(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＴ細胞内でタンパク質をコードする導入遺伝子の発現を上昇させる方法であって、
ａ）第１および第２の共刺激剤を用いてＴ細胞集団を活性化させるステップ、ここで当該第１共刺激剤が、ＣＤ３抗体を含み、そして第２共刺激剤がＣＤ２８抗体を含み；と、
ｂ）活性化させた前記Ｔ細胞集団を、タンパク質をコードする導入遺伝子、及び少なくとも１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする配列を含むアデノウイルス発現ベクターと接触させるステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がビーズ上に結合している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の共刺激剤がＩＬ−１５を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の共刺激剤が支持細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アデノウイルス発現ベクターを偽型化した、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
偽型化した前記アデノウイルス発現ベクターがアデノウイルス５型（Ａｄ５）およびアデノウイルス３５型（Ａｄ３５）に由来する配列を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ａｄ３５配列がＦ３５である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
偽型化した前記アデノウイルス発現ベクターがアデノウイルス５型（Ａｄ５）およびアデノウイルス１１型（Ａｄ１１）に由来する配列を含有し、そして前記導入遺伝子、及び少なくとも１のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼがＣＣＲ５における標的部位に結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞内でタンパク質をコードする導入遺伝子の発現を増加させるためのキットであって、第１及び第２共刺激剤、ここで当該第１共刺激剤がＣＤ３抗体を含み、かつ第２共刺激剤がＣＤ２８抗体を含む；と、（i)当該タンパク質をコードする導入遺伝子及び（ii)少なくとも１のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする配列を含むアデノウイルスベクターとを含むキット。
【請求項１３】
内因性遺伝子を切断する方法であって、
請求項１０又は１１に記載の方法によって単離されたＴ細胞内で少なくとも１つのジンクフィンガーヌクレアーゼを発現させるステップを含み、それによって前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが前記内因性遺伝子を切断することとなる方法。
【請求項１４】
前記内因性遺伝子がＣＣＲ５遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記内因性遺伝子がＧＲ遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府に資金援助された研究の下でなされた発明に対する権利の陳述
適用可能ではない。
本発明は一般に、細胞内において外因性核酸を発現させるための改良された方法および組成物に関し、より詳細には、アデノウイルスベクターを用いた、ヒト免疫細胞内における外因性遺伝物質の改良された発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞のような免疫エフェクター細胞内において導入遺伝子を確実に発現させることは、免疫機構に対する必要な洞察を提供し、かつ免疫学的疾患、血液学的疾患、感染症、遺伝病、および癌を治療するための遺伝子治療法など新たな免疫治療戦略の実現にも役立つであろう。しかし不幸にも、Ｔ細胞内において導入遺伝子を安定的かつ効果的に発現させることは、達成が困難であることが示されてきており、運まかせの実験を行わなければならないことが多い。たとえば、初期Ｔリンパ球をレトロウイルス由来のベクターなどのウイルスベクターと一緒にしておくことによって形質導入を行った場合、一般的にきわめて低効率となることが十分に証明されている（ＹａｍａｓｈｉｔａおよびＥｍｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６  Ｊａｎ  ５；３４４（ｌ）：８８−９３）。したがって、レトロウイルスを介して初期Ｔ細胞に遺伝子を移入する研究が過去１０年以上行われ、形質導入効率を改良するためにいくつかの異なる戦略が検討されてきたが、導入遺伝子の十分な発現を達成するにはまだ遠く、むしろさらに大きな困難を克服しなければならない。
【０００３】
宿主細胞内に永久的に組み込み可能なウイルス系の場合には、レンチウイルスの形質導入と併せてＴ細胞を活性化させることよって、Ｔ細胞に対する遺伝子送達を有意に改良できることが示された。Ｕｎｕｔｍａｚら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９９  Ｊｕｎ  ７；１８９（ｌｌ）：１７３５−４６、Ｐｏｌｌｏｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８  Ｊｕｎ；７２（６）：４８８２−９２、Ｃｏｓｔｅｌｌｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００  Ａｐｒ；７（７）：５９６−６０４、Ｂａｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３  Ａｕｇ；１０（１７）：１４４６−５７、Ｌｕら、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２００４  Ｓｅｐ；６（９）：９６３−７３などを参照されたい。たとえば、ＢａｉらとＬｕらは各々、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体との両方によるＴリンパ球に対する共刺激によってレンチウイルスの遺伝子送達効率を改良できることを報告し、８０〜９９％の形質導入効率を示している。しかし、これらの報告で形質導入効率において成功がみられたにも関わらず、これらの研究者によって実際に得られた遺伝子発現のレベルは、報告されたデータによると決定的ではない。
【０００４】
しかし不幸にも、非組み込み型のウイルス系を用いてこれらの結果を再現するには、より多くの問題がある。たとえば、ＳｃｈｒｏｅｒｓらのＥｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４  Ｊｕｎ；３２（６）５３６４６を参照されたい。Ｓｃｈｒｏｅｒｓの研究において、アデノウイルスベクターを用いた場合のＰＨＡによる活性化では、形質導入効率がわずかに向上するのみで、４５％の形質導入効率しか達成されず、レンチウイルスベクターを用いた場合に得られる効率よりかなり低いものであった。そのため、非組み込み型のウイルス系においてＴ細胞内で導入遺伝子の高発現を可能にする改良された方法や組成物が、たとえば、治療用、工業用または研究用のタンパク質を提供するために、当技術分野においてきわめて必要とされている。本発明は、こういった必要性に焦点を当てたものである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、他のＴ細胞活性化方法とは異なり、Ｔ細胞共刺激シグナルによって、アデノウイルスを介した外因性核酸によるＴ細胞の形質導入がかなり向上し、さらに重要なことに、コードされた外因性分子が高レベルで発現するという驚くべき発見に由来している。本明細書に記載の組成物および方法によって、任意のＴ細胞内における任意の外因性塩基配列の発現を一過的に増強することができる。したがって、挿入変異の誘発や位置効果による発現の変化を引き起こす恐れのある組み込み型のベクター（レトロウイルスまたはレンチウイルス）を用いる必要がなくなった。さらに、Ｔ細胞内において外因性塩基配列を一過的に発現させることによって、より安定な細胞集団を得られる場合もある。たとえば、一過的な発現の場合には、宿主の免疫系が応答を開始する前に免疫原性のペプチドをなくすこともできる。そのため、本明細書に記載のように、該外因性分子は診断用または治療用の所望の任意分子であってもよく、したがって、多種多様な病態および疾患の診断、治療、および／または予防のための新規な方法を提供し得る。
【０００６】
一態様では、Ｔ細胞内において外因性核酸の発現を増強する方法を提供し、この方法は、１）少なくとも第１および第２の共刺激剤によって生じる共刺激シグナルでｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのＴ細胞集団を活性化させるステップと、２）活性化させた前記Ｔ細胞集団を前記外因性核酸を含有するアデノウイルス発現ベクターと接触させるステップとを含み、前記接触によって、前記活性化Ｔ細胞のうち５０％を超える細胞内において前記外因性核酸にコードされる導入遺伝子を発現させることとなる方法である。一実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の一実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０００７】
好ましい一実施形態では、共刺激シグナルがＴ細胞受容体の活性化を含み、かつ用いる共刺激剤がＣＤ３リガンドを含む。特に好ましい一実施形態では、このＣＤ３リガンドが抗ＣＤ３抗体を含む。特定の実施形態では、ＰＨＡおよび／またはＩＬ２で活性化してアデノウイルスベクターで形質導入を行ったＴ細胞と比較して、外因性遺伝子の発現が約３倍以上、好ましくは約５倍以上、より好ましくは約６倍以上の高さである。
【０００８】
好ましい一実施形態では、共刺激シグナルがさらにＣＤ２８受容体の活性化を含み、かつ共刺激剤がさらにＣＤ２８リガンドを含む。特に好ましい一実施形態では、このＣＤ２８リガンドが抗ＣＤ２８抗体を含む。
【０００９】
一代替実施形態では、共刺激剤がさらにＩＬ−１５を含む。他の一代替実施形態では、共刺激シグナルがさらに支持細胞を含む。
【００１０】
好ましい一実施形態では、アデノウイルス発現ベクターを偽型化して、Ｔ細胞などの免疫細胞を標的とするのを促進する。一実施形態では、偽型化したアデノウイルス発現ベクターが、アデノウイルス５型（Ａｄ５）およびアデノウイルス３５型（Ａｄ３５）に由来する塩基配列を含有する。特定の一実施形態では、このＡｄ３５の塩基配列がＦ３５である。他の一実施形態では、偽型化したアデノウイルス発現ベクターが、Ａｄ５およびアデノウイルス１１型（Ａｄ１１）に由来する塩基配列を含有する。
【００１１】
一態様では、外因性核酸が、たとえば蛍光タンパク質（ＧＦＰまたはＲＦＰなど）のような診断用の分子をコードする。
【００１２】
他の一態様では、外因性核酸が、たとえばＲＮＡ分子または治療タンパク質のような治療用の分子をコードする。好ましい実施形態では、治療用のタンパク質が、ホルモン、酵素、サイトカイン、ケモカイン、抗体、分裂促進因子、成長因子、分化因子、血管新生に影響を与える因子、細胞のアポトーシスに影響を与える因子、および炎症に影響を与える因子からなる群から選択される。
【００１３】
他の一態様では、外因性核酸が、たとえば転写因子や核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）のような内因性遺伝子の発現を阻害、促進、または変更できる分子をコードする。好ましい実施形態では、外因性核酸がジンクフィンガータンパク質をコードする。特定の一実施形態では、前記ジンクフィンガータンパク質がＣＣＲ５に誘導される。
【００１４】
他の一態様では、外因性核酸配列によって、１つ以上の非コード配列、たとえば１つ以上のＲＮＡ分子（短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を生成させてもよい。
【００１５】
一態様では、本発明はＴ細胞内に外因性塩基配列を組み込むための改良された方法を提供し、前記方法は、ａ）共刺激シグナルによって前記Ｔ細胞を活性化させるステップと、活性化させた前記Ｔ細胞を、前記外因性塩基配列を含有するアデノウイルスベクターに曝露するステップとを含み、たとえばＺＦＮを介する標的化した組み込みを用いる。特定の実施形態では、外因性塩基配列の組み込みが少なくとも約７０〜９０％の効率であって、この間の任意の値（たとえば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％）が含まれる。
【００１６】
一態様では、Ｔ細胞内における外因性塩基配列の発現および／または組込みのためのキットを提供し、このキットには、本明細書に記載の共刺激剤とアデノウイルス発現ベクターとが含まれる。
【００１７】
一態様では、細胞内において内在性遺伝子を切断する方法を提供し、その方法は、本明細書に記載の任意の方法に従って少なくとも１つのジンクフィンガーヌクレアーゼをＴ細胞内で発現させるステップを含み、これによってジンクフィンガーヌクレアーゼに内在性遺伝子を切断させる方法である。特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、細胞内へのＨＩＶ侵入に関わる受容体をコードする遺伝子（たとえばＣＣＲ５）を切断する。他の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼが糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）を切断する。したがって、ＣＣＲ５に結合するジンクフィンガーヌクレアーゼをＴ細胞内で発現させることによってＨＩＶの予防および／または治療を行う方法も提供する。また、ＧＲを切断することによって糖質コルチコイド処理中のＴ細胞の免疫機能を保持する方法も提供する。
【００１８】
本発明のさらなる特徴および利点は、下記の発明を実施するための形態に記載しており、当業者にはこの記載から部分的に容易に明らかであるか、あるいは下記の発明を実施するための形態、請求項、および添付図面を含む本明細書に記載の本発明を実践することによって理解されるであろう。
【００１９】
上記の一般的な記述および下記の詳細な説明の両方が本発明の実施形態を示しており、記載のような本発明の性質および特徴を理解するための概要または枠組を提供することを意図していることを理解されたい。添付図面は、本発明の理解を深めるために含まれており、この明細書の一部に組み込まれ、かつこの明細書の一部を構成している。これらの図面は、本発明の多様な実施形態を説明し、かつ本明細書と共に本発明の原則および実施について説明するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化後の初期Ｔリンパ球における、Ａｄ５アデノウイルスベクターまたはＡｄ５／Ｆ３５  ＧＦＰアデノウイルスベクターのいずれかを用いた場合のＧＦＰの形質導入および発現を示したグラフである。
