(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、コンピュータが実施する融解曲線データの解析の方法、但し、融解曲線データは、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）の融解曲線データである：
（ａ）融解曲線データをパラメータモデルフィッティングすること、
（ｂ）融解曲線データの主成分分析を実施すること、及び
（ｃ）融解曲線データを群にクラスタリングするために主成分を利用すること。
【請求項２】
融解曲線データが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した後の試料におけるｄｓＤＮＡの特定配列を同定するための融解曲線データである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コンピュータが記憶媒体及びモニター又は視覚表示装置を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、以下の形式のモデルに融解曲線データをフィッティングすることを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法：
【数１】
0005805535.tif 000037
式中、Ａは最小の観察された蛍光の推定値であり、Ｂ及びＣは融解曲線の初期部分の切片及び傾きの推定値であり、Ｔ０は融解曲線の最大（負）の傾きの点として推定され、かつλはおよそ２である。
【請求項５】
工程（ａ）が最良のフィットの線への融解曲線のスケーリングを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
融解曲線の転移の前の融解曲線データの領域及び融解曲線の転移に続く融解曲線データの領域が選択され、かつ平均の蛍光値が算出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも最初の２つの主成分が工程（ｃ）において利用される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記クラスタリングが、教師なし融解曲線データについてのｋ−平均クラスタリング又は階層的クラスタリングによって生じる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
融解曲線データについて群の数を決定するためにギャップ統計量が利用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
融解曲線データについて群の数を決定することが、真のクラスターを有さないと分かっているデータに対するクラスターの質の測定の比較を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
クラスターの質の測定が、以下の式を適用して決定される、請求項９又は１０に記載の方法：
【数２】
0005805535.tif 000038
式中、Ｃｊはｊ−ｔｈクラスターであり、かつ
【数３】
0005805535.tif 000039
はその中心である。
【請求項１２】
融解曲線データについて群の数を決定することが以下の工程を含む、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法：
（ｉ）観察されたデータをクラスタリングし、クラスターｋ＝１，２・・・・最大Ｋに対するＫの数を変化させ、及び各ｋについてＷｋを計算すること；
（ｉｉ）Ｂランダム参照データセットを生成し、及び工程（ｉ）のようにそれぞれをクラスタリングし、ｋ＝１，２，・・・Ｋかつｂ＝１，２、・・・ＢについてＷｋｂを計算すること；
（ｉｉｉ）以下の式を適用して各ｋについてギャップ統計量及び標準誤差を計算すること：
【数４】
0005805535.tif 000040
及び
【数５】
0005805535.tif 000041
；並びに
（ｉｖ）Gap（ｋ）≧Gap（ｋ＋１）−ｓｋ+1となるように最小のｋであるクラスター
【数６】
0005805535.tif 000042
の数を選択すること。
【請求項１３】
融解曲線データについて群の数を決定するためにベイズ情報量基準解析が利用される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記融解曲線データが既知の物質のためのものであり、かつ前記クラスタリングが線形判別分析を利用して融解曲線データを群にクラスタリングする、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記クラスタリングが、典型性指標を利用して融解曲線データを群に割り振る、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記融解曲線及び前記クラスタリングが事後クラス確率を利用して融解曲線データを群にクラスタリングする、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
以下を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を融解曲線データの解析のためのコンピュータが実施するシステム：
生の高解像度融解データを取り込む取り込み手段；及び
取り込んだデータを構文的に解析する構文解析手段。
【請求項１８】
ユーザーが非特異的な増幅産物の領域を回避できるようにするクロッピング手段をさらに含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
ユーザーが試料を選択できるようにする試料選択手段、及び試料選択に続いてユーザーが教師付きデータセットの解析又は教師なしデータセットの解析のどちらかを選択できるようにするモード選択手段をさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
ユーザーが教師なしデータセットを解析することを選択した場合、ｋ−平均クラスタリング、ギャップ統計量又はその両方を介して最適なクラスター数と最適な主成分の数とを選択するパラメータ選択手段をさらに含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
ユーザーが教師付きデータセットを解析することを選択した場合、ユーザーが各遺伝子型について適切な対照を選択できるようにする対照選択手段をさらに含み、その際、各群について２を超える対照を使用する場合には線形判別分析が用いられ、及びクロス検定関数を介して主成分の適切な数を決定し、並びに単一の対照が起動する場合には線形判別分析を用いた再計算によって実施される試料の群への最近傍分類が用いられる、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
以下の工程を含む、融解曲線データの解析の方法、但し、融解曲線データは、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）の融解曲線データである：
（ａ）熱サイクラーを用いて融解曲線データを生成すること；
（ｂ）コンピュータ上の電子ファイルに融解曲線データを保存すること；
（ａ）コンピュータのメモリにおいて、融解曲線データをパラメータモデルフィッティングすること；
（ｂ）コンピュータのメモリにおいて、融解曲線データの主成分分析を実施すること；
（ｃ）融解曲線データを群にクラスタリングするために主成分を利用すること。
【請求項２３】
コンピュータを、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法を実施する手段として機能させるためのコンピュータプログラム。
【請求項２４】
コンピュータを、生の高解像度融解データを取り込むように準備された取り込み手段、及び取り込んだデータを構文的に解析するように準備された構文解析手段として更に機能させるための請求項２３に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２５】
コンピュータを、ユーザーが非特異的な増幅産物の領域を回避できるように準備されたクロッピング手段として更に機能させるための請求項２３又は２４に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２６】
コンピュータを、試料選択手段、及び試料選択に続いてユーザーが教師付きデータセットの解析又は教師なしデータセットの解析のどちらかを選択できるように準備されたモード選択手段として更に機能させるための請求項２３から２５のいずれか１項に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２７】
コンピュータを、ユーザーが教師なしデータセットを解析することを選択した場合、ｋ−平均クラスタリング及びギャップ統計量を介して最適なクラスター数と最適な主成分の数とを選択するように準備されたパラメータ選択手段として更に機能させるための請求項２６に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２８】
コンピュータを、ユーザーが教師付きデータセットを解析することを選択した場合、ユーザーが各遺伝子型について適切な対照を選択できるように準備された対照選択手段として更に機能させるためのコンピュータプログラムであって、その際、各群について２を超える対照を使用する場合には線形判別分析が用いられ、及びクロス検定関数を介して主成分の適切な数を決定し、並びに単一の対照が起動する場合には線形判別分析を用いた再計算によって実施される試料の群への最近傍分類が用いられる、請求項２６又は２７に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２９】
請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法を実施する際の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を実施した後の試料における二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の特定配列を同定することに関するものであり、特にそれに関連する融解曲線の解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した後の試料における二本鎖ＤＮＡの特定配列を同定することは困難であることが多い。試験条件、試料の大きさ及び測定の回数を含む多数の変数が、データの解析を困難にする頻繁な低いシグナル対ノイズ比に影響を及ぼす。
【０００３】
ＰＣＲは当該技術分野で周知であり、一般に、特定のポリヌクレオチド鋳型配列を増幅するためのインビトロ法を指す。ＰＣＲの技法は、ＰＣＲ：実用的アプローチ（PCR: A Practical Approach）、エム・ジェー・マックファーソンら（Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）、ＩＲＬ出版（IRL Press）（１９９１）；ＰＣＲプロトコール：方法と応用の指針（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）、イニス(Innis)らによる、アカデミック・プレス(Acedemic Press)（１９９０）;及びＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅のための原理と応用(PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification)、エイチ・エー・エリック(H. A. Erlich)、ストックトン・プレス（Stockton Press）(1989)を含む多数の出版物に記載されている。
