(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合し、
（ａ）配列番号５を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｂ）配列番号６を含むＣＤＲ−Ｌ２；
（ｃ）配列番号７を含むＣＤＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列番号８を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｅ）配列番号９を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｆ）配列番号１０を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ヒトＶＬ及びＶＨフレームワーク領域；
（ｈ）Ｌ４６Ｐ変異を有する配列番号１３を含むＶＬ配列と、配列番号１５を含むＶＨ配列、
を含む単離された抗体。
【請求項２】
ヒトＩｇＧ４定常ドメインを含む請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｓ２４１Ｐ変異をさらに含む請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに対してよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合する請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１から４の何れかに記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又はビヒクルを含有する組成物。
【請求項６】
悪性腫瘍、ウイルス感染、炎症疾患、及び／又は自己免疫疾患の治療に使用される請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を生産する方法であって、抗体をコードする核酸断片を含む一又は複数のベクターで形質転換された宿主細胞を、核酸断片の発現を容易にする条件下で培養し、場合によっては生産された抗体を回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある種の抗ＮＫＧ２Ａ抗体、特にマウス抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９のヒト化型を含むＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの非競合的アンタゴニスト、並びにかかる抗体を製造し使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）及びＴ細胞（α／β及びγ／δ）のサブセットに見出される阻害性レセプターである。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-リガンドＨＬＡ-Ｅを発現する細胞に対するサイトカイン放出及び上述のリンパ球の細胞傷害性応答を制限する（例えば国際公報９９／２８７４８号を参照）。ＨＬＡ-Ｅはまたある種の腫瘍細胞（Derre等, J Immunol 2006;177:3100-7）及び活性化された内皮細胞（Coupel等, Blood 2007;109:2806-14）によって可溶型で分泌されることが見出されている。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達を阻害する抗体は、例えばＨＬＡ−Ｅ発現腫瘍細胞に対するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性腫瘍特異的Ｔ細胞の応答、又はウイルス感染細胞に対するＮＫ応答のように、ＨＬＡ−Ｅ陽性標的細胞に対するサイトカイン放出及びリンパ球の細胞溶解活性を増加させうる。従って、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを阻害するがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の死滅を誘発しない治療用抗体（つまり、非枯渇抗体）は、癌患者における腫瘍増殖の制御を誘起しうる。
【０００３】
また、ある種のリンパ腫、例えばＮＫ-リンパ腫は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現に特徴がある。このような患者では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞を標的としてこれを死滅させる治療用抗体（つまり枯渇抗体）は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を経由して腫瘍細胞を根絶しうる。また、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、自己免疫性疾患又は炎症性疾患の治療での使用が示唆されている（例えば、米国特許出願公開第２００３００９５９６５号、国際公開第２００６０７０２８６号を参照）。
【０００４】
ＮＫＧ２Ａに対する様々な抗体が従来から記述されている。例えば、Sivori等 (Eur J Immunol 1996;26:2487-92)はマウス抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ２７０に言及し、Carretero等 (Eur J Immunol 1997;27:563-7)ではマウス抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９(現在Beckman Coulter, Inc., Product No. IM2750, USAから市販)が記載され、Vance等 (J Exp Med 1999;190: 1801-12)はラット抗マウスＮＫＧ２抗体２０Ｄ５(現在BD Biosciences Pharmingen, カタログ番号550518, USAから市販)に言及し、米国特許出願公開第２００３００９５９６５号は、主張するところによればＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｅに結合するマウス抗体３Ｓ９を記載している。
【０００５】
現在利用可能な抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体は非ヒト起源であり、このため、その免疫原性により殆どのヒトの治療用途には適さないものとなっている。従って、ヒト患者の治療に適した抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＮＫＧ２Ａ結合薬剤、例えば抗ＮＫＧ２Ａ抗体、並びにかかる薬剤を含有する組成物、及びかかる薬剤を製造し使用する方法を提供する。該薬剤は典型的にはヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの非競合的アンタゴニストであり、そのリガンドのＨＬＡ−Ｅの結合を阻止することなくレセプターの阻害活性を低減する。一実施態様では、薬剤は、ＮＫＧ２Ｃに対してよりもＮＫＧ２Ａに有意に高い親和性で結合し、また残基Ｐ９４−Ｎ１０７及び／又はＭ１８９−Ｅ１９７を含むＮＫＧ２Ａのセグメント、又は双方のセグメントに結合する抗体である。更なる又は代替の実施態様では、該薬剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合においてマウス抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９と競合する。該薬剤は例えばヒト又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体であり得る。
【０００７】
一実施態様では、ヒト化抗体はＺ１９９のヒト化型である。改善した性質、例えば低い免疫原性、改善した抗原結合又は他の機能的性質、及び／又は改善した生理化学的特性、例えばより良好な安定性を有するかかるヒト化抗体のフレームワーク領域(ＦＲ)におけるアミノ酸置換のための例示的な相補性決定領域(ＣＤＲ)残基又は配列及び／又は部位が提供される。一態様では、本発明は、Ｚ１９９カバットＣＤＲの少なくとも一部がヒトアクセプター配列の対応する部分と同一であるヒト化抗体を提供する。一実施態様では、ヒトフレームワーク配列は少なくとも一の逆突然変異、例えば１、２、３、４、５又は６の逆突然変異を含む。他の実施態様では、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのヒトフレームワーク配列は単一の逆突然変異を含む。
【０００８】
他の態様では、本発明は、かかる薬剤と担体を含有する医薬組成物、及び細胞傷害剤又は検出可能な薬剤にコンジュゲートさせたかかる薬剤を含有してなるコンジュゲートを提供する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、かかる薬剤をコードする核酸及びベクター、及びかかる核酸及び／又はベクターを含む宿主細胞を提供する。また提供されるものは、核酸が生産されるようにかかる宿主細胞を培養することによる薬剤製造の組換え法である。
【００１０】
他の態様では、本発明は、かかる薬剤を含む容器と、患者の癌やウイルス疾患などの疾患を治療するために使用者に指示する指示書とを具備する製造品を提供する。場合によって、製造品は他の薬剤を含む他の容器を具備し得、その指示書は薬剤と組み合わせた抗体によって疾患を治療するように使用者に指示するものである。
【００１１】
本発明は、患者における癌、ウイルス性疾患、炎症性疾患又は自己免疫性疾患等の疾患の治療に、場合によっては他の抗癌剤、抗ウイルス疾患剤、又は抗炎症剤と組合わせて、本発明の薬剤を使用する方法をまた提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬ細胞の機能的ＨＬＡ−Ｅを発現し又は欠く標的細胞を死滅させる能力、並びにマウス抗体ＨＰ−３Ｄ９（Ａ）（抗ＣＤ９４）又はＺ１９９（Ｂ）（抗ＮＫＧ２Ａ）のＨＬＡ−Ｅ発現標的細胞の死滅に対する効果を評価するＣｒ−５１放出アッセイの結果を示す。ＮＫＬ細胞は機能的ＨＬＡ−Ｅを欠いたＣｒ−５１標識標的細胞を効果的に死滅させたが、機能的ＨＬＡ−Ｅを発現する標的細胞は余り効率的には死滅させられなかった。ＮＫＬ細胞をＺ１９９と共にプレインキュベートすると、ＨＬＡ−Ｅを発現する標的細胞は、ＨＬＡ−Ｅを欠く標的細胞と同等に良好に死滅させられ、Ｚ１９９がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを機能的に阻害することが確認される。
【図２】ＨＬＡ−Ｅ四量体と共にプレインキュベートした一本鎖ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ Ｆｃ（ｓｃＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ−Ｆｃ）コンストラクトがＺ１９９に結合する一方ＨＰ−３Ｄ９は結合が妨げられたＢｉａｃｏｒｅ実験を示している。
【図３】ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞が、フローサイトメトリーによって評価して、ＨＬＡ−Ｅ四量体、ＨＰ−３Ｄ９、及びＺ１９９に結合したことを示している。Ｚ１９９と共にプレインキュベートした場合、Ｂａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞はＨＬＡ−Ｅ四量体に尚も結合することができたが、ＨＰ−３Ｄ９と共にプレインキュベートした場合は結合しなかった。
【図４】Ｚ１９９のＶＬ（配列番号２）及びＶＨ（配列番号４）配列のヒト化についてなされた配列解析を示している。カバットスキームによる残基番号付けを示す最初のラインでは、マスクは下線を付して示され、カバットのＣＤＲは太字で示されている。生殖細胞系列配列において、マウス／ヒト生殖細胞系列の差は灰色の背景で付与されている（ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６／ＪＫ２：配列番号１２；ＶＨ３＿２１／ＪＨ３：配列番号１４）。ヒト化Ｚ１９９（ｈｕｍＺ１９９）のＶＬ（配列番号１３）及びＶＨ（配列番号１５）領域の得られた配列は、太字で下線を付したヒトとの潜在的な逆突然変異残基と共に与えられている。
【図５】軽鎖中に逆突然変異Ｅ１Ｑ、Ｌ４６Ｐ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ又はＤ７０Ｓを有するｈｕｍＺ１９９変異体のＢｉａｃｏｒｅにおける結合プロファイルを示す。組換え的に発現された親のマウス抗体Ｚ１９９（ｒｅｃ）及びヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）部分を有するキメラＺ１９９（ｃｈｉｍ）はｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ−Ｆｃに効率的に結合したが、如何なる逆突然変異も含まないヒト化Ｚ１９９（ｈｕｍ）はｓｃＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ−Ｆｃに対して非常に低い結合能であった。これとは対照的に、Ｚ１９９軽鎖における単一の逆突然変異Ｌ４６Ｐは結合を回復した。
【図６】軽鎖中のＬ４６Ｐと組み合わされて選択された逆突然変異を有するｈｕｍＺ１９９変異体の親和性の定量を示す。各変異体のＫＤ値を、軽鎖中のＬ４６Ｐ変異を有するｈｕｍＺ１９９の値に対して正規化して（図中「ｈｕＺ１９９（ＬＣ：Ｌ４６Ｐ）」と命名）、ＫＤの相対変化を得た。
【図７】星印で示されたＺ１９９のＶＬ及びＶＨ配列においてなされたＡｌａ−突然変異の位置を示す。配列番号については図４を参照のこと。
【図８】ｃｈｉｍＺ１９９の結合に対して正規化した固定化ｓｃＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ−Ｆｃに対するＶＨ領域にアラニン変異を有するＺ１９９の結合を示す。
【図９】ｃｈｉｍＺ１９９の結合に対して正規化した固定化ｓｃＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ−Ｆｃに対するＶＬ領域にアラニン変異を有するＺ１９９の結合を示す。
【図１０】ＮＫＧ２Ａ（配列番号１１）及びＮＫＧ２Ｃ（配列番号１６）のアラインメントに対する（下線を付した）露出残基のマッピングを示す。ＮＫＧ２Ａ配列からの残基番号付けを使用した。保存された残基は＊の印をつけている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（定義）
ここでの「抗体」なる用語は、最も広義に使用され、特に、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片を含む。抗体の生産に関連する様々な技術は、例えば、Harlow等, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).)に提供される。
【００１４】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその抗原結合性又は可変領域を含み、合成及び半合成抗体誘導分子を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的にはＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的にはＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ及びＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えばIll等, Protein Eng 1997;10: 949-57を参照）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；及び抗体断片から形成された多特異性抗体断片、及び一又は複数の単離ＣＤＲ又は機能的パラトープが含まれ、ここで、単離ＣＤＲ又は抗原結合残基又はポリペプチドは互いに関連又は連結して機能的抗体断片を形成しうる。様々な種類の抗体断片が、例えばHolliger及びHudson, Nat Biotechnol 2005;23, 1126-1136；国際公開第２００５０４０２１９号、及び公開米国特許出願第２００５０２３８６４６号及び同第２００２０１６１２０１号に記載されているか又は概説されている。
【００１５】
ここで使用される「抗体誘導体」なる用語には、完全長抗体又は、好ましくは少なくとも抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む抗体の断片が含まれ、このとき、例えば第二の分子に抗体を連結させるために、例えばアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって一又は複数のアミノ酸が化学的に修飾されているものである。これには、ペグ化抗体、システイン-ペグ化抗体及びその変異体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「イムノコンジュゲート」には、細胞傷害性剤、検出可能試薬などの第二薬剤と結合した又は連結した抗体誘導体が含まれる。
【００１６】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むヒト／非ヒトのキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列の残基である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、場合によって免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。詳しくは、例えばJones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及び、Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、国際公報９２／０２１９０、米国特許公開２００６００７３１３７及び米国特許第６７５０３２５号、同第６６３２９２７号、同第６６３９０５５号、同第６５４８６４０号、同第６４０７２１３号、同第６１８０３７０号、同第６０５４２９７号、同第５９２９２１２号、同第５８９５２０５号、同第５８８６１５２号、同第５８７７２９３号、同第５８６９６１９号、同第５８２１３３７号、同第５８２１１２３号、同第５７７０１９６号、同第５７７７０８５号、同第５７６６８８６号、同第５７１４３５０号、同第５６９３７６２号、同第５６９３７６１号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号及び同第５２２５５３９号を参照のこと。
【００１７】
本明細書中で用いられる「高頻度可変領域」なる用語は抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；上掲のKabat等, 1991)及び／又は「高度可変ループ」の残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。一般的に、この領域のアミノ酸残基の番号付けは、上掲のカバット等において記述される方法によって行われる。本明細書中の「カバット位置」、「カバット番号付けを使用して」、「カバットに記載の可変ドメイン残基番号付け」、及び「カバットによると」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。カバット番号付けシステムを用いて、実際の直鎖状のペプチドのアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に応じてアミノ酸が減っていても又は増えていてもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入(カバットによると残基５２ａ)を含んでいてもよいし、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによると残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)を含んでいてもよい。残基のカバット番号付けは、抗体の配列の相同領域に「標準の」カバット番号付けした配列と整列させて所定の抗体について決定してもよい。特に明記しない又は内容に反しない限り、本明細書中に記載したＶＬ又はＶＨ配列中のすべてのアミノ酸残基の位置はカバットに従う。
【００１８】
本明細書において定められるように、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基はＣＤＲ以外のＶＨ又はＶＬ残基である。
ポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチド、一般的に天然又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、天然のアミノ酸配列内の特定の位置に一又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有してもよい。
「保存的」アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の物理化学的性質を有する側鎖を持つアミノ酸残基に置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で知られており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００１９】
２つのアミノ酸配列の関係において「実質的に同一の」なる用語は、例えば初期設定のギャップ加重を用いたプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって、最適に整列させられた場合に、配列が少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約９８又は少なくとも約９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。一実施態様では、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換が異なる。配列同一性は、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を用いて類似の配列を適合させる。例えば、公的に利用可能なＧＣＧソフトウェアは、異なる生物種からの相同ポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間、又は野生型タンパク質とその変異体間の配列相同性又は配列同一性を決定するために初期設定パラメーターと共に用いられうる「Ｇａｐ」及び「ＢｅｓｔＦｉｔ」などのプログラムを含む。例えばＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた初期設定又は推奨パラメーターを適用してＦＡＳＴＡ又はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて比較されうる。ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）により、クエリー及びサーチ配列が整列され、最善のオーバーラップの領域のパーセント配列同一性がもたらされる（Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98；Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219）。ある配列を様々な生物の多数の配列を含むデータベースと比較する場合、又はそれを推定する場合の他の好適なアルゴニズムは、初期設定パラメーターを用いたコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐである。例えば各々出典明示によりここに援用されるAltschul等, J. Mol. Biol. 1990;215:403-410；Altschul等, Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)を参照。２つの実質的に同一のアミノ酸配列における「対応する」アミノ酸位置は、典型的には初期設定パラメーターを用いた、ここで言及したタンパク質分析ソフトウェアの何れかによって整列されるものである。
【００２０】
参照抗体の「生物学的特性」を有する抗体（例えばＺ１９９）は、同じ抗原（例えばＮＫＧ２Ａ）に結合する他の抗体とそれを区別するその抗体の生物学的特性の一又は複数を有するものである。例えば、Ｚ１９９の生物学的特性を有する抗体は、ＮＫＧ２Ａの活性化をブロックするか、及び／又はＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインと結合する際にＺ１９９と交差競合しうる。
【００２１】
ＮＫＧ２Ａ（ＯＭＩＭ １６１５５５、その全開示内容は出典明示によって本明細書中に援用される）は転写物のＮＫＧ２Ａグループのメンバーである（Houchins,等 (1991) J. Exp. Med. 173: 1017-1020）。ＮＫＧ２Ａは２５ｋｂにわたる７つのエクソンによってコードされ、幾つかのディファレンシャルスプライシングを示す。ＣＤ９４と共に、ＮＫＧ２Ａは、ＮＫ細胞、α／βＴ細胞、γ／δＴ細胞及びＮＫＴ細胞のサブセットの表面に見出されるヘテロ二量体阻害性レセプターを形成する。阻害性ＫＩＲレセプターと同様に、その細胞質ドメインにＩＴＩＭを有している。ここで使用される場合、「ＮＫＧ２Ａ」は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子又はコード配列の任意の変異体、誘導体又はアイソフォームを意味する。また包含されるものは、野生型の完全長ＮＫＧ２Ａと一又は複数の生物学的特性又は機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の同一性を共有する任意の核酸又はタンパク質配列である。ヒトＮＫＧ２Ａは、３つのドメインに２３３のアミノ酸を含み、細胞質ドメインは残基１−７０を含み、膜貫通領域は残基７１−９３を含み、細胞外領域は残基９４−２３３を含む、以下の配列である。
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL(配列番号１１)。
【００２２】
ＮＫＧ２Ｃ（ＯＭＩＭ ６０２８９１、その全開示内容は出典明示によってここに援用される）とＮＫＧ２Ｅ（ＯＭＩＭ ６０２８９２、その全開示内容は出典明示によってここに援用される）は、転写物のＮＫＧ２Ａグループの他の２つのメンバーである（Gilenke,等 (1998) Immunogenetics 48:163-173）。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ及びＣＤ９４／ＮＫＧ２ＥレセプターはＮＫ細胞及びＴ細胞のようなリンパ球のサブセットの表面に見出される活性化レセプターである。
【００２３】
ＨＬＡ−Ｅ（ＯＭＩＭ１４３０１０、その全開示内容は出典明示によってここに援用される）は、細胞表面上に発現され、他のＭＨＣクラスＩ分子のシグナル配列由来断片のようなペプチドの結合によって制御される非古典的なＭＨＣ分子である。ＨＬＡ−Ｅの可溶型もまた同定されている。そのＴ細胞レセプター結合特性に加えて、ＨＬＡ−Ｅは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ、及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに特異的に結合することによって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）及びＴ細胞（α／β及びγ／δ）のサブセットに結合する（例えばその全開示内容が出典明示によってここに援用されるBraud等 (1998) Nature 391:795-799を参照）。ＨＬＡ−Ｅの表面発現は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ、Ｔ又はＮＫＴ細胞クローンによる溶解から標的細胞を保護する。ここで使用される場合、「ＨＬＡ−Ｅ」は、ＨＬＡ−Ｅ遺伝子又はコードされるタンパク質の任意の変異体、誘導体又はアイソフォームを意味する。また包含されるものは、野生型の完全長ＨＬＡ−Ｅと一又は複数の生物学的特性又は機能を共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸同一性を共有する任意の核酸又はタンパク質配列である。
