(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ(v)インテグリンインヒビターの血管形成における作用および／またはそのようなインヒビターの癌に対する治療的有効性を、ADAMTS1、STC1、EDN1、MCP-1、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40リガンドおよびIL6から成る群から選択される少なくとも1つの精選バイオマーカー遺伝子またはその遺伝子生成物の手段によって評価するex vivoの方法であって、前記インテグリンインヒビターがモノクローナル抗体DI-17E6またはRGDペプチドシレンジチドであり、(i)前記インテグリンインヒビターの投与によりADAMTS1およびSTC1がアップレギュレートされ、MCP-1、INHBA、EDN1および／またはPDGF-BBがダウンレギュレートされ；(ii)シレンジチドの投与によりIL-8がダウンレギュレートされ、かつ(iii)DI17E6の投与により、IL8、IL6およびCRPがアップレギュレートされ、CD40リガンドがダウンレギュレートされ、
（a）前記インヒビターで未だ処理されていない個体から入手される、体液または組織のサンプル中の少なくとも1つの選択バイオマーカーの基準濃度および／または改変の状態を技術的手段および／または装置によって測定する工程；
（b）前記インヒビターで既に処理された個体から入手される（a）のサンプルまたは後の工程で前記インヒビターによって処理される（a）のサンプル中の前記選択バイオマーカーの濃度および／または改変の状態を技術的手段および／または装置によって測定する工程；
（c）工程（a）および（b）によって入手される選択バイオマーカーの濃度および／または改変の状態間の相違を技術的手段および／または装置によって測定する工程；および、（d）工程（c）で得られる前記相違から、インヒビターの以下の特性またはパラメーター、分子標的および前記分子標的と連関するそれぞれのシグナル伝達経路に対する薬力学的作用；血管形成に対する作用；癌の患者における治療の有効性および臨床的成果の1つ以上を決定する工程、
を含み、
前記改変の状態が前記バイオマーカータンパク質の、分子サイズまたはグリコシル化の変更、異なるタンパク質または同じタンパク質サブユニットとの相互作用の変化である、前記インヒビターの、血管形成における作用もしくは治療的有効性、安全性、予後または用量決定に関する臨床的測定および活性の評価、または固体における血管形成疾患に対する効果に関する臨床的測定および活性評価可能にする、前記方法。
【請求項２】
採取された体液サンプルが、血液、血漿、血清、リンパ、尿、涙液、滑液、創傷液および／または脳脊髄液である、請求項1に記載のex vivoの方法。
【請求項３】
組織サンプルが罹患組織または健康な組織を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
組織サンプルが、癌組織、皮膚組織および／または滑膜組織から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
採取された組織サンプルから内皮細胞が調製される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
内皮細胞が、それらが個体から入手され組織サンプルから調製された後で検査室条件下にて培養され、少なくとも1つのバイオマーカーが細胞培養の培養液または前記細胞の抽出物から決定される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
内分泌細胞および／または体液のサンプルが、健康な個体および／または癌を罹患する病気の個体に由来する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アルファ(v)インテグリンインヒビターであるモノクローナル抗体DI-17E6またはRGDペプチドシレンジチドの細胞系アッセイでの血管形成における作用、またはそのようなインヒビターのex vivo有効性および／または用量決定を評価または予測するための、ADAMTS1、STC1、EDN1、MCP-1、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40リガンドおよびIL6から成る群から選択されるバイオマーカー遺伝子またはその遺伝子生成物の使用であって、(i)前記インテグリンインヒビターの投与によりADAMTS1およびSTC1がアップレギュレートされ、MCP-1、INHBA、EDN1および／またはPDGF-BBがダウンレギュレートされ；(ii)シレンジチドの投与によりIL-8がダウンレギュレートされ、かつ(iii)DI17E6の投与により、IL8、IL6およびCRPがアップレギュレートされ、CD40リガンドがダウンレギュレートされる、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリンインヒビターおよび小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターの血管形成に対する作用を一定のある種のバイオマーカーを用いることにより評価する方法に関する。本方法は、主として血管形成関連疾患（例えば癌）の治療に用いられるインテグリンインヒビターおよび小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターの有効性の決定に極めて有益である。特に、本発明は、好ましくは体液において接近可能であり、したがって非侵襲的態様で標的調節の解析を可能にする血管形成連関バイオマーカーに関する。インテグリン阻害活性を有する化合物のスクリーニングのための前記バイオマーカーの使用もまた開示される。
【背景技術】
【０００２】
血管形成作用は、一般的には既存の脈管構造から新規血管を形成するために働く。DNA合成が進行中の内皮細胞の増殖は、血管形成性微細血管系の血管芽のよく知られた特徴であるが、一方、広範囲にわたる血管芽は主として内皮細胞の遊走を必要とする。血管形成作用は、一連の血管形成因子および血管形成インヒビターによって統制される根源的プロセスである。内皮細胞増殖および遊走のアクチベーターは、主にチロシンキナーゼリガンドレセプター、例えば血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）および表皮増殖因子（EGF）であるが、前記はまた非常に多様な起源、例えばリゾホスフェート（LPA）起源でも有り得る（Bergers et al. 2003, Nature Reviews 3:401-410）。EGFはVEGF、FGFおよびインターロイキン8（IL-8）をアップレギュレートするが、LPAはVEGFレベルをアップレギュレートする。最初に記載された血管形成性インヒビターはトロンボスポンジン-1（内皮細胞増殖および運動性を調節する）であった。注目すべきことには、多くの阻害性分子（例えばスタチン）は、血管形成に対して作用をもたないより大きなタンパク質に由来し、例えばアンギオスタチン（プラスミノゲンのフラグメントでATPシンターゼおよびアネキシンIIIと結合する）、エンドスタチン、ツムスタチンおよびカンスタチン（コラーゲンのフラグメントでインテグリンと結合する）である。一般的には、アクチベーターおよびインヒビターのレベルは、内皮細胞が休止状態であるか血管形成状態であるかを示す。血管形成バランスの変化は血管形成の転換を媒介すると考えられる。
【０００３】
その生理学的役割は、細胞、組織および器官の発生、再生および修復にある。病理学的血管形成は、顕微鏡的サイズを越えて増殖するために腫瘍および腫瘍の転移に必要であり、出血、血管の漏れおよび組織破壊を生じる。病理学的血管形成の結果、広範囲の血管形成関連疾患に付随する症状、不能または死が直接的または間接的に招来される。そのような疾患の例には、とりわけ腫瘍性疾患、自己免疫疾患、黄斑変性およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。
腫瘍の進行の場合、血管形成の転換は、腫瘍のタイプおよび環境にしたがって腫瘍進行経路の種々の段階で発生し得る。しかしながら新脈管形成は、通常は腫瘍進行の前提条件である。
いくつかのシグナル伝達経路が血管形成プロセスに必要である。VEGFは、脈管形成および血管形成に中枢的役割を果たす。全ての血管形成因子のうち、VEGFは腫瘍進行および転移にもっとも頻繁に関係する。予備的証拠によれば、多様なアイソフォームの過剰発現が腫瘍に対して様々な作用を有し得ることが示唆される。
【０００４】
腫瘍関連血管形成の重要なステップには腫瘍細胞によるVEGFの分泌が含まれる。VEGFは、内皮細胞上のそのレセプターVEGFR2およびニューロピリンと結合する（Folkman 2007, Nature Review, 6:273-286）。VEGFは、腫瘍由来の少なくとも6つの他のプロ-血管形成因子でもっとも一般的である。マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は腫瘍細胞から遊離されるが、VEGF刺激細胞によってもまた遊離される。MMPはプロ-血管形成タンパク質をストロマから動員するが、前記はまた血管壁のコラーゲン18から血管形成インヒビターのエンドスタチンを切り出し、さらに循環プラスミノゲンから血管形成インヒビターアンギオスタチンの切り出しに関与する。腫瘍細胞はアンギオポエチン2（ANGPT2）を分泌する（前記は、内皮TIE2レセプターとの結合に対してANGP1と競合する）。多くの細胞によって発現されるアンギオポエチン1（ANGPT1）は、内皮TIE2（TEKとしてもまた知られている）レセプターと結合し、血管の標準化状態の維持を助ける。ANGPT2は血管基底膜の分解および内皮細胞の遊走を増進し、したがって血管芽形成を促進する。PDGF（多くの腫瘍によって分泌される）は、内皮細胞上のそれ自身のレセプター（PDGFR）をアップレギュレートすることができる。基礎線維芽細胞増殖因子（bFGF）は他の腫瘍によって分泌される。増殖調節因子（例えばVEGFおよびbFGF）に応答して、内皮細胞はある種のインテグリンをアップレギュレートする。インテグリンは細胞表面粘着分子であり、内皮と外部環境との結合（細胞が生存率および増殖調節タンパク質に対する応答性を維持するための必要条件）を促進する。内皮細胞は足場依存性がもっとも強い細胞である。インテグリンは、腫瘍への遊走に必要な断続的脱落の最中に内皮細胞の生存率を維持し、さらにそれら細胞の増殖調節因子（例えばVEGFおよびbFGF）に対する感度を高めると考えられる。
【０００５】
インテグリンは、腫瘍の血管形成および転移で、さらに乾癬および慢性関節リウマチのような他のいくつかの血管形成依存性ヒト疾患で重要な役割を果たす（SA Mousa 1998, Drugs of the future, 23(1):51-60）。インテグリンは、細胞外環境を細胞骨格と結合させる細胞表面粘着分子である（B. Geiger et al. 2001, Nat Rev Mol Cell Biol 2:793-805）。それらの構造的機能に加えて、インテグリンは、細胞粘着、遊走、増殖および生存に重要なシグナルを伝達するためのレセプターである。
インテグリンによって誘導されるシグナル伝達事象は複合的で細胞の状況に左右される。細胞外インテグリンドメインとリガンドとの結合によって、形状変化およびインテグリンのクラスター形成が誘導されてシグナル伝達カスケードの活性化が生じ、さらに多重タンパク質複合体が補充されて巣状性接着に至る（B. Geiger et al. 2001, Nat Rev Mol Cell Biol 2:793-805）。メッセージは、多様な細胞内タンパク質キナーゼおよびアダプター分子（Ras、MAPキナーゼ（MAPK）、巣状性接着キナーゼ（FAK）、Src、Rac/Rho/cdc42 GTPase、PKCおよびP13Kを含む）を介して伝達される。これらの分子を介して、インテグリンシグナル伝達は、緊密かつ協調的にレセプターチロシンキナーゼシグナル伝達と相互作用して、生存、増殖、接着および遊走を調節する（FG Giancotti et al. 1999, Science 285(5430):1028-32）。
