(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、標的配列の少なくとも第二の対立遺伝子変種を含むことが疑われる核酸試料において該標的配列の第一の対立遺伝子変種を検出する方法であって、該第一の対立遺伝子変種がまれな対立遺伝子変種であり、該第二の対立遺伝子変種が豊富な対立遺伝子変種であり、該まれな第一の対立遺伝子変種が、該豊富な第二の対立遺伝子変種の100,000〜約1,000,000コピーより大きいバックグラウンドにおいて該まれな第一の対立遺伝子変種の1コピーの選択性レベルで該方法により検出され、該核酸試料が試料容積1μLに対して1ngまたはそれ未満の核酸を有する、方法：
（a）（i）該核酸試料と、
（ii）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が該標的配列の該第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）該第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブがプライマー伸長反応を抑制する副溝バインダー（minor groove binder）を3'末端に含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である第一の座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、第一の座特異的プライマーと、
（v）5'ヌクレアーゼプローブであり、2つの標識を有する、第一の座特異的検出プローブと
を混合することによって、第一の反応混合物を形成する段階；
（b）第一のアンプリコンを形成するために、該第一の座特異的プライマーと該第一の対立遺伝子特異的プライマーとを用いて該第一の反応混合物に対して増幅反応を行う段階であって、
2段階サイクリングプロトコールを含み、
2段階サイクリングプロトコールの第一の段階のサイクル数が、第二の段階で用いられるサイクル数より少ないサイクルを含み、
該第一の段階中に用いられるアニーリング／伸長温度が、該第二の段階中に用いられるアニーリング／伸長温度より1〜3℃低く、
該第一の段階がマルチプレックス反応であり、かつ該第二の段階がシングルプレックス反応である、段階；ならびに
（c）該第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって該第一のアンプリコンを検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第一の対立遺伝子変種を検出する段階。
【請求項２】
前記第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を用いて、前記第一の対立遺伝子変種を定量する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
（d）（i）前記核酸試料と、
（ii）第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が前記標的配列の前記第二の対立遺伝子変種と相補的である、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）前記第一の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブがプライマー伸長反応を抑制する副溝バインダーを3'末端に含む、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である第二の座特異的プライマーであって、該領域が、第二の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、第二の座特異的プライマーと、
（v）5'ヌクレアーゼプローブであり、2つの標識を有する、第二の座特異的検出プローブと
を混合することによって、第二の反応混合物を形成する段階；
（e）第二のアンプリコンを形成するために、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと該座特異的プライマーとを用いて該第二の反応混合物に対して増幅反応を行う段階；ならびに
（f）該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって該第二のアンプリコンを検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第二の対立遺伝子変種を検出する段階。
【請求項４】
前記第一の反応混合物における前記第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を、前記第二の反応混合物における前記第二の検出プローブの検出可能な特性の変化と比較する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記第一の対立遺伝子特異的プライマー、前記第二の対立遺伝子特異的プライマー、もしくは該第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび該第二の対立遺伝子特異的プライマー、ならびに／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、前記第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、もしくは該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、少なくとも1つの修飾塩基を含む、請求項1または3記載の方法。
【請求項６】
前記修飾塩基が8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
前記修飾塩基がfdU塩基またはイソdC塩基である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
前記修飾塩基が、マッチ（matched）標的配列またはマッチヌクレオチドとミスマッチ（mismatched）標的配列またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる修飾塩基である、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾塩基が前記対立遺伝子特異的プライマー内および／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）および（b）、（b）および（c）、（a）および（c）、もしくは（a）、（b）および（c）の組み合わせに位置する、請求項5記載の方法。
【請求項１１】
前記第一の対立遺伝子特異的プライマー、前記第二の対立遺伝子特異的プライマー、もしくは該第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび該第二の対立遺伝子特異的プライマーに、ならびに／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、前記第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、もしくは該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブに前記修飾塩基を含めることによって、それが存在しない場合と比較して、前記検出する段階の特異性が改善される、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
前記改善が少なくとも2倍である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記検出する段階の特異性が、ASB-PCR法を用いて核酸試料中の対立遺伝子変種を検出する特異性と比較して少なくとも2倍改善される、請求項1または3記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の段階のサイクル数が前記第二の段階のサイクル数より90％少ないサイクルである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の段階のサイクル数が3〜7サイクルであり、かつ前記第二の段階のサイクル数が42〜48サイクルである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一のサイクリング段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が56〜59℃であり、かつ前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が59〜62℃である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記第一の段階が、対立遺伝子特異的プライマーと座特異的プライマーとの少なくとも2つの完全なセットを用いるマルチプレックス増幅反応を含み、各セットが関心対象の特異的ポリヌクレオチドを増幅するのに適しているかまたは有効である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記マルチプレックス増幅反応の産物が、二次シングルプレックス増幅反応に分割され、各々のシングルプレックス増幅反応が、該マルチプレックス反応において既に用いられた少なくとも1つのプライマーセットを含有する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記マルチプレックス増幅反応が、複数の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、核酸試料において標的配列中の第一の対立遺伝子変種を検出する方法であって、該核酸試料が試料容積1μLに対して1ngまたはそれ未満の核酸を有し、該第一の対立遺伝子変種が、該第二の対立遺伝子変種の100,000〜約1,000,000コピーより大きいバックグラウンドにおいて、1コピーの選択性レベルで検出される、方法：
（a）（i）核酸試料と、
（ii）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が該標的配列の該第一の対立遺伝子変種と相補的である、該対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該対立遺伝子特異的ブロッカープローブがプライマー伸長反応を抑制するブロッキング部分を3'末端に含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと、
（v）5'ヌクレアーゼプローブであり、2つの標識を有する、座特異的検出プローブと
を含む反応混合物を形成する段階；
（b）2段階サイクリングプロトコールを用いて該標的配列をPCR増幅する段階であって、該2段階サイクリングプロトコールが、
（i）第一のアニーリング／伸長温度で行われる、第一のサイクル数を含む第一の増幅段階と、
（ii）第二のアニーリング／伸長温度で行われる、第二のサイクル数を含む第二の増幅段階と
を含み、該第一のサイクル数が該第二のサイクル数より少なく、かつ該第一のアニーリング／伸長温度が該第二のアニーリング／伸長温度より1〜3℃低く、該第一の増幅段階がマルチプレックス反応であり、かつ該第二の増幅段階がシングルプレックス反応である、段階；
（c）段階（b）によって産生された該標的配列の増幅産物における検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第一の対立遺伝子変種を検出する段階。
【請求項２１】
前記第一の段階のサイクル数が前記第二の段階のサイクル数より90％少ないサイクルである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記第一の段階のサイクル数が3〜7サイクルであり、かつ前記第二の段階のサイクル数が42〜48サイクルである、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が56〜59℃であり、かつ前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が59〜62℃である、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
以下の段階を含む、核酸試料において標的配列中の対立遺伝子変種を検出する方法であって、第一の反応混合物がマルチプレックス反応であり、かつ第二および第三の反応混合物がシングルプレックス反応であり、標的遺伝子の該対立遺伝子変種が、該標的遺伝子の100,000〜約1,000,000コピーより大きいバックグラウンドにおいて1コピーの選択性レベルで検出される、方法：
a）（i）試料容積1μLに対して1ngまたはそれ未満の核酸を有する核酸試料、および
（ii）（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列内の所定のSNPの第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子とそれぞれ相補的である、該第一および該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（b）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一および該第二の対立遺伝子から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと
を各セットが含み、異なる標的配列に対して各々が特異的である、少なくとも2つのプライマーセット
を含む第一の反応混合物を、単一の容器において形成する段階；
b）線形期内に反応を保つのに適したサイクル数を用いて該異なる標的配列を増幅する段階；
c）段階b）の増幅産物を少なくとも2つの別個の容器に分割する段階；
d）段階c）の分割した産物の各々に、
（i）段階a）で用いられた少なくとも1つのプライマーセットと、
（ii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブがプライマー伸長反応を抑制する副溝バインダーを3'末端に含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）5'ヌクレアーゼプローブであり、2つの標識を有する、座特異的検出プローブと
を添加して、該少なくとも2つの別個の容器において第二および第三の反応混合物を形成する段階；
e）該第二および第三の反応混合物において該標的配列を増幅する段階；ならびに
f）段階e）によって産生された該標的配列の増幅産物の各々における該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該対立遺伝子変種を検出する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2009年12月17日に提出された米国特許出願第12/641,321号の一部係属出願であり、かつ2009年11月5日に提出された米国特許仮出願第61/258,582号；2009年10月20日に提出された同第61/253,501号；2009年10月14日に提出された同第61/251,623号；2009年6月12日に提出された同第61/186,775号；および2009年3月27日に提出された同第61/164,230号に対して35 U.S.C. 119の下で優先権の恩典を主張するものであり、それら全ての全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
一塩基多型（SNP）は、ヒトゲノムにおける遺伝子多様性の最も一般的なタイプであり、ヒトゲノムDNAにおいてヌクレオチド1,000個またはそれ未満においてSNP約1個の頻度で出現する（Kwok, P-Y, Ann Rev Genom Hum Genet 2001, 2:235-258）（非特許文献1）。SNPは、遺伝的障害、異なる疾患に対する感受性、薬物に対する有害反応に対する素因、および法医学研究での使用に関係している。このように、SNP（またはまれな変異）の検出は、血液中の循環性腫瘍細胞の検出、出生前診断のみならず、混合細胞集団における疾患関連変異の検出などの初期段階の疾患の診断において、大きな可能性を提供する。
【０００３】
ハイブリダイゼーション、ライゲーション、またはDNAポリメラーゼを含む方法に基づいて、SNP遺伝子型決定に関する多数のアプローチが開発されている（Chen, X., and Sullivan, PF, The Pharmacogeonomics Journal 2003, 3, 77-96.（非特許文献2））。例えば、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（AS-PCR）は、DNA配列バリエーションを検出するために広く用いられる戦略である（Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Wallace RB., Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:2757-2760（非特許文献3））。AS-PCRはその名前が示す通り、1つまたは双方のプライマーが、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子を識別することができる配列バリエーションの部位でアニーリングするように設計される、PCRに基づく方法である。AS-PCRは、マッチする3'塩基を有するプライマーよりかなり低い効率で、つまり100〜100,000倍低い効率でミスマッチ3'塩基を有するプライマーを伸長させるDNAポリメラーゼの忠実度を利用している（Chen, X., and Sullivan, PF, The Pharmacogeonomics Journal 2003; 3:77-96（非特許文献2））。ミスマッチプライマーを伸長させることの難しさによって、容易に検出することができるPCR増幅の減少が起こる。
【０００４】
しかし、AS-PCRの特異性および選択性は、対立遺伝子識別力を急速に減衰させるPCRの指数関数的増幅という性質に大きく依存する。たとえプライマーを、特異的変種のみを選択的に増幅するためにその変種にマッチするように設計しても、実際には、かなりのミスマッチ増幅がしばしば起こる。その上、AS-PCRの対立遺伝子変種の識別能は、変異のタイプまたは変異もしくはSNP周囲の配列（Ayyadevara S, Thaden JJ, Shmookler Reis RJ., Anal Biochem 2000;284: 11-18（非特許文献4））、試料中に存在する対立遺伝子変種の量のみならず、別の対立遺伝子との比率によって影響を受けうる。集合的に、これらの要因はしばしば、疑陽性結果が頻繁に出現する原因であり、そのために多くの研究者たちはAS-PCRの信頼性を増加させようと試みている（Orou A, Fechner B, Utermann G, Menzel HJ., Hum Mutat 1995;6:163-169（非特許文献5））（Imyanitov EN, Buslov KG, Suspitsin EN, Kuligina ES, Belogubova EV, Grigoriev MY, et al., Biotechniques 2002;33:484-490（非特許文献6））（McKinzie PB, Parsons BL. Detection of rare K-ras codon 12 mutations using allele-specific competitive blocker PCR. Mutat Res 2002; 517:209-220（非特許文献7））（Latorra D, Campbell K, Wolter A, Hurley JM., Hum Mutat 2003;22:79-85（非特許文献8））。
【０００５】
いくつかの場合において、AS-PCRの選択性は、ロックド核酸（LNA）（Latorra, D., et al., Hum Mut 2003, 2:79-85；Nakiandwe, J. et al., Plant Method 2007, 3:2（非特許文献9））、または修飾（modified）塩基（Koizumi, M. et al. Anal Biochem. 2005, 340:287-294（非特許文献10））を含有するSNPに基づくPCRプライマーを用いることによって、対立遺伝子10個中1個から対立遺伝子100,000個中1個の検出まで増加している。しかし、これらの塩基の「模倣体」または修飾は、全体的な分析コストを増加させ、かつしばしば大量の最適化を必要とする。
【０００６】
対立遺伝子のバリエーションを識別するために用いられるプローブハイブリダイゼーション法を含む別の技術は、TaqMan（登録商標）遺伝子型決定である。しかし、AS-PCRと同様に、この方法を用いる選択性は、限られており、混合試料におけるまれな（≧1,000個中1個）対立遺伝子または変異の検出には適さない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kwok, P-Y, Ann Rev Genom Hum Genet 2001, 2:235-258
【非特許文献２】Chen, X., and Sullivan, PF, The Pharmacogeonomics Journal 2003, 3, 77-96
【非特許文献３】Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Wallace RB., Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:2757-2760
【非特許文献４】Ayyadevara S, Thaden JJ, Shmookler Reis RJ., Anal Biochem 2000;284: 11-18
【非特許文献５】Orou A, Fechner B, Utermann G, Menzel HJ., Hum Mutat 1995;6:163-169
【非特許文献６】Imyanitov EN, Buslov KG, Suspitsin EN, Kuligina ES, Belogubova EV, Grigoriev MY, et al., Biotechniques 2002;33:484-490
【非特許文献７】McKinzie PB, Parsons BL. Detection of rare K-ras codon 12 mutations using allele-specific competitive blocker PCR. Mutat Res 2002; 517:209-220
【非特許文献８】Latorra D, Campbell K, Wolter A, Hurley JM., Hum Mutat 2003;22:79-85
【非特許文献９】Latorra, D., et al., Hum Mut 2003, 2:79-85；Nakiandwe, J. et al., Plant Method 2007, 3:2
【非特許文献１０】Koizumi, M. et al. Anal Biochem. 2005, 340:287-294
【発明の概要】
【０００８】
概要
いくつかの態様において、本発明は全体として、異なる対立遺伝子間の配列バリエーションの識別に用いるための組成物、方法、およびキットに関する。より具体的には、いくつかの態様において、本発明は、特異性が高い豊富な（例えば、野生型）対立遺伝子変種を含む試料においてSNPまたはヌクレオチド（NT）の挿入もしくは欠失などのまれな（例えば、変異体）対立遺伝子変種を定量するための組成物、方法、およびキットを提供する。特に、いくつかの態様において、本発明は、競合的対立遺伝子特異的TaqMan PCR（competitive allele-specific TaqMan PCR）（「cast-PCR」）と呼ばれる選択性の高い変異検出法に関する。
【０００９】
1つの局面において、本発明は、核酸試料における対立遺伝子変種の同定および／または定量に用いるための組成物を提供する。これらの組成物のいくつかは、（a）対立遺伝子特異的プライマー；（b）対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；（c）検出プローブ；および／または（d）座特異的プライマーを含みうる。
【００１０】
組成物のいくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーは、標的特異的部分と対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分とを含む。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーは、テールをさらに含んでもよい。いくつかの例示的な態様において、テールは対立遺伝子特異的プライマーの5'端に位置する。他の態様において、対立遺伝子特異的プライマーのテールはグアニンとシトシン残基の反復を有する（「GCに富む」）。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマー全体の融解温度（「Tm」）は、約50℃〜67℃の範囲である。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマー濃度は約20〜900 nMである。
【００１１】
組成物のいくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、3'末端に位置する。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の選択は、識別性の高い塩基（例えば、A/A、A/G、G/A、G/G、A/C、またはC/A対立遺伝子を検出するため）を用いることを含む。いくつかの態様において、例えば検出される対立遺伝子がA/GまたはC/T SNPを含む場合、AもしくはGが、対立遺伝子特異的プライマーの3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられる（例えば、AもしくはTが標的対立遺伝子である場合）か、またはCもしくはTが対立遺伝子特異的プライマーの3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられる（例えば、CもしくはGが標的対立遺伝子である場合）。他の態様において、Aは、A/T SNPを検出および／または定量する場合に、対立遺伝子特異的プライマーの3'端における識別塩基として用いられる。他の態様において、GはC/G SNPを検出および／または定量する場合に、対立遺伝子特異的プライマーの3'端における識別塩基として用いられる。
【００１２】
組成物のいくつかの態様において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、3'末端に伸長不可能なブロッカー部分を含む。いくつかの例示的態様において、伸長可能なブロッカー部分は、副溝バインダー（minor groove binder）（MGB）である。いくつかの態様において、標的対立遺伝子の位置は、対立遺伝子特異的ブロッカープローブの伸長不可能なブロッカー部分から約6、約7、約8、約9、または約10ヌクレオチドなどの約6〜10ヌクレオチド離れて位置する。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、5'末端にMGB部分を含む。いくつかの例示的な態様において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、PCR増幅中に切断されない。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブのTmは約58℃〜66℃の範囲である。
