(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中を循環する７７ｋＤグッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）を検出する方法であって、
（ａ）ＧＰＢＰ結合分子の７７ｋＤ  ＧＰＢＰに対する選択的結合を促進する条件下で、前記７７ｋＤ  ＧＰＢＰに結合する前記ＧＰＢＰ結合分子と血漿試料とを接触させること、
（ｂ）非結合ＧＰＢＰ結合分子、血漿、またはそれら両方を除去すること、および
（ｃ）前記ＧＰＢＰ結合分子と、前記血漿試料中の前記７７ｋＤ  ＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること、を含む方法。
【請求項２】
前記７７ｋＤ  ＧＰＢＰは、配列番号４によるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＧＰＢＰ結合分子が抗体を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、ヒト血漿からの天然の循環する７７ｋＤ  ＧＰＢＰを検出することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出することは、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、およびクロマトグラフィからなる群から選択される技術を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記血漿試料は、自己免疫疾患を有すると疑われるヒト対象から得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記自己免疫疾患は、グッドパスチャー症候群および免疫複合体型糸球体腎炎からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、自己免疫疾患を有すると疑われるヒト対象の診断に使用される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
尿グッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）を検出する方法であって、
（ａ）７７ｋＤ  ＧＰＢＰまたは９１ｋＤ  ＧＰＢＰに対するＧＰＢＰ結合分子の選択的結合を促進する条件下で、前記７７ｋＤ  ＧＰＢＰまたは９１ｋＤ  ＧＰＢＰに結合する前記ＧＰＢＰ結合分子と尿試料とを接触させること、
（ｂ）非結合ＧＰＢＰ結合分子を除去すること、および
（ｃ）前記尿試料中の前記７７ｋＤ  ＧＰＢＰまたは９１ｋＤ  ＧＰＢＰと、前記ＧＰＢＰ結合分子との間の複合体形成を検出すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグッドパスチャー抗原結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
（相互参照）
本出願は、米国特許仮出願番号６１／０８２７４１（２００８年７月２２日付で出願）及び６１／０８５２１１（２００８年７月３１日付で出願）の利益を主張し、どちらの出願もその全体を本明細書に援用する。
（背景技術）
基底膜コラーゲンＩＶのα３鎖の非コラーゲン様（ＮＣ１）ドメイン［α３（ＩＶ）ＮＣ１］のコンフォメーションは、一部分においてリン酸化に依存している。グッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）（特許文献１および２）は、その超分子集合の間のα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの構造異性化を触媒し、その結果、基底膜で複数のα３（ＩＶ）ＮＣ１配座異性体を生成し安定化させる、新規な非従来型のタンパク質キナーゼである。ＧＰＢＰレベルの上昇は、グッドパスチャー（「ＧＰ」）疾患に関与する自己免疫反応をもたらす、非耐性化α３（ＩＶ）ＮＣ１配座異性体の産生と関連する。ＧＰ患者において、ＩＶ型コラーゲンα３鎖の非コラーゲン様Ｃ末端ドメイン（ＮＣ１）（「グッドパスチャー抗原」又は「ＧＰ抗原」）に対する自己抗体は、急速進行性糸球体腎炎および多くの場合に肺出血を引き起こし、これはＧＰ症候群の２つの基本的な臨床症状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ００／５０６０７
【特許文献２】ＷＯ０２／０６１４３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＧＰＢＰの同定は、自己免疫疾患、癌、タンパク質の誤った折りたたみが関与する障害、および異常なアポトーシスを治療するための化合物の同定法を提供し、これらの障害の可能性のある治療法も提供する。従って、新規ＧＰＢＰアイソフォームの同定は、少なくともこれらの分野において有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる９０％又はそれより高い純度の単離ポリペプチド（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）を提供する。
第２の態様において、本発明は、一般式  Ｘ−配列番号２（Ｘは検出可能なポリペプチドである）を有する実質的に精製された組換え型ポリペプチドを提供する。この態様の好ましい一実施形態において、検出可能なポリペプチドは、蛍光ポリペプチド及び結合対のポリペプチドメンバーからなる群から選択される。別の態様において、本発明は、本発明のこの第２の態様のポリペプチドをコードする実質的に精製された核酸を提供する。
【０００６】
第３の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）をコードする実質的に精製された核酸を提供する。好ましい一実施形態において、実質的に精製された核酸は、配列番号１の核酸、又はそのｍＲＮＡ産物からなる。
【０００７】
第４の態様において、本発明は、本発明の任意の態様の実質的に精製された核酸を含む
組換え型発現ベクターを提供する。
第５の態様において、本発明は、本発明の組換え型発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０００８】
第６の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチド（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）又は配列番号４を含む実質的に精製されたポリペプチド（７７ｋＤ  ＧＰＢＰ）を提供し、この場合、配列番号２又は配列番号４のポリペプチドは、３０５−３４４番目のアミノ酸残基ＧＧＰＤＹＥＥＧＰＮＳＬＩＮＥＥＥＦＦＤＡＶＥＡＡＬＤＲＱＤＫＩＥＥＱＳＱＳＥＫ（配列番号１０）（番号付けは７７ｋＤ  ＧＰＢＰ内の位置に基づく）に直接的及び／又は間接的に関与する１以上の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を有する。好ましい一実施形態において、１以上のＰＴＭは共有結合ＰＴＭを含む。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、３０５−３４４番目のアミノ酸（配列番号１０）内に共有結合ＰＴＭを含む。好ましい一実施形態において、１以上のＰＴＭは、３２０−３２７番目の残基（ＥＥＦＦＤＡＶＥ、配列番号５）に直接的及び／又は間接的に関与する。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、３２０−３２７番目の残基（ＥＥＦＦＤＡＶＥ、配列番号５）内に１以上の共有結合ＰＴＭを含む。この態様の様々な好ましい実施形態において、実質的に精製されたポリペプチドは、配列番号２（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）又は配列番号４（７７ｋＤ  ＧＰＢＰ）のアミノ酸配列を有するか、またはこれからなる。
【０００９】
第７の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチド（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）又は配列番号４を含む実質的に精製されたポリペプチド（７７ｋＤ  ＧＰＢＰ）を提供し、この場合、配列番号２又は配列番号４のポリペプチドは、３７１−３９６番目の残基ＰＹＳＲＳＳＳＭＳＳＩＤＬＶＳＡＳＤＤＶＨＲＦＳＳＱ（配列番号９）（番号付けは７７ｋＤ  ＧＰＢＰ内の位置に基づく）に直接的及び／又は間接的に関与する１以上のＰＴＭを含む。好ましい一実施形態において、１以上のＰＴＭは、共有結合ＰＴＭを含む。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、アミノ酸３７１−３９６（配列番号９）内に共有結合ＰＴＭを含む。好ましい一実施形態において、１以上のＰＴＭは、直接的及び／又は間接的に３８８−３９２残基（ＤＤＶＨＲ、配列番号６）に関与する。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、３８８−３９２残基（配列番号６）内に１以上の共有結合ＰＴＭを含む。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、３０５−３４４番目のアミノ酸残基ＧＧＰＤＹＥＥＧＰＮＳＬＩＮＥＥＥＦＦＤＡＶＥＡＡＬＤＲＱＤＫＩＥＥＱＳＱＳＥＫ（配列番号１０）（番号付けは７７ｋＤ  ＧＰＢＰ内の位置に基づく）に直接的及び／又は間接的に関与する１以上のＰＴＭをさらに含み、好ましくは１以上のＰＴＭは共有結合ＰＴＭを含み、なお一層好ましくは１以上のＰＴＭは、アミノ酸３０５−３４４（配列番号１０）内に共有結合ＰＴＭを含む。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、直接的又は間接的に３２０−３２７番目の残基（ＥＥＦＦＤＡＶＥ、配列番号５）に関与する。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、３２０−３２７番目の残基（ＥＥＦＦＤＡＶＥ、配列番号５）内に１以上の共有結合ＰＴＭを含む。この態様の様々な好ましい実施形態において、実質的に精製されたポリペプチドは、配列番号２（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）又は配列番号４（７７ｋＤ  ＧＰＢＰ）のアミノ酸配列を有するか、またはこれからなる。
【００１０】
第８の態様において、本発明は、本発明の第６又は第７の態様のポリペプチドと選択的に結合する、実質的に精製されたモノクローナル抗体を提供する。
第９の態様において、本発明は、配列番号２のポリペプチドと特異的に結合するが、配列番号４のポリペプチドとは結合しない、実質的に精製されたモノクローナル抗体を提供する。好ましい一実施形態において、モノクローナル抗体は、アミノ酸配列ＤＧＷＫＧＲＬＰＳＰＬＶＬＬＰＲＳＡＲＣ（配列番号７）内のエピトープと結合する。
【００１１】
第１０の態様において、本発明は、血液中を循環するグッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）を検出する方法であって、
（ａ）ＧＰＢＰ結合分子のＧＰＢＰに対する選択的結合を促進する条件下で、ＧＰＢＰ結合分子と血漿試料を接触させること、
（ｂ）非結合ＧＰＢＰ結合分子を除去すること、および
（ｃ）ＧＰＢＰ結合分子と血漿試料中のＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること、
を含む方法を提供する。
【００１２】
第１１の態様において、本発明は、尿グッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）を検出する方法であって、
（ａ）尿試料をＧＰＢＰ結合分子と、ＧＰＢＰ結合分子のＧＰＢＰに対する選択的結合を促進する条件下で接触させること、
（ｂ）非結合ＧＰＢＰ結合分子を除去すること、および
（ｃ）尿試料中のＧＰＢＰ結合分子とＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること、
を含む方法を提供する。
【００１３】
第１２の態様において、本発明は、天然の７７ｋＤ  ＧＰＢＰを単離する方法であって、
（ａ）血漿試料を硫酸アンモニウム沈殿させること、
（ｂ）硫酸アンモニウム沈殿した血清試料に対してイオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を実施すること、
（ｃ）天然の７７ｋＤ  ＧＰＢＰを含むＩＥＣ画分を同定すること、
（ｄ）天然の７７−ＧＰＢＰを含むＩＥＣ画分をゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ）すること、および
（ｅ）天然の７７ｋＤ  ＧＰＢＰを含むＧＦＣ画分を同定すること、
を含む方法を提供する。
【００１４】
第１３の態様において、本発明は、天然の９１ｋＤ  ＧＰＢＰを単離する方法であって、
（ａ）尿試料を塩析沈殿すること、
（ｂ）塩析タンパク質試料に対してダブルイオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を実施すること、および
（ｃ）天然の９１ｋＤ  ＧＰＢＰを含むＩＥＣ画分を同定すること、
を含む方法を提供する。
【００１５】
第１４の態様において、本発明は、天然のＧＰＢＰアイソフォームを単離する方法であって、
（ａ）血漿試料又は尿試料を、天然のＧＰＢＰと選択的に結合するＧＰＢＰ結合分子を含むイムノアフィニティーカラムに通すこと、
（ｂ）イムノアフィニティーカラムから血漿又は尿試料からの非結合タンパク質を洗い流すこと、および
（ｃ）前記カラムから天然のＧＰＢＰアイソフォームを溶出させること、
を含む方法を提供する。
【００１６】
好ましい一実施形態において、これらの方法は、例えば、以下の実施例においてさらに詳細に開示するように、天然の７７ｋＤ  ＧＰＢＰ及び天然の９１ｋＤ  ＧＰＢＰを、それぞれ血漿及び尿から実質的に精製するために使用できる。別の好ましい実施形態において、ＧＰＢＰ結合分子はＧＰＢＰ抗体を含む。別の好ましい実施形態において、抗体は本発明の新規モノクローナル抗体を含む。別の好ましい実施形態において、溶出ステップは、変性溶出緩衝液の使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＣＯＬ４Ａ３ＢＰは、７７ｋＤａ、９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのポリペプチドをコードする。Ａにおいて、ＦＬＡＧ標識ＧＰＢＰ又はＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴ（１０−２０ｎｇ）を、示された抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。Ｂにおいて、細胞抽出物（５０μｇ）をＡにおけるのと同様に分析した。Ｃにおいて、対照細胞（−）から又はｐｃ−ｎ４’を発現する細胞からの抽出物（１０μｇ）をＡにおけるのと同様に分析した。Ｄにおいて、非トランスフェクト細胞（−）から又は示されたｓｉＲＮＡ発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞からの抽出物（５０μｇ）をＡにおけるのと同様に分析した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をローディング対照およびｓｉＲＮＡ特異性として使用した。ｍＡｂ  ｅ２６と天然又は組換え型ポリペプチドとの反応性は、ＧＰＢＰｐｅｐ１（２０μＭ）を抗体阻害ペプチドとして使用する場合に完全に消失した（非図示）。この図及び以下の図において、数字及び線分又は矢印は、それぞれ、ＭＷ標準又は反応性ポリペプチドのサイズ（ｋＤａ）及び位置を示す。この図および以下の図に示す結果は、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図２】９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのＧＰＢＰポリペプチドは、ｍＲＮＡ非標準翻訳開始の産物である。Ａは、示されたプラスミドを構築するために使用したｃＤＮＡの略図である。Ｂにおいて、細胞抽出物（１０μｇ）（エキソビボ）又は示されたプラスミド構築物を発現する個々の転写／翻訳混合物（インビトロ）を、ｍＡｂ  ｅ２６（エキソビボ）を用いたウェスタンブロット又はフルオログラフィー（インビトロ）によって分析した。非トランスフェクト細胞からの溶解物（エキソビボ）又はプラスミドを含まない混合物（インビトロ）を対照として使用した。Ｃにおいて、ＧＰＢＰのＮ末端オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列（配列番号１５）を１文字コードで表示し、対応するｍＲＮＡヌクレオチド配列（配列番号１４）を大文字で表示する。灰色および黒色の文字は、それぞれ５’−ＵＴＲ及びＡＴＲを示す。枠で囲んだのは、標準及び非標準翻訳開始のコドン及び残基である。Ａｂ２４によって標的とされるペプチド配列を灰色で強調する。右側の負の数は、標準翻訳開始部位（ＡＵＧ又はＭｅｔ、＋１）からのコドン又は残基の位置を意味する。Ｄにおいて、示された位置に終止コドンを有さないか（−）又は有する、示されたプラスミド構築物を発現しない細胞（対照）又は発現する細胞からの抽出物（１０μｇ）を、示された抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。Ｅにおいて、部分的に精製された細胞抽出物（５０μｇ）を、示された反応種及び非反応性Ｆ（ａｂ）２Ａｂ２０（Ｃｏｎｔ）を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【図３】９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのＧＰＢＰアイソフォームは不溶性膜結合ポリペプチドである。Ａにおいて、無傷細胞を、αＧＰＢＰ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７抗体（αＧＰＢＰ−ＡＦ６４７）とともに、ＧＰＢＰｐｅｐ１又は等モル量の非関連性ペプチド（Ｃｏｎｔｐｅｐ）及び生細胞のミトコンドリア染色のためのローダミン１２３の存在下でインキュベートし、共焦点顕微鏡法によって分析した。スケールバーは２１μＭである。Ｂにおいて、細胞を分離し、ビオチニル化αＧＰＢＰ抗体の非存在下（対照）又は存在下（αＧＰＢＰ）でブロッキング溶液とともにインキュベートした。細胞表面結合抗体は、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ及びフローサイトメトリーを用いて検出した。対照として、平行培養物（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を同じ抗体とともにＧＰＢＰｐｅｐ１の存在下（αＧＰＢＰ＋ＧＰＢＰｐｅｐ１）又は等モル量の非関連性ペプチドの存在下（αＧＰＢＰ＋Ｃｏｎｔｐｅｐ）でインキュベートし、同様に分析した。Ｃにおいて、同様の量（１０μｇ）の示された細胞画分を、示されたタンパク質の抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した。本発明者等は、細胞区画マーカーとして：ミトコンドリアについてはピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、リソソームについてはカテプシンＤ、ミクロソームについてはプリオンタンパク質（ＰｒＰ）、および核及びサイトゾルについては核因子カッパＢ（ｐ６５）を使用した。ＧＰＢＰ及びＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴ検出のために、本発明者等は、ｍＡｂ  ｅ２６及びｍＡｂ  １４をそれぞれ使用した。本発明者等は、サイトゾルにおいて７７ｋＤａのＧＰＢＰの発現を検出しなかったので、この区画におけるｍＡｂ  １４反応性は、ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴに起因すると考えることができる。
【図４】７７ｋＤａのＧＰＢＰアイソフォームは、培養細胞においてＩＶ型コラーゲンと相互作用する。Ａにおいて、ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３−ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）細胞を架橋し、溶解させ、αＦＬＡＧ抽出した。５０マイクログラムの細胞溶解物（インプット）又は対応するＦＬＡＧ−免疫沈降物質（ＩＰ  αＦＬＡＧ）を、逆架橋（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）し、クマシーブルー染色又はαＧＰＢＰｒを用いたウェスタンブロットによって分析した。ＦＬＡＧ−免疫沈降物（矢印）中の主な特異的ポリペプチドを切除し、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析法によって同定した。Ｂにおいて、ＨＥＫ２９３（−）又はＨＥＫ２９３−ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）（＋）細胞を、ｐｃＤＮＡ３（−）又はｐｃ−ｎ４’（＋）でトランスフェクトし、架橋し、処理し、示された抗体を用いたウェスタンブロットによりＡにおけるのと同様に分析した。
【図５】７７ｋＤａのＧＰＢＰの細胞外区画への排出。Ａにおいて、ＨｅＬａ細胞を示されたプラスミド構築物でトランスフェクトし、示されたタンパク質を標準的間接免疫蛍光法によって可視化した。ＤＮＡを、核視覚化のために４’−６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。原倍率×４００。ＢおよびＣにおいて、示されたプラスミド構築物（溶解物）を発現する細胞由来の抽出物（１０μｇ）または対応する培地由来のＦＬＡＧ−免疫沈降物（培地ＩＰ）を、示された抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【図６】９１ｋＤａ  ＧＰＢＰは、培養細胞における７７ｋＤａ  ＧＰＢＰ分泌を調節する。Ａにおいて、組換え９１ｋＤａ  ＧＰＢＰを発現するか（ｃ８）又は発現しない（ｃ１９）２つの独立したクローン由来の抽出物（１０μｇ）を、天然の９１ｋＤａ  ＧＰＢＰとあまり反応しないｍＡｂ１４抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した（図１Ｂ）。Ｂにおいて、同じクローンをｐｃ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰでトランスフェクトし、細胞抽出物（溶解物）又は対応する培地由来のＦＬＡＧ−免疫沈降物（培地ＩＰ）を、示された抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。ｃ８と類似した組換え９１ｋＤａのＧＰＢＰのレベルを発現する独立したＨＥＫ２９３クローンであるｃ１４を分析すると、同様の結論が得られた（非図示）。
【図７】ＧＰＢＰではなくＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴがスフィンゴミエリナーゼ細胞処理に対して感受性である。Ａにおいて、ＨｅＬａ細胞を示されたプラスミド構築物でトランスフェクトし、スフィンゴミエリナーゼで処理するか（＋）又は処理せず（−）、溶解させ、ＦＬＡＧ−免疫沈降させ、αＦＬＡＧ抗体（ｂＳＭａｓｅ）を用いたウェスタンブロットによって分析した。未処理細胞由来の免疫沈降物をホスファターゼとともにインキュベートするか（＋）又はインキュベートせず（−）、同様に分析した（λＰＰａｓｅ）。本発明者等は８−１２％勾配ゲル及び広範囲電気泳動（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いてＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴのリン酸化型及び脱リン酸化型を分離し、ウェスタンブロット及びデンシトメトリーによってそれらの相対的存在量を推定した。Ｂにおいて、Ａにおけるのと同じ細胞をメタノール／アセトンによって固定し、抗ＦＬＡＧ−ＦＩＴＣ抗体（緑）及びＤＡＰＩ（青）で二重標識し、直接免疫法によって分析した。原倍率×４００。
