(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなる温度感受性ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有することを特徴とする酵母。
【請求項２】
酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性が野生型酵母細胞内の比活性の３分の１以下に低下したことを特徴とする、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記温度感受性ピルビン酸脱炭酸酵素５が、摂氏３４度以上で温度感受性を示すことを特徴とする、請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項４】
前記野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子の塩基配列が、配列番号２１に示す塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項５】
前記温度感受性ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子が、配列番号１９又は２０のいずれかに示す塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項６】
前記酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項７】
前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母を培養することを特徴とする、乳酸の製造方法。
【請求項９】
酵母を摂氏２５〜３４度で培養することを特徴とする、請求項８に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１０】
連続培養を行うことを特徴とする、請求項８又は９に記載の乳酸の製造法。
【請求項１１】
連続培養が、発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の発酵培養液に追加する連続培養である、請求項１０に記載の乳酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異酵母およびその利用に関するものである。具体的には、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が変異した酵母及び該酵母を用いた乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は古くから酒造やパンの製造など発酵食品に利用されてきた微生物であるが、遺伝子組換えＤＮＡ技術や分子育種技術の進歩により、他種微生物や動植物、昆虫由来の外来遺伝子を発現させたり、また、その遺伝子組換え酵母を培養することにより本来の主要発酵産物であるアルコール（エタノール）以外の物質を発酵生産する基礎技術の開発が進んでいる。
【０００３】
一方、近年高まりつつある資源循環型社会への志向の中で、バイオマスを原料としたポリマーに注目が集まっており、中でもポリ乳酸（ＰＬＡ）は優れた性質を有することが明らかになってきている。このPLAの原料である乳酸の生産技術としては、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属等、乳酸菌と総称される微生物を用いた発酵生産法が主流である。しかし、これら乳酸菌は、原料糖に対する生産乳酸量の収率には優れるものの、酸に対する耐性が低く、酸性物質である乳酸を多量に蓄積させるためには培養時に炭酸カルシウムや水酸化アンモニウム、あるいは水酸化ナトリウムなどのアルカリによる中和行程を必要とする。
【０００４】
しかし、この中和操作により乳酸ナトリウムや乳酸カルシウムなどの乳酸塩が生じるため、その後の精製工程において乳酸塩を乳酸に戻す操作が必要になり、その処理には多大なコストが生じる。
【０００５】
そこで、酸に耐性のある酵母に乳酸を生産させることができれば中和操作の軽減が期待され、低コストで乳酸を生産できる可能性が考えられる。しかし、酵母は乳酸生産能を持たないことから、酵母による乳酸生産を可能にするためには、遺伝子組み換え技術により外来生物種由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をコードする遺伝子を酵母に導入しなければならない。例えば、Ｌ−乳酸の生産については、外来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子をサッカロマイセス・セレビシエ属の酵母に導入し、Ｌ−乳酸を生産させる試みが既に報告されている（特許文献１）。この手法では、解糖経路を経て原料グルコースをピルビン酸まで代謝した後、Ｌ−乳酸脱炭酸酵素によってピルビン酸を乳酸に還元する。
【０００６】
一方、酵母は旺盛にエタノール発酵を行う微生物である。その代謝経路は、解糖系産物であるピルビン酸をピルビン酸脱炭酸酵素によりアセトアルデヒドに変換し、そのアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素によってエタノールに変換する。この酵母に乳酸脱水素酵素遺伝子を導入するとエタノールと乳酸のヘテロ発酵となり、効率的な乳酸発酵には不向きである。これを解決するために、ピルビン酸からアセトアルデヒドに還元する酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素アイソザイムの遺伝子座に乳酸脱炭酸酵素を組み込むことにより、ピルビン酸からアセトアルデヒドを経由したエタノールの発酵を減少させ、ピルビン酸から乳酸への還元反応を強化する試みがなされているが、エタノール発酵の十分な抑制には至っていない（特許文献２）。
【０００７】
ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子にはピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）、ピルビン酸脱炭酸酵素５（ＰＤＣ５）、およびピルビン酸脱炭酸酵素６（ＰＤＣ６）の３種類が存在し、そのうちＰＤＣ１とＰＤＣ５のみが酵母細胞内においてピルビン酸脱水素酵素活性を有するとされている。ＰＤＣ１およびＰＤＣ５を欠失すれば、エタノールへの代謝経路が遮断され、理論的にはＬＤＨによる乳酸の生産効率が高くなるはずであるが、これまでの試みでは、乳酸の生産効率が極めて低下することが明らかになっている（特許文献３、非特許文献１）。また、酵母の種類によっては、グルコースを唯一炭素源とした場合、極めて生育が悪くなる（非特許文献２）。以上のように、酵母を乳酸発酵に用いるメリットあるものの、発酵乳酸の対糖収率を向上させるために、酵母のエタノールへの代謝経路が制御されることが望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−０９３０６０号公報
【特許文献２】特開２００３―３３４０９２号公報
【特許文献３】特表２００１−５１６５８４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】アプライド・アンド・エンバイルメント・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、２００４年、第７０巻、ｐ．２８９８―２９０５
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、１９９０年、第１７２巻、ｐ．３９０９−３９１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入され、かつピルビン酸脱炭酸酵素活性を低下させた酵母を用いた乳酸の発酵生産において、乳酸の対糖収率を向上させ、効率的に乳酸を製造する方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題の解決の手段として、酵母のピルビン酸脱炭酸酵素活性を低下させることにより、乳酸の生産効率が向上できると考え、鋭意検討した結果、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなる温度感受性ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有することを特徴とする酵母、および該酵母を培養することによる乳酸の製造方法を提供するものである。
【００１３】
本発明の酵母の好ましい様態によれば、前記の酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性が野生型酵母細胞内の比活性の３分の１以下に低下している。
【００１４】
本発明の酵母の好ましい様態によれば、前記温度感受性ピルビン酸脱炭酸酵素５が、摂氏３４度以上で温度感受性を示す。
【００１５】
本発明の酵母の好ましい様態によれば、前記野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子の塩基配列が、配列番号２１に示す塩基配列からなる遺伝子である。
【００１６】
本発明の酵母の好ましい様態によれば、前記温度感受性ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子が、配列番号１９又は２０のいずれかに示す塩基配列からなる遺伝子である。
【００１７】
本発明の酵母の好ましい様態によれば、前記酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する。
【００１８】