【００２４】
核酸が、他の核酸配列と機能的な関係に配されている場合、「作用可能に連結」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関わっているタンパク質前駆体として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡと作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合はコード化配列と作用可能に連結している；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にする位置にある場合はコード配列と作用可能に連結している。一般に、「作用可能に連結した」とは、連結しているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は都合のよい制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、常套的な慣行に従って使用される。
【００２５】
「単離された」分子は、それが属する分子のクラスに関して見出される組成物中の主な種である分子である（すなわち、それは、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を占め、典型的には組成物中の分子、例えばペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上を占める）。一般には、抗体分子の組成物は、組成物中の全ての存在するペプチド種の関係において、又は少なくとも提案された用途の関係において実質的に活性なペプチド種に対して、抗体分子の９８％、９８％又は９９％の均一性を示すであろう。
【００２６】
本発明の前後関係において、前後関係によって否定されない限り、「処置」又は「治療する」は、疾患又は疾病の一又は複数の症状又は臨床的に関連する徴候を予防するか、緩和するか、管理するか、治癒するか、又は低減することを指す。例えば、症状又は疾患ないし疾病の臨床的に関連する兆候が同定されていない患者の「処置」は予防又は防止的な治療であるのに対して、症状又は疾患ないし疾病の臨床的に関連する兆候が同定されている患者の「処置」は一般的に予防又は防止的な治療を成さない。
【００２７】
本発明の文脈において、「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球」は細胞表面にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するリンパ様系統の細胞（例えばＮＫ−、ＮＫＴ−及びＴ−細胞）を意味し、これは例えばＣＤ９４及びＮＫＧ２Ａ上の組合わさったエピトープ又はＮＫＧ２Ａ上の単独のエピトープを特異的に認識する抗体を使用するフローサイトメトリーによって検出することができる。「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球」はまたリンパ球由来の不死細胞株（例えばＮＫＬ、ＮＫ−９２）を含む。
【００２８】
本発明の文脈において、「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球の表面に発現されたヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を低減させる」とは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａが細胞内プロセスにネガティブに影響を及ぼすその能力が阻害され、サイトカイン放出及び細胞傷害応答のようなリンパ球応答を生じるプロセスを意味する。これは、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球によるＨＬＡ−Ｅ陽性細胞の死滅を刺激する治療用化合物の能力が測定される標準的なＮＫ−又はＴ−細胞ベースの細胞毒性アッセイで測定することがでいる。一実施態様では、抗体調製物はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞傷害性の少なくとも１０％の増強、好ましくはリンパ球細胞傷害性の少なくとも４０％又は５０％の増強、又はより好ましくはＮＫ細胞傷害性の少なくとも７０％の増強を引き起こし、記載された細胞傷害性アッセイを意味する。
【００２９】
本発明の文脈において、「ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合する薬剤」とは、薬剤がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ａの存在下でインキュベートされ、結合が例えば放射標識、物理的方法、例えば質量スペクトルを介して検出され、又は直接的もしくは間接的蛍光標識が例えば細胞蛍光測定分析法（例えばＦＡＣＳｃａｎ）を使用して検出される任意の標準的なアッセイを使用して検出可能なヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターへの結合性を有する薬剤を意味する。コントロールの非特異的薬剤で見られる量を越える結合量は薬剤が標的に結合することを示している。
【００３０】
本発明の文脈において、「Ｚ１９９抗体」は、Carretero等（Eur J Immunol 1997;27:563-7）によって記載され、Beckman Coulter社（Product No. IM2750, USA）を介して現在市販されているマウス抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９である。Ｚ１９９のＶＨ及びＶＬ配列の決定は実施例２に記載されている。Ｚ１９９のヒト化型は、ここでは「ｈｕｍＺ１９９」、「ｈｕＺ１９９」、「ｈｚＺ１９９」、又は「ｈＺ１９９」と称されうる。
【００３１】
発明の説明
本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合するある種の薬剤が非競合的アンタゴニストである、つまりレセプターへのＨＬＡ−Ｅの結合を阻止しないでＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を低減するという発見に部分的に基づいている。好ましい薬剤は、活性化するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターに対してよりも高効率で阻害性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合する。ここで示されるように、かかる薬剤は、残基Ｐ９４−Ｎ１０７、Ｍ１８９−Ｅ１９７、又は双方を含むＮＫＧ２Ａ（配列番号１１）のセグメントに結合しうる。本発明の非競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストを、例えば癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患のような幾つかのタイプの疾病及び疾患において治療用薬剤として使用することができる。非競合的アンタゴニストは、有利には、例えば可溶型ＨＬＡ−Ｅが存在している治療用途に使用することができる。
【００３２】
ここに記載の非競合的アンタゴニストの一つのタイプは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、特にヒト患者の治療に適した抗体である。かかる抗体はヒト抗体又は非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化型でありうる。ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合においてマウス抗体Ｚ１９９と結合するヒト又はヒト化抗体が本発明の特定の態様である。一実施態様では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターへの結合においてＺ１９９と競合するヒト又はヒト化抗体は、残基Ｐ９４−Ｎ１０７、Ｍ１８９−Ｅ１９７を含むＮＫＧ２Ａのセグメントに結合し、又は双方のセグメントに結合する。例えば、抗体は、ＮＫＧ２ＡのＰ９４、Ｓ９５、Ｔ９６、Ｌ９７、Ｉ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｈ１０１、Ｌ１０６、Ｍ１８９、又はＥ１９７から選択される残基を含むエピトープに結合しうる。他の実施態様では、抗体はＺ１９９と同じエピトープに結合する。実施例に記載されているように、Ｚ１９９は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの機能を阻害したが（図１に示す）、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡレセプターへのＨＬＡ−Ｅの結合には影響を及ぼさなかったので（図２及び３）、リンパ球上に発現されたヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの非競合的アンタゴニストであることが見出された。Ｚ１９９は更に高特異性でＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合し、ＫＤはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターへの結合の値より少なくとも１００倍低かった。
【００３３】
他の態様では、本発明は、Ｚ１９９のヒト化型である特定のヒト化抗体を提供する。かかる抗体は典型的にはヒトフレームワーク配列中にＺ１９９のＣＤＲからのキーとなるアミノ酸残基を含むことを特徴とする。例えば、ヒト化Ｚ１９９抗体はＺ１９９ＶＬドメインにカバット残基Ｙ３２、Ｌ５０、及びＰ９５を、Ｚ１９９のＶＨドメイン中にカバット残基Ｙ５６、Ｙ９８及びＰ９９を含みうる。Ｚ１９９のＶＨ及びＶＬ配列中において、これらは、Ｚ１９９のＣＤＲのものに対応するカバット位置での、Ｚ１９９のＶＬドメイン（配列番号２）のアミノ酸残基Ｙ３１、Ｌ４９及びＰ９４と、Ｚ１９９のＶＨドメイン（配列番号４）のアミノ酸残基Ｙ５７、Ｙ１０２、及びＰ１０３に対応する。
【００３４】
ヒト化Ｚ１９９抗体は、例えばヒト化抗体の親和性、安定性、又は他の性質を亢進させるためにヒトフレームワーク配列中に一又は複数の逆突然変異を更に含みうる。好ましい逆突然変異は、好ましくはＺ１９９のＶＨ及びＶＬドメインのものに対応するカバット位置に、Ｚ１９９のＶＬドメイン配列のアミノ酸残基Ｑ１、Ｐ４５、Ｗ４６、Ｖ５７、及びＳ６９の一又は複数及び／又はＺ１９９のＶＨドメイン配列のアミノ酸残基Ａ４９、Ｔ７８、及びＴ９７の一又は複数、好ましくはＺ１９９のＶＬドメイン配列の少なくとも残基Ｐ４５を含むヒト化抗体を生じるものを含む。一実施態様では、ヒト化Ｚ１９９抗体は、Ｚ１９９のＶＬドメイン配列の少なくともアミノ酸残基２４−３３、４９−５５、及び８８−９６と、Ｚ１９９のＶＨドメイン配列の少なくともアミノ酸残基３１−３５、５０−６０及び９９−１０８を含み、場合によってはまたＺ１９９のＶＨドメイン配列の残基６２、６４、６６を含む。ヒト化抗体はまたＣＤＲ、特にＣＤＲ＿Ｌ１に挿入された一又は複数のアミノ酸、例えばＺ１９９のＶＬドメインの残基３０及び３１間に挿入されたセリン（Ｓ）を含みうる。
【００３５】
他の態様では、本発明は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合し、
（ａ）配列番号５を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｂ）配列番号６を含むＣＤＲ−Ｌ２；
（ｃ）配列番号７を含むＣＤＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列番号８を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｅ）配列番号９を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｆ）配列番号１０を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ヒトフレームワーク配列；及び
（ｈ）ＶＬドメイン中のカバット位置４６のプロリン（Ｐ）残基
を含む単離された抗体を提供する。
【００３６】
カバット位置４６のプロリン（Ｐ）残基はヒトＶＬフレームワーク配列中に天然に存在しうるか、又はアミノ酸置換又は配列の他の修飾によって導入されうる。特定の実施態様では、抗体は、Ｌ４６Ｐ変異を有する配列番号１３を含むＶＬ配列と、配列番号１５を含むＶＨ配列を含む。抗体は、安定性を改善するための任意のＳ２４１Ｐ変異を含むＩｇＧ４定常ドメインを更に含みうる。
これらの態様及び他の態様は次のセクションと実施例に更に詳細に記載する。
【００３７】
薬剤
本発明は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの細胞外部分に結合する薬剤に関し、該薬剤は、（ａ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球の表面に発現するヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を低減し；かつ（ｂ）ＨＬＡ−Ｅと同時にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合可能であり、該薬剤はＺ１９９抗体ではない。
【００３８】
更なる又は別の実施態様では、本発明は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの細胞外部分に結合する薬剤に関し、該薬剤は、（ａ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球の表面に発現するヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を低減し；かつ（ｂ）ＨＬＡ−ＥとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合において競合せず、該薬剤は、配列番号２を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と配列番号４を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む抗体ではない。
【００３９】
本発明の一態様では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球は、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、例えばα／βＴ細胞又はγ／δＴ細胞、及びＮＫＴ細胞からなる群から選択される。
【００４０】
本発明の一態様では、薬剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合に対してＺ１９９抗体と競合する抗体からの少なくともＣＤＲｓを含む完全長抗体、抗体断片、及び合成又は半合成抗体由来分子から選択される抗体である。
【００４１】
本発明の一態様では、薬剤は、完全なヒト抗体、ヒト化抗体、及びキメラ抗体から選択される抗体である。
【００４２】
本発明の一態様では、薬剤は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体から選択される抗体である。
【００４３】
本発明の一態様では、薬剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４アイソタイプから選択されるヒト定常ドメインを含む抗体である。
【００４４】
本発明の一態様では、薬剤は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体から選択される抗体の断片である。
【００４５】
本発明の一態様では、薬剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択される定常ドメインを含む抗体の断片である。
【００４６】
本発明の一態様では、薬剤は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、重鎖Ｉｇ（ラマ又はラクダＩｇ）、ＶＨＨ断片、単一ドメインＦＶ、及び単鎖抗体断片から選択される抗体断片である。
【００４７】
本発明の一態様では、薬剤は、ｓｃＦＶ、ｄｓＦＶ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、ＩｇＮＡＲ；及び多重特異性抗体から選択される合成又は半合成抗体誘導分子である。
【００４８】
本発明はよってＮＫＧ２Ａに結合する抗体又は他の薬剤に関する。一態様では、抗体は、ヒトＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅに対してよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａに結合するマウスモノクローナル抗体である抗体Ｚ１９９のヒト化型である。Ｚ１９９はヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの機能をブロックし得、特にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球による細胞の死滅を濃度依存的な形で誘導する。
【００４９】
本発明の一態様では、薬剤は、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターにおける立体構造変化を防止又は誘導し、及び／又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの二量体化及び／又はクラスター形成に影響を及ぼすことによって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達を妨害することによりＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現リンパ球のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介阻害を低減させる。
【００５０】
本発明の一態様では、薬剤は、ＮＫＧ２Ｃに対するよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する。更に好ましい態様では、該薬剤は、ＮＫＧ２Ｃに対するよりも少なくとも１５０、２００、３００、４００、又は１００００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する。本発明の他の態様では、薬剤は、ＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅ分子に対するよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する。更に好ましい態様では、該薬剤は、ＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅ分子に対するよりも少なくとも１５０、２００、３００、４００、又は１００００倍低いＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する。これは、例えば、固定化されたＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ（例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２発現細胞から精製され、又はバイオ系で生産された）の細胞外部分に結合する薬剤の能力を測定し、同じアッセイにおける同様に生産されたＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ及び／又は他のＣＤ９４／ＮＫＧ２変異体への薬剤の結合と比較するＢｉａＣｏｒｅ実験で測定することができる。あるいは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを自然に発現するか又は過剰発現する（例えば一過性又は安定な形質移入）細胞への薬剤の結合を測定し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ及び／又は他のＣＤ９４／ＮＫＧ２変異体を発現する細胞の結合と比較することができる。本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＣＤ９４と共に阻害レセプターを形成するＮＫＧ２ＡスプライシングバリアントであるＮＫＧ２Ｂに場合によっては結合しうる。
【００５１】
本発明の一態様では、薬剤は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの細胞外部分への結合において抗体Ｚ１９９と競合する。これは、例えば、Ｚ１９９で飽和された(satured)固定化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター（例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２発現細胞から精製され、又はバイオ系で生産された）の細胞外部分に結合する薬剤の能力を測定するＢｉａＣｏｒｅ実験で測定することができる。あるいは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを自然に発現するか又は過剰発現し（例えば一過性又は安定な形質移入）、飽和用量のＺ１９９と共にプレインキュベートされている細胞への薬剤の結合が測定される。
【００５２】
本発明の一態様では、薬剤はＺ１９９抗体と同じか又は本質的に同じエピトープに結合する。
【００５３】
本発明の一態様では、薬剤はＺ１９９のＶＨ及びＶＬドメインから誘導されたＣＤＲ配列を含む。本発明の他の態様では、薬剤は、Ｚ１９９のＣＤＲ配列にアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。本発明の他の態様では、薬剤は、Ｚ１９９のＣＤＲに限られた数の置換、例えば１、２、３、４、５、又は６の逆突然変異のような逆突然変異を天然マウスＣＤＲ配列に含む。
【００５４】
本発明の一態様では、薬剤は、Ｚ１９９の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（配列番号４）のアミノ酸残基３１−３５、５０−６０、６２、６４、６６、及び９９−１０８とＺ１９９可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（配列番号２）のアミノ酸残基２４−３３、４９−５５、及び８８−９６を、場合によっては１、２、３、４、又はそれ以上のアミノ酸置換と共に含む。
【００５５】
本発明の一態様では、薬剤は、軽鎖のカバット位４６にプロリンを含む完全なヒト又はヒト化抗体である。
【００５６】
本発明の一態様では、薬剤は、組換え生殖細胞系列配列及び関連した体細胞突然変異からなる群から選択されるヒトフレームワーク領域を含む。
【００５７】
本発明の一態様では、抗体は、生殖細胞系列Ｊ−セグメントとしてＪＨ３及びＪＫ２を伴うヒトＶＨ３＿２１及びＶＫＩＩＩ＿Ｌ６スキャフォールド配列を含むが、原理的には多くの他の鋳型、例えばＶＨ３＿２１、ＶＨ３＿２３、ＶＨ３＿１１、ＶＨ３＿０７、ＶＨ３＿４８、ＶＨ３＿３０＿３、ＶＨ３＿６４、ＶＨ３＿３０＿５（重鎖）及びＶＫＩＩＩ＿Ｌ６、ＶＫＩ＿Ｌ２３、ＶＫＩＩＩ＿Ａ１１、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ２０、ＶＫＶＩ＿Ａ１４、ＶＫＩ＿Ｌ２３、ＶＫＩ＿Ｌ８、ＶＫＩ＿Ｌ１５（軽鎖）を使用することができる。
【００５８】
本発明の一態様では、薬剤は、抗体Ｚ１９９が結合するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａエピトープに対して産生されたか、又はＺ１９９のイディオタイプに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体に対して産生された完全なヒト抗体である。
【００５９】
本発明の一態様では、薬剤は、ヒトフレームワーク配列、４６位にプロリン残基及び次の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）：ａ）配列番号８を含むＣＤＲ−Ｈ１；ｂ）配列番号９を含むＣＤＲ−Ｈ２；ｃ）配列番号１０を含むＣＤＲ−Ｈ３；ｄ）配列番号５を含むＣＤＲ−Ｌ１；ｅ）配列番号６を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びｆ）配列番号７を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。
本発明の一態様では、薬剤は少なくとも部分的に精製された形態にある。
本発明の一態様では、薬剤は本質的に単離された形態である。
【００６０】
本発明は、例えばＣＤＲ−Ｈ２のようなＶＨ ＣＤＲの少なくとも一部がヒトＶＨアクセプター配列の対応する部分に同一であり、よってヒト化抗体の免疫原性を低減するｈｕｍＺ１９９変異体を提供する。例えば、図４に示されるように、ｈｕｍＺ１９９ ＣＤＲ−Ｈ２中の残基Ｙ５８からＧ６５はＶＨ３＿２１配列と同一である。このようなヒト化変異体はまたＺ１９９のマウス又はキメラ型と同様にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の細胞傷害性を増強するのに効果的でありうる。他の態様では、本発明はマウス抗体Ｚ１９９のものに対応するある種の抗原結合残基、及びヒトフレームワーク配列を含むＣＤＲｓを有する抗体を提供する。例えば、実施例４に示されているように、Ｚ１９９のＶＬ ＣＤＲｓ中のカバット残基Ｙ３２、Ｌ５０、及びＰ９５及びカバット残基Ｙ５６、Ｙ９８、及びＹ９９は抗原認識に有意に寄与する。一実施態様では、本発明に係る抗体は、よってこれらの残基の少なくとも幾つか、好ましくは全てを含む。
【００６１】
ヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野で記述されている。一般に、ヒト化方法では、マウス抗体の相互作用領域をコードするヌクレオチドを、ヒトＩｇＧをコードするｃＤＮＡベクター中にクローニングすることができ、これは、マウスＣＤＲ由来のアミノ酸残基を内部に持つヒトＩｇＧ骨格からなるキメラ抗体が生産されるように行うことができる。このような抗体は、元のマウス抗体と比べて低親和性、低安定性、又は他の望ましくない特徴を表し得、また免疫原性を持ちうる。従って、キメラＡｂの個々のアミノ酸は、ヒトの医療用途に対して高い品質の機能的なｍＡｂを得るために最適化される必要があるかもしれない。
【００６２】
典型的には、ヒト化抗体は、非ヒトである供与源から導入される一又は複数のアミノ酸残基を有している。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入(import)」可変ドメインから取られる「移入」残基と称される。ヒト化は、本質的にはWinter及び共同研究者（Jones等, Nature, 321: 522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332: 323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239: 1534-1536 (1988)）の方法に従って、高頻度可変領域配列をヒト「アクセプター」抗体の対応する配列と置換することにより、行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾つかの高頻度可変領域残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位の残基によって置換されたヒト抗体である。
【００６３】
ヒト化抗体の他の作製方法は米国特許出願公開第２００３／００１７５３４号に記載されており、ここでヒト化抗体及び抗体調製物はトランスジェニック非ヒト動物から産生されている。非ヒト動物に遺伝的操作を加えて、トランスジェニック非ヒト動物で遺伝子再構成及び遺伝子転換が可能になるように一又は複数のヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含有させて、多様なヒト化免疫グロブリンを生産する。
【００６４】