【０００４】
ｄｓＤＮＡに結合した際、一部の色素は蛍光を高めるので、ｄｓＤＮＡと結合する色素の使用は試料中のｄｓＤＮＡの同定を容易にすることができる。ＳＹＢＲグリーンＩは試料中でｄｓＤＮＡを同定するのに使用されるこの特性を持つ色素の周知の例である。そのような色素の蛍光シグナルは試料中のｄｓＤＮＡの総量に比例する。融解曲線と共にそのような色素を使用することは試料中のｄｓＤＮＡの特定配列を同定する能力を高める。
【０００５】
融解曲線は、温度の関数として特定の試料の蛍光を測定する。ｄｓＤＮＡ配列の融解温度は、ｄｓＤＮＡ配列の半分が一本鎖ＤＮＡに解離する温度である。解離又は変性は、ｄｓＤＮＡの個々の鎖が一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に分離する工程である。異なったｄｓＤＮＡ配列は異なった融解温度を有することが多く、かつｄｓＤＮＡに結合しない場合には色素の蛍光が減少するという複合効果によって、融解曲線に由来する蛍光シグナルが、ＰＣＲ後試料で見い出されるｄｓＤＮＡ配列を決定するのに役立つように使用されることが可能になる。
【０００６】
ＰＣＲ機器からの融解曲線の生データは、通常、各試料について１つの、融解曲線のセットから成る。通常、フルオロフォアはｓｓＤＮＡ鎖を分離する（融解する）ことによって放出された後に消光するので、融解曲線は温度の上昇と共に低下する蛍光測定から成る。融解には増幅相が先行し、このことと開始試料の定量の限界（及びそのほかの因子）のために、融解曲線はすべて同一開始点から出発するわけではない。
【０００７】
アズベル（Ａｚｂｅｌ）[エム・ワイエー・アズベル(M. Ya Azbel),「ＤＮＡ配列と融解曲線」("DNA Sequencing and Melting Curve")、米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci.), 76(1), pp. 101-105, 1979]は、温度の関数として単一ＤＮＡドメインの融解の速度を議論している。以下のロジスティック方程式の形態を有する、（短い）ドメインのための理想化された融解曲線にこれを変換することができる。
【数１】
0005805535.tif 000002
式中、Ｔは温度であり、Ｔ0は融解の最大速度の温度であり、かつλは融解温度の広がりを制御する（推定上、加熱速度にも依存する）定数である。
【０００８】
実際には、この方程式は有効ではない。しかしながら、ｄｓＤＮＡについての情報を確認するために融解曲線の正確なモデルを得ることは重要である。
【０００９】
さらに、突然変異のスクリーニング及び発見のためのツールとして高解像度融解（ＨＲＭ）の出現と共に、さらに大きな試料サイズの高い自動処理を可能にするために分析技法が追求されつつある。今のところ、ＨＲＭは、融解曲線正規化の常法を利用し、通常その後、既知の対照を選択することによって生成される減法プロット(subtraction plot)が続く。既知の対照に対する試料の平均連結(average linkage)を用い、遺伝子型の呼び出しに使用される系統樹を生成することによってこれら減法プロットにおける集積的な、偏らないクラスター形成（agglomerative, unbiased clustering）を行う（[バンダースティーン・ジェー・ジー（Vandersteen JG）,ベイラク-トイデマー・ピー(Bayrak-Toydemir P),パライス・アール・エー（Palais RA）,ウィッター・シー・ティー(Wittwer CT), 「高解像度融解による共通する遺伝的変異体の同定」(Identifying common genetic variants by high-resolution melting )、クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem), 2007; 53(7): 1191-1198]を参照）。該方法は未知の試料の自動化された遺伝子型判定を可能にするが、既知の遺伝子型のものである未知の試料の可能性を示唆するために真の統計的情報（判別分析(discriminant analysis)又は「教師あり学習」("supervised learning")）も提供されないし、それは、未知の突然変異の発見に有用となる、存在する対立遺伝子の数の決定（クラスター分析又は「教師なし学習」("unsupervised learning")）も可能としない。
【００１０】
今までのところ、研究者らは、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen;ＨＬＡ）の型判定（[ゾウ・エル(Zhou L), バンダースティーン・ジェー(Vandersteen J), ワング・エル（Wang L）, フュラー・ティー(Fuller T), テイラー・エム(Taylor M), パライス・ビー(Palais B), ウィッター・シー・ティー(Wittwer CT),「ＨＬＡ遺伝子型の同一性を確立するための高解像度融解曲線の解析」("High-resolution DNA melting curve analysis to establish HLA genotypic identity"),ティシュー・アンチジェンズ(Tissue Antigens), 2004; 64(2): 156-164]を参照）、生物の分類（[ジェフェリー・エヌ(Jeffery N),ガッサー・アール・ビー(Gasser RB), スティアー・ピー・エー（Steer PA）,ノルモハマディ・エー・エイチ(Noormohammadi AH),「ｖｌｈＡ遺伝子の単一コピー領域の一本鎖構造多型及び高解像度融解曲線の解析を用いたマイコプラズマ・シノビアエ株の分類」("Classification of Mycoplasma synoviae strains using single-strand conformation polymorphism and high-resolution melting-curve analysis of the vlhA gene single-copy region"),マイクロバイオロジー(Microbiology), 2007; 153: 2679-2688]を参照）、ＤＮＡメチル化の検出及び定量（[ウジュダクズ・ティー・ケー(Wojdacz TK),ドブロビック・エー(Dobrovic A.),「ＤＮＡメチル化解析のための融解曲線アッセイ」("Melting curve assays for DNA methylation analysis"),メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods Mol Bio.) 2009; 507: 229-240]を参照）、候補となる素因遺伝子の同定（[サイツ・エイチ(Saitsu H),カトウ・エム（Kato M）,ミズグチ・ティー（Mizuguchi T）,ハマダ・ケー(Hamada K),オサカ・エイチ（Osaka H）,トヤマ・ジェー（Tohyama J）,ウルノ・ケー(Uruno K),クマダ・エス(Kumada S),ニシヤマ・ケー(Nishiyama K),ニシムラ・エー(Nishimura A),オカダ・アイ(Okada I),ヨシムラ・ワイ(Yoshimura Y),ヒライ・エス(Hirai S),クマダ・ティー(Kumada T),ハヤサカ・ケー(Hayasaka K),フクダ・エー(Fukuda A),オガタ・ケー(Ogata K),マツモト・エヌ(Matsumoto N),「ＳＴＸＢＰ１（ＭＵＮＣ１８−１）をコードする遺伝子におけるデノボ突然変異は早期の小児癲癇性脳症の原因となる」("De novo mutations in the gene encoding STXBP1 (MUNC18-1) cause early infantile epileptic encephalopathy"),ネイチャー・ジェネティクス(Nat Genet.), 2008; 40(6): 782-788]を参照）、体細胞後天性突然変異の比率（[クリパイ・エム(Krypuy M),ニューハム・ジー・エム(Newnham GM),トーマス・ディー・エム(Thomas DM),コンロン・エム(Conron M),ドブロビック・エー(Dobrovic A),「臨床試料における突然変異の迅速かつ感度の高い検出のための高解像度融解解析：非小細胞肺癌におけるＫＲＡＳコドンの１２及び１３の変異」("High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer"), ビーエムシー・キャンサー(BMC Cancer), 2006; 6:295]を参照）、突然変異の発見（[クリパイ・エム(Krypuy M),アーメド・エー・エー(Ahmed AA),エテマドモグハダム・ディー(Etemadmoghadam D),ハイランド・エス・ジェー(Hyland SJ); オーストラリアの卵巣癌研究グループ(Australian Ovarian Cancer Study Group)、デファジオ・エー(DeFazio A),フォックス・エス・ビー(Fox SB),ブレントン・ジェー・ディー(Brenton JD),ボウテル・ディー・ディー(Bowtell DD),ドブロビック・エー(Dobrovic A),「ＴＰ５３エクソン５〜８の突然変異走査のための高解像度融解」("High resolution melting for mutation scanning of TP53 exons 5-8"),ビーエムシー・キャンサー(BMC Cancer),2007; 7: 168-181]を参照）、集団における対立遺伝子保有率(allelic prevalence)（[ポラコバ・ケー・エム(Polakova KM),ロポトバ・ティー(Lopotova T),クラモバ・エイチ(Klamova H),モラブコバ・ジェー(Moravcova J.)「高解像度融解曲線の解析：ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインにおける突然変異の最初のスクリーニング」("High-resolution melt curve analysis: initial screening for mutations in BCR-ABL kinase domain"),ロイケミア・リサーチ(Leuk. Res.) 2008; 32(8): 1236-1243]を参照）、及びＤＮＡフィンガープリンティング（[ゲイル・エヌ(Gale N),フレンチ・ディー・ジェー(French DJ),ホワード・アール・エル(Howard RL),マクドウェル・ディー・ジー(McDowell DG),デベナム・ピー・ジー(Debenham PG),ブラウン・ティー(Brown T),「ハイビーコン（ＨｙＢｅａｃｏｎ）融解によるヒトゲノムにおけるＳＴＲｓの迅速型判定」("Rapid typing of STRs in the human genome by HyBeacon melting"),オーガニック・アンド・バイオモレキュラー・ケミストリー(Org. Biomol. Chem), 2008; 6(24): 4553-4559]）のように多様な応用にＨＲＭを適用することができている。