【図２Ａ】ＩＬ−７による活性化後（図２Ａ）または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化後（図２Ｂ）のＣＤ４＋細胞内における、Ａｄ５アデノウイルスベクターまたはＡｄ５／Ｆ３５  ＧＦＰアデノウイルスベクターのいずれかを用いた場合のＧＦＰの形質導入および発現を示したグラフである。
【図２Ｂ】ＩＬ−７による活性化後（図２Ａ）または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化後（図２Ｂ）のＣＤ４＋細胞内における、Ａｄ５アデノウイルスベクターまたはＡｄ５／Ｆ３５  ＧＦＰアデノウイルスベクターのいずれかを用いた場合のＧＦＰの形質導入および発現を示したグラフである。
【図３Ａ】抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化後の初期Ｔリンパ球内（図３Ａ）またはＣＤ４＋細胞内（図３Ｂ）のいずれかにおける、ロットの異なる２つのＡｄ５／Ｆ３５  ＧＦＰアデノウイルスベクターを用いた形質導入と発現を示したグラフである。
【図３Ｂ】抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化後の初期Ｔリンパ球内（図３Ａ）またはＣＤ４＋細胞内（図３Ｂ）のいずれかにおける、ロットの異なる２つのＡｄ５／Ｆ３５  ＧＦＰアデノウイルスベクターを用いた形質導入と発現を示したグラフである。
【図４】ＰＨＡまたは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体のいずれかによる活性化後のＣＤ４＋細胞内において、３０または１００のＭＯＩで生じた形質導入を時系列で示したグラフである。
【図５】ＰＨＡ／ＩＬ−２または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体のいずれかによる活性化後にＡｄ５／Ｆ３５  ＧＦＰアデノウイルスベクターを用いて行った形質導入後１日目のＣＤ４＋細胞内におけるＧＦＰの形質導入（図５Ａ）と発現（図５Ｂ）を示したグラフである。
【図６】ＰＨＡ／ＩＬ−２または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体のいずれかによる活性化後にＡｄ５／Ｆ３５  ＧＦＰアデノウイルスベクターを用いて行った形質導入後２日目のＣＤ４＋細胞内におけるＧＦＰの形質導入（図６Ａ）と発現（図６Ｂ）を示したグラフである。
【図７】ＰＨＡまたは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体のいずれかによる活性化後のＣＤ４＋細胞内において、３０または１００のいずれか表示のＭＯＩで生じたＧＦＰ発現を時系列で示したグラフである。
【図８】ＰＨＡまたは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体のいずれかによる活性化後の０、１０、３０または１００のＭＯＩにおけるＴ細胞の増殖を時系列で示したグラフである。
【図９】ＰＨＡまたは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体のいずれかによって予め刺激してＣＣＲ５を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼを送達するＡｄ５／Ｆ３５ベクターに曝露した場合の、ＣＤ４＋Ｔ細胞内におけるＣＣＲ５遺伝子の改変の違いを示したゲルの写真である。レーン１は形質導入を行っていない細胞を示しており、レーン２はＧＦＰをコードするＡｄ５／Ｆ３５で形質導入させた細胞を示しており、レーン３はＩＬ２Ｒγ遺伝子を標的とするＺＦＮ対で形質導入させた細胞を示しており、レーン４はＣＣＲ５を標的とするＺＦＮ対で形質導入させた細胞を示しており、かつレーン５は第２のＣＣＲ５  ＺＦＮ対で形質導入させた細胞を示している。ＣＣＲ５を標的とするＺＦＮ対は国際特許公開ＷＯ２００７／１３９９８２号などに、ＩＬ２Ｒγを標的とするＺＦＮ対はＷＯ２００５／０１４７９１号、ＷＯ２００５／０８４１９０号などに記載されている。形質導入後の表示の指示された日に一定分量の細胞を回収して、マスターピュアＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出する。異なる活性化状態に対するＺＦＮの活性レベルは、サーベイヤー（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）アッセイを用いて前記内在性ＣＣＲ５遺伝子座における遺伝子改変の効率を測定することによって評価する。ＮＨＥＪが生じた割合を各レーンの下に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ここで、本発明の好ましい実施形態について詳細に言及する。これらの実施例を添付図面に示す。
【００２２】
本発明は、アデノウイルスベクターなどの非組み込み型のウイルスベクターを用いてＴ細胞内に外因性核酸を形質導入するための方法および組成物に関し、詳細には、これらの細胞内に入った導入遺伝子の発現に関する。本発明は、共刺激シグナルで活性化して外因性遺伝子物質を運ぶアデノウイルスベクターを用いて形質導入を行った際に、Ｔ細胞内における形質導入が高効率であったばかりでなく導入遺伝子も高発現していたという驚くべき結果に少なくとも部分的に基づいている。
【００２３】
本発明の一態様は、Ｔ細胞内において外因性核酸を発現させるための方法に関する。好ましい実施形態では、本発明は、導入遺伝子をコードする外因性核酸を、この導入遺伝子を発現させる細胞内に導入するための改良された方法を提供する。「外因性核酸」は、細胞内に導入する任意の核酸として定義することができる。この外因性核酸が１つのポリペプチド産物をコードしてもよい。あるいは、この外因性核酸配列によって、１つ以上の非コード配列、たとえば１つ以上のＲＮＡ分子（短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を生成させてもよい。この外因性核酸は、ある配列（たとえば遺伝子）と一致していてもしていなくてもよく、あるいは、細胞内においてみられるまたは発現されるものであってもよい。たとえば「外因性」核酸が、正常Ｔ細胞においては通常みられるが、形質導入を行うＴ細胞内においてはみられない、またはみられてもより少ない、あるいは発現量が少ない、ある遺伝子と一致していてもよい。本明細書において用いる「導入遺伝子」とは、発現させるために、すなわち転写および／または翻訳によってポリペプチド産物を生成させるために、細胞内に導入する外因性遺伝子を表す。また、本明細書においては「外因性核酸」を「外因性遺伝子物質」と互換可能に用いる。
【００２４】
本明細書において用いる「核酸」という用語は、１本鎖または２本鎖の構造をしたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体を表すことができる。この用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどを示すために用いる。本開示の目的のために、これらの用語がポリマーの長さに関して限定するように解釈されるべきではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの既知のアナログ、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸基を改変したヌクレオチドを包含することができる。一般的に、ある特定のヌクレオチドのアナログは同じ塩基対特異性を有する。すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対をなすであろう。また、この用語は、天然に生じた場合に致死性となるような、あるいは天然に生じないような修飾主鎖残基または結合を含む核酸も包含する。このようなアナログの例には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の方法によって形質導入させるＴ細胞は、任意の哺乳動物の任意のＴ細胞であってよい。本明細書において用いているように、「Ｔ細胞」は「Ｔリンパ球」と互換可能に用いられる。好ましい実施形態では、Ｔ細胞が初期リンパ球であり、より好ましくはヒトの初期Ｔリンパ球である。いくつかの好ましい実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ４＋細胞である。また、このＴ細胞がＣＤ８＋細胞であってもよく、あるいはＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の混合物であってもよい。当技術分野において周知の方法によって、本発明の組成物および方法に使用するためのＴ細胞を採取かつ／または入手することができる。試料はすぐに使用可能であり、あるいは将来使用するために凍結することもできる。凍結試料の場合には、当技術分野において周知の方法に従って、使用前に適切な培養液で解凍して培養することができる。
共刺激シグナル
【００２６】
本発明の方法には、共刺激シグナルでＴ細胞を活性化することが含まれる。本明細書において用いているように、「共刺激シグナル」とは、少なくとも２つの共刺激剤が協調して働く活性化シグナルを表す。好ましい実施形態では、共刺激シグナルがＴ細胞の受容体の活性化を含み、かつ第１の共刺激剤がＣＤ３リガンドを含み、好ましくは抗ＣＤ３抗体を含む。Ｔ細胞および特にＣＤ４＋Ｔ細胞の好ましい実施形態では、共刺激シグナルはさらにＣＤ２８受容体の活性化を含み、かつ第２の共刺激剤がＣＤ２８リガンドを含み、好ましくは抗ＣＤ２８抗体を含む。ＣＤ８＋Ｔ細胞の代替実施形態では、共刺激シグナルがさらにＩＬ−１５受容体の活性化を含み、かつ第２の共刺激剤がＩＬ−１５を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、たとえばＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド市）のようにビーズ上に結合している。
【００２７】
ＣＤ３およびＣＤ２８の経路の共刺激はＣＤ４＋Ｔ細胞の最適な形質導入に必要とされる一方、本明細書に示すように、追加の造血細胞系統はまた少なくとも２つの異なる伝達経路（たとえば、分裂シグナルや細胞間接触に関連するシグナル）を通って、完全な活性化を達成するために共刺激を必要とする。したがって、本明細書に記載の方法は、特定の細胞種に適した共刺激シグナルを除いて、同様のアデノウイルスベクターを使って別の細胞種に適用できるかもしれない。例としては、抗ＣＤ３抗体およびＣＤ１３７リガンド（４−１ＢＢＬ）によって共刺激されるＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｗｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｍａｙ  １５；１６８（１０）：４８９７−９０６）、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４によって共刺激されるＢリンパ球（Ｆｅｃｔｅａｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ  ｌ；１７１（９）：４６２１−９）、および抗ＣＤ９４抗体およびＩＬ−２またはＩＬ−１５によって共刺激されるＮＫ細胞のサブセット（Ｖｏｓｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  Ｆｅｂ  ｌ５；１６０（４）：１６１８−２６）が含まれるが、それらに限定されない。
発現ベクター
【００２８】
本方法のさらなるステップには、活性化した細胞を、発現させる外因性遺伝子物質を運ぶベクターに曝露することが含まれる。本明細書で用いる「ベクター」という用語は、キャリアー核酸分子を表す。キャリアー核酸分子内には、細胞内に導入する核酸配列を挿入することができる。いくつかの実施形態では、このキャリアー核酸分子は導入された細胞内で複製可能である。好ましい実施形態では、ベクターが発現ベクターである。「発現ベクター」とは、形質導入させた細胞内において外因性遺伝子の転写を、かつ任意で翻訳を、許可するための適切な制御配列を含むベクターを意味する。一般的に、発現ベクターには「発現カセット」が含まれ、発現カセットには転写させる核酸をプロモーターに結合させて転写可能にしたものが含まれる。たとえば、発現ベクターの調節領域には挿入した核酸配列の転写を活性化するプロモーター配列が含まれていてもよい（このプロモーター配列に挿入する核酸を結合させて転写可能にする）。また、発現ベクターには塩基配列、たとえば１つ以上のＲＮＡ分子（たとえば、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を転写させるためのベクターも含まれる。
【００２９】
