(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における肺疾患又は呼吸器感染症の治療又は予防に用いるためのナノエマルジョンであって、
(a)治療又は予防がナノエマルジョンを対象に肺送達により投与するステップを含み；
(b)対象が、一種又は複数種の微生物による感染症に罹患しやすいか、又はその感染症を有し；
(c)ナノエマルジョンが、
(i)水、
(ii)約0.001%〜約10%の、塩化セチルピリジニウム、Poloxamer 407、Tween 20、ポリソルベート80、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、又は塩化ベンザルコニウムである少なくとも一種の界面活性剤、
(iii)約0.1%〜約50%の少なくとも一種の有機溶媒、及び
(iv)約1%〜約80%の少なくとも一種の油
を含み；
(d)ナノエマルジョンが約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含む；
前記ナノエマルジョン。
【請求項２】
肺疾患が急性肺胞疾患、急性気管支炎、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、アレルギー感染症、石綿肺症、喘息、細菌性肺炎、ベリリウム肺症、気管支炎、気管支拡張症、綿肺症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炭坑夫塵肺症(CWP)、嚢胞性線維症(CF)、肺気腫放射線肺炎、好酸球性肺炎、真菌性肺炎、特発性肺線維症(ILD)、コラーゲン血管障害に関連するILD、間質性肺疾患、人工呼吸器誘発肺損傷、胎便吸引症候群(MAS)、マイコバクテリア肺炎、院内肺炎、閉塞性呼吸器疾患、中耳炎、肺炎、ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii)肺炎、塵肺症、ニューモシスチス・カリニ(Pneyumocystis carinii)、肺浮腫、インフルエンザなどの別の障害の結果であるか又はそれに続発する肺炎症、呼吸器感染症、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、呼吸促迫症候群(RDS)、喫煙に起因する炎症に関連する呼吸器感染症、関節リウマチ、鼻炎/副鼻腔炎、サルコイドーシス、敗血症、珪肺症、煙吸引、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、結核、上気道疾患、人工呼吸器関連肺炎、及びウイルス肺炎からなる群から選択される、請求項1に記載のナノエマルジョン。
【請求項３】
微生物が細菌、グラム陽性菌種、グラム陰性菌種、古細菌、真菌、カビ、酵母、原生動物、ウイルス、マイコプラズマ、皮膚糸状菌、プリオン、寄生生物、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項1又は2に記載のナノエマルジョン。
【請求項４】
呼吸器感染症又は肺疾患が微生物のバイオフィルム及び／又は嚢胞性線維症の痰と関連している、請求項1から3のいずれか一項に記載のナノエマルジョン。
【請求項５】
治療または予防が、ナノエマルジョンの投与の前、最中又は後のいずれかに、一種又は複数種の抗微生物剤を投与するステップをさらに含み、
ここで、
(a)ナノエマルジョン及び少なくとも一種の抗微生物剤の投与が、部分阻害濃度(FIC)指数、部分殺菌濃度(FBC)指数又はその組合せによって定義されるように相乗的であり；
(b)ナノエマルジョンが、抗微生物剤といかなる拮抗作用も示さず；
(c)抗微生物剤が抗生物質、抗体、抗菌酵素、ペプチド、及びランチオン(lanthione)含有分子からなる群から選択され；又は
(d)(a)、(b)、及び／又は(c)の任意の組み合わせ；
である、請求項1から4のいずれか一項に記載のナノエマルジョン。
【請求項６】
(a)ナノエマルジョンが、最小の毒性若しくは副作用を示すか、又は毒性若しくは副作用を全く示さず；
(b)ナノエマルジョンの最小阻害濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)又はその組合せが、ナノエマルジョンの静菌活性又は殺菌活性を示し；
(c)一種又は複数種の微生物種が、一種又は複数種の抗生物質に対して耐性を示し；
(d)微生物種がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)であり；
(e)微生物種がバンコマイシンに耐性であり；
(f)微生物種がフルオロキノロンに耐性であり；
(g)微生物種がコリスチンに耐性であり；
(h)微生物種が多剤耐性であり；
(i)微生物種がバークホルデリア(Burkholderia)属の薬剤耐性菌種であり；
(j)微生物種がシュードモナス(Pseudomonas)属の薬剤耐性菌種であり；
(k)ナノエマルジョンが微生物耐性を示さず；又は
(l)それらの任意の組み合わせ；
である、請求項1から5のいずれか一項に記載のナノエマルジョン。
【請求項７】
(a)キレート剤；
(b)少なくとも一種の保存剤；
(c)少なくとも一種のpH調節剤；
(d)少なくとも一種のバッファー；
(e)少なくとも一種の抗生物質製剤；又は
(f)それらの任意の組合せ；
をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のナノエマルジョン。
【請求項８】
ナノエマルジョンが対象において全身的に吸収されないか、又はごくわずかなナノエマルジョンが対象において全身的に吸収される、請求項1から7のいずれか一項に記載のナノエマルジョン。
【請求項９】
対象が嚢胞性線維症(CF)を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載のナノエマルジョン。
【請求項１０】
ワクチンに用いるための、請求項1から9のいずれか一項に記載のナノエマルジョン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2008年9月26日出願の米国仮出願第60/100,559号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、治療用ナノエマルジョン組成物及びその利用方法に関する。特に本明細書では、感染症(例えば呼吸器感染症(例えば嚢胞性線維症に関連するもの))の治療及び/又は予防、熱傷管理、並びに免疫原性組成物を投与した対象において有効な免疫応答(例えば、バークホルデリア属の細菌種に対する)を発生させる免疫原性組成物(例えばバークホルデリア抗原を含む)における使用が見出されるナノエマルジョン組成物が記載される。本発明の組成物及び方法は、中でも、臨床(例えば、治療用及び予防用医薬品)、工業及び研究適用における使用が見出される。
【背景技術】
【０００３】
日和見菌及び/又は病原菌(例えば、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa))によって引き起こされる細菌感染症は、世界の先進国及び発展途上国の両方における主な問題である。例えば、易感染性の高齢者の癌化学療法患者、喘息に罹患している個体、遺伝的な遺伝性疾患(例えば、嚢胞性線維症)に罹患している個体、及びウイルスに感染している個体(例えば、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、アデノウイルス及び/又はヒト免疫不全ウイルスに感染している)を含む特定の種類の個体は、呼吸器感染症(例えば、細菌(例えば、日和見菌)、ウイルス、真菌及び/又は寄生虫による)に罹患しやすい。同様に、対象に存在する創傷(例えば熱傷)は、細菌の増殖及び生存にとって理想的な場所を提供する。
【０００４】
医学的、獣医学的及び農学的目的で従来の医薬用抗生物質の使用が増大するにつれて、病原菌の抗生物質耐性菌が出現してきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗菌剤治療の代替戦略の開発が必要とされている。例えば、現在の抗菌治療の形態に対して非感受性の細菌系によって引き起こされる細菌感染症(例えば、菌血症)を治療又は予防する新しい組成物及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、嚢胞性線維症(CF)を有する対象における呼吸器感染症を治療又は予防する方法を対象とする。該方法は、一種又は複数種のグラム陽性又はグラム陰性菌種による感染症に罹患しやすいか、又はそれを有する対象に、ナノエマルジョンを投与するステップを含む。ナノエマルジョンは、水、少なくとも一種の有機溶媒、少なくとも一種の界面活性剤及び少なくとも一種の油を含む。さらにナノエマルジョンは、約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含む。本発明の一実施形態では、呼吸器感染症は、対象の肺に存在する細菌のバイオフィルムに関連している。
【０００７】
本発明の別の実施形態では、熱傷を有する対象の感染症を治療又は予防する方法が記載される。該方法は、一種又は複数種のグラム陽性又はグラム陰性菌種による感染症に罹患しやすいか、又はそれを有する対象に、ナノエマルジョンを投与するステップを含む。ナノエマルジョンは、水、少なくとも一種の有機溶媒、少なくとも一種の界面活性剤及び少なくとも一種の油を含む。さらにナノエマルジョンは、約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含む。
【０００８】
グラム陰性又はグラム陽性菌感染症を有するか、又はそれに罹患しやすい対象に向けた方法では、細菌は、任意の公知のグラム陰性又はグラム陽性菌であってよい。本発明の別の実施形態では、細菌種は、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属の種、ヘモフィルス(Haemophilus)属の種、シュードモナス(Pseudomonas)属の種、バークホルデリア(Burkholderia)属の種、アシネトバクター(Acinetobacter)属の種、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)属の種、エシェリキア(Escherichia)属の種、クレブシエラ(Klebsiella)属の種及びプロテウス(Proteus)属の種からなる群から選択される。細菌種は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginos)、B.セノセパシア(B. cenocepacia)、A.バウマンニ(A. baumannii)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus  aureus)、インフルエンザ菌(H. influenzae)、大腸菌(E. coli)、K.ニューモニエ(K. pneumoniae)及びプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)からなる群から選択することもできる。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態では、非CF対象のインフルエンザ菌感染症を治療又は予防する方法が記載される。該方法は、インフルエンザ菌感染症を有するか、又は有する危険性がある対象に、ナノエマルジョンを投与するステップを含む。ナノエマルジョンは、水、少なくとも一種の有機溶媒、少なくとも一種の界面活性剤及び少なくとも一種の油を含む。さらにナノエマルジョンは、約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含む。
【００１０】
本明細書に記載の全ての方法は、ナノエマルジョンの投与の前、最中又は後のいずれかに、一種又は複数種の抗生物質を投与するステップをさらに含むことができる。一実施形態では、ナノエマルジョン及び少なくとも一種の抗生物質の投与は相乗的である。「相乗作用」は、部分阻害濃度(FIC)指数、部分殺菌濃度(FBC)指数又はその組合せによって定義される通りであり得る。抗生物質を投与するステップを含む方法は、任意の抗生物質の使用を包含する。例示的な抗生物質には、それに限定されるものではないが、ポリミキシン抗生物質(例えば、コリスチン)又は任意のアミノグリコシド(例えば、トブラマイシン)が含まれる。好ましくは、抗生物質を利用する本発明の方法では、ナノエマルジョンは、抗生物質といかなる拮抗作用も示さない。
【００１１】
本明細書に記載の全ての方法について、好ましくは、ナノエマルジョンは最小の毒性若しくは副作用を示すか、又は毒性若しくは副作用を全く示さない。さらに好ましくは、ナノエマルジョンは耐性を示さない。本明細書に記載の全ての方法に適用できる別の実施形態では、ナノエマルジョンの最小阻害濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)又はその組合せは、ナノエマルジョンの静菌活性又は殺菌活性を示す。
【００１２】
本明細書に記載の全ての方法について、一種又は複数種の細菌種は、一種又は複数種の抗生物質に対する耐性を示し得る。例えば細菌種は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)であってよい。
【００１３】
本発明の方法の一実施形態では、ナノエマルジョンは、ヒト対象において全身的に吸収されず、又は該ナノエマルジョンは、ヒト対象において全身的にごくわずかに吸収される。
【００１４】
本発明の方法では、ナノエマルジョンは、任意の薬学的に許容される手段を使用して送達することができる。例えば、ナノエマルジョンは、吸入により、局所的に、粘膜表面に局所的に、噴霧により、又はその任意の組合せによって送達することができる。
【００１５】
本発明はまた、本発明の方法に有用な組成物を包含する。例示的な組成物には、それに限定されるものではないが、(a)水、(b)エタノール又はグリセロール、(c)塩化セチルピリジニウム(CPC)又は塩化ベンザルコニウム又はアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(BTC824)、(d)大豆油、及び(e)Poloxamer 407、Tween 80又はTween 20を含むナノエマルジョンが含まれる。さらなる一実施形態では、ナノエマルジョンは、EDTAをさらに含むことができる。
【００１６】
先の概要及び以下の図面の簡単な説明及び詳細な説明は、例示的且つ説明的であり、特許請求する本発明をさらに説明することを企図するものである。他の目的、利点及び新しい特徴は、本発明の以下の詳細な説明から、当業者には容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のナノエマルジョン(NE)による、10分でのPBS中のセパシア菌の死滅を示すグラフである。
【図２】単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のNEによる、20分でのPBS中のセパシア菌の死滅を示すグラフである。
【図３】単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のNEによる、40分でのPBS中のセパシア菌の死滅を示すグラフである。
【図４Ａ】(A)単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のNEによる、40分でのPBS中のセパシア菌の死滅を示すグラフである。
【図４Ｂ】(B)単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のNEによる、60分でのPBS中のセパシア菌の死滅を示すグラフである。
【図４Ｃ】(C)単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のNEによる、60分でのPBS中のセパシア菌の死滅を示すグラフである。
【図５】単独のNE及びEDTAと合わせたNEによる、15分及び30分での高張食塩水(6%NaCl)中のセパシア菌の死滅を示すグラフである。
【図６】7%NaCl中のセパシア菌及び緑膿菌の15分以内の死滅を示すグラフである。
【図７】7%NaCl中のセパシア菌及び緑膿菌(混合培養物)の15分以内の死滅を示すグラフである。
【図８】マイクロタイター段階希釈MICアッセイを示す画像である。プレートの上の数字は、ウェルの各縦行に加えたP4075ECの濃度(μg/ml、CPC)を示す。各横行のウェルに加えた細菌種を左側に示す。これらの株(上から下まで)に対するMICは、≦15.6μg/ml、125μg/ml、及び31.2μg/mlである。
【図９】バークホルデリア及び非バークホルデリアの150株に対するP4075ECのMICの分布を示すグラフである。
【図１０】CF痰による、P4075EC活性の時間-死滅試験及びP4075EC活性の濃度依存性阻害を示すグラフである。(A)105CFU/mlのB.マルチボランス、ATCC17616を、MIC(62.5μg/ml)前後の種々の濃度のP4075ECに曝露させ、示した時間における生存可能な細菌数を決定した。(B)105CFU/mlのB.マルチボランス、ATCC17616を、三つの濃度のCF痰の存在下で種々の濃度のP4075ECに24時間曝露させた後、生存可能な細菌数を決定した。挿入した四角内の数字及び記号は、使用したP4075ECの濃度(μg/ml、CPC)を示す。
【図１１】P4075ECのin vitroにおける活性を示す表である。
【図１２】バイオフィルム細菌に対するP4075ECのin vitroにおける活性及びCF痰の存在下でのP4075ECのin vitroにおける活性を示す表である。
【図１３】セパシア菌、緑膿菌及び大腸菌それぞれのバイオフィルムに対するP4075ECの影響を示すグラフである。
【図１４】混合したバイオフィルムに対するP4075ECの影響を示すグラフである。
【図１５】混合したバイオフィルムに対するP4075ECの影響を示すグラフである。
【図１６】セパシア菌バイオフィルムの逃避コロニーに対するP4075ECの影響を示すグラフである。
【図１７】本発明の一実施形態におけるP4075ECの段階的な2倍希釈を示す表である。
【図１８】CF患者における呼吸器感染症の年齢特異的な罹患率を示すグラフである。
【図１９】図19Aは、部分阻害濃度指数を示すグラフである。図19Bは、抗菌剤A(マイクログラム/mL)及び抗菌剤B(マイクログラム/mL)についての拮抗、不関、及び相乗効果の関係を実証するグラフである。
【図２０Ａ】電子顕微鏡の画像である。図2Aは0分、無処理の対照を示す。
【図２０Ｂ】電子顕微鏡の画像である。図2Bは処理の10分後を示す。
【図２０Ｃ】電子顕微鏡の画像である。図2Cは処理の20分後を示す。
【図２０Ｄ】電子顕微鏡の画像である。図2Dは処理の30分後を示す。
【図２１】ナノエマルジョンの局所適用により、熱傷創傷における緑膿菌の増殖が減少したことを示すグラフである。雄性のSprague-Dawleyラットに、中間層熱傷創傷を受けさせた。損傷の8時間後、動物に106CFUの緑膿菌を接種した。熱傷の16時間後及び24時間後に、動物を生理食塩水(対照)、プラセボ(塩化ベンザルコニウムなしのW205GBA2ED)、W205GBA2ED(ナノエマルジョン)、又はSulfamylon(酢酸マフェニド)を用いて局所的に処置した。32時間目に動物を屠殺し、皮膚試料を得、ホモジナイズし、プレーティングし、そしてCFUを計数した。散在しているプロットは、個々の動物それぞれについての培養されたCFUを示す。各群の中央値を横線でプロットしている。NB-201で処置した動物23体のうち12体において病原体の増殖が最小であった。熱傷損傷を有する対照動物の大部分(29/32)及びプラセボ動物の大部分(9/12)が、W205GBA2EDを用いて処置した動物よりも、創傷に存在する細菌が有意に多く、陽性の定量的な創傷培養物に基づく創傷感染症の証拠を有した。p<0.0001、クラスカル・ワルス検定、生理食塩水対W205GBA2ED、プラセボ対W205GBA2ED、及び生理食塩水対Sulfamylonについてp<0.05、ダンの多重比較検定。
【図２２】熱傷損傷後にナノエマルジョンで処置することにより、皮膚の炎症性サイトカインの発現が減衰することを示すグラフである。群は、偽、熱傷、及びW205GBA2ED処置を伴う熱傷であった(群当たりn=8〜10)。A)IL-1β(p=0.02、一元配置のANOVA)、B)IL-6(p=0.8)、C)TNF-α(p=0.5)、D)CINC-1(p=0.04)、E)CINC-3(p=0.005)、及びF)ミエロペルオキシダーゼ(p=0.07)。ナノエマルジョンを用いて処置した熱傷損傷動物では、無処置の中間層熱傷動物と比較してIL-1βレベル(1773±516pg/mL対5625±1743pg/mL)及びCINC-3レベル(225±66pg/mL対1589±527pg/mL)が低下した。*p<0.05、t検定又はチューキーの多重比較検定。
【図２３】緑膿菌の熱傷創感染後にナノエマルジョン処置することにより、皮膚の炎症性サイトカインの発現が減衰することを示すグラフである。全ての動物に熱傷損傷を受けさせ、群は、生理食塩水、プラセボ、W205GBA2ED、及びSulfamylonであった(群当たりn=10〜30)。A)IL-1β(p=0.001、一元配置のANOVA)、B)IL-6(p=0.07)、C)TNF-α(p=0.3)、D)CINC-1(p=0.8)、E)CINC-3(p=0.4)、及びF)ミエロペルオキシダーゼ(p=0.0001)。ナノエマルジョンを用いて処置した熱傷創傷感染動物では、IL-1βレベル(1007±157pg/mL対3054±499pg/mL)及びIL-6レベル(244±51pg/mL対485±73pg/mL)が低下した。ミエロペルオキシダーゼアッセイから明らかなように、ナノエマルジョン処置群及びSulfamylon処置群では、生理食塩水群及びプラセボ群と比較して皮膚の好中球分画の減少が実証されている(W205GBA2ED:0.09±0.02μg/mL、Sulfamylon:0.08±0.02μg/mL、生理食塩水:0.40±0.06μg/mL、プラセボ:0.45±0.11μg/mL)。*p<0.05、チューキーの多重比較検定。
【図２４】熱傷損傷により、皮膚のTGF-β発現が上方制御され、熱傷創傷感染症の状況においてナノエマルジョンを用いて処置することにより、創傷のTGF-βレベルが低下することを示すグラフである。抗炎症性サイトカインであるIL-IO及びTGF-βの皮膚におけるレベルを、熱損傷の32時間後に、ナノエマルジョンを用いて処置した動物、及び細菌に曝露し、ナノエマルジョン又はSulfamylonを用いて処置した動物の熱傷創傷において測定した。A)IL-10(p=0.4、一元配置のANOVA)及びB)TGF-β(p=0.0001)。中間層熱傷により、偽群と比較して皮膚に存在するTGF-βが増加した(624±55pg/mL対232±17pg/mL)。W205GBA2EDを用いて感染した熱傷創傷を治療することにより、無処置の熱傷群と比較して皮膚TGF-βレベルが有意に低下した(404±43pg/mL対624±55pg/mL)。Sulfamylon処置では、感染した熱傷創傷におけるIL-10又はTGF-βのレベルは抑制されなかった。*p<0.05、チューキーの多重比較検定。
【図２５】緑膿菌に感染し、生理食塩水又はナノエマルジョンによって処置した後の熱傷皮膚の断面組織像を示す画像である。どちらも、熱傷損傷の32時間後の皮膚の画像である。A)生理食塩水(対照)処置した動物からの代表的な断面図である(ヘマトキシリン及びエオシン×40)。B)W205GBA2ED(ナノエマルジョン)処置した動物の代表的な横断面である(ヘマトキシリン及びエオシン×40)。
【図２６】毛細管漏出及び組織水腫を定量化するためのエバンスブルーアッセイについて示すグラフである。エバンスブルーは、血清アルブミンに結合する色素であり、定量化して血管透過性を決定することができる。局所的にナノエマルジョン処置することにより、生理食塩水で処置した対照動物と比較して、熱損傷及び細菌の接種後の毛細管漏出が少なくなった(1.26±0.05エバンスブルーμg/組織mg対1.93±0.24エバンスブルーμg/組織mg、群当たりn=8)。*p=0.02、t検定。
【図２７】毛包細胞のアポトーシスを検出するために蛍光標識TUNEL染色した、中間層熱傷皮膚の顕微鏡写真である。熱傷の12時間後に皮膚試料を回収した。熱損傷の0時間後及び8時間後に処置を行った。全ての画像が倍率4O×である。
【図２８】中間層熱傷損傷後の毛包細胞のアポトーシスについてのTUNELアッセイについて示すグラフである。偽、熱傷+生理食塩水(対照)、熱傷+プラセボ(塩化ベンザルコニウムなしのW205GBA2ED)、及び熱傷+W205GBA2EDからの皮膚試料を、フルオレセイン標識TUNELアッセイのために薄片に切った。損傷の0時間後及び8時間後に処置を行った。この実験では熱傷を受けた皮膚への細菌接種は行わなかった。熱傷損傷を受け、処置された動物の間で、損傷の12時間後に回収した組織試料について毛包のアポトーシスの程度が有意に減少した(p=0.006、一元配置のANOVA)。偽対熱傷+生理食塩水、熱傷+生理食塩水対熱傷+プラセボ、及び熱傷+生理食塩水対熱傷+W205GBA2EDについて差異が見られた(*p<0.05、チューキーの多重比較検定)。
【図２９】OMP調製物の特徴付けを示す画像である。A)アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色。レーン1.DNAラダー;レーン2.高速遠心分離によって分離する前の全細胞溶解物(WCL);レーン3.100,000×gで回転させた後の上清(図1B、1C、及び1DのレーンB);レーン4.粗製OMP調製物(図1B、1C、及び1DのレーンC);レーン5.エンドトキシン(ET)枯渇OMP画分(図1B、1C、及び1DのレーンE)。容量分析的にローディングした銀染色B)OMP調製物のウェスタンブロット(C〜D)。レーンA.6000×gで遠心分離した後に生じた上清からのタンパク質をローディングした;レーンB.100,000×gで遠心分離した等量の上清;レーンC.粗製OMP(100,000×gで回転させ再懸濁させたペレット画分);レーンD〜J.エンドトキシン枯渇OMP画分(エンドトキシンカラムの連続的なフロースルー部分);レーンK〜N.エンドトキシンカラムの保持画分(デオキシコール酸ナトリウムを加えた後にカラムから再生される連続的な流体)。C)エンドトキシン枯渇OMP-NE調製物を用いて免疫化したマウスからの血清を用いて探索したウェスタンブロット。D)PBS中OMP調製物を用いて免疫化したマウスからの血清を用いて探索したウェスタンブロット。
【図３０】B.セノセパシアOMPに対する抗体応答を示すグラフである。A)ナノエマルジョンを含んだOMP調製物又はナノエマルジョンなしのOMP調製物を用いて免役化した後の、血清におけるIgG応答についてのELISAの結果である。血清抗OMP IgG抗体の濃度は、個々の血清±SEMにおけるエンドポイント力価の平均として示している。*は、抗OMP IgG力価における統計的差異(p<0.05)を示す。B)ナノエマルジョンを含んだ鼻内ワクチン接種又はナノエマルジョンなしの鼻内ワクチン接種の後の、OMPに対する粘膜の抗体sIgA及びIgG。sIgA及びIgGは、BAL溶液中で測定した。ODレベルを試料中のタンパク質含有量に対して標準化した。
【図３１】鼻内OMP-NEワクチンによって誘導された細胞型の免疫応答を示すグラフである。A)NE(OMP-NE)又はPBS(OMP-PBS)のいずれかと混合した5μgのOMPを用いて免疫化したマウスからの血清を、抗体のサブタイプの分布について分析した。結果は、全IgG力価に対する特異的なサブクラスIgGの比率として示している。*:IgG2bサブタイプとIgGlサブタイプの統計的差異を示す(p<0.05)。B)NE(OMP-NE)又はPBS(OMP-PBS)のいずれかと混合した5μgを用いて免疫化したマウスの脾細胞のサイトカインのプロファイリング。データは、OMPで活性化された脾細胞と活性化されていない脾細胞を比較する倍の変化±SEMで示し、ワクチン接種していないマウスにおける応答に対して標準化している。*:OMP-NE群とPBS中OMP群の統計的差異を示す(p<0.05)。
【図３２】OMP調製物中のタンパク質エピトープ及びLPSの同定を示す画像である。レーン1.タンパク質ラダー;レーン2.粗製OMP調製物;レーン3.プロテイナーゼKで消化された粗製OMP調製物;レーン4.エンドトキシン枯渇OMP;レーン5;プロテイナーゼKで消化されたエンドトキシン枯渇OMP。ウェスタンブロットは、示したように、PBS中OMP又はOMP-NEのいずれかで免疫化したマウスからの血清、又はモノクローナル抗鼻疽菌LPS抗体を用いて探索した。
【図３３】血清中和アッセイを示すグラフである。B.セノセパシア又はB.マルチボランスのcfuの減少の割合を、無処理の血清を有する試料と対照してプロットした。OMP-NEを用いて免疫化したマウスからの血清とPBS中OMP製剤を用いて免疫化したマウスからの血清の間でB.セノセパシア中和活性の統計的差異を観察した(5μgのOMP-NEに対してp=9.9×lO-5、15μgのOMP-NEに対して0.03)。OMP-NE用いて免疫化したマウスからの血清と未処置のマウスからの血清の間で、B.マルチボランスの交差中和活性を観察した(p=0.04)。*は、OMP-NEとPBS中OMPの中和活性における統計的に有意な差異を示す(p<0.05)。**は、OMP-NEワクチン接種したマウスと未処置のマウスの中和活性における統計的に有意な差異を示す(p<0.05)。
【図３４】肺及び脾臓のコロニー形成アッセイを示すグラフである。5×107cfuのB.セノセパシアで気管内攻撃した6日後に決定されたA)肺組織関連cfu及びB)脾臓組織関連cfu。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語及び句を、以下に定義する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「微生物」は、それに限定されるものではないが、細菌、ウイルス、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、プリオン及び寄生生物を含む任意の種又は種類の微生物を指す。微生物という用語は、別の生物(例えば、ヒトを含む動物及び植物)に対してそれら自体が病原性である生物と、別の生物にとって病原性である物質を生成するが、それ自体その他の生物にとって直接的に病原性又は感染性ではない生物の両方を包含する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「病原体」は、宿主において病状(例えば、感染症、敗血症等)を引き起こす生物学的作用物質を指す。「病原体」には、それに限定されるものではないが、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、プリオン及び寄生生物が含まれる。
【００２１】
用語「細菌(bacteria)」及び「細菌(bacterium)」は、原核生物界の門の全てを含む全ての原核生物を指す。この用語は、マイコプラズマ、クラミジア、アクチノミセス、ストレプトマイセス及びリケッチアを含む細菌とみなされる全ての微生物を包含することを企図する。球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラスト等を含む全ての形態の細菌が、この定義に含まれる。またこの用語には、グラム陰性又はグラム陽性である原核生物が含まれる。「グラム陰性」及び「グラム陽性」は、当技術分野で周知のグラム染色法による染色パターンを指す。(例えば、Finegold and Martin, Diagnostic Microbiology, 6th Ed., CV Mosby St. Louis, pp. 13-15 (1982)参照)。「グラム陽性菌」は、グラム染色で使用される第一色素を保持する細菌であり、このグラム染色は、染色した細胞を顕微鏡下で一般に紺青色から紫色に見えるようにするものである。「グラム陰性菌」は、グラム染色に使用される第一の色素を保持しないが、対比染色によって染色される。したがって、グラム陰性菌は一般に赤色に見える。いくつかの実施形態では、細菌は継続的に培養される。いくつかの実施形態では、細菌は培養されず、それらの自然環境に(例えば、創傷又は感染症の部位に)存在するか、又は患者の組織から得られる(例えば生研によって)。細菌は、病的成長又は増殖を示し得る。細菌の例には、それに限定されるものではないが、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)、エシェリキア(Escherichia)、エンテロバクター(Enterobacter)、セラチア(Serratia)、プロテウス(Proteus)、エルシニア(Yersinia)、シトロバクター(Citrobacter)、エドワージエラ(Edwardsiella)、プロビデンシア(Providencia)、クレブシエラ(Klebsiella)、ハフニア(Hafnia)、エウィンゲラ(Ewingella)、クライベラ(Kluyvera)、モルガネラ(Morganella)、プラノコッカス(Planococcus)、ストマトコッカス(Stomatococcus)、ミクロコッカス(Micrococcus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ビブリオ(Vibrio)、エロモナス(Aeromonas)、プレジオモナス(Plessiomonas)、ヘモフィルス(Haemophilus)、アクチノバチルス(Actinobacillus)、パスツレラ(Pasteurella)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、ウレアプラズマ(Ureaplasma)、リケッチア(Rickettsia)、コクシエラ(Coxiella)、ロシャリメア(Rochalimaea)、エーリキア(Ehrlichia)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、アエロコッカス(Aerococcus)、ゲメラ(Gemella)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、ペディオコッカス(Pedicoccus)、バチルス(Bacillus)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、アルカノバクテリウム(Arcanobacterium)、アクチノミセス(Actinomyces)、ロドコッカス(Rhodococcus)、リステリア(Listeria)、エリシペロスリクス(Erysipelothrix)、ガードネレラ(Gardnerella)、ナイセリア(Neisseria)、カンピロバクター(Campylobacter)、アーコバクター(Arcobacter)、ウォリネラ(Wolinella)、ヘリコバクター(Helicobacter)、アクロモバクター(Achromobacter)、アシネトバクター(Acinetobacter)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、クリセオモナス(Chryseomonas)、コマモナス(Comamonas)、エイケネラ(Eikenella)、フラビモナス(Flavimonas)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、モラクセラ(Moraxella)、オリゲラ(Oligella)、シュードモナス(Pseudomonas)、シュワネラ(Shewanella)、ウィークセラ(Weeksella)、ザントモナス(Xanthomonas)、ボルデテラ(Bordetella)、フランシセラ(Franciesella)、ブルセラ(Brucella)、レジオネラ(Legionella)、アフピア(Afipia)、バルトネラ(Bartonella)、カリマトバクテリウム(Calymmatobacterium)、カルジオバクテリウム(Cardiobacterium)、ストレプトバチルス(Streptobacillus)、スピリルム(Spirillum)、ペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)、ペプトコッカス(Peptococcus)、サルシナ(Sarcinia)、コプロコッカス(Coprococcus)、ルミノコッカス(Ruminococcus)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、モビルンカス(Mobiluncus)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ユーバクテリウム(Eubacterium)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ロチア(Rothia)、クロストリジウム(Clostridium)、バクテロイド(Bacteroides)、ポルフィロモナス(Porphyromonas)、プレボテラ(Prevotella)、フソバクテリウム(Fusobacterium)、バイロフィラ(Bilophila)、レプトトリキア(Leptotrichia)、ウォリネラ(Wolinella)、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)、メガスフェラ(Megasphaera)、ベイヨネラ(Veilonella)、ノカルジア(Norcardia)、アクチノマヅラ(Actinomadura)、ノカルジオプシス(Norcardiopsis)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ミクロポリスポラス(Micropolysporas)、サーモアクチノミセス(Thermoactinomycetes)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、トレポネーマ(Treponema)、ボレリア(Borrelia)、レプトスピラ(Leptospira)及びクラミジア(Chlamydiae)を含む群から選択される細菌の属の細菌細胞が含まれる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「微生物(microorganism)」及び「微生物(microbe)」は、それに限定されるものではないが、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ及び寄生生物を含む、任意の種又は種類の微生物を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「真菌」は、二形性真菌を含むカビ及び酵母などの真核生物を指して使用される。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「疾患」及び「病的状態」は、本明細書では別段の指定がない限り交換可能に使用され、種又は群(例えば、ヒト)のメンバーについて正常又は平均であるとみなされる状態から逸脱することを説明するものであり、その種又は群の個体の大多数にとって有害ではない条件下において罹患している個体にとっては有害な状態である。かかる逸脱は、正常機能の遂行を妨害又は変更する、対象又はその器官若しくは組織のいずれかの正常状態の任意の機能障害に関連する状態、徴候及び/又は症候(例えば、下痢、悪心、発熱、疼痛、水疱、おでき、発疹、免疫抑制、炎症等)として現れ得る。疾患又は病的状態は、微生物(例えば、病原体又は他の感染性物質(例えば、ウイルス又は細菌))によって生じ、又はそれとの接触から生じることがあり、環境因子(例えば、栄養障害、工業災害及び/又は気候)に応答性があり、生物の固有の欠損(例えば、遺伝的異常)又はこれら及び他の因子の組合せに応答性があり得る。
【００２５】
「呼吸器」及び「呼吸」は、鼻、喉、喉頭、気管、気管支及び肺を含む身体系を介して酸素が身体に取り込まれ、二酸化炭素が放出される過程を指す。
【００２６】
「呼吸器感染症」及び「肺感染症」は、呼吸器の感染症(例えば、細菌、ウイルス、真菌等の)を指す。ヒトにおいては、呼吸器は、上気道(例えば、鼻、喉又は咽頭及び喉頭)、気道(例えば、発声器又は喉頭、気管(windpipe)又は気管(trachea)及び気管支)、及び肺(例えば、気管支、気管支梢、肺胞管、肺胞嚢及び肺胞)を含む。
【００２７】
「呼吸器疾患」、「肺疾患」、「呼吸器障害」、「肺障害」、「呼吸器状態」、「肺状態」、「肺症候群」及び「呼吸器症候群」は、炎症を伴い、特に気管、気管支及び肺を含む呼吸器系の構成要素に影響を及ぼすいくつかの病気のいずれか一つを指す。かかる病気の例には、急性肺胞疾患、閉塞性呼吸器疾患(例えば、喘息、気管支炎及びCOPDと呼ばれる慢性閉塞性肺疾患)、上気道疾患(例えば、中耳炎、及び鼻炎/副鼻腔炎など)、間質性(insterstitial)肺疾患、アレルギー及び呼吸器感染症(例えば、肺炎、ニューモシスチス・カリニ(pneyumocystis carinii)及び呼吸器シンシチウム(syncitial)ウイルス(RSV))が含まれる。
【００２８】
急性肺胞疾患の具体例には、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、胎便吸引症候群(MAS)及び呼吸促迫症候群(RDS)が含まれる。ALIは、肺の気嚢である肺胞に直接又は間接的に損傷を与える状態に関連している。ALIは、肺のサーファクタント層の関連する崩壊を伴う肺の炎症及び透過性の増大の症候群である。ALIの最も重篤な徴候は、ARDSである。ALIの原因には、一般にいくつかの主な外科手術に関連する合併症、人工呼吸器によって誘発される肺損傷(しばしばVILIと呼ばれる)、煙吸引、肺炎及び敗血症がある。
【００２９】
用語「対象」は、本明細書で使用される場合、本発明の組成物によって治療される生物を指す。かかる生物には、動物(家畜動物種、野生動物)及びヒトが含まれる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「不活化する」、「不活化」及び文法的な等価表現は、微生物を参照して使用される場合、感染し、並びに/或いは宿主の病的応答及び/又は疾患を引き起こす微生物の能力を、死滅、排除、中和及び/又は低減することを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「融合性の(fusigenic)」は、微生物因子(例えば、バクテリア又は細菌の胞子)の膜と融合することができるエマルジョンを指すことを企図する。融合性エマルジョンの具体例を、本明細書に記載する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「溶原性」は、微生物因子(例えば、ウイルス(例えば、ウイルスエンベロープ)又はバクテリア、細菌の胞子若しくは細菌のバイオフィルム)の膜を破壊することができるエマルジョン(例えば、ナノエマルジョン)を指す。本発明の好ましい実施形態では、同じ組成物中の溶原性及び融合性薬剤の存在は、いずれかの薬剤のみと比較して強化された不活化作用をもたらす。この改善された抗微生物組成物を使用する方法及び組成物を、本明細書に詳細に記載する。
【００３３】
用語「ナノエマルジョン」は、本明細書で使用される場合、水非混和性油相が水相と混合されるときに水から無極性残基(即ち、長い炭化水素鎖)を離し、極性頭部基を水に向かわせる疎水力の結果として形成し得る分散液又は液滴、並びに他の脂質構造を含む。これらの他の脂質構造には、それに限定されるものではないが、単層、少数層(paucilamellar)及び多層脂質小胞、ミセル並びに層状の相が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「接触する」、「接触した」、「曝露する」及び「曝露された」は、ナノエマルジョン及び生きている微生物に言及して使用される場合、ナノエマルジョンが、存在する場合には微生物又は病原性物質を死滅させ、且つ/又はその成長を減弱するように、一つ又は複数のナノエマルジョンを微生物(例えば、病原体)と接触させることを指す。本発明は、微生物の死滅及び/又は成長の減衰のために使用されるナノエマルジョンの量又は種類によって制限されない。本発明における使用が見出される様々なナノエマルジョンが、本明細書及び他所に記載されている(例えば、それぞれその全体があらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第20020045667号及び第20040043041号、並びに米国特許第6,015,832号、第6,506,803号、第6,635,676号及び第6,559,189号に記載のナノエマルジョン)。それに限定されるものではないが、本明細書に記載のもの(例えば、実施例1〜4、それに関連する図及び図17における)を含むナノエマルジョンの比及び量が、本発明では企図される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「約」は、当業者によって理解されるものであり、それが使用される状況に応じてある程度変わることになる。それが使用される状況が与えられた当業者にとって明確ではない用語が使用される場合、「約」は、その特定の用語の最大10%プラス又はマイナスを意味する。
【００３６】
用語「界面活性剤」は、水による溶媒和をエネルギー的に好む極性頭部基と、水によって十分に溶媒和されない疎水性の尾部の両方を有する任意の分子を指す。用語「カチオン性界面活性剤」は、カチオン性頭部基を有する界面活性剤を指す。用語「アニオン性界面活性剤」は、アニオン性頭部基を有する界面活性剤を指す。
【００３７】
用語「親水性-親油性バランス指数」及び「HLB指数」は、界面活性剤分子の化学的構造と、それらの表面活性との相関指数を指す。HLB指数は、参照によって本明細書に組み込まれるMeyers(Meyers, Surfactant Science and Technology, VCH Publishers Inc., New York, pp. 231-245 [1992])によって記載の通り、様々な実験式によって算出することができる。本明細書で使用される場合、界面活性剤のHLB指数は、McCutcheon's Volume 1: Emulsifiers and Detergents North American Edition, 1996(参照によって本明細書に組み込まれる)の界面活性剤に割り当てられたHLB指数である。HLB指数は、市販の界面活性剤については0〜約70又はそれを超える範囲をとる。高い水溶性及び可溶化特性を有する親水性界面活性剤は高性能であり、低い水溶性の界面活性剤は、水の油への良好な可溶化剤であるが性能が低い。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「相互反応強化剤」は、エマルジョンと微生物(例えば、細菌(例えばグラム陰性菌)の細胞壁又はウイルスエンベロープとの相互反応を強化するように作用する化合物を指す。企図される相互反応強化剤には、それに限定されるものではないが、キレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)テトラ酢酸(EGTA)等)及び特定の生物学的作用物質(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)等)が含まれる。
【００３９】
用語「バッファー」又は「緩衝剤」は、それを溶液に添加すると溶液がpHの変化に抵抗する材料を指す。
【００４０】
用語「還元剤」及び「電子供与体」は、電子を第二の材料に供与させて、第二の材料の原子の一つ又は複数の酸化状態を低減する材料を指す。
【００４１】
用語「一価の塩」は、その金属(例えば、Na、K又はLi)が、溶液中、正味1+の電荷(即ち、電子よりも一つ多い陽子)を有する任意の塩を指す。
【００４２】
用語「二価の塩」は、その金属(例えば、Mg、Ca又はSr)が、溶液中、正味2+の電荷を有する任意の塩を指す。
【００４３】
用語「キレーター」又は「キレート剤」は、金属イオンと結合するのに利用可能な孤立電子対を有する二つ以上の電子を有する任意の材料を指す。
【００４４】
用語「溶液」は、水性又は非水性混合物を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、有益な又は所望の結果(例えば、感染症を治療且つ/又は予防すること(例えば、細菌の細胞を死滅させ、且つ/又は細菌の細胞増殖を予防することにより)を得るのに十分な組成物(例えば、ナノエマルジョンを含む組成物)の量を指す。有効量は、一回又は複数回の投与、適用又は用量で投与することができ、特定の製剤又は投与経路に限定されるものではない。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「免疫応答を誘発する組成物」は、対象に投与される場合(例えば、一回、二回、三回又はそれ以上(例えば、週、月又は年で分けて))、対象の免疫応答を刺激し、発生させ、且つ/又は引き出す(例えば、疾患を引き起こすことができる微生物(例えば、病原体)に対する完全な又は部分的な免疫をもたらす)組成物を指す。本発明の好ましい実施形態では、組成物は、ナノエマルジョン及び免疫原を含む。さらに好ましい実施形態では、ナノエマルジョン及び免疫原を含む組成物は、それに限定されるものではないが、治療剤、生理的に許容される液体、ゲル、担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、サリチル酸塩、ステロイド、免疫抑制剤、免疫賦活薬、抗体、サイトカイン、抗生物質、結合剤、充填剤、保存剤、安定化剤、乳化剤及び/又はバッファーを含む一つ又は複数の他の化合物又は薬剤を含む。免疫応答は、先天性(例えば、非特異的)免疫応答又は学習的(例えば、後天性)免疫応答(例えば、対象の感染性、罹患率又は死亡率の発生(例えば、病原微生物への曝露によって引き起こされる)を低減し、又は対象の感染性、罹患率又は死亡率の発生(例えば、病原微生物への曝露によって引き起こされる)を予防する)であってよい。したがっていくつかの好ましい実施形態では、ナノエマルジョン及び免疫原を含む組成物は、対象にワクチンとして投与される(例えば、疾患を予防又は減弱するため(例えば、疾患に対する完全な又は部分的な免疫を対象にもたらし、或いは疾患の徴候、症候又は状態の完全な又は部分的な減衰(例えば抑制)をもたらすことによって)。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」は、免疫応答(例えば、粘膜免疫応答)を刺激することができる任意の物質を指す。いくつかのアジュバントは、免疫系の細胞の活性化を引き起こす(例えば、アジュバントによって免疫細胞はサイトカインを生成し、分泌することができる)。免疫系の細胞の活性化を引き起こすことができるアジュバントの例には、それに限定されるものではないが、本明細書に記載のナノエマルジョン製剤、QS21(HPLC分取により21番目のピークで溶離する糖脂質;Aquila Biopharmaceuticals, Inc.、Worcester、Mass.)などの、Q.サポナリア(saponaria)の木の樹皮から精製したサポニン;ポリ(ジ(カルボキシレートフェノキシ)ホスファゼン(PCPPポリマー;Virus Research Institute、USA);モノホスホリル脂質A(MPL;Ribi ImmunoChem Research, Inc.、Hamilton、Mont.)、ムラミルジペプチド(MDP;Ribi)及びスレオニル-ムラミルジペプチド(t-MDP;Ribi)などのリポ多糖の誘導体;OM-174(脂質Aに関係するグルコサミン二糖;OM Pharma SA、Meyrin、Switzerland);コレラ毒素(CT)、並びにリーシュマニア(Leishmania)伸長因子(精製したリーシュマニアタンパク質;Corixa Corporation、Seattle、Wash.)が含まれる。従来のアジュバントは当技術分野で周知であり、それには、例えばアルミニウムのリン酸塩又は水酸化物塩(「alum」)が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、一つ又は複数のアジュバントと共に投与される(例えば、免疫応答をTh1及び/又はTh2型応答に偏らせるため)。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「免疫応答を誘発するのに有効な量」(例えば、免疫応答を誘発する組成物の)は、対象における免疫応答を刺激し、発生させ、且つ/又は引き出すのに必要な(例えば、対象に投与される場合に)投与量レベルを指す。有効量は、一回又は複数回の投与(例えば、同じ又は異なる経路を介して)、適用又は用量で投与することができ、特定の製剤又は投与経路に限定されるものではない。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「対象が免疫応答を発生する条件下」は、免疫応答(例えば、先天性又は後天性)の任意の質的又は量的誘発、発生及び/又は刺激を指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「免疫応答」は、対象の免疫系による任意の検出可能な応答を指す。例えば免疫応答には、それに限定されるものではないが、トール受容体活性化、リンホカイン(例えば、サイトカイン(例えば、Th1又はTh2型サイトカイン)又はケモカイン)の発現及び/又は分泌、マクロファージ活性化、樹状細胞活性化、T細胞(例えば、CD4+又はCD8+T細胞)活性化、NK細胞活性化、並びに/或いはB細胞活性化(例えば、抗体の産生及び/又は分泌)の変化(例えば増加)が含まれる。免疫応答のさらなる例には、免疫原(例えば、抗原(例えば、免疫原性ポリペプチド))とMHC分子の結合及び細胞傷害性Tリンパ球(「CTL」)応答の誘発、B細胞応答(例えば、抗体産生)及び/又はT-ヘルパーリンパ球応答及び/又は遅発性過敏症(DTH)応答(例えば、免疫原性ポリペプチドが由来する抗原に対する)の誘発、免疫系の細胞(例えば、T細胞、B細胞(例えば任意の発生段階の(例えば、血漿細胞)の増殖(例えば、細胞集団の成長)、並びに抗原提示細胞による抗原の処理及び提示の増大が含まれる。免疫応答は、対象の免疫系が異物として認識される免疫原(例えば、微生物(例えば、病原体)由来の非自己抗原、又は異物として認識される自己抗原)に対するものであってよい。したがって本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、それに限定されるものではないが、先天性免疫応答(例えば、トール受容体シグナル伝達カスケードの活性化)細胞媒介性免疫応答(例えば、T細胞(例えば、抗原特異的T細胞)及び免疫系の非特異的細胞によって媒介される応答)、並びに液性免疫応答(例えば、B細胞によって媒介される応答(例えば、血漿、リンパ液、及び/又は組織液内での抗体の産生及び分泌による)を含む任意の種類の免疫応答を指すことを理解されたい。用語「免疫応答」は、抗原及び/又は免疫原に対して対象の免疫系が応答する能力(例えば、免疫原(例えば、病原体)に対する最初の応答、並びに適応性免疫応答の結果である後天性(例えば、記憶)応答の両方)の全ての態様を包含することを意味する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「免疫」は、疾患を引き起こすことができる微生物(例えば、病原体)への曝露時に、疾患から保護すること(例えば、疾患の徴候、症候又は状態の予防又は減弱(例えば抑制))を指す。免疫は、先天性(例えば、予め抗原に曝露されないで存在する非適応性(例えば、非後天性)免疫応答)、及び/又は後天性(例えば、抗原に予め曝露された後のB及びT細胞(例えば、抗原に対して高い特異性及び反応性を示す)によって媒介される免疫応答)であってよい。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「免疫原」及び「抗原」は交換可能に使用され、対象の免疫応答を引き出すことができる薬剤(例えば、微生物(例えば、細菌、ウイルス又は真菌)及び/又はその部分若しくは成分(例えば、タンパク質抗原))を指す。好ましい実施形態では、免疫原は、本発明のナノエマルジョンと併用投与される場合、免疫原(例えば、微生物(例えば、病原体又は病原体産物))に対する免疫を引き出す。本明細書で使用される場合、バークホルデリア抗原という用語は、対象に投与される場合に免疫応答を引き出すバークホルデリア属の細菌の成分又は産物を指す。抗原は、それに限定されるものではないが、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、核酸、膜画分及び多糖を含む生物(例えば、バークホルデリア属の細菌)に由来する成分又は産物であってよい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「強化された免疫」は、組成物が投与されていない対象における適応性及び/又は後天性免疫のレベルと比較した、組成物を投与した後の所与の免疫原(例えば微生物(例えば病原体))に対する対象の適応性及び/又は後天性免疫のレベルの増大を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「精製される」又は「精製すること」は、サンプル又は組成物から汚染物質又は望ましくない化合物を除去することを指す。本明細書で使用される場合、用語「実質的に精製された」は、サンプル又は組成物から汚染物質又は望ましくない化合物を約70〜90%、最大100%除去することを指す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「投与」及び「投与すること」は、生理系(例えば、対象、又はインビボ、インビトロ若しくはエクスビボ細胞、組織及び器官)に対して薬物、プロドラッグ又は他の薬剤若しくは治療用処置(例えば、本発明の組成物)を与える行為を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「併用投与」及び「併用投与すること」は、対象に、少なくとも二つの薬剤(複数可)(例えば、ナノエマルジョン及び一つ又は複数の他の薬学的に許容される物質(例えば、第二のナノエマルジョン))又は療法を投与することを指す。いくつかの実施形態では、二つ以上の薬剤又は療法の併用投与は同時である。他の実施形態では、第一の薬剤/療法は、第二の薬剤/療法の前に投与される。いくつかの実施形態では、併用投与は、同じ又は異なる投与経路を介して行うことができる。当業者は、使用される様々な薬剤又は療法の製剤及び/又は投与経路が変わり得ることを理解されよう。併用投与の適切な用量は、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、薬剤又は療法が併用投与される場合、それぞれの薬剤又は療法は、それらの単独の投与に適した用量よりも低い用量で投与される。したがって併用投与は、薬剤若しくは療法の併用投与によって、潜在的に有害な(例えば、毒性)薬剤(複数可)の必須用量が低減される実施形態において、及び/又は二つ以上の薬剤の併用投与が、他の薬剤の併用投与を介して薬剤の一つの有益な作用に対する対象の感受性をもたらす場合に、特に望ましい。他の実施形態では、併用投与は、二つ以上の種類の感染病原体(例えば、細菌及び/又はウイルス)による感染症を治療且つ/又は予防することが好ましい。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「局所」は、皮膚及び/又は粘膜細胞及び組織(例えば、肺胞、頬側、舌、咀嚼、膣内又は鼻粘膜、並びに中空器官又は体腔を覆う他の組織及び細胞)の表面に、本発明の組成物(例えば、ナノエマルジョンを含む組成物)を適用することを指す。本明細書に記載の組成物は、例えば、鼻腔内、頬側、舌下、経口、直腸、眼、非経口(静脈内、皮内、筋肉内、皮下、嚢内、腹腔内)、肺、膣内、局所(locally)投与、局所(topically)投与、経粘膜投与、エアゾールによる、又は頬側若しくは点鼻薬製剤などによる、任意の薬学的に許容される方法を使用して適用することができる。さらに、本明細書に記載のナノエマルジョンワクチンは、液体分散剤、ゲル、エアゾール、肺エアゾール、鼻エアゾール、軟膏、クリーム剤、半固体剤形及び懸濁剤などの任意の薬学的に許容される剤形に製剤化することができる。さらに組成物は、制御放出製剤、徐放製剤、即時放出製剤又はその任意の組合せであってよい。
