(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のｉ〜ｖのいずれかを有することを特徴とする完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体：
ｉ）配列番号１９に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４２に示される軽鎖可変領域、
ｉｉ）配列番号２０に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４３に示される軽鎖可変領域、
ｉｉｉ）配列番号２１に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４４に示される軽鎖可変領域、
ｉｖ）配列番号２２に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４５に示される軽鎖可変領域、
ｖ）配列番号２３に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４６に示される軽鎖可変領域。
【請求項２】
請求項１に記載の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体において、
前記ｉを有する場合、配列番号４７に示される重鎖ポリペプチド、及び、配列番号４８に示される軽鎖ポリペプチドを有することを特徴とする完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体において、
当該完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体が、組換え抗体であることを特徴とする完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体。
【請求項４】
完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体のものであり、以下のｉ〜ｖのいずれかを有することを特徴とするＶＡＰ−１結合断片：
ｉ）配列番号１９に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４２に示される軽鎖可変領域、
ｉｉ）配列番号２０に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４３に示される軽鎖可変領域、
ｉｉｉ）配列番号２１に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４４に示される軽鎖可変領域、
ｉｖ）配列番号２２に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４５に示される軽鎖可変
領域、
ｖ）配列番号２３に示される重鎖可変領域、及び、配列番号４６に示される軽鎖可変領域。
【請求項５】
請求項４に記載のＶＡＰ−１結合断片において、
前記ｉを有する場合、配列番号４７に示される重鎖ポリペプチド、及び、配列番号４８に示される軽鎖ポリペプチドを有することを特徴とするＶＡＰ−１結合断片。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載のＶＡＰ−１結合断片において、
当該ＶＡＰ−１結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖであることを特徴とするＶＡＰ−１結合断片。
【請求項７】
請求項４から請求項６のいずれか１つに記載のＶＡＰ−１結合断片において、
当該ＶＡＰ−１結合断片は、組換え抗体の断片であることを特徴とするＶＡＰ−１結合断片。
【請求項８】
単離された核酸分子であって、
請求項１から請求項３のいずれか１つに記載の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体、及び、当該完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体のＶＡＰ−１結合断片のいずれかをコードし、以下のＡ〜Ｅのいずれかを含むことを特徴とする核酸分子：
Ａ）配列番号６４に示される核酸配列及び配列番号８４に示される核酸配列、又は、それらの保存的配列変異体、
Ｂ）配列番号６５に示される核酸配列及び配列番号８５に示される核酸配列、又は、それらの保存的配列変異体、
Ｃ）配列番号６６に示される核酸配列及び配列番号８６に示される核酸配列、又は、それらの保存的配列変異体、
Ｄ）配列番号６７に示される核酸配列及び配列番号８７に示される核酸配列、又は、それらの保存的配列変異体、
Ｅ）配列番号６８に示される核酸配列及び配列番号８８に示される核酸配列、又は、それらの保存的配列変異体。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子において、
前記Ａを有する場合、配列番号８９に示されるヌクレオチド配列及び配列番号９０に示されるヌクレオチド配列、又は、それらの保存的配列変異体を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項１０】
請求項８又は請求項９に記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１から請求項３のいずれか１つに記載の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の薬学的組成物において、
ＶＡＰ−１媒介性炎症性疾患の処置又は診断のためのものであることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の薬学的組成物において、
前記ＶＡＰ−１媒介性炎症性疾患が、関節炎及び結合組織疾患、炎症性腸疾患、皮膚病、多発性硬化症、炎症性ニューロパシー、炎症性筋疾患、急性散在性脳脊髄炎、中枢神経系の血管炎、シェーグレン症候群、糖尿病、全身性エリテマトーデス、喘息、炎症性肝疾患、グレーヴス病、並びに、甲状腺炎からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の薬学的組成物において、
前記関節炎及び前記結合組織疾患が、反応性関節障害、感染後関節障害、炎症性多発性関節障害、全身性結合組織病、炎症性脊椎障害、筋炎、滑膜炎、ライター病、血清反応陽性関節リウマチ、関節リウマチ、関節外リウマチ、乾癬性及び腸疾患性関節障害、若年性関節炎、不特定関節炎、結節性多発動脈炎及び関連する症状、壊死性脈管障害、多発性筋炎、全身性硬化症、結合組織の全身性病変、強直性脊椎炎、並びに、炎症性脊椎障害からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の薬学的組成物において、
前記炎症性腸疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１４に記載の薬学的組成物において、
前記皮膚病が、水疱性疾患、皮膚炎、丘疹鱗屑性障害、紅斑、硬化性萎縮性苔癬、外陰部萎縮性苔癬、円板状エリテマトーデス、モルフェア、天疱瘡、類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、不特定接触皮膚炎、乾癬、多形性紅斑からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１３に記載の薬学的組成物において、
前記ＶＡＰ−１媒介性炎症性疾患が、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎を含む眼の炎症、アルコール性肝炎、同種移植、異種移植、糸球体腎炎、心筋梗塞及び脳卒中後の再灌流傷害及び急性の炎症症状からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項４から請求項７のいずれか１つに記載のＶＡＰ−１結合断片を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の薬学的組成物において、
ＶＡＰ−１媒介性炎症性疾患の処置又は診断のためのものであることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の薬学的組成物において、
前記ＶＡＰ−１媒介性炎症性疾患が、関節炎及び結合組織疾患、炎症性腸疾患、皮膚病、多発性硬化症、炎症性ニューロパシー、炎症性筋疾患、急性散在性脳脊髄炎、中枢神経系の血管炎、シェーグレン症候群、糖尿病、全身性エリテマトーデス、喘息、炎症性肝疾患、グレーヴス病、並びに、甲状腺炎からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の薬学的組成物において、
前記関節炎及び前記結合組織疾患が、反応性関節障害、感染後関節障害、炎症性多発性関節障害、全身性結合組織病、炎症性脊椎障害、筋炎、滑膜炎、ライター病、血清反応陽性関節リウマチ、関節リウマチ、関節外リウマチ、乾癬性及び腸疾患性関節障害、若年性関節炎、不特定関節炎、結節性多発動脈炎及び関連する症状、壊死性脈管障害、多発性筋炎、全身性硬化症、結合組織の全身性病変、強直性脊椎炎、並びに、炎症性脊椎障害からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の薬学的組成物において、
前記炎症性腸疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項２１に記載の薬学的組成物において、
前記皮膚病が、水疱性疾患、皮膚炎、丘疹鱗屑性障害、紅斑、硬化性萎縮性苔癬、外陰部萎縮性苔癬、円板状エリテマトーデス、モルフェア、天疱瘡、類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、不特定接触皮膚炎、乾癬、多形性紅斑からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項２０に記載の薬学的組成物において、
前記ＶＡＰ−１媒介性炎症性疾患が、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎を含む眼の炎症、アルコール性肝炎、同種移植、異種移植、糸球体腎炎、心筋梗塞及び脳卒中後の再灌流傷害及び急性の炎症症状からなる群より選択されることを特徴とする薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト内皮細胞接合タンパク質ＶＡＰ−１を認識する完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体、ＶＡＰ−１結合断片、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び、薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中で使用される刊行物及び他の材料は、本発明の背景、特に、実施に関するさらなる詳細を提供する実施例を明らかにするために、引用により組み入れられる。
一般的に、全ての抗体は、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖とにより構成される共通のＹ型構造を共有している。これらの４つのポリペプチドサブユニットは、２つの重鎖が連結され、軽鎖はジスルフィド結合によって各重鎖に結び付くように構築される。抗体を構成している各ポリペプチドは、可変領域及び定常領域により構成される。
【０００３】
可変領域は、Ｙ型抗体の腕に相当する部位に位置し、当該抗体の抗原結合特異性を決定する。この領域には、その抗原に対する抗体の結合に関与する短いアミノ酸配列が含まれる。これらの領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）と呼ばれる。可変領域の残りの部分は、全体としての抗原結合ポケットの立体構造に重要である。
抗体の定常領域は、重鎖の底部に位置し、特異的受容体との相互作用により免疫反応を活性化させる抗体の能力を決定する。これらの領域は一般的にはよく保存されており、その可変性は、５種類の基本的なイソフォームであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに限られる。
【０００４】
血管接合タンパク質−１（ＶＡＰ−１）は、血管内皮細胞上で発現される旧知ではない炎症誘導性の接合分子であり、当該血管接合タンパク質−１は、血管内皮細胞上で生理学的剪断（physiological shear）下での白血球の回転を媒介する。この役割において、それは、免疫監視機構の正常なプロセスの一部として、２次リンパ組織の高内皮細静脈（ＨＥＶ）を介したリンパ球の再循環に寄与する。
しかしながら、炎症条件下では、ＶＡＰ−１は、炎症組織への白血球の浸潤を促進し、それにより炎症応答に寄与し、それを維持する。この浸潤自体が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬及び多くの自己免疫疾患のような慢性の炎症性疾患、並びに、他の炎症性疾患に悪影響を及ぼす可能性がある。他の状況では、心筋梗塞、脳卒中及び他の疾患によって生じる重度の組織損傷後の組織への大量の炎症誘発性細胞の浸潤が、これらの急性の炎症応答において見られる組織の破壊に寄与する。ブロッキング抗体を用いてＶＡＰ−１機能を妨げることによって炎症部位への細胞の浸潤を減少させることにより、炎症を消散し、これらの疾患の臨床症状を改善へと導く可能性がある。
【０００５】
米国特許第５５８０７８０号（特許文献１）には、ＶＡＰ−１を認識し、凍結切片アッセイにおいて扁桃腺のＨＥＶに対するリンパ球の結合をブロックできるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１Ｂ２が記載されている。ＭＡｂ  １Ｂ２はマウスＩｇＭ抗体であり、これはＶＡＰ−１に特異的である。
【０００６】
治療法としてマウスｍＡｂを使用することは、ヒトの免疫系がマウス抗体を異物として認識し、それらを体から排除するためにヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を産生するので、可能性は限られている。この免疫反応は、繰り返し投与する必要がある場合の長期治療におけるマウス抗体の使用に対する主要な制約である。病院でのマウス抗ＶＡＰ−１抗体の使用は、免疫抑制剤で処置され、それによりＨＡＭＡ反応の傾向が低い患者、及び、急性心筋梗塞又は急性呼吸促迫症候群における虚血再灌流障害のような抗体の１回だけの投与が適している処置レジュメに限定されなければならない。
治療にマウスＩｇＭ抗ＶＡＰ−１抗体を使用することに関連する１つのさらなる欠点は、そのような抗体の好ましくないキネティクプロフィール（すなわち、短い半減期）であり、これにより、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬及び多くの他の疾患のような慢性病に対する使用は適さない。
【０００７】
