(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロースを分解処理して得た処理液を基質とし、嫌気性微生物であるクロストリジウム・サーモアセチカム（Clostridium thermoaceticum）を使用して、システイン塩酸塩１水和物（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ）添加量を０．０５〜０．１ｇ／Ｌにして、酢酸発酵する工程を有する酢酸の製造方法であって、
前記酢酸発酵工程では、ｐＨ測定器により液のｐＨを測定し、その結果に基づいてアルカリ水溶液を添加することにより、発酵中の液のｐＨを６．５〜７．５に保持することを特徴とする、前記酢酸の製造方法。
【請求項２】
前記酢酸発酵において、嫌気性微生物として、クロストリジウム・サーモアセチカム（Clostridium thermoaceticum）とクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）とを併用することを特徴とする請求項１に記載の酢酸の製造方法。
【請求項３】
更に、リグノセルロースを加圧熱水処理する工程を有し、該加圧熱水処理により得られた処理液を、前記酢酸発酵の基質とすることを特徴とする請求項１又は２に記載の酢酸の製造方法。
【請求項４】
前記加圧熱水処理工程は、圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度１３０〜４００℃の条件で、０．１秒〜６０分間行うことを特徴とする請求項３に記載の酢酸の製造方法。
【請求項５】
前記加圧熱水処理工程は、第１段階として、圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度１３０〜２７０℃の条件で１〜６０分間処理した後、第２段階として、圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度２３０〜４００℃でかつ第１段階よりも高い温度の条件で０．１秒〜６０分間処理することを特徴とする請求項４に記載の酢酸の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の酢酸の製造方法によって酢酸を製造する工程、及び該工程により製造された酢酸を、エステル化及び水素化分解して、エタノールを得る工程を有するバイオエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気性微生物を用いた酢酸の製造方法及びこの製造方法を利用したバイオエタノールの製造方法に関する。より詳しくは、加圧熱水処理などのリグノセルロースの分解処理をすることにより得られる処理液を基質として酢酸発酵により酢酸を製造する方法、及びその酢酸をエステル化及び水素化することによりエタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオエタノールは、生物由来の原料から作られたエタノールを指し、主に、サトウキビやビートの搾汁などに含まれる糖質又はトウモロコシやサツマイモなどに含まれるデンプン質を糖化したものを、発酵させることによって製造されている（特許文献１参照）。例えば、特許文献１に記載の方法では、糖質（炭水化物）を発酵させて得た酢酸を、エステル化及び水素化することによってエタノールを製造している。
【０００３】
この特許文献１に記載のエタノールの生産方法では、発酵工程を、乳酸発酵及び酢酸発酵の２段階で行っている。また、その酢酸発酵においては、クロストリジウム（Clostridium）属の微生物、具体的にはクロストリジウムサーモアセチカム（Clostridium thermoaceticum）やクロストリジウムフォルミコアセチカム（Clostridium formicoaceticum）などの酢酸生成菌を使用している。
【０００４】
また、従来、バイオマス資源を原料として、エタノールを製造する方法も提案されている（特許文献２参照）。この特許文献２に記載の方法では、酸加水分解や酵素加水分解によりバイオマス資源に含まれるセルロースから、発酵可能な糖質を得ている。更に、本発明者らにより、リグノセルロースを加圧熱水で処理することにより広範な糖類を得て、これらを酢酸発酵により酢酸に変換し、その酢酸をエステル化及び水素化してエタノールを得る方法も提案されている（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５３７８４８号公報
【特許文献２】特表２０１０−５１７５８１号公報
