(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ε-ビニフェリンを有効成分とするＣＤ３６蛋白質発現抑制剤（食品形態および動脈硬化予防・治療用途を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はε‐ビニフェリン（epsilon-viniferin）を有効成分とする動脈硬化組織のマクロファージ泡沫化抑制剤に関する。本発明は食品、医薬製剤、化粧品、飼料等に好適に適用される。
【背景技術】
【０００２】
酸素は、多くの生物の生命維持に必須の物質であり、生体においてエネルギー産生等の様々な役割を果たしている。このエネルギー産生系や他の反応系において、酸素は酵素、紫外線、他の放射線等の作用により、スーパーオキシドアニオン、一重項酸素、ヒドロキシアニオン等の活性酸素となる。
活性酸素は、白血球による殺菌作用、即ち、食細胞が捕食した異物を分解する作用等の面で、生体にとって極めて重要な役割を果たしている。その反面、前記活性酸素が過剰に生産されると、生体組織自体に障害を起こし、生体膜のリン脂質を形成する不飽和脂肪酸の過酸化を促進して過酸化脂質等の炎症因子の産生を誘発する。また、当該過酸化脂質と一緒になってアルコキシラジカルやヒドロキシラジカルを発生して生体膜を攻撃し、膜障害を誘発させ、有用な種々の酵素類を失活させるリスクがある。
【０００３】
一方、生体内には、活性酸素を失活させる酵素類としては、例えば、スーパーオキサイドディスムターゼ（SOD）、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等が挙げられる。また、抗酸化作用を有する各種ビタミン類としては、例えば、α‐トコフェロール（ビタミンE）等が挙げられる。これら酵素やビタミン類の作用により正常な生体維持がなされている。しかし、現代の生体を取りまく環境中には活性酸素の生体内産生を促す各種化学物質、例えば、除草剤、殺虫剤、洗剤、医薬品、各種食品添加物等が多量に存在している。これら化学物質の影響によって、前記酵素類やビタミン類等による適切な防御機構の能力を越える活性酸素の発生や過酸化脂質の生成や蓄積が生じる。前記活性酸素が体内において異常に増加した場合には、過酸化反応の連鎖反応的進行に伴って、例えば、種々の炎症、肝障害、腎障害、胃障害、動脈硬化、溶血、老人性痴呆症、網膜症、肺障害、虚血性血管疾患等の重大な障害が発生するおそれがある。特に活性酸素が原因となって動脈硬化が発生することが最近明らかになってきた。特に活性酸素によって酸化されたLDLコレステロールは、アテローム性動脈硬化症を促進するための血管内皮細胞の炎症惹起するサイトカインや接着分子の発現を含むさまざまな作用を有し、また、単球の遊走因子でもある。さらに、内皮細胞に対する細胞障害作用も示す。動脈内の単球は、接着分子を介して動脈内膜に集まり、マクロファージに分化して、いくつかのスカベンジャー受容体を発現し、その受容体は酸化LDLの細胞内への取り込みを促す。マクロファージによる酸化LDLの取り込みは不可逆であり、過剰な取り込みを制御する機構がないために、泡沫化を来たして動脈内膜内に沈着することが知られている（非特許文献１−３）。このようなマクロファージの泡沫化が蓄積されることにより、動脈の一部が肥大し、アテローム性動脈硬化となることが明らかになってきた。
【０００４】
このように、過剰な活性酸素が、動脈硬化の一次的要因であり、生体に悪影響を及ぼすことが広く認識されている。そのため、日常口にする飲食物等に活性酸素の除去作用を積極的に付与することが検討され、例えば、活性酸素の除去作用を有する飲食物が提案されている（特許文献１）。
或いは、植物に存在して生理活性を示す天然物質、特にポリフェノール類の化合物に近年関心が集中している。ポリフェノール類は一般に茶、野菜、果実、ハーブ類等に含まれ、食品あるいは嗜好品として長期間の摂取経験のある、副作用のない治療・予防剤として期待できるものである。
ポリフェノール化合物は植物の二次代謝産物で、植物界に普遍的、かつ多量に存在し、多彩な生理活性を示すことが知られ、古くは薬学、植物化学等の分野で、近年も健康食品分野で注目を集めている。例えば、茶のポリフェノール、特にカテキン類は、抗菌、抗ウイルス、抗突然変異、抗酸化、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、抗う蝕、抗アレルギー、腸内フローラ改善、消臭など、広範囲の生理活性を有することが知られている。
【０００５】
ポリフェノールの中でもレスベラトロール類と呼ばれるスチルベノイド（Stilbenoid）が注目されている。スチルベノイドは、C6-C2-C6の炭素数14の基本骨格から構成される化合物群である。スチルベノイドは、植物での分布は、限られているが、ブドウ科にはこれらが含まれており、その代表的な化合物は、trans-resveratrol（（E）-3,4’,5-trihydoroxy-stilbene）である。