【図８】循環する７７ｋＤａ  ＧＰＢＰのレベルは、グッドパスチャー患者及び免疫複合体型糸球体腎炎の動物モデルにおいて上方調節される。Ａにおいて、イムノアフィニティークロマトグラフィによってグッドパスチャー患者血漿交換から単離された物質を、ＧＰＢＰ特異性抗体の存在下（αＧＰＢＰ）又は非存在下（対照）でのウェスタンブロットによって分析した。Ｂは、組換えＧＰＢＰを用いて示された物質および方法におけるのと同様にして実施したＥＬＩＳＡから得られた標準曲線を表すプロットである。Ｃ及びＤは、同様のＥＬＩＳＡによって測定された任意単位（Ａ．Ｕ．）での蛍光強度（Ｉ．Ｆ．）の散布図である。健常なドナー（対照）、グッドパスチャー患者（ＧＰ）、および示された月齢のＮＺＷマウスから得た血清を１：１０に希釈した。血清の非存在下での蛍光をバックグラウンドと見なし、個々の値から差し引いた。どちらの系においても、Ｐ＜０．００１であった。線分は、各系の平均を表し、円は個々の試料の平均値を表す。Ａ−Ｄにおいて、αＧＰＢＰｒは捕捉抗体であり、αＧＰＢＰａｂは検出抗体であった。
【図９】ｍＡｂ  １４の結合部位は、ＧＰＢＰのＦＦＡＴモチーフに位置する。Ａにおいて、１文字コードで表されているのは、ＧＰＢＰ（残基３１６−３３３）（配列番号８）におけるＦＦＡＴモチーフ及びフランキング領域の一次構造並びにＧＰＢＰΔFFAT（配列番号２９）におけるホモローガスな領域であり、図中、点線はＦＦＡＴモチーフ（枠中）内の欠失残基を示す。Ｂにおいて、示されたタンパク質を発現する細胞抽出物（１０μｇ）を、示された抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【図１０】組換えＧＰＢＰ発現は、サイトゾルにおけるＧＰＢＰポリペプチドの蓄積を誘発する。細胞を示されたプラスミド構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションの一日後に集め、実施例１の物質および方法で示されたように分別に付し、示された抗体を用いて図３Ｃにおけるのと同様にウェスタンブロットによって分析した。矢印及び数字は、異なるＧＰＢＰポリペプチドの位置及びＭｒ（ｋＤａ）を示す。１２０ｋＤａポリペプチドは、主にリソソーム分画において見いだされ、少量でミクロソーム分画において見いだされ、このことは分泌経路において生じた９１ｋＤａの共有結合修飾型であることをさらに示唆する。さらに観察されることとしては、サイトゾル中に存在する９１ｋＤａポリペプチドに対してｍＡｂ  ｅ２６が示す比較的低い反応性（ポリペプチドがサイトゾル又はミクロソーム中に存在する場合、ｍＡｂ  ｅ２６をｍＡｂ  １４反応性と比較する−１５０，０００×ｇ）が挙げられる。
【図１１】細胞外７７ｋＤａ  ＧＰＢＰは、ｍＡｂ  ｅ２６とあまり反応しない。ｐｃ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰでトランスフェクトされた細胞を溶解させ、対応する培地をＦＬＡＧ−免疫沈降に付した。同様の量の細胞抽出物（溶解物）又は免疫沈降物（培地ＩＰ）を、示された抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【図１２】化学的技術を用いて血漿試料から単離されたＧＰＢＰのウェスタンブロット分析。約１．２５ｍＬのヒト血漿から部分的に精製されたＧＰＢＰ（実施例２を参照）を、ＨＲＰ標識ｍＡｂ  Ｎ２７を用いて還元条件下でウェスタンブロットにより分析した。矢印及び数字は、反応性ポリペプチドの位置及び推定Ｍｒを示す。
【図１３】イムノアフィニティークロマトグラフィを用いて対照ドナーの尿から単離されたＧＰＢＰ。２５０ミリリットルの対照ドナーからの尿（あらかじめ遠心分離によって精製し、Ｔｒｉｓで中和）を、２００μｇのウサギポリクローナル抗ＧＰＢＰ抗体と結合させたセファロース４Ｂの１ｍＬカラム上にかけた。カラムを３０ｍＬのＴＢＳで洗浄し、結合物質をＧｅｎｔｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（商標）Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出させた。溶出された物質をＴＢＳに対して透析し、ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体（αＧＰＢＰｃｈ）及びＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ（二次抗体）を用いたウェスタンブロットによってさらに分析した。二次抗体で同じ物質をロードした対照レーンを染色することによって、抗体特異性を確認した（Ｃｏｎｔ）。線分と数字又は矢印と数字は、それぞれ、ＭＷ標準（左）又はＧＰＢＰポリペプチド（右）の位置とサイズ（ｋＤａ）を示す。
【図１４】尿試料中のＧＰＢＰを検出するための間接ＥＬＩＳＡ。尿中で希釈した組換えＧＰＢＰ及び７人のドナー（１−７）からの尿試料をＥＬＩＳＡプレート上に一夜４℃でコーティングした。プレートをＰＢＳ中３％ＢＳＡでブロックし、ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体（αＧＰＢＰｃｈ）及びＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ（二次抗体）を用いて免疫検出を実施した。Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてプレートを発色した。Ａには、示されたＧＰＢＰ濃度対蛍光強度（Ｆ．Ｉ．）（任意単位（Ａ．Ｕ．）で表示）のｌｏｇ−ｌｏｇスケールでの散布図を表す。Ｂには、均等目盛上にプロットされた示された濃度およびそれらの各Ｆ．Ｉ．値を用いて計算した線形回帰線を表し、これを用いてＤでＧＰＢＰ試料濃度を決定した。Ｃには、二次抗体（Ｃｏｎｔ）、非特異的ニワトリＩｇＹ及び二次抗体（ＩｇＹ）、又はαＧＰＢＰｃｈ及び二次抗体（αＧＰＢＰｃｈ）を用いてドナー試料を分析して得られた生データを表す。Ｄにおいて、表は、Ｂで得られた曲線を用いた対応する変換データを示す。
【図１５】尿試料の塩析及びイオン交換クロマトグラフィ。遠心分離によって精製した４００ミリリットルの尿を０．８５ＭのＮａＣｌに一夜４℃で加え、１０．０００×ｇで３０分間４℃にて遠心分離に付した。その後の分析に採用するために、上清の試料（Ｓｐｔ  ０．８５Ｍ  ＮａＣｌ）を４℃で保存した。結果として得られたペレットを５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に溶解させ、同緩衝液に対して透析し、０．７ｍＬのＣＭ樹脂で抽出し、非結合物質を０．５ｍＬのＤＥＡＥ樹脂でさらに抽出した。ＣＭ樹脂を１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で溶出し（ＣＭ、１Ｍ  ＮａＣｌ）、ＤＥＡＥ樹脂を続いて０．３５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）（ＤＥＡＥ、０．３５Ｍ  ＮａＣｌ）及び１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）（ＤＥＡＥ、１Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出した。ＤＥＡＥ抽出の上清（Ｓｐｔ  ＣＭ／ＤＥＡＥ）を有する等量の各試料を、ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体及びＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ（αＧＰＢＰｃｈ）を用いたウェスタンブロットによって分析した。非特異的反応性ポリペプチドを、ＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ（Ｃｏｎｔ）のみを用いて平行分析を染色することによって同定した。線分と数字又は矢印と数字は、それぞれ、ＭＷ標準（左）又は抗ＧＰＢＰ抗体と特異的に反応し、ＳｐｔＣＭ／ＤＥＡＥにおいてのみ検出されたポリペプチド（右）の位置及びサイズ（ｋＤａ）を示す。
【図１６】個々のＮ１−Ｎ２８モノクローナル抗体を用いてＨＥＫ２９３細胞において産生された細胞内及び細胞外ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰのウェスタンブロット分析。上側の合成画像では、組換えＦＬＡＧ−ＧＰＢＰを発現するＨＥＫ２９３細胞からの全タンパク質抽出物１０μｇを、Ｎ１−Ｎ２８抗体（１−２８）を用いたウェスタンブロットに付した。完全長組換えＧＰＢＰポリペプチドを表す約７７ｋＤａの主なポリペプチドと、低Ｍｒ（４５−７７ｋＤａ）の誘導ポリペプチドの変動し得る存在が観察された。下側の合成画像では、同じ抗体を、ＨＥＫ２９３細胞を発現するＦＬＡＧ−ＧＰＢＰの培地から抗ＦＬＡＧ免疫沈降によって精製された細胞外組換えＧＰＢＰ（７７ｋＤａのポリペプチド）に対して分析した（Ｒｅｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８３：３０２４６−５５）。完全長ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰポリペプチドを表す主なポリペプチド約７７ｋＤａが、二次抗体（抗マウスＩｇＧ）と反応し免疫沈降性抗体（マウス抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧ）からの誘導産物であると思われる低Ｍｒの少量の非特異的ポリペプチド（Ｃｏｎｊ）とともに検出された（非図示）。特に別段の記載がない限り、このウェスタンブロット及びその後のウェスタンブロットにおいて、１−２８はＮ１−Ｎ２８であり、抗マウス−ＨＲＰ及び化学発光を発色目的で使用した。
【図１７】Ｎ１−Ｎ２７モノクローナル抗体を用いたＨＥＫ２９３細胞抽出物のウェスタンブロット分析。５０μｇのＨＥＫ２９３細胞抽出物を、示された抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。抗体は、４つの異なるＧＰＢＰ関連ポリペプチド、すなわち７７ｋＤａの標準的ポリペプチド、４５ｋＤａの断片、８８ｋＤａのバンド、及び９１ｋＤａのポリペプチド（ｍＡｂ  ｅ２６によっても標的とされる）を認識した。矢印によって示されるポリペプチドは、二次抗体（抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ標識）によって認識され、したがってＧＰＢＰ産物ではない。８８ｋＤａのポリペプチドの起源は未知であるが、そのＭrは、これが７７ｋＤａの標準的ポリペプチドのリン酸化型であることを示唆する。
【図１８】ＧＰＢＰ欠失変異体のクローニング。Ａにおいて、ＧＰＢＰ（配列番号４）の一次構造に関して、標準的ＰＣＲ及び組換えＤＮＡ手順によって得られた１３の３’末端ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰｃＤＮＡ欠失変異体（１−１３）のＣ末端（折れ曲がった矢印）を示す。Ｂにおいては、欠失変異体７（上側の枠）及び８（下側の枠）のＣ末端領域を含むＧＰＢＰの配列を示す。各レーンにおいて、最後の残基の数字を表示する。Δ１は残基２８５−３０４が欠失したＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ欠失変異体であり、同様にΔ２−Δ４変異体は、それぞれ残基３０５−３２４、３２５−３４４及び３４５−３６４が欠失している（配列番号３０−３３）。太字配列（配列番号８）のペプチドは、ＧＰＢＰと結合するｍＡｂ  １４と有効に競合し、配列Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌを下線の残基の代わりに含むＧＰＢＰ変異体はｍＡｂ  １４と反応しなかった。Ｃにおいて、個々のｐＣＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ１（Δ１）−ｐＣＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ４（Δ４）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のタンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び示された抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。同様の結果が、領域７−８：Ｎ４、Ｎ７、Ｎ９、Ｎ１１、Ｎ１４、Ｎ２５、Ｎ２７、Ｎ２８（Ｎ２２と同様）；及びＮ２、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ１０、Ｎ１２、Ｎ１３（Ｎ８と同様）で表１に含まれる残りの抗体について得られた。Ｎ１６抗体はマッピングしなかった。
【図１９】９１ｋＤ  ＧＰＢＰの配列（配列番号２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で言及される全ての参照文献は、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。本出願内で、特に別段の記載がない限り、利用される技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），およびＡｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などのいくつかの周知の参照文献のいずれかに見いだすことができる。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、数詞を限定しない対象は、文脈で別段の明示の記載がない限り、複数の対象を包含する。本明細書で用いられる「及び」は、別段明示の記載がない限り、「又は」と交換可能に用いられる。
【００２０】
本出願で用いられる場合、「天然のタンパク質」という用語は、任意の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を有する、細胞によって自然に生産されるタンパク質を意味し、非変性タンパク質、又は変性タンパク質（たとえば、実質的に精製され、１以上の変性剤に付されて、たとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけられた、天然に生産されたタンパク質）を包含する。
【００２１】
本出願で用いられる場合、「実質的に精製されたポリペプチド」とは、ポリペプチドが、そのインビボ細胞環境から分離されたことを意味する。単離されたポリペプチドが、ポリアクリルアミド、アガロース、およびクロマトグラフィ試薬などのゲル剤（ｇｅｌ  ａｇｅｎｔ）をも実質的に含まないことがさらに好ましい。
【００２２】
文脈で別段の明示の記載がない限り、本発明の一態様に関して開示された実施形態を、本発明の他の態様および本発明の他の態様でも用いることができ、開示された他の実施形態との組み合わせで用いることができる。
【００２３】
第１の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる９０％又はそれより高い純度の単離されたポリペプチド（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）を提供する。本発明者らは
、ＷＯ２００４／０７００２５において先に提案された９１ｋＤのＧＰＢＰの仮定された配列が正しくないことを見出し、本願で天然の９１ｋＤのタンパク質を単離し、その正しいアミノ酸配列を見出し、これを配列番号２で示す。図１９は、９１ｋＤ  ＧＰＢＰの配列を示し、太字の筆記体で下線付きの形態で、ＮからＣ末端まで、それぞれＡｂ２４、ｍＡｂ  １４及びｍＡｂ  ｅ２６のエピトープを含むアミノ酸残基を示す。標準的７７ｋＤａ  ＧＰＢＰ（配列番号４）の最初の残基（Ｍｅｔ）を、図中では太字かつ枠で囲んで強調している。このように、９１ｋＤａ及び７７ｋＤａのＧＰＢＰは、強調した「Ｍｅｔ」残基からタンパク質の末端までのアミノ酸配列において一致する。以下で示す様に、本発明者らは、ＧＰＢＰのｍＲＮＡが標準的（ＡＵＧ）及び非標準（ＡＣＧ）翻訳開始を受けて、それぞれ７７ｋＤａ及び９１ｋＤａの２つの一次ポリペプチドを生成する有力な証拠を得た。この研究から得られる結果は、両生成物が分泌経路に入ることも裏付ける。しかし、７７ｋＤａが細胞外区画に達し、可溶性免疫沈降性形態で存在するのに対して、９１ｋＤａは、細胞膜と結合して主に不溶性のままであり、細胞膜の外面に到達する可能性が高い。この証拠は、１２０ｋＤａのＧＰＢＰアイソフォームが９１ｋＤａのＧＰＢＰの共有的誘導産物であり（すなわち唯一の違いが翻訳後修飾である）、したがって９１ｋＤａのポリペプチドのアミノ酸配列を共有することを裏付ける。したがって、本明細書において用いられる場合、「９１ｋＤａ  ＧＰＢＰ」という用語は、９１ｋＤａ及びその翻訳後修飾、たとえばこれらに限定されるものではないが、１２０ｋＤａのＧＰＢＰ、並びに９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのＧＰＢＰの凝集体を包含する。本発明は、９１ｋＤａ  ＧＰＢＰが血漿及び尿において可溶性形態で存在することのさらなる証拠を提供し、９１ｋＤａ  ＧＰＢＰが細胞膜から放出され得ることを明らかにする。本発明のこの態様のポリペプチドを、たとえば９１ｋＤａ  ＧＰＢＰに対する抗体を産生するために使用することができ、ＧＰＢＰ活性を妨害する化合物の同定の標的として使用することができ、これによって、グッドパスチャー症候群をはじめとする様々な障害の有用な治療法となる。
【００２４】
したがって、本発明者らのデータは、ｍＲＮＡ選択的翻訳開始は、分泌経路、細胞膜及び細胞外区画を包含する複数の場所へＧＰＢＰを向かわせる方法であるという概念を裏付ける。
【００２５】
本発明のこの態様及び他のポリペプチド態様並びに実施形態において、ポリペプチドを用いて、たとえば、血清又は尿中に存在する天然のＧＰＢＰの異なるアイソフォームを検出するための特異抗体を生成させることができ、これらはしたがって、たとえば自己免疫疾患及び他の障害の診断薬として使用することができる。本発明のポリペプチドは、たとえば、以下でさらに詳細に議論するように、様々な特定種類の天然のＧＰＢＰアイソフォームを阻害するための候補化合物を同定するため、並びにたとえば自己免疫及びタンパク質の誤った折りたたみが関与する障害を治療するための候補化合物を同定するための手段としても用いることができる。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「９０％又はそれより高い純度」とは、夾雑タンパク質が単離されたポリペプチドの１０％以下、様々な好ましい実施形態においては、単離されたポリペプチドの９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０．５％以下を構成することを意味する（たとえば、配列番号２のアミノ酸配列からなる９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％、もしくはそれより高い純度の単離されたポリペプチド）。単離されたポリペプチドがポリアクリルアミド及びアガロースなどのゲル剤も実質的に含まないことがさらに好適である。さらなる好ましい実施形態において、単離されたポリペプチドは、溶液中で、凍結して、または乾燥粉末として存在する。好ましい一実施形態において、この第１の態様の単離されたポリペプチドは、場合によって、これらに限定されるものではないが、蛍光標識又は放射性標識をはじめとする検出可能な非ポリペプチド標識で標識される。
【００２７】
第２の態様において、本発明は、一般式  Ｘ−配列番号２（Ｘは検出可能なポリペプチドである）を有するか、またはこれからなる実質的に精製された組換え型ポリペプチドを提供する。この態様において、９１ｋＤ  ＧＰＢＰ（配列番号２）の正しいアミノ酸配列は、検出可能なポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。本発明のこの態様のポリペプチド、たとえば、９１ｋＤ  ＧＰＢＰを細胞においてトラックするために用いたり、ＧＰＢＰ活性を妨害する化合物を同定するための検出可能な標的として用いたりすることができ、これによってグッドパスチャー症候群はじめとする様々な障害の有用な治療法となる。この態様において用いられる場合、「組換え型ポリペプチド」とは、検出可能なポリペプチドが、ＧＰＢＰ由来でないか、又はＧＰＢＰｍＲＮＡから発現されず、したがってヘテロローガスな検出可能なペプチドを正しい９１ｋＤ  ＧＰＢＰポリペプチドと融合させることを意味する。本明細書において用いられる場合、「検出可能なポリペプチド」は、検出でき、したがって組換え型ポリペプチドの検出を可能にする、任意のヘテロローガスなペプチドである。好ましい一実施形態において、検出可能なポリペプチドは蛍光タンパク質を含む。当該技術分野で公知の任意の蛍光タンパク質を本発明で使用することができる。たとえば、生物発光において刺胞動物のエネルギー伝達アクセプターとして作用する刺胞動物の緑色蛍光タンパク質は、蛍光指示薬における使用に好適な蛍光タンパク質である。緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）は、緑色に発光するタンパク質であり、青色蛍光タンパク質（「ＢＦＰ」）は、青色に発光するタンパク質である。ＧＦＰは、北西太平洋クラゲ（オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ））、ウミシイタケ（レニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、及びフィアリジウム・グレガリウム（Ｐｈｉａｌｉｄｉｕｍ  ｇｒｅｇａｒｉｕｍ）から単離された。Ｗａｒｄ，  Ｗ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，  ３５：８０３  ８０８（１９８２）；及びＬｅｖｉｎｅ，  Ｌ．  Ｄ．，  ｅｔ
ａｌ．，  Ｃｏｍｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ７２Ｂ：７７  ８５（１９８２）を参照。有用な励起及び発光スペクトルを有する様々なオワンクラゲ関連ＧＦＰは、オワンクラゲ由来の天然に存在するＧＦＰのアミノ酸配列を修飾することによって改変されてきた。Ｐｒａｓｈｅｒ，  Ｄ．  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １１１  ：２２９  ２３３（１９９２）；Ｈｅｉｍ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ９１  ：１２５０１  ０４（１９９４）；Ｕ．Ｓ．  Ｓｅｒ．  Ｎｏ．  ０８／３３７，９１５（１９９４年１１月１０日付で出願）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４６９２（１９９５年１１月１０日付で出願）；及びＵ．Ｓ．  Ｓｅｒ．  Ｎｏ．  ０８／７０６，４０８（１９９６年８月３０日付で出願）を参照。ＧＦＰのｃＤＮＡは、多くの他のタンパク質をコードするものと連結させることができ、結果として得られる融合物は、一般的に蛍光性であり、パートナータンパク質の生化学的特性を保有する。Ｃｕｂｉｔｔ，  Ａ．  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２０：４４８  ４５５（１９９５）を参照。突然変異生成の研究によって、シフトした励起または発光波長を有するＧＦＰ変異体が産生された。Ｈｅｉｍ，  Ｒ．  ＆  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ６：１７８  １８２（１９９６）を参照。好適な対、たとえばブルーシフトしたＧＦＰ変異体Ｐ４−３（Ｙ６６Ｈ／Ｙ１４５Ｆ）及び改善された緑色変異体Ｓ６５Ｔは、それぞれ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナー及びアクセプターとしての働きをすることができる。Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．  ３：２４２  ２４５（１９９３）を参照。