免疫原性が低いモノクローナル抗体を作製するいくつかの方法が当該分野で公知である。好ましいアプローチには抗体の「ヒト化」が含まれる。頻繁に使用される方法は、キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ又は完全ヒトｍＡｂを作製することである。キメラｍＡｂは、可変領域はマウスに由来するが、定常領域はヒト起源のものである抗体である。キメラ抗体において、通常、齧歯類抗体分子のおよそ７０％は、特定の特異性と親和性を有している齧歯類の抗原結合部位を維持しつつ、対応するヒト配列と置き換えられる。ヒト化抗体は、可変領域はマウスに由来し得るが、ヒト抗体により類似するように変異させられており、ヒト起源の定常領域を含み得る抗体である。完全ヒト抗体は可変領域及び定常領域がそれぞれヒト起源のものである抗体である。
【０００８】
国際特許公開ＷＯ０３／０９３３１９号（特許文献２）には、対応するマウス抗体と比較して低い免疫原性を有する可能性があるキメラ抗ＶＡＰ−１モノクローナル抗体ＢＴＴ−１００２が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５５８０７８０号
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ０３／０９３３１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ＢＴＴ−１００２は、キメラ抗体ではあるものの、オリジナルのマウス抗体に直接由来し、そして、当該オリジナルのマウス抗体から修飾されていない抗体の可変領域に対応するタンパク質配列を、なおも有する。この抗体は、ヒトに投与された場合には、なおも異物として認識され、免疫原性である可能性がある。また、この抗体の排出半減期や機能的特性のような薬理学的特性は、その免疫原性や、結果としてそれに対する抗体の産生により低下するかもしれない。
このように、低い免疫原性と改善された薬理学的特性とを有する完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体が当該分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、新規の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体、ＶＡＰ−１結合断片、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び、薬学的組成物に関する。
本発明の１つの目的は、患者において免疫応答を誘発する可能性が低く、治療の目的に好ましい薬理学的プロフィールを有する、インビボでの診断及び／又は治療に使用される完全ヒトモノクローナル抗体を提供することである。
本発明の別の目的は、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の重鎖及び軽鎖、又は、それらの断片を提供することである。
本発明の更なる目的は、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体をコードする核酸又はその断片、並びに、抗ＶＡＰ−１抗体の組み換え発現のためのこれらの核酸が組み込まれている発現ベクター及び宿主細胞を提供することである。
本発明の関連技術としての産生方法は、組み換え産生法により本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体を産生するための方法に関する。
上記抗体を含む薬学的組成物及びその治療的使用もまた開示される。
以下では、本発明は添付の図面を参照して好ましい実施形態によって更に詳細に記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】抗ＶＡＰ−１抗体８Ｃ１０の可変領域の軽鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図１Ｂ】抗ＶＡＰ−１抗体８Ｃ１０の可変領域の重鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図２Ａ】抗ＶＡＰ−１抗体８Ａ４の可変領域の軽鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図２Ｂ】抗ＶＡＰ−１抗体８Ａ４の可変領域の重鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図３Ａ】抗ＶＡＰ−１抗体３Ｆ１０の可変領域の軽鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図３Ｂ】抗ＶＡＰ−１抗体３Ｆ１０の可変領域の重鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図４Ａ】抗ＶＡＰ−１抗体５Ｆ１２の可変領域の軽鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図４Ｂ】抗ＶＡＰ−１抗体５Ｆ１２の可変領域の重鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図５Ａ】抗ＶＡＰ−１抗体４Ｂ３の可変領域の軽鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図５Ｂ】抗ＶＡＰ−１抗体４Ｂ３の可変領域の重鎖のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示す図。可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡから推測した。アミノ酸鎖における３つのＣＤＲを、下線をつけた対応するヌクレオチド配列とともに太字で示す。
【図６Ａ】コンセンサス配列を示している８Ｃ１０、８Ａ４、３Ｆ１０、５Ｆ１２及び４Ｂ３のＶＨ重鎖の可変領域のタンパク質配列のアラインメントを示す図。
【図６Ｂ】コンセンサス配列を有するＶＨ重鎖ＣＤＲ１のアラインメントを示す図。
【図６Ｃ】コンセンサス配列を有するＶＨ重鎖ＣＤＲ２のアラインメントを示す図。
【図６Ｄ】コンセンサス配列を有するＶＨ重鎖ＣＤＲ３のアラインメントを示す図。
【図６Ｅ】コンセンサス配列を示している８Ｃ１０、８Ａ４、３Ｆ１０、５Ｆ１２、及び４Ｂ３のＶＬ軽鎖の可変領域のタンパク質配列のアラインメントを示す図。
【図６Ｆ】コンセンサス配列を有するＶＬ軽鎖ＣＤＲ１のアラインメントを示す図。
【図６Ｇ】コンセンサス配列を有するＶＬ軽鎖ＣＤＲ２のアラインメントを示す図。
【図６Ｈ】コンセンサス配列を有するＶＬ軽鎖ＣＤＲ３のアラインメントを示す図。
【図７】コントロールの染色された細胞と比較して、ＢＴＴ−１０２３で染色されたＡｘ  ＶＡＰ−１細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別法）分析により示される、細胞表面上にヒトＶＡＰ−１を発現するＡｘ細胞に対する組換え完全ヒト抗体ｒ８Ｃ１０（ＢＴＴ−１０２３）のＶＡＰ−１結合を説明する図。
【図８】インビトロでの白血球の移動に対するＢＴＴ−１０２３の影響を説明する図。当該図には、ＢＴＴ−１０２３又はコントロール抗体で処理された内皮細胞単層から移動した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の数が示されている。なお、エラーバーは平均の標準誤差である。Ｎ＝６。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ヒト血管接合タンパク質−１（ＶＡＰ−１）を特異的に認識する、好ましくは、組み換えによって産生された、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に関する。本発明の完全ヒトモノクローナル抗体は、対応するヒト化抗体と比較して免疫原性が低く、多数の自己免疫疾患、炎症症状、結合組織、皮膚及び消化管、中枢神経系、並びに肺システムの疾患（慢性関節炎、炎症性腸疾患及び慢性皮膚疾患のような症状を含む）の処置に有用である。完全ヒトＶＡＰ−１抗体は更に、炎症部位のインビボ免疫シンチグラフィーイメージングを含む、インビトロ及びインビボでの診断的適用に有用である。
【００１４】
「保存的配列変異体」との語は、本明細書中で使用される場合には、本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の結合特性を有意には変化させないヌクレオチド配列の修飾及びアミノ酸配列の修飾を含むように意図される。保存的ヌクレオチド配列変異体には、遺伝子コードの変性によって、及び、サイレント変異によって生じる変異体が含まれる。ヌクレオチドの置換、欠失及び付加もまた含まれる。保存的アミノ酸配列変異体には、当該分野で周知の類似アミノ酸でのアミノ酸置換によって生じる変異体が含まれる。上記と同様に、アミノ酸の欠失及び付加もまた含まれる。
【００１５】
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドには、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体に対して、又は、以下に記載される上記抗体をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の同一性、又は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の同一性を有するものが含まれる。
本発明により、以下からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲコンセンサス配列を含む完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体重鎖が提供される。
ａ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号１）の配列中、
Ｘ１は、Ｓ、ＮもしくはＲのような、小さい極性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、
Ｘ２は、ＹもしくはＳのような、芳香族アミノ酸又は小さい極性アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ａ、ＧもしくはＷのような、小さい疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり、
Ｘ４は、ＭもしくはＩのような、疎水性アミノ酸であり、
Ｘ５は、ＨもしくはＳのような、小さい極性アミノ酸又は塩基性アミノ酸である；
ｂ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＧＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＳＶＸ１２Ｇ（配列番号２）の配列中、
Ｘ１は、Ｖ、Ａ、もしくはＮのような、小さいアミノ酸であり、
Ｘ２は、ＩもしくはＬのような、小さい脂肪族アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｗ、Ｇ、もしくはＫのような、芳香族アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は、疎水性アミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｑ、Ｖ、もしくはＹのような、芳香族アミノ酸、脂肪族疎水性アミノ酸、又は、極性アミノ酸であり、
Ｘ５は、ＤもしくはＧのような、小さい酸性アミノ酸又は小さいアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｓ、Ｇ、もしくはＩのような、小さいアミノ酸又は脂肪族アミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｎ、Ｅ、もしくはＹのような、極性アミノ酸であるか、又は、アミノ酸は存在せず、
Ｘ８は、Ｅ、Ｋ、もしくはＴのような、極性アミノ酸であり、
Ｘ９は、Ｙ、Ｄ、もしくはＮのような、極性アミノ酸であり、
Ｘ１０は、ＹもしくはＨのような、芳香族アミノ酸であり、
Ｘ１１は、ＶもしくはＡのような、小さい疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１２は、ＫもしくはＲのような、電荷を持つ塩基性アミノ酸である；及び、
ｃ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＤＹ（配列番号３）の配列中、
Ｘ１は、ＤもしくはＥのような、電荷を持つ酸性アミノ酸であり、
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、もしくはＹのような、小さいアミノ酸又は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｗ、Ｆ、Ｇ、もしくはＮのような、芳香族アミノ酸又は小さいアミノ酸であり、
Ｘ４は、ＦもしくはＧのような、芳香族アミノ酸又は小さいアミノ酸であるか、あるいは、アミノ酸は存在せず、
Ｘ５は、ＧもしくはＳのような、小さいアミノ酸であるか、又は、アミノ酸は存在せず、
Ｘ６は、Ｇのような、小さいアミノ酸であるか、又は、アミノ酸は存在せず、
Ｘ７は、Ｔのような、小さい極性アミノ酸であるか、又は、アミノ酸は存在せず、
Ｘ８は、Ｙのような、極性芳香族アミノ酸であるか、又は、アミノ酸は存在せず、
Ｘ９は、ＥもしくはＦのような、電荷を持つ酸性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であるか、あるいはアミノ酸は存在せず、
Ｘ１０は、Ｆ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、もしくはＷのような、芳香族アミノ酸又は小さいアミノ酸であり、
Ｘ１１は、ＹもしくはＧのような、小さいアミノ酸又は極性芳香族アミノ酸であり、
Ｘ１２は、ＦもしくはＩのような、芳香族アミノ酸又は脂肪族疎水性アミノ酸である。
【００１６】
より具体的には、本発明により、配列番号４〜８とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第１のＣＤＲアミノ酸配列、及び／又は、配列番号９〜１３とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第２のＣＤＲアミノ酸配列、及び／又は、配列番号１４〜１８とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第３のＣＤＲアミノ酸配列を含む、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の重鎖が提供される。本発明の特定の抗体の重鎖には、配列番号１９〜２３とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される可変領域が含まれる。
【００１７】
