(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸またはその塩、難溶性有機窒素源、炭素源である糖アルコールを含有する培地で菌株コレオフォマ・エンペトリF-11899(FERM BP2635)またはその誘導変異菌株を培養し、下記式I化合物またはその塩を得る、式Iで示される化合物またはその塩を製造する方法であって、
前記アミノ酸がグルタミン酸、プロリン、オルニチン、トレオニンまたはこれらの塩からなる群のうちの１種または１種以上の混合物であり、
前記難溶性有機窒素源が大豆粕、大豆タンパク質分離物、落花生ミール、綿実ミール、大豆ミールからなる群のうちの１種または１種以上の混合物であり、
前記糖アルコールがプロパントリオール（グリセリン）、エリトリトール、キシリトール、リビトール、アラビニトール、ソルビトール、マンニトール及びガラクチトールからなる群のうちの１種または１種以上の混合物であり、
前記誘導変異菌株がCGMCC 4129であることを特徴とする製造方法。
【化１】
0005818915.tif 000006
（ただし、Rは、Hまたは薬学的に許容される付加塩を形成することができるカチオンを表す。）
【請求項２】
培地の全重量で計算すると、前記アミノ酸またはその塩の濃度が０．５〜５．０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
培地の全重量で計算すると、前記難溶性有機窒素源の濃度が０．５〜３．０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
培地の全重量で計算すると、前記糖アルコールの濃度が１．０〜１０．０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記菌株の培養は、２０℃〜３０℃、ｐＨ５．５〜６．５で行われることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記菌株の培養過程において、糖アルコール及びアミノ酸またはその塩を追加することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記糖アルコール及びアミノ酸またはその塩を追加するタイミングは、４０〜８０時間培養した時点であることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
培養液の最初の体積で計算すると、追加される糖アルコールの量は、毎日０．５％〜３％で、追加されるアミノ酸またはその塩の量は、毎日０．１％〜１％であることを特徴とする請求項６又は７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状リポペプチド化合物を生合成する方法、具体的に、生物発酵で式I化合物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌感染は、既に免疫不全患者の発症率及び死亡率が向上する要因となっている。過去の20年で、真菌感染の発症率が顕著に増加してきた。真菌感染の危険性が高い人は、重篤な患者、外科の患者およびHIV感染、血液癌や他の腫瘍の患者を含む。臓器移植の患者も、同様に真菌感染の危険性が高い人である。
【０００３】
エキノカンジンは、新規な抗真菌薬として、カンジダ菌やアスペルギルス菌による感染の治療に効果が優れたものである。このような薬物は、典型的にカスポファンギンやミカファンギンがある。エキノカンジン系薬物は、1,3-βグリコシド結合の形成を阻害することによって真菌を抑制することで、人体への障害をより減少させ、効率的で且つできるだけ副作用を低下させるため、使用の過程において従来の抗真菌薬よりも安全である。
【０００４】
FK463(ミカファンギン)は、式IIIで示される化合物で、式I化合物FR901379を前駆体として酵素で側鎖を除去して得られる式IIの化合物FR179642をさらに化学修飾したものである。このように、ミカファンギンを得るには、式I化合物の発酵生産量が重要である。
【０００５】
しかし、式I化合物の発酵はずっと低いレベルにとどまっており、低コストで高生産量の培地の開発に努力してきたが、結果がなかなか得られない。これは、式I化合物の製造の難易度を高め、コストが向上することで、間接的にFK463を高価にさせる。そのため、低コストで効率的な式I化合物を合成する方法が切望されている。
【０００６】
日本の藤沢薬品工業株式会社は、非特許文献１において、トウモロコシデンプンの代わりに可溶性デンプンを用いて殺菌後の培地の粘度を低下させ、且つ硫酸塩とリン酸塩を入れて発酵過程におけるpHをコントロールし、A-3培地を得た。その後、同社は、また非特許文献２において、A-3培地をさらに改善し、A-3培地により高濃度の硫酸アンモニウムを入れてさらに粘度を低下させ、綿実粉の代わりにコーンスティープリカーを使用することで、式I化合物の生産量がより高い培地A-4を得た。