【００５８】
用語「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」は、本明細書で使用される場合、宿主(例えば、動物又はヒト)に投与されるときに有害なアレルギー反応又は免疫反応を実質的にもたらさない組成物を指す。かかる製剤には、浸漬、スプレー、種子粉衣、茎部(stem)注入、スプレー及び噴霧が含まれる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、任意の且つ全ての溶媒、分散媒、コーティング、湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)、等張剤及び吸収遅延剤、崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプン又はナトリウムデンプングリコール酸)等が含まれる。担体、安定剤及びアジュバントの例は説明されており、当技術分野で公知である(例えば、参照によって本明細書に組み込まれるMartin、Remington's Pharmaceutical Sciences、15th Ed.、Mack Publ. Co.、Easton、Pa.(1975年)参照)。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される塩」は、標的対象において生理的に耐性のある本発明の組成物の任意の塩(例えば、酸又は塩基との反応によって得られる)を指す。本発明の組成物の「塩」は、無機又は有機酸及び塩基に由来し得る。酸の例には、それに限定されるものではないが、塩酸、臭化水素、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、スルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が含まれる。シュウ酸などの他の酸は、それら自体薬学的に許容されないが、本発明の組成物及びそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得るのに中間体として有用な塩の調製に使用することができる。
【００６０】
塩基の例には、それに限定されるものではないが、アルカリ金属(例えば、ナトリウム)水酸化物、アルカリ土類金属(例えば、マグネシウム)水酸化物、アンモニア及び式NW4+の化合物(式中、WはC1〜4アルキルである)等が含まれる。
【００６１】
塩の例には、それに限定されるものではないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸(flucoheptanoate)、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩(palmoate)、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩等が含まれる。塩の他の例には、Na+、NH4+及びNW4+(式中、WはC1〜4アルキル基である)などの適切なカチオンと組み合わせた本発明の化合物のアニオンが含まれる。治療上の使用に関して、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されるものとして企図される。しかし、薬学的に許容されない酸及び塩基の塩にも、例えば、薬学的に許容される化合物の調製又は精製における使用を見出すことができる。
【００６２】
治療上の使用に関して、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されるものとして企図される。しかし、薬学的に許容されない酸及び塩基の塩にも、例えば、薬学的に許容される化合物の調製又は精製における使用を見出すことができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「疾患の危険性がある」及び「感染症の危険性がある」は、特定の疾患及び/又は感染症を経験しやすい対象を指す。この素因は、遺伝的(例えば、遺伝性障害などの疾患を経験する特定の遺伝的傾向)であり得、又は他の因子(例えば、環境条件、環境に存在する有害な化合物への曝露等)によるものであり得る。したがって本発明は、任意の特定の危険性(例えば、対象は、病原体を伝染させる危険性を担持する他のヒトに単に曝露され、相互作用することによって「疾患の危険性」にあり得る)に限定されるものではなく、本発明は、任意の特定の疾患及び/又は感染症に限定されるものでもない。
【００６４】
「経鼻適用」は、本明細書で使用される場合、鼻を介して、鼻若しくは洞経路又はその両方に適用されることを意味する。適用は、例えば鼻及び洞経路に適用されるドロップ、スプレー、噴霧、コーティング又はその混合物によって実施され得る。
【００６５】
「肺適用」及び「肺投与」は、本発明の組成物を、対象の肺系に適用する任意の手段を指す。本発明は、投与の任意の特定の手段に限定されない。実際、本明細書に記載の手段を含む様々な手段が、肺投与に有用であることが企図される。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、材料を送達するための任意の送達系を指す。本発明のナノエマルジョン組成物の状況下では、かかる送達系には、組成物及び/又は支持材料(例えば、材料等の使用に関する取扱説明書)の保存、ある場所から別の場所への輸送又は配送を可能にする系が含まれる。例えば、キットは、関連するナノエマルジョン及び/又は支持材料を含有する一つ又は複数の同封物(例えば箱)を含む。本明細書で使用される場合、用語「細分化キット」は、それぞれ全てのキット成分の一部を含有する二つ以上の別個の容器を含む送達系を指す。各容器は、一緒に又は別個に、所期のレシピエントに送達することができる。例えば、第一の容器は、特定の使用に合わせたナノエマルジョンを含む組成物を含有することができ、第二の容器は、第二の薬剤(例えば、抗生物質又はスプレーアプリケーター)を含有する。実際、それぞれ全てのキット成分の一部を含有する二つ以上の別個の容器を含む任意の送達系は、用語「細分化キット」に含まれる。対照的に、「組合せキット」は、単一の容器における(例えば、所望の成分のそれぞれを収容する単一の箱における)特定の使用に必要な組成物の成分の全てを含有する送達系を指す。用語「キット」は、細分化キット及び組合せキットの両方を含む。
【００６７】
本発明は、肺感染症の治療に有用な方法及び組成物に関する。特に本発明は、バイオフィルムに関連している細菌(例えば、肺感染症において見出される)を治療するためのナノエマルジョン組成物及びその使用方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、中でも、臨床(例えば、治療用及び予防用医薬品)、工業及び研究適用における使用が見出される。
【００６８】
いくつかの病原微生物は、胃腸管、中咽頭、呼吸器又は尿生殖器路を覆う粘膜上皮細胞と接触することによって感染症を惹起する。インフルエンザウイルス、パラ百日咳菌又はコレラ菌などのいくつかの病原体は、粘膜組織において又はその中に残り、チフス菌又は肝炎Aウイルスなどの他のものは、より深い組織への浸透を可能にする機構を有し、全身に伝播する。粘膜の特異的及び非特異的防御機構は、両方の種類の病原体に対する一次保護を提供する。非特異的エフェクターには、在住マクロファージ、抗菌ペプチド、ラクトフェリン及びリゾチーム、極度のpH、胆汁酸、消化酵素、粘液、上皮細胞の脱落、フラッシング機構(ぜん動、繊毛の拍動、排尿(micturation)等)及び局所細菌叢との競合が含まれる。しかし、首尾よい病原体は一般に、それらが感染する部位に存在する非特異的防御を生き延びるための進化した手段を有しており、その分泌免疫系が、いくつかの細菌性及びウイルス性病原体によって引き起こされる疾患に対する保護において主な役割を担い、粘膜表面に限定される病原体に対する主なエフェクターとなる可能性が高い。全身に伝播する生物に関して、局所性及び全身性免疫応答の両方が、最適な免疫にとって望ましい。
【００６９】
本明細書に記載の通り、特定の微生物(例えば、細菌)は、正常な及び/又は健康な免疫系がある理由又は別の理由で適切に機能しない場合に繁栄することができる。嚢胞性線維症(CF)、喘息、HIV感染症、化学療法及び他の状態の宿主は、普通ならば健康な対象において病理を引き起こすことができる微生物から保護し、その微生物を除去するように機能するはずの免疫応答の機能不全及び/又は減衰に至る。
【００７０】
例えば、緑膿菌は、易感染性の高齢者の癌化学療法患者及びCFに罹患している個体に感染する日和見病原体である。CF肺疾患では、緑膿菌は、気道上皮を覆う肥厚性の低酸素性乾燥粘液中に捕捉される。形態的データは、CF患者の気道内腔が、球状の微小コロニーとして特徴付けられる緑膿菌バイオフィルムを宿すことを示唆している。
【００７１】
他の種類の微生物は、別の健康な宿主対象において病理を引き起こすことがある。例えば、グラム陰性球桿菌としてのパラ百日咳菌による呼吸器のコロニー形成は、ヒトの乳児の罹患率及び死亡率の重要な原因である百日咳(pertussis)とも呼ばれる百日咳(whooping cough)をもたらす。ボルデテラの他の二つの近縁単離株、パラ百日咳菌(B.parapertussis)及び気管支敗血症菌(B.bronchiseptica)も、ヒトにおいて見出されている。分子遺伝的分析は、別個の種として分類されるこれら三種類の単離株が、非常に近縁であることを示唆している。(Gilchrist. M. J. R., 1991, "Bordetella", in Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., Balows, A. et al., eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C.参照)。百日咳は、それが産生する毒素の性質において気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌とは異なるが、気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌は、実に活性な毒素を産生し(Hausman, S. Z. et al., 1996, Infect. Immun. 64: 4020-4026参照)、百日咳生物はパラ百日咳菌表現型に変換し得ることを示すいくらかの証拠がある(Gilchrist, M. J. R., 1991, "Bordetella", in Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., Balows, A. et al., eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C.)。
【００７２】
したがって本発明は、呼吸器感染症の治療のための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、シュードモナス(例えば、緑膿菌、P.パウシモビリス(P. paucimobilis)、P.プチダ(P. putida)、P.フルオレッセンス(P. fluorescens)及びP.アシドボランス(P. acidovorans))、ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、連鎖球菌(肺炎連鎖球菌を含む)、大腸菌、クレブシエラ、エンテロバクター、セラチア、ヘモフィルス、ペスト菌、類鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei)、B.セパシア、B.グラディオリ(B. gladioli)、B.マルチボランス(B. multivorans)、B.ベトナミエンシス(B. vietnamiensis)、ヒト型結核菌、M.アビウム(M. avium)コンプレックス(MAC)(M.アビウム及びM.イントラセルラーレ(M. intracellulare))、M.カンサシ(M. kansasii)、M.ゼノピ(M. xenopi)、M.マリナム(M. marinum)、M.ウルセランス(M. ulcerans)又はM.フォーチュイタム(M. fortuitum)コンプレックス(M.フォーチュイタム及びM.ケロネイ(M. chelonei))、パラ百日咳菌(Bordetella pertussis)、パラ百日咳菌(B. parapertussis)及び気管支敗血症菌の一つ又は複数によって引き起こされる呼吸器感染症(例えば、嚢胞性線維症患者における)を治療且つ/又は予防するために使用することができる。さらに、本発明の組成物及び方法は、呼吸器感染症(例えば、上気道(例えば、鼻、耳、洞及び喉)及び下気道(例えば、気管、気管支及び肺)の呼吸器感染症)の宿主の治療及び/又は予防における使用が見出される。治療できる(例えば死滅させ、且つ/又は成長を減弱させる(例えば、対象の呼吸器内))微生物のいくつかの例を、以下に提示する。
【００７３】
したがっていくつかの実施形態では、本発明は、ナノエマルジョンを含む組成物、並びに呼吸器感染症を予防且つ/又は治療するための肺へのその投与方法を提供する。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンは、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む。本発明は、使用されるEDTAの量によって制限されない。いくつかの実施形態では、0.01〜0.1mM、0.1〜1.0mM、1.0〜1.5mM、1.5〜2.5mM、2.5〜5.0mM、5.0〜10.0mM、10〜20mM、20〜30m又は30〜50mMのEDTAが使用される。しかし本発明は、EDTAのこの量に限定されない。いくつかの実施形態では、0.01mM未満又は50mM超のEDTAが利用される。いくつかの実施形態では、組成物は、高張塩(例えば、塩化ナトリウム)溶液(例えば、6〜7%、1〜3%、3〜6%、0.1〜1%、又は7%超の塩溶液(例えば、NaCl溶液))と併用投与される。いくつかの実施形態では、組成物は20%ナノエマルジョン溶液を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、20%を超える(例えば、25%、30%、又はそれを超える)ナノエマルジョン溶液を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、20%未満の(例えば、15%、10%又はそれ未満の)ナノエマルジョン溶液を含む。しかし本発明は、ナノエマルジョン(nanoemusion)のこの量(例えば、百分率)に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、10%未満のナノエマルジョンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、20%を超えるナノエマルジョンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、10mMのEDTAを含む。いくつかの実施形態では、組成物は20mMのEDTAを含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載のナノエマルジョンのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、細菌(例えば、対象の肺空間に存在する(例えば、バイオフィルムを形成する細菌))を治療するために利用されるナノエマルジョンを含む組成物は、P4075ECを含む。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物はW805ECを含む。
【００７４】
ナノエマルジョン単独又はEDTA(例えば、10〜20mMのEDTA)との併用投与は、PBS中、60分で106個の細菌の完全な死滅をもたらすことができた(実施例2〜4参照)。高張生理食塩水(例えば、6〜7%NaCl)の存在下では、ナノエマルジョンの死滅能力は、驚くべきことに著しく強化され、20mMのEDTAの存在下でも15分以内に完全な死滅をもたらした(実施例2参照)。また、低濃度のEDTAを含むナノエマルジョンは、高張生理食塩水の存在下では30分で細胞の完全な死滅をもたらすことができた。
【００７５】
したがっていくつかの実施形態では、本発明は、ナノエマルジョン組成物が短期間(例えば、60分未満、30分未満、又は15分未満)で細菌を死滅(例えば完全に)させるために使用できることを提供する。
【００７６】
本発明はまた、本発明の組成物が、細菌の混合集団を根絶できることを示す。さらに、本発明の実施形態の開発中に実施した毒性試験によって、ナノエマルジョン組成物は安全であり、対象に検出可能な害を引き起こさないこと(例えば、組織学的変化及び/又は検出可能な病理がなかった(例えば、実施例1参照))が特徴付けられた。
【００７７】
実施例3及び4に記載の通り、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、一般に健康なヒトにおいては病原性ではないが、重篤な慢性呼吸器感染症を引き起こす(例えば、嚢胞性線維症(CF)を有する個体において)日和見性である細菌種を治療する(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害する)ことができる。これらの種による絶え間ない感染は、炎症及び進行性肺疾患をもたらし、それは結果として肺不全に至り、CF患者の死因をもたらす。これまでのCFの肺感染症の有効な療法は、ヒト感染症に最もよく見られる薬物耐性菌の中でもこれらの種により示される広範な抗菌耐性によって、大幅に制限されてきた。CFにおける感染症の部位は、有効な療法にとって別の重要な障害をもたらす。感染菌は、第一に痰、気道上皮表面液及び気管支粘膜(ref)の気道内腔内に残留する。全身送達される抗菌剤のこの感染部位への浸透度は、一般に低い。治療はさらに、感染患者の気道に生じると思われている細菌のバイオフィルム形成によって、及びCF呼吸器を特徴付ける異常に粘性の分泌物によって阻まれる。
【００７８】
機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョンを含む組成物を利用する細菌及び/又はウイルスの死滅機序は、エマルジョンと微生物の脂質膜の融合を伴って、急速な浸透崩壊及び細胞溶解をもたらす(例えば、Hamouda and Baker, J Appl Microbiol. 2000 Sep;89(3):397-403参照)。さらに、いくつかの実施形態では、静電気引力(例えば、CPCのカチオン性表面電荷によってもたらされる)は、中性及びイオン性洗浄剤に対するグラム陰性菌のLPS媒介性の耐性を克服する(例えば、Hamouda and Baker, J Appl Microbiol. 2000 Sep;89(3):397-403参照)。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン(例えば、P4075EC(例えば、グラム陰性及び/又はグラム陽性菌に対する))を含む組成物の殺菌活性は、EDTAの添加によって強化される。機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、EDTAは、外膜LPSを安定化する二価カチオンをキレートし、それによってカチオン性エマルジョンとの相互作用、膜透過化及び溶解をもたらす相互作用を容易にし、巨大分子の膜貫通拡散を増大する(例えば、Rabinovich-Guilatt et al., J Drug Target. 2004;12(9-10):623-33, Vaara, Microbiol Rev. 1992 Sep;56(3):395-411参照)。
【００７９】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験によって、PARI LC Plus噴霧器を使用して7%生理食塩水で噴霧した後にP4075ECが安定であることを同定した。7%生理食塩水で噴霧した単回用量のP4075ECの吸入は、動物によって十分に耐性が示された。したがっていくつかの実施形態では、本発明は、P407SEC及び高張生理食塩水を含む組成物、並びに一又は複数の種類の肺細菌感染症を治療するための(例えば、CF患者への既に高い治療負担を増大することなく、細菌及び/又は細菌のバイオフィルム(例えば、従来の治療に対して耐性を有する)を治療するための)、その使用方法(例えば、吸入により(例えば、溶液の噴霧後))を提供する。
【００８０】
例えば、本発明の実施形態の開発中に実施した実験によって、ナノエマルジョンを含む組成物(例えば、P4075EC及び生理食塩水溶液)が、バークホルデリア・セパシアコンプレックス(Bcc)の種を治療する(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害する)のに有効であることが示された(例えば実施例3参照)。バークホルデリア・セパシア種による感染症は、特に抗菌療法に対して抵抗性があり、CFの高い罹患率及び死亡率に関連している。Bccによる感染症はまた、多くのCF治療センターによって肺移植に対する絶対的禁忌とみなされている。ナノエマルジョンを含む組成物(例えば、P4075EC及び生理食塩水溶液)は、CFのBcc感染症の大部分の原因であるB.マルチボランス及びB.セノセパシアを治療する(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害する)のに有効であった(例えば、Reik J Clin Microbiol. 2005 Jun;43(6):2926-8参照)。ナノエマルジョンを含む組成物(例えば、P4075EC及び生理食塩水溶液)は、BccのメンバーではないがCF患者から高い頻度で回収されるB.グラディオリを治療する(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害する)のに有効であった。また実施例3に示す通り、ナノエマルジョン(例えば、P4075EC)を含む組成物は、現在CFにおいてまれに回収されるが、この患者集団において出現する病原体であると思われるアシネトバクターを治療する(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害する)のに有効であった。実施例3で試験した単離株の大部分(94%)は、CFを有するヒトからの呼吸器被験物の培養物から回収した。パネルはまた、それぞれが複数のCF患者に感染するものとして同定されている先に記載の五種類のいわゆる流行性分化系列のそれぞれから、1種類の代表的な単離株を含んでいた。これらは、B.セノセパシアET12(Johnson et al., J Clin Microbiol 1994;32:924-30)、PHDC(Chen et al., J Pediatr 2001;139:643-9)、及びMidwest(Coenye and LiPuma, J. Infect. Dis. 185:1454-1462)分化系列、並びにB.マルチボランスOHBM分化系列(Biddick et al., FEMS Microbiol Lett 2003;228:57-62)、及びB.ドロサ(B. dolosa)SLC6分化系列(Biddick et al., FEMS Microbiol Lett 2003;228:57-62)を含んでいた。ナノエマルジョンを含む組成物(例えば、P4075EC及び生理食塩水溶液)は、これらの様々な種のそれぞれを有効に治療した(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害した)。さらに、ナノエマルジョン(例えば、P4075EC)を含む組成物は、以前の感受性試験において多剤耐性(例えば、三種類の抗生物質:ラクタム(カルバペネムを含む)、アミノグリコシド及びキノロンのうち二種類において試験した全ての抗生物質に耐性があると定義した)並びに汎耐性(panresistant)系であることが見出された系を治療する(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害する)のに有効であった(実施例3参照)。全ての単離株の遺伝子型分析を実施して、治療した各サンプルが異なる系であったことを確認した。
【００８１】
実施例3に示す通り、P4075ECは、試験した系に対して非常に良好な活性を示した。二種類のB.セノセパシア系を除き、試験パネルの全ての系は、P4075EC濃度≦125μg/ml又は1:16希釈の出発材料によって阻害され、系の59%は、濃度≦31.2μg/ml、1:64希釈のP4075ECによって阻害された。多剤耐性又は汎耐性系は、P4075ECに対する低い感受性を示さず、それぞれ125μg/ml及び62.5μg/mlのMIC90を示した。一般に、バークホルデリア種は、試験した他の種よりもP4075ECに対してわずかに感受性が低い傾向があった。最高のMICを必要とする18の系のうち16がバークホルデリアであった。逆に、試験した最小のMIC(15.6μg/ml)を有する38の系のうち33が非バークホルデリア種であった。試験した10種類のバークホルデリア種の中で、P4075EC活性には著しい差異は観測されなかったが、最高のMIC(250μg/ml及び500μg/ml)を必要とする二つの系は、共にB.セノセパシアであった。非バークホルデリア種の中では、ラルストニア(Ralstonia)系が最も感受性が高く(MIC90≦15.6μg/ml)、アシネトバクター系は相対的に感受性が低かった(MIC90=125μg/ml)。MIC及びMBCの両方が決定された34の系のサブセットのうちP4075ECへの耐性が見出されたという証拠はなかった。プランクトン様に増殖した細菌のP4075ECによる死滅は、時間及び濃度依存性であり、MICよりも16倍高い濃度で30分以内に完全な死滅をもたらした。したがって本発明は、P4075ECへの相対的に短時間の細菌の曝露が、生存可能な細菌を数ログ低減するのに利用できることを提供する。したがって、本発明のナノエマルジョン(例えば、P4075EC)を含む組成物は、細菌を死滅させ、且つ/又はその成長を阻害するために個々に、又は他の抗菌剤と組み合わせて利用することができる。
【００８２】
実験は、バイオフィルム(biofim)としてインビトロで増殖した細菌に対するP4075ECの活性を評価するために、本発明の実施形態の開発中に実施した。実施例3に記載の通り、P4075EC活性の厳密な試験を提供する目的で、インビトロバイオフィルム形成の相対的に厳密な定義を使用した。定義を満たした12の系を試験した。実施例3に示す通り、これらの系は、標準のMIC/MBC試験に基づくP4075ECに対するいくつかの種及びある範囲の感受性を表していた。P4075ECのMBIC及びMBECは、試験した各系のそれぞれのMIC及びMBCと比較して高かったが(MICと比較してMBICは4倍高い中央値)、全ての12の系は、バイオフィルムとして増殖した場合、P4075ECによって阻害され、又は死滅した。生存可能なバイオフィルム細菌の根絶のために、わずかに単一の系が、非希釈P4075EC(2000μg/ml)を必要とした。バイオフィルム形成系の中で、相対的バイオマスを分光光度法により結晶バイオレット染色を用いて評価したが、バイオマスとMBIC/MBECの間に相関関係は観測されなかった。実際、B.グラディオリ系AU10529は、試験した12の系の中で最大のバイオマスを生成したが、この系のP4075ECのMBIC及びMBECは、相対的に低かった(共に62.5μg/ml)。逆に、B.セノセパシア系J2315は、相対的にバイオマスを殆ど生成しなかったが、P4075ECのMBECを1000μg/ml必要とした。
【００８３】
バイオフィルムに似たCF痰は、抗菌剤の活性に拮抗することが報告されている(例えば、Hunt et al., Antimicrob Agents Chemother. 1995 Jan;39(1):34-9参照)。痰の乾燥重量2〜3%を構成するムチンなどの糖タンパク質及び高分子量DNAは、異常に粘性の高い痰をもたらす高いレベルで存在し、その痰が細菌を保護する物理的障壁を提供する。さらにこれらの巨大分子は、抗生物質と結合し、それを隔絶するが、カチオン性小分子及びCF痰の低pHは、細菌への薬物の浸透を遮断し、薬物の生物活性を低減する。これらの障害を克服するために薬物用量を増大する戦略は、薬物の毒性によって制限される。P4075ECの抗菌活性に対する痰の影響を評価するために、標準のプランクトンの感受性試験を、CF痰の存在下で12のバイオフィルム形成系について反復した。巨大分子及び高分子量DNA組成物、並びにイオン状態の患者間変動を回避するために、15人のCF患者からの痰混合物を使用し、自然の微小環境の変化を最小限に抑えるために、機械的せん断のみを適用した(例えば、Grebski et al., Chest. 2001 May;119(5):1521-5参照)。43%痰(試験系において達成される最大痰濃度)を含有する培地に懸濁した細菌に対するP4075ECの活性は、痰なしのそれぞれのプランクトンのMBCよりも2〜32倍高い殺菌濃度により減少した。痰のMBCは、バイオフィルム増殖細菌によって得られたMBECと同一であり(12のうち6)、又はその1倍希釈以内であった(12のうち6)。P4075ECの活性は、CF痰及びバイオフィルム増殖の両方によって同様に拮抗されたが、両方の試験条件下で試験した全ての系について殺菌性が残っていた(図10参照)。
【００８４】
したがっていくつかの実施形態では、本発明は、ナノエマルジョン(例えば、P4075EC)を含む組成物及びCF関連日和見病原体による感染症のための抗菌治療に対するその使用方法を提供する。特に、本発明のナノエマルジョン組成物は、プランクトン様に又はバイオフィルムとして、或いはCF痰の存在下で増殖しようとすまいとその細菌に対して急速な殺菌性があり、活性である。さらに、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は非常に安定であり、噴霧後も不変であり、広範な殺菌性がある。重要なことに、今までに試験された任意の細菌種による本発明のナノエマルジョン(nanemulsion)組成物に対する耐性の発生は観測されていない。したがって本発明は、P4075ECが、吸入用抗微生物剤として有効に使用できることを提供する。
【００８５】
本発明は、肺空間(例えば、CFを有する対象内の)に残留する細菌のバイオフィルムの治療に限定されない。実際、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、任意の臨床及び/又は工業環境における細菌のバイオフィルムの治療剤及び/又は抗微生物剤として(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害するため)利用することができる。
【００８６】
バイオフィルムを形成できる複数種の細菌が存在する。例えば、埋め込まれた医学的装置又は損傷を受けた組織に接着する細菌は、バイオフィルムを形成するために、しばしば多糖及びタンパク質の水和マトリックス中にそれら自体を包む。バイオフィルムは、抗微生物剤に対するバイオフィルム関連生物の耐性の増大、及び感染症と、留置用の医学的装置又は損傷を受けた組織を有する患者におけるこれらの生物との関連が原因となり、公衆衛生に関して重大な問題を有する。バイオフィルム内で増殖する細菌の抗生物質耐性は、埋め込まれた医学的装置との関連など、感染症の残留性及び慢性的性質に寄与する。バイオフィルムの耐性機構は、個々の細菌細胞に先天性耐性を付与する、現在よく知られているプラスミド、トランスポゾン及び変異体とは異なっている。バイオフィルムでは、耐性は、多細胞戦略に依存するように見える。
【００８７】
バイオフィルムは、表面に結合した、又は界面若しくは損傷を受けた組織に連結した微生物の複雑なコミュニティーである。純粋培養のプランクトン(自由遊泳性)細菌が現代の微生物学的研究の中心であるにもかかわらず、天然、臨床及び工業環境において見出される殆どの細菌が、バイオフィルムとして表面と連結して持続することが今や広く認識されている。さらに、これらの微生物コミュニティーは、それぞれ他の及びそれらの環境と相互作用する多数の種から構成されることが多い。バイオフィルム構造、特に微小コロニー(細胞のクラスター)の互いの空間的配置の決定は、これらの複雑なコミュニティーの機能に対して深い関わり合いを有する。
【００８８】
バイオフィルムマトリックスは、成分としての微生物細胞が、ホメオスタシスに達するように見え、且つ全ての利用可能な栄養分を使用するのに最適に組織される動的環境である。したがってマトリックスは、数々の微小環境が存在し得る高い微小不均一性を示す。バイオフィルム形成は、細菌細胞が表面に接着した後に、多層細胞クラスター中の細菌の増殖依存性蓄積が生じる二段階過程であると思われる。菌体外多糖は、マトリックスの枠組みを提供するが、バイオフィルム内に広範な酵素活性を見出すことができ、そのいくつかは、構造的安全性及び安定性に大きな影響を及ぼす。
【００８９】
より具体的には、形成の第一相中に、宿主血漿のフィブリノゲン及びフィブロネクチンが、医療用インプラント又は損傷を受けた組織の表面を覆い、構成的に発現した微生物の表面成分によって同定され、これが生体材料又は損傷を受けた組織の表面への細菌の最初の接着を媒介すると仮定される。第二段階では、細胞内接着(ica)座と呼ばれる細菌細胞中の特異的遺伝子座が、細菌細胞の互いの接着を活性化し、それによってバイオフィルムの二次的な層を形成する。ica座は、莢膜多糖オペロンの発現の原因となり、糖類としてのポリ-N-スクシニルグルコサミン(PNSG)、a-1,6-結合グルコサミノグリカンを介して多糖細胞間接着(PIA)を活性化する。この多糖層の産生は、電子顕微鏡を使用して見た場合、バイオフィルムにそのスライム状の外観を与える。
【００９０】
黄色ブドウ球菌は、高度に病原性のヒト病原体である。S.アウレウス(S. aureus)及び凝固酵素陰性ブドウ球菌の両方は、埋め込まれた医学的装置及び損傷を受けた組織上のバイオフィルム形成に関連する主な院内病原体として現れた。これらの生物は、ヒトの皮膚及び粘膜の正常な保因細菌叢の中にあるが、侵襲的な外科手術又は長期入院中及びその後にはそれらが流行性合併症となる。細菌は健康なヒト及び病気のヒトの両方に担持されるが、ブドウ球菌は、開いた創傷又は生体材料としてのインプラントを介して患者に浸潤する日和見病原体とみなされる。
【００９１】
S.アウレウスに関連するバイオフィルム感染症は、特に病院、養護ホーム及び診療所などの環境において、罹患率及び死亡率の重要な原因である。危険性のある患者には、乳児、高齢者、易感染性、免疫抑制性の患者及び頻繁な入院が必要な慢性状態にある患者が含まれる。血管内及び他の埋め込まれた人工器官を有する患者は、組織に損傷を与え、且つ/又はバイオフィルムの形成のための表面として作用するように働く易感染性免疫系及び異物の導入が原因となり、ブドウ球菌感染症のさらに大きな危険性がある。かかる感染症は、致死的でないにせよ慢性的な関わり合いを有することがある。
【００９２】
抗生物質に対するバイオフィルムの耐性の原因には、バイオフィルムの全ての層に浸透するいくつかの抗微生物剤が欠如していること、特定のバイオフィルム細胞の増殖速度が遅く、それによって抗微生物剤に対するバイオフィルム細胞の感受性が低減し、活性な細菌増殖を必要とすること、及びバイオフィルムに包埋された細菌細胞によって、細菌細胞のプランクトン(自由遊泳性)状態で発現した遺伝子とは異なる遺伝子パターンが発現することが含まれる。バイオフィルム関連細菌におけるこれらの差異は、プランクトン細菌を死滅させるのに有効に働く抗微生物剤を、バイオフィルム関連細菌の死滅において無効にする。しばしば、バイオフィルム(例えば、カテーテル又は人工器官に関連する)を治療する唯一の方法は、汚染された装置を除去することであるが、これはさらなる外科手術を必要とし、患者に対してさらなる危険性をもたらすことがある。
【００９３】
したがって本明細書で使用される場合、バイオフィルムは、内部又は外部組織又は器官などの表面への接着並びにその表面上のコロニー形成及び凝集体の増殖を容易にする細胞外マトリックスを有する微生物の凝集体を指す。バイオフィルムは、細菌、真菌、酵母、原生動物又は他の微生物から構成され得る。細菌のバイオフィルムは一般に、バイオフィルムで増殖しない同じ細菌よりも抗生物質に対する高い耐性、しばしば最大1,000倍高い耐性を示す。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、対象(例えば、肺系内、内部器官又は組織(例えば、膀胱、腎臓、心臓、中耳、洞、関節、目)上、外部組織(例えば、皮膚)上、及び/又は歯、舌、経口粘膜若しくは歯肉などの経口表面上及び/又はその中のバイオフィルムを治療し(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害し)、且つ/又はバイオフィルムを予防するために利用される。本発明の組成物及び方法は、軟部組織感染症、慢性副鼻腔炎、心内膜炎、骨髄炎、尿路感染症、慢性細菌の膣疾患、歯垢又は口臭、人工器官及び/又はカテーテルの感染症、細菌性角膜炎、或いは前立腺炎などのバイオフィルム関連状態を治療するために使用できる。
【００９５】
実施例3及び4に記載の通り、本発明の組成物は、任意の一又は複数のグラム陽性及びグラム陰性菌種を治療(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害)するために利用できる。実際、本発明の組成物及び方法は、それに限定されるものではないが、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミス(Staphylococcus epidermis)、化膿連鎖球菌(A群)、ストレプトコッカス種(ビリダンス(viridans)群)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)(B群)、S.ボビス(S. bovis)、ストレプトコッカス(嫌気性種)、肺炎連鎖球菌、エンテロコッカス種、炭疽菌、コリネバクテリウム・ジフテリアエ(Corynebacterium diptheriae)及びジフテロイド(diptheroid)であるコリネバクテリウム種(好気性及び嫌気性)などの凝固酵素陰性ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、破傷風(Clostridium tetani)及びクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、大腸菌、エンテロバクター種、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirablis)、緑膿菌、クレブシエラ・ニューモニエ、サルモネラ、シゲラ、セラチア、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ナイセリア、カタル球菌(Branhamella catarrhalis)並びにパスツレラを含むいくつかの細菌種を死滅させ、且つ/又はその成長を阻害するために利用できる。
【００９６】
本発明の組成物及び方法は、それに限定されるものではないが、皮膚糸状菌(dermatophyte)(例えば、ミクロスポルム・カニス(Microsporum canis)などのミクロスポルム(Microsporum)種、トリコフィトン・ラブラム(Trichophyton rubrum)及びトリコフィトン・メンタグロフィテス(Trichophyton mentagrophytes)などの白癬菌(Trichophyton)種)、酵母(例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・パラプローシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)及び薬物耐性カンジダ種を含む他のカンジダ種)、エピダーマフィトン・フルコッサム(Epidermophyton floccosum)、マラセジア・フルフール(Malassezia fuurfur)(ピチロスポルム・オルビクラーレ(Pityropsporon orbiculare)、ピチロスポルム・オバーレ(Pityropsporon ovale))、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)及び他のアスペルギルス(Aspergillus)種、接合菌(Zygomycetes)(リゾプス(Rizopus)、ムコール(Mucor))、ヒアロヒホ真菌症(hyalohyphomycosis)(フサリウム(Fusarium)種)、南アメリカ分芽菌(Paracoccidiodes brasiliensis)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastmyces dermatitides)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、スポロトリクス・シェンキィ(Sporothrix schenckii)並びにブラストミセス(Blastomyces)を含むバイオフィルムを形成できる生物を治療(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害)するために利用できる。
【００９７】
したがっていくつかの実施形態では、本発明は、バイオフィルムを有する(例えば、留置人工器官又はカテーテルを有し、その留置人工器官又はカテーテルがバイオフィルムと接触しているか、或いはその対象が、バイオフィルムが残留している感染症(例えば、呼吸器感染症)を有する)対象を治療する方法を提供し、該方法は、バイオフィルムが変化し、並びに/或いはバイオフィルム内に残留している細菌が死滅し、且つ/又はそれらの成長が阻害される条件下で、対象にナノエマルジョン(例えば、P4075EC)を含む組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、バイオフィルムの変化は、バイオフィルムの根絶を含む。いくつかの実施形態では、バイオフィルムの変化は、バイオフィルムの形成に関与する細菌の死滅を含む。いくつかの実施形態では、細菌は、S.アウレウス、S.エピデルミデス(S. epidermidis)、抗生物質耐性菌(例えば、メチシリン耐性、バンコマイシン耐性等)、及び/又は本明細書に記載の他の種類の細菌を含む。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン(例えば、P4075EC)を含む組成物は、一つ又は複数の抗微生物剤と併用投与される。いくつかの実施形態では、抗微生物剤は、それに限定されるものではないが、抗生物質、抗体、抗菌酵素、ペプチド及びランチオン(lanthione)を含有する分子を含む群から選択される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、細胞壁の合成を妨害又は阻害する。いくつかの実施形態では、抗生物質は、それに限定されるものではないが、β-ラクタム、セファロスポリン、グリコペプチド、アミノグリコシド、スルホンアミド(sulfonomide)、マイクロライド、葉酸、ポリペプチド及びその組合せを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、タンパク質合成(例えば、グリコシド、テトラサイクリン及びストレプトグラミン)を妨害する。本発明は、投与されるナノエマルジョンを含む組成物の用量数によって制限されない。いくつかの実施形態では、多回用量は別々の日に投与される。いくつかの実施形態では、多回用量は同じ日に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノエマルジョンを含む組成物は、連続的に投与される。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物の併用投与は、ナノエマルジョンを含む組成物の併用投与なしに投与されるよりも低い用量の抗菌剤の投与を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノエマルジョンを含む組成物は、噴霧器を使用して投与される。いくつかの実施形態では、投与は、筋肉内、皮下、局所、感染部位に直接的に、留置人工器官上に直接的に(例えば、シャント、ステント、組織構築物の足場、栄養管、涙点(punctual)プラグ、人工関節、ペースメーカー、人工弁等)又はカテーテルにより行われる。いくつかの実施形態では、投与はカテーテルを介して直接的に行われる。
【００９８】
本発明は、治療される微生物の種類によって制限されない。実際、本発明の組成物及び方法を使用して、対象における、それに限定されるものではないが本明細書に記載の細菌、ウイルス及び真菌を含む様々な病原性微生物を治療し(例えば、死滅させ(例えば、完全に死滅させ))且つ/又はその成長を予防し、且つ/又は減弱することができる。
【００９９】
本発明はまた、これまでに広範な抗生物質(例えば、アシネトバクター属種)に耐性を示している生物を治療する(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害する)ための組成物及び方法を提供する。
【０１００】
アシネトバクター種は、一般に、健康な個体には非病原性であるとみなされる。しかしいくつかの種は、院内環境に残留し、易感染性患者において生命を危うくする重篤な感染症を引き起こす(例えば、Gerischer U (editor). (2008). Acinetobacter Molecular Biology, 1st ed., Caister Academic Press参照)。これらの生物の抗生物質耐性の範囲と一緒にそれらの生存能力は、高度先進国及びその他の国の両方において再発する大流行によって報告されている通り、病院にとって脅威となる。感染症は易感染性個体において生じ、A.バウマンニ系は、二番目に最も一般的に単離される、ヒト被験物の非発酵性細菌である。アシネトバクターは、院内感染症において単離されることが多く、特に集中治療室において蔓延するが、これらは共に孤発例であると同時に流行性及び風土性の発生が一般的である。A.バウマンニは、院内肺炎、特に遅発性の人工呼吸器関連肺炎の原因になることが多い。A.バウマンニは、皮膚及び創傷感染症、菌血症並びに髄膜炎を含む様々な他の感染症を引き起こすことがある。A.ルオフィイ(lwoffi)は、髄膜炎の原因でもある。A.バウマンニは、ヒトの皮膚又は乾燥表面に数週間生存することができる。
【０１０１】
イラク戦争の開始以来、700名を超える米国兵がA.バウマンニに感染し、又はそれに侵されている。ワシントンD.C.のウォルターリード陸軍病院で、重篤な疾患の治療を受けていた4人の民間人がA.バウマンニ感染症に感染し、死亡した。ドイツの米国軍病院であるLandstuhl Regional Medical Centerでは、治療中の別の民間人である63歳のドイツ人女性が、施設内でA.バウマンニ感染群の同じ系に感染し、やはり死亡した。
【０１０２】
アシネトバクター種は、ペニシリン、クロラムフェニコール及びしばしばアミノグリコシドを含む多くの種類の抗生物質に対して本質的に耐性がある。フルオロキノロンに対する耐性が、治療中に報告されており、フルオロキノロンに対する耐性は、活性な薬物流出を介して媒介される他の薬物種への耐性増加ももたらしている。アシネトバクター系における抗生物質耐性の劇的な増加はCDCによって報告されており、カルバペネムは、最終手段の代表的な存在及び/又は治療として認識されている。カルバペネムに対する耐性の増加により治療選択肢は殆ど残されていないが、ポリミキシンBでいくらかの成功が報告されている。アシネトバクター種は、細菌のβ-ラクタマーゼを阻害するために最も一般的に使用されるスルバクタムに対して感受性がある点で珍しいが、これはスルバクタム自体の抗菌特性の一例である。
【０１０３】
したがっていくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、アシネトバクター種を治療し(例えば、それを死滅させ、且つ/又はその成長を阻害する)ために利用される(例えば、個々に又は他の治療(例えば、カルバペネム、ポリミキシンB、及び/又はスルバクタム)と組み合わせて)。
【０１０４】
嚢胞性線維症
嚢胞性線維症(CF)は、電解質のバランスに関与するCFTRと呼ばれる欠陥膜貫通タンパク質により重篤な肺損傷を引き起こす、生命を危うくする障害である。濃い粘液は、肺の管(tube)、管(duct)及び通路の栓子を形成する。この環境は、バイオフィルムコミュニティーを確立して呼吸器感染症をもたらす日和見性細菌にとって理想的である。全身投与された抗生物質は、悪化の頻度及び重症度を低減することができるが、細菌が気道及び肺から完全に根絶することは決してない。噴霧器で投与する抗生物質が使用されるが、様々な耐性種の耐性の出現及び/又はコロニー形成は大きな懸案事項である。嚢胞性線維症(CF)は、黄色ブドウ球菌及びインフルエンザ菌などの病原菌種、並びに緑膿菌、アクロモバクター・キシロスオキシダンス(Achromobacter xylosoxidans)、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ラルストニア種、パンドレア(Pandoraea)種及びバークホルデリア・セパシアコンプレックス(Bcc)種などのいくつかの日和見種のコロニー形成のための環境を提供する、先天性の呼吸器防御機構の機能障害をもたらす(例えば、LiPuma et al., (2009) Antimicrob Agents Chemother 53, 249-255参照)。Bccは、少なくとも17の系統的に関連している腐生グラム陰性桿菌の群を含み、その大部分はバイオフィルムを形成し得る(例えば、Al Bakri et al., 2004, Journal of Applied Microbiology 96, 455-463;Eberl and Tummler, 2004, International Journal of Medical Microbiology 294, 123-131;LiPuma et al., (2009) Antimicrob Agents Chemother 53, 249-255;並びにTomlin et al., 2004, Journal of Microbiological Methods 57, 95-106参照)。それらは特に治療困難であり、CF患者の高い罹患率及び死亡率に関連している。それらはまた、ヒト感染症において遭遇する最も抗菌耐性のある種に含まれる(例えば、LiPuma et al., 2005, Curr Opin Pulm Med 11, 528-533;LiPuma et al., (2009) Antimicrob Agents Chemother 53, 249-255参照)。感染症及び関連の炎症は、一度確立するとめったに排除されず、最終的には肺不全及び死亡に至る進行性肺疾患をもたらす(例えば、LiPuma et al., (2009) Antimicrob Agents Chemother 53, 249-255;Saiman and Seigel, 2003, Infect Control Hosp Epidemiol 24, S6-S52参照)。
【０１０５】
本発明は、新しい広範な抗菌ナノエマルジョン(NE)及びその使用を対象とする。NEは病原体を、それらの膜と相互作用させることによって死滅させる。この物理的な接触死滅(kill-on-contact)機構は、耐性に関する任意の懸念を有意に低減する。NEは、薬学的に認可された安全な成分から製剤化される。
【０１０６】
以下の実施例8では、CF患者において問題のある細菌の四つの対抗(against)属、シュードモナス、バークホルデリア、アシネトバクター及びステノトロホモナスの最小阻害濃度(MIC)及び最小殺菌濃度(MBC)を評価した。実施例8はまた、NEと他の抗微生物剤との間の潜在的な相乗作用の評価を説明するものである。実施例8で評価した緑膿菌、B.セノセパシア、A.バウマンニ及びS.マルトフィリアは、嚢胞性線維症患者の急性悪化に関与する重要な呼吸器病原体である。本発明の一態様では、ナノエマルジョンの活性を、その最小阻害濃度(MIC)及び/又は最小殺菌濃度(MBC)に関して、共に従来使用されている抗微生物医薬品と比較して本明細書では定義する。
【０１０７】
実施例8に記載の結果は、試験したNEに関するMIC90/MBC90値は、緑膿菌については8/64μg/ml、B.セノセパシアについては64/>514μg/ml、A.バウマンニについては8/64μg/ml及びS.マルトフィリアについては8/32μg/mlであったことを示している。コリスチンは、緑膿菌、B.セノセパシア、A.バウマンニ及びS.マルトフィリアについてそれぞれ2/8、>32/>32、1/>16及び>32/>32のMIC90/MBC90値を有していた。セフェピム、イミペネム、レボフロキサシン及びトブラマイシンは、全ての系に対してそれぞれ>32/>32、>32/>32、16/16及び>32/>32μg/mlのMIC90/MBC90値を有していた。これらの結果は、CFを治療するために使用されるが用量増加に伴って著しい副作用及び潜在的な毒性を示すことがある、コリスチン、セフェピム、イミペネム、レボフロキサシン及びトブラマイシンなどの従来の薬物とは著しく対照的であり、NEは完全に非毒性である。
【０１０８】
また、相乗作用データを以下の実施例8で評価した。具体的には、別の抗微生物剤と組み合わせた場合の部分阻害濃度(FIC)指数、及び別の抗微生物剤と組み合わせた場合の部分殺菌濃度(FBC)指数も評価した。FIC及びFBCは、組合せのナノエマルジョンの相乗作用、拮抗作用又は不関性(indifference)に対する判断を行うために算出する。この決定のために、バークホルデリア、ステノトロホモナスの10の系及びアシネトバクターの10の系を試験して、P4075EC+EDTAを、CF患者の肺において慢性肺感染症を治療するために使用される二種類の従来の抗微生物剤、コリスチン又はトブラマイシンのいずれかと組み合わせた場合のMICの変化を決定した。結果は、コリスチンと組み合わせて試験した(texted)NE(P4075EC+EDTA)が、ステノトロホモナス系の90%(FICに関して)及び70%(FBCに関して)について相乗作用することが見出されたが、トブラマイシンと組み合わせた場合には不関性であり、FICによればわずか20%の相乗作用であり、FBCによれば0%であったことを示した。アシネトバクター系に関して、コリスチンと組み合わせたP4075EC+EDTAは不関性であり、FICによればわずか20%の相乗作用であり、FBCによれば0%であり、並びにトブラマイシンと組み合わせた場合には、FICによればわずか10%の相乗作用であり、FBCによれば10%であったことが見出された。バークホルデリア系に関して、コリスチンと組み合わせたP4075EC+EDTAは不関性であり、FICによればわずか30%の相乗作用であり、FBCによれば10%であり、並びにトブラマイシンと組み合わせた場合には、FICによれば50%の相乗作用であり、FBCによれば20%であったことが見出された。
【０１０９】
最後に、物理的接触死滅の作用機構を示すために、実施例8で短期間-死滅曲線を作製して、電子顕微鏡を使用する図で使用されるサンプルをバークホルデリア系について生成した。時間-死滅により、開始の未処理から30分の時点までで全体の4.44ログ減少(cfu/ml)を得た。各10分の時点で、以下の通り1〜2の間のログ減少があった。未処理から10分の時点までで1.40ログ減少、10〜20分の時点で1.91ログ減少、及び20〜30分の時点で1.13ログ減少があった。図2A〜2D参照。
【０１１０】