【０００６】
スチルベン化合物の代表であるレスベラトロール(trans-resveratrol)は、活性酸素発生因子であるNADPHオキシダーゼまたはキサンチンオキシダーゼの阻害活性や活性酸素消去系のスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ活性の増加、グルタチオンの増加などを通じて抗酸化作用を発揮することが知られており、その他にも血管弛緩作用、抗炎症作用、血小板凝集抑制作用などのように優れた生理活性を有している（非特許文献４）。さらに、高脂肪食条件下においてもカロリー制限と類似の寿命延長効果が報告され（非特許文献５）、アンチエイジングのための健康維持効果のある天然由来物質として応用されている。
【０００７】
レスベラトロールに代表されるスチルベン化合物は、天然では種子植物科の植物中に存在し、特にイタドリやブドウの新芽、若葉、蔓、ブドウ果皮、そしてブドウを発酵させて製造するワイン中に含有される化合物である。これらを材料として、スチルベン化合物が混合物として分離され、飲料、菓子類、健康食品、化粧品、育毛剤などに配合されて市販されるに至っている。
【０００８】
スチルベン化合物を含有する植物では、重合度の大きいものから小さいものまで、さまざまな重合度のものが混合物として含まれており、例えば、レスベラトロールは、モノマーであるが、ブトウ若芽からは、レスベラトロール以外にも、peceatannol、piceid（配糖体）、astringin（配糖体）、ダイマーとして、epsilon-viniferin、delta-viniferin、iso-epsilon-viniferin、ampelopsin A、pallidol、トリマーとして、miyabenol C、テトラマーとして、hopeaphenol、R-viniferin、R-2-viniferinなどが見出されている。
【０００９】
高脂肪・高カロリーが動脈硬化の促進因子として知られているが、フランスでは高脂肪・高カロリーの食習慣にも関わらず冠動脈疾患の発症率が低く、いわゆるフレンチパラドックスとして知られている。この現象はフランスの赤ワインの消費量が多いこととの関連から、ブドウに由来するポリフェノールに脚光があたっており、そのなかでもレスベラトロールと呼ばれる物質に注目があつまっている。しかし、レスベラトロールが有用な生体調節作用を示すには、生体に吸収されて利用される必要があるが、摂取してもすぐに排泄されるため、ヒトにおけるバイオアベイラビリティは低いことが知られている（非特許文献６）。したがって、このような抗酸化作用だけに依存しても、動脈硬化を完全に予防し、あるいは治療することが困難であることが明らかとなってきた。本発明者は、所謂狭義の、レスベラトロールの二量体であるε‐ビニフェリンについて研究を行ったところ、これまで全く知られていない強い抗動脈硬化作用、生体細胞内活性酸素消去活性を見出した。
さらに検討を進めたところ、レスベラトロールの２量体であるε‐ビニフェリンが、マクロファージや、動脈硬化層に陥入固定化された単球細胞表面のスカベンジャー受容体ファミリーのひとつであるCD36蛋白質の発現を抑制し、過剰な酸化LDL−コレステロールの貪食を抑え、マクロファージの泡沫化を抑制することができることを見出した。CD36は、分子量78-88kDaの複数の糖タンパク分子の総称であり、単球、マクロファージ、血小板、脂肪細胞等の多くの細胞種に発現している。マクロファージでは、CD36は、特定の酸化リン脂質や酸化リポタンパク質を認識するスカベンジャー受容体として機能し、アポトーシス細胞、特定の細菌病原体や真菌病原体、及び修飾低密度リポタンパク質の細胞内移行に関与し、それによって炎症応答およびアテローム血栓症に寄与する。実際に、マクロファージ表面のCD36の過剰発現が抑制されることで、血管内膜からマクロファージが泡沫化することなく可動性を保持し、動脈硬化巣を退縮させる（非特許文献７）ことが示されている。
【００１０】
また、我々はε‐ビニフェリンが単球表面に発現する接着分子であるＣＤ11ａの発現を抑制することを見出した。これにより、末梢の単球が動脈硬化巣に付着し、動脈内に陥入するのを抑え、動脈硬化が加速されるのを抑えることができる。LFA-1（CD11aとCD18のヘテロダイマー）は、リンパ球間の同種接着や、血管内皮などへのリンパ球の異種細胞間接着に関与する。LFA-1のリガンドとして、Intercellular adhesion molecules（ICAMs）、すなわちICAM-1（CD54）、ICAM-2（CD102）、ICAM-3（CD50）等が知られている。ここでいうCD11aは、単球、マクロファージ、顆粒球、T細胞等の白血球に発現し、活性化した血小板にもCD11aとCD18を発現する。CD11a（LFA-1α）抗原は、分子量180kDaのインテグリンαL鎖で、95kDaのCD18抗原（インテグリンβ2）と非共有結合的に会合する。