【００２８】
この第２の態様の別の好ましい実施形態において、検出可能なポリペプチドは、非ＧＰＢＰエピトープを含み、これに対する抗体は商業的に入手可能であり、たとえば、これらに限定されるものではないが、ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ｍｙｃ（９Ｅ１０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、６−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、及びＨＡ（ヘマグルチニン）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。
【００２９】
本発明の第２の態様の実施形態の全てにおいて、単離されたポリペプチドは、好ましくは検出可能なポリペプチドと配列番号２のポリペプチド間にリンカー配列をさらに含み得る。この実施形態において、リンカーは、ＧＰＢＰの一部でないか、またはＧＰＢＰｍＲＮＡによってコードされない。このようなリンカーは、任意の所望の長さのものであってよく、好ましくは存在するならば１−２０アミノ酸、さらに好ましくは存在するならば１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、又は１−２アミノ酸である。たとえば、検出可能なポリペプチド及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰ配列を最適に配置するため、及び検出可能なポリペプチドの除去を可能にするためにプロテアーゼ認識部位の特異的配列を含めるために、リンカーを用いることができる。本発明の第２の態様の実施形態の全てにおいて、単離されたポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基又は異なる細胞及び細胞外区画へポリペプチドを送達するためのペプチド配列などの、発現に必要な任意の追加の残基をさらに含むことができる。
【００３０】
本発明の実質的に精製されたポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法によって作製することができるが、好ましくは本明細書で提供する教唆に基づいた組換え手段によって作製される。たとえば、本明細書で開示される興味のあるコード領域は、組換え型発現ベクター中にクローンすることができ、次いでこれを用いて、宿主細胞によるタンパク質産生のために宿主細胞をトランスフェクトすることができる。
【００３１】
第３の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）をコードする実質的に精製された核酸を提供する。実質的に精製された核酸配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。本明細書において用いられる場合、「実質的に精製された核酸」は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列においてこれらの通常の周囲の核酸配列から取り出されたものである。このような実質的に精製された核酸配列は、これらに限定されるものではないが、ｐｏｌｙＡ配列、修飾Ｋｏｚａｋ配列、並びにエピトープタグ、排出シグナル、及び分泌シグナル、核局在化シグナル、及び細胞膜局在化シグナルをコードする配列をはじめとする、コードされたタンパク質の発現及び／又は精製を促進するために有用な追加の配列を含んでもよい。好ましい一実施形態において、実質的に精製された核酸コード領域は、配列番号１の核酸、又はそのｍＲＮＡ産物からなる。別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の第二の態様において議論するように、一般式  Ｘ−配列番号２を含むか、またはこれからなる実質的に精製された組換え型ポリペプチドの任意の実施形態のポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸を提供する。
【００３２】
第４の態様において、本発明は、プロモータと機能的に連結された本発明のいずれかの態様の実質的に精製された核酸を含む組換え型発現ベクターを提供する。「組換え型発現ベクター」は、核酸コード領域又は遺伝子と、遺伝子産物の発現を行うことができる任意のプロモータとを機能的に連結するベクターを含む。哺乳動物系において、開示された核酸配列の発現を行うために用いられるプロモータ配列は、構成的（これらに限定されるものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦをはじめとする様々なプロモータのいずれかによって決定される）であっても、又は誘導的（これらに限定されるものではないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド反応性をはじめとする多くの誘導性プロモータのいずれかによって促進される）であってもよい。原核細胞のトランスフェクションに用いられる発現ベクターの構築も当該技術分野において周知であり、したがって、標準的技術によって行うことができる。（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．）、及びＡｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸを参照）。発現ベクターは、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡ中へ組込むことによるかのいずれかで、宿主生物において複製可能でなければならない。好ましい実施形態において、発現ベクターはプラスミドを含む。しかし、本発明は、ウイルスベクターなどの等しい機能を果たす他の発現ベクターを含むことが意図される。
【００３３】
第５の態様において、本発明は、本明細書で開示された組換え型発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供し、この場合、宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。細胞は一時的又は安定してトランスフェクトすることができる。このような発現ベクターの原核生物及び真核生物細胞中へのトランスフェクションは、これらに限定されるものではないが、標準的細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、又はリポソーム介在性、ＤＥＡＥデキストラン介在性、ポリカチオン介在性若しくはウイルス介在性トランスフェクションをはじめとする当該技術分野で公知の任意の技術によって行うことができる。（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照。
【００３４】
第６の態様において、本発明は、配列番号２（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）又は配列番号４（７７ｋＤ  ＧＰＢＰ）のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを提供し、この場合、配列番号２又は配列番号４のポリペプチドは、３０５−３４４番目のアミノ酸残基ＧＧＰＤＹＥＥＧＰＮＳＬＩＮＥＥＥＦＦＤＡＶＥＡＡＬＤＲＱＤＫＩＥＥＱＳＱＳＥＫ（配列番号１０）（番号付けは７７ｋＤ  ＧＰＢＰ内の位置に基づく）に直接的及び／又は間接的に関与する１以上の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を有する。以下の実施例で開示するように、本発明者らは、天然の７７ｋＤ及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰの第１の精製法を提供し、７７ｋＤ及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰの組換え型と結合する既存のモノクローナル抗体は、精製された天然物とは結合しないことを確認し、７７ｋＤ  ＧＰＢＰの組換え型と天然型間及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰの組換え型と天然型間に存在する構造的な違いを検証した。本発明のこの態様のポリペプチドを、例えば天然のＧＰＢＰ型に対する抗体を産生するために使用することができ、また天然のＧＰＢＰ活性を妨害する化合物を同定するための標的として使用することができ、これによってグッドパスチャー症候群をはじめとする様々な障害の有用な治療法となる。好ましい一実施形態において、１以上のＰＴＭは、共有結合ＰＴＭを含む。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、３０５−３４４番目のアミノ酸（配列番号１０）内に共有結合ＰＴＭを含む。好ましい一実施形態において、１以上のＰＴＭは、直接的及び／又は間接的に３２０−３２７番目の残基（ＥＥＦＦＤＡＶＥ、配列番号５）に関与する。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、３２０−３２７番目の残基（ＥＥＦＦＤＡＶＥ、配列番号５）内に共有結合ＰＴＭを含む（番号付けは７７ｋＤ  ＧＰＢＰ内の位置に基づく）。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、残基３２０、３２１、及び／又は３２７において存在するもう１つのＰＴＭを含み、最も好ましくはこれらの残基で存在する１以上のＰＴＭは、共有結合ＰＴＭを含む。この態様の実施形態のいずれかのさらなる好ましい実施形態において、実質的に精製されたポリペプチドは、配列番号２（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）又は配列番号４（７７ｋＤ  ＧＰＢＰ）からなるアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「翻訳後修飾」（ＰＴＭ）という用語は、タンパク質の翻訳後のタンパク質の構造における修飾を意味する。好ましい一実施形態において、ＰＴＭ
は、これらに限定されるものではないが、カルボキシル化、メチル化、シトルリン化、リン酸化、グリコシル化、及び非定型イソアスパルチルの形成をはじめとする官能基の付加を含む。別の好ましい実施形態において、ＰＴＭは異性化を含み、構造変化に至る。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、「直接的に」とは、ＰＴＭが特定の残基内で起こることを意味し、一方、「間接的に」とは、ＰＴＭが特定の残基の外側で起こるが、前記残基内の構造変化をもたらすことを意味する。
【００３７】
本開示の教唆に基づいた、配列番号２又は配列番号４の共有結合的に修飾されたポリペプチドを作製するのに好適な任意の方法、たとえば本明細書で開示されるＧＰＢＰの天然源からの単離、及びＧＰＢＰの組換え産生とそれに続くアミノ酸残基の関連領域内の好適な共有結合修飾（当業者に公知の標準的方法使用）を用いることができる。
【００３８】
第７の態様において、本発明は、配列番号２（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）又は配列番号４（７７ｋＤ  ＧＰＢＰ）のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを提供し、この場合、配列番号２又は配列番号４のポリペプチドは、３７１−３９６番目の残基ＰＹＳＲＳＳＳＭＳＳＩＤＬＶＳＡＳＤＤＶＨＲＦＳＳＱ（配列番号９）（番号付けは７７ｋＤ  ＧＰＢＰ内の位置に基づく）を直接的及び／又は間接的に含む１以上のＰＴＭを含む。以下の実施例で開示するように、本発明者らは、天然の７７ｋＤ及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰの第１精製法を提供し、７７ｋＤ及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰの組換え型と結合する既存のモノクローナル抗体は、精製された天然の７７ｋＤ及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰ型と結合しないことを確認し、７７ｋＤ及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰの組換え型と天然型との間に存在する構造の違いを検証した。本発明のこの態様のポリペプチドを、たとえば、天然のＧＰＢＰに対する抗体を産生するために使用することができ、また天然のＧＰＢＰ活性を妨害する化合物を同定するための標的として用いることができ、これらを、グッドパスチャー症候群をはじめとする様々な障害の有用な治療法とする。好ましい一実施形態において、１以上のＰＴＭは、共有結合ＰＴＭを含む。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、アミノ酸３７１−３９６（配列番号９）内に共有結合ＰＴＭを含む。好ましい一実施形態において、１以上のＰＴＭは、直接的又は間接的に３８８−３９２番目の残基（ＤＤＶＨＲ、配列番号６）を有する。別の好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは、残基３８８−３９２（配列番号６）内に１以上の共有結合ＰＴＭを含む。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、直接的又は間接的に３２０−３２７番目の残基（ＥＥＦＦＤＡＶＥ、配列番号５）を有する１以上のＰＴＭをさらに含む。さらなる好ましい実施形態において、残基３２０−３２７内の１以上のＰＴＭは、共有結合ＰＴＭである。この態様の様々な好ましい実施形態において、実質的に精製されたポリペプチドは、配列番号２（９１ｋＤ  ＧＰＢＰ）又は配列番号４（７７ｋＤ  ＧＰＢＰ）からなるアミノ酸配列を有する。配列番号２又は配列番号４の共有結合的に修飾されたポリペプチドを作製するための任意の好適な方法、例えば本明細書で開示されるＧＰＢＰの天然源からの単離、及びＧＰＢＰの組換え産生とそれに続くアミノ酸残基の関連領域内の好適な共有結合修飾（当業者に公知の標準的方法を使用）を用いることができる。
【００３９】
第８の態様において、本発明は、本発明の第６または第７の態様の実質的に精製されたポリペプチドと選択的に結合する実質的に精製されたモノクローナル抗体を提供する。先に開示したように、本発明者らは、実質的に精製された場合に既存のＧＰＢＰ特異性モノクローナル抗体と結合しない天然の７７ｋＤａ及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰ種をはじめて単離した。たとえば、既存のモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡにおいて血漿又は尿試料中のＧＰＢＰを検出せず、血漿又は尿ＧＰＢＰの精製に使用することもできない。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、たとえば、尿又は血漿中のＧＰＢＰ検出のためのＥＬＩＳＡに基づく分析及び血漿又は血清からのＧＰＢＰの精製に有用である。本発明者らは、本明細書において、これらの天然の７７ｋＤ  ＧＰＢＰ及び天然の９１ｋＤ  ＧＰＢＰ
種が翻訳後修飾され、これらのＰＴＭの少なくとも一部は、実質的に精製された天然のＧＰＢＰを既存のモノクローナルＧＰＢＰ抗体に対して非反応性にすることをさらに証明する。本発明のこの態様のモノクローナル抗体の例を以下の実施例に記載する。
【００４０】
本発明の「モノクローナル抗体」は、これらに限定されるものではないが、標準的モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル、キメラモノクローナル、及びこれらの断片をはじめとする任意の種類のモノクローナル抗体であり得る。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「実質的に精製された」とは、記載されたモノクローナル抗体が、実質的に精製された試料中、抗体の少なくとも８０％を構成することを意味し、さらに好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上を構成することを意味する。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「選択的に結合する」とは、当業者には十分に理解されるように、１以上の他の生体分子、構造、細胞、組織などではなく、天然のＧＰＢＰエピトープに対してＧＰＢＰモノクローナル抗体を優先的に結合させることを意味する。
【００４３】
モノクローナル抗体は、脾臓細胞を動物から得ることによって産生することができる［Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５）を参照］。一例を挙げれば、興味のあるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウスを天然の７７ｋＤ  ＧＰＢＰ、天然の９１ｋＤのＧＢＰＢ、又はその抗原断片（これらに限定されるものではないが、ＰＴＭ含有ペプチドＥＥＦＦＤＡＶＥ（配列番号５）、ＤＤＶＨＲ（配列番号６）、ＬＩＮＥＥＥＦＦＤＡＶＥＡＡＬＤＲＱ（配列番号８）、ＰＹＳＲＳＳＳＭＳＳＩＤＬＶＳＡＳＤＤＶＨＲＦＳＳＱ（配列番号９）、及びＧＧＰＤＹＥＥＧＰＮＳＬＩＮＥＥＥＦＦＤＡＶＥＡＡＬＤＲＱＤＫＩＥＥＱＳＱＳＥＫ（配列番号１０）を有するか、またはこれらからなる１以上のエピトープを包含する）で免疫化することによって調製される。したがって、さらに好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、ＰＴＭ含有ＥＥＦＦＤＡＶＥ（配列番号５）、ＤＤＶＨＲ（配列番号６）、ＬＩＮＥＥＥＦＦＤＡＶＥＡＡＬＤＲＱ（配列番号８）、ＰＹＳＲＳＳＳＭＳＳＩＤＬＶＳＡＳＤＤＶＨＲＦＳＳＱ（配列番号９）、及びＧＧＰＤＹＥＥＧＰＮＳＬＩＮＥＥＥＦＦＤＡＶＥＡＡＬＤＲＱＤＫＩＥＥＱＳＱＳＥＫ（配列番号１０）からなる群から選択される１以上のＰＴＭを含む１以上のエピトープを結合する。さらなる好ましい実施形態において、１以上のＰＴＭは共有結合ＰＴＭである。別の好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、残基３２０、３２１、及び／又は３２７（番号付けは７７ｋＤ  ＧＰＢＰに基づく）において存在する１以上のＰＴＭ（好ましくは、共有結合ＰＴＭ）を有するエピトープと結合する。
【００４４】
一実施形態において、マウスをＩＰ又はＳＣ経路により、免疫反応を引き起こすために十分な量及び間隔で免疫化する。マウスに第０日に初回予防接種をし、約３−約３０週間休ませる。免疫化されたマウスを、静脈内（ＩＶ）経路により１回以上ブースター免疫化する。当該技術分野で公知の標準的手順によって免疫化されたマウスから脾臓を取り出すことによって、抗体陽性マウスからリンパ球を得る。脾臓リンパ球を適切な融合パートナーと、安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下で混合することによって、ハイブリドーマ細胞を生成させる。抗体産生細胞及び融合パートナー細胞をポリエチレングリコール中、約３０％−約５０％の濃度で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で公知の手順により、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを添加したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させることによって選択する。上清液を成長陽性ウェルから集め、固相イムノラジオアッセイ（ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏａｓｓａｙ）などのイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーンする。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ，ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３の軟寒天技術などの技術によってクローニングする。
【００４５】
「ヒト化モノクローナル抗体」とは、マウスモノクローナル抗体などの非ヒトモノクローナル抗体から誘導されるモノクローナル抗体を意味する。あるいは、ヒト化モノクローナル抗体は、親の非ヒトモノクローナル抗体の抗原結合特性を保持するか、または実質的に保持するが、ヒトに投与された場合に親のモノクローナル抗体と比較して減少した免疫原性を示すキメラ抗体から誘導することができる。たとえば、キメラモノクローナル抗体は、ヒト及びネズミ抗体断片、一般的にヒト定常及びマウス可変領域を含み得る。ヒト化モノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、（１）非ヒトモノクローナル抗体からの相補性決定領域をヒトフレームワーク及び定常領域上にグラフトすること（「ヒト化」）、及び（２）非ヒトモノクローナル抗体可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面でこれらを「覆う」こと（「被覆（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」）をはじめとする当該技術分野で公知の様々な方法を用いて調製することができる。これらの方法は、たとえば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７（１９９４）；及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１）で開示されている。
【００４６】
モノクローナル抗体を、従来技術を用いて断片化することができ、断片を全抗体についてと同じ方法で有用性についてスクリーンすることができる。たとえば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成させることができる。結果として得られるＦ（ａｂ’）２断片を処理して、ジスルフィドブリッジを還元してＦａｂ’断片を生成させることができる。Ｆａｂ断片は、ＩｇＧ抗体をパパインで処理することによって得ることができ、Ｆ（ａｂ’）断片は、ＩｇＧ抗体のペプシン消化を用いて得ることができる。Ｆ（ａｂ’）断片は、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合によって結合させることによっても生成させることができる。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体断片である。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片をジチオトレイトールなどの還元剤で処理することによって得ることができる。抗体断片ペプチドは、組換え細胞でのかかるペプチドをコードする核酸の発現によって生成させることもできる（たとえば、Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４：１２３−３８（１９９５）を参照）。たとえば、Ｆ（ａｂ’）２断片の一部分をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列と、それに続く翻訳終止コドンを含んで、このような切断された抗体断片分子を得ることができる。
【００４７】
モノクローナル抗体断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片（本質的にＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ  Ｉドメインからなる一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２及びＦ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）本質的にＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）本質的に抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）本質的にＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）１以上の単離されたＣＤＲ又は機能的パラトープが挙げられる。
