(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の微生物を検出する方法であって、
濾過中の目詰まりが防止された孔を有し、かつ静電相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、物理的相互作用、及び生物相互作用からなる群から選択される相互作用により、微生物を引きつける繊維状物質を有するデプスフィルターであるフィルター媒体でサンプルを濾過することにより、微生物をフィルターに収集するステップと、
微生物の増殖を局在化させ及び／又は微生物検出試薬の蒸発を防止するポリマーと、微生物検出試薬とをフィルターに加工するステップであって、前記ポリマーが、環境感受性ヒドロゲル又はヒドロゲル粒子であり、前記環境感受性ヒドロゲルが、温度、ｐＨ、入射光量、イオン濃度、圧力、磁場、電場、音波照射または生化学的分子濃度の環境的変化を受ける前は、少なくとも部分的にゾル形態であって、低粘度を有しているが、環境的変化を受けると、粘度が増加し、少なくとも部分的にゲル形態となるものであり、前記ヒドロゲル粒子が前記フィルターの孔より小さいものであるステップと、
前記フィルターをインキュベートして、微生物を検出できるレベルに増殖させるステップと、
サンプル中の微生物の存在を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記濾過ステップ後に、フィルターを洗浄して、微生物の検出又は増殖を阻害する物質を除去するステップを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記繊維状物質が、セルロース繊維、ガラスマイクロファイバー又はヒドロゲル繊維を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物を認識する薬剤が、前記フィルターのマトリックス上に特異的又は非特異的に固定化されており、この薬剤が、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、核酸及び炭水化物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーが、前記環境感受性ヒドロゲルである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記フィルターへの前記環境感受性ヒドロゲルの加工が、
少なくとも部分的にゾル形態である環境感受性ヒドロゲルを含む溶液を前記フィルターに加工するステップと、
環境的変化を与えて、前記溶液をゲル化するステップと
を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーが、前記ヒドロゲル粒子である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒドロゲル粒子を含む懸濁液の吸収、吸引、濾過、浸漬及びスプレーからなる群から選択される手法により、前記ヒドロゲル粒子を加工するステップを更に含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記フィルターが、多孔質で球状のマイクロビーズの層を更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物検出試薬が、微生物の増殖を選択的に促進する増殖培地を備える請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖培地が、検出すべき微生物は耐性を持つが、他の生物は耐性を持たない選択的な試薬又は抗生物質を含むか、検出すべき微生物は迅速に増殖し及び／又は他の生物の増殖は緩慢に若しくは阻害するように選択されたｐＨ及び温度を含むか、又は検出すべき微生物により容易に代謝されるが、他の生物によっては容易に代謝されない栄養素を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出ステップが、微生物の存在下でシグナルを生じるシグナリング試薬からのシグナルを検知し、それによって微生物を検出することを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナリング試薬が、微生物に特異的な酵素のための基質、微生物に特異的な酵素のための発色性又は発蛍光性の基質、及び微生物に特異的な酵素のための基質とこの基質の消化を検出する発色性又は発蛍光性の指示薬との組合せからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年８月１日提出の米国仮出願第６０／９５３４２２号、２００７年１１月１日提出の米国仮出願第６０／９８４６２４号、２００７年１２月３１日提出の米国仮出願第６１／０１８０７９号、及び２００８年５月２１日提出の米国仮出願第６１／０５５０９９号の優先権を主張する。これら関連出願の全ては、ここに引用することにより本明細書の記載の一部をなすものとする。
【０００２】
発明の分野
本開示は、大容量の微粒子サンプル中の病原体を検出するための試薬、方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
疾病予防管理センター（ＣＤＣ）による最近の評価によれば、米国内で、各年だけで、７６００万の食品媒介疾病（food-borne illness）の例、３２万５千の入院例、及び５０００の死亡例の原因が、食品媒介病原体（food-borne pathogen）である。ヒトへの有害
な医学的影響に加えて、これらの食品媒介事例の大発生は、医療費増大、生産性低下、商品回収、及び輸出差し止めによって、経済に悪影響をもたらす。米国農務省（ＵＳＤＡ）は、特定の食品媒介病原体が少量でも生き残り、食中毒又は大発生を引き起こし得るので、その病原体に対してゼロトレランス政策を推奨している。そのため、食品サンプル中の１個の病原体でも検出できる高精度の病原体検出技術の開発が必要である。
【０００４】
現在、多数の検出技術及び製品が、食品媒介病原体の検出に利用できるが、数グラムの食品サンプルを汚染する１個の病原体を、２４時間という時間枠内で検出することは、今もなお困難である。一般に、病原体は、希釈及び均質化により食品サンプルから抽出され、これらは数百ｍＬほどの又はそれ以上のサンプル容積を生じる。大容量のサンプル中にある少数の病原体を検出するためには、病原体濃度が病原体検出アッセイに適するレベルに達するまで、細胞を培養することが必要である。必要な前増菌（pre-enrichment）時間は、標的病原体の倍加時間、生存能力、及び検出に要する病原体濃度に依存する。前増菌は、通常少なくとも１２〜４８時間かかる。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などの高感度検出アッセイを用いても、食品サンプル中の病原体混入の検出は、依然として１日又は２日を必要とする。更に、これらのアッセイは、一般に、高価であり、熟練の検査技師を必要とする。
【０００５】
更に、前増菌培養を用いる食品病原体アッセイは、増菌した病原体の取り扱いを要し、これは、試験所及び検査技師の二次汚染を生じ得る。従って、これらのアッセイは、食品製造プラントでの現場検査には適切ではなく、その代わりに現場の外、例えば委託試験所（reference laboratories）で行う必要がある。また、混入病原体の生存能力及び食品サンプルの成分が、病原体増殖速度に影響を与え得るという理由から、及びサンプルが細胞増殖の静止期又は衰退期にどれほど迅速に到達するかどうかは、病原体汚染レベルに依存し得るという理由から、前増菌培養によって、混入食品病原体に関する定量的情報が失われてしまう。そのため、前増菌を用いる食品病原体アッセイは、非定量的であり、食品の病原体汚染レベルの評価は難しい。
【０００６】
前増菌を伴う病原体アッセイの上記欠点を克服するために、病原体濃度を増すために、大容量のサンプルの遠心分離又は濾過などの他の増菌手順が必要となろう。しかしながら
、遠心分離は、遠心分離機が必要であり、特に、多数の大容量サンプルを検査する必要がある場合、一般に、厄介なプロセスである。
【０００７】
濾過は、より高い処理能力で遂行でき、かつ大容量サンプル中に存在する少ない数の病原体でも濃縮することができる。病原体を濃縮するために、濾過法は、通常、標的病原体より小さい孔径を有する精密濾過（ＭＦ）膜フィルターを、一般に利用する。こうして、病原体は、そのようなフィルターで濃縮でき、いくつかの検出法、例えばコロニー形成及びＤＮＡプローブハイブリダイゼーションにより検出することができる。しかしながら、これらの膜フィルターは、粒子捕捉能力（dirt-holding capacity）が非常に低く、その
小さい孔径のために、微粒状の食品抽出物により容易に目詰まりを起こす傾向がある。これらのフィルターは、飲料水や環境水などの微粒子をほとんど含有しないサンプル、又は非常に小容量の微粒子のサンプルに適する。適切な保持率を備えたデプスフィルターも、病原体の捕捉に使用されるが、しかしながら、そのようなデプスフィルターに捕捉された病原体の検出は、その３次元マトリックス構造及びフィルター厚さのため、より面倒である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、その実施形態として、以下のステップの１つ又は複数によってサンプル中の微生物を検出する方法に関する。
濾過中の目詰まりを防ぐように構成された孔を有し、かつ微生物を引きつけるように構成されたフィルターでサンプルを濾過して、微生物をフィルターに収集するステップ。
微生物の増殖を局在化させ及び／又は微生物検出試薬の蒸発を防止するように構成されるポリマーと、微生物検出試薬とをフィルターに添加するステップ。
検出できるレベルまで微生物を増殖させるのに十分な時間にわたりフィルターをインキュベートするステップ。
サンプル中に微生物の存在を検出するステップ。
【０００９】