【００１３】
組成物のいくつかの態様において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび／または対立遺伝子特異的プライマーは、少なくとも1つの修飾塩基を含む。いくつかの態様において、修飾塩基は、マッチ（matched）標的配列とミスマッチ（mismatched）標的配列との間のTmの差を増加させ、かつ／またはミスマッチプライミング効率を低下させ、それによってアッセイ法の特異性のみならず選択性も改善しうる。そのような修飾塩基は、例えば8-アザ-7-デアザ-dA（ppA）、8-アザ-7-デアザ-dG（ppG）、2'-デオキシプソイドイソシチジン（イソdC）、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（fdU）ロックド核酸（LNA）、または2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸（ENA）塩基を含んでもよい（例えば、図4Bも参照のこと）。いくつかの態様において、修飾塩基は、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内および／または対立遺伝子特異的プライマー内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）、もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する。
【００１４】
組成物のいくつかの態様において、検出プローブは、配列に基づく検出プローブまたは座特異的検出プローブである。他の態様において、検出プローブは5'ヌクレアーゼプローブである。いくつかの例示的な態様において、検出プローブは、MGB部分、レポーター部分（例えばFAM（商標）、TET（商標）、JOE（商標）、VIC（商標）、またはSYBR（登録商標）Green）、クエンチャー部分（例えば、Black Hole Quencher（商標）またはTAMRA（商標））、および／またはパッシブリファレンス（例えば、ROX（商標））を含みうる。いくつかの例示的な態様において、検出プローブは、米国特許第6,727,356号（その開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載される方法および原理に従って設計される。いくつかの例示的な態様において、検出プローブは、TaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems, Foster City）である。
【００１５】
組成物のいくつかの態様において、組成物は、ポリメラーゼ；デオキシリボヌクレオチド3リン酸（dNTP）；増幅に適した他の試薬および／または緩衝液；および／または鋳型配列または核酸試料をさらに含みうる。いくつかの態様において、ポリメラーゼはDNAポリメラーゼでありうる。いくつかの他の態様において、ポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼなどの熱安定性でありうる。他の態様において、鋳型配列または核酸試料は、ゲノムDNA（gDNA）または相補的DNA（cDNA）などのDNAでありうる。他の態様において、鋳型配列または核酸試料は、メッセンジャーRNA（mRNA）などのRNAでありうる。
【００１６】
別の局面において、本開示は、対立遺伝子特異的配列を増幅するための方法を提供する。これらの方法のいくつかは、以下の段階の1つまたは複数を含みうる：（a）第一の対立遺伝子（対立遺伝子-1）を含む第一の核酸分子に、対立遺伝子特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階；（b）第二の対立遺伝子（対立遺伝子-2）を含む第二の核酸分子に対立遺伝子特異的ブロッカープローブをハイブリダイズさせる段階であって、対立遺伝子-2が対立遺伝子-1と同じ座に対応する段階：（c）該第一の核酸分子に検出プローブをハイブリダイズさせる段階；（d）該対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物に座特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階、および（e）対立遺伝子-1を含む第一の核酸分子をPCR増幅する段階。
【００１７】
別の局面において、本発明は、他の対立遺伝子を含むプールされた試料または混合試料において対立遺伝子変種を検出および／または定量するための方法を提供する。これらの方法のいくつかは、以下の段階の1つまたは複数を含みうる：（a）第一の反応混合物において、第一の対立遺伝子（対立遺伝子-1）を含む第一の核酸分子に、第一の対立遺伝子特異的プライマーをハイブリダイズさせ、かつ第二の反応混合物において、第二の対立遺伝子（対立遺伝子-2）を含む第一の核酸分子に、第二の対立遺伝子特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階であって、対立遺伝子-2が対立遺伝子-1と同じ座に対応する段階；（b）該第一の反応混合物において、対立遺伝子-2を含む第二の核酸分子に、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをハイブリダイズさせ、かつ該第二の反応混合物において、対立遺伝子-1を含む第二の核酸分子に、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをハイブリダイズさせる段階；（c）該第一の反応混合物において、該第一の核酸分子に第一の検出プローブをハイブリダイズさせ、かつ該第二の反応混合物において、該第一の核酸分子に第二の検出プローブをハイブリダイズさせる段階；（d）該第一の反応混合物において、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物に第一の座特異的プライマーをハイブリダイズさせ、かつ該第二の反応混合物において、該第二の対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物に第二の座特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階；ならびに（e）該第一の核酸分子をPCR増幅して第一の組または試料のアンプリコンを形成し、かつ第二の核酸分子をPCR増幅して第二の組または試料のアンプリコンを形成する段階；ならびに（f）該第一の組のアンプリコンを該第二の組のアンプリコンと比較して、対立遺伝子-2を含む該試料中の対立遺伝子-1、および／または対立遺伝子-1を含む該試料中の対立遺伝子-2を定量する段階。
【００１８】
方法のいくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーは、標的特異的部分と対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分とを含む。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーはテールをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマー全体のTmは約50℃〜67℃の範囲である。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマー濃度は約20〜900 nMである。
【００１９】
方法のいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分および第二の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、同じ配列を含む。他の態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分および第二の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、同じ配列である。
【００２０】
方法のいくつかの態様において、テールは、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの5'端に位置する。いくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールは、同じ配列を含む。他の態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールは、同じ配列である。他の態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーのテールはGCに富む。
【００２１】
方法のいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、SNPの第一の対立遺伝子（対立遺伝子-1）に対して特異的であり、第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立電子特異的ヌクレオチド部分は、同じSNPの第二の対立遺伝子（対立遺伝子-2）に対して特異的である。方法のいくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、3'末端に位置する。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の選択は、識別性の高い塩基（例えば、A/A、A/G、G/A、G/G、A/C、またはC/A対立遺伝子を検出するため）を用いることを含む。いくつかの態様において、例えば検出される対立遺伝子がA/GまたはC/T SNPを含む場合、AもしくはGが、第一および／もしくは第二の対立遺伝子特異的プライマーの3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられる（例えばAもしくはTが多数の対立遺伝子である場合）か、またはCもしくはTが、第一および／もしくは第二の対立遺伝子特異的プライマーの3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられる（例えば、CもしくはGが多数の対立遺伝子である場合）。他の態様において、Aは、A/T SNPを検出および／または定量する場合に、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの3'端における識別塩基として用いられる。他の態様において、Gは、C/G SNPを検出および／または定量する場合に、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの3'端における識別塩基として用いられる。
【００２２】
方法のいくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、3'末端に伸長不可能なブロッカー部分を含む。いくつかの例示的な態様において、伸長不可能なブロッカー部分はMGBである。いくつかの態様において、標的対立遺伝子の位置は、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブの伸長不可能なブロッカー部分から、約6、約7、約8、約9、または約10ヌクレオチドなどの約6〜10ヌクレオチド離れて位置する。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、5'末端にMGB部分を含む。他の態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、PCR増幅中に切断されない。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブのTmは約58℃〜66℃の範囲である。
【００２３】
方法のいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび／もしくは第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブならびに／または第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび／もしくは第二の対立遺伝子特異的プライマーは、少なくとも1つの修飾塩基を含む。いくつかの態様において、修飾塩基は、マッチ標的配列とミスマッチ標的配列との間のTmの差を増加させ、かつ／またはミスマッチプライミング効率を低下させ、それによってアッセイ法の特異性のみならず選択性も改善しうる。そのような修飾塩基は、例えば8-アザ-7-デアザ-dA（ppA）、8-アザ-7-デアザ-dG（ppG）、2'-デオキシプソイドイソシチジン（イソdC）、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（fdU）、ロックド核酸（LNA）、または2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸（ENA）塩基を含んでもよい（例えば、図4Bも参照のこと）。いくつかの態様において、修飾塩基は、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内ならびに／または第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマー内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）、もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する。
【００２４】
方法のいくつかの態様において、対立遺伝子識別の特異性は、非修飾対立遺伝子特異的プライマーまたはブロッカープローブを用いる場合と比較して、第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび／もしくは第二の対立遺伝子特異的プライマーに、ならびに／または第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブに修飾塩基を含めることによって改善される。いくつかの態様において、特異性の改善は、少なくとも2倍である。
【００２５】
方法のいくつかの態様において、対立遺伝子識別の特異性は、ブロッキング試薬による対立遺伝子特異的PCR法（Allele-Specific PCR with a Blocking reagent（ASB-PCR））を用いる対立遺伝子識別の特異性より、少なくとも2倍（例えば、2倍、3倍、4倍、5倍等）良好である。
【００２６】
いくつかの態様において、方法は、2段階サイクリングプロトコールをさらに含む。いくつかの態様において、2段階サイクリングプロトコールの第一の段階のサイクル数は、第二の段階で用いられるサイクル数より少ないサイクルを含む。他の態様において、第一の段階のサイクル数は、第二の段階のサイクル数より約90％少ないサイクルである。なお他の態様において、第一の段階のサイクル数は、3〜7サイクルであり、第二の段階のサイクル数は42〜48サイクルである。
【００２７】
いくつかの態様において、2段階サイクリングプロトコールの第一のサイクリング段階中に用いられるアニーリング／伸長温度は、第二の段階中に用いられるアニーリング／伸長温度より1〜3℃低い。好ましい態様において、2段階サイクリングプロトコールの第一のサイクリング段階中に用いられるアニーリング／伸長温度は56〜59℃であり、第二の段階中に用いられるアニーリング／伸長温度は60〜62℃である。
【００２８】
いくつかの態様において、方法はプレ増幅段階をさらに含む。好ましい態様において、プレ増幅段階は、対立遺伝子特異的プライマーと座特異的プライマーとの少なくとも2つの完全なセットを用いるマルチプレックス増幅反応を含み、各々のセットが、関心対象の特異的ポリヌクレオチドを増幅するのに適しているかまたは有効である。他の態様において、マルチプレックス増幅反応の産物は、cast-PCR反応などの二次シングルプレックス増幅反応に分割され、各々のシングルプレックス増幅反応は、マルチプレックス反応において既に用いられた少なくとも1つのプライマーセットを含有する。他の態様において、マルチプレックス増幅反応は、複数の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをさらに含む。いくつかの態様において、マルチプレックス増幅反応は、増幅の線形期内に該反応を保つのに適したサイクル数行われる。
【００２９】
方法のいくつかの態様において、第一および／または第二の検出プローブは同じである。いくつかの態様において、第一および／または第二の検出プローブは異なる。いくつかの態様において、第一および／または第二の検出プローブは、配列に基づく検出プローブまたは座特異的検出プローブである。他の態様において、第一および／または第二の検出プローブは5'ヌクレアーゼプローブである。いくつかの例示的な態様において、第一および／または第二の検出プローブは、MGB部分、レポーター部分（例えばFAM（商標）、TET（商標）、JOE（商標）、VIC（商標）、またはSYBR（登録商標）Green）、クエンチャー部分（例えば、Black Hole Quencher（商標）またはTAMRA（商標））、および／またはパッシブリファレンス（例えば、ROX（商標））を含む。いくつかの例示的な態様において、第一および／または第二の検出プローブは、米国特許第6,727,356号（その開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載される方法および原理に従って設計される。いくつかの例示的な態様において、検出プローブは、TaqMan（登録商標）プローブである。
【００３０】
方法のいくつかの態様において、第一の座特異的プライマーおよび第二の座特異的プライマーは、同じ配列を含む。いくつかの態様において、第一の座特異的プライマーおよび第二の座特異的プライマーは、同じ配列である。
【００３１】
方法のいくつかの態様において、第一および／または第二の反応混合物は、ポリメラーゼ；dNTP；PCR増幅に適した他の試薬および／または緩衝液；ならびに／または鋳型配列または核酸試料をさらに含みうる。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼでありうる。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼなどの熱安定性でありうる。いくつかの態様において、鋳型配列または核酸試料は、gDNAまたはcDNAなどのDNAでありうる。他の態様において、鋳型配列または核酸試料は、mRNAなどのRNAでありうる。
【００３２】
方法のいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、第二の対立遺伝子特異的プライマーと同じ鎖または配列に結合する一方で、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは第一の対立遺伝子特異的プライマーと同じ鎖または配列に結合する。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、第二の対立遺伝子および／または第一の対立遺伝子のいずれかからそれぞれ生成されたバックグラウンドシグナルの量を低減させるために用いられる。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、伸長不可能であり、選択的に第二の対立遺伝子または第一の対立遺伝子にそれぞれアニーリングし、それによって例えば伸長可能な第一の対立遺伝子特異的プライマーの第二の対立遺伝子へのアニーリング、および／または伸長可能な第二の対立遺伝子特異的プライマーの第一の対立遺伝子へのアニーリングを遮断する。
【００３３】
いくつかの例示的な態様において、第一の対立遺伝子は、まれな（例えば、少数の）対立遺伝子または変異体対立遺伝子である。他の例示的な態様において、第二の対立遺伝子は、豊富な（例えば、多数の）対立遺伝子または野生型対立遺伝子である。
【００３４】
別の局面において、本発明は、第二の対立遺伝子変種を含む試料において第一の対立遺伝子変種を定量するためのキットを提供し、該キットは、（a）第一の対立遺伝子特異的プライマー；（b）第二の対立遺伝子特異的プライマー；（c）第一の座特異的プライマー；（d）第二の座特異的プライマー；（e）第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；（f）第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；および（g）第一の座特異的検出プローブ；および（h）第二の座特異的検出プローブを含む。
【００３５】
キットのいくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーは、標的特異的部分と対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分とを含む。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーは、テールをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマー全体のTmは、約50℃〜67℃の範囲である。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマー濃度は約20〜900 nMである。
【００３６】
キットのいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分および第二の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、同じ配列を含む。他の態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分および第二の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、同じ配列である。
【００３７】
キットのいくつかの態様において、テールは、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの5'端に位置する。いくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールは、同じ配列を含む。他の態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールは、同じ配列である。他の態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーのテールはGCに富む。
【００３８】
キットのいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、SNPの第一の対立遺伝子（対立遺伝子-1）に対して特異的であり、第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、同じSNPの第二の対立遺伝子（対立遺伝子-2）に対して特異的である。開示される方法のいくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、3'末端に位置する。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の選択は、識別性の高い塩基（例えば、 A/A、A/G、G/A、G/G、A/C、またはC/A対立遺伝子を検出するため）を用いることを含む（図2）。いくつかの態様において、例えば検出される対立遺伝子がA/GまたはC/T SNPを含む場合、AもしくGが、第一および／もしく第二の対立遺伝子特異的プライマーの3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられる（例えば、AもしくTが標的対立遺伝子である場合）か、またはCもしくはTが、第一および／もしく第二の対立遺伝子特異的プライマーの3'対立遺伝子特異的ヌクレオチドとして用いられる（例えば、CもしくはGが標的対立遺伝子である場合）。他の態様において、Aは、A/T SNPを検出および／または定量する場合に、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの3'端における識別塩基として用いられる。他の態様において、Gは、C/G SNPを検出および／または定量する場合に、第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマーの3'端における識別塩基として用いられる。
【００３９】
キットのいくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、3'末端に伸長不可能なブロッカー部分を含む。いくつかの例示的態様において、伸長不可能ブロッカー部分はMGBである。いくつかの態様において、標的対立遺伝子の位置は、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブの伸長不可能なブロッカー部分から約6、約7、約8、約9、または約10ヌクレオチドなどの約6〜10ヌクレオチド離れて位置する。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、5'末端にMGB部分を含む。他の態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、PCR増幅中に切断されない。いくつかの態様において、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブのTmは約58℃〜66℃の範囲である。
【００４０】
キットのいくつかの態様において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブならびに／または第一および／もしくは第二の対立遺伝子特異的プライマーは、少なくとも1つの修飾塩基を含む。いくつかの態様において、修飾塩基は、マッチ標的配列とミスマッチ標的配列との間のTmの差を増加させ、かつ／またはミスマッチプライミング効率を低下させ、それによってアッセイ法の特異性のみならず選択性も改善しうる。そのような修飾塩基は、例えば8-アザ-7-デアザ-dA（ppA）、8-アザ-7-デアザ-dG（ppG）、2'-デオキシプソイドイソシチジン（イソdC）、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（fdU）、ロックド核酸（LNA）、または2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸（ENA）塩基（例えば、図4Bも参照のこと）を含んでもよい。いくつかの態様において、修飾塩基は、第一および／または第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内および／または第一および／または第二の対立遺伝子特異的プライマー内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）、もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する。
【００４１】