調査される対立遺伝子を含有するＤＮＡ断片の増幅に続いて、１つの試料の相対的な融解曲線の形状及び位置を別の試料と比較することによって、ＨＲＭは、遺伝子型の識別を可能にする（[ウィッター・シー・ティー(Wittwer CT),リード・ジー・エイチ(Reed GH),グランドリー・シー・エヌ(Grundry CN),バンダースティーン・ジェー・ジー(Vandersteen JG),プリヨール・アール・ジェー(Pryor RJ),「ＬＣグリーンを用いたアンプリコンの融解解析による高解像度の遺伝子型判定」("High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen"),クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem), 2003; 49: 853-860]を参照）。１つの融解曲線から別の融解曲線の形状及び位置の変動は、そのほかの反応変数と共に、アンプリコンの長さ、グアニン−シトシン（ＧＣ）の含量、バッファー条件及びヘテロ二本鎖のランダムな生成に左右される（[リリー・ケー・エム(Ririe KM),ラスムセン・アール・ピー(Rasmussen RP),ウィッター・シー・ティー(Wittwer CT),「ポリメラーゼ連鎖反応の間でのＤＮＡ融解曲線の解析による産物の区別」("Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction"),アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochem.), 1997; 245: 154-160]又は[ウィッター・シー・ティー(Wittwer CT),リード・ジー・エイチ(Reed GH),グランドリー・シー・エヌ(Grundry CN),バンダースティーン・ジェー・ジー(Vandersteen JG), プリヨール・アール・ジェー(Pryor RJ),「ＬＣグリーンを用いたアンプリコンの融解解析による高解像度の遺伝子型判定」("High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen"),クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem.), 2003; 49: 853-860]を参照）。ヘテロ二本鎖の形成によって試料の中でヘテロ接合体及びさらに複雑な変異の検出が可能になる。ポリメラーゼ連鎖反応の間での冷却の期間に、変性した鎖の再会合は、たとえば、一塩基変異多型（ＳＮＰ）のような小規模なヌクレオチド変異の対立遺伝子の間でミスマッチを生じ得る（[ジェンセン・エム・エー(Jensen MA),ストラウス・エヌ(Straus N),「細菌のリボゾームＤＮＡのスペーサー領域の増幅におけるヘテロ二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ産物の形成に対するＰＣＲ条件の影響」("Effect of PCR conditions on the formation of heteroduplex and single-stranded DNA products in the amplification of bacterial ribosomal DNA spacer regions"),ピーシーアール・メソッズ・アンド・アプリケーションズ(PCR Methods Appl.), 1993; 3: 186-194]を参照）。これらのミスマッチは、一致した鋳型の解離に先立って低温で変性するので、二重の屈曲を伴った融解曲線を生じる（[リード・ジー・エイチ(Reed GH),ウィッター・シー・ティー(Wittwer CT),「高解像度融解解析による一塩基変異多型の走査の感度及び特異性」("Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis"),クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem.), 2004; 50(10): 1748-1754]を参照）。ヌクレオチド対と近隣との間で最低のエネルギーを持つアンプリコンがより早く変性するので、ホモ接合体の変異は曲線の位置における変化を生じるが、この方法は、機器依存性であり、０．０５℃未満の温度均一性と０．１℃未満の温度分解能とを必要とする（[リュー・エム(Liew M),プリヨール・アール(Pryor R),パライス・アール(Palais R),ミドウズ・シー（Meadows C）, エラリ・エム(Erali M),リオン・イー(Lyon E),ウィッター・シー(Wittwer C),「小さいアンプリコンの高解像度融解による一塩基変異多型の遺伝子型判定」("Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons"),クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem.), 2004; 50(7): 1156-1164]又は[ハーマン・エム・ジー(Herrmann MG),ダートッシュイ・ジェー・ディー(Durtschi JD),ブロムレイ・エル・ケー(Bromley LK),ウィッター・シー・ティー(Wittwer CT),ボエルカーディング・ケー・ブイ(Voelkerding KV),「突然変異の走査及び遺伝子型判定のためのアンプリコンＤＮＡの融解解析：機器及び色素のクロスプラットホーム比較」("Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes"),クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem.), 2006; 52(3): 494-503]を参照）。現在のＨＲＭソフトウエアパッケージは、これらの変異を曲線の形状及び位置でプロットすることができるが、教師付きデータセット及び教師なしデータセットの双方についてこれらの差異を統計学的に定量する能力を提供しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、従来技術の短所の少なくとも１つを克服する若しくは改善すること、又は有用な代替の融解曲線解析を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の種々の態様によれば、このニーズは、独立請求項１の特徴によって定義されるような融解曲線データの解析のコンピュータが実施する方法、独立請求項１７によって定義されるようなコンピュータのプログラム、及び独立請求項２３の特徴によって定義されるような装置によって解決される。この文脈で融解曲線データは、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、タンパク質などの融解曲線データに関する。本発明の好ましい実施形態は従属項の主題である。
【００１３】
実施形態の１つでは、本発明は、以下の工程を含む、コンピュータが実施する方法を提供する：（ａ）融解曲線データをパラメータモデルフィッティングすること、（ｂ）融解曲線データの主成分分析を実施すること、（ｃ）融解曲線データを群にクラスタリングするために主成分を利用すること。方法は、言及された工程の順で必ずしも行われる必要はない。工程（ａ）〜工程（ｃ）のそのほかの順も可能であり、その際、言及された順は好ましい実施形態である。本発明に係る方法によって融解曲線の形状及び位置における変異の効率的な解析が可能になり、教師付き及び教師なしのデータセット双方についてこれらの変異を統計的に定量することが可能になる。現在の融解解析法は、各未知のものの統計的測定も可能にしないし、教師なしデータセット（すなわち、存在する群の未知の数）の決定も可能にしない。本発明に係る方法は特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した後の試料におけるｄｓＤＮＡの特定配列を同定するのに有利であり得る。
【００１４】
一の実施形態では、工程（ａ）は、以下の形式のモデルに融解曲線データをフィッティングすることを含む：
【数２】
0005805535.tif 000003
式中、Ａは最小の観察された蛍光の推定値であり、Ｂ及びＣは融解曲線の初期部分の切片及び傾きの推定値であり、Ｔ0は融解曲線の最大（負）の傾きの点として推定され、かつλはおよそ２である。融解曲線のそのようなモデルを用いて、より理想化され、かつ比較できる形態への実際の融解曲線の効率的な正規化が可能である。
【００１５】
別の実施形態では、工程（ａ）は最良のフィット（適合）の線への融解曲線のスケーリングを含む。そのような工程（ａ）は、主成分の抽出後の最終結果に影響を与えうる融解曲線の特徴における喪失を防ぐことができる。好ましくは、融解曲線は、最高の蛍光値が約１００であり、かつ最低の蛍光値が約０となるように計測（スケール）される。さらに、融解曲線の転移の前の融解曲線データの領域及び融解曲線の転移に続く融解曲線データの領域が好ましくは選択され、平均の蛍光値が好ましくは算出される。好ましくは、鋳型対照(template control)は解析から除かれない。そのような工程（ａ）を適用して、高い事後確率及び典型性を伴ったクラスター及び試料すべての正確な呼び出しを達成することができる。
【００１６】
好ましくは、少なくとも最初の２つの主成分が工程（ｃ）で利用される。主成分分析によって融解曲線データセットの範囲内で特徴の決定が可能になる。融解曲線の解析のほかの方法は、曲線間の平均の距離を単に比較するので、試料を統計的に定義することができず、又はデータセット内にどれだけ多くの群が存在してもよいのかを検出することができない。好ましくは、前記クラスタリングは、ｋ−平均クラスタリング(k-means clustering)又は階層的クラスタリング(hierarchical clustering)によって生じる。ｋ−平均クラスタリングの方法は、系統樹を用いた群の単純な決定とは対照的に、合理的な方法で存在する多数の群を検出する利点を提供する。ギャップ統計量と組合せたK−平均によって存在するクラスターの真の数の決定が可能になり、クラスターの数が知られる場合、系統樹は単に試料をグループ分けすることができる。
【００１７】
好ましくは、融解曲線データについて群の数を決定するためにギャップ統計量を利用する。そのような方法は、好ましい数のクラスターと主成分の次元性の適切な検出を提供することができる。従って、融解曲線データに関して群の数を決定することは好ましくは、真のクラスターを有さないと分かっているデータに対するクラスターの質の測定の比較を含む。特に、クラスターの質の測定は好ましくは、以下の式を適用して好ましくは決定することができる。
【数３】
0005805535.tif 000004
式中、Ｃjはｊ−ｔｈクラスターであり、かつ
【数４】
0005805535.tif 000005
はその中心である。
【００１８】