【００４８】
抗体反応を生じさせるために、免疫原を典型的には非経口投与用の薬剤的に許容される担体と配合する。このような許容されるアジュバントとしては、これらに限定されるものではないが、フロインド完全、フロインド不完全、ミョウバン沈殿物（ａｌｕｍ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒｖｕｍ）及びｔＲＮＡを含む油中水エマルジョンが挙げられる。ポリペプチドの濃度並びにビヒクル及び他の成分の選択をはじめとする、かかる組成物の処方は、当該分野の技術範囲内である。
【００４９】
第９の態様において、本発明は、配列番号２のポリペプチドと特異的に結合するが、配列番号４のポリペプチドとは結合しない実質的に精製されたモノクローナル抗体を提供する。本発明のこのようなモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、尿又は血漿中のＧＰＢＰ検出のためのＥＬＩＳＡに基づく分析をはじめとする分析において、９１ｋＤ  ＧＰＢＰを７７ｋＤ  ＧＰＢＰと識別するのに有用である。このようなモノクローナル抗体は、前記開示の方法を用い、配列番号２のポリペプチドにおいて存在するが配列番号４においては存在しないペプチド免疫源を使用して生成させることができる。このような免疫原は、抗体反応を生じさせるために好適な任意の長さを有するものであってよい。一実施形態例において、モノクローナル抗体を、ＤＧＷＫＧＲＬＰＳＰＬＶＬＬＰＲＳＡＲＣ（配列番号７）を有するか、またはこれからなる免疫源に対して生成させる。このように、この実施形態において、モノクローナル抗体は、アミノ酸配列ＤＧＷＫＧＲＬＰＳＰＬＶＬＬＰＲＳＡＲＣ（配列番号７）内のエピトープと結合する。かかる抗体Ａｂ２４の例を以下で開示する。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、本発明の第８又は第９の態様のモノクローナル抗体を発現する単離されたハイブリドーマ細胞を提供する。
本発明は、前述および以下で開示するような、本発明の抗体を作製する方法も提供する。
【００５１】
第１０の態様において、本発明は、循環するグッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）を検出する方法であって、
（ａ）血漿試料を、ＧＰＢＰと結合するＧＰＢＰ結合分子と、ＧＰＢＰ結合分子のＧＰＢＰに対する選択的結合を促進する条件下で接触させること、
（ｂ）非結合ＧＰＢＰ結合分子を除去すること、および
（ｃ）ＧＰＢＰ結合分子と血漿試料中のＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること、を含む方法を提供する。
【００５２】
「血漿試料」とは、血漿、つまり血液の液体成分を意味し、たとえば、全血を遠心分離して血液細胞を除去することによって調製される。本明細書において用いられる場合、血漿試料は、血液凝固因子が除去された血清試料も含む。
【００５３】
第１１の態様において、本発明は、尿グッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）を検出する方法であって、
（ａ）尿試料を、ＧＰＢＰと結合するＧＰＢＰ結合分子と、ＧＰＢＰ結合分子のＧＰＢＰに対する選択的結合を促進する条件下で接触させること、
（ｂ）非結合ＧＰＢＰ結合分子を除去すること、および
（ｃ）尿試料におけるＧＰＢＰ結合分子とＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること、を含む方法を提供する。
【００５４】
尿試料は容易に得られ、尿中の検体測定は、当該技術分野で周知である。
「ＧＰＢＰ結合分子」は、１以上の他の生体分子、構造、細胞、組織等ではなく、ＧＰ
ＢＰと選択的に結合するペプチド又は核酸分子である。かかるＧＰＢＰ結合分子の実施形態例としては、これらに限定されるものではないが、抗体、アプタマー、又は基質が挙げられる。本明細書において用いられる場合、「ＧＰＢＰ基質」は、ＧＰＢＰ、又はＧＰＢＰ結合活性を保持するその断片と結合するＧＰＢＰ生物活性の標的である。かかるＧＰＢＰ基質としては、これらに限定されるものではないが、Ｉ−２０（配列番号１６）、ＧＰＢＰ相互作用タンパク質（ＧＩＰ）（配列番号１７−２１）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびその誘導体（配列番号２２−２５）、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）（配列番号２６）、ＩＶ型コラーゲンα３鎖ＮＣ１ドメイン（α３（ＩＶ）ＮＣ１）（配列番号２７）、及びアルツハイマー病ベータペプチド（Ａβ１−4２）（配列番号２８）が
挙げられる。これらの基質のＧＰＢＰ結合を証明する文献例は、米国特許第６，５７９，９６９号、第７，１４７，８５５号、及び第７，３２６，７６８号（その全体が本明細書において参照することによって組み込まれる）において見いだすことができる。
【００５５】
下記実施例で開示されるように、本発明者らは、１６０ｋＤ、９１ｋＤ、７７ｋＤ、７０ｋＤ、６６ｋＤ、６０ｋＤ、５８ｋＤ、５６ｋＤ、５３ｋＤ、５０ｋＤ、４６ｋＤ、３５ｋＤ及び３４ｋＤのＧＰＢＰアイソフォームをはじめとするＧＰＢＰの循環型および尿型、並びにその様々な凝集体を見いだした。したがって、第１０及び第１１の態様において、「ＧＰＢＰ」という用語は、これらに限定されるものではないが、７７ｋＤ  ＧＰＢＰ及び９１ｋＤ  ＧＰＢＰ、並びに１６０ｋＤ、６０ｋＤ、５８ｋＤ、５６ｋＤ、５３ｋＤ、５０ｋＤ、４６ｋＤ、３５ｋＤ及び３４ｋＤの低分子量及び高分子量ＧＰＢＰアイソフォーム、並びにその凝集体をはじめとする、ＧＰＢＰ選択的抗体と反応する全てのＧＰＢＰアイソフォームを意味する。
【００５６】
「血漿試料」又は「尿試料」は、任意の好適な対象、好ましくは、これらに限定されるものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、又は家畜（ウシ、ヒツジなど）をはじめとする哺乳動物から得ることができる。最も好ましい実施形態において、血漿試料又は尿試料は、これらに限定されるものではないが、グッドパスチャー症候群及び／又は免疫複合体型糸球体腎炎をはじめとする自己免疫疾患を有することが疑われるヒト対象などのヒト対象から得られる。本明細書で開示されるように、本発明者らはヒト血漿から天然の循環する７７ｋＤ  ＧＰＢＰを単離し、グッドパスチャー患者及び免疫複合体型糸球体腎炎の動物モデルにおいて増大したレベルを観察し、ＧＰＢＰ分泌がインビボで起こることを証明し、ＧＰＢＰの血清学的及び尿測定の臨床的有用性を明らかにした。
【００５７】
抗体は、前記のようなポリクローナル、モノクローナル、又はヒト化モノクローナルに関係なく任意の選択的ＧＰＢＰ抗体であり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。一実施形態において、本発明の第８又は第９の態様の抗体を用いる。本発明の第１０及び第１１の態様の方法は、７７ｋＤ  ＧＰＢＰ又は９１ｋＤ  ＧＰＢＰなどの特異的ＧＰＢＰアイソフォームの分析を含み得、これらの実施形態において、これらに限定されるものではないが、本明細書で開示される選択的抗体をはじめとする、７７ｋＤ  ＧＰＢＰに関して選択的であるか、又は９１ｋＤ  ＧＰＢＰに関して選択的である抗体を使用できる。最も好ましい実施形態において、本発明の第１０及び第１１の態様の方法において用いられる抗体は、本明細書で開示されるものなどの天然のＧＰＢＰアイソフォームと結合するものである。
【００５８】
抗体、アプタマー又は基質などのＧＰＢＰ結合分子の、血漿又は尿試料中のＧＰＢＰに対する結合を促進するために適した条件は、本明細書における教唆及び下記実施例に基づいて当業者が決定できる。例えば、抗体−抗原結合は、多くの場合、疎水性相互作用に依存し（いわゆる疎水結合）、したがってモル範囲などの高い塩濃度を用いて、非特異結合を還元し、特異的抗原−抗体結合を増大させることができる。場合によって、これらに限定されるものではないが、非結合又は緩く結合した血清タンパク質、高濃度血清タンパク
質の結合を還元するための非特異結合の阻害剤、ＧＰＢＰアイソフォームを含むことが知られている対照試料及び／又はＧＰＢＰアイソフォームと結合しないことが知られている負の対照を除去するための１以上の洗浄ステップ、及び／又はＧＰＢＰを有しない（例えばＧＰＢＰが欠失している）ことが知られている血清又は尿試料の包含をはじめとするさらなるステップを含めて、選択性及び特異性を増進してもよい。
【００５９】
本発明のこれらの第１０及び第１１の態様を用いて、これらに限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、及びクロマトグラフィ（例えば側方流動分析であり、この分析では、抗体を表面上に固定し、血漿又は尿タンパク質を標識し、血漿又は尿中のＧＰＢＰに対する抗体の結合を可能にするために適した条件下で表面上を流動させる）をはじめとする標準的技術によって、血漿又は尿試料中のＧＰＢＰの存在について試験するのに使用することができる。一実施形態において、フローサイトメトリーとあわせて機能性ビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、この技術は、生体液又は細胞／組織抽出物中のタンパク質のレベルを測定するための新たな方法である。特に、蛍光マトリックスで作られたビーズを１以上の特異的ＧＰＢＰ抗体でコーティングし、血漿試料と混合し、フィコエリトリンで標識された検出抗体とともにさらにインキュベートする。最後に、ビーズをフローサイトメトリープログラムによって分析し、このプログラムは、マトリックス蛍光発光及びフィコエリトリン発光による検体のレベルの測定値にしたがってビーズを選択する。３０までの異なる種類のビーズを同時に検出することができ、血球計算器によって判別することができる。この方法は、ＧＰＢＰ抗体でコーティングされた特異的ビーズ種を他の検体の結合ペプチド（すなわち、自己抗体）でコーティングされた別のビーズ種と混合でき、同時に測定できるので、高感度及び性能と多様性とを兼ね備える。様々な検体の測定は、ＧＰＢＰ測定の可能性を向上させることができる。一実施形態において、この技術は、（１または複数の）ＧＰＢＰアイソフォームの存在又は非存在のみを決定し得る。あるいは、この技術は定量的であってよく、試料中の興味のあるタンパク質又はペプチドの相対量についての情報を提供する。定量的目的に関しては、ＥＬＩＳＡが好ましい。
【００６０】
免疫複合体形成の検出は、標準的検出技術によって行うことができる。たとえば、免疫複合体の検出は、標識された抗体又は二次抗体を使用することによって行うことができる。標識の選択を包含するこのような方法は、当業者に公知である。（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、上記を参照）。あるいは、抗体を検出可能な物質と結合させることができる。「結合した」という用語は、検出可能な物質が抗体と物理的に結合していることを意味するために用いられる。好適な検出可能な物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド又はフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の一例としては、ルミノールが挙げられる。好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが挙げられる。
【００６１】
前述のように、本発明者らは、グッドパスチャー患者及び免疫複合体型糸球体腎炎の動物モデルにおいて増大したレベルを観察し、ＧＰＢＰ分泌がインビボで起こることを証明し、ＧＰＢＰの血清学的測定の臨床的有用性を明らかにした。従って、本発明のこの態様の方法は、たとえば、これらに限定されるものではないが、抗体介在性障害（これらに限定されるものではないが、ＩｇＡネフロパシー、全身性紅斑性狼瘡及びグッドパスチャー疾患からなる群から選択される糸球体腎炎を包含する）、炎症、及びＥＲストレス介在性障害、並びに薬剤耐性癌をはじめとする、対照におけるＧＰＢＰ介在性障害を検出するた
めに用いることができる。これらの実施形態において、方法は、試験血清又は尿試料中で検出されるＧＰＢＰレベルを対照、例えば「正常」レベルのＧＰＢＰを有することが知られている血清若しくは尿試料からの対照、又は血清を得た対象からの血清若しくは尿中のＧＰＢＰについてあらかじめ測定された正常値と比較することを含む。様々な実施形態において、対照によって、組換えＧＰＢＰ又は基準値を用いて標準曲線が得られる。血清又は尿試料中のＧＰＢＰの量の対照との比較において、対象に対して血清又は尿試料中のＧＰＢＰにおける増加（好ましくは、標準的統計分析技術を用いた統計的に有意な増加）は、１以上の前記障害の存在、又は１以上の障害の発症の危険性の増大を示し、これらは全て増大したＧＰＢＰ発現と相関する。
【００６２】
増大したＧＰＢＰ発現がＩｇＡネフロパシー、免疫複合体関連糸球体腎炎を誘発すること、増大したＧＰＢＰ発現がグッドパスチャー症候群発症と密接に関連すること、及び増大したＧＰＢＰ発現が、タンパク質の間違った折りたたみを誘発し、ＥＲストレス介在性細胞死を誘発する化学療法剤に対する癌細胞の耐性に関与することが先に開示されている。本発明の方法は従って、ＧＰＢＰの存在に関する血清学的又は尿試験によってこれらの障害を診断する方法を提供する。従って、この方法は、１以上の抗体介在性障害（これらに限定されるものではないが、ＩｇＡネフロパシー、全身性紅斑性狼瘡及びグッドパスチャー疾患からなる群から選択される糸球体腎炎を包含する）、炎症、ＥＲストレス介在性障害、及び薬剤耐性癌に罹っているか、罹る危険性があるかのいずれかの個体を特定する。非制限的一実施形態において、当該方法は、化学療法レジメンの開始前又は開始後のいずれかの癌患者を試験するために用いることができ、ＧＰＢＰの増大した血清レベルについて陽性と出た患者は、薬剤耐性腫瘍を有する危険性が増大しているか、または彼らの腫瘍が薬剤耐性を発現し得る危険性が増大し、担当医はこれらを考慮して適切な治療法の選択肢を評価することができる。さらに、このような患者は、薬剤耐性腫瘍を発現する潜在的な危険性をモニタリングするために、ＧＰＢＰの血清又は尿レベルについて定期的試験を受けることができる。同様に、ＩｇＡネフロパシー、全身性紅斑性狼瘡及びグッドパスチャー疾患からなる群から選択される糸球体腎炎を発症する危険性があると考えられるか、又はすでに発症していることが疑われる患者を、ＧＰＢＰの血清又は尿レベルについて試験することができる。さらなる実施形態は、本明細書における教唆に基づいて当業者には明らかになるであろう。
【００６３】
ＧＰＢＰは、循環する分子であり、ＧＢＭ（糸球体基底膜）は糸球体濾過障壁の主成分であり、したがって糸球体におけるＧＰＢＰ蓄積は、局所産生から起こり得るが、ほかの場所で産生された循環するＧＰＢＰの隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）からも起こり得、尿中の増大したＧＰＢＰにも反映され得る。局所的過剰産生は、一次抗体介在性糸球体腎炎の原因となり得、一方、増大した循環レベルは、この病理の二次形態を誘導し得、おそらくは腎移植に際する疾患再発に関与する。従って、別の実施形態において、循環又は尿ＧＰＢＰのレベルの定量化は、一次抗体介在性糸球体腎炎と二次抗体介在性糸球体腎炎の識別、及び腎移植の臨床的モニタリングに有用である。
【００６４】
さらなる実施形態において、ＧＰＢＰ測定を他の検体の分析と組み合わせると、当該方法により前記障害において識別診断又は予後診断を実施することが可能になる。非制限的一例において、本発明者等は一部のＩｇＡネフロパシー患者が抗基底膜自己抗体を産生することを見いだした。これらの循環する自己抗体は、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインを認識する。これらの抗体価の測定は、疾患の進行のモニタリング又は異なるＩｇＡネフロパシー患者の識別又はこれらの患者における予後診断の実施に役立つ可能性がある。抗ｓｓＤＮＡ、抗ヌクレオソーム自己抗体及びＧＰＢＰレベルを測定することにより、全身性紅斑性狼瘡を診断することができるが、一次ＩｇＡネフロパシーと全身性紅斑性狼瘡に続発するＩｇＡネフロパシーとを区別することもできる。様々なさらなる実施形態において、ＩｇＡの糸球体堆積と関連してＤｏｎａｄｉｏ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｄｅ（２００２）
Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４７，７３８−７４８において記載されている原発性疾患の診断に用いられる任意の測定を、二次ＩｇＡネフロパシー患者における識別診断のためのＧＰＢＰ血漿又は尿検出のための本発明の方法と併せて用いることができる。
【００６５】
別の実施形態において、標準曲線の基準としてのＧＰＢＰの正常値は、血漿中では約１ｎｇ／ｍｌ−１０ｎｇ／ｍｌであり、尿中では約０．２ｎｇ／ｍｌ−１．５ｎｇ／ｍｌであり、一方、グッドパスチャー患者は正常値を少なくとも２倍超え、他の実施形態においては、正常値を少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又はそれ以上超える。
【００６６】
第１２の態様において、本発明は、天然のＧＰＢＰアイソフォームを単離する方法であって、
（ａ）血漿試料を硫酸アンモニウム沈殿させること、
（ｂ）硫酸アンモニウム沈殿した血清試料に対してイオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を実施すること、
（ｃ）天然のＧＰＢＰアイソフォームを含むＩＥＣ画分を同定すること、
（ｄ）天然のＧＰＢＰアイソフォームを含むＩＥＣ画分をゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ）すること、および
（ｅ）天然のＧＰＢＰアイソフォームを含むＧＦＣ画分を同定すること、を含む方法を提供する。
【００６７】
好ましい一実施形態において、これらの方法を用いて、たとえば、下記実施例においてさらに詳細に開示されるように、天然の７７ｋＤ  ＧＰＢＰを血漿から実質的に精製することができる。
【００６８】
第１３の態様において、本発明は、天然のＧＰＢＰアイソフォームを単離する方法であって、
（ａ）尿試料を塩析すること、
（ｂ）塩析したタンパク質試料に対してダブルイオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を実施すること、および
（ｃ）天然のＧＰＢＰアイソフォームを含むＩＥＣ画分を同定すること、を含む方法を提供する。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、「ダブルイオン交換クロマトグラフィ」とは、ステップ（ｃ）の前に２回連続して別個のイオン交換クロマトグラフィステップを実施することを意味する。ＩＥＣ技術の実施形態例は当該技術分野において周知であり、以下の実施例で開示されるものを包含する。
【００７０】
好ましい実施形態において、これらの方法を用いて、下記実施例でさらに詳細に開示される様に、天然の９１ｋＤ  ＧＰＢＰを尿から実質的に精製することができる。
第１４の態様において、本発明は、天然のＧＰＢＰアイソフォームを単離する方法であって、
（ａ）血漿試料又は尿試料を、天然のＧＰＢＰと選択的に結合するＧＰＢＰ結合分子を含むアフィニティーカラムに通すこと、
（ｂ）血漿又は尿試料からの非結合タンパク質をアフィニティーカラムから洗い流すこと、および
（ｃ）カラムから天然のＧＰＢＰアイソフォームを溶出させること、を含む方法を提供する。
【００７１】
好ましい実施形態において、これらの方法を用いて、以下の実施例でさらに詳細に開示されるように、例えば血漿及び尿からの天然の７７ｋＤ  ＧＰＢＰ及び天然の９１ｋＤ  
ＧＰＢＰを実質的に精製することができる。別の好ましい実施形態において、ＧＰＢＰ結合分子はＧＰＢＰ抗体を含む。別の好ましい実施形態において、抗体は本発明の新規モノクローナル抗体を含む。別の好ましい実施形態において、溶出ステップは変性溶出緩衝液の使用を含む。
【００７２】
本発明の第１２、第１３、および第１４の態様の精製法の詳細を下記実施例で記載する。
【実施例１】
【００７３】
概要
グッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）は、基底膜のＩＶ型コラーゲンの非従来型Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼである。最近になって、本発明者等は、ＧＰＢＰが、過剰発現された場合にＩＶ型コラーゲン崩壊及び糸球体基底膜における免疫複合体の堆積を誘発する細胞外タンパク質であることを示した（参考文献４）。本明細書では、本発明者らは、標準的（７７ｋＤａ）及び非標準（９１ｋＤａ）ｍＲＮＡ翻訳開始によって少なくとも２つのＧＰＢＰアイソフォームを細胞が発現したことを示す。７７ｋＤａのポリペプチドは、ＩＶ型コラーゲンと相互作用し、可溶性形態として細胞外区画において局在した。９１ｋＤａ及び誘導された１２０ｋＤａポリペプチドは、細胞膜と結合し、細胞外区画において７７ｋＤａのポリペプチドのレベルを調節した。ＦＦＡＴモチーフ及び２６−残基Ｓｅｒリッチな領域は、７７ｋＤａポリペプチドの排出に必要であった。次に２６−残基Ｓｅｒリッチな領域を除去すると、先に認識されたＧＰＢＰアイソフォーム（ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴ）が得られ、これはサイトゾルであり、ＧＰＢＰとは対照的にスフィンゴミエリナーゼ細胞処理に対して感受性であった。これらのデータ及び先のデータは、ＣＯＬ４Ａ３ＢＰをタンパク質分泌のマルチ区画プログラムに関連付け（すなわち、ＩＶ型コラーゲン）、このプログラムは：１）リン酸化及びタンパク質分子／超分子組織の調節（ＧＰＢＰ）、並びに２）細胞小器官間セラミド輸送及び血漿膜へのタンパク質カーゴ輸送（ｃａｒｇｏ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）の調節（ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴ）を有する。最後に、本発明者らは、ヒト血漿から循環する７７ｋＤａ  ＧＰＢＰを単離し、グッドパスチャー患者及び免疫複合体型糸球体腎炎の動物モデルにおいて増大したレベルを観察し、ＧＰＢＰ分泌がインビボで起こることを証明し、ＧＰＢＰの血清学的測定の臨床的有用性を明らかにした。
【００７４】
序文
グッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）は、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲン性１（ＮＣ１）ドメイン［α３（ＩＶ）ＮＣ１］をリン酸化する（１）。このドメインは、糸球体基底膜（ＧＢＭ）コラーゲンの分子及び超分子組織における中枢構造であり、グッドパスチャー疾患における糸球体腎炎に関与する自己抗体の標的でもある（２）。増大したＧＰＢＰ発現は、グッドパスチャー疾患をはじめとする自己免疫の発症機序に関連し（３）、またＧＢＭコラーゲン崩壊及びＩｇＡ抗体の堆積の誘発と関連する（４）。これらの観察は、ＧＰＢＰがＧＢＭコラーゲン構成を調節し、その発現が異常に上昇する場合にＩＶ型コラーゲンベースの抗体が関与する糸球体腎炎を誘発することを示唆する（３、４）。ＣＯＬ４Ａ３ＢＰは、これらの病的状態では外見上調節されないＧＰＢＰΔ２６（より豊富で活性の低い選択的にスプライスされたＧＰＢＰ変異体であり、２６−残基Ｓｅｒリッチな領域が欠失したもの）もコードする（３）。
【００７５】