【０００７】
しかし、式I化合物の生産量のさらなる向上が必要とされ、しかも上述した培地の粘度がまだ高く、発酵の過程において菌体が球状に生長するため、発酵の過程における溶解酸素のコントロールおよび後過程のろ過操作に不利である。
【０００８】
本発明者らは、創造性のある思考と大量の試験を経て、式I化合物の生産量を高める培地を見出し、この培地で発酵を行うと、粘度が低く、溶解酸素のコントロールが容易で、菌糸体が球状に生長することがない。
【０００９】
【化１】
0005818915.tif 000002
【００１０】
【化２】
0005818915.tif 000003
【００１１】
【化３】
0005818915.tif 000004
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】”Improvement of FR901379 production by mutant selection and medium optimization”, Journal of Bioscience and Bioengineering, VOL 107No.5,530-534,2009
【非特許文献２】”Scale-up fermentation of echinocandin type antibiotic FR901379, Journal of Bioscience and Bioengineering”, VOL 109 No. 2,138-144,2010
【発明の概要】
【００１３】
本発明の解決しようとする技術課題は、式I化合物の発酵生産菌に、式I化合物の生産量を高める培地を提供することである。
【００１４】
そのため、発明者らは、振とう培養試験において、まず、炭素源として小分子の有機物を使用することによって培地の粘度を低下させ、且つ最適化実験で本発明における炭素源物質の種類およびその含有量を確定した。前駆体物質にできることから、発明者らは、各種のアミノ酸またはその塩を添加することによってその式I化合物の生産能力を高め、且つ最適化によって本発明におけるアミノ酸またはその塩の種類およびその含有量を確定した。また、菌体の生長に必要な微量元素および成長因子と提供するため、培地にさらに酵母エキスや各種の微量の金属イオンを入れた。上述した培地に対する改善によって、菌株の振とう培養における式I化合物の生産能力が大幅に向上し、且つ発酵液の粘度が低く、菌体のろ過が非常に容易になった。
【００１５】
発明者らは、上述培地を50Lに拡大したとき、菌体が正常に生長できなくなり、菌量が少なく、且つ球状に集まりやすくなり、式I化合物の生産量も低くなった。発明者は、接種量、溶解酸素、撹拌・せん断などによる可能性を排除した後、難溶性有機窒素源を添加することによってこの問題をうまく解決できることを見出し、さらに最適化試験で本発明における有機窒素源の種類およびその含有量を確定した。
【００１６】
上述した培地に対するさらなる改善によって、菌株の50Lのシステムにおける式I化合物の生産能力が大幅に向上し、且つ発酵液の粘度が低く、菌体のろ過が非常に容易になった。さらに、発明者らは、上述した培地を3000Lに拡大したところ、50Lのシステムと同様の結果になった。
【００１７】
本発明で使用される菌株は、コレオフォマ・エンペトリ（Coleophoma empetri）F-11899(FERM BP2635)、およびその誘導変異で選択培養した菌株である。例えば、中国特許出願CN201010587865.4に記載の受託番号がCGMCC4129である誘導変異で選択培養した菌株が挙げられるが、これに限定されない。
【００１８】
発明者らは、コレオフォマ・エンペトリ F-11899(FERM BP2635)に基づいて本発明を完成し、且つかかる培地は同様にそれに続く複種の誘導変異した菌株に適することを見出した。
【００１９】
本発明に係る式I化合物を製造するための培地には、以下の基質を必要成分として含有する。
（1）アミノ酸またはその塩、
（2）難溶性有機窒素源、
（3）糖アルコール。
【００２０】
この培地に必要成分としてアミノ酸またはその塩を含有し、前記アミノ酸は、グルタミン酸、プロリン、オルニチン、トレオニンまたはこれらの塩の1種または1種以上の混合物であり、グルタミン酸、プロリンが好ましい。培地における濃度が0.5〜5.0wt％である場合、効果が特に優れる。
【００２１】