従って、融解曲線データについて群の数を決定することは好ましくは、以下の工程を含む：（ｉ）観察されたデータをクラスタリングし、クラスターｋ＝１，２・・・・最大Ｋに対するＫの数を変化させ、及び各ｋについてＷkを計算すること；（ｉｉ）Ｂランダム参照データセットを生成し、及び工程（ｉ）のようにそれぞれをクラスタリングし、ｋ＝１，２，・・・Ｋかつｂ＝１，２、・・・ＢについてＷkbを計算すること；（ｉｉｉ）以下の式を適用して各ｋについてギャップ統計量及び標準誤差を計算すること：
【数５】
0005805535.tif 000006
及び
【数６】
0005805535.tif 000007
；並びに（ｉｖ）Gap（ｋ）≧Gap（ｋ＋１）−ｓk+1となるように最小のｋであるクラスター
【数７】
0005805535.tif 000008
の数を選択すること。それに関して、方法は、工程（ｉ）〜（ｉｖ）の言及された順で必ずしも実施される必要はない。工程（ｉ）〜（ｉｖ）のほかの順も可能であるが、その際、言及された順は好ましい実施形態である。
【００１９】
実施形態の１つでは、融解曲線データについて群の数を決定するためにベイズ情報量基準解析(Bayes Information Criterion analysis)を利用する。そのような方法もまた、クラスターの好ましい数及び主成分の次元性の効率的な検出を提供する。
【００２０】
好ましくは、前記融解曲線データは既知の物質のためのものであり、前記クラスタリングは線形判別分析（linear discriminant analysis;ＬＤＡ）を利用して融解曲線データを群にクラスタリングする。データが多変量正規分布を有し、各クラスが同一の分散／共分散マトリクスを有するが、異なった平均値を有する場合、有利な分類としてこれを使用することができる。特に、ＬＤＡは効果的かつ効率的な分類子となり得る。
【００２１】
好ましくは、前記クラスタリングは、典型性指標(typicality index)を利用して融解曲線データを群に割り振る。これまで、未知の試料がどのように上手く特定の群に属するのかについての手段はない。これによって特に、診断的性質であってもよいアプリケーションにおいて未知のものの統計的評価(statistical qualification)を可能にすることができる。さらに、前記融解曲線及び前記クラスタリングは事後クラス確率を利用して融解曲線データを群にクラスタリングする。同様に、未知のものを、どの群それらが属してよいのかを評価することを可能にする方法は存在しない。典型性に関しては、未知の試料の統計的評価が、診断的応用において融解曲線解析について利点を有することができる。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、上述の方法を実施するための手段を含むコンピュータプログラムを取り扱う。本明細書では、用語「コンピュータプログラム」は、コンピュータプログラムがどんな種類のコンピュータプログラム製品に相当してもよいように、用語「ソフトウエア」「コンピュータ用プログラム」などと同義に使用される。コンピュータプログラムは、ほかのハードウエアとともに、又はその一部として供給される光学式記憶媒体又は固体式媒体などの適切な媒体に保存/配布されてもよいが、たとえば、インターネット又はそのほかの有線の若しくは無線の通信システムを介したそのほかの形態で配布されてもよい。そのようなコンピュータプログラムによってユーザーは、分子生物学の種々のアプリケーションにおいてＨＡＭのデータセットから未知のものの教師付き及び教師なし双方の遺伝子型判定を達成することができ、最終目標として診断設定において複数の実行ファイルを可能にする。
【００２３】
好ましくは、コンピュータプログラムは、生の高解像度融解データを取り込むように準備された取り込み手段と、取り込んだデータを構文的に解析するように準備された構文解析手段とを含む。そのような取り込み手段によって、記録されたデジタルデータの効率的かつ好都合なさらなる処理を達成することができる。特に、そのほかのソフトウエアからのデータ、たとえば、ロター-ジーン(Ｒｏｔｅｒ−Ｇｅｎｅ)ソフトウエア[ロター-ジーン・キュー(Rotor-Gene Q),バージョン1.7,コルベット・リサーチ(Corbett Research), 2008]からの生ＨＲＭプロット及び特にその特徴が記述されたスプレッドシートは、自動的にコンピュータプログラムに組み込まれてもよい。コンピュータプログラムの取り込み手段は、正確なデータが処理されていることを確実にするために、データの構文的解析のための構文解析手段を有することもできる。さらに、コンピュータプログラムは好ましくは、ユーザーが非特異的な増幅産物の領域を回避できるように準備されたクロッピング手段(cropping means)を含む。
【００２４】
一の実施形態では、コンピュータプログラムは、試料選択手段と、試料選択に続いてユーザーが教師付きデータセットの解析又は教師なしデータセットの解析のどちらかを選択できるように準備されたモード選択手段を含む。これによって効果的な正規化を保証することができる。従って、コンピュータプログラムは好ましくは、ユーザーが教師なしデータセットを解析することを選択した場合、ｋ−平均クラスタリング及び／又はギャップ統計量を介して最適なクラスター数と最適な主成分の数とを選択するように準備されたパラメータ選択手段を含む。好ましくは、コンピュータプログラムは、ユーザーが教師付きデータセットを解析することを選択した場合、ユーザーが各遺伝子型について適切な対照（コントロール）を選択できるように準備された対照選択手段も含み、その際、各群について２を超える対照を使用する場合には線形判別分析が用いられ、及びクロス検定関数を介して主成分の適切な数を決定し、並びに単一の対照が起動する場合には線形判別分析を用いた再計算によって実施される試料の群への最近傍分類が用いられる。
【００２５】
本発明の別のさらなる態様は、上述の方法を実施する際の装置を取り扱う。好ましくは、そのような装置は、上述のコンピュータプログラムを含むコンピュータシステムとして準備される。そのようなコンピュータシステムによって正確かつ迅速な態様で本発明に係る方法を効率的に実施することができる。
【００２６】
添付の図面を参照して例のみにより今や本発明の実施形態が説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の好ましい実施形態の工程のフローチャートを示す図である。
【図２】第５因子ライデン（Ｇ１６１９Ａ）遺伝子型についての正規化曲線を示す図である。
【図３Ａ】教師なし分析について好ましい主成分（ＰＣ）の次元性を決定することを示す図である。
【図３Ｂ】教師なし分析について好ましい主成分（ＰＣ）の次元性を決定することを示す図である。
【図４】合成されたＡからＴへのＳＮＰの教師なしクラスタリングを示す図である。
【図５】ＴＨ０１のＳＴＲの教師なしクラスタリングを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で開示される実施形態は、高解像度ＤＮＡ融解曲線（ＨＲＭ）の改善された解析を提供する方法、該方法を実施するためのコンピュータプログラム、及び該方法を実施する装置を提供する。好ましい実施形態は、以下の工程を含む：
ＨＲＭ曲線の融解曲線パラメータモデルフィッティングと、
既知の場合によって定義される群へのＨＲＭ曲線の自動呼び出しと、
ＨＲＭ曲線の群への新規(デノボ；de novo)クラスタリング。
【００２９】
開示される方法論は機器の一回の実行を伴う使用ために利用することができるので、９６までの試料が含まれることが予想される。好ましい実施形態は複数回の実行からのデータの解析にも好適である。
【００３０】
先ず、本発明の最初の例となる実施形態を参照すると、図１に示すように好ましい実施形態の１０の工程のフローチャートがある。最初に、１.データを正規化し、２.その後、主成分を抽出するプロセスが続き、３.群当たりの既知の試料の数によって、４.データをクラスタリングするか、５.最近隣法(Nearest Neighbour)を用いて分類するか、又は６.ＬＤＡ法を用いて分類する。
【００３１】
ＨＲＭデータの取得
所与の体積及び濃度の、リバースプライマー及びフォワードプライマーとしてのアンプリコン特異的オリゴヌクレオチド、挿入色素（インターカレーティング色素）、反応バッファー、塩化マグネシウム、デオキシリボヌクレオチド並びにＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた設定でＨＲＭデータを取得することができる。試料は所定の濃度の精製されたＤＮＡの形態であることができる。目的の配列を増幅するために反応をサイクルさせることができ、通常、熱サイクラー(サーマル・サイクラー；thermal cycler)（ロター‐ジーン・キュー（Rotor-Gene Q）,コルベット・リサーチ（Corbett Research）,オーストラリア（Aus））を用いて実施される。所定の数のサイクルに続いて、ＨＲＭ機能を有する同一の熱サイクラー(サーマル・サイクラー；thermal cycler)（たとえば、ロター‐ジーン・キュー（Rotor-Gene Q））において、所定の融解プロファイルを用いて増幅された配列を変性させることができる。融解のプロセスの間、チャンバーの温度は所定の増分（通常、＞０．１℃）を超えて増加させることができ、その間、機器において挿入色素の時間蛍光レベルを測定する。このプロセスには、所定の光源（たとえば、発光ダイオード）からの所定の励起光波長を用いて蛍光色素を励起することが含まれ、それは、所定のフィルターを用いることによってさらに狭められる。励起光源は、所定の光波長で光を放射する蛍光色素を励起する。所定の照射フィルター（emission filter）及び照射検出器(emission detection device)（たとえば、光電子増倍管）を介して照射を検出することができる。二本鎖増幅産物の解離に先立って、挿入色素をＤＮＡに結合することができ、励起の際、所定の周波数で光を放射する。融解の間、挿入色素が放出されるのを引き起こす所定の温度範囲の間でＤＮＡ産物は解離する。色素の放出の際、さらなる励起は、蛍光照射の有意に低いレベルを生じる。蛍光におけるそれに続く低下を測定し、温度に対してプロットして各所定の試料について融解曲線を生成することができる。このＨＲＭデータはデジタル形式で取得し、電子ファイルとして保存することができる。それは、本発明のソフトウエアがその解析を実行するのに用いることができる高解像度融解の電子ファイルである。
【００３２】
正規化１
方程式１に内在する主な前提の１つは、蛍光は温度に無関係な様式で融解していないＤＮＡの量に比例するということである。実際、この前提は有効ではなく、バックグラウンドの程度に加えて蛍光自体が温度に影響される。
【００３３】
特定の実施形態では、正規化プロセスでは修正した方程式が使用される。一定のバックグラウンドＡ、及びフルオロフォア固有の温度依存性に対する線形近似を用いることによって、単一ＤＮＡドメインの融解曲線のための以下の大きく経験的なモデルが与えられる：
【数８】
0005805535.tif 000009
【００３４】
当然、実際、試料は混合物（たとえば、ヘテロ接合体）及びさらに複雑なシナリオを含有してもよく、これは、さらに複雑な融解曲線を生じるであろう。しかしながら、方程式２は、さらに理想化された（したがって、比較可能である）形態に実際の融解曲線を正規化する目的のためには十分であると考えられる。
【００３５】
レーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）アルゴリズム［ディー・ダブリュ・マルカート（D.W. Marquardt）,「非線形パラメータの最小二乗推定のためのアルゴリズム」("An Algorithm For Least-Squares Estimation Of Nonlinear Parameters"),ジャーナル・オブ・インダストリアル・アンド・アプライド・マスマティックス(J. Soc. Indust. Appl. Math.), 11(2), 1963］を用いた最小二乗法によって方程式２を各個々の融解曲線にフィッティングさせる。最小二乗法は正規分布のための最大尤度と同等であるが、正規分布がこのデータにとって適切なモデルであることは示唆されていない。事実、分散は幾分平均値に左右されると思われる。正規化の本目的では、最小二乗法が十分であると思われる。
【００３６】
レーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）アルゴリズムは反復性であり、かつパラメータについて合理的なセットの初期値を必要とする。以下の初期値を使用することができる：
・Ａ（バックグラウンド）は最小の観察される蛍光として推定される。
・Ｂ及びＣは融解曲線の初期部分の切片及び傾きとして推定される。初期部分は最大曲率の点を探し、かつこの前のすべてのものを取ることによって決定される。
・Ｔ0は融解曲線の最大（負）の傾きの点として推定される。
・λは２という初期値に設定される。
【００３７】
いったん方程式２を特定の試料の融解曲線にフィッティングさせると、曲線の概要としてたった５つのパラメータを用いてそれを進行させてもよい。しかしながら、モデルは目的とする曲線の特徴をすべて捕捉するわけではないので、さらに経験的なアプローチが採用される。すなわち、モデルからの残りを計算し、理想化された融解曲線に戻し加えて正規化されたデータセットを作製する。
【００３８】
数学的には、｛ｙT｝が生の融解曲線からの蛍光値の列であると仮定する。
【数９】
0005805535.tif 000010
を生データにフィッティングさせた後の方程式２の値とする。正規化されたデータ
【数１０】
0005805535.tif 000011
は以下によって定義される：
【数１１】
0005805535.tif 000012
【００３９】
ここでは、１００のデータ値を使用するが、一部のデータセットについてはより適切な値があってもよい一方で、又は最大値１００までの生データの初期スケーリングが適切であってもよい。課題は、不適切な値が使用されたら、残りは幾分圧倒されうるということであるが、以下で議論される特徴抽出は実際での主な問題を防ぐと思われる。
【００４０】
主成分の抽出２
正規化されたデータは今や各データセットについて比較可能な基準にあるが、完全な融解曲線では、役立つように続行するには通常過度に多い情報がある。前に述べたように、方程式２の５つのパラメータの一部又は全部を特徴として使用することができるが、これは、データの一部の重要な特性（たとえば、ヘテロ接合性）を捕捉できないかも知れない。
【００４１】
実施形態の１つでは、さらに経験的なアプローチが利用される。第１に、データの差異を利用する。これは、融解曲線間の差異が変化のスケールの比率で強調されるからである。第２に、主成分分析の形態を使用して各（異なった）融解曲線について少数の特徴を抽出する。主成分分析は、第１の主成分として試料の中で最も変動を示すデータベクトルの線形結合を選択する。
【００４２】
再び数学的に、
【数１２】
0005805535.tif 000013
として、式中、Ｔi-1は、温度Ｔiの直前に測定される温度である。次いでこの試料についての第１の主成分のスコアが以下であり：
【数１３】
0005805535.tif 000014
式中、｛ａi｝はＰＣ1が試料全体で最大の変動を示すように選択される。次いで、先行する成分に直交する変動性対象を最大化するそれら線形結合として、後続の主成分を定義することができる。たとえば、
【数１４】
0005805535.tif 000015
であり、式中、｛ｂi｝は、ＰＣ2が試料全体で最大の変動を示し、かつΣiａiｂi＝０となるように選択される。主成分の計算には本質的に固有値問題が含まれ、それらは特異値分解を用いて効率的に計算することができる（たとえば、ゴラブ（Ｇｏｌｕｂ）[ジー・エイチ・ゴラブ（G.H. Golub）及びシー・エフ・バン・ローン（C.F. Van Loan）,「マトリクス計算」("Matrix Computations")、ジョンスホプキンス大学出版(Johns Hopkins University Press)、1996 (第３版)]又はプレス(Ｐｒｅｓｓ)ら[ダブリュ・エイチ・プレス(W.H. Press),ビー・ピー・フラネリー(B.P. Flannery),エス・エー・テウコルスキー(S.A. Teukolsky)及びダブリュ・ティー・ヴェターリング(W.T. Vetterling),「Ｃにおける数値のレシピ」(Numerical Recipes in C"),ケンブリッジ大学出版(Cambridge University Press)、1988]を参照）。各温度についてロードする主成分があるので（たとえば、ａiは、ｉ−ｔｈの温度Ｔiに相当する）、｛ａi｝を温度の関数として考え、それをプロットすることが可能である。
【００４３】
別の方法では、これらの主成分の関数（又は曲線）が幾分平坦であることをさらに特定することも可能である。これは平坦主成分として知られる分析をもたらす（ラムセイ(Ｒａｍｓａｙ)及びシルバーマン(Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ)[ジェー・オー・ラムセイ(J.O. Ramsay)及びビー・ダブリュ・シルバーマン(B.W. Silverman),「機能的なデータ解析」スプリンガー(Springer), 1997]を参照）。これは、特異値分解の改変された形態をもたらす。
【００４４】
いったん、主成分スコアを計算すると、数を選択して使用する。本実施例では、２又は３が最も有用であると判明している。
【００４５】
クラスター分析及びギャップ統計量４
クラスター分析の目的は、既知の標識を有する試料なしでデータにおいて新規 (デノボ；de novo) の群を見つけ出すことである。２つの主な種類のクラスター分析を使用することができる：
・ｋ−平均クラスター分析は、事前に特定される所望のクラスターの数及び定義された初期クラスターの中心を必要とする短所はあるが、相対的に単純な実施という長所を有する。
・単一リンク階層的クラスタリング(single link hierarchical clustering)：階層的クラスタリングは、自身のクラスターにおける各試料で出発して試料すべてを含有する単一のクラスターまでのネスト化されたクラスター（nested cluster）の完全なセットを作製する。効率的な実施の困難さの異なった程度を伴った複数の変異体がある（９６試料の最大値について、力ずくのアプローチが十分らしいが）。所望のクラスターの数は事後に選択される。
【００４６】
ｋ−平均
ｋ−平均クラスタリングのアルゴリズムは以下のように進行する。ｋ個のクラスターを必要とし、かつｋ個のクラスターの中心を提案していると仮定する−可能性の１つは、データセットから無作為に選択された試料である。次いで各試料は最近傍のクラスター中心に割り振られる。次いで、割り振られた試料によって定義されるクラスターの中心として中心が再計算され、アルゴリズムが繰り返し適用される。この基本的アルゴリズムに作られ得る多数のさらなる改変がある。
【００４７】
階層的クラスタリング
上述のように、階層的クラスタリングは自身のクラスターにおける各試料と共にｎ個のクラスターを定義する（ｎ試料ある場合）ことによって出発する。次いで、試料すべてを含有するたった１つのクラスターが残るまでクラスターを統合させる。次いで、統合するクラスターの階層を用いて所望のクラスターの数ｋについてクラスターのセットを見つけ出すことができる。一般に、各段階で、最も近い２つのクラスターが統合される。これを行うには、試料間に距離があるのなら、クラスター間の距離を定義することが必要である。一般的な３つの定義は：
・２つのクラスター間の距離が、各クラスターにおける試料を伴う試料の対の間の距離の最小である単一リンク又は最小リンク。
・２つのクラスター間の距離が、各クラスターにおける試料を伴う試料の対の間の距離の最大である完全リンク又は最大リンク。
・２つのクラスター間の距離が、各クラスターにおける試料を伴う試料のすべての対の間の距離の平均である平均リンク。
【００４８】
ギャップ統計量
クラスターの数の選択は、クラスター分析の困難な一面となり得る。クラスターの数を選択することに対する考えられる指針としてギャップ統計量が提案された[アール・チブシラニ(R. Tibshirani),ジー・ワルサー(G Walther)及びティー・ハスティー(T. Hastie),「ギャップ統計量を介したデータセットにおけるクラスターの数の推定」("Estimating The Number Of Clusters In A Data Set Via The Gap Statistic"),ジャーナル・オブ・ローヤル・ステティスティカル・ソサイアティ・シリーズ・ビー（J. R. Statist. Soc. B）, 63(2), pp. 411-423, 2001]。主な考えは、クラスターの質の測定を見て、真のクラスターを有さないことが分かっている類似するデータのそれと比較することである。使用されるクラスターの質の測定は一般にクラスターの平方和：
【数１５】
0005805535.tif 000016
の範囲内であり、式中、Ｃjはｊ−ｔｈクラスターであり、かつ
【数１６】
0005805535.tif 000017
はその中心（平均値）である。参照データの選択の１つは、元々のデータを含有するボックスに関して均一にランダムに生成されたデータである。これは主成分の空間（スペース）で行われることが多いが、我々の特徴はすでに平坦化された主成分スコアなので、それはこのアプリケーションには必要ではない。従ってアルゴリズムは以下である。
【００４９】
工程１：クラスターの数ｋ＝１、２、・・・何らかの最大ＫについてＫを変化させ、観察されたデータをクラスタリングし、各ｋについてＷｋを計算する。
【００５０】
工程２：無作為参照データセットＢを生成し、工程１のようにそれぞれをクラスタリングし、ｋ=１、２、・・・Ｋ及びｂ＝１、２、・・・ＢについてＷｋｂを計算する。
【００５１】
工程３：各ｋについてギャップ統計量及び標準誤差を計算する：
【数１７】
0005805535.tif 000018
【数１８】
0005805535.tif 000019
【００５２】
工程４：Ｇａｐ（ｋ）≧Ｇａｐ（ｋ＋１）−ｓk+1となるように、最小ｋであるクラスターｋ’の数を選択する。
【００５３】
試料のクラスタリングと共に２つの目立った問題がある。第１は、使用する主成分次元の数の選択であり、第２は、ギャップ統計量の自動化された使用である。好適な結果を示す初期試験は二次元及び三次元でギャップ統計量を用いて達成することができる。一般に、より多数の小さなクラスターがある場合、三次元が必要とされるが、より少数のより大きなクラスターについては、二次元でクラスター分析を実施することがより良好であると思われる。クラスターが小さい場合、ギャップ統計量を用いたクラスターの数の自動選択は問題があることが分かっているので、ユーザーの介入が許容可能であり、かつ得られるギャップ統計量を指針として用いることが推奨される。
