(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ含有試料からグリコシル化されたＩｇＧを単離する方法であって、
（ａ）前記ＩｇＧ含有試料を、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＥｎｄｏＳポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：２の残基１９１から１９９を含有し、配列番号：２のアミノ酸配列の完全長と少なくとも９０％の同一性を有する（ｉ）の変異体、または
（ｉｉｉ）配列番号：２の１９９位と同等の位置にグルタミン酸を含有しない場合において、配列番号：２の残基１９１から１９９が１個または複数の保存的置換を有する、前記（ｉｉ）の変異体
と接触させるステップであって、前記ポリペプチドまたは変異体が、ＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を欠如し、グリコシル化されたＩｇＧに特異的に結合することができるものである、前記ステップと、
（ｂ）それによってＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
（ｃ）接触試料から前記ＥｎｄｏＳを分離するステップと
を含み、それによってグリコシル化された単離ＩｇＧを得る方法。
【請求項２】
試料中のグリコシル化されたＩｇＧの有無を決定する方法であって、
（ａ）前記試料を、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＥｎｄｏＳポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：２の残基１９１から１９９を含有し、配列番号：２のアミノ酸配列の完全長と少なくとも９０％の同一性を有する（ｉ）の変異体、または
（ｉｉｉ）配列番号：２の１９９位と同等の位置にグルタミン酸を含有しない場合において、配列番号：２の残基１９１から１９９が１個または複数の保存的置換を有する、前記（ｉｉ）の変異体
と接触させるステップであって、前記ポリペプチドまたは変異体が、ＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を欠如し、グリコシル化されたＩｇＧに特異的に結合することができるものである、前記ステップと、
（ｂ）それによってＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
（ｃ）所望により、前記ＥｎｄｏＳを接触試料から分離するステップと、
（ｄ）前記分離したＥｎｄｏＳがＩｇＧに結合しているかどうかを決定するステップと
を含み、それによって前記試料中のグリコシル化されたＩｇＧの有無を決定する方法。
【請求項３】
前記ＥｎｄｏＳポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸配列、または配列番号：２のアミノ酸１から４０９からなる前記断片からなるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
単離された、または検出されたＩｇＧが天然の機能的に活性のある形態である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
単離された、または検出されたＩｇＧが、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の少なくとも１種、好ましくは２種、３種または４種全てを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）がさらに、試料を、ＥｎｄｏＳポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ（ｃ）が、接触試料上で磁場分離を実施することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＩｇＧ含有試料のグリコシル化状態を評価する方法であって、ＩｇＧ含有試料の第１および第２の部分試料を採取することを含み、請求項１または３から５のいずれか一項に記載のステップ（ａ）から（ｃ）を第１の部分試料に適用し、ＥｎｄｏＳポリペプチドが、グリコシル化されていないＩｇＧに結合できる代替のＩｇＧ結合試薬で置換されていることを除いて、請求項１または３から５のいずれか一項に記載のステップ（ａ）から（ｃ）を第２の部分試料に適用し、さらに、
（ｅ）第１の部分試料におけるＥｎｄｏＳポリペプチドに結合したＩｇＧの量および第２の部分試料における代替のＩｇＧ結合試薬に結合したＩｇＧの量を定量するステップと、
（ｆ）（ｅ）において決定した結合ＩｇＧの量の両方を比較するステップと
を含み、それによってＩｇＧ含有試料のグリコシル化状態を評価する方法。
【請求項８】
代替のＩｇＧ結合試薬がプロテインＧおよび／またはプロテインＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
単離ＩｇＧ試料からＦａｂ断片を単離する方法であって、
（ａ）前記ＩｇＧ含有試料を、請求項１の（ａ）（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体と接触させ、それによってＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
（ｂ）前記ＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体を接触試料から分離するステップと、
（ｃ）ＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体からＩｇＧを溶出し、それによってＩｇＧ含有試料を得るステップ
によって前記試料を調製するステップと、
そして次に、
（ｄ）（ｃ）の試料と、配列番号：８または９のポリペプチドおよび請求項１の（ａ）（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体とを接触させるステップと、
（ｅ）前記配列番号：８または９のポリペプチド、及びＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体を、（ｃ）の接触試料から分離し、それによってＦａｂ断片を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
ステップ（ｄ）がさらに、試料を、前記配列番号：８もしくは９のポリペプチド、および／またはＥｎｄｏＳポリペプチドもしくは変異体に結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ（ｅ）が、接触試料上で磁場分離を実施することを含み、かつ／またはＥｎｄｏＳポリペプチドが請求項３に記載のものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＩｇＧ含有試料からグリコシル化されたＦｃ断片を単離する方法であって、
（ａ）前記ＩｇＧ含有試料を前記配列番号：８または９のポリペプチドと接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物から前記配列番号：８または９のポリペプチドを分離し、それによってＦａｂおよびＦｃ断片を単離するステップと、
（ｃ）前記ＦａｂおよびＦｃ断片を、請求項１の（ａ）（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体と接触させ、それによってＦｃ断片−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた混合物からＦｃ断片−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体を分離するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られたＦｃ断片−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体からＦｃ断片を単離するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）がさらに、試料を、配列番号：８もしくは９のポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ（ｃ）がさらに、ステップ（ｂ）で得られた単離ＦａｂおよびＦｃ断片を、前記ＥｎｄｏＳポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ（ｂ）および（ｄ）が、それぞれ接触試料または単離されたＦａｂおよびＦｃ断片上で磁場分離を実施することを含み、かつ／または前記ＥｎｄｏＳポリペプチドが請求項３に記載のものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩｇＧ含有試料からグリコシル化されたＩｇＧを単離するための、または試料中のグリコシル化されたＩｇＧの有無を決定するためのキットであって、
（ａ）請求項１の（ａ）（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体と、所望により
（ｂ）試料から前記ＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体を分離するための手段と
を含むキット。
【請求項１４】
ＩｇＧ含有試料のグリコシル状態を評価するためのキットであって、
（ａ）請求項１の（ａ）（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体と、
（ｂ）脱グリコシル化されたＩｇＧに結合できる代替のＩｇＧ結合試薬と、
（ｃ）前記ＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体および前記代替のＩｇＧ結合試薬を試料から分離するための手段と、
を含み、所望により前記代替のＩｇＧ結合試薬は、プロテインＧおよび／またはプロテインＡおよび／またはプロテインＡ／Ｇを含むものである、キット。
【請求項１５】
ＩｇＧのグリコシル化されたＦｃ断片を単離するためのキットであって、
（ａ）配列番号：８または９のポリペプチドと、
（ｂ）請求項１の（ａ）（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のＥｎｄｏＳポリペプチドまたは変異体と、
（ｃ）前記配列番号：８もしくは９のポリペプチドおよびＥｎｄｏＳポリペプチドを試料から分離するための手段と
を含む、キット。
【請求項１６】
前記ＥｎｄｏＳポリペプチドが請求項３に記載のものである、請求項１１から１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＥｎｄｏＳポリペプチドもしくは変異体、前記代替のＩｇＧ結合試薬、または前記配列番号：８もしくは９のポリペプチドを試料から分離するための手段が、磁性ナノ粒子の集団であり、各集団は、示されたポリペプチド／試薬／タンパク質の少なくとも１種に結合することができ、所望により、試料上において磁場分離を実施するための指示をさらに含むものである、請求項１１から１６のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞集団の単離、ＩｇＧを単離し評価する方法、ＩｇＧのＦａｂまたはＦｃ断片を単離する方法、およびこのような方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスの抗体は、病原体に対するヒト宿主の適応免疫防御において重要な役割を果たす。ＩｇＧは、２本の同一な重鎖および２本の同一な軽鎖からなり、これらの鎖は可変ドメインおよび定常ドメインから構成される。ＩｇＧ分子をパパイン処理することによって、抗原を認識するＦａｂ断片、および宿主受容体の認識部位であり、いくつかのエフェクター分子と相互作用する部位であるＦｃ断片を得ることができる。
【０００３】
ＩｇＧのＦｃ部分はまた、各重鎖のＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７残基に結合した保存された複合炭水化物またはグリカンを含有する。これらのグリカンは、ＩｇＧが天然型（native form）のとき、ＣＨ２ドメイン間の境界面に位置する。これらのグリカンは、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸およびガラクトースなどの末端および分岐炭水化物が付加したＮ−アセチルグルコサミンおよびマンノースの二分岐コアからなる。この炭水化物の存在は、適切な抗体構造ならびに細胞性イムノグロブリンＧ  Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）および補体系との相互作用に極めて重大である。
【０００４】
エンドグリコシダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ）は、ストレプトコッカス  ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）によって分泌され、ＩｇＧの重鎖のアスパラギン２９７残基に結合した保存されたグリカンを加水分解することによって、天然ＩｇＧに対して特異的にエンドグリコシダーゼ活性を有する。ＥｎｄｏＳは天然のＩｇＧに特有の特異性を有することが初めて知られた細菌酵素である。対照的に、その他の公知のエンドグリコシダーゼの活性は、糖タンパク質基質の変性を必要とし、それによって増強される。
【０００５】
ＩｇＧなどの抗体は、基礎研究ならびに診断薬および薬剤の開発において多く適用されている。これらの適用のいくつか、例えば、免疫組織化学、免疫測定法、腫瘍検出、放射線療法、抗体結合部位の結晶学的研究および免疫標的化において、ＩｇＧ分子全体よりもＦａｂ断片を使用した方が便利である。Ｆａｂ断片を使用する利点のいくつかは、細胞または沈殿した抗原上のＦｃ受容体によって影響を受けないこと、免疫原性が低下していること、食作用の影響を受けにくいこと、放射標識Ｆａｂ断片が完全なＩｇＧ分子よりも組織から迅速に排除されることである。その他の適用では、ＩｇＧのＦｃ断片を使用することが望ましい。
【０００６】
ＦａｂおよびＦｃ断片を大規模に生成する場合、組換えタンパク質として生成してもよい。精製のために、組換えＩｇＧおよび血清から生成したＩｇＧは、完全な分子として生成されることが多く、その後、ＦａｂまたはＦｃ断片を得るために化学的に加工される。
【０００７】
ＩｇＧのＦａｂおよびＦｃ断片への切断は、ペプシンまたはパパインなどのタンパク質分解酵素を使用して実施することが最も多い。これらの酵素は、その他のタンパク質を切断することが多く、そのため切断反応は一般的に精製ＩｇＧ画分で実施しなければならない。さらに、ペプシンおよびパパインは一般的に、複数の部位でＩｇＧを切断する。これは、得られた断片が完全なＦａｂまたはＦｃ断片に対応しないことが多く、切断によってＦａｂおよびＦｃ断片が生じても、より小さい断片に切断されやすいことを意味する。Ｆａｂ断片からのＦｃ断片の単離は、細菌のプロテインＡおよびＧのＦｃ結合特性を利用したプロテインＡまたはＧアフィニティー分離カラムを使用して実施されることが最も多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、細胞とＥｎｄｏＳの接触が、既にＦｃγＲに結合したＩｇＧを除去するという驚くべき発見をした。本発明によれば、Ｆｃγ受容体−ＩｇＧ複合体を解離するインビトロの方法であって、複合体をＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させ、それによってＩｇＧに結合していないＦｃγ受容体を得ることを含み、所望によりＦｃγ受容体−ＩｇＧ複合体が細胞含有試料中に存在する方法を提供する。本発明はまた、Ｆｃγ受容体結合ＩｇＧ分子を実質的に含まない細胞集団を単離する方法であって、
（ａ）細胞含有試料をＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させるステップと、
（ｂ）細胞を接触試料（contacted sample）から分離するステップと
を含み、それによって前記細胞集団を得る方法を提供する。
【０００９】
本発明者らはまた、ＩｇＧを単離するための改善された方法を同定した。この方法は、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドを使用する。本発明者らは、このような改変ＥｎｄｏＳポリペプチドが天然の機能的に活性のある形態のＩｇＧ糖タンパク質に特有の特異性を有することを初めて示した。したがって、この方法は、グリコシル化された、かつ／または機能的に活性のあるＩｇＧを単離するのに特に有用である。このような改変ＥｎｄｏＳポリペプチドを、変性し、かつ／または脱グリコシル化したＩｇＧに結合できる代替のＩｇＧ結合試薬と併用することによって、本発明者らはまた、ＩｇＧ含有試料のグリコシル化状態または機能的品質を評価する方法を同定した。
【００１０】
本発明によれば、ＩｇＧ含有試料からＩｇＧを単離する方法であって、
（ａ）前記ＩｇＧ含有試料を、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させるステップと、
（ｂ）接触試料から前記ＥｎｄｏＳを分離するステップと
を含み、それによって単離ＩｇＧを得る方法を提供する。
【００１１】
さらに、ＩｇＧ含有試料のグリコシル化状態または機能的品質を評価する方法であって、ＩｇＧ含有試料の第１および第２の部分試料を採取することを含み、前記方法によるステップ（ａ）および（ｂ）を第１の部分試料に適用し、ＥｎｄｏＳポリペプチドが、変性し、かつ／または脱グリコシル化したＩｇＧに結合できる代替のＩｇＧ結合試薬で置換されていることを除いて、前記のステップ（ａ）および（ｂ）を第２の部分試料に適用し、さらに
（ｃ）第１の部分試料におけるＥｎｄｏＳポリペプチドに結合したＩｇＧの量および第２の部分試料における代替のＩｇＧ結合試薬に結合したＩｇＧの量を定量するステップと、
（ｄ）（ｃ）で決定した結合ＩｇＧの量の両方を比較するステップと
を含み、それによってＩｇＧ含有試料のグリコシル化状態または機能的品質を評価する方法を提供する。
【００１２】
本発明者らはまた、ＩｇＧのＦａｂまたはＦｃ断片を単離する改善された方法を同定した。本発明の方法は、Ｓ．ピオゲネスの特異性の高いＩｇＧ切断酵素、ＩｄｅＳ（Ｓ．ピオゲネスのイムノグロブリンＧ分解酵素、Immunoglobulin G-degrading enzymes of S. pyogenes）およびＦｃ結合タンパク質を使用する。したがって、本発明の方法には、背景の部分で記載したような従来の方法、例えば、ペプシンおよびパパインを使用する方法のような限界はない。これは、ＩｄｅＳがＩｇＧ分子のヒンジ領域内に唯一限定された切断部分を有し、ＦａｂおよびＦｃ断片がさらに切断される可能性がないためである。
【００１３】
本発明の一方法では、ＩｇＧ含有試料をＩｄｅＳおよびＦｃ結合タンパク質と接触させる。好ましいＦｃ結合タンパク質は、前述のようなエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドである。改変ＥｎｄｏＳタンパク質は、広く使用されている他のＦｃ結合タンパク質、例えば、プロテインＡおよびプロテインＧよりも好ましい。これは、改変ＥｎｄｏＳタンパク質がＦｃのみに結合し、一方、本発明者らはプロテインＡおよびプロテインＧはまた、Ｆａｂ断片に結合できることを発見したためである。したがって、これらのタンパク質でＦｃ断片からＦａｂ断片を単離することはより困難である。その他の好ましいＦｃ結合タンパク質には、プロテインＨが含まれる。
【００１４】
本発明の方法では、一般的に、ＩｄｅＳはＩｇＧをＦａｂおよびＦｃ断片に切断し、Ｆｃ結合タンパク質はＦｃ断片に結合する。その後、Ｆｃ断片を、Ｆａｂ断片から分離する。
【００１５】
この方法は、精製したＩｇＧを含む試料からＦａｂまたはＦｃ断片を単離するのに特に有用である。より具体的には、本発明の改変ＥｎｄｏＳポリペプチドを使用して、精製したＩｇＧを含む試料からＦａｂまたはＦｃ断片を単離するのに有用である。しかし、この方法はまた、未精製ＩｇＧ、例えば、血清、細胞溶解物または細胞培養培地を含有する試料に使用するために適合させることができる。
【００１６】
本発明の方法を実施するためのキットおよび本発明による方法によって単離された細胞集団も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＥｎｄｏＳが４種類のヒトＩｇＧサブクラス全てに対してグリコシダーゼ活性を有することを示した図である。パネルＡ：ヒトＩｇＧのグリカン構造。ＩｇＧのγ鎖上のグリカンは、アスパラギン２９７に結合した。ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｆｕｃ、フコース；Ｍａｎ、マンノース；Ｇａｌ、ガラクトース；ＮｅｕＡｃ、シアル酸。ＥｎｄｏＳの切断部位およびレンズマメアグルチニンレクチン（ＬＣＡ）の認識部位を示す。パネルＢ：精製ＩｇＧ１〜４をＥｎｄｏＳとインキュベートして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、染色した。パネルＣ：ＩｇＧ１〜４をＥｎｄｏＳとインキュベートして、ＬＣＡレクチンブロットを使用して分析した。
【図２】図２は、血漿環境におけるＥｎｄｏＳによるヒトＩｇＧサブクラス類の加水分解を示した図である。ヒト血漿をＥｎｄｏＳまたはＰＢＳで処理し、その後、精製ＩｇＧ画分のＬＣＡレクチンＥＬＩＳＡを行った。ＩｇＧグリカン加水分解は、ＬＣＡレクチンＥＬＩＳＡを使用して検出した。結果は、未処理血漿のシグナルと比較した各サブクラスの加水分解のパーセントとして表す。
【図３】図３は、ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）がＩｇＧサブクラス全てに結合することを示した図である。パネルＡ：ニトロセルロース膜に３、１．５および０．７５μｇの量で固定された各ＩｇＧサブクラスに対するＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）の結合を示したスロットブロット。結合は、ＥｎｄｏＳに対する抗血清を使用して検出した。パネルＢ：ＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用した固定ＩｇＧクラスに対するＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）の結合。選択したプロットは、ＩｇＧ１へのＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）の結合を示し、参考（バルク変化を差し引いてある）として加水分解ＩｇＧ１を使用している。結合反応速度定数は、該当するならば表に示す。Ｎｂは、その組み合わせについて調べてはいるが、ＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用しても結合が認められないことを示す。
