(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板、前記基板上に配置された作用極と対極とを少なくとも含む電極系、及び、前記電極系上に配置された試薬層を備え、
前記試薬層が、乳酸オキシダーゼ、メディエータ、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を含み、
前記メディエータが、フェナジンメトサルフェート及び／又はその誘導体とルテニウム化合物とを含む、
乳酸センサ。
【請求項２】
前記試薬層が、さらにオリゴ糖及び多糖類からなる群から選択される糖を含む、請求項１記載の乳酸センサ。
【請求項３】
前記糖が、デキストランである、請求項２記載の乳酸センサ。
【請求項４】
前記試薬層が、さらに層状無機化合物及び／又は界面活性剤を含む、請求項１から３のいずれかに記載の乳酸センサ。
【請求項５】
前記メディエータが、ルテニウム化合物とフェナジンメトサルフェート若しくはその誘導体とである、請求項１から４のいずれかに記載の乳酸センサ。
【請求項６】
前記フェナジンメトサルフェートの誘導体が、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェートである、請求項１から５のいずれかに記載の乳酸センサ。
【請求項７】
乳酸オキシダーゼ、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を含む試薬と、試料とを接触させること、及び
前記試料中の乳酸と前記乳酸オキシダーゼとの反応を、メディエータを介して電気化学的に測定することを含み、
前記メディエータが、フェナジンメトサルフェート及び／又はその誘導体とルテニウム化合物とを含む、
乳酸濃度の測定方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の乳酸センサを用いて行う、請求項７記載の測定方法。
【請求項９】
前記接触後に前記乳酸センサの電極系に電圧を印加すること、前記印加時の応答電流値を測定すること、及び、前記応答電流値に基づいて前記試料中の乳酸濃度を算出することを含む、請求項８記載の測定方法。
【請求項１０】
作用極と対極とを少なくとも含む電極系が配置された絶縁性基板の前記電極系上に、乳酸オキシダーゼ、メディエータ、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を含む試薬層を形成することを含み、
前記メディエータが、フェナジンメトサルフェート及び／又はその誘導体とルテニウム化合物とを含む、
乳酸センサの製造方法。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載の乳酸センサと、
前記乳酸センサの電極系に電圧を印加する手段と、
電極系における電流を測定するための手段とを含む、
試料中の乳酸濃度を測定するための乳酸濃度測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、乳酸オキシダーゼ及びメディエータを含む乳酸センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、運動後に体内に生成される疲労物質であることが知られている。このため、乳酸センサは、トレーニング効果やトレーニング状態を把握するために、フィールドや現場において広く使用されており、また簡易に検出・計測できることが求められている。しかしながら、乳酸センサに用いられる乳酸オキシダーゼは、グルコースセンサに用いられるグルコースオキシダーゼと比較してユニットあたりの単価が高いことから、センサの単価が高くなるという問題があった。このため、この問題を解決するために、例えば、反応層に乳酸オキシダーゼの活性を向上させるためにリン酸塩を含む乳酸センサ（特許文献１）等が提案されている。
【０００３】
また、乳酸センサなどのバイオセンサの製造方法としては、例えば、電極を有する基板上表面に、少なくともメディエータ、界面活性剤、緩衝剤及び層状無機化合物を含む無機ゲル層を形成する工程を含む方法がある（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３４９８１０５号公報
【特許文献２】特許第４０８８３１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したとおり、乳酸は疲労度のマーカーとなるため、乳酸センサはスポーツ分野のトレーニング等において広く使用されている。一方、トレーニングの場合、疲労度を速やかに計測して疲労度を確認し、次の運動負荷を決定する必要がある。このため、短時間で精度よく計測可能な乳酸センサが求められている。しかしながら、従来の乳酸センサでは酵素反応速度が遅いため、測定に要する時間が長く、更なる測定時間の短縮が求められている。