好ましい実施形態では、ベクターがアデノウイルス発現ベクターである。アデノウイルスは、約３６、０００塩基対の直鎖状２本鎖ＤＮＡ分子と約９０〜１４０塩基対の同一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）とを含有している。このＩＴＲの正確な長さは、アデノウイルスのセロタイプに依存する。アデノウイルスは、その感染のメカニズムを利用することによって、さまざまな型の細胞内で形質導入や導入遺伝子の発現を達成するためのベクターとして使用されてきた。たとえば、Ａｄ５ベクターを使って、感染を成功させるための最初のステップは、アデノウイルスを標的細胞に結合させることであり、その過程はそれらの繊維タンパク質によって仲介される。この繊維タンパク質は３量体の構造を有している（Ｓｔｏｕｔｅｎ，Ｐ．Ｗ．Ｆ．、Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ、Ｒｕｉｇｒｏｋ，Ｒ．Ｗ．Ｈ．、およびＣｕｓａｃｋ，Ｓ．（１９９２）アデノウイルス繊維の軸の新しい３重らせんモデル、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２６，１０７３−１０８４）。また、この繊維タンパク質はウイルスのセロタイプにより長さが異なる（Ｓｉｇｎａｓ，Ｇ．、Ａｋｕｓｊａｒｖｉ，Ｇ．、およびＰｅｔｔｅｒｓｏｎ，Ｕ．（１９８５）アデノウイルス３繊維ポリペプチド遺伝子：繊維タンパク質の構造の複雑さ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５３，６７２−６７８；Ｋｉｄｄ，Ａ．Ｈ．、Ｃｈｒｂｏｃｚｅｋ，Ｊ．、Ｃｕｓａｃｋ，Ｓ．、およびＲｕｉｇｒｏｋ，Ｒ．Ｗ．／Ｈ．（１９９３）アデノウイルスタイプ４０ウイルス粒子は２つの異なる繊維を含んでいる、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９２，７３−８４）。異なるセロタイプは、構造的に似たＮ末端およびＣ末端を有し、しかし中間の基部領域は異なるポリぺプチドを有している。Ｎ末端の最初の３０アミノ酸は、ペントン基を繊維に固着するのに関わる（Ｗ．ＤｏｅｒｆｅｒおよびＰ．Ｂｏｈｍ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン市、アデノウイルスの分子レパートリーＩ、内のＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋ  Ｊ．、Ｒｕｉｇｒｏｋ  Ｒ．Ｗ．Ｈ．、およびＣｕｓａｃｋ  Ｓ．、１９９５．アデノウイルス繊維、ｐ．１６３−２００．）。特に、尾部に保存されたＦＮＰＶＹＰ領域がある（Ａｍｂｅｒｇ  Ｎ．、Ｍｅｉ  Ｙ．およびＷａｄｅｌｌ  Ｇ．、１９９７．目と生殖器指向性を有するアデノウイルスの繊維遺伝子、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２７：２３９−２４４）。Ｃ末端、または“ノブ”は細胞のアデノウイルス受容体と最初の相互作用をするのに関わる。この最初の結合の後、キャプシドペントン基と細胞表面のインテグリン間の第２の結合は、コートされたくぼみの中のウイルス粒子の内部移行と飲食作用を導く（Ｍｏｒｇａｎ，Ｃ、Ｒｏｚｅｎｋｒａｎｔｚ，Ｈ．Ｓ．、およびＭｅｄｎｉｓ，Ｂ．（１９６９）電子顕微鏡に観察されるようなウイルスの構造と発達Ｘ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ４、７７７−７９６；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｖ．およびＰｅｒｓｓｏｎ，Ｒ．（１９８４）．アデノウイルス２型のＨｅＬａ細胞への侵入、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５１、６８７−６９４；Ｖａｒｇａ，Ｍ．Ｊ．、Ｗｅｉｂｕｌｌ，Ｃ、およびＥｖｅｒｉｔｔ，Ｅ．（１９９１）．アデノウイルス２型の感染侵入経路、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５、６０６１−６０７０；Ｇｒｅｂｅｒ，Ｕ．Ｆ．、Ｗｉｌｌｅｔｓ，Ｍ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｐ．、およびＨｅｌｅｎｉｕｓ，Ａ．（１９９３）．細胞に侵入している間のアデノウイルス２型の段階的な分解、Ｃｅｌｌ  ７５、４７７−４８６；Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．、Ｍａｔｈｉａｓ，Ｐ．、Ｃｈｅｒｉｓｈ，Ｄ．Ａ．、およびＮｅｍｅｒｏｗ，Ｇ．Ｒ．（１９９３）ウイルス付着ではないインテグリンａｖｂ３とａｖｂ５プロモーターアデノウイルス内部移行、Ｃｅｌｌ  ７３、３０９−３１９）。インテグリンはαβヘテロ２量体で、少なくともその１４αと８βサブユニットは同定されている（Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．（１９９２）インテグリン：細胞接着の万能性、調節と情報伝達、Ｃｅｌｌ  ６９、１１−２５）。細胞内で発現しているインテグリンの配列は複雑で、細胞種と細胞の環境間で変動するであろう。このノブはセロタイプ間である保存された領域を含むが、ノブタンパク質は高度な可変性を示し、かつそのことは、異なるアデノウイルス受容体が存在することを示している。
【００３０】
いくつかの他のアデノウイルスベクターは、侵入する際に、別のメカニズムを使用することもある。たとえば、Ａｄ３５のようなサブグループＢアデノウイルスは細胞接着受容体としてヒトＣＤ４６を使う（Ｇａｇｇａｒら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．９、ｐｐ．１４０８−１４１２）。キメラＡｄ５１３５ベクターはＡｄ３５と同じ受容体特異性を有し、したがってヒト造血幹細胞のような細胞のＣＡＲ非依存的形質導入を許すことも証明されてきている（Ｎｉｌｓｓｏｎら（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｏｌ．９、ｐｐ．３７７−３８８）。
【００３１】
ヒトアデノウイルスの少なくとも６つの異なるサブグループが提唱され、約５０の異なるアデノウイルスセロタイプが含まれる。これらのヒトアデノウイルスの他に、多くの動物のアデノウイルスが同定されている（たとえば、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｍ．およびＹａｓｕｅ（１９８３）動物のアデノウイルス１２章、ｐ４９７−５６１を参照されたい）。動物の抗血清（ウマやウサギ）での定量的中和によって決定づけられるように、セロタイプはその免疫学的違いに基づいて定義され得る。もし中和することで２つのウイルス間である程度の相互反応が示されるならば、セルタイプの違いは、Ａ）たとえば、赤血球凝集素阻害における交差反応の欠如によって示されるように、赤血球凝集素と関係ないかどうか、または、Ｂ）ＤＮＡの中に実質的な生物物理学的／生化学的な違いが存在するかどうか、が想定される。（Ｆｒａｎｃｋｉ，Ｒ．Ｉ．Ｂ．、Ｆａｕｑｕｅｔ，Ｃ．Ｍ．、Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．およびＢｒｏｗｎ，Ｆ．（１９９１）。ウイルスの分類と命名法、ウイルス分類国際委員の第５報告書、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．２，１４０−１４４）異なるアデノウイルスセロタイプの抗体を中和するのに対する感受性の違いの他に、Ａｄ２やＡｄ５のようなサブグループＣの中のアデノウイルスは、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ２１、Ａｄ３４およびＡｄ３５のようなサブグループＢ由来のアデノウイルスと比較したときに、異なる受容体に結合する（たとえば、Ｄｅｆｅｒ  Ｃ、Ｂｅｌｉｎ  Ｍ．、Ｃａｉｌｌｅｔ−Ｂｏｕｄｉｎ  Ｍ．およびＢｏｕｌａｎｇｅｒ  Ｐ．、１９９０．ヒトアデノウイルス宿主細胞相互作用：サブグループＢとＣのメンバーを用いた比較研究、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６４（８）：３６６１−３６７３；Ｇａｌｌ  Ｊ．、Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ  Ａ．、Ｌｅｉｎｗａｎｄ  Ｌ．およびＦａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  Ｅ．、１９９６．アデノウイルスの５型と７型とのキャプシドキメラ：繊維交換は初期免疫中和エピトープに影響することなく受容体の指向性を変える、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０（４）：２１１６−２１２３、などを参照されたい）。
【００３２】
１つのアデノウイルスセロタイプの繊維タンパク質のノブ領域を、もう１つのセロタイプのそれと置き換えることによって、アデノウイルスベクターの偽型化は、本来可能となり得る（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９７  Ｊｕｎ；７１（６）：４７８２−９０）。この種の繊維タンパク質操作は、ベクター指向性の変更を許す、すなわち細胞種の異なる範囲の形質導入を許す（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ２００２、キメラな５型と３５型の繊維タンパク質を含むアデノウイルスベクターは変えられかつ拡大された指向性を示し、かつ外因性遺伝子のサイズ制限を増す、Ｆｅｂ  ２０；２８５（ｌ−２）：６９−７７．、Ｔａｋａｙａｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００３  Ｍａｙ  １０；３０９（２）：２８２−９３．；Ｓｔｅｃｈｅｒら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００１  Ｊｕｌ；４（ｌ）：３６−４４）。このようなキメラアデノウイルスベクターの構築は、当技術分野で周知である。たとえば、受容体特異性は、Ａｄ３ノブタンパク質とＡｄ５ノブタンパク質を、逆も同じであるが、交換することにより、変えられ得ることが証明されてきている（Ｋｒａｓｎｙｋｈ  Ｖ．Ｎ．、Ｍｉｋｈｅｅｖａ  Ｇ．Ｖ．、Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｊ．Ｔ．およびＣｕｒｉｅｌ  Ｄ．Ｔ．、１９９６．ウイルス指向性を変えるため修飾された繊維を有する組み換えアデノウイルスベクターの産生、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０（１０）：６８３９−６８４６；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｓ．Ｃ、Ｒｏｌｌｅｎｃｅ  Ｍ．、Ｗｈｉｔｅ  Ｂ．、Ｗｅａｖｅｒ  Ｌ．およびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ  Ａ．、１９９５．ヒトアデノウイルスセロタイプ３と５は、繊維の頭部領域を経由して、２つの異なる細胞の受容体に結合する、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６９（５）：２８５０−２８５７、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｓ．Ｃ、Ｒｏｌｌｅｎｃｅ  Ｍ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ−Ｎｅｆｆ  Ｊ．およびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ  Ａ．、  １９９７．修飾された繊維タンパク質を含むキメラアデノウイルスベクターによるヒト細胞の選択的標的、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１（６）：４７８２−４７９０；また、Ｙｏｔｎｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  Ｊｕｎ；８（１２）：９３０−７なども参照されたい）。
【００３３】
いくつかの実施形態では、アデノウイルス発現ベクターが偽型化される。たとえばベクターが、キメラのアデノウイルスベクター、すなわち２つ以上のアデノウイルス（外因性遺伝子を含む）由来の核酸配列を含む遺伝的に修飾されたベクターを含み得る。特に、この核酸配列は、２つの異なるセロタイプのアデノウイルス由来のアデノウイルスタンパク質と一致するであろう。好ましい実施形態では、ベクターが、少なくとも１つの組織指向性を決定づけている、サブグループＢアデノウイルス由来の繊維タンパク質の断片と一致する配列を含む。この場合の指向性は、Ｔ細胞指向性である。より好ましい実施形態では、ベクターがＡｄ５とＡｄ３５アデノウイルス由来の配列を含み、たとえば、ベクター上でＡｄ５繊維遺伝子をＡｄ３５繊維遺伝子に置換する。さらにより好ましい実施形態では、Ａｄ３５塩基配列が、Ｆ３５として知られる繊維タンパク質のノブ部分をコードするＡｄ３５の遺伝子と一致する。このようなベクターは、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターと呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、ベクターがＡｄ５とＡｄ１１の塩基配列を含む。さらにいくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターの組合せ、たとえば、本明細書に記載の任意の種類のアデノウイルス発現ベクターおよび／またはキメラアデノウイルスベクターの組合せを使用することができる。
【００３４】
当業者は、本発明のいくつかの実施形態の実施において、アデノウイルスベクターに他の修飾または変更がなされ得ることを理解されよう。たとえば、いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターを改変して、標的細胞内におけるアデノウイルス核酸の複製を減少または不能にさせる。いくつかの実施形態では、アデノウイルス核酸を改変して、アデノウイルス核酸によってコードされるアデノウイルスタンパク質に対する免疫応答を開始するための宿主免疫システムの能力を減少または不能にさせる。いくつかの実施形態では、アデノウイルス核酸を改変して、宿主細胞ゲノムに組み込まれるようにする。たとえば、いくつかの実施形態では、類似配列を使用して、たとえば標的化した相同組換えを介して、アデノウイルス核酸の少なくとも一部を宿主細胞のゲノムに組み込む。
【００３５】
本発明の方法に従って、たとえば、形質導入に適した状況下でＴ細胞をベクターに曝露することによって、ベクターでＴ細胞を形質導入させることができる。たとえば、Ｔリンパ球培養物は約３７℃、５％ＣＯ2で培養することができる。ベクターで細胞を「形質導入」させるとは、ベクターを細胞に侵入させることを表す。侵入はいかなる過程、たとえば、受容体を介した飲食作用、すなわち粒子が細胞に取り込まれる手段によってもよい。上記のより詳細な概要として、いくつかのアデノウイルス粒子の取り込みには一般的に２段階の過程がある。まず、ウイルスの繊維タンパク質と細胞受容体との相互作用がこの過程に関わる。たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子とコクサッキーウイルス−アデノウイルス受容体との相互作用などである。ウイルスペントンタンパク質は、次いで、受容体を介した飲食反応を経た内部移行を促進することによって、インテグリン細胞受容体に結合する。たとえば、これは、Ａ５ベクターによって使われるメカニズムである。他のアデノウイルスベクター、たとえばＡｄ５／Ａｄ３５ベクターは、侵入のためにＣＤ４６を使用する。当技術分野で知られた方法および／またはＡｄＥａｓｙ（商標）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ市）キットのような商業的に利用可能なキットを使って、アデノウイルスベクターを簡単に構築することができる。
【００３６】
本発明のさらにいくつかの実施形態では、本明細書に記載の１又は複数のアデノウイルスベクターを、当技術分野で知られた別のアプローチと組み合わせて使用する。たとえば、アデノウイルスとレンチウイルスベクターの混合物を、形質導入を達成するために使用してもよい。
【００３７】
当業者に知られているように、感染多重度（ＭＯＩ）を変えるために、ベクターをさまざまな希釈で前記Ｔ細胞に直接加えることができる。たとえば、１細胞あたり約１０〜１０００感染単位の範囲のＭＯＩになるように、ベクターを培養液で希釈することができる。本発明を使用することによる利点は、ＭＯＩを、特にヒトの免疫細胞およびＴ細胞に対してより毒性の低いレベルに低下させることができると同時に、効果的なアデノウイルス形質導入と適切な導入遺伝子発現レベルをなお達成していることである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８抗体で被覆されたビーズを使ってＣＤ４＋細胞を活性化し、導入させる外因性遺伝子を運ぶＡｄ５／Ｆ３５ベクターで形質導入させる。