【特許文献３】特開２００９−１０６２７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前述した従来の技術には、エタノールへの変換効率が低いという問題点がある。例えば、糖質やデンプン質を原料とする従来のバイオエタノールの製造方法では、一般に、下記化学式（１）に示すように、１モルのグルコース（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）から２モルのエタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）と２モルの二酸化炭素（ＣＯ２）が生成するが、エタノール生成には、グルコースの６個の炭素のうち４個の炭素しか使用されておらず、炭素の利用効率が低い。
【０００７】
【化１】
0005675220.tif 000002
【０００８】
これに対して、特許文献１〜３に記載の方法のように、酢酸を経由したバイオエタノールの製造方法は、理論上はエタノールの生成効率を向上させることができるが、例えば、特許文献１に記載の方法には、酢酸を得るための酢酸発酵の前工程として乳酸発酵が必要であり、プロセスが複雑であるという問題点がある。また、特許文献２に記載の方法は、材料の前処理がいかなるもので、どのような化合物が得られ、それらからの酢酸生産性がどの程度なのかなどの具体的内容が不明確であるという問題点がある。
【０００９】
一方、特許文献３に記載の方法は、加圧熱水処理によりリグノセルロースを糖類に分解し、更に、広範な糖類を全て酢酸に変換し得る微生物を用いているため、前述した従来法よりも効率よく処理液の基質からエタノールを製造することができるが、糖類から酢酸への変換率が十分でない。
【００１０】
そこで、本発明は、高効率で、リグノセルロースから酢酸を生成することができる酢酸の製造方法及びバイオエタノールの製造方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、これまでの研究により、Clostridium thermoaceticum及びClostridium thermocellumの２種類の微生物の混合発酵系を用いることで、木材の加圧熱水処理により得られるヘキソース、ペントース及びこれらのオリゴ糖、更にはグルクロン酸などの広範な化合物からなる基質を、酢酸に変換できることを明らかにしてきた。そして、本発明者は、この嫌気性微生物を用いた酢酸の製造方法において、前述した課題を解決するために鋭意実験検討を行った結果、以下に示す知見を得た。
【００１２】
本発明者は、先ず、酢酸への変換率が、理論値よりも低くなる原因について検討を行い、（ｉ）投入した基質が多量に菌体の増殖に用いられており、酢酸への代謝が十分でないこと、（ii）発酵液に用いる栄養液や緩衝液が基質を減少させていること、を発見した。そして、（ｉ）については、「栄養液中に含まれるシステイン投入量を原料することにより、菌体増殖が抑制されること」を見出し、（ii）については、「ｐＨセンサーにより培養液のｐＨをモニターしながら、適時アルカリ水溶液を添加しながら発酵を行うことで、発酵系への緩衝液の投入が不要となること」を見出して、本発明に至った。
【００１３】
即ち、本発明に係る酢酸の製造方法は、リグノセルロースを分解処理して得た処理液を基質とし、嫌気性微生物であるClostridium thermoaceticumを使用して、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ添加量を０．０５〜０．１ｇ／Ｌにして、酢酸発酵する。
ここで、「分解処理」とは、加圧熱水処理などの水熱処理、爆砕処理、酸加水分解処理、アルカリ処理及び酵素分解処理などを指す。
本発明においては、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ添加量を０．０５〜０．１ｇ／Ｌに低減しているため、発酵中における菌体の増殖が抑制される。その結果、酢酸に変換される基質の量を増加させることができるため、酢酸への変換効率が向上する。
この製造方法では、酢酸発酵工程において、ｐＨ測定器により液のｐＨを測定し、その結果に基づいてアルカリ水溶液を添加することにより、発酵中の液のｐＨを６．５〜７．５に保持することもできる。
また、酢酸発酵の際、嫌気性微生物として、Clostridium thermoaceticumとClostridium thermocellumとを併用してもよい。
更に、リグノセルロースを加圧熱水処理する工程を有し、この加圧熱水処理により得られた処理液を、前記酢酸発酵の基質とすることもできる。