キットのいくつかの態様において、第一および／または第二の検出プローブは同じである。開示されるキットのいくつかの態様において、第一および／または第二の検出プローブは異なる。開示されるキットのいくつかの態様において、第一および／または第二の検出プローブは、配列に基づく検出プローブまたは座特異的検出プローブである。他の態様において、第一および／または第二の検出プローブは5'ヌクレアーゼプローブである。いくつかの例示的な態様において、第一および／または第二の検出プローブは、MGB部分、レポーター部分（例えばFAM（商標）、TET（商標）、JOE（商標）、VIC（商標）、またはSYBR（登録商標）Green）、クエンチャー部分（例えば、Black Hole Quencher（商標）またはTAMRA（商標））、および／またはパッシブリファレンス（例えば、ROX（商標））を含む。いくつかの例示的な態様において、第一および／または第二の検出プローブは、米国特許第6,727,356号（その開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載される方法および原理に従って設計される。いくつかの例示的な態様において、検出プローブは、TaqMan（登録商標）プローブである。
【００４２】
キットのいくつかの態様において、第一の座特異的プライマーおよび第二の座特異的プライマーは、同じ配列を含む。いくつかの態様において、第一の座特異的プライマーおよび第二の座特異的プライマーは、同じ配列である。
【００４３】
キットのいくつかの態様において、第一および／または第二の反応混合物は、ポリメラーゼ；dNTP；PCR増幅に適した他の試薬および／または緩衝液；および／または鋳型配列または核酸試料をさらに含みうる。いくつかの態様において、ポリメラーゼはDNAポリメラーゼでありうる。いくつかの他の態様において、ポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼなどの熱安定性でありうる。
【００４４】
いくつかの態様において、本発明の組成物、方法、およびキットは、高い対立遺伝子識別特異性および選択性を提供する。いくつかの態様において、特異性および／または選択性の定量的な判定は、第一の組のアンプリコンと第二の組のアンプリコンとの間のCt値の比較を含む。いくつかの態様において、選択性は、別の1つまたは複数の対立遺伝子の約100万コピー中所定の対立遺伝子1コピーが検出されうるレベルにある。
【００４５】
上記は、以下の1つまたは複数を用いて対立遺伝子変種の改善された検出および識別を提供する本発明の様々な態様を説明している：（a）テールを有する対立遺伝子特異的プライマー；（b）低い対立遺伝子特異的プライマー濃度；（c）より低いTmを有するように設計された対立遺伝子特異的プライマー；（d）識別塩基を標的とするように設計された対立遺伝子特異的プライマー；（e）試料中の別のかつおそらくより豊富な対立遺伝子変種からの増幅を防止するように設計された、MGBを含有する対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；ならびに（f）マッチ標的配列とミスマッチ標的配列との間でデルタTmを増加させるために、修飾塩基を含むように設計された対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび／または対立遺伝子特異的プライマー。
【００４６】
上記の改善のいくつかを使用する特定の態様が本明細書において論述されるが、調べられる試料の性質に応じて、好都合の結果に達するように、上記の改善の様々な組み合わせを組み合わせることができることは当業者に明らかであると考えられる。このように、例えば、デルタTmを増加させるために修飾塩基を含有する対立遺伝子特異的プライマーを使用する方法を含む態様について、非MGBブロッカープローブを用いることができ；そのようなプライマーはまた識別塩基を標的とするように設計されることができ；かつプライマーは低いプライマー濃度で用いられうる。よって、本開示に基づく代替の態様を用いて対立遺伝子検出の適したレベルに到達することができる。
【００４７】
本開示は、特定の状況において、列挙された改善の任意の組み合わせが当業者によって使用されうるという長所を提供する。例えば、本発明は、改善a、c、d、およびf；改善b、c、およびe；または改善を使用する方法または反応混合物を含みうる。
【００４８】
前記の全般的な記載および以下の詳細な記載は、例示的であり、説明のためのものに過ぎず、特許請求の範囲によって請求される本発明を制限するものではないと理解されるべきである。
【００４９】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示のいくつかの例示的な態様を明示し、記述と共に一定の教示を説明するために役立つ。
[本発明1001]
以下の段階を含む、標的配列の少なくとも第二の対立遺伝子変種を含むことが疑われる核酸試料において該標的配列の第一の対立遺伝子変種を検出する方法：
（a）（i）該核酸試料と、
（ii）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が該標的配列の該第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）該第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダー（minor groove binder）を含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である第一の座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、第一の座特異的プライマーと、
（v）第一の検出プローブと
を混合することによって、第一の反応混合物を形成する段階；
（b）第一のアンプリコンを形成するために、該第一の座特異的プライマーと該第一の対立遺伝子特異的プライマーとを用いて該第一の反応混合物に対して増幅反応を行う段階；ならびに
（c）該第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって該第一のアンプリコンを検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第一の対立遺伝子変種を検出する段階。
[本発明1002]
前記第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を用いて、前記第一の対立遺伝子変種を定量する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
以下の段階をさらに含む、本発明1001の方法：
（d）（i）前記核酸試料と、
（ii）第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が前記標的配列の前記第二の対立遺伝子変種と相補的である、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）前記第一の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である第二の座特異的プライマーであって、該領域が、第二の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、第二の座特異的プライマーと、
（v）第二の検出プローブと
を混合することによって、第二の反応混合物を形成する段階；
（e）第二のアンプリコンを形成するために、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと該座特異的プライマーとを用いて該第二の反応混合物に対して増幅反応を行う段階；ならびに
（f）該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって該第二のアンプリコンを検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第二の対立遺伝子変種を検出する段階。
[本発明1004]
前記第一の反応混合物における前記第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を、前記第二の反応混合物における前記第二の検出プローブの検出可能な特性の変化と比較する段階をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記第一の対立遺伝子特異的プライマー、前記第二の対立遺伝子特異的プライマー、もしくは該第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび該第二の対立遺伝子特異的プライマー、ならびに／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、前記第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、もしくは該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、少なくとも1つの修飾塩基を含む、本発明1001または1003の方法。
[本発明1006]
前記修飾塩基が8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記修飾塩基がfdU塩基またはイソdC塩基である、本発明1005の方法。
[本発明1009]
前記修飾塩基が、マッチ（matched）標的配列またはマッチヌクレオチドとミスマッチ（mismatched）標的配列またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、本発明1005の方法。
[本発明1010]
前記修飾塩基が前記対立遺伝子特異的プライマー内および／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する、本発明1005の方法。
[本発明1011]
前記第一の対立遺伝子特異的プライマー、前記第二の対立遺伝子特異的プライマー、もしくは該第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび該第二の対立遺伝子特異的プライマーに、ならびに／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、前記第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、もしくは該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブに前記修飾塩基を含めることによって、それが存在しない場合と比較して、前記検出する段階の特異性が改善される、本発明1005の方法。
[本発明1012]
前記改善が少なくとも2倍である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記検出する段階の特異性が、ASB-PCR法を用いて核酸試料中の対立遺伝子変種を検出する特異性と比較して少なくとも2倍改善される、本発明1001または1003の方法。
[本発明1014]
前記増幅反応を行う段階が、2段階サイクリングプロトコールを含む、本発明1001または1003の方法。
[本発明1015]
前記2段階サイクリングプロトコールの第一の段階のサイクル数が、第二の段階で用いられるサイクル数より少ないサイクルを含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記第一の段階のサイクル数が前記第二の段階のサイクル数より約90％少ないサイクルである、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記第一の段階のサイクル数が3〜7サイクルであり、かつ前記第二の段階のサイクル数が42〜48サイクルである、本発明1014の方法。
[本発明1018]
前記2段階サイクリングプロトコールの第一のサイクリング段階中に用いられるアニーリング／伸長温度が、第二の段階中に用いられるアニーリング／伸長温度より1〜3℃低い、本発明1014の方法。
[本発明1019]
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一のサイクリング段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が56〜59℃であり、かつ前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が60〜62℃である、本発明1014の方法。
[本発明1020]
前記段階（a）の前にプレ増幅段階が行われる、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記プレ増幅段階が、対立遺伝子特異的プライマーと座特異的プライマーとの少なくとも2つの完全なセットを用いるマルチプレックス増幅反応を含み、各セットが関心対象の特異的ポリヌクレオチドを増幅するのに適しているかまたは有効である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記マルチプレックス増幅反応の産物が、二次シングルプレックス増幅反応に分割され、各々のシングルプレックス増幅反応が、該マルチプレックス反応において既に用いられた少なくとも1つのプライマーセットを含有する、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記マルチプレックス増幅反応が、複数の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記マルチプレックス増幅反応が、増幅の線形期内に該反応を保つのに適したサイクル数行われる、本発明1021の方法。
[本発明1025]
（a）核酸分子；
（b）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第一の対立遺伝子変種と相補的である、該対立遺伝子特異的プライマー；
（c）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；
（d）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマー；および
（e）検出プローブ
を含む、反応混合物。
[本発明1026]
前記対立遺伝子特異的プライマーおよび／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブが少なくとも1つの修飾塩基を含む、本発明1025の反応混合物。
[本発明1027]
前記修飾塩基が、8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、本発明1026の反応混合物。
[本発明1028]
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、本発明1026の反応混合物。
[本発明1029]
前記修飾塩基がfdU塩基またはイソdC塩基である、本発明1026の反応混合物。
[本発明1030]
前記修飾塩基が、マッチ標的配列またはマッチヌクレオチドとミスマッチ標的配列またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、本発明1026の反応混合物。
[本発明1031]
前記修飾塩基が、前記対立遺伝子特異的プライマー内および／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する、本発明1026の反応混合物。
[本発明1032]
（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマー；
（b）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
を含む、組成物。
[本発明1033]
座特異的プライマーをさらに含む、組成物であって、
該座特異的プライマーが、前記標的配列の領域と相補的であり、該領域が、前記第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
前記第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが少なくとも1つの修飾塩基を含む、本発明1032または1033の組成物。
[本発明1035]
前記修飾塩基が8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、本発明1034の組成物。
[本発明1036]
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、本発明1034の組成物。
[本発明1037]
前記修飾塩基がfdU塩基またはイソdC塩基である、本発明1034の組成物。
[本発明1038]
前記修飾塩基が、マッチ標的配列またはマッチヌクレオチドとミスマッチ標的配列またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、本発明1034の組成物。
[本発明1039]
前記修飾塩基が、前記対立遺伝子特異的プライマー内および／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する、本発明1034の組成物。
[本発明1040]
2つまたはそれ以上の容器のうちの1つに独立して分配された以下の構成要素を含む該2つまたはそれ以上の容器を含む、キット：
（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマー；および
（b）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ。
[本発明1041]
座特異的プライマーをさらに含む、キットであって、
該座特異的プライマーが、前記標的配列の領域と相補的であり、該領域が、前記第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、本発明1040のキット。
[本発明1042]
前記第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが少なくとも1つの修飾塩基を含む、本発明1041のキット。
[本発明1043]
前記修飾塩基が8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、本発明1042のキット。
[本発明1044]
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、本発明1042のキット。
[本発明1045]
前記修飾塩基が、マッチ標的配列および／またはマッチヌクレオチドとミスマッチ標的配列および／またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、本発明1042のキット。
[本発明1046]
前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、該対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の3'端に、5'端に、および／または内部位置にMGB部分を含む、本発明1042のキット。
[本発明1047]
以下の段階を含む、核酸試料において標的配列中の第一の対立遺伝子変種を検出する方法：
（a）（i）核酸試料と、
（ii）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が該標的配列の該第一の対立遺伝子変種と相補的である、該対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該対立遺伝子特異的ブロッカープローブがブロッキング部分を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと、
（v）検出プローブと
を含む反応混合物を形成する段階；
（b）2段階サイクリングプロトコールを用いて該標的配列をPCR増幅する段階であって、該2段階サイクリングプロトコールが、
（i）第一のアニーリング／伸長温度で行われる、第一のサイクル数を含む第一の増幅段階と、
（ii）第二のアニーリング／伸長温度で行われる、第二のサイクル数を含む第二の増幅段階と
を含み、該第一のサイクル数が該第二のサイクル数より少なく、かつ該第一のアニーリング／伸長温度が該第二のアニーリング／伸長温度より低い、段階；
（c）段階（b）によって産生された該標的配列の増幅産物における検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第一の対立遺伝子変種を検出する段階。
[本発明1048]
前記第一の段階のサイクル数が前記第二の段階のサイクル数より約90％少ないサイクルである、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記第一の段階のサイクル数が3〜7サイクルであり、かつ前記第二の段階のサイクル数が42〜48サイクルである、本発明1014の方法。
[本発明1050]
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が、前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度より1〜3℃低い、本発明1014の方法。
[本発明1051]
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が56〜59℃であり、かつ前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が60〜62℃である、本発明1014の方法。
[本発明1052]
以下の段階を含む、核酸試料において標的配列中の対立遺伝子変種を検出する方法：
a）（i）核酸試料、および
（ii）（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列内の所定のSNPの第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子とそれぞれ相補的である、該第一および該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（b）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一および該第二の対立遺伝子から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと
を各セットが含み、異なる標的配列に対して各々が特異的である、少なくとも2つのプライマーセット
を含む第一の反応混合物を、単一の容器において形成する段階；
b）線形期内に反応を保つのに適したサイクル数を用いて該異なる標的配列を増幅する段階；
c）段階b）の増幅産物を少なくとも2つの別個の容器に分割する段階；
d）段階c）の分割した産物の各々に、
（i）段階a）で用いられた少なくとも1つのプライマーセットと、
（ii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）検出プローブと
を添加して、該少なくとも2つの別個の容器において第二および第三の反応混合物を形成する段階；
e）該第二および第三の反応混合物において該標的配列を増幅する段階；ならびに
f）段階e）によって産生された該標的配列の増幅産物の各々における該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該対立遺伝子変種を検出する段階。
[本発明1053]
前記第一の反応混合物がマルチプレックス反応であり、かつ前記第二および第三の反応混合物がシングルプレックス反応である、本発明1052の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
当業者は、添付の図面が例示目的にすぎないことを理解すると考えられる。図面は、決して本発明の教示の範囲を限定するよう意図するものではない。
【図１】cast-PCRの例示的な態様の概略図を図示する。いくつかの態様において、cast-PCRの構成要素は以下を含む：1つの座特異的TaqManプローブ（LST）；2つのMGBブロッカー：1つの対立遺伝子-1特異的MGBブロッカー（MGB1）および1つの対立遺伝子-2特異的MGBブロッカー（MGB2）；3つのPCRプライマー：1つの座特異的PCRプライマー（LSP）；1つの対立遺伝子-1特異的プライマー（ASP1）および1つの対立遺伝子-2特異的プライマー（ASP2）。
【図２】まれな対立遺伝子変種を検出するための識別性の高い塩基を含む対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いるcast-PCRの例示的な態様の概略図を図示する。識別性の高い塩基は、例えばA/A、A/G、G/A、G/G、A/C、C/Aを含んでもよい。識別性の低い塩基は、例えばC/C、T/C、G/T、T/G、C/Tを含んでもよい。いくつかの態様において、例えばA-GまたはC-T SNPを検出するために、A//Tが対立遺伝子変種（例えば、変異体対立遺伝子）である場合に、AおよびGが識別塩基として用いられるか；またはC//Gが対立遺伝子変種（例えば、変異体対立遺伝子）である場合に、CおよびTが識別塩基として用いられる。
【図３】5'端にMGB部分を有する対立遺伝子特異的ブロッカープローブを用いるcast-PCRの例示的な態様の概略図を図示する。いくつかの態様において、プローブの3'端のブロッカー部分は、例えばNH2、ビオチン、MGB、PO4、およびPEGを含んでもよい。
【図４Ａ】MGBブロッカープローブまたは対立遺伝子特異的プライマーにおいて修飾塩基を用いるcast-PCRの例示的な態様の概略図を図示する（G*はppGを表す）。
【図４Ｂ】MGBブロッカープローブまたは対立遺伝子特異的プライマーの修飾塩基のいくつかの例を図示する。
【図５】cast-PCRの1つの例示的な態様のTaqMan様の感度およびダイナミックレンジを図示する。
【図６】cast-PCR法を用いて検出可能であるコドン12および13におけるKRAS変異の配列を図示する。コドン12および13におけるKRAS変異は、転移性結腸直腸癌におけるセツキシマブまたはパニツムマブに対する抵抗性に関連する（Di Nicolantonio F., et al., J Clin Oncol. 2008; 26:5705-12）。
【図７】1つの例示的な態様においてcast-PCRアッセイ法を用いてKRAS変異検出の特異性を図示する。
【図８】野生型DNA 106コピー中変異体DNA 1コピーを検出するためにcast-PCR法を用いる1つの例示的な態様を図示する。
【図９】cast-PCR法を用いて野生型試料にスパイクされた変異体試料（KRAS-G12A）の相対的コピー数の検出を図示する。
【図１０】cast-PCRの1つの例示的な態様を用いて腫瘍試料において検出される多数の異なる腫瘍マーカー（SNP）を図示する。
【図１１Ａ】cast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーとプローブの一覧を示す。小文字で示されたヌクレオチドはプライマーのテール部分である。対立遺伝子特異的プライマー（ASP）のヌクレオチド部分は、各プライマーの最も3'末端に存在し、太字で示される。ブロッカープローブ（MGB）の対立遺伝子部分は、ブロッカー部分に対して内部の様々な位置にあり、いくつかの場合において太字で示される。
【図１１Ｂ】cast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーとプローブの一覧を示す。小文字で示されたヌクレオチドはプライマーのテール部分である。対立遺伝子特異的プライマー（ASP）のヌクレオチド部分は、各プライマーの最も3'末端に存在し、太字で示される。
【図１１Ｃ】cast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーとプローブの一覧を示す。小文字で示されたヌクレオチドはプライマーのテール部分である。対立遺伝子特異的プライマー（ASP）のヌクレオチド部分は、各プライマーの最も3'末端に存在し、太字で示される。
