(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ４の活性化を阻害することができる抗ＣＸＣＲ４抗体、またはその機能的断片の選択方法であって、前記機能的断片が、断片Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび二重特異性抗体から選択され、
ｉ）産生した抗体をスクリーニングし、ＣＸＣＲ４に特異的に結合しかつＣＸＣＲ４の活性化を調節することができる抗体を選択し、
ｉｉ）段階ｉ）で選択された抗体を試験し、ＣＸＣＲ４ホモ二量体にコンホメーション変化を誘導することができる抗体を選択し、次いで、
ｉｉｉ）段階ｉｉ）で選択された抗体を試験し、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体にコンホメーション変化を誘導することができる抗体を選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２】
段階ｉｉ）が、ＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ４−ＹＦＰを両方とも発現する細胞上でＢＲＥＴ分析によって抗体を評価し、ＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％を阻害することができる抗体を選択することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階ｉｉｉ）が、ＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ２−ＹＦＰを両方とも発現する細胞上でＢＲＥＴ分析によって抗体を評価し、ＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％を阻害することができる抗体を選択することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＸＣＲ−４の活性化を阻害することができる抗体、またはその機能的断片であって、前記機能的断片が、断片Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび二重特異性抗体から選択され、
ａ）ＩＭＧＴで配列番号１の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２の配列であるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
ＩＭＧＴで配列番号７の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号８の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
を含んでなる抗体、またはその機能的断片、
ｂ）Ｋａｂａｔで配列番号９の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０の配列であるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
Ｋａｂａｔで配列番号１１の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
を含んでなる抗体、またはその機能的断片、
ｃ）ＩＭＧＴで配列番号４０の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２の配列であるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号４１の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
ＩＭＧＴで配列番号４４の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４５の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
を含んでなる抗体、またはその機能的断片、および
ｄ）Ｋａｂａｔで配列番号４６の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７の配列であるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号４１の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
Ｋａｂａｔで配列番号４８の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４３の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
を含んでなる抗体、またはその機能的断片
からなる群から選択される抗体、またはその機能的断片。
【請求項５】
請求項４に記載の抗体、またはその機能的断片であって、
ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる抗体、またはその機能的断片、および
ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号５１のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる抗体、またはその機能的断片
からなる群から選択される抗体、またはその機能的断片。
【請求項６】
２００７年１０月２２日にＣＮＣＭ、Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、パリにＩ−３８６０の番号で寄託された、または２００８年６月２５日にＣＮＣＭ、Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、パリにＩ−４０１９の番号で寄託されたハイブリドーマから選択される、マウスハイブリドーマによって分泌される、抗体。
【請求項７】
キメラ抗体からなる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体、またはその機能的断片であって、
ａ）配列番号６４のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号６５のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなるキメラ抗体、またはその機能的断片、および
ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号６７のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなるキメラ抗体、またはその機能的断片
からなる群より選択される抗体、またはその機能的断片。
【請求項９】
ａ）請求項４〜８のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ
である、単離核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸から構成される、ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターによって形質転換した細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
請求項４〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片の産生方法であって、
請求項１１に記載の宿主細胞の培地および適当な培養条件での培養、および
培地からまたは前記培養細胞から産生した前記抗体、またはその機能的断片の１つの回収
の段階を含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
薬剤として使用するための、請求項４〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片。
【請求項１５】
請求項４〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片を活性成分として含んでなる、医薬組成物。
【請求項１６】
同時、個別または拡張使用する配合物としてＣＸＣＲ４に対する抗体以外の抗腫瘍抗体を更に含んでなる、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
同時、個別または拡張使用する配合または接合生成物として細胞毒性／細胞増殖抑制剤、細胞毒素および／または放射性同位体を更に含んでなる、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
薬剤として使用するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
細胞におけるＣＸＣＲ４活性を調節する薬剤としての、請求項４〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片、および／または請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌の予防または治療のための、請求項４〜８のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的断片、および／または請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記癌が、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌および結腸癌から選択される癌である、請求項２０に記載の抗体、またはその機能的断片、および／または医薬組成物。
【請求項２２】
２００７年１０月２２日にＣＮＣＭ、Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、パリにＩ−３８６０の番号で寄託された、または２００８年６月２５日にＣＮＣＭ、Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、パリにＩ−４０１９の番号で寄託されたハイブリドーマから選択される、マウスハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗体、詳細には、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）に特異的に結合することができるキメラおよびヒト化マウスモノクローナル抗体、並びにこのような抗体をコードするアミノ酸および核酸配列に関する。一側面から見れば、本発明は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合することができかつ強力な抗腫瘍活性を有する新規な抗体、誘導化合物または機能的断片に関する。本発明は、癌の予防および／または治療的処置のための薬剤としての並びに癌診断に関係した手順またはキットにおけるこのような抗体の使用も含んでなる。最後に、本発明は、抗体、細胞毒性／細胞増殖抑制性の毒素のような他の抗癌化合物と配合または接合されているこのような抗体を含んでなる組成物、およびある種の癌の予防および／または治療のための前記組成物の使用を含んでなる。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、特に免疫反応の際にケモカイン勾配として知られるリガンドの化学勾配に沿って白血球の遊走を制御する小さな分泌ペプチドである（Zlotnick A. et al., 2000）。それらは、それらのＮＨ２末端のシステイン残基の位置に基づいて２つの主要なサブファミリー、ＣＣおよびＣＸＣに分類され、Ｇタンパク質共役受容体に結合し、その２つの主要なサブファミリーはＣＣＲおよびＣＸＣＲと呼ばれる。５０種類を上回るヒトケモカインおよび１８種類のケモカイン受容体が、これまでに見出されている。
【０００３】
多くの癌は、腫瘍の免疫細胞浸潤、並びに腫瘍細胞増殖、生存、遊走および血管形成に影響を与える複雑なケモカインネットワークを有する。免疫細胞、内皮細胞および腫瘍細胞は、それら自体がケモカイン受容体を発現し、ケモカイン勾配に対応することができる。ヒト癌生験試料およびマウス癌モデルの研究は、癌細胞ケモカイン−受容体発現が転移能の増加と関係していることを示している。様々な種類の癌に由来する悪性細胞は、様々なケモカイン−受容体発現のプロフィールを有するが、ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）が最も普通に見られる。少なくとも２３種類の上皮、間葉および造血起源のヒト癌の細胞は、ＣＸＣＲ４受容体を発現する（Balkwill F. et al., 2004）。
【０００４】
ケモカイン受容体４（フシン（fusin）、ＣＤ１８４、ＬＥＳＴＲまたはＨＵＭＳＴＲとしても知られている）は、３５２または３６０のアミノ酸を含んでなる２種類のアイソフォームとして存在する。残基Ａｓｎ１１はグリコシル化されており、残基Ｔｙｒ２１は硫酸基の付加によって修飾されており、Ｃｙｓ１０９および１８６は受容体の細胞外部分でジスルフィド架橋により結合している（Juarez J. et al., 2004）。
【０００５】
この受容体は、様々な種類の正常組織、ナイーブ、非記憶Ｔ細胞、調節Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、内皮細胞、一次単球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞によって、および心臓、結腸、肝臓、腎臓および脳において低レベルで発現する。ＣＸＣＲ４は、白血球輸送、Ｂ細胞リンパ球産生および骨髄造血に重要な役割を演じている。
【０００６】
ＣＸＣＲ４受容体は、結腸癌（Ottaiano A. et al., 2004）、乳癌（Kato M. et al., 2003）、前立腺癌（Sun Y.X. et al., 2003）、肺癌［小細胞および非小細胞癌（Phillips R.J. et al., 2003)］、卵巣癌（Scotton CJ. et al., 2002）、膵臓癌（Koshiba T. et al., 2000）、腎臓癌、脳腫瘍（Barbero S et al., 2002）、膠芽腫およびリンパ腫などこれらに限定されない多数の癌で過剰発現される。
【０００７】
これまでに報告されたＣＸＣＲ４受容体のユニークなリガンドは、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）またはＣＸＣＬ１２である。ＳＤＦ−１は、リンパ節、骨髄、肝臓、肺において多量に、また腎臓、脳および皮膚によって少量分泌される。ＣＸＣＲ４は、ヒトヘルペスウイルスＩＩＩ型によってコードされるウイルスマクロファージ炎症性タンパク質ＩＩ（ｖＭＩＰ−ＩＩ）である拮抗するケモカインによっても認識される。
【０００８】
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸は、癌において重要な役割を果たしており、転移を生じる遊走、侵襲に直接関与している。実際に、癌細胞はＣＸＣＲ４受容体を発現し、それらは体循環へと遊走して入る。次いで、癌細胞は、高レベルのＳＤＦ−１を産生する臓器の血管床に止められ、そこで増殖し、血管形成を誘導し、転移腫瘍を形成する（Murphy PM., 2001）。この軸は、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）経路の活性化（Barbero S. et al., 2003）および血管形成（Romagnani P., 2004）を介する細胞増殖にも関与している。実際に、ＣＸＣＲ４受容体およびそのリガンドＳＤＦ−１は、ＶＥＧＦ−Ａ発現を刺激することによって明らかに血管形成を促進し、次いで、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１の発現を増加する（Bachelder R.E. et al., 2002）。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍の低酸素領域に蓄積し、刺激されて、腫瘍細胞と協同して血管形成を促進することも知られている。低酸素症は、ＴＡＭを含む様々な種類の細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を選択的に増加させることが観察された（Mantovani A. et al., 2004）。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸は、ＣＸＣＲ４＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）の輸送／移入（ホーミング）を制御し、新血管新生においてある役割を演じている可能性があることが最近になって明らかになった。ＨＳＣの他に、機能性ＣＸＣＲ４は、他の組織由来の幹細胞（組織コミット幹細胞＝ＴＣＳＣｓ）でも発現するので、ＳＤＦ−１は臓器／組織再生に必要なＣＸＣＲ４＋ＴＣＳＣｓの化学誘引に枢要な役割を演じていることがあるが、これらのＴＣＳＣは癌発生の細胞性起源であることもありうる（癌幹細胞理論）ことが明らかにされている。癌の幹細胞起源は、ヒト白血病について、また最近では脳腫瘍および乳癌のような数種類の固形腫瘍について明らかにされている。白血病、脳腫瘍、小細胞肺癌、乳癌、胚芽腫、卵巣および子宮頸癌のような正常なＣＸＣＲ４＋組織／臓器特異的幹細胞に由来することがある数例のＣＸＣＲ４＋腫瘍がある（Kucia M. et al., 2005）。
【０００９】
ＣＸＣＲ４受容体を干渉することによる癌転移ターゲッティングは、ＣＸＣＲ４受容体に対するモノクローナル抗体を用いることによってインビボ（in vivo）で明らかにされた（Muller A. et al., 2001）。簡単に言えば、ＣＸＣＲ４受容体に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ  １７３  R&D Systems）は、ＳＣＩＤマウスでの同所性乳癌モデル（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）におけるリンパ節転移の数を有意に減少させることが示された。もう１つの研究（Phillips R.J et al., 2003）でも、ＳＤＦ−１に対するポリクローナル抗体を用いる同所性肺癌モデル（Ａ５４９）における転移でのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸の決定的役割が示されたが、この研究では、腫瘍増殖にも血管形成にも効果はなかった。幾つかの他の研究では、ＣＸＣＲ４の二本鎖ｓｉＲＮＡ（Liang Z. et al., 2005）、生体内で安定なＣＸＣＲ４ペプチド拮抗薬（Tamamura H. et al., 2003）を用いるインビボでの転移またはＡＭＤ３１００（Rubin J.B. et al., 2003; De Falco V. et al., 2007）またはＭａｂ（特許ＷＯ２００４／０５９２８５  Ａ２号公報）のようなＣＸＣＲ４の小分子拮抗薬を用いるインビボでの腫瘍増殖の抑制も示された。従って、ＣＸＣＲ４は、癌についての確認された治療ターゲットである。
【００１０】
もう１つのケモカイン受容体であるケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）も、腫瘍学における興味深いターゲットとして記載されている。実際に、ＣＸＣＲ２は、幾つかの種類の腫瘍細胞でオートクリン細胞増殖シグナルを伝達し、血管形成を促進することによって間接的に腫瘍増殖に影響を及ぼすこともできる（Tanaka T. et al. 2005）。
【００１１】
ＣＸＣＲ２ケモカイン受容体は、３６０個のアミノ酸を包含する。それは、主として内皮細胞内で、特に新血管新成中に発現する。幾つかのケモカインは、ＥＲＬ＋血管新生促進性ケモカインに属するＣＸＣＲ２受容体であるＣＸＣＬ５、−６、−７、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、−βおよびγを結合する。ＣＸＣＲ２受容体は、ＣＸＣＲ４受容体と配列相同性を共有しており、３７％の配列同一性および４８％の配列相同性を有する。ＣＸＣＲ２／リガンド軸は、転移（Singh RK. et al., 1994）、細胞増殖（Owen J.D. et al., 1997）のような幾つかの腫瘍増殖機構およびＥＲＬ＋ケモカイン媒介性血管形成（Strieter R.M. et al., 2004; Romagnani et al., 2004）に関与している。最後に、腫瘍関連マクロファージおよび好中球は、炎症誘導腫瘍増殖の重要な要素であり、ＣＸＣＬ５、ＩＬ−８およびＧＲＯ−αのようなケモカインは、好中球動員を開始する。
【００１２】
二量体化は、ケモカイン受容体などのＧタンパク質共役受容体の機能を制御するための一般機構として明らかになっている（Wang J. and Norcross M., 2008）。ケモカイン結合に応答するホモおよびヘテロ二量体化は、多数のケモカイン受容体によるシグナル伝達の開始および変更に必要とされることが示されている。受容体二量体またはオリゴマーはおそらくケモカイン受容体の基本的機能性単位であろうという概念が、支持される証拠が増えてきている。ケモカイン受容体二量体はリガンドの非存在下で見出されており、ケモカインは、受容体二量体のコンホメーション変化を誘導する。ＣＸＣＲ４は、ホモ二量体を形成することが知られているが、例えば、δ−オピオイド受容体（ＤＯＲ）（Hereld D., 2008）またはＣＣＲ２（Percherancier Y. et al., 2005）ともヘテロ二量体を形成することが知られている。後者の例では、ＣＸＣＲ４の膜貫通ドメイン由来のペプチドは、二量体のリガンド誘導コンホメーション遷移をブロックすることによって活性化を阻害した（Percherancier Y. et al., 2005）。もう１つの研究は、ＣＸＣＲ４の膜貫通領域の合成ペプチドであるＣＸＣＲ４−ＴＭ４ペプチドが、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のプロモーター間のエネルギー移動を減少させ、悪性細胞におけるＳＤＦ−１誘導遊走およびアクチン重合を阻害することを示した（Wang J. et al., 2006）。更に近年では、ＣＸＣＲ７はＣＸＣＲ４と機能性ヘテロ二量体を形成し、ＳＤＦ−１誘導シグナル伝達を増加させることも報告された（Sierro F. et al., 2007）。構成的ヘテロ二量体の他の例としては、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２が相互作用を示し、それぞれのホモ二量体を形成する研究が挙げられる。それらのいずれについても別のＧＰＣＲ（α（１Ａ）−アドレナリン受容体）との相互作用は見られず、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の相互作用の特異性を示していた（Wilson S. et al., 2005）。
【００１３】
上記のように、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２受容体は、興味深い腫瘍ターゲットである。これらの受容体による干渉は、腫瘍によっておよびＣＸＣＲ４癌幹細胞を阻害することによって腫瘍細胞増殖、血管形成、腫瘍細胞遊走および侵襲、好中球およびマクロファージ動員を減少させることにより、腫瘍増殖および転移を極めて効率的に阻害するものである。
【００１４】
本発明の発明態様の１つは、ＣＸＣＲ４二量体にコンホメーション変化を誘導するマウスモノクローナル抗体を産生することである。本発明は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体のいずれにも結合しかつコンホメーション変化を誘導することができ、マウス異種移植および生存モデルのいずれでも強力な抗腫瘍活性を有するＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５（またはその断片）を包含する。本発明は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体のいずれにも結合しかつコンホメーション変化を誘導することができ、強力な抗腫瘍活性を有するＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ５１５Ｈ７（またはその断片）も包含する。抗−ＣＸＣＲ４４１４Ｈ５  Ｍａｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルで腫瘍増殖を阻害し、Ｕ９３７モデルでのマウス生存を増加させる。それらは、ＣＸＣＲ４ホモ二量体だけでなくＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体でもコンホメーション変化を誘導する。この新規な特性は、癌におけるこれら２種類のケモカイン受容体の重要な役割を考慮すれば、癌治療応用について興味深いものである。
【００１５】
受容体のホモおよびヘテロ二量体のターゲッティングは、Ｍａｂ治療効果を増加することが既に見出されている。実際に、例えば、ＩＧＦ−１Ｒおよびインスリン／ＩＧＦ−１ハイブリッド受容体をいずれもターゲッティングするＭａｂ（ｈ７Ｃ１０）は、ＩＧＦ−１ＲのみをターゲッティングするＭａｂよりインビボで腫瘍増殖を一層強力に阻害したことが明らかにされている（Pandini G., 2007）。
【００１６】
更に、抗ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７はＣＸＣＲ４のサイレント拮抗薬であり、それらはインビトロ試験では基本シグナルを変化させないが、様々なアッセイ（ＧＴＰγＳ結合、ｃＡＭＰ放出）ではＳＤＦ−１によるシグナル伝達誘導を阻害し、インビトロでのＳＤＦ−１誘導腫瘍細胞増殖および遊走を阻止することもできる。
【００１７】
部分作動薬または逆作動薬として作用する分子は、リガンドの非存在下で固有の活性を示す。これらの種類の分子は、リガンドの非存在下においても、それぞれ高親和性または低親和性ＧＰＣＲ状態を安定させ、それによって下流のシグナル伝達カスケードを活性化または阻害する（Galandin et al, 2007; Kenakin, 2004）。
【００１８】
４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂの場合には、これらの分子は、サイレント拮抗薬として作用し、ＳＤＦ−１の非存在下ではＣＸＣＲ４受容体では固有活性は全くない。この薬理学的特徴は、オピオイド受容体リガンドについて既に観察されているように、部分または逆作動薬と比較して小さめの反副作用と関連していると思われる（Bosier and Hermans, 2007）。実際に、４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂの機能活性は、ＳＤＦ−１の存在に完全に依存しており、ＣＸＣＲ４受容体活性は、ＳＤＦ−１リガンドが発現せず、分泌せずまたは血流によって供給されない組織や臓器では観察されない。従って、４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂは、正または負の効力を有する他のＣＸＣＲ４受容体リガンドと比較して毒性は低めであると思われる。加えて、サイレント拮抗薬は、薬理学的領域では、少数派の種である（Wurch et al., 1999, Kenakin, 2004）。
【発明の開示】
【００１９】
驚くべきことには、本発明者らは、初めてＣＸＣＲ４に結合することができるだけでなくＣＸＣＲ４ホモ二量体および／またはヘテロ二量体のコンホメーション変化を誘導することもできる抗体を産生することができた。更に詳細には、本発明の抗体は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体だけでなくＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体のコンホメーション変化を誘導することもできる。
【００２０】
下記の明細書において、複数の表現「ＣＸＣＲ４二量体」は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体をも包含するものと理解しなければならない。
【００２１】
このような抗体は、従来の技術分野では報告されたことがないことをこの段階で述べておかなければならない。更に、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体の存在は、全く報告されなかったことを述べなければならない。
【００２２】
本発明の一部分は、ＣＸＣＲ４とＣＸＣＲ２によって形成されたヘテロ二量体の存在を見出したことである。
【００２３】
従って、特定態様では、本発明は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体を含んでなるまたはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体からなる単離複合体に関する。
【００２４】
好ましくは、前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ４複合部分は、
ジーンバンクアクセッション番号（Genbank accession number）ＮＰ  ００３４５８  配列番号２９：
ＭＥＧＩＳＩＹＴＳＤＮＹＴＥＥＭＧＳＧＤＹＤＳＭＫＥＰＣＦＲＥＥＮＡＮＦＮＫＩＦＬＰＴＩＹＳＩＩＦＬＴＧＩＶＧＮＧＬＶＩＬＶＭＧＹＱＫＫＬＲＳＭＴＤＫＹＲＬＨＬＳＶＡＤＬＬＦＶＩＴＬＰＦＷＡＶＤＡＶＡＮＷＹＦＧＮＦＬＣＫＡＶＨＶＩＹＴＶＮＬＹＳＳＶＬＩＬＡＦＩＳＬＤＲＹＬＡＩＶＨＡＴＮＳＱＲＰＲＫＬＬＡＥＫＶＶＹＶＧＶＷＩＰＡＬＬＬＴＩＰＤＦＩＦＡＮＶＳＥＡＤＤＲＹＩＣＤＲＦＹＰＮＤＬＷＶＶＶＦＱＦＱＨＩＭＶＧＬＩＬＰＧＩＶＩＬＳＣＹＣＩＩＩＳＫＬＳＨＳＫＧＨＱＫＲＫＡＬＫＴＴＶＩＬＩＬＡＦＦＡＣＷＬＰＹＹＩＧＩＳＩＤＳＦＩＬＬＥＩＩＫＱＧＣＥＦＥＮＴＶＨＫＷＩＳＩＴＥＡＬＡＦＦＨＣＣＬＮＰＩＬＹＡＦＬＧＡＫＦＫＴＳＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲＧＳＳＬＫＩＬＳＫＧＫＲＧＧＨＳＳＶＳＴＥＳＥＳＳＳＦＨＳＳ