抗原性を低減するために、ヒト化抗体を作製する際に使用される軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列が既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー又はヒト生殖系配列のライブラリーに対してスクリーニングされる。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列がヒト化抗体のヒトフレームワーク領域として受け入れられうる（Sims等, J. Immunol. 1993;151:2296 et seq.；Chothia等, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917）。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carter等, PNAS USA, 1992;89:4285 et seq.；Presta等, J Immunol 1993;151:2623 et seq.）。ヒト患者における抗体分子の免疫原性を低減するために設計される他の方法には、ベニヤ抗体(veneered抗体)（例として米国特許第６７９７４９２号及び米国特許出願公開第２００２００３４７６５号及び同２００４０２５３６４５号を参照）及びＴ細胞エピトープ分析及び除去によって修飾されている抗体（例えば米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号及び米国特許第５７１２１２０号を参照)が含まれる。
【００６５】
抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが更に重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性の増加のような、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００６６】
Ｚ１９９が非競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストである意外な知見は、実施例１及び図１、２及び３に示されている。ＨＰ−３Ｄ９（抗ＣＤ９４）（図１Ａ）、Ｚ１９９（抗ＮＫＧ２Ａ）（図１Ｂ）及びＺ２７０（抗ＮＫＧ２Ａ）は全てＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球によるＨＬＡ−Ｅ発現標的細胞の死滅化を効果的に誘導した。しかしながら、ＨＰ−３Ｄ９及びＺ２７０はＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡとＨＬＡ−Ｅの間の相互作用を防止する一方、Ｚ１９９はこの相互作用を防止しなかった。更に、用量範囲１００ｐｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌで試験したｈｕｍＺ１９９は、飽和用量のＨＬＡ−Ｅ四量体と共にプレインキュベートしたＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞に結合することができた。
【００６７】
Ｚ１９９及びｈｕｍＺ１９９は従って非競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストである。理論に拘束されるものではないが、Ｚ１９９は、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターにおける立体構造変化を防止又は誘導し、及び／又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの二量体化及び／又はクラスター形成に影響を及ぼすことによって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達を妨害することが可能である。
【００６８】
一態様では、本発明に係る薬剤は非競合的アンタゴニストである。更なる態様では、本発明に係る薬剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターのインターナリゼーションの速度又は量に異なった効果を有し、よって更なる治療用薬剤及び／又はＨＬＡ−Ｅによる結合に対してより多くの又は少ない抗原を利用できるようにする非競合的アンタゴニストである。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター及びＨＬＡ−Ｅ間の相互作用を防止する薬剤は、他のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター（例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ）へのＨＬＡ−Ｅの結合の増加を生じ得、この活性化がこれらレセプターによって惹起される望まれない生物学的応答を生じうる（例えば望まれない炎症誘発性応答を生じる）。一態様では、本発明に係る薬剤は、他のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合してトリガーするＨＬＡ−Ｅの潜在性を増加させないで、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターをブロックし、他のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターによって引き起こされる望まれない副作用があまり起こらないようにする。
【００６９】
実施例２は例示的なヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体の設計を記載し、実施例３はｈｕｍＺ１９９及び逆突然変異変異体のＢｉａｃｏｒｅ分析を記載している。最初は、ヒト化Ｚ１９９抗体は抗原に結合することができないことが見出された。従って、ｈｕｍＺ１９９の軽鎖及び重鎖に逆突然変異が導入された。興味深いことに、軽鎖の逆突然変異Ｌ４６Ｐは抗原を認識しこれに結合する抗体の能力を回復した（図５）。この変異体の親和性は７２ｐＭと決定され、これはキメラＺ１９９（２４ｐＭ）と同じ大きさのオーダーであった（表１）。軽鎖の他の逆突然変異は、Ｌ４６Ｐと組合わされたときに抗体の親和性を有意には亢進させなかった（図６）。
【００７０】
実施例４はアラニンスキャンによるＺ１９９可変配列中の重要な残基の同定を示す。キメラＺ１９９と比較した場合、試験した全てのａｌａ変異体はアッセイで使用された２つのｍＡｂ濃度で匹敵する結合プロファイルを示したが、キメラＺ１９９軽鎖中のカバット残基Ｙ３２、Ｌ５０又はＰ９５がアラニンに置換され、又は重鎖中のカバット残基Ｙ５６、Ｙ９８又はＰ９９がアラニンに置換されたＺ１９９変異体は例外であった。Ｚ１９９軽鎖アラニン変異体Ｙ３２Ａ、Ｌ５０Ａ、及びＰ９５Ａは約４０％の抗原結合能を示した。軽鎖変異体Ｙ４９Ａの相対結合性は６０−８０％であった（図９）。従って、Ｚ１９９軽鎖中のカバット残基Ｙ３２、Ｌ５０、及びＰ９５は抗原の認識に有意に寄与したが、軽鎖中のカバット残基Ｙ４９は抗原結合性への影響は中程度であった。従って、本発明は、ＶＬドメイン中にカバット残基Ｙ３２、Ｌ５０又はＰ９５を保持しているｈｕｍＺ１９９変異体を提供する。
【００７１】
アミノ酸残基の番号付けに関して、マウスＺ１９９軽鎖の可変ドメインは、ｈｕｍＺ１９９のものより１残基短く、ｈｕｍＺ１９９軽鎖配列中のカバット残基Ｓ３１に対応する残基を欠くことに留意されなければならない（図４及び７）。従って、カバットに従って番号付けした残基、例えばｈｕｍＺ１９９軽鎖配列中のＹ３２、Ｌ４６、Ｌ５０及びＰ９５はマウスＺ１９９軽鎖配列中のカバット残基Ｙ３１、Ｐ４５、Ｌ４９及びＰ９４に対応する。しかしながら、図４及び７に示されたカバット番号付けは、別の定義がなされない限り、ここで言及される全てのＺ１９９（マウス又はヒト化で、天然又は変異された重鎖又は軽鎖）可変領域残基のカバット番号付けの標準として使用される。
【００７２】
Ｚ１９９重鎖アラニン変異体Ｙ５６Ａ、Ｙ９８Ａ、及びＰ９９Ａは約４０％の抗原結合能を保持したが、重鎖変異体Ｙ５８Ａ及びＤ９７Ａの相対結合性は６０−８０％である（図８）。従って、Ｚ１９９重鎖中のカバット残基Ｙ５６、Ｙ９８、及びＰ９９は抗原認識に有意に寄与する。一方、重鎖中のカバット残基Ｙ５８及びＤ９７は抗原結合性に中程度に影響を及ぼす。
【００７３】
ｈｕｍＺ１９９のようなＺ１９９に基づく治療用化合物は、よって好ましくは、Ｚ１９９軽鎖に見出されるようにＣＤＲ１にＹ３２を、ＣＤＲ２にＬ５０を、ＣＤＲ３にＰ９５を、Ｚ１９９重鎖に見出される位置付けで、ＣＤＲ２にカバット残基Ｙ５６を、ＣＤＲ３にＹ９８とＰ９９の双方を含む。
【００７４】
一態様では、本発明は、Ｚ１９９ハイブリドーマによって生産される抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒト化型、並びにＺ１９９と生物学的特徴及び／又は実質的な配列同一性を共有する非ヒト抗体のヒト化型を提供する。他の実施態様では、モノクローナル抗体又はその断片又は誘導体は非ヒト霊長類ＮＫＧ２Ａに結合可能である。
【００７５】
ここでのヒト化抗体は、ヒトＶＨ及びＶＬドメイン中に導入された非ヒト高頻度可変領域又はＣＤＲ残基を含む。
【００７６】
一態様では、本発明は、ヒトアクセプターフレームワークにマウス抗体Ｚ１９９のＣＤＲ由来の抗原結合残基を含み、ＣＤＲ-Ｈ２の６のＣ末端アミノ酸残基がヒトアクセプター配列中のものと同じであるヒト化抗体を提供する。かかるヒト化抗体は、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球、例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、α／βＴ細胞、及び／又はγ／δＴ細胞、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞傷害性リンパ球の集団の細胞傷害活性を増強する等において、元のマウスＺ１９９抗体又はそのキメラ型よりもより効果的でありうる。
【００７７】
図４に示されるように、ｈｕｍＺ１９９ＶＬ及びＶＨ中の潜在的な逆突然変異はヒトとして太字及び下線で提供される。よって本発明の好ましい実施態様は、カバット番号付けを使用した、次の逆突然変異されたｈｕｍＺ１９９の軽鎖及び重鎖変異体を必要とする：
ｈｕｍＺ１９９のＶＬ：Ｅ１Ｑ、Ｌ４６Ｐ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ｄ７０Ｓ及び（Ｅ１Ｑ、Ｌ４６Ｐ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ｄ７０Ｓ）の任意の組合せ
ｈｕｍＺ１９９のＶＨ：Ｓ４９Ａ、Ｓ７７Ｔ、Ａ９３Ｔ、Ａ６０Ｐ、Ｓ６２Ｔ、Ｋ６４Ｔ及び（Ｓ４９Ａ、Ｓ７７Ｔ、Ａ９３Ｔ、Ａ６０Ｐ、Ｓ６２Ｔ、Ｋ６４Ｔ）の任意の組合せ。
【００７８】
また好ましいのは、上に示された逆突然変異されたヒト化重鎖及び軽鎖の任意の組合せを含む抗体である。
他の態様では、本発明は、Ｚ１９９又はｈｕｍＺ１９９（例えば図４の配列を参照）のＶＨドメインに対して少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％の配列同一性（例えば少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、又はそれ以上の同一性）を有するＶＨドメインを含むヒト化抗体を提供する。他の特定の態様では、本発明は、ヒトＶＨドメインに導入された非ヒトＣＤＲ残基を含むＶＨドメインを含むＮＫＧ２Ａに結合し、ＶＨドメインがｈｕｍＺ１９９ＶＨと少なくとも約５０％（例えば少なくとも９０％）同一であるヒト化抗体を提供する。
【００７９】
ヒト化抗体の様々な形態が考慮される。例えば、ヒト化抗体は、抗体断片、例えばここに記載のＦａｂ又は他のタイプの断片でありうる。あるいは、ヒト化抗体は、完全長又はインタクトな抗体、例えば完全長又はインタクトなＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体でありうる。一実施態様では、ヒト化抗体は完全長ＩｇＧ４抗体又はその断片である。
【００８０】
一態様では、本発明は、ａ）ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する、ｂ）Ｆｃレセプターに特異的に結合しない；そしてｃ）ヒトＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合した場合に、標的細胞が上記ＮＫ細胞と接触すると、該ＮＫ細胞に標的細胞表面上にＨＬＡ−Ｅを有する標的ヒト細胞を溶解させる、ことを特徴とするヒト化抗体を提供する。一実施態様では、ヒト化抗体は、Ｆｃレセプターへの結合を妨げるように修飾されたヒトＩｇＧ１定常領域、又はヒトＩｇＧ４定常領域を含む。このような抗体、並びにＦｃレセプターに結合しない抗体断片は、抗体依存性細胞傷害性によって媒介されるかも知れないので、ＮＫ細胞自体を枯渇させることなく、ＮＫ細胞を活性化することが望ましい用途（例えば癌、感染性疾患）に特に有用であり、「非枯渇(non-depleting)」抗体と称されうる。
【００８１】
他の態様では、ヒト化抗体は、Ｆｃレセプターに結合するヒトＩｇＧ１定常領域（例えばＩｇＧ１、-２又は-３）、又はＦｃレセプターに結合するか又はＦｃレセプターへの結合を増加させるように修飾されているヒトＩｇＧ１、２、３又は４の定常領域、又はヒトＩｇＧ４定常領域を含む。他の実施態様では、モノクローナル抗体又はその断片が、抗体が結合している細胞に対して毒性がある部分に連結される。このような抗体は、ＮＫ-ＬＤＧＬ（顆粒リンパ球のＮＫ型リンパ球増殖性疾患；ＮＫ-ＬＧＬとも言う）のような所定の用途に有用な、ＮＫ細胞を枯渇させることが望ましい用途に特に有用であり、「枯渇(depleting)」抗体と称されうる。
【００８２】
ヒト化抗体の組換え産生のためには、ヒト化ＶＨ及びＶＬ領域、又はその変異体型を、標準的な組換え法に従って、ヒト抗体の完全長又は切断型定常領域をコードする発現ベクター中にクローニングすることができる（例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照）。その結果、選択されたＶＨ及びＶＬ領域及び定常領域を含む対象のヒト化抗体分子を発現して、分泌する形質移入細胞株となる。ヒト抗体の定常領域をコードするｃＤＮＡ配列は知られている。例えばＧｅｎＢａｎｋによって利用可能であり、それぞれが出典明示によってその全体が援用される例示的なｃＤＮＡ配列は、以下の通りである。
ヒトＩｇＧ１定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｊ００２２８、
ヒトＩｇＧ２定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｊ００２３０、
ヒトＩｇＧ３定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ０４６４６、
ヒトＩｇＧ４定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｋ０１３１６、及び
ヒトκ軽鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｊ００２４１。
【００８３】
所望ならば、ヒト化抗体のクラスがまた既知の方法によって「切り換えられ(switched)」うる。例えば、ＩｇＭ分子として元々は産生された抗体がＩｇＧ抗体にクラス切換えされうる。また、クラス切換え技術を用いて、ＩｇＧサブクラスから他へ、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換しうる。よって、本発明の抗体のエフェクター機能は、例えば、様々な治療的用途のためにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体へアイソタイプを切換えることによって変化させうる。
【００８４】
定常領域は既知の方法に従って更に修飾されうる。例えば、ＩｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２４１をプロリン(Ｐ)残基に突然変異させて、ヒンジで完全なジスルフィド架橋を形成させてもよい（例えばAngal等, Mol Immunol. 1993;30:105-8を参照）。
【００８５】
抗体断片
本発明のヒト化抗体は抗体断片として調製され得、又は抗体断片がヒト化完全長抗体から調製されうる。
ヒト化抗体の抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全長抗体のタンパク質分解性消化によって誘導された（例えばMorimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)；及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照）。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的にカップリングさせてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる（Carter等, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養物から直接分離することができる。抗体断片を生産するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開１９９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」でありうる。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性でありうる。
【００８６】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知であり、完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は通常２つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づいており、ここで２つの鎖は異なる特異性を持つものである（Millstein等, Nature, 305: 537-539 (1983)）。本発明に係る二重特異性抗体では、少なくとも一方の結合エピトープがＮＫＧ２Ａタンパク質上にある。抗ＮＫＧ２Ａ結合「アーム」は、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）、又はＩｇＧのためのＦｃレセプター（Ｆｃγ−Ｒ）、例えばＦｃ−γ−ＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ−γ−ＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃ−γ−ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの白血球上のトリガー分子に結合する「アーム」と組み合わせて、ＮＫＧ２Ａ発現細胞に対して細胞防御機構を集中させてもよい。また、二重特異性抗体を用いて細胞傷害剤をＮＫＧ２Ａを発現する細胞に局在化させてもよい。これら抗体は、ＮＫＧ２Ａ結合アームと、細胞傷害剤（例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート、又は放射性同位体ハプテン）を結合するアームを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体）として調製することができる。２以上の結合価を有する抗体が考慮される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J. Immunol, 147: 60 (1991)。
【００８７】
抗体誘導体
本発明の範囲内の抗体誘導体には、第二薬剤にコンジュゲートさせ又は共有結合させたヒト化抗体が含まれる。
本発明の一態様では、薬剤は第二薬剤にコンジュゲートされ又は融合される。
更なる態様では、第二薬剤は、遅延化基、例えばＰＥＧ、細胞傷害剤、検出可能なマーカー、標的薬剤から選択される。
【００８８】
例えば、一態様では、本発明は、細胞傷害性剤にコンジュゲートさせ又は共有結合させたヒト化抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。ここで用いられる「細胞傷害性剤」なる用語は、その細胞表面上にＮＫＧ２Ａレセプターを有する細胞を死滅化することができる分子である。細胞傷害作用又は細胞抑制作用を有する任意のタイプの部分を、本抗体にコンジュゲートさせて、本発明の細胞傷害性コンジュゲートを形成させ、特定のＮＫレセプター発現細胞を阻害又は死滅化させることができ、治療用放射性同位体、毒性タンパク質、毒性小分子、例えば薬剤、毒素、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、治療用放射性核種、血管形成阻害剤、化学療法剤、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ-２阻害剤、ＳＮ-３８、抗有糸分裂剤、抗血管形成及びアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ-１１、カンプトテカン、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、緑膿菌外毒素、リシン、アブリン、５-フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ(ＲＮアーゼ)、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン-Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン(gelonin)、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、及び緑膿菌内毒素及び他のものが含まれる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19版 (Mack Publishing Co. 1995)；Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001)；Pastan等 (1986) Cell 47:641；Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43；米国特許第６０７７４９９号を参照；その全ての開示が出典明示によりここに援用される）。毒素は、動物、植物、真菌又は微生物由来のものであってよく、又は化学合成により新たに作製することもできることが理解される。
【００８９】
他の実施態様では、抗体は、放射性同位体、例えば治療用放射性核種又は検出目的のために適切な放射性核種によって誘導体化される。多くの適切な放射性同位体の任意のものを使用することができ、限定されるものではないが、Ｉ-１３１、インジウム-１１１、ルテチウム-１７１、ビスマス-２１２、ビスマス-２１３、アスタチン-２１１、銅-６２、銅-６４、銅-６７、イットリウム-９０、ヨード-１２５、ヨード-１３１、リン-３２、リン-３３、スカンジウム-４７、銀-１１１、ガリウム-６７、プラセオジミウム-１４２、サマリウム-１５３、テルビウム-１６１、ジスプロシウム-１６６、ホルミウム-１６６、レニウム-１８６、レニウム-１８８、レニウム-１８９、鉛-２１２、ラジウム-２２３、アクチニウム-２２５、鉄-５９、セレン-７５、ヒ素-７７、ストロンチウム-８９、モリブデン-９９、ロジウム-１０５、パラジウム-１０９、プラセオジミウム-１４３、プロメチウム-１４９、エルビウム-１６９、イリジウム-１９４、金-１９８、金-１９９、及び鉛-２１１が含まれる。一般に、放射性核種は、オージェエミッターで好ましくは２０〜６０００ＫｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ＫｅＶの範囲、ベータエミッターで１００〜２５００ＫｅＶ、アルファエミッターで４０００〜６０００ＫｅＶの崩壊エネルギーを有する。また、アルファ粒子を発生して実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。
【００９０】
他の実施態様では、第二薬剤は検出可能な部分であり、それは定量的又は定性的に観察されるか又は測定されうる任意の分子でありうる。本発明のコンジュゲート抗体に有用な検出可能なマーカーの例は、放射性同位体、蛍光色素、又は相補的な結合対のメンバー、例えば抗原／抗体(ＮＫＧ２Ａに対する抗体以外)、レクチン／糖質；アビジン／ビオチン；レセプター／リガンド；又は、分子的にインプリントされたポリマー／プリント分子システムの何れか一のメンバーである。
【００９１】
第二薬剤はまたもしくはあるいは、例えば、ヒト化抗体の循環半減期を増やすことを目的とするポリマーでありうる。例示的なポリマー及び該ポリマーをペプチドに接着させる方法は、例えば米国特許第４７６６１０６号；同第４１７９３３７号；同第４４９５２８５号；及び同第４６０９５４６号に例示される。更なる例示的なポリマーには、ポリオキシエチレート化ポリオール及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分が含まれる（例えば、完全長抗体又は抗体断片は、約１０００から約４００００、例えば約２０００から約２００００、例えば約３０００から１２０００の間の分子量を有する一又は複数のＰＥＧ分子にコンジュゲートさせうる）。
【００９２】
細胞傷害性剤又は他の化合物は、多数の利用可能な方法の任意のものを使用し、直接的又は間接的に抗体に結合させることができる。例えば、薬剤は、Ｎ-スクシニル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)等の架橋剤を使用し、ジスルフィド結合形成を介して、又は抗体のＦｃ領域内の糖質部分を介して、還元された抗体成分のヒンジ領域に接着させることができる（例えば、Yu等 (1994) Int. J. Cancer 56: 244；Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991)；Upeslacis等, "Modification of Antibodies by Chemical Methods," Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch等編, pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter等編, pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)、Cattel等 (1989) Chemistry today 7:51-58、Delprino等 (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704；Arpicco等 (1997) Bioconjugate Chernistry 8:3；Reisfeld等 (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217を参照；それぞれの全ての開示は、出典明示によりここに援用される）。
【００９３】
別法として、抗ＮＫＧ２Ａ抗体と第二(細胞傷害性又は他の)ポリペプチド薬剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成によって作製されうる。
【００９４】
結合アッセイ
本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａに結合する抗体、特にＺ１９９ハイブリドーマによって産生される抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒト化型を提供する。
多種多様なアッセイの何れかを用いてヒトＮＫＧ２Ａに対する抗体の結合を評価することができる。とりわけ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、ＢＩＡＣＯＲＥ及び他の競合アッセイに基づくプロトコールが使用に適しており、当該分野でよく知られている。
【００９５】
例えば、試験抗体を標的タンパク質又はエピトープ（例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はその一部）の存在下でインキュベートし、未結合抗体を洗い流し、例えば放射標識、質量分析などの物理学的方法、又は細胞蛍光測定分析法（例えばＦＡＣＳｃａｎ）などを用いて検出される直接的又は間接的蛍光標識を使用して結合抗体の存在を評価する単純な結合アッセイを用いることができる。このような方法は当業者によく知られている。コントロールである非特異的な抗体で見られる量を上回る任意の結合量は、抗体が標的に特異的に結合することを示す。