【図４】図４は、ＩｇＧサブクラスのＥｎｄｏＳ処理がＦｃγＲＩＩに対するＩｇＧの結合を阻害することを示した図である。パネルＡ：ＥｎｄｏＳ処理した、またはしていない精製ＩｇＧサブクラスのマイクロタイタープレートに固定したＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂへの結合。ＨＲＰ標識プロテインＧは、結合したＩｇＧサブクラスの検出のために使用した。（＋）は、完全な（intact）ＩｇＧを示し、（−）はＥｎｄｏＳ加水分解ＩｇＧを示す。パネルＢ：ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を使用して視覚化した固定受容体に対するＩｇＧサブクラスの結合。プロットは、一般的なセンサーグラム、本明細書ではＦｃγＲＩＩａへのＩｇＧ１の結合を示す。空のフローセルを参考（差し引く）として使用する。表２で示したデータは、結合するＩｇＧサブクラスの速度定数である。Ｎｂは、そのＩｇＧ受容体の組み合わせをこの技術を使用して観察しているが、本明細書では相互作用が認められないことを示している。
【図５】図５は、ＥｎｄｏＳ処理ＩｇＧがＫ５６２細胞上のＦｃγＲＩＩａに結合しないことを示す図である。パネルＡ：ＥｎｄｏＳで処理した、または処理していない放射活性ＩｇＧのＫ５６２細胞に対する相対的結合。細胞は、１２５ヨウ素標識ＩｇＧ（完全またはＥｎｄｏＳ処理）でインキュベートした。洗浄した細胞ペレットの放射活性を検出した。ここで１００％として示した１２５Ｉ−ＩｇＧ（完全）のＫ５６２細胞への結合は、冷却ＩｇＧを添加することによって阻害され得るＫ５６２細胞への特異的ＩｇＧ結合を表す。パネルＢ：Ｋ５６２細胞は、ＥｎｄｏＳまたはＰＢＳで処理したヒト血漿でインキュベートした。細胞は、溶解緩衝液に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＩｇＧに対する抗血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。
【図６】図６は、ＥｎｄｏＳ処理ＩｇＧが単球に結合しないことを示す図である。パネルＡ：単球は、１２５ヨウ素標識ＩｇＧ（完全またはＥｎｄｏＳ処理）でインキュベートした。室温で３０分間インキュベートした後、細胞溶解物のタンパク質、全タンパク質１０μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを乾燥させ、リン光イメージング（phosphorimaging）によって分析した。パネルＢ：ＥｎｄｏＳで処理した血液中の活性化単球に対するＩｇＧの結合減少を示したフローサイトメトリー分析。ヒト血液は、白血球活性化剤ｆＭＬＰを添加する前にＥｎｄｏＳで処理した。単球へのＩｇＧ結合は、マウス抗ヒトＩｇＧおよび２次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して検出した。
【図７】図７は、ＥｎｄｏＳで処理したときのＦｃγＲＩＩからのＩｇＧの解離を示した図である。パネルＡ：Ｋ５６２細胞に結合したＩｇＧは、ＥｎｄｏＳでインキュベートするとＦｃγＩＩＲａから解離するが、ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）でインキュベートしても解離しない。Ｋ５６２細胞は、血漿でインキュベートし、その後ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）またはＰＢＳでインキュベートした。細胞溶解物、全タンパク質１０μｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＩｇＧに対する抗血清を使用したブロットを使用して、ＩｇＧについて分析した。パネルＢ：単球に結合したＩｇＧは、ＥｎｄｏＳで処理した後ＦｃγＲから解離する。単球は、血漿でインキュベートし、その後ＥｎｄｏＳまたはＰＢＳでインキュベートした。再懸濁した細胞ペレットは、ヒトＩｇＧに対する抗血清を使用したブロットによってＩｇＧについて分析した。ＩｇＧのグリカンは、ブロットおよびＬＣＡレクチンに対する反応性によって検出した。パネルＣ：ＢＩＡｃｏｒｅ装置は、ＥｎｄｏＳが固定した受容体ＦｃγＲＩＩａからのＩｇＧ１の解離に影響を及ぼすことを示している。２種類の併行した実験では、ＥｎｄｏＳの注入（黒い曲線）をＩｇＧ１−ＦｃγＲＩＩａ相互作用の解離相における同時点の緩衝液（バッファー）の注入（波線）と比較する。
【図８】図８は、様々なＳ．ピオゲネス血清型、Ｓ．エクイおよびＳ．ズーエピデミカスのＥｎｄｏＳ相同体のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列比較を示した図である。株名、種、およびＭ血清型は左に示す。アミノ酸同一性および類似性は、灰色で示し、コンセンサス配列はアラインメントの下に示す。保存されたキチナーゼモチーフは四角で囲い、活性に必須のグルタミン酸は配列の下にアスタリスクの印を付けてある。
【図９】図９は、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａのＥｎｄｏＦ２のＥｎｄｏＳ  αドメインおよびヒツジ偽結核菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）のＣＰ４０のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列比較を示した図である。タンパク質名は左に示す。アミノ酸同一性および類似性は、灰色で示し、コンセンサス配列はアラインメントの下に示す。保存されたキチナーゼモチーフは四角で囲い、活性に必須のグルタミン酸は配列の下にアスタリスクの印を付けてある。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一般的なポリペプチド特性
本発明は、細菌タンパク質ＥｎｄｏＳおよびＩｄｅＳならびにその他のタンパク質を利用する様々な方法を提供する。タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドという用語は、本明細書では同義に使用する。本発明の特定の方法は、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するＥｎｄｏＳポリペプチドを必要とし、一方、本発明の他の方法は、前記活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドを必要とする。
【００１９】
以下の部分は、本発明のポリペプチド全ての一般的な特性、特に、本発明のポリペプチドに含まれるアミノ酸配列の変化、改変、修飾または誘導体化に関する。本明細書に記載するようなポリペプチドの変化、改変、修飾または誘導体化は、ポリペプチドが本開示の以後の部分で詳述されるように、さらに必要な活性または特性を保持する必要があることを理解されたい。
【００２０】
本発明のポリペプチドの変異体は、本開示のその後の部分でさらに詳細を説明する特定のレベルのアミノ酸同一性によって定義され得る。アミノ酸同一性は、適切なアルゴリズムを使用して計算することができる。例えば、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜１０で記載されたように、相同性または整列配列を計算することができる（例えば、（通常、初期設定において）同等もしくは対応する配列を同定する）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、あるポジティブに評価された閾値スコアＴと合致するか、または満足させる問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアリングシーケンスペア（high scoring sequence pair）（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、文字列スコア閾値（neighbourhood word score threshold）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前述）。これらの最初の文字列ヒットは、これらを含有するＨＳＰを見出すための検索を開始するための種（ｓｅｅｄ）として働く。文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。各方向における文字列ヒットの延長は、以下の場合停止される。累積アラインメントスコアがその最大限に達成された値から量Ｘだけ低下する場合、１またはそれ以上のネガティブのスコアリング残基アラインメントの累積によって累積スコアが０以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５〜１０９１９を参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いる。
【００２１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実施する、例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１測定値は、２つのポリヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標となる最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第２の配列に対して第１の配列の比較した最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合、配列はもう１つの配列と類似であると見なされる。あるいは、ＵＷＧＣＧパッケージは、（例えば、初期設定で使用した）相同性の計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、３８７〜３９５）。
【００２２】
本発明のポリペプチドの変異体はまた、置換変異体を含むことを理解されたい。置換変異体には、好ましくは、同数のアミノ酸による１個または複数のアミノ酸の置換および保存的アミノ酸置換の形成が含まれる。例えば、アミノ酸は、類似の特性を有する別のアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸または別の脂肪族アミノ酸で置換されてもよい。適切な置換を選択するために使用できる２０個の主要なアミノ酸のいくつかの特性は以下の通りである。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に単離された形態であってもよい。ポリペプチドは、ポリペプチドの企図した目的を妨害しない担体または希釈剤と混合することができ、それでも実質的に単離されていると考えられる。本発明で使用するためのポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、一般的にポリペプチドは調製物中に含まれ、調製物中のポリペプチドの５０重量％超、例えば、８０重量％超、９０重量％超、９５重量％超または９９重量％超が本発明のポリペプチドである。
【００２５】
本発明で使用するためのポリペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含み、または化合物の安定性を増大させるように改変することができる。ポリペプチドが合成手段によって生成されるとき、このようなアミノ酸は生成中に導入してもよい。ポリペプチドはまた、合成的生成か、または組換えによる生成のいずれかの後に改変してもよい。
【００２６】
本発明で使用するポリペプチドはまた、Ｄ−アミノ酸を使用して生成してもよい。このような場合、アミノ酸はＣからＮ方向の逆配列に結合される。これは、このようなポリペプチドを生成するために当業界では一般的である。いくつかの側鎖改変が当業界では知られており、ポリペプチドの側鎖に行うことができ、本明細書で記載することができるような他の任意の必要な活性または特性を保持するポリペプチドに行うことができる。
【００２７】
本発明で使用したポリペプチドは化学的に改変でき、例えば、翻訳後に改変できることも理解されたい。例えば、ポリペプチドはグリコシル化したり、リン酸化したりすることもでき、改変したアミノ酸残基を含むこともできる。細胞膜への挿入を促進するために、シグナル配列の添加によって改変することもできる。
【００２８】
本発明のポリペプチドはまた、単離または精製を助けるために誘導体化するか、または改変することができる。したがって、本発明の一実施形態では、本発明で使用するためのポリペプチドは、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを添加することによって、誘導体化されるか、または改変される。あるいは、ポリペプチドは、結合対の１つの構成要素を添加することによって誘導体化されるか、または改変され、分離手段は結合対の他方の構成要素を添加することによって誘導体化されるか、または改変された試薬を含む。いかなる適切な結合対も使用できる。本発明で使用するためのポリペプチドが結合対の１つの構成要素を添加することによって誘導体化されるか、または改変される好ましい実施形態では、ポリペプチドはヒスチジンタグまたはビオチンタグを付けられることが好ましい。一般的に、ヒスチジンタグまたはビオチンタグの配列をコードするアミノ酸は、遺伝子レベルで含まれ、タンパク質は大腸菌において組換えによって発現される。ヒスチジンタグまたはビオチンタグは一般的に、ポリペプチドの１つの末端、Ｎ末端か、またはＣ末端のいずれかに存在する。ヒスチジンタグは一般的に、６個のヒスチジン残基からなるが、これよりも長く、一般的に、７、８、９、１０または２０個までのアミノ酸であってもよく、または短く、例えば、５、４、３、２または１個のアミノ酸であってもよい。さらに、ヒスチジンタグは、１個または複数のアミノ酸置換、好ましくは前記で定義したような保存的置換を含有してもよい。
【００２９】
ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するＥｎｄｏＳポリペプチド
この場合のＥｎｄｏＳポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスＥｎｄｏＳ、またはＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を保持するＳ．ピオゲネスＥｎｄｏＳの変異体もしくは断片であることが好ましい。変異体は、別の生物、例えば、別の細菌由来のＥｎｄｏＳポリペプチドであってもよい。細菌は好ましくは、ストレプトコッカス、例えば、ストレプトコッカス  エクイ、ストレプトコッカス  ズーエピデミカス、または、好ましくはストレプトコッカス  ピオゲネスである。あるいは、変異体は、ヒツジ偽結核菌由来、例えば、ＣＰ４０タンパク質；エンテロコッカス  フェカリス由来、例えば、ＥｎｄｏＥタンパク質；またはエリザベトキンギア  メニンゴセプティカ（以前は、フラボバクテリウム  メニンゴセプティカム）由来、例えば、ＥｎｄｏＦ２タンパク質であってもよい。様々なＳ．ピオゲネス血清型由来およびＳ．エクイおよびＳ．ズーエピデミカス由来のＥｎｄｏＳ変異体の配列を図８に示す。図９は、ＥｎｄｏＳαドメインとエリザベトキンギア  メニンゴセプティカ由来のＥｎｄｏＦ２およびヒツジ偽結核菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）由来のＣＰ４０との配列比較を示した図である。
【００３０】
ＥｎｄｏＳポリペプチドは、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するその変異体、または
（ｃ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するそのいずれかの断片
を含むことができる。
【００３１】
好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：１の配列を含むか、またはそれからなる。配列番号：１は、シグナル配列を含まない、Ｓ．ピオゲネス由来のＥｎｄｏＳの成熟形態の配列である。本発明のＥｎｄｏＳポリペプチドは、シグナル配列をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明のＥｎｄｏＳポリペプチドは、公的に入手可能で（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＡＫ００８５０）、配列番号：３として提供されるＳ．ピオゲネス由来のＥｎｄｏＳの未成熟形態のアミノ酸配列を含んでいてもよい。配列番号：１は、配列番号：３のアミノ酸３７から９９５に対応する。
【００３２】
この部分で記載した変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号：１または３のアミノ酸配列とは異なるが、ＥｎｄｏＳのＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を保持しているものである。このような変異体は、ペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を維持している限り、対立形質変異体およびタンパク質配列内の単一のアミノ酸またはアミノ酸の群の欠失、改変もしくは付加を含んでいてもよい。
【００３３】
変異体配列は一般的に、少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、１００個以上の変異（アミノ酸の置換、欠失または挿入であってもよい）によって異なる。例えば、改変したポリペプチドがＩｇＧ特異的エンドグリコシダーゼとしての活性を保持するならば、１個から１００個、２個から５０個、３個から３０個または５個から２０個のアミノ酸置換、欠失または挿入を行ってもよい。
【００３４】
配列番号：１または３のアミノ酸配列の変異体は、好ましくは配列番号：１の残基１９１から１９９、すなわち、配列番号：１のＬｅｕ−１９１、Ａｓｐ−１９２、Ｇｌｙ−１９３、Ｌｅｕ−１９４、Ａｓｐ−１９５、Ｖａｌ−１９６、Ａｓｐ−１９７、Ｖａｌ−１９８およびＧｌｕ−１９９（配列番号：３の残基２２７から２３５、すなわち、配列番号：３のＬｅｕ−２２７、Ａｓｐ−２２８、Ｇｌｙ−２２９、Ｌｅｕ−２３０、Ａｓｐ−２３１、Ｖａｌ−２３２、Ａｓｐ−２３３、Ｖａｌ−２３４およびＧｌｕ−２３５）を含有する。これらのアミノ酸は、グルタミン酸で終わるキチナーゼファミリー１８の活性部位を構成する。キチナーゼの活性部位のグルタミン酸は、酵素活性に不可欠である。最も好ましくは、配列番号：１または３の変異体は、配列番号：１の１９９位と同等の位置（配列番号：の２３５位）にグルタミン酸を含有する。配列番号：１の変異体が、配列番号：１の１９９位と同等の位置（配列番号：３の２３５位）にグルタミン酸を含有するならば、変異体は１個または複数の保存的置換を有する配列番号：１の残基１９１から１９９（配列番号：３の２２７から２３５）を含有してもよい。
【００３５】
典型的には、ＥｎｄｏＳのＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を示し、配列番号：１または３のアミノ酸配列と約５０％、５５％もしくは６５％の同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドは、そのタンパク質の変異体と見なされる。配列番号：１または３の変異体の同一性は、配列番号：１で示された配列の少なくとも１００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、少なくとも８００個、少なくとも８５０個、少なくとも９００個、少なくとも９５０個、少なくとも９５５個以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、より好ましくは配列番号：１または３の完全長にわたって測定することができる。
【００３６】
本発明で使用したＥｎｄｏＳポリペプチドの断片は一般的に、ＥｎｄｏＳのＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を保持している限り、少なくとも１０個、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０個以上のアミノ酸長、１００、２００、２５０、３００、５００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または９５５個のアミノ酸長である。好ましくは、本発明で使用したＥｎｄｏＳポリペプチドの断片は、配列番号：１の残基１９１から１９９、すなわち、配列番号：１のＬｅｕ−１９１、Ａｓｐ−１９２、Ｇｌｙ−１９３、Ｌｅｕ−１９４、Ａｓｐ−１９５、Ｖａｌ−１９６、Ａｓｐ−１９７、Ｖａｌ−１９８およびＧｌｕ−１９９（配列番号：３の残基２２７から２３５、すなわち、配列番号：３のＬｅｕ−２２７、Ａｓｐ−２２８、Ｇｌｙ−２２９、Ｌｅｕ−２３０、Ａｓｐ−２３１、Ｖａｌ−２３２、Ａｓｐ−２３３、Ｖａｌ−２３４およびＧｌｕ−２３５）を包含する。本発明の好ましい断片は、ストレプトコッカスのシステインプロテアーゼＳｐｅＢによる切断によって生じたＥｎｄｏＳの酵素的活性のあるαドメインに対応する、配列番号：１のアミノ酸１から４０９（配列番号：３のアミノ酸３７から４４５）からなる。別の好ましい断片は、シグナル配列除去後のＥｎｄｏＳの分泌型に対応する、配列番号：３のアミノ酸３７から９９５からなる。
【００３７】
本発明で使用するためのポリペプチドは、ＥｎｄｏＳポリペプチドまたはＥｎｄｏＳポリペプチドの変異体を発現する任意の適切な生物から単離することができる。一般的に、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、ストレプトコッカスの適切なＥｎｄｏＳ発現株、好ましくはＳ．ピオゲネスの株から単離する。適切な生物および株は、いくつかの技術によって同定することができる。例えば、Ｓ．ピオゲネス株は最初、ｎｄｏＳ遺伝子の存在を試験することができる。ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、例えば、配列番号：１または３に基づいて設計することができる。次に、ｎｄｏＳ遺伝子の存在は、このようなプライマーを使用してＰＣＲによって、またはＳ．ピオゲネス株のゲノムＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションによって、確認することができる。
