(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
KKLRIKSKEK(配列番号1)の配列を含有するまたはそれからなるペプチドを除く、シンデカン1受容体と結合できる、多くとも30アミノ酸であるKaa2aa3Raa5aa6aa7aa8aa9aa10の配列を含むまたはそれからなる合成ペプチドであって、式中、生理的pHにおいて、
aa2＝KまたはA、aa6＝K、A、RまたはQ、aa8＝K、AまたはQ、aa10＝K、A、RまたはQであり、それらのうちで最大で1つは電荷が中性の残基（AまたはQ）であり、
aa3＝AまたはLであり、
aa5＝A、L、I、K、S、TまたはHであり、
aa7＝S、LまたはQであり、
aa9＝EまたはAである
ペプチド。
【請求項２】
以下の群:
- KALRIKSKEK (配列番号2)
- KKARIKSKEK (配列番号3)
- KKLRAKSKEK (配列番号4)
- KKLRIASKEK (配列番号5)
- KKLRIKSAEK (配列番号6)
- KKLRIKSKAK (配列番号7)
- KKLRIKSKEA (配列番号8)
- KKLRLRSKER (配列番号9)
- KKLRHKSKEK (配列番号10)
- KKLRTKSKEK (配列番号11)
- KKLRKKSKEK (配列番号12)
- KKLRSKSKEK (配列番号13)
- KKLRIKLKEK (配列番号14)
- KKLRIKQKEK (配列番号15)
- KKLRIQSKEK (配列番号16)
- KKLRIKSQEK (配列番号17)
- KKLRIKSKEQ (配列番号18)
から選択される配列を含有するまたはそれからなることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
シンデカン1受容体と結合できる、多くとも30アミノ酸であるKaa2aa3Raa5aa6aa7aa8aa9aa10の配列を含むまたはそれからなる合成ペプチドの医薬品の製造のための使用であって、式中、生理的pHにおいて、
aa2＝KまたはA、aa6＝K、A、RまたはQ、aa8＝K、AまたはQ、aa10＝K、A、RまたはQであり、それらのうちで最大で1つは電荷が中性の残基（AまたはQ）であり、
aa3＝AまたはLであり、
aa5＝A、L、I、K、S、TまたはHであり、
aa7＝S、LまたはQであり、
aa9＝EまたはAである
医薬品の製造のための合成ペプチドの使用。
【請求項４】
以下の群:
- KKLRIKSKEK(配列番号1)
- KALRIKSKEK (配列番号2)
- KKARIKSKEK (配列番号3)
- KKLRAKSKEK (配列番号4)
- KKLRIASKEK (配列番号5)
- KKLRIKSAEK (配列番号6)
- KKLRIKSKAK (配列番号7)
- KKLRIKSKEA (配列番号8)
- KKLRLRSKER (配列番号9)
- KKLRHKSKEK (配列番号10)
- KKLRTKSKEK (配列番号11)
- KKLRKKSKEK (配列番号12)
- KKLRSKSKEK (配列番号13)
- KKLRIKLKEK (配列番号14)
- KKLRIKQKEK (配列番号15)
- KKLRIQSKEK (配列番号16)
- KKLRIKSQEK (配列番号17)
- KKLRIKSKEQ (配列番号18)
から選択される配列を含有するまたはそれからなることを特徴とする、請求項３に記載の医薬品の製造のための合成ペプチドの使用。
【請求項５】
皮膚の治癒を促進するための医薬組成物の製造のための、請求項３または４に記載のペプチドの使用。
【請求項６】
組織再生を促進するための医薬組成物の製造のための、請求項３または４に記載のペプチドの使用。
【請求項７】
請求項３または４に規定されるペプチドを含有する医薬組成物または化粧用組成物。
【請求項８】
自己ケラチノサイトまたは間葉細胞を含み得るクリーム、ヒドロゲル、溶液、注射用製剤または噴霧剤の形態であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項３または４に規定されるペプチドを含有する医療デバイス。
【請求項１０】
前記合成ペプチドがグラフトもしくは堆積された、またはその中に組み込まれた支持体の形態であり、支持体が、コラーゲン、ゼラチン、多糖、ヒアルロン酸、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、キトサン、ヒトもしくは動物の無細胞真皮からなる群より選択される生体材料、またはシリコーン、ポリウレタン、PLLAからなる群より選択される合成材料、または綿、ポリエステルおよびポリアミドを含む群より選択される織物包帯材材料からなるフィルムもしくはマトリックスの形態であることを特徴とする、請求項９に記載の医療デバイス。
【請求項１１】
上皮細胞または間葉細胞のin vitro培養用の、請求項３または４に規定されるペプチドを含有する培養培地。
【請求項１２】
請求項３または４に規定されるペプチドがグラフトまたは吸着された実際の支持体を含み、ポリスチレン培養皿、バイオポリマーで作製されたフィルムもしくは多孔性マトリックス、織物のメンブレンまたはゲルコラーゲンの形態である、上皮細胞培養用の支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラミニン332(ラミニン5)のLG4小球(globule)のα3鎖に存在する規定の配列を有する新しいペプチド、およびシンデカン1受容体と結合できる規定の配列を有する該ペプチドと相同な配列を有するペプチドに関する。本発明はまた、上記のペプチドを含有する医薬組成物または化粧用組成物にも関する。最後に、本発明は、組織治癒および組織再生の分野における、または表皮もしくは上皮の再構築を意図する培養培地の補助剤としてのペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、数千万人の患者が、組織の喪失または臓器の欠陥に苦しんでいる。関心のある臓器および組織の移植は部分的に要求を満たしているが、この治療アプローチは、提供者の欠如と、長期の免疫抑制治療を必要とする同種移植片の拒絶の可能性とにより大きく制限される。
【０００３】
過去十年あまりにわたって、組織工学に対する関心が、基礎研究と、種々の企業により臨床的な用途について提供され始めている「人工組織」の確立および開発との両方の点において途方もなく迅速に拡大している。組織工学は、工学および生命科学の原理を、組織機能の回復、維持または改善を目的とする生物学的置換物の開発に応用する、多くの専門分野にわたる領域である。
【０００４】
組織工学は、生分解性の天然および合成の生体材料、未分化細胞(幹細胞)もしくは分化細胞(ケラチノサイト、線維芽細胞、軟骨細胞など)ならびに(または)成長因子もしくは接着分子などの活性分子と関連する。実際に、細胞接着は、人体に生体材料をうまく移植するために必須の決定的なステップである。これは、高度に相互作用性の表面の開発により改良されているが、それにも関わらず、マトリックス接着タンパク質の存在または細胞によるそれらの合成にまだ依存している。
【０００５】
さらに、5百万人が毎年、難しい損傷(焼痂および下腿潰瘍)を治療するための治癒包帯材を必要とする。皮膚の治癒を促進することを前提とする多くの包帯材が、現在、市場にあり、この領域における研究は増加している。感染および脱水の治療ならびに予防において努力がなされているが、複雑な治癒の問題の管理に関してまだ多くの問題がある。実際に、期待寿命および加齢人口の増加のために、慢性損傷の治癒の問題は増加している。接着分子を含有する包帯材の開発について新しい段階が期待されている。
【０００６】
皮膚の治癒は、真皮および表皮の事象が密接に結び付いた複雑な現象である。これは、長い間考えられていたような、その間に成長因子が合成されて細胞増殖および遊走を活性化する単純な直線的なプロセスではない。対照的に、皮膚の治癒は、可溶性因子、血液および細胞外マトリックス(ECM)の成分、ならびに実質および上皮細胞を活動させるいくつかの動的で相互作用性のプロセスの結果である(Clark、1996)。
【０００７】
細胞とECMとの間の相互作用は、あるいくつかの遺伝子の発現を制御することまたは遊走、増殖、分化もしくはプログラムされた細胞死を調整することにより細胞挙動を組織化することにおいて役割を有する(Hynes、1992)。細胞挙動のこの制御は、組織再構成の間に必須である。皮膚創傷がある場合に、真皮表皮接合部(DEJ)が傷つき、それを構成する分子は破壊されるか特定の酵素により分解される。真皮は、ケラチノサイトが直接接触する上皮細胞および情報を与えるマトリックス分子のための可溶性因子を生成することにより再上皮化の間に基本的な役割を有する。好ましい条件の下では、表皮の再上皮化は、外傷の数時間後に開始する。炎症性反応により、創床上にマトリックス分子が出現し、その上に残存した上皮構造からのケラチノサイトが迅速に遊走する。
【０００８】
修復プロセス中、遊走するケラチノサイトは頂部-基部極性を失い、暫定的マトリックスに接着し、それらが側方に遊走することを可能にする仮足を形成する(Larjavaら、1993)。上皮が創床を覆う際に、DEJタンパク質が、創傷の端から逐次的で規則正しい様式で再出現して、中央に向かって拡張する。基底膜ケラチノサイトは、次いで、頂部極性を有する定常表現型を再び採用し、基底膜表面上に再形成されたヘミデスモソーム(HD)を介してDEJに堅くつなぎとめられる。基底膜ケラチノサイトの遊走および接着は、マトリックス分子上に存在するある特定のペプチドモチーフと、接着複合体として分類される膜貫通型受容体(この細胞内ドメインは、細胞骨格の構成要素と連結している)との間の特異的相互作用により制御される(Aumailleyら、1996)。細胞接着複合体は、細胞膜を横切る情報の二方向移動を可能にする大きい多分子集合体である。細胞外、膜貫通(インテグリンおよびシンデカン)、サイトゾルおよび細胞骨格のタンパク質からなるこれらの複合体は、高度に動的な構造であり、種々の構成要素同士の特異的相互作用により多少一過性の様式で安定化されている。接着複合体の集合および分解は、精密に調節されて、細胞が接着、遊走、増殖および分化などの重要な作用を行うことを可能にする。
【０００９】
広範囲の細胞外リガンドのうち、ラミニン5としても知られるラミニン332(LN332)は、これらのプロセスの両方において基本的な役割を有する(AumailleyおよびRousselle、1999;Ghohestaniら、2001)。この接着分子は、2つの機能を有する。精密に制御された調節により、これは、強く静的な細胞接着、または逆に、一過性の細胞遊走を可能にする低い親和性接着を誘導できる。この特性は、皮膚において非常によく説明される。なぜなら、LN332は、表皮をつなぎとめることを担い、治癒プロセス中のケラチノサイト遊走にも関与するからである。
【００１０】
LN332は、3つのサブユニット、すなわちα3、β3およびγ2の集合体からなる(図1)。これは、表皮における主要な置き換えできない接着タンパク質であり、表皮において、HDを皮膚のDEJの基底部分に連結させる構造であるアンカーフィラメントの主成分として同定された(Rousselleら、1991)。LN332は、体の多くのその他の上皮細胞の接着に関与する(RousselleおよびAumailley、1994)。LN332は、上皮細胞によってのみ460kDa前駆体(プレLN332)として合成される。他の2つよりも長いα3鎖は、そのカルボキシ末端に、LG1〜LG5と呼ばれる5つの小球として生じる塩基性残基の5つの反復からなる球状ドメインを有する(LG1-2-3-4-5)。これらの球状ドメインはケラチノサイト接着を担うドメインを含むため、非常に重要である。