ＧＰＢＰは、Ｎ末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｙａａ領域、二分核定位シグナル、コイルドコイルドメイン、酸性トラック中２つのフェニルアラニン（ＦＦＡＴ）モチーフ及びＣ末端ステロイド産生急性調節関連脂質伝達（ＳＴＡＲＴ）ドメインをはじめとする複数の構造要素を含む。さらなる構造特性としては、自己相互作用及びリン酸化のモチーフが挙げられる（１、３、５、６）。ＰＨドメインは、真核生
物においてのみ存在する、様々な十分に保存されていない構造を含み、この構造は、ホスホイノシチドとの相互作用によって細胞膜へのタンパク質ターゲティングに関与することが提案されている（７）。いくつかのタンパク質キナーゼを包含する様々なタンパク質はＰＨドメインを含む（８）。ＦＦＡＴモチーフは、小胞関連膜タンパク質関連タンパク質（ＶＡＰ）の貫膜サイトゾルドメインとの相互作用によってタンパク質をＥＲへと向かわせ（９）、ＶＡＰは小胞体（ＥＲ）におけるタンパク質折りたたみのホメオスタシスの維持及び細胞膜へのタンパク質カーゴ輸送の調節に関与することが提案されている（１０、１１）。ＳＴＡＲＴドメインは、セラミド、リン脂質及びステロールをはじめとする脂質と結合し、異なる生理的及び病理的機能を有する様々なタンパク質において存在するモジュールである（１２、１３）。
【００７６】
最近のレポートは、ＦＦＡＴモチーフ及びＰＨドメインを、それぞれＧＰＢＰポリペプチドのＥＲ及びゴルジ装置に対する結合と関係付けている。これらの細胞小器官に対する結合は、ＳＴＡＲＴドメインがＥＲからセラミドを捕捉し、これをゴルジ装置へ送達することを可能にすると仮定されている。これらの観察に基づいて、ＧＰＢＰポリペプチドは、非小胞サイトゾルセラミド輸送体として記載され、ＣＥＲＴＬ（ＧＰＢＰ）及びＣＥＲＴ（ＧＰＢＰΔ２６）と新たに命名された（５、１４）。しかし、これらの著者の結論は、天然のタンパク質の細胞内分布に関連する正確なデータなしに出され、基底膜に関連したＧＰＢＰの顕著な発現を示す免疫化学的証拠を全く無視している（３）。最近のレポートは、ＣＥＲＴ依存性セラミド輸送が、ホスホリパーゼＡ２αの動員並びにトランスゴルジ網でのタンパク質キナーゼＤの動員及び活性化に重要であり、従って最終的に、プロスタグランジン産生及びタンパク質エクソサイトーシスをそれぞれ調節することを示している（６、１５）。
【００７７】
免疫組織化学的証拠は、ＧＰＢＰが主に細胞外であるが、様々な細胞内部位に局在化する可能性があることを示唆する（３、４）。タンパク質分布は、タンパク質機能に関して非常に情報価値があり、したがって、ＧＰＢＰの生物学的機能を理解するためにさらなる研究が必要であった。本明細書では、本発明者らはＧＰＢＰについてのｍＲＮＡの翻訳が、いくつかのポリペプチドを生成させ、そのうちのいずれもサイトゾルでは有意に発現されなかったことを示す。一方、現在の研究は、ＧＰＢＰが分泌経路に入り、ＩＶ型コラーゲンと相互作用する証拠を提供する。さらに、本発明者らは、２６−残基Ｓｅｒリッチな領域の選択的エクソンスプライシングによる除去は、タンパク質をサイトゾルに局在化させることを示し、ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴがＧＰＢＰの可溶性細胞内型であることを明らかにした。本データは、選択的エクソンスプライシング及び翻訳開始が、ＣＯＬ４Ａ３ＢＰの産物がマルチ区画生物学的プログラムを調整することが期待される異なる場所へこれらを向かわせる方法であることを示唆する。様々な証拠は、後のものが、基底膜コラーゲン構成（ＧＰＢＰ）（１、３、４）並びに細胞膜への小胞タンパク質カーゴ輸送を調節する細胞小器官間セラミド輸送（ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴ）のリン酸化及び調節を包含することを裏付ける（６、１４）。最後に、本発明者らは、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰが、抗体介在性糸球体腎炎（すなわち、グッドパスチャー疾患及び免疫複合体型糸球体腎炎）の臨床的マーカーとして使用できる血清学的成分であることを示す。
【００７８】
物質及び方法
血清試料の処理
マウス及びヒト血液試料を人体研究及び動物実験機関ガイドラインにしたがって得た。本発明者等は、あらかじめ特徴付けし（４）、健康な若年（４ヶ月）及びＩｇＡ免疫複合体関与を受けた老年（７ヶ月）であるニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）マウスから得た血清を使用した。ヒト血漿交換及び対照又はグッドパスチャー患者由来の血清を標準的手順にしたがって得た。
【００７９】
抗体及び組換えタンパク質
切断された組換えＧＰＢＰアイソフォーム及び合成ペプチドを用いて、本発明者らはＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６特異性マウスモノクローナル抗体１４（ｍＡｂ１４）のエピトープ（１）をＦＦＡＴモチーフにマッピングした（図９）。マウスｍＡｂ  ｅ２６はＧＰＢＰに特徴的な２６残基（ＧＰＢＰｐｅｐ１）に対して産生され、したがってＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴと反応しなかった（図１Ａ）。ヒトモノクローナルＦ（ａｂ）２断片を、ＧＰＢＰの選択的に翻訳された領域（ＡＴＲ）である合成ペプチドを用いて組換えＦ（ａｂ）２発現ライブラリから単離した（図２Ｃ）（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓ  ｂｙ  Ｄｅｓｉｇｎ，ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ）。反応性Ｆ（ａｂ）２断片を、ウェスタンブロットおよび予想されるＡＴＲを発現する組換えタンパク質を用いてさらに特徴付けした（非図示）。最も反応性の高いＦ（ａｂ）２断片（Ａｂ  ２４）を用いて天然のＧＰＢＰポリペプチドを特徴付けし、最も反応性の低いＦ（ａｂ）２断片（Ａｂ２０）をこれらの研究において負の対照として使用した。先に報告された（４）免疫精製ニワトリポリクローナルＧＰＢＰ特異性抗体（αＧＰＢＰ）を、フローサイトメトリーにおいて使用するためにビオチニル化するか、又は直接免疫蛍光法のためにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴについて特異的なポリクローナル抗体は、標準的手順にしたがってＧＳＴ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ（１）で免疫化したウサギにおいて（αＧＰＢＰｒ）又は特異的合成ペプチドで免疫化されたニワトリにおいてのいずれかで産生され、Ａｂｃａｍから購入した（αＧＰＢＰａｂ）。αＧＰＢＰｒにおける特異抗体を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＣＮＢｒ（Ｓｉｇｍａ）と結合した組換えＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ（下記参照）を用いてアフィニティー精製した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ検出のために、本発明者らはＥｒｗｉｎ  Ｋｎｅｃｈｔによって提供されたマウスモノクローナル抗体を使用した。カルレギュリン（ｃａｌｒｅｇｕｌｉｎ）、ｐ６５又はカテプシンＤに対して特異的なポリクローナル抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃから得、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）に対して特異的なものはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから得た。ＰｒＰ（クローン３Ｆ４）又はｇｏｌｇｉｎ−９７に対して特異的なモノクローナル抗体は、それぞれＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから得た。ＦＬＡＧを検出するために、本発明者らは、ウェスタンブロット分析に関してはＦＬＡＧ／Ｍ２又はＦＬＡＧ／Ｍ２−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ）および免疫蛍光法（Ａｂｃａｍ）に関してはニワトリ抗体（αＦＬＡＧ）又はヤギ抗体（αＦＬＡＧ−ＦＩＴＣ）を使用した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−ストレプトアビジンはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから得、二次抗体はＰｒｏｍｅｇａ（抗マウス及び抗ウサギＨＲＰ複合体）、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（抗ヒトＦ（ａｂ）2−ＨＲＰ）及びＳｉｇｍａ（抗ニワトリＨＲＰ並びに他のＦＩＴＣ及
びＴＲＩＴＣ複合体）から得た。組換えＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ及びＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ２６を、すでに記載されているようにして、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現させ、アフィニティー精製した（１、３）。
【００８０】
プラスミド構築物
ｐｃ−ｎ４’、ＧＰＢＰｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びコーディング配列を有するｃＤＮＡを発現するｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）誘導構築物の産生が報告されている（１）。ｐｃ−ｎ４’から誘導されるプラスミドは、ｐｃ−ＧＰＢＰ−Ｍｅｔ（５’ＵＴＲが欠失した欠失変異体）、及びｐｃ−ｎ４’−Ｍｍｕｔ（標準的ＡＵＧ（Ｍｅｔ）翻訳開始がＧＧＡ（Ｇｌｙ）で置換された構築物）を含んでいた。ＧＰＢＰのコーディング配列と融合したＦＬＡＧ配列を発現するｐｃ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰの産生は、すでに報告されており（１）、ＦＦＡＴモチーフにおいて欠失を有するｐｃ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔFFAT（図９）を得るために使用された。ｐｃ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ２６は、ＧＰＢＰΔ２６のコード領域と融合したＦＬＡＧ配列を発現し、ｐｃ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰと同様に産生される。ＡＴＲの原因となる開始部位を決定するために、本発明者等は、
ｉＭｅｔ位置の上流のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）における様々な位置で終止コドンを導入することによってｐｃ−ｎ４’及びｐｃ−ｎ４’−Ｍｍｕｔ変異体を産生した。ＧＰＢＰ又はＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６について特異的な低分子干渉ｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の一時的発現のためにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）２．１−Ｕ６  ｈｙｇｒｏ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いた。対応する誘導構築物及びｃＤＮＡ標的配列は：ｐＳｉ−ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６−２、ＡＣＡＧＡＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧ（配列番号１１）；ｐＳｉ−ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６−３、ＧＴＡＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＧＴＧＣＴ（配列番号１２）；ｐＳｉ−ＧＰＢＰ−１、ＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＣＧＣＴＣＴＴＣＣ（配列番号１３）であった。標的配列及びプラスミド構築物の選択は、供給者の勧告に基づいた。ｓｉＲＮＡ発現プラスミドの効率を、細胞組換え発現系において評価した（非図示）。これらの研究における対照プラスミド（ｐＳｉ−対照）は、ヒト細胞において発現されないタンパク質である、緑色蛍光タンパク質のｍＲＮＡを標的とするために設計された。全変異体は、標準的ＰＣＲに基づく突然変異生成によって産生され、クローニングされた全てのｃＤＮＡクローンの忠実性を、ヌクレオチドシークエンシングにより確認した。
【００８１】
細胞培養及びトランスフェクション
ＨＥＫ−２９３又はＨｅＬａ細胞をそれぞれ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清及びペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）／硫酸ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコの修飾イーグル培地またはイーグル最小必須培地を用いて、３７℃、加湿５％ＣＯ2環境中で成長させた。特に記載しない限り、この研究で使
用した細胞はＨＥＫ２９３細胞であった。
【００８２】
ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、供給者の勧告に従って、トランスフェクションを１６−２４時間実施した。免疫蛍光研究のために、細胞を２４穴プレート中、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングされたカバーガラス上に播種した。必要があれば、ＨＥＫ２９３細胞をｐｃ−ｎ４’−Ｍｍｕｔでトランスフェクトし、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１５日間選択した。耐性細胞を制限希釈によってさらにクローニングし、多くの個々のクローンにおける９１ｋＤａ  ＧＰＢＰの発現を細胞抽出物のウェスタンブロット分析によって測定した（下記参照）。上昇したレベル（ｃ８、ｃ１４）又は低下したレベル（ｃ１９）の９１ｋＤａを発現するクローンを機能研究において使用した。
【００８３】
インビトロ転写及び翻訳
本発明者らは、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ
Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、供給者の勧告にしたがって約１μｇのプラスミドのインビトロ転写／翻訳を実施した。タンパク質合成を評価するために、［Ｓ３５］メチオニンを混合物に添加し、標識されたポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びフルオログラフィーによって同定した。手短に言えば、電気泳動後、ゲルを４５％メタノール及び７．５％酢酸で１時間固定した。続いて、ゲルを、ジメチルスルホキシドで３０分間、そしてジメチルスルホキシド中２２．５％の２，５−ジフェニルオキサゾールでさらに３０分間、２回処理した。最後に、ゲルを水で平衡化し、乾燥し、−７０℃に暴露した。
【００８４】
細胞抽出物及び細胞分画
細胞抽出物を得るために、成長培地を氷冷リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）ですすぎ、氷床上、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び１０μｇ／ｍｌのロイペプチンで均質化した。混合物を５００×ｇで１０分間遠心分離
することによって精製し、タンパク質濃度を測定し、−７０℃で保存した。
【００８５】
細胞下分画のために、９０％コンフルエンスの培養物をＰＢＳ中に集め、遠心分離に付した（５００×ｇで１０分間）。細胞ペレットを２５０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．５、１０μｇ／ｍｌのロイペプチンを含む）、１ｍＭのＰＭＳＦ中に分散させ、ガラス製乳棒を用いてＤｏｕｎｃｅ均質化（２０ストローク）で破壊した。細胞ホモジネートを連続遠心分離（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｅｎｔｒｕｆｕｇａｔｉｏｎ）によって徐々に精製して、異なる細胞画分を得た。核及び破壊されていない細胞を５００×ｇで１０分間遠心分離することによって集めた。上清を７，０００×ｇで１０分間遠心分離することによってさらに精製して、ミトコンドリア／リソソーム画分を得た。最後に、上清を１５０，０００で１時間遠心分離することによって精製して、ミクロソーム分画を得、これは細胞膜の断片、すなわち、小胞体、細胞膜及び分泌小胞（ペレット）並びにサイトゾル画分（上清）を有する。全てのステップは０−４℃で実施し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質濃度を測定した。
【００８６】
いくつかの目的で、５００×ｇの上清をリソース−Ｑ  ＦＰＬＣカラムにかけ、結合物質を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中０から１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出させた。細胞ＧＰＢＰの大部分を含む０．５５−０．６ＭのＮａＣｌ画分をエタノールで沈殿させ、ウェスタンブロット分析用の部分的に精製されたＧＰＢＰとして使用した。
【００８７】
エキソビボ架橋、スフィンゴミエリナーゼ処理及びＦＬＡＧ−免疫沈降
エキソビボ架橋に関して、本発明者らは、本質的にすでに記載されているようにして得られた排出可能なヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメイン（ＢＭ４０−ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）ＮＣ１）を発現するＨＥＫ２９３−ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）細胞を使用した（１、１６）。細胞を、１５０ｍｍプレート中（天然のＧＰＢＰ）又は６穴プレート中（組換えＧＰＢＰ）のいずれかで７０−９０％コンフルエンスまで成長させた。トランスフェクションの４８時間後又は細胞が指示されたコンフルエンスに達したら、架橋を行った。手短に言えば、細胞をＰＢＳですすぐことによってＲＴにし、１％ホルムアルデヒドを含む培地とともに１０分間インキュベートした。架橋反応を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１２５ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌで１０分間ＲＴにて急冷した。氷冷ＰＢＳですすぐことによって細胞を４℃にし、処理を４℃で続けた。細胞を、１又は５ｍｌ（６穴又は１５０ｍｍプレート）の抽出緩衝液［１６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１６０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０１％のＳＤＳ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦ］で３０分間溶解させ、５００×ｇで１０分間遠心分離して、細胞片を除去し、そして上清を、５０又は２５０μｌ（６穴又は１５０ｍｍプレート）のＦＬＡＧ−アフィニティーゲルの５０％スラリーで、穏やかに揺らしながら一夜抽出した。ビーズを遠心分離によって集め、１ｍＬの抽出緩衝液で２回、Ｔｒｉｓ緩衝塩溶液（ＴＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１回洗浄した。タンパク質を２５又は１２５μｌ（６穴又は１５０ｍｍプレート）のＦＬＡＧペプチドのＴＢＳ中１００μｇ／ｍｌ溶液でＲＴにて２回溶出させた。溶出した試料を電気泳動試料緩衝液（２Ｘ）とともに１５分間沸騰させて逆架橋させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色又はウェスタンブロットのいずれかによってさらに分析した。
【００８８】
必要があれば、ｐｃ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ又はｐｃ−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ２６でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、すでに記載したようにして（５）セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）スフィンゴミエリナーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理するか、または処理せず、細胞をメタノール／アセトンで固定し、そして直接免疫蛍光法（下記参照）によって分析するか又は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＦ、１
ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦ中で溶解させ、遠心分離（５００×ｇで１０分間）によって精製し、ＦＬＡＧ−免疫沈降に使用した（前記参照）。未処理細胞からの免疫精製物質を分割し、半分を５Ｕ／μｌのλＰＰａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で３０℃にて３０分間、供給者の勧告にしたがって処理した。全試料を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットによってさらに分析した。
【００８９】
いくつかの実験に関しては、細胞を１５０ｍｍプレート中で成長させ、ＦＬＡＧ標識タンパク質をコードするプラスミド構築物２０μｇでトランスフェクトし、さらに２日間新鮮な培地中で培養した。２０ミリリットルの培地を本質的に前述のようにしてＦＬＡＧ−免疫沈降に使用した。
【００９０】
フローサイトメトリー
細胞をやさしく分離し、培地中に分散させた。細胞表面上の非特異性抗体結合部位を、非関連ｍＡｂを含むマウス腹水（ブロッキング溶液）でブロックした。細胞を続いてブロッキング溶液中、阻害ペプチド（ＧＰＢＰｐｅｐ１）若しくは非関連性合成ペプチドを含むか又は含まないビオチニル化αＧＰＢＰの存在下或いは非存在下でインキュベートした。細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−ストレプトアビジンとともにブロッキング溶液中でインキュベートし、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００流動血球計算器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）でさらに分析して、蛍光発光を測定した。未処理の新鮮な細胞を基準として使用し、前方及び側方散乱を測定して、細胞統合性を評価した。全てのインキュベーションはＲＴで１時間であった。
【００９１】
固定細胞を用いた直接及び間接免疫蛍光法
細胞をトランスフェクトし、−２０℃で１０分間冷却されたメタノール−アセトン（１／１）で固定した。続いて、細胞をブロッキング溶液（ＰＢＳ中で１：２に希釈されたウサギ血清）とともに３０分間ＲＴでインキュベートし、一次抗体（ブロッキング溶液中２０μｇ／ｍｌ）とともに２時間３７℃にて加湿チャンバー中でインキュベートし、続いて二次抗体（ブロッキング溶液中１：２００）とともに１時間ＲＴでインキュベートした。細胞をマウント液（ＤＡＫＯ）中ＤＡＰＩ（１．２５μｇ／ｍｌ）で染色し、Ｓｐｏｔカメラ及びソフトウェア・バージョンｖ２．２（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）と組み合わせたＡｘｉｏｓｋｏｐ−２  ｐｌｕｓ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で可視化した。いくつかの実験に関しては、細胞をトランスフェクトし、固定し、αＦＬＡＧ−ＦＩＴＣとともにインキュベートし、前述のように可視化した。非トランスフェクト細胞を負の対照として使用した。