【００１１】
更に我々は、マクロファージの産生するスーパーオキシドアニオンを強力に消去する現象も見出した。マクロファージは貪食作用を発揮する際に活性酸素種のなかでもスーパーオキシドアニオンを産生する。これは、動脈硬化巣の炎症反応を促進しマクロファージの泡沫化を加速させることから、スーパーオキシドアニオン産生を抑制するためにNADPH酸化酵素の活性抑制の観点から動脈硬化巣の進展を防ぐアプローチも研究されている（非特許文献７）。従って、マクロファージ自ら産生するスーパーオキシドアニオンを無毒化することにより、マクロファージの泡沫化を抑制することができる。
以上のように、マクロファージ表面のCD36、接着分子のCD11aの発現を抑制し、さらにスーパーオキシドアニオンの有害作用を抑えたりするような物質は、動脈硬化巣へのマクロファージの過剰な集合を防ぎ、その病巣の進展を抑制することができる。特にマクロファージの泡沫化を防ぐことにより、酸化LDLを取り込んだマクロファージが動脈内膜に沈着することが回避できるだけではなく、正常な細胞機能を維持できることから、取り込んだコレステロールを細胞外へ分泌しHDLによりABCA1トランスポーターを介して、分泌されたコレステロールを動脈硬化巣から引き抜き、それが回収されることで動脈硬化巣を退縮、改善することもできる。
本発明者らは、鋭意検討を進めた結果ε‐ビニフェリンを有効成分とすることを特徴とする動脈硬化層のマクロファージのスカベンジャー受容体発現抑制剤、ならびに接着分子発現抑制作用及びスーパーオキシドアニオン消去活性を併せ持ち、これらの作用に基づく動脈硬化組織内マクロファージ泡沫化抑制剤を完成させたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平１１−３４６７１５号公報
【特許文献２】特開２００１−１２２７２３号公報
【特許文献３】特開平６−４９０５３号公報
【特許文献４】国際公開第００／６４８８３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３／０９１２３７号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００４／１０３９８８号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献２】Gerrity RG. The American Journal of Pathology, The role of the monocyte in atherogenesis: I. Transition of blood-borne monocytes into foam cells in fatty lesions. 103 (2): 181-190, 1981.
【非特許文献３】Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, Khoo JC, Witztum JL. New England Journal of Medicine, Beyond cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity, 320 (17): 915-924, 1989.
【非特許文献４】Berliner JA, Navab M, Fogelman AM, Frank JS, Demer LL, Edwards PA, Watson AD, Lusis AJ. Circulation, Atherosclerosis: Basic mechanisms. Oxidation, inflammation, and genetics, 91 (9): 2488-2496, 1995.
【非特許文献５】市来俊弘．循環器内科, ワインに含まれるレスベラトロールの作用とその機序，67(2): 216-222, 2010.
【非特許文献６】Baur JA, Pearson KJ, Sinclair DA, et al. Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature, 444 (7117): 337-342, 2006.
【非特許文献７】Walle T, Hsieh F, Walle K, et al. High absorption but very low bioavailability of oral resveratrol in humans. Drug Metabolism and Dispositions, 32 (12): 1377-1382, 2004.