【００１１】
文献WO2000/66731は、組換え形のラミニン5全体の生成について記載している。
【００１２】
文献WO2006/018551は、ラミニン5のN末端のγ2鎖に存在するTALRIRATYGEYの配列が、表皮ケラチノサイト接着に関与することについて記載している。
【００１３】
本出願において、本出願人は、プレLN332のα3鎖のカルボキシ末端に関心を持っている。
【００１４】
生理的条件の下で、LN332のα3サブユニットおよびγ2サブユニットはそれぞれ、それぞれのカルボキシ末端およびアミノ末端の細胞外翻訳後切断を受ける(Marinkovichら、1994;Goldfingerら、1998;Amanoら、2000)。この異なる切断により、アミノ末端での超分子編成レベルに対して、そしてLGドメインによりもたらされる細胞相互作用に関しての両方の上皮-間葉接着において重要な役割を有する成熟形がもたらされる(AumailleyおよびRousselle、1999)。LG4/5タンデムを分割することによるα3鎖の成熟は、LN332における決定的な機能変化を誘導する。なぜなら、このことは、α6β4インテグリンを介する隣接上皮細胞の接着と、安定した接着構造であるヘミデスモソームの集合を可能にするからである(Sonnenbergら、1993;RousselleおよびAumailley、1994;Niessenら、1994)。したがって、成熟LN332は細胞運動性に対する障壁となろう(Bakerら、1996;Goldfingerら、1998;Ryanら、1999)。しかし、プレLN332は、α3鎖前駆体のLG4/5小球により、ヘミデスモソームの形成を妨げ、細胞遊走を誘導できる(Ryanら、1999;Goldfingerら、1999;Bachyら、2008)。皮膚治癒のin vivo研究は、創傷定着領域でのケラチノサイトによる種々のLN332鎖の発現の増加を示しており(Ryanら、1994)、ここで、LN332は、その前駆体の形で細胞外マトリックスに存在する(Ryanら、1994;Lampeら、1998;Nguyenら、2000)。したがって、プレLN332は、暫定的マトリックスに存在するが、その成熟形で出現する組織化された基底層には全く存在しない(Lampeら、1998;Goldfingerら、1999;Tungallら、2002)。さらに、in vitro研究により可動性ケラチノサイトによるLN332の過剰発現および合成の増加は直ちに報告されたが(Rousselleら、1991)、前駆体の形態による関与は、かなり後になってからしか見出されていない(Nguyenら、2000;DeclineおよびRousselle、2001)。これらのデータは全て、LG4/5ドメインが細胞遊走に影響し、上皮修復プロセスにおいて役割を有することを示す。本出願の発明者らのものを含む研究は、プレLN332が、α3β1インテグリンと共同して、細胞の極性化および遊走を制御することを示している(Goldfingerら、1998;DeclineおよびRousselle、2001;FrankおよびCarter、2004;Bachyら、2008)。さらに、細胞外マトリックスにおけるプレLN332の沈着および保持におけるLG4/5フラグメントの役割を示唆する研究がある(Sigleら、2004)。
【００１５】
最後に、プレLN332のLG4/5ドメインが、ケラチノサイト遊走中に、プロテオグリカンファミリーに属する受容体であるシンデカン1と相互作用することが示されている(Okamotoら、2003;Bachyら、2008)。
【００１６】
表皮において、シンデカン1は、基底上層のケラチノサイトの細胞周囲領域に局在し、基底層ではほとんど発現されない。特に、シンデカン1の発現は、創傷治癒中に強く活性化され、主に創傷の端部に局在化される(Eleniusら、1991;Oksalaら、1995;Jaakkolaら、1998)。この発現パターンは、他のシンデカンについて見出されていないので、シンデカン1に特異的である(Galloら、1996)。さらに、シンデカン1をコードする遺伝子が欠損したマウスは、創傷治癒中のケラチノサイトの増殖および遊走に欠陥がある(Steppら、2002)。シンデカンは、遊走などの細胞プロセスに関与することが知られており、インテグリンおよび成長因子と共同する共受容体としても知られている(Bernfieldら、1999;Woodsら、2000)。これらの点の全ては、プレLN332のLG4/5ドメインが、創傷治癒中のシンデカン1についての優先的なリガンドであり、上皮修復のプロセスを促進する細胞内シグナル伝達カスケードについての基礎であるという仮説を支持する。
【００１７】
α3鎖上のLG4/5フラグメントの切断部位が決定され(Declineら、2003)、LG4/5フラグメントが組換え形で生成されている(Okamotoら、2003)。LG4/5フラグメントを用いて行われた細胞接着および遊走実験は、このドメインが細胞遊走に関与し、膜受容体であるシンデカン1が、この認識に特異的に関与することを示している(Okamotoら、2003、Bachyら、2008)。シンデカンは、全ての接着細胞の表面上で発現されるヘパラン硫酸の鎖を有する膜受容体ファミリーに属する。これらの受容体は、細胞骨格と連結された細胞内シグナル伝達を介してインテグリン活性を調整できる分子「促進因子」として記載されている。LG4/5フラグメントへの細胞接着は、シンデカン1上に存在するヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸の鎖に依存する。これらのグリコサミノグリカンの2つの鎖は異なる親和性でLG4/5フラグメントと結合するが、これらは、LG4/5小球中の同じ相互作用ドメインを認識する(Okamotoら、2003)。プレLN332は、LG4/5ドメインとのシンデカン1相互作用により、正常ヒトケラチノサイトの遊走を誘導する。プレLN332のLG4/5ドメインとのシンデカン1依存性接着は、正常ヒトケラチノサイト細胞骨格の再組織化を誘導して、細胞遊走に特徴的な細胞質突出物である糸状仮足および微小針状体(microspicule)の形成を導く。この初期の段階は、細胞遊走に特異的な一過性接着複合体の形成に関与することが知られているGTPアーゼであるGTPアーゼRacおよびCdc42の活性化を伴う(Bachyら、2008)。
【００１８】
LN211のα2鎖のLG5モジュールの構造決定により(Tisiら、2000;Timplら、2000)、これらのLGモジュールで基本的構造モデルを作製できたが、これらのモジュールは、構造の外側に向けられたループにより互いに連結された14個のβラメラ(A〜N)の形態で組織化される。ヘパリン被覆ビーズへの組換えLG4/5フラグメントの共有結合と、その後のタンパク質の酵素的切断に基づく技術を用いて、「ヘパリン結合領域」に相当する3つの配列が同定され(Vivesら、2004)、これらの配列はそれぞれ配列KKLRIKSKEK、PSGKPKSLPおよびTSVTPKQSLである。この文献において、実験は未変性タンパク質を用いて行われ、ペプチド状態において単離されることなく結合部位を同定した。
【００１９】
JP2006063033およびUtaniら、2001の文献は、同時に、LG4分子に存在するNSFMALYLSKGR配列(α3鎖の配列の残基1412〜残基1423)が、シンデカン2およびシンデカン4を介して細胞接着を誘導すると記載した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】WO2000/66731
【特許文献２】WO2006/018551
【特許文献３】JP2006063033
【特許文献４】米国特許出願公開第2005/0059602号
【特許文献５】米国特許第5654135号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Urushibataら(Biochemistry、2009、48、10522〜10532頁)
【非特許文献２】Hashimotoら(Biomaterials 25 (2004)、1407〜1414頁)
【非特許文献３】BoyceおよびHam(Cultivation, frozen storage, and clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in serum-free media、Tiss Cult. Meth. 1985、9:83〜93頁)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本出願人は、KKLRIKSKEK(配列番号1)の配列(LG4小球におけるβFおよびGラメラを連結するループ内にあるα3鎖の配列の残基1433〜残基1442)が、LG4モジュールにおけるシンデカン1との結合部位であることを示した。なぜなら、(1)この配列は単独で、シンデカン1依存性細胞接着を誘導でき、(2)この配列は、LG4/5ドメイン全体と等しい様式で、特異的に、シンデカン1と結合できるからである。
【００２３】
これほど小さい機能的ペプチドの同定は、Urushibataら(Biochemistry、2009、48、10522〜10532頁)の文献が示すように、全く自明でない。この文献において、著者らは、ラミニンα3鎖のGドメインに属する107種の合成ペプチドの生物活性を分析したが、本発明の主題であるものを明らかにはしなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
したがって、本発明は第1に、配列KKLRIKSKEK(配列番号1)、またはシンデカン1受容体と結合できるK残基(1位)とR残基(4位)とが保存された同一サイズの配列を含む合成または類似のペプチドに関する。
【００２５】
配列番号1の配列自体または配列番号1を含有する配列がすでに記載されている対象のペプチドに関して、本発明は、この配列の機能的バリアントに有利に焦点を当てる。つまり、好ましい実施形態において、本発明は、シンデカン1受容体と結合できるKaa2aa3Raa5aa6aa7aa8aa9aa10の配列を含有するまたはそれからなる合成ペプチドに関するが、KKLRIKSKEK(配列番号1)の配列を含有するまたはそれからなるペプチドは除く。しかし、治療用途について、配列番号1の配列を含有するまたはそれからなるものを含む全てのペプチドが関係すると考えられる。
【００２６】
米国特許出願公開第2005/0059602号の文献は、実際に、12aaからなり配列番号1を含むA3G78の配列について記載している。したがって、より具体的には、以下のペプチド:
- KKLRIKSKEK;
- DGKKLRIKSKEK
が除外される。
【００２７】
Hashimotoら(Biomaterials 25 (2004)、1407〜1414頁)の文献は、アルギン酸包帯材に関連するハイブリッドペプチドについて記載している。いくつかのものは10aaの大きさを有し、4位にアルギニン残基(R)を有する。しかし、これらのペプチドは、アセチルリシン(ac-K)を1位に有し、シンデカン1受容体と結合できない。したがって、以下のペプチドも、本発明に包含されない:
- Ac-KSIRVAVAPG
- Ac-KSIRIAIAPG
- Ac-KSIRVGVGPG
- Ac-KSIRIGIGPG。
【００２８】