【００５４】
ベイズ情報量基準（ＢＩＣ）
クラスターが同一（対角線）の分散マトリクスと共に球形に正規分布するとみなされる場合、ｋ-平均クラスター分析は、（およそ）最大尤度の推定量として理解され得る。パラメータｐの増えていく数とモデルを比較する場合の最大尤度の設定では、モデルの選択はベイズ情報量基準（ＢＩＣ）を用いて行われることがあるので、このことは有用である。一般に、ＢＩＣに使用される式は、
【数１９】
0005805535.tif 000020
であり、
式中、ｌｏｇｌｉｋmaxは、パラメータｐの所定の数についての最大化されたログ尤度であり、かつｎは試料の数である。この基準（ＢＩＣ）は次いで一般にｐについて最大化されてモデルを選択する。
【００５５】
我々の場合では、これは、
【数２０】
0005805535.tif 000021
となり、式中、ｄはデータの次元性であり、ｋはクラスターの数であり、かつ
【数２１】
0005805535.tif 000022
は全ての次元及びクラスターに共通する推定分散である。
【００５６】
ＢＩＣを考慮する理由は、教師付きの場合への一般化のその平易さであるが、実際には、これは有用であることが判明していない。
【００５７】
一部の既知の試料による分類
既知の群からの試料が同一の実行に含まれる既知の群に未知の試料を分類することの課題は、群の新規(デノボ；de novo)生成より上手く理解される。既知の試料による分類に好適な方法の１つは、線形判別分析である。
【００５８】
線形判別分析
線形判別分析は、データが多変量の正規分布を有する場合、好ましい分類子として生じ、各クラスは同一の分散/共分散マトリクスを有するが、平均値が異なる。実際、これらの仮定が有効ではないかも知れないとしても、線形判別分析（ＬＤＡ）は効果的かつ効率的な分類子である。
【００５９】
ｘをあるセットからの単一の試料（すなわち、ｐ＝２又はｐ＝３のいずれか）のｐ主成分スコアとする。次いでＬＤＡはｘの密度関数が以下の式によって与えられると仮定する。
【数２２】
0005805535.tif 000023
式中、μkは、クラスｋの平均値（中心）であり、かつΣは全てのクラスの分散/共分散マトリクスである。μk及びΣの双方が推定される必要がある。各群における既知の試料の数が２以上である場合、既知の試料を用いて形式的にこれらのパラメータを推定することができる。しかしながら、これより多くの既知の試料を有することが望ましく―おそらく、群当たり５以上がさらに良好な結果を生成する。群当たり既知の試料がない場合、そのときは、クラスター分析を利用することができる（教師なし）。群当たりたった１つの既知の試料がある場合（又は、実際、ほかの少数の既知の試料について）、考えられる２つのアプローチを使用することができる：
・事前に定義したΣを使用する：これを適合すればよく、たとえば、ＬＤＡが最近傍分類に崩壊した場合の同一性マトリクスであり、又はさらに多くの既知の試料を実行させた以前の実験からそれを決定すればよい。後者の場合、実行から実行の変動を考慮する必要がある。
・段階的アプローチを使用する。上記のアプローチを用いて適切な群に試料を割り振り、次いで割り振りが正しいと仮定するΣを推定する。推定される分散が少し小さすぎるという意味でこれは楽観的であると思われる。しかしながら、第一に、主成分の空間（スペース）で群が上手く分離される場合、楽観主義の程度は小さいだろう。第二に、未知の試料の最終的な群の割り振りを決定するのに使用される事後確率には楽観主義は大きな影響を有さなくてもよい。決定したΣ及び既知の試料から推定されたものの混合を使用することが可能である。これは正規化判別分析(regularised discriminant analysis)として知られる。
【００６０】
事後クラス確率
事後クラス確率とは、試料が群の１つのメンバーであると仮定して、各試料が各群のメンバーである確率である（すなわち、試料が群の１つにあるならば、これらは条件付き確率である）。これらは以下の式によって推定されることを示すことができる。
【数２３】
0005805535.tif 000024
式中、ｆk（ｘ）は上記で定義され、かつ和は全群にわたって取り込まれる。未知の試料は最大の事後クラス確率ｐk（ｘ）を持つ群に割り振られるだろう。
【００６１】
典型性
事後クラス確率は、それがそれらの少なくとも１つのメンバーであるならば、どの群で試料がメンバーである可能性が最も高いかを伝える。典型性指標は、未知の試料が群のいずれかとどのように一致するかを伝える。典型性の一般的な測定は、
【数２４】
0005805535.tif 000025
がｐにてＦ−分布を有し、ｎ−ｇ−ｐ＋１度の自由度を有するという観察に由来する。従って設定は、
【数２５】
0005805535.tif 000026
【数２６】
0005805535.tif 000027
ｘが群のいずれかに由来する確率としてａ（ｘ）を解釈することが可能である。
【００６２】
Ｆ統計量を用いた上記の観察は複雑であるが、統計的に最も有効であるわけではない。代わりの近似法は、
【数２７】
0005805535.tif 000028
が、μ及びΣが既知であると仮定されたならＸ2分布を有することを言及すべきである。これは利用するのにより適切な形態である。
【００６３】
教師付きの場合における次元の選択
教師付きの場合における次元の選択は何らかの助言を必要とする。直観的に、最も少ない数の誤分類を生じる次元の数を使用することを望むであろう。クロス確認を用いて誤分類の数を推定することができる。クロス確認には、（既知の）試料を残し、残りを用いて分類子を作り上げることが含まれる。次いで取り残された観察を分類し、誤差を数える。このプロセスを目的とする次元について繰り返し、最低の誤差率を持つ次元性を選択する。
【００６４】
誤差率は全く不連続である傾向があるので、２以上の次元性で同数の誤差が生じることが多い。不連続性の少ないアプローチは既知の場合について真のクラスの事後確率を調べることである。既知の場合すべてにわたってこれらの確率を乗じる（又はログを合計する）ことによって分類の質の全体の測定を得ることができる。原則として、これを行うのにクロス確認のアプローチも使用することができる。
【００６５】
あらゆる次元についてこれらの測定の双方が本質的にゼロに戻る（最良の結果）ので、次元の選択を支援しないことが報告される。これは多分、相対的によく分離されたクラスターによるものである。
【００６６】
以下では、本発明の第２の好ましい実施形態が具体的な実施例によって記載される。それについて、５つの異なったＨＲＭデータセットを使用する。データセットのうち４つは、マスターミックス及び鋳型を含有する２５μＬ体積を用いたロター‐ジーン６０００（Ｒｏｔｅｒ−Ｇｅｎｅ６０００）にて生成する。これらには、ヒト第５因子ライデン（Ｇ１６１９Ａ）多型についての各対立遺伝子の３２の既知の複製が含まれ、１×アンプリタック・ゴールド・サイバーグリーン（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）マスターミックス（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems、米国）、３００ｎＭの各プライマー及び２５ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いてそれを実行する。合成Ａ〜ＴのＳＮＰの鋳型の各対立遺伝子の５つの複製は、１×ＨＲＭセンシ(Ｓｅｎｓｉ)ミックス（バイオライン(Ｂｉｏｌｉｎｅ)）、１×エバクリーン蛍光挿入色素（EvaGreen fluorescent intercalating dye）（バイオティウム(Ｂｉｏｔｉｕｍ)、米国）、３００ｎＭの各プライマー及び２０ｎｇの鋳型を用いて実行する。ヒトＢＲＣＡ１エクソン１１〜６断片の５つの対立遺伝子それぞれの３つの複製は、１×ＳＹＴＯ−９蛍光グリーン挿入色素(fluorescent green intercalating dye)（インビトロジェン(Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ)、米国）と共にチタニウムｔａｑポリメラーゼを用いて実行する（データ提供、ベルギー、ルーヴェンの人類遺伝学センター(Centre for Human Genetics, Leuven, Belgium)）。最終的に、ヒトＴＨ０１短縦列反復（short tandem repeat;ＳＴＲ）配列についての複雑なＤＮＡフィンガープリントアッセイを分析する。８つの既知の対立遺伝子は、５〜８の試料の範囲で複製を用いて実行する（データ提供、デイビッド・フレンチ博士（Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｆｒｅｎｃｈ），ＬＧＣ，テディングトン(Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ)，英国）。
【００６７】
正規化
２つのはっきりと異なる方法を用いて生のＨＲＭ曲線を正規化する。第１の方法は、最高の蛍光値が１００に等しく、かつ最低の蛍光値がゼロに等しくなるように最良適合（フィット）の線に曲線をスケーリングすることを適用する。融解曲線転移の前と後との融解データの２つの領域を選択し、曲線の平均蛍光及び傾きを計算し、正規化に適用する。この方法のさらなる反復は、定義された領域における指数関数的傾きを正規化することを含めばよい（ＷＯ２００７／０３５８０６Ａ２を参照）。
【００６８】
第２の方法は、本発明の第１の好ましい実施形態に関して上述されたような二本鎖融解曲線の定義された理想的なモデルを用いて、非線形パラメータのレーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）の最小二乗法の概算を適用する。上述したように、理想的な融解曲線は、方程式１によって表すことができる。
【００６９】
しかしながら、ＨＲＭ曲線はバックグラウンドノイズ及び温度による蛍光の変化を含むより複雑な成分から成る。上述のように、モデル曲線として使用される方程式２においてこれらのパラメータが考慮に入れられ、偏差の二乗の和が各個々の生曲線について最小になるようにレーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）アルゴリズムが適用されて５つのパラメータをモデルにフィッティングさせる反復プロセスを実行する。モデルからの残りを計算し、理想化された融解曲線に戻し添加し、正規化されたデータを生成する。
【００７０】
数学的には、｛ｙＴ｝は生の融解曲線からの蛍光値の列であると仮定する。
【数２８】
0005805535.tif 000029
を生データにフィッティングさせた後の方程式２からの値とする。正規化されたデータ
【数２９】
0005805535.tif 000030
は方程式３によって定義される。
【００７１】
ここでは値１００を使用するが、一部のデータセットについてはより適切な値があってもよいし、又はおそらく、最大値１００への生データの初期スケーリングが適切であってもよいことに留意すること。課題は、不適切な値を使用すると、残りが幾分圧倒されうるということであるが、次のセクションで議論される特徴抽出が主な問題を防ぐと考えられる。
【００７２】
異なった断片の長さ及び配列の複雑性の種々の種類の対立遺伝子を含有する２つのＨＲＭデータセットを用いて、記載された正規化法の双方を比較する。課題の目的は、教師なしクラスター分析を用いて分析されたデータにおいてどちらの方法が既知の遺伝子型の最良の説明を提供するかを判定することである。