【０００６】
そこで、本開示は、一態様として、短時間で精度よく乳酸濃度を測定可能な乳酸センサを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一態様として、絶縁性基板、前記基板上に配置された作用極と対極とを少なくとも含む電極系、及び、前記電極系上に配置された試薬層を備え、前記試薬層が、乳酸オキシダーゼ、メディエータ、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（以下、「ＡＣＥＳ」ともいう）を含む、乳酸センサ（以下、「本開示の乳酸センサ」ともいう）に関する。
【０００８】
本開示は、その他の態様として、乳酸オキシダーゼ、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を含む試薬と、試料とを接触させること、及び前記試料中の乳酸と前記乳酸オキシダーゼとの反応を、メディエータを介して電気化学的に測定することを含む、乳酸濃度の測定方法（以下、「本開示の乳酸濃度測定方法」ともいう）に関する。
【０００９】
本開示は、さらにその他の態様として、作用極と対極とを少なくとも含む電極系が配置された絶縁性基板の前記電極系上に、乳酸オキシダーゼ、メディエータ、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を含む試薬層を形成することを含む、乳酸センサの製造方法（以下、「本開示の製造方法」ともいう）に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、一態様として、短時間で精度よく乳酸濃度を測定可能な乳酸センサを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、乳酸センサの製造方法の一例を説明する模式図である。
【図２】図２は、乳酸センサの構成の一例を説明する模式図であって、図１Ｆに示す乳酸センサのI-I断面図である。
【図３】図３は、実施例１及び比較例１〜６の乳酸センサで試料を測定した時に検出された電流値を示すグラフの一例である。
【図４】図４は、実施例１及び２の乳酸センサで試料を測定したときに検出された電流値と試料の乳酸濃度との関係を示すグラフの一例である。
【図５】図５は、実施例２及び比較例７の乳酸センサで試料を測定したときに検出された電流値と試料の乳酸濃度との関係を示すグラフの一例である。
【図６】図６は、実施例４で作製した乳酸センサで試料を測定したときに検出された電流値と試料の乳酸濃度との関係を示すグラフの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、一態様として、従来の乳酸センサでは、酵素反応速度が遅いことから、特に試料中の乳酸濃度が高い場合、短時間の測定では十分な感度が得られない、という知見に基づく。また、本開示は、一態様として、緩衝剤としてＡＣＥＳを使用すれば、乳酸オキシダーゼの酵素反応速度を向上させることができることから、反応に要する時間を短縮することができ、好ましくは試料中の乳酸濃度が高い場合であっても短時間で精度よく乳酸濃度を測定できる、という知見に基づく。
【００１３】
緩衝剤としてＡＣＥＳを使用することにより、反応に要する時間を短縮することができ、短時間で乳酸濃度を測定できるメカニズムの詳細は不明であるが、以下のように推定される。すなわち、ＡＣＥＳが乳酸オキシダーゼの活性を向上させることによって、試料中の乳酸と乳酸オキシダーゼとの反応速度が向上される。このため、酵素反応開始から終了までの時間が短縮され反応に要する時間を短縮することができ、また、試料中の乳酸濃度が高い場合であっても、短時間で精度よく乳酸濃度を測定できるようになると考えられる。但し、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。なお、本明細書において、「試料中の乳酸濃度が高い場合」とは、一又は複数の実施形態において、試料中の乳酸濃度が、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、又は２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上のことをいう。
【００１４】
［試料］
本開示の乳酸センサ及び本開示の乳酸濃度測定方法における測定対象試料は、一又は複数の実施形態において、血液、体液、尿などの生体試料であってもよく、その他の液体試料であってもよい。
【００１５】
[乳酸センサ]
本開示の乳酸センサは、絶縁性基板、作用極と対極とを少なくとも含む電極系、及び試薬層を備え、前記電極系は前記基板上に配置され、前記試薬層は前記電極系上に配置された構成である。
