(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含有される核酸標的配列の鋳型を増幅するための方法であって、
前記核酸標的配列の鋳型に相補的なプライマーを含有する増幅反応混合物と前記試料を接触させることと、
反応の温度を上位変性温度と下位ハイブリダイゼーション温度との間で周期的に変動させ、温度の変化を、複数回の温度サイクル中、２０℃以下とすることと、
前記核酸標的配列の鋳型を増幅することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記温度の変化が、複数回の温度サイクル中、１５℃以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度の変化が、複数回の温度サイクル中、１０℃以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記温度の変化が、複数回の温度サイクル中、５℃以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記上位温度または前記下位温度に到達した後、前記反応の温度が、設定期間にわたり温度のゆらぎ内に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記温度範囲内で上位または下位温度に到達した後、前記反応の温度が他の温度に変化させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記下位温度が５０℃以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記上位温度が８５℃以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸標的配列の鋳型が１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸標的配列の鋳型が２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸標的配列の鋳型がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸標的配列の鋳型がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸の長さが１０００ｂｐ未満であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸の長さが２５０ｂｐ未満であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸の長さが１５０ｂｐ未満であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸の長さが１００ｂｐ未満であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅反応混合物が、前記核酸の鋳型の逆鎖に結合するプライマー対を含む、請求項１から請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマー対が、その溶融温度が６５℃以上となるような長さおよびＧＣ含量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマー対が、その溶融温度が７０℃以上となるような長さおよびＧＣ含量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記プライマー対が、３５から７０塩基対の間の長さを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記プライマー対の各プライマーの溶融温度が、７０から８０℃の間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記プライマー対が、それぞれ４０から４７塩基対の間の長さを有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
試料中に含有される核酸標的配列の鋳型を増幅させるための方法であって、
前記試料を、
３５から７０塩基対の長さを有し、前記核酸標的配列の鋳型に対して相補的であるプライマーまたはプライマー対であって、前記プライマー対の各プライマーの溶融温度が７０から８０℃の間である、プライマーまたはプライマー対と、
ＤＭＳＯと、
一価陽イオンと、
二価陽イオンと、
ｄＮＴＰと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
を含む増幅反応混合物と、を接触させることと、
反応の温度を上位変性温度と下位ハイブリダイゼーション温度との間で周期的に変動させ、前記温度の変化を、複数回の温度サイクル中、２０℃以下とすることと、
前記核酸標的配列の鋳型を増幅することと、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記二価陽イオンが、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される塩である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記一価陽イオンが、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、アンモニウム、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される塩である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記増幅反応混合物が核酸不安定化剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅反応が、ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２３または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼおよび、ＤｅｅｐＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項２３または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を含む、請求項２３または２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない、請求項２３または２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記増幅反応混合物が、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項３３】
前記逆転写酵素が耐熱性逆転写酵素である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ−ＲＴ、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素またはＭＭＬＶ−ＲＴから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅反応混合物が、１本鎖結合タンパク質を含む、請求項１または２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記１本鎖結合タンパク質が、耐熱性の１本鎖結合タンパク質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１本鎖結合タンパク質が、非耐熱性の１本鎖結合タンパク質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記増幅反応混合物が不安定化剤を含有し、且つ該不安定化剤がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはホルムアミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料がアルコール不含ではない、請求項１または２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が塩不含ではない、請求項１または２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記増幅反応混合物が、増幅反応混合緩衝液を含み、該増幅反応混合緩衝液は、
１本鎖または２本鎖核酸不安定化剤と、
一価陽イオンと、
二価陽イオンと、
ｄＮＴＰと、
活性を支えるためにｐＨで緩衝化されているＤＮＡポリメラーゼと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
１本鎖結合タンパク質をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記不安定化剤がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはホルムアミドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記二価陽イオンが、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される塩である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記一価陽イオンが、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、アンモニウムまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される塩である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤｅｅｐＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２０１１年４月２０日提出の米国特許仮出願第６１／４７７，４３７号、題名「Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」に対する優先権およびその利益を主張し、その明細書および特許請求の範囲を参照により本明細書中に組み込む。
【０００２】
本願は、２０１１年４月２０日提出の米国特許仮出願第６１／４７７，３５７号、題名「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」に対する優先権およびその利益を主張し、その明細書および特許請求の範囲を参照により本明細書中に組み込む。
【０００３】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当せず
【０００４】
コンパクトディスクによる提出材料の参照による援用
該当せず
【０００５】
著作物
該当せず
【０００６】
配列リスト、表またはコンピュータプログラムに対する参照
出願人は本明細書により、２０１２年４月２０日に、１０Ｋバイトの０４１８１２＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のテキストファイルとして配列リストを提出し、このファイルはＡＳＣＩＩに準拠し、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００７】
（発明の背景）
本発明の実施形態は、任意の熱重合サイクル中、反応温度を好ましくは２０℃以下という狭い範囲で周期的に変動させることによる、核酸標的配列の鋳型依存性増幅のための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００８】
次の考察は、多くの刊行物および参考文献を参照することに注意されたい。本明細書中でのこのような刊行物の考察は、より完全な科学的原理の背景のために与えられるものであり、このような刊行物が、特許性決定の目的に対して先行技術であることを自認するものとして解釈されるべきではない。
【０００９】
核酸の増幅は、分子生物学における最も欠かせない技術のなかでも、研究、遺伝子検査、農業および法医学で広く使用される１つである。最も一般的な増幅方法は、溶液中で特定の核酸標的配列の存在量を指数関数的に増加させる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書、第４，６８３，２０２号明細書、第４，８００，１５９号明細書参照）。ＰＣＲ反応は、増幅しようとする標的配列の上流（５’）または下流（３’）の何れかのＤＮＡ二重らせんの逆鎖に対してハイブリッド形成する２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。標的配列を「コピー」し、２本鎖ＤＮＡ産物を生成させるために、（一般に耐熱性である）ＤＮＡポリメラーゼを使用し、デオキシヌクレオシド−三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を添加することによって、５’→３’方向でハイブリッド形成したプライマーを伸長させる。反応混合物の温度（通常は９５℃）を繰り返し回転させることによって、２本のＤＮＡ鎖を高温で分離させ、それらをより低温（例えば５５℃および６０℃）でのさらなるプライマー結合および重合のための鋳型とすることができる。この過程を多数回繰り返した後、１個の標的配列を数十億コピーに増幅させ得る。
【００１０】
ＰＣＲは、設備の整った研究室では究極の増幅方法であるが、一方でかなり複雑であり、アクティブ加熱および冷却発熱素子や正確な温度調節機能を備える高価で精巧な熱サイクリング機器と、意義のある結果を収集するための熟練技術者との両方を必要とする。例えば、殆どのＰＣＲ反応には、少なくとも２つの温度（例えば９５℃と５７℃）間での迅速で正確なサイクル進行が必要であるため、通常、高価でエネルギー面で非効率的なペルチェエンジン（熱電冷却機構）および正確な温度調節素子を使用することとなる。このような固有の制限により、ＰＣＲは、サポートする研究室基盤がない場合に有用である、費用効果のある、ポイント・オブ・ケアの核酸診断の開発とは相容れない。多くの資源を必要とするＰＣＲの要件の一部を軽減しようとする努力において、様々な「一定温度」増幅技術が過去数十年間、開発されてきた。このような反応では、単一温度で核酸を増幅させうるため、高価なサーモサイクラーが不要となるので、廉価な診断装置での使用が受け入れられ易くなる。例としては、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ヘリカーゼ介在増幅、鎖置換増幅、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）などが挙げられる。しかし、これらの等温増幅法は、（インビトロでの酵素反応速度が低速であるため）６０から９０分の増幅時間を要し、極めて厳格な増幅反応に対応するために単一温度で正確な温度調節が必要であることが多く、これも、ポイント・オブ・ユース診断適用に必要なロバスト性およびスピードを欠く。
【００１１】
鋳型依存的な核酸増幅は、核酸に基づく分子診断の基盤である。ロバストかつ廉価で迅速なポイント・オブ・ケア核酸診断は、ヘルスケア、農業において、またバイオテロおよび戦争行為の関連において、緊急に必要とされている。しかし、既存のＰＣＲまたは等温増幅が付随するアッセイ化学ストラテジーは、工学的な面およびロバスト性の面で著しい制限があるため、このような増幅アプローチは、核酸に基づく分子が、新たに出現する疾患の予防および制御に対して最も影響を与え得る、資源の限られた状況では高価であり、実際的ではない。専用の実験室インフラ基盤を欠く状況に対して手頃でロバストな診断を可能にするためには、核酸増幅が大幅に改善されなければならない。
【００１２】
従来型のＰＣＲは、通常は温度が４０℃と大幅に変動する、非常に特異的で、迅速な熱サイクリングに依存する。このような増殖法は、溶液温度を正確に維持することに加え、ＰＣＲ反応混合物を迅速に加熱および（特に）冷却するために高価な機器を必要とする。等温核酸増幅手順は、複雑な熱サイクリング機器を必要としないものの、一般的に低速で（少なくとも６０分間の反応時間）、信頼性が低く、正確な温度較正が必要である。
【００１３】