シンデカン1との結合は、当業者に知られている任意の技術により、特に親和性クロマトグラフィーにより容易に明らかにすることができる。この種の試験は、例えば、試験するペプチドをビーズに固定し、次いで、ビーズをケラチノサイト溶解物と共にインキュベートすることからなり得る。次いで、ペプチド上にこのようにして固定された細胞タンパク質をSDS PAGE電気泳動、次に免疫検出を行うことにより分析して、シンデカン1含量を評価することができる。
【００２９】
以下の記載において、定量分析を用いて、KKLRIKSKEKペプチド(配列番号1)により示される細胞接着が、NSFMALYLSKGRペプチドにより示される接着よりも効果的であることを示す。これは、第1に、より少ない量の固定化ペプチドにより細胞接着が誘導されたこと、第2に、固定化されたペプチドの量に関わらず、接着細胞の総数がKKLRIKSKEKペプチドで200%大きいことによる。
【００３０】
以下の記載および特許請求の範囲において、「ペプチド類似体」との用語は、ペプチドがシンデカン1と結合する能力を保持していることを条件として、修飾形態の本発明のペプチドを意味する。修飾は、立体的であり得る。したがって、ペプチドは、オリゴマー化された形態、折り畳まれた形態、または環化された形態であってよい。修飾は、化学的であってもよいので、例えば、対象のモチーフがグラフトされたペプチドまたはその側鎖が化学的に修飾されたペプチドも本発明に包含される。
【００３１】
ある特定の実施形態において、本発明のペプチドは、最大で30個のアミノ酸、好ましくは最大で18個のアミノ酸を含有し、KKLRIKSKEK(配列番号1)の配列を含有する。
【００３２】
別の実施形態において、ペプチドは、KKLRIKSKEK(配列番号1)の配列、またはK残基(1位)とR残基(4位)とが保存された同一サイズの配列からなる。
【００３３】
ある特定の実施形態において、本発明のペプチドは、aa1aa2aa3aa4aa5aa6aa7aa8aa9aa10の配列
(式中、生理的pHにおいて:
aa1は、リシン残基であり、
aa4は、アルギニン残基であり、
aa2、aa6、aa8、aa10は、正に帯電した残基であり、それらのうちで最大で1つは電荷が中性の残基で置換されていてもよく、
aa3は、電荷が中性の残基であり、
aa5は、電荷が中性の残基であり、
aa7は、アラニン以外の電荷が中性の残基であり、
aa9は、負に帯電した残基または電荷が中性の残基である)
を含有するまたはそれからなる。
【００３４】
言い換えると、本発明のペプチドは、Kaa2aa3Raa5aa6aa7aa8aa9aa10の配列
(式中、生理的pHにおいて:
aa2、aa6、aa8、aa10は、正に帯電した残基であり、それらのうちで最大で1つは電荷が中性の残基で置換されていてもよく、
aa3は、電荷が中性の残基であり、
aa5は、電荷が中性の残基であり、
aa7は、アラニン以外の電荷が中性の残基であり、
aa9は、負に帯電した残基または電荷が中性の残基である)
を含有するまたはそれからなる。
【００３５】
以下の記載および特許請求の範囲において、電荷が中性の残基とは、以下のアミノ酸:フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、プロリン、グリシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンのことをいう。
【００３６】
同様に、正に帯電した残基とは、以下のアミノ酸:リシン、アルギニンおよびヒスチジンのことをいう。
【００３７】
最後に、負に帯電した残基とは、以下のアミノ酸:アスパラギン酸、グルタミン酸のことをいう。
【００３８】
本出願人は、以下の配列を含有するまたはそれからなるペプチドを用いて、非常に良好な細胞接着の結果を得た。
- A2: KALRIKSKEK (配列番号2)
- A3: KKARIKSKEK (配列番号3)
- A5: KKLRAKSKEK (配列番号4)
- A6: KKLRIASKEK (配列番号5)
- A8: KKLRIKSAEK (配列番号6)
- A9: KKLRIKSKAK (配列番号7)
- A10: KKLRIKSKEA (配列番号8)
- M2: KKLRLRSKER (配列番号9)
- M4: KKLRHKSKEK (配列番号10)
- M5: KKLRTKSKEK (配列番号11)
- M6: KKLRKKSKEK (配列番号12)
- M7: KKLRSKSKEK (配列番号13)
- M8: KKLRIKLKEK (配列番号14)
- M9: KKLRIKQKEK (配列番号15)
- U1: KKLRIQSKEK (配列番号16)
- U2: KKLRIKSQEK (配列番号17)
- U3: KKLRIKSKEQ (配列番号18)。
【００３９】
本発明は、上記で規定されるペプチドを含有するまたはそれからなる合成ペプチド配列の、医薬品として、あるいは皮膚の治癒、特に以下の皮膚疾患もしくは外傷を改善することを有利に意図する医薬組成物または医療デバイスの製造のための使用にも関する。
【００４０】
対象の皮膚状態は、特に:
・潰瘍、焼痂、
・例えば加齢、肝斑に対処するための美容目的、CO2もしくはエルビウムレーザ治療、フラクショナルレーザ、化学ピーリング、ミクロ皮膚剥離術(microdermabrasion)のための皮膚科処置の後の皮膚の治療、
・真皮表皮接合部の疾患、例えば表皮水泡症、
・乾癬
である。
【００４１】
対象の外傷は、特に:
・浅達性から深達性の第2度熱傷、第3度熱傷、皮膚の表皮剥脱、水泡
・皮膚の再構築、形成手術、皮膚移植
・皮膚移植提供部位
である。
【００４２】
本発明によるペプチドは、組織再生、特に皮膚を再パルプ化(repulping)または再び厚くするために用いることもできる。この関係において、例えばしわを埋めることが興味の対象である。
【００４３】
本発明は、いくつかの形態をとり得る上記のペプチドを含有する医薬組成物または化粧用組成物にも関する。
【００４４】
第1の実施形態において、本発明の医薬組成物は、より医療デバイスのようであり、この場合、本発明の合成ペプチドがグラフトもしくは堆積された、またはその中に組み込まれた支持体であり、該支持体は、コラーゲン、ゼラチン、多糖、ヒアルロン酸、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、キトサン、ヒトもしくは動物の無細胞真皮からなる群より選択される生体材料、またはシリコーン、ポリウレタン、PLLAからなる群より選択される合成材料、または綿、ポリエステルおよびポリアミドを含む群より選択される織物包帯材材料からなるフィルムもしくはマトリックスの形態である。
【００４５】
このようなデバイスは、特に、第3度熱傷の皮膚の再構築のために用いられる。本発明は、よって、上記の医療デバイスを皮膚に接触させて施用するステップからなる、特に第3度熱傷の皮膚再構築方法にも関する。
【００４６】
第2の実施形態において、本発明の医薬組成物または化粧用組成物は、自己ケラチノサイトまたは間葉細胞を含み得るクリーム、ヒドロゲル、溶液、注射用製剤または噴霧剤の形態である。
【００４７】
溶液、クリームまたはヒドロゲルの場合、1種または複数のペプチドは、例えば、表皮または真皮表皮移植の提供者および受容者の部位にて皮膚移植中に皮膚に塗布され、かつ擦過、第2度熱傷の皮膚の治癒、慢性損傷または表皮を治療する任意の医療処置においても用いることを意図するこれらの製剤に組み込まれる。
【００４８】
別の用途において、1種または複数のペプチドは、皮膚の加齢を治療する、例えばメソセラピーのための注射用製剤に組み込まれる。局所での使用も構想される。
【００４９】
噴霧剤の形態は、例えば重症熱傷の治療または潰瘍のような不応性創傷の治癒のために表皮ラメラまたは自己もしくは同種の皮膚全体を配置する前の組織工学における用途に特に適する。ある特定の実施形態において、ペプチドに加えて、噴霧剤の形態は、自己ケラチノサイトも含有してよい。重症熱傷の症例において特に行われる治療は、1または2段階で行うことができる。
【００５０】
1段階治療:
皮弁を除去した後にこの組織を酵素消化し、次いで、細胞懸濁物を回収して、1種または複数のペプチドを加える。細胞/ペプチド混合物を、次いで、治療する創傷に噴霧する。
【００５１】
2段階治療:
皮弁を除去した後に表皮弁を酵素消化する。ケラチノサイトを単離し、次いで、増幅のために培養する。細胞を懸濁物として回収し、1種または複数のペプチドを加える。混合物を、次いで、治療する創傷に噴霧する。
【００５２】
本発明は、上皮または間葉細胞のin vitro培養のための上記のペプチドを含有する培養培地にも関する。
【００５３】
より具体的には、1種または複数のペプチドは、製造中に培養培地に直接、または使用中に培養培地に即時に加える補充物としてのいずれかで、上皮または間葉細胞(なかでもケラチノサイトおよび線維芽細胞)のin vitro培養のための特定の培養培地に加えることができる。
【００５４】
このような培養培地は、医療、科学、研究または薬理毒物学の用途のためにケラチノサイトおよびその他の上皮細胞(角膜上皮、頬側または膣の上皮)を培養するためであってよく、該1種または複数のペプチドの添加は、培養段階を促進および/もしくは短縮し、かつ/または培養物および細胞構築物(細胞の層、偽表皮、再構築上皮)の質を改善するためである。
【００５５】
代表的なケラチノサイト培養培地は、例えば、米国特許第5654135号に記載される。
【００５６】
上皮細胞またはケラチノサイト培養物の用途は、例えば以下のものを含む:
・化粧用もしくは薬理学的分子または薬理学的もしくは化粧用調製物を試験するための表皮または再構築上皮の生成(動物モデルを用いない)
・細胞または表皮ラメラに噴霧することによる重症熱傷の患者の治療または創傷治癒の治療(例えば静脈瘤性潰瘍および糖尿病性潰瘍)において。本発明のペプチドは、特に重症熱傷の患者のために、移植前に置換皮膚を存続可能に保つことを意図する正常ヒトケラチノサイト用の培養培地に用いてもよい。
・研究、遺伝子治療、ケラチノサイトの研究、新しい活性物質、成長因子の試験などの目的のため。
・細胞バンクの構築のため。
【００５７】
1種または複数のペプチドを含有する培養培地は、ケラチノサイトの播種前と、その後の偽表皮の生成段階との両方で、線維芽細胞をin vitroで培養して皮膚全体を生成することを意図し得る。1種または複数のペプチドは、線維芽細胞のよりよい接着と広がりとを可能にして、播種直後の線維芽細胞の喪失を制限し、かつ播種された線維芽細胞のより大きい運動性を可能にする。
【００５８】
品質が良好な真皮等価物を得るために必要な時間が低減され、皮膚全体をより迅速に得ることができる。
【００５９】
in vivoでは、3次元マトリックス内にペプチドが存在するので、線維芽細胞はよりよく接着して広がり、皮膚治癒中の肉芽組織の形成が制限される。
【００６０】
本発明は、ケラチノサイトなどの上皮細胞の培養のためのペプチドを含有する支持体にも関する。支持体は、生成物、分子または化粧用もしくは医薬用製剤の毒性試験のために用いることができる偽表皮または皮膚全体を生成するために用いることができるメンブレンまたはマトリックスの形態であってよい。
【００６１】
1種または複数のペプチドは、播種の喪失を低減し、表皮再構築の速度を高め、再構築表皮の構造の質を改善できる。
【００６２】
より具体的には、培養支持体は、その上にペプチドが吸着またはグラフトされたポリスチレン培養皿であってよい。
【００６３】
培養支持体は、その上にペプチドが吸着またはグラフトされたI型およびIV型コラーゲンのメンブレンのような皮膚等価物の再構築のために用いられるメンブレンまたはバイオポリマーフィルムであってもよい。