実施例8に提示のデータなどの本明細書のデータは、試験したP4075ECなどのナノエマルジョンが、バークホルデリア及びステノトロホモナスのコリスチン耐性単離株を含む、多剤耐性である系に対して有効であることを示す。記載のシュードモナス種における脂質Aの修飾はいずれも、P4075ECによるMIC/MBCに影響を及ぼさなかった。二つの主な抗生物質であるコリスチン及びトブラマイシンによる拮抗作用の証拠は観測されず、ステノトロホモナスの場合、相乗作用が明らかとなった。このことは、CFを有する患者の治療が、ナノエマルジョンを使用するために中止される、患者の治療プログラムを複雑にする通常の抗生物質管理体制を必要とすべきではないことから価値がある。SEM画像は、この場合、強靭な外膜を有することが知られているグラム陰性菌の接触死滅機構を示す。嚢胞性線維症患者における肺感染症の治療に関して、P4075ECの噴霧を調査するためのさらなる研究が進行中である。
【０１１１】
栄養及び粘膜分泌の管理によるCF患者の機能的な肺生理の保存においては治療の進歩があったが、Bcc感染症の予防及び管理のための治療介入においては殆ど進歩がない。例えば今のところ、Bccに対する有効なワクチンは利用可能ではない。Bccの粘膜ワクチンの開発は、同定されている防御抗原の欠如及び有効な粘膜アジュバントの欠如により、部分的に制限されている(例えば、Davis、2001年、Advanced Drug Delivery Reviews 51、21〜42頁参照)。
【０１１２】
以下の実施例10に示す通り、本発明は、対象に投与した場合にバークホルデリア属(例えば、B.セノセパシア、B.マルチボランス又は呼吸器感染症に関連する他の種)由来の細菌に対して対象において免疫(例えば、防御免疫)を誘発するナノエマルジョン及びバークホルデリア抗原(例えば、バークホルデリア外膜タンパク質(OMP))を含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ナノエマルジョンを含む免疫原性組成物(例えば対象に投与するための(例えば、対象においてバークホルデリア属の細菌に対する免疫を誘発するための))中で利用される、バークホルデリア属の細菌由来のOMP(例えば、単離、精製及び/又は組換えOMP))の全て又は一部を提供する(例えば、実施例10、表25参照)。実施例10に示す通り、本発明は、対象に投与した場合に、ナノエマルジョン及びバークホルデリアOMPを含む免疫原性組成物が、粘膜及び全身の抗OMP抗体の両方を誘発することを提供する。また実施例10に示す通り、本発明は、対象に投与した場合に、ナノエマルジョン及びバークホルデリアの特定の系(例えば、B.セノセパシア)由来のOMPを含む免疫原性組成物が、OMPが由来する特定の種(例えば、B.セノセパシア)の細菌を中和し、細菌の(例えば、バークホルデリア属の)一つ又は複数の他の種由来の細菌を交差中和する粘膜及び全身の抗OMP抗体の両方を誘発することを提供する。
【０１１３】
実施例10は、OMP-NEによる鼻の単回免疫化が、IFN-γ、IL-2及び粘膜sIgA及びIgGの誘発によって実証される通り、抗原特異的なT細胞応答及び二次抗体応答の急速な誘発を特徴とする強い免疫応答をもたらすこと、並びにその後免疫応答が促進され得ることを示す。OMP-NEで免疫化したマウスは、免疫化しなかった対照と比較して、肺のK56-1コロニー形成単位(cfu)に劇的な減少を示した。肺細菌のクリアランスは、ワクチン接種しなかった群と比較して、脾臓にB.セノセパシア生物を殆ど示さなかった、OMP-NEワクチン接種したマウスにおいて有意に強化された。したがって本発明は、粘膜OMP-NE投与が防御免疫をもたらし、対象における敗血症の可能性を低減したことを提供する。
【０１１４】
実施例10はまた、17KDaのOmpA様タンパク質及び該タンパク質への曝露に関連する免疫応答を同定するデータを提供する。17KDaのリポタンパク質画分は、OMP-NEワクチン接種したマウスの血清に含まれていた抗体によってより良好に認識された(例えば、実施例10、図29C参照)。したがって本発明は、17KDaのOmpA様タンパク質に含まれているエピトープを含む免疫原性組成物が、その免疫原性組成物を投与した対象において防御抗体(例えばバークホルデリアの一つ又は複数の種に対する)を産生することを提供する。
【０１１５】
OMP-NEとOMPとの間でPBS応答に著しい差異は観測されなかった。例えば、ナノエマルジョンなしのOMPによる免疫化は、相対的に高い滴定量のIgGをもたらしたが、OMP-NE免疫原性組成物によって誘発されたものよりも一貫して低かった(13〜30倍)。ナノエマルジョンなしのOMPによる免疫化は、追加免疫に応答しなかった。OMPとナノエマルジョンによって誘発された応答は、主に調製物に含まれる特定のタンパク質を対象とするものであったが、ナノエマルジョンなしのOMPは、内因性エンドトキシン含有物に対する免疫応答を引き出していたように見える。
【０１１６】
したがって本発明は、免疫応答を刺激するための方法及び組成物を提供する。特に本発明は、免疫応答(例えば、先天性及び/又は適応性免疫応答(例えば、バークホルデリア属の細菌種(例えば、B.セノセパシア、B.マルチボランス等)に対する宿主の免疫を発生させるため))を誘発するための、免疫原性ナノエマルジョン組成物及びその使用方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、中でも臨床(例えば、治療用及び予防用医薬品(例えば、ワクチン接種))及び研究適用における使用が見出される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、バークホルデリア属の細菌種(例えば、B.セノセパシア、B.マルチボランス等)に対する免疫応答(例えば、免疫)を刺激するための、ナノエマルジョンアジュバント及びそれを含む組成物(例えば、ワクチン)を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象(例えば、ヒト又は他の哺乳動物対象)に投与した場合に、免疫応答(例えば、先天性免疫応答及び/又は適応性/後天性免疫応答)を刺激し、且つ/又は引き出すナノエマルジョンアジュバント組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、一つ又は複数のバークホルデリア(例えば、B.セノセパシア、B.マルチボランス等)抗原(例えば、バークホルデリア成分から単離及び/又は精製した、並びに/或いは組換えバークホルデリアタンパク質(例えば、OMP))を含むナノエマルジョンアジュバント組成物を提供する。本発明は、任意の特定のナノエマルジョン又はバークホルデリア抗原に限定されない。例示的な免疫原性組成物(例えば、ワクチン組成物)及び該組成物の投与方法を、以下により詳細に記載する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ナノエマルジョン及び一つ又は複数のバークホルデリア抗原(例えば、B.セパシア抗原)を含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象においてバークホルデリア(例えば、B.セパシア)に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、対象並びにナノエマルジョン及び免疫原を含む免疫原性組成物を提供するステップ(該免疫源はバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)抗原を含む)、並びに対象がバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)特異的免疫応答を生じる条件下で、対象に該組成物を投与するステップを含む。本発明は、本発明の組成物を投与するために選択される経路によって制限されない。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原性組成物の投与は、対象の粘膜表面を組成物と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、粘膜表面は鼻粘膜を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答の誘発は、対象におけるバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)に対する免疫を誘発するものである。
【０１１９】
ナノエマルジョン(NE)及びバークホルデリア抗原を含む組成物が、対象において免疫応答を生じさせるために利用できるかどうかを決定するために、本発明の実施形態の開発中に実験を実施した。ナノエマルジョンと混合したホールセル肺炎連鎖球菌抗原(WCPAg)による鼻の免疫化を実施し、宿主対象におけるIgG応答及びS.ニューモニエの上気道コロニー形成を根絶するその能力を誘発することを示した。
【０１２０】
特に実施例10に記載の通り、本発明は、対象に投与した場合、対象においてバークホルデリア属由来の細菌(例えば、B.セノセパシア、B.マルチボランス又は呼吸器感染症に関連する他の種)に対する免疫(例えば、防御免疫)を誘発するナノエマルジョン及びバークホルデリア抗原(例えば、バークホルデリア外膜タンパク質(OMP))を含む免疫原性組成物を提供する。したがっていくつかの実施形態では、本発明は、対象へのナノエマルジョン及びバークホルデリア抗原(例えば、OMP抗原(例えば、配列番号1〜16から選択されるアミノ酸配列を含む17KDaのタンパク質))を含む組成物の投与(例えば、経鼻投与)によって、対象におけるバークホルデリアに対する免疫をもたらし、それによってバークホルデリア感染症(例えば、呼吸器感染症に関連するもの)から対象を保護することを提供する。
【０１２１】
本発明は、本発明の免疫原性組成物及びその使用方法に利用されるバークホルデリア属の細菌の種類によって制限されない。いくつかの実施形態では、細菌は病原体である。いくつかの実施形態では、病原体は、呼吸器感染症又は呼吸器に関連する感染症の原因となるバークホルデリア種である。それに限定されるものではないが、B.セノセパシア、B.ドロサ、B.マルチボランス、B.アムビファリア(B. ambifaria)、B.ベトナミエンシス、B.ウボネンシス(B. ubonensis)、B.タイランデンシス(B. thailandensis)、B.グラミニス(B. graminis)、B.オクラホメンシス(B. oklahomensis)、類鼻疽菌、B.ゼノボランス(B. xenovorans)、B.フィトフィルマンス(B. phytofirmans)、B.フィマツム(B. phymatum)、R.メタリデュランス(R. metallidurans)、R.ユートロファ(R. eutropha)、R.ソラナセアラム(R. solanacearum)を含む様々なバークホルデリア種に、本発明の組成物及び方法における使用が見出される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、バークホルデリア属の細菌はB.セパシア(B. cepecia)である。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン及びOmp-A様タンパク質を含む免疫原性組成物は、それに限定されるものではないが、B.セノセパシア、B.ドロサ、B.マルチボランス、B.アムビファリア、B.ベトナミエンシス、B.ウボネンシス、B.タイランデンシス、B.グラミニス、B.オクラホメンシス、類鼻疽菌、B.ゼノボランス、B.フィトフィルマンス、B.フィマツム、R.メタリデュランス、R.ユートロファ、R.ソラナセアラムを含むバークホルデリア種由来のOmp-A様タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン及びOmp-A様タンパク質を含む免疫原性組成物は、配列番号1〜16で同定されたアミノ酸配列を含むOmp-A様タンパク質(例えば、単離、精製及び/又は組換えOmp-A様タンパク質)を含む。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン及びOmp-A様タンパク質を含む免疫原性組成物は、配列番号1のアミノ酸配列を含むOmp-A様タンパク質(例えば、単離、精製及び/又は組換えOmp-A様タンパク質)を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン及びバークホルデリア抗原を含む免疫原性組成物は、抗原(例えば、多糖、タンパク質、死滅ホールセル(例えば、コンジュゲート又は非コンジュゲート抗原))を含み、該抗原は、バークホルデリアの多数(例えば、少なくとも2、3、5、7、10、15、20又はそれを超える)の血清型に由来する。利用されるバークホルデリア抗原の数は、二種類の異なる血清型〜20種類の異なる血清型の範囲をとり得る。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン及びバークホルデリア抗原を含む免疫原性組成物は、全て公知の且つ/又は単離したバークホルデリア血清型由来のバークホルデリア抗原(例えば、ホールセル、多糖、Omp-Aタンパク質、他のタンパク質等)を含むことができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン及びバークホルデリア(例えば、B.セパシア)抗原を含む免疫原性組成物は、一つ、二つ、又はそれを超える様々な種類の担体タンパク質(例えば、タンパク質、糖類の担体として作用するもの等)を含む。例えば、一実施形態では、二つ以上の異なる糖類又はタンパク質は、同じ担体タンパク質、担体タンパク質の同じ分子、又は同じ担体タンパク質の異なる分子にコンジュゲートしていてもよい。担体タンパク質は、TT、DT、CRM197、TTの断片C、PhtD、PhtBE又はPhtDE融合(特にWO01/98334及びWO03/54007に記載のもの)、解毒化ニューモリシン及びタンパク質Dであってよい。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン及びバークホルデリア(例えば、B.セノセパシア)抗原を含む組成物に存在する担体タンパク質は、ポリヒスチジン三次構造(triad)ファミリー(Pht)タンパク質のメンバー、その断片又は融合タンパク質である。PhtA、PhtB、PhtD又はPhtEタンパク質は、WO00/37105又はWO00/39299に開示の配列と(例えば、PhtDについてWO00/37105の配列番号4のアミノ酸配列1〜838又は21〜838と)、80%、85%、90%、95%、98%、99%又は100%の同一性を共有するアミノ酸配列を有することができる。例えば、融合タンパク質は、PhtA、PhtB、PhtD、PhtEの全長又は二つ、三つ若しくは四つの断片から構成される。融合タンパク質の例は、PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B及びPhtE/Dであり、該タンパク質は、N末端において最初に言及したものと結合している(例えばWO01/98334参照)。担体は、ヒスチジン三次構造モチーフ(複数可)及び/又はコイルドコイル領域を含むことができる。ヒスチジン三次構造モチーフは、配列HxxHxH(Hはヒスチジンであり、xはヒスチジン以外のアミノ酸である)を有するポリペプチドの一部である。コイルドコイル領域は、「Coils」algorithm Lupus、Aら(1991年)Science 252;1162〜1164頁によって予測されている領域である。
【０１２５】
本発明で使用できる担体タンパク質の例は、DT(ジフテリアトキソイド)、TT(破傷風トキソイド)又はTTの断片C、DT CRM197(DT変異体)CRM176、CRM228、CRM45などの他のDT点突然変異体(Uchida et al., J. Biol. Chem. 218;3838-3844, 1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103及びCRM107並びにNicholls and YouleのGenetically Engineered Toxins, Ed:Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992によって記載の他の変異;Glu-148からAsp、Gln若しくはSer及び/又はAla158からGlyの欠失又は変異、並びに米国特許第4,709,017号又は米国特許第4,950,740号に開示の他の変異;少なくとも一つ又は複数の残基Lys516、Lys526、Phe530及び/又はLys534の変異、並びに米国特許第5,917,017号又は第6,455,673号に開示の他の変異;或いは米国特許第5,843,711号に開示の断片、何らかの方法で解毒したply、例えばdPLY-GMBS(WO04081515、PCT/EP2005/010258)又はdPLY-ホルモルを含む肺炎球菌ニューモリシン(Kuo et al (1995) Infect Immun 63;2706-13)、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE及びPhtタンパク質の融合物、例えばPhtDE融合物、PhtBE融合物(WO01/98334及びWO03/54007)、(PhtA-Eを以下により詳細に記載する)を含むPhtX、OMPC(髄膜炎菌性外膜タンパク質--通常は髄膜炎菌血清型Bから抽出--EP0372501)、PorB(髄膜炎菌由来)、PD(インフルエンザ菌タンパク質D--例えば、EP0594610B参照)、又はその免疫学的な機能的等価物、合成ペプチド(EP0378881、EP0427347)、熱ショックタンパク質(WO93/17712、WO94/03208)、百日咳タンパク質(WO98/58668、EP0471177)、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子又はホルモン剤(WO91/01146)、N19タンパク質(Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72;4884-7)などの様々な病原体由来の抗原からの多数のヒトCD4+T細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31;3816-3824)肺炎球菌表面タンパク質PspA(WO02/091998)、鉄取込みタンパク質(WO01/72337)、C.ディフィシルの毒素A又はB(WO00/61761)である。
【０１２６】
抗体産生
ナノエマルジョン及びバークホルデリア(例えば、B.セノセパシア)抗原を含む免疫原性組成物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル又はヒトなどの哺乳動物を免疫化してポリクローナル抗体を生成するために使用することができる。所望に応じて、バークホルデリア(例えば、B.セノセパシア)抗原は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン又は本明細書に記載の他の担体などの担体タンパク質にコンジュゲートしていてもよい。宿主の種に応じて様々なアジュバントを使用して、免疫学的応答を増大することができる。かかるアジュバントには、それに限定されるものではないが、フロイントアジュバント、鉱物ゲル剤(例えば、水酸化アルミニウム)、及び表面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、本明細書に記載のナノエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノール)が含まれる。ヒトにおいて使用されるアジュバントの中では、BCG(カルメット・ゲラン(Calmette-Guerin)桿菌)及びコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)が特に有用である。
【０１２７】
バークホルデリア(例えば、B.セパシア)抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は、培地中の連続細胞系によって抗体分子を産生する任意の技術を使用して調製することができる。これらの技術には、それに限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBVハイブリドーマ技術が含まれる(例えば、Kohler et al., Nature 256, 495 497, 1985;Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 3142, 1985;Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026 2030, 1983;Cole et al., Mol. Cell. Biol. 62, 109 120, 1984参照)。
【０１２８】
さらに、「キメラ抗体」産生のために開発された技術、適切な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングを使用することができる(例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851 6855, 1984;Neuberger et al., Nature 312, 604 608, 1984;Takeda et al., Nature 314, 452 454, 1985)参照。モノクローナル及び他の抗体は、それが治療で使用される場合には、患者が抗体に対する免疫応答を開始するのを予防するために「ヒト化」することもできる。かかる抗体は、療法に直接使用されるヒト抗体と配列が十分に類似していてもよく、又は非常に重要ないくつかの残基の変更を必要としてもよい。げっ歯類抗体とヒト配列との間の配列の差異は、個々の残基の部位特異的な変異誘発によりヒト配列のものとは異なる残基を置き換えることによって、又は全ての相補性決定領域をグレーティングすることによって最小化することができる。
【０１２９】
或いはヒト化抗体は、以下に記載の通り、組換え法を使用して生成することができる。特定の抗原に特異的に結合する抗体は、米国特許第5,565,332号に開示の通り、部分的又は完全にヒト化されている抗原結合部位を含有することができる。
【０１３０】
或いは、単一鎖抗体の生成について説明されている技術は、特定の抗原に特異的に結合する単一鎖抗体を生成するための当技術分野で公知の方法を使用して適用することができる。関連する特異性を有するが特徴的なイディオタイプの組成物の抗体は、無作為な組合せの免疫グロブリン(immunoglobin)ライブラリーからチェーンシャッフリング(chain shuffling)することによって産生することができる(例えば、Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120 23, 1991参照)。
【０１３１】
単一鎖抗体は、鋳型としてハイブリドーマcDNAを使用するPCRなどのDNA増幅法を使用して構築することもできる(例えば、Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11参照)。単一鎖抗体は、単一特異性又は二重特異性であってよく、二価又は四価であってもよい。例えば、Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63では、四価の二重特異性の単一鎖抗体の構築が教示されている。例えば、Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199〜206では、二価の二重特異性の単一鎖抗体の構築が教示されている。
【０１３２】
単一鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、以下に記載の通り、手引きによる又は自動化ヌクレオチド合成を使用して構築し、標準の組換えDNA方法を使用して発現構築物にクローン化し、コード配列を発現する細胞に導入することができる。或いは、単一鎖抗体は、例えば繊維状ファージ技術を使用して直接生成することができる(例えば、Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501;Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91参照)。
【０１３３】
特定の抗原に特異的に結合する抗体は、文献に開示の通り、リンパ球集団中でインビボ生成を誘発することによって、又は免疫グロブリンライブラリー若しくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって産生することもできる(例えば、Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989;Winter et al., Nature 349, 293 299, 1991参照)。
【０１３４】
キメラ抗体は、WO93/03151に開示の通り構築することができる。免疫グロブリンに由来し、WO94/13804に記載の「二重特異性抗体」などの多価及び多重特異性である結合タンパク質を調製することもできる。抗体は、当技術分野で周知の方法によって精製することができる。例えば抗体は、関連する抗原が結合するカラムを通過させることによってアフィニティー精製することができる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度のバッファーを使用してカラムから溶出することができる。
【０１３５】
熱傷管理
現代の熱傷管理は、部分層(partial thickness)の熱傷に対して支持療法を提供し、局所用抗菌包帯材(dressing)を変えると共に、早期に壊死組織切除し、生存不可能な皮膚を再構築することを含む。現代の熱傷治療の目的は、表皮の再生に最適な環境を提供することである。皮膚の完全性の修復は、保存した毛包からのケラチノサイトの再生、又は非熱傷領域から回収した分層植皮の移植によって行われる。表皮再生期間中、皮膚に対するさらなる損傷を回避し、熱傷の進行を抑制し、創傷感染症などの続発性合併症を最小限に抑えることが重要である。全層熱傷焼痂の初期切除、即時植皮、及び局所用抗菌剤による熱傷の残りの開口又は部分層領域の治療が、熱傷コロニー形成及び侵襲性創傷感染症を最小限に抑える最も有効な手法である。(例えば、Bessey, Wound care. In Herndon DN, ed: Total Burn Care 3rd edition. Philadelphia, PA: Elsevier Inc., 2007, 127-135参照)。一般的な局所用抗菌剤には、スルファジアジン銀(SILVADENE)、酢酸マフェニド(SULFAMYLON)及び銀コロイドを含浸させた包帯材(ACTICOAT、SILVERLON)が含まれる。これらの薬剤のそれぞれは、焼痂に浸透する可変能力、グラム陰性及びグラム陽性菌の両方に対する不均等な効率、並びに宿主免疫細胞に対する潜在的毒性などの、潜在的な制限を有する(例えば、Steinstraesser et al., Antimicrob Agents Chemother 46(6):1837-1844, 2002参照)。
【０１３６】
したがって本発明は、熱傷の治療のためのナノエマルジョン組成物及びその使用方法を提供する。例えば実施例9に示す通り、本発明は、熱傷の細菌増殖を低減、減弱且つ/又は予防するためのナノエマルジョン組成物及びその使用方法を提供する。本発明はまた、熱傷後の創傷炎症を低減するナノエマルジョン組成物を提供する。機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、熱傷後に創傷に適用されるナノエマルジョン組成物は、熱傷により深く、均一に浸透することができる(例えば、それによって創傷部位における細菌増殖及び/又は炎症を低減且つ/又は阻害する)。実施例9に示す通り、本発明は、熱傷の細菌増殖を低減、阻害且つ/又は排除する方法を提供し、該方法は、熱傷及びナノエマルジョンを提供し、細菌増殖が低減、阻害且つ/又は排除される条件下で熱傷にナノエマルジョンを投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノエマルジョン組成物は、熱傷部位の細菌増殖を最小限に抑えるために熱傷に投与するための一つ又は複数の抗微生物薬物と組み合わされる。本発明は、任意の特定の抗微生物薬物に限定されない。実際、当業者に公知の細菌増殖を阻害する任意の抗微生物薬物は、本明細書に記載のナノエマルジョン組成物と組み合わせて利用することができる。
【０１３７】
重篤な皮膚熱傷は、局所作用に加えて、末端器官の機能障害の高い危険性をもたらす全身性炎症反応症候群(SIRS)を誘発することが知られている(例えば、Barton et al., J Burn Care Rehabil 18(1):1〜9, 1997参照)。熱傷後のSIRSの結果としての血管透過性及び全身性毛細管漏出の増大は、体中の間質性組織への血漿の漏出をもたらす。この組織浮腫及び血管内の血液量減少は、ショック、肺機能障害、腹部又は四肢のコンパートメント症候群及び心不全などの望ましくない臨床問題のある宿主に関与している。
【０１３８】
以下の実施例9に記載の通り、本明細書に記載のナノエマルジョン組成物は、熱傷部位における炎症、組織浮腫及び/又は血管内血液量減少を治療(例えば低減、減弱且つ/又は予防)するために、熱傷に投与することができる。いくつかの実施形態では、熱傷部位における炎症、組織浮腫の減少及び/又は血管内の血液量減少は、ショック、肺機能障害、腹部又は四肢のコンパートメント症候群、及び/又は心不全の発生を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノエマルジョン組成物は、初期の熱傷炎症及び組織浮腫を最小限に抑えるための一つ又は複数の抗炎症薬と併用される(例えば、同時投与される)。本発明は、任意の特定の抗炎症性薬物に限定されない。実際、初期の熱傷炎症及び組織浮腫を最小限に抑える任意の抗炎症薬物は、本明細書に記載のナノエマルジョン組成物と組み合わせて利用することができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョン(例えば、W205GBA2ED)は、部分層熱傷内の細菌増殖(例えば、黄色ブドウ球菌、緑膿菌又は他の細菌)を予防、減弱且つ/又は根絶するために熱傷に投与される。実施例9は、微生物感染症の低減が、低レベルの局所皮膚炎症促進性サイトカインの産生、及び熱傷への好中球ゼクエストレーションの低減の証拠と相まっていたことを示す。この熱傷細菌増殖及び炎症の減少によって、熱傷後の初期における毛細管漏出も少なかった。熱傷の直後における毛細管漏出及び組織浮腫の臨床的な低減能力を有することにより、大量の晶質液蘇生の必要が低減し、生理的体液過剰、肺機能障害及び腹部コンパートメント症候群の関連後遺症が低減する。
【０１４０】
熱傷によって損傷を受けた皮膚は、熱傷によって引き起こされた身体的バリア機能及び続発する免疫抑制の両方を喪失することによって、感染症から宿主を保護するその能力を失う。さらに、熱傷期間中のTGF-β及びIL-10の産生増大は、免疫抑制をもたらし得る(例えば、Lyons et al., Arch Surg 134(12):1317-1323, 1999;Varedi et al., Shock 16(5):380-382、2001参照)。熱傷を受けた動物の抗TGF-βによる治療は、緑膿菌の局所及び全身クリアランスを改善できることが確立されている(例えば、Huang et al., J Burn Care Res 27(5):682-687, 2006参照)。TGF-βの阻害はまた、細菌の攻撃後の生存率も増大する。実施例9に示す通り、IL-10ではなくTGF-βの著しい上昇が、部分層熱傷後の皮膚において観測された。しかし、細菌を播種した熱傷に対するナノエマルジョンの局所適用(例えば、10%W205GBA2ED)は、未処理の熱傷と比較した場合、TGF-βレベルの低減をもたらした。
【０１４１】
熱傷における細菌感染症の開始は、組織治癒過程を遅延し、又は逆行させることがある(例えば、Steinstraesser et al., Crit Care Med 29(7):1431-1437, 2001参照)。局所用抗菌療法は、熱傷の微生物量を低減し、感染症のこの危険性を低減するために使用される。現在の局所薬剤には、硝酸銀(AgNO3)、スルファジアジン銀、酢酸マフェニド及びナノ結晶を含浸させた銀包帯材が含まれる。硝酸銀は、それが接触染色(contact staining)から作り出され、その抗真菌活性が制限されているという問題のために、使用が制限される。スルファジアジン銀は、局所用熱傷抗菌治療の中心である。スルファジアジン銀は、緑膿菌及び他のグラム陰性腸溶細菌に対して殺菌性である。これらの生物のいくつかによるSilvadeneへの耐性が現れている(例えば、Silver et al., J Ind Microbiol Biotechnol 33(7):627-634, 2006参照)。この薬剤は、抗真菌活性が制限されているが、ニスタチンと併用することができる。Silvadeneは、熱傷による焼痂に浸透する実際の能力をもたず、時に白血球減少症に至り、別の局所薬剤への変換を要する。酢酸マフェニドの使用は、それが選択生物に対して静菌性であり、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌に対する活性が制限されていること、及び広い表面積にわたるその使用が、炭酸脱水酵素阻害剤へのその代謝のために代謝性アシドーシスに至り得ることによって制限される。ナノ結晶銀包帯材は、現在の利用可能な薬剤の熱傷病原体に対する最も広範な活性を有する。それらは、焼痂に浸透する中程度の能力を有し、何日もそのまま残ることができる(例えば、Church et al., Clin Microbiol Rev 19(2):403-434, 2006)参照。活性化したp38MAPKの阻害剤としてのSB202190は、熱傷において発生する皮膚炎症を実質的に低減することができる(例えば、Arbabi et al., Shock. 26(2):201-209, 2006参照)。熱傷は、皮膚の炎症性及びアポトーシス促進性細胞シグナル伝達を惹起する。
【０１４２】
実施例9に示す通り、ナノエマルジョン、(例えばW205GBA2EDの局所適用は、熱傷を受けた皮膚の真皮における毛包細胞のアポトーシスの低減をもたらした。したがっていくつかの実施形態では、本発明は、熱傷に投与された場合、「うっ滞性帯域」内の部分層熱傷の全層熱傷の領域への変換を低減するために使用できるナノエマルジョン組成物を提供する。
【０１４３】
吸入性損傷の証拠がない患者において、熱傷はそれ自体、炎症促進性サイトカインの発生及び熱傷への好中球のゼクエストレーションを介して全身性炎症反応を誘発する主要供給源である(例えば、Hansbrough et al., J Surg Res 61(1):17-22, 1996;Piccolo et al., Inflammation 23(4):371-385, 1999;Till et al., J Clin Invest 69(5):1126-1135, 1982参照)。p38MAPK阻害剤の局所適用は、真皮レベルにおける炎症の供給源を制御し、低レベルの炎症促進性メディエーター、好中球ゼクエストレーション及び微小血管損傷の低減、並びに熱傷毛包細胞における上皮アポトーシスの低減をもたらすことができる(例えば、Ipaktchi et al., Shock. 26(2):201-209, 2006参照)。炎症の皮膚供給源の制御はまた、げっ歯類モデルにおいて細菌増殖を低減し、全身性炎症反応を減弱し、部分層熱傷後の急性肺損傷及び心機能不全を低減する。したがっていくつかの実施形態では、局所皮膚炎症及び熱傷(例えば初期熱傷、部分層創傷、全層創傷又は他の熱傷)における感染症の危険性を低減するために、本発明のナノエマルジョンが単独で、或いは抗炎症剤及び/又は抗微生物剤と組み合わせて利用される(例えば、投与される)。本発明は、本明細書に記載のナノエマルジョンとの併用投与のために利用される抗炎症剤及び/又は抗微生物剤の種類によって制限されない。実際、それに限定されるものではないが、硝酸銀(AgNC3)、スルファジアジン銀、酢酸マフェニド、ナノ結晶を含浸した銀包帯材、p38MAPK阻害剤(例えば、SB202190)、又は本明細書に記載の別の抗炎症剤若しくは抗微生物剤を含む様々な抗炎症剤及び/又は抗微生物剤を使用することができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョンが熱傷に投与される場合、ナノエマルジョンは、それに限定されるものではないが、直接使用、或いは溶液(例えばコロイド溶液)に懸濁し、表面(例えば、細菌(例えば病原菌)を含む表面又は細菌の浸潤を受けやすい表面)に適用する;スプレーアプリケーターを使用して表面上にスプレーする;フィブリン糊と混合し、表面(例えば、皮膚の熱傷又は創傷)上に適用する(例えばスプレーする);創傷包帯材又は包帯上に含浸させ、その包帯を表面(例えば感染症又は熱傷)に適用する;制御放出機構によって適用する;或いは無細胞生物学的マトリックスの片面又は両面上に含浸させ、次いでそれを表面(例えば皮膚熱傷又は創傷)上に置き、それによって創傷及びグラフト界面の両方を保護することを含む多数の方法によって投与することができる(例えば対象に(例えば熱傷又は創傷表面に))。いくつかの実施形態では、本発明は、(a)ナノエマルジョン(例えば、W205GBA2ED)を含む組成物、及び(b)一つ又は複数の他の薬剤(例えば、抗生物質)を含有する医薬組成物を提供する。他の種類の抗生物質の例には、それに限定されるものではないが、アルメシリン(almecillin)、アムジノシリン、アミカシン、アモキシシリン、アンホマイシン、アンホテリシンB、アンピシリン、アザシチジン、アザセリン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、バカンピシリン、バシトラシン、ベンジルペニシロイル-ポリリジン、ブレオマイシン、カンジシジン、カプレオマイシン、カルベニシリン、セファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフェピム、セフィキシム、セフメノキシム(cefinenoxime)、セフメタゾール(cefinetazole)、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォキシチン、セフピラミド、セフポドキシム、セフプロジル、セフスロジン、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シラスタチン、シンナマイシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クリンダマイシン、クリオキノール、クロキサシリン、コリスチメタート、コリスチン、シクラシリン、サイクロセリン、シクロスポリン、シクロ-(Leu-Pro)、ダクチノマイシン、ダルババンシン、ダルホプリスチン、ダプトマイシン、ダウノルビシン、デメクロサイクリン、デトルビシン、ジクロキサシリン、ジヒドロストレプトマイシン、ジリスロマイシン、ドキソルビシン、ドキシサイクリン、エピルビシン、エリスロマイシン、エベミノマイシン(eveminomycin)、フロキサシリン、ホスホマイシン、フシジン酸、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、グラミシジン、グリセオフルビン、ヘタシリン、イダルビシン、イミペネム、イセガナン、イベルメクチン、カナマイシン、ラスパルトマイシン、リネゾリド、リノコマイシン(linocomycin)、ロラカルベフ、マガイニン、メクロサイクリン、メロペネム、メタサイクリン、メチシリン、メズロシリン、ミノサイクリン、マイトマイシン、モエノマイシン、���キサラクタム、モキシフロキサシン、ミコフェノール酸、ナフシリン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニフィマイシン(niphimycin)、ニトロフラントイン、ノボビオシン、オレアンドマイシン、オリタバンシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシラミン、ペニシリンG、ペニシリンV、フェネチシリン、ピペラシリン、プリカマイシン、ポリミキシンB、プリスチナマイシン、キヌプリスチン、リファブチン、リファンピン、リファマイシン、ロリテトラサイクリン、シソマイシン、スペクチノマイシン(spectrinomycin)、ストレプトマイシン、ストレプトゾシン、スルバクタム、スルタミシリン、タクロリムス、タゾバクタム、テイコプラニン、テリスロマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、チゲサイクリン、トブラマイシン、トロレアンドマイシン、ツニカマイシン、チルスリシン(tyrthricin)、バンコマイシン、ビダラビン、バイオマイシン、ヴァージニアマイシン、BMS-284,756、L-749,345、ER-35,786、S-4661、L-786,392、MC-02479、Pep5、RP59500及びTD-6424が含まれる。いくつかの実施形態では、二つ以上の組合せの薬剤(例えば、ナノエマルジョン及び抗生物質を含む組成物)は、一緒に又は逐次的に使用することができる。いくつかの実施形態では、抗生物質は、バクテリオシン、タイプAランチビオティクス、タイプBランチビオティクス、リポシドマイシン(liposidomycin)、ムレイドマイシン(mureidomycin)、アラノイルコリン(alanoylcholine)、キノリン、エベミノマイシン、グリシルシクリン(glycylcycline)、カルバペネム、セファロスポリン、ストレプトグラミン、オキサゾリドノン(oxazolidonone)、テトラサイクリン、シクロチアリジン(cyclothialidine)、バイオキサロマイシン(bioxalomycin)、カチオン性ペプチド、及び/又はプロテグリンを含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物はリゾスタフィンを含む。
【０１４５】
本発明は、利用するナノエマルジョンの種類(例えば、呼吸器への投与、熱傷への投与及び/又は防御免疫応答の誘発のための免疫原性組成物における使用のための)によって制限されない。実際、様々なナノエマルジョン組成物が、本発明において有用であることが企図される。
【０１４６】
例えば、いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンは、(i)水相、(ii)油相、及び少なくとも一つのさらなる化合物を含む。本発明のいくつかの実施形態では、これらのさらなる化合物は、組成物の水性又は油性相のいずれかに混合される。他の実施形態では、これらのさらなる化合物は、予め乳化した油相及び水相の組成物に混合される。これらの実施形態のいくつかでは、一つ又は複数のさらなる化合物は、その使用直前に、既存のエマルジョン組成物に混合される。他の実施形態では、一つ又は複数のさらなる化合物は、既存のエマルジョン組成物の使用直前に、その組成物に混合される。
【０１４７】
本発明のナノエマルジョンにおける使用に適したさらなる化合物には、それに限定されるものではないが、一つ又は複数の有機物質、より具体的には、有機リン酸系溶媒、界面活性剤及び洗浄剤、カチオン性ハロゲン含有化合物、発芽強化剤(germination enhancer)、相互反応強化剤、食品添加物(例えば、香味剤、甘味剤、増量剤等)及び薬学的に許容される化合物が含まれる。本発明の組成物における使用を企図した様々な化合物のいくつかの例示的な実施形態を以下に提示する。別段の記載がない限り、非希釈形態のナノエマルジョンが記載される。
【０１４８】
本発明のナノエマルジョンの保存時及び適用後の安定性
保存安定性
本発明のナノエマルジョンは、約40℃及び相対湿度約75%で、少なくとも最大約1カ月、少なくとも最大約3カ月、少なくとも最大約6カ月、少なくとも最大約12カ月、少なくとも最大約18カ月、少なくとも最大約2年、少なくとも最大約2.5年又は少なくとも最大約3年間、安定であり得る。
【０１４９】
本発明の別の実施形態では、本発明のナノエマルジョンは、約25℃及び相対湿度約60%で、少なくとも最大約1カ月、少なくとも最大約3カ月、少なくとも最大約6カ月、少なくとも最大約12カ月、少なくとも最大約18カ月、少なくとも最大約2年、少なくとも最大約2.5年又は少なくとも最大約3年、少なくとも最大約3.5年、少なくとも最大約4年、少なくとも最大約4.5年又は少なくとも最大約5年間、安定であり得る。
【０１５０】
さらに、本発明のナノエマルジョンは、約4℃で、少なくとも最大約1カ月、少なくとも最大約3カ月、少なくとも最大約6カ月、少なくとも最大約12カ月、少なくとも最大約18カ月、少なくとも最大約2年、少なくとも最大約2.5年、少なくとも最大約3年、少なくとも最大約3.5年、少なくとも最大約4年、少なくとも最大約4.5年、少なくとも最大約5年、少なくとも最大約5.5年、少なくとも最大約6年、少なくとも最大約6.5年又は少なくとも最大約7年間、安定であり得る。
【０１５１】
適用時の安定性
本発明のナノエマルジョンは、驚くべきことに該ナノエマルジョンが適用時にそれらの物理的構造を喪失しないので、適用時に安定である。本発明によるナノエマルジョンの適用後の皮膚表面の顕微鏡検査は、本発明のナノエマルジョンの物理的完全性を示している。この物理的完全性は、本発明のナノエマルジョンで観測される所望の吸収をもたらすことができる。
【０１５２】
ナノエマルジョン
用語「ナノエマルジョン」は、本明細書で使用される場合、分散液又は液滴又は任意の他の脂質構造を指す。本発明で企図される一般的な脂質構造には、それに限定されるものではないが、単層、少数層及び多層脂質小胞、ミセル並びに層状の相が含まれる。
【０１５３】
本発明のナノエマルジョンは、約1,000nm未満、約950nm未満、約900nm未満、約850nm未満、約800nm未満、約750nm未満、約700nm未満、約650nm未満、約600nm未満、約550nm未満、約500nm未満、約450nm未満、約400nm未満、約350nm未満、約300nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満又はその任意の組合せの平均直径を有する液滴を含む。一実施形態では、液滴は、約125nm超及び約300nm以下の平均直径を有する。異なる一実施形態では、液滴は、約50nm超又は約70nm超及び約125nm以下の平均直径を有する。本発明の他の実施形態では、ナノエマルジョン液滴は、約300nm〜約600nmの平均直径を有し、又はナノエマルジョン液滴は、約150nm〜約400nmの平均直径を有する。
【０１５４】
本発明の一実施形態では、ナノエマルジョンは、狭い範囲のMIC(最小阻害濃度)及びMBC(最小殺菌濃度)値を有する。別の実施形態では、ナノエマルジョンのMIC及びMBCは、4倍未満又は4倍異なり、これはナノエマルジョンが殺菌性であることを意味する。さらに、ナノエマルジョンのMIC及びMBCは、4倍を超えて異なることがあり、これはナノエマルジョンが静菌性であることを意味する。
【０１５５】
本発明の一実施形態では、ナノエマルジョンは、(a)水相、(b)約1%油〜約80%油、(c)約0.1%有機溶媒〜約50%有機溶媒、(d)約0.001%界面活性剤又は洗浄剤〜約10%界面活性剤又は洗浄剤、(e)約0.0005%〜約1.0%キレート剤、或いは(e)その任意の組合せを含む。本発明の別の実施形態では、ナノエマルジョンは、(a)約10%油〜約80%油、(b)約1%有機溶媒〜約50%有機溶媒、(c)約0.1%〜約10%の量で存在する少なくとも一つの非イオン性界面活性剤、(d)約0.01%〜約3%の量で存在する少なくとも一つのカチオン性薬剤、又はその任意の組合せを含む。
【０１５６】
別の実施形態では、ナノエマルジョンは、塩化セチルピリジニウム(CPC)又は塩化ベンザルコニウム又はアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(BTC824)或いはその組合せのいずれかであるカチオン性界面活性剤を含む。カチオン性界面活性剤は、ナノエマルジョン中約5.0%未満及び約0.001%超の濃度を有することができ、又はさらに、約5%未満、約4.5%未満、約4.0%未満、約3.5%未満、約3.0%未満、約2.5%未満、約2.0%未満、約1.5%未満、約1.0%未満、約0.90%未満、約0.80%未満、約0.70%未満、約0.60%未満、約0.50%未満、約0.40%未満、約0.30%未満、約0.20%未満、約0.10%未満、約0.001%超、約0.002%超、約0.003%超、約0.004%超、約0.005%超、約0.006%超、約0.007%超、約0.008%超、約0.009%超及び約0.010%超の濃度を有することができる。
【０１５７】
さらなる一実施形態では、ナノエマルジョンは非イオン性界面活性剤を含み、約0.01%〜約10.0%又は約0.1%〜約3%の濃度のポリソルベートなどの非イオン性界面活性剤を有することができる。
【０１５８】
本発明のさらなる他の実施形態では、ナノエマルジョンは、(a)少なくとも一つのカチオン性界面活性剤を含み、(b)塩化セチルピリジニウム又は塩化ベンザルコニウム又はアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(BTC824)或いはその組合せのいずれかであるカチオン性界面活性剤を含み、(c)カチオン性界面活性剤を含み、カチオン性界面活性剤の濃度は、約5.0%未満及び約0.001%超であり、(d)カチオン性界面活性剤を含み、カチオン性界面活性剤の濃度は、約5%未満、約4.5%未満、約4.0%未満、約3.5%未満、約3.0%未満、約2.5%未満、約2.0%未満、約1.5%未満、約1.0%未満、約0.90%未満、約0.80%未満、約0.70%未満、約0.60%未満、約0.50%未満、約0.40%未満、約0.30%未満、約0.20%未満、約0.10%未満、約0.001%超、約0.002%超、約0.003%超、約0.004%超、約0.005%超、約0.006%超、約0.007%超、約0.008%超、約0.009%超及び約0.010%超からなる群から選択され、或いは(e)その任意の組合せである。さらなる他の実施形態では、(a)ナノエマルジョンは、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤及び少なくとも一つの非カチオン性界面活性剤を含み、(b)ナノエマルジョンは、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤及び少なくとも一つの非カチオン性界面活性剤を含み、非カチオン性界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、(c)ナノエマルジョンは、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤及び少なくとも一つの非カチオン性界面活性剤を含み、非カチオン性界面活性剤は、ポリソルベート非イオン性界面活性剤であり、(d)ナノエマルジョンは、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤及び少なくとも一つの非カチオン性界面活性剤を含み、非カチオン性界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、非イオン性界面活性剤は、約0.05%〜約10%、約0.05%〜約7.0%、約0.1%〜約7%又は約0.5%〜約5%の濃度で存在し、(e)ナノエマルジョンは、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤及び少なくとも一つの非イオン性界面活性剤を含み、カチオン性界面活性剤は、約0.05%〜約2%又は約0.01%〜約2%の濃度で存在し、或いは(f)その任意の組合せで
ある。
【０１５９】
他の実施形態では、ナノエマルジョンは、(a)水、(b)エタノール又はグリセロール(グリセリン)或いはその組合せ、(c)塩化セチルピリジニウム(CPC)又は塩化ベンザルコニウム又はアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(BTC824)或いはその組合せ、(c)大豆油、及び(e)Poloxamer 407、Tween 80又はTween 20を含む。ナノエマルジョンは、EDTAをさらに含むことができる。
【０１６０】
ナノエマルジョンに存在する各成分のこれらの量は、治療用ナノエマルジョンについて言及しており、インビトロで試験されるナノエマルジョンに言及するものではない。これは、インビトロで試験されるナノエマルジョンが、治療上の使用、例えば局所使用を企図したナノエマルジョン中に存在するよりも一般に低い濃度の油、有機溶媒、界面活性剤又は洗浄剤、及び(存在する場合)キレート剤を有する場合に重要である。これは、インビトロ試験ではナノエマルジョン液滴が皮膚を横断することを必要としないためである。局所、エアゾール、皮内等での使用に関して、成分の濃度は、治療用ナノエマルジョンをもたらすために、より高くなければならない。しかし、インビトロで試験されるナノエマルジョンに使用される各成分の相対量は、治療用に使用されるナノエマルジョンに適用することができ、したがって、インビトロ量は、治療用組成物を調製するために増大することができ、インビトロデータは局所適用の成功を予測するものである。
【０１６１】
1.水相
水相は、それに限定されるものではないが、水(例えば、H2O、蒸留水、水道水)及び溶液(例えばリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)溶液)を含む任意の種類の水相を含むことができる。特定の実施形態では、水相は、pH約4〜10、好ましくは約6〜8の水を含む。水は、脱イオン化することができる(以下「DiH2O」)。いくつかの実施形態では、水相は、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を含む。水相はさらに滅菌されており、発熱物質を含まないものであってよい。
【０１６２】
2.有機溶媒
本発明のナノエマルジョンの有機溶媒には、それに限定されるものではないが、C1〜C12アルコール、ジオール、トリオール、リン酸ジアルキル、リン酸トリ-n-ブチルなどのリン酸トリ-アルキル、その半合成誘導体及びその組合せが含まれる。本発明の一態様では、有機溶媒は、非極性溶媒、極性溶媒、プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒から選択されるアルコールである。
【０１６３】
ナノエマルジョンの適切な有機溶媒には、それに限定されるものではないが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、中鎖トリグリセリド、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、酢酸、n-ブタノール、ブチレングリコール、芳香剤(perfumer)としてのアルコール、イソプロパノール、n-プロパノール、ギ酸、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、工業用メチル化アルコール、トリアセチン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、1,4-ジオキサン(dixoane)、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ギ酸、その半合成誘導体及びその任意の組合せが含まれる。
【０１６４】
3.油相
本発明のナノエマルジョン中の油は、任意の化粧上又は薬学的に許容される油であってよい。油は、揮発性又は不揮発性であってよく、動物油、植物油、天然油、合成油、炭化水素油、シリコーン油、その半合成誘導体及びその組合せから選択することができる。
【０１６５】
適切な油には、それに限定されるものではないが、鉱油、スクアレン油、香油、ケイ素油、精油、水不溶性ビタミン、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸セチル、ベヘン酸トリデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、アントラ酸メチル(Menthyl)、オクタン酸セチル、サリチル酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ネオペンチルグリコールジカルペートセトール(dicarpate cetol)、Ceraphyls(登録商標)、オレイン酸デシル、アジピン酸ジイソプロピル、乳酸C12〜15アルキル、乳酸セチル、乳酸ラウリル、ネオペンタン酸イソステアリル、乳酸ミリスチル、ステアリン酸イソセチルステアロイル、ステアリン酸オクチルドデシルステアロイル、炭化水素油、イソパラフィン、液体パラフィン、イソドデカン、ワセリン、アルガン(Argan)油、キャノーラ油、チリ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、アマニ油、ブドウ種子油、カラシ油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ピーナッツ油、マツ種子油、ケシ種子油、カボチャ種子油、米ぬか油、ベニバナ油、茶油、トリュフ油、植物油、アプリコット(核)油、ホホバ油(シモンジア・キネンシス(simmondsia chinensis)種子油)、ブドウ種子油、マカダミア油、小麦胚芽油、アーモンド油、ナタネ油、ウリ油、大豆油、ゴマ油、ヘーゼルナッツ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、大麻油、ボワドローズ油、ククイの実の(Kuki nut)油、アボカド油、クルミ油、魚油、ベリー油、オールスパイス油、ジュニパー油、種子油、アーモンド種子油、アニス種子油、セロリ種子油、クミン種子油、ナツメグ種子油、葉油、バジル葉油、ローリエ葉油、桂皮油、コモンセージ葉油、ユーカリ葉油、レモングラス葉油、メラレウカ葉油、オレガノ葉油、パチョリ葉油、ペパーミント葉油、松葉油、ローズマリー葉油、スペアミント葉油、ティーツリー葉油、タイム葉油、ウィンターグリーン葉油、花精油、カモミール油、クラリーセージ油、クローブ油、ゼラニウム花精油、ヒソップ花精油、ジャスミン花精油、ラベンダー花精油、マヌカ花精油、マジョラム(Marhoram)花精油、オレンジ花精油、バラ花精油、イラン-イラン花精油、樹皮油、カッシア樹皮油、シナモン樹皮油、サッサフラス樹皮油、木油、ショウノウ木油、杉木油、シタン油、ビャクダン油)、根茎(ショウガ)木油、樹脂油、乳香油、ミルラ油、皮油、ベルガモット皮油、グレープフルーツ皮油、レモン皮油、ライム皮油、オレンジ皮油、タンジェリン皮油、根油、バレリアン油、オレイン酸、リノール酸、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、その半合成誘導体及びその任意の組合せが含まれる。
