(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を検出する方法であって、前記方法が、
ｉ）試料を、脂質二重層中に埋め込まれ、化合物と結合することができる少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体を含む無細胞組成物と接触させるステップであって、
Ｇタンパク質共役受容体が、同じまたは異なる１つまたは複数のサブユニットを含み、
それぞれのサブユニットは、Ｇタンパク質共役受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体が、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含み、生物発光タンパク質が、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはその生物学的に活性な変異体もしくは断片であり、アクセプター分子が緑色蛍光タンパク質２（ＧＦＰ２）であるステップと、
ｉｉ）ステップｉ）と同時にまたはそれに連続して、生物発光タンパク質の基質を提供し、かつ基質がセレンテラジン４００ａであり、生物発光タンパク質が基質を修飾することを可能にするステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）が生物発光タンパク質とアクセプター分子の間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を変動させるかどうかを決定するステップと
を含み、化合物がＧタンパク質共役受容体と結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にあり、かつ、ＢＲＥＴ比率の変化の幅が試料中の化合物の相対量を示し、かつ、
１）Ｇタンパク質共役受容体のサブユニットが、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含む化合物と結合することができ、化合物がサブユニットに結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、
２）Ｇタンパク質共役受容体は、生物発光タンパク質およびアクセプター分子とを含む第１のサブユニットと、化合物と結合することができる第２のサブユニットとを含み、化合物が第２のサブユニットと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、
かつ、１）および２）において、
ａ）生物発光タンパク質がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子がＣ末端の一部を形成し、または
ｂ）アクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質がＣ末端の一部を形成する、前記方法。
【請求項２】
生物発光タンパク質およびアクセプター分子のＦｏｒｓｔｅｒ距離が、６．８ｎｍおよび７．６ｎｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物発光タンパク質およびアクセプター分子のＦｏｒｓｔｅｒ距離が、７．５ｎｍである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｉ）無細胞組成物が、組換え細胞中でＧタンパク質共役受容体を産生し、細胞の膜を破壊することによって得られた、または
ｉｉ）Ｇタンパク質共役受容体が、リポソームの脂質二重層中に埋め込まれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
組換え細胞が酵母細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マイクロ流体工学を使用して行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
無細胞組成物中にあるものの代わりにインタクトな細胞中に存在する同じＧタンパク質共役受容体を使用する場合より少なくとも１０倍強いＢＲＥＴシグナルをもたらす、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
化合物を検出するための精製および／または組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ｉ）Ｇタンパク質共役受容体のサブユニットと、
ｉｉ）生物発光タンパク質が、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはその生物学的に活性な変異体もしくは断片であり、アクセプター分子が緑色蛍光タンパク質２（ＧＦＰ２）である、生物発光タンパク質およびアクセプター分子と
を含み、かつ、細胞中で発現したときにサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にあり、かつ化合物がポリペプチドと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、かつ、ＢＲＥＴ比率の変化の幅が試料中の化合物の相対量を示し、かつ
ａ）生物発光タンパク質がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子がＣ末端の一部を形成し、または
ｂ）アクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質がＣ末端の一部を形成する、前記ポリペプチド。
【請求項９】
ｉ）サブユニットが、第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットのＮ末端および１番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分、第２のＧタンパク質共役受容体サブユニットの１番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分から５番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、ならびに第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットの５番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端までを含むか、または
ｉｉ）サブユニットが、第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットのＮ末端から５番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、および第２のＧタンパク質共役受容体サブユニットの５番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端までを含む、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｉ）サブユニットが、第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットのＮ末端および１番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分、第２のＧタンパク質共役受容体サブユニットの１番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分から５番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、ならびに第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットの５番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端までを含むか、または
ｉｉ）サブユニットが、第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットのＮ末端から５番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、および第２のＧタンパク質共役受容体サブユニットの５番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端までを含む、
請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｇタンパク質共役受容体が嗅覚受容体である、請求項１〜７または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
サブユニットが、２つ以上の異なるＧタンパク質共役受容体サブユニットの部分のキメラである、請求項１〜７または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｇタンパク質共役受容体が嗅覚受容体である、請求項８または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
サブユニットが、２つ以上の異なるＧタンパク質共役受容体サブユニットの部分のキメラである、請求項８または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
嗅覚受容体が、脊索動物受容体、線虫受容体、またはそのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくは断片である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
嗅覚受容体が、脊索動物受容体、線虫受容体、またはそのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくは断片である、請求項１３または１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項８、１０、１３、１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離および／または外因性ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
プロモーターと作動可能に連結する、請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
酵母細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項８、１０、１３、１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１７に記載のポリヌクレオチド、請求項１８に記載のベクター、および／または請求項１９または２０に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項２２】
脂質二重層中に埋め込まれている、請求項８、１０、１３、１４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む無細胞組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の無細胞組成物を作製する方法であって、前記方法が、請求項１９または２０に記載の細胞を得るステップと、細胞の膜を破壊するステップとを含む、前記方法。
【請求項２４】
請求項８、１０、１３、１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１９または２０に記載の宿主細胞、請求項２１に記載の組成物、および／または請求項２２に記載の無細胞組成物を含むバイオセンサー。
【請求項２５】
Ｇタンパク質共役受容体と結合する化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法が、
ｉ）候補化合物を、脂質二重層中に埋め込まれ、化合物と結合することができる少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体を含む無細胞組成物と接触させるステップであって、
Ｇタンパク質共役受容体が、同じまたは異なる１つまたは複数のサブユニットを含み、それぞれのサブユニットは、Ｇタンパク質共役受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体が、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含み、生物発光タンパク質が、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはその生物学的に活性な変異体もしくは断片であり、アクセプター分子が緑色蛍光タンパク質２（ＧＦＰ２）であるステップと、
ｉｉ）ステップｉ）と同時にまたはそれに連続して、生物発光タンパク質の基質を提供し、かつ基質がセレンテラジン４００ａであり、生物発光タンパク質が基質を修飾することを可能にするステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）が生物発光タンパク質とアクセプター分子の間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を変動させるかどうかを決定するステップと
を含み、ＢＲＥＴの変動が、化合物がＧタンパク質共役受容体と結合することを示し、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にあり、かつ、ＢＲＥＴ比率の変化の幅が試料中の化合物の相対量を示し、かつ
１）Ｇタンパク質共役受容体のサブユニットが、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含む化合物と結合することができ、化合物がサブユニットに結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、
２）Ｇタンパク質共役受容体は、生物発光タンパク質およびアクセプター分子とを含む第１のサブユニットと、化合物と結合することができる第２のサブユニットとを含み、化合物が第２のサブユニットと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、
かつ、１）および２）において、
ａ）生物発光タンパク質がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子がＣ末端の一部を形成し、または
ｂ）アクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質がＣ末端の一部を形成する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の化合物を検出するための方法およびポリペプチドに関する。詳細には、本発明は、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある、脂質二重層中に埋め込まれ、化合物と結合することができる少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体を含む無細胞組成物の使用に関する。任意選択で、組成物は、Ｇタンパク質共役受容体の細胞内ループおよび／またはＣ末端と直接または間接的に結合する少なくとも１つのアクセサリー分子も含む。Ｇタンパク質共役受容体および／または存在する場合アクセサリー分子は、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を一緒に含み、生物発光タンパク質およびアクセプター分子によって、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を使用して受容体に結合する化合物を検出することができる。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞の外側で分子を感知し、内側でシグナル伝達経路を、最終的に細胞応答を活性化する膜貫通受容体のファミリーである。ＧＰＣＲは、酵母および動物を含む真核生物でしか発見されていない。ＧＰＣＲと結合しそれを活性化するリガンドには、光感受性化合物、匂い、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質があり、小分子からペプチド、大分子タンパク質までサイズが様々である。Ｇタンパク質共役受容体は多数の疾患に関与し、治療用薬物の標的でもある。
【０００３】
脊椎動物およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓの嗅覚受容体（ＯＲ）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーのメンバーである（Ｂｕｃｋら、１９９１；Ｔｒｏｅｍｅｌら、１９９５）。ＧＰＣＲは、その７つの膜貫通ドメインを特徴とし、リガンド結合ドメインが膜の細胞外側にあり、Ｇタンパク質結合ドメインが細胞内側にあると推測される。受容体がリガンドと結合したとき、高次構造変化が受容体中に起こり、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化することを可能にする（Ｋｏｂｉｌｋａら、２００７）。次いで、活性化したＧタンパク質は、グアニルシクラーゼやホスホリパーゼＣ経路などのシグナル伝達経路を活性化することができ、シグナルをより高位の処理中枢に伝達する（Ｇａｉｌｌａｒｄら、２００４）。
【０００４】
Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動、または単に共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）とは、励起状態のドナー分子から基底状態のアクセプター分子へのエネルギーの非放射性移動である（Ｇｈａｎｏｕｎｉら、２００１）。エネルギー移動効率は、ドナーとアクセプターとの距離、スペクトルの重複の程度およびアクセプターとドナーの双極子の相対的配向に依存的である。分子内ＲＥＴがＧＰＣＲ活性化のモニタリングに使用されていた以前の場合では、蛍光ドナーおよびアクセプターといった、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれる方法を使用している。ほとんどの場合、蛍光ドナーとアクセプターはどちらも、Ａｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の工学的変異体である（Ｔｓｉｅｎ、１９９８）。最も広く使用されるＦＲＥＴの対は、ドナーであるシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）とアクセプターである黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）であり（ＰｉｓｔｏｎおよびＫｒｅｍｅｒｓ、２００７）、このＦＲＥＴ系は、いくつかのＧＰＣＲによる直接的なリガンド結合を定量するのに以前から使用されている（Ｌｏｈｓｅら、２００３および２００７；Ｖｉｌａｒｄａｇａら、２００３；Ｒｏｃｈａｉｓら、２００７；Ｌｉｓｅｎｂｅｅら、２００７）。
【０００５】
受容体の活性化をモニタリングする１つの方法では、単一のＧＰＣＲを、それぞれ３番目の細胞内ループおよびＣ末端内の挿入部位において、ＣＦＰおよびＹＦＰで二重標識する。４３６ｎｍの光でＣＦＰを励起すると、４８０ｎｍでのＣＦＰの放出、および５３５ｎｍで放出するＹＦＰのＦＲＥＴを引き起こす。ＦＲＥＴの効率は、ドナーとアクセプターとの距離の６乗によって変化し、このことから、ＧＰＣＲにおける高次構造変化が極めて感度よく示される。このことは、α２ＡＲ、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ）、β１−ＡＲおよびセクレチン受容体を用いて、インタクトな細胞において実証された。アゴニストであるノルアドレナリンとα２ＡＲ（Ｌｏｈｓｅら、２００３）、副甲状腺ホルモンとＰＴＨＲ（Ｖｉｌａｒｄａｇａら、２００３）、ノルエピネフリンとβ１−ＡＲ（Ｒｏｃｈａｉｓら、２００７）、およびセクレチンとセクレチン受容体（Ｌｉｓｅｎｂｅｅら、２００７）の相互作用はＣＦＰとＹＦＰとの距離を変化させ、それによってＦＲＥＴシグナルの変化が生じた。
【０００６】
ＦＲＥＴ系においてＹＦＰアクセプターをフルオレセインヒ素ヘアピン結合体であるＦｌＡｓＨと交換すると（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００５；Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、２００６）、α２アドレナリン作動性受容体活性化のモニタリングに使用したとき、アゴニスト誘導ＦＲＥＴシグナルがＣＦＰ／ＹＦＰ系と比較して５倍増大した（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、２００６）。しかし、ＦｌＡｓＨは、困難な標識化および洗浄手順を伴い、広い調査集団での使用が限定されている。ＣＦＰ／ＹＦＰ系は、依然として、分子内の高次構造変化をモニタリングするのに最も頻繁に報告されているＦＲＥＴ系である。ＦＲＥＴに付随する主な不利点は、ドナー蛍光体にエネルギーを与えるのに光源が必要となることである（ＰｉｓｔｏｎおよびＫｒｅｍｅｒｓ、２００７）。これは、ドナーの励起波長でアクセプターの望ましくない直接励起を引き起こす（「クロストーク」と呼ばれる問題）。
【０００７】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）では、ＦＲＥＴのドナー蛍光体をルシフェラーゼと交換し、アクセプターは任意の適切な蛍光体でよい。基質を添加すると生物発光放出、したがってＲＥＴが開始されるので、ルシフェラーゼを使用すると、照明の必要が回避される。ＢＲＥＴの２つの一般的な実行形態は、ＧＦＰ突然変異体のＹＦＰ（ＢＲＥＴ１；λｅｍ＝約５３０ｎｍ）またはＧＦＰ２（ＢＲＥＴ２；λｅｍ＝約５１０ｎｍ）のどちらかと結合した、ドナー系であるセレンテラジンｈ（ＢＲＥＴ１；λｅｍ＝約４７５ｎｍ）またはセレンテラジン４００ａ（Ｃｌｚ４００ａ）基質（ＢＲＥＴ２；λｅｍ＝約３９５ｎｍ）を有するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）を含む。ＢＲＥＴ２系は、量子収量を消費して、ＢＲＥＴ１系の約５５ｎｍと比較して約１１５ｎｍという、ドナーとアクセプターの放出ピーク間の優れたスペクトル分離をもたらす（ＰｆｌｅｇｅｒおよびＥｉｄｎｅら、２００６）。
【０００８】
嗅覚受容体でのＦＲＥＴは、クラスＡ（ａ２−アドレナリン作動性および副甲状腺ホルモン、（Ｖｉｌａｒｄａｇａら、２００３））およびクラスＢ（セクレチン、（Ｌｉｓｅｎｂｅｅら、２００７））ＧＰＣＲでしか以前には実証されていない。ＧＰＣＲクラスＡに属する哺乳動物ＯＲと異なり、線虫ＯＲ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９９８および２００１）は、これらのクラスのどちらにも属さず、進化的および構造的に異なる。さらに、ＧＰＣＲスーパーファミリーのクラスＡ内にある、哺乳動物ＯＲを含めた全てのＯＲは、その発現の点では非定型的である。一般に、これらのタンパク質は、化学感覚系列に由来するニューロン以外では機能的に発現できない。哺乳動物および線虫ＯＲの適切な発現にその存在が必要となるいくつかのアクセサリータンパク質が同定されている。
【０００９】
したがって、例えば、バイオセンサーで使用するＧタンパク質共役受容体と結合する化合物の検出を可能にする適切に感度のよい方法および分子が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、嗅覚受容体（ＯＲ）など、キメラのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を使用して標的化合物を検出する無細胞の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）が、全細胞を使用したＢＲＥＴやＦＲＥＴなど他の検出方法より感度がよいことを見出した。
【００１１】
したがって、第１の態様では、本発明は、化合物を検出する方法であって、前記方法が、
ｉ）試料を、
ａ）脂質二重層中に埋め込まれ、化合物と結合することができる少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体と、
ｂ）任意選択で、Ｇタンパク質共役受容体の細胞内ループおよび／またはＣ末端と直接または間接的に結合する少なくとも１つのアクセサリー分子と
を含む無細胞組成物と接触させるステップであって、
Ｇタンパク質共役受容体が、同じまたは異なる１つまたは複数のサブユニットを含み、Ｇタンパク質共役受容体および／または存在する場合アクセサリー分子が、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を一緒に含むステップと、
ｉｉ）ステップｉ）と同時にまたはそれに連続して、生物発光タンパク質の基質を提供し、生物発光タンパク質が基質を修飾することを可能にするステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）が生物発光タンパク質とアクセプター分子の間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を変動（modulate）させるかどうかを決定するステップと