本発明によっては更に、以下からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲコンセンサス配列を含む完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の軽鎖が提供される：
ａ）配列ＲＡＳＱＸ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５ＬＡ（配列番号２４）の配列中、
Ｘ１は、ＧもしくはＳのような、小さいアミノ酸であり、
Ｘ２は、ＩもしくはＶのような、脂肪族アミノ酸であり、
Ｘ３は、ＳもしくはＲのような、小さい極性アミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｓのような、小さい極性アミノ酸であるか、又は、アミノ酸は存在せず、
Ｘ５は、Ａ、Ｆ、Ｗ、もしくはＹのような、小さい疎水性アミノ酸又は芳香族疎水性アミノ酸である；
ｂ）配列Ｘ１ＡＳＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号２５）の配列中、
Ｘ１は、ＤもしくはＧのような、小さい酸性アミノ酸又は小さいアミノ酸であり、
Ｘ２は、ＳもしくはＮのような、小さい極性アミノ酸であり、
Ｘ３は、ＬもしくはＲのような、脂肪族アミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ａ、Ｅ、もしくはＱのような、小さいアミノ酸又は極性アミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｓ、Ｔ、もしくはＲのような、極性アミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸である；及び
ｃ）配列ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｔ（配列番号２６）の配列中、
Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、もしくはＲのような、芳香族アミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｎ、Ｇ、もしくはＳのような、小さいアミノ酸であり、
Ｘ３は、ＳもしくはＮのような、小さい極性アミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、もしくはＳのような、芳香族アミノ酸又は小さい極性アミノ酸であり、
Ｘ５は、ＬもしくはＲのような、脂肪族アミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸である。
【００１８】
更に詳細には、本発明により、配列番号２７〜３１とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第１のＣＤＲアミノ酸配列、及び／又は、配列番号３２〜３６とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第２のＣＤＲアミノ酸配列、及び／又は、配列番号３７〜４１とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第３のＣＤＲアミノ酸配列を含む、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の軽鎖が提供される。本発明の特定の抗体の重鎖には、配列番号４２〜４６とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される可変領域が含まれる。
【００１９】
本発明の更なる態様は、本発明の重鎖及び軽鎖を含む完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体を提供することである。本発明の抗体分子及び鎖には、以下が含まれ得る：完全長の重鎖及び軽鎖を有している完全な天然の抗体分子；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ断片のような前記抗体分子の断片；軽鎖もしくは重鎖の単量体又は二量体；あるいは、単鎖抗体（例えば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている単鎖Ｆｖ）；あるいは、任意の他の組換え体又はＣＤＲ移植分子。
同様に、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、必要に応じて他の抗体ドメインと組み合わせ得る。
【００２０】
ＣＤＲ３ドメインが、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメイン（単数又は複数）から独立して、単独で同種抗原に対する抗体の結合特異性を決定できること、及び、共通するＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有している複数の抗体を作製できると予想され得ることは、当該分野で周知である。
【００２１】
従って、本開示により、ヒト又はヒト以外の動物に由来する抗体由来の１つ以上の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は、軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体が提供され、ここでは、当該モノクローナル抗体は、ＶＡＰ−１に特異的に結合できる。特定の態様においては、本開示により、マウス抗体又はラット抗体のような非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は、軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体が提供され、ここでは、当該モノクローナル抗体は、ＶＡＰ−１に特異的に結合できる。いくつかの実施形態においては、非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は、軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むそのような本発明の抗体は、（ａ）対応する元の非ヒト抗体との結合に競合できる；（ｂ）対応する元の非ヒト抗体の機能的特性を保持している；（ｃ）対応する元（親）の非ヒト抗体と同じエピトープに結合する；及び／又は（ｄ）対応する元の非ヒト抗体と類似する結合親和性を有する。
【００２２】
他の態様においては、本開示により、ヒト抗体（例えば、ヒト以外の動物から得られたヒト抗体）由来の１つ以上の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は、軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体が提供され、ここでは、当該ヒト抗体は、ＶＡＰ−１に特異的に結合することができる。他の態様においては、本開示により、例えば、ヒト以外の動物から得られたヒト抗体のような第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は、軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体が提供され、ここでは、当該第１のヒト抗体は、ＶＡＰ−１に特異的に結合することができ、そして、第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３ドメインは、ＶＡＰ−１に特異的に結合できる第２のヒト抗体を作製するために、ＶＡＰ−１に対する結合特異性を持たないヒト抗体中のＣＤＲ３ドメインに取って代わる。いくつかの実施形態においては、上記第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、及び／又は、軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むそのような本発明の抗体は、（ａ）対応する元の第１のヒト抗体との結合に競合できる；（ｂ）対応する元の第１のヒト抗体の機能的特性を保持している；（ｃ）対応する元の第１のヒト抗体と同じエピトープに結合する；及び／又は、（ｄ）対応する元の第１のヒト抗体と類似する結合親和性を有する。
【００２３】
本開示の抗体は、抗ＶＡＰ−１抗体の様々な物理的特性によって更に特徴付けられる。様々なアッセイが、これらの物理的特性に基づいて抗体の様々なクラスを検出及び／又は区別するために使用され得る。
いくつかの実施形態においては、本開示の抗体には、１つ以上のグリコシル化部位が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のいずれかに含まれ得る。可変領域中の１つ以上のグリコシル化部位の存在は、当該分野で周知であるように、抗原結合の変化のために、抗体の免疫原性の増大、又は、抗体の薬物動態の変化を生じ得る。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで起こることが知られている。可変領域のグリコシル化は、抗体を切断してＦａｂを生じさせるＧｌｙｃｏｂｌｏｔアッセイ、その後の、過ヨウ素酸塩の酸化及びシッフ塩基の形成を測定するアッセイを使用するグリコシル化についての試験を使用して試験され得る。あるいは、可変領域のグリコシル化は、Ｆａｂ由来の糖を単糖へと切断し、個々の糖含有量を分析するＤｉｏｎｅｘ社のライト（Light）クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ）を使用して試験され得る。いくつかの場合には、可変領域のグリコシル化を含まない抗ＶＡＰ−１抗体を有することが好ましい。これは、可変領域中にはグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択すること、又は、当該分野で周知の標準的な技術を使用してグリコシル化モチーフの内部にある残基を変異させることのいずれかにより行われ得る。
【００２４】
好ましい実施形態においては、本開示の抗体には、アスパラギン異性部位は含まれない。脱アミド化又はイソアスパラギン酸効果はそれぞれ、Ｎ−Ｇ配列又はＤ−Ｇ配列上で起こり得る。イソアスパラギン酸の生成は、イソアスパラギン酸を試験するために逆相ＨＰＬＣを使用するｉｓｏ−ｑｕａｎｔアッセイを使用して測定することができる。
個々の抗体は固有の等電点（ｐＩ）を有しているであろうが、通常、多くの抗体はｐＨ６〜９．５までの間の範囲に入るであろう。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、通常はｐＨ７〜９．５の範囲にあり、そしてＩｇＧ４抗体のｐＩは、通常はｐＨ６〜８の範囲にある。この範囲外のｐＩを有している抗体も存在し得る。等電点は、当該分野で周知であるように、ｐＨ勾配を作成し、正確性向上のためにレーザー集束を利用することができるキャピラリー等電点電気泳動アッセイを使用して試験することができる。いくつかの場合には、正常範囲内にあるｐＩ値を含む抗ＶＡＰ−１抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有している抗体を選択すること、又は、当該分野で周知の標準的な技術を使用して電荷を有している表面残基を変異させることのいずれかによって達成できる。
【００２５】
個々の抗体は、熱安定性の指標である融解温度を有するであろう。熱安定性が高ければ高いほど、インビボで、より高い全体的な抗体安定性を示す。抗体の融点は、示差走査熱量測定のような技術を使用して測定することができる。ＴＭ１は、抗体の最初のアンホールディング（変性、unfolding）の温度を示す。ＴＭ２は、抗体の完全なアンホールディングの温度を示す。一般的には、本開示の抗体のＴＭ１は、６０℃より高いことが好ましく、より好ましくは６５℃より高く、更に好ましくは７０℃より高い。あるいは、抗体の熱安定性は、当該分野で周知のように円偏光二色性を使用して測定され得る。
【００２６】
好ましい実施形態においては、急速には分解しない抗体が選択される。抗ＶＡＰ−１抗体の断片化は、当該分野でよく理解されているように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を使用して測定され得る。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、最小凝集効果を有する抗体が選択される。凝集は望ましくない免疫応答及び／又は薬物動態特性の変化、もしくは、好ましくない薬物動態特性の誘発へとつながる可能性がある。一般的には、抗体には、２５％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下、そして、なおより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び、単量体、二量体、三量体又は多量体を同定するための光散乱を含む、当該分野で周知のいくつかの技術によって測定され得る。
【００２８】
本発明の抗体は、好ましくはＩｇＧ型の抗体であり、より好ましくはＩｇＧ４型の抗体である。しかしながら、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ及びＩｇＥのような他の抗体アイソタイプも含まれる。
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体には、本明細書中に記載される好ましい抗体のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が含まれ、ここでは、抗体は、本発明の抗ＶＡＰ−１抗体の所望される機能的特性を保持している。
例えば、本発明により、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分が提供される。ここでは：（ａ）重鎖可変領域には、配列番号１９〜２３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列が含まれる；（ｂ）軽鎖可変領域には、配列番号４２〜４６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列が含まれる；（ｃ）当該抗体は、１×１０−７Ｍ以下のＫｄでヒトＶＡＰ−１に結合する。
【００２９】
