(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２１ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチドが、ヒトジストロフィンエクソン４５の一部分と相補的であり、
前記一部分が、配列番号３を含む配列の少なくとも２１ヌクレオチドと相補的である、
上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記ヌクレオチドの少なくとも１つが、ヌクレオチドアナログである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ＲＮＡ残基、及び／又はＤＮＡ残基を含む、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記ヌクレオチドアナログが、修飾塩基、修飾糖部分及び／若しくは非天然ヌクレオシド間結合、又はこれら修飾の組合せを有するヌクレオチドとして定義される、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ヌクレオチドアナログが、修飾塩基を有する、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、修飾骨格を有する、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記修飾糖部分が、２’、３’及び／又は５’位置において１又は２基置換されたリボースである、請求項４〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記リボースが、２’−Ｏ−置換リボースである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記リボースが、２’−Ｏ−メチルリボースである、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記修飾骨格が、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチル骨格、チオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、スルホネート骨格、スルホンアミド骨格、メチレンイミノ骨格、メチレンヒドラジノ骨格及びアミド骨格からなる群から選択される、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド核酸、及び／又はロックド核酸を含む、請求項１、２及び４〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号３の塩基配列を含むか又はからなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合及び２’−Ｏ−アルキル置換リボースを含む、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチドの各糖部分が、２’−Ｏ−メチル置換を含み、前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合のそれぞれが、ホスホロチオエート部分であり、かつ
前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列５’ｕｕｕｇｃｃｇｃｕｇ  ｃｃｃａａｕｇｃｃａ  ｕｃｃｕｇ３’（配列番号３）からなる、
上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１又は１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を駆動する発現カセットを含む、ウイルスに基づくベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は請求項１５に記載のベクター、及び／又は薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医薬組成物であって、
患者のジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエクソン７、４４、４６、５１、５３、５９又は６７（表２に示されている）の群から選択される別のエクソンのスキッピングを誘導又は促進することができる別のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
前記別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むウイルスに基づくベクター
をさらに含み、
前記組成物が、少なくとも２個の標的エクソンを前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体から排除することができ、好ましくは、前記組成物が、前記ｍＲＮＡ前駆体の中の前記２個の標的エクソンの間の全領域を排除することができる、
上記医薬組成物。
【請求項１８】
エクソン４５スキッピングを誘導若しくは促進するための、又はＤＭＤ患者の治療のための薬剤を調製するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項１５に記載のベクター又は請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の少なくとも前記２個の標的エクソンが、好ましくは、前記２個の標的エクソンの間の全領域が、スキップされる、請求項１７に記載の医薬組成物の、ＤＭＤ又はＢＭＤ患者を治療するための薬剤を調製するための使用。
【請求項２０】
患者、好ましくは前記患者の単離細胞におけるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５のスキッピングを誘導又は促進するためのインビトロ方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項１５に記載のベクター又は請求項１６又は１７に記載の医薬組成物を前記細胞に提供するステップを含む、上記インビトロ方法。
【請求項２１】
患者に機能ジストロフィンタンパク質が提供され、及び／又は前記患者における異常ジストロフィンタンパク質の生成が減少し、前記機能ジストロフィンレベルが方法開始における前記患者の前記ジストロフィンレベルとの比較によって評価される、請求項２０に記載のインビトロ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝学、特にヒト遺伝学の分野に関する。本発明は、特にヒトＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオパシーは、筋肉の機能不全をもたらす障害である。筋ジストロフィー（ＭＤ）は、進行性の脱力及び骨格筋の変性によって特徴付けられる遺伝病を意味する。Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、筋ジストロフィーの最も一般的な小児型である。これらは劣性障害であり、ＤＭＤ及びＢＭＤの責任遺伝子はＸ染色体上に存在するため、この突然変異は男児３５００人に約１人の発生率で主に男性に影響を及ぼす。
【０００３】
ＤＭＤ及びＢＭＤは、収縮における筋線維安定性を維持するための細胞骨格と細胞外マトリックスとの間の相互作用に必要な筋タンパク質である、ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子の遺伝的欠損に起因する。ＤＭＤは１２歳前に車椅子補助への依存をもたらす重篤な致死性神経筋障害であり、ＤＭＤ患者は多くの場合呼吸及び心不全により３０歳前に死亡する。対照的に、ＢＭＤ患者は多くの場合高齢期まで歩行可能であり続け、ほぼ標準的な平均寿命を有する。ＤＭＤ遺伝子におけるＤＭＤ突然変異は、機能ジストロフィンの欠損をもたらす、フレームシフトを生じる挿入若しくは欠失又はナンセンス点突然変異によって主に特徴付けられる。一般にＢＭＤ突然変異は、リーディングフレームをインタクトに保ち、部分的に機能的なジストロフィンを合成させる。
【０００４】
過去１０年間、ＤＭＤ転写産物の途絶したリーディングフレームを回復するための特定のスプライシング修飾は、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の有望な治療法として浮上してきた（ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ、ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８；１０（２）：１４０〜９、Ｙｏｋｏｔａ、Ｄｕｄｄｙ、Ｐａｒｔｉｄｇｅ、Ａｃｔａ  Ｍｙｏｌ．２００７；２６（３）：１７９〜８４、ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００７；３５７（２６）：２６７７〜８６）。
【０００５】
スプライシングシグナルに干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いて、特定のエクソンのスキッピングをＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体に誘導し、したがってオープンリーディングフレームを回復させて重症型のＤＭＤをより軽症型のＢＭＤ表現型に変換することができる（ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００１；１０：１５４７〜５４；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ２００３；１２（８）：９０７〜１４）。ｉｎ  ｖｉｖｏの実証実験は、先ずエクソン２３におけるナンセンス突然変異に起因するジストロフィン欠損型ｍｄｘマウスモデルで得られた。変異エクソン２３を標的とするＡＯＮの筋肉内及び静脈内注射は、少なくとも３カ月間ジストロフィン発現を回復させた（Ｌｕら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３；８：１００９〜１４；Ｌｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５；１０２（１）：１９８〜２０３）。これは、線維膜におけるジストロフィン関連タンパク質の回復、そして処置筋肉の機能改善を伴った。マウス５番染色体に統合されたヒトＤＭＤ遺伝子の完全コピーを含むｈＤＭＤマウスモデルにおいて、ヒトエクソンのｉｎ  ｖｉｖｏスキッピングも達成された（Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００４；１０：２３２〜４０；‘ｔ  Ｈｏｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００８；２８３：５８９９〜９０７）。