ＰＣＲ熱サイクリングプロセスにおいて、ＰＣＲサイクラーは、試料中の温度を均一に維持し、標準的な試料加熱（および／または冷却）速度である少なくとも２℃／秒を維持するために、温度調節が良好でなければならない。温度調節は、通常、フィードバックループ系により達成され、一方、温度均一性は、銅などの熱伝導性が高いが、嵩張る物質により達成される。高速加熱は、最大散逸パワーおよび熱容量により制限される比例・積分・微分（ＰＩＤ）調節法の実行により遂行される。高速冷却の達成は非常に困難であり、嵩張る系は、熱電素子（Ｐ．Ｗｉｌｄｉｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｓｈｏｆｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｊ.Ｋｒｉｃｋａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，４０，１８１５−１８１７）（ペルチェ素子と呼ばれることも多い）または水などの他の手段（Ｊ．Ｂ．Ｆｉｎｄｌａｙ，Ｓ．Ｍ．Ａｔｗｏｏｄ，Ｌ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍｅｌｌｉ，Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｙ，Ｔ．Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｗ．Ｄｏｎｉｓｈ，Ｔ．Ｅｋｅｚｅ，Ｊ．Ｆａｌｖｏ，Ｄ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｐｕｓｋａｓ，Ｊ．Ｑｕｅｎｉｎ，Ｊ．Ｓｈａｈ，Ｄ．Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｊ．Ｗ．Ｈ．Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｈ．Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗｅｌｌｍａｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３９，９，１９２７−１９３３）の何れかの強制冷却を必要とする。これらのＰＣＲ機は、複雑であり、電力を浪費する機器である。系が嵩張るので、その熱時定数は秒単位ではなく分単位であり、その結果、遷移時間が長くなり、ＰＣＲの不要な副産物を生成することとなる。電力消費が大きいため、電池式および携帯ＰＣＲシステムとすることはできない。
【００１４】
シリコン技術に基づくマイクロマシニングおよびバイオ微小電気機械システム（ｂｉｏＭＥＭＳ）の近年の進歩により、世界中の多くのグループが、ラボ・オン・チップまたはマイクロ全分析システム（μＴＡＳ）の中心部である、マイクロＰＣＲ（μＰＣＲ）の開発を開始した。研究者らは、２種類の基礎的なアプローチ、すなわち、循環温度による定置システムおよび温度の異なる３つのゾーンがある流動系に追随している。両システムとも、長所と短所とがある。定置システムは、ＰＣＲ溶液の温度を修正するためにチャンバの温度を繰り返し回転させる。このシステムは、ＰＣＲ試料を移動させるための汲み出し系または他の手段を必要としない。フロースルー系は、通常、３種類の定常温度ゾーンがある。試料温度変化は、異なる温度ゾーン間の移動によってのみである。このタイプのＰＣＲシステムは、定置システムよりも速いが、試料を移動させるための機構の実装を必要とする。両ケースとも、ＰＣＲシステムに加熱器が組み込まれるので、僅か１回の試験を行った後に交差汚染を回避するために機器を処分することは経済的ではない。これらの２種類の形式により示される主要な長所は、従来の機器と比較して、使用する試料体積が小さく、サイクル時間が短縮されていることである。しかし、これらのＰＣＲチップは、高価で精巧な製造工程を必要とするシリコンなどの基板材料を使用しており、そのため単価が非常に高くなる。さらに、表面積対体積率を高くするために反応体積が極めて小さいこと（＜μｌ）およびμＰＣＲチップで使用される材料の種類から、生体試料の非特異的吸着、阻害、試料蒸発および泡形成を含め、従来のＰＣＲではあまり一般的ではないいくつかの影響が重要になる。その他の現在の取り組みには、定置チャンバＰＣＲチップにおけるサイクル数および温度ゾーン数を柔軟に変動させる一方で、フロースルーマイクロチャネルＰＣＲチップの効率的な温度サイクリングを行うために、定置チャンバおよび連続流動ＰＣＲを統合した、温度サイクリング反応マイクロチップの開発も含まれる。しかし、ハイブリッドＰＣＲ機器の効率は、現在もなお検証中であり、このようなμＰＣＲチップアプローチに付随する試料阻害、吸着および泡形成に関する問題によって、なお、先行的試料調製／核酸単離プロセス、増幅試薬および反応条件、例えば超高濃度のポリメラーゼ濃度、ＰＣＲプライマー濃度など、の全てに対して非常に厳しい条件が課される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｐ．Ｗｉｌｄｉｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｓｈｏｆｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｊ.Ｋｒｉｃｋａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，４０，１８１５−１８１７
【非特許文献２】Ｊ．Ｂ．Ｆｉｎｄｌａｙ，Ｓ．Ｍ．Ａｔｗｏｏｄ，Ｌ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍｅｌｌｉ，Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｙ，Ｔ．Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｗ．Ｄｏｎｉｓｈ，Ｔ．Ｅｋｅｚｅ，Ｊ．Ｆａｌｖｏ，Ｄ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｐｕｓｋａｓ，Ｊ．Ｑｕｅｎｉｎ，Ｊ．Ｓｈａｈ，Ｄ．Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｊ．Ｗ．Ｈ．Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｈ．Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗｅｌｌｍａｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３９，９，１９２７−１９３３
【発明の概要】
【００１７】
本発明のある実施形態は、試料中に含有される核酸標的配列の鋳型を増幅するための方法を提供する。本方法は、核酸標的配列の鋳型に相補的なプライマーを含有する増幅反応混合物と試料を接触させることを含む。反応温度は、上位温度と下位温度との間で周期的に変動し、この場合、温度の変化は、複数回の温度サイクル中、約２０℃以下である。核酸標的配列の鋳型が増幅される。
【００１８】
本発明のある実施形態では、複数回の温度サイクル中、温度の変化が約１５℃以下である。別の実施形態では、複数回の温度サイクル中、温度の変化が約１０℃以下である。さらに別の実施形態では、複数回の温度サイクル中、温度の変化が約５℃以下である。温度は、本発明のある実施形態によると、所定の温度および／または範囲に対して（＋／−２℃）のゆらぎがあり得る。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、上位温度または下位温度に到達した後、その温度が、設定期間にわたり温度のゆらぎ内に維持される。あるいは、温度範囲内で上位または下位温度に到達した後、温度は他の温度に変動する。ある実施形態において、下位温度は約５０℃以上である。別の実施形態において、上位温度は約８５℃以下である。上位および下位温度は、ある実施形態によれば、約＋／−５℃変動し得る。
【００２０】
本発明のある実施形態によれば、核酸標的配列の鋳型は、１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。標的核酸の長さは、１０００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満または１００ｂｐ未満であり得る。
【００２１】
１つまたは複数の実施形態は、核酸の鋳型の逆鎖に結合するプライマー対を含み得る。プライマー対は、溶融温度が６５℃以上となるような長さおよびＧＣ含量を有し得る。別の実施形態において、プライマー対は、溶融温度が７０℃以上となるような長さおよびＧＣ含量を有する。例えば、プライマー対の各プライマーは個々に、３５から７０塩基対の間の長さを有する。本発明のある実施形態によれば、プライマー対の各プライマーの溶融温度は、７０から８０℃の間である。好ましい実施形態において、プライマー対は、それぞれが４０から４７塩基対の間の長さを有する、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態は、試料中に含有される核酸標的配列の鋳型を増幅するための方法を提供する。本方法は、長さが３５から７０塩基対であり、核酸標的配列の鋳型に対して相補的であり、プライマー対の各プライマーの溶融温度が７０から８０℃の間である、プライマーまたはプライマー対を含む増幅反応混合物と試料を接触させることを含む。増幅反応混合物はまた、ＤＭＳＯ、一価陽イオン、二価陽イオン、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼも含む。反応温度は、上位温度と下位温度との間で周期的に変動し、温度の変化は、複数回の温度サイクルおよび核酸標的配列の鋳型の増幅中は、約２０℃以下である。好ましい実施形態において、二価陽イオンは、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、一価陽イオンは、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、アンモニウムまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、増幅反応混合物は、核酸不安定化剤を含む。より好ましい実施形態において、本反応は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり得るＤＮＡポリメラーゼを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤｅｅｐＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択され得るが、これらに限定されず、本明細書中で開示され、当該技術分野で公知である他のポリメラーゼが含まれ得る。ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を含み得る。別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がない。別の実施形態において、鋳型を増幅させるための方法は、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを添加することをさらに含む。例えば、逆転写酵素は、耐熱性逆転写酵素である。逆転写酵素は、ＡＭＶ−ＲＴ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素またはＭＭＬＶ−ＲＴから選択され得るが、これらに限定されず、当該技術分野で公知の他の逆転写酵素が使用され得る。本発明の別の実施形態は、開示されるような反応混合物への１本鎖結合タンパク質の添加をさらに含む。例えば、１本鎖結合タンパク質は耐熱性の１本鎖結合タンパク質であるか、または１本鎖結合タンパク質は非耐熱性１の本鎖結合タンパク質である。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態は、１本鎖または２本鎖核酸不安定化剤を含む混合物を提供する。例えば、グリセロールなどの他の薬剤のように、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはホルムアミドが、これらに限定されるわけではないが、同じ目的で添加され得る。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、試料がアルコール不含ではなく、および／または試料が塩不含ではない方法を提供する。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態は、増幅反応混合物が１本鎖または２本鎖核酸不安定化剤と、一価陽イオンと、二価陽イオンと、ｄＮＴＰと、活性を支持するためにｐＨで緩衝化されたＤＮＡポリメラーゼとを含む、試料中に含有される核酸標的配列の鋳型を増幅するための方法を提供する。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、１本鎖または２本鎖核酸不安定化剤と、一価陽イオンと、二価陽イオンと、ｄＮＴＰと、活性を支持するためにｐＨで緩衝化されたＤＮＡポリメラーゼとのうち、１つまたは複数を含む増幅反応混合緩衝液を提供する。ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤｅｅｐＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択され得るが、それらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し得る。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がないＤＮＡポリメラーゼが選択され得る。増幅反応混合物はまた、１本鎖結合タンパク質と、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはホルムアミドである不安定化剤と、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される塩であり得る二価陽イオンと、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、アンモニウムまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される塩である一価陽イオンとのうち、１つまたは複数を含み得る。
【００２７】
本発明の、目的、利点および新規性のある特徴ならびにさらなる適用範囲は、添付の図面に関連して行われた詳細な説明にある程度は明らかにされ、以下を検討することで当業者にある程度は明らかになり、本発明の実施により理解され得るであろう。発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される手段および組み合わせによって、実現され、達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本明細書に組み込まれ、その一部をなす添付の図面は、本発明の実施形態を例示し、詳細な説明とともに、本発明の原理を説明するものである。図面は、単に本発明の好ましい実施形態を例示する目的のものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【００２９】
【図１Ａ】本発明のある実施形態による周期変動性ＰＣＲ増幅反応の概略図を示しており、従来の２段階ＰＣＲ反応（黒線）と比較して、ＯＰＣＲａｒの数サイクル中に観察される温度のゆらぎの代表的なトレース（灰色線）を示している。
【図１Ｂ】本発明のある実施形態による周期変動性ＰＣＲ増幅反応の概略図を示しており、本発明のある実施形態によるヌクレオチド増幅のための方法を示している。
【図２Ａ】本発明のある実施形態により、様々なポリメラーゼを使用して１５３塩基対（ｂｐ）の産物を生成した、アクリルアミドゲルの一連の写真を表す。
【図２Ｂ】本発明のある実施形態により、様々なポリメラーゼを使用して１５３塩基対（ｂｐ）の産物を生成した、アクリルアミドゲルの一連の写真を表す。
【図２Ｃ】本発明のある実施形態により、様々なポリメラーゼを使用して１５３塩基対（ｂｐ）の産物を生成した、アクリルアミドゲルの一連の写真を表す。
【図２Ｄ】本発明のある実施形態により、様々なポリメラーゼを使用して１５３塩基対（ｂｐ）の産物を生成した、アクリルアミドゲルの一連の写真を表す。
【図２Ｅ】本発明のある実施形態により、様々なポリメラーゼを使用して１５３塩基対（ｂｐ）の産物を生成した、アクリルアミドゲルの一連の写真を表す。
【図３Ａ】本発明のある実施形態による核酸増幅におけるエタノールの影響を例示するアクリルアミドゲルの写真を表す。
【図３Ｂ】本発明のある実施形態による核酸増幅におけるエタノールの影響を例示するアクリルアミドゲルの写真を表す。
【図４】本発明のある実施形態による効率的な増幅を支持するためのアニーリング温度およびプライマー溶融温度の差異を例示する、アクリルアミドゲルの写真である。
【図５】本発明のある実施形態によるプライマー二量体形成におけるホットスタートＤＮＡポリメラーゼの影響を例示する、アクリルアミドゲルの写真である。
【図６】本発明のある実施形態によるプライマー二量体形成におけるＧＣおよびＡＴクランプの影響を例示する、アクリルアミドゲルの写真である。
【図７】本発明のある実施形態による産物形成における１本鎖結合タンパク質の影響を例示する、アクリルアミドゲルの写真である。
【図８Ａ】本発明のある実施形態によるＴ４遺伝子タンパク質３２によるプライマー二量体形成の量の減少を例示するアクリルアミドゲルの写真を表す。