【００１６】
電極系は、一又は複数の実施形態において、少なくとも作用極と対極とを含んでいればよく、その他に参照極等を含んでいてもよい。前記電極は、従来又は今後開発される乳酸センサやグルコースセンサ等のバイオセンサで使用されるものが使用でき、特に制限されるものではない。作用極及び対極としては、特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、カーボン電極を用いてもよいし、金属電極を用いてもよい。カーボンとしては、一又は複数の実施形態において、パイロロティックグラファイトカーボン、グラッシーカーボン、カーボンペースト、及びペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）等が挙げられる。金属としては、一又は複数の実施形態において、白金、金、銀、ニッケル、及びパラジウム等が挙げられる。参照極は、特に制限されるものではなく、電気化学実験において一般的に使用されているものを適用することができ、一又は複数の実施形態において、飽和カロメル電極、銀−塩化銀電極等が挙げられる。電極系は、形成する電極の材質に応じて従来公知の方法により形成することができ、特に限定されるものではないが、一又は複数の実施形態において、フォトリソグラフィ技術、蒸着法、スパッタ法、及び印刷技術等により形成することができる。印刷技術としては、一又は複数の実施形態において、スクリーン印刷、グラビア印刷、及びフレキソ印刷等が挙げられる。
【００１７】
絶縁性基板の材質は、従来又は今後開発されるバイオセンサで使用されるものが使用でき、特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、シリコン、ガラス、ガラスエポキシ、セラミック、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、及びポリイミド等が挙げられる。
【００１８】
本開示の乳酸センサにおいて、試薬層は、乳酸オキシダーゼ、メディエータ、及びＡＣＥＳを含む。
【００１９】
乳酸オキシダーゼは、特に制限されるものではなく、従来又は今後開発される乳酸センサに使用される公知の乳酸オキシダーゼや市販の乳酸オキシダーゼ等が使用できる。乳酸オキシダーゼの乳酸センサ１枚あたりの含有量は、一又は複数の実施形態において、従来又は今後開発される乳酸センサに配置されている量であってよく、生産性（コスト）及び検出感度の維持の観点から、１．０〜３．０Ｕ、１．６〜２．４Ｕ、又は１．８〜２．２Ｕが好ましい。なお、本明細書においてＵは酵素単位であって、１Ｕは、乳酸オキシダーゼが１μｍｏｌの乳酸を３０℃１分で酸化する酵素量である。
【００２０】
本明細書において「乳酸センサ１枚あたりの含有量」とは、一又は複数の実施形態において、作用極と対極とを少なくとも含む電極系を１つ有する乳酸センサに使用される量をいい、さらなる一又は複数の実施形態において、１つの電極系上に配置された試薬層に含まれる量をいい、さらなる一又は複数の実施形態において、試料が添加された時（使用時）に試薬層が試料によって溶解することにより形成される反応系に含まれるように配置される量をいう。また、本明細書において「乳酸センサ１枚あたりの含有量」というときの乳酸センサは、一又は複数の実施形態において、血液試料に対して使用される通常のサイズのものであって、添加される血液試料が、例えば０．１〜５．０μｌ、又は０．３〜１．０μｌのものをいう。また、乳酸センサは、さらなる一又は複数の実施形態において、血液試料が試薬層と接触して形成する反応系の容量が、例えば０．１〜５．０μｌ、又は０．３〜１．０μｌのものをいう。したがって、「乳酸センサ１枚あたりの含有量」は、一又は複数の実施形態において、電極系の数、及び／又は、試料若しくは反応系の容量に応じ、本明細書に開示する範囲を適宜調節できる。
【００２１】
ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｃ4Ｈ10Ｎ2Ｏ4Ｓ）は、グッド緩衝剤の一つであり、市販のものが使用できる。ＡＣＥＳの乳酸センサ１枚あたりの含有量は、一又は複数の実施形態において、測定時間の短縮及び測定感度の向上の点から、例えば、０．１〜１０重量％、又は０．５〜５．０重量％である。本開示の乳酸センサにおいて、ＡＣＥＳ以外の緩衝剤を含んでいてもよい。一又は複数の実施形態において、測定時間の短縮及び測定感度の向上の点から、全緩衝剤におけるＡＣＥＳの割合が５０重量％以上、８０重量％以上、又は実質的にＡＣＥＳからなることが好ましい。
【００２２】