他の実施形態においては、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、上記に示された配列に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し得る。上記で示された配列のＶＨ領域及びＶＬ領域に対して高い（すなわち、８０％以上の）相同性を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１９〜２３及び４２〜４６をコードする核酸分子の変異を誘発（例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介性変異誘発）し、その後、保持された機能ついて、コードされた変化抗体を試験することによって得ることができる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、２つのアミノ酸配列間でのパーセント相同性は、２つの配列間でのパーセント同一性と同等である。２つの配列間でのパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数と各ギャップの長さとを考慮した、当該配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一である位置の数／位置の総数×１００）である。各配列の比較と２つの配列間での同一性を示すパーセントの決定とは、当該分野で公知の標準的な方法を使用して達成され得る。
【００３１】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は、抗原依存性細胞傷害性のような抗体の機能的特性を１つ以上変化させるために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本発明の抗体は、抗体の機能的特性を１つ以上再び変化させるために、化学的に修飾され得る（例えば、１つ以上の化学的成分が抗体に付着され得る）か、又は、そのグリコシル化部位を変化させるように修飾され得る。
【００３２】
例えば、Ｆｃ領域は、抗体がエフェクターリガンドに対して変化した親和性を有するが、元の抗体の抗原結合能力を保持するように、１つの異なるアミノ酸残基で置き換えることができるアミノ酸残基２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２９７位、３１８位、３２０位及び３２２位（Ｆｃ領域中の残基のナンバリングはＫａｂａｔのＥＵ指数のナンバリングである）から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基を置き換えることによって変化されるかもしれない。親和性が変化したエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣｌ成分であり得る。このアプローチは、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号及び米国特許第５，６４８，２６０号に、更に詳細に記載されている。
【００３３】
本発明によって意図される本明細書中の抗体の別の修飾はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を長くするためにペグ化され得る。抗体をペグ化するためには、抗体又はその断片は、通常は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステル又はアルデヒド誘導体のようなＰＥＧと、１つ以上のＰＥＧ基が当該抗体又は抗体断片に付着した状態となる条件下で反応させられる。好ましくは、ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（もしくは同様の反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を通じて行われる。本明細書中で使用される場合は、「ポリエチレングリコール」との語は、モノ（Ｃｌ−ＣｌＯ）アルコキシポリエチレングリコールもしくはアリールオキシポリエチレングリコール、又はポリエチレングリコールマレイミドのような、他のタンパク質へと誘導するために使用されているＰＥＧの任意の形態を含むように意図されている。特定の実施形態においては、ペグ化される抗体はグリコシル化されていない抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該分野で公知であり、本発明の抗体に適用できる。
【００３４】
好ましい実施形態においては、本発明により、特異的な完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体８Ｃ１０、８Ａ４、３Ｆ１０、４Ｂ３及び５Ｆ１２が提供される。他の好ましい実施形態においては、本発明により、組換え体８Ｃ１０、８Ａ４、３Ｆ１０、４Ｂ３及び５Ｆ１２のような組換え完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体が提供される。組換え体ｒ８Ｃ１０（ＢＴＴ−１０２３）の中では、重鎖は配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖は配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体は、好ましくは、本来のマウス免疫グロブリン遺伝子が不活化され、そして、ヒト免疫グロブリン遺伝子レパートリーの全体、又は、その一部で機能的に置き換えられたマウスを免疫化することによって調製される。そのようなマウスは、ＶＡＰ−１抗原で免疫化され、その後、ヒト抗体を産生するハイブリドーマが、通常の手順を使用してマウスから生成される。その後、ＶＡＰ−１抗原と反応するモノクローナル抗体を産生するクローニングされたハイブリドーマ細胞が同定され、精製された完全ヒトモノクローナル抗体を産生するために増殖される。
【００３７】
ヒト抗体を生成するための別の方法には、動物抗体の特異性をヒト免疫グロブリンへと移すことが含まれる。例えば、マウスはＶＡＰ−１抗原で免疫化され、その後、抗体を産生するハイブリドーマが通常の手順を使用して当該マウスから生成される。次いで、ＶＡＰ−１抗原と反応するモノクローナル抗体を産生するクローニングされたハイブリドーマ細胞が同定され、精製されたモノクローナル抗体を産生するために増殖される。抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列が決定され、相補性決定領域（ＣＤＲ）が同定される。重鎖及び軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体の一致するＣＤＲを置き換え、それにより、齧歯類抗ＶＡＰ−１抗体の特異性をヒト抗体へと移すために使用される。得られる抗ＶＡＰ−１抗体は、オリジナルのＣＤＲアミノ酸配列は齧歯類に由来するが、同じアミノ酸配列をヒト由来の抗体で生じさせることができるという点で完全ヒト型であり、これは齧歯類に特異的であるとして正確に定義することはできない。
【００３８】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するためには、免疫化されたマウスに由来する脾細胞及び／又はリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株のような適切な不死化細胞株に融合させる。得られるハイブリドーマは、抗原特異的抗体の産生のためにスクリーニングされる。
【００３９】
例えば、免疫化されたマウス由来の脾臓リンパ細胞の単細胞懸濁液を６分の１の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）に対して５０％のＰＥＧを用いて融合させることができる。細胞は、平底マイクロタイタープレート中におよそ２×１０５でプレートされ、続いて、２０％の胎児Ｃｌｏｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、１８％の「６５３」条件培地、５％のｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ社製）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及びＩＸ  ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ社製；ＨＡＴは融合の２４時間後に添加される）を含む選択培地中で２週間インキュベートされる。
【００４０】
およそ２週間後、細胞を、ＨＡＴがＨＴで置き換えられた培地中で培養する。その後、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。一旦、大量のハイブリドーマの増殖が起こると、培地は通常は１０日〜１４日後に観察される。抗体を分泌するハイブリドーマを再度プレートし、再びスクリーニングし、なおもヒトＩｇＧについてポジティブであれば、モノクローナル抗体を限界稀釈によって少なくとも２回サブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをインビトロで培養し、特性決定のために組織培養培地で少量の抗体を生じさせることができる。
【００４１】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体の精製のための２リットルのスピナーフラスコの中で増殖させることができる。上清を濾過し、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．）でのアフィニティークロマトグラフィーの前に濃縮することができる。溶離したＩｇＧは、純度を保証するために、ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーによってチェックすることができる。緩衝溶液はＰＢＳに交換することができ、その濃度は減衰係数１．４３を使用してＯＤ２８０で決定できる。当該モノクローナル抗体は、一定分量に分けられ、−８０℃で保存され得る。
【００４２】
完全ヒト抗体はまた、組換えファージの表面にヒト抗体タンパク質を提示及び産生するように遺伝子操作されたファージを使用するファージディスプレイライブラリーから産生させることもできる。任意の特定の標的に対して高い親和性と特異性とを有する単鎖抗体がスクリーニングによって選択され、その後、抗体配列が、組換え完全ヒト抗体を産生するためにファージから単離され得る。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当該分野で確立されている。
【００４３】
本発明の完全ヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化されるとヒト抗体応答を生じ得るようにヒトの免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。そのようなマウスは、例えば、米国特許第５，４７６，９９６号及び同第５，６９８，７６７号に記載されている。
【００４４】
所望される場合には、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡを単離することができ、そして、発現ベクターに挿入されて組換え完全ヒト抗体を産生させるのに適した発現宿主にトランスフェクトされるＤＮＡ構築物を生じさせるために、任意の所望されるヒト定常領域、又は、修飾されたヒト定常領域をコードするＤＮＡに融合させることができる。このように、本発明の抗体はまた、例えば、当該分野で周知であるように、組み換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで産生させることもできる。
【００４５】
例えば、抗体又はその抗体断片を発現させるためには、部分的又は完全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学技術（例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング又はＰＣＲ増幅）によって得ることができ、当該ＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳の制御配列に動作可能にリンクされるように発現ベクターに挿入することができる。本明細書中では、「動作可能にリンクされる」との語は、ベクター中の転写及び翻訳の制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節すべく意図されたそれらの機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中に連結されることを意味するように意図されている。発現ベクターと発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子は別のベクターに挿入することができ、また通常は、各遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。
【００４６】
抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的な制限部位の連結、又は、制限部位が存在しない場合は平滑末端の連結）によって発現ベクターに挿入される。本明細書中に記載される抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター中の重鎖定常（ＣＨ）セグメント（単数又は複数）に動作可能に連結され、ＶＫセグメントがベクター中の軽鎖定常（ＣＬ）セグメントに動作可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクター中にそれらを挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長の抗体遺伝子を作製するために使用され得る。
【００４７】
加えて、又は代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってよく、また、異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド）であってもよい。
【００４８】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持する。「調節配列」との語は、当該分野で周知であるように、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び、他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択や、所望されるタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることは当業者に認識されるであろう。
【００４９】
哺乳動物宿主細胞での発現にとって好ましい調節配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーのような、哺乳動物細胞中で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーター又はβ−グロビンプロモーターのような非ウイルス調節配列が使用される場合がある。なお更に、ＳＶ４０初期プロモーター及び１型ヒトＴ細胞白血病ウイルスの長末端反復に由来する配列を含むＳＲαプロモーターシステムのような、異なるソースに由来する配列からなる調節エレメントが使用される場合もある。
