＸ４０の連続した結合が必要とされる。活性化されたＴ細胞上にＯＸ４０が連結すると、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方で、サイトカイン産生および増殖の増進が導かれ（Ｇｒａｍａｇｌｉａら，  ２０００，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６５，  ３０４３−３０５０、Ｂａｎｓａｌ−Ｐａｋａｌａら，  ２００４，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １７２，  ４８２１−４２５）、そして進行中のＴｈ１およびＴｈ２反応両方に貢献しうる（Ｇｒａｍａｇｌｉａら，  １９９８，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏ．，  １６１，  ６５１０−６５１７、Ａｒｅｓｔｉｄｅｓら，  ２００２，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２，  ２８７４−２８８０）。ＯＸ４０共刺激は、免疫反応の初期エフェクター相を超えてＴ細胞生存を延長し、そしてエフェクターＴ細胞死の阻害を通じて、メモリーＴ細胞数を増加させる。
【０００５】
免疫活性化が過剰であるかまたは制御されていない場合、病的なアレルギー、喘息、炎症、自己免疫および他の関連疾患が生じうる。ＯＸ４０は、免疫反応を増進するように機能するため、自己免疫および炎症性疾患を悪化させうる。
【０００６】
疾患モデルにおけるＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用の役割は、ＯＸ４０ノックアウトマウスにおいて立証されてきている。多発性硬化症のモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、ＯＸ４０ノックアウトマウスでは、疾患の臨床徴候がより重度でないこと、およびＣＮＳ内の炎症浸潤物が減少していることが注目された（Ｃａｒｂｏｎｉら，  ２００３，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １４５，  １−１１）。また、オボアルブミンで抗原刺激されそして誘発されたＯＸ４０ノックアウトマウスは、肺炎症の減少（好酸球増加症の８０〜９０％の減少）、粘液産生の減少、および気道反応亢進の有意な減弱を示す（Ｊｅｍｂｅｒら，  ２００１，  Ｊ．  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １９３，  ３８７−３９２）。ネズミＯＸ４０リガンドに対するモノクローナル抗体は、関節リウマチのコラーゲン誘導性関節炎モデル（Ｙｏｓｈｉｏｋａら，  ２０００，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３０，  ２８１５−２８２３）、ＥＡＥ（Ｎｏｈａｒａら，  ２００１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６６，  ２１０８−２１１５）、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス（Ｐａｋａｌａら，  ２００４，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３４，  ３０３９−３０４６）、Ｔ細胞回復マウスにおける大腸炎（Ｍａｌｍｓｔｒｏｍら，  ２００１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６６，  ６９７２−６９８１、Ｔｏｔｓｕｋａら，  ２００３，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２８４，  Ｇ５９５−Ｇ６０３）および肺炎症モデル（Ｓａｌｅｋ−Ａｒｄａｋａｎｉら，  ２００３，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９８，  ３１５−３２４、Ｈｏｓｈｉｎｏら，  ２００３，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ３３，  ８６１−８６９）において、有益な効果を示してきている。ヒトＯＸ４０Ｌに対する抗体は、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）における肺炎症モデルにおいてプロファイリングされてきており、そしてアレルゲン曝露後、細気管支洗浄液における、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびエフェクター・メモリーＴ細胞レベルの減少を生じた（Ｓｅｓｈａｓａｙｅｅら，  ２００７，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，  １１７，  ３８６８−３８７８）。
【０００７】
ＯＸ４０発現の増加が、いくつかの自己免疫および炎症性疾患において注目されてきている。これには、関節リウマチ患者の滑液から単離されたＴ細胞上のＯＸ４０発現の増加が含まれる（Ｂｒｕｇｎｏｎｉ  Ｄら，  １９９８，  Ｂｒ．Ｊ．  Ｒｈｅｕｍ．，  ３７，  ５８４−５８５；  Ｙｏｓｈｉｏｋａら，  ２０００，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３０，  ２８１５−２８２３；  Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ  Ｒら，  ２００１，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，  １９，  ３１７−３２０）。同様に、ＯＸ４０発現増加は、潰瘍性大腸炎およびクローン病患者由来の胃腸組織において（Ｓｏｕｚａら，  １９９９，  Ｇｕｔ，  ４５，  ８５６−８６３；  Ｓｔｕｂｅｒら，  ２０００，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，  ３０，  ５９４−５９９）、そして多発性硬化症患者の活性病変において（Ｃａｒｂｏｎｉら，  ２００３，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １４５，  １−１１）、注目されてきている。ＯＸ４０Ｌもまた、ヒト気道平滑筋（ＡＳＭ）上で検出可能であり、そして喘息患者ＡＳＭ細胞は、健康なドナーよりもＯＸ４０Ｌ連結に対してより大きい炎症反応を示し、喘息において、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ経路が役割を果たしていることが示される（Ｂｕｒｇｅｓｓら，  ２００４，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１３，  ６８３−６８９；  Ｂｕｒｇｅｓｓら，  ２００５，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１５，  ３０２−３０８）。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の末梢血から単離されたＣＤ４＋  Ｔ細胞が、上昇したレベルのＯＸ４０を発現し、これが疾患活性に関連することもまた報告されてきている（Ｐａｔｓｃｈａｎら，  ２００６，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４５，  ２３５−２４２）。
【０００８】
アレルギー、喘息、ならびに自己免疫および炎症に関連する疾患におけるＯＸ４０の役割を考慮すると、これらの疾患において療法に向かう１つのアプローチは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体またはアンタゴニスト性抗ＯＸ４０抗体の使用を通じて、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を遮断することである。
【０００９】
抗ＯＸ４０Ｌ抗体は、例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９に記載されてきている。多くのアゴニスト性抗ＯＸ４０抗体が記載されてきているが、アンタゴニスト性抗ＯＸ４０抗体は非常にわずかしか知られていない。ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌの間の相互作用を遮断するウサギ・ポリクローナル抗マウスＯＸ４０抗体が、Ｓｔｕｂｅｒら，  １９９６，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，  １８３，  ９７９−９８９によって産生された。ヒトＯＸ４０に結合するマウス・モノクローナル抗体、１３１および３１５が、Ｉｍｕｒａら，  １９９６，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，  ２１８５−２１９５によって生成された。
【００１０】
完全ヒト・アンタゴニスト性抗体がＷＯ２００７／０６２２４５に記載されてきており、これらの抗体の最高アフィニティは、細胞表面（活性化されたＴ細胞）で発現されたＯＸ４０に対して１１ｎＭのアフィニティであった。
【００１１】
ヒト化アンタゴニスト性抗体がＷＯ２００８／１０６１１６に記載されてきており、そしてＯＸ４０に対する最高アフィニティを持つ抗体は、０．９４ｎＭのアフィニティを有した。
【００１２】
他の抗ＯＸ４０抗体が記載されてきており、これには、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより商業的に入手可能なネズミＬ１０６（米国特許第６，２７７，９６２号）およびネズミＡＣＴ３５が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０２９８７９
【特許文献２】ＷＯ２００７／０６２２４５
【特許文献３】ＷＯ２００８／１０６１１６
【特許文献４】米国特許第６，２７７，９６２号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｏｄｍｅｒら，  ２００２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，  ２７，  １９−２６
【非特許文献２】ＣｏｍｐａａｎおよびＨｙｍｏｗｉｔｚ，  ２００６，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １４，  １３２１−１３３０
【非特許文献３】ＴａｙｌｏｒおよびＳｃｈｗａｒｚ，  ２００１，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２５５，  ６７−７２
【非特許文献４】Ｇｒａｍａｇｌｉａら，  ２０００，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６５，  ３０４３−３０５０
【非特許文献５】Ｂａｎｓａｌ−Ｐａｋａｌａら，  ２００４，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １７２，  ４８２１−４２５
【非特許文献６】Ｇｒａｍａｇｌｉａら，  １９９８，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏ．，  １６１，  ６５１０−６５１７
【非特許文献７】Ａｒｅｓｔｉｄｅｓら，  ２００２，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２，  ２８７４−２８８０
【非特許文献８】Ｃａｒｂｏｎｉら，  ２００３，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １４５，  １−１１
【非特許文献９】Ｊｅｍｂｅｒら，  ２００１，  Ｊ．  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １９３，  ３８７−３９２
【非特許文献１０】Ｙｏｓｈｉｏｋａら，  ２０００，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３０，  ２８１５−２８２３
【非特許文献１１】Ｎｏｈａｒａら，  ２００１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６６，  ２１０８−２１１５
【非特許文献１２】Ｐａｋａｌａら，  ２００４，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３４，  ３０３９−３０４６
【非特許文献１３】Ｍａｌｍｓｔｒｏｍら，  ２００１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６６，  ６９７２−６９８１
【非特許文献１４】Ｔｏｔｓｕｋａら，  ２００３，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２８４，  Ｇ５９５−Ｇ６０３
【非特許文献１５】Ｓａｌｅｋ−Ａｒｄａｋａｎｉら，  ２００３，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９８，  ３１５−３２４
【非特許文献１６】Ｈｏｓｈｉｎｏら，  ２００３，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ３３，  ８６１−８６９
【非特許文献１７】Ｓｅｓｈａｓａｙｅｅら，  ２００７，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，  １１７，  ３８６８−３８７８
【非特許文献１８】Ｂｒｕｇｎｏｎｉ  Ｄら，  １９９８，  Ｂｒ．Ｊ．  Ｒｈｅｕｍ．，  ３７，  ５８４−５８５
【非特許文献１９】Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ  Ｒら，  ２００１，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，  １９，  ３１７−３２０
【非特許文献２０】Ｓｏｕｚａら，  １９９９，  Ｇｕｔ，  ４５，  ８５６−８６３
【非特許文献２１】Ｓｔｕｂｅｒら，  ２０００，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，  ３０，  ５９４−５９９
【非特許文献２２】Ｂｕｒｇｅｓｓら，  ２００４，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１３，  ６８３−６８９
【非特許文献２３】Ｂｕｒｇｅｓｓら，  ２００５，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１５，  ３０２−３０８
【非特許文献２４】Ｐａｔｓｃｈａｎら，  ２００６，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４５，  ２３５−２４２
【非特許文献２５】Ｓｔｕｂｅｒら，  １９９６，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，  １８３，  ９７９−９８９
【非特許文献２６】Ｉｍｕｒａら，  １９９６，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，  ２１８５−２１９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、患者を治療するのに適した、改善された抗ＯＸ４０抗体に対する必要性が、当該技術分野においてなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ここで、ＯＸ４０によって仲介されるか、またはＯＸ４０レベルの増加に関連する病理学的障害の治療または予防において使用するのに適した、高アフィニティアンタゴニスト性抗ＯＸ４０抗体を同定した。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−Ａ】本開示記載の抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。
【図１−Ｂ】本開示記載の抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。
【図１−Ｃ】本開示記載の抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。
【図１−Ｄ】本開示記載の抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。
【図１−Ｅ】本開示記載の抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。
【図２】Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ形式の抗体の図表示を示す。
【図３】細胞表面ＯＸ４０に対するＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ抗体の細胞に基づくアフィニティを示す。
【図４】Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ抗体による、活性化されたＴ細胞へのＯＸ４０Ｌ結合の阻害パーセントを示す。
【図５】ヒトＭＬＲにおけるＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ抗体によるＴ細胞増殖の阻害パーセントを示す。
【図６】破傷風トキソイドに曝露されたＰＢＭＣの増殖のＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ阻害を示す。
【図７】ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）・アレルゲン性抽出物に曝露されたＰＢＭＣからのＩＬ−１３産生のＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ阻害パーセントを示す。
【図８】ヤケヒョウヒダニ・アレルゲン性抽出物に曝露されたＰＢＭＣからのサイトカイン産生のＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ阻害パーセントを示す。
【図９】Ｈｕ−ＳＣＩＤモデルにおいて、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧがＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を阻害することを示す。
【図１０】ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧによる関節炎スコア（曲線下面積として）の阻害を示す。
【図１１】関節炎ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける総組織学的スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ヒト化抗体を得た元来のラット抗体は、本明細書において、ＣＡ０４４＿０００２６と称される。
一般的にＦａｂ断片または他の断片の形であるヒト化ＣＡ０４４＿０００２６は、Ａ２６と称される。
【００１９】
図２に示す形式のＰＥＧ化抗体「Ａ２６」は、本明細書において、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧと称される。
抗体可変ドメイン中の残基は、慣用的に、Ｋａｂａｔらによって考案された系にしたがって番号付けされる。この系は、Ｋａｂａｔら，  １９８７，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ，  ＵＳＡ（本明細書において以後、「Ｋａｂａｔら（上記）」と称される）中に示される。別に示さない限り、本明細書において、この番号付け系が用いられる。
【００２０】
Ｋａｂａｔ残基命名は、アミノ酸残基の直鎖番号付けと、常に直接対応するわけではない。実際の直鎖アミノ酸配列は、厳密なＫａｂａｔ番号付けに比較して、基本的可変ドメイン構造のフレームワークであれまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ、構造構成要素の短縮または該要素への挿入に対応する、より少ないまたはさらなるアミノ酸を含有しうる。「標準的」Ｋａｂａｔ番号付け配列と抗体配列中の相同な残基を整列させることによって、所定の抗体に関して、残基の正確なＫａｂａｔ番号付けを決定してもよい。
【００２１】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け系にしたがって、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）および残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．およびＬｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６，  ９０１−９１７（１９８７））にしたがうと、ＣＤＲ−Ｈ１と同等なループは、残基２６から残基３２に広がる。したがって、別に示さない限り、本明細書で使用する際の「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付け系およびＣｈｏｔｈｉａの形態的ループ定義の組み合わせによって記載されるように、残基２６〜３５を指すよう意図される。
【００２２】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け系にしたがって、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）および残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００２３】
本明細書において、用語「アンタゴニスト性抗体」は、例えばＯＸ４０リガンドへのＯＸ４０の結合を遮断するかまたは結合を実質的に減少させて、そしてしたがってＯＸ４０の活性化を阻害することによって、ＯＸ４０の生物学的シグナル伝達活性を阻害し、そして／または中和することが可能な抗体を記載する。