【図１１Ｄ】cast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーとプローブの一覧を示す。
【図１１Ｅ】cast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーとプローブの一覧を示す。ブロッカープローブ（MGB）の対立遺伝子部分は、ブロッカー部分に対して内部の様々な位置にあり、いくつかの場合において太字で示される。
【図１２】cast-PCRによる分析の前にプレ増幅された試料の対立遺伝子識別の特異性を図示する。
【図１３】テールを有する対立遺伝子特異的プライマー対テールを有しない対立遺伝子特異的プライマーを用いて行ったcast-PCRアッセイ法の対立遺伝子識別の特異性を図示する。
【図１４】cast-PCRによって分析した試料対ASB-PCR法によって分析した試料の対立遺伝子識別の特異性を図示する。
【図１５】MGBブロッカープローブまたはリン酸ブロッカープローブを用いて行ったcast-PCRアッセイ法の対立遺伝子識別の特異性を図示する。
【図１６】LNA修飾対立遺伝子特異的プライマーを用いて行ったcast-PCRアッセイ法の対立遺伝子識別の特異性を図示する。
【図１７】様々な化学修飾対立遺伝子特異的プライマーを用いて行ったcast-PCRアッセイ法の対立遺伝子識別の特異性を比較する。
【図１８Ａ】プレ増幅およびcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的な対立遺伝子特異的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図１８Ｂ】プレ増幅およびcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的な対立遺伝子特異的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図１９Ａ】テール（ASP+テール）を有する対立遺伝子特異的プライマーまたはテールを有しない（ASP-テール）対立遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いるcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図１９Ｂ】テール（ASP+テール）を有する対立遺伝子特異的プライマーまたはテールを有しない（ASP-テール）対立遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いるcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。（ASP＋テールプライマーのテール部分を小文字で示す）。
【図１９Ｃ】テール（ASP+テール）を有する対立遺伝子特異的プライマーまたはテールを有しない（ASP-テール）対立遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いるcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図１９Ｄ】テール（ASP+テール）を有する対立遺伝子特異的プライマーまたはテールを有しない（ASP-テール）対立遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いるcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図２０Ａ】ASB-PCRにおいて用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図２０Ｂ】ASB-PCRにおいて用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図２０Ｃ】ASB-PCRにおいて用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。ASB-PCRにおいて用いられたブロッカープローブは、ブロッカープローブの3'端においてリン酸基を含む（PHOS）。
【図２１Ａ】LNA修飾対立遺伝子特異的プライマーを用いて行ったcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。この例示的な態様において、ASPのLNA修飾は3'端に存在する（「+」は、LNA修飾ヌクレオチドを示し、かつ括弧内に記される）。
【図２１Ｂ】LNA修飾対立遺伝子特異的プライマーを用いて行ったcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図２１Ｃ】LNA修飾対立遺伝子特異的プライマーを用いて行ったcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。
【図２２】他の化学修飾対立遺伝子特異的プライマーを用いて行ったcast-PCRアッセイ法において用いられた例示的なプライマーおよびプローブの一覧を示す。この例示的な態様において、ASPの化学修飾（例えば、ppA、ppG、fdUおよびイソdC）は3'端に存在する（化学修飾ヌクレオチドを括弧内に示す）。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
I．緒言
関心対象対立遺伝子の選択的増幅はしばしば、別の対立遺伝子上でのミスマッチ対立遺伝子特異的プライマーのミスプライミングおよび伸長を含む要因のために複雑である。そのようなミスプライミングおよび伸長は、別の対立遺伝子変種の過剰量が存在する試料中に存在するまれな対立遺伝子を検出する場合には特に問題となりうる。十分に過剰量存在する他の対立遺伝子変種のミスプライミングおよび伸長によって、関心対象の対立遺伝子の検出が曖昧になる可能性がある。PCRに基づく方法を用いる場合、別の対立遺伝子変種を含有する試料における特定の対立遺伝子の識別は、試料中に存在する他の対立遺伝子の増幅を最小限にしながらまたは防止しながら、関心対象の対立遺伝子を選択的に増幅することに依存する。
【００５２】
単独でまたは組み合わせて、対立遺伝子特異的PCRの識別力の増強に寄与する多数の要因が同定されている。本明細書において開示される通り、ミスマッチ対立遺伝子特異的プライマーとマッチ対立遺伝子特異的プライマーとの間でより大きいΔCt値を提供する要因は、対立遺伝子変種間の識別力がより大きいことを示している。本発明の方法を用いて対立遺伝子変種の識別を改善することが見いだされたそのような要因は、例えば、以下の1つまたは複数を用いることを含む：（a）テールを有する対立遺伝子特異的プライマー；（b）低い対立遺伝子特異的プライマー濃度；（c）より低いTmを有するように設計された対立遺伝子特異的プライマー；（d）識別塩基を標的とするように設計された対立遺伝子特異的プライマー；（e）試料中の別のかつおそらくより豊富な対立遺伝子変種からの増幅を防止するように設計された対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；および（f）マッチ標的配列とミスマッチ標的配列との間のデルタTmを増加させるために、修飾塩基を含むように設計された対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび／または対立遺伝子特異的プライマー。
【００５３】
上記の要因は、特に組み合わせて用いられる場合、対立遺伝子特異的PCRが、試料中に存在する異なる対立遺伝子を識別する能力に影響を及ぼしうる。このように、本開示は全体として、ΔCt値を増加させることによってPCR中の対立遺伝子変種の識別を改善するために先に言及された要因の組み合わせを使用する、cast-PCRと呼ばれる新規増幅法に関する。いくつかの態様において、本発明の方法は、野生型分子約1000〜10,000個、約10,000〜100,000個、約20,000〜250,000個、約30,000〜300,000個、約40,000〜400,000個、約50,000〜500,000個、約75,000〜750,000個、もしくは約100,000〜1,000,000個、またはその間の任意の部分範囲（fractional range）などの、野生型分子少なくとも1,000〜1,000,000個のバックグラウンドにおいて変異体分子1個が検出されうる高レベルの選択性を含みうる。いくつかの態様において、開示される方法を含む第一の組のアンプリコンと第二の組のアンプリコンの比較は、約1000〜10,000倍、約10,000〜100,000倍、約20,000〜250,000倍、約30,000〜300,000倍、約40,000〜400,000倍、約50,000〜500,000倍、約75,000〜750,000倍、約100,000〜1,000,000倍、約2,000,000〜25,000,000倍、約3,000,000〜30,000,000倍、約4,000,000〜40,000,000倍、約5,000,000〜50,000,000倍、約7,5000,000〜75,000,000倍もしくは約10,000,000〜100,000,000倍の差、またはその間の任意の部分範囲などの、1,000倍の差から100,000,000倍の差まで特異性の改善を提供する。
【００５４】
II．定義
本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語には複数形が含まれ、その逆も含まれる。以下に説明するいかなる定義も、参照により本明細書に組み入れられる任意の文書が含まれる他の任意の文書におけるその言葉の使用と矛盾する場合には、反対の意味が明らかに意図される場合を除き、本明細書およびその関連する特許請求の範囲を解釈する目的で、以下に記載する定義が常に支配する。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、「対立遺伝子」という用語は通常、例えば相同染色体上などのDNAのセグメント上の同じ物理的座での別のDNA配列を指す。対立遺伝子は、単細胞もしくは生物内の相同染色体上で見いだされる同じ物理的座間で異なるDNA配列、または多細胞もしくは生物内の同じ物理的座で異なるDNA配列（「対立遺伝子変種」）を指しうる。いくつかの例において、対立遺伝子は、特定の物理的座で1ヌクレオチドの差に対応しうる。他の態様において、対立遺伝子はヌクレオチド（1つまたは多数の）の挿入または欠失に対応しうる。
【００５６】
本明細書において用いられる場合、「対立遺伝子特異的プライマー」という用語は、関心対象対立遺伝子を含む配列にハイブリダイズして、PCRにおいて用いられる場合、第一鎖cDNA合成を実行するために伸長されうるオリゴヌクレオチド配列を指す。対立遺伝子特異的プライマーは、所定の標的DNAまたは座の特定の対立遺伝子に対して特異的であり、標的配列においてヌクレオチド1個という小さい差を検出するために設計されうる。対立遺伝子特異的プライマーは、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分、標的特異的部分および／またはテールを含んでもよい。
【００５７】
本明細書において用いられる場合、「対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分」または「対立遺伝子特異的標的ヌクレオチド」という用語は、同じ座の他の対立遺伝子（例えば、対応する多数の対立遺伝子または野生型対立遺伝子）を除外して、所定の座で1つの対立遺伝子（例えば、少数の対立遺伝子または変異体対立遺伝子）に選択的にハイブリダイズし、そこから伸長されうる対立遺伝子特異的プライマーにおける1つのヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを指す。
【００５８】
本明細書において用いられる場合、「標的特異的部分」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする対立遺伝子特異的プライマーの領域を指す。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、検出される対立遺伝子変種の5'のプライミング領域で標的配列に対して相補的であるプライミングセグメントである。対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を含んでもよい。他の例において、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に隣接する。
【００５９】
本明細書において用いられる場合、「テール」または「5'テール」という用語は、プライマーの非3'端を指す。この領域は典型的には、分析される標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的でない配列を含有するが、必ずしも含有する必要はない。5'テールは、長さが約2〜30、2〜5、4〜6、5〜8、6〜12、7〜15、10〜20、15〜25、もしくは20〜30ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲の任意の長さでありうる。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、「対立遺伝子特異的ブロッカープローブ」（同様に本明細書において「ブロッカープローブ」、「ブロッカー」と呼ばれる）という用語は、対立遺伝子特異的プライマーによって結合される鎖と同じ、反対、または相補的鎖上に位置する特定の対立遺伝子変種を含むDNAの鎖に結合し、その特定の対立遺伝子変種の増幅を低減または防止する、オリゴヌクレオチド配列を指す。本明細書においてより詳細に論述される場合、対立遺伝子特異的ブロッカープローブは通常、ポリメラーゼによるプライマーの伸長を防止する修飾を、例えばリボース環の3'-OHにおいて含む。対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、対立遺伝子特異的プライマーがアニーリングする同じ鎖または反対鎖にアニーリングするように設計されることができ、かつその3'末端端部でブロッキング基（例えば、「伸長不可能なブロッカー部分」）によって修飾されることができる。このように、ブロッカープローブは、対立遺伝子特異的プライマーの伸長によって変異体対立遺伝子（例えば、まれな対立遺伝子変種）を含む同じ鎖上または反対鎖上で増幅を起こさせるが、例えば野生型対立遺伝子の増幅を抑制するために野生型対立遺伝子（例えば豊富な対立遺伝子変種）に堅固に結合するように設計されうる。例示的な態様において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブには、蛍光標識、放射活性標識、または化学発光標識などの標識は含まれない。
【００６１】
本明細書において用いられる場合、「伸長不可能なブロッカー部分」という用語は通常、例えばPCR反応においてその相補的配列にハイブリダイズしてもポリメラーゼによる伸長を不可能にするプローブおよび／またはプライマーなどのオリゴヌクレオチド配列上の修飾を指す。ブロッカー部分の一般的な例には、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド配列の‘3端へのさらなる塩基の付加を防止する、オリゴヌクレオチドのリボース環の3'-OHの修飾が含まれる。そのような3'-OH修飾は当技術分野において周知である（例えば、その開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Josefsen, M., et al., Molecular and Cellular Probes, 23 (2009):201-223；McKinzie, P. et al., Mutagenesis. 2006, 21(6):391-7；Parsons, B. et al., Methods Mol Biol. 2005, 291:235-45；Parsons, B. et al., Nucleic Acids Res. 1992, 25:20(10):2493-6；およびMorlan, J. et al., PLoS One 2009, 4 (2): e4584を参照されたい）。
【００６２】
本明細書において用いられる場合、「MGB」、「MGB基」、「MGB化合物」、または「MBG部分」という用語は、副溝バインダーを指す。オリゴヌクレオチドの3'端にコンジュゲートされると、MGB基は伸長不可能なブロッカー部分として機能しうる。
【００６３】
MGBは、二本鎖DNAの副溝内に結合する分子である。公知のMGB化合物は広く多様な化学構造を有することから、そのような化合物全てに関する一般的化学式を提供することはできないが、DNAの副溝において結合することができる化合物は一般的に言えば、半月形の三次元構造を有する。ほとんどのMGB部分は、二本鎖DNAのB型のA-T（アデニンおよびチミン）に富む領域に対して強い選択性を有する。それにもかかわらず、C-G（シトシンおよびグアニン）に富む領域に対して選択性を示すMGB化合物もまた理論的に可能である。ゆえに、C-G領域に対して選択性を有する副溝バインダー分子に由来するラジカルまたは部分を含むオリゴヌクレオチドも同様に、本発明の範囲内である。
【００６４】
いくつかのMGBは、103 M-1またはそれ以上の結合定数で二本鎖DNAの副溝内に結合することができる。このタイプの結合は、紫外線（UV）および核磁気共鳴（NMR）分光法などの十分に確立された分光光度法によって、および同様にゲル電気泳動によっても検出されうる。副溝バインダー分子の結合時のUVスペクトルのシフトおよび「核オーバーハウザー」（NOSEY）効果を利用するNMR分光法は、特に周知であり、この目的にとって有用な技術である。ゲル電気泳動は、そのような結合によって二本鎖DNAの移動度が変化することから、二本鎖DNAまたはその断片に対するMGBの結合を検出する。
【００６５】
適した多様な副溝バインダーが文献において記載されている。例えばKutyavin, et al. 米国特許第5,801,155号；Wemmer, D. E., and Dervan P. B., Current Opinion in Structural Biology, 7:355-361 (1997)；Walker, W. L., Kopka, J. L. and Goodsell, D. S., Biopolymers, 44:323-334 (1997)；Zimmer, C. and Wahnert, U. Prog. Biophys. Molec. Bio. 47:31-112 (1986)およびReddy, B. S. P., Dondhi, S. M., and Lown, J. W., Pharmacol. Therap., 84: 1-111 (1999)（それらの開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。本開示による好ましいMGBはDPI3である。そのようなMGBの合成法および／または供給源も同様に当技術分野において周知である（例えば、開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,801,155号；同第6,492,346号；同第6,084,102号；および同第6,727,356号を参照されたい）。
【００６６】
本明細書において用いられる場合、「MGBブロッカープローブ」、「MBGブロッカー」、または「MGBプローブ」という用語は、その3'および／または5'端において副溝バインダー部分にさらに付着されたオリゴヌクレオチド配列および／またはプローブである。MGB部分にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖のDNA標的と極めて安定な二重鎖を形成するため、より短いプローブをハイブリダイゼーションに基づくアッセイ法において用いることが可能となる。非修飾DNAと比較すると、MGBプローブは、特にハイブリダイズした二重鎖のMGB領域近傍にミスマッチがある場合には、より高い融解温度（Tm）および増加した特異性を有する（例えば、Kutyavin, I. V., et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 2: 655-661を参照されたい）。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、「修飾塩基」という用語は、天然に存在する核酸において見いだされる塩基とは構造が異なる、核酸中の塩基または塩基の化学的連結の任意の修飾を指す。そのような修飾には、核酸中の塩基の化学構造もしくは塩基の化学的連結、または核酸の骨格構造における変化が含まれうる（例えば、Latorra, D. et al., Hum Mut 2003, 2:79-85. Nakiandwe, J. et al., Plant Method 2007, 3:2を参照されたい）。
【００６８】
本明細書において用いられる場合、「検出プローブ」という用語は、増幅を示す多様な任意のシグナル伝達分子を指す。例えば、SYBR（登録商標）Greenおよび他のDNA結合色素は検出プローブである。いくつかの検出プローブは配列に基づく（同様に本明細書において「座特異的検出プローブ」とも呼ばれる）、例えば5'ヌクレアーゼプローブでありうる。様々な検出プローブ、例えば本明細書において記載されるTaqMan（登録商標）プローブ（米国特許第5,538,848号も参照されたい）、様々なステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第6,103,476号および同第5,925,517号ならびにTyagi and Kramer, Nature Biotechnology 1996, 14:303-308）、ステムレスまたはリニアビーコン（例えばWO 99/21881を参照されたい）、PNA Molecular Beacons（商標）（例えば、米国特許第6,355,421号および同第6,593,091号を参照されたい）、リニアPNAビーコン（例えば、Kubista et al., 2001, SPIE 4264:53-58を参照されたい）、非FRETプローブ（例えば、米国特許第6,150,097号を参照されたい）、Sunrise（登録商標）/Amplifluor（登録商標）プローブ（米国特許第6,548,250号）、ステムループおよび二重鎖Scorpion（商標）プローブ（Solinas et al., 2001, Nucleic Acids Research 29:E96および米国特許第6,589,743号）、バルジループプローブ（米国特許第6,590,091号）、シュードノットプローブ（米国特許第6,589,250号）、サイクリコン（cyclicon）（米国特許第6,383,752号）、MGB Eclipse（商標）プローブ（Epoch Biosciences）、ヘアピンプローブ（米国特許第6,596,490号）、ペプチド核酸（PNA）ライトアッププローブ、自己アセンブルナノ粒子プローブ、ならびに例えば米国特許第6,485,901号；Mhlanga et al., 2001, Methods 25:463-471；Whitcombe et al., 1999, Nature Biotechnology. 17:804-807；Isacsson et al., 2000, Molecular Cell Probes. 14:321-328；Svanvik et al., 2000, Anal Biochem. 281:26-35；Wolffs et al., 2001, Biotechniques 766:769-771；Tsourkas et al., 2002, Nucleic Acids Research. 30:4208-4215；Riccelli et al., 2002, Nucleic Acids Research 30:4088-4093；Zhang et al., 2002 Shanghai. 34:329-332；Maxwell et al., 2002, J. Am. Chem. Soc. 124:9606-9612；Broude et al., 2002, Trends Biotechnol. 20:249-56；Huang et al., 2002, Chem Res. Toxicol. 15:118-126；およびYu et al., 2001, J. Am. Chem. Soc 14:11155-11161において記載されるフェロセン修飾プローブが、当技術分野において公知である。検出プローブは、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、またはテトラクロロフルオレセイン（TET）などのレポーター色素を含みうる。検出プローブはまた、テトラメチルローダミン（TAMRA）、Black Hole Quenchers（Biosearch）、アイオワブラック（IDT）、QSYクエンチャー（Molecular Probes）、ならびにDabsylおよびDabcelスルホネート／カルボキシレートクエンチャー（Epoch）などのクエンチャー部分を含みうる。検出プローブはまた、2つのプローブを含むことができ、例えば蛍光体が一方のプローブ上にあり、かつクエンチャーが他方のプローブ上にあり、標的上で2つのプローブが共にハイブリダイズするとシグナルを消光するか、または標的上でハイブリダイズすると、蛍光の変化によってシグナルサインが変化する。検出プローブはまた、カルボキシレート基の代わりにSO3を有するフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホラミダイト型、CY5のホスホラミダイト型（例えば、Amersham Biosciences-GE Healthcareから入手可能）も含むことができる。
【００６９】
本明細書において用いられる場合、「座特異的プライマー」という用語は、PCR反応における第一のプライマー（対立遺伝子特異的プライマーなどの）の伸長に由来する産物にハイブリダイズして、該産物の第二鎖cDNA合成を実行することができるオリゴヌクレオチド配列を指す。従って、いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーは、フォワードPCRプライマーとして働き、かつ座特異的プライマーは、リバースPCRプライマーとして働くか、またはその逆である。いくつかの好ましい態様において、座特異的プライマーは、対立遺伝子特異的プライマーと比較してより高濃度で存在する。
【００７０】
本明細書において用いられる場合、「まれな対立遺伝子変種」という用語は、別の対立遺伝子変種と比較して試料中により低レベルで存在する標的ポリヌクレオチドを指す。まれな対立遺伝子変種はまた、「少数の対立遺伝子変種」および／または「変異体対立遺伝子変種」とも呼ばれることがある。例えば、まれな対立遺伝子変種は、所定のSNPまたは遺伝子に関する別の対立遺伝子変種と比較して1/10、1/100、1/1,000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000、1/10,000,000、1/100,000,000、または1/1,000,000,000未満の頻度で見いだされる場合がある。または、まれな対立遺伝子は例えば、試料または反応体積1、10、100、1,000マイクロリットルあたり2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750、1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、25,000、50,000、75,000、100,000、250,000、500,000、750,000、または1,000,000コピー未満でありうる。
【００７１】
