(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２の両方に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、以下：
（ａ）配列番号４もしくは配列番号５の軽鎖可変ドメイン配列、および配列番号７の重鎖可変ドメイン配列；または
（ｂ）配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号３０のＣＤＲＬ２、配列番号３２もしくは３３のＣＤＲＬ３、配列番号３５のＣＤＲＨ１、配列番号３７のＣＤＲＨ２、および配列番号３９のＣＤＲＨ３、
を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号３０のＣＤＲＬ２、配列番号３２のＣＤＲＬ３、配列番号３５のＣＤＲＨ１、配列番号３７のＣＤＲＨ２、および配列番号３９のＣＤＲＨ３を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号３０のＣＤＲＬ２、配列番号３３のＣＤＲＬ３、配列番号３５のＣＤＲＨ１、配列番号３７のＣＤＲＨ２、および配列番号３９のＣＤＲＨ３を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号１０に示す配列を有する、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２の両方に結合するＹＷ６８．１１．２６抗体。
【請求項５】
Ｎｒｐ２に対して少なくとも０．１５ｎＭの結合親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
Ｎｒｐ１に対して少なくとも０．２５ｎＭの結合親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも０．２５ｎＭの結合親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方へのＳｅｍａ３の結合を阻止する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
Ｎｒｐ１またはＮｒｐ２へのＶＥＧＦの結合を阻止しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
インビトロにおいてセマフォリンの生物学的活性を阻害する、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
インビボにおいてセマフォリンの生物学的活性を阻害する、請求項８または請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
二重特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
さらなる前記特異性は、ＶＥＧＦに結合する能力である、請求項１２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）およびニューロピリン２（Ｎｒｐ２）のフラグメント単独の結晶構造、ならびに抗ニューロピリン抗体との複合体での結晶構造、そしてそれらの使用を提供する。本発明は、Ｎｒｐ１および／またはＮｒｐ２に結合する抗体、ならびにそれらの使用方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脈管系の発生は、多くの生理学的および病理学的プロセスに対する基本的な必要条件である。胚および腫瘍などの活発に成長している組織は、十分な血液の供給を必要とする。それらの組織は、一般に新脈管形成と呼ばれるプロセスを介して新しい血管の形成および維持を促進する新脈管形成促進（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）因子を産生することによって、この要求に応える。脈管形成は、以下の工程：ａ）内皮細胞（ＥＣ）が、既存のＥＣから増殖するか、または前駆細胞から分化する工程；ｂ）ＥＣが、遊走し、そして癒合することにより、索様構造が形成される工程；ｃ）次いで、脈管の索が管形成を起こすことにより、中央が管腔になっている管が形成される工程、ｄ）既存の索または管が出芽することにより、二次管が形成される工程；ｅ）初期の脈管叢が、さらに再造形および再形成を起こす工程；そしてｆ）周囲の内皮細胞が補充されて、内皮の管が被われることにより、その管に対して維持および調節性の機能がもたらされる工程のすべてまたは多くを含む、複雑であるが整然とした生物学的事象である；そのような細胞としては、小さい毛細管に対する周皮細胞、大きい管に対する平滑筋細胞および心臓における心筋細胞が挙げられる。Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：４８−５０（１９９７）；Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．＆  Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ，Ｐ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３：５１３−２３（２００２）；Ｌｕｂａｒｓｋｙ，Ｂ．＆  Ｋｒａｓｎｏｗ，Ｍ．Ａ．Ｃｅｌｌ．１１２：１９−２８（２００３）。
【０００３】
現在、新脈管形成が種々の障害の病原に関係することは、十分に立証されている。これらの障害としては、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化症、水晶体後線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内血管新生疾患（例えば、増殖性網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植された角膜組織および他の組織の免疫拒絶）、関節リウマチおよび乾癬が挙げられる。Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−２３９（１９９１）；およびＧａｒｎｅｒ  Ａ．“Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”：Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．，Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  ＧＫ，ｅｄｓ．，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９４），ｐｐ１６２５−１７１０。
【０００４】
腫瘍成長の場合、新脈管形成は、過形成から新形成への移行、ならびに腫瘍の成長および転移のための栄養物の供給にとって重大であるとみられる。Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：５８（１９８９）。この新血管形成によって、腫瘍細胞は、正常細胞と比べて、成長優位性および増殖自律性を獲得することができる。腫瘍は、通常、利用可能な毛細管床からの距離に起因して、たった数立方ミリメートルのサイズに増殖することができる単一の異常な細胞として始まり、長時間にわたってさらに成長および内転移することなく「休眠」のままでいることができる。そして、いくつかの腫瘍細胞が、新脈管形成の表現型に切り換わり、内皮細胞を活性化し、その内皮細胞が、増殖して新しい毛細血管に成熟する。これらの新しく形成された血管は、原発腫瘍の成長の継続だけでなく、転移性腫瘍細胞の内転移および再転移増殖も可能にする。したがって、腫瘍部分における微小な管の密度と、乳癌ならびに他のいくつかの腫瘍において生存している患者との間に、相関が観察された。Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３２４：１−６（１９９１）；Ｈｏｒａｋら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１１２０−１１２４（１９９２）；Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１４５−１４６（１９９２）。新脈管形成の切り換えを制御する正確なメカニズムは、十分に理解されていないが、腫瘤の新血管形成は、多数の新脈管形成の刺激物質およびインヒビタの正味のバランスに起因すると考えられている（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９５，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １（１）：２７−３１）。
【０００５】
脈管発生のプロセスは、厳重に制御されている。現在までに、周囲の細胞によって産生される主に分泌型の因子であるかなりの数の分子が、ＥＣの分化、増殖、遊走および索様構造への癒合を制御すると示されている。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、新脈管形成の刺激および脈管透過性の誘導に関与する鍵となる因子と同定されている。Ｆｅｒｒａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１８：４−２５（１９９７）。ＶＥＧＦ対立遺伝子が、単一であっても喪失されると胚致死をもたらすという知見は、脈管系の発生および分化においてこの因子が果たす、代わりがきかない役割を指摘している。さらに、ＶＥＧＦは、腫瘍および眼内障害に関連する新血管形成の鍵となるメディエータであると示されている。Ｆｅｒｒａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．前出。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは、調べられたヒト腫瘍の大部分によって過剰発現されている。Ｂｅｒｋｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１５３−１５９（１９９３）；Ｂｒｏｗｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２６：８６−９１（１９９５）；Ｂｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４７２７−４７３５（１９９３）；Ｍａｔｔｅｒｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：９３１−９３４（１９９６）；Ｄｖｏｒａｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９（１９９５）。
【０００６】
また、眼の体液中のＶＥＧＦの濃度レベルは、糖尿病性網膜症および他の虚血関連網膜症を有する患者における血管の活発な増殖の存在に高度に相関する。Ａｉｅｌｌｏら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１４８０−１４８７（１９９４）。さらに、研究によって、ＡＭＤに罹患した患者における血管新生脈絡膜におけるＶＥＧＦの局在化が証明されている。Ｌｏｐｅｚら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：８５５−８６８（１９９６）。
【０００７】
抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて種々のヒト腫瘍細胞株の成長を抑制し（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）；Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１７８９−１７９７（１９９５）；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｅｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４０３２−４０３９（１９９６）；Ｍｅｌｎｙｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：９２１−９２４（１９９６））、また、虚血性網膜障害のモデルにおいて、眼内の新脈管形成を阻害する。Ａｄａｍｉｓら、Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６−７１（１９９６）。ゆえに、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体またはＶＥＧＦ作用の他のインヒビタは、腫瘍および様々な眼内血管新生障害を処置するための有望な候補である。そのような抗体は、例えば、１９９８年１月１４日公開のＥＰ８１７，６４８；ならびにＷＯ９８／４５３３１およびＷＯ９８／４５３３２（両方とも１９９８年１０月１５日公開）に記載されている。抗ＶＥＧＦ抗体の１つであるベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）は、転移性直腸結腸癌（ＣＲＣ）および非小（ｎｏｎ−ｓａｍｌｌ）細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を処置するために化学療法レジメンと組み合わせて使用するためにＦＤＡによって承認されている。そして、ベバシズマブは、様々な癌の徴候を処置するために、多くの進行中の臨床試験において調査されている。
【０００８】
神経系の発生中、ニューロンは、それらの標的に到達するために、長距離にわたって移動する太索様の軸索を送り出す。非特許文献１による概説を参照のこと。伸長している軸索の先頭端は、成長円錐と呼ばれる高度に運動性で知覚性の構造である。その成長円錐は、糸状仮足の伸長の、伸長と退縮とのダイナミックなサイクルを通じて、その空間的な環境における無数のガイダンスキューを絶えず感知して評価し、その最終的な標的に向かって伸長するための正確な進路を正確に選択する。
【０００９】
過去１０年間で、軸索ガイダンスメカニズムの理解は、かなり進歩した。Ｄｉｃｋｓｏｎ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１９５９−６４による概説を参照のこと。ガイダンスのキューは、４種類ある：誘引物質（ａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ）および反発物質（ｒｅｐｅｌｌｅｎｔｓ）；これらは、短い範囲（すなわち、細胞−またはマトリックス−会合型）または長い範囲（すなわち、拡散性）のいずれかにおいて作用し得る。今までのところ、軸索誘導分子の４つの主要なファミリー：ネトリン、セマフォリン、エフリンおよびスリット（ｓｌｉｔｓ）が同定されている。Ｈｕｂｅｒら（２００３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：５０９−６３による概説を参照のこと。
【００１０】
セマフォリン（Ｓｅｍａ）（コラプシンとも呼ばれる）は、系統的に保存された分泌型および膜結合型のタンパク質の大きなファミリーに属している。セマフォリンファミリーのメンバーは、神経発生中において、反発する軸索ガイダンス事象と、誘引する軸索ガイダンス事象との両方を媒介することができる。Ｒａｐｅｒ（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １０：８８−９４。現在までに同定された３０個を超えるセマフォリンのすべてが、約５００アミノ酸の保存されたＮ末端Ｓｅｍａドメインを共有している。セマフォリンメンバーは、それらの構造的な類似度および起源となる種に応じて、８つのサブファミリーに分類される。セマフォリンに対する統合された名称についての詳細は、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９７：５５１−５５２を参照のこと。
【００１１】
ニューロピリン（ＮＲＰ）ファミリーは、２つの相同タンパク質であるニューロピリン−１（ＮＲＰ１）およびニューロピリン−２（ＮＲＰ２）を含む。ＮＲＰ１は、成長中の軸索の成長円錐において発現される１３０ｋＤａのＩ型膜貫通型糖タンパク質として初めて同定された。続いて、ＮＲＰ２が、発現クローニングによって同定された。非特許文献２。ＮＲＰは、クラス３セマフォリンであるセマフォリンのサブセットに対するレセプターであると見出されている。ＮＲＰは、別のセマフォリンレセプターファミリーであるプレキシン（ｐｌｅｘｉｎｓ）とともに非シグナル伝達コレセプターとして機能すると示唆された。
【００１２】
ＮＲＰは、軸索ガイダンスのメディエータとして最初に報告されたが、脈管発生においても重大な役割を果たすと見出されている。非特許文献１。ＮＲＰは、腫瘍細胞および内皮細胞上で発現されるアイソフォーム特異的ＶＥＧＦレセプターとして同定され、これにより、脈管および腫瘍の生物学におけるＮＲＰの役割を理解するためのかなりの試みが促されている。非特許文献３；非特許文献４。遺伝的研究から、Ｎｒｐ１が、脈管の形態形成に必要であるという強力な証拠がもたらされた。Ｎｒｐ１の機能が喪失することにより、血管リモデリングおよび分枝に欠陥がもたらされ、これは、Ｎｒｐ２機能の喪失によってさらに増強されうる表現型である。非特許文献５；非特許文献６。これらの結果は、発生の初期において、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２が、重複した機能を有し得ることを示唆している。しかしながら、各Ｎｒｐの発現は、発生の後期では分配されるようになり、Ｎｒｐ１は、主に動脈において発現し、Ｎｒｐ２は、静脈およびリンパ管において発現する。非特許文献７；非特許文献８。特に、Ｎｒｐ２機能の喪失だけで、リンパ管の発生が明確に損なわれる。
【００１３】
Ｎｒｐ１は、発生中の他の多くの細胞型において発現されるので、ＥＣ特異的ノックアウトを作製することによって、脈管Ｎｒｐ１の役割に取り組んだところ、ヌル対立遺伝子に見られるものと同様の脈管の欠陥がもたらされた。非特許文献９。興味深いことに、この研究は、ＮＲＰ１へのＳｅｍａ３Ａの結合が、脈管発生に必要ないことも示した。別の研究では、Ｎｒｐ１  ＫＯ胚における菱脳の発生の際の内皮端細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｉｐ  ｃｅｌｌ）のガイダンスにおいて欠陥が観察された。非特許文献１０。
【００１４】
脈管発生におけるＮＲＰ１の役割に関して広く研究されているにもかかわらず、ＮＲＰ１が、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）へのＶＥＧＦの結合に対するエンハンサーとしてもっぱらＶＥＧＦＲ２経路を介してＶＥＧＦＲ２シグナル伝達のためにその脈管の機能を果たすのか、ＶＥＧＦＲ２とは無関係のシグナル伝達経路を介してその脈管の機能を果たすのか、またはその両方の組み合わせを介してその脈管の機能を果たすのかに関しては不明なままである。
【００１５】
モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ技術を用いて作られ得る。モノクローナル抗体、特に、げっ歯類由来のモノクローナル抗体が広範に使用されているが、しかしながら、非ヒト抗体は、ヒトにおいて頻繁に抗原性である。当該技術は、非ヒト抗原結合ドメインがヒト定常ドメインに結合されている、「キメラ」抗体（Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号）を構築することによって、この問題を克服するように試みている。ヒト定常ドメインのアイソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害に関与するためのキメラ抗体を作るように選択され得る。抗体の抗原結合機能を解析し、ヒト抗体における異種配列の使用を最小にするためのさらなる試みでは、実質的にインタクトでないヒト可変ドメインが領域において非ヒト種由来の対応配列で置換されている、様々な抗原に対するヒト化抗体が作製されている。例えば、げっ歯類残基が、ヒト抗体の対応するセグメントに対して置換されている。実際に、ヒト化抗体は、代表的には、いくつかの相補性決定領域（ＣＤＲ）残基およびおそらくいくつかのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、げっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基で置換されている、ヒト抗体である。Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６。
【００１６】
治療用抗体をヒトに投与する前の、非ヒト哺乳動物における前臨床試験は、通常、その抗体の有効性および／または毒性を評価することを目的とする。理想的には、これらの研究に供される抗体は、マウスまたは非ヒト霊長類などの宿主動物にとって内因性の標的抗原を認識することができ、その標的抗原と高力価で反応することができるものである。
【００１７】
ファージディスプレイ技術は、抗原などのリガンドに結合する新規タンパク質を生成および選択するための強力なツールを提供した。ファージディスプレイの手法を用いると、タンパク質バリアントの大きなライブラリを作製することができ、そして、高親和性で標的抗原に結合する配列を迅速に選別することができる。バリアントポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質などのウイルスのコートタンパク質をコードする核酸配列に融合される。タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列が遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合された一価のファージディスプレイシステムが開発された（Ｂａｓｓ，Ｓ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８：３０９；Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３：２０５）。一価のファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が、低レベルで発現され、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も、粒子の感染性を保持するように発現される。ペプチドライブラリを生成する方法およびそれらのライブラリをスクリーニングする方法は、多くの特許（例えば、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２，０１８号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号および米国特許第５，４９８，５３０号）に開示されている。
【００１８】
繊維状ファージの表面上でのペプチドの発現およびＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム中での機能性抗体フラグメントの発現の実証は、抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリの開発の際に重要であった（Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５；Ｓｋｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８）。抗体または抗原結合ポリペプチドのライブラリは、ランダムなＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変化させること、または関連遺伝子のファミリーをクローニングすることによる方法をはじめとした、いくつかの方法で調製される。ファージディスプレイを用いて抗体または抗原結合フラグメントをディスプレイするための方法は、米国特許第号５，７５０，３７３号、同第５，７３３，７４３号、同第５，８３７，２４２号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，５８０，７１７号および同第５，６５８，７２７号に記載されている。次いで、そのライブラリを所望の特徴を有する抗体または抗原結合タンパク質の発現についてスクリーニングする。
【００１９】
ファージディスプレイ技術は、所望の特徴を有する抗体を調製するための従来のハイブリドーマ法および組換え法に対していくつかの利点を有する。この技術では、多種多様な配列を有する抗体の大きなライブラリを、長い時間をかけず、かつ動物を使用せずに、開発することができる。ハイブリドーマの調製またはヒト化抗体の調製は、たいてい数ヶ月間の調製を必要とし得る。さらに、免疫化が必要ないので、毒性であるかまたは抗原性の低い抗原に対するファージ抗体ライブラリを作製することができる（Ｈｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：１−２０）。ファージ抗体ライブラリはまた、新規の治療抗体を作製し、同定するためにも使用され得る。
【００２０】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリは、免疫されたヒト、免疫されていないヒト、生殖系列配列、またはナイーブＢ細胞Ｉｇレパートリーからヒト抗体を作製するために使用されていた（Ｂａｒｂａｓ  ＆  Ｂｕｒｔｏｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：２３０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５；Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９；Ｗｉｎｔｅｒ  ＥＰ０３６８６８４Ｂ１）。ナイーブまたは非免疫の抗原結合ライブラリは、種々のリンパ（ｌｙｍｐｈｏｉｄａｌ）組織を用いて作製されてきた。これらのライブラリのいくつか（例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＭｏｒｐｈｏｓｙｓによって開発されたもの）（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９；Ｋｎａｐｐｉｋら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７）が、市販されている。しかしながら、これらのライブラリの多くは、多様性が限られている。
【００２１】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリから高親和性抗体を同定する能力および単離する能力は、治療的に使用するための新規抗体を単離する際に重要である。ライブラリからの高親和性抗体の単離は、ライブラリのサイズ、細菌細胞における産生効率およびそのライブラリの多様性に左右される。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７を参照のこと。ライブラリのサイズは、抗体または抗原結合タンパク質の不適当な折り畳みおよび終止コドンの存在に起因して、産生が効率的でないことによって小さくなる。細菌細胞における発現は、その抗体または抗原結合ドメインが正しく折り畳まれない場合に、阻害され得る。発現は、可変／定常界面の表面、または選択されたＣＤＲ残基において順に残基を変異させることによって改善され得る（Ｄｅｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９５３３、Ｕｌｒｉｃｈら（１９９５）ＰＮＡＳ，９２：１１９０７−１１９１１；Ｆｏｒｓｂｅｒｇら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２４３０）。抗体ファージライブラリが細菌細胞において産生されるとき、フレームワーク領域の配列は、正しい折り畳みをもたらす際の１つの因子である。
【００２２】
抗体または抗原結合タンパク質の多種多様なライブラリを作製することもまた、高親和性抗体の単離にとって重要である。限定されたＣＤＲにおいて多様化を有するライブラリは、種々のアプローチを用いて作製される。例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：９８９−９９４を参照のこと。１つには、ＣＤＲ３領域は、しばしば抗原結合に関与すると見出されているという理由で、ＣＤＲ３領域が興味深い。重鎖上のＣＤＲ３領域のサイズ、配列および構造の立体配座は、広く多様である。
【００２３】
他の研究者らも、各位置において２０個すべてのアミノ酸を用いて可変重鎖および可変軽鎖のＣＤＲ領域をランダム化することによって、多様性を作製している。２０個すべてのアミノ酸を用いることが、バリアント抗体の配列の大きな多様性をもたらし得、新規抗体を突きとめる可能性を増加させ得ると考えられた（Ｂａｒｂａｓ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：３８０９；Ｙｅｌｔｏｎ，ＤＥ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１９９４；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５４：３３１０およびＨａｗｋｉｎｓ，ＲＥ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２６：８８９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】ＣａｒｍｅｌｉｅｔおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３６：１９３−２００
【非特許文献２】ＦｕｊｉｓａｗａおよびＫｉｔｓｕｋａｗａ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ（１９９８）８：５８７−５９２
【非特許文献３】Ｓｏｋｅｒら、Ｃｅｌｌ（１９９８）９２：７３５−７４５
【非特許文献４】Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ（２００２）５１５：３３−４８
【非特許文献５】Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９９）１２６：４８９５−４９０２
【非特許文献６】Ｔａｋａｓｈｉｍａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９：３６５７−３６６２
【非特許文献７】Ｙｕａｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００２）１２９：４７９７−４８０６
【非特許文献８】Ｈｅｒｚｏｇら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ（２００１）１０９：１１５−１１９