【００９６】
このようなアッセイでは、試験抗体の標的細胞又はヒトＮＫＧ２Ａに結合する能力を、(ネガティブ)コントロールタンパク質、例えば構造的に関係のない抗原に対する抗体又は非Ｉｇペプチド又はタンパク質の同じ標的に結合する能力と比較することができる。任意の適切なアッセイを用いたときの抗体又は断片の標的細胞又はＮＫＧ２Ａへの結合親和性がコントロールタンパク質よりも２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％ないしそれ以上に増加している場合に、標的「に特異的に結合する」又は「と特異的に相互作用する」と言い、以下に記載の治療方法への使用に好ましい。また、ＮＫＧ２Ａ、例えばマウス又はヒト化Ｚ１９９、あるいはその誘導体に対する(ポジティブ)コントロール抗体の結合に影響する試験抗体の能力を評価してもよい。
【００９７】
ヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体はヒトＮＫＧ２Ｃに結合してもしなくともよく、ヒトＮＫＧ２Ｅに結合してもしなくともよく、ヒトＮＫＧ２Ｃ及びＥの何れかに結合してもしなくともよい。特定の実施態様では、モノクローナル抗体又は断片は、他のヒトＮＫＧ２レセプター、特に活性化レセプターＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ及び／又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅに、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに対してよりも有意に低い親和性で結合する。本発明の抗体のＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｅ結合特性は、単にＮＫＧ２Ａを対象の分子と交換する上記のものと類似のアッセイで評価することができる。
【００９８】
一態様では、本発明は、生物学的特徴及び／又は実質的な配列同一性をＺ１９９と共有している非ヒト抗体のヒト化型を提供する。ある例示的な生物学的特徴は、Ｚ１９９エピトープ、すなわちＺ１９９抗体が結合するＮＫＧ２Ａの細胞外ドメイン内の領域への結合である。Ｚ１９９エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane (1988)に記載のもののような常套的な交差ブロックアッセイを実施することができる。
【００９９】
例示的な交差ブロック又は競合アッセイでは、Ｚ１９９(コントロール)抗体と試験抗体が混合され(又は予め吸着され)、ＮＫＧ２Ａを含む試料に適用される。ある実施態様では、ＮＫＧ２Ａ含有試料に適用する前の一定時間、コントロール抗体を様々な量の試験抗体(例えば１：１０又は１：１００)とプレミックスしてもよい。他の実施態様では、コントロールと様々な量の試験抗体が、抗原／標的試料への曝露の間に単に混合されうる。遊離した抗体から結合した抗体を(例えば、分離法又は洗浄技術を用いて未結合抗体を取り除くことによって)、また試験抗体からコントロール抗体を(例えば、種-又はアイソタイプ-特異的な二次抗体を用いることによって、コントロール抗体を検出可能な標識で特異的に標識することによって、又は異なる化合物を区別するための質量分析のような物理的な方法を用いることによって)区別することができる限り、試験抗体が抗原へのコントロール抗体の結合を低減するかどうかを決定することができ、試験抗体がコントロールと実質的に同じエピトープを認識することが示される。このアッセイにおいて、完全に無関係な抗体の存在下で(標識した)コントロール抗体が結合すると、コントロール値は高い。低いコントロール値は、標識した(ポジティブ)コントロール抗体(Ｚ１９９)を未標識コントロール抗体とインキュベートすることによって得られ、そこで競合が生じて標識した抗体の結合が低減される。
【０１００】
試験アッセイでは、試験抗体の存在下で標識抗体の反応性が有意に低減した場合、試験が抗体が同じエピトープを認識する、すなわち標識したコントロール抗体と「交差反応する」ことを表す。約１：１０から約１：１００の間のコントロール：試験抗体又は化合物の何れかの比率で、抗原／標的への標識したコントロールの結合性を少なくとも５０％又はより好ましくは７０％低減する任意の試験抗体又は化合物は、コントロールと実質的に同じエピトープ又は決定基に結合する抗体又は化合物であると考えられる。好ましくは、このような試験抗体又は化合物は、抗原／標的へのコントロールの結合を少なくとも９０％低減するであろう。しかしながら、コントロール抗体又は化合物の結合を測定可能な程度に低減する任意の化合物又は抗体を本発明で使用することができる。
【０１０１】
同様の交差ブロックアッセイをまた用いて、Ｚ１９９をＨＬＡ-Ｅの好適な形態と交換することによって、試験(ヒト化)抗体が、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの天然のリガンドであるＨＬＡ-ＥのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合に影響するか否かを評価することができる。例えば、ヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体調製物がＨＬＡ-ＥとのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ相互作用を低減又はブロックするか否かを決定するために、以下の試験を実施することができる：ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、例えばＢａ／Ｆ３-ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＬ又はＮＫ９２を発現する細胞株を３０分間氷上でインキュベートし、試験抗ＮＫＧ２Ａ抗体の濃度を上げる。ついで、細胞を、標準的な方法によって、ＰＥ標識したＨＬＡ-Ｅ四量体と氷上で３０分間インキュベートし、再度洗浄して、フローサイトメーター(ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Beckton Dickinson)にてＨＬＡ-Ｅ四量体の結合を分析する。試験抗体がない場合、ＨＬＡ-Ｅ四量体は細胞に結合する。ＨＬＡ-ＥへのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-結合をブロックする抗体調製物の存在下では、細胞へのＨＬＡ-Ｅ四量体の結合が低減し、このようなｍＡｂは「遮断(ブロッキング)抗体」と称される。本発明は、ＨＬＡ−ＥをブロックしないでヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を低減する抗体を提供する。
【０１０２】
ＮＫＧ２Ａ発現細胞を死滅させることが望まれないなどの本発明のある態様では、本発明のヒト化抗体はＦｃレセプターに対して実質的に特異的な結合を示さないのが好ましい。このような抗体は、Ｆｃレセプターに結合しないことが分かっている様々な重鎖の定常領域を含みうる。そのような一例はＩｇＧ４定常領域である。あるいは、定常領域を含まない抗体断片、例えばＦａｂ又はＦ(ａｂ')２断片を、Ｆｃレセプター結合を避けるために使用することができる。Ｆｃレセプター結合は、例えばＢＩＡＣＯＲＥアッセイでのＦｃレセプタータンパク質に対する抗体の結合を試験することを含む当該分野で知られている方法に従って評価することができる。また、Ｆｃ部分がＦｃレセプターへの結合を最小化するか又は避けるように修飾されている任意の他の抗体タイプを使用することもできる（例えばその開示内容が出典明示によってここに援用される国際公開０３１０１４８５を参照）。例えばＦｃレセプター結合を評価するための細胞ベースのアッセイなどのアッセイは当該分野でよう知られており、例えば国際公開第０３１０１４８５に記載されている。
【０１０３】
機能的アッセイ
抗ＮＫＧ２Ａ抗体がＨＬＡ-ＥとのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ相互作用を低減又はブロックする場合、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞傷害能を亢進しうる。これは、典型的な細胞傷害性アッセイによって評価されるが、その例を以下に記載する。
【０１０４】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介性シグナル伝達を低減させる抗体の能力は、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫＬ細胞、及びＨＬＡ-Ｅを発現する標的細胞を使用する、標準的な４時間インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験することができる。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡがＨＬＡ-Ｅを認識して、リンパ球媒介性細胞溶解を防止する阻害シグナル伝達の開始及び伝播を引き起こすので、このようなＮＫＬ細胞は、ＨＬＡ-Ｅを発現する標的を効果的には死滅させない。例えば、Coligan等編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y.,(1992, 1993)に記載されているように、このようなインビトロ細胞傷害性アッセイは、当該分野でよく知られている標準的な方法で実施可能である。標的細胞は、ＮＫＬ細胞の添加前に５１Ｃｒで標識され、ついで、死滅の結果として、死滅度は、細胞から培地への５１Ｃｒの放出度合いに対する比率として推定される。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ-Ｅへの結合を阻害する抗体を添加すると、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介して阻害シグナル伝達の開始及び伝播が阻害される。よって、このような薬剤が添加されると、標的細胞のリンパ球媒介性死滅度が増加する。この工程により、例えばリガンド結合をブロックすることで、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ誘発性陰性シグナル伝達を阻害する薬剤が同定される。特定の５１Ｃｒ-放出細胞傷害性アッセイにおいて、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬエフェクター細胞は、ＨＬＡ-Ｅ陰性ＬＣＬ７２１.２２１標的細胞を死滅させることが可能であるが、ＨＬＡ-Ｅ発現ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３コントロール細胞に対してはあまり効果的ではない。これに対し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを欠くＹＴＳエフェクター細胞は、双方の細胞系を効果的に死滅させる。よって、ＮＫＬエフェクター細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介したＨＬＡ-Ｅ誘発性阻害シグナル伝達のため、ＨＬＡ-Ｅ＋ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３細胞の死滅にはあまり効果的ではない。このような５１Ｃｒ-放出細胞傷害性アッセイにおいて、ＮＫＬ細胞が、本発明に係るブロッキング抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体と共にプレインキュベートされる場合、ＨＬＡ-Ｅ発現ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３細胞は、抗体濃度依存的な様式でより効果的に死滅される。
【０１０５】
本発明の抗体の阻害活性（つまり、細胞傷害性亢進潜在性）は、例えばその開示が出典明示によりここに援用されるSivori等, J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136に記載されるような、細胞内の遊離カルシウムへのその効果により、多くの他の方法の何れかで評価することができる。ＮＫ、Ｔ又はＮＫＴ細胞活性もまた、例えばクロム放出又は他のパラメーターを測定し、Ｐ８１５細胞、Ｋ５６２細胞、又はその開示が出典明示によりここに援用されるSivori等, J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136；Vitale等, J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072；Pessino等 J. Exp. Med. 1998;188:953-960；Neri等 Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135；Pende等 J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516に開示される適切な腫瘍細胞を殺傷するようにＮＫ細胞を刺激する抗体の能力を評価するために、細胞ベースの細胞傷害性アッセイを用いて評価することができる。
【０１０６】
一実施態様では、抗体調製物は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞傷害性を少なくとも１０％増強させ、好ましくはＮＫ細胞傷害性を少なくとも４０％又は５０％増強させ、又はより好ましくはＮＫ細胞傷害性を少なくとも７０％増強させる。
【０１０７】
また、細胞傷害性リンパ球の活性は、ＮＫ細胞を抗体と共にインキュベートしてＮＫ細胞のサイトカイン産生(例えばＩＦＮ-ｙ及びＴＮＦ-α産生)を刺激するサイトカイン放出アッセイを使用して調べることができる。例示的なプロトコールでは、ＰＢＭＣからのＩＦＮ-ｙ産生が、培養の４日後にフローサイトメトリーによって細胞表面及び細胞質内を染色して分析することによって評価される。簡単に述べると、培養の最後４時間に、５μｇ／ｍｌの最終濃度でブレフェルジンＡ(Sigma Aldrich)を添加する。ついで、細胞を、透過処理前に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６ｍＡｂ(IntraPrepTM; Beckman Coulter)と共にインキュベートし、ＰＥ-抗ＩＦＮ-ｙ又はＰＥ-ＩｇＧ１(Pharmingen)で染色する。ポリクローナル活性化ＮＫ細胞からのＧＭ-ＣＳＦ及びＩＦＮ-ｙ生産を、ＥＬＩＳＡ(GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-: OptElA set, Pharmingen)を使用し、上清において測定する。
【０１０８】
特定の態様では、本発明は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞傷害能を亢進する、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の細胞傷害活性を高める、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介性のシグナル伝達を低減又は阻害することがより可能か、又は元の非ヒト化抗体及び／又はそのキメラ型よりもより有効である抗体を提供する。このような抗体は、元の非ヒト化抗体及び／又はそのキメラ型よりも、例えば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％以上機能可能か又は有効である。
【０１０９】
抗体生産
本発明はまたここに記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする単離された核酸、並びにかかる核酸を含むベクター及び宿主細胞を提供する。
一態様では、本発明に係る薬剤をコードする核酸断片が提供される。
一態様では、ＤＮＡ及びＲＮＡ断片から選択される本発明に係る薬剤をコードする核酸断片が提供される。
【０１１０】
また提供されるものは、例えば核酸又はベクターを含む好適な宿主細胞を培養して核酸を発現させ、ヒト化抗体を産生させるなどの、組換え技術を用いてかかる抗ＮＫＧ２Ａ抗体を生産する方法である。培養前に、宿主細胞に、可変重鎖ドメインをコードする核酸を含むベクターと可変軽鎖ドメインをコードする核酸を含むベクターとを同時形質移入してもよい。また、抗体は既知の技術を用いて宿主細胞から回収され、及び／又は精製されうる。有用なベクター、宿主細胞、及び技術を以下に更に記載する。
【０１１１】
一般に、抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター中に挿入され、典型的には一又は複数の発現制御エレメントに作用可能に連結される。一般的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって）、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、配列決定される。多くのベクターが既知で入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
【０１１２】
シグナル配列成分
本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。
【０１１３】
天然抗ＮＫＧ２Ａ抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第１９９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードするＤＮＡのリーディングフレームにライゲートされる。
【０１１４】
複製起点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、ＥＢＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
【０１１５】
選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含みうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１１６】
選択方法の一例では、宿主細胞の増殖を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換される細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１１７】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸を捕捉するのにコンピテントな細胞を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
【０１１８】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いる場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。
【０１１９】
あるいは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１２０】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドが補完される。
【０１２１】
また、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による組換え成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【０１２２】
プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物によって認識され抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含む。
【０１２３】
真核生物に対しても様々なプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５から３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多くの遺伝子の転写開始位置から７０から８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１２４】
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘導プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許出願公開第７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【０１２５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【０１２６】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１２７】
エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１２８】
転写終結成分
真核生物宿主細胞(例えば酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'末端、時には３'末端の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１２９】
宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０１３０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードするベクターに適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【０１３１】
グリコシル化抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウイルスは本発明においてここに記載したウイルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【０１３２】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓(ＨＥＫ)株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))、例えばＤＧ４４(Urlaub等, Som. Cell and Mol. Gen., 12: 555-566 (1986))及びＤＰ１２細胞株；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０１３３】
宿主細胞の培養
本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ),(Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ(Cibco)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ), Sigma)が宿主細胞の培養に好適である。また、例えばHam等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１３４】
抗体精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、又は細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成される場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎＴＭ又はＰｅｌｌｉｃｏｎＴＭの限外濾過装置を用いて濃縮する。フェニルメチルスルホニルフルオライド(ＰＭＳＦ)などのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１３５】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法もまた、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０１３６】
薬学的製剤
一実施態様では、医薬として使用するための本発明に係る薬剤が提供される。
一態様では、悪性腫瘍、ウイルス感染、炎症疾患、及び自己免疫疾患の治療に医薬として使用される本発明に係る薬剤が提供される。
一態様では、ヒト患者における細胞表面に発現されるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を中和又は低減させるために医薬として使用するための本発明に係る薬剤が提供される。
一態様では、ヒト患者におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の細胞死滅活性を増強するための医薬として使用するための本発明に係る薬剤が提供される。
【０１３７】
一態様では、ヒト患者においてＣｗ３発現標的細胞の死滅を誘導するための医薬として使用するための本発明に係る薬剤が提供される。
更なる態様では、本発明に係る薬剤を薬学的に許容可能な担体、希釈剤又はビヒクルと共に含有する組成物が提供される。
一実施態様では、本発明はここに記載の抗体を一又は複数の担体と共に含有する薬学的組成物を提供する。
【０１３８】
従って、本発明の他の目的は、前記の抗体を、１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在しているものを含有する薬学的製剤を提供することであり、該製剤は２．０〜１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存料、等張化剤、キレート剤、安定剤及び界面活性剤を更に含有する。一実施態様では、薬学的製剤は水性製剤、すなわち水分を含有する製剤である。このような製剤は典型的には溶液又は懸濁液である。更なる実施態様では、薬学的製剤は水溶液である。「水性製剤」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している製剤として定義される。同様に、「水溶液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している溶液として定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している懸濁液として定義される。
【０１３９】
他の実施態様では、薬学的製剤は凍結乾燥製剤であり、これに医師又は患者が使用前に溶剤及び／又は希釈液を添加する。
他の実施態様では、薬学的製剤は、何ら事前溶解させることのない使用準備が整った乾燥製剤(例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥されたもの)である。
更なる態様では、薬学的製剤は前記抗体の水溶液とバッファーを含み、該抗体は１ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在し、該製剤は約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
他の実施態様では、製剤のｐＨは、約２．０から約１０．０、約３．０から約９．０、約４．０から約８．５、約５．０から約８．０、及び約５．５から約７．５からなるリストから選択される範囲である。
【０１４０】
更なる実施態様では、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物から選択されうる。これらの特定のバッファーの各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【０１４１】
更なる実施態様では、製剤は、製薬的に許容可能な保存料を更に含有する。保存料は、例えばフェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ；又は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在しうる。これらの特定の保存料の各一が、本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１４２】