【００２４】
当該技術分野に知られる適切な方法のいずれを用いて、本発明で使用するための抗体を得てもよい。融合タンパク質、例えばＯＸ４０−Ｆｃ融合タンパク質を含む、ＯＸ４０ポリペプチド／タンパク質、または（組換え的にまたは天然に）該ポリペプチドを発現している細胞（例えば活性化されたＴ細胞）を用いて、ＯＸ４０を特異的に認識する抗体を産生してもよい。ＯＸ４０ポリペプチドは、「成熟」ポリペプチドあるいはその生物学的活性断片または誘導体であってもよい。適切には、ＯＸ４０ポリペプチドは、成熟ヒトポリペプチドあるいはその細胞外ドメインまたは断片である。細胞外ドメインは、典型的には、ＯＸ４０タンパク質のアミノ酸２９〜２１４を含む（ＳＷＩＳＳ  ＰＲＯＴエントリーＰ４３４８９）。発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から、当該技術分野に周知のプロセスによってＯＸ４０ポリペプチドを調製してもよいし、または天然生物学的供給源から該ポリペプチドを回収してもよい。本出願において、用語「ポリペプチド」には、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。これらは、別に明記されない限り、交換可能に用いられる。ＯＸ４０ポリペプチドは、いくつかの例で、例えばアフィニティタグに融合した融合タンパク質などの、より大きいタンパク質の一部であってもよい。動物の免疫が必要な場合、周知でありそしてルーチンであるプロトコルを用いて、動物、好ましくは非ヒト動物にＯＸ４０ポリペプチドを投与することによって、該ポリペプチドに対して生成される抗体を得ることも可能であり、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ（監修），  Ｖｏｌ  ４，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ，  １９８６を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダまたはブタなどの多くの温血動物が免疫可能である。しかし、マウス、ウサギ、ブタおよびラットが、一般的に最も適切である。
【００２５】
本発明で使用するための抗体には、全抗体およびその機能的活性断片または誘導体が含まれ、そして限定されるわけではないが、モノクローナル、ヒト化、完全ヒトまたはキメラ抗体であってもよい。
【００２６】
ハイブリドーマ技術(Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  １９７５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ４：７２）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｐｐ７７−９６，  Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８５）などの当該技術分野に知られる任意の方法によって、モノクローナル抗体を調製してもよい。
【００２７】
また、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，  Ｊ．ら，  １９９６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３−７８４８ｌ；  ＷＯ９２／０２５５１；  ＷＯ２００４／０５１２６８および国際特許出願第ＷＯ２００４／１０６３７７号に記載される方法によって、特異的抗体産生のために選択された単一のリンパ球から生成される免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングしそして発現させることによって、単一リンパ球抗体法を用いて、本発明で使用するための抗体を生成してもよい。
【００２８】
ヒトＯＸ４０への結合を測定するアッセイおよび／またはリガンド、ＯＸ４０ＬへのＯＸ４０の結合を遮断する能力を測定するアッセイを用いて、抗体に関するスクリーニングを行ってもよい。結合アッセイの例は、ＥＬＩＳＡであり、特に、プレート上に固定されたヒトＯＸ４０およびヒトＦｃの融合タンパク質を用い、そしてコンジュゲート化二次抗体を使用して、融合タンパク質に結合した抗ＯＸ４０抗体を検出するものである。遮断アッセイの例は、ヒトＣＤ４細胞上のＯＸ４０へのＯＸ４０リガンド融合タンパク質の結合の遮断を測定する、フローサイトメトリーに基づくアッセイである。蛍光標識二次抗体を用いて、細胞へのＯＸ４０リガンド融合タンパク質結合の量を検出する。このアッセイは、上清中の抗体が、ＯＸ４０へのリガンド融合タンパク質の結合を遮断する際のシグナルの減少を調べる。遮断アッセイのさらなる例は、プレートにコーティングされたＯＸ４０リガンド融合タンパク質によって仲介される、未処理（ｎａｉｖｅ）ヒトＴ細胞の共刺激の遮断を、トリチウム標識チミジン取り込みを測定することによって測定するアッセイである。
【００２９】
ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ  ５，５８５，０８９；  ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。全ＣＤＲではなくＣＤＲの特異性決定残基を導入すればよい可能性もあることが認識されるであろう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，  ２００５，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３６，  ２５−３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、場合によって、ＣＤＲが由来した非ヒト種に由来する１以上のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。
【００３０】
キメラ抗体は、要素が由来する種の特性を保持するように、２つの異なる種に由来する要素で構成される。一般的に、キメラ抗体は、１つの種、例えばマウス、ラット、ウサギまたは類似のものに由来する可変領域、および別の種、例えばヒトに由来する定常領域を含むであろう。
【００３１】
本発明で使用するための抗体はまた、当該技術分野に知られる多様なファージディスプレイ法を用いても生成可能であり、そしてこれには、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９５，  １８２：４１−５０）中、Ａｍｅｓら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９５，  １８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９４，  ２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ，  １９９７  １８７  ９−１８）、Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９９４，  ５７：１９１−２８０）ならびにＷＯ  ９０／０２８０９；  ＷＯ  ９１／１０７３７；  ＷＯ  ９２／０１０４７；  ＷＯ  ９２／１８６１９；  ＷＯ  ９３／１１２３６；  ＷＯ  ９５／１５９８２；  ＷＯ  ９５／２０４０１；ならびにＵＳ  ５，６９８，４２６；  ５，２２３，４０９；  ５，４０３，４８４；  ５，５８０，７１７；  ５，４２７，９０８；  ５，７５０，７５３；  ５，８２１，０４７；  ５，５７１，６９８；  ５，４２７，９０８；  ５，５１６，６３７；  ５，７８０，２２５；  ５，６５８，７２７；  ５，７３３，７４３および５，９６９，１０８に開示されるものが含まれる。
【００３２】
完全ヒト抗体は、重鎖および軽鎖両方の可変領域および定常領域（存在する場合）がすべてヒト起源のものであるか、または必ずしも同じ抗体由来でなくても、ヒト起源の配列に実質的に同一である抗体である。完全ヒト抗体の例には、例えば、上述のファージディスプレイ法によって産生される抗体、ならびに例えばＥＰ０５４６０７３  Ｂ１、ＵＳ  ５，５４５，８０６、ＵＳ  ５，５６９，８２５、ＵＳ  ５，６２５，１２６、ＵＳ  ５，６３３，４２５、ＵＳ  ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ  ０４３８４７４およびＥＰ０４６３１５１に一般論として記載されるように、ネズミ免疫グロブリン可変領域および場合によって定常領域遺伝子が、ヒト対応物によって置換されている抗体が含まれてもよい。
【００３３】
１つの態様において、本発明は、重鎖を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、重鎖可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に関して図１（ｃ）配列番号１に提供する配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２に関して図１（ｃ）配列番号２または配列番号２０に提供する配列を有するＣＤＲ、およびＣＤＲ−Ｈ３に関して図１（ｃ）配列番号３に提供する配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、前記抗体を提供する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、重鎖を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、重鎖可変ドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも２つが、以下：ＣＤＲ−Ｈ１に関して配列番号１に提供する配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して配列番号２に提供する配列、およびＣＤＲ−Ｈ３に関して配列番号３に提供する配列より選択される、前記抗体を提供する。例えば、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１に提供する配列を有し、そしてＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２に提供する配列を有する重鎖を含んでもよい。あるいは、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１に提供する配列を有し、そしてＣＤＲ−Ｈ３が配列番号３に提供する配列を有する重鎖を含んでもよく、または抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２に提供する配列を有し、そしてＣＤＲ−Ｈ３が配列番号３に提供する配列を有する重鎖を含んでもよい。疑義を回避するため、すべての順列が含まれることが理解される。
【００３５】
別の態様において、本発明は、重鎖を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、重鎖可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に関して配列番号１に提供する配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して配列番号２に提供する配列、およびＣＤＲ−Ｈ３に関して配列番号３に提供する配列を含む、前記抗体を提供する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、重鎖を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、重鎖可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に関して配列番号１に提供する配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して配列番号２０に提供する配列、およびＣＤＲ−Ｈ３に関して配列番号３に提供する配列を含む、前記抗体を提供する。
【００３７】
１つの態様において、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、軽鎖可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に関して図１（ｃ）配列番号４または配列番号２１に提供する配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２に関して図１（ｃ）配列番号５に提供する配列を有するＣＤＲ、およびＣＤＲ−Ｌ３に関して図１（ｃ）配列番号６に提供する配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、前記抗体を提供する。
【００３８】
別の態様において、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも２つが、以下：ＣＤＲ−Ｌ１に関して配列番号４に提供する配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して配列番号５に提供する配列、およびＣＤＲ−Ｌ３に関して配列番号６に提供する配列より選択される、前記抗体を提供する。例えば、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号４に提供する配列を有し、そしてＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５に提供する配列を有する軽鎖を含んでもよい。あるいは、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号４に提供する配列を有し、そしてＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６に提供する配列を有する軽鎖を含んでもよく、または抗体は、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５に提供する配列を有し、そしてＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６に提供する配列を有する軽鎖を含んでもよい。疑義を回避するため、すべての順列が含まれることが理解される。
【００３９】
別の態様において、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に関して配列番号４に提供する配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して配列番号５に提供する配列、およびＣＤＲ−Ｌ３に関して配列番号６に提供する配列を含む、前記抗体を提供する。
【００４０】
別の態様において、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に関して配列番号２１に提供する配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して配列番号５に提供する配列を、およびＣＤＲ−Ｌ３に関して配列番号６に提供する配列を含む、前記抗体を提供する。
【００４１】
本発明の抗体分子は、それぞれ相補的軽鎖または相補的重鎖を適切に含む。
したがって、１つの態様において、本発明記載の抗体は、重鎖可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に関して配列番号１に提供する配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して配列番号２または配列番号２０に提供する配列、およびＣＤＲ−Ｈ３に関して配列番号３に提供する配列を含む、重鎖、ならびに軽鎖可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に関して配列番号４または配列番号２１に提供する配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して配列番号５に提供する配列、およびＣＤＲ−Ｌ３に関して配列番号６に提供する配列を有する、軽鎖を含む。
【００４２】
抗体がＯＸ４０に結合し、そしてＯＸ４０活性を中和する能力を有意に改変することなく、本発明によって提供されるＣＤＲに、１以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を行ってもよいことが認識されるであろう。いかなるアミノ酸置換、付加および／または欠失の影響も、当業者によって、例えば本明細書に、特に実施例に記載の方法を用いて、ＯＸ４０結合およびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用阻害を決定することによって、容易に試験可能である。したがって、本発明は、ＣＤＲＨ−１（配列番号１）、ＣＤＲＨ−２（配列番号２または配列番号２０）、ＣＤＲＨ−３（配列番号３）、ＣＤＲＬ−１（配列番号４または配列番号２１）、ＣＤＲＬ−２（配列番号５）およびＣＤＲＬ−３（配列番号６）より選択される１以上のＣＤＲを含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有する抗体であって、１以上のＣＤＲ中の１以上のアミノ酸が別のアミノ酸、適切には以下に定義するような類似のアミノ酸で置換されている、前記抗体を提供する。１つの態様において、本発明は、図１（ｃ）に示すようなＣＤＲＨ−１（配列番号１）、ＣＤＲＨ−２（配列番号２または配列番号２０）、ＣＤＲＨ−３（配列番号３）、ＣＤＲＬ−１（配列番号４または配列番号２１）、ＣＤＲＬ−２（配列番号５）およびＣＤＲＬ−３（配列番号６）を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有する抗体であって、例えば１以上のＣＤＲ中の１以上のアミノ酸が別のアミノ酸、例えば以下に定義するような類似のアミノ酸で置換されている、前記抗体を提供する。
【００４３】
１つの態様において、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖可変ドメインが３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ−Ｈ１の配列が配列番号１に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有し、そして／またはＣＤＲ−Ｈ３が配列番号３に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する。別の態様において、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖可変ドメインが３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ−Ｈ１の配列が配列番号１に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有し、そして／またはＣＤＲ−Ｈ３が配列番号３に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する。
【００４４】
「同一性」は、本明細書において、整列された配列中の任意の特定の位で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。「類似性」は、本明細書において、整列された配列中の任意の特定の位で、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシンまたはバリンで置換可能である。互いにしばしば置換されうる他のアミノ酸には、限定されるわけではないが：
−フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびに
−システインおよびメチオニン（イオウ含有側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。同一性および類似性の度合いは容易に計算可能である（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．監修，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．監修，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１、ＮＣＢＩより入手可能なＢＬＡＳＴＴＭソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．ら，  １９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０；  Ｇｉｓｈ，  Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ，  Ｄ．Ｊ．  １９９３，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ３：２６６−２７２．  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｔ．Ｌ．ら，  １９９６，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：１３１−１４１；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．ら，  １９９７，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ，  Ｔ．Ｌ．  １９９７，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：６４９−６５６，）。
【００４５】