本発明の酵母の好ましい様態によれば、前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００１９】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい様態によれば、酵母を摂氏２５〜３４度で培養する。
【００２０】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい様態によれば、連続培養を行う。
【００２１】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい様態によれば、発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の発酵培養液に追加する連続培養を行う。
【発明の効果】
【００２２】
乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入され、ピルビン酸脱炭酸酵素活性が低下した本発明の酵母を用いることにより、効率的に乳酸を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明で用いられる発現ベクターの一例であるプラスミドｐＴＲＳ１１の構築図である。
【図２】図２は、本発明で用いることができる連続発酵装置の１つの例を説明する概略側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなる温度感受性ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有する酵母と、概酵母を培養することを特徴とする乳酸の製造方法である。
【００２５】
本発明において、乳酸脱水素酵素コードする遺伝子（以下、ｌｄｈ遺伝子ということがある）は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変換する活性を持つ乳酸脱水素酵素をコードしている遺伝子である。ｌｄｈ遺伝子には、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化している遺伝的多型性や、既知の方法の用いて人工的に遺伝子に変異を導入する変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。
【００２６】
ｌｄｈ遺伝子の酵母への導入方法としては、該遺伝子をプラスミドにクローニングして導入しても良いし、酵母染色体上に組み込んでも良い。該遺伝子の発現様式としては、詳細は後記するが、遺伝子を発現させることができるプロモーターの支配下に該遺伝子が連結されていれば、プラスミドによる発現、または染色体への組み込みによる発現など特に限定されない。得られたプラスミドまたはＰＣＲ断片を酵母に導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。
【００２７】
酵母のピルビン酸脱炭酸酵素（以下、ＰＤＣということがある）をコードする遺伝子群としては、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子（以下、ＰＤＣ１遺伝子ということがある）、ピルビン酸脱炭酸酵素５をコードする遺伝子（以下、ＰＤＣ５遺伝子ということがある）及びピルビン酸脱炭酸酵素６をコードする遺伝子（以下、ＰＤＣ６遺伝子ということがある）の３種類が知られている。これらのうち、ピルビン酸脱炭酸酵素としての主要な機能を持つ遺伝子はＰＤＣ１遺伝子，およびＰＤＣ５遺伝子である。
【００２８】
本発明の酵母は、ＰＤＣ１遺伝子を欠失させたものである。ＰＤＣ１遺伝子を欠失させることにより、ピルビン酸脱炭酸酵素活性はＰＤＣ１遺伝子野生型と比較して低下する。ＰＤＣ１遺伝子、ＰＤＣ５遺伝子を共に欠失させるとピルビン酸脱炭酸酵素活性をさらに低下させることができるが、上記のとおり、グルコースを含む培地においては極めて生育が悪くなることが知られている。そこで、本発明においては、ＰＤＣ５遺伝子に変異を導入することで適度にＰＤＣ５遺伝子由来のピルビン酸脱炭酸酵素活性を低下させることができ、酵母のエタノールへの代謝経路を制御することが可能になる。具体的には、本発明の酵母は、酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性が野生型酵母細胞内の比活性の３分の１以下に低下したものが好ましい。酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性は、ＰＤＣ１遺伝子を欠失させることにより、野生型酵母の比活性の３分の１以下に低下させることが可能である。酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性は、後記の方法により測定することができる。
【００２９】
ＰＤＣ１遺伝子の欠失は、通常酵母に用いられる栄養要求性マーカー遺伝子や、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを用いたＰＤＣ１遺伝子座の相同組換えにより行うことが可能である。例えば、URA3、LEU2, TRP1, HIS3等の栄養要求性マーカー遺伝子（「メソッヅ  イン  エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、 101巻、p.202-211、G-418）や薬剤耐性遺伝子（「ジーン（Gene）」、 1083年、26巻、p243-253）を利用することができるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の酵母は、野生型ＰＤＣ５遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなる温度感受性ＰＤＣ５遺伝子を有するものである。ここで、一部塩基の欠失、挿入、置換及び／又は付加の変異は、いずれか単独の変異であってもよく、又はこれらの複数の組合せであってもよい。また、野生型ＰＤＣ５遺伝子としては、配列番号２１に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【００３１】
本発明の酵母が有する温度感受性ＰＤＣ５遺伝子としては、配列番号２１に示す塩基配列からなる野生型ＰＤＣ５遺伝子の変異体であることが好ましく、具体的には、配列番号１９又は２０のいずれかに示す塩基配列からなる遺伝子であることがより好ましい。
【００３２】
ピルビン酸脱炭酸酵素５の温度感受性とは、変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５を有する酵母が、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素５を持つ酵母に比較して、ある培養温度では同程度のピルビン酸脱炭酸酵素活性を示すが、培養温度を変化させて特定の培養温度以上になるとピルビン酸脱炭酸酵素５の消失又は低下を示す性質をいう。酵母の通常の培養温度は２８℃から３０℃であり、温度感受性を示す温度が通常の培養温度に近いほど、培養温度を変化させるために必要な熱量が少なくて済み、培養にかかるコストを低減させることが出来るので、好都合である。本発明においては、変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５が３４℃以上で温度感受性を示す酵母であることが好ましい。
【００３３】
ＰＤＣ５遺伝子に変異を導入する具体的な方法は後記するが、通常行われる方法によりＰＤＣ５遺伝子のＤＮＡ配列を改変することで実現する。ＰＤＣ５遺伝子の改変の方法としては、例えば変異剤を用いた突然変異株分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年，学会出版センター）を用いることができる。また、分子生物学的手法としては、例えばＰＣＲ反応を利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（PCR Methods Appl.）、１９９２年、第２巻、ｐ．28-33.）を好適に用いることができる。
【００３４】
また、これら突然変異株群から温度感受性を有する突然変異株を取得する方法でも、該酵素活性低下株を得ることができる。これは、ピルビン酸脱炭酸酵素活性が検出されない酵母はグルコースを唯一炭素源とした場合、著しく生育が遅くなる性質を利用して該酵素活性低下株を取得する方法であって、後記のように、非制限温度条件下では、ピルビン酸脱炭酸酵素活性が残存しているため野生型酵母と同等程度の生育能力を示すが、制限温度条件下では該酵素活性が低下することで生育能力が著しく低下する変異株を取得することで、望ましい温度感受性を有する変異型ＰＤＣ５遺伝子を得ることができる。
【００３５】
本発明の酵母としては特に制限はなく、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が挙げられが、好ましくは、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属に属する酵母である。そのサッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属に属する酵母は、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)である。
【００３６】
次に、本発明のＰＤＣ１遺伝子が欠失し、変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する酵母の取得方法を、より具体的に説明する。
【００３７】
まず、本発明の変異型ＰＤＣ５遺伝子のスクリーニングを行うために、ＰＤＣ１遺伝子とＰＤＣ５遺伝子の両方を欠失させたΔｐｄｃ１ Δｐｄｃ５二重欠失酵母を造成する。ここで、記号「Δ」は「欠失」を意味する。