この培地に必要成分として難溶性有機窒素源を含有し、前記有機窒素源は、大豆粕、大豆タンパク質分離物、落花生ミール、綿実ミール、大豆ミールの1種または1種以上の混合物であってもよく、綿実ミール、大豆ミール、落花生ミールなどの顆粒系の難溶性有機窒素源が好ましい。培地における濃度が0.5〜3.0wt％である場合、効果が特に優れる。
【００２２】
この培地に必要成分として炭素源である糖アルコールを含有し、前記糖アルコールはプロパントリオール（グリセリン）、エリトリトール、キシリトール、リビトール、アラビニトール、ソルビトール、マンニトール及びガラクチトールの1種または1種以上の混合物であり、ソルビトール、マンニトールやガラクチトールなどのヘキシトールが好ましい。培地における濃度が1.0〜10.0wt％である場合、効果が特に優れ、より好ましい濃度が2.0〜8.0wt％である。
【００２３】
本発明の培地に、必要成分として、ある程度の量の、例えば酵母エキス、マグネシウム塩、硫酸塩や他の微量元素などの他の基質を含有する。
【００２４】
本発明の好適な例において、前記の菌の培養過程でさらに糖アルコールおよびアミノ酸またはその塩を追加する。
【００２５】
ここで、糖アルコールおよびアミノ酸またはその塩を追加するタイミングは、40〜80時間培養した時点であることが好ましい。培養液の最初の体積で計算すると、追加される糖アルコールの量は、毎日0.5％〜3％で、追加されるアミノ酸またはその塩の量は、毎日0.1％〜1％である。具体的な追加のタイミングおよび量は、最初の培地における糖アルコールおよびアミノ酸またはその塩の含有量で決定する。最初の培地における含有量が高い場合、追加のタイミングを適当に遅くし、追加の量を適当に減少させてもよい。最初の培地における含有量が低い場合、追加のタイミングを適当に早くし、追加の量を適当に増加させてもよい。
【００２６】
本発明の過程において使用される種菌培地および一部のプロセスのパラメーターのコントロールは非特許文献２における種菌の培養方法および発酵プロセスのパラメーターのコントロールを参照する。
【００２７】
本発明の主な利点は以下の通りである。
１．本発明は、式I化合物の発酵の力価を大幅に高めることができる培地を提供し、この培地における式I化合物の力価の向上によって、抽出および後の処理の過程における有機溶媒の使用量を減少し、環境へのダメージを軽減する。
２．本発明は、発酵の粘度を大幅に低下させ、且つ菌体の生長形態を改善する培地を提供し、この培地は粘度を低下させ、且つ菌体の生長形態を改善することで、発酵の過程における溶解酸素がコントロールしやすく、且つ発酵後の菌体のろ過が非常に容易で、エネルギー消費および生産コストを低下させる。
３．本発明は、式I化合物の発酵の生産量を大幅に高めることで、式I化合物および後の式II化合物と式III化合物の生産コストを低下させ、式I化合物の産業化生産および式III化合物の普及により有利である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明者らは、幅広く深く研究したところ、従来の発酵培地の最適化手段によって、式I化合物の発酵生産に適する培地を得て、この発酵培地に基づいて本発明を完成した。
【００２９】
ここで用いられるように、「式Iで示される化合物」または「式I化合物」は、いずれも以下の構造式を持つ化合物またはその薬学的に許容される塩を指し、入れ替えて使用することができる。
【００３０】
【化４】
0005818915.tif 000005
【００３１】
ただし、Rは、Hまたは薬学的に許容される付加塩を形成することができるカチオンを表す。
【００３２】
薬学的に許容される塩は、好ましく、金属塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、有機塩基と形成した塩（例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン塩など）など、有機酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩など）、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、アミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）と形成した塩などを含む。
【００３３】
本発明で使用される菌株は、コレオフォマ・エンペトリ F-11899(FERM BP2635)、およびその誘導変異で選択培養した菌株である。例えば、中国特許出願CN201010587865.4に記載の受託番号がCGMCC4129である誘導変異で選択培養した菌株が挙げられるが、これに限定されない。
【００３４】
