(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多様な種類の生物学的試料に相応するターゲット核酸の定性分析または定量分析を同時に行うリアルタイム核酸分析統合装置であって、ターゲット核酸を含む多様な生物学的試料からターゲット核酸を分離精製する、多数の自動精製分注装置１００と、
列単位で選択的に測定項目が設定されるマルチウェル温度循環ブロック２１０を含み、前記多数の自動精製分注装置１００から得られた互いに異なるターゲット核酸を含む夫々の診断キットが前記マルチウェル温度循環ブロック２１０に載置され、前記多数の自動精製分注装置１００から得られた互いに異なるターゲット核酸の量をリアルタイムで測定するリアルタイム核酸増幅器２００と、を含み、
夫々の前記自動精製分注装置１００毎に分離精製される互いに異なるターゲット核酸の種類に相応するように、前記リアルタイム核酸増幅器２００の温度循環ブロック２１０上のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定し、前記自動精製分注装置１００による生物学的試料の情報を、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して保存し、前記温度循環ブロックの同一の条件下で同時増幅を行って、夫々のターゲット核酸を定性分析または定量分析する増幅結果が、前記自動精製分注装置１００で分離精製される夫々の生物学的試料に相応するように統合的に管理し、多様な種類の生物学的試料から求められる多様なターゲットの検査が一連の一段階過程により並列的に処理される制御部と、
前記制御部の定性分析または定量分析の結果をリアルタイムで出力するディスプレイ部３００と、
を含むことを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項２】
前記リアルタイム核酸増幅器の温度循環ブロック２１０上のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定し、前記自動精製分注装置１００による生物学的試料の情報を、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して保存するにあたり、陽性標準試料、陰性標準試料、または定量標準試料の情報をさらに保存することを特徴とする請求項１に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項３】
前記マルチウェル温度循環ブロック２１０は、１２列×８行のウェルからなる９６ウェルの温度循環ブロックであることを特徴とする請求項２に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項４】
前記制御部は、夫々の前記自動精製分注装置１００で多様な種類の生物学的試料とともにインターナルコントロール（ＩＰＣ）を分離する場合、前記自動精製分注装置１００による核酸分離の成功有無を前記リアルタイム核酸増幅器２００での増幅産物から判断し、核酸分離の再遂行有無を決めることができることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項５】
前記制御部は、前記リアルタイム核酸増幅器２００の同一の条件下での同時増幅により得られる夫々の生物学的試料のターゲット核酸のＣｔ値を臨界Ｃｔ値と比較し、ターゲット核酸の存在有無を定性的に検出することを特徴とする請求項１に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項６】
前記制御部は、前記リアルタイム核酸増幅器２００で同一の条件で既知の濃度の定量標準試料と夫々の生物学的試料を同時に増幅して得られる夫々のＣｔ値を定量標準試料のＣｔ値の定量グラフと比較し、ターゲット核酸の数を計算して試料内のターゲット核酸を定量的に決めることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項７】
前記自動精製分注装置１００は、核酸を含む多様な生物学的試料とこれから核酸を抽出するために用いられるバッファーが含まれているカートリッジ、冷蔵ブロック、高温ブロック、廃液筒、ピペットカートリッジが備えられた基板上への移動が可能で、ピペットの装着及び脱着が可能であり、前記ピペットの磁場の印加または解除のための磁場印加手段を備えるピペットブロックを含み、前記自動精製分注装置１００による夫々の標準試料及び生物学的試料の情報とターゲット核酸の情報が制御部に保存されることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項８】
前記リアルタイム核酸増幅器２００は、温度が所定温度に変更されるマルチウェル温度循環ブロックと、前記温度循環ブロックに装着された反応チューブへ光を照射するための照射光源と、前記反応チューブから発生する光を受光するための蛍光検出センサと、を備え、前記設定された列毎に測定項目が設定されて保存されることを特徴とする請求項２に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項９】
前記リアルタイム核酸分析統合装置は、分析結果を保存する保存データベース装置４００をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
【請求項１０】
１）多数の自動精製分注装置１００で、標準試料と核酸を含む多様な生物学的試料から各試料に含まれた核酸を分離精製した後、分離精製された溶液を核酸増幅反応混合物の反応チューブに加えて混合する段階と、
２）前記核酸増幅反応混合物の反応チューブが装着されるマルチウェル温度循環ブロック２１０と前記自動精製分注装置１００で分離精製される夫々のターゲット核酸が相応するように、マルチウェル温度循環ブロック２１０のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定し、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して、前記自動精製分注装置１００で分離される標準試料と生物学的試料の情報を保存する段階と、
３）上記段階２）で保存されたリアルタイム核酸増幅器のマルチウェル温度循環ブロック２１０の各ウェルの生物学的試料の情報に一致するように、段階１）で準備された反応チューブを各ウェルに装着する段階と、
４）前記リアルタイム核酸増幅器の温度循環ブロック２１０に装着された夫々のターゲット核酸を同一の条件下で同時に増幅して、多様な種類の生物学的試料から求められる多様なターゲットの検査が一連の一段階過程により並列的に処理されることにより、多数の生物学的試料に対する夫々のターゲット核酸を定性分析または定量分析し、増幅結果を得る段階と、
を含むことを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記１）段階は、自動精製分注装置１００で生物学的試料にインターナルコントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＰＣ）を添加して核酸を分離し、前記増幅結果から、自動精製分注装置１００でのターゲット核酸分離の成功有無と増幅効率を判断して、ターゲット核酸の検出の有効性を決めることを特徴とする請求項１０に記載のリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記１）段階において、前記核酸増幅反応混合物の反応チューブは、前記分離精製された核酸溶液を核酸増幅に必要な成分が乾燥された形態で含まれた反応チューブに加え、前記溶液と前記成分を混合することにより製造されることを特徴とする請求項１０に記載のリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記インターナルコントロールは、ターゲット核酸がＲＮＡである場合、タバコモザイクウイルス粒子であることを特徴とする請求項１１に記載のリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記インターナルコントロールは、ターゲット核酸がＤＮＡである場合、プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ増幅産物であることを特徴とする請求項１１に記載のリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイム核酸分析統合装置及びそれを利用したターゲット核酸の検出方法に関し、より詳細には、多様な種類の多数の生物学的試料から、試料に相応する遺伝子の定性分析または定量分析を同時に行うリアルタイム核酸分析統合装置及びそれを利用したターゲット核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外診断検査（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ：ＩＶＤ  ｔｅｓｔｉｎｇ）は、疾病の感染有無などを判定することを目的に、血液、尿（ｕｒｉｎｅ）、唾液（ｓａｌｉｖａ）など人体に由来する試料を検体として特定指標物質を検出したり、定量分析する検査である。分子診断検査（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ）または核酸診断検査（ＮＡＴ；ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ）は、体外診断検査市場において最も速い速度で成長している分野であるが、操作の複雑性のため大型病院及び臨床検査専門機関を中心に検査が行われている。
【０００３】
分子診断検査は、現在、感染疾患、即ちウイルス、細菌などの定性、定量検査が主となっており、感染疾患の診断検査の結果を独立的に確認したり、変異株を確認するための確認検査（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔ）などが行われている。腫瘍の早期確認、治療法の効能増加のための診断検査（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ）も速い速度で増えており、個人の遺伝子の遺伝的素因（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）による疾病に係わる異常遺伝子を検出したり、治療法の決定と薬物選択及び薬効評価のための個別化医療（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の分野で多様に応用されている。
【０００４】
現在利用されている分子診断検査の自動化システムは、核酸の抽出、増幅、確認の全過程が自動化される方式に発展している。その一例として、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社のタイグリスダイレクトチューブサンプリング（ＴＩＧＲＩＳ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｔｕｂｅ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ、ＴＩＧＲＩＳ  ＤＴＳ）システムは、米国食品医薬品局により承認を受けた最初の自動化システムであり、標的捕獲、増幅、確認、検査結果の出力過程が自動化されており、代表的な性病の一つである淋病の原因菌である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）と性感染疾患の原因菌であるクラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の感染有無を検査することができる。他の例としては、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＣＯＢＡＳシステム（Ａｍｐｌｉｐｒｅｐ、Ｔａｑｍａｎ  ａｎａｌｙｚｅｒ）、Ａｂｂｏｔｔ社のｍ２０００システム（ｍ２０００ｓｐ、ｍ２０００ｒｔ）、Ｃｅｐｈｅｉｄ社のＧｅｎｅＸｐｅｒｔシステム、ＩＱｕｕｍ  ＩｎｃのＬｉａｔ（Ｌａｂ−ｉｎ−ａ−ｔｕｂｅ）ａｎａｌｙｚｅｒなども重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）基盤の自動化システムに開発され、市場で販売されている。
【０００５】
しかし、上記のような既存の自動化システムは、一種類の試料に対して、試料の準備（Ｐｒｅｐ）−リアルタイム定量分析−記録（ｒｅｐｏｒｔ）まで一つのステップで検査が行われるようになされているため、複数の異なる種類の試料に対して、試料の準備−リアルタイム定量、定性分析−記録まで同時に検査を行うことが不可能である。
【０００６】
特に、Ｂ型肝炎の場合は患者数が多い反面、結核の場合は患者数が多くない。この場合、検査を行うために、一定数量の検体が得られるまで数日間待たなければならないという不便がある。複数の異なる種類の検体を診断検査する場合には、種類毎に異なる検査を行わなければならず、繰り返して実験を行わなければならないため、一日に多くの検査を行うことができないという欠点がある。Ｂ型肝炎ウイルスを検出するためには、Ｂ型感染の検出のための検体試料を集めて核酸を分離精製し、増幅するためには多くの時間が必要となる。
【０００７】
上記の場合のように、同一の種類の検体試料を多数得るまでは多くの時間がかかり、少ない数のＢ型肝炎検出試料を分析するためには、現在の９６ウェル核酸増幅反応器を用いるには多くの浪費が生じる。この場合には、結局、装置の作動を浪費するようになるか、または検体試料が得られるまで数日間待たなければならない。このような理由で、中小規模の病院で比較的少ない数の臨床検体から多様な臨床検査を行うことは、経済的且つ時間的に制限があるため、外部の検査機関に委託するようになり、むしろより多くの時間、コスト及び手間がかかるという問題点があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明者らは一度に多様な種類のターゲットを同時に抽出及び分析し、報告（ｒｅｐｏｒｔ）まですることができる自動化システムを研究した結果、比較的検体試料数が多くない中小規模の病院で多様な診断検査を効率的に行うために、多様な種類の検体試料を集めて当日に多様な種類の検体から核酸を抽出し、一つの核酸増幅器で同時に検出するリアルタイム核酸分析統合装置及びそれを利用したターゲット核酸の分析方法を開発し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明の目的は、多様な種類の多数の生物学的試料から、試料に相応する遺伝子の定性分析または定量分析を同時に行うリアルタイム核酸分析統合装置を提供することにある。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、前記リアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、多様な種類の生物学的試料に相応する核酸の定性分析または定量分析を同時に行うリアルタイム核酸分析統合装置を提供する。