を含み、化合物がＧタンパク質共役受容体と結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある方法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、化合物と結合することができるＧタンパク質共役受容体のサブユニットは、
ｉ）生物発光タンパク質と、
ｉｉ）アクセプター分子と
を含み、化合物がサブユニットと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化する。例えば、サブユニットは、
ｉ）配列番号１３、１５、５２もしくは５４として示されるアミノ酸配列、または
ｉｉ）配列番号１３、１５、５２もしくは５４のいずれか１つもしくは複数と少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列
を含んでよい。
【００１３】
代替の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体は、
ｉ）ａ）生物発光タンパク質と、
ｂ）アクセプター分子と
を含む第１のサブユニットと、
ｉｉ）化合物と結合することができる第２のサブユニットと
を含み、化合物が第２のサブユニットと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化する。
【００１４】
さらなる実施形態では、
ｉ）生物発光タンパク質がサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｉ）アクセプター分子がサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質が５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｉｉ）生物発光タンパク質がサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｖ）アクセプター分子がサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質が３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｖ）生物発光タンパク質がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子がＣ末端の一部を形成し、または
ｖｉ）アクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質がＣ末端の一部を形成する。
【００１５】
さらに別の代替の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体は、
ｉ）生物発光タンパク質を含む第１のサブユニットと、
ｉｉ）アクセプター分子を含む第２のサブユニットと
を含む。例えば、第１または第２のサブユニットは、
ｉ）配列番号１７もしくは１９として示されるアミノ酸配列、または
ｉｉ）配列番号１７および／もしくは１９と少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列
を含んでよい。
【００１６】
一実施形態では、
ｉ）生物発光タンパク質が第１のサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が第２のサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｉ）アクセプター分子が第１のサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質が第２のサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｉｉ）生物発光タンパク質が第１のサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が第２のサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｖ）アクセプター分子が第１のサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質が第２のサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｖ）生物発光タンパク質が第１のサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が第２のサブユニットのＣ末端の一部を形成し、または
ｖｉ）アクセプター分子が第１のサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質が第２のサブユニットのＣ末端の一部を形成する。
【００１７】
さらなる代替の実施形態では、
ｉ）Ｇタンパク質共役受容体が生物発光タンパク質を含むサブユニットを含み、アクセサリー分子がアクセプター分子を含み、または
ｉｉ）Ｇタンパク質共役受容体がアクセプター分子を含むサブユニットを含み、アクセサリー分子が生物発光タンパク質を含む。
【００１８】
別の代替の実施形態では、アクセサリー分子は、
ｉ）生物発光タンパク質と、
ｉｉ）アクセプター分子と
を含む。
【００１９】
さらなる代替の実施形態では、組成物は、少なくとも２つのアクセサリー分子を含み、第１のアクセサリー分子は生物発光タンパク質を含み、第２のアクセサリー分子はアクセプター分子を含む。
【００２０】
本発明者らは、ＦＲＥＴ−無細胞およびＢＲＥＴ−全細胞検出系と比較したときに本発明がいかに優れているかを発見して特に驚いた。したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法は、非生物発光タンパク質をドナー分子として使用し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の変動を決定する場合より少なくとも２倍、３倍または４倍感度がよい。さらなる好ましい実施形態では、本発明の方法は、この方法で無細胞組成物中にあるものの代わりにインタクトな細胞中に存在する同じＧタンパク質共役受容体を使用する場合より少なくとも１０倍、２０倍、３０倍または４０倍強いＢＲＥＴシグナルをもたらす。
【００２１】
クラスＡのＧＰＣＲ、一般にＯＲ、特に線虫ＯＲの非定型的性質を考慮すると、ＢＲＥＴドナーおよびアクセプタータグとともにクラスＡのＧＰＣＲを含むキメラが、ａ）構造的完全性を保持し、ｂ）匂い物質による受容体活性化を光学的シグナルに変換することができることは驚くべきことであった。したがって、好ましい実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体はクラスＡのＧＰＣＲである。さらなる好ましい実施形態では、クラスＡのＧＰＣＲは嗅覚受容体である。細胞中で発現したときに受容体のＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある限り、嗅覚受容体はどんな供給源由来のものでもよい。例として、それだけに限らないが、脊索動物受容体、線虫受容体、またはそのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくは断片がある。脊索動物受容体の例として、それだけに限らないが、哺乳動物受容体、鳥類受容体および魚類受容体がある。好ましい実施形態では、嗅覚受容体は、線虫受容体、またはその生物学的に活性な変異体もしくは断片である。一実施形態では、線虫受容体は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ受容体、またはその生物学的に活性な変異体もしくは断片である。
【００２２】
一実施形態では、嗅覚受容体は、
ｉ）配列番号１〜６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列と、
ｉｉ）配列番号１〜６のいずれか１つまたは複数と少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列と
を含む。
【００２３】
別の実施形態では、サブユニットは、２つ以上の異なるＧタンパク質共役受容体サブユニットの部分のキメラである。
【００２４】
アクセサリー分子は、Ｇタンパク質共役受容体と直接または間接的に結合する任意の分子でよい。例として、それだけに限らないが、Ｇタンパク質およびアレスチンがある。
【００２５】
ＢＲＥＴの変化の幅に対して化合物の濃度を変化させる効果は、その応答が用量依存的であることを最初に示した。したがって、好ましい実施形態では、ＢＲＥＴのレベルは、試料中の化合物の相対量を示す。
【００２６】
生物発光タンパク質の例として、それだけに限らないが、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ（lactamase）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼまたはβ−グルコシダーゼがある。
【００２７】
ルシフェラーゼの例として、それだけに限らないが、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、ホタル（Firefly）ルシフェラーゼ、腔腸動物（Coelenterate）ルシフェラーゼ、北アメリカツチボタル（North America glow worm）ルシフェラーゼ、コメツキム（click beetle）シルシフェラーゼ、鉄道虫（railroad worm）ルシフェラーゼ、細菌（bacterial）ルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ、エクオリン、ヒカリキノコバエ（Ａｒａｃｈｎｏｃａｍｐａ）ルシフェラーゼ、またはそのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくは断片、またはその２つ以上のキメラがある。
【００２８】
基質の例として、それだけに限らないが、甲虫（beetle）ルシフェリン、他のルシフェリン、セレンテラジン、またはセレンテラジンの誘導体がある。また、エクオリンなどの一部の発光タンパク質の場合、基質は、カルシウムイオンなどの補助因子でもよい。
【００２９】
一実施形態では、アクセプター分子はタンパク質であり、その例として、それだけに限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強型ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強型ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド（Ｅｍｅｒａｌｄ）、トパーズ（Ｔｏｐａｚ）、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔ−ダイマー２、ｔ−ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン（pocilloporin）、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ＧＦＰ、モンスター（Ｍｏｎｓｔｅｒ）  ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデ（Ｋａｅｄｅ）タンパク質もしくはフィコビリタンパク質（Phycobiliprotein）、またはそのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくは断片がある。
【００３０】
代替の実施形態では、アクセプター分子は非タンパク質であり、その例として、それだけに限らないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光マイクロスフェア、発光マイクロスフェア、蛍光ナノ結晶、マリナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、テキサスレッド、希土類元素キレート、またはその任意の組合せもしくは誘導体がある。
【００３１】
別の実施形態では、前記方法は、ステップｉ）もしくはステップｉｉ）と同時にまたはそれに連続して、生物発光タンパク質の補助因子を提供するステップをさらに含む。例として、それだけに限らないが、ＡＴＰ、マグネシウム、酸素、ＦＭＮＨ２、カルシウム、またはそのいずれか２つ以上の組合せがある。
【００３２】
一実施形態では、無細胞組成物は、組換え細胞中でＧタンパク質共役受容体を産生し、細胞の膜を破壊することによって得られた。
【００３３】
一実施形態では、組換え細胞は、Ｇタンパク質共役受容体と結合する非内因性タンパク質を産生しない。
【００３４】
無細胞組成物を得ることができる細胞は、Ｇタンパク質共役受容体を発現し、この受容体をその細胞膜に取り込むことができる任意の細胞型である。特に好ましい実施形態では、組換え細胞は酵母細胞である。
【００３５】
代替の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体は、リポソームの脂質二重層中に埋め込まれる。
【００３６】
さらなる実施形態では、前記方法は、マイクロ流体工学を使用して行われる。
【００３７】
別の態様では、本発明は、化合物を検出するための精製および／または組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ｉ）Ｇタンパク質共役受容体のサブユニットと、
ｉｉ）生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子と
を含み、細胞中で発現したときにサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある、ポリペプチドを提供する。
【００３８】
一実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数の異なるＧタンパク質共役受容体サブユニット、および任意選択で１つまたは複数の異なるアクセサリー分子を含むＧタンパク質共役受容体であるタンパク質複合体の一部を形成する。
【００３９】
一実施形態では、
ｉ）生物発光タンパク質がサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｉ）アクセプター分子がサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質が５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｉｉ）生物発光タンパク質がサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｖ）アクセプター分子がサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質が３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｖ）生物発光タンパク質がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子がＣ末端の一部を形成し、または
ｖｉ）アクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質がＣ末端の一部を形成し、または
ｖｉｉ）生物発光タンパク質もしくはアクセプター分子がサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｖｉｉｉ）生物発光タンパク質もしくはアクセプター分子がサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｉｘ）生物発光タンパク質もしくはアクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、または
ｘ）生物発光タンパク質もしくはアクセプター分子がサブユニットのＣ末端の一部を形成する。
【００４０】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含み、化合物がポリペプチドと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化する。
【００４１】
代替の実施形態では、ポリペプチドはサブユニットおよび生物発光タンパク質を含み、ポリペプチドはアクセプター分子を含む第２のポリペプチドと直接または間接的に結合し、化合物がポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化する。
【００４２】
さらなる代替の実施形態では、ポリペプチドはサブユニットおよびアクセプター分子を含み、ポリペプチドは生物発光タンパク質を含む第２のポリペプチドと直接または間接的に結合し、化合物がポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化する。
【００４３】
上記２つの実施形態では、第２のポリペプチドは、（本明細書で定義されるホモもしくはヘテロ二量体または高次の多量体を形成する）Ｇタンパク質共役受容体サブユニットまたはアクセサリー分子のいずれかを含む。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、化合物を検出するための精製および／または組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ｉ）Ｇタンパク質共役受容体の細胞内ループおよび／またはＣ末端と直接または間接的に結合するアクセサリー分子と、
ｉｉ）生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子と
を含み、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある、ポリペプチドを提供する。
【００４５】
熟練した読者なら理解するであろうが、検出の方法に関する上記の実施形態の多くは、本発明のポリペプチドの態様にも当てはまる。
【００４６】
本発明のポリペプチドをコードする単離および／または外因性ポリヌクレオチドも提供される。
【００４７】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号７〜１２、１４、１６、１８、２０、５１もしくは５３のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列、または
ｉｉ）配列番号７〜１２、１４、１６、１８、２０、５１もしくは５３のいずれか１つまたは複数と少なくとも４０％同一であるヌクレオチド配列
を含む。
【００４８】
別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーターと作動可能に連結する。
【００４９】
さらなる態様では、本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００５０】
好ましくは、宿主細胞は本発明のポリペプチドを産生し、したがってそれを含む。
【００５１】
宿主細胞は任意の細胞型でよい。
【００５２】
本発明者らは、酵母の膜における、哺乳動物の嗅覚受容体と進化的に異なる線虫の嗅覚受容体の機能的発現も最初に示す。したがって、好ましい実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。
【００５３】
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、および／または本発明の宿主細胞を含む組成物を提供する。
【００５４】
好ましくは、ポリペプチドは脂質二重層中に埋め込まれている。
【００５５】
ｉ）Ｇタンパク質共役受容体サブユニットを含む本発明のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが脂質二重層中に埋め込まれ、ならびに／または
ｉｉ）Ｇタンパク質共役受容体の細胞内ループおよび／もしくはＣ末端と直接もしくは間接的に結合したアクセサリー分子を含む本発明のポリペプチドであって、Ｇタンパク質共役受容体が脂質二重層中に埋め込まれ、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある、ポリペプチド
を含む無細胞組成物も提供される。
【００５６】
好ましくは、脂質二重層は、酵母脂質二重層である。
【００５７】
一実施形態では、無細胞組成物は、生物発光タンパク質の基質および／または生物発光タンパク質の補助因子をさらに含む。
【００５８】
熟練した読者なら理解するであろうが、検出の方法に関する上記の実施形態の多くは、本発明の無細胞の態様にも当てはまる。
【００５９】
さらなる態様では、本発明は、本発明の無細胞組成物を作製する方法であって、本発明の細胞を得るステップと、細胞の膜を破壊するステップとを含む方法を提供する。
【００６０】
一実施形態では、細胞を浸透化または溶解する。
【００６１】
一実施形態では、細胞をフレンチプレスで溶解する。
【００６２】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の宿主細胞、本発明の組成物および／または本発明の無細胞組成物を含むバイオセンサーを提供する。
【００６３】
さらなる態様では、本発明は、Ｇタンパク質共役受容体と結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
ｉ）候補化合物を、
ａ）脂質二重層中に埋め込まれ、化合物と結合することができる少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体と、
ｂ）任意選択で、Ｇタンパク質共役受容体の細胞内ループおよび／またはＣ末端と直接または間接的に結合する少なくとも１つのアクセサリー分子と
を含む無細胞組成物と接触させるステップであって、
Ｇタンパク質共役受容体が、同じまたは異なる１つまたは複数のサブユニットを含み、Ｇタンパク質共役受容体および／または存在する場合アクセサリー分子が、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を一緒に含むステップと、
ｉｉ）ステップｉ）と同時にまたはそれに連続して、生物発光タンパク質の基質を提供し、生物発光タンパク質が基質を修飾することを可能にするステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）が生物発光タンパク質とアクセプター分子の間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を変動させるかどうかを決定するステップと
を含み、ＢＲＥＴの変動が、化合物がＧタンパク質共役受容体と結合することを示し、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある、前記方法を提供する。
【００６４】
熟練した読者なら理解するであろうが、検出の方法に関する上記の実施形態の多くは、本発明のスクリーニングの方法の態様にも当てはまる。
【００６５】
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組成物、本発明の無細胞組成物、および／または本発明のバイオセンサーを含むキットを提供する。
【００６６】
明らかとなるように、本発明の１つの態様の好ましい性質および特徴は、本発明の多くの他の態様に適用可能である。
【００６７】
本明細書全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられた要素、整数もしくはステップ、または一群の要素、整数もしくはステップを包含することを意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または一群の要素、整数もしくはステップを除外することを意味しないことが理解されるであろう。
【００６８】
以後、下記の非限定的な実施例により、添付図面を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＧＦＰ２およびＲＬｕｃと融合したＯＤＲ−１０受容体における共鳴エネルギー移動の原理を示す図である。ＧＦＰ２はＧＰＣＲの３番目の細胞内ループ中に、ＲＬｕｃはそのＣ末端に挿入されている。ジアセチルが結合した結果、高次構造変化が生じ、ＲＬｕｃとＧＦＰ２との距離が短く（上部右側）、もしくは長くなり（下部右側）、またはその発色団双極子の相対的配向の変化が生じ得、用量依存的にＢＲＥＴ２シグナルが変化する。
【図２】（Ａ）μＭ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２）および（Ｂ）ｎＭ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）濃度のリガンドまたは水に対するＯＧＯＲの応答を示す図である（＊は、水と比較して有意差がある（Ｐ≦０．０５）ことを示す）。
【図３】水単独と比較した、（Ａ）μＭ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２）および（Ｂ）ｎＭ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）濃度のリガンドに対するＯＧＯＲのＢＲＥＴ２比率（％）の変化を示す図である。
【図４】ＯＧＯＲのＢＲＥＴ２応答のジアセチル濃度依存性を示す図である（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）。