【０００６】
大多数のＤＭＤ患者はホットスポット領域にクラスター形成した欠失を有するため、少数エクソンのスキッピングを比較的多数の患者に利用することができる。エクソンスキッピングの実際的な利用可能性は、ｗｗｗ．ｄｍｄ．ｎｌに提供されているライデンＤＭＤ突然変異データベース等、ＤＭＤ突然変異データベースに報告されている欠失、重複及び点突然変異について決定することができる。ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の治療目的のスキッピングは、欠失を有する全ＤＭＤ患者の合計１６％で発生する、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１２〜４４、１８〜４４、４４、４６、４６〜４７、４６〜４８、４６〜４９、４６〜５１、４６〜５３、４６〜５５、４６〜５９、４６〜６０を含むがこれらに限定されない欠失を有するＤＭＤ患者のオープンリーディングフレームを回復させるであろう（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ及びｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ、２００７、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｃｕｓ、２００７  Ｎｏｖａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ）。さらに、一部のＤＭＤ患者については、エクソン４５に加えてエクソン５１又は５３等、追加のエクソンのうちの１個の同時スキッピングが正確なリーディングフレーム回復に必要とされる。非限定的な例として、エクソン４５及び５１の同時スキッピングを必要とするエクソン４６〜５０の欠失を有する、又はエクソン４５及び５３の同時スキッピングを必要とするエクソン４６〜５２の欠失を有する患者が挙げられる。
【０００７】
近年、エクソン５１のスキッピングを誘導するＡＯＮを４名のＤＭＤ患者の前脛骨筋の小領域に注射した、ヒト初回投与試験の完成に成功した。処置した４名の患者全員において筋線維の大部分に新規ジストロフィン発現が観察され、ＡＯＮは安全で耐容性良好であった（ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００７；３５７：２６７７〜８６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
試験されてきた多くのＡＯＮは最大で２０ヌクレオチドを含み、この比較的短いサイズがＡＯＮの組織分布及び／又は細胞透過性を改善することが議論されてきた。しかし、このような短いＡＯＮは、ゲノムの他の領域に同一配列が存在するリスクの増加による限定的な特異性と、ＡＯＮ−標的複合体の低い自由エネルギーによる限定的な標的結合又は標的親和性をもたらすであろう。したがって、本発明者らは、これら問題点のいずれも示すことのない、新規の、必要に応じて改良したオリゴヌクレオチドを設計することを決定した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
方法
第一の態様において、本発明は、患者、好ましくは該患者の単離細胞におけるＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５のスキッピングを誘導及び／又は促進するための方法であって、前記細胞及び／又は前記患者にエクソン内の一続きの少なくとも２１ヌクレオチドと結合する分子を提供するステップを含む方法を提供する。
【００１０】
したがって、これとともに、好ましくは患者の単離細胞におけるＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５のスキッピングを誘導及び／又は促進するための方法であって、前記細胞及び／又は前記患者にエクソン内の一続きの少なくとも２１ヌクレオチドと結合する分子を提供するステップを含む方法が提供される。
【００１１】
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法を包含することを理解するべきである。
【００１２】
本明細書で定義されているように、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体は、好ましくは、ＤＭＤ又はＢＭＤ患者のＤＭＤ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を意味する。ＤＭＤ遺伝子又はタンパク質は、ジストロフィン遺伝子又はタンパク質に相当する。
【００１３】
患者は、本明細書で後に定義するＤＭＤ若しくはＢＭＤの患者又は患者の遺伝的背景によりＤＭＤ若しくはＢＭＤを発症し易い患者を意味するものとすることが好ましい。
【００１４】
エクソンスキッピングは、通常であればそこに存在する特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡを細胞に誘導することを意味する。エクソンスキッピングは、前記ｍＲＮＡのｍＲＮＡ前駆体を発現している細胞に、例えば、両者共にスプライシングの酵素プロセスを行わせるのに必要とされるスプライスドナー又はスプライスアクセプター配列等、配列に干渉することができる分子、又はヌクレオチド配列がｍＲＮＡに包含するべきエクソンとして認識されるのに必要とされるエクソン包含シグナルに干渉することができる分子を提供することにより達成される。ｍＲＮＡ前駆体という用語は、細胞核中のＤＮＡ鋳型から転写により合成された、未プロセシング又は部分プロセシングされたｍＲＮＡの前駆体を意味する。
【００１５】
本発明の状況では、本明細書に示されているエクソンのスキッピングの誘導及び／又は促進は、処置された患者の１又は複数の（筋）細胞におけるＤＭＤ  ｍＲＮＡの少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が前記エクソンを含まないことを意味する。これは、実施例に記載されているように、ＰＣＲによって評価されることが好ましい。
【００１６】
好ましくは、患者の１又は複数の細胞におけるＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５のスキッピングを誘導又は促進することによる本発明の方法は、前記患者に機能ジストロフィンタンパク質を提供し、及び／又は前記患者における異常ジストロフィンタンパク質の生成を低下させる。したがって、好ましい方法は、患者又は前記患者の細胞に機能ジストロフィンタンパク質が提供され、及び／又は前記患者又は前記患者の細胞における異常ジストロフィンタンパク質の生成が減少する方法である。
【００１７】
異常ジストロフィンの生成減少はｍＲＮＡレベルで評価することができ、好ましくは、異常ジストロフィンｍＲＮＡ初期量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下がＲＴ−ＰＣＲによってなお検出可能であることを意味する。本明細書において、異常ジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質は、非機能ジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質とも言う。非機能ジストロフィンタンパク質は、アクチン及び／又はＤＧＣタンパク質複合体メンバーと結合できないジストロフィンタンパク質であることが好ましい。非機能ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンｍＲＮＡは通常、そのインタクトなＣ末端を備えるジストロフィンタンパク質を含有しない、又はコードしない。
【００１８】
前記患者又は前記患者の細胞における機能ジストロフィンの生成増加は、ｍＲＮＡレベルで（ＲＴ−ＰＣＲ解析により）評価することができ、好ましくは、検出可能量の機能ジストロフィンｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより検出できることを意味する。別の実施形態において、検出可能なジストロフィンｍＲＮＡの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が機能ジストロフィンｍＲＮＡである。
【００１９】
前記患者又は前記患者の細胞における機能ジストロフィンの生成増加は、タンパク質レベルで（免疫蛍光及びウエスタンブロット解析により）評価することができ、好ましくは、検出可能量の機能ジストロフィンタンパク質が免疫蛍光又はウエスタンブロット解析により検出できることを意味する。別の実施形態において、検出可能ジストロフィンタンパク質の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が機能ジストロフィンタンパク質である。
【００２０】
本明細書に定義されているように、機能ジストロフィンは、配列番号１として識別されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する野生型ジストロフィンであることが好ましい。機能ジストロフィンは、そのＮ末端部分のアクチン結合ドメイン（Ｎ末端の最初の２４０アミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１〜３６８５）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５アミノ酸）を有するジストロフィンであることが好ましく、当業者に知られている通り、これらドメインのそれぞれが野生型ジストロフィンに存在している。本明細書に示されているアミノ酸は、配列番号１に表されている野生型ジストロフィンのアミノ酸に対応する。即ち、機能ジストロフィンは、少なくともある程度の野生型ジストロフィン活性を呈するジストロフィンである。「少なくともある程度」は、好ましくは、対応する野生型機能ジストロフィン活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％を意味する。この文脈において、機能ジストロフィンの活性とは、好ましくは、アクチン及びジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）との結合のことである（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  Ａら、（２００６）、Ｅｎｔｒｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｉｄｅｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｃａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｉｒｍ  ｔｈｅ  ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ  ｒｕｌｅ、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５〜１４４）。ジストロフィンのアクチン及びＤＧＣ複合体との結合は、当業者の知る通り、筋生検由来の全タンパク質抽出物を用いた共免疫沈降か、切片の免疫蛍光解析のいずれかによって可視化することができる。