【図８Ｂ】本発明のある実施形態によるＴ４遺伝子タンパク質３２によるプライマー二量体形成の量の減少を例示するアクリルアミドゲルの写真を表す。
【図９】本発明のある実施形態による増幅２本鎖ＤＮＡ中に存在する特異的標的配列を例示するアクリルアミドゲルの写真である。
【図１０】本発明のある実施形態によるｓｓＤＮＡに存在する特異的標的配列の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真である。
【図１１】本発明のある実施形態によるプラスミドＤＮＡに存在する特異的標的配列の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真である。
【図１２】本発明のある実施形態による１本鎖ＲＮＡの増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真である。
【図１３】本発明のある実施形態による細菌ゲノムＤＮＡ中の特異的標的配列の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真である。
【図１４】本発明のある実施形態による葉緑体ＮＤＡに存在する特異的標的配列の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真である。
【図１５】本発明のある実施形態による２つの標的配列の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真である。
【図１６Ａ】本発明のある実施形態による、より低い溶融温度でのＳＳＢ存在下での標的配列の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真を表す。
【図１６Ｂ】本発明のある実施形態による、より低い溶融温度でのＳＳＢ存在下での標的配列の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真を表す。
【図１７Ａ】典型的なＰＣＲサーモサイクラーにおいて必要とされるような正確な温度調節および／または急ランピングパラメータでの標的の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真を表す。
【図１７Ｂ】典型的なＰＣＲサーモサイクラーにおいて必要とされるような正確な温度調節および／または急ランピングパラメータでの標的の増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真を表す。
【図１８】ランピングまたは正確な温度調節のない廉価な加熱器において増幅された標的Ｒｂｃｌの増幅を例示するアクリルアミドゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「核酸」という用語は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を意味する。１本鎖核酸は、ヘアピン、ループおよびステムエレメントなどの二次構造を有し得る。２本鎖または１本鎖核酸は、線状または環状であり得る。２本鎖核酸は、インタクトであるかまたはニックが入ったものであり得る。２本鎖分子は、平滑末端であり得るか、または１本鎖突出末端を有し得る。核酸試料は、細胞またはウイルスから単離され得、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む染色体外ＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、ＤＮＡフラグメント、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡまたは細胞もしくはウイルスで生じるその他のＲＮＡを含み得る。核酸は、農業、食品、環境、発酵または体液、例えば唾液、血液、鼻腔吸引物もしくは肺吸引物、脳脊髄液、痰、糞便、乳汁、粘膜組織のスワブ、組織試料もしくは細胞などの、あらゆる多くの起源から単離され得る。核酸は、インビトロで、単離、クローニング、または合成され得る。上記の核酸内で、個々のヌクレオチドは、修飾または、メチル化などの化学的変化を受け得る。これらの修飾および変化は、自然にまたはインビトロ合成によって起こり得る。
【００３１】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「標的核酸」または「鋳型核酸」という用語は、選択的に増幅しようとする１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントもしくは配列を意味する。増幅しようとする核酸の大きさは、上流（５’）および下流（３’）境界により定められ、５００ｂｐ未満、好ましくは２５０ｂｐ未満、より好ましくは１５０ｂｐ未満、より好ましくは１００ｂｐ未満であり得る。標的核酸は、より長い２本鎖もしくは１本鎖核酸内に含有されるフラグメントであり得るかまたは、２本鎖もしくは１本鎖核酸全体であり得る。
【００３２】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「二重鎖」という用語は、全体または一部が２本鎖である、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸分子を意味する。
【００３３】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「熱サイクル」という用語は、核酸増幅が起こるために必要な反復される温度のゆらぎを意味する。熱サイクルは、高温溶融または変性段階と、低温アニーリングまたはハイブリッド形成段階とを含み得るが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「溶融」または「変性」という用語は、高温での核酸二重鎖の２本の相補鎖の全てまたは一部を分離させることを意味する。溶融または変性温度は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さおよび配列、二重鎖不安定化試薬、例えばＤＭＳＯおよびホルムアミドなどの濃度ならびに溶液のイオン強度またはｐＨにより影響され得る。
【００３５】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「アニーリング」または「ハイブリッド形成」という用語は、１本鎖核酸鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーの配列特異的な結合を意味する。プライマーは、鋳型鎖の一方でその相補的配列とのみ結合し、鋳型のその他の領域とは結合し得ない。アニーリングまたはハイブリッド形成の特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さおよび配列、結合が行われる温度、二重鎖不安定化試薬、例えばＤＭＳＯおよびホルムアミドなどの濃度ならびに溶液のイオン強度またはｐＨにより影響され得る。
【００３６】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「プライマー」という用語は、標的核酸のポリメラーゼ依存性複製を可能にする配列特異的形式で標的核酸上の１本鎖領域と結合可能である１本鎖核酸またはオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３７】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「ＯＰＣＲａｒ」という用語は、変性温度とアニーリング温度との間で典型的な増幅技術よりも小さい温度変動、例えば２０℃未満、好ましくは１５℃未満、より好ましくは１０℃未満の温度変動を使用して核酸を増幅するためのインビトロ技術である周期変動性ＰＣＲ増幅反応を意味する。
【００３８】
本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、「付属タンパク質」という用語は、活性を刺激可能な何らかのタンパク質、例えば耐熱性１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、例えばｒｅｃＡまたはＲＰＡ（複製タンパク質Ａ）などを指すが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の実施形態において、温度変化が好ましくは２０℃未満、より好ましくは１５℃未満、さらにより好ましくは１０℃未満である熱サイクリングによって特異的な核酸標的を指数関数的に増幅するための方法が提供される。これには、増幅しようとする核酸の１本鎖鋳型を提供する段階、核酸鋳型に対するハイブリッド形成のためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階、ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＤＮＡポリメラーゼにより鋳型鎖に対して相補的である２本鎖伸長産物を合成する段階、選択核酸標的を指数関数的に増幅させるために上記段階を繰り返す段階が含まれる。
【００４０】
ここで図１Ａを参照して、パネルＡで従来の２段階ＰＣＲ反応（黒線）と比較した、ＯＰＣＲａｒの数サイクル中に観察される温度のゆらぎの代表的なトレース（灰色線）を示し、本発明のある実施形態による周期変動性ＰＣＲ増幅反応（ＯＰＣＲａｒ）の概略図を例示する。ＯＰＣＲａｒにおける温度変化の劇的な縮小化に注意されたい。図１Ｂは、２本鎖標的核酸が溶融段階に入ることを示しており、この段階では温度に依存して、本発明のある実施形態による二重鎖の部分的または完全変性の何れかを引き起こし得る。標的の末端で二重鎖がほどけ始め、１本鎖核酸が１本鎖結合タンパク質（丸）によって結合し、これにより安定化される。反応物が冷却され、ハイブリッド形成／重合段階に入り、この段階で標的二重鎖の各鎖の５’末端にプライマーが特異的にハイブリッド形成する。プライマーハイブリッド形成後、ＤＮＡポリメラーゼ（四角）は鋳型／プライマー二重鎖に結合し、ｄＮＴＰの組み込みにより５’→３’方向にプライマーを伸長させ、ＤＮＡの鋳型鎖をコピーする。使用されるポリメラーゼが鎖置換活性を有する場合、部分的に変性した複合体において逆側の鎖を置換することができる。新しい二重鎖ＤＮＡの生成時、熱サイクルを多数回繰り返し、その結果、標的核酸配列が指数関数的に増幅される。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態において、熱サイクリングは、ΔＴが好ましくは２０℃以下、より好ましくは１５℃以下、さらにより好ましくは１０℃以下の、２つの温度間の温度の周期変動またはサイクリングを含む。２つの温度のうち高い方の温度は、２本鎖標的ＤＮＡを変性させるのに十分であるか、または好ましくは２本鎖ＤＮＡ標的を部分的にのみ変性させる結果となるものである。高い方の温度または低い方の温度の何れかに到達したら、その温度を設定期間にわたり維持するか、好ましくは他方の温度にすぐに変化させる。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態において、核酸標的は、２本鎖ＤＮＡなどの２本鎖核酸であるか、または１本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡなどの１本鎖核酸であり得る。標的核酸が２本鎖である場合、ＤＮＡポリメラーゼ活性および増幅に必要な１本鎖鋳型または鋳型領域を形成させるために、熱により、または酵素的に、完全もしくは部分的にこの標的核酸を変性させなければならない。標的核酸の長さは、１０００ｂｐ未満、好ましくは２５０ｂｐ未満、より好ましくは１５０ｂｐ未満であり得る。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態において、標的核酸増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、特異的な２本鎖標的核酸の逆鎖に結合するプライマー対であり、一方のプライマーは標的の５’末端の上流に結合し、一方のプライマーは標的の３’末端の下流に結合する。多重条件下で、同じ反応混合物中で複数の核酸標的を同時に増幅するために、複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用し得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、普遍的に認められているＰＣＲ緩衝液条件下で溶融温度が６５℃を超えるような、好ましくは７０℃を超えるような、長さおよびＧＣ含量を有し得る。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態において、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼおよび類似の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから選択される。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性を保持し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含有しない（図１Ｂ参照）。さらに、鋳型核酸が１本鎖ＲＮＡである場合、使用される逆転写酵素は、ＡＭＶ−ＲＴ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および類似の耐熱性酵素から選択される。
【００４５】
その他−好熱性ポリメラーゼの可能性
好熱性ＤＮＡポリメラーゼ
【００４６】
ポリメラーゼおよび（業者）
【００４７】
ＶｅｎｔＲ（登録商標）（ＮＥＢ）
【００４８】
ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）（登録商標）（ＮＥＢ）
【００４９】
Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ＮＥＢ）
【００５０】
Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）（ＮＥＢ）
【００５１】
Ｔａｇ（ＮＥＢ）
【００５２】
ＰｙｒｏＳｃｒｉｐｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）
【００５３】
ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３、野生型（Ｌｕｃｉｇｅｎ）
【００５４】
ＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｇ（ＮＥＢ）
【００５５】
Ｂｓｔポリメラーゼ
【００５６】
Ｐｈｉｒｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ（ＮＥＢ）
【００５７】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
【００５８】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（ＮＥＢ）
【００５９】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ（ＮＥＢ）
【００６０】
９  Ｎｍ（ＮＥＢ）
【００６１】
ＤｙＮＡｚｙｍｅ  ＩＩ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ（ＮＥＢ）
【００６２】
ＤｙＮＡｚｙｍｅ  ＥＸＴ（ＮＥＢ）
【００６３】
ＤｒｅａｍＴａｇ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
【００６４】
Ｔａｇ（ネイティブ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
【００６５】
Ｍａｘｉｍａ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｇ（Ｆｅｍｅｎｔａｓ）
【００６６】
Ｐｆｕ（組み換え）、（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
【００６７】
Ｂｓｍ（大フラグメント）、（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
【００６８】
ＴｒｕｅＳｔａｒｔ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｇ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
【００６９】
Ｔｆｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００７０】
ＡｍｐｉＴａｇ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００７１】
ＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００７２】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ
【００７３】
本発明のさらなる実施形態において、反応混合物は、好ましくは、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、例えばＴ４遺伝子３２タンパク質または、好熱性生物から単離され、クローニングされた耐熱性のＳＳＢなどを含む。
【００７４】
さらに、酵素標品は、１または２本鎖核酸不安定化剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはホルムアミドなどを、好ましくは総反応体積の８から１５％の濃度で含む。あるいは他の試薬、例えばグリセロールデアザ−ｄＧＴＰ、３ダゾプレイン（ｄａｚｏｐｕｒｅｉｎ）、ｄＩＴＰを、単独で、または互いにもしくは先に挙げた物質と組み合わせて使用し得る。
【００７５】
本発明の実施形態は、発熱素子上にマイクロ流体層が置かれる廉価のポイント・オブ・ケア核酸診断での使用に対して理想的に適している。温度範囲サイクリング要件を少なくすることによって、反応溶液の温度を迅速に回すために、受動冷却機構付きの比較的単純な加熱を使用できるようになる。熱サイクリング中の最大温度が低いほど、増幅反応全体に負の影響を及ぼし得る液体蒸発が最小限に抑えられる。より重要なこととして、増幅のロバスト性が従来のＰＣＲプロセスと比較して大きく改善しており、それにより、新しい方法は、増幅プロセス中の温度のゆらぎ（不正確な温度調節）に適応することができる。本発明の特異的な反応化学は、反応体積全体にわたり温度を均一にする必要なく、多岐にわたる溶融（例えば７０−１０５℃、基本的に泡形成に反応しない）およびハイブリッド形成温度で機能することが示された。最後に、本発明の実施形態は、アルコールおよび塩（例えば〜１０％エタノール）の存在下で良好に機能するので、アルコールベースの洗浄（例えば、エタノールまたはイソプロパノール）と、従来の核酸抽出化学を含む核酸溶出段階との間の、遠心、熱乾燥または真空段階が不要となり、前もって行う核酸単離法の厳格性が大きく軽減される。
【００７６】
本発明の実施形態は、病原体の核酸が標的核酸である、生体試料中の病原体の検出を含む。あるいは、本発明は、染色体ＤＮＡの相違を検出するために使用され得、この場合、染色体ＤＮＡのフラグメントが標的核酸である。このような方法において、同じまたは異なる起源からの標的核酸において一塩基多型が検出され得る。
【００７７】
本発明の増幅技術の実施形態は、「周期変動性ＰＣＲ増幅反応」（ＯＰＣＲａｒ）と呼ばれる。ＯＰＣＲａｒは、限定されないが、反応溶融温度を低下させる２本鎖不安定化剤および、所定の熱サイクルにおいてアニーリング温度を上昇させるための、溶融温度（Ｔｍ）が非常に高いオリゴヌクレオチドプライマーの併用に基づく。このようにして、好ましくは  ２０℃、より好ましくは１５℃未満、なおより好ましくは１０℃未満の異なる温度の間での迅速な熱サイクリングによって、標的核酸のインビトロ増幅が行われ得る（図１Ａ）。標的核酸の上流（５’）および下流（３’）領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型とハイブリッド形成し、これによって、標的を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能となる。使用されるＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性がない鎖置換ポリメラーゼである場合、必要とされる溶融温度を低下させるための二重鎖不安定化剤とともに作用するならば、２本鎖標的核酸の完全な熱変性は不要である。温度サイクリングプロセスが繰り返され、その結果、特異的な核酸標的配列が指数関数的に増幅される（図１Ｂ）。ＯＰＣＲａｒにおいて、２本鎖標的核酸は、温度に依存して、二重鎖の部分的または完全変性の何れかをもたらし得る溶融段階に入る。標的の末端で二重鎖がほどけ始め、１本鎖核酸が１本鎖結合タンパク質（丸）によって結合し、これにより安定化される。反応物が冷却され、標的二重鎖の各鎖の５’末端にプライマーが特異的にハイブリッド形成する、ハイブリッド形成／重合段階に入る。プライマーハイブリッド形成後、ＤＮＡポリメラーゼ（四角）は鋳型／プライマー二重鎖に結合し、ｄＮＴＰの組み込みにより５’→３’方向にプライマーを伸長させ、ＤＮＡの鋳型鎖をコピーする。使用されるポリメラーゼが鎖置換活性を有する場合、部分的に変性した複合体において逆側の鎖（ｓｔａｎｄ）を置換することができる。新しい二重鎖ＤＮＡの生成時、熱サイクルを多数回繰り返し、その結果、標的核酸配列が指数関数的に増幅される。
【００７８】
ＯＰＣＲａｒ法は、限定されないが、反応溶融温度を低下させる核酸不安定化剤および、熱サイクリング中、アニーリング温度を上昇させるための、溶融温度（Ｔｍ）が非常に高い２つのオリゴヌクレオチドプライマーの併用に基づく。所定の標的核酸に対して、一方のオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、標的配列を含有するセンス鎖の５’末端とハイブリッド形成し、一方のプライマーは、好ましくは、逆相補的標的配列を含有するアンチセンス鎖の５’末端とハイブリッド形成する。ＯＰＣＲａｒは、好ましくは、限定されないが、効率的な標的核酸増幅に必要な溶融または変性温度をさらに低下させるために、エキソヌクレアーゼ活性がない鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの使用を利用する。ＯＰＣＲａｒは、付属タンパク質の存在下または非存在下で標的核酸を増幅させ得る。任意の特定のＯＰＣＲａｒ系は、混合物内での成分の付加、除去または置換によって最適化され得る。
【００７９】
この増幅技術は、廉価で迅速なポイント・オブ・ケア核酸診断と関連して先行技術で報告されている他の増幅法を上回る改良特性を有する。上述の核酸増幅法とは異なり、そのロバストな酵素性プロセスにより可能となるＯＰＣＲａｒ系は、ロバストであり、高速で、廉価な加熱機器の温度ゆらぎに耐性があるので、廉価なポイント・オブ・ケア適用に理想的に適している。熱サイクリング中に直面する温度の差異を最小限に抑えることによって、ＯＰＣＲａｒは、ＰＣＲのスピードおよび信頼性と、等温増幅法のより低い機器装備要件とを兼ね備える。
【００８０】
ＯＰＣＲａｒ系の簡易な熱サイクリング要件は、受動冷却機器に理想的に適しており、チャンバの一方の面に加熱が適用され得、反対側の面での大気への熱放散を通じて冷却が起こる。このような受動冷却によって、あらゆる核酸診断機器のコストおよび複雑性が劇的に低下する。受動冷却は、診断機器での使用に関して以前に報告されているが、これらの機器は、標的核酸を増幅するために従来のＰＣＲサイクリングアッセイ化学を使用しており、これにより反応速度が制限される（Ｌｕｏ  ｅｔ．ａｌ．Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００５；Ｗｉｌｄｉｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９６；Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８；）。ＯＰＣＲａｒの別の利点は、広範囲の溶融およびアニーリング温度にわたり、効率的な核酸増幅が起こり得、結果的に、必要とされる温度調節機構の厳格性が低くなることである。小型化核酸診断の構築において、反応体積全体にわたる均一な温度の維持は、厳しいものとなる可能性があり、特に反応チャンバの加熱側と非加熱側との間で高い温度勾配が生じる。このような温度変化の結果、従来のＰＣＲまたは等温反応化学を使用した増幅は非効率的となり得る。ＯＰＣＲａｒは、ロバストなポリメラーゼ、不安定化試薬および他のポリメラーゼ付属因子の組み合わせの使用を通じて、正確な温度制御および維持に関する問題を最小限に抑えるように設計されており、反応チャンバの最冷領域が、所定の核酸標的に対する最低の可能な溶融温度および最高の可能なアニーリング温度を維持する限り、反応体積の他の領域が１０℃を超えて変化するとしても、反応が効率的に進行する。さらに、電力／エネルギー消費が最小であるロバストなＯＰＣＲａｒの増幅化学の性質により、かなり大きい体積（典型的なμＰＣＲチップでμｌ以下であるのに対して例えば２０μｌ）での増幅反応を迅速かつ効率的なものにすることができるようになり、前もって行われる試料調製／核酸単離プロセスの厳格性（高濃度核酸であり、かつ、例えば塩およびエタノールの持ち越し物などの何らかの微量混入物質および阻害物質不含の超純粋核酸である、μｌ以下の投入鋳型を得ることに関して）および超高濃度および超高純度のＰＣＲ酵素および生物学的試薬（ｂｉｏｅａｇｅｎｔｓ）の要件が大幅に緩められた。
【００８１】
溶媒試薬
ＤＭＳＯおよびホルムアミドなどの溶媒は、添加される体積１％ごとに〜０．５から０．７℃、二重鎖核酸の溶融温度を低下させることが知られている。これらの試薬は、高ＧＣ含量を含有し、したがってＴｍが高い標的核酸の増幅効率を向上させるために、溶融しにくい２本鎖鋳型の完全変性を促進するために、使用されることが多い。一般に、ＰＣＲ熱サイクリング温度は、ＰＣＲ反応への二重鎖不安定化剤の組み込み時には一定に維持される。対照的に、ＯＰＣＲａｒは、好ましくは、熱サイクルの溶融温度を劇的に低下させるために比類なく高濃度のＤＭＳＯの添加を利用する。従来のＰＣＲにおいて、１０％ｖ／ｖを超えるＤＭＳＯが使用されることは稀であるが、これは、これらの高濃度の試薬は、溶融段階の高温状態（一般に９０℃超）と合わさると、ポリメラーゼ活性喪失を伴うからである。ＯＰＣＲａｒ系および方法は、一方で、好ましくは、１０から１５％の間のＤＭＳＯ濃度を使用する。予想外に、この量のＤＭＳＯは、著しいポリメラーゼ活性喪失を生じさせない。
【００８２】
ここで図２を参照して、本発明のある実施形態による増幅は、条件に依存して、様々なＤＮＡポリメラーゼと適合する。ＶｅｎｔＲポリメラーゼを用いた多重逆転写−ＯＰＣＲａｒ条件下で、インフルエンザＡウイルス（０．３ｎｇ／μＬ）を含有する鼻腔吸引物から単離されるリボ核酸を核酸鋳型として使用した。ＯＰＣＲａｒプライマー、ＦＰ３およびＲＰ４を使用して、１５３ｂｐの産物を生成させ、臭化エチジウムで染色した１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によりこれを可視化した。反応は全てＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を含有し、熱サイクリング前に最初のｃＤＮＡ生成段階を５５℃で５分間行った。ゲルのレーンは、ＤＭＳＯの濃度、使用した溶融およびハイブリッド形成段階温度とともに表示しており、反応は４０回繰り返した。
【００８３】
従来のＰＣＲ酵素、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ反応混合物は、何らかの微量のアルコール、例えばエタノールに非常に敏感であり、一方、本発明のある実施形態において、新規反応混合物は、エタノールによる阻害に非常に耐性がある。ここで図３を参照して、本発明のある実施形態による核酸増幅に対するエタノールの影響が明らかとなる。カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ，Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）感染葉組織（３．４ｎｇ／μＬ）から単離した全核酸を出発鋳型として使用した。ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｔ  ＳＳＢならびにプライマー、ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖを用いて、１５％ＤＭＳＯ存在下のＯＰＣＲａｒ条件（図３Ａ）またはＴａｑポリメラーゼならびにプライマー、ＨＬＢａｓ−Ｐ２およびＨＬＢｒ−Ｐ１を用いた従来のＰＣＲ条件（図３Ｂ）下の何れかで反応を行った。ＯＰＣＲａｒ溶液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、７６℃で１０秒間と６０℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル行い、１３９ｂｐの産物を生成させた。従来のＰＣＲ反応液を９５℃で２分間加熱し、次いで９５℃で１０秒間と５８℃で４０秒間との間で変動させて４０サイクル行い、１３０ｂｐの産物を生成させた。臭化エチジウムで染色した１２％アクリルアミドゲル上で増幅産物を可視化した。増幅反応混合物中に含まれたエタノール濃度を示す。従来のＰＣＲ（図３Ｂ）と比較した場合、ＯＰＣＲａｒ法（図３Ａ）が、エタノールによる不活性化に対してより著しく耐性があることは明らかである。
【００８４】
典型的なＯＰＣＲａｒ条件下でＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼおよびＥｔ  ＳＳＢを使用すると、１０％以下のエタノールでは活性喪失はない。これは、廉価なポイント・オブ・ケア機器に対するＯＰＣＲａｒの応用に関して、重要なさらに驚くべき発見である。その後、ＰＣＲおよび等温増幅の一般通例では、通常、使用者に対して、アルコールおよび塩不含である高純度の核酸投入を提供することが推奨される。結果として、殆ど全ての研究者が、ＰＣＲ増幅プロセスを通じて、試料を処理する前に、アルコールベースの洗浄と、核酸親和性マイクロビーズ、ガラスフリット、マトリックスまたはフィルタなどからの標的核酸抽出との間に、ある種の真空乾燥、空気乾燥、スピンダウンまたは加熱段階を取り入れている。集積型ポイント・オブ・ケア診断機器の例の場合、核酸の増幅および検出に加えて、機器はまた迅速に標的核酸を単離しなければならない。一般に、これは、核酸をグラスファイバーマトリックスに結合させ、かなりの濃度の塩およびエタノールの存在下で洗浄し、続いて最低限の塩を含有、エタノール不含の緩衝液中で抽出することにより行われる。溶出前に、溶出体積に対する持ち越しを防ぐために結合マトリックス上で保持される洗浄緩衝液を除去するが、市販の核酸単離キットでは、これは一般的には遠心により行われる。ＯＰＣＲａｒの特異的な酵素混合物によって、この、核酸単離中にエタノールを慎重に除去する必要がなくなり、本発明のこの実施形態は、真空、遠心、空気乾燥または加熱乾燥部品を必要としない廉価な集積型診断に合うものとなる。
【００８５】
プライマー
ここに記載されたようなオリゴヌクレオチドプライマーは、当該技術分野で公知の方法によって合成および精製され得る（例えば米国特許第６，２１４，５８７号参照）。本実施形態において、標的核酸配列を指数関数的に増幅させるために、プライマー対を代表する２つの配列特異的なプライマーを使用する。第一のプライマーは、標的核酸の上流５’領域とハイブリッド形成し、第二のプライマーは、標的配列の下流、３’領域とハイブリッド形成する。プライマーは、標的二重鎖に存在する一方の鎖の５’末端とハイブリッド形成し、標的ヌクレオチド配列を鋳型として使用して、プライマーが５’から３’の方向にポリメラーゼにより伸長される（図１Ｂ）。ハイブリッド形成の条件は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｐｕｂ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００３）に記載のような標準的なものである。所定の標的配列の特異的な増幅を達成するために、プライマー中の全てのヌクレオチドが標的配列に相補的である相同プライマーが好ましい。しかし、プライマーは、鋳型核酸に対して非相同である塩基または標的ヌクレオチド配列に対して非相補的である５’配列を含み得る。同じ反応混合物中で複数の核酸標的を同時に増幅するために、１回のＯＰＣＲａｒ実験において複数のプライマー対を使用し得る。いわゆる多重化は、一塩基多型分析において、病原体の検出において、および個々の反応への内部対照の組み込みのために、一般的に使用される技術である。異なる内部病原体配列を有する標的配列全てのユニバーサル増幅を可能にする各標的特異的３’領域に導入される５’ユニバーサルタグ配列の使用を通じて、より高レベルの多重化も達成され得る。
【００８６】
オリゴヌクレオチドプライマー設計は、いくつかのパラメータ、例えば溶融温度など、およびプライマー内およびプライマー間配列アラインメントを含む。溶融温度は、プライマーの長さおよびＧＣ含量などの因子により支配される。プライマー間配列相補性の結果、ヘアピン構造が生じ得るが、これは効率的な増幅を妨げ、一方で、プライマー内相同性の結果、プライマー二量体と呼ばれる不要な増幅産物が生じ得る。プライマーを設計する際、増幅しようとする核酸分子に特異的であり、それ自身または増幅反応中に存在する他のプライマーの何れかとの相互作用が最低限に抑えられる配列を標的内で選択することは重要である。
【００８７】