【００５０】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子のような、更なる配列を保持する場合がある。当該分野で周知であるように、選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。例えば、通常は、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートのような薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に対して付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞において使用される）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【００５１】
軽鎖及び重鎖の発現のためには、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（単数又は複数）が標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」との語の様々な形態は、原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションなど、を含むように意図される。原核生物宿主細胞及び真核生物宿主細胞のいずれにおいても本発明の抗体を発現させることは理論的には可能であるが、そのような真核生物細胞、特に哺乳動物細胞は、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体の構築及び分泌を行う可能性が原核生物細胞よりも高いと思われるので、真核生物細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物での発現は、活性な抗体の高収率な産生には効果が薄いと報告されている。
【００５２】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（当該分野で公知のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されると、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現を可能にする十分な期間、又は、より好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地中への抗体の分泌を可能にする十分な期間、当該宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収できる。
【００５３】
本発明の更なる態様は、配列番号４９〜５３とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第１のＤＮＡ配列、及び／又は、配列番号５４〜５８とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第２のＤＮＡ配列、及び／又は、配列番号５９〜６３とそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される第３のＤＮＡ配列を含む完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子を提供することであり、上記ＤＮＡ配列はそれぞれ、ＣＤＲ領域１〜３をコードする。特定の態様に従うと、本発明により、重鎖可変領域をコードし、配列番号６４〜６８とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子が提供される。
【００５４】
本発明のなお更なる態様は、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体軽鎖可変領域をコードし、配列番号６９〜７３とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第１のＤＮＡ配列、及び／又は、配列番号７４〜７８とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第２のＤＮＡ配列、及び／又は、配列番号７９〜８３とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択される第３のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を提供することであり、上記ＤＮＡ配列はそれぞれ、ＣＤＲ領域１〜３をコードする。特定の態様に従うと、本発明により、重鎖可変領域をコードし、配列番号８４〜８８とそれらの保存的配列変異体とからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子が提供される。
【００５５】
一実施形態においては、本発明により、組換え体８Ｃ１０、８Ａ４、３Ｆ１０、４Ｂ３及び５Ｆ１２のような組換え完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体をコードするＤＮＡ分子が提供される。組換え体ｒ８Ｃ１０（ＢＴＴ−１０２３）においては、重鎖は配列番号８９に示されるポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡによってコードされ、軽鎖は配列番号９０に示されるポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡによってコードされる。
【００５６】
【表２】
0005728225.tif 000003
【００５７】
本発明によっては更に、上記ヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。適切な発現ベクターとしては、哺乳動物宿主細胞でのタンパク質の発現及び分泌に重要なエレメントを含むベクターが挙げられる。当該ベクターには、ヒト重鎖定常領域もしくは軽鎖定常領域、又は、その両方をコードするＤＮＡが含まれ得る。同じベクターが、重鎖及び軽鎖の両方の発現に使用され得るか、あるいは、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のいずれかを含む異なるベクターが使用され得る。
【００５８】
本発明の一実施形態においては、発現ベクターには、ＦｃγＲＩ結合を減少させ、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低下させるために、米国特許第５，６２４，８２１号に記載されているようにアミノ酸２３５位のロイシンをアラニンで置換することによって修飾されたヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域が含まれる。Ｆｃ領域中の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵ指数のナンバリングである。
【００５９】
本発明によってはなお更に、本発明の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクターシステムが、完全ヒト抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列の発現に使用され得る。細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））及び他の微生物系が、具体的には、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片のような抗体断片、特に、Ｆｖ断片及び単鎖抗体断片（例えば、単鎖Ｆｖ’ｓ）の発現に使用され得る。真核生物（例えば、植物、酵母又は哺乳動物）宿主細胞発現システム、あるいは、トランスジェニック植物及びトランスジェニック動物が、完全な抗体分子を含むより大きな抗体産物の産生に、及び／又は、グリコシル化された生成物が必要である場合に使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、以上の説明から明らかなように、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞や、骨髄腫細胞株、又は、ハイブリドーマ細胞株が挙げられる。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００６０】
本発明の更なる態様は、適切なプロモーター及び分泌シグナルの制御下で本発明の完全ヒト抗体重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いて、宿主細胞をトランスフェクトする工程と、個々の鎖が発現されるような条件下で上記宿主細胞を増殖させる工程と、培養物から上記の発現及び構築がなされた完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体、又は、その生物学的に活性な誘導体を単離する工程とを含むプロセスによって、組換え完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体を産生するための方法を提供することである。ベクターが構築され得る一般的な方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は当該分野で周知である。
【００６１】
本発明によっては更に、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、有効成分として本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体とを含む薬学的組成物が提供される。本発明の組成物には、アンタゴナイズが必要な患者においてＶＡＰ−１の生物学的リガンドに対する患者の本来のＶＡＰ−１の結合、及び、白血球上に提示されたＶＡＰ−１リガンドに対して特異的な患者の本来のＶＡＰ−１結合に（完全に又は部分的に）アンタゴナイズするために十分な量の本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体が含まれる。
【００６２】
本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の投与量及び投与のためのレジュメは、炎症関連疾患の処置の臨床分野の当業者によって容易に決定され得る。一般的には、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体処置の投与量は、以下のような考慮事項によって変わるであろう：処置される患者の年齢、性別、及び全体的な健康状態；存在する場合には現在行われている処置の種類；処置の頻度と所望される効果の性質；組織損傷の程度；症状の持続期間；並びに、個々の医師によって調整される他の変数。所望される用量は、所望される結果を得るために１回以上のアプリケーションにおいて投与することができる。本発明の薬学的組成物は、単位投薬形態で提供され得る。
【００６３】
本発明の薬学的組成物は、投与のための任意の適切な薬理学的担体で投与することができる。これらは、ヒト又は動物患者のＶＡＰに媒介される病状の状況に予防的、緩和的、阻止的、又は、治癒的効果がある任意の形態で投与することができる。非経口投与及び局所投与のための本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の薬学的組成物としては、滅菌の水性又は非水性溶媒、懸濁液、及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、水−アルコール溶液（生理食塩水を含む）、及び、緩衝化された医療用非経口ビヒクル（塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース溶液、デキストロース及び塩化ナトリウムの溶液、ラクトース含有リンガー溶液、又は、固定油を含む）が挙げられる。静脈内投与用のビヒクルとしては、体液、栄養補給剤、電解質補給剤（リンガーデキストロースをベースにしたもの）などが挙げられる。
【００６４】
本発明の水性組成物には、標的のｐＨ範囲次第で、ナトリウム及びカリウムのリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、炭酸塩のような適切な緩衝化剤、又は、グリシン緩衝液が含まれ得る。浸透圧調整剤として塩化ナトリウムの使用も有用である。組成物には、安定化剤又は保存剤のような他の賦形剤が含まれ得る。有用な安定化賦形剤としては、界面活性剤（ポリソルベート２０及びポリソルベート８０、ポロキサマー４０７）、ポリマー（ポリエチレングリコール、ポビドン）、炭水化物（スクロース、マンニトール、グルコース、ラクトース）、アルコール（ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール）、適切なタンパク質（アルブミン）、適切なアミノ酸（グリシン、グルタミン酸）、脂肪酸（エタノールアミン）、抗酸化物質（アスコルビン酸、システインなど）、キレート剤（ＥＤＴＡ塩、ヒスチジン、アスパラギン酸）又は金属イオン（Ｃａ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｍｎ）が挙げられる。有用な保存剤には、ベンジルアルコール、クロロブタノール（chlorbutanol）、塩化ベンズアルコニウム、及び、場合によってはパラベンがある。
【００６５】
本発明の薬学的組成物は、要求に応じて再構成される濃縮形態又は粉末の形態で提供され得る。そのような場合には、上記注射／注入用賦形剤用の溶液のための粉末の処方物が使用され得る。凍結乾燥の場合には、ポリマー（ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン）、糖（スクロース、グルコース、ラクトース）、アミノ酸（グリシン、アルギニン、グルタミン酸）、及び、アルブミンを含む特定の抗凍結剤が好ましい。再構成のための溶液がパッケージングに加えられる場合には、これは、例えば、注射用の純水、又は、塩化ナトリウム溶液、又はデキストロースもしくはグルコース溶液から構成され得る。
【００６６】