【００３８】
Δｐｄｃ１ Δｐｄｃ５二重欠失酵母の造成の方法は、特に限定されないが、例えば変異剤を用いた突然変異株分離法、目的遺伝子欠失株分離法（「メソッズ・イン・イースト・ジェネティクス  ２０００年版（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、２０００年、（米国）」）を用いることができる。目的遺伝子欠失株分離法を具体的に説明する。目的遺伝子座の欠失は、通常酵母に用いられる栄養要求性マーカー遺伝子や、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを用いたＰＤＣ１遺伝子、ＰＤＣ５遺伝子の相同組換えにより実施できる。例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、 ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＬＹＳ２等の栄養要求性マーカー遺伝子、Ｇ４１８薬剤耐性遺伝子を利用することができるが、これに限定されるものではない。酵母がサッカロマイセス属に属する酵母であれば、目的遺伝子欠失株分離法を用いて、Δｐｄｃ１単独欠失株、Δｐｄｃ５単独欠失株を造成して、それらの２倍体からの四分子分離法によりΔｐｄｃ１ Δｐｄｃ５二重欠失酵母を造成することもできる。
【００３９】
次に、変異型ＰＤＣ５遺伝子の作成方法について述べる。作成の方法は、特に限定されないが、ポリメレース連鎖反応（以下、ＰＣＲという）反応を利用した遺伝子工学的手法による取得方法を開示するが、この方法に限定されるわけではない。
【００４０】
特定の遺伝子のＤＮＡ配列を変異させる方法としては、ランダムに変異を導入する方法と部位特異的に変異を導入する方法がある。前者のランダム変異の導入方法としては、例えばＰＣＲ反応を利用した手法があり、これはＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子合成に誤りを起こさせることにより、改変された遺伝子ＤＮＡ断片を調製することができる。ランダム変異を導入した断片の増幅方法は、例えば、部位特異的変異導入用キットMutan-K(TAKARA社製)を用いる方法や、ランダム変異導入用キットBD Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(CLONTECH社製)を用いる方法などがある。
【００４１】
このように得られた変異型ＰＤＣ５遺伝子の導入には、ギャップ修復法（「酵母分子遺伝学実験法」、学会出版センター、１９９６年）、すなわち、変異型ＰＤＣ５遺伝子ＤＮＡ断片、およびＰＤＣ５遺伝子をクローニングした自立複製能力があるプラスミドにおいて、ＰＤＣ５遺伝子内に欠失して線状化したものを酵母細胞に同時に導入すると、変異型ＰＤＣ５遺伝子ＤＮＡ断片と欠失部分両端の相同性配列で相同組み換えが起こり、欠失部分の修復が行われ、同時にプラスミドが閉環され自立複製能力が復帰することを利用することができる。具体的には、ＰＤＣ５遺伝子をクローニングした酵母用発現ベクターを適当な制限酵素により切断して得られる変異導入標的領域ＤＮＡを削除したベクターと、適当なプライマーを用いてＰＤＣ５遺伝子領域についてランダム変異を導入しながら増幅した断片を用いて、同時にΔｐｄｃ１ Δｐｄｃ５二重欠失酵母に導入することにより、変異導入標的領域にランダム変異を導入された変異型ＰＤＣ５遺伝子がクローニングされた環状プラスミドが得られる。
【００４２】
ギャップ修復法による変異導入に用いるベクターは、正常な機能を持つＰＤＣ５遺伝子を自律複製型酵母−大腸菌シャトルベクターにクローニングすることによって得られる。この際、導入されるＰＤＣ５遺伝子領域には、当該遺伝子の上流域及び下流域に存在する当該遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーターおよびエンハンサー等のいわゆる調節配列をも含むことが好ましい。この調節配列によりクローニングしたＰＤＣ５遺伝子、あるいは変異型ＰＤＣ５遺伝子を発現させることによって、得られたタンパク質の機能を調べることができる。
【００４３】
また、上記の変異導入で利用するベクターは、コピー数が少なく、例えば酵母のセントロメアの複製開始点と大腸菌のColE1複製開始点の両方を有しており、また、薬剤耐性遺伝子、ＵＲＡ３の酵母選択マーカー、および、アンピシリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を含む大腸菌の選択マーカーを有することが好ましい。例えば、YCp50、pRS315、pRS316、pAUR112またはpAUR123等のベクターが挙げられる。
【００４４】
ベクターと増幅遺伝子断片の微生物への導入方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションおよびエレクトロポレーション等の方法があり、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（「ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Journal of bacteriology）」、１９８３年、第１５３巻、ｐ．163-168）やプロトプラスト法（「モレキュラー・セル・バイオロジー（Molecular Cell Biology）」、１９８４年、第４巻、ｐ.771-778）等によって実施できる。
【００４５】
また、得られた形質転換酵母の培養方法はすでに公知であり、例えば、「「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、（米国）、第１８１巻」に記述の培地、及び方法を用いることができる。
【００４６】
次に、変異型ＰＤＣ５遺伝子の導入によって、細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素活性が変化した酵母の選抜方法について説明する。ピルビン酸脱炭酸酵素活性が変化したことの確認方法としては、上記のギャップ修復法でえられた各々の形質転換細胞を培養した破砕物について、後記の方法によりピルビン酸脱炭酸酵素比活性を測定し、野生型ＰＤＣ５遺伝子を有する酵母に比較して変化していることを指標として選抜できる。
【００４７】
野生型ＰＤＣ５遺伝子を有する酵母に比べてピルビン酸脱炭酸酵素比活性が低下した変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する形質転換酵母細胞の選抜は、変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する酵母のピルビン酸脱炭酸酵素比活性を測定し、野生型ＰＤＣ５遺伝子を有する酵母に比較して該酵素比活性が低下した細胞を選抜することで行うことができる。また、あるいは変異型ＰＤＣ５遺伝子が温度感受性を示す形質転換酵母を選抜することによって、より好ましい酵母の選抜ができる。
【００４８】
ここで、本発明でいう温度感受性とは、非制限温度条件においては野生型と同程度の生育を示し、制限温度条件において生育しなくなること形質を有することを意味する。例えば、酵母の一般的な培養温度である２８℃乃至３０℃という非制限温度条件下では、ピルビン酸脱炭酸酵素活性が残存していて野生型酵母と同等程度の生育能力を示すが、３４℃という制限温度条件下では該酵素活性が低下することで生育能力が著しく低下する形質を有する酵母が例示される。温度感受性形質の細胞を選抜することで、変異型ＰＤＣ５遺伝子を得ることができ、温度感受性を獲得した変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する本発明の酵母を用いることによって、ＰＤＣ５遺伝子産物であるピルビン酸脱炭酸酵素の酵素活性に酵母の生育を依存させることができる。本発明では、選抜する好ましい温度条件として２５℃、３０℃、３４℃が挙げられ、特に３４℃が好ましいが、選抜する培養温度の設定はこれらに限定されない。
【００４９】
上記で選抜した酵母の細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素活性の評価方法を説明する。該酵素活性は、以下（１）〜（３）に概略を示すプロンクらの方法（「イースト（Ｙｅａｓｔ）」、１９９６年、第１２巻、ｐ．１６０７−１６３３）を適時改変して測定することができる。
（１）：ピルビン酸脱炭酸酵素により基質ピルビン酸からアセトアルデヒドが生じる。
（２）：（１）において生じたアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素が還元型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素としてエタノールに変換する。
（３）：（２）においてアルコール脱水素酵素がアセトアルデヒドをエタノールに変換する際に減少するＮＡＤＨの量を測定する。
【００５０】
ここで、（２）において減少したアセトアルデヒドの量は、（１）において生じたアセトアルデヒドの量と等しいとすると、（３）で測定したＮＡＤＨの減少量と（１）におけるピルビン酸の減少量は等しいこととなる。すなわち、酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素活性は、上記反応系のＮＡＤＨ減少量から測定できる。
【００５１】