別の態様において、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖可変ドメインが３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ−Ｌ１の配列が配列番号４に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有し、そして／またはＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する。別の態様において、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖可変ドメインが３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ−Ｌ１の配列が配列番号４に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有し、そして／またはＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する。
【００４６】
１つの態様において、本明細書に提供する抗体はモノクローナル抗体である。
１つの態様において、本明細書に提供する抗体はキメラ抗体である。
１つの態様において、本発明に提供する抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、２０および／または２１（図１（ｃ））に提供するＣＤＲまたはその変異体の１以上を含む、ＣＤＲ移植抗体分子である。本明細書において、用語「ＣＤＲ移植抗体分子」は、重鎖および／または軽鎖が、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域フレームワーク内に移植された、ドナー抗体（例えばネズミ・モノクローナル抗体）由来の１以上のＣＤＲ（望ましい場合、１以上の修飾ＣＤＲを含む）を含有する抗体分子を指す。概説には、Ｖａｕｇｈａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １６，  ５３５−５３９，  １９９８を参照されたい。１つの態様において、全ＣＤＲを移動させるのではなく、上記のＣＤＲのいずれか１つ由来の１以上の特異性決定領域のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，  ２００５，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３６，  ２５−３４を参照されたい）。１つの態様において、上記のＣＤＲの１以上由来の特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる。別の態様において、上記の各ＣＤＲ由来の特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる。
【００４７】
ＣＤＲまたは特異性決定残基を移植した際、マウス、霊長類およびヒト・フレームワーク領域を含めて、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を用いてもよい。適切には、本発明記載のＣＤＲ移植抗体は、ヒト・アクセプター・フレームワーク領域、ならびに上記のＣＤＲまたは特異性決定残基の１以上を含む可変領域を有する。したがって、１つの態様において、可変ドメインがヒト・アクセプター・フレームワーク領域および非ヒトドナーＣＤＲを含む、中和ＣＤＲ移植抗体を提供する。
【００４８】
本発明で使用可能なヒト・フレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（Ｋａｂａｔら、上記）。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭを重鎖に用いてもよく、ＲＥＩを軽鎖に用いてもよく、そしてＥＵ、ＬＡＹおよびＰＯＭを重鎖および軽鎖両方に用いてもよい。あるいは、ヒト生殖系列配列を用いてもよく；これらは：  ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／で入手可能である。
【００４９】
本発明のＣＤＲ移植抗体において、アクセプター重鎖および軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来しなくてもよく、そして望ましい場合、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。
【００５０】
本発明のＣＤＲ移植抗体の重鎖に適したフレームワーク領域は、ＪＨ４を伴うヒト下位群ＶＨ３配列１−３  ３−０７に由来する。したがって、重鎖フレームワーク領域がＪＨ４を伴うヒト下位群ＶＨ３配列１−３  ３−０７に由来する、少なくとも１つの非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲ移植抗体を提供する。ヒトＪＨ４の配列は以下の通りである:  （ＹＦＤＹ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２２）。ＹＦＤＹモチーフはＣＤＲ−Ｈ３の一部であり、そしてフレームワーク４の一部ではない（Ｒａｖｅｔｃｈ，  ＪＶ．ら，  １９８１，  Ｃｅｌｌ，  ２７，  ５８３−５９１）。
【００５１】
本発明のＣＤＲ移植抗体の軽鎖に適したフレームワーク領域は、ＪＫ４を伴うヒト生殖系列下位群ＶＫ１配列２−１  １−０２に由来する。したがって、軽鎖フレームワーク領域がＪＫ４を伴うヒト下位群配列２−１  １−０２に由来する、少なくとも１つの非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲ移植抗体を提供する。ＪＫ１の配列は以下の通りである：  （ＷＴ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２３）。ＷＴモチーフはＣＤＲ−Ｌ３の一部であり、そしてフレームワーク４の一部ではない（Ｈｉｅｔｅｒ，  ＰＡ．ら，  １９８２，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５７，  １５１６−１５２２）。
【００５２】
また、本発明のＣＤＲ移植抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと正確に同じ配列でなくてもよい。例えば、異常な残基を、そのアクセプター鎖クラスまたはタイプに関して、より頻繁に存在する残基に変更してもよい。あるいは、アクセプター・フレームワーク領域中の選択された残基が、ドナー抗体中の同じ位で見られる残基に対応するように、該残基を変更してもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２，  ３２３−３２４を参照されたい）。こうした変更は、ドナー抗体のアフィニティを回復するのに必要な最小限度に留めておくべきである。変更する必要がある可能性があるアクセプター・フレームワーク領域中の残基を選択するためのプロトコルは、ＷＯ  ９１／０９９６７に示される。
【００５３】
適切には、本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター重鎖がＪＨ４を伴うヒトＶＨ３配列１−３  ３−０７を有する場合、重鎖のアクセプター・フレームワーク領域は、１以上のドナーＣＤＲに加えて、３７位、７３位、７８位または９４位（Ｋａｂａｔら（上記）による）の少なくとも１つのドナー残基を含む。したがって、重鎖可変ドメインの３７位、７３位、７８位および９４位の少なくとも１つの残基がドナー残基であるＣＤＲ移植抗体を提供する。
【００５４】
適切には、本発明記載のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター軽鎖がＪＫ４を伴うヒト下位群ＶＫ１配列２−１  １−０２を有する場合、軽鎖のアクセプター・フレームワーク領域は、１以上のドナーＣＤＲに加えて、６４位または７１位の少なくとも１つのドナー残基を含む。したがって、軽鎖可変ドメインの６４位および７１位の少なくとも１つの残基がドナー残基であるＣＤＲ移植抗体を提供する。
【００５５】
ドナー残基はドナー抗体、すなわちＣＤＲが元来得られた抗体由来の残基である。
１つの態様において、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインが図１（ｂ）配列番号９に提供する配列を含む、重鎖を含む。
【００５６】
抗体がＯＸ４０に結合し、そしてＯＸ４０活性を中和する能力を有意に改変することなく、本発明によって提供される抗体可変ドメインに、１以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を行ってもよいことが認識されるであろう。いかなるアミノ酸置換、付加および／または欠失の影響も、当業者によって、例えば本明細書に、特に実施例に記載の方法を用いて、ＯＸ４０結合およびリガンド遮断を決定することによって、容易に試験可能である。
【００５７】
別の態様において、本発明の抗体は、重鎖を含み、ここで重鎖可変ドメインが配列番号９に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む。１つの態様において、本発明の抗体は、重鎖を含み、ここで重鎖可変ドメインが配列番号９に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する配列を含む。
【００５８】
１つの態様において、本発明の抗体は、軽鎖を含み、ここで軽鎖可変ドメインが図１（ａ）配列番号７に提供する配列を含む。
別の態様において、本発明の抗体は、軽鎖を含み、ここで軽鎖可変ドメインが配列番号７に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む。１つの態様において、本発明の抗体は、軽鎖を含み、ここで軽鎖可変ドメインが配列番号７に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する配列を含む。
【００５９】
１つの態様において、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号９に提供する配列を含む、重鎖、および軽鎖可変ドメインが配列番号７に提供する配列を含む、軽鎖を含む。
【００６０】
本発明の別の態様において、抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖可変ドメインが配列番号９に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号７に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む。適切には、抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号９に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する配列を含む、重鎖、および軽鎖可変ドメインが配列番号７に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する配列を含む、軽鎖を含む。
【００６１】
本発明の抗体分子は、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子またはその断片を含んでもよく、そして限定されるわけではないが、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨまたはＶＬまたはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価または四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび上記いずれかのエピトープ結合断片であってもよい（例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，  ２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３（９）：１１２６−１１３６；  ＡｄａｉｒおよびＬａｗｓｏｎ，  ２００５，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−  Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３），  ２０９−２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を生成し、そして製造するための方法が当該技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら，  １９９８，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２１６，  １６５−１８１を参照されたい）。本発明で使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０およびＷＯ２００５／００３１７１に記載されるＦａｂおよびＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は、多重特異性を含んでもよいし、または単一特異性であってもよい（例えばＷＯ  ９２／２２８５３およびＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。
【００６２】
１つの態様において、本開示記載の抗体は、例えばＷＯ２００９／０４０５６２に記載されるように、免疫グロブリン部分、例えばＦａｂまたはＦａｂ’断片、およびそれに直接または間接的に連結された１つまたは２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含むＯＸ４０結合抗体融合タンパク質として提供される。
【００６３】
１つの態様において、融合タンパク質は、例えば場合によってジスルフィド結合によって連結された、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）対としての、２ドメイン抗体を含む。
【００６４】
１つの態様において、融合タンパク質のＦａｂ’要素のＦａｂは、単数または複数の単一ドメイン抗体に同じまたは類似の特異性を有する。１つの態様において、ＦａｂまたはＦａｂ’は、単数または複数の単一ドメイン抗体に対して異なる特異性を有し、すなわち融合タンパク質は多価である。１つの態様において、本発明記載の多価融合タンパク質は、アルブミン結合部位を有し、例えばその中のＶＨ／ＶＬ対がアルブミン結合部位を提供する。
【００６５】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提唱される機能、そして特に必要とされうるエフェクター機能を考慮して選択可能である。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、特に抗体分子が療法使用に意図され、そして抗体エフェクター機能が必要とされる場合は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプのものを用いてもよい。あるいは、抗体分子が療法目的に意図され、そして例えば単にＯＸ４０活性を遮断するために抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプを用いてもよい。これらの定常領域ドメインの配列変異体もまた使用可能であることが認識されるであろう。例えば、Ａｎｇａｌら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９９３，  ３０（１），  １０５−１０８に記載されるように、２４１位のセリンが、プロリンに変更されているＩｇＧ４分子を用いてもよい。当業者にはまた、抗体が多様な翻訳後修飾を経てもよいことが認識されるであろう。これらの修飾のタイプおよび度合いは、しばしば、抗体を発現するのに使用する宿主細胞株ならびに培養条件に応じる。こうした修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギン脱アミド化の変動が含まれてもよい。しばしば、修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リジンまたはアルギニンなど）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，  ＲＪ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４，  １９９５に記載されるようなもの）。したがって、図１（ｆ）、配列番号１５に提供する抗体重鎖のＣ末端リジンは存在しなくてもよい。
【００６６】
１つの態様において、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、そして抗体軽鎖はカッパまたはラムダいずれかのＣＬドメインを含む。
１つの態様において、本発明が提供する抗体は、重鎖定常領域が修飾ヒンジ領域を含む、ヒトＯＸ４０に特異性を有するアンタゴニスト性抗体である。したがって、本発明は、重鎖が図１（ｆ）、配列番号１５に提供する配列を含むかまたは該配列からなる抗体を提供する。
【００６７】
抗体がＯＸ４０に結合し、そしてＯＸ４０活性を中和する能力を有意に改変することなく、本発明によって提供される抗体可変および／または定常ドメインに、１以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を行ってもよいことが認識されるであろう。いかなるアミノ酸置換、付加および／または欠失の影響も、当業者によって、例えば本明細書に、特に実施例に記載の方法を用いて、ＯＸ４０結合およびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用遮断を決定することによって、容易に試験可能である。
【００６８】
本発明の１つの態様において、抗体は、配列番号１５に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む、重鎖を含む。適切には、抗体は、配列番号１５に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する配列を含む、重鎖を含む。
【００６９】
１つの態様において、本発明記載の抗体分子は、図１（ｄ）、配列番号１１に提供する配列を含む軽鎖を含む。
本発明の１つの態様において、抗体は、配列番号１１に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む、軽鎖を含む。例えば、抗体は、配列番号１１に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する配列を含む、軽鎖を含む。
【００７０】
１つの態様において、本発明は、重鎖が配列番号１５に提供する配列を含むかまたは該配列からなり、そして軽鎖が配列番号１１に提供する配列を含むかまたは該配列からなる、抗体を提供する。
【００７１】
本発明の１つの態様において、抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖が配列番号１５に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含み、そして軽鎖が配列番号１１に提供する配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む。一般的には、抗体は、配列番号１５に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する重鎖、および配列番号１１に提供する配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性または類似性を有する軽鎖を含む。
【００７２】
抗体または断片などの生物学的分子は、酸性および／または塩基性官能基を含有し、それによって分子に純陽性または陰性電荷を与える。全体の「観察される」電荷の量は、実体の絶対アミノ酸配列、３Ｄ構造中の荷電基の局所環境、および分子の環境条件に応じるであろう。等電点（ｐＩ）は、特定の分子またはその溶媒アクセス可能表面が純電荷を持たないｐＨである。１つの態様において、本開示記載の抗体または断片は、少なくとも７の等電点（ｐＩ）を有する。１つの態様において、抗体または断片は、少なくとも８、例えば８．５、８．６、８．７、８．８または９の等電点を有する。
【００７３】
本発明のＯＸ４０抗体および断片は、適切な等電点を有するように操作されてきている。これは、より頑強な特性、特に適切な可溶性および／または安定性プロフィールおよび／または改善された精製特性を持つ抗体および／または断片を導きうる。
【００７４】
したがって、１つの側面において、本発明は、元来同定された抗体ＣＡ０４４＿０００２６のものと異なる等電点を有するように操作されたヒト化ＯＸ４０抗体を提供する。抗体は、例えば、アミノ酸残基を置換することによって、例えば酸性アミノ酸残基を１以上の塩基性アミノ酸残基で置換することによって操作してもよい。あるいは、塩基性アミノ酸残基を導入してもよいし、または酸性残基を除去してもよい。あるいは、分子が許容しえないほど高いｐＩ値を有する場合、必要に応じて、酸性残基を導入してｐＩを下げてもよい。望ましいように操作される抗体または断片のターゲットｐＩは、例えば、８以上、例えば８．５または９であってもよい。ｐＩを操作する場合、抗体または断片の望ましい活性を保持するように注意しなければならないことが重要である。したがって、１つの態様において、操作された抗体または断片は、「非修飾」抗体または断片と同じかまたは実質的に同じ活性を有する。
【００７５】
＊＊ＥｘＰＡＳＹ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｔ−ａｒｌｅｓ．ｕｐ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｗ３ｂｂ／ｄ＿ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ−ｐ．ｈｔｍｌなどのプログラムを用いて、抗体または断片の等電点を予測してもよい。
【００７６】
本発明がやはり提供するのは、本発明が提供する抗体、特に重鎖配列ｇＨ２（配列番号９）および／または軽鎖配列ｇＬ８（配列番号７）を含む抗体が結合する、ヒトＯＸ４０の特異的領域またはエピトープである。
【００７７】