【非特許文献９】Ｇｕら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ（２００３）５：４５−５７
【非特許文献１０】Ｇｅｒｈａｒｄｔら、Ｄｅｖ  Ｄｙｎ（２００４）２３１：５０３−５０９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の要旨
本発明は、ニューロピリン−１およびニューロピリン−２（Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２）のフラグメント単独の結晶構造、ならびにセマフォリンまたはＶＥＧＦの結合を選択的に阻止する抗体との複合体での結晶構造を提供する。Ｎｒｐは、ａ２、ｂ１およびｂ２ドメインが密に詰め込まれたコアを形成する予想外のドメイン配置をとる。インビトロでの実験とともに、その抗体エピトープの位置は、ＶＥＧＦおよびセマフォリンが、Ｎｒｐ結合について直接競合しないことを示している。ａ１ドメインによって媒介される結晶学的なＮｒｐ二量体に基づいて、本発明は、レセプターの二量体化およびリガンドの結合に対するモデルをさらに提供する。
【００２６】
これらの結果に基づいて、１つの局面では、本発明は、Ｎｒｐ１ｂ１ｂ２フラグメントの３次元構造を表す回折パターンを生成するＸ線放射線を回折し、以下のおおよそのセル定数ａ＝６５．９Å、ｂ＝６６．７Å、ｃ＝７４．７ÅおよびＰ２１２１２１という空間群を有する、前記フラグメントによって形成される結晶を提供する。
【００２７】
別の局面では、本発明は、Ｎｒｐ１ａ２ｂ１ｂ２フラグメントの３次元構造を表す回折パターンを生成するＸ線放射線を回折し、以下のおおよそのセル定数ａ＝５３．２Å、ｂ＝６８．２Å、ｃ＝６６．６ÅおよびＰ２１という空間群を有する、前記フラグメントによって形成される結晶に関する。
【００２８】
なおも別の局面では、本発明は、Ｎｒｐ１ｂ１フラグメントと、Ｎｒｐ１への血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の結合を阻害する抗Ｎｒｐ１Ｂ抗体（ＹＷ１０７．４．８７）のＦａｂフラグメントとの間で形成される複合体の結晶に関し、ここで、前記結晶は、前記複合体の３次元構造を表す回折パターンを生成するＸ線放射線を回折し、以下のおおよそのセル定数ａ＝２１３Å、ｂ＝２１３Å、ｃ＝４５．３ÅおよびＨ３という空間群を有する。
【００２９】
さらなる局面では、本発明は、Ｎｒｐ２ｂ１ｂ２フラグメントの３次元構造を表す回折パターンを生成するＸ線放射線を回折し、以下のおおよそのセル定数ａ＝３６．５Å、ｂ＝７０．５Å、ｃ＝１２２ÅおよびＰ２１２１２１という空間群を有する、前記フラグメントによって形成される結晶に関する。
【００３０】
なおもさらなる局面では、本発明は、Ｎｒｐ２ａ２ｂ１ｂ２フラグメントの３次元構造を表す回折パターンを生成するＸ線放射線を回折し、以下のおおよそのセル定数ａ＝５０．１Å、ｂ＝１９３Å、ｃ＝６６．２ÅおよびＰ２１という空間群を有する、前記フラグメントによって形成される結晶に関する。
【００３１】
別の局面では、本発明は、Ｎｒｐ２ａ１ａ２ｂ１ｂ２フラグメントと、Ｎｒｐ２へのセマフォリンの結合を阻害する抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体のＦａｂフラグメントとの間で形成される複合体の結晶に関し、ここで、前記結晶は、前記複合体の３次元構造を表す回折パターンを生成するＸ線放射線を回折し、以下のおおよそのセル定数ａ＝１４８Å、ｂ＝１０６Å、ｃ＝９２．４ÅおよびＣ２という空間群を有する。
【００３２】
本発明は、Ｎｒｐ２ａ１ａ２ｂ１ｂ２フラグメントと、Ｎｒｐ２へのセマフォリンの結合を阻害する抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体のＦａｂフラグメントとの間で形成される複合体の結晶にさらに関し、ここで、前記結晶は、前記複合体の３次元構造を表す回折パターンを生成するＸ線放射線を回折し、以下のおおよそのセル定数ａ＝１２１Å、ｂ＝１２１Å、ｃ＝２０３ÅおよびＰ３２２１という空間群を有する。
【００３３】
別の局面では、本発明は、図７に示される軽鎖可変ドメイン配列および／もしくは図８に示される重鎖可変ドメイン配列を含む抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体、またはそのフラグメントに関する。
【００３４】
なおも別の局面では、本発明は、図９Ａに示される配列を含む抗ｐａｎＮｒｐＡＹＷ６８．１１抗体Ｆａｂフラグメントに関する。
【００３５】
さらなる局面では、本発明は、図９Ｂに示される配列を含む抗ｐａｎＮｒｐＡＹＷ６８．１１．２６抗体Ｆａｂフラグメントに関する。
【００３６】
なおもさらなる局面では、本発明は、Ｎｒｐの結合について抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体と競合する抗Ｎｒｐ抗体に関する（ｃｏｃｅｒｎｓ）。
【００３７】
１つの実施形態において、抗Ｎｒｐ抗体は、抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体と同じエピトープに本質的に結合する。
【００３８】
別の実施形態では、抗Ｎｒｐ抗体は、Ｎｒｐ２ａ１ａ２ｂ１ｂ２アミノ酸配列のアミノ酸残基Ｙ３９、Ｙ４５、Ｐ４６、Ｑ４７、Ｆ７２、Ｎ７３、Ｐ７４、Ｈ７５、Ｆ７６、Ａ１３３およびＲ１３８によって定義される界面の少なくとも一部を含むエピトープに結合する。
【００３９】
さらに別の実施形態では、抗Ｎｒｐ抗体は、Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に結合する。
【００４０】
さらなる実施形態では、抗Ｎｒｐ抗体は、Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．１０ｎＭ、またはＮｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．１５ｎＭ、またはＮｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．２０ｎＭ、またはＮｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．２５ｎＭ、またはＮｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．３０ｎＭの結合親和性を有する。
【００４１】
別の実施形態では、抗Ｎｒｐ抗体は、Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方へのＳｅｍａ３の結合を阻止する。
【００４２】
さらに別の実施形態では、抗Ｎｒｐ抗体は、Ｎｒｐ１またはＮｒｐ２へのＶＥＧＦの結合を阻止しない。
【００４３】
異なる実施形態では、抗Ｎｒｐ抗体は、インビトロにおいて、セマフォリンの生物学的活性を阻害する。
【００４４】
さらなる実施形態では、抗Ｎｒｐ抗体は、インビボにおいて、セマフォリンの生物学的活性を阻害する。
【００４５】
別の局面では、本発明は、セマフォリンアンタゴニストを調製する方法に関し、この方法は、Ｎｒｐ２ａ１ａ２ｂ１ｂ２アミノ酸配列のアミノ酸残基Ｙ３９、Ｙ４５、Ｐ４６、Ｑ４７、Ｆ７２、Ｎ７３、Ｐ７４、Ｈ７５、Ｆ７６、Ａ１３３およびＲ１３８によって定義される界面の少なくとも一部を含む部位に結合する分子を設計する工程、その化合物を合成する工程、およびその化合物がＮｒｐ１およびＮｒｐ２へのセマフォリンの結合を阻止することを確認する工程を包含する。
【００４６】
１つの実施形態において、上記アンタゴニストは、Ｎｒｐ１またはＮｒｐ２へのＶＥＧＦの結合を妨げず、上記方法は、前記アンタゴニストがＮｒｐ１またはＮｒｐ２へのＶＥＧＦの結合を妨げないことを確認するさらなる工程（ｓｔｅ）を包含し得る。
【００４７】
別の実施形態では、上記方法は、上記アンタゴニストがＶＥＧＦの生物学的活性を妨げないことを確かめる工程をさらに包含する。
【００４８】
上記アンタゴニストは、例えば、抗体、抗体フラグメント、結合ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチド小分子からなる群より選択され得、好ましくは、抗体または抗体フラグメントであり、ここで、抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、線状抗体（linear ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ダイアボディ、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
別の局面では、本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストを調製する方法に関し、この方法は、Ｎｒｐ１ｂ１フラグメントと、抗Ｎｒｐ１Ｂ抗体（ＹＷ１０７．４．８７）のＦａｂフラグメントとの間で形成される複合体の結晶から得られる３次元構造（その結晶は、前記複合体の３次元構造を表す回折パターンを生成するＸ線放射線を回折し、以下のおおよそのセル定数ａ＝２１３Å、ｂ＝２１３Å、ｃ＝４５．３ÅおよびＨ３という空間群を有する）を使用することにより、前記Ｎｒｐ１Ｂ抗体によって結合されるエピトープの少なくとも一部を含む部位に結合する分子を設計する工程、その化合物を合成する工程、およびその化合物がＮｒｐ１へのＶＥＧＦの結合を阻害することを確認する工程を包含する。
【００５０】
１つの実施形態において、上記アンタゴニストは、Ｎｒｐ１へのセマフォリンの結合を妨げず、上記方法は、これを確認する工程をさらに包含し得る。
【００５１】
別の実施形態では、上記アンタゴニストは、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害する。
【００５２】
さらに別の実施形態では、上記方法は、上記アンタゴニストがＶＥＧＦの生物学的活性を阻害することを確認する工程をさらに包含する。
【００５３】
さらなる実施形態では、上記アンタゴニストは、血管リモデリングを阻害する。
【００５４】
なおもさらなる実施形態では、上記アンタゴニストは、抗体、抗体フラグメント、結合ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチド小分子からなる群より選択され、好ましくは、抗体または抗体フラグメントであり、ここで、抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、線状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体であり得る。
【００５５】
本発明は、さらに、癌を処置するための方法に関し、この方法は、その必要のある哺乳動物被験体に、本発明の前述の方法によって調製される有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する。癌は、例えば、乳癌、直腸結腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫および多発性骨髄腫からなる群より選択され得る。
【００５６】
別の実施形態では、上記処置は、第２の治療薬をさらに含み、ここで、その第２の治療薬は、さらなるＶＥＧＦアンタゴニストなどの、抗新脈管形成剤、抗腫瘍性組成物、化学療法剤および細胞傷害剤からなる群より選択される薬剤であり得るが、これらに限定されない。
【００５７】
さらなる実施形態では、上記さらなるＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ｈＶＥＧＦ抗体またはそのフラグメントである。
【００５８】
抗ｈＶＥＧＦ抗体は、例えば、抗体Ａ４．６．１、具体的には、ベバシズマブまたはラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）と同じＶＥＧＦエピトープに結合することができる。
【００５９】
他の実施形態では、第２の治療薬は、バタラニブ（ｖａｔａｌａｎｉｂ）（ＰＴＫ７８７）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ＯＳＩ−７９０４、ＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標））、ＺＤ６１２６（ＡＮＧ４５３）、ＺＤ１８３９、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、セマキサニブ（ｓｅｍａｘａｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、ＡＭＧ７０６、ＡＧ０１３７３６、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＭＬＮ−５１８、ＣＥＰ−７０１、ＰＫＣ−４１２、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）（ＧＳＫ５７２０１６）、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、ＸＬ８８０およびＣＨＩＲ−２６５からなる群より選択されるレセプターチロシンキナーゼインヒビタである。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば以下の結晶などが提供される：
（項目１）
Ｘ線放射線を回折して、Ｎｒｐ１ｂ１ｂ２フラグメントの３次元構造を表す、以下のおおよそのセル定数ａ＝６５．９Å、ｂ＝６６．７Å、ｃ＝７４．７ÅおよびＰ２１２１２１という空間群を有する回折パターンを生成する、該フラグメントによって形成される結晶。
（項目２）
Ｘ線放射線を回折して、Ｎｒｐ１ａ２ｂ１ｂ２フラグメントの３次元構造を表す、以下のおおよそのセル定数ａ＝５３．２Å、ｂ＝６８．２Å、ｃ＝６６．６ÅおよびＰ２１という空間群を有する回折パターンを生成する、該フラグメントによって形成される結晶。
（項目３）
Ｎｒｐ１ｂ１フラグメントと、Ｎｒｐ１への血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の結合を阻害する抗Ｎｒｐ１Ｂ抗体（ＹＷ１０７．４．８７）のＦａｂフラグメントとの間で形成される複合体の結晶であって、ここで、該結晶は、Ｘ線放射線を回折して、該複合体の３次元構造を表す、以下のおおよそのセル定数ａ＝２１３Å、ｂ＝２１３Å、ｃ＝４５．３ÅおよびＨ３という空間群を有する回折パターンを生成する、複合体の結晶。
（項目４）
Ｘ線放射線を回折して、Ｎｒｐ２ｂ１ｂ２フラグメントの３次元構造を表す、以下のおおよそのセル定数ａ＝３６．５Å、ｂ＝７０．５Å、ｃ＝１２２ÅおよびＰ２１２１２１という空間群を有する回折パターンを生成する、該フラグメントによって形成される結晶。
（項目５）
Ｘ線放射線を回折して、Ｎｒｐ２ａ２ｂ１ｂ２フラグメントの３次元構造を表す、以下のおおよそのセル定数ａ＝５０．１Å、ｂ＝１９３Å、ｃ＝６６．２ÅおよびＰ２１という空間群を有する回折パターンを生成する、該フラグメントによって形成される結晶。
（項目６）
Ｎｒｐ２ａ１ａ２ｂ１ｂ２フラグメントと、Ｎｒｐ２へのセマフォリンの結合を阻害する抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体のＦａｂフラグメントとの間で形成される複合体の結晶であって、ここで、該結晶は、Ｘ線放射線を回折して、該複合体の３次元構造を表す、以下のおおよそのセル定数ａ＝１４８Å、ｂ＝１０６Å、ｃ＝９２．４ÅおよびＣ２という空間群を有する回折パターンを生成する、複合体の結晶。
（項目７）
Ｎｒｐ２ａ１ａ２ｂ１ｂ２フラグメントと、Ｎｒｐ２へのセマフォリンの結合を阻害する抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体のＦａｂフラグメントとの間で形成される複合体の結晶であって、ここで、該結晶は、Ｘ線放射線を回折して、該複合体の３次元構造を表す、以下のおおよそのセル定数ａ＝１２１Å、ｂ＝１２１Å、ｃ＝２０３ÅおよびＰ３２２１という空間群を有する回折パターンを生成する、複合体の結晶。
（項目８）
図７に示される軽鎖可変ドメイン配列および／もしくは図８に示される重鎖可変ドメイン配列を含む、抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体、またはそのフラグメント。
（項目９）
図９Ａに示される配列を含む、抗ｐａｎＮｒｐＡＹＷ６８．１１抗体Ｆａｂフラグメント。
（項目１０）
図９Ｂに示される配列を含む、抗ｐａｎＮｒｐＡＹＷ６８．１１．２６抗体Ｆａｂフラグメント。
（項目１１）
抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体と、Ｎｒｐへの結合について競合する、抗Ｎｒｐ抗体。
（項目１２）
前記抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体と同じエピトープに本質的に結合する、項目１１に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目１３）
前記Ｎｒｐ２ａ１ａ２ｂ１ｂ２アミノ酸配列のアミノ酸残基Ｙ３９、Ｙ４５、Ｐ４６、Ｑ４７、Ｆ７２、Ｎ７３  Ｐ７４、Ｈ７５、Ｆ７６、Ａ１３３およびＲ１３８によって定義される界面の少なくとも一部を含むエピトープに結合する、項目１１に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目１４）
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に結合する、項目１１に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目１５）
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．１０ｎＭの結合親和性を有する、項目１４に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目１６）
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．１５ｎＭの結合親和性を有する、項目１４に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目１７）
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．２０ｎＭの結合親和性を有する、項目１４に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目１８）
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．２５ｎＭの結合親和性を有する、項目１４に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目１９）
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方に対して少なくとも約０．３０ｎＭの結合親和性を有する、項目１４に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目２０）
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方へのＳｅｍａ３の結合を阻止する、項目１４に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目２１）
Ｎｒｐ１またはＮｒｐ２へのＶＥＧＦの結合を阻止しない、項目２０に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目２２）
インビトロにおいてセマフォリンの生物学的活性を阻害する、項目２０または項目２１に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目２３）
インビボにおいてセマフォリンの生物学的活性を阻害する、項目２０または項目２に記載の抗Ｎｒｐ抗体。
（項目２４）
セマフォリンアンタゴニストを調製する方法であって、Ｎｒｐ２ａ１ａ２ｂ１ｂ２アミノ酸配列のアミノ酸残基Ｙ３９、Ｙ４５、Ｐ４６、Ｑ４７、Ｆ７２、Ｎ７３、Ｐ７４、Ｈ７５、Ｆ７６、Ａ１３３およびＲ１３８によって定義される界面の少なくとも一部を含む部位に結合する分子を設計する工程、化合物を合成する工程、および該化合物がＮｒｐ１およびＮｒｐ２へのセマフォリンの結合を阻止することを確認する工程を包含する、方法。
（項目２５）
前記アンタゴニストが、Ｎｒｐ１またはＮｒｐ２へのＶＥＧＦの結合を妨げない、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記アンタゴニストがＮｒｐ１またはＮｒｐ２へのＶＥＧＦの結合を妨げないことを確認する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記アンタゴニストがＶＥＧＦの生物学的活性を妨げないことを確認する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記アンタゴニストが、抗体、抗体フラグメント、結合ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチド小分子からなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記アンタゴニストが、抗体または抗体フラグメントである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、線状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体からなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
ＶＥＧＦアンタゴニストを調製する方法であって、Ｎｒｐ１ｂ１フラグメントと、抗Ｎｒｐ１Ｂ抗体（ＹＷ１０７．４．８７）のＦａｂフラグメントとの間で形成される複合体の結晶から得られる３次元構造を使用することにより、該Ｎｒｐ１Ｂ抗体によって結合されるエピトープの少なくとも一部を含む部位に結合する分子を設計する工程であって、ここで、該結晶は、Ｘ線放射線を回折して、該複合体の３次元構造を表す、以下のおおよそのセル定数ａ＝２１３Å、ｂ＝２１３Å、ｃ＝４５．３ÅおよびＨ３という空間群を有する回折パターンを生成する、工程、化合物を合成する工程、および該化合物がＮｒｐ１へのＶＥＧＦの結合を阻害することを確認する工程を包含する、方法。
（項目３２）
前記アンタゴニストが、Ｎｒｐ１へのセマフォリンの結合を妨げない、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記アンタゴニストが、Ｎｒｐ１へのセマフォリンの結合を妨げないことを確認する工程をさらに包含する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記アンタゴニストが、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害する、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記アンタゴニストがＶＥＧＦの生物学的活性を阻害することを確認する工程をさらに包含する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記アンタゴニストが、血管リモデリングを阻害する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記アンタゴニストが、抗体、抗体フラグメント、結合ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチド小分子からなる群より選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記アンタゴニストが、抗体または抗体フラグメントである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、線状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体からなる群より選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
癌を処置するための方法であって、その必要のある哺乳動物の被験体に、項目３１に記載の方法によって調製される有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目４１）
前記癌が、乳癌、直腸結腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫および多発性骨髄腫からなる群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記処置が、第２の治療薬をさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記第２の治療薬が、抗新脈管形成剤、抗腫瘍性組成物、化学療法剤および細胞傷害剤からなる群より選択される薬剤である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記抗新脈管形成剤が、さらなるＶＥＧＦアンタゴニストである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記さらなるＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ｈＶＥＧＦ抗体またはそのフラグメントである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記抗ｈＶＥＧＦ抗体が、抗体Ａ４．６．１と同じＶＥＧＦエピトープに結合することができる、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記抗ｈＶＥＧＦ抗体が、ベバシズマブまたはラニビズマブである、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記第２の治療薬が、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ＯＳＩ−７９０４、ＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標））、ＺＤ６１２６（ＡＮＧ４５３）、ＺＤ１８３９、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、セマキサニブ（ＳＵ５４１６）、ＡＭＧ７０６、ＡＧ０１３７３６、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＭＬＮ−５１８、ＣＥＰ−７０１、ＰＫＣ−４１２、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６）、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、ＸＬ８８０およびＣＨＩＲ−２６５からなる群より選択されるレセプターチロシンキナーゼインヒビタである、項目４２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１−１】表１−データ収集および精密化統計量。
【図１−２】図１−ＶＥＧＦはＤＲＧニューロンのＳｅｍａ３Ａ誘導性成長円錐崩壊を阻止しない。Ａ）軸索成長円錐の像。未処置のＤＲＧは、Ｓｅｍａ３Ａが加えられると著しく縮小するアクチンが豊富な大きな成長円錐（矢頭）を有する。抗Ｎｒｐ抗体を５０μｇ／ｍｌで加えた。Ｂ）Ｓｅｍａ３Ａ誘導性の成長円錐崩壊の定量化。崩壊した成長円錐のパーセンテージを、崩壊した成長円錐および崩壊していない成長円錐を数えることによって計算した（１条件あたりＮ＝４つの外植片）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図２Ａ】図２−ニューロピリン結晶構造の要約。Ａ）Ｎｒｐ外部ドメインは、タンデム型ＣＵＢ（ａ１ａ２）、タンデム型凝固因子Ｖ／ＶＩＩＩ（ｂ１ｂ２）および１つのＭＡＭ（ｃ１）ドメインを含む。この報告に示される７つの結晶構造の絵による描写の下に解像度限界を列挙した。橙色の球は、ａ２ドメイン内の結合しているカルシウムイオンを示している。Ｂ）ヒトＮｒｐ１およびＮｒｐ２のａ１ａ２ｂ１ｂ２ドメインの配列アラインメント。二次構造エレメントとは、Ｎｒｐ２−ａ１ａ２ｂ１ｂ２構造のことを指し（青色、ａ１；緑色、ａ２；黄色、ｂ１；赤色、ｂ２）、この二次構造エレメントは、精子アドヘシン（ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ）ＣＵＢドメイン（Ｒｏｍｅｒｏ，Ａ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４，７８３−８（１９９７））および凝固因子ＶＣ２ドメインＭａｃｅｄｏ−Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，４３４−９（１９９９））に対して採用されている慣習に従って命名される。青色および黄色で囲まれている残基は、それぞれ抗ｐａｎＮｒｐＡおよび抗Ｎｒｐ１Ｂに対する抗体エピトープを表している。橙色で強調されたアミノ酸は、ａ２におけるＣａ２＋結合部位を示しており、赤色で強調された残基は、ａ１ドメインにおける推定上のＣａ２＋結合部位を表している。緑色で影がかけられている残基は、Ｓｅｍａ３ＡとＮｒｐ１との相互作用を妨害するアミノ酸置換の位置を強調している（Ｇｕ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，１８０６９−７６（２００２））。このアラインメントは、ＥｓＰｒｉｐｔ（Ｇｏｕｅｔ，Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｉ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，３３２０−３（２００３））を用いて生成した。