で示される配列を有するケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモティーフ）受容体４アイソフォームｂ［ホモサピエンス］、
ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ  ００１００８５４０  配列番号３０：
ＭＳＩＰＬＰＬＬＱＩＹＴＳＤＮＹＴＥＥＭＧＳＧＤＹＤＳＭＫＥＰＣＦＲＥＥＮＡＮＦＮＫＩＦＬＰＴＩＹＳＩＩＦＬＴＧＩＶＧＮＧＬＶＩＬＶＭＧＹＱＫＫＬＲＳＭＴＤＫＹＲＬＨＬＳＶＡＤＬＬＦＶＩＴＬＰＦＷＡＶＤＡＶＡＮＷＹＦＧＮＦＬＣＫＡＶＨＶＩＹＴＶＮＬＹＳＳＶＬＩＬＡＦＩＳＬＤＲＹＬＡＩＶＨＡＴＮＳＱＲＰＲＫＬＬＡＥＫＶＶＹＶＧＶＷＩＰＡＬＬＬＴＩＰＤＦＩＦＡＮＶＳＥＡＤＤＲＹＩＣＤＲＦＹＰＮＤＬＷＶＶＶＦＱＦＱＨＩＭＶＧＬＩＬＰＧＩＶＩＬＳＣＹＣＩＩＩＳＫＬＳＨＳＫＧＨＱＫＲＫＡＬＫＴＴＶＩＬＩＬＡＦＦＡＣＷＬＰＹＹＩＧＩＳＩＤＳＦＩＬＬＥＩＩＫＱＧＣＥＦＥＮＴＶＨＫＷＩＳＩＴＥＡＬＡＦＦＨＣＣＬＮＰＩＬＹＡＦＬＧＡＫＦＫＴＳＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲＧＳＳＬＫＩＬＳＫＧＫＲＧＧＨＳＳＶＳＴＥＳＥＳＳＳＦＨＳＳ
で示される配列を有するケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモティーフ）受容体４アイソフォームａ［ホモサピエンス］、
配列番号２９または３０を有するこれらｂまたはａアイソフォームの１つと少なくとも９５％の同一性を有するその選択的転写スプライシング（alternate transcriptional splice）変異体または天然変異体、および
その天然リガンド間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）によって特異的に認識することができかつ好ましくは少なくとも１００、１５０および２００アミノ酸長を有するその断片
からなる群から選択される２種類のヒトＣＸＣＲ４アイソフォームの１つである。
【００２５】
好ましくは、前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ２複合部分は、
ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ  ００１５４８  配列番号３１：
ＭＥＤＦＮＭＥＳＤＳＦＥＤＦＷＫＧＥＤＬＳＮＹＳＹＳＳＴＬＰＰＦＬＬＤＡＡＰＣＥＰＥＳＬＥＩＮＫＹＦＶＶＩＩＹＡＬＶＦＬＬＳＬＬＧＮＳＬＶＭＬＶＩＬＹＳＲＶＧＲＳＶＴＤＶＹＬＬＮＬＡＬＡＤＬＬＦＡＬＴＬＰＩＷＡＡＳＫＶＮＧＷＩＦＧＴＦＬＣＫＶＶＳＬＬＫＥＶＮＦＹＳＧＩＬＬＬＡＣＩＳＶＤＲＹＬＡＩＶＨＡＴＲＴＬＴＱＫＲＹＬＶＫＦＩＣＬＳＩＷＧＬＳＬＬＬＡＬＰＶＬＬＦＲＲＴＶＹＳＳＮＶＳＰＡＣＹＥＤＭＧＮＮＴＡＮＷＲＭＬＬＲＩＬＰＱＳＦＧＦＩＶＰＬＬＩＭＬＦＣＹＧＦＴＬＲＴＬＦＫＡＨＭＧＱＫＨＲＡＭＲＶＩＦＡＶＶＬＩＦＬＬＣＷＬＰＹＮＬＶＬＬＡＤＴＬＭＲＴＱＶＩＱＥＴＣＥＲＲＮＨＩＤＲＡＬＤＡＴＥＩＬＧＩＬＨＳＣＬＮＰＬＩＹＡＦＩＧＱＫＦＲＨＧＬＬＫＩＬＡＩＨＧＬＩＳＫＤＳＬＰＫＤＳＲＰＳＦＶＧＳＳＳＧＨＴＳＴＴＬ
で示される配列を有するインターロイキン８受容体β［ホモサピエンス］、
配列番号３１を有するこのインターロイキン８受容体βと少なくとも９５％の同一性を有するその選択的転写スプライシング変異体または天然変異体、および
ＩＬ−８によって特異的に認識することができかつ好ましくは少なくとも１００、１５０および２００アミノ酸長を有するその断片
からなる群から選択される。
【００２６】
この特定態様では、本発明はまた、前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体を含んでなるポリペプチドをコードする単離ＲＮＡまたはＤＮＡを含んでなる。
【００２７】
本発明は、更に核酸構築物、好ましくは前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体をコードするプラスミドのような発現ベクターを含んでなる。
【００２８】
本発明は、更に少なくとも１個の核酸構築物、好ましくは前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ４部分をコードするプラスミドのような発現ベクターと、第二の構築物、好ましくは前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ２部分をコードするプラスミドのような発現ベクターを含んでなる組成物を含んでなる。
【００２９】
この態様では、本発明は、更に前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体を発現する組換え宿主細胞の調製方法であって、
ａ）核酸構築物、好ましくは前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体をコードするプラスミドのような発現ベクターにより、または
ｂ）少なくとも１個の核酸構築物、好ましくは前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ４部分をコードするプラスミドのような発現ベクターと、第二の構築物、好ましくは前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ２部分をコードするプラスミドのような発現ベクターにより
前記宿主細胞を形質転換する段階を含んでなる、方法を含んでなる。
【００３０】
好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、哺乳類細胞のような真核細胞である。
【００３１】
好ましい実施形態では、前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体をコードする核酸構築物は、ｌｕｃマーカーのようなＣＸＣＲ４配列と（特に、共有結合（covalent coupling）によって）結合している第一のマーカー、およびＧＦＰマーカー（すなわち、ＢＲＥＴ分析用）のようなＣＸＣＲ２配列と（特に、共有結合によって）結合している第二のマーカーもコードする。
【００３２】
本発明は、抗癌活性を有する化合物の選択または癌治療の組成物の調製に用いることができる方法であって、
ａ）前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体を発現する本発明の組換え宿主細胞を供試化合物と接触させ、および
ｂ）この化合物が組換え宿主細胞におけるこのＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体の活性を調節する、好ましくは阻害することができるかどうかを測定する
段階を含んでなる、前記方法も含んでなる。
【００３３】
第一の態様では、本発明の主題は、本発明による抗体の産生および選択の方法である。
【００３４】
更に詳細には、本発明は、ＣＸＣＲ４のリガンド依存性およびリガンドとは独立した活性化のいずれをも阻害することができる抗ＣＸＣＲ４抗体またはその機能的断片または誘導体の１つの選択方法であって、
ｉ）産生した抗体をスクリーニングし、ＣＸＣＲ４に特異的に結合しかつＣＸＣＲ４の活性化を調節することもできる抗体を選択し、
ｉｉ）段階ｉ）で選択された抗体を試験し、ＣＸＣＲ４ホモ二量体にコンホメーション変化を誘導することができる抗体を選択し、次いで、
ｉｉｉ）段階ｉｉ）で選択された抗体を試験し、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体にコンホメーション変化を誘導することができる抗体を選択する
段階を含んでなる、前記方法に関する。
【００３５】
「調節する」という表現は、増加または阻害と理解しなければならない。好ましくは、本発明の選択した抗体は、ＣＸＣＲ４活性化を阻害しなければならない。
【００３６】
上記で説明したように、ＣＸＣＲ４二量体コンホメーション変化の誘導は、このような抗体がより大きな患者集団に対して実質利益を提供するので、本発明の主要な態様である。
【００３７】
抗体の産生は、例えば、骨髄腫細胞と免疫化したマウスまたは選択した骨髄腫細胞と適合性のある他の種由来の脾臓細胞との融合のような、当業者に知られている任意の方法によって実現することができる(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)。免疫化した動物としては、ヒト免疫グロブリン座を有するトランスジェニックマウスを挙げることができ、これは次いでヒト抗体を直接産生する。もう一つの可能な実施形態は、ライブラリーのスクリーニングのためファージディスプレイ法を用いることにある。
【００３８】
スクリーニング段階ｉ）は、当業者に知られている任意の方法または工程によって実現することができる。非制限的例としては、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、免疫組織化学、ＦＡＣＳ分析および機能的スクリーニングを挙げることができる。好ましい方法は、ＣＸＣＲ４トランスフェクタントおよび少なくとも１種類の腫瘍細胞系でのＦＡＣＳ分析によってスクリーニングして、産生した抗体が腫瘍細胞上の本来の受容体を認識することもできることを確かめることにある。この方法を、下記の実施例で一層詳細に説明する。
【００３９】
「ＣＸＣＲ４活性化を調節する」という表現は、下記の例４、５、７および１３に示される活性の少なくとも１つを調節することを意図する。
【００４０】
好ましくは、
受容体ＣＸＣＲ４（例４参照）上、特にヒト野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１膜のような真核生物の形質転換した細胞膜上での競合によるリガンドＳＤＦ−１の細胞膜での特異結合、
受容体ＣＸＣＲ４（例５参照）上、特に野生型ＣＸＣＲ４受容体膜を安定的かつ構成的に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞のような真核生物の形質転換した細胞膜上でのＧＴＰγＳの細胞膜での特異結合、
ｃＡＭＰ生成のＣＸＣＲ４媒介性阻害（例７参照）、および
細胞内カルシウム貯蔵のＣＸＣＲ４受容体媒介性流動化（例１３参照）
を調節しようとするものである。
【００４１】
更に好ましくは、これらの活性の少なくとも１つの調節は、活性の阻害である。
【００４２】
本発明の方法の選択の段階ｉｉ）およびｉｉｉ）の好ましい実施形態では、前記段階ｉｉ）およびｉｉｉ）は、それぞれＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ４−ＹＦＰおよびＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ／ＣＸＣＲ２−ＹＦＰを発現する細胞上でＢＲＥＴ分析により抗体を評価し、ＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％、好ましくは４５％、５０％、５５％、最も好ましくは６０％を阻害することができる抗体を選択することからなる。
【００４３】
ＢＲＥＴ法は、タンパク質二量体化の典型的なものとして知られている手法である(Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89)。
【００４４】
この方法の段階ｉｉ）およびｉｉｉ）で用いられるＢＲＥＴ法は、当業者に周知であり、下記の実施例で詳細に説明する。更に詳細には、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）は、生物発光供与体（ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ））とＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）の変異体である蛍光受容体との間で起こる非放熱性エネルギー移動である。本発明の場合には、ＥＹＦＰ（増強黄色蛍光タンパク質）を用いた。移動の効力は、供与体と受容体の配向および距離に依存する。次いで、エネルギー移動は、２個の分子が接近（１〜１０ｎｍ）している場合にのみ起こり得る。この特性を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用分析を行う。実際に、２つのパートナー同士の相互作用を研究するため、第一のパートナーをウミシイタケルシフェラーゼに遺伝的に融合させ、第二のパートナーをＧＦＰの黄色変異体に融合させる。融合タンパク質は、通常は哺乳類細胞で発現させるが、必須のものではない。その膜透過性基質（コエレンテラジン）の存在下では、Ｒｌｕｃは青色光を発光する。ＧＦＰ変異体がＲｌｕｃから１０ｎｍより近くにあれば、エネルギー移動が起こることができ、追加の黄色シグナルを検出することができる。ＢＲＥＴシグナルは、受容体によって発光される光線と供与体によって発光される光線との比として測定される。従って、２個の融合タンパク質が近接しまたはコンホメーション変化によってＲｌｕｃとＧＦＰ変異体が一層近くなると、ＢＲＥＴシグナルは増加する。
【００４５】
ＢＲＥＴ分析が好ましい実施形態からなる場合には、当業者に知られている任意の方法を用いて、ＣＸＣＲ４二量体コンホメーション変化を測定することができる。制限なしに、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）、ＦＬＩＭ（蛍光寿命画像顕微鏡法）またはＳＷ−ＦＣＣＳ（単一波長蛍光相互相関分光法）の手法を挙げることができる。
【００４６】
共免疫沈降、α−スクリーン、化学架橋、二重ハイブリッド、アフィニティークロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡまたはファーウェスタンブロット法のような他の古典的手法を、用いることもできる。
【００４７】
本発明による方法の特定態様では、段階ｉｉ）は、ＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ４−ＹＦＰを両方とも発現する細胞上でＢＲＥＴ分析によって抗体を評価し、ＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％を阻害することができる抗体を選択することからなる。
【００４８】
本発明による方法のもう一つの特定態様では、段階ｉｉｉ）は、ＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ２−ＹＦＰを両方とも発現する細胞上でＢＲＥＴ分析によって抗体を評価し、ＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％を阻害することができる抗体を選択することからなる。
【００４９】
第二の態様では、本発明の目的は、前記方法によって得られる単離抗体、またはその機能的断片または誘導体の１つである。前記抗体またはその前記断片または誘導体はヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合することができ、必要ならば、好ましくはさらにそのリガンドの天然付着物を阻害することもでき、前記抗体はＣＸＣＲ４二量体コンホメーション変化を誘導することもできる。
【００５０】
「機能的断片および誘導体」という表現は、本明細書において下記において詳細に定義される。
【００５１】
本発明は、天然形態の抗体に関するものではなく、すなわち、それらは、天然環境にはないが、天然供給源から精製によって単離しまたは得ることができたものであり、あるいは遺伝子組換えまたは化学合成によって得ることができるものであり、かつ次にそれらは、更に説明されるように非天然アミノ酸を含むことができることをここで理解しなければならない。
【００５２】
更に詳細には、本発明のもう一つの態様によれば、抗体、またはその機能的断片または誘導体が特許請求され、前記抗体は、配列番号１〜１２のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域ＣＤＲから選択される少なくとも１個のＣＤＲを含んでなる。
【００５３】
更に詳細には、本発明のもう一つの態様によれば、抗体、またはその機能的断片または誘導体が特許請求され、前記抗体は、配列番号２、５または４０〜４９のアミノ酸配列を含んでなる相補性決定領域ＣＤＲから選択される少なくとも１個のＣＤＲを含んでなる。
【００５４】
第一の態様によれば、本発明は、配列番号１、２、３、４、５または６の配列のＣＤＲから選択される少なくとも１個のＣＤＲ、または配列が、最適アライメント後に配列番号１、２、３、４、５または６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲを含んでなる、単離抗体、またはその誘導化合物または機能的断片に関する。
【００５５】
もう一つの態様によれば、本発明は、配列番号４０、２、４１、４２、５または４３の配列のＣＤＲから選択される少なくとも１個のＣＤＲ、または配列が、最適アライメント後に配列番号４０、２、４１、４２、５または４３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲを含んでなる、単離抗体、またはその誘導化合物または機能的断片に関する。
【００５６】
抗体の「機能的断片」は、詳細には、断片Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは二重特異性抗体のような抗体断片、または半減期が増加した任意の断片を意味する。このような機能的断片は、本明細書において以下に詳細に説明する。
【００５７】
抗体の「誘導化合物」または「誘導体」は、詳細には、ＣＸＣＲ４を認識するその能力を保存するためにペプチド骨格と元の抗体のＣＤＲの少なくとも１個から構成される結合性タンパク質を意味する。当業者に周知のこのような誘導化合物は、本明細書において以下に更に詳細に説明する。
【００５８】
更に好ましくは、本発明は、特に遺伝子組換えまたは化学合成によって得られたキメラまたはヒト化した本発明による抗体、それらの誘導化合物またはそれらの機能的断片を含んでなる。
【００５９】
好ましい実施形態によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【００６０】
「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均質な抗体の個体群から生じる抗体を意味するものと理解される。更に詳細には、ある個体群の個々の抗体は、最小限の比率で見出すことができる少数の可能な天然に存在する変異体を除き、同一である。換言すれば、モノクローナル抗体は、単一細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均一抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクションした真核生物の宿主細胞、均一抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクションした原核生物の宿主細胞など）の増殖から生じる均一抗体からなり、一般に１個かつただ１種のクラスおよびサブクラスの重鎖、およびただ１タイプの軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一抗原に対する。更に、典型的には様々な決定基またはエピトープに対する様々な抗体を包含するポリクローナル抗体の調製とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原の単一エピトープに対する。
【００６１】
本発明は、天然形態の抗体に関するものではなく、すなわち、それらの天然環境から得られるものではないが、天然供給源から精製によって単離されまたは得られ、あるいは遺伝子組換えまたは化学合成によって得られるものであり、従って、それらは下記に説明するように非天然アミノ酸を有することができることを理解しなければならない。
【００６２】
更に詳細には、本発明の好ましい実施形態によれば、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、配列番号１、２または３のアミノ酸配列のＣＤＲから選択される少なくとも１個のＣＤＲ、または配列が、最適アライメント後に配列番号１、２または３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなるか、または配列番号４、５または６のアミノ酸配列のＣＤＲから選択される少なくとも１個のＣＤＲ、または配列が、最適アライメント後に配列番号４、５または６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００６３】
もう一つの実施形態によれば、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号１、２または３の配列である３個のＣＤＲの少なくとも１個、または最適アライメント後に配列番号１、２または３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個の配列を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００６４】
好ましい様式では、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、下記の３種類のＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする：ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１または９の配列、または最適アライメント後に配列番号１または９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２または１０の配列、または最適アライメント後に配列番号２または１０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、および
ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号３の配列、または最適アライメント後に配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる。
【００６５】
特定実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号１の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２の配列であるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００６６】
もう一つの特定実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号９の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０の配列であるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００６７】
更に詳細には、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号４、５または６の配列である３個のＣＤＲの少なくとも１個、または最適アライメント後に配列番号４、５または６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個の配列を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００６８】
更に一層好ましくは、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、下記の３種類のＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする：ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号４、７または１１の配列、または最適アライメント後に配列番号４、７または１１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号５または１２の配列、または最適アライメント後に配列番号５または１２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、および
ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６または８の配列、または最適アライメント後に配列番号６または８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる。
【００６９】
特定実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号７の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号８の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００７０】
もう一つの特定実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的
断片の１つは、配列番号１１の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００７１】
更に詳細には、本発明の好ましい実施形態によれば、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、配列番号４０、２または４１のアミノ酸配列のＣＤＲから選択される少なくとも１個のＣＤＲ、または配列が、最適アライメント後に配列番号４０、２または４１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなるか、または配列番号４２、５または４３のアミノ酸配列のＣＤＲから選択される少なくとも１個のＣＤＲ、または配列が、最適アライメント後に配列番号４２、５または４３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００７２】
もう一つの実施形態によれば、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号４０、２または４１の配列の３個のＣＤＲの少なくとも１個、または最適アライメント後に配列番号４０、２または４１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個の配列を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００７３】
好ましい様式では、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、下記の３種類のＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする：ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号４０または４６の配列、または最適アライメント後に配列番号４０または４６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２または４７の配列、または最適アライメント後に配列番号２または４７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、および
ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号４１の配列、または最適アライメント後に配列番号４１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる。
【００７４】
特定実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号４０の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２の配列であるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号４１の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００７５】
もう一つの特定実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号４６の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７の配列であるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号４１の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００７６】
更に詳細には、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号４２、５または４３の配列である３個のＣＤＲの少なくとも１個、または最適アライメント後に配列番号４２、５または４３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１個の配列を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００７７】