【００２１】
Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーを患う個体又は患者は通常、ＤＭＤ遺伝子に、完全ジストロフィンタンパク質の合成を妨げる、即ち、早期停止によりＣ末端の合成を妨げる突然変異を有する。Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーにおいて、ＤＭＤ遺伝子もまた野生型遺伝子と比べて突然変異を有するが、この突然変異は通常早期停止を誘導せず、通常Ｃ末端は合成される。この結果、必ずしも同じ活性量ではないが、野生型タンパク質と少なくとも本質的に同じ活性を有する機能ジストロフィンタンパク質が合成される。ＢＭＤ個体のゲノムは通常、Ｎ末端部分（Ｎ末端の最初の２４０アミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１〜３６８５）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５アミノ酸）を含むジストロフィンタンパク質をコードするが、その中央の桿状ドメインは野生型ジストロフィンよりも短い可能性がある（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  Ａら、（２００６）、Ｅｎｔｒｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｉｄｅｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｃａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｉｒｍ  ｔｈｅ  ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ  ｒｕｌｅ、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５〜１４４）。ＤＭＤ治療のためのエクソンスキッピングは通常、桿状ドメインにおけるエクソンをスキッピングしてリーディングフレームを修正し、（より小さい桿状ドメインの結果タンパク質が若干小さくなるが）ジストロフィンタンパク質のＣ末端を含む残り部分を合成させることによる、ｍＲＮＡ前駆体における早期停止の克服を対象とする。好ましい一実施形態において、本明細書に定義されている方法による処置を受けているＤＭＤ個体は、少なくともある程度の野生型ジストロフィン活性を呈するジストロフィンを提供される。より好ましくは、前記個体がＤｕｃｈｅｎｎｅ型患者又はＤｕｃｈｅｎｎｅ型患者の疑いがある場合、機能ジストロフィンはＢＭＤ個体のジストロフィンである。通常、前記ジストロフィンは、アクチンとＤＧＣの両方と相互作用することができるが、その中央の桿状ドメインは野生型ジストロフィンよりも短い可能性がある（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  Ａら、（２００６）、Ｅｎｔｒｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｉｄｅｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｃａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｉｒｍ  ｔｈｅ  ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ  ｒｕｌｅ、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５〜１４４）。野生型ジストロフィンの中央の桿状ドメインは、２４個のスペクトリン様リピートを含む（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  Ａら、（２００６）、Ｅｎｔｒｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｉｄｅｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｃａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｉｒｍ  ｔｈｅ  ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ  ｒｕ��ｅ、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５〜１４４）。例えば、本明細書に提供されているジストロフィンの中央の桿状ドメインは、アクチン及びＤＧＣと結合できるだけの長さの、５〜２３、１０〜２２又は１２〜１８個のスペクトリン様リピートを含むことができる。
【００２２】
本発明の方法は、患者のＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１２〜４４、１８〜４４、４４、４６、４６〜４７、４６〜４８、４６〜４９、４６〜５１、４６〜５３、４６〜５５、４６〜５９、４６〜６０を含むがこれらに限定されない欠失を有するＤＭＤ患者（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ及びｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ、２００７、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｃｕｓ、２００７  Ｎｏｖａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ）に由来、並びにエクソン４５及び５１の同時スキッピングを必要とするエクソン４６〜５０の欠失を有する又はエクソン４５及び５３の同時スキッピングを必要とするエクソン４６〜５２の欠失を有する患者を含むがこれらに限定されない、エクソン４５に加えて追加のエクソンのうちの１個の同時スキッピングを必要とするＤＭＤ患者に由来する筋細胞の１又は複数種の特性を緩和することができる。
【００２３】
好ましい方法において、ＤＭＤ患者由来の筋原細胞又は筋細胞の１又は複数種の症状（単数又は複数）又は特性（単数又は複数）が緩和される。このような症状又は特性は、細胞、組織レベルで又は患者自身において評価することができる。
【００２４】
１又は複数種の症状又は特性の緩和は、患者由来の筋原細胞又は筋細胞における次のアッセイ、即ち筋細胞によるカルシウムの取込み低減、コラーゲン合成の低下、形態学的変化、脂質生合成の変化、酸化ストレスの低下、並びに／又は筋線維の機能、完全性及び／若しくは生存性の改善のうちのいずれかにより評価することができる。これらパラメーターは通常、筋生検切片の免疫蛍光及び／若しくは組織化学的解析を用いて評価される。
【００２５】
筋線維の機能、完全性及び／又は生存性の改善はまた、次のアッセイ、即ち血中クレアチンキナーゼの検出可能な減少、ジストロフィーの疑いのある筋肉の生検切片における筋線維壊死の検出可能な減少及び／又はジストロフィーの疑いのある筋肉の生検切片における筋線維直径の均質性の検出可能な増加のうちの少なくとも１種を用いて評価することができる。これらアッセイのそれぞれは当業者に知られている。
【００２６】
クレアチンキナーゼは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ  Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１〜６０２．２００６）に記載されている通り、血液中で検出することができる。クレアチンキナーゼの検出可能な減少は、処置前の同一ＤＭＤ患者におけるクレアチンキナーゼ濃度と比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を意味することができる。
【００２７】
筋線維壊死の検出可能な減少は、好ましくは筋生検で、より好ましくはＨｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ  Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１〜６０２．２００６）に記載されている通り生検切片を用いて評価される。壊死の検出可能な減少は、生検切片を用いて壊死が確認された領域の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少となり得る。減少は、処置前の同一ＤＭＤ患者で評価された壊死との比較により測定される。
【００２８】
筋線維直径の均質性の検出可能な増加は、好ましくは筋生検切片で、より好ましくはＨｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ  Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１〜６０２．２００６）に記載されている通りに評価される。増加は、処置前の同一ＤＭＤ患者の筋生検切片における筋線維直径の均質性との比較によって測定される。
【００２９】