好ましい実施形態では、前記ポリマーはヒドロゲルである。好ましくは、ヒドロゲルは、環境感受性ヒドロゲルである。環境感受性ヒドロゲルは、環境的変化を受ける前は、少なくとも部分的にゾル形態であって、低粘度を有するが、環境的変化を受けると、粘度が増加し、少なくとも部分的にゲル形態となる。好ましい実施形態では、環境的変化は、温度、ｐＨ、入射光量、イオン濃度、圧力、磁場、電場、音波照射又は生化学的分子の濃度である。好ましい実施形態では、フィルターへの環境感受性ヒドロゲルの添加は、少なくとも部分的にゾル形態の環境感受性ヒドロゲルを有する溶液をフィルターに添加するステップと、環境的変化を起こして、この溶液をゲル化するステップとを含む。
【００１０】
好ましい実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲル粒子である。好ましくは、ヒドロゲル粒子は、ヒドロゲル粒子の懸濁液を吸収、吸引、濾過又は浸漬及びスプレーするなどの方法により添加される。好ましい実施形態では、ヒドロゲル粒子は、フィルター孔より小さく、そのため、フィルター孔を効率的に塞ぐ。
【００１１】
好ましい実施形態では、ヒドロゲルは、脱水形態でフィルター孔に添加され、次いでフィルター孔の内側で水和させる。好ましくは、脱水ヒドロゲルの水和は、１分から６時間の時間がかかる。好ましくは、脱水ヒドロゲルは、溶液の形態でフィルター孔に添加され、１分から６時間にわたるインキュベーションにより、孔の内側で水和させる。
【００１２】
好ましい実施形態では、フィルターに加工されるポリマーは、粘着性ポリマー溶液である。粘着性ポリマー溶液は、フィルターに流入して、孔を満たし、微生物の増殖を効果的に局在化させる。好ましくは、粘着性ポリマー溶液には、水溶性ポリマー又はヒドロゲル懸濁液がある
【００１３】
好ましい実施形態では、フィルターに加工される微生物検出試薬は、微生物の増殖を選択的に促進するように構成された増殖培地を含有する。好ましくは、増殖培地は、検出すべき微生物は耐性を持つが、他の生物は耐性を持たない選択的な試薬又は抗生物質を含むか、検出すべき微生物は迅速に増殖し及び／又は他の生物の増殖は緩慢もしくは阻害するように選択されたｐＨ及び温度を含むか、又は検出すべき微生物によって容易に代謝されるが、他の生物によっては容易に代謝されない栄養素を含む。一部の好ましい実施形態では、増殖培地は、好気性菌の増殖に十分な量の酸素を含むか、又は嫌気性菌の増殖のために十分な量の酸素を含まない。
【００１４】
好ましい実施形態では、検出ステップは、微生物の存在下でシグナルを生じるように構成されたシグナリング試薬からのシグナルを検出し、これにより微生物を検出することを含む。好ましくは、シグナリング試薬は、微生物に特異的な酵素のための基質、微生物に特異的な酵素のための発色性もしくは発蛍光性の基質、又は微生物に特異的な酵素のための基質とこの基質の消化を検出する発色性もしくは発蛍光性の指示薬との組合せである。
【００１５】
一部の好ましい実施形態では、シグナリング試薬は、検出すべき微生物又はこの微生物の細胞成分を認識する薬剤、例えば、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、核酸又は炭水化物である。好ましくは、この薬剤は、例えば染料分子、金属コロイド、ポリマー粒子、磁性粒子、半導体粒子、リポソーム、ポリマーソーム、タンパク質、酵素又は核酸からの標識を有する。
【００１６】
本発明は、別の実施形態として、濾過中の目詰まりを防ぐように構成された孔と、微生物を引きつけるように構成されたフィルターとを有し、更に多孔質で球状のマイクロビーズの層も含む層状フィルター複合体を用いて、微粒子サンプルを濾過することにより、この微粒子サンプルから微生物を分離するステップを含む方法に関する。好ましくは、この方法は、フィルター中に固定化された微生物を検出するステップを含む。
【００１７】
本発明の実施形態では、前記方法の濾過ステップ後に、微生物の検出又は増殖を阻害する物質を除去するのに十分な時間にわたりフィルターを洗浄するステップを含んでもよい。
【００１８】
好ましい実施形態では、前記方法でのフィルターは、繊維状物質を有するデプスフィルターである。好ましくは、繊維状物質は、セルロース繊維又はガラスマイクロファイバーである。
【００１９】
好ましくは、フィルターは、静電相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、物理的相互作用、又は生物的相互作用などの相互作用によって微生物を引きつけるように構成されている。好ましい実施形態では、微生物を認識する薬剤は、フィルターマトリックス上に特異的に又は非特異的に固定化される。薬剤は、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、核酸又は炭水化物であってよい。
【００２０】
好ましい実施形態では、前記方法におけるフィルターは、更に、多孔質で球状のマイクロビーズの層を含む。一部の好ましい実施形態では、この多孔質球状マイクロビーズの層は、フィルターの上流側の面に配置される。一部の好ましい実施形態では、多孔質球状マイクロビーズの層は、メッシュ支持体の上流側の面に配置される。メッシュ支持体は、フィルター上に又はフィルターの上流側に配置される。
【００２１】
好ましい実施形態では、多孔質球状マイクロビーズの層は、均等又はグレーデッド(graded)層を形成する。好ましくは、多孔質球状マイクロビーズの層表面は、極めて不活性で
あり、微生物に対する非特異的な結合が低い。
【００２２】
好ましい実施形態では、マイクロビーズの直径は１〜１０００μｍであり、より好ましくは、マイクロビーズの直径は１５〜６００μｍであり、更により好ましくは、マイクロビーズの直径は５０〜３００μｍである。好ましくは、マイクロビーズの孔径は、微生物のサイズより小さく、微生物は、濾過ステップの間、マイクロビーズの間を通過する。一部の好ましい実施形態では、マイクロビーズは、架橋された親水性ポリマーを含む。
【００２３】
一部の好ましい実施形態では、濾過ステップの後に、洗浄液を添加することにより多孔質球状マイクロビーズ層を破壊し、その後、マイクロビーズを懸濁させ、洗浄液をフィルターで濾過する。
【００２４】
本発明は、その実施形態として、以下の構成要素のうち１つ又は複数を含む微生物検出キットに関する。
濾過中の目詰まりを防ぐように構成された孔を有し、かつ微生物を引きつけるように構成されたフィルター。
微生物の存在を検出するように構成された微生物検出試薬。
微生物の増殖を局在化するように及び／又は微生物検出試薬の蒸発を防止するように構成されたポリマー。
【００２５】
好ましい実施形態では、フィルターは、繊維状物質を有するデプスフィルターである。好ましくは、繊維状物質は、セルロース繊維及びガラスマイクロファイバーから選択される。
【００２６】
好ましくは、フィルターは、例えば静電相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、物理的相互作用、及び生物相互作用などの相互作用によって微生物を引きつけるように構成されている。
【００２７】
好ましい実施形態では、微生物を認識する検出試薬は、フィルターマトリックス上に特異的に又は非特異的に固定化される。薬剤は、好ましくは、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、核酸又は炭水化物である。
【００２８】
好ましい実施形態では、キットのポリマー成分はヒドロゲルである。好ましくは、ヒドロゲルは、環境感受性ヒドロゲルであり、これは、少なくとも部分的にゾル形態である。環境感受性ヒドロゲルは、環境的変化を受ける前は低粘度を有し、環境的変化を受けると、粘度が増加し、少なくとも部分的にゲル形態になる。好ましくは、環境的変化は、温度、ｐＨ、入射光量、イオン濃度、圧力、磁場、電場、音波照射又は生化学的分子濃度の変化である。
【００２９】
好ましい実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲル粒子である。好ましくは、ヒドロゲル粒子は、フィルター孔より小さく、そのため、フィルター孔を効率的に塞ぐ。更に好ましくは、ヒドロゲルは、脱水形態であってよい。
【００３０】
好ましい実施形態では、キット中のフィルターは、多孔質で球状のマイクロビーズの層も含む。一部の好ましい実施形態では、この多孔質球状マイクロビーズの層は、フィルターの上流側の面に配置される。一部の好ましい実施形態では、多孔質球状マイクロビーズの層は、メッシュ支持体の上流側の面に配置され、メッシュ支持体は、フィルター上に又はフィルターの上流側に配置される。
【００３１】
好ましい実施形態では、多孔質球状マイクロビーズ層は、均等な又はグレーデッドな層
を形成する。好ましい実施形態では、多孔質球状マイクロビーズ層の表面は、極めて不活性であり、微生物に対する非特異的な結合が低い。
【００３２】
好ましい実施形態では、マイクロビーズの直径は１〜１０００μｍであり、更に好ましくは、マイクロビーズの直径は１５〜６００μｍであり、更になお好ましくは、マイクロビーズの直径は５０〜３００μｍである。
【００３３】
好ましい実施形態では、マイクロビーズの孔径は、微生物のサイズより小さく、そのため微生物は、濾過ステップの間、マイクロビーズの間を通過する。一部の好ましい実施形態では、マイクロビーズは、架橋された親水性ポリマーを含む。
【００３４】
好ましい実施形態では、キット中の微生物検出試薬は、微生物の増殖を選択的に促進するように構成された増殖培地を含有する。好ましくは、増殖培地は、検出すべき微生物は耐性を持つが、他の生物は耐性を持たない選択的な試薬又は抗生物質を含むか、検出すべき微生物を迅速に増殖し及び／又は他の生物の増殖は緩慢にもしくは阻害するように選択されたｐＨ及び温度を含むか、又は検出すべき微生物によって容易に代謝されるが、他の生物によっては容易に代謝されない栄養素を含む。一部の好ましい実施形態では、増殖培地は、好気性菌の増殖に十分な量の酸素を含むか、又は嫌気性菌の増殖のために十分な量の酸素を含まない。
【００３５】
好ましい実施形態では、増殖培地は、微生物の存在下でシグナルを生じることにより、微生物を検出するように構成されたシグナリング試薬を含む。好ましくは、シグナリング試薬は、微生物に特異的な酵素、微生物に特異的な酵素のための発色性もしくは発蛍光性の基質、又は微生物に特異的な酵素のための基質とこの基質の消化を検出する発色性もしくは発蛍光性の指示薬との組合せである。