当該技術分野に知られる適切なエピトープマッピング法と本発明が提供する抗体のいずれか１つを組み合わせて、ヒトＯＸ４０ポリペプチドの特定の領域またはエピトープを同定してもよい。こうした方法の例には、本発明の抗体への結合に関して、抗体によって認識されるエピトープの配列を含有する、抗体に特異的に結合可能な最小断片を用いて、ＯＸ４０由来の多様な長さのペプチドをスクリーニングする工程が含まれる。ＯＸ４０ペプチドを合成的に産生してもよいし、またはＯＸ４０ポリペプチドのタンパク質分解的消化によってもよい。抗体に結合するペプチドを、例えば質量分析によって同定してもよい。別の例において、ＮＭＲ分光計またはＸ線結晶学を用いて、本発明の抗体が結合するエピトープを同定してもよい。ひとたび同定したら、本発明の抗体に結合するエピトープ断片を、必要であれば、免疫源として用いて、同じエピトープに結合するさらなるアンタゴニスト性抗体を得てもよい。
【００７８】
本発明記載の抗体、特に重鎖配列ｇＨ２（配列番号９）および軽鎖配列ｇＬ８（配列番号７）を含む抗体の結合を交差遮断する抗体は、同様に、ＯＸ４０活性をアンタゴナイズするのに有用でありうる。したがって、本発明はまた、ヒトＯＸ４０に特異性を有するアンタゴニスト性抗体であって、ヒトＯＸ４０への上記の抗体のいずれか１つの結合を交差遮断し、そして／またはこれらの抗体の１つによってＯＸ４０への該抗体の結合が交差遮断される、前記抗体も提供する。１つの態様において、こうした抗体は、上記抗体と同じエピトープに結合する。別の態様において、交差遮断中和抗体は、上記抗体が結合するエピトープと隣接し、そして／または重複する。別の態様において、本発明のこの側面の交差遮断中和抗体は、本発明の抗体と同じエピトープ、あるいは前記エピトープと隣接し、そして／または重複するエピトープに結合しない。
【００７９】
当該技術分野の任意の適切な方法を用いて、例えばヒトＯＸ４０への交差遮断抗体の結合が、本発明の抗体の結合を防止するかまたはその逆である、競合ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いることによって、交差遮断抗体を同定してもよい。
【００８０】
１つの態様において、重鎖が配列ｇＨ２（配列番号９）を含み、そして軽鎖が配列ｇＬ８（配列番号７）を含む抗体のヒトＯＸ４０への結合を交差遮断する、ヒトＯＸ４０に特異性を有するアンタゴニスト性抗体を提供する。１つの態様において、本発明が提供する交差遮断抗体は、重鎖配列ｇＨ２（配列番号９）および軽鎖配列ｇＬ８（配列番号７）を含む抗体の結合を、８０％より大きく、例えば８５％より大きく、例えば９０％より大きく、特に９５％より大きく阻害する。
【００８１】
あるいはまたはさらに、本発明のこの側面記載のアンタゴニスト性抗体は、重鎖配列ｇＨ２（配列番号９）および軽鎖配列ｇＬ８（配列番号７）を含む抗体によってヒトＯＸ４０への結合が交差遮断されうる。したがって、重鎖配列ｇＨ２（配列番号９）および軽鎖配列ｇＬ８（配列番号７）を含む抗体によってヒトＯＸ４０への結合が交差遮断される、ヒトＯＸ４０に特異性を有するアンタゴニスト性抗体分子も提供する。１つの態様において、本発明のこの側面が提供するアンタゴニスト性抗体は、重鎖配列ｇＨ２（配列番号９）および軽鎖配列ｇＬ８（配列番号７）を含む抗体によって、ヒトＯＸ４０への結合が、８０％より大きく、例えば８５％より大きく、例えば９０％より大きく、特に９５％より大きく阻害される。
【００８２】
１つの態様において、本発明が提供する交差遮断抗体は、完全にヒトである。１つの態様において、本発明が提供する交差遮断抗体は、ヒト化されている。１つの態様において、本発明が提供する交差遮断抗体は、ヒトＯＸ４０に対して、１００ｐＭまたはそれより優れたアフィニティを有する。１つの態様において、本発明が提供する交差遮断抗体は、ヒトＯＸ４０に対して、５０ｐＭまたはそれより優れたアフィニティを有する。
【００８３】
１つの態様において、交差遮断抗体は、少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９．０の等電点を有する。
本発明の抗体分子は、適切には、高い結合アフィニティ、特にピコモル濃度のアフィニティを有する。天然または組換えＯＸ４０あるいは適切な融合タンパク質／ポリペプチドを用い、本明細書の実施例に記載するように、ＢＩＡｃｏｒｅを含む、当該技術分野に知られる任意の適切な方法を用いて、アフィニティを測定してもよい。１つの例において、本明細書の実施例に記載するような組換えヒトＯＸ４０細胞外ドメインを用いて、アフィニティを測定する。１つの例において、用いる組換えヒトＯＸ４０細胞外ドメインは、二量体、例えばＦｃ融合二量体である。適切には、本発明の抗体分子は、単離ヒトＯＸ４０に対して、約２００ｐＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。１つの態様において、本発明の抗体分子は、約１００ｐＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。１つの態様において、本発明の抗体分子は、約５０ｐＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。１つの態様において、本発明の抗体分子は、約４０ｐＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。１つの態様において、本発明の抗体分子は、約３０ｐＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。１つの態様において、本発明の抗体分子は、完全ヒトまたはヒト化抗体であり、そして約１００ｐＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。
【００８４】
本発明の抗体分子は、適切には、活性化されたＴ細胞表面上で発現されたヒトＯＸ４０に対して、高い結合アフィニティ、例えばナノモル濃度またはピコモル濃度アフィニティを有する。活性化されたＣＤ４＋  ＯＸ４０＋ヒトＴ細胞を用いて、本明細書の実施例に記載するような方法を含めて、当該技術分野に知られる任意の適切な方法を用いて、アフィニティを測定してもよい。特に、本発明の抗体分子は、細胞表面で発現されたヒトＯＸ４０に対して、約２ｎＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。１つの例において、本発明の抗体分子は、細胞表面で発現されたヒトＯＸ４０に対して、約１．５ｎＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。別の例において、本発明の抗体分子は、細胞表面で発現されたヒトＯＸ４０に対して、約１．２ｎＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する。１つの態様において、細胞表面で発現されたＯＸ４０に対して、約２ｎＭまたはそれより優れた結合アフィニティを有する、完全ヒトまたはヒト化抗体分子を提供する。
【００８５】
当該技術分野に知られる任意の適切な方法を用いて、本発明が提供する抗体のアフィニティを改変してもよいことが認識されるであろう。本発明はしたがってまた、ＯＸ４０に対して改善されたアフィニティを有する、本発明の抗体分子の変異体にも関する。こうした変異体は、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５４，  ３９２−４０３，  １９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０，  ７７９−７８３，  １９９２）、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のミューテーター株の使用（Ｌｏｗら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５０，  ３５９−３６８，  １９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ８，  ７２４−７３３，  １９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５６，  ７７−８８，  １９９６）および性別ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ２８８−２９１，  １９９８）を含むいくつかのアフィニティ成熟プロトコルによって、得られうる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記）は、アフィニティ成熟のこれらの方法を論じる。
【００８６】
１つの態様において、本発明の抗体分子は、ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌの間の相互作用を遮断する。抗体がこの相互作用を遮断する能力を決定するのに適した多くのアッセイを本明細書の実施例に記載する。１つの態様において、本発明は、活性化されたヒトＣＤ４＋ＯＸ４０＋  Ｔ細胞へのヒトＯＸ４０Ｌ（最終濃度２μｇ／ｍｌで試験）の結合を、５ｎＭ未満の濃度で５０％阻害可能なヒトＯＸ４０に対する特異性を有する中和抗体を提供する。１つの態様において、該アッセイで用いるヒトＯＸ４０Ｌは天然ヒトＯＸ４０である。１つの態様において、該アッセイで用いるヒトＯＸ４０は組換えヒトＯＸ４０である。１つの態様において、中和抗体はヒト化または完全ヒト抗体である。
【００８７】
望ましい場合、本発明で使用するための抗体を１以上のエフェクター分子にコンジュゲート化してもよい。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、または本発明の抗体に付着可能な単一部分を形成するように連結された２以上のこうした分子を含んでもよいことが認識されるであろう。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが望ましい場合、抗体断片が直接またはカップリング剤を介してのいずれかでエフェクター分子に連結される、標準的な化学的または組換えＤＮＡ法によって、これを調製してもよい。抗体にこうしたエフェクター分子をコンジュゲート化するための技術が当該技術分野に周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  第２版，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎら監修，  １９８７，  ｐｐ．  ６２３−５３；  Ｔｈｏｒｐｅら，  １９８２，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ６２：１１９−５８およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら，  １９９９，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８３，  ６７−１２３を参照されたい）。特定の化学的方法には、例えば、ＷＯ  ９３／０６２３１、ＷＯ  ９２／２２５８３、ＷＯ  ８９／００１９５、ＷＯ  ８９／０１４７６およびＷＯ０３０３１５８１に記載されるものが含まれる。あるいは、エフェクター分子がタンパク質またはポリペプチドである場合、例えばＷＯ  ８６／０１５３３およびＥＰ０３９２７４５に記載されるように、組換えＤＮＡ法を用いて、連結を達成してもよい。
【００８８】
用語、エフェクター分子は、本明細書で用いる場合、抗新生物剤、薬剤、毒素、生物学的活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体または抗体断片、合成または天然存在ポリマー、核酸およびその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子およびレポーター基、例えば蛍光化合物あるいはＮＭＲまたはＥＳＲ分光計によって検出可能な化合物が含まれる。
【００８９】
エフェクター分子の例には、細胞に有害である（例えば細胞を殺す）いなかる剤も含む細胞毒素または細胞傷害剤が含まれてもよい。例には、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が含まれる。
【００９０】
エフェクター分子にはまた、限定されるわけではないが、代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシンまたはデュオカルマイシン）、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含まれる。
【００９１】
他のエフェクター分子には、キレート放射性核種、例えば１１１Ｉｎおよび９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２およびタングステン１８８／レニウム１８８；または限定されるわけではないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイドおよびスラミンなどの薬剤が含まれてもよい。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチドおよび酵素が含まれる。関心対象の酵素には、限定されるわけではないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。関心対象のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドには、限定されるわけではないが、免疫グロブリン、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素、タンパク質、例えばインスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子または組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤または抗血管新生剤、例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチン、あるいは生物学的反応修飾剤、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）または他の増殖因子および免疫グロブリンが含まれる。
【００９２】
他のエフェクター分子には、例えば診断で有用な検出可能物質が含まれてもよい。検出可能物質の例には、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影に使用するためのもの）、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。一般的には、診断剤として使用するための、抗体にコンジュゲート化可能な金属イオンに関して、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジンおよびビオチンが含まれ；適切な蛍光物質には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルおよびフィコエリトリンが含まれ；適切な発光物質には、ルミノールが含まれ；適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ；そして適切な放射性核種には１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９Ｔｃが含まれる。
【００９３】
別の例において、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の半減期を増加させ、そして／または抗体の免疫原性を減少させ、そして／または上皮バリアを渡って免疫系に到達する抗体送達を増進することも可能である。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、またはＷＯ０５／１１７９８４に記載されるものなどのアルブミン結合化合物が含まれる。
【００９４】
エフェクター分子がポリマーである場合、該分子は、一般的に、合成または天然存在ポリマー、例えば場合によって置換された直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマーあるいは分枝または非分枝多糖、例えばホモまたはヘテロ多糖であってもよい。
【００９５】
上述の合成ポリマー上に存在してもよい特定の場合による（ｏｐｔｉｏｎａｌ）置換基には、１以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基が含まれる。
合成ポリマーの特定の例には、場合によって置換された直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）またはその誘導体、特に場合によって置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体が含まれる。
【００９６】
特定の天然存在ポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲンまたはその誘導体が含まれる。
「誘導体」は、本明細書において、反応性誘導体、例えばチオール選択性反応基、例えばマレイミド等を含むよう意図される。反応基は、直接またはリンカーセグメントを通じて、ポリマーに連結されてもよい。いくつかの場合、こうした基の残基が、抗体断片およびポリマー間の連結基として、産物の一部を形成することが認識されるであろう。
【００９７】
ポリマーサイズは、望ましいように多様であってもよいが、一般的に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲である。ポリマーサイズは、特に、製品の意図される使用、例えば腫瘍などの特定の組織を位置決定するか、または循環半減期を延長させる能力に基づいて選択されてもよい（概説には、Ｃｈａｐｍａｎ，  ２００２，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ５４，  ５３１−５４５を参照されたい）。したがって、例えば、産物が循環を離れ、そして例えば腫瘍治療で使用するため、組織に浸透することを意図される場合、小分子量ポリマー、例えば約５０００Ｄａの分子量を持つポリマーを使用することが好適でありうる。産物が循環中に留まる適用に関しては、より高分子量のポリマー、例えば、２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーが好適でありうる。
【００９８】
適切なポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）あるいは特にメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体であり、そして特に、約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を持つものが含まれる。
【００９９】
１つの例において、本発明で使用するための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着される。１つの特定の例において、抗体は抗体断片であり、そしてＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば任意の未結合（ｆｒｅｅ）アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を通じて付着してもよい。こうしたアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在してもよいし、または組換えＤＮＡ法を用いて断片内に操作されてもよい（例えばＵＳ  ５，２１９，９９６；  ＵＳ  ５，６６７，４２５；  ＷＯ９８／２５９７１を参照されたい）。１つの例において、本発明の抗体分子は、修飾Ｆａｂ断片であって、該修飾が、その重鎖Ｃ末端への１以上のアミノ酸の付加であり、これがエフェクター分子の付着を可能にする、前記修飾Ｆａｂ断片である。適切には、さらなるアミノ酸は、エフェクター分子が付着可能な１以上のシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する。多数の部位を用いて、２以上のＰＥＧ分子を付着させてもよい。
【０１００】
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通じて共有結合される。修飾抗体断片に付着した各ポリマー分子を、断片に位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合してもよい。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合、または特にイオウ−炭素結合であろう。チオール基を付着点として用いる場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばチオール選択的誘導体、例えばマレイミドおよびシステイン誘導体を用いてもよい。活性化されたポリマーを、上述のようにポリマー修飾抗体断片の調製において、出発材料として用いてもよい。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸またはエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホンまたはジスルフィドなどのチオール反応基を含有する任意のポリマーであってもよい。こうした出発材料を商業的に（例えばＮｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、米国アラバマ州ハンツビルより）得てもよいし、または慣用的な化学的方法を用いて、商業的に入手可能な出発材料から調製してもよい。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；  Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；およびＳｕｎＢｉｏより入手可能）およびＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒより入手可能）が含まれる。
【０１０１】