メディエータとしては、一又は複数の実施形態において、フェリシアン化カリウム、シトクロムＣ、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、銅錯体、ルテニウム化合物、及びフェナジンメトサルフェート及びその誘導体等が挙げられ、これらは単独で使用してもよいし、２種以上で併用してもよい。これらの中でも、測定時間の短縮及び測定感度の向上の点から、ルテニウム化合物、又はルテニウム化合物とフェナジンメトサルフェート若しくはその誘導体との併用が好ましい。
【００２３】
ルテニウム化合物としては、バイオセンサにメディエータとして使用されてきた又は今後使用されるルテニウム化合物を使用できる。ルテニウム化合物は、一又は複数の実施形態において、酸化型のルテニウム錯体として前記反応系に存在し得るものであることが好ましい。前記ルテニウム錯体としては、一又は複数の実施形態において、メディエータ（電子伝達体）として機能すればその配位子の種類は特に限定されないが、酸化型のものが下記化学式で示されるものを使用することが好ましい。
[Ru(NH3)5X]n+
前記化学式におけるＸとしては、一又は複数の実施形態において、ＮＨ3、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、又はＨ2Ｏ等が挙げられ、これらの中でもＮＨ3又はハロゲンイオン（例えば、Ｃｌ-、Ｆ-、Ｂｒ-、I-）が好ましい。前記化学式におけるｎ＋は、酸化型ルテニウム(III)錯体の価数を表し、Ｘの種類により適宜決定される。
【００２４】
ルテニウム化合物の乳酸センサ１枚あたりの含有量は、一又は複数の実施形態において、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、０．１〜１００μｇ、１〜８０μｇ、又は１０〜５０μｇが好ましい。
【００２５】
フェナジンメトサルフェート及びその誘導体（以下、「ＰＭＳ」ともいう）としては、一又は複数の実施形態において、フェナジンメトサルフェート及び１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１−メトキシＰＭＳ）等が挙げられ、試薬安定性の観点から、１−メトキシＰＭＳが好ましい。
【００２６】
ＰＭＳの乳酸センサ１枚あたりの含有量は、一又は複数の実施形態において、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、１〜２０００ｐｍｏｌ、１０〜１０００ｐｍｏｌ、又は１００〜５００ｐｍｏｌが好ましい。
【００２７】
試薬層は、一又は複数の実施形態において、さらなる測定感度向上の観点から、多糖類及び／又はオリゴ糖（以下、単に「糖」ともいう）を含むことが好ましい。本明細書において「多糖類」とは、単糖が１０個以上結合したものをいい、一又は複数の実施形態において、デキストラン、シクロデキストラン、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、セルロース、及びアガロース等が挙げられる。本明細書において「オリゴ糖」とは、単糖が１０個未満結合したものをいい、一又は複数の実施形態において、単糖が２個結合した二糖類、単糖が３個結合した三糖類、及び単糖が４個結合した四糖類等が挙げられる。２糖類としては、一又は複数の実施形態において、マルトース、及びスクロース等が挙げられる。糖としては、中でも、低温での測定における測定感度の向上の観点から、デキストラン、及びマルトースが好ましく、低温での測定及び試料中の乳酸濃度が高い場合における測定感度の向上の観点から、デキストランがより好ましい。試薬層がデキストランを含む形態の乳酸センサであれば、試料中の乳酸濃度が高い場合や、測定時の雰囲気温度が低温である場合に測定感度をさらに向上できることから、ウィンタースポーツ等の分野のトレーニング等において有用である。デキストランは、特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、増粘剤として使用されている公知のデキストランが使用できる。デキストランの分子量は特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、１００〜２００００であり、溶解性の点から、１０００〜２００００が好ましい。デキストランの乳酸センサ１枚あたりの含有量は、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、０．１〜１０μｇ、０．５〜５．０μｇ、又は１．０〜３μｇが好ましい。なお、本明細書において「低温での測定」とは、一又は複数の実施形態において、乳酸センサを用いて測定を行う際の雰囲気温度の上限が、１０℃以下、又は５℃以下、その下限が、−５℃以上、０℃以上、又は１℃以上のことをいう。
【００２８】