【図５】水または１μＭのジアセチル水溶液に対するＯＧＯＲ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）およびＯＧＯＲ突然変異体（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）の応答の比較を示す図である。
【図６】水または１μＭのジアセチル水溶液に対するＯＣＯＹ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）およびＯＧＯＲ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）の応答の比較を示す図である。
【図７】様々な濃度のジアセチルを添加した時のＯＣＯＹのスペクトルスキャンを示す図である。上部：生データ。下部：標準化した（５００ｎｍ）データ。
【図８】ＦＲＥＴ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）とＢＲＥＴ２（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）の両方でタグを付けたＯＤＲ−１０の標準化した用量反応曲線を示す図である。
【図９】ＬＢ単独と比較した、ＬＢ中のＯＰ５０細菌上清（ＬＢ）またはＯＰ５０細菌培養物１０μＬ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）に対するＴＧＴＲの応答を示す図である（＊は、ＬＢと比較して有意差がある（Ｐ≦０．０５）ことを示す）。
【図１０】μＭ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）濃度のリガンドまたは水に対するＴＧＴＲの応答を示す図である（＊は、水と比較して有意差がある（Ｐ≦０．０５）ことを示す）。
【図１１】ＯＤＲ−１０伝達カセットを示す図である。暗部：ＯＤＲ−１０配列、明部：可変受容体リガンド結合ドメイン。Ａ）カセット中で固定されたＮ末端、Ｂ）Ｎ末端可変ＯＲ配列。Ｒルシフェラーゼは４１０ｎｍで放出するものとして示し、ＧＦＰ２は５１５ｎｍで放出するものとして示す。
【図１２】共焦点顕微鏡法（Ｅｘ４８８ｎｍ、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２共焦点レーザー走査型顕微鏡）によりｏｄｒ−１０受容体の局在およびタグ付きｏｄｒ−１０の発現レベルを示す、ｏｄｒ−１０−Ｒｌｕｃおよびｏｄｒ−１０−ＧＦＰ２を同時発現した酵母細胞を示す図である。
【図１３】生存Ｉｎｖｓｃ１酵母細胞における線虫ｏｄｒ−１０の構成的ＢＲＥＴ２を示す図である。タグ付きｏｄｒ−１０タンパク質を発現するように、試験した全ての酵母株を１５℃で２４時間誘導した。１０ｕＭのセレンテラジンｈ（ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ）を添加し、二重波長マイクロプレート読取り器で、方法において記載するＲｌｕｃおよびＧＦＰ２のフィルター設定を用いて光放出を測定することにより、生存細胞でエネルギー移動測定を行った。データは、２つの独立した実験の平均±ＳｔＤである。Ｉｎｓｖｃ１／ｏｄｒ−１０−ＲＬｕｃ：陰性対照。Ｉｎｖｓｃ１／ｏｄｒ−１０−ＲＬｕｃ＋Ｉｎｖｓｃ１／ｏｄｒ−１０−ＧＦＰ２：別々の細胞におけるＯＲおよびＯＧ。プレートの読み取りで細胞を一緒に混合した：２つの構築物が別々の細胞で発現したので、ＢＲＥＴは予想されない。Ｉｎｖｓｃ１／ｏｄｒ−１０−ＲＬｕｃ；ｏｄｒ−１０−ＧＦＰ２：どちらの構築物も同じ細胞で発現した。ＢＲＥＴが存在し、したがって二量体形成も起こっている。
【図１４】免疫沈降によるＯｄｒ−１０オリゴマーの検出を示す図である。示された受容体を同時発現しているＩｎｖｓｃ１酵母細胞の粗製膜を可溶化し、同じ量のルシフェラーゼ活性に調整した。次いで、抗ＧＦＰ抗体を用いて受容体を免疫沈降し、沈降物におけるルシフェラーゼ活性を決定した。値は、沈降したルシフェラーゼ活性の最大量の％として示す。データは２つの生物学的反復の平均である。
【図１５】超遠心分離後の無細胞膜調製物１００μＬの全細胞アッセイ試料１００μＬに５μＭのセレンテラジン４００ａを添加した後、ＢＲＥＴ２チャネルで測定された光放出量を示す図である。
【図１６】全細胞および無細胞アッセイ系を使用してモニタリングした、１μＭのジアセチルとのインキュベーション（４５分）後のＢＲＥＴ２シグナルを示す図である（平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
発明の詳細な説明
一般的技術および定義
別段具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、バイオセンサー、Ｇ共役型タンパク質受容体の生物学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学における）当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有するとみなすものとする。
【００７１】
別段示されていない限り、本発明において利用される組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技術は標準的な手順であり、当業者に周知である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１および２巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．ＧｌｏｖｅｒおよびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１〜４巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての最新版を含む）、Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８８）、ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの全ての最新版を含む）などの出典における文献全体にわたって記載され、説明されている。
【００７２】
本明細書において、別段指定されていない限り、「Ｇタンパク質共役受容体」という用語は、Ｇタンパク質を介してシグナル伝達する７回膜貫通受容体を指す。この受容体は、単一のサブユニットでもよく、または２つ以上の受容体サブユニットでもよい。２つ以上の受容体サブユニットが存在するとき、それらは同じでもよく、異なってもよく、またはその組合せ（例えば、１つのサブユニットが２つ、別のサブユニットが１つだけ）でもよい。さらに、別段の指定または含意がない限り、「Ｇタンパク質共役受容体」および「Ｇタンパク質共役受容体のサブユニット」という用語、またはその変化形は互換的に使用される。
【００７３】
本明細書において、「嗅覚受容体」、「嗅受容体」、「ＯＲ」という用語またはその変化形は、生物の細胞中に存在するとき、化学感覚的知覚に関与するポリペプチドを指す。一実施形態では、細胞はニューロンである。さらに、「嗅覚受容体」または「嗅受容体」という用語は、匂い物質リガンドと結合し、または匂い物質リガンドと結合するタンパク質複合体の一部を形成し、その結果生理的応答を起こすポリペプチドを指す。
【００７４】
本明細書において、「生物発光タンパク質」という用語は、適切な基質に作用し、発光を生じさせることができる任意のタンパク質を指す。
【００７５】
本明細書において、「基質」という用語は、生物発光タンパク質とともに、発光を生じさせまたは吸収することができる任意の分子を指す。
【００７６】
本明細書において、「生物発光タンパク質が基質を修飾することを可能にする」という語句は、エネルギーを産生する、基質に対する生物発光タンパク質の任意の酵素活性を指す。
【００７７】
本明細書において、「アクセプター分子」という用語は、生物発光タンパク質の活性の結果放出されたエネルギーを受容し、光エネルギーとして再び放出することができる任意の化合物を指す。
【００７８】
本明細書において、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）とは、生物発光タンパク質ドナーとアクセプター分子の間のエネルギーの非放射性移動に基づく近接アッセイである。
【００７９】
本明細書において、「変動させる」もしくは「変動」という用語またはその変化形は、生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子の強度および／または放出スペクトルの変化を指す。
【００８０】
本明細書において、「空間的位置」という用語は、Ｇタンパク質共役受容体を含む本明細書で定義されるポリペプチドと化合物が結合した結果変化する、アクセプター分子に対する生物発光タンパク質の三次元での位置付けを指す。
【００８１】
本明細書において、「双極子配向」という用語は、三次元空間におけるその配向に対する、生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子に関連する双極子モーメントの三次元空間における方向を指す。双極子モーメントは、分子に対して電荷が変化する結果生じるものである。
【００８２】
本明細書において、「感度がよい」（more sensitive）という用語は、１つのレポーター系（例えば、ＢＲＥＴ）で別のレポーター系（例えば、ＦＲＥＴ）に対してリガンドの非結合形態とリガンドの結合形態の間の共鳴エネルギー移動の比率が大きく変化することを指す。Ｇタンパク質共役受容体サブユニットを含む本発明の単離および／または組換えポリペプチドを含有していること。好ましくは、無細胞組成物は、本発明のポリペプチドを含んでも含まなくても、生細胞を含まない。
【００８３】
本明細書において、「接触させる」という用語は、Ｇタンパク質共役受容体と結合することができるという形で検出される化合物を含む、または含む可能性がある試料を添加することを指す。
【００８４】
本明細書において、「脂質二重層」という用語は、内部に共通する疎水性の二重層および２つの親水性の表面を有する、互いに反対に整列した分子の並びの、典型的には両親媒性の２つの層を指す。脂質二重層は、天然に存在するものでもよく、または人工のものでもよい。最も好ましくは、脂質二重層は、Ｇタンパク質共役受容体を含む本明細書で定義されるポリペプチドが中に挿入される細胞または生体膜、例えば、哺乳動物、昆虫、植物または酵母細胞膜であり、最も好ましくは、酵母細胞膜である。
【００８５】
本明細書において、「酵母脂質二重層」という用語は、Ｇタンパク質共役受容体を含む本明細書で定義されるポリペプチドを発現する酵母細胞に由来する脂質二重層を指す。当業者は、それだけに限らないが、Ｆｕｓ１ｐタンパク質（ＴｒｕｅｈｅａｒｔおよびＦｉｎｋ、１９８９）、Ｓｓｏ１／２ｐ、ＳｎｃｉｐおよびＳｅｃ９ｐタンパク質を含むＳＮＡＲＥ複合体（Ｓｔｒｏｐら、２００７）、フェロモン受容体Ｓｔｅ２ｐ（Ｃｅｌｉｃら、２００３）、および／またはＡｌｒ１（Ｇｒａｓｃｈｏｐｆら、２００１）など、膜中に埋め込まれた、酵母中に天然に存在するタンパク質を検出することによって、脂質二重層が酵母に由来するかどうかを容易に決定することができる。
【００８６】
本明細書において、「同時にまたは連続して」という用語は、試料を本明細書で定義されるポリペプチドと接触させる前、その間、またはその後に基質を提供できることを意味する。好ましくは、試料と同時またはその後に基質を提供する。
【００８７】
「試料」は、検出する化合物を含むことが疑われる任意の物質または組成物でよい。試料の例として、空気、液体、生体材料および土壌がある。試料は、環境もしくは供給源から直接得ることもでき、または本発明の方法を行う前に適切な手順によって少なくとも部分的に精製することもできる。
【００８８】
本明細書において、「Ｇタンパク質共役受容体および／または存在する場合アクセサリー分子が、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を一緒に含む」という用語は、生物発光タンパク質が、Ｇタンパク質共役受容体のサブユニットまたはアクセサリー分子と結合する、好ましくは共有結合する、より好ましくはそれとの融合タンパク質として産生され、アクセプター分子が、Ｇタンパク質共役受容体のサブユニットまたはアクセサリー分子と結合する、好ましくは共有結合する、より好ましくはそれとの融合タンパク質として産生されることを意味する。生物発光タンパク質およびアクセサリー分子は、同じもしくは異なるＧタンパク質共役受容体のサブユニットまたは同じもしくは異なるアクセサリー分子と結合する、好ましくは共有結合する、より好ましくはそれとの融合タンパク質として産生することができる。さらに、生物発光タンパク質およびアクセサリー分子の一方は、Ｇタンパク質共役受容体のサブユニットと結合する、好ましくは共有結合する、より好ましくはそれとの融合タンパク質として産生することができ、生物発光タンパク質およびアクセサリー分子の他方は、アクセサリー分子と結合することができる。さらに、複数の生物発光タンパク質とアクセサリー分子の対は、多重化して異なるリガンドを検出し、または同じリガンドの検出の感度を増大させる組合せとして存在し得る。
【００８９】
本明細書において、「の一部を形成する（ｆｏｒｍｓ  ｐａｒｔ  ｏｆ）」という用語は、Ｇタンパク質共役受容体またはそのサブユニットの特定の領域内に位置する生物発光タンパク質またはアクセプター分子を指す。この用語は、生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子が、Ｇタンパク質共役受容体に付着または結合するが、アミノ酸の連続した鎖を形成しない可能性も含む。一実施形態では、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、Ｇタンパク質共役受容体の特定の領域と完全に入れ替わる。別の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体の特定の領域の全部ではないが一部が入れ替わる。さらに別の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体の特定の領域が入れ替わらない。熟練した受け手なら理解するであろうが、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、本発明のポリペプチドのＧタンパク質共役受容体部分が標的化合物と結合してアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の位置および／または双極子配向の空間的変化を起こすことができないようには挿入されない。
【００９０】
本明細書において、Ｇタンパク質共役受容体の特定の部分（ドメイン）の「少なくとも大部分」という用語は、特定の領域の少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％を指す。
【００９１】
「実質的に精製された」または「精製された」とは、その天然の状態で結合する１つまたは複数の脂質、核酸、他のポリペプチド、または他の混入分子から分離しているポリペプチドを意味する。実質的に精製されたポリペプチドは、それと天然に結合する他の構成成分を少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％含まないことが好ましい。しかし、現在のところ、本発明のポリペプチドが天然に存在する証拠はない。
【００９２】
ポリペプチドとの関連で「組換え」という用語は、その天然の状態と比較して変化した量または変化した速度で、細胞によって、または無細胞発現系で産生されたときのポリペプチドを指す。一実施形態では、細胞は、そのポリペプチドを天然に産生しない細胞である。しかし、細胞は、産生するポリペプチドの量を変化させる、好ましくは増大させる非内因性遺伝子を含む細胞でもよい。本発明の組換えポリペプチドは、それが産生されたトランスジェニック（組換え）細胞、または無細胞発現系の他の構成成分から分離していないポリペプチド、および少なくとも一部の他の構成成分から後で精製して除かれる、そのような細胞または無細胞系で産生されたポリペプチドを含む。
【００９３】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は一般に互換的に使用され、１本のポリペプチド鎖を指し、非アミノ酸基の付加によって修飾されてもよく、またはされなくてもよい。そのようなポリペプチド鎖は、他のポリペプチドもしくはタンパク質、または補助因子などの他の分子と結合し得ることが理解されるであろう。本明細書において「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載のポリペプチドの変異体、突然変異体、生物学的に活性な断片、修飾物、類似体および／または誘導体も含む。
【００９４】
ポリペプチドの％同一性は、ＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）により、ギャップ生成ペナルティー＝５、ギャップ伸長ペナルティー＝０．３を用いて決定する。質問配列は長さが少なくとも２５アミノ酸であり、ＧＡＰ分析は少なくとも２５アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。より好ましくは、質問配列は長さが少なくとも５０アミノ酸であり、ＧＡＰ分析は少なくとも５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。より好ましくは、質問配列は長さが少なくとも１００アミノ酸であり、ＧＡＰ分析は少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。さらにより好ましくは、質問配列は長さが少なくとも２５０アミノ酸であり、ＧＡＰ分析は少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。さらにより好ましくは、ＧＡＰ分析はその全長にわたって２つの配列を整列させる。
【００９５】
本明細書において、「生物学的に活性な断片」とは、完全長ポリペプチドの定められた活性を維持する、本明細書に記載のポリペプチドの部分である。例えば、Ｇタンパク質共役受容体の生物学的に活性な断片は、標的化合物と結合して、高次構造変化を起こすことができなければならない。生物学的に活性な断片は、定められた活性を維持する限りどんなサイズでもよい。好ましくは、生物学的に活性な断片は、長さが少なくとも１５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５０アミノ酸である。
【００９６】
本明細書において、「生物学的に活性な変異体」とは、１つまたは複数のアミノ酸により天然に存在する分子および／または定められた分子と異なるが、生物学的に活性な断片について上記で定められたような定められた活性を維持する分子である。生物学的に活性な変異体は、天然に存在する分子および／または定められた分子と、典型的には少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００９７】
定められたポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、上記で示したものより高い％同一性の数字が好ましい実施形態を包含することが理解されるであろう。したがって、適用可能な場合、最小の％同一性の数字に照らして、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、関連する指定された配列番号と、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００９８】
センスもしくはアンチセンス方向または両方の組合せにおける、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含めて、「単離ポリヌクレオチド」とは、その天然の状態で結合または連結するポリヌクレオチド配列から少なくとも部分的に分離しているポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、それと天然に結合する他の構成成分を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％含まない。
【００９９】
ポリヌクレオチドとの関連で、「外因性」という用語は、その天然の状態と比較して変化した量で、細胞または無細胞発現系中に存在するときのポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、細胞は、そのポリヌクレオチドを天然に含まない細胞である。しかし、細胞は、コードされたポリペプチドの産生量を変化させる、好ましくは増大させる非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞でもよい。本発明の外因性ポリヌクレオチドは、それが存在するトランスジェニック（組換え）細胞、または無細胞発現系の他の構成成分から分離していないポリヌクレオチド、および少なくとも一部の他の構成成分から後で精製して除かれる、そのような細胞または無細胞系で産生されたポリヌクレオチドを含む。
【０１００】
さらに、「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、「核酸」という用語と互換的に使用される。本発明のポリヌクレオチドは、これとともに提供される分子と比較したときに、ヌクレオチド残基または修飾された残基の欠失、挿入、または置換である１つまたは複数の突然変異を有してよい。突然変異体は、天然に存在するもの（すなわち、天然供給源から単離されたもの）でもよく、または合成のもの（例えば、核酸上で部位特異的突然変異導入を行うことによるもの）でもよい。通常、ポリヌクレオチドの単量体は、ホスホジエステル結合またはその類似物によって連結する。ホスホジエステル結合の類似物には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート（phosphoranilidate）およびホスホラミデートがある。
【０１０１】
本発明の組成物は、「許容される担体」を含んでよい。そのような許容される担体の例として、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、および他の生理的に均衡のとれた水性の塩溶液がある。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチルやトリグリセリドなどの非水性媒体を使用することもできる。「許容される担体」の正確な性質は、組成物の用途に依存する。本明細書に記載の用途、および組成物における本発明の構成成分の性質を考慮すると、当業者は、特定の用途について適切な「（複数の）許容される担体」を容易に決定することができる。
【０１０２】
生物発光タンパク質
生物発光タンパク質は、基質を活性化した産物に転換する酵素であり、次いでその産物は緩和するにつれてエネルギーを放出することが当技術分野で理解されている。（基質に対する生物発光タンパク質の活性によって生じた）その活性化した産物は、アクセプター分子に移る、生物発光タンパク質によって生じた発光の供給源である。
【０１０３】
本発明で使用できるいくつかの異なる生物発光タンパク質がある（例えば、表１を参照）。生物発光タンパク質のサイズを考慮すると、本発明に有用な機能的ポリペプチドを産生できたことは驚きであった。光放出系が知られており、細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚類、ヤスデ類、ハエ、菌類、蠕虫、甲殻類、および甲虫、特にＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属のコメツキムシ、ならびにＰｈｏｔｉｎｕｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ、およびＬｕｃｉｏｌａ属のホタルを含めた多数の発光生物から単離されている。生物発光を示すさらなる生物は、ＷＯ００／０２４８７８、ＷＯ９９／０４９０１９およびＶｉｖｉａｎｉ（２００２）に列挙されている。
【０１０４】
１つの非常によく知られている例は、特異的な生化学物質であるルシフェリン（天然に存在する蛍光体）がルシフェラーゼ活性を有する酵素によって酸化される、エネルギーを産生する化学反応を触媒するルシフェラーゼとして知られるタンパク質のクラスである（Ｈａｓｔｉｎｇｓ、１９９６）。原核生物も真核生物も、細菌、藻類、菌類、昆虫、魚類および他の海洋形態の種を含めて、非常に多様な生物がこのように光エネルギーを放出することができ、それぞれが、他の生物のものと化学的に異なる特異的なルシフェラーゼ活性およびルシフェリンを有する。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系は、形態、化学的性質および機能において非常に多様である。したがって、ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質は、様々な供給源からまたは様々な手段によって入手可能である。ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、米国特許第５，２２９，２８５号、第５，２１９，７３７号、第５，８４３，７４６号、第５，１９６，５２４号および第５，６７０，３５６号で見つけることができる。最も広く使用されている２つのルシフェラーゼは、（ｉ）ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）、３５ｋＤａのタンパク質、基質としてセレンテラジンを使用し、４８０ｎｍで光を放出する（Ｌｏｒｅｎｚら、１９９１）；および（ｉｉ）ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来）、６１ｋＤａのタンパク質、基質としてルシフェリンを使用し、５６０ｎｍで光を放出する（ｄｅ  Ｗｅｔら、１９８７）である。