【０００６】
インテグリンは、2つのサブユニット（アルファおよびベータ）から成るヘテロダイマーを形成する（RO Hynes 1999, Trends Cell Biol, 12:33-37）。それらは多様な細胞タイプ上で弁別的に発現され、細胞外マトリックスタンパク質（例えばコラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチンおよびラミニン）の多様なリガンドを認識する。インテグリンサブセット（アルファ(V)ベータ(3)およびアルファ(V)ベータ(5)を含む）は、リガンド（例えばビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノゲン）に存在するそれらのリガンドの共通モチーフ、RGD配列を認識する（E. Ruoslahti 1996, Ann Rev Cell Dev Biol, 12:697-715）。
αvβ5インテグリンは特にビトロネクチンと結合し、一方、αvβ3はまた暫定的ECMの他の巨大分子と結合する。αvβ3は、例えばフィブリン、フィブリノゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、フォン・ビルブラント因子、オステオスポンチンおよび骨シアロプロテインIを含むリガンドと結合する。組織中の多くの細胞相互作用で示されるこれらインテグリンの特異的な細胞粘着の役割はなお研究中であるが、種々の生物学的機能を有する種々のインテグリンが存在することは明白である。
【０００７】
αvβ3は活性化された内皮細胞（例えば腫瘍内皮細胞）で大量に発現されるが、休止内皮細胞および大半の正常な器官系では発現されない。このことにより、αvβ3を抗血管形成療法の適切な標的となる（PC. Brooks et al. 1994, Science, 264:569-71）。αvβ3は最初癌で悪性メラノーマにおける進行依存性マーカーとして認められた。前記はin vivoでメラノーマの増殖を、in vitroで生存を強化する。αvβ3ブロッカーはこれらの作用を反転させる。続いて、αvβ3は他の腫瘍（神経膠芽細胞腫、腎癌、卵巣癌およびその他を含む）で見出された。αvβ3はまた、多くの悪性疾患のECで広範囲に過剰発現される。in vitroでは、腫瘍由来増殖因子によって活性化された血管形成モデルはαvβ3を過剰発現し、さらに血管芽を形成する血管構造上でαvβ3を必要としたが、一方、αvβ3およびαvβ5の遮断は血管形成表現型を抑制することができた。αvβ5はまた、いくつかの腫瘍由来増殖因子によって誘導された新血管構造を支持することが示された。αvβ5の阻害は腫瘍細胞のアポトーシスを始動させることができる。
インテグリンインヒビターは、主として血管形成関連疾患の特に予防及び治療のためのヒト並びに獣医医薬の医薬的活性成分として提唱されてきた。前記は、血行、血栓症、心筋梗塞、動脈硬化症、炎症、脳卒中、狭心症、腫瘍疾患、骨溶解性疾患（特に骨そしょう症）、血管形成および血管形成から生じる異常、例えば眼の糖尿病性網膜症、黄斑変性、眼のヒストプラズマ症、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、ルベオーシス緑内障（rubeotic glaucoma）、さらにまた潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、乾癬および血管形成術後の再狭窄の治療および予防のために用いることができる。
【０００８】
癌、関節炎および乾癬治療のために臨床開発下にあるいくつかのインテグリンインヒビターが存在する。それらは、例えばシレンギチド、アベグリン（ヴィタキシン、MEDI-522）、CNTO95、DI-17E6およびヴォロシキシマブである（JA Nemeth et al. 2007, Cancer Invest, 25(7):632-646）。前記は、インテグリンの細胞外マトリックス（ECM）との相互作用に拮抗し、内皮細胞および腫瘍細胞の機能を混乱させる。前記インテグリンインヒビターはそれぞれ別個の特異性および作用メカニズムを特徴とする。アベグリン、ヴォロシキシマブ、DI-17E6およびCNTO95はモノクローナル抗体アンタゴニストである。
シレンギチドは、RGD-モチーフを模倣した環状ペプチド（シクロ-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)）アンタゴニストである（EP0770622）。シレンギチドはαv-インテグリン、特にαvβ3およびαvβ5を標的とする。
US6521593は、αvβ3/αvβ5インテグリンインヒビターとしてシレンギチドを用いる、脳内の腫瘍増殖を阻害する方法を開示する。この発明は、前記インテグリンインヒビターが、抗血管形成作用に依存する抗腫瘍形成作用を示すことを含んでいる。さらにまた、前記インテグリン拮抗作用は、抗血管形成作用に依存しない直接的な腫瘍細胞致死を誘導し得る。WO02/41910は、血管形成から生じる患者の眼の疾患の治療のために、αvβ3/αvβ5インテグリンインヒビターとしてシレンギチドを使用することに関する。
【０００９】
マウスモノクローナル抗体17E6は、ヒトインテグリンレセプター保持細胞のαv-インテグリンサブユニットを特異的に阻害する。マウスIgG1抗体は、例えばMitjansら（J Cell Sci, 1995, 108:2825）並びに以下の特許US5,985,278およびEP719859によって記載されている。ネズミ17E6は、精製してセファロースに固定したヒトαvβ3で免疫したマウスから生成された。免疫マウスの脾臓リンパ球をネズミのミエローマ細胞と融合させ、生じたハイブリドーマクローンの1つがモノクローナル抗体17E6を産生した。DI-17E6（CAS No: 1105038-73-0）は、マウスモノクローナル抗体17E6の生物学的特徴を有するが、とりわけヒトでの免疫原性に関して改善された特性をもつ抗体である。この改変抗体の完全な可変および定常アミノ酸配列は図1およびWO2009/010290に提示されている。
チロシンキナーゼインヒビター（例えばVEGFおよびVEGFRに対抗するもの）が、抗血管形成療法で使用するために開発されてきた。VEGFRのチロシンキナーゼインヒビターは低分子量のATP模倣タンパク質であり、VEGFRのチロシンキナーゼドメインのATP結合触媒部位と結合して細胞内シグナル伝達を遮断する（Morabito et al. 2006, The Oncologist 11:753-764）。これらの薬剤のいくつかは現在種々の臨床開発段階にある。広範囲の任意抽出フェーズII試験によって、標準的療法に対して耐性を示す胃腸支質性腫瘍（GIST）および腎癌に罹患している患者の治療でスニチニブおよびソラフェニブの有効性がそれぞれ示された。
【００１０】
スニチニブ（SU011248）は、強力な抗血管形成性および抗腫瘍性活性を示す経口用小分子チロシンキナーゼインヒビターである（AM O’Farrell et al. 2003, Blood 101:3597-3605）。前記は小分子ATP部位指向競合性インヒビターである。チロシンキナーゼインヒビター、例えばSU6668およびSU5416（セマキサニブ）は貧弱な薬理学的特性および限定的有効性しか示さなかったので、したがってスニチニブは、論理的に設計され、その高い生体利用性および抗血管形成性レセプターチロシンキナーゼ（RTK）（血管内比増殖因子レセプター（VEGFR）および血小板由来増殖因子レセプター（PDGFR））に対するナノモル域の潜在能力について選別された。スニチニブは他のチロシンキナーゼ（KIT、FLT3、コロニー刺激因子１（CSF-1）およびRETを含む）を阻害する。前記チロシンキナーゼは、多数の悪性疾患（小細胞肺癌、GI支質性腫瘍（GIST）、乳癌、急性脊髄性白血病、多発性内分泌性新形成2A型および2B型、並びに家族性髄質性甲状腺癌を含む）に関与する。スニチニブは前臨床試験で強烈な抗腫瘍活性を示し、前記抗腫瘍活性は腫瘍増殖阻害をもたらしただけでなく、大腸癌、非小細胞性肺癌、メラノーマ、腎癌および扁平上皮癌（前記はVEGFRおよびPDGFRの阻害を伴う））のモデルで腫瘍退縮もまたもたらした。フェーズII試験では、臨床的活性が神経内分泌癌、大腸癌および乳癌において示され、一方、明確な有効性が進行した腎細胞癌およびイマチニブ低応答性GISTで示され、米国食品医薬局はこれら2つの疾患の治療にスニチニブを承認した。多様な腫瘍タイプで単独および化学療法併用スニチニブについて精査する研究が進行中である。RTKのスプリット-キナーゼドメインファミリーメンバーであるこの小分子インヒビターの臨床ベンチマーク決定は、腫瘍、支質区画および内皮区画内の多数のシグナル伝達経路を標的とする薬剤の生物学、潜在的バイオマーカーおよび臨床的有用性に関する更なる洞察をもたらすであろう。
【００１１】
ソラフェニブは、新規な二アリール尿素であり、最初はRafキナーゼシグナル伝達の特異的インヒビターとして開発された（Morabito et al. 2006, The Oncologist 11:753-764）。その後の研究によって、この化合物はまた、腫瘍の進行に必要とされるいくつかの他のチロシンキナーゼ（VEGFR）を阻害することが示された。ソラフェニブで処理した大腸癌、乳癌および非小細胞性肺癌（NSCLC）の異種移植モデルは、抗CD31免疫染色で測定したとき、腫瘍の血管形成の有意な阻害を示した。任意抽出した広範囲のフェーズII試験が、ソラフェニブを用いて種々のタイプの腫瘍をもつ患者で実施された。進行した腎細胞癌をもつ202人の患者についての結果が報告された。その後の任意抽出プラセボ管理フェーズIII試験によって、サイトカイン非応答性進行性腎細胞癌患者におけるソラフェニブの有効性が確認された。ソラフェニブは良好な耐性を示し、副作用は管理可能であった（すなわち発疹（34%）、下痢（33%）、手足の皮膚の反応（27%）、疲労（26%）および高血圧（11%））。これらの結果を基にして、FDAは、進行した腎癌の患者についてソラフェニブの承認を2005年12月に発表した。さらにまた、欧州委員会は最近、肝細胞癌の治療についてソラフェニブにみなし児医薬品の地位を与えた。フェーズII試験では、ソラフェニブで処置された患者の43%が少なくとも4ヶ月間の症状の安定を示し、さらに9%の患者が腫瘍の退縮を示した。現在のところ、フェーズIII試験で肝細胞癌、転移性メラノーマおよびNSCLCにおけるソラフェニブの有効性が評価されつつある。さらにまた、ソラフェニブの治療能力を最大にするためにいくつかの化学療法剤（イリノテカン、ダカルバジン）または分子標的剤（ゲフィニチブ）と併用されるソラフェニブに関して、いくつかの他のフェーズI/II試験が進行中である。
【００１２】
抗血管形成療法は、主として（例えば腫瘍内の）活性化血管内皮細胞を標的とする。前記療法は、内皮細胞が上記に記載のインテグリン阻害を介して環境に応答することを妨げることによってこれを達成することができる。抗血管形成療法はまた、ベヴァシズマブのように（下記参照）血管形成因子を中和することによっても機能を果たすことができる。
例えば血管形成因子の遺伝的変型は血管形成関連疾患の臨床的治療について重大な結果を有する。例えば、ダウン症候群の個体は、エンドスタチン前駆体遺伝子の余剰コピーのために正常な個体よりも1.6倍高いエンドスタチンレベルを有する。ダウン症候群の個体は癌に対して全人類でもっとも防護されているように思われる。したがって、遺伝的変型による血管形成の差異は抗血管形成療法で考慮されるべきである。
抗血管形成療法は、最適には内皮細胞が安定的な血中レベルのインヒビターに暴露されることを要求するかもしれない。したがって、シクロポリペプチドインヒビター（例えばシレンジチド）については頻繁な投与が最適であるかもしれない。しかしながら、モノクローナル抗体（例えばD7E16）は、長期間持続する抗体であるのでより長期の間隔で投与することができる。