【００３８】
活性型ＥｎｄｏＳまたはその変異体を発現するストレプトコッカス株は、培養上清中のＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性をアッセイすることによって、またはＥｎｄｏＳに特異的な抗体を使用した免疫検出によって同定することができる。活性ＥｎｄｏＳを発現することが確認されたストレプトコッカス株は、Ｓ．ピオゲネスＭ１血清型ＡＰ１株およびＳＦ３７０株、Ｓ．エクイ４０４７株およびＳ．ズーエピデミカスＨ７０株である。さらに、ｎｄｏＳ遺伝子は、以下のＳ．ピオゲネス株、Ｍ１血清型ＳＳＩ−１株およびＭＧＡＳ５００５株、Ｍ２血清型ＭＧＡＳ１０２７０株、Ｍ３血清型ＭＧＡＳ３１５株、Ｍ４血清型ＭＧＡＳ１０７５０株、Ｍ５血清型Ｍａｎｆｒｅｄｏ株、Ｍ６血清型ＭＧＡＳ１０３９４株、Ｍ１２血清型ＭＧＡＳ９４２９株、Ｍ１８血清型ＭＧＡＳ８２３２株、Ｍ２８血清型ＭＧＡＳ６１８０株およびＭ４９血清型５９１株に見出される。
【００３９】
発現しているＳ．ピオゲネス培養物またはＥｎｄｏＳを発現しているその他の細胞の培養物からのＥｎｄｏＳの単離および精製は一般的に、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性に基づいている。好ましくは、精製方法には、硫酸アンモニウム沈殿ステップおよびイオン交換クロマトグラフィーステップが関与する。一方法では、培養培地は、硫酸アンモニウムの量を漸増添加することによって分画する。硫酸アンモニウムの量は、１０から８０％であってもよい。好ましくは、培養培地は５０％硫酸アンモニウムで分画し、得られた上清はさらに７０％硫酸アンモニウムで沈殿させる。次に、ペレット化したポリペプチドはイオン交換クロマトグラフィー、例えば、Ｍｏｎｏ  ＱカラムのＦＰＬＣを行うことができる。溶出した画分は、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を測定することができ、ピーク活性画分を収集することができる。画分は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析することができる。画分は、−８０℃で保存してもよい。ＥｎｄｏＳを精製する他の方法では、シグナル配列を含まないＥｎｄｏＳ（すなわち、配列番号：１の配列を有する）は、ＧＳＴ遺伝子融合系（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して大腸菌において発現させる。ｎｄｏＳ配列の塩基３０４から３２３２を対照とする２９２９塩基対ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ部位（下線部）を含むプライマー５’−ＡＣＴ−ＧＧＧ−ＡＴＣ−ＣＣＧ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＡＧ−ＡＣＴ−３’およびＸｈｏＩ部位（下線部）を含む５’−ＴＴＡ−ＡＴＣ−ＴＣＧ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＣＴＡ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−３’を使用してＳ．ピオゲネスゲノムＤＮＡから増幅する。この断片をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓを形質転換するために使用するｐＧＥＸ−５Ｘ−３生成プラスミドｐＧＥＸｎｄｏＳに連結する。ｐＧＥＸｎｄｏＳ／ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓは、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１ｍＭで誘導される。誘導後、細菌はＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して溶解し、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ融合タンパク質はグルタチオン−セファロース（登録商標）で精製する。ＧＳＴタグは、プロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にしたがって因子Ｘａを使用して除去し、残存する因子ＸａはＸａｒｒｅｓｔ（商標）−アガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して除去する。これによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥｎｄｏＳ特異的抗体を使用したＷｅｓｔｅｒｎブロットによって評価した均一な組換えＥｎｄｏＳ（ｒＥｎｄｏＳ）の調製物が生じる。インビボ実験の前に、タンパク質試料を０．２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して滅菌濾過する。精製したＥｎｄｏＳタンパク質は、リン酸緩衝生理食塩水中で−８０℃で保存する。
【００４０】
本発明で使用するポリペプチドはまた、このように単離したポリペプチドの断片として調製することができる。さらに、ＥｎｄｏＳポリペプチドはまた、合成的に、または組換え手段によって生成することができる。例えば、組換えＥｎｄｏＳポリペプチドは、培養した哺乳類細胞を、適切な対照配列に操作可能に結合したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質移入し、細胞を培養し、細胞によって産生されたＥｎｄｏＳポリペプチドを抽出し精製することによって生成することができる。
【００４１】
この部分で記載した本発明のＥｎｄｏＳポリペプチドは、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を示す。好ましくは、このポリペプチドは、完全長ＩｇＧ重鎖ポリペプチドの残基２９７に対応するアスパラギン残基に結合した保存されたグリカンを加水分解することによって、ＩｇＧまたはＩｇＧ  Ｆｃ断片を加水分解する。好ましくは、このポリペプチドは、アスパラギン結合グリカンのβ−１，４−ジ−Ｎ−アセチルキトビオースコアを加水分解する。好ましくは、この活性はＩｇＧに特異的である。
【００４２】
エンドグリコシダーゼ活性は、適切なアッセイによって測定することができる。例えば、試験ポリペプチドは、適切な温度、例えば、３７℃でＩｇＧとインキュベートすることができる。開始物質および反応産物は、その後ＳＤＳＰＡＧＥによって分析することができる。一般的に、ＩｇＧ重鎖の分子量は、試験ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するならば、約３ｋＤａ減少する。試験ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するかどうかを決定する別のアッセイは、レンズマメアグルチニンレクチン（ＬＣＡ）を使用して、所望により、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ基質を用いて、グリコシル化ＩｇＧを検出することによる。一般的に、試験ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するならば、炭水化物シグナルは減少する。試験ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するかどうかを決定する別のアッセイは、試験ポリペプチドを精製ＩｇＧ  Ｆｃ断片とインキュベートし、その後試料をジチオスレイトール１０ｍＭで還元し、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で解析することによる。一般的に、試験ポリペプチドがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するならば、単量体ＩｇＧ  Ｆｃの質量は、１４１７±１４Ｄａ減少する。
【００４３】
ポリペプチドのエンドグリコシダーゼ活性はさらに、阻害研究（inhibition studies）によって特徴付けることができる。
【００４４】
ポリペプチドのエンドグリコシダーゼ活性は一般的にＩｇＧ特異的で、ＩｇＧの切断を可能にする条件下でその他の種類のＩｇ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとインキュベートしたとき、ポリペプチドはこれらのイムノグロブリンを分解できない。ＥｎｄｏＳポリペプチドは、対象から採取した試料に存在するＩｇＧ分子を加水分解することができる。したがって、対象がヒトである場合、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、ヒトＩｇＧの重鎖のグリカンを加水分解することができる。ＥｎｄｏＳは、ヒトＩｇＧの４種のサブクラス（ＩｇＧ１〜４）全てを加水分解することができる。好ましい実施形態では、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、ヒト、アカゲザル、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、イヌおよびブタＩｇＧを加水分解する能力を有する。
【００４５】
ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如したＥｎｄｏＳポリペプチド
この場合のＥｎｄｏＳポリペプチドは、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如するように操作されているが、ＩｇＧ結合活性を有する改変Ｓ．ピオゲネスＥｎｄｏＳであることが好ましい。ＩｇＧ結合活性によって、改変ＥｎｄｏＳは、ＩｇＧまたはその変異体もしくは断片、特に正常にグリコシル化されているそのＦｃ断片に結合すると理解されたい。「正常にグリコシル化された（normally glycosylated）」とは、ＩｇＧ分子またはその断片の変異体が、天然に存在するＩｇＧ分子に結合することが見出された少なくとも１種の炭水化物基が結合したＩｇＧポリペプチド重鎖（またはその断片の変異体）を少なくとも含む糖タンパク質であることを理解されたい。特に、少なくとも１個の炭水化物基は、完全長ＩｇＧ重鎖ポリペプチドの残基２９７に対応するアスパラギン残基に結合したグリカンである。好ましくは、アスパラギン結合グリカンは、β−１，４−ジ−Ｎ−アセチルキトビオースコアを有する。
【００４６】
ＥｎｄｏＳポリペプチドは、部位特異的変異誘発によって操作されることが好ましい。ＩｇＧ結合活性によって、この部分で記載したＥｎｄｏＳポリペプチドはＩｇＧサブクラス、ＩｇＧ１〜４の少なくとも１種、好ましくは２種、３種または４種全てに結合すると理解されたい。好ましくは、少なくとも１種のＩｇＧサブクラスは、高い親和性および／または高い特異性で結合する。
【００４７】
高い親和性とは、改変ＥｎｄｏＳとＩｇＧサブクラスとの相互作用の結合親和定数（ＫＤ）が、０．０５μＭを上回り、好ましくは０．０６μＭ、０．０７μＭまたは０．０８μＭを上回ることを意味する。結合活性は測定することができ、結合親和性は任意の適切な手段によって評価することができる。例えば、表面プラズモン共鳴相互作用解析、平衡透析分析、または、例えば、スキャッチャード分析と併用した任意の標準的生化学的方法による。
【００４８】
高い特異性とは、ＩｇＧへの結合を可能にする条件下でその他の種類のＩｇ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとインキュベートしたとき、ポリペプチドがこれらのイムノグロブリンと結合できないことを意味する。
【００４９】
この場合の変異体はＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如しているが、ＩｇＧ結合活性を有すことを除いて、前記の部分で記載されているように、変異体は、別の生物、例えば、別の細菌のＥｎｄｏＳポリペプチドから得ることができる。改変ＥｎｄｏＳポリペプチドは、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如したその変異体、または
（ｃ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如したそのいずれかの断片
を含むことができる。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：２の配列を含むか、またはそれからなる。配列番号：２は、配列番号：１の配列から得られるが、配列番号：１の１９９位のグルタミン酸（Ｅ）をグルタミン（Ｑ）に置換することによってＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如するように操作されている。これは、配列番号：３（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＡＫ００８５０）の２３５位に対応しており、この特定の改変をＥ２３５Ｑと称する。このようなポリペプチドは一般的に、前述のようにＩｇＧ結合活性を有する。
【００５０】
この部分で記載した変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号：２の配列とは異なるが、ＥｎｄｏＳのＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、ＩｇＧ結合活性を保持しているものである。このような変異体は、ペプチドが前記の特性を保持している限り、対立形質変異体およびタンパク質配列内の単一のアミノ酸またはアミノ酸の群の欠失、改変もしくは添加を含むことができる。
【００５１】
変異体配列は一般的に、少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、５０または１００個以上の変異（アミノ酸の置換、欠失または挿入であってもよい）によって異なる。例えば、改変ポリペプチドがＩｇＧ特異的エンドグリコシダーゼの活性を欠如し、ＩｇＧ結合活性を保持するならば、１個から１００個、２個から５０個、３個から３０個または５個から２０個のアミノ酸置換、欠失または挿入を行ってもよい。
【００５２】
配列番号：２のアミノ酸配列の変異体は、好ましくは配列番号：２の残基１９１から１９９、すなわち、配列番号：２のＬｅｕ−１９１、Ａｓｐ−１９２、Ｇｌｙ−１９３、Ｌｅｕ−１９４、Ａｓｐ−１９５、Ｖａｌ−１９６、Ａｓｐ−１９７、Ｖａｌ−１９８およびＧｌｕ−１９９（配列番号：１の残基１９１から１９９と同等）を含有する。これらのアミノ酸は、Ｃ末端グルタミン酸がグルタミンで置換されていること以外は、配列番号：１におけるようにキチナーゼファミリー１８活性部位を構成する。キチナーゼの活性部位のグルタミン酸は、酵素活性に不可欠である。したがって、最も好ましくは、配列番号：２の変異体は、配列番号：２の１９９位と同等の位置にグルタミンを含有する。変異体が、配列番号：２の１９９位と同等の位置にグルタミン酸を含有しないならば、配列番号：２の変異体は、１個または複数の保存的置換を有する配列番号：２の残基１９１から１９９を含有することができる。
【００５３】
典型的には、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、ＩｇＧ結合活性を保持し、配列番号：２のアミノ酸配列と約５０％、５５％もしくは６５％の同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドは、そのタンパク質の変異体と見なされる。配列番号：２の変異体の同一性は、配列番号：２で示された配列の少なくとも１００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、少なくとも８００個、少なくとも８５０個、少なくとも９００個、少なくとも９５０個、少なくとも９５５個以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、より好ましくは配列番号：２の完全長にわたって測定することができる。
【００５４】
本発明で使用したＥｎｄｏＳポリペプチドの断片は一般的に、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、ＩｇＧ結合活性を保持している限り、少なくとも１０個、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０個以上のアミノ酸長、１００、２００、２５０、３００、５００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または９５５個までのアミノ酸長である。好ましくは、この場合本発明で使用したＥｎｄｏＳポリペプチドの断片は、配列番号：２の残基１９１から１９９、すなわち、配列番号：２のＬｅｕ−１９１、Ａｓｐ−１９２、Ｇｌｙ−１９３、Ｌｅｕ−１９４、Ａｓｐ−１９５、Ｖａｌ−１９６、Ａｓｐ−１９７、Ｖａｌ−１９８およびＧｌｎ−１９９を包含する。本発明の好ましい断片は、配列番号：２のアミノ酸１から４０９（ストレプトコッカスのシステインプロテアーゼＳｐｅＢによる切断によって生じたＥｎｄｏＳの酵素活性のあるαドメインに対応するアミノ酸）からなる。
【００５５】
ＥｎｄｏＳを発現するストレプトコッカス株またはＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、ＩｇＧ結合活性を保持しているその変異体は、ＥｎｄｏＳに特異的な抗体を使用した免疫検出、その後の前述したようなＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性およびＩｇＧ結合活性のアッセイによって同定することができる。活性型ＥｎｄｏＳを発現することが確認されたストレプトコッカス株は、前記の部分で記載する。これらの株は、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、ＩｇＧ結合活性を保持しているＥｎｄｏＳポリペプチドの発現が可能な良好な候補である。発現しているＳ．ピオゲネス培養物からのＥｎｄｏＳの単離および精製も前記に記載する。
【００５６】
他の方法では、所望する特性を備えたＥｎｄｏＳタンパク質は、ＥｎｄｏＳタンパク質をコードするヌクレオチドを改変し、次に適切な系で前記ヌクレオチドを発現することによって生成することができる。適切な方法には、タンパク質をコードするヌクレオチドの部位特異的変異誘発が含まれる、この技術は、タンパク質機能の研究で広く使用されてきた。この技術は一般的に、オリゴヌクレオチドをベースにしており、以下のステップを含む。
（１）プラスミドベクターに挿入する対象のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするステップ。
（２）１本鎖を生成するためにプラスミドＤＮＡを変性させるステップ。
（３）合成オリゴヌクレオチドが標的領域にアニールするように、変性したＤＮＡと、標的配列に相補的であるが所望する変異（複数可）（点突然変異、欠失または挿入）を組み込んだ合成オリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド類）とを接触させる、ステップ。
（４）鋳型としてプラスミドＤＮＡ鎖を使用してＤＮＡポリメラーゼによって変異した鎖を伸長するステップ。
（５）大腸菌での形質転換によってヘテロ２本鎖（変異／非変異鎖）を増殖させるステップ。
【００５７】
増殖後、生成したヘテロ２本鎖の約５０％は変異型で、その他の５０％は「野生型」（変異なし）である。選択および濃縮方法は、変異型の生成に都合良いように使用される。例えば、未変異の親鎖は、メチル化ＤＮＡのみを消化する制限酵素（ＤｐｎＩ）で消化することができる。新たに合成された鎖がメチル化されておらず、一方、親鎖（正しい大腸菌バックグラウンドから精製されたならば）はメチル化されているので、これによって、大腸菌を形質転換する前に反応から親鎖を除去することが可能である。
【００５８】
他の部位特異的変異誘発には、
（１）特異的変異誘発プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースにした方法、または後でタンパク質機能の所望する変異もしくは欠如／獲得をスクリーニングするエラープローンＰＣＲ、
（２）対象とする遺伝子を有するプラスミドの大腸菌変異株（ＤＮＡ校正系を欠如している）への導入およびその後の所望する変異またはタンパク質機能の欠如／獲得のスクリーニング、
（３）所望する変異を含有する部分的遺伝子または完全な遺伝子の化学的合成およびその後の適切なタンパク質発現系への導入が含まれる。
【００５９】
あるいは、所望する特性を備えたＥｎｄｏＳタンパク質は、所望する変異を有するポリペプチドの一部の化学的合成を含むＤＮＡ依存的方法によって生成することができる。
【００６０】
本発明で使用するためのポリペプチドはまた、このように単離したポリペプチドの断片として調製することができる。さらに、ＥｎｄｏＳポリペプチドはまた、合成的に、または組換え手段によって生成することができる。例えば、組換えＥｎｄｏＳポリペプチドは、培養した哺乳類細胞を、適切な対照配列に操作可能に結合したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質移入し、細胞を培養し、細胞によって産生されたＥｎｄｏＳポリペプチドを抽出し精製することによって生成することができる。
【００６１】
ポリペプチドのＩｇＧ結合活性は一般的にＩｇＧ特異的であり、結合相互作用を可能にする条件下でその他の種類のＩｇ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとインキュベートしたとき、ポリペプチドがこれらのイムノグロブリンに結合できない。ＥｎｄｏＳポリペプチドは、対象から採取した試料に存在するＩｇＧ分子に結合することができる。したがって、対象がヒトである場合、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、ヒトＩｇＧに結合することができる。ＥｎｄｏＳは、４種のサブクラス（ＩｇＧ１〜４）全てのヒトＩｇＧに結合することができる。好ましい実施形態では、ＥｎｄｏＳポリペプチドは、ヒト、アカゲザル、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、イヌおよびブタＩｇＧに結合する能力を有する。
【００６２】
ＩｄｅＳ