【０１０５】
【表１】
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0005684145.tif 000003
【０１０６】
ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来）は、生化学的アッセイで使用されている（Ｖｅｒｈａｅｇｅｎら、２００２）。ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼは２０ｋＤａのタンパク質であり、セレンテラジンを迅速な反応で酸化し、その結果４７０ｎｍで明るい光が放出される。
【０１０７】
本発明に有用なルシフェラーゼは、Ａｎａｃｈｎｏｃａｍｐａ種（ＷＯ２００７／０１９６３４）からも特徴付けられている。これらの酵素は、サイズが５９ｋＤａであり、放出スペクトルがスペクトルの青色部分に入る発光反応を触媒するＡＴＰ依存性ルシフェラーゼである。
【０１０８】
本発明で使用できる代替の非ルシフェラーゼ生物発光タンパク質は、適切な基質に作用して発光シグナルを生じさせる任意の酵素である。そのような酵素の具体例は、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−グルコシダーゼである。これらの酵素の合成発光基質は当技術分野で周知であり、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）などの企業から市販されている。
【０１０９】
本発明に有用なペルオキシダーゼの例は、Ｈｕｓｈｐｕｌｉａｎら（２００７）によって記載されている。
【０１１０】
好ましい実施形態では、立体障害による相互作用の阻害を防止するために、低分子量の生物発光タンパク質が使用される。生物発光タンパク質は、好ましくは１本のポリペプチド鎖からなる。また、生物発光タンパク質は、好ましくはオリゴマーまたは凝集物を形成しない。生物発光タンパク質のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼおよびホタルルシフェラーゼはこれらの基準の全てまたはほとんどを満たす。
【０１１１】
基質
基質の選択は、生物発光タンパク質によって生じた光の波長および強度に影響を及ぼし得る。
【０１１２】
広く知られている基質は、刺胞動物、カイアシ類、毛顎動物（chaetgnaths）、有櫛動物、十脚類シュリンプ、アミ類シュリンプ、放散虫類および一部の魚類の分類群に存在するセレンテラジンである（ＧｒｅｅｒおよびＳｚａｌａｙ、２００２）。例えばウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼでは、４１８〜５１２ｎｍの間で光を放出するセレンテラジン類似体／誘導体が利用可能である（Ｉｎｏｕｙｅら、１９９７）。セレンテラジン類似体／誘導体（４００Ａ、ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ）は、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼで光を４００ｎｍで放出することが記載されている（ＷＯ０１／４６６９１）。セレンテラジン類似体／誘導体の他の例は、ＥｎｄｕＲｅｎおよびＶｉｖｉＲｅｎである。
【０１１３】
本明細書において、「ルシフェリン」という用語は、生物発光が可能な生物で認められる、光を放出する生物学的色素のクラスを指し、それは酵素ルシフェラーゼの存在下で酸化されて、オキシルシフェリンおよび光の形でのエネルギーを産生する。ルシフェリン、または２−（６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）−２−チアゾリン−４−カルボン酸は、ホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓから初めて単離された。それ以来、様々な異なる生物から、主に海洋、例えば魚類およびイカから様々な形態のルシフェリンが発見され研究されてきたが、多くは陸上生物、例えば、蠕虫、甲虫および様々な他の昆虫において同定されている（Ｄａｙら、２００４；Ｖｉｖｉａｎｉ、２００２）。
【０１１４】
ルシフェリンには少なくとも５つの一般的な型があり、それぞれが化学的に異なり、広範囲の異なる補助因子を使用する化学的構造的に異なるルシフェラーゼによって触媒される。第１はホタルルシフェリンというホタルルシフェラーゼの基質であり、触媒作用にＡＴＰを必要とする（ＥＣ１．１３．１２．７）。第２は細菌ルシフェリンであり、一部のイカおよび魚類でも認められ、長鎖アルデヒドおよび還元型リン酸リボフラビンからなる。細菌ルシフェラーゼはＦＭＮＨ依存性である。第３は渦鞭毛藻類（dinoflagellate）ルシフェリンであり、夜間の海洋のリン光に関与する生物である渦鞭毛藻類（海洋プランクトン）で認められるテトラピロールクロロフィル（tetrapyrrolic chlorophyll）誘導体である。渦鞭毛藻類ルシフェラーゼは渦鞭毛藻類ルシフェリンの酸化を触媒し、触媒活性のある３つの同一のドメインからなる。第４はイミダゾロピラジンのヴァルグリン（vargulin）であり、特定の貝虫類および深海魚、例えばＰｏｒｉｃｈｔｈｙｓで認められる。最後はセレンテラジン（イミダゾールピラジン）であり、放散虫類、有櫛動物、刺胞動物、イカ、カイアシ類、毛顎動物、魚類およびシュリンプで認められるタンパク質エクオリンの光放出体である。
【０１１５】
アクセプター分子
本発明で使用できるいくつかの異なるアクセプター分子がある。アクセプター分子は、タンパク質でもよく、または非タンパク質性のものでもよい。タンパク質であるアクセプター分子の例として、それだけに限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強型ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強型ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド（Ｅｍｅｒａｌｄ）、トパーズ（Ｔｏｐａｚ）、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔ−ダイマー２、ｔ−ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）  ＧＦＰ、モンスター（Ｍｏｎｓｔｅｒ）  ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデ（Ｋａｅｄｅ）タンパク質もしくはフィコビリタンパク質（Phycobiliprotein）、またはそのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくは断片がある。タンパク質でないアクセプター分子の例として、それだけに限らないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光マイクロスフェア、発光マイクロスフェア、蛍光ナノ結晶、マリナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、テキサスレッド、希土類元素キレート、またはその任意の組合せもしくは誘導体がある。
【０１１６】
１つの非常によく知られている例は、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質および分子生物学、例えば突然変異導入およびキメラタンパク質技術の適用から生じた多数の他の変異体（ＧＦＰ）を含む蛍光体の群である（Ｔｓｉｅｎ、１９９８）。ＧＦＰは、その発色団の独特の構成成分に基づいて分類され、各クラスは異なる励起および放出波長を有する：クラス１、中性フェノールとアニオン性フェノレートの野生型混合物：クラス２、フェノレートアニオン：クラス３、中性フェノール：クラス４、積み重なったｓ電子系を有するフェノレートアニオン：クラス５、インドール：クラス６、イミダゾール：およびクラス７、フェニル。
【０１１７】
突然変異した、天然に存在するアクセプター分子（変異体）も本発明に有用であり得る。ＢＲＥＴに適する工学的に作製された系の１つの例は、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼとＧＦＰの増強型黄色突然変異体（ＥＹＦＰ）の対であり、１または複数の媒介タンパク質（この場合、Ｇタンパク質共役受容体）が存在しないと単独では互いにそれほど直接相互作用しない（Ｘｕら、１９９９）。
【０１１８】
別の実施形態では、アクセプター分子は蛍光ナノ結晶である。ナノ結晶、または「量子ドット」は、光分解に対する耐性、明るさの向上、非毒性、およびいくつかのプロセスを同時にモニタリングすることを可能にするサイズ依存性の狭い放出スペクトルを含めて、蛍光標識として有機分子を上回るいくつかの利点を有する。さらに、ナノ結晶の吸収スペクトルは最初のピークの上で連続し、全てのサイズ、したがって全ての色を、単一の励起波長を用いて励起することを可能にする。
【０１１９】
蛍光ナノ結晶は、様々な形でタンパク質に付着させ、または「バイオコンジュゲート」させることができる。例えば、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）または両親媒性ポリマー由来のカルボキシレート基を用いて、「量子ドット」の表面キャップを負に帯電させることができる。直接、または組換えタンパク質と融合した正に帯電したロイシンジッパーペプチドからなる架橋を介して、タンパク質をＤＨＬＡ−ナノ結晶と静電的にコンジュゲートさせることができる。後者は、意図された標的との特異性によって一次抗体と結合する。あるいは、従来のカルボジイミド化学を用いて、抗体、ストレプトアビジン、または他のタンパク質をナノ結晶のポリアクリレートキャップと共有結合させる。
【０１２０】
セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウムおよびリン化インジウムを含めたナノ結晶を生成するコロイド法がある。これらの量子ドットは、その量子ドットの体積内にわずか１００〜１００，０００個の原子を含有することができ、直径は原子１０〜５０個である。一部の量子ドットは、一方の物質が他方の物質に埋まり、大きなバンドギャップを有する小さな領域である。これらはいわゆるコアシェル構造といえ、例えば、コアにＣｄＳｅ、シェルにＺｎＳを有するもの、またはオルモシル（ormosil）と呼ばれるシリカの特殊な形態に由来するものがある。ドットが大きいと、その蛍光スペクトルは赤く（低エネルギーと）なる。逆に、小さいドットは、青い（高エネルギー）の光を放出する。色合いは、量子ドットのエネルギーレベルに直接関連する。定量的にいうと、蛍光の光のエネルギー（したがって色）を決定するバンドギャップエネルギーは、量子ドットのサイズの２乗に反比例する。大きい量子ドットは、大きいエネルギーレベルを有し、より密集している。このことは、量子ドットが低いエネルギー、すなわちスペクトルの赤い方に近いものを含有する光子を吸収することを可能にしている。
【０１２１】
代替の実施形態では、アクセプター分子は蛍光マイクロスフェアである。これらは典型的にはポリマーでできており、ポリマーマトリックス中に取り込まれた蛍光分子（例えば、フルオレセインＧＦＰまたはＹＦＰ）を含有し、様々な試薬とコンジュゲートさせることができる。蛍光マイクロスフェアは内部標識することもでき、または表面上で標識することもできる。内部標識で、典型的には狭い蛍光放出スペクトルを有する非常に明るく安定した粒子が生成される。内部標識すると、表面の基は、リガンド（例えばタンパク質）とビーズの表面とのコンジュゲートに利用可能なままとなる。内部標識したビーズは、光退色に対して高い耐性を示すので、画像化の用途で広く使用される。
【０１２２】
カルボキシレート修飾蛍光マイクロスフェアは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）などの水溶性カルボジイミド試薬を使用したタンパク質の共有結合に適している。硫酸蛍光マイクロスフェアは比較的疎水性であり、ほとんどどんなタンパク質も受動的にかつほとんど不可逆的に吸着する。アルデヒド−硫酸蛍光マイクロスフェアは、表面アルデヒド基を付加し、タンパク質と反応するように修飾された硫酸マイクロスフェアである。
【０１２３】
別の実施形態では、アクセプター分子は発光マイクロスフェアである。これらは典型的にはポリマーでできており、ポリマーマトリックス中に取り込まれた発光分子（例えば、ユーロピウムまたは白金の複合体）を含有し、様々な試薬とコンジュゲートさせることができる。
【０１２４】
生物発光タンパク質とアクセプター分子の対
ＢＲＥＴに適した対を決定する際に考慮すべき基準は、生物発光タンパク質と比較した、アクセプター分子の相対的な放出／蛍光スペクトルである。生物発光タンパク質の放出スペクトルは、生物発光タンパク質の発光の放出からの光エネルギーが、２つの分子が適切に近接し互いに対して適切な配向にあるときにアクセプター分子を励起することができ、それによってアクセプター分子の蛍光を促進する波長であるように、アクセプター分子の吸光度スペクトルと重複すべきである。例えば、観察可能な放出スペクトルのピークに基づくと、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ／ＥＧＦＰの対はウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ／ＥＹＥＦの対ほど良好でないことが実証されている（Ｘｕ、１９９９；Ｗａｎｇら、（１９９７）、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｎｓ、Ｈａｓｔｉｎｇｓら編（Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．４１９〜４２２）。潜在的な対を研究するために、選択した生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含有するタンパク質融合物を調製し、適当な基質の存在下で試験する。
【０１２５】
生物発光タンパク質とアクセプター分子が誤って互いに結合しないことも確認すべきである。これは、同じ細胞中で生物発光タンパク質およびアクセプター分子を別々に同時発現させ、次いで発光スペクトルをモニタリングしてＢＲＥＴが起こるかどうかを決定することにより行うことができる。これは、例えば、Ｘｕら、（１９９９）の方法を使用して実現することができる。ＢＲＥＴがほとんどまたは全く観察されない場合、選択した生物発光タンパク質とアクセプター分子は適切なＢＲＥＴの対を形成する。
【０１２６】
生物発光タンパク質放出は、基質の修飾によって操作することができる。ルシフェラーゼの場合、基質はセレンテラジンである。生物発光タンパク質放出を変化させることの背後にある論理的根拠は、ドナー放出とアクセプター放出の間の分解能を向上させることにある。元のＢＲＥＴ系は、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼをドナーとして、ＥＹＦＰ（またはＴｏｐａｚ）をアクセプターとして、セレンテラジンｈ誘導体を基質として使用する。ＢＲＥＴアッセイで組み合わせたとき、これらの構成成分は、生物発光タンパク質については４７５〜４８０ｎｍで、アクセプター分子については５２５〜５３０ｎｍで光を発し、スペクトル分解能は４５〜５５ｎｍとなる。
【０１２７】
残念ながら、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼでは実質的にＧＦＰ放出と重複する広い放出ピークが生じ、これは系のシグナル対ノイズを低下させる一因となる。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼの基質としてｃｏｅｌ４００ａを使用する本発明の１つのＢＲＥＴ系は、ドナーとアクセプターの放出波長間の広いスペクトル分解能をもたらす（−１０５ｎｍ）。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼとｃｏｅｌ４００ａは、３９０〜４００ｎｍで光を発し、この範囲で光を吸収し、５０５〜５０８ｎｍで光を再び放出するＧＦＰを調製した。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼとＧＦＰの放出間のスペクトル分解能のこの増大のため、このＢＲＥＴ系は、本発明のポリペプチドの高次構造の小さな変化をモニタリングする優れた生物学的ツールをもたらす。これは、ドナーとアクセプターの波長の差がおよそ５１ｎｍである、セレンテラジンｈ誘導体およびＥＹＦＰを使用する以前に記載されている系を上回る著しい向上である。
【０１２８】
ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性の結果（野生型セレンテラジンにより発せられるものとは異なる）様々な波長で光を発するｃｏｅｌ４００ａを含めて、様々なセレンテラジン誘導体が当技術分野で知られている。当業者は、ドナーの光放出ピークが変化したため、この波長で光を吸収し、それによって効率のよいエネルギー移動を可能にするアクセプター分子を選択する必要があることを理解するであろう。これは、例えばＧＦＰクラス４を、クラス３または１のＧＦＰとなるように変更することによって行うことができる。ドナーの光放出とアクセプターの光吸収ピークとの間のスペクトルの重複は、とりわけ、効率のよいエネルギー移動の１つの条件である。クラス３および１のＧＦＰは、４００ｎｍで光を吸収し、５０５〜５１１ｎｍで再び放出することが知られている。この結果、およそ１１１ｎｍのドナーとアクセプターの放出間の波長の差となる。
【０１２９】
さらなる生物発光タンパク質とアクセプター分子の対の例を表２に示す。
【０１３０】
【表２】
0005684145.tif 000004
【０１３１】
Ｇタンパク質共役受容体
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、７回膜貫通受容体、７ＴＭ受容体、７回らせん（heptahelical）受容体、およびＧタンパク質連結受容体（ＧＰＬＲ）としても知られている。ＧＰＣＲは、細胞の外側で分子を感知し、内側でシグナル伝達経路を、最終的に細胞応答を活性化する膜貫通受容体の大型タンパク質のファミリーである。これらの受容体と結合しそれを活性化するリガンドには、光感受性化合物、匂い、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質があり、小分子からペプチド、大型タンパク質までサイズが様々である。ＧＰＣＲは多数の疾患に関与するが、現代の全医療用薬物のほぼ半分の標的でもある。ＧＰＣＲは、配列相同性および機能類似性に基づいて、少なくとも５つのクラスに分類することができる：
クラスＡのロドプシン様、
クラスＢのセクレチン様、
クラスＣの代謝型／フェロモン、
クラスＤの菌類フェロモン、および
クラスＥのｃＡＭＰ受容体。
【０１３２】
クラスＡのロドプシン様受容体には、アミン受容体：アセチルコリン、アルファアドレナリン受容体、ベータアドレナリン受容体、ドーパミン、ヒスタミン、セロトニン、オクトパミン、および微量アミン；ペプチド受容体：アンギオテンシン、ボンベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、ＡＰＪ様、インターロイキン−８、ケモカイン受容体（Ｃ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、ＢＯＮＺＯ受容体（ＣＸＣ６Ｒ）、Ｃ−Ｘ３−Ｃケモカイン、およびＸＣケモカイン）、ＣＣＫ受容体、エンドセリン受容体、メラノコルチン受容体、神経ペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、ソマトスタチン受容体、タキキニン受容体（サブスタンスＰ（ＮＫ１）、サブスタンスＫ（ＮＫ２）、ニューロメジンＫ（ＮＫ３）、タキキニン様１、およびタキキニン様２）、バソプレッシン様受容体（バソプレッシン、オキシトシン、およびコノプレッシン）、ガラニン様受容体（ガラニン、アラトスタチン、およびＧＰＣＲ５４）、プロテイナーゼ活性化様受容体（例えば、トロンビン）、オレキシン＆神経ペプチドＦＦ、ウロテンシンＩＩ受容体、アドレノメデュリン（Ｇ１０Ｄ）受容体、ＧＰＲ３７／エンドセリンＢ様受容体、ケモカイン受容体様受容体、およびニューロメジンＵ受容体；ホルモンタンパク質受容体：卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性ゴナドトロピンホルモン、チロトロピン、およびゴナドトロピン；オプシン（ロドプシン）受容体；嗅受容体；プロスタノイド受容体：プロスタグランジン、プロスタサイクリン、およびトロンボキサン；ヌクレオチド様受容体：アデノシンおよびプリン受容体；カンナビス受容体；血小板活性化因子受容体；ゴナドトロピン放出ホルモン受容体；チロトロピン放出ホルモン＆分泌促進物質受容体：チロトロピン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、および成長ホルモン分泌促進物質様；メラトニン受容体；ウイルス受容体；リゾスフィンゴ脂質＆ＬＰＡ（ＥＤＧ）受容体；ロイコトリエンＢ４受容体：ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ１およびロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ２；ならびにクラスＡオーファン／他の受容体：血小板ＡＤＰ＆ＫＩ０１受容体、ＳＲＥＢ、Ｍａｓ原癌遺伝子、ＲＤＣ１、ＯＲＰＨ、ＬＧＲ様（ホルモン受容体）、ＧＰＲ、ＧＰＲ４５様、システイニルロイコトリエン、Ｍａｓ関連受容体（ＭＲＧ）、およびＧＰ４０様受容体がある。
【０１３３】
ＧＰＣＲのクラスＢ（セクレチン受容体ファミリー）には、ポリペプチドホルモンの受容体（カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、−２、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、血管作用性小腸ポリペプチド、利尿ホルモン、ＥＭＲ１、ラトロフィリン）、形質膜での細胞間相互作用を媒介すると考えられる分子（脳特異的血管新生阻害因子（ＢＡＩ））ならびにストレス応答および寿命を制御する一群のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質（Ｍｅｔｈｕｓｅｌａｈ様タンパク質）がある。
【０１３４】
クラスＣの代謝型グルタミン酸／フェロモン受容体には、代謝型グルタミン酸、代謝型グルタミン酸グループＩ、代謝型グルタミン酸グループＩＩ、代謝型グルタミン酸グループＩＩＩ、他の代謝型グルタミン酸、細胞外カルシウム感知、推定上のフェロモン受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ１、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ２、およびオーファンＧＰＲＣ５受容体がある。
【０１３５】
ＧＰＣＲは、視覚、嗅覚、行動および気分の制御、免疫系の活性および炎症の制御、自律神経系の伝達、細胞密度の感知、ならびにその他多くを含めて、多種多様な生理的過程に関与する。不活性なＧタンパク質は、その不活性状態で受容体と結合することが知られている。リガンドを認識した後、受容体またはそのサブユニットは高次構造を変化させ、それによってＧタンパク質を機械的に活性化し、Ｇタンパク質は受容体から解離する。受容体はここで別のＧタンパク質を活性化することもでき、切り替わって不活性状態に戻ることもできる。受容体分子は、活性と不活性の生物物理的状態の間の高次構造の平衡状態にあると考えられている。リガンドが受容体に結合すると、活性な受容体の状態の方に平衡状態を変化させることができる。本発明のポリペプチドはＧタンパク質共役受容体を含み、細胞中で発現したときにその受容体のＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある。当業者は、膜貫通タンパク質の配向を検出するのに適した技術を承知している。そのような技術は、それだけに限らないが、結晶解析、ＮＭＲ研究、モデリング研究ならびに光学または電子顕微鏡標本の界面活性剤浸透化対照と組み合わせた免疫標識のような顕微鏡技術、２つのポリペプチドの断片相補性タギングなどを含む。
【０１３６】