【００１２】
また、本発明は、核酸を含む生物学的試料から、前記本発明のリアルタイム核酸分析統合装置を利用してターゲット核酸を検出する方法を提供する。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明によると、多様な種類の生物学的試料に相応するターゲット核酸の定性分析または定量分析を同時に行うリアルタイム核酸分析統合装置であって、ターゲット核酸を含む多様な生物学的試料からターゲット核酸を分離精製する、多数の自動精製分注装置１００と、列単位で選択的に測定項目が設定されるマルチウェル温度循環ブロック（multi-well temperature circulation block）２１０を含み、前記多数の自動精製分注装置１００から得られた互いに異なるターゲット核酸を含む夫々の診断キットが前記マルチウェル温度循環ブロック２１０に載置され、前記多数の自動精製分注装置１００から得られた互いに異なるターゲット核酸の量をリアルタイムで測定するリアルタイム核酸増幅器２００と、を含み、夫々の前記自動精製分注装置１００毎に分離精製される互いに異なるターゲット核酸の種類に相応するように、前記リアルタイム核酸増幅器２００の温度循環ブロック２１０上のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定（assign：割当）し、前記自動精製分注装置１００による生物学的試料の情報を、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して保存し、前記温度循環ブロックの同一の条件下で同時増幅を行って、夫々のターゲット核酸を定性分析または定量分析する増幅結果が、前記自動精製分注装置１００で分離精製される夫々の生物学的試料に相応するように統合的に管理し、多様な種類の生物学的試料から求められる多様なターゲットの検査が一連の一段階過程により並列的に処理される制御部と、前記制御部の定性分析または定量分析の結果をリアルタイムで出力するディスプレイ部３００と、を含むことを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００１５】
本発明によると、前記リアルタイム核酸増幅器の温度循環ブロック２１０上のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定し、前記自動精製分注装置１００による生物学的試料の情報を、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して保存するにあたり、陽性標準試料、陰性標準試料、または定量標準試料の情報をさらに保存することを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００１７】
本発明によると、前記マルチウェル温度循環ブロック２１０は、１２列×８行のウェルからなる９６ウェルの温度循環ブロックであることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００１９】
本発明によると、前記制御部は、夫々の前記自動精製分注装置１００で多様な種類の生物学的試料とともにインターナルコントロール（ＩＰＣ）を分離する場合、前記自動精製分注装置１００による核酸分離の成功有無を前記リアルタイム核酸増幅器２００での増幅産物から判断し、核酸分離の再遂行有無を決めることができることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００２０】
本発明によると、前記制御部は、前記リアルタイム核酸増幅器２００の同一の条件下での同時増幅により得られる夫々の生物学的試料のターゲット核酸のＣｔ値を臨界Ｃｔ値と比較し、ターゲット核酸の存在有無を定性的に検出することを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００２１】
本発明によると、前記制御部は、前記リアルタイム核酸増幅器２００で同一の条件で既知の濃度の定量標準試料と夫々の生物学的試料を同時に増幅して得られる夫々のＣｔ値を定量標準試料のＣｔ値の定量グラフと比較し、ターゲット核酸の数を計算して試料内のターゲット核酸を定量的に決めることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００２２】
本発明によると、前記自動精製分注装置１００は、核酸を含む多様な生物学的試料とこれから核酸を抽出するために用いられるバッファーが含まれているカートリッジ、冷蔵ブロック、高温ブロック、廃液筒、ピペットカートリッジが備えられた基板上への移動が可能で、ピペットの装着及び脱着が可能であり、前記ピペットの磁場の印加または解除のための磁場印加手段を備えるピペットブロックを含み、前記自動精製分注装置１００による夫々の標準試料及び生物学的試料の情報とターゲット核酸の情報が制御部に保存されることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００２３】
本発明によると、前記リアルタイム核酸増幅器２００は、温度が所定温度に変更されるマルチウェル温度循環ブロック２１０と、前記温度循環ブロックに装着された反応チューブへ光を照射するための照射光源と、前記反応チューブから発生する光を受光するための蛍光検出センサと、を備え、前記設定された列毎に測定項目が設定されて保存されることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００２４】
本発明によると、前記リアルタイム核酸分析統合装置は、分析結果を保存する保存データベース装置４００をさらに備えることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置が提供される。
【００２５】
本発明によると、１）多数の自動精製分注装置１００で、標準試料と核酸を含む多様な生物学的試料から各試料に含まれた核酸を分離精製した後、分離精製された溶液を核酸増幅反応混合物の反応チューブに加えて混合する段階と、２）前記核酸増幅反応混合物の反応チューブが装着されるマルチウェル温度循環ブロック２１０と前記自動精製分注装置１００で分離精製される夫々のターゲット核酸が相応するように、マルチウェル温度循環ブロック２１０のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定し、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して、前記自動精製分注装置１００で分離される標準試料と生物学的試料の情報を保存する段階と、３）段階２）で保存されたリアルタイム核酸増幅器のマルチウェル温度循環ブロック２１０の各ウェルの生物学的試料の情報に一致するように、段階１）で準備された反応チューブを各ウェルに装着する段階と、４）前記リアルタイム核酸増幅器の温度循環ブロック２１０に装着された夫々のターゲット核酸を同一の条件下で同時に増幅して、多様な種類の生物学的試料から求められる多様なターゲットの検査が一連の一段階過程により並列的に処理されることにより、多数の生物学的試料に対する夫々のターゲット核酸を定性分析または定量分析し、増幅結果を得る段階と、を含むことを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法が提供される。
【００２６】
本発明において、前記段階２）と段階３）は同時に行ってもよく、または段階３）が段階２）より先に行われてもよい。
【００２７】
本発明によると、前記自動精製分注装置１００で生物学的試料にインターナルコントロール（ＩＰＣ）を添加して核酸を分離し、前記増幅結果から、自動精製分注装置１００でのターゲット核酸分離の成功有無と増幅効率を判断して、ターゲット核酸の検出の有効性を決めることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法が提供される。
【００２８】
本発明によると、前記１）段階において、前記核酸増幅反応混合物の反応チューブは、前記分離精製された核酸溶液を核酸増幅に必要な成分が乾燥された形態で含まれた反応チューブに加え、前記溶液と前記成分を混合することにより製造されることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法が提供される。
【００２９】
本発明によると、前記インターナルコントロールは、ターゲット核酸がＲＮＡである場合、タバコモザイクウイルス粒子であることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法が提供される。
【００３０】
本発明によると、前記インターナルコントロールは、ターゲット核酸がＤＮＡである場合、プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ増幅産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）であることを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置は、少なくとも二つ以上の自動精製分注装置を利用して多様な種類の生物学的試料から自動で核酸を分離及び精製することができ、リアルタイム核酸増幅器で多様な試料を同一の条件で一度に同時に分析することができ、自動精製分注装置とリアルタイム核酸増幅器を管理する制御部により、検査時間を短縮し、コストを低減することができる長所がある。
【００３２】
本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法は、自動精製分注装置で生物学的試料とともに本発明のインターナルコントロールを添加して分離精製することにより、生物学的試料夫々に対する核酸分離の有無及びリアルタイム核酸増幅器での核酸増幅過程の問題を確認することができる長所がある。
【００３３】
また、夫々の自動精製分注装置で分離精製される互いに異なるターゲット核酸の種類に相応するように、列単位でマルチウェル温度循環ブロックのマルチウェル領域をターゲット核酸の種類毎に設定することができるため、多様な検体から求められる多様なターゲット検査が一連の一段階過程により並列的に処理されることにより、病気の迅速な診断が必要である病院などで効率的に使用することができる長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置の概略図である。
【図２】本発明によるリアルタイム核酸増幅器２００に備えられたマルチウェル温度循環ブロック２１０の図面である。
【図３】本発明によるディスプレイ部３００を示す図面である。
【図４】本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置の全体フローダイアグラム（ｆｌｏｗ  ｄｉａｇｒａｍ）を示す図面である。
【図５】本発明による自動精製分注装置において、カートリッジの試料ローディングウェル部分を示す図面である。
【図６】本発明のタバコモザイクウイルス粒子（ＩＰＣ）によるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）標準テンプレートのリアルタイム重合酵素連鎖反応を示すグラフである。
【図７】本発明のタバコモザイクウイルス粒子（ＩＰＣ）によるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）標準テンプレートのリアルタイム重合酵素連鎖反応のグラフに対する標準曲線（勾配：−０．２８３、Ｒ２：１）を示す図面である。
【図８】本発明のＨＢＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを利用して、リアルタイム核酸増幅器でＨＢＶ標準テンプレートＤＮＡに対するリアルタイム重合酵素連鎖反応のグラフを示す図面である。
【図９】本発明のＨＢＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを利用して、リアルタイム核酸増幅器でＨＢＶ標準テンプレートＤＮＡに対するリアルタイム重合酵素連鎖反応のグラフに対する標準曲線（勾配：−０．２８８２、Ｒ２：０．９９９７）を示す図面である。
【図１０】本発明のＨＣＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを利用して、リアルタイム核酸増幅器でＨＣＶ標準テンプレートＲＮＡのリアルタイム重合酵素連鎖反応のグラフを示す図面である。
【図１１】本発明のＨＣＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを利用して、リアルタイム核酸増幅器でＨＣＶ標準テンプレートＲＮＡのリアルタイム重合酵素連鎖反応のグラフに対する標準曲線（勾配：−０．２９７０、Ｒ２：０．９９９８）を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、添付図面を参照して本発明のリアルタイム核酸分析統合装置を詳細に説明する。以下で紹介される図面は、当業者に本発明の思想が十分に伝達されるようにするために例として提供されるものであり、誇張されて図示されることができる。
【００３６】
この際、用いられる技術用語及び科学用語において、他に定義されない限り、この発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が通常的に理解している意味を有し、下記の説明及び添付図面において、本発明の要旨を不明瞭にする可能性のある公知機能及び構成についての説明は省略する。
【００３７】
［実施例１］
実施例１は、本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置に関するものである。図１は本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置の概略図を示すものであり、以下、本発明をより詳細に説明する。
【００３８】