更に一層好ましくは、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、下記の３種類のＣＤＲで、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする：ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号４２、４４または４８の配列、または最適アライメント後に配列番号４２、４４または４８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号５または４９の配列、または最適アライメント後に配列番号５または４９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなり、および
ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号４５または４３の配列、または最適アライメント後に配列番号４５または４３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる。
【００７８】
特定実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号４４の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４５の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００７９】
もう一つの特定実施形態によれば、抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つは、配列番号４８の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４３の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００８０】
本発明の明細書において、「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」および「抗体化合物またはそれらの配列に結合したタンパク質」という用語は、代替可能である。
【００８１】
本発明は、天然形態の抗体に関するものではなく、すなわち、それらは、それらの天然環境からは得られないが、天然供給源から精製によって単離しまたは得ることができるものであり、あるいは遺伝子組換えまたは化学合成によって得ることができるものであり、従ってそれらは、下記に説明されるように非天然アミノ酸を有することができることを理解しなければならない。
【００８２】
第一の態様では、相補性決定領域またはＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．によって定義される免疫グロブリンの重および軽鎖の超可変領域を意味する（Kabat et al.,「免疫学的に重要なタンパク質の配列（Sequences of proteins of immunological interest）」, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 および以後の版）。３種類の重鎖ＣＤＲと３種類の軽鎖ＣＤＲがある。本発明では、「ＣＤＲ」および「ＣＤＲｓ」は、場合によるが、抗体が認識する抗原またはエピトープの抗体の結合親和性に関与するアミノ酸残基の大部分を含む領域の１以上またはすべてを示すのに用いられる。
【００８３】
第二の実施形態では、ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴによって定義された免疫グロブリンの重および軽鎖の超可変領域を示すことを意図する。
【００８４】
ＩＭＧＴのユニークなナンバリングは、抗原受容体、鎖のタイプまたは種類がなんであれ、可変ドメインを比較するために定義されたものである(Lefranc M. -P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))。ＩＭＧＴのユニークなナンバリングでは、保存されたアミノ酸は常に同じ位置を有し、例えばシステイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）である。ＩＭＧＴのユニークなナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６位、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８）および相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７の標準化限界（standardized delimitation）を提供する。ギャップは非占有位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧の中に示され、ドットで区切られる、例えば［８．８．１３］）は、非常に重要な情報となる。ＩＭＧＴのユニークなナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２Ｄグラフィック表現(Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007))およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢにおける３Ｄ構造(Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., 「Ｔ細胞受容体およびＭＨＣ構造データー(T cell receptor and MHC structure data)」．Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004))に用いられる。
【００８５】
３種類の重鎖ＣＤＲと３種類の軽鎖ＣＤＲが存在する。ＣＤＲまたはＣＤＲｓという用語は、本明細書では、場合によるが、抗体が認識する抗原またはエピトープの抗体の親和性よる結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つまたは数個またはすべてを示すのに用いられる。
【００８６】
より分かりやすくするため、下記の説明および更に詳細には、表２および３において、ＣＤＲはＩＭＧＴナンバリング、Ｋａｂａｔナンバリングおよび共通ナンバリングによって定義されることを理解しなければならない。
【００８７】
共通ナンバリングでは、ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔナンバリングシステムによって定義されたＣＤＲに共通するそれぞれのＣＤＲの残基部分を再編成する。
【００８８】
ＩＭＧＴナンバリングシステムは、上記で定義したようにＩＭＧＴシステムに準じてＣＤＲを定義し、一方、Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、上記で定義したようにＫａｂａｔシステムに準じてＣＤＲを定義する。
【００８９】
更に詳細には、ＣＤＲ−Ｌ１は、共通およびＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号１（ＱＳＬＹＮＳＲＴＲＫＮＹ）からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号９（ＫＳＳＱＳＬＹＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡ）からなる。
【００９０】
ＣＤＲ−Ｌ２に関しては、共通およびＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号２（ＷＡＳ）からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１０（ＷＡＳＴＲＥＳ）からなる。
【００９１】
ＣＤＲ−Ｌ３は、３種類のナンバリングシステムのそれぞれについて配列番号３（ＫＱＳＹＮＬＲＴ）からなる。
【００９２】
重鎖については、ＣＤＲ−Ｈ１は共通ナンバリングシステムでは配列番号４（ＴＤＹＹ）からなり、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号７（ＧＦＴＦＴＤＹＹ）からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１１（ＴＤＹＹＭＳ）からなる。
【００９３】
ＣＤＲ−Ｈ２は、共通およびＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号５（ＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴ）からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号１２（ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧ）からなる。
【００９４】
最後に、ＣＤＲ−Ｈ３は、共通およびＫａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号６（ＤＩＰＧＦＡＹ）からなり、一方、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号：８（ＡＲＤＩＰＧＦＡＹ）からなる。
【００９５】
更に詳細には、ＣＤＲ−Ｌ１は、共通およびＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号４０（ＱＳＬＦＮＳＲＴＲＫＮＹ）からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号４６（ＫＳＳＱＳＬＦＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡ）からなる。
【００９６】
ＣＤＲ−Ｌ２に関しては、共通およびＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号２（ＷＡＳ）からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号４７（ＷＡＳＡＲＤＳ）からなる。
【００９７】
ＣＤＲ−Ｌ３は、３種類のナンバリングシステムのそれぞれについて配列番号４１（ＭＱＳＦＮＬＲＴ）からなる。
【００９８】
重鎖については、ＣＤＲ−Ｈ１は、共通ナンバリングシステムでは配列番号４２（ＤＮＹ）からなり、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号４４（ＧＦＴＦＴＤＮＹ）からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号４８（ＤＮＹＭＳ）からなる。
【００９９】
ＣＤＲ−Ｈ２は、共通およびＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号５（ＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴ）からなり、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号４９（ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＤＹＳＡＳＶＲＧ）からなる。
【０１００】
最後に、ＣＤＲ−Ｈ３は、共通およびＫａｂａｔナンバリングシステムでは配列番号４３（ＤＶＧＳＮＹＦＤＹ）からなり、一方、ＩＭＧＴナンバリングシステムでは配列番号４５（ＡＲＤＶＧＳＮＹＦＤＹ）からなる。
【０１０１】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２つの配列の「同一性率」とは、最適アライメント後に得られた比較を行う２つの配列の間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味し、この割合は純粋に統計的なものでありかつ２つの配列の間の差はそれらの長さに沿ってランダムに分布する。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、従来的にはそれらを最適アライメントした後に配列を比較することによって行われ、前記比較はセグメントによってまたは「アライメントウインドウ」を用いることによって行うことができる。比較のための配列の最適アライメントは、手作業による比較の他に、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所相同性アルゴリズム法(Ad. App. Math. 2:482)によって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）の局所相同性アルゴリズム法(J. Mol. Biol. 48:443)によって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）の同様な検索方法(Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 85:2444)によって、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウェア法(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIでのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウェアＢＬＡＳＴ  ＮＲまたはＢＬＡＳＴ  Ｐによる)によって行うことができる。
【０１０２】
２つの核酸またはアミノ酸配列の間の同一性率は、２つの最適アライメントした配列であって、比較する核酸またはアミノ酸配列が２つの配列間の最適アライメントのための参照配列と比較して付加または欠失を有することができるものを比較することによって決定される。同一性率は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは残基が２つの配列、好ましくは２つの完全配列の間で同一である位置の数を決定し、同一位置の数をアライメントウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を乗じて、２つの配列間の同一性率を得ることによって計算される。
【０１０３】
例えば、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al,「Ｂｌａｓｔ  ２配列−タンパク質とヌクレオチド配列の比較のための新たなツール(Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences)」, FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特にパラメーターについては、「オープン・ギャップ・ペナルティ」：５、および「エクステンション・ギャップ・ペナルティ」：２；選択したマトリックスは、例えば、プログラムによって提案された「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックス）で用いることができ、２つの配列間の同一性率は、このプログラムによって直接計算される。
【０１０４】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列については、好ましい例としては、参照配列、ある種の修飾、特に少なくとも１個のアミノ酸の欠失、付加または置換、切断または伸張を含むものが挙げられる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合には、置換されるアミノ酸が「同等な」アミノ酸によって置き換わる置換が好ましい。本発明において、「同等なアミノ酸」という表現は、対応する抗体および下記で定義するそれら具体例の生物活性を変更することなく構造アミノ酸の１つを置換すると思われる任意のアミノ酸を示すことを意味する。
【０１０５】
同等なアミノ酸は、置換するアミノ酸とそれらの構造的相同性または産生されると思われる様々な抗体間での生物活性の比較試験の結果に基づいて決定することができる。
【０１０６】
非制限的例として、下表１には、対応する修飾された抗体の生物活性の有意な変更を生じることなく行われると思われる可能な置換がまとめてあり、逆置換は同じ条件下にて自然に可能である。
【０１０７】
【表１】
0005723279.tif 000002
【０１０８】
当該技術分野の現在の状態では、６つのＣＤＲの間の最大可変性（長さおよび組成）は、３種類の重鎖ＣＤＲ、更に詳細にはこの重鎖のＣＤＲ−Ｈ３で見出されることが当業者に知られている。従って、本発明の抗体、またはそれらの誘導化合物または機能的断片の１つの好ましい特徴的なＣＤＲは、重鎖の３種類のＣＤＲであり、すなわち、４１４Ｈ５については、それぞれＩＭＧＴおよびＫａｂａｔに準じて定義された配列番号７、５、８および１１、１２、６の配列によってコードされたＣＤＲであり、５１５Ｈ７については、それぞれＩＭＧＴおよびＫａｂａｔに準じて定義された配列番号４４、５、４５および４８、４９、４３の配列によってコードされたＣＤＲであることは明らかであろう。更に一層好ましくは、４１４Ｈ５については、ＣＤＲは配列番号８または６の配列によってコードされたＣＤＲ−Ｈ３に対応し、５１５Ｈ７については、４５または４３の配列によってコードされたＣＤＲ−Ｈ３に対応する。
【０１０９】
具体的実施形態では、本発明は、マウス抗体、またはその誘導化合物または機能的断片に関する。
【０１１０】
本発明のもう一つの実施形態は、下記の３種類のＣＤＲを含んでなる軽鎖：
配列番号１の配列、または最適アライメント後に配列番号１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２の配列、または最適アライメント後に配列番号２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号３の配列、または最適アライメント後に配列番号３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３、および
下記の３種類のＣＤＲを含んでなる重鎖：
配列番号４の配列、または最適アライメント後に配列番号４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５の配列、または最適アライメント後に配列番号５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２、および
配列番号６の配列、または最適アライメント後に配列番号６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
【０１１１】
本発明の更にもう一つの実施形態は、下記の３種類のＣＤＲを含んでなる軽鎖：
配列番号１の配列、または最適アライメント後に配列番号１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２の配列、または最適アライメント後に配列番号２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号３の配列、または最適アライメント後に配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３、および
下記の３種類のＣＤＲを含んでなる重鎖：
配列番号７の配列、または最適アライメント後に配列番号７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５の配列、または最適アライメント後に配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２、および
配列番号８の配列、または最適アライメント後に配列番号８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
【０１１２】
本発明の更にもう一つの態様は、下記の３種類のＣＤＲを含んでなる軽鎖：
配列番号９の配列、または最適アライメント後に配列番号９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号１０の配列、または最適アライメント後に配列番号１０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号３の配列、または最適アライメント後に配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３、および
下記の３種類のＣＤＲを含んでなる重鎖：
配列番号１１の配列、または最適アライメント後に配列番号１１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号１２の配列、または最適アライメント後に配列番号１２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２、および
配列番号６の配列、または最適アライメント後に配列番号６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
【０１１３】
本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、
配列番号１の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２の配列であるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
配列番号７の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の配列であるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
を含んでなることを特徴とする。
【０１１４】
もう一つの実施形態では、本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、
配列番号９の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０の配列であるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
配列番号１１の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列であるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
を含んでなることを特徴とする。
【０１１５】
更にもう一つの実施形態によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、配列番号１３のアミノ酸配列または最適アライメント後に配列番号１３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号１４のアミノ酸配列または最適アライメント後に配列番号１４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖配列を含んでなることを特徴とする。
【０１１６】
本発明のもう一つの実施形態は、下記の３種類のＣＤＲを含んでなる軽鎖：
配列番号４０の配列、または最適アライメント後に配列番号４０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２の配列、または最適アライメント後に配列番号２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号４１の配列、または最適アライメント後に配列番号４１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３、および  下記の３種類のＣＤＲを含んでなる重鎖：
配列番号４２の配列、または最適アライメント後に配列番号４２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５の配列、または最適アライメント後に配列番号５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２、および
配列番号４３の配列、または最適アライメント後に配列番号４３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
【０１１７】
本発明の更にもう一つの実施形態は、下記の３種類のＣＤＲを含んでなる軽鎖：
配列番号４０の配列、または最適アライメント後に配列番号４０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２の配列、または最適アライメント後に配列番号２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号４１の配列、または最適アライメント後に配列番号４１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３、および
下記の３種類のＣＤＲを含んでなる重鎖：
配列番号４４の配列、または最適アライメント後に配列番号４４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５の配列、または最適アライメント後に配列番号５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２、および
配列番号４５の配列、または最適アライメント後に配列番号４５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
【０１１８】
本発明の更にもう一つの実施形態は、下記の３種類のＣＤＲを含んでなる軽鎖：
配列番号４６の配列、または最適アライメント後に配列番号４６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号４７の配列、または最適アライメント後に配列番号４７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号４１の配列、または最適アライメント後に配列番号４１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３、および
下記の３種類のＣＤＲを含んでなる重鎖：
配列番号４８の配列、または最適アライメント後に配列番号４８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号４９の配列、または最適アライメント後に配列番号４９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２、および
配列番号４３の配列、または最適アライメント後に配列番号４３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
【０１１９】
本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、
配列番号４０の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２の配列であるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４１の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
配列番号４４の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の配列であるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４５の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
を含んでなることを特徴とする。
【０１２０】
もう一つの実施形態では、本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、
配列番号４６の配列であるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７の配列であるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４１の配列であるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
配列番号４８の配列であるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９の配列であるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４３の配列であるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
を含んでなることを特徴とする。
【０１２１】
更にもう一つの実施形態によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、配列番号５０のアミノ酸配列または最適アライメント後に配列番号５０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号５１のアミノ酸配列または最適アライメント後に配列番号５１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖配列を含んでなることを特徴とする。
【０１２２】
上記から分かるように、本発明は、本発明で記載された抗体から誘導される任意の化合物にも関する。
【０１２３】
更に詳細には、本発明の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、前記誘導化合物が、初期抗体のパラトープ認識特性のすべてまたは一部を保存するような方法で少なくとも１個のＣＤＲがグラフトしているペプチド骨格を含んでなる結合タンパク質からなることを特徴としている。
【０１２４】