更なる実施態様では、製剤は等張化剤を更に含有しうる。等張化剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されうる。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、固定された限界値があるものではない。糖又は糖アルコールの濃度は、例えば約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。等張化剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ；１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌ；８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌ；又は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の等張化剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に等張化剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１４３】
更なる実施態様では、製剤はキレート剤も更に含有しうる。キレート剤は、例えばエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択されうる。キレート剤は例えば０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ；又は２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物にキレート剤を使用することは当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１４４】
本発明の更なる実施態様では、製剤は安定剤を更に含有しうる。製薬用組成物に安定剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。より具体的には、本発明の組成物は安定した液状製薬用組成物であり、その治療的活性化合物は、液状薬学的製剤の保存中に、凝集体の形成を示す可能性のあるポリペプチドを含む。「凝集体形成」とは、オリゴマーを形成するポリペプチド分子間の物理的相互作用を意図しており、これは、可溶性か、又は溶液から沈殿する大きな可視できる凝集体として残る。「保存中」とは、調製されて直ぐの液状製薬用組成物又は製剤が、患者に直ぐ投与されるものではないことを意図している。むしろ、調製後に、液状の形態、凍結状態、液状形態に後で再構成される乾燥した形態、又は患者への投与に適した他の形態で、包装されて保存される。「乾燥した形態」とは、液状製薬用組成物又は製剤が、フリーズドライ(すなわち凍結乾燥；例えばWilliams及びPolli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59を参照)、噴霧乾燥(Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676；Broadhead等, (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18：1169-1206；及びMumenthaler等, (1994) Pharm. Res. 11：12-20を参照)、又は空気乾燥(Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25：459-470；及びRoser (1991) Biopharm. 4：47-53)により乾燥されることを意図している。液状製薬用組成物の保存中におけるポリペプチドによる凝集体形成は、ポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼすおそれがあり、製薬用組成物の治療効果が損なわれる。更に、凝集体形成は、例えばチューブ、膜、又はポリペプチド含有製薬用組成物が注入システムを使用して投与される場合はポンプの閉塞のような、他の問題を生じさせうる。
【０１４５】
本発明の製薬用組成物は、組成物の保存中、ポリペプチドによる凝集体形成を低減させるのに十分な量のアミノ酸塩基を更に含有しうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せを意図しており、任意の与えられたアミノ酸が、その遊離塩基の形態又はその塩の形態の何れかで存在している。アミノ酸の組合せを使用する場合、全てのアミノ酸が遊離塩基の形態で存在していてもよく、全てが塩の形態で存在していてもよく、又は幾つかが遊離塩基の形態で存在していてもよく、残りが塩の形態で存在していてもよい。一実施態様では、本発明の組成物の調製に使用されるアミノ酸は、帯電側鎖を担持しているもの、例えばアルギニン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸である。特定のアミノ酸(例えば、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物)の任意の立体異性体(すなわち、Ｌ、Ｄ、又はそれらの混合物)、又はこれらの立体異性体の組合せが、該特定のアミノ酸が遊離塩基の形態又は塩の形態の何れかで存在している限り、本発明の製薬用組成物中に存在していてもよい。一実施態様では、Ｌ-立体異性体が使用される。また本発明の組成物は、これらのアミノ酸の類似体と共に製剤化されうる。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液状製薬用組成物の保存中に、ポリペプチドによる凝集体形成を低減させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体を意図している。適切なアルギニン類似体は、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチル-Ｌ-アルギニンを含み、適切なメチオニン類似体はエチオニン及びブチオニンを含み、適切なシステイン類似体はＳ-メチル-Ｌ-システインを含む。他のアミノ酸と同様、アミノ酸類似体は、遊離塩基の形態又は塩の形態の何れかで組成物中に導入される。本発明の更なる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止し又は遅延化させるのに十分な濃度で使用される。
【０１４６】
本発明の更なる実施態様では、メチオニン(又は他の硫黄含有アミノ酸又はアミノ酸類似体)は、治療剤として作用するポリペプチドが酸化を受けやすい少なくとも一のメチオニン残基を有するポリペプチドである場合、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために添加されうる。「阻害」とは、経時的なメチオニン酸化種の蓄積を最小にすることを意図している。メチオニン酸化を阻害すると、適切な分子形態でのポリペプチドの保持が更に高まる。メチオニン(Ｌ又はＤ)の任意の立体異性体又はそれらの任意の組合せを使用することができる。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関にとって許容可能であるような、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量とするべきである。典型的には、これは、組成物が約１０％〜約３０％を越えるメチオニンスルホキシドを含まないことを意味する。一般的に、これは、メチオニン残基に添加されるメチオニンの比率が、約１：１〜約１０００：１、例えば１０：１〜約１００：１の範囲になるようにメチオニンを添加することで、達成することができる。
【０１４７】
更なる実施態様では、本発明の製剤は高分子量ポリマー又は低分子量化合物の群から選択される安定剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ３３５０)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの誘導体(例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ及びＨＰＭＣ)、シクロデキストリン類、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノール、及び異なった塩(例えば塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【０１４８】
製薬用組成物は、その中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に高める付加的な安定剤をまた含有しうる。本発明にとって特に関心のある安定剤は、限定されるものではないが、メチオニンの酸化に対してポリペプチドを保護するＥＤＴＡ及びメチオニン、及び凍結解凍又は機械的剪断に関連する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４９】
更なる実施態様では、製剤は更に界面活性剤を含有しうる。界面活性剤は、例えば、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンのブロックポリマー(例えばポロキサマー、例えばプルロニック(Pluronic)(登録商標)Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトンＸ-１００)、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレンの誘導体、例えばアルキル化されアルコキシル化された誘導体(トゥイーン類(tweens)、例えばトゥイーン-２０、トゥイーン-４０、トゥイーン８０及びビリジ(Brij)-３５)、モノグリセリド類又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド類又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチン及びリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン)、リン脂質の誘導体(例えばホスファチジン酸ジパルミトイル)及びリゾリン脂質(例えばパルミトイル-リゾホスファチジル-Ｌ-セリン、及びエタノールアミン、コリン、セリン又はスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファートエステル)、及びリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)-誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン及び極性頭部基の修飾体、コリン類、エタノールアミン類、ホスファチジン酸、セリン類、スレオニン類、グリセロール、イノシトール、及び正に帯電したＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン、及びリゾホスファチジルスレオニン、及びグリセロリン脂質(例えばセファリン類)、グリセロ糖脂質(例えばガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えばセラミド類、ガングリオシド類)、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体-(例えばタウロ-ジヒドロフジシン酸ナトリウム等)、長鎖脂肪酸及びそれらのＣ６-Ｃ１２塩(例えばオレイン酸及びカプリル酸)、アシルカルニチン類及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含有するジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と２つの帯電したアミノ酸の任意の組合せを含有するトリペプチドのＮα-アシル化誘導体、ＤＳＳ(ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号[５７７-１１-７])、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号[１２８-４９-４])、ドキュセートカリウム、ＣＡＳ登録番号[７４９１-０９-０])、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩、及びグリシン又はタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホナート、アニオン性(アルキル-アリール-スルホナート類)の一価の界面活性剤、双性イオン性界面活性剤(例えば、Ｎ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、カチオン性界面活性剤(第４級アンモニウム塩基)(例えばセチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシル-β-Ｄ-グルコピラノシド)、ポロキサミン類(例えばテトロニックス(Tetronic's))で、エチレンジアミンにプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを逐次付加することにより誘導された四官能性ブロックコポリマーから選択され、又は界面活性剤は、イミダゾリン誘導体又はそれらの混合物の群から選択されうる。これらの特定の界面活性剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
製薬用組成物に界面活性剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１５０】
更なる実施態様では、製剤は、プロテアーゼインヒビター、例えばＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)及びベンズアミジンＨＣｌを更に含有し、他の商業的に入手可能なプロテアーゼインヒビターを使用することもできる。プロテアーゼインヒビターを使用することは、自己触媒を阻害するため、プロテアーゼのチモーゲンを含有する製薬用組成物に特に有用である。
【０１５１】
他の成分が本発明のペプチド薬学的製剤中に存在していてもよい。このような付加的な成分は、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、張力修正剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質)及び双性イオン(例えばアミノ酸、特にベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジン)を含みうる。もちろん、このような付加的な成分は、本発明の薬学的製剤の全体的な安定性に悪影響がないようにすべきである。
【０１５２】
本発明の一又は複数の抗体を含む製薬用組成物は、幾つかの部位、例えば局所的部位、特に皮膚及び粘膜部位、動脈、静脈、心臓への投与等、バイパス吸収がなされる部位、例えば皮膚、皮下、粘膜又は腹部への投与等、吸収に関連する部位において、このような治療が必要とされる患者に投与されうる。
【０１５３】
本発明の製薬用組成物は、幾つかの投与経路、例えば皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬、口、経口、胃、及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼球を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、このような治療を必要としている患者に投与されうる。
【０１５４】
本発明の組成物は、幾つかの投与形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、被覆錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼球用軟膏、眼球用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注入溶液、インサイツ形質転換溶液、例えばインサイツゲル化、インサイツ硬化用、インサイツ沈殿化、インサイツ結晶化のもの、注入液、及び移植片として投与されうる。
【０１５５】
本発明の組成物は、更に、抗体の安定性を更に高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤送達系、及び進化した薬剤送達系において配合し、又は付加されうる。担体、薬剤送達系及び進化した薬剤送達系の例は、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリラート及びメタクリラートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、及びそれらのブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶、及びそれらの分散液、Ｌ２相、及び脂質-水系における相挙動が当業者によく知られているそこでの分散液、ポリマー性ミセル、多相エマルション、自己乳化剤、自己-マイクロ乳化剤、シクロデキストリン及びそれらの誘導体、及びデンドリマーを含む。
【０１５６】
本発明の組成物は、全て当業者によく知られたデバイスである、定量吸入器、乾燥パウダー吸入器、及び噴霧器等を使用し、抗体を肺に投与するための、固形、半固形、パウダー及び溶液の製剤に有用である。
【０１５７】
本発明の組成物はまた、制御、徐放性、持続性、遅延性及び低速放出性の薬剤送達系の製剤に有用である。特に限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出性及び徐放性系(双方の系とも、投与の数が何倍も低下する)製剤に有用である。更に好ましいのは、皮下投与される制御放出性及び徐放性系のものである。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出性及び組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマー性ミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
【０１５８】
本発明の組成物に有用な制御放出性系の作製方法は、限定されるものではないが、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界流体プロセスを含む。一般的には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L.編. Marcel Dekker, New York, 2000)及びDrug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Formulation and Delivery(MacNally, E.J.編. Marcel Dekker, New York, 2000)を参照。
【０１５９】
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施されうる。あるいは、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。更なる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態で抗体化合物を投与するための溶液又は懸濁液であってよい組成物にある。更なる選択肢としては、本発明の抗体を含む製薬用組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与用、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
【０１６０】
抗体は、肺薬剤送達系に適した任意の既知のタイプのデバイスを使用し、ビヒクル、例えば溶液、懸濁液又は乾燥パウダーとして、肺経路を介して投与することができる。これらの例には、限定されるものではないが、肺薬剤送達用の３種類のエアゾール発生の一般的タイプが含まれ、ジェット又は超音波噴霧器、定量吸入器、又は乾燥パウダー吸入器が含まれうる(Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453を参照)。
【０１６１】
標準化された試験法に基づき、粒子の空気動力学的直径(ｄａ)を、単位密度(１ｇ／ｃｍ３)の参照基準球形粒子の幾何学的相当直径として定義する。最も単純な場合、球形粒子に対して、ｄａは、
0005774312.tif 000002
に記載されるような密度比の平方根の関数として、参照直径(ｄ)に関係している。
【０１６２】
この関係は非球形粒子に対しては修正される(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。「ＭＭＡＤ」及び「ＭＭＥＡＤ」なる用語は、詳しく記載されており、当該分野で知られている(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R、空気動力学的粒子径分布の中央値の測定値を表す。Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385を参照)。空気動力学的中央粒子径(ＭＭＡＤ)及び有効空気動力学的中央粒子径(ＭＭＥＡＤ)(mass median effective aerodynamic diameter)は、交換可能に使用され、統計パラメータであり、実際の形状、サイズ又は密度に無関係に、肺中に沈着するそれらの可能性に関連して、エアゾール粒子のサイズが経験的に記載されている(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。通常、ＭＭＡＤは、空気中における粒子の慣性挙動を測定する装置、衝突体を用いてなされる測定から算出される。
【０１６３】
更なる実施態様では、製剤は、１０μｍ未満、より好ましくは１−５μｍ、最も好ましくは１−３μｍのエアゾール粒子のＭＭＡＤを達成するために、任意の既知のエアゾール化技術、例えばネブライゼーションによりエアゾール化することができる。好ましい粒子径は、肺の奥深くまで薬剤を送達せしめるのに最も効果的なサイズに基づいており、タンパク質が最適に吸収されるようになされる (例えば、Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。
抗体を含有する肺用製剤を肺の奥深くに付着させることは、吸入技術、例えば限定されるものではないが、低吸入速度(例えば３０Ｌ／分)、呼吸停止及び作動のタイミングを修正して最適化されうる。
【０１６４】
「安定化された製剤」なる用語は、物理的安定性が増し、化学的安定性が増し、又は物理的及び化学的安定性が増した製剤を意味する。
【０１６５】
ここで使用されるタンパク質製剤の「物理的安定性」なる用語は、タンパク質が熱-機械的ストレスに暴露され、及び／又は不安定な表面及び界面、例えば疎水性表面及び界面と相互作用する結果として、タンパク質が生物学的に不活性になり及び／又は不溶性の凝集体が形成されるというタンパク質の傾向を意味する。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)に充填された製剤を、様々な時間、異なる温度で機械的／物理的ストレス(例えば攪拌)に暴露した後に、視覚検査及び／又は濁度測定することで評価される。製剤の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライト下において実施される。製剤の濁度は、例えば０〜３のスケールで、濁りの程度をランク付けする視覚スコア(濁りのない製剤は視覚スコア０に相当し、日光下で視覚的に濁りのある製剤は視覚スコア３に相当する)により特徴付ける。製剤は、日光下で視覚的濁りを示す場合に、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。あるいは、製剤の濁度は、当業者によく知られている簡単な濁度測定法により評価することもできる。また水性タンパク質製剤の物理的安定性は、タンパク質の立体構造状態のプローブ又は分光剤を使用して評価することもできる。プローブは、好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴは、アミロイド原繊維の検出に広範囲に使用されている蛍光染料である。原繊維とまたおそらく他のタンパク質立体配置が存在すると、チオフラビンＴが約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、原繊維タンパク質形態に結合した時に、約４８２ｎｍで増強発光する。未結合のチオフラビンＴは、本質的にはその波長で非蛍光性である。
【０１６６】
天然から非天然状態までのタンパク質構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の暴露された疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、その天然状態にあるタンパク質の３次構造内に一般的に埋められているが、タンパク質の展開及び変性が始まると、暴露されるようになる。これらの小分子の例、分光プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光プローブは金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン等のコバルト金属錯体である。
【０１６７】
ここで使用される場合、タンパク質製剤の「化学的安定性」なる用語は、天然のタンパク質構造と比較して、免疫原性の潜在的増加及び／又は生物学的有効性の潜在的低下を伴う、化学的な分解産物の形成に至るタンパク質構造における化学的共有変化を意味する。様々な化学的な分解産物が、天然タンパク質の性質及び種類、及びタンパク質が暴露される環境に応じて形成されうる。化学的分解の排除は、多くの場合、完全に回避することはできず、当業者によく知られているように、タンパク質製剤の保存及び使用中に、化学的な分解産物の量の増加が見られる。殆どのタンパク質は、脱アミド化する傾向にあり、グルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を形成する。他の分解経路は高分子量の形質転換産物の形成に関与しており、２又はそれ以上のタンパク質分子が、アミド転移及び／又はジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及びポリマーの分解産物の形成に至る(Stability of Protein Phramaceuticals, Ahern. T. J.及びManning M.C., Plenum Press, New York 1992)。(例えばメチオニン残基の)酸化も、化学的分解の他の変形例として挙げることができる。タンパク質製剤の化学的安定性は、異なる環境条件に暴露させた後、種々の時点での化学的な分解産物の量を測定することにより評価することができる(分解産物の形成は、多くの場合、例えば温度上昇により促進される)。個々の分解産物の各々の量は、多くの場合、様々なクロマトグラフィー技術(例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ)を使用し、分子サイズ及び／又は電荷に応じて、分解産物を分離することにより測定される。
【０１６８】
よって、上に概要を述べたように、「安定化された製剤」とは、物理的安定性が増加、化学的安定性が増加、又は物理的及び化学的安定性が増加した製剤を意味する。一般的に、製剤は、有効期限に到達するまで、使用及び保存中に(推奨される用途及び保存条件で)安定していなければならない。
【０１６９】
本発明の一実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、６週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の他の実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、４週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、４週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、２週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
【０１７０】