また、酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素活性は、比活性を指標として比較することができる。すなわち、同条件下で培養した酵母からタンパク質を抽出し、その抽出液を用いてＮＡＤＨの減少に伴う波長３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定する。その際に、３０℃において１分間当たりに１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）と定義することにより、ピルビン酸脱炭酸酵素の比活性は、次の式（１）で表すことができる。ここで、Δ３４０は１分間あたりの波長３４０ｎｍの吸光度の減少量、６．２２は光路長１ｃｍにおけるＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数である。同条件下で測定をで行い、算出されたピルビン酸脱炭酸酵素の比活性により該酵素活性を比較することができる。
【００５２】
【数１】
0005660167.tif 000002
【００５３】
次に、変異型ＰＣＤ５遺伝子を有し、ＰＤＣ１遺伝子が欠失したΔｐｄｃ１  改変ｐｄｃ５酵母の造成について説明する。上記で得られた、変異型ＰＤＣ５遺伝子がクローニングされたプラスミドを形質転換酵母より取得する。取得の方法は特に限定されないが、市販の酵母プラスミド回収キット、例えばYEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit（クロンテック社）などを用いることができる。得られたプラスミドのＰＤＣ５遺伝子配列内を切断しない制限酵素で消化、線状化したもので、上記のように造成したΔｐｄｃ１ Δｐｄｃ５二重欠失酵母を形質転換すると、ＰＤＣ５遺伝子座に隣接するＤＮＡ配列と線状化プラスミドのＤＮＡ配列の相同領域で組み換えがおこり、ＰＤＣ５を欠失した際に用いたマーカー遺伝子と変異型ＰＤＣ５遺伝子とが置換され、目的とするΔｐｄｃ１  改変ｐｄｃ５酵母を得ることができる。これは、「ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔ法」（「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８７年、第１５４巻、ｐ．164-174」に記載）を応用することで実施できる。
【００５４】
乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）が導入され、ＰＤＣ１遺伝子が欠失し、温度感受性ＰＤＣ５遺伝子を有する本発明の酵母を培養することによって、効率的に乳酸を製造することができる。
【００５５】
ｌｄｈ遺伝子の発現様式としては、遺伝子を発現させることができるプロモーターの支配下に該遺伝子が連結されていれば、プラスミドによる発現、または染色体への導入による発現など特に限定されない。
【００５６】
プラスミドによる発現としては、乳酸脱水素酵素遺伝子を酵母の発現プラスミドに連結し、後述する遺伝子導入の方法に従って該プラスミドによる酵母の形質転換を行う方法が挙げられる。通常、酵母で利用する発現プラスミドは、例えば、酵母の２μmプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）もしくはセントロメアの複製開始点と大腸菌のＣｏｌＥ１複製開始点の両方を有しており、また、例えば、薬剤耐性遺伝子、ＵＲＡ３およびＬＥＵ２等の酵母選択マーカー、および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を有することが好ましい。また、導入した遺伝子を発現させるために、その遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーターおよびエンハンサー等のいわゆる調節配列をも含んでいることが望ましい。例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターおよびＧＡＰＤＨターミネーターが挙げられる。
【００５７】
発現ベクターは、例えば、染色体挿入型のベクターであってもかまわない。染色体への導入による発現としては、例えば、乳酸脱水素酵素遺伝子を、染色体上の目的箇所に、好ましくはピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモーターの下流に、相同組み換えで挿入する方法が挙げられる。染色体上の目的箇所に乳酸脱水素酵素遺伝子を相同組換えで挿入する方法としては、乳酸脱水素酵素遺伝子の上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を用いて酵母の形質転換を行う方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転換株の選択を容易にするために、上記ＰＣＲ断片には酵母選択マーカーを含んでも構わない。
【００５８】
本発明の酵母を培養して乳酸を製造する方法とは、本発明の酵母を発酵培地に接種して培養することで該酵母に乳酸を発酵培養液中に産成せしめ、その発酵培養液から乳酸採取することによる乳酸の製造方法のことである。
【００５９】
本発明の酵母を培養する発酵培地としては、該酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該酵母の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。炭素源としては、該酵母が資化しうるものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース等の糖類、これらの糖類を含有する糖蜜、デンプン又はデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。上記炭素源は、培養開始時に一括して添加してもよいし、又は培養中に分割して若しくは連続的に添加することもでき、５０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００６０】
本発明の酵母の培養は、振とう培養もしくは撹拌培養などで行うことができる。酸素供給条件は特に限定されるものではないが、好気的条件下あるいは微好気条件下で好ましく行うことができる。培養中の発酵培養液のｐＨは２．５〜５．０に保持することが望ましく、このｐＨの調整はアルカリ溶液、アルカリ懸濁液、アルカリ性のガスを培養液に投入することで行うことができる。アルカリ溶液あるいはアルカリ懸濁液には水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、炭酸カルシウムを好ましく用いることができる。アルカリ性のガスにはアンモニアを好ましく用いることができる。
【００６１】
本発明の酵母の培養方法としては、回分培養、流加培養、ならびに連続培養を採用することができ、それぞれの培養の発酵培養液から乳酸を採取することで乳酸を製造することができる。培養温度は２５〜３５℃がよく、培養時間は、回分培養ならびに流加培養の場合は、通常２４時間〜５日間である。
【００６２】
これらの培養方法のうち、本発明の酵母を連続培養することで乳酸を製造する方法が好ましい。連続培養とは、発酵培養を行っている発酵培養槽から、発酵培養液を連続的に抜き取り、抜き取った発酵培養液から生産物を回収するとともに発酵培地を前記の発酵培養液に追加しながら培養する方法であり、こうすることで乳酸を連続発酵することができる。連続培養の利点は、発酵培地を連続的に供給することから、目的生産物である乳酸の生産速度が向上する。また、発酵培養液を連続的に抜き取ることから発酵培養液中の乳酸濃度を抑えることが可能であり、目的生産物の濃度による生産能力阻害から回避できることから、乳酸の生産速度の向上が可能となる。培養温度は２５〜３５℃がよく、培養時間は所望の連続培養時間を設定できる。
【００６３】
更に分離膜を用いた連続培養を行うことで乳酸の連続発酵を行うこともできる。具体的には、本発明の酵母の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の発酵培養液に追加する連続発酵方法である。分離膜を用いた連続培養では、未濾過液に含まれる酵母が再び発酵培養液に保持または還流され、発酵培養槽内の酵母濃度が向上することから、乳酸の生産速度向上が可能となる。培養温度は２５〜３５℃が好ましく、培養時間は所望の連続培養時間を設定できる。
【００６４】
ここで、本発明の乳酸の製造法で用いることができる分離膜について説明する。分離膜としては多孔性膜を用いることが望ましい。多孔性膜とは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜の材質は前記性能を有していれば特に制限されないが、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
【００６５】
多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
【００６６】
本発明の乳酸の製造法で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【００６７】
本発明の乳酸の製造法で用いられる多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００６８】
本発明の乳酸の製造法で用いられる多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
【００６９】
また、多孔質基材の多孔質樹脂層には、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。
【００７０】
有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００７１】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００７２】