その場合、加圧熱水処理工程は、圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度１３０〜４００℃の条件で、０．１秒〜６０分間行うことが好ましい。
また、加圧熱水処理工程は、例えば、第１段階として、圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度１３０〜２７０℃の条件で１〜６０分間処理した後、第２段階として、圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度２３０〜４００℃でかつ第１段階よりも高い温度の条件で０．１秒〜６０分間処理してもよい。
【００１４】
一方、本発明に係るバイオエタノールの製造方法は、前述した酢酸の製造方法によって製造された酢酸を、エステル化及び水素化分解して、エタノールを得る工程を有する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ添加量を従来よりも低減しているため、菌体の増殖が抑制され、リグノセルロースから酢酸を高効率で生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Clostridium thermoaceticumによるヘキソースから酢酸への発酵経路を示す図である。
【図２】本発明の第２実施形態に係るバイオエタノールの製造方法を模式的に示す図である。
【図３】酢酸水溶液からエタノールを生成するエタノール製造装置の概要を示す図である。
【図４】横軸に発酵系のシステイン濃度をとり、縦軸に基質消費率をとって、システイン投入量と菌体増殖のための基質消費率との関係を示すグラフ図である。
【図５】横軸に発酵系のシステイン濃度をとり、縦軸に酢酸生成率をとって、システイン投入量と酢酸生成率との関係を示すグラフ図である。
【図６】本発明の第２実施例で用いたファーメンターの構成を模式的に示す図である。
【図７】横軸に発酵時間をとり、縦軸に酢酸生成率及び酢酸生成モル比（酢酸／グルコース）をとって、酢酸発酵状態を示すグラフ図である。
【図８】横軸に発酵時間をとり、縦軸に酢酸濃度をとって、緩衝液の添加有無と酢酸生成量との関係を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して、詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。
【００１８】
＜第１の実施形態＞
先ず、本発明の第１の実施形態に係る酢酸の製造方法について説明する。本実施形態の酢酸の製造方法は、リグノセルロースを分解処理する工程（ステップＳ１）と、ステップＳ１で得られた処理液を基質とし、嫌気性微生物であるClostridium thermoaceticumを使用し、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（以下、単にシステインという。）の添加量を０．０５〜０．１ｇ／Ｌにして酢酸発酵する工程（ステップＳ２）と、を有する。
【００１９】
［ステップＳ１：分解処理工程］
リグノセルロースは、木材の主要な化学構成物質であり、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンなどで構成されている。そして、このリグノセルロースを分解処理すると、各種単糖、オリゴ糖、多糖、糖過分解物、有機酸及びリグニン由来物質などが生成する。その際の処理方法は特に限定するものではないが、例えば、加圧熱水処理などの水熱処理、爆砕処理、酸加水分解処理、アルカリ処理及び酵素分解処理などが挙げられる。
【００２０】
これら分解処理方法の中でも、特に、加圧熱水処理が好ましい。リグノセルロースを加熱熱水処理する際の条件は、特に限定されるものではないが、例えば圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度１３０〜４００℃、処理時間０．１秒〜６０分間とすることができる。このように、加圧熱水処理によりリグノセルロースを分解すると、触媒などを使用せずに、水だけで反応を進行させることができ、更に、反応時間を短縮することができる。
【００２１】