【非特許文献８】Curtiss LK. Reversing atherosclerosis? New England Journal of Medicine, 360 (11): 1144-1146, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、優れた動脈コレステロール沈着抑制効果を有する医薬品又は健康食品に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために本発明者らは種々の化合物や天然物質の探索を鋭意進めた結果、上記したとおり、レスベラトロール類と総称される化合物群の中で、特にε‐ビニフェリンが公知のレスベラトロールと比較して特異的に、マクロファージ表面のCD36発現を抑制させ、動脈硬化層のマクロファージの泡沫化を抑制させる働きがあることを見出した。さらに、接着分子発現抑制作用及びスーパーオキシドアニオン消去活性を併せ持ち、これらの作用に基づく動脈内へのコレステロール沈着を抑制する方法を完成させたものである。
【００１６】
すなわち、本発明は、
ε-ビニフェリンを有効成分とするＣＤ３６蛋白質発現抑制剤（食品形態および動脈硬化予防・治療用途を除く）。
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明はマクロファージのスカベンジャー受容体ファミリーのひとつであるCD36の発現を抑制することにより泡沫化を防ぐ効果が高く、さらにマクロファージの接着分子であるLFA−１の構成蛋白であるＣＤ11aの発現を抑えるため、動脈の炎症部位のアテローム形成を抑制することができる。また、マクロファージ自身が産生するスーパーオキシドアニオンの消去活性が高いため、それを利用した各種疾患治療剤や健康食品を提供することができ、活性酸素が関与するとされるメタボリックシンドローム、糖尿病やその合併症、動脈硬化、消化器疾患等の種々の病態の治療・予防に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】フローサイトメトリー法によるＣＤ３６の発現を示す図。対照群（影部分）、ＴＮＦα（実線）添加２４時間後。
【図２】フローサイトメトリー法ＣＤ３６の発現を示す図。ＴＮＦα（影部分）、レスベラトロール（上段実線）及びビニフェリン（下段実線）添加２４時間後。
【図３】フローサイトメトリー法によるＣＤ１１ａの発現を示す図。対照群（影部分）、レスベラトロール（上段実線）及びビニフェリン（下段実線）添加２４時間後。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳述する。
【００２０】
本発明で用いるε‐ビニフェリンは、スチルベン化合物であり、ブドウのファイトアレキシンの一種として知られている。本発明でいうレスベラトロールは、スチルベン骨格を基本構造とするポリフェノールのモノマーを言う。ε‐ビニフェリンはこのダイマーである。スチルベン化合物を含有する植物体、好ましくはブドウ側枝より、各種抽出溶媒、好ましくは70％メタノールを用いてε‐ビニフェリンを抽出することができる。抽出されたε‐ビニフェリンは分取高速液体クロマトグラフィなどの分離精製手段によって分離、精製できる。
【００２１】
ε‐ビニフェリンは、レスベラートル類と総称されているが、本発明においては区別して用いることとする。レスベラトロールは上述のとおり、ブドウの葉、新芽、果皮等に存在するポリフェノールの一種で、スチルベン化合物であり、trans-レスベラトロールが代表的な化合物である。これまで複合体や混合物としてし、いわゆるサーチュイン活性を測定し、その作用過程の一部として活性酸素除去能が測定され、評価されてきた。本発明者らは、さらに研究を進め、ε‐ビニフェリン単独で強いマクロファージ表面のCD36の発現抑制を確認し、効果を確認することができた。
【００２２】
ε―ビニフェリンは、有機化学的または微生物を用いて合成した高純度品の他、上述のブドウなどの植物体から抽出して用いることができ、その場合、抽出物を用いてもよく、またはその抽出物から単離したレスベラトロールを用いてもよい。天然物としては、ε−ビニフェリンの含有量がコントロールされているものであればよく、例えば、ブドウ、落花生、およびイタドリやツルドクダミ等のタデ科植物等が挙げられる。
【００２３】
天然物としてはブドウが特に好ましい。ブドウの種類は、特に限定されるものではないが、デラウエア、巨峰、甲州、ピオーネ、マスカット、シュナンブラン、グレナッシュ、マタロ、ミュラーテュルガウ、トレッビアーノ、ベリーＡ、カベルネソービニオン、メルロー、ピノノアール、カベルネフラン、シラー、シャルドネ、ソービニヨンブラン、セミヨン、シラー、ガメイ、リースリング、アリゴテ等が好ましい。ブドウ抽出物とは、ブドウ果実、ブドウ葉またはブドウに由来する物からの抽出物を指す。ブドウに由来する物としては、ブドウジュース、ワイン、ワイン製造時の残渣、ワイン濃縮物等をいう。抽出は、例えば、レスベラトロール類はブドウの果皮や新芽、葉、蔓に多く含まれていることが知られているので、それらを必要により乾燥した後、抽出溶媒に一定期間浸漬するか、あるいは加熱還流している抽出溶媒と接触させ、次いで濾過し、濃縮し、さらに上述の分取クロマトによって分取することができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、あるいはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いられる。また、ワイン、ワインの濃縮物または濃縮乾固した固形物中にも含まれているので、それらを用いることもできる。また、ワイン製造時に発生するブドウの残渣をそのまま用いるか、それから上記抽出方法と同様にして抽出することもできる。有機溶剤としてはエタノール等のアルコールが好ましく、特にエタノールが好ましい。
【００２４】