【００９２】
生細胞の直接免疫蛍光法
細胞をガラス底のマイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ）上で培養し、約５０％コンフルエンスに達したら、培地を捨て、１０μｇ／ｍｌのαＧＰＢＰ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と過剰のＧＰＢＰｐｅｐ１又は等モル量の非関連性合成ペプチドを生細胞のミトコンドリア染色のためのローダミン１２３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに含む新鮮な培地と交換した。蛍光の生細胞分析を、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２倒立共焦点顕微鏡を用いて実施した。細胞は全てのステップにおいて３７℃、加湿５％ＣＯ2環境中で維持した。
【００９３】
質量分析法
各タンパク質バンドをクマシーブルー染色されたゲルから切除し、変色させ、ゲル中トリプシン消化（ｉｎ−ｇｅｌ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｄｉｇｅｓｔ）し、遠心分離した。１マイクロリットルの上清を乾燥し、１μｌのマトリックス溶液（ａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、Ｓｉｇｍａ製）中に再懸濁させ、試料プレートに塗布し、乾燥し、質量分析計
中に導入した。トリプシン消化ペプチドをＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析法（４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。集められたデータを、ＧＰＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析し、タンパク質を、検索エンジンＭＡＳＣＯＴ  ｖ２．０（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて識別した。
【００９４】
循環するＧＰＢＰのヒト血漿からの単離
１０ミリリットルのグッドパスチャー患者からの血漿交換を、５ｍｇの共有結合したαＧＰＢＰｒを含むＳｅｐｈａｒｏｓｅ−ＣＮＢｒ（Ｓｉｇｍａ）カラム（１ｍｌ床）にかけた。カラムを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を有する２０ｍｌのＴＢＳで洗浄し、Ｇｅｎｔｌｅ−Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出させた。溶出物をＴＢＳに対して透析し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、αＧＰＢＰａｂを用いたウェスタンブロットによってさらに分析した。
【００９５】
血液中を循環するＧＰＢＰレベルの推定
マイクロタイタープレートの各ウェルを一夜αＧＰＢＰｒ（ＴＢＳ中２μｇ／ｍｌ）でコーティングし、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）とともに２時間さらにインキュベートした。組換えＧＰＢＰ及び血清試料をウシ胎仔血清中で希釈し、２連で２時間インキュベートした。プレートを次に、αＧＰＢＰａｂ（ＴＢＳ中１：５，０００）とともに、そして抗ニワトリＨＲＰ結合（ＴＢＳ中１：２０，０００）とともにそれぞれ１時間インキュベートした。コーティング（４℃）を除くすべてのステップはＲＴであり、ステップごとにウェルをＴＢＳＴでよく洗浄した。最後に、Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（約５６８／５８１ｎｍの励起／発光最大値）を用いてＶｉｃｔｏｒ  ２マイクロタイタープレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出を実施した。標準曲線の直線部分が、０．５−１０ｎｇ／ｍｌの組換えＧＰＢＰで見られた。本発明者らはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を用いて、系統間の違いを評価した。＜０．０５のＰ値を有意と見なした。Ｐｒｉｓｍ４．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を計算に用いた。
【００９６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析−還元条件下で、標準的手順にしたがい、抗体検出のために化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実施した。
【００９７】
結果
ＣＯＬ４Ａ３ＢＰは７７ｋＤａ、９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのポリペプチドをコードする
ＧＰＢＰ及びＧＰＢＰΔ２６を同定するために、本発明者らは２つの異なるモノクローナル抗体、すなわち、ｍＡｂ１４（ＧＰＢＰ及びＧＰＢＰΔ２６を認識することがすでに報告されている（１））、並びにｍＡｂ  ｅ２６（ＧＰＢＰを除く２６−残基Ｓｅｒリッチな領域に対して産生された新規モノクローナル抗体）を使用した（図１Ａ）。ＧＰＢＰ欠失変異体及び合成ペプチドを用いて、本発明者らはｍＡｂ１４エピトープをＦＦＡＴモチーフに位置づけ、したがって、この抗体はＦＦＡＴモチーフが欠失したＧＰＢＰ変異体（ＧＰＢＰΔFFAT）と反応しなかった（図９）。
【００９８】
細胞抽出物のウェスタンブロット分析によって、ｍＡｂ１４が主に約７７ｋＤａの見かけの分子量（Ｍｒ）を有する１つのポリペプチドを認識し（１）、一方、ｍＡｂ  ｅ２６は約９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのＭｒの２つのポリペプチドと反応することが明らかになった（図１Ｂ）。わずかな変動し得る反応性も、ｍＡｂ  ｅ２６を含む約７７ｋＤａ、６０ｋＤａ、５０ｋＤａ及び３２ｋＤａのポリペプチドに対して、及びｍＡｂ１４を含む−９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのポリペプチドに反発して観察された（非図示）。本発明
者らは、同様の反応性分子種を、ＨＥＫ２９３（図１Ｂ）、ヒト線維芽細胞、ＨｅＬａ、ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ及びｈＴＥＲＴ−ＢＪｌ細胞をはじめとする多くの培養したヒト細胞において見いだした（非図示）。
【００９９】
ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ産物をさらに特徴付けするために、本発明者らは、天然のｍＲＮＡ及び組換えｍＲＮＡの発現を比較した（図１Ｃ）。このために、ｐｃ−ｎ４’（ＣＯＬ４Ａ３ＢＰの５’ＵＴＲ及びコーディング配列を有する構築物）（１、１７）を培養細胞における一時的遺伝子発現分析で使用した。ｐｃ−ｎ４’の発現によって、ｍＡｂ  ｅ２６により検出される約７７ｋＤａ、９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａの３つのポリペプチドを得た。対照的に、約７７ｋＤａ及び９１ｋＤａのポリペプチドだけがｍＡｂ１４と顕著に反応した。驚くことに、組換え溶解物において最も顕著なｍＡｂ  ｅ２６反応性ポリペプチド（７７ｋＤａ）（すでに報告されているｍＲＮＡ産物（１））は、重要な天然のカウンターパートを有していなかった。本発明者らは、ｍＡｂ１４が１２０ｋＤａの組換え型ポリペプチドとよりも９１ｋＤａの組換え型ポリペプチドと比較的強力に反応することも観察した。
【０１００】
天然のポリペプチドの起源をさらに究明するために、本発明者らは、ＣＯＬ４Ａ３ＢＰについて特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用した（図１Ｄ）。３つの天然のポリペプチド全ての発現は、これらのｓｉＲＮＡを発現する場合に減少したが、ＧＰＢＰ及びＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴの両方について特異的なｓｉＲＮＡは、７７ｋＤａのポリペプチドの発現を減少させるのにより有効であり、一方、ＧＰＢＰ特異性ｓｉＲＮＡは、９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのポリペプチドの発現をより有効に減少させた（ｐＳｉ−ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６−３及びｐｓｉＧＰＢＰ−１を比較）。まとめると、本発明者らのデータは、ＣＯＬ４Ａ３ＢＰの主な細胞産物は、ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴ（７７ｋＤａ）並びに９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａの従来認識されていないＧＰＢＰアイソフォームを含み、後者は、一貫したｍＡｂ１４結合を防止する修飾ＦＦＡＴモチーフを有する可能性が高いことを示唆していた。ＧＰＢＰ特異性ｓｉＲＮＡｓを用いる場合の７７ｋＤａポリペプチドの細胞レベルにおける減少は、このポリペプチドがｍＡｂ  ｅ２６と有意な反応性を示さないので、さらなる調査を必要とする（図１Ｂ）。
【０１０１】
主な細胞ＧＰＢＰアイソフォームは非標準ｍＲＮＡ翻訳開始から得られる
細胞ＧＰＢＰアイソフォームの起源をさらに明確にするために、本発明者らは、５’ＵＴＲ−欠失又はｉＭｅｔからＧｌｙへの置換からなるｍＲＮＡ変異体を発現する（ｐｃ−ｎ４’）誘導構築物を生成させ（図２Ａ）、これらをタンパク質発現分析で使用した（図２Ｂ）。細胞において、５’ＵＴＲ−欠失ｍＲＮＡである構築物（ｐｃ−ＧＰＢＰ−Ｍｅｔ）は、７７ｋＤａのポリペプチドのみを産生し、ｉＭｅｔからＧｌｙへの置換である構築物（ｐｃ−ｎ４’−Ｍｍｕｔ）は、９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのポリペプチドのみを発現した（図２Ｂ、エキソビボ）。しかし、無細胞翻訳系において、ｐｃ−ＧＰＢＰ−Ｍｅｔは７７ｋＤａ  ＧＰＢＰポリペプチドも発現するが、ｐｃ−ｎ４’Ｍｍｕｔは９１ｋＤａのポリペプチドのみを生成し、１２０ｋＤａのポリペプチドの有意な発現は観察されなかった（図２Ｂ、インビトロ）。これらのデータは、ＧＰＢＰｍＲＮＡが（１つ若しくは複数の）非標準翻訳開始部位を５’ＵＴＲ中に含み、これは９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのポリペプチドをもたらし、一方、７７ｋＤａのポリペプチドは標準翻訳開始の産物であることを示していた。さらに、本発明者らのデータは、９１ｋＤａが非標準翻訳開始の主要生成物であり、１２０ｋＤａのポリペプチドは、細胞膜のない無細胞系において発現できない翻訳後誘導産物であることを示唆していた。
【０１０２】
さらなる非標準翻訳開始を特徴付けするために、すでに認識されている（１）ＧＰＢＰｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおいて存在するＯＲＦ（図２Ｃ）を、ｐｃ−ｎ４’Ｍｍｕｔにおける各位置で終止コドンを導入することによって中断し、細胞タンパク質発現をウェスタ
ンブロットによって分析した（図２Ｄ）。終止コドンを−８３（本来ＡＣＧ、トレオニン）で有する構築物は、９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのポリペプチドを発現しなかったが、終止コドンを−８４（本来ＧＣＧ、アラニン）で有する構築物は２つのポリペプチドを発現し、選択的翻訳開始部位をコドン−８３に位置づけた（図２Ｃにおいて枠で囲ったＴｈｒ）。ｐｃ−ｎ４’の−８３終止変異体を分析した場合に、同じ結論が得られた（図２Ｄ）。
【０１０３】
非標準翻訳開始も９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａの内因性ＧＰＢＰポリペプチドが原因であることを確認するために、予想されるＡＴＲである合成ペプチドと特異的に反応するヒトＦ（ａｂ）2断片（Ａｂ２４）（図２Ｃにおいて網がけした配列）を、部分的に精製さ
れたＧＰＢＰポリペプチドのウェスタンブロット分析に使用した（図２Ｅ）。予想通り、Ａｂ２４は９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａの２つのポリペプチドと特異的に反応し、これらのポリペプチドはｍＡｂ  ｅ２６によっても認識され、このことは、天然のＧＰＢＰポリペプチドが非標準翻訳産物に特徴的なＡＴＲを含んでいることを示唆した。
【０１０４】
９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのＧＰＢＰアイソフォームは不溶性膜結合ポリペプチドである
９１ｋＤａ  ＧＰＢＰアイソフォームは、ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ  ２．０  Ｓｅｒｖｅｒ（１８，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ／）を用いて分析すると、非古典的分泌タンパク質であり、ＰＳＯＲＴ  ＩＩ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｆｏｒｍ２．ｈｔｍｌ）を用いて分析すると、ミトコンドリア（６０．９％）、核（２６．１％）、細胞骨格（８．７％）及び分泌系の小胞（４．３％）中に局在化することが予想された。したがって、これらの理論的考察から、非標準翻訳開始から得られるＧＰＢＰアイソフォームが、分泌経路を包含する細胞小器官中に入る非サイトゾルポリペプチドであることが示唆された。
【０１０５】
これらの予想を評価するために、無傷生細胞をαＧＰＢＰとともにインキュベートし、抗体結合検出のための直接免疫蛍光法及びフローサイトメトリーによって分析した（図３Ａ及び３Ｂ）。興味深いことに、αＧＰＢＰは特異的に生細胞と結合した。その理由は、抗体の結合がＧＰＢＰである合成ペプチド（ＧＰＢＰｐｅｐ１）によって効率的に消失するが、非関連性ポリペプチド（Ｃｏｎｔｐｅｐ）によっては消失しなかったからである。これらのデータは、細胞ＧＰＢＰアイソフォームが細胞膜の外部表面に存在することを示唆する。
【０１０６】
ＧＰＢＰの細胞内分布をさらに特徴付けするために、細胞を破壊し、細胞下分画及びウェスタンブロット分析に付した（図３Ｃ）。予想通り、９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａのＧＰＢＰアイソフォームは可溶性物質として検出されなかったが、ミトコンドリア−リソソーム及びミクロソーム画分と主に結合して見いだされた。核画分におけるＧＰＢＰの存在が、これらのタンパク質又はこの画分を含む非破壊細胞及び／又はミトコンドリアの核発現を実際に反映するかどうかは明らかではない。対照的に、ｍＡｂ１４と反応し、ｍＡｂ
ｅ２６と顕著な反応性を示さない約７７ｋＤａのポリペプチドが、１５０，０００×ｇで１時間試料を遠心分離した後に可溶物として単独で検出された（サイトゾル）。
【０１０７】
これらのデータは、９１ｋＤａ及び１２０ｋＤａの天然のＧＰＢＰポリペプチドは細胞膜と結合して不溶性で発現され、一方、７７ｋＤａの天然のＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴポリペプチドは細胞質において可溶性で発現されることが示唆された。
【０１０８】
７７ｋＤａ  ＧＰＢＰはＩＶ型コラーゲンと相互作用する可溶性細胞外タンパク質である。
従来のレポートは、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰがＩＶ型コラーゲンと相互作用することを示唆した（１、３、４）。このことを、ＢＭ４０−ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）ＮＣ１（ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１の組換え排出可能な形態）（１６）を発現するか、または発現しない細胞のエキソビボ架橋及びＦＬＡＧ−免疫沈降とそれに続く免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってさらに評価した（図４Ａ）。ＦＬＡＧ特異性抗体はＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）ＮＣ１及びＧＰＢＰ又はＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴのいずれかである７７ｋＤａのポリペプチド（２）（ウェスタン）を、タンパク質折りたたみ及びＥＲホメオスタシス維持に関与する２つのＥＲ常在性シャペロンであるＧｒｐ７８及びＧｒｐ９４（クマシー）とともに効率よく沈殿させた（１９、２０）。ＧＰＢＰが実際にＥＲにおいてＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）と相互作用することさらに判定するために、ＢＭ４０−ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）ＮＣ１を発現するか又は発現しない細胞をｐｃ−ｎ４’でトランスフェクトし、同様に分析した（図４Ｂ）。ＦＬＡＧ抗体は、ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）ＮＣ１を発現する細胞から７７ｋＤａ  ＧＰＢＰを効率的に沈殿させたが、対照細胞からは沈殿させず、このことにより、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰアイソフォームが分泌経路中に入り、ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）ＮＣ１と相互作用することが示唆される。
【０１０９】
一次構造分析により、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰポリペプチドの細胞質局在化が予想された（未公表の観察結果）。しかし、インビトロ（１、３）、エキソビボ（図４）及びインビボ（４）研究は、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰアイソフォームがＩＶ型コラーゲンと結合し、リン酸化させることを示唆した。さらに、組換え発現研究により、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰポリペプチドが最も顕著なポリペプチドであることが明らかになったが、有意なレベルの天然のカウンターパートは細胞内で検出されなかった（図１）。まとめると、これらの観察結果は、標準的ＧＰＢＰが、非古典的分泌を受けるサイトゾルポリペプチドであることを示唆した。
【０１１０】
ＧＰＢＰが分泌されるかどうかを調査するために、本発明者らはまずＦＬＡＧ標識ＧＰＢＰをＨｅＬａ細胞において発現させ、ＦＬＡＧ特異性抗体を用いて細胞内組換えタンパク質分布を分析した（図５Ａ）。ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰはカルレギュリン（ＥＲ常在性タンパク質）と広範囲にわたって共存し、このことは、ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴについて記載されるように（２１、２２）、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰがＦＦＡＴ−ＶＡＰ相互作用によってＥＲと結合することを示唆する。したがって、本発明者らは、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔFFAT（ＦＦＡＴモチーフを含まないＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ変異体）を発現し、同様に分析した。ＦＦＡＴモチーフの欠失はＧＰＢＰのＥＲへの分布を防止した。というのも、このタンパク質がｇｏｌｇｉｎ−９７（ゴルジ装置常在性タンパク質）と広範囲にわたって共存することが判明したからである（図５Ａ）。ＨＥＫ２９３細胞において研究を行うと、同じ結論が得られた（非図示）。本発明者らのデータは、組換えＧＰＢＰが、その排出のためにＦＦＡＴモチーフによりＶＡＰと結合したサイトゾルタンパク質であり、ＦＦＡＴ−相互作用が損なわれた場合にのみ、タンパク質はゴルジ装置と結合する可能性を有するという概念と一致した。ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ又はＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔFFATを培養細胞において発現し、免疫沈降及びウェスタンブロット分析によって培地を続いて分析することによって、このことを研究した（図５Ｂ）。興味深いことに、ＦＬＡＧ特異性抗体は、組換えタンパク質を、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰを発現する培地から効率的に免疫沈降させ、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔFFATを発現する細胞の培地からは免疫沈降させず、このことから、ＥＲに対するＦＦＡＴが関与する結合は７７ｋＤａ  ＧＰＢＰ分泌に必須であることが明らかになった。
【０１１１】
ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴは、ＦＦＡＴ依存的方法でＥＲとも結合する（２１、２２）；しかし、本発明者らは、サイトゾルにおいてＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴ及び細胞外区画において７７ｋＤａ  ＧＰＢＰを見いだし、このことは、ＧＰＢＰに限定されるＳｅｒリッチな２６−残基領域もＧＰＢＰ分泌について重要であることを裏付ける。これを同様に
ＦＬＡＧ標識７７ｋＤａ  ＧＰＢＰ又はＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴを発現する培養物において研究した（図５Ｃ）。予想通り、２６−残基Ｓｅｒリッチな領域の存在は、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ２６が培地において顕著に発現されないならば、タンパク質分泌に重要であった。
【０１１２】
９１ｋＤａ  ＧＰＢＰは、細胞外区画における７７ｋＤａ  ＧＰＢＰレベルを調節する
この証拠は、７７ｋＤａ及び９１ｋＤａの両ＧＰＢＰアイソフォームは分泌経路中に入るが、９１ｋＤａが膜と結合したままであるのに対して、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰは細胞外区画中に可溶性であることを裏付ける。本発明者らは、９１ｋＤａ  ＧＰＢＰが７７ｋＤａ  ＧＰＢＰの細胞外レベルを調節するかどうかを研究した。これは、組換え９１ｋＤａ
ＧＰＢＰを異なるレベルに発現する各細胞系におけるＦＬＡＧ−ＧＰＢＰの組換え発現（図６Ａ）とそれに続く対応する培地のＦＬＡＧ−免疫沈降及びウェスタンブロットによる免疫沈降物の分析によって行った（図６Ｂ）。興味深いことに、組換え９１ｋＤａ  ＧＰＢＰの発現の増加は、培地におけるＦＬＡＧ−ＧＰＢＰのレベルの増加と関連し、このことは、９１ｋＤａ  ＧＰＢＰが７７ｋＤａ  ＧＰＢＰの細胞外区画への分泌を誘発したことを示唆する。
【０１１３】
７７ｋＤａ  ＧＰＢＰはスフィンゴミエリナーゼでの細胞処理に対して感受性でない