本発明で記載される６種類のＣＤＲ配列の中の１以上の配列は、様々な免疫グロブリンタンパク質骨格形成時にも存在することができる。この場合には、タンパク質配列は、グラフトしたＣＤＲの折り畳みに適したペプチド骨格を回復することができ、それらにパラトープ抗原認識特性を保存させることができる。
【０１２５】
一般に、当業者であれば、元の抗体から生じるＣＤＲの少なくとも１個をグラフトするためのタンパク質骨格のタイプを決定する方法を知っている。更に詳細には、選択されるには、このような骨格は、下記のような最大数の基準：
良好な系統発生的保存、
既知の三次元構造（例えば、結晶学、ＮＭＲ分光法、または当業者に知られている任意の他の手法による）、
小サイズ、
転写後修飾が僅かまたは全くない、および／または
産生、発現および精製が容易
に適合しなければならないことが知られている（Skerra A., J. MoI. Recogn., 2000, 13:167-187）。
【０１２６】
このようなタンパク質骨格の起源は、フィブロネクチンおよび優先的にはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１０、リポカリン、アンチカリン（Skerra A., J. Biotechnol, 2001, 74(4):257-75）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのドメインＢから生じるプロテインＺ、チオレドキシンＡ、または「アンキリン反復」（Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705）、「アルマジロ反復」、「ロイシンリッチ反復」および「テトラトリコペプチド反復」のような反復モティーフを有するタンパク質から選択される構造であることができるが、これらに限定されない。
【０１２７】
例えば、サソリ、昆虫、植物、軟体動物由来の毒素などのような毒素由来の骨格、および神経型ＮＯ合成酵素のタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）も挙げられる。
【０１２８】
このようなハイブリッド構成物の一例は、決して制限的なものではなく、ＰＩＮにおけるループの１つでの抗ＣＤ４抗体、すなわち１３Ｂ８．２のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）の挿入であり、このようにして得られた新規結合タンパク質は、元の抗体と同じ結合特性を保存している（Bes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343(1), 334-344）。純粋に説明的基盤では、抗リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）の、ネオカルジノスタチンのループの１つへのグラフトを挙げることもできる（Nicaise et al., Protein Science, 2004, 13(7):1882-1891）。
【０１２９】
最後に、上記のように、このようなペプチド骨格は、元の抗体から生じる１〜６種類のＣＤＲを含んでなることができる。必要条件ではないが好ましくは、当業者であれば重鎖から少なくとも１つのＣＤＲを選択するであろうし、この重鎖は主として抗体の特異性に関与していることが知られている。１以上の関連ＣＤＲの選択は当業者には明らかであり、適当な既知の手法を選択するであろう（Bes et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74）。
【０１３０】
本発明の具体的態様は、本発明による抗体から誘導される化合物を選択する方法に関し、前記誘導化合物はインビトロおよび／またはインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害することができ、かつ前記誘導化合物は少なくとも１つの抗体ＣＤＲがグラフトしているペプチド骨格を含んでなり、
ａ）少なくとも１つの抗体ＣＤＲがグラフトしているペプチド骨格からなる化合物を、腫瘍細胞を増殖させる条件下で増殖することができるこれらの細胞を含む生物試料とインビトロで接触させ、
ｂ）前記化合物がこれらの腫瘍細胞の増殖を阻害することができるときには、前記化合物を選択する
段階を含んでなることを特徴とし、かつ前記の少なくとも１つのグラフトしたＣＤＲが、下記のＣＤＲ：
配列番号１、９、４０、４６の配列または最適アライメント後に配列番号１、９、４０、４６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ、
配列番号２、１０、４７の配列または最適アライメント後に配列番号２、１０、４７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ、
配列番号３、４１の配列または最適アライメント後に配列番号３、４１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ、
配列番号４、７、１１、４２、４４、４８の配列または最適アライメント後に配列配列番号４、７、１１、４２、４４、４８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ、
配列番号５、１２、４９の配列または最適アライメント後に配列番号５、１２、４９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ、および
配列番号６、８、４３、４５の配列または最適アライメント後に配列番号６、８、４３、４５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ
から選択されることを特徴とする。
【０１３１】
好ましい様式によれば、この方法は、段階ａ）における少なくとも２または３種類の抗体ＣＤＲがグラフトしているペプチド骨格を含んでなる化合物をインビトロで接触させることを包含することができる。
【０１３２】
この方法の更に一層好ましい様式によれば、ペプチド骨格は、構造について上記した骨格または結合タンパク質から選択される。
【０１３３】
明らかに、これらの実施例は決して制限的なものではなく、当業者に知られているまたは明らかな任意の他の構造を、本特許出願明細書によって与えられる保護によって守られるものと考えるべきである。
【０１３４】
従って、本発明は、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片に関し、ペプチド骨格が、ａ）系統発生的に良好に保存され、ｂ）強固な構造であり、ｃ）周知な３Ｄ分子構成を有し、ｄ）サイズが小さく、および／またはｅ）安定性特性を変更することなく欠失および／または挿入によって修飾することができる領域を含んでなるタンパク質から選択されることを特徴とする。
【０１３５】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、前記ペプチド骨格が、ｉ）フィブロネクチン、優先的にはフィブロネクチン３型ドメイン１０、リポカリン、アンチカリン、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのドメインＢから生じるプロテインＺ、チオレドキシンＡ、または「アンキリン反復」(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロ反復」、「ロイシンリッチ反復」および「テトラトリコペプチド反復」のような反復モティーフを有するタンパク質、またはｉｉｉ）神経型ＮＯ合成酵素タンパク質阻害剤（ＰＩＮ）から選択されることを特徴とする。
【０１３６】
本発明のもう一つの態様は、上記抗体の機能的断片に関する。
【０１３７】
更に詳細には、本発明は、前記機能的断片が断片Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび二重特異性抗体、またはＰＥＧ化断片のような半減期が増加した任意の断片から選択されることを特徴とする、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片に関する。
【０１３８】
本発明による抗体のこのような機能的断片は、例えば、断片Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは二重特異性抗体、またはポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコールの付加（ＰＥＧ化）（ＰＥＧ化断片は、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧおよびＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）のような化学修飾によってもしくはリポソーム、微小球またはＰＬＧＡに、特に一般的な様式で断片が生じる抗体の活性を部分的であっても発揮することができる本発明の特徴的ＣＤＲの少なくとも１つを有する前記断片を組込むことによって半減期を増加した任意の断片からなる。
【０１３９】
好ましくは、前記機能的断片は、それらが誘導される抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列を含んでなりまたは包含すると、前記部分配列は、それが生じる抗体と同じ結合特異性および十分な親和性、好ましくはそれが生じる抗体の少なくとも１／１００、更に好ましくは少なくとも１／１０の親和性を保持するだろう。
【０１４０】
このような機能的断片は、それが生じる抗体の配列の少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは６、７、８、１０、１５、２５、５０または１００個の連続的アミノ酸を含むだろう。
【０１４１】
好ましくは、これらの機能的断片は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは二重特異性抗体のタイプであり、一般的に断片が生じる抗体と同じ結合特異性を有する。本発明によれば、本発明の抗体の断片は、ペプシンまたはパパインを含む酵素消化のような方法によっておよび／または化学還元によるジスルフィド架橋の開裂によって上記抗体から得ることができる。抗体断片は、これもまた当業者に知られている組換え遺伝学の手法によって、または例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓなどによって発売されているような自動ペプチド合成装置によるペプチド合成によって得ることもできる。
【０１４２】
更に分かりやすくするために、下表２には、本発明の抗体に対応する様々なアミノ酸配列をまとめている。
【０１４３】
【表２】
0005723279.tif 000003
【０１４４】
本発明のもう一つの具体的態様は、キメラ抗体、またはその誘導化合物または機能的断片であって、前記抗体が、マウスとは異種の、特にヒトの抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域をも含んでなることを特徴とするものに関する。
【０１４５】
更にもう一つの本発明の具体的態様は、ヒト化抗体、またはその誘導化合物または機能的断片であって、ヒト抗体由来の軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれλまたはκ領域、およびγ−１、γ−２、またはγ−４領域であることを特徴とするものに関する。
【０１４６】
もう一つの態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ、特に２００７年１０月２２日に国立微生物カルチャーコレクション（French collection for microrganism cultures）（ＣＮＣＭ，Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，パリ，仏国）にＩ−３８６０の番号で寄託したマウス起源のハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫化マウス脾臓細胞と骨髄腫Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４系の細胞との融合によって得られた。
【０１４７】
本発明において４１４Ｈ５と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその誘導化合物または機能的断片であって、前記抗体が、２００７年１０月２２日にＣＮＣＭにＩ−３８６０の番号で寄託したハイブリドーマによって分泌されることを特徴とするものは、明らかに本発明の部分を形成する。
【０１４８】
もう一つの態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ、特に２００８年６月２５日に国立微生物カルチャーコレクション（French collection for microrganism cultures）（ＣＮＣＭ，Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，パリ，仏国）にＩ−４０１９の番号で寄託したマウス起源のハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫化マウス脾臓細胞と骨髄腫Ｓｐ２／Ｏ-Ａｇ１４系の細胞との融合によって得られた。
【０１４９】
本発明において５１５Ｈ７と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその誘導化合物または機能的断片であって、前記抗体が、２００８年６月２５日にＣＮＣＭにＩ−３８６０の番号で寄託したハイブリドーマによって分泌されることを特徴とするものは、明らかに本発明の部分を形成する。
【０１５０】
本発明の抗体は、キメラ化またはヒト化抗体をも含んでなる。
【０１５１】
キメラ抗体は、所定の種の抗体由来の天然可変領域（軽鎖および重鎖）を含み、前記所定の種に異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域を組合せたものである。
【０１５２】
抗体、またはそのキメラ断片は、組換え遺伝学の手法を用いて調製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒト、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体定常領域をコードする配列とを含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって産生することができた。このような組換え遺伝子によってコードされる本発明によるキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性は、マウスＤＮＡ由来の可変領域およびヒトＤＮＡ由来の定常領域によって決定されるそのアイソタイプによって決定することができた。キメラ抗体の調製方法については、Ｖｅｒｈｏｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（BioEssays, 8:74, 1988）を参照されたい。
【０１５３】
もう一つの態様では、本発明は、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片であって、キメラ抗体にあるものを説明する。
【０１５４】
特に好ましい実施形態では、本発明のキメラ抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号６５のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる。
【０１５５】
もう一つの好ましい実施形態では、本発明のキメラ抗体、またはその誘導化合物または機能的断片は、配列番号６６のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号６７のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる。
【０１５６】
「ヒト化抗体」は、非ヒト起源の抗体由来のＣＤＲ領域を含む抗体であって、この抗体分子の他の部分は１（または数）種類のヒト抗体由来であることを意味する。更に、骨格部分残基（ＦＲと呼ばれる）の幾つかは、修飾して結合親和性を保存することができる（Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988）。
【０１５７】
本発明のヒト化抗体、またはその断片は、当業者に知られている手法（例えば、Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992；およびBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992の文献に記載の手法など）によって調製することができる。このようなヒト化抗体は、インビトロでの診断、またはインビボでの予防的および／または治療的処置などの方法におけるそれらの使用に好ましい。これもまた当業者に知られている、例えば「ＣＤＲグラフト」法のような他のヒト化手法は、欧州特許第０４５１２６１号公報、欧州特許第０６８２０４０号公報、欧州特許第０９３９１２７号公報、欧州特許第０５６６６４７号公報、または米国特許第５，５３０，１０１号公報、米国特許第６，１８０，３７０号公報、米国特許第５，５８５，０８９号公報、および米国特許第５，６９３，７６１号公報にＰＤＬによって記載されている。米国特許第５，６３９，６４１号公報またはＵＳ６，０５４，２９７号公報、５，８８６，１５２号公報および５，８７７，２９３号公報も、引用することができる。
【０１５８】
更に、本発明は、上記のマウス抗体から生じるヒト化抗体にも関する。
【０１５９】
好ましい様式では、ヒト抗体由来の軽鎖および重鎖の定常領域は、それぞれλまたはκ、およびγ−１、γ−２またはγ−４領域である。
【０１６０】
アイソタイプＩｇＧ１に対応する実施形態では、この抗体の追加的特徴は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）のようなエフェクター機能を示すことである。
【０１６１】
本発明の新規な態様は、下記の核酸（任意の縮重遺伝子コードを含む）：
本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
ａ）で定義した核酸に相補性の核酸、
配列番号１５〜２６または配列番号５２〜６１の核酸配列または最適アライメント後に配列番号１５〜２６または配列番号５２〜６１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲの少なくとも１個と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１８個のヌクレオチドの核酸、および
少なくとも配列番号２７または配列番号６２または配列番号６８または７０の核酸配列の軽鎖および／または配列番号２８または配列番号６３または配列番号６９または７１の核酸配列の重鎖または最適アライメント後に配列番号２７および／または２８または配列番号６２および／または６３または配列番号６８および／または６９または配列番号７０および／または７１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１８個のヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする、単離核酸に関する。
【０１６２】
下表３は、本発明の抗体に関する様々なヌクレオチド配列をまとめている。
【０１６３】
【表３】
0005723279.tif 000004
【０１６４】
本発明で代替可能に用いられる「核酸」、「核酸配列（nucleic sequence）」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は、修飾されたまたはされていない、核酸の断片または領域を画定する、非天然ヌクレオチドを含むまたは含まない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物であるヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【０１６５】
本発明は、天然の染色体環境、すなわち、天然状態でのヌクレオチド配列に関するものではないことも本発明に包含されるべきである。本発明の配列は、単離されおよび／または精製され、すなわち、それらは、例えば複製によって直接または間接的にサンプリングされ、それらの環境は少なくとも部分的に修飾されている。例えば宿主細胞による組換え遺伝学の方法によって得られたまたは化学合成によって得られた単離核酸も、本明細書において記載される。
【０１６６】
「最適アライメント後に、好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性率を示す核酸配列」は、詳細には、特に規則的な欠失、切断、伸張、キメラ融合および／または置換のようなある種の修飾を参照核酸配列に関して示す核酸配列を意味する。好ましくは、これらは、参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列であり、これは、遺伝子コードの縮重、または好ましくは高ストリンジェント条件、特に以下に定義される条件下で、参照配列と特異的にハイブリダイズすると思われる相補性配列に関するものである。
【０１６７】
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、温度およびイオン強度に関する条件がハイブリダイゼーションを２つの相補性ＤＮＡ断片の間で保持できるような方法で選択されることを意味する。純粋に説明的基盤では、上記のポリヌクレオチド断片を画定するためのハイブリダイゼーション段階の高ストリンジェント条件は、下記の通りであるのが有利である。
【０１６８】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０ｘデンハルト溶液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含むリン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）中での４２°Ｃ、３時間のプレハイブリダイゼーション、（２）プローブの長さによって変化する温度（すなわち、長さが＞１００ヌクレオチドのプローブについては４２°Ｃ）で２０時間の主ハイブリダイゼーションの後、２ｘＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中で２０°Ｃで２回の２０分間の洗浄、０．１ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で２０°Ｃで１回の２０分間の洗浄。最後の洗浄は、０．１ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で、長さが＞１００ヌクレオチドのプローブについては６０°Ｃにて３０分間行う。画定されたサイズのポリヌクレオチドについて上記した高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当業者によって更に長いまたは短いオリゴヌクレオチドについてＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．に記載の手順に準じて適合させることができる(「分子クローニング：実験室便覧（Molecular cloning: a laboratory manual)」，Cold Spring Harbor Laboratory；第３版，２００１年）。
【０１６９】
本発明は、本発明に記載の核酸を含んでなるベクターにも関する。
【０１７０】
本発明は、特にこのようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターに関する。
【０１７１】
本発明のベクターは、好ましくは所定の宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現および／または分泌することができる要素を含む。従って、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、並びに適当な転写調節領域を含んでいなければならない。このベクターは、宿主細胞で安定的に保持することができなければならず、場合によっては、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特異的シグナルを有することがある。これらの様々な要素は、用いられる宿主細胞に準じて当業者によって選択され、最適化される。この目的のため、ヌクレオチド配列を、選択された宿主内の自己複製ベクターに挿入し、または選択された宿主の組込みベクターに挿入することができる。
【０１７２】
このようなベクターは、当業者によって典型的に用いられる方法によって調製され、生成するクローンをリポフェクション、電気穿孔、熱ショックまたは化学的方法のような標準的方法によって適当な宿主に導入することができる。
【０１７３】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは、本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現する目的で宿主細胞を形質転換するのに用いられる。
【０１７４】
本発明は、本発明に記載のベクターによって形質転換されたまたはベクターを含んでなる宿主細胞も含んでなる。
【０１７５】
宿主細胞は、例えば、細菌細胞だけでなく、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳類細胞のような原核細胞または真核細胞系から選択することができる。昆虫または植物細胞を、用いることもできる。
【０１７６】
本発明は、本発明による形質転換した細胞を有するヒト以外の動物にも関する。
【０１７７】
本発明のもう一つの態様は、本発明による抗体、またはその機能的断片の１つの産生方法であって、
ａ）本発明による宿主細胞の培地および適当な培養条件での培養、および
ｂ）このようにして培養培地または前記培養細胞から産生した前記抗体、またはその機能的断片の１つの回収
の段階を含んでなることを特徴とする、前記方法に関する。
【０１７８】
本発明による形質転換した細胞は、本発明による組換えポリペプチドの調製方法に有用である。組換え形態の本発明によるポリペプチドの調製方法であって、本発明によるベクターおよび／または本発明によるベクターによって形質転換した細胞を用いることを特徴とする前記方法も、本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換された細胞は、上記ポリペプチドを発現させかつ前記組換えペプチドを回収することができる条件下で培養される。
【０１７９】
上記のように、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞系から選択することができる。詳細には、このような原核細胞または真核細胞系において、分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を確認することができる。従って、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌される組換えタンパク質の産生の目的で有利に用いることができる。実際に、目的のこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞内よりは細胞培養物の上清に存在するという事実によって容易になる。
【０１８０】
本発明のポリペプチドは、化学合成によって調製することもできる。このような調製方法も、本発明の目的である。当業者であれば、断片の縮合によるまたは溶液中の通常の合成による固相法（特にSteward et al., 1984, 「固相ペプチド合成（Ｓolid phase peptideｓ synthesis)」, Pierce Chem. Company, Rockford, 111,第２版を参照）または部分固相法のような化学合成の方法を知っている。化学合成によって得られかつ対応する非天然アミノ酸を含むことができるポリペプチドも、本発明に含まれる。
【０１８１】
本発明の方法によって得られると思われる抗体、またはその誘導化合物または機能的断片も、本発明に含まれる。
【０１８２】
更にもう一つの態様によれば、本発明は、上記抗体であって、更にヒトケモカインファミリー受容体に特異的に結合することができおよび／またはこのような受容体のシグナル伝達を特異的に阻害することができることを特徴とする前記抗体に関する。
【０１８３】
新規な実施形態によれば、本発明は、例えば、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＲ２ｎｅｕ、ＨＧＦ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦ、テトラスパニン、インテグリン、ＣＸＣＲ４（本発明の抗体以外、すなわち、別のエピトープをターゲッティングする）、ＣＸＣＲ７またはＣＸＣＲ２のような、腫瘍の発達に関与した任意の受容体と相互作用することができる第二のモティーフを含んでなるという意味において二重特異性である抗体からなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片に関する。
【０１８４】
二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる可変領域が同一分子で結合しているモノクローナル抗体の第二世代を構成している（Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419）。それらの有用性は、新たなエフェクター機能を補充しまたは腫瘍細胞の表面上の幾つかの分子を目標とするそれらの能力に関して診断および治療ドメインのいずれにおいても明らかにされ、このような抗体は、化学的方法（Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat., 377-382）または体細胞法（Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol, 121 :210-228）だけでなく、優先的にはヘテロ二量体化を強行することによって求める抗体の精製を容易にすることができる遺伝子工学の手法によって得ることもできる（Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16:677-681）。