本発明の活性酸素除去剤は医薬製剤としてヒトおよび動物に投与することができる他、各種飲食品、飼料（ペットフード等）に配合しても摂取させることができる。
【００２５】
医薬製剤は、経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの医薬製剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。
【００２６】
本発明医薬製剤において、有効成分であるε‐ビニフェリンの投与量は、その種類、その剤型、また患者の年令、体重、適応症状などによって異なるが、例えば経口投与の場合は、成人１日１回〜数回投与され、１日あたり１回約1 mg〜200 mg、好ましくは3 mg〜20 mg／人程度投与するのがよい。
【００２７】
本発明の活性酸素除去剤を飲食品、飼料等として用いる場合、一般の飲食品の他、メタボリックシンドロームの予防・治療、糖尿病およびその合併症の予防・治療剤、癌（子宮内膜癌、閉経後乳癌、白血病、大腸癌、胃癌、前立腺癌等を含む）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）およびそれに由来する肝疾患の予防・治療等の生理機能をコンセプトとし、その旨を表示した機能性飲食品、疾病者用食品、特定保険用食品等に応用することができる。
【００２８】
飲食品の形態としては、例えば、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、または、液体状に任意に成形することができる。これらには、食品中に含有することが認められている公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜含有させることができる。
【００２９】
本発明の飲食品中に含まれる有効成分であるε‐ビニフェリンの含有量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができ、例えば、１〜10質量％程度とすることができる。特に、保健用飲食品等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。従ってこのような場合には、本発明の飲食品は、ε‐ビニフェリンを含有し、酸化ＬＤＬの低下、あるいはメタボリックシンドロームなどの種々の疾患の予防または改善等に用いられるものである旨の表示を付した飲食品とすることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、配合量はすべて質量％で示す。
【００３１】
実施例１
マクロファージ表面のCD36発現誘導の確認試験
〈方法〉フローサイトメトリー（Flow Cytometry；FCM）検討用の細胞は、U937（ヒト・組織球性リンパ腫由来、マクロファージ様）細胞株を用いた。
U937細胞（DSファーマバイオメディカル株式会社、吹田、大阪）は、フラスコ（> 106個）で購入し、これをF0世代と定めた。継代培養している限り、世代番号は変えないが、継代10回以内の細胞を実験に供した。細胞は、Submaximal confluentに達したものを、1：10の割合でsubculture（継代培養）を行い、24hr培養した細胞を用いた。U937細胞は、浮遊細胞であり、培地としては、2 g/Lの割合で炭酸水素ナトリウム（Sodium Bicarbonate、Life Technologies Japan、八丁堀、東京）及び抗菌−抗真菌剤（Antibiotic-Antimycotic、10 mg/L、Life Technologies Japan）を加えた、改変RPMI-1640液体培地（R7388、20 mM HEPES含有、シグマ-アルドリッチジャパン株式会社、品川、東京）に１０％の割合でＨｙＣｌｏｎｅＲウシ胎仔血清（Ｌｏｔ  Ｎｏ．：  ＡＴＤ３１９９５、Fetal Bovine Serum Defined；FBS、HyClone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA）を添加したものを用いた。
0hrに、発現刺激剤として、ヒトTNＦα（Recombinant Human Tumor Necrosis Ｆａｃｔｏｒ  α、Lot No.: AA3309072、R&D Systems, Inv., Mineapolis、MN、USA）を最終濃度20 ng/mLになるように細胞浮遊液に添加し、同時に、最終濃度１００  μＭのtrans-resveratrol（レスベラトロール、> 98%、185-01721、C14H12O3=228.24、和光純薬工業株式会社、道修町、大阪）及びepsilon-viniferin（ビニフェリン、228-01741、C28H22O6=454.47、和光純薬工業株式会社）を添加した。対照群の細胞浮遊液には、ヒトTNＦαを添加せず、被験薬の溶媒であるエタノール（EtOH、99.5v/v%、053-06531、和光純薬工業株式会社）を同量（20 μL）添加した。試験開始、6、12、24、36、48 hr後の細胞浮遊液を1.5 mLエッペンチューブ（eppendorf AG、Hamburg, Germany）に分取し、Staining Buffer（SB）［2% Bovine Serum Albumin（BSA、>95%、014-15134、Lot No.: CDK4319、和光純薬工業株式会社）及び0.5%NaN3（Sodium Azide、NaN3=65.01、Lot No.: PER1519、>98%、190-14901、和光純薬工業株式会社）を添加した、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS、(-)CaCl2(-)MgCl2、14190-144、500 mL、Gibco-Invitrogen、八丁堀、東京)］にて、細胞を洗浄後、抗ヒトCD36マウス・モノクローナル抗体を用い、細胞表面抗原への特異的結合を施した（4℃、30 min）後、CellFIXTM（340181、BD Bioscience、San Jose、CA、USA）にて細胞固定後、FCM解析に供した（細胞固定後、約１週間は、FCM測定可能である）。