また、加圧熱水処理は、条件を変えて、複数回行うこともできる。例えば、２段階処理を行う場合、第１段階（1st Stage）として、圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度１３０〜２７０℃の条件で、１〜６０分間処理し、その後、第２段階として（2nd Stage）、圧力０．１１〜５０ＭＰａ、温度２３０〜４００℃でかつ第１段階よりも高い温度の条件で、０．１秒〜６０分間処理することもできる。このように２段階で処理することにより、ヘミセルロースとセルロースのように反応性の異なる成分を、それぞれ好適な反応条件で処理することが可能となる。
【００２２】
［ステップＳ２：酢酸発酵工程］
本実施形態の酢酸の製造方法では、前述したステップＳ１で得られた処理液を基質とし、Clostridium属の嫌気性微生物であるClostridium thermoaceticumを用いて、嫌気性酢酸発酵を行う。嫌気性酢酸発酵は、無酸素状態で発酵を行う方法であり、下記化学式（２）で表されるように、グルコースなどの糖類を直接酢酸に変換することができる。このため、エタノールの酸化により酢酸を生成する好気性酢酸発酵に比べて、炭素の利用効率が高く、酢酸の生産性を向上させることが可能である。
【００２３】
【化２】
0005675220.tif 000003
【００２４】
（嫌気性微生物）
この嫌気性酢酸発酵において使用する嫌気性微生物は、基質であるリグノセルロースの分解処理液に含まれる成分に応じて適宜選択することができるが、本実施形態の酢酸の製造方法においては、少なくともClostridium属の嫌気性微生物であるClostridium thermoaceticumを使用する。下記表１に各種嫌気性微生物の酢酸発酵における代謝可能な基質を示す。
【００２５】
【表１】
0005675220.tif 000004
【００２６】
上記表１に示すように、Clostridium thermoaceticumは、単糖を基質とする微生物であり、ヘキソース（グルコース、マントース、ガラクトース、フルクトース、ラムノース）、ペントース（キシロース、アラビノース）、酸性糖であるグルクロン酸、有機酸（蟻酸、乳酸）、更には一部の糖過分解物（５−ヒドロキシメチルフルフラール、フルフラール、エリトロース、グリコールアルデヒド、メチルグリオキザール）やリグニン由来物質（グアイアコール、シリンゴール、バニリン、シリンガアルデヒド、コニフェリルアルデヒド、シナピルアルデヒド、コニフェリルアルコール、シナピルアルコール）をも、酢酸に変換することが可能である。
【００２７】
図１はClostridium thermoaceticumによるヘキソースから酢酸への発酵経路を示す図である。なお、図１中ＡＴＰはアデノシン三リン酸であり、Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡはアセチル補酵素Ａである。図１に示すように、Clostridium thermoaceticumは、エタノールを経由せずにヘキソースを酢酸に変換することができ、変換効率にも優れ、酢酸以外の生成物が少ないという特徴がある。
【００２８】
しかしながら、前述したClostridium thermoaceticumは多糖やオリゴ糖は変換することができない。このため、より広範な基質を酢酸に変換するためには、Clostridium thermocellumと、他の嫌気性微生物とを併用することが望ましい。具体的には、Clostridium thermoaceticumとClostridium thermocellumを併用することが望ましい。
【００２９】
Clostridium thermocellumは、多糖を基質とする微生物であり、セルロースを分解する能力が高く、セルロース以外にもキシランやマンナンなどのミセルセルロースなども変換可能である。このClostridium thermocellumはグルコースやキシロースなどの単糖は変換できず、Clostridium thermoaceticumに比べて、酢酸への変換効率が低いという欠点もあるが、Clostridium thermoaceticumと併用することにより、お互いの能力を補完し合い、高効率で酢酸への変換が可能となる。
【００３０】
このことについて、本発明者は、実験により、例えば、多糖類であるセルロースを基質として用いた場合は、Clostridium thermocellumを単独で用いて発酵させると、酢酸変換効率は３０％に満たないが、Clostridium thermoaceticumとClostridium thermocellumを併用すると、６０．５％の変換効率で酢酸が生成することを確認している。
【００３１】