【０１８５】
これらの二重特異性抗体は、総ＩｇＧ、二重特異性Ｆａｂ’２、Ｆａｂ’ＰＥＧ、二重特異性抗体または二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができるだけでなく、２つの結合部位が目標としたそれぞれの抗原に対して存在する四価の二重特異性抗体（Park et al., 2000, Mol. Immunol., 37(18): 1123-30）、または上記したものの断片としても構築することができる。
【０１８６】
二重特異性抗体の産生および投与は２種類の特異性抗体の産生より廉価であることを考慮した経済的利点に加えて、このような二重特異性抗体の使用は治療上の毒性を少なくする利点を有する。実際に、二重特異性抗体の使用により、循環抗体の全量、従って、起こり得る毒性を減少させることができる。
【０１８７】
本発明の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は二価または四価の抗体である。
【０１８８】
最後に、本発明は、薬剤として使用するための上記抗体、またはその誘導化合物または機能的断片に関する。
【０１８９】
本発明は、本発明の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片の１つからなる化合物を活性成分として含んでなる医薬組成物にも関する。好ましくは、前記抗体は、賦形剤および／または薬学上許容可能なキャリヤーにより補足される。
【０１９０】
本発明は、同時、個別または拡張手法で使用する配合物としてＣＸＣＲ４に対する抗体以外の抗腫瘍抗体を更に含んでなることを特徴とする組成物にも関する。
【０１９１】
更にもう一つの実施形態によれば、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃＭＥＴ、ＶＥＧＦＲまたはＶＥＧＦのような受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる化合物、または当業者に知られている任意の他の抗腫瘍化合物から選択される少なくとも１種類の第二の抗腫瘍化合物を含んでなる、上記の医薬組成物にも関する。
【０１９２】
本発明の第二の好ましい態様では、前記の第二の化合物は、前記受容体によって促進される転移性伝播の増殖および／または抗アポトーシスおよび／または血管形成および／または誘導活性を阻害することができる単離された抗体である抗ＥＧＦＲ、抗ＧＦ−ＩＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ｃＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦなど、またはそれらの機能的断片および誘導化合物から選択することができる。
【０１９３】
リツキシマブ、イブリツモマブまたはトシツモマブのような抗ＣＤ２０抗体、ゲムツズマブまたはリンツズマブのような抗ＣＤ３３抗体、エプラツズマブのような抗ＣＤ２２抗体、アレムツズマブのような抗ＣＤ５２抗体、エドレコロマブ、Ｃｈ１７−１ＡまたはＩＧＮ−１０１のような抗ＥｐＣＡＭ抗体、ザクチンのような抗ＣＴＰ２１または１６抗体、１３１Ｉ−Ｃｏｔａｒａ  ＴＮＴ−１のような抗ＤＮＡ−Ａｇ抗体、ペムツモマブ（pemtumomab）またはＲ１１５０のような抗ＭＵＣ１抗体、ＡＢＸ−Ｍａｌのような抗ＭＵＣ１８抗体、ミツモマブのような抗ＧＤ３抗体、ＣｅａＶａｃまたはラベツズマブのような抗ＥＣＡ抗体、ＯｖａＲｅｘのような抗ＣＡ１２５抗体、アポリズマブのような抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、ＭＤＸ−０１０のような抗ＣＴＬＡ４抗体、ＭＤＸ−０７０、１１１Ｉｎ＆９０Ｙ−Ｊ５９１、１７７Ｌｕ  Ｊ５９１、Ｊ５９１−ＤＭ１のような抗ＰＳＭＡ抗体、ＩＧＮ３１１のような抗ルイスＹ抗体、ＡＳ１４０５および９０ＹｍｕＢＣ１のような血管形成阻害抗体、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１ｍＡｂまたはＴＲＡＩＬ  Ｒ２ｍＡｂのような抗Ｔｒａｉｌ−Ｒ１抗体も適しているものとして挙げられる。
【０１９４】
本発明の補足的なもう一つの実施形態は、同時、個別または拡張使用のため配合または接合生成物として細胞毒性／細胞増殖抑制剤を更に含んでなる上記組成物からなる。
【０１９５】
「同時使用」は、含まれている組成物の両化合物を単一投薬形態で投与することを意味する。
【０１９６】
「個別使用」は、同時に、含まれている組成物の両化合物を別個の投薬形態で投与することを意味する。
【０１９７】
「拡張使用」は、組成物の両化合物であって、それぞれが別個の投薬形態に含まれているものを連続的に投与することを意味する。
【０１９８】
一般に、本発明による組成物は、癌治療の有効性をかなり増加させる。換言すれば、本発明の抗体の治療効果は、細胞毒性剤の投与によって予期しない方法で増強される。本発明の組成物によって得られるもう一つの主要な続いて得られる利点は、活性成分を低めの有効用量で用いることができ、従って、副作用、特に細胞毒性剤の効果の出現の危険性を回避または減少させることができることに関する。更に、この組成物は、予想される治療効果を一層迅速に達成することができる。
【０１９９】
「治療用抗癌剤」または「細胞毒性剤」は、それを患者に投与すると、患者における癌の発達を治療または妨げる物質を意味する。このような薬剤の非制限的例としては、「アルキル化」剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能化阻害剤、血管形成阻害剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン剤、および免疫調節剤が挙げられる。
【０２００】
このような薬剤は、例えば、ＶＩＤＡＬの「細胞毒性」の見出しで腫瘍学および血液学に関する化合物に費やされた頁に引用されており、この文献の参照によって引用された細胞毒性化合物は、好ましい細胞毒性剤として本明細書に引用される。
【０２０１】
「アルキル化剤」は、任意の分子、優先的には細胞中の核酸（例えば、ＤＮＡ）と共有結合することができるまたはアルキル化することができる任意の物質を表す。このようなアルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、クロルハイドレート、ピポブロマン、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウムまたはエストラムスチンのようなナイトロジェンマスタード；シクロホスファミド、アルトレタミン、トロホスファミド、スルホホスファミドまたはイホスファミドのようなオキサザホスホリン；チオテパ、トリエチレンアミンまたはアルテトラミンのようなアジリジンまたはエチレンイミン；カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチンまたはロムスチンのようなニトロソウレア；ブスルファン、トレオスルファンまたはインプロスルファンのようなアルキルスルホン酸塩；ダカルバジンのようなトリアジン；またはシスプラチン、オキサリプラチンまたはカルボプラチンのような白金錯体が挙げられる。
【０２０２】
「代謝拮抗剤」は、ある種の活性、一般的にはＤＮＡ合成を妨げることによって増殖および／または細胞代謝を遮断する物質を表す。代謝拮抗剤の例としては、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フロクスリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデソキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシンおよびペントスタチンが挙げられる。
【０２０３】
「抗腫瘍抗生物質」は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の合成を妨げまたは阻害することができる化合物を表す。このような抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびプロカルバジンが挙げられる。
【０２０４】
「有糸分裂阻害剤」は、細胞サイクルおよび有糸分裂の正常な進行を妨げる。一般に、パクリタキセルまたはドセタキセルのような微小管阻害剤または「タキソイド」は、有糸分裂を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイドも、有糸分裂を阻害することができる。
【０２０５】
「クロマチン阻害剤」または「トポイソメラーゼ阻害剤」は、トポイソメラーゼＩおよびＩＩのようなクロマチンを形成するタンパク質の正常な機能を阻害する物質である。このような阻害剤の例としては、トポイソメラーゼＩについては、カンプトテシンおよびイリノテカンまたはトポテカンのようなその誘導体、トポイソメラーゼＩＩについては、エトポシド、エチポシドホスフェートおよびテニポシドが挙げられる。
【０２０６】
「血管形成阻害剤」は、血管の増殖を阻害する任意の薬物、化合物、物質または薬剤である。血管形成阻害剤の例としては、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、タリドミド、ＣＤＣ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スカラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチンおよびビタキシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
「抗エストロゲン剤」または「エストロゲン拮抗剤」は、エストロゲン作用を減少させ、拮抗しまたは阻害する任意の物質を表す。このような薬剤の例は、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、およびエクセメスタンである。
【０２０８】
「抗アンドロゲン剤」または「アンドロゲン拮抗剤」は、アンドロゲン作用を減少させ、拮抗しまたは阻害する任意の物質を表す。抗アンドロゲン剤の例としては、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スプリロノラクトン、シプロテロン酢酸、フィナステリドおよびシミチジンが挙げられる。
【０２０９】
免疫調節剤は、免疫系を刺激する物質である。免疫調節剤の例としては、アルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキン・ジフチトックス、またはインターロイキン−２のようなインターフェロン、インターロイキン、タソネルミンのような腫瘍壊死因子、またはレンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃ、または５−フルオロウラシルと組合せたレバミソールのような他の種類の免疫調節剤が挙げられる。
【０２１０】
更に詳細については、当業者であれば、「治療化学，第６巻、癌の治療における抗腫瘍薬および展望（Therapeutic chemistry, vol. 6, Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer）」ＴＥＣおよびＤＯＣ監修、２００３年［仏国］」という標題のＦｒｅｎｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅａｃｈｅｒｓによって刊行されたマニュアルを参照することができる。
【０２１１】
特に好ましい実施形態では、配合物としての本発明の前記組成物は、同時使用のために、前記細胞毒性剤が化学的に前記抗体に結合していることを特徴とする。
【０２１２】
特に好ましい実施形態では、前記組成物は、前記細胞毒性／細胞増殖抑制剤が、紡錘体阻害剤または安定剤、好ましくはビノレルビンおよび／またはビンフルニンおよび／またはビンクリスチンから選択されることを特徴とする。
【０２１３】
前記細胞毒性剤と本発明による抗体の間の結合を促進するため、ポリ（アルキレン）グリコール、ポリエチレングリコールまたはアミノ酸のような２つの化合物の間に結合するように導入することができるスペーサー分子、または、もう一つの実施形態態様では、前記抗体と反応することができる機能を導入した前記細胞毒性剤の活性誘導体を用いることができる。これらの結合技術は当業者に周知であり、本明細書では更に詳細には説明しない。
【０２１４】
他のＥＧＦＲ阻害剤としては、モノクローナル抗体Ｃ２２５および抗ＥＧＦＲ２２Ｍａｂ(ImClone Systems Incorporated)、ＡＢＸ−ＥＧＦ(Abgenix/Cell Genesys)、ＥＭＤ−７２００(Merck KgaA)または化合物ＺＤ−１８３４、ＺＤ−１８３８およびＺＤ−１８３９(Astra Zeneca)、ＰＫＩ−１６６(Novartis)、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６(Novartis)、ＰＴＫ  ７８７(Novartis)、ＣＰ  ７０１(Cephalon)、フルノミド(Pharmacia/Sugen)、ＣＩ−１０３３(Warner Lambert Parke Davis)、ＣＩ−１０３３／ＰＤ  １８３、８０５(Warner Lambert Parke Davis)、ＣＬ−３８７、７８５(Wyeth-Ayerst)、ＢＢＲ−１６１１(Boehringer Mannheim GMBH/Roche)、Ｎａａｍｉｄｉｎｅ  Ａ(Bristol-board Myers Squibb)、ＲＣ−３９４０−ＩＩ(Pharmacia)、ＢＩＢＸ−１３８２(Boehringer Ingelheim)、ＯＬＸ−１０３(Merck & Co)、ＶＲＣＴＣ−３１０(Ventech Research)、ＥＧＦ融合毒素(Seragen Inc.)、ＤＡＢ−３８９(Seragen/Lilgand)、ＺＭ−２５２８０８(Imperial Cancer Research Fund)、ＲＧ−５０８６４(INSERM)、ＬＦＭ−Ａ１２(Parker Hughes Center Cancer)、ＷＨＩ−Ｐ９７(Parker Hughes Center Cancer)、ＧＷ−２８２９７４(Glaxo)、ＫＴ−８３９１(Kyowa Hakko)または「ＥＧＦＲワクチン」(York Medical/Centro of Immunologia Molecular)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
本発明のもう一つの態様は、前記抗体、またはその誘導化合物または機能的断片の少なくとも１つが細胞毒素および／または放射性同位体と配合または接合していることを特徴とする、組成物に関する。
【０２１６】
好ましくは、前記毒素または前記放射性同位体は、腫瘍細胞の成長または増殖を妨げ、特に前記腫瘍細胞を完全に不活性化することができる。
【０２１７】
また好ましくは、前記毒素は、腸内細菌毒素、特にシュードモナス外毒素Ａである。
【０２１８】
治療抗体と優先的に結合した放射性同位体は、γ線、好ましくはヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７およびアンチモン２１１を放射する放射性同位体である。αおよびβ線を放射する放射性同位体も、理論的には用いることができる。
【０２１９】
「本発明の抗体、またはその機能的断片の少なくとも１つと結合した毒素または放射性同位体」は、結合する分子を導入しまたはせずに、前記毒素または前記放射性同位体を少なくとも１つの抗体に、特に２つの化合物の間の共有結合によって結合することができる任意の手段を表す。
【０２２０】
接合体の要素のすべてまたは部分を化学的（共有）、静電的または非共有結合させる薬剤の例としては、詳細には、ベンゾキノン、カルボジイミド、更に詳細には、ＥＤＣ（ｌ−エチル−３−［３−ジメチル−アミノプロピル］−カルボジイミド−塩酸）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、１以上の基を有し、１以上のフェニルアジド（phenyaside）基を有し、紫外（ＵＶ）線と反応する架橋剤、最も好ましくはＮ−［４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミド−イル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）および６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）が挙げられる。
【０２２１】
特に放射性同位体についてのもう一つの結合形態は、二官能化イオンキレート化剤の使用からなることができる。
【０２２２】
このようなキレート化剤の例としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）から誘導されるキレート化剤であって、金属、特に放射性金属を免疫グロブリンと結合させる目的で開発されたものが挙げられる。従って、ＤＴＰＡおよびその誘導体は、リガンド−金属錯体の安定性と剛性を増加させるような方法で、炭素鎖上で様々な基によって置換することができる（Krejcarek et al., 1977; Brechbiel et al., 1991; Gansow, 1991;米国特許第４，８３１，１７５号公報）。
【０２２３】
例えば、その遊離形態または金属イオンとの錯体で薬剤および生物学において広く長期間用いられてきたＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）およびその誘導体は、癌治療のための放射性免疫接合体の開発を目的とする抗体のような治療または診断上重要なタンパク質とカップリングすることができる金属イオンと安定なキレートを形成する注目すべき特徴を示す（Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990）。
【０２２４】
また好ましくは、前記接合体を形成する本発明の少なくとも１つの抗体は、その機能的断片、特にｓｃＦｖ断片のようなそれらのＦｃ部分を喪失した断片から選択される。
【０２２５】
本発明は、癌の予防または治療を目的とする薬剤を調製するための組成物の使用をも含んでなる。
【０２２６】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する薬剤の調製のための、本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片、好ましくはヒト化したもの、および／または組成物の使用にも関する。一般に、本発明は、癌の予防または治療のための薬剤の調製のための、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片、好ましくはヒト化したもの、および／または組成物の使用に関する。
【０２２７】
予防および／または治療することができる好ましい癌としては、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、または任意の他の癌が挙げられる。
【０２２８】
本発明は、細胞におけるＣＸＣＲ４活性を調節する薬剤の調製のために、上記の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片、および／または組成物の使用にも関する。
【０２２９】
本発明のもう一つの態様は、ＣＸＣＲ４発現レベルに関する疾患の診断方法、好ましくはインビトロでの診断方法における上記抗体の使用に関する。好ましくは、前記の診断方法における前記ＣＸＣＲ４タンパク質関連疾患は癌である。
【０２３０】
従って、本発明の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を、インビトロでの生物試料におけるＣＸＣＲ４タンパク質の検出および／または定量の方法、特にこのタンパク質の異常発現に関連した癌などの疾患の診断の方法であって、
ａ）生物試料を本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片と接触させ、
ｂ）形成される可能性がある抗原−抗体複合体を明らかにする
段階を含んでなる、前記方法に用いることができる。
【０２３１】
従って、本発明は、下記の要素：
ａ）本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体、
ｂ）場合によっては、免疫反応に好都合な媒体を構成する試薬、
ｃ）場合によっては、免疫反応によって産生される抗原−抗体複合体を明らかにする試薬
を含んでなる、上記方法の実施のためのキットまたは付属品も含んでなる。
【０２３２】
好都合には、抗体またはその機能的断片を、支持体、特にタンパク質チップ上に固定することができる。１つのこのようなタンパク質チップは、本発明の目的である。
【０２３３】
好都合には、タンパク質チップを、生物試料のＣＸＣＲ４タンパク質の検出および／または定量に必要なキットまたは付属品に用いることができる。
【０２３４】
「生物試料」という用語は、本発明では、生体から採取される試料（特に、哺乳類、特にヒトから採取される血液、組織、臓器、または他の試料）、またはこのようなＣＸＣＲ４タンパク質を含むと思われる任意の試料（例えば、必要ならば、形質転換した細胞の試料）に関する。
【０２３５】
前記抗体、またはその機能的断片は、検出可能および／または定量可能なシグナルを得るために、免疫接合体または標識抗体の形態であることができる。
【０２３６】
本発明の標識抗体、またはその機能的断片としては、例えば、抗体接合体（免疫接合体）が挙げられ、これは、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼのような酵素、またはビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモ−デオキシウリジン（desoxyuridine）のような分子によって結合することができる。蛍光標識も、本発明の抗体、またはその機能的断片と結合することができ、特にフルオレセインおよびその誘導体、フルオロクロム、ローダミンおよびその誘導体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。このような接合体において、本発明の抗体、またはその機能的断片は、当業者に知られている方法によって調製することができる。それらは、酵素または蛍光標識と、直接、ポリアルデヒド、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）のようなスペーサー基または結合基を介して、または治療接合体について上記したもののような結合剤の存在下にて結合することができる。フルオレセイン標識を有する接合体は、イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。
【０２３７】
他の接合体は、ルミノールおよびジオキセタンのような化学発光標識、ルシフェラーゼおよびルシフェリンのような生物発光標識、またはヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、イットリウム１９９およびヨウ素１３１のような放射性標識が挙げられる。放射性同位体を抗体と、直接にまたは上記ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡのようなキレート化剤を介して結合させるための当業者に知られている既成の方法を、診断用放射性同位体に用いることができる。従って、クロラミン−Ｔ法による［Ｉ１２５］Ｎａの標識(Hunter W.M. and Greenwood F. C.(1962) Nature 194:495)、Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，４２４，２００号公報）に記載のテクネチウム９９ｍの標識またはＨｎａｔｏｗｉｃｈ（米国特許第４，４７９，９３０号公報）に記載のＤＴＰＡを介する結合が挙げられる。
【０２３８】
本発明は、ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する細胞に生物活性を有する化合物を特異的にターゲッティングするための薬剤を調製する目的での本発明による抗体の使用にも関する。
【０２３９】
本発明の説明の意味において、「生物活性化合物」は、細胞活性、特に成長、増殖、転写および遺伝子翻訳を調節する、特に阻害することができる任意の化合物である。
【０２４０】
本発明は、本発明による抗体、またはその機能的断片であって、好ましくは標識され、特に放射性標識したものを含むインビボでの診断試薬、および医療画像化におけるその使用であって、特にＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する細胞に関係した癌の検出を目的とするものにも関する。
【０２４１】
本発明は、薬剤として用いられる本発明による配合物としての組成物または抗−ＣＸＣＲ４／毒素接合体または放射性同位体にも関する。
【０２４２】
好ましくは、配合物としての前記組成物または前記接合体は、賦形剤および／または薬学ビヒクルが補足される。
【０２４３】
本発明の説明において、「薬ビヒクル」は、二次的反応を引き起こさず、かつ例えば活性化合物の投与を容易にし、生体でのその寿命および／または有効性を増加させ、溶液でのその溶解性を増加させ、またはその保管を向上させる医薬組成物に入る化合物または化合物の配合物を意味する。このような薬学キャリヤーは周知であり、選択された活性化合物の性質および投与経路に準じて当業者によって適合させるであろう。
【０２４４】
好ましくは、このような化合物は、全身経路、特に静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下または経口経路によって投与される。更に好ましくは、本発明による抗体を含む組成物は、等しい時間間隔を置いて数回投与される。
【０２４５】
それらの投与経路、投薬計画、および最適剤形（optimal galenic forms）は、患者に適する治療法を確立するときに一般に考慮される基準、例えば患者の年齢または体重、患者の総体的状態の重度、患者の治療に対する耐性および体験した副作用に準じて決定することができる。
【０２４６】
従って、本発明は、ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する細胞に対して生物活性を有する化合物を特異的にターゲッティングするための薬剤を調製するための、抗体、またはその機能的断片の１つの使用に関する。
【０２４７】
本発明の他の特徴および利点は、実施例と以下に説明が示される図を用いる説明において更に明白になる。
【図面の簡単な説明】
【０２４８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、ｑＰＣＲ分析による癌細胞でのＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２の発現を示す。
【図２】図２は、ＦＡＣＳ分析による癌細胞でのＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２タンパク質発現を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、野生型ヒトＣＸＣＲ４を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞膜における未標識ＳＤＦ−１（図３Ａ）および４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂ（図３Ｂ）による特異的［１２５Ｉ］ＳＤＦ１結合の競合を示す（Ｔ：総結合；ＮＳ：非特異的結合）。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞で安定的に発現した野生型ＣＸＣＲ４受容体の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合応答を観察することによる、４１４Ｈ５Ｍａｂ（図４Ａ）および５１５Ｈ７Ｍａｂ（図４Ｂ）によるＧタンパク質活性化の調節を示す。
【図５】図５は、ＳＤＦ−１（１０および１００ｎＭ）で刺激したＨｅＬａヒト腫瘍細胞の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合応答を観察することによる、抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７によるＧタンパク質活性化の調節を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、ＨＥＫ２９３細胞における生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を用いるＳＤＦ−１および４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂによる様々な相互作用パートナーとのＣＸＣＲ４受容体との会合の調節を示す（図６Ａおよび６Ｂ：ＣＸＣＲ４：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化、図６Ｃおよび６Ｄ：ＣＸＣＲ２：ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体化、および図６Ｅおよび６Ｆ：β−アレスチンのＣＸＣＲ４媒介性動員）。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＳＤＦ−１および４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂによるホルスコリン刺激ｃＡＭＰ産生の阻害を示す。