本発明の生産方法は、誘導変異で選択培養した菌株および発酵の条件以外、他の条件、例えば、式I化合物の抽出、精製のプロセスが既存の技術における式I化合物の生産方法とほぼ同様である。
【００３５】
本発明の式I化合物を生産するための発酵条件は、上述した必要栄養元素、例えばアミノ酸、難溶性有機窒素源、糖アルコールの他、酵母エキス、マグネシウム塩、硫酸塩および他の微量元素などを含有する必要がある。pH5.5〜6.5（好ましくはpH5.7〜6.2）且つ20℃〜30℃（好ましくは23℃〜28℃）の条件で発酵が行われる。
【００３６】
好適な培地の一部は、以下の通りである。
【００３７】
斜面培地は、ポテトブドウ糖寒天培地（PDA）を使用し、その組成は、ポテト30％、ブドウ糖2％、寒天1.5％である。
【００３８】
種菌培地は、非特許文献２における配合を使用し、その組成は、ショ糖1％、綿実ミール2％、乾燥酵母1％、ペプトン1％、KH2PO4  0.2％、CaCO3  0.2％、消泡剤0.05％である。
【００３９】
発酵培地（比較例において）は、非特許文献２における配合を使用し、その組成は、可溶性デンプン12％、米糠油3％、コーンスティープリカー4％、(NH4)2SO4  1％、KH2PO4  0.5％、MgSO4・７H2O  0.2％、Adekanol  LG-109  0.05％である。
【００４０】
本発明における発酵培地の組成は、アミノ酸またはその塩（好ましくはグルタミン酸、プロリン）0.5〜5.0wt％、難溶性有機窒素源（好ましくは大豆ミール、綿実ミール、落花生ミール）0.5〜3.0wt％、糖アルコール（好ましくはソルビトール、マンニトールやガラクチトール）2.0〜8.0wt％、(NH4)2SO4  0.1〜1.0％、KH2PO4  0.1〜0.5wt％、MgSO4・７H2O  0.02〜0.2wt％、微量元素1.0〜2.0wt％、消泡剤0.05wt％である。
【００４１】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００４２】
好適な発酵で式I化合物を生産する過程は、以下の通りである。
【００４３】
菌株コレオフォマ・エンペトリ F-11899(FERM BP2635)または誘導変異菌株CGMCC 4129を25℃で斜面で6〜10日培養して成熟させ、成熟した菌糸体または胞子を種菌培地に接種し、さらに25℃でシェーカーで回転数280RPMで2〜4日培養する。
【００４４】
発酵培地に2〜10％の種菌培養液を接種した後、全自動発酵タンクで培養し、培養温度が23℃〜28℃で、pHをpH5.7〜6.2に維持する。菌体が3〜6日生長したら、毎日1〜6％の炭素源（糖アルコール、デンプン）を、1〜4％の窒素源（アミノ酸、たとえばプロリン、グルタミン酸、トレオニンなど）とともに追加し、培養は一般的に8〜12日維持する。
【００４５】
式I化合物の測定方法は、以下の通りである。
【００４６】
所定体積の発酵液を取り、発酵液の2倍体積のメタノールを入れ、撹拌して式I化合物を抽出した後、遠心で菌糸体を除去し、HPLC外標準法で抽出液における式I化合物の含有量を測定する。
【００４７】
実施例において式I化合物のHPLC検出に使用される方法は、以下の通りである。
【００４８】
Waters分析性HPLC系で分析を行う。FR901379、PneumocandinB0および他の類似物の測定に逆相HPLC分析を使用する。逆相分析はCALESIL ODSカラム（粒子径5μm、4.6mmi.d×250mm）を使用し、且つ35℃に保持する。50％アセトニトリル/0.5％リン酸二水素アンモニウム水溶液を移動相とし、流速が1ml/分で、且つ210nmにおけるUV検出を行う。
【００４９】
実施例における発酵液の粘度の測定方法は、本分野で公知の方法で、例えばBrookfield粘度計で測定する。
【００５０】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われた。別の説明がない限り、すべての百分率、比率、比例或いは部は、重量で計算される。
【００５１】
本発明における重量体積百分率の単位は当業者にとって熟知で、例えば100mLの溶液における溶質の重量を指す。
【００５２】
別の定義がない限り、本文に用いられるすべての専門用語と科学用語は、本分野の技術者に知られている意味と同様である。また、記載の内容と類似或いは同等の方法及び材料は、いずれも本発明の方法に用いることができる。ここで記載の好ましい実施方法及び材料は例示のためだけである。
【００５３】
［実施例1］発酵菌株の調製  コレオフォマ・エンペトリ F-11899(FERM BP2635)
非特許文献２における種菌の培養方法を参照してコレオフォマ・エンペトリ F-11899(FERM BP2635)の種菌液を調製し、後の式I化合物の発酵に備えた。