本発明の組成物は、炎症反応を起こす任意の症状の診断又は処置に適しており、当該炎症反応では、ＶＡＰ−１の接合が、血液から炎症部位への白血球の移動及び浸潤を媒介することに関与する。従って、本発明の組成物は、反応性関節障害、感染後関節障害、炎症性多発性関節障害、全身性結合組織病、炎症性脊椎障害、筋炎、滑膜炎、ライター病、血清反応陽性関節リウマチ、他の関節リウマチ、関節外リウマチ、乾癬性及び腸疾患性関節炎、若年性関節炎、不特定関節炎（unspecified arthritis）、結節性多発動脈炎及び関連する症状、他の壊死性脈管障害、皮膚多発性筋炎、全身性硬化症、結合組織の全身性病変を伴う他の疾患、強直性脊椎炎、並びに他の炎症性脊椎障害のような、炎症性関節炎及び結合組織の疾患の診断又は処置に有用である。加えて、クローン病及び潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、水疱性疾患、皮膚炎、丘疹鱗屑性障害、紅斑、硬化性萎縮性苔癬、外陰部萎縮性苔癬（craurosis vulvae）、円板状エリテマトーデス、モルフェア、天疱瘡、類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触性皮膚炎、不特定接触性皮膚炎（unspecified contact dermatitis）、乾癬、多形性紅斑のような皮膚病、多発性硬化症、炎症性ニューロパシー、炎症性筋疾患、急性散在性脳脊髄炎、中枢神経系の血管炎、シェーグレン症候群、糖尿病、全身性エリテマトーデス、喘息及び炎症性肝疾患、グレーヴス病及び甲状腺炎、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎を含む眼の炎症、アルコール性肝炎、同種移植、異種移植、糸球体腎炎のような他の炎症性疾患、並びに、心筋梗塞及び脳卒中後の再灌流傷害及び急性の炎症症状が、本発明の組成物による診断又は処置に適切であり得る。
【００６７】
治療的に有用な本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体は、所望される作用部位に対する抗体の標的化を提供する他の薬剤に対して、化学的操作及び遺伝子操作のいずれかによって結合させられ得る。あるいは、抗体に対して更なる特性、特に、ＶＡＰ−１結合によって媒介される有害な作用の緩和を促進する抗体の能力を高める特性の増強又は提供のために、化学的操作及び遺伝子操作のいずれかによって、他の化合物が本発明の抗体に対して結合させられ得る。
【００６８】
本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体は、検出可能な抗体を提供するために、化学的操作及び遺伝子操作のいずれかによって標識され得る。そのように標識された抗体は、ヒトの炎症部位の画像化に、特に、炎症部位のインビボでの免疫シンチグラフィーイメージングに有用なツールであろう。このタイプの画像化は、より煩雑で費用のかかる現在使用されている白血球画像化法にとって代わる可能性がある。画像化の目的のためには、抗体断片の使用が抗炎症治療に対する完全な抗体のアプローチよりも好ましく、完全ヒト抗体に由来する断片は、それらのキメラ又はマウス等価物よりも更に安全であるはずである。
【００６９】
別の態様においては、本発明は、本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体を有効なレベルで、体内の炎症の処置が必要なヒト患者に投与することによる、ヒトの体内の炎症をインビボで弱めるか又は処置する方法に関する。「処置」との語、又は、「処置すること」との語は、ＶＡＰ−１の接着事象によって媒介される疾患の予防、緩和、阻止又は治癒が含まれ得る目的のために、被験体への完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の投与を含むように意図される。本発明の方法の対象である特定の抗ＶＡＰ−１抗体は、精製された本発明の組換え完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体である。
【００７０】
完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の「有効レベル」は、ＶＡＰ−１によって媒介される事象の有害な影響が改善される最小レベルを意味する。本発明の抗体の有効量は、白血球浸潤が有害であるか又は望ましくない炎症部位への白血球浸潤を阻害するために、白血球の内皮結合をブロックするか又は部分的にブロックするために十分な量である。完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体の投与量及び投与レジュメは、炎症関連疾患の処置の臨床分野の当業者によって容易に決定され得る。好ましくは、本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体は、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、最も好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、１週間に１回から３ヶ月に１回の間の範囲の間隔で血管内に提供される。あるいは、本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは０．２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、最も好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、１週間に１回から３ヶ月に１回の間の範囲の間隔で皮下に提供される。
【００７１】
以下の実施例は、本発明の更なる詳細をより明確にするために提供されるが、本発明の範囲を限定するようには意図されない。更なる適用及び使用は、当業者（すなわち、炎症性疾患及びその処置に精通している医師）に容易に理解される。
【実施例】
【００７２】
〔実施例１〕
〔ヒト抗ＶＡＰ−１モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマの単離〕
ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウス株（ＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）；Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ．社製）を、ヒト抗ＶＡＰ−１モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞を作成するために使用した。ＨｕＭＡｂ  ｍｏｕｓｅ（登録商標）には、再配置されたヒト重鎖（μ及びγ）とκ軽鎖との免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座が、内因性のμ鎖及びκ鎖遺伝子座を不活化させる標的変異とともに含まれる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照のこと）。従って、マウスは、マウスＩｇＭ又はκの低い発現を示し、そして免疫化に反応して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生じる。
【００７３】
ＨｕＭａｂマウスの調製及び使用、並びに、そのようなマウスが保持するゲノム修飾は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；及び同第５，７７０，４２９号（全て、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙ）；Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４及びＷＯ９９／４５９６２（全て、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙ）；並びに、ＫｏｒｍａｎらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４に記載されている。
【００７４】
組換えヒトＶＡＰ−１（ｒｈＶＡＰ-１）で免疫化されると、このトランスジェニックマウスはヒトＶＡＰ−１に特異的なヒトＩｇＧ抗体を産生する。
免疫化の計画は以下のとおりであった：マウスを、完全フロイントアジュバントと混合した、ヒトＶＡＰ−１  ｃＤＮＡを含み、かつ、ヒトＶＡＰ−１を発現する発現プラスミド（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８８：１７-２７）で、続いて、不完全フロイントアジュバントと混合したｒｈＶＡＰ−１又はＲｉｂｉアジュバントと混合したｒｈＶＡＰ−１により、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から精製されたｒｈＶＡＰ−１の複数回の腹腔内注射及び皮下注射によって免疫化した。免疫化したマウス由来の血清試料を、固定したｒｈＶＡＰ−１を用いた抗体捕捉ＥＬＩＳＡ、及び、ヒトＶＡＰ−１  ｃＤＮＡを含み、ヒトＶＡＰ−１を発現する発現プラスミドで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いた蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ：Fluorometric Microvolume Assay Technology）による免疫状態のモニタリングのために分析した。ｒｈＶＡＰ−１の最後のブースト注射を、脾臓摘出前に静脈内及び腹腔内に投与した。
【００７５】
ヒト抗ＶＡＰ−１モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）を、ｆｕｓｉｏｎｏｇｅｎとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて上記のように免疫化したマウスの脾細胞と融合させることによって得られた。ハイブリドーマ上清を、最初に、κ軽鎖を持つヒトＩｇＧ抗体の存在についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。その後、ｒｈＶＡＰ−１についてはＥＬＩＳＡによって、また、ヒトＶＡＰ−１  ｃＤＮＡを含む発現プラスミドで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の表面上に発現されたＶＡＰ−１に対する結合についてはＦＭＡＴによって、ヒトＩｇＧ陽性細胞をスクリーニングした。５つのヒト抗ＶＡＰ−１  ＩｇＧ１ハイブリドーマクローン、すなわち、５Ｆ１２、４Ｂ３、３Ｆ１０、８Ａ４及び８Ｃ１０を選択した。
【００７６】
〔実施例２〕
〔完全ヒト抗体５Ｆ１２、４Ｂ３、３Ｆ１０、８Ａ４及び８Ｃ１０のＶＡＰ−１結合特性〕
時間分解免疫蛍光アッセイを、ｒｈＶＡＰ−１に対する５Ｆ１２、４Ｂ３、３Ｆ１０、８Ａ４及び８Ｃ１０の結合を試験するために定量的に使用した。マイクロタイタープレートをｒｈＶＡＰ−１でコーティングし、その後、ウシ血清アルブミン溶液でブロックした。続いて、２〜４３２０ｎｇ／ｍｌの間の抗体量を加えてｒｈＶＡＰ−１に結合させ、結合した抗体を、ユーロピウム結合マウス抗ヒト抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．社製）によって検出した。時間分解蛍光（Ｖｉｃｔｏｒ３  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．社製）を６１５ｎｍで測定することによって、標識を検出した。蛍光カウント数は、その標的に結合した抗体の量と直接の相関関係がある。その後、試料のデータをリファレンスの標準曲線と比較して分析した。データは、５Ｆ１２、４Ｂ３、３Ｆ１０、８Ａ４及び８Ｃ１０がｒｈＶＡＰ−１に結合することを示しており、その親和性（Ｋｄ）を表３に示す。
【００７７】
【表３】
0005728225.tif 000004
【００７８】
〔実施例３〕
〔完全ヒト抗体５Ｆ１２、４Ｂ３、３Ｆ１０、８Ａ４及び８Ｃ１０の可変領域のｃＤＮＡの調製、クローニング及び配列決定〕
組換え抗体を構築するために、実施例１で得られた抗体に由来するヒト重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを単離し、配列分析のためのプラスミドベクターにクローニングした。
【００７９】
ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のｃＤＮＡクローンを、以下の方法で、抗ＶＡＰ−１を発現するハイブリドーマ細胞５Ｆ１２、４Ｂ３、３Ｆ１０、８Ａ４及び８Ｃ１０から得た。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙキットを使用して、５×１０６個のハイブリドーマ細胞から調整した。ＶＬ  ｃＤＮＡ及びＶＨ  ｃＤＮＡを、ＲＮＡの逆転写、その後のＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製「ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット」及び高性能な「Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ  ２  ＰＣＲキット」を使用した「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ：rapid amplification of cDNA ends）」手順によって調製した。その後、ＰＣＲ増幅産物を精製し、当該ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、大腸菌株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換した。５Ｆ１２、４Ｂ３、３Ｆ１０、８Ａ４及び８Ｃ１０のそれぞれのＶＬ及びＶＨのプラスミドクローンについてのミニプレップＤＮＡの配列が決定され、そのヌクレオチド配列及び推定される対応するタンパク質配列を、図１〜６に示す。
【００８０】
〔実施例４〕
〔組換え体ｒ８Ｃ１０  ｍＡｂを発現させるための哺乳類発現ベクターの構築〕
８Ｃ１０可変領域を、ＣＨＯ細胞中で機能的組換え体ｒ８Ｃ１０抗体（ＢＴＴ−１０２３と命名）を産生させるために、以下に記載するように、適切な重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む適切な哺乳類発現ベクターに挿入した。
【００８１】
抗体のＦｃ領域が免疫応答を指示する抗体／抗原複合体の能力を決定することは、公知である。その目的は、血管内皮に対する白血球の結合をブロックし、エフェクター機能を回復させることのない治療用抗体を産生することであった。従って、米国特許第５６２４８２１号に記載されているように、アミノ酸２３５位のロイシンをアラニンで置換することにより、ＦｃγＲＩ結合を減少させ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低下させるように修飾されたヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域を、発現ベクター中に使用した。
【００８２】
８Ｃ１０  ＶＬ  ｃＤＮＡ及びＶＨ  ｃＤＮＡを、５’末端に最適なＫｏｚａｋコンセンサス配列と適切なクローニング部位とを含むように、ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して増幅させた。正方向ＰＣＲプライマーと逆方向ＰＣＲプライマーとを、クローニングのための適切な制限部位を有するように設計した。天然のＶＬシグナル配列及びＶＨシグナル配列をそれぞれ含むＰＣＲ産物を精製し、２２８位のセリンからプロリンへの変異及び２３５位のロイシンからアラニンへの変異を含み、ヒトκ軽鎖定常領域及びヒトγ４重鎖を保持し、ｐＩＣＯ−ｇ４ＰＡ（ＶＡＰ１．８Ｃ１０）と呼ばれるプラスミドベクターに、当該ＰＣＲ産物をクローニングしてプラスミドを得て、その後、当該プラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。当該プラスミドのＶＬ領域及びＶＨ領域の配列を、クローニングしたＰＣＲ産物の完全性を確認するために決定した。