腫瘍は、特に単一抗血管形成療法がただ1つの血管形成タンパク質（例えばVEGF）を標的とする場合には、抗血管形成療法に対して耐性になることがある。抗VEGF療法（例えばVEGFに対する抗体（ベヴァシズマブ））の場合、初期腫瘍の血管網は縮小し、腫瘍増殖は制限される。しかしながら、過去の経過を分析すると、転移腫瘍のベヴァシズマブによる継続的抗血管形成治療は有益な結果をもたらさなかった。ヒト腫瘍の60%しかVEGFを発現しないが、大半の腫瘍はまた5個から8個の他の血管形成タンパク質を発現することができる。発現が長期間抑制されるとき、別の血管形成タンパク質の発現が生じ得る（Dorrell et al. 2007, Proc Natl Acad Sci doi:10.1073/pnas.0607542104）。
【００１３】
したがって、上記に記載した理由のために、連関するシグナル経路を明らかにする感度が高くかつ特異的なバイオマーカーパネルは、抗血管形成療法の選択を支援することができよう。さらにまた、それらバイオマーカーは、顕微鏡的再発腫瘍を解剖学的にその位置を突き止める前にさえ診断することを助けることができよう。
さらにまた、血管形成が貧弱な腫瘍は、高度に血管形成された腫瘍に必要な血管形成インヒビターよりも極めて低い用量のインヒビターによって阻害されるであろう。これらの腫瘍はそれら自体の血管形成インヒビターを発現し、かつ低用量の血管形成インヒビターに応答するかもしれない。
広範囲の腫瘍タイプおよびそれらの発生における例えば遺伝的変型および多様な血管形成プロセスは、抗血管形成療法を最適化させかつ個々の要求に適合させるために、情報に富むバイオマーカーの広域パネルをとりわけ必要とする。
新形成ではないある種の血管形成依存疾患の進行または緩和をモニターするために、血管形成系バイオマーカーを使用することもまた可能かもしれない。これらの疾患にはとりわけアテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、クローン病および慢性関節リウマチが含まれる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、抗血管形成治療薬は情報豊富な分子性バイオマーカーを必要とするという種々の経験に基づく（F. Bertolini et al. 2007, Drug Discov Today, 12(19-20):806-12）。前記バイオマーカーは好ましくは例えば以下のために用いることができよう：
（1）分子標的の状態および標的に対する薬剤の作用の薬力学的（PD）終末点の測定、
（2）血管形成連関経路を識別する、
（3）個々の患者についてもっとも適切な抗血管形成薬を発見する、
（4）標的調節概念の証拠を提供する、
（5）基礎となる仮説を試験する、
（6）抗血管形成療法の用量およびスケジュールの論理的選択を提供する、
（7）臨床結果を解説または予想する。
分子性癌治療薬（例えばトラスツズマブおよびイマチニブ）の多くの成功にもかかわらず、臨床まで進んだ腫瘍薬のほんのわずかが市販承認にこぎつけただけである。分子性バイオマーカーの使用はこの高レベルの損耗を緩和し、それによって薬剤開発コストを下げ、刷新的で活性を有する薬剤が癌患者に提供される確率を高めるはずである。
【００１５】
これらの分子性バイオマーカーは、細胞性バイオマーカーによって提供される情報を補足しえよう。細胞性バイオマーカーは、例えば種々の内皮細胞集団、例えば循環内皮細胞および循環内皮前駆細胞（これらは血管形成のためのマーカーとして用いられる）である。分子性バイオマーカーは、細胞性バイオマーカーの欠点（例えば内皮細胞集団を主観的に列挙する）を補う。前記細胞性バイオマーカーの使用は、癌関連内皮細胞の特徴の決定でははるかに多くの作業を必要とする（Bertolini et al. 2007, Drug Discov Today, 12:806-12）。さらにまた、血管形成の測定のためのアプローチとしての画像化技術、例えばダイナミックコントラスト磁気共鳴画像化（DCE-MRI）は、日常的利用のためにはある程度厳しい制限を有する。これらの技術は高価であり、適切な設備を有するセンターに限定される。
本発明は、血管形成関連疾患、好ましくは癌に罹患した患者を治療するための血管形成インヒビター、好ましくはインテグリンインヒビターまたは小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターである治療薬または薬剤の作用、有効性、安全性、予後および/または用量決定を評価する方法に関する。
本発明はさらに、血管形成インヒビター、好ましくはインテグリンインヒビターまたは小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターのそのようなものとしての血管形成に対する作用を評価する方法に関する。
本発明はまた、細胞系モデルにおいてインテグリン調節化合物についてスクリーニングする方法に関する。
【００１６】
第一の特徴では、本発明は、血管形成インヒビター、好ましくはインテグリンまたはATP部位指向マルチキナーゼインヒビターの血管形成に対する作用を、規定の情報量豊富な分子性バイオマーカーの手段によって評価する方法に関する。したがって、本発明は特に、好ましくは抗血管形成療法の環境に置かれた個体に適用されるべき血管形成インヒビターの有効性を評価する必要性に基づくものである。前記抗血管形成療法は、背景の項に記載の血管形成関連疾患を治療するために適用されるであろう。別の特徴では、本発明は、血管形成、好ましくはインテグリン関連疾患に罹患している患者の診断および治療でそのようなインヒビターの有効性を決定または予測するために、前記情報量豊富な分子性バイオマーカーを使用することに関する。
抗血管形成療法の環境に置かれた個体に投与される血管形成インヒビターの有効性を評価するべき情報量豊富な分子性バイオマーカーの確立で考慮しなければならない種々の心得が存在する。
例えば、抗血管形成療法は、様々な種類の血管形成関連疾患に施され、さらに様々な種類の組織および／または器官が前記疾患に関係するので、分子性バイオマーカーの解析のために十分な生検標本を得ることが困難であるか、または医学的理由のために不可能な場合すらある。さらにまた、血管形成インヒビターを例えばある個体の転移性腫瘍を標的とするために用いる場合は、前記インヒビターの作用を解析するために多様な標的組織の種々の生検標本が必要とされよう。したがって、血管形成インヒビターによる治療を用いる血管形成依存性腫瘍の進行の評価には一定の種々の組織サンプルが必要とされよう。
【００１７】
さらにまた、血管形成は新規な血管の形成に依存し、さらに多数の血管形成工程が循環タンパク質を必要とするので、抗血管形成療法の成功は、ある組織における分子性バイオマーカーの出現または消失の解析だけでは評価することができない。
したがって、循環タンパク質をバイオマーカーとして使用することによって抗血管形成療法の成功に関する情報が得られよう。前記循環タンパク質は体液で検出可能なことがあり、したがってそれらは前記考察した心得を克服するために有益であり得よう。これまでただ１つの選択血管形成増殖因子（例えばVEGF、bFGFおよびPLGF）が、一定の抗血管形成療法の実施後に血漿で解析された（Jubb et al. 2006, Nature Reviews, 6:626-635）。しかしながら、血漿中の血管形成増殖因子の有意義な評価は、血小板および他の細胞から多くの増殖因子が活発に取り込まれるために限定される。さらにまた、腫瘍細胞ははっきりと認識し得るレベルの前記血管形成増殖因子を発現する。その上、血管形成の複雑さおよびタンパク質循環の複雑さのために、サンプル中のわずかばかりの単一バイオマーカーの評価は抗血管形成療法の評価には不十分である。したがって、好ましくは異なるタンパク質ファミリーに属し、さらに異なる態様で血管形成または関連するシグナル伝達経路に巻き込まれる一定のバイオマーカーのパネルは、抗血管形成薬のモニタリングにおける十分なツールの欠如を補完し得よう。
【００１８】
本発明は、血管形成インヒビターを個体に投与したことにより、さらにそれらインヒビターがその精選標的と結合したことにより、好ましくは組織細胞からそれら細胞の環境中に分泌される一定の分子性バイオマーカーに関する。好ましくは、これらの分子性バイオマーカーは組織細胞からそれらの環境中に分泌され、さらにその結果として、それらは体液で検出され得よう。したがって、前記血管形成インヒビターによって治療された個体から得られた体液が、好ましくは分子性バイオマーカーの解析のために用いられた。
本発明にしたがって血管形成関連レセプター（好ましくはインテグリンおよびATP部位指向マルチキナーゼ）およびこれらのレセプターのインヒビターと反応することが判明したバイオマーカーは以下のものである：
ADAMTS1、ADAMTS9、SERPINB2、SERPIND2、STC1、ADAM15、SRPX、CORO1C、PBEF1、LTB4DH、IL15RA、ENPP4、PLAUR、LAMA5、TNFRSF1A、CLU、TOR3A、IL1RL1、IL1R1、TCN2、VEGFC、LMNA、CTSL、PTX3、NCL、GUSB、CLEC3B、IL8、GPX3、CXCL1、SDFR1、STAT1、CDCA7、DAF、HYAL2、CD40、NOTCH1、INHBA、EDN1、MCP1、MMP10、AUTS2、LIPG、PDGFB、BMP4、MGP、HTRA1、FBLN5、HHIP、COL4A1、GALNT、MMP2、IL13RA1、MFAP2、NTN4、DKK3、SERPINE2、COL5A1、CHST1、PGF、EFNA4、BCHE、ENG、ROR1、ANGPTL4、ESM1、CUBN、IGFBP7、CYR61、FLT4、SPOCK、COL12A1、LTBP1、MMP28、TMEM4、CTSB、COL1A2、GRP124、SPARC、FST、DKK4、PHLDB2、PVR、CYR61、MERTK、FSTL3、APLN、PTX3、CTGF、NRG1、DKK3、CD44、BCHE、BDNF、FBXO4、EFEMP1、STC2、IL-6、CRP、CD40リガンドおよび／またはMMP9。
【００１９】
いくつかの特定の血管形成インヒビターの治療に対するその応答性の関係で本発明にしたがって好ましいバイオマーカーは、ADAMTS1、STC1、EDN1、MCP1、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40リガンドおよびIL6である。
本発明にしたがってもっとも好ましいバイオマーカーはADAMTS1、STC1、EDN1およびIL8または前記の組合せである。
好ましい実施態様では、分子性バイオマーカーは、体液（例えば血液および血漿、リンパ、羊水および／または尿）中に検出し得る。特に好ましい実施態様では、分子性バイオマーカーは血液および／または尿中に検出され得る。この場合に、血液および尿は非侵襲的態様で採取できるので、容易に前記バイオマーカーを精査することができる。
本発明の好ましい実施態様では、血管形成インヒビターはインテグリンインヒビターから選択される。より好ましい実施態様では、前記インテグリンインヒビターはアルファ(v)インテグリンインヒビターから選択される。
特に好ましい実施態様では、前記インテグリンインヒビターは、DI-17E6またはその誘導体および／またはシレチジン（シクロ-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)）から選択される。そのようにした場合、分子性バイオマーカーは、治療的に有効と推定される量のDI-17E6またはその誘導体および／またはシレンジチドで治療された個体から入手した体液で解析されるであろう。
【００２０】
別の好ましい実施態様では、前記インテグリンインヒビターは内皮細胞上のインテグリンと特異的に結合する。好ましくは、分子性バイオマーカーは前記内皮細胞でアップレギュレートされ、より高い量で内皮細胞の環境中に分泌されるであろう。別の場合には、前記バイオマーカーの分泌は前記インヒビターの治療により開始される。内皮細胞の環境は血管の管腔および近隣組織を含む。特に好ましい実施態様では、分子性バイオマーカーは、内皮細胞から分泌された後で血流に到達する。