【００７３】
主成分分析
遺伝子型間の差異を強調するために、変化の割合のスケールを観察できるように正規化された融解曲線を差別化する。曲線からさらなる情報をさらに引き出すために、対照として分析された曲線すべての中央値複合曲線を用いて減法プロットを生成する。減法プロッティングのこの方法は対照の既知のセットに対する必要性を除くので、ユーザーがデータセットに内在する未知の遺伝子型を検出するのを可能にする。減法プロットから、主成分分析の形態を用いて各曲線の少数の特徴を抽出する。主成分分析は、試料の中で第１の主成分（ＰＣ）として最大の変動を示すデータベクトルの線形結合を選択する（[ジョリッフェ・アイ(Jolliffe I.)「主成分分析」(Principle component analysis)スプリンガー(Springer), 第２版]を参照）。後続のＰＣは、できるだけ多くの残りの変動性を説明することになる。各個々の試料はＰＣのそれぞれに対する特定の量の負荷を有し、それをプロットしてクラスターを生成する。ほかのＰＣにおける残りの分散のほとんどがノイズに起因するので、ほとんどのデータセットは最初の３つのＰＣを必要とするに過ぎない。使用するのに適当な数のＰＣｓの選択は以下に記載される。
【００７４】
教師なしデータのクラスター分析
教師なしクラスター分析の目的は、既知の標識を有する試料なしでデータにて新規(デノボ；de novo)の群を見つけ出すことである。クラスター（ｋ）の数が定義されるが、クラスターの好ましい数の検出が可能でない場合、単一リンク階層的クラスタリング(single link hierarchical clustering)のみを使用することができる。これを可能にするには、ｋ−平均クラスター分析の方法が選択される。ｋ−平均は試料のメンバーの質量に中心を置くことによってクラスターを提供する（[ハーチガン・ジェー・エー(Hartigan JA.)及びワング・エム・エー(Wong MA.),「アルゴリズムＡＳ１３６：ｋ−平均のクラスタリングアルゴリズム」(Algorithm AS 136: A k-means clustering algorithm),アプライド・ステティクス(Appl. Statist.), 1979; 28(1): 1000-108]を参照）。単独で、クラスターの好ましい数を提供することはできず、むしろ、クラスターの数に基づいてクラスターを定義する。クラスターの好ましい選択を決定するには、ｋ−平均法をギャップ統計量と組み合わせる（[チブシラニ・アール(Tibshirani R),ワルサー・ジー(Walther G),及びハスティー・ティー(Hastie T.),「ギャップ統計量を介したデータセットにおけるクラスターの数の推定」(Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic), ジャーナル・オブ・ローヤル・ステティスティカル・ソサイアティ（J. R. Statist. Soc.）, 2001; 63: 411-423]を参照）。考えは、クラスターの質の測定を調べ、真のクラスターを有さないことが分かっている類似データのそれと比較することである。使用されるクラスターの質の測定は上記方程式６で定義されるようなクラスターの平方和の範囲内である。
【００７５】
式中、Ｃjがｊ−ｔｈクラスターであり、かつ
【数３０】
0005805535.tif 000031
は中心（平均値）である。アルゴリズムは第１に、データをクラスタリングしクラスターの数（ｋ＝１,２、・・・Ｋ）を変化させてＷkを計算する。第２に、それは、Ｂランダム参照データを生成し、工程１のようにそれぞれをクラスタリングしてｋ＝１,２、・・・Ｋ及びｂ＝１、２、・・・ＢについてＷkbを計算する。第３に、方程式７及び方程式８（上記参照）を適用して、それは各ｋについてギャップ統計量と標準誤差を計算する。
【００７６】
最終的にそれは、Ｇａｐ（ｋ）≧Ｇａｐ（ｋ＋１）−ｓk+1となるように最小ｋであるクラスター
【数３１】
0005805535.tif 000032
の数を選択する。グラフ上では、好ましいクラスターの数は通常、後続のクラスター数対ギャップ値によるプラトーが先行するギャップ値における最大変化の点として認められる。ギャップを用いることに伴う目立った課題の１つは、ＰＣの次元性の選択であるので、ギャップ統計量は二次元のＰＣと三次元のＰＣとの双方についてプロットされる。ＰＣ数の好ましい選択は最高の転移変異を伴ったギャップのプロットである。
【００７７】
本発明の第２の好ましい実施形態について、図１はフローチャートにおけるＨＲＭ分析のためのプロセスにおける工程を示す。プロセスは正規化１で始まり、主成分（ＰＣ）を抽出すること２が続く。対立遺伝子の数が未知であれば３、ｋ−平均及びギャップ統計量を組み合わせる教師なしのクラスター分析４が利用される。対立遺伝子当たりたった１つの対照が既知であれば、そのときは最近傍分類子が適用され５、線形判別分析（ＬＤＡ）を用いて、群分けされた試料が再計算される。対立遺伝子当たり２以上の対照が提供される場合、そのときは教師付き分析においてＬＤＡ６を適用する。
【００７８】
ギャップ統計量に対する別の代替は、ベイズ情報量基準(Bayes Information Criterion)の使用であり、それは、モデル選択に有用なパラメトリック法統計量である（[シュワルツ，ジー(Schwarz, G.) 1978,「モデルの次元を推定すること」(Estimating dimension of a model),アナルズ・オブ・ステティクス(Annals of Statistics), 1978; 6(2):461-464]を参照）。使用される一般式は、ｌｏｇｌｉｋmaxが所定の数のパラメータｐについての最大ログ尤度であり、かつｎが試料の数である方程式９（上記参照）である。次いでＢＩＣは一般にｐに関して最大化され、モデルを選択するが、我々の場合、それはクラスターの数である。選択されたＨＲＭのデータセットを用いてクラスターとＰＣの選択の双方の方法を比較する。
【００７９】
教師付きデータの判別分析
既知の試料を対照として用いた未知の試料の既知の群への分類は、線形判別分析（ＬＤＡ）を用いて達成される。ＬＤＡは、データが多変量の正規分布を有する場合の好ましい分類子として生じ、各クラスは同一の分散／共分散マトリクスを有するが、平均値で異なる（[ユェ・ジェー(Ye J),リー・ティー(Li T),ジオング・ティー(Xiong T),ジャナーダン・アール(Janardan R.),「遺伝子発現のデータによる組織の分類に非相関の判別分析を使用すること」(Using uncorrelated discriminant analysis for tissue classification with gene expression data), IEEE/ACMとトランザクションズ・オン・コンピュテイショナル・バイオロジー・アンド・バイオインフォマティックス(IEEE/ACM Trans. Comput. Biol. Bioinform), 2004; 1(4):181-90]を参照）。実際、これらの仮定が当てはまらないとしても、ＬＤＡは効果的かつ効率的な分類子である。ｘをあるセットからの単一試料（ｐ＝２又はｐ＝３のいずれか）のｐＰＣスコアとする。そのとき、ＬＤＡはｘの密度関数が方程式１１によって与えられると仮定する。
【００８０】
式中、μkは、クラスｋの平均値（中心）であり、かつΣは全てのクラスの分散/共分散マトリクスである。μk及びΣの双方が推定される必要がある。各群における既知の試料の数が２以上である場合、既知の試料（訓練セット;training set）を用いて形式的にこれらのパラメータを推定することができる。しかしながら、これより多くの既知の試料を有することが望ましいであろう（群当たり５を超える対照）。群当たりたった１つの試料がある場合、それを最近傍分類に引き延ばし、次いで割り振りが正しい推量Σであり、ＬＤＡを再計算することを仮定する。
【００８１】
教師付きデータを用いたＰＣの次元性の選択は、クロス確認を用いて最低数の誤分類を生じるＰＣの数を見つけ出すことによって達成される。クロス確認には、既知の試料を残し、残りを用いて分類子を作り上げることが含まれる。次いで取り残された観察を分類し、誤差を数える。このプロセスを各ＰＣ数について繰り返し、最低の誤差率を持つ次元性を選択する。二又は三のＰＣで同一の誤差が生じることが多いので、既知の場合について真のクラスの事後確率を調べる不連続性の低いアプローチを使用することができる。既知の場合すべてにわたってこれらの確率を乗じることによって分類の質の全体の測定が得られる。発明のソフトウエアでは、最低の「誤差」値を持つＰＣが選択されるべきである。しかしながら、双方の誤差が同一であるならば、そのときは、最低の「事後」計算値を持つＰＣが好ましく使用される。双方の値がゼロに等しければ、そのときは、より低いＰＣが選択されるべきである。
【００８２】
事後クラス確率及び典型性
事後クラス確率は、試料が群の１つのメンバーであると仮定して、各試料が各群のメンバーである確率である。ｆk（ｘ）が上記方程式１１で定義され、かつ群すべてについて和が取り込まれる方程式１２（上記参照）によってこれらが推定されることを示すことができる。未知の試料は、最大の事後クラス確率ｐk（ｘ）を持つ群に割り振られる。
【００８３】
事後クラス確率は、それがそれらの少なくとも１つのメンバーであるならば、試料がどの群のメンバーである可能性が最も高いかを伝える。典型性指標は、未知の試料が群のいずれかとどのように一致するかを伝える。典型性の一般的な測定は、方程式１３の結果がｐにてＦ−分布を有し、かつｎ−Ｋ−ｐ+１の自由度の程度を有するという観察に由来する。従って、方程式１４及び方程式１５を設定して、ｘが群のいずれかに由来する確率としてａ（ｘ）を解釈することが可能である。
【００８４】
ソフトウエア
本発明のソフトウエアの実施形態の作業の流れの図式を図１に示す。正確なデータが分析されていることを確実にするために統語解析（構文解析）を用い、コンマで記述したスプレッドシートを用いて、ロター−ジーン(Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅソフトウエアからの生のＨＲＭのプロットをソフトウエアに取り込む。クロッピング機能を利用可能にしてユーザーが非特異的な増幅産物の領域を回避できるようにする。有効な正規化を保証するには、できるだけ多くの融解前及び融解後のデータを解析に利用できるようにする。融解曲線の特徴の欠如が正規化に影響を及ぼすので、鋳型対照のすべてが自動的に除かれるわけではない（ＮＴＣ）。試料の選択に続いて、ユーザーは教師付きデータセット又は教師なしデータセットのどちらかを選択することができる。「教師なし」を選択することは、最も適切な使用するクラスター数及びＰＣ数を選択するソフトウエアによってｋ−平均クラスタリング及びギャップ統計量アルゴリズムを可能にした。「教師付き」の特徴を使用することは、ユーザーが各遺伝子型について適切な対照を選択することを可能にした。各群について２を超える対照を使用したのであれば、ＬＤＡを用いて、クロス確認関数を介してＰＣの適切な数が決定される。たった１つの対照を有することは、試料の群への最近傍分類を起動し、それは、ＬＤＡを用いた再計算によって進められる。
【００８５】