【００３９】
形質導入後、Ｔ細胞で外因性遺伝子を発現させることができる。以下の実施例でより詳細に説明しているように、本発明のいくつかの実施形態によって、以前に記載された方法（たとえば、レンチウイルス遺伝子送達を使う方法）と比較して、驚くべきかつ予想外に高い導入遺伝子発現レベルが得られた。さらに、本発明のいくつかの実施形態の方法は、Ｔ細胞活性化を用いない場合を超える、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、または少なくとも約２０倍の改良をもたらす。
【００４０】
たとえばいくつかの好ましい実施形態では、本明細書で提供する方法が、以前に当技術分野で記載された方法と比較して外因性遺伝子の発現レベルを上昇させるという結果が得られた。たとえば、本明細書での方法は、共刺激シグナルを用いずに得られた発現レベルの約２倍以上、約３倍以上、または約４倍以上のレベルを提供し得る。さらに、本発明はまた、細胞を活性化する既知の方法と比較して改良された発現レベルも提供し得る。たとえば、ＰＨＡまたはＩＬ−２による刺激前と比較して、本発明のいくつかの実施形態の方法では、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍の導入遺伝子発現レベルを提供する。たとえば、以下の実施例を参照されたい。実施例では、導入遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を用いることによって、ＧＦＰの蛍光強度から導入遺伝子発現レベルを測定している。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＰＨＡまたはＩＬ−２によって予め刺激した場合と比較して、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、またはさらに少なくとも約１５倍の導入遺伝子発現のレベルを提供する。たとえば、以下の実施例を参照されたい。実施例では、導入遺伝子としてコードされたヌクレアーゼの発現によって生じるＮＨＥＪの割合から導入遺伝子発現レベルを測定している。図１１も参照されたい。図１１には、ＰＨＡまたは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体のいずれかによって予め刺激した場合の、ＣＣＲ５を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼを運ぶＡｄ５／Ｆ３５ベクターに曝露したＣＤ４＋Ｔ細胞内におけるＣＣＲ５遺伝子の改変の違いを示している。
【００４２】
形質導入によって、一過的に発現させることも、あるいは安定的に発現させることもできる。導入遺伝子が、安定的に宿主ゲノムに組み込まれる場合には、たとえば、安定した発現が得られる。いくつかの適用例においては、一過的な発現がより好ましい。たとえば、ある方法には、宿主のゲノム上の領域と１塩基違いのほぼ相同な配列を使うことが含まれる。この場合の組込みは、たとえば、１０個中１個または２０個中１個のような高い確率で起こり得る。しかし、細胞が分裂するときに、このヌクレオチドの違いは修復される。この方法によって、高い形質導入効率と高いが一過的な導入遺伝子発現を得ることができる。
【００４３】
当業者は、細胞に導入した外因性核酸を発現させる必要のない適用例にも気付くであろう。たとえば、本発明のいくつかの実施形態の方法は、それ自体に有効な核酸配列を送達することができる。転写されるが、翻訳されない核酸配列には、たとえば、アプタマー、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、スプライセオソーマルＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡが含まれる。したがって、本発明の他の一態様は、共刺激シグナルでＴ細胞を活性化し、外因性遺伝子を送達するアデノウイルスベクターにＴ細胞を曝露し、かつベクターをＴ細胞に侵入させることによってＴ細胞を形質導入させる方法に関する。上記に記載の細胞、ベクター、および共刺激シグナルを、本発明のこの態様に用いることもできる。本発明の好ましい実施形態によって、Ｔ細胞に外因性遺伝子物質を導入することに関して、形質導入効率の増大が得られる。たとえば、いくつかの実施形態では、形質導入効率が、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％である。核酸送達効率は、当技術分野に知られるさまざまな技術によって測定することができる。例として、フローサイトメトリー、Ｃｅｌ１アッセイ、およびその類似方法を含むが、これらに限定されない。
キット
【００４４】
本発明の他の一態様では、Ｔ細胞を形質導入させるためのかつ／またはＴ細胞内で外因性遺伝子を発現させるためのキットを含む。このようなキットは、１つ又は複数の本発明の組成物を含む適切な物質を、より好ましくは適切なラベルをして、適切な容器で、パッケージすることで構築され得る。キットはまた、該方法を実施するためにかつ／または形質導入および／または導入遺伝子発現の割合を測定するために役立つ追加的試薬や物質（たとえば、適切な緩衝液、塩類溶液など）も含み得る。いくつかの実施形態では、このキットがさらに、本明細書で開示する形質導入および／または導入遺伝子発現に関係する適切な説明書のセットも含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、キットが共刺激剤およびアデノウイルスベクターを含み、たとえば、さらにアデノウイルス発現ベクターを含む。本明細書において用いる「共刺激剤」とは、Ｔ細胞活性化のために共刺激シグナルを与えることができる任意の化合物、組成物、凝集物、溶液などを表すことができる。例としては、本明細書に記載のような組合せで、抗ＣＤ３抗体の被覆ビーズ、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の被覆ビーズ、およびＩＬ−１５を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
キットのアデノウイルスベクターは、本明細書に記載の任意の１つ又は複数のアデノウイルスベクターにすることができる。好ましい実施形態では、ベクターが、Ｔ細胞の形質導入を促進するために偽型化したアデノウイルス発現ベクターである。特定の一実施形態では、ベクターにはＡｄ５／Ｆ３５ベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターがさらに、Ｔ細胞における形質導入および／または発現のための外因性遺伝子を運ぶ。他の実施形態では、ベクターが外来の挿入断片なしで提供される。たとえば、使用者が選択した外因性遺伝子を挿入できるように、ベクターがアデノウイルスの塩基配列と説明書とで提供される。
【００４７】
当業者は、本明細書に記載の改良された方法や組成物のさまざまな用途を理解されよう。たとえば、本発明の方法は、より高い形質導入効率（形質導入される確率という観点から）かつ／またはより高い形質導入発現レベルが望まれるｅｘ  ｖｉｖｏでの応用に用いることもできる。このような適用例は、遺伝子改変、遺伝子の機能解析、およびＴ細胞の性質を変えることを含むが、これらに限定されない。
遺伝子改変
【００４８】
遺伝子改変に関しては、ヌクレアーゼの送達および／または発現の増強によって、遺伝子破壊、遺伝子改変、および／または標的化した組込みを導くことができる。たとえば、そのような適用例においては、外因性遺伝物質が、より詳しくは後述するがＣＣＲ５−ＺＦＮ（８２６７および８１９６ｚ）やＧＲ−ＺＦＮ（９６７４および９６６６）などのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のようなヌクレアーゼを含んでもよい。ＮＨＥＪを介してかつ／または相同組換え修復（ＨＤＲ）の供与体を介して組込みが生じて、改変する標的遺伝子の領域および／またはランダムに破壊する多様な遺伝子の領域に外因性遺伝子が導入され得る。ＨＤＲには、ＨＤＲ装置の鋳型として用いることのできるＺＦＮ標的部位と相同な配列を供与分子に提供することが含まれる。
【００４９】
いくつかの実施例では、導入に用いるベクターがジンクフィンガー対を含む。ジンクフィンガー対とは、２つの結合ドメインを有する１つ又は複数のジンクフィンガータンパク質を表す。「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」の用語は、亜鉛（ジンク）によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を表す。個々のＤＮＡ結合ドメインは、一般的に「指（フィンガー）」として表される。ＺＦＰは少なくとも１つのフィンガー、一般的には２つのフィンガー、３つのフィンガー、４つのフィンガー、５つのフィンガー、または６つのフィンガーを持つ。それぞれのフィンガーは、２〜４塩基対のＤＮＡに結合し、一般的には３〜４塩基対のＤＮＡに結合する。ＺＦＰは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。それぞれのフィンガーは一般的に、約３０アミノ酸、ジンクキレート、ＤＮＡ結合サブドメインを含む。これらのタンパク質の１つのクラス（Ｃ2Ｈ2クラス）を特徴づける例示的なモチーフは、‐Ｃｙｓ‐（Ｘ）2-4‐Ｃｙｓ‐（Ｘ）12‐Ｈｉｓ‐（Ｘ）3-5‐Ｈｉｓ（Ｘは任意のアミノ酸）である（配列番号２９）。研究によって、このクラスの１つのジンクフィンガーは、１つのベータターンの２つのシステイン残基とともにジンクに連動する２つの不変のヒスチジン残基を含むアルファへリックスを含むことが示されている（たとえばＢｅｒｇおよびＳｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１０８１−１０８５  （１９９６年）を参照されたい）。非標準的な（すなわち、非Ｃ2Ｈ2）ジンクフィンガータンパク質も、たとえば米国特許第７，２７３，９２３号、および第７，２６２，０５４号、ならびに米国特許公開第２００６０２４６５８８号、第２００６０２４６５６７号、および第２００３０１０８８８０号に記載されている。
【００５０】
ジンクフィンガー結合ドメインを改変して、予め決定したヌクレオチド配列と結合させることができる。たとえば、米国特許出願公開第２００７／００５９７９５号を参照されたい。好ましい実施形態では、たとえば、ジンクフィンガー対がＣＣＲ５を標的とすることができる。より好ましい実施形態では、たとえば、ベクターがＣＣＲ５を標的とするジンクフィンガー対とヌクレアーゼ（ＺＦＮ）との両方を運び、後に詳しく述べるように、それによってヌクレアーゼがＣＣＲ５遺伝子を特異的に切断することができる。
【００５１】
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼ由来であってもよい。たとえば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩのようなエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼに由来する認識配列が知られている。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照されたい。加えて、エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼに由来するＤＮＡ結合特異性を改変して、非天然の標的部位に結合させることができる。たとえば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
【００５２】
本明細書に記載するのは、たとえばＣＣＲ５遺伝子の不活化のような、遺伝子の不活化に用いることができるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮはジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼならびにそれらの作製方法および使用方法についての例示的な開示は、米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号、第２００５／００２６１５７号、第２００５／００６４４７４号、第２００５／０２０８４８９号、および第２００６／０１８８９８７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／８４１９０号および第ＷＯ２００７１１４２７５号に提供される。例示的なＣＣＲ５標的化ＺＦＮ対ならびにそれらの作製方法および使用方法は、国際特許公開第ＷＯ２００７／１３９９８２号に開示され、本明細書にも完全に組み込まれる。
Ａ．ジンクフィンガータンパク質
【００５３】
ジンクフィンガー結合ドメインを改変して、選択した配列と結合させることができる。たとえば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。改変したジンクフィンガー結合ドメインが、天然に生成されるジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有していてもよい。改変方法には、合理的な設計およびさまざまな様式の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的な設計には、たとえば、３塩基組（または４塩基組）のヌクレオチド配列およびそれぞれのジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることが含まれ、３塩基組または４塩基組のヌクレオチド配列のそれぞれが、特定の３塩基組または４塩基組の配列に結合するジンクフィンガーの１つ又は複数のアミノ酸配列と関連している。たとえば、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号、ならびに米国特許出願公開第２００４／０１９７８９２号を参照されたい。また、これらのすべてが参照により本明細書に完全に組み込まれる。設計方法は、米国特許第６，０１３，４５３号、第６，４７９，６２６号、第６，７４６，８３８号、第６，８６６，９９７号、第６，９０３，１８５号、第７，０３０，２１５号、および第７，１５３，９４９号、ならびに第ＷＯ０１／５３４８０号にも開示されており、これらの開示は参照によりその全体が組み込まれる。
【００５４】
例示的な選択方法には、ファージディスプレイ系およびツーハイブリッド系が含まれ、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号、第６，２４２，５６８号、第６，７９０，９４１号、ならびに国際特許第ＷＯ９８／３７１８６号、第ＷＯ９８／５３０５７号、第ＷＯ００／２７８７８号、第ＷＯ０１／８８１９７号および第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されており、これらの開示は参照によりその全体が組み込まれる。ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性を高めることについては、たとえば、共同所有の米国特許第６，７９４，１３６号に開示されている。