【００６４】
ペプチドがフィルム、マトリックス、メンブレンまたは細胞培養皿の表面にグラフトされる用途において、C末端部分またはN末端部分に基を加えて、支持体との共有結合を可能にすることができる。支持体と反応するこの基は、スペーサアームによりペプチドと分けられていてよい。
【００６５】
この基は、例えば、Masudaら(2009)に記載されるようなクロロアセチルキトサンとの反応のために、Cys-Gly-Glyモチーフを、N末端部分にグラフトさせることからなってよい。
【００６６】
ビオチンアームを加えて、アビジン官能化支持体への非共有的グラフト化を可能にしてもよい。
【００６７】
培養支持体は、その上にペプチドが吸着またはグラフトされた織物のメンブレンまたは多孔性マトリックスの形態であってもよい。
【００６８】
培養支持体は、その上にペプチドが吸着またはグラフトされたゲル、例えば酸可溶性コラーゲンゲルの形態であってもよい。
【００６９】
1種または複数のペプチドは、培養培地に関係なく、コーティング溶液として、例えば皮膚等価物を再構築するために用いられる培養皿またはバイオポリマーメンブレン、例えばI型およびIV型コラーゲンのメンブレンを被覆するために加えてもよい。
【００７０】
本発明およびそれにより得られる利点を、実施例および添付の図面により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ラミニン332の図。α3鎖、β3鎖およびγ2鎖を組み合わせて、それらのC末端で高次コイルαヘリックスを形成する。その他の2つよりも長いα3鎖は、そのC末端に、一連の5つの球状ドメインLG1〜LG5を有する。分子は、ドメイン:LN(ラミニンN末端ドメイン)、LE(ラミニン表皮成長因子様ドメイン)、L4(ラミニンドメイン4)、LG(ラミニン球状ドメイン)、LCC(ラミニンコイルドコイル)に組織化される。
【図２】LG4/5ドメインのペプチド配列およびシンデカン1結合部位の位置。プレLN332のα3鎖のLG4/5ドメインの配列。N末端配列は、1338位のアスパラギン酸切断部位から開始し、1713位のグルタミン酸で終了する。下線を付した領域は、小球間の直鎖状「スペーサ」ドメインを表す。シンデカン1結合ドメインKKLRIKSKEK(配列番号1)は、1433位〜1442位に黒色の太字で示す。
【図３】正常ヒトケラチノサイトおよびHT1080細胞の、LG4/5フラグメントおよびペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)への接着。(A、B)ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)およびLG4/5タンパク質への正常ヒトケラチノサイトおよびHT1080株の細胞の用量依存性接着。ペプチド(A)およびタンパク質LG4/5(B)を、96ウェルプレート上に、横座標に示す濃度で固定化した。各ウェルに6.104個の細胞を入れ、プレートを37℃にて1時間インキュベートした。洗浄の後に、接着細胞を固定し、細胞接着を、方法の部分に記載するようにして測定した。(C)KKLRIKSKEKペプチド(配列番号1)およびLG4/5タンパク質に接着する正常ヒトケラチノサイトおよびHT1080細胞の観察。観察は、PlasDic干渉ユニットを備えたZeiss Axiovert 40顕微鏡で行った。50μmのバー。
【図４】LG4/5フラグメントおよびラミニン332への細胞の接着に対するペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の影響。LG4/5(白色のバー)およびLN332(灰色のバー)タンパク質(1μg/ウェル)を、96ウェルプレートに吸着させた。(A)LG4/5およびLN332タンパク質への細胞の接着に対するポリクローナル抗LG4/5抗体の影響。ウェルを飽和させた後に、抗LG4/5抗体の溶液(10μg/ml)を1時間加え、その後、HT1080細胞(細胞6.104個/ウェル)を用いて接着試験を行った。(B、C)LG4/5フラグメントへのシンデカン1依存性接着に対する溶液中のLG4/5タンパク質およびペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の影響。HT1080細胞を皿から剥がし、グラフに記載するように、そのまま、またはLG4/5タンパク質(10μg/ml)もしくはペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)(20μg/ml)の存在下でウェル(細胞6.104個/ウェル)に入れた。(A、B、C)プレートを37℃にて1時間インキュベートした。洗浄した後に、接着細胞を固定し、細胞接着を、方法の部分に記載するようにして測定した。抗体または競合タンパク質の存在下での細胞接着を、競合物質なしで同じ基質に対して得られた細胞接着のパーセンテージとして示した。
【図５】親和性クロマトグラフィーによるペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)へのシンデカン1の特異的結合の証明。(A)正常ヒトケラチノサイトの溶解物を、材料および方法の部分に記載するようにして調製し、2mgの溶解物を、被覆していない(レーン1)かまたはビオチン化ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)(レーン2)、PSGKPKSLP(配列番号19)(レーン3)およびTSVTPKQSL(配列番号20)(レーン4)で被覆したニュートラアビジンビーズと共にインキュベートした。洗浄した後に、ビーズと結合した物質を、ヘパリチナーゼIおよびコンドロイチナーゼABCの混合物で消化して、シンデカン1のタンパク質部分をグリコサミノグリカンから遊離させた。次いで、試料を8%アクリルアミドゲルにて非変性条件下でのSDS PAGE電気泳動、およびポリクローナル抗シンデカン抗体H174を用いるイムノブロッティングにより分析した。(B)正常ヒトケラチノサイトの溶解物を調製し、2mgの溶解物を、ビオチン化ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)で被覆していない(レーン1)かもしくは被覆した(レーン3)ニュートラアビジンビーズ、またはLG4/5フラグメント全体で被覆したセファロースビーズ(レーン2)と共にインキュベートした。洗浄した後に、ビーズと結合した物質を、ヘパリチナーゼIおよびコンドロイチナーゼABCの混合物で消化して、シンデカン1のタンパク質部分をグリコサミノグリカンから遊離させた。次いで、試料を8%アクリルアミドゲルにて非変性条件下でのSDS PAGE電気泳動、およびポリクローナル抗シンデカン抗体H174を用いるイムノブロッティングにより分析した。(A、B)分子量マーカーの位置を左に示す。
【図６】ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)およびNSFMALYLSKGR(配列番号21)へのHT1080細胞の接着。(A)漸減範囲のペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)およびNSFMALYLSKGR(配列番号21)を、96ウェルMicrolonプレートに固定化し、実際に吸着された量を、即時調製したペプチドの対応する範囲を参照にするタンパク質アッセイにより決定した。試験したペプチドの量は、グラフの横軸に示す。6.104個の細胞を各ウェルに入れ、プレートを37℃にて1時間インキュベートした。洗浄した後に、接着細胞を固定し、細胞接着を、方法の部分に記載するようにして測定した。(B)ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)およびNSFMALYLSKGR(配列番号21)に接着するHT1080細胞の観察。観察は、PlasDic干渉ユニットを備えたZeiss Axiovert 40顕微鏡で行った。50μmのバー。
【図７】ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の突然変異誘発およびシンデカン1との結合についてのその影響。一連の点突然変異を、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)に、各アミノ酸をアラニン(A)で順に置き換えることにより導入した。種々のビオチン化変異ペプチドを図に示し、A1〜A10まで番号を付す。野生型ペプチド(T+)は、黒色で示す。「太字」のアミノ酸は、グリコサミノグリカンとの相互作用において重要な役割を有すると考えられる塩基性アミノ酸(リシンおよびアルギニン)の位置を示す。アラニン(A)への各変異を強調する。正常ヒトケラチノサイトの溶解物を、材料および方法の部分に記載するようにして調製し、2mgの溶解物を、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)で被覆していない(T-)もしくは被覆した(T+)、または種々の変異ペプチドで被覆した(A1〜A10)ニュートラアビジンビーズと共にインキュベートした。洗浄した後に、ビーズと結合した物質を、ヘパリチナーゼIおよびコンドロイチナーゼABCの混合物で消化して、シンデカン1のタンパク質部分をグリコサミノグリカンから遊離させた。次いで、試料を8%アクリルアミドゲルにて非変性条件下でのSDS PAGE電気泳動、およびポリクローナル抗シンデカン抗体H174を用いるイムノブロッティングにより分析した。分子量マーカーの位置を左に示す。
【図８】ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)突然変異誘発およびシンデカン1との結合についてのその影響。一連の点突然変異または多重突然変異を、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)に、1つまたは複数のリシン(K)をグルタミン(Q)で置き換えることにより導入した。種々のビオチン化変異ペプチドを図に示し、U1〜U9と称する。野生型ペプチドはT+と示す。「太字」のアミノ酸は、グリコサミノグリカンとの相互作用において重要な役割を有すると考えられる塩基性アミノ酸(リシンおよびアルギニン)の位置を示す。グルタミン(Q)への点または多重の各変異を強調する。3残基短いペプチドをU9と示す。正常ヒトケラチノサイトの溶解物を、材料および方法の部分に記載するようにして調製し、2mgの溶解物を、ペプチドKKLRIKSKEKで被覆していない(レーンT-)かもしくは被覆した(T+)か、または種々の改変ペプチドで被覆した(U1〜U9)ニュートラアビジンビーズと共にインキュベートした。洗浄した後に、ビーズと結合した物質を、ヘパリチナーゼIおよびコンドロイチナーゼABCの混合物で消化して、シンデカン1のタンパク質部分をグリコサミノグリカンから遊離させた。次いで、試料を8%アクリルアミドゲルにて非変性条件下でのSDS PAGE電気泳動、およびポリクローナル抗シンデカン抗体H174を用いるイムノブロッティングにより分析した。分子量マーカーの位置を左に示す。