【００３６】
一部の好ましい実施形態では、シグナリング試薬は、検出すべき微生物又はこの微生物の細胞成分を認識する薬剤であり、例えば、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、核酸又は炭水化物であり、好ましくは、薬剤は、例えば染料分子、金属コロイド、ポリマー粒子、磁性粒子、半導体粒子、リポソーム、ポリマーソーム、タンパク質、酵素及び核酸等の標識を含む。
【００３７】
本発明は、その実施形態として、濾過中の目詰まりを防ぐように構成された孔を有するとともに微生物を引きつけるように構成された濾過媒体（filter medium）と、多孔質で
球状のマイクロビーズ層とを含む微生物検出用の層状フィルター複合体に関する。
【００３８】
好ましい実施形態では、層状フィルター複合体中の濾過媒体は、繊維状物質を有するデプスフィルターである。好ましくは、繊維状物質は、セルロース繊維又はガラスマイクロファイバーである。
【００３９】
好ましい実施形態では、層状フィルター複合体の濾過媒体は、例えば静電相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、物理的相互作用、及び生物的相互作用などの相互作用によって微生物を引きつけるように構成されている。好ましい実施形態では、微生物を認識する薬剤は、フィルターマトリックス上に特異的に又は非特異的に固定化され、薬剤は、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、核酸及び炭水化物から選択される。
【００４０】
好ましい実施形態では、層状フィルター複合体中の多孔質球状マイクロビーズの層は、フィルターの上流側の面に配置される。他の好ましい実施形態では、多孔質球状マイクロビーズの層は、メッシュ支持体の上流側の面に配置され、メッシュ支持体は、フィルター上に又はフィルターの上流側に配置される。好ましくは、多孔質球状マイクロビーズ層は
、均等な又はグレーデッドな層を形成する。好ましくは、多孔質球状マイクロビーズ層の表面は、極めて不活性であり、微生物への非特異的な結合が低い。
【００４１】
好ましい実施形態では、マイクロビーズの直径は１〜１０００μｍであり、更に好ましくは、マイクロビーズの直径は１５〜６００μｍであり、更になお好ましくは、マイクロビーズの直径は５０〜３００μｍである。好ましい実施形態では、マイクロビーズの孔径は、微生物のサイズより小さく、そのため微生物は、濾過ステップの間、マイクロビーズの間を通過する。一部の実施形態では、マイクロビーズは、架橋した親水性ポリマーを含む。
【００４２】
本発明は、その実施形態として、多孔質フィルターに関し、これは、膨潤し得るが、水に溶解しない３次元高分子網目構造体であるヒドロゲルと、濾過中の目詰まりを防ぐように構成された孔を有するとともに微生物を引きつけるように構成されたフィルターとを含む。
【００４３】
好ましい実施形態では、多孔質フィルターのヒドロゲルは、脱水形態である。
【００４４】
好ましい実施形態では、フィルターは、繊維状物質を含むフィルターマトリックスを有する。
【００４５】
好ましい実施形態では、ヒドロゲルの３次元高分子網目構造体には、例えば、寒天、キトサン、セルロース、カラギーナン、アルギネート、アクリレートポリマー及びコポリマー、ポリエチレングリコール、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ペクチン、ローカストビーンガム、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリヒドロキシバレレート（ＰＨＶ）、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリアンヒドリド、ポリシアノアクリレート、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリプロピレンフマレート、ポリアルキレンオキサレート、シリコーンポリマー、コラーゲン、フィブリノゲン、フィブリン、ゼラチン、デンプン、アミロース、デキストラン、シルク、ケラチン、エラスチン、アクチン、ミオシン、グリコサミノグリカン又はポリビニルアルコール等のポリマーがある。
【００４６】
好ましい実施形態では、フィルターは、例えば、静電相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、物理的相互作用、及び生物的相互作用などの相互作用によって微生物を引きつけるように構成されている。
【００４７】
好ましい実施形態では、微生物を認識する薬剤は、フィルターマトリックス上に特異的に又は非特異的に固定化される。好ましくは、前記薬剤は、金属水酸化物又は金属酸化物、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、核酸又は炭水化物から選択される。好ましくは、金属水酸化物又は金属酸化物は、水酸化ジルコニウム、水酸化チタン、酸化ハフニウム、ヒドロキシアパタイト、酸化鉄、酸化チタン又は酸化アルミニウムである。
【００４８】
好ましい実施形態では、フィルターは、微生物検出試薬を含有し、かつ微生物含有サンプルの濾過の間にわたりこの微生物検出試薬を保持する。好ましくは、微生物検出試薬は、検出すべき微生物の増殖を選択的に促進するように構成された増殖培地と、微生物の存在下でシグナルを生じるように構成されたシグナリング試薬とを含む。好ましくは、増殖培地は、検出すべき微生物は耐性を持つが、他の生物は耐性を持たない選択的な試薬又は抗生物質を含むか、検出すべき微生物は迅速に増殖し及び／又は他の生物の増殖は緩慢にもしくは阻害するように選択されたｐＨ及び温度を含むか、又は検出すべき微生物によって容易に代謝されるが、他の生物によっては容易に代謝されない栄養素を含む。一部の好ましい実施形態では、増殖培地は、好気性菌の増殖に十分な量の酸素を含むか、又は嫌気
性菌の増殖のために十分な酸素を含まない。
【００４９】
好ましい実施形態では、シグナリング試薬は、微生物に特異的な酵素のための基質、微生物に特異的な酵素のための発色性又は発蛍光性の基質、及び微生物に特異的な酵素のための基質とこの基質の消化を検出する発色性又は発蛍光性の指示薬との組合せから選択される。
【００５０】
好ましい実施形態では、シグナリング試薬は、検出すべき微生物又はこの微生物の細胞成分を認識する薬剤であり、例えば抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、核酸及び炭水化物等である。好ましくは、この薬剤は、例えば染料分子、金属コロイド、ポリマー粒子、磁性粒子、半導体粒子、リポソーム、ポリマーソーム、タンパク質、酵素又は核酸等の標識を含む。
【００５１】
本発明は、その実施形態として、以下のステップのうちの１つ又は複数のステップを含むサンプル中の微生物を検出する方法における前記多孔質フィルターの使用に関する。
サンプルを前記多孔質フィルターにより濾過して、微生物を固定化するステップ。
微生物を検出可能なレベルまで増殖させるのに十分な時間にわたりフィルターをインキュベートするステップ。
シグナリング試薬を使用して微生物を検出するステップ。
【００５２】
一部の好ましい実施形態では、濾過後に、多孔質フィルターは溶解する。例えば、多孔質フィルターは、分解性ポリマーを含んでよい。好ましくは、分解性ポリマーは、例えば繊維、表面コーティング、ビーズ、粒子、シート又は層などの形状で提供される。一部の好ましい実施形態では、分解性ポリマーは、加水分解、酸化又は酵素機構を介して、溶液となる。
【００５３】
一部の実施形態では、この分解性多孔質フィルターは、以下のステップのうちの１つ又は複数によりサンプル中の微生物を検出する方法に使用される。
（ａ）サンプルをフィルターで濾過して、微生物を固定化するステップ。
（ｂ）分解性フィルターを分解して溶液にするステップ。
（ｃ）この溶液から、微生物又は微生物に特異的な分子マーカーを抽出するステップ。
（ｄ）微生物又は微生物に特異的な分子マーカーを検出して、サンプル中の微生物の存在を確認するステップ。
【００５４】
本発明の他の態様、特徴及び利点は、後述する好ましい実施形態の詳細な説明から明らかとなろう。
【００５５】
以下に、図面を参照して、本発明の上述した特徴及び他の特徴を説明するが、この図面の好ましい実施形態は、本発明を図解することを意図するものであり、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】多孔質の球状ビーズを用いた濾過の概略図を示す。
【図２】環境感受性ヒドロゲルを使用する病原体検出アッセイ手順のステップの概略図を示す。
【図３】ヒドロゲルマイクロビーズを使用する病原体検出アッセイ手順のステップの概略図を示す。
【図４】ヒドロゲル複合フィルターの種々の構造を示す。図４Ａは、ヒドロゲルがフィルターマトリックス層の間に位置する実施形態を示す。図４Ｂは、ヒドロゲル粒子がフィルターマトリックス層の間に位置する実施形態を示す。図４Ｃは、ヒドロゲル粒子がフィルターマトリックス全体にわたり分散している実施形態を示す。図４Ｄは、ヒドロゲル繊維がフィルターマトリックスを形成している実施形態を示す。
【図５】病原体検出試薬が装入されたスマートヒドロゲル粒子を含む複合ヒドロゲルフィルターを示す。
【図６】分解性フィルターの種々の構造を示す。図６Ａは、フィルター膜が分解性粒子からできている実施形態を示す。図６Ｂは、フィルター膜が分解性繊維からできている実施形態を示す。図６Ｃは、フィルター膜が分解性コーティングを備えた水溶性粒子からできている実施形態を示す。
【図７】分解性フィルターを使用して病原体を収集かつ検出するアッセイを図解する。
【図８】ガラスファイバーデプスフィルターで濾過した１０％全乳サンプル２５０ｍＬについての病原体検出アッセイの結果を示す。図８Ａ及び８Ｂは、リステリア細胞２００ｃｆｕを接種した乳サンプルの３０℃で４０時間インキュベートした後の結果を示す。図８Ｃ及び８Ｄは、リステリア細胞を含まない乳サンプルの３０℃で４０時間インキュベートした後の結果を示す。