【００５５】
特定の実施形態では、本明細書に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガードメインが、ＣＣＲ５遺伝子における標的配列に結合する。表１は、ヒトＣＣＲ５遺伝子のヌクレオチド配列に結合するように改変された、いくつかのジンクフィンガー結合ドメインを示している。それぞれの行は別々の場所にあるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを示している。それぞれのドメインのＤＮＡ標的配列を第１列目に示しており（ＤＮＡ標的部位は大文字で、接触しないヌクレオチドは小文字で示されている）、第２〜５列目はタンパク質のそれぞれのジンクフィンガー（Ｆ１〜Ｆ４）の認識領域のアミノ酸配列を示している（ヘリックスの開始位置に対して、アミノ酸−１から＋６）。第１列目には、それぞれのタンパク質の特定番号をも示している。
ヒトＣＣＲ５遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ
【表１】
0005666903.tif 000002
【表２】
0005666903.tif 000003
【表３】
0005666903.tif 000004
【表４】
0005666903.tif 000005
【００５６】
特定の実施形態では、表１に示すようなジンクフィンガー結合ドメインを、切断ハーフドメイン、たとえば、ＦｏｋＩなどのタイプII制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインのようなものと融合する。このようなジンクフィンガー／ヌクレアーゼハーフドメイン融合物の対は、たとえば米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号に記載されるように、標的化した切断のために利用される。たとえば、ＺＦＮ‐２１５は、８２６７（配列番号１に示した標的配列により認識され、配列番号２、６、４、および８に示した４つの認識へリックスを含む）と８１９６ｚ（配列番号９に示した標的配列により認識され、配列番号１０、１７、１２、および１３に示した４つの認識へリックスを含む）との対で設計されたジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質を意味する。ＺＦＮ‐２０１は８２６６（配列番号１に示した標的配列を認識し、配列番号２、５、４、および８に示した４つの認識へリックスを含む）および８１９６ｚ（配列番号９に示した標的配列により認識され、配列番号１０、１７、１２、および１３に示した４つの認識へリックスを含む）で設計されたジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質の対を意味する。
【００５７】
標的化した切断のために、結合部位の近隣端は５つもしくはそれ以上のヌクレオチド対に分離することができ、また、それらの融合タンパク質は標的ＤＮＡの反対鎖と結合することができる。したがって、表１に「ｒ１６２設計」（リバース鎖に結合し、その結合部位の下流端がヌクレオチド１６２にあることを示している）として示したタンパク質はいずれも、「１６８設計」（ｒ１６２設計により方向づけられ、またはその結合部位の上流端がヌクレオチド１６８である反対鎖に結合することで示される）として示した任意のタンパク質と対をなすことができる。たとえば、タンパク質８２６７はタンパク質８１９６またはタンパク質８１９６ｚ、あるいは１６８設計のその他の任意のタンパク質と対をなすことができ、すなわち、タンパク質８２６６はタンパク質８１９６または８１９６ｚ、あるいは１６８設計のその他の任意のタンパク質とも対をなすことができる。すべてのｒ１６２および１６８設計の対合成は、ＣＣＲ５遺伝子を標的とした切断および変異生成に用いることができる。同様に、７５２４タンパク質（または他の任意のｒ６２７設計）はＣＣＲ５遺伝子を標的とした切断および変異生成を行うために８０４０タンパク質（または他の任意の６３３設計）との結合に利用することができる。
【００５８】
本明細書に記載のＣＣＲ５‐ＺＦＮは、ＣＣＲ５ゲノム内の任意の配列を標的とすることができる。たとえば、ＣＣＲ５のゲノム配列（ＣＣＲ５‐Ａ３２のような対立遺伝子多型を含む）は当技術分野で周知であり、ホモ接合型のＣＣＲ５‐４３２を有する個体（たとえば、Ｌｉｕら（１９９６年）Ｃｅｌｌ  ３６７３７７を参照されたい）はＨＩＶ‐１感染に抵抗性である。
Ｂ．切断ドメイン
【００５９】
本明細書に記載の融合切断ドメイン部は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを得ることのできる例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。たとえば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州ビバリー市、およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する酵素は他にも知られている（たとえば、Ｓ１ヌクレアーゼ、大豆ヌクレアーゼ、膵ＤＮアーゼＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼなど、また、Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年も参照されたい）。既知のホーミングヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの例としては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれるが、これらに限定されない。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。これらの酵素（またはその機能性断片）の１つ又は複数を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの提供源として利用することができる。
【００６０】
同様に、切断ハーフドメインは任意のヌクレアーゼまたはそれらの一部分から得ることができ、上記のように、切断活性のために２量体化が必要とされる。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合には、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む１つのタンパク質を用いることも可能である。２つの切断ハーフドメインは同じエンドヌクレアーゼ（またはそれらの機能性フラグメント）から得ることができ、あるいはそれぞれの切断ハーフドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（またはそれらの機能性フラグメント）から得ることもできる。加えて、２つの融合タンパク質がそれらの各々の標的部位に結合する際に、切断ハーフドメインが、たとえば２量体化によって、機能的な切断ドメインを形成できる空間的な方向性で互いに位置することができるように、２つの融合タンパク質の標的部位を互いに配置することが好ましい。したがって、特定の実施形態では、標的部位の隣接端は５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離される。しかし、２つの標的部位の間に、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対（たとえば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ以上）があってもよい。一般的に、切断部位は２つの標的部位の間にある。
【００６１】
制限ヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、また、ＤＮＡの特定配列に（認識領域において）結合して、結合した部位またはその近隣のＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（たとえば、タイプIIＳ）は認識領域とは違う部位でＤＮＡを切断し、結合ドメインおよび切断ドメインが離れている。たとえば、タイプIIＳ、ＦｏｋＩ酵素はその１つの鎖の認識部位から９ヌクレオチドおよびその他のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。たとえば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号、および第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５４２７９、Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１、９７８−３１、９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質が、少なくとも１つのタイプIIＳ制限酵素および１つ又は複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）を含み、これらは改変したものでもしていないものでもよい。
【００６２】
切断ドメインが結合ドメインと離れている例示的なタイプIIＳ制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素は２量体で活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０、５７０−１０、５７５。したがって、本開示の目的のために、記載の融合タンパク質に用いるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー‐ＦｏｋＩ融合の標的となる二本鎖切断および／または細胞配列の標的置換は、触媒的に活性のある切断ドメインに再構成される。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインを有する単一ポリペプチド分子または２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインも利用され得る。標的化した切断およびジンクフィンガー‐ＦｏｋＩ融合を用いた変性標的配列のパラメーターは、この開示の他の部分に記載する。
【００６３】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を有するタンパク質の任意の部分、あるいは多量体化（たとえば、２量体化）して機能的な切断ドメインを形成し得るタンパク質の任意の部分とすることができる。
【００６４】
例示的なタイプIIＳ制限酵素は、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号および国際特許公開第ＷＯ２００７／０１４２７５号に開示されており、その全体が本明細書に組み込まれる。付加的な制限酵素も、分離した結合部位および切断ドメインを含み、かつこれらは本開示によって熟慮される。たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【００６５】
切断特異性を高めるために、切断ドメインも修飾されるであろう。ある実施形態では、切断ハーフドメインの多型が採用され、それは多型が最小限に抑えられている、または切断ハーフドメインのホモ２量体化を防ぐものである。そのような改変された切断ハーフドメインの非限定的な例は、詳細にＷＯ２００７／０１４２７５に述べられており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、切断ドメインが、ホモ２量体化を最小限にするあるいは防ぐように改変された切断ハーフドメイン（２量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含有する。これは当業者に知られており、たとえば、米国特許公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＦｏｋＩのアミノ酸残基４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位はすべて、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの２量体化に影響する標的部位である。たとえば、米国特許公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号、国際特許公開第ＷＯ０７／１３９８９８号、Ｍｉｌｌｅｒら（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（７）：７７８−７８５を参照されたい。
【００６６】
ヘテロ２量体を構成するＦｏｋＩの例示的な改変切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に変異を有し、かつ第２の切断ハーフドメインが４８６位および４９９位のアミノ酸残基に変異を有する対を含む。国際特許公開ＷＯ２００７／１３９９８２の図２、３、および４を参照されたい。また、これらは参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００６７】
したがって、一実施形態では、図３および４に示すように、４９０における変異ではＧＩｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、５３８における変異ではＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、４８６における変異ではＧｉｎ（Ｑ）をＧＩｕ（Ｅ）に置換し、かつ４９９における変異ではＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。特に、本明細書に記載される改変切断ハーフドメインは、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」改変切断ハーフドメインとして導入される１つの切断ハーフドメインにおける４９０位（ＥからＫ）および５３８位（ＩからＫ）の変異、および「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」改変切断ハーフドメインとして導入される他方の切断ハーフドメインにおける４８６位（ＱからＥ）および４９９位（ＩからＬ）の変異によって調整される。本明細書に記載の改変切断ハーフドメインは変種の切断が最小限化されまたは除去されるヘテロ２量体変異体となる。たとえば、国際特許公開０７／１３９８９８の実施例１を参照されたい。この開示は、参照によりすべての目的のためにその全体が組み込まれる。
【００６８】
本明細書に記載の改変切断ハーフドメインは、適切な任意の方法を用いて調整することができ、たとえば、米国特許公開第２００５／００６４４７４号（たとえば実施例５）および第ＷＯ２００７／１４２７５号（たとえば実施例３８）に記載されるように野性型の切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異導入法による。