また、Clostridium thermocellumによって多糖類を低分子化し、それによって生成される単糖をClostridium thermoaceticumで酢酸に変換することができるという効果もある。即ち、Clostridium thermoaceticumとClostridium thermocellumを併用することにより、広範な木質バイオマスの加圧熱水処理物から高効率で酢酸を生産することが可能となる。
【００３２】
（システイン添加量：０．０５〜０．１ｇ／Ｌ）
嫌気性酢酸発酵は、基質（リグノセルロースの分解処理液）に、前述した嫌気性微生物の培養液、緩衝液及び栄養液を加え、酸素を含まない雰囲気下で、所定の温度で、一定時間撹拌することにより行う。その際使用する栄養液は、嫌気性微生物の種類に応じて適宜調整することができるが、Clostridium thermoaceticumを使用する場合は、栄養液中にシステインが添加されている。
【００３３】
システインは、Clostridium thermoaceticumの育成に不可欠な硫黄分を供与するだけでなく、還元剤としての役割を担っており、溶液内の酸化還元のバランスを適切に保つ効果がある。しかしながら、前述したように、栄養液中にＣｙｓｔｅｉｎｅが大量に含まれていると、基質が大量に菌体増殖に使用され、酢酸への変換効率が低下してしまう。
【００３４】
そこで、本実施形態の酢酸の製造方法においては、栄養液中に添加するシステイン量を従来よりも少ない０．０５〜０．１ｇ／Ｌにする。これにより、Clostridium thermoaceticumの菌体増殖が抑制され、酢酸への代謝が促進される。
なお、栄養液中のシステイン含有量が０．１ｇ／Ｌを超えると、菌体増殖が増加し、酢酸への変換効率が低下する。一方、栄養液中のシステイン含有量が０．０５ｇ／Ｌ未満の場合、菌体増殖は抑制できるが、酢酸への変換効率も低下してしまう。
【００３５】
（発酵中の液のｐＨ調整）
前述したように、本発明者は、緩衝液には、基質溶液中の糖類を分解する作用があることを発見した。具体的には、加熱により、糖と塩類が化学反応し、分解されると考えられる。そこで、酢酸への変換効率をより高めるためには、緩衝液を使用せずに、水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液を添加することにより、発酵中の液のｐＨを調整することが望ましい。
【００３６】
その具体的方法としては、例えば、ｐＨ測定器により発酵中に液のｐＨをモニターし、その結果に基づいてアルカリ水溶液を適時添加することにより、発酵中の液のｐＨを６．５〜７．５に保持する方法を適用することができる。これにより、緩衝液を使用せずに、発酵中の液のｐＨを適正な範囲に保つことができるため、基質の減少を抑制して、酢酸への発酵効率をより高めることができる。
【００３７】
以上詳述したように、本実施形態の酢酸の製造方法では、リグノセルロースの分解処理液を基質とし、Clostridium thermoaceticumを使用して嫌気性酢酸発酵する際に、システイン添加量を従来よりも減量しているため、菌体の増殖を抑制することができる。その結果、菌体増殖よる基質の減少が抑制され、基質から酢酸への変換効率が向上する。
【００３８】
また、システインの減量に加えて、緩衝液を使用せずに、アルカリ水溶液の添加により発酵中のｐＨ調整を行うことにより、緩衝液により基質の分解も防止することができる。これにより、酢酸への変換効率をより一層高めることができる。
【００３９】
＜第２の実施形態＞
次に、本発明の第２の実施形態に係るバイオエタノールの製造方法について説明する。図２は本実施形態のバイオエタノールの製造方法を模式的に示す図である。本実施形態のバイオエタノールの製造方法は、前述した第１の実施形態の酢酸の製造方法を利用してバイオエタノールを製造する方法であり、第１の実施形態の酢酸の製造方法で製造した酢酸を、エステル化した後、水素化分解して、エタノールを得る。
【００４０】
具体的には、図２に示すように、本実施形態のバイオエタノールの製造方法では、リグノセルロースを分解処理する工程と（ステップＳ１）、ステップＳ１で得られた処理液を基質とし、Clostridium thermoaceticumを使用して、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ添加量を０．０５〜０．１ｇ／Ｌにして、酢酸発酵する工程（ステップＳ２）と、ステップＳ２で得られた酢酸からエタノールを生成する工程と（ステップＳ３）を行う。
【００４１】
以下、各工程について詳細に説明する。なお、分解処理工程（ステップＳ１）及び酢酸発酵工程（ステップＳ２）については、前述した第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。