【図２Ｂ】図２−ニューロピリン結晶構造の要約。Ａ）Ｎｒｐ外部ドメインは、タンデム型ＣＵＢ（ａ１ａ２）、タンデム型凝固因子Ｖ／ＶＩＩＩ（ｂ１ｂ２）および１つのＭＡＭ（ｃ１）ドメインを含む。この報告に示される７つの結晶構造の絵による描写の下に解像度限界を列挙した。橙色の球は、ａ２ドメイン内の結合しているカルシウムイオンを示している。Ｂ）ヒトＮｒｐ１およびＮｒｐ２のａ１ａ２ｂ１ｂ２ドメインの配列アラインメント。二次構造エレメントとは、Ｎｒｐ２−ａ１ａ２ｂ１ｂ２構造のことを指し（青色、ａ１；緑色、ａ２；黄色、ｂ１；赤色、ｂ２）、この二次構造エレメントは、精子アドヘシン（ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ）ＣＵＢドメイン（Ｒｏｍｅｒｏ，Ａ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４，７８３−８（１９９７））および凝固因子ＶＣ２ドメインＭａｃｅｄｏ−Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，４３４−９（１９９９））に対して採用されている慣習に従って命名される。青色および黄色で囲まれている残基は、それぞれ抗ｐａｎＮｒｐＡおよび抗Ｎｒｐ１Ｂに対する抗体エピトープを表している。橙色で強調されたアミノ酸は、ａ２におけるＣａ２＋結合部位を示しており、赤色で強調された残基は、ａ１ドメインにおける推定上のＣａ２＋結合部位を表している。緑色で影がかけられている残基は、Ｓｅｍａ３ＡとＮｒｐ１との相互作用を妨害するアミノ酸置換の位置を強調している（Ｇｕ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，１８０６９−７６（２００２））。このアラインメントは、ＥｓＰｒｉｐｔ（Ｇｏｕｅｔ，Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｉ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，３３２０−３（２００３））を用いて生成した。
【図３】図３−ニューロピリンの全体的なドメイン構成。Ａ）抗ｐａｎＮｒｐＡのＦａｂフラグメント（淡橙色、重鎖；灰色、軽鎖）との複合体での、Ｎｒｐ２のドメイン組成（青色、ａ１；緑色、ａ２；黄色、ｂ１；赤色、ｂ２）。Ｎ−グリコシル化された残基は、赤紫色で示されている。Ｂ）Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のａ２ｂ１ｂ２構造のリボン表示；橙色の球は、結合したカルシウムイオンを強調している。Ｃ）ａ２ｂ１ｂ２ドメインに基づいた、２つの異なる結晶型のＮｒｐ２／Ｆａｂ複合体の重ね合わせ。ａ２ｂ１ｂ２領域と比較すると、ａ１ドメインの重ね合わせは不良であることに注目されたい。すべての構造図は、ＰｙＭｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて作成した。
【図４】図４−ニューロピリンＣＵＢドメインの分子の詳細。Ａ）ａ２ｂ１ｂ２構造では、ａ２ドメインは、結合しているカルシウムイオン（橙色）を含む。Ｎｒｐ  ａ１ドメイン（パネルＣを参照のこと）およびａ２ドメインは、精子アドヘシンに見られるｂ１ストランド（Ｒｏｍｅｒｏら、前出）を欠く。Ｂ）Ｎｒｐ１  ａ２ドメインのカルシウムイオンは、３つの負に帯電したアミノ酸、２つの主鎖カルボニル酸素および水分子によって配位される。これらの相互作用は、Ｎｒｐ間で高度に保存されている（図Ｓ２〜Ｓ３を参照のこと）。Ｃ）（左のパネル）Ｎｒｐ２／Ｆａｂ界面において埋もれている溶媒接触表面（ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）のパーセンテージに従ってアミノ酸に色を付けた（赤色、７５〜１００％；橙色、５０〜７４％；黄色、２５〜４９％）。抗ｐａｎＮｒｐＡは、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２に交差反応し、この構造エピトープ内の１４残基中１１残基が、同一である（黒文字、同一；白文字、非保存；星印は、側鎖がａ１タンパク質コアに向かっている残基を示す）。緑色で示された残基は、Ｎｒｐ１とＳｅｍａ３Ａ２３との相互作用に必要なアミノ酸置換の位置を表している。（右のパネル）これらのアミノ酸置換のＣα原子が、緑色の球として示されている。紫色で影がかけられたＣα原子は、推定上のカルシウム結合部位を表している。Ｄ）抗ｐａｎＮｒｐＡ／Ｎｒｐ２の界面。Ｎｒｐ２は、静電ポテンシャルに従って分子表面として示されている（赤色、酸性；青色、塩基性）。抗体接触残基は、ＣＤＲ  Ｈ２、Ｈ３およびＬ３からの芳香族の残基によって支配されている。
【図５】図５−Ｎｒｐ  ＶＥＧＦ−およびヘパリン−結合ドメインの特徴。Ａ）Ｎｒｐ  ｂ１ｂ２結晶構造の重ね合わせ（Ｎｒｐ１、黄色（ｂ１）および赤色（ｂ２）；Ｎｒｐ２、灰色）。青色（Ｎｒｐ１）および緑色（Ｎｒｐ２）の残基は、ｂ１ではなくｂ２の「スパイク」における立体配座の相違を強調している。Ｂ）ラット（ＰＤＢアクセッション番号２ＯＲＺ）（Ｖａｎｃｅｒ  Ｋｏｏｉ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００７））およびヒトのｂ１ｂ２結晶構造の分子表面に、静電ポテンシャルによって色を付けた。黄色の矢印は、ｂ１ドメインにおける「スパイク」によって形成され、ラットの構造ではタフトシン結合部位である酸性の溝を示している（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉら、前出）。緑色の矢印は、ヘパリン結合パッチのおおよその位置を示している。Ｃ）１２個のＮｒｐ間におけるｂ１ｂ２ドメインの相対的配列保存（緑色、１００％；黄色、≧７５％）（図Ｓ３）は、ヒトＮｒｐ１  ｂ１ｂ２構造の表面上にマッピングされた。２つの高度に保存されたパッチは、橙色で表されている。青緑色で示された残基は、抗Ｎｒｐ１Ｂ−Ｆａｂ／ｂ１複合体におけるＦａｂと接触する残基を示している。ａ２ドメイン（淡黄色）は、Ｎｒｐ１由来のｂ１ｂ２構造とａ２ｂ１ｂ２構造との重ねあわせを用いることによって示されている。Ｄ）抗Ｎｒｐ１Ｂ−Ｆａｂ／ｂ１複合体のリボン表示（黄色、ｂ１；橙色、重鎖；灰色、軽鎖）。Ｅ）抗Ｎｒｐ１Ｂ／ｂ１の界面。ｂ１ドメインは、静電ポテンシャルに従って分子表面として描かれている；黄色の矢印は、ＶＥＧＦテイルに結合する溝を示している。ＣＤＲ  Ｈ３およびＬ１だけが、ｂ１と接触する。
【図６】図６−Ｎｒｐ２の結晶学的な二量体が、ＶＥＧＦ結合およびセマフォリン結合についてのモデルを提唱する。Ａ）Ｎｒｐ２は、Ｎｒｐ２／Ｆａｂ複合体の両方の結晶型において鞍形二量体を形成する。この図は、Ｆａｂ複合体の単斜晶型からのＮｒｐ２  ａ１ａ２ｂ１ｂ２ドメインを強調している。推定上のＶＥＧＦテイル結合部位、ヘパリン結合部位およびセマフォリン結合部位が示されている。Ｂ）結晶構造におけるＮｒｐ  ａ１介在性二量体に基づいた、ＶＥＧＦ／Ｎｒｐ複合体およびセマフォリン／Ｎｒｐ複合体の潜在的なモデル。
【図７】図７−抗ｐａｎＮｒｐＡクローンＹＷ６８．１１およびＹＷ６８．１１．２６の軽鎖可変ドメイン配列アラインメント。
【図８】図８−抗ｐａｎＮｒｐＡクローンＹＷ６８．１１およびＹＷ６８．１１．２６の重鎖可変ドメイン配列アラインメント。
【図９】図９Ａ−ヒト抗ｐａｎＮｒｐＡＩｇＧ１抗体ＹＷ６８．１１の完全な配列。図９Ｂ−ヒト抗ｐａｎＮｒｐＡＩｇＧ１抗体ＹＷ６８．１１．２６の完全な配列。
【図１０】表Ｓ１−結晶化および凍結保護に使用した条件。
【図１１】図Ｓ１−抗Ｎｒｐ抗体結合動態の解析。抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体のＢＩＡｃｏｒｅ動態解析。ＩｇＧ固定化ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップに対する２５℃での５００ｎＭの各ヒトＮＲＰタンパク質の注入についてのセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）は、結合特異性を証明している。抗ｐａｎＮｒｐＡは、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のａ１ａ２ｂ１ｂ２に結合するが、Ｎｒｐ２のｂ１ｂ２ドメインに結合しない。
【図１２−１】図Ｓ２−Ｎｒｐ  ＣＵＢドメインは、保存されたカルシウム結合部位を含む。Ａ）Ｎｒｐ１  ａ２ｂ１ｂ２構造におけるカルシウムイオンの周りの電子密度（１．５σで線が引かれている最終的な２Ｆ０−Ｆｃマップ。Ｂ）Ｎｒｐ２  ａ２ドメインのカルシウムイオン。Ｃ）カルシウム結合部位を表している３つの負に帯電したアミノ酸（橙色で影がかけられている）は、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２由来のＣＵＢドメインにおいて保存されている。
【図１２−２】図Ｓ２−Ｎｒｐ  ＣＵＢドメインは、保存されたカルシウム結合部位を含む。Ａ）Ｎｒｐ１  ａ２ｂ１ｂ２構造におけるカルシウムイオンの周りの電子密度（１．５σで線が引かれている最終的な２Ｆ０−Ｆｃマップ。Ｂ）Ｎｒｐ２  ａ２ドメインのカルシウムイオン。Ｃ）カルシウム結合部位を表している３つの負に帯電したアミノ酸（橙色で影がかけられている）は、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２由来のＣＵＢドメインにおいて保存されている。
【図１３−１】図Ｓ３−ニューロピリンの配列アラインメント。ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ（ＢＲＡＲＥ）、カエル（ＸＥＮＬＡ）およびニワトリのＮｒｐ１およびＮｒｐ２由来のａ１ａ２ｂ１ｂ２ドメインの完全長配列アラインメント。この図は、図２Ｂと同じスキームを用いて色がつけられており、ＥｓＰｒｉｐｔ（Ｇｏｕｅｔ  Ｐ．ら、前出）を用いて作成された。
【図１３−２】図Ｓ３−ニューロピリンの配列アラインメント。ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ（ＢＲＡＲＥ）、カエル（ＸＥＮＬＡ）およびニワトリのＮｒｐ１およびＮｒｐ２由来のａ１ａ２ｂ１ｂ２ドメインの完全長配列アラインメント。この図は、図２Ｂと同じスキームを用いて色がつけられており、ＥｓＰｒｉｐｔ（Ｇｏｕｅｔ  Ｐ．ら、前出）を用いて作成された。
【図１３−３】図Ｓ３−ニューロピリンの配列アラインメント。ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ（ＢＲＡＲＥ）、カエル（ＸＥＮＬＡ）およびニワトリのＮｒｐ１およびＮｒｐ２由来のａ１ａ２ｂ１ｂ２ドメインの完全長配列アラインメント。この図は、図２Ｂと同じスキームを用いて色がつけられており、ＥｓＰｒｉｐｔ（Ｇｏｕｅｔ  Ｐ．ら、前出）を用いて作成された。
【図１３−４】図Ｓ３−ニューロピリンの配列アラインメント。ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ（ＢＲＡＲＥ）、カエル（ＸＥＮＬＡ）およびニワトリのＮｒｐ１およびＮｒｐ２由来のａ１ａ２ｂ１ｂ２ドメインの完全長配列アラインメント。この図は、図２Ｂと同じスキームを用いて色がつけられており、ＥｓＰｒｉｐｔ（Ｇｏｕｅｔ  Ｐ．ら、前出）を用いて作成された。
【図１４】図Ｓ４−Ｎｒｐ１／タフトシンとｂ１／Ｆａｂ構造との比較。Ａ）ｎｒｐ１−ｂ１／抗Ｎｒｐ１Ｂ−Ｆａｂ複合体において、対称関連分子由来の重鎖のＣ末端のテイル（紫色）は、タフトシン結合部位を占有する（Ｎｒｐ２、静電ポテンシャルによる分子表面；橙色、抗体重鎖；灰色、抗体軽鎖）。Ｂ）ラットＮｒｐ１  ｂ１ｂ２（ＰＤＢアクセッション番号２ＯＲＺ）（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉら、前出）との複合体でのタフトシンの位置（緑色）。Ｃ）パネルＡにおいて強調された２つの構造の重ね合わせ。抗体およびタフトシンペプチドは、先のパネルと同様に色が付けられており、ヒトＮｒｐ１  ｂ１は、黄色が付けられており、ラットＮｒｐ１  ｂ１ｂ２は、青緑色が付けられている。
【図１５】図Ｓ５−Ｎｒｐ２二量体の界面。Ａ）この構造の単斜晶型において見られるようなＮｒｐ２−ａ１ａ２ｂ１ｂ２／Ｆａｂ二量体のリボン表示。Ｂ）Ｎｒｐ２／Ｆａｂ結晶構造上へのＮｒｐ１−ｂ１／抗Ｎｒｐ１Ｂ−Ｆａｂ構造の重ね合わせ。Ｃ）二量体化時に埋もれる溶媒接触表面のパーセンテージに従って、ａ１／ａ１界面に埋もれているアミノ酸に色をつけている（赤色、７５〜１００％；橙色、５０〜７４％；黄色、２５〜４９％）。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＮＲＰ媒介性の生物学的活性を調節するための新規の結晶構造、組成物、方法、およびＮＲＰ媒介性の生物学的活性を調節することができる候補を同定するスクリーニングアッセイに関する。
【００６２】
定義
「ニューロピリン」またはＮＲＰとは、Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌら（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７０：２１１−２２２に記載されているような、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）、ニューロピリン−２（ＮＲＰ２）ならびにそれらのアイソフォームおよびバリアントのことを集合的に指す。ニューロピリンは、１２０〜１３０ｋＤａの非チロシンキナーゼレセプターである。複数のＮＲＰ−１およびＮＲＰ−２スプライスバリアントおよび可溶性アイソフォームが存在する。ニューロピリンの基本構造は、５つのドメイン：３つの細胞外ドメイン（ａ１ａ２、ｂ１ｂ２およびｃ）、膜貫通型ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ａ１ａ２ドメインは、補体成分Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ（ＣＵＢ）と相同であり、通常、２つのジスルフィド（ｄｉｓｃｕｌｆｉｄ）架橋を形成する４個のシステイン残基を含む。ｂ１ｂ２ドメインは、凝固因子ＶおよびＶＩＩＩと相同である。ｃドメインの中央の部分は、メプリン（ｍｅｐｒｉｎ）、Ａ５およびレセプターチロシンホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ）μタンパク質と相同性を示すことに起因して、ＭＡＭと命名されている。ａ１ａ２およびｂ１ｂ２ドメインは、リガンド結合に関与する一方で、ｃドメインは、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化にとって非常に重要である。Ｇｕら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２７７：１８０６９−７６；Ｈｅ  ａｎｄ  Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ９０：７３９−５１。
【００６３】
「ニューロピリン媒介性の生物学的活性」とは、一般に、ニューロピリン−１および／またはニューロピリン−２が実質的な役割を果たす生理学的または病理学的な事象のことを指す。そのような活性の非限定的な例は、胚の神経系発生中またはニューロン再生中の軸索ガイダンス、新脈管形成（血管モデリングを含む）、腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｇｅｎｅｓｉｓ）および腫瘍転移である。
【００６４】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを特に包含する。
【００６５】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用されるとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことを指し、すなわち、その集団を構成する個別の抗体は、微量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、代表的には様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られているという抗体の特性を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製が必要であると解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって初めて報告されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８：およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７に記載されている手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離され得る。
【００６６】
本明細書中のモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体における対応配列、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか、あるいは相同でありながら、それらの鎖の残りの部分が、別の種に由来する抗体における対応配列または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか、あるいは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。
【００６７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、大部分について、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）の超可変領域由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、代表的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと。
【００６８】
「種依存性抗体」は、第１の哺乳動物種由来の抗原に対する結合親和性のほうが第２の哺乳動物種由来の抗原のホモログに対する結合親和性よりも強い抗体のことである。通常、種依存性抗体は、あるヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、たった約１×１０−７Ｍ、好ましくは、たった約１×１０−８Ｍ、最も好ましくは、たった約１×１０−９Ｍの結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍または少なくとも約５００倍または少なくとも約１０００倍弱い、第２の非ヒト哺乳動物種由来のホモログに対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義したような様々なタイプの抗体のうちのいずれでもあり得るが、好ましくは、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００６９】
本明細書中で使用されるとき、「抗体変異体」または「抗体バリアント」とは、種依存性抗体のアミノ酸配列バリアントのことを指し、ここで、その種依存性抗体のアミノ酸残基の１つ以上が改変されている。そのような変異体は、必然的に、種依存性抗体と１００％未満の配列の同一性または類似性を有する。好ましい実施形態において、抗体変異体は、種依存性抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または類似性は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するようにギャップを導入した後に、種依存性抗体残基と、同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づいた同じ群由来のアミノ酸残基、以下を参照のこと）である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと本明細書中で定義される。可変ドメインの外側の抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失または挿入は、配列の同一性または類似性に影響を及ぼすと解釈されてはならない。
【００７０】
「単離された」抗体は、同定されていて、そしてその天然の環境の成分から分離および／または回収されている抗体である。その天然の環境の夾雑物成分は、抗体に対する診断的または治療的な用途を妨げ得る材料であり、それらとしては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、その抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって測定されるとき、抗体の９５重量％超に、最も好ましくは、９９重量％超に、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）クマシーブルー、もしくは好ましくは、銀染色を用いる、還元条件下もしくは非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一に、精製される。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュの抗体を包含する。なぜなら、そこには抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００７１】
本明細書中で使用されるとき、「抗体可変ドメイン」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖の部分のことを指す。ＶＨとは、重鎖の可変ドメインのことを指す。ＶＬとは、軽鎖の可変ドメインのことを指す。本発明において使用される方法によれば、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１））に従って定義され得る。抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸のナンバリングもまた、Ｋａｂａｔに従う。
【００７２】
本明細書中で使用されるとき、用語「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）とは、抗体可変ドメインのアミノ酸残基のことを指し、その存在は、抗原結合に必要である。各可変ドメインは、代表的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と識別される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義されるような「相補性決定領域」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基約２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含み得る。いくつかの場合において、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されるＣＤＲ領域と超可変ループとの両方由来のアミノ酸を含み得る。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
【００７３】
「フレームワーク領域」（本明細書中以後、ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、代表的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と識別される４つのＦＲを有する。ＣＤＲが、Ｋａｂａｔに従って定義される場合、軽鎖ＦＲ残基は、残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）および９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基における残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）および１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが、超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖における残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）および９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基における残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）および１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。いくつかの場合において、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲと、超可変ループとの両方に由来するアミノ酸を含むとき、ＦＲ残基は、しかるべく調整される。例えば、ＣＤＲＨ１が、アミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は、１〜２５位であり、ＦＲ２残基は、３６〜４９位である。
【００７４】
本明細書中で使用されるとき、「コドンセット」とは、所望のバリアントアミノ酸をコードするために使用される様々なヌクレオチドトリプレット配列のセットのことを指す。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば、固相合成法により合成され得、それは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットのすべての可能な組み合わせであり、かつ所望の群のアミノ酸をコードする配列を含む。コドン命名の標準的な形態は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載されるＩＵＢコードの形態である。コドンセットは、代表的には、斜体の３つの大文字で表される（例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなど）。したがって、「非ランダムコドンセット」とは、本明細書中で使用されるとき、本明細書中に記載されるようなアミノ酸選択に対する基準を部分的に、好ましくは、完全に満たす、選ばれたアミノ酸をコードするコドンセットのことを指す。ある特定の位置において、選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知であり、例えば、ＴＲＩＭアプローチである（Ｋｎａｐｐｅｋら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６）；Ｇａｒｒａｒｄ  ＆  Ｈｅｎｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２８：１０３）。ある特定のコドンセットを有するそのようなオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）を使用して合成され得るか、または商業的に（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）入手可能である。ゆえに、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは、代表的には、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、その相違は、配列全体の中のコドンセットによって確立される。オリゴヌクレオチドは、本発明に従って使用されるとき、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションが可能であり、そして例えばクローニング目的で有用な、制限酵素部位を含み得る（が、必ずしも含まなくてもよい）配列を有する。
【００７５】
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。この領域は、天然において、例えば、ｓｃＦｖにおいて、共有結合であり得る堅固な会合での、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するように相互作用する。この６つのＣＤＲまたはそれらのサブセットは、一緒になって、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性は通常低い。
【００７６】
「Ｆａｂ」フラグメントは、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、ならびに重鎖の可変ドメインおよび第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、一般にＦａｂフラグメントのカルボキシ末端付近でそれらのフラグメント間のヒンジシステインによって共有結合されているＦａｂフラグメントの対を含む。抗体フラグメントの他の化学結合もまた当該分野で公知である。
【００７７】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖに関する概説として、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００７８】
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントのことを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨおよびＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成することができないくらい短いリンカーを用いることにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８に一層十分に記載されている。
【００７９】
表現「線状抗体」とは、Ｚａｐａｔａら（１９９５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２）に記載されている抗体のことを指す。簡潔には、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに抗原結合領域の対を形成するタンデム型のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む。線状抗体は、二重特異的または単一特異的であり得る。
【００８０】
本明細書中で使用されるとき、「ライブラリ」とは、複数の抗体配列もしくは抗体フラグメント配列（例えば、本発明のポリペプチド）またはこれらの配列をコードする複数の核酸のことを指し、これらの配列は、本発明の方法に従ってこれらの配列に導入されたバリアントアミノ酸の組み合わせが異なる。
【００８１】