殆どの核酸増幅ストラテジーにおいて、プライマーの溶融温度は、好ましくは、ハイブリッド形成および増幅が行われる温度よりも約１０から３０℃高い。ＰＣＲ反応においてアニーリング／重合段階の温度が５５から６０℃である場合、プライマーは一般的には１８から３０塩基対長である。この特異的なオリゴヌクレオチド長は、配列特異性の喪失なく容易なプライマー結合を可能にするために最低限に抑えられる。しかし、ＯＰＣＲａｒ系において、プライマーは、好ましくは、アニーリング段階の温度を上昇させるために、３５から５５塩基対と非常に長く、溶融温度が好ましくは７０から８０℃になるように設計される。典型的ＯＰＣＲａｒ反応で使用される二重鎖不安定化剤、ＤＭＳＯのレベル（〜１０から１５％）を考慮すれば、ＯＰＣＲａｒプライマーのＴｍ計算値は、好ましくは熱サイクリング中に使用されるアニーリング温度よりもわずか１０℃未満だけ高くなる。実験において、過剰な長さのＯＰＣＲａｒプライマーを使用して、（ＤＭＳＯ濃度を補填する）プライマーＴｍとアニーリング／伸長温度の差が最小限であるにもかかわらず、効率的な増幅が起こる。
【００８８】
ここで図４を参照して、ＯＰＣＲａｒプライマーは、本発明のある実施形態による効率的な増幅を支えるためにアニーリング段階温度とプライマーＴｍとの間で最小限の差が必要である。プライマーｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖを用いてｈｙｖｌ遺伝子配列（１２ｎｇ／μＬ）を含有するプラスミドを増幅して１３９ｂｐの産物を生成させ、臭化エチジウムで染色した１２％アクリルアミドゲル上での電気泳動によりこれを可視化した。最初の２分間の８５℃の溶融段階後、全反応を指定の溶融およびハイブリッド形成温度のそれぞれで１０秒間、４０サイクル繰り返した。プライマー、ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖに対するＴｍ計算値は、それぞれ７２．２℃および７０．９℃である。１０％ＤＭＳＯ中で反応を行ったが、これにより、１％体積あたり０．７℃低下すると仮定すると、有効Ｔｍが７℃低下することになる。プライマーＴｍとハイブリッド形成温度との間の差はごく僅かであるものの、温度差がかなり小さいかのように効率的に増幅反応が進行することが観察される。
【００８９】
ここで図５を参照して、ＯＰＣＲａｒを用いたプライマー二量体形成におけるホットスタートＤＮＡポリメラーゼの影響。プライマー対、ＦＰ３およびＲＰ４（各８μΜ）および１５％ＤＭＳＯの存在下で、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴおよび、ＴａｑまたはＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、核酸鋳型を含有しない対照反応を行った。サイクリングパラメータは、５５℃で５分間と、８５℃で２分間と、８０℃で１５秒間および６５℃で１５秒間を４０サイクルとであった。１２％アクリルアミドゲル上での電気泳動後、臭化エチジウムで染色することによってＯＰＣＲａｒ産物を可視化した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑは、通常のＰＣＲ条件下で反応溶液を９４℃に加熱した際に解離する抗体と複合化されている市販のホットスタート酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。鋳型核酸の存在下で、このプライマー対は１５３ｂｐの産物を生成させる。このホットスタート標品は、ＯＰＣＲａｒ中の１１０ｂｐ未満プライマー二量体形成を減少させることにおいて従来のＴａｑと変わりはないことは明らかである。ＯＰＣＲａｒ反応で使用される長いプライマーの、ある複雑な状況とは、それらが、結果的にプライマー二量体として知られる非特異的で不要な増幅産物を生じさせる傾向がより大きいということである。増幅反応開始時の最初の温度上昇中にプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端が一時的に互いに結合した場合、プライマー二量体が形成される。この重要な期間中、ＤＮＡポリメラーゼは、これらの一時的複合体を伸長させ得、その結果、熱サイクリング中、特に開始鋳型核酸濃度が非常に低い場合、特異的な標的増幅と競合する産物が生じる。ＰＣＲ中にプライマー二量体形成を低減させるために一般に使用される技術は、いわゆる「ホットスタート」ＤＮＡポリメラーゼを利用することである。これらの市販の酵素は、抗体などの阻害分子と非共有結合している。反応温度が９０℃を超えて上昇する場合、阻害分子が解離してポリメラーゼを解放し、正常に機能できるようにする。しかし、驚くべきことに、発明者らの側では、ホットスタート酵素Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、多量のプライマー二量体増幅をはっきりと減少させられず、このことから、一般的に使用されるこの方法は、ＯＰＣＲａｒには不十分であることが示され、ＯＰＣＲａｒプロセスが、従来のＰＣＲプロセスにおいて通常は起こらないホモおよびヘテロ二量体の一時的な動力学的衝突由来の二量体形成を可能にする旧来のＰＣＲよりも、かなり効率のよい増幅プロセスであることが示唆される。
【００９０】
ここで図６を参照して、本発明のある実施形態によるＯＰＣＲａｒ中のプライマー二量体形成におけるＧＣおよびＡＴクランプの影響を例示するゲルが表示されている。プライマー二量体形成に対する傾向を調べるために、出発鋳型（３．５ｎｇ／μＬ）の非存在下で、カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）の伸長因子遺伝子を増幅させるために設計されたプライマーを使用した。鋳型の存在下で、様々なプライマーセットに対する産物の大きさは、１４０から１５５ｂｐの範囲である。プライマー配列は、右側に見られ、ＡＴまたはＧＣクランプを灰色で示す。「ｍｏｄ」プライマーセットの場合、各プライマーは、第二のプライマーとの相同性を向上させる、鋳型（下線）に対する非相同塩基を含有する。反応は全て、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｔ  ＳＳＢを用いて、１５％ＤＭＳＯの存在下で行った。溶液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で１５秒間と６５℃で１５秒間との間で周期的に変動させて、３０または４０サイクルの何れかを行った。臭化エチジウムで染色した１２％アクリルアミドゲル上で増幅産物を可視化した。明らかに観察されるように、ＧＣクランプ・プライマー・セットにより、顕著なプライマー二量体形成が起こり、一方でＡＴクランププライマーでは、プライマー二量体形成が起こらない。
【００９１】
プライマー二量体形成の可能性を最小限に抑えるために、従来のＰＣＲプライマーを生成させるために使用されるものとは異なるいくつかのストラテジーを使用するようにＯＰＣＲａｒプライマーが設計され得る。第一に、ＰＣＲプライマーは、一般に「ＧＣクランプ」と呼ばれるＧＣに富む３’末端を保持し、その結果、標的配列への特異的な結合がより多くなる。しかし、ＯＰＣＲａｒプライマーにおいて、プライマーの３’領域でのＧＣ含量が高いと、その結果、プライマー二量体形成が多くなることが認められており、したがってＯＰＣＲａｒプライマーは、これらの不要な増幅産物を生じさせる３’−３’プライマー相互作用の親和性をエネルギー的に低下させるために、ＡＴに富む３’領域を含有するようにされる（図６）。ＯＰＣＲａｒプライマー設計の第二のストラテジーは、少なくとも５個の連続ヌクレオチドの相補的５’または内部配列を含有するプライマーを設計することである。このようにして設計されたオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ伸長に対して競合しない二重鎖構造に対して、最初の反応温度上昇中にあらゆるプライマーハイブリッド形成を導く。標的核酸配列中で適切な相補的配列を見つけることができない場合、非相同または突然変異がある塩基を使用して、ＯＰＣＲａｒプライマー内でそれらを生成させることができる。例外的な長さのＯＰＣＲａｒプライマーは、増幅反応の初期のサイクル中のプライマーと標的との間の小さな誤った対形成を克服する。プライマーセットは、以下の通りである。
ＥＵ  ＡＴ
フォワード
ＧＴＴＣＴＴＧＴＡＧ  ＣＧＴＴＧＣＡＧＴＣ  ＴＴＣＴＧＣＧＧＡＡ  ＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴ  ＴＧＣＴＴＴ（配列番号２１）
リバース
ＧＧＧＣＡＣＧＴＴＴ  ＡＴＴＡＧＣＡＡＣＡ  ＡＴＡＧＡＡＧＧＡＴ  ＣＡＡＧＣＡＴＣＴＧ  ＣＡＣＡＧＡＡＡＴ（配列番号２２）

ＥＵ  ＧＣ
フォワード
ＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴ  ＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣ  ＴＧＣＧＧＡＡＧＡＴ  ＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣ  ＴＴＴＣＴＧＣＧ（配列番号２３）
リバース
ＣＡＣＧＴＴＴＡＴＴ  ＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡ  ＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡ  ＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣ  ＡＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧ（配列番号２４）

ＥＵ−Ａｔｍｏｄ
フォワード
ＧＧＴＧＴＴＣＴＴＧ  ＴＡＴＣＧＴＴＧＣＡ  ＧＴＣＴＴＣＴＧＣＧ  ＧＡＡＧＡＴＡＡＧＧ  ＡＡＴＴＧＣＴＴＴ（配列番号２５）
リバース
ＧＴＡＡＴＧＧＧＣＡ  ＣＧＴＴＴＡＴＴＡＧ  ＣＡＡＣＧＡＴＡＧＡ  ＡＧＧＡＴＣＡＡＧＣ  ＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧ  ＡＡＡＴ（配列番号２６）

ＥＵ  ＧＣｍｏｄ
フォワード
ＣＴＴＧＴＡＴＣＧＴ  ＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣ  ＴＧＣＧＧＡＡＧＡＴ  ＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣ  ＴＴＴＣＴＧＣＧ（配列番号２７）
リバース
ＧＧＣＡＣＧＴＴＴＡ  ＴＴＡＧＣＡＡＣＧＡ  ＴＡＧＡＡＧＧＡＴＣ  ＡＡＧＣＡＴＣＴＧＣ  ＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡ  ＣＣＧ（配列番号２８）
【００９２】
ＯＰＣＲａｒプライマーは、デオキシリボヌクレオチド塩基アデニン「Ａ」、チミン「Ｔ」、グアニン「Ｇ」またはシトシン「Ｃ」及び／又は１つまたは複数のリボヌクレオチド塩基、Ａ、Ｃ、ウラシル（ｕｒａｃｅｉｌ）「Ｕ」、Ｇの何れかを含み得る。さらに、ＯＰＣＲａｒプライマーは、１つまたは複数の修飾デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基を含有し得るが、この修飾は、標的核酸に対するプライマーハイブリッド形成、ポリメラーゼによるプライマー伸長または二重鎖核酸の変性を妨げない。ＯＰＣＲａｒプライマーは、メチルホスホナートもしくはホスホロチオアートなどの化学基により、非ヌクレオチドリンカーにより、ビオチンにより、またはカルボキシフルオレセインのアミン反応性フルオレセインエステルなどの蛍光標識により、修飾され得る。このような修飾は、プライマー機能を高め得るか、または増幅産物の検出および特性評価を容易にし得る。
【００９３】
ポリメラーゼ
ＯＰＣＲａｒ中に１本鎖鋳型核酸領域がプライマーとハイブリッド形成した後、重合段階が起こる。標的核酸がＤＮＡである場合、４種類のｄＮＴＰヌクレオチド塩基存在下で核酸鋳型に沿ってハイブリッド形成したプライマーを伸長させ、２本鎖産物を形成させる（新たに合成された鎖は鋳型のヌクレオチド配列に対して相補的である。）ために標的において作用するＤＮＡポリメラーゼが選択される（図１）。最初の標的がＲＮＡである場合、ＤＮＡポリメラーゼによりＯＰＣＲａｒ中にさらに増幅されるｃＤＮＡ分子へとＲＮＡ鋳型をコピーするために、逆転写酵素が最初に使用される。
【００９４】
特に、不安定化剤およびアルコールの存在下で、熱安定性およびプロセシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）に基づき、ＯＰＣＲａｒに対して様々なＤＮＡポリメラーゼが選択され得る（図２）。必要ではないものの、鎖置換活性を示し、エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼは、ＯＰＣＲａｒ反応を顕著に改善することが分かっている（図２）。適切なＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ・大フラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＶｅｎｔＲまたはＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ＤｅｅｐＶｅｎｔＲまたはＤｅｅｐＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および類似の酵素が挙げられる。適切な耐熱性逆転写酵素としては、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および類似の酵素が挙げられる。ＯＰＣＲａｒ増幅の独特のロバスト性の要件ゆえに、公表されている従来のＰＣＲ増幅ポリメラーゼ混合物では、ＯＰＣＲａｒを行うことができないことに注意すべきである。選択ポリメラーゼおよびバイオ試薬成分は全て、使用前に慎重に評価し、実験的に試験すべきである。
【００９５】
１本鎖結合タンパク質
ＯＰＣＲａｒ系は、好ましくは溶融段階とアニーリング熱サイクリング段階との間の温度差を最小限にするが、この温度差は、二重鎖核酸の完全変性が不要である場合に最小となる。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼがこの点で役立つ一方、効率的な増幅に対する温度要件をさらに低くするために付属タンパク質が使用され得る。１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、２本鎖の二重鎖形成のアニーリングを妨げるために１本鎖核酸を安定化することが知られており、核酸増幅反応の効率を向上させることが示されている。本発明の実施形態によるＯＰＣＲａｒ法への耐熱性ＳＳＢの添加の結果、活性が向上することが分かっている（図７）。例としては、Ｅｔ  ＳＳＢ（ＢｉｏＨｅｌｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）であるが、ＳＳＢの選択は、特異的なタンパク質に限定されず、好熱性生物から単離され、クローニングされたかまたは非耐熱性前駆体ＳＳＢから改変されたＳＳＢを含み得る。
【００９６】
ここで図７を参照して、本発明のある実施形態によるＯＰＣＲａｒ産物形成における１本鎖結合タンパク質の影響を示すゲルが例示される。ＯＰＣＲａｒプライマー、ＦＰ３およびＲＰ３を使用して、ユニバーサルインフルエンザＡ１本鎖ＤＮＡ鋳型（１Ｅ６コピー／μＬ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を増幅させ、１３３ｂｐの産物を生成させ、これを臭化エチジウムで染色した１２％アクリルアミドゲル上での電気泳動により可視化した。次の条件下で、耐熱性ＳＳＢの存在下または非存在下で、本発明のある実施形態によるＯＰＣＲａｒを行った：ｉ）１５％ＤＭＳＯ；ｉｉ）１５％ＤＭＳＯ、５％グリセロール；ｉｉｉ）１５％ＤＭＳＯ、０．２５Ｍベタイン。全ての反応に対して使用したサイクリングパラメータは、７５℃で１５秒間および６５℃で１５秒間であり、４５回繰り返した。
【００９７】