また、分離膜として用いる多孔性膜の平均細孔径は、０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが望ましい。多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、発酵に使用される微生物もしくは培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍ四方の範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００７３】
分離膜として用いる多孔性膜においては、培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、分離膜として用いる多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００７４】
多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。
【００７５】
また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００７６】
上記のような多孔性膜を分離膜として用いて、本発明の酵母の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によって乳酸を製造することができる。
【００７７】
次に、分離膜を用いた連続発酵に用いる連続発酵装置の概要を説明する。本発明で用いることができる連続発酵装置は、本発明の酵母を発酵培養させるための発酵反応槽を有するものである。
【００７８】
本発明の乳酸の製造方法で用いることができる連続発酵装置のひとつの形態は、発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、その分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段を有する。該分離膜エレメントには分離膜として上述の多孔性膜が用いることができる。
【００７９】
本発明で用いられる連続発酵装置の別の形態は、発酵反応槽と、その発酵反応槽に発酵培養液循環手段を介して接続され内部に分離膜エレメントを備えた発酵培養液を濾過するための膜分離槽を有する。該分離膜エレメントには分離膜として上述の多孔性膜が用いることができる。
【００８０】
次に、本発明の乳酸の製造法で用いることができる連続発酵装置について、発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、その分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段からなる装置について、具体的に図面を用いて説明する。
【００８１】
図２は、本発明で用いることができる連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。本発明の乳酸の製造方法で用いることができる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図２の概略図に示す。
【００８２】
図２において、連続発酵装置は、内部に分離膜エレメント２を備えた発酵反応槽１と水頭差制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内の分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。
【００８３】
次に、図２の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地は、投入前に必要に応じて、加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌する。発酵生産時には、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。発酵生産時は、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵液のｐＨを調整し、必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００８４】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰ（Oxidation Reduction Potential：酸化還元電位）の制御、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により、発酵液中のピルビン酸の濃度を測定し、発酵培養液中の乳酸の濃度を指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入は、好ましくは、上記計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節する。
【００８５】
図２において、発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物と発酵生産物が、濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物が装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメントによる濾過・分離には、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽（図示せず）で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽１内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、その培養液を必要に応じて発酵反応槽１内に供給することにより、常にフレッシュな本発明の酵母による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００８６】
本発明の酵母を上述の培養条件で培養することにより、乳酸を含む発酵培養液、またはその濾過液を得ることができる。得られた乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、HPLCを用いる方法や、Ｆ−キット（ロシュ社製）を用いる方法などがある。乳酸の光学純度の測定法は特に制限されないが、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法によって測定することができる。
【００８７】
得られた培養液中の乳酸は、従来より知られている方法によって、精製することができる。例えば、微生物を遠心分離した発酵液をｐＨ１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出する方法、活性炭を用いて不純物を除去する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとしてから蒸留する方法、ならびにカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などがある。また、分離膜を用いることで精製することも可能である。例えば、ＵＦ膜、ＮＦ膜によって乳酸と不純物とを分離精製することができる。また、前記精製された乳酸を濃縮する場合には、晶析、蒸留などの方法を採用しうる。また、ＲＯ膜を用いた濃縮も可能である。
【実施例】
【００８８】
以下、乳酸としてＬ−乳酸を選定し、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００８９】
下記、分子遺伝学的な実施の手法に関しては、特に断らないかぎり「「モレキュラー・クローニング  第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  ｅｄ．）」、１９９１年、（米国）」、「「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９９１年、（米国）、第１９４巻」、「「メソッズ・イン・イースト・ジェネティクス  ２０００年版（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ）」、２０００年、（米国）」に従った。
【００９０】
参考例１  ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のクローニング
ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングは下記のように実施した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸発酵能力を持つ酵母を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００９１】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００９２】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより配列番号３で表されるヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を図１に示す酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。
【００９３】
参考例２  アフリカツメガエル由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子のクローニング