【００５４】
斜面培地は、ポテトブドウ糖寒天培地（PDA）を使用し、その組成は、ポテト30％、ブドウ糖2％、寒天1.5％であった。
【００５５】
種菌培地の組成は、ショ糖1％、綿実ミール2％、乾燥酵母1％、ペプトン1％、KH2PO4  0.2％、CaCO3  0.2％、消泡剤0.05％であった。
【００５６】
菌株コレオフォマ・エンペトリ F-11899(FERM BP2635)を25℃で斜面で6〜10日培養して成熟させ、成熟した菌糸体または胞子を種菌培地に接種し、さらに25℃でシェーカーで回転数280RPMで2〜4日培養した。
【００５７】
［実施例2］発酵菌株の調製（誘導変異株CGMCC4129）
非特許文献２における種菌の培養方法を参照して誘導変異株CGMCC4129の種菌液を調製し、後の式I化合物の発酵に備える。
【００５８】
斜面培地は、ポテトブドウ糖寒天培地（PDA）を使用し、その組成は、ポテト30％、ブドウ糖2％、寒天1.5％である。
【００５９】
種菌培地の組成は、ショ糖1％、綿実ミール2％、乾燥酵母1％、ペプトン1％、KH2PO4  0.2％、CaCO3  0.2％、消泡剤0.05％であった。
【００６０】
菌株CGMCC4129を25℃で斜面で6〜10日培養して成熟させ、成熟した菌糸体または胞子を種菌培地に接種し、さらに25℃でシェーカーで回転数280RPMで2〜4日培養した。
【００６１】
［実施例3］式I化合物の調製
250ml振とうフラスコに、マンニトール濃度5％、酵母エキス濃度0.5％、L-プロリン濃度1％、綿実ミール濃度1％、硫酸アンモニウム濃度0.1％、硫酸マグネシウム濃度0.06％、微量元素溶液濃度0.1％、MES濃度2％の培地50mlを入れ、pHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例1で得られた種菌1ml（2％）をこの培養液に接種し、25℃で280RPMで240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2200cpで、その式I化合物の含有量が0.5g/Lであった。
【００６２】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００６３】
［実施例4］式I化合物の調製
250ml振とうフラスコに、マンニトール濃度4％、グルタミン酸ナトリウム濃度1％、トレオニン濃度0.8％、大豆ミール濃度2％、酵母エキス濃度0.8％、硫酸アンモニウム濃度0.2％、硫酸マグネシウム0.05％、微量元素溶液濃度0.1％、MES濃度2.5％の培地50mlを入れ、pHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例2で得られた種菌1ml（2％）をこの培養液に接種し、25℃で280RPMで240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2300cpで、その式I化合物の含有量が1.94g/Lであった。
【００６４】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００６５】
［実施例5］式I化合物の調製
50Lの発酵タンクに、水道水29L、大豆ミール600g（濃度2％）、マンニトール2400g（濃度8％）、L-プロリン600g（濃度2％）、酵母エキス240g（濃度0.8％）、硫酸アンモニウム30g（濃度0.1％）、硫酸マグネシウム12g（濃度0.04％）、微量元素溶液30ml（濃度0.1％）を入れ、水酸化ナトリウム又は塩酸でpHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例1で得られた種菌をこの培養液に接種し、種菌液の体積が0.9L(3％)で、培養液30Lを得た。通気量1〜2vvm、溶解酸素80％以上、pH6.0±0.5、且つ培養温度25±5℃とし、60時間培養した時点から、毎日マンニトール1％、L-プロリン0.5％（最初の培養液の体積30Lで計算）を追加した。240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が4500cpで、その式I化合物の含有量が0.50g/Lであった。
【００６６】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００６７】
［実施例6］式I化合物の調製