１つの態様において、抗体は、例えばＥＰ  ０９４８５４４またはＥＰ１０９００３７に開示する方法にしたがって、ＰＥＧ化された、すなわち共有結合されたＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する修飾Ｆａｂ断片またはｄｉＦａｂである［また、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  １９９２，  Ｊ．  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（監修），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  “Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  １９９７，  Ｊ．  Ｍｉｌｔｏｎ  ＨａｒｒｉｓおよびＳ．  Ｚａｌｉｐｓｋｙ（監修），  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、ならびに“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，  １９９８，  Ｍ．  ＡｓｌａｍおよびＡ．  Ｄｅｎｔ，  Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｃｈａｐｍａｎ，  Ａ．  ２００２，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２，  ５４：５３１−５４５を参照されたい］。１つの例において、ＰＥＧをヒンジ領域中のシステインに付着させる。１つの例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域中の単一チオール基に共有結合されたマレイミド基を有する。リジン残基をマレイミド基に共有結合してもよいし、そしてリジン残基上の各アミン基に、およそ２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを付着させてもよい。したがって、Ｆａｂ断片に付着したＰＥＧの総分子量は、およそ４０，０００Ｄａであってもよい。
【０１０２】
１つの態様において、本発明は、配列番号９に提供する配列を含む重鎖および配列番号７に提供する配列を含む軽鎖を有し、そしてその重鎖Ｃ末端に、エフェクター分子が付着する少なくとも１つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を有する、修飾Ｆａｂ断片である、ヒトＯＸ４０に特異性を有するアンタゴニスト性抗体分子を提供する。適切には、エフェクター分子はＰＥＧであり、そしてＷＯ９８／２５９７１およびＷＯ２００４０７２１１６に、またはＷＯ２００７／００３８９８に記載される方法を用いて付着する。適切には、リジルマレイミド基が重鎖Ｃ末端のシステイン残基に付着し、そしてリジル残基の各アミノ基が、共有結合した約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を有するような方式で、エフェクター分子が付着される。したがって、抗体に付着するＰＥＧの総分子量はおよそ４０，０００Ｄａである。特定のＰＥＧ分子には、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒより入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００）修飾リジンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれる。
【０１０３】
ＰＥＧリンカーの別の供給源には、ＮＯＦが含まれ、ＮＯＦはＧＬ２−４００ＭＡ２（以下の構造中のｍが５である）およびＧＬ２−４００ＭＡ（ｍが２である）を供給し、そしてｎはおよそ４５０である：
【０１０４】
【化１】
0005782385.tif 000002
【０１０５】
すなわち各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。以下のタイプのさらなる別のＰＥＧエフェクター分子：
【０１０６】
【化２】
0005782385.tif 000003
【０１０７】
が、Ｒｅｄｄｙ博士、ＮＯＦおよびＪｅｎｋｅｍより入手可能である。
１つの態様において、鎖中のアミノ酸２２６のまたはその近傍のシステインアミノ酸残基、例えば重鎖アミノ酸２２６（連続番号付けによる）を通じて付着される、ＰＥＧ化された（例えば本明細書記載のＰＥＧで）抗体を提供する。
【０１０８】
１つの態様において、本発明は、配列番号１５に提供する配列を含むかまたは該配列からなる重鎖、および配列番号１１に提供する配列を含むかまたは該配列からなる軽鎖を有し、そして重鎖の２２６位（配列番号１５由来の直鎖番号付け）のシステインに付着したエフェクター分子を有する修飾Ｆａｂ断片である、ヒトＯＸ４０に特異性を有するアンタゴニスト性抗体分子を提供する。適切には、エフェクター分子はＰＥＧであり、そしてＷＯ９８／２５９７１およびＷＯ２００４０７２１１６、またはＷＯ２００７／００３８９８に記載される方法を用いて付着され、そしてリジルマレイミド基が重鎖の２２６位のシステイン残基（配列番号１５）に付着し、そしてリジル残基の各アミノ基が、共有結合した約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を有する。したがって、抗体に付着したＰＥＧの総分子量はおよそ４０，０００Ｄａである。特定のＰＥＧ分子には、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒより入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００）修飾リジンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれる。適切には、本発明の抗体分子は、図２に示すようなＰＥＧ化修飾Ｆａｂ’断片である。このＰＥＧ化分子は、本明細書において、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧと称される。
【０１０９】
別の例において、出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０およびＷＯ２００５／００３１７１に記載される方法を用いて、エフェクター分子を抗体断片に付着させてもよい。
【０１１０】
本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖および／または軽鎖（単数または複数）をコードする単離ＤＮＡ配列も提供する。適切には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖または軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、合成ＤＮＡ、例えば化学的プロセシングによって産生されるもの、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはその任意の組み合わせを含んでもよい。当業者に周知の方法によって、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を得てもよい。例えば、抗体重鎖および軽鎖の一部またはすべてをコードするＤＮＡ配列を、望ましいように、決定したＤＮＡ配列から、または対応するアミノ酸配列に基づいて、合成してもよい。
【０１１１】
アクセプター・フレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者に広く入手可能であり、そして既知のアミノ酸配列に基づいて、容易に合成可能である。
分子生物学の標準的技術を用いて、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製してもよい。オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、望ましいＤＮＡ配列を完全にまたは部分的に合成してもよい。部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適切なように用いてもよい。
【０１１２】
適切な配列の例を、図１（ｈ）配列番号８；図１（ｉ）配列番号１０；図１（ｊ）配列番号１３；図１（ｋ）配列番号１４；図１（ｌ）配列番号１７および図１（ｍ）配列番号１８に提供する。配列番号１８のヌクレオチド１〜６３および配列番号１４の１〜６３は、シグナルペプチド配列ＯｍｐＡをコードし、該配列は切断されて、本発明のアンタゴニスト性抗体分子を生じる（シグナルペプチドは、それぞれ、図１（ｇ）配列番号１６のアミノ酸残基１〜２１および図１（ｅ）配列番号１２の１〜２１に対応する）。本発明はまた、配列番号１７または配列番号１８を含む、本発明の抗体の重鎖をコードする単離ＤＮＡ配列も提供する。本発明はまた、配列番号１３または配列番号１４を含む、本発明の抗体の軽鎖をコードする単離ＤＮＡ配列も提供する。
【０１１３】
本発明はまた、本発明の１以上のＤＮＡ配列を含むクローニングまたは発現ベクターにも関する。したがって、本発明の抗体をコードする１以上のＤＮＡ配列を含むクローニングまたは発現ベクターを提供する。適切には、クローニングまたは発現ベクターは、本発明の抗体分子の軽鎖および重鎖それぞれをコードする２つのＤＮＡ配列を含む。適切には、本発明記載のベクターは、配列番号１４および配列番号１８に提供する配列を含む。配列番号１８のヌクレオチド１〜６３および配列番号１４の１〜６３は、ＯｍｐＡ由来のシグナルペプチド配列をコードし（それぞれ、配列番号１６の残基１〜２１および配列番号１２の１〜２１）、これは、最も適切には、切断されて、本発明の中和抗体分子を生じる。１つの例において、ベクターは、重鎖および軽鎖間の遺伝子間配列、例えばＩＧＳ２を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照されたい）。したがって、１つの態様において、本発明のベクターは、図１（ｎ）に提供する配列（配列番号１９）を含む。
【０１１４】
ベクターを構築可能な一般的な方法、トランスフェクション法および培養法が当業者に周知である。これに関して、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  １９９９，  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ（監修），  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇによるＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【０１１５】
本発明の抗体をコードする１以上のＤＮＡ配列を含む１以上のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞もまた提供する。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために、任意の適切な宿主細胞／ベクター系を用いてもよい。細菌、例えば大腸菌、および他の微生物系を用いてもよいし、または真核、例えば哺乳動物宿主細胞発現系もまた用いてもよい。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０１１６】
本発明はまた、本発明記載の抗体分子を産生するためのプロセスであって、本発明のベクターを含有する宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質発現を導くのに適した条件下で培養し、そして抗体分子を単離する工程を含む、前記プロセスも提供する。
【０１１７】
抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含んでもよく、この場合、宿主細胞をトランスフェクションするのに重鎖または軽鎖ポリペプチドコード配列のみを用いればよい。重鎖および軽鎖両方を含む産物を産生するためには、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第一のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第二のベクターで細胞株をトランスフェクションしてもよい。あるいは、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む、単一のベクターを用いてもよい。
【０１１８】
本開示記載の抗体および断片は、宿主細胞から優れたレベルで発現される。したがって、抗体および／または断片の特性は最適化され、そして商業的プロセシングを助長する。
本発明の抗体は、病理学的状態の治療および／または予防に有用であるため、本発明はまた、１以上の薬学的に許容されうる賦形剤、希釈剤またはキャリアーと組み合わされた、本発明の抗体分子を含む薬学的組成物または診断組成物も提供する。したがって、薬剤製造のための本発明の抗体の使用を提供する。組成物は、通常、薬学的に許容されうるキャリアーを通常は含む、無菌薬学的組成物の一部として供給されるであろう。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容されうるアジュバントをさらに含んでもよい。
【０１１９】
本発明はまた、薬学的組成物または診断組成物を調製するためのプロセスであって、本発明の抗体分子と１以上の薬学的に許容されうる賦形剤、希釈剤またはキャリアーを一緒に添加しそして混合する工程を含む、前記プロセスを提供する。
【０１２０】
抗体分子は、薬学的組成物または診断組成物中の単独の活性成分であってもよいし、あるいは他の抗体成分、例えば抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγまたは抗ＬＰＳ抗体、またはキサンチンなどの非抗体成分を含む、他の活性成分を伴ってもよい。他の適切な活性成分には、寛容を誘導可能な抗体、例えば抗ＣＤ３または抗ＣＤ４抗体が含まれる。
【０１２１】
さらなる態様において、本開示記載の抗体、断片または組成物を、さらなる薬学的活性剤、例えばコルチコステロイド（プロピオン酸フルチカゾンなど）および／またはベータ−２アゴニスト（サルブタモール、サルメテロールまたはホルモテロール）または細胞成長および増殖の阻害剤（例えばラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキセート）または別のＣＤ２８および／またはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて使用する。１つの態様において、阻害剤は小分子である。別の態様において、阻害剤はターゲットに特異的な抗体である。
【０１２２】
薬学的組成物は、適切に、本発明の抗体の療法的有効量を含む。用語「療法的有効量」は、本明細書において、ターゲットとされる疾患または状態を治療するか、軽減するかまたは防止するか、あるいは検出可能な療法的または予防的効果を示すのに必要である療法剤の量を指す。任意の抗体に関して、療法的有効量は、最初に、細胞培養アッセイ中あるいは動物モデル中のいずれか、通常は、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類中で概算可能である。また、動物モデルを用いて、適切な濃度範囲および投与経路を決定してもよい。次いで、こうした情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定してもよい。
【０１２３】
ヒト被験体のための正確な療法的有効量は、疾患状態の重症度、被験体の全身健康状態、被験体の年齢、体重および性別、食餌、投与時間および頻度、併用薬剤（単数または複数）、反応感度および療法に対する耐性／反応に応じるであろう。この量は、ルーチンの実験によって決定可能であり、そして臨床医の判断能力内である。一般的に、療法的有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。薬学的組成物は、好適に、用量あたり、あらかじめ決定された量の本発明の活性剤を含有する単位用量型で提示可能である。
【０１２４】
組成物を個々に患者に投与してもよいし、あるいは他の剤、薬剤またはホルモンと組み合わせて（例えば同時に、連続してまたは別個に）投与してもよい。
本発明の抗体分子を投与する用量は、治療しようとする状態の性質、存在する炎症の度合い、および抗体分子が予防的に用いられるか、または現存する状態を治療しようとするかのいずれかであるかに応じる。
【０１２５】
用量頻度は、抗体分子の半減期およびその効果の期間に応じるであろう。抗体分子が短い半減期（例えば２〜１０時間）を有する場合、１日１用量以上を投与する必要がありうる。あるいは、抗体分子が長い半減期（例えば２〜１５日）を有する場合、１日１回、１週間に１回、またはさらに１または２ヶ月ごとに１回の投薬量を与えればよい可能性もある。
【０１２６】
薬学的に許容されうるキャリアーは、それ自体、組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導してはならないし、そして毒性であってはならない。適切なキャリアーは、巨大な緩慢に代謝される巨大分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子であってもよい。
【０１２７】
薬学的に許容されうる塩、例えば鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩、または有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩を用いてもよい。
【０１２８】
療法組成物中の薬学的に許容されうるキャリアーは、さらに、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含有してもよい。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝物質が、こうした組成物中に存在してもよい。こうしたキャリアーは、薬学的組成物が、患者による摂取のため、錠剤、丸剤、ドラジェ、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリーおよび懸濁物として配合されることを可能にする。
【０１２９】
投与に適した型には、例えば注射または注入による、例えばボーラス注射または連続注入による、非経口投与に適した型が含まれる。産物が注射または注入用のものである場合、産物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンの型であってもよいし、そして配合剤、例えば懸濁剤、保存剤、安定化剤および／または分散剤を含有してもよい。あるいは、抗体分子は、使用前に、適切な無菌液で再構成するため、乾燥型であってもよい。
【０１３０】
ひとたび配合したら、本発明の組成物を被験体に直接投与してもよい。治療される被験体は動物であってもよい。しかし、１以上の態様において、組成物は、ヒト被験体への投与のために適応している。
【０１３１】
適切には、本開示記載の配合物において、最終配合物のｐＨは、抗体または断片の等電点の値と類似ではなく、例えば、配合物のｐＨが７である場合、８〜９またはそれより高いｐＩが適切でありうる。理論によって束縛されることは望ましくないが、これは、最終的に、改善された安定性の最終配合物を提供し、例えば抗体または断片は、溶液中に留まる。
【０１３２】
１つの態様において、４．０〜７．０の範囲のｐＨの薬学的配合物は：１〜２００ｍｇ／ｍＬの本開示にしたがった抗体、１〜１００ｍＭの緩衝剤、０．００１〜１％の界面活性剤、ａ）１０〜５００ｍＭの安定化剤、ｂ）１０〜５００ｍＭの安定化剤および５〜５００ｍＭの等張剤、またはｃ）５〜５００ｍＭの等張剤を含む。
【０１３３】
例えば、およそｐＨ６の配合物は、１〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスタジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）ＨＣｌ、２４０ｍＭトレハロースおよび０．０２％ポリソルベート２０を含んでもよい。あるいは、およそｐＨ５．５の配合物は、１〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体、２０ｍＭクエン酸緩衝剤、２４０ｍＭスクロース、２０ｍＭアルギニン、および０．０２％ポリソルベート２０を含んでもよい。
【０１３４】
本発明の薬学的組成物を、限定されるわけではないが、経口、静脈内、筋内、動脈内、髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えばＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む、多くの経路のいずれによって投与してもよい。また、皮下噴射器を用いて、本発明の薬学的組成物を投与してもよい。典型的には、療法組成物を、溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製してもよい。注射前に、液体ビヒクル中で溶液にまたは懸濁物にするのに適した固体型もまた調製してもよい。
【０１３５】
組成物の直接送達は、一般的に、注射によって、皮下、腹腔内、静脈内または筋内で達成されるか、あるいは組織の間質内空間に送達されるであろう。また、組成物を病変中に投与してもよい。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであってもよい。
【０１３６】
組成物中の活性成分が抗体分子であることが認識されるであろう。こうしたものとして、組成物は、胃腸管における分解に感受性であろう。したがって、胃腸管を用いた経路によって組成物を投与しようとする場合、組成物は、抗体が分解しないように保護するが、ひとたび胃腸管から吸収されたならば、抗体を放出する剤を含有する必要があるであろう。
【０１３７】
薬学的に許容されうるキャリアーの完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎ．Ｊ．  １９９１）で入手可能である。
【０１３８】
１つの態様において、配合物を、吸入を含む局所投与のための配合物として提供する。
適切な吸入調製物には、吸入可能粉末、噴霧ガスを含有する計量エアロゾル、または噴霧ガスを含まない吸入可能溶液が含まれる。活性物質を含有する開示にしたがった吸入可能粉末は、単に、上記活性物質、または上記活性物質と生理学的に許容されうる賦形剤の混合物からなってもよい。