本発明の別の好ましい実施態様では、前記インテグリンインヒビターと内皮細胞との特異的結合のために、分子性バイオマーカーは前記内皮細胞でダウンレギュレートされ、より低い量で内皮細胞の環境中に分泌される。別の場合には、前記バイオマーカーの分泌は前記インヒビターによる治療により停止される。
本発明のある実施態様では、インテグリンインヒビターの治療により一定の体液で検出できる前記分子性バイオマーカーはタンパク質である。好ましくは、前記タンパク質は血清の可溶性タンパク質または血漿に含まれるタンパク質である。本発明のある実施態様では、前記タンパク質は、主として免疫学系技術、例えばウェスタンブロット、ELISA、Luminexおよび関連技術によって検出できる。
本発明の目的のためには、前記バイオマーカー（好ましくはタンパク質）は、インテグリンインヒビターによる治療に応答して好ましい体液中で定量的に上昇または減少する。好ましい実施態様では、多数の試験で特徴づけられる、インテグリンインヒビター治療によるあるバイオマーカーの上昇または減少は、0.01を超過しないp値によって規定される。
【００２１】
本発明の別の特徴では、前記バイオマーカー（好ましくはタンパク質）は、インテグリンインヒビターによる治療に応答して改変される。これらの改変には、当該タンパク質の分子サイズにおける変化、例えば当該タンパク質のグリコシル化における改変、異なるまたは同じタンパク質サブユニットとの相互作用における改変が含まれよう。
本発明の別の特徴では、前記バイオマーカーの遺伝子発現の改変はRNAレベルで検出できる。したがって、RNAは、インテグリンインヒビターによる治療に応答した個体から得られた組織細胞のサンプルから抽出される。したがってあるバイオマーカーの発現RNA転写物を既知の遺伝子発現プロフィル決定技術（例えばアレイ技術）によって解析することができる。好ましくは、RNA抽出のために採取される組織細胞サンプルは内皮細胞に由来する。
好ましくは、抗血管形成療法におけるインテグリンインヒビターの有効性を評価する方法は、第一に治療的に有効と推定される量のインテグリンインヒビターを個体に投与する工程を含む。治療的に有効な量の仮定および決定は、例えば以前の前臨床的および臨床的研究に基づく。第二に、治療的に有効と推定される量の前記インテグリンインヒビターの投与の有効性が本発明の方法によって評価される。前記評価の判定を引証して、異なる条件下でさらに数回の血管形成療法を繰り返す。
【００２２】
本発明にしたがえば、バイオマーカーは、好ましくはこれまで血管形成に付随し、かつインテグリンレセプターと連関するシグナル経路に巻き込まれる可能性がある候補マーカーである。より好ましくは、バイオマーカーは、インテグリンインヒビターを投与された後で血管形成の遮断に巻き込まれる可能性がある。別の特徴は、本発明のバイオマーカーの群の多様性に関する。好ましくは、それらは、高い配列相同性のために１つのタンパク質グループに分類することが不可能であり、さらにそれらの生理学的関連性のために１つの機能的グループに分類することが不可能である（例えば血管形成因子VEGF、EGFおよびPLGF）。
本発明の別の特徴では、抗血管形成薬の作用を評価するためにバイオマーカーを別々に、本発明の異なるバイオマーカーと一緒に、または本発明以外で決定された他の血管形成バイオマーカーと一緒に用いることができる。
さらにまた、サンプル（例えば体液）中のタンパク質レベルの決定によって得られる分子性バイオマーカー判定の結果は、サンプル（例えば内皮細胞）中のRNAレベルの結果によって得られる遺伝子発現の結果によって達成することができる。前記代替は、タンパク質転写物の形としての分子性バイオマーカーは例えばある種の生理学的環境のために血液または尿中では安定でない可能性があるので有用であり得る。
【００２３】
本発明の第二の特徴では、本発明は、血管形成インヒビターの作用を分子性バイオマーカーによって評価する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：血管形成インヒビターの投与前に個体から組織サンプルを採取し、前記採取組織サンプルから細胞（好ましくは内皮細胞）を調製した。前記細胞を規定の検査室条件の下でin vitroにて培養し、後で血管形成インヒビターによって処理した。血管形成インヒビターによる処理のために、バイオマーカーの発現および分泌が変化する可能性があり得る。前記分泌の変化を細胞培養液中で追跡することができる。詳しく言えば、これらの分子性バイオマーカーは、血管形成インヒビターによる処理のために前記細胞からそれらの環境中に、すなわち培養液に分泌される。結果として、それらは細胞培養液中で検出できる。この場合、培養細胞の細胞培養液は入手および取り扱いが容易であるので、分子性バイオマーカーを容易に精査およびモニターすることができる。
好ましい実施態様では、分子性バイオマーカーは内皮細胞でアップレギュレートされ、内皮細胞の培養液中により高い量で分泌されるであろう。別の場合には、前記インヒビターによる処理のために前記バイオマーカーの分泌が開始される。本発明の別の好ましい実施態様では、分子性バイオマーカーは内皮細胞でダウンレギュレートされ、内皮細胞の培養液中により低い量で分泌される。別の場合には、前記インヒビターによる処理のために前記バイオマーカーの分泌が停止される。
【００２４】
前記工程を特徴とする方法は、好ましくはインテグリンインヒビターから選択される血管形成インヒビターを含む。より好ましい実施態様では、前記インテグリンインヒビターはアルファ(V)インテグリンインヒビターから選択される。
特に好ましい実施態様では、前記インテグリンインヒビターはDI-17E6またはその誘導体および／またはシレンジチドから選択される。そのようにして、分子性バイオマーカーは、有効と推定される量のDI-17E6またはその誘導体および／またはシレンジチドで処理された内皮細胞から採取した細胞培養液で解析されるであろう。
本発明のある実施態様では、インテグリンインヒビターで処理したために上清で検出できる前記バイオマーカーは、前述の項に記載したタンパク質である。
本発明の目的のためには、前記バイオマーカー（好ましくはタンパク質）は、インテグリンインヒビターによる処理に応答して内皮細胞サンプルの上清で定量的に上昇または減少する。好ましい実施態様では、一定の試験で特徴づけられるインテグリンインヒビターの処理によるあるバイオマーカーの上昇または減少は、0.01を超過しないp値によって規定される。
本発明の別の特徴では、細胞培養で検出される前記バイオマーカー（好ましくはタンパク質）は、前述の項に記載のように改変される。
本発明の別の特徴では、前記バイオマーカーの遺伝子発現の変化は、インテグリンインヒビターによる処理のために、内皮細胞のRNAの抽出によってRNAレベルを基にして検出できる。したがってあるバイオマーカーの発現RNA転写物を既知の遺伝子発現プロフィル決定技術（例えばアレイ技術）によって解析することができる。
【００２５】
上記の項に記載した前記細胞培養系における血管形成に対するインテグリンインヒビターの作用を評価する方法は、第一に治療的に有効と推定される量のインテグリンインヒビターの内皮細胞への投与を含む。治療的に有効と推定される量の決定は以前の前臨床および臨床研究に基づく。第二に、治療的に有効と推定される量の前記インテグリンインヒビターの投与の効果が、本発明に記載した分子性バイオマーカーによって解析される。前記評価の判定は、抗血管形成療法の決定または反復のために引証される。
別の特徴では、上記の項に記載した前記細胞培養における血管形成に対するインテグリンインヒビターの作用を評価する方法は、第一に実地調査量のインテグリンインヒビターの内皮細胞への投与を含む。この実地調査量の決定は、以前の前臨床および臨床研究に基づく。第二に、有効な実地調査量の前記インテグリンインヒビターの投与の効果が、本発明に記載した分子性バイオマーカーによって解析される。前記解析の判定は、更なる前臨床または臨床研究のために引証される。
本発明のある実施態様にしたがえば、細胞培養の培養液で決定される分子性バイオマーカーは、好ましくは前述の項に記載の候補マーカーである。
本発明の別の特徴では、抗血管形成薬を評価するために、バイオマーカーを別々に、本発明の異なるバイオマーカーと一緒に、または本発明以外で決定された他の血管形成バイオマーカーと一緒に用いることができる。
さらにまた、細胞培養液中のタンパク質レベルの決定によって得られた分子性バイオマーカー判定の結果は、細胞培養の細胞のRNAレベルの結果によって得られる遺伝子発現の結果によって達成することができる。
さらにまた、分子性バイオマーカーの手段による血管形成インヒビターの作用の評価は、インテグリンインヒビターで治療した個体から得られた組織サンプル或いは体液の解析およびインテグリンインヒビターで処理した上記に記載の細胞培養サンプル或いはその細胞培養の培養液の解析をまとめることによって実施することができる。
【００２６】
さらに別の特徴では、インテグリンインヒビターの抗血管形成作用および前記インヒビターの血管形成関連疾患に対する有効性を評価するために本明細書に記載した方法はまた、小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターの抗血管形成作用および前記インヒビターの血管形成関連疾患に対する有効性を評価するために利用することができる。
好ましい実施態様では、小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターは標的キナーゼのATP結合部位と結合し、さらに前記を模倣する（前記ATP結合部位は標的キナーゼの触媒活性部位に存在する）。
前記マルチキナーゼインヒビターの標的キナーゼは、好ましくは種々のレセプターチロシンキナーゼ、例えばVEGFR、PDGFR、KIT、FLT3、CSF-1およびRETとともにセリン/スレオニン細胞内キナーゼRAFを含む。
特に好ましい実施態様では、小分子ATP部位マルチキナーゼインヒビターはスニチニブおよび／またはソラフェニブである。
さらにまた、分子性バイオマーカーの手段によって血管形成インヒビターの効果を評価する前記方法のいずれの方法およびその使用も、背景の項に記載の血管形成関連疾患の予防及び治療のために有益であり得る。
さらに別の特徴では、本発明は、本発明の分子性バイオマーカーの使用によって広範囲の抗血管形成薬の作用を評価する方法に関する。前記バイオマーカーを用いて、本発明の抗血管形成薬に含まれないかまたは無関係である他の抗血管形成薬の血管形成に対する作用を評価することが可能である。
別の特徴では、血管形成療法の関係で血管形成薬の評価のために前記バイオマーカーを使用する以外に、それらバイオマーカーは早期発見においてもまた重要であり得よう。
【００２７】
本明細書に規定した方法は、抗血管形成療法の成功についての情報を以下のようにして提供することができる。前記方法は、血管形成関連疾患に罹患した患者に投与される抗血管形成薬の有効な用量および／または有効なスケジュールの発見および最適化のために用いることができる。詳細に述べれば、例えば有効と推定される初期用量の抗血管形成薬（例えばインテグリンインヒビター）による血管形成関連疾患の罹患患者の治療を含む抗血管形成療法の有効性は、本発明の方法によって評価することができる。前記抗血管形成療法の有効性が低下したように思われる場合は、条件の変更、例えば用量および／または投与スケジュールおよび／または抗血管形成薬の選択の変更を前記患者に適用することができる。抗血管形成療法条件の変更のために、前記患者に最適な個々の療法が見出されるまで本発明の方法をさらに数回反復することができる。
別の好ましい実施態様では、抗血管形成疾患に罹患した患者に投与される抗血管形成薬の初期用量が本発明の方法に有効であると評価された場合、条件の変更は、用量の低下またはスケジュールの延長を含むことができる。個体に投与される化合物、組成物、薬剤および治療を減少させる利点には、より高い投与量に付随する副作用発生率の減少が含まれる。特許請求の範囲に記載しさらに実施例でより詳細に記載した方法の結果として、これまでの薬剤を変更し、さらにより明瞭なバイオマーカーパターンをもたらす別の薬剤に置きかえることができよう。
【００２８】