50Lの発酵タンクに、水道水29L、大豆ミール150g（濃度0.5％）、マンニトール300g（濃度1％）、L-プロリン750g（濃度2.5％）、グルタミン酸ナトリウム750g（濃度2.5％）、酵母エキス240g（濃度0.8％）、硫酸アンモニウム30g（濃度0.1％）、硫酸マグネシウム12g（濃度0.04％）、微量元素溶液30ml（濃度0.1％）を入れ、水酸化ナトリウム又は塩酸でpHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例1で得られた種菌をこの培養液に接種し、種菌液の体積が0.9L(3％)で、培養液30Lを得た。通気量1〜2vvm、溶解酸素80％以上、pH6.0±0.5、且つ培養温度25±5℃とし、40時間培養した時点から、毎日マンニトール1.5％、L-プロリン0.8％（最初の培養液の体積30Lで計算）を追加した。240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2300cpで、その式I化合物の含有量が0.43g/Lであった。
【００６８】
［実施例7］式I化合物の調製
50Lの発酵タンクに、水道水29L、大豆ミール900g（濃度3.0％）、マンニトール3000g（濃度10％）、L-プロリン150g（濃度0.5％）、トレオニン30g（濃度0.1％）、酵母エキス240g（濃度0.8％）、硫酸アンモニウム30g（濃度0.1％）、硫酸マグネシウム12g（濃度0.04％）、微量元素溶液30ml（濃度0.1％）を入れ、水酸化ナトリウム又は塩酸でpHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例1で得られた種菌をこの培養液に接種し、種菌液の体積が0.9L(3％)で、培養液30Lを得た。通気量1〜2vvm、溶解酸素80％以上、pH6.0±0.5、且つ培養温度25±5℃とし、80時間培養した時点から、毎日マンニトール0.5％、L-プロリン1％（最初の培養液の体積30Lで計算）を追加した。240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2600cpで、その式I化合物の含有量が0.44g/Lであった。
【００６９】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００７０】
［実施例8］式I化合物の調製
50Lの発酵タンクに、水道水29L、綿実ミール300g（濃度1.0％）、マンニトール2400g（濃度8.0％）、グルタミン酸ナトリウム900g（濃度3.0％）、トレオニン300g（濃度1.0％）、酵母エキス240g（濃度0.8％）、硫酸アンモニウム30g（濃度0.1％）、硫酸マグネシウム12g（濃度0.04％）、微量元素溶液30ml（濃度0.1％）を入れ、水酸化ナトリウム又は塩酸でpHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例1で得られた種菌をこの培養液に接種し、種菌液の体積が0.9L(3％)で、培養液30Lを得た。通気量1〜2vvm、溶解酸素80％以上、pH6.0±0.5、且つ培養温度25±5℃とし、60時間培養した時点から、毎日マンニトール1％、トレオニン0.3％（最初の培養液の体積30Lで計算）を追加し、240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2100cpで、その式I化合物の含有量が0.58g/Lであった。
【００７１】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００７２】
［実施例9］式I化合物の調製
50Lの発酵タンクに、水道水29L、落花生ミール600g（濃度2％）、マンニトール600g（濃度2％）、L-プロリン600g（濃度2％）、酵母エキス240g（濃度0.8％）、硫酸アンモニウム30g（濃度0.1％）、硫酸マグネシウム12g（濃度0.04％）、微量元素溶液30ml（濃度0.1％）を入れ、水酸化ナトリウム又は塩酸でpHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例1で得られた種菌をこの培養液に接種し、種菌液の体積が0.9L(3％)で、培養液30Lを得た。通気量1〜2vvm、溶解酸素80％以上、pH6.0±0.3、且つ培養温度25±2℃とし、50時間培養した時点から、毎日マンニトール3％、L-プロリン0.5％（最初の培養液の体積30Lで計算）を追加した。240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2900cpで、その式I化合物の含有量が0.52g/Lであった。
【００７３】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００７４】
［実施例10］式I化合物の調製