アフリカツメカエル（ゼノプス・レービス）由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングは下記のように行った。Ｌ−ｌｄｈ遺伝子は、ＰＣＲ法によりクローニングを行った。ＰＣＲには、アフリカツメカエル（ゼノプス・レービス）の腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より、各付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡをＰＣＲの鋳型とした。
【００９４】
ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記得られたファージミドＤＮＡをそれぞれ５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、およびKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、配列番号４、配列番号５で表されるアフリカツメガエル由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子増幅用プライマーは、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００９５】
各ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ（またはＳａｌＩ）およびＮｏｔＩで切断し、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【００９６】
このＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いＬ−ｌｄｈ遺伝子断片を精製した。ここで、得られたアフリカツメガエル由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号６に示す。得られたアフリカツメガエルＬ−ｌｄｈ遺伝子断片を図１に示す酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法によりＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入された酵母発現用ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したアフリカツメガエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターをｐＬ−ｌｄｈ９とする。
【００９７】
実施例１  Δｐｄｃ１  Δｐｄｃ５二重欠失株の造成
下記、酵母分子遺伝学的な手法を実施に用いた生育培地としてはYPD培地、YPAD培地、YPG培地、YPAG培地、SD培地、SPO培地、は「「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９９１年、（米国）、第１９４巻」に従い調整した。酵母最小培地であるSD培地には必要に応じて、アミノ酸及び核酸塩基[トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、ウラシル（最終濃度各20 mg/L）、チロシン、ロイシン、イソロイシン、リジン（各30 mg/L）、バリン（150 mg/L）、フェニルアラニン（60 mg/L）、スレオニン（200 mg/L）、およびアデニン（40 mg/L）]を加えて用いた。グリセロールを炭素源とした最小培地にはSG培地[グルコースの代わりにグリセロール30 g]を用いた。酵母の合成完全培地にはSC培地[1 literあたりグルコース20 g、Yeast Nitrogen Base w/o amino acids（Difco社製） 6.7 g、ロイシンを除く標準19種アミノ酸76 mg、ロイシン380 mg、イノシトール76 mg、p-アミノ安息香酸8 mg、アデニン40 mg、およびウラシル76 mg]を用い、グリセロールを炭素源とした培地にはSCG培地[グルコースの代わりにグリセロール30 g]を用いた。必要に応じて任意のアミノ酸及び核酸塩基を加えない培地（例えばウラシルを加えない培地はSCＧ-Ura培地）を用いた。尚、これらはYeast Synthetic Drop-out Medium Supplements（Sigma-Aldrich社製）を用いても調整できる。四分子解剖用培地にはYPAD培地あるいはYPAG培地1 literに精製寒天粉末（ナカライ社製）20 gを加え、90 mmシャーレ（岩城硝子社製）に寒天培地12 mlを満たすことで調整した。5-FOA培地は1 literあたりグルコース20 g、Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g、Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements w/o uracil（Sigma-Aldrich社製） 1.92 g、ウラシル50 mg、および5-FOA（和光純薬社製）1 g（高圧蒸気滅菌後添加）を含む。平板培地を調整するときは、断らない限り1 literあたりBactoagar（Difco） 20 g、あるいは精製寒天粉末（ナカライ社製）20 gを加えた。滅菌は1 kg/cm2、20分間の条件でオートクレーブを用い高圧蒸気滅菌した。
【００９８】
まず、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＢＲＣ１０５０５株のゲノムＤＮＡ上に存在するＰＤＣ１遺伝子を欠失した酵母を造成した。プラスミドｐＲＳ４０４を増幅鋳型として、配列番号７及び配列番号８で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲによりで表される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより１．３ｋｂのＴＲＰ１遺伝子ＤＮＡ断片を増幅した。該断片を１．５％アガロースゲル電気泳動し、常法により精製した。その精製産物で常法により酵母ＮＢＲＣ１０５０５株をトリプトファン非要求性に形質転換した。得られた形質転換細胞はゲノムＤＮＡ上のＰＤＣ１遺伝子がＴＲＰ１遺伝子に置換されているｐｄｃ１欠失株となっているはずである。それを確認するために、ゲノムＤＮＡを増幅鋳型として、配列番号９及び配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより得られた増幅産物を１．５％アガロース電気泳動した。ゲノムＤＮＡ上のＰＤＣ１遺伝子がＴＲＰ１遺伝子に置換されていた場合、１．３ｋｂの増幅産物が得られる。一方、置換されていない場合、１．９ｋｂ産物が得られる。１．３ｋｂ産物が得られたことから、該形質転換体をＰＤＣ１遺伝子が欠失されたＳＷ０１０株とした。
【００９９】
また、ゲノムＤＮＡ上に存在するＰＤＣ５遺伝子を欠失した酵母を下記のように造成した。プラスミドｐＲＳ４０６を増幅鋳型として、配列番号１１及び配列番号１２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲによりで表される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより１．３ｋｂのＵＲＡ３遺伝子ＤＮＡ断片を増幅した。該断片を１．５％アガロースゲル電気泳動し、常法により精製した。その精製産物で常法により酵母ＮＢＲＣ１０５０６株をウラシル非要求性に形質転換した。得られた形質転換細胞はゲノムＤＮＡ上のＰＤＣ５遺伝子がＵＲＡ３遺伝子に置換されているｐｄｃ５欠失株となっているはずである。それを確認するために、ゲノムＤＮＡを増幅鋳型として、配列番号１３及び配列番号１４で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより得られた増幅産物を１．５％アガロース電気泳動した。ゲノムＤＮＡ上のＰＤＣ１遺伝子がＵＲＡ３遺伝子に置換されていた場合、１．２ｋｂの増幅産物が得られる。一方、置換されていない場合、１．９ｋｂ産物が得られる。１．２ｋｂ産物が得られたことから、該形質転換体をＰＤＣ５遺伝子が欠失されたＳＷ０１１株とした。Δｐｄｃ１  Δｐｄｃ５二重欠失株は下記のように造成した。上記得られたＳＷ０１０株、ＳＷ０１１株を接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、ＹＰＡＧ培地でそれぞれの胞子を生育させ、それぞれの一倍体細胞を得た。得られた一倍体細胞の栄養要求性を調べた。目的とするΔｐｄｃ１  Δｐｄｃ５二重欠失株は、ウラシルおよびトリプトファン非要求性を示すはずである。栄養供給性を調べた結果、ウラシルおよびトリプトファン非要求性を示した。得られたウラシル、およびトリプトファン非要求性株のゲノムＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号９及び配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号１３及び配列番号１４で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＰＤＣ１遺伝子、およびＰＤＣ５遺伝子が欠失されていることを確認した。このΔｐｄｃ１  Δｐｄｃ５二重欠失株をＳＷ０１２株とした。ＳＷ０１２株はグルコースを唯一炭素源として生育しないことを確認した。
【０１００】