前記リアルタイム核酸分析統合装置は、核酸を含む多様な種類の生物学的試料から互いに異なる核酸を分離精製するための多数の自動精製分注装置１００を備える。前記生物学的試料は、自然環境から分離され、核酸を含む生物学的物質を意味する。本発明による生物学的試料は、精製または分離された核酸溶液、微生物、組職、生物学的流体、または細胞であることができる。生物学的流体には、血液、血漿、痰、尿、脳脊髄液、胃洗浄液、ロイコフォレーシス（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、人体から得られた各種検体試料などが含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の試料は、核酸を含む任意植物、動物、人体、細菌またはウイルスに由来するサンプルで構成されることができる。本発明において、核酸は通常ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド及びこれらを含む物質を意味するが、これに限定されず、本発明の装置をタンパク質などの物質を分離、検出するために採択して用いることができるであろう。
【００３９】
図１を参照すると、本発明の自動精製分注装置１００は、単一または複数、多様な種類の試料から核酸を分離するために、好ましくは２〜６個に、多数装着することを特徴とする。本発明の自動精製分注装置１００は、多数の生物学的試料溶液から核酸を分離するために磁性粒子を利用し、磁性粒子と核酸を可逆的に結合させて核酸を分離することを特徴とする。
【００４０】
前記自動精製分注装置１００は、核酸を自動で精製及び分注する装置であり、核酸を含む多様な生物学的試料とこれらから核酸を抽出するために用いられるバッファーが含まれているカートリッジ、冷蔵ブロック、高温ブロック、廃液筒、ピペットカートリッジ、このようなブロック及びカートリッジが備えられた基板上への移動が可能で、ピペットの装着及び脱着が可能であり、前記ピペットの磁場の印加または解除のための磁場印加手段を備えるピペットブロックを含む。前記ピペットブロックは８〜１６個のピペットが装着及び脱着されることができる。
【００４１】
多数の生物学的試料溶液から核酸を分離するために利用される磁性粒子は、バッファー溶液内で核酸と結合するようになり、ピペット内部に磁性粒子と結合された核酸が吸入された状態で磁場をピペットに印加する場合、核酸が結合された磁性粒子はピペット内部に凝集して付着され、その他の溶液はピペットの外に排出される。
【００４２】
本発明の磁性粒子は、表面積が広く、微細な磁性粒子を用いることが好ましい。
【００４３】
本発明において、ピペットに磁場を加えるための磁場印加手段としては、永久磁石または電磁石が用いられることができ、ピペットに可逆的に磁場を加えるようになる。ピペットの作動は、ピペットに連結されたピストンによって溶液が排出されることができ、ピペット移動手段によって移動が可能である。
【００４４】
本発明の自動精製分注装置１００は、通常の公知された自動精製分注装置を用いることができ、例えば、韓国登録特許１４８２３９号、ＵＳ５７０２５９０、ＵＳ５６４７９９４、ＥＰ０６９１５４１、ＵＳ５３３６７６０号、ＵＳ５８９７７８３号、ＵＳ６１８７２７０号、韓国特許出願１０−２００８−００３２９０４号に記載された装置が用いられることができる。また、バイオニア社のＥｘｉＰｒｅｐＴＭ（登録商標）１６−ｆｕｌｌｙ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ/ＲＮＡ/Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍが本発明の自動精製分注装置１００として好ましく用いられることができる。
【００４５】
前記自動精製分注装置１００で分離／精製された核酸は、予め装着された単位反応チューブからなる診断キットに分注される。使用者は、自動精製分注装置１００内で分注された８−ウェルストリップチューブからなる診断キットを取り出して透明フィルムで密封した後、リアルタイム核酸定量増幅器の設定された列に載置した後動作して、結果を自動で導出させる。
【００４６】
前記核酸を含む生物学的試料から核酸を分離、精製するための多数の自動精製分注装置１００は、バーコード（ｂａｒ  ｃｏｄｅ）認識装置（不図示）をさらに備えることができる。バーコード認識装置により認識された生物学的試料の情報は、データベース化されてリアルタイム核酸分析統合装置内のシステム管理（ｍａｎａｇｅｒ）ソフトウェアである制御部に保存され、このような情報はリアルタイム核酸増幅器２００にも自動適用されることができる。前記バーコードは、生物学的試料の性別、年、種類など、試料を識別するために必要な内容を示す。
【００４７】
本発明は、前記多数の自動精製分注装置１００から得られた互いに異なるターゲット核酸をリアルタイムで増幅するリアルタイム核酸増幅器２００を含む。
【００４８】
本発明のリアルタイム核酸増幅器２００は、前記自動精製分注装置１００から分離及び精製された核酸に相応する診断キットが載置され、所定温度（設定温度）に変更されるマルチウェル温度循環ブロック２１０と、前記温度循環ブロックに装着された反応チューブ内に光を照射するための光源と、反応チューブ内の検出標識から発生する光を受光するための蛍光検出センサと、を含んで構成される。前記蛍光検出センサは、ターゲット核酸に対するリアルタイム定量及び定性分析を可能にする。
【００４９】
本発明のリアルタイム核酸増幅器２００は、リアルタイム重合酵素連鎖反応が可能な装置であり、公知されたリアルタイム核酸重合酵素連鎖反応用装置が用いられることができる。好ましくは、韓国特許第７９４７０３号に記載された装置、ＰＣＴ／ＫＲ２００８／０６４５５８号に記載された装置、またはバイオニア社のＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ製品を採択して用いることができる。
【００５０】
前記リアルタイム核酸増幅器２００はマルチウェル温度循環ブロック２１０を含み、前記マルチウェル温度循環ブロックは１２列×８行のウェルからなる９６ウェルで構成されており、前記各ウェルは列単位で区分されて列単位で設定される。従って、互いに異なるターゲット核酸の種類による夫々のターゲット核酸の増幅量及びターゲット情報が、列単位でリアルタイムでディスプレイ部３００に表示されることができる。本発明では、列単位でターゲット核酸の検出項目が設定されているが、これに限定されず、行またはウェル毎に変形して設定することが可能である。
【００５１】
本発明において、前記リアルタイム核酸分析統合装置は、分析結果を保存する保存データベース装置４００をさらに備えることができる。
【００５２】
本発明のリアルタイム核酸増幅器２００は、前記自動精製分注装置１００で分離精製されるターゲット核酸の種類及び生物学的試料に関する情報を保存する。また、前記リアルタイム核酸増幅器２００は、夫々の自動精製分注装置１００で分離された夫々のターゲット核酸の種類によって、列単位でマルチウェル温度循環ブロック２１０のマルチウェル領域を設定する。前記マルチウェル温度循環ブロックで１個以上の列に設定することが好ましい。同一の検出ターゲットを有する設定領域内の各ウェルには、生物学的試料から分離された核酸と標準試料が入れられ、これらに関する情報が各ウェル毎に保存される。
【００５３】
本発明において、ウェル２１１ａは、診断キットの反応チューブが載置されることができるマルチウェル温度循環ブロック２１０の各ウェルを意味する。診断キットの種類によって、核酸増幅器の温度循環ブロック上の列単位で夫々の検出ターゲットを設定する。
【００５４】
本発明は、自動精製分注装置１００及びリアルタイム核酸増幅器２００をコルトロ−ルし、前記自動精製分注装置からの情報をリアルタイム核酸増幅器に伝達して、前記リアルタイム核酸増幅器の情報を保存及び管理するリアルタイム核酸分析統合装置の管理（ｍａｎａｇｅｒ）ソフトウェアを含む。
【００５５】
本発明で用いられる診断キットは、検出可能な標識を含み、特定ターゲット核酸を増幅するための同量のプライマー及び緩衝溶液が入っている反応チューブ５００からなっている。
【００５６】
本発明において、「反応チューブ５００」は試料を含むことができる容器を意味するものであり、１〜９６個、好ましくは８個、１２個、１６個、９６個である。これは、プラスチックまたは類似材料に形成された凹みまたはチューブであることができ、好ましくは、規則的なパターン、例えば、格子状に９６ウェル反応プレート（１２列×８行）、３８４ウェル反応プレート、または８−ウェルストリップ形態からなるチューブであることができる。
【００５７】
前記診断キットの反応チューブ５００には、ターゲット核酸を増幅するためのプライマー、検出可能な標識及び緩衝溶液を含み、前記分離された核酸が加えられて、総量は１０〜５０μｌが好ましいが、これに限定されない。多数の診断キットの互いに異なるプライマー及び／またはプローブは同一のアニール（Ｔ１）温度によって増幅され、前記診断キットの単位反応チューブ毎に互いに異なるターゲット核酸を増幅するように操作されたプライマーとプローブを含む。
【００５８】
本発明における診断キットは、核酸の特定部分を増幅するための特異的プライマー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）、蛍光が付着されたプローブ、ＤＮＡ重合酵素、ｄＮＴＰを混合した組成物が乾燥されて製造される。安定化剤を追加して乾燥することができる。乾燥方法としては、凍結乾燥、加温乾燥、真空減圧乾燥などが用いられることができる。従って、本発明における診断キットは乾燥された形態であるため、量を調節することなく分離精製された核酸溶液の一定量を添加して、直ちに核酸増幅反応混合物を製造することができる。
【００５９】
本発明において、夫々の診断キットに用いられるターゲット核酸の検出のためのプライマーは、各ターゲット核酸の診断検査のためにＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ、℃）が類似するようにデザインされた塩基配列を利用する。前記Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ、℃）はターゲット核酸の一部塩基配列に基づいて設計され、アニール温度に基づいて多様なターゲット核酸を同時に選択的に増幅するために、同一の反応温度条件に設定することが重要である。本発明によると、一人からの検体試料、または多数の人からの検体試料から同時に多数のターゲット核酸を検出することができる。例えば、ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、性病診断を、同一の増幅条件で一度に一つのリアルタイム核酸増幅器で行うことができる。
【００６０】
図２は前記多数の診断キットの反応チューブ５００が夫々対応して載置される多数のウェルを備えるマルチウェル温度循環ブロック２１０の図面である。本発明において、反応チューブ５００は、好ましくは８ストリップ、１６ストリップまたは９６ウェルプレートの形態からなることができる。
【００６１】
図２を参照すると、前記設定された列のウェル２１１ａに、同種の生物学的試料から分離精製された核酸が注入された反応チューブが載置され、同一の列に載置された反応チューブ夫々に、同一のターゲット核酸を増幅するように操作されたプライマー及び／またはプローブが含まれている。
【００６２】
図２を参照すると、前記マルチウェル温度循環ブロック２１０は、多数のウェル２１１からなる。夫々のウェル２１１ａに診断キットの反応チューブ５００が載置されることができる。本発明では、マルチウェル温度循環ブロック上に互いに異なる多数の診断キットの反応チューブが載置されることができ、列単位で、マルチウェル温度循環ブロックのマルチウェル領域をターゲット核酸の種類毎に設定する。マルチウェル温度循環ブロック上に互いに異なるターゲット核酸を含む多数の診断キットが載置され、これにより、互いに異なるターゲット核酸の種類に相応するように、列単位で、マルチウェル温度循環ブロック上のマルチウェル領域をターゲット核酸の種類毎に指定するが、増幅反応条件は同一に行われることを特徴とする。
【００６３】
本発明のリアルタイム核酸増幅器のマルチウェル温度循環ブロック２１０は、９６ウェル（１２列×８行）形態であることができ、前記マルチウェル温度循環ブロックのマルチウェル領域は、隣接した一つまたは二つの列単位で検出ターゲットを設定することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００６４】
本発明のリアルタイム核酸増幅器２００は、後述する制御部の制御により、第１温度であるアニール（Ｔ１）温度と第２温度である拡張（Ｔ２）温度に繰り返して変化される。
【００６５】
従って、ウェル２１１ａに載置される診断キットの反応チューブは、第１温度であるアニール（Ｔ１）温度と第２温度である拡張（Ｔ２）温度との間で変化されることにより核酸が増幅され、第３温度が変性のためにさらに求められることもできる。前記マルチウェル温度循環ブロック２１０の第１温度であるアニール（Ｔ１）温度、第２温度である拡張（Ｔ２）温度及び第３温度が、ターゲット核酸によって多様に設定されることができる。
【００６６】
リアルタイム核酸増幅器２００は、マルチウェル温度循環ブロック上の設定領域のターゲット核酸の種類及び生物学的試料に関する情報に基づいて、夫々のターゲット核酸の増幅程度及び量を同時に測定し、前記ターゲット核酸の測定は、反応チューブに含まれた検出可能な検出標識のシグナルの数値によって測定される。
【００６７】
前記標識によって発生したシグナルの水準は、増幅される標的核酸の量に比例する。検出標識のシグナルは、例えば、発光シグナル、色染料シグナル、または放射性シグナルを含む何れかの種類のシグナルであることができる。好ましい様態として、検出可能なシグナルは発光シグナルである。発光シグナルは、蛍光シグナルまたは化学発光シグナルであることができる。ターゲット核酸の増幅が始まることにより光が発光し、ターゲット核酸の増幅量によって発光時期及び発光強さが変わるようになり、ターゲット核酸の増幅された量をモニタリングすることができるようにする。
【００６８】
本発明では、シグナル検出のために蛍光色素が結合されたプローブまたはインターカレート色素などの蛍光色素が用いられることができる。好ましくは、核酸増幅のために、デュアルラベルプローブ（ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅ）を主に用いることができる。
【００６９】