【図８】図８は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で安定的に発現した構成的活性変異体Ａｓｎ１１９ＳｅｒＣＸＣＲ４受容体における［３５Ｓ］ＧＴＰｙＳ結合応答を観察することによる、抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７によるＧタンパク質活性化の調節を示す。
【図９】図９は、インビトロでのＭａｂ４１４Ｈ５によるＳＤＦ−１誘導Ｈｅｌａ細胞増殖の阻害を表す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、インビトロでのＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５（図１０Ａ）およびＭａｂ５１５Ｈ７（図１０Ｂ）によるＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走の阻害を示す。
【図１１】図１１は、Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウスでの抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５（Ａ）およびＭａｂ５１５Ｈ７（Ｂ）によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍増殖の阻害を示す。
【図１２】図１２は、Ｕ９３７Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウス生存モデルにおける抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５活性を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＣＨＯ−ＣＸＣＲ４細胞（図１３Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１３Ｂ）およびＵ９３７癌細胞（図１３Ｃ）における抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ５１５Ｈ７によるＳＤＦ−１誘導カルシウム放出阻害を示す。
【図１４】図１４は、４１４Ｈ５によるＮｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおけるＴ細胞ＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍の阻害を示す。
【図１５】図１５は、Ｕ９３７Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウス生存モデルにおけるマウス抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂｍ５１５Ｈ７の活性を示す。
【図１６】図１６は、Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスでのＴ細胞ＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍増殖の阻害におけるマウス抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂｍ５１５Ｈ７の活性を示す。
【図１７】図１７は、野生型ヒトＣＸＣＲ４を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞膜でのマウスｍ４１４Ｈ５およびｍ５１５Ｈ７ＭａｂおよびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７による特異的［１２５Ｉ］ＳＤＦ１結合の競合を示す（Ｔ：総結合；ＮＳ：非特異的結合）。
【図１８】図１８は、ＳＤＦ−１（１０ｎＭ）で刺激したＮＩＨ−３Ｔ３細胞で安定的に発現した野生型ＣＸＣＲ４受容体での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合応答を観察することによるマウスｍ４１４Ｈ５およびｍ５１５Ｈ７ＭａｂおよびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７によるＧタンパク質活性化の調節を示す。
【図１９】図１９は、ＳＤＦ−１（１０ｎＭ）で刺激したＨｅＬａヒト腫瘍細胞での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合応答を観察することによる、抗−ＣＸＣＲ４マウスｍ４１４Ｈ５およびｍ５１５Ｈ７ＭａｂおよびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７によるＧタンパク質活性化の調節を示す。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞における生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を用いるＳＤＦ−１およびｍ４１４Ｈ５、ｃ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７およびｃ５１５Ｈ７Ｍａｂによる様々な相互作用パートナーとのＣＸＣＲ４受容体会合の調節を示す（図２０Ａ：ＣＸＣＲ４：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化、図２０Ｂ：ＣＸＣＲ２：ＣＸＣＲ４ヘテロ−二量体化、および図２０Ｃ：β−アレスチンのＣＸＣＲ４媒介性動員）。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、ＣＨＯ−ＣＸＣＲ４細胞（図２１Ａ）およびＵ９３７細胞（図２１Ｂ）におけるＳＤＦ−１誘導カルシウム放出の阻害を示す。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、インビトロでのＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ｍ４１４Ｈ５およびｃ４１４Ｈ５（図２２Ａ）およびＭａｂ  ｍ５１５Ｈ７およびｃ５１５Ｈ７（図２２Ｂ）によるＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走の阻害を示す。
【図２３】図２３は、Ｕ９３７Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウス生存モデルにおける抗−ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７活性を示す。
【実施例】
【０２４９】
例１：癌細胞でのＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２の発現
Ｑ−ＰＣＲ分析：
様々な癌細胞系におけるＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２の相対発現を定量するため、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた。
【０２５０】
ＲＮＡ試料は、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉまたはＭｉｄｉ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Qiagen Corporation, 仏国）を用いて様々な細胞系から抽出した。次いで、ＲＮＡ試料をＥｘｐｅｒｉｏｎ自動電気泳動システム（BIO-RAD Corporation, 仏国）を用いて泳動し、良好な品質／完全性を示した。それぞれのＲＮＡ試料１μｇを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（BIO-RAD Corporation, 仏国）を用いてｃＤＮＡ鋳型に転換した。ｃＤＮＡレベルを、ＣＸＣＲ２についてはＴａｑＭａｎプローブまたはＣＸＣＲ４についてはＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎを用いるｑＰＣＲによって定量した。試料の比較には規格化が必要であったので、内部参照ＲＰＬ０を導入した。ＴａｑＭａｎプローブ（ＣＸＣＲ２について用いた）は、５’ＦＡＭレポーター標識と３’ＴＡＭＲＡクエンチャー基を有していた。ＰＣＲ酵素を、５０°Ｃで２分間および９５°Ｃで１０分間加熱して活性化した。５０μｌの総容積中にｃＤＮＡ鋳型（希釈倍率１／２０）５μｌ、１ｘｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems corporation, Branchburg New Jersey, 米国）、それぞれのプライマー５０〜９００ｎＭ、および５０〜１００ｎＭプローブを含むＰＣＲミックスで、４０または４５サイクル、９５°Ｃで１５秒間および６２°Ｃで１分間の二段階処理を用いた。総ての反応は、ｉＣｙｃｌｅｒ装置（BIO-RAD Corporation）を用いて行った。Ｑ−ＰＣＲにより、サイクル閾値（Ｃｔ）を決定した。Ｃｔ値が小さいほど、供試遺伝子が多量に発現する。ヒトリボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０についてのプライマーおよびプローブは、
フォワードプライマー：５’−ＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号３２）、
リバースプライマー：５’−ＡＧＧＡＣＴＣＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＧＴＴＧＡ−３’（配列番号３３）、
プローブ：５−（ＦＡＭ）−ＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＡＣＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＡ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号３４）
であった。
【０２５１】
ヒトＣＸＣＲ４（ケモカイン受容体４）のプライマーは、
フォワードプライマー：５’−ＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号３５）、
リバースプライマー：５’−ＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号３６）
であった。
【０２５２】
ヒトＣＸＣＲ２（ケモカイン受容体２）についてのプライマーとプローブは、
フォワードプライマー：５’−ＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧ−３’（配列番号３７）、
リバースプライマー：５’−ＣＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号３８）、
プローブ：５−（ＦＡＭ）−ＴＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号３９）
であった。
【０２５３】
この比較研究では、２個の遺伝子［供試遺伝子（ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ２）およびＲＰＬ０］）の発現を、供試細胞系および参照細胞系の異なる２種類の試料で定量した。参照細胞系は、最低発現の定量した遺伝子を含む細胞系に相当した。比較遺伝子発現は、下式：
相対的遺伝子発現＝（１＋Ｅ遺伝子）−ΔＣｔ(１)／（１＋ＥＲＰＬ０）−ΔＣｔ(２)
Ｅ遺伝子＝定量した遺伝子のプライマー／プローブを用いるＰＣＲ効率
ＥＲＰＬ０＝ＲＰＬ０プライマー／プローブを用いるＰＣＲ効率
Ｃｔ＝サイクル閾値
ΔＣｔ（ｌ）＝Ｃｔ遺伝子（供試細胞系）−Ｃｔ遺伝子（参照細胞系）
ΔＣｔ（２）＝ＣｔＲＰＬ０（供試細胞系）−ＣｔＲＰＬ０（参照細胞系）
を用いて計算した。
【０２５４】
それぞれのＰＣＲシリーズについて、相対遺伝子量の値を計算し、癌細胞系を、最高からネガティブまでの発現レベルを考慮して群に分類した。すべてのデーターを、図１Ａおよび１Ｂに示す。試験した総ての癌細胞系は、ＣＸＣＲ２についてのＤＵ１４５およびＵ−８７ＭＧを除き、ＣＸＣＲ４（図１Ａ）およびＣＸＣＲ２（図１Ｂ）を発現した。
【０２５５】
ＦＡＣＳ分析：
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３およびＵ９３７癌細胞系を透過性化した後、抗−ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体［４４７１７（R&D Systems）対そのアイソタイプコントロールＩｇＧ２ｂ（SIGMA）］１０μｇ／ｍｌまたは抗−ＣＸＣＲ２モノクローナル抗体（抗ｈ−ＣＸＣＲ２、クローン４８３１１，R&D Systems，Ｍａｂ３３１対そのアイソタイプコントロールＩｇＧ２ａ）１０μｇ／ｍｌとインキュベーションした。細胞を、次に１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で洗浄した。次いで、Ａｌｅｘａ標識した二次抗体を細胞に加え、４°Ｃで２０分間インキュベーションした。細胞を、次に２回再度洗浄した。２回目の洗浄の後、ＦＡＣＳ分析を行った。これらの結合研究の結果を、図２に示す。従って、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３およびＵ９３７のような腫瘍細胞は、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２タンパク質を両方とも発現した。
【０２５６】
例２：ヒトＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の産生
ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体を産生させるため、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、組換えＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞および／またはＣＸＣＲ４細胞外Ｎ末端およびループに対応するペプチドで免疫した。最初の免疫時に６〜１６週齢のマウスを、完全フロイントアジュバント中の抗原で１回皮下（ｓ．ｃ．）免疫した後、不完全フロイントのアジュバント中の抗原で２〜６回皮下免疫した。免疫応答を、後眼窩採血によって観察した。血清をＥＬＩＳＡによってスクリーニングし（後記）、高い力価の抗−ＣＸＣＲ４抗体を有するマウスを用いて融合した。マウスに抗原を静脈内投与で追加免疫し、２日後に屠殺して、脾臓を取り出した。
【０２５７】
ＥＬＩＳＡ
抗−ＣＸＣＲ４抗体を産生するマウスを選択するため、免疫化マウスの血清をＥＬＩＳＡによって試験した。簡単に説明すれば、マイクロタイタープレートを、５μｇ当量ペプチド／ｍｌでＢＳＡに接合した精製した［１−４１］Ｎ末端ペプチドでコーティングし、１００μｌ／ウェルを４°Ｃで一晩インキュベーションした後、２５０μｌ／ウェルの０．５％ゼラチン／ＰＢＳでブロックした。ＣＸＣＲ４を免疫したマウスからの血漿の希釈物をそれぞれのウェルに加え、３７°Ｃで２時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ（Jackson Laboratories）に接合したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体と３７°Ｃにて１時間インキュベーションした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で展開し、１００μｌ／ウェルの１ＭＨ２ＳＯ４を加えて５分後に反応を停止した。最高力価の抗−ＣＸＣＲ４抗体を発現したマウスを用いて、抗体を産生した。
【０２５８】
ＣＸＣＲ４に対するＭａｂを産生するハイブリドーマの生成
最高力価の抗−ＣＸＣＲ４抗体を発現したＢａｌｂ／ｃマウスから単離したマウス脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２／ＯにＰＥＧを用いて融合した。細胞を、約１ｘ１０５／ウェルでマイクロタイタープレートにて培養した後、ウルトラ（ｕｌｔｒａ）培養培地＋２ｍＭＬ−グルタミン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１ｘＨＡＴを含む選択培地で２週間培養した。次いで、ウェルを抗−ＣＸＣＲ４モノクローナルＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次に、抗体を分泌するハイブリドーマを、限定希釈によって少なくとも２回サブクローニングし、インビトロで培養し、抗体を産生して更に分析した。
【０２５９】
例３：抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７の結合特異性および癌細胞系認識のＦＡＣＳ分析による特性決定
この実験では、抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７のヒトＣＸＣＲ４に対する特異的結合を、ＦＡＣＳ分析によって検討した。
【０２６０】
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクション細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅｌａおよびＵ９３７癌細胞系を、１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体４１４Ｈ５および５１５Ｈ７でインキュベーションした。次に、細胞を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で洗浄した。次いで、Ａｌｅｘａ標識した二次抗体を細胞に加え、４°Ｃで２０分間インキュベーションした。次いで、細胞を２回再度洗浄した。２回目の洗浄の後、ＦＡＣＳ分析を行った。これらの結合研究を、下表４に示すが、これは、［ＦＡＣＳによって得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）］であって、抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７がヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクション細胞系に特異的に結合したが、親ＮＩＨ３Ｔ３細胞では認識されないことを示している。これらのＭａｂは、ヒト癌細胞系、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、Ｕ９３７前骨髄球癌細胞およびＨｅｌａ子宮頸部癌細胞を認識することもできた。
【０２６１】
抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７はＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクタントを認識したが、親ＮＩＨ３Ｔ３野生型細胞は認識しなかった。Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７は、癌細胞系を認識することもできた。
【０２６２】
【表４】
0005723279.tif 000005
【０２６３】
例４：ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１膜における［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１についての抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７の競合結合
この分析により、４１４Ｈ５および５１５Ｈ７  Ｍａｂの放射性標識した［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４受容体へのオルソステリックまたはアロステリック結合部位のいずれかにおける結合について競合する能力を評価することができる。
【０２６４】
ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的かつ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）と、ヒトＣＸＣＲ４受容体の全コード配列（参照配列ＮＭ  ００３４６７）を有する哺乳類発現ベクターとのトランスフェクションによって得られた。細胞を、完全培養培地［５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびゲネチシン５００μｇ／ｍｌを補足したＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓＦ１２］で増殖させた。放射性リガンド結合実験を、ライシスバッファー［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ１５０ｍＭ］中でＣＨＯ／ＣＸＣＲ４細胞を機械的に破砕した後、遠心分離（１００００ｇ、１５分間）して得た細胞膜で行った。［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合（比活性：１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＳＰＡ法（シンチレーション近接分析−GE Healthcare）を用いて行った。簡単に説明すると、細胞膜（３０μｇ／ウェル）を、結合緩衝液［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２１ｍＭ、ＭｇＣｌ２５ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＢＳＡ１％］中で評価を行う化合物（ＳＤＦ−１またはｍＡｂ）、放射性リガンド（１ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と共にインキュベーションした。２５°Ｃで１時間後に結合平衡に達した。遠心分離［１０００ｇ、１０分間］した後、放射能をシンチレーションカウンター（TopCount,Perkin Elmer）で測定した。非特異的結合は、１０μＭの未標識ＳＤＦ−１の存在下にて評価した。
【０２６５】
未標識ＳＤＦ−１は、７．７５±０．２７ｎＭ（ｎ＝４）のｐＫｉ値（ＩＣ５０＝特異的［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合の５０％阻害を生じるリガンド濃度）で、［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合を用量依存的に阻害した（図３Ａ）。同じ実験条件下では、本発明者らの抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ（１００ｎＭ）は、［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合について下記の順位序列の競合効率で競合した（［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の阻害率）：５１５Ｈ７（６４±３％）４１４Ｈ５（４３±４％）（図３Ｂ）。
【０２６６】
例５：抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５ａｎｄ５１５Ｈ７による野生型ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞膜での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の調節
この機能分析により、野生型ヒトＣＸＣＲ４受容体を介するＧタンパク質活性化およびＣＸＣＲ４リガンドおよび４１４Ｈ５および５１５Ｈ７ｍＡｂによるその調節を観察することができる。
【０２６７】
野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的にかつ構成的に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞についての上記例で記載した方法によって得た。ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部癌）細胞を、完全培養培地［１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、２μ重炭酸ナトリウムを補足したＥＭＥＭ］で増殖させた。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は、ライシスバッファー［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ１５０ｍＭ］中で機械的に破砕し、更に遠心分離（１００００ｇ、１５分間）して得た細胞膜で行った。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（比活性：１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の組込みおよび検出は、ＳＰＡ法（シンチレーション近接分析−GE Healthcare）を用いて行った。簡単に説明すれば、細胞膜（１０μｇ／ウェル）を、結合緩衝液［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ＧＤＰ３μＭ、ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ＝７．４］中で評価を行う化合物（目的のＳＤＦ−１またはＭＡｂ）、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．２〜０．４ｎＭ）、および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と共にインキュベーションした。結合反応は、２５°Ｃで１時間行った。遠心分離［１０００ｇ、１０分間］の後、放射能の数値をシンチレーションカウンター（TopCount,PerkinElmer）で測定した。拮抗剤の効果を、Ｃｈｅｎｇ  Ｐｒｕｓｓｏｆの式：
ＫＢ＝［拮抗剤濃度］／｛（ＥＣ５０’／ＥＣ５０）−ｌ｝
（式中、ＥＣ５０およびＥＣ５０’は、それぞれｍＡｂの非存在下および存在下でのＳＤＦ−１の効能である）
を適用することによって計算した。
【０２６８】
ＣＸＣＲ４受容体によるＧタンパク質活性化の結果として、ＳＤＦ−１は、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用量依存的に増加させた。［３５Ｓ］ＧＴＰｙＳ結合の最大刺激は、ＨｅＬａおよびＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞膜について基底［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合に対しそれぞれ１６７％および３２０％である。ＳＤＦ−１の効能は両細胞系について同様であり、４１．３±９．７ｎＭに相当した（図４Ａ〜４Ｂ）。これらの実験条件下で、ＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞で測定した４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂの拮抗剤の効能は、それぞれ５１ｎＭおよび１５ｎＭであった。同様な拮抗剤の有効性が、ＨｅＬａ細胞について観察された（図５）。
【０２６９】
例６：ＣＸＣＲ４と様々な相互作用パートナーの会合：ホモおよびヘテロ二量体化、生物発光共鳴エネルギー移動法（ＢＲＥＴ）によるβ−アレスチンの動員、およびこれらの二量体に対する４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂの影響
この機能分析により、ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ−二量体形成並びにβ−アレスチン−２シグナル伝達タンパク質の動員のレベルでＣＸＣＲ４受容体に結合するＳＤＦ−１および／または４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂで誘導されるコンホメーション変化を評価することができる。
【０２７０】
検討した相互作用パートナーのそれぞれについての発現ベクターを、通常の分子生物学の手法を適用することによって対応する色素（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ、Ｒｌｕｃ、および黄色蛍光タンパク質、ＹＦＰ）との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ実験を行う２日前に、ＨＥＫ２９３細胞を、対応するＢＲＥＴパートナー：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化の検討のための［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２ヘテロ−二量体化の検討のための［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ２：ＹＦＰ］、およびβ−アレスチン−２のＣＸＣＲ４媒介性動員の検討のための［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋β−ａｒｒ２：ＹＦＰ］をコードする発現ベクターを用いて一過的にトランスフェクションした。翌日、細胞を、完全培養培地［１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ］中でポリ−リシンをプレコートした白色９６ＭＷプレートに分注した。細胞を、最初にＣＯ２５％で３７°Ｃにて培養し、細胞をプレートに接着させた。次いで、細胞を、２００μｌＤＭＥＭ／ウェルで一晩飢餓状態に置いた。ＢＲＥＴ実験の直前に、ＤＭＥＭを除き、細胞をＰＢＳで速やかに洗浄した。次いで、細胞を抗体の存在下または非存在下にてＰＢＳ中で３７°Ｃで１０分間インキュベーションした後、５μＭコエレンテラジンＨを３００ｎＭＳＤＦ−１と共にまたはなしで追加し、最終容積を５０μｌとした。３７°Ｃで更に１０分間インキュベーションした後、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光取得（light-emission acquisition）をＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０マルチラベルリーダー（Berthold）を用いて開始した（１ｓ／波長／ウェルで、室温にて１５回反復）。