「ファージディスプレイ」は、バリアントポリペプチドを、コートタンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてファージ（例えば、繊維状ファージ）の粒子の表面上にディスプレイする手法のことである。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質バリアントの大きなライブラリを、高親和性で標的抗原に結合するそれらの配列について迅速かつ効率的に選別することができるという事実にある。ペプチドライブラリおよびタンパク質ライブラリのファージ上のディスプレイは、何百万ものポリペプチドを、特異的な結合特性を有するものについてスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合を介して小さなランダムペプチドおよび低分子タンパク質をディスプレイするために使用されている。Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：３５５−３６２およびこれに引用されている参考文献。一価ファージディスプレイでは、タンパク質ライブラリまたはペプチドライブラリは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合されており、それらは、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下において低レベルで発現し、ファージ粒子は、融合タンパク質の１コピーをディスプレイするかまたはディスプレイしない。選別が、内因性リガンド親和性に基づくものであり、ＤＮＡ操作を簡便にするファージミドベクターを使用しているために、アビディティー効果は、多価ファージと比べて低い。Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５−０２１６。
【００８２】
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、繊維状バクテリオファージおよびラムダバクテリオファージをはじめとした任意の公知のバクテリオファージにおいて使用され得る。このプラスミドはまた、通常、抗生物質耐性についての選択マーカーを含む。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖され得る。これらのベクターを含む細胞は、ファージ粒子の産生に必要なすべての遺伝子が提供されると、プラスミドの複製様式をローリングサークル複製に変更することによって、プラスミドＤＮＡの１本の鎖のコピーを生成し、そしてファージ粒子を包む。ファージミドは、感染性または非感染性のファージ粒子を形成し得る。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上にディスプレイされるように遺伝子融合物として異種ポリペプチド遺伝子に連結されたファージコートタンパク質遺伝子またはそのフラグメントを含むファージミドを包含する。
【００８３】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含み、かつ複製することができる、バクテリオファージの二本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージの複製およびファージ粒子の形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、繊維状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージまたはそれらの派生物）またはラムダファージ（例えば、ラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４などまたはそれらの派生物）である。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、「溶媒接触位置」とは、潜在的に、溶媒の到達および／または抗体特異的抗原などの分子との接触に利用可能であるような、抗体または抗原結合フラグメントの構造、構造の集団および／またはモデル化された構造に基づいて決定される、起源の抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および軽鎖の可変領域におけるアミノ酸残基の位置のことを指す。これらの位置は、代表的には、ＣＤＲ内およびタンパク質の外面上に見られる。本明細書中に定義されるような、抗体または抗原結合フラグメントの溶媒接触位置は、当該分野で公知のいくつかのアルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。好ましくは、溶媒接触位置は、抗体の３次元モデルからの座標を使用して、好ましくは、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのコンピュータプログラムを使用して、決定される。溶媒接触位置はまた、当該分野で公知のアルゴリズムを使用しても決定され得る（例えば、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，３７９およびＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６，５４８）。溶媒接触位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる３次元構造情報を使用して行われ得る。これらの目的で利用され得るソフトウェアとしては、ＳＹＢＹＬ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が挙げられる。一般に、および好ましくは、アルゴリズム（プログラム）が、ユーザーによって入力されるサイズパラメータを必要とする場合、その計算に使用されるプローブの「サイズ」は、約１．４オングストロームまたはそれより小さい半径のセットである。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した、溶媒接触領域および面積法の決定は、Ｐａｃｉｏｓ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７−３８６に記載されている。
【００８５】
「新脈管形成因子または新脈管形成剤」は、血管の発生を刺激する成長因子、例えば、新脈管形成、内皮細胞成長、血管の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｙ）および／または脈管形成などを促進する成長因子である。例えば、新脈管形成因子としては、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリー、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、エフリン、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミッドカイン、ニューロピリン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子、特にＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦＲ−ベータ、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン（Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）、プロリフェリン（Ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）、トランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）などが挙げられるが、これらに限定されない。新脈管形成因子はまた、創傷治癒を加速させる因子（例えば、成長ホルモン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、ならびにＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ）を含み得る。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４；Ｔｏｎｉｎｉら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば、公知の新脈管形成因子を列挙している表１）；およびＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６を参照のこと。
【００８６】
「抗新脈管形成剤」または「新脈管形成インヒビタ」とは、新脈管形成、脈管形成または望ましくない脈管透過性を直接または間接的のいずれかで阻害する、低分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体またはそれらの結合体もしくは融合タンパク質のことを指す。抗新脈管形成剤は、新脈管形成因子またはそのレセプターに結合し、新脈管形成因子またはそのレセプターの脈管形成活性を阻止する物質を含むと理解されるべきである。例えば、抗新脈管形成剤は、上で定義したような脈管形成剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ａレセプター（例えば、ＫＤＲレセプターまたはＦｌｔ−１レセプター）に対する抗体、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（メシル酸イマチニブ）などの抗ＰＤＧＦＲインヒビタである。抗新脈管形成（Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｓｉｓ）剤は、天然の新脈管形成インヒビタ、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンなども含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９（例えば、悪性黒色腫における抗新脈管形成の治療を列挙している表３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４；Ｔｏｎｉｎｉら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば、公知の抗新脈管形成因子を列挙している表２）；およびＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６（例えば、臨床試験において使用されている抗新脈管形成剤を列挙している表１）を参照のこと。
【００８７】
用語「ＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦ−Ａ」とは、本明細書中で使用されるとき、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６およびＨｏｕｃｋら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ，５：１８０６に記載されているような１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子、ならびに関連の１２１、１８９および２０６アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子、そして、それらの天然に存在する対立遺伝子型およびプロセシングされた型のことを指す。用語「ＶＥＧＦ」とは、非ヒト種（例えば、マウス、ラットまたは霊長類）由来のＶＥＧＦのことも指す。時折、特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦに対するｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦに対するｍＶＥＧＦなどの用語として記載される。用語「ＶＥＧＦ」は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含むポリペプチドの切断型のことを指すためにも使用される。そのような形態のＶＥＧＦのいずれかに対する言及は、本願において例えば、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」または「ＶＥＧＦ１６５」によって特定され得る。「切断型」天然ＶＥＧＦに対するアミノ酸位置は、天然ＶＥＧＦ配列において示されるようにナンバリングされる。例えば、切断型天然ＶＥＧＦにおけるアミノ酸１７位（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦにおいても１７位（メチオニン）である。切断型天然ＶＥＧＦは、ＫＤＲおよびＦｌｔ−１レセプターに対して天然ＶＥＧＦに匹敵する結合親和性を有する。
【００８８】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性および特異性で、ＶＥＧＦに結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関わる疾患または状態を標的化する際および妨げる際に、治療薬として使用され得る。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログにも、他の成長因子（例えば、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦまたはｂＦＧＦ）にも結合しない。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｐｒｅｓｔａら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９に従って作製される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、そのような抗体としては、ベバシズマブ（ＢＶ；Ａｖａｓｔｉｎ（商標））として知られている抗体が挙げられるがこれに限定されない。
【００８９】
抗ＶＥＧＦ抗体である「ベバシズマブ（ＢＶ）」（「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）としても知られる）は、Ｐｒｅｓｔａら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９に従って作製される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これは、ヒトＶＥＧＦがそのレセプターに結合するのを阻止するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の変異されたヒトＩｇＧ１フレームワーク領域および抗原結合相補性決定領域を含む。ベバシズマブの約９３％のアミノ酸配列（フレームワーク領域の大部分を含む）が、ヒトＩｇＧ１由来であり、約７％の配列が、マウス抗体Ａ４．６．１由来である。ベバシズマブは、約１４９，０００ダルトンの分子質量を有し、グリコシル化されている。
【００９０】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」とは、ＶＥＧＦ活性（例えば、１つ以上のＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦの結合が挙げられるがこれに限定されない）を中和することができるか、阻止することができるか、阻害することができるか、抑止することができるか、低下させることができるか、または妨げることができる分子のことを指す。ＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合フラグメント、ＶＥＧＦに特異的に結合することにより、そのＶＥＧＦが１つ以上のレセプターに結合するのを抑えるレセプター分子および誘導体、抗ＶＥＧＦレセプター抗体およびＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビタ）が挙げられるがこれらに限定されない。用語「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、本明細書中で使用されるとき、ニューロピリン（ｎｅｕｔｒｏｐｉｌｉｎ）−１および／またはニューロピリン−２（Ｎｒｐ−１および／またはＮｒｐ−２）に結合し、ＶＥＧＦ活性を中和することができるか、阻止することができるか、阻害することができるか、抑止することができるか、低下させることができるか、または妨げることができる、抗体、抗体フラグメント、他の結合ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチド小分子を含む分子（例えば、抗Ｎｒｐ１および抗Ｎｒｐ２抗体、ならびにＮｒｐ１およびＮｒｐ２と交差反応する（ただし、ＶＥＧＦ活性を中和することができるか、阻止することができるか、阻害することができるか、抑止することができるか、低下させることができるか、または妨げることができる）抗体が挙げられるがこれらに限定されない）を特に包含する。したがって、用語「ＶＥＧＦ活性」は、ニューロピリン媒介性のＶＥＧＦの生物学的活性（本明細書中の上で定義したような活性）を特に包含する。
【００９１】
「セマフォリンアンタゴニスト」とは、セマフォリン活性（例えば、１つ以上のセマフォリンレセプターへのセマフォリンの結合が挙げられるがこれに限定されない）を中和することができるか、阻止することができるか、阻害することができるか、抑止することができるか、低下させることができるか、または妨げることができる分子のことを指す。セマフォリンアンタゴニストとしては、抗セマフォリン抗体およびその抗原結合フラグメント、セマフォリンに特異的に結合することにより、そのセマフォリンが１つ以上のレセプターに結合するのを抑えるレセプター分子および誘導体、抗セマフォリンレセプター抗体およびセマフォリンレセプターアンタゴニスト（例えば、セマフォリンの小分子インヒビタ）が挙げられるがこれらに限定されない。用語「セマフォリンアンタゴニスト」は、本明細書中で使用されるとき、ニューロピリン−１および／またはニューロピリン−２（Ｎｒｐ−１および／またはＮｒｐ−２）に結合し、セマフォリン活性を中和することができるか、阻止することができるか、阻害することができるか、抑止することができるか、低下させることができるか、または妨げることができる、抗体、抗体フラグメント、他の結合ポリペプチド、ペプチドおよび非ペプチド小分子を含む分子（例えば、抗Ｎｒｐ１および抗Ｎｒｐ２抗体、ならびにＮｒｐ１およびＮｒｐ２と交差反応する（ただし、セマフォリン活性を中和することができるか、阻止することができるか、阻害することができるか、抑止することができるか、低下させることができるか、または妨げることができる）抗体が挙げられるがこれらに限定されない）を特に包含する。したがって、用語「セマフォリン活性」は、ニューロピリン媒介性のクラス３セマフォリンの生物学的活性（本明細書中の上で定義したような活性）を特に包含する。そのような生物学的活性としては、例えば、胚の神経系発生中およびニューロン再生中の神経突起成長の阻害効果が挙げられる。
【００９２】
「処置」とは、治療的な処置と、予防的または防止的な措置の両方のことを指す。処置の必要な者としては、障害をすでに有している者、ならびに障害が予防されるべき者が挙げられる。
【００９３】
「障害」は、処置の恩恵を受け得る任意の状態である。例えば、異常な新脈管形成（過剰か、不適当か、または調節されていない、新脈管形成）もしくは脈管透過性に苦しんでいるか、またはそれらを予防する必要のある、哺乳動物。これには、その哺乳動物をその対象の障害にさせる病理学的な状態を含む、慢性および急性の障害または疾患が包含される。本明細書中において処置される障害の非限定的な例としては、悪性および良性の腫瘍；非白血病およびリンパ系悪性疾患；ニューロンの障害、グリアの障害、アストロサイトの（ａｓｔｒｏｃｙｔａｌ）障害、視床下部の障害および他の腺の障害、マクロファージの（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ）障害、上皮の障害、間質の障害および胞胚腔の障害；ならびに炎症性障害、脈管形成の障害および免疫学的障害が挙げられる。
【００９４】
異常な新脈管形成は、病的状態または病的状態を引き起こすような状態において、新しい血管が、過剰か、不十分か、または不適切に成長するとき（例えば、新脈管形成の位置、タイミングまたは開始が、医学的な観点から望ましくないとき）に、生じる。過剰か、不適当か、または調節されていない新脈管形成は、上記病的状態の悪化に関与するか、またはある病的状態（例えば、癌、特に、脈管形成された固形腫瘍および転移性腫瘍（結腸癌、肺癌（特に、小細胞肺癌）または前立腺癌を含む）、眼球の血管新生、特に、糖尿病による失明、網膜症、主に糖尿病性網膜症または加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、乾癬、乾癬性関節炎、血管腫などの血管芽細胞腫（ｈａｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）によって引き起こされる疾患；炎症性腎疾患（例えば、糸球体腎炎、特に、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症または高血圧性腎硬化症）；様々な炎症性（ｉｍｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）疾患（例えば、関節炎、特に、関節リウマチ、炎症性腸疾患）、乾癬（ｐｓｏｒｓａｓｉｓ）、サルコイドーシス、動脈硬化症および移植後に生じる疾患、子宮内膜症または慢性喘息、ならびに７０を超える他の状態、におけるような病的状態）を引き起こす、新しい血管の成長が存在するとき、生じる。その新しい血管は、罹患組織を養い得、正常組織を破壊し得、そして、癌の場合、新しい血管は、腫瘍細胞が循環中に漏れ出ること、および他の器官に留まること（腫瘍転移）を可能にし得る。不十分な新脈管形成は、例えば、冠状動脈疾患、脳卒中などの疾患における病的状態の悪化および創傷治癒の遅延に関与する不適当な血管の成長が存在するとき、生じる。さらに、潰瘍、発作および心臓発作は、自然治癒に通常必要な新脈管形成が生じないことが原因であり得る。本発明は、上で述べた疾病を発症するリスクのある患者の処置を企図する。
【００９５】
本発明の抗体または他の分子を投与される候補である他の患者は、線維血管性（ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）組織の異常な増殖、酒さ性ざ瘡、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔｓ）病、血液由来（ｂｌｏｏｄ  ｂｏｒｎｅ）腫瘍、頚動脈閉塞性疾患、脈絡膜新生血管、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性ブドウ膜炎、コンタクトレンズ過剰装用（ｃｏｎｔａｃｔ  ｌｅｎｓ  ｏｖｅｒｗｅａｒ）、角膜移植片拒絶、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、過粘稠度症候群、カポジ肉腫、白血病、脂質変性、ライム病、辺縁表皮剥離（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染、近視、眼球血管新生疾患、視神経ピット（ｏｐｔｉｃ  ｐｉｔｓ）、オスラー・ウェーバー症候群（オスラー・ウェーバー・ランデュ、変形性関節症、パジェット病、扁平部炎、類天疱瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、多発性動脈炎、レーザー後合併症、原虫感染、弾性線維性仮性黄色腫、翼状片乾燥性角膜炎（ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）、放射状角膜切開、網膜血管新生、未熟児網膜症、水晶体後線維増殖症、サルコイド、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン（Ｓｏｇｒｅｎｓ）症候群、固形腫瘍、シュタルガルト（Ｓｔａｒｇａｒｔｓ）病、スティーブンス・ジョンソン病、上輪部角膜炎、梅毒、全身性狼瘡、テリエン辺縁変性、トキソプラズマ症、外傷、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏およびウェゲナーサルコイドーシス、糖尿病に関連する望まれない新脈管形成、寄生虫病、異常な創傷治癒、外科術後、損傷後または外傷後の肥大、毛成長の阻害、排卵および黄体形成の阻害、着床の阻害ならびに子宮における胚発生の阻害を有しているか、またはそれらを発症するリスクがある。
【００９６】
抗新脈管形成治療は、移植片拒絶、肺の炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、心膜炎に関連するものなどの心内膜液浸出（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ）および胸水、望ましくない脈管透過性を特徴とする疾患および障害、例えば、脳腫瘍に関連する浮腫、悪性疾患に関連する腹水症、メイグス症候群、肺の炎症、ネフローゼ症候群、心内膜液浸出、胸水、心筋梗塞後および発作後の状態などの循環器疾患に関連する透過性などの一般的な処置において有用である。
【００９７】
本発明の他の新脈管形成依存性疾患としては、血管線維腫（出血傾向がある異常な血管）、血管新生緑内障（眼における血管の成長）、動静脈奇形（動脈と静脈との異常な連絡）、偽関節骨折（治癒しない骨折）、動脈硬化巣（動脈の硬化）、化膿性肉芽腫（血管から構成される一般的な皮膚病変）、強皮症（結合組織疾患の一形態）、血管腫（血管から構成される腫瘍）、トラコーマ（第三世界における失明の主な原因）、血友病性関節、脈管の癒着および肥厚性瘢痕（異常な瘢痕形成）が挙げられる。
【００９８】
用語「癌」および「癌性」とは、代表的には、制御されていない細胞成長を特徴とする哺乳動物における生理学的状態のことを指すか、または記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が挙げられるがこれらに限定されない。そのような癌のより詳細な例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（消化器癌を含む）、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、およびに様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大病変（ｂｕｌｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球白血病；および移植後リンパ球増殖障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）およびメイグス症候群に関連する異常な脈管増殖が挙げられる。
【００９９】
用語「抗腫瘍性組成物」とは、少なくとも１つの活性な治療薬、例えば、「抗癌剤」を含む、癌の処置に有用な組成物のことを指す。治療薬（抗癌剤）の例としては、例えば、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害剤、放射線治療に使用される薬剤、抗新脈管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および癌を処置するための他の薬剤（例えば、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼインヒビタ）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビタ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、血小板由来成長因子インヒビタ（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２インヒビタ（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦレセプター、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２のうちの１つ以上に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ならびに他の生理活性剤および有機化学剤などが挙げられるが、これらに限定されない。それらの組み合わせもまた、本発明に包含される。
【０１００】
用語「細胞傷害剤」とは、本明細書中で使用されるとき、細胞の機能を阻害するか、もしくは妨害し、そして／または細胞の破壊を引き起こす、物質のことを指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤およびトキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性なトキシン、またはそれらのフラグメント）を含むと意図される。
【０１０１】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、癌の処置に有用な化合物が挙げられる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミド；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ））；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ）；アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成アナログを含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマｌＩおよびカリケアマイシンオメガｌＩ）（例えば、Ａｇｎｅｗ（１９９４）Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６を参照のこと）；ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質のエンジイン抗菌性（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃ���ｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ）などのメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロ��ルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有アルブミン操作ナノ粒子処方物のＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵおよびロイコボリンを用いたイリノテカンの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼインヒビタＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン処置レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；細胞増殖を減少させる、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標）））およびＶＥＧＦ−Ａのインヒビタ、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１０２】