【図９】細胞外マトリックスにおける相同タンパク質の探索によるペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の突然変異誘発、およびシンデカン1との結合についてのその影響。ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の一連のバリアントを、細胞外マトリックスタンパク質で見出された配列相同性に基づいて生成した。野生型ペプチドはT+と示す。「太字」のアミノ酸は、シンデカン1との相互作用において重要な役割を有するアミノ酸の位置を示す(図6および7を参照されたい)。元の配列とは異なるアミノ酸を強調する。(A)KKLRIKSKEK配列(配列番号1)の相同配列を、細胞外マトリックスタンパク質において見出し、M1(ヒトおよびマウスラミニンα4鎖から)、M2(マウスラミニンα3鎖から)およびM3(ヒトADAM 20タンパク質から)と称した。(B)R-X-KSK配列の相同配列を、細胞外マトリックスタンパク質において見出し、M4〜M7として列挙した。(C)RIK-X-K配列の相同配列を、細胞外マトリックスタンパク質において見出し、M8およびM9として列挙した。正常ヒトケラチノサイトの溶解物を、材料および方法の部分に記載するようにして調製し、2mgの溶解物を、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)で被覆していない(レーンT-)かもしくは被覆した(T+)か、または種々の改変ペプチド(M1〜M9)で被覆したニュートラアビジンビーズと共にインキュベートした。洗浄した後に、ビーズと結合した物質を、ヘパリチナーゼIおよびコンドロイチナーゼABCの混合物で消化して、シンデカン1のタンパク質部分をグリコサミノグリカンから遊離させた。次いで、試料を8%アクリルアミドゲルにて非変性条件下でのSDS PAGE電気泳動、およびポリクローナル抗シンデカン抗体H174を用いるイムノブロッティングにより分析した。分子量マーカーの位置を左に示す。
【図１０】NHKの生存性に対するペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の影響。NHKを、96ウェルプレートに、ウェルあたり104個の細胞で播種した。24時間後に、培養培地を除去し、記載する濃度でペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)(上の曲線)またはLG4/5タンパク質(下の曲線)を含有するKBM-2培地に置き換えた。37℃で48時間の接触の後に、培地を除去し、このステップを2回繰り返した。37℃で48時間の接触の後に、培地をXTT試薬に置き換えた。プレートを、次いで、37℃のインキュベータに入れ、吸収を6時間後に読み取った。ペプチドもタンパク質も含まない対照を、同じプレート上に作製した。
【図１１】生細胞でのリアルタイムビデオ顕微鏡による、NHKの遊走に対するペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の影響。NHKを、24ウェルプレートに、ウェルあたり細胞20,000個にて、LG4/5フラグメントの非存在下(A)もしくは存在下(10μg/ml、B)またはペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の存在下(10μg/ml、C)に、KGM培養培地中に播種した。細胞の挙動を、次いで、5時間にわたってリアルタイムビデオ顕微鏡(低速度撮影)により直ちに記録し、画像は10分毎に記録した。図は、所定の視野において無作為に選択した20細胞の挙動を表す。データ分析を容易にするために、行路をx(0)、y.(0)から側位した。及んだ距離を、グラフの軸上にマイクロメートルで示す。
【図１２】NHK創傷閉鎖に対するペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の影響。NHKを、24ウェルプレートに播種し、集密まで成長させた。培地を除去し、ピペットチップを用いて細胞層に創傷を作製した。PBSですすいだ後に、この領域をKBM-2培養培地と、37℃にて、LG4/5タンパク質(10μg/ml)もしくはペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)(20μg/ml)の非存在下または存在下でインキュベートした。創傷の周囲の細胞の挙動を、次いで、画像を48時間毎に記録する低速度撮影ビデオ顕微鏡により、5% CO2を含む湿潤チャンバ中で直ちに追跡した。(A)実験の開始時、24時間および48時間で記録した画像は、実験中に各条件で細胞により覆われた創傷の領域の合計を示す(黒色の線は、記録の開始時の創傷の端を表す)。バー、100μM。(B)創傷の領域(細胞を除く)を開始時、24時間(灰色のバー)および48時間(黒色のバー)に、Adobe Photoshop CS3 Extendedプログラム(バージョン10.0)を種々の条件で用いて測定した。各創傷の閉鎖の割合を、最初の創傷のパーセンテージとして表した。各条件を3重で行った(条件あたり3つのウェル)。
【図１３】種々の細胞外マトリックスタンパク質への細胞接着についてのペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の影響の分析。(A)HT1080細胞の接着に対する可溶形のペプチドの影響の研究。用量応答接着実験の補助により、平均的な接着を誘導するI型コラーゲン(0.02μg/ウェル)、IV型コラーゲン(0.5μg/ウェル)、フィブロネクチン(0.1μg/ウェル)、ラミニン111(0.1μg/ウェル)およびラミニン332(0.2μg/ウェル)の固定量をこの実験のために選択し、96ウェルプレートに固定化した。6.104のHT1080細胞を各ウェルに、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)(50μg/ml)の存在下(黒色のバー)または非存在下(灰色のバー)で配置した。プレートを37℃にて1時間インキュベートし、洗浄した後に、接着細胞を固定した。細胞接着を、方法の部分に記載するようにして測定した。(B)マトリックスタンパク質へのHT1080細胞の接着に対する固定化ペプチドの影響の研究。マトリックスタンパク質であるI型コラーゲン(0.02μg)、IV型コラーゲン(0.5μg)、フィブロネクチン(0.1μg)、ラミニン111(0.1μg)およびラミニン332(0.2μg)を、96ウェルプレートに単独で固定化(灰色のバー)したかまたはペプチドKKLRIKSKEK(2.5μg、黒色のバー)と共固定化した。6.104個のHT1080細胞を各ウェルに入れ、プレートを37℃にて1時間インキュベートした。洗浄後に、接着細胞を固定し、細胞接着を、方法の部分に記載するようにして測定した。
【図１４】真皮線維芽細胞におけるシンデカン1は、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)と相互作用する。(A)ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)とのシンデカン1の結合を示す。正常ヒト線維芽細胞の溶解物および正常ヒトケラチノサイトの溶解物を、材料および方法の部分に記載するようにして調製し、2mgの各溶解物を、ビオチン化ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)で被覆していない(レーン1)かまたは被覆した(レーン2)ニュートラアビジンビーズと共にインキュベートした。陽性対照は、ケラチノサイト溶解物を用いて行って、2つの型の細胞におけるシンデカン1のサイズおよび量を比較した。洗浄した後に、ビーズと結合した物質を、ヘパリチナーゼIおよびコンドロイチナーゼABCの混合物で消化して、シンデカン1のタンパク質部分をグリコサミノグリカンから遊離させた。次いで、試料を8%アクリルアミドゲルにて非変性条件下でのSDS PAGE電気泳動、およびポリクローナル抗シンデカン抗体H174を用いるイムノブロッティングにより分析した。分子量マーカーの位置を左に示す。(B、C)ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)およびLG4/5タンパク質への正常ヒト線維芽細胞の細胞接着。一方の場合(B)において、5μgのペプチドKKLRIKSKEKおよび1μgのタンパク質LG4/5を96ウェルプレートに固定化し、他方の場合(C)において、ペプチドKKLRIKSKEKを、横軸に示す濃度で固定化した。6.104個の真皮線維芽細胞を各ウェルに入れ、プレートを37℃にて1時間インキュベートした。洗浄した後に、接着細胞を固定し、細胞接着を、方法の部分に記載するようにして測定した。
【図１５】ブタでの実験モデルにおける浅達性皮膚創傷の上皮化におけるペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の効力。(A)0.9 mmの深さの浅達性創傷を、2匹のブタの背部に作製し、PBS(対照)またはペプチドKKLRIKSKEKの20μg/ml(ブタ1)もしくは50μg/ml(ブタ2)の溶液で処置した。創傷の上皮化の巨視的評価は、第7日での2つの条件の間に被覆の差を示した。写真において、非上皮化領域を黒色の線で囲む。第11日での巨視的観察は、ペプチドの存在下でのよりよい皮膚の回復を示した。(B)第7日に写真撮影した各創傷の再上皮化面積を、Adobe Photoshop CS3 Extendedプログラムを用いて評価し、上皮化の割合を、最初の創傷のパーセンテージとして表した。これらの結果は、各ペプチド濃度について4つの異なる創傷を処置した後に得られた結果の平均である(条件あたり2つの対照創傷)。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
実施形態の例
1)ペプチド生成方法
ペプチド合成を、Fmoc-Opfp/Hobt化学を用いるMilligen 9050合成機で行った。ペプチドを、次いで樹脂から外し、スカベンジャー(フェノール、水、エタンジチオールおよびチオアニソール)を含有するTFA溶液を用いて脱保護した。次いで、ペプチドを分析し、直径4.6または10mm、長さ250mmのVydac C18 5mmカラムで精製し、SCIEX API 165でのエレクトロスプレー質量分析により特徴決定した。ビオチン化ペプチドは、Eurogentec(Eurogentec、Angers、France)により生成した。
【００７３】
2)対象ペプチド:KKLRIKSKEK(配列番号1)についての情報
アミノ酸の数:10
分子量:1257.5
理論的等電点:10.58
【００７４】
【表１】
0005812420.tif 000002
【００７５】
負に帯電した残基(Asp+Glu)の総数:1
正に帯電した残基(Arg+Lys)の総数:6
ペプチド類似体の理論的等電点:10〜12
- A2: KALRIKSKEK: 10.46
- A3: KKARIKSKEK: 10.58
- A5: KKLRAKSKEK: 10.58
- A6: KKLRIASKEK: 10.46
- A8: KKLRIKSAEK: 10.46
- A9: KKLRIKSKAK: 11.39
- A10: KKLRIKSKEA: 10.46
- M2: KKLRLRSKER: 11.73
- M4:KKLRHKSKEK: 10.58
- M5: KKLRTKSKEK: 10.58
- M6: KKLRKKSKEK: 10.68
- M7: KKLRSKSKEK: 10.58
- M8: KKLRIKLKEK: 10.58
- M9: KKLRIKQKEK: 10.58
- U1: KKLRIQSKEK: 10.46
- U2: KKLRIKSQEK: 10.46
- U3: KKLRIKSKEQ: 10.46
【００７６】
3)研究に用いた細胞
A-株