【０２７１】
ＢＲＥＴ比の計算は、以前に報告されている方法で行った(Angers et al.,2000)：［（発光５３０ｎｍ）−（発光４８５ｎｍ）ｘＣｆ］／（発光４８５ｎｍ）
（式中、同一実験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質のみを発現する細胞については、Ｃｆ＝（発光５３０ｎｍ）／（発光４８５ｎｍ）である）。この式の簡略化は、ＢＲＥＴ比は、２つのＢＲＥＴパートナーが存在するときに得られる比５３０／４８５ｎｍに対応し、Ｒｌｕｃに融合したパートナーのみが分析で存在するときに同じ実験条件下で得られる比５３０／４８５ｎｍによって補正されることを示している。判読しやすくするため、結果はミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表され、ｍＢＵは、ＢＲＥＴ比に１０００を乗じたものに相当する。
【０２７２】
ＳＤＦ１（３００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４受容体に融合したアダプターおよび受容体タンパク質の空間的近接から生じるＢＲＥＴシグナルを約２０％増加させ、これは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成、または以前に存在していた二量体のコンホメーション変化を示していると思われる（図６Ａおよび６Ｂ）。興味深いことには、ＳＤＦ１（３００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４に融合したアダプターおよび受容体タンパク質の空間的近接から生じるＢＲＥＴシグナルを約２４％減少させ、同様にＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体形成または以前に存在していた二量体のコンホメーション変化を示していると思われる（図６Ｃおよび６Ｄ）。この後者の場合には、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２のＳＤＦ−１によって活性化したコンホメーションは、ＢＲＥＴエネルギー移動には余り好ましくないと思われる。いずれの場合にも、４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂは、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のＳＤＦ−１誘導コンホメーション変化を調節することができ（４１４Ｈ５についてＳＤＦ−１誘導ＢＲＥＴの阻害は６３％増加、５１５Ｈ７についてＳＤＦ−１誘導ＢＲＥＴの阻害は６９％増加、それぞれ図６Ａおよび６Ｂ）、同様に、ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ−二量体形成を調節することができる（４１４Ｈ５についてＳＤＦ−１誘導ＢＲＥＴの阻害は５０％減少、Ｓ５１５Ｈ７についてＤＦ−１誘導ＢＲＥＴの阻害は９０％減少、それぞれ図６Ｃおよび６Ｄ）。４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂもそれら自身で、それぞれＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４空間的近接を調節することができ、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモおよびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ−二量体コンホメーションの両方に対する４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂの影響を示している（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄ）。
【０２７３】
ＳＤＦ−１（３００ｎＭ）によるＣＸＣＲ４活性化は、ＢＲＥＴシグナルが２３３％増大することによって示されるように、細胞内シグナル伝達分子β−アレスチンが大幅な動員を生じる（図６Ｅおよび６Ｆ）。この動員は、４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂによって部分的に阻害され（４１４Ｈ５について約２０％阻害および５１５Ｈ７について９５％阻害、それぞれ、図６Ｅおよび６Ｆ）、シグナル伝達に対するＭａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７の効果を示していた。
【０２７４】
例７：ｃＡＭＰ産生のＣＸＣＲ４依存性阻害
この機能分析は、阻害性Ｇｉ／ｏタンパク質を介するアデニレートシクラーゼのレベルでのＣＸＣＲ４受容体シグナル伝達を観察する目的で行った。
【０２７５】
ｃＡＭＰ  ＬＡＮＣＥ処理（Perkin Elmer）を、供給業者によって詳細に説明されているように適用した。簡単に説明すれば、野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的にかつ構成的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、上記の方法で得て、増殖させた。細胞をトリプシンフリー薬剤のＶｅｒｓｅｎｅを用いて集め、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ結合抗ｃＡＭＰＭａｂ（ｌ／１００倍希釈液）および化合物（ホルスコリン、ＳＤＦ−１および／または４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂ）を含む溶液中に１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。室温で３０分間インキュベーションした後、ユーロピウム−ストレプトアビジン（１／１２５倍希釈液）およびビオチン−ｃＡＭＰ（１／１２５倍希釈液）複合体を含む検出ミックスを加えた。室温で１時間インキュベーションした後、生成するＦＲＥＴシグナルをＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０（Berthold）マルチラベルリーダーで測定した。データーは、任意蛍光値としてまたはＦＫ効果を差し引いたＳＤＦ−１に対する相対刺激として表される。
【０２７６】
ホルスコリン（ＦＫ）は、ＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞で約０．３μＭの効能でｃＡＭＰ産生を用量依存的に刺激した（図７Ａ）。ＳＤＦ−１の同時存在では、細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＣＸＣＲ４受容体による阻害性Ｇｉ／ｏタンパク質活性化の結果として減少した。ＳＤＦ−１の効能は、５．０±３．１ｎＭであった（図７Ａ）。４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂは、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）のホルスコリン刺激効果を４１４Ｈ５については６０％を上回るだけ、また５１５Ｈ７については８０％を上回るだけ効率的に阻害した（図７Ｂ）。
【０２７７】
例８：Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７による活性変異体Ａｓｎ１１９ＳｅｒＣＸＣＲ４受容体を構成的に発現する細胞膜における［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の調節
この機能分析により、構成的活性変異体（ＣＡＭ）Ａｓｎ１１９ＳｅｒＣＸＣＲ４受容体を介するＧタンパク質活性化を観察することができる（Zhang et al, 2002参照）。この高感度の分析により、固有活性に基づいてＣＸＣＲ４リガンドを識別することができる（部分作動薬、サイレント拮抗薬または逆作動薬）。Ｚｈａｎｇと協同研究者らによって以前に報告されているように、ＡＭＤ３１００またはＴ１４０のようなＣＸＣＲ４リガンドは、ＣＡＭ  ＣＸＣＲ４受容体でそれぞれ部分作動薬および逆作動薬として作用した。このクラスの分子はＣＸＣＲ４の活性および不活性状態のいずれについても同様の親和性を示さなければならないので、サイレント拮抗薬の同定は困難なことがある(Wurch et al., 1999)。
【０２７８】
ＣＸＣＲ４受容体のコード配列へのＡｓｎ１１９Ｓｅｒ変異の導入は、通常の分子生物学の手法を適用することによって行った（QuickChange site directed mutagenesis kit、 Stratagene、米国）。ＣＡＭ  ＣＸＣＲ４受容体を安定的かつ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、上記例に記載の方法で得た。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は、ライシスバッファー［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ１５０ｍＭ］で機械的に破砕し、更に遠心分離（１００００ｇ、１５分間）して得た細胞膜で行った。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（比活性：１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の組込みは、ＳＰＡ法（シンチレーション近接分析−GE Healthcare）を用いて行った。簡単に説明すれば、細胞膜（１０μｇ／ウェル）を、結合緩衝液［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ＧＤＰ３μＭ、ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ＝７．４］中で評価を行う化合物（ＳＤＦ−１またはｍＡｂ）、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．２〜０．４ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と共にインキュベーションした。結合反応は、２５°Ｃで１時間行った。遠心分離［１０００ｇ、１０分間］した後、放射能をシンチレーションカウンター（TopCount, Perkin Elmer）で測定した。
【０２７９】
ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）は、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を１３０％刺激した。逆作動薬Ｔ１４０は、基底（−１７％）およびＳＤＦ−１刺激（−１５９％）［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の両方を阻害した。対照的に、４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂは、ＣＡＭ  ＣＸＣＲ４ではサイレント拮抗薬として作用し、基底［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を変更させなかったが（図８）、ＳＤＦ−１誘導［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を阻害した（図８）。
【０２８０】
例９：インビトロでのＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５によるＳＤＦ−１誘導Ｈｅｌａ細胞増殖の阻害
ＡＴＣＣからのＨｅＬａ細胞を、ＥＭＥＭ培地（Lonza Corporation. Venders.ベルギー）、１０％ＦＣＳ（SIGMA Corporation,St Louis,米国）、１％Ｌ−グルタミン（Invitrogen Corporation,スコットランド．英国）、２％重炭酸ナトリウム７．５％溶液（Invitrogen Corporation.スコットランド．英国）中で常法により培養した。細胞を、増殖分析３日前に継代し、コンフルエントになるようにした。
【０２８１】
ＳＤＦ−１誘導Ｈｅｌａ細胞増殖
ＨｅＬａ細胞を、９６−ウェル組織培養プレートに２００μｌの無血清培地（ＥＭＥＭ培地＋１％Ｌ−グルタミン、２％重炭酸ナトリウム７．５％溶液）中１ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。播種から２４時間後、ＳＤＦ−１の適当な希釈液をＨｅＬａ細胞に加えた。全部で７６時間の培養後、細胞に０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Amersham Biosciences AB,Uppsala,スウェーデン）を１６時間加えた。ＤＮＡに組込まれた［３Ｈ］チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。
【０２８２】
結果は、増殖指数＝［細胞の平均ｃｐｍ＋ＳＤＦ−１／細胞−ＳＤＦ−１の平均ｃｐｍ］として表した。
【０２８３】
ＨｅＬａ細胞を、ＳＤＦ−１（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションした。ＳＤＦ−１は、インビトロでＨｅＬａ細胞増殖を１．５〜２倍に刺激した。最高かつ再現性のある増殖指数を得るためのＳＤＦ−１の濃度は、２００ｎｇ／ｍｌ（２５ｎＭ）であった。
【０２８４】
インビトロでのＣＸＣＲ４４１４Ｈ５ＭａｂによるＳＤＦ−１誘導Ｈｅｌａ細胞増殖の阻害
ＨｅＬａ細胞を、９６−ウェル組織培養プレートに２００μｌの無血清培地（ＥＭＥＭ培地＋１％  Ｌ−グルタミン、２％重炭酸ナトリウム７．５％溶液）中１ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。播種の２４時間後に、抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５の適当な希釈液である希釈培地を、ＳＤＦ−１の存在下または非存在下にて最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ（２５ｎＭ）でＨｅＬａ細胞に３回加えた。全部で７６時間の培養の後、細胞に０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Amersham Biosciences AB,Uppsala,スウェーデン）を１６時間加えた。ＤＮＡに組込まれた［３Ｈ］チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。
【０２８５】
結果は、式：
Ｆａ＝［１−［Ｍａｂ＋ＳＤＦ−１とインキュベーションした細胞の平均ｃｐｍ／希釈培地＋ＳＤＦ−１とインキュベーションした細胞の平均ｃｐｍ）］ｘ１００
を用いて計算した影響比（affected fraction；Ｆａ）として表した。
【０２８６】
ＳＤＦ−１誘導ＨｅＬａ細胞増殖に対する抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５のインビトロ効果を、特性決定した。ＨｅＬａ細胞を、ＳＤＦ−１（２００ｎｇ／ｍｌ）を含むまたは含まず４１４Ｈ５Ｍａｂまたはコントロールのいずれかとインキュベーションした。ＳＤＦ−１は、ＨｅＬａ細胞のインビトロ増殖を刺激した（１．５〜２倍）。細胞播種の２４時間後に、０〜１５００ｎＭの範囲のＭａｂの連続２倍希釈液で細胞を処理することによって、４１４Ｈ５Ｍａｂの用量−応答曲線を得た。播種の７６時間後に細胞増殖を評価したので、それぞれの試験条件はＭａｂまたはコントロールへの４８時間の暴露時間に対応する。結果は、上記のＦａ式を用いて影響比として表した。結果（図９に表した）は、ＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５がＳＤＦ−１誘導Ｈｅｌａ細胞増殖をインビトロで阻害することを示した。
【０２８７】
例１０：ＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走に対する抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７の効果
遊走過程に対する抗−ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体４１４Ｈ５および５１５Ｈ７の阻害効果を評価するため、２％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中の１００  ０００個のＵ−９３７細胞を、ウェルの下室にＳＤＦ−１の存在下または非存在下にてかつ上室にＭａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７の有りまたはなしで、遊走チャンバー（８−μｍ細孔径を有する２４ウェルプレート）の上室に播種した。この試験では、マウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２Ｂをアイソタイプコントロールとして導入した。播種の２時間後に、遊走細胞を計数した。４１４Ｈ５について図１０Ａおよび５１５Ｈ７について図１０Ｂに示した結果は、予想したように、ＳＤＦ−１がＵ−９３７細胞遊走の有意な増加を誘導することができることを示していた。ＩｇＧ２アイソタイプコントロールとインキュベーションした細胞には、効果は全く見られなかった。対照的に、４１４Ｈ５および５１５Ｈ７  Ｍａｂとインキュベーションした細胞については、ＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走の有意かつ再現性のある減少が観察された：４１４Ｈ５Ｍａｂでは５０％であり、５１５Ｈ７Ｍａｂでは８０％を上回った。
【０２８８】
例１１：Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍増殖の抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５阻害
これらの実験の目的は、Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスでのＭＤＢ−ＭＢ−２３１異種移植片の増殖を阻害する抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７の能力を評価することであった。
【０２８９】
ＥＣＡＣＣからのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＤＭＥＭ培地（Invitrogen Corporation，スコットランド，英国）、１０％ＦＣＳ（Sigma,St Louis, MD,米国）中で常法により培養した。細胞を、移植４８時間前に継代し、対数増殖期となるようにした。１０７個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＰＢＳ中で７週齢のＮｏｄ／Ｓｃｉｄマウス（Charles River,仏国）に移植した。移植から５日後に、腫瘍は測定可能となり（３４ｍｍ３＜Ｖ３＜４０ｍｍ３）、動物を類似の腫瘍サイズの６尾ずつのマウス群に分けた。マウスに、それぞれＭａｂ４１４Ｈ５およびＭａｂ５１５Ｈ７  ２ｍｇ／マウス負荷用量を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。
【０２９０】
次いで、マウスに、Ｍａｂ４１４Ｈ５  １ｍｇ／用量／マウスを週２回またはＭａｂ５１５Ｈ７  ０．５ｍｇ／用量／マウスを週３回投与した。ＰＢＳ群は、この実験ではコントロール群として導入した。腫瘍体積を週に２回測定し、式：π／６ｘ長さｘ幅ｘ高さによって計算した。統計分析は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて、それぞれの測定時に行った。
【０２９１】
これらの実験では、治療中に死亡は観察されなかった。ＰＢＳ群と比較して、４１５Ｈ５  Ｍａｂ  １ｍｇ／用量または５１５Ｈ７  ０．５ｍｇ／用量についてはＤ７およびＤ３９（ｐ＜０．００２）の間で腫瘍増殖の有意な阻害があり、治療から５週間後の平均腫瘍体積は、それぞれＭａｂ  ４１５Ｈ５および５１５Ｈ７についてＰＢＳに対して８２％および５０％減少した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
【０２９２】
例１２：Ｕ９３７マウス生存モデルにおける抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５活性
ＡＴＣＣからのＵ９３７細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を、移植２日前に継代し、対数増殖期となるようにした。１０７個のＵ９３７細胞を、雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにｉ．ｐ．投与した。移植から２日後に、マウスに４１４Ｈ５ｍＡｂ／マウス  ２ｍｇ負荷用量を皮下注射（ｓ．ｃ．）処理した後、抗体／マウス１ｍｇを週２回処理した。以前の検討では、ＰＢＳを投与したマウスとマウスＩｇＧアイソタイプコントロールを投与したマウスとの間には、生存率の差は見られなかったことが示されているので、コントロールマウスにはＰＢＳ注射液を投与した。マウスの生存は、毎日観察した。
【０２９３】
図１２に示した結果は、４１４Ｈ５Ｍａｂを投与したマウスは、寿命が劇的かつ有意に増加し、Ｔ／Ｃ％は約３４３となったことを示した。
【０２９４】
例１３：細胞内カルシウム貯蔵のＣＸＣＲ４受容体媒介性流動化
この機能分析は、小胞体からの細胞内貯蔵からカルシウム遊離を誘導するホスホリパーゼＣ経路の刺激によるＣＸＣＲ４受容体シグナル伝達の観察を目的として行った。
【０２９５】
野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的かつ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、上記例で記載した方法で得た。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳腺癌）およびＵ９３７（ヒトリンパ腫）細胞を、完全培養培地、それぞれ［１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ］および［１０％ＦＣＳ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム、１％Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／１グルコースを補足したＲＰＭＩ１６４０］で増殖させた。すべての細胞タイプは、黒色の９６ＭＷプレートに適当な培養培地中１００，０００個の細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩飢餓状態にした後、実験を行った。細胞に、蛍光カルシウム色素（Fluo-4 No Wash, Invitrogen 米国）をローディングバッファー［ＨＢＳＳ１ｘ、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ、プロベネシド酸２５ｍＭ］に溶解したものを３７°Ｃで３０分間、次いで２５°Ｃで３０分間装填した。ＳＤＦ−１による刺激は、それぞれのウェルに直接投与することによって行った。拮抗実験のため、Ｍａｂ溶液１０μｌを、ローディングバッファーにＳＤＦ−１の少なくとも１０分前に直接加えた。動的蛍光測定は、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０（Berthold）で、下記の設定値：励起４８５ｎｍ、発光５３５ｎｍ、励起エネルギー１００００任意単位で行った。それぞれのウェルの蛍光を、毎秒０．１秒およびＳＤＦ−１投与前は２０秒間（基底シグナル）記録する。次いで、ＳＤＦ−１  ２０μｌを投与し、データー記録を２分間行う。それぞれの実験条件は、２回行う。それぞれのウェルの値を、最初に、基底蛍光および細胞なしのコントロールウェルによって発光された蛍光を差し引くことによって補正する。相対データーは、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって得られる最大刺激の割合として表される。
【０２９６】
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、組換えＣＨＯ／ＣＸＣＲ４において細胞内カルシウムの速やかかつ強力な放出を誘導したが、ナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞では蛍光シグナルは検出されなかった。最大強度は、基底蛍光に対して＞１６０％に達し、ＳＤＦ−１で刺激したときには約３０秒間観察され、同様な動的曲線がＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＵ−９３７のいずれでも見られたが（図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ）、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）による最大蛍光強度は低めであった（基底蛍光に対して１３０〜１４０％）。５１５Ｈ７抗体（１３３ｎＭ）は、３種類すべての検討した細胞系でＳＤＦ−１（１００ｎＭ）誘導カルシウムシグナルを強力かつほぼ完全に阻害した。
【０２９７】
例１４：Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおけるＴ細胞ＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍増殖の抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ４１４Ｈ５阻害
この実験の目的は、Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスでのＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植片の増殖を阻害する抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ  ４１４Ｈ５および５１５Ｈ７の能力を評価することであった。
【０２９８】
ＥＣＡＣＣからのＫＡＲＰＡＳ２２９細胞を、ＲＰＭＩ培地、１％Ｌ−Ｇｌｕおよび１０％ＦＣＳ（Sigma,St Louis, MD, 米国）中で、常法により培養した。細胞を、移植４８時間前に継代し、対数増殖期となるようにした。５ｘ１０６個のＫＡＲＰＡＳ２９９細胞を、ＰＢＳ中で７週齢のＮｏｄ／Ｓｃｉｄマウス（Charles River,仏国）に移植した。移植から５日後に、腫瘍は測定可能となり（３２ｍｍ３＜Ｖ３＜４９ｍｍ３）、動物を類似の腫瘍サイズの６尾ずつのマウス群に分けた。マウスに、Ｍａｂ４１４Ｈ５  ２ｍｇ／マウス負荷用量をｉ．ｐ．投与した。
【０２９９】
次いで、マウスに、Ｍａｂ４１４Ｈ５  １ｍｇ／用量／マウスを週２回投与した。ＰＢＳ群は、この実験ではコントロール群として導入した。腫瘍体積を週に２回測定し、式：π／６ｘ長さｘ幅ｘ高さによって計算した。統計分析は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて、それぞれの測定時に行った。
【０３００】
この実験では、治療中に死亡は観察されなかった。ＰＢＳ群と比較して、４１４Ｈ５  Ｍａｂ  １ｍｇ／用量についてはＤ７およびＤ３３（ｐ＜０．００２）の間で腫瘍増殖の有意な阻害があり、治療から５週間後の平均腫瘍体積は、Ｍａｂ４１４Ｈ５についてＰＢＳに対して７３％減少した（図１４）。
【０３０１】
例１５：Ｕ９３７マウス生存モデルにおける抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ５１５Ｈ７活性
ＡＴＣＣからのＵ９３７細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を、移植２日前に継代し、対数増殖期となるようにした。１０７個のＵ９３７細胞を、雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにｉ．ｐ．投与した。移植から２日後に、マウスに５１５Ｈ７Ｍａｂ／マウス２ｍｇの負荷用量をｓ．ｃ．投与した後、抗体／マウス１ｍｇを週２回投与した。以前の検討では、ＰＢＳを投与したマウスとマウスＩｇＧアイソタイプコントロールを投与したマウスとの間には生存率の差は見られなかったことが示されているので、コントロールマウスにはＰＢＳ注射液を投与した。マウスの生存は、毎日観察した。
【０３０２】
図１５に示した結果は、５１５Ｈ７Ｍａｂを投与したマウスは、寿命が劇的かつ有意に増加し、Ｔ／Ｃ％は約２８０となったことを示した（図１５）。