前記リアルタイム核酸増幅器２００は制御部を備える。前記制御部は、前記自動精製分注装置１００で分離されるターゲット核酸の種類及び前記自動精製分注装置１００で分離精製される夫々の生物学的試料に関する情報を保存し、夫々の自動精製分注装置１００で分離精製される互いに異なるターゲット核酸の種類に相応するように、列単位で、マルチウェル温度循環ブロックのマルチウェル領域をターゲット核酸の種類毎に設定し、前記温度循環ブロック上の全てのターゲット核酸が同一の条件下で同時に増幅されるようにして、前記設定された列に相応するターゲット核酸の種類及び夫々のウェルに対する生物学的試料に関する情報に基づいて、同時増幅された夫々のターゲット核酸を測定して判断する。
【００７０】
前記制御部に保持される全ての情報は使用者により入力され、入力された情報を保存及び維持できるようにセットされる。
【００７１】
前記リアルタイム核酸増幅器２００は、前記マルチウェル温度循環ブロック２１０に装着された列毎に、またはウェル毎に、互いに異なるターゲット核酸を検出するための診断キットの種類によって夫々のターゲット核酸の増幅量及びターゲット情報をリアルタイムでディスプレイ部３００に表示する。
【００７２】
図３は本発明によるディスプレイ部３００を示す図面である。図３を参照すると、ディスプレイ部３００は、リアルタイム核酸増幅器２００の前記設定された列情報を表示する第１ディスプレイ部３０２と、単位反応チューブで増幅されるターゲット核酸の量を測定して図示化する第２ディスプレイ部３０１と、使用者がウェル２１１ａを個別的に選択して見ることができるウェル選択部３０３と、を備える。前記ウェル選択部３０３による使用者の選択に応じて、一つまたはそれ以上の単位反応チューブの診断結果を多様な色で一度に表示することにより、その差異を明瞭に区分して表示することができる。
【００７３】
本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置は、自動精製分注装置及びリアルタイム核酸増幅器を統合的に管理し、より詳細には、生物学的試料のデータを自動精製分注装置からリアルタイム核酸増幅器に伝達し、リアルタイム核酸増幅器から得られる互いに異なるターゲット核酸の種類による夫々のターゲット核酸情報及び増幅結果を定性分析または定量分析する制御部を含む。
【００７４】
本発明のリアルタイム核酸分析統合装置は、制御部のソフトウェアにより作動され、これは、図４に示すように、大きく１．情報入力、２．自動精製分注装置１００での核酸の分離精製、３．リアルタイム核酸増幅器２００での作動（ＲＵＮ）、４．結果分析（Ｕｐｄａｔｅ  Ｒｅｓｕｌｔ／Ａｎａｌｙｓｉｓ）の四つに分類される。本発明の制御部のソフトウェアは全体的な運営を掌る。ソフトウェアの役割は、大きくＤＢ機能及び維持、自動精製分注装置の制御維持、リアルタイム核酸増幅器の作動及び分析制御維持などの役割を遂行する。
【００７５】
本発明のリアルタイム核酸分析統合装置は、二つのコンピュータと三つの自動精製分注装置と一つのリアルタイム核酸増幅器で構成される。まず、制御部のソフトウェアは、使用者がリアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェアに入力したデータを基盤とする。二つのコンピュータのうち一つは、ローカルＤＢ、リアルタイム核酸分析統合システムの管理ソフトウェア及び自動精製分注装置プログラムが設けられるリアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェア用コンピュータである。他の一つのコンピュータは、リアルタイム核酸増幅器プログラム用である。各コンピュータは、ＴＣＰ／ＩＰ通信を介してデータを送受する。リアルタイム核酸分析統合装置の管理（ｍａｎａｇｅｒ）ソフトウェア用コンピュータは、三つの自動精製分注装置とＴＣＰ／ＩＰを介して通信する。リアルタイム核酸増幅用コンピュータは、核酸増幅器とＵＳＢを介して通信する。前記リアルタイム核酸分析統合装置は、コンピュータ間のクライアントサーバ環境、リアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェア及び自動精製分注装置間のクライアントのサーバ環境で構成される。
【００７６】
より詳細には、各病院サイトにはメインＤＢが存在する。メインＤＢへの試料入力作業をリアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェアを利用して行う。この作業は、本発明のリアルタイム核酸分析統合装置に用いられるローカルＤＢに作業リスト（ｗｏｒｋｌｉｓｔ）を搭載する過程である。搭載された作業リストは、バーコードまたは自動割り当て方式によって、使用者により各自動精製分注装置に割り当てられる。全て割り当てられた後、自動精製分注装置を運営する。運営が全て完了すると、完了と同時に動作完了によるアップデートを行う。リアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェア用コンピュータは、アップデートをチェックし、ローカルＤＢを更新する。本発明の統合管理ソフトウェアは、複数の核酸精製分注装置を同時に夫々制御することができ、これらの動作状態を提供する。
【００７７】
前記リアルタイム核酸分析統合装置の管理（ｍａｎａｇｅｒ）ソフトウェア用コンピュータは、リアルタイム核酸増幅器が準備されたことを使用者に知らせる。使用者は知らせの指示を受け、９６ウェルマルチウェル温度循環ブロックに反応チューブを装着する。反応チューブの装着が完了すると、リアルタイム核酸増幅器の作動を行う。動作が完了すると、使用者に分析（ａｎａｌｙｓｉｓ）プログラムを実行させるかを知らせる。分析が完了すると、使用者により完了及び終了が実行される。統合管理ソフトウェア用コンピュータは、全ての作動及び分析が完了したかをチェックし、チェックの完了後、ローカルＤＢを更新する。
【００７８】
まず、本発明のリアルタイム核酸分析統合装置を作動するためには、情報（データ）が入力されなければならない。データ情報の入力は、使用者が、検体試料毎にリアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェア用コンピュータの統合管理プログラム内のデータベースに従ってデータ情報を入力するという意味である。データ情報の入力によって該当診断キット毎に用いられるプロトコルが決まっている。即ち、試料の名前を入力し、診断キット、核酸類型、サンプルソースタイプ（ｓａｍｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ｔｙｐｅ）、分離プロトコルを選択する。入力すべき試料数を選択して「ｉｎｐｕｔ」ボタンを押す。自動精製分注装置では、入力された情報（データ）を利用して各自動精製分注装置のカートリッジウェルに「Ａｓｓｉｇｎ（割当）」する。本発明において、「Ａｓｓｉｇｎ」は「Ａｕｔｏ  ａｓｓｉｇｎ（自動割当）」とバーコード「ａｓｓｉｇｎ」を支援する。本発明は、精製すべき試料をクリックする順に、自動で「ａｓｓｉｇｎ」する。各自動精製分注装置の「ａｓｓｉｇｎ」が完了すると、自動精製分注装置が動作できる状態となる。使用者は、自動精製分注装置で夫々の装置を動作させる。自動精製分注装置ソフトウェアは、動作に関する全ての情報を保存する。自動精製分注装置ソフトウェアは、作動時間、進行状態などの進行情報を使用者に提供する。自動精製分注装置の動作時間は、約４０〜５０分がかかる。自動精製分注装置の作動が完了すると、リアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェアが自動検知を行う。自動検知により、次の工程であるリアルタイム核酸増幅器の作動を指示する。
【００７９】
本発明の実施例では、リアルタイム核酸増幅器の該当コンピュータが別に分けられているため、使用者がリアルタイム核酸増幅器プログラムを実行する。実行時、作業リストが自動精製分注装置からリアルタイム核酸増幅器に伝送され、使用者に自動で提供される。統合管理ソフトウェアによって実行された核酸増幅器ソフトウェアにより、実験する診断キットを選択する。本発明では、選択された診断キットによってコントロールは自動で「ａｓｓｉｇｎ」されるようになっている。使用者は、核酸精製分注装置で遂行された作業リストを呼び出して実行する。サンプルをクリックする順に応じてマルチウェルに「ａｓｓｉｇｎ」される。該当設定された情報に相応する診断キットを装着し、核酸増幅器の動作を実行する。リアルタイム核酸増幅器の動作は約２〜３時間かかる。核酸増幅器の作動s／wの動作が終わると、該当結果ファイルを管理s／wに伝送する。動作が完了すると、リアルタイム核酸分析統合装置の「管理（ｍａｎａｇｅｒ）」ソフトウェアで動作状態を自動で認知して結果をアップデートし、作業リストを次の工程に移管する。「ｍａｎａｇｅｒ」プログラムは、結果アップデートを行うことにより全ての結果をアップデートする。マルチウェルのウェル毎にアップデートすべき試料を選択する。失敗したものはアップデートせず、分離工程または増幅工程の該当工程にさらに戻す。現在の全ての分析状態を示す「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ウィンドウを実行することにより、使用者が増幅状態を分析することができる。
【００８０】
本発明のリアルタイム核酸分析統合装置の制御部は、「ｗｏｒｋ  ｌｉｓｔ」ローカルデータベース、リアルタイム核酸分析統合装置の管理（ｍａｎａｇｅｒ）ソフトウェア、自動精製分注装置ソフトウェア、リアルタイム核酸増幅器の作動ソフトウェア、リアルタイム核酸増幅器の分析ソフトウェアの五つのプログラムを自動で連結させて、一連の自動化工程を提供する。動作時のヒューマンエラーを防止するために、「ａｓｓｉｇｎ」時に関連画面を提供し、全てのデータを追跡することができるようにしている。全ての装備運用時、ログファイルが生成される。
【００８１】
本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置は、上記の夫々の診断キットの単位反応チューブの分析結果を保存する保存データベース装置４００をさらに備えることができる。
【００８２】
［実施例２］
実施例２は、本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法に関するものであり、以下、より詳細に説明する。
【００８３】
本発明によると、１）多数の自動精製分注装置１００で標準試料と核酸を含む多様な生物学的試料から、各試料に含まれた核酸を分離精製した後、分離精製された溶液を核酸増幅反応混合物の反応チューブに加えて混合する段階と、２）前記核酸増幅反応混合物の反応チューブが装着されるマルチウェル温度循環ブロック２１０と前記自動精製分注装置１００で分離精製される夫々のターゲット核酸が相応するように、マルチウェル温度循環ブロック２１０のマルチウェルをターゲット核酸の種類毎に列単位で分割してブロックを設定し、前記設定されたブロック内の夫々のウェル毎に、前記自動精製分注装置１００で分離される標準試料と生物学的試料の情報を保存する段階と、３）段階２）で保存されたリアルタイム核酸増幅器２００のマルチウェル温度循環ブロック２１０の各ウェルの生物学的試料の情報に一致するように、段階１）で準備された反応チューブを各ウェルに装着する段階と、４）前記リアルタイム核酸増幅器２００の温度循環ブロックに装着された夫々のターゲット核酸を同一の条件下で同時に増幅し、多数の生物学的試料に対する夫々のターゲット核酸を定性分析または定量分析して増幅結果を得る段階と、を含むことを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法が提供される。
【００８４】
本発明において、前記段階２）と段階３）は同時に行ってもよく、または段階３）が段階２）より先に行ってもよい。
【００８５】
本発明において、前記１）段階の自動精製分注装置１００で精製及び分注される核酸は夫々互いに異なる核酸であることができ、多様な種類の生物学的試料が核酸分離に用いられることができる。
【００８６】
本発明において、前記自動精製分注装置１００で生物学的試料にインターナルコントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＰＣ）を添加して核酸を分離し、前記増幅結果から自動精製分注装置１００でのターゲット核酸分離の成功有無及び増幅効率を判断して、ターゲット核酸の検出の有効性を決めることを特徴とする。
【００８７】
本発明において、前記１）段階における反応チューブは核酸増幅に必要な成分が乾燥された形態で含まれたものであり、これに分離精製された核酸溶液を加えて混合することにより、核酸増幅反応混合物の反応チューブを製造することを特徴とする。
【００８８】
本発明の診断キットは乾燥組成物からなっているため、分離精製された核酸溶液を加えて直ちに混合物を製造することができる。溶液状態の診断キットは、分離された核酸溶液を添加すると、反応容量が多くなるという問題が生じ、分離された核酸濃度が低くなる。
【００８９】
本発明において、前記インターナルコントロールは、ターゲット核酸がＲＮＡである場合、タバコモザイクウイルス粒子であることを特徴とする。
【００９０】
本発明において、前記インターナルコントロールは、ターゲット核酸がＤＮＡである場合、プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ増幅産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）であることを特徴とする。ＰＣＲ増幅産物は、ＰＣＲ増幅によって作られたＤＮＡを意味する。
【００９１】
前記１）段階において、インターナルコントロールは、既知の濃度毎に追加した定量標準試料をさらに含んで分離することを特徴とする。
【００９２】
前記１）段階において、標準試料として陰性コントロール（ＮＴＣ）と陽性コントロール（ＰＣ）をさらに用いて分離することを特徴とする。
【００９３】
前記インターナルコントロールの増幅のためのプライマー、プローブは、下記表１に提示された配列を用いることを特徴とする。
【００９４】
本発明では、前記インターナルコントロール（または内部対照群、ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＰＣ）を核酸の分離精製段階から適用して、試料から核酸を分離した後、リアルタイム核酸増幅器で増幅を行う。これは、核酸の不十分な増幅の原因が、精製過程にあるか、または増幅過程にあるかを確認することが困難であるという問題を解決するために利用される。本発明では、分離過程から既知の濃度のインターナルコントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＰＣ）を試料に添加して、ともに分離、精製することにより、自動核酸精製分注装置で分離がまともになされたかと確認することができるだけでなく、分離後に増幅過程で核酸増幅がまともになされなかった場合、分離段階から問題があったか、核酸増幅段階で問題があったか、その原因を容易に分かるようになる。本発明では、タバコモザイクウイルスをインターナルコントロール（ＩＰＣ）として用いた。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）は、ＲＮＡウイルスであり、新種インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスのようなＲＮＡウイルスの検出をターゲットとする場合に適したインターナルコントロール（ＩＰＣ）として用いることができる。