腫瘍に対するホルモンの作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤（例えば、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節因子（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）（ＳＥＲＭ））もまた上記の定義に包含され、それらとしては、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびＦＡＲＥＳＴＯＮ・トレミフェン；副腎におけるエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビタ（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニ（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール）；および抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン）を含む）；ならびにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な（ａｂｈｅｒａｎｔ）細胞増殖に関わる、シグナル伝達経路中の遺伝子（例えば、ＰＫＣ−アルファ、ＲａｆおよびＨ−Ｒａｓ）の発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現インヒビタ（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビタなどのリボザイム；ワクチン（例えば、遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン）；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビタ；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビンおよびエスペラミシン（Ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、および上記のもののいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１０３】
用語「プロドラッグ」とは、本願において使用されるとき、親薬物と比べて腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く、酵素的に活性化されるか、またはより活性な親型に変換されることが可能な、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体の型のことを指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ（１９８６）“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ＢｅｌｆａｓｔおよびＳｔｅｌｌａら（１９８５）．“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。本発明のプロドラッグとしては、より活性な細胞傷害剤非含有薬物に変換され得る、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されるフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または必要に応じて置換されるフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン、および他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用するためのプロドラッグ型に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例としては、上に記載した化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
セマフォリンアンタゴニストを用いて処置され得る疾患および状態としては、神経疾患、および神経再生を必要とするかまたは神経再生の恩恵を受ける疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０５】
「小分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有すると本明細書中で定義される。
【０１０６】
「単離された」核酸分子は、同定されていて、そしてその抗体核酸の天然の起源において通常関連する少なくとも１つの夾雑物の核酸分子から分離されている、核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然において見られる形態以外または状況以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、それが天然の細胞中に存在するときは、核酸分子と区別されている。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、その核酸分子が天然の細胞の核酸分子とは異なる染色体位置に存在する場合に、抗体を通常発現する細胞中に含まれる核酸分子を包含する。
【０１０７】
表現「調節配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列のことをいう。原核生物に適した調節配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【０１０８】
核酸が、別の核酸配列と機能的な関連性をもって配置されているとき、その核酸は、「作動可能に連結されている」。例えば、あるポリペプチドに対するＤＮＡが、そのポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡが、そのポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されている；そのポリペプチドに対するＤＮＡが、その配列の転写に影響を与える場合、プロモーターまたはエンハンサーが、コード配列に作動可能に連結されている；またはそのポリペプチドに対するＤＮＡが、翻訳を促進するように位置されている場合、リボソーム結合部位が、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結されている（された）」とは、連結されているＤＮＡ配列が、隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合は、隣接的かつ読み枠（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接的である必要はない。連結は、好都合な制限酵素認識部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
【０１０９】
本明細書中で使用されるとき、表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され、そのような呼称のすべてが、子孫を包含する。したがって、単語「形質転換体」および「形質転換された細胞」は、初代被験細胞、および継代の回数に関係なくそれらに由来する培養物を包含する。すべての子孫のＤＮＡ含有量は、故意または偶然の変異に起因して、正確には同じでないかもしれないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされるのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が包含される。異なる呼称が意図されるが、それは、文脈から明らかである。
【０１１０】
本発明を実施するための形態
Ｎｒｐの細胞外ドメインは、ドメイン構造および機能特性に基づいて、代表的には、３つの機能単位：ａ１ａ２、ｂ１ｂ２およびｃに分けられ、これらはそれぞれ主要なセマフォリン結合領域、ＶＥＧＦ結合領域および二量体化領域である（Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ５，１０９９−１０７（２００６））。構造機能研究によって、ニューロピリン機能は全部のドメインが必要であることが示されているが、これらのレセプター／リガンド複合体の分子の詳細は、十分に理解されていないままである。現在までに（ｏ  ｄａｔｅ）、Ｎｒｐの構造情報は、Ｎｒｐ１のｂ１ｂ２ドメインに限られている（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉら、前出；Ｌｅｅ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，５７０２−１０（２００６））。ＶＥＧＦ１６５のＣ末端に相同なテトラペプチドであるタフトシンとの複合体のＮｒｐ１  ｂ１ｂ２の結晶構造は、Ｎｒｐとその結合パートナーであるＶＥＧＦとの相互作用についての最初の構造情報を提供した（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉら、前出；ｖｏｎ  Ｗｒｏｎｓｋｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，５７０２−１０（２００６））。
【０１１１】
本発明は、インビトロにおいてＮｒｐ１とＮｒｐ２との両方にＳｅｍａ３が結合するのを阻止し得る抗体のＦａｂフラグメントとの複合体でのＮｒｐ２  ａ１ａ２ｂ１ｂ２の結晶構造を提供する。両方のＮｒｐアイソフォームのａ２ｂ１ｂ２およびｂ１ｂ２フラグメントの構造も比較し、対比する。さらに、インビボにおいてＮｒｐ１へのＶＥＧＦ１６５の結合を特異的に阻害する最近報告されたファージ由来抗体のＦａｂフラグメントと結合したＮｒｐ１のｂ１ドメインの構造（Ｌｉａｎｇ，Ｗ．Ｃ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６６，８１５−２９（２００７）；Ｐａｎ，Ｑら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１，５３−６７（２００７）もまた提供し、評価する。あわせて、これらの構造は、Ｎｒｐ細胞外ドメインの大部分の詳細な像をもたらし、ＶＥＧＦとセマフォリンとの結合についてのモデルを提唱する。２つの異なる結晶型で存在するＮｒｐ２二量体に基づいて、Ｎｒｐ二量体化およびリガンド結合についての新規メカニズムを提唱する。
【０１１２】
結晶学的（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｈｉｃ）研究の詳細は、下記の実施例に提供される。抗ＮＲＰ抗体を作製するための一般的な方法は、本明細書中および実施例１に記載される。
【０１１３】
抗ＮＮＰ抗体の作製
本明細書中の本発明は、抗Ｎｒｐ抗体の作製および使用を包含する。抗体を作製するための例示的な方法は、以下の節に詳細に記載される。
【０１１４】
抗Ｎｒｐ抗体は、哺乳動物種由来のＮＲＰ（例えば、ＮＲＰ１および／またはＮＲＰ２）抗原を用いて選択される。好ましくは、抗原は、ヒトＮＲＰ（ｈＮＲＰ）である。しかしながら、他の種由来のＮＲＰ（例えば、マウスＮＲＰ（ｍＮＲＰ））も標的抗原として使用することができる。様々な哺乳動物種由来のＮＲＰ抗原が、天然の起源から単離され得る。他の実施形態では、抗原は、組換え的に生成されるか、または当該分野で公知の他の合成方法を用いて作製される。
【０１１５】
選択された抗体は、通常、ＮＲＰ抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。例えば、その抗体は、たった約５ｎＭ、好ましくは、たった約２ｎＭ、より好ましくは、たった約５００ｐＭのＫｄ値でｈＮＲＰに結合し得る。抗体親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えば、実施例に記載されるようなＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ）アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ）によって測定され得る。
【０１１６】
また、本抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するために他の生物学的活性アッセイに供され得る。そのようなアッセイは、当該分野で公知であり、標的抗原および本抗体に対して意図される用途に依存する。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ（下記の実施例に記載されるようなもの）；腫瘍細胞成長阻害アッセイ（例えば、ＷＯ８９／０６６９２に記載されているようなもの）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）；ならびにアゴニスト活性または造血アッセイ（ＷＯ９５／２７０６２を参照のこと）が挙げられる。
【０１１７】
目的の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているアッセイなどの日常的なクロスブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイが行われ得る。あるいは、例えば、Ｃｈａｍｐｅら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されているようなエピトープマッピングを行うことにより、その抗体が目的のエピトープに結合するか否かを判定することができる。
【０１１８】
合成抗体ファージライブラリからの抗ＮＲＰ抗体の作製
好ましい実施形態において、抗ＮＲＰ抗体は、独特のファージ・ディスプレイ・アプローチを用いて選択される。そのアプローチは、単一のフレームワーク鋳型に基づいた合成抗体ファージライブラリの作製、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化させた可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、標的ＮＲＰ抗原に対して高親和性を有する候補抗体の選択、および選択された抗体の単離を包含する。
【０１１９】
ファージディスプレイ法の詳細は、例えば、２００３年１２月１１日公開のＷＯ０３／１０２１５７に見られる。
【０１２０】
１つの局面において、抗体ライブラリは、抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲにおける、溶媒接触位置および／または高度に多様な位置を変異させることによって作製され得る。ＣＤＲの一部または全部が、本明細書中に提供される方法を用いて変異され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３中の位置を変異させて単一のライブラリを形成するか、またはＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３中の位置を変異させて単一のライブラリを形成するか、またはＣＤＲＬ３ならびにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３中の位置を変異させて単一のライブラリを形成することによって、多様な抗体ライブラリを作製することが好ましい場合がある。
【０１２１】
例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の溶媒接触位置および／または高度に多様な位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリを作製し得る。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３中に変異を有する別のライブラリを作製し得る。これらのライブラリを互いに組み合わせて使用することによって、所望の親和性の結合物が作製され得る。例えば、標的抗原に対する結合について重鎖ライブラリを１回以上選択した後、さらなる回の選択にむけて重鎖の結合物の集団に軽鎖ライブラリを戻すことにより、その結合物の親和性を高めることができる。
【０１２２】
好ましくは、重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域中のもとのアミノ酸をバリアントアミノ酸で置換することによってライブラリを作製する。得られたライブラリは、複数の抗体配列を含み得、ここで、その配列の多様性は、主に重鎖配列のＣＤＲＨ３領域に存在する。
【０１２３】
１つの局面において、ヒト化抗体４Ｄ５配列、すなわち、ヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の状況において、ライブラリを作製する。好ましくは、そのライブラリは、重鎖の少なくとも残基９５〜１００ａを、ＤＶＫコドンセット（ＤＶＫコドンセットを使用することにより、これらの位置のうちのすべての位置に対するバリアントアミノ酸のセットがコードされる）によってコードされるアミノ酸で置換することによって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの例は、配列（ＤＶＫ）７を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリは、残基９５〜１００ａを、ＤＶＫコドンセットとＮＮＫコドンセットとの両方によってコードされるアミノ酸で置換することによって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの例は、配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）を含む。別の実施形態では、ライブラリは、少なくとも残基９５〜１００ａをＤＶＫコドンセットとＮＮＫコドンセットの両方によってコードされるアミノ酸で置換することによって作製される。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの例は、配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）を含む。これらの置換の作製に有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例は、配列（ＮＮＫ）６を含む。適当なオリゴヌクレオチド配列の他の例は、本明細書中に記載される基準に従って当業者によって決定され得る。
【０１２４】
別の実施形態では、様々なＣＤＲＨ３の設計を利用することにより、高親和性の結合物が単離され、種々のエピトープに対する結合物が単離される。このライブラリにおいて作製されるＣＤＲＨ３の長さの範囲は、１１〜１３アミノ酸であるが、これとは異なる長さのものも作製され得る。Ｈ３の多様性は、ＮＮＫ、ＤＶＫおよびＮＶＫコドンセットを用いることによって拡大され得、ならびにＮ末端および／またはＣ末端における多様性は、より限定され得る。
【０１２５】
ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２においても多様性が作製され得る。ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２の多様性の設計は、記載されるような天然の抗体レパートリーを模倣する標的化ストラテジー（以前の設計よりも天然の多様性により一致した多様性に焦点を合わせた改変を行うもの）に従う。
【０１２６】
ＣＤＲＨ３における多様性について、異なる長さのＨ３を含む複数のライブラリを、別々に構築し、次いで、標的抗原に結合するものを選択するためにそれらを組み合わせることができる。その複数のライブラリは、以前に記載されているような、および本明細書中の下記に記載するような、固体支持体選択法および溶液選別法を用いて、プールされ、選別され得る。複数の選別ストラテジー（ｓａｔｒａｔｅｇｉｅｓ）が使用され得る。例えば、１つの変法は、固体に結合した標的に対する選別の後、融合ポリペプチド上に存在し得るタグ（例えば、抗ｇＤタグ）について選別し、その後、固体に結合した標的に対してもう一度選別することを包含する。あるいは、まず、上記ライブラリを、固体表面に結合した標的に対して選別し、次いで、標的抗原の濃度を減少させながら溶相結合を使用して、溶出された結合物を選別し得る。異なる選別方法を組み合わせることにより、高度に発現する配列だけの選択の最小化およびいくつかの異なる高親和性クローンの選択がもたらされる。
【０１２７】
標的のＮＲＰ抗原に対する高親和性結合物が、ライブラリから単離され得る。多様性をＨ１／Ｈ２領域に限定することにより、縮重が約１０４〜１０５倍減少し、Ｈ３の多様性を一層許容にすることにより、より高親和性の結合物がもたらされる。ＣＤＲＨ３中に様々なタイプの多様性を有するライブラリを利用することにより（例えば、ＤＶＫまたはＮＶＴを利用して）、標的抗原の様々なエピトープに結合し得る結合物が単離される。
【０１２８】
上に記載したようにプールされたライブラリから単離された結合物のうち、限られた多様性を軽鎖に提供することによって、親和性がさらに改善され得ることが見出されている。この実施形態では、軽鎖多様性は、以下のとおり、ＣＤＲＬ１において作製される：アミノ酸２８位は、ＲＤＴによってコードされ；アミノ酸２９位は、ＲＫＴによってコードされ；アミノ酸３０位は、ＲＶＷによってコードされ；アミノ酸３１位は、ＡＮＷによってコードされ；アミノ酸３２位は、ＴＨＴによってコードされ；必要に応じて、アミノ酸３３位は、ＣＴＧによってコードされ；ＣＤＲＬ２において：アミノ酸５０位は、ＫＢＧによってコードされ；アミノ酸５３位は、ＡＶＣによってコードされ；そして必要に応じて、アミノ酸５５位は、ＧＭＡによってコードされ；ＣＤＲＬ３において：アミノ酸９１位は、ＴＭＴもしくはＳＲＴまたはその両方によってコードされ；アミノ酸９２位は、ＤＭＣによってコードされ；アミノ酸９３位は、ＲＶＴによってコードされ；アミノ酸９４位は、ＮＨＴによってコードされ；そしてアミノ酸９６位は、ＴＷＴもしくはＹＫＧまたはその両方によってコードされる。
【０１２９】
別の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３領域に多様性を有する単数あるいは複数のライブラリが作製される。この実施形態では、ＣＤＲＨ３における多様性は、種々の長さのＨ３領域を使用し、そして主にコドンセットＸＹＺおよびＮＮＫまたはＮＮＳを使用して、作製される。個別のオリゴヌクレオチドを用いてライブラリが形成され、プールされ得るか、またはオリゴヌクレオチドをプールすることにより、ライブラリのサブセットが形成され得る。この実施形態のライブラリは、固体に結合した標的に対して選別され得る。複数の選別物から単離されたクローンは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、特異性および親和性についてスクリーニングされ得る。特異性については、所望の標的抗原ならびに他の非標的抗原に対して、クローンをスクリーニングし得る。次いで、標的のＮＲＰ１抗原に対して結合したものを、溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合アッセイにおいて、親和性についてスクリーニングし得る。高親和性で結合したものを、上に記載したように調製されたＸＹＺコドンセットを利用して、ライブラリから単離し得る。これらの結合物は、細胞培養において抗体または抗原結合フラグメントとして容易に高収率で生成され得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３領域の長さがより多様性であるライブラリを作製することが望ましい場合がある。例えば、約７〜１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を有するライブラリを作製することが望ましい場合がある。
【０１３１】
これらの実施形態のライブラリから単離される高親和性結合物は、細菌および真核細胞の培養物中において容易に高収率で生成される。それらのベクターは、ウイルスのコートタンパク質成分配列であるｇＤタグなどの配列を容易に除去し、そして／または、定常領域配列に加えることにより、完全長抗体または抗原結合フラグメントの高収率の生成をもたらすように設計され得る。
【０１３２】
ＣＤＲＨ３中に変異を含むライブラリが、他のＣＤＲの、例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２の、バリアントバージョンを含むライブラリと組み合わされ得る。したがって、例えば、１つの実施形態において、ＣＤＲＨ３ライブラリは、所定のコドンセットを使用して、２８、２９、３０、３１および／または３２位にバリアントアミノ酸を有する、ヒト化４Ｄ５抗体配列の状況において作製されたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わされる。別の実施形態では、ＣＤＲＨ３に変異を含むライブラリが、バリアントＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わされ得る。１つの実施形態において、ＣＤＲＨ１ライブラリは、２８、３０、３１、３２および３３位にバリアントアミノ酸を有するヒト化抗体４Ｄ５配列を用いて作製される。ＣＤＲＨ２ライブラリは、所定のコドンセットを使用して、５０、５２、５３、５４、５６および５８位にバリアントアミノ酸を有するヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いて作製され得る。
【０１３３】
抗ＮＲＰｐ抗体変異体
ファージライブラリから作製された抗ＮＲＰ抗体は、親抗体に対して物理的、化学的およびまたは生物学的特性が改善された抗体変異体が得られるようにさらに改変され得る。用いられるアッセイが、生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、好ましくは、最適なアッセイにおいて、親抗体のそのアッセイにおける生物学的活性よりも少なくとも約１０倍良好な、好ましくは、少なくとも約２０倍良好な、より好ましくは、少なくとも約５０倍良好な、時折、少なくとも約１００倍または２００倍良好な、生物学的活性を有する。例えば、抗ＮＲＰ１抗体変異体は、好ましくは、親抗ＮＲＰ抗体の結合親和性よりも、少なくとも約１０倍強い、好ましくは、少なくとも約２０倍強い、より好ましくは、少なくとも約５０倍強い、時折、少なくとも約１００倍または２００倍強い、ＮＲＰに対する結合親和性を有する。
【０１３４】
抗体変異体を作製するために、１つ以上のアミノ酸の変更（例えば、置換）を親抗体の超可変領域の１つ以上に導入する。あるいは、またはさらに、フレームワーク領域残基の１つ以上の変更（例えば、置換）が、親抗体に導入され得るが、これらによって、第２の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。改変するフレームワーク領域残基の例としては、抗原に直接非共有結合する残基（Ａｍｉｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：７４７−７５３）；ＣＤＲの立体配座と相互作用する残基／ＣＤＲの立体配座に影響する残基（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）；および／またはＶＬ−ＶＨ界面に関与する残基（ＥＰ２３９４００Ｂ１）が挙げられる。ある特定の実施形態において、そのようなフレームワーク領域残基の１つ以上の改変によって、第２の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体の結合親和性が増大する。例えば、約１〜約５個のフレームワーク残基が、本発明のこの実施形態において変更され得る。時折、これは、超可変領域のいずれの残基も変更されない場合でさえも、前臨床試験における使用に適した抗体変異体を得るのに十分であり得る。しかしながら、通常は、抗体変異体は、さらなる超可変領域の変更を含む。
【０１３５】
特に、親抗体の開始結合親和性が、ランダムに作製された抗体変異体が容易にスクリーニングされ得るようなものである場合、変更される超可変領域残基は、そのようにランダムに変更され得る。
【０１３６】
そのような抗体変異体を作製するための有用な手順の１つは、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。この場合、超可変領域残基の１つ以上が、アラニンまたはポリアラニン残基で置換されることにより、それらのアミノ酸と、第２の哺乳動物種由来の抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、その置換に対して機能的な感度を示す超可変領域残基を、置換の部位において、または置換の部位に対して、さらなる変異または他の変異を導入することによって、洗練させる。したがって、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位が予め決められている場合、変異の性質は本質的に予め決められている必要はない。この方法で作製されたａｌａ−変異体は、本明細書中に記載されるような生物学的活性についてスクリーニングされる。
【０１３７】
通常、以下で「好ましい置換」という標題のもとに示されるようなものなどの保存的置換を用いて開始し得る。そのような置換が、生物学的活性（例えば、結合親和性）の変化をもたらす場合、以下の表において「例示的な置換」と称されるか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるような、より実質的な変化が、導入され、その生成物がスクリーニングされる。
【０１３８】
好ましい置換：
【０１３９】
【表２−１】
0005723840.tif 000002
【０１４０】
【表２−２】
0005723840.tif 000003
抗体の生物学的特性のなおもより実質的な改変は、（ａ）例えば、シートまたはらせん状の立体配座のような、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における当該分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に対する作用が著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１４１】
非保存的置換は、これらのクラスの中の１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴う。