１又は複数種の症状又は特性の緩和は、患者自身における次のアッセイ、即ち歩行能力喪失までの時間延長、筋力改善、重量物持ち上げ能力の改善、床からの立ち上がりに要する時間の改善、９メートル歩行時間の改善、４段階段を登るのに要する時間の改善、脚の機能グレードの改善、肺機能改善、心機能改善、クオリティーオブライフ改善のうちのいずれかにより評価することができる。これらアッセイのそれぞれが当業者に知られている。一例として、Ｍａｎｚｕｒら（Ｍａｎｚｕｒ  ＡＹら、（２００８）、Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ｒｅｖｉｅｗ），Ｗｉｌｅｙ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｔｈｅ  Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ．）の刊行物は、これらアッセイのそれぞれに対して広範な説明を与える。これらアッセイのそれぞれに対して、アッセイにおける測定パラメーターの検出可能な改善又は延長が判明し次第、これは好ましくは、本発明の方法を用いることによって、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーの１又は複数種の症状が個体において緩和したことを意味する。検出可能な改善又は延長は、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ  Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１〜６０２．２００６）に説明されている通り、統計的に有意な改善又は延長であることが好ましい。或いは、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーの１又は複数種の症状（単数又は複数）の緩和は、本明細書で後に定義する通り、筋線維の機能、完全性及び／又は生存性の改善を測定することにより評価することができる。
【００３０】
本発明に係る方法における治療は、少なくとも１週間、少なくとも１カ月、少なくとも数カ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年以上の期間がかかる可能性がある。本発明のオリゴヌクレオチド、組成物、化合物の投与頻度は、患者の年齢、突然変異の種類、分子の数（用量）、前記分子の製剤等、数種類のパラメーターに依存し得る。頻度は、２週間、３週間、４週間、５週間又はそれ以上長い期間に少なくとも１回の範囲となることができる。
【００３１】
本明細書に定義されている、本発明に係る使用のための各分子若しくはオリゴヌクレオチド又はそれらの均等物は、ＤＭＤに罹患又は発症リスクのある個体の細胞、組織及び／又は器官へのｉｎ  ｖｉｖｏでの直接投与に適切となることができ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接投与することができる。本明細書におけるオリゴヌクレオチドは、ＤＭＤに罹患した、又は発症リスクのある個体のｉｎ  ｖｉｖｏの細胞、組織及び／又は器官への投与に適し、またｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与することができる。前記オリゴヌクレオチドは、ＤＭＤに罹患した、又は発症リスクのある個体のｉｎ  ｖｉｖｏの細胞、組織及び／又は器官へ直接的又は間接的に投与することができ、またｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接的又は間接的に投与することができる。Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーは筋細胞において明確な表現型を有するため、前記細胞は筋細胞であることが好ましく、前記組織は筋組織であることがさらに好ましく及び／又は前記器官は筋組織を含む若しくはからなることがさらに好ましい。好ましい器官は心臓である。好ましくは、前記細胞は、変異ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましくは、前記細胞は、ＤＭＤに罹患した個体の細胞である。
【００３２】
分子若しくはオリゴヌクレオチド又はそれらの均等物は、細胞そのものへと送達することができる。前記分子、オリゴヌクレオチド又はそれらの均等物を個体に投与する場合、それらを送達方法と適合する溶液に溶解することが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下及び／又は脳室内投与のため、溶液は生理食塩水であることが好ましい。本明細書に定義されている前記分子、オリゴヌクレオチド又はそれらの機能的均等物の細胞及び細胞内、好ましくは筋細胞への送達をさらに増強する賦形剤の使用が、本発明の方法に特に好ましい。好ましい賦形剤は、表題「医薬組成物」節に定義されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、本出願人らは、実施例に示す通り、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＥｘＧｅｎ５００、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて非常に良好な結果を得た。
【００３３】
本発明の好ましい方法において、患者のＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体の別個のエクソンスキッピングを誘導及び／又は促進することができる追加的な分子が用いられる。好ましくは、第二のエクソンが、患者のジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエクソン７、４４、４６、５１、５３、５９、６７から選択される。用いることができる分子は、表２に示されている。好ましい分子は、表２に開示されているオリゴヌクレオチドのうちのいずれかを含む又はからなる。数種のオリゴヌクレオチドは、組み合わせて用いることもできる。このように、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体の２個以上のエクソンの、該ｍＲＮＡ前駆体から生成されたｍＲＮＡにおける含有が抑制される。この実施形態は、さらに二重又は複数エクソンスキッピングとも言う（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  Ａ、Ｊａｎｓｏｎ  ＡＡ、Ｋａｍａｎ  ＷＥら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｌｔｉｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍａｋｅｓ  ｍｏｒｅ  ｓｅｎｓｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００４；７４（１）：８３〜９２、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  Ａ、Ｋａｍａｎ  ＷＥ、Ｗｅｉｊ  Ｒ、ｄｅｎ  Ｄｕｎｎｅｎ  ＪＴ、ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ  ＧＪ、ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ  ＪＣ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｘｏｎｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；１４（３）：４０１〜７）。多くの場合、二重エクソンスキッピングは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体から２個の標的エクソンのみの排除をもたらす。しかし、他の場合、前記ｍＲＮＡ前駆体における標的エクソン及び該エクソン間の全領域は、他のエクソン（介在エクソン）がこのような領域に存在していたとしても、生成されたｍＲＮＡには存在しないことが判明した。この複数スキッピングは、エクソン４５に対するオリゴヌクレオチド１種及びエクソン５１に対するオリゴヌクレオチド１種がＤＭＤ遺伝子を転写している細胞に添加された、ＤＭＤ遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドの組合せにおいて顕著にその通りであった。このようなセットアップは、エクソン４５〜５１を含まずに生成されたｍＲＮＡを生じた。明らかに、言及されているオリゴヌクレオチド存在下のｍＲＮＡ前駆体の構造は、スプライシング機構が刺激されてエクソン４４と５２を互いに接続するようなものであった。
【００３４】
２本の相補的オリゴヌクレオチドの間の接続を提供することによって、介在エクソンのスキッピングも特異的に促進することが可能である。したがって、一実施形態において、少なくとも２個のジストロフィンエクソンと相補的なヌクレオチド配列は、接続部分によって分離される。少なくとも２本のヌクレオチド配列は、本実施形態において、このように単一分子を形成するよう接続される。
【００３５】
場合により、２種以上の化合物が本発明の方法において用いられ、前記化合物類は任意の順序で個体に投与することができる。一実施形態において、前記化合物類は同時に投与される（前記化合物類が１０時間以内、好ましくは１時間以内に投与されることを意味する）。しかし、これは必要とされない。別の実施形態において、前記化合物類は順次投与される。
【００３６】
分子
第二の態様において、前節の表題「方法」に記載されている方法における使用のための分子が提供される。この分子は、好ましくはオリゴヌクレオチドを含む又はからなり、前記オリゴヌクレオチドは好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）又はアンチセンスオリゴリボヌクレオチドである。
【００３７】
本研究者らにより、特にエクソン４５が、前記エクソン内の一続きの少なくとも２１ヌクレオチドと結合する分子を用いて高頻度で特異的にスキッピングされることが判明した。この効果は、一続きの２１ヌクレオチド未満と結合する分子と比べて前記分子のより高い結合親和性と関連し得るが、ハイブリッド二本鎖の熱力学的、動態的又は構造的特性に有利に働く関連する他の細胞内パラメーターが存在する可能性がある。好ましい一実施形態において、前記エクソン内の一続きの少なくとも２１、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドと結合する分子が用いられる。
【００３８】