【００９５】
タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を用いる利点は次のとおりである。既存の場合、検体試料から核酸を分離する時にインターナルコントロール（ＩＰＣ）をともに用いず、核酸の増幅反応時にのみ特定種類のＲＮＡを分離された核酸試料に添加して反応させた。本発明では、ウイルス粒子自体を検体試料の分離段階からともに分離、精製して、リアルタイム核酸増幅反応までともに進行するため、効率検定に有用である。植物ウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）は、大量精製が可能であり、取り扱いに危険負担がない。人体ウイルスと植物ウイルスは、反応する「ｒｅｃｅｐｔｏｒ」が夫々異なるため植物ウイルスが人に感染されることがなく、ターゲットとする人体ウイルスとは類縁関係が遠いため、プライマー及び探針の製作時、または核酸の増幅反応時、所望の人体核酸ターゲットと塩基配列が一致する現象が少ないか、殆どないという長所がある。
【００９６】
本発明において、診断キットは、単位反応チューブにインターナルコントロ−ル（ＩＰＣ）と増幅されるターゲット核酸に相応するプライマー、ターゲット核酸を検出するための検出標識及び緩衝溶液が同量に備えられることを特徴とする。単位反応チューブとしては、８−ウェルストリップが用いられることができる。また、前記単位反応チューブ内の核酸増幅の反応物は、乾燥された形態であることを特徴とする。
【００９７】
本発明において、前記リアルタイム核酸増幅器２００で生物学的試料にインターナルコントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、  ＩＰＣ）を添加して核酸を分離して確認するための増幅結果は、前記自動精製分注装置１００で得られた核酸分離の有無及び前記リアルタイム核酸増幅器２００を利用して同一の条件下で同時に増幅して得られる増幅過程により確認することができる。
【００９８】
本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置は、多数の自動精製分注装置から分離された核酸をリアルタイム核酸増幅器２００を利用して一度に同時に増幅することができる。
【００９９】
また、同時に増幅された夫々の核酸から、検出しようとするターゲット核酸の情報を収集する段階をさらに含む。
【０１００】
例えば、血液、小便、痰、細胞などから核酸を分離する過程は異なることがありえるが、これらから分離された核酸は一つの増幅器で同時に増幅することができる。本発明では、多数の核酸自動精製分注装置で核酸を分離する。三つの自動精製分注装置で夫々血液、小便、痰の試料から核酸を分離する。分離された核酸は、例えばＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、マラリア、結核、性病の診断キットを利用してこれらを同時に検出するために適用されることができる。
【０１０１】
リアルタイム核酸増幅器でこれらの疾病原因を同時に検出するために、本発明では、マルチウェル温度循環ブロックを列毎に分け、特定領域を指定することができる。例えば、１列はＡＩＤＳ、２列はＢ型肝炎、３列はＣ型肝炎、４列は性病に、マルチウェル温度循環ブロックの列を指定した後、これらの増幅条件を同一に設定した後、分離された核酸を含む夫々の診断キットをマルチウェル温度循環ブロック上の夫々の設定領域に合わせて装着し、増幅反応を行う。増幅反応の条件を同一に設定するために、各診断キットの反応条件のＴｍ値を全て同一または類似するように設定した。プライマーまたはプローブのＴｍ値が同一に設定される同一の重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）条件下で、９６ウェル核酸増幅器で同時増幅を行う。その結果、便利性が増加し、検出時間が短縮することができる。さらに、多数の種類のターゲットを一つずつ順に検出することによって発生する時間の誤差を減らすことができる。また、一度に一種類のターゲット病源菌を検出していたことに代えて、同時に同一の条件下でリアルタイム核酸増幅器で多数のターゲットＤＮＡまたはＲＮＡを検出するため、確認仮定を容易に行うことができる。一人に由来する多数の種類の試料、または多数の人に由来する試料から核酸を分離し、これらから多様なターゲット核酸を一度に同時に検出するため、多数の病原体を速い時間内に同時に確認することができる長所がある。本発明では、マルチウェル温度循環ブロックの列単位で、特定病原体の検査項目を指定することができる。
【０１０２】
本発明によって多数の自動精製分注装置１００を利用して生物学的試料から核酸を分離、精製する過程は、次のとおりである。本発明の実施例では、自動核酸分注装置としてバイオニア社のＥｘｉＰｒｅｐＴＭ  Ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを採択して使用し、バイオニア社の  ＥｘｉＰｒｅｐＴＭ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを核酸精製キットとして採択及び変形して使用した。
【０１０３】
本発明において、自動精製分注装置の核酸精製キットは、核酸を含む多様な生物学的試料から核酸を抽出するために用いられるバッファーが含まれているカートリッジセットと、精製するために用いられるプラスチック消耗品セットと、で構成される。カートリッジセットは、細胞内のタンパク質を分解するためのタンパク質分解酵素、細胞を分解するための分解溶液、溶出された核酸を結合させるためのシリカ磁性粒子と溶出された核酸とシリカ磁性粒子との結合のための結合溶液が含まれているカートリッジ(1)と、シリカ磁性粒子の表面に付着された核酸以外の物質を洗浄するための１種以上の洗浄溶液、シリカ磁性粒子の表面から核酸を効率的に分離させるための溶出溶液を含んでいるカートリッジ(2)と、で構成される。プラスチック消耗品セットは、核酸の精製過程で各種緩衝溶液を運搬、移送するために用いられる使い捨てフィルタチップ、タンパク質分解酵素による細胞分解の過程で用いるための反応用チューブ、最終精製された核酸を貯蔵するための溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブで構成される。
【０１０４】
核酸精製キットのカートリッジはマルチウェルカートリッジであり、９６ウェル型カートリッジが好ましく使用される。新種インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ＲＮＡの分離のための核酸精製キットとしては、バイオニア社のＥｘｉＰｒｅｐＴＭ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｋｉｔを採択して使用することができる。ウイルスＲＮＡの抽出過程は、サンプルの前処理過程と、標準試料としてポジティブコントロール（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ネガティブコントロール（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、インターナルコントロール（ＩＰＣ）、検体試料を添加する過程と、自動精製分注装置を利用した核酸の抽出過程と、からなる。抽出された核酸は自動でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用診断キットと混合されるため、核酸の抽出後、手動で診断キットにウイルスＲＮＡを入れる必要がなくなる。
【０１０５】
具体的な一例として、リアルタイム核酸分析統合装置の核酸自動精製分注装置と核酸精製キットを利用して、新種インフルエンザＡウイルスのウイルスＲＮＡを精製する過程は、次のとおりである。
【０１０６】
綿棒を利用して患者の口腔及び鼻咽腔から検体を採取する。核酸の精製に用いる前に、ウイルス輸送培地（ＶＴｍ  ｍｅｄｉａ、Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉａ）が入っている検体保管用チューブをボルテックスミキサーを利用して１分間強く振って、ウイルスが綿棒からウイルス運送バッジに効果的に移るようにする。綿棒に付いているウイルスが溶液（ＰＢＳ、ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ、  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｅｄｉａなど）に移るようにボルテックスミキサーを利用して１分以上混ぜる。１．５ｍｌテストチューブに混合された試料溶液１ｍｌを移し、１３，０００ｒｐｍで５秒〜１０秒間遠心分離する。上層液２００μｌを回収し、ウイルスＲＮＡ抽出に用いる。
【０１０７】
自動精製分注装置の電源を押して初期化を進行する。本発明のリアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェア（ｍａｎａｇｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）は大きく二つの部分に分けられるが、一つは自動核酸精製分注装置を制御する部分とリアルタイム核酸増幅器を制御する部分とからなる。ウイルスＲＮＡを抽出するために、ソフトウェアのメイン画面の左側の自動精製分注装置の絵をクリックして、検査に使用する診断キットを選択する。診断キットの入力をクリックして新種インフルエンザ検査用診断キットを選択すると、抽出すべき核酸の種類が自動で選択される。「ｓａｍｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ｔｙｐｅ」入力ウィンドウに患者の検体類型による検体種類を入力する。検体種類を入力すると、自動でカートリッジ状態を問うポップアップウィンドウが表示される。バッファーカートリッジ(1)を参考して使用されたウェルがあるか否かを確認し、使用されたウェルがある場合は、これ以上使用されないように該当ウェルをクリックして表示する。自動でカートリッジ(1)の残っているウェルにネガティブコントロール（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、ポジティブコントロール（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）位置が表示される。基本設定はＮＴＣ、ＰＣ夫々一つずつであり、二つずつに変更してセットすることができる。もし、再検が必要なリストがある場合、この段階で再検すべきリストが表示され、リストのうち再検すべき検体番号を選択すると、順に「ａｓｓｉｇｎ」が完了される。「ｓａｍｐｌｅ  ｎａｍｅ」をクリックし、バーコードリーダーやキーボードを利用して検体情報を入力する。今まで入力された情報をリアルタイム核酸分析統合装置に適用させるために、「Ａｐｐｌｙ」ボタンをクリックする。
【０１０８】
作業台で、核酸精製キットのカートリッジ(1)の１列と２列にインターナルコントロール（ＩＰＣ）を夫々２０μｌずつ入れる。リアルタイム核酸分析統合装置で入力した内容に合わせて、カートリッジ(1)のポジティブコントロール（ＰＣ）の位置に、即ち、Ａ−１の位置のウェルに標準物質（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＣ）を２００μｌ入れ、カートリッジ(1)のネガティブコントロール（ＮＴＣ）の位置に、即ち、Ｂ−１の位置のウェルにＤＥＰＣ処理された３次滅菌水（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＴＣ）２００μｌを入れる。その他には、Ｃ−１でＨ−１、Ａ−２でＨ−２の位置には患者の検体を２００μｌずつ入れる。この際、必ずリアルタイム核酸分析統合装置で入力した位置に合わせて核酸試料をカートリッジに入れなければならない。夫々の標準物質、ＤＥＰＣ処理された３次滅菌水、患者の検体が入っているカートリッジのウェル位置に合わせて、使い捨てフィルターチップ、単位反応チューブを各自動精製分注装置内のラックに装着する。
【０１０９】
また、精製された核酸が入っている溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブと新種インフルエンザ診断検査用診断キットを冷蔵ブロックに装着する。準備されたカートリッジセットとプラスチック消耗品セットを自動精製分注装置に装着した後、リアルタイム核酸分析統合装置の管理ソフトウェアの「ＲＵＮ］ボタンをクリックすることにより自動精製分注装置を作動させ、患者の検体から新種インフルエンザウイルスのＲＮＡを精製する。核酸精製が完了されると、核酸保管のための溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブと診断検査用診断キットを冷蔵ブロックから分離し、核酸保管用チューブは提供されたチューブキャップを利用してキャッピングした後、−８０℃で保管する。診断キットは、光学接着剤（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ）フィルムを利用してストリップチューブの上端をシーリングした後、リアルタイム核酸増幅器に移してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行う。抽出が完了すると、核酸分注精製装置内の溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブと診断キットの反応チューブには５０ｕＬずつの抽出された核酸溶液が入っている。
【０１１０】
本発明の実施例では、リアルタイム核酸増幅器としてはｅｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋを採択して使用し、バイオニア社のＡｃｃｕＰｏｗｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｋｉｔを診断キットとして採択して使用した。