ＩｄｅＳは、ヒト病原体Ｓ．ピオゲネスによって産生される細胞外システインプロテアーゼであり、ＷＯ０３／０５１９１４に記載されている。ＩｄｅＳは元々、血清型Ｍ１のＡ群ストレプトコッカス株から単離されたが、ｉｄｅｓ遺伝子は、今では試験されたＡ群ストレプトコッカス株全てで同定されている。ＩｄｅＳは、基質特異性が極端に高く、唯一同定された基質はＩｇＧである。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧの低いヒンジ領域の単一のタンパク質分解切断を触媒する。このタンパク質分解は、Ａ群ストレプトコッカスの殺滅を妨害するオプソニン化貪食作用の阻害を促進する。ＩｄｅＳはまた、様々な動物のＩｇＧのいくつかのサブクラスを切断し、ＩｇＧをＦｃおよびＦａｂ断片に効率よく変換する。ｉｄｅｓ遺伝子をクローニングし、ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で発現させた。
【００６３】
本発明の方法で使用するためのＩｄｅＳポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスＩｄｅＳ、またはシステインプロテアーゼ活性を保持するＳ．ピオゲネスＩｄｅＳの変異体もしくは断片であることが好ましい。変異体は、別の生物、例えば、別の細菌のＩｄｅＳポリペプチドであってもよい。細菌はストレプトコッカスが好ましい。ストレプトコッカスは、Ａ群ストレプトコッカス、Ｃ群ストレプトコッカスまたはＧ群ストレプトコッカスが好ましい。特に、変異体は、Ｃ群ストレプトコッカス、例えば、Ｓ．エクイまたはＳ．ズーエピデミカスのＩｄｅＳポリペプチドであってもよい。あるいは、変異体は、シュードモナス  プチダ由来であってもよい。
【００６４】
ＩｄｅＳポリペプチドは、
（ａ）配列番号：８のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するその変異体、または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそのいずれかの断片
を含むことができる。
【００６５】
好ましくは、ＩｄｅＳポリペプチドは、配列番号：８の配列を含むか、またはそれからなる。配列番号：８は、シグナル配列を含まないＩｄｅＳの成熟形態の配列であり、配列番号：９のアミノ酸３０から３３９に対応する。
【００６６】
変異体ＩｄｅＳポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号：８のアミノ酸配列とは異なるが、ＩｄｅＳと同様のＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を示すものである。一般的に、配列番号：８のアミノ酸と約５０％、５５％または６５％を上回る同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドは、タンパク質の変異体と見なされる。このような変異体には、ペプチドがＩｄｅＳの基本的機能を保持している限り、対立形質変異体およびタンパク質配列内の単一のアミノ酸またはアミノ酸の群の欠失、改変もしくは添加を含むことができる。配列番号：８の変異体の同一性は、配列番号：８で示された配列の少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも２７５個、少なくとも３００個以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、より好ましくは配列番号：８の完全長にわたって測定することができる。
【００６７】
配列番号：８のアミノ酸配列の変異体は、配列番号：８の残基Ｌｙｓ−５５および／またはＣｙｓ−６５および／またはＨｉｓ−２３３および／またはＡｓｐ−２５５および／またはＡｓｐ−２５７を含有することが好ましい。配列番号：８の変異体は、配列番号：８の残基Ｌｙｓ−５５、Ｃｙｓ−６５、Ｈｉｓ−２３３、Ａｓｐ−２５５およびＡｓｐ−２５７を含有することが最も好ましい。
【００６８】
変異体配列は一般的に、少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０個以上の変異（アミノ酸の置換、欠失または挿入であってもよい）によって異なる。例えば、１個から５０個、２個から３０個、３個から２０個または５個から１０個のアミノ酸置換、欠失または挿入を行ってもよい。改変ポリペプチドは、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼとしての活性を保持する。好ましくは、変異体ポリペプチドは、システインプロテアーゼに一般的に見出された間隔でシステイン残基およびヒスチジン残基を含む。例えば、配列番号：８において、これらの残基は、通常、システインプロテアーゼに見出されるように、アミノ酸約１３０個の間隔で見出される。
【００６９】
本発明で使用したＩｄｅＳポリペプチドの断片は一般的に、ＩｄｅＳのＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を保持している限り、少なくとも１０個、例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０個以上のアミノ酸長、１００、１５０、２００、２５０または３００個までのアミノ酸長である。好ましくは、本発明で使用したＩｄｅＳポリペプチドの断片は、配列番号：１の残基Ｌｙｓ−５５および／またはＣｙｓ−６５および／またはＨｉｓ−２３３および／またはＡｓｐ−２５５および／またはＡｓｐ−２５７を包含する。断片が配列番号：８の残基Ｌｙｓ−５５、Ｃｙｓ−６５、Ｈｉｓ−２３３、Ａｓｐ−２５５およびＡｓｐ−２５７のそれぞれを包含することが最も好ましい。
【００７０】
本発明にしたがって使用するためのＩｄｅＳポリペプチドは、イムノグロブリンシステインプロテアーゼ活性、特にＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を示す。好ましくは、このポリペプチドはＩｇＧをヒンジ領域で、さらに詳細には重鎖のヒンジ領域で切断する。切断によって、ＩｇＧのＦｃ断片およびＦａｂ断片の生成が生じる。好ましくは、活性はＩｇＧに特異的である。システインプロテアーゼ活性は、適切なアッセイによって測定することができる。例えば、試験ポリペプチドは、適切な温度、例えば、３７℃でＩｇＧと一緒にインキュベートすることができる。開始物質および反応産物は、所望するＩｇＧ切断産物が存在するかどうかを決定するために、その後ＳＤＳＰＡＧＥによって分析することができる。一般的に、この切断産物は３１ｋＤａ断片である。一般的に、この最初の切断の後、さらにＩｇＧの分解は起こらない。切断産物は、切断がＩｇＧのヒンジ領域で生じることを確認するために、Ｎ末端配列決定を行うことができる。好ましくは、Ｎ末端配列は配列ＧＰＳＶＦＬＦＰを含む。
【００７１】
ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性はさらに、阻害研究によって特徴付けることができる。好ましくは、活性は、いずれもプロテアーゼ阻害剤であるペプチド誘導体Ｚ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２によって、および／またはヨード酢酸によって阻害される。しかし、活性は通常、Ｅ６４によっては阻害されない。
【００７２】
ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は一般的にＩｇＧ特異的で、ＩｇＧの切断を可能にする条件下でその他の種類のＩｇ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとインキュベートしたとき、ポリペプチドがこれらのイムノグロブリンを分解できない。ＩｄｅＳポリペプチドは、ヒトＩｇＧを切断することができる。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、ヒト、ウサギ、マウスまたはヤギＩｇＧを切断する能力を有する。
【００７３】
本発明で使用するためのＩｄｅＳポリペプチドは、ＩｄｅＳポリペプチドを発現する任意の適切な生物から単離することができる。一般的に、ＩｄｅＳポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスの適切なＩｄｅＳ発現株から単離する。適切な生物および株は、いくつかの技術によって同定することができる。例えば、Ｓ．ピオゲネス株は最初、ｉｄｅｓ遺伝子の存在を試験することができる。ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、例えば、配列番号：８、９または１０に基づいて設計することができる。次に、ｉｄｅｓ遺伝子の存在は、プライマーを使用したＰＣＲによって、またはＳ．ピオゲネス株のゲノムＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションによって、確認することができる。
【００７４】
活性型ＩｄｅＳを発現するＳ．ピオゲネス株は、培養上清中のＩｇＧシステインプロテアーゼ活性をアッセイすることによって同定することができる。いかなるＳｐｅＢシステインプロテアーゼ活性も阻害するために、阻害剤Ｅ６４を上清に添加することが好ましい。少なくとも５種類の株、ＡＰ１、ＡＰ１２、ＡＰ５５、ＫＴＬ３およびＳＦ３７０株は活性型ＩｄｅＳを発現する。好ましくは、発現株は、ＡＰ１、ＡＰ１２およびＡＰ５５から選択される。
【００７５】
発現しているＳ．ピオゲネス培養物またはＩｄｅＳを発現しているその他の細胞の培養物からのＩｄｅＳの単離および精製は一般的に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性に基づいている。好ましくは、精製方法は、硫酸アンモニウム沈殿ステップおよびイオン交換クロマトグラフィーステップを含む。一方法では、培養培地は、硫酸アンモニウムの量を漸増添加することによって分画する。硫酸アンモニウムの量は、１０から８０％であってもよい。好ましくは、培養培地は５０％硫酸アンモニウムで分画し、得られた上清はさらに７０％硫酸アンモニウムで沈殿させる。次に、ペレット化したポリペプチドはイオン交換クロマトグラフィー、例えば、Ｍｏｎｏ  ＱカラムによるＦＰＬＣを行う。溶出した画分は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を測定することができ、ピーク活性画分を収集することができる。画分は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析することができる。例えば、Ｎ末端配列は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥタンパク質バンドから得ることができる。画分は、−２０℃で保存してもよい。
【００７６】
Ｆｃ結合タンパク質
本発明の方法で使用するために好ましいＦｃ結合タンパク質は、前述の関連した部分で記載したようなエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドである。本発明の改変ＥｎｄｏＳポリペプチドは、正常にグリコシル化されるならば、ＩｇＧサブクラス全てのＦｃ断片に結合する。
【００７７】
本発明の方法で使用するために好ましい別のＦｃ結合タンパク質は、プロテインＨである。プロテインＨは、Ｓ．ピオゲネスによって発現し、ＥＰ−Ａ−０３７１１９９およびＷＯ９１／１０７４０に記載されている。プロテインＨは、特徴的な一連のイムノグロブリン結合特性、例えば、ＩｇＧのＦｃ部分への結合を有する。これはアルブミンに結合することもできる。プロテインＨ内ではいくつかの領域が同定されており、Ｓ、Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＤ領域と表されている。ＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインはＡＢ領域に存在し、一方、Ｃ反復（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）は、アルブミン結合に関与する。プロテインＨはまた、核を標的とし、細胞分裂停止効果を有することが見出された。
【００７８】
本発明の方法で使用するためのプロテインＨポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスプロテインＨ、またはＩｇＧ  Ｆｃ結合活性を保持するＳ．ピオゲネスプロテインＨの変異体もしくは断片であることが好ましい。変異体は、別の生物、例えば、別の細菌のプロテインＨポリペプチドであってもよい。細菌はストレプトコッカスが好ましい。
【００７９】
プロテインＨポリペプチドは、
（ａ）配列番号：１１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、ＩｇＧ  Ｆｃ結合活性を有するその変異体、または
（ｃ）ＩｇＧ  Ｆｃ結合活性を有するそのいずれかの断片
を含むことができる。
【００８０】
好ましくは、プロテインＨポリペプチドは、配列番号：１１の配列を含むか、またはそれからなる。配列番号：１１は、シグナル配列を含まないプロテインＨの成熟形態の配列であり、配列番号：１２のアミノ酸４２から３７６に対応する。
【００８１】
変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号：１１のアミノ酸配列とは異なるが、プロテインＨと同様のＩｇＧ  Ｆｃ結合活性を保持しているものである。一般的に、配列番号：１１のアミノ酸と約５０％、５５％または６５％を上回る同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドは、タンパク質の変異体と見なされる。このような変異体は、ペプチドがプロテインＨの基本的機能を保持している限り、対立形質変異体およびタンパク質配列内の単一のアミノ酸またはアミノ酸の群の欠失、改変もしくは添加を含むことができる。配列番号：１１の変異体の同一性は、配列番号：１１で示された配列の少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも２７５個、少なくとも３００個以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、より好ましくは配列番号：１１の完全長にわたって測定することができる。
【００８２】
配列番号：４のアミノ酸配列の変異体は、ＩｇＧ  Ｆｃ結合に関与する残基を含有するプロテインＨのＮ末端ＡＢ領域である配列番号：１１のアミノ酸１から１１７を含有することが好ましい。このような変異体は、プロテインＨのＩｇＧ  Ｆｃ結合領域の一部である配列番号：１１の残基８４から１０８を含有することが最も好ましい。プロテインＨの変異体は、プロテインＨのＣ反復（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）、すなわち、配列番号：１１のアミノ酸１１８から２４２を含有することが好ましい。
【００８３】
変異体配列は一般的に、少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０個以上の変異（アミノ酸の置換、欠失または挿入であってもよい）によって異なる。例えば、１個から５０個、２個から３０個、３個から２０個または５個から１０個のアミノ酸置換、欠失または挿入を行ってもよい。改変ポリペプチドは、ＩｇＧ  Ｆｃ結合活性を保持する。
【００８４】
本発明で使用したプロテインＨポリペプチドの断片は一般的に、プロテインＨのＩｇＧ  Ｆｃ結合活性を保持している限り、少なくとも１０個、例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０個以上のアミノ酸長、１００、１５０、２００、２５０、３００または３２５個までのアミノ酸長である。好ましくは、本発明で使用したプロテインＨポリペプチドの断片は、配列番号：１１の残基８４から１０８を包含する。配列番号：１１の好ましい断片には、プロテインＨのＮ末端ＡＢ領域であり、ＩｇＧ  Ｆｃ結合に関与する領域を含有する配列番号：１１のアミノ酸１から１１７、配列番号：１１のアミノ酸１から１０８、Ｎ末端Ａ領域である配列番号：１１のアミノ酸１から８０、配列番号：１１のアミノ酸１から７７、プロテインＨのＢ領域である配列番号：１１のアミノ酸８１から１１７、大腸菌において組換えによって産生されたプロテインＨの形態である配列番号：１１のアミノ酸１から３０５、ストレプトコッカスのシステインプロテアーゼの作用によってストレプトコッカスの細胞表面から切断されたプロテインＨの形態である配列番号：１１のアミノ酸１から２８５が含まれる。
【００８５】
本発明にしたがって使用するためのポリペプチドは、ＩｇＧ  Ｆｃ結合活性を示す。ＩｇＧ  Ｆｃ結合活性は、適切なアッセイ、例えば、ウェスタンブロットもしくはプローブとして放射標識ＩｇＧ  Ｆｃを使用したスロットブロット分析によって、またはＥＬＩＳＡによって、例えば、Ｆｒｉｃｋら（１９９４）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：１４３〜１５１に記載されたように測定することができる。
【００８６】
プロテインＨポリペプチドのＩｇＧ  Ｆｃ結合活性はさらに、阻害研究によって特徴付けることができる。例えば、放射標識プロテインＨのポリアクリルアミドビーズに固定したＩｇＧ  Ｆｃへの結合は、例えば、Ｆｒｉｃｋら（１９９４）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：１４３〜１５１に記載されたように、プロテインＨポリペプチドで阻害することができる。
【００８７】
プロテインＨポリペプチドのＦｃ結合活性は一般的にＩｇＧ特異的で、ＩｇＧへの結合を可能にする条件下でその他の種類のＩｇ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとインキュベートしたとき、ポリペプチドはこれらのイムノグロブリンに結合できない。プロテインＨポリペプチドは、ヒトＩｇＧに結合することができる。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、ヒト、ウサギおよびヒヒＩｇＧを切断する能力を有する。
【００８８】
本発明で使用するためのプロテインＨポリペプチドは、プロテインＨを発現する任意の適切な生物から単離することができる。一般的に、プロテインＨポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスの適切なプロテインＨ発現株から単離する。適切な生物および株は、いくつかの技術によって同定することができる。例えば、Ｓ．ピオゲネス株は最初、プロテインＨをコードする遺伝子の存在を試験することができる。ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、例えば、配列番号：１１，１２または１３をベースにして設計することができる。次に、プロテインＨをコードする遺伝子の存在は、プライマーを使用してＰＣＲによって、またはＳ．ピオゲネス株のゲノムＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションによって、確認することができる。
【００８９】
活性型プロテインＨを発現するＳ．ピオゲネス株は、培養上清中のＩｇＧ結合活性を測定することによって同定することができる。活性型プロテインＨを発現するＳ．ピオゲネスの株は、Ｍ１血清型に属する株、例えば、ＡＰ１である。
【００９０】
発現するＳ．ピオゲネス培養物からの、またはプロテインＨを発現するその他の細胞の培養物からのプロテインＨの単離および精製は一般的に、ＩｇＧ結合活性をベースにしている。好ましくは、精製方法には、セファロースに結合させたＩｇＧを使用したアフィニティークロマトグラフィーステップが含まれる。
【００９１】
前記と類似の考察を、本発明の方法で使用することができるその他の適切なＦｃ結合タンパク質に適用する。例えば、プロテインＧ（一般的に、ストレプトコッカス細菌由来）、プロテインＡ（一般的にスタフィロコッカス細菌由来）およびプロテインＡ／Ｇ（プロテインＡおよびプロテインＧ両方のＩｇＧ結合ドメインを一緒にする組換え融合タンパク質）の１つまたは複数は、本発明の方法においてプロテインＨの代わりに、またはプロテインＨに加えて使用することができる。これらのタンパク質は、いずれも哺乳類のイムノグロブリンのＦｃ領域に結合する能力を有する微生物由来の天然タンパク質および組換えタンパク質として良く特徴付けられている。様々なタンパク質とイムノグロブリンとの相互作用は、抗体サブクラス全てについて同等ではなく、ＩｇＧ特異的Ｆｃ結合活性を備えたＦｃ結合タンパク質が好ましいと理解されよう。
【００９２】
ＦｃγＲに結合したＩｇＧ分子を実質的に含まない細胞集団の単離方法
４種類のサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類されたＩｇＧは、様々な活性化プロファイルをもたらす様々な種類のＦｃγＲと相互作用することが記載されている。ＦｃγＲは、体液性および細胞性免疫応答の間の連携をもたらす。食細胞は、構造的および機能的相同性ならびにＩｇＧのＣＨ２領域上の特異的認識部位を特徴とする、３種類のＩｇＧ−Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩの構成要素を発現する。病原体−ＩｇＧ複合体のＦｃγＲへの結合は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣＣ）、エンドサイトーシス、食作用、酸化的バースト、炎症媒介物の放出などを引き起こすシグナルのカスケードを開始することによって、病原体に対する宿主の重要な応答を媒介する。複合体化したＩｇＧ−ＦｃγＲは、補体のＣ１ｑ成分の活性化の他に、その他のリガンド、例えば、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）、新生児受容体ＦｃＲｎ、マンノース受容体（ＭＲ）なども活性化することができる。ＦｃγＲは、構造的に造血細胞上で発現することができ、サイトカインおよびその他の薬剤によって誘導または上方制御することができる。ＦｃγＲは、ＩｇＧ媒介エフェクター刺激を活性化および阻害する両方の能力を備えた、免疫系の活性化シグナル（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａ）と阻害シグナル（ＦｃγＲＩＩｂ）の均衡に関与する。
【００９３】