好ましい実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体はクラスＡのＧＰＣＲである。さらなる好ましい実施形態では、クラスＡ（ロドプシン様）ＧＰＣＲは嗅覚受容体またはアドレナリン作動性受容体であり、より好ましくは嗅覚受容体である。細胞中で発現したときに受容体のＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にある限り、嗅覚受容体はどんな供給源由来のものでもよい。例として、それだけに限らないが、脊索動物受容体、線虫受容体、またはそのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくは断片がある。脊索動物受容体の例として、それだけに限らないが、哺乳動物受容体、鳥類受容体および魚類受容体がある。好ましい実施形態では、嗅覚受容体は、線虫受容体、またはその生物学的に活性な変異体もしくは断片である。一実施形態では、線虫受容体は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ受容体、またはその生物学的に活性な変異体もしくは断片である。本発明のポリペプチドの生成に使用し、かつ／または本発明の方法で使用することができる嗅覚受容体の例は、ＢｕｃｋおよびＡｘｅｌ（１９９１）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９９８および２００１）、Ａｌｏｎｉら（２００６）、Ｆｅｌｄｍｅｓｓｅｒ（２００６）、Ｏｌｅｎｄｅｒら（２００４ａおよびｂ）、Ｇｌｕｓｍａｎら（２０００ａ、２０００ｂおよび２００１）、Ｆｕｃｈｓら（２００１）、ＰｉｌｐｅｌおよびＬａｎｃｅｔ（１９９９）、Ｓｈａｒｏｎら（１９９８）、Ｚｏｚｕｌｙａら（２００１）、ＮｉｉｍｕｒａおよびＮｅｉ（２００３）、Ｌａｎｄｅｒら（２００１）、ＺｈａｎｇおよびＦｉｒｅｓｔｅｉｎ（２００２）、Ｙｏｕｎｇら（２００２）に記載されている。さらに、嗅覚受容体の包括的な一覧がＳｅｎｓｅＬａｂのウェブサイトから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｎｓｅｌａｂ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ）。
【０１３７】
他の実施形態では、ＧＰＣＲはクラスＢまたはクラスＣの受容体であり、これら２つの実施形態のうちクラスＣがより好ましい。
【０１３８】
特に好ましい実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体は７回膜貫通ドメインを含む。
【０１３９】
生物発光タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体（または本発明のポリペプチド）の１番目、３番目、５番目の非膜貫通ループ（ドメイン）またはＣ末端の一部を形成することができる。アクセプター分子も、Ｇタンパク質共役受容体（または本発明のポリペプチド）の１番目、３番目、５番目の非膜貫通ループ（ドメイン）またはＣ末端の一部を形成することができる。Ｇタンパク質共役受容体が発現し、細胞中に存在するときに、これらの領域はそれぞれ細胞内にある。
【０１４０】
アクセプター分子は、同じ分子の一部（すなわち、同じ１本のポリペプチド鎖）のとき、生物発光タンパク質と同じ領域にある可能性はないが、Ｇタンパク質共役受容体が二量体または高次の多量体として存在するとき、アクセプター分子は生物発光タンパク質と等しい領域にある可能性がある。例えば、生物発光タンパク質は、受容体の１つのサブユニットのＣ末端の一部を形成することができ、アクセプター分子は、受容体の別のサブユニットのＣ末端の一部を形成することができる。この例では、標識が結合したサブユニットは同じでもよく、または異なっていてもよく、例えば２つのサブユニットが同一であり、生物発光タンパク質で標識された一方とアクセプター分子で標識された他方が離れていてもよい。一実施形態では、生物発光タンパク質はＧＰＣＲサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は５番目の非膜貫通ループの一部を形成する。代替の実施形態では、アクセプター分子はＧＰＣＲサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は５番目の非膜貫通ループの一部を形成する。
【０１４１】
別の実施形態では、生物発光タンパク質はＧＰＣＲサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は３番目の非膜貫通ループの一部を形成する。別の実施形態では、アクセプター分子はＧＰＣＲサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は３番目の非膜貫通ループの一部を形成する。
【０１４２】
好ましい実施形態では、生物発光タンパク質はＧＰＣＲサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子はＣ末端の一部を形成する。代替の実施形態では、アクセプター分子はＧＰＣＲサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質はＣ末端の一部を形成する。
【０１４３】
別の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体は少なくとも２つのサブユニットを含み、生物発光タンパク質が第１のサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が第２のサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成する。代替の実施形態では、アクセプター分子は第１のサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は第２のサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成する。
【０１４４】
別の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体は少なくとも２つのサブユニットを含み、生物発光タンパク質が第１のサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が第２のサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成する。別の実施形態では、アクセプター分子は第１のサブユニットの１番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は第２のサブユニットの３番目の非膜貫通ループの一部を形成する。
【０１４５】
別の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体は少なくとも２つのサブユニットを含み、生物発光タンパク質が第１のサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子が第２のサブユニットのＣ末端の一部を形成する。代替の実施形態では、アクセプター分子は第１のサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は第２のサブユニットのＣ末端の一部を形成する。
【０１４６】
別の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体は少なくとも２つのサブユニットを含み、ドナーおよびアクセプター分子はそれぞれ第１および第２のサブユニットの同じ部位にある。
【０１４７】
一実施形態では、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、５番目の膜貫通ドメインの２番目のアミノ酸の後、６番目の膜貫通ドメインの開始の前から２番目のアミノ酸の前に位置する。別の実施形態では、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、５番目の膜貫通ドメインの後のアミノ酸８付近の後、または５番目の膜貫通ドメインの後のアミノ酸２２付近の後に位置する。さらなる実施形態では、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、６番目の膜貫通ドメインから約１０または１２アミノ酸前に挿入される。最も好ましくは、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、３番目の非膜貫通ループ（ドメイン）の中央に位置する。
【０１４８】
Ｃ末端に関しては、天然のＣ末端の約５〜２５アミノ酸が７番目の膜貫通ドメインの末端に残存することが好ましい。好ましくは、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、７番目の膜貫通部の後から約１６または２０アミノ酸後に挿入される。
【０１４９】
１番目の非膜貫通ループ（ドメイン）における生物発光タンパク質またはアクセプター分子の位置については、前記標識が１番目の膜貫通ドメインの末端から約２アミノ酸後、および２番目の膜貫通ドメインの開始から約２アミノ酸前に挿入されることが好ましい。最も好ましくは、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、１番目の非膜貫通ループ（ドメイン）の中央に位置する。
【０１５０】
さらなる実施形態では、生物発光タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体（または本発明のポリペプチド）のＮ末端、２番目、４番目または６番目の非膜貫通ループ（ドメイン）の一部を形成することができる。アクセプター分子も、Ｇタンパク質共役受容体（または本発明のポリペプチド）のＮ末端、２番目、４番目または６番目の非膜貫通ループ（ドメイン）の一部を形成することができるが、同じ分子の一部のとき、生物発光タンパク質と同じ領域にある可能性はない。Ｇタンパク質共役受容体が発現し、細胞中に存在するときに、これらの領域はそれぞれ細胞外にある。
【０１５１】
ＧＰＣＲは、２つ以上の異なるＧＰＣＲの天然に存在しないキメラでもよい。特に、このことは、１つの受容体の部分が、検出する化合物に応じて多種多様なＧＰＣＲの他の部分が挿入されたキメラ中に常に存在する伝達カセットを生成することを可能にする。
【０１５２】
一実施形態では、サブユニットは、第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットのＮ末端および１番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分、第２のＧタンパク質共役受容体サブユニットの１番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分から５番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、ならびに第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットの５番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端までを含む。
【０１５３】
別の実施形態では、サブユニットは、第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットのＮ末端から５番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、および第２のＧタンパク質共役受容体サブユニットの５番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端までを含む。
【０１５４】
当業者は、Ｇタンパク質共役物のＮ末端、膜貫通ドメイン、非膜貫通ループ（ドメイン）およびＣ末端を容易に決定することができる。例えば、様々なバイオインフォマティクスの手法を使用して、そのアミノ酸配列およびＧタンパク質共役受容体の既知の膜貫通ドメインとの類似性に基づいて、タンパク質における膜貫通ドメインの位置およびトポロジーを決定することができる。アラインメントおよびアミノ酸配列比較は、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムまたはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用することにより、当技術分野で日常的に行われる。既知の膜貫通ドメイン含有タンパク質とのアラインメントに基づいて、当業者は膜貫通ドメインの位置を予測することができる。さらに、一部の膜貫通タンパク質の三次元構造が知られており、例えば、７回膜貫通Ｇタンパク質共役ロドプシン光受容体構造がＸ線結晶解析によって解析されている。そのような３Ｄ構造の分析およびそれとの比較に基づいて、他の膜タンパク質における膜貫通ドメインの位置およびトポロジーを予測することができる。タンパク質における膜貫通ドメインの位置およびトポロジーの予測に利用可能な多数のプログラムも存在する。例えば、膜貫通タンパク質のセグメントを予測するＴＭｐｒｅｄ（ＨｏｆｍａｎｎおよびＳｔｏｆｆｅｌ、１９９３）；膜タンパク質のトポロジーを予測するＴｏｐＰｒｅｄ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら、１９９２）；単一および複数の配列から二次構造を予測するＰＲＥＤＡＴＯＲ（ＦｒｉｓｈｍａｎおよびＡｒｇｏｓ、１９９７）；複数整列させた配列からタンパク質の膜貫通領域を予測するＴＭＡＰ（ＰｅｒｓｓｏｎおよびＡｒｇｏｓ、１９９４）；ならびに単一の配列から膜貫通領域を予測するＡＬＯＭ２（Ｋｌｉｅｎら、１９８４）の１つまたは組合せを使用することができる。
【０１５５】
標準的な命名法に従って、膜貫通ドメインおよび非膜貫通ループ（ドメイン）の番号付けは、ポリペプチドのＮ末端に応じて行う。
【０１５６】
天然に存在するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列突然変異体／変異体は、コードするポリヌクレオチド中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、または所望のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成により調製することができる。そのような突然変異体には、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換物がある。最終的なポリペプチド産物が所望の特徴を有することを条件として、欠失、挿入および置換の組合せを行って最終的な構築物に到達することができる。
【０１５７】
突然変異（変異）ポリペプチドは、当技術分野で知られている任意の技術を使用して調製することができる。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異導入にかけることができる。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異導入技術には、適切なベクターへのポリヌクレオチドのサブクローニング、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの「突然変異誘発」株へのベクターの形質転換、および適切な数の世代にわたる形質転換細菌の増殖が含まれ得る。別の例では、Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）によって大枠が記載されている通りに、Ｇタンパク質共役受容体をコードするポリヌクレオチドをＤＮＡシャッフリング技術にかける。本明細書に記載の技術を使用して突然変異／変異ＤＮＡに由来する産物を容易にスクリーニングして、それが本発明の方法に有用であるかを決定することができる。
【０１５８】
アミノ酸配列突然変異体の設計において、突然変異部位の位置および突然変異の性質は、改変する（複数の）特徴に依存する。突然変異の部位は、例えば、（１）最初に保存的アミノ酸を選択して置換し、次いで得られた結果に応じて選択を急進的にして置換すること、（２）標的残基を欠失させること、または（３）位置する部位の隣に他の残基を挿入することによって、個々にまたは連続して改変することができる。
【０１５９】
アミノ酸配列の欠失は、一般に約１〜１５個の残基であり、より好ましくは約１〜１０個の残基であり、典型的には約１〜５個の連続した残基に及ぶ。
【０１６０】
置換突然変異体は、Ｇタンパク質共役受容体における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入される。置換突然変異導入で最も興味深い部位は、機能にとって重要なものとして同定された部位を含む。他の興味深い部位は、様々な株または種から得られた特定の残基が同一であるものである。これらの位置は、生物活性にとって重要である可能性がある。これらの部位、特に少なくとも３つの他の同一に保存されている部位の配列に入るものは、比較的保存的な形で置換することが好ましい。そのような保存的置換を表３に示す。
【０１６１】
さらに、所望される場合、置換物または付加物として非天然アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を本明細書に記載のポリペプチドに導入することができる。そのようなアミノ酸には、それだけに限らないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、および一般のアミノ酸類似体がある。
【０１６２】
例えば、ビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子または他の細胞性リガンドとの連結などにより、合成の間またはその後に異なった形で修飾されたポリペプチドも、本発明の範囲に含まれる。これらの修飾物は、ポリペプチドの安定性および／または生物活性を増大させる働きをし得る。
【０１６３】
【表３】
0005684145.tif 000005
【０１６４】
本明細書に記載のポリペプチドは、組換えポリペプチドの産生および回収、ならびにポリペプチドの化学合成を含めた様々な形で生成することができる。一実施形態では、ポリペプチドを発現することができる細胞をポリペプチドの産生に有効な条件下で培養し、そのポリペプチドを回収することにより、本発明の単離ポリペプチドを生成する。培養するのに好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。有効な培養条件には、それだけに限らないが、有効な培地、バイオリアクター、ポリペプチド産生を可能にする温度、ｐＨおよび酸素条件がある。有効な培地とは、細胞を培養して本発明のポリペプチドを産生する任意の培地を指す。典型的には、そのような培地は、同化できる炭素、窒素およびリン酸源、ならびに適当な塩、ミネラル、金属およびビタミンなどの他の栄養素を有する水性培地を含む。従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイター皿、およびペトリ皿の中で本発明の細胞を培養することができる。組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素含量で培養を実施することができる。そのような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内にある。
【０１６５】
アクセサリー分子
アクセサリー分子は、Ｇ共役型タンパク質受容体のシグナル伝達に関与するタンパク質である。例として、Ｇタンパク質およびアレスチンがある。任意の標識アクセサリー分子は、Ｇタンパク質共役受容体（および／または本明細書で定義されるポリペプチド）と直接または間接的に結合し、化合物とＧタンパク質共役受容体が結合した後、２つの標識の相対的位置が空間的に変化して、ＢＲＥＴの検出を可能にする限り、本発明の方法で使用することができる。
【０１６６】
当業者は、当技術分野で標準的な技術を使用して、特定のＧタンパク質共役受容体と結合するアクセサリー分子を容易に同定することができる。
【０１６７】
Ｇタンパク質共役受容体について上記で記載した突然変異体（変異体）の詳細は、アクセサリー分子にも当てはまる。
【０１６８】
生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、アクセサリー分子が依然として受容体と直接または間接的に結合することができ、対象とする化合物と結合した後、ＢＲＥＴの変化を検出することができる限り、アクセサリー分子中のどこにでも位置することができる。一実施形態では、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、アクセサリー分子のＣ末端またはＮ末端に位置する。ＧＰＣＲとの複合体の形成に少なくとも１つの他のアクセサリー分子を必要とする場合、アクセサリー分子は受容体と間接的に結合し、例えば、第１のアクセサリー分子は受容体と結合し、第２のアクセサリー分子は、第１のアクセサリー分子と直接結合することによって受容体と間接的に結合する。
【０１６９】
Ｇタンパク質
Ｇタンパク質は、細胞内シグナル伝達のセカンドメッセンジャーカスケードに関与するタンパク質のファミリーである。Ｇタンパク質は、不活性なグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）結合状態と活性なグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合状態とを入れ替える「分子スイッチ」として機能する。最終的に、Ｇタンパク質はシグナル伝達ネットワークのカスケードを開始することにより下流の細胞過程を制御するＨｏｆｍａｎｎら、２００９；ＯｌｄｈａｍおよびＨａｍｍ、２００８）。
【０１７０】
２つの異なるＧタンパク質のファミリー：Ｇタンパク質共役受容体によって活性化され、アルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）サブユニットで構成される、時折「大型」Ｇタンパク質と称されるヘテロ三量体Ｇタンパク質；ならびに低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリーに属する「小型」Ｇタンパク質（２０〜２５ｋＤａ）がある。これらのタンパク質は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質で認められるアルファ（α）サブユニットと相同であり、やはりＧＴＰおよびＧＤＰと結合し、シグナル伝達に関与する。形質膜と結合するために、多数のＧタンパク質が共有結合により脂質で修飾され、例えば、ヘテロ三量体Ｇタンパク質サブユニットはミリストイル化、パルミトイル化、またはプレニル化されていることがあり、一方で小型Ｇタンパク質はプレニル化されていることがある。
【０１７１】
熟練した受け手なら気づくであろうが、既知のＧタンパク質が多数ある。線虫においていくつかのヘテロ三量体Ｇタンパク質が同定されており、例えばＣ．ｅｌｅｇａｎｓは２１個のＧα、２個のＧβおよび２個のＧγ遺伝子を有する（Ｊａｎｓｅｎら、１９９９；Ｃｕｐｐｅｎら、２００３）。配列類似性に基づいて、哺乳動物Ｇαサブユニットは、４つのファミリー：Ｇｓ、Ｇｉ／ｏ、ＧｑおよびＧ１２に分けられている（Ｎｅｖｅｓら、２００２）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは各哺乳動物ファミリーの１つのオルソログを発現する：ＧＳＡ−１（Ｇｓ）、ＧＯＡ−１（Ｇｉ／ｏ）、ＥＧＬ−３０（Ｇｑ）およびＧＰＡ−１２（Ｇ１２）。残りのＣ．ｅｌｅｇａｎｓαサブユニット（ＧＰＡ−１〜１１、ＧＰＡ−１３〜１７およびＯＤＲ−３）は、分類を可能にするほど十分な相同性を有さない。保存されるＧαサブユニットは、ＧＰＡ−１２を除いて幅広く発現されるが、新たなＧα遺伝子のうち１４個が化学感覚ニューロンのサブセット中で発現される。
【０１７２】
ＧβサブユニットＧＰＢ−１ならびにＧγサブユニットＧＰＣ−２は、古典的なＧタンパク質ヘテロ三量体中でαサブユニットと一緒に機能すると思われる。残りのＧβサブユニットＧＰＢ−２は特定のＲＧＳタンパク質の機能を制御すると考えられるが、残りのＧγサブユニットＧＰＣ−１は、化学感覚において制限された役割を有する。したがって、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるほとんどのＧタンパク質経路の機能的差異はαサブユニットにある。
【０１７３】
アレスチン
アレスチンは、Ｇタンパク質シグナル伝達の終結に重要なタンパク質の１つである。活性化したＧＰＣＲはＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によって特異的にリン酸化され、次いでアレスチンと結合して受容体／Ｇタンパク質相互作用が妨げられ、その結果後のシグナル伝達が抑えられる。アレスチンは、アゴニストで活性化されているものを含むＧＰＣＲと結合し、ＧＲＫによってリン酸化されていないものよりされているものと堅く結合する。
【０１７４】
ＧＰＣＲの分類をもたらす、細胞内のアレスチン輸送の２つの異なるパターンが以下のように描写されている：アレスチンが細胞表面で受容体と相互作用するが、エンドサイトーシスで小胞中に取り込まれず、したがって受容体との一過性の相互作用を示すクラスＡ、ならびにＲ−アレスチンおよび受容体が細胞膜からエンドサイトーシス小胞へと一緒に輸送されるクラスＢ。これら２つのクラスの受容体は、異なるアレスチンアイソフォームに対する親和性に関しても異なる。さらに、クラスＡ受容体は、Ｒ−アレスチン２と優先的に結合するが、クラスＢ受容体は、等しい親和性でβ−アレスチン１およびＨ−アレスチン２と結合する。
【０１７５】
Ｒ−アレスチンの結合により受容体がその同族Ｇタンパク質から脱共役し、下流のセカンドメッセンジャー分子を介したＧＰＣＲシグナル伝達の抑制または脱感作を引き起こす。
【０１７６】