前記試薬層には、測定感度向上の観点から、一又は複数の実施形態において、層状無機化合物、及び／又は界面活性剤等がさらに含有されてもよい。層状無機化合物としては、従来又は今後開発されるバイオセンサに使用されているものが使用でき特に制限されるものではないが、同様の観点から、イオン交換能を有する膨潤性粘土鉱物が好ましい。膨潤性粘土鉱物の中でも、同様の観点から、ベントナイト、スメクタイト、バーミキュライト、合成フッ素雲母等が好ましく、より好ましくは合成ヘクトライトや合成サポナイト等の合成スメクタイト；合成フッ素雲母等の膨潤性合成雲母；Ｎａ型雲母等の合成雲母（天然の雲母は、通常、非膨潤性の粘土鉱物である）等である。これらの層状無機化合物は、単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２９】
前記界面活性剤としては、従来又は今後開発されるバイオセンサに使用されているものが使用でき、特に制限されないが、適宜、非イオン性、アニオン性、カチオン性、両性の界面活性剤を使用し得る。これらの中でも、測定感度向上の観点からは、両性界面活性剤が好ましい。両性界面活性剤としては、一又は複数の実施形態において、カルボキシペタイン、スルホペタイン、及びホスホペタイン等が挙げられ、同様の観点からスルホペタインが好ましい。スルホペタインとしては、一又は複数の実施形態において、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル］）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、及びアルキルヒドロキシスルホペタイン等が挙げられ、同様の点からＣＨＡＰＳが好ましい。
【００３０】
前記試薬層は、全ての試薬が含まれる単層構造であってもよく、多層の積層構造であってもよい。一又は複数の実施形態において、メディエータを含む第１の試薬層を形成し、その上に乳酸オキシダーゼ、及びＡＣＥＳを含む第２の試薬層を形成することによって形成される構成の試薬層であってもよい。また、メディエータがルテニウム化合物とＰＭＳとを併用する場合、一又は複数の実施形態において、ルテニウム化合物を含む第１の試薬層を形成し、その上に乳酸オキシダーゼ、ＡＣＥＳ及びＰＭＳを含む第２の試薬層を形成することによって形成される構成の試薬層であってもよい。試薬層が多糖類等の糖を含む場合は、第２の試薬層が多糖類等の糖を含むことが好ましい。乳酸センサにおける試薬層は、保存安定性の観点から、電極系上に乾燥状態で配置されることが好ましい。
【００３１】
本開示の乳酸センサの大きさは、特に制限されるものではなく、供給する試料の量等により適宜設定でき、一又は複数の実施形態において、全体長さ５〜５０ｍｍ、全体幅１〜５０ｍｍ、最大厚み２０００〜５００μｍ、最小厚み５０〜５００μｍであってもよい。なお、「長さ」とは乳酸センサの長手方向の長さをいい、「幅」とは乳酸センサの幅方向の長さをいう。
【００３２】
本開示の乳酸センサは、一又は複数の実施形態において、ある一定の時間で所定の電圧を加える手段、乳酸センサから伝達される電気信号を測定する手段、前記電気信号を測定対象物濃度に演算する演算手段等の種々の手段を備えた測定機器と組み合わせて使用できる。
【００３３】
［乳酸センサの製造方法］
本開示は、さらにその他の態様として、作用極と対極とを少なくとも含む電極系が配置された絶縁性基板の前記電極系上に、乳酸オキシダーゼ、メディエータ、及びＡＣＥＳを含む試薬層を形成することを含む、乳酸センサの製造方法に関する。本開示の製造方法によれば、本開示の乳酸センサを製造することができる。乳酸オキシダーゼ、メディエータ、及びＡＣＥＳとしては本開示の乳酸センサと同様のものが使用できる。
【００３４】
一又は複数の実施形態において、試薬層は、試薬液を電極系上に配置することにより形成できる。試薬液におけるＡＣＥＳの含有量は、一又は複数の実施形態において、測定時間の短縮及び測定感度の向上の点から、例えば、０．１〜１０重量％、又は０．５〜５．０重量％である。試薬液における乳酸オキシダーゼの含有量は、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、例えば、０．５〜１０ｋＵ／ｍＬ、又は１〜５Ｕ／ｍＬである。
【００３５】
本開示の製造方法のその他の実施形態において、メディエータは、測定時間の短縮及び測定感度の向上の点から、ルテニウム化合物、又はルテニウム化合物とフェナジンメトサルフェート若しくはその誘導体との併用が好ましい。試薬液におけるルテニウム化合物の含有量は、一又は複数の実施形態において、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、例えば、１．０〜１５重量％、又は５．０〜１０重量％である。試薬液におけるＰＭＳの含有量は、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、例えば、１０〜１０００ｐｍｏｌ、又は１００〜５００ｐｍｏｌである。