好ましい一実施形態において、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の一部と相補的な配列を含む本発明の分子又はオリゴヌクレオチドは、相補部分が、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％又はさらにより好ましくは９８％、最も好ましくは最大１００％となるものである。「エクソン４５の一部」は、好ましくは、一続きの少なくとも２１ヌクレオチドを意味する。最も好ましい一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書に定義されているジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の一部と相補的な配列からなる。或いは、オリゴヌクレオチドは、本明細書に定義されているジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の一部と相補的な配列及び追加的なフランキング配列を含むことができる。より好ましい一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの前記相補部分の長さは、少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドの長さである。様々な種類のフランキング配列を使用することができる。好ましくは、追加的なフランキング配列は、タンパク質と前記分子若しくはオリゴヌクレオチドとの結合を修飾するため、又はオリゴヌクレオチドの熱力学的特性を修飾するため、より好ましくは、標的ＲＮＡ結合親和性を修飾するために用いられる。別の好ましい一実施形態において、追加的なフランキング配列は、エクソン４５に存在しないＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体の配列と相補的である。このようなフランキング配列は、好ましくはエクソン４５のスプライス部位アクセプター又はドナーコンセンサス配列を含む又はからなる配列と相補的である。好ましい一実施形態において、このようなフランキング配列は、エクソン４５に隣接するＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体イントロン、即ち、イントロン４４又は４５の配列を含む又はからなる配列と相補的である。エクソン４５内の一続きの少なくとも２１、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドは、好ましくは配列、
【化１】
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から選択される。
【００３９】
配列番号２の一続きの少なくとも２１、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドを含む又はからなるヌクレオチド配列と結合する分子が、この分子を提供された細胞においてエクソン４５の高効率のスキッピングをもたらすことが判明した。配列番号２の一続きの２１ヌクレオチド未満を含むヌクレオチド配列と結合する分子は、本発明の分子よりも効率が悪くエクソンスキッピングを誘導することが判明した。したがって、好ましい一実施形態において、分子が配列番号２内の一続きの少なくとも２１、２５、３０、３５ヌクレオチドと結合する方法が提供される。一般的な考えに反して、本発明者らは驚くべきことに、少なくとも２１ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドを用いて、エクソンスキッピングのより高度な特異性及び効率性を達成できることを見出した。示されている配列のうち、スプライスジャンクション部位の保存部分に由来するものはない。したがって、前記分子は、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体由来の他のエクソン又は他の遺伝子由来のエクソンのディファレンシャルなスプライシングを媒介する様子はない。
【００４０】
一実施形態において、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の包含に干渉することができる本発明の分子は、特定の配列と結合する化合物分子、又はＲＮＡ結合タンパク質若しくは示されているＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と結合できるよう修飾された非天然ジンクフィンガータンパク質等、タンパク質である。特定のヌクレオチド配列と結合する化合物分子をスクリーニングするための方法は、例えば参照として本明細書に組み込まれている国際出願ＰＣＴ／ＮＬ０１／００６９７号明細書及び米国特許第６８７５７３６号明細書に開示されている。特定のヌクレオチド配列と結合するＲＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質を設計するための方法は、参照として本明細書に組み込まれているＦｒｉｅｓｅｎ及びＤａｒｂｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５４３〜５４６（１９９８）によって開示されている。
【００４１】
さらに別の一実施形態において、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の包含に干渉することができる本発明の分子は、ＤＭＤ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のコード鎖と相補的であり塩基対合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で後にさらに詳述するよう、好ましくはＲＮＡ残基、ＤＮＡ残基及び／又はヌクレオチドアナログ若しくはその均等物を含む。
【００４２】
本発明の好ましい分子は、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド又は５０ヌクレオチド等、２１〜５０ヌクレオチド又は塩基、より好ましくは２１〜４０ヌクレオチド、より好ましくは２１〜３０ヌクレオチドの、ヌクレオチドに基づく、ヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
本発明の最も好ましい分子は、２５ヌクレオチドのヌクレオチドに基づく配列を含む。
【００４４】
好ましい一実施形態において、本発明の分子は、ヌクレオチド配列、配列番号２内の一続きの少なくとも２１ヌクレオチドと結合し、又は配列番号２内の少なくとも一続きの少なくとも２１ヌクレオチドと相補的であり、又はそれに対してアンチセンスである。
【００４５】
特定の一実施形態において、本発明は、配列番号６８を除いた表１に示されているアンチセンスヌクレオチド配列から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５に存在する配列番号２の配列に対してアンチセンスである本発明の分子は、好ましくは配列番号３；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６及び／又は配列番号：６７のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる。
【００４６】
より好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号３；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び／又は配列番号８のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。
【００４７】
最も好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号３のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。この分子が、筋細胞におけるＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５のスプライシング調節に非常に効率的であることが判明した。
【００４８】
本発明の分子のヌクレオチド配列は、本明細書で後にさらに詳述するように、ＲＮＡ残基、ＤＮＡ残基、ヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むことができる。さらに、本発明の分子は、本明細書に定義されている本発明の分子の機能的均等物を包含することができる。
【００４９】
本発明の分子は、ヌクレアーゼ抵抗性を高めるよう、及び／又はアンチセンスヌクレオチドの標的配列に対する親和性を高めるよう修飾された１個又は少なくとも１個の残基を含むことが好ましい。したがって、好ましい一実施形態において、アンチセンスヌクレオチド配列は、修飾塩基及び／若しくは修飾骨格及び／若しくは非天然ヌクレオシド間結合、又はこれら修飾の組合せを有する残基として定義された、１個又は少なくとも１個のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含む。
【００５０】
好ましい一実施形態において、ヌクレオチドアナログ又はその均等物は修飾骨格を含む。このような骨格の例として、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネート及びスルホンアミド骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格並びにアミド骨格が挙げられる。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーは、以前にアンチセンス薬として研究された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環に置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合に置換された、非荷電骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解抵抗性であり、ＲＮａｓｅＨを活性化させることよりもむしろ、翻訳を停止すること、又はｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに干渉することにより、アンチセンス薬として機能すると思われる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に崩壊させる方法により組織培養細胞に首尾よく送達され、これら方法の数種を比較したある研究により、スクレイプローディングが最も効率的な送達方法であることが判明した。しかし、モルホリノ骨格は非荷電であるため、カチオン性脂質は細胞へのモルホリノオリゴヌクレオチド取込みの効果的な媒介物ではない。近年の報告は、モルホリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成を示し、これら研究は、モルホリノオリゴヌクレオチドがその非イオン性骨格のため、マグネシウムの不在下で三重鎖を形成できることを示した。
【００５１】