本明細書において用いられる場合、「豊富な対立遺伝子変種」という用語は、別の対立遺伝子変種と比較して試料中により高レベルで存在する標的ポリヌクレオチドを指してもよい。豊富な対立遺伝子変種はまた、「多数の対立遺伝子変種」および／または「野生型対立遺伝子変種」と呼ばれることがある。例えば、豊富な対立遺伝子変種は、所定のSNPまたは遺伝子に関する別の対立遺伝子変種と比較して10倍、100倍、l,000倍、10,000倍、100,000倍、l,000,000倍、10,000,000倍、100,000,000倍、または1,000,000,000倍より大きい頻度で見いだされる場合がある。または、豊富な対立遺伝子変種は例えば、試料または反応体積1、10、100、1,000マイクロリットルあたり2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750、1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、25,000、50,000、75,000、100,000、250,000、500,000、750,000、または1,000,000コピーより多く存在しうる。
【００７２】
本明細書において用いられる場合、「第一」および「第二」という用語は、第一の反応（例えば、「第一の」反応；「第一の」対立遺伝子特異的プライマー）、および第二の反応（例えば、「第二の」反応；「第二の」対立遺伝子特異的プライマー）の構成要素を識別するために用いられる。慣例によって、本明細書において用いられる場合、第一の反応は第一の（例えば、まれな）対立遺伝子変種を増幅して、第二の反応は第二の（例えば、豊富な）対立遺伝子変種を増幅するか、またはその逆である。
【００７３】
本明細書において用いられる場合、「第一の対立遺伝子変種」および「第二の対立遺伝子変種」はいずれも同じ生物からの所定の座の対立遺伝子に関係しうる。例えば、野生型対立遺伝子を含むヒト試料（例えば、細胞）の場合と同様に、そのいくつかは、少数のまたはまれな対立遺伝子を形成するように変異している。本発明の教示の第一および第二の対立遺伝子変種は、また、異なる生物由来の対立遺伝子を指しうる。例えば、第一の対立遺伝子は、遺伝子改変された生物の対立遺伝子であることができ、第二の対立遺伝子は、野生型生物の対応する対立遺伝子であることができる。本教示の第一の対立遺伝子変種および第二の対立遺伝子変種は、gDNAのみならずmRNAおよびcDNAに含有されることができ、通常、例えばSNPまたはヌクレオチド挿入および／または欠失変異により配列の多様性を示す任意の標的核酸であることができる。
【００７４】
本明細書において用いられる場合、「熱安定な」または「熱安定ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性または熱抵抗性であり、デオキシリボヌクレオチドの重合化を触媒して、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物を形成する酵素を指す。本明細書において有用な熱安定性DNAポリメラーゼは、PCR増幅中に一本鎖核酸の脱安定化または二本鎖核酸の変性を行うために必要な時間、上昇した温度に供されても不可逆的に不活化されない。酵素の不可逆的な変性は、酵素活性の実質的な喪失を指す。好ましくは、熱安定性DNAポリメラーゼは、PCR増幅に典型的に必要とされるなどの条件の下で、約90℃〜100℃において不可逆的に変性しないと考えられる。
【００７５】
本明細書において用いられる場合、「PCR増幅する」または「PCR増幅」という用語は通常、例えばInnis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)において記載される通り、相補鎖にハイブリダイズするプライマーを使用する核酸のポリメラーゼ媒介指数関数的増幅の繰り返しを指す。明記された波長の光線を放射することができる蛍光指示薬を含有する組成物によってサーマルサイクリング反応を行うことができ、蛍光色素の強度を読み取ることができ、および各サイクル後に蛍光強度を表示することができる装置が開発されている。サーマルサイクラー、光線エミッター、および蛍光シグナル検出器を含む装置は、例えば米国特許第5,928,907号；同第6,015,674号；同第6,174,670号；および同第6,814,934号において記載されており、これにはABI Prism（登録商標）7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, California）、ABI GeneAmp（登録商標）5700 Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, California）、ABI GeneAmp（登録商標）7300 Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, California）、ABI GeneAmp（登録商標）7500 Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, California）、StepOne（商標）Real-Time PCR System（Applied Biosystems, Foster City, California）、およびABI GeneAmp（登録商標）7900 Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, California）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００７６】
本明細書において用いられる場合、「プレ増幅」または「プレ増幅する」という用語は、複数のプライマー対がマルチプレックスPCR増幅反応に含まれ、かつ、PCRに基づくプレ増幅反応がPCRのプラトーおよび／または試薬枯渇の前に終了するようにマルチプレックス増幅反応が制限されたサイクル数行われる、プロセスを指す。「PCRに基づくプレ増幅」という用語は、典型的にはPCRに基づくプレ増幅反応より低い多重（plexy）レベルの二次増幅反応がその後行われることを示すと見なされうる。この二次増幅反応は典型的には、異なる複数の二次増幅反応であり、マルチプレックスPCRに基づくプレ増幅反応において用いられるプライマーによってコードされるプライマー対を使用することができる。しかし、各々の二次増幅反応は典型的には単一のまたは少数のプライマー対を含む。PCRに基づくプレ増幅アプローチのさらなる例は、例えば、開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,605,451号、および米国特許出願第10/723,520号において見いだされうる。
【００７７】
本明細書において用いられる場合、「Tm」または「融解温度」という用語は、一本鎖オリゴヌクレオチドの集団中の分子の50％がその相補的配列にハイブリダイズし、かつ集団中の分子の50％が該相補的配列にハイブリダイズしない温度（セ氏での温度）を指す。プライマーまたはプローブのTmは、融解曲線によって経験的に決定されうる。いくつかの場合において、それはまた、当技術分野において周知の式を用いても計算されうる（例えば、Maniatis, T., et al., Molecular cloning: a laboratory manual / Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.: 1982を参照されたい）。
【００７８】
本明細書において用いられる場合、「感度」という用語は、所定のアッセイ法によって検出されうる鋳型の最少量（コピー数または質量）を指す。本明細書において用いられる場合、「特異性」という用語は、マッチ鋳型対ミスマッチ鋳型からの増幅を識別するアッセイ法の能力を指す。しばしば、特異性は△Ct＝Ctミスマッチ−Ctマッチとして表記される。特異性の改善または「特異性改善」または「倍率差」は、本明細書において2(△Ct_条件1−(△Ct_条件2)として表記される。「選択性」という用語は、AS-PCRアッセイ法を用いて、多数の（しばしば野生型）対立遺伝子によって干渉されることなく、混合物中の少数の（しばしば変異体）対立遺伝子を決定することができる程度を指す。選択性はしばしば、比率または百分率として表記される。例えば、野生型鋳型100個の存在下で変異体鋳型1個を検出することができるアッセイ法は、1：100または1％の選択性を有すると言われる。本明細書において用いられる場合、アッセイ法の選択性はまた、1/2△Ctとして、または(1/2△Ct×100)を用いて百分率として計算されうる。
【００７９】
本明細書において用いられる場合、「Ct」または「Ct値」という用語は閾値サイクルを指し、アンプリコンの生成を示すレポーターからのシグナル（例えば、蛍光）が初めてバックグラウンドレベルより上で検出可能となる、PCR増幅アッセイ法のサイクルを意味する。いくつかの態様において、閾値サイクルまたは「Ct」は、PCR増幅が指数関数的になるサイクル数である。
【００８０】
本明細書において用いられる場合、「デルタCt」または「△Ct」という用語は、異なる2つの試料間または反応間の固定閾値をシグナルが通過するサイクル回数の差を指す。いくつかの態様において、デルタCtは異なる2つの試料または反応の間で指数関数的増幅に達したサイクル回数の差である。デルタCtは、対応する標的核酸配列に対するマッチプライマーと、同じ対応する標的核酸配列に対するミスマッチプライマーとの間の特異性を同定するために用いられうる。
【００８１】
いくつかの態様において、ミスマッチプライマーとマッチプライマーとの間のデルタCt値の計算は、対立遺伝子特異的PCRの識別力の1つの測定として用いられる。一般的に、標的配列（例えば、関心対象対立遺伝子変種を含む配列）にマッチするプライマーを用いる増幅反応のCt値と、ミスマッチプライマーを用いる増幅反応のCt値の差を増加させるいかなる因子によっても、より大きい対立遺伝子識別力が得られると考えられる。
【００８２】
様々な態様に従って、Ct値は、PCR曲線の導関数を用いて決定されてもよい。例えば、Ct値を決定するために、PCR曲線において第一次、第二次、または第n次の微分法を行ってもよい。様々な態様において、Ct値の決定に導関数の特徴を用いてもよい。そのような特徴には、第二次導関数の正の変曲、第二次導関数の負の変曲、第二次導関数のゼロ交差、または第一次導関数の正の変曲が含まれてもよいがこれらに限定されるわけではない。様々な態様において、Ct値は、閾値決定およびベースライン決定法を用いて決定されてもよい。例えば、PCR曲線の指数関数期に対する上限を、微分法を用いて確立してもよく、PCR曲線の指数関数期に対する下限を確立するために、PCR曲線のベースラインを決定してもよい。PCR曲線の上限および下限から閾値を確立してもよく、そこからCt値を決定する。例えば、フィットポイント（fit point）法の様々な態様およびシグモイド法の様々な態様に限定されない、当技術分野において公知のCt値を決定するための他の方法（例えば、開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,303,305号；同第6,503,720号；同第6,783,934号；同第7,228,237号；および米国特許出願第2004/0096819号を参照されたい）。
【００８３】
III．組成物、方法、およびキット
1つの局面において、本発明は、核酸試料における対立遺伝子変種の同定および／または定量に用いるための組成物を提供する。これらの組成物のいくつかは、（a）対立遺伝子特異的プライマー、（b）対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、（c）検出プローブ、および（d）座特異的プライマー、またはそれらの任意の組み合わせを含みうる。組成物のいくつかの態様において、組成物は、ポリメラーゼ、dNTP、PCR増幅に適した試薬および／または緩衝液、ならびに／または鋳型配列または核酸試料をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、ポリメラーゼは熱安定でありうる。
【００８４】
別の局面において、本発明は組成物を提供し、該組成物は、（i）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第一の対立遺伝子変種に対して相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマー；および（ii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域に対して相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブを含む。
【００８５】
いくつかの例示的な態様において、組成物は、座特異的プライマーをさらに含むことができ、該座特異的プライマーは標的配列の領域に対して相補的であり、該領域は、第一の対立遺伝子変種から3’側であり、かつ反対鎖上に存在する。
【００８６】
さらなる態様において、組成物は、検出プローブをさらに含みうる。
【００８７】
他の態様において、プレ増幅のための組成物はさらに、下記でさらに詳細に記載する通りに提供される。
【００８８】
別の局面において、本発明は、対立遺伝子特異的配列を増幅するための方法を提供する。これらの方法のいくつかは、以下の段階を含みうる：（a）標的対立遺伝子を含む第一の核酸分子に、対立遺伝子特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階；（b）該標的対立遺伝子と同じ座に対応する別の対立遺伝子を含む第二の核酸分子に、対立遺伝子特異的ブロッカープローブをハイブリダイズさせる段階；（c）該第一の核酸分子に座特異的検出プローブをハイブリダイズさせる段階；（d）該対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物に、座特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階；および（e）該標的対立遺伝子をPCR増幅する段階。
【００８９】
別の局面において、本発明は、混合試料において対立遺伝子変種を検出および／または定量するための方法を提供する。これらの方法のいくつかは、以下の段階を含みうる：（a）第一の反応混合物において、第一の対立遺伝子（対立遺伝子-1）を含む第一の核酸分子に第一の対立遺伝子特異的プライマーをハイブリダイズさせ、かつ第二の反応混合物において、第二の対立遺伝子（対立遺伝子-2）を含む第一の核酸分子に、第二の対立遺伝子特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階であって、該対立遺伝子-2が対立遺伝子-1と同じ座に対応する段階；（b）該第一の反応混合物において、対立遺伝子-2を含む第二の核酸分子に第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをハイブリダイズさせ、かつ該第二の反応混合物において、対立遺伝子-1を含む第二の核酸分子に第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをハイブリダイズさせる段階；（c）該第一の反応混合物において、該第一の核酸分子に第一の検出プローブをハイブリダイズさせ、かつ該第二の反応混合物において、該第一の核酸分子に第二の検出プローブをハイブリダイズさせる段階；（d）該第一の反応混合物において、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物に第一の座特異的プライマーをハイブリダイズさせ、かつ該第二の反応混合物において、該第二の対立遺伝子特異的プライマーの伸長産物に第二の座特異的プライマーをハイブリダイズさせる段階；ならびに（e）該第一の核酸分子をPCR増幅して第一の組または試料のアンプリコンを形成し、かつ該第二の核酸分子をPCR増幅して第二の組または試料のアンプリコンを形成する段階；ならびに（f）該第一の組のアンプリコンを該第二の組のアンプリコンと比較して、対立遺伝子-2を含む該試料中の対立遺伝子-1、および／または対立遺伝子-1を含む該試料中の対立遺伝子-2を定量する段階。
【００９０】
さらに別の局面において、本発明は、対立遺伝子変種を検出および／または定量するための方法を提供する。これらの方法のいくつかは、以下の段階を含みうる：（a）（i）低濃度の第一の対立遺伝子特異的プライマーと、（ii）第一の座特異的プライマーと、（iii）第一のブロッカープローブとを含む第一の反応において、第一の対立遺伝子変種をPCR増幅して、第一のアンプリコンを形成する段階；（b）（i）低濃度の第二の対立遺伝子特異的プライマーと、（ii）第二の座特異的プライマーと、（iii）第二のブロッカープローブとを含む第二の反応において、第二の対立遺伝子変種をPCR増幅して、第二のアンプリコンを形成する段階、ならびに（d）該第一のアンプリコンを該第二のアンプリコンと比較して、第二の対立遺伝子変種を含む試料中の該第一の対立遺伝子変種を定量する段階。
【００９１】
さらに別の局面において、本発明は、標的配列の少なくとも第二の対立遺伝子変種を含むことが疑われる核酸試料において該標的配列の第一の対立遺伝子変種を検出するための方法を提供する。この局面の方法は、以下の段階を含む：（i）核酸試料と；（ii）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、該標的配列の該第一の対立遺伝子変種に対して相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマーと；（iii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域に対して相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと；（iv）該標的配列の領域に対して相補的である第一の座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3’側であり、かつ反対鎖上に存在する、第一の座特異的プライマーと；（v）第一の検出プローブとを混合することによって、第一の反応混合物を形成する段階。
【００９２】
次に、第一のアンプリコンを形成するために、第一の座特異的プライマーと第一の対立遺伝子特異的プライマーとを用いて第一の反応混合物に対して増幅反応、典型的にはPCR増幅反応を行う。次に、アンプリコンに結合した場合の第一の検出プローブの検出可能な特性の変化によって第一のアンプリコンを検出し、それによって核酸試料中の標的遺伝子の第一の対立遺伝子変種を検出する。いくつかの例示的な態様において、検出プローブは5'ヌクレアーゼプローブである。いくつかの例示的な態様において、検出可能な特性は蛍光である。
【００９３】
いくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの5'標的領域の3'ヌクレオチド位置は、対立遺伝子特異的ヌクレオチド位置である。第一の対立遺伝子特異的プライマーの5'標的領域の3'ヌクレオチド位置が対立遺伝子特異的ヌクレオチド位置である態様を含む、ある他の例示的な態様において、対立遺伝子特異的プライマーのブロッキング領域は、対立遺伝子特異的ヌクレオチド位置を包含する。さらに、例示的な態様において、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、副溝バインダーを含む。さらに、ある例示的な態様において対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、標識、例えば蛍光標識またはクエンチャーを有しない。
【００９４】
ある例示的な態様において、第一の対立遺伝子変種の量は、第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を評価することによって決定される。
【００９５】
ある例示的な態様において、方法は、以下の段階をさらに含む：（i）核酸試料と；（ii）第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第二の対立遺伝子変種に対して相補的である、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと；（iii）第一の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域に対して相補的である、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第二の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと；（iv）該標的配列の領域に対して相補的である第二の座特異的プライマーであって、該領域が、該第二の対立遺伝子変種から3’側であり、かつ反対鎖上に存在する、第二の座特異的プライマーと；（v）第二の検出プローブとを混合することによって、第二の反応混合物を形成する段階。次に、第二のアンプリコンを形成するために、第二の対立遺伝子特異的プライマーと座特異的プライマーとを用いて第二の反応混合物に対して増幅反応を行う。次に、第二のアンプリコンを検出プローブの検出可能な特性の変化によって検出する。
【００９６】
ある態様において、方法は、第一の反応混合物における第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を、第二の反応混合物における第二の検出プローブの検出可能な特性の変化と比較する段階をさらに含む。
【００９７】
いくつかの好ましい態様において、方法には、2段階サイクリングプロトコールが含まれてもよい。いくつかの態様において、核酸試料において標的配列中の対立遺伝子変種を検出する方法は、以下の段階を含む：
（i）核酸試料と、
（ii）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第一の対立遺伝子変種と相補的である、該対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する部分を含み、かつ該対立遺伝子特異的ブロッカープローブがブロッキング部分を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと、
（v）検出プローブと
を含む反応混合物を形成する段階；
（b）2段階サイクリングプロトコールを用いて該標的配列をPCR増幅する段階であって、該2段階サイクリングプロトコールが、
（i）第一のアニーリング／伸長温度で行われる、第一のサイクル数を含む第一の増幅段階と、
（ii）第二のアニーリング／伸長温度で行われる、第二のサイクル数を含む第二の増幅段階と
を含み、該第一のサイクル数が該第二のサイクル数より少なく、かつ該第一のアニーリング／伸長温度が該第二のアニーリング／伸長温度より低い、段階；ならびに
（c）段階（b）によって産生された該標的配列の増幅産物における該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出する段階。
【００９８】
いくつかの態様において、サイクリングプロトコールは、より低いアニーリング／伸長温度で最初のサイクル数を使用する第一の増幅段階の後に、より高いアニーリング／伸長温度で多数のサイクルを使用する第二の増幅段階を含む。cast-PCR対立遺伝子特異的プライマーのTmがより低い（例えば、53〜56℃）ために、PCRは、標準的なアニーリング／伸長条件（例えば、60〜64℃）で最適ではない可能性がある。その結果、cast-PCRの効率を有意に改善する最初のサイクリング段階中、より低いアニーリング／伸長温度を用いてもよい。
【００９９】
いくつかの態様において、cast-PCRサイクリングプロトコールの第一の段階で用いられるサイクル数は、第二の段階で用いられるサイクル数より少ない。cast-PCR法のいくつかの態様において、サイクリングプロトコールの第一の段階で用いられるサイクル数は、第二の段階で用いられる総サイクル数の約2％〜20％、4％〜18％、6％〜16％、8％〜14％、10％〜12％、またはその間の任意のパーセントである。いくつかの態様において、第一の段階は、1〜10サイクル、2〜8サイクル、3〜7サイクル、または4〜6サイクル、およびその間の全てのサイクル数、例えば2、3、4、5、6、もしくは7サイクルを使用する。
【０１００】
いくつかの態様において、cast-PCRサイクリングプロトコールの第二の段階で用いられるサイクル数は、第二の段階で用いられるサイクル数より多い。cast-PCR法のいくつかの態様において、サイクリングプロトコールの第二の段階で用いられるサイクル数は、第一の段階で用いられるサイクル数の5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、18倍、25倍、または30倍である。いくつかの態様において、第二の段階は、30〜50サイクル、35〜48サイクル、40〜46サイクル、またはその間の任意のサイクル数、例えば42、43、44、45、もしくは46サイクルを使用する。
【０１０１】
いくつかの態様において、第一のサイクリング段階中に用いられるより低いアニーリング／伸長温度は、第二のサイクリング段階中に用いられるアニーリング／伸長温度より約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、または約5℃低い。いくつかの好ましい態様において、第一の段階のアニーリング／伸長温度は、50℃〜60℃、52℃〜58℃、または54℃〜56℃、例えば53℃、54℃、55℃、もしくは55℃である。いくつかの好ましい態様において、第二の段階のアニーリング／伸長温度は、56℃〜66℃、58℃〜64℃、または60℃〜62℃、例えば58℃、60℃、62℃、もしくは64℃である。
【０１０２】
cast-PCRにおいて用いられるこの2段階PCRサイクリングプロトコールには、それを従来のAS-PCR法よりも良好にするいくつかの主要な長所が存在する。第一に、これは、マッチした標的または対立遺伝子に関するCt値を低下させることによって検出感度を改善する。次に、これはマッチ配列のCt値とミスマッチ配列のCt値との間の△Ct値を増加させることによって、cast-PCRの特異性を改善する。最後に、これは、様々なアッセイにわたってcast-PCRを同様に効率的にすることによってcast-PCRの均一性を改善することができる。
【０１０３】
いくつかの態様において、2段階サイクリングプロトコールは、cast-PCRの効率（例えば、特異性および感度）を改善する。いくつかの態様において、特異性は、2段階サイクリングプロトコールを用いることなく行ったcast-PCR反応の特異性より2〜8倍、3〜7倍、もしくは4〜6倍、またはその間の任意の倍率（例えば、3倍、4倍、5倍、6倍、または7倍）増加する。他の態様において、感度は、2段階サイクリングプロトコールを用いることなく行ったcast-PCR反応の感度より1〜3倍（例えば、1倍、2倍、または3倍）増加する。いくつかの態様において、2段階サイクリングプロトコールを用いることなく行ったcast-PCRアッセイ法と比較して、2段階サイクリングプロトコールによるcast-PCRを用いて行ったアッセイ法との間の△Ctの差は、△Ctが1、2、または3である。
【０１０４】
さらに別の局面において、本発明は、以下を含む反応混合物を提供する：（i）核酸分子：（ii）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第一の対立遺伝子変種に対して相補的である、該対立遺伝子特異的プライマー；（iii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域に対して相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；（iv）該標的配列の領域に対して相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、第一の対立遺伝子変種から3’側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマー；および（v）検出プローブ。