【図９】ヒドロゲル微粒子の顕微鏡画像を示す。微粒子は、より高いコントラストをつけるため、トリパンブルーで染色した。
【図１０】陽電荷フィルターで濾過した病原体検出アッセイの結果を示し、図１０Ａ〜図１０Ｅは、ＢＨＩブロス１０ｍＬ当たりリステリア細胞２３５、２３．５、２．３５、０．２３５及び０ｃｆｕについての結果である。
【図１１】１０％デリ・ミート（Ａ）及び１０％スティックチーズホモジネート（Ｂ）に関して、多孔質マイクロビーズ２ｇと共に陽電荷デプスフィルターを使用する濾過速度（黒丸）、無孔ガラスビーズ１５ｇと共に陽電荷デプスフィルターを使用する濾過速度（黒四角）及び濾過補助材無しで陽電荷デプスフィルターを使用する濾過速度（黒三角）を示す。
【図１２】幾つかのグレードの多孔質球状マイクロビーズ濾過補助材：架橋ポリメタクリレートマイクロビーズ（直径４５〜９０μｍ：０．５ｇ（白丸）、１．０ｇ（黒丸））、及び架橋デキストランマイクロビーズ（直径１７〜７０μｍ：０．５ｇ（白四角）、直径３５〜１４０μｍ：０．５ｇ（ひし形）、直径８６〜２５８μｍ：０．５ｇ（白三角）、１．０ｇ（黒三角）、直径１７０〜５２０μｍ：０．５ｇ（×））と共にガラスファイバーデプスフィルターを使用して、１０％デリ・ミート（Ａ）及び１０％フランクフルトソーセージホモジネート（Ｂ）を濾過する速度を示す。
【図１３】ガラスファイバーデプスフィルター及び多孔質マイクロビーズ濾過補助材により濾過された、１０％デリ・ミートホモジネートの〜２２５ｍＬ（デリ・ミート２５ｇ）当たりリステリア細胞２２０ｃｆｕ（図１３Ａ、１３Ｂ）、２２ｃｆｕ（図１３Ｃ、１３Ｄ）及び０ｃｆｕ（図１３Ｅ、１３Ｆ）に関する病原体検出アッセイの結果を示す。図１３Ａ、１３Ｃ及び１３Ｅは、３０℃で２４時間のインキュベーション後の結果を示し、図１３Ｂ、１３Ｄ及び１３Ｆは、３０℃で４０時間のインキュベーション後の結果を示す。
【図１４】ガラスファイバーデプスフィルター及び多孔質マイクロビーズ濾過補助材により濾過された１０％デリ・ミートホモジネート〜２２５ｍＬ（デリ・ミート２５ｇ）中の病原体検出アッセイの結果を示す。図１４Ａの表は、フィルターの上流側（上部）及び下流側（底部）から観察される着色スポットの数をまとめたものである。図１４Ｂは、観察された着色スポットの総数を、接種された病原体濃度に対してプロットしたものである。黒丸及び白丸は、リステリア・モノサイトゲネスとリステリア・イノキュアをそれぞれ示す。
【図１５】加工フィルターによるアッセイの結果を示し、インキュベーション後にフィルター上に見出されるリステリア細胞を示す。
【図１６】スマートヒドロゲルにより固定化された病原体検出試薬を有する複合フィルターについてのアッセイの結果を示す。
【図１７】病原体検出のための分解性フィルターについてのアッセイのＰＣＲ結果を示す。サイクルは、ＰＣＲサイクル数を示し、ΔＲＮは、基準強度を控除した後の各反応における規格化相対蛍光強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
ここに記載する実施形態は本発明の好ましい実施形態であるが、当然ながら、本発明の精神から逸脱しない範囲で種々の改変が当業者によって行われるであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって決定されるべきである。
【００５８】
本開示は、低コストで且つ短い実践時間で、大容量の微粒子サンプル中の病原体を高感度で検出することを可能にする方法、この方法で使用されるフィルターの製作、及びこの方法における多孔質球状マイクロビーズの濾過補助材の使用に関する。
【００５９】
超多孔質のフィルター、多孔質球状マイクロビーズ濾過補助材及びヒドロゲル材料を使用する病原体検出濾過アッセイ
本開示の方法は、一実施形態として、大容量の微粒子サンプルから病原体を効率よく濃縮するために、病原体吸着能力及び高い粒子捕捉能力を有する超多孔質のフィルターを利用するものである。本開示の方法の実施形態に有用な超多孔質のフィルターは、静電相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、物理的相互作用、又は生物的相互作用により標的病原体を引きつけることができ、また微粒子サンプルによるフィルターの目詰まりを十分に防止できる多孔質なものがよい。特定の実施形態では、配置されたフィルターは、高い粒子捕捉能力及び病原体捕捉能力を提供する３次元マトリックスを備えたデプスフィルターである。有用なデプスフィルターは、例えばガラスファイバー及びニトロセルロース繊維などの繊維状物質から製造されていてよく、単層又は同じか若しくは異なる粒子保持率を有する多層のフィルターからなる。フィルターは、病原体を効果的に捕捉し、かつサンプル中の粒子によるフィルター目詰まりを回避するのに適切である粒子保持率及び厚さを有する。例えば、長さ０．５〜２μｍ、直径０．４〜０．５μｍである病原体、例えばリステリア等をデプスフィルターに捕捉するためには、デプスフィルターの適切な粒子保持率は、０．１〜１０μｍ、好ましくは０．７〜２．４μｍであろう。また、フィルターは、濾過の間にかけられる真空力又は圧力に耐えるのに十分な機械的強度を有する。
【００６０】
他の実施形態では、病原体表面が、通常、その中に含有されるリポ多糖類、テイコ酸及び表面タンパク質のために正味の陰電荷を有するので、フィルターは、陽性電荷を使用して病原体を引きつけるデプスフィルターである。病原体は、フィルターマトリックによってではなく、フィルター上の陽性電荷により固定化され得、従って、フィルター多孔度を更に増し、かつより高い粒子捕捉能力を得て、フィルターの目詰まりを更に効果的に回避することができる。陽性電荷は、フィルターマトリックスをカチオン性分子で表面コーティングすることにより、又は陽性物質から製造された陽性コロイド、粒子もしくは繊維を組み入れることにより提供することができる。陽性物質の例は、金属水酸化物及び金属酸化物、例えば、水酸化ジルコニウム、水酸化チタン、酸化ハフニウム、酸化鉄、酸化チタン、酸化アルミニウム及びヒドロキシアパタイト、である。好ましくは、金属水酸化物又は金属酸化物の等電点は、サンプルと検出試薬のｐＨ値より高くあって良い。ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）などの正電気を帯びたバクテリアの例が、ごく稀にある。そのような微生物は、陽性電荷ではなく陰性電荷を使用して、前記の陽電荷フィルターと同様にして製造できる陰性電荷を有するフィルターにより一層容易に保持することができる。
【００６１】
他の実施形態では、フィルターは、病原体認識剤、例えば、抗体、抗原、タンパク質、核酸、炭水化物、アプタマー、又はバクテリオファージを含む。これらの病原体認識剤は、サンプル中に発見される他の病原体に対して、病原体を選択的又は非選択的に認識でき
、かつ化学結合、物理結合又は他の標準固定法により、フィルターマトリックス上に固定化することができる。特定の実施形態では、病原体認識剤は、トール様受容体（ＴＬＲ）であり、これは、種々の微生物の表面に存在する構造的に保存された分子を認識する。ＴＬＲ２は、グラム陽性ペプチドグリカン及びリポテイコ酸を認識でき、かつＴＬＲ４は、グラム陰性バクテリア上のリポ多糖類を認識できる。
【００６２】
フィルターの他に、本開示は、検査すべきサンプル中の微粒子によるフィルター目詰まりを防止するための多孔質球状マイクロビーズ濾過補助材の使用に関する（図１）。有用なマイクロビーズは、小さいサイズで分布する球状の、回転楕円体形状の又は楕円体形状の多孔質マイクロビーズであってよい。このマイクロビーズは立方最密構造や六方細密構造などの最密構造又はそれに近い構造をとることができる。検査すべき病原体が、サンプル濾過時に、マイクロビーズの間を通過するために、マイクロビーズは、通常は、直径を１〜１０００μｍ、好ましくは１５〜６００μｍ、更に好ましくは５０〜３００μｍにしてもよい。有用なマイクロビーズは、水、緩衝液、増殖培養液又はサンプル溶液に、浮くのではなく、懸濁するのに適切な比重を有する。マイクロビーズは、通常、標的病原体より小さい孔を有することで、サンプル濾過時に病原体が多孔質球状マイクロビーズの孔の内側に留まるのを阻むことができる。好ましくは、マイクロビーズは、不活性表面、好ましくは親水性表面を有してよく、かつタンパク質、核酸、炭水化物、バクテリア、ウィルス及び細胞を含む生体分子及び微生物への非特異的な結合は低い。特定の実施形態では、マイクロビーズ濾過補助材は、例えばポリメタクリレートやデキストランなどの架橋ポリマーから製造されている。場合により、マイクロビーズは、その多孔質構造のため、後段の検出を阻害し得る物質を除去できる。
【００６３】
大容量の微粒子サンプルを少なくとも次の手法又はその組合せの１つで濾過するのを支援するために、多孔質球状マイクロビーズの濾過補助材を使用することができる。濾過補助材の配置としては、サンプルの濾過前に、病原体吸着能力を有する超多孔質のフィルターの上流側の面上に、多孔質球状マイクロビーズの均等な又はグレーデッドな層を配置することができる。又は、濾過前に、微粒子サンプルに濾過補助材を添加して、サンプル濾過時に多孔質球状マイクロビーズ層を形成することにより、マイクロビーズの新層を連続的に設け、濾過を更に改良することができる。サンプル濾過後に、濾過補助材層を容易に除去するために、超多孔質のフィルターと濾過補助材層の間にメッシュ支持体を配置できる。場合により、マイクロビーズ表面への病原体の結合を最小にするために、使用前に、多孔質マイクロビーズ濾過補助材は、ペプチド又はタンパク質などのブロッキング試薬含有溶液中に懸濁させるか又はプレインキュベートする。
【００６４】