ＯＰＣＲａｒを支援する耐熱性ＳＳＢに加えて、ＯＰＣＲａｒ溶液の最初の加熱におけるプライマー二量体形成を減少させるために、Ｔ４バクテリオファージＳＳＢ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）などの非耐熱性ＳＳＢを使用し得る（図８）。モル過剰量のＴ４遺伝子３２タンパク質存在下でＯＰＣＲａｒプライマーを予め温置し、次いでそれらを反応混合物に添加することにより、ＯＰＣＲａｒ中のプライマー二量体の不要な増幅が最小限に抑えられることが認められている。これらのＳＳＢは、推定されるように１本鎖オリゴヌクレオチドプライマーに結合し、それにより、３’−３’対形成、したがってプライマー二量体形成の可能性が低下する。６５℃を超えて溶液を加熱すると、Ｔ４ＳＳＢが変性し、熱サイクリング中の正常な反応性のためにプライマーを放出する。ここで図８を参照して、ゲルは、Ｔ４遺伝子３２タンパク質とプライマーとの予温置を行った本発明のある実施形態中、形成されるプライマー二量体の量が減少することを例示する。反応混合物への添加前に、指定の化学量論的過剰量の活性単位のＴ４遺伝子３２タンパク質（Ｔ４  ＳＳＢ）とともに２５℃で５分間、１ＸＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ．ＭＡ）の存在下でＯＰＣＲａｒプライマーを温置した。プライマー、ＦＰ３およびＲＰ３を用いて合成ユニバーサルＦｌｕ  Ａ  ＤＮＡ鋳型（１Ｅ６コピー／μＬ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を増幅し、１３３ｂｐの産物配列を生成させた。反応を８５℃で２分間保持し、続いて７５℃で１５秒間および６５℃で１５秒間を５０サイクル繰り返した。臭化エチジウムで染色した１２％アクリルアミドゲル上での電気泳動によって反応産物を可視化した。データの再現性を評価するために、異なる研究者によって、異なる日に図７に記載の実験を繰り返したが、これを図８で示す。予温置を行わない場合（最も右のレーン）と比較すると、Ｔ４  ＳＳＢとのプライマーの予温置が、増幅産物の量を増加させ、同時にプライマー二量体バンド（〜１００ｂｐ）の強度を低下させることが明らかに観察され得る。
【００９８】
ＯＰＣＲａｒ法は、題名「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ  ＤＥＶＩＣＥ  ＦＯＲ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」の、本明細書と同日提出の権利者が共通の特許仮出願に記載のものなどの機器との使用に対して特によく適している。その機器のある一定の実施形態の配置によって、溶液を同じチャンバ中に留めながら、好ましくは能動冷却なしで、溶液の温度を迅速に循環させることができるようになる。例えば、温度は、２０秒以下、またはより好ましくは１５秒以下、またはより好ましくは約８秒以下、またはより好ましくは約４秒以下で、ＯＰＣＲａｒを行うのに十分に上下し得る。したがって、８秒という短時間で、または８秒間よりもさらに速く、ＯＰＣＲａｒ温度サイクルを行い得る。
【実施例１】
【００９９】
実施例１：ＯＰＣＲａｒによるＤＮＡ標的二重鎖の増幅方法
ＯＰＣＲａｒが、２本鎖ＤＮＡ検体に存在する特異的な標的配列を増幅させることができることを明らかにするために、発明者らは、ＯＰＣＲａｒ系によって、２種類のＯＰＣＲａｒプライマー、プライマーＨＬＢ（Ｈｕａｎｇ  Ｌｏｎｇ  Ｂｉｎｇ）ＦｏｒＳｈおよびプライマーＨＬＢＲｅｖＳｈを使用し、カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）の伸長因子遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントから１４０ｂｐ配列を生成させた。ＯＰＣＲａｒ緩衝液（１０Ｘ）を予め調製したが、これには４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウムおよび０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有された。次のものを混合することにより、２０μＬ  ＯＰＣＲａｒ溶液を用意した：
８．４μＬ  水
２．０μＬ  １０ｘＯＰＣＲａｒ緩衝液
３．０μＬ  ＤＭＳＯ
０．４μＬ  塩化カリウム（２Ｍ）
０．５μＬ  塩化マグネシウム（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ジチオスレイトール（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
２．０μＬ  プライマーセット、ＨＬＢＦｏｒＳｈおよびＨＬＢＲｅｖＳｈ（各４μＭ）
０．５μＬ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）
０．２μＬ  Ｅｔ  ＳＳＢ、超耐熱性１本鎖結合タンパク質（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（５００μｇ／ｍＬ）
２．０μＬ  ＰＣＲ産物希釈液（０．６から０．０００６ｎｇ／μＬ出発濃度）。
【０１００】
この反応液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で５秒間と６５℃で５秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。反応完了後、５μＬのＯＰＣＲａｒ産物を２μＬの６Ｘ試料ローディング緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および１μＬのホルムアミドと混合し、１２％アクリルアミドゲル上で流し、臭化エチジウムで可視化した。示される全ての希釈度で１４０ｂｐ産物が明らかに観察されたが、これは、ＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する（図９）。
【０１０１】
ここで図９を参照して、本発明のある実施形態による２本鎖ＤＮＡ中に存在する特異的標的配列の増幅がゲルにおいて示される。カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）伸長因子遺伝子（０．６から０．０００６ｎｇ／μＬ）のＰＣＲ増幅フラグメントの連続希釈液を出発鋳型として使用した。１５％ＤＭＳＯの存在下で１４０ｂｐ配列を生成させるためにＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｔ  ＳＳＢおよびプライマー、ＨＬＢＦｏｒＳｈおよびＨＬＢＲｅｖＳｈを使用して反応を行った。これらの反応液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で５秒間と６５℃で５秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。臭化エチジウムで染色して１２％アクリルアミドゲル上でＯＰＣＲａｒ産物を可視化した。示される全ての希釈度で標的配列の予想の長さと合致する１４０ｂｐ産物が明らかに観察された。
【実施例２】
【０１０２】
実施例２：ＯＰＣＲａｒによる１本鎖ＤＮＡ標的の増幅方法
ＯＰＣＲａｒが１本鎖ＤＮＡ鋳型から特異的な標的配列を増幅可能であることを明らかにするため、発明者らは、ＯＰＣＲａｒ系によって市販のユニバーサルインフルエンザＡ鋳型（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）から１５３ｂｐ配列を生成させるために、ＯＰＣＲａｒプライマー、ＦＰ３およびＲＰ４を使用した。１０ｘＯＰＣＲａｒ緩衝液には、４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウムおよび０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有された。次のものを混合することにより、２０μＬ  ＯＰＣＲａｒ溶液を用意した：
８．４μＬ  水
２．０μＬ  １０ｘＯＰＣＲａｒ緩衝液
３．０μＬ  ＤＭＳＯ
０．４μＬ  塩化カリウム（２Ｍ）
０．５μＬ  塩化マグネシウム（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ジチオスレイトール（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
２．０μＬ  プライマーセットＦＰ３およびＲＰ４（各８μＭ）
０．５μＬ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）
０．２μＬ  Ｅｔ  ＳＳＢ、超耐熱性１本鎖結合タンパク質（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（５００μｇ／ｍＬ）
２．０μＬ  １本鎖ＤＮＡ鋳型（１Ｅ９から１Ｅ２コピー／μＬ）。
【０１０３】
感度の比較として、上記のＯＰＣＲａｒに対して使用したものと同一の鋳型濃度を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。１０ｘＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）は、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭ硫酸マグネシウムおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する。次のものを混合することにより、１５μＬ  ＲＴ−ＰＣＲ溶液を用意した：
９．７μＬ  水
１．５μＬ  １０ｘＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液
０．４μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
ＴａｑＭａｎプローブＵｎｉＡｐＣＤＣ（１μΜ）を含む１．５μＬプライマーセットＵｎｉＡｆＣＤＣ／ＵｎｉＡｒＣＤＣ（各４μΜ）
０．４μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）
１．５μＬ  １本鎖ＤＮＡ鋳型（１Ｅ９から１Ｅ２コピー／μＬ）。
【０１０４】
１５％ＤＭＳＯ存在下でのＯＰＣＲａｒおよびＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより、１Ｅ９から１Ｅ２コピー／μＬの間のユニバーサルインフルエンザＡ１本鎖ＤＮＡ鋳型の連続希釈液を増幅させた。ＯＰＣＲａｒ反応液を最初に８５℃に２分間加熱し、次いで８０℃で１５秒間と６５℃で１５秒間との間で４０サイクル繰り返した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液を９５℃に２分間加熱し、次いで９５℃で１０秒間と５８℃で４０秒間との間で４５サイクル繰り返した。反応完了後、５μＬのＯＰＣＲａｒ産物を２μＬの６Ｘ試料ローディング緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および１μＬのホルムアミドと混合し、１２％アクリルアミドゲル上で流し、臭化エチジウムで可視化した。全試料に対して１５３ｂｐ産物が明らかに観察されたが（図１０）、これは、ＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する。
【０１０５】
ここで図１０を参照して、本発明のある実施形態により増幅された１本鎖ＤＮＡ鋳型に存在する標的配列を示すゲルが表示されている。１５％ＤＭＳＯの存在下でプライマーＦＰ３およびＲＰ４を使用して、ＯＰＣＲａｒによってユニバーサルインフルエンザＡ１本鎖ＤＮＡ鋳型（１Ｅ９から１Ｅ２コピー／μＬ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の連続希釈液を増幅させ、１５３ｂｐの産物を生成させて、これを臭化エチジウムで染色した１２％アクリルアミドゲル上での電気泳動により可視化した（左パネル）。比較として、プライマーセット、ＵｎｉＡｆＣＤＣ／ＵｎｉＡｒＣＤＣおよびＴａｑＭａｎプローブＵｎｉＡｐＣＤＣを用い、リアルタイムＰＣＲに対する出発鋳型として同一の希釈物を使用した（右パネル）。ＯＰＣＲａｒ反応液を最初に８５℃に２分間加熱し、次いで８０℃で１５秒間と６５℃で１５秒間との間で４０サイクル繰り返した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液を９５℃に２分間加熱し、次いで９５℃で１０秒間と５８℃で４０秒間との間で４５サイクル繰り返した。ＯＰＣＲａｒが、的確に最適化された場合、従来のＰＣＲ反応と同様の感度を有することは明らかである。
【実施例３】
【０１０６】
実施例３：ＯＰＣＲａｒによる、プラスミドＤＮＡ上に存在する特異的配列の増幅方法
ＯＰＣＲａｒが、２本鎖プラスミドＤＮＡに存在する特異的な標的配列を増幅させることができることを明らかにするために、発明者らは、ＯＰＣＲａｒ系によって、２種類のＯＰＣＲａｒプライマー、プライマーｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびプライマーｈｙｖｌ＿Ｒｅｖを使用し、カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）のｈｙｖｌ遺伝子を含有するプラスミドから１３９ｂｐ配列を生成させた。ＯＰＣＲａｒ緩衝液（１０Ｘ）を予め調製したが、これには４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウムおよび０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有された。次のものを混合することにより、２０μＬ  ＯＰＣＲａｒ溶液を用意した：
９．４μＬ  水
２．０μＬ  １０ｘＯＰＣＲａｒ緩衝液
２．０μＬ  ＤＭＳＯ
０．４μＬ  塩化カリウム（２Ｍ）
０．５μＬ  塩化マグネシウム（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ジチオスレイトール（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
２．０μＬ  プライマーセット、ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖ（各８μＭ）
０．５μＬ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）
０．２μＬ  Ｅｔ  ＳＳＢ、超耐熱性１本鎖結合タンパク質（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（５００μｇ／ｍＬ）
健常組織およびカンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）感染組織から抽出された２．０μＬのＤＮＡ（１７．２ｎｇ／μＬ）。
【０１０７】
１３から８％ｖ／ｖでＤＭＳＯでの滴定を行った。この反応液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で１０秒間と６５℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。反応完了後、５μＬのＯＰＣＲａｒ産物を２μＬの６Ｘ試料ローディング緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および１μＬのホルムアミドと混合し、１２％アクリルアミドゲル上で流し、臭化エチジウムで可視化した。全試料に対して１３９ｂｐ産物が明らかに観察されたが（図１１）、これは、ＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する。
【０１０８】
ここで図１１を参照して、本発明のある実施形態により増幅されたプラスミドＤＮＡに存在する特異的標的配列のゲルが表示されている。カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）ｈｙｖｌ遺伝子を含有するプラスミド（１７．２ｎｇ／μＬ）を出発鋳型として使用し、１３から８％ｖ／ｖでＤＭＳＯ濃度を滴定した。反応は全て、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｔ  ＳＳＢおよびプライマーｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖを用いて行った。この反応液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で１０秒間と６５℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。臭化エチジウムで染色して１２％アクリルアミドゲル上でＯＰＣＲａｒ産物を可視化した。試験した全てのＤＭＳＯ濃度で標的配列の予想の長さと合致する１３９ｂｐ産物が明らかに観察された。
【実施例４】
【０１０９】
実施例４：ＯＰＣＲａｒによる、鼻腔吸引物に存在するヒト病原性ウイルスのＲＮＡ標的配列の増幅方法
ＯＰＣＲａｒが、１本鎖ＲＮＡ鋳型に存在する特異的な標的配列を増幅させることができることを明らかにするために、発明者らは、ＯＰＣＲａｒプライマー対、ＦＰ３およびＲＰ４を使用し、インフルエンザＡウイルスに感染しているか、または感染していないか何れかの臨床鼻腔吸引物から単離されたリボ核酸から１５３ｂｐ配列を生成させた。ＯＰＣＲａｒ緩衝液（１０Ｘ）を予め調製したが、これには４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウムおよび０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有された。次のものを混合することにより、２０μＬ  ＯＰＣＲａｒ溶液を用意した：