前記バイオマーカーはまた、一般的に内皮細胞のホメオスタシスまたは血管形成作用の解明のために用いることができる。前記バイオマーカーの判定は、その生理学的プロセスのより深い理解を得る余地がある実験で情報を提供しえよう。
本発明の別の特徴にしたがえば、本発明は、インテグリン調節活性を有する可能性がある化合物をスクリーニングする方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：
（a）前記インヒビターで未だ処置されていない個体から入手した、体液および／または組織のサンプル中の少なくとも1つの選択バイオマーカーの基準濃度および／または改変状態を決定する工程；
（b）前記インヒビターで処置した（a）のサンプル中の選択バイオマーカーの濃度および／または改変状態を決定する工程；
（c）工程（a）および（b）によって入手した選択バイオマーカーの濃度および／または改変状態間の相違を計算する工程；
（d）前記相違から得られる判定または予測は、血管形成関連疾患に対する血管形成および／または抗血管形成有効性に対して影響を有するインテグリン調節分子の指標となる。
【００２９】
好ましい実施態様では、問題の化合物の投与は、処理細胞を得るためにインテグリン調節活性が可能な範囲にあると概算される種々の用量で細胞（好ましくは内皮細胞）に実施される。
好ましい実施態様では、前述の項に記載した解析のために前記処理細胞の細胞培養の培養液が採取された。
好ましい実施態様では、前記スクリーニング化合物による処理に対して応答する、細胞培養の培養液で解析およびモニターされる前記バイオマーカーは、前述の項に記載のタンパク質である。
好ましい実施態様では、一定の試験で特徴づけられたスクリーニング化合物の処理によるあるバイオマーカーの上昇または減少は、0.01を超過しないp値によって規定される。
本発明の別の特徴では、前記バイオマーカー（好ましくはタンパク質）は、前述の項に記載の前記スクリーニング化合物による処理に応答して改変される。
本発明の別の特徴では、前記バイオマーカーの遺伝子発現の変化は、スクリーニング化合物によって処理された細胞のRNA抽出物によってRNAレベルを基に検出できる。したがってあるバイオマーカーの発現RNA転写物を既知の遺伝子発現プロフィル決定技術（例えばアレイ技術）によって解析することができる。
したがって要約すれば、本発明はより詳細には以下に関する：
＊少なくとも1つの選択的バイオマーカーによって、血管形成インヒビターの血管形成に対する作用および／または前記インヒビターの血管形成関連疾患に対する有効性を評価するex vivoの方法であって、
前記バイオマーカーが、ADAMTS1、ADAMTS9、SERPINB2、SERPIND2、STC1、ADAM15、SRPX、CORO1C、PBEF1、LTB4DH、IL15RA、ENPP4、PLAUR、LAMA5、TNFRSF1A、CLU、TOR3A、IL1RL1、IL1R1、TCN2、VEGFC、LMNA、CTSL、PTX3、NCL、GUSB、CLEC3B、IL8、GPX3、CXCL1、SDFR1、STAT1、CDCA7、DAF、HYAL2、CD40、NOTCH1、INHBA、EDN1、MCP1、MMP10、AUTS2、LIPG、PDGFB、BMP4、MGP、HTRA1、FBLN5、HHIP、COL4A1、GALNT、MMP2、IL13RA1、MFAP2、NTN4、DKK3、SERPINE2、COL5A1、CHST1、PGF、EFNA4、BCHE、ENG、ROR1、ANGPTL4、ESM1、CUBN、IGFBP7、CYR61、FLT4、SPOCK、COL12A1、LTBP1、MMP28、TMEM4、CTSB、COL1A2、GRP124、SPARC、FST、DKK4、PHLDB2、PVR、CYR61、MERTK、FSTL3、APLN、PTX3、CTGF、NRG1、DKK3、CD44、BCHE、BDNF、FBXO4、EFEMP1、STC2、IL-6、CRP、CD40リガンドおよび／またはMMP9から成る群から選択される遺伝子生成物から選択され、
以下の（a）−（d）の工程を含む前記方法：
（a）前記インヒビターで未だ処理されていない個体から入手した、体液または組織のサンプル中の少なくとも1つの選択バイオマーカーの基準濃度および／または改変状態を決定する工程；
（b）前記インヒビターで既に処理された個体から入手した（a）のサンプルまたは前記インヒビターによってその後の工程で処理される（a）のサンプル中の前記選択バイオマーカーの濃度および／または改変状態を決定する工程；
（c）工程（a）および（b）によって入手した選択バイオマーカーの濃度および／または改変状態間の相違を計算する工程；
（d）前記相違から、インヒビターの以下の特性、分子標的および前記分子標的と連関するそれぞれのシグナル伝達経路に対する薬力学的効果；血管形成に対する効果；血管形成関連疾患をもつ患者での治療の有効性および臨床的成果の1つ以上を判定または予測する工程。
【００３０】
＊対応するex vivoの方法であって、前記採取された体液サンプルが、血液、血漿、血清、リンパ、尿、涙液、滑液、創傷液および／または脳脊髄液である、前記方法。
＊対応する方法であって、前記組織サンプルが病気の組織または健康な組織を含む、前記方法。
＊対応する方法であって、前記組織サンプルが、癌組織、皮膚組織および／または滑膜組織から成る群から選択される、前記方法。
＊対応するex vivoの方法であって、採取された組織サンプルから内皮細胞が調製される、前記方法。
＊対応する方法であって、前記内皮細胞が、それらが個体から入手され組織サンプルから調製された後に検査室条件下で培養され、少なくとも1つのバイオマーカーが細胞培養の培養液または前記細胞の抽出物から決定される、前記方法。
＊対応する方法であって、前記血管形成インヒビターが小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターである、前記方法。
＊対応する方法であって、前記インテグリンインヒビターがアルファ(V)インテグリンのインヒビターである、前記方法。
＊対応する方法であって、前記アルファ(V)インテグリンのインヒビターが抗体もしくはその誘導体または小さな化学分子またはRGDペプチドである、前記方法。
＊対応する方法であって、前記アルファ(V)インテグリンのインヒビターがDI-17E6またはシレンジチドである、前記方法。
＊対応する方法であって、前記小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビタースニチニブおよび／またはソラフェニブである、前記方法。
＊対応する方法であって、前記内分泌細胞および／または体液のサンプルが、健康な個体および／または腫瘍疾患および／または別の血管形成関連疾患を罹患した病気の個体に由来する、前記方法。
【００３１】
＊対応する方法であって、前記血管形成関連疾患が腫瘍またはその対応する疾患もしくは異常である、前記方法。
＊対応する方法であって、血管形成インヒビターの投与のために、前記バイオマーカーが、それらのレベルおよび／または改変状態においてダウンレギュレートまたはアップレギュレートされる、前記方法。
＊対応する方法であって、前記バイオマーカーが、ADAMTS1、STC1、MCP-1、IL-8、EDN1、PDGF-BB、INHBA、IL-6、CRP、CD40リガンドおよび／またはMMP9から成る群から選択される、前記方法。
＊対応する方法であって、前記バイオマーカーADAMTS1および／またはSTC1が、規定された少なくとも1つのインテグリンインヒビターの投与のためにアップレギュレートされる、前記方法。
＊対応する方法であって、前記バイオマーカーMCP-1、INHBA、EDN1および／またはPDGF-BBが、規定された1つのインテグリンインヒビターの投与のためにダウンレギュレートされる、前記方法。
＊対応する方法であって、前記バイオマーカーIL-8が、シレンジチドまたはソラフェニブの投与のためにダウンレギュレートされ、さらにDI-17E6またはスニチニブの投与のためにアップレギュレートされる、前記方法。
＊対応する方法であって、前記バイオマーカーIL-6および／またはCRPが、DI-17E6の投与のためにアップレギュレートされる、前記方法。
＊対応する方法であって、前記バイオマーカーCD40リガンドが、DI-17E6の投与のためにダウンレギュレートされる、前記方法。
＊対応する方法であって、前記バイオマーカーSTC1が、規定される小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターの投与のためにダウンレギュレートされる、前記方法。
＊対応する方法であって、前記バイオマーカーEDN1が、規定される小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターの投与のためにアップレギュレートされる、前記方法。
【００３２】
＊少なくとも1つの精選バイオマーカーの手段によって、細胞系モデルでインテグリン調節化合物スクリーニングするためのex vivoの方法であって、
前記バイオマーカーが、ADAMTS1、ADAMTS9、SERPINB2、SERPIND2、STC1、ADAM15、SRPX、CORO1C、PBEF1、LTB4DH、IL15RA、ENPP4、PLAUR、LAMA5、TNFRSF1A、CLU、TOR3A、IL1RL1、IL1R1、TCN2、VEGFC、LMNA、CTSL、PTX3、NCL、GUSB、CLEC3B、IL8、GPX3、CXCL1、SDFR1、STAT1、CDCA7、DAF、HYAL2、CD40、NOTCH1、INHBA、EDN1、MCP1、MMP10、AUTS2、LIPG、PDGFB、BMP4、MGP、HTRA1、FBLN5、HHIP、COL4A1、GALNT、MMP2、IL13RA1、MFAP2、NTN4、DKK3、SERPINE2、COL5A1、CHST1、PGF、EFNA4、BCHE、ENG、ROR1、ANGPTL4、ESM1、CUBN、IGFBP7、CYR61、FLT4、SPOCK、COL12A1、LTBP1、MMP28、TMEM4、CTSB、COL1A2、GRP124、SPARC、FST、DKK4、PHLDB2、PVR、CYR61、MERTK、FSTL3、APLN、PTX3、CTGF、NRG1、DKK3、CD44、BCHE、BDNF、FBXO4、EFEMP1、STC2、IL-6、CRP、CD40リガンドおよび／またはMMP9から成る群から選択される遺伝子生成物から選択され、
前記方法が以下の（a）−（d）の工程を含む前記方法：
（a）前記インヒビターで未だ処理されていない個体から入手した、体液または組織のサンプル中の少なくとも1つの選択バイオマーカーの基準濃度および／または改変状態を決定する工程；
（b）前記インヒビターで既に処理された（a）のサンプル中の前記選択バイオマーカーの濃度および／または改変状態を決定する工程；
（c）工程（a）および（b）によって入手した選択バイオマーカーの濃度および／または改変状態間の相違を計算する工程；
（d）血管形成における作用および／または血管形成関連疾患に対する抗血管形成有効性をもつインテグリン調節分子の指標となる特性を前記相違から判定または予測する工程。
【００３３】
＊ADAMTS1、ADAMTS9、SERPINB2、SERPIND2、STC1、ADAM15、SRPX、CORO1C、PBEF1、LTB4DH、IL15RA、ENPP4、PLAUR、LAMA5、TNFRSF1A、CLU、TOR3A、IL1RL1、IL1R1、TCN2、VEGFC、LMNA、CTSL、PTX3、NCL、GUSB、CLEC3B、IL8、GPX3、CXCL1、SDFR1、STAT1、CDCA7、DAF、HYAL2、CD40、NOTCH1、INHBA、EDN1、MCP1、MMP10、AUTS2、LIPG、PDGFB、BMP4、MGP、HTRA1、FBLN5、HHIP、COL4A1、GALNT、MMP2、IL13RA1、MFAP2、NTN4、DKK3、SERPINE2、COL5A1、CHST1、PGF、EFNA4、BCHE、ENG、ROR1、ANGPTL4、ESM1、CUBN、IGFBP7、CYR61、FLT4、SPOCK、COL12A1、LTBP1、MMP28、TMEM4、CTSB、COL1A2、GRP124、SPARC、FST、DKK4、PHLDB2、PVR、CYR61、MERTK、FSTL3、APLN、PTX3、CTGF、NRG1、DKK3、CD44、BCHE、BDNF、FBXO4、EFEMP1、STC2、IL-6、CRP、CD40リガンドおよび／またはMMP9から選択される少なくとも1つのバイオマーカーのための検出系、および本方法の適用を可能にする規定の血管形成インヒビターを含む、診断キット。