適した抗体製剤は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体の場合の経験を調べることによってまた決定できる。例えばリツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ベキサール（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリムのような数種のモノクローナル抗体が臨床現場で効果的なことが証明されており、同様の製剤を本発明の抗体について使用することができる。例えば、モノクローナル抗体は、塩化ナトリウム９．０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム二水和物７．３５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート０．７ｍｇ／ｍＬ、注射用滅菌水に静脈内投与用に処方された１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアルの何れかで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供されうる。ｐＨは６．５に調整される。他の実施態様では、抗体は約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含みｐＨが約６．０の製剤で供給される。
【０１７１】
治療用途
ここに記載された抗ＮＫＧ２Ａ抗体を使用する患者の治療方法がまた提供される。一実施態様では、本発明は、ヒト患者に投与するための薬学的組成物の調製におけるここに記載された抗体の使用を提供する。典型的には、患者は癌、ウイルス疾患、炎症疾患、又は自己免疫疾患に罹患しているか又はそのリスクを有している。あるいは、本発明の抗体は患者における骨髄移植を改善するために使用される。
【０１７２】
例えば、一態様では、本発明は、それを必要とする患者においてＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球の活性を増強する方法であって、ヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体を上記患者に投与する工程を含み、該抗体がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体レセプターのＨＬＡ−Ｅ媒介活性化を低減し又は防止する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、増加したＮＫ、Ｔ、及び／又はＮＫＴ細胞活性が有益であり、ＮＫ、Ｔ、又はＮＫＴ細胞による溶解を受けやすい細胞を含み、該細胞に影響を及ぼし、又は該細胞によって引き起こされる疾患、例えば癌、感染症又は免疫疾患を有する患者におけるリンパ球の活性を増加させるものである。
【０１７３】
より詳細には、本発明の方法と組成物は、限定するものではないが、癌、例えば膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺及び皮膚の癌、例えば扁平上皮癌；リンパ系の造血器腫瘍、例えば白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫及びバーケットリンパ腫、及び多発性骨髄腫；骨髄系の造血器腫瘍、例えば急性及び慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、及び骨髄異形成症候群；間葉系由来の腫瘍、例えば線維肉腫及び横紋筋肉腫；他の腫瘍、例えばメラノーマ、セミノーマ、奇形癌腫、ニューロブラストーマ及びグリオーマ；中枢及び末梢神経系の腫瘍、例えばアストロサイトーマ、ニューロブラストーマ、グリオーマ、及びシュワン細胞腫；間葉系由来の腫瘍、例えば線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫；及び他の腫瘍、例えばメラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性癌及び奇形癌腫を含む様々な癌及び他の増殖性疾患の治療に対して利用される。
【０１７４】
本発明に従って治療することができる特定の疾患には、リンパ系の造血器腫瘍、例えばＴ細胞及びＢ細胞腫瘍、例えば限定するものではないがＴ細胞疾患、例えば小細胞及び脳状細胞型のものを含むＴ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／後胸腺(peripheral/post-thymic)Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽細胞サブタイプ）；血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ１＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞性リンパ腫；Ｔリンパ芽球性；リンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）、多発性骨髄腫が含まれる。
【０１７５】
例えば過形成、線維症（特に肺、但し腎臓線維症のような他のタイプの線維症も）、血管新生、乾癬、アテローム性動脈硬化症及び血管中の平滑筋増殖、例えば血管形成術後の狭窄症又は再狭窄等の他の増殖性疾患もまた本発明によって治療することができる。
【０１７６】
特定の態様では、本発明の抗体は、ＮＫ細胞又はＮＫ様細胞、つまり表面抗原発現の特徴的な組合せを示す大顆粒リンパ球（例えばＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋等； 例えばLoughran (1993) Blood 82:1を参照）のクローン増殖によって引き起こされる増殖性疾患の一クラスを意味するＮＫ−ＬＧＬとも呼ばれる顆粒リンパ球のＮＫ型リンパ球増殖性疾患を治療するために使用される。これらの疾患の根底にある細胞増殖は、ある患者に見られる穏やかな症状からしばしばＮＫ−ＬＤＧＬ白血病と呼ばれる疾患の侵襲性の致命的な形態までの範囲の様々な効果を持ちうる。このクラスの疾患の徴候は、発熱、穏やかな好中球減少、血小板減少、貧血、リンパ球増加、脾腫大、肝腫大、リンパ節腫大、骨髄浸潤等々を含みうる（例えばZambello等(2003) Blood 102:1797；Loughran (1993) Blood 82:1；Epling-Burnette等 (2004) Blood-2003-02-400を参照）。
【０１７７】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体ベースの治療はまた感染症、例えば好ましくはウイルス、細菌、原虫、カビ又は真菌による感染によって引き起こされる任意の感染を治療し又は予防するために使用することもできる。かかるウイルス感染性生物には、限定されるものではないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エチノウイルス(echinovirus)、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス及びヒト免疫不全症ウイルス１型又は２型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）が含まれる。細菌は感染性生物の他の好ましいクラスを構成し、限定されるものではないが、次のものを含む：ブドウ球菌；連鎖球菌、例えば化膿性連鎖球菌；腸球菌；バチルス、例えば炭疽菌、及びラクトバシラス；リステリア；ジフテリア菌；ガードネレラ菌、例えばガードネレラ・バギナリス；ノカルジア；ストレプトマイセス；サーモアクチノミセス・ブルガリス；トレポネーマ；カンピロバクター；シュードモナス、例えば緑膿菌；レジオネラ；ナイセリア、例えば淋菌及び髄膜炎菌；フラボバクテリウム、例えばフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム及びフラボバクテリウム・オドラツム；ブルセラ；ボルデテラ、例えば百日咳菌及びボルデテラ・ブロンキセプチカ；大腸菌類、例えば大腸菌、クレブシエラ；エンテロバクター、セラチア、例えば 霊菌及びセラチア・リクファシエンス；エドワージエラ；プロテウス、例えばプロテウス・ミラビリス及びプロテウス・ブルガリス；ストレプトバチルス；リケッチア科、例えば リケッチア・フィッケツフィ(fickettsfi）、クラミジア、例えばオウム病クラミジア及びトラコーマクラミジア；マイコバクテリウム、例えば結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・フォーチュイタム、ライ菌、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・ボビス 、マイコバクテリウム・アフリカヌム、カンサシ菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、及びマイコプラズマ・レプラムリウム；及びノカルジア。原虫（原生動物）には、限定されるものではないが、リーシュマニア、コクジジオア(kokzidioa)及びオリパノソーマが含まれる。寄生虫には、限定されるものではないが、クラミジア及びリケッチアが含まれる。感染症の完全なリストは、疾病管理センター(CDC) の感染症国立センター(National Center for Infectious Disease (NCID))のウェブサイト(World-Wide Web (www) address cdc.gov/ncidod/diseases/)に見出すことができ、このリストは出典明示にここに援用する。これらの疾患の全てが本発明の阻害抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体を使用する治療の候補である。
【０１７８】
別の態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば癌性細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現によって特徴付けられる癌、例えばＮＫ又はＴ細胞リンパ腫に罹患している患者においてＮＫＧ２Ａ発現細胞を標的としそれを死滅させるために使用される。一実施態様では、ヒト化抗体が、ヒト化抗体と細胞傷害剤を含む免疫複合体の形態で投与される。
【０１７９】
別の態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は自己免疫又は炎症疾患を治療し又は予防するために使用される。本方法を使用して治療することができる自己免疫疾患の例には、とりわけ、溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ブドウ膜炎、グレーブス病、アルツハイマー病、甲状腺炎、心筋炎、リウマチ熱、強皮症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡／類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、橋本甲状腺炎、乾癬、及び白斑が含まれる。
【０１８０】
これらの方法によって治療することができる炎症疾患の例には、限定されるものではないが、副腎炎、肺胞炎、胆管胆嚢炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液包炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮頚管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛殻炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合織炎、毛包炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、灰白脊髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、セレロ脈絡膜炎(selerochoroiditis)、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、 耳管炎、腱炎、扁桃腺炎、尿道炎、及び膣炎が含まれる。
【０１８１】
樹状細胞のアロ反応性ＮＫ細胞死滅化は骨髄移植における造血細胞の生着を改善したことがまた示されている（L. Ruggeri等, Science, 2002, 295:2097-2 100）。よって、他の実施態様では、本発明は、患者における造血細胞の生着を改善する方法であって、活性化抗体を含む本発明の組成物を上記患者に投与する工程を含む方法を提供する。移植の改善は、移植片対宿主病の発症又は重篤度の低減、移植片の長い生存、又は移植によって治療される疾患の徴候（例えば造血器癌）の低減又は除去の何れかから明らかになる。この方法は好ましくは白血病の治療に使用される。
【０１８２】
併用治療
多くの治療剤を癌の治療に利用できる。よって、本発明の抗体組成物と方法は、特定の疾患、特に腫瘍、癌疾患、又は患者が示す他の疾病又は疾患の治療に一般的に用いられる任意の他の方法と組み合わせることもできる。特定の治療アプローチ法がその患者の症状自体に致命的であることが知られておらず、抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体ベースの治療法と有意には反対の作用をしない限り、本発明とのその併用が考えられる。
【０１８３】
固形腫瘍の治療に関しては、本発明は、古典的なアプローチ法、例えば、外科治療、放射線療法、化学療法等と併用されうる。従って、本発明は、本発明に係る抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体が外科又は放射線治療と同時に、その前に、又はその後に使用され；あるいは他の抗癌剤の投与と共に、その前に、又はその後に患者に投与される併用療法を提供する。本発明の組成物中の活性剤と併用される外科、放射線療法、又は抗癌剤は、癌に対して有利な併用効果を奏することが担保されるであろう。
【０１８４】
例示的な抗癌剤には、化学療法剤、ホルモン剤、抗血管新生剤、抗転移薬、抗癌抗体（例えばリツキシマブ）、抑制性ＫＩＲ分子に対する抗体、増殖因子阻害剤、アポトーシス促進化合物、サイトカイン及び他の免疫調節剤、毒素又は放射性核種に結合した腫瘍標的化剤、ＤＮＡ複製、有糸分裂及び染色体分離を妨害する化合物、及びポリヌクレオチド前駆体の合成とフィデリティーを乱す薬剤が含まれる。
【０１８５】
自己免疫又は炎症疾患では、とりわけ、免疫抑制剤、例えばアザチオプリン（例えばイムラン）、クロラムブシル（例えばロイケリン）、シクロホスファミド（例えばシトキサン）、シクロスポリン（例えばサンディミュン、ネオーラル）、メトトレキセート（例えばリウマトレックス）、コルチコステロイド、プレドニゾン（例えばデルタゾン、メチコルテン(Meticorten)）、エタネルセプト（例えばエンブレル）、インフリキシマブ（例えばレミケード）、ＴＮＦ阻害剤、ＦＫ-５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、抗リンパ球グロブリン、デオキシスパガリン又はＯＫＴを含む、一又は複数のタイプの自己免疫又は炎症疾患あるいは自己免疫又は炎症疾患のあらゆる徴候又は特徴に対して、効果的であることが知られている任意の他の化合物である。
【０１８６】
免疫調節化合物の好ましい例にはサイトカインが含まれる。他の例には、効果、好ましくはＮＫ細胞活性の活性化又は増強効果を有するか、又はＮＫ細胞の増殖を誘導し又は支援する化合物が含まれる。本発明の薬剤を含む組成物の前、それと同時に、又はその後に投与される他の化合物は、補助化合物（例えば制吐薬及び鎮痛薬）及び抗ウイルス薬である。
【０１８７】
当業者によって理解されるように、抗癌剤の適切な用量は、抗癌剤が単独で又は他の薬剤と併用して投与される臨床治療に既に用いられているものに近似する。用量の変動は治療されている症状に応じて生じる可能性がある。治療薬を投与する医師は個々の被験者に対して適当な用量を決定することができる。
【０１８８】
製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を含む製造品が提供される。例えば、該製造品は、ここに記載された抗体を含む容器を、哺乳動物における癌又はウイルス疾患のような疾患を有効量の抗体で治療する指示を使用者に与える指示書と共に含みうる。好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。該製造品は典型的には容器と該容器上に又は該容器に付随せしめられたラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも一種の活性剤はここでのヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はかかるヒト化抗体を含む抗体誘導体（例えば免疫複合体）である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が、選択した症状、例えば癌又はウイルス疾患の治療に使用されることを示している。
【０１８９】
更に、製造品は、（ａ）組成物がそこに収容され、該組成物がここに記載された抗体を含む第一の容器と、（ｂ）組成物がそこに収容され、該組成物が第一の抗体以外の治療剤を含む第二の容器を含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の組成物が癌又はウイルス疾患の治療のために併用できることを示すパッケージ挿入物を更に含みうる。かかる治療剤は先のセクションに記載した補助療法剤の任意のものでありうる（例えば、化学療法剤、抗血管新生薬、抗ホルモン化合物、心臓保護薬、及び／又はサイトカインを含む哺乳動物における免疫機能調節剤）。あるいは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含有する第二（又は第三）の容器を更に含みうる。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
【０１９０】
投与
上述のように、数種のモノクローナル抗体が臨床現場で効果的であることが証明されており（例えばリツキサン（リツキシマブ）と他のもの）、同様な投与計画（つまり、用量及び／又は投与プロトコル）を本発明の抗体について使用することができる。投与のスケジュール及び投薬量は、例えば製造者の指示書を使用し、これらの製品に対して知られた方法に従って決定することができる。例えば、抗体製剤は１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアルの何れかで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供されうる。本発明の抗体の場合の例示的な好ましい投薬量範囲は約１０ｍｇ／ｍ２と５００ｍｇ／ｍ２の間である。例えば細胞を２４時間、４８時間、７２時間、又は１週間又は１ヶ月飽和させる抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量及びスケジュールは抗体の親和性とその薬物動態パラメータを考慮して決定することができる。しかしながら、これらのスケジュールは例示的なものであり、最適なスケジュール及び治療計画及び抗体の耐容性は臨床試験において決定されなければならない。
【０１９１】
非治療的な用途
また、本発明の抗体(例えばヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体)は被治療的な用途を有する。
例えば抗体を親和性精製剤として用いることができる。このプロセスでは、当該分野でよく知られている方法を使用して、抗体をセファデックスＴＭ樹脂又は濾紙などの固相に固定する。固定された抗体はＮＫＧ２Ａタンパク質(又はその断片)を含む試料に接触させて精製し、その後、固定した抗体に結合するＮＫＧ２Ａタンパク質以外の試料中の実質的に全ての材料を除去する適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、支持体を、他の適切な溶媒、例えば、ＮＫＧ２Ａタンパク質を抗体から放出させるｐＨ５．０のグリシン緩衝液によって洗浄する。
抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、特異的な細胞、組織又は血清中の発現を検出するような、ＮＫＧ２Ａタンパク質についての診断アッセイにおいてまた有用でありうる。
【０１９２】
診断用途に対しては、抗体は典型的には検出可能な部分で標識される。一般に次のカテゴリーに分類することができる数多くの標識が利用可能である：
（ａ）放射性同位体、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ。抗体は、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen等編 Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)に記載される技術を用いて放射性同位体で標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
（ｂ）希土類キレート（ユウロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン及びテキサス・レッドのような蛍光標識が利用できる。蛍光標識は、例えば、上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量できる。
（ｃ）様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４２７５１４９号にはこれらの幾つかの概説がある。酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を一般に触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒しうる。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量するための技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる（例えば化学発光計測計を用いて）か、又はエネルギーを蛍光アクセプターに与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートさせる技術は、O'Sullivan等, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone及びH. Van Vunakis編), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０１９３】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを伴う西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆体（例えばオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）色素生産性基質としてリン酸パラ−ニトロフェニルを伴うアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び
（ｉｉｉ）色素生産性基質（例えばｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−ｐ−β−ガラクトシダーゼを有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
【０１９４】
多数の他の酵素基質の組合せが当業者に利用可能である。これらの一般的な概説については、米国特許第４２７５１４９号及び４３１８９８０を参照。
【０１９５】
しばしば、標識は抗体と間接的にコンジュゲートされる。これを達成するための様々な技術は当業者には分かるであろう。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した標識の３つの広い分類のうちの何れかをアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、よって、標識をこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体を小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの一つを抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。よって、抗体と標識の間接的なコンジュゲーションを達成することができる。
【０１９６】
本発明の他の実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は標識する必要がなく、その存在をＮＫＧ２Ａ抗体と結合する標識二次抗体を用いて検出することができる。
【０１９７】
本発明の抗体は、任意の既知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接的及び間接的なサンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイに用いることができる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
免疫組織化学では、腫瘍試料は新鮮なものでも凍結されたものでも、パラフィン包埋されていても、例えばホルマリンのような防腐剤で固定されていてもよい。
【０１９８】
また、抗体はインビボ診断用アッセイにも使用することもできる。一般に、抗体は、例えば核磁気共鳴法又は当該分野で知られている他の方法によって検出可能な放射性核種又は非放射性指示薬で標識される。好ましくは、標識は、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ又は１１１Ｉｎなどの放射性標識である。標識された抗体は、好ましくは血流を介して宿主に投与され、宿主中の標識した抗体の存在や位置がアッセイされる。腫瘍の検出、ステージ分類及び治療には画像技術が好適に用いられる。放射性同位体は、金属キレート化合物又はラクトペルオキシダーゼ、又はヨウ素化のためのヨードゲン技術を含む任意の手段によってタンパク質にコンジュゲートされる。
【０１９９】
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち診断検査を実施するための指示書と共に予め定められた量でパッケージされた試薬組合せで提供することができる。抗体を酵素で標識する場合、キットには、基質と、酵素に必要な補因子（例えば検出可能な発色基又は蛍光体を提供する基質前駆体）が含まれるであろう。加えて、安定剤、緩衝液（例えばブロックバッファー又は溶解バッファー）などの他の添加物も含まれうる。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液の濃度が得られるように、広範囲に変化させられうる。特に、溶解して適切な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥として試薬は提供されうる。
【実施例】
【０２００】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例により例示される。
【０２０１】
実施例１−Ｚ１９９は非競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストである
この実施例は、ＨＰ−３Ｄ９、Ｚ２７０、及びＺ１９９のアンタゴニスト及びＨＬＡ−Ｅブロック能の評価を記載する。
【０２０２】
材料及び方法
Ｚ１９９は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限ＮＫ細胞によるＨＬＡ−Ｅ発現腫瘍細胞の死滅化を誘導する。ＨＬＡ−Ｅは、図１に示されるように、ＮＫ阻害レセプターＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに対する機能的なリガンドである。この図は、５１Ｃｒ標識ＬＣＬ７２１．２２１（機能的にはＨＬＡ−Ｅ−）又はＬＣＬ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞（機能的にはＨＬＡ−Ｅ＋）を死滅させるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫＬ細胞の能力が示される代表的な５１Ｃｒ−放出細胞傷害性アッセイを含む。これらのアッセイでは、エフェクター細胞（Ｅ）を、３７℃で４時間、５％のＣＯ２を含む加湿インキュベーターにおいて様々なＥ：Ｔ比で、５１Ｃｒ標識標的細胞（Ｔ）と共にインキュベートする。標的細胞の死滅は、死滅時に標的細胞あら放出される組織培養培地中の５１Ｃｒの量を測定することによって分析する。死滅は、同じ期間における細胞による５１Ｃｒの自然の放出を修正した、最大の可能な死滅（つまり、全細胞が溶解）の割合として注釈付けされる。式では、特定の死滅（％）は