【０１３９】
これらの吸入可能粉末には、単糖（例えばグルコースまたはアラビノース）、二糖（例えばラクトース、スクロース、マルトース）、オリゴ糖および多糖（例えばデキストラン）、多価アルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）またはこれらと互いとの混合物が含まれてもよい。単糖または二糖を適切に用い、ラクトースまたはグルコースは、特に、排他的にではないが、その水和物の形で用いる。
【０１４０】
肺中に沈着させるための粒子は、１０ミクロン未満、例えば１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍの粒子サイズを必要とする。活性成分（例えば抗体または断片）の粒子サイズが主に重要である。
【０１４１】
吸入可能エアロゾルを調製するのに使用可能な噴霧ガスが当該技術分野に知られる。適切な噴霧ガスは、炭化水素、例えばｎ−プロパン、ｎ−ブタンまたはイソブタンおよびハロ炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンまたはシクロブタンの塩素化および／またはフッ素化誘導体の中から選択される。上述の噴霧ガスをそれ自体で、またはその混合物中で用いてもよい。
【０１４２】
特に適切な噴霧ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａおよびＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）およびその混合物が特に適切である。
【０１４３】
噴霧ガス含有吸入可能エアロゾルはまた、他の成分、例えば共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、酸化防止剤、潤滑剤およびｐＨを調節するための手段も含有してもよい。すべてのこれらの成分が当該技術分野に知られる。
【０１４４】
本発明記載の噴霧ガス含有吸入可能エアロゾルは、活性成分重量を５％まで含有してもよい。本発明記載のエアロゾルは、例えば重量０．００２〜５％、重量０．０１〜３％、重量０．０１５〜２％、重量０．１〜２％、重量０．５〜２％または重量０．５〜１％の活性成分を含有する。
【０１４５】
あるいは、肺への局所投与はまた、ネブライザー、例えばコンプレッサーに連結されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，  Ｉｎｃ．、バージニア州リッチモンドによって製造された、Ｐａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）コンプレッサーに連結されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）などのデバイスを使用した、溶液または懸濁物配合物の投与によってもよい。
【０１４６】
本発明の抗体を溶媒中に分散させて、例えば溶液または懸濁物の形で送達してもよい。該抗体を適切な生理学的溶液、例えば生理食塩水または他の薬理学的に許容されうる溶媒または緩衝溶液中で懸濁してもよい。当該技術分野に知られる緩衝溶液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、１ｍｌの水あたり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇ  ＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇ無水クエン酸、および０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇクエン酸ナトリウムを含有してもよい。懸濁物は、例えば凍結乾燥抗体を使用してもよい。
【０１４７】
療法懸濁物または溶液配合物はまた、１以上の賦形剤も含有してもよい。賦形剤は当該技術分野に周知であり、そして緩衝剤（例えばクエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤および重炭酸緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含む。溶液または懸濁物をリポソームまたは生体分解可能微小球体中に被包してもよい。配合物は、一般的に、無菌製造プロセスを使用して、実質的に無菌である型で提供されるであろう。
【０１４８】
これには、一般の当業者によく知られる方法による、産生、および配合に使用した緩衝溶媒／溶液のろ過による滅菌、無菌緩衝溶媒溶液中での抗体の無菌懸濁、および無菌容器内への配合物の分配が含まれてもよい。
【０１４９】
本開示記載の噴霧可能な配合物を、例えば、ホイルエンベロープにパッキングされた、単回用量単位（例えば密封プラスチック容器またはバイアル）として提供してもよい。各バイアルは、溶媒／溶液緩衝液の体積、例えば２ｍＬ中、単位用量を含有する。
【０１５０】
本明細書に開示する抗体は、噴霧を介した送達に適切でありうる。
本発明の抗体が遺伝子治療を使用することによって投与されうることもまた予想される。これを達成するため、適切なＤＮＡ構成要素の制御下で抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を患者に導入し、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、そしてｉｎ  ｓｉｔｕで組み立てられるようにする。
【０１５１】
本発明はまた、炎症性疾患、例えば急性または慢性炎症性疾患を制御する際に使用するための、抗体分子（または該分子を含む組成物）も提供する。適切には、抗体分子（または該分子を含む組成物）を用いて、炎症プロセスを減少させるかまたは炎症プロセスを防止してもよい。１つの態様において、活性化Ｔ細胞、特に不適切な炎症免疫反応に関与するもの、例えばこうした反応の近傍／位置に補充されるもののｉｎ  ｖｉｖｏ減少を提供する。
【０１５２】
活性化Ｔ細胞の減少は、本明細書で使用した際、治療前または治療なしと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセントまたはそれを超える減少であってもよい。好適には、本発明記載の抗体、断片または組成物での治療は、患者Ｔ細胞の全身レベル（不活性化Ｔ細胞）を減少させることなく、活性化Ｔ細胞レベルの減少を可能にしうる。これは、より少ない副作用を生じる可能性もあり、そしておそらく、患者におけるＴ細胞枯渇を防止する可能性もある。
【０１５３】
本発明はまた、ＯＸ４０によって仲介されるか、またはＯＸ４０レベルの増加と関連する病理学的障害の治療または予防において使用するための本発明の抗体分子も提供する。病理学的状態は、例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌および寄生虫）、感染に関連する内毒素ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫ブドウ膜炎、中枢神経系および末梢神経系の免疫仲介炎症性障害、例えば多発性硬化症、ループス（例えば全身性エリテマトーデス）およびギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫肝炎、線維性肺胞炎、グレーブズ病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植拒絶、虚血性疾患を含む心臓病、例えば心筋梗塞、ならびにアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周病および低酸症からなる群より選択されることも可能である。
【０１５４】
１つの態様において、本発明記載の抗体は、アレルギー（ａｌｌｅｒｙ）、ＣＯＰＤ、自己免疫疾患または関節リウマチの治療に使用される。
本発明はまた、疼痛、特に炎症と関連する疼痛の治療または予防において使用するための、本発明記載の抗体分子も提供する。
【０１５５】
本発明はさらに、ＯＸ４０によって仲介されるか、またはＯＸ４０レベルの増加と関連する病理学的障害の治療または予防のための薬剤製造における、本発明記載の抗体分子、断片または組成物の使用を提供し、特に、病理学的障害は、関節リウマチ、喘息またはＣＯＰＤである。
【０１５６】
本発明はさらに、本明細書に記載する１以上の医学的徴候の治療または予防のための薬剤製造における、本発明記載の抗体分子、断片または組成物の使用を提供する。
本発明の抗体分子、断片または組成物を、ヒトまたは動物体内でＯＸ４０の影響を減少させるのが望ましい、任意の療法に利用してもよい。ＯＸ４０は体内で循環していてもよいし、または体の特定の部位、例えば炎症部位に、望ましくなく高レベルで局在して存在していてもよい。
【０１５７】
１つの態様において、本発明の抗体分子または該抗体分子を含む組成物を、例えば本明細書に記載するような炎症性疾患の制御のために用いる。
本発明はまた、ＯＸ４０によって仲介される障害に罹患しているかまたはそのリスクがあるヒトまたは動物被験体を治療する方法であって、該被験体に、本発明の抗体分子、または該抗体分子を含む組成物の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１５８】
１つの態様において、抗体（特に本発明記載の抗体または断片）を精製するためのプロセスであって：
不純物がカラムに保持され、そして抗体が溶出されるような非結合様式の陰イオン交換クロマトグラフィーを行う
工程を含む、前記プロセスを提供する。
【０１５９】
該プロセスで用いるのに適したイオン交換樹脂には、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給される）が含まれる。該工程を、例えば約８のｐＨで行ってもよい。
【０１６０】
該プロセスは、さらに、例えば約４〜５、例えば４．５のｐＨで行う陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する最初の捕捉工程を含んでもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂またはＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給される）などの樹脂を使用してもよい。次いで、イオン性塩溶液、例えば塩化ナトリウムの、例えば２００ｍＭ濃度のものを使用して、抗体または断片を樹脂から溶出してもよい。
【０１６１】
したがって、単数または複数のクロマトグラフ工程には、適切なように、１以上の洗浄工程が含まれてもよい。
精製プロセスはまた、１以上のろ過工程、例えばダイアフィルトレーション工程も含まれてもよい。
【０１６２】
抗体または断片の、約８より高い、例えば８．５、８．６、８．７、８．８または９．０のｐＩは、精製を補助して、不純物、例えば内毒素、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質を「含まない」かまたは「実質的に含まない」抗体または断片を提供すると考えられる。
【０１６３】
したがって、１つの態様において、精製ＯＸ４０抗体または断片、例えばヒト化抗体または断片、特に実質的に精製された、特に内毒素および／または宿主細胞タンパク質またはＤＮＡを含まないかまたは実質的に含まない本発明記載の抗体または断片を提供する。
【０１６４】
上記のような精製型は、少なくとも９０％純度、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗまたはそれより純粋であることを指すよう意図される。
【０１６５】
実質的に内毒素を含まない、は、一般的に、抗体産物ｍｇあたり１ＥＵの内毒素含量以下、例えば産物ｍｇあたり０．５または０．１ＥＵを指すよう意図される。
実質的に宿主細胞タンパク質またはＤＮＡを含まない、は、一般的に、抗体産物ｍｇあたり４００μｇのタンパク質および／またはＤＮＡ含量以下、例えばｍｇあたり１００μｇ以下、特に適切なように、ｍｇあたり２０μｇを指すよう意図される。
【０１６６】
また、本発明の抗体分子を、診断、例えば、ＯＸ４０に関与する疾患状態のｉｎ  ｖｉｖｏ診断および画像化にも用いてもよい。
本明細書の背景において、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するよう意図される。
【０１６７】
技術的に適切である場合、本発明の態様を組み合わせてもよい。
態様は、本明細書において、特定の特徴／要素を含むように記載される。本開示はまた、前記特徴／要素からなるまたは本質的にこれらからなる別個の態様に広がる。
【０１６８】
本発明は、以下の実施例において、例示のためのみにさらに記載され、これらは付随する図に言及する。
【実施例】
【０１６９】
図１詳細：
ａ）抗体Ａ２６の軽鎖Ｖ領域（配列番号７）
ｂ）抗体Ａ２６の重鎖Ｖ領域（配列番号９）
ｃ）抗体Ａ２６のＣＤＲＨ１（配列番号１）、ＣＤＲＨ２（配列番号２）、ＣＤＲＨ３（配列番号３）、ＣＤＲＬ１（配列番号４）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）、ＣＤＲＬ３（配列番号６）、ならびに抗体ＣＡ０４４＿０００２６のＣＤＲＨ２（配列番号２０）およびＣＤＲＬ１（配列番号２１）
ｄ）抗体Ａ２６の軽鎖（配列番号１１）
ｅ）シグナル配列（下線）を含む抗体Ａ２６の軽鎖（配列番号１２）
ｆ）抗体Ａ２６の重鎖（配列番号１５）
ｇ）シグナル配列（下線）を含む抗体Ａ２６の重鎖（配列番号１６）
ｈ）抗体Ａ２６の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ（配列番号８）
ｉ）抗体Ａ２６の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ（配列番号１０）
ｊ）抗体Ａ２６の軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１３）
ｋ）シグナル配列を含む抗体Ａ２６の軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１４）
ｌ）抗体Ａ２６の重鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１７）
ｍ）シグナル配列を含む抗体Ａ２６の重鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１８）
ｎ）シグナル配列および遺伝子間配列ＩＧＳ２を含む抗体Ａ２６の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１９）
ＤＮＡ操作および一般的な方法
大腸菌株ＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換およびルーチンの培養増殖に用いた。ＤＮＡ制限酵素および修飾酵素をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから得た。Ｍａｘｉプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２１６５）を用いて、プラスミド調製を行った。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーター配列決定キット（カタログ番号４３０４１４９）を用いて、ＤＮＡ配列決定反応を行い、そしてＡＢＩ  ３１００自動化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で泳動した。プログラムＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデータを分析した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからオリゴヌクレオチドを得た。最初のＶ領域配列をコードする遺伝子を設計し、そしてＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨによる自動化合成アプローチによって構築し、そして修飾して、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発によって移植型を生成した。Ｆａｂ’アセンブリーＥＬＩＳＡを用いて、Ｆａｂ’濃度を決定した。
【０１７０】
実施例１：中和抗ＯＸ４０抗体Ａ２６の産生およびヒト化
ヒトＯＸ４０およびｍＦＣの組換え融合タンパク質で、雌スプレーグ・ドーリー・ラットを免疫した。ＷＯ９２／０２５５１に記載する方法を用いて、ヒトＯＸ−４０に結合する抗体ＣＡ０４４＿０００２６を単離した。抗体ＣＡ０４４＿０００２６の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の遺伝子を単離し、そして逆転写ＰＣＲを通じたクローニングにしたがって配列決定した。
【０１７１】
ヒトＶ領域アクセプターフレームワークを用いて、そしてフレームワーク領域中のドナー残基の数を変化させることによって、一連のヒト化ＶＬおよびＶＨ領域を設計した。２つの移植ＶＨ領域（ｇＨ１および２）および８つの移植ＶＬ領域（ｇＬ１〜８）を設計し、そしてオリゴヌクレオチドアセンブリーおよびＰＣＲ突然変異誘発によって、遺伝子を構築した。
【０１７２】
ヒト化可変ドメインをコードする遺伝子を用いて、抗体Ｆａｂ’断片を各移植に関して構築して、ヒトＣγ１重鎖ＣＨ１ドメイン（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）およびヒトＣカッパ軽鎖定常ドメイン（Ｋ１ｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有する大腸菌発現ベクターｐＴＴＯＤ（ＷＯ０３／０４８２０８に以前記載される通り）内にサブクローニングした。ヒンジ領域を一部切除し（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、そしてＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＣｙｓからＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａへの配列変化からなる修飾を行って、ＰＥＧ部分の部位特異的付着に利用可能な単一のシステイン残基を持つヒンジ領域を生成した（実施例２を参照されたい）。
【０１７３】
ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードする配列を、重鎖および軽鎖両方をコードする遺伝子の５’端に付着させた。発現に際して、シグナル配列は、各ポリペプチドの細菌周辺質への輸送をターゲットとする。細胞膜を通じた転位置後、シグナル配列は切り落とされ、成熟Ｆａｂ’重鎖および軽鎖が残る。
【０１７４】
各移植を含有するｐＴＴＯＤベクターを宿主株大腸菌Ｋ１２  Ｗ３．１１０に形質転換し、そして標準法を用いた細胞高密度培養によって、大腸菌において、抗体Ｆａｂ’断片が産生された。標準法を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー後に陰イオン交換クロマトグラフィーを用い、抗体を精製した（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら，  ２００２，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２６，  ３０９−３２０）。
【０１７５】
産生した多様なＦａｂ’断片を以下に記載する結合および遮断で試験し、そして大腸菌における発現、親抗体と比較した強度、ならびに精製および下流プロセシングに関する適切性に関して、各々を評価した。これによって、移植ｇＬ８ｇＨ２が選択され、これをＡ２６と名付けた。この移植片のＶ領域配列を、軽鎖（ｇＬ２）および重鎖（ｇＨ２）に関して、それぞれ、図１（ａ）および（ｂ）、ならびに配列番号７および９に示す。
【０１７６】
重鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖系列配列ＶＨ３  １−３  ３−０７とヒトＪＨ領域生殖系列ＪＨ４のこの部分に由来するフレームワーク４である。軽鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖系列ＶＫ１  ２−１  １−０２とヒトＪＫ領域生殖系列ＪＫ４のこの部分に由来するフレームワーク４である。配列番号９の重鎖中、３７位、７３位、７８位および９４位（Ｋａｂａｔ番号付け）のアミノ酸はドナー残基（親抗体由来）であり、これらは完全強度を保持するために必須であることが見出された。ＣＤＲＨ２内の残基６４をドナーのグルタミン酸からアクセプターのリジン（Ｅ６４Ｋ）に変換して、イオン交換精製により好ましい、より高いｐＩを持つ分子を生成した。配列番号７の軽鎖中、６４位および７１位（Ｋａｂａｔ番号付け）のアミノ酸は、完全強度を保持するために必須であることが見出されたドナー残基である。ＣＤＲ−Ｌ１内の残基２７および２８をドナーのグルタミン酸およびアスパラギン酸からアクセプターのグルタミン（Ｅ２７Ｑ）およびセリン（Ｄ２８Ｓ）に変換して、イオン交換精製により好ましい、より高いｐＩを持つ分子を生成した。
【０１７７】
この抗体のＣＤＲを図１（ｃ）に示し、修飾されていない元来のＣＤＲＨ２（配列番号２０）およびＣＤＲＬ１（配列番号２１）も示す。全長軽鎖および重鎖を、それぞれ、図１（ｄ）および（ｆ）に示す。
【０１７８】
ｇＬ８およびｇＨ２遺伝子は、ＤＮＡレベルで再設計されて、大腸菌における発現のために最適化された可変および定常領域両方に関するコドンを含有する。軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、図１（ｋ）、配列番号１４および（ｍ）配列番号１８に示す。
【０１７９】
このＦａｂ’（定常領域を含む）のタンパク質配列を、配列番号１１および１２（ＯｍｐＡシグナルペプチドを含まないおよび含む軽鎖）、ならびに配列番号１５および１６（ＯｍｐＡシグナルペプチドを含まないおよび含む重鎖）に提供する。ｐＴＴＯＤ（Ａ２６  ＩＧＳ２）二シストロン発現ベクターには、図１（ｎ）および配列番号１９に提供する配列が含まれる。配列は、軽鎖および重鎖遺伝子間に、遺伝子間配列ＩＧＳ２（ＷＯ０３／０４８２０８を参照されたい）を、そして軽鎖および重鎖遺伝子両方の開始部分にＯｍｐＡリーダー配列を含有する。