【０１０５】
ある態様において、本発明の方法は、所定のSNPまたは遺伝子に関する第二の対立遺伝子変種の1/10未満、1/100未満、1/1,000未満、1/10,000未満、1/100,000未満、1/1,000,000未満、1/10,000,000未満、1/100,000,000未満、または1/1,000,000,000未満、およびその間の任意の部分範囲の頻度で存在する第一の対立遺伝子変種を検出するために用いられる。他の態様において、方法は、試料または反応体積1、10、100、1,000マイクロリットルあたり2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750、1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、25,000、50,000、75,000、100,000、250,000、500,000、750,000、または1,000,000コピー未満、およびその間の任意の部分範囲で存在する第一の対立遺伝子変種を検出するために用いられる。
【０１０６】
いくつかの態様において、第一の対立遺伝子変種は変異体である。いくつかの態様において、第二の対立遺伝子変種は野生型である。いくつかの態様において、本発明の方法は、野生型分子約1000〜10,000個、約10,000〜100,000個、もしくは約100,000〜1,000,000個、またはその間の任意の部分範囲などの、野生型分子少なくとも1,000〜1,000,000個のバックグラウンドにおいて変異体分子1個を検出する段階を含みうる。いくつかの態様において、方法は、TaqMan（登録商標）に基づくアッセイ法と少なくとも同等である高い感度および効率を提供することができる。
【０１０７】
いくつかの態様において、開示される方法を含む第一のアンプリコンと第二のアンプリコンの比較は、約1000〜10,000倍、約10,000〜100,000倍、もしくは約100,000〜1,000,000倍の差、またはその間の任意の部分範囲などの、1,000倍の差から1,000,000倍の差まで特異性の改善を提供する。いくつかの態様において、アンプリコンのサイズは長さが約60〜120ヌクレオチドの範囲である。
【０１０８】
いくつかの態様において、方法は、下記でさらに詳細に記載する通り、cast-PCR反応のプレ増幅に用いられる追加の段階をさらに含みうる。
【０１０９】
別の局面において、本発明は、別の第二の対立遺伝子変種を含む試料において第一の対立遺伝子変種を定量するためのキットを提供し、該キットは、（a）第一の対立遺伝子特異的プライマー；（b）第二の対立遺伝子特異的プライマー；（c）第一の座特異的プライマー；（d）第二の座特異的プライマー；（e）第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；（f）第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；および（g）ポリメラーゼを含む。開示されるキットのいくつかの態様において、キットは、第一の座特異的検出プローブと第二の座特異的検出プローブとをさらに含む。
【０１１０】
別の局面において、本発明は、2つまたは以上の容器のうちの1つに独立して分配された以下の構成要素を含む該2つまたはそれ以上の容器を含む、キットを提供する：（i）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列の第一の対立遺伝子変種に対して相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマー；および（ii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域に対して相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ。
【０１１１】
いくつかの例示的な態様において、キットは、座特異的プライマーをさらに含むことができ、該座特異的プライマーは標的配列の領域に対して相補的であり、該領域は、第一の対立遺伝子変種から3’側であり、かつ反対鎖上に存在する。
【０１１２】
他の態様において、キットは、検出プローブをさらに含みうる。
【０１１３】
いくつかの態様において、方法は、下記でさらに詳細に記載する通り、プレ増幅に用いられる追加の構成要素をさらに含みうる。
【０１１４】
いくつかの態様において、組成物、方法、および／またはキットは、診断において循環性細胞を検出するために用いられうる。1つの態様において、組成物、方法、および／またはキットは、初期癌診断のために血液中の腫瘍細胞を検出するために用いられうる。いくつかの態様において、組成物、方法、および／またはキットは、癌または疾患関連遺伝子バリエーションまたは体細胞変異の検出および検証のために用いられうる。いくつかの態様において、組成物、方法、および／またはキットは、四対立遺伝子、三対立遺伝子、および二対立遺伝子のSNPを遺伝子型決定するために用いられうる。他の態様において、組成物、方法、および／またはキットは、一塩基または複数塩基の挿入または欠失の変異を同定するために用いられうる。いくつかの態様において、組成物、方法、および／またはキットは、QCおよびヒト同定アッセイ法のために混合DNA試料からのDNA型決定のために、細胞混入に関する細胞株QCのために、対立遺伝子遺伝子発現分析のために、ウイルス型決定／まれな病原体検出のために、プールされた試料からの変異検出のために、血液中の循環性腫瘍細胞の検出のために、および／または出生前診断のために用いられうる。
【０１１５】
いくつかの態様において、組成物、方法、および／またはキットは、例えばApplied Biosystems（Foster City, CA）のSDS機器などの様々な機器と適合性である。
【０１１６】
対立遺伝子特異的プライマー
低いTmを有する設計された対立遺伝子特異的プライマー（ASP）は、対立遺伝子変種の識別の増加を示した。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーは、ヌクレオチド約16〜28、約17〜26、約18〜24、もしくは約20〜22個、またはその間の任意の範囲などの約15〜30個の範囲の長さを有する短いオリゴマーである。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーのTmは、約52℃〜68℃、約54℃〜66℃、約56℃〜64℃、約58℃〜62℃、またはその間の任意の範囲（例えば53℃、54℃、55℃、56℃）などの約50℃〜70℃の範囲である。他の態様において、対立遺伝子特異的プライマーのTmは、増幅中に使用されるPCRサイクリング条件のアニーリング／伸長温度より約3℃〜6℃高い。
【０１１７】
低い対立遺伝子特異的プライマー濃度もまた、選択性を改善することができる。対立遺伝子特異的プライマーの濃度を900 nMより下に低減させると、マッチ配列とミスマッチ配列との間のデルタCtを増加させることができる。開示される組成物のいくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーの濃度は、約50 nM〜700 nM、約100 nM〜500 nM、約200 nM〜300 nM、約400 nM〜500 nM、またはその間の任意の範囲などの約20 nM〜900 nMの範囲である。いくつかの例示的な態様において、対立遺伝子特異的プライマーの濃度は約200 nM〜400 nMである。
【０１１８】
いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーは、関心対象の標的対立遺伝子に対して特異的な対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を含みうる。対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、遺伝子の1つの対立遺伝子に対して相補的であるが、遺伝子の別の対立遺伝子に対しては相補的でない。言い換えれば、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、遺伝子の異なる対立遺伝子変種に関して異なるヌクレオチドを含むことが知られているヌクレオチド位置である、遺伝子の1つまたは複数の可変ヌクレオチド位置に結合する。対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、長さが少なくとも1ヌクレオチドである。例示的な態様において、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、長さが1ヌクレオチドである。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、対立遺伝子特異的プライマーの3'末端に位置する。他の態様において、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分は、対立遺伝子特異的プライマーの最も3'の端部から約1〜2、3〜4、5〜 6、7〜8、9〜11、12〜15、または16〜20ヌクレオチドに位置する。
【０１１９】
識別塩基を標的とするように設計された対立遺伝子特異的プライマーもまた、対立遺伝子変種の識別を改善することができる。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分のヌクレオチドは、識別性の高い塩基（例えば、A/A、A/G、G/A、G/G、A/C、またはC/A対立遺伝子を検出するため）を標的とする。識別性の低い塩基は、例えばC/C、T/C、G/T、T/G、C/T対立遺伝子の検出を含む可能性がある。いくつかの態様において、例えば、検出される対立遺伝子がA/GまたはC/T SNPを含む場合、AもしくはGが対立遺伝子特異的プライマーの3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられても（例えば、AもしくはTが多数の対立遺伝子である場合）、またはCもしくはTが対立遺伝子特異的プライマーの3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分として用いられてもよい（例えば、CもしくはGが多数の対立遺伝子である場合）。他の態様において、A/T SNPを検出および／または定量する場合、対立遺伝子特異的プライマーの3'端において、Aをヌクレオチド特異的部分（例えば、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分）として用いてもよい。他の態様において、C/G SNPを検出および／または定量する場合、対立遺伝子特異的プライマーの3'端においてGをヌクレオチド特異的部分として用いてもよい。
【０１２０】
いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーは、関心対象のポリヌクレオチド配列（または座）に対して特異的な標的特異的部分を含みうる。いくつかの態様において、標的特異的部分は、関心対象の標的ポリヌクレオチド配列に対して約75〜85％、85〜95％、95〜99％、または100％相補的である。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分を含みうる。他の態様において、標的特異的部分は、対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分に対して5'に位置する。標的特異的部分は、長さが約4〜30、約5〜25、約6〜20、約7〜15、または約8〜10ヌクレオチドでありうる。いくつかの態様において、標的特異的部分のTmは、PCRサイクリングのために用いられるアニーリング／伸長温度より約5℃低い。いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分のTmは、約51℃〜60℃、約52℃〜59℃、約53℃〜58℃、約54℃〜57℃、約55℃〜56℃、または約50℃〜約60℃の範囲である。
【０１２１】
開示される方法およびキットのいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分および第二の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、同じ配列を含む。他の態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分および第二の対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分は、同じ配列である。
【０１２２】
いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーはテールを含む。テールを含む対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーの全長を縮小させることができ、それによってアッセイ法の感度に有意な影響を及ぼすことなくTmを低下させる。
【０１２３】
いくつかの例示的な態様において、テールは対立遺伝子特異的プライマーの5'末端にある。いくつかの態様において、テールは、対立遺伝子特異的プライマーの標的特異的部分および／または対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の5'に位置する。いくつかの態様において、テールは、関心対象の標的ポリヌクレオチド配列に対して約65〜75％、約75〜85％、約85〜95％、約95〜99％、または約100％非相補的である。いくつかの態様において、テールは長さが、約4〜30、約5〜25、約6〜20、約7〜15、または約8〜10ヌクレオチドなどの約2〜40ヌクレオチドでありうる。いくつかの態様において、テールはGCに富む。例えば、いくつかの態様において、テール配列は、約50〜100％、約60〜100％、約70〜100％、約80〜100％、約90〜100％、または約95〜100％のGおよび／またはCヌクレオチドを含む。
【０１２４】
対立遺伝子特異的プライマーのテールは、プライマー伸長産物における相補的配列（存在すれば）にハイブリダイズするためにプライマーの伸長後にテール領域が利用可能である立体配置を含むが、これらに限定されるわけではない、多数の異なる様式で構成されてもよい。このように、例えば、対立遺伝子特異的プライマーのテールは、座特異的プライマーの伸長に起因する伸長産物における相補的配列にハイブリダイズすることができる。
【０１２５】
開示される方法およびキットのいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーのテールおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーのテールは、同じ配列を含む。他の態様において、第一の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの5'テールは、同じ配列である。
【０１２６】
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
対立遺伝子特異的ブロッカープローブ（またはASB）（本明細書において時に「ブロッカープローブ」と呼ばれる）は、一本鎖であり、長さが100ヌクレオチドまたはそれ未満、より好ましくは50ヌクレオチドまたはそれ未満、さらにより好ましくは30ヌクレオチドまたはそれ未満、および最も好ましくは20ヌクレオチドまたはそれ未満であり、下限がおよそ5ヌクレオチドである短いオリゴマーとして設計されてもよい。
【０１２７】
いくつかの態様において、ブロッカープローブのTmは、58℃〜70℃、61℃〜69℃、62℃〜68℃、63℃〜67℃、64℃〜66℃、もしくは約60℃〜約63℃の範囲、またはその間の任意の範囲である。さらに他の態様において、対立遺伝子特異的ブロッカープローブのTmは、増幅中に使用されるPCRサイクリング条件においてアニーリング／伸長温度より約3℃〜6℃高い。
【０１２８】
いくつかの態様において、ブロッカープローブは、PCR増幅中に切断されない。いくつかの態様において、ブロッカープローブは、その3'端に伸長不可能なブロッカー部分を含む。いくつかの態様において、ブロッカープローブは、その3'端に、5'端に、および／またはその間の任意の内部位置に他の部分（追加の伸長不可能なブロッカー部分、クエンチャー部分、蛍光部分等を含むがこれらに限定されるわけではない）を含みうる。いくつかの態様において、対立遺伝子の位置は、その標的配列にハイブリダイズした場合に対立遺伝子特異的ブロッカープローブの伸長不可能なブロッカー部分から約5〜11、約6〜10、約7〜9、約7〜12などの約5〜15ヌクレオチド離れて、または約6、約7、約8、約9、約10、もしくは約11ヌクレオチドなどの約9〜11ヌクレオチド離れて位置する。いくつかの態様において、伸長不可能なブロッカー部分は、アミン（NH2）、ビオチン、PEG、DPI3、またはPO4でありうるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい態様において、ブロッカー部分は副溝バインダー（MGB）部分である。（本発明のオリゴヌクレオチド-MGBコンジュゲートは、以下、「MGBブロッカープローブ」または「MGBブロッカー」と呼ばれる場合もある）。
【０１２９】
本明細書において開示される通り、対立遺伝子特異的ブロッカープローブにおけるMGB部分の使用は、対立遺伝子特異的PCRの特異性を増加させることができる。この効果の1つの可能性は、一本鎖または二本鎖の核酸の相補的配列にハイブリダイズして強く結合するその強い親和性により、MGBが、連結したオリゴヌクレオチドのTmを低下させることができるという点である（例えば、Kutyavin, I., et al., Nucleic Acids Res., 2000, Vol. 28, No. 2: 655-661を参照されたい）。オリゴヌクレオチドとMGB部分との間のリンカーは、DNA二重鎖形成後に副溝にMGBを配置させるために十分に柔軟でなければならないことから、MGB部分を含むオリゴヌクレオチドは厳密な幾何学的必要条件を有する。このように、MGBブロッカープローブは、従来のDNAブロッカープローブと比較してマッチ対立遺伝子対ミスマッチ対立遺伝子の間でより大きいTmの差を提供することができる。
【０１３０】
一般的に、MGB部分は、二本鎖DNAの副溝内に結合する分子である。公知のMGB化合物は広く多様な化学構造を有することから、そのような化合物全てに関する一般的化学式を提供することはできないが、DNAの副溝において結合することができる化合物は一般的に言えば、半月形状の三次元構造を有する。ほとんどのMGB部分は、二本鎖DNAのB型のA-T（アデニンおよびチミン）に富む領域に対して強い選択性を有する。それにもかかわらず、C-G（シトシンおよびグアニン）に富む領域に対して選択性を示すMGB化合物も同様に、理論的に可能である。ゆえに、C-G領域に対して選択性を有する副溝バインダー分子に由来するラジカルまたは部分を含むオリゴヌクレオチドも同様に、本発明の範囲内である。
【０１３１】
いくつかのMGBは、103 M-1またはそれ以上の結合定数で二本鎖DNAの副溝内に結合することができる。このタイプの結合は、紫外線（UV）および核磁気共鳴（NMR）分光法などの十分に確立された分光光度法によって、かつゲル電気泳動によっても検出されうる。副溝バインダー分子の結合時のUVスペクトルのシフトおよび「核オーバーハウザー」（NOSEY）効果を利用するNMR分光法は、この目的のために特に周知で有用な技術である。ゲル電気泳動は、そのような結合によって二本鎖DNAの移動度が変化することから、二本鎖DNAまたはその断片に対するMGBの結合を検出する。
【０１３２】
適した多様な副溝バインダーが文献に記載されている。例えばKutyavin, et al. 米国特許第5,801,155号；Wemmer, D. E., and Dervan P. B., Current Opinion in Structural Biology, 7:355-361 (1997)；Walker, W. L., Kopka, J. L. and Goodsell, D. S., Biopolymers, 44:323-334 (1997)；Zimmer, C. and Wahnert, U. Prog. Biophys. Molec. Bio. 47:31-112 (1986)およびReddy, B. S. P., Dondhi, S. M., and Lown, J. W., Pharmacol. Therap., 84:1-111 (1999)を参照されたい。1つの群の態様において、MGBは、CC1065類似体、レキシトロプシン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール、およびピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピンからなる群より選択される。本開示よる好ましいMGBは、DPI3である（開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,727,356号を参照されたい）。
【０１３３】
リンカーを通してMGBをオリゴヌクレオチドまたはプローブに付着させるために適した方法は、例えば米国特許第5,512,677号；同第5,419,966号；同第5,696,251号；同第5,585,481号；同第5,942,610号；同第5,736,626号；同第5,801,155号；および同第6,727,356号において記載されている（それらの各々の開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、切断可能なリンカーを有する固相支持体から自動オリゴヌクレオチド合成法を用いて、MGB-オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成することができる。他の例において、MGBプローブを、実質的にLukhtanov et al. Bioconjugate Chern., 7: 564-567 (1996)（その開示の全内容も参照により本明細書に組み入れられる）の方法に従ってMGB修飾固相支持体から調製することができる。これらの方法に従って、1つまたは複数のMGB部分をオリゴヌクレオチドの5'端、3'端、および／または任意の内部部分に付着させることができる。
【０１３４】
MGB-オリゴヌクレオチドコンジュゲート内でのMGBの位置は、そのようなコンジュゲートの識別特性に影響を及ぼしうる。二重鎖内の非対形成領域によっておそらく、ミスマッチ塩基の近傍での副溝の形状の変化が起こると考えられる。MGBは完全にマッチしたDNA二重鎖の副溝内で最良に適合することから、副溝内での形状の変化が起こるミスマッチは、ミスマッチを含有する領域に対するMGBの結合強度を低減させると考えられる。よって、MGBがそのようなハイブリッドを安定化させる能力は低下し、それによって完全にマッチした二重鎖からミスマッチを識別するMGB-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの能力を増加させると考えられる。一方、ミスマッチがMGB-オリゴヌクレオチドコンジュゲートに対して相補的な領域外にある場合、等しい長さの非コンジュゲートおよびMGB-コンジュゲートオリゴヌクレオチドの識別能は、ほぼ同じであると予想される。1塩基対ミスマッチを識別するオリゴヌクレオチドプローブの能力はその長さに依存することから、より短いオリゴヌクレオチドはミスマッチの識別においてより効果的である。この状況においてMGB-オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いる第一の長所は、MGBコンジュゲーションの顕著な安定化効果により、当技術分野において用いられるオリゴヌクレオチド（すなわち、20量体またはそれより短い）と比較してかなり短い、より大きい識別力を有するオリゴヌクレオチドを用いることができるという事実にある。その結果、対立遺伝子特異的ブロッカープローブのより大きいデルタTmは、AS-PCRアッセイ法の特異性および選択性を改善することができる。
【０１３５】
5'末端にMGBを有するブロッカープローブは、3'末端のみにブロッカー部分（例えば、MGB、PO4、NH2、PEG、またはビオチン）を有する他のブロッカープローブに対して追加の長所を有する場合がある。これは、少なくとも、5'末端にMGBを有するブロッカープローブ（伸長を防止する3'端におけるブロッキング部分に加えて）が、PCR増幅中に切断されないためである。このように、プローブ濃度は、PCRを通して一定レベルで維持されうるが、これは非特異的プライミングを遮断する有効性を維持するために役立つことができ、それによって、cast-PCRアッセイ法の特異性および選択性を増加させる（図3）。
【０１３６】
図4Aにおいて図示される通り、いくつかの態様において、対立遺伝子特異的プライマーおよび／または対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、天然に存在する塩基（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシル）とは異なる1つまたは複数の修飾核酸塩基または修飾ヌクレオシド塩基を含みうる。いくつかの態様において、修飾塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミン部分を含有する核酸単位にさらに効果的にハイブリダイズすることができる。いくつかの態様において、修飾塩基はマッチ標的配列とミスマッチ標的配列との間のTmの差を増加させる、および／またはミスマッチプライミング効率を低下させる可能性があり、それによってアッセイ法の特異性のみならず、選択性も改善する。
【０１３７】
修飾塩基は、1つまたは複数の官能基の付加もしくは欠失、複素環構造における相違（すなわち、ヘテロ原子の代わりに炭素を用いる、またはその逆）、および／または1つまたは複数のリンカーアーム構造の塩基への付着によって天然に存在する塩基とは異なる塩基であると考えられる。いくつかの態様において、天然に存在する塩基の全ての互変異型、修飾塩基、および塩基類似体もまた、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブに含まれてもよい。
【０１３８】
修飾塩基のいくつかの例には、例えば、一般的なクラスの塩基類似体である7-デアザプリンおよびその誘導体、ならびにピラゾロピリミジンおよびその誘導体（PCT WO 90/14353；および米国特許出願第09/054,630号に記載され、それらの各々の開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）が含まれてもよい。このタイプの塩基類似体の例には、例えばグアニン類似体6-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オン（ppG）、アデニン類似体4-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン（ppA）、およびキサンチン類似体1H-ピラゾロ[4,4-d]ピリミジン-4(5H)-6(7H)-ジオン（ppX）が含まれる。これらの塩基類似体は、本発明のいくつかの態様のオリゴヌクレオチドに存在する場合、ハイブリダイゼーションを強化して、ミスマッチ識別を改善することができる。
【０１３９】