Ｇタンパク質シグナルを終結する一方で、アレスチンの結合は、ＧＰＣＲからの新たなシグナル伝達を開始することができる。例えば、Ｒ−アレスチンは、Ｓｒｃなどの非受容体チロシンキナーゼに、内在化している受容体とのシグナル伝達複合体を形成させるアダプターとして働く。Ｈ−アレスチンは、ＡＳＫ−ＭＫＫ４−ＪＮＫ３やＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ１／２などのＭＡＰＫモジュールの、ＧＰＣＲによって制御された足場として機能する。さらに、アレスチンはクラスリン、ＡＰ２複合体のβ−アダプチンサブユニット２やＡｒｆ−６などのエンドサイトーシス機構のタンパク質と相互作用し、したがってクラスリン被覆小胞を介して受容体の内在化を促進する。
【０１７７】
線虫アレスチンの例は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来のＡＲＲ−１であり、これはＨＳＮニューロンおよび様々な化学感覚ニューロンを含めた神経系で主として発現し、可溶性および揮発性匂い物質の検出に関与する。２０を超える推定上のアレスチンが線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて現在同定されている。そのようなアレスチンは神経系全体を通じて発現し、脊椎動物非視覚性アレスチンと同様に受容体内在化を支援し、視覚／感覚性サブタイプと同様に嗅覚および視覚にも関与する。
【０１７８】
組換えベクター
本発明の一実施形態は、宿主細胞中にポリヌクレオチド分子を送達することができる任意のベクター中に挿入された、本明細書に記載のポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離／外因性ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む。そのようなベクターは、異種のポリヌクレオチド配列を含有し、この配列は本発明のポリヌクレオチド分子の隣に天然には認められないポリヌクレオチド配列であり、好ましくは、その（複数の）ポリヌクレオチド分子が由来する種以外の種に由来する。ベクターはＲＮＡでもまたはＤＮＡでもよく、原核生物性でもまたは真核生物性でもよく、典型的には（米国特許第５，７９２，２９４号に記載のような）トランスポゾン、ウイルスまたはプラスミドである。
【０１７９】
組換えベクターの１つの型は、発現ベクターと作動可能に連結する（複数の）ポリヌクレオチドを含む。作動可能に連結するという語句は、分子が宿主細胞に形質転換されたときに発現することができるような形で発現ベクター中にポリヌクレオチド分子を挿入することを指す。本明細書において、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、特定のポリヌクレオチド分子の発現を行うことができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは原核生物性でもまたは真核生物性でもよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。発現ベクターは、細菌、菌類、内部寄生生物、節足動物、動物、および植物細胞を含めた組換え細胞中で機能する（すなわち、遺伝子発現を誘導する）任意のベクターを含む。本発明のベクターを使用して無細胞発現系でポリペプチドを産生することもでき、そのような系は当技術分野で周知である。
【０１８０】
本明細書において「作動可能に連結する」とは、２つ以上の核酸（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写される配列に対する転写制御エレメントの機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、適当な宿主細胞および／または無細胞発現系中でコード配列の転写を刺激または調節する場合、本明細書で定義されるポリヌクレオチドなどのコード配列と作動可能に連結する。一般に、転写される配列と作動可能に連結しているプロモーター転写制御エレメントは、転写される配列と物理的に連続し、すなわちそれはシス作用性である。しかし、エンハンサーなど一部の転写制御エレメントは、転写を亢進するコード配列と物理的に連続し、または近接して位置する必要はない。
【０１８１】
具体的には、本発明の発現ベクターは、転写調節配列、翻訳調節配列、複製起点や、組換え細胞に適合し本発明のポリヌクレオチド分子の発現を調節する他の制御配列などの制御配列を含有する。具体的には、本発明の組換え分子は、転写調節配列を含む。転写調節配列は、転写の開始、延長、および終結を調節する配列である。特に重要な転写調節配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターやレプレッサー配列など、転写開始を調節するものである。適切な転写調節配列は、本発明の組換え細胞の少なくとも１つの中で機能することができる任意の転写調節配列を含む。様々なそのような転写調節配列が当業者に知られている。好ましい転写調節配列には、それだけに限らないが、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージラムダ、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、α接合因子、Ｐｉｃｈｉａアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノムプロモーター（シンドビズウイルスサブゲノムプロモーターなど）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（中間初期プロモーターなど）、シミアンウイルス４０、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス長末端反復配列、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸および硝酸転写調節配列、ならびに原核または真核細胞中で遺伝子発現を調節することができる他の配列など、細菌、酵母、節足動物、線虫、植物または動物細胞中で機能するものがある。
【０１８２】
宿主細胞
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の１つもしくは複数の組換え分子で形質転換された宿主細胞またはその子孫細胞を含む。細胞へのポリヌクレオチド分子の形質転換は、ポリヌクレオチド分子を細胞中に挿入できる任意の方法で行うことができる。形質転換の技術には、それだけに限らないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合がある。組換え細胞は、単細胞のままでもよく、または成長して組織、臓器もしくは多細胞生物になってもよい。本発明の形質転換されたポリヌクレオチド分子は、染色体外にあるままでもよく、または発現する能力が保持される形で、形質転換される（すなわち組換え）細胞の染色体内の１つまたは複数の部位に組み込むこともできる。
【０１８３】
形質転換するのに適した宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換することができる任意の細胞を含む。本発明の宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドを内因的に（すなわち天然に）産生することもでき、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド分子で形質転換した後にそのようなポリペプチドを産生することもできる。本発明の宿主細胞は、本明細書で定義される少なくとも１つのタンパク質を産生することができる任意の細胞でよく、細菌、菌類（酵母を含む）、寄生生物、線虫、節足動物、動物および植物細胞を含む。宿主細胞の例として、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、ＢＨＫ（仔ハムスター腎）細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ−７）細胞、およびＶｅｒｏ細胞がある。宿主細胞のさらなる例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ；弱毒化株を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ；および非腫瘍原性マウス筋原細胞のＧ８細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２４６）である。特に好ましい宿主細胞は、それだけに限らないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種やＰｉｃｈｉａ種などの酵母細胞である。
【０１８４】
組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子のコピー数、そのポリヌクレオチド分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することにより、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現を向上させることができる。本発明のポリヌクレオチド分子の発現の増大に有用な組換え技術には、それだけに限らないが、高コピー数のプラスミドへのポリヌクレオチド分子の作動的連結、１つまたは複数の宿主細胞染色体へのポリヌクレオチド分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写調節シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳調節シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガルノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン使用に対応するような本発明のポリヌクレオチド分子の改変、および転写物を不安定にする配列の欠失がある。
【０１８５】
無細胞組成物
細胞から無細胞組成物を調製する方法は当技術分野で周知であり、それには、凍結融解サイクルの反復、粉砕、超音波処理デバイスにおける超音波での細胞の処理、ホモジナイズ処理、フレンチプレスの使用、界面活性剤および／または酵素の添加、ガラスビーズ溶解、分画遠心、様々な勾配媒体を使用するいくつかの密度勾配の手順がある。これらの技術は当業者によく知られており、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」；Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃａｌｉｇａｎ；Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ；Ｈｉｄｄｅ  Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ；Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ；Ｐａｕｌ  Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ；Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）で詳細に論じられている。
【０１８６】
細胞膜抽出物の単離または調製では、これらの方法の組合せが通常使用される（ＲｉｅｄｅｒおよびＥｍｒ、２００１）。一般に、機械的手段により、または界面活性剤を使用して細胞を溶解し、例えば、米国特許第７，３９３，９３４号に概略が述べられているように、分画遠心により膜分画を単離する。Ｍｏｏｒｅ（１９９４）に概略が述べられている方法が一般的に使用される。そのような方法の例は、米国特許第７，３２０，８７５号で見つけることができる。他の方法、例えば水性二相アフィニティー分配も膜分画の調製に利用可能である（ＰｅｒｓｓｏｎおよびＪｅｒｇｉｌ、１９９４）。
【０１８７】
細胞膜分画の精製に利用可能な多数の市販のキット、例えば、ＱｉａｇｅｎのＱｐｒｏｔｅｏｍｅ形質膜タンパク質キット（Qproteome Plasma Membrane Protein Kit）もある。細胞を低張性緩衝液中でインキュベートし、それを膨張させる。弱い界面活性剤を添加し、得られた細胞懸濁液を機械的破壊によってホモジナイズする。インタクトな細胞、細胞片、核および主要な細胞内小器官を遠心分離によって除去する。得られた上清は、細胞質タンパク質およびミクロソーム、ゴルジ小胞、ならびに形質膜を含有する。細胞膜上の分子に特異的なリガンドを上清に添加する。リガンドは細胞膜小胞と結合し、リガンドと結合する磁性ビーズを使用してリガンド−小胞複合体を沈降させる。洗浄後、天然の条件下で形質膜小胞を溶出させ、リガンドはビーズと結合したままである。
【０１８８】
酵母細胞では、細胞膜の調製に一般的に使用される方法は、細胞をスフェロプラストにすることである。これは高収量をもたらし、形質膜の大規模単離に申し分なく適している。一般に、そのような方法では、スフェロプラストの負に帯電した表面を高密度のカチオン性シリカビーズで被覆し、その膜を細胞の他のどんな膜の細胞内小器官よりも高密度にする必要がある。洗浄手順で、過剰なカチオン性ビーズを除去し、その後ポリアクリル酸を添加して、ビーズ上の遊離カチオン性基を遮断する。その後、ＥＧＴＡ含有溶解緩衝液中で、手作業でホモジナイズすることにより、被覆したスフェロプラストを溶解して膜構成成分の凝集を防止する。スフェロプラスト溶解物の遠心分離により、重い形質膜−マイクロビーズ集合物をペレットにし、細胞内にある膜の細胞内小器官を上清中に残す。
【０１８９】
本発明に使用することができるＧタンパク質共役受容体関連ポリペプチドを含む無細胞組成物の生成のさらなる例は、Ｋａｉｓｅｒら（２００８）に記載されている。
【０１９０】
特定の実施形態では、ＧＰＣＲを含む本発明のポリペプチドは、リポソーム調製物の脂質二重層中に埋め込まれる。本明細書において、「リポソーム」という用語は、両親媒性のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールの二重層を含む閉じた小胞を指す。リポソームは、（ホスファチジルエタノールアミンのような）脂質鎖が混合した天然由来のリン脂質、またはＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のような純粋な表面活性物質成分から構成され得る。
【０１９１】
本明細書に記載のポリペプチドを含有するリポソームは、水中で、例えば超音波処理により、タンパク質を発現する細胞のリン脂質膜を破壊することによって作製することができる。リン脂質は再び集合して、水溶液の中心部を含有するリポソームの球体になる。剪断速度が低いと多数の層を有する多重膜リポソームが生じる。高速剪断超音波処理を続けると、より小さい単層のリポソームが形成され、これは本発明の適用により適している。配向および到達性が最適である最適なリポソームサイズにする実験は、当業者の日常的な能力の範囲内である。
【０１９２】
本明細書に記載のポリペプチドを生成し、界面活性剤中で解離させ、その後脂質の存在下で膜を再構成し、界面活性剤を除去する膜再構成技術によってそのポリペプチドをリポソーム中に取り込むこともできる。結合相手（化合物）との、リポソームに入っているポリペプチドの配向および到達性が確実に最適になるように、リポソーム組成物を調整する。最適なリポソーム組成物にするそのような調整は、当技術分野で日常的である。
【０１９３】
ＢＲＥＴのアッセイ
好ましい実施形態では、生物発光タンパク質とアクセプター分子の間で起こるエネルギー移動は、特定の波長を選択する光学フィルターを使用して測定された放出（１つはアクセプター分子の放出、もう１つは生物発光タンパク質の放出）から計算された比率として示される（方程式１を参照）。
Ｅａ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比率                                          （１）
上式で、Ｅａはアクセプター分子の放出強度として定義され（放出光はアクセプターの放出に適合した特異的なフィルターを使用して選択される）、Ｅｄは生物発光タンパク質の放出強度として定義される（放出光は生物発光タンパク質の放出に適合した特異的なフィルターを使用して選択される）。
【０１９４】
光学フィルターは、ＢＲＥＴに適した波長識別を可能にする任意の型のフィルターでよいことが、当業者には容易に理解されるはずである。例えば、本発明に従って使用される光学フィルターは、干渉フィルター、ロングパスフィルター、ショートパスフィルターなどであり得る。フィルターを通過する波長の強度（通常はカウント毎秒（ＣＰＳ）または相対発光単位（ＲＬＵ））は、光電子増倍管（ＰＭＴ）またはＣＣＤカメラを使用して定量することができる。その後、定量したシグナルを使用してＢＲＥＴ比率を計算し、エネルギー移動効率を表す。アクセプター放出の強度が増大するにつれて、ＢＲＥＴ比率は増大する。
【０１９５】
一般に、ドナー放出強度に対するアクセプター放出強度の比率が決定され（方程式１を参照）、これは、エネルギー移動効率を反映する任意の単位で表された数である。この比率は、エネルギー移動効率の増大につれて増大する（Ｘｕら、１９９９を参照）。
【０１９６】
エネルギー移動効率は、アクセプター放出強度に対するドナー放出強度の逆比率を使用して表すこともできる（方程式２を参照）。この場合、エネルギー移動効率が増大するにつれて比率は低下する。この計算を行う前に、バックグラウンドの光および基質の自己発光の存在について放出強度を補正する。この補正は、基質を含有するが、生物発光タンパク質、アクセプター分子または本発明のポリペプチドを含有しない対照試料から適当な波長で測定された放出強度を減算することにより一般に行われる。
Ｅｄ／Ｅａ＝ＢＲＥＴ比率                                          （２）
上式で、ＥａおよびＥｄは上記で定義した通りである。
【０１９７】
生物発光タンパク質およびアクセプター分子の放出の光強度は、分光蛍光光度計など単色光分光器ベースの機器、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラまたはダイオードアレイ検出器を使用して定量することもできる。分光蛍光光度計を使用して、基質の添加後に生物発光タンパク質とアクセプター分子の放出ピークがどちらも検出されるように放出スキャンを行う。ピーク下の面積は相対的な光強度を表し、上記で概略を述べた通り、これを比率の計算に使用する。同じ試料から生物発光タンパク質およびアクセプター分子の光を測定することができる任意の機器を使用して、本発明のＢＲＥＴ系をモニタリングすることができる。
【０１９８】
代替的な実施形態では、単独のアクセプター分子の放出がＢＲＥＴの有効な検出および／または定量に適している。この場合、エネルギー移動効率は、アクセプター放出強度のみを使用して表される。エネルギー移動を測定するために、比率の計算を行わずにアクセプター放出強度を使用できることが、当業者には容易に明らかとなるであろう。これは、理想的には、アクセプター分子が、生物発光タンパク質から移動した光を吸収する場合にのみ光を放出することに起因する。この場合、光フィルターが１つだけ必要である。
【０１９９】
関連する実施形態では、単独の生物発光タンパク質の放出がＢＲＥＴの有効な検出および／または定量に適している。この場合、エネルギー移動効率は、生物発光タンパク質放出強度のみを使用して計算される。エネルギー移動を測定するために、比率の計算を行わずにドナー放出強度を使用できることが、当業者には容易に明らかとなるであろう。これは、アクセプター分子が、生物発光タンパク質から移動した光を吸収するので、生物発光タンパク質から検出可能な放出が対応して低下することに起因する。この場合、光フィルターが１つだけ必要である。
【０２００】
代替的な実施形態では、エネルギー移動効率は、測定に１つの光学フィルターしか必要としない比率的測定を使用して表される。この場合、適当な光学フィルターを使用してドナーまたはアクセプターの光強度を決定し、フィルターを使用せずに試料の別の測定を行う（オープンスペクトルの強度）。この後者の測定では、（全ての波長について）光の総放出量を定量する。次いで、方程式３または４を使用して比率の計算を行う。方程式３では、アクセプターの光学フィルターのみを必要とする。方程式４では、ドナーの光学フィルターのみを必要とする。
Ｅａ／Ｅｏ−Ｅａ＝ＢＲＥＴ比率または＝Ｅｏ−Ｅａ／Ｅａ  （３）
Ｅｏ−Ｅｄ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比率または＝Ｅｄ／Ｅｏ−Ｅｄ  （４）
上式で、ＥａおよびＥｄは上記で定義した通りであり、Ｅｏは、全ての波長を組み合わせた（オープンスペクトル）放出強度として定義される。
【０２０１】
方程式１〜４からさらなる方程式を導き出せることが、当業者には容易に明らかであるはずである。例えば、そのように導き出された式の１つでは、生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子の放出波長で存在するバックグラウンドの光について補正する。
【０２０２】
ＢＲＥＴアッセイを行う際に、ＢＲＥＴＣｏｕｎｔを使用して、各ウェルから光放出を決定することができる。ＢＲＥＴＣｏｕｎｔ機器は改変型のＴｏｐＣｏｕｎｔであり、ＴｏｐＣｏｕｎｔは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）から販売されているマイクロタイタープレートシンチレーションおよび発光計数器である。バックグラウンドノイズを除去するために同時に２つの光電子増倍管（ＰＭＴ）を利用する古典的な計数器と異なり、ＴｏｐＣｏｕｎｔは、ノイズ低減に単一のＰＭＴ技術および時間分解パルス計数を使用して、標準の不透明なマイクロタイタープレートでの計数を可能にする。不透明なマイクロタイタープレートの使用は、光学的なクロストークをごくわずかなレベルまで低減することができる。ＴｏｐＣｏｕｎｔには、１、２、６または１２個の試料の同時読み取りを可能にするそれぞれ１、２、６および１２個の検出器（ＰＭＴ）を含めて、様々なフォーマットがある。ＢＲＥＴＣｏｕｎｔの他に、他の市販の機器：Ｖｉｃｔｏｒ２（Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＦｕｓｉｏｎ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｍｅｒｉｄｅｎ）でＢＲＥＴを行うことが可能である。少なくともアクセプター分子の放出、および好ましくは２つの波長（アクセプター分子および生物発光タンパク質）またはそれ以上を検出できる読取り器を使用して、ＢＲＥＴを行うことができる。
【０２０３】
本発明の一実施形態では、マイクロ流体工学デバイスを使用してＢＲＥＴを検出する。好都合なことに、マイクロ流体工学デバイスは、マイクロ流体工学デバイスの試料貯蔵所に移すのに、一般に約５０μＬ以下の試料のアリコートしか必要としない。これは、手作業でまたはシリンジ、キャピラリーなどを介した圧気注入によって行われる。
【０２０４】
マイクロ流体工学を使用した自動化発光バイオチップデバイスを使用して、全ての必要なＢＲＥＴ反応ステップを行うことができる。複数の手作業での操作ステップを回避し、実験を行う際の人間の時間および労力を低減するため、マイクロ流体バイオチッププラットホームでＢＲＥＴ反応を自動化することは望ましい。マイクロ流体工学デバイスは、パターン化されたマイクロチャネルを有する内蔵型の使い捨てバイオチップ、ならびに複数の試料、試薬、および基質を貯蔵するための貯蔵手段を有する区画を含有し得る。区画からマイクロチャネルを介して反応部位へと試料、または試薬の少なくとも１つ、次いで発光基質を連続して移すステップを自動化することができる。次いで発光基質がドナー分子と反応して発光し、それが光学検出器によって検出される。発光を検出するマイクロ流体工学デバイスの例が米国特許第６，９４９，３７７号に記載されている。
【０２０５】
使用
本発明を使用して、多種多様な化合物、特に匂い物質を検出することができる。典型的には、匂い物質は、少なくとも１つの生物の化学感覚的嗅覚受容体によって検出することができる揮発性の有機もしくは無機化合物または無機ガスとなる。これらは、アミンおよび／またはスルフヒドリル含有化合物、カルボン酸、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、芳香族化合物、エステル、テルペンまたはテルペン誘導体、エーテル、ＣＯ２など、ならびにこれらの性質の組合せを有する化合物を含み得る。
【０２０６】
匂い物質は、ヒトにとって価値のあるまたは興味深いいくつかの生物学的または化学的状態を示し得る。そのように示される状態には、以下が含まれ得る：
・食料および飲料、医薬品または関連材料の感覚的訴え、品質または安全性。
・ヒトまたは動物の健康、栄養または運動状態。
・病原体を含めた危険な物質の存在の有無。
・産業プロセスの進行または状態。
・環境汚染または状態。
・香料、芳香剤または他の化粧品の感覚的訴え、品質または安全性。
【０２０７】
特に好ましい実施形態では、化合物は、本明細書に記載のポリペプチドの受容体部分とのみ結合する。
【０２０８】