検出すべき病原体は、マイクロビーズの間を通過し、マイクロビーズの表面上又は孔中に捕捉されることはない。他方で、濾過補助材層を含まないフィルターを通常目詰まりさせるサンプル中の粒子は、マイクロビーズ表面上及び多孔質球状マイクロビーズ間の間隙に捕捉されるであろう。マイクロビーズの多孔質構造のために、濾過時のサンプル流は、ビーズの間を通過するだけでなく、マイクロビーズ自体にも浸透し、そのため、サンプル粒子は、ビーズ間の間隙よりもビーズ表面に捕捉される傾向があり、そのことにより多孔質球状濾過補助材層は、高い粒子捕捉能力をもたらし、大容量微粒子サンプルの濾過の際のフィルターの目詰まりを防止できる。サンプルの完全な濾過後に、濾過補助材層を崩壊させて、マイクロビーズを洗浄溶液中に懸濁させることができる。この洗浄溶液を濾過して、微粒子サンプルの最初の濾過の間に濾過補助材層に捕捉される病原体を収集できることにより、フィルターへの病原体固定化収量を改良することができる。この洗浄プロセスを数回繰り返して、フィルターへの病原体の回収量を最大にすることができる。洗浄溶液は、一般に、病原体に悪影響を及ぼさない緩衝溶液又は増殖培養液である。
【００６５】
フィルターと濾過補助材に加え、本開示は、病原体検出反応の間の病原体検出試薬の蒸
発を防ぎ、フィルター中で病原体の増殖を局在化させるために、ポリマー材料を使用することにも関する。有用なポリマー材料には、多糖類及びタンパク質などの天然又は合成ポリマーがある。ポリマー材料の幾つかの例には、寒天、アルギネート、カラギーナン、セルロース、キトサン、デキストラン、ペクチン、コラーゲン、フィブリノゲン、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール並びにこれらの誘導体及びコポリマーがあるが、これらに限定はされない。ポリマー材料は、分子内及び/又は分
子間架橋によりヒドロゲルを形成することが望ましい。ヒドロゲルは、膨潤し得るが水に不溶であり、かつ一定の期間、蒸発せずに水又は溶液を保持し得る３次元高分子網目構造体である。
【００６６】
特定の実施形態では、ヒドロゲルは、環境感受性ヒドロゲルである。有用な環境感受性ヒドロゲルは、環境からの刺激、例えば、温度、ｐＨ、光、イオン、圧力、磁場、電場、音波照射又は生化学的分子の１つ又は複数に応答し得る。環境感受性ヒドロゲルが、ゾル形態である場合、物質は水溶性ポリマーの形状であるが、刺激を与えた結果として、物質はゲル形態（ヒドロゲル）に変換され、不水溶性となり、分子内又は分子間架橋される。ゾル形態とゲル形態の間の変換は完全に又は部分的に起こり得る。特定の実施形態では、環境感受性ヒドロゲル及び環境的刺激は、特に生存病原体を検出すべき場合、病原体に有害ではない。特定の実施形態では、ゾル形態は、孔を容易に充填するためには、フィルター孔に容易に流入できないほど高粘性であってはならない。ゲル形態は、病原体検出試薬の蒸発を防止し、病原体の増殖を効果的に局在化させる。環境感受性ヒドロゲルの幾つかの例には、アガロース、低融点アガロース、カラギーナン、ペクチン、メチルセルロース及びＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７があるが、これらに限定はされない。アガロースは、〜４５℃でゾル形態であり、〜３７℃まで冷却するとゲルとなる。低融点アガロースは、〜３７℃でゾル形態であり、〜２０℃でゲル形態である。カラギーナン及びペクチンは、カリウム及びカルシウムなどの特定のイオンの不在下でゾル形態であり、これらのイオンを添加するとゲルとなる。メチルセルロース及びＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７は、〜４℃でゾル形態であり、〜３７℃まで加温後にゲル形態となる。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルの濃度は、種々のヒドロゲルに応じて変化し得る。特定の実施形態では、アガロース又は低融点アガロースの適切な濃度は、０．０１％〜３０％、好ましくは０．１％〜１０％、更に好ましくは０．５％〜５％である。特定の実施形態では、サンプルの濾過後に、吸収、吸引、毛管作用、濾過、浸漬、スプレー又は他の技術によりゾル形態をデプスフィルター孔に添加することができ、環境からの刺激によりゲル形態に変換することができる。
【００６７】
特定の実施形態では、サンプル濾過後に、フィルター孔はヒドロゲル粒子で充填される。ヒドロゲル粒子は、単分散系又は多分散系であって良い。ヒドロゲル粒子の有用な形状は、球形、四面体、六面体、多面体又は円柱形であるが、これらに限定はされない。しかしながら、任意の規則的又は不規則的な形状を使用することもできる。フィルター孔をヒドロゲル粒子で効果的に充填するために、ヒドロゲル粒子は、フィルター孔より小さく、フィルター孔に入り込むことができる。場合により、ヒドロゲル粒子は、フィルター中に保持されるのに十分なほどに大きく、かつ超多孔質のフィルターの保持率より大きくて良い。フィルター孔へのヒドロゲル粒子の加工は、吸収、吸引、毛管作用、濾過、浸漬、スプレー又は他の技術により遂行できる。有用なヒドロゲル粒子は、幾つかの慣用技術、例えば鋳造、乳化重合／ゲル化、沈殿重合、膜乳化、切断、スライス及び破砕などにより合成又は調製することができる。一部の実施形態では、ヒドロゲル粒子は、アガロースゲルから製造され、適切なアガロース濃度は、０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．１％〜５％（ｗ／ｖ）である。
【００６８】
特定の実施形態では、フィルター孔は、脱水ヒドロゲルの水和作用によって満たされる。脱水ヒドロゲルが水和の際に膨潤すると、ヒドロゲル容積は劇的に増加する。脱水ヒド
ロゲルは、吸収、吸引、毛管作用、濾過、浸漬、スプレー又は他の技術により、フィルター孔に加工でき、脱水ヒドロゲルの水和は、例えば、水、緩衝液又は増殖培養液などの溶液により加工した後に行うことができる。特定の実施形態では、脱水ヒドロゲルは、単分散又は多分散粒子であり、脱水ヒドロゲル粒子のサイズは、フィルター孔に効果的に入るのに十分な小ささで良い。脱水ヒドロゲル粒子は、加熱、乾燥、凍結乾燥及び任意の他の技術によってヒドロゲル粒子を脱水することにより、調製することができる。特定の実施形態では、脱水ヒドロゲル粒子の水和作用は、１０秒〜６時間、更に有利には１〜３０分に及ぶ一定の時間がかかり、そのため、水和前に、溶液に懸濁する脱水ヒドロゲル粒子を前記技術によりフィルター孔に添加し、次いで孔内部をインキュベーションにより水和させることができる。
【００６９】
特定の実施形態では、フィルター孔は、高粘性ポリマー溶液で充填される。この溶液は、フィルター孔に容易に流入し、孔を容易に充填することができないほど粘性が高くはないが、病原体の増殖を効果的に局在化するのに十分なほどの粘性がある。ポリマー溶液として、水溶性ポリマー又はヒドロゲル懸濁液を挙げることができる。
【００７０】
特定の実施形態では、病原体検出試薬は、病原体の増殖培地を含有する。増殖培地は、通常、病原体増殖のための種々の塩、炭素源、窒素源及びアミノ酸の１つ又は複数を含む。特定の実施形態では、増殖培地は、選択的培地であり、抗菌作用／抗真菌効果、温度もしくはｐＨ耐性又は特定の代謝産物の合成能力により、選択的に特定の病原体の増殖を促進し、そうして病原体を、他の競合バクテリア又は微生物に対し選択的に増殖させることができる。一部の実施形態では、病原体検出試薬は、増殖培地の酸素濃度を減らすことにより、特定の病原体の増殖を促進するか又は損傷した病原体の蘇生を促進する化合物、例えばＬ−システイン及びＯｘｙｒａｓｅ（Ｏｘｙｒａｓｅ  Ｉｎｃ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＯＨ）、を含有することができる。
【００７１】
一部の実施形態では、病原体検出試薬は、他のバクテリア又は微生物から病原体を識別するシグナリング試薬を含有してよい。前記シグナリング試薬の一例は、病原体に特異的な酵素のための発色性又は発蛍光性の基質である。前記基質の例には、Ｘ−、ラピス（Lapis）−、マゼンタ（Magenta）−、サーモン（Salmon）−、グリーン（Green）−、ＯＮ
Ｐ−及びＭＵ−結合基質、例えばβ−Ｄ−グルクロニド、β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド、β−Ｄ−グルコ−ピラノシド、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、カプリレート−ノナノエート、ブチレート、ｍｙｏ−イノシトール−１−ホスフェート及びホスフェートがある。前記シグナリング試薬の別の例は、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬とキシロースなどの病原体特異的酵素用基質との組合せである。基質の代謝は、検出試薬のｐＨを変え、かつｐＨ指示薬は比色法でｐＨ変化を示す。前記シグナリング試薬の他の例は、病原体もしくは病原体特異的細胞成分を認識するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡを含む核酸もしくは他の核酸、抗体、抗原、又はアプタマーである。これらのプローブ分子を、シグナル生成のため、蛍光染料分子、金又は銀コロイド、ポリマー粒子、磁性粒子、半導体粒子、量子ドット、フォトニック結晶粒子、リポソーム、ポリマーソーム、酵素、タンパク質及び核酸により標識化することができる。
【００７２】
特定の実施形態では、環境感受性ヒドロゲルを使用する大容量の微粒子サンプル中の病原体の検出は、以下のステップを含む（図２）。
（１）検出すべき病原体を含有し得る大容量の微粒子サンプルを、超多孔質のフィルターと多孔質マイクロビーズ濾過補助材とを含む層状フィルターで濾過して、標的病原体をフィルターに収集するステップ。
（２）もし必要な場合は、フィルターへの病原体の回収率を最大にし、かつ病原体検出アッセイの潜在的な阻害剤を除去するために、フィルターと多孔質マイクロビーズ濾過補助
材を洗浄するステップ。
（３）フィルターを回収し、病原体検出試薬を含有する環境感受性ヒドロゲルのゾル形態を用いて、吸収、浸漬、スプレー又は他の技術によりフィルター孔に充填するステップ。（４）環境的刺激を与えて、環境感受性ヒドロゲルのゾル形態をゲル形態に変換するステップ。
（５）病原体を検出可能にするために病原体の増殖に十分な時間、ヒドロゲルを含有するフィルターをインキュベートするステップ。
（６）シグナリング試薬を使用して増殖病原体を検出するステップ。
【００７３】
特定の実施形態では、ヒドロゲル粒子を使用する、大容量微粒子サンプル中の病原体の検出は、以下のステップを含む（図３）。