したがって、ＦｃγＲによって媒介される効果は、免疫の研究において非常に興味深い。しかし、対象または個体から単離された細胞には一般的にＦｃγＲに結合したＩｇＧが予め負荷されているので、このような効果の評価は、インビトロでは複雑である。したがって、受容体はブロックされており、さらなる分析を妨げている。細胞にさらに損傷を与えることなく、ＦｃγＲから結合したＩｇＧを取り除くための適切な試薬は当業界では存在しない。したがって、研究者らはやむをえず、ＩｇＧなしで培養することができるＦｃγＲ発現細胞系を使用してきた。これでは、対象から単離した天然細胞の近似しかもたらされず、したがって、この分野の研究は妨げられてきた。本発明者らは、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するＥｎｄｏＳポリペプチドがＩｇＧの全サブクラスを加水分解することができ、ＦｃγＲへの結合を防御することを示した。さらに、本発明者らは、細胞とＥｎｄｏＳとの接触がＦｃγＲからの結合ＩｇＧの遊離を導くことを示した。したがって、以前細胞系に限定されてきた研究は、今では天然の細胞で実施することが可能である。これによって、例えば、ＩｇＧ／受容体親和性、反応速度論および細胞当たりの受容体数の計算の研究が可能で、細胞系ではなく天然の細胞においてＦｃ媒介シグナル伝達現象が解明されるだろう。
【００９４】
したがって、本発明は、Ｆｃγ受容体結合ＩｇＧ分子を実質的に含まない細胞集団を単離する方法であって、細胞含有試料をＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させるステップと、細胞を接触した試料から分離するステップとを含み、それによって前記細胞集団を得る方法を提供する。
【００９５】
細胞含有試料は、対象または個体から採取した血液または血清試料であってもよく、あるいは細胞培養培地であってもよい。対象または個体は、ヒトであることが好ましいが、動物であってもよく、好ましくはアカゲザル、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、イヌおよびブタから選択される。
【００９６】
細胞含有試料は、ポリペプチドと細胞との間の相互作用を起こさせ、エンドグリコシダーゼ活性を生じさせるために適切な条件下でＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させる。適切な条件には、ＥｎｄｏＳを少なくとも１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌの濃度、好ましくは少なくとも１０μｇ／ｍｌで使用することが含まれる。適切な条件にはまた、細胞含有試料とＥｎｄｏＳを少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分または１２０分、好ましくは少なくとも９０分インキュベートすることが含まれる。インキュベーションは、好ましくは室温で、より好ましくは、約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃または４５℃、最も好ましくは約３７℃で行う。
【００９７】
細胞は、任意の適切な手段によって接触した試料から分離する。適切な手段には、生細胞の分離を引き起こす手段が含まれる。したがって、これらの手段には、細胞に障害を与えず、細胞において炎症応答を誘導しない方法が含まれる。適切な手段には、例えば、細胞の穏やかな洗浄が含まれる。穏やかに洗浄することは、細胞含有試料を少なくとも１回約１０００×ｇで約５分間遠心し、その後上清を吸引し、適切な新鮮な細胞培養培地にペレットを再懸濁することを包含するものとする。遠心、吸引および再懸濁のステップは、好ましくは少なくとも１、２、３、４回、または好ましくは５回繰り返す。
【００９８】
他の手段には、ＥｎｄｏＳポリペプチドを試料から除去するための方法、または切断したＩｇＧを試料から除去する方法を含めてもよい。ＥｎｄｏＳを試料から除去する好ましい方法には、前述のように誘導体化または改変ＥｎｄｏＳの使用が含まれる。
【００９９】
好ましい改変には、ヒスチジンタグの添加が含まれる。ヒスチジンタグの存在は、ポリペプチドが表面上にニッケル、銅または亜鉛イオンを有するキレート基を含有する試薬または分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ヒスチジンタグは、これらの金属イオンに強力に結合する。したがって、このような試薬は、ＥｎｄｏＳを試料から分離するために使用することができる。
【０１００】
別の好ましい改変には、ビオチンタグの添加が含まれる。ビオチンタグの存在は、ポリペプチドがストレプトアビジンを含む試薬または分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ビオチンタグは、ストレプトアビジンに強力に結合する。したがって、このような試薬は、ＥｎｄｏＳを試料から分離するために使用することができる。
【０１０１】
好ましい試薬および分離手段は、ＥｎｄｏＳポリペプチドを結合できる磁性粒子の集団である。例えば、ＥｎｄｏＳポリペプチドがヒスチジンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は表面上にニッケル、銅または亜鉛イオンを有するキレート基を含有する。あるいは、ＥｎｄｏＳポリペプチドがビオチンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は表面上にストレプトアビジンを含有する。
【０１０２】
したがって、試料からＥｎｄｏＳを除去する好ましい方法は、前述のような磁性粒子の集団を使用するステップと、試料上に磁場分離を実施するステップとを含む。磁性粒子は、磁性ナノ粒子であることが好ましく、磁場分離は、高勾配磁場分離であることが好ましい。
【０１０３】
いかなる適切な分離手段を使用してもよいことを理解されたい。例えば、超遠心および超音波をベースにした分離技術を使用してもよい。他の例として、一実施形態では、分離手段は、固体支持体を含む。好ましい固体支持体には、アフィニティークロマトグラフィーカラムにおいてマトリクスとして使用できる架橋アガロースビーズ、または類似物が含まれる。あるいは、固体支持体は、適切なシリカをベースにした物質またはポリスチレンを含むことができる。一実施形態では、固体支持体は、分離すべきポリペプチドを直接吸着できるプラスティック容器、例えば、マイクロタイタープレートまたは同等物を含むことができる。
【０１０４】
あるいは、分離手段には、当業界で標準の方法によって作製することができる、分離すべきポリペプチドに特異的な抗体を含む試薬が含まれる。この意味での抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、１本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体またはヒト化抗体が含まれる。抗体は、完全なイムノグロブリン分子またはその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片であってもよい。複数の抗体が存在する場合、抗体は、ポリペプチドに同時に結合できるように様々な非重複決定因子を有することが好ましい。抗体は、固体支持体に結合することができるか、または分離もしくは単離を支援する他の化学基もしくは分子で標識するか、または結合させることができる。例えば、一般的な化学基には、蛍光標識、例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）もしくはフィコエリスリン（ＰＥ）、またはタグ、例えば、ビオチンが含まれる。
【０１０５】
さらに他の手段はさらに、Ｆｃγ−受容体から解離したＩｇＧの除去方法を含むことができる。解離したＩｇＧは、グリコシル化されていない、および／または変性形態のＩｇＧを結合できる代替のＩｇＧ結合試薬を添加することによって、試料から除去できた。適切な作用物質には、プロテインＡおよびプロテインＧが含まれる。これらの作用物質は次に、試料から分離し、それによって解離したＩｇＧを除去することができる。代替のＩｇＧ結合試薬は、分離を支援するために、ＥｎｄｏＳについて前述したように誘導体化もしくは改変することができる。好ましい代替のＩｇＧ結合試薬は、前述した誘導体化または改変ＥｎｄｏＳのように同様の分離手段と相互作用するように誘導体化または改変されるだろう。例えば、代替のＩｇＧ結合試薬は、誘導体化または改変ＥｎｄｏＳのように同様の磁性粒子集団と相互作用するように誘導体化または改変することができた。ＥｎｄｏＳポリペプチドおよび代替のＩｇＧ結合試薬はいずれもその後、磁場分離によって試料から除去することができる。
【０１０６】
試料中のＩｇＧの有無を決定する方法またはＩｇＧ含有試料からＩｇＧを単離する方法
ＩｇＧの単離および／または検出は一般的に、プロテインＧまたはプロテインＡのような薬剤を使用して当技術で実施される。これらの細菌タンパク質は、ＩｇＧと十分に相互作用する。しかし、プロテインＡは、４種類のＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１〜４）全てと結合せず、プロテインＡおよびプロテインＧはどちらも、グリコシル化されておらず、かつ／または変性した不活性型ＩｇＧと、グリコシル化した、かつ／または天然の機能的に活性のあるＩｇＧとを区別することができない。それに反して、本発明者らは、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如したＥｎｄｏＳポリペプチドは一般的に高い親和性で４種類のＩｇＧサブクラス全てと結合し、正常にグリコシル化されたＩｇＧ、すなわち、天然の機能的に活性のある形態のＩｇＧに選択的であることを同定した。
【０１０７】
したがって、本発明は、試料中のＩｇＧの有無を決定する改善された方法であって、前記試料を、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如したＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させるステップと、接触試料から前記ＥｎｄｏＳを分離するステップと、それによってＩｇＧの有無を決定するステップと、所望により、ＩｇＧが存在する場合、単離されたＩｇＧを得るステップとを含む方法を提供する。したがって、本発明はまた、ＩｇＧ含有試料からＩｇＧを単離する方法であって、前記試料を、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如したＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させるステップと、接触試料から前記ＥｎｄｏＳを分離するステップとを含み、それによって単離されたＩｇＧを得る方法を提供する。
【０１０８】
前記試料は、ポリペプチドと試料との間の相互作用を起こさせ、ＩｇＧ結合活性を生じさせるため、すなわち、ＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体の形成を可能にするために適切な条件下でＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させる。適切な条件には、ＥｎｄｏＳを少なくとも１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度で使用することが含まれる。適切な条件にはまた、試料とＥｎｄｏＳを少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分または１２０分、好ましくは少なくとも６０分インキュベートすることが含まれる。インキュベーションは、好ましくは室温で、より好ましくは、約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃または４５℃、最も好ましくは約３７℃で行う。
【０１０９】
これらの方法におけるＥｎｄｏＳの特定の利点は、ＥｎｄｏＳが正常なグリコシル化ＩｇＧに特異的に結合することである。その他のＩｇＧ結合剤のＩｇＧ結合活性は通常、ＩｇＧ糖タンパク質の変性を必要とし、それによって増強される。これは一般的に、ＩｇＧ含有試料を酸で処理することによって実施される。このような処理は、いくつかの抗体（酸感受性抗体）に損傷を与え、変性させ得る。本発明の方法はこのような処理を必要としないので、この方法は試料から天然の形態（native form）で酸感受性ＩｇＧを単離するために特に適している。
【０１１０】
ＥｎｄｏＳは、任意の適切な手段によって接触した試料から分離することができる。ＥｎｄｏＳを試料から除去するための好ましい方法には、前述のように誘導体化または改変したＥｎｄｏＳの使用が含まれる。
【０１１１】
好ましい改変には、ヒスチジンタグの添加が含まれる。ヒスチジンタグの存在は、ポリペプチドが表面上にニッケル、銅または亜鉛イオンを有するキレート基を含有する試薬または分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ヒスチジンタグは、これらの金属イオンに強力に結合する。したがって、このような試薬は、ＥｎｄｏＳを試料から分離するために使用することができる。
【０１１２】
別の好ましい改変には、ビオチンタグの添加が含まれる。ビオチンタグの存在は、ポリペプチドがストレプトアビジンを含む試薬または分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ビオチンタグは、これらのストレプトアビジンに強力に結合する。したがって、このような試薬は、ＥｎｄｏＳを試料から分離するために使用することができる。
【０１１３】
好ましい試薬および分離手段は、ＥｎｄｏＳポリペプチドを結合できる磁性粒子の集団である。例えば、ＥｎｄｏＳポリペプチドがヒスチジンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は表面上にニッケル、銅または亜鉛イオンを有するキレート基を含有する。あるいは、ＥｎｄｏＳポリペプチドがビオチンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は表面上にストレプトアビジンを含有する。
【０１１４】
したがって、試料からＥｎｄｏＳを除去する好ましい方法は、前述のような磁性粒子の集団を使用するステップと、試料上において磁場分離を実施するステップとを含む。磁性粒子は、磁性ナノ粒子であることが好ましく、磁場分離は、高勾配磁場分離であることが好ましい。
【０１１５】
いかなる適切な分離手段も使用できることを理解されたい。例えば、他の手段は、前記の部分に記載されている。
【０１１６】
接触した試料のＥｎｄｏＳは、任意の適切な手段によって結合したＩｇＧの有無のために評価することができる。
【０１１７】
例えば、ＥｎｄｏＳの分子量を分析することができる。ＩｇＧに結合したＥｎｄｏＳは、ＩｇＧに結合していないＥｎｄｏＳよりも分子量が大きい。したがって、適切な方法には、重量によってタンパク質種を区別できる任意の方法、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット、質量分析などが含まれる。あるいは、前記のウェスタンブロットは、ＩｇＧ特異的抗体または特定のＩｇＧサブクラスに特異的な抗体を使用することによってＩｇＧの存在を直接分析することができる。このようにブロットでタンパク質を検出することは、当業界で広く使用される技術である。
【０１１８】
ＥｎｄｏＳに結合したＩｇＧの有無を検出するその他の適切な手段には、ＥｎｄｏＳとＩｇＧに対する抗体または酵素が結合したＩｇＧ結合タンパク質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）とをインキュベートし、その後蛍光発生／発色性基質を添加することが含まれる。この場合、色素信号の発生は、ＩｇＧの存在を示し、ＩｇＧの量は信号の強度に比例する。このようにタンパク質を検出することは、当業界で広く使用される技術である。
【０１１９】
ＥｎｄｏＳに結合したＩｇＧの有無を検出するために適切な他の手段には、前記の方法のいずれかまたは任意の適切な方法によってＥｎｄｏＳを独立して分析／検出できるように、ＥｎｄｏＳから結合したＩｇＧを最初に分離することが含まれる。ＩｇＧは、任意の適切な手段によってＥｎｄｏＳから分離することができる。適切な手段には、接触した試料のＥｎｄｏＳと適切な溶出緩衝液を接触させることによってＥｎｄｏＳからＩｇＧを溶出することが含まれる。溶出緩衝液の選択は一般的に、ＥｎｄｏＳに結合したＩｇＧが公知であるか、または酸感受性と考えられるかどうか、すなわち、酸との接触によって変性／不活性化されやすいかどうかに左右される。
【０１２０】
抗体が酸感受性ではない場合、低ｐＨ溶出緩衝液を使用した溶出プロトコールが通常使用され得る。この種の溶出プロトコールは当業界では周知である。このような溶出緩衝液のｐＨは、一般的に約３未満、最も好ましくは約２未満のｐＨである。好ましい例には、ｐＨ２のグリシン０．１Ｍが含まれる。さらに、または所望により、このような溶出緩衝液は一般的に、以下の
−好ましくは約０．５Ｍから約１Ｍの濃度のナトリウムもしくはカリウム塩、
−天然ＩｇＧ上のＡｓｎ−２９７に結合したグリカンと類似した構造を有する単糖類、二糖類、もしくは多糖類、
または任意のその組み合わせの少なくとも１種を含む。
【０１２１】
しかし、前記に概略したように、本発明の方法は、酸感受性抗体の検出／単離に特に適している。したがって、ＥｎｄｏＳに結合したＩｇＧが公知であるか、または酸感受性と考えられる場合、低ｐＨを必要としない溶出緩衝液およびプロトコールを使用することが好ましい。このようなプロトコールはまた当業界では公知で、ＥｎｄｏＳへの結合を結合ＩｇＧと競合し、こうして結合ＩｇＧの遊離を導く分子を含む緩衝液を提供するという原理に基づいている。したがって、適切な競合溶出緩衝液には一般的に、１種または複数の、天然ＩｇＧ上のＡｓｎ−２９７と結合したグリカンと類似した構造を有する単糖類、二糖類、もしくは多糖類が含まれる。特に好ましい溶出緩衝液には、好ましくはｐＨが約５．３から約８．３のスクロース約０．２５Ｍから約０．５Ｍが含まれる。特に好ましい溶出緩衝液の例には、例えば、ＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かしたスクロース０．２５Ｍ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かしたスクロース０．５Ｍ、ＰＢＳ  ｐＨ５．３に溶かしたスクロース０．２５Ｍ、ＰＢＳ  ｐＨ８．５に溶かしたスクロース０．２５Ｍ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かしたスクロース０．２５Ｍ、マルトース０．２５Ｍが含まれる。
【０１２２】
さらに、または所望により、このような競合溶出緩衝液は一般的に、約０．５から約１Ｍの濃度のナトリウム塩またはカリウム塩を含んでいてもよい。
【０１２３】
前述のようにＥｎｄｏＳから結合ＩｇＧを分離するための手段はまた、単離したＩｇＧを得るために必要であり得る。
【０１２４】
ＩｇＧ含有試料のグリコシル化状態および／または機能的品質（functional quality）を評価する方法
前述したように、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、ＩｇＧ結合活性を有する本発明のＥｎｄｏＳポリペプチドは、グリコシル化された、かつ／または天然の機能的に活性のあるＩｇＧに特異的である。したがって、前記ＥｎｄｏＳポリペプチドを代替のＩｇＧ結合試薬と併用することによって、本発明は、ＩｇＧ含有試料のグリコシル化状態または機能的品質を評価する方法であって、ＩｇＧ含有試料から第１および第２の部分試料を採取し、第１の部分試料を前記部分で記載したようなＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させ、第２の部分試料を、グリコシル化されておらず、かつ／または変性した、不活性型ＩｇＧを結合できる代替のＩｇＧ結合試薬と接触させるステップと、その後第１の部分試料中のＥｎｄｏＳポリペプチドに結合したＩｇＧの量および第２の部分試料中の代替のＩｇＧ結合試薬に結合したＩｇＧの量を定量するステップとを含む方法を提供する。最終的に、第１の部分試料および第２の部分試料中で測定された結合ＩｇＧ量の両方を比較することによって、ＩｇＧ含有試料のグリコシル化状態または機能的品質を評価することができる。
【０１２５】
代替のＩｇＧ結合試薬は通常、ＩｇＧの全形態（天然型または変性型）に結合するプロテインＡまたはプロテインＧである。したがって、この場合、前記試薬に結合したＩｇＧの量は、第２の部分試料中に存在する全ＩｇＧを表す。ＥｎｄｏＳポリペプチドは、グリコシル化された、かつ／または天然の機能的に活性のあるＩｇＧにのみ結合し、したがって、ＥｎｄｏＳに結合したＩｇＧの量は第１の部分試料中に存在するグリコシル化された、かつ／または天然の機能的に活性のあるＩｇＧのみを表す。第２の部分試料中の全ＩｇＧの濃度を第１の部分試料中の天然型ＩｇＧの濃度と比較することによって、元の試料中のグリコシル化された、かつ／または天然の機能的に活性のある形態であるＩｇＧの比を反映する比が得られることを当業者は認識するだろう。
【０１２６】
別の実施形態では、代替のＩｇＧ結合試薬は、グリコシル化されておらず、かつ／または変性したＩｇＧに特異的であり得る。このような試薬は、例えば、抗体であることができる。したがって、この実施形態では、元の試料中のグリコシル化された、かつ／または天然の機能的に活性のある形態で存在するＩｇＧの比は、式、
【数１】
0005722627.tif 000003
によって評価することができる。
【０１２７】
前記方法における試料は、ポリペプチドまたは試薬と試料との間に相互作用を起こさせ、ＩｇＧ結合活性が生じるために適切な条件下で、ＥｎｄｏＳポリペプチドまたは代替のＩｇＧ結合試薬と接触させる。適切な条件は、例えば、前記の部分で記載したものと同等である。
【０１２８】
ＩｇＧ含有試料からＩｇＧ  ＦａｂまたはＦｃ断片を単離する方法
本発明の方法は、ＩｇＧ含有試料からＦａｂ断片を単離するために使用することができる。一実施形態では、本発明は、ＩｇＧ含有試料からＦａｂ断片を単離する方法であって、
（ａ）前記ＩｇＧ含有試料をＩｄｅＳおよびＦｃ結合タンパク質と接触させるステップと、
（ｂ）接触試料から前記ＩｄｅＳおよび前記Ｆｃ結合タンパク質を分離するステップと
を含み、それによってＦａｂ断片を単離する方法を提供する。
【０１２９】
試料からＩｄｅＳおよびＦｃ結合タンパク質を分離する好ましい方法には、前述のように誘導体化または改変ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質の使用が含まれる。同一または異なる改変をＩｄｅＳおよびＦｃ結合タンパク質のいずれかに使用することができる。
【０１３０】