用いた細胞は、それらの表面上で多量のシンデカン1を発現する株に由来した(Okamotoら、2003)。これらは、HT1080(線維肉腫、ヒト)、American Type Culture Collection CCL-121株の細胞であった。
【００７７】
これらの細胞を、10%胎児ウシ血清および2mMグルタミンを補ったDMEM培地で培養中に維持し、37℃にてCO2インキュベータ(5% CO2、95%空気および湿度98%)中で培養した。
【００７８】
B-初代ケラチノサイト
新しく単離した正常ヒトケラチノサイトを用いた。ヒトケラチノサイトは、包皮生検試料から得た(手術廃棄物、Pavilion T bis、Edouard Herriot Hospital)。用いた培養培地は、Cloneticsにより製造されLonza(Belgium)により販売される、0.15mM CaCl2を含有するpH7.2〜7.4のケラチノサイトの培養用に規定されたKGM-2培地(ウシ脳下垂体抽出物35mg、hEGF 10ng/ml、インスリン5μg/ml、ヒドロコルチゾン0.5μg/ml、トランスフェリン0.1%、アドレナリン0.1%を含有)であった。
【００７９】
ケラチノサイトは、BoyceおよびHam(Cultivation, frozen storage, and clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in serum-free media、Tiss Cult. Meth. 1985、9:83〜93頁)により記載された技術を用いて得た。抗生物質を含有するPBS緩衝液ですすいだ後に、皮膚の小片を真皮下の脂肪組織から滅菌器具を用いて分離した。次いで、皮膚を3mm2の小片に切断し、小片をPBS中の0.25%トリプシン滅菌溶液に16時間、4℃にて入れた。トリプシンの酵素作用を停止するために、表皮からの真皮の分離は、培養培地を含有するペトリ皿において微細なピンセットを用いて行った。表皮の断片をピペットで数回吸引および排出して、遊離の基底細胞を剥がした。得られた細胞懸濁物を1000rpmにて5分間遠心分離し、このようにして得られたペレットを、既知体積のKBM-2に懸濁して、排除色素であるトリパンブルーを用いて生細胞を計数した。1cm2あたり3.104個の生細胞を25cm2の組織培養皿(Corning、Polylabo、France)に播種した。ケラチノサイトを37℃にてCO2インキュベータ(5% CO2、95%空気および湿度98%)中で培養した。培地は2日おきに交換した。細胞が亜集密になった際に継代培養が生じた。細胞層を、次いで、PBSですすぎ、トリプシン-EDTA溶液(0.05〜0.02%)で覆った。37℃にて短時間インキュベーションした後に、細胞をプラスチック支持体から剥がした。次いで、細胞を75cm2の培養皿に播種した。1mlの体積中に10%ジメチルスルホキシド(DMSO)および20%ウシ血清が存在する用いる培養培地中で、細胞を凍結させた(アンプルあたり3〜5百万)。
【００８０】
C-初代線維芽細胞
新しく単離した正常ヒト線維芽細胞を用いた。これらは、ケラチノサイトを得るために用いた包皮生検試料から得た。用いた培養培地は、10%胎児ウシ血清および2mMグルタミンを補ったDMEMであった。真皮を表皮から分離した際に、真皮の断片を数日間、10%胎児ウシ血清および2mMグルタミンを補ったDMEMの存在下のペトリ皿中に、37℃にてCO2インキュベータ(5% CO2、95%空気および湿度98%)中に置いた。培地は2日おきに交換した。線維芽細胞が真皮外植片からはずれてペトリ皿に定着した際に、これらを、トリプシンを用いて皿から外し、通常の細胞培養技術により増幅させた。
【００８１】
4)比色試験による、対象ペプチドの細胞接着特性の定量的分析:
-接着基体の調製
精製LG4/5タンパク質(BelinおよびRousselle、2007)および精製LN332(Rousselleら、1991)のペプチドを、細胞接着実験において用いた。7つの漸減濃度範囲を、PBS(リン酸緩衝食塩水、KH2PO4 1.54mM;Na2HPO4 1.42mM;NaCl 131mM)または固定化緩衝液Na2CO3 20mM pH9中で1mg/ml開始溶液からの系列希釈により作製した。これらの溶液を、直ちに、96ウェル培養プレート(Greiner、Dutscher、Brumath、France)に、ウェルあたり100μlで分配した。その他のマトリックスタンパク質であるウシI型コラーゲン(Symatese Biomateriaux)、ヒトIV型コラーゲン、フィブロネクチンおよびヒトラミニン1(BD Biosciences、Le Pont de Claix、France)をPBS中で調製し、96ウェルプレート(Corning、Amsterdam、Netherlands)に分配した。次いで、プレートを+4℃に16〜18時間置いた。次いで、プレートを逆さにすることにより溶液を除去し、各ウェルをPBS-BSA 1%(ウシ血清アルブミン)溶液で飽和させた。基質を含まないさらに3つのウェルに同じ処理を行い、対照とした。
【００８２】
ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)およびNSFMALYLSKGR(配列番号21)により誘導される接着を比較する実験を、2つのペプチドを同じ効力で固定化したMicrolon 96ウェルプレート(Greiner、Dutscher)を用いて行った。固定化したペプチドの量は、ビシンコニン酸を用いて決定した(BCAプロテインアッセイ、Perbio Science、Brebiere、France)。
【００８３】
-細胞接着試験
細胞を、培養皿から、PBS/EDTA 10mMの溶液を用いて剥がし、次いで、細胞株について添加物を含まないDMEM、ヒトケラチノサイトについて添加物を含まないKBM-2に懸濁した。ウェルあたり播種した細胞の数は、グラフ上に示す(ウェルあたり5.104〜105個の細胞)。
【００８４】
-細胞接着試験の評価
細胞を播種した後に、マルチウェルプレートを、37℃で5% CO2雰囲気のインキュベータに入れた。30〜60分のインキュベーションの後に、細胞を位相差顕微鏡で観察して、試験が正しく行われていることを確認した。次いで、接着培地を除去し、各ウェルを滅菌PBS溶液で洗浄して、接着しなかった細胞を除去した。次いで、基体に接着した残りの細胞を、15分間、PBS中の1%グルタルアルデヒド溶液で固定した。グルタルアルデヒド溶液を除去し、次いで、細胞を30分間、蒸留水で1%に希釈したクリスタルバイオレットの溶液を用いて染色した。水中で十分にすすいだ後に、細胞を15分間、0.02%トリトンの溶液で浸透化させて、クリスタルバイオレットを溶解した。吸収の読取りを570nmにて、ELISAプレートリーダー(MR500、Dynatech、Guernsey、Channel Islands)を用いて行った。各実験点は3重で行った。ブランクの値は、3つの対照ウェル(BSA)の平均吸収である。これを、実験点について得られたそれぞれの光学密度の値から減じた。3つの吸収の値の平均を、次いで、3点の各組について計算した。
【００８５】
結果を、吸収の値が縦軸、そして異なる基質濃度が横軸のグラフに示した。接着細胞を、位相差顕微鏡を用いて写真撮影した。
【００８６】
5)競合による細胞接着の阻害試験
96ウェルプレートを、記載される量のペプチドKKLRIKSKEKまたはラミニン332で吸着により+4℃にて16〜18時間被覆した。以前と同様に、ウェルを1% PBS-BSAの溶液で1時間飽和させた。HT1080細胞を培養皿から剥がし、次いで、無血清DMEMに懸濁した。細胞を計数した後に、LG4/5タンパク質全体またはペプチドを細胞懸濁物に加え、30分後に接着試験を行った。競合物質を含まない対照を系統的に行い、100%接着とみなした。抗LG4/5抗体による阻害の場合において、1% PBS-BSAで飽和させた後に、後者を固定化タンパク質に1時間供した。
【００８７】
6)細胞生存性試験
正常ヒトケラチノサイトの細胞生存性に対するペプチドの影響を、比色アッセイを用いて分析した(XTT細胞増殖キット、Roche Diagnostics、Meylan、France)。LG4/5タンパク質を用いる対照を並行して行った。試験の化学反応は、黄色のテトラゾリウムXTT塩をオレンジ色のホルマザン塩に還元する生細胞のNADPH生成に基づく。490nmでの吸収を、ELISAプレートリーダーを用いて測定する。細胞を、96ウェルプレートに、ウェルあたり10,000個の細胞(6ウェル/条件)で、KBM-2培養培地中に播種した。37℃で5% CO2にて24時間培養した後に、培養培地を除去し、グラフに示す量のペプチドまたはタンパク質とアッセイ試薬とを含有する無血清培地に置き換えた。次いで、プレートを37℃のインキュベータに入れ、吸収の読取りを1時間、2時間、3時間、4時間および5時間で行った。ペプチドもタンパク質も含まない対照を、同じプレートに作製した。結果は、ペプチドもタンパク質も含まない対照に対する、ペプチドまたはタンパク質の存在下での細胞のパーセンテージ生存率として示す。この場合、細胞生存率は、式:
%生存率=(Abs.ペプチドを用いた細胞/Abs.対照細胞)×100
から計算した。
【００８８】
7)親和性クロマトグラフィーアッセイおよびシンデカン1の検出
ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)と結合する細胞受容体の性質を同定するために、ペプチドで被覆されたビーズを細胞溶解物と共にインキュベートすることにより、親和性クロマトグラフィーまたは「プルダウン」アッセイを行った。初代ケラチノサイトまたは線維芽細胞の溶解物を、N-エチルマレイミドおよびフッ化フェニルメチルスルホニル50mMを含有するPBS、pH7.5中の1%トリトンX-100の溶解緩衝液を用いて作製した。野生型ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)および変異ペプチドをアミノ末端にてビオチンと結合させ、16時間、+4℃でのインキュベーションにより、100μgの各ビオチン化ペプチドをアガロース-ニュートラアビジンビーズ(Perbio Science、Bezons、France)に付着させた。次いで、ビーズを2mgの細胞溶解物と共に2時間、+4℃にてインキュベートした。溶解緩衝液で3回洗浄した後に、ビーズを、8mU/mlのヘパリチナーゼIおよび50mU/mlのコンドロイチナーゼABC(Seikagaku America、Coger、Paris、France)を含有する消化緩衝液(20mM酢酸ナトリウム、5mM CaCl2、pH7.0)に2時間、25℃にて移した。この処理により、グリコサミノグリカンのシンデカン1のタンパク質部分が除かれ、イムノブロッティングによる分析が容易になる。次いで、試料を非変性条件下での8%アクリルアミドゲルSDS PAGE電気泳動、およびポリクローナル抗シンデカン抗体H174(Santa Cruz Biotechnology、Le Perray en Yvelines、France)を用いるイムノブロッティングにより分析した。
【００８９】
8)生細胞に対するリアルタイムビデオ顕微鏡(低速度撮影)
ビデオ顕微鏡実験を、CCDカメラ(10分毎または毎時間1画像)を備えたZeiss Axiovert 100M顕微鏡を用いて行った。図11の実験において、Metaviewソフトウェア(Roper Scientific、Princeton Instruments、Evry、France)を用いて100個の細胞の運動を分析した。
【００９０】
9)in vivoでの治癒