＊インテグリンインヒビターまたは小分子ATP部位指向キナーゼインヒビターの細胞系アッセイでの血管形成における作用、またはそのようなインヒビターのex vivoにおける有効性および／または用量決定を評価または予測するための、ADAMTS1、STC1、EDN1、MCP-1、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40リガンドおよびIL6から成る好ましい群から選択されるバイオマーカー遺伝子またはその遺伝子生成物の使用。
＊インテグリンインヒビターまたは小分子ATP部位指向キナーゼインヒビターの製造を目的とする、ADAMTS1、STC1、EDN1、MCP-1、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40リガンドおよびIL6から成る好ましい群から選択されるバイオマーカー遺伝子またはその遺伝子生成物の使用であって、前記インヒビターが、これらのバイオマーカーの少なくとも1つに応答性である患者の癌の治療用である、前記使用。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】DI-17E6の完全な軽鎖（A）および重鎖（B）配列を示す。可変領域には下線が付され、CDRは太字である。定常領域の太字の配列は改変IgG1ヒンジ並びに296位および297位の変異を示す。
【図２】DI-17E6がHUVECの上清でADAMTS1タンパク質レベルを誘導することを示す。
【図３】シレンジチドがHUVECの上清でADAMTS1タンパク質レベルを誘導することを示す。
【図４】DI-17E6およびシレンジチドがHUVECの上清でSTC-1のタンパク質レベルを誘導することを示す。
【図５】DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるMCP-1の調節を示す。
【図６】DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるIL-8の調節を示す。
【図７】DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるPDGF-BBの調節を示す。
【図８】DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるEDN1の調節を示す。
【図９】DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるアクチビンAの調節を示す。
【図１０】スーテントおよびソラフェニブに応答するHUVECにおけるSTC-1の調節を示す。
【図１１】スーテントおよびソラフェニブに応答するHUVECにおけるEDN1の調節を示す。
【図１２】スーテントおよびソラフェニブに応答するHUVECにおけるIL-8の調節を示す。
【図１３】サルのマトリゲルプラグにおける血管形成のDI-17E6による阻害を示す。
【図１４】DI-17E6による処理に応答する血漿CRPおよびIL-6の調節を示す。
【図１５】DI-17E6による処理に応答する血漿CD40リガンドおよびMMP9の調節を示す。
【図１６】インテグリン特異的シグナル伝達経路の阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
“血管形成関連疾患”という用語は、調節性が失われた血管形成の直接的な結果であるか、または調節性が失われた血管形成による間接的作用が大きい多数の疾患に与えられる。前記多数の疾患には、腫瘍疾患、心脈管系疾患、炎症、自己免疫疾患、変性性疾患、眼の疾患が含まれる。血管形成の調節逸脱は多様な病理学的刺激によって誘導されよう。
“抗血管形成作用”という用語は、血管形成が遮断されるかまたは少なくとも阻害されることを意味する。本発明との関係では、抗血管形成薬剤または物質は、好ましくは新規血管の病理学的形成（血管形成）を制限することによって血管形成関連疾患を相殺するために用いられ、血管形成によって媒介される症状は抗血管形成薬の投与により緩和される。
“バイオマーカー”という用語は、生物学的状態の指標として用いられる物質を指す。“バイオマーカー”は、正常な生物学的プロセス、病理学的プロセスまたは治療薬介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定および判定される形質である。本発明では、バイオマーカーという用語は、好ましくは遺伝子転写物（例えばRNAおよびタンパク質）を含む分子性バイオマーカーとして用いられる。前記バイオマーカーは定量的であるとともに定性的な変化であってもよい。好ましくは本発明では、分子性バイオマーカーは定量的に変化し（すなわちそれらのレベルは減少または上昇する）、それによって同じ条件下で一定の試験で調査されるバイオマーカーの信頼度を特徴付けるp-値は0.01の値を越えない。
【００３６】
“体液”という用語には、個体で見出される液体が含まれる。“体液”には、身体から排出または分泌される液体とともに通常では排出または分泌されない液体も含まれる。これらそれぞれの液体には、水性の液体、血液、血清、間質液、リンパ、粘液、胸膜液、唾液、血漿、尿、涙液、滑液、創傷液および／または脳脊髄液が含まれる。好ましくは、血清および血漿を含む血液並びに尿が本発明では用いられる。
“癌”および“腫瘍／腫瘍性疾患”という用語は、典型的には調節性が失われた細胞増殖を特徴とする哺乳動物の病理学的状態を指すか、または表す。本発明の医薬組成物の手段によって腫瘍を治療することができる。前記腫瘍は、例えば乳房、心臓、肺臓、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸および肝臓の腫瘍である。
“細胞系モデル／アッセイ”という用語は、本明細書では、動物および／またはヒトの組織および／または器官に由来し、もっとも好ましくは血管形成調節化合物のスクリーニングに使用される前に検査室条件下で培養される細胞を指す。細胞系モデルには細胞株もまた含まれる。
抗体の“誘導体”は抗体から導かれる形態を表す。
“診断キット”という用語には、好ましくは種々の診断用抗体パッケージおよび／または遺伝子チップアレイおよび／または本発明のバイオマーカーの定量的および／または定性的判定に必要な試薬、および原則として試薬、診断用抗体または遺伝子アレイを用いるための指示を含む検出系が含まれる。試薬と同様に抗体は液体、散剤、錠剤、懸濁物として提供され得る。抗体（すなわち遺伝子アレイ）および試薬は、本発明の方法にしたがって別々に適用するために適した別個のパッケージとして提供することができる。本発明のキットはまた、パッケージに含まれる物質を“使用するための指示書”を含む。
【００３７】
“改変状態”という用語は、遺伝子生成物における改変の変化、例えばタンパク質の分子サイズまたはグリコシル化の変更を指す。さらにまた、前記はまた、異なるタンパク質または同じタンパク質サブユニットとの相互作用の変化を指す。
“個体”には、疾患／異常をもつヒトおよび動物、および／またはコントロール発端者として健康なヒトおよび動物が含まれる。さらにまた実験動物が含まれる。
“レセプター”または“レセプター分子”は、可溶性または膜結合／関連タンパク質または糖タンパク質であって、リガンドが結合してレセプター-リガンド複合体を形成する１つ以上のドメインを含むものである。リガンド（アゴニストまたはアンタゴニストであり得る）と結合することによって、レセプターは活性化または不活化され、経路のシグナル伝達を開始または遮断することができる。
“組織サンプル”は、バイオマーカーの解析および判定のために細胞として用いるために個体から取り出される生検標本を意味する。本発明では、組織サンプルは生検後直ちにバイオマーカーの解析に用いることができる。本発明の別の特徴では、生検材料から抽出した細胞を一定の検査室条件下で培養し、そのバイオマーカーについて後で解析することが可能である。本発明では、好ましくは内皮細胞が用いられる。
【００３８】
“治療的に有効な用量＝TED”という用語は、哺乳動物において疾患または異常を治療するために有効な薬剤（例えば治療抗体）の量を指す。癌の場合、治療的に有効な量の薬剤は、癌細胞数を減少させるか、腫瘍サイズを減少させるか、周辺組織への癌細胞の浸潤を阻害するか（すなわちある程度浸潤を遅らせ、さらに好ましくは停止させる）、腫瘍の転移を阻害するか（すなわちある程度転移を遅らせ、さらに好ましくは停止させる）、腫瘍増殖をある程度阻害し、および／または癌関連症状の１つ以上をある程度緩和することができる。当該薬剤が現存の癌細胞の増殖を妨げおよび／またはこれを死滅させる程度に、前記は細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。抗腫瘍療法については、有効性は、例えば疾患進行時間（TTP）を評価するかおよび／または応答率（RR）を決定することによって測定することができる。
“応答する”または“応答性”という用語は、任意の終末点表示を用いて患者にとっての利益を評価することができる状態を指し、疾患進行のある程度の抑制（完全な進行停止の遅延を含む）；疾患関連エピソードおよび／または症状の数の減少；適用されたインヒビター薬剤に対する自己免疫応答の緩和；治療の後の症状非提示期間の延長；および治療後のある時点の死亡率の低下が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記用語は、完全応答（CR）および部分応答（PR）を含む測定可能な応答を指す。
本発明の関係で抗体の“ネズミ型、キメラ型またはヒト化型”には、抗体の部分がネズミ抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体の規定にしたがって置換されている等価の抗体または誘導体が含まれる。
【００３９】
本研究では、インテグリンインヒビターおよび小分子ATP部位指向マルチキナーゼインヒビターの抗血管形成活性と連関し、体液において接近が可能な、したがって非侵襲的態様で標的調節の解析を可能にし得るバイオマーカーを認定した。前記を達成するために、2つの異なる手法を実行した。第一に、薬剤処理に応答する内皮細胞の遺伝子発現プロフィルで全ゲノム変化を解析した。第二に、薬剤によって調節される血漿バイオマーカーを識別するためにin vivo血管形成モデルを用いる候補-プロテオミック駆動アプローチを実施した。
１．遺伝子発現プロフィルを用いるバイオマーカーの識別
治療に関連するバイオマーカーを識別するために、HUVECをシレンジチドまたはDI-17E6で処理した。ウェスタンブロット分析によって、処理後にFAKおよびMAPKのリン酸化がシレンジチドおよびDI-17E6についてそれぞれ阻害されることが示された。各条件をトリプリケートで試験した実験から遺伝子発現プロフィルを作製した。前記を達成するために、RNAを処理細胞およびコントロール細胞から抽出し、全ゲノムアフィメトリックス（Affymetrix）オリゴヌクレオチドマイクロアレイとハイブリダイズさせて、遺伝子発現プロフィルを作製した。GCRMAアルゴリズム（Z. Wu 2004, J American Statistica Association 99:909-917）によるプレプロセッシングの後、Affymetrix GeneChipのデータをフィルター処理して、低多様性、低シグナルまたは低プローブ注釈のプローブセットを排除する。遺伝子を特異的にフィルター処理し、ヒトの体液中に検出することが可能で、かつ患者において非侵襲的方法でモニターできる分泌候補を得た。薬剤処理細胞と非処理またはコントロール処理細胞とにおいて弁別的に発現される遺伝子を、各プローブセットの発現データの直線モデル解析とそれに続く緩和（moderated）t-検定（GK. Smyth 2004, Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3:Article 3）によって識別した。