【０１６６】
油は、揮発性シリコーン成分などのシリコーン成分をさらに含むことができ、これはシリコーン成分の唯一の油であってよく、又は他のシリコーン及び非シリコーンの揮発性及び不揮発性油と組み合わせることができる。適切なシリコーン成分には、それに限定されるものではないが、メチルフェニルポリシロキサン、シメチコン、ジメチコン、フェニルトリメチコン(又はその有機変性型)、ポリマーシリコーンのアルキル化誘導体、セチルジメチコン、ラウリルトリメチコン、ジメチコノールなどのポリマーシリコーンのヒドロキシル化誘導体、揮発性シリコーン油、環式及び直鎖シリコーン、シクロメチコン、シクロメチコンの誘導体、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、揮発性直鎖ジメチルポリシロキサン、イソヘキサデカン、イソエイコサン、イソテトラコサン、ポリイソブテン、イソオクタン、イソドデカン、その半合成誘導体及びその組合せが含まれる。
【０１６７】
揮発性油は有機溶媒であってよく、又は揮発性油は、有機溶媒に加えて存在することができる。適切な揮発性油には、それに限定されるものではないが、テルペン、モノテルペン、セスキテルペン、駆風剤、アズレン、メントール、ショウノウ、ツジョン、チモール、ネロール、リナロール、リモネン、ゲラニオール、ペリリルアルコール、ネロリドール、ファルネソール、イランゲン、ビサボロール、ファルネセン、アスカリドール、アカザ油、シトロネラル、シトラール、シトロネロール、カマズレン、ノコギリソウ、グアイアズレン、カモミール、半合成誘導体又はその組合せが含まれる。
【０１６８】
本発明の一態様では、シリコーン成分中の揮発性油は、油相中の油とは異なる。
【０１６９】
4.界面活性剤/洗浄剤
本発明のナノエマルジョン中の界面活性剤又は洗浄剤は、薬学的に許容されるイオン性界面活性剤、薬学的に許容される非イオン性界面活性剤、薬学的に許容されるカチオン性界面活性剤、薬学的に許容されるアニオン性界面活性剤又は薬学的に許容される双性イオン性界面活性剤であってよい。
【０１７０】
有用な例示的な界面活性剤は、参照によって具体的に組み込まれるApplied Surfactants:Principles and Applications. Tharwat F. Tadros、Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA、Weinheim ISBN:3-527-30629-3に記載されている。
【０１７１】
さらに、界面活性剤は、薬学的に許容されるイオン性ポリマー性界面活性剤、薬学的に許容される非イオン性ポリマー性界面活性剤、薬学的に許容されるカチオン性ポリマー性界面活性剤、薬学的に許容されるアニオン性ポリマー性界面活性剤又は薬学的に許容される双性イオンポリマー性界面活性剤であってよい。ポリマー性界面活性剤の例には、それに限定されるものではないが、ポリ(メチルメタクリレート)主鎖と複数の(少なくとも一つの)ポリエチレンオキシド(PEO)側鎖のグラフトコポリマー、ポリヒドロキシステアリン酸、アルコキシル化アルキルフェノールホルムアルデヒド融合物、ポリアルキレングリコール修飾ポリエステルと脂肪酸疎水性物質、ポリエステル、その半合成誘導体又はその組合せが含まれる。
【０１７２】
表面活性剤又は界面活性剤は両親媒性分子であり、これは非極性疎水性部分、通常、極性又はイオン性親水性部分に結合している、8〜18個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐炭化水素又はフッ化炭素鎖からなる。親水性部分は、非イオン性、イオン性又は双性イオン性であってよい。炭化水素鎖は、水性環境中の水分子と弱く相互作用する一方、極性又はイオン性頭部基は、双極子又はイオン双極子相互反応を介して水分子と強く相互作用する。親水性基の性質に基づき、界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、双性イオン性、非イオン性及びポリマー性界面活性剤に分類される。
【０１７３】
適切な界面活性剤には、それに限定されるものではないが、9〜10単位のエチレングリコールを含むエトキシル化ノニルフェニル、8単位のエチレングリコールを含むエトキシル化ウンデカノール、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレアート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレアート、エトキシル化水素化リシン油、ラウリル硫酸ナトリウム、エチレンオキシド(ethyleneoxyde)及びプロピレンオキシドのジブロックコポリマー、エチレンオキシド-プロピレンオキシドブロックコポリマー、並びにエチレンオキシド及びプロピレンオキシド系四官能性ブロックコポリマー、グリセリルモノエステル、カプリン酸グリセリル、カプリル酸グリセリル、グリセリルココエート(cocate)、エルカ酸グリセリル、ヒドロキシステアリン酸グリセリル、イソステアリン酸グリセリル、ラノリン脂肪酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、リノール酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル、グリセリルPABA、パルミチン酸グリセリル、リシノール酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、チオグリコール酸(thiglycolate)グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジオレイン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、セスキオレイン酸(sesuioleate)グリセリル、ステアリン酸乳酸グリセリル、ポリオキシエチレンセチル/ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンコレステロールエーテル、ラウリン酸又はジラウリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸又はジステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ステロイド、コレステロール、βシトステロール、ビサボロール、アルコールの脂肪酸エステル、ミリスチン酸イソプロピル、n-酪酸脂肪族(Aliphati)イソプロピル、n-ヘキサン酸イソプロピル、n-デカン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル(Isoproppyl)、ミリスチン酸オクチルドデシル、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化酸、アルコキシル化アミド、アルコキシル化糖類誘導体、天然油及びワックスのアルコキシル化誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ノノキシノール-14、ラウリン酸PEG-8、PEG-6ココアミド、PEG-20セスキステアリン酸メチルグルコース、PEG40ラノリン、PEG-40ヒマシ油、PEG-40水素化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、グリセリルジエステル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレンラウリルエーテル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸(dimystate)グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、その半合成誘導体又はその混合物が含まれる。
【０１７４】
さらなる適切な界面活性剤には、それに限定されるものではないが、ラウリン酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、その半合成誘導体及びその混合物などの非イオン性脂質が含まれる。
【０１７５】
さらなる実施形態では、界面活性剤は、約2〜約100個の基の範囲のポリオキシエチレン頭部基を有するポリオキシエチレン脂肪エーテルであり、或いは構造R5--(OCH2CH2)y--OHを有するアルコキシル化アルコールであり、式中、R5は、約6〜約22個の炭素原子を有する分岐又は非分岐のアルキル基であり、yは、約4から約100の間、好ましくは約10から約100の間である。好ましくは、アルコキシル化アルコールは、R5がラウリル基であり、yが平均値23を有する種である。
【０１７６】
異なる一実施形態では、界面活性剤は、ラノリンアルコールのエトキシル化誘導体であるアルコキシル化アルコールである。好ましくは、ラノリンアルコールのエトキシル化誘導体はlaneth-10であり、これは、平均エトキシル化値10を有するラノリンアルコールのポリエチレングリコールエーテルである。
【０１７７】
非イオン性界面活性剤には、それに限定されるものではないが、エトキシル化界面活性剤、エトキシル化アルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化脂肪酸、エトキシル化モノアルカノールアミド(monoalkaolamide)、エトキシル化ソルビタンエステル、エトキシル化脂肪アミノ、エチレンオキシド-プロピレンオキシドコポリマー、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、ノノキシノール-9、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、Brij(登録商標)35、Brij(登録商標)56、Brij(登録商標)72、Brij(登録商標)76、Brij(登録商標)92V、Brij(登録商標)97、Brij(登録商標)58P、Cremophor(登録商標)EL、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-デカノイル-N-メチルグルカミン、n-デシルα-D-グルコピラノシド、デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデカノイル-N-メチルグルカミド、n-ドデシルα-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、n-ヘキサデシルβ-D-マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Igepal CA-630、Igepal CA-630、メチル-6-O-(N-ヘプチルカルバモイル)-α-D-グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル-β-D-グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレ
ングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルW-1、ポリオキシエチレン10トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン100ステアレート、ポリオキシエチレン20イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン20オレイルエーテル、ポリオキシエチレン40ステアレート、ポリオキシエチレン50ステアレート、ポリオキシエチレン8ステアレート、ポリオキシエチレンビス(イミダゾリルカルボニル)、ポリオキシエチレン25プロピレングリコールステアレート、キラヤ樹皮由来のサポニン、Span(登録商標)20、Span(登録商標)40、Span(登録商標)60、Span(登録商標)65、Span(登録商標)80、Span(登録商標)85、Tergitol、Type 15-S-12、Tergitol、Type 15-S-30、Tergitol、Type 15-S-5、Tergitol、Type 15-S-7、Tergitol、Type 15-S-9、Tergitol、Type NP-10、Tergitol、Type NP-4、Tergitol、Type NP-40、Tergitol、Type NP-7、Tergitol、Type NP-9、Tergitol、Tergitol、Type TMN-10、Tergitol、Type TMN-6、テトラデシル-β-D-マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS- 15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、Triton X-207、Triton(登録商標)X-114、Triton(登録商標)X-165、Triton(登録商標)X-305、Triton(登録商標)X-405、Triton(登録商標)X-45、Triton(登録商標)X-705-70、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)21、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)61、TWEEN(登録商標)65、TWEEN(登録商標)80、TWEEN(登録商標)81、TWEEN(登録商標)85、Tyloxapol、n-ウンデシルβ-D-グルコピラノシド、その半合成誘導体又はその組合せが含まれる。
【０１７８】
さらに、非イオン性界面活性剤は、ポロキサマーであってよい。ポロキサマーは、ポリオキシエチレンのブロック、それに続くポリオキシプロピレンのブロック、それに続くリオキシエチレンのブロックから生成されるポリマーである。ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンの単位の平均数は、そのポリマーに関連する数に基づいて変わる。例えば、最小ポリマーとしてのPoloxamer 101は、平均2単位のポリオキシエチレンのブロック、平均16単位のポリオキシプロピレンのブロック、それに続く平均2単位のポリオキシエチレンのブロックからなる。ポロキサマーは、無色液体及びペーストから白色固体にわたる。化粧用及び個人医療用生成物では、ポロキサマーは、皮膚洗浄剤、入浴製品、シャンプー、ヘアコンディショナー、洗口剤、アイメーキャップ除去剤並びに他の皮膚及び毛髪用製品の配合物に使用される。Poloxamersの例には、それに限定されるものではないが、Poloxamer 101、Poloxamer 105、Poloxamer 108、Poloxamer 122、Poloxamer 123、Poloxamer 124、Poloxamer 181、Poloxamer 182、Poloxamer 183、Poloxamer 184、Poloxamer 185、Poloxamer 188、Poloxamer 212、Poloxamer 215、Poloxamer 217、Poloxamer 231、Poloxamer 234、Poloxamer 235、Poloxamer 237、Poloxamer 238、Poloxamer 282、Poloxamer 284、Poloxamer 288、Poloxamer 331、Poloxamer 333、Poloxamer 334、Poloxamer 335、Poloxamer 338、Poloxamer 401、Poloxamer 402、Poloxamer 403、Poloxamer 407、Poloxamer 105ベンゾエート及びPoloxamer 182ジベンゾエートが含まれる。
【０１７９】
適切なカチオン性界面活性剤には、それに限定されるものではないが、四級アンモニウム化合物、アルキルトリメチルアンモニウムクロライド化合物、ジアルキルジメチルアンモニウムクロライド化合物、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロヨウ素酸塩、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エチルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジラール試薬T、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、N,N',N'-ポリオキシエチレン(10)-N-獣脂-1,3-ジアミノプロパン、トンゾニウムブロミド、トリメチル(テトラデシル)アンモニウムブロミド、1,3,5-トリアジン-1,3,5(2H,4H,6H)-トリエタノール、1-デカンアミニウム、N-デシル-N、N-ジメチル-、クロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、2-(2-(p-(ジイソブチル)クレソスキシ(cresosxy))エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、2-(2-(p-(ジイソブチル)フェノキシ)エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、アルキル1又は3ベンジル-1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリニウムクロライド、アルキルビス(2-ヒドロキシエチル)ベンジルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルベンジル(demethyl benzyl)アンモニウムクロライド、アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウムクロライド(100%C12)、アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウムクロライド(50%C14、40%C12、10%C16)、アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウムクロライド(55%C14、23%C12、20%C16)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(100%C14)、アルキルジメチルベンジ
ルアンモニウムクロライド(100%C16)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(41%C14、28%C12)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(47%C12、18%C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(55%C16、20%C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(58%C14、28%C16)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(60%C14、25%C12)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(61%C11、23%C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(61%C12、23%C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(65%C12、25%C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(67%C12、24%C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(67%C12、25%C14)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(90%C14、5%C12)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(93%C14、4%C12)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(95%C16、5%C18)、アルキルジデシルジメチルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(C12〜16)、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(C12〜18)、ジアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルジメチルベンジル(dimethybenzyl)アンモニウムクロライド、アルキルジメチルエチルアンモニウムブロミド(90%C14、5%C16、5%C12)、アルキルジメチルエチルアンモニウムブロミド(大豆油の脂肪酸に見られるような混合アルキル基及びアルケニル基)、アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムクロライド(60%C14)、アルキルジメチルイソプロピルベンジルアンモニウムクロライド(50%C12、30%C14、17%C16、3%C18)、アルキルトリメチルアンモニウムクロライド(58%C18、40%C16、1%C14、1%C12)、アルキルトリメチルアンモニウムクロライド(90%C18、10%C16)、アルキルジメチル(エチルベンジル)アンモニウムクロライド(C12〜18)、ジ-(C8〜10)-アルキルジメチルアンモニウムクロライド、ジアルキルジメチルアンモニウムクロライド、ジアルキルメチルベンジルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ジイソデシルジメチルアンモニウムクロライド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロライド、ドデシルビス(2-ヒドロキシエチル)オクチル水素アンモニウムクロライド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ドデシルカルバモイルメチルジメチル(dinethyl)ベンジルアンモニウムクロライド、ヘプタデシルヒドロキシエチルイミダゾリニウムクロライド、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-s-トリアジン、ミリスタルコニウムクロライド(及び)Quat RNIUM 14、N,N-ジメチル-2-ヒドロキシプロピルアンモニウムクロライドポリマー、n-テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド一水和物、オクチルデシルジメチルアンモニウムクロライド、オクチルドデシルジメチルアンモニウムクロライド、オクチルフェノキシエトキシエチル(Octyphenoxyethoxyethyl)ジメチルベンジルアンモニウムクロライド、オキシジエチレンビス(アルキルジメチルアンモニウムクロライド)、トリメトキシシリル(Trimethoxysily)プロピルジメチルオクタデシルアンモニウムクロライド、トリメトキシシリル四級(quat)、トリメチルドデシルベンジルアン���ニウムクロライドなどのカチオン性ハロゲン含有化合物、その半合成誘導体及びその組合せが含まれる。
【０１８０】
例示的なカチオン性ハロゲン含有化合物には、それに限定されるものではないが、ハロゲン化セチルピリジニウム、ハロゲン化セチルトリメチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルエチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化セチルトリブチルホスホニウム、ハロゲン化ドデシルトリメチルアンモニウム又はハロゲン化テトラデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。いくつかの特定の実施形態では、適切なカチオン性ハロゲン含有化合物は、それに限定されるものではないが、塩化セチルピリジニウム(CPC)、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、セチルピリジニウムブロミド(CPB)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、セチル(cetyi)ジメチルエチルアンモニウムブロミド、セチルトリブチルホスホニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド及び四分子セチル(ecyl)トリメチルアンモニウムブロミドを含む。特に好ましい実施形態では、カチオン性ハロゲン含有化合物はCPCであるが、本発明の組成物は、特定のカチオン含有化合物を用いた製剤によって制限されない。
【０１８１】
適切なアニオン性界面活性剤には、それに限定されるものではないが、カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、ウシ又はヒツジ胆汁、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、N,N-ジメチルドデシルアミンN-オキシド、ドクサートナトリウム塩、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物、合成、グリココール酸ナトリウム塩水和物、合成、グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコリトコール酸3-硫酸二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、N-ラウロイルザルコシンナトリウム塩、N-ラウロイルザルコシン溶液、N-ラウロイルザルコシン溶液、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸リチウム、Lugol溶液、Niaproof 4、Type 4、1-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、1-ブタンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-ドデカンスルホン酸ナトリウム、無水1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム、無水1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム、1-ノナンスルホン酸ナトリウム、1-プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、2-ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム一水和物、ドデシル硫酸ナトリウム、無水ヘキサンスルホン酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、無水ペンタンスルホン酸塩ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロヒオデオキシコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリソコール酸3-硫酸二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、Trizma(登録商標)ドデシル硫酸塩、TWEEN(登録商標)80、ウルソデオキシコール酸、その半合成誘導体及びその組合せが含まれる。
【０１８２】
適切な双性イオン界面活性剤には、それに限定されるものではないが、N-アルキルベタイン、ラウリルアミド(amindo)プロピルジメチルベタイン、アルキルジメチルグリシネート、N-アルキルアミノプロピオネート、CHAPS、最小98%(TLC)、CHAPS、SigmaUltra、最小98%(TLC)、CHAPS、電気泳動用、最小98%(TLC)、CHAPSO、最小98%、CHAPSO、SigmaUltra、CHAPSO、電気泳動用、3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート内塩、3-ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート内塩、SigmaUltra、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート内塩、3-(N,N-ジメチルミリスチルアンモニオ)プロパンスルホネート、3-(N,N-ジメチルオクタデシルアンモニオ)プロパンスルホネート、3-(N,N-ジメチルオクチルアンモニオ)プロパンスルホネート内塩、3-(N,N-ジメチルパルミチルアンモニオ)プロパンスルホネート、その半合成誘導体及びその組合せが含まれる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンはカチオン性界面活性剤を含み、これは、塩化セチルピリジニウムであってよい。本発明の他の実施形態では、ナノエマルジョンはカチオン性界面活性剤を含み、カチオン性界面活性剤の濃度は、約5.0%未満及び約0.001%超である。本発明のさらに別の実施形態では、ナノエマルジョンはカチオン性界面活性剤を含み、カチオン性界面活性剤の濃度は、約5%未満、約4.5%未満、約4.0%未満、約3.5%未満、約3.0%未満、約2.5%未満、約2.0%未満、約1.5%未満、約1.0%未満、約0.90%未満、約0.80%未満、約0.70%未満、約0.60%未満、約0.50%未満、約0.40%未満、約0.30%未満、約0.20%未満又は約0.10%未満からなる群から選択される。さらに、ナノエマルジョン中のカチオン性薬剤の濃度は、約0.002%超、約0.003%超、約0.004%超、約0.005%超、約0.006%超、約0.007%超、約0.008%超、約0.009%超、約0.010%超又は約0.001%超である。一実施形態では、ナノエマルジョン中のカチオン性薬剤の濃度は、約5.0%未満及び約0.001%超である。
【０１８４】
本発明の別の実施形態では、ナノエマルジョンは、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤及び少なくとも一つの非カチオン性界面活性剤を含む。非カチオン性界面活性剤は、ポリソルベート80又はポリソルベート20などのポリソルベート(Tween)などの非イオン性界面活性剤である。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、約0.05%〜約7.0%の濃度で存在し、又は非イオン性界面活性剤は、約0.5%〜約4%の濃度で存在する。本発明のさらに別の実施形態では、ナノエマルジョンは、約0.01%〜約2%の濃度で存在するカチオン性界面活性剤を、非イオン性界面活性剤と組み合わせて含む。
【０１８５】
5.追加成分
本発明のナノエマルジョンにおける使用に適した追加化合物には、それに限定されるものではないが、有機リン酸塩系溶媒、増量剤、着色剤、薬学的に許容される賦形剤、保存剤、pH調節剤、バッファー、キレート剤などの一つ又は複数の溶媒が含まれる。追加化合物は、予め乳化したナノエマルジョンに混合することができ、又は追加化合物は、乳化されるべき元の混合物に添加することができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、一つ又は複数のさらなる化合物は、その使用の直前に、既存のナノエマルジョン組成物に混合される。
【０１８６】
本発明のナノエマルジョンの適切な保存剤には、それに限定されるものではないが、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン、イミダゾリジニル尿素、フェノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸、ブロノポール、クロロクレソール、パラベンエステル、フェノキシエタノール、ソルビン酸、α-トコフェロール(tocophernol)、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、クエン酸、エデト酸、その半合成誘導体及びその組合せが含まれる。他の適切な保存剤には、それに限定されるものではないが、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン(ビス(p-クロロフェニルジグアニド)ヘキサン)、クロルフェネシン(3-(-4-クロロフェノキシ(pheoxy))-プロパン-1,2-ジオール)、Kathon CG(メチル及びメチルクロロイソチアゾリノン)、パラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルヒドロベンゾエート(hydrobenzoate))、フェノキシエタノール(2-フェノキシエタノール)、ソルビン酸(ソルビン酸カリウム、ソルビン酸)、Phenonip(フェノキシエタノール、メチル、エチル、ブチル、プロピルパラベン)、Phenoroc(フェノキシエタノール0.73%、メチルパラベン0.2%、プロピルパラベン0.07%)、Liquipar油(イソプロピル、イソブチル、ブチルパラベン)、Liquipar PE(70%フェノキシエタノール、30%liquipar油)、Nipaguard MPA(ベンジルアルコール(70%)、メチル&プロピルパラベン)、Nipaguard MPS(プロピレングリコール、メチル&プロピルパラベン)、Nipasept(メチル、エチル及びプロピエル(propyel)パラベン)、Nipastat(メチル、ブチル、エチル及びプロピエルパラベン)、Elestab 388(プロピレングリコール中フェノキシエタノールとクロルフェネシン及びメチルパラベン)及びKillitol(7.5%クロルフェネシン及び7.5%メチルパラベン)が含まれる。
【０１８７】
ナノエマルジョンは、少なくとも一つのpH調節剤をさらに含むことができる。本発明のナノエマルジョン中の適切なpH調節剤には、それに限定されるものではないが、ジエチアノールアミン(diethyanolamine)、乳酸、モノエタノールアミン、トリエチルアノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、その半合成誘導体及びその組合せが含まれる。
【０１８８】
さらに、ナノエマルジョンは、キレート剤を含むことができる。本発明の一実施形態では、キレート剤は、約0.0005%〜約1.0%の量で存在する。キレート剤の例には、それに限定されるものではないが、フィチン酸、ポリリン酸、クエン酸、グルコン酸、酢酸、乳酸、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)及びジメルカプロールが含まれ、好ましいキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸である。
【０１８９】
ナノエマルジョンは、薬学的に許容される緩衝剤などの緩衝剤を含むことができる。緩衝剤の例には、それに限定されるものではないが、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、≧99.5%(NT)、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、≧99.0%(GC)、L-(+)-酒石酸、≧99.5%(T)、ACES、≧99.5%(T)、ADA、≧99.0%(T)、酢酸、≧99.5%(GC/T)、酢酸、ルミネッセンス用、≧99.5%(GC/T)、酢酸アンモニウム溶液、分子生物学用、H2O中約5M、酢酸アンモニウム、ルミネッセンス用、≧99.0%(乾燥物質に対する理論値、T)、重炭酸アンモニウム、≧99.5%(T)、二塩基性クエン酸アンモニウム、≧99.0%(T)、ギ酸アンモニウム溶液、H2O中10M、ギ酸アンモニウム、≧99.0%(乾燥物質に対する理論値、NT)、シュウ酸アンモニウム一水和物、≧99.5%(RT)、二塩基性リン酸アンモニウム溶液、H2O中2.5M、二塩基性リン酸アンモニウム、≧99.0%(T)、一塩基性リン酸アンモニウム溶液、H2O中2.5M、一塩基性リン酸アンモニウム、≧99.5%(T)、二塩基性リン酸アンモニウムナトリウム四水和物、≧99.5%(NT)、硫酸アンモニウム溶液、分子生物学用、H2O中3.2M、二塩基性酒石酸アンモニウム溶液、H2O中2M(20℃において無色溶液)、二塩基性酒石酸アンモニウム、≧99.5%(T)、BES緩衝生理食塩水、分子生物学用、2×濃度、BES、≧99.5%(T)、BES、分子生物学用、≧99.5%(T)、BICINEバッファー溶液、分子生物学用、H2O中1M、BICINE、≧99.5%(T)、BIS-TRIS、≧99.0%(NT)、重炭酸塩バッファー溶液、>0.1MのNa2CO3、>0.2MのNaHCO3、ホウ酸、≧99.5%(T)、ホウ酸、分子生物学用、≧99.5%(T)、CAPS、≧99.0%(TLC)、CHES、≧99.5%(T)、酢酸カルシウム水和物、≧99.0%(乾燥した材料に対する理論値、KT)、炭酸カルシウム、沈殿した、≧99.0%(KT)、三塩基性クエン酸カルシウム四水和物、≧98.0%(乾燥物質に対する理論値、KT)、クエン酸濃縮溶液、分子生物学用、H2O中1M、クエン酸、無水、≧99.5%(T)、クエン酸、ルミネッセンス用、無水、≧99.5%(T)、ジエタノールアミン、≧99.5%(GC)、EPPS、≧99.0%(T)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物、分子生物学用、≧99.0%(T)、ギ酸溶液、H2O中1.0M、Gly-Gly-Gly、≧99.0%(NT)、Gly-Gly、≧99.5%(NT)、グリシン、≧99.0%(NT)、グリシン、ルミネッセンス用、≧99.0%(NT)、グリシン、分子生物学用、≧99.0%(NT)、HEPES緩衝生理食塩水、分子生物学用、2×濃度、HEPES、≧99.5%(T)、HEPES、分子生物学用、≧99.5%(T)、イミダゾールバッファー溶液、H2O中1M、イミダゾール、≧99.5%(GC)、イミダゾール、ルミネッセンス用、≧99.5%(GC)、イミダゾール、分子生物学用、≧99.5%(GC)、リポタンパク質リフォールディングバッファー、酢酸リチウム二水和物、≧99.0%(NT)、三塩基性クエン酸リチウム四水和物、≧99.5%(NT)、MES水和物、≧99.5%(T)、MES一水和物、ルミネッセンス用、≧99.5%(T)、MES溶液、分子生物学用、H2O中0.5M、MOPS、≧99.5%(T)、MOPS、ルミネッセンス用、≧99.5%(T)、MOPS、分子生物学用、≧99.5%(T)、酢酸マグネシウム溶液、分子生物学用、H2O中約1M、酢酸マグネシウム四水和物、≧99.0%(KT)、三塩基性クエン酸マグネシウム九水和物、≧98.0%(乾燥物質に対する理論値、KT)、ギ酸マグネシウム溶液、H2O中0.5M、二塩基性リン酸マグネシウム三水和物、≧98.0%(KT)、in-situハイブリダイゼーション用のin-situハイブリダイゼーション中和溶液、分子生物学用、シュウ酸二水和物、≧99.5%(RT)、PIPES、≧99.5%(T)、PIPES、分子生物学用、≧99.5%(T)、リン酸塩緩衝生理食塩水、溶液(オートクレーブ済み)、リン���塩緩衝生理食塩水、ウェスタンブロッティングにおけるペルオキシダーゼコンジュゲートのための洗浄バッファー、10×濃度、ピペラジン、無水、≧99.0%(T)、一塩基性D-酒石酸カリウム、≧99.0%(T)、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、H2O中5M、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、H2O中約1M、酢酸カリウム、≧99.0%(NT)、酢酸カリウム、ルミネッセンス用、≧99.0%(NT)、酢酸カリウム、分子生物学用、≧99.0%(NT)、重炭酸カリウム、≧99.5%(T)、炭酸カリウム、無水、≧99.0%(T)、塩化カリウム、≧99.5%(AT)、一塩基性クエン酸カリウム、≧99.0%(乾燥した材料、NT)、三塩基性クエン酸カリウム溶液、H2O中1M、ギ酸カリウム溶液、H2O中14M、ギ酸カリウム、≧99.5%(NT)、シュウ酸カリウム一水和物、≧99.0%(RT)、二塩基性リン酸カリウム、無水、≧99.0%(T)、二塩基性リン酸カリウム、ルミネッセンス用、無水、≧99.0%(T)、二塩基性リン酸カリウム、分子生物学用、無水、≧99.0%(T)、一塩基性リン酸カリウム、無水、≧99.5%(T)、一塩基性リン酸カリウム、分子生物学用、無水、≧99.5%(T)、三塩基性リン酸カリウム一水和物、≧95%(T)、一塩基性フタル酸カリウム、≧99.5%(T)、酒石酸カリウムナトリウム溶液、H2O中1.5M、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、≧99.5%(NT)、テトラホウ酸カリウム四水和物、≧99.0%(T)、四シュウ酸カリウム二水和物、≧99.5%(RT)、プロピオン酸溶液、H2O中1.0M、STEバッファー溶液、分子生物学用、pH7.8、STETバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、バルビツール酸ナトリウム5,5-ジエチル、≧99.5%(NT)、酢酸ナトリウム溶液、分子生物学用、H2O中約3M、酢酸ナトリウム三水和物、≧99.5%(NT)、酢酸ナトリウム、無水、≧99.0%(NT)、酢酸ナトリウム、ルミネッセンス用、無水、≧99.0%(NT)、酢酸ナトリウム、分子生物学用、無水、≧99.0%(NT)、重炭酸ナトリウム、≧99.5%(T)、酒石酸水素ナトリウム一水和物、≧99.0%(T)、炭酸ナトリウム十水和物、≧99.5%(T)、炭酸ナトリウム、無水、≧99.5%(乾燥物質に対する理論値、T)、一塩基性クエン酸ナトリウム、無水、≧99.5%(T)、三塩基性クエン酸ナトリウム二水和物、≧99.0%(NT)、三塩基性クエン酸ナトリウム二水和物、ルミネッセンス用、≧99.0%(NT)、三塩基性クエン酸ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.5%(NT)、ギ酸ナトリウム溶液、H2O中8M、シュウ酸ナトリウム、≧99.5%(RT)、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、≧99.0%(T)、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、ルミネッセンス用、≧99.0%(T)、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.0%(T)、二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、≧99.0%(T)、二塩基性リン酸ナトリウム溶液、H2O中0.5M、二塩基性リン酸ナトリウム、無水、≧99.5%(T)、二塩基性リン酸ナトリウム、分子生物学用、≧99.5%(T)、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、≧99.0%(T)、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.0%(T)、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、分子生物学用、≧99.5%(T)、一塩基性リン酸ナトリウム溶液、H2O中5M、二塩基性ピロリン酸ナトリウム、≧99.0%(T)、四塩基性ピロリン酸ナトリウム十水和物、≧99.5%(T)、二塩基性酒石酸ナトリウム二水和物、≧99.0%(NT)、二塩基性酒石酸ナトリウム溶液、H2O中1.5M(20℃における無色溶液)、テトラホウ酸ナトリウム十水和物、≧99.5%(T)、TAPS、≧99.5%(T)、TES、≧99.5%(乾燥物質に対する理論値、T)、TMバッファー��液、分子生物学用、pH7.4、TNTバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、TRISグリシンバッファー溶液、10×濃度、TRIS酢酸塩-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、TRIS緩衝生理食塩水、10×濃度、TRISグリシンSDSバッファー溶液、電気泳動用、10×濃度、TRISリン酸塩-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、濃縮、10×濃度、トリシン、≧99.5%(NT)、トリエタノールアミン、≧99.5%(GC)、トリエチルアミン、≧99.5%(GC)、酢酸トリエチルアンモニウムバッファー、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、リン酸トリエチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、酢酸トリメチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、リン酸トリメチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1M、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、濃縮、100×濃度、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、pH7.4、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、Trizma(登録商標)酢酸塩、≧99.0%(NT)、Trizma(登録商標)塩基、≧99.8%(T)、Trizma(登録商標)塩基、≧99.8%(T)、Trizma(登録商標)塩基、ルミネッセンス用、≧99.8%(T)、Trizma(登録商標)塩基、分子生物学用、≧99.8%(T)、Trizma(登録商標)炭酸塩、≧98.5%(T)、Trizma(登録商標)塩酸塩バッファー溶液、分子生物学用、pH7.2、Trizma(登録商標)塩酸塩バッファー溶液、分子生物学用、pH7.4、Trizma(登録商標)塩酸塩バッファー溶液、分子生物学用、pH7.6、Trizma(登録商標)塩酸塩バッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、Trizma(登録商標)塩酸塩、≧99.0%(AT)、Trizma(登録商標)塩酸塩、ルミネッセンス用、≧99.0%(AT)、Trizma(登録商標)塩酸塩、分子生物学用、≧99.0%(AT)、及びTrizma(登録商標)マレイン酸塩、≧99.5%(NT)が含まれる。
【０１９０】
ナノエマルジョンは、エマルジョンの形成を助けるための一つ又は複数の乳化剤を含むことができる。乳化剤は、二つの隣接する液滴間の直接接触を予防する種類の連続膜を形成するための、油/水界面で凝集する化合物を含む。本発明の特定の実施形態は、それらの抗ウイルス特性を損なうことなく、水で所望の濃度に容易に希釈できるナノエマルジョンを特徴とする。
【０１９１】
6.本発明のナノエマルジョンに組み込まれる活性剤
本発明のさらなる一実施形態では、ナノエマルジョンは、抗生物質又は緩和剤(熱傷治療のためなど)などの追加の活性剤を含む。別の薬剤を添加することによって、ナノエマルジョンの治療有効性を強化することができる。ナノエマルジョンは、それ自体抗菌活性を有しており、治療有効性を得るための別の活性剤と組み合わせる必要はない。細菌感染症を治療するのに適した任意の抗菌(又は抗生物質)薬剤を、本発明の局所用ナノエマルジョンに組み込むことができる。
【０１９２】
かかる抗生物質製剤の例には、それに限定されるものではないが、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マイクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ポリペプチド、ポリミキシン、キノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、及びその他(例えば、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、ピラジナミド、キヌプリスチン/ダルホプリスチン、リファンピシン(USではリファンピン)、チアンフェニコール、チニダゾール、ダプソン及びクロファジミン(lofazimine)が含まれる。
【０１９３】
これらの種類の抗生物質の例には、それに限定されるものではないが、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム/シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン又はセファロチン(Cefalothin)、セファレキシン、セファクロール、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、アズトレオナム、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンB、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、マフェニド、スルホンアミドクリソイジン(Sulfonamidochrysoidine)(旧名)、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメチゾール、スルファンアミド(Sulfanamide)(旧名)、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム(rimethoprim)-スルファメトキサゾール(コトリモキサゾール)(TMP-SMX)、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン及びテトラサイクリンが含まれる。
【０１９４】
本発明のナノエマルジョンに組み込むことができる緩和剤の例には、それに限定されるものではないが、メントール、ショウノウ、フェノール、アラントイン、ベンゾカイン、コルチコステロイド、フェノール、酸化亜鉛、ショウノウ、プラモキシン、ジメチコン、メラジメート(meradimate)、オクチノキサート、オクチサレート、オキシベンゾン、ジクロニン、アルコール(例えば、ベンジルアルコール)、鉱油、プロピレングリコール、二酸化チタン、硝酸銀(AgNO3)、スルファジアジン銀、酢酸マフェニド、ナノ結晶を含浸させた銀包帯材、p38MAPK阻害剤及びステアリン酸マグネシウムが含まれる。
【０１９５】
D.医薬組成物
本発明のナノエマルジョンは、任意の従来の薬学的投与方法を使用して、治療有効量のナノエマルジョン及びそれを必要としているヒト対象に投与するのに適した薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に製剤化することができる。かかる賦形剤は、当技術分野で周知である。
【０１９６】
「治療有効量」という句は、微生物を死滅させ、又はその成長を阻害し、微生物が病原性を喪失するようにし、又はその任意の組合せによって微生物を治療するのに有効なナノエマルジョンの任意の量を意味する。
【０１９７】
例示的な剤形は、それに限定されるものではないが、パッチ、軟膏、クリーム剤、エマルジョン、液剤、ローション剤、ゲル剤、生体付着性ゲル剤、エアゾール、ペースト、発泡剤、日焼け止め剤、カプセル剤、マイクロカプセルを含むことができ、或いは包帯、挿入剤、シリンジ様アプリケーター、ペッサリー、散剤及びタルク、又は他の固体などの物質又は担体の形態であってもよい。
【０１９８】
医薬組成物は、即時放出、徐放、制御放出、遅延放出又はその任意の組合せに合わせて製剤化することができる。いくつかの実施形態では、製剤は、角質層を介して表皮又は真皮にナノエマルジョンが浸透するのを強化するための(即ち、熱傷を治療する方法のための)浸透強化剤を含むことができる。適切な浸透強化剤には、それに限定されるものではないが、エタノールなどのアルコール、トリグリセリド及びアロエ組成物が含まれる。浸透強化剤の量は、製剤の約0.5重量%〜約40重量%を構成することができる。
【０１９９】
適切な場合、例えば熱傷を治療する場合、本発明のナノエマルジョンは、電気泳動送達/電気泳動法を利用して適用及び/又は送達することができる。電流を適用することを含むかかる経皮的な方法は、当技術分野で周知である。
【０２００】
本発明の別の実施形態では、局所投与時にナノエマルジョンの最小限の全身吸収が生じる。かかる最小限の全身曝露は、対象の血漿中のナノエマルジョンに存在する一つ又は複数の界面活性剤を10ng/mL未満、8ng/mL未満、5ng/mL未満、4ng/mL未満、3ng/mL未満又は2ng/mL未満検出することによって決定することができる。全身吸収の欠如は、例えば、治療を受けているヒト対象の血漿中の、カチオン性界面活性剤などの界面活性剤の量を測定することによってモニタすることができる。血漿中の約10ng/ml以下の量の界面活性剤は、全身吸収が最小限であることを確認するものである。
【０２０１】
医薬組成物は、単回投与又は多回投与で適用することができる。医薬組成物は、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、週1回、少なくとも週2回、少なくとも1日1回、少なくとも1日2回、1日複数回、毎週、隔週で複数回、少なくとも月1回、又はその任意の組合せで適用することができる。
【０２０２】
局所又は皮内投与後、ナノエマルジョンは閉塞されていても、半閉塞であってもよい。閉塞又は半閉塞は、局所用調製剤を包帯、ポリオレフィンフィルム、布製品、不透過性(impermeabile)障壁又は半不透過性障壁で覆うことによって実施することができる。
【０２０３】
例示的ナノエマルジョン
いくつかの例示的なナノエマルジョンを以下に記載するが、本発明の方法は、かかるナノエマルジョンの使用に限定されない。それぞれの成分及び量は、他のナノエマルジョンの調製において本明細書に記載の通り、変わり得る。(「CPC」は塩化セチルピリジニウムを指し、これはナノエマルジョンに存在するカチオン性界面活性剤である)。組成物は別段の記載がない限りw/w%である。
【表１】
0005722782.tif 000002
【０２０４】
以下のナノエマルジョン、W205ECED、P4075EC、W205GBA2、W805EC及びW205GBA2EDは、約300nm〜約600nmの平均粒径(液滴)を有する。高圧加工を受けるW205ECEDL2は、約150nm〜約400nmの平均粒径(液滴)を有する。先の表に列挙した製剤は、「純粋」又は「濃縮」製剤であり、これは、治療使用を企図する製剤を所望に応じて希釈できることを意味する。
【０２０５】
製造方法
本発明のナノエマルジョンは、従来のエマルジョン形成技術を使用して形成することができる。例えば、米国特許出願第2004/0043041号参照。また、それら全てが参照によって組み込まれる米国特許第6,015,832号、第6,506,803号、第6,559,189号、第6,635,676号及び米国特許出願第20040043041号を参照。さらに、エマルジョンの製造方法は、米国特許第5,103,497号及び第4,895,452号(参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。例示的な方法では、相対的に高いせん断力の下(例えば、高動水力及び機械力を使用して)で油を水相と混合して、約1000nm未満の平均直径を有する油液滴を含むナノエマルジョンを得る。本発明のいくつかの実施形態は、エタノールなどのアルコールを含む油相を有するナノエマルジョンを使用する。油相及び水相は、フレンチプレス又は高せん断ミキサー(例えばAdmix、Inc.、Manchester、N.H.製の、FDA承認の、例えば高せん断ミキサーが利用可能である)などの、エマルジョンを形成するのに十分なせん断力をもたらすことができる任意の装置を使用してブレンドすることができる。かかるエマルジョンの製造方法は、それら全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,103,497号及び第4,895,452号に記載されている。
【０２０６】
例示的な一実施形態では、本発明の方法において使用するナノエマルジョンは、水などの水性連続相に分散した油性不連続相の液滴を含む。本発明のナノエマルジョンは安定であり、長期保存後も分解しない。本発明の特定のナノエマルジョンは、嚥下され、吸入され、又は対象の皮膚に接触させられる場合、非毒性であり安全である。
【０２０７】
本発明の組成物は、多量に製造することができ、広範な温度範囲で何カ月も安定である。ナノエマルジョンは、半固体クリームのものから薄いローションの質感を有することができ、手によって局所適用することができ、表面上にスプレーすることができ、又は噴霧器によって投与することができる。