好ましい改変には、ヒスチジンタグの添加が含まれる。ヒスチジンタグの存在は、ポリペプチドが表面上にニッケル、銅または亜鉛イオンを有するキレート基を含有する試薬または分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ヒスチジンタグは、これらの金属イオンに強力に結合する。したがって、このような試薬は、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質を試料から分離するために使用することができる。
【０１３１】
別の好ましい改変には、ビオチンタグの添加が含まれる。ビオチンタグの存在は、ポリペプチドがストレプトアビジンを含む試薬または分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ビオチンタグは、ストレプトアビジンに強力に結合する。したがって、このような試薬は、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質を試料から分離するために使用することができる。
【０１３２】
好ましい試薬または分離手段は、ＥｎｄｏＳポリペプチドを結合できる磁性粒子の集団である。例えば、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質ポリペプチドがヒスチジンタグで誘導体化される場合、磁性粒子はその表面にニッケル、銅または亜鉛イオンを有するキレート基を含有する。あるいは、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質ポリペプチドがビオチンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は表面上にストレプトアビジンを含有する。
【０１３３】
したがって、試料からＥｎｄｏＳを除去する好ましい方法は、前述のような磁性粒子の集団を使用するステップと、試料上において磁場分離を実施するステップとを含む。磁性粒子は、磁性ナノ粒子であることが好ましく、磁場分離は、高勾配磁場分離であることが好ましい。
【０１３４】
したがって、前記方法のステップ（ａ）は、好ましくはさらに、試料をＩｄｅＳおよびＦｃ結合タンパク質に結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ（ｂ）は試料上で磁場分離を実施することを含む。
【０１３５】
任意の適切な分離手段を使用できることを理解されたい。例えば、ＦｃγＲに結合したＩｇＧ分子を実質的に含まない細胞集団を単離するための方法に関してこの部分で記載した他の手段は、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質の分離に適応することができた。
【０１３６】
Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＨまたはエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドである。
【０１３７】
本発明の前記実施形態では、ＩｇＧ含有試料は通常、精製された、または単離されたＩｇＧを含む。「精製された、または単離されたＩｇＧ」とは、通常の商用等級の純度のＩｇＧ画分を意味する。ＩｇＧは通常、血清、または組換えＩｇＧの場合は細胞溶解物などの試料から単離される。単離は、適切な方法にしたがって、好ましくは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドを使用したＩｇＧの単離について前述した方法にしたがって実施することができる。したがって、本発明の一実施形態は、ステップ（ａ）の前に、
（ｉ）前記ＩｇＧ含有試料を、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を欠如するＥｎｄｏＳポリペプチドと接触させ、それによってＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
（ｉｉ）前記ＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体を接触試料から分離するステップと、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体からＩｇＧを溶出し、それによってＩｇＧ接触試料を得るステップと
を含み、ステップ（ａ）および（ｂ）がステップ（ｉｉｉ）で得られたＩｇＧ含有試料で実施される、前述の方法を包含する。ＩｇＧ−ＥｎｄｏＳポリペプチド複合体の試料からの分離は、試料中のＩｇＧの有無を決定する方法、またはＩｇＧ含有試料からＩｇＧを単離する方法に関して前記部分で記載した方法にしたがって実施することが好ましい。
【０１３８】
本発明の他の実施形態では、この方法は、この方法を実施する前にＩｇＧを精製する必要なくＩｇＧ含有試料からＦａｂ断片を単離するのに適合している。これらの方法は、未精製ＩｇＧ、例えば、全血清、細胞溶解物または細胞培養培地を含有する試料で実施することができる。本発明のこの実施形態では、この方法は、
（ａ）前記ＩｇＧ含有試料をＦｃ結合タンパク質と接触させ、それによってＩｇＧ−Ｆｃ結合タンパク質複合体の形成を可能にするステップと、
（ｂ）前記ＩｇＧ−Ｆｃ結合タンパク質複合体を接触した試料から分離するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られたＩｇＧ−Ｆｃ結合タンパク質にＩｄｅＳを添加するステップと、
（ｄ）（ｃ）で得られた混合物から前記ＩｄｅＳおよび前記Ｆｃ結合タンパク質を分離するステップと
を含み、それによってＦａｂ断片を単離する。
【０１３９】
試料／前記混合物からＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質を分離するための方法は、前述のように誘導体化または改変したＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質を使用することを含むことが好ましい。同じまたは異なる改変をＩｄｅＳおよびＦｃ結合タンパク質のいずれかに使用することができる。好ましい試薬および分離手段は、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質を結合できる磁性粒子の集団である。例えば、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質ポリペプチドがヒスチジンタグで誘導体化される場合、磁性粒子はその表面にニッケル、銅または亜鉛イオンを有するキレート基を含有する。あるいは、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質ポリペプチドがビオチンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は表面上にストレプトアビジンを含有する。
【０１４０】
したがって、前記方法のステップ（ａ）は、好ましくはさらに、試料をＦｃ結合タンパク質に結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ（ｃ）はさらに、ステップ（ｂ）で得られたＩｇＧ−Ｆｃ結合タンパク質複合体とＩｄｅＳおよびＦｃ結合タンパク質に結合できる磁性ナノ粒子の集団とを接触させることを含み、ステップ（ｂ）および（ｄ）はそれぞれ（ａ）の試料および（ｃ）で得られた混合物において磁場分離を実施することを含む。
【０１４１】
いかなる適切な分離手段も使用できることを理解されたい。例えば、ＦｃγＲに結合したＩｇＧ分子を実質的に含まない細胞集団を単離するための方法に関してこの部分で記載した他の手段は、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質の分離に適応させることができた。
【０１４２】
前記実施形態におけるＦｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＨまたはエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドを使用する。
【０１４３】
本発明の前記方法はまた、ＩｇＧ含有試料からＦｃ断片を単離するために使用することができる。本発明のこのような一実施形態では、この方法は、
（ａ）前記ＩｇＧ含有試料をＩｄｅＳと接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物からＩｄｅＳを分離し、それによってＦａｂおよびＦｃ断片を単離するステップと、
（ｃ）前記ＦａｂおよびＦｃ断片をＦｃ断片結合タンパク質と接触させ、それによってＦｃ断片−Ｆｃ結合タンパク質複合体の形成を可能にするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた混合物からＦｃ断片−Ｆｃ結合タンパク質複合体を分離するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られたＦｃ断片−Ｆｃ結合タンパク質複合体からＦｃ断片を単離するステップとを含む。
【０１４４】
いかなる適切な手段も前述のように使用することができるが、試料／前記混合物からＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質を分離するための方法は、前述のように誘導体化または改変したＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質を使用することを含むことが好ましいことを理解されたい。
【０１４５】
好ましくは、前記方法のステップ（ａ）はさらに、試料をＩｄｅＳに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ（ｃ）はさらに、ステップ（ｂ）で得られたＦａｂおよびＦｃ断片とＦｃ結合タンパク質に結合できる磁性ナノ粒子の集団を接触させることを含み、ステップ（ｂ）および（ｄ）はそれぞれ（ａ）の試料および（ｃ）で得られた混合物において磁場分離を実施することを含む。Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＨまたはエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドを使用する。
【０１４６】
他の実施形態では、
（ａ）前記ＩｇＧ含有試料をＩｄｅＳおよびＦｃ結合タンパク質と接触させるステップと、
（ｂ）（ａ）で得られた混合物からＦｃ結合タンパク質を分離するステップと
を含み、それによってＦｃ断片を単離する方法によって、Ｆｃ断片はＩｇＧ含有試料から単離することができる。
【０１４７】
いかなる適切な分離手段も前述のように使用できることを理解されたい。しかし、前記方法のステップ（ａ）は、好ましくはさらに、試料をＦｃ結合タンパク質に結合できるが、ＩｄｅＳには結合できない磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ（ｂ）は（ａ）で得られた混合物上で磁場分離を実施することを含む。好ましくは、ＩｄｅＳおよび／またはＦｃ結合タンパク質は、前述のように誘導体化、または改変されるが、但し、様々な改変がそれぞれに適用される。例えば、ニッケル、銅または亜鉛イオンを有するキレート基をその表面に含有する磁性粒子の集団に結合するように、ヒスチジンタグの添加によってＩｄｅＳが改変される場合、Ｆｃ結合タンパク質は、表面上にストレプトアビジンを含有する磁性粒子の集団に結合タンパク質に結合するようにビオチンタグを添加することによって改変することができる。Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＨまたはエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変ＥｎｄｏＳポリペプチドである。
【０１４８】
Ｆａｂ断片の単離方法と同様に、Ｆｃ断片を分離する方法において、ＩｇＧ含有試料は一般的に精製または単離ＩｇＧを含むことを理解されたい。ＩｇＧを単離する好ましい方法は、前記で記載したようにステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載されている。
【０１４９】
キット
本発明は、
（ａ）エンドグリコシダーゼ活性を有する本発明によるＥｎｄｏＳポリペプチドと、所望により
（ｂ）試料から細胞を分離するための手段および／または指示と
を含む、Ｆｃγ受容体結合ＩｇＧ分子を実質的に含まない細胞集団を単離するためのキット、
（ａ）エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明によるＥｎｄｏＳポリペプチドと、所望により
（ｂ）試料から前記ＥｎｄｏＳポリペプチドを分離するための手段と
を含む、ＩｇＧ含有試料からＩｇＧを単離するためのキット、
（ａ）エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明によるＥｎｄｏＳポリペプチドと、所望により
（ｂ）試料から前記ＥｎｄｏＳポリペプチドを分離するための手段と
を含む、試料中のＩｇＧの有無を決定するためのキット、
（ａ）エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明によるＥｎｄｏＳポリペプチドと、所望により
（ｂ）変性し、かつ／または脱グリコシル化したＩｇＧに結合できる代替のＩｇＧ結合試薬と、
（ｃ）試料から前記ＥｎｄｏＳポリペプチドを分離するための手段と、
（ｄ）試料から前記代替のＩｇＧ結合試薬を分離するための手段と
を含む、ＩｇＧ含有試料のグリコシル状態および／または機能的品質を評価するためのキットを提供する。代替のＩｇＧ結合試薬は、プロテインＧおよび／またはプロテインＡおよび／またはプロテインＡ／Ｇを含む。
【０１５０】
本発明はまた、
（ａ）ＩｄｅＳと、
（ｂ）Ｆｃ結合タンパク質と、
（ｃ）前記ＩｄｅＳおよび前記Ｆｃ結合タンパク質を試料から分離するための手段と
を含む、ＩｇＧのＦａｂまたはＦｃ断片を単離するためのキットを提供する。
【０１５１】
好ましい実施形態では、キットはさらに、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明によるＥｎｄｏＳポリペプチドおよび試料から前記ＥｎｄｏＳポリペプチドを分離するための手段を含む。Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＨまたはエンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明によるＥｎｄｏＳポリペプチドである。
【０１５２】
前記のキットの好ましい実施形態はさらに、本発明の方法においてキットを使用する指示を含む。さらに好ましい実施形態には、ＥｎｄｏＳポリペプチド、代替のＩｇＧ結合試薬、ＩｄｅＳポリペプチドまたはＦｃ結合タンパク質を試料から分離するための手段は磁性ナノ粒子の集団であり、各集団は、示されたポリペプチド／試薬／タンパク質の少なくとも１種に結合できる実施形態が含まれる。この実施形態では、キットは通常さらに、試料上において磁場分離を実施するための指示を含む。
【０１５３】
前記方法およびキットの好ましい実施形態では、使用されるポリペプチド／タンパク質／試薬は、前記ポリペプチドの分離を助けるため、アフィニティータグ、好ましくはヒスチジンタグで誘導体化する。
【実施例】
【０１５４】
以下の実施例は本発明を例示する。
【０１５５】
実施例１
本発明の研究において、ＥｎｄｏＳのＩｇＧサブクラスに対する効果（複数可）およびＩｇＧ−ＦｃｇＲ相互作用を明らかにする。結果によって、ＥｎｄｏＳは、可溶性および血漿環境の両方の４種類のヒトＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１〜４）全ての重鎖を加水分解することが明らかになった。さらに、ＩｇＧグリカンのＥｎｄｏＳ加水分解は、ＩｇＧの可溶性、固定化ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂならびにＦｃγＲ発現細胞への結合に劇的な影響を及ぼすことを発見した。さらに、これらの細胞に結合したＩｇＧは、細胞をＥｎｄｏＳで処理することによって解離する。さらに、部位特異的変異誘発によって生じたＥｎｄｏＳの完全な形態は、高い親和性でＩｇＧ１〜４に結合し、一方、活性型はその基質と一時的に相互作用するにすぎない。これらの結果は、細菌による宿主免疫防御の酵素的調節機構についての新たな情報を提供し、ＩｇＧグリカン加水分解酵素とＩｇＧの間の分子的相互作用についての新たな情報を提供し、正確な抗体エフェクター機能のためのＩｇＧグリコシル化の重要性を強調する。
【０１５６】
材料および方法
タンパク質および試薬
血液は、健康な個体から採取し、ヘパリン含有試験管に収集した。融合物としてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する（ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ）または有さない完全長ＥｎｄｏＳは、組換えによって発現し、プラスミドｐＧＥＸｎｄｏＳを有する大腸菌から精製した。ＥｎｄｏＳのグルタミン酸２３５のグルタミンへの変異は、以下の通りに実施した。グルタミン酸２３５（Ｇｌｕ−２３５）のグルタミン（Ｅ２３５Ｑ）への変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して実施した。変異原性オリゴヌクレオチドプライマー（変異は下線を引いてある）５’−ＣＣＴ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＴＣＣ−３’および前記配列のアンチセンスは、変性したプラスミドｐＧＥＸｎｄｏＳにアニールすることができた。変異した鎖は、高忠実度ＤＮＡを使用して増幅し、メチル化された親鎖はＤｐｎＩで消化した。その後、ニック修復および複製のためにスーパーコンピテント大腸菌Ｘｌ−１  Ｂｌｕｅに形質転換し、変異したプラスミドｐＧＥＸｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）を作製した。その後、組換えＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）を発現させ、ＥｎｄｏＳについて前述したように精製した。可溶性の精製Ｆｃ受容体は、ｐＮＴ−ｎｅｏ−ＦｃγＲＩＩまたはｐＮＴ−ｎｅｏ−ＦｃγＲＩＩＩプラスミドでＣＨＯ−Ｋ１（ＣＨＯ）細胞を同時形質移入し、その後ジェネテシン１ｍｇ／ｍｌで選択することによって作製した。ＩｇＧサブクラスは、記載されたように（参考文献）ヒト血漿から精製した。ＲＰＭＩ１６４０培地およびハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）は、ＧＩＢＣＯ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｕ．Ｋ．製であった。その他の試薬は全て、特に指示しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１５７】
ヒト血漿のＥｎｄｏＳによる処理およびＩｇＧの精製
ヒト血漿２ｍｌ量をＥｎｄｏＳまたはＰＢＳ２０μｇと３７℃で１．５時間インキュベートした。プロテインＧセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してＩｇＧ画分を精製した。簡単に説明すると、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液１０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  １２０ｍＭ、ＫＣｌ  ３ｍＭ）に１：１で懸濁したプロテインＧセファロース２００μｌを血漿試料に添加し、４℃で２時間または一晩インキュベートした。８０００×ｇで５分間遠心した後、上清を廃棄し、ペレットをＰＢＳで３回洗浄した。ＩｇＧをグリシン０．１Ｍ  ｐＨ２．０で溶出し、１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いて中和した。ＩｇＧ濃度は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＵＳＡ）を使用して８ｍｇ／ｍｌに決定した。
【０１５８】
細胞調製物
Ｋ５６２細胞系は、Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）１００μｇ／ｍｌおよび牛胎児血清１０％を補給したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で、５％ＣＯ２を含有し、湿度９５％の大気中で培養した。細胞培養用のＮｕｎｃｌｏｎフラスコを使用した（Ｎｕｎｃ  Ａ／Ｓ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）。細胞は、実験に使用する前に無血清培地で２０時間培養した。単球は、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ調製用キット（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）またはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、製造者によって提供された指示にしたがってヒト全血から単離した。単離後、細胞を計数し、ＰＢＳまたはＲＰＭＩ培地に再懸濁した。
【０１５９】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