【０１１１】
リアルタイム核酸増幅器で得られる増幅結果は、次の過程によってなされる。まず、リアルタイム核酸統合分析装置でリアルタイム核酸増幅器の絵をクリックする。管理ソフトウェアには抽出が終わった検体リストが左側上端にキット毎に保存されている。該当するリストを選択して、「Ｇｅｔ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｌｉｓｔ（サンプルリスト取得）」ボタンをクリックする。
【０１１２】
この際、選択された診断キットをマルチウェル温度循環ブロックのどの位置に入れるかを指定するためのポップアップウィンドウが表示される。反応チューブストリップ毎のサンプルリストのチェックボックス（ｃｈｅｃｋ  ｂｏｘ）を選択し、マルチウェルに検体を「aｓsｉｇｎ」する。各ウェルを選択すると位置が指定できるようになり、画面のマルチウェルの絵を見て所望の位置を選択する。
【０１１３】
診断キットストリップの数に合わせて、温度循環ブロックのどこにストリップを装着するか、列と行の数字を選択する。例えば、核酸が分注された診断キットが８−ストリップである場合、核酸増幅器のマルチウェル温度循環ブロックの中間部に位置するように、９６ウェルの該当位置のボタンをクリックする。選択が完了すると、データ名を入力できるウィンドウが表示され、所望のデータ名を入力した後ボントンをクリックすると、核酸増幅すべき作業リストが生成される。
【０１１４】
診断キットを「ａｓｓｉｇｎ」された位置に合わせて、リアルタイム核酸増幅器のマルチウェル温度循環ブロックに装着した後、リアルタイム核酸増幅器のｒｕｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを実行する。リアルタイム核酸増幅器で作動が完了すると、管理ソフトウェアに結果データが送信される。リアルタイム核酸分析統合装置において、制御部の管理ソフトウェアのメニュー部で確認することができる「ｔａｐ」をクリックし、「ｕｐｄａｔｅ  ｒｅｓｕｌｔ（結果更新）」を選択して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）結果を呼び出す。新たに表示されたウィンドウの左側上端に生成された「ｗｏｒｋ  ｌｉｓｔ（作業リスト）」を選択して結果を呼び出す。結果値は「ａｓｓｉｇｎ」された順にエクセルファイルの形式で確認することができる。各検体毎の結果グラフは連結されている分析プログラムと連動されて分析することができる。結果が確認された検体は管理プログラム上に結果をアップデートし、結果が確認されなかった場合は増幅段階から再検査または分離（Ｐｒｅｐ）段階から再検査を選択して再検査リストが生成される。
【０１１５】
より詳細には、ＢＳＣ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｃａｂｉｎｅｔ）内で準備された自動精製分注装置のプレートに、各反応（Ｒｅａｃｔｉｏｎ）チューブラック、使い捨てチップ（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｔｉｐ）ラック、溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブラック、バッファーカートリッジ（ｂｕｆｆｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）(1)を載置する。検体試料の数に合わせて反応チューブ、使い捨てフィルターチップ（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｔｉｐ）、溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブ、診断キットを各ラックに挿入する。提供された「ｈｏｌｅ−ｐｕｎｃｈ」を利用して、検体試料の数と標準試料として用いられるポジティブコントロール（ＰＣ）とネガティブコントロール（ＮＴＣ）の数に合わせて、バッファーカートリッジ（ｂｕｆｆｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）(1)とバッファーカートリッジ（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）(2)のシーリングフィルムに孔を空ける。図５に示す図面を参照して、検体試料とポジティブコントロール（ＰＣ）、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）を入れる位置に合わせて２０μｌの植物性インターナルコントロール（ＩＰＣ）をウェルに入れる。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）ウェルにＤＥＰＣ処理した蒸溜水２００μｌを入れる。ポジティブコントロール（ＰＣ）ウェルに２００μｌのポジティブコントロール（ＰＣ）を添加する。カートリッジウェルに、上記のように準備された患者の検体試料２００μｌを入れる。透明アクリル蓋を閉じた後、自動精製分注装置に入れる。
【０１１６】
自動精製分注装置を駆動させて、新種インフルエンザ検査用プログラムを呼び出す。使用する装備を確認した後、標準試料として用いられるポジティブコントロール（ＰＣ）とネガティブコントロール（ＮＴＣ）が入ったウェルを表示する。ポジティブコントロール（ＰＣ）、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）が入ったウェルを除いた検体ウェルに、バーコードリーダーまたは手動で患者の検体試料に対する患者の情報（名前、性別、担当課など）を入力する。「ＲＵＮ」ボタンを押してウイルスＲＮＡ抽出を始める。
【０１１７】
前  記ウイルスＲＮＡの抽出過程が完了すると、「Ｄｏｏｒ」を開いて「Ｂａｓｅ  ｐｌａｔｅ」を前方に引き出すと溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブと診断キットが装着された溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブラックを見ることができる。
【０１１８】
溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブと診断キットには、抽出されたウイルスＲＮＡが夫々５０μｌずつ入っている。従って、ＲＮＡやＤＥＰＣ処理した蒸溜水をさらに入れる過程は必要ではない。新種インフルエンザ検査に必要な診断キットは、溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブラックから取り出して直ちにリアルタイム核酸増幅器を利用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに適用することができ、溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブに入っているウイルスＲＮＡは再検査時に用いる。抽出されたウイルスＲＮＡは、できるかぎり使用時まで−８０℃で保管する。溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）チューブラックは抽出された核酸を保管するために４℃の状態に維持される。
【０１１９】
本発明に用いられる診断キットに含まれている核酸増幅分析試薬は、ターゲット核酸増幅に必要な全ての成分が入っている分析試薬を含み、前記分析試薬は、リアルタイム核酸増幅器を利用して検体試料内のターゲットＤＮＡまたはＲＮＡをリアルタイム定性または定量的に検出するために、「ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（そのまますぐに使える）」方式で構成されている。
【０１２０】
前記本発明に用いられる診断キット内の分析試薬は、核酸増幅に必要な反応のために、緩衝溶液、ＭｇＣｌ２、４種のｄＮＴＰ、重合酵素、プライマー及び検出標識、及び選択的に安定剤を含み、乾燥された状態である。検出標識は、蛍光染料または蛍光染料が標識されたプローブであることを特徴とする。また、本発明によると、分析試薬組成物は、凍結乾燥、真空乾燥、加温乾燥、または減圧乾燥などによって乾燥された形態の組成物であることが好ましい。
【０１２１】
本発明で用いられる診断キットは、例えば、バイオニア社のＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＰＣＲ  ｋｉｔを採択して使用することができる。バイオニア社のＮｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）＆Ｉｎｆ  Ａ  Ｐｒｅｍｉｘには新種インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）とインフルエンザＡウイルスのゲノムの特定部分を増幅するためのプライマー、ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰｓ及び安定剤が含まれている。増幅産物は、熱サイクリング（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ）の間に特定プローブに結合された蛍光を測定して確認することができる。重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）産物のサイクルによる増幅は、プローブから離れたレポーター色素（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｄｙｅ）を測定することによりリアルタイムで測定される。また、診断キットには、試料の定性分析のためにＮｅｗ  Ｉｎｆ  Ａ  Ｈ１Ｎ１＆Ｉｎｆ  Ａ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌsが含まれている。
【０１２２】
核酸増幅分析試薬を増幅段階で用いる場合、分析試薬が入っているストリップ（Ｓｔｒｉｐ）に分離された核酸を入れる。この際、Ｎｅｗ  Ｉｎｆ  Ａ  Ｈ１Ｎ１＆  Ｉｎｆ  Ａ  ポジティブコントロールＲＮＡとインターナルコントロール（ＩＰＣ）ＲＮＡ試薬をチューブに添加する。ＤＥＰＣを処理した蒸溜水とインターナルコントロール（ＩＰＣ）ＲＮＡとを計算された数量だけ混合して混合液を製造し、ストリップの各ウェルに４５μｌずつ分注する。
【０１２３】
全ての試薬及びＲＮＡ分注の完了されたストリップは、蓋で閉じるか、またはシーリングフィルムでシーリングした後、混合液の内容物が完全に混じるようにする。この際、バイオニア社のＥｘｉｓｐｉｎＴＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ：Ａ−７０４０、バイオニア社製．韓国）を利用して混合した後、スピン過程を行うことが好ましい。その後、ストリップをリアルタイム核酸増幅器（ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、バイオニア社製）のマルチウェル温度循環ブロックに載置し、リアルタイム核酸増幅器を実行させる。
【０１２４】
前記リアルタイム核酸増幅器（ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ９６）の裏面下端のメインパワースイッチをオンする。９６ウェルのマルチウェル温度循環ブロックが機械の前に出ると、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）ストリップまたはプレートをマルチウェル温度循環ブロックのウェル方向に合わせて入れる。「ｄｏｏｒ」ボタンをさらに押すと、９６ウェルのマルチウェル温度循環ブロック（ｔｈｅｒｍａｌ  ｂｌｏｃｋ）が内側に入る。ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ９６のオペレーティングプログラム（Ｒｕｎ  ＥｘｉＤｉａｇｎｏｓｉｓ  ｉｃｏｎ）を実行する。重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）に必要な作動方法を実行するために、上端の「Ｆｉｌｅ−Ｄｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（ファイル−デザイン実験）」をクリックする。
【０１２５】
次に、「Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｋｉｔ  ｗｉｎｄｏｗ（診断キットウインドウ選択）」が表示されると、「Ｎｅｗ  Ｉｎｆ  Ａ  ａｎｄ  ＩｎｆＡ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ」を選択する。前記「Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｋｉｔ」選択が完了すると、９６ウェルのマルチウェル温度循環ブロック内のストリップ位置情報が入力されたエクセルファイルを選択して実行させる。
【０１２６】
全ての選択が終わると、キットに適した重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）条件と選択した位置情報が見られるプロトコルとプレート情報のディスプレイウィンドウを確認することができる。
【０１２７】
「Ｒｕｎ  ｔａｐ」ボタンをクリックすると、結果を保存するためのファイル名が入力できる新しいウィンドウが表示される。実験日付及びサンプルに関する情報を入力して「ＯＫ」ボタンを押すと、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）が始まる。入力したファイル名を利用して分析プログラムで結果を確認することができる。
【０１２８】
前記核酸増幅に対する増幅結果は、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ９６  分析プログラムを利用して分析される。分析しようとする「ＰＣＲ  ｄａｔａ  ｆｉｌｅ（．ｅｘ３）」を選択する。増幅結果の「Ｆｌｕ．Ｇｒａｐｈ」画面で「Ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ（ｍａｎｕａｌ方式）によって個別化分析が可能であり、「ａｕｔｏ  ｓｃａｌｅ  ｂｕｔｔｏｎ」を用いて分析プログラムで提供する基本的な分析結果を確認することもできる。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）ウェルの場合、Ｎｅｗ  Ｉｎｆ  Ａ  ＆  Ｉｎｆ  Ａ  ＲＮＡが添加されていないため、ＦＡＭとＴｅｘａｓｒｅｄ蛍光値が測定される必要がない。インターナルコントロール（ＩＰＣ）ＲＮＡウェルの場合、全てのウェルでＴＡＭＲＡ蛍光値が測定することが必要である。