【０３０３】
例１６：Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおけるＴ細胞ＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍増殖の抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ５１５Ｈ７阻害
この実験の目的は、Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおけるＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植片の増殖を阻害する抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ５１５Ｈ７の能力を評価することである。
【０３０４】
ＥＣＡＣＣからのＫＡＲＰＡＳ２９９細胞を、ＲＰＭＩ培地、１％Ｌ−Ｇｌｕおよび１０％ＦＣＳ（Sigma, St Louis, MD, 米国）中で、常法により培養した。細胞を、移植４８時間前に継代し、対数増殖期となるようにした。５ｘ１０６個のＫＡＲＰＡＳ２９９細胞を、ＰＢＳ中で７週齢のＮｏｄ／Ｓｃｉｄマウス（Charles River, 仏国）に移植した。移植から５日後に、腫瘍は測定可能となり（３２ｍｍ３＜Ｖ３＜４９ｍｍ３）、動物を類似の腫瘍サイズの６尾ずつのマウス群に分割した。マウスに、Ｍａｂ５１５Ｈ７  ２ｍｇ／マウス負荷用量をｉ．ｐ．投与した。
【０３０５】
次いで、マウスに、Ｍａｂ５１５Ｈ７  １ｍｇ／用量／マウスを週２回投与した。ＰＢＳ群は、この実験ではコントロール群として導入した。腫瘍体積を週に２回測定し、式：π／６ｘ長さｘ幅ｘ高さによって計算した。統計分析は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて、それぞれの測定時に行った。
【０３０６】
この実験では、治療中に死亡は観察されなかった。ＰＢＳ群と比較して、５１５Ｈ７Ｍａｂ  １ｍｇ／用量についてはＤ７およびＤ３３（ｐ＜０．００２）の間で腫瘍増殖の有意な阻害が見られ、治療から５週間後の平均腫瘍体積は、Ｍａｂ５１５Ｈ７についてＰＢＳに対して６３％減少した（図１６）。
【０３０７】
例１７：抗−ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７の産生
マウス４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂのキメラ型を、下記のようにして設計した：それらは、ヒトＣκおよびＩｇＧ１定常ドメインに遺伝学的に融合した目的のマウス抗体の軽および重鎖可変ドメインに相当する。すべての組換えＭａｂは、ｐＣＥＰ４発現ベクターを有するＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡシステム（InVitrogen,米国）を用いることによって一過性トランスフェクションによって産生した。
【０３０８】
４１４Ｈ５および５１５Ｈ７Ｍａｂ軽および重鎖の可変ドメインに相当する全ヌクレオチド配列は、包括的遺伝子合成（Genecust,ルクセンブルグ）によって合成した。それらを、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン軽鎖［Ｃκ］または重鎖［ＣＨｌ−Ｈｉｎｇｅ−ＣＦ２−ＣＦ３］の定常ドメインの全コード配列を有するｐＣＥＰ４ベクター（InVitrogen,米国）にサブクローニングした。すべてのクローニング段階は、「実験室マニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」(Sambrook and Russel, 2001)に記載の通常の分子生物学の手法または供給業者の使用説明に準じて行った。それぞれの遺伝子構築物は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems,米国)を用いるヌクレオチドシークエンシングによって完全検証し、３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystems,米国)を用いて分析した。
【０３０９】
懸濁液適合（suspension-adapted）ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（InVitrogen,米国）を、２５０ｍｌフラスコ中でオービタルシェーカー（１１０ｒｐｍ回転速度）上で６ｍＭグルタミンを補足した無血清培地Ｅｘｃｅｌｌ２９３（SAFC Biosciences）５０ｍｌ中で常法により増殖させた。一過性トランスフェクションは、水中で、混合して１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に調製した線状２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Polysciences）とプラスミドＤＮＡ（重鎖対軽鎖プラスミド比１：１については最終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、２．１０６細胞／ｍｌで行った。トランスフェクションの４時間後に、培養物を新鮮な培養培地１容で希釈し、最終細胞密度を１０６細胞／ｍｌとした。培養工程は、細胞の生存可能性およびＭａｂ産生に基づいて観察した。典型的には、培養物を４〜５日間保持した。Ｍａｂは、プロテインＡ樹脂（GE Healthcare, 米国）上で通常のクロマトグラフィー法を用いて精製した。すべての様々なＭａｂは、機能性評価に適当なレベルで産生した。生産性レベルは、典型的には精製Ｍａｂが６〜１５ｍｇ／ｌの範囲である。
【０３１０】
例１８：抗−ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７結合特異性のＦＡＣＳ分析による特性決定および癌細胞系認識
この実験では、ヒトＣＸＣＲ４への抗−ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７の特異的結合を、ＦＡＣＳ分析によって検討した。
【０３１１】
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクション細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞系を、モノクローナル抗体ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７  １０μｇ／ｍｌとインキュベーションした。次いで、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で洗浄した。次いで、Ａｌｅｘａ−標識した二次抗体を細胞に加え、４°Ｃで２０分間インキュベーションした。次いで、細胞を更に２回洗浄した。２回目の洗浄の後、ＦＡＣＳ分析を行った。これらの結合研究の結果を下表５に挙げるが、これは、抗−ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７がヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクション細胞系に特異的に結合した［ＦＡＣＳによって得られる平均蛍光強度（ＭＦＩ）］、およびヒト癌細胞系、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞をも認識することをも示している。
【０３１２】
【表５】
0005723279.tif 000006
【０３１３】
例１９：ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１膜における放射能標識［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１に対する抗−ＣＸＣＲ４マウスＭａｂ  ｍ４１４Ｈ５およびｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７の競合結合
この分析により、放射能標識［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１のヒトＣＸＣＲ４受容体のオルソステリックまたはアロステリック結合部位での結合を競合するマウスＭａｂ  ｍ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５、ｃ５１５Ｈ７の能力を評価することができる。
【０３１４】
ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的かつ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）とヒトＣＸＣＲ４受容体の全コード配列（参照配列ＮＭ  ００３４６７）を有する哺乳類発現ベクターのトランスフェクションによって得た。細胞を、完全培養培地［５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびゲネチシン５００μｇ／ｍｌを補足したＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓＦ１２］で増殖させた。放射性リガンド結合実験を、ライシスバッファー［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ１５０ｍＭ］中でＣＨＯ／ＣＸＣＲ４細胞を機械的に破砕した後、遠心分離（１００００ｇ、１５分間）して得た細胞膜で行った。［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合（比活性：１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＳＰＡ法（シンチレーション近接分析−GE Healthcare）を用いて行った。簡単に説明すると、細胞膜（３０μｇ／ウェル）を、結合緩衝液［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２１ｍＭ、ＭｇＣｌ２５ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＢＳＡ１％］中で評価を行う化合物（ＳＤＦ−１またはｍＡｂ）、放射性リガンド（１ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と共にインキュベーションした。２５°Ｃで１時間後に結合平衡に達した。遠心分離［１０００ｇ、１０分間］した後、放射能をシンチレーションカウンター（TopCount, Perkin Elmer)で測定した。非特異的結合（ＮＳ）は、１０μＭの未標識ＳＤＦ−１の存在下にて評価した。
【０３１５】
抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂ（１００ｎＭ）は、［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合について下記の順位序列の競合効率で競合した（［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の阻害率％）：ｍ５１５Ｈ７（６２±１０％）、ｃ５１５Ｈ７（５５±４％）、ｍ４１４Ｈ５（３０±５％）およびｃ４１４Ｈ５（２１±１０％）（図１７）。
【０３１６】
例２０：抗−ＣＸＣＲ４マウスＭａｂ  ｍ４１４Ｈ５およびｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７による野生型ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞膜での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の調節
この機能分析により、野生型ヒトＣＸＣＲ４受容体を介するＧタンパク質活性化および抗−ＣＸＣＲ４マウスＭａｂ  ｍ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５、ｃ５１５Ｈ７によるその調節を観察することができる。
【０３１７】
野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的にかつ構成的に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞についての上記例で記載した方法によって得た。ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部癌）細胞を、完全培養培地［１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、２μＭ重炭酸ナトリウムを補足したＥＭＥＭ］で増殖させた。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は、ライシスバッファー［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ１５０ｍＭ］中で機械的に破砕し、更に遠心分離（１００００ｇ、１５分間）して得た細胞膜で行った。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（比活性：１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の組込みおよび検出は、ＳＰＡ法（シンチレーション近接分析−GE Healthcare）を用いて行った。簡単に説明すれば、細胞膜（１０μｇ／ウェル）を、結合緩衝液［Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ＧＤＰ３μＭ、ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ＝７．４］中で、評価を行う化合物（目的のＳＤＦ−１またはＭＡｂ）、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．２〜０．４ｎＭ）、および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と共にインキュベーションした。結合反応は、２５°Ｃで１時間行った。遠心分離［１０００ｇ、１０分間］の後、放射能の数値をシンチレーションカウンター（TopCount, Perkin Elmer）で測定した。ＩＣ５０を、それぞれのＭａｂについて計算した。
【０３１８】
これらの実験条件下では、ＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞で測定したｍ４１４Ｈ５、ｃ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７およびＣ５１５Ｈ７ＭａｂのＩＣ５０は、それぞれ１．６ｎＭ、１．１ｎＭ、１．９ｎＭおよび１．５ｎＭであった（図１８）。同じ実験条件下でＨｅｌａ細胞を用いて測定したｍ４１４Ｈ５、ｃ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７およびｃ５１５Ｈ７ＭａｂのＩＣ５０は、それぞれ０．５ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭおよび０．６ｎＭであった（図１９）。
【０３１９】
例２１：ＣＸＣＲ４と様々な相互作用パートナーの会合：ホモおよびヘテロ二量体化、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法によるβ−アレスチンの動員、およびこれらの二量体に対するネズミＭａｂ  ｍ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７の影響
この機能分析により、ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ−二量体形成並びにβ−アレスチン−２シグナル伝達タンパク質の動員のレベルでＣＸＣＲ４受容体に結合するＳＤＦ−１および／またはｍ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７マウスＭａｂおよびｃ４１４Ｈ５、およびｃ５１５Ｈ７キメラＭａｂで誘導されるコンホメーション変化を評価することができる。
【０３２０】
検討した相互作用パートナーのそれぞれについての発現ベクターを、通常の分子生物学の手法を適用することによって対応する色素（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ、Ｒｌｕｃ、および黄色蛍光タンパク質、ＹＦＰ）との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ実験を行う２日前に、ＨＥＫ２９３細胞を、対応するＢＲＥＴパートナー：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化の検討のための［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２ヘテロ−二量体化の検討のための［ＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ２−ＹＦＰ］、およびβ−アレスチン−２のＣＸＣＲ４媒介性動員の検討のための［ＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ＋β−ａｒｒ２−ＹＦＰ］をコードする発現ベクターを用いて一過的にトランスフェクションした。翌日、細胞を、完全培養培地［１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ］中でポリ−リシンをプレコートした白色９６ＭＷプレートに分注した。細胞を、最初にＣＯ２５％で３７°Ｃにて培養し、細胞をプレートに接着させた。次いで、細胞を、２００μｌＤＭＥＭ／ウェルで一晩飢餓状態に置いた。ＢＲＥＴ実験の直前に、ＤＭＥＭを除き、細胞をＰＢＳで速やかに洗浄した。次いで、細胞を抗体の存在下または非存在下にてＰＢＳ中で３７°Ｃで１０分間インキュベーションした後、５μＭコエレンテラジンＨを１００ｎＭＳＤＦ−１と共にまたはなしで追加し、最終容積を５０μｌとした。ホモおよびヘテロ二量体について、３７°Ｃで５分間インキュベーションし、室温で２０分間更にインキュベーションした後、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍの発光取得をＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０マルチラベルリーダー（Berthold）を用いて開始した（１ｓ／波長／ウェルで、室温にて１５回反復）。
【０３２１】
ＢＲＥＴ比の計算は、以前に報告されている方法で行った（Angers et al., 2000）：［（発光５３０ｎｍ）−（発光４８５ｎｍ）ｘＣｆ］／（発光４８５ｎｍ）
（式中、同一実験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質のみを発現する細胞については、Ｃｆ＝（発光５３０ｎｍ）／（発光４８５ｎｍ）である）。この式の簡略化は、ＢＲＥＴ比は、２つのＢＲＥＴパートナーが存在するときに得られる比５３０／４８５ｎｍに対応し、Ｒｌｕｃに融合したパートナーのみが分析に存在するときに同じ実験条件下で得られる比５３０／４８５ｎｍによって補正されることを示している。判読しやすくするため、結果はミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表され、ｍＢＵは、ＢＲＥＴ比に１０００を乗じたものに相当する。
【０３２２】
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４受容体に融合した供与体および受容体タンパク質の空間的近接から生じるＢＲＥＴシグナルを約１０％増加させ、これは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成、または以前に存在していた二量体のコンホメーション変化を示していると思われる（図２０Ａ）。興味深いことには、ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４に融合した供与体および受容体タンパク質の空間的近接から生じるＢＲＥＴシグナルを約１７％減少させ、同様にＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体形成または以前に存在していた二量体のコンホメーション変化を示していると思われる（図２０Ｂ）。この後者の場合には、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２のＳＤＦ−１によって活性化したコンホメーションは、ＢＲＥＴエネルギー移動には余り好ましくないと思われる。いずれの場合にも、ｍ４１４Ｈ５、ｃ４１４Ｈ５およびｍ５１５Ｈ７、ｃ５１５Ｈ７Ｍａｂは、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のＳＤＦ−１誘導コンホメーション変化を調節することができ（ＳＤＦ−１誘導ＢＲＥＴの阻害はｃ４１４Ｈ５については７５％増加、ＳＤＦ−１誘導ＢＲＥＴの阻害はｃ５１５Ｈ７については９６％増加、図２０Ａ）、同様に、ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ−二量体形成を調節することができる（ＳＤＦ−１誘導ＢＲＥＴの阻害はｃ４１４Ｈ５について７７％減少、ＳＤＦ−１誘導ＢＲＥＴの阻害はｃ５１５Ｈ７について９８％減少、図２０Ｂ）。ｍ４１４Ｈ５、ｃ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７およびｃ５１５Ｈ７Ｍａｂもそれら自身で、それぞれＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４空間的近接を調節することができ、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモおよびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ−二量体コンホメーション両方に対するこれらのＭａｂの影響を示している（図２０Ａおよび２０Ｂ）。
【０３２３】
ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によるＣＸＣＲ４活性化は、ＢＲＥＴシグナルの４００％増大することによって示されるように、細胞内シグナル伝達分子β−アレスチンが大幅に動員された（図２０Ｃ）。この動員は、ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７Ｍａｂによって部分的に阻害され（ｃ４１４Ｈ５について約６３％阻害およびｃ５１５Ｈ７について９３％阻害、図２０Ｃ）、シグナル伝達に対するこれらのＭａｂの効果を示していた。
【０３２４】
例２２：細胞内カルシウム貯蔵のＣＸＣＲ４受容体媒介性流動化
この機能分析は、小胞体からの細胞内貯蔵からカルシウム遊離を誘導するホスホリパーゼＣ経路の刺激によるＣＸＣＲ４受容体シグナル伝達の観察を目的として行った。
【０３２５】
野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的かつ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、上記例で記載した方法で得た。Ｕ９３７（ヒトリンパ腫）細胞を、完全培養培地、それぞれ［１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ］および［１０％ＦＣＳ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム、１％Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／１グルコースを補足したＲＰＭＩ１６４０］で増殖させた。すべての細胞タイプは、黒色の９６ＭＷプレートに適当な培地中１００，０００個の細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩飢餓状態にした後、実験を行った。細胞に、蛍光カルシウム色素（Fluo-4 No Wash, Invitrogen 米国）をローディングバッファー［ＨＢＳＳ１ｘ、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ、プロベネシド酸２５ｍＭ］に溶解したものを３７°Ｃで３０分間、次いで２５°Ｃで３０分間装填した。ＳＤＦ−１による刺激は、それぞれのウェルに直接投与することによって行った。拮抗実験のため、Ｍａｂ溶液１０μｌを、装填緩衝液にＳＤＦ−１の少なくとも１０分前に直接加えた。動的蛍光測定は、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０（Berthold）で、下記の設定値：励起４８５ｎｍ、発光５３５ｎｍ、励起エネルギー１００００任意単位で行った。それぞれのウェルの蛍光を、毎秒０．１秒およびＳＤＦ−１投与前は２０秒間記録する（基底シグナル）。次いで、ＳＤＦ−１  ２０μｌを投与し、データー記録を２分間行う。それぞれの実験条件は、２回行う。それぞれのウェルの値を、最初に、基底蛍光および細胞なしのコントロールウェルによって放射された蛍光を差し引くことによって補正する。相対データーは、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって得られる最大刺激の割合として表される。
【０３２６】
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、組換えＣＨＯ／ＣＸＣＲ４において細胞内カルシウムの速やかかつ強力な放出を誘導したが、ナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞では蛍光シグナルは検出されなかった。最大強度は、基底蛍光に対し＞１４０％に達し、ＳＤＦ−１で刺激したときには約４０秒間観察され、同様な動的曲線がＵ−９３７で見られた（図２１Ａ、２１Ｂ）。キメラ抗体ｃ５１５Ｈ７（１３３ｎＭ）は、検討したいずれの細胞系でもＳＤＦ−１（１００ｎＭ）誘導カルシウムシグナルを強力かつほぼ完全に阻害した。
【０３２７】
例２３：ＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走に対する抗−ＣＸＣＲ４マウスＭａｂｍ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５、ｃ５１５Ｈ７の効果
遊走工程に対する抗−ＣＸＣＲ４Ｍａｂｍ４１４Ｈ５、ｍ５１５Ｈ７、ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７の阻害効果を評価するため、２％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中の１００  ０００  Ｕ−９３７細胞を、ウェルの下室にＳＤＦ−１の存在下または非存在下にて、かつ上室にＭａｂｃ４１４Ｈ５、ｍ４１４Ｈ５、ｃ５１５Ｈ７およびｍ５１５Ｈ７の有りまたはなしで、遊走チャンバー（８−μｍ細孔径を有する２４ウェルプレート）の上室に播種した。この試験では、マウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２Ｂをアイソタイプコントロールとして導入した。播種の２時間後に、遊走細胞を計数した。図２２Ａ（ｃ４１４Ｈ５対ｍ４１４Ｈ５）および図２２Ｂ（ｃ５１５Ｈ７対ｍ５１５Ｈ７）に示した結果は、予想したように、ＳＤＦ−１がＵ−９３７細胞遊走の有意な増加を誘導することができることを示していた。細胞をＩｇＧ２アイソタイプコントロールとインキュベーションしたときには、効果は全く見られなかった。対照的に、ｃ４１４Ｈ５、ｍ４１４Ｈ５、ｃ５１５Ｈ７およびｍ５１５Ｈ７Ｍａｂとインキュベーションした細胞については、ＳＤＦ−１−誘導Ｕ９３７細胞遊走の有意かつ再現性のある減少が観察され、ｃ４１４Ｈ５およびｍ４１４Ｈ５Ｍａｂでは５０％であり、ｃ５１５Ｈ７およびｍ５１５Ｈ７Ｍａｂでは８０％を上回った。
【０３２８】
例２４：Ｕ９３７マウス生存モデルにおける抗−ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ  ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７活性
ＡＴＣＣからのＵ９３７細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を、移植２日前に継代し、対数増殖期となるようにした。１０７個のＵ９３７細胞を、雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにｉ．ｐ．投与した。移植から２日後に、マウスにｃ４１４Ｈ５またはｃ５１５Ｈ７Ｍａｂ／マウス  ２ｍｇの負荷用量をｓ．ｃ．投与した後、抗体／マウス１ｍｇを週２回投与した。以前の検討では、ＰＢＳを投与したマウスと、マウスＩｇＧアイソタイプコントロールを投与したマウスとの間には生存率の差は見られなかったことが示されているので、コントロールマウスにはＰＢＳ注射液を投与した。マウスの生存は、毎日観察した。
【０３２９】
図２３に示した結果は、ｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７Ｍａｂを投与したマウスは、寿命が劇的かつ有意に増加し、Ｔ／Ｃ％はｃ４１４Ｈ５およびｃ５１５Ｈ７について、それぞれ約２１０および１８０となった。
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図８】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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