（１）検出すべき病原体を含有し得る大容量の微粒子サンプルを、超多孔質のフィルターと多孔質マイクロビーズ濾過補助材とを含む層状フィルターで濾過して、標的病原体をフィルターに収集するステップ。
（２）もし必要な場合は、フィルターへの病原体の回収率を最大にし、かつ病原体検出アッセイの潜在的な阻害剤を除去するために、フィルター及び／又は多孔質マイクロビーズ濾過補助材を洗浄するステップ。
（３）フィルターを回収し、病原体検出試薬を含有するヒドロゲル粒子を用いて、フィルター孔に充填するステップ。
（４）ヒドロゲル及び粒子を含有するフィルターを、病原体を検出可能にするために病原体の増殖に十分な時間、インキュベートするステップ。
（５）シグナリング試薬を使用して増殖病原体を検出するステップ。
【００７４】
場合により、損傷した病原体の蘇生及び検出のために、サンプルの濾過及び病原体検出の前に、損傷した病原体の蘇生を可能にする増殖培地又は溶液中で微粒子サンプルを調製し、かつインキュベートできる。或いは、損傷した病原体は、サンプル濾過後に、インキュベーション（損傷した病原体の蘇生を可能にする増殖培地、溶液又は環境中で行なわれ得る）によりフィルター中で蘇生させ、病原体検出試薬により検出することができる。或いは、病原体検出試薬は、損傷した病原体を蘇生させるように構成され、かつ本明細書に記載のヒドロゲル物質を含有する又は含有しない状態で、追加の試薬、例えば抗生物質、の補充により、病原体検出試薬の濃度、成分又はｐＨをインキュベーションの間に変化させることができ、これにより、損傷病原体を蘇生させ、かつ検出することができる。
【００７５】
微粒子サンプルの濾過及びヒドロゲル含有検出試薬の適用は、手作業を必要とし、これらのプロセスは、１時間以内に終了することができる。これらのプロセスは、標準的な自動化装置を使用して、容易に自動化することができる。病原体増殖及び検出のために必要なインキュベーション時間は、病原体の倍加時間と、シグナリング試薬の感度に依存する。フィルター中の１個の病原体を検出するのに必要とされるインキュベーション時間を、表１に示す。感度の低い発色基質を使用して、病原体を確認した場合ですら、全アッセイは、非常に短い実践時間で、２４時間以内に終了することができる。
【００７６】
【表１】
0005723838.tif 000002
【００７７】
特定の実施形態では、病原体を超多孔質フィルターへ固定後に、代替の病原体検出アッセイを使用することができる。１つの有用な病原体検出法は、ヒドロゲルを含まずに、病原体に特異的な酵素基質を含む選択的な培地中におけるフィルターインキュベーションである。発色性もしくは発蛍光性の酵素基質、又はフェノールレッドなどのｐＨ指示薬とキシロースなどの病原体特異的酵素用基質との組合せを使用して、病原体を検出できる。培地の光学密度、光吸収、又は蛍光強度は、インキュベーション後に又はインキュベーションの間にわたり、測定又はモニターして、病原体の存在を検出することができる。又は培地中で増殖された病原体を慣用の病原体検出アッセイ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅法（ＬＡＭＰ）、その他の等温核酸増幅法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫クロマトグラフィー、バイオセンサー又は核酸プローブなどにより検出することができる。或いは、病原体、又は特定の病原体の存在を指示する病原体の細胞成分、例えばゲノムＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ又はタンパク質などは、界面活性剤、カオトロピック試薬、有機溶剤又は電気泳動法を使用して、フィルター構造を破壊するか又は破壊せずにフィルターから抽出でき、かつ慣用の病原体検出法を使用して検出できる。或いは、フィルターに固定化された病原体は、フィルターに検知剤（sensing agent）を加工して検出することができる。有
用な検知剤は、静電相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、物理的相互作用、又は生物的相互作用により、フィルター内部に固定化することができる。検知剤の例は、米国特許第６０８７１１４号及びＲｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＡＢ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ
Ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１，２１３−１５（２００３）に開示されている病原体特異的抗体固定化Ｂ−細胞である。
【００７８】
検出できる病原体の例には、ヒト、動物、植物、環境及び/又は産業に伝染性又は有害
である病原菌及び他の微生物がある。病原菌の例には、エシェリキア（Escherichia）、
サルモネラ、リステリア、カンピロバクター（Campylobacter）、シゲラ（Shigella）、
ブルセラ（Brucella）、ヘリコバクター（Helicobactor）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）及びシュードモナス（Pseudomonas）
があるが、これらに限定はされない。病原性ウィルスは、本明細書に開示されるように、慣用の病原体検出法を併用して検出できる。病原性ウィルス科の例には、アデノウィルス科、ピコルナウィルス科、ヘルペスウィルス科、ヘパドナウィルス科、フラビウィルス科、レトロウィルス科、オルトミクソウィルス科、パラミクソウィルス科、パポバウィルス科、ラブドウィルス科及びトガウィルス科があるが、これらに限定されない。更に、開示
された濾過システムは、大容量の微粒子サンプル中の病原性及び非病原性微生物の両方の検出に有用である。
【００７９】
検査できる微粒子サンプルの例には、食品サンプル、食品サンプルホモジネート、食品サンプルの洗浄溶液、飲料水、海／河川水、環境水、泥及び土があるが、これらに限定されない。更に、種々の環境表面を拭うスワブ、スポンジ及びタオルも検査することができる。更に、開示された濾過システムは、ヒトの体液、尿、血液及び製造用水／溶液を含む他の大容量の微粒子サンプルを検査するのに役立つ。サンプル、特に固体形、は、より効率良く濾過するために、サンプルの濾過前に、５０〜１０００μｍ孔を有するメッシュにより希釈、均質化及び／又は濾過することができる。
【００８０】
病原体検出のための複合ヒドロゲルフィルター
特定の実施形態では、ヒドロゲルは、病原体認識能力を備えた超多孔質のフィルターに含まれて、複合ヒドロゲルフィルターを形成する。複合ヒドロゲルフィルターは、さまざまな手法で製造することができる。一実施形態では、ヒドロゲル又はヒドロゲル粒子は、ガラスファイバー又はニトロセルロース繊維などの繊維物質を含むフィルターマトリックスの上部、底部、又は内部に配置することができる。他の実施形態では、フィルターマトリックスは、ヒドロゲル繊維から形成される。ヒドロゲルは３次元高分子網目構造体なので、その脱水状態では超多孔質である。多孔度は、ヒドロゲルの生成に使用する重合方法に依存して調整することができる。一実施形態では、濾過の間、サンプル溶液は、ヒドロゲル内側の孔を通って浸透することができる。別の実施形態では、溶液は、ヒドロゲル粒子の間の間隙を通って濾過することができる。このように、複合ヒドロゲルフィルターでは、濾過の間、目詰まりが起こり得ない。複合ヒドロゲルフィルターの多種多様な実施形態を図４Ａ〜４Ｄに示す。
【００８１】
一実施形態では、複合ヒドロゲルフィルターは、ヒドロゲルの内側又は表面上に病原体検出試薬を含有し、検査すべきサンプル溶液の濾過後でも、効果的に試薬を保持する。別の実施形態では、サンプル濾過の間に病原体検出試薬が溶出するのを防止するために、環境感受性ヒドロゲル（スマートヒドロゲル）を使用して、病原体検出試薬を保持及び放出する。スマートヒドロゲルは、小さい物理的、生物学的又は化学的刺激に応答でき、縮小、膨潤及びゾル形態−ゲル形態間の変換等の大きな特性の変化を起こす。この実施形態では、膨潤している間は、病原体検出試薬がスマートヒドロゲル中に取り込まれた状態にある。スマートヒドロゲルは、サンプル濾過の間は、病原体検出試薬を放出しない。濾過後に環境的刺激を与えて、スマートヒドロゲルを縮まらせると、病原体検出試薬がスマートヒドロゲルから放出され、フィルターに分散する（図５）。病原体検出剤含有スマートヒドロゲル又はヒドロゲル粒子は、図４Ａ〜４Ｃに示されるように、フィルターマトリックスの上部、その間、又は全体にわたって組み込むことができる。別の実施形態では、病原体検出試薬は、スマートヒドロゲルがゾル形態である間は、そこに取り込まれた状態にある。ゲル形態のスマートヒドロゲルは、サンプル濾過の間、病原体検出試薬を放出しない。濾過後に環境的刺激を与えて、スマートヒドロゲルをゾル形態に変換させると、病原体検出試薬が、スマートヒドロゲルから放出され、フィルター全体にわたり分散する。
【００８２】
病原体検出試薬を含有する複合ヒドロゲルフィルターを使用する大容量微粒子サンプル中の病原体検出は、以下のステップを含み、図３に示される方法よりステップ数を少なくできる。
（１）検出すべき病原体を含有し得る大容量の微粒子サンプルを、複合ヒドロゲルフィルターで濾過して、標的病原体をフィルターに収集するステップ。
（２）もし必要な場合は、病原体検出アッセイ又は病原体増殖の潜在的な阻害剤を除去するために、フィルターを洗浄するステップ。
（３）病原体を検出可能にするために、病原体の増殖に十分な時間、フィルターをインキ
ュベートするステップ。
（４）シグナリング試薬を使用して増殖病原体を検出するステップ。
【００８３】
分解性フィルター膜