【０１２９】
重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行う際、ウェルのうち一定ウェルを指定する。例えば、Ａ１、Ｂ１はネガティブコントロール（ＮＴＣ）、Ｃ１、Ｄ１はポジティブコントロール（ＰＣ）に指定する。ポジティブコントロールとネガティブコントロールは標準試料として用いられる。前記二つのコントロールが基準に合わない場合、分析プログラムでエラー（ｅｒｒｏｒ）メッセージが発生する可能性がある。本発明では、診断分析時、ソフトウェアが「Ａｕｔｏ」分析機能をし、結果分析を自動で分析して示す。
【０１３０】
［実施例３］
実施例３は、本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法において、核酸の分離精製に用いられるインターナルコントロール及び多数の検体の同時検出に関するものであり、以下、本発明をより詳細に説明する。
【０１３１】
（１）植物性インターナルコントロールプライマー、プローブのデザイン及び適用
植物性インターナルコントロール（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＰＣ）は、タバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ、ＴＭＶ）のゲノムＲＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ．ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＣ００１３６７）の塩基配列４９０３から５７０９（Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ、ＭＰ）、５７１２から６１９１（Ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ、ＣＰ）の間で、長さは１８〜２８ｂｐ、Ｔｍ値は５５℃〜６２℃となるように、任意で塩基配列を選択して正方向及び逆方向プライマーとして用いた。
【０１３２】
また、前記塩基配列の間で、長さは１９〜３０ｂｐの間、Ｔｍ値は６７〜７２℃の間で任意で塩基配列を選択して探針として用い（表１）、Ｔｍ値はＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓプログラムを利用してチェックした。
【０１３３】
【表１】
0005774499.tif 000002
【０１３４】
まず、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のプライマーセット毎に組み合わせて、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（核酸検出用の染色試薬）とリアルタイム定量増幅器としてＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（バイオニア社製、韓国）を利用して、適したプライマーの組み合わせを選定するための過程を行った。
【０１３５】
６セットに組み合わせたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）プライマー、核酸染色用試薬、蒸溜水（Ｄ．Ｗ．）、タバコモザイクウイルステンプレートを添加して、リアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応を行った。これを９５℃で１０分間変性させた後、９５℃で２０秒、５５℃で３０秒ずつ４５サイクルを進行させた。増幅された蛍光値は、各重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）サイクルが進行されるに伴って、５５℃で３０秒反応後に１回ずつ持続的に測定する。
【０１３６】
その結果、前記プライマーセットのうち１、２、３番（ＭＰ１、２、３セット）が４、５、６（ＣＰ１、２、３セット）に比べ増幅反応速度が速いため、前者のセットを選択した。
【０１３７】
以後の実験では、非特異的な核酸染色用試薬の代わりに特異的配列の核酸を検出するプローブを利用して、適したプローブセットを選択する過程を追加に行った。１０×バッファー  ５μｌ、ＭＭＬＶ  ６００Ｕ、Ｔａｑ  ７．５ｕｎｉｔ、ｄＮＴＰ  ２０ｍＭ  ３μｌ、安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）、最適化された濃度（１５ｐ）のプライマー、プローブなどと罹病葉から抽出したタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ＲＮＡを添加して、蒸溜水で総容量が５０μｌになるように一つのチューブに入れて、リアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応を行った。これを４５℃で１５分間逆転写反応させた後、９５℃で５分間変性させた後、９５℃で５秒、５５℃で５秒ずつ４５サイクルを進行させた。
【０１３８】
タバコモザイクウイルスのプライマー及びプローブセット１、２、３のうち重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅効率がもっとも良好であったものはセット１（ＭＰ１）で、次はセット３（ＭＰ３）、セット２（ＭＰ２）の順であった。
【０１３９】
これらのうちセット１、３の二つのセットを利用して、上記のような組成のＲＴ−ＰＣＲ混合液にタバコモザイクウイルスをインターナルコントロールＲＮＡとして使用し、新種インフルエンザＲＮＡをテンプレートとして添加して、標準テンプレートリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応の適用実験を行った。実験結果、セット１（ＭＰ１）、セット３（ＭＰ３）全て１×１０６ｃｏｐｙインターナルコントロールＲＮＡをともに反応させたにも関わらず、新種インフルエンザＲＮＡテンプレートの増幅に大きい影響を与えず、インターナルコントロールの増幅が独立的になされたことを確認した。
【０１４０】
（２）植物性インターナルコントロールの製造、核酸の抽出過程での適用及びリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応の適用
生物学的試料とともに使用可能な植物性インターナルコントロールを製造するために、まず、タバコモザイクウイルスを増殖した。タバコＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ種子（韓国農村振興庁の植物ウイルス研究室で分譲）を１００〜２００粒播種した後、１０日後に芽が生じるとそれから１０日後に各個体毎に小さな植木鉢に移植し、さらに１０日間育てた。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）罹病葉（韓国農村振興庁の植物ウイルス研究室で分譲）をモルタルに入れて０．０１Ｍ  リン酸塩バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．２）とともに粉砕して汁液を製造し、カーボランダム（ｃａｒｂｏｒｕｎｄｕｍ）を吹き付けたタバコ葉に汁液を塗布し、傷を介してＴＭＶの接種がなされるようにした。
【０１４１】
接種１０日後、タバコ葉でモザイク斑と葉の奇形などが観察された。さらに２０日程度育て、タバコモザイクウイルスの増殖量を増やした。その後、ＴＭＶ罹病葉３０ｇを収穫し、ウイルス粒子を精製するための実験を行った。
【０１４２】
具体的には、ミキサーにタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）罹病葉３０ｇ、０．１Ｍ  リン酸塩バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．２）９０ｍｌ、β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）０．６ｍｌを入れ、葉を磨砕してガーゼでろ過した後、１２ｍｌのｎ−ブタノールを添加して１時間３０分間混合した（４℃維持）。混合液を８０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離機で分離した後、上層液のみを回収してＭｉｒａ  ｆｉｂｅｒ  ｃｌｏｔｈでろ過し、上層液の体積の８％ＰＥＧ、０．１Ｍ  ＮａＣｌを添加して３時間混合した（４℃維持）。
【０１４３】
その後、前記混合液を１００００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離機で分離した後、上層液は除去し、ペレットを０．１Ｍ  リン酸塩バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）７．５ｍｌに溶かした。これを再び１００００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離機で分離した後、上層液を回収して越原心分離機で２８０００ｒｐｍ、４℃で２時間３０分間分離させた。上層液を除去した後、残りのペレットを３００μｌのＤＥＰＣを添加した蒸溜水で溶かし、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）粒子を抽出した。抽出した粒子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと電子顕微鏡写真を利用して確認し、ＵＶ分光計（Ｓｈｉｍａｚｕ社製、日本）で吸光度（２６０ｎｍ）を測定した後、下記の公式を利用してウイルス濃度を定量した。
【０１４４】
［２６０ｎｍで吸光度／３．０（ＴＭＶ吸光係数）］×稀釈倍数
【０１４５】
濃度定量の結果に基づいて、ＲＮＡコピー数（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ）を下記の公式によって計算した。
【０１４６】
６．０２×１０２３×濃度（ＵＶ分光計で測定された濃度ｍｇ／ｍｌ）／６３９５（タバコモザイクウイルスゲノムのサイズ（ｂｐ））×３３０
【０１４７】
前記実験で抽出したタバコモザイクウイルス粒子をＲＮＡ抽出段階である分離（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）から適用するための適正濃度を選定する実験を行った。まず、タバコモザイクウイルス粒子を濃度毎に稀釈し、２００μｌを添加して核酸分離精製装置（ＥｘｉＰｒｅｐＴＭ、バイオニア社製、韓国）で５０μｌ抽出した後、これをインターナルコントロールＲＮＡとして１μｌ使用し、１０×バッファー５μｌ、ＭＭＬＶ  ６００Ｕ、Ｔａｑ  ７．５ｕｎｉｔ、ｄＮＴＰ２０  ｍＭ  ３μｌ、安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）、最適化された濃度（１５ｐ）のプライマー、プローブなどと新種インフルエンザＲＮＡを標準テンプレートとして添加し、蒸溜水で総容量が５０μｌになるように一つのチューブに入れて、核酸増幅器でリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応を行った。これを４５℃で１５分間逆転写反応させた後、９５℃で５分間変性させた後、９５℃で５秒、５５℃で５秒ずつ４５サイクルを進行させた。
【０１４８】
その結果、分離精製時、一つの反応液当たり２×１０８〜２×１０９／２００μｌがインターナルコントロールＲＮＡとしての適正な重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）効率を示すことを確認した。
【０１４９】
次に、ＲＮＡ抽出段階からタバコモザイク粒子を新種インフルエンザ検体試料とともに抽出し、リアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応までの適用実験を行い、既存に使用されていたインターナルコントロール（バイオニア社ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｋｉｔに含まれたインターナルコントロール（マウスＤＶＬ遺伝子プラスミド））と比較した。ＲＮＡ抽出時、前記実験で選定した二つの濃度に合わせて、２×１０８〜２×１０９ｃｏｐｙ／２０μｌを新種インフルエンザ検体試料２００μｌと交ぜてともに核酸分注精製装置で分離、抽出した。また、核酸増幅器でリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応時には、前記実施例２で選択したプライマー、プローブセット１、３（ＭＰ１、ＭＰ３）を利用した。
【０１５０】
実験結果、ＲＮＡ抽出時のタバコモザイクウイルス粒子の適正濃度は２×１０８ｃｏｐｙ／２０μｌである。従って、精製（Ｐｒｅｐ）段階で２００μｌの１×１０７ｃｏｐｙのタバコモザイクウイルス粒子を検体試料２００μｌと交ぜることが好ましい。また、ＴＭＶインターナルコントロールを増幅するためのプライマー、プローブセットは、１番（ＭＰ１）がより効率性が高いことを確認した。
【０１５１】
また、これを同じ新種インフルエンザ検体試料に対する既存のインターナルコントロールの反応結果と比較すると、タバコモザイクウイルスを検体試料とともに抽出、反応させたにも関わらず、新種インフルエンザＲＮＡテンプレートの増幅に影響を与えず、植物性インターナルコントロールの増幅が独立的になされたことを確認し、結果が良好であることを確認した。さらに、既存のバイオニア社で診断キットに使用していたインターナルコントロールに比べ、蛍光値がより高く出て、反応強度が高いということを確認した。
【０１５２】
また、定量的分析が可能であるかを確認するために、タバコモザイクウイルス粒子を１０２〜１０８ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度で夫々使用し、核酸分離精製装置でＲＮＡを抽出して、核酸増幅器でリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応を実施した。
【０１５３】