加えて、いくつかの態様において、修飾された糖または糖類似体は、本発明によるオリゴヌクレオチドコンジュゲートのヌクレオチドサブユニットの1つまたは複数に存在しうる。糖修飾には、糖の2'、3'、および／または4'炭素原子への置換基の付着、糖の異なるエピマー型、グリコシド結合のαまたはβ立体配置における相違、および他のアノマー変化が含まれるが、これらに限定されるわけではない。糖部分には、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、リボース、デオキシリボース、グルコース、アラビノース、ペントフラノース、キシロース、リキソース、およびシクロペンチルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４０】
ロックド核酸（LNA）型修飾は、例えば典型的にはA型DNAにおいて認められるN型コンフォメーションに糖を拘束するかまたは「ロックする」リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのペントース糖への変更を含む。いくつかの態様において、このロックは、1,2:5,6-ジ-O-イソプロピレン-α-D-アロフラノースにおける2'-O、4'-Cメチレン連結によって達成されうる。他の態様において、この変更は次に、ロックドヌクレオチドホスホラミダイトモノマーを合成するための基礎となる（例えば、各々の開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Wengel J., Acc. Chem. Res., 32:301-310 (1998)、米国特許第7,060,809号; Obika, et al, Tetrahedron Lett 39: 5401-5405 (1998); Singh, et al., Chem Commun 4:455-456 (1998); Koshkin, et al., Tetrahedron 54: 3607-3630 (1998)を参照されたい）。
【０１４１】
いくつかの好ましい態様において、修飾塩基には、8-アザ-7-デアザ-dA（ppA）、8-アザ-7-デアザ-dG（ppG）、2'-デオキシシュードシチジン（イソdC）、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（fdU）、ロックド核酸（LNA）、または2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸（ENA）塩基が含まれる。本発明において用いることができる修飾塩基の他の例は、図4Bに示され、米国特許第7,517,978号（その開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載される。
【０１４２】
例えばLNA、ppA、ppG、5-フルオロ-dU（fdU）が含まれる多くの修飾塩基が市販されており、当技術分野において周知のオリゴヌクレオチド合成法において用いることができる。いくつかの態様において、修飾プライマーおよび修飾プローブの合成は、当技術分野において周知である標準的な化学的手段を用いて行われうる。例えば、一定の態様において、修飾部分または修飾塩基を、（a）DNA合成支持体としての修飾ヌクレオシド、（b）ホスホラミダイトとしての修飾ヌクレオシド、（c）DNA合成時の試薬（例えば、DNA配列に組み入れられた場合に転換可能なアミダイトのベンジルアミン処理）、または（d）合成後修飾を用いることによって導入することができる。
【０１４３】
いくつかの態様において、プライマーまたはプローブは、修飾塩基が3'端に位置するように合成される。いくつかの態様において、修飾塩基は、対立遺伝子特異的なプライマーまたはブロッカープローブの3'端から1〜6ヌクレオチド離れて、例えば2、3、4、5ヌクレオチド離れて位置する。いくつかの好ましい態様において、プライマーまたはプローブは、修飾塩基が、対立遺伝子特異的なプライマーまたはブロッカープローブの最も3'端に位置するように合成される。
【０１４４】
改変ヌクレオチド間連結もまた、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートに存在しうる。そのような改変された連結は、ペプチド、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、アルキルホスフェート、アルカンホスホネート、チオホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、置換ホスホラミデート等を含むがこれらに限定されるわけではない。プローブおよび／またはプライマーとして役立つオリゴヌクレオチドにおけるその使用と適合性である塩基、糖、および／またはヌクレオチド連結のいくつかのさらなる改変は、当業者に明らかであると考えられる。
【０１４５】
加えて、いくつかの態様において、本発明の対立遺伝子特異的なプライマーおよび／またはブロッカープローブのオリゴヌクレオチドに組み入れられるヌクレオチド単位は、連結アームを通して塩基の1つまたは複数に共有結合するクロスリンク機能（アルキル化剤）を有してもよい。
【０１４６】
方法およびキットのいくつかの態様において、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、第一の対立遺伝子特異的プライマーと同じ鎖または配列に結合するが、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブは、第一の対立遺伝子特異的プライマーと反対の鎖および／または相補的配列に結合する。
【０１４７】
検出プローブ
いくつかの態様において、検出プローブは、約16、約18、約22、約24、約30、またはその間の任意の数などの約15〜30ヌクレオチドの範囲の短いオリゴマーとして設計される。いくつかの態様において、検出プローブのTmは、約60℃〜70℃、約61℃〜69℃、約62℃〜68℃、約63℃〜67℃、もしくは約64℃〜66℃、またはその間の任意の温度である。
【０１４８】
いくつかの態様において、検出プローブは、座特異的検出プローブ（LST）である。他の態様において、検出プローブは5'ヌクレアーゼプローブである。いくつかの例示的な態様において、検出プローブはMGB部分、レポーター部分（例えば、FAM（商標）、TET（商標）、JOE（商標）、VIC（商標）、またはSYBR（登録商標）Green）、クエンチャー部分（例えば、Black Hole Quencher（商標）またはTAMRA（商標））、および／またはパッシブリファレンス（例えば、ROX（商標））を含みうる。いくつかの例示的な態様において、検出プローブは、米国特許第6,727,356号（その開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載される方法および原理に従って設計される。いくつかの例示的な態様において、検出プローブは、TaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems, Foster City）である。例示的な態様において、座特異的検出プローブは米国特許第6,727,356号（その開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載される原理および方法に従って設計されうる。例えば、1つのDNA鎖の3'末端にクエンチャーを有し、かつ5'末端に蛍光体を有する、蛍光発生プローブを調製することができる。そのような例において、Taq DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性はDNA鎖を切断して、それによってクエンチャーから蛍光体を分離して蛍光シグナルを放出することができる。いくつかの態様において、検出プローブは、PCR増幅のプライマー伸長段階（例えば、60〜65℃）中に鋳型鎖にハイブリダイズする。さらに他の態様において、MGBは座特異的検出プローブのクエンチャー部分に共有的に付着される（例えば、リンカーを通して）。
【０１４９】
開示される方法およびキットのいくつかの態様において、第一および第二の検出プローブは同じであり、かつ／または同じ配列を含むかまたは同じ配列である。
【０１５０】
座特異的プライマー
いくつかの態様において、座特異的プライマー（LSP）は、約16、約18、約22、約24、約30個、またはその間の任意の数などの約15〜30ヌクレオチドの範囲の短いオリゴマーとして設計される。いくつかの態様において、座特異的プライマーのTmは、約60℃〜70℃、約61℃〜69℃、約62℃〜68℃、約63℃〜67℃、もしくは約64℃〜66℃、またはその間の任意の範囲である。
【０１５１】
開示される方法およびキットのいくつかの他の態様において、第一の座特異的検出プローブおよび／または第二の座特異的検出プローブは、同じ配列を含むか、または同じ配列である。
【０１５２】
追加の構成要素
本発明の実践に適したポリメラーゼ酵素は、当技術分野において周知であり、多数の供給源に由来しうる。例えば市販されている多様な好熱性細菌（例えば、American Type Culture Collection, Rockville, Md.から）から、当業者に周知である方法を用いて熱安定性ポリメラーゼを得てもよい（例えば、米国特許第6,245,533号を参照されたい）。細菌細胞を、当業者に周知である特定の種の活性な培養物を生育させるために適した培養培地およびインキュベーション条件を用いて、標準的な微生物学技術に従って生育させてもよい（例えば、Brock, T. D., and Freeze, H., J. Bacteriol. 98(l):289-297 (1969)；Oshima, T., and Imahori, K, Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1): 102-112 (1974)を参照されたい）。熱安定性ポリメラーゼ供給源として用いるために適しているのは、好熱性細菌サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、パイロコッカス・ウーシイ（Pyrococcus woosii）およびパイロコッカス属の他の種、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、スルホロブス・アシドカウダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）、サーマス・フラブス（Thermus flavus）、サーマス・ルベル（Thermus ruber）、サーマス・ブロキアヌス（Thermus brockianus）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）およびサーモトガ属の他の種、ならびにメタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム（Methanobacterium thermoautotrophicum）、ならびにこれらの種の各々の変異体である。好ましい熱安定ポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼ、Tne DMAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、またはその変異体、誘導体、もしくは断片を含みうるが、これらに限定されるわけではない。
【０１５３】
核酸の様々な供給源および／または調製法
開示される組成物、方法、および／またはキットにおける核酸試料の供給源は、循環血液、口腔内上皮細胞、培養細胞および腫瘍細胞などのヒト細胞を含むがこれらに限定されるわけではない。同様に他の哺乳動物組織、血液、および培養細胞も、適した鋳型核酸供給源である。加えて、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、真菌、および他の微生物は、分析のための核酸源でありうる。DNAはゲノムDNAであっても、またはプラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）もしくは他のベクターにおいてクローニングされてもよい。RNAは、関連する細胞から直接単離されても、または適したRNAプロモーターからのインビトロプライミングによって、もしくはインビトロ転写によって産生されてもよい。本発明はまた、ヒト、動物、またはその他であるか否かによらず、ゲノムDNAにおけるバリエーションを検出するために用いられてもよい。本発明は、遺伝性または後天性の疾患または障害の分析において特に用途を見いだす。特定の用途は遺伝子疾患の検出である。
【０１５４】
いくつかの態様において、鋳型配列または核酸試料は、gDNAでありうる。他の態様において、鋳型配列または核酸試料はcDNAでありうる。さらに他の態様において、RT-PCRによる遺伝子発現の同時分析の場合と同様に、鋳型配列または核酸試料はRNAでありうる。DNAまたはRNA鋳型配列または核酸試料は、例えばホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍標本を含む任意のタイプの組織から抽出されうる。
【０１５５】
プレ増幅
別の局面において、cast-PCR増幅反応を「強化する」またはプレ増幅するための追加の組成物、方法およびキットが提供される。いくつかの態様において、cast-PCR反応のプレ増幅は、核酸コピー数が非常に低い限られた量の標本のために使用される。
【０１５６】
いくつかの態様において、「強化する」組成物、方法、およびキットは、第一のプレ増幅反応（例えば、開示の全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,605,451号および同第7,087,414号、ならびに米国特許出願公開第2004/0175733号を参照されたい）の後に第二の増幅（すなわちcast-PCR）反応を含む2段階増幅プロセスを含む。
【０１５７】
いくつかの態様において、cast-PCRプレ増幅反応において用いられるプレ増幅組成物は、
（i）核酸試料、および
（ii）（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列内の所定のSNPの第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子にそれぞれ相補的である、該第一および該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（b）該標的配列の領域に対して相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一および該第二の対立遺伝子から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと
を各セットが含む、少なくとも2つのプライマーセット
を含み、該少なくとも2つのプライマーセットが各々、異なる標的配列に対して特異的である。
【０１５８】
いくつかの態様において、cast-PCRプレ増幅法は、以下の段階を含む：
a）（i）核酸試料、および
（ii）（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列内の所定のSNPの第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子にそれぞれ相補的である、該第一および該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（b）該標的配列の領域に対して相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一および該第二の対立遺伝子から3'側にあり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと
を各セットが含み、異なる標的配列に対して各々が特異的である、少なくとも2つのプライマーセット
を含む第一の反応混合物を、単一の容器において形成する段階；
b）線形期内に反応を保つのに適したサイクル数を用いて該異なる標的配列を増幅する段階；
c）段階b）の増幅産物を少なくとも2つの別個の容器に分割する段階；
d）段階c）の分割した産物の各々に、
（i）段階a）で用いられる少なくとも1つのプライマーセットと、
（ii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）検出プローブと
を添加して、該少なくとも2つの別個の容器において第二および第三の反応混合物を形成する段階；
e）該第二および第三の反応混合物において該標的配列を増幅する段階；ならびに
f）段階e）によって産生された該標的配列の増幅産物の各々において該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の対立遺伝子変種を検出する段階。
【０１５９】
いくつかの態様において、第一の反応はマルチプレックス反応であり、かつ第二の反応はシングルプレックス反応である。いくつかの好ましい態様において、マルチプレックス反応は、各々のセットが関心対象の特異的ポリヌクレオチドを増幅するのに適しているかまたは有効である、少なくとも2つの完全なプライマーセット（例えば、1セットは1つのフォワード対立遺伝子-1特異的プライマー、1つのフォワード対立遺伝子-2特異的プライマー、および1つのリバース座特異的プライマーを含む）を用いることを必要とする。他の態様において、第一の段階で獲得された得られたマルチプレックス産物を、各々が第一のマルチプレックス段階で既に用いられた少なくとも1つのプライマーセットを含有する最適な二次的シングルプレックスcast-PCR増幅反応に分割し、次に本明細書において記載されるcast-PCR法を用いてPCR増幅する。
【０１６０】
他の好ましい態様において、第一のマルチプレックス反応は、cast-PCR増幅反応である（PCR、RT-PCR、NASBA、SDA、TMA、CRCA、リガーゼ連鎖反応等などの、しかしこれらに限定されない他の周知の増幅方法を用いることができる）。一定の態様において、第一のマルチプレックス反応は、複数の対立遺伝子特異的プライマーおよび座特異的プライマーを含み、その各群は、特定の関心対象対立遺伝子に対して特異的であり、本明細書において記載されるcast-PCR法に従って設計される。単一の増幅された配列を生成するシングルプレックスcast-PCR反応とは異なり、マルチプレックスcast-PCR増幅反応は、複数の異なるプライマーセットを用いることによって、複数の異なる関心対象配列を単一の反応で同時に増幅することができる。複数の異なる配列が単一の反応で同時に増幅されることから、マルチプレックス増幅は、下流のcast-PCRアッセイ法のために使用可能な試料の濃度または量を効果的に増加させることができる。このように、いくつかの好ましい態様において、プレ増幅cast-PCR試料によって、当初の試料によって行うことができた場合よりも有意に多くの分析またはアッセイ法を行うことができる。
【０１６１】
マルチプレックス増幅において用いられる異なる増幅プライマー対の数は重要ではなく、わずか2個から数十個、数百個、数千個、またはさらにそれ以上もの数までの範囲でありうる。このように、特定の条件に応じて、マルチプレックス増幅は、2個もの少ない数から数十個、数百個、数千個、またはさらにそれ以上の関心対象ポリヌクレオチド配列を同時に増幅することができる。
【０１６２】
マルチプレックス増幅によって行われる増幅サイクル数は、他の要因の中でも望ましい増幅の程度に依存しうる。次に、望ましい増幅の程度は、その後のcast-PCRアッセイ法を用いて増幅されるポリヌクレオチド試料または検出される対立遺伝子もしくは変異の数などの要因に依存しうる。
【０１６３】
好ましい態様において、マルチプレックス増幅が指数関数期または線形期を超えて進行しないようにすることが望ましい場合がある。実際に、いくつかの態様において、指数関数期内または線形期内に反応を保つのに適したサイクル数でマルチプレックス反応を行うことが望ましい場合がある。短縮した（truncated）マルチプレックス増幅ラウンドを用いることによって、約100〜1000倍増加した強化された産物コピー数を有する試料を得ることができる。
【０１６４】
多くの態様において、プレ増幅によって、当初使用可能であったより多くの試料またはより高い試料濃度を必要とするcast-PCRアッセイ法または分析を行うことができる。例えば、10倍、100倍、1000倍、10,000倍等のマルチプレックス増幅後では、その後のcast-PCRシングルプレックスアッセイ法をそれぞれ10倍、100倍、1000倍、10,000倍等少ない試料容積を用いて行うことができる。いくつかの態様において、これによって、各シングルプレックスcast-PCR反応を最大の感度が得られるように最適化することができ、かつ分析される各対立遺伝子を検出する1つの方法のみ必要とする。このことは、いくつかの態様において、これによって、任意の所定の標的配列に関するcast-PCRアッセイ法を再設計するおよび／または再度最適化することに対して多大な努力を行うことなく、またはそれに対する制約なく、共にプールされてマルチプレックス増幅反応において用いられる既成の市販のcast-PCR試薬およびキットを用いることができることから、cast-PCR分析にとって有意な恩典でありうる。その上、いくつかの態様において、cast-PCR分析のために既に最適化された試薬およびキットによってマルチプレックス増幅を行うことができることにより、その後のシングルプレックスcast-PCRアッセイ法と理想的に相関またはマッチするマルチプレックス増幅反応を作製することができる。
【０１６５】
1つの局面において、少なくとも1つの別個の容器に独立して分配された以下の構成要素を含む少なくとも1つの該別個の容器を含む、キットが提供される：（i）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマー；（ii）第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第二の対立遺伝子変種と相補的である、該第二の対立遺伝子特異的プライマー；および（iii）共通の座特異的プライマー。
【０１６６】
以下の実施例は、本発明を説明するものであるが制限するものではないことを意図される。
【実施例】
【０１６７】
I．一般的なcast-PCRアッセイ法の設計：
以下の実施例において用いられるcast-PCRアッセイ法の一般的な概略を図1に明示する。分析された各SNPに関して、対立遺伝子特異的プライマー（ASP）を、第一の対立遺伝子（すなわち、対立遺伝子-1）および第二の対立遺伝子（すなわち、対立遺伝子-2）を標的とするように設計した。対立遺伝子-1分析のためのcast-PCRアッセイ反応混合物には、5'テールを有する対立遺伝子-1特異的プライマー（ASP1）、1つのMGB対立遺伝子-2ブロッカープローブ（MGB2）、1つの共通の座特異的TaqManプローブ（LST）、および1つの共通の座特異的プライマー（LSP）が含まれた。対立遺伝子-2分析のためのcast-PCRアッセイ反応混合物には、5'テールを有する対立遺伝子-2特異的プライマー（ASP2）、1つのMGB対立遺伝子-1ブロッカープローブ（MGB1）、1つの共通の座特異的TaqManプローブ（LST）、および1つの共通の座特異的プライマー（LSP）が含まれた。
【０１６８】
II．反応条件：
各アッセイ反応混合物（全体で10μl）は、1×TaqMan Genotyping Master Mixture（Applied Biosystems, Foster City, CA; P/N 437135）、0.5ng/μL ゲノムDNAまたはプラスミドDNA 100万コピー（または別に示されている通り）、300 nM（特に明記していなければ）のテールを有するまたはいくつかの場合においてテールを有しない対立遺伝子特異的プライマー（対立遺伝子-1を検出するためのASP1、または対立遺伝子-2を検出するためのASP2）、200 nM TaqManプローブ（LST）、900 nM座特異的プライマー（LSP）、150 nM対立遺伝子特異的MGBブロッカープローブ（対立遺伝子2を検出するためのMGB1または対立遺伝子-1を検出するためのMGB2）を含有した。反応物を384ウェルプレートにおいて95℃で10分間インキュベートした後、95℃で15秒間および58℃で1分間を5サイクル、次に95℃で15秒間および60℃で1分間を45サイクル行った。反応は全て、ABI PRISM 7900HT（登録商標）Sequence Detection Systemにおいて、製造元の説明書に従って、2通りまたはそれより多く行われた。
【０１６９】
cast-PCR増幅反応に関して以下の実施例において用いられる2段階サイクリングプロトコールは、従来の対立遺伝子特異的PCR（AS-PCR）とは異なる。2段階サイクリングプロトコールは、より低いアニーリング／伸長温度（例えば、58℃）における最初の5サイクルの後に、より高いアニーリング／伸長温度（例えば、60℃）における標準的な45サイクルを含む。cast-PCR対立遺伝子特異的プライマーのより低いTm（例えば、53〜56℃）により、PCRは、標準的なアニーリング／伸長条件（例えば、60℃）では最適ではない。その結果、最初の5サイクルの間に用いられるより低いアニーリング／伸長温度は、全体的なcast-PCR効率を増加させる。
【０１７０】
III．核酸試料：
特異的SNP配列を含有するプラスミドを設計しBlueHeron（Bothell, WA）に注文した（以下の実施例のうちのいくつかにおいて用いられるSNPを含むプラスミドの一覧に関しては表1を参照されたい）。プラスミドを、TaqMan RNase P Assay（Applied Biosystems, Foster City, CA; P/N 4316838）を用いて製造元の説明書に従って定量して、所定のアッセイ法の感度、直線性のダイナミックレンジ、特異性、および選択性を検証するために鋳型として用いた（表1、RNアーゼP対照を参照されたい）。
【０１７１】
ゲノムDNAをCoriell Institute for Medical Research（Camden, NJ; NA17203, NA17129, NA17201）から購入した。標的SNPの遺伝子型を、TaqMan SNP Genotyping Assay（Applied Biosystems, Foster City, CA; P/N 4332856）によって製造元の説明書に従って検証した。
【０１７２】
IV．修飾オリゴヌクレオチド：
修飾塩基を、Berry and Associates（ppA：P/N BA 0239；ppG：P/N BA 0242；fdU：P/N BA 0246；およびイソdC：P/N BA 0236）、またはExicon（LNA-T Amidile：P/N EQ-0064；LNA-mC Amidite：P/N EQ-0066；LNA-G Amidite：P/N EQ-0082；およびLNA-A Amaidite：P/N EQ-0063）から購入した。3'端において修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを、製造元の説明書に従って合成した。
【０１７３】
（表１）プラスミドSNP配列（標的対立遺伝子を括弧内に示す）
0005805064.tif 000002
0005805064.tif 000003
【０１７４】
データ分析：
自動のベースラインおよびマニュアル閾値0.2を用いて、蛍光が固定閾値を通過するフラクショナルサイクル数（fractional cycle number）として定義される閾値サイクル（Ct）を計算した。PCR反応を全体で50サイクル行った。cast-PCR反応については、より低いアニーリング／伸長温度での5サイクルのプレ反応を行った後に、より高いアニーリング／伸長温度でさらに45サイクルを行った。マッチ配列対ミスマッチ配列についての増幅反応間の△Ctを、cast-PCRの特異性として定義する（△Ct＝Ctミスマッチ−Ctマッチ）。ミスマッチ標的とマッチ標的との間の△Ctが大きくなればなる程、アッセイ法の特異性はより良好となる。1/2△Ctに等しい、またはいくつかの場合では％（1/2△Ct×100）として計算される識別力（または選択性）を、2△Ct値を用いて推定した。