１００＊（試料中の５１Ｃｒ放出  −  自然の５１Ｃｒ放出）
（最大の５１Ｃｒ放出  −  自然の５１Ｃｒ放出）
として定義される。
【０２０３】
図１中、ＮＫＬ細胞が、機能的ＨＬＡ−Ｅを欠く腫瘍細胞（菱形）を比較して機能的ＨＬＡ−Ｅを発現する腫瘍細胞（三角形）をそれほど効果的には死滅させないことが明らかである。ＮＫＬ細胞を飽和濃度のマウスｍＡｂのＨＰ−３Ｄ９（抗ＣＤ９４）又はＺ１９９（抗ＮＫＧ２Ａ）と共にプレインキュベートしたとき、ＨＬＡ−Ｅ＋標的細胞は、同アッセイにおいて、ＨＬＡ−Ｅ腫瘍細胞のものに匹敵するレベルで更により効率的に死滅させられた（十字）。よって、ＨＬＡ−ＥはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現エフェクター細胞（例えば、ＮＫ、ＮＫＴ、α／βＴ細胞及びγ／δＴ細胞）による標的細胞の死滅化を制限し、これは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを機能的に阻害するｍＡｂによって防止することができる。
【０２０４】
Ｚ１９９は非競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストである。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害抗体がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへのリガンド（つまりＨＬＡ−Ｅ）結合を防止するかどうかを支援するために、我々は、ＨＰ−３Ｄ９及びＺ１９９が、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）へのＨＬＡ−Ｅ四量体の結合を防止できるかどうかを解析した。このために、Ｂａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを、１）ｍＡｂ（ＨＰ−３Ｄ９（１０μｇ／ｍｌ）又はＺ１９９（１０μｇ／ｍｌ））と共に、２）ＰＥ標識ＨＬＡ−Ｅ四量体（４．７μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、あるいは３）最初にｍＡｂと共にインキュベートし、ついでＰＥ標識ＨＬＡ−Ｅ四量体と共にインキュベートした。全てのインキュベーションは氷上で２％のＦＣＳを含む組織培養培地で実施した。ついで、洗浄後、細胞を、マウスＡｂに対して特異的なＡＰＣコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートし、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳアレイを使用してフローサイトメトリーによって分析した。図２に示されるように、ＨＰ−３Ｄ９（２Ａ）及びＺ１９９（２Ｄ）は、未染色細胞が存在するゲートからＹ軸に沿った細胞集団のシフトを引き起こす（左下方の１／４部分）。これに対して、ＨＬＡ−Ｅ（２Ｂ，２Ｅ）は、未染色細胞が存在する左下方の１／４部分からＸ軸に沿った細胞集団のシフトを引き起こす。抗体とＨＬＡ−Ｅ四量体の双方がＢａ／Ｆ３−ＮＫＧ２Ｄ細胞に結合できず、それらがこれらのアッセイにおいてＢａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに特異的に結合することを示している。Ｂａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞を最初にＨＰ−３Ｄ９と共に、ついでＨＬＡ−Ｅ四量体と共にインキュベートした場合、ＨＬＡ−Ｅ四量体の結合は検出できなかった（図２Ｃ）。ＨＰ−３Ｄ９はよってＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡへのＨＬＡ−Ｅの結合を防止し、ＮＫ細胞傷害性アッセイにおけるこのｍＡｂのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害効果（図１）はよってＨＬＡ−ＥがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介して細胞傷害性リンパ球にネガティブなシグナルを誘導可能であることを防ぐ結果である。しかして、ＨＰ−３Ｄ９は競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストと考えることができる。これに対して、Ｂａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞を最初にＺ１９９と共に、続いてＨＬＡ−Ｅ四量体と共にインキュベートしたとき、細胞へのＺ１９９及びＨＬＡ−Ｅ四量体双方の結合が、図２Ｆにおける右上部１／４部分の二重陽性細胞によって示されるように、検出することができた。Ｚ１９９はＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡへのＨＬＡ−Ｅの結合を防止しないので、図１に示されるようなＮＫ細胞傷害性アッセイにおけるＺ１９９のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害効果は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを経由して細胞傷害性リンパ球へネガティブなシグナルを誘導し得ることを妨げる効果ではない可能性が高い。しかして、Ｚ１９９は非競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストと考えることができる。
【０２０５】
図２に示された観察は、ＢｉａＣｏｒｅ実験で確認された。これらの実験において、ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ａの細胞外部分からなる単鎖コンストラクトとＣ末端で融合したマウスＩｇＧ１からなるＦｃ融合タンパク質ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ−ｍＦｃをチップに固定し、続いてＨＰ−３Ｄ９又はＺ１９９で飽和させた。続いて、タンパク質複合体に対するＨＬＡ−Ｅ四量体の結合を分析した。ＨＰ−３Ｄ９飽和ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡはＨＬＡ−Ｅ四量体に結合できなかったが、ＨＬＡ−Ｅ四量体は、Ｚ１９９で飽和させたｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合できた（図３）。これらの結果は、Ｚ１９９はＨＬＡ−ＥがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合するのを防止しないが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを機能的にブロックするその能力は非競合的拮抗作用に基づいていることを裏付けている。
【０２０６】
結果
ＨＰ−３Ｄ９（抗ＣＤ９４）（図１Ａ）、Ｚ１９９（抗ＮＫＧ２Ａ）（図１Ｂ）及びＺ２７０（抗ＮＫＧ２Ａ）の全てがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ制限リンパ球によるＨＬＡ−Ｅ発現標的細胞の死滅化を効果的に誘導した。図２Ａ及び２Ｂに示されているように、ＨＰ−３Ｄ９はＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡとそのリガンドＨＬＡ−Ｅの間の相互作用を防止したが、Ｚ１９９はこの相互作用を防止しなかった。Ｚ２７０はまたＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡとＨＬＡ−Ｅの間の相互作用を防止した。
【０２０７】
細胞を飽和用量のＨＬＡ−Ｅ四量体と共にプレインキュベートしたとき、試験された全ての用量のｈｕｍＺ１９９（１００ｐｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまで）がＢａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞に結合することができたが、結合のＫＤは些か影響を受けたが（〜１ｌｏｇ）、これは使用されたＨＬＡ−Ｅ複合体の四量体の性質によって引き起こされたある種の立体障害による可能性が高い（データは示さず）。
【０２０８】
従って、Ｚ１９９及びｈｕｍＺ１９９は非競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストである。理論に拘束されるものではないが、Ｚ１９９は、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターにおける立体構造変化を防止し又は誘導し、及び／又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの二量体化及び／又はクラスター形成に影響を及ぼすことによってＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達を妨害することが可能である。
【０２０９】
実施例２−Ｚ１９９のヒト化
Ｚ１９９の重鎖（Ｚ１９９．Ｈ）及び軽鎖（Ｚ１９９．Ｌ）中の可変ドメインをコードするｃＤＮＡを、Ｚ１９９ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡから、５’ＲＡＣＥ−及びＲＴ−ＰＣＲクローニングによって得た。
Ｚ１９９ＶＨ（１配列）及びＶＬ（１配列）の配列を、Ｚ１９９ハイブリドーマからのクローニング（５’ＲＡＣＥ及びＲＴ ＰＣＲ，ＮＮ Ｃｈｉｎａ）によって得た。
【０２１０】
Ｚ１９９ＶＬ：
caaattgttctcacccagtctccagcactcatgtctgcgtctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatttactggtaccagcagaagccaagatcctcccccaaaccctggatttatctcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtggtaacccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg（配列番号１）
翻訳された配列：
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPAR
FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSGNPYTFGGGTKLEIKR（配列番号２）
Ｚ１９９ＶＨ：
gaagttcaactggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcttgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagtctccagagaagaggctggagtgggtcgcagaaattagtagtggtggtagttacacctactatccagacactgtgaccggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctggaaatcagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtacaaggcatggtgactaccctaggttcttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca（配列番号３）
翻訳された配列：
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISSGGSYTYY
PDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEISSLRSEDTAMYYCTRHGDYPRFFDVWGAGTTVTVSS（配列番号４）
【０２１１】
親和性は発現によって確認した。
Ｚ１９９配列の解析から、カバット定義によるＣＤＲｓは次の通りである：
0005774312.tif 000003
【０２１２】
３Ｄタンパク質構造モデルを、構造鋳型ＰＤＢ：１ＭＨＰと共にＭＯＥを使用して構築した。ＰＤＢデータベース中の２０１の抗体−抗原複合体の統計的解析に基づくと、パラトープ中の最も可能な残基は重鎖：２３−３５、４９−５８、９３−１０２；軽鎖：２４−３４、４９−５６、８９−９７である。ＭＯＥを使用して、パラトープと相互作用する（疎水性、水素結合、荷電）残基を同定し、残基の組合せセット（パラトープ＋相互作用残基）をＺ１９９のマスクとした。
【０２１３】
Ｚ１９９．Ｌ及びＺ１９９．Ｈでの生殖系列Ｖデータベースの検索は次の潜在的なフレームワーク鋳型に戻る（Ｅ−値を括弧内に記す）：
重鎖：ＶＨ３＿２１（１ｅ−０４４）、ＶＨ３＿２３（１ｅ−０４３）、ＶＨ３＿１１（３ｅ−０４３）、ＶＨ３＿０７（６ｅ−０４３）、ＶＨ３＿４８（８ｅ−０４３）
軽鎖：ＶＫＶＩ＿Ａ１４（３ｅ−０３３）、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６（１ｅ−０３２）、ＶＫＩ＿Ｌ２３（２ｅ−０３１）、ＶＫＩ＿Ｌ８（３ｅ−０３１）、ＶＫＩ＿Ｌ１５（３ｅ−０３１）
マスクでの生殖系列データベースの検索は次の潜在的なフレームワーク鋳型に戻る（Ｅ−値を括弧内に記す）：
重鎖：ＶＨ３＿２３（１ｅ−０１２）、ＶＨ３＿２１（１ｅ−０１２）、ＶＨ３＿３０＿３（４ｅ−０１２）、ＶＨ３＿６４（７ｅ−０１２）、ＶＨ３＿３０＿５（１ｅ−０１１）
軽鎖：ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６（３ｅ−００７）、ＶＫＩ＿Ｌ２３（６ｅ−００７）、ＶＫＩＩＩ＿Ａ１１（１ｅ−００６）、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７（２ｅ−００６）、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ２０（３ｅ−００６）
アラインメントとヒットのマニュアル検査後に、ＶＨ３＿２１及びＶＫＩＩＩ＿Ｌ６をヒトスキャフォールドとして選択したが、原理的には、例えばヒト化タンパク質の物理化学的性質を最適にするために選択することができた。ＪＨ３及びＪＫ２が生殖系列Ｊ−セグメントとして選択される。
【０２１４】
さて、ヒト化は次の規則で実施することができる：
- マスク外の残基をヒトとする。
- マスク内及びカバットＣＤＲ内の残基をマウスとする。
- マウス／生殖系列コンセンサスを含むマスク内及びカバットＣＤＲ外の残基をコンセンサス配列とする。
- マウス／生殖系列の差を伴うマスク内及びカバットＣＤＲ外の残基に潜在的な逆突然変異を施す。
【０２１５】
Ｚ１９９．Ｌ及びＺ１９９．Ｈに対する分析を図４に示す（マスクは下線を付した配列番号で示され、カバットＣＤＲｓ（基準としてヒト化配列を使用）は太字の配列番号で示され、マウス／生殖系列の差は灰色で、潜在的な体細胞高頻度変異残基は下線を付した残基文字で示され、潜在的な逆突然変異残基は太字の残基文字で示される）。
得られた配列ｈｕｍＺ１９９ＶＬ及びｈｕｍＺ１９９ＶＨにはヒトとして潜在的な逆突然変異残基が与えられる。ヒト化Ｚ１９９の変異体は次の通りである：
ｈｕｍＺ１９９ＶＬ：野生型、Ｅ１Ｑ、Ｌ４６Ｐ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ｄ７０Ｓ及びＥ１Ｑ、Ｌ４６Ｐ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、及びＤ７０Ｓの任意の組合せ。
ｈｕｍＺ１９９ＶＨ：野生型、Ｓ４９Ａ、Ｓ７７Ｔ、Ａ９３Ｔ及びＳ４９Ａ、Ｓ７７Ｔ、Ａ９３Ｔの任意の組合せ。
上述のＶＨ及びＶＬ変異の異なった組合せを有する重鎖及び軽鎖を持つヒト化Ｚ１９９変異体をまた生産することができ、興味ある性質について試験することができる。
カバットの定義による新規なヒト化抗体のＣＤＲｓは次の通りである：
0005774312.tif 000004
ＣＤＲ＿Ｌ１及びＣＤＲ＿Ｈ２（太字で示す）にあるマウスＣＤＲｓと比較した差に留意のこと。
【０２１６】
実施例３−ｈｕｍＺ１９９及び逆突然変異変異体のＢｉａｃｏｒｅ分析
マウス（ｒｅｃＺ１９９）及びキメラ（Ｚ１９９の可変ドメインに融合したヒトＩｇＧ４の定常ドメインからなるｃｈｉｍＺ１９９）をＨＥＫ２９３６Ｅ細胞中での一過性過剰発現によって生産した。同様な形で、図６に示すものを含むヒト化Ｚ１９９（ｈｕｍＺ１９９）変異体を生産した。
製造した全ての抗体はプロテインＡビーズを用いて収集した。最適なヒト化ｈｕｍＺ１９９ＶＬ及びｈｕｍＺ１９９ＶＨの組合せを見出すために、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合するＺ１９９変異体の能力を、抗原として固定化単鎖（ｓｃ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ−マウスＦｃ融合タンパク質を使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００を使用して決定した。
【０２１７】
ｈｕｍＺ１９９変異体の抗原結合性をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Biacore AB, Uppsala, Sweden）で分析した。抗原ｓｃ−ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用してアミン基を介してセンサーＣＭ５チップ（Biacore AB, Uppsala, Sweden）に共有的に固定した。固定化レベルは３００ＲＵで標的化した。結合分析では、精製した抗体変異体を、流れているバッファーＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１０ｎＭに希釈した。動態研究では、Ｚ１９９抗体変異体をＨＢＳ−ＥＰバッファー中で一連の濃度（１．２５，２．５，５，７．５，及び１０ｎＭ）まで希釈した。ついで全ての試料を４０ｕｌ／分の流量で２分間固定した抗原に注入した。ついで、流れているバッファーを、抗体解離分析のために４０ｕｌ／分で４分間注入した。各実験後、再生バッファー（１０ｍＭ ＮａＯＨ，５００ｍＭ ＮａＣｌ）を注入して（３０秒、１０ｕｌ／分）、残りの抗体を抗原から完全に取り除いた。データはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを用いて評価した。
【０２１８】
結果
最初は、ヒト化Ｚ１９９抗体が抗原に結合することができないことが見出された。従って、逆突然変異をｈｕｍＺ１９９の軽鎖及び重鎖に導入した。興味深いことに、軽鎖中の一つの逆突然変異Ｌ４６Ｐによって抗体が抗原を認識しそれに結合するようになった（図５）。この変異体の親和性は７２ｐＭと定量され、これはキメラＺ１９９のＫＤ（２４ｐＭ）より２．７倍だけ少なかった（表１）。軽鎖中のＬ４６Ｐと組み合わせた他の逆突然変異は抗体親和性を更に有意には亢進しなかった（図６）。従って、軽鎖中に単一の逆突然変異Ｌ４６Ｐを含むｈｕｍＺ１９９を更なる特徴付けのために選択した。
0005774312.tif 000005
【０２１９】
実施例４−Ｚ１９９可変配列中の重要な残基の同定
アラニンスキャンを実施してＺ１９９可変配列中の重要な残基を同定した。
Ｚ１９９抗体のインシリコ構造解析に基づいて、基礎としてｃｈｉｍＺ１９９を使用して、１５の軽鎖及び９の重鎖ａｌａスキャン変異体をつくり、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合し、それによってそのアンタゴニスト機能を奏するためのＺ１９９中の重要な残基を決定した（Ａｌａスキャン変異体の概要については図７を参照）。次は生産した変異体のリストである：
ＬＣ：Ｓ２４Ａ、Ｓ２６Ａ、Ｓ２７Ａ、Ｓ２８Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｙ４９Ａ、Ｌ５０Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｎ５３Ａ、Ｌ５４Ａ、Ｓ５６Ａ、Ｓ９２Ａ、Ｎ９４Ａ、Ｐ９５Ａ。
ＨＣ：Ｔ２８Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｓ３１Ａ、Ｙ５６Ａ、Ｙ５８Ａ、Ｄ９７Ａ、Ｙ９８Ａ、Ｐ９９Ａ、Ｖ１０２Ａ。
【０２２０】
変異体をＨＥＫ２９３細胞中で個々に発現させ、発現した抗体を含む組織培養培地を、ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへのその結合プロファイルについてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Biacore AB, Uppsala, Sweden）で試験した。
抗原ｓｃ−ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用してアミン基を介してセンサーＣＭ５チップ（Biacore AB, Uppsala, Sweden）に共有的に固定した。固定化レベルは３００ＲＵで標的化した。精製したＺ１９９アラニン変異体を、流れているバッファーＨＢＳ−ＥＰ中で５ｎＭ又は１０ｎＭに希釈した。ついで全ての試料を１０μｌ／分の流量で４分間固定した抗原に注入した。ついで、流れているバッファーを、抗体結合安定性分析のために１０μｌ／分で１分間注入した。各実験後、再生バッファー（１０ｍＭ ＮａＯＨ，５００ｍＭ ＮａＣｌ）を注入して（３０秒、１０μｌ／分）、残りの抗体を抗原から完全に取り除いた。データはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを用いて評価した。各変異体の相対結合性は、Ｂｉａｃｏｒｅから得たその結合レベル（ＲＵ）をｃｈｉｍＺ１９９のレベルで割ることによって計算した。
【０２２１】
結果
ｃｈｉｍＺ１９９と比較して、全てのａｌａ−スキャン試料は、アッセイにおいて使用した２つのｍＡｂ濃度（２．５ｎＭ及び５ｎＭ）で匹敵する結合プロファイルを示したが、例外は、ｃｈｉｍＺ１９９ＶＬにおいて残基Ｙ３２、Ｌ５０又はＰ９５Ａがアラニンに置換され、又はｃｈｉｍＺ１９９ＶＨにおいて残基Ｙ５６、Ｙ９８又はＰ９９がアラニンに置換されたＺ１９９変異体であった。
Ｚ１９９重鎖アラニン変異体Ｙ５６Ａ、Ｙ９８Ａ、及びＰ９９Ａは約４０％の抗原結合能を保持する一方、重鎖変異体Ｙ５８Ａ及びＤ９７Ａの相対結合性は６０−８０％であった（図８）。従って、Ｚ１９９重鎖中のアミノ酸Ｙ５６、Ｙ９８、及びＰ９９が抗原認識に有意に寄与する。更に、重鎖中のアミノ酸Ｙ５８及びＤ９７が抗原結合性に中程度に影響を及ぼす。
同様に、Ｚ１９９軽鎖アラニン変異体Ｙ３２Ａ、Ｌ５０Ａ、及びＰ９５Ａは、約４０％の抗原結合能を証明した。軽鎖変異体Ｙ４９Ａの相対結合性は６０−８０％である（図９）。従って、Ｚ１９９軽鎖中のアミノ酸Ｙ３２、Ｌ５０、及びＰ９５が抗原の認識に有意に寄与する一方、軽鎖中のアミノ酸Ｙ４９は抗原結合性に中程度に影響を及ぼす。
【０２２２】
ｈｕｍＺ１９９のようなＺ１９９に基づく治療用化合物は、よって好ましくは、Ｚ１９９＿Ｌに見出されるＣＤＲ１中にＹ３２、ＣＤＲ２中にＬ５０、ＣＤＲ３中にＰ９５の位置付けを、Ｚ１９９＿Ｈに見出されるＣＤＲ２中にＹ５６、ＣＤＲ３中にＹ９８とＰ９９の双方の位置付けを含む。これらのカバット位置は、Ｚ１９９ＶＬドメイン（配列番号２）のアミノ酸残基Ｙ３１、Ｌ４９、及びＰ９４、とＺ１９９ＶＬドメイン（配列番号４）のアミノ酸残基Ｙ５７、Ｙ１０２、及びＰ１０３にそれぞれ対応する。
【０２２３】
実施例５−Ｚ１９９エピトープの同定
Ｚ１９９のような非競合的抗ＮＫＧ２Ａアンタゴニスト抗体はＨＬＡ−Ｅと同時にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合可能である。従って、該抗体は、ＨＬＡ−ＥがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ複合体に結合したとき露出したままである細胞外ＮＫＧ２Ａ残基に結合する。更に、抗体は、ＨＬＡ−ＥがインタクトなＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターにだけ結合するので、ＣＤ９４相互作用を破壊しない。
ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４に複合体化したＨＬＡ−Ｅの３Ｄ構造（Petrie, E.J.等（２００８）, J.Exp.Med. 205: 725-735）を使用して、露出した側鎖原子を持つ細胞外ＮＫＧ２Ａ残基（使用したプローブ半径４．０Å）を同定した。残基Ｐ９４−Ｋ１１２は３Ｄ構造では目に見えず、よって全てが露出していると仮定した。
【０２２４】
図１０に示されるように、非競合的ＮＫＧ２Ａ抗体のエピトープは従って次のセグメントの一又は複数に残基を含まなければならない：Ｐ９４−Ｈ１１５、Ｈ１１８、Ｐ１２０−Ｅ１２２、Ｓ１２７−Ｎ１２８、Ｙ１３２、Ｋ１３５−Ｔ１３９、Ｅ１４１−Ｅ１４２、Ｌ１４４−Ｌ１４５、Ｔ１４８−Ｎ１５１、Ｓ１５３、Ｄ１５８−Ｅ１６１、Ｋ１６４、Ｆ１７８−Ｎ１９０、Ｌ１９２−Ａ１９３、Ｋ１９５−Ｅ１９７、Ｋ１９９−Ｎ２０７、Ｎ２１４−Ｒ２１５、Ｑ２２０−Ｃ２２１、Ｓ２２４、Ｈ２３１−Ｋ２３２、及びその任意の組合せ。
ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃのアミノ酸配列は非常に類似している（図１１参照）。ＮＫＧ２Ａに特異的であり、（Ｚ１９９のような）更に低い親和性でＮＫＧ２Ｃに結合する抗体のＮＫＧ２Ａエピトープは、よってＮＫＧ２Ａ配列にのみ存在する露出残基を含む。従って、非競合的アンタゴニスト抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、完全長ＮＫＧ２Ａ配列の残基Ｐ９４−Ｎ１０７及びＭ１８９−Ｅ１９７にそれぞれ対応するストーク又はループのエピトープに結合する。好ましくは、抗体のエピトープはこれらのセグメントに少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の露出残基、より特定的には完全長ＮＫＧ２Ａ配列（配列番号１１）の残基Ｐ９４、Ｓ９５、Ｔ９６、Ｌ９７、Ｉ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｈ１０１、Ｌ１０６、Ｍ１８９、Ｅ１９７を含む。
【０２２５】
結論として、ＨＬＡ−Ｅと競合せず、ＣＤ９４相互作用を破壊せず、ＮＫＧ２Ｃに対してよりもＮＫＧ２Ａに対してより高い親和性をもって結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体のＮＫＧ２Ａエピトープは、従って次のセグメントの何れか又は双方に残基を含まなければならない：ＮＫＧ２Ａ配列（配列番号１１）のＰＳＴＬＩＱＲＨＮＮＳＳＬＮ（Ｐ９４からＮ１０７）又はＭＮＧＬＡＦＫＨＥ（Ｍ１８９からＥ１９７）。
【０２２６】
例示的実施態様
次の段落は本発明の例示的な実施態様を記載するものである。
１．  ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの細胞外部分に結合する薬剤であって、
（ａ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球の表面に発現するヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を低減させ、及び
（ｂ）ＨＬＡ−Ｅと同時にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合可能であり、
マウスＺ１９９抗体ではない薬剤。
２．  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球がＮＫ細胞である実施態様１に記載の薬剤。
３．  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球がＮＫＴ細胞である実施態様１に記載の薬剤。
４．  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球が細胞傷害性Ｔ細胞である実施態様１に記載の薬剤。