50Lの発酵タンクに、水道水29L、綿実ミール600g（濃度2％）、マンニトール1800g（濃度6％）、L-プロリン600g（濃度2％）、酵母エキス240g（濃度0.8％）、硫酸アンモニウム30g（濃度0.1％）、硫酸マグネシウム12g（濃度0.04％）、微量元素溶液30ml（濃度0.1％）を入れ、水酸化ナトリウム又は塩酸でpHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例2で得られた種菌をこの培養液に接種し、種菌液の体積が0.9L(3％)で、培養液30Lを得た。通気量1〜2vvm、溶解酸素80％以上、pH6.0±0.5、且つ培養温度25±2℃とし、50時間培養した時点から、毎日マンニトール1％、L-プロリン0.5％（最初の培養液の体積30Lで計算）を追加した。240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2300cpで、その式I化合物の含有量が2.5g/Lであった。
【００７５】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００７６】
［実施例11］式I化合物の調製
50Lの発酵タンクに、水道水29L、綿実ミール300g（濃度1％）、ソルビトール2400g（濃度8％）、L-プロリン600g（濃度2％）、酵母エキス120g（濃度0.4％）、硫酸アンモニウム30g（濃度0.1％）、硫酸マグネシウム30g（濃度0.1％）、微量元素溶液30ml（濃度0.1％）を入れ、水酸化ナトリウム又は塩酸でpHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例2で得られた種菌をこの培養液に接種し、種菌液の体積が0.9L(3％)で、培養液30Lを得た。通気量1〜2vvm、溶解酸素80％以上、pH6.0±0.5、且つ培養温度25±2℃とし、70時間培養した時点から、毎日ソルビトール1％、L-プロリン0.5％（最初の培養液の体積30Lで計算）を追加した。240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2300cpで、その式I化合物の含有量が2.0g/Lであった。
【００７７】
微量元素：FeSO4・7H2O 10 g/L、MnSO4・H2O 10 g/L、ZnSO4・7H2O 2g/L、CaCl20.7 g/L、H3BO3 0.56 g/L、CuCl2・2H2O 0.25 g/L、（NH4）6Mo7O24・7H2O 0.19g/L、濃塩酸500 mL/L。
【００７８】
［実施例12］式I化合物の調製
50Lの発酵タンクに、水道水29L、綿実ミール600g（濃度2％）、ガラクチトール2400g（濃度8％）、グルタミン酸ナトリウム300g（濃度1％）、酵母エキス120g（濃度0.4％）、硫酸アンモニウム60g（濃度0.2％）、硫酸マグネシウム15g（濃度0.05％）、微量元素溶液30ml（濃度0.1％）を入れ、水酸化ナトリウム又は塩酸でpHを5.5±0.5に調整し、121℃で30min殺菌し、実施例2で得られた種菌をこの培養液に接種し、種菌液の体積が0.9L(3％)で、培養液30Lを得た。通気量1〜2vvm、溶解酸素80％以上、pH6.0±0.5、且つ培養温度25±2℃とし、60時間培養した時点から、毎日ガラクチトール1％、グルタミン酸ナトリウム0.5％（最初の培養液の体積30Lで計算）を追加した。240時間培養した後培養を終え、サンプリングして分析したところ、最終の培養液の粘度が2600cpで、その式I化合物の含有量が1.8g/Lであった。
【００７９】
［比較例1］
50Lの発酵タンクで、非特許文献２における式I化合物の発酵方法に従い、コレオフォマ・エンペトリ F-11899(FERM BP2635)および誘導変異株CGMCC 4129をそれぞれ培養したところ、最終の培養液の粘度がそれぞれ11000cp及び9800cpで、その式I化合物の含有量がそれぞれ0.2g/L及び1.4g/Lであった。
【００８０】
［比較例2］
50Lの発酵タンクで、EP0431350B1の実施例1における式I化合物の発酵方法に従い、コレオフォマ・エンペトリ F-11899(FERM BP2635)および誘導変異株CGMCC 4129をそれぞれ培養したところ、最終の培養液の粘度がそれぞれ10500cp及び9400cpで、その式I化合物の含有量がそれぞれ0.14g/L及び1.2g/Lであった。
【００８１】
以上の説明は本発明の好ましい実施例だけで、本発明の実質の技術内容の範囲を限定するものではなく、本発明の実質の技術内容は広義的に出願の請求の範囲に定義され、他の人が完成した技術実体或いは方法は、出願の請求の範囲に定義されたものとまったく同じものであれば、或いは効果が同等の変更であれば、いずれもその請求の範囲に含まれるとみなされる。