皮膚採取器を用いて、約4カ月齢の2匹の雌のブタの背部に長さ12cm、幅8cm、深さ0.9mmの皮膚創傷を作製した(ブタあたり2つの対照および4つの処置創傷、脊柱の両側に)。2つの濃度のペプチド、すなわち20μg/ml(ブタ1)および50μg/ml(ブタ2)ならびにPBS溶液(対照)を、第1日および各包帯材交換時(D1、D2、D4、D7およびD11)に創傷に塗布した。臨床的分析の後に、写真を撮影し、皮膚生検を採取した。第7日からの写真から、上皮化領域をAdobe Photoshop CS3 Extendedプログラム(バージョン10.0)を用いて評価した。実験は、Claude Bourgelat Institute Veterinary Campus(VetAgro Sup)、Lyonで行い、プロトコルは、VetAgro Sup獣医学キャンパスの倫理委員会により承認された。
【００９１】
結果:
a/LG4/5フラグメントおよびペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)への正常ヒトケラチノサイトおよびHT1080細胞の接着の研究
図3に示すように、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)は、HT1080細胞および正常ヒトケラチノサイトの細胞接着を用量依存的な様式で誘導する。対照接着実験を、精製LG4/5フラグメント全体に対して同じ細胞を用いて行って、シンデカン1依存性接着を示し、LG4/5フラグメント全体とシンデカン1ペプチド相互作用配列との間で得られる細胞形態を比較した。細胞は、ペプチドに堅くつなぎとめられている。なぜなら、LG4/5フラグメント全体と同様に、これらは、固定の前の種々の洗浄に耐性であったからである。最大細胞接着は、固定化のために平均量10マイクログラムのペプチドをウェルに入れた際に得られた。2つの型の細胞、すなわちHT1080およびNHKの接着プロファイルは、対象ペプチドに対して同一である。この実験は定性的であり、ペプチドと接触した細胞の挙動を分析するために行った。したがって、接着を誘導する濃度は示唆的である。なぜなら、(1)これらはウェルに固定化されたペプチドの実際の量を反映せず、(2)これらは、各ウェル中の細胞の量に依存するからである。これらの観察結果は、発表された量が過大評価であり、より少ない量がシンデカン1依存性細胞接着を誘導できたことを示す。実際に、用量依存的影響を示し、個別の細胞の形態を分析するために、比較的少数の細胞をこの実験においてわざと用いた。この観察は、過剰に集密な層により妨げられる。位相差顕微鏡により得られた写真は、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)と接着したHT1080細胞およびケラチノサイトの形態が、LG4/5フラグメント全体に接着したこれらの細胞のものと同じであったことを示した。このことは、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)が、LG4/5フラグメント全体が有する接着特性を誘導できることを示す。出願人による出版物に詳細に記載されるように、LG4/5への接着は、糸状仮足の形態での突出した細胞質伸長を有して細胞が広がることを誘導する(Declineら、2003、Okamotoら、2003、Bachyら、2008、Sulkaら、2009)。アクチン細胞骨格と関連するこれらの構造は、細胞遊走のプロセスに関与する。
【００９２】
ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)がLG4/5フラグメントに対する細胞接着を担う配列に相当することを確認するために、細胞をペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)と共にプレインキュベートした後にそれらをLG4/5フラグメントに接着させることにより競合実験を行った(図4)。この実験において、細胞接着は、LN332に対しても試験して、LG4/5タンパク質に対するペプチドの影響の特異性であって、その他のマトリックスタンパク質に対する影響でないことを確実にした。LG4/5への接着を阻害する特異的陽性対照を、LG4/5機能を遮断すると我々が特徴決定したポリクローナル抗LG4/5抗体を用いて行った。LG4/5タンパク質全体も、この実験において陽性対照として用いた。よって、HT1080細胞をそのまま、またはLG4/5タンパク質全体もしくはペプチドと共にプレインキュベートして用いた。次いで、これらを接着実験のためにLG4/5およびLN332基体に堆積させた。予測されたように、我々の抗LG4/5抗体は、LN332への接着を変化させることなくLG4/5フラグメントへの接着を阻害した。細胞がシンデカン1と結合することにより、溶液として加えたLG4/5フラグメントも、LN332への接着に影響することなく固定化LG4/5フラグメントへの接着を遮断した。溶液として加えたペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)も、LG4/5フラグメントへの細胞接着を完全に遮断し、LN332への接着に影響しなかった。この結果は、ペプチドが、LG4/5フラグメントへの接着に関与する受容体と単独で結合できたことを示す。これがLN332への接着を阻害しなかった事実は、LG4/5フラグメントに対するこの活性の特異性を確認する。これらの結果は、KKLRIKSKEK配列(配列番号1)が、LG4/5フラグメントへのシンデカン1依存性接着を担う配列であることを示す。これらは、可溶形で加えたLG4/5フラグメントおよびペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)が共に、細胞と相互作用し、シンデカン1受容体と結合する能力を有することも示す。このことは、これらのタンパク質が、可溶形で加えた際に、シンデカン1依存性シグナル伝達経路も活性化できたことを示す。
【００９３】
b/親和性クロマトグラフィーによる、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)とのシンデカン1の特異的結合の証明
ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)がLG4/5フラグメントに対するシンデカン1の相互作用部位であることを証明するために、親和性クロマトグラフィー実験を、ビオチンと組み合わせたKKLRIKSKEKペプチド(配列番号1)をストレプトアビジンビーズ上に固定することにより行った。このようにしてビーズの表面上に露出されたペプチドは、正常ヒトケラチノサイトの抽出物中のその受容体を捕捉するための分子留め金となった。この実験において、ヘパリン結合に関与するとLG4/5フラグメント中で同定された他の2つの配列(PSGKPKSLP(配列番号19)およびTSVTPKQSL(配列番号20)、Vivesら、2003)もビオチン化して試験した。初代ケラチノサイトホモジネートを調製し、異なるペプチドで被覆したビーズを、等しい量のこれらの溶解物と共にインキュベートした(図5A)。次いで、ビーズに固定されたタンパク質をSDS-PAGE電気泳動とその後の免疫検出により分析して、それらのシンデカン1含量を評価した。
【００９４】
図5Aに示すように、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)で被覆されたビーズに固定されたタンパク質抽出物(レーン2)のみが、抗シンデカン1抗体により認識されるタンパク質を有する。ペプチドで被覆されていないビーズ(陰性対照、レーン1)および他の2つのペプチドで被覆されたビーズ(レーン3および4)は、シンデカン1を保持しなかった。ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)と結合したタンパク質が実際にシンデカン1であったことを確認するために、LG4/5フラグメント全体を陽性対照として用いて実験を反復した(図5B)。この場合、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)により精製されたタンパク質(レーン3)は実際にシンデカン1である。なぜなら、これは、LG4/5フラグメント全体により精製されたタンパク質(レーン2)に相当するからである。ペプチドで被覆されていないビーズは、非特異的結合を示さなかった(レーン1)。これらの結果は、シンデカン1が、LG4/5フラグメント全体と匹敵する様式で、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)についての特異的受容体であることを示す。
【００９５】
c/ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)およびNSFMALYLSKGR(配列番号21)(特開2006063033に記載される)へのHT1080細胞の接着。
LG4/5モジュールの配列全体に順に及ぶペプチドの生成に基づくアプローチにより、別の配列が、シンデカン2または4のような他の受容体を介して細胞接着を誘導することが同定された(Utanら、2001およびJP2006063033)。この配列NSFMALYLSKGR(配列番号21)(α3鎖の配列の残基1412〜残基1423)は、LG4モジュール中に存在する。細胞接着を誘導するペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の能力をこのペプチド配列と比較するために、比較接着試験を、シンデカン1を発現するHT1080細胞を用いて行った(図6)。2つのペプチドを96ウェルプレートに固定化し、吸着されたペプチドの量を定量して、両方の場合においてペプチドの量が等しいことを確実にした。実際に固定化されたペプチドの範囲を、ウェルあたり2μg〜0.07μgにした。シンデカンを保存する条件下で培養皿から剥がした後に、HT1080細胞を2つのペプチドを含有するウェルに堆積させ、血清の非存在下で1時間接触させたままにした(図6A)。細胞接着の定量分析は、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)が、ペプチドNSFMALYLSKGR(配列番号21)よりも効果が高いことを示した。なぜなら、(1)細胞接着が、より少ない量の固定化ペプチド(約0.025μg)について誘導され、(2)プラトーに達した最高細胞接着が著しくより高かった(約200%)からである。細胞形態の分析も、KKLRIKSKEK(配列番号1)と接着する細胞はフラグメントLG4/5へのシンデカン1依存性接着の典型的な形態を示したが(図3を参照されたい)、ペプチドNSFMALYLSKGR (配列番号21)への細胞の接着は、同じ細胞の広がりを伴わなかったことを示した。なぜなら、細胞質伸長が見られなかったからである(図6B)。このペプチドへの接着は、シンデカン2および4を伴うと記載されている(Utanら、2001)。このことは、このペプチドが、我々がペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)について記載するものからの異なる細胞プロセスに関与し得ることを示唆する。
【００９６】
d/変異
ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の活性を特徴決定するために、シンデカン1との相互作用における種々のアミノ酸の重要性を、これらのアミノ酸のいくつかの置換を行うことにより評価した。この研究は、ペプチドの活性に必須の残基を同定することも目的とした。最初の場合において、ペプチドの最小限の構造的変化を引き起こすために、配列KKLRIKSKEK(配列番号1)の各アミノ酸を、中性アミノ酸であるアラニン(A)に順に置換した(図7)。この一連の変異ペプチドを用いるシンデカン1動員実験は、3つの残基の個別の置換が、シンデカン1との相互作用を阻害するのに十分であることを示した。これらの残基は、アミノ酸1:リシン(K)、アミノ酸4:アルギニン(R)およびアミノ酸7:セリン(S)である。5つのリシン残基がペプチド配列KKLRIKSKEK(配列番号1)内にあり、最初のものの変異だけがペプチドとの相互作用活性の完全な喪失を引き起こした。このことは、その他のリシン残基のそれぞれの活性がシンデカン1との相互作用中に補足されたことを示す。ペプチド配列中のリシン残基の役割をより正確に特徴決定するために、これらの残基のそれぞれの電荷を改変し、シンデカン1との結合に対するこの変化の影響を分析した。このことを行うために、これらのアミノ酸を、生理的pHにて中性のアミノ酸であるグルタミン(Q)に置き換えた(図8)。これらの変異は、点(単独アミノ酸の置換)または群(2または3の同時置換)のいずれかであった。
【００９７】
e/相同配列
KKLRIKSKEK配列(配列番号1)の相同配列を、細胞外マトリックスタンパク質において探索して、シンデカン1との結合についての特性を有する可能性のある相同配列を同定し、この配列の活性の特異性を確認した。ヒトラミニンα3鎖のKKLRIKSKEK配列(配列番号1)に相同な配列を有すると同定された4つの細胞外マトリックスタンパク質は、マウスラミニンα3鎖(M2)、ヒト(M1)およびマウス(M1)ラミニンα4鎖、ならびに膜貫通タンパク質ADAM 20(M3)である(図9A)。これらの配列は全て、シンデカン1と結合するそれらの能力について試験され、ヒトおよびマウスのラミニンα3ならびにα4の配列だけが、シンデカン1と結合できることが示されたが、タンパク質ADAM 20の配列は非活性であった(図9C)。これらの結果は全て、ヒトラミニンα3鎖中のシンデカン1結合配列が、マウスにおいて保存されていることを示す。さらに、相同配列が、ラミニンα4鎖に存在する。ADAM 20タンパク質中に存在する配列がシンデカン1と結合しないという事実は、ラミニンに存在する配列の特異性および独自性を強調する。いくつかの残基を置換する可能性を支持するために、ペプチド配列のフラグメントについて相同配列を探索し、同定された配列を、ペプチド全体の関係において置き換えた(図9B)。特に、アミノ酸5(イソロイシン、M4〜M7)およびアミノ酸7(セリン、M8およびM9)の置換が同定された。図9Cにおいて、これらの変異のいずれも、相互作用を阻害しなかったことがわかる。
【００９８】
f /細胞生存性
最後に、ペプチドがケラチノサイトに対して毒性の影響を有さないことを確実にするために、100〜1μg/mlのペプチド濃度の範囲を用いて細胞生存性を試験した。並行して、LG4/5タンパク質を用いる対照を行った(図10)。ケラチノサイトを96ウェルプレートに、ウェルあたり104個の細胞で播種した。24時間後に、培養培地を除去し、グラフに示す量のペプチド(ピンク色の曲線)またはLG4/5タンパク質(青色の曲線)を含有するKBM-2培地に置き換えた。37℃にて2日間の後に、このステップを2回反復し、生細胞を、XTT試薬試験を用いて定量した。対照と比較したペプチドまたはLG4/5タンパク質の存在下での生細胞のパーセンテージとして示す結果は、ペプチドKKLRIKSKEKもタンパク質LG4/5も表皮ケラチノサイトに対して長期の細胞毒性の影響を有さないことを示す。
【００９９】
g /細胞遊走の誘導
可溶形のLG4/5フラグメント全体またはKKLRIKSKEK配列(配列番号1)を正常ヒトケラチノサイトの培養培地に加えることの影響を、生細胞についてのリアルタイムビデオ顕微鏡により分析した。最初は、5時間のケラチノサイトの観察が、ペプチドが存在するかまたは存在しないかに依存して著しく異なることを強調した。標準的な培養培地で維持した正常ケラチノサイトは、小さい振幅の円形の運動を行い、その合計距離は40μmを決して超えなかった(図11A)。LG4/5タンパク質またはペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)を培養培地に加えることにより、挙動の劇的な変化が誘導された(図11BおよびC)。両方の場合において、ケラチノサイトの円形の運動が、150μmほど長くまで到達する距離(起点から)での無作為な直線状の移動に置き換えられた。これらの結果は、LG4/5フラグメントが、細胞と結合した際に細胞遊走を誘導することを示す。ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)は、LG4/5フラグメントの活性を再現できる。LG4/5フラグメントへの接着が、プレLN332により誘導される細胞遊走において重要な役割を有するが、この同じLG4/5フラグメント(またはその最小限の配列KKLRIKSKEK(配列番号1))は、細胞遊走を単独で誘導できる。
【０１００】
LG4/5フラグメントおよびペプチドの影響を、集密ケラチノサイト層の中央に作製した創傷の閉鎖についても分析した(図12)。in vivo創傷と同様に、このモデルにおいて閉鎖は、創傷の端にあるケラチノサイトの遊走および増殖により生じた。対照条件(培養培地のみ)において、創傷は徐々に閉鎖され、測定は、細胞が、24時間後に創傷の面積の43%を、48時間後に62%を覆ったことを示した。LG4/5タンパク質を培養培地に加えた場合、細胞は24時間で面積の65%を、48時間で91%を覆い、このことは、ラミニン332のこのドメインが、創傷閉鎖のプロセスを促進することを示す。この効果は、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)を用いて見出されたか、または増幅さえされた。なぜなら、創傷閉鎖は、24時間で72%、48時間で96%であったからである(図12AおよびB)。ペプチドは、皮膚治癒を誘導する特性を有する。
【０１０１】
ペプチドが皮膚治癒を誘導する特性を有するとの仮説が、ブタの実験モデルにおける浅達性皮膚創傷の上皮化におけるペプチドの効力を研究することにより確認された(図15)。ブタ皮膚組織は、ヒト皮膚のものと同様の特徴を有する。ペプチドを深さ0.9mmの損傷に塗布することにより、創傷の閉鎖が促進された(図15A)。実際に、対照において(PBSを用いる)、創傷は徐々に閉鎖され、測定は、創傷を作製した7日後に上皮が損傷面積の65%を覆ったことを示した。創傷をペプチド(20μg/mlまたは50μg/ml)で処置した場合に、創傷の再上皮化のパーセンテージは、表面の96%まで到達したので、第7日にほぼ完全であった。この実験は、ペプチドが、in vivoでの創傷閉鎖のプロセスを促進することを示す。ペプチドで処置した後に、完全閉鎖後の創傷の巨視的観察により(第11日、図15 A)、修復された領域の周囲の組織と同一の特性を有する均一で健常な皮膚組織が明らかになったが、対照の場合は、まだ脆弱で損傷されているように見えた。これらの結果は、修復された皮膚が、ペプチドで処置された場合に、より強くより良好な質であるように見えることを示す。
【０１０２】
h /細胞外マトリックスへの細胞の接着についてのペプチドの影響
皮膚の細胞外マトリックスに関するペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)の影響を分析するために、我々は、可溶形で用いられるかまたはこれらのマトリックスタンパク質と共固定化されたペプチドの存在下でのこれらのマトリックスタンパク質への接着についての実験を行った。試験したマトリックスタンパク質(I型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン111およびラミニン332)は、インテグリンファミリーに属する受容体を介して皮膚細胞の接着を誘導することが広く知られている。これらのマトリックスタンパク質への細胞の接着に対するペプチドの影響を分析するために、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)を、EDTAを用いて予め分離させたHT1080細胞と接触させた後に、基体であるマトリックス上に堆積させた(図13A)。対照細胞(ペプチドなし、灰色のバー)およびペプチドで処理した細胞(黒色のバー)により得られる種々のマトリックスタンパク質への接着の分析は、タンパク質に依存して20〜50%の接着の増加を示した。この効果は、ペプチドをこれらのタンパク質と共固定化した場合にさらにより著しかった(図13B)。なぜなら、20〜150%の範囲の接着の増加が観察されたからである。これらの結果は全て、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)が、細胞外マトリックスタンパク質へのHT1080細胞の接着を強化することを示す。ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)は、細胞外マトリックスのタンパク質への細胞の親和性を増加させ、よって、微小環境とのより良好な連絡を可能にする。
【０１０３】
i/LG4/5フラグメントおよびペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)への正常ヒト線維芽細胞の接着の研究
真皮線維芽細胞がシンデカン1を発現し、これがペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)と相互作用できることを証明するために、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)との親和性についてのクロマトグラフィー実験を、正常ヒト線維芽細胞の溶解物を用いて行った(図14A)。対照実験は、初代ケラチノサイトを用いて行った。ビーズに固定したタンパク質を、次いで、SDS-PAGE電気泳動と、その後の免疫検出により分析して、それらのシンデカン1含量を評価した。図14Aに示すように、シンデカン1は線維芽細胞により発現され、ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)と結合する。細胞接着実験は、ヒト真皮線維芽細胞が、LG4/5ドメイン全体およびペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)に接着することを示す(図14B)。図14Cに示すように、KKLRIKSKEKペプチド(配列番号1)は、正常ヒト線維芽細胞の接着を用量依存的な様式で誘導する。最大の細胞接着は、ペプチドの5マイクログラムの平均量を固定化のためにウェルに入れた場合に得られた。ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)およびLG4/5フラグメントに接着する線維芽細胞の形態は、広がっており、細胞質伸長を有した(データは示さず)。ペプチドKKLRIKSKEK(配列番号1)は真皮線維芽細胞と相互作用し、それらをそれらのマトリックス微小環境につなぎとめること、および広がること(これらの条件は、組織修復および再生を促進する)を可能にする接着基体である。
【０１０４】
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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