【０１８０】
実施例２：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの産生
実施例１に記載するように大腸菌で産生し、そして精製したＦａｂ’断片Ａ２６を、ＷＯ２００７／００３８９８に記載される方法にしたがってＰＥＧ化した。リジルマレイミド基が重鎖（配列番号１５）の２２６位のシステイン残基に付着し、そしてリジル残基の各アミノ基が、共有結合した分子量約２０，０００Ｄａを有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を有するように、ＰＥＧを重鎖（配列番号１５）の２２６位（直鎖番号付け）のヒンジ・システインに付着させた。抗体に付着したＰＥＧの総分子量はしたがって、図２に示すようにおよそ４０，０００Ｄａであった。
【０１８１】
実施例３：ＯＸ４０に対するＡ２６およびＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧのアフィニティの評価
ＢＩＡｃｏｒｅ技術は、リアルタイムで、そして標識する必要性を伴わず、生体分子間の結合を監視する。リガンドと称される相互作用物質の一方を直接固定するか、または固定化表面上に捕捉するかいずれかを行い、一方、分析物と称されるもう一方を、溶液中で捕捉表面上に流動させる。分析物がリガンドに結合して、表面上で複合体を形成するにつれて、センサーが、センサー表面上の質量変化を検出する。これが会合プロセスに対応する。分析物が緩衝剤によって置換された際、リガンドからの分析物の解離が監視される。アフィニティＢＩＡｃｏｒｅアッセイでは、リガンドは試験される抗体であり、そして分析物はヒトＯＸ４０である。
【０１８２】
装置：Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ。
センサーチップ：ＣＭ５（研究等級）カタログ番号：ＢＲ−１００１−１４、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ。チップを４℃で保存した。
【０１８３】
アミンカップリングキット：カタログ番号：ＢＲ−１０００−５０、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ。
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）。蒸留水中で７５ｍｇ／ｍＬにして、そして２００μＬアリコット中、−７０℃で保存した。
【０１８４】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）。蒸留水中で１１．５ｍｇ／ｍＬにして、そして２００μＬアリコット中、−７０℃で保存した。
１Ｍエタノールアミン塩酸−ＮａＯＨ  ｐＨ８．５。２００μＬアリコット中、−７０℃で保存。
【０１８５】
緩衝剤：泳動緩衝剤：ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）。カタログ番号：ＢＲ−１００１−８８、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ。緩衝剤を４℃で保存。
【０１８６】
固定化緩衝剤：アセテート５．０（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０）。カタログ番号：ＢＲ−１００３−５１、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ。緩衝剤を４℃で保存。
【０１８７】
リガンド捕捉：Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的。Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ（米国ペンシルバニア州）カタログ番号：１０９−００６−０９７。試薬を４℃で保存。
【０１８８】
リガンド：抗体Ａ２６およびＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ、４℃で保存。
分析物：ネズミＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（２３２ａａ）に融合させたヒトＯＸ４０細胞外（１８５ａａ）ドメイン（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ａｎｃｅｌｌ番号５１３−０２０、ロット１４２８０５）、４℃で保存。
【０１８９】
再生溶液：１１．６Ｍストック溶液（ＢＤＨ、英国プール。カタログ番号：１０１２５４Ｈ）から、蒸留水での希釈によって調製した４０ｍＭ  ＨＣｌ。
５０ｍＭストック溶液から、蒸留水での希釈によって調製した５ｍＭ  ＮａＯＨ。カタログ番号：ＢＲ−１００３−５８。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ。
【０１９０】
アッセイ法：アッセイ形式は、固定された抗ヒトＦ（ａｂ’）２による抗体の捕捉後、捕捉表面上でのヒト細胞外ドメインＯＸ４０の滴定であった。方法の例を以下に提供する：
ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いて、ＢＩＡ（生体分子相互作用分析）を行った。アミンカップリング化学反応を介して、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、ＣＭ５センサーチップ上に、〜４０００反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルまで固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝剤（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）を泳動緩衝剤として、１０μｌ／分の流速で用いた。０．５μｇ／ｍＬのＦａｂ’または５０μｇ／ｍＬのＦａｂ’−ＰＥＧの１０μｌ注入を、固定化抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために用いた。ヒトＯＸ４０を、３０μＬ／分の流速、多様な濃度（２５ｎＭ〜０．７８ｎＭ）で、捕捉抗体上で滴定した。１０μＬ／分の流速での１０μＬの４０ｍＭ  ＨＣｌ注入後、５μＬの５ｍＭ  ＮａＯＨ注入によって、表面を再生した。
【０１９１】
標準法にしたがって、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．２）を用いて、バックグラウンドを減じた結合曲線を分析した。適合アルゴリズムから、動力学パラメーターを決定した。
【０１９２】
Ａ２６に関して決定したアフィニティ値は、１９〜４５．４ｐＭの範囲であり、そしてＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは１３．７〜５０．３ｐＭの範囲であった。
以下の表は、ヒトＯＸ４０に結合する非ＰＥＧ化ヒト化Ｆａｂ断片Ａ２６（ｆａｂ＊）およびＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ  Ｆａｂ断片（Ｆａｂ−ＰＥＧ＊＊）に関する反復データを示す：
表１
【０１９３】
【表１】
0005782385.tif 000004
【０１９４】
＊５回の測定の平均、＊＊４回の測定の平均
実施例３ａ：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの細胞に基づくアフィニティおよびリガンド遮断能
細胞に基づくアフィニティ
細胞表面で発現された抗原に対するＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧのアフィニティを決定するため、活性化されたＣＤ４＋ＯＸ４０＋  Ｔ細胞、およびＦＩＴＣ標識抗体を用いて、飽和結合実験を行った。リガンド濃度範囲に渡る平衡時の受容体への抗体の特異的結合を用いて、結合曲線のどの地点でも非常に少量の抗体のみが受容体に結合すると仮定して、ＫＤを決定した。
【０１９５】
以下の等式を用いて、平衡結合を記載する：
【０１９６】
【化３】
0005782385.tif 000005
【０１９７】
受容体と抗体の会合率＝ｋｏｎｘ［受容体未結合］ｘ［抗体未結合］
受容体−抗体複合体の解離率＝ｋｏｆｆｘ［受容体−抗体］
平衡時、会合率および解離率は等しく、そして結合等温線を記載する等式が得られうる；片対数プロット上、結合はシグモイド状である。ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎによって定義され、そして最大の半分の結合が生じる濃度として結合曲線から計算可能である。
【０１９８】
４対数濃度範囲に渡るフローサイトメトリーによって、ＦＩＴＣ標識Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの活性化されたヒトＣＤ４＋ＯＸ４０＋  Ｔ細胞への結合を測定した。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧに関する代表的な結合曲線を図３に示す。３人の異なるドナー由来の活性化された細胞に関して得られたＫＤ値は、１．１９３ｎＭ、１．０７１ｎＭおよび１．０５５ｎＭであった。
【０１９９】
Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの細胞に基づくＫＤ（平均１．１０６ｎＭ）は、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定された組換えＯＸ４０に対する結合（３１．３ｐＭ）より有意に弱い。これは、いくつかの要因のためである可能性があった。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、二量体Ｆｃ融合タンパク質として発現された組換えＯＸ４０に対してより高いアフィニティを有する可能性があり、該組換えＯＸ４０は、細胞膜中で非共有結合三量体として会合していると予測される、天然細胞表面で発現されるＯＸ４０とは異なる三次構造および四次構造を有する（Ｃｈａｎら、２０００）。さらに、天然ＯＸ４０に対する組換えＯＸ４０の示差グリコシル化によって、アフィニティが改変されうる。膜旋回（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）および同時局在タンパク質などの細胞膜の三次元環境もまた、立体障害を提供して、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧへのＯＸ４０のアクセス可能性を限定しうる。その結果、細胞に基づくアフィニティは、おそらく、ｉｎ  ｖｉｖｏでの真の薬剤アフィニティにより近い測定値に相当する。
【０２００】
方法：ヒト活性化ＣＤ４＋ＯＸ４０＋  Ｔ細胞へのＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ結合
Ｆｉｃｏｌｌ勾配上での分離によってＰＢＭＣを単離し、そして１μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ−Ｌを３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で３日間活性化した。磁気ビーズを用いた陰性選択によって、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を単離した（ヒト用ＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キットＩＩ）。およそ１．２ｘ１０５細胞を抗体の存在下（最終濃度範囲１０μｇ／ｍＬ〜０．０００６μｇ／ｍＬ（１１１ｎＭ〜０．００６８ｎＭ））、氷上で２時間インキュベーションした。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーによって、分析前に細胞を洗浄した。１つはＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを用いて、そして二番目は非特異的結合対照としてｇＡ３３Ｆａｂ’−ＰＥＧを用いて、２つの滴定曲線を産生した。線形回帰分析を用いて、非特異的結合を減じ、そしてこうして生成した特異的結合曲線を非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標））によって分析して、ＫＤを決定した。
【０２０１】
実施例３ｂ：リガンド遮断能
フローサイトメトリーに基づくリガンド遮断アッセイを用いて、細胞表面で発現されたＯＸ４０および組換えＯＸ４０Ｌ間の相互作用をＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧが遮断する能力を測定した。簡潔には、活性化されたヒトＣＤ４＋ＯＸ４０＋  Ｔ細胞を、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの滴定とプレインキュベーションした。続いて組換えＯＸ４０Ｌを細胞に添加し、そしてＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの存在下で結合を可能にした。次いで、標識二次試薬を用いたフローサイトメトリーによって、結合したＯＸ４０Ｌの比率を検出した。図４は、代表的な阻害曲線を示し、そしてＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧが、ＯＸ４０Ｌ結合を完全に遮断可能であることを立証する。組換えＯＸ４０Ｌ結合阻害の平均ＩＣ５０は４．１ｎＭであった（ｎ＝２ドナー）。
【０２０２】
方法：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧによる、ヒト活性化ＣＤ４＋ＯＸ４０＋  Ｔ細胞へのＯＸ４０Ｌ結合の阻害。Ｆｉｃｏｌｌ勾配上の分離によってＰＢＭＣを単離し、そして１μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ−Ｌで、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で３日間活性化した。２．５ｘ１０５細胞を抗体の存在下（最終濃度範囲２０μｇ／ｍＬ〜０．０００３μｇ／ｍＬ（２２９ｎＭ〜０．００３５ｎＭ））、氷上で１０分間インキュベーションした。ＯＸ４０Ｌ（ビオチン化ＣＤ２５２  ｍｕＣＤ８、Ａｎｃｅｌｌ）を最終濃度２μｇ／ｍＬで添加し、そして氷上でさらに３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーによる分析の前に、ＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とのインキュベーションによって、ＯＸ４０Ｌ結合を検出した。ｇＡ３３  Ｆａｂ’−ＰＥＧを非特異的対照として用いた。非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標））によって阻害曲線を分析して、ＩＣ５０を決定した。示すデータは、２人のうち、１人の代表的なドナー由来である。
【０２０３】
実施例４：ヒト機能アッセイにおけるＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの強度
細胞相互作用中の内因性ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ結合を遮断する際の強度を評価するため、抗原が駆動するヒトＴ細胞反応の範囲内で、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを試験した。
【０２０４】
実施例４ａ：混合リンパ球反応
１９６４年に最初に開発された（Ｂａｃｈら，  １９６４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４３，  ８１３−８１４）同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、２人の関連しないドナー由来の全末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いた、同種反応性Ｔ細胞活性化および増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルである（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙら，  ２０００，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １００，  ２８９−２９９）。関連しないドナーの刺激因子ＰＢＭＣ上の同種主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原の認識を通じて、ドナーＴ細胞を活性化して、細胞増殖およびサイトカイン産生を生じる（Ｌｕｋａｃｓら，  １９９３，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １４３，  １１７９−１１８８）。Ｔリンパ球同種反応は、同種ＭＨＣ抗原および結合したペプチドの両方によって駆動されることが示されてきており（Ｓｈｅｒｍａｎら，  １９９３，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １１，  ３８５−４０２）、ＭＬＲ反応が刺激因子である同種ＭＨＣ抗原および結合したペプチドの両方に対するものでありうることが示唆されてきている。ＭＬＲ反応の度合いは、反応因子−刺激因子対間のＭＨＣミスマッチの度合いと相関する（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら，  ２００４，  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  Ａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍ，  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｒｅｓｓ，  ６６−６７）。ＭＬＲ反応は、反応中のドナーからの細胞の増殖、ならびにＴＨ１（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）およびＴＨ２（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）両方のＴ細胞由来サイトカインの産生を生じる。ＭＬＲにおける正確なサイトカインプロフィールは、反応因子−刺激因子対に特異的であると考えられる（Ｊｏｒｄａｎら，  ２００２，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２６０，  １−１４）。ＭＬＲアッセイは、Ｔ細胞活性化経路を研究し、そして免疫抑制薬剤をスクリーニングする研究において、そして後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者における免疫機能を評価し、そして移植レシピエントにおいてありうるドナー臓器拒絶を予測する臨床設定において広く用いられてきている（Ｂｒｏｍｅｌｏｗら，  ２００１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２４７，  １−８）。
【０２０５】
本質的にＯ’Ｆｌａｈｅｒｔｙら、２０００によって記載されるようなＭＬＲアッセイを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト同種反応性Ｔ細胞活性化および増殖に対するＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの影響を調べた。２人の関連しないドナー由来のＰＢＭＣを、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの存在下および非存在下で同時培養し、そして３Ｈ−チミジン取り込みによって、細胞増殖を測定した。図５に示すように、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、用量依存方式でＴ細胞増殖を阻害し、ＩＣ５０値は２．１４９ｎＭ（０．１８７７μｇ／ｍＬ）であり、そして最大阻害は５７％であった。中規模発見（ＭＳＤ）ヒト・サイトカインアッセイにおいてヒトＭＬＲ由来の上清を分析して、サイトカイン産生に対するＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの影響を調べた。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ化は、ＭＬＲにおいて、ＩＦＮ−γ（５５％阻害）、ＩＬ−１３（５０％阻害）およびＩＬ−５（８０％阻害）の産生を部分的に阻害した。
【０２０６】
方法：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧによる、ヒト同種一方向全ＰＢＭＣ  ＭＬＲ増殖反応の阻害。２人の関連しないドナー由来のヒトＰＢＭＣを全血から単離した。一方のドナー由来の細胞をγ照射によって不活性化して、刺激因子集団を生成した。残ったドナー由来の細胞は反応因子集団を形成した。刺激因子および反応因子集団を１：１の比（１ｘ１０５細胞／ドナー）で混合し、そしてＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ（１ｎｇ〜１００μｇ／ｍＬ）の存在下で６日間培養した。Ａ３３Ｆａｂ’−ＰＥＧ（社内試薬）を対照試薬として利用した。第６日、３Ｈ−チミジン取り込み（０．５μＣｉ／ウェル）によって細胞増殖を測定した。データを、生物学的試薬の非存在下での反応因子＋刺激因子反応と比較した阻害パーセントとして示し、そしてこれは、１０人の異なるドナー対からの組み合わせデータ（平均±ＳＥＭ）であった。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを用いてＩＣ５０値を計算した。結果を図５に示す。
【０２０７】
実施例４ｂ：破傷風トキソイド反応