【０２０８】
前述の通り、エマルジョンの少なくとも一部分は、それに限定されるものではないが、単層、多層及び少数層の脂質小胞、ミセル及び層状の相を含む形態の脂質構造であってよい。
【０２０９】
本発明は、記載のナノエマルジョンの多くの変形が、本発明の方法において有用となることを企図する。候補のナノエマルジョンが、本発明の使用に適しているかどうかを決定するために、三つの基準を分析する。本明細書に記載の方法及び標準を使用して、候補のエマルジョンが適しているかどうかを決定するために、それらを容易に試験することができる。第一に、ナノエマルジョンが形成され得るかどうかを決定するために、所望の成分を本明細書に記載の方法を使用して調製する。ナノエマルジョンを形成できなかった場合、その候補は却下される。第二に、候補ナノエマルジョンは、安定なエマルジョンを形成すべきである。ナノエマルジョンは、その所期の使用を可能にする十分な期間、それがエマルジョン形態のままである場合に安定である。例えば、保存、輸送等がされるべきナノエマルジョンについては、ナノエマルジョンが数カ月から数年間、エマルジョンのままであることが望ましいことがある。相対的に不安定な一般的なナノエマルジョンは、数日内にそれらの形態を喪失することになる。第三に、候補ナノエマルジョンは、その所期の使用に合った効率を有するべきである。例えば、本発明のエマルジョンは、微生物をインビトロで死滅させ、又は無能にするべきである。所望の微生物に対する特定の候補ナノエマルジョンの適切性を決定するために、ナノエマルジョンを、適切な対照サンプル(例えば、水などの陰性対照)との比較実験において一つ又は複数の期間、微生物に曝露し、ナノエマルジョンがその微生物を死滅させ、又は無能にするかどうか、及びその程度を決定する。
【０２１０】
本発明のナノエマルジョンは、多くの様々な種類の容器及び送達系で提供することができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、ナノエマルジョンは、液剤、ローション剤、クリーム剤又は他の固体若しくは半固体形態として提供される。本発明のナノエマルジョンは、ヒドロゲル製剤に組み込むことができる。
【０２１１】
ナノエマルジョンは、任意の適切な容器で送達することができる(例えば、対象又は顧客に)。所望の適用に合った、ナノエマルジョンの一つ又は複数の単回使用量又は多回使用量を提供する適切な容器を使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ナノエマルジョンは、懸濁液又は液体形態で提供される。かかるナノエマルジョンは、スプレーボトル(例えば、加圧スプレーボトル、噴霧器)を含む任意の適切な容器で送達することができる。
【０２１２】
例示的な使用方法
本願を通して、より詳細に説明する通り、本発明は、嚢胞性線維症(CF)を有する対象における呼吸器感染症を治療且つ/又は予防する方法を対象とする。一般に、該方法は、ナノエマルジョンを対象に投与するステップを含み、該ナノエマルジョンは、(i)水、(ii)少なくとも一つの有機溶媒、(iii)少なくとも一つの界面活性剤、及び(iv)少なくとも一つの油を含み、約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含む。本発明の一実施形態では、対象は、スタフィロコッカス属の種、ヘモフィルス属の種、シュードモナス属の種、バークホルデリア属の種、アシネトバクター属の種、ステノトロホモナス属の種、エシェリキア属の種、クレブシエラ属の種及びプロテウス属の種からなる群から選択される一つ又は複数の細菌種による感染症に罹患しやすいか、又はそれを有する。ナノエマルジョンは、任意の薬学的に許容される手段を使用して、有用な一投与方法である吸入により送達することができる。
【０２１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、熱傷を有する対象における感染症を治療又は予防する方法を対象とし、(a)該方法は、ナノエマルジョンを対象に投与するステップを含み、(b)該ナノエマルジョンは、(i)水、(ii)少なくとも一つの有機溶媒、(iii)少なくとも一つの界面活性剤及び(iv)少なくとも一つの油を含み、該ナノエマルジョンは、約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含む。本発明の一実施形態では、対象は、一つ又は複数のグラム陰性又はグラム陽性菌種による感染症に罹患しやすいか、又はそれを有する。別の実施形態では、細菌種は、スタフィロコッカス属の種、ヘモフィルス属の種、シュードモナス属の種、バークホルデリア属の種、アシネトバクター属の種、ステノトロホモナス属の種、エシェリキア属の種、クレブシエラ属の種及びプロテウス属の種からなる群から選択される。ナノエマルジョンは、任意の薬学的に許容される手段を使用して、有用な投与方法の例である吸入、噴霧及び粘膜表面への局所適用により送達することができる。
【０２１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、対象のインフルエンザ菌感染症を治療又は予防する方法を対象とし、(a)該方法は、インフルエンザ菌感染症を有するか、又は有する危険性がある対象にナノエマルジョンを投与するステップを含み、(b)該ナノエマルジョンは、(i)水、(ii)少なくとも一つの有機溶媒、(iii)少なくとも一つの界面活性剤及び(iv)少なくとも一つの油を含み、(c)該ナノエマルジョンは、約1000nm未満の平均直径を有する液滴を含む。ナノエマルジョンは、任意の薬学的に許容される手段を使用して、有用な投与方法の例である吸入、噴霧及び粘膜表面への送達により送達することができる。
【０２１５】
本発明の一実施形態では、ナノエマルジョンは最小の毒性若しくは副作用を示すか、又は全く示さない。好ましくは、ナノエマルジョンは、細菌に対する耐性を示さない。この実施形態は、本明細書に記載の全ての方法に適用される。
【０２１６】
該方法が呼吸器感染症に関する場合、一実施形態では、呼吸器感染症は、対象の肺に存在するバイオフィルムなどの細菌のバイオフィルムに関連し得る。
【０２１７】
本発明の方法の全ては、ナノエマルジョンの投与前、最中又は後のいずれかに一つ又は複数の抗生物質を投与するステップをさらに含むことができる。さらに別の実施形態では、一つ又は複数の抗生物質は、ナノエマルジョンに組み込むことができる。本発明のさらに別の実施形態では、ナノエマルジョンは、抗生物質といかなる拮抗作用も示さない。
【０２１８】
本発明の一実施形態では、ナノエマルジョン及び少なくとも一つの抗生物質の投与は、部分阻害濃度(FIC)指数、部分殺菌濃度(FBC)指数又はその組合せによって定義される通り、相乗作用する。この実施形態は、本明細書に記載の全ての方法に適用される。かかる抗生物質の例には、それに限定されるものではないが、ポリミキシン(コリスチン)及びアミノグリコシド(トブラマイシン)が含まれる。
【０２１９】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、緑膿菌、B.セノセパシア、A.バウマンニ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、黄色ブドウ球菌、インフルエンザ菌、大腸菌、K.ニューモニエ及びプロテウス・ミラビリスからなる群から選択される一つ又は複数の細菌種による感染症を治療又は予防するために使用することができる。全ての他のグラム陽性又はグラム陰性菌も、本発明の方法によって包含される。
【０２２０】
一実施形態では、ナノエマルジョンの最小阻害濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)又はその組合せは、ナノエマルジョンの静菌活性又は殺菌活性を示す。この実施形態は、本明細書に記載の全ての方法に適用される。
【０２２１】
本発明の別の実施形態では、一つ又は複数の細菌種は、一つ又は複数の抗生物質に対して耐性を示すことができる。例えば細菌種は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)であってよい。この実施形態は、本明細書に記載の全ての方法に適用される。
【０２２２】
本発明は、本発明の組成物が投与される対象の種類によって制限されない。先に記載の対象(例えば、呼吸器感染症に罹患しやすい)のそれぞれに、本発明の組成物を投与することができる。さらに、本発明の組成物及び方法は、急性気管支炎、気管支拡張症、肺炎(人工呼吸器関連肺炎、院内肺炎、ウイルス肺炎、細菌性肺炎、マイコバクテリア肺炎、真菌性肺炎、好酸球性肺炎及びニューモシスチス・カリニ肺炎を含む)、結核、嚢胞性線維症(CF)、肺気腫放射線肺炎、及び喫煙によって引き起こされた炎症に関連する呼吸器感染症、肺浮腫、塵肺症、サルコイドーシス(sarcoidiosis)、珪肺症、石綿肺、ベリリウム肺症、炭坑夫塵肺(CWP)、綿肺症、特発性肺線維症などの間質性肺疾患(ILD)、コラーゲン血管障害に関連するILD、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性硬化症、並びにインフルエンザなどの別の障害の結果であるか、又はそれに続発する肺炎症などの他の呼吸器疾患及び障害の治療に有用である。
【０２２３】
本発明は、本発明のナノエマルジョンを含む組成物の特定の製剤によって制限されない。実際、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、ナノエマルジョンに加えて、一つ又は複数の異なる薬剤を含むことができる。これらの薬剤又は補因子には、それに限定されるものではないが、アジュバント、界面活性剤、添加剤、バッファー、可溶化剤、キレート剤、油、塩、治療剤、薬物、生理活性剤、抗菌剤及び抗微生物剤(例えば、抗生物質、抗ウイルス等)が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、微生物(例えば、呼吸器に位置する)を死滅させるナノエマルジョンの能力を強化する薬剤及び/又は補因子を含む。いくつかの好ましい実施形態では、一つ又は複数の補因子又は薬剤の存在は、微生物を死滅させ、且つ/又はその成長を減衰するのに必要なナノエマルジョンの量を低減する。本発明は、本発明の治療剤に使用される補因子又は薬剤の種類によって制限されない。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン組成物に使用される補因子又は薬剤は、生理活性剤である。例えば、いくつかの実施形態では、生理活性剤は、細胞(例えば、CFTR発現細胞)において有用な生理活性剤であってよい。生理活性剤は、本明細書で使用される場合、放射性標識及び蛍光標識などの診断用薬剤を含む。生物活性剤は、ペプチド、核酸、並びに他の天然及び合成薬物分子を含む、細胞(例えば、CFTR発現細胞)の代謝に影響を及ぼす分子も含む。生物活性剤には、それに限定されるものではないが、アドレナリン作用薬;副腎皮質ステロイド;副腎皮質抑制薬;アルコール抑制物質;アルドステロン拮抗薬;アミノ酸;アンモニア解毒剤;タンパク質同化剤;滋養強壮剤;鎮痛剤;アンドロゲン;麻酔補助剤;麻酔剤;食欲低下薬;拮抗薬;下垂体前葉抑制薬;駆虫剤;抗ニキビ剤;抗アドレナリン作動薬;抗アレルギー剤;抗アメーバ剤;抗アンドロゲン剤;抗貧血剤;抗狭心症;抗不安症;抗関節炎;抗喘息;抗アテローム硬化性薬;抗菌剤;抗胆石剤;抗胆石形成剤(anticholelithogenic);抗コリン作用薬;抗凝固剤;抗コクシジウム剤;抗痙攣剤;抗うつ剤;抗糖尿病剤;止瀉薬;抗利尿剤;解毒剤;抗嘔吐剤;抗てんかん剤;抗エストロゲン剤;抗血栓溶解剤;抗真菌剤(antifungal);抗緑内障薬;抗血友病剤;抗出血剤;抗ヒスタミン剤;抗高脂血症剤;抗高リポタンパク血症剤;抗高血圧剤;抗低血圧剤;抗感染症剤;抗感染症剤、局所用;抗炎症;抗角質化薬;抗マラリア剤;抗微生物剤;抗片頭痛剤;抗有糸分裂剤;抗真菌剤(antimycotic)、抗催吐剤、抗新生物、抗好中球減、抗強迫神経症(antiobessional)剤;駆虫剤;抗パーキンソン病薬;逆ぜん動薬、抗ニューモシスチス剤;抗増殖剤;抗前立腺肥大剤;抗原虫剤;抗掻痒剤;抗精神病剤;抗リウマチ剤;抗住血吸虫剤;抗脂漏剤;抗分泌剤;抗痙攣剤;抗血栓症剤;鎮咳剤;抗潰瘍剤;抗尿路結石剤;抗ウイルス剤;食欲抑制薬;良性前立腺肥大症治療剤;血液グルコース制御因子;骨再吸収阻害剤;気管支拡張剤;炭酸脱水酵素阻害剤;心抑制薬;心臓保護剤;強心剤;心血管系薬剤;利胆薬;コリン作用薬;コリン作動薬;コリンエステラーゼ不活化剤;抗コクシジウム剤;認知アジュバント;認知賦活薬;抑制剤;診断用助剤;利尿剤;ドーパミン作用剤;外部寄生虫撲滅薬;嘔吐剤;酵素阻害剤;エストロゲン;血栓溶解剤;蛍光薬剤;遊離酸素ラジカル捕捉剤;消化管運動エフェクター;グルココルチコイド;生殖腺刺激物質(principle);毛髪成長刺激物質;止血剤;ヒスタミンH2受容体拮抗薬;ホルモン;低コレステロール血症;血糖降下剤;脂質低下薬;低血圧;造影剤;免疫剤;免疫変調剤;免疫調節剤;免疫賦活薬;免疫抑制剤;性交不能症療法補助剤;阻害剤;角質溶解薬;LHRH作動薬;肝臓障害治療;ルテオリジン;記憶アジュバント;精神能力賦活薬;気分制御因子;粘液溶解薬;粘膜保護剤;散瞳薬;抗鼻閉薬;神経筋遮断薬;神経保護;NMDA拮抗薬;非ホルモン性ステロール誘導体;分娩誘発剤;プラスミノーゲン活性化因子;血小板活性化因子拮抗薬;血小板凝集阻害剤;脳卒中後及び頭部外傷後治療;強化剤;プロゲスチン;プロスタグランジン;前立腺成長阻害剤;プロ甲状腺刺激ホルモン;向精神剤;肺面;放射性医薬品;制御因子;弛緩薬;再分配剤;疥癬虫殺虫剤;硬化剤;鎮静剤;鎮静剤-睡眠剤;選択的アデノシンA1拮抗薬;セロトニンアンタゴニスト;セロトニン阻害剤;セロトニン受容体拮抗薬;ステロイド;刺激物質;抑制薬;症候性多発性硬化症;共力剤;甲状腺ホル���ン;甲状腺阻害剤;甲状腺ホルモン様剤;精神安定剤;筋萎縮性側索硬化症薬;脳虚血薬;パジェット病薬;不安定狭心症薬;尿酸排泄促進薬;血管収縮剤;血管拡張剤;傷薬;創傷治癒剤;キサンチン酸化酵素阻害剤が含まれる。
【０２２５】
抗微生物剤として有用な分子は、本発明の方法及び組成物によって送達することができ、その結果呼吸器感染症が低減又は排除される。本発明のナノエマルジョンを含む組成物との併用投与において使用を見出すことができる抗生物質には、それに限定されるものではないが、アルメシリン、アムジノシリン、アミカシン、アモキシシリン、アンホマイシン、アンホテリシンB、アンピシリン、アザシチジン、アザセリン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、バカンピシリン、バシトラシン、ベンジルペニシロイル-ポリリジン、ブレオマイシン、カンジシジン、カプレオマイシン、カルベニシリン、セファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフェピム、セフィキシム、セフメノキシム、セフメタゾール、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォキシチン、セフピラミド、セフポドキシム、セフプロジル、セフスロジン、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シラスタチン、シンナマイシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クリンダマイシン、クリオキノール、クロキサシリン、コリスチメタート、コリスチン、シクラシリン、サイクロセリン、シクロスポリン、シクロ-(Leu-Pro)、ダクチノマイシン、ダルババンシン、ダルホプリスチン、ダプトマイシン、ダウノルビシン、デメクロサイクリン、デトルビシン、ジクロキサシリン、ジヒドロストレプトマイシン、ジリスロマイシン、ドキソルビシン、ドキシサイクリン、エピルビシン、エリスロマイシン、エベミノマイシン、フロキサシリン、ホスホマイシン、フシジン酸、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、グラミシジン、グリセオフルビン、ヘタシリン、イダルビシン、イミペネム、イセガナン、イベルメクチン、カナマイシン、ラスパルトマイシン、リネゾリド、リノコマイシン、ロラカルベフ、マガイニン、メクロサイクリン、メロペネム、メタサイクリン、メチシリン、メズロシリン、ミノサイクリン、マイトマイシン、モエノマイシン、モキサラクタム、モキシフロキサシン、ミコフェノール酸、ナフシリン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニフィマイシン、ニトロフラントイン、ノボビオシン、オレアンドマイシン、オリタバンシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシラミン、ペニシリンG、ペニシリンV、フェネチシリン、ピペラシリン、プリカマイシン、ポリミキシンB、プリスチナマイシン、キヌプリスチン、リファブチン、リファンピン、リファマイシン、ロリテトラサイクリン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ストレプトゾシン、スルバクタム、スルタミシリン、タクロリムス、タゾバクタム、テイコプラニン、テリスロマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、チゲサイクリン、トブラマイシン、トロレアンドマイシン、ツニカマイシン、チルスリシン、バンコマイシン、ビダラビン、バイオマイシン、ヴァージニアマイシン、BMS-284,756、L-749,345、ER-35,786、S-4661、L-786,392、MC-02479、Pep5、RP59500及びTD-6424を含む殺菌性及び/又は静菌性(例えば、細菌の複製を阻害し、又は感染性生物の生存に必要な細菌成分の合成を阻害する)の薬剤又は薬物が含まれる。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、一つ又は複数の粘膜付着剤を含む(例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第20050281843号参照)。本発明は、利用する粘膜付着剤の種類によって制限されない。実際、それに限定されるものではないが、ポリ(アクリル酸)の架橋誘導体(例えば、カーボポール及びポリカルボフィル)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖(例えば、アルギン酸塩及びキトサン)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、レクチン、線毛タンパク質及びカルボキシメチルセルロースを含む様々な粘膜付着剤が、本発明において有用であることが企図される。機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、粘膜付着剤(例えば、ナノエマルジョンを含む組成物中)の使用は、粘膜付着剤を使用しないでナノエマルジョンに曝露した期間及び/又は量と比較して、粘膜付着剤を使用した場合に対象及び/又は微生物が経験するナノエマルジョンへの曝露期間及び/又は量が増大することにより、微生物(例えば、本発明の組成物に曝露される)の死滅及び/又はその成長の減衰を強化する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、滅菌水性調製物を含むことができる。許容されるビヒクル及び溶媒には、それに限定されるものではないが、水、リンガー溶液、リン酸緩衝食塩水及び等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに滅菌固定油は、溶媒又は懸濁化媒体として従来使用されている。この目的では、合成モノ又はジグリセリドを含む任意の無刺激性の固定鉱油又は非鉱油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注入可能な調製物における使用が見出されている。粘膜、肺、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内又は他の経路を介する投与に適した担体製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.に見出すことができる。
【０２２８】
本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、治療のために(例えば、既存の感染症を死滅させ、且つ/又はその成長を減弱するため)、又は予防的なものとして(例えば、微生物の成長及び/又はコロニー形成を予防するため(例えば、疾患の徴候又は症候を予防するため))使用することができる。本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、いくつかの異なる送達経路及び方法を介して対象に投与することができる。
【０２２９】
例えば、本発明の組成物は、それに限定されるものではないが、溶液に懸濁し、表面に適用する;溶液に懸濁し、スプレーアプリケーターを使用して表面上にスプレーする;粘膜付着剤と混合し、表面(例えば粘膜又は肺面)上に適用する(例えばスプレーし、又は拭く);鼻及び/又は肺アプリケーター上に置くか、又は含浸させ、適用する;制御放出機構によって適用する;噴霧器を使用して適用し、エアゾール化し、リポソームとして適用する;或いはポリマー上に適用することを含む多数の方法によって、対象に投与することができる(例えば、経粘膜的に、又は肺経路によって)。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、経粘膜的に投与される(例えば標準技術を使用して、例えばそれぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995(例えば、鼻腔内及び肺技術を含む粘膜送達技術について)、並びに欧州特許第517,565号及びIllum et al., J. Controlled Rel., 1994, 29:133-141参照(例えば、鼻腔内投与技術について)を使用して)。本発明は、投与経路によって制限されない。
【０２３１】
治療を受ける対象の鼻咽頭にナノエマルジョンの液滴又はスプレー形態を投与することを含む鼻腔内及び肺投与の方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、噴霧器によって投与されるか、又はエアゾール化されるナノエマルジョンを含む組成物を提供する。胃に耐性のある経口投与用のカプセル剤、直腸又は膣内投与用の坐剤などの腸溶製剤も、本発明の一部を形成することができる。本発明の組成物は、経口経路を介して投与することもできる。これらの状況下では、ナノエマルジョンを含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、且つ/又はアルカリ性緩衝液若しくは腸溶カプセル剤を含むことができる。経鼻送達用の製剤は、アジュバントとしてデキストラン又はシクロデキストラン及びサポニンを用いるものを含むことができる。
【０２３２】
好ましい実施形態では、本発明のナノエマルジョンは、肺送達経路及び/又は手段を介して投与される。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含有する水溶液を、穏やかに徹底的に混合して、溶液を形成する。溶液を滅菌濾過して(例えば、0.2ミクロンフィルターにより)、滅菌した閉鎖性容器に入れる。溶液を、滅菌条件下で適切な小開口部を通過させて、液滴(例えば、0.1及び10ミクロンの間)を生成する。
【０２３３】
粒子は、いくつかの様々なアプリケーターのいずれかを使用して投与することができる。製造及び投与の適切な方法は、それぞれ本明細書に組み込まれる以下の米国特許第6,592,904号;第6,518,239号;第6,423,344号;第6,294,204号;第6,051,256号及びINHALE(現在NEKTAR)の第5,997,848号;並びに米国特許第5,985,309号;RE37,053;米国特許第6,436,443号;第6,447,753号;第6,503,480号;及びEdwardsらの第6,635,283号(MIT、AIR)に記載されている。
【０２３４】
したがっていくつかの実施形態では、本発明の組成物は、肺送達によって投与される。例えば、本発明の組成物は、吸入によって対象(例えばヒト)の肺に送達することができる(例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるAdjei, et al. Pharmaceutical Research 1990;7:565-569;Adjei, et al. Int. J. Pharmaceutics 1990;63:135-144;Braquet, et al. J. Cardiovascular Pharmacology 1989 143-146;Hubbard, et al. 1989 Annals of Internal Medicine, Vol. III, 206-212;Smith, et al. J. Clin. Invest. 1989;84:1145-1146;Oswein, et al. "Aerosolization of Proteins", 1990; Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado;Debs, et al. J. Immunol. 1988;140:3482-3488;及びPlatz, et al米国特許第5,284,656号参照)。全身作用のための薬物の肺送達の方法及び組成物は、参照によって本明細書に組み込まれるWong, et al.米国特許第5,451,569号に記載されている。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLicalsi, et al.米国特許第6,651,655号も参照))。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物は、二つ以上の経路又は手段によって対象に投与される(例えば、肺経路並びに粘膜経路によって投与される)。
【０２３５】
さらに、本発明の実施における使用には、それに限定されるものではないが、全て当業者には知られている噴霧器、定量噴霧式吸入器及び粉末吸入器を含む、医薬品の肺及び/又は鼻粘膜送達のために設計された広範な機械装置が企図される。本発明の実施に適した市販の装置のいくつかの具体例は、ULTRAVENT噴霧器(Mallinckrodt Inc.、St. Louis、Mo.)、ACORN II噴霧器(Marquest Medical Products、Englewood、Colo.)、VENTOLIN定量噴霧式吸入器(Glaxo Inc.、Research Triangle Park、N.C.)及びSPINHALER粉末吸入器(Fisons Corp.、Bedford、Mass.)である。かかる全ての装置は、治療剤を分散するのに適した散剤の使用を必要とする。一般に各製剤は、使用される装置の種類に特異的であり、通常の希釈剤、アジュバント、界面活性剤、担体及び/又は療法において有用な他の薬剤に加えて、適切な推進剤材料の使用を伴うことがある。また、リポソーム、マイクロカプセル若しくはミクロスフェア、包接錯体、又は他の種類の担体の使用も企図される。
【０２３６】
したがっていくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、粘膜、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、肺、静脈内、皮下又は本明細書に記載の他の投与経路によりナノエマルジョンを含む組成物を投与する手段によって、疾患に罹患しやすいか、又はそれに罹患している対象を保護且つ/又は治療するために使用することができる。ナノエマルジョン及び/又はナノエマルジョンと併用投与される薬剤の全身投与方法は、従来のシリンジ及び針、又は弾道的送達用に設計された装置(例えば、参照によって本明細書に組み込まれるWO99/27961参照)、又は無針圧力液体ジェット装置(例えば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第4,596,556号、米国特許第5,993,412号参照)、又は経皮パッチ(例えば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれるWO97/48440、WO98/28037参照)を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のナノエマルジョン組成物を予め充填した、全身投与のための送達装置を提供する。
【０２３７】
先に記載の通り、本発明は、本発明の組成物を投与する対象の種類によって制限されない。実際、多種多様な対象が、本発明の組成物の投与により利益を受けることが企図される。好ましい実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、微生物に曝露されたか、又は曝露される可能性が高いヒト対象は、任意の年齢である(例えば、成人、子ども、乳児等)。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、病原微生物への直接的な曝露を受ける可能性がより高い対象、又は病原体への曝露後に疾患の徴候及び症候を示す可能性がより高い対象である(例えば、CF又は喘息を有する対象、軍隊における対象、公務員、頻繁に旅行する人、学校又はデイケアに参加し、又はそこで働く人、医療従事者、高齢者、易感染性の人、及び救急隊員(例えば、警察、消防職員、EMT従業員))。いくつかの実施形態では、一般人の任意の一人又は全てのメンバーに、本発明の組成物を投与することができる(例えば、疾患の発生又は伝播を予防するため)。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、ある群のヒト(例えば、地域、都市、州及び/又は国)を彼ら自身の健康のために治療し(例えば、疾患を予防又は治療するため)、且つ/又は動物(例えば、鳥、ウシ、ヒツジ、ブタ等)からヒトへの疾患の伝播の危険性を予防し若しくは低減するために利用される。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物である(例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ又は他の家畜、或いはマウス、ラット、ウサギ又は他の動物)。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、研究環境(例えば、研究動物を用いる)において利用される。
【０２３８】
本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、治療用のものとして、又は微生物感染症を予防する予防用のものとして投与することができる(例えば、対象に(例えば肺及び/又は粘膜経路を介して)又は微生物に(例えば細菌(例えば日和見菌及び/又は病原菌(例えば、対象の呼吸器系上若しくは内、及び/又は熱傷上若しくは内に住む))))。したがっていくつかの実施形態では、本発明は、ナノエマルジョンを含む組成物を、微生物(例えば、細菌(例えば、日和見菌及び/又は病原菌)に投与するステップを含む、微生物の(例えば、細菌の(例えば、日和見菌及び/又は病原菌)成長を変える方法を提供する。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物の微生物(例えば、細菌(例えば、日和見菌及び/又は病原菌)への投与によって、微生物を死滅させる。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物の微生物(例えば、細菌(例えば、日和見菌及び/又は病原菌)への投与によって、微生物の成長を阻害する。ナノエマルジョンを含む組成物を、いくつかの送達経路及び/又は機構を介して微生物(例えば、細菌(例えば、日和見菌及び/又は病原菌(例えば、呼吸器内に住む)))に投与できることが企図される。
【０２３９】
本発明の組成物は、医薬組成物に従来見出されている他の補助成分をさらに含有することができる。したがって、例えば組成物は、例えば、抗掻痒剤、収斂薬、局所麻酔剤又は抗炎症剤などの適合性のある薬学的に活性な追加材料を含有することができ、或いは色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形の物理的製剤化において有用な追加材料を含有することができる。しかしかかる材料は、追加される場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害しないことが好ましい。製剤は滅菌化することができ、所望に応じてナノエマルジョンと有害に相互作用しない助剤(例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、バッファー、着色剤、香味剤及び/又は芳香族物質等)と混合することができる。いくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョン組成物は、薬学的に許容される塩の形態で投与される。塩は、それが使用される場合には薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容される塩を調製するために好都合に使用することができる。かかる塩には、それに限定されるものではないが、以下の酸、塩酸、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸及びベンゼンスルホン酸から調製される塩が含まれる。またかかる塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム又はカルシウム塩などの、アルカリ金属又はアルカリ土類塩として調製することができる。
【０２４０】
適切な緩衝剤には、それに限定されるものではないが、酢酸及び塩(1〜2%w/v)、クエン酸及び塩(1〜3%w/v)、ホウ酸及び塩(0.5〜2.5%w/v)、並びにリン酸及び塩(0.8〜2%w/v)が含まれる。適切な保存剤は、塩化ベンザルコニウム(0.003〜0.03%w/v)、クロロブタノール(0.3〜0.9%w/v)、パラベン(0.01〜0.25%w/v)及びチメロサール(0.004〜0.02%w/v)を含むことができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物は、一つ又は複数の抗生物質と併用投与される。例えば、一つ又は複数の抗生物質は、ナノエマルジョンを含む組成物の投与と同時、その前及び/又は後に投与することができる。本発明は、併用投与される抗生物質の種類によって制限されない。実際、それに限定されるものではないが、β-ラクタム抗生物質、ペニシリン(天然ペニシリン、アミノペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリンなど)、セファロスポリン(第一世代、第二世代及び第三世代のセファロスポリン)、及び他のβ-ラクタム(イミペネム、モノバクタムなど)、β-ラクタマーゼ阻害剤、バンコマイシン、アミノグリコシド及びスペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、メトロニダゾール、ポリミキシン、ドキシサイクリン、キノロン(例えば、シプロフロキサシン)、スルホンアミド、トリメトプリム、並びにキノリンを含む様々な抗生物質を併用投与することができる。
【０２４２】
多種多様な抗微生物剤が、細菌、真菌及びウイルス感染症の治療における使用に現在利用可能である。かかる薬物の一般的な種類及びそれらの作用機構に対する包括的な論文については、当業者はGoodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Eds. Hardman et al., 9th Edition, Pub.McGraw Hill, chapters 43 through 50, 1996(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照されたい。一般に、これらの薬剤には、細胞壁合成を阻害する薬剤(例えば、ペニシリン、セファロスポリン、サイクロセリン、バンコマイシン、バシトラシン)、並びにイミダゾール抗真菌剤(例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール及びクロトリマゾール)、微生物の細胞膜を破壊するために直接作用する薬剤(例えば、ポリミキシン及びコリスチメタートなどの洗浄剤、並びに抗真菌としてのニスタチン及びアンホテリシンB)、タンパク質合成を阻害するリボソームサブユニットに影響を及ぼす薬剤(例えば、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン(erthromycin)及びクリンダマイシン)、タンパク質合成を変え、細胞死をもたらす薬剤(例えば、アミノグリコシド)、核酸代謝に影響を及ぼす薬剤(例えば、リファマイシン及びキノロン)、代謝拮抗剤(例えば、トリメトプリム及びスルホンアミド)、並びにDNA合成にとって必須のウイルス酵素を阻害する作用をするジドブジン、ガンシクロビル(gangcyclovir)、ビダラビン及びアシクロビルなどの核酸類似体が含まれる。様々な組合せの抗微生物剤を使用することができる。
【０２４３】
本発明はまた、ナノエマルジョンを含む組成物と、一つ又は複数のさらなる活性な薬剤及び/又は抗感染症薬剤との併用投与を伴う方法を含む。併用投与手順において、薬剤は、同時に又は逐次的に投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、他の活性剤(複数可)の前に投与される。医薬製剤及び投与方法は、本明細書に記載のもののいずれかであってよい。さらに、併用投与される二つ以上の薬剤は、異なる方法(例えば経路)又は異なる製剤を使用してそれぞれ投与することができる。併用投与される追加の薬剤(例えば、抗生物質、第二の種類のナノエマルジョン等)は、それに限定されるものではないが、現在臨床で使用されているものを含む、当技術分野で周知の薬剤のいずれかであってよい。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物は、二つ以上の経路を介して対象に投与される。例えば対象は、粘膜投与(例えば、経鼻投与又は本明細書に記載の他の粘膜経路)を受けることにより、さらには一つ又は複数の他の投与経路(例えば、肺投与(例えば、噴霧器、吸入器又は本明細書に記載の他の方法を介して)を受けることにより、利益を得ることができる。
【０２４５】
他の送達系は、時間放出、遅延放出又は徐放送達系を含むことができる。かかる系は、組成物の反復投与を回避し、対象及び医師にとっての利便性を高めることができる。多くの種類の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。これらには、ポリ(ラクチド-グリコリド)、コポリオキサレート(copolyoxalate)、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリ酸無水物などのポリマーベース系が含まれる。薬物を含有する先のポリマーのマイクロカプセルは、例えば参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,075,109号に記載されている。送達系は、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸などのステロールを含む脂質、又はモノ-ジ-及びトリ-グリセリドなどの中性脂肪;ヒドロゲル放出系;サイラスティック(sylastic)系;ペプチドベース系;ワックスコーティング;従来の結合剤及び賦形剤を使用する圧縮錠剤;部分的に融着する(fused)インプラント等である非ポリマー系も含む。具体例には、それに限定されるものではないが、(a)そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第4,452,775号、第4,675,189号及び第5,736,152号に記載のものなどの、本発明の薬剤がマトリックス内形態で含有される浸食系、並びに(b)そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第3,854,480号、第5,133,974号及び第5,407,686号に記載のものなどの、活性な成分がポリマーから制御された速度で浸透する拡散系が含まれる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系を使用することができ、そのいくつかは移植に適している。
【０２４６】
好ましい実施形態では、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、対象に投与される場合、対象における微生物(例えば、病原体微生物(例えば、病原菌、ウイルス等))を死滅し、且つ/又はその成長を減弱するのに適した量のナノエマルジョンを含む。本発明は、使用されるナノエマルジョンの量によって制限されない。いくつかの好ましい実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物中のナノエマルジョンの量は、著しい有害な副作用なしに微生物を死滅させ、且つ/又はその成長を減弱する量として選択される。量は、どの特定のナノエマルジョン(複数可)が使用されるかによって変わることになり、それに限定されるものではないが、対象の種、年齢及び全体的な状態(例えば、健康)並びに投与方法を含むいくつかの因子に応じて、対象毎に変わり得る。対象における微生物(例えば、病原微生物(例えば、病原菌、ウイルス等))を死滅させ、且つ/又はその成長を減弱するために対象に投与されるナノエマルジョンの適切な量を決定する手順は、公知の手段を使用して当業者によって容易に決定され得る。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、各用量(例えば、ナノエマルジョンを含む組成物の(例えば、微生物を死滅させ、且つ/又はその成長を減弱するために対象に投与される))は、10〜40%のナノエマルジョン、いくつかの実施形態では、20%のナノエマルジョン、いくつかの実施形態では20%未満(例えば、15%、10%、8%、5%又はそれ未満のナノエマルジョン)、いくつかの実施形態では20%超のナノエマルジョン(例えば、25%、30%、35%、40%又はそれを超えるナノエマルジョン)を含むことが期待される。特定の投与に最適の量(例えば、微生物を死滅させ、且つ/又はその成長を減弱するため)は、対象における微生物の成長及び/又は死滅並びに他の応答の観測を含む標準の研究を使用して、当業者によって確認され得る。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、各用量(例えば、ナノエマルジョンを含む組成物の(例えば、微生物を死滅させ、且つ/又はその成長を減弱するために対象に投与される))は、ナノエマルジョンの重量が0.001〜40%又はそれを超える(例えば、0.001〜10%、0.5〜5%、1〜3%、2%、6%、10%、15%、20%、30%、40%又はそれを超える)。
【０２４９】
同様に、本発明は、ナノエマルジョンが対象に投与される期間(例えば、微生物を死滅させ、且つ/又はその成長を減弱するため)によって制限されない。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンは、一日一回又は複数回(例えば、二回、三回、四回又はそれを超える)投与される。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物は、感染症が根絶するか、又は微生物の成長及び/又は存在が所望のレベルに低減されるまで、一日一回又は複数回投与される。いくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、対象に投与する前に希釈することができる濃縮用量で製剤化される。例えば、対象が、本明細書で提供される特定用量の任意の一つ又は複数を受けられるように、濃縮組成物の希釈物を対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、濃縮組成物の希釈物は、対象に、濃縮組成物に存在する0.5〜50%のナノエマルジョンを含む組成物が投与されるように(例えば単回用量で)生成することができる。濃縮組成物は、多数の対象に本発明の組成物を投与できる環境(例えば病院)において有用であることが企図される。いくつかの実施形態では、本発明のナノエマルジョンを含む組成物(例えば、濃縮組成物)は、室温で1週間を超えて、いくつかの実施形態では2週間を超えて、いくつかの実施形態では3週間を超えて、いくつかの実施形態では4週間を超えて、いくつかの実施形態では5週間を超えて、及びいくつかの実施形態では6週間を超えて安定である。
【０２５０】
用量単位は、それに限定されるものではないが、対象の体重、年齢及び健康状態を含むいくつかの因子を元にして比例的に増大又は低減することができる。さらに用量単位は、その後の投与のために増大又は低減することができる。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物は、微生物(例えば、細菌(例えば、日和見菌及び/又は病原菌))が死滅する条件下で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョンを含む組成物は、微生物(例えば、細菌の(例えば、日和見菌及び/又は病原菌)の成長が抑制及び/又は減弱される条件下で対象に投与される。いくつかの実施形態では、90%超(例えば、全て検出可能な95%、98%、99%超)の微生物(例えば、細菌(例えば、日和見菌及び/又は病原菌)が死滅する。いくつかの実施形態では、微生物(例えば、細菌(例えば、日和見菌及び/又は病原菌)の存在が、2ログ超(例えば、3ログ、4ログ、5ログ超、又はそれを超える)減少する。いくつかの実施形態では、減少及び/又は死滅は、1時間以内(例えば、45分、30分、15分又はそれ未満)に観測される。いくつかの実施形態では、減少及び/又は死滅は、6時間以内(例えば、5時間、4時間、3時間、2時間又は1時間未満)に観測される。いくつかの実施形態では、減少及び/又は死滅は、治療開始後2日以内(例えば、24時間未満、20時間未満、18時間又はそれ未満)に観測される。いくつかの実施形態では、減少及び/又は死滅は、3日以内、4日以内又は5日以内に観測される。
【０２５２】
本発明のナノエマルジョンを含む組成物は、感染の性質及び/又は疾患の原因物質(例えば、呼吸器感染症の徴候、症候又は適応症を引き起こす)が公知である場合、並びに感染の性質及び/又は疾患の原因物質が未知である場合(例えば、新興疾患において(例えば、汎発性割合の(例えば、インフルエンザ又は他の疾患の大流行)))に使用が見出される。例えば本発明は、今後同定されるべき新興感染症及び/又は疾患の原因物質(例えば、感染症及び/又は疾患の原因物質の遺伝的、生化学的又は他の特徴付けなしに、罹患したヒトから単離及び/又は培養した)に関連する感染症の治療又は予防における本発明の組成物の使用を企図する。
【０２５３】
本発明の組成物及び方法は、研究環境を含む様々な環境における使用が見出されるであろうことが企図される。例えば、本発明の組成物及び方法はまた、免疫系の研究(例えば、適応性免疫応答(例えば、防御免疫応答(例えば、粘膜又は全身性免疫))の特徴付け)における使用が見出される。本発明によって提供される組成物及び方法の使用は、ヒト及び非ヒト対象及びこれらの対象からのサンプルを包含し、これらの対象を使用する研究適用も包含する。本発明の組成物及び方法はまた、ナノエマルジョン、免疫原及び他の成分の試験及び最適化、並びに新しい成分のスクリーニングに有用である。したがって本発明は、任意の特定の対象及び/又は適用環境に限定されることを企図しない。
【０２５４】
本製剤は、肺、粘膜及び他の送達経路の試験のために開発されたいくつかの動物モデルにおいて、インビボで試験することができる。容易に理解される通り、本発明の組成物は、ウイルス、細菌、寄生虫及び真菌によって引き起こされる多種多様な疾患及び感染症の予防及び/又は治療に有用である。本組成物は、先に記載の通り予防又は治療に使用できるだけでなく、ポリクローナル及びモノクローナル両方の抗体(例えば、診断目的で)を調製するために、並びに対象となる抗原の免疫精製のために使用することもできる。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ナノエマルジョンを含む組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットはさらに、組成物を投与する装置を提供する。本発明は、キットに含まれる装置の種類によって制限されない。いくつかの実施形態では、装置は、本発明の組成物の肺適用のために構成される(例えば鼻用吸入器又は鼻用噴霧器)。いくつかの実施形態では、キットは、濃縮形態の(例えば、対象への投与の前に希釈することができる)ナノエマルジョンを含む組成物を含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、全てのキット成分は、単一の容器(例えば、バイアル又は管)内に存在する。いくつかの実施形態では、各キット成分は、単一の容器(例えば、バイアル又は管)内に設置される。いくつかの実施形態では、一つ又は複数のキット成分は、単一の容器(例えば、バイアル又は管)内に設置され、同じキットの他の成分は、別個の容器(例えば、バイアル又は管)内に設置される。いくつかの実施形態では、キットはバッファーを含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに、使用のための指示を含む。
【０２５７】
免疫原性組成物の治療及び予防のための使用
本発明は、免疫応答(例えば、先天性及び/又は適応性免疫応答(例えば、バークホルデリア属の細菌種(例えば、B.セノセパシア、B.マルチボランス等)に対する宿主免疫の発生のため))の誘発のための、免疫原性ナノエマルジョン組成物及びその使用方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、中でも、臨床(例えば、治療用及び予防用医薬品(例えば、ワクチン接種))及び研究適用における使用が見出される。
【０２５８】
実施例10に示す通り、本発明の免疫原性組成物(例えば、ナノエマルジョン及びバークホルデリア(Bukholderia)抗原を含む)は、全身及び粘膜の免疫の両方を誘発する(例えば、対象に投与した場合)。したがっていくつかの好ましい実施形態では、対象へのナノエマルジョン及びバークホルデリア抗原を含む組成物の投与は、バークホルデリアへの曝露(例えば、粘膜及び/又は呼吸器曝露)に対する保護をもたらす。機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、粘膜投与(例えば、ワクチン接種)は、バークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)感染症(例えば、粘膜表面において開始する)に対する保護をもたらす。これまでに、粘膜表面に侵入する病原体に対する分泌IgA応答及び保護を刺激することは困難であることが証明されているが(例えば、Mestecky et al, Mucosal Immunology. 3ed edn. (Academic Press, San Diego, 2005)参照)、いくつかの実施形態では、本発明は、対象における病原体(例えば、バークホルデリア、ヘモフィルス、スタフィロコッカス又は他の細菌属の病原体種)に対する粘膜免疫(例えば、防御IgA応答)を刺激する組成物及び方法を提供する。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本発明は、粘膜ワクチンとして働く組成物(例えば、ナノエマルジョン及びバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セノセパシア)抗原(例えば、配列番号1又は配列番号2〜16のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド)を含む組成物)を提供する。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン(NE)及びバークホルデリア抗原を含む免疫原性組成物は、NE及びバークホルデリア属の死滅ホールセル細菌(例えば、バークホルデリア・セパシア(例えば、ナノエマルジョン、アルコール(例えば、エタノール)又は他の方法を使用して死滅させた)、バークホルデリアの単離、精製及び/又は組換えタンパク質及び/又は糖類成分(例えば、タンパク質/ペプチド(例えば、バークホルデリア由来のタンパク質、生存ウイルスベクター由来のタンパク質、組換えタンパク質、組換え変性タンパク質/抗原、小ペプチド断片タンパク質/抗原)を用いて生成される。
【０２６０】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、NE及び免疫原(例えば、精製、単離又は合成バークホルデリアタンパク質又はその誘導体、変異体、又は類似体;或いはバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・マルチボランス(例えば、死滅した及び又は不活化ホールセル細菌)の一つ又は複数の種を含む、免疫応答を発生させる組成物を提供する。対象に投与する場合、本発明の組成物は、対象における免疫源に対する免疫応答を刺激する。機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、免疫応答の発生(例えば、ナノエマルジョン及び免疫原を含む組成物の投与から得られる)は、対象(例えば、バークホルデリア感染症(例えば、連鎖球菌性咽頭炎、髄膜炎、細菌のニューモニエ、心内膜炎、丹毒及び/又は壊死性筋膜炎)に関連する疾患の徴候、症候又は状態の)に、全ての又は部分的免疫をもたらす。いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、本発明の免疫原性組成物への曝露後の、疾患からの保護及び/又は免疫(例えば、疾患の徴候、症候又は状態を予防又は減弱(例えば抑制)する、対象の免疫系の能力)は、適応性(例えば、後天性)免疫応答(例えば、本発明の免疫原を含むNEへの曝露後にB及びT細胞によって媒介される免疫応答(例えば、バークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)に対する高い特異性及び反応性を示す免疫応答)によるものである。したがっていくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、バークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)に関連する徴候、症候又は状態を予防又は減弱するために、予防又は治療に使用される。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、免疫原(例えば、バークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)抗原)を含むNEは、単独で投与される。いくつかの実施形態では、NE及び免疫原(例えば、バークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)抗原)を含む組成物は、一つ又は複数の他の薬剤(例えば、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤等)を含む。いくつかの実施形態では、本発明の免疫応答を刺激する組成物は、液性免疫応答を誘発するやり方で投与される。いくつかの実施形態では、本発明の免疫応答を刺激する組成物は、液性応答ではなく細胞性(例えば細胞傷害性Tリンパ球)免疫応答を誘発するやり方で投与される。いくつかの実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、細胞性及び液性免疫応答の両方を誘発する。
【０２６２】
本発明は、NE及び免疫原を含む組成物に使用されるバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)のアイソタイプ、系又は種によって制限されない。実際、各バークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)ファミリーメンバー単独又は別のファミリーメンバーとの組合せを使用して、本発明のNE及び免疫原(例えば、免疫応答を発生させるために使用される)を含む組成物を生成することができる。バークホルデリアの例示的な種は、本明細書に記載されている。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、利用されるバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)種は、より強い病原体の能力(例えば、より重篤なバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・セパシア)誘発性疾患(例えば、強化された且つ/又はより重篤な呼吸器感染症等を含む)を生じる)を示す、改変した(例えば、遺伝的に改変した(例えば、自然淘汰により自然に改変された、又は組換え遺伝技術を使用して改変した))種である。いくつかの実施形態では、それに限定されるものではないが、B.セノセパシア、B.ドロサ、B.マルチボランス、B.アムビファリア、B.ベトナミエンシス、B.ウボネンシス、B.タイランデンシス、B.グラミニス、B.オクラホメンシス、類鼻疽菌、B.ゼノボランス、B.フィトフィルマンス、B.フィマツム、R.メタリデュランス、R.ユートロファ、R.ソラナセアラムを含むバークホルデリア属の任意の一つ又は複数のメンバーが、本発明の免疫反応性組成物において利用される。