【００３６】
本開示の製造方法のその他の実施形態において、前記試薬液は、測定感度が向上された乳酸センサを製造する観点から、多糖類等の糖を含むことが好ましく、低温での測定及び試料中の乳酸濃度が高い場合における測定感度が向上された乳酸センサを製造する観点から、デキストランを含むことがより好ましい。デキストランとしては上述の本開示の乳酸センサと同様のものが使用できる。試薬液におけるデキストランの含有量は、一又は複数の実施形態において、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、例えば、０．０１〜１重量％、又は０．０５〜０．１重量％である。
【００３７】
本開示の製造方法のその他の実施形態において、前記試薬が、さらに層状無機化合物及び又は界面活性剤を含んでいてもよい。層状無機化合物及び界面活性剤としては、一又は複数の実施形態において、上述の本開示の乳酸センサと同様のものが使用できる。
【００３８】
本開示の製造方法のその他の実施形態において、前記試薬層の形成は、例えば、ルテニウム化合物を含む第１の試薬液を前記電極系上に配置して第１の試薬層を形成すること、及び前記第１の試薬層上に、乳酸オキシダーゼ、ＰＭＳ、及びＡＣＥＳを含む第２の試薬液を配置して第２の試薬層を形成することにより行ってもよい。この場合、第１の試薬液がさらに層状無機化合物及び又は界面活性剤を含み、前記第２の試薬液がさらに多糖類等の糖を含むことが好ましい。
【００３９】
第１の試薬液におけるルテニウム化合物の含有量は、一又は複数の実施形態において、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、例えば、０．０５〜１．０重量％、又は０．１〜０．５重量％である。第２の試薬液におけるＡＣＥＳの含有量は、一又は複数の実施形態において、測定時間の短縮及び測定感度の向上の点から、例えば、０．１〜１０重量％、又は０．５〜５．０重量％である。第２の試薬液におけるＰＭＳの含有量は、一又は複数の実施形態において、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、例えば、１０〜１０００ｐｍｏｌ、又は１００〜５００ｐｍｏｌである。第２の試薬液における乳酸オキシダーゼの含有量は、一又は複数の実施形態において、生産性（コスト）及び検出感度の観点から、例えば、０．５〜１０ｋＵ／ｍＬ、又は１〜５Ｕ／ｍＬである。
【００４０】
[乳酸濃度の測定方法]
本開示は、その他の態様において、乳酸オキシダーゼ、及びＡＣＥＳを含む試薬と、試料とを接触させること、及び前記試料中の乳酸と前記乳酸オキシダーゼとの反応を、メディエータを介して電気化学的に測定することを含む乳酸濃度の測定方法に関する。本開示の乳酸濃度測定方法によれば、反応に要する時間を短縮することができるため短時間での測定が可能となり、好ましくは試料中の乳酸濃度が高い場合であっても、短時間で精度よく乳酸濃度を測定できる。本開示の乳酸濃度測定方法の一実施形態としては、本開示の乳酸センサを用いた乳酸濃度測定方法が挙げられる。
【００４１】
本明細書において「電気化学的に測定する」とは、電気化学的な測定手法を適用する測定することをいい、一又は複数の実施形態において、電流測定法、電位差測定法、電量分析法等が挙げられ、中でも電流測定法により、還元された電子伝達物質を印加により酸化される際に生ずる電流値を測定する方法が特に好ましい。
【００４２】
本開示の乳酸濃度測定方法は、その他の実施形態において、前記試薬との接触後に前記電極系に電圧を印加すること、前記印加時に放出される応答電流値を測定すること、及び、前記応答電流値に基づいて前記試料中の乳酸濃度を算出することを含んでもよい。印加する電圧としては特に制限されるものではないが、一又は複数の実施形態において、１０〜７００ｍＶ、５０〜５００ｍＶ、又は１００〜４００ｍＶが好ましい。
【００４３】
本開示の乳酸濃度測定方法は、その他の実施形態において、前記試薬との接触後所定の時間非印加の状態で保持した後、電極系に電圧を印加してもよいし、前記試薬との接触と同時に電極系に電圧を印加してもよい。非印加の状態で保持する時間としては、一又は複数の実施形態において、０秒を超え３０秒以下、又は０秒を超え１０秒以下である。
【００４４】
本開示の乳酸濃度測定方法における、電極系への電圧の印加、応答電流値の測定、及び、乳酸濃度の算出は、従来又は今後開発される乳酸濃度測定装置等を用いて適宜行うことができる。
【００４５】
［乳酸濃度測定システム］