短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合又は１若しくは複数種の短鎖へテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合により形成された結合等、骨格における残基間の結合は、リン原子を含まないことがさらに好ましい。
【００５２】
好ましいヌクレオチドアナログ又はその均等物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４、１４９７〜１５００）。ＰＮＡに基づく分子は、塩基対認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣となる。ＰＮＡ骨格は、ヌクレオ塩基がメチレンカルボニル結合により骨格と結合した、ペプチド結合により結合したＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットを含む。代替的な骨格は、１炭素伸長したピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ及びＫｕｍａｒ（２００５）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ、４９５〜４９７）。ＰＮＡ分子の骨格は荷電リン酸基を含まないため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは通常、それぞれＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドより安定的である（Ｅｇｈｏｌｍら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６５、５６６〜５６８）。
【００５３】
さらに好ましい骨格は、リボース又はデオキシリボース糖がモルホリノ六員環に置換されたモルホリノヌクレオチドアナログ又はその均等物を含む。最も好ましいヌクレオチドアナログ又はその均等物は、リボース又はデオキシリボース糖がモルホリノ六員環に置換され、隣接するモルホリノ環間のアニオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合に置換された、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含む。
【００５４】
さらに別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログ又はその均等物は、ホスホジエステル結合における非架橋酸素のうちの少なくとも１個の置換を含む。この修飾は、塩基対合を僅かに不安定化させるが、ヌクレアーゼ分解に対する顕著な抵抗性を付加する。好ましいヌクレオチドアナログ又はその均等物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネートや、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート等、メチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネートや、３’−アミノホスホラミデート、アミノアルキルホスホラミデート及びチオノホスホラミデート等、ホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート又はボラノホスフェートを含む。
【００５５】
本発明のさらに好ましいヌクレオチドアナログ又はその均等物は、−ＯＨ；−Ｆ；１又は複数のヘテロ原子によって分断され得る置換又は非置換、直鎖又は分岐鎖低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、アリール又はアラルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；−アミノキシ；メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；及び−ジメチルアミノエトキシエトキシ等、２’、３’、及び／又は５’位置において１又は２基置換された１又は複数種の糖部分を含む。糖部分は、ピラノース若しくはその誘導体又はデオキシピラノース若しくはその誘導体、好ましくはリボース若しくはその誘導体又はデオキシリボース若しくはその誘導体となることができる。このような好ましい誘導体化糖部分は、２’−炭素原子が糖環の３’又は４’炭素原子と結合し、これにより二環式糖部分を形成しているロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を含む（Ｍｏｒｉｔａら、２００１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｎｏ．１：２４１〜２４２）。これら置換は、ヌクレオチドアナログ又はその均等物にＲＮａｓｅＨ及びヌクレアーゼ抵抗性を付与し、標的ＲＮＡに対する親和性を高める。
【００５６】
当業者であれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける全位置が均一に修飾される必要がないことが理解できる。さらに、上述のアナログ又はその均等物のうちの２種以上が、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り込まれてもよく、又はさらにはアンチセンスオリゴヌクレオチド内の単一位置に取り込まれてもよい。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種類の異なるアナログ又はその均等物を有する。
【００５７】
本発明に係る好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース及び／又はハロゲン化誘導体等のこれら修飾の置換誘導体等、２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００５８】
本発明に係る最も好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートリボースを含む。
【００５９】
本発明の分子の機能的均等物は、該機能的均等物の活性が少なくともある程度保持されている、本明細書に定義されているオリゴヌクレオチドとして定義することができる。好ましくは、前記機能的均等物の活性は、エクソン４５スキッピングを誘導し、機能ジストロフィンタンパク質を提供する。したがって、前記機能的均等物の前記活性は、エクソン４５スキッピングの検出及び機能ジストロフィンタンパク質量の定量化によって評価されることが好ましい。本明細書における機能ジストロフィンは、アクチン及びＤＧＣタンパク質複合体のメンバーと結合できるジストロフィンとして定義されることが好ましい。オリゴヌクレオチドの前記活性評価は、ＲＴ−ＰＣＲにより、又は免疫蛍光又はウエスタンブロット解析により実施されることが好ましい。前記活性は、機能的均等物の由来する前記オリゴヌクレオチドの対応する活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％以上を示す場合、少なくともある程度保持されることが好ましい。本願を通じて、単語、オリゴヌクレオチドが用いられている場合、これは本明細書に定義されているその機能的均等物に置き換えることができる。
【００６０】
また、当業者であれば、ヒトＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５を効率的にスキッピングするため、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み合わせてよいことを理解するであろう。好ましい一実施形態において、２種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、３種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、４種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは５種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はさらにそれ以上等、少なくとも２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せが、本発明の方法に用いられる。配列番号６８を除いた表１に示されている数種のオリゴヌクレオチド又は分子を組み合わせることもまた、本発明により包含される。
【００６１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、好ましくは筋原細胞又は筋細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド取込みを増強する構成成分と結合することができる。このような構成成分の例として、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質や、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータンを含むがこれらに限定されない細胞透過性ペプチド、オリゴアルギニン、ポリアルギニン、オリゴリシン又はポリリシン等、正荷電アミノ酸、及び抗体、抗体のＦａｂフラグメント又はラクダ型（ｃａｍｅｌｏｉｄ）単ドメイン抗原結合ドメイン等、短鎖抗原結合ドメインにより提供されるような抗原結合ドメインが挙げられる。
【００６２】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド結合ＰＭＯを含む。
【００６３】
本発明の１又は複数種のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含む好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、全身送達において心筋細胞等、１又は複数の筋細胞におけるスプライシングを調節する。この点において、特定のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの全身送達は、筋細胞のサブセットへのターゲティングをもたらし得るが、異なるヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋細胞の異なるサブセットへのターゲティングをもたらし得る。したがって、一実施形態において、ヒトＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５のスキッピングを調節するために、異なるヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せを使用することが好ましい。