Ｃ．ＣＣＲ５の標的化した切断への付加的方法
【００６９】
本明細書に開示する方法には、ＣＣＲ５遺伝子に標的部位を持つ任意のヌクレアーゼを用いることができる。たとえば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼはきわめて長い認識領域を持ち、それらのうちいくつかは、統計学によると、かつてはヒトサイズのゲノムに存在していたようである。ＣＣＲ５遺伝子の特徴的な標的部位を有する任意のヌクレアーゼを、ＣＣＲ５遺伝子を標的とした切断のためにジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに、または付加的に用いることができる。
【００７０】
例示的なホーミングエンドヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、ＩＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。これらの認識配列は知られている。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照されたい。
【００７１】
多くのホーミングエンドヌクレアーゼも切断特異性はそれらの認識領域に対して絶対的なものではないが、その部位は、哺乳類ゲノムに対する単一切断がその認識部位の単一コピーを含む細胞中でホーミングエンドヌクレアーゼが発現することによって得られるに充分な長さである。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性は非天然標的部位に結合させるために改変できることも報告されている。たとえば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６を参照されたい。
遺伝子解析
【００７２】
遺伝子の機能解析に関して、ｃＤＮＡカセットの送達および／または発現の改良によって、研究を行う遺伝子の発現を大幅に上昇させることができる。別の一実施例としては、ｓｉＤＮＡ発現カセットの送達および／または発現の改良によって、研究を行う遺伝子の発現を大幅に低下させることができる。いずれの場合にも、発現における大幅な変化によって、Ｔ細胞遺伝子の遺伝子機能の解析を促進することができる。
【００７３】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける適用例には、形質導入されたＴ細胞集団の機能的特性を変更することも含まれる。Ｔ細胞の機能を変更するために用いることのできる導入遺伝子の例には、より詳しくは後述するように、Ｔ細胞集団を特定抗原に再標的化させることができるキメラなＴ細胞受容体、ならびに過剰発現させることによって免疫機能および／または抗ウイルス活性を高めることのできるサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
治療
【００７４】
本明細書に記載の方法および組成物を、動物対象者におけるいくつかの血液学的、免疫学的かつ／または遺伝的な疾患の治療に用いることもできる。本明細書で用いる「治療」（およびその文法上の変形）という用語は、治療上の利益および／または予防上の利益を得ることを含む。治療上の利益は治療する原因となっている疾患の根絶または寛解を意味する。同様に、治療上の利益は、対象者がまだ病気の状態にある事実にも関わらず、対象者に改善がみられるような状態下に関連する１つ又は複数の生理的な症状の根絶または寛解が得られる。予防上の利益のためには、本発明の組成物が、まだ診断がついていないとしても、状態の進行のリスクがある対象者、またはそのような状態の１つ又は複数の生理学的症状が報告される対象者に投与される。
【００７５】
本発明はまた、本明細書に開示する１つ又は複数の方法および／または組成物を用いて治療を行うことができる対象者に投与するための医薬組成物を提供する。いくつかの実施例では、医薬組成物は、アデノウイルスベクターにより送達し、ｅｘ  ｖｉｖｏで宿主細胞に導入する外因性遺伝子のような治療遺伝子を含む。「治療遺伝子」とは、形質導入および／または発現をさせた場合に、治療する対象者において利益ある結果をもたらす核酸分子を意味する。そのような治療遺伝子の例としては、Ｔ細胞発現を増強して、癌患者の治療に用い得るＩＬ−２、ならびにＴＩＣ細胞感染およびＡＰＣ変異において重要な役割を果たし、ある種の白血病の患者の治療に用い得るＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９またはＣＤ１５４）が含まれる。特定の一実施例として、アロステリック制御可能なリボザイムがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでｂ２ａ２型ｂｃｒ‐ａｂｌ腫瘍遺伝子に存在する慢性骨髄性白血病のセルラインに細胞死を誘導することが示されている。Ｔａｎａｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００年、４０６：４７３−４７４。本発明のいくつかの実施例では、ＣＭＬ患者の初期Ｔ細胞内にこのリボザイムを形質導入するという用途もあり得、それはたとえば、本明細書で教示する１つ又は複数の方法を用いてリボザイムを形質導入して高いレベルで発現させることができる場合などである。
免疫学的疾患
【００７６】
一実施形態では、形質導入されたＴ細胞によって発現した治療タンパク質は、免疫調節活性を持つ。たとえば、本発明の治療ポリペプチドは、免疫細胞の激増、分化、または可動化（走化性）の活性化または阻害により、免疫系の不全または疾患の治療に有用となり得る。免疫細胞は、多能性造血幹細胞から血液生成の過程、骨髄性（血小板、赤血球細胞、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）の生成を通して発達する。これらの免疫不全または疾患は、遺伝的病因、体細胞性病因、たとえば癌または自己免疫疾患、後天的病因（たとえば、化学療法または毒による）、または感染によるものである。
【００７７】
本発明の治療ポリペプチドは、血液生成細胞の欠陥または疾患の治療に有用である。本発明の治療ポリペプチドは、特定の（または多くの）タイプの血液生成細胞の減少に関連するそれらの疾患を治療しようとする目的で、多能性造血幹細胞を含む血液生成細部の分化および増殖の増加に用いることができる。免疫欠乏症候群の例には、血液タンパク質疾患（たとえば、γグロブリン欠乏血症、異常γグロブリン血症）、血管拡張性失調症、一般変異型免疫不全症、ディジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球粘着因子欠乏症、リンパ球減少症、食細胞殺菌性機能不全、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤｓ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、貧血、血小板減少症、またはヘモグロビン尿症が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明の治療用ポリペプチドは自己免疫疾患の治療にも有用である。多くの自己免疫疾患は、免疫細胞により異物として自己を不適当に認識することに起因する。この不適当な認識は宿主組織の破壊を誘導する免疫応答という結果となる。したがって、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害する本発明の治療用ポリペプチドの投与は、自己免疫疾患の防止に効果的な療法である。
【００７９】
本発明により治療される自己免疫疾患の例には、アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、リウマチ性関節炎、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水疱性類天然痘、天然痘、多内分泌障害、紫斑病、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺胞性炎症、ギラン・バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、および、自己免疫性炎症性眼疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
同様に、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸器系の問題のような、アレルギー反応および状態が本発明の治療用ポリペプチドによって治療されうる。
【００８１】
さらに、これらの分子はアナフィラキシー、抗原分子への過敏症、または血液型不一致の治療にも用いることができる。
【００８２】
本発明の治療用ポリペプチドを、臓器拒絶反応または移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療および／または予防に用いることもできる。臓器拒絶反応は、宿主免疫細胞が免疫応答を介して移植組織を破壊することによって起こる。同様に、ＧＶＨＤにも免疫応答が含まれるが、しかしこの場合では、外部から移植された免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特に、Ｔ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害する本発明の治療用ポリペプチドを投与することは、臓器拒絶反応またはＧＶＨＤを予防するために効果的な療法となり得る。
【００８３】
同様に、炎症を調節するために本発明の治療用ポリペプチドを用いてもよい。たとえば、この治療用ポリペプチドによって、炎症反応に関わる細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子を慢性および急性の両方の炎症性疾患の治療に用いることができ、これには、感染に起因する炎症（たとえば、敗血症ショック、敗血症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））や、虚血再潅流による損傷、エンドトキシン致死性、関節炎、補体媒介劇症拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカインに誘導された肺損傷、炎症性大腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（たとえば、ＴＦＮまたはＩＬ‐１）の過剰発現に起因するものが含まれる。
【００８４】
免疫調節活性を持つタンパク質のクラスの例には、サイトカインおよび胸腺ホルモンが含まれる。胸腺ホルモンには、たとえば、プロチモシンアルファ、チモリン、胸腺液性因子（ＴＨＦ）、ＴＨＦ‐γ‐２、胸腺細胞増殖ペプチド（ＴＧＰ）、チモポイエチン（ＴＰＯ）、チモペンチン、およびチモシン‐α‐１が含まれる。サイトカインという用語は、細胞内のコミュニケーションを仲介して個々の細胞および組織の機能的な活性を調整する、分泌型可溶性のタンパク質およびペプチドの多様なグループを表す。サイトカインのクラスには、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、およびケモカインが含まれる。サイトカインの例には、ＩＬ‐１α、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐２からＩＬ‐３０、白血球抑制因子（ＬＩＦ）、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐γ、ＴＦＮ、ＴＦＮ‐α、ＴＧＦ‐β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。たとえば免疫機能および／または抗ウイルス特性を増強するためなどに、１つ又は複数のサイトカインをＴ細胞に導入して過剰発現させることができる。
高増殖性疾患
【００８５】
一実施形態では、本発明の治療タンパク質は細胞増殖の調節をすることができる。そのような治療ペプチドは腫瘍を含む、高増殖性疾患を治療することに用いることができる。
【００８６】
本発明の治療ペプチドによる治療が可能な高増殖性疾患の例としては、腫瘍が腹腔、骨、乳房、消化器系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、目、頭部および頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器に位置するものが含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
同様に、本発明の治療用ポリペプチドによってその他の高増殖性疾患を治療することも可能である。そのような高増殖性疾患の例としては、高γグロブリン血症、リンパ増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増加症、および上記に列挙した器官系に位置する、腫瘍以外の任意の他の過剰増殖性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
本発明による導入遺伝子によって発現する治療用ポリペプチドは、直接または間接的な相互作用を通した異常増殖を阻止する。形質導入された細胞の全身的な投与は、さまざまな組織の広範囲への治療タンパク質の接近方法を提供する。あるいは、本発明の治療用ポリペプチドが、高増殖性疾患を阻止することができるその他の細胞の増殖を刺激してもよい。
【００８９】
たとえば、免疫応答を増強させること、特に、高増殖性疾患の抗原性を高めること、あるいはＴ細胞を増殖、分化、または可動化させることによって、高増殖性疾患を治療することができる。既存の免疫応答を促進すること、または新しい免疫応答を開始すること、いずれによってこの免疫応答を増強させてもよい。あるいは、化学療法因子を用いた場合のように、免疫応答を減少させることも、高増殖性疾患の治療方法となり得る。
感染症
【００９０】
一実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドを感染症の治療に用いることができる。たとえば、免疫応答を増強することによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を促進して、感染症を治療してもよい。免疫応答は、免疫応答の存在、または新しい免疫応答の開始のいずれによっても増強されうる。あるいは、本発明の治療用ポリペプチドが、必ずしも免疫応答の誘発をすることなく、感染因子を直接的に阻害してもよい。
【００９１】