特に好ましい実施形態では、嗅覚受容体を含む本明細書で定義されるポリペプチドをバイオセンサーで使用して、対象とする（複数の）化合物を検出する。バイオセンサーとは、生物学的な構成成分を物理化学的な検出器構成成分と組み合わせた、分析対象を検出するためのデバイスである。それは、典型的には３つの部分からなり、第１はＧタンパク質共役受容体を含む本明細書で定義される少なくとも１つのポリペプチドである。第２に、変換器または検出器エレメントを必要とし、これは物理化学的に（例えば、光学的、電気化学的に）働き、化合物とポリペプチドの相互作用から生じるシグナルを、容易に測定および定量できる別のシグナルに変換する（すなわち、変換器）。第３に、関連の電子またはシグナル処理装置を必要とし、ユーザーフレンドリーに相互作用の結果を提示する。ＢＲＥＴを含むバイオセンサーの例は、Ｃｈａｒｅｓｔら（２００５）に記載されている。
【０２０９】
別の実施形態では、スクリーニング方法を薬物の発見および／または開発に使用する。より具体的には、受容体は、潜在的な治療薬の標的である。したがって、この実施形態では、受容体が、それだけに限らないが、アドレナリン作動性受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、代謝型／グルタミン酸受容体、ＧＡＢＡ受容体、鋤鼻受容体（vomeronasal receptor）、味覚受容体やセクレチン様受容体などの臨床的に重要な分子であることが好ましい。
【０２１０】
Ｇタンパク質共役受容体と相互作用することが可能な分子を同定し、特徴付け、スクリーニングする方法も本発明の範囲内にあり、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル（および他）の市販のプレートを使用して実施される、当技術分野で知られているいわゆるハイスループットスクリーニング方法および類似した手法（Ｓｐｅｎｃｅｒ、１９９８；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ、１９９８；Ｍｉｌｌｉｇａｎ、１９９９）を含む。本発明に従って使用されるさらなる方法は、それだけに限らないが、（とりわけＰｏｐｅ、１９９９に記載の）ハイスループットスクリーニングにおける均等蛍光読取り（homogenous fluorescence readout）を含む。
【０２１１】
当業者なら気づくであろうが、本発明を多重化することもできる。この系では、異なる化合物と結合する、異なるＧタンパク質共役受容体を含む２つ以上のポリペプチドを提供する。異なる波長で放出して異なる標的化合物の検出および定量を可能にするように、異なる各Ｇタンパク質共役受容体を異なる生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子で標識する。
【実施例】
【０２１２】
[実施例１]
二重標識ＢＲＥＴ  ＯＤＲ−１０（ＯＧＰＲ）構築物
材料および方法
二重標識ＢＲＥＴ  ＯＲ構築物の設計および構築
３番目の細胞内ループ（ＩＣ３）およびＣ末端に挿入されたＢＲＥＴ２構成成分を用いてＢＲＥＴ２受容体構築物を作製した。（１）ＩＣ３の中央にあるＧＦＰ２、およびＣ末端にあるＲＬｕｃ（ｈ）；（２）ＩＣ３の中央にあるＲＬｕｃ（ｈ）およびＣ末端にあるＧＦＰ２の付いたＯＲを用いて２つのＢＲＥＴ構築物を作製した。Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＷｏｒｋｂｅｎｃｈにあるＴＭＡＰという、膜貫通セグメントを予測するウェブベースのツール（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｑｔｏｏｌ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ）を使用して、３番目の細胞内ループ（ＩＣ３）の位置を決定した。ＯＤＲ−１０では、ＩＣ３の中央はアミノ酸２４０〜２４１である。ＯＧＯＲと称されるこの構築物のアミノ酸配列は、配列番号１５として示される（コードするヌクレオチド配列は配列番号１６として示される）。
【０２１３】
ＯＤＲ−１０は、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、標準的な技術を用いて調製したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分を行い、９４℃で１５秒、５９℃で３０秒、６８℃で７０秒を３０サイクル、最後の伸長ステップが６８℃で５分であった。標準のＰｆｘ５０  ＰＣＲ成分を、プライマーＯＤＲ−１０Ｘｂａ１Ｆ  ５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＧＡＧＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＴＡ−３’（配列番号２１）およびＯＤＲ−１０−ａｔｔｂ１−Ｒ  ５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＣＧＴＣＧＧＡＡＣＴＴＧＡＧ−３’（配列番号２２）とともに使用した。増幅したｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、配列を決定した。
【０２１４】
ＢＲＥＴ構成成分のＧＦＰ２およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼＲＬｕｃ（ｈ）は、市販のプラスミドｐＧＦＰ２−ＭＣＳ−Ｒｌｕｃ（ｈ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｌｏｔ＃６３１００５１−６Ｄ１）から入手した。
【０２１５】
構築物の個々の断片をＰＣＲ増幅することによってＢＲＥＴ構築物を構築した（プライマーおよびアニーリング温度については表４を参照）。Ｐｆｘ５０（商標）標準成分（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲを行い、条件は、９４℃で２分を行い、９４℃で１５秒、５９℃で３０秒、６８℃で７０秒を３０サイクル、最後の伸長ステップが６８℃で５分であった。構築物の別々の構成成分を、重複するプライマーを使用して増幅した。
【０２１６】
【表４】
0005684145.tif 000006
0005684145.tif 000007
【０２１７】
次いで、構成成分を精製し、対の反応に入れて９４℃で変性し、５２℃で（重複するプライマー部位で）アニールし、６８℃で５分伸長して必要な対にした。次いでこれを、その対のほとんど５’および３’のプライマーを使用するＰＣＲの鋳型として使用した。完全長の構築物が作製されるまでこれを反復した。次いでこれらをｐＧＥＭ−Ｔにクローニングし、配列を決定した。ＡｐａＬＩを使用してエラーのないクローンをｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。次いでＧａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を使用してこれらをｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして（ａｔｔＢ部位は元の５’および３’プライマーに含まれていた）、その後Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させた。
【０２１８】
ＯＧＯＲ突然変異体（Ｈ１１０Ｙ）の構築
二本鎖鋳型としてｐＤＯＮＲ２０１ベクター中のＯＧＯＲ（上記参照）を用いて部位特異的突然変異導入を実施した。標準的なプロトコールに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異導入キットを使用して、以下のプライマー：５’−ＣＡＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴ−３’（ＷＴ）（配列番号４３）および５’−ＡＡＧＴＴＧＣＡＡＡＡＴＡＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＴＧ−３’（Ｈ１１０Ｙアンチセンス）（配列番号４４）を使用してヒスチジン１１０からチロシンへの（Ｈ１１０Ｙ）突然変異を行った。
【０２１９】
Ｐｆｘ５０（商標）標準成分（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲを行い、条件は、９４℃で２分を行い、９４℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で６．８分を１６サイクルであった。次いで、配列決定の後、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を使用してＯＧＯＲ突然変異体をｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして（５’および３’のａｔｔＢ部位は元のＯＧＯＲ配列に含まれていた）、その後Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させた。
【０２２０】
溶液調製
２０％（ｗ／ｖ）グルコース  −  グルコース２０ｇを脱イオン水１００ｍＬに添加し、溶解するまでホットプレート（５０℃）上で加熱し、溶液をフィルター精製（０．２μｍフィルター）する。
【０２２１】
２０％（ｗ／ｖ）ラフィノース  −  グルコース２０ｇを脱イオン水１００ｍＬに添加し、溶解するまでホットプレート（５０℃）上で加熱し、溶液をフィルター精製（０．２μｍフィルター）する。
【０２２２】
２０％（ｗ／ｖ）ガラクトース  −  ガラクトース２０ｇを脱イオン水１００ｍＬに添加し、溶解するまでホットプレート（５０℃）上で加熱し、溶液をフィルター精製（０．２μｍフィルター）する。
【０２２３】
ＹＰＤ培地  −  細菌用ペプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇを脱イオン水１Ｌに添加する。１５分間オートクレーブをかける。
【０２２４】
ＹＰＤプレート  −  細菌用ペプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇおよび寒天２０ｇを脱イオン水１Ｌに添加する。１５分間オートクレーブをかける。オートクレーブした後、２０％グルコースを２０ｍＬ添加し、寒天プレートに注ぐ。
【０２２５】
Ｙｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ  Ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｕｒａｃｉｌ（ＳＣＭＭ−Ｕ）培地−  アミノ酸不含酵母窒素塩基（yeast nitrogen base without amino acids）（製品番号Ｙ  ０６２６、Ｓｉｇｍａ）６．７ｇおよびウラシル不含酵母合成離脱培地補充物（yeast synthetic drop-out media supplement without uracil）（製品番号Ｙ  １５０１）１．９２ｇを脱イオン水１Ｌに添加する。１５分間オートクレーブをかける。
【０２２６】
ＳＣＭＭ−Ｕプレート  −  アミノ酸不含酵母窒素塩基（製品番号Ｙ  ０６２６、Ｓｉｇｍａ）１．３４ｇ、ウラシル不含酵母合成離脱培地補充物（製品番号Ｙ  １５０１、Ｓｉｇｍａ）０．３８４ｇおよび寒天４ｇを脱イオン水１８０ｍＬに添加する。１５分間オートクレーブをかける。オートクレーブした後、２０％グルコースを２０ｍＬ添加し、寒天プレートに注ぐ。
【０２２７】
１×リン酸ナトリウム緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）  −  リン酸水素二ナトリウム８２．３３ｇ（０．５８Ｍ）、リン酸ナトリウム一塩基酸２３．４５ｇ（０．１７Ｍ）、および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）４０ｇを脱イオン水中で溶解することにより１０×ストック溶液を調製した。ストック溶液を脱イオン水で１×ＰＢＳに希釈した。
【０２２８】
セレンテラジン４００ａ  −  純エタノール１０．２０ｍＬ中でセレンテラジン４００ａ（Ｃｌｚ４００ａ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）１ｍｇを溶解して２５０μＭストック溶液を作製する。４０または４００μＬのセレンテラジン４００ａのアリコートをピペットで微量遠心管に入れ、次いでＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＳＣ１１０Ａ（Ｓａｖａｎｔ）を用いてドライダウンする。−８０℃でアリコートを貯蔵する。試料を１００または１０００μＬの無水エタノール（それぞれ４０または４００μＬのアリコート）で再構成して、５０μＭの濃度を得る。
【０２２９】
匂い物質調製物  −  匂い物質のジアセチル、ベンズアルデヒドおよびオクタナールの１％ストック溶液をそれぞれの溶媒である水、エタノールおよびＤＭＳＯで作製した。匂い物質を水で段階希釈して、所望の終濃度を得た。匂い物質を添加していない溶媒の同じ希釈物も調製した。
【０２３０】
プラスミド形質転換プロトコール
酵母形質転換キット（ＹＥＡＳＴ−１、Ｓｉｇｍａ）を使用して、酵母形質転換を実施した。ＹＰＤプレートをＩＮＶＳＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｓ．ｃｅｒｖｅｓｉａｅ株で画線し、２８℃で２〜３日間インキュベートした。ＹＰＤプレートからＩｎＶＳＣ１細胞１ループ分を掻き取って微量遠心管に入れる。形質転換緩衝液（製品コードＴ  ０８０９）０．５ｍＬ中で細胞を再懸濁し、５秒間遠心する。上清を除去し、緩衝液５０〜１００μＬを管に残す。１０ｍｇ／ｍＬサケ精巣ＤＮＡ（製品コードＤ  ９１５６）１０μＬを管に添加する。研究するｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−ＯＲプラスミドＤＮＡ１μｇを添加し、１０秒間ボルテックスをかける。ＰＬＡＴＥ緩衝液（製品コード８９６６）６００μＬを添加し、ボルテックスをかける。室温で４時間インキュベートする。４２℃熱ブロックで試料に１５分間熱ショックをかける。微量遠心機で３秒間遠心し、上清を除去する。滅菌水５００μＬ中で細胞を再懸濁する。ＳＣＭＭ−Ｕプレートに１００μＬを播く。コロニーが現れるまで２８℃で２〜３日間インキュベートする。
【０２３１】
発現プロトコール
ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−ＯＲ構築物を含有する単一コロニーを、２％グルコースを含有するＳＣＭＭ−Ｕ培地１５ｍＬに接種する。振盪（２００ｒｐｍ）しながら２８℃で一晩増殖させる。
【０２３２】
一晩培養物のＯＤ６００を決定した。誘導培地（ＳＣＭＭ−Ｕ、２％ガラクトース、２％ラフィノース）３０ｍＬ中で０．４のＯＤ６００を得るのに必要な一晩培養物の量を取り出し、１５００×ｇ、５分間で細胞をペレットにした。誘導培地１ｍＬ中で細胞を再懸濁し、それを誘導培地２９ｍＬに接種した。振盪（２００ｒｐｍ）しながら１５℃で７２時間増殖させる。フラスコから培養物を取り出し、１５００×ｇで５分間、４℃で細胞を遠心分離する。上清をデカントし、滅菌水１ｍＬ中で細胞を再懸濁する。滅菌した微量遠心管に細胞を移し、試料を１０，０００×ｇで１分間遠心分離する。上清を除去し、膜単離を実施する。
【０２３３】
膜調製
１５００×ｇ（４℃）で５分間の遠心分離によって細胞を回収し、水で洗浄し、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、３６ｍｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）または１×ＰＢＳ４ｍＬ中で再懸濁した。フレンチプレス（約１８０００ｐｓｉ）によって細胞を溶解し、９３００×ｇ（４℃）で１５分間の遠心分離によって可溶性タンパク質分画を単離した。この後、１３．１５ｍＬポリカーボネート厚肉遠心管に可溶性タンパク質分画を移し、４℃で１時間、４０，０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌ−８０超遠心分離機）で超遠心分離をかけた。上清をデカントし、Ｄ−ＰＢＤまたは１×ＰＢＳ１ｍＬ中で膜ペレットを再懸濁し、可溶化するまで４℃で一晩放置した。
【０２３４】
スペクトル測定
プレートを読み取るＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２分光蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、全てのスペクトルスキャンを記録した。９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、１００μＬの膜調製物試料のアリコートをスキャンした。蛍光スペクトルスキャンは、励起波長４２０ｎｍで、４５５ｎｍ放出カットオフフィルターを使用して、４５０から６００ｎｍまで記録した。
【０２３５】
同時二重放出検出
ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡマイクロプレート読取り器（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ）を用いて、同時二重放出ＲＥＴ測定を実施した。同時放出測定ではＢＲＥＴ２フィルターセット（４１０〜８０／５１５〜３０）を使用し、各チャネルについてセットのそれぞれのゲインを用いた（３３００／４０９５）。
【０２３６】
ＲＥＴ分析プロトコール
試料濃度の標準化
ＢＲＥＴ２タグ付き受容体試料の相対的濃度を評価するために、スペクトルスキャンから試料の蛍光強度を決定し、ＯＧＯＲの蛍光強度によって試料の量を標準化した。ＧＦＰ２の強度を濃度に転換するために、精製したＧＦＰ２タンパク質を様々な濃度でアッセイして、蛍光強度に対する濃度に関して較正グラフを作成した。コバルトアフィニティークロマトグラフィーを使用して、供給された使用説明書に従って（ＢＤ  Ｔａｌｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））ＧＦＰ２タンパク質を精製した。最良適合の方程式の線を再編成すると（ｙ＝２７１ｘ＋２３３．３１）、蛍光強度が濃度に転換される。最終体積１００μＬで５または１０ｎＭの概算濃度をアッセイに使用した。
【０２３７】
選択性
９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）でＲＥＴ分析を実施し、特定の二重タグ付き受容体タンパク質（ＯＧＯＲ）を１μＭの特定の各匂い物質とともに４５分間インキュベートした。最終体積は１００μＬであり、１０μＬの匂い物質、受容体タンパク質試料（「試料濃度の標準化」の節を参照）、Ｄ−ＰＢＳ（または１×ＰＢＳ）および５μＬのＣｌｚ４００ａ（５μＭ）を含んでいた。Ｄ−ＰＢＳ（または１×ＰＢＳ）の試料をアッセイすることによって、バックグラウンドシグナルを記録した。インキュベーション時間の間、９６ウェルプレートウェルをＴｏｐｓｅａｌ（商標）−Ａ（Ｐａｃｋａｒｄ）で密封し、各試料の領域を個々に密封した。非匂い物質試料（水、ピルビン酸、クエン酸、乳酸）を調製し、最初にアッセイした。この後、ドラフト中で匂い物質溶液を調製し、以下の順序でアッセイした：２−ブタノン、２，３−ペンタンジオン、２，３−ブタンジオールおよびジアセチル。
【０２３８】
ＢＲＥＴ２測定では、４５分のインキュベーション時間後にＣｌｚ４００ａ基質（５μＭ）を添加し、５秒間に対して０．５０ｓの積分時間（integration time）を使用してシグナルを記録した。Ｃｌｚ４００ａを添加した後、シグナルを記録する間ウェルを再度密封して、試料の交差汚染を低減した。試料をウェルに添加した順にアッセイを連続して実施した。
【０２３９】
ＢＲＥＴ２比率は、（（受容体試料の５１５ｎｍでの放出）−（Ｄ−ＰＢＤ（または１×ＰＢＳ）の５１５ｎｍでの放出）／（受容体試料の４１０ｎｍでの放出）−（Ｄ−ＰＢＤの４１０ｎｍでの放出）（または１×ＰＢＳ）のように測定された放出比率として計算する。
【０２４０】
用量反応曲線
ＧＦＰ２の強度によって、ＯＧＯＲの濃度を１０ｎＭに標準化した。本文中に示したように、濃度範囲にわたって匂い物質の濃度を変化させることにより、用量反応曲線を構築した。常に最低の濃度を最初に、最高の濃度を最後にアッセイした。
【０２４１】
Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＸＰ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用した非線形回帰分析により、Ｓ字状の用量反応曲線を適合させ、ＥＣ５０を計算した。
【０２４２】
結果
リガンド応答および選択性
生成した構築物は、嗅覚受容体の３番目の細胞内ループ内およびＣ末端に挿入されたＢＲＥＴ２ドナーおよびアクセプターを有する（図１）。ＯＤＲ−１０によってジアセチルが結合すると、ドナーおよびアクセプター構成成分が離れた場合にＢＲＥＴ２比率が増大し、またはこれらの構成成分が互いに近づいた場合にシグナルが増大する。
【０２４３】
ＯＧＯＲを１０ｎＭまたは１μＭの以下のリガンド：水、ピルビン酸、クエン酸、乳酸、２−ブタノン、２，３−ペンタンジオン、２，３−ブタンジオールおよびジアセチルとともにインキュベートした後、ＢＲＥＴ２シグナルを記録した（図２ａおよびｂ）。ＢＲＥＴ２シグナルの最大の変化が、ＯＧＯＲをμＭ濃度のジアセチルとともにインキュベートした時に起こり、溶媒（水）の応答と比較してシグナルの３７．５％の差が生じた（図３ａ）。これは、無細胞アッセイのフォーマットで二重標識ＢＲＥＴ２タグ付き受容体を使用してリガンド結合をモニタリングした最初の例である。
【０２４４】
ｎＭとμＭどちらの濃度のジアセチルをＯＧＯＲに添加した時でも、ＢＲＥＴ２比率の変化は、対照応答（水）に対して有意差があった（Ｐ＞０．０５）（図３ａおよびｂ）。ジアセチル刺激に対するＯＧＯＲの応答は、ｎＭとμＭ両方の濃度で試験した他の全てのリガンドと比較して、対照応答に対して有意差があった唯一の応答であった。これらの結果から、ＯＤＲ−１０がジアセチルと選択的に結合することが確認される。ジアセチルは、ＯＤＲ−１０を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＣａ２＋上昇応答を生じさせる唯一の揮発性化合物であることが以前に確認されていた（Ｚｈａｎｇら、１９９７）。
【０２４５】
３７．５％という、リガンド結合に対するＢＲＥＴ２応答の最大の変化は、α２Ａ受容体による１０μＭのノルエピネフリンの結合時（約５％）（Ｌｏｈｓｅら、２００３）およびＰＴＨＲによる１μＭのＰＴＨの結合時（約２０％）（Ｖｉｌａｒｄａｇａら、２００３）にＦＲＥＴシグナルで観察された変化より実質的に大きい。ジアセチルの添加時のＢＲＥＴ２シグナルの低下から、ＢＲＥＴ２構成成分が匂い物質の結合時に離れることが示唆される。これは、分子内変化のモニタリングについて、このＢＲＥＴ２伝達系が、ＦＲＥＴ伝達系と比較して優れた感度を示す最初の実証である。
【０２４６】
用量応答
ＯＧＯＲのＢＲＥＴ２シグナルの変化の幅に対する匂い物質の濃度変化の効果（図４）は、用量依存的応答の最初の実証をもたらす。ＥＣ５０値は３．５５ｆＭジアセチルと計算され、これは０．３１千兆分率（ｐｐｑ）に等しい。ヒト細胞で発現され、カルシウム画像化技術によってモニタリングされたとき、ジアセチルに対するＯＤＲ−１０の見かけの親和性は、２．３μＭ（約０．２百万分率（ｐｐｍ））と計算され、ＥＣ５０値は走化性の結果と一致する（Ｚｈａｎｇら、１９９７）。
【０２４７】
ここで示した無細胞アッセイは、全細胞アッセイ、および蛍光検出（Ｌｉら、２００９）や炎イオン化検出を伴うガスクロマトグラフィー技術（ＧＣ−ＦＩＤ）（Ｍａｃｃｉｏｌａら、２００８）など既存の化学的検出系と比較して、ジアセチル定量について９桁を超えて感度が高い。
【０２４８】
陰性対照−ＯＧＯＲ突然変異（Ｈ１１０Ｙ）
ジアセチルに対するＯＧＯＲ応答の理想的な陰性対照は、ＯＧＯＲ受容体の場合と同じ距離離れてＢＲＥＴ２構成成分を置くが、その受容体はジアセチル自体に応答しない。ＯＤＲ−１０の３番目の膜貫通残基にある１１０位でヒスチジンをチロシンに交換すると、ジアセチルに対する走化性応答を強く欠損する（Ｔｒｏｅｍｅｌら、１９９５；Ｓｅｎｇｕｐｔａら、１９９６）。
【０２４９】
ＯＧＯＲ構築物にヒスチジン１１０からチロシンへの（Ｈ１１０Ｙ）突然変異を導入すると、μＭ濃度のジアセチルに対する応答が、ＯＧＯＲについて３２．４％から４．１％に低減した（図５）。ジアセチルに対する応答のこの低下は、溶媒（水）の応答とは有意差がなく（Ｐ＜０．０５）、この突然変異から機能喪失が生じたことが示唆された。このことから、ジアセチルに対するＯＧＯＲの応答が、ＯＤＲ−１０受容体とジアセチルの相互作用に起因し、ＢＲＥＴ２構成成分自体との非特異的な相互作用に起因しないことが推測される。
【０２５０】
[実施例２]
二重標識ＦＲＥＴ  ＯＤＲ−１０（ＯＣＯＹ）と二重標識ＢＲＥＴ２  ＯＤＲ−１０（ＯＧＯＲ）の比較
ＧＰＣＲ活性化のモニタリングについてＢＲＥＴ２系とＦＲＥＴ系の感度を比較するため、ＯＤＲ−１０受容体にタグを付けるのに使用したＢＲＥＴ２構成成分をＦＲＥＴ構成成分と交換し、その結果３番目の細胞内ループにＣＦＰが、Ｃ末端にＹＦＰが挿入された（ＯＣＯＹ）。ＣＦＰ（ｍＣＦＰ）（配列番号４５）およびＹＦＰ（ｍシトリン）（配列番号４６）誘導体はどちらも単量体であり、酵母発現についてコドンを最適化した（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ）（それぞれ配列番号４７および４８）。
【０２５１】
材料および方法