【００４０】
＊DI-17E6に応答してアップレギュレートされる遺伝子には以下が含まれる：ADAMTS1、ADAMTS9、SERPINB2、SERPIND2、STC1、ADAM15、SRPX、CORO1C、PBEF1、LTB4DH、IL15RA、ENPP4、PLAUR、LAMA5、TNFRSF1A、CLU、TOR3A、IL1RL1、IL1R1、TCN2、VEGFC、LMNA、CTSL、PTX3、NCL、GUSB、CLEC3B、IL8、GPX3、CXCL1、SDFR1、STAT1、CDCA7。
＊シレンジチドに応答してアップレギュレートされる遺伝子には以下が含まれる：ADAMTS9、DAF、STC1、ADAMTS1、LAMA5、TCN2、SRPX、ADAM15、GUSB、HYAL2、PLAUR、CD40、NOTCH1、ENPP4。
＊DI-17E6に応答してダウンレギュレートされる遺伝子には以下が含まれる：INHBA、EDN1、MCP1、MMP10、AUTS2、LIPG、PDGFB、BMP4、MGP、HTRA1、FBLN5、HHIP、COL4A1、GALNT、MMP2、IL13RA1、MFAP2、NTN4、DKK3、SERPINE2、COL5A1、CHST1、PGF、EFNA4、BCHE、ENG、ROR1、ANGPTL4、ESM1、CUBN、IGFBP7、CYR61、FLT4、SPOCK、COL12A1、LTBP1、MMP28、TMEM4、CTSB、COL1A2、GRP124、SPARC。
＊シレンジチドに応答してダウンレギュレートされる遺伝子には以下が含まれる：INHBA、EDN1、FST、DKK4、BMP4、MCP1、HHIP、NTN4、PHLDB2、PVR、CYR61、AUTS2、MERTK、FSTL3、APLN、PTX3、ANGPTL4、CTGF、SPOCK、IL8、NRG1、DKK3、CD44、BCHE、BDNF、FBXO4、EFEMP1、STC2。
与えられた条件下で顕著な応答／応答の変化／応答性を示す遺伝子には下線が付されている。
前記遺伝子および前記遺伝子の遺伝子生成物は、本発明の定義によって、同じ機能的活性を誘引する相同配列もまた含み、特に本来の配列に対して80%を超える、好ましくは90%を超える、特に好ましくは95%を超える相同性を有する配列が関係する。したがって、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%の相同性を有する配列が本発明の目的の物質である。
【００４１】
どちらかのインテグリンインヒビターによってRNAレベルが極めて顕著に調節された遺伝子をタンパク質レベルで解析した。分泌バイオマーカーが当面関係を有するので、個々の候補をインテグリンインヒビター処理細胞の上清で解析した。HUVECをDI-17E6またはシレンジチドのどちらかで処理した。種々の時間の後で、培養上清を採集し、ウェスタンブロッティング、ELISAまたはルミネックスによって種々のバイオマーカー候補について解析した。薬剤誘導バイオマーカー調節をコントロール細胞と比較して判定した。種々の候補の中で、ADAMTS1、STC-1、MCP-1、IL-8、エンドテリン-1、アクチビンAおよびPDGF-BBが、インテグリンインヒビターに応答して調節されることが判明した。
ウェスタンブロット解析によって、スロンボスポンジン1型モチーフ（ADAMTS1）およびスタンニオカルシン-1（STC-1）をもつADAMメタロペプチダーゼが、DI-17E6またはシレンジチドによる処理に応答してアップレギュレートされることが示された（図2−4）。
ADAMTS-1は細胞外間隙に存在するメタロプロテアーゼである。種々の生物学的な系を用いて、ADAMTS1は血管形成を阻害することが示された（F. Vazquez et al. 1999, J Biol Chem, 274(33):23349-57）。最初STC-1は、硬骨魚類のカルシウムおよびホスフェートのホメオスタシスに必要とされるホルモンとして報告された分泌糖タンパク質である。前記は、血管形成を含む多くの生理学的プロセスで役割を果たし、さらにプロ-血管形成および抗血管形成活性がSTC-1について報告された（EH. Filvaroff et al. 2002, Endcrinology, 143:3681-90；C. Zlot et al. 2003, J Biol Chem, 278(48):47654-9）。
【００４２】
単球のケモアトラクタントタンパク質-1（MCP-1／CCL2）およびインターロイキン-8（IL-8／CXCL8）をルミネックスによって解析した。MCP-1はDI-17E6およびシレンジチドに応答してダウンレギュレートされた（図5）。対照的に、IL-8は両方のインテグリンインヒビターによって弁別的に調節された。DI-17E6に応答してIL-8はアップレギュレートされ、一方、シレンジチドはこのケモカインのダウンレギュレションを誘導した（図6）。MCP-1は、マクロファージの補充および活性化に決定的な役割を果たす。前記は、プロ-血管形成性マクロファージを腫瘍に引きつける重要なアゴニストの1つである。MCP-1のインヒビターはマウスで血管形成および腫瘍増殖を低下させる（M. Koga et al. 2008, Biochem Biophys Res Commun, 365(2):279-84）。最初IL-8／CXCL8はその白血球走化性活性として特徴づけられた（前記は腫瘍原性およびプロ-血管形成特性を有することが知られている）（K. Xie et al. 2001, Cytokine Growth Factor Rev, 12(4):375-91）。
【００４３】
アクチビンA、エンドテリン-1（EDN1）および血小板由来増殖因子BB（PDGF-BB）をELISAによって解析した。3つのタンパク質のいずれもDI-17E6およびシレンジチドに応答してダウンレギュレートされた（図7−9）。EDN1は、血管形成を含む多数の腫瘍促進活性を媒介する。前記は、インテグリン連関キナーゼ（ILK）（インテグリンによって誘引される細胞内シグナル伝達を伝えるマルチドメイン巣状粘着タンパク質）を調節する（L. Rosano et al. 2006, Mol Cancer Ther, 5(4):833-42）。アクチビンA（2つのインヒビンβαサブユニットのホモダイマー）はアクチビン／インヒビンファミリーのメンバーである（前記は形質転換増殖因子β（TGF-β）スーパーファミリーに属する）。アクチビンAは、発生および生殖プロセス、炎症、癌および血管形成を含む広域の生物学的活性を示す。血管形成の調節におけるアクチビンAの役割は矛盾する。なぜならばプロ-血管形成および抗血管形成機能が報告されているからである（E. Panopoulou et al. 2005, Cancer Res, 65(5):1877-86；V. Poulaki et al. 2004, Am J Pathol 164(4):1293-302）。PDGF-BBは、4つのPDGFリガンド（PDGF-A、PDGF-B、PDGF-CおよびPDGF-D）の1つである（L. Fredriksson et al. 2004, Cytokine Growth Factor Rev, 15:197-204）。前記は、リガンドおよびレセプターのVEGF/PDGFスーパーファミリー（それらの緊密な配列相同性および進化的関連性により一緒に分類されている）に属する。PDGF-BBはしばしば抗レベルで多様な腫瘍組織で発現される（M. Nguyen et al. 1994, J Natl Cancer Inst, 86:356-361）。前記は血管周囲細胞のための有糸分裂誘導性および走化性因子であり、血管壁アッセンブリー時の血管細胞の調節において決定的な役割を果たす（P. Lindahl et al. 1997, Science, 277:242-245）。
【００４４】
前記識別バイオマーカーの他の種々の血管形成インヒビター（スニチニブおよびソラフェニブ）に応答する調節を解析して、前記識別バイオマーカーが血管形成阻害と一般的に相関関係を有するか否かを判定した。両インヒビターは、キナーゼのATP結合触媒部位と結合することによって無関係の作用メカニズムにより機能する小分子マルチキナーゼインヒビターである（A. Morabito et al. 2006, Current Status and Future Oncologist, 11:753-764）。
スニチニブおよびソラフェニブで処理した後、バイオマーカー候補のレベルを内皮細胞の上清で解析した。インテグリンインヒビターについて認められたように、いくつかのバイオマーカーがこれらのキナーゼインヒビターに応答して調節された。例えば、STC-1はどちらかの薬剤に応答してダウンレギュレートされ（図10）、一方、EDN1はアップレギュレートされた（図11）。興味深いことに、逆の調節がインテグリンインヒビターについて認められた。IL-8は、キナーゼによってそれぞれ弁別的に調節された。スーテントはこのケモカインのアップレギュレーションを引き起こし、一方、ソラフェニブは処理後にタンパク質レベルを低下させた（図12）。インテグリンインヒビターの場合、弁別的調節がまた観察された。これらのデータを総合すれば、前記識別バイオマーカーは、インテグリンインヒビターと同様にキナーゼインヒビターの活性のモニタリングに用いることが可能であることを示している。しかしながら、内皮細胞のホメオスタシスで別個の作用が予想されるかもしれない。なぜならば、それぞれのタンパク質は異なる態様で調節され、別個の生物学的応答を生じ得るからである。全ての薬剤が別個の作用メカニズムにより機能しているので、異なるバイオマーカーの調節に関係する経路は種々のインヒビター間でおそらく相違する。
要約すれば、インテグリンインヒビターの薬力学的作用と相関関係を示す薬剤特異的バイオマーカーが、内皮細胞培養の遺伝子発現プロフィルで識別された。前記識別候補のいくつかは細胞上清で薬剤調節タンパク質として確認され、体液での検出の可能性が示唆された。これら候補のいくつかはまた無関係のマルチキナーゼインヒビターによって調節され、これらバイオマーカーは、内皮細胞のホメオスタシスおよび血管形成における作用のモニタリングに広い意味で利用できることが提唱された。
【００４５】
２．in vivo血管形成モデルの手段による薬剤調節血漿バイオマーカーの識別
このモデルでは、血管形成は血管形成増殖因子bFGFによってマトリゲルプラグで誘導される。bFGFを含むマトリゲルプラグを健康なキノモルグスモンキーの腹部皮下に移植し、その後直ちにこの動物に種々の用量のDI-17E6を静脈内注射した。血管形成の評価は、マトリゲル移植後にマトリゲルプラグ内のヘモグロビン含有量を定量することによって実施した。マトリゲルプラグを移植した種々の動物で各条件を試験した。DI-17E6によるサルの処理は新規血管の形成を全ての用量で阻止することが判明した（図13）。
DI-17E6のPD作用と相関関係を有するバイオマーカーを識別するために、処理前および処理後に血漿サンプルを採集した。種々のタンパク質の絶対濃度は、それぞれの標準物と比較することによってルミネックスで測定した。生のデータをログ変換によってプレプロセッシングを実施し、さらにDI-17E6処理群をプラセボ処理動物と各時点で比較することによりDI-17E6の作用をt-検定解析で調べた。