【０２６４】
本発明は、使用されるバークホルデリア系によって制限されない。実際、それに限定されるものではないが、バークホルデリアの古典系、減弱化系、非複製系、改変系(例えば、遺伝的に又は機械的に改変した系(例えば、病原性を高め、又は少なくするために))又は他の連続希釈系を含む様々なバークホルデリア系が本発明において有用であることが企図される。NE及び免疫原を含む組成物は、バークホルデリア・セノセパシア及び/又は他の種類のバークホルデリア(例えば、バークホルデリア・マルチボランス)の一つ又は複数の系を含むことができる。さらに、NE及び免疫原を含む組成物は、バークホルデリアの一つ又は複数の系、及び非バークホルデリア免疫原の一つ又は複数の系をさらに含むことができる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、免疫原は、病原体(例えば、バークホルデリア)に由来する一つ又は複数の抗原を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、免疫原は、精製、組換え、合成又はその他の単離タンパク質である(例えば、免疫原性組成物を生成するためにNEに添加される)。同様に、免疫原性タンパク質は、病原体からのタンパク質の誘導体、類似体又はその他の改変された(例えば、コンジュゲート化)形態であってよい。
【０２６６】
本発明は、本発明のNE及び免疫原を含む組成物の特定の製剤によって制限されない。実際、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、NE及び免疫原に加えて、一つ又は複数の異なる薬剤を含むことができる。これらの薬剤又は補因子には、それに限定されるものではないが、アジュバント、界面活性剤、添加剤、バッファー、可溶化剤、キレート剤、油、塩、治療剤、薬物、生物活性剤、抗菌剤及び抗微生物剤(例えば、抗生物質、抗ウイルス等)が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、免疫応答を誘発する免疫原の能力を強化する薬剤及び/又は補因子(例えば、アジュバント)を含む。いくつかの好ましい実施形態では、一つ又は複数の補因子又は薬剤の存在は、免疫応答(例えば、防御免疫応答(例えば、防御免疫化))の誘発に必要な免疫原の量を低減する。いくつかの実施形態では、一つ又は複数の補因子又は薬剤の存在は、免疫応答を、細胞性(例えば、T細胞媒介性)又は液性(例えば、抗体媒介性)免疫応答に偏らせるために使用できる。本発明は、本発明の治療剤に使用される補因子又は薬剤の種類によって制限されない。
【０２６７】
アジュバントは、一般に、Vaccine Design--the Subunit and Adjuvant Approach edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995に記載されている。本発明は、利用されるアジュバント(例えば、NE及び免疫原を含む組成物(例えば医薬組成物)における使用のため)の種類によって制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、適切なアジュバントには、水酸化アルミニウムゲル(alum)又はリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩であってよく、或いはアシル化チロシン、又はアシル化糖類、カチオン性若しくはアニオン性誘導体化多糖、又はポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、Th1型応答を誘発する一つ又は複数のアジュバントを含むことが好ましい。しかし他の実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、Th2型応答を誘発する一つ又は複数のアジュバントを含むことが好ましい。
【０２６９】
一般に、免疫応答は、抗原と免疫系の細胞との相互反応によって抗原に対して発生する。免疫応答は、液性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答(例えば従来、それぞれ抗体及び細胞エフェクターの防御機構によって特徴付けられている)の二つの分類に、広範に分類することができる。応答のこれらの分類は、Th1型応答(細胞媒介性応答)及びTh2型免疫応答(液性応答)と呼ばれている。
【０２７０】
免疫応答の刺激は、細胞の直接的又は間接的な応答、或いは介入(例えば、免疫原に対する曝露)に対する免疫系の成分から得ることができる。免疫応答は、免疫系の細胞(例えば、B細胞、T細胞、樹状細胞、APC、マクロファージ、NK細胞、NKT細胞等)の活性化、増殖又は分化;マーカー及びサイトカインの上方制御又は下方制御発現;IgA、IgM又はIgG力価の刺激;脾腫(高い脾臓細胞充実性を含む);様々な器官における過形成及び混合細胞浸潤物を含む多くの方法で測定することができる。免疫刺激に関して評価できる免疫系の他の応答、細胞及び成分は、当技術分野で公知である。
【０２７１】
機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、サイトカインの発現及び分泌を誘発する(例えば、マクロファージ、樹状細胞及びCD4+T細胞による)。特定のサイトカインの発現の調節は、局所的又は全身的に生じ得る。サイトカインプロファイルは、免疫応答におけるT細胞制御性及びエフェクター機能を決定できることが知られている。いくつかの実施形態では、Th1型サイトカインを誘発することができ、したがって、本発明の免疫賦活性組成物は、細胞傷害性T細胞を含むTh1型抗原に特異的な免疫応答を促進することができる(例えばそれによって、望ましくないTh2型免疫応答(例えば疾患の重症度の強化に関与するTh2型サイトカイン(例えば、IL-13)の発生(例えば、粘液形成のIL-13誘発))を回避する)。
【０２７２】
サイトカインは、T細胞の応答を方向付ける役割を担う。ヘルパー(CD4+)T細胞は、B及び他のT細胞を含む他の免疫系細胞に対して作用する可溶性因子の生成によって、哺乳動物の免疫応答を組織化する。殆どの成熟CD4+Tヘルパー細胞は、二つのサイトカインプロファイル:Th1又はTh2の一方を発現する。Th1型CD4+T細胞は、IL-2、IL-3、IFN-γ、GM-CSF及び高レベルのTNF-αを分泌する。Th2細胞は、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF及び低レベルのTNF-αを発現する。Th1型サイトカインは、細胞媒介性免疫と、マウスのIgG2a及びヒトのIgG1に転換する免疫グロブリンのクラスを特徴とする液性免疫の両方を促進する。Th1応答は、遅延型過敏症及び自己免疫疾患にも関連し得る。Th2型サイトカインは、主に液性免疫を誘発し、IgG1及びIgEに転換するクラスを誘発する。Th1応答に関連する抗体アイソタイプは、一般に、中和及びオプソニン化能を有するが、Th2応答に関連する抗体アイソタイプは、それよりもアレルギー反応に関連する。
【０２７３】
いくつかの因子は、免疫応答をTh1又はTh2型応答のいずれかに偏らせるように影響することが示されている。最も特徴付けられている制御因子は、サイトカインである。IL-12及びIFN-γは、陽性Th1及び陰性Th2制御因子である。IL-12はIFN-γ生成を促進し、IFN-γはIL-12の陽性フィードバックをもたらす。IL-4及びIL-10は、Th2サイトカインプロファイルの確立にとって、又はTh1サイトカイン産生を下方制御するために重要と思われる。
【０２７４】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、NE及び免疫原を含む組成物を対象に投与するステップを含む、対象のTh1型免疫応答を刺激する方法を提供する。しかし、他の実施形態では、本発明は、NE及び免疫原を含む組成物を対象に投与するステップを含む、対象のTh2型免疫応答を刺激する方法を提供する(例えば、T媒介性応答の平衡化が望ましい場合)。さらに好ましい実施形態では、アジュバント(例えば、本発明の組成物と併用投与することができる)を使用して、免疫応答をTh1又はTh2型免疫応答のいずれかに偏らせることができる。例えばTh2応答を誘発するか、又はTh1応答を弱めるアジュバントには、それに限定されるものではないが、alum、サポニン及びSB-As4が含まれる。Th1応答を誘発するアジュバントには、それに限定されるものではないが、MPL、MDP、ISCOMS、IL-12、IFN-γ及びSB-AS2が含まれる。
【０２７５】
本発明の組成物及び方法において、Th1型免疫原のいくつかの他の種類を使用することができる(例えば、アジュバントとして)。これらには、それに限定されるものではないが、以下が含まれる。いくつかの実施形態では、モノホスホリル脂質A(例えば、特に3-de-O-アシル化モノホスホリル脂質A(3D-MPL))が使用される。3D-MPLは、Ribi Immunochem、Montanaによって製造された周知のアジュバントである。化学的には、3-de-O-アシル化モノホスホリル脂質Aと、4、5又は6アシル化鎖のいずれかとの混合物として供給される。いくつかの実施形態では、ジホスホリル脂質A及びその3-O-脱アシル化変異体が使用される。これらの免疫原のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるGB2122204Bに記載の方法によって精製し、調製することができる。他の精製及び合成リポ多糖も説明されている(例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,005,099号及びEP0729473;Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6;Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6;並びにEP0549074参照)。いくつかの実施形態では、3D-MPLは、粒子状製剤の形態(例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるEP0689454に記載の、直径0.2μm未満の小粒径を有する)で使用される。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物において、サポニンが免疫原として使用される(例えば、Th1型アジュバント)。サポニンは周知のアジュバントである(例えば、Lacaille-Dubois and Wagner (1996) Phytomedicine vol 2 pp 363-386参照)。サポニンの例には、Quil A(南アメリカの木であるQuillaja Saponaria Molinaの樹皮由来)、及びその画分(例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,057,540号;Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2):1-55;及びEP0362279参照)が含まれる。溶血性サポニンQS7、QS17及びQS21も、本発明において有用であることが企図される(Quil AのHPLC精製画分;例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるKensil et al. (1991) J. Immunology 146, 431-437、米国特許第5,057,540号;WO96/33739;WO96/11711及びEP0362279参照)。QS21及びポリソルベート又はシクロデキストリンの組合せも有用であることが企図される(例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWO99/10008参照)。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、非メチル化CpGジヌクレオチド(「CpG」)を含有する免疫原性オリゴヌクレオチドが、本発明のアジュバントとして使用される。CpGは、DNAに存在するシトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。CpGは、全身及び粘膜経路の両方によって投与される場合のアジュバントとして、当技術分野では公知である(例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるWO96/02555、EP 468520、Davis et al., J. Immunol, 1998, 160(2):870-876;McCluskie and Davis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6;並びに米国特許出願第20050238660参照)。例えば、いくつかの実施形態では、免疫賦活性配列は、プリン-プリン-C-G-ピリミジン-ピリミジンであり、CGモチーフはメチル化されていない。
【０２７８】
機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、一つ又は複数のCpGオリゴヌクレオチドの存在は、ナチュラルキラー細胞(IFN-γを産生する)及びマクロファージを含む様々な免疫サブセットを活性化する。いくつかの実施形態では、CpGオリゴヌクレオチドは、免疫応答を誘発するために、本発明の組成物に製剤化される。いくつかの実施形態では、CpGの遊離溶液は、抗原(例えばNE溶液に存在する)と一緒に併用投与される(例えば、参照によって本明細書に組み込まれるWO96/02555参照)。いくつかの実施形態では、CpGオリゴヌクレオチドは、抗原と共有結合的にコンジュゲートしており(例えば、参照によって本明細書に組み込まれるWO98/16247参照)、又は水酸化アルミニウムなどの担体と一緒に製剤化される(例えば、Brazolot-Millan et al., Proc.Natl.AcadSci., USA, 1998, 95(26), 15553-8参照)。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントなどのアジュバント、サイトカイン(例えば、インターロイキン(例えば、IL-2、IFN-γ、IL-4等)、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子等)、コレラ毒素(CT)、百日咳毒素(PT)又は大腸菌熱に不安定な毒素(LT)などの細菌のADP-リボース化毒素の解毒化変異体、特にLT-K63(リシンが、63番目の位置において野生型アミノ酸を置換している)LT-R72(アルギニンが72番目の位置において野生型アミノ酸を置換している)、CT-S109(セリンが109番目の位置において野生型アミノ酸を置換している)及びPT-K9/G129(リシンが9番目の位置において野生型アミノ酸を置換しており、グリシンが129番目の位置で置換している)(例えば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれるWO93/13202及びWO92/19265参照)、並びに他の免疫原性物質(例えば、本発明の組成物の有効性を高める)は、本発明のNE及び免疫原を含む組成物と併用される。
【０２８０】
本発明における使用が見出されるアジュバントのさらなる例には、ポリ(ジ(カルボキシルアトフェノキシ(carboxylatophenoxy))ホスファゼン(PCPPポリマー;Virus Research Institute、USA);モノホスホリル脂質Aなどのリポ多糖の誘導体(MPL;Ribi ImmunoChem Research、Inc.、Hamilton、Mont.)、ムラミルジペプチド(MDP;Ribi)及びスレオニル-ムラミルジペプチド(t-MDP;Ribi);OM-174(脂質Aに関係するグルコサミン二糖;OM Pharma SA、Meyrin、Switzerland);並びにリーシュマニア伸長因子(精製リーシュマニアタンパク質;Corixa Corporation、Seattle、Wash.)が含まれる。
【０２８１】
アジュバントは、NE及び免疫原を含む組成物に添加することができ、又はアジュバントは、NE及び免疫原を含む組成物と混合するか、又はそれと併用投与する前に、担体、例えばリポソーム又は金属塩(例えば、アルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム))を用いて製剤化することができる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物は、単一のアジュバントを含む。他の実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物は、二つ以上のアジュバントを含む(例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるWO94/00153、WO95/17210、WO96/33739、WO98/56414、WO99/12565、WO99/11241、及びWO94/00153参照)。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、一つ又は複数の粘膜付着剤を含む(例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第20050281843参照)。本発明は、利用される粘膜付着剤の種類によって制限されない。実際、それに限定されるものではないが、ポリ(アクリル酸)の架橋誘導体(例えば、カーボポール及びポリカルボフィル)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖(例えば、アルギン酸塩及びキトサン)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、レクチン、線毛タンパク質、及びカルボキシメチルセルロースを含む様々な粘膜付着剤が、本発明において有用であることが企図される。機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、粘膜付着剤の使用(例えば、NE及び免疫原を含む組成物中)は、粘膜付着剤を使用しない免疫原への曝露の期間及び/又は量と比較して、粘膜付着剤が使用される場合に対象が経験する免疫原への曝露の期間及び/又は量が増大することにより、対象(例えば本発明の組成物を投与した)の免疫応答の誘発が強化される。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、滅菌水性調製物を含むことができる。許容されるビヒクル及び溶媒には、それに限定されるものではないが、水、リンガー溶液、リン酸緩衝食塩水及び等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに滅菌固定油は、溶媒又は懸濁化媒体として従来使用されている。この目的では、合成モノ又はジグリセリドを含む任意の無刺激性の固定鉱油又は非鉱油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注入可能な調製物における使用が見出されている。粘膜、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内又は他の経路を介する投与に適した担体製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.に見出すことができる。
【０２８５】
本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、治療のために(例えば、免疫応答を強化するため)、又は予防的なものとして(例えば、免疫化のため(例えば、疾患の徴候又は症候を予防するため))使用することができる。本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、いくつかの異なる送達経路及び方法を介して対象に投与することができる。
【０２８６】
例えば、本発明の免疫原性組成物は、それに限定されるものではないが、溶液に懸濁し、表面に適用する;溶液に懸濁し、スプレーアプリケーターを使用して表面上にスプレーする;粘膜付着剤と混合し、表面(例えば粘膜表面)上に適用する(例えばスプレーし、又は拭く);鼻及び/又は膣内アプリケーター上に置くか、又は含浸させ、適用する;制御放出機構によって適用する;リポソームとして適用する;或いはポリマー上に適用することを含む多数の方法によって、対象に投与することができる(例えば、経粘膜的に(例えば、鼻粘膜、膣内粘膜等))。
【０２８７】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、経粘膜投与される(例えば、標準技術を使用する、例えばそれぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれるRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995(例えば、鼻腔内、肺、膣内及び直腸技術を含む粘膜送達技術について)、並びに欧州特許第517,565号及びIllum et al., J. Controlled Rel., 1994, 29:133-141参照(例えば、鼻腔内投与技術について))。或いは、本明細書に記載の免疫原性組成物は、標準技術を使用して皮膚を介して又は経皮的に投与される(例えば、Remington: The Science arid Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995参照)。本発明は、投与経路によって制限されない。
【０２８８】
鼻腔内ワクチン接種などの粘膜ワクチン接種は、鼻粘膜のみならず、生殖器粘膜などの遠位粘膜部位における粘膜免疫も誘発することができる(例えば、Mestecky, Journal of Clinical Immunology, 7:265-276, 1987参照)。粘膜免疫応答の誘発に加えて、粘膜ワクチン接種は、全身性免疫も誘発する(例えば、実施例10参照)。いくつかの実施形態では、非経口ではない投与(例えば、ワクチンの粘膜投与)は、全身性免疫を追加するための(例えば、非経口又は粘膜ワクチン接種によって誘発される(例えば、多数の追加免疫が、活発な全身性免疫を持続するために使用される場合))、効率的且つ便利な方法を提供する。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、粘膜経路(例えば、経口/消化管又は鼻経路)を介して本発明の組成物を投与する手段によって、疾患に罹患しやすいか、又はそれに罹患している対象を保護又は治療するために使用できる。代替の粘膜経路には、膣内及び直腸内経路が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、鼻の投与経路が使用され、本明細書では「鼻腔内投与」又は「鼻腔内ワクチン接種」と呼ぶ。免疫化される対象の鼻咽頭へのワクチンの液滴又はスプレー形態の投与を含む、鼻腔内ワクチン接種の方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、噴霧器によって投与されるか、又はエアゾール化される、NE及び免疫原を含む組成物が提供される。経口投与用の腸溶性カプセル剤、直腸又は膣内投与用の坐剤などの腸溶製剤も、本発明の一部を形成する。本明細書に記載の免疫原性組成物は、経口経路を介して投与することもできる。これらの状況下では、NE及び免疫原を含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、且つ/又はアルカリ性緩衝液若しくは腸溶カプセル剤を含むことができる。経鼻送達用の製剤は、アジュバントとしてデキストラン又はシクロデキストラン及びサポニンを用いたものを含むことができる。
【０２９０】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、膣内経路を介して投与することもできる。かかる場合には、NE及び免疫原を含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤及び/又は乳化剤、ポリマー(例えば、CARBOPOL)並びに膣内クリーム剤及び坐剤の他の公知の安定剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、直腸経路を介して投与される。かかる場合には、NE及び免疫原を含む組成物は、当技術分野で公知の、直腸坐剤を形成するための賦形剤及び/又はワックス並びにポリマーを含むことができる。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、初回抗原刺激及び追加免疫用ワクチン接種の両方に対して、同じ投与経路(例えば、粘膜投与)が選択される。いくつかの実施形態では、免疫応答を刺激する(例えば、本明細書に記載の免疫原性組成物を使用して)ために、複数の投与経路が利用される(例えば、同時に、或いは逐次的に)。
【０２９２】
例えば、いくつかの実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物は、初回抗原刺激又は追加免疫用ワクチン接種レジメンのいずれかで、対象の粘膜表面に投与される。或いは、いくつかの実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物は、初回抗原刺激又は追加免疫用ワクチン接種レジメンのいずれかで全身投与される。いくつかの実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物は、粘膜投与を介する初回抗原刺激ワクチン接種レジメン及び全身投与を介する追加免疫レジメンで、対象に投与される。いくつかの実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物は、全身投与を介して初回抗原刺激ワクチン接種レジメン及び粘膜投与を介する追加免疫レジメンで、対象に投与される。全身投与経路の例には、それに限定されるものではないが、非経口、筋肉内、皮内、経皮、皮下、腹腔内又は静脈内投与が含まれる。NE及び免疫原を含む組成物は、予防及び治療目的の両方で使用することができる。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、肺送達経路によって投与される。例えば、本明細書に記載の免疫原性組成物は、吸入を介して対象(例えば、ヒト)の肺に送達することができる(例えば、それによって肺上皮層を横断して血流に至る)(例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Adjei, et al. Pharmaceutical Research 1990; 7:565-569;Adjei, et al. Int. J. Pharmaceutics 1990; 63:135-144;Braquet, et al. J. Cardiovascular Pharmacology 1989, 143-146;Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, 206-212;Smith, et al. J. Clin. Invest. 1989;84:1145-1146;Oswein, et al. "Aerosolization of Proteins", 1990;Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado;Debs, et al. J. Immunol. 1988; 140:3482-3488;及びPlatzらの米国特許第5,284,656号参照)。全身作用のための薬物の肺送達の方法及び組成物は、参照によって本明細書に組み込まれるWong, et al.米国特許第5,451,569号に記載されている。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLicalsi et al.米国特許第6,651,655号も参照))。さらに、本明細書に記載の免疫原性組成物の送達の実施では、本明細書に記載の医薬品の肺及び/又は鼻粘膜送達に合わせて設計された広範な機械装置の使用が企図される。
【０２９４】
したがっていくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、対象において免疫原特異的免疫応答を誘発する条件下で、粘膜、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、肺、静脈内、皮下又は本明細書に記載の他の投与経路によるNE及び免疫原を含む組成物を投与する手段によって、疾患に罹患しやすいか、又はそれに罹患している対象を保護及び/又は治療するために使用できる。ワクチン調製物の全身投与方法は、従来のシリンジ及び針、又は固体ワクチンの弾道的送達用に設計された装置(例えば、参照によって本明細書に組み込まれるWO99/27961参照)、又は無針圧力液体ジェット装置(例えば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第4,596,556号、米国特許第5,993,412号参照)、又は経皮パッチ(例えば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれるWO97/48440、WO98/28037参照)を含むことができる。本発明は、皮膚に適用される抗原の免疫性を強化するために使用することもできる(経皮又は経皮的送達、例えばそのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれるWO98/20734、WO98/28037参照)。したがっていくつかの実施形態では、本発明は、本発明のワクチン組成物を予め充填した、全身投与用の送達装置を提供する。
【０２９５】
本発明は、本発明の組成物を投与する(例えば、免疫応答を刺激するため(例えば、防御免疫(例えば、粘膜及び/又は全身性免疫)を発生させるため))対象の種類によって制限されない。実際、多種多様な対象が、本発明の組成物の投与によって利益を得ることが企図される。好ましい実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、微生物(例えば、バークホルデリア属の細菌)に曝露されたか、又は曝露される可能性が高いヒト対象は、任意の年齢である(例えば、成人、子ども、乳児等)。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、日和見感染症に罹患する可能性がより高い対象である(例えば、CFを有する対象又は免疫抑制性対照(例えば、ヒト免疫不全ウイルスを有する対象))。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物である(例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ又は他の家畜;或いはマウス、ラット、ウサギ又は他の動物)。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、研究環境(例えば、研究動物を用いる)において利用される。いくつかの実施形態では、本発明は、安全で有効な量の本発明の免疫原性組成物(例えば、小児ワクチン)を乳児に投与することによって、乳児(例えば、約0〜2歳)における免疫応答(例えば、防御免疫応答)を引き出す方法を提供する。本発明のさらなる実施形態は、医薬品に使用するための本発明の免疫原性バークホルデリアナノエマルジョン組成物、及びバークホルデリアによって引き起こされる疾患の予防(又は治療)のための医薬品の製造における本発明のバークホルデリアナノエマルジョン組成物の使用を提供することを含む。さらに別の実施形態では、本発明は、安全で有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与することによって、高齢者の集団(例えば、50歳以上、一般に55歳超、より一般的には60歳超の対象)における免疫応答(例えば、防御免疫応答)を引き出す方法を提供する。
【０２９６】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、粘膜、経口、局所、非経口又は本明細書に記載の他の経路などの任意の経路による投与に合わせて製剤化することができる。組成物は、それに限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、ロゼンジ剤、発泡剤、クリーム剤又は液体調製物を含む任意の一つ又は複数の異なる形態であってよい。
【０２９７】
局所製剤は、例えば、軟膏、クリーム剤又はローション剤、発泡剤及びエアゾールとして提示することができ、保存剤、溶媒(例えば、浸透を補助するため)、並びに軟膏及びクリーム剤の皮膚軟化剤などの適切な従来の添加剤を含有することができる。
【０２９８】
局所製剤は、皮膚を介して活性成分の浸透を強化する薬剤を含むこともできる。例示的な薬剤には、N-(ヒドロキシエチル)ピロリドン及び細胞表層に障害を与える化合物、スルホキシド又はホスフィンオキシドと組み合わせた糖類エステル、並びにスクロースモノオレアート、デシルメチルスルホキシド及びアルコールの二成分の組合せが含まれる。
【０２９９】
皮膚への浸透を増大する他の例示的な材料には、それに限定されるものではないが、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート(oleoate)(ポリソルベート80);ソルビタンモノオレアート(Span 80);p-イソオクチルポリオキシエチレン-フェノールポリマー(Triton WR-1330);ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート(Tween 85);スルホコハク酸ジオクチルナトリウム;及びサルコシンナトリウム(Sarcosyl NL-97);並びに他の薬学的に許容される界面活性剤を含む界面活性剤又は湿潤剤が含まれる。
【０３００】
本発明の特定の実施形態では、組成物は、一つ又は複数のアルコール、亜鉛を含有する化合物、皮膚軟化剤、湿潤剤、増粘剤及び/又はゲル化剤、中和剤及び界面活性剤をさらに含むことができる。製剤に使用される水は、好ましくは中性pHを有する脱イオン水である。局所製剤の追加の添加剤には、それに限定されるものではないが、シリコーン溶液、色素、芳香剤、pH調節剤及びビタミンが含まれる。
【０３０１】
局所製剤は、クリーム剤又は軟膏基剤及びローション剤用のエタノール又はオレイルアルコールなどの適合性のある従来の担体を含有することもできる。かかる担体は、製剤の約1%から最大約98%で存在することができる。軟膏基剤は、ワセリン、鉱油、セレシン、ラノリンアルコール、パンテノール、グリセリン、ビサボロール、カカオバター等の一つ又は複数を含むことができる。
【０３０２】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、医薬組成物に従来見出されている他の補助成分をさらに含有することができる。したがって、例えば組成物は、例えば、抗掻痒剤、収斂薬、局所麻酔剤又は抗炎症剤などの適合性のある薬学的に活性な追加材料を含有することができ、或いは色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形の物理的製剤化において有用な追加材料を含有することができる。しかしかかる材料は、追加される場合、本明細書に記載の免疫原性組成物の生物学的活性を過度に妨害しないことが好ましい。製剤は滅菌化することができ、所望に応じて製剤のNE及び免疫原と有害に相互作用しない助剤(例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、バッファー、着色剤、香味剤及び/又は芳香族物質等)と混合することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、薬学的に許容される塩の形態で投与される。塩は、それが使用される場合には薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容される塩を調製するために好都合に使用することができる。かかる塩には、それに限定されるものではないが、以下の酸、塩酸、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸及びベンゼンスルホン酸から調製される塩が含まれる。またかかる塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム又はカルシウム塩などの、アルカリ金属又はアルカリ土類塩として調製することができる。
【０３０３】
適切な緩衝剤には、それに限定されるものではないが、酢酸及び塩(1〜2%w/v)、クエン酸及び塩(1〜3%w/v)、ホウ酸及び塩(0.5〜2.5%w/v)、並びにリン酸及び塩(0.8〜2%w/v)が含まれる。適切な保存剤は、塩化ベンザルコニウム(0.003〜0.03%w/v)、クロロブタノール(0.3〜0.9%w/v)、パラベン(0.01〜0.25%w/v)及びチメロサール(0.004〜0.02%w/v)を含むことができる。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物は、一つ又は複数の抗生物質と併用投与される。例えば、一つ又は複数の抗生物質は、NE及び免疫原を含む組成物の投与と同時、その前及び/又は後に投与することができる。本発明は、併用投与される抗生物質の種類によって制限されない。実際、それに限定されるものではないが、β-ラクタム抗生物質、ペニシリン(天然ペニシリン、アミノペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリンなど)、セファロスポリン(第一世代、第二世代及び第三世代のセファロスポリン)、及び他のβ-ラクタム(イミペネム、モノバクタムなど)、β-ラクタマーゼ阻害剤、バンコマイシン、アミノグリコシド及びスペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、メトロニダゾール、ポリミキシン、ドキシサイクリン、キノロン(例えば、シプロフロキサシン)、スルホンアミド、トリメトプリム、並びにキノリンを含む様々な抗生物質を併用投与することができる。
【０３０５】
膨大な数の抗微生物剤が、細菌、真菌及びウイルス感染症の治療における使用に現在利用可能である。かかる薬物の一般的な種類及びそれらの作用機構に対する包括的な論文については、当業者はGoodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics" Eds. Hardman et al., 9th Edition, Pub.McGraw Hill, chapters 43 through 50, 1996(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照されたい。一般に、これらの薬剤には、細胞壁合成を阻害する薬剤(例えば、ペニシリン、セファロスポリン、サイクロセリン、バンコマイシン、バシトラシン)、並びにイミダゾール抗真菌剤(例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール及びクロトリマゾール)、微生物の細胞膜を破壊するために直接作用する薬剤(例えば、ポリミキシン及びコリスチメタートなどの洗浄剤、並びに抗真菌としてのニスタチン及びアンホテリシンB)、タンパク質合成を阻害するリボソームサブユニットに影響を及ぼす薬剤(例えば、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン及びクリンダマイシン)、タンパク質合成を変え、細胞死をもたらす薬剤(例えば、アミノグリコシド)、核酸代謝に影響を及ぼす薬剤(例えば、リファマイシン及びキノロン)、代謝拮抗剤(例えば、トリメトプリム及びスルホンアミド)、並びにDNA合成にとって必須のウイルス酵素を阻害する作用をするジドブジン、ガンシクロビル、ビダラビン及びアシクロビルなどの核酸類似体が含まれる。抗微生物剤の様々な組合せを使用することができる。
【０３０６】
本発明はまた、NE及び免疫原を含む組成物と、一つ又は複数のさらなる活性な薬剤及び/又は免疫賦活性薬剤との併用投与を伴う方法を含む(例えば、NE及び異なる免疫原、抗生物質、抗酸化剤等を含む組成物)。実際、本発明のさらなる一態様は、本発明の組成物を併用投与することによって、従来技術の免疫賦活化方法(例えば、免疫化方法)及び/又は医薬組成物を強化する方法を提供する。併用投与手順において、薬剤は、同時に又は逐次的に投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、他の活性剤(複数可)の前に投与される。医薬製剤及び投与方法は、本明細書に記載のもののいずれかであってよい。さらに、併用投与される二つ以上の薬剤は、異なる方法(例えば経路)又は異なる製剤を使用してそれぞれ投与することができる。併用投与される追加の薬剤(例えば、抗生物質、アジュバント等)は、それに限定されるものではないが、現在臨床で使用されているものを含む、当技術分野で周知の薬剤のいずれかであってよい。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物は、二つ以上の経路を介して対象に投与される。例えば、病原微生物に対する防御免疫応答(例えば、免疫)を有することにより利益を得ることができる対象は、粘膜投与(例えば、経鼻投与又は本明細書に記載の他の粘膜経路)を受けることにより、さらには一つ又は複数の他の投与経路(例えば、非経口又は肺投与(例えば、噴霧器、吸入器又は本明細書に記載の他の方法を介して)を受けることにより、利益を得ることができる。いくつかの好ましい実施形態では、粘膜経路を介する投与は、免疫原又は免疫原が由来する生物に対する粘膜並びに全身性免疫の両方を誘発するのに十分である。他の実施形態では、多数の経路を介する投与は、粘膜及び全身性免疫の両方を提供するように働く。したがって、機構の理解は本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、多数の投与経路を介して本発明の組成物を投与された(例えば、免疫化(例えば、本発明のNE及び免疫原を含む組成物の粘膜並びに気道又は非経口投与)対象は、免疫原に対して、ただ一つの経路を介して組成物を投与された対象よりも強い免疫応答を有することができることが企図される。
【０３０８】
他の送達系は、時間放出、遅延放出又は徐放送達系を含むことができる。かかる系は、組成物の反復投与を回避し、対象及び医師にとっての利便性を高めることができる。多くの種類の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。これらには、ポリ(ラクチド-グリコリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリ酸無水物などのポリマーベース系が含まれる。薬物を含有する先のポリマーのマイクロカプセルは、例えば参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,075,109号に記載されている。送達系は、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸などのステロールを含む脂質、又はモノ-ジ-及びトリ-グリセリドなどの中性脂肪;ヒドロゲル放出系;サイラスティック系;ペプチドベース系;ワックスコーティング;従来の結合剤及び賦形剤を使用する圧縮錠剤;部分的に融着するインプラント等である非ポリマー系も含む。具体例には、それに限定されるものではないが、(a)そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第4,452,775号、第4,675,189号及び第5,736,152号に記載のものなどの、本発明の薬剤がマトリックス内形態で含有される浸食系、並びに(b)そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第3,854,480号、第5,133,974号及び第5,407,686号に記載のものなどの、活性な成分がポリマーから制御された速度で浸透する拡散系が含まれる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系を使用することができ、そのいくつかは移植に適している。
【０３０９】
好ましい実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、対象に投与される場合、対象における免疫応答を誘発するのに適切な量の免疫原を含む。好ましい実施形態では、免疫応答は、免疫原又は免疫原が由来する微生物(例えば、バークホルデリア属の細菌)へのその後の曝露から対象を保護(例えば、免疫防御)するのに十分なものである。本発明は、使用される免疫原の量によって限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、NE及び免疫原を含む組成物における免疫原(例えば、バークホルデリア細菌(例えば、バークホルデリア・セパシア)或いはその一つ又は複数の成分部分)の量(例えば、免疫化用量として使用するための)は、著しい有害な副作用なしに免疫防御応答を誘発する量として選択される。その量は、どの特定の免疫原又はその組合せが使用されるかによって変わることになり、それに限定されるものではないが、対象の種、年齢及び全体的な状態(例えば、健康)並びに投与方法を含むいくつかの因子に応じて、対象毎に変わり得る。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、各用量(例えば、NE及び免疫原を含む組成物の(例えば、免疫応答(例えば、防御免疫応答(例えば、防御免疫))を誘発するために対象に投与される)は、約0.05〜5000μgの免疫原(例えば、組換え及び/又は精製バークホルデリアOMPタンパク質)を含む。いくつかの実施形態では、各用量(例えば、NE及び免疫原を含む組成物の(例えば、免疫応答(例えば、防御免疫応答(例えば、防御免疫))を誘発するために対象に投与される)は、約0.05〜5000μgの免疫原(例えば、組換え及び/又は精製バークホルデリアOMPタンパク質)を含み、約0.05〜5000μgの別の免疫原(例えば、組換え及び/又は精製タンパク質、アジュバント(例えば、コレラ毒素)等)を含む。いくつかの実施形態では、各用量は1〜500μg、いくつかの実施形態では、各用量は350〜750μg、いくつかの実施形態では、各用量は50〜200μg、いくつかの実施形態では、各用量は25〜75μgの免疫原(例えば、組換え及び/又は精製タンパク質(例えば、バークホルデリア抗原)を含むことになる。いくつかの実施形態では、各用量は、免疫応答を発生させるのに十分な量の免疫原を含む。一用量における免疫原の有効量は、その免疫原の量が、対象に投与される場合に対象において免疫応答を発生させる限り、定量化する必要はない。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、各用量(例えば、NE及び免疫原を含む組成物の(例えば、免疫応答を誘発するために対象に投与される))は、免疫原(例えば、中和細菌或いは組換え及び/又は精製タンパク質)が0.001〜15重量%又はそれを超える(例えば、0.001〜10%、0.5〜5%、1〜3%、2%、6%、10%、15%又はそれを超える)ことが期待される。いくつかの実施形態では、初回の又は抗原刺激の投与用量は、実に、その後の追加免疫用量よりも多い免疫原を含有する。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物は、対象に投与する前に希釈できる濃縮用量で製剤化される。例えば、濃縮組成物の希釈物は、対象が、本明細書で提供する特定の用量の任意の一つ又は複数を受けるように、対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、濃縮組成物の希釈物は、対象が、濃縮組成物に存在するNE及び免疫原を0.5〜50%含む組成物を投与される(例えば単回用量で)ように、生成することができる。いくつかの好ましい実施形態では、対象は、濃縮組成物に存在するNE及び免疫原を1%含む組成物を単回用量で投与される。濃縮組成物は、多数の対象が本発明の組成物を投与され得る環境(例えば、免疫診療所、病院、学校等)において有用であることが企図される。いくつかの実施形態では、本発明のNE及び免疫原を含む組成物(例えば、濃縮組成物)は、1週間を超えて、いくつかの実施形態では2週間を超えて、いくつかの実施形態では3週間を超えて、いくつかの実施形態では4週間を超えて、いくつかの実施形態では5週間を超えて、及びいくつかの実施形態では6週間を超えて、室温で安定である。
【０３１３】
一般に、本発明のエマルジョン組成物は、液体組成物1ml当たりエマルジョンを少なくとも0.001%〜100%、好ましくは0.01〜90%含むことになる。製剤は、液体組成物1ml当たりエマルジョンを約0.001%、約0.0025%、約0.005%、約0.0075%、約0.01%、約0.025%、約0.05%、約0.075%、約0.1%、約0.25%、約0.5%、約1.0%、約2.5%、約5%、約7.5%、約10%、約12.5%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約98%含み得ることが想定される。先に列挙した二つの数値間の範囲は、本発明の境界内に包含されることを具体的に企図することを理解されたい。用量におけるいくらかの変動が、特定の病原体及び免疫化される対象の状態に応じて必然的に生じることになる。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物の初回投与(例えば、初回のワクチン接種)後、対象は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十及び/又はそれを超える投与後に、一つ又は複数の免疫追加投与(例えば、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約10週、約3カ月、約4カ月、約6カ月、約9カ月、約1年、約2年、約3年、約5年、約10年)を受けることができる。機構の理解は、本発明を実施するのに必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、追加免疫用量の免疫原の再導入は、対象における全身性免疫を活発化することができる。免疫追加は、一次免疫応答に与えられたのと同じ製剤を用いて行うことができ、又は免疫原を含有する異なる製剤を用いて行うことができる。投与レジメンはまた、少なくとも部分的に対象の要求によって決定され、担当医の判断に依存して決まることになる。
【０３１５】
用量単位は、それに限定されるものではないが、対象の体重、年齢及び健康状態を含むいくつかの因子に応じて比例的に増大又は低減することができる。さらに用量単位は、その後の投与(例えば、免疫追加投与)のために増大又は低減することができる。
【０３１６】
本発明の組成物及び方法は、研究環境を含む様々な環境における使用が見出されるであろうことが企図される。例えば、本発明の組成物及び方法はまた、免疫系の研究(例えば、適応性免疫応答(例えば、防御免疫応答(例えば、粘膜又は全身性免疫))の特徴付け)における使用が見出される。本発明によって提供される組成物及び方法の使用は、ヒト及び非ヒト対象及びこれらの対象からのサンプルを包含し、これらの対象を使用する研究適用も包含する。本発明の組成物及び方法はまた、ナノエマルジョン、免疫原及び他の成分の試験及び最適化、並びに新しい成分のスクリーニングに有用である。したがって本発明は、任意の特定の対象及び/又は適用環境に限定されることを企図しない。
【０３１７】
本製剤は、粘膜及び他の送達経路の試験のために開発されたいくつかの動物モデルにおいて、インビボで試験することができる。容易に理解される通り、本発明の組成物は、ウイルス、細菌、寄生虫及び真菌によって引き起こされる多種多様な疾患及び感染症の予防及び/又は治療、並びに様々な抗原に対する免疫応答を引き出すのに有用である。本組成物は、先に記載の通り予防又は治療に使用できるだけでなく、ポリクローナル及びモノクローナル両方の抗体(例えば、診断目的で)を調製するために、並びに対象となる抗原の免疫精製のために使用することもできる。ポリクローナル抗体が所望の場合、選択哺乳動物(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等)を、本発明の組成物で免疫化することができる。動物は通常、2〜6週後に抗原の一回又は複数回の投与により追加免疫される。次いで、ポリクローナル抗血清を免疫化動物から得、公知の手順に従って使用することができる(例えば、Jurgens et al., J. Chrom. 1985, 348:363-370参照)。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、NE及び免疫原を含む組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットはさらに、組成物を投与する装置を提供する。本発明は、キットに含まれる装置の種類によって制限されない。いくつかの実施形態では、装置は、本発明の組成物の経鼻適用のために構成される(例えば、鼻用アプリケーター(例えばシリンジ)又は鼻用吸入器又は鼻用噴霧器)。いくつかの実施形態では、キットは、濃縮形態の(例えば、対象への投与の前に希釈することができる)NE及び免疫原を含む組成物を含む。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、全てのキット成分は、単一の容器(例えば、バイアル又は管)内に存在する。いくつかの実施形態では、各キット成分は、単一の容器(例えば、バイアル又は管)内に設置される。いくつかの実施形態では、一つ又は複数のキット成分は、単一の容器(例えば、バイアル又は管)内に設置され、同じキットの他の成分は、別個の容器(例えば、バイアル又は管)内に設置される。いくつかの実施形態では、キットはバッファーを含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに、使用のための指示を含む。
【０３２０】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態及び態様を実証し、さらに例示するために提供しており、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０３２１】
in vivo毒性試験
本発明のナノエマルジョン組成物を試験して、組成物を対象に肺内投与することにより、任意の組織学的な変化及び/又は病変が誘発されるかどうかを決定した。
【０３２２】
20%のナノエマルジョン(W805EC)及び0.1%のEDTAを含む溶液を噴霧器によって投与した。PARl LC噴霧器(Midlothian、VA)及び圧迫器を持つ噴霧容器のみの特別注文のマウスの鼻を使用した。0.9%のNaCl溶液を対照として使用した。噴霧器を使用して、マウスにナノエマルジョン+EDTA又はNaCl溶液を10分間噴霧投与した。投与した24時間後、マウスを屠殺にし、身体的性質及び組織学的性質を評価した。
【０３２３】
試験時、組織学的な変化はなく、噴霧されたナノエマルジョンの投与時に毒性がなかったことが示された。身体的な所見は正常であった。
【実施例２】
【０３２４】
ナノエマルジョン組成物及び呼吸器で発見された細菌を利用した死滅アッセイ
ナノエマルジョン(W805EC)を単独で、若しくはEDTAと組み合わせて含む組成物、及び/又は高張食塩水が存在することにより、呼吸器で発見される細菌について、増殖を減衰させる、且つ/又は死滅させることができるかどうかを決定した。
【０３２５】
セパシア菌又は緑膿菌の一晩の培養を、-80℃の凍結貯蔵細菌からのカチオン調整ミューラー・ヒントン(MHB)6ml中で開始した。培養物を振とうインキュベーター内、37℃でインキュベートした。次の日に、新鮮なMHBを用いて一晩培養物を1:4に逆希釈することによって細菌を対数増殖期に導いた。逆希釈した培養物を、振とうインキュベーター内、37℃で、OD600が0.40〜0.45に達するまでインキュベートした。培養物1mlを、3500〜4000rpmで15分遠心沈殿させた。細菌ペレットを、1mlの滅菌2×PBS、12%又は14%の生理食塩水中に再懸濁させた。同じ溶液を用いて適切な希釈を行って、50μlにおける所望の細菌数を得た(およそ0.5のOD600=細菌109個)。出発細菌懸濁液の希釈物をルリア・ベルターニ(LB)寒天プレート上にプレーティングして、出発細菌数を見積もった。所望の最終的なナノエマルジョンの濃度及びEDTAを含んだナノエマルジョンの濃度を、滅菌ミリQ水を用いて2倍にした。ナノエマルジョン50マイクロリットルを、細菌50μlと混合し、ボルテックスにかけて反応物を混合した。混合物を、所望の時間間隔で、37℃でインキュベートした。インキュベートした後、反応物を500μlの1×PBSで希釈し、ボルテックスにかけて内容物を混合した。内容物を、4000rpmで15分遠心分離して細菌をペレット化し、ナノエマルジョンを分離した。ナノエマルジョンを含有する上清を除去し、細菌ペレットを1×PBS中に再懸濁させた。無希釈の再懸濁した細菌ペレット又は再懸濁した細菌ペレットの希釈物を、コロニーを計数するためにLB寒天プレート上にプレーティングした。細菌の対数死滅を出発数との比率から算出した。
【０３２６】
以下の死滅アッセイを行った:
単独又は20mMのEDTAとあわせた20%のナノエマルジョン(NE)による、10分でのPBS中のセパシア菌の死滅(図1参照);
単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のNEによる、20分以内のPBS中のセパシア菌の死滅(図2参照);