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ制限部位に挟まれたＯＣＯＹ配列を合成した。そのＯＣＯＹ配列を、ｐＥＮＴＲ１１ベクターのＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入した。次いで、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を使用してこれらをｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えて、その後Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させた。ＯＣＯＹコード配列は配列番号４９として示されるが、そのアミノ酸配列は配列番号５０として示される。
【０２５２】
ＯＣＯＹ発現
ＯＧＯＲ発現と同じ発現プロトコールを、ＩｎＶＳＣ１におけるＯＣＯＹの発現に使用した。
【０２５３】
濃度の標準化
二重タグ付き受容体試料の相対的濃度を評価するために、スペクトルスキャンから試料の蛍光強度を決定し、ＯＣＯＹの蛍光強度によって試料の量を標準化した。ＹＦＰの強度（５３０ｎｍ）は、ＯＣＯＹについて７２１．３２ａ．ｕ．に標準化された。５０μＬのＯＣＯＹをピペットで適当なウェルに入れ、１×ＰＢＳで体積を１００μＬにした。
【０２５４】
結果
リガンド応答
μＭ濃度のジアセチルに応答して、ＯＣＯＹのＦＲＥＴ比率（５２０ｎｍでの強度／４８０ｎｍでの強度）は、ＯＧＯＲでの３２．４％の低減と比較して、７．６％低減した（図６）。ＯＣＯＹの応答は、溶媒（水）の応答に対して有意差がある（Ｐ＜０．０５）ことが示された。ＯＧＯＲは、ジアセチル結合のモニタリングについて、ＯＣＯＹより４倍を超えて感度が高いことが示された。
【０２５５】
ＢＲＥＴ２系の、最大のＲＥＴ効率の５０％に対応するＲＥＴプローブ分離であるＦｏｒｓｔｅｒ距離（Ｒ０）が７．５ｎｍであると最近決定され、遺伝的にコードされた任意のＲＥＴ対について最大のＲ０値が決定された（Ｄａｃｒｅｓら、２００９）。ＦＲＥＴ系のＲ０値は４．８ｎｍであると以前に決定され（Ｅｖｅｒｓら、２００６）、ＢＲＥＴ２系が、ＦＲＥＴ系（２．４〜７．２ｎｍ）より大きな距離範囲（３．８〜１１．３ｎｍ）でプローブを置くことができることが示唆される。ＯＧＯＲで測定された移動効率は、ジアセチル（１μＭ）の添加時６４．３％から４７％に変化し、６．８ｎｍから７．６ｎｍへの距離の変化が示唆される。ＦＲＥＴ系など、Ｆｏｒｓｔｅｒ距離が４．８ｎｍの系は、ジアセチルの添加時にこの距離の変化で１１．３％から６．０％への移動効率の変化しか示さない。このことから、ＢＲＥＴ２系が、検出感度の点から、この距離範囲におけるこの距離の変化の測定により適していることが確認される。
【０２５６】
ＯＣＯＹ用量反応曲線
ジアセチルに対するＯＣＯＹの応答が溶媒（水）の応答に対して有意差があったことを確認した後、用量反応をプロットした。このデータを得るために、様々な濃度のジアセチルを添加してスペクトルスキャンを記録した（図７）。ジアセチルの濃度が１×１０−２１Ｍから１×１０−１０Ｍに増大すると、ＹＦＰの放出強度は低下し、ＣＦＰの放出強度は付随して増大した（図７）。ＯＣＯＹの応答を、標準化されたＯＧＯＲの反応曲線に対してスケーリングすると（図８）、ＢＲＥＴ２検出が、ＯＤＲ−１０によるジアセチル結合のモニタリングについてＦＲＥＴ検出より感度が高いことが確認された。ＦＲＥＴ検出系で計算されたＥＣ５０対数値は−１６．４３±０．９７４１Ｍ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）であったが、これは、ＢＲＥＴ２系で計算されたＥＣ５０対数値−１４．４３±０．５４６８（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）に対して有意差がない（Ｐ＜０．０５）。このことから、ジアセチルに対するＯＤＲ−１０の親和性がどちらの検出系でも統計的に類似していることが実証され、ジアセチルがＯＤＲ−１０受容体と特異的に相互作用し、ＲＥＴ構成成分自体とは相互作用しないことが推測される。
【０２５７】
[実施例３]
二重タグ付きＳｔｒ１１２（ＴＧＴＲ）
材料および方法
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挟まれたＴＧＴＲ配列を合成した。そのＴＧＴＲ配列を、ｐＥＮＴＲ１１ベクターのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位に挿入した。次いで、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を使用してこれらをｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えて、その後Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させた。
【０２５８】
ＴＧＴＲ発現
ＯＧＯＲ発現と同じ発現プロトコールを、ＩｎＶＳＣ１におけるＴＧＴＲの発現に使用した。ＴＧＴＲコード配列は配列番号５１として示されるが、そのアミノ酸配列は配列番号５２として示される。
【０２５９】
ＲＥＴ分析プロトコール
ＯＧＯＲ選択性研究で記載したのと同じＲＥＴ分析プロトコール。１０ｎＭのＴＧＴＲで、１μＭのリガンドのピルビン酸、クエン酸、酢酸エチル、アセトインおよびジアセチルをアッセイした。
【０２６０】
細菌抽出物アッセイの調製
ＬＢ中で一晩、３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら細菌株ＯＰ５０を増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＯＰ５０は、実験室において線虫成長用食物源として通常使用される（Ｂｒｅｎｎｅｒ、１９７４）。ＯＰ５０細菌培養物を使用して２つのアッセイを行った。第１のアッセイでは、１０μＬの細菌培養物または１０μＬのＬＢを１０ｎＭのＴＧＴＲに添加した。第２のアッセイは、１ｍＬの細菌培養物を微量遠心管に入れ、１００００×ｇで１分間遠心分離することを必要とした。新鮮な微量遠心管にデカントで入れた後の１０μＬの上清、または１０μＬのＬＢを１０ｎＭのＴＧＴＲに添加した。細菌試料を添加した後、ＯＧＯＲのＲＥＴ分析と同じプロトコールに従った。
【０２６１】
結果
ＯＰ５０細菌上清またはＬＢ中の細菌培養物１０μＬの添加に対するＴＧＴＲの応答は、ＬＢ単独に対して有意差があった（Ｐ≦０．０５）（図９）。増殖の間にＯＰ５０から放出された複雑な匂い物質混合物に対してＳｔｒ１１２受容体を刺激すると、ＢＲＥＴ２比率が増大し、このことから、ＢＲＥＴ２構成成分が匂い物質の結合時に互いに近づくことが示唆される。
【０２６２】
いくつかのリガンドを個々に試験し（図１０）、ピルビン酸とアセトインでどちらも水に対するＴＧＴＲの応答と比較して有意に高いＢＲＥＴ２シグナルが生じた（Ｐ≦０．０５）。このことから、リガンド結合時にＢＲＥＴ２構成成分が互いに近づくことが確認される。アセトインに応答したＢＲＥＴ２シグナルの２０．８％の増大は、ノルエピネフリンに対するＦＲＥＴタグ付きα２Ａアドレナリン作動性受容体の応答（Ｌｏｈｓｅら、２００３）より４倍大きい。これは、Ｓｔｒ１１２線虫受容体による匂い物質結合の最初の実証であり、ＢＲＥＴ２タグ付きＳｔｒ１１２による匂い物質結合をモニタリングした最初の例でもある。
【０２６３】
[実施例４]
受容体キメラ
ＢＲＥＴタグの付いたＯＤＲ−１０のＮ末端（ａａ１〜３２）およびＩＣ３からＣ末端（ａａ２２５〜ａａ３３９）がマルチクローニング部位を挟むように、ＯＤＲ−１０伝達カセットを工学的に作製する（図１１）。キメラ受容体を酵母で発現させる。ＯＲのリガンド結合領域をシャッフルして「インフレーム」でこのカセットに入れ、これらのキメラ受容体を使用して、ＢＲＥＴによるリガンド結合を評価することができる。
【０２６４】
[実施例５]
嗅受容体のオリゴマー形成
Ｃ末端においてＲｌｕｃで標識されたＯｄｒ１０（配列番号１７）およびＣ末端においてＧＦＰ２で標識されたＯｄｒ１０（配列番号１９）を酵母で同時発現させて、受容体のオリゴマー形成およびＢＲＥＴの変動を示した。
【０２６５】
材料および方法
形質転換体の培養およびタグ付き遺伝子の誘導条件
形質転換された酵母細胞のコロニーを、適当な栄養素（ウラシル（Ｕ）、トリプトファン（Ｔ）など）を欠く酵母合成離脱培地（ＳＣＭＭ、Ｓｉｇｍａ）中で増殖させて、２％グルコースを用いて一晩、２８℃、１９０ｒｐｍで振盪しながらプラスミド含有細胞について選択した；ＳＣＭＭ−Ｕ−Ｔは、Ｉｎｖｓｃ１に対してｐＹｅｓＤｅｓｔ５２−Ｏｄｒ１０−ＲｌｕｃおよびｐＤｅｓｔｐＥＳＣ−Ｏｄｒ１０−ＧＦＰ２を同時発現させ（Ｉｎｖｓｃ１／ＯＲ／ＯＧ）、ＳＣＭＭ−Ｕは、Ｉｎｖｓｃ１に対してそれぞれ単独のｐＶＶ２１４−ｏｄｒ１０−Ｒｌｕｃ（Ｉｎｖｓｃ１／ＯＲ）および単独のｐＹｅｓＤｅｓｔ５２  ｏｄｒ１０−ＧＦＰ２（Ｉｎｖｓｃ１／ＯＧ）を発現させる。
【０２６６】
一晩培養後、ＯＤ６００を決定し、細胞を誘導培地（培養培地のようなグルコースの代わりに２％ガラクトースおよび１％ラフィノースを有する）中で懸濁して０．４の最終的なＯＤ６００を得た。この誘導培地を１５℃で振盪しながら２４時間インキュベートして融合受容体発現を誘導した。次いで培養物をペレットにし、冷やしたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でそれを２回洗浄した。細胞ペレットは−８０℃で貯蔵することができ、ＢＲＥＴ２アッセイの直前にＰＢＳ緩衝液中で懸濁した。
【０２６７】
ＢＲＥＴ２アッセイ用酵母細胞の定量
最初に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２分光蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、白色９６ウェルマイクロプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中で直接Ｅｘ４２０ｎｍでＧＦＰ２を励起することによるＧＦＰ強度（１ウェル当たり１００μｌ中約３０００ＲＬＵまたはｃ．ｐ．ｓ）によってＩｎｖｓｃ１／ＯＲ／ＯＧを定量した。ルシフェリン天然セレンテラジン（終濃度５μＭ）を９６ウェル白色マイクロプレート中の総体積１００μｌの細胞に添加し、直ちに発光シグナルを測定する（Ｐｏｌａｒｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ）ことによって、定量したＩｎｖｓｃ１／ＯＲ／ＯＧ細胞のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性を決定した。
【０２６８】
Ｉｎｖｓｃ１／ＯＲ／ＯＧと類似したＧＦＰ強度を有するように、Ｉｎｖｓｃ１／ＯＧを標準化した。Ｉｎｖｓｃ１／ＯＲ／ＯＧと類似したＲｌｕｃ活性を有するように、Ｉｎｖｓｃ１／ＯＲを標準化した。Ｉｎｖｓｃ１／ＯＲ／ＯＧと同じ細胞密度を有するように、陰性対照（宿主株）Ｉｎｖｓｃ１を定量した。
【０２６９】
マイクロプレートＢＲＥＴ２細胞ベースアッセイ
ＩｓｓａｄおよびＪｏｃｋｅｒｓ（２００６）からアッセイ手順を改変し、９６ウェル白色マイクロプレート中で、総体積１００μｌで、各試料について２回反復してそれを行った。３つの生物学的に独立したアッセイを行い、データをプールする。終濃度１０μＭでセレンテラジンｈ  ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ基質（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ）を添加し、二重波長発光／蛍光測定マイクロプレート読取り器（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）を用いて読み取りを行った。以下の最適化されたフィルター設定を使用して、Ｒｌｕｃの光放出（４１０±８０ｎｍ）およびＧＦＰ２の光放出（５１５±３０ｎｍ）を測定した。同時発現したＲｌｕｃおよびＧＦＰ２融合タンパク質の５１５ｎｍ／４１０ｎｍでの放出、ならびにＲｌｕｃ融合タンパク質単独の５１５ｎｍ／４１０ｎｍでの放出の差として、ＢＲＥＴ比率を定義した。結果をミリＢＲＥＴ単位で表し、１ミリＢＲＥＴは１０００を乗じたＢＲＥＴ比率の値に対応する（Ａｙｏｕｂ、２００２）。同じ設定での、ＲｌｕｃまたはＧＦＰ２融合物を発現しない対照細胞（宿主株Ｉｎｖｓｃ１）の照明の結果、細胞の自己蛍光が検出される。ＢＲＥＴ比率の値を計算する前に、試験した全ての試料から自己蛍光を減算した。
【０２７０】
粗製膜調製、可溶化、および免疫沈降
適切に誘導された（ＧＦＰ２レベルが宿主株Ｉｎｖｓｃ１細胞のバックグラウンドに対して２倍以下であった）酵母細胞を、氷冷した緩衝液Ａ（７５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で３回洗浄し、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋プロテアーゼ阻害剤カクテル、コンプリートＭｉｎｉ  ＥＤＴＡ−フリー（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））中で最終的なペレットを懸濁した。次いでフレンチプレスを使用して酵母細胞を破壊し、それを１０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。１３００００×ｇで上清を１時間超遠心分離し、冷やした緩衝液Ｂ中でペレットを懸濁した。
【０２７１】
Ａｙｏｕｂら（２００２）に記載の方法に従って、膜タンパク質の可溶化および免疫沈降の手順を改変した。粗製膜を０．５％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）で可溶化し、４℃でこの混合物を３時間撹拌した。１８，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離することにより、可溶化されていない膜タンパク質を除去した。冷やした緩衝液Ｂを使用してジギトニン濃度を０．２％に調整し、ポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１２０−２９０００）を添加して最終希釈率を１：１０００にした。穏やかにかき混ぜながら、免疫複合体形成を４℃で１２時間進行させ、プロテインＡ−アガロース懸濁物（Ｓｉｇｍａ）を添加して最終体積を１：１０（アガロース懸濁物：試料）にし、穏やかにかき混ぜながら４℃でさらに６時間インキュベートした。５０００×ｇで１分間遠心分離した後、上清をデカントし、冷やした緩衝液Ｃ（緩衝液Ｂ＋０．２％ジギトニン）０．５ｍｌでアガロースビーズを５回洗浄した。基質としてセレンテラジンを使用して（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、発光測定器（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）でルシフェラーゼ活性を評価することにより、沈降物を分析した。
【０２７２】
結果
酵母細胞における線虫ｏｄｒ−１０の視覚化  −  共焦点顕微鏡法
２４時間の誘導後にｏｄｒ−１０−Ｒｌｕｃおよびｏｄｒ−１０−ＧＦＰ２を同時発現した酵母株Ｉｎｖｓｃ１の共焦点画像から、ＧＦＰ２融合タンパク質がほとんど細胞の膜上でのみ発現したことが明らかとなり、タグ付きｏｄｒ−１０の過剰発現は観察されなかった。細胞の約３２％がタグ付きｏｄｒ−１０タンパク質を発現した。誘導時間を４８時間まで延長すると、共焦点画像は、細胞中でのＧＦＰ２の過剰発現を示し、凝集したＧＦＰ２粒子が細胞の細胞質ゾル中で観察された（図１２）。
【０２７３】
ＢＲＥＴ２による生存酵母細胞における構成的ｏｄｒ−１０オリゴマーの検出
ＢＲＥＴ２実験の結果から、ｏｄｒ−１０−Ｒｌｕｃおよびｏｄｒ−１０−ＧＦＰ２を同時発現する酵母細胞で著しいエネルギー移動が観察されたことが示され（図１３）、ｏｄｒ−１０がホモオリゴマーを形成することが示唆される。半分の酵母細胞がｏｄｒ−１０−Ｒｌｕｃを発現した試料およびあと半分の酵母細胞がｏｄｒ−１０−ＧＦＰ２を発現した試料では、著しいエネルギー移動は得られなかった。
【０２７４】
免疫沈降による生存酵母細胞における構成的Ｏｄｒ−１０オリゴマーの検出
受容体−Ｒｌｕｃおよび−ＧＦＰ２融合物の対の発現、その後の抗緑色蛍光タンパク質抗体を使用した沈降、および免疫共沈降したルシフェラーゼ活性の測定によって、生存酵母細胞におけるＯｄｒ−１０のオリゴマー形成が確認された。図１４で示された結果から、Ｏｄｒ−１０が細胞中でオリゴマーを形成することが示唆される。免疫共沈降が受容体に非依存的な、ＧＦＰ２とＲｌｕｃとの相互作用から生じ得る可能性を除外するために、（１）ｏｄｒ−１０−Ｒｌｕｃ／ＧＦＰ２、（２）受容体−ＧＦＰ２または受容体−Ｒｌｕｃのどちらかを発現した可溶化膜の混合物を使用した免疫共沈降も実施した。同じ細胞中でのｏｄｒ−１０−ＧＦＰ２およびｏｄｒ−１０−Ｒｌｕｃの同時発現と比較してルシフェラーゼ活性の２０％未満が回復したこれらの試料の結果から、同時発現するｏｄｒ−１０−ＧＦＰ２およびｏｄｒ−１０−Ｒｌｕｃの融合タンパク質間の相互作用が特異的であったことが示唆される。
【０２７５】
[実施例６]
ＢＲＥＴ２タグ付きマウスα２Ａアドレナリン作動性受容体
そのＮ末端がＡｌａ２５０の後にあり、そのＣ末端がＡｒｇ３７２の隣にある３番目の細胞内ループ中にＧＦＰ２が挿入されるように、マウスα２Ａアドレナリン作動性受容体（配列番号５６）を工学的に作製した。受容体のＣ末端中のＶａｌ４６１にＲｌｕｃを融合させた（アミノ酸配列は配列番号５４として、コードするオープンリーディングフレームは配列番号５３として示される）。
【０２７６】
二重タグ付きアドレナリン作動性受容体を酵母で発現させる。これらの受容体を使用して、ＢＲＥＴ２比率の変化を介してマウスα２Ａアドレナリン作動性受容体によるリガンド結合をモニタリングすることができる。
【０２７７】
[実施例７]
全細胞対無細胞ＢＲＥＴアッセイ
本発明の無細胞アッセイ系を全細胞アッセイ系と比較すると、ＲＬｕｃチャネルで測定したときの光放出量の点から、全細胞アッセイと比較して無細胞アッセイで、ＢＲＥＴ２シグナルの強度が４０倍を超えて大きかったことが実証される（図１５）。１μＭのジアセチルのアッセイの結果、全細胞アッセイを使用するとＢＲＥＴ２シグナルの有意な変化はなかったが（Ｐ≦０．０５）、無細胞アッセイ系を使用すると５２％の有意な低下（Ｐ≦０．０５）が観察された（図１６）。
【０２７８】
広く記載されている本発明の趣旨または範囲を逸脱せずに、具体的な実施形態に示されている本発明に多数の変更および／または改変をなし得ることが当業者に理解されるであろう。したがって、本実施形態は、全ての点において例示的であり制限的ではないとみなされるべきである。
【０２７９】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１月２９日に出願されたＵＳ６１／１４８，２７１の優先権を主張するものである。
【０２８０】
本明細書で論じ、かつ／または言及した全ての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８１】
本明細書に含まれている、文書、行為、材料、デバイス、物品などのどんな論述も、本発明の場面を提供する目的のものに過ぎない。それは、これらの事項のいずれかまたは全てが従来技術の基礎の一部を形成し、または本出願の各請求項の優先日前から存在する、本発明に関連する分野における共通の一般知識であったことを承認するものとみなすべきでない。
【０２８２】
（参考文献）
0005684145.tif 000008
0005684145.tif 000009
0005684145.tif 000010
【配列表フリーテキスト】
【０２８３】
配列番号１−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体。
配列番号２−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１２受容体。
配列番号３−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１３受容体。
配列番号４−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１４受容体。
配列番号５−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１５受容体。
配列番号６−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１６受容体。
配列番号７−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体をコードするＯＲＦ。
配列番号８−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１２受容体をコードするＯＲＦ。
配列番号９−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１３受容体をコードするＯＲＦ。
配列番号１０−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１４受容体をコードするＯＲＦ。
配列番号１１−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１５受容体をコードするＯＲＦ。
配列番号１２−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｔｒ１１６受容体をコードするＯＲＦ。
配列番号１３−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体、３番目の細胞内ループ（５番目の非膜貫通ループ）中に挿入されたＲＬｕｃおよびＣ末端に挿入されたＧＦＰを含む本発明のポリペプチド。
配列番号１４−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体、３番目の細胞内ループ（５番目の非膜貫通ループ）中に挿入されたＲＬｕｃおよびＣ末端に挿入されたＧＦＰを含む本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１５−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体、３番目の細胞内ループ（５番目の非膜貫通ループ）中に挿入されたＧＦＰおよびＣ末端に挿入されたＲＬｕｃを含む本発明のポリペプチド。
配列番号１６−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体、３番目の細胞内ループ（５番目の非膜貫通ループ）中に挿入されたＧＦＰおよびＣ末端に挿入されたＲＬｕｃを含む本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１７−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体およびＣ末端に挿入されたＲＬｕｃを含む本発明のポリペプチド。
配列番号１８−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体、Ｃ末端に挿入されたＲＬｕｃを含む本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１９−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体およびＣ末端に挿入されたＧＦＰ２を含む本発明のポリペプチド。
配列番号２０−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｏｄｒ１０受容体、Ｃ末端に挿入されたＧＦＰ２を含む本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２１〜４４−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号４５−ｍシトリン誘導体。
配列番号４６−ｍＣＦＰ誘導体。
配列番号４７−ｍシトリン誘導体をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４８−ｍＣＦＰ誘導体をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４９−Ｏｄｒ１０ＦＲＥＴ二重標識融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号５０−Ｏｄｒ１０ＦＲＥＴ二重標識融合タンパク質。
配列番号５１−Ｓｔｒ１１２ＢＲＥＴ二重標識融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号５２−Ｓｔｒ１１２ＢＲＥＴ二重標識融合タンパク質。
配列番号５３−マウスα２Ａアドレナリン作動性受容体ＢＲＥＴ二重標識融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号５４−マウスα２Ａアドレナリン作動性受容体ＢＲＥＴ二重標識融合タンパク質。
配列番号５５−マウスα２Ａアドレナリン作動性受容体をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号５６−マウスα２Ａアドレナリン作動性受容体。
【図１】
0005684145.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005684145.tif 000026
【配列表】
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