ヒト特異的抗体に関して、CD36は、Allophycocyanin (APC)接合型抗体（Isotype: Mouse IgM）を用い、陰性対照として、それぞれの色素を結合したマウス免疫グロブリンに対する抗体であるIsotype Controlを用いた（PE-IgG2a、APC-IgM）。PEは、励起波長：564 nm、蛍光波長：585 nmでアルゴンイオン（Ar）レーザーで励起され、APCは、励起波長：650 nm、蛍光波長：660 nmで、ヘリウム・ネオン（He-Ne）レーザーにより励起される。FCMは、BD社のFluorescence Activated Cell Sorter (FACS；FACSCaliburTM 、BD Bioscience)を用いて、データを取得し、CellQuestProTMソフトウエア（MacOS、BD Bioscience）によりデータ解析を行った。アイソタイプコントロールにおける蛍光強度のデータを基準とし、これよりも強い蛍光強度のデータを陽性（M2%）とした。
データは一元配置分散分析の後、群間比較はScheffeの多重比較検定を実施した。有意水準は5％以下とした。
〈結果〉
0005774839.tif 000002
CD36の場合は、ヒトTNＦα（最終濃度：20 ng/mL）の添加により、有意ではないものの、発現が増強したため、このTNＦα添加の条件で、trans-resveratrol（レスベラトロール）、epsilon-viniferin（ビニフェリン）による、このマーカーの発現に対する影響を検討した。図1には、対照群の発現とTNＦα添加時のCD36発現の典型例を示す（図1）。図1に示すように、24hr後の対照群の細胞におけるＭ２％は、６３．９９  ±  ６．５３０％（ｎ＝３）である。ＴＮＦα20 ng/mＬ添加群のＭ２％は、６６．０７  ±  2.944%（n=3）であり、実験により、M2画分の細胞集団の割合には、TNＦα添加により、U937細胞におけるCD36の発現は、僅かながら増強した。このTNＦα添加の条件で、レスベラトロール １００  μＭ添加、及び、ビニフェリン １００  μＭ添加による、CD36発現への影響を検討した。
図2には、レスベラトロール １００  μＭ添加、及び、ビニフェリン １００  μＭ添加時の典型例を示す（図2）。3回の独立した実験結果を表１に示すが、TNＦαによって惹起されたCD36の発現は対照に比較してレスベラトロールによって抑制傾向を示した。一方、ビニフェリンは、対照に比較して有意にCD36の発現が抑制されることを確認した。
【００３２】
【表１】
0005774839.tif 000003
【００３３】
実施例２
マクロファージ表面のCD11a発現誘導の確認試験
〈方法〉実施例１と同様にフローサイトメトリー（Flow Cytometry；FCM）検討用の細胞は、U937（ヒト・組織球性リンパ腫由来、マクロファージ様）細胞株を用いた。詳細な培養条件及び手順も実施例1に準じて行った。但し、実施例1では0hrに、発現刺激剤としてヒトTNＦαを最終濃度20 ng/mLになるように細胞浮遊液に添加したが、CD11aについては予備的検討により、ヒトTNＦα無添加状態の細胞において高発現が認められ、逆にヒトTNＦαの添加により、発現が低下したためこのマーカーの発現量の評価には、TNFaを添加していない培養条件で行った。レスベラトロール及びビニフェリンは最終濃度１００  μＭのtrans-resveratrol（レスベラトロール、> 98%、185-01721、C14H12O3=228.24、和光純薬工業株式会社、道修町、大阪）及びepsilon-viniferin（ビニフェリン、228-01741、C28H22O6=454.47、和光純薬工業株式会社）を添加した。対照群の細胞浮遊液には、ヒトTNＦαを添加せず、被験薬の溶媒であるエタノール（EtOH、99.5v/v%、053-06531、和光純薬工業株式会社）を同量（20 μL）添加した。試験開始、24 hr後の細胞浮遊液を1.5 mLエッペンチューブ（eppendorfAG、Hamburg, Germany）に分取し、Staining Buffer（SB）［2% Bovine Serum Albumin（BSA、>95%、014-15134、Lot No.: CDK4319、和光純薬工業株式会社）及び0.5%NaN3（Sodium Azide、NaN3=65.01、Lot No.: PER1519、>98%、190-14901、和光純薬工業株式会社）を添加した、Dulbecco１’s Phosphate Buffered Saline (DPBS、(-)CaCl2(-)MgCl2、14190-144、500 mL、Gibco-Invitrogen、八丁堀、東京)］にて、細胞を洗浄後、抗ヒトCD11aマウス・モノクローナル抗体を用い、細胞表面抗原への特異的結合を施した（4℃、30 min）後、CellFIXTM（340181、BD Bioscience、San Jose、CA、USA）にて細胞固定後、FCM解析に供した。ヒト特異的抗体に関して、CD11aは、Phycoerythrin (PE)接合型抗体（Isotype: Mouse IgG2a）、FCMは、BD社のFluorescence Activated Cell Sorter (FACS；FACSCaliburTM 、BD Bioscience)を用いて、データを取得し、CellQuestProTMソフトウエア（MacOS、BD Bioscience）によりデータ解析を行った。アイソタイプコントロールにおける蛍光強度のデータを基準とし、これよりも強い蛍光強度のデータを陽性（M2%）とした。
〈結果〉CD11aの場合、FCSの典型例を示す（図3）。