ウイルスは、本発明の治療用ポリペプチドによって治療されうる疾患または症状が起こる可能性のある感染因子の１つの例である。ウイルスの例としては、次に述べるＤＮＡおよびＲＮＡウイルスファミリー、すなわち、アルボウイルス科、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス科、ビルナウイルス科、ブニアウイルス科、カリシウイルス科、シルコウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス科（サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状疱疹など）、モノネガウイルス科（たとえば、パラクリウイルス科、ブルビリウイルス、ラブドウイルス）、オルソミキソウイルス科（たとえば、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（天然痘または牛痘など）、レオウイルス科（たとえば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ‐Ｉ、ＨＴＬＶ‐ＩＩ、レンチウイルス）、および、トガウイルス科（たとえば、ルビウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。これらのファミリーの範囲内にあるウイルス群が引き起こす種々の疾患または症状には、関節炎、気管支炎、脳炎、眼感染症（たとえば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、慢性活動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染（たとえば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、おたふく風邪、パラインフルエンザ、狂犬病、一般的な風邪、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（たとえば、カポジ、いぼ）、およびウイルス血症が含まれるが、これらに限定されない。これらの任意の症状または疾患の治療に、本発明の治療用ポリペプチドを用いることができる。
【００９２】
ＨＩＶ感染に関して、一方法では、上記により詳細に説明したように、ＣＣＲ５遺伝子部位を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼを導入遺伝子として送達するアデノウイルスベクターを利用することを含む。たとえば、国際特許公開ＷＯ２００７／１３９９８２も参照されたい。また、本明細書にその全体が組み込まれる。本発明のいくつかの実施形態によれば、改良された形質導入および導入遺伝子発現を達成することが可能であり、その結果、ＣＣＲ５内で効率的な標的指向および切断が生じる。
【００９３】
疾患または症状を引き起こす可能性があり、本発明の治療用ポリペプチドにより治療または検出することができる細菌性または真菌性の因子は、以下のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌のファミリーならびに真菌であり、放線菌目（たとえば、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ノルカディア属）、アスペルギルス症、バチルス科（たとえば、炭疽菌、クロストリジウム）、バクテロイデス科、ブラストミセス症、ボルテデラ属、ボレリア属、ブルセラ症、カンジダ症、カンピロバクター属、コクシジウム症、クリプトコッカス症、皮膚真菌症、エンテロバクター（クレブシエラ属、サルモネラ属、セラチア属、エラシニア属）、エリシペロトリックス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、マイコプラズマ目、ナイセリア科（たとえば、アシネトバクター属、淋病、髄膜炎菌）、パスツレラ感染症（たとえば、アクチノバチルス、ヘモフィルス、パスツレラ）、シュードモナス属、リケッチア属、クラミジア科、梅毒、およびブドウ球菌性が含まれるが、これらに限定されない。これらの細菌性または真菌性ファミリーが引き起こす疾患または症状には、菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染（たとえばＡＩＤＳに関連する感染症）、爪周囲炎、プロステーシス関連感染症、ライター病、百日咳または蓄膿のような気道感染症、敗血症、ライム病、ネコひっかき病、赤痢、パラチフス、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ハンセン病、傍結核、結核、ループス、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染症、皮膚病（たとえば、蜂巣炎、皮膚真菌症）、毒素血症、尿路感染症、創傷感染症が含まれるが、これらに限定されない。これらの任意の症状または疾患の治療に、本発明の治療用ポリペプチドを用いることができる。
【００９４】
さらに、本発明の治療用ポリペプチドにより治療できる疾患または症状を起こす寄生因子には、以下のファミリー、すなわち、アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外寄生生物、ジアルジア症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノゾーマ症、およびトリコモナス症が含まれるが、これらに限定されない。これらの寄生生物が引き起こすさまざまな疾患または症状には、疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（たとえば、赤痢、ジアルジア症）、肝疾患、肺疾患、日和見感染（たとえばＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラズマ症が含まれるが、これらに限定されない。これらの任意の症状または疾患の治療に、本発明の治療用ポリペプチドを用いることができる。
再生
【００９５】
本発明の治療用ポリペプチドを、組織を培養して再生させる際の細胞の分化、増殖、および誘引に用いることもできる。（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：５９〜８７（１９９７）を参照されたい。）組織の再生は、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、老化疾患（たとえば、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む外科手術、線維症、再灌流傷害、または全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織の修復、交換、または保護に用いられることがある。
【００９６】
本発明の治療用タンパク質が再生に貢献し得る組織には、器官（たとえば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）や、筋肉組織（平滑筋、骨格筋、または心筋）、脈管組織（脈管内皮を含む）、神経組織、造血組織、骨格組織（骨、軟骨、腱、および靭帯）が含まれる。小瘢痕で、あるいは瘢痕なく再生させることが好ましい。また、血管新生が再生に含まれることもある。
【００９７】
さらに、本発明の治療用ポリペプチドによって、治癒困難な組織の再生を促進してもよい。たとえば、腱／靭帯の再生を促進することによって、損傷後の回復時期が早まるであろう。また、本発明の治療用ポリペプチドを、損傷回避のための処置に予防的に用いることもできる。治療し得る特定の疾患には、腱炎、手根管症候群、および腱または靭帯の他の障害が含まれる。非治癒性創傷の組織再生のさらなる実施例には、圧迫性潰瘍や、血管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連した潰瘍が含まれる。
走化性
【００９８】
一実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドが走化性活性を有する。走化性分子によって炎症、感染、または過剰増殖の部位など体内の特定部位に細胞（たとえば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞、および／または内皮細胞）を誘引または移動させ、移動した細胞によってその特定の外傷または異常を撃退および／または治癒することができる。
【００９９】
本発明の治療用ポリペプチドによって、形質導入した細胞の走化性活性を高めることもできる。走化性分子を発現させ、体内の特定部位を標的とする細胞数を増加させることによって、これを炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害の治療に利用することができる。たとえば、損傷部位にさらに多くの免疫細胞を誘引するような走化性分子を、組織創傷および他の組織外傷の治療に利用することができる。本発明の走化性分子によって線維芽細胞を誘引することも可能であり、これを創傷の治療に利用することもできる。
【０１００】
また、本発明の治療用ポリペプチドが走化性活性を阻害し得ることも意図され、そのような分子も疾患の治療に利用可能であろう。したがって、本発明の治療用ポリペプチドを走化性の阻害剤として用いることもできる。
【０１０１】
利用が意図される他の治療用ポリペプチドには下記のものが含まれるが、これらに限定されない。成長障害または消耗症候群の治療用として、成長因子（たとえば、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、血小板由来成長因子、上皮成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子（３など）；外因性抗原または病原体（たとえば、ヘリコバクターピロリ）に対する対象者の受動免疫または防御を提供するためとして、あるいは癌、関節炎、または心血管疾患の治療用として、抗体（たとえば、ヒト抗体、ヒト化抗体）；サイトカイン、インターフェロン（たとえば、インターフェロン（ＩＮＦ）、ＩＮＦ−ａ２ｂ、ＩＮＦ−ａ２ａ、ＩＮＦ−ａＮ１、ＩＮＦ−（３１ｂ、ＩＮＦ−γ）、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦ−Ｒ）、ケモカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ポリペプチドホルモン、抗微生物性ポリペプチド（たとえば、抗細菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、および／または抗寄生虫性のポリペプチド）、酵素（たとえば、アデノシンデアミナーゼ）、性腺刺激ホルモン、ケモタキシン、脂質結合タンパク質、フィルグラスチム（ニューポジェン）、ヘモグロビン、エリスロポエチン、インシュリノトロピン、イミグルセラーゼ、サルグラモスチム、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＷＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アデノシン、デアミダーゼ、カタラーゼ、カルシトニン、エンドセリアン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ペプシン、ウリカーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、ラクターゼ、サッカラーゼ、内因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）様ホルモン、可溶性ＣＤ４、ならびに抗体（たとえば、オルソクローンＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）、ＧＰｌｌｂ／ｌｌａモノクローナル抗体）および／またはその抗原結合フラグメント（たとえば、Ｆａｂ）。
【０１０２】
当業者は、本発明のさまざまな実施形態の方法および／または組成物を用いて形質導入した細胞内において、他の治療用遺伝子産物を発現し得ることを理解されよう。米国特許出願公開第２００７／００５９８３３号などに記載される他の実施例を参照されたい。当業者はまた、本明細書に開示する遺伝子療法のための方法の有用性を理解されよう。遺伝子療法において、遺伝情報を宿主細胞に送達する目的は、通常、宿主細胞における遺伝的な欠陥を修正（補正）するため、宿主細胞内での望ましくない作用を阻害するため、あるいは宿主細胞を除去するためである。さらに、遺伝情報によって宿主細胞に所望の機能をもたらすことを意図してもよく、たとえば、宿主細胞に分泌タンパク質を供給して、その宿主個体の別の細胞を治療することなども可能である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の治療用遺伝子産物を医薬品用に精製することもできる。いくつかの実施形態では、後でさらに詳細に説明するように、遺伝子を導入したＴ細胞自体を治療に用いてもよく、該医薬組成物には遺伝子導入Ｔ細胞が含まれる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、該医薬組成物には医薬的に許容される担体が含まれる。医薬的に許容される担体は、投与する特定の組成物ならびにその組成物の特定の投与方法に部分的に依存する。したがって、適切に利用可能な医薬組成物の配合は多種多様である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ著  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１７版、１９８９などを参照されたい）。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、これを必要とする対象者にその有効量を投与することができる。本明細書に記載のように形質導入したＴ細胞を含む医薬組成物の場合の有効量とは、一般に、医学または薬学の技術分野における各種の規制組織または諮問組織のいずれか（米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、米国医師会（ＡＭＡ）など）によって、あるいは製造業者または販売業者によって推奨または承認された、用量範囲、投与方法、配合などを意味することとなる。白血病など、特定の疾患の治療において効果を生ずる場合の有効量とは、一般に、内科または外科の技術分野における各種の規制組織または諮問組織のいずれか（ＦＤＡ、ＡＭＡなど）によって、あるいは製造業者または販売業者によって推奨または承認された臨床結果を達成する量を意味することとなる。
【０１０６】
当業者は、本明細書に記載の形質導入Ｔ細胞の有効投与量を決定することができる。この有効量は、使用する外因性遺伝子および／または共刺激剤に依存する場合もあり、既知のデータを治療する対象者用に換算して導き出すことができる。データとしては、その外因性遺伝子に期待される発現に関するデータや、ｅｘ  ｖｉｖｏ（たとえば、本明細書の実施例に示すような）および／またはモデル動物におけるその外因性遺伝子に関する測定値などが用いられる。
【０１０７】