【０１４２】
別の実施形態では、改変のために選択される部位は、ファージディスプレイ（上記を参照のこと）を用いて親和性成熟される。
【０１４３】
アミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、親抗体の先に調製された変異体または非変異バージョンの、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。変異体を作製するための好ましい方法は、部位特異的突然変異誘発である（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８を参照のこと）。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、抗体変異体は、単一の超可変領域残基だけが置換されている。他の実施形態では、親抗体の超可変領域残基の２つ以上が、置換され、例えば、約２〜約１０個の超可変領域が置換される。
【０１４５】
通常、生物学的特性が改善された抗体変異体は、親抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または類似性は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するようにギャップを導入した後に、親抗体残基と、同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づいた同じ群由来のアミノ酸残基、上記を参照のこと）である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと本明細書中で定義される。可変ドメインの外側の抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失または挿入は、配列の同一性または類似性に影響を及ぼすと解釈されてはならない。
【０１４６】
抗体変異体を作製した後、その分子の生物学的活性を親抗体と比べて測定する。上で述べたように、これは、抗体の結合親和性および／または他の生物学的活性の測定を包含し得る。本発明の好ましい実施形態において、抗体変異体のパネルを調製し、ＮＲＰ１またはそのフラグメントなどの抗原に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の１つ以上を、必要に応じて１つ以上のさらなる生物学的活性アッセイに供することにより、結合親和性が増大した抗体変異体が、例えば、前臨床試験に対して実際に有用であることを確認する。
【０１４７】
そのように選択された抗体変異体は、しばしばその抗体の意図される用途に応じて、さらなる改変に供され得る。そのような改変は、アミノ酸配列のさらなる変更、異種ポリペプチドへの融合、および／または以下で詳述するものなどの共有結合性の改変を包含し得る。アミノ酸配列の変更に関して、例示的な改変は、上で詳述した。例えば、抗体変異体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基が、一般にセリンで置換されることにより、その分子の酸化安定性が改善され得、そして異常な架橋が妨害され得る。逆に、システイン結合を抗体に付加することにより、その安定性を改善してもよい（特に、その抗体が、Ｆｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。別のタイプのアミノ酸変異体は、変更されたグリコシル化パターンを有する。これは、抗体内に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／またはその抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することによって、達成され得る。抗体のグリコシル化は、代表的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合のことを指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することによって、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸（最も通常ではセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る）への糖のＮ−アセチルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの結合のことを指す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、その抗体が上記のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むように、アミノ酸配列を変更することによって都合よく達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。もとの抗体の配列に対する１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加またはそれらによる置換によっても変更が行われ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
【０１４８】
ベクター、宿主細胞および組換え法
本発明の抗ＮＲＰ抗体は、容易に利用可能な手法および容易に入手可能な材料を用いて、組換え的に作製され得る。
【０１４９】
抗Ｎｒｐ抗体を組換え作製する場合、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現に向けて、複製可能なベクターに挿入する。本抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離されるか、または従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）合成される。多くのベクターが利用可能である。一般に、ベクター成分としては、以下のもの：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
（ｉ）シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接、組換え的に作製され得るだけでなく、好ましくは、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくは成熟ポリペプチドのＮ末端において特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても、組換え的に作製され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然抗体のシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列によって置換される。酵母分泌の場合、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む）もしくは酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞での発現では、哺乳動物のシグナル配列ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１５１】
そのような前駆領域に対するＤＮＡを、本抗体をコードするＤＮＡに読み枠で連結する。
【０１５２】
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクターとクローニングベクターとの両方が、１つ以上の選択された宿主細胞においてそのベクターが複製されることを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、そのベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にする配列であり、その配列としては、複製開始点配列または自律複製配列が挙げられる。そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに対して十分に知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は、酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、哺乳動物の発現ベクターでは、複製起点成分は必要ない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むという理由だけで、代表的に使用され得る）。
【０１５３】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠乏を補うタンパク質、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重大な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉに対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０１５４】
選択スキームの１つの例では、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生成するので、選択レジメンを生き残る。そのような優性選択の例では、薬物のネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを使用する。
【０１５５】
哺乳動物細胞に適した選択マーカーの別の例は、抗体核酸を取り込む細胞成分の同定を可能にするもの（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）である。
【０１５６】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養液中で形質転換体のすべてを培養することによって同定される。野生型ＤＨＦＲが使用されるときの適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０１５７】
あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質および別の選択マーカー（例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））をコードするＤＮＡ配列で形質転換されたか、または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）が、選択マーカーに対する選択物質（例えば、アミノグリコシドの抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）を含む培地中での細胞成長によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１５８】
酵母における使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠いた酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１に、選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ（１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２。次いで、酵母宿主細胞ゲノム内のｔｒｐ１の破壊が存在することにより、トリプトファンの非存在下における成長による形質転換の検出に対して有効な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補完される。
【０１５９】
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１から得られるベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用され得る。あるいは、組換え子ウシキモシンの大規模生産用の発現系が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓに対して報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための、安定な多コピー発現ベクターもまた開示されている。Ｆｌｅｅｒら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５。
【０１６０】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、抗体核酸に作動可能に連結されている、プロモーターを含む。原核生物の宿主とともに使用するために適したプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターも適している。細菌系において使用するためのプロモーターは、当該抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含む。
【０１６１】
真核生物に対するプロモーター配列は、公知である。実質的にすべての真核生物の遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核生物の遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列が存在する。これらの配列のすべてが、真核生物の発現ベクター内に適切に挿入される。
【０１６２】
酵母宿主とともに使用するための適当なプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ−フルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼ）に対するプロモーターが挙げられる。
【０１６３】
成長条件によって調節される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素に対するプロモーター領域である。酵母の発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、さらにＥＰ７３，６５７に記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０１６４】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、サルウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーター、異種の哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって、調節されるが、ただし、そのようなプロモーターは、宿主細胞系と適合している。
【０１６５】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いた哺乳動物宿主におけるＤＮＡの発現用の系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの支配下の、マウス細胞における、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について、Ｒｅｙｅｓら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１もまた参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列が、プロモーターとして使用され得る。
【０１６６】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
本発明の抗体をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が、現在知られている。しかしながら、代表的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。例としては、複製起点の後ろ側（ｂｐ１００〜２７０）におけるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側におけるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエレメントの増強について、Ｙａｎｉｖ（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体のコード配列に対する５’または３’位においてベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターに対して５’部位に位置する。
【０１６７】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。そのような配列は、通常、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域の５’から、たまに３’から、入手可能である。これらの領域は、当該抗体をコードするｍＲＮＡの翻訳されない部分に、ポリアデニル化されたフラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。有用な転写終結成分の１つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに開示されている発現ベクターを参照のこと。
【０１６８】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書中のベクター内のＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、上に記載した原核生物、酵母または高等真核生物の細胞である。この目的で適当な原核生物としては、真正細菌、例えば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａ）、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主の１つは、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の菌株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５））も適当である。これらの例は、限定ではなく、例示である。
【０１６９】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核生物の微生物も、抗体をコードするベクターに適したクローニングまたは発現の宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち、通常のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最もよく使用される。しかしながら、いくつかの他の属、種および菌株（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；および糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ））が、市販されており、本明細書中において有用である。
【０１７０】
グリコシル化される抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変種、ならびに宿主（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）からの、対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変種およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株）は、公的に入手可能であり、そのようなウイルスは、本発明に従って本明細書中のウイルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。
【０１７１】
しかしながら、脊椎動物細胞に最も関心が寄せられており、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖が、日常的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されるサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎株（懸濁培養物中での成長のためにサブクローン化される２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶｌ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら（１９８２）Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ株（ＨｅｐＧ２）である。
【０１７２】
宿主細胞は、抗体作製のための上記の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて形質転換され、そして、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切であるように改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０１７３】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を作製するために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。市販の培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ））が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｒｅ．）３０，９８５号に記載されている培地のいずれかも、宿主細胞用の培養液として使用してもよい。必要に応じて、これらのいずれの培地にも、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物）、微量元素（最終濃度がマイクロモルの範囲で通常存在する無機化合物として定義される）ならびにグルコースまたは等価なエネルギー源が補充され得る。また、他の任意の必要な補充物が、当業者に公知であり得る適切な濃度で含められてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞とともにこれまで使用されてきたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１７４】
（ｉｘ）抗体精製
組換えの手法を用いる場合、抗体は、細胞内か、細胞周辺腔内に産生され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、第１工程として、宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれかである粒状の破片を、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７には、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順が記載されている。簡潔には、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下において、約３０分間にわたって細胞ペーストを溶かす。細胞残屑を遠心分離によって除去し得る。抗体が培地中に分泌される場合、一般に、まずそのような発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼインヒビタが、前述の工程のいずれかにおいて含められていてもよく、外来性の夾雑物の増殖を妨害するために抗生物質が含められていてもよい。
【０１７５】
上記細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィを用いて精製され得、アフィニティークロマトグラフィが、好ましい精製手法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、本抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに左右される。プロテインＡを使用することにより、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づいて抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓら（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５）。親和性リガンドが付着しているマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの力学的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得る流速および処理時間よりも速い流速および短い処理時間を可能にする。抗体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が、精製に有用である。タンパク質精製のための他の手法（例えば、イオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）におけるクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）におけるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安塩析）もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１７６】
任意の予備的な精製工程の後、目的の抗体および夾雑物を含む混合物を約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供してもよく、それは、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われ得る。
【０１７７】
薬学的処方物
本抗体の治療的な処方物は、所望の純度を有する本抗体と、任意の生理的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤とを混合することによって、凍結乾燥された処方物または水溶液の形態で貯蔵用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントにとって無毒性であり、それらとしては、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン）；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【０１７８】
本明細書中の処方物は、必要に応じて、処置される特定の徴候に対する２つ以上の活性な化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものも含み得る。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましい場合がある。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。
【０１７９】
上記活性成分は、例えば、コアセルベーションの手法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル）中、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に封入されてもよい。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１８０】
インビボ投与のために使用される処方物は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌された濾過膜による濾過によって容易に達成される。
【０１８１】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適当な例としては、本抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形された物品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日を超えて分子を放出することができるが、ある特定のヒドロゲルは、それより短い期間にわたってタンパク質を放出する。被包された抗体が、長時間にわたって体内に残存するとき、その抗体は、３７℃の水分に曝露した結果として、変性し得るか、または凝集し得、それにより、生物学的活性が低下し、免疫原性が変化する可能性がある。関与するメカニズムに応じて、安定化のために、合理的なストラテジーが工夫され得る。例えば、凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド交換を介した分子間のＳ−Ｓ結合形成であると見出される場合、安定化は、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の調節、適切な添加物の使用、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって達成され得る。
【０１８２】
治療的な使用
本発明の抗体は、哺乳動物を処置するために使用され得ると企図される。１つの実施形態において、本抗体は、例えば、前臨床データを得る目的で、非ヒト哺乳動物に投与される。処置される例示的な非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、および前臨床試験が行われる他の哺乳動物が挙げられる。そのような哺乳動物は、本抗体で処置される疾患に対する確立された動物モデルであり得るか、または目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態の各々において、用量漸増研究が、その哺乳動物において行われ得る。その抗体が、抗ＮＲＰ１抗体である場合、その抗体は、例えば、固形腫瘍モデルにおいて宿主のげっ歯類に投与され得る。
【０１８３】
さらに、または代替として、本抗体は、ヒト、例えば、本抗体の投与の恩恵を受け得るある疾患または障害に罹患している患者を処置するために使用される。
【０１８４】