単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のNEによる、40分以内のPBS中のセパシア菌の死滅(図3参照);
単独又は20mMのEDTAと合わせた20%のNEによる、40分以内又は60分以内のPBS中のセパシア菌の死滅(図4参照);
NE単独及びNEとEDTAによる、15分及び30分での高張食塩水(6%NaCl)中のセパシア菌の死滅(図5参照);
7%NaCl中のセパシア菌及び緑膿菌の15分以内の死滅(図6参照);及び
7%NaCl中のセパシア菌及び緑膿菌(混合培養物)の15分以内の死滅(図7参照)。
【０３２７】
ナノエマルジョン単独又はEDTA(例えば、10〜20mMのEDTA)との組合せにより、60分でPBS中の細菌106個の完全な死滅を実現することができた。20mMのEDTAの存在と同時に、高張食塩水(例えば、6〜7%のNaCl)の存在下で、ナノエマルジョンの死滅させる能力は著しく増強され、15分以内の完全な死滅が実現された。同様に、高張食塩水の存在下で、低濃度のEDTAを含むナノエマルジョンにより、30分で細菌の完全な死滅を実現することができた。したがって、本発明は、EDTAを含むナノエマルジョン組成物を、短時間で(例えば、<60分)細菌を死滅させる(例えば、完全に)ために使用することができることを提供する。さらに、本発明は、高張食塩水及びEDTAを含んだナノエマルジョンを、さらに短時間で(例えば、<30分、<15分)細菌を死滅させるために使用することができること、及びEDTA及び高張食塩水の溶液濃度により、速度が細菌を根絶することができるように変更されることを提供する。本発明は、本発明の組成物によって、細菌の混合集団を根絶可能であることも実証している。
【実施例３】
【０３２８】
多剤耐性株を含めた嚢胞性線維症(CF)関連細菌のナノエマルジョンによる死滅
材料と方法
細菌株及び培養条件。バークホルデリア分離株75株、並びに緑膿菌、アクロモバクター・キシロスオキシダンス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アシネトバクター種、パンドレア種(P.アピスタ(P. apista)、P.プノメヌサ(P. pnomenusa)、P.プルモニコーラ(P. pulmonicola)、P.ノリンベルゲンシス(P. norimburgensis)、及びP.スプトラム(P. sputorum))、及びラルストニア種(R.マンニトリリティカ(R. mannitolilytica)及びR.ピッケティ(R. pickettii))を含めた他のCF関連種に属する分離株75株を含めた150株の分離株を分析した。臨床分離株145株を、Burkholderia cepacia Research Laboratory and Repository(BcRLR、University of Michigan、Ann Arbor、MI)から入手した。これらは、1997年9月〜2007年10月に142個体から回収され、米国内のCF治療センター62ヶ所から分析のためにBcRLRに付託された。残りの5株は、環境分離株であるB.マルチボランス、ATCC17616(American Type Culture Collection、Manassas、Virginia)、P.ノリンベルゲンシス、LMG 18379T(BCCM/LMG Bacteria Collection、Laboratorium voor Micrbiologie Gent、Universiteit Gent、Ghent、Belgium)及びB.ピロシニア(B. pyrrocinia)、HI3642(BcRLR collection)、並びに臨床型の株であるB.セノセパシア、LMG 16656T(aka J2315)及びP.プルモニコーラ、LMG 18106Tを含んだ。臨床分離株147株のうち134株(91%)は、CFの人間から回収され;そのうち114株(78%)が痰培養からのものであり、残りは咽頭スワブからのもの(n=17)、気管内吸引/気管吸引からのもの(n=5)、血液からのもの(n=5)、気管支洗浄からのもの(n=3)、並びに、上顎洞、腹膜腔、及び喉頭蓋それぞれからのものであった。分離株150株のうち49株(33%)が、付託された微生物研究所で行われた感受性試験に基づいて、多剤耐性であると定義された(抗生物質の二つ又は三つのクラス:カルバペネムを含むラクタム系、アミノグリコシド系、及びキノロン系の試験した全ての薬物に対して耐性;例えば、Taccetti et al., Eur J Epidemiol. 1999 Jan;15(l):85-8を参照されたい);そのうち20株(41%)が汎耐性であった。残りの分離株のうち72株(48%)は、少なくとも一つの抗生物質に対して感受性であり、29株(19%)の分離株については感受性試験の結果が入手できなかった。全ての分離株が、BcRLRにおいて、記載の通り表現型アッセイ及び遺伝子型アッセイを使用した多相分析によって種のレベルまで同定された(例えば、Reik et al., J Clin Microbiol. 2005 Jun;43(6):2926-8を参照されたい)。例外として、アシネトバクターについては、決定的な種特異的アッセイを欠いたために属のレベルまでしか同定されなかった。全ての分離株は、以前に記載された通り、BOX AlRプライマーを使用した反復性の遺伝子外エレメントPCR(rep-PCR)分類にも供して(例えば、Coenye et al., J Clin Microbiol. 2002 Sep;40(9):3300-7を参照されたい)、試験パネルに含まれる分離株150株全てが遺伝子型的に明らかに異なることを確実にした。細菌を、脱脂乳中又は15%のグリセロールを含んだルリア・ベルターニ(LB)培地中、-8O℃で貯蔵し、一晩の凍結貯蔵物からミューラー・ヒントン(MH)寒天上に回収した。
【０３２９】
ナノエマルジョン。本明細書に記載のナノエマルジョンP4075ECは、NANOBIO Corp.(Ann Arbor、MI)によって製造された。P4075ECの液滴は、400nmの平均粒子直径を有した。P4075ECの製造に利用された界面活性剤及び食品物質は、FDAから「一般に安全と認められ」(GRAS)、製造及び品質管理基準(GMP)に従って製造された。実験に使用したP4075ECの量の代理として、CPCの濃度を使用した。P4075ECは、40℃において12カ月以上安定であった。
【０３３０】
感受性試験。P4075ECは不透明であるため、臨床・評価標準協会(CLSI)に承認されたマイクロタイター段階希釈法を改変したものを使用することによって、この化合物の試験細菌に対するMICを決定した(例えば、Clinical and Laboratory Standards Institute. 2006. Approved standard M7-A7, seventh edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PAを参照されたい)。P4075ECを、7%のNaCl及び20mMのEDTAを補充したMH培地中2mg/ml(CPC)の濃度に希釈した。補充なしのMH培地中でこの調製物の連続的な2倍希釈を行い、96ウェル平底マイクロタイタープレートに分注した(100μl/ウェル)。MH寒天上で一晩増殖させた細菌を、MH培地中に、0.5マクファーランド濁度標準(625nmにおける吸光度0.08〜0.13)まで再懸濁させ、MH培地中に1:100までさらに希釈し、P4075EC段階希釈ウェルに加えた(5μl/ウェル)。細菌を含むがP4075ECを含まないウェル及びP4075EC希釈液を含むが細菌を含まないウェルを含めた適切な対照を各プレートに含めた。マイクロタイタープレートを少しの間振とうし、細菌を含有するがP4075ECを含有しないウェルから1μlを取り出し、MH培地1ml中に希釈し、MH寒天(100μl)にプレーティングし、37℃で24〜48時間インキュベートして、最初の接種物の細菌濃度を決定した。次いで、マイクロタイタープレートを、37℃で振とうせずにインキュベートした。MBCを決定するために、一晩増殖させた後、各ウェルから10μlを取り出し、MH寒天上にスポットし、37℃でインキュベートした。24時間後にコロニーを数え、MBCを、最初の接種物と比較してCFU/mlが3log減少したP4075EC濃度として記録した。MICを決定するために、10μlのレサズリン(resazurin)(R&D SYSTEMS、Minneapolis、MN)を各ウェルに加え、マイクロタイタープレートを少しの間振とうし、ホイルで覆い、37℃で振とうせずにインキュベートした。次の日にウェルを視覚的に検査し、MICを、青色が残存しているP4075ECの最低濃度として記録した。MICの結果を、分光蛍光光度計で励起560nm/放出590nmにおける蛍光を記録することによってさらに定量化した。
【０３３１】
バイオフィルム増殖及び感受性試験。バイオフィルム形成分離株を同定するために、細菌をトリプティックソイ培地中で一晩増殖させ、0.5マクファーランド濁度標準に対して調整し、MH培地中に1:10までさらに希釈し、100μlを96ウェル平底マイクロタイタープレートの内部のウェルに3連で播種した。細菌なしの陰性対照のウェルを含めた。蒸発を最小にするために、残りのウェルをMH培地で満たし、プレートをプラスチックのラップで包んだ後、振とうせずに37℃で48時間インキュベートした。ウェルをリン酸緩衝食塩水(PBS;pH7.4)で2回、穏やかに洗浄し、37℃で2時間乾燥させ、次いで、1%の水中クリスタルバイオレットを用いて15分間染色した。染色されたウェルを、PBSで3回洗浄し、無水メタノールを加えることによってクリスタルバイオレットを可溶化した。室温で5分間インキュベートした後、可溶化したクリスタルバイオレットを新しいマイクロタイタープレートに移し、分光光度計で590nmにおいて走査した。バイオフィルム形成分離株を、3ウェルの平均吸光度が陰性対照のウェルの平均吸光度+三つの標準偏差よりも大きいものと定義した(例えばStepanovic et al., J Microbiol Methods. 2000 Apr;40(2): 175-9を参照されたい)。
【０３３２】
バイオフィルム感受性試験のために、クリスタルバイオレット試験によって、バイオフィルムを産生することが示された分離株を、上記の通り、3連で48時間増殖させた。浮遊性MIC試験のために、上記の通り段階希釈したP4075ECを加える前に、ウェルをPBSで2回穏やかに洗浄した。37℃で一晩インキュベートした後、ウェルを再度PBSで2回洗浄し、MH培地中10%レサズリン100μlをウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、ホイルで覆い、再度37℃で一晩、振とうせずにインキュベートした。次の日にプレートを視覚的に検査し、最小バイオフィルム阻害濃度(MBIC)を、ウェルが青色であるP4075ECの最低濃度として記録した。最小のバイオフィルム根絶濃度(MBEC)を算出するために、バイオフィルムをMBIC試験に使用したものと同じウェル中に、マイクロタイタープレートを振とうし、次いで、ピペットの先端でウェルの側面をこすることによって再懸濁させた。各ウェルから10μLを取り出し、MH寒天プレート上にスポットし、37℃でインキュベートした。一晩増殖させた後、MBECを、増殖しなかったP4075ECの最低濃度として記録した(例えば、Tomlin et al., Can J Microbiol. 2001 Oct;47(10):949-54を参照されたい)。最初の接種物の濃度を確認し、バイオフィルム増殖培地において生存可能な細菌を定量化するために、MBECを算出するために、0.5マクファーランド播種培養物の10倍段階希釈物、及び再懸濁したバイオフィルムを含んだ無処理の陽性対照のウェルからコロニーを数えた。
【０３３３】
痰の調製。CF患者から日常的なケアの間に採取した喀痰物を、ミシガン大学Health System clinical microbiology laboratoryから入手し、-80℃で貯蔵した。15個体からの等容量の痰をプールし、TISSUE MISERホモジナイザー(FISHER SCIENTIFIC、Pittsburg、PA)を、室温、最大速度で5分間使用して機械的にせん断し、次いで、80℃のウォーターバスで20分間インキュベートした。処理した痰を10mlの一定分量に分割し、各一定分量から100μlをMH寒天にプレーティングし、37℃で48時間インキュベートして滅菌を確認した。一定分量を-8O℃で貯蔵した。
【０３３４】
結果
浮遊性細菌の感受性。P4075ECが不透明な白色であるために、標準のCLSI承認マイクロタイター段階希釈法を、細菌の生存可能性の指標としてレサズリンを加えることを含むように改変した。P4075ECを15.6〜2000μg/mlの濃度範囲で試験した。MICを、青色から淡紅色への色の変化を生じなかったP4075ECの最低濃度として定義した(図8参照)。この視覚的な屈曲点と蛍光定量的分析の比較により、63%のMICウェルが無処理の対照のウェルの代謝活性の≦1%を有し;91%が対照のウェルと比較して≦5%の代謝活性を有し、96%が対照のウェルと比較して≦10%の代謝活性を有した。MICの結果を図11に示す。全ての株が、試験した濃度のP4075ECによって阻害された。150株のパネル全体に対するMIC50は31.2μg/mlであり、MIC90は125μg/mlであった。38株(25%)が、試験した最低濃度のP4075ECによって阻害され(15.6μg/ml)、単一の株のみが、阻害のためにそれぞれ250μg/ml及び500μg/mlの濃度を必要とした。P4075ECは、バークホルデリア株(MIC5062.5μg/ml;MIC90125μg/ml)よりも非バークホルデリア株に対してわずかに活性であった(MIC5031.2μg/ml;MIC9062.5μg/ml)(図9参照)。活性は、試験した10株のバークホルデリア種にわたって同程度であった。多剤耐性バークホルデリア株に対するP4075ECの活性は、一つ又は複数の抗生物質に対して感受性の株と比較して差異は見られなかった。
【０３３５】
浮遊性細菌に対するP4075ECの殺菌活性を評価するために、バークホルデリア22株及び非バークホルデリア12株を含めた34株のサブセットに対するMBCを決定した。250μg/mlのMIC及び2000μg/mlのMBCを有した単一のB.セノセパシア株を除いて全てのMBCが、この株のサブセットに対するそれぞれのMICの一つの希釈度の範囲内であった。B.マルチボランス、ATCC 17616の時間-死滅試験により、時間及び濃度に依存した死滅が示され、MICの2倍高いP4075EC濃度で90分以内に細菌の生存率が99%減少し、MICの8倍高い濃度で30分以内に完全に死滅した(図10A参照)。
【０３３６】
バイオフィルムで増殖した細菌の感受性。P4075ECの活性をさらに評価するために、バイオフィルムとして増殖した細菌を感受性について試験した。クリスタルバイオレット染色により、試験パネルからスクリーニングした25株の中から12株のバイオフィルム形成株が同定された。12株のうち9株(75%)がP4075ECに対する感受性の減少を示し、バイオフィルムとして増殖したとき、MICと比較してMBICが少なくとも4倍増加すると定義された(図12参照)。このセット内の株に対するP4075ECのそれぞれのMICと比較してMBICの中央値は8倍増加した。バイオフィルム細菌のP4075ECに対するトレランスの証拠は見られなかった;MBECは、12株のうち10株について、それぞれのMBICと同じであった。
【０３３７】
CF痰における細菌の感受性。バイオフィルム形成株12株を、痰の存在下でのP4075ECに対する感受性についても試験して、CFの肺の微小環境をより綿密にモデリングした。浮遊条件下で増殖した12株全てに対するP4075ECのMBCが、43%の痰(マイクロタイターアッセイで得ることができる痰の最高濃度)の存在下で、標準の条件下でのそれぞれのMBCと比較して増加した(図12参照)。それにもかかわらず、全ての株が、痰の存在下でP4075ECに対して感受性のままであった。CF痰は、浮遊性細菌に対するP4075ECの活性を、濃度依存性の形で阻害した(図10B参照)。
【実施例４】
【０３３８】
個々の細菌性バイオフィルム及び混合した細菌性バイオフィルムのナノエマルジョンによる死滅
ナノエマルジョンP4075EC、7%の生理食塩水及び20mMのEDTAを含む組成物を、バイオフィルム(個々又は混合)中に存在する細菌を死滅させるその能力について試験した。
【０３３９】
バイオフィルムの増殖。ポリカーボネート膜上の細菌性バイオフィルムをCurrent Protocols in Microbiology(John Wiley & Sons, Inc.、NJ、USA)に記載の手順に従って形成した。ポリカーボネート膜を、滅菌したピンセットを使用して膜の両側をUV光に10分間曝露させることによって、又は121℃で20分間の蒸気滅菌によって滅菌した。滅菌した膜を、寒天培地の表面に、光沢のある表面を上に向けて置いた。対象の細菌株の一晩培養物を、OD600が0.05になるまで培養液の培地で希釈し、希釈された培養物0.5μlを、寒天プレート培地上のポリカーボネート膜の光沢のある表面に置いた。膜を有するプレートを37℃で24時間インキュベートし、その後、バイオフィルムを形成させるために、さらに24時間、膜を新しい寒天培地に移した。
【０３４０】
バイオフィルム細菌に対する殺菌アッセイ。バイオフィルムを有するポリカーボネート膜を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中、20mMのEDTA及び7%の塩化ナトリウム(NaCl)を含んだ250μlの20%P4075ECに37℃で3時間浸漬した。7%のNaClは陰性対照として機能した。インキュベートした後、膜を10mlの滅菌PBSを含有する15mlの滅菌ポリプロピレンチューブに移した。1mlの滅菌PBSをエッペンドルフ反応チューブに加え、ボルテックスにかけ、3500rpmで15分回転させた。遠心分離した後、NEを含有する上清を除去し、細菌ペレットを、それぞれの、ポリカーボネート膜を回収した15mlのチューブ中に再懸濁させた。次いで、15mlのチューブを最大速度で3分間ボルテックスにかけて膜からPBS中に細菌を得た。コロニーを計数するために、無希釈の、及び希釈した、処理試料及び対照試料100マイクロリットルをLB寒天プレート上にプレーティングした。
【０３４１】
図13〜16に示されるように、7%の生理食塩水及び20mMのEDTAを含んだ20%のP4075ECは、単一の細菌株を含むバイオフィルム(例えば、図13参照）、複数の細菌株を含むバイオフィルム(例えば図14〜15参照)、並びに第一回目の処理で死滅から逃避した細菌から生じたバイオフィルム(例えば図16参照)に存在する細菌を死滅させるのに有効であり、4〜9logの細菌数の減少が実現した。
【実施例５】
【０３４２】
本実施例は、種々のナノエマルジョン製剤の、CF、創傷、熱傷及び熱傷患者、又は他の環境に関連し得る種々のグラム陰性病原体に対する有効性について記載している。
【０３４３】
上記のように、CFは、生涯の早期における黄色ブドウ球菌の感染及びインフルエンザ菌の感染で始まる慢性呼吸器感染症及び後期の緑膿菌のムコイド株のコロニー形成を特徴とする。CF肺疾患では、早期のセパシア菌のコロニー形成が、CF患者における予後不良と相関する。患者は、多くの場合細菌感染症の増悪を防ぐために、吸入用トブラマイシンを処方される。時間と共に、患者はトブラマイシン療法/予防法に対して無応答になり得る。既知の抗生物質に交差耐性を示さない新しい吸入局所薬剤が、吸入用トブラマイシンの代替として有用性があると思われる。
【０３４４】
いくつかの局所用ナノエマルジョンを、緑膿菌及びセパシア菌を含めたグラム陰性分離株に対する微生物学的活性について評価した。3種全てのナノエマルジョンにより、EDTAなどの外膜透過性化剤の存在下ですぐに死滅した。ナノエマルジョンを、グラム陰性分離株35株のうち23株に対する殺活性について評価し、全てが殺菌性であった(85〜95%)。したがって、一つ又は複数のこれらの新規ナノエマルジョンは、慢性肺感染症の増悪を防ぐために使用することができる。
【０３４５】
方法:CLSI標準方法を使用してMIC及びMBCを決定した。ナノエマルジョンについてのMICを、5mMの、ナノエマルジョン活性の公知の増強剤であるEDTAの存在下で決定した。代謝活性に応答して発色変化をもたらす酸化還元指示薬であるalamar blueの添加を使用して、高濃度において不透明であるナノエマルジョンのMICを決定した。
【０３４６】
エマルジョンの製造:ナノエマルジョンW205EC、P4075EC及びW205GBA2EDは、一般に安全と認められた(GRAS)成分から製造された、ヒトの経口使用に対して安全であることが証明さた活性成分としてカチオン性界面活性剤(塩化セチルピリジニウム(CPC)又は塩化ベンザルコニウム(BA))を有する油中水エマルジョンである。エマルジョンは、高度に精製された油、エタノール、非イオン性界面活性剤及び水から形成される。平均のナノエマルジョン液滴サイズは、Malvern Zetasizer Nano3600 (Malvern Instruments Ltd.、Worcestershire、UK)を使用した動的光散乱によって測定すると、W205ECについて180nm並びにP4075EC及びW205GBA2EDについて350nmであった。W205EC及びP4075ECの製剤について上記している。W205GBA2ED(v/v%)は、蒸留水(18.93%)、TWEEN 20(5%)、グリセリン(8%)、大豆油(64%)、50%のBTC824(4%)(Stepan、Northfield、Illinois)及びEDTA(0.0745%)である。製剤は、水に希釈して(例えば、W205GBA2EDを60%、水40%)60%のW205GBA2EDを提供することができる。この材料は1OmMのEDTAを含んだ10%製剤に希釈することができる(例えば、60%のW205GBA2ED20g当たり100mMのEDTA24g当たり水76g)。したがって、一部の実施形態では、油、水、グリセリン、界面活性剤、及びBTC(n-アルキルジメチルベンジル塩化アンモニウム)、及び/又はEDTAを含む製剤が提供される。
【０３４７】
分離株の供給源。臨床分離株の供給源は、過去2年間にJMI Laboratoriesによって採取された血流又は皮膚及び軟組織の分離株であった。
【０３４８】
MIC及びMBCの決定。W205EC±0mM、5mM、10mM、15mM、及び20mMのEDTAのMICを、カチオン調整ミューラー・ヒントン培地において、M7〜A7当たり微量希釈することによって評価した(2006)。グラム陰性分離株のパネルに対して、5mMのEDTAの存在下でナノエマルジョンW205EC、P4075EC、及びW205GBA2EDのMICを決定した。EDTAは、グラム陰性の外皮を透過性にするために使用し、細胞膜へのナノ液滴の注入を助け、溶解をもたらした。播種した2時間後、MICエンドポイントの検出を増強するために、アッセイパネルにalamar blueを加えた。全てのノエマルジョン及び比較化合物(フシジン酸)についてのMBC値を、MICウェル及び選択された生物それぞれに対するMICを上回る4倍希釈物からの全培地内容物を血液寒天増殖培地上にプレーティングすることによって評価した。定量的なコロニーの計数を、最初の接種物に対して行った。出発試験接種物の≧99.9%を死滅させた抗微生物剤の最低濃度をMBCエンドポイントとして定義した。表2、3、及び4を参照されたい。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０３４９】
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【０３５０】
結果:3種全てのナノエマルジョンが、グラム陰性分離株に対して活性を有した(A.バウマンニ及びS.マルトフィリアのそれぞれ3株及び5株が、EDTA単独で阻害された)。これには、比較薬剤に対して耐性を示す分離株が含まれた。MBCを分離株23株について行った;W205EC、P4075EC、及びW205GBA2EDは、それぞれ、85%、95%、及び90%の分離株に対して殺菌性であった。いずれのナノエマルジョンに対しても、どんな公知の抗生物質に対する交差耐性も観察されなかった。
【０３５１】
結論:ナノエマルジョンは、多剤耐性分離株を含めたグラム陰性種に対して広く活性であった。実証されたMICは、皮膚又は粘膜組織への局所的な適用で実現可能な濃度の範囲内であった。一つ又は複数のナノエマルジョンが、嚢胞性線維症患者における慢性肺感染症の予防法及び/又は治療的治療に有用であり得る。
【実施例６】
【０３５２】
本実施例の目的は、本発明によるナノエマルジョンがインフルエンザ菌分離株に対する活性を有するかどうかを決定することであった。インフルエンザ菌は、嚢胞性線維症患者の急性増悪、並びに非CFの正常な個体に対する上気道及び下気道の感染症に関係する重要な呼吸器病原体である。
【０３５３】
本実施例では、3種の代表的なナノエマルジョン(W205EC、P4075EC及びW205GBA2)と、それに加えて比較薬物の、インフルエンザ菌の臨床分離株に対する最小阻害濃度を決定した。結果は、以下に詳細を記載した通り、P4075EC及びW205ECが、1.88〜3.75μg/mlの同様のMIC範囲を有することを示している。W205GBA2は8〜16μg/mlのMIC範囲を有した。ナノエマルジョンを含有する各ウェルへの1mMのEDTAの添加は、MICには影響を与えなかった。1mMを超える濃度のEDTAは、おそらくカチオンの濃度を、増殖を補助する濃度を下回るレベルまで低下させて、細菌の増殖を阻害した。3種のナノエマルジョン+1mMのEDTAについてのMBCデータを、7株について得た。MBCは、それぞれのMICの4倍以内であり、インフルエンザ菌分離株に対する殺菌活性を有するそれぞれのナノエマルジョンと一致している。
【０３５４】
A.材料と方法
薬物の供給源。W205EC、ロット×1151、濃度5000μg/ml(貯蔵濃度)は、Patheon、Mississaauga、Ontario、Canadaで製造された臨床試験材料(NB-001)のプール試料であった。P4075EC、ロット×l138、及びW205GBA2、ロット×1103は、NanoBio Corporationにおいて製造された。比較化合物であるアジスロマイシン、アンピシリン、セフェピム及びクリンダマイシンは、The United States Pharmacopeiaから購入した;カタログ番号は、それぞれ、1046056、1033000、1097636、1136002であった。テトラサイクリンは、Fluka Biochemikaから購入し、カタログ番号は87128であった。エマルジョンは、水と不混和性の油相を水相と混合することによって作製した。基剤は、以下の表5に示し、それは未希釈のエマルジョンを表しており、それを所望の%にさらに希釈した。組成物は、特に断りのない限り、w/w%である。
【表５】
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【０３５５】
細菌株の供給源。インフルエンザ菌の臨床分離株10株は、Case Western Reserve University、Cleveland、Ohioから入手した。品質対照分離株であるATCC 49247はAmerican Type Culture Collectionから入手した。
【０３５６】
感受性アッセイ。市販の抗生物質5種及びナノエマルジョン製剤3種に対するインフルエンザ菌分離株の感受性を、Clinical Laboratory Standards Institute (Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility and Testing; Seventeenth Informational Supplement. CLSI document MIOO-S17 (ISBN 1-56238-625-5). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1988, 2007)から発行されたガイドラインを使用して評価した。試験した薬物の濃度の範囲は、以下の通りであった:アジスロマイシン0.25〜128μg/ml、アンピシリン0.063〜32μg/ml、セフェピム0.063〜32μg/ml、クリンダマイシン0.125〜64μg/ml、テトラサイクリン0.125〜64μg/ml、P4075EC 0.12〜60μg/ml塩化セチルピリジニウム、W205EC 0.12〜60μg/ml塩化セチルピリジニウム、W205GBA2 0.125〜64μg/ml塩化ベンザルコニウム。ナノエマルジョンは単一の構成成分ではないので、MIC/MBCはカチオン性界面活性剤の濃度として表した;W205EC及びP4075ECはどちらもカチオン性界面活性剤として塩化セチルピリジニウム(CPC)を含有し、一方W205GBA2はカチオン性界面活性剤として塩化ベンザルコニウム(BA)を含有する。分離株は、同じ濃度範囲のナノエマルジョン+1〜5mMのEDTAでも同様に試験して、後者がナノエマルジョンの活性を増強するかどうかを調べた。EDTAの濃度は、EDTAによるカチオン性のキレート化が、ナノエマルジョンと独立して細菌の増殖を阻害するのに十分であることを確実にするために単独で試験した。
【０３５７】
最小阻害濃度(MIC)を、各薬物の一連の10の濃度における最初の完全に透明なウェルとして視覚的に決定した。ナノエマルジョンについては、それらが本質的に不透明であるので、段階希釈の最小濃度から最大濃度までにおいて、いくらか透明化したことが観察された最初のウェルとしてMICを決定した。臨床株7株及びATCC49257分離株について、MICであると決定されたウェル及びMICを上回る4ウェルからの10μlをチョコレート血液寒天培地上にプレーティングすることにより、ナノエマルジョン+1mMのEDTAのMBC値を評価した。出発試験接種物の≧99.9%を死滅させた抗微生物剤の最低濃度をMBCとして定義した。MBC/MIC比が≦4である場合に、その化合物又はナノエマルジョンを殺菌性であると定義した。
【０３５８】
結果:MIC及びMBCについてのデータを表6〜7に示す。P4075EC、W205EC、及びW205GBA2は、1mMのEDTAの存在下又は非存在下で、同等に有効な抗微生物剤であった。これらの化合物についてのMIC90値は、それぞれ、3.75μg/ml、3.75μg/ml、及び16μg/mlであった(表6)。MIC90値で、大部分の分離株がアジスロマイシン、セフェピム、テトラサイクリン及びアンピシリンに対して感受性であったが、クリンダマイシン及びアンピシリンに対しては耐性であった。
【０３５９】
試験した各分離株について、MBC値はそれぞれのMICの4倍以内であった(表7);したがって、ナノエマルジョンのそれぞれが、インフルエンザ菌に対して殺菌性であり、P4075EC、W205EC、及びW205GBA2についてのMBCの範囲は、それぞれ、1.88〜7.5μg/ml、1.88〜7.5μg/ml及び8〜16μg/mlであった。
【０３６０】
結論:P4075EC及びW205ECは、インフルエンザ菌の臨床分離株に対して同等に有効であることが明らかになった。塩化ベンザルコニウム製剤であるW205GBA2は、MIC90値及びMBC値で他のナノエマルジョンの1/2〜1/4の活性であった。濃度が≧2mMのEDTAは、これらの増殖条件下でインフルエンザ菌の増殖を阻害した。EDTAの添加は、どのナノエマルジョンの活性を増強するためにも必要ではなかった。
【表６】
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【表７】
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【０３６１】
以下の表8について、薬物の濃度は、比較物についてはμg/mlであり、W205EC及びP4075ECについては塩化セチルピリジニウム(CPC)μg/mlとし、W205GBA2については塩化ベンザルコニウム(BA)μg/mlとする。NCは、陰性対照であり、GCは増殖対照である。チャートには96ウェルマイクロタイタープレートのウェルが記載されている。I、J、K、及びLと記載されている横行は、異なる濃度のEDTAを用いたナノエマルジョンを評価するために使用した部分プレートの横行である。臨床株及び対照株のそれぞれについて、以下のチャートを、MICデータ及びMBCデータを追跡するために使用した。ウェルがMIC()を読み取るのに不透明すぎる場合、MBCを信頼してMICを規定した。表8において、明るく強調した横行はMBCに対する生菌数を含有する。2番目の数字は、MBCを決定するために使用したマイクロタイタープレートからの試料10μlの生菌数である。MBCは、接種物の≧3-log減少として定義した。暗く強調したところはMICに対応する。
【表８】
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【０３６２】
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【０３６３】
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【０３６４】
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【０３６５】
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【０３６６】
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【０３６７】
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【０３６８】
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【０３６９】
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【０３７０】
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【０３７１】
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【０３７２】
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【０３７３】
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【０３７４】
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【実施例７】
【０３７５】
本試験の目的は、本発明によるナノエマルジョン(NE)4種のMIC及びMBCを決定し、MRSAに対するNEの性能を従来の抗生物質と比較することであった。MRSAは、若年の嚢胞性線維症患者において肺感染症を引き起こす微生物の一つであり、熱傷の創傷感染症を含めた皮膚及び軟組織の感染症にも関係する。病原性機構が多様であるので、MRSAによって引き起こされる感染症は致死的である。
【０３７６】
本実施例の目的は、本発明によるナノエマルジョン4種を、感染性疾患の局所的な治療における使用について評価することであった。試験したナノエマルジョンは、W805EC、W205ECEDL2、W205GBA2ED及びP4075ECであった。本実施例では、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の臨床分離株29株に対する4種のナノエマルジョンとそれに加えて比較薬物の最小阻害濃度(MIC)を決定した。
【０３７７】
以下に示す結果は、ナノエマルジョンについてのMICの範囲が、それぞれ、0.5〜2μg/ml(W805EC)、0.5〜4μg/ml(W205ECEDL2)、1〜4μg/ml(W205GBA2ED)、1〜4μg/ml(P4075EC)であったことを実証している。最小細菌濃度(MBC)のデータも同様に収集し、MBCの範囲は、それぞれ、0.5〜16μg/ml(W805EC)、1〜>32μg/ml(W205ECEDL2)、2〜16μg/ml(W205GBA2ED)、及び1〜>16μg/ml(P4075EC)であった。
【０３７８】
A.材料と方法
薬物及び分離株の供給源。12種の比較化合物、クリンダマイシン(USP#1136002)、ドキシサイクリン(USP#1226003)、エリスロマイシン(Sigma#E0774)、レボフロキサシン(Sigma#28266)、酢酸マフェニド(USP#1373008)、ムピロシン(Sigma#M7694)、シルバデン(Silvadene)(USP#61260)、バンコマイシン(Sigma#V1764)、オキサシリン(Sigma#28221)、スルファメトキサゾール(USP#1631001)、トリメトプリム(USP#1692505)、及び硝酸銀(VWR #VW3462-0)を4種のナノエマルジョンと比較した。4種のナノエマルジョンは、(a)W805EC、(b)W205ECEDL2、(c)W205GBA2ED及び(d)P4075ECであった。薬物のパネルのテンプレートを提供している表10を参照されたい(パネルの横方向に希釈が増加している)。エマルジョンは、水不混和性の油相を水相と混合することによって作製した。W205ECEDL2製剤は微小流動化した。基剤は以下の表9に示し、それは未希釈のエマルジョンを表しており、それを所望の%にさらに希釈した。特に断りのない限り、組成物はw/w%である。
【表９】
0005722782.tif 000024
【表１０】
0005722782.tif 000025
【０３７９】
細菌株の供給源。MRSAの臨床分離株29株は、University of Dentistry and Medicine of New Jerseyから入手した。品質対照分離株、ATCC29213は、American Type Culture Collectionから入手した。以下の表11に各株の表現型/遺伝子型を提供する。
【表１１】
0005722782.tif 000026
【０３８０】
感受性アッセイ。MRSAの、伝統的な12種の抗微生物剤及び4種のナノエマルジョン製剤に対する感受性を、Clinical Laboratory Standards Institute (Clinical and Laboratory Standard Institute, "Antimicrobial Susceptibility and Testing; Seventeenth Informational Supplement. CLSI document M100-S17 (ISBN 1 -56238-625-5)、CLSI、Wayne、PA)によって発行されたガイドラインを使用して試験した。薬物の濃度範囲は以下の通りであった:クリンダマイシン(64〜0.125μg/ml)、ドキシサイクリン(128〜0.25μg/ml)、エリスロマイシン(128〜0.25μg/ml)、レボフロキサシン(64〜0.125μg/ml)、酢酸マフェニド(128〜0.25μg/ml)、ムピロシン(64〜0.125μg/ml)、シルバデン(128〜0.25μg/ml)、バンコマイシン(64〜0.125μg/m)、オキサシリン(16〜0.03125μg/ml)、スルファメトキサゾール(32〜0.0625μg/ml)、トリメトプリム(64〜125μg/ml)、硝酸銀(0.01〜.00002%)、W805EC(32〜0.0625μg/ml)、W205ECEDL2(32〜0.0625μg/ml)、W205GBA2ED(64〜0.125μg/ml)、及びP4075EC(32〜0.0625μg/ml)。
【０３８１】
最小阻害濃度(MIC)を各薬物の一連の10の濃度における最初の完全に透明なウェルとして視覚的に決定した。ナノエマルジョンについては、それらが本質的に不透明であるので、MICは、段階希釈の最小濃度から最大濃度までにおいて、いくらか透明化したことが観察された最初のウェルとみなした。最小細菌濃度(MBC)の値を、試験した全ての抗菌剤について評価した。出発試験接種物の2:99.9%を死滅させた抗微生物剤の最低濃度をMBCとして定義した。MBC/MIC比が約4である場合に、その化合物又はナノエマルジョンを殺菌性であると定義した。
【０３８２】
B.結果
MIC及びMBCについてのデータを表11及び12に示す。4種のナノエマルジョン全てが、MRSAの臨床分離株に対して効力があり、市中感染MRSA(SCCmecIV型)又は院内感染MRSA(SCCmecI〜III型)に対して示される活性と差異がなかった。さらに、公知の抗生物質のいずれに対してもナノエマルジョンの交差耐性はないように見えた。P4075EC、W205ECEDL2及びW805ECについてMIC90値は2μg/mlであった。W205GBA2EDは、4μg/mlのMIC90値を有した。MIC90値により、このMRSAコレクションが、経口用抗生物質であるドキシサイクリン(MIC90=4μg/ml)、スルファメトキサゾール(MIC90=4μg/ml)、トリメトプリム(MIC9O=0.5μg/ml)、及びバンコマイシン(MIC90=1μg/ml)に対して感受性であることが示された。分離株はおおむね、経口用抗生物質であるレボフロキサシン(MIC90=32μg/ml)、クリンダマイシン(MIC90=>64μg/ml)及びエリスロマイシン(MIC90=>128μg/ml)に対して耐性であった。熱傷の創傷感染症の治療に使用される局所用抗生物質であるシルバデン及び硝酸銀は、それぞれ、32μg/ml及び0.00063%のMIC90値を有した。酢酸マフェニド(Sulfamylon)は、熱傷の創傷感染症に対する別の局所的治療法であるが、MRSAに対して一様に不活性であった(MIC90=>128μg/ml)。ムピロシンは、皮膚及び軟組織の感染症に対する局所的治療法であり、MRSAの保因を根絶するために同様に使用される;分離株の31%がこの抗生物質に対して耐性であった。
【０３８３】
全てのナノエマルジョンについてのMBC90値は、それぞれのMIC90値の4倍以内であり、ナノエマルジョンが分離株の約90%に対して殺菌性であることが示されている。他の12種の抗生物質の中で、バンコマイシンのみが殺菌性であった。
【表１２】
0005722782.tif 000027
【表１３】
0005722782.tif 000028
【０３８４】
C.結論
W805EC、W205ECEDL2、W205GBA2ED及びP4075ECは、MIC90値が2μg/ml又は4μg/mlであり、MRSA臨床分離株に対して同等に有効であると思われた。さらに、MBC90/MIC90比に基づいて、4種のナノエマルジョンは殺菌性であった。予想されたように、MRSAは多剤耐性であり、MRSA感染症を治療するための新規薬剤の必要性が強調された。本発明によるナノエマルジョンは緑膿菌及びバークホルデリア種などの重大なグラム陰性病原体に対する活性も有するので(LiPuma et al., "In vitro activities of a novel nanoemulsions against Burkholderia and other multidrug-resistant cystic fibrosis-associated bacterial species," Antimicrob. Agents Chemother., 53:249-255 (2009))、ナノエマルジョンは嚢胞性線維症患者の吸入治療/維持に有用である。さらに、ナノエマルジョンは、本明細書に記載の病原因子の感染を予防/治療するための熱傷創傷の治療において有用である。
【実施例８】
【０３８５】
本実施例の目的は、代表的なナノエマルジョン(P4075EC)の、嚢胞性線維症(CF)に罹患している患者からの緑膿菌、バークホルデリア・セノセパシア、アシネトバクター・バウマンニ、ステノトロホモナス・マルトフィリアの臨床分離株に対する最小阻害濃度(MIC)及び最小細菌濃度(MBC)を、比較薬物と比較して決定することであった。
【０３８６】
MIC及びMBCの結果の要約:P4075EC+EDTAは、それぞれ、<4〜16μgCPC/ml、<4〜64μgCPC/ml、2〜8μgCPC/ml、<1〜16μgCPC/mlのMICの範囲を有した。シュードモナス及びバークホルデリアに対して5mM、及びアシネトバクター及びステノトロホモナスに対して1mMのEDTAを、ナノエマルジョンを含有する各ウェルに加えることによりMICが改善された。ナノエマルジョン+EDTAのMBCデータを、シュードモナス20株、バークホルデリア10株、アシネトバクター10株及びステノトロホモナス11株から得た。試験した三つの属の細菌について、データにより、静菌活性が示唆された。ステノトロホモナスに対するMBCは、それぞれのMICの4倍以内であり、殺菌活性を有するナノエマルジョンと一致している。
【０３８７】
相乗効果の結果の要約:標準のMIC及びMBCを決定することに加えて、チェッカーボード相乗効果試験を行って、P4075EC+EDTAが、嚢胞性線維症の患者を治療するために一般に使用される伝統的な抗微生物剤と相乗作用する、又はそれに拮抗する可能性を評価した。部分阻害濃度(FIC)指数及び部分殺菌濃度(FBC)指数を決定して、2種の薬物の組合せが互いに対して相乗的、拮抗的、又は不関であるかを判断した。バークホルデリア10株、ステノトロホモナス10株及びアシネトバクター10株を試験して、P4075EC+EDTAを、慢性肺感染症を治療するためにCF患者の肺に使用される伝統的な抗微生物剤の2種であるコリスチン又はトブラマイシンのいずれかと組み合わせたときのMICの変化を決定した。ステノトロホモナス株に関して、コリスチンと組み合わせたP4075EC+EDTAは、90%(FICに関して)、及び70%(FBCに関して)相乗的であるが、トブラマイシンと組み合わせたときは、FICで20%相乗的、FBCで0%相乗的なだけであり、不関であることがわかった。アシネトバクター株に対しては、コリスチンと組み合わせたP4075EC+EDTAは、FICで20%相乗的、FBCで0%相乗的なだけであり、同様にトブラマイシンと組み合わせたとき、FICで10%相乗的、FBCで10%相乗的なだけであり、不関であることがわかった。バークホルデリア株に対しては、コリスチンと組み合わせたP4075EC+EDTAは、FICで30%相乗的、FBCで10%相乗的なだけであり、不関であるが、トブラマイシンと組み合わせたとき、FICで50%相乗的、FBCで20%相乗的であることがわかった。
【０３８８】
A.材料と方法
CF患者から単離した多剤耐性のグラム陰性細菌分離株を本実施例において試験した。MIC及びMBCを、CLSIガイドライン及び標準的な方法であるM7-A7及びM100-S17を使用して決定した。属に応じて、1mM又は5mMの、NE活性の透過性増強剤であるEDTAの存在下でMICを行った。ステノトロホモナス及びアシネトバクターは、ナノエマルジョン中に1mMのEDTAを有した。シュードモナス及びバークホルデリアは、ナノエマルジョン中に5mMのEDTAを有した。これは、標準のMIC及びMBCの決定、並びにチェッカーボード相乗効果研究の間の場合であり、時間-死滅試験については以下に記載する。NE(P4075EC)は高い濃度において不透明であるので、代謝活性に応答して発色変化をもたらす酸化還元指示薬であるalamar blueの添加を使用してNE(P4075EC)のMICを決定した。
【０３８９】
チェッカーボード相乗効果試験を、収集したMICデータ及びMBCデータ、P4075EC+EDTAとコリスチン又はP4075EC+EDTAとトブラマイシンの組合せのマイクロタイタープレートを使用することによって行った。
【０３９０】
部分阻害濃度(FIC)指数(例えば図19参照)は、単一の薬物を別の薬剤と組み合わせた場合のMICと、その薬物単独のMICの比を求めるものである。薬物を組み合わせた場合にMICが下がると、1未満の分数が得られる。
【０３９１】
X=薬物を組み合わせたMIC/薬物単独のMIC
薬物A及び薬物Bの両方についてこの比を算出する。分数を合計する。合計を以下の範囲と比較する。
【０３９２】
相乗効果:2種の薬物についてのFICの合計  ≦0.5;
不関:2種の薬物についてのFICの合計  >0.5〜≦4;
拮抗的:2種の薬物についてのFICの合計  >4
図19Aにおいて、横行Dは、組み合わせる2種の薬物のフランキング濃度を選択するために使用する予め決定したMICを示す。図19Bにおいて、X軸及びY軸上の水平のスラッシュ記号は、各薬物単独の典型的なMIC濃度を示す。
【０３９３】
時間-死滅試験を、0分の無処理対象を含めた10分、20分、30分の短い時間曲線にわたって行って、写真用の試料を電子顕微鏡の下に固定した。
【０３９４】
B.分離株の供給源
分離株46株を評価し、その全てはUniversity of Maryland-Baltimore School of Dentistryから入手した。受け取った分離株は以下の通りであった:シュードモナス20株、バークホルデリア11株、アシネトバクター10株及びステノトロホモナス5株。緑膿菌分離株は、多くのCF患者において実証されている定義済みのリピドA修飾を有した。ステノトロホモナスの追加の分離株10株を第2の供給源から受け取った(Eurofins、Virginia)。これらの10株は一覧の最後にあり、試料を取り出した個体の年齢を伴う分離株である。分離株を以下の表14に要約する。
【表１４】
0005722782.tif 000029
【０３９５】
0005722782.tif 000030
【０３９６】
C.薬物の供給源
薬物パネルプレートに使用した薬物及びその供給源を以下の表に要約する
【表１５】
0005722782.tif 000031
【０３９７】
P4075ECの組成を以下の表16に提供する。エマルジョンは、水不混和性の油相を水相と混合することによって作製した。基剤は以下に未希釈のエマルジョンを表し、それを所望の%にさらに希釈した。
【表１６】
0005722782.tif 000032
【０３９８】
D.薬物濃度の調製
薬物濃度の調製を以下の表17及び18に記載する。特に、表17は、96ウェルの薬物パネルプレートの調製に関する詳細を提供し、表18は、96ウェルのチェッカーボード相乗効果プレートの調製に関する詳細を提供する。
【表１７】
0005722782.tif 000033
【０３９９】
0005722782.tif 000034
【表１８】
0005722782.tif 000035
【０４００】
E.MIC及びMBCの決定
96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、播種されたウェルを35℃で20時間インキュベートした後に観察した。各横行には、横行それぞれに左から右に高濃度から低濃度までの範囲で薬物が存在し、各ウェルは左隣のウェルの1/2の濃度である。一連で最初の透明のウェルをMICとみなした。これは、培地を濁らせる細菌の増殖を阻害した薬物の濃度である。ナノエマルジョンには本質的に濁度があるので、ナノエマルジョンを含有する横行には、alamar blue(CellTiter Blue、Promega)を培養物の容量の20μL〜100μLの割合で加えた。プレートを1時間インキュベーターに戻し、最初の青色のウェルをMICとみなした(低濃度のナノエマルジョンで、細菌が増殖しているウェルは淡紅色に変化した)。各ウェル中の出発接種物は、一般に2〜7×l05cfu/mLであった。出発接種物に対する特定の濃度は、各試験プレートについて、マイクロタイタープレートを設置した時点で、マイクロタイタープレートに播種するのに使用する接種物をサンプリングすることによって決定した。正確な細菌濃度を使用して各試験パネルのパネル内の各薬物についてのMBCを決定した。MBCを、細菌数を99.9%減少させた薬物濃度として定義する。MICは、MICと、それに加えて左に4つのウェルから10μL/ウェルのサンプリングを始め、寒天プレート上に、プレート当たり試料一つを置くために使用する目印である。寒天プレートを35℃で24時間インキュベートし、コロニーを計数した。得られたコロニーの数値を接種物の出発濃度と比較して、どのウェル、すなわちどの薬物濃度がcfu/mLで3logの降下をもたらしたかを決定した。
【０４０１】
F.チェッカーボード相乗効果試験
各ウェル中の出発接種物は、一般に2〜7×105cfu/mLであった。出発接種物に対する特定の濃度は、各試験プレートについて、マイクロタイタープレートを設置した時点で、マイクロタイタープレートに播種するのに使用する接種物をサンプリングすることによって決定した。これらの正確な細菌濃度を使用して各試験パネルのパネル内の各薬物についてのMBCを決定した。MBCを、細菌数を99.9%減少、細菌の元の濃度から3log降下させた薬物濃度として定義する。MICは、MICと、それに加えて右に縦行11までの全ウェルから10μL/ウェルのサンプリングを始め、寒天プレート上に、プレート当たり試料一つを置くために使用する目印である。寒天プレートを35℃で24時間インキュベートし、コロニーを計数した。得られたコロニーの数値を接種物の出発濃度と比較して、どのウェル、すなわちどの薬物濃度がcfu/mLで3logの降下をもたらしたかを決定した。
【０４０２】
96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、播種したウェルを35℃で20時間インキュベートした後に観察した。各横行には、横行それぞれに右から左に高濃度から低濃度までの範囲で薬物が存在し、各ウェルは左隣のウェルの1/2の濃度である。概して、しかし必ずしもそうとは限らないが、横行はナノエマルジョン、薬物Aを含有した。縦行内で上下しているのは薬物Bであり、これが、それぞれ、AからGまで高濃度から低濃度で組み合わせて試験する第2の薬物である。横行Hは、薬物Aの対照として機能させるために第2の薬物を含有しない。縦行1は、薬物Bの対照となることができるように、薬物Aをいくらも含有しない。伝統的に、横行の右から左までの一連で最初の透明のウェルをMICとみなした。これは、培地を濁らせる細菌の増殖を阻害した薬物の濃度であり、この場合は、MICを定義するための代謝活性を見出すためにalamar blueを使用したので、青色から淡紅色への色の変化によって示された。各ウェルにPromegaからのCellTiter Blueを20μL加えた。それは元の培養物の容量の20%である。
【０４０３】
各横行についてMICを有するウェル及びMBCを有するウェルを認めた。2種の薬物の組合せのMICが認められた全てのウェルを、それぞれ単独で作用している薬物A及び薬物BのMIC濃度と比較した。例えば、2μg/mLの薬物A及び8μg/mLの薬物Bを含有したウェルは、Aの濃度を組み合わせたときの1μg/mLを単独で作用しているときの16μg/mLで割る。これは0.125の比を与える。さらに本実施例では、8μg/mLの薬物Bを、Bが単独で作用している32μg/mLで割る。そこで薬物Bについての組合せ:単独の比は0.25である。本実施例では、FIC指数は、薬物Aについて0.125、薬物Bについて0.25であるといえ、本実施例では、合計0.325である。相乗効果は合計が0.5以下に対して定義される。不関は0.5より大きく4以下である。拮抗は4より大きい。例えば、詳しく図示している図9を参照されたい。
【０４０４】
G.時間-死滅試験
バークホルデリアNB 29 @ O.D. 0.14〜0.20の細菌懸濁液を用意した。T0、無処理の対照のために、生理食塩水チューブの中に生理食塩水500μL及び細菌懸濁液500μLを混合し、次いで、5mMのCaCl2を含んだTA(トリプトン-アゾレクチン)培地と1対1で混合して希釈し、下記の通りプレーティングした。処理チューブ中、細菌懸濁液を処理混合物(CPCが64μg/mLの2×P4075EC及び10mMのEDTA)に1対1で加え、10分後、20分後及び30分後の各時点で400μLを抜き取り、5mMのCaCl2を含んだTA培地400μLと混合した。次に、100μLを抜き取って、生理食塩水中、10-8まで段階的に1/10希釈した。次いで、その一連の各希釈チューブから100μLを抜き取り、3連でプレーティングした。これらのプレートを、35℃で一晩インキュベートし、計数して各時点におけるcfu/mLを決定した。その時点で、無処理の試料又は処理した細菌を同時に加えてTA溶液を中和し、それぞれの時点でグルタルアルデヒド113μLに試料450μLを加えた。
【０４０５】
H.走査型電子顕微鏡(SEM)
走査型電子顕微鏡(SEM)用に、Sorensonバッファー中グルタルアルデヒド10%水溶液113μL、pH7.4を細菌懸濁液450μLと混合し、ナノエマルジョンに曝露させた。混合物をボルテックスにかけ、4℃で少なくとも18時間置いた。表19は、試料を走査型電子顕微鏡用に固定し、染色する手順を提供する。
【表１９】
0005722782.tif 000036
【０４０６】
I.結果
a.MIC及びMBCのデータ
P4075ECについてのMIC90/MBC90値は、緑膿菌に対して8/64μg/ml、B.セノセパシアに対して64/>514μg/ml、A.バウマンニに対して8/64μg/ml、及びS.マルトフィリアに対して8/32μg/mlであった。コリスチンは、緑膿菌、B.セノセパシア、A.バウマンニ及びS.マルトフィリアに対して、それぞれ、2/8、>32/>32、1/>16及び>32/>32のMIC90/MBC90値を有した。セフェピム、イミペネム、レボフロキサシン及びトブラマイシンは、全ての株に対して、それぞれ、≧32/>32μg/ml、≧32/>32μg/ml、16/16μg/ml及び>32/>32μg/mlのMIC90/MBC90値を有した。
【０４０７】
b.相乗効果データ