【００４２】
［ステップＳ３：エタノール生成工程］
図３は酢酸水溶液からエタノールを生成するエタノール製造装置の概要を示す図である。ステップＳ３のエタノール生成工程では、下記化学式（３）で表されるエステル化反応と、下記化学式（４）で表される水素化反応を行う。これらの反応は、例えば、図３に示すようなエタノール製造装置２０を用いて、ワンパスで行うことができる。
【００４３】
【化３】
0005675220.tif 000005
【００４４】
【化４】
0005675220.tif 000006
【００４５】
図３に示すエタノール製造装置２０では、先ず、導入された酢酸水溶液を脱水・濃縮し、その後、生成水（Ｈ２Ｏ）を除去しながら、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）とエタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）から、酢酸エチル（ＣＨ３ＣＯＯＣ２Ｈ５）を得る。そして、この酢酸エチル（ＣＨ３ＣＯＯＣ２Ｈ５）と水素（Ｈ２）から、エタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）を得る。この反応では、３ｍｏｌの酢酸エチルから、６ｍｏｌのエタノールが得られる。
【００４６】
このエタノール生成工程は、例えば温度：１００〜３５０℃、圧力：０．１〜２０ＭＰａの条件で行うことができる。なお、図２，図３では、エステル化反応と水素化反応を、１つの装置内で行う場合を示しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、それぞれ別の装置で連続して行ってもよい。
【００４７】
そして、前述したステップＳ１〜ステップＳ３の各工程で行われる反応（化学式２〜４）をまとめると、下記化学式（５）に示す反応となり、１ｍｏｌのヘキソース（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）から３ｍｏｌのエタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）を得ることができる。このように、本実施形態のバイオエタノールの製造方法は、リグノセルロースという資源を十分に活用し得るエタノール生産プロセスであるといえる。
【００４８】
【化５】
0005675220.tif 000007
【００４９】
更に、本実施形態のバイオエタノールの製造方法では、リグノセルロースの分解処理液を基質とし、Clostridium thermoaceticumを使用して嫌気性酢酸発酵する際に、システイン添加量を減量し、菌体の増殖を抑制しているため、基質から高効率で酢酸を生成することができる。その結果、従来の方法に比べて、リグノセルロースから得られるエタノールの収率も向上させることもできる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げて、本発明の効果について具体的に説明する。
【００５１】
＜第１実施例＞
先ず、第１実施例として、システイン添加量を変えて酢酸発酵を行い、菌体増殖のための基質消費率及び酢酸生成率を求めた。その際、嫌気性微生物にはClostridium thermoaceticumを使用し、反応温度は６０℃とし、二酸化炭素雰囲気中で、撹拌しながら９６時間発酵を行った。また、発酵系には、基質としてグルコース水溶液（１００ｇ／Ｌ）を５ｍｌ、Clostridium thermoaceticum培養液を５ｍｌ、緩衝液を２０ｍｌ、栄養液を２０ｍｌ投入した。
【００５２】
本実施例で使用した緩衝液の組成を下記表２に、栄養液の組成を下記表３に、発酵系におけるＣｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ量を下記表４に、それぞれ示す。
【００５３】
【表２】
0005675220.tif 000008
【００５４】
【表３】
0005675220.tif 000009
【００５５】
【表４】
0005675220.tif 000010
【００５６】
図４は横軸に発酵系のシステイン濃度をとり、縦軸に基質消費率をとって、システイン投入量と菌体増殖のための基質消費率との関係を示すグラフ図である。なお、図４に示す基質消費率は、投入した基質量に対する酢酸の生成に用いられた基質の割合であり、下記数式（１）により求められる。
【００５７】
【数１】
0005675220.tif 000011
【００５８】