本発明は、腫瘍成長を支える栄養分を供給するために必要な腫瘍の血管の発生を阻害することを目的としている新規の癌処置ストラテジーである、抗新脈管形成性の癌の治療を包含する。新脈管形成が、原発腫瘍の成長と転移との両方に関与するので、本発明によって提供される抗新脈管形成処置は、原発部位において腫瘍の腫瘍性の成長を阻害することができ、ならびに続発部位において腫瘍の転移を妨害することができ、ゆえに、他の治療によるその腫瘍の攻撃を可能にする。本明細書中で処置される癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が挙げられるがこれらに限定されない。そのような癌のより詳細な例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（消化器癌を含む）、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、およびに様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球白血病；および移植後リンパ球増殖障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）およびメイグス症候群に関連する異常な脈管増殖が挙げられる。より詳細には、本発明の抗体によって処置されやすい癌としては、乳癌、直腸結腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫および多発性骨髄腫が挙げられる。
【０１８５】
本発明の抗体が、腫瘍などの様々な疾患を処置するために使用されるとき、本発明の抗体は、同じ疾患または類似の疾患に適した他の治療薬と併用され得ることが企図される。本発明の抗体が、癌を処置するために使用されるとき、本発明の抗体は、従来の癌治療（例えば、外科術、放射線治療、化学療法またはそれらの組み合わせ）と組み合わせて使用され得る。
【０１８６】
ある特定の局面において、本発明の抗体と併用される癌治療に有用な他の治療薬としては、他の抗新脈管形成剤が挙げられる。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ（２０００）によって列挙されているものをはじめとした多くの抗新脈管形成剤が同定されており、当該分野で公知である。
【０１８７】
１つの局面において、本発明の抗体は、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦレセプターフラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを阻止することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼのインヒビタおよびそれらの任意の組み合わせ）と組み合わせて使用される。あるいは、またはさらに、２つ以上の抗ＮＲＰ１抗体が、患者に共投与され得る。より好ましい実施形態では、相加効果または相乗効果をもたらすために、本発明の抗ＮＲＰ１Ａ抗体または抗ＮＲＰＢ抗体が、抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて使用される。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体としては、抗ｈＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合する抗体が挙げられる。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブまたはラニビズマブである。
【０１８８】
いくつかの他の局面において、本発明の抗体と併用される腫瘍治療に有用な他の治療薬としては、腫瘍成長に関与する他の因子のアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２としても知られる）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４またはＴＮＦ）が挙げられる。好ましくは、本発明の抗ＮＲＰ１抗体は、１つ以上のチロシンキナーゼレセプター（例えば、ＶＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＥＧＦレセプターおよびＰＤＧＦレセプター）を標的化する小分子レセプターチロシンキナーゼインヒビタ（ＲＴＫＩ）と組み合わせて使用され得る。多くの治療的な小分子であるＲＴＫＩが、当該分野で公知であり、それらとしては、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ＯＳＩ−７９０４、ＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標））、ＺＤ６１２６（ＡＮＧ４５３）、ＺＤ１８３９、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、セマキサニブ（ＳＵ５４１６）、ＡＭＧ７０６、ＡＧ０１３７３６、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＭＬＮ−５１８、ＣＥＰ−７０１、ＰＫＣ−４１２、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６）、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、ＸＬ８８０およびＣＨＩＲ−２６５が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
単独か、または第２の治療薬（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）と組み合わされた、本発明の抗Ｎｒｐ抗体は、さらに１つ以上の化学療法剤と組み合わされて使用され得る。種々の化学療法剤が、本発明の併用処置方法において使用され得る。企図される化学療法剤の例示的かつ非限定的なリストは、本明細書中の「定義」のもとに提供されている。
【０１９０】
抗Ｎｒｐ抗体が、第２の治療薬と共投与されるとき、その第２の治療薬が初めに投与された後に抗Ｎｒｐ抗体が投与され得る。しかしながら、同時の投与または抗Ｎｒｐ抗体が初めに投与されるのも企図される。第２の治療薬に対する適当な投薬量は、現在使用されている量であり、その薬剤と抗Ｎｒｐ抗体との組み合わされる作用（相乗作用）に起因して、減少させてもよい。
【０１９１】
疾患が予防または処置される場合、抗体の適切な投薬量は、処置される疾患のタイプ、その疾患の重症度および経過（本抗体が予防的な目的で投与されるのか、治療的な目的で投与されるのかに関係なく）、以前の治療、患者の病歴および本抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量に左右される。本抗体は、１回、または一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。
【０１９２】
疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるか、持続注入によるかに関係なく、抗体の約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、患者に投与するための最初の候補投薬量である。代表的な１日投薬量は、上で述べた因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれ以上であり得る。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、処置は、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで継続される。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。好ましい局面では、本発明の抗体は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で２〜３週間ごとに投与される。より好ましくは、そのような投薬レジメンは、転移性直腸結腸癌を処置するための一次治療としての化学療法レジメンと組み合わせて用いられる。いくつかの局面では、化学療法レジメンは、従来の高用量の間欠投与を含む。他のいくつかの局面では、化学療法剤は、計画的な中断を行わずに、より少ない用量およびより頻繁な投薬を用いて投与される（「メトロノミック（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ）化学療法」）。本発明の治療の進捗は、従来の手法およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１９３】
本抗体組成物は、良好な医療行為と一致する様式で、製剤化され、調薬され、そして投与される。この文脈において考慮される因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および開業医に公知の他の因子が挙げられる。投与される抗体の「治療有効量」は、そのような考慮すべき事項によって左右され、疾患または障害を予防するか、回復させるか、または処置するのに必要な最小量である。本抗体は、対象の障害を予防するか、または処置するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される必要はないが、必要に応じて、そのように製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、その製剤中に存在する抗体の量、障害または処置のタイプ、および上で考察した他の因子に依存する。これらは、通常、同じ投薬量かつ、本明細書中の前で使用されたような投与経路を用いて、またはこれまで使用されていた投薬量の約１〜９９％の投薬量で使用される。一般に、疾患または障害の軽減または処置は、その疾患または障害に関連する１つ以上の症状または医学上の問題の減少を含む。癌の場合、治療有効量の薬物は、以下のもの：癌細胞の数の減少；腫瘍サイズの縮小；末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減少および／または停止）；腫瘍転移の阻害；腫瘍成長のある程度の阻害；および／または、癌に関連する症状の１つ以上のある程度の緩和のうちの１つまたはそれらの組み合わせを達成することができる。薬物が、成長を妨害し得、そして／または既存の癌細胞を殺滅し得る限り、その薬物は、細胞分裂抑制性および／または細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、被験体または哺乳動物において上記疾患または障害の発生または再発を予防するために使用され得る。
【０１９４】
非治療的な使用
本発明の抗体は、親和性の精製物質として使用され得る。このプロセスでは、当該分野で周知の方法を用いて、本抗体をＳｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙のような固相上に固定化する。固定化した抗体を、精製される抗原を含むサンプルと接触させ、その後、その支持体を、固定化された抗体に結合している精製される抗原以外の、サンプル中の実質的にすべての材料を除去する適当な溶媒で洗浄する。最後に、その支持体を、本抗体から抗原を放出するグリシン緩衝液，ｐＨ５．０などの別の適当な溶媒で洗浄する。
【０１９５】
本発明の抗体は、例えば、特定の細胞、組織または血清における目的の抗原の発現を検出するための、診断アッセイにおいても有用であり得る。
【０１９６】
診断的な適用の場合、本抗体は、代表的には、検出可能な部分で標識される。一般に、以下のカテゴリーに分類され得る多数の標識が利用可能である：
（ａ）放射性同位体（例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２３Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ）。本抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １および２，Ｃｏｌｉｇｅｎら（１９９１）Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｕｂｓに記載されている手法を用いて放射性同位体で標識され得、放射能は、シンチレーション測定法を用いて測定され得る。
（ｂ）蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユウロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンならびにテキサスレッド）が利用可能である。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前出に開示されている手法を用いて、本抗体に結合体化され得る。蛍光は、蛍光光度計を使用して定量化され得る。
（ｃ）様々な酵素−基質標識が利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号は、これらのうちのいくつかの概説を提供している。上記酵素は、一般に、様々な手法を用いて測定され得る、色素生産性基質の化学変換を触媒する。例えば、上記酵素は、分光光度的に測定され得る、基質の色の変化を触媒し得る。あるいは、上記酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量化するための手法は、上に記載した。化学発光の基質は、化学反応によって電子的に励起されて、次いで、（例えば、ケミルミノメーターを使用して）測定され得るか、または蛍光性のアクセプターにエネルギーを供与する、光を発し得る。酵素的な標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌のルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類酸化酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素を結合体化するための手法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（ｅｄ  Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ７３：１４７−１６６に記載されている。
【０１９７】
酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば：
（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と、基質としての水素ペルオキシダーゼ（ここで、水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する）；
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、色素生産性基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェート；および
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と、色素生産性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質の４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
が挙げられる。
【０１９８】
多数の他の酵素−基質の組み合わせもまた、当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概説については、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０号を参照のこと。
【０１９９】
時折、標識は、間接的に本抗体と結合体化される。当業者は、これを達成するための様々な手法を承知している。例えば、本抗体は、ビオチンと結合体化され得、そして上で述べた３つの広範なカテゴリーのうちのいずれかが、アビジンと結合体化され得るか、またはその逆を行う。ビオチンは、アビジンに選択的に結合するので、その標識は、この間接的な様式で本抗体と結合体化され得る。あるいは、標識と本抗体との間接的な結合体化を達成するために、本抗体を小型のハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合体化し、そして上で述べた様々なタイプの標識のうちの１つを抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）と結合体化する。このようにして、その標識と本抗体との間接的な結合体化が達成され得る。
【０２００】
本発明の別の実施形態では、本抗体は、標識される必要がなく、その存在は、その抗体に結合する標識された抗体を用いて検出され得る。
【０２０１】
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ）において使用され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。
【０２０２】
競合結合アッセイは、標識された標準物質が、被験サンプル検体（ｔｅｓｔ  ｓａｍｐｌｅ  ａｎａｌｙｚｅ）と、限られた量の抗体との結合について競合する能力に依存する。被験サンプル中の抗原の量は、その抗体に結合される標準物質の量に反比例する。結合されている標準物質の量の測定を容易にするために、その抗体に結合している標準物質および検体（ａｎａｌｙｚｅ）が、未結合のままの標準物質および検体から都合よく分離され得るように、その抗体を、通常、競合の前または後に不溶化する。
【０２０３】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体（各々が、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分、すなわちエピトープに結合することができる）の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、被験サンプル検体が、固体支持体上に固定化されている第１抗体に結合し、その後、第２抗体が、その検体に結合するので、不溶性の３部の複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。その第２抗体は、それ自体が検出可能な部分で標識されていてもよいし（直接サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識されている抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つのタイプのサンドイッチアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０２０４】
免疫組織化学の場合、腫瘍サンプルは、新鮮であり得るか、もしくは凍結されたものであり得るか、またはパラフィン内に包埋され、例えば、ホルマリンなどの保存剤で固定されているものであり得る。
【０２０５】
本抗体はまた、インビボにおける診断アッセイにも使用され得る。一般に、本抗体は、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）または免疫シンチグラフィ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を用いて腫瘍の位置をつきとめ得る色素を用いて標識される。
【０２０６】
１つの実施形態において、生物学的サンプル（例えば、組織、血液、血清、髄液）または調製された生物学的サンプル中のＮＲＰ１を検出する方法は、本発明の抗体を上記サンプルと接触させる工程、およびそのサンプル中のＮＲＰ１に結合した抗ＮＲＰ１抗体を観察するか、またはそのサンプル中のＮＲＰ１に結合した抗ＮＲＰ１抗体の量を測定する工程を包含し得る。別の実施形態では、被験体内のＮＲＰ１を検出する方法は、本発明の抗体を被験体に投与する工程、および被験体内のＮＲＰ１に結合した抗ＮＲＰ１抗体を観察するか、または被験体（例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ラットなど）内のＮＲＰ１に結合した抗ＮＲＰ１抗体の量を測定する工程を包含する。
【０２０７】
診断キット
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち、診断アッセイを行うための指示書と所定の量の試薬とが組み合わされて包装されたものとして、提供され得る。本抗体が、酵素で標識されている場合、キットは、その酵素に必要な基質およびコファクター（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を備える。さらに、安定剤、緩衝液（例えば、ブロッキング緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加物も備え得る。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液中の濃度を提供するために、大きく変化し得る。特に、試薬は、乾燥粉末として、通常は凍結乾燥されたものとして、提供され得、それは、溶解したときに適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む。
【０２０８】
製品
本発明の別の実施形態では、上に記載した障害の処置に有用な材料を備えた製品が提供される。その製品は、容器およびラベルを備える。適当な容器としては、例えば、ビン、バイアル、注射器および試験管が挙げられる。その容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されたものであり得る。その容器は、上記状態を処置するために有効な組成物を保持しており、滅菌された接続口を有し得る（例えば、その容器は、皮下注射針で突き刺すことのできる栓を有する静脈内溶液用のバッグまたはバイアルであり得る）。上記組成物中の活性な薬剤は、本抗体である。上記容器上のラベルまたは上記容器に関連付けられているラベルは、その組成物が、最適な状態を処置するために使用されることを示している。本製品は、薬学的に許容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液）が入った第２の容器をさらに備え得る。本製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用に関する指示を含む添付文書をはじめとした、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備え得る。
【０２０９】
以下の実施例は、本発明の実施を例示することだけが意図されており、限定する目的で提供されない。本明細書中に引用されるすべての特許および科学文献の開示の全体が、明確に参考として援用される。
【実施例】
【０２１０】
実施例１
抗（ａｎｉ−）Ｎｒｐ１Ｂ抗体および抗ｐａｎＮｒｐＡ抗体の構築および機能
セマフォリンまたはＶＥＧＦのいずれかがＮｒｐ１に結合するのを選択的に阻止するファージ由来抗体を得るためのストラテジーは、Ｌｉａｎｇら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６６，８１５−２９（２００７）およびＰａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１，５３−６７（２００７）によって報告されている。これらのモノクローナル抗体は、いずれかのリガンドに対するＮｒｐ１媒介性応答を区別するツールとして、およびマウス腫瘍モデルにおいて治療薬としての能力を評価するツールとして、設計された。
【０２１１】
簡潔には、ＶＨ／ＶＬ多様性を有する単一のコンセンサススキャフォールドにおいて構築されるヒト合成抗体ファージライブラリを設計した。この抗体ライブラリの設計および選択の詳細は、Ｌｉａｎｇら、前出に記載されており、２００３年１２月１１日公開のＷＯ０３／１０２１５７（これらの開示の全体が、本明細書中で参考として援用される）にも見られる。このライブラリから、ヒトおよびマウスのＮＲＰ１に対する機能的なブロッキング抗体を得た。ＮＲＰ１のｂ１ｂ２ドメインにマッピングする抗体は、ＶＥＧＦとＮＲＰ１との結合およびＶＥＧＦ誘導性のＨＵＶＥＣ細胞遊走を阻止し得る。同定された抗体は、０．２ｎＭの親和性でＮｒｐ１に結合するＶＥＧＦブロッキング抗体（クローンＹＷ１０７．４．８７；抗Ｎｒｐ１Ｂ）を含んだ（Ｌｉａｎｇら、前出；Ｐａｎら、前出）。この抗体は、ＶＥＧＦとＮｒｐ１との相互作用を阻止するが、Ｓｅｍａ３Ａの機能と拮抗しない。インビボにおいて、抗Ｎｒｐ１Ｂは、マウス網膜において血管リモデリングを減少させるだけでなく、腫瘍成長を遅延させる抗ＶＥＧＦ治療と相加的に働く（Ｌｉａｎｇら、前出およびＰａｎら、前出）。
【０２１２】
同じアプローチに従い、単一のコンセンサスフレームワークにおいて構築されたヒト合成抗体ファージライブラリを用いて、Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との両方と、それぞれ０．２１および０．１５ｎＭの親和性で交差反応する抗体（クローンＹＷ６８．１１．２６、抗ｐａｎＮｒｐＡ）を得た（図Ｓ１）。ＹＷ６８．１１．２６および関連のＹＷ６８．１１の軽鎖可変ドメイン配列および重鎖可変ドメイン配列をそれぞれ図７および８に示す。抗ｐａｎＮｒｐＡＩｇＧ１抗体であるＹＷ６８．１１およびＹＷ６８．１１．２６のＦａｂフラグメントのアミノ酸配列をそれぞれ図９Ａおよび９Ｂに示す。
【０２１３】
抗Ｎｒｐ１Ｂとは対照的に、抗ｐａｎＮｒｐＡは、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ−Ｃの結合に影響を及ぼさない（データ示さず）。両方の抗体の、マウス後根神経節（ＤＲＧ）由来の軸索成長円錐のＳｅｍａ３Ａ媒介性の崩壊を阻害する能力の評価（図１）。Ｓｅｍａ３Ａの添加によって、ＤＲＧ成長円錐によるアクチンプロセスの後退がもたらされる；この作用は、抗ｐａｎＮｒｐＡによって完全に拮抗されるが、抗Ｎｒｐ１Ｂによって拮抗されない。
【０２１４】
実施例２
ニューロピリン／抗体複合体の構造の研究
材料および方法
機能アッセイおよび抗体結合親和性
崩壊アッセイおよび抗Ｎｒｐ抗体結合親和性の測定を以前に報告されているとおりに行った（Ｈｅ，Ｚ  ａｎｄ  Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ  ９０，７３９−５１（１９９７）；Ｌｉａｎｇら、前出およびＰａｎら、前出。
【０２１５】
結晶学研究のためのタンパク質発現および精製
Ｎｒｐ１−ｂ１、Ｎｒｐ１−ｂ１ｂ２およびＮｒｐ２−ｂ１ｂ２（ドメインの境界線については表Ｓ１を参照のこと）をｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、３７℃（Ｎｒｐ１−ｂ１および−ｂ１ｂ２）または１６℃（Ｎｒｐ２−ｂ１ｂ２）において誘導した後、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。ニューロピリンタイプｂフラグメントのすべてを、リフォールディングプロトコルの必要のない可溶性タンパク質として発現させる。細胞を溶解した後、タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００〜５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾール中のニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂を用いて精製し、同じ緩衝液＋２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。ｈｉｓ６−タグを、トロンビンを用いて除去し、サンプルを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィでさらに精製した。
【０２１６】
Ｈｉ５細胞からのＮｒｐ１−ａ２ｂ１ｂ２、Ｎｒｐ２−ａ２ｂ１ｂ２、Ｎｒｐ２−ａ１ａ２ｂ１ｂ２、および完全長Ｎｒｐ２−ＥＣＤ（表Ｓ１）の分泌を促進する組換えバキュロウイルスを作製した。Ｎｒｐ２−ａ１ａ２ｂ１ｂ２および完全長Ｎｒｐ２−ＥＣＤをＮｒｐ２天然分泌シグナルおよびＣ末端Ｈｉｓ６−タグとともに、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ｐＤＥＳＴ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えることにより、ウイルスバクミドを作製した。Ｎｒｐ１−ａ２ｂ１ｂ２およびＮｒｐ２−ａ２ｂ１ｂ２をｐＡｃＧＰ６７Ｂ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）にクローニングした。感染後、培養液を回収し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＮｉＣｌ２を補充した；細菌が発現するニューロピリン構築物について記載したように、Ｎｉ−ＮＴＡおよびゲル濾過クロマトグラフィを用いてタンパク質を精製した。
【０２１７】
抗Ｎｒｐ１Ｂ（ＹＷ１０７．４．８７）および抗ｐａｎＮｒｐＡ（ＹＷ６８．１１．２６）に対するＦａｂフラグメントをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＰＢＳ中で平衡化されたプロテインＧカラム上に捕捉し、０．５８％酢酸で溶出した。タンパク質画分を２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５）中のイオン交換クロマトグラフィ（ＳＰ−セファロース）でさらに精製し、０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌの勾配を用いて溶出した。Ｆａｂ／Ｎｒｐ複合体を、代表的には１：１のモル比で混合し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および２００ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムを用いてさらに精製した。結晶化に向けて、未結合のニューロピリンおよびＮｒｐ／Ｆａｂ複合体サンプルのすべてを、表Ｓ１に詳述されているように濃縮した。
【０２１８】
結晶化、構造決定および精密化
等容積のタンパク質＋ウェル溶液を混合することによって、すべての結晶を１９℃における蒸気拡散法によって得た（詳細については補表１を参照のこと）。凍結保護のために、通常、結晶を母液＋２０％グリセロールまたはエチレングリコールの溶液に移す（表Ｓ１）。Ｎｒｐ１−ｂ１／Ｆａｂ複合体の結晶を１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、２５％ＰＥＧ１，５００および１０％エチレングリコールに移し；１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、２５％ＰＥＧ１，５００および２０％エチレングリコールに対して一晩脱水させ；液体窒素中で急速冷凍した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ビームライン（ｂｅａｍ−ｌｉｎｅｓ）５．０．１または５．０．２）またはＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ビームライン９−２または１１−１）においてデータセットを収集した。ＨＫＬ  Ｓｕｉｔｅ製のＤｅｎｚｏおよびＳｃａｌｅｐａｃｋを用いてデータを処理した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ  ＆  Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７６，３０７−３２６（１９９７）。細胞パラメータおよびデータの統計を表１に要約した。