10株のバークホルデリア、ステノトロホモナス及び10株のアシネトバクターを試験して、P4075EC+EDTAを、慢性肺感染症を治療するためにCF患者の肺に使用される二つの伝統的な抗微生物剤である、コリスチン又はトブラマイシンのいずれかと組み合わせたときのMICの変化を決定した。コリスチンと組み合わせたP4075EC+EDTAは、ステノトロホモナス株に関して90%(FICに関して)及び70% (FBCに関して)相乗的であるが、トブラマイシンと組み合わせたときは、FICで20%相乗的、FBCで0%相乗的なだけであり、不関であることがわかった。アシネトバクター株に対しては、コリスチンと組み合わせたP4075EC+EDTAは、FICで20%相乗的、FBCで0%相乗的なだけであり、同様にトブラマイシンと組み合わせたとき、FICで10%相乗的、FBCで10%相乗的なだけであり、不関であることがわかった。バークホルデリア株に対しては、コリスチンと組み合わせたP4075EC+EDTAは、FICで30%相乗的、FBCで10%相乗的なだけであり、不関であるが、トブラマイシンと組み合わせたとき、FICで50%相乗的、FBCで20%相乗的であることがわかった。
【０４０８】
c.時間-死滅試験
時間-死滅は、全体で、無処理の開始時から30分時点までで、cfu/mlで4.44logの減少という結果であった。10分時点それぞれは、以下の通り、1〜2logの減少を有した:無処理時点から10分時点までは1.40logの減少、10分時点から20分時点までは、1.91logの減少、及び20分時点から30分時点までは1.13logの減少であった。図20A〜20Dを参照されたい。
【表２０】
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【０４０９】
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【０４１０】
0005722782.tif 000039
【０４１１】
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【０４１２】
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【表２１】
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【表２２】
0005722782.tif 000043
【０４１３】
0005722782.tif 000044
【表２３】
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【０４１４】
0005722782.tif 000046
【表２４】
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【０４１５】
0005722782.tif 000048
【０４１６】
J.結論
本実施例は、試験したP4075ECなどのナノエマルジョンが、バークホルデリア及びステノトロホモナスのコリスチン耐性分離株を含めた、多剤耐性株に対して有効であることを実証している。記載のシュードモナス種におけるリピドA修飾体はいずれもP4075ECによってMIC/MBCに影響がなかった。2種の主要な抗生物質であるコリスチン及びトブラマイシンによる拮抗の証拠は観察されず、ステノトロホモナスの場合、相乗効果が明らかであった。このことは、CF患者の治療について、その治療プログラムを複雑にしている、ナノエマルジョンを使用するために通常の抗生物質レジメンを一時停止する必要がないはずなので、有用である。SEM画像は、この場合では、丈夫な外膜を有するという評判を持つグラム陰性細菌の、接触機構での死滅を実証している。
【実施例９】
【０４１７】
局所用ナノエマルジョン療法により、熱傷損傷後の細菌性創傷感染症及び炎症が減少する
材料と方法
試薬。特に断りがなければ、全ての試薬は、Sigma-Aldrich Corp.(St. Louis、MO)から購入した。
【０４１８】
動物。雄性の特定病原体をもたないSprague-Dawleyラット(Harlan、Indianapolis、IN)、体重およそ250〜300gを全ての実験で使用した。ラットは標準ケージに収容し、実験に使用する前に7日間、周囲に順応させた。ラットを12時間の明サイクルに保ち、試験の間中、標準のラット用飼料及び水を制限なく利用させた。実験は、National Institutes of Health guidelines for care and use of animalsに従って行った。University of Michigan Animal Care and Use Committeeから実験プロトコールの承認を得た。
【０４１９】
熱傷モデル。動物を、40mg/kgのペントバルビタールナトリウム(Nembutal; Abbott Laboratories、North Chicago、IL)を腹腔内(ip)注射して麻酔した。背面の毛を、Nair脱毛クリーム(Church & Dwight Inc.、Princeton、NJ)を使用してしっかり刈り取り、除去して完璧且つ均一に毛衣を除去した。各ラットを、総体表面積の20%を超える背面領域が露出する、隔離された特別注文の型に置いた。Meeh's formula:体表面積(cm2)=9.46×(動物の体重(g))2/3(Gilpin, Burns 22(8):607-611, 1996を参照されたい)を使用して、総体表面積の一部分として熱傷面積を決定した。ラットの露出した皮膚を60℃のウォーターバスに27秒置くことにより、中間層熱湯損傷を実現した。偽の熱傷動物は、室温の水(21〜24℃)に浸漬したことを除いて同じ処置を受けさせた。熱傷創傷を乾燥した滅菌ガーゼで消毒、切除し、0.9%の滅菌でNaClすすいだ。各動物を、乳酸リンゲル液4mL/%熱傷総体表面積/体重kgを用いて蘇生させた。熱傷損傷の直後に、この流体容量の半分を腹腔内、半分を皮下に与えた。熱傷で損傷した皮膚を覆わずに風乾した。乾燥させた後、創傷の汚染を防ぐために滅菌TELFA(Kendall Co.、Tyco Healthcare Group LP、Mansfield、MA)及びTEGADERM HP(3M Health Care、St Paul、MN)の密封包帯を適用した。実験の間、各ラットを単独で収容し、熱傷後の痛みを制御するために、熱傷時及び16時間の時点で0.01mg/kgのブプレノルフィンを皮下に受けさせた。
【０４２０】
局所創傷治療。貯蔵ナノエマルジョンW205GBA2EDを、NanoBio Corporation(Ann Arbor、MI)から入手した。このナノエマルジョンは、超精製(super-refined)大豆油と水を本明細書に記載の界面活性剤及びアルコールを用いて乳化させることにより製造された。生じた液滴は、350nmの平均粒子直径を有した。実験溶液は、60%貯蔵製剤1mLを滅菌生理食塩水4.88mLで希釈し、1Mのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)120μLを加えて最終濃度を10%のW205GBA2ED及び20mMのEDTAにすることによって作製した。プラセボナノエマルジョン(W205GBA2EDプラセボ)化合物を、W205GBA2EDと同様に製造したが、製剤から塩化ベンザルコニウムを取り除いた。5%のSulfamylon(UDL Laboratories, Inc.、Rockford、IL)溶液を、酢酸マフェニド粉末50gを0.9%の滅菌生理食塩水1L中に混合することによって調剤した。使用した対照試薬は、0.9%の滅菌生理食塩水であった。実験群は、偽、熱傷、熱傷+W205GBA2ED、熱傷+細菌+生理食塩水、熱傷+細菌+プラセボ、熱傷+細菌+W205GBA2ED、及び熱傷+細菌+Sulfamylonからなった。熱傷損傷の16時間後に、動物を吸入イソフルランで麻酔した。密封包帯及びTELFAを除去した。ナノエマルジョン(W205GBA2ED)、プラセボ、Sulfamylon又は滅菌生理食塩水を、噴霧ボトルを使用して熱傷創傷表面に均一に適用した。偽群又は熱傷群の動物には、局所的な処置を受けさせなかったが、麻酔下で包帯材を交換した。次いで、熱傷創傷をTELFA及びTEGADERMの密封包帯で再度包帯した。この処置及び包帯材の交換を、熱傷損傷の24時間後に繰り返した。
【０４２１】
細菌培養及び接種。ヒト熱傷患者から分離した緑膿菌はDepartment of Pathology at the University of Michiganによって以前提供された。この細菌分離株は、局所用薬剤であるSilvadene及びSulfamylonに感受性である。細菌接種物を、Trypticase soy培地(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)40mL中の一定分量(0.5mL、50%脱脂粉乳中-80℃で貯蔵)を解凍し、275rpmで絶え間なく振とうしながら37℃で一晩、増殖させることによって調製した。生じた静止期の培養物の試料を新鮮なTrypticase soy培地35mLに移し、対数増殖期に達するまで2.5時間インキュベートした。この二次培養物を、50mLの円錐形のポリスチレンチューブに移し、4℃、880gで10分間遠心分離した。細菌ペレットを、0.9%の滅菌生理食塩水で洗浄し、氷冷生理食塩水10mL中に再懸濁させた。懸濁物の光学濃度を620nmで測定し、式OD620×2.5×108を用いて細菌濃度(コロニー形成単位(CFU)/mL)を算出した。細菌懸濁液を、0.9%の滅菌生理食塩水で希釈して最終濃度を100μL当たり1×106CFUにした。熱傷損傷の8時間後、動物を、吸入イソフルランを用いて麻酔した。次いで、ラットに、滅菌生理食塩水100μL中1×106CFUの対数増殖期の緑膿菌を、一切れのTELFAにピペットで均一に移し、その後TEGADERM密封包帯で覆って局所的に適用した。
【０４２２】
組織の回収。熱損傷の32時間後、動物を屠殺し、滅菌法を使用して皮膚組織試料を回収した。皮膚試料をすぐに使用するか、液体窒素中で凍結させた。
【０４２３】
細菌性創傷感染症の定量化。切除した皮膚組織の100mgの小片を、1mLの0.9NaCl中で機械的にホモジナイズした。次いで、このホモジネートを、滅菌生理食塩水9mLを用いてさらに希釈した。段階希釈を行い、皮膚のホモジネートを、血液寒天プレート(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)上に3連でプレーティングした。培養プレートを、37℃で24時間インキュベートし、CFUを計数した。
【０４２４】
皮膚のサイトカインの分析(ELISA)。背面皮膚試料100mgを、50mLのPBS及びプロテアーゼ阻害剤(Complete X、Roche、Indianapolis、IN)及び50μLのTriton X(Roche)からなる氷冷溶解バッファー1mL中でホモジナイズした。ホモジネートを、3000gで5分間遠心分離し、上清を採取し、使用するまで-80℃で凍結貯蔵した。ラットのILl-β、IL-6、TNF-α、CINC-1、CINC-3、IL-10及びTGF-βを、抗体及び試薬を使用したR&D Systems, Inc. (Minneapolis、MN)からのサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって測定した。96ウェルマイクロプレート(Immunoplate Maxisorb、Nunc、Neptune、NJ)において、キットの説明書に従ってアッセイを行い、マイクロプレートリーダー(Biotek Instruments、Winooski、VT)を使用し、540nmにおける波長補正を伴って450nmにおいて試料を読み取った。プレートリーダーソフトウェア及び7点検量線を使用してサイトカインの濃度を決定した。結果を、先の希釈に対して調整し、pg/mLで表した。
【０４２５】
好中球分画の検出(ミエロペルオキシダーゼアッセイ)。皮膚組織100mgを115mMのリン酸二水素カリウムからなる氷冷リン酸カリウムバッファー(Sigma Aldrich、Milwaukee、WI)1mL中で機械的にホモジナイズした。ホモジネートを、4℃、3000gで10分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを、リン酸水素二カリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム及び酢酸からなるC-TABバッファー(Sigma Aldrich、Milwaukee、WI)1mL中に再懸濁させた。懸濁液を氷上で40秒間、超音波処理した(Branson Sonifier 250、Danbury、CT)。ホモジネートを、4℃、3000gで10分間遠心分離し、上清を採取した。上清を、60℃のウォーターバス中で2時間インキュベートした(Shaker Bath, 2568; Forma Scientific、Marietta、OH)。試料を、必要になるまで-80℃で貯蔵した、又はすぐにアッセイした。
【０４２６】
20μLの標準物質(Calbiochem、Gibbstown、NJ)又は試料を96ウェル免疫吸着マイクロプレート(NUNC、Rochester、NY)に加え、その後、115mMのリン酸カリウムバッファー中3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン/N,N-ジメチルホルムアミドからなる、20mMのTMB/DMF(Fischer Scientific、Pittsburgh、PA)を各ウェルに155μL加えた。試料をよく混合した後、3mMのH2O2を20μL、各ウェルに素早く加えた。0.061mg/mLのカタラーゼ(Roche、Indianapolis、IN)を50μL/wellで加えることによってすぐに反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを使用して620nmにおいてプレートを読み取った。線形検量線を使用してミエロペルオキシダーゼ(MPO)の濃度を算出し、先の希釈に対して調整した。最終濃度をμg/mLで表した。
【０４２７】
皮膚の毛細血管の漏出及び組織水腫の決定(エバンスブルー)。動物を、組織を回収する前に90分間麻酔した。50mg/体重kgの10%エバンスブルー(Merck KgaA、Darmstadt、Germany)を、熱損傷の30.5時間後の時点で、熱傷の動物にip注射した。組織を回収した時点で、動物を、下大静脈を切開することによって失血させた。20Gの血管カテーテルを、大動脈弁を過ぎて左心室の尖部内に、及び上行大動脈内に挿入することによって全身性のエバンスブルーを洗い流した。脈管構造に流すために全部で血液の容量(7.46mL/体重100g)の4倍の、100ユニット/mLのヘパリンを含んだ0.9 NaClを使用し、灌流ポンプによって一定の流量で投与した。灌流期間の最後までに、右心房からの流出液は透明に変わった。背面皮膚試料を回収し、試料100mgを、ポリエチレンチューブ中、99.5%のホルムアミド4mLの中に置いた。チューブを、エバンスブルー抽出のために、室温で48時間、振とう機上に置いた。上清を採取し、マイクロプレートリーダーで、620nmにおける吸光度を読み取った。ホルムアミド検量線におけるエバンスブルーから濃度を算出した。結果を、皮膚組織ミリグラム当たりのエバンスブルーのマイクログラムで表した。
【０４２８】
組織学的検査。皮膚試料を、10%の緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。8μmの厚い切片をスライドガラスに貼り付け、脱パラフィンし、ヘマトキシリン及びエオシンを用いて染色して形態学的な変化を評価した。
【０４２９】
毛包細胞のアポトーシスの検出(TUNELアッセイ)。動物を、麻酔し、20%の中間層熱湯傷創傷又は偽の損傷を生じさせた。処置群は、偽、熱傷+生理食塩水、熱傷+プラセボ、及び熱傷+W205GBA2EDからなった。熱傷の0時間後及び8時間後に処置及び包帯の交換を行った。この実験では細菌を感染させなかった。毛包細胞のアポトーシスを決定するために、熱損傷の12時間後及び24時間後に、熱傷損傷全体を横切って三つの部位から全層皮膚試料を取った。時間試料当たり処置群当たり動物4体であった。
【０４３０】
アポトーシスを、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイ(ApopTag、CHEMICON International, Inc、Temecula、CA)を使用したDNA鎖切断のフルオレセインベースの標識を用いてin situで検出した。各動物について、三つの新鮮な皮膚試料を、最適な切断温度を有する化合物で満たした使い捨てのビニール製cryomold(Sakura Finetek, U.S.A., Inc.、Torrance、CA)の中に置き、使用する準備ができるまで-80℃で凍結させる。凍結した包埋皮膚検体を、クリオスタットで4mmの厚さの連続した切片に切断し、Superfrost Plusスライドガラス(Fisher Scientific、Pittsburgh、PN)上に採取した。間接的な免疫蛍光検査のために、製造者の説明書に従って、切片をPBS中1%パラホルムアルデヒド中、4℃で一晩固定した。PBSで2回洗浄した後、切片をエタノール:酢酸の2:1溶液中、-20℃で5分間、後固定した。PBSでさらに2回洗浄した後、切片を平衡バッファーで5分間インキュベートした。次いで、切片を、加湿チャンバー内、37℃で1時間、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素と一緒にインキュベートした。停止/洗浄バッファーで切片をすすぐことによって反応を終了させた。切片を、加湿チャンバー内、室温で30分間、抗ジゴキシゲニンフルオレセイン(フルオレセインイソチオシアネート、FITC)と一緒にインキュベートし、PBSで3回すすいだ。吸引した後、切片を水で1回洗浄し、ProLong Gold Antifade(Molecular Probes, Inc、Eugene、OR)を使用してカバーガラスを適用し、これには4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)対比染色を含めた。
【０４３１】
TUNELアッセイのスライドガラスを群について目隠しし、顕微鏡の下、無作為に選出した高倍率視野で適切な毛包細胞を同定した。分析に適した毛包は、正中矢状面又は正中冠状面に切片化されるものであった。スライドガラスに存在する三つの皮膚試料の中から全部で3〜6の毛包を選択した。蛍光の退色を制御するために、Olympus BX-51蛍光顕微鏡を固定画像取込み設定及び40×倍率で使用して、蛍光標識したTUNELスライドガラスを標識後の同じ時間にデジタル処理で取り込んだ。各毛包を、選択し、まず、DAPI励起/放射チャネルを使用して、存在する対比染色された核を視覚化することによってデジタル処理で取り込んだ。次いで、分析される各毛包について、励起/フィルタチャネルを変更して、フルオレセイン標識されたTUNEL陽性細胞を視覚化し、画像を再度デジタル処理で取り込んだ。取り込まれた画像の中に、対照の領域(ROI)をデジタル処理で定義し、毛包細胞のみを含んで、明るい蛍光を発する毛幹及び周囲の細胞を排除するように設定した(NIH Image J software、NIH、Bethesda、Md)。TUNEL陽性細胞の蛍光を定量化し、ROIサイズに規格化し、ROIサイズの差異を調節してピクセル/領域区画として表した。
【０４３２】
統計的方法。GraphPad Prism 5.0 software(GraphPad Software、La Jolla、CA)を使用して統計分析及びグラフ化を行った。特に断りのない限り、結果は平均値±SEMで示した。対応のない両側スチューデントのt検定及び/又は一元配置ANOVA、その後チューキーの事後比較を使用して連続変数を分析した。ダンの多重比較を用いたクラスカル・ワリス検定を使用して、ノンパラメトリック分布を持つデータに対する中央値の差異を評価した。フィッシャー正確確率検定を使用して離散変数を比較した。統計的有意性は、p値<0.05と定義した。
【０４３３】
ナノエマルジョンを局所適用することにより、熱傷創傷における緑膿菌の増殖が減少する
ナノエマルジョンで処置した動物は、生理食塩水で処置した対照と比較して、皮膚組織のグラム当たりの細菌CFUの平均値(6.5×104対7.9×107、p=0.07)及び中央値(0対4.4×106、p<0.05)の数値が減少した(図21参照)。W205GBA2EDで処置した動物対W205GBA2EDプラセボで処理した動物について、皮膚の細菌数に同様の減少が見られた(平均値:6.5×104対5.5×106、p=0.02)。臨床組織試料に対して定量的な創傷培養を行う場合、一般に、組織グラム当たり、生物がCFUで1×105超増殖することを陽性の結果とみなす(例えば、Neal et al., J Burn Care Rehabil 2:35-39, 1981;Taddonio et al., Burns Incl Therm Inj 14(3): 180-184, 1988; Uppal et al., Burns 33(4):460-463, 2007を参照されたい)。これらの基準を使用して、対照群の32体の動物のうち29体が定量的な創傷培養の陽性の証拠を示し、ナノエマルジョン群の23体の動物のうち3体のみがこのレベルの創傷感染症の証明を実証した(91%対13%、p<0.0001、以下の表24を参照されたい)。Sulfamylonで処理した動物でも、生理食塩水対照と比較して、創傷の細菌レベルの中央値の有意な減少が実証された(3×104対4.4×106、p<0.05)。ナノエマルジョン又はSulfamylonを用いた処置によって、生理食塩で処置した動物と比較して、熱傷創傷から培養したシュードモナスのレベルに同様の減少が生じた。しかし、プラセボ群とSulfamylon群の間に統計的有意差はなかったのに対して、W205GBA2EDプラセボと比較したW205GBA2ED群については差異があった。
【表２５】
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【０４３４】
熱傷損傷後にナノエマルジョンで処置することにより、皮膚の炎症性サイトカインレベルが減衰する
中間層の熱傷をもたらす熱湯損傷により、偽の損傷動物と比較して、損傷の32時間後に得た皮膚のホモジネート中の皮膚のIL-Iβ及びサイトカイン誘導性好中球化学誘引物質-3(CINC-3)のレベルに差異が生じた(図22A及びE参照)。熱傷の16時間後及び24時間後にW205GBA2EDを用いて処置すると、細菌感染の非存在下で、皮膚のこれらの2種の炎症性メディエーターのレベルが減少して基線(偽)まで戻った。細菌の創傷感染を発生させなかった実験では、熱傷を受けた皮膚においてラットCXCケモカインCINC-3が上昇したにもかかわらず、ミエロペルオキシダーゼアッセイによって測定された好中球分画における差異は観察されなかった。これらの三つの群全て(偽、熱傷、及び熱傷+W205GBA2ED)でCINC-1について差異が見られたが(p=0.04、ANOVA)、群間比較の値は統計的有意に達しなかった。
【０４３５】
緑膿菌の熱傷創感染後にナノエマルジョン処置することにより、皮膚のサイトカインレベルが減衰し、好中球分画が減少した
ナノエマルジョンで処置した群からの皮膚のホモジネートは、IL-Iβ及びIL-6のレベルは、生理食塩水で処置した動物において測定されたレベルと比較して大幅に縮小した(図23A及びB参照)。動物の二つの実験群間で、TNF-αレベルに統計的有意差は見られなかった(図22C及びD参照)。感染した熱傷創傷を、Sulfamylonを用いて処置すると、対照と比較して、測定された炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6、TNF-α、CINC-1又はCINC-3)の皮膚レベルにどんな有意な変化ももたらされなかった。W205GBA2ED又はSulfamylonいずれかを用いた治療によって、感染した熱傷創傷において損傷の32時間後に見られたミエロペルオキシダーゼのレベルが減少した。したがって、一部の実施形態では、ナノエマルジョン及び/又は抗微生物剤を用いた処置により、中間層熱傷創傷への好中球分画が減少する。
【０４３６】
熱傷損傷により、偽の損傷動物と比較して、抗炎症性サイトカインであるTGF-βのレベルの上昇が引き起こされるが、IL-IOのレベルの上昇は引き起こされない(図24参照)。W205GBA2ED処置により、感染した熱傷創傷に存在するTGF-βの量は、熱傷創傷単独で見られるレベルと比較して減少する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、W205GBA2EDが、急性の熱傷創傷性皮膚炎を減少させるために利用することができること、別の実施形態では、熱損傷によって発生する最終的な免疫抑制を減少させるために利用することができることを提供する。
【０４３７】
生理食塩水対照動物からの皮膚の組織学的試験において、表皮の大部分の喪失及び表皮下部へのびまん性の細胞浸潤があり、コラーゲン原線維が浸潤性白血球及び水腫液によって分離された下皮の結合組織に及ぶ(図25A参照)。力が強いと、コラーゲンの束間の細胞浸潤のほぼ全体が好中球からなる。水腫液によってコラーゲン原線維が分離される。図25Bでは、皮膚を熱損傷させた後、緑膿菌を適用し、その後、熱傷部位にナノエマルジョンを局所適用した。表皮のケラチン層が分離し、ケラチンの一部は喪失している。縦方向に薄片に切った細静脈の壁に接着している好中球と共に、皮内に検出可能な好中球の存在は殆どない(顕微鏡写真の中央)。この顕微鏡写真における変化は、図25Aにおいて見られる変化よりも実質的に範囲が狭い。
【０４３８】
毛細管漏出及び組織水腫の定量化
熱傷創傷は、著しいレベルの毛細管漏出に関連する。これは血管内容積の枯渇及び静脈内への大量の晶質液投与の必要性につながる。ナノエマルジョンを用いた処置により、炎症が減少すると同時に毛細管漏出が減少するかどうかを評価するために、エバンスブルーアッセイを利用して血管透過性を測定した。血流から浸出し皮膚組織内に浸出するこの色素の量を定量的に測定することにより、ナノエマルジョンで処置した動物が、生理食塩水で処置した対照よりも少ない、熱傷後の毛細管漏出及び組織水腫の証拠を有したことが明らかになった(図26参照)。
【０４３９】
ナノエマルジョンを用いた処置により、熱傷誘導性毛包アポトーシスが減少する
熱損傷の後、毛包細胞において皮膚のアポトーシスが起こる。蛍光標識TUNELアッセイを使用すると、生理食塩水で処置した熱傷創傷は、緑色に見える強いFITC-TUNEL陽性細胞の証拠を示した(図27参照)。DAPI核染色により、青色に染色された細胞を持つ、冠状又は矢状の薄片に切った毛包を同定することが可能になる。FITC-TUNEL陽性細胞は緑色に見え、アポトーシス細胞を表している。合成した画像では、アポトーシス毛包細胞は、熱傷+生理食塩水動物からのスライドガラスにおいて明らかであり、これらの変化は、熱傷+W205GBA2EDで処理した動物では縮小する。対象の毛包部内のTUNEL陽性細胞のピクセルを計数することにより、局所用ナノエマルジョンを用いた処置による毛包細胞のアポトーシスの減少を定量化することが可能になる(図28参照)。生理食塩水で処置した対照動物では、偽の熱傷動物と比較してTUNEL陽性細胞の量が増加した。W205GBA2ED処置及びプラセボ処置ではどちらも、熱損傷の12時間後に回収した組織において、中間層熱傷損傷後の毛包細胞のアポトーシスの減少がもたらされた。この差異は、熱傷の24時間後に試料採取された皮膚においては明らかでなかった。したがって、一部の実施形態では、本発明は、熱傷後の早期の毛包におけるアポトーシスによる細胞死を減少させる方法であって、熱傷後の早期にナノエマルジョン(例えば、W205GBA2ED)を熱傷創傷に投与することを含む方法を提供する。
【実施例１０】
【０４４０】
ナノエマルジョン及びバークホルデリア免疫原を含む免疫原性組成物及び対象においてバークホルデリア種に対する防御免疫を誘導する方法
材料と方法
B.セノセパシア株K56-2の貯蔵維持及び培養。バークホルデリア・セノセパシア株K56-2は、Dr. Pam Sokol(University of Calgary)から豊富に提供された。K56-2は、臨床分離株であり、バークホルデリアの分子微生物学及びゲノム研究に使用されている(例えば、Goldberg, 2007 Burkholderia Molecular Microbiology and Genomics. Gent, Belgium: Taylor & Francisを参照されたい)。これは伝染性且つ悪性のB.セノセパシアETl 2系統の代表である(例えば、Johnson et al., 1994, J Clin Microbiol 32, 924-930; Saijan et al., 2008, Infect Immun 76, 5447-5455を参照されたい)。株間の中和アッセイのために、バークホルデリア・マルチボランス、ATCC 17616を使用した。K56-2株及びATCC 17616株をどちらも、15%グリセロールを含んだルリア・ベルターニ培地中、-80℃で貯蔵し、凍結貯蔵物からブレインハートインフュージョン寒天上に回収し、37℃で一晩置いた。
【０４４１】
B.セノセパシア外膜タンパク質(OMP)の調製。K56-2のブレインハートインフュージョン培地での一晩培養物を、3500rpmで20分間遠心分離した。細胞ペレットを、PBS(pH7.4)で数回洗浄し、PBS(pH8.0)中1mMのEDTA中に再懸濁させ、次いで、室温で30分間インキュベートした。インキュベート後、高圧を使用して細菌を26ゲージの針(Becton Dickinson)を数回通過させた。Triton X-100(Sigma)を最終濃度2%まで加え、室温で10分間インキュベートして細胞を溶解した。複数回超音波処理して(各1分間)機械的な分離を行った。次いで、超音波処理した溶解物を、6000×gで10分間、2回遠心分離し(Beckman Optima XL-1OOk超遠心機、25℃)、各回転後、上清を保持した。2回目の遠心分離の後、上清を4℃、100,000×gで1時間遠心分離した。得られたペレットを、エンドトキシンを含まないPBS中に再懸濁させた。粗OMP調製物を、エンドトキシン除去カラム(Pierce)を製造者の説明書に従って用いて精製した(エンドトキシン枯渇OMP)。フロースルー画分を、使用するまで-80℃で貯蔵した。
【０４４２】
OMPの分析。OMP調製物中に含有されるタンパク質を、BCAアッセイ(Pierce)を使用して定量化した。以前に記載されている確立されたプロトコールに従って、ウェスタンブロット及び銀染色を行った(例えば、Makidon et al., 2008, PLoS ONE 3, e2954を参照されたい)。エンドトキシンの混入を定量化するために、LAL Kinetic-QCL(Lonza)を使用してOMPを分析した。エンドトキシン枯渇OMP調製物において、1.93エンドトキシン単位/mgのエンドトキシンが検出された。DNA混入物の除去を、アガロース-EtBrゲル電気泳動によって検証し、UV表に画像処理した(図29A参照)。オリゴヌクレオチド混入物は、粗製OMP又はエンドトキシン枯渇OMP調製物のいずれにおいても検出されなかった。
【０４４３】
OMPの配列決定及び検証。
【０４４４】
試料の調製。SDS-PAGEによってタンパク質試料を分離した(図29B参照)。ウェスタンブロットにおいて高強度(約17KDa)で免疫染色されたタンパク質バンド(図29C参照)を切除し、ゲル内消化に供した。ゲル内消化は、Protein Structure Facility at the University of Michiganにおいて、Rosenfeldら及びHellmanらによる手順に従って行った。例えば、Hellman et al., 1995, Analytical Biochemistry 224, 451-455; Rosenfeld et al., 1992, Analytical Biochemistry 203, 173-179)を参照されたい。5pmolのウシ血清アルブミン(BSA)を含有するゲルのスライスを、陽性対照として同時に分析した。
【０４４５】
質量分析。HPLC-エレクトロスプレーイオン化(ESI)タンデム質量分析(MS/MS)を、ナノスプレー源(Waters Inc.)を備えたQ-tof premier質量分析計(Waters Inc)で行った。質量分析計は、質量精度3ppm以内に較正した。Atlantis Cl 8カラム(Waters、内径100mm、長さ100mm、粒子サイズ3mm)を用いたWaters UPLC systemを使用してオンラインのキャピラリーHPLCを行った。消化物を、Atlantisカラムにローディングする前にオンラインのトラップカラム(Waters、Symmetry C18、内径180mm、長さ20mm、粒子サイズ5mm)を使用して脱塩した。データ依存性タンデム質量分析の手法を利用して、フルスキャンスペクトル(検索スキャン)を使用してペプチドを同定し、その後、ピーク強度が1秒当たり20カウントより高くなる検索スキャンにおける全てのイオンの衝突解離(CID)質量スペクトルを同定した。検索スキャンは、ロックマス補正(Gu-フィブリノペプチドB、(M+H)2+:785.8426)及び荷電状態のピーク選択(2+、3+及び4+)を用いた、質量範囲が50〜2000Daを超えるV+モードにおいて取得した。MS/MSスキャンは、荷電状態の認識による衝突エネルギー制御を用いて5秒間取得した。
【０４４６】
データ分析及びバイオインフォマティクス。Mass Lynxソフトウェア(Version 4.1)を使用してタンデム質量スペクトルを取得した。未加工のデータファイルを、まず、Protein Lynx Global ServerソフトウェアVer. 4.25(Waters Inc.)を使用して、ロックマス補正、ノイズ低減、センタリング、及び脱アイソトープのために処理した。生成した、フラグメント質量スペクトルを含有するピークリストファイルを、Protein LynxGlobal Server and Mascot (Matrix Science Inc.、Boston、MA)検索エンジン及びSwiss Protデータベース及びNCBIデータベース、並びにSanger Instituteのウェブサイトからダウンロードしたバークホルデリア・セノセパシアのデータベースを使用したデータベース検索に供した。
【０４４７】
ナノエマルジョンベースのOMP(OMP-NE)ワクチンの調製。ナノエマルジョン(W805EC: 5vol.%のTWEEN 80、8vol.%のエタノール、1vol.%のCPC、64vol.%の大豆油)及び22vol.%のDiH2O)が、NanoBio Corporation(Ann Arbor、MI)によって提供され、液滴の粒子直径が200〜400nmであった。PBSを希釈剤として使用し、エンドトキシン枯渇OMP調製物(図29BレーンF参照)と濃縮NEを勢いよく混合することによってOMP-NE製剤を調製した。鼻腔内免疫化のために、OMP-NEを、0.25μg/μL又は0.75μg/μLのいずれかのOMPを20%(v/v)のNEに混合して含有するように調剤した。
【０４４８】
動物及び免疫化の手順。病原体をもたない、非近交系CD-1マウス(雌性、6〜8週齢)をCharles River Laboratoriesから購入した。マウスはAmerican Association for Accreditation of Laboratory Animal Careの基準に従って収容した。これらのマウスを使用することは、University of Michigan University Committee on Use and Care of Animals(UCUCA)に承認された。マウス(群当たりn=10)に、どちらかのOMP-NEワクチンを4週間間隔で2回投与してワクチン接種した。IMPAC6麻酔送達系を使用してイソフルランで麻酔したマウスにおいて鼻腔内(i.n.)免疫化を行った。麻酔した動物を仰臥位に保持し、マイクロピペットの先端を使用して20μL(10μL/鼻腔)のOMP-NEワクチンを鼻腔にゆっくりと投与した。マウスを、NEを含んだOMPを15μg、PBS中OMPを15μg、NEを含んだOMPを5μg、又はPBS中OMPを5μgのいずれかを用いて免疫化した。
【０４４９】
静脈切開、気管支肺胞洗浄、及び脾細胞の採取。研究の期間を通して、21日毎に伏在静脈から血液を採取した。安楽死の直後に心臓穿刺によって最終試料を得た。凝固の後、3500rpmで遠心分離(15分間)することによって全血試料を分離した。血清試料を、分析するまで-20℃で貯蔵した。記載の通り、マウスから、安楽死させた直後に気管支肺胞洗浄(BAL)液を得た(Makidon et al.、2008、PLoS ONE 3、e2954を参照されたい)。サイトカイン応答のin vitroにおける測定値をワクチン接種したマウスの脾臓を使用して決定した。脾臓を機械的に破壊して単細胞の脾細胞のPBS中懸濁液を得た。赤血球をACKバッファー(150mMのNH4Cl、10mMのKHCO3、0.1mMのNa2EDTA)を用いて溶解し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄することによって除去した。次いで、脾細胞を、2%のFBS、200nMのL-グルタミン、及びペニシリン/ストレプトマイシン(100U/mL及び100mg/mL)を補充したRPMI 1640培地中に再懸濁させた。
【０４５０】
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)。血清IgG及び粘膜分泌性IgA(sIgA)について、ELISAによってエンドトキシン枯渇OMPと対照して決定した。OMPをコーティングバッファー(Sigma)中15μg/mLに調製し、100μLを、Polysorbプレート(Nunc)の各ウェルに適用し、4℃で一晩インキュベートした。血清を0.1%のBSA/PBSで段階希釈した。次いで、希釈した血清又は無希釈のBALのいずれかをプレートに加え、4℃で一晩インキュベートした。16時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗マウスIgG(H&L)抗体、IgG1抗体、IgG2a抗体、IgG2b抗体、sIgA抗体(鎖特異的な)(Rockland Immunochemicals, Inc)を、0.1%のBSA/PBS中、1:2000又は1:1000で加えた。プレートをOD405において読み取り、無処置の動物のレベルに基づいて滴定を終了した。sIgAのレベルを全タンパク質含有量に対して標準化した。
【０４５１】
血清IgGによって認識される抗原の分析。ウェスタンブロット分析に加えて、ELISAを使用して、血清中の、血清リポタンパク質特異的なIgG抗体及びリポ多糖特異的なIgG抗体を測定した。簡単に述べると、96ウェルのPolysorbアッセイプレート(Nunc)を0.05μg/ウェルの粗製OMP調製物、エンドトキシン枯渇OMP、又はLPS(List Biological Laboratories)でコーティングした。最初にワクチン接種した8週間後にOMP+NEを用いて免疫化したマウスから血清を採取した。血清を0.1%のBSA/PBSで段階希釈し、次いで、コーティングしたウェルに加えた。ELISAの手順を上記の通り行った。OMPベースのワクチン中に含有されるタンパク質及びLPSの免疫原性的寄与を評価するために、粗製OMP調製物又はエンドトキシン枯渇OMP調製物のいずれか100μl中、250μgのPCRグレード組換えプロテイナーゼK(Roche)を使用して酵素的なタンパク質消化を行った。プロテイナーゼKを、OMP調製物と一緒に室温で16時間インキュベートした。銀染色SDS-PAGEを使用してタンパク質の消化を検証した。LPS特異的及びOMPタンパク質特異的なエピトープを、PBS中のOMP-NE若しくはOMPのいずれかを用いてワクチン接種したマウスからの血清を用いて探索する、又は抗鼻疽菌LPS抗体(GeneTex)を用いて探索するウェスタンブロット分析を使用して評価した。
【０４５２】
サイトカインの発現の分析。新しく単離したマウスのマウス脾細胞を、細胞4×106個/mL(RPMI 1640、2%のFBS)で24ウェルプレートに播種し、OMP(15μg/mL)と一緒に、又は対照としてPHA-Pマイトジェン(2g/mL)と一緒に、72時間インキュベートした。細胞培養物の上清を採取し、LUMINEX多分析物プロファイリングビーズ(LUMINEX Corporation、Austin、TX)を製造者の説明書に従って使用して、サイトカインの存在について分析した。
【０４５３】
血清抗体の中和の測定。B.セノセパシア株、K56-2及びB.マルチボランス、ATCC17616の抗体-補体中和活性を、最初のi.n.ワクチン接種の6週間後にマウスから回収した血清を使用してアッセイした。血清(1×、2×、3×、4×、又は5×に段階希釈した)25μLを、マイクロ培養プレート(Nunc)中、MH培地を補充した、1×103個のK56-2又はB.マルチボランスを含有する溶液25μLに加えた。プレートを、37℃で48時間インキュベートした。対照は、25μLの滅菌1×PBS、及び1×103個の細菌を含有するMH培地50μLを含んだ血清25μLを含んだ。インキュベートした後、ウェルを混合し、溶液10μLを、ポリスチレン培養プレート(Fisherbrand)上のバークホルデリア選択寒天(BCSA)培地(Henry et al., 1997, J Clin Microbiol 35, 614-619を参照されたい)にプレーティングし、次いで、手動でコロニー形成単位(cfu)を数え挙げる前に、37℃で72時間インキュベートした。
【０４５４】
肺への細菌の攻撃。最初にワクチン接種した10週間後の免疫化したマウス(群あたりn=5)又はワクチン接種していない対照マウス(n=10)において、記載のセパシア菌の感染症の慢性の肺性のモデル(Bertot et al., 2007, Infect Immun 75, 2740-2752;Chu et al., 2002 Infect Immun 70, 2715-2720;Chu et al., 2004, Infect Immun 72, 6142-6147を参照されたい)の改変版を使用して細菌の攻撃試験を行った。簡単に述べると、麻酔したマウスの主気管支の分岐に及ぶ経気管カテーテルを通して、85μLのPBSに懸濁させた5×107個のK56-2を点滴注入した。マウスを、6日間維持した。攻撃試験の前に、非侵襲的に皮下体温を測定するために、マウスに、手持ち型の携帯スキャナ(DAS-6002、Bio Medic Data Systems, Inc.)を備えたプログラム可能な体温トランスポンダ(IPTT-3000、Bio Medic Data Systems, Inc.)を非外科的に移植した。生存中の分析は、以下の測定基準:体重、体温、摂餌量、及び活動性を評価することによって各動物の臨床状態をモニタリングすることを含んだ。安楽死させた直後、肺組織及び脾臓を滅菌条件下で採取し、各器官を1mLの1×PBS(Mediatec Inc)を含有する個々の容器内に置いた。次いで、組織を、Tissue TEAROR(Biospec Products Inc.)を使用し、氷上で50秒間ホモジナイズした。ホモジネートの段階希釈物(1:102〜1:108)を、別々のBCSAプレート上に播種した。次いで、手動でcfuを数える前に、全てのプレートを37℃で72時間インキュベートした。安楽死させた直後に、全血を、EDTA(BD)を含有するチューブに採取した。全末梢リンパ球及び単核リンパ球を決定するために、Animal Diagnostic Laboratory at the University of Michiganにより、HEMAVETH 950血液分析器(Drew Scientific, Inc.)を製造者の推奨に従って使用して、抗凝固血液を処理した。
【０４５５】
統計。抗体の最終的な力価の結果を、平均値±平均値の標準誤差(SEM)又は±標準偏差(SD)で表した。スチューデントのt検定及びフィッシャーの正確検定の両側検定を使用したANOVA(分散分析)によって統計的有意性を決定した。細菌の攻撃試験について、コロニー形成の分布は非常に非対称であり、したがって、データを標準化するために、データを変換した(自然対数変換)。標準化された肺及び脾臓における平均細菌応答を、両側のp値を用いて試験した独立した試料を使用して比較した。p<0.05を統計的に有意であるとみなした。全ての分析を95%の信頼限界で行った。
【０４５６】
免疫反応性タンパク質の同定
免疫反応性OMPタンパク質を、銀染色(図29B参照)及びウェスタンブロット(図29C及びD参照)によって同定した。主要な反応性バンドは、どちらの場合でも62KDa、45KDa、17KDa、及び10KDaにおいて実証された。しかし、バンドの強度は、PBS調製物中OMPを用いて免疫化したマウスからの等価の血清希釈物を用いて探索したブロット(図29D参照)と比較して、NEベースのワクチンを用いて免疫化したマウスからの血清のほうがずっと高かった(図29C参照)。
【０４５７】
強度が最も高いバンドは、約17KDaに位置していた(図29C参照)。同定するために、17KDaのバンドをゲルから単離し、M ALDI-TOF分析によって同定した。タンパク質は、MW16.396KDaのセパシア菌外膜リポタンパク質A(OmpA)であることが同定された(例えば、Ortega et al., 2005 J Bacteriol 187, 1324-1333;Plesa et al., 2004, J Med Microbiol 53, 389-398を参照されたい)。National Center for Biotechnology Information(NCBI)のタンパク質BLASTを使用した配列分析により、これらのタンパク質が、他の密接に関連するバークホルデリア種に存在することが確認された(以下表25参照)。高度なタンパク質相同性(87.9%の配列相同性)が多数のバークホルデリア及びラルストニアの生物体株において同定され、OmpAファミリーの残りからの高度に保存されたアミノ酸が17KDaのタンパク質の配列中に存在している(表25参照)。したがって、本発明は、セパシア菌からの免疫反応性OMPタンパク質、並びにセパシア菌から同定された免疫反応性OMPタンパク質に対して高度な相同性を示す、バークホルデリア種の関連株からのタンパク質(例えば、ナノエマルジョンを含む免疫原性組成物(例えば、対象において、ナノエマルジョン及び免疫反応性OMPタンパク質又は相同物を含む免疫原性組成物に対する特異的な免疫応答を発生させるために対象に投与される免疫原性組成物)に使用されるタンパク質)を同定し、提供する。
【表２６】
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【０４５８】
OMP-NEを用いて鼻腔内免疫化することにより抗OMP特異的抗体が誘導される
OMPを用いた鼻部ワクチンによって誘導されたOMPに対する体液性免疫応答を、CD-1マウスにおいてin vivoで特徴付けた。OMP調製物+NE(OMP-NE)を5μg又は15μgのいずれかを用いて鼻腔内ワクチン接種することにより、最初のワクチン接種後6週間の時点で、それぞれ、2.8×105及び5.1×105の、高いOMP特異的IgG抗体の血清力価がもたらされた(図30A参照)。アジュバントなしのOMPは免疫原性であり、最初のi.n.免疫化の6週間後、1.9×104及び3.8×104の血清抗OMPIgG力価をもたらした。しかし、アジュバントとしてNEを含んだ処置群は、追加免疫後の全ての時点でアジュバントなしの群よりも有意に高度に応答した(13〜30倍)(p<0.05)。さらに、PBS中OMPを用いて免疫化したマウスは、2回目のワクチン接種の後に有意な追加免疫の効果を実証しなかった(図30A参照)。
【０４５９】
OMP-NEワクチンをさらに特徴付けるために、OMP-NE組成物の、細気管支分泌における特異的抗体産生を誘発する能力を評価した。粘膜非呼吸器病原体に対する保護において、分泌型抗体が決定的なエフェクターであると考えられているので、粘膜の抗体産生は、バークホルデリアのコロニー形成に対する保護のために重要であり得る(例えば、Nelson et al., 1993, J Med Microbiol 39, 39-47を参照されたい)。5μgのOMP-NE又は5μgのPBS中OMPを用いて免疫化した動物の気管支肺胞洗浄(BAL)液において、粘膜の免疫応答を評価した。OMP-NE又はNEアジュバントなしのOMPを用いて免疫化したマウスにおいて、同等のレベルのBAL中抗OMP抗体が検出された(図30B参照)。
【０４６０】
OMP-NEで免疫化することにより、バランスのとれたTh1/Th2細胞性応答がもたらされる
血清IgGサブクラスの分析を行って、細胞性応答のヘルパーT細胞型のバイアスを決定した。IgGサブクラスの分布パターンは、OMP-NEを用いてi.n.免疫化することにより、Th1型IgG2bサブクラス抗体対Th2型IgG1サブクラス抗体のレベルが上昇した(p=0.048)(図31A参照)。それに対し、PBS中OMPを用いた免疫化では、同様のレベルのIgG1抗体及びIgG2b抗体が生じた(図31A参照)。
【０４６１】
OMP特異的な細胞性応答を、OMP-NEを用いた最初にワクチン接種した6週間後に得た脾細胞において特徴付けた。細胞を、エンドトキシン枯渇OMPを用いて刺激し、次いで、特異的なサイトカインの産生について評価した。OMP-NEワクチン接種したマウスから採取した脾細胞において、Th1サイトカインであるIFN-γ及びIL-2の産生が、ワクチン接種していないマウスからの脾細胞に対して、それぞれ、22.1倍及び18.6倍増加した(それぞれ、p=0.01及び0.003)(図31B参照)。IFN-γは、PBS中OMPを用いて免疫化したマウスからの脾細胞において同等に誘導された。Th2サイトカインであるIL-4、IL-5、IL-6、及びIL-IOは、OMP-NEで免疫化したマウス及びOMPで免疫化したマウスのどちらにおいても、同等量で最小限誘導された(≦5.22倍増加)。脾臓のサイトカイン発現及びIgGサブクラスの分布のパターンの結果は、OMP-NEワクチン接種に対するバランスのとれたTh1/Th2応答を示している。
【０４６２】
抗体応答はOMPリポタンパク質及びLPSを対象とする
LPSが本質的にバークホルデリア種のOMP調製物に関連していることが以前実証されている(例えば、Bertot et al., 2007, Infect Immun 75, 2740-2752を参照されたい)。免疫応答の特異性を調査し、B.セノセパシアのOMP調製物中のエンドトキシンの、可能性のある免疫を増強する役割を評価するために、OMP-NEを用いて免疫化したマウスからの血清を、粗製OMP、エンドトキシン枯渇OMP、又はLPSのいずれかを用いたELISAを使用して分析した。IgGの反応性は、エンドトキシン枯渇OMP調製物及び粗製OMP調製物に対して最も高かった。統計分析により、LPSに対するエンドトキシン枯渇OMP(OD405=2.37±0.11(p=0.001))及びLPSに対する粗製OMP(OD405=1.49±0.14(p=0.01))において有意に高い応答性が示された。しかし、血清は、有意なレベルのIgG抗LPS抗体も含有した(OD405=0.59±0.05)。
【０４６３】
OMP調製物中のエンドトキシンの役割を明らかにするために、プロテイナーゼKを用いて粗製OMP調製物及びエンドトキシン枯渇OMP調製物のタンパク質分解的消化を行った。OMP-NEを用いてワクチン接種したマウスからの血清抗体に対してPBS中OMPを用いてワクチン接種したマウスにおいて生成した血清抗体を比較するウェスタンブロット分析によって免疫原性エピトープを決定した(図32参照)。結果は、抗体応答が主にOMP調製物内に含有される62KDaのタンパク質及び17KDaのタンパク質を対象としたことを明白に示した。このことは、タンパク質分解的に消化されたOMP調製物においてタンパク質のバンドが完全に存在しないことによって確認された(図32、OMP-NE血清ウェスタンブロットを参照されたい)。さらに、市販のモノクローナル抗LPS抗体を用いてOMP調製物を探索すると、LPSはOMP調製物の本質部分として検出された。しかし、タンパク質分解的消化により、LPSの検出が全てではないが、縮小した。全体的に見て、本発明は、OMP-NEを用いて鼻部を免疫化することにより、OMPタンパク質に対して特異的な抗体の産生が増強されることを提供する(図32参照)。
【０４６４】
OMP-NEを用いて鼻腔内ワクチン接種することにより、交差防御的中和血清抗体がもたらされる
B.セノセパシア中和抗体を、コロニー減少アッセイ使用して決定した。鼻腔内に5μg又は15μgのOMP-NEをワクチン接種したマウスは、ワクチン接種していないマウスからの血清と比較して、それぞれ、92.5%又は98.3%のB.セノセパシアコロニーを阻害した血清中和抗体を産生した(図33参照)。アジュバントを欠くOMPを用いてワクチン接種したマウスも同様に、33.3%及び46.7%(それぞれ、5μgのOMP-PBS及び15μgのOMP-PBSについて)のcfuの減少をもたらし、比較的高レベルの阻害を実証した。統計分析により、B.セノセパシアの増殖が、OMP調製物単独で免疫化されたものからの血清と比較して、OMP-NEから導かれる血清によって有意に阻害されたことが示された(図33参照)。
【０４６５】
OMP-NEによって他の細菌株からの交差反応性保護が生じ得るかどうかを評価するために、15μgのOMP-NEを用いてワクチン接種したマウスからの血清も同様にB.マルチボランスと一緒にインキュベートした。B.マルチボランスは、Bcc生物体に感染したCF患者から培養した最も一般的な分離株であるので、これを選択した(例えば、Baldwin et al., 2008, J ClinMicrobiol 46, 290-295を参照されたい)。OMP-NEを用いてワクチン接種したマウス及びアジュバントなしのOMPを用いてワクチン接種したマウス由来の血清は、B.マルチボランスの増殖を、それぞれ、80.1%、49.8%阻害し、これはOMP-NE又はPBS中OMPのいずれかを用いた免疫化の後の、有意な交差防御的抗体を示唆している(図33参照)。
【０４６６】
OMP-NEを用いた免疫化は、肺のB.セノセパシア攻撃から保護し、敗血症発生率を低下させる
鼻腔内免疫化の保護作用を、肺感染症モデルにおいて、in vivoでさらに試験した。OMP-NE又はアジュバントなしのOMPを用いて鼻腔内免疫化したマウスにおいて、気管内接種した後6日間、肺組織からのB.セノセパシアのクリアランスを評価した。15μgのOMP-NEをワクチン接種することにより、ワクチン接種していないマウスと比較して有意に高い肺のクリアランス速度がもたらされた(p=9.2×10-3)(図34A参照)。6日目の肺の平均細菌負荷量は、肺当たり1.28×106±3.36×106cfuであったワクチン接種してないマウスと比較して、15μgのOMP-NEを用いてワクチン接種したマウスでは、22.5±26.2cfuであり、細菌負荷量が5log超減少したことを示している。
【０４６７】
敗血症を評価する方法として、B.セノセパシアを肺に接種した後の脾臓でのコロニー形成を評価した(図34B参照)。15μgのOMP-NEを用いてワクチン接種することにより、個々のマウスの肺への攻撃の6日目の脾臓における細菌の発生率が、ワクチン接種していないマウスで平均脾臓当たり3.54×103±6.97×103cfuからワクチン接種したマウスで脾臓当たり2.5±5cfuまで、有意に低下した(p=0.0307)。
【０４６８】
OMP-NEを用いて鼻腔内免疫化することにより、B.セノセパシア感染後の全身性疾病が減衰する
B.セノセパシアの感染により、OMP-NE又はアジュバントなしのOMPを用いて免疫化したマウスよりも、ワクチン接種していないマウスにおいて、6日目までに体温調節が大幅に失われる。B.セノセパシアを感染させた6日後の平均体温は、15μgのOMP-NEを用いてワクチン接種したマウス(36.8℃±0.31、p=0.008)、5μgのOMP-NEを用いてワクチン接種したマウス(37.1℃±0.42、p=0.008)、又は5μgのアジュバントなしのOMPを用いてワクチン接種したマウス(36.8℃±0.61、p=0.01)と比較して、ワクチン接種していないマウス(35.4℃±0.7)では有意に低下した。
【０４６９】
ワクチン接種していないマウスにおける、屠殺した時点で決定された全末梢白血球の数は、15μgのOMP-NEを用いてワクチン接種したマウス(p=0.047)、5μgのOMP-NEを用いてワクチン接種したマウス(p=0.026)、又は15μgのPBS中OMPを用いてワクチン接種したマウス(p=0.032)について観察された値より有意に高かった。全末梢白血球に対する多形核白血球の比率も同様に、15μgのOMP-NEを用いてワクチン接種したマウス(47.7%、p=0.02)、5μgのOMP-NEを用いてワクチン接種したマウス(45.6%、p=0.024)、又は15μgのPBS中OMPを用いてワクチン接種したマウス(48.7%、p=0.04)と比較して、ワクチン接種していないマウス(76.0%)において有意に高かった(以下表26参照)。上記の脾臓でのコロニー形成の結果と合わせて(図39B参照)、本発明は、OMP-NEを用いて免疫化することによって、B.セノセパシアによる感染後の全身性疾患の有意な減少がもたらされることを提供する。
【表２７】
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【０４７０】
上記の明細書において言及した全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記載されている本発明の組成物及び方法の種々の改変及び変形が、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく当業者に明らかになるであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、当然のことながら、特許請求された本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されない。実際に、関連分野の当業者に明らかである、本発明を実行するための記載の方式の種々の改変は、本発明の範囲内であるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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