【００６４】
細胞は、プラスミド由来のアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現又はウイルスに基づくベクターによって提供されたウイルス発現により、ヒトＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の高効率的のスキッピングをもたらす、必須配列に干渉することができる分子を提供され得る。このようなウイルスに基づくベクターは、本明細書で同定されているアンチセンス分子の発現を駆動する発現カセットを含む。好ましいウイルスに基づくベクターは、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスに基づくベクターを含む。発現は、Ｕ１、Ｕ６又はＵ７ＲＮＡプロモーター等、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより駆動されることが好ましい。筋又は筋原細胞は、水溶液中のプラスミドを提供することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドを提供され得る。或いは、プラスミドは、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））又はそれらの誘導体等、公知のトランスフェクション剤を用いてトランスフェクションにより提供され得る。
【００６５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド発現の好ましい一システムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターである。ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の高効率のスキッピングのための小さなアンチセンスヌクレオチド配列の長期発現に用いることができる、一本鎖及び二本鎖のＡＡＶに基づくベクターが開発された。
【００６６】
好ましいＡＡＶに基づくベクターは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）により駆動される発現カセットを含む。好ましいＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、例えばＵ１、Ｕ６又はＵ７ＲＮＡプロモーターである。
【００６７】
したがって、本発明は、ヒトＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５のスキッピングを誘導するための、本発明の１又は複数種のアンチセンス配列を発現するためのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター駆動発現カセットを含む、ウイルスに基づくベクターも提供する。
【００６８】
医薬組成物
必要に応じて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する分子又はベクターは、薬学的に許容される担体を添加することにより、薬学的に活性な混合物又は組成物に取り込まれることができる。
【００６９】
したがって、さらに別の態様において、本発明は、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む分子、及び／又は本発明に係るアンチセンス配列（単数又は複数）を発現する、ウイルスに基づくベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。
【００７０】
好ましい医薬組成物は、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のエクソン７、４４、４６、５１、５３、５９、６７のスキッピングを調節することができる、分子及び／又はベクターと任意選択で組み合わせた、本明細書に定義されている分子及び／又は本明細書に定義されているベクターと、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む。
【００７１】
好ましい賦形剤は、本明細書に定義されているこのような分子、好ましくは複合体を形成した又は細胞膜により小胞又はリポソームに捕捉されたオリゴヌクレオチドを送達する複合体、小胞及び／又はリポソームを形成することができる賦形剤を含む。これら賦形剤の多くは、本技術分野で公知のものである。適切な賦形剤は、このような分子、好ましくは本明細書に定義されているオリゴヌクレオチドを細胞、好ましくは筋細胞に送達できる粒子に自己集合することができる、ポリエチレンイミンとその誘導体、又はポリプロピレンイミン若しくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）とその誘導体等を含む、類似のカチオン性ポリマー、合成両親媒性物質、リポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ及び／又はウイルスカプシドタンパク質を含む。このような賦形剤は、（アンチセンス等、オリゴヌクレオチド）核酸を筋細胞等、種々の培養細胞へ効率的に送達することが示された。本出願人らは、実施例に示す通り、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＥｘＧｅｎ５００、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて非常に良好な結果を得た。これらの高いトランスフェクション潜在能力は、全細胞生存に関して除外される低度から中程度の毒性と組み合される。構造的修飾の容易さを利用して、さらなる修飾と、これらのさらなる（ｉｎ  ｖｉｖｏ）核酸転移特性及び毒性を分析することができる。
【００７２】
リポフェクチンは、リポソームトランスフェクション剤の一例を表す。これは、２種の脂質成分、カチオン性Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．ＤＯＴＡＰは、メチル硫酸塩）及び中性脂肪ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる。中性成分は、細胞内放出を媒介する。デリバリーシステムの別のグループは、高分子ナノ粒子である。
【００７３】
ＤＮＡトランスフェクション剤としてよく知られているジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン等、ポリカチオンは、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わせて、本明細書に定義されている分子又は化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドを、細胞膜を通過して細胞内に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤することができる。
【００７４】
これら一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンは、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドをコロイドとして製剤するための代替的アプローチを提供する。このコロイド状ナノ粒子システムは、簡便な自己集合プロセスにより調製されて、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドを封入し細胞内放出を媒介することができる、いわゆるプロティクル（ｐｒｏｔｉｃｌｅ）を形成することができる。当業者であれば、本明細書に定義されている化合物、好ましくはヒトのＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーの治療のために前記化合物を送達する、本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドの封入及び送達のための、上述又は他の市販の代替的賦形剤及びデリバリーシステムのうちのいずれかを選択し、適合させることができる。
【００７５】
さらに、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドは、細胞、細胞質及び／又はその核への取込みを促進するよう特異的に設計されたターゲティングリガンドと共有又は非共有結合することができる。このようなリガンドは、（ｉ）細胞への取込みを促進する、細胞、組織又は器官特異的エレメントを認識する（ペプチド（様）構造を含むがこれに限定されない）化合物、及び／又は（ｉｉ）細胞への取込み及び／又は本明細書で定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドの小胞、例えばエンドソーム又はリソソームから細胞内への放出を促進することができる化学合成物を含むことができる。
【００７６】
したがって、好ましい一実施形態において、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドが、少なくとも１種類の賦形剤及び／又は送達のためのターゲティングリガンド及び／又は前記化合物の細胞への送達デバイス及び／又はその細胞内送達を促進する物質を提供された薬剤に製剤される。したがって、本発明は、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１種類の賦形剤及び／又は送達のためのターゲティングリガンド及び／又は前記化合物の細胞への送達デバイス及び／又はその細胞内送達を促進する物質をさらに含む、薬学的に許容される組成物も包含する。
【００７７】
分子、化合物又はオリゴヌクレオチドは、単一の組成物又は調製物に製剤してはならないことを理解するべきである。当業者であれば、その同一性に依存して、どの種類の製剤が各化合物に最も適切であるか理解することができるであろう。
【００７８】