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図3に示すように、対照群の細胞におけるCD11aのM2%で示されるように高度にCD11aの発現が認められた。レスベラトロール １００  μＭ添加群及びビニフェリン１００  μＭ添加群のM2%は、いずれも、CD11aの発現を抑制していたが、その作用は、ビニフェリンの方が強かった。なお、3回の独立した実験結果を表2に示すが、ほぼ、同様の成績であった。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
実施例３
スーパーオキサイドアニオン消去活性能の評価試験
レスベラトロール及びビニフェリンの各種活性酸素種の消去能を電子スピン共鳴法により評価した。
〈方法〉
（１）．一重項酸素消去作用
一重項酸素の消去作用の評価法は、2,2,6,6-tetramethyl-4-poperidinol（4-OH TEMP）をスピントラップ剤としたESR（Electron Spin Resonance）スピントラップ法により測定した。任意の濃度に調製した被験薬の99.5%（v/v）methanol水溶液0.1 mLを試験管に滴下した。続いて、milliQ水0.02 mL、100 mMの4-OH TEMP水溶液0.04  mL、0.1 mMのローズベンガル水溶液0.04 mLをこの順番で混合し、総量0.2 mLの混合液とした。これに、光増感反応の光源として、試験管の背面より極大波長530 nmの発光ダイオード（緑色LED）を20分間照射して、一重項酸素を発生させた。この混合液を、ESR用扁平水溶液セルに移し、ESRスペクトルを測定し、ESRスペクトル強度から、一重項酸素消去率を求めた。
使用機器：JEOL JES RE1X、X-band ESR装置（100 kHz、日本電子株式会社、      昭島、東京）
条件設定：センターフィールド：335.0 ±  5.0 mT
マイクロウェーブ  ：4 mW
モジュレーション・アンプリチュード：0.1 mT
ゲイン：200
タイムコンスタント：0.1秒
スキャンニングタイム：１分
なお、被験薬の調製方法と使用機器及び機器の条件設定は、いかに記載する他の活性化ラジカル消去方法についても同様である。
（２）．一酸化窒素消去作用
200 μMのsodium 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetraimidazolin-1-oxy-3- oxide（カルボキシ‐PTIO）20 μLと10 mMの1-hydroxy-2-oxo-3-(N-methyl-3- aminopropyl)-3-methyl-  1-triazen（NOC-7）の反応混液から発生したNOラジカルを30% dimethyl sulfoxide（DMSO）存在下の0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）中で測定した。NOラジカル供与体として開発されたNOC-7は、アルカリ溶液中では安定だが、中性及び酸性条件下では、NOラジカルを生成する不安定な化合物（37℃、pH7.4条件下で、半減期５分）である。カルボキシ‐PTIOのESRシグナルは、強度比=１：２：３：２：１の5つのピーク成分で構成されていた。
（３）．ハイドロキシラジカル消去作用
ハイドロキシラジカル消去作用の評価法は、5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide（DMPO）をスピントラップ剤としたESRスピントラップ法により測定した。まず、200 μM diethylenetriamine-N,N,N’，Ｎ’’，Ｎ’’’-pentaacetic acid（DTPA）0.1 mLを試験管に加え、続けて、500 μM硫酸鉄（ＩＩ）水溶液0.02 mL、10 mM 5,5-demethyl-1-pyrroline-N-oxide（DMPO）水溶液0.02 mLを順次加え、次に、10mM 過酸化水素水溶液0.02 mLを添加直後、この混合液をESR測定用扁平セルに移し、ESRスペクトルを測定した。それぞれの濃度の被験薬と同じ濃度のethanolを加えた水溶液0.04 mLを添加した検体を対照として、ESRスペクトル強度から、ハイドロキシラジカル消去率を求めた。
（４）．スーパーオキシドアニオン消去作用
スーパーオキシドアニオン消去作用の評価法は、DMPOをスピントラップ剤としたESRスピントラップ法により測定した。まず、2 mMヒポキサンチン0.01 mMリン酸緩衝液（pH7.4）0.05 mLを試験管に加えた。次に、1.33 mM DTPA0.015 mL、1.33 M（原液） DMPO 0.015 mL、被験薬水溶液0.1 mLを加え、最後に200mU/mLキサンチンオキシダーゼ0.1 mMリン酸緩衝液（pH7.4）0.02 mLを添加し、この直後、試験管ミキサーを用いて、5秒間攪拌した。この混合液をESR用扁平セルに移し、キサンチンオキシダーゼ添加2分後にESRスペクトルを測定した。
〈結果〉
各活性酸素種に対するレスベラトロール及びビニフェリンの濃度依存的な消去能活性（％）及び５０％消去濃度（IC50）を表３〜表６に示した。一重項酸素消去能、一酸化窒素消去能、ハイドロキシラジカル消去能は、レスベラトロール及びヴィニフェリンは同様の活性を示した。一方、スーパーオキシドアニオン消去活性能は、レスベラトロールに対してヴィニフェリンは20倍以上の活性を示すことが示された。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
【表４】
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【００３８】
【表５】
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【００３９】