５．  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現リンパ球のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介阻害を、ＨＬＡ−Ｅ誘導ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達の妨害によって減少させる、先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
６．  薬剤が、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃのような活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２分子に対してよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの細胞外部分に結合する先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
７．  ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの細胞外部分への結合において抗体Ｚ１９９と競合する先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
８．  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合に対してＺ１９９抗体と協業する抗体由来の少なくともＣＤＲを含む、抗体、抗体断片及び合成又は半合成抗体誘導分子から選択される先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
９．  完全なヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である実施態様８に記載の薬剤。
１０．  ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＭである実施態様９に記載の薬剤。
１１．  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である実施態様１０に記載の薬剤。
１２．  実施態様１０又は１１に記載の抗体の断片である実施態様８に記載の薬剤。
１３．  抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、重鎖Ｉｇ（ラマ又はラクダＩｇ）、ＶＨＨ断片、単一ドメインＦＶ、及び単鎖抗体断片から選択される実施態様８に記載の薬剤。
１４．  合成又は半合成抗体誘導分子が、ｓｃＦＶ、ｄｓＦＶ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、ＩｇＮＡＲ；ｔａｎｄＡｂ、ＢＩＴＥ；及び多重特異性抗体から選択される実施態様８に記載の薬剤。
１５．  Ｚ１９９のＶＨ及びＶＬドメインからのＣＤＲ配列を含む先の実施態様の何れかに記載の薬剤。
１６．  Ｚ１９９のＣＤＲ配列に１、２、３、４、５、又は６の逆突然変異を含む実施態様１５に記載の薬剤。
１７．  Ｚ１９９可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（配列番号４）のアミノ酸残基３１−３５、５０−６０、６２、６４、６６、及び９９−１０８と、Ｚ１９９可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（配列番号２）のアミノ酸残基２４−３３、４９−５５、及び８８−９６を含む実施態様１６に記載の薬剤。
１８．  軽鎖の４６位にプロリンを含む完全なヒト又はヒト化抗体である実施態様１７に記載の薬剤。
１９．  組換え生殖系列配列及び関連した体細胞突然変異からなる群から選択されるヒトフレームワーク領域を含む実施態様１０に記載の薬剤。
２０．  抗体Ｚ１９９に結合するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａエピトープに対して産生された、又はＺ１９９のイディオタイプに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体に対して産生された完全なヒト抗体である実施態様１０−１２の何れか一に記載の薬剤。
２１．  ヒトフレームワーク、４６位のプロリン残基及び次の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ａ）配列番号８を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号９を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号１０を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号５を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号６を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）配列番号７を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
２２．  少なくとも部分的に精製された形態である先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
２３．  本質的に単離された形態である先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
２４．  第二の薬剤にコンジュゲート又は融合されている実施態様の何れか一に記載の薬剤。
２５．  第二の薬剤が遅延化基、例えばＰＥＧ、細胞傷害剤、検出可能なマーカー、標的薬剤から選択される実施態様２４に記載の薬剤。
２６．  医薬として使用される先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
２７．  悪性腫瘍、ウイルス感染、炎症疾患、及び自己免疫疾患の治療に医薬として使用される先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
２８．  ヒト患者における細胞表面に発現されるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を中和又は低減させるために医薬として使用するための先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
２９．  ヒト患者におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の細胞死滅活性を増強するための医薬として使用するための先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
３０．  ヒト患者におけるＣｗ３発現標的細胞の死滅を誘導するための医薬として使用するための先の実施態様の何れか一に記載の薬剤。
３１．  先の実施態様の何れか一に記載の薬剤を薬学的に許容可能な担体、希釈剤又はビヒクルと共に含有する組成物。
３２．  実施態様９及び実施態様９に従属する場合の実施態様１０の何れか一に記載の薬剤をコードする核酸断片。
３３．  ＤＮＡ及びＲＮＡ断片から選択される実施態様３２に記載の核酸断片。
３４．  実施態様３２又は３３に記載の核酸断片を含むベクター。
３５．  クローニングベクター及び発現ベクターから選択される実施態様３４に記載のベクター。
３６．  実施態様３２又は３３に記載の核酸断片、又は実施態様３４又は３５に記載のベクターを含む形質転換された宿主細胞。
３７．  （ａ）重鎖及び軽鎖アミノ酸配列双方のコード領域であって、同一又は異なった調節遺伝子エレメントの制御下にあるコード領域を含む実施態様３２又は３３に記載の一核酸断片、又は
（ｂ）一方が軽鎖アミノ酸配列をコードし他方が重鎖アミノ酸配列をコードする実施態様３２又は３３に記載の２つの別個の核酸断片
を含む、実施態様３６に記載の形質転換された細胞。
３８．  実施態様３２又は３３に記載の核酸断片を発現する、実施態様３６又は３７に記載の形質転換された宿主細胞。
３９．  実施態様３６−３８の何れか一に記載の形質転換細胞を製造する方法において、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする実施態様３４又は３５に記載のベクター、又は一方が重鎖アミノ酸配列をコードし他方が軽鎖アミノ酸配列をコードする実施態様３４又は３５に記載の二つの異なったベクターで宿主細胞を形質転換し又は形質導入することを含む方法。
４０．  実施態様３６−３８の何れか一に記載の形質転換された宿主細胞を、実施態様３２又は３３の核酸断片の発現を容易にする条件下で培養し、場合によってはこのようにして生産された発現産物を回収することを含む、実施態様９及び実施態様９に従属する限りにおいて実施態様１０−２３に記載の薬剤を製造する方法。
４１．  治療又は寛解を必要とするヒト患者において悪性腫瘍、ウイルス感染、炎症疾患、及び自己免疫疾患を治療又は寛解する方法において、実施態様１−２５の何れか一に記載の薬剤又は実施態様３１に記載の組成物の有効量を上記ヒト患者に投与することを含む方法。
４２．  実施態様４１に記載の方法において、上記悪性腫瘍が、扁平上皮癌、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、線毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、急性又は慢性の骨髄性白血病、前骨髄球白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫；メラノーマ、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫、膠腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、膠腫、シュワン細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌、奇形癌腫、膀胱、胸部、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸管、甲状腺又は皮膚の他の癌腫、リンパ系統の他の造血性腫瘍、骨髄系統の他の造血性腫瘍、間充織起源の他の腫瘍、中枢又は末梢神経系の他の腫瘍、又は間葉系起源の他の腫瘍からなる群から選択される方法。
４３．  悪性腫瘍が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫及び急性骨髄性リンパ腫から選択される実施態様４２に記載の方法。
４４．  実施態様４１に記載の方法において、上記自己免疫疾患が、溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ブドウ膜炎、グレーブス病、アルツハイマー病、甲状腺炎、心筋炎、リウマチ熱、強皮症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡／類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、橋本甲状腺炎、乾癬、及び白斑からなる群から選択される方法。
４５．  実施態様４１に記載の方法において、上記炎症疾患が、副腎炎、肺胞炎、胆管胆嚢炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液包炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮頚管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛殻炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合織炎、毛包炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、灰白脊髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、セレロ脈絡膜炎(selerochoroiditis)、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、 耳管炎、腱炎、扁桃腺炎、尿道炎、及び膣炎からなる群から選択される方法。
４６．  実施態様４１に記載の方法において、上記ウイルス感染が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エチノウイルス(echinovirus)、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス及びヒト免疫不全症ウイルス１型又は２型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）からなる群から選択される方法。
４７．  （ａ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現リンパ球の表面上に発現されたヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの細胞外部分に結合し；
（ｂ）ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を減少させ；かつ
（ｃ）ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターへの結合においてＨＬＡ−Ｅと競合せず、及び／又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに同時に結合可能であり、及び／又はＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡレセプターへのＨＬＡ−Ｅの結合を防止しない
単離されたヒト又はヒト化抗体。
４８．  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに対してよりも少なくとも１００倍低いＫＤでＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合する抗ＮＫＧ２抗体である実施態様４７に記載の抗体。
４９．  ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合においてＺ１９９抗体と競合する実施態様４７−４８の何れか一に記載のヒト又はヒト化抗体。
５０．  Ｚ１９９抗体と同じＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ上の同じエピトープに結合する実施態様４７−４９の何れか一に記載のヒト又はヒト化抗体。
５１．  他の実施態様において、
（ａ）Ｐ９４−Ｎ１０７及び／又はＭ１８９−Ｅ１９７；
（ｂ）Ｐ９４からＮ１０７；又は
（ｃ）Ｍ１８９からＥ１９７
を含むＮＫＧ２Ａ配列（配列番号１１）中のセグメントに結合する、実施態様４７−５０の何れか一に記載のヒト又はヒト化抗体。
５２．  ヒト化Ｚ１９９抗体である実施態様４７−５１の何れか一に記載のヒト化抗体。
５３．  Ｚ１９９のＶＬドメイン（配列番号２）のアミノ酸残基Ｙ３１、Ｌ４９、及びＰ９４とＺ１９９のＶＬドメイン（配列番号４）のアミノ酸残基Ｙ５７、Ｙ１０２、及びＰ１０３を含む実施態様５２の何れかに記載のヒト化抗体。
５４．  可変重鎖（ＶＨ）又は可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに少なくとも一の逆突然変異を含む実施態様５２−５３の何れか一に記載のヒト化抗体。
５５．  Ｚ１９９のＶＬドメインのアミノ酸残基Ｐ４５を含む実施態様５２−５４の何れか一に記載のヒト化抗体。
５６．  Ｚ１９９のＶＬドメインのアミノ酸残基２４−３３、４９−５５、及び８８−９６と、Ｚ１９９のＶＨドメインのアミノ酸残基３１−３５、５０−６０、６２、６４、６６、及び  ９９−１０８を含む、実施態様５２−５５の何れか一に記載のヒト化抗体。
５７．  ＣＤＲ＿Ｌ１中に挿入されたアミノ酸を含む実施態様５２−５６の何れか一に記載のヒト化抗体。
５８．  挿入されたアミノ酸が、Ｚ１９９のＶＬドメインの残基３０及び３１間に挿入されたセリン（Ｓ）である実施態様５７に記載のヒト化抗体。
５９．  Ｚ１９９のＶＬドメインのアミノ酸残基Ｑ１、Ｗ４６、Ｖ５７、及びＳ６９の一又は複数及び／又はＺ１９９のＶＨドメインのアミノ酸残基Ａ４９、Ｔ７８、及びＴ９７の一又は複数を含む、実施態様５２−５８の何れか一に記載のヒト化抗体。
６０．  ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合し、
（ａ）配列番号５を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｂ）配列番号６を含むＣＤＲ−Ｌ２；
（ｃ）配列番号７を含むＣＤＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列番号８を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｅ）配列番号９を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｆ）配列番号１０を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ヒトスキャフォールド配列；及び
（ｈ）カバット位置４６のプロリン（Ｐ）残基
を含む単離された抗体。
６１．  場合によってはＳ２４１Ｐ変異を含むＩｇＧ４定常領域を含む実施態様４７−６０の何れか一に記載の抗体。
６２．  抗原結合抗体断片である実施態様４７−６０の何れか一に記載の抗体。
６３．  第二の薬剤にコンジュゲートされ又は融合された実施態様４７−６０の何れか一に記載の抗体。
６４．  第二の薬剤が遅延化基、例えばＰＥＧ、細胞傷害剤、検出可能なマーカー、標的薬剤から選択される実施態様６３に記載の抗体。
６５．  医薬として使用される実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体又はその抗原結合断片。
６６．  悪性腫瘍、ウイルス感染、炎症疾患、及び／又は自己免疫疾患を治療するのに使用される実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体。
６７．  ヒト患者における細胞表面に発現されるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害活性を低減させるために使用される実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体。
６８．  ヒト患者におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の細胞死滅活性を増強するために使用される実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体。
６９．  ヒト患者におけるＨＬＡ−Ｅ発現標的細胞の死滅を誘導するために使用される実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体。
７０．  実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体、希釈剤又はビヒクルを含有する組成物。
７１．  実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体をコードする核酸断片。
７２．  ＤＮＡ及びＲＮＡ断片である実施態様７０に記載の核酸断片。
７３．  実施態様７１又は７２に記載の核酸断片を含むベクター。
７４．  クローニングベクター及び発現ベクターから選択される実施態様７３に記載のベクター。
７５．  実施態様７１又は７２に記載の核酸断片、又は実施態様７３又は７４に記載のベクターを含む形質転換された宿主細胞。
７６．  （ａ）重鎖及び軽鎖アミノ酸配列双方のコード領域であって、同一又は異なった調節遺伝子エレメントの制御下にあるコード領域を含む実施態様７１又は７２に記載の核酸断片、又は
（ｂ）一方が軽鎖アミノ酸配列をコードし他方が重鎖アミノ酸配列をコードする実施態様７１又は７２に記載の２つの別個の核酸断片
を含む、実施態様７５に記載の形質転換された細胞。
７７．  核酸断片を発現する、実施態様７５又は７６に記載の形質転換された宿主細胞。
７８．  実施態様７６及び７７の何れかに記載の形質転換細胞を製造する方法において、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする実施態様７３又は７４に記載のベクター、又は一方が重鎖アミノ酸配列をコードし他方が軽鎖アミノ酸配列をコードする実施態様７３又は７４に記載の二つの異なったベクターで宿主細胞を形質転換し又は形質導入することを含む方法。
７９．  実施態様７５−７７の何れか一に記載の形質転換された宿主細胞を、核酸断片の発現を容易にする条件下で培養し、場合によってはこのようにして生産された抗体を回収することを含む、実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体を製造する方法。
８０．  治療又は寛解を必要とするヒト患者において悪性腫瘍、ウイルス感染、炎症疾患、及び自己免疫疾患を治療又は寛解する方法において、実施態様４７−６４の何れか一に記載の抗体又は実施態様７０に記載の組成物の有効量を上記ヒト患者に投与することを含む方法。
８１．  上記悪性腫瘍が、扁平上皮癌、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、線毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、急性又は慢性の骨髄性白血病、前骨髄球白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫；メラノーマ、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫、膠腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、膠腫、シュワン細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌、奇形癌腫、膀胱、胸部、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸管、甲状腺又は皮膚の他の癌腫、リンパ系統の他の造血性腫瘍、骨髄系統の他の造血性腫瘍、間充織起源の他の腫瘍、中枢又は末梢神経系の他の腫瘍、又は間葉系起源の他の腫瘍からなる群から選択される実施態様８０に記載の方法。
８２．  悪性腫瘍が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫及び急性骨髄性リンパ腫から選択される実施態様８１に記載の方法。
８３．  上記自己免疫疾患が、溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ブドウ膜炎、グレーブス病、アルツハイマー病、甲状腺炎、心筋炎、リウマチ熱、強皮症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡／類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、橋本甲状腺炎、乾癬、及び白斑からなる群から選択される実施態様８０に記載の方法。
８４．  上記炎症性疾患が、副腎炎、肺胞炎、胆管胆嚢炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液包炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮頚管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛殻炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合織炎、毛包炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、鼓膜炎、腎炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、灰白脊髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、セレロ脈絡膜炎(selerochoroiditis)、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、 耳管炎、腱炎、扁桃腺炎、尿道炎、及び膣炎からなる群から選択される実施態様８０に記載の方法。
８５．  上記ウイルス感染が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エチノウイルス(echinovirus)、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス及びヒト免疫不全症ウイルス１型又は２型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）からなる群から選択される実施態様８０に記載の方法。
【０２２７】
ここに引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体がここに記載されているのと同じ程度に、出典明示によりここに援用される。ここでの特許文献の引用及び援用は便宜上のものであって、このような特許文献の有効性、特許性及び／又は権利行使性についての見解を反映するものではない。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解してはならない。
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、全ての考えられる変更において上記の要素の何れの組み合わせも本発明に包含される。
【０２２８】
発明を記述する際に使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる用語及び同様の指示対象は、ここで別の記載がなされていないか、文脈上はっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーしていると解されるものである。
本明細書中の値の記載は単に、その範囲内にあるそれぞれ別々の値を個々に示す方法を短縮して示すことを意図しているだけであって、本明細書中で明記されない限り、それぞれ別々の値は、個別に挙げられているものとして本明細書中に組み込まれている。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である（例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる）。
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、本明細書中に記載のすべての方法は任意の好適な順序で行われうる。
【０２２９】
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に別段の記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も、明示的に記載していない限り、如何なる要素も本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
他に言及しない又は前後関係ではっきりと矛盾していない限りは、要素又は要素群に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含んでいる」等の用語を使用する本発明の任意の態様又は実施態様のここでの記載は、その特定の要素又は要素群「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含む」本発明の類似した態様又は実施態様をサポートすることを意図したものである（例えば、特定の要素を含むものとしてここに記載されている組成物は、他に言及しない限り又は前後関係ではっきりと矛盾していないならば、その要素からなる組成物をまた記載しているものと理解すべきである）。
本発明は、適用される法律によって許容される最大の範囲で、ここに提示された態様又は特許請求の範囲に記載された主題事項のあらゆる変形例及び均等物を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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