本開示は、さらにその他の態様として、本開示の乳酸センサと、前記乳酸センサの電極系に電圧を印加する手段と、電極系における電流を測定するための手段とを含む、試料中の乳酸濃度を測定するための乳酸濃度測定システムに関する。本開示の乳酸濃度測定システムによれば、本開示の乳酸センサを用いて試料中の乳酸濃度を測定するため、反応に要する時間を短縮することができるため短時間での測定が可能となる。本開示の乳酸濃度測定システムは、一又は複数の実施形態において、試料中の乳酸濃度が高い場合や測定時の雰囲気温度が低温であっても、短時間で精度よく乳酸濃度を測定できる。
【００４６】
印加手段としては、乳酸センサの電極系と導通し、電圧を印加可能であれば特に制限されるものではなく、公知の印加手段が使用できる。印加手段としては、一又は複数の実施形態において、乳酸センサの電極系と接触可能な接触子、及び直流電源等の電源等を含みうる。
【００４７】
測定手段は、電圧印加時に生じた電極系における電流を測定するためのものであって、一又は複数の実施形態において、乳酸センサの試薬層のメディエータから放出された電子の量に相関する応答電流値を測定可能なものであればよく、従来又は今後開発される乳酸センサで使用されているものが使用できる。
【００４８】
本開示の乳酸センサ及び製造方法の一実施形態について、図１及び２に基づいて説明する。図１Ａ〜Ｆは、本実施形態の乳酸センサを製造する一連の工程を示した斜視図である。また、図２は、図１Ｆに示す乳酸センサのI-I方向断面図である。なお、図１Ａ〜Ｆ及び図２において、同一箇所には同一符号を付している。但し、以下の説明は一例に過ぎず、本開示はこれに限定されないことはいうまでもない。
【００４９】
図１Ｆ及び図２に示すように、乳酸センサは、絶縁性基板１１、リード部１２ａを有する作用極１２とリード部１３ａを有する対極１３とから構成された電極系、絶縁層１４、第１の試薬層１６、第２の試薬層１７、開口部を有するスペーサー１８及び貫通孔２０を有するカバー１９を備えている。電極系は絶縁性基板１１上に形成されている。絶縁層１４は、電極系の上部であって、電極系のリード部１２ａ，１３ｂ及び後述する第１の試薬層１６が形成される部分を除く絶縁性基板１１に形成されている。第１の試薬層１６及び第２の試薬層１７は、作用極１２及び対極１３上であって、絶縁層１４が形成されていない部分にこの順序で形成されている。この第１の試薬層１６及び第２の試薬層１７が形成された部分が検出部１５となる。スペーサー１８は、絶縁層１４上に配置されており、第２の試薬層１７及びカバー１９の貫通孔２０に対応する箇所が開口部となっている。カバー１９は、スペーサー１８上に配置されている。図１Ｂに示すように、乳酸センサにおいて、スペーサー１８の開口部の空間部分であり、かつ、第２の試薬層１７及び絶縁層１４とカバー１９とに挟まれた空間部分が、キャピラリー構造の試料供給部２１となり、カバー１９の貫通孔２０が、試料を毛管現象により吸入するための空気孔となる。
【００５０】
絶縁層１４の材質としては、一又は複数の実施形態において、絶縁性樹脂が挙げられる。絶縁性樹脂としては、一又は複数の実施形態において、ポリエステル、プチラール樹脂、及びフェノール樹脂等が挙げられる。スペーサー１８の材質としては、一又は複数の実施形態において、樹脂フィルムやテープ等が挙げられる。カバー１９の材質としては、特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、各種プラスチック等が使用でき、好ましくは透明樹脂であり、より好ましくはＰＥＴである。
【００５１】
第１の試薬層１６及び第２の試薬層１７に含有させる試薬の構成は、特に限定されるものではないが、一又は複数の実施形態において、第１の試薬層１６がルテニウム化合物及び層状無機化合物を含み、第２の試薬層１７が乳酸オキシダーゼ、ＰＭＳ、界面活性剤、及びＡＣＥＳを含む構成であってもよい。
【００５２】
本実施形態の乳酸センサは、例えば、以下のようにして製造することができる。
【００５３】
まず、図１Ａに示すように、リード部１２ａを有する作用極１２とリード部１３ａを有する対極１３とからなる電極系が形成された絶縁性基板１１を準備する。電極系が形成された市販の絶縁性基板を使用してもよいし、絶縁性基板１１に電極系を形成してもよい。絶縁性基板の材質、電極の材質及び電極の形成方法は上述の通りである。
【００５４】
つぎに、図１Ｂに示すように、電極系が形成された絶縁基板１１上に絶縁層１４を形成する。絶縁層１４は、一又は複数の実施形態において、絶縁性樹脂を溶媒に溶解した絶縁ペーストを絶縁性基板１１に印刷し、ついで加熱又は紫外線処理を行うことにより形成できる。溶媒としては、一又は複数の実施形態において、カルビトールアセテート、二塩基酸エステル系混合溶剤（ＤＢＥソルベント）等が挙げられる。
【００５５】
つぎに、図１Ｃ及びＤに示すように、絶縁層１４が形成されていない検出部１５の電極系上及び絶縁性基板１１上に第１の試薬層１６及び第２の試薬層１７をこの順序で形成する。第１の試薬層１６及び第２の試薬層１７は、それぞれの層に含有させる試薬を含む試薬液を分注し、乾燥させることによって形成することができる。試薬液の濃度は上述の通りである。