更にプラスミドｐＲＳ４０３を増幅鋳型として、配列番号１１及び配列番号１２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲによりで表される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより１．３ｋｂのＨＩＳ３遺伝子ＤＮＡ断片を増幅した。該断片を１．５％アガロースゲル電気泳動し、常法により精製した。その精製産物で常法により酵母ＮＢＲＣ１０５０６株をヒスチジン非要求性に形質転換した。得られた形質転換細胞はゲノムＤＮＡ上のＰＤＣ５遺伝子がＨＩＳ３遺伝子に置換されているｐｄｃ５欠失株となっているはずである。それを確認するために、ゲノムＤＮＡを増幅鋳型として、配列番号１３及び配列番号１４で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより得られた増幅産物を１．５％アガロース電気泳動した。ゲノムＤＮＡ上のＰＤＣ５遺伝子がＨＩＳ３遺伝子に置換されていた場合、１．３ｋｂの増幅産物が得られる。一方、置換されていない場合、１．９ｋｂ産物が得られる。１．３ｋｂ産物が得られたことから、該形質転換体をｐｄｃ５が欠失されたＳＷ０１３株とした。Δｐｄｃ１  Δｐｄｃ５二重欠失株は下記のように造成した。上記得られたＳＷ０１０株、ＳＷ０１３株を接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、ＹＰＡＧ培地でそれぞれの子嚢を生育させ、それぞれの一倍体細胞を得た。得られた一倍体細胞の栄養要求性を調べた。目的とするΔｐｄｃ１  Δｐｄｃ５二重欠失株は、ヒスチジンおよびトリプトファン非要求性を示すはずである。栄養供給性を調べた結果、得られたヒスチジンおよびトリプトファン非要求性株のゲノムＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号９及び配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号１３及び配列番号１４で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＰＤＣ１およびＰＤＣ５遺伝子が欠失されていることを確認した。このΔｐｄｃ１  Δｐｄｃ５二重欠失株をＳＷ０１４株とした。ＳＷ０１４株はグルコースを唯一炭素源として生育しないことを確認した。
【０１０１】
実施例２  ｐｄｃ５ｔｓ変異遺伝子の取得
ＢＹ４７４１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１５及び配列番号１６で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＰＤＣ５遺伝子を含む２．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を得た。該断片をＮｏｔＩで消化し、予めＮｏｔＩで消化しておいたプラスミドｐＲＳ３１６のＮｏｔＩ間隙に挿入した。得られたプラスミドｐＲＳ３１６−ＰＤＣ５によって、ＳＷ０１３株をウラシル非要求性に形質転換した。該形質転換体がグルコースを唯一炭素源として生育能力が回復し、且つ３７℃での生育能力を有していることを確認した。該形質転換体から、プラスミドｐＲＳ３１６−ＰＤＣ５を常法によって回収し、ｐＲＳ３１６に挿入した２．７ｋｂの塩基配列を常法によって決定し、ｐＲＳ３１６−ＰＤＣ５はＰＤＣ５遺伝子が含まれていることを確認した。
【０１０２】
次に、プラスミドｐＲＳ３１６−ＰＤＣ５を増幅鋳型とし、配列番号１７及び配列番号１８で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとし、BD Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(クロンテック社製)を用いたＰＣＲによりＰＤＣ５をコードする１．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を得た。該ｋｉｔを用いたＰＣＲにより、ＤＮＡ増幅時に変異導入頻度が高くなり、上記得られた１．７ｋｂ断片は通常のＰＣＲで得られる断片と比較して、変異を含む断片を含む頻度が高い。得られた１．７ｋｂ断片と、プラスミドｐＲＳ３１６−ＰＤＣ５を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉ、Ｂｐｕ１１０２Ｉにより消化し線状化したプラスミド断片によって、ＳＷ０１４株をウラシル非要求性に形質転換し、ＳＣ−Ｕｒａ培地を用い２５℃で保温することで生育する形質転換体を選択した。ギャップ修復法を応用した方法により、上記１．７ｋｂ断片と線状化プラスミドが相同組み換えを起こし、再び環状化したプラスミドを獲得した細胞のみが生育する。得られた形質転換体群を新鮮なＳＣ−Ｕｒａ培地にレプリカし３４℃で保温した。レプリカした形質転換体群の中で３４℃で生育しない形質転換体を２株選択し、ｐｄｃ５温度感受性変異ｐｄｃ５ｔｓ−９、およびｐｄｃ５ｔｓ−１１とした。この形質転換体から常法によりプラスミドを回収し、上記１．７ｋｂ増幅ＤＮＡ断片に対応する塩基配列を決定した。その結果、ｐｄｃ５ｔｓ−９は、配列番号１９で表される構造遺伝子ＤＮＡの１３９７番目の塩基がＣからＴへの一塩基置換変異、またｐｄｃ５ｔｓ−９は、配列番号２０で表される構造遺伝子ＤＮＡの７０１番目の塩基がＣからＴへの一塩基置換変異であった。それぞれの該プラスミドをｐｄｃ５温度感受性変異アレルをもつｐＲＳ３１６−ｐｄｃ５ｔｓ９、およびｐＲＳ３１６−ｐｄｃ５ｔｓ１１とした。
【０１０３】
実施例３  ｐｄｃ５ｔｓ変異株の造成
プラスミドｐＲＳ３１６−ｐｄｃ５ｔｓ９およびｐＲＳ３１６−ｐｄｃ５ｔｓ１１をＮｏｔＩで消化し、ｐｄｃ５ｔｓ９およびｐｄｃ５ｔｓ１１変異遺伝子を含む２．７ｋｂ断片を得た。該断片を用いてＳＷ０１２株をウラシル要求性に形質転換し、５ＦＯＡ培地で２５℃に保温し生育する形質転換体を選択した。得られた形質転換体群を新鮮なＳＣ−Ｕｒａ培地にレプリカし３４℃で保温した。レプリカした形質転換体群の中で３４℃で生育しない形質転換体を選択し、ｐｄｃ５ｔｓ９温度感受性変異株ＳＷ０１５株、ｐｄｃ５ｔｓ１１温度感受性変異株ＳＷ０１６株とした。
【０１０４】
実施例４  ｐｄｃ５ｔｓ変異株の諸性質
ＰＤＣ野生型株、Δｐｄｃ１欠失株およびΔｐｄｃ１  ｐｄｃ５温度感受性株のＰＤＣ活性を測定した。
【０１０５】
（ａ）菌体からのタンパク質抽出
寒天培地上からＮＢＲＣ１０５０５株、ＳＷ０１０株、ＳＷ０１５株、およびＳＷ０１６株をそれぞれ少量とり、３mLのＹＰＤ液体培地に植菌し一晩培養した（前培養）。前培養液を新しいＹＰＤ液体培地２０ｍＬに１％植菌し、１００ｍＬ容坂口フラスコを用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した（本培養）。本培養液１０ｍＬを遠心分離により集菌、１０ｍＬのリン酸バッファーで洗浄後、１ｍＬのリン酸バッファーに懸濁した。上記菌体懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、さらに等量のガラスビーズ（ＳＩＧＭＡ社製、直径０．６ｍｍ）を加え、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｕｂｅ  Ｍｉｘｅｒ（ＴＯＭＹ社製）を用い４℃で菌体を破砕した。このようにして菌体を破砕した後、遠心分離して得られる上清をＰＤＣ酵素液とした。
【０１０６】
（ｂ）ＰＤＣ活性測定
上記（ａ）で得られたＰＤＣ酵素液の濃度を、ウシＩｇＧ（１．３８ｍｇ／ｍＬ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）をスタンダードとして作製した検量線をもとにＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）により測定し、それぞれのＰＤＣ酵素液が２ｍｇ／ｍＬになるように滅菌水で希釈した。次に、表１に示した割合でＰＤＣ酵素液およびＮＡＤＨを除いた混合液をセミミクロキュベットに分注し、測定を始める直前にＰＤＣ酵素液及びＮＡＤＨを加え混合した。
【０１０７】
【表１】
0005660167.tif 000003
【０１０８】
各ＰＤＣ酵素液の３４０ｎｍにおける吸光度の減少を分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００Ｐｒｏ  アマシャム社製）で測定し、得られたΔ３４０の値を式（１）にあてはめ、ピルビン酸ナトリウム５ｍＭについて、各ＰＤＣの比活性を算出した。その結果を表２に示す。
【０１０９】
【表２】
0005660167.tif 000004
【０１１０】
この結果、変異型ＰＤＣ５遺伝子を有するｐｄｃ５ｔｓ９温度感受性変異株ＳＷ０１５株、ｐｄｃ５ｔｓ１１温度感受性変異株ＳＷ０１６株のＰＤＣ比活性は、ＮＢＲＣ１０５０５株の１／３以下、且つＳＷ０１０株より低いことが明らかになり、ＰＤＣ５遺伝子の温度感受性変異酵母を取得することで、ＰＤＣ比活性が低下した酵母を得ることができた。
【０１１１】
実施例５、６  ｐｄｃ５温度感受性変異株による乳酸発酵試験（ヒト由来ＬＤＨ遺伝子）
上記で取得したｐｄｃ５温度感受性変異株の乳酸発酵試験を行った。ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５でＳＷ０１５株、およびＳＷ０１６株を形質転換することで、ヒト由来ＬＤＨを導入した。乳酸発酵試験には表３に示す乳酸発酵培地を高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）した。
【０１１２】
【表３】
0005660167.tif 000005
【０１１３】
生産物である乳酸の濃度の評価は、下記に示す条件でＨＰＬＣを用いて評価した。
【０１１４】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、