【表６】
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【００４０】
実施例 4
ε−ビニフェリンの調製
ブドウ側枝（品種デラウエア）約５kgよりε−ビニフェリンを７０％メタノール１０ｌにより抽出し、分取ＨＰＬＣにより分離・精製して約２００mgのε−ビニフェリンを得た。ＨＰＬＣ分取時の移動相としてはアセトニトリル／水（７：１３）を用い、１ｍｌ／分の流速で約８分後に検出される。検出は紫外吸収２８８ｎｍで行った。このようにして得たビニフェリンを実施例１の試験例に用いた。またメタノール抽出後溶媒を留去して得た残渣を、粗精製ε−ビニフェリンとして、以下の処方例におけるビニフェリンとして用いた。
【００４１】
処方例１：サプリメント
（配  合  成  分）                              （質量％）
乳糖                                              ５４．０
結晶セルロース                                    ３５．０
澱粉分解物                                        １０．０
ε−ビネフェリン                                    １．０
【００４２】
処方例２：ソフトカプセル
（配  合  成  分）                              （質量％）
食用大豆油                                        ５０．０
ε−ビネフリン                                      １．０
グリセリン脂肪酸エステル                         １２．０
ミツロウ                                            ５．０
ゼラチン                                          １２．０
水                                                ２０．０
【００４３】
処方例３：グミ
（配  合  成  分）                              （質量％）
還元水飴                                          ４４．０
グラニュー糖                                      ２０．０
ブドウ糖                                          ２０．０
ゼラチン                                            ４．７
水                                                  ９．６
ε−ビネフリン                                      １．０
フレーバー                                          ０．６
色素                                                ０．１
【００４４】
処方例３：清涼飲料
（配  合  成  分）                              （質量％）
果糖ブドウ糖液糖                                  ３０．０
ブドウ果汁                                        ２０．０
乳化剤                                              ０．５
ε−ビネフリン                                      １．０
香料                                                適量
精製水                                              残余
【００４５】
処方例４：錠菓
（配  合  成  分）                              （質量％）
砂糖                                              ７６．０
グルコース                                        １９．０
ε−ビニフェリン                                    １．０
ショ糖脂肪酸エステル                                ０．２
精製水                                              ３．８
【００４６】
処方例５：キャンディー
（配  合  成  分）                              （質量％）
砂糖                                              ５０．０
水飴                                              ３３．０
水                                                １４．０
有機酸                                              ２．０
ε−ビニフェリン                                    ０．５
香料                                                ０．５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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