好ましい一実施形態において、０．１ｎＭ〜１μＭの範囲のｉｎ  ｖｉｔｒｏ濃度の、本明細書に定義されている分子又はオリゴヌクレオチドが用いられている。より好ましくは、用いられている濃度は、０．３〜４００ｎＭ、さらにより好ましくは１〜２００ｎＭの範囲である。本明細書に定義されている分子又はオリゴヌクレオチドは、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で用いることができる。数種類の分子又はオリゴヌクレオチドが用いられる場合、これらの濃度は、オリゴヌクレオチドの合計濃度又は添加された各オリゴヌクレオチドの濃度を意味することができる。上述のオリゴヌクレオチド（単数又は複数）の濃度範囲は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおける使用に好ましい濃度である。当業者であれば、用いられているオリゴヌクレオチド（単数又は複数）、処置される標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベルに依存して、用いられる培地並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件、用いられるオリゴヌクレオチド（単数又は複数）濃度はさらに変化することができ、さらなる最適化が必要となり得ることを理解するであろう。
【００７９】
より好ましくは、ＤＭＤを予防、治療するために本発明に用いられる化合物、好ましくはオリゴヌクレオチド及び補助化合物は合成的に生成され、薬学的に許容される組成物又は調製物の製剤形態で、細胞、組織、器官及び／又は患者に直接投与される。医薬組成物の被験者への送達は、好ましくは１又は複数種の非経口注射、例えば静脈内及び／又は皮下及び／又は筋肉内及び／又はくも膜下及び／又は脳室内投与、好ましくはヒトの身体の１又は複数部位における注射により行われる。
【００８０】
使用
さらに別の態様において、本発明は、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを誘導及び／又は促進するための、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは分子及び／又は本発明に係る１若しくは複数種のアンチセンス配列を発現するウイルスに基づくベクター及び／又は医薬組成物の使用を提供する。スプライシングは、好ましくはヒト筋原細胞又は筋細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節される。より好ましくは、スプライシングはヒト筋原細胞又は筋細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏで調節される。
【００８１】
したがって、本発明はさらに、ＤＭＤ  ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを誘導及び／又は促進するための、又はＤＭＤ患者を治療するための薬剤を調製するための、本明細書に定義されている分子及び／又は本明細書に定義されているベクター及び／又は本明細書に定義されている医薬組成物の使用に関する。
【００８２】
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用形は、その非限定的な意義で用いられ、この単語の前の項目が包含されるが、特に言及されていない項目が除外されるわけではないことを意味する。さらに、動詞「からなる」は、「から本質的になる」に置き換えてもよく、本明細書に定義されている分子、ウイルスに基づくベクター又は組成物が、特に同定されている成分以外に、本発明の独自の特性を変化させない追加的な成分（単数又は複数）を含んでよいことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」、「ａｎ」による要素への言及は、文脈がその要素の１つ及び１つだけが存在することを明らかに必要としない限り、１を超える要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」、「ａｎ」は通常、「少なくとも１」を意味する。
【００８３】
本明細書に同定されている各実施形態は、他に断りがない限り、共に組み合わせることができる。本明細書に引用されているあらゆる特許及び参考文献は、これによりその全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【００８４】
次の実施例は、説明目的のためだけに提供されており、決して本発明の範囲を限定することを目的としない。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ヒトコントロール筋管において、その全てがエクソン４５の特定配列（即ち、配列番号２）内の一続きの２１ヌクレオチドと結合する一連のＡＯＮ（ＰＳ２２０〜ＰＳ２２５；配列番号３〜８）を、２種の異なる濃度（２００及び５００ｎＭ）で試験した。配列解析によって確認されたように（データなし）、６種のＡＯＮの全てが特異的エクソン４５スキッピングの誘導に効果的であった。しかし、ＰＳ２２０（配列番号３）は、最高レベルのエクソン４５スキッピングを再現可能に誘導した（図２を参照）。（ＮＴ：未処置細胞、Ｍ：サイズマーカー）
【図２】ヒトコントロール筋管において、２５塩基長のＰＳ２２０（配列番号３）を増加濃度で試験した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬａｂＣｈｉｐ解析により評価した通り、最大７５％のエクソン４５スキッピングレベルが（４００ｎＭで）再現可能に観察された。
【図３】ヒトコントロール筋管において、「短い」１７塩基長のＡＯＮ４５−５（配列番号６８）及びその対応する重複した「長い」２５塩基長のＰＳ２２０の効率を、２００ｎＭ及び５００ｎＭで直接比較した。ＰＳ２２０は、両濃度において明らかにより効率的であった。これは、４５−５を用いて得られた３％と比較したところ、６３％であった（ＮＴ：未処置細胞、Ｍ：サイズマーカー）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８６】
（例１及び２）
材料及び方法
ＡＯＮ設計は、（部分的に）ｍ−ｆｏｌｄプログラム（Ｚｕｋｅｒ、Ｍ．（２００３）Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３１、３４０６〜３４１５）によって推測される標的エクソンＲＮＡの重複オープン二次構造に基づき、また４種の最も豊富なＳＲタンパク質（ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ５５）の結合部位を予見するＥＳＥｆｉｎｄｅｒ（Ｃａｒｔｅｇｎｉ、Ｌ．ら、（２００３）ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ：Ａ  ｗｅｂ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｅｘｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３１、３５６８〜７１；Ｓｍｉｔｈ、Ｐ．Ｊ．ら、（２００６）Ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＦ２／ＡＳＦ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１５、２４９０〜２５０８）等、多くのソフトウエアプログラムによって推測される（部分的に）重複推定ＳＲタンパク質結合部位に基づいて行った。ＡＯＮは、Ｐｒｏｓｅｎｓａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｂ．Ｖ．（ライデン、オランダ）により合成し、これは２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及び全長ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。
【００８７】
組織培養、トランスフェクション及びＲＴ−ＰＣＲ解析
健常な個体由来の筋管培養物（「ヒトコントロール」）を以前記載した通りに得た（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２００３；１２（８）：９０７〜１４）。ＡＯＮのスクリーニングのため、０〜５００ｎＭの各ＡＯＮを用いて筋管培養物をトランスフェクションした。メーカーの取扱説明書に従い、トランスフェクション試薬ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＥｘＧｅｎ５００  ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を１μｇのＡＯＮにつき２μｌのＰＥＩで用いた。エクソンスキッピング効率は、エクソン４５側方のエクソンに存在するプライマーを用いたネステッドＲＴ−ＰＣＲ解析により決定した。配列検証のため、アガロースゲルからＰＣＲ断片を単離した。定量化のため、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ１０００ＬａｂＣｈｉｐｓキット及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いてＰＣＲ産物を解析した。
【００８８】
結果
エクソン４５内の配列番号２内の配列を標的とする一連のＡＯＮを設計し、トランスフェクション並びに続く単離ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析により正常な筋管培養物で試験した。ＰＳ２２０（配列番号３）は、ＰＳ２２１〜ＰＳ２２５と比べて最高レベルのエクソン４５スキッピングを再現可能に誘導した（図１）。最大７５％の高レベルのエクソン４５スキッピングは、既に４００ｎＭのＰＳ２２０で達成された（図２）。直接的な比較において、ＰＳ２２０（２５塩基長）は、ＡＯＮ濃度２００ｎＭと５００ｎＭの両方において、その対応するより短い１７塩基長のＡＯＮ４５−５（配列番号６８；以前ｈ４５ＡＯＮ５として刊行された（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００４；７４：８３〜９２））よりもエクソン４５スキッピングの誘導に再現可能に効率的であり、これは５００ｎＭにおいてそれぞれ６３％対３％であった（図３）。この結果は恐らく、実際は完全に重複したＡＯＮ４５−５である延長された長さのＰＳ２２０は、エクソン４５スキッピング誘導の効率も増加させるように、ＡＯＮ−標的複合体の自由エネルギーを増加させるという事実に起因する。
【表１−１】
0005786109.tif 000003
【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【図１】
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【図２】
0005786109.tif 000011
【図３】
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【配列表】
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