組換え発現研究によっても、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰは、ＦＦＡＴモチーフが突然変異するとゴルジ装置への転移を受ける、ＥＲと関連したサイトゾルポリペプチドであることが示された（図５Ａ）。したがって、本発明者らは、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰが、ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴについて先に報告されている様に、スフィンゴミエリナーゼ細胞処理に反応して脱リン酸化及びゴルジ装置への転移を受けるかどうかを疑問に思った（５）。これらの研究のために、ＦＬＡＧ標識ＧＰＢＰ又はＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴを発現する細胞をセレウス菌スフィンゴミエリナーゼ（ｂＳＭａｓｅ）で処理し、興味のある細胞内タンパク質をＦＬＡＧ−免疫沈降及びウェスタンブロットによって分析した（図７Ａ）。すでに指摘されているように（１、５）、両組換えタンパク質をリン酸化し、一般的ホスファターゼ（λＰＰａｓｅ）での処理によってそれらのＭｒを同様の程度まで減少させた（上及び下の矢印）。しかし、スフィンゴミエリナーゼ細胞処理は、各組換えタンパク質について異なる結果をもたらし、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴは低Ｍｒまでシフトしたのに対して（上および中央の矢印）、顕著なＭｒシフトはＦＬＡＧ−ＧＰＢＰについては観察されなかった。このことは、スフィンゴミエリナーゼ処理によって引き起こされるスフィンゴミエリンの細胞レベルにおける減少が、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴの脱リン酸化を誘発するが、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰのリン酸化状態に顕著な影響を及ぼさなかったことを示唆する。予想通り、細胞の免疫蛍光法分析によって、スフィンゴミエリナーゼ処理は、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰの細胞内分布を著しく変更することなく、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴのゴルジ装置への転移を促進したことが明らかになった（図７Ｂ）。
【０１１４】
７７ｋＤａ  ＧＰＢＰの血液循環レベルは、グッドパスチャー患者及び免疫複合体型糸球体腎炎の動物モデルにおいて上方調節される
証拠は、インビボの可溶性タンパク質がイムノアフィニティークロマトグラフィによって最初に研究され、血液循環するヒト７７ｋＤａ  ＧＰＢＰが単離された際に、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰが分泌されたことを示唆した（図８Ａ）。標準的治療手段によって、高レベルのＧＰＢＰを発現することが予想されるグッドパスチャー患者から得た血漿交換を使用した（３）。予想通り、本発明者らは、アフィニティーカラムから溶出された物質において１つの７７ｋＤａポリペプチドを同定し、これはＧＰＢＰ特異性抗体と反応し、このことは、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰがインビボで分泌され、ヒト血漿の成分であることを示唆する。アフィニティー精製を実証し、かつ７７ｋＤａ  ＧＰＢＰのレベルをさらに正確な方法で決定するために、本発明者らは、ヒト組換えＧＰＢＰを捕捉し、検出するためにアフ
ィニティークロマトグラフィで用いられた同じ抗体を利用するＥＬＩＳＡを開発した（図８Ｂ）。本発明者らは、このＥＬＩＳＡを使用して、対照及び抗体介在性糸球体腎炎を表す試料における循環する７７ｋＤａ  ＧＰＢＰレベルを推定した（図８Ｃ、Ｄ）。ＥＬＩＳＡは、組換えＧＰＢＰを測定する場合、０．５ｎｇから１０ｎｇ／ｍｌの間で直線範囲を示し（図８Ｂ）、グッドパスチャー患者において対照個体におけるよりも比較的多くの循環する７７ｋＤａ  ＧＰＢＰを検出した（図８Ｃ）。本発明者らは、若年（４ヶ月）及び高齢（７ヶ月）ＮＺＷマウスを比較した場合に、同様の結果を得（図８Ｄ）、ＧＰＢＰ依存性ＩｇＡ免疫複合体型糸球体腎炎を発症し、狼瘡になりやすい自己抗体産生を発現したマウス種では７ヶ月の月齢で始まった（４）。
【０１１５】
考察
ここで、本発明者らは、ＧＰＢＰのｍＲＮＡが標準的（ＡＵＧ）及び非標準（ＡＣＧ）翻訳開始を経て、それぞれ７７ｋＤａ及び９１ｋＤａの２つの主なポリペプチドを生成するという有力な証拠を得た。本研究からの結果はまた、両生成物が分泌経路に入ることを裏付ける。しかし、７７ｋＤａが細胞外区画に達し、可溶性免疫沈降性形態で存在するのに対して、９１ｋＤａおよびその誘導１２０ｋＤａポリペプチドは、細胞膜と結合して、主に不溶性のままであった。ＡＣＧでの翻訳開始及び非標準翻訳開始を使用して、タンパク質を選択的細胞区画へ向かわせることが、他のヒト遺伝子について記載されている（２３、２４）。従来の証拠（２１、２２）に基づいて、ＥＲに対するＦＦＡＴ介在性ＧＰＢＰ結合（図５）はＶＡＰによって起こり、したがってＦＦＡＴ−ＶＡＰ相互作用がＥＲ中へのＧＰＢＰ転移の根底にある分子機構に関与することが予想される。さらに、本発明者らは、すでに報告された、選択的にスプライスされたＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴが、細胞質において主に可溶性のままであるＧＰＢＰ変異体であることも示す。このように、本発明者らのデータは、ｍＲＮＡ選択的翻訳開始及びエクソンスプライシングが、サイトゾル、分泌経路、細胞膜及び細胞外区画をはじめとする複数の位置へＧＰＢＰを向かわせるための方法であるという考えを裏付ける。さらに、先の観察結果では、ＧＰＢＰはヒト精原細胞の核（１）並びにラット肝臓のミトコンドリア及びリソソームで見いだされ（未発表の観察結果）、このことは、ＧＰＢＰの分布が実質的に偏在し、したがって、その生物学的プログラムはいくつかの区画において機能することが予想されることを示唆する。
【０１１６】
肺動脈内皮細胞由来のヒトＧＰＢＰｃＤＮＡが報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＫ０９６８５４）。興味深いことに、ＡＫ０９６８５４は選択的標準翻訳開始部位（ｉＭｅｔ）を有し、これは、９１ｋＤａポリペプチドのＯＲＦを上流に４５残基延長する。本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞においても、肝臓、腎臓、脳、筋肉、膵臓、ケラチノサイト、リンパ球及びＨｅＬａ細胞をはじめとする多くの他のヒト組織においても、ＡＫ０９６８５４ｍＲＮＡ発現についての証拠を見いだせなかった（非図示）。それでも、本明細書で報告される非標準翻訳開始産物と類似したＭｒを有する標準的ｍＲＮＡ翻訳開始によって産生されるＧＰＢＰアイソフォーム（すなわち、ＡＫ０９６８５４）の存在は排除できなかった。
【０１１７】
一次構造分析から、非標準的に翻訳されたＧＰＢＰ産物は分泌経路に入ることが予想される。いくつかの観察結果、すなわち、１）非標準ＧＰＢＰアイソフォームは細胞膜と結合する分子種であること（図３）；２）非標準ＧＰＢＰアイソフォームは細胞における主なＧＰＢＰ種（図１）及び無傷生細胞の外表面と結合したＧＰＢＰ特異性抗体であること（図３）；３）１２０ｋＤａのポリペプチドは、翻訳が細胞膜のない無細胞系で起こる場合に、ｍＲＮＡから発現されないこと（図２）；及び４）９１ｋＤａ  ＧＰＢＰアイソフォームは細胞外区画で７７ｋＤａ  ＧＰＢＰのレベルを調節すること（図６）が、この予想を裏付けている。総合すると、これらの観察結果は、９１ｋＤａのポリペプチドが非標準翻訳開始の主要生成物であるという概念を裏付ける。このアイソフォームは、分泌経路に入り、ここで共有結合修飾を受けて１２０ｋＤａのポリペプチドを産生し、膜に結合し
たままで、細胞膜の外表面に達する。９１ｋＤａ  ＧＰＢＰが７７ｋＤａ  ＧＰＢＰの細胞外レベルを調節する機構はまだわかっていない。
【０１１８】
本発明者らは、発現が異常に高まる場合（すなわち、一時的遺伝子発現）、ＧＰＢＰポリペプチドがサイトゾルにおいて蓄積することを観察し（図１０）、ＥＲ中へのＧＰＢＰ輸送が飽和過程であることが明らかになった。興味深いことに、これらの発現条件下で、ｍＡｂ  ｅ２６は、細胞外区画中にある場合、サイトゾル７７ｋＤａポリペプチドについて、このアイソフォームよりも高い反応性を示した（図１０及び１１）。さらに、ｍＡｂ１４は、天然の９１ｋＤａ  ＧＰＢＰとよりも組換え体と比較的反応し、天然又は組換え１２０ｋＤａ産物と顕著に反応しなかった（図１）。これらの観察結果はすべて、２６−残基Ｓｅｒリッチな領域（ｍＡｂ  ｅ２６）及びＦＦＡＴモチーフ（ｍＡｂ１４）が分泌経路において共有結合修飾を受けることを示唆している。これらのデータは、特定の調節（生理的又は病理学的）状況下で、ＧＰＢＰはサイトゾルにおいて可溶性ポリペプチドとして発現され得ることも意味する。最後に、９１ｋＤａ  ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴが内因的に発現されるかどうか、及びＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴが分泌を受けずにＥＲ中へ輸送され得るかどうかは明らかではない。
【０１１９】
ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴを表すサイトゾル７７ｋＤａポリペプチドの発現レベルは、ＧＰＢＰ特異性ｓｉＲＮＡを発現する細胞において有意に減少した（図１Ｄ）。このことは、ｓｉＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡも標的とするか、またはＧＰＢＰのｍＲＮＡがある程度ＧＰＢＰΔ２６  ｍＲＮＡの前駆体であるかのいずれかであることを示唆する。本発明者らは、組換えＧＰＢＰを発現する細胞が、少量の組換えＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴも発現することを見いだした（未発表の観察結果）。このことにより、成熟ＧＰＢＰｍＲＮＡは、ＥＲストレスシグナルに反応してＸＢＰ１について報告されているのと同様に、非古典的プロセシングに付されることが明らかになる（２５）。あるいは、共有結合的に修飾された２６−残基Ｓｅｒリッチな領域を有するＧＰＢＰ種であってＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴとともに移動するものも、この観察を説明できる。
【０１２０】
いくつかの証拠、すなわち：
１）７７ｋＤａ  ＧＰＢＰは、インビボでリン酸化される部位（１）でα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインと結合し、リン酸化する非従来型Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼであること（２６）；
２）７７ｋＤａ  ＧＰＢＰは細胞外区画において可溶性（図５及び図８）又はＧＢＭコラーゲンと結合し（４）、かつ培養細胞のサイトゾルにおいて有意なレベルで発現されないことが主に判明していること（図１及び３）；
３）細胞ＧＰＢＰアイソフォームは細胞膜の外表面で局在化すること（図３）；
４）９１ｋＤａ  ＧＰＢＰアイソフォームは細胞膜と結合し（図３）、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰアイソフォームの細胞外レベルを調節すること（図６）；
５）α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインは独自の構造的多様化を受け、少なくとも２つの異なる構造アイソフォーム（配座異性体）が基底膜に集まること（２７）；
６）７７ｋＤａ  ＧＰＢＰの発現の増大が、ＩＶ型コラーゲンの四次構造を混乱させ、このことは、上昇したＧＰＢＰレベルがα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの構造多様化プログラム（三次構造）を妨害することを示唆する（４）；
７）ＧＰＢＰの血清レベルの増加は、ＩＶ型コラーゲンに基づく糸球体腎炎と相関すること（図８）；
８）ＦＦＡＴモチーフは７７ｋＤａ  ＧＰＢＰ分泌の構造的要件であり（図５）、ＶＡＰは、ＥＲにおける適切なタンパク質折りたたみのためのホメオスタシス維持に重要であること（１０）；
９）ＥＲに存在し、タンパク質の誤った折りたたみに対する細胞反応を調節するＧｒｐ７８及びＧｒｐ９４シャペロンは（１８、１９）、ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）及び７７ｋＤ
ａ  ＧＰＢＰと結合すること（図４）；
１０）ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ発現の増加は、タンパク質の誤った折りたたみ及びＥＲストレス介在性細胞死を誘発する化学療法剤に対する癌細胞の耐性に関与することが判明したこと（２８）；
１１）細胞のスフィンゴミエリナーゼでの処理は、脱リン酸化を誘発せず、７７ｋＤａ
ＧＰＢＰの細胞内分布も変えないこと（図７）；
１２）タンパク質キナーゼＤはＧＰＢＰをリン酸化するが、ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴと同じ程度までではないこと（６）；
１３）ノックダウン及び救済実験により、ＧＰＢＰ及びＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴがセブラフィッシュにおける胚発生の間に様々な生物学的機能を果たすことが明らかになること（２９）；並びに
１４）ＧＰＢＰは、分泌経路において内腔／細胞外側から膜に対して固定されるタンパク質ＲＴＮ３及びＲＴＮ４と相互作用すること（３０）は、ＧＰＢＰが、サイトゾルにおける細胞小器官間セラミド輸送ではなく、ＥＲにおけるタンパク質折りたたみ及び細胞外区画における超分子組織を調節することを裏付ける。
【０１２１】
２６−残基Ｓｅｒリッチな領域が欠失したＧＰＢＰもＶＡＰと結合する（２１、２２）；しかし、セラミド吸収は、ＶＡＰとの結合の次に起こり、続いて、タンパク質はゴルジ装置へと向かい、ここでセラミドは放出され、タンパク質エクソサイトーシスが誘発される（６、１４）。したがって、リン酸塩転移及びセラミド輸送は分子戦略であってよく、これによってＣＯＬ４Ａ３ＢＰはタンパク質分泌を調節する（すなわち、ＩＶ型コラーゲン）。これと一致して、ＶＡＰも細胞膜へのタンパク質カーゴ輸送の調節に重要であることが示された（１１）。
【０１２２】
様々な証拠は、ＣＯＬ４Ａ３ＢＰが、抗体介在性障害（３、４）、炎症（１５）、ＥＲストレス介在性疾患（１０）及び薬剤耐性癌（２８）を診断及び治療する方法の魅力的な標的であることを裏付ける。しかし、これらの結論を裏付ける観察結果は、今では解釈し直す必要があるかもしれない。その理由は、多くが、異なる細胞区画で発現される異なる遺伝子産物（すなわち、ＧＰＢＰ及びＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴ）間の区別ができない手段（すなわち、ｓｉＲＮＡ又は抗体）を用いて得られ、刺激に反応して異なって調節されるからである（３）。したがって、本研究は、ＧＰＢＰの様々なアイソフォームが細胞内で産生されるメカニズムを明らかにすることによって、これを理解するための重要な助けとなる。
【０１２３】
さらに、血液循環するヒト７７ｋＤａ  ＧＰＢＰを同定することによって、本発明者らは、ＧＰＢＰ分泌もインビボで生物学的に関連するという有力な証拠を提供する。血液循環する７７ｋＤａ  ＧＰＢＰのレベルが免疫複合体型糸球体腎炎のマウスモデルにおけるＧＰＢＰ糸球体発現及び発症と相関するという発見は、ＧＰＢＰの血清学的測定が臨床状況で関連することを示唆する。これと一致して、グッドパスチャー患者における循環するＧＰＢＰの上方調節を示す本研究は、これらの結論を裏付け、ＧＰＢＰがこれらの患者において過剰発現されるという従来の観察結果を実証する（３、３１）。
【０１２４】
これらおよび従来の発見は、ＧＰＢＰがＩＶ型コラーゲン分泌及び超分子組織を促進することを裏付ける。したがって、ＧＰＢＰは、適切なＧＢＭ集合に重要であり、異常なＧＰＢＰ蓄積は、ＧＢＭ破壊を誘発し、ＩｇＡ免疫複合体を堆積させる（４）。我々の知る限りでは、ＧＰＢＰ発現の増加、ＧＢＭ解離及び免疫複合体の堆積は、腎疾患の根底にある新規メカニズムである。類似のメカニズムがヒト発症において機能するかどうかは明らかではないが、ＧＢＭ破壊及び電子密度の高い物質の蓄積の超構造的証拠は、ＩｇＡネフロパシー及びループス腎炎にかかった患者において報告されている（３２、３３）。さらに、ＧＰＢＰ発現の増加は、ＩＶ型コラーゲンの四次構造の強化を低下させる可能性があ
り、これによってエピトープ暴露、免疫系の活性化及びグッドパスチャー疾患における自己抗体結合を促進する（３４）。後の仮定と一致して、グッドパスチャー患者は循環するＧＰＢＰレベルの増加を示し、ＧＰＢＰ発現がグッドパスチャー組織において上方調節されるという従来の観察結果を裏付ける（３、３１）。ＧＰＢＰは、循環する分子であり、ＧＢＭは糸球体濾過障壁の主成分であり、したがって、糸球体における病原性ＧＰＢＰ蓄積は、局所産生から起こり得るが、ほかの場所で産生された循環するＧＰＢＰの隔離からも起こり得る。局所的過剰産生は一次抗体介在性糸球体腎炎の主な原因となり得るのに対して、循環するレベルの増加はこの病理の二次形態を誘発し得、おそらくは腎移植による疾患再発に関与する。したがって、循環するＧＰＢＰレベルの定量化は、一次抗体介在性糸球体腎炎と二次抗体介在性糸球体腎炎との識別において、及び腎移植の臨床的モニタリングに重要であり得る。
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脚注
（１）７７ｋＤａポリペプチドは、ＧＰＢＰΔ２６／ＣＥＲＴのリン酸化（高）及び脱リン酸化（低）型を表す二重項として分割することができる（５）。
【０１２５】
（２）７７ｋＤａ  ＧＰＢＰの分泌は、分泌経路における天然の７７ｋＤａ  ＧＰＢＰのレベルを推定するためのこの抗体の使用を除いて、ｍＡｂ  ｅ２６との反応性の損失と関連した（図１１）。
【０１２６】
略語
使用する略語は次のとおりである：α３（ＩＶ）ＮＣ１：ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン、ＡＴＲ：選択的翻訳領域、ＣＥＲＴ及びＣＥＲＴＬ：セラミド輸送タンパク質の短鎖及び大型アイソフォーム、ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ：ＧＰＢＰ（ＣＥＲＴＬ）及びＧＰＢＰΔ２６（ＣＥＲＴ）をコードする遺伝子（コラーゲンＩＶα３−結合タンパク質
と命名されたもの）、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＥＲ：小胞体、ＦＦＡＴ：酸性トラック中の２つのフェニルアラニン、ＧＢＭ：糸球体基底膜；ＧＰＢＰ及びＧＰＢＰΔ２６：グッドパスチャー抗原結合タンパク質の大型及び短鎖の選択的にスプライスされた変異体、ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ｍＡｂ：モノクローナル抗体、ＮＣ１：非コラーゲン様−１ドメイン、ＯＲＦ：オープン・リーディング・フレーム、ＮＺＷ：ニュージーランドホワイト、ＰＢＳ：リン酸緩衝塩溶液、ＰＨ：プレクストリン相同、ＲＴ：室温、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＴＡＲＴ：ステロイド産生急性調節関連脂質伝達、ＵＴＲ：非翻訳領域；ＶＡＰ：小胞関連膜タンパク質関連タンパク質。
【実施例２】
【０１２７】
ヒト血漿からのＧＰＢＰの同定および単離
ここでは、本発明者らはヒト血漿のタンパク質分別のための古典的な化学的方法を使用し、ヒト血漿中の循環する複数の三次及び四次ＧＰＢＰ構造を同定した。データは、７７ｋＤａ  ＧＰＢＰ及び低分子量の誘導種が、単離され部分的に精製されたＧＰＢＰ四次構造から血漿を再構成することによって決定される主なＧＰＢＰ循環アイソフォームであることも示す。
【０１２８】
物質及び方法
ＧＰＢＰを、５０ｍＬの凍結対照血漿から、塩析、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過の組み合わせを用いて精製した。
【０１２９】
凍結によって沈殿したタンパク質を、まず８２００×ｇ、１０分間４℃での血漿遠心分離によって除去した。血漿ＧＰＢＰの精製についての特異性はわからないので、タンパク質をもとの試料から、（ＮＨ4）2ＳＯ4飽和度を増大させて（２０％、４０％、６０％及
び８０％）連続して沈殿させた。連続沈殿は、８２００×ｇで１０分間４℃にて遠心分離することによって実施し、沈殿を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５ｍｌ中に溶解させた。３．５ｋＤａカットオフのメンブレンバッグを用いて５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析することにより、タンパク質混合物を脱塩した。（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿の最終上清を同様に透析し、沈殿プロセスによって得られる最終画分と
して精製するためにさらに使用した。
【０１３０】
塩析によって得られる画分を、次いでＨｉＴｒａｐ  Ｑ−セファロースアニオン交換カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって分析した。カラムをまず緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化し、各試料をさらに添加し、１０体積の緩衝液Ａで洗浄した。結合タンパク質を緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌ）への勾配で溶出し、０．６ｍＬの画分中に集めた。ＧＰＢＰ物質を含むＩＥＣ画分を、ＧＰＢＰ特異性ビオチニル化Ｎ２７モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。ＧＰＢＰ含有ＩＥＣ画分をプールし、０．５ｍｌに濃縮し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  １０／３００ＣＬを用いたゲル濾過クロマトグラフィに付した。このプロセスでは、カラムをまずＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化し、試料をカラム中に注入し、タンパク質をサイズによって分離した。ゲル濾過画分を、ビオチニル化Ｎ２７モノクローナル抗体を用いたＧＰＢＰ物質の検出のためにウェスタンブロットによって分析した。ＧＰＢＰ含有画分をプールし、８０％アセトンで沈殿させ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８Ｍ尿素中に再懸濁させた。結果として得られた混合物（それぞれは連続（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿によって得
られる異なる初期画分に対応する）を、天然の血漿タンパク質組成を忠実に再構成するために等しい割合でプールした。最終プールの試料を、ＨＲＰ標識Ｎ２７モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに付した。
【０１３１】
結果
結果として得られるウェスタンブロットにおいて、本発明者らは７７ｋＤａ、７０ｋＤａ、６６ｋＤａ、５８ｋＤａ、５６ｋＤａ及び５３ｋＤａの主なＧＰＢＰアイソフォームを観察した。図１２においてウェスタンブロットで有意な量で表されない追加のポリペプチドが存在し、これらは精製プロセス中に実施されたウェスタンブロットによって同定された。これらは、約３６８ｋＤａの［２０％（ＮＨ4）2ＳＯ4］のポリペプチド、４０ｋ
Ｄａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ及び３１１ｋＤａの［４０％（ＮＨ4）2ＳＯ4］、並
びに９１ｋＤａ、１４６ｋＤａ、１７１ｋＤａ及び３００ｋＤａのポリペプチド［６０％（ＮＨ4）2ＳＯ4］を含んでいた（データは非図示）。最後に、各ＧＰＢＰ四次構造を表