【０２１９】
すべての結晶構造を、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６１，４５８−６４（２００５）を用いて分子置換によって解析した。各凝固因子ドメインに対する検索モデルとしてＮｒｐ１−ｂ１結晶構造（ｐｄｂアクセッション番号ｌＫＥＸ）（Ｌｅｅら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１，９９−１０８（２００３））を用いて、Ｎｒｐ１−ｂ１ｂ２構造を解析した。Ｎｒｐ１−ｂ１ｂ２構造の微細な座標は、Ｎｒｐ２−ｂ１ｂ２構造のための探索プローブとして機能した。Ｎｒｐ２  ａ１ａ２ｂ１ｂ２／抗ｐａｎＮｒｐＡ−Ｆａｂ複合体の単斜晶型を、Ｎｒｐ２−ｂ１ｂ２構造、およびＢ２０−４／ＶＥＧＦ複合体（ｐｄｂアクセッション番号２ＦＪＨ）からの可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）または定常ドメイン（ＣＨ１／ＣＬ）のいずれかを含むＦａｂフラグメントを用いて解析した。ａ２ドメインを、ＭＡＳＰ−２由来のＮ末端のＣＵＢドメインを用いる分子置換によって同定した；ａ１ドメインは、分子置換によって配置することができず、手動でその電子密度内に配置させた。Ｎｒｐ１−ｂ１／Ｆａｂ複合体を、上に記載したＮｒｐ１−ｂ１結晶構造およびＢ２０−４Ｆａｂフラグメントを用いて解析した。残りのすべての構造を、Ｎｒｐ２−ａ１ａ２ｂ１ｂ２／Ｆａｂ複合体からのｂ１ｂ２構造およびａ２ＣＵＢドメインの微細な座標を用いて解析した。Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．＆  Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ｃｏｏｔ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０，２１２６−３２（２００４））を用いて原子模型を構築し、Ｒｅｆｍａｃ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ５３，２４０−２５５（１９９７））を用いて精密化した。
【０２２０】
Ｎｒｐ１、Ｎｒｐ２およびニューロピリン（Ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ）／Ｆａｂ複合体の結晶化
２つの異なるストラテジーを用いて、構造研究用のタンパク質を生成した。タイプｂドメインだけを含む小さいニューロピリンフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されたが、大きいＮｒｐ構築物は、バキュロウイルス感染昆虫細胞からの分泌型タンパク質としての生成が必要だった。７つの構造の概要を図２に示す。簡潔には、Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のＶＥＧＦ結合部分（ｂ１ｂ２）の結晶は、それぞれ１．８および１．９５Åという最大解像度まで回折した。Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のａ２ｂ１ｂ２ドメインの結晶をそれぞれ２．０および２．３Åという解像度まで精密にし、ＶＥＧＦ−ブロッキングＦａｂである抗Ｎｒｐ１Ｂとの複合体でのＮｒｐ１のｂ１ドメインは、２．２Åという解像度まで回折した。最後に、Ｎｒｐ２  ａ１ａ２ｂ１ｂ２ドメインの結晶構造を、セマフォリン−ブロッキングＦａｂである抗ｐａｎＮｒｐＡとの複合体で解析した；２．７５および３．１Åまで回折する、この複合体の２つの結晶型が同定された。すべての構造が、分子置換によって解析され、良好な立体化学を有する２０／２５％未満の最終的なＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅ値で報告される（表１）。Ｎｒｐ１  ａ２ｂ１ｂ２構造は、ａ２ドメインの反対側に２つのＮ結合型グリコシル化部位を有する（図３Ｂ）。Ｎｒｐ２／Ｆａｂ複合体の単斜晶型もまた、ａ２ドメイン内に２つのグリコシル化部位を示す（図３Ａ）；しかしながら、これらの糖部分は、Ｎｒｐ２−ａ２ｂ１ｂ２構造の電子密度において十分定義されないので、モデリングされない（図３Ｂ）。
【０２２１】
ニューロピリン外部ドメインの全体的なドメイン構成
ニューロピリン細胞外領域は、それぞれ、主要なセマフォリン結合ドメイン（ａ１ａ２）、ＶＥＧＦ結合ドメイン（ｂ１ｂ２）および二量体化ドメイン（ｃ）と記述される３つの単位に分けられることが多い（Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ５，１０９９−１０７（２００６））。実際に、ラットＮｒｐ１  ｂ１ｂ２の最近の結晶構造（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，６１５２−６１５７（２００７））では、ｂ１ドメインとｂ２ドメインとの間の大きな界面が同定され、そしてドメイン間に埋もれている残基が、配列において保存されているので、このｂ１ｂ２ドメインの配置が、Ｎｒｐファミリーの一般的な特徴として認識された。ここで、ａ２、ｂ１およびｂ２ドメインを含むＮｒｐの４つの結晶構造を、種々の結晶化条件（表Ｓ１）から解析した（図２，３）。２つのモデルは、Ｆａｂフラグメントに結合したａ１ドメインを含み、他の２つは、ａ２ドメイン内にカルシウムイオンを含む。これらの相違にもかかわらず、これらの３つのドメイン（ａ２、ｂ１およびｂ２）は、すべての結晶構造において同じ配置を共有し、偽３回軸のまわりに密に詰め込まれている（図３）。Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のａ２ｂ１ｂ２構造は、非常に似ており、３１７Ｃα原子に対して１．２Åというｒ．ｍ．ｓ．ｄ．（根平均二乗変位）で重ね合わされる。ｂ１とｂ２との間の界面は、両方のニューロピリン間で保存されており、約１２００〜１５００Å２の溶媒接触表面が埋もれている。興味深いことに、ａ２ドメインとｂ１ｂ２との間の界面は、すべての構造で同様に保存されており、２０００Å２を超える溶媒接触表面が埋もれており、これらのことから、３つすべてのドメインが堅い（ｒｉｇｉｄ）構造単位を形成することが示唆される（図３）。
【０２２２】
対照的に、ａ１とａ２ｂ１ｂ２との間のドメイン配置は、Ｎｒｐ２／抗ｐａｎＮｒｐＡ−Ｆａｂ複合体の２つの結晶型間で保存されていない。それらのレセプターのａ２ｂ１ｂ２コアを重ね合わせるとき、ａ１ドメインは、互いに関して約７Åずれている。ａ１とａ２ｂ１ｂ２との間の界面は、小さく（約８００Å２の埋もれた表面積）、保存されていない。強力な相互作用を欠くことから、ａ１ドメインの可撓性が確認され、このことは、溶液中で、またはレセプターと結合したときに、Ｎｒｐの残りの部分に関して立体配座を変化させ得ると示唆される（図３Ｃ）。
【０２２３】
Ｎｒｐ  ＣＵＢドメインはカルシウム−およびセマフォリン−結合部位を含む
Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のａ１およびａ２ドメインは、ＣＵＢドメインである（Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｍ，Ｍｏｌ  Ｃｅｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ５，１０９９−１０７（２００６））。ＣＵＢドメインの原型である精子アドヘシン（Ｒｏｍｅｒｏ，Ａ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４，７８３−８（１９９７）において、その折り畳みは、β−サンドイッチを形成する２つの５本鎖βシートを含む。ストランドβ２、β４、β９、β６およびβ７は、ストランドβ１、β３、β１０、β５およびβ８を含む他のシートともに１つのβシートを形成する；しかしながら、ストランドβ１およびβ２は、いくつかの補体ファミリータンパク質由来のＣＵＢドメインに存在しないことが多い（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ｈ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２２，２３４８−５９（２００３）；Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，３２１５７−６４（２００３）；Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ  Ｂｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，２９３９１−７（２００４））。これらのタンパク質と同様に、Ｎｒｐのａ１およびａ２ドメインは、β１ストランドを欠く（図４）。概して、ＣＵＢドメインは、高度の類似性を示す。例えば、Ｎｒｐ  ａ２ドメインは、Ｎｒｐ１  ａ２ドメイン（０．９Åというｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）、Ｎｒｐ２  ａ１ドメイン（０．９Åというｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）および精子アドヘシン由来のＣＵＢドメイン（Ｒｏｍｅｒｏ，Ａ．ら、前出）（１．４Åというｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）と構造的に似ている。
【０２２４】
補体ファミリータンパク質であるＣ１ｓおよびＭＡＳＰ−２３６，３７由来のＣＵＢドメインの結晶構造は、上記サンドイッチの一端にカルシウム結合部位を含む。Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のａ２ｂ１ｂ２構造もまた、ドメインａ２内のこの位置に、結合したイオンを含む（図３Ｂ，４Ａ）。Ｎｒｐ１構造では、このイオンは、二価の陽イオンが結晶化中に含められていなかったとしても（表Ｓ１）、その電子密度内にはっきりと観察される（図Ｓ２）。Ｎｒｐ１では、カルシウムイオンは、３つの負に帯電した側鎖（Ｇｌｕ１９５、Ａｓｐ２０９およびＡｓｐ２５０）、２つのカルボニル酸素（Ａｌａ２５２およびＩｌｅ２５３）および水分子によって配位される（図４Ｂ）。同様に、そのカルシウム配位は、Ｎｒｐ２において３つの負に帯電したアミノ酸（Ｇｌｕ１９７、Ａｓｐ２１１およびＡｓｐ２５２；図Ｓ２を参照のこと）を伴う；これらの３つの残基は、１２個の遠縁種由来のａ２ドメインにおいて絶対的に保存されている（図Ｓ３）。
【０２２５】
Ｎｒｐのａ１ドメインとａ２ドメインとの配列アラインメント（図Ｓ２）は、この帯電した残基の３つ組もまた、Ｎｒｐのａ１ドメイン内で厳格に保存されていることを示している。しかしながら、Ｎｒｐ２／抗ＮｒｐＡ−Ｆａｂ複合体では、結合したイオンは、ａ１ドメインにおいて示されていない。推定上のａ１Ｃａ２＋結合部位を定義する残基を与えるループは、十分に配列されていないことから、Ｃａ２＋が、このドメインの折り畳みの安定化に関与すると示唆される。配列が高度に保存されていることに基づくと、カルシウム結合が、Ｎｒｐ  ＣＵＢドメインの共通の特徴である可能性がある。
【０２２６】
ニューロピリンは、セマフォリンのクラス３ファミリーの選択されたメンバーに対するコレセプターとして機能する。そのＮ末端は、７枚β−プロペラである「Ｓｅｍａ」というシグニチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）のドメインを含み（Ａｎｔｉｐｅｎｋｏ，Ａ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ３９，５８９−９８（２００３））、このドメインは、ニューロピリンのａ１ａ２ドメインの結合に必要である。抗ｐａｎＮｒｐＡは、Ｓｅｍａ３がＮｒｐ１とＮｒｐ２との両方に結合するのを阻止する（図１）が、ＶＥＧＦへの結合には影響を及ぼさない（データ示さず）。Ｎｒｐ２／抗ｐａｎＮｒｐＡ−Ｆａｂ複合体の構造（図４Ｃ）において、Ｆａｂフラグメントは、約１４００Å２の溶媒接触表面が埋もれている上記サンドイッチのβ８−５−１０−３面上のＮｒｐ２のａ１ドメインだけと接触する。この抗体によって認識される界面内に埋もれている接触表面の２５％超である１４個中１１個のＮｒｐ２残基が、２つのレセプター間で同一であるので、その界面は、Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との間で十分に保存されている（図４Ｃ）。Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との間でエピトープの認識が保存されていることは、その抗体がナノモル以下の範囲の親和性で両方のレセプターに結合する能力を説明する（図Ｓ１）。
【０２２７】
抗体側では、ＣＤＲ  Ｌ３、Ｈ２およびＨ３由来の１１個の側鎖が、Ｎｒｐ２と接触し、それらのうちの７つは、芳香族の性質である（図４Ｄ）。以前の研究では、部位特異的突然変異誘発を用いてＮｒｐ１のセマフォリン結合部位の境界線が明らかにされた（Ｇｕ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，１８０６９−７６（２００２）。精子アドヘシンのモデルに基づいて、アミノ酸置換のために、ａ１ドメインの表面上の推定上の溶媒露出残基を選択した。このアプローチを用いて、Ｓｅｍａ３ＡとＮｒｐ１との相互作用を妨害するいくつかの変異体を同定し（Ｇｕら、前出）、そしてそれらが、Ｎｐｒ１  ａ１のモデル上にマッピングされるとき、それらは、ａ１  β−サンドイッチの１極におけるループ上に配置される（図４Ｃ）。そのドメインの他方の端における置換は、Ｓｅｍａ３Ａ結合に影響を及ぼさない（Ｇｕら、前出）。Ｓｅｍａ３Ａ結合を妨害する変異は、Ｓｅｍａ３Ａ−ブロッキングＦａｂによって認識されるエピトープと近接している（図４Ｃ）ことから、ｓｅｍａドメインが、Ｎｒｐ２  ａ１ドメイン内の、ループおよびサンドイッチの８−５−１０−３面に結合することが強く示唆される。セマフォリン結合部位の位置も、ａ１ドメインの推定上のカルシウム結合部位とも近接している（図４Ｃ）ことから、カルシウム結合が、そのリガンドとレセプターとの相互作用に関与し得ることが示唆される。
【０２２８】
Ｎｒｐタイプｂドメインは、ヘパリン結合部位およびＶＥＧＦ結合部位を含む
ヒトニューロピリンｂ１ｂ２構造由来のｂドメイン（図５ＡおよびＶａｎｄｅｒ  Ｋｏｏら、前出，Ｌｅｅら、前出）は、凝固因子ＶおよびＶＩＩＩ（Ｆ５／８）由来のリン脂質結合（Ｃ２型）モジュール（Ｍａｃｅｄｏ−Ｒｉｂｅｉｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，４３４−９（１９９９）；Ｐｒａｔｔ，Ｋ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，４３９−４２（１９９９））および細菌のシアリダーゼのガラクトース結合ドメイン（Ｇａｓｋｅｌｌ，Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１１９７−２０５（１９９５））と著しい相同性を共有する。これらのドメインは、一緒になって、８つのコアβ−ストランドから構成されるゆがんだゼリーロールβ−バレルとして位相幾何学的に分類されるジスコイジンの折り畳みを定義する。このドメインの１極は、代表的にはジスコイジンファミリーメンバーに対するリガンド結合部位を構成する３つの広範囲の「スパイク」またはループを含む（Ｍａｃｅｄｏ−Ｒｉｂｅｉｒｏら、前出；Ｐｒａｔｔら、前出；Ｇａｓｋｅｌｌら、前出。Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のｂ１ｂ２フラグメントは、５０％配列同一性を共有し、３０７Ｃα原子に対して２．３Åというｒ．ｍ．ｓ．ｄ．で重ね合わされる（図５Ａ）。Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２のｂ１ドメインは、ほぼ区別不能である（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ＝０．６Å）が、ｂ２ドメインは、それほど十分に重ね合わされず（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．＝２．７Å）、その相違は、その「スパイク」の立体配座が異なることが大きな原因である（図５Ａ）。これらのスパイクが、ジスコイジンファミリー内の結合部位を定義することが多い（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉら、前出；Ｌｅｅら、前出；Ｍａｃｅｄｏ−Ｒｉｂｅｉｒｏら、前出；Ｐｒａｔｔら、前出；Ｇａｓｋｅｌｌら、前出）ので、Ｎｒｐ１とＮｒｐ２との相違点は、Ｎｒｐが異なる結合パートナーを認識する１つの方法であり得る。
【０２２９】
Ｎｒｐ１とＮｒｐ２のｂ２ドメインが異なるにもかかわらず、それらのｂドメインは、密に詰め込まれ、硬いスキャフォールドを形成する（図５）。ドメイン間ジャンクションは、この２つのｂドメインの長軸に対してほぼ垂直に走る深い割れ目を形成する（図５）。ｂ１のβ４：β５ループおよびｂ２のβ５：β６ループによって形成されるこの割れ目は、いくつかの正に帯電した残基に囲まれており、ラットＮｒｐ１における突然変異誘発実験に基づくと（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏら、前出）、それらは、Ｎｒｐのヘパリン結合部位である。その電気陽性のパッチは、両方のヒトＮｒｐの構造中に同様に存在する（図５Ｂ）。ＶＥＧＦ１６５のＣ末端ドメイン（ＶＥＧＦ５５としても知られる）（Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６，６３７−４８（１９９８））もまた、ヘパリン結合部位を含む。ヘパリンが、ＶＥＧＦ１６５に対するｂ１ｂ２の親和性を最大１００倍高める（Ｍａｍｌｕｋ，Ｒ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，２４８１８−２５（２００２）；Ｆｕｈ，Ｇ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２６６９０−５（２０００））ので、Ｎｒｐがヘパリンを用いてこの領域にＶＥＧＦ１６５をリクルートすることは、もっともらしいことである。
【０２３０】
ＶＥＧＦ１６５のエキソン７とのヘパリン媒介性の相互作用に加えて、エキソン８によってコードされるＶＥＧＦのＣ末端テイル（ＣＤＫＰＲＲＣＯＯＨ）は、Ｎｒｐに直接結合することができる。ＶＥＧＦテイルのテトラペプチド模倣物（ＴＫＰＲＣＯＯＨ）（ｖｏｎ  Ｗｒｏｎｓｋｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，５７０２−１０（２００６））であるタフトシンとの複合体でのラットＮｒｐ１−ｂ１ｂ２の結晶構造において（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉら、前出）、Ｃ末端のアルギニンは、ｂ１ドメインの保存された「スパイク」からの残基によって形成される酸性の溝の中に密に押し込まれている。３つすべてのＦａｂ複合体を含む本発明者らの構造のいくつかにおいて、対称関連分子からのＣ末端の残基（ヒスチジン）は、タフトシンペプチドの同じ酸性のポケットを占有する（図Ｓ４）。
【０２３１】
ＶＥＧＦ結合に関与する潜在的な残基をさらに詳述するために、ｂ１ｂ２表面上のＮｒｐ残基の表面保存を調べた（図５Ｃ）。２つの隣接するパッチが、１２個のＮｒｐ１およびＮｒｐ２のタンパク質の間で保存されている（図Ｓ３）。これらの部位の１つは、タフトシン結合部位に直接マッピングされるが、第２の部位は、ヘパリン結合パッチの縁に残基を含むことから、ＮｒｐとＶＥＧＦとが相互作用するためのさらなる領域が示唆される。
【０２３２】
Ｎｒｐ１−ｂ１／抗Ｎｒｐ１Ｂ−Ｆａｂ複合体の結晶構造（図５Ｄ）において、Ｆａｂは、これらの２つの推定上のＶＥＧＦ結合部位間に位置するエピトープと接触し、部分的にタフトシンに結合する割れ目と重なる。ＣＤＲ  Ｌ１およびＨ３由来の残基のみを含む、このＶＥＧＦブロッキング抗体のエピトープは、珍しい。平均して、Ｆａｂ／抗原界面には、１６８０Å２の溶媒露出表面が埋もれている（Ｌｏ  Ｃｏｎｔｅら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８５，２１７７−９８（１９９９））が、しかしながら、９００Å２だけが、Ｎｒｐ１−ｂ１／Ｆａｂ界面において保護されている。この小さな界面にもかかわらず、抗Ｎｒｐ１Ｂは、０．２ｎＭの親和性でＮｒｐ１に堅固に結合する（Ｌｉａｎｇら、前出；Ｐａｎら、前出）。
【０２３３】
ＶＥＧＦとＳｅｍａ３Ａとは、Ｎｒｐ結合について競合しない
本発明のＮｒｐ／Ｆａｂ結晶構造では、ＶＥＧＦ結合およびセマフォリン結合を阻止する結合エピトープは、６５Å離れており、Ｎｒｐの反対側の部位に位置する（図Ｓ５）。いくつかの研究は、ＶＥＧＦとセマフォリンとが、細胞表面上で結合について競合し、この競合は、ｂ１ドメイン上の部分的に重複する結合部位が関与すると報告している（Ｇｕら、前出；Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｑ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４６，２１７７−９８（１９９９）；Ｎａｒａｚａｋｉ，Ｍ．＆  Ｔｏｓａｔｏ，Ｇ．，Ｂｌｏｏｄ  １０７，３８９２−９０１（２００６））。ＶＥＧＦ１６５およびクラス３セマフォリンのカルボキシルテイルは、両方とも塩基性残基が豊富なので、これらのテイルは、ｂ１ドメインにおける「スパイク」によって形成される電気陰性の溝について競合し得ると示唆された（Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉら、前出；Ｌｅｅら、前出）。最近のｂ１ｂ２／タフトシン結晶構造は、おそらくＶＥＧＦ１６５テイルがこの結合部位を占めると明らかにした。本発明者らは、以前に、抗ＮＲＰ１Ｂが後根神経節（ＤＲＧ）由来の軸索のＳｅｍａ３Ａ媒介性の崩壊に拮抗しないことを示し（Ｌｉａｎｇら、前出；Ｐａｎら、前出）、このことから、Ｓｅｍａ３のＣ末端のテイルが同じ溝に結合しないことが示唆される。
【０２３４】
以前の競合実験（Ｇｕら、前出；Ｍｉａｏら、前出；Ｎａｒａｚａｋｉら、前出）では、そのタンパク質のＣ末端において異種タグ（例えば、アルカリホスファターゼ）を含む含むＶＥＧＦおよびセマフォリンを使用した。観察された競合は、ＶＥＧＦとＳｅｍａ３テイルとの直接的な競合ではなく、タグによる立体的な不一致の結果である可能性がある。本発明者らは、ＶＥＧＦ１６５がＤＲＧ由来の軸索伸長のＳｅｍａ３媒介性の崩壊に拮抗する能力を調べた。１００ｍＭという濃度でさえも、ＶＥＧＦ１６５は、Ｓｅｍａ３Ａがアクチンプロセスを後退させる能力に影響を及ぼさなかった（図１）。これらのデータから、Ｓｅｍａ３が、ｂ１ドメインへの結合についてＶＥＧＦと競合せず、セマフォリンのテイルが、このドメイン内の異なる部位と接触することが証明される。
【０２３５】
ニューロピリン二量体化についてのモデル
Ｎｒｐ１およびＮｒｐ２は、リガンドの非存在下でもホモ−またはヘテロ−多量体を形成することができ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ  ９９，５９−６９（１９９９）；Ｃｈｅｎ，Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２１，１２８３−９０（１９９８）；Ｇｉｇｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２１，１０７９−９２（１９９８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １，４８７−９３（１９９８）））、ニューロピリン複合体の正確な化学量論は、まだ確立されていないが、Ｎｒｐは、リガンド結合時にはホモ二量体を形成すると広く推定されている。現在のデータは、ｃドメインを欠いている切断変異体が、完全長ＥＣＤと比べて多量体化（ｍｕｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の低下を示すので、このドメインが、Ｎｒｐオリゴマー化に必要であるが、十分ではないことを示している（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  ９９，５９−６９（１９９９）；Ｃｈｅｎら、前出；Ｇｉｇｅｒら、前出；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２１，１０９３−１００（１９９８））。ａ１ａ２およびｂ１ｂ２ドメインを含むニューロピリン構築物は、ａ１ａ２ドメインがＶＥＧＦに結合しないにもかかわらず、いくつかのＶＥＧＦアイソフォームに対して、ｂ１ｂ２ドメインだけを含む構築物よりも高い親和性を有する（Ｍａｍｌｕｋ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２４８１８−２５（２００２）；Ｋａｒｐａｎｅｎ，Ｔ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０，１４６２−７２（２００６）；Ｇｉｇｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２５，２９−４１（２０００）。ゆえに、ａ１ａ２ドメインは、Ｎｒｐ二量体化に直接寄与するので、２：２複合体を安定化させることによってＮｒｐとＶＥＧＦ二量体との相互作用を強めることは、ありうることである。興味深いことに、２つの異なる結晶型からのＮｒｐ２−ａ１ａ２ｂ１ｂ２の結晶構造（表１）は、ａ１が介在する、保存された結晶学的界面を含む。この二量体において、ａ１ドメインは、β７およびβ８ストランドに沿っておおよそ逆平行の配置で整列する。この界面には、約１２００Å２の溶媒接触表面積が埋もれており、この界面は、疎水性相互作用によって支配されている（図Ｓ５）。興味深いことに、同様の二量体が、他のＣＵＢドメインファミリーメンバーについても観察されている（Ｒｏｍｅｒｏら、前出）。しかしながら、多角度光散乱によって３つのＮｒｐ２構築物（ａ２ｂ１ｂ２、ａ１ａ２ｂ１ｂ２およびａ１ａ２ｂ１ｂ２ｃ）の分子量を調べたところ、３つすべてのＮｒｐ２構築物が、溶液中で単量体であることが明らかになった（データ示さず）。これらのデータは、Ｎｒｐのホモ二量体化が、ＭＡＭドメインの存在下であっても溶液中では非常に弱く、レセプター二量体化は、リガンド結合時にだけ生じ得ることを示唆している。結晶学的Ｎｒｐ２二量体の配向は、ＶＥＧＦ結合についてのモデルを提唱する。ａ１界面は、約３５×６０Åの寸法を有するＶＥＧＦ１０９二量体を収容するのに十分大きい約７０Åの幅の鞍形の二量体を形成する（図６）。重要なことに、タフトシン結合部位およびヘパリン結合パッチは、その鞍の内部表面上に見られる。ヘパリンは、Ｎｒｐのヘパリン結合部位とＶＥＧＦとの相互作用を安定化し得、���ＥＧＦテイルとｂ１の「スパイク」との会合をさらに促進し得る。この配置もまた、下流のシグナル伝達のためのＶＥＧＦレセプター結合ドメインを介するＶＥＧＦＲ結合を調整し得る。それゆえ、ａ１ドメインは、ＶＥＧＦと直接関わらないが、Ｎｒｐ二量体化を促進するので、ＮｒｐのＶＥＧＦ結合を増大させ得る。この二量体は、Ｓｅｍａ３結合をさらに調整し得る（図６）。Ｓｅｍａ３Ａ結晶構造（Ａｎｔｉｐｅｎｋｏ，Ａ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ３９，５８９−９８（２００３））では、２つの「ｓｅｍａ」ドメインが、１つの界面において共に密に詰め込まれている。Ｓｅｍａ３Ａのｓｅｍａドメインは、Ｎｒｐと結合するとき、解離することにより、ａ１ａ２上の主要な結合部位との相互作用が可能になる（Ａｎｔｉｐｅｎｋｏら、前出）。本明細書中に示されるａ１介在性のＮｒｐ二量体のモデルにおいて、２つの推定上のＳｅｍａ３Ａ結合部位は、反対側に位置し、２つの結合したＳｅｍａ３分子の大きなβ−プロペラを収容するのに十分離れている（図６およびＳ５）。
【０２３６】
本発明の構造解析は、Ｎｒｐ  ＥＣＤのＶＥＧＦ（ｂ１ｂ２）部分とセマフォリン結合（ａ１ａ２）部分との両方の最初の詳細な像を提供する。以前の突然変異誘発研究（Ｇｕら、前出；Ｖａｎｄｅｒ  Ｋｏｏｉら、前出）とともに、抗体複合体（図３〜５）は、セマフォリンのＳｅｍａドメインおよびＶＥＧＦのヘパリン結合ドメインに対するＮｒｐ結合部位を表している。これらの構造は、将来の突然変異誘発実験に対する基礎を提供し、それらのリガンドならびにシグナル伝達レセプターＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、セマフォリンおよびプレキシンとの複合体でのＮｒｐの構造を解明するストラテジーを提供する。さらに、本発明によって提供された結晶構造および他の情報は、ＶＥＧＦおよび／またはセマフォリンのアンタゴニストおよびアゴニストの設計を可能にし、そして、スクリーニングアッセイにおいて使用されることにより、そのようなアンタゴニストまたはアゴニストを同定することができる。
【０２３７】
前述の説明では、ある特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、そのように限定されない。実際に、本明細書中に示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者に明らかになり、それらの改変は、添付の請求項の範囲内に包含される。
【０２３８】
本明細書全体において引用されたすべての参考文献およびそれらの中で引用されている参考文献の全体が、本明細書によって明示的に参考として援用される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図２Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２−２】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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