教師付き及び教師なしの双方の方法について、クラスターはグラフ上で、試料すべて（たとえば、ＰＣ１対ＰＣ２）に関する各ＰＣのローディング・スコアを用いてプロットされる。分類に続いてクラスターの分散／共分散を表す楕円も描かれる。全ての試料について計算された事後確率及び典型性を用いて未知の試料が各クラスター群に分類される。
【００８６】
結果
正規化法の評価に関して、ソフトウエアの第１の評価は正規化技法の適切な選択である。２セットのＨＲＭデータを用いて、ＰＣ抽出及びクラスタリングを用いたさらなる解釈に必要とされる多すぎる情報を失うことなく、各方法が、融解曲線をどのように上手く正規化するかを究明することが設定される。教師なし分析に関して観察されたクラスタリング、事後確率及び典型性を、疑似未知と呼ばれる事前に定義された遺伝子型及び複製について比較する。最良適合（フィット）の線への蛍光スケーリングの正規化プロセスを用いて、データが、正規化後、ほとんどの曲線の特徴を保持したことが認められる（図２Ａを参照）。曲線の特徴におけるそのような保持は、レーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）アルゴリズムを用いてさほど明らかではなく、それは、特徴的なヘテロ二本鎖曲線の二重屈曲を生じ、消失する（図２Ｂを参照）。レーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）アルゴリズムを用いたそのような観察にもかかわらず、未知の試料及びクラスターのクラスタリングと呼び出しは、たとえば、第５因子ライデン（Ｇ１６９１Ａ）のデータセットのような上手く定義された融解曲線の分離には未だに有効である。しかしながら、以下の表１に由来することができるように、低解像度融解曲線の多型変異体（ＢＲＣＡ１のエクソン１１〜６）を含有するデータセットの１つについて、レーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）アルゴリズムを用いた正規化の後の曲線の特徴の欠如は、教師なし分析を用いた疑似未知の不正確なクラスタリングと呼び出しを生じる。最良適合（フィット）モデルの線への蛍光スケーリングを用いて、高い事後確率及び典型性を伴ってクラスター及び試料のすべてが正確に呼び出される。
【００８７】
【表１】
0005805535.tif 000033
＃教師なし分析の特徴を用いてクラスターの数をランダムに決定する。この結果の目的で、５つの決定されたクラスターがあるはずであり、各対立遺伝子についての複製は同一のクラスター数を有するはずである。
【００８８】
図２では、第５因子ライデン（Ｇ１６９１Ａ）遺伝子型の正規化曲線を示す。最良適合（フィット）の線への蛍光のスケーリングを用いて、正規化法は二重屈曲の保持によって３つの遺伝子型すべてが明瞭に判別されることを可能にし、それはヘテロ二本鎖を表す（図２Ａを参照）。逆に、非線形パラメータのレーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）最小二乗推定を用いた正規化は、ヘテロ二本鎖の二重屈曲の欠如を生じる（図２Ｂを参照）。後者の方法では曲線の特徴の欠如はあるものの、このＨＲＭデータセットについては教師付き又は教師なしの分析に対して影響は認められない。従って、好ましい正規化法として、最良適合（フィット）の線への蛍光のスケーリングが選択される。
【００８９】
好ましいクラスターの決定の評価に関して、ｋ−平均のためにクラスターの好ましい数を決定するための２つの代替法：ギャップ統計量及びＢＩＣを評価した。その次元では情報が寄与しないように第１のデータセットが第３のＰＣに割り振られる４つのクラスター中心を有するように、４つのクラスターを含有する一対の模擬データを使用する。図３は模擬データのプロット、ギャップ統計量とＢＩＣのプロットを示す。双方の方法は、４つのクラスターの二次元ＰＣ解決にやや有利に働く。第２のデータセットは、次元が必要な情報を加えるように第３のＰＣの次元の中及び別のクラスターの後に移動させたクラスターの１つを有する。ギャップ統計量は三次元における４つのクラスターの選択にやや有利に働く一方で、ＢＩＣは強く有利に働くが、不正確に二次元における３つのクラスターに有利に働く（図３Ｂを参照）。
【００９０】
次にソフトウエアに関する図３を再び見て、教師なし分析の最適なＰＣの次元性の決定を示す。４つのクラスターの模擬データセットを用いて、その次元によって情報が寄与されないように第１のセットがクラスターを第三次元に割り振る（図３Ａを参照）。ギャップ統計量及びベイズ情報量基準（ＢＩＣ）を最適なクラスターの決定に用いて、双方の方法が二次元における４つのクラスターに有利に働くことが明らかにされる。４つのクラスターは第三次元が情報を提供したように割り振られると、ギャップ統計量を用いることのみが好まれる第三次元のＰＣにおける４つのクラスターである（図３Ｂを参照）。ＢＩＣを使用することは、二の次元で有利に働く３つのクラスターを生じる。結果は明らかにギャップ統計量がソフトウエアで使用するのに好ましい方法であることを示す。
【００９１】
好ましい結果を達成するために適切な方法を決定した実験データに関して、合成のＡからＴの置換アッセイデータセットと、ＬＧＤのデイビッド・フレンチ(Ｄａｖｉｄ  Ｆｒｅｎｃｈ（英国、テディントン）によって開発されたヒトＴＨ０１ＳＴＲアッセイを用いてソフトウエアを評価する。教師なし分析の特徴を使用する場合、ソフトウエアは、疑似未知のすべてを正しく各遺伝子型に呼び出す合成ＡからＴの多型データセットの３つの遺伝子型すべてをクラスタリングすることが可能である（図４を参照）。ギャップ統計量は以前のデータセットとしては定義されないが、それは二のＰＣの次元における３つのクラスターに正しく有利に働く。以下の表２に由来することができるように、教師付き分析の特徴が適用され、各遺伝子型の最初の２つの試料が対照として選択される場合、ソフトウエアは再び、疑似未知のすべてを正しく呼び出すことが可能である。
【００９２】
【表２】
0005805535.tif 000034
*試料は対照として選択される。
【００９３】
再び図４を参照して、合成ＡからＴのＳＮＰ教師なしクラスタリングを示す。教師なし分析の特徴を用いて、Ａ（赤）、Ｔ（青）及びＡＴ（緑）についての疑似未知はすべて正しくクラスタリングされ、各遺伝子型に呼び出される。二のＰＣ次元プロットで分類された試料の分散／共分散を表す楕円によってクラスターを強調する。ホモ接合体の対立遺伝子間の差異が０．１℃未満であり得るので、ＨＲＭを用いてＡからＴの多型を判別するのは最も難しい。
【００９４】
ＴＨ０１ ＳＴＲのデータセットの教師なし分析は三ＰＣ次元において認められる８つのクラスターを生じる（図５を参照）。高い事後確率及び典型性を伴って、疑似未知はすべて各対立遺伝子の反復のそれぞれに正しく呼び出される。同様に、教師付き分析を用いて、最初の３つの試料を対照として選択することは１つを除いたすべての疑似未知の正しい呼び出しを提供する。不正確に呼び出される試料は５０％の事後確率値を有する。ソフトウエアは、ロター−ジーン・キュー(Ｒｏｔｅｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ)バージョン１．７ソフトウエアを用いて得られた結果に、ＴＨ０１ＳＴＲデータセットに関する教師付き結果を比較する。以下の表２に由来することができるように、各遺伝子型の最初の試料を対照として選択し、パーセンテージ信頼限界(percentage confidencee limit)を７０％に設定する。７０％の信頼比率が適用されると、ロター−ジーン・キュー(Ｒｏｔｅｒ−ＧｅｎｅＱ)ＨＲＭ解析ソフトウエアを用いて多数の試料を正しく呼び出すことができない。
【００９５】
【表３】
0005805535.tif 000035
0005805535.tif 000036
*試料は対照として選択された。
【００９６】
再び図５を参照して、ＴＨ０１ ＳＴＲ教師なしクラスタリングを示す。教師なし分析の特徴を用いて種々のＴＨ０１ ＳＴＲ対立遺伝子についての疑似未知すべてが正しくクラスタリングされ、各遺伝子型に呼び出される。二ＰＣ次元プロットにて分類された試料の分散／共分散を表す楕円によってクラスターが強調される。ＤＮＡのフィンガープリンティングは、複数の融解曲線と、密接に関連する配列及びヘテロ接合体を識別することが可能であることが分かっているコンステレーション・ソフトウエア(Constellation software)との間での識別を必要とする。
【００９７】
上述の本発明のソフトウエアに実施形態に関して、ソフトウエアは、単純な及び複雑な多型双方についての異なったアッセイ条件を用いて生成された種々のＨＲＭデータセットから遺伝子型を正しく検出し、クラスタリングし、かつ呼び出すことが可能である。２つの異なった正規化技法の比較は、最良適合（フィット）の線を用いた蛍光のスケーリングがレーベンバーグ・マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）アルゴリズムに比べて使用にさらに適することを明示する。後者の方法は、主成分の抽出後、最終結果に影響しうる融解曲線の特徴における欠如を引き起こす傾向がある。教師なし分析については、ギャップ統計量がクラスターの好ましい数及びＰＣの次元性を検出するためのより適切な方法を証明する。従って、好ましくはこれらの方法をソフトウエアのワークフローに対して実施するが、双方の方法は考えられるＨＲＭデータセットの大半についてさらに許容可能である。
【００９８】
結論として、ソフトウエアによって、ユーザーが分子生物学の種々のアプリケーションにおいてＨＲＭデータセットからの未知のものの教師付き及び教師なしの双方の遺伝子型判定を達成するのが可能になり、最終目標は、診断の設定において複数の実行ファイルを可能にすることである。
【００９９】
前述は本発明の好ましい形態を記載している。本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明らかな改変をそれに対して行うことができる。
【０１００】
本発明は図面及び前述の説明にて詳細に説明され、記載されているが、そのような説明及び記載は説明的又は例示的とみなされるべきであり、限定的とはみなされるべきではない。以下の請求項の範囲及び精神の範囲内で変更及び改変が当業者によって為されてもよいことが理解されるであろう。特に、本発明は、上記及び下記の異なった実施形態の特徴の組み合わせによってさらなる実施形態に及ぶ。本発明はまた、それらが、前の又は以下の記載に記載されてなかったかもしれないが、図に示されるさらなる特徴すべてに個々に及ぶ。
【０１０１】
さらに、請求項では、「含むこと」という用語はほかの要素又は工程を排除せず、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数を排除しない。単一単位は、請求項に記載される幾つかの特徴の機能を満たしてもよい。相互に異なる従属項に特定の測定が記載される単なる事実は、これらの測定の組み合せを利益を得るのに使用することができないことを示さない。クレームにおける参照記号は範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【図１】
0005805535.tif 000043
【図２】
0005805535.tif 000044
【図３Ａ】
0005805535.tif 000045
【図３Ｂ】
0005805535.tif 000046
【図４】
0005805535.tif 000047
【図５】
0005805535.tif 000048