す、ゲル濾過分析における各クロマトグラフィピークのサイズも評価した。特に、本発明者らは、１４００ｋＤａ及び９２０ｋＤａ（２０％（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿中）、３１０ｋ
Ｄａ及び１４５ｋＤａ（４０％（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿中）、９２０ｋＤａ、４２０ｋＤａ
、２７０ｋＤａ、及び１２５ｋＤａ（６０％（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿中）；６６ｋＤａ（８
０％（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿中）；並びに９１ｋＤａ（８０％（ＮＨ4）2ＳＯ4飽和で可溶性形態）のＧＰＢＰ凝集体を見いだした。
【０１３２】
結論
１．多くの異なる四次構造に集合した複数の循環ＧＰＢＰアイソフォームが存在する。
２．主な循環ＧＰＢＰアイソフォームは、すでに認識されている７７ｋＤａ及び低Ｍｒの誘導ポリペプチドを含む。
【実施例３】
【０１３３】
ヒト尿からのＧＰＢＰ単離及び定量化
ここでは、本発明者らは、ＧＰＢＰが、簡単な免疫学に基づく方法（すなわち、ＥＬＩＳＡ）によって測定でき、かつ化学的方法および免疫化学的方法によって単離できる、尿の通常の成分であることを示す。証拠は、９１ｋＤａのポリペプチド及び誘導ポリペプチドが主な尿ＧＰＢＰ産物であることを示す。
【０１３４】
イムノアフィニティークロマトグラフィによる尿ＧＰＢＰの単離
ＧＰＢＰを、ＧＰＢＰ特異性ウサギポリクローナル抗体をロードしたセファロース４Ｂを用いて対照ドナーの尿より抽出した。カラム結合物質を溶出させ、ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した（図１３）。広範囲のＭＷを示す多くのポリペプチドが、イムノアフィニティー精製された試料においてＧＰＢＰ特異性抗体で検出された。９１ｋＤａのポリペプチドは、低ＭＷの他の誘導ポリペプチド（４６ｋＤａ及び５０ｋＤａ）［Ｊｕａｎ  Ｓａｕｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ｒｅｖｅｒｔ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｒｅｖｅｒｔ−Ｒｏｓ  “Ｎｏｖｅｌ  Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ
ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１０７４  ｙ  ＷＯ２００４／０７００２５］とともにヒト尿中で最も豊富なＧＰＢＰ物質であることが判明した。
【０１３５】
特に、２５０ミリリットルの対照ドナー由来の尿（遠心分離によってあらかじめ精製し、Ｔｒｉｓで中和）を、２００μｇのウサギポリクローナル抗ＧＰＢＰ抗体を結合させた１ｍＬのセファロース４Ｂのカラムにかけた。カラムを３０ｍＬのＴＢＳで洗浄し、結合物質をＧｅｎｔｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出した。溶出された物質をＴＢＳに対して透析し、ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体（αＧＰＢＰｃｈ）及びＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ（二次抗体）を用いたウェスタンブロットによってさらに分析した（図１３）。抗体特異性は、二次抗体を含む同じ物質を加えた対照レーン（Ｃｏｎｔ）を染色することによって確認した。線分と
数字又は矢印と数字は、それぞれＭＷ標準（左）又はＧＰＢＰポリペプチド（右）の位置及びサイズ（ｋＤａ）を示す。
【０１３６】
ＥＬＩＳＡによる尿ＧＰＢＰの測定
尿中のタンパク質濃度は低い（通常８０ｕｇ／ｍＬ未満）ので、７人のドナーから得られた試料を用いて間接ＥＬＩＳＡを試みた。このために、プレートを尿試料でコーティングし、ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体およびＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ（二次抗体）を用いて免疫検出を実施した。ヒト尿中で希釈されたヒト組換えＧＰＢＰを用いて標準曲線を同様に得た。ＧＰＢＰは全てのドナーにおいて検出され、それぞれの場合でバックグラウンド（非特異的ＩｇＹを用いて測定したＦ．Ｉ．）を差し引くことによって各濃度を決定した（図１４）。全てのドナーは検出可能なレベルのＧＰＢＰを示し、ドナー３は尿中で異常に上昇したＧＰＢＰ濃度を示した。
【０１３７】
特に、尿中で希釈された組換えＧＰＢＰ及び７人のドナーから得られた尿試料（１−７）をＥＬＩＳＡプレート上に一夜４℃でコーティングした。プレートをＰＢＳ中３％ＢＳＡでブロックし、ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体（αＧＰＢＰｃｈ）及びＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ（二次抗体）を用いて免疫検出を実施した。Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレート発色のために使用した（図１４）。Ａにおいて、示されたＧＰＢＰ濃度対蛍光強度（Ｆ．Ｉ．）（任意単位（Ａ．Ｕ．）で表示）のｌｏｇ−ｌｏｇスケールでの散布図を示す。Ｂにおいて、示された濃度及びそれらの各Ｆ．Ｉ．値を均等目盛でプロットしたものを用いて計算した線形回帰線を表し、これを用いてＤにおいてＧＰＢＰ試料濃度を決定した。Ｃにおいて、二次抗体（Ｃｏｎｔ）、非特異的ニワトリＩｇＹ及び二次抗体（ＩｇＹ）、又はαＧＰＢＰｃｈ及び二次抗体（αＧＰＢＰｃｈ）を用いてドナー試料を分析して得られた生データを示す。Ｄにおいて、表は、Ｂにおいて得られた曲線を用いた対応する変換データを示す。
【０１３８】
本発明者らは、血清／血漿試料について使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いてＴＢＳ希釈尿に関してＧＰＢＰを測定した場合に、同様の濃度値を得た（データは非図示）。
【０１３９】
塩析及びイオン交換クロマトグラフィによる尿ＧＰＢＰ単離
イムノアフィニティー及びＥＬＩＳＡ法を検証し、どのＧＰＢＰ種がドナー３において増大したかを確認するために、本発明者らは、古典的な化学的精製法を用いて、この尿からのＧＰＢＰ精製を試みた。これらには、塩析及びダブルイオン交換クロマトグラフィ［カルボキシメチルセルロース（ＣＭ）及びジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）］、並びに各精製ステップを代表する異なる物質のウェスタンブロット分析（図１５）が含まれていた。ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析によって、ＧＰＢＰ物質のほとんどが塩によって沈殿し、ＣＭ又はＤＥＡＥのいずれとも結合しないことが明らかになった。９１ｋＤａの主なＧＰＢＰペプチドが、有意な量の７７ｋＤａ  ＧＰＢＰポリペプチドとごく微量の６０ｋＤａ及び５０ｋＤａのＧＰＢＰ関連ポリペプチドとともに検出された。
【０１４０】
イムノアフィニティー及びＥＬＩＳＡ法を検証し、どのＧＰＢＰ種がドナー３において増加したかを確認するために、本発明者らは、古典的な化学的精製法を用いてこの尿からのＧＰＢＰ精製を試みた。４００ミリリットルの遠心分離によって精製した尿を０．８５ＭのＮａＣｌに一夜４℃で添加し、１０．０００×ｇで３０分間４℃にて遠心分離した。上清の試料（Ｓｐｔ  ０．８５Ｍ  ＮａＣｌ）を、後の分析で採用するために４℃で保存した。結果として得られるペレットを５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に溶解させ、同緩衝液に対して透析し、０．７ｍＬのＣＭ樹脂で抽出し、非結合物質を０．５ｍＬのＤＥＡＥ樹脂でさらに抽出した。ＣＭ樹脂を１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７
．５）（ＣＭ、１ＭのＮａＣｌ）で溶出させ、ＤＥＡＥ樹脂を続いて０．３５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）（ＤＥＡＥ、０．３５Ｍ  ＮａＣｌ）及び１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）（ＤＥＡＥ、１Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出させた。ＤＥＡＥ抽出の上清を含む等量の各試料（Ｓｐｔ  ＣＭ／ＤＥＡＥ）を、ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体及びＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ（αＧＰＢＰｃｈ）を用いたウェスタンブロットによって分析した。非特異的反応性ポリペプチドは、ＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹのみを用いた平行分析（Ｃｏｎｔ）を染色することによって同定された。線分と数字又は矢印と数字は、それぞれ、ＭＷ標準（左）又は抗ＧＰＢＰ抗体と特異的に反応し、ＳｐｔＣＭ／ＤＥＡＥでのみ検出されるポリペプチド（右）の位置及びサイズ（ｋＤａ）を示す（図１５）。ＧＰＢＰ特異性ニワトリポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析によって、ＧＰＢＰ物質のほとんどが塩によって沈殿し、ＣＭまたはＤＥＡＥのいずれとも結合しないことが明らかになった。９１ｋＤａの主なＧＰＢＰポリペプチドが、有意な量の７７ｋＤａＧＰＢＰポリペプチド及びごく微量の６０ｋＤａ及び５０ｋＤａのＧＰＢＰ関連ポリペプチドとともに検出された。
【０１４１】
結論
１）ＧＰＢＰポリペプチドは、尿から、アフィニティークロマトグラフィによるか、又は塩析とそれに続くイオン交換クロマトグラフィによるかのいずれかで単離することができる。
【０１４２】
２）尿中のＧＰＢＰレベルは、間接的ＥＬＩＳＡ又はサンドイッチＥＬＩＳＡのいずれかによって特異的抗ＧＰＢＰ抗体を用いて評価することができる。
３）尿中で見いだされる主なＧＰＢＰポリペプチドは９１ｋＤａである。
【実施例４】
【０１４３】
ＧＰＢＰを標的とするモノクローナル抗体の産生及び特徴付け
すでに報告されたＧＰＢＰ中のｍＡｂｌ４及びｍＡｂ  ｅ２６エピトープを分泌の間に翻訳後修飾に付す（Ｒｅｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３０２４６−５５）。したがって、これらのモノクローナル抗体は、ヒト血漿中に存在する循環するＧＰＢＰアイソフォームと顕著に反応しなかった。このことにより、単離及びヒト血漿におけるＧＰＢＰ循環レベルの推定のために、ポリクローナル抗体に基づく免疫学的方法の使用が推奨された（実施例１を参照）。ここで、本発明者らは、ポリクローナル抗体に基づく方法よりも信頼性の高い、血漿中のＧＰＢＰの免疫学的検出のための新規ＧＰＢＰ特異性モノクローナル抗体の産生及び特徴付けを報告する。
【０１４４】
ＧＰＢＰに対する新規モノクローナル抗を産生するハイブリドーマの増殖及び冷凍保存
間接ＥＬＩＳＡ及び酵母において作製された組換えＧＰＢＰを使用して、本発明者らは、２８の独立したハイブリドーマクローン（Ｎ１−Ｎ２８）を得、単離し、これらは抗ＧＰＢＰモノクローナル抗体を産生した。クローンを、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、ＦＢＳ中１０％ＤＭＳＯ中で凍結させ、液体窒素中で保存した。保存前に、各クローンから１０ｍＬの培地を集め、４℃で０．０１％アジ化ナトリウムとともに保存し、さらなる抗体特徴付けのために使用した（下記参照）。
【０１４５】
ＨＥＫ２９３細胞において発現された組換え及び天然のＧＰＢＰアイソフォームを用いた新規モノクローナル抗体のウェスタンブロット特徴付け
２８のハイブリドーマのそれぞれ由来の抗体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生された組換えＧＰＢＰ（２５ｎｇ）と反応した（データは非図示）。Ｎ２０及びＮ２１を除いて、残りの抗体の全ては細胞内組換えＧＰＢＰとも反応した（図１６）。１１のモノクローナル抗体（Ｎ４、Ｎ５、Ｎ７、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３、Ｎ１４、Ｎ２２、Ｎ２５
、Ｎ２７及びＮ２８）は同様に細胞内及び細胞外組換えＧＰＢＰのどちらも認識した。７の抗体（Ｎ１、Ｎ６、Ｎ１７、Ｎ１８、Ｎ１９、Ｎ２４及びＮ２６）は細胞内ＧＰＢＰを標的とし、細胞外ＧＰＢＰは標的としなかったが、残りの抗体（Ｎ２、Ｎ３、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、Ｎ１５、Ｎ１６及びＮ２３）は細胞外組換えＧＰＢＰとの比較的低い反応性を示した（図１６）。
【０１４６】
ＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質抽出物を使用して、本発明者等は、１８のモノクローナル抗体［Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ２２、Ｎ２５、Ｎ２７（図示）及びＮ２８（非図示）］が天然の細胞内７７ｋＤａＧＰＢＰアイソフォームを認識することを確認した。１８の抗体のうちの１１［Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３、Ｎ１４、Ｎ１６、Ｎ２５、Ｎ２７（図示）及びＮ２８（非図示）］も、細胞において存在することがすでに報告されている４５ｋＤａのＧＰＢＰアイソフォームを標的とした［Ｊｕａｎ  Ｓａｕｓ、Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ｒｅｖｅｒｔ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｒｅｖｅｒｔ−Ｒｏｓ“Ｎｏｖｅｌ  Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”ＷＯ２００４／０７００２５］。抗体Ｎ４、Ｎ７、Ｎ１１、Ｎ１４及びＮ２７は約８８ｋＤａのさらなるＧＰＢＰ関連ポリペプチドも認識し、これらは７７ｋＤａの標準的ポリペプチドのリン酸化型であり得る（Ｒａｙａ  ｅｔ  ａｌ  １９９９  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４、１２６４２−１２６４９）。Ｎ２６抗体は９１ｋＤａポリペプチドを認識し、これは、ｍＡｂ  ｅ２６の標的である最近特徴付けされた９１ｋＤａ  ＧＰＢＰアイソフォーム（Ｒｅｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３０２４６−５５）とともに移動した（図１７）。ＧＰＢＰアイソフォーム（天然又は組換え）を検出するための新規モノクローナル抗体の相対的有効性を推定し、表２にまとめる。
【０１４７】
Ｎ１−Ｎ２８モノクローナル抗体に関するエピトープマッピング
このために、本発明者等は、ＧＰＢＰの各Ｃ末端欠失変異体である１３の異なるｃＤＮＡ構築物を産生した（図１８Ａ）。各構築物をＨＥＫ２９３細胞トランスフェクションのために使用し、対応する細胞抽出物をウェスタンブロットによって分析して、各抗体結合を評価した。２８の新規モノクローナル抗体のうち１７が欠失変異体８を認識したが、変異体７は認識しなかった（表１）；抗体の残りは、Ｎ末端を標的とするか、又はウェスタンブロット分析において反応性がないのでエピトープは確認されないかのいずれかであった。抗体の大部分は欠失変異体８と反応し、欠失変異体７と反応しなかったので、本発明者等は、欠失変異体７及び８のＣ末端間に含まれる配列である合成ペプチドを用いて各エピトープマッピングをさらに試みた。驚くべきことに、本発明者等はこれらの４０残基に対する抗体の反応性を確認できず、これらのペプチドはＧＰＢＰ抗体結合と競合し得なかった。データは、適切なエピトープ集合のためにＧＰＢＰＮ末端領域を必要とする高免疫原性である領域が存在していたことを示唆した。このことを、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ内部欠失変異体（Δ１−Δ４）を産生することによって調査し、この場合、示された各２０残基配列のみを除去した（図１８Ｂ）。欠失変異体Δ１−Δ４は、２回の連続したＰＣＲ及び対応する欠失を導入するための特異的プライマーを用いた標準的手順によって得られた（図１８Ｂ）。興味深いことに、全ての抗体はΔ２及びΔ３内部欠失ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ変異体と反応しなかったが、Δ１及びΔ４変異体と反応した（図１８Ｃ）。データは、ＧＰＢＰの残基３０５−３４４によって表される配列（ＧＧＰＤＹＥＥＧＰＮＳＬＩＮＥＥＥＦＦＤＡＶＥＡＡＬＤＲＱＤＫＩＥＥＱＳＱＳＥＫ、配列番号１０）が高免疫原エピトープクラスターと一致することを示す。一貫して、すでに特徴付けされたｍＡｂ１４は、ＦＡＴＴモチーフでこの領域と反応することが判明した（Ｒｅｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３０２４６−５５）。
【０１４８】
モノクローナル抗体の分類
これは、エピトープマッピング及びウェスタンブロット分析における天然又は組換え細胞内若しくは細胞外ＧＰＢＰアイソフォームのいずれかとの反応性を考慮して実施した（表１）。
【０１４９】
【表１】
0005654989.tif 000002
【０１５０】
組換えＧＰＢＰを発現するＨｅＬａ細胞の間接免疫蛍光法分析によるＮ１−Ｎ２８モノクローナル抗体の特徴付け
ＨｅＬａ細胞をｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰでトランスフェクトし、さらに２４時間培養し、メタノール／アセトン（５０％−５０％）で固定した。固定後、細胞をＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）でブロックし、ブロッキング溶液中で１：２に希釈された表示抗体（培地）とともにインキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ−標識抗マウスＩｇＧとともにインキュベートし、再度洗浄し、倒立蛍光顕微鏡を用いてマウントし、観察した。４０×対物レンズを用い、同じ露光時間及びゲインを使用して画像を取得した。Ｎ６を除く全ての抗体は、異なる反応性を有する、ＨｅＬａ細胞において発現されたＦＬＡＧ−ＧＰＢＰを認識し、この目的に関して最も反応性の高い抗体は、Ｎ１３、Ｎ１４、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ２１、Ｎ２２及びＮ２６であった（相対的検出有効性については表２を参照）。反応性抗体のうち、Ｎ２８を除く全ては、ＧＰＢＰに特徴的な網状分散パターン（小胞体でのＧＰＢＰの局在化の結果）を示した（Ｒｅｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３０２４６−５５）。
【０１５１】
ＨｅＬａ細胞の間接免疫蛍光法分析によるＮ１−Ｎ２８モノクローナル抗体の特徴付け
ＨｅＬａ細胞をクリスタルスライド上に播種し、培養し、前述のように処理し、４０×
対物レンズ及び１．６３の画像増幅を用いて倒立蛍光顕微鏡で分析した。Ｎ２６を除いて、全ての抗体は、合成画像の左に示される抗体Ｎ２７によって産生されたものと同様の小胞体分布を示した。一部の細胞はゴルジ装置に典型的な核周囲及び限局性強化も示した（白色矢印）。Ｎ２６によって明らかになったパターンは、核及び核周囲断続クラスター（ｐｅｒｉ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｕｎｃｔｕａｔｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ）を有するすでに記載された網状分布と、細胞膜の線形修飾を混ぜ合わせたものである。Ｎ２６を除いて、全ての抗体は、組換えＧＰＢＰポリペプチドについて記載された小胞体分布のみを明らかにした。抗体Ｎ２６は、網状パターンを産生することとは別に、細胞膜を装飾し、断続的核周囲及び核蓄積を証明した。ＨｅＬａ細胞において内因性ＧＰＢＰ物質を検出するための最良の抗体は、Ｎ５、Ｎ１２、Ｎ１６、Ｎ２１、Ｎ２６及びＮ２７であった（表２を参照）。
【０１５２】
パラフィン包埋ヒト腎臓組織の免疫組織化学的分析によるＮ１−Ｎ２８モノクローナル抗体の特徴付け
各モノクローナル抗体を、パラフィン包埋ヒト腎臓試料の標準的免疫組織化学的分析に使用した。全ての反応性抗体は、主に尿細管及び集合管を染色し、メサンギウム細胞、有足細胞、メサンギウムマトリックス及び毛細血管壁で糸球体内も著しく染色した。後の場合では、内皮表面では直線的パターンであり、毛細血管壁内では粒様分布であった。毛細血管壁において、免疫染色は頻度が低く、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ１０及びＮ２６がこれらのために最良の抗体であった。免疫組織化学的技術を用いてより良好なＧＰＢＰ検出をもたらす抗体は、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、Ｎ１２、Ｎ２６及びＮ２７であった（表２を参照）。
【０１５３】
Ｎ１−Ｎ２８モノクローナル抗体がサンドイッチＥＬＩＳＡ分析においてＧＰＢＰを捕捉する能力の評価
サンドイッチＥＬＩＳＡ分析用の各抗体を選択するために、あらかじめ抗マウス抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して、培地からのモノクローナル抗体と、評価される組換え及び天然ＧＰＢＰを捕捉するそれらの能力とを結びつけた。抗マウスコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに、示された抗体のハイブリドーマからの培地又は抗ＧＡＰＤＨハイブリドーマからの培地（ｃｏｎｔ）を添加した。続いて、プレートをＰＢＳ中３％ＢＳＡでブロックし、示された濃度のＦＢＳ中で希釈した組換えＧＰＢＰとともに、又はＦＢＳ（ブランク）とともにインキュベートした。結合ＧＰＢＰは、ニワトリポリクローナル抗ＧＰＢＰ及びＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹで検出された。蛍光試薬（Ａｍｐｌｅｘ）を用いて発色させた。
【０１５４】
ａ）ヒト組換えＧＰＢＰの捕捉分析。全ての抗体は効率よくＦＬＡＧ−ＧＰＢＰを捕捉し、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ８、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ２０、Ｎ２３、Ｎ２６、Ｎ２７およびＮ２８が、１０ｎｇ／ｍｌのＦＬＡＧ−ＧＰＢＰを含むＦＢＳからＦＬＡＧ−ＧＰＢＰを捕捉する最良の効率を示した（表２）
ｂ）ヒト循環ＧＰＢＰ（血漿）の捕捉分析。抗マウスコーティングされたＥＬＩＳＡプレートをロードし、前述のようにブロックし、ＦＢＳ中で１：１０に希釈されたグッドパスチャー患者ヒト血漿（登録番号Ｍ０４９）又はＦＢＳ単独（ブランク）とともにさらにインキュベートした。２８の抗体のうちの９（Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３、Ｎ２６及びＮ２７）が効率的にヒト血漿からのＧＰＢＰを捕捉した（表２）。
【０１５５】
結論
本発明者らは、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法及び免疫組織化学的方法による天然のＧＰＢＰ検出のための新規モノクローナル抗体を提供する。
【０１５６】
【表２】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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