該医薬組成物は、当技術分野で知られるさまざまな方法によって投与することができる。たとえば、個々の患者から採取して体外培養した細胞（たとえば、リンパ球、骨髄穿刺液、生検組織）などにｅｘ  ｖｉｖｏでベクターを送達し、通常、ベクターを組み込んだ細胞を選択した後に、その細胞を患者内に再移植することができる。細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変した後に対象者に再導入する療法は、細胞療法などと呼ばれることもある。好ましい一実施形態では、対象生体から細胞を採取して、本開示の記載に従い外因性遺伝子（遺伝子またはｃＤＮＡ）で形質導入を行い、それを再び対象生体（たとえば、患者）内に注入して戻す。特定の一実施例としては、本発明のいくつかの実施形態に従って自己由来の癌細胞を改変して１つ又は複数の免疫賦活タンパク質を発現させることが可能であり、たとえば癌ワクチンとして、この細胞を患者に再導入することもできる。
【０１０８】
当業者は、本明細書において教示する形質導入効率および／または導入遺伝子発現効率が予想外に高いためにもたらされる、本発明の実施形態のいくつかの利点を理解されよう。特に、アデノウイルスベクターを使用することによって、レンチウイルスベクターを超える特有の利点が得られる。たとえば、アデノウイルスでは、ベクターが外因性遺伝物質のより大きな挿入断片を送達するようにウイルスを改変して、大きなペイロードを運ばせることができる。たとえば、Ａｄ５ベクターは一般的にウイルスゲノムの初期転写遺伝子（Ｅ１および／またはＥ３）を欠失しており、ここに新しい遺伝情報を導入することができる（また、このＥ１の欠失により組換えウイルスが複製不能となる）。さらに、大量のベクターを作製して、一度に多数の細胞を形質導入させることができる。当技術分野で知られているように、アデノウイルスベクターの濃縮および精製は比較的容易である。その上、これらのベクターを患者に使用するにあたって有用な情報が治験から得られている。
【０１０９】
さらに、送達および／または発現の効率が改良されることによって、所定の効果を達成するために必要なアデノウイルスがより少なくなる。したがって、本発明のいくつかの実施形態を実施することによって、（細胞間および／または培養液中での）アデノウイルスに対する過剰な曝露が原因となって生じる細胞毒性を低下させることができる。また、長期培養に好都合な方法で細胞に形質導入を行った場合には、形質導入した細胞の長期間作用、たとえば、所望の導入遺伝子を長期間発現することなどを解析できる。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、長期培養および／または長期培養についての試験をさらに容易にする。特に関心があるのは、このような長期培養によって、アデノウイルス形質導入後の遺伝子導入物質の臨床製造が可能となることである。たとえば、いくつかの実施形態では、アデノウイルス形質導入後の培養によって１００9個以上、１００11個以上、または１００13個以上の遺伝子導入細胞を得ることができる。したがって、細胞療法用の遺伝子導入細胞をより効率よく作製するために本発明を用いることもできる。
【０１１０】
当業者は、本明細書に記載の詳細な開示に鑑み、Ｔ細胞における遺伝情報の導入および／または発現に改良が望まれる他の適用例を理解されよう。
【０１１１】
すべての引用は、参照によりその全体が本明細書に明白に組み込まれる。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で活性化させたＴリンパ球の形質導入
Ａ．抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体で活性化させたＴ細胞
健常なドナーから初期Ｔリンパ球を得た。凍結試料の場合には、細胞を解凍して、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２（Ｓｉｇｍａ  １２６４４）を加えたＲＰＭＩ培養液中において、１×１０6細胞／ｍＬの細胞密度で培養した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド市）を用いて、直ちにこれらのＴリンパ球をＣＤ３／ＣＤ２８に対する経路によって活性化させた。Ｄｙｎａｂｅａｄｓの調製や操作は、製造業者のプロトコルに従って行った。簡単に説明すると、細胞に再懸濁するビーズ（１×１０6細胞／ｍＬあたり７５ｕＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ）を、エッペンドルフチューブ中において培養液で３回洗浄した。各回の洗浄にあたっては磁石を用いてビーズを沈殿させた。Ｔリンパ球の培養物を３７℃、５％ＣＯ2で１５〜４８時間インキュベートした。
【０１１３】
インキュベート後、活性化Ｔリンパ球を３×１０5〜１×１０6細胞／ｍＬに希釈した。１細胞あたり１０〜１０００の範囲の感染単位（ＩＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）でＴリンパ球を形質導入させるために、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターを培養液で希釈した。次いで、希釈したＡｄ５／Ｆ３５ベクターを、希釈した活性化Ｔリンパ球に直接加えて再びインキュベートした。フローサイトメトリー（Ａｄ５／Ｆ３５  ＧＦＰベクターを使用した場合）またはＣｅｌ１アッセイ（Ａｄ５／Ｆ３５  ＺＦＮベクターを使用した場合）によって遺伝子送達効率を評価した。
【０１１４】
図１に示すように、１００ＩＵ／細胞および１０００ＩＵ／細胞のＭＯＩにおいて、活性化Ｔ細胞のうち最高で９２％および８７％の細胞がＡｄ５ベクターまたはＡｄ５／３５ベクターにより形質導入され、平均蛍光強度（ＭＦＩ）はそれぞれ６３０および１７８０であった。
Ｂ．ビーズで活性化させたＴ細胞とＩＬ−７で活性化させたＴ細胞との形質導入効率の比較
【０１１５】
ＩＬ−７で刺激したＴリンパ球内へのアデノウイルスベクターの形質導入効率の評価も行った。簡単に説明すると、Ｔ細胞の活性化のためにＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８の代わりに１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を培養物に加えたことを除き、実施例１Ａに記載のように初期Ｔ細胞の採取および活性化を行った。
【０１１６】
図２Ａおよび２Ｂに示すように、１００ＩＵ／細胞および１０００ＩＵ／細胞のＭＯＩにおいて、ＩＬ−７で活性化させたＴ細胞の形質導入効率はそれぞれ５５％および７０％、ＭＦＩは１０９および２８８となったのに比較して、Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化させたＴ細胞の形質導入効率はそれぞれ９１％および８７％、ＭＦＩは９１０および１６２０であった。
Ｃ．ビーズで活性化させたＴ細胞とＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化させたＴ細胞との形質導入効率の比較
【０１１７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞に対しても、ＰＨＡおよびＩＬ−２、または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体被覆ビーズを４日間添加することによって活性化を行った。次いで、活性化させたＣＤ４＋Ｔ細胞にＡｄ５／３５  ＧＦＰベクターを３０または１００のＭＯＩで用いて形質導入を行った。２つの活性化条件を３０または１００のＭＯＩで比較するために、形質導入後１日目および２日目に、ＦＡＣＳ解析でＧＦＰを発現している細胞の割合を測定することによって形質導入効率を決定した。
【０１１８】
図４に示すように、ビーズで活性化させたＴ細胞は、ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化させた細胞よりも高い効率で形質導入された（たとえば、３０のＭＯＩにおいて、ＰＨＡの刺激によりＧＦＰを発現した細胞は約３５％であったのに対して、抗ＣＤ３／２８抗体の刺激によりＧＦＰを発現した細胞は約６５％であった）。
【０１１９】
これらの結果により、細胞表面受容体であるＣＤ３およびＣＤ２８に対するモノクローナル抗体で被覆されているビーズによって予め刺激したＴリンパ球のＡｄ５／Ｆ３５の形質導入効率は６０〜９０％となることが示される。これと比較して、ＰＨＡで活性化させたＴリンパ球ではＡｄ５／Ｆ３５ベクターの形質導入効率が４５％程度である。上記のＳｃｈｒｏｅｒｓらの文献などを参照されたい。さらに、ＣＣＲ５を標的とする１対のＺＦＮをコードするＡｄ５／Ｆ３５ベクターを用いて形質導入を行った場合に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズでの共刺激によって活性化させたＴ細胞では、Ｔリンパ球の他の刺激方法（ＰＨＡまたはＩＬ−７）と直接比較して有意に、より高レベルの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が生じた。
【０１２０】
実施例２
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化させたＴリンパ球の形質導入
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＣＤ４  Ｔ細胞に対しても、実施例１および２に記載のように、別々に調製した（ロットが異なる）２つのＡｄ５／３５  ＧＦＰベクターを用いて形質導入を行った。
【０１２１】
図３Ａおよび３Ｂに示すように、いずれの調製のＡｄ５／３５  ＧＦＰベクターを用いた場合も、１００および３００のＭＯＩにおいて、高い割合（６７〜９１％）かつＭＦＩ（５９８〜１４０８）でＰＢＭＣおよびＣＤ４  Ｔ細胞が形質導入された。両方のロットのＡｄ５／３５  ＧＦＰベクターで同様の形質導入効率がみられた。
【０１２２】
実施例３
導入遺伝子の発現
ビーズで活性化させたＴ細胞における導入遺伝子の発現レベルの評価も行った。ＰＨＡおよびＩＬ−２、または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体被覆ビーズのいずれかを４日間添加することによってＣＤ４  Ｔ細胞を活性化させた。次いで、Ａｄ５／３５  ＧＦＰベクターを１０、３０、または１００のＭＯＩで用いて、これらの活性化細胞に形質導入を行った。
【０１２３】
形質導入後１日目（図５）および２日目（図６）に、試験した全３条件のＭＯＩについて、ＧＦＰを発現している細胞の割合を測定することにより形質導入効率を決定し（図５Ａおよび６Ａ）、形質導入された細胞集団のＭＦＩを測定することにより導入遺伝子の発現レベルを決定した（図５Ｂおよび６Ｂ）。
【０１２４】
導入遺伝子の発現が一過性であったこと、あるいは導入遺伝子の発現がＰＨＡ／ＩＬ−２での活性化による何らかの遅延反応の影響を受けていないことを示すために、形質導入後１４日目までの長期間、３０および１００のＭＯＩの試料におけるＧＦＰの発現を調べた。図７は、ＰＨＡで活性化させたＴ細胞にＭＯＩ  ３０（黒四角）またはＭＯＩ  １００（黒三角）で形質導入を行った場合と比較した、ビーズで活性化させたＴ細胞にＭＯＩ  ３０（灰四角）またはＭＯＩ  １００（灰三角）で形質導入を行った場合のＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。
【０１２５】
また、導入遺伝子の発現が細胞分裂の低下や形質導入したベクター配列の希釈によって影響を受けた可能性を排除するために、集団倍加数を測定してＴ細胞の増殖率を調べた。
【０１２６】
図８に示すように、ビーズで活性化させたＴ細胞は、ＰＨＡで活性化させたＴ細胞と同様に、あるいはよりよく増殖した。さらに、ビーズで活性化させたＴ細胞は、ＰＨＡで活性化させたＴ細胞と比較してより高い効率でアデノウイルスベクターによって形質導入された。図９を参照されたい。
【０１２７】
実施例４
内因性標的の切断
上記のように、ＰＨＡ／ＩＬ−２または抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでＴ細胞を活性化して、ＧＦＰ、ＣＣＲ５−ＺＦＮ、およびＧＲ−ＺＦＮをコードするＡｄ５／Ｆ３５ウイルスで形質導入を行う。形質導入後３日目および１０日目に細胞を回収して、ゲノムＤＮＡを抽出する。ＺＦＮがＣＣＲ５またはＧＲにおけるそれぞれの標的部位を切断可能であるかどうかをＣｅｌ１アッセイによって解析する。
【０１２８】
細胞に入ったウイルスのコピー数を調べるために、定量的ＰＣＲ解析を用いて内因性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子あたりのアデノウイルスＥ４遺伝子の数を測定して、活性化し形質導入させた細胞あたりに存在するウイルスゲノムの数を決定する。それぞれの活性化条件によって、導入遺伝子が発現するかどうか、あるいは形質導入効率が影響される（たとえば、より多くのアデノウイルス粒子を細胞に導入する）かどうかを判定するために定量ＰＣＲを行う。
【０１２９】
ＧＦＰベクターによる形質導入後にフローサイトメトリーを行い、形質導入された細胞の数（割合）を測定する。ＭＦＩも測定して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって、導入遺伝子が発現しているかどうか、あるいはその発現細胞の増加および／または発現レベルの上昇（ＭＦＩが上昇してもＧＦＰ陽性細胞の割合が比較的一定である場合など）が生じているかどうかを評価する。また、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターの細胞表面受容体（ＣＤ４６）のレベルが、それぞれの活性化条件に応答してどのように変化するかについてもフローサイトメトリーで測定する。ＣＤ３／ＣＤ２８に対する活性化によって細胞表面受容体ＣＤ４６の発現が上昇して形質導入が生じているかどうかを判定するために、抗ＣＤ４６抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーを用いてＭＦＩの変化を評価する。
【０１３０】
実施例５
Ａｄ５／１１を用いた形質導入
該方法の融通性を実証するために、実施例１に記載のように調製し活性化させたＴ細胞に、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターの代わりにＡｄ５／１１ベクターを用いて形質導入を行う。Ｔ細胞の形質導入効率および導入遺伝子の活性を検証するために、同様の解析を行う。
【０１３１】
本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明のさまざまな変更形態および変形形態が可能であることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、添付の請求項およびこれらと同等なものの範囲内にある限りにおいて、本発明の変更形態および変形形態を包含することが意図されている。
【０１３２】
本明細書に記載の刊行物、論文、特許、および特許出願はすべて、各個の刊行物、論文、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれているものとして具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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