【００８３】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位及び最適なＫｏｚａｋコンセンサス配列を含み、３’末端にＥｃｏＲＩクローニング部位を含むように、鋳型としてのｐＩＣＯ−ｇ４ＰＡ（ＶＡＰ１．８Ｃ１０）プラスミドとＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘとを利用して、８Ｃ１０軽鎖をＰＣＲによって増幅させた。
天然の８Ｃ１０軽鎖シグナル配列を含むＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及び制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、精製し、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社から入手した発現ベクターｐＥＥ１２．４のＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、プラスミド２１１６を作製した。当該２１１６プラスミドをＤＨ５α  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．社製）コンピテント大腸菌セルに形質転換した。
【００８４】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位及び最適なＫｏｚａｋコンセンサス配列を含み、３’末端にＥｃｏＲＩクローニング部位を含むように、鋳型としてのｐＩＣＯ−ｇ４ＰＡ（ＶＡＰ１．８Ｃ１０）プラスミド及びＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを利用して、８Ｃ１０重鎖をＰＣＲによって増幅させた。
天然の８Ｃ１０重鎖シグナル配列を含むＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。８Ｃ１０重鎖含有断片を精製し、そしてＬｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社から入手したＬｏｎｚａベクターｐＥＥ６．４のＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、プラスミド２１１７を作製した。当該２１１７プラスミドをＤＨ５α  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙコンピテントセルに形質転換した。
【００８５】
プラスミド２１１６及びプラスミド２１１７を制限酵素ＳａｌＩ及び制限酵素ＮｏｔＩで切断し、それぞれの切断物に由来する最長の断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して連結させて、プラスミド２１１８［２１１８−ｐＥＥ１２．４−ＶＡＰ１（８Ｃ１０）］を得た。プラスミド２１１８をＤＨ５a  Ｍａｘ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙコンピテントセルに形質転換した。重鎖及び軽鎖の全体をコードするＤＮＡの配列を、当該配列の正確性及び完全性を確認するために決定した。
【００８６】
〔実施例５〕
〔ＣＨＯ細胞での組換え完全ヒト抗体ＢＴＴ−１０２３の発現〕
完全ヒト抗体ＢＴＴ−１０２３を、以下のようにしてＣＨＯ細胞から生じさせた。
２１１８−ｐＥＥ１２．４−ＶＡＰ１（８Ｃ１０）プラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで直鎖状にした。当該ＤＮＡを、エレクトロポレーションによって、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社から入手したＣＨＯＫ１ＳＶ細胞にトランスフェクトした。
その後、当該細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで、既知組成（ＣＤ）ＣＨＯ（カタログ番号＃０４−０１１９，Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）感染後培地（Ｌ−グルタミン非含有ＣＤ  ＣＨＯ＋１×ＧＳ（グルタミン合成酵素）補助剤＋２．１６ｍｇ／Ｌのチミジン）における９６ｗｅｌｌプレート（２．５×１０３細胞／ｗｅｌｌ）にプレートした。
【００８７】
次いで２４時間後、プレートに、１５０μＬ／ｗｅｌｌのＣＤ  ＣＨＯ選択培地（Ｌ−グルタミン非含有ＣＤ  ＣＨＯ＋１×ＧＳ補助剤＋２．１６ｍｇ／Ｌのチミジン＋６６．６μＭのＭＳＸ（メチオニンスルホキシミン）又は１３３．３μＭのＭＳＸ）を加え、最終的に全体的なＭＳＸ濃度を５０μＭ又は１００μＭとした。ＭＳＸ耐性コロニーによる抗体産生のレベルを、ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
高レベルの抗体を産生するコロニーを、ＣＤ  ＣＨＯ増殖培地（Ｌ−グルタミン非含有ＣＤ  ＣＨＯ＋１×ＧＳ補助剤＋２．１６ｍｇ／Ｌのチミジン＋５０μＭのＭＳＸ又は１００μＭのＭＳＸ）で、最初は２４ウェルプレートで、その後Ｔ−フラスコで増殖させるために選択した。
【００８８】
細胞を、５バイアルのトランスフェクトーマセルバンク（ＴＣＢ）の調製前に震盪フラスコの中で増殖させた。細胞株１５Ｂ７を５０μＭのＭＳＸプレートから選択し、５０μＭのＭＳＸを含むＣＤ  ＣＨＯ増殖培地中で維持した。抗体を、上記のようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培養することによって産生させて条件培地を生じさせ、これからＢＴＴ−１０２３を、培養上清からモノクローナル抗体を精製するための標準的な技術を使用して精製することができた。
【００８９】
〔実施例６〕
〔組換え完全ヒト抗体ＢＴＴ−１０２３の結合特性〕
時間分解免疫蛍光アッセイを、ｒｈＶＡＰ−１に対するＢＴＴ−１０２３の結合を定量的に試験するために使用した。マイクロタイタープレートをｒｈＶＡＰ−１でコーティングし、その後、ウシ血清アルブミン溶液でブロックした。続いて２〜４３２０ｎｇ／ｍｌの間の量のＢＴＴ−１０２３を加えてＶＡＰ−１に結合させ、結合したＢＴＴ−１０２３をユーロピウム結合マウス抗ヒト抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．社製）によって検出した。時間分解蛍光（Ｖｉｃｔｏｒ３  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．社製）を６１５ｎｍで測定することによって、標識を検出した。蛍光カウント数は、その標的に結合したＢＴＴ−１０２３の量と直接の相関関係がある。その後、試料のデータをリファレンスの標準曲線と比較して分析した。データは、ＢＴＴ−１０２３が組換体ヒトＶＡＰ−１に対して、０．３８ｎＭの親和性（Ｋｄ）で結合することを示している。
【００９０】
Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴アッセイを使用するリアルタイム直接結合アッセイを、ＢＴＴ−１０２３に対するｒｈＶＡＰ−１の結合キネティクスを分析するために使用した。ストレプトアビジンがコーティングされたチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）に固定されたビオチニル化プロテインＧ’（Ｓｉｇｍａ社製）を移動相からＢＴＴ−１０２３を捕捉するために使用した。それぞれの実行は２段階からなった：ＢＴＴ−１０２３  ｍＡｂの１回の注射及びリガンド結合分析物（ｒｈＶＡＰ−１）の注射。一定量のｒｈＶＡＰ−１を、ｍＡｂの飽和濃度についての分析物（リガンド）として使用した。実験はＢＩＡｌｉｔｅ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を使用して行い、データはＢｉａｃｏｒｅソフトウェアを使用して分析した。当該データは、組換えヒトＶＡＰ−１がＢＴＴ−１０２３に対して０．１３ｎＭの親和性（Ｋｄ）で結合することを示している。
【００９１】
完全ヒトＢＴＴ−１０２３のヒトＶＡＰ−１に対する結合を、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーのためには、ヒトＶＡＰ−１  ｃＤＮＡを発現するラット内皮細胞株（Ａｘ細胞）由来のトランスフェクトされた細胞（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８８：１７−２７）を使用した。これらを、２０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸Ｎａ、１０μＭのβ−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）、１％の非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び、０．７５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（商標））を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）中で、１７５ｃｍ３のフラスコ内で増殖させた。細胞を遊離させるために、これらをＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で２回洗浄し、１０ｍｌの細胞解離緩衝液（Cell Dissociation Buffer）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）中で３７℃で３分間インキュベートした。培地１０ｍｌを添加した後、細胞をペレット状にし（５分、１０００ｇ、室温)、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）［ＰＢＳ、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、０．１％（ｖ／ｖ）のＮａＮ３］中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、氷上で維持した。
【００９２】
細胞懸濁液（１００μｌ／ｗｅｌｌ）を９６ｗｅｌｌプレートに移し、細胞をペレット状にし（４分、１０００ｇ、１０℃）、そして抗体溶液の１００μｌのアリコートをウェルに加えた。氷上で３０分間のインキュベーションの後、細胞を１５０μｌの洗浄緩衝液／ウェルで２回洗浄し、その後、１００μｌの３９μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合（フルオレセインイソチオシアネート）抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的、Ｓｉｇｍａ社製）とともに氷上で３０分間インキュベートした。最後に、先に記載したように細胞を洗浄し、１％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドを含む１００μｌの洗浄緩衝液を加えて固定し、フローサイトメータでの分析まで４℃に保った。コントロール試料は、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体だけで染色した。
【００９３】
全てのフローサイトメトリー試料をＦＡＣＳｃａｎ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で分析した。個々の試料について、最低でも１００００のゲートイベント（gated event）についてのデータを収集し、蛍光の幾何学的平均チャンネルをＬｙｓｙｓ  ＩＩソフトウェアを使用して計算した。
ＢＴＴ−１０２３は、それらの表面にＶＡＰ−１を発現するトランスフェクトされたＡｘ細胞の染色によって示されるように、ヒトＶＡＰ−１に特異的に結合した（図７）。
【００９４】
〔実施例７〕
〔ＢＴＴ−１０２３の機能的特性〕
インビトロでの移動アッセイを、内皮単層を通り抜ける白血球の移動を阻害するＢＴＴ−１０２３の機能的能力を試験するために使用した。それらの表面上に組換えヒトＶＡＰ−１を発現するようにトランスフェクトされたＡｘラット内皮細胞の単層を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の上部チャンバーにて増殖させた。新たに単離したヒト末梢血単核細胞を上部チャンバーに配置し、２時間かけて底部チャンバー中の単球の化学接着ペプチドｆＭＬＰ（Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン、１００ｎＭ）に向かって移動させた。当該単層をＢＴＴ−１０２３、ＢＴＴ−１００８（ヒト定常領域を有する非結合ネガティブコントロール抗体）（Ｋｉｒｔｏｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）３５：３１１９−３０）、及び、ＢＴＴ−１００２（ＶＡＰ−１に媒介される接合及び移動を遮断（ブロック）することが知られているポジティブコントロールであるキメラ抗ＶＡＰ−１  ｍＡｂ）のいずれかで処理した。単層から移動した細胞を底部チャンバーから収集し、顕微鏡でカウントした。
【００９５】
ＢＴＴ−１０２３は、１０ｎｇ  ｍｌ−１で、内皮細胞単層からの細胞の移動を有意に減少させ、そして１μｇ  ｍｌ−１で移動をブロックした。ネガティブコントロール抗体ＢＴＴ−１００８は、１μｇ  ｍｌ−１では効果がなかったが、一方、ポジティブコントロール抗体ＢＴＴ−１００２もまた、図８に見られるように、１μｇ  ｍｌ−１で移動を完全にブロックした。
【００９６】
〔実施例８〕
〔キメラ抗体ＢＴＴ−１００２と比較した組換え完全ヒト抗体ＢＴＴ−１０２３の改善された薬物動態特性〕
２匹の雌のマーモセット（非ヒト霊長類）にそれぞれ２５ｍｇ／ｋｇのＢＴＴ−１０２３を、ボーラス静脈内注射によって投与した。ＢＴＴ−１０２３濃度の分析用の血液試料を、投与後１０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間及び１４４時間で収集した。
【００９７】