グリカン検出のために、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、Ｎａ２ＣＯ３  １６ｍＭおよびＮａＨＣＯ３  ３５ｍＭを含有するコーティング緩衝液、ｐＨ９．６で最終濃度１．５〜０．５μｇ／ｍｌまで希釈したマウス抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ（登録商標）、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）１００μｌでコーティングし、４℃で一晩維持した。次に、プレートを、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、ＭｎＣｌ２  ０．０１ｍＭ、ＣａＣｌ２  ０．１ｍＭおよび０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するレクチン緩衝液で３回洗浄し、同緩衝液で室温で１時間ブロックした。次のステップで、精製したＩｇＧ画分（１：１００に希釈）を添加し、３７℃でさらに２時間インキュベートを続行した。レクチン緩衝液で３回洗浄した後、ビオチン化レンズマメアグルチニン（ＬＣＡ）−レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）１μｇ／ｍｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートを続行した。さらに３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン０．１μｇ／ｍｌ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。色反応は、０．０１２％  ｖ／ｖ  Ｈ２Ｏ２および２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）１．７ｍＡを含有するクエン酸１水和物  ０．１Ｍ、Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ  ０．１Ｍ緩衝液  ｐＨ４．５で発色させた。吸光度は、マイクロタイタープレートリーダーモデル５５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で４１５ｎｍで読み取った。ヒトＩｇＧサブクラスのＦｃγＲへの結合を検出するために、プレートを可溶性ＦｃγＲＩＩａまたはＦｃγＲＩＩｂまたはＦｃγＲＩＩＩａで濃度５μｇ／ｍｌで４℃で２０時間コーティングした。翌日、プレートを、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）および２％ｗ／ｖ牛血清アルブミンを補給したＰＢＳで室温で２時間ブロックした。このステップの後、精製したＩｇＧサブクラスそれぞれ０．１μｇを添加した。コーティングステップの後およびその後のインキュベーションステップそれぞれの間にプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ結合プロテインＧ（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）（１：５０００に希釈）を検出用に使用した。色反応は前記の通り実施した。実験は全て３連（triplicates）で行った。
【０１６０】
放射活性標識
タンパク質は、０．２ｍＣｉ  Ｎａ１２５Ｉ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｕｐｐｌａｎｄｓ−Ｖａｓｂｙ、Ｓｗｅｄｅｎ）で、ＩＯＤＥ−ＢＥＡＤＳヨウ素化試薬キット（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、製造者の指示書にしたがって標識した。未結合の放射活性は、ＰＤ−１０セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上のタンパク質を脱塩することによって除去した。標識したタンパク質の活性は、４μＣｉ／μｇタンパク質と推定した。
【０１６１】
細胞に結合したＩｇＧの検出
ＩｇＧは、前述のようにＥｎｄｏＳまたはＰＢＳで処理したヒト血漿から精製し、その後１２５ヨウ素（１２５Ｉ）で標識した。Ｋ５６２細胞に結合した１２５Ｉ−ＩｇＧを検出するために、細胞２×１０６個を１２５Ｉ−ＩｇＧまたは１２５Ｉ−脱グリコシル化ＩｇＧ  ０．５×１０６ｃｐｍと室温で３０分インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄し、１０００×ｇで３分間遠心した後、細胞ペレットの放射活性をＷａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ（商標）１４７０自動ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して検出した。他の実験では、単球１×１０６個を１２５Ｉ−ＩｇＧまたは１２５Ｉ−ＥｎｄｏＳ処理ＩｇＧ  ０．５×１０６ｃｐｍと室温で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで５回繰り返して洗浄し、１０００×ｇで５分間遠心して細胞を最終的にペレットにした後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  ０．１５０Ｍ、１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ−１００および０．２５％  ｖ／ｖ  ＮＰ４０を含有する溶解緩衝液に４℃で１０分間再懸濁した。次に、試料を１４０００×ｇで１０分間遠心し、上清をポリアクリルアミドゲルに添加した。分離後、ゲルを乾燥させ、試料をＦｕｊｉｘ  ＢＡＳ  ２０００バイオイメージング分析器（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｓｖｅｒｉｇｅ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）でホスホイメージングによって分析した。（前述の通り）ＩｇＧの細胞への結合をウェスタンブロットによって分析する実験では、細胞０．５〜１０６個をＥｎｄｏＳまたは緩衝液で処理した血漿と３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞はＰＢＳまたはＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、溶解緩衝液１００μｌに再懸濁し、細胞溶解物中の結合ＩｇＧはウェスタンブロットによって分析した。
【０１６２】
細胞とＥｎｄｏＳとのインキュベーション
Ｋ５６２細胞２×１０６個または単球８×１０６個をヒト血漿２ｍｌと３７℃で３０分間インキュベートした。細胞は、ＰＢＳで５回洗浄し、各洗浄後、１０００ｇで１０分間遠心した。ＰＢＳに溶かしたＥｎｄｏＳ４０μｇまたはＰＢＳのみを細胞に添加し、その後３７℃で１時間インキュベートした。細胞は、ＰＢＳで３回洗浄し、溶解緩衝液１００μＬに再懸濁した。試料を１４０００×ｇで５分間遠心し、ペレットを廃棄し、上清を分析のために保存した。上清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを使用してＩｇＧおよびグリカンの含量を分析した。
【０１６３】
スロットブロッティング分析
ＰＢＳ中のＩｇＧ１〜４それぞれ０．３、０．１５、０．０７５μｇをＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｉｎｃ．、Ｋｅｎｅ、ＮＨ  ０３４３１、ＵＳＡ製のスロットブロット装置を使用してＰＶＤＦ膜に添加した。この膜をＰＢＳＴ、５％脱脂乳で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴおよび５％脱脂乳に溶かしたＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）０．０５ｍｇ／ｍｌで１時間インキュベートした。洗浄後、この膜をウサギＥｎｄｏＳ抗血清でインキュベートし、その後ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体でインキュベートした。発色は、ペルオキシダーゼ基質としてＡＢＴＳを使用して行った。インキュベートステップは全て室温で実施した。
【０１６４】
ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴相互作用分析
受容体、ＩｇＧおよび脱グリコシル化ＩｇＧは、酢酸ナトリウム１０ｍＭ  ｐＨ４で希釈し、ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の異なるフローセルにアミン結合によって固定した。固定レベルは、約８０００〜１００００レスポンスユニットに最適化した。ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）が脱グリコシル化ＩｇＧ変異体に対して非結合剤であることが決定された後、これらのフローセルはＩｇＧ１からＩｇＧ４にそれぞれ結合するＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）のバルク屈折率変化の対照と見なされた。受容体ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａに対するＩｇＧ１−ＩｇＧ４の親和性を測定する実験では、固定方法は行うが、タンパク質を添加しないフローセルを対照として使用した。親和性を測定するために、結合および解離相をＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置でモニターした。可能性のある物質移動制限の対照実験において、ＩｇＧを受容体に、ＥｎｄｏＳ変異体はＩｇＧサブクラスに様々な流速で注入した。５μｌ／分以上では初期の結合に差は認められず、いかなる組み合わせの制限も示されなかった。反応体を、様々な濃度（通常、１０〜１．２５μｇ／ｍｌ）で３５μｌ／分で２５℃で様々なコーティング表面（フローセル）に注射した（ランニング緩衝液：Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、サーファクタントＰ２０  ０．００５％およびＥＤＴＡ  ３．４ｍＭ）。実験間には、表面はＮａＣｌ  ２Ｍを含有するランニング緩衝液でパルスし、その後基準に到達した後徹底的に洗浄処置を行うことで再生した。予備固定したＦｃγＲＩＩａに結合したＩｇＧのＥｎｄｏＳ消化のために、ＩｇＧ１濃度（１０μｇ／ｍｌ）は、ＩｇＧ１注入を中断し、ランニング緩衝液に置換した時点で適切な定常状態解離相を与えるように選択した。この実験は対照と見なされ、それ自体、ＩｇＧ１がＦｃγＲＩＩａに結合した後の同時点でのＥｎｄｏＳ注入と比較した。データをＸおよびＹで正規化した後、各注入濃度の対照フローセルの盲検曲線を差し引いた。適用可能ならば、結合定数（Ｋａ）および解離速度定数（Ｋｄ）は、ＢＩＡ評価４．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ）において１：１ラングミュア結合の式を使用して同時に測定した。結合曲線は、局所的に適合させ、平衡解離定数（ＫＤ）は得られた速度定数の平均値から計算した。
【０１６５】
全血のフローサイトメトリー分析
血液１５ｍｌ量をＥｎｄｏＳ  ０．４ｍｇまたはＰＢＳと３７℃で３５分間インキュベートした。次に、白血球の活性化剤、ホルミル−メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）（１：１００００に希釈）（ＳＩＧＭＡ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ、ＵＳＡ）を添加し、インキュベーションを３７℃で１０分間続行した。次に、血液試料を１０００ｇで５分間遠心した。血漿およびバフィーコートを別の管に移し、１０００ｇで５分間遠心した。その後、細胞を、３０％ｖ／ｖＲＰＭＩを含有するＨＢＳＳで３回洗浄し、最終的に同媒体１００ｍｌに再懸濁した。マウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体は、等量のマウス抗ヒトＩｇＧ１（５１ｍｇ／ｍｌ）、ＩｇＧ２（２２ｍｇ／ｍｌ）、ＩｇＧ３（１６ｍｇ／ｍｌ）およびＩｇＧ４（２４ｍｇ／ｍｌ）と混合することによって調製し、この混合物５μｌを添加し、試料は室温で１０分間インキュベートした。次のステップでは、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｕｔｉ−Ｌｙｓｅ赤血球キット（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を使用して赤血球を溶解する前に、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）５μｌを添加した。シグナルは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で分析した。単球は、前方散乱光および側方散乱光の特徴によって同定した（ＦＳＣ／ＳＳＣ）。
【０１６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、ＢＩＯ−ＲＡＤ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ装置またはＬＫＢ  ｐｒｕｄｕｋｔｅｒ（Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ）製の装置を使用して、Ｌａｅｍｍｌｉ（１７）によって記載された緩衝系を使用して実施した。試料は５％メルカプトエタノールを補給した試料緩衝液と１：１（ｖ／ｖ）で混合し、１０％ポリアクリルアミドゲルに添加する前に５分間煮沸した。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｐｌｕｓ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）は、高分子質量標準物質として使用した。ポリアクリルアミドゲルは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０で染色し、場合によっては乾燥させた。イムノブロッティングのため、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（１８）によって記載されたようにゲルをポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移した。ブロッティング後、膜を、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）および５％ｗ／ｖ脱脂乳（ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を補給したＰＢＳで室温で２０分間ブロックした。ＩｇＧを検出するために、ブロットをその後ＰＢＳＴで洗浄し、ウサギ抗ヒトＩｇＧ（１：３０００に希釈）（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で３７℃で１時間インキュベートした。洗浄ステップの後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）（１：１０００に希釈）とインキュベートした。レクチンブロット分析のために、膜をレクチン緩衝液、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、ＭｎＣｌ２  ０．０１ｍＭ、ＣａＣｌ２  ０．１ｍＭおよび０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０で２０分間室温でブロックし、ビオチン化ＬＣＡレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：５０００に希釈）とインキュベートした。レクチン緩衝液で繰り返し洗浄した後、膜をペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：１００００に希釈）とインキュベートした。膜は全て、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳイメージングシステムおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ画像分析ソフトウェア（ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって分析する前に、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、製造者の指示にしたがって発色させた。
【０１６７】
結果
ＥｎｄｏＳは４種類のヒトＩｇＧサブクラス全てに対してグリコシダーゼ活性を有する
ＥｎｄｏＳがヒトポリクローナルＩｇＧのγ鎖の保存されたＮ結合グリカンのキトビオースコア（chitobiose core）を加水分解することが以前に示されている（図１Ａ）。したがって、ＥｎｄｏＳがヒトＩｇＧの４種類のサブクラス（ＩｇＧ１〜４）全てに対して活性を有するかどうかを解明することに関心が持たれた。精製した組換えＥｎｄｏＳを精製したヒトＩｇＧ１〜４とインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、全サブクラスのＥｎｄｏＳ処理ＩｇＧは未処理ＩｇＧよりも約３ｋＤａ低い見かけ上の分子量に移動したことが明らかになり（図１Ｂ）、これはＩｇＧグリカンのキトビオースコアの加水分解と一致する。グリカンの加水分解を確認するために、試料はまた、α結合マンノース残基を認識するレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ）レクチンを使用したレクチンブロットによって分析した（図１Ａ）。試料のレクチンブロット分析によって、全ＩｇＧサブクラスは全て、ＥｎｄｏＳとインキュベート後、ＬＣＡとの反応性を欠如することが明らかになり、グリカンの完全な、またはほぼ完全な加水分解と一致する（図１Ｃ）。さらに、血漿環境中においてＩｇＧ１〜４に対するＥｎｄｏＳのグリコシダーゼ活性を調べた。この実験では、ヒト血漿を、精製したＥｎｄｏＳまたは緩衝液とインキュベートし、その後ＩｇＧ画分の親和性精製を行った。その後、これらの画分に、ＩｇＧを捕捉するためにＩｇＧ１〜４に対する固定化モノクローナル抗体を使用したＬＣＡ  ＥＬＩＳＡを行った。これによって、血漿を緩衝液（対照）とインキュベートすると４種類のＩｇＧサブクラス全てはレクチンと反応し、グリカンが存在することが明らかになった。対照的に、血漿をＥｎｄｏＳで処理すると、ＩｇＧ１〜４とＬＣＡレクチンとの反応性の著しい減少が認められ、ＩｇＧ１〜４上のグリカンが加水分解されていることが示された（図２）。考え合わせると、これらの結果は、ＥｎｄｏＳが精製型（purified form）ならびに全血漿中のヒトＩｇＧの全サブクラスを加水分解する能力を有することを明らかに示している。
【０１６８】
ＥｎｄｏＳの不活性型はＩｇＧに結合する
以前に、ＩｇＧのＥｎｄｏＳ加水分解の分子的な必要性を部分的に解明した。触媒トンネルの提示された入り口の配列番号：１のグルタミン酸１９９（配列番号：３の２３５位）のグルタミンへの部位特異的変異誘発（ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ））によって酵素的活性が消失する。さらに、トリプトファンの化学的ブロックによって、これらのアミノ酸残基は活性に重要であることが明らかになった。酵素と基質の間の物理的相互作用をさらに調べるために、ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）の固定化ポリクローナルＩｇＧおよびＩｇＧ１〜４サブクラスへの結合は、ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）で探査された固定化ＩｇＧによるスロット結合実験を使用して研究した。精製した、可溶性ＩｇＧサブクラス１〜４は、それぞれニトロセルロース膜に固定し、ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）で探査し、その後ＥｎｄｏＳに対する抗体とインキュベーションした。この実験によって、ポリクローナルＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２へのＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）の強力な結合（binding）、およびＩｇＧ３およびＩｇＧ４への弱い会合（association）が明らかになり、一方、活性ＥｎｄｏＳと全サブクラスの間には非常に弱い相互作用のみが認められた（図３Ａ）。ＥｎｄｏＳと固定化ＩｇＧ１〜４の間の親和定数を計算するために、表面プラズモン共鳴を使用した。スロット結合結果と同様に、これらによって、ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）はＩｇＧサブクラス全てに高い親和性で結合し、一方、ＥｎｄｏＳのＩｇＧに対する結合は検出できないことが示された（図３Ｂ、表１）。固定化ＩｇＧサブクラスに対するＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）結合の動力学的変数は、類似の指標を示し、最も強い相互作用は、ＩｇＧ１とＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）の間で示され、結合親和定数（ＫＤ）は０．４２μＭであった。ＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）はいずれも、固定前（immobilized）にＥｎｄｏＳによって加水分解されたＩｇＧ１〜４サブクラスには結合しないことが検出された。これらの発見は、完全な（intact）ＩｇＧグリカンはＥｎｄｏＳとＩｇＧの間の相互作用に必要であることを示している。さらに、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）およびＩｇＧの間の相互作用を比較する実験によって、ＥｎｄｏＳは高い親和性でＩｇＧに結合するが、活性型酵素は、グリカンがグリカン加水分解後直ちに「ｔｏｕｃｈ  ａｎｄ  ｇｏ」方式で遊離されることを示している。
【０１６９】
ＥｎｄｏＳはＩｇＧ１〜４のＦｃγＲへの結合に影響を及ぼす