有意に調節されるタンパク質にはC-反応性タンパク質（CRP）およびIL-6、CD40リガンドおよびMMP9が含まれる。CRPおよびIL-6は、DI-17E6による処理に応答してアップレギュレートされた（図14）。対照的に、CD40リガンドおよびMMP9はコントロール群で特異的に調節された。144時間後、プラセボ処理動物でCD40リガンドはダウンレギュレートされ、MMP9はアップレギュレートされた（図15）。CRPは炎症マーカーであり、急性期応答の重要な媒介物質である（MB. Pepys et al. 1983, Adv Immunol 34:141-212）。前記は損傷細胞を認識し、免疫系と相互作用することによってそれらの排除を開始させ、したがってDI-17E6処理に応答して損傷した細胞の除去に関与するかもしれない。IL-6は、血管形成および腫瘍増殖に付随する多面発現性サイトカインである（ET. Keller et al. 1996, Front Biosci, 1:340-357；B. Ancrile et al. 2007 Jul, Genes Dev, 21(14):1714-9）。DI-17E6処理に応答するIL-6のアップレギュレーションはその薬理学的活性と矛盾するように思われるが、他の血管形成インヒビターについて認められるように調節性フィードバックループを表しているのかもしれない。CD40リガンドは、腫瘍壊死因子αと構造的に関連するトランスメンブレンタンパク質である。前記は、炎症、血栓症および新血管形成に寄与するプロ-炎症性およびプロ-凝固性因子である（P. Ferroni et al. 2007, Curr Med Chem, 14(20):2170-80）。最後に、MMP9は、細胞外環境のホメオスタシスの媒介に役割を果たすマトリックスメタロプロテイナーゼファミリーに属する。プロ-腫瘍原性および抗腫瘍原性活性の両方が報告されている（M. Egeblad et al. 2002, Nature Rev Cancer 2:161-174）。前記は新血管再建を調整し、腫瘍の増殖を促進する（M. Seandel et al. 2008, Cancer Cell 13(3):181-3）。
要約すれば、ヒトの体液で検出することが可能であり、標的調節の考えに資する証明の提供；適切な用量およびスケジュールの選択；および臨床成果の潜在的な説明または予測のために用いることが可能な薬剤特異的薬力学的血漿バイオマーカーが検出された。これら識別バイオマーカーのうち、CRPおよびMMPは、DI-17E6処理後の血管形成の阻止に機械学的に必要とされるかもしれない。
【００４６】
３．要旨
これら2つの研究で、インテグリンインヒビターおよびマルチキナーゼインヒビターのためのいくつかのPDバイオマーカーが識別された。前記はヒトの体液で検出可能であり、標的調節の考えについての証明を提供し；用量およびスケジュールの論理的選択を提供し；さらに臨床成果を潜在的に説明または予測することが可能である。興味深いことには、ほとんどの候補は血管形成に付随し、したがって薬剤処理後の血管形成の阻止に機械学的に必要とされるかもしれない。興味深いことに、いくつかのバイオマーカーは異なる作用メカニズムを有する無関係の薬剤によって調節され、それらを内皮細胞のホメオスタシスおよび血管形成に対する作用のモニタリングに一般的に用いることが可能であること、したがって種々の薬剤クラス（インテグリンインヒビター（例えばシレンジチド、DI-17E6）、VEGFインヒビター（例えばアバスチン）、マルチキナーゼインヒビター（例えばスニチニブおよびソラフェニブ）を含む）のために利用することが適切であることが示唆された。
【実施例１】
【００４７】
DI-17E6はHUVEC上清でいろいろなレベルのADAMTS1タンパク質を誘導する
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のDI-17E6とともに6時間から72時間インキュベートした。培養上清を採集しウェスタンブロッティングによりADAMTS1について解析した。A）ADAMTS1（65kDおよび85kD）のDI-17E6媒介調節（図2）。
【実施例２】
【００４８】
シレンジチドはHUVEC上清でいろいろなレベルのADAMTS1タンパク質を誘導する
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のシレンジチドとともに6時間から72時間インキュベートした。培養上清を採集しウェスタンブロッティングによりADAMTS1について解析した。A）ADAMTS1（65kDおよび85kD）のシレンジチド媒介調節（図3）。
【実施例３】
【００４９】
DI-17E6およびシレンジチドはHUVEC上清でいろいろなタンパク質レベルのSTC-1を誘導する
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のDI-17E6またはシレンジチドとともに24時間から72時間インキュベートした。培養上清を採集しウェスタンブロッティングによりSTC-1について解析した。A）DI-17E6に応答するSTC-1の調節。B）シレンジチドに応答するSTC-1の調節。（図4）。
【実施例４】
【００５０】
DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるMCP-1の調節
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のDI-17E6またはシレンジチドとともに6時間から72時間インキュベートした。培養上清を採集しルミネックスによりMCP-1について解析した。A）DI-17E6に応答するMCP-1の調節。B）シレンジチドに応答するMCP-1の調節。（図5）。
【実施例５】
【００５１】
DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるIL-8の調節
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のDI-17E6またはシレンジチドとともに6時間から72時間インキュベートした。培養上清を採集しルミネックスによりIL-8について解析した。A）DI-17E6に応答するIL-8の調節。B）シレンジチドに応答するIL-8の調節。（図6）。
【実施例６】
【００５２】
DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるPDGF-BBの調節
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のDI-17E6またはシレンジチドとともに6時間から72時間インキュベートした。培養上清を採集しELISAによりPDGF-BBについて解析した。A）DI-17E6に応答するPDGF-BBの調節。B）シレンジチドに応答するPDGF-BBの調節。（図7）。
【実施例７】
【００５３】
DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるEDN1の調節
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のDI-17E6またはシレンジチドとともに6時間から72時間インキュベートした。培養上清を採集しELISAによりEDN1について解析した。A）DI-17E6に応答するEDN1の調節。B）シレンジチドに応答するEDN1の調節。（図8）。
【実施例８】
【００５４】
DI-17E6およびシレンジチドに応答するHUVECにおけるアクチビンAの調節
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のDI-17E6またはシレンジチドとともに6時間から72時間インキュベートした。培養上清を採集しELISAによりアクチビンAについて解析した。A）DI-17E6に応答するアクチビンAの調節。B）シレンジチドに応答するアクチビンAの調節。（図9）。
【実施例９】
【００５５】
スーテントおよびソラフェニブに応答するHUVECにおけるSTC-1の調節
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のスーテントまたはソラフェニブとともに6時間から48時間インキュベートした。培養上清を採集しウェスタンブロッティグによりSTC-1について解析した。A）スーテントに応答するSTC-1の調節。B）ソラフェニブに応答するSTC-1の調節。（図10）。
【実施例１０】
【００５６】
スーテントおよびソラフェニブに応答するHUVECにおけるEDN-1の調節
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のスーテントまたはソラフェニブとともに6時間から48時間インキュベートした。培養上清を採集しウェスタンブロッティグによりEDN-1について解析した。A）スーテントに応答するEDN-1の調節。B）ソラフェニブに応答するEDN-1の調節。（図11）。
【実施例１１】
【００５７】
スーテントおよびソラフェニブに応答するHUVECにおけるIL-8の調節
HUVECをビトロネクチン被覆皿で一晩培養し、さらに種々の濃度のスーテントまたはソラフェニブとともに6時間から48時間インキュベートした。培養上清を採集しルミネックスによりIL-8について解析した。A）スーテントに応答するIL-8の調節。B）ソラフェニブに応答するIL-8の調節。（図12）。
【実施例１２】
【００５８】
DI-17E6はサルのマトリゲルプラグで血管形成を阻害する
DI-17E6によるサルのマトリゲルプラグでの血管形成阻害。血管形成は、キノモルグスモンキーの皮下のマトリゲル移植物（bFGF 5μg/mLを含む）で誘導された。DI-17E6を100、30、10または3mg/kgでの1回輸液として投与した。6日後に、マトリゲルプラグのヘモグロビン含有量を測定することによって血管形成を定量した。*はp値が0.05未満であることを示し、**はp値が0.01未満であることを示す（図13）。
【実施例１３】
【００５９】
DI-17E6による処理に応答する血漿CRPおよびIL-6の調節
キノモルグスモンキーにbFGF含有マトリゲルプラグおよび種々の濃度のDI-17E6を６日間移植した。血漿を採集しルミネックスによりCRPおよびIL-6について解析した。A）CRPの調節。B）IL-6の調節。（図14）。
【実施例１４】
【００６０】
DI-17E6による処理に応答する血漿CD40リガンドおよびMMP9の調節
キノモルグスモンキーにbFGF含有マトリゲルプラグおよび種々の濃度のDI-17E6を６日間移植した。血漿を採集しルミネックスによりCD40リガンドおよびMMP9について解析した。A）CD40リガンドの調節。B）MMP9の調節。（図15）。
【実施例１５】
【００６１】
インテグリン特異的シグナル伝達経路の阻害
増殖因子刺激の他に、インテグリンに媒介される細胞外マトリックスへの接着は、細胞の増殖、生存および遊走の促進のために重要である。インテグリン結合に際して、Ras、MAPK、FAK、Src、Rac/Rho/cdc42 GTPaseの活性化を含む広域の細胞内シグナル伝達事象が誘導される。血管形成時の内皮細胞の生存を支援するために、FAKとともにインテグリンアルファ(V)ベータ(3)／(5)が、MAPKカスケード（すなわちERK1/2）の持続的活性化のために要求される。本実験では、2つのインテグリンインヒビター、DI-17E6およびシレンジチドの内皮細胞でのインテグリン媒介シグナル伝達経路における作用が解析された。この目的のために、ヒトの臍静脈内皮細胞（HUVEC）をビトロネクチンにプレートし、アルファ(V)ベータ(3)インテグリンを活性化し、続いて培養液または種々の濃度のDI-17E6またはシレンジチドで処理した。24時間処理した後、細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロッティングによって解析した。シグナル伝達経路における作用は、それぞれのシグナル伝達分子の全レベル対リン酸化レベル比を比較することによって判定し、細胞剥離により現れる潜在的作用を説明した。図16から分かるように、0.01μg/mLから10μg/mLの濃度範囲のDI-17E6および0.01μMから10μMの濃度範囲のシレンジチドが、用量依存態様でFAKおよびERK1/2の活性化を阻止した。
【図１Ａ）】
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【図１Ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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