その結果、１０２〜１０８ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度を適用したＴＭＶ粒子は、最低１０３コピーまで検出が可能であった（図６）、標準テンプレートリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応の標準グラフを作成した時、勾配は−０．２８、Ｒ２値は１であった（図６）。ここで、Ｒ２はリアルタイム重合酵素連鎖反応の標準グラフで、グラフの直線性を示す相関係数であり、１に近いほど（直線に近いほど）、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）がまともに進行されたことを意味する。ＴＭＶ  ＲＮＡで標準テンプレートリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応を実施した標準グラフと比較すると、タバコモザイクウイルス粒子の濃度はＲＮＡ抽出後に１／１０程度に減少される傾向があるが、濃度毎に一定の間隔を有して標準グラフを示すため、定量的分析が可能であるということを確認した。
【０１５４】
（３）互いに異なる４種の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を利用したリアルタイム重合酵素連鎖反応
多様な生物学的試料から分離精製された互いに異なる種類のターゲット核酸を、同時に検出及び診断することが可能であるかを確認した。本発明のリアルタイム核酸分析統合システム内に構成されている核酸増幅器としてはＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（バイオニア社製、韓国）を使用し、バイオニア社の診断キットを用いた。リアルタイム重合酵素連鎖反応に使用された診断キットは、ＨＢＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（バイオニア社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＢＶ−１１１１）、ＨＣＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（バイオニア社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＣＶ−１１１１）、Ｎｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（バイオニア社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＩＶ−１１１１）、ＣＴ＆ＮＧ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（バイオニア社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＴＤ２Ａ−１１１１）の４種を使用した。
【０１５５】
ＨＢＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔは、Ｂ型肝炎の感染有無を確認するために、血清の検体試料から抽出されたＨＢＶ  ＤＮＡを増幅して定量的な分析をすることができるように構成されたキットであり、１０×ＰＣＲ  バッファー  ５μｌ、ｗＴｆｉ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ５Ｕ、ｄＮＴＰ  ２０ｍＭ  ５μｌ、Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＰＰｉ、安定化剤などの重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）混合液と、ＨＢＶ  ＤＮＡのみを特異的に増幅するようにデザインしたプライマー及びプローブが凍結乾燥されている（表２）。
【０１５６】
ＣＴ＆ＮＧ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔは、性病の感染有無を確認するために、尿またはスワッブ検体試料から抽出されたＣＴ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＤＮＡとＮＧ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＤＮＡを一つの反応チューブ内で同時に増幅するキットであり、ＨＢＶ診断キットと同一の重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）混合液を含み、ＣＴ  ＤＮＡまたはＮＧ  ＤＮＡのみを特異的に増幅するようにデザインされたプライマー及びプローブが凍結乾燥されている（表２）。
【０１５７】
前記の二つのキットは、ターゲットとしてＤＮＡを増幅するという類似点を有するが、ＨＢＶ診断キットの場合には血清から抽出したウイルスＤＮＡを単一増幅し、ＣＴ＆ＮＧ診断キットの場合には小便から抽出したＣＴとＮＧの二つの種類のバクテリアＤＮＡを一度に同時増幅するという差異を有しており、ＨＢＶ診断キットの場合はＤＮＡの定量的分析のために、ＣＴ＆ＮＧキットの場合はＤＮＡの定性的分析のために考案されたものであるという差がある。
【０１５８】
【表２】
0005774499.tif 000003
【０１５９】
Ｃ型肝炎の感染有無を診断するために開発されたＨＣＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔは、血清から抽出した核酸を増幅し、定量的に分析することができるという点でＨＢＶ診断キットと類似するが、ＨＢＶ診断キットの場合はウイルスＤＮＡを増幅し、ＨＣＶ診断キットの場合はウイルスＲＮＡを逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅するという差異を有する。
【０１６０】
新種インフルエンザの感染有無を診断するために最近開発されたＮｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔは、ＲＮＡターゲットを増幅するという点でＨＣＶ診断キットと類似するが、血清でなく呼吸器の検体からＲＮＡを抽出するという差異があり、定量分析が可能であるＨＣＶ診断キットと異なって、定性分析のために考案されたものであるという差がある。ＲＮＡ逆転写重合酵素連鎖反応のためのＨＣＶ診断キット、またはＮｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）診断キットには、具体的に１０×ＲＴ  バッファー  ５μｌ、ＭＭＬＶ  ６００Ｕ、ｗＴｆｉ  ５  ｕｎｉｔ、ｄＮＴＰ  ２０ｍＭ  ３μｌ、ＤＴＴ  ５０ｍＭ、ＲＮａｓｉｎ  １５Ｕ、安定化剤などのＲＴ−ＰＣＲ混合液と、ＨＣＶ  ＲＮＡまたはＮｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）ＲＮＡを選択的に増幅するようにデザインされたプライマー及びプローブ、が凍結乾燥されている（表２）。各診断キットに含まれたプライマー及びプローブは、５５℃〜５７℃の範囲で類似のＴｍ値を有するようにデザインされており、互いに異なる４種のキットも同時に重合酵素連鎖反応を進行することが可能である。
【０１６１】
前記の４種のキットを利用したリアルタイム重合酵素連鎖反応、または逆転写重合酵素連鎖反応を核酸増幅器で同時に進行するために、まず、各キットの乾燥重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）混合物にテンプレートＤＮＡまたはＲＮＡ  ５μｌ、インターナルコントロール用（内部対照群、ＩＰＣ）ＤＮＡまたはＲＮＡ  １μｌ、蒸溜水４４μｌを入れて、総容量が５０μｌになるように混合した。テンプレートＤＮＡまたはＲＮＡは、各ターゲットの特定部位をアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）過程によって選択した後、遺伝子合成法（ＮＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，２４８，２００−２０３）を利用してバイオニア社で合成し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）によりクローニングしたものである。
【０１６２】
一つのリアルタイム核酸増幅器（ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ、バイオニア社）の温度循環ブロックに、総容量５０μｌに混合されたＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＴ＆ＮＧ、Ｎｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）診断キットを装着し、装着された領域と合うようにソフトウェアプログラム上で列及びウェルを設定し、重合酵素連鎖反応条件は４５℃で１５分間逆転写反応を進行し、９５℃で５分間変性過程を経た後、９５℃で５秒、５５℃で５秒ずつ４５サイクルでプログラムを設定して、一度に反応させた。ＨＢＶ診断キットとＨＣＶ診断キットの場合、定量的分析のために、テンプレートＤＮＡ１０１〜１０７ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度を夫々使用し、ＣＴ＆ＮＧ診断キットとＮｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）診断キットの場合、定性分析のためのポジティブコントロールテンプレートＤＮＡまたはＲＮＡの一つの濃度のみを使用した。
【０１６３】
インターナルコントロール用ＤＮＡまたはＲＮＡは、テンプレートＤＮＡまたはＲＮＡの増幅に何の影響を与えることなく、独立的に増幅がなされるように考案された遺伝子であり、テンプレートＤＮＡまたはＲＮＡ増幅が全くなされていないネガティブコントロール結果から、インターナルコントロールＤＮＡまたはＲＮＡの増幅がまともになされたか否かを確認することにより、重合酵素連鎖反応には何らの問題もないということを検証するために用いられる。
【０１６４】
その結果、定量的分析のために１０１〜１０７ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度を適用したＨＢＶ診断キットのテンプレートＤＮＡは、最低１０コピーまで検出が可能であった（図８）。また、標準テンプレートリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応の標準グラフを作成すた時、勾配は−０．２８、Ｒ２値は０．９９９７であった（図９）。ここで、Ｒ２は、リアルタイム重合酵素連鎖反応の標準グラフで、グラフの直線性を示す相関係数であり、１に近いほど（直線に近いほど）、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）がまともに進行されたことを意味する。ＨＣＶ診断キットの場合にも、最低１０コピーまでテンプレートＲＮＡの検出が可能であった（図１０）。また、標準テンプレートリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応の標準グラフを作成した時、勾配は−０．２９、Ｒ２値は０．９９９８であった（図１１）。前記結果から、ＲＮＡとＤＮＡの差に関わらず、一つのリアルタイム核酸増幅器で重合酵素連鎖反応を同時に進行することができるという点を確認した。
【０１６５】
定性的分析のために考案されたＣＴ＆ＮＧ診断キットの場合にも、定量分析キットであるＨＢＶ、ＨＣＶ診断キットと重合酵素連鎖反応を同時に進行した場合、ＣＴポジティブコントロールＤＮＡ、ＮＧポジティブコントロールＤＮＡ及びインターナルコントロール用ＤＮＡの全てが正常に増幅された。検出可能限界を確認するために、１０１〜１０７ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度のＣＴ及びＮＧテンプレートＤＮＡを準備して反応を進行した結果、ＣＴ及びＮＧの全て１０コピー検出が可能であるということを確認し、標準テンプレートリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応の標準グラフを作成した時、ＣＴの勾配は−０．２８、Ｒ２値は０．９９９７であり、ＮＧの勾配は−０．３０、Ｒ２値は０．９９９６であった。
【０１６６】
ＣＴ＆ＮＧキットと類似の方法でＮｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）キットを適用した場合にも、ポジティブコントロールＲＮＡが正常に増幅されることが確認された。検出可能限界を確認するために、１０１〜１０７ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度のＮｅｗ  ＩｎｆＡ（Ｈ１Ｎ１）テンプレートＲＮＡを準備して反応を進行した結果、１０コピーが検出可能であることを確認し、標準テンプレートリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応の標準グラフを作成した時、勾配は−０．２８、Ｒ２値は０．９９９６であった。これにより、定量的分析または定性的分析のために考案されたキットでも、重合酵素連鎖反応を同時に進行することができるという点が確認された。
【０１６７】
前記の実験結果から、リアルタイム核酸分析統合システム内に構成されている一つのリアルタイム核酸増幅器を使用して、重合酵素連鎖反応及び逆転写重合酵素連鎖反応を進行するにあたり、定量分析及び定性分析のために考案された互いに異なる４種の診断キットを利用しても、血清、尿、呼吸器などの互いに異なる検体から抽出されたＤＮＡ及びＲＮＡを同一の条件で同時に増幅することができることが確認された。
【符号の説明】
【０１６８】
１００  自動精製分注装置
２００  リアルタイム核酸増幅器
３００  ディスプレイ部
４００  保存データベース装置
【図１】
0005774499.tif 000004
【図２】
0005774499.tif 000005
【図３】
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【図４】
0005774499.tif 000007
【図５】
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【図６】
0005774499.tif 000009
【図７】
0005774499.tif 000010
【図８】
0005774499.tif 000011
【図９】
0005774499.tif 000012
【図１０】
0005774499.tif 000013
【図１１】
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