０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０１１５】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【０１１６】
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｅｎａｎｔｉｏ Ｌ１（東ソー社製）
移動相 ：１ｍＭ  硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃。
【０１１７】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【０１１８】
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【０１１９】
グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０１２０】
乳酸発酵試験条件を以下に示す。
【０１２１】
醗酵装置：Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ（丸菱バイオエンジ社製）
培地：１Ｌ  乳酸発酵培地
培養温度：３０℃
通気量：１００  ｍｌ／ｍｉｎ
撹拌速度：２００  １／ｍｉｎ
ｐＨ：５．０
中和剤：１Ｎ  ＮａＯＨ溶液。
【０１２２】
まず、ＳＷ０１５株（実施例５）、およびＳＷ０１６株（実施例６）を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を発酵装置に植菌し、乳酸発酵試験を行った。その結果を表４に示した。尚、産生されたＬ−乳酸の光学純度はすべて９９．９％であった。
【０１２３】
実施例７、８  ｐｄｃ５温度感受性変異株による乳酸発酵試験（アフリカツメガエル由来ＬＤＨ遺伝子）
上記で取得したｐｄｃ５温度感受性変異株の乳酸発酵試験を行った。アフリカツメガエル由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ９でＳＷ０１５株、およびＳＷ０１６株を形質転換することで、アフリカツメガエル由来ＬＤＨを導入した。乳酸発酵試験には表３に示す乳酸発酵培地を高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）した。
【０１２４】
生産物である乳酸の濃度の評価には、下記に示すＨＰＬＣを用いて評価した。
【０１２５】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、
０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０１２６】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【０１２７】
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｅｎａｎｔｉｏ Ｌ１（東ソー社製）
移動相：１ｍＭ  硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：３０℃。
【０１２８】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【０１２９】
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【０１３０】
グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０１３１】
乳酸発酵試験条件を以下に示す。
【０１３２】
醗酵装置：Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ（丸菱バイオエンジ社製）
培地：１Ｌ  乳酸発酵培地
培養温度：３０℃
通気量：１００  ｍｌ／ｍｉｎ
撹拌速度：２００  １／ｍｉｎ
ｐＨ：５．０
中和剤：１Ｎ  ＮａＯＨ溶液。
【０１３３】
まず、アフリカツメガエル由来プラスミドｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換したＳＷ０１５株（実施例７）、およびＳＷ０１６株（実施例８）を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を発酵装置に植菌し、乳酸発酵試験を行った。その結果を表４に示した。尚、産生されたＬ−乳酸の光学純度はすべて９９．９％であった。
【０１３４】
比較例１  ＰＤＣ５野生型株を用いた乳酸発酵（ヒト由来ＬＤＨ遺伝子）
また、対照比較例としてＰＤＣ５野生型株を用いた発酵試験を行った。ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５でＰＤＣ５野生型株であるＳＷ０１１株を形質転換した形質転換細胞を用い、ｐｄｃ５温度感受性変異株と同条件で発酵試験を行った。その試験結果を表４に示した。
【０１３５】
比較例２  ＰＤＣ５野生型株を用いた乳酸発酵（アフリカツメガエル由来ＬＤＨ遺伝子）
更に、対照比較例としてアフリカツメガエル由来ＬＤＨを含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換したＳＷ０１１株を、ｐｄｃ５温度感受性変異株と同条件で発酵試験を行った。その試験結果を表４に示した。
【０１３６】
【表４】
0005660167.tif 000006
【０１３７】
これらの結果から、ｐｄｃ５温度感受性変異株を用いることで、高い収率で乳酸の製造できることが明らかになった。
【０１３８】
参考例３  多孔性膜の作成
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
【０１３９】
［原液］
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％。
【０１４０】
次に、上記の原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに下記組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
【０１４１】
［凝固浴］
・水：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【０１４２】
実施例９  ｐｄｃ５温度感受性変異株による乳酸連続発酵試験
本発明の酵母としてアフリカツメガエル由来プラスミドｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換したＳＷ０１５株を用い、発酵培地として表３に示す組成の乳酸発酵培地を用い、図２に示す連続発酵装置を用いて連続培養を行い、乳酸の連続発酵試験を行った。また、上記の乳酸発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例１で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例９における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【０１４３】
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３２（℃）
・発酵反応槽通気量：２０（ｍｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨを５に調整した
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
【０１４４】
また、乳酸の濃度、乳酸の光学純度、ならびにグルコース濃度の測定は、実施例７と同様の方法で行った。
【０１４５】
まず、ｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換したＳＷ０１５株を、試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で２８℃の温度で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、２８℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度、乳酸の光学純度および残存グルコース濃度を測定した。また、その乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表５に示す。尚、連続発酵期間中のＬ−乳酸の光学純度は９９．９％であった。
【０１４６】
比較例３  ＰＤＣ５野生型株を用いた連続乳酸発酵試験
対照比較例として、アフリカツメガエル由来ＬＤＨを含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ９で形質転換したＳＷ０１１株を用いて、その他の条件はすべて実施例９と同様で連続乳酸発酵試験を行った。その試験結果を表５に示した。
【０１４７】
【表５】
0005660167.tif 000007
【０１４８】
これらの結果、ｐｄｃ５温度感受性変異株を用いた連続発酵を行うことで、高い収率かつ高い生産速度で乳酸が製造できることが明らかになった。
【符号の説明】
【０１４９】
１  発酵反応槽
２  分離膜エレメント
３  水頭差制御装置
４  気体供給装置
５  攪拌機
６  レベルセンサ
７  培地供給ポンプ
８  ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９  ｐＨセンサ・制御装置
１０  温度調節器
【図１】
0005660167.tif 000008
【図２】
0005660167.tif 000009
【配列表】
0005660167000001.app