９．３μＬ  水
２．０μＬ  １０ｘＯＰＣＲａｒ緩衝液
３．０μＬ  ＤＭＳＯ
０．４μＬ  塩化カリウム（２Ｍ）
０．５μＬ  塩化マグネシウム（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ジチオスレイトール（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
２．０μＬ  プライマーセットＦＰ３およびＲＰ４（各８μＭ）
０．５μＬ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）
０．２μＬ  Ｅｔ  ＳＳＢ、超耐熱性１本鎖結合タンパク質（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（５００μｇ／ｍＬ）
０．１μＬ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μＬ）
臨床鼻腔吸引物から単離された２．０μＬの核酸（０．３ｎｇ／μＬ）。
【０１１０】
この反応液を５５℃で５分間温置して、ｃＤＮＡを生成させ、８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で１０秒間と６５℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。反応完了後、５μＬのＯＰＣＲａｒ産物を２μＬの６Ｘ試料ローディング緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および１μＬのホルムアミドと混合し、１２％アクリルアミドゲル上で流し、臭化エチジウムで可視化した。陽性の臨床試料では１５３ｂｐ産物が明らかに観察されたが、陰性臨床試料では観察されず（図１２）、この長さは、ＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する。
【０１１１】
ここで図１２を参照して、本発明のある実施形態により増幅された１本鎖ＲＮＡに存在する特異的な標的配列を示すゲルが例示される。インフルエンザＡウイルスに感染しているか、または感染していないかの何れかである鼻腔吸引物から単離されたリボ核酸（０．３ｎｇ／μＬ）を鋳型として使用した。反応は全て、１５％ＤＭＳＯの存在下で、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｔ  ＳＳＢおよびプライマー、ＦＰ３およびＲＰ４を用いて行った。この反応液を５５℃で５分間温置して、ｃＤＮＡを生成させ、８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で１０秒間と６５℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。臭化エチジウムで染色して１２％アクリルアミドゲル上でＯＰＣＲａｒ産物を可視化した。陽性の臨床試料では、標的配列の予想の長さと合致する１５３ｂｐ産物が明らかに観察されたが、陰性の臨床試料では観察されなかった。
【実施例５】
【０１１２】
実施例５：ＯＰＣＲａｒによる病原性植物細菌からの標的配列の増幅方法
ＯＰＣＲａｒが、病原性植物細菌ゲノムに存在する特異的な標的配列を増幅させることができることを明らかにするために、発明者らは、ＯＰＣＲａｒプライマー対、ＥＵ５２３３７７−Ｆ−５７およびＥＵ５２３３７７−Ｒ−５６を使用し、感染植物組織から単離された全核酸から、カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）伸長因子遺伝子の２１３ｂｐフラグメントを生成させた。ＯＰＣＲａｒ緩衝液（１０Ｘ）を予め調製したが、これには４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウムおよび０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有された。次のものを混合することにより、２０μＬ  ＯＰＣＲａｒ溶液を用意した：
８．４μＬ  水
２．０μＬ  １０ｘＯＰＣＲａｒ緩衝液
３．０μＬ  ＤＭＳＯ
０．４μＬ  塩化カリウム（２Ｍ）
０．５μＬ  塩化マグネシウム（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ジチオスレイトール（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
２．０μＬ  プライマーセットＥＵ５２３３７７−Ｆ−５７およびＥＵ５２３３７７−Ｒ−５６（各４μＭ）、プライマーＥＵ５２３３７７−Ｆ−５７は、ビオチン化（５’）または非ビオチン化されたものであった。
０．５μＬ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）
０．２μＬ  Ｅｔ  ＳＳＢ、超耐熱性１本鎖結合タンパク質（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（５００μｇ／ｍＬ）
カンキツグリーニング病菌（  Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）感染植物組織から単離された２．０μＬの全核酸（１．１ｎｇ／μＬ）。
【０１１３】
プライマー修飾がＯＰＣＲａｒと適合することを明らかにするために、いくつかの反応においてフォワードプライマーＥＵ５２３３７７−Ｆ−５７を５’末端でビオチン化した。ＯＰＣＲａｒ溶液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で１５秒間と６５℃で１５秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。反応完了後、５μＬのＯＰＣＲａｒ産物を２μＬの６Ｘ試料ローディング緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および１μＬのホルムアミドと混合し、１２％アクリルアミドゲル上で流し、臭化エチジウムで可視化した。全試料に対して２１３ｂｐ産物が明らかに観察されたが、これは、ＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する（図１３）。
【０１１４】
ここで図１３を参照して、本発明のある実施形態により増幅された場合の細菌ゲノムＤＮＡに存在する特異的標的配列のゲルが表示されている。カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）感染葉組織から単離された全核酸（１．１ｎｇ／μＬ）を出発鋳型として使用した。反応は全て、１５％ＤＭＳＯの存在下で、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｔ  ＳＳＢおよび、プライマーＥＵ５２３３７７−Ｆ−５７およびＥＵ５２３３７７−Ｒ−５６を用いて行った。プライマーＥＵ５２３３７７−Ｆ−５７は、オリゴヌクレオチドの５’末端でビオチン化したかまたは未修飾であったかの何れかであった。ＯＰＣＲａｒ溶液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、８０℃で１５秒間と６５℃で１５秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。臭化エチジウムで染色して１２％アクリルアミドゲル上で増幅産物を可視化した。２１３ｂｐ産物は全陽性試料に対して明らかに観察され、陰性試料では観察されず、長さはＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する。
【実施例６】
【０１１５】
実施例６：細胞小器官ＤＮＡ上の特異的配列の増幅方法
ＯＰＣＲａｒが、細胞小器官ＤＮＡ、この場合は葉緑体ＤＮＡに存在する特異的な標的配列を増幅させることができることを明らかにするために、発明者らは、ＯＰＣＲａｒプライマー対、ｒｂｃＬ＿ＦｏｒおよびｒｂｃＬ＿Ｒｅｖを使用し、カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）に感染したかまたは感染していないかの何れかの植物組織から単離された全核酸から、植物のｒｂｃＬ遺伝子の１３７ｂｐフラグメントを生成させた。ＯＰＣＲａｒ緩衝液（１０Ｘ）を予め調製したが、これには４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウムおよび０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有された。次のものを混合することにより、２０μＬ  ＯＰＣＲａｒ溶液を用意した：
８．４μＬ  水
２．０μＬ  １０ｘＯＰＣＲａｒ緩衝液
３．０μＬ  ＤＭＳＯ
０．４μＬ  塩化カリウム（２Ｍ）
０．５μＬ  塩化マグネシウム（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ジチオスレイトール（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
２．０μＬ  プライマーセットｒｂｃＬ＿ＦｏｒおよびｒｂｃＬ＿Ｒｅｖ（各２または４μＭ）
０．５μＬ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）
０．２μＬ  Ｅｔ  ＳＳＢ、超耐熱性１本鎖結合タンパク質（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（５００μｇ／ｍＬ）
葉組織から単離された２．０μＬの全核酸（３．３ｎｇ／μＬ）。
【０１１６】
２つの異なる濃度のプライマー対、ｒｂｃＬ＿ＦｏｒおよびｒｂｃＬ＿Ｒｅｖを使用して、ｒｂｃＬ遺伝子フラグメントを効率的に増幅するために必要なプライマー濃度に対する閾値を調べた。この反応液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、７６℃で１０秒間と６０℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。反応完了後、５μＬのＯＰＣＲａｒ産物を２μＬの６Ｘ試料ローディング緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および１μＬのホルムアミドと混合し、１２％アクリルアミドゲル上で流し、臭化エチジウムで可視化した。感染および非感染の両試料に対して１３７ｂｐ産物が明らかに観察されたが、これは、ＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する（図１４）。
【０１１７】
ここで図１４を参照して、本発明のある実施形態による葉緑体ＤＮＡ中に存在する特異的標的配列の増幅がゲルにおいて表示されている。カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）感染（ｉ）、または非感染（ｉｉ）の葉組織の何れかから単離された全核酸（３．３ｎｇ／μＬ）を出発鋳型として使用した。反応は全て、１０％ＤＭＳＯの存在下で、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｔ  ＳＳＢおよび、プライマーｒｂｃＬ＿ＦｏｒおよびｒｂｃＬ＿Ｒｅｖを用いて行った。ＯＰＣＲａｒ溶液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、７６℃で１０秒間と６０℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。臭化エチジウムで染色して１２％アクリルアミドゲル上で増幅産物を可視化した。全陽性試料に対して１３７ｂｐ産物が明らかに観察されたが、これは、ＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する。
【実施例７】
【０１１８】
実施例７：ＯＰＣＲａｒによる、標的配列および陽性対照の多重増幅の方法
ＯＰＣＲａｒ
ＯＰＣＲａｒが、複数の特異的な標的配列を増幅させることができることを明らかにするために、発明者らは、ＯＰＣＲａｒプライマー対、ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒ／ｈｙｖｌ＿ＲｅｖおよびｒｂｃＬ＿Ｆｏｒ／ｒｂｃＬ＿Ｒｅｖを用いて、カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）感染植物組織から抽出した核酸を増幅した。これらのプライマーセットは、それぞれ１３９および１３７ｂｐの産物を生成させる。ＯＰＣＲａｒ緩衝液（１０Ｘ）を予め調製したが、これには４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウムおよび０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有された。次のものを混合することにより、２０μＬ  ＯＰＣＲａｒ溶液を用意した：
６．４μＬ  水
２．０μＬ  １０ｘＯＰＣＲａｒ緩衝液
３．０μＬ  ＤＭＳＯ
０．４μＬ  塩化カリウム（２Ｍ）
０．５μＬ  塩化マグネシウム（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ジチオスレイトール（１００ｍＭ）
０．５μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
２．０μＬ  プライマーセット、ｒｂｃＬ＿ＦｏｒおよびｒｂｃＬ＿Ｒｅｖ（各２または３μＭ）
２．０μ    プライマーセット、ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖ（各８μＭ）
０．５μＬ  ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）
０．２μＬ  Ｅｔ  ＳＳＢ、超耐熱性１本鎖結合タンパク質（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（５００μｇ／ｍＬ）
葉組織から単離された２．０μＬの全核酸（３．３ｎｇ／μＬ）
【０１１９】
ｈｙｖｌ遺伝子フラグメントに特異的な８００ｎＭプライマーの存在下でｒｂｃＬ遺伝子フラグメントを効率的に増幅するために必要なプライマー濃度に対する閾値を調べるために、２つの異なる濃度のプライマー対、ｒｂｃＬ＿ＦｏｒおよびｒｂｃＬ＿Ｒｅｖを使用した。この反応液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、７６℃で１０秒間と６０℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。反応完了後、５μＬのＯＰＣＲａｒ産物を２μＬの６Ｘ試料ローディング緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および１μＬのホルムアミドと混合し、１２％アクリルアミドゲル上で流し、臭化エチジウムで可視化した。１３９ｂｐおよび１３７ｂｐの両産物が明らかに観察されたが、これは、ＯＰＣＲａｒ標的配列の予想の長さと合致する。明確にするために、両プライマー対のみを用いて生成したＯＰＣＲａｒ産物（実施例３および６）を多重反応と並んで流した（図１５）。
【０１２０】
ここで図１５を参照して、本発明のある実施形態による二重の標的配列の増幅産物を示すゲルが表示されている。カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）感染葉組織から単離された全核酸（３．３ｎｇ／μＬ）を出発鋳型として使用した。反応は全て、１０％ＤＭＳＯの存在下で、指定濃度の、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｔ  ＳＳＢおよびプライマーセット、ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒ／ｈｙｖｌ＿ＲｅｖおよびｒｂｃＬ＿Ｆｏｒ／ｒｂｃＬ＿Ｒｅｖを用いて行った。多重ＯＰＣＲａｒ溶液を８５℃で２分間加熱し、鋳型を変性させ、次いで、７６℃で１０秒間と６０℃で１０秒間との間で周期的に変動させて、４０サイクル繰り返した。臭化エチジウムで染色して１２％アクリルアミドゲル上で多重産物を可視化した。何れかのプライマーセットのみから生成されたＯＰＣＲａｒ産物と比較した場合（図１１および１５参照）、１３９および１３７ｂｐ産物の両方が明らかに観察された。
【０１２１】