【０１７５】
実施例1
テールを有するプライマーは対立遺伝子変種の識別を改善する
以下の実施例は、テールを含む対立遺伝子特異的プライマーを適用することにより、対立遺伝子変種の識別が有意に改善されることを明示する。
【０１７６】
従来のAS-PCRにおいて、3'ヌクレオチドミスマッチの識別は、SNP周囲の配列および対立遺伝子の性質に大きく依存する。マッチプライマーとミスマッチプライマーとの増幅反応間の△Ctは多様である。マッチ配列とミスマッチ配列の増幅の識別を改善するために、その5'末端にテールを含むように対立遺伝子特異的プライマーを設計して、AS-PCRアッセイ法におけるその適切性に関して試験した。
【０１７７】
先に示した（ブロッカープローブを含まなかったことおよびテールを有するアリル特異的プライマーまたはテールを有しないアリル特異的プライマーのいずれかを添加したことを除いて）一般的な実験設計および反応条件を用いて、核酸鋳型として3つの対立遺伝子（A、C、またはT）の1つを含むhsv11711720 SNP（表2Aを参照されたい）を含有する0.5ng/μL ゲノムDNAを用いてアッセイ法を行った。表2Bに3つの遺伝子型を示す。プライマーおよびプローブを表3に示される配列に従って設計した。
【０１７８】
（表２Ａ）hsv11711720 SNPについてのゲノムDNA配列（標的対立遺伝子を括弧内に示す）
0005805064.tif 000004
【０１７９】
（表２Ｂ）hsv11711720 SNPについてのゲノムDNA配列の遺伝子型
0005805064.tif 000005
【０１８０】
（表３）ゲノムDNAのためのプライマーおよびプローブの一覧および配列
0005805064.tif 000006
従来の対立遺伝子特異的プライマー（「ASP」）；テールを有する対立遺伝子特異的プライマー（「テールASP」）；座特異的TaqManプローブ（LST）；座特異的プライマー（LSP）。小文字で示されるヌクレオチドはプライマーのテールを有する部分である。各対立遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド特異的部分は、各プライマーの最も3'側の末端である（太字で示される）。
【０１８１】
表4に示される通り、テールを有しないASP（「ASP-テール」）を用いる場合、3'ヌクレオチドミスマッチの識別は、△Ct値のかなりの範囲が3'末端塩基の同一性に応じて観察されることから、対立遺伝子の性質に大きく依存する。マッチヌクレオチド（「NT」）とミスマッチヌクレオチドとの間の△Ct値の範囲は、-0.1〜10であった。しかし、テールを有するASP（ASP+テール）では、3'ヌクレオチドミスマッチの識別は有意に改善された。実際に、表4に示される通り、マッチヌクレオチドとミスマッチヌクレオチドとの間の△Ct値は、テールを有するASPを用いた場合には、一貫して10に等しいかまたはそれ以上であった。テールを有するASPを用いた場合のマッチ配列の増幅に関するCt値は、従来のASPまたはテールを有しないASPを用いた場合のCt値と同等であった。これらの結果は、テールを有するASPがAS-PCRの特異性を改善することができるが、検出感度を改善しない可能性があることを示している。
【０１８２】
（表４）テールを有する対立遺伝子特異的プライマー（「ASP」）は、対立遺伝子変種の識別を有意に改善する
0005805064.tif 000007
テールを有するプライマー対テールを有しないプライマーを用いたCt値の差に基づいて特異性（「倍率差」）を計算した（2(△Ct(ASP+テール)−(△Ct(ASP-テール)）。ASP（+/-テール）と標的対立遺伝子の3'対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分のミスマッチヌクレオチドも同様に示す（「NTミスマッチ」）。
【０１８３】
実施例2
低いプライマー濃度は対立遺伝子変種の識別を改善する
先に示した一般的な実験設計および反応条件を用いて、様々なSNP標的配列を含有するプラスミドDNA（表1を参照されたい）100万コピー、および200 nMまたは800 nMテールを有するASP（表記の通り）の存在下でアッセイ法を行った。アッセイ法のプライマーおよびプローブを、図11Aに示される配列に従って設計した。
【０１８４】
対立遺伝子変種の識別に対するテールを有するASP濃度の効果を表5に要約する。マッチプライマーとミスマッチプライマーとの増幅反応間の△Ctは、より低いテールを有するASP濃度が対立遺伝子変種の識別を改善することを明示している。
【０１８５】
（表５）テールを有する対立遺伝子特異的プライマーの異なる濃度を用いるアッセイ法結果
0005805064.tif 000008
【０１８６】
実施例3
低減されたTmを有する設計されたプライマーは、対立遺伝子変種の識別を改善する
先に示した一般的な実験設計および反応条件を用いて、様々なSNP標的配列を含有するプラスミドDNA（表1を参照されたい）100万コピーの存在下で、Tmがより高い（約57℃）テールを有するASPまたはTmがより低い（約53℃）テールを有するASPを用いて、アッセイ法を行った。アッセイ法のプライマーおよびプローブを、図11B〜Eに示される配列に従って設計した（より高いTm ASPについては図11Bおよびより低いTM ASPについては図11Cを参照されたい）。
【０１８７】
対立遺伝子変種の識別に対する対立遺伝子特異的プライマーTmの効果を表6に要約する。Tmがより低い対立遺伝子特異的プライマーの△Ctは、Tmがより高い対立遺伝子特異的プライマーの△Ctより有意に高い。Tmを低減するように設計された対立遺伝子特異的プライマーは、いくつかの場合では118倍の差ほどで、または平均約13倍の差で、対立遺伝子変種の識別を改善した。
【０１８８】
（表６）Tmがより低い（約53℃）またはTmがより高い（約57℃）テールを有するASPを用いた△Ct値
0005805064.tif 000009
【０１８９】
実施例4
ブロッカープローブの使用は対立遺伝子変種の識別を改善する
以下の実施例は、MGBブロッカープローブを用いることがAS-PCR反応において標的配列に対する3'ヌクレオチドのミスマッチプライマーおよびマッチプライマー間の識別を改善することを例証している。
【０１９０】
先に示した一般的なcast-PCR概略および反応条件を用いて、様々なSNP標的配列を含有するプラスミドDNA（表1を参照されたい）100万コピーを用いて、MGBブロッカープローブの存在下またはMGBブロッカープローブの非存在下でアッセイ法を行った。アッセイ法のプライマーおよびプローブを図11C〜Eに示される配列に従って設計した。
【０１９１】
AS-PCRの選択性を改善するために、その3'末端にMGB基を含むブロッカープローブを合成した（例えば、Kutyavin, I. V., et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 2: 655-661、米国特許第5,512,677号；同第5,419,966号；同第5,696,251号；同第5,585,481号；同第5,942,610号、および同第5,736,626号を参照されたい）。
【０１９２】
MGBブロッカープローブを用いたcast-PCRの結果を表7に要約する。MGBブロッカープローブ有りのcast-PCRの△Ctは、MGBブロッカープローブ無しのcast-PCRの△Ctより大きい。示される通り、MGBブロッカープローブは、対立遺伝子変種の識別を改善する。
【０１９３】
（表７）MGBブロッカープローブは対立遺伝子変種の識別を改善する
0005805064.tif 000010
【０１９４】
実施例5
識別塩基を標的とするように設計されたプライマーは、対立遺伝子変種の識別を改善する
先に示した一般的なcast-PCR概略および反応条件を用いて、SNP標的配列を含有するプラスミドDNA（表1を参照されたい）100万コピーの存在下で、アッセイ法を行った。図11C〜Eに示される配列に従ってアッセイ法のプライマーおよびプローブを設計した。
【０１９５】
表8に要約されるデータに従って、cast-PCRの識別は、分析される対立遺伝子の性質に依存した。表8に示される通り、対立遺伝子-1についてのミスマッチ配列とマッチ配列との間の△Ctは、対立遺伝子-2についてのミスマッチ配列とマッチ配列との間の△Ctとは異なった。しかし、T塩基と比較した場合にA塩基およびG塩基はいずれも、調べた4つ全てのSNPにおいて対立遺伝子-1と対立遺伝子2とを高度に識別した。
【０１９６】
（表８）識別塩基を標的とするように設計されたプライマーは、対立遺伝子変種の識別を改善する
0005805064.tif 000011
【０１９７】
実施例6
cast-PCRのための感度およびダイナミックレンジの決定
本実施例において、cast-PCRの感度およびダイナミックレンジを、様々なコピー数の標的プラスミドを用いてcast-PCRを行うことによって決定した。
【０１９８】
先に示した一般的なcast-PCR概略および反応条件を用いて、NRAS-181CA SNP標的配列を含有するプラスミドDNA（表1を参照されたい）1×100（1コピー）〜1×107コピーを用いてアッセイ法を行った。アッセイ法のプライマーおよびプローブを図11C〜Eに示される配列に従って設計した。
【０１９９】
表5に示される通り、テールを有するプライマーおよびMGBブロッカープローブの使用は、cast-PCRの感度がテールを有するプライマーまたはブロッカープローブを用いないTaqManアッセイ法と同等であることから、cast-PCRの感度に有害な影響を及ぼさない。さらに、図5は、cast-PCRアッセイ法が少なくとも7つの対数にわたって直線性のダイナミックレンジを示すことを示している。
【０２００】
実施例7
cast-PCRの特異性の判定
本実施例において、対応するブロッカープローブの存在下での、マッチASPまたはミスマッチASPのいずれかを用いたKRASの特定の対立遺伝子の増幅を、所定の対立遺伝子と比較することによって、cast-PCRの特異性を判定した。
【０２０１】
先に示した一般的なcast-PCR概略および反応条件を用いて、KRAS-183AC SNP標的配列の2つの対立遺伝子のいずれか1つを含有するプラスミドDNA（表1を参照されたい）1×106コピーを用いたアッセイ法を行った。アッセイ法のプライマーおよびプローブを図11C〜Eに示される配列に従って設計した。
【０２０２】
図7の左側のパネルは、A2ブロッカープローブの存在下でマッチ（A1）プライマーまたはA1ブロッカープローブの存在下でミスマッチ（A2）プライマーを用いた、対立遺伝子-1 DNAに関するcast-PCRの増幅プロットを示す。右側のパネルは、cast-PCRを対立遺伝子-2 DNAに関して行った同様の実験を示す。図7のデータ要約に示される通り、20を超える強い△Ct値が、調べたKRAS-183ACの双方の対立遺伝子上でのcast-PCRに関して観察された。これは、対立遺伝子-1および対立遺伝子-2に関してそれぞれ9×106および2×106の2△Ctの計算によって決定される場合の特異性に対応する。さらに、選択性の計算（1/2△Ct）は、対立遺伝子-1および対立遺伝子-2に関してそれぞれ1/1.1×107および1/5.0×107の値が観察されることを示している。
【０２０３】
実施例8
cast-PCRは野生型DNA 100万コピー中1コピーの変異体DNAを検出することができる。
本実施例において、cast-PCRの選択性を、すなわち、cast-PCRが過剰な野生型DNA中のまれな変異体DNAを検出できるか否かを判定した。
【０２０４】
先に示した一般的なcast-PCR概略および反応条件を用いて、野生型KRAS-183ACプラスミドDNA（表1を参照されたい）1×106コピーと混合した様々なコピー数の変異体KRAS-183ACプラスミドDNA（1コピー〜1×106コピー）を用いて、アッセイ法を行った。アッセイ法のプライマーおよびプローブを図11C〜Eに示される配列に従って設計して、野生型または変異体の対立遺伝子特異的プライマーおよび対応するMGBブロッカープローブを用いてcast-PCR反応を行った。
【０２０５】
図8は、cast-PCRが、100万倍過剰量の野生型配列に取り囲まれた場合であっても、1コピーという少ない変異体DNA配列を検出できることを示している。
【０２０６】
実施例9
腫瘍細胞DNAと正常細胞DNAとの識別におけるcast-PCRの選択性
本実施例において、様々な量の腫瘍細胞ゲノムDNAを、正常細胞からのゲノムDNAに混合または「スパイク」した試料についてアッセイ法を行うことによって、cast-PCRの選択性を判定した。DNA試料をQIAmp DNA Mini Prep Kits（Qiagen）を用いて抽出した。野生型DNAをSW48細胞株から抽出して、変異体DNAをH1573細胞株から抽出した。
【０２０７】
変異体DNAはKRAS-G12A変異を含有した（図6を参照されたい）。スパイクした試料中の腫瘍細胞DNAの百分率は、0.5〜100％まで多様であった。cast-PCRを用いて、これらの百分率で存在する腫瘍細胞DNAの存在を検出した。
【０２０８】
先に示した一般的なcast-PCR概略および反応条件を用いて、1反応あたりgDNA 30 ngを用いてアッセイ法を行った。アッセイ法のプライマーおよびプローブを、図18A〜Bに示される通りKRAS-G12A SNP IDに対応する配列に従って設計した。
【０２０９】
図9に示される通り、腫瘍細胞DNAは、正常細胞DNAと比較してわずか0.5％のレベルで存在する場合であっても、cast-PCRを用いて容易に検出される。
【０２１０】
実施例10
腫瘍試料中の腫瘍細胞を検出するためのcast-PCRの使用
本実施例において、cast-PCRを用いて、腫瘍試料中の腫瘍細胞を検出してその百分率を決定した。様々な正常および腫瘍試料を得て、図10に示される通り、癌に関連する多数のSNPの存在に関してcast-PCRによってアッセイした。
【０２１１】
先に示した一般的なcast-PCR概略および反応条件を用いて、正常試料または腫瘍試料のいずれかから得られたgDNA 5 ngまたはcDNA 1.5 ngを用いてアッセイ法を行った。図10に示されるSNPに対応するアッセイ法のプライマーおよびプローブを図11C〜Eに示される配列に従って設計した。
【０２１２】
図10に示される結果は、cast-PCRが正常試料中の変異体細胞の存在を検出できなかったことにより示されるように、cast-PCRが低い疑陽性率を有することを示している。対照的に、cast-PCRは、NRAS-183AT SNPを含有する腫瘍試料に関してほんの2％未満から、CTNNB1-134CT SNPを含有する試料に関して80％超までの範囲で、様々な腫瘍試料中の腫瘍細胞の百分率の決定を提供することができた。
【０２１３】
実施例11
cast-PCRにおけるプレ増幅の使用
以下の実施例は、cast-PCR法と組み合わせたプレ増幅が、限られた量のゲノムDNA鋳型から多数の対立遺伝子の検出を可能にすることを明示する。
【０２１４】
cast-PCR増幅を行う前に、異なる7個のKRAS変異に関してマルチプレックス反応を行った（表9を参照されたい）。
【０２１５】
異なる7個のKRAS SNPの各々に関して、図18A〜Bに記載した通り、45 nMの各対立遺伝子特異的プライマー（対立遺伝子-1特異的プライマーおよび対立遺伝子-2特異的プライマーが含まれる）および45 nMの各座特異的プライマー、0.1 ng/μLゲノムDNA、および1×Preamp Master Mix（Applied Biosystems, Foster City, CA; P/N 437135）を1つの反応に混合することによって、マルチプレックス反応10μlを1本の試験管において調製した。プレ増幅反応10μlを96または384ウェルプレートにおいてApplied Biosystems 9700 Thermocyler中で95℃で10分間インキュベートした後、95℃で15秒間、60℃で4分間、および99.9℃で10分間を10サイクル行った後、4℃で維持した。次に、0.1×TE pH 8.0 190μlを各プレ増幅反応（20倍希釈）10μlに加えた。次に、希釈したプレ増幅反応産物をその後のcast-PCR反応において直接用いたか、または使用するまで少なくとも1週間-20℃で保存した。
【０２１６】
（表９）KRAS SNP配列（標的対立遺伝子を括弧内に示す）
0005805064.tif 000012
【０２１７】
プレ増幅後、希釈したプレ増幅産物をシングルプレックスcast-PCR反応に等分した。個々のアッセイ法を、上記の（実施例のII章を参照されたい）一般的な実験設計および反応条件を用いて異なる7個のKRAS変異の各々に関して行った。10 μLのcast-PCR反応を、核酸鋳型として20倍希釈のプレ増幅反応産物（先に調製した）1μL、または比較としてゲノムDNA 0.07 ngのいずれかを含有するアッセイ法のために行った。全てのアッセイ法のプライマーおよびプローブを、図18A〜Bに示される配列に従って設計した。
【０２１８】
図12に示される通り、プレ増幅を行わないアッセイ法では、試験したKRAS変異の7個の△Ctの平均値は12.0であったのに対し、プレ増幅を用いたアッセイ法では△Ctの平均値は17.0であった。このように、両者の間の△△Ctは改善 約5を与え、これは、プレ増幅を行わない反応に対して、プレ増幅した反応についての感度における約32倍の増加である。
【０２１９】
理想的な状況において（PCR効率＝100％の場合）、標的遺伝子のコピー数は、10サイクルで約1000倍増加する。これらの条件下で、プレ増幅反応における開始コピー数が0.1ng/μL（または、およそ33コピー/μL）である場合、10サイクル後のコピー数はおよそ33,000コピー/μLに増加する。上記の例において、20倍希釈したプレ増幅産物のコピー数はおよそ1,650コピー/μLであると推定される。ゆえに、1,650コピー/μLの希釈プレ増幅産物 1μLをcast-PCR反応に加えた後（最終容積10μL）、cast-PCR産物の濃度は、およそ165コピー/μLである。この推定に基づくと、1ng/μL ゲノムDNAからのプレ増幅産物 10μLを、200倍も希釈することができ、さらに、その後のcast-PCR反応において用いるための最大2000μLの核酸鋳型を提供することができる。
【０２２０】
実施例12
cast-PCR特異性に対するテールを有するASPの効果
上記の一般的なcast-PCR概略および反応条件（実施例のII章を参照されたい）を用いて、様々なSNP標的配列を含有するプラスミドDNA 100万コピーを用いてアッセイ法を行った（表10を参照されたい）。アッセイ法のプライマーおよびプローブを図19A〜Dに示される配列に従って設計した。分析した各SNPについては、ブロッカープローブ、座特異的プローブ、および座特異的プライマーは同じであり、かつ対立遺伝子特異的プライマーのみを変化させた（例えば、テールを有するまたはテールを有しない）。
【０２２１】
（表１０）プラスミドSNP配列（標的対立遺伝子を括弧内に示す）
0005805064.tif 000013
【０２２２】
テールを有しないASPを用いたcast-PCRおよびテールを有するASPを用いたcast-PCRの結果を図13に要約する。テールを有しないプライマーを有するcast-PCR反応において、調べた変異12個の△Ctの平均値は10.3であったのに対し、テールを有するプライマーを用いるcast-PCR反応では、調べた112回のアッセイ法の△Ctの平均値は16.3であった。このように、テールを有するASPを含むcast-PCR対テールを有さないASPを含むcast-PCRの△△Ctの平均値は約6.0であったが、これはASP＋テールプライマーを含む反応についての特異性における約64倍の改善である。
【０２２３】
実施例13
cast-PCRとASB-PCRの比較
cast-PCR法を用いるアッセイ法に関する対立遺伝子識別を、他のブロッキング試薬による対立遺伝子特異的PCR（ASB-PCR）法を用いるアッセイ法と比較した（例えば、Morlan et al., 2009を参照されたい）。
【０２２４】
一般的な概略および上記の反応条件を用いて、様々なSNP標的配列を含有するプラスミドDNA 100万コピーを用いてcast-PCRアッセイ法を行った（表10を参照されたい）。一般的な実験設計および上記の反応条件を用いてアッセイ法を行った（実施例のII章を参照されたい）。アッセイ法のプライマーおよびプローブを、図19B〜Dに示される配列に従って設計した。
【０２２５】
ASB-PCRアッセイ法を、様々なSNP標的配列を含有するプラスミドDNA 100万コピー（表10を参照されたい）、900nM テールを有さない対立遺伝子特異的プライマー（Tm 58〜62℃）、3600nM 対立遺伝子特異的リン酸ブロッカー（Tm 58〜62℃）、200nM 座特異的TaqManプローブ（Tm 70〜74℃）、および900nM 座特異的プライマー（Tm 60〜63℃）を用いて行った。
【０２２６】
ASB-PCRアッセイ法のプライマーおよびプローブを、図20A〜Cに示される配列に従って設計した。ASB-PCR反応を384ウェルプレートにおいて95℃で10分間インキュベートした後、92℃で20秒間、60℃で45秒間を50サイクル行った。反応は全て、ABI PRISM 7900HT（登録商標）Sequence Detection Systemにおいて製造元の説明書に従って4通り行った。
【０２２７】
本実施例の結果を図14に要約する。ASB-PCRアッセイ法において、異なる変異12個の△Ctの平均値は14.1であった。cast-PCRアッセイ法において、同じ変異12個の△Ctの平均値は16.3であった。ASB-PCRとcast-PCRとの間の△△Ctは2.2であったが、これはcast-PCRの特異性がASB-PCRアッセイ法よりおよそ4.6倍高かったことを示している。
【０２２８】
実施例14
cast-PCRにおけるMGBブロッカープローブおよびリン酸ブロッカープローブの比較
cast-PCRアッセイ法において、MGBブロッカープローブの使用を、PO4ブロッカープローブなどの他のタイプのブロッカープローブ（例えば、Morlan et al., 2009）の使用と比較した。
【０２２９】
アッセイ法は全て、反応が150nm 対立遺伝子特異的MGBブロッカープローブまたは150nm 対立遺伝子特異的3'-リン酸ブロッカープローブのいずれかを含有したことを除き、一般的なcast-PCR概略および上記の反応条件（実施例のII章を参照されたい）を用いて、様々なSNP標的配列を含有するプラスミドDNA 100万コピーを用いて行った（表10を参照されたい）。アッセイ法のプライマーおよびプローブを、図19B〜D（MGBブロッカープローブを用いるcast-PCRに関して）、または図19B〜Cおよび図20C（リン酸ブロッカープローブを用いるcast-PCRに関して：対立遺伝子-1を遮断するために「PHOS1」および対立遺伝子-2を遮断するために「PHOS2」）に示される配列に従って設計した。
【０２３０】
リン酸ブロッカープローブまたはMGBブロッカープローブによるアッセイ法の結果を図15に要約する。リン酸ブロッカープローブを用いて行われたcast-PCRアッセイ法において、異なる変異12個の△Ctの平均値は15.1であった。比較すると、MGBブロッカープローブによって行われたcast-PCRアッセイ法を用いた場合、同じ変異12個に関する△Ctの平均値は、わずかに高く、△Ct 15.8を与えた。
【０２３１】
実施例15
LNA修飾ASPを用いるcast-PCRの特異性の改善
LNA修飾cast-PCRアッセイ法を、一般的な実験設計および上記の反応条件（実施例のII章を参照されたい）を用いて、0.5ng/μL ゲノムDNAを用いて行った。アッセイ法のプライマーおよびプローブを図21A〜Cに示される配列に従って設計した。分析した各SNPに関して、ブロッカープローブ、座特異的プローブ、および座特異的プライマーは同じであったが、対立遺伝子特異的プライマーのみを変化させた（すなわち、3'端におけるLNA修飾を有するかまたは有しない）。
【０２３２】
cast-PCRの特異性に対するASPのLNA修飾の効果を図16に要約する。LNA修飾対立遺伝子特異的プライマーを用いて行われた12個のcast-PCRアッセイ法に関して△Ctの平均値は16.3であった。比較すると、修飾を有しない対立遺伝子特異的プライマーによって行われたcast-PCRアッセイ法を用いた場合、同じ変異12個に関する△Ctの平均値は18.5で顕著に高かった。△△Ctに基づくと、アッセイ法の特異性は、LNA修飾対立遺伝子特異的プライマーを用いるアッセイ法に関しておよそ4倍増加した。
【０２３３】
実施例16
他の修飾ASPを用いるcast-PCRの特異性の改善
他の化学修飾ASPを用いるcast-PCRアッセイ法を、様々なSNP標的配列を含有するプラスミドDNA 100万コピーの存在下で、一般的な実験設計および上記の反応条件（実施例のII章を参照されたい）を用いて行った（表10を参照されたい）。アッセイ法のプライマーおよびプローブを図22に示される配列に従って設計した。分析した各SNPに関して、ブロッカープローブ、座特異的プローブ、および座特異的プライマーは同じであったが、対立遺伝子特異的プライマーのみを変化させた（すなわち、3'端における化学修飾を有するかまたは有しない、すなわちppA、ppG、イソdC、またはfdU）。
【０２３４】
非修飾ASPを用いるcast-PCRアッセイ法および修飾ASPを用いるcast-PCRアッセイ法の結果を図17に要約する。示される通り、その3'端においてピロリン酸修飾（ppAまたはppG）を有する対立遺伝子特異的プライマーは△Ctを2〜3増加させたが、これはアッセイ特異性においておよそ4〜6倍増加である。
【０２３５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その」には、明白におよび無条件に1つの指示対象に限定される場合を除き、複数形が含まれることに注意されたい。「または」の使用は、特に明記していなければ「および／または」を意味する。「含む」「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（include）」、「含む（includes）」、および「含む（including）」の使用は、互換的であり、限定的であることを意図されない。さらに、1つまたは複数の態様の記載が「含む」という用語を用いる場合、当業者は、いくつかの特異的な例において、その態様または複数の態様が、「本質的にからなる」および／または「からなる」という言語を用いて代わりに記載されうることを理解すると考えられる。
【０２３６】
本明細書において用いられる見出しは、系統立てる目的のために過ぎず、記載の主題を限定すると解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、および学術論文が含まれるがこれらに限定されるわけではない、本出願において引用された全ての文書、または文書の一部は、任意の目的に関してその全内容が明白に参照により本明細書に組み入れられる。組み入れられた文書の1つまたは複数が、本出願におけるその用語の定義と矛盾する用語を定義する場合、本出願が支配する。
【０２３７】
特許、特許出願、論文、教本等、およびその中で引用された参考文献が含まれる本明細書において引用された全ての参考文献は、それらが既に組み入れられていない程度に、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。組み入れられた文献および類似の材料の1つまたは複数が異なる場合において。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【配列表】
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