マーモセットの血清中の分析物（ＢＴＴ−１００２及びＢＴＴ−１０２３のいずれか）濃度の定量のための時間分解免疫蛍光アッセイは、ストレプトアビジンをコーティングしたマイクロタイタープレート上で、捕捉物質（capturer）として、ビオチンが結合させられた分析物特異的ウサギポリクローナル抗体を利用する。そのようなポリクローナル抗体は、ＢＴＴ−１００２及びＢＴＴ−１０２３のいずれかでのウサギの反復免疫化、血清の収集、並びに、得られた抗ＢＴＴ−１００２ポリクローナル抗体又は抗ＢＴＴ−１０２３ポリクローナル抗体の親和性精製によって作成した。結合した分析物の検出は、ユーロピウム結合二次抗体を使用して行った。標識は、時間分解蛍光（Ｖｉｃｔｏｒ３  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．社製）を６１５ｎｍで測定することによって検出した。蛍光カウント数は、試料中に存在する分析物の量と直接の相関関係がある。その後、試料のデータをリファレンスの標準曲線と比較して分析した。
【００９８】
薬物動態パラメーターを、非コンパートメント分析を使用して決定した。４０ｍｇ／ｍｌを２匹の雌のマーモセットのそれぞれに静脈内投与した、ＢＴＴ−１００２を用いて行った同様の研究から導かれたデータと比較すると、完全ヒトＶＡＰ−１抗体は、改善された経時的血清濃度（ＡＵＣ）プロフィールと延長された排出半減期とを有する改善された薬物動態特性を示す（表４）。
【００９９】
【表４】
0005728225.tif 000005
【０１００】
〔実施例９〕
〔完全ヒト抗体の薬学的組成物〕
注射用又は注入用の溶液、若しくはそのような溶液用の濃縮物として提供され、非経口投与に適している本発明の完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体を含む薬学的組成物の例。
１ｍｌについての成分のパーセント量
抗ＶＡＰ−１抗体                                  ０．１〜１０％
塩化ナトリウム又は塩化カリウム                    ０．５〜１．５％
リン酸水素二ナトリウム二水和物                    ０．１〜２％
リン酸二水素ナトリウム又はリン酸二水素カリウム    ０．１〜２％
スクロース                                        ０．５〜１０％
ポリソルベート２０又はポリソルベート８０          ０．０１〜１％
注射用水                                          １ｍｌになるように
１ｍｌについての成分のパーセント量
抗ＶＡＰ−１抗体                                  ０．１〜１０％
塩化ナトリウム                                    ０．５〜１．５％
ＥＤＴＡ／ＤＴＰＡ                                ０．０１〜１．５％
マンニトール                                      ０．１〜５％
ポリソルベート２０又はポリソルベート８０          ０．０１〜１％
二水和物としてのクエン酸ナトリウム                ０．５〜５％
注射用水                                          １ｍｌになるように
【０１０１】
〔実施例１０〕
〔炎症のインビボモデルにおける完全ヒト抗体の有効性〕
〔アカゲザルのコラーゲン誘導性関節炎における完全ヒトＶＡＰ−１抗体処置の有効性〕
完全ヒト抗体の効果は、関節炎指標におけるＢＴＴ−１０２３抗体の有用性についてのデータ収集の助けとなるアカゲザルのコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）のモデルにおいて評価される。
【０１０２】
ウシＩＩ型コラーゲンで免疫化された９９％のＣＩＡ指数を有するＭＨＣ  Ａ２６に関してネガティブである成体のアカゲザルが、研究のために選択される。１０匹の動物は、５匹の動物の２つの群に分けられる。関節炎は、動物の背中の１０箇所のスポット中に、完全フロイントアジュバント中の３〜５ｍｇのウシコラーゲンを注射することによって誘導される。このアプローチを使用すると、関節炎は、免疫化後３〜５週間で顕性化し、通常、７〜９週間持続する。
【０１０３】
１週間に２回の１〜５０ｍｇ／ｋｇの間の用量の完全ヒト抗体を用いた４週間の静脈内処置は、≧２０ｍｇ／ｌのＣＲＰレベルが２回の連続する記録において検出された時点で開始される。コントロールの動物には、ビヒクル溶液が投与される。動物の症状は、総体的臨床スコア（０＝関節炎の臨床兆候なし、０．５＝発熱（＞０．５℃）、１＝無気力、可動性の低下及び食欲不振、２＝体重減少、四肢及び／又は関節の微熱、痛みがあるが軟部組織腫脹（ＳＴＳ）は伴わない、３＝関節の中度の紅化及びＳＴＳ、四肢の正常な柔軟性、４＝関節の重度の紅化及びＳＴＳ、関節の硬直を伴う、５＝安楽死が指示される重症関節炎）、及び、ＣＩＡ重傷度スコア（−から＋＋＋のスケールで評価された軟部組織腫脹、柔軟性及び捻髪音の重篤度：−なし、±疑わしい、＋中度、＋＋重度、＋＋＋極度）を使用して評価した。全てのこれらのパラメーターは、半定量的スケールであるＣＩＡ重篤度の総体的臨床スコアをもたらす。
【０１０４】
〔ＶＡＰ−１ヒト化マウスのコラーゲン抗体誘導性関節炎の処置における完全ヒトＶＡＰ−１抗体の有効性〕
内皮上にヒトＶＡＰ−１を発現するトランスジェニックマウスのコラーゲン抗体誘導性関節炎に対する完全ヒト抗体の有効性が評価され得る。急速に進行する関節炎は、抗体カクテルを、それに続いて３日後に腹腔内にリポ多糖を注射することによって誘導される。完全ヒト抗体の３ｍｇ  ｋｇ−１、１０ｍｇ  ｋｇ−１又は３０ｍｇ  ｋｇ−１の静脈内用量が、１日目、３日目及び７日目にマウスに投与される。コントロールの動物には、ビヒクルが投与される。コントロールとの比較における関節炎スコアの統計学的に有意な低下によって証明されるように、関節炎疾患の軽減が示され得る。
【０１０５】
〔乾癬のヒト化マウスモデルにおけるＶＡＰ−１抗体処置の有効性〕
ヒト化異種移植モデルの最近の確立及び検証は、この疾患の理解を深め、新しい薬物療法を試験するための有用なツールを提供した（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ  ＢＪ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ．（１９９９）８：３９３−４０１）。
このモデルでは、以前に説明されたように（Ｗｒｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ  Ｔ．ら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）９８：１８７８−１８８７）、乾癬患者由来で非損傷性（ｎｏｎ−ｌｅｓｉｏｎａｌ）の完全な厚みの皮膚生検が、およそ７〜９週齢の麻酔された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植される。当該動物には、疾患の誘導前に少なくとも２〜３週間、外科手術から回復するための余地を与えた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、生検時に採取された血液試料から単離され、スーパー抗原ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）で活性化させられる。静脈内及び皮内のいずれかでの異種移植片への活性化されたＰＢＭＣの注射によって、疾患が誘導される。
【０１０６】
完全ヒトＶＡＰ−１抗体又はビヒクルは、静脈内又は皮下に投与される。様々な期間の予防的及び治療的投与レジュメは、いずれも可能である。加えて、より詳細に細胞への浸潤に対する効果を調べるために、完全ヒトＶＡＰ−１抗体処置に続いて、標識されたヒトＴ細胞を静脈内に注射することができる。
処置期間の最後に、マウスは屠殺され、移植片は、周辺のマウスの皮膚と一緒に摘出され、ホルマリン中に固定されるか、或いは、窒素中で一瞬で凍結させられる。組織学的検査及び免疫組織化学的検査が、表皮厚み、細胞浸潤、及び、接合分子の発現における変化のような病理学的変化をスコアするために行われる。コントロールとの比較においてスコアの統計学的に有意な低下によって証明されるように、乾癬疾患の軽減が示され得る。
【０１０７】
〔ＶＡＰ−１ヒト化マウスに対するＣＣｌ４の投与によって生じる肝臓の炎症の処置における完全ヒトＶＡＰ−１抗体の有効性〕
肝臓の炎症及び線維症に対する完全ヒトＶＡＰ−１抗体の効果が、ＣＣｌ４の投与によって肝臓線維症を生じたマウスモデルにおいて評価される。内皮上にヒトＶＡＰ−１を発現するトランスジェニックマウスに、０．２５ｕｌ／ｇのＣＣｌ４が腹腔内に１週間に２回、１２週間にわたって注射される。１２週間の全体にわたって、広範囲の肝臓の炎症及び瘢痕が生じるが、ＣＣｌ４注射の中断後、当該瘢痕は完全に消散する。このモデルを使用して損傷を阻止し、既存の線維症を消散することにおいて、１週間に２回、１〜２５ｍｇ／ｋｇの間の用量で静脈内又は腹腔内に投与された完全ヒト抗体の有効性は、肝臓の病理学的及び組織学的変化をスコアすることによって調べられる。コントロールとの比較においてスコアの統計学的に有意な減少によって証明されるように、疾患の軽減が示され得る。
【０１０８】
〔麻酔されたウサギの急性心筋梗塞のモデルにおけるＶＡＰ−１抗体処置の有効性〕
左開胸が、麻酔され人工呼吸器が装着されたニュージーランドシロウサギに対して行われる。心臓が露出され、左冠状動脈（ＬＣＡ）が単離され、閉塞される。完全ヒトＶＡＰ−１抗体が、閉塞の開始後２５分で静脈内に投与される。抗体投与の５分後、閉塞が除去され、次いでその領域が６時間まで再灌流させられる。当該動物は、過剰量の麻酔薬の使用によって死亡させられ、心臓が摘出され、生理食塩水でリンスされる。再びＬＣＡが閉塞され、Ｍｏｎａｓｔｒａｌ又はＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅが心臓全体に灌流させられて、心筋を着色するが、リスクがある領域は着色されないまま残る。心臓が凍結させられ、左心室が薄い切片になるように切り分けられる。
【０１０９】
スライスされた切片全てとリスクがある領域とが、画像分析システムを使用して決定される。その後、当該切片は、リン酸緩衝化生理食塩水中の１％のトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）溶液とともにインキュベートされ、続いて１０％の中性の緩衝化ホルマリン中でインキュベートされる。生存能力のある心筋はＴＴＣインキュベーションによって赤色に着色され、従って染色されなかった組織領域を測定することによって梗塞領域が決定され、決定されたリスクがある領域の割合として表される。コントロールとの比較においてリスクがある領域の割合の統計学的に有意な減少によって証明されるように、組織損傷の減少が示され得る。
【０１１０】
〔ウサギのｍＢＳＡ誘導性関節炎におけるＶＡＰ−１抗体処置の有効性〕
生理食塩水中に溶解したメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）は、等量の完全フロイントアジュバントと混合され、エマルジョンが調製される。ニュージーランドシロウサギは、１４日の間をあけて、当該エマルジョンを２回皮内注射されて免疫化される。２回目の免疫化のおよそ１０日後、血清が当該動物から収集され、ｍＢＳＡ溶液が皮内注射により投与される。ポジティブな皮膚反応を示す動物が選択され、これらは、抗ｍＢＳＡ  ＩｇＧの血清力価に基づいて、複数の処置群に無作為に分けられる。
【０１１１】
２回目の免疫化の１４日後、ＶＡＰ−１抗体又はビヒクルが、右膝の関節腔へのｍＢＳＡ溶液の注射の直前に、静脈内又は皮下に投与される。各動物の左膝には、生理食塩水が注射される。ＶＡＰ−１抗体の注射又はネガティブコントロールの注射は、研究を通じて１週間に１回又は２回投与される。
誘導日（０日目）から、研究期間中、ウサギは、視診及び触診によって行動及び外見について毎日観察され、体重が特定の間隔で記録される。膝関節の腫脹は、予め決定された時点で、炎症を起こした（右）膝と炎症を起こしていない（左）膝との直径を比較することによって評価される。
【０１１２】
研究の実験部分の終わり（２１日目）に、当該動物は屠殺される。滑液が、全白血球数及びタンパク質含有量の決定のために収集される。各動物の滑膜が膝関節から解体され、膝蓋骨の部位で２つの検体になるように長軸方向に分割される。一方は、ＶＡＰ−１抗体及びＶＡＰ−１発現の決定のために液体窒素の中で冷凍され、他方の滑膜の検体及び残りの膝関節組織は、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）、並びに、リンタングステン酸−ヘマトキシリン（ＰＴＡＨ）での染色のために、１０％の中性緩衝化ホルマリン中に固定される。ＨＥ染色された切片は炎症反応について評価され、ＰＴＡＨ染色された切片は滑膜の表面上でのフィブリンの蓄積の程度について評価される。コントロールとの比較においてスコアの統計学的に有意な低下によって証明されるように、関節炎疾患の軽減が見られ得る。
【０１１３】
〔結論〕
これらの実施例は、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体が、抗ＶＡＰ−１抗体の特異的ＶＡＰ−１認識特性を保持し（実施例２及び６）、内皮からの白血球のＶＡＰ−１依存性の移動をブロックし（実施例７）、そして、以前の抗ＶＡＰ−１モノクローナル抗体と比較して改善された薬物動態特性を有していた（実施例８）ことを明らかにしている。
技術進歩に伴い、本発明の概念を様々な方法で履行できることは、当業者に明らかであろう。本発明とその実施形態とは、上記の実施例には限定されず、特許請求の範囲の中で変化し得る。
【図１Ａ】
0005728225.tif 000006
【図１Ｂ】
0005728225.tif 000007
【図２Ａ】
0005728225.tif 000008
【図２Ｂ】
0005728225.tif 000009
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005728225.tif 000011
【図４Ａ】
0005728225.tif 000012
【図４Ｂ】
0005728225.tif 000013
【図５Ａ】
0005728225.tif 000014
【図５Ｂ】
0005728225.tif 000015
【図６Ａ】
0005728225.tif 000016
【図６Ｂ】
0005728225.tif 000017
【図６Ｃ】
0005728225.tif 000018
【図６Ｄ】
0005728225.tif 000019
【図６Ｅ】
0005728225.tif 000020
【図６Ｆ】
0005728225.tif 000021
【図６Ｇ】
0005728225.tif 000022
【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
0005728225.tif 000025
【配列表】
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