特定の実施形態では、病原体認識能力を有する超多孔質のフィルターは、サンプル濾過後に、溶媒に分解又は溶解させ、固定化された病原体を効率よく収集する。分解性フィルターは、濾過の前又は間は、保全されるが、簡易処理により分解させることができる。このフィルターは、例えば合成の分解性もしくは腐食性ポリマー、又は天然の分解性もしくは腐食性ポリマー、又はこれらのコポリマーなどの分解性材料から製造される。合成分解性ポリマーには、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリヒドロキシバレレート（ＰＨＶ）、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリアンヒドリド、ポリシアノアクリレート、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリプロピレンフマレート及びこれらのコポリマーがある。天然ポリマーには、コラーゲン、フィブリノゲン、フィブリン、ゼラチン、セルロース、キトサン、デンプン、アミロース、アルギネート、デキストラン、シルク、ケラチン、エラスチン、アクチン、ミオシン、グリコサミノグリカン、カラギーナン及びこれらのコポリマーがある。フィルターの分解は、加水分解、酸化又は酵素機構を介して行うことができる。
【００８４】
分解性フィルターはさまざまな手法で製造することができる。一実施形態では、フィルターは、分解性ポリマーから構成されるので、サンプル溶液は、濾過の間、多孔質分解性ポリマー内側の孔を通って浸透することができる。別の実施形態では、フィルター膜は、多数の分解性ポリマー粒子から構成されるので、溶液は、分解性ポリマー粒子間の間隙を抜けて濾過することができる。従って、複合分解性フィルターが、濾過の間に詰まることはありえない。もう１つ別の実施形態では、フィルターは、分解性ポリマーコーティングが施された水溶性ポリマーから構成される。別の実施形態では、フィルターは、分解性ポリマーコーティングが施された多数の水溶性ポリマー粒子から構成される。複合ヒドロゲルフィルターの種々の実施形態が、図６Ａ〜６Ｃに図示される。
【００８５】
病原体検出試薬を含有する分解性フィルターを使用する大容量微粒子サンプルの病原体検出は、以下のステップを含む（図７）。
（１）検出すべき病原体を含有し得る大容量の微粒子サンプルを、分解性フィルターで濾過して、標的病原体をフィルターに収集するステップ。
（２）刺激を与えて、フィルターを溶液にするステップ。
（３）分解溶液から病原体又は病原体特異的分子マーカーを収集するステップ。
（４）病原体又は病原体特異的分子マーカーを検出するステップ。
【実施例】
【００８６】
例１：環境感受性ヒドロゲルを使用する１０％全乳での病原体検出アッセイ
病原体検出アッセイは、種々の用量のリステリア細胞を接種した１０％全乳２５０ｍＬに行った。
【００８７】
リステリア・イノキュア（Listeria innocua）を、ＢＨＩブロス中で、３７℃で一晩培養した。リステリア濃度は、１／１０６希釈後に、コロニーを数えて評価した。１０％全乳は、全乳２５ｍＬを滅菌ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２２５ｍＬで希釈して調製した。リステリア検出試薬は、以下のようにして調製した。
（１）Ｆｒａｓｅｒ  ｂｒｏｔｈ  ｂａｓｅ（Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）１１．５ｇ及びＢａｃｔｏ  ａｇａｒｏｓｅ２ｇを蒸留水２００ｍＬ中に溶解させ、１２０℃で２０分間滅菌し、４５℃でゾル形態に保持した。
（２）Ｆｒａｓｅｒ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）１ｖｉａｌ／５００ｍＬとＸ−グルコシド（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）５０ｍｇ／Ｌを溶液に追加した。
【００８８】
病原体検出アッセイは、以下のようにして行った。
（１）リステリア（２００ｃｆｕ）接種サンプル又はリステリア−ネガティブサンプルを、ＧＭＦ１５０  １μｍ（Ｗｈａｔｍａｎ，ＮＪ）で、真空濾過により濾過した。
（２）ＧＭＦ１５０  １μｍ濾過媒体を滅菌容器に移し、４５℃で５分間保持した。
（３）フィルターをリステリア検出試薬５ｍＬに４５℃で５分間浸漬し、リステリア検出試薬を室温まで冷却することでゲル形態に変換した。
（４）フィルターを、３０℃で一晩インキュベートしてリステリア細胞の増殖を検出した。
【００８９】
２４時間のインキュベーション後、リステリア−ポジティブサンプルについてはリステリア細胞によるＸ−グルコシドの代謝のため、フィルター中にコロニー様着色スポットが観察された。これらの着色は、２４時間より４０時間で非常に濃くなり、このことは、リステリア細胞の増殖を示す（図８Ａ、８Ｂ）。これとは対照的に、リステリアネガティブサンプルは、何ら着色を示さなかった（図８Ｃ、８Ｄ）。
【００９０】
例２：ヒドロゲル粒子の調製
ヒドロゲル粒子を、油中水（Ｗ／Ｏ）乳化法を使用して調製した。低融点（ＬＭＰ）アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）溶液を、水に溶解し、濃度３％（ｗ／ｖ）にし、５５℃に保持した。ＬＭＰアガロース溶液１ｍＬを鉱油４０ｍＬに１滴づつ混合し、５５℃に保持し、磁気撹拌機で強力に撹拌し、Ｗ／Ｏ乳液を形成した。撹拌しながら温度を４℃まで減じて、ＬＭＰアガロース含有乳液をゲル化して、ＬＭＰアガロース粒子を形成した。アガロース粒子を滅菌水で３度洗浄し、使用まで４℃に保持した。顕微鏡分析により、得られたアガロース粒子が、直径５〜５０μｍの球形であることを確認した（図９）。
【００９１】
例３：ヒドロゲルマイクロビーズを使用する病原体検出アッセイ
新たに、リステリア・イノキュアを、ＢＨＩブロス中で、３７℃で一晩培養した。アガロース粒子（２５０μＬ当量）を、Ｘ−グルコシド５０ｍｇ／Ｌ、ＬｉＣｌ２８ｇ／Ｌ及びＲａｐｉｄ  Ｌ．Ｍｏｎｏ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２（Ｂｉｏｒａｄ，ＣＡ）６６．４μＬ／ｍＬを含有する滅菌ＢＨＩブロス５ｍＬ中に、室温で少なくとも１時間懸濁させた。
【００９２】
一連の希釈したリステリア細胞を含有するサンプルを、真空吸引を使用して、Ｎａｎｏｃｅｒａｍフィルター（直径４７−ｍｍ，Ａｒｇｏｎｉｄｅ，ＦＬ）で濾過した。懸濁アガロース粒子を含有する溶液をフィルター上部に添加し、１分間インキュベートし、かつ真空吸引を使用して濾過した。アガロース粒子含有フィルターを３７℃で最長２日までインキュベートした。１７〜２４時間のインキュベーション後に、リステリアの増殖を示すブルースポットが、裸眼で観察された。ブルースポットの数は、サンプル中に接種されたリステリア細胞の量によく相関した（図１０）。
【００９３】
例４：食品ホモジネートの濾過
多孔質球状マイクロビーズ（架橋ポリメタクリレート、ＥＧ５０ＯＨ、日立化成、日本）０．５〜１ｇ、多孔質マイクロビーズ（架橋デキストラン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）０．５〜２ｇ、無孔濾過補助材（ガラスビーズ、直径４０μｍ、Ｆｉｌｔｅｒ  ａｉｄ  ４００，３Ｍ，ＭＮ）１５ｇを使用するか又は濾過補助材を使用しないで、Ｎａｎｏｃｒｅａｍ  ｆｉｌｔｅｒ（直径４７−ｍｍ，Ａｒｇｏｎｉｄｅ，ＦＬ）又はＧＭＦ１５０  １μｍ（Ｗｈａｔｍａｎ，ＮＪ）について、食品ホモジネートの濾過速度を比較した。食品ホモジネートの濾過前に、濾過補助材を、ナノセーラムフィルター（Nanoceramfilter）又はＧＭＦ１５０  １μｍフィルターの上流側
の面に置いた。
【００９４】
食品ホモジネートは、以下のようにして調製した。
（１）食品サンプル（デリ・ミート、フランクフルトソーセージ又はスティックチーズ）２５ｇを蒸留水２２５ｍＬと混合した。
（２）食品サンプルを手動又はストマッカー（stomacher；Ｓｅｗａｒｄ，ＵＫ）で、２
３０ｒｐｍで２分間、粉砕消化（stomach）した。
（３）ストマッカー袋（Ｎａｓｃｏ，ＷＩ）付属のフィルターを使用して、食品ホモジネートを分離した。
【００９５】
１０％デリ・ミートホモジネートにおいて、濾過補助材無しのナノセーラムフィルター（黒三角）は、ホモジネート１００ｍＬより少量で目詰まりをおこした（図１１Ａ）。しかしながら、ガラスビーズ（黒四角）又は多孔質マイクロビーズ濾過補助材（架橋デキストラン２ｇ、８６〜２５８μｍ）（黒丸）を使用すると、フィルターの目詰まりを起こさずに、ホモジネートサンプル２２５ｍＬ全部を濾過することが可能であった。多孔質マイクロビーズ濾過補助材を用いる濾過は、５分以内に完了し、ガラスビーズ濾過補助材を用いる濾過よりはるかに迅速であった。
【００９６】
１０％チーズホモジネートにおいて、濾過補助材無し（黒三角）及びガラスビーズ濾過補助材有り（黒四角）のナノセーラムフィルターは、それぞれホモジネート５及び７５ｍＬより少量で目詰まりをおこした（図１１Ｂ）。しかしながら、多孔質マイクロビーズ濾過補助材（架橋デキストラン、２ｇ、８６〜２５８μｍ）（黒丸）を使用すると、ホモジネート２２５ｍＬ全部を５分以内に濾過することができた。
【００９７】
様々なグレードの多孔質球状マイクロビーズ濾過補助材の濾過性能を、１０％デリ・ミートホモジネートを使用して比較した。架橋ポリメタクリレートマイクロビーズ（直径４５〜９０μｍ：０．５ｇ（白丸）、１．０ｇ（黒丸））及び架橋デキストランマイクロビーズ（直径１７〜７０μｍ：０．５ｇ（白四角）、直径３５〜１４０μｍ：０．５ｇ（ひし形）、直径８６〜２５８μｍ：０．５ｇ（白三角）、１．０ｇ（黒三角）、直径１７０〜５２０μｍ：０．５ｇ（×））を、ＧＭＦ１５０  １μｍフィルターについて評価した（図１２Ａ）。直径１７０〜５２０μｍの架橋デキストランマイクロビーズを除き、ホモジネート２２５ｍＬ全部は５分以内に完全に濾過された。
【００９８】
様々なグレードの多孔質球状マイクロビーズ濾過補助材の濾過性能を、１０％フランクフルトソーセージホモジネートを使用して同様に比較した。架橋ポリメタクリレートマイクロビーズ（直径４５〜９０μｍ：０．５ｇ（白丸））及び架橋デキストランマイクロビーズ（直径１７〜７０μｍ：０．５ｇ（白四角）、直径３５〜１４０μｍ：０．５ｇ（ひし形）、直径８６〜２５８μｍ：０．５ｇ（白三角）、直径１７０〜５２０μｍ：０．５ｇ（×））を、ＧＭＦ１５０  １μｍフィルターについて評価した（図１２Ｂ）。ホモジネート２２５ｍＬ全部は５分以内に完全に濾過された。これらの実験により、多孔質マイクロビーズ濾過補助材が慣用の無孔濾過補助材より、優れた粒子捕捉能力及び濾過能力を有することが説明される。