ここで図１６を参照して、本発明のある実施形態によるＥｔ  ＳＳＢ存在下での反応の結果得られる増幅産物が例示される。ＳＳＢは、本発明の系および方法を用いてより低い溶融温度で増幅効率を向上させる。発明者らは、極度の耐熱性１本鎖結合タンパク質「ＥＴ  ＳＳＢ」が、ある一定の溶融温度でＯＰＣＲａｒの性能を促進することを示すために、その使用を調べた。ＨＬＢ病遺伝子を含有する精製葉試料ＤＮＡを用いて、ＨＬＢ病原性標的に対してＯＰＣＲａｒ反応を行った。鋳型は、柑橘類のカンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）感染樹木の葉から精製されたＤＮＡであった。プライマーは、ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒ／およびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖであった。サーモサイクラー条件は、８５℃で２分間の最初の溶融後、続いて７６℃または７４℃の何れかで１０秒間の変性と６０℃で１０秒間のアニーリングとを４０サイクル繰り返すものであった。この結果から、Ｅｔ  ＳＳＢの存在下で、アッセイした全ての温度レジメンでカンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）標的の増幅が起こったことが示された。ＥＴ  ＳＳＢタンパク質が存在する状態およびＥＴ  ＳＳＢがない状態下で、２つの組で比較ＯＰＣＲａｒ実験を行った。ＳＳＢありおよび、なしでの増幅性能の評価を可能にするために、正確な温度調節付きの標準的なＰＣＲサーモサイクラーを使用した。結果から、発明者らがＥＴ  ＳＳＢの存在下では７４℃でＨＬＢが増幅されていることを見出し、ＥＴ  ＳＳＢなしでは観察不能であったことが示された。
【０１２２】
ここで図１７を参照して、本発明のある実施形態による、ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖプライマーおよび感染樹木の葉から単離された精製カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）ＤＮＡを用いて行われたＯＰＣＲａｒ反応のゲル電気泳動が示されるが、この反応は、典型的なＰＣＲサーモサイクラーにおいて含まれるランピングパラメータ（ｒａｍｐｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を含まないか（図１７Ａ）または温度のサイクル化に対するランピング時間（ｒａｍｐｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を含む（図１７Ｂ）。ランピング（Ｒａｍｐｉｎｇ）とは、本明細書中で使用される場合、昇温を指す（例えば、各熱サイクリングにおいてアニーリング温度から変性温度へと増幅反応温度を上昇させるための加熱プロセスはランプアップ（ｒａｍｐｉｎｇ  ｕｐ）と呼ばれ、変性温度からアニーリング温度への冷却はランプダウン（ｒａｍｐ  ｄｏｗｎ）と呼ばれる）。従来のＰＣＲサイクラーおよび方法は全て、ランプアップ（ｒａｍｐｉｎｇ  ｕｐ）が約３℃／秒を超え、ランプダウン（ｒａｍｐｉｎｇ  ｄｏｗｎ）速度が約１℃／秒を超える制御型加熱設計を有する。典型的なサイクリングプロファイルにはランプ時間は含まれず、機器は、望ましい温度に到達するまで、変性、アニーリングおよび伸長段階中、時間分のカウントを開始しない。例えば、変性時間は９０℃で１０秒であり、機器は、９０℃に到達するまでその１０秒間という時間のカウントを開始しない。一方、本発明の系および方法は、例えば８０℃で１０秒に設計される廉価な加熱機器を提供するが、これは（望ましい変性温度に到達するまで待つのではなく）加熱プロセス開始時に時間のカウントを開始するというものである。図１７Ａ：発明者らは、廉価な加熱器エンジンにおいて、ＨＬＢ病（カンキツグリーニング病の病原体、Ｈｕａｎｇ  Ｌｏｎｇ  Ｂｉｎｇ）標的のＯＰＣＲａｒ増幅を調べた（能動冷却および正確な温度調節なし、ゆらぎは±２℃を超える（例えば６１／４７７，３５７で開示されるような系および装置参照）。マイクロプロセッサにより温度変化に対するコマンドが実行された後すぐに開始するように（即ちランプ時間なし、図１７Ａ）プログラムの各温度セグメントに対して１０秒の保持時間が計算されるように、Ｍｅｓａ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ＭＴＩ  Ｄｅｖｉｃｅ）により開発された機器における、または従来型のＰＣＲサーモサイクラー（ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）におけるマイクロプロセッサ制御下、マイクロヒータ反応チャンバ中でＯＰＣＲａｒの２０μＬの反応を行った。これは、反応ウェルにある温度センサにより標的温度が検知された後すぐに開始するよう計算されたプログラムの各温度セグメントに対する１０秒の保持時間（即ちランプ時間、図１７Ｂ）とは大きく異なる。ＰＣＲサーモサイクラー条件は、次のとおり、最初の溶融：８５℃で２分間の後、続いて８０℃で１０秒間と６０℃で１０秒間とを４０サイクル繰り返すものであった。ＭＴＩ機器の条件は、次のとおり、最初の溶融：８５℃で２分間、８２℃で１０秒間と５９℃で２０秒間とを４０サイクル繰り返すものであった。
【０１２３】
図１７Ａ：第一のレーン、個々のランピングなしのＯＰＣＲａｒ増幅（２０μｌ反応）。左から：５０ｂｐ標準ＤＮＡサイズラダー；第二および第三レーン（ｌａｎｃｅｓ）：ランプ段階および正確な温度調節が付いている標準的ＰＣＲ熱サイクルエンジンにおけるＯＰＣＲａｒ増幅反応（２つ組、第二および第三レーン）。最初の溶融：８５℃で２分間、８０℃で１０秒間の変性と６０℃で１０秒間のアニーリングとの間で４０サイクル繰り返し。第四および第五レーン：能動冷却及び／又は個別のランプ調節のない廉価な熱機関において行ったＯＰＣＲａｒ増幅。この熱機関は、変性またはアニーリング温度の何れに対してもランプ段階を持たない場合と比べると、周囲の場の温度（〜２５℃）から、８０℃変性温度に変化（ｒａｍｐ）するか、または６０℃アニーリング温度に下降するかの何れかである。２０μＬの反応において、ＨＬＢ病標的配列を含有する精製植物ＤＮＡを用いて、ＨＬＢ  ＯＰＣＲａｒを行った。発明者らは、ＭＴＩ機器試験に対する陽性対照についてはＰＣＲサーモサイクラーを使用した。ＰＣＲサーモサイクラーの条件は、次のとおりであり、ランプなしの場合のＭＴＩ機器サーモサイクラーの条件は、次のとおり、最初の溶融：８５℃で２分間、８２℃で１０秒間の変性と５９℃で２０秒間のアニーリングとの間でサイクルを繰り返すものであった。このサイクルを４０回繰り返した。ランプアップ（ｒａｍｐｉｎｇ  ｕｐ）段階に対するＭＴＩ機器サーモサイクラーは、１０秒間未満のランプアップ段階および２０秒間未満のランプダウン段階があることを除き、同じ条件であった。データから、ＨＬＢ  ＯＰＣＲａｒは、ランプアップおよびランプダウン段階がなくても、やはりＨＬＢ単位複製配列を複製し得ることが示唆された。１７Ａおよび１７Ｂの比較から、ランプ時間が与えられる場合、増幅産物の収率の顕著な向上が明らかとなる。
【０１２４】
ここで図１８を参照して、上述のようなＭＴＩの熱抵抗器に基づく廉価な増幅機器における２種類のプライマーセット：１）カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）ＤＮＡ標的に特異的なｈｙｖｌ＿Ｆｏｒおよびｈｙｖｌ＿Ｒｅｖプライマーおよび２）柑橘類ハウスキーピング遺伝子ｒｂｃＬに特異的な、プライマー、ｒｂｃｌ＿（リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナーゼ）Ｆｏｒおよびｒｂｃｌ＿Ｒｅｖを含有する本発明のある実施形態による多重ＯＰＣＲａｒ反応の増幅産物がゲルに例示される。ランプ（例えばＰＣＲ機器の５℃／秒）がなく、正確な温度調節のない、廉価な加熱器で行われるような、上記のＰＣＲ増幅の結果得られる反応産物をゲル上で流した。発明者らは、ＰＣＲサーモサイクラーおよびＭＴＩ機器（ランプありまたはランププログラムなし）においてＨＬＢプライマーを用いてＲｂＣＬ内部陽性対照を試験した。発明者らは、精製ＨＬＢ試料を用いて４０μＬの反応を行った。ＰＣＲサーモサイクラー条件は、次のとおり、最初の溶融：８５℃で２分間、８０℃で１０秒間の変性と６０℃で１０秒間のアニーリングとの間でサイクルを繰り返すものであった。ＭＴＩ機器増幅条件は、次のとおり、最初の溶融：９０℃で２分間、８２℃で１０秒間の変性と５９℃で２０秒間のアニーリングとの間でサイクルを繰り返すものであった。発明者らは、ランプなしで、ＨＬＢおよびＲｂＣＬプライマー配列の両方を増幅することがなお可能であったことを見出した。〜１４７ｂｐ前後のＨＬＢ産物および〜１４０ｂｐ前後のＲｂＣＬ産物。両条件に対するＭＴＩ機器は、ＰＣＲサーモサイクラー増幅産物と同等であった。この反応に対するフォワードプライマーは、ｃｃａｇｃｃｔｔｇａ  ｔｃｇｔｔａｃａａａ  ｇｇｇｃｇａｔｇｃｔ  ａｃａａｃａｔｔ（配列番号９）（Ｔｍは約７３．９℃（１０％ＤＭＳＯ、７６／６０Ｃ）であり、リバースプライマーは、ｃａｔｇｔｔａｇｔａ  ａｃａｇａａｃｃｔｔ  ｃｔｔｃａａａａａｇ  ｇｔｃｔａａｃｇｇｇ  ｔａａ（配列番号１０）（Ｔｍは約７１．２Ｃ（１０％ＤＭＳＯ、７６／６０Ｃ）である。示されるように、（図１６および１７に対して記載のとおり）温度保持時間においてランプ時間を含む、または含まずにＯＰＣＲａｒ反応を行った。カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）感染樹木からの柑橘類の葉の精製ＤＮＡを使用して、４０μＬの反応を行った。ＰＣＲサーモサイクラー対照条件は、次のとおり、最初の溶融：８５℃で２分間、８０℃で１０秒間と６０℃で１０秒間とを４０サイクル繰り返すものであった。ＭＴＩ機器の増幅条件は、次のとおり、最初の溶融：９０℃で２分間、８２℃で１０秒間と５９℃で２０秒間とを４０サイクル繰り返すものであった。この結果から、保持時間計算においてランプ時間を含まずに、ＭＴＩ機器が、カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）およびｒｂｃＬ配列の両方を増幅させることができたことが明らかとなった。カンキツグリーニング病菌（Ｃ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）産物はおよそ１４７ｂｐ（ＨＬＢ）であり、ｒｂｃＬ（ＲｂＣＬ）産物はおよそ１４０ｂｐである。
【０１２５】
プライマー溶融温度（Ｔｍ）は全て、Ｐｒｉｍｅｒ  ３Ｔｍ計算ソフトウェアを使用し、ＩＤＴ  ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．１（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を用いて計算し、ここで塩、ｄＮＴＰ、Ｍｇ、プライマー濃度パラメータは、次のパラメータを使用するものと考えられる：
オリゴヌクレオチド濃度：０．２５μΜ；Ｎａ＋濃度：５０ｍＭ；Ｍｇ＋＋濃度＝２．５ｍＭ；ｄＮＴＰ濃度＝０．２５μΜ。記号「ａ」はアデニンを意味し、「ｇ」はグアニンを意味し、「ｃ」はシトシンを意味し、「ｔ」はチミンを意味し、「ｕ」はウラシルを意味し、「ｒ」はプリンを意味し、「ｙ」はピリミジンを意味し、「ｍ」はアミノを意味し、「ｋ」はケトを意味し、「ｎ」はａまたはｇまたはｃまたはｔ／ｕの何れか、不明またはその他を意味する。
【０１２６】
（配列番号１）
受託番号：ＣＹ０８７０３４
タイプ：ウイルスＲＮＡ
長さ：１０１０
生物：インフルエンザＡウイルス（Ｈ１Ｎ１）
その他の情報：マトリックスタンパク質２（Ｍ２）およびマトリックスタンパク質１（Ｍ１）遺伝子
【０１２７】
（配列番号２）
タイプ：フォワードプライマー
名称：ＦＰ３
長さ：４６
Ｔｍ：平均７５℃
【０１２８】
（配列番号３）
タイプ：リバースプライマー
名称：ＲＰ３
長さ：４０
Ｔｍ：平均７７．８℃
【０１２９】
（配列番号４）
タイプ：リバースプライマー
名称：ＲＰ４
長さ：４６
Ｔｍ：平均７４．７℃
【０１３０】
（配列番号５）
タイプ：フォワードプライマー
名称：ＵｎｉＡｆＣＤＣ
長さ：２２
Ｔｍ：平均６５．０℃
【０１３１】
（配列番号６）
タイプ：リバースプライマー
名称：ＵｎｉＡｒＣＤＣ
長さ：２４
Ｔｍ：平均６６．６℃
【０１３２】
（配列番号７）ＦＡＭ−ｔｇｃａｇｔｃｃｔｃ  ｇｃｔｃａｃｔｇｇｇ  ｃａｃｇ−ＢＨＱ
タイプ：ＴａｑＭａｎプローブ
名称：ＵｎｉＡｐＣＤＣ
長さ：２４
Ｔｍ：７３．４℃
【０１３３】
（配列番号８）
受託番号：ＡＢ５０５９５７
タイプ：葉緑体ＤＮＡ
長さ：１３２６
生物：オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）
他の情報：ｒｂｃＬ，リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット
【０１３４】
（配列番号９）
タイプ：フォワードプライマー
名称：ｒｂｃＬ＿Ｆｏｒ
長さ：３８
Ｔｍ：７３．９℃
【０１３５】
（配列番号１０）
タイプ：リバースプライマー
名称：ｒｂｃＬ＿Ｒｅｖ
長さ：４３
Ｔｍ：７１．２℃
【０１３６】
（配列番号１１）
受託番号：ＥＵ５２３３７７から
タイプ：細菌ＤＮＡ
長さ：８９０
生物：カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）
その他の情報：伸長因子Ｔｓ
【０１３７】
（配列番号１２）
タイプ：フォワードプライマー
名称：ＮＢＥＵ５２３３７７−Ｆ−５７
長さ：５７
Ｔｍ：７５．８℃
【０１３８】
（配列番号１３）〔ビオチン−５〕ｔｃｔｔｃｇｔａｔｃ  ｔｔｃａｔｇｃｔｔｃ  ｔｃｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｇｔｔｔａｇｇａｔ  ｃｇａｔｔｇｇｔｇｔ  ｔｃｔｔｇｔａ
タイプ：ビオチン化フォワードプライマー
名称：ＥＵ５２３３７７−Ｆ−５７
長さ：５７
Ｔｍ：７５．８℃
【０１３９】
（配列番号１４）
タイプ：フォワードプライマー
名称：ＨＬＢＦｏｒＳｈ
長さ：４７
Ｔｍ：７５．６℃
【０１４０】
（配列番号１５）
タイプ：リバースプライマー
名称：ＥＵ５２３３７７−Ｒ−５６
長さ：５６
Ｔｍ：７５．８℃
【０１４１】
（配列番号１６）
タイプ：リバースプライマー
名称：ＨＬＢＲｅｖＳｈ
長さ：４９
Ｔｍ：７５．５℃
【０１４２】
（配列番号１７）
標的：カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）１６ＳリボソームＲＮＡ
タイプ：フォワードプライマー（下線）、５’検出配列含有
名称：ＨＬＢａｓ−Ｐ２
長さ：３９
Ｔｍ：６２．７℃
【０１４３】
（配列番号１８）
標的：カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ）１６ＳリボソームＲＮＡ
タイプ：リバースプライマー（下線）、５’Ｔ７プロモーター含有
名称：ＨＬＢｒ−Ｐ１
長さ：５６
Ｔｍ：６４．５℃
【０１４４】
（配列番号１９）
タイプ：フォワードプライマー
名称：ｈｙｖｌ＿Ｆｏｒ
長さ：４５
Ｔｍ：７２．２℃
【０１４５】
（配列番号２０）
タイプ：リバースプライマー
名称：ｈｙｖｌ＿Ｒｅｖ
長さ：５１
Ｔｍ：７０．９℃
【０１４６】
記載の実施形態を特に参照して本発明を詳述してきたが、他の実施形態で同じ結果を達成し得る。本発明の変形および改変は当業者にとって明らかであり、このような改変および同等物が全て包含されるものとする。上記で引用される全ての特許および刊行物の開示全体が、参照により本明細書に援用される。
【図１Ａ】
0005731066.tif 000002
【図１Ｂ】
0005731066.tif 000003
【図２Ａ】
0005731066.tif 000004
【図２Ｂ】
0005731066.tif 000005
【図２Ｃ】
0005731066.tif 000006
【図２Ｄ】
0005731066.tif 000007
【図２Ｅ】
0005731066.tif 000008
【図３Ａ】
0005731066.tif 000009
【図３Ｂ】
0005731066.tif 000010
【図４】
0005731066.tif 000011
【図５】
0005731066.tif 000012
【図６】
0005731066.tif 000013
【図７】
0005731066.tif 000014
【図８Ａ】
0005731066.tif 000015
【図８Ｂ】
0005731066.tif 000016
【図９】
0005731066.tif 000017
【図１０】
0005731066.tif 000018
【図１１】
0005731066.tif 000019
【図１２】
0005731066.tif 000020
【図１３】
0005731066.tif 000021
【図１４】
0005731066.tif 000022
【図１５】
0005731066.tif 000023
【図１６Ａ】
0005731066.tif 000024
【図１６Ｂ】
0005731066.tif 000025
【図１７Ａ】
0005731066.tif 000026
【図１７Ｂ】
0005731066.tif 000027
【図１８】
0005731066.tif 000028
【配列表】
0005731066000001.app