破傷風トキソイド（ＴＴ）は、ワクチン接種された個体において、強いＴ細胞特異的免疫反応を誘導する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、増殖およびＰＢＭＣからのサイトカイン産生（ＴＨ１およびＴＨ２）を監視することによって、ＴＴ曝露に対する抗原特異的リコール反応を検出してもよい（Ｂｉｓｈｏｐら、２００５）。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、用量依存方式で、増殖、ならびにＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生を阻害し（データ未提示）、増殖最大阻害は３８％に達した。２人のドナーに関して計算した、増殖阻害に関するＩＣ５０値は、０．５８ｎＭ（０．０５１μｇ／ｍＬ）および１．１１ｎＭ（０．０９７μｇ／ｍＬ）であった。図６は、１人のドナーに関するＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ増殖阻害曲線を示す。
【０２０８】
方法：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、破傷風トキソイドに曝露されたＰＢＭＣの増殖を阻害する。
Ｆｉｃｏｌｌ勾配上での分離によってＰＢＭＣを単離し、そして９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり２００μＬの最終体積中で、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの存在下（濃度範囲５μｇ／ｍＬ〜０．００１μｇ／ｍＬ）、１μｇ／ｍＬ破傷風トキソイド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に曝露した。３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で５日間インキュベーションした後、活発に分裂している細胞への３Ｈチミジン（０．５μＣｉ／ウェル）の取り込みによって、細胞増殖を測定した。単一の代表的なドナーからの結果を提示する。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを用いてＩＣ５０値を計算した。
【０２０９】
実施例４ｃ：イエダニ（ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）反応
ヤケヒョウヒダニ属由来の種を含むイエダニなどの吸入抗原によって、重度急性喘息が誘発されうる（Ｔｉｌｌｉｅ−Ｌｅｂｌｏｎｄら，  ２００５，  Ａｌｌｅｒｇｙ，  ６０，  （１），  ２３−２９）。こうしたアレルゲンは、アトピー患者において、末梢血細胞による増殖反応およびＴＨ２に偏ったサイトカイン産生を誘導するが、非アトピー患者では誘導しない（Ｌｉｎｇら，  ２００４，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３６３，  ６０８−６１５）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイをセットアップして、抗原曝露に反応したＴＨ２サイトカインＩＬ−１３の産生に対するＯＸ４０遮断の影響を決定した。３〜５の間のアレルゲン特異的ＩｇＥ（ＲＡＳＴ）スコア（スケール０〜６）を持つアトピー患者からＰＢＭＣを採取し、そしてＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧまたは対照抗体の存在下で、ヤケヒョウヒダニ抗原で刺激した。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、最大６０％までＩＬ−１３産生を阻害し、ＩＣ５０値は１．２３ｎＭであった（図７）。さらに、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧはまた、このアッセイにおいて、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＴＮＦ−α産生も強力に阻害し、一方、制御サイトカイン、ＩＬ−１０のレベルを増進した（図８）。
【０２１０】
方法  図７：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、ヤケヒョウヒダニ・アレルギー性抽出物に曝露されたＰＢＭＣからのＩＬ−１３産生を阻害する。Ｆｉｃｏｌｌ勾配上での分離によって、アレルギーを有する志願者からＰＢＭＣを単離した。精製ＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり２００μＬの最終体積中で、試験抗体の存在下（濃度範囲１０μｇ／ｍＬ〜０．０００５μｇ／ｍＬ）、２５μｇ／ｍＬのヤケヒョウヒダニ・アレルゲン性抽出物（Ｇｒｅｅｒ）に曝露した。３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で６日間インキュベーションした後、上清を採取し、そしてＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）によってＩＬ−１３含量に関してアッセイした。グラフは、３人のドナー由来のプールしたデータに相当する（平均±ＳＥＭ）。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを用いて、ＩＣ５０値を計算した。
【０２１１】
方法  図８：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、ヤケヒョウヒダニ・アレルゲン性抽出物に曝露されたＰＢＭＣからのサイトカイン産生を調節する。Ｆｉｃｏｌｌ勾配上での分離によって、アレルギーを有する志願者からＰＢＭＣを単離した。精製ＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり２００μＬの最終体積中で、１０μｇ／ｍＬのＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ（１１４ｎＭ）または対照（ＴＮ３  Ｆａｂ’−ＰＥＧ）の存在下、２５μｇ／ｍＬのヤケヒョウヒダニ・アレルゲン性抽出物（Ｇｒｅｅｒ）に曝露した。３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で６日間インキュベーションした後、上清を採取し、そしてマルチスポットアッセイ（ＭＳＤ）を用いて、サイトカイン含量に関してアッセイした。グラフは、３人のドナー由来のプールしたデータに相当する（平均±ＳＥＭ）。
【０２１２】
要約
ヒト機能アッセイにおけるＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧに関するＩＣ５０値を表２に要約する。Ａ２６Ｆａｂ−ＰＥＧの強度は、３つのアッセイすべてに渡って類似であり、そして１．１０６ｎＭである細胞に基づくアフィニティ測定値とよく相関する。これらのアッセイにおいて、細胞増殖および／または多数の炎症性サイトカインの産生のいずれかが有意に抑制され、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧがＴ細胞活性化を大規模に阻害することが立証される。破傷風トキソイドおよびイエダニアッセイは、どちらも、メモリーＴ細胞によるリコール反応を測定し、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧが多様な抗原に対する確立されたＴ細胞反応を阻害可能であることを示す。
【０２１３】
表２  ヒト機能ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧに関する平均ＩＣ５０値
【０２１４】
【表２】
0005782385.tif 000006
【０２１５】
イエダニ抗原に対するアトピー性メモリーＴＨ２反応は、アレルギー性喘息に関して適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを提供し、そしてこのデータは、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧがこの徴候において有効な療法となりうることを示唆する。ＯＸ４０同時刺激は、以前、肺炎症と結びつけられてきており、ここで、アレルゲン特異的未処理ＣＤ４＋  Ｔ細胞の炎症性ＴＨ２細胞への分化およびメモリーＴＨ２細胞のリコール反応の両方において、非常に重要な役割を果たすことが示唆された（Ｗａｎｇ  ＆  Ｌｉｕ，  ２００７，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ，  １１７（１２），  ３６５５−３６５７）。アレルギー性炎症中、ストレスを受けた上皮細胞によって産生される生得的サイトカイン胸腺間質リンホポエチン（ｌｙｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＳＬＰ）は、ヒト樹状細胞の成熟を駆動し、そしてＯＸ４０Ｌの発現を誘導する。ＯＸ４０Ｌは、ＴＮＦ−αが増進するがＩＬ−１０産生がない炎症性表現型を伴う、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＴＨ２極性化を促進するよう機能する（Ｉｔｏら，  ２００５，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ，  ２０２（９），  １２１３−１２２３）。ＨＤＭ反応において、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、古典的ＴＨ２サイトカイン、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＬ−４ならびにＴＮＦ−αを強力に阻害する。さらに、４人のアレルギーを有するドナーのうち、２人において、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧはＩＬ−１０産生を増進した。したがって、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、アレルギー反応を阻害するだけでなく、これらを制御表現型に向けるように調節する能力も有しうる。
【０２１６】
実施例５：
Ｈｕ−ＳＣＩＤモデルにおいて、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を阻害する。
【０２１７】
Ｈｕ−ＳＣＩＤモデルは、ヒトＰＢＭＣでのＳＣＩＤマウスの再構成を伴い、これは次いで、宿主マウスに対する強い異種反応を誘発する。この反応は、マウスにおけるヒトＴ細胞の増殖によって追跡される。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧのＰＫに対して実験的に決定されたデータを用いて、８、２３および３４μｇ／ｍｌのＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの定常状態血漿濃度を生じる投薬措置を設計した。図９のデータは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞が、８、２３および３４μｇ／ｍｌのＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの定常状態血漿レベルを維持することによって、非常に阻害されることを示す。
【０２１８】
方法：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、Ｈｕ−ＳＣＩＤモデルにおいて、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を阻害する。
マウスに第２日、０．８２５、２．４７５または８．２５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．装填用量を、そして次いで、それぞれ、０．２５、０．７５または２．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．維持用量を毎日投与した。第０日に腹腔内に８００万のヒトＰＢＭＣをトランスファーする前日、ＴＭβ１を投薬することによって、マウスのＮＫ細胞を枯渇させる。次いで、実験を第１４日に終結させ、そして血液、腹腔洗浄液および脾臓ホモジネートを、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞に関して分析する。第１４日、頸椎脱臼によってマウスを屠殺し、そして心臓穿刺によって出血させた。次いで、ＦＡＣＳ分析によって、ヒトＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞数を測定した。データ（ｎ＝１０）を平均±ＳＥＭで表す。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ投与後の血中のＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の減少を図９に示す。
【０２１９】
実施例６：非ヒト霊長類ＯＸ４０とＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの交差反応性
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）疾患モデルおよび前臨床毒性学におけるＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの使用を検証するため、ヒトおよびＮＨＰ細胞上で、相対的アフィニティおよび機能的強度を比較した。
ＮＨＰ細胞上の細胞に基づくアフィニティ
カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）またはアカゲザルＣＤ４＋  Ｔ細胞を末梢血から単離し、そして活性化して高レベルのＯＸ４０を発現させた。図３に示すような平衡結合曲線の非線形回帰分析によって、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧのアフィニティを測定した。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧは、ヒトに比較した際、カニクイザルまたはアカゲザルＣＤ４＋  Ｔ細胞に関してアフィニティの２倍未満の低下を示し、非常に交差反応性であることが示された（表３）。
【０２２０】
表３  ヒトおよびＮＨＰ細胞上のＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧの細胞に基づくアフィニティの比較
【０２２１】
【表３】
0005782385.tif 000007
【０２２２】
ＮＨＰ  ＰＢＭＣをＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（ＶＨ  Ｂｉｏ）勾配上で分離し、１μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ−Ｌ、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で３日間活性化し、そして磁気ビーズ（非ヒト霊長類用ＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キットＩＩ；  ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いた陰性選択によって、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を単離した。実施例３ａに記載するようにアフィニティを測定した（図３）。
【０２２３】
実施例７：カニクイザルＣＩＡモデルにおける有効性研究
研究および研究設計の原理
カニクイザル・コラーゲン誘導性関節炎は、ヒト実験の前に、潜在的な抗関節炎薬剤をプロファイリングするのに用いられる、標準モデルである。ここでは、このモデルは、ＴＮＦαおよびＩＬ−６に対して向けられる治療に反応する。これらのデータは、同等の抗ヒト療法を用いた臨床的ＲＡ知見と一致する。
【０２２４】
カニクイザルにおける関節炎の誘導には、３週間の期間をおいたコラーゲンＩＩでの２回の免疫工程が必要である。関節炎症状（１以上の関節の腫脹および圧痛）は、第二の免疫後のいかなる時点で明らかになる可能性もあり、そしてこれを、関節炎スコアを用いて毎週評価した。実験は全部で１１週間行った。ＯＸ４０は共刺激分子であり、そしてしたがって、機能障害は、モデルの免疫期に影響を有すると予期される。Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧでの３回の投薬措置を評価した。１つの群には、第一の免疫の前日にのみ一度、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与した。第二の群には、第二の免疫の前日にのみ一度、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与し、そして第三の群には、第一および第二の免疫の前日に、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与した。動物の対照群には、酢酸緩衝液ビヒクルを投与した。ビヒクル処置群での疾患開始を、急性期タンパク質であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびハプトグロビン（ＲＡ試験において臨床的に測定されるバイオマーカー）の血清上昇によって特徴付けた。関節完全性をｘ線によってそして組織学的検査によって評価した。
【０２２５】
結果および結論
第一の免疫前日に、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧで処置した動物において、関節炎重症度は、一般的に、ビヒクル処置群におけるより低かった。関節炎スコアにおけるこれらの相違は、第４９日、６３日および７６日で統計的に有意であった。図１０は、臨床スコアに関する曲線下面積として示される、個々の動物に関するデータの全体の要約を示す。関節に対する骨浸食のＸ線評価もまた減少し（表４）、組織病理学的変化も同様であった（図１１）。ＣＲＰおよびハプトグロビンの濃度は、対照群におけるより低くなる傾向があった。第一の免疫の前日、および第二の免疫の前日に、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与した動物群に関して、類似の結果を得た。しかし、第二の免疫前日にのみ一度、Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与された動物では、説得力がある関節炎効果はなかった。これらのデータは、カニクイザルＣＩＡにおける抗ＯＸ４０治療の抗関節炎効果を示し、そして病原性免疫反応開始に対するＯＸ４０の重要性を立証する。
【０２２６】
図１０：カニクイザルＣＩＡにおけるＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧによる関節炎スコアの阻害。データは、第一および第二の免疫前に酢酸緩衝液を投与した対照動物（Ａｃ  Ａｃ）、第一の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与した動物（Ａ２６  Ａｃ）、第二の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与した動物（Ａｃ  Ａ２６）、ならびに第一および第二の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与した動物（Ａ２６  Ａ２６）に関する、個々の動物の臨床スコアデータの曲線下面積を示す。バーは中央値である。
【０２２７】
表４  骨浸食のｘ線スコアに対するＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧ治療の効果
【０２２８】
【表４】
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【０２２９】
Ａｃ  Ａｃ動物には酢酸緩衝液ビヒクルを投与し、Ａ２６  Ａｃ動物には第一の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与し、Ａｃ  Ａ２６動物には第二の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与し、そしてＡ２６  Ａ２６動物には第一および第二の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ウィルコクソン検定。
【０２３０】
方法  図１１：Ａ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧによるカニクイザルＣＩＡにおける総組織学的スコアの減少。データは、研究終了時の個々の動物に関する総組織学的スコア（軟骨および骨の変性、線維症、肉芽組織および過形成を取り込む）を示す。Ａｃ  Ａｃ動物には酢酸緩衝液ビヒクルを投与し、Ａ２６  Ａｃ動物には第一の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与し、Ａｃ  Ａ２６動物には第二の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与し、そしてＡ２６  Ａ２６動物には第一および第二の免疫前にＡ２６Ｆａｂ’−ＰＥＧを投与した。バーは中央値である。
【０２３１】
本発明は例示のためのみに記載されてきており、いかなる点でも限定を意味せず、そして詳細の修飾は、以下の請求項の範囲内で行われうることが、もちろん理解されるであろう。本発明の各態様の好ましい特徴は、変更すべきところを変更して、他の態様各々に関する好ましい特徴でもある。限定されるわけではないが、本明細書に引用される特許および特許出願を含むすべての刊行物は、各個々の刊行物が、具体的に、そして個々に、完全に示されるかのように本明細書に援用されると示されるかのように、本明細書に援用される。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図１−Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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