【００９９】
実験５：１０％デリ・ミートホモジネート２２５ｍＬでの病原体検出アッセイ
病原体検出アッセイは、種々の用量のリステリア細胞を接種した１０％デリ・ミートホモジネート２２５ｍＬを用いて行った。
【０１００】
リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）及びリステリア・イノキュアを、ＢＨＩブロス中で、３７℃で一晩培養した。リステリア濃度は、１／１０６希釈後に、コロニーを数えて評価した。１０％デリ・ミートホモジネートは、以下のようにして
調製した。
（１）デリ・ミート２５ｇを滅菌ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２２５ｍＬと混合した。
（２）デリ・ミートサンプルをストマッカー（Ｓｅｗａｒｄ，ＵＫ）により、２３０ｒｐｍで２分間、粉砕消化した。
（３）ストマッカー袋（Ｎａｓｃｏ，ＷＩ）付属のフィルターを使用して、デリ・ミートホモジネートを分離した。
濾過の前に、デリ・ミートホモジネートに、種々の用量のリステリア細胞を接種した。多孔質マイクロビーズ濾過補助材（架橋デキストラン、直径８６〜２５８μｍ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）は、ＢＨＩブロスに懸濁させ（５０ｇ／Ｌ）、１２０℃で２０分間滅菌した。リステリア検出試薬は以下のようにして調製した。
（１）フレーザーブロス基礎培地（Fraser broth base；Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）１１．５ｇ
及びバクトアガロース（Bacto agarose）２ｇを蒸留水２００ｍＬ中に溶解させ、１２０
℃で２０分間滅菌し、４５℃でゾル形態に保持した。
（２）フレーザーサプリメント（Fraser supplement）（Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）１ｖｉａｌ
／５００ｍｌとＸ−グルコシド（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）５０ｍｇ／Ｌを溶液に追加した。
【０１０１】
病原体検出アッセイは、以下のようにして行った。
（１）多孔質マイクロビーズ濾過補助材０．５ｇを、ＧＭＦ１５０  １μｍ濾過媒体（直径４７ｍｍ：Ｗｈａｔｍａｎ，ＮＪ）及びポリエチレンメッシュセパレーター（穴：直径３３０μｍ）の上部に置いた。
（２）多孔質マイクロビーズ濾過補助材０．５ｇを、リステリア接種デリ・ミートホモジネートと混合した。
（３）デリ・ミートホモジネートを真空濾過により濾過した。
（４）多孔質マイクロビーズを滅菌ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）２０ｍＬで徹底的に３回洗浄した。
（５）ＧＭＦ１５０  １μｍ濾過媒体を滅菌容器に移し、４５℃で５分間保持した。
（６）フィルターをリステリア検出試薬５ｍＬに４５℃で５分間浸漬し、リステリア検出試薬を室温まで冷却することでゲル形態に変換した。
（７）フィルターを、３０℃で一晩インキュベートしてリステリア細胞の増殖を検出した。
【０１０２】
２４時間のインキュベーション後、リステリア細胞によるＸ−グルコシドの代謝のため、フィルター中にコロニー様着色スポットが観察された（図１３Ａ、１３Ｃ）。これらの着色は、２４時間より４０時間で更に濃くなり、このことは、リステリア細胞の増殖を示す（図１３Ｂ、１３Ｄ）。これとは対照的に、リステリアネガティブサンプルは、３日間のインキュベーション後ですら何ら着色を示さなかった（図１３Ｅ、１３Ｆ）。着色スポットの数は、接種リステリア細胞の数に密接に相関し、１０％デリ・ミートホモジネート〜２２５ｍＬ（デリ・ミート２５ｇ）から接種リステリア細胞の約６０％が濾過媒体に収集された（図１４Ａ、図１４Ｂ）。
【０１０３】
例６：複合ヒドロゲルフィルター
複合ヒドロゲルフィルターの製作のために、アルミナナノ繊維（病原体認識試薬）を含むナノセーラムフィルター（直径４７−ｍｍ，Ａｒｇｏｎｉｄｅ，ＦＬ）を、ヒドロゲルを担持するマトリックスとして使用した。費用が安いため、寒天ヒドロゲルを使用した。ナノセーラムフィルターで寒天ゲルを濾過して、新しいフィルターを製作した。病原体認識試薬、ここではアルミナナノ繊維、が、ヒドロゲルで被覆されると、これらは、病原体との静電相互作用の損失のため、通常、機能不全になり得るが、ここで、ナノセーラムフィルターは、多層から構成されるデプスフィルターであり、この問題が起こるのを防ぐために最上層を、寒天ヒドロゲルで被覆した。
【０１０４】
製作手順は、以下に説明する。ナノセーラムフィルターの最上層を、バルク膜から剥がし、１％寒天溶液を最上層に注いだ。次いで、寒天溶液は、真空下に最上層を通って濾過され、最上層のもともとの多孔性を保持した。その後、最上層を室温で空気乾燥させ、少量の水をその上にスプレーし、かつコンプレッサーを使用して、層を一緒に圧縮して、再びバルク膜へ取り付けた。最終的に組立てられたフィルター膜は、室温で乾燥させた。
【０１０５】
製造されたフィルター膜を、以下の手順により、病原体溶液を使用して検査した。
（１）フィルター膜を滅菌水１５０ｍＬで洗浄した。
（２）ＢＨＩブロス１０ｍＬ中リステリア細胞約１０３ｃｆｕをフィルターに添加し、真空下で濾過した。
（３）濾過後に、ＢＨＩブロス５ｍＬ及びＸ−グルコシド（発色基質）５０ｍｇ／Ｌをフィルター膜に添加した。
（４）フィルター膜を３７℃で１５時間インキュベートした。
【０１０６】
図１５は、その結果を示す。着色は、インキュベーション後にフィルター上に発見されたリステリア細胞の存在を示す
【０１０７】
例７：スマートヒドロゲルにより固定化された病原体検出試薬を有する複合ヒドロゲルフィルター
温度が３７℃（インキュベーション温度）に達すると、縮む能力を有するので、感熱性ヒドロゲル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）／キトサンを使用した。合成は、以下のステップを含む。
（１）キトサン（０．０３ｇ）、酢酸（２４０μｌ）及びＮＩＰＡｍ（１．６ｇ）を蒸留水（２０ｍＬ）に溶解させた。
（２）架橋剤、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（０．０６ｇ）、開始剤２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（０．０１ｇ）及び触媒Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（２００μｌ）を溶液に添加し、窒素下に４０分間脱気した。
（３）溶液を、ペトリ皿中で、３６５ｎｍＵＶ光下で２時間光重合させた。
（４）ヒドロゲルを、毎日水を換えながら、蒸留水に３日間浸漬した。
生成されたスマートヒドロゲルを粉砕して、小粒子にし、Ｘ−グルコシド（発色基質）２００ｍｇ／Ｌを有するＢＨＩブロスに浸漬し、３７℃と２５℃との間で数回、加熱／冷却した。次いで粒子を集め、ヒドロゲル複合ナノセーラムフィルター（例６に示される）を使用して、図５に図示されるように、スマートヒドロゲル粒子を最上層とバルク層との間に添加することにより組み立てた。
【０１０８】
乾燥フィルター膜は、病原体溶液を使用して、以下の手順に従い、検査した。
（１）フィルター膜を滅菌水１５０ｍＬで洗浄した。
（２）ＢＨＩブロス中のリステリア細胞（〜１０４ｃｆｕ／ｍＬ）５ｍＬを濾過した。
（３）フィルターを、密閉容器中で３７℃で１５時間インキュベートした。
【０１０９】
図１６は、その結果を示す。検出すべきサンプルの濾過後に、なんら発色基質溶液を添加することなく、着色がフィルター上に見られた。
【０１１０】
例８：分解性フィルター膜
ｋ−カラギーナン及びアルギン酸ナトリウムを使用して、分解性フィルターを製作した。アルギン酸ナトリウム０．４ｇ、ｋ−カラギーナン０．２ｇ及びＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（界面活性剤）０．２ｇを蒸留水３０ｍｌに９０℃で溶解させ、次いで酢酸１００μｌを溶液に添加した。重炭酸ナトリウム０．２ｇを溶液に移し、気泡を発生させた。泡
状溶液を形成後、溶液の１０ｍＬを直径６０ｍｍのペトリ皿に注いだ。ペトリ皿の溶液を室温まで冷却すると、多孔質ゲルが形成された。次いでゲル膜を０．５ＭＣａＣｌ２と０．５ＭＫＣｌ溶液に１時間浸漬して、架橋ヒドロゲル構造体を形成した。その後、架橋ヒドロゲル構造体を、真空下に凍結乾燥し、分解性ヒドロゲルフィルターを製造した。
【０１１１】
分解性フィルターを使用する病原体検出アッセイを行った。リステリア・イノキュア〜１０９ｃｆｕを接種したＰＢＳ緩衝液５０ｍＬを、真空吸引で、分解性ヒドロゲルフィルターに通して濾過させた。次いで、フィルターを１００ｍＭＥＤＴＡ溶液１０ｍＬ中で８０℃で１５分間インキュベートして、ヒドロゲルフィルターを完全に溶解させた。取扱説明書に従い、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＡ）を使用して、フィルター溶解溶液２４０μＬから、リステリアゲノムＤＮＡを抽出した。抽出されたリステリアゲノムＤＮＡは、ＡＢＩ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ）を用いるリアルタイムＰＣＲにより検出し、閾値サイクル（Ｃｔ）値は２３〜２４．５である（図１７）。他方、リステリアゲノムＤＮＡは、ネガティブ対照、リステリアネガティブＰＢＳ緩衝液１０ｍＬ、では検出されなかった。
【０１１２】
本発明の精神から逸脱せずに多数かつ種々の変更をなし得ることは当業者であれば理解するであろう。よって、上述した本発明の態様は、一例にすぎず、本発明の範囲を限定する意図はないことが、明確に理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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