また、図５は横軸に発酵系のシステイン濃度をとり、縦軸に酢酸生成率をとって、システイン投入量と酢酸生成率との関係を示すグラフ図である。なお、図５に示す酢酸生成率は、投入した基質量に対する酢酸の生成量であり、下記数式（２）により求められる。
【００５９】
【数２】
0005675220.tif 000012
【００６０】
図４，５に示すように、システイン投入量が本発明の範囲内である実施例１，２では、菌体増殖に使用される基質量を低減し、酢酸の生成率を高めることができた。これに対して、システイン投入量が多い比較例２〜４では、菌体増殖に使用される基質量が多く、酢酸生成率が低下した。一方、システインを投入していない比較例１では、菌体の育成に不可欠な硫黄分が欠乏しているため、菌体が繁殖できず、菌体増殖に使用される基質量は５％と低くなったが、酢酸生成率も５４％と他の条件に比べて著しく低下した。
【００６１】
以上の結果から、本発明によれば、基質から酢酸への変換効率が向上することが確認された。
【００６２】
＜第２実施例＞
次に、本発明の第２実施例として、ファーメンターを用いて酢酸発酵を行った。図６は本実施例で用いたファーメンターの構成を模式的に示す図である。図６に示すように、本実施例で使用したファーメンター１は、ｐＨセンサー２により発酵液３のｐＨを監視しながら、アルカリ水溶液出口４から水酸化ナトリムなどのアルカリ水溶液１１を適時注入することが可能となっている。
【００６３】
また、外部のガスボンベから直接、発酵容器５にガス１２を送り込むことが可能である。また、発酵容器５の最下部にガス出口６が設けられており、その直上域には、撹拌用の羽根７が設置されている。これにより、ファーメンター１は、ガス出口６から送り込まれたガス１２が、回転する撹拌用の羽根７によって発酵液３内をまんべんなく通過し、効率的にバブリングを行える構成となっている。
【００６４】
更に、このファーメンター１では、液面に浮上したガス１３は、冷却管８を通ってガス排出口から外部に排出されるため、発酵容器５内は、常にガスボンベからのガス１２のみで満たされた状態となり、絶対嫌気状態を作り出すことができる。更にまた、発酵容器５を覆うように帯状のヒーター９が取り付けられているため、温度センサー１０により適時温度調整を行うこともできる。
【００６５】
そして、本実施例においては、先ず、前述したファーメンター１を使用して、グルコース（１０ｇ／Ｌ）の酢酸発酵を行った。その際、嫌気性微生物にはClostridium thermoaceticumを使用し、反応温度は６０℃とし、二酸化炭素雰囲気中で、撹拌しながら発酵を行った。また、緩衝液は使用せず、５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を適時添加することにより、液のｐＨを７．０に保った。また、栄養液は、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ量を０．１０ｇとした以外は、上記表３と同様の組成とした。
【００６６】
図７は横軸に発酵時間をとり、縦軸に酢酸生成率及び酢酸生成モル比（酢酸／グルコース）をとって、酢酸発酵状態を示すグラフ図である。図７に示すように、緩衝液を使用せずに、ファーメンターを使用した酢酸発酵では、１ｍｏｌのグルコースから２．９ｍｏｌの酢酸が得られ、酢酸生成率９６％を達成することができた。
【００６７】
次に、緩衝液を使用した従来の発酵方法と、ファーメンターを使用した発酵方法とで、酢酸生成量を比較した。その際、嫌気性微生物には、Clostridium thermoaceticumとClostridium thermocellumとを併用し、基質は、ブナ木粉を、圧力は１０ＭＰａで一定にし、２３０℃で１５分間、その後２７０℃で１５分間処理した加圧熱水処理液を使用した。
【００６８】
図８は横軸に発酵時間をとり、縦軸に酢酸濃度をとって、緩衝液の添加有無と酢酸生成量との関係を示すグラフ図である。図８に示すように、緩衝液を使用せずに、ファーメンターを使用した酢酸発酵では、緩衝液を使用した従来の酢酸発酵に比べて、酢酸生成量が増加することが確認された。
【符号の説明】
【００６９】
１  ファーメンター
２  ｐＨセンサー
３  発酵液
４  アルカリ水溶液出口
５  発酵容器
６  ガス出口
７  羽根
８  冷却管
９  ヒーター
１０  温度センサー
１１  アルカリ水溶液
１２、１３  ガス
２０  エタノール製造装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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