ＦｃγＲとＩｇＧのＦｃドメインの間の相互作用の性質はＩｇＧグリコシル化状態に強く左右されるので、ＩｇＧのＦｃγＲとの相互作用に対するＥｎｄｏＳ活性の影響を調査した。したがって、ＥＬＩＳＡ実験において、可溶性ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａを固定し、精製したＩｇＧ１〜４サブクラスで探査した。その他の観察と一致して、本明細書ではＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＩＩｂはＩｇＧ１に結合することがわかった。この結合は、ＩｇＧ１をＥｎｄｏＳで処理した後ほとんど消失した。その他のＩｇＧサブクラスのこれらの受容体に対する結合は弱く、ＥｎｄｏＳで処理した後、さらに減少した。一般に、ＥＬＩＳＡ研究では、ＩｇＧサブクラスの結合親和性パターンは、ＦｃγＩＩａではＩｇＧ１＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２であり、ＦｃγＲＩＩｂではＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ２であることが明らかになった（図４Ａ）。さらに、ＥｎｄｏＳで加水分解されたＩｇＧは、ＦｃγＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂへの結合に関していえば、未処理ＩｇＧ２と比較して、より広範な結合能力で異なる結果を有することが認められた。ＦｃγＲＩＩＩａは全ＩｇＧサブクラスの結合では否定的であった（データは示さず）。ＥｎｄｏＳで処理した、または処理していないＩｇＧ１〜４とＦｃγＲとの相互作用はさらに、表面プラズモン共鳴によって分析した。ＩｇＧサブクラスそれぞれは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂまたはＦｃγＲＩＩＩａを固定した表面に捕捉された。ＥＬＩＳＡデータと一致して、この結果は、ＩｇＧがＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＩＩｂの両方に最強の親和性を有し、結合親和定数は類似しており、それぞれ９７ｎＭおよび１７ｎＭであることを示した（図４Ｂ、表２）。以前の発見と一致して、ＥｎｄｏＳ処理ＩｇＧ１を使用したとき、これらの受容体へのＩｇＧの結合は検出できなかった。ＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂとＩｇＧ２またはＩｇＧ３の間、あるいはＩｇＧ４とＦｃγＲＩＩａの間には相互作用は検出されなかった（表２）。可溶性ＩｇＧ１〜４サブクラスの固定化ＦｃＲＩＩＩａへの結合は検出できなかった。これらの結果は、ＥｎｄｏＳ加水分解がＩｇＧのＦｃγＲへの親和性を劇的に減少させることを示している。
【０１７０】
ＥｎｄｏＳはＩｇＧの血液細胞への結合を減少させる
ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴の結果に基づいて、ＥｎｄｏＳグリコシダーゼ活性のＦｃγＲとＩｇＧの間の相互作用に対する効果（複数可）の分析を続行した。この目的のため、ＦｃγＲＩＩａを広範に発現する赤白血病細胞系（Ｋ５６２）を使用した。可溶性ＦｃγＲＩは入手できなかったので、ＦｃγＲＩによってＩｇＧに主に結合するヒト単球も調べた。したがって、ＩｇＧはＥｎｄｏＳまたはＰＢＳで処理した血漿から精製し、１２５Ｉで標識し、Ｋ５６２細胞とインキュベートした。細胞ペレットの放射活性を測定した。これらの細胞への特異的なＩｇＧ結合は、放射活性ＩｇＧの結合を阻害した冷却ヒトＩｇＧを添加することによって計算した。これによって、ＥｎｄｏＳで処理した血漿から元々精製した放射活性ＩｇＧの結合は、完全に消失することが示された（図５Ａ）。細胞をヒト血漿とインキュベーションした後、ＩｇＧのＫ５６２細胞への強力な結合は、ウェスタンブロットおよび細胞溶解物とヒトＩｇＧに対する抗体との反応性によって確認された。対照的に、ＥｎｄｏＳで予め処理した血漿でインキュベートしたＫ５６２細胞に対するＩｇＧの結合は明らかに減少した（図５Ｂ）。同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した１２５Ｉ−ＩｇＧの単球への結合は、ＩｇＧをＥｎｄｏＳで処理したとき、完全に阻害された（図６Ａ）。単球上のＦｃγＲとＩｇＧの間の相互作用に対するＥｎｄｏＳの影響をさらに分析するために、全血のフローサイトメトリー分析を実施した。ヒト血液は、血液を白血球活性化剤ｆＭＬＰで予めインキュベートした後ＥｎｄｏＳとインキュベートした。単球は、前方散乱光および側方散乱光をベースにしてゲートし、単球の抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体との反応性を評価した。この結果によって、単球の８７％がＩｇＧ結合について陽性であり、一方ＥｎｄｏＳとインキュベートした血液中の単球は４３％のみが陽性であることが（図６Ｂ）明らかになった。これらの結果は、ＥｎｄｏＳ加水分解ＩｇＧが、ＦｃγＲの様々な組を発現するヒト細胞の結合能力を著しく減少させることを示した。
【０１７１】
ＥｎｄｏＳで処理するとＩｇＧはＦｃγＲＩＩａから解離する
ここまでの実験によって、ＩｇＧのＥｎｄｏＳ加水分解は細胞および表面上のＦｃγＲへの結合を阻害するが、ＥｎｄｏＳが既にＦｃγＲに結合したＩｇＧに活性を有するかどうか、このような活性がＦｃγＲに結合したＩｇＧを遊離させ得るかどうかは不明なままであった。したがって、ヒト血漿に曝露し、その後ＥｎｄｏＳで処理したＫ５６２細胞に結合したＩｇＧに対するＥｎｄｏＳの効果を調べた。細胞溶解物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＩｇＧに対する抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した。図７Ａに提示した結果によって判断されるように、Ｋ５６２細胞に対するＩｇＧの著しい結合が存在した。興味深いことに、細胞をＥｎｄｏＳで処理したとき、ブロット上にはＩｇＧのバンドは認められず、ＩｇＧは全て細胞から解離していることが示唆された（図７Ａ）。ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）を使用した対照実験では、Ｋ５６２細胞の表面上のＩｇＧシグナルは未処理細胞と同程度であることが明らかになった。これらの結果は、ＥｎｄｏＳによるＮ−グリカンの加水分解によって、ＩｇＧが細胞表面から解離することを強く示唆する。同様に、単球に結合したＩｇＧに対するＥｎｄｏＳの効果を分析した。これによって、単球結合ＩｇＧのほとんどは、未処理細胞と比較されるように、ＥｎｄｏＳによる処理によって細胞から解離したことが示された（図７Ｂ）。予測通り、対照細胞とは対照的に、ＥｎｄｏＳで処理した単球は、ＬＣＡレクチンとの反応は示さず、ＩｇＧブロットで検出されたように細胞上に残存するわずかな量のＩｇＧはＥｎｄｏＳによって加水分解される可能性が高いことが示された（図７Ｂ）。前記に示した結果はさらに、表面プラズモン共鳴実験によって確認された。ＩｇＧ１がＦｃγＲＩＩの最強の結合剤であることが以前観察されたため、可溶性ＩｇＧ１およびＦｃγＲＩＩ受容体を選択した。ＩｇＧ１が予め固定したＦｃγＩＩａに結合し、定常状態の解離相に達した後、ＩｇＧ１注入を中断し、ＥｎｄｏＳ注入またはランニング緩衝液に置換した。これによって、ＥｎｄｏＳ注入は、固定されたＦｃγＲＩＩａ受容体からのＩｇＧ１の解離を引き起こし、一方、ＦｃγＲＩＩａからのＩｇＧ１解離は、ランニング緩衝液を添加しても影響を受けないことが明らかになった（図７Ｃ）。これらを考え合わせると、これらの結果は、ＩｇＧグリカン加水分解によってＥｎｄｏＳは細胞および表面上のＦｃγＲに結合したＩｇＧを遊離することができることを明らかに示している。
【０１７２】
考察
本実施例では、ＥｎｄｏＳとＩｇＧの間の物理的相互作用およびＩｇＧ−ＦｃγＲ相互作用に対するＥｎｄｏＳのＩｇＧ  Ｎ−グリカン加水分解活性の生理学的関連を解明する。ＥｎｄｏＳが、精製された形態および血漿環境の両方においてヒトＩｇＧサブクラス全てに対してエンドグリコシダーゼとして特異的に作用することを初めて提示する。予測通り、酵素と全ＩｇＧサブクラスの間には物理的相互作用があることを酵素的に不活性なＥｎｄｏＳの変異型を使用して示すことに成功した。この研究では、ＥｎｄｏＳで加水分解したＩｇＧは単球に結合せず、ＥｎｄｏＳによる加水分解によって単球からＩｇＧがほとんど完全に解離することを認めた。単球はＦｃＲＩを発現し、この受容体はＩｇＧに最高の親和性を有するので、ＥｎｄｏＳはＦｃＲＩに結合しているＩｇＧであっても影響を及ぼすと結論づけた。なぜならば、観察したＥｎｄｏＳの効果は主にＦｃＩＩの関与によるものに違いないからである。興味深いことに、ＥｎｄｏＳはＦｃγＲＩＩ受容体の両イソタイプに対して効果を有するものと考えられ、したがって、ＩｇＧが媒介するエフェクター刺激の活性化および阻害の両方に影響を及ぼす。
【０１７３】
前記のデータは、ＥｎｄｏＳポリペプチドを利用する本発明の方法を支持する。ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するＥｎｄｏＳポリペプチドは、これらの細胞上の様々なＦｃγＲに既に結合しているＩｇＧを除去するために、全血または精製した血球細胞などの試料のインビトロ処理に使用することができた。これによって、予め結合したＩｇＧの妨害を受けることなく、受容体結合および細胞活性化に関して、細胞に添加された特異的ＩｇＧ調製物の効果を分析することが容易になるだろう。ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性は欠如するが、ＩｇＧ結合活性は有するＥｎｄｏＳポリペプチド、例えば、ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）は、特異的ＩｇＧの精製および検出手段として非常に有望である。本研究では、ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）がＩｇＧの全サブクラスと同等に十分相互作用することを示した。これは、ＩｇＧの調製および検出のために最近使用された主要な分子の１つ、プロテインＧで認め得るものと同程度であるが、利点はＩｇＧ３に結合しないプロテインＡと同程度である。さらに、プロテインＡはまた、ＩｇＭおよびＩｇＡにある程度結合する。ＥｎｄｏＳとＩｇＧまたはＩｇＡの間には相互作用はないことを以前示した。さらに、本明細書では、ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）は重鎖グリカンを欠如したＩｇＧと相互作用しないことを示すことができた。これは、グリコシル化状態に関わりなくＩｇＧに結合するプロテインＧおよびプロテインＡの両方とは対照的である。これは、機能的エフェクター領域を有する完全なＩｇＧのみが必要とされる場合、特に重要となり得る。プロテインＧのような現在利用可能な試薬を使用するとき、例えば、レクチンカラムを使用した第２の精製ステップがＩｇＧのグリコシル化画分のみを得るために必要である。ＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）のこの特性は、ＩｇＧ調製物のグリコシル化／機能的品質を評価するために、例えばプロテインＧと組み合わせて使用することができた。
【０１７４】
実施例２：ヒスチジンタグをつけたプロテインＨの構築
クローニング
プロテインＨをコードする構造遺伝子のヌクレオチド１２４から１０４８は、制限部位ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩを使用して、ｐＥＴ２１ｂベクターにクローニングした。構造遺伝子は、鋳型としてベクターｐＨＤ３８９を用いてＰＣＲを使用して得られた。
【０１７５】
使用したＰＣＲプライマーは以下の通りであった。
５’−ＴＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（３７ｍｅｒ）
５’−ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＡＡ  −３’（３６ｍｅｒ）
【０１７６】
ＰＣＲ断片およびベクターｐＥＴ２１ｂは、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化した。消化した断片は、０．８％アガロースゲル（Ｅゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ）で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットで精製した。ＰＣＲ断片は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のリガーゼを使用してベクターｐＥＴ２１ｂに連結した。
【０１７７】
ＤＮＡ構築物を調べるために、連結混合物を大腸菌ＥＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレートした。プラスミド精製を使用し、その後ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化して、５個のクローンを試験した。陽性コロニーを選出し、プラスミド精製のために増殖させた。プラスミドは、効果的なタンパク質発現のために大腸菌ＢＬ２１に挿入した。
【０１７８】
タンパク質発現および精製
タンパク質発現は、ｐＥＴ２１ｂベクターを使用する発現のための標準的方法および指示を使用して実施した。細胞を収集し、緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。細胞残渣は、遠心を使用して廃棄し、透明な溶解物をＡｍｅｒｓｈａｍ  ＢＩｏＳｃｉｅｎｃｅｓ製の１ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐカラムに標準的方法を使用して添加した。カラムから溶出したタンパク質は、ＮｕＰａｇｅ４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して還元条件下でエレクトロポレーションを使用して分析した。タンパク質の分子量は約３５ｋＤａであった。ＨｉｓプロテインＨの理論的分子量は３６ｋＤａである。
【０１７９】
ＩｇＧ結合活性は、ヒトＩｇＧとＨｉｓプロテインＨを混合し、次いで複合体をＨｉｓＴｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上に捕捉させ、その後ＮｕＰａｇｅ４〜１２％Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分析することによって示した。溶出液はＩｇＧ断片を含有しておらず、ＩｇＧがカラムにプロテインＨと一緒に捕捉されたことを示した。
【０１８０】
実施例３：ヒスチジンタグＩｄｅＳの構築
クローニング
ＩｄｅＳをコードする構造遺伝子のヌクレオチド７９から１０２０は、制限部位ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを使用して、ｐＥＴ２１ｂベクターにクローニングした。構造遺伝子は、ｐＧＥＸ：ＩｄｅＳベクター上でＰＣＲを使用して得られた。
【０１８１】
使用したＰＣＲプライマーは以下の通りであった。
５’−ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣ−３’  （２６ｍｅｒ）
５’−ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＣＣ  −３’（２６ｍｅｒ）
【０１８２】
ＰＣＲ断片およびベクターｐＥＴ２１ｂは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。消化した断片は、０．８％アガロースゲル（Ｅゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットで精製した。ＰＣＲ断片は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のリガーゼを使用してベクターｐＥＴ２１ｂに連結した。
【０１８３】
ＤＮＡ構築物を調べるために、連結混合物を大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレートした。プラスミド精製を使用し、その後ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して、５個のクローンを試験した。陽性コロニーを選出し、プラスミド精製のために増殖させた。プラスミドは、効果的なタンパク質発現のために大腸菌ＢＬ２１に挿入した。
【０１８４】
タンパク質発現および精製
タンパク質発現は、ｐＥＴ２１ｂベクターを使用する発現のための標準的方法および指示を使用して実施した。細胞を収集し、緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。細胞残渣は、遠心を使用して廃棄し、透明な溶解物をＡｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ製の１ｍｌＨｉｓＴｒａｐカラムに標準的方法を使用して添加した。カラムから溶出したタンパク質は、ＮｕＰａｇｅ４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて還元条件下でエレクトロポレーションを使用して分析した。発現し、精製したタンパク質は、ＮｕＰａｇｅ４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してエレクトロポレーションを使用して分析した。タンパク質の分子量は、約３４ｋＤａであった。
【０１８５】
ＩｄｅＳ活性は、ヒトＩｇＧとＩｄｅＳを３７℃で１時間混合することによって試験した。結果は、還元条件下でＮｕＰａｇｅ４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したエレクトロポレーションで評価した。純粋なＨｉｓＩｄｅＳおよび純粋なＩｇＧは、参照として使用した。このゲルによって、ＩｇＧ分子が消化され、その結果、以前に記載されたように（Ｖｉｎｃｅｎｔｓら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５５４０〜１５５４９）、ＩｇＧ切断産物に対応する約３１ｋＤａのバンドがゲル上にさらに出現することが明らかになった。
【０１８６】
実施例４：プロテインＨ存在下でのヒスチジンタグＩｄｅＳの活性
以下の反応は、エッペンドルフ管内で設定し、結果はＮｕＰａｇｅ４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したエレクトロポレーションで分析した。
【０１８７】
【表２】
0005722627.tif 000004
【０１８８】
前記の結果は、ヒスチジンタグＩｄｅＳは、タグを付けていない、およびヒスチジンタグプロテインＨの存在下でＩｇＧ画分を切断することを示した。
【０１８９】
実施例５
溶出緩衝液
以下の方法は、ＩｇＧセファロースからのＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）の溶出において使用するための様々な溶出緩衝液を試験するために使用した。試験した緩衝液は、酸感受性抗体に特異的な本発明の方法で使用するために特に適しているだろう。試験した様々な緩衝液は、
１．ＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かしたスクロース０．２５Ｍ
２．ＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かしたスクロース０．５Ｍ
３．ＰＢＳ  ｐＨ５．３に溶かしたスクロース０．２５Ｍ
４．ＰＢＳ  ｐＨ８．５に溶かしたスクロース０．２５Ｍ
５．ＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かしたスクロース０．２５Ｍ、マルトース０．２５Ｍ
６．ＰＢＳ、ｐＨ７．４
【０１９０】
ＩｇＧセファロースゲルは、標準的方法にしたがって作製し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４を使用して洗浄した。試験した溶出緩衝液それぞれについて、ＧＳＴタグＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）０．３ｍｇを試験試料としてゲルに添加した。試料は、振動台上で１時間インキュベートして、上清は５００ｇで３分間遠心することによって除去した。試料は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、４×１．０ｍｌで洗浄した。次に、ＧＳＴタグＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）は、前記の１〜６から選択した溶出緩衝液１．０ｍｌを使用して溶出した。１〜６のそれぞれは、別々の試料について試験した。試料は全て、振動台上で１．５時間インキュベートした。次に、第１の溶出液（溶出液１）を５００ｇで３分間遠心することによって除去した。それぞれの溶出緩衝液１．０ｍｌをさらに各試料に添加し、試料を振動台上で約３０分間インキュベートした。第２の溶出液（溶出液２）を前述のように遠心によって除去した。最後に、それぞれの溶出緩衝液１．０ｍｌをさらに各試料に添加し、試料を振動台上で約５０分間インキュベートした。最後の溶出液（溶出液３）を前述のように遠心によって除去した。
【０１９１】
各試料からの溶出液全ておよび元の上清は、その後、ゲル電気泳動（示さず）によって分析する前に、ＰＢＳ３００μｌで希釈した。
【０１９２】
ゲル分析によって、ＧＳＴタグＥｎｄｏＳ（Ｅ２３５Ｑ）は、溶出液として様々な濃度および様々な種類の糖を使用してＩｇＧから溶出することができた。スクロースを０．２５Ｍおよび０．５Ｍ含む溶出緩衝液が最も効果的であった。
【配列表フリーテキスト】
【０１９３】
配列の簡単な説明
配列番号：１は、Ｓ．ピオゲネスＡＰ１から単離したＥｎｄｏＳポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：２は、配列番号：１の配列から得られた改変ＥｎｄｏＳポリペプチド（Ｅ２３５Ｑ）のアミノ酸配列である。
配列番号：３は、シグナル配列を含む、Ｓ．ピオゲネスＡＰ１から単離したＥｎｄｏＳポリペプチドのアミノ酸配列である。この配列は、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＡＫ００８５０に対応する。
配列番号：４は、シグナル配列を含む、Ｓ．ピオゲネスＡＰ１から単離したＥｎｄｏＳをコードする核酸配列である。
配列番号：５から７は、プライマー配列である。
配列番号：８は、Ｓ．ピオゲネスＡＰ１から単離したＩｄｅＳのアミノ酸配列である。
配列番号：９は、推定シグナル配列を含む、Ｓ．ピオゲネスＡＰ１から単離したＩｄｅＳのアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、シグナル配列を含む、Ｓ．ピオゲネスＡＰ１から単離したＩｄｅＳをコードする核酸配列である。
配列番号：１１は、成熟プロテインＨのアミノ酸配列である。
配列番号：１２は、シグナル配列を含む、プロテインＨのアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、シグナル配列を含む、プロテインＨをコードする核酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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