【００５６】
つぎに、図１Ｅ及びＦに示すように、絶縁層１４上にスペーサー１８及びカバー１９をこの順序で配置する。
【００５７】
本実施形態における乳酸センサを用いた乳酸の測定方法の一例について説明する。但し、以下の説明は一例に過ぎず、本開示はこれに限定されないことはいうまでもない。
【００５８】
まず、全血試料を乳酸センサの試料供給部２１の一端に接触させる。この試料供給部２１は前述のようにキャピラリー構造となっており、その他端に対応するカバー１９の開口部２０が空気孔となることから、毛管現象によって前記試料が乳酸センサの内部に吸引される。吸引された試料は、第２の試薬層１７に浸透し、第２の試薬層１７中の乳酸オキシダーゼ及びＡＣＥＳ等を溶解して、さらに第２の試薬層１７の下層である第１の試薬層１６表面に達する。そして、表面に達した試料中の乳酸と乳酸オキシダーゼとＰＭＳとルテニウム化合物とがＡＣＥＳ存在下で反応する。具体的には、測定対象物である乳酸は乳酸オキシダーゼにより酸化され、その酸化反応により移動した電子がＰＭＳを介してルテニウム化合物に伝達され、還元型ルテニウム(II)錯体が形成される。そして、還元された還元型ルテニウム(II)錯体と第１の試薬層１６の下に位置する電極系との間で電子授受が行われ、これによって乳酸濃度が測定されうる。
【００５９】
以下に、実施例及び比較例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００６０】
［実施例１］
以下に示すようにして、図１に示す乳酸センサと同様の構造の実施例１の乳酸センサを作製した。
【００６１】
まず、乳酸センサの絶縁性基板１１として、ＰＥＴ製基板（長さ５０ｍｍ、幅６ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、スクリーン印刷により、リード部１２ａ，１３ａをそれぞれ有する作用極１２及び対極１３からなるカーボン電極系を形成した。
【００６２】
つぎに、以下に示すようにして電極系上に絶縁層１４を形成した。まず、絶縁性樹脂ポリエステルを濃度７５重量％になるように溶媒カルビトールアセテートに溶解させて絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極系上にスクリーン印刷した。印刷条件は、３００メッシュスクリーン、スキージ圧４０ｋｇであり、印刷する量は、電極面積１ｃｍ2当たり０．００２ｍＬとした。なお、検出部１５上と、リード部１２ａ、１３ａ上には、スクリーン印刷を行わなかった。そして、絶縁性ペーストを９０℃で６０分間加熱処理することによって絶縁層１４を形成した。
【００６３】
続いて、絶縁層１４を形成しなかった検出部１５に、以下に示すようにして第１の試薬層１６を形成した。まず、合成スメクタイト（商品名「ルーセンタイトＳＷＮ」、コープケミカル社製）０．３重量％、ルテニウム化合物（［Ｒｕ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3、同仁化学研究所社製）６．０重量％、重量％、酢酸ナトリウム、及びコハク酸を含む第１の試薬液（ｐＨ７．５）を調製した。この第１の試薬液１．０μＬを、検出部１５に分注した。検出部１５の表面積は約０．１ｃｍ2であり、検出部１５における作用極１２及び対極１３の表面積は約０．１２ｃｍ2であった。そして、これを３０℃で乾燥させて、第１の試薬層１６を形成した。
【００６４】
さらに、第１の試薬層１６の上に、第２の試薬層１７を形成した。まず、乳酸オキシダーゼ（商品名「LCO301」、東洋紡社製）２Ｕ、１−メトキシＰＭＳ（同仁化学研究所社製）２５重量％、ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）及び界面活性剤を含む第２の試薬液を調製した。この第２の試薬液１．０μＬを第１の試薬層１６の上に分注して、３０℃で乾燥させて第２の試薬層１７を形成した。
【００６５】
最後に、開口部を有するスペーサー１８を絶縁層１４上に配置し、さらに、スペーサー１８上に空気孔となる貫通孔２０を有するカバー１９を配置して実施例１の乳酸センサを作製した。カバー１９と絶縁層１４とに挟まれたスペーサー１８の開口部の空間を試料供給部２１とした。
【００６６】
［比較例１〜６］
比較例１〜６として、ＡＣＥＳに変えて下記表１に示す緩衝剤を使用した以外は実施例１と同様に乳酸センサを作製した。
【００６７】
実施例１及び比較例１から６の乳酸センサを用いて試料中の乳酸の測定を行った。試料としては２ｍｍｏｌ／Ｌ乳酸調合液を使用し、測定装置は乳酸測定治具を用いた。測定は、２５℃に設定した環境試験室内で、乳酸センサに試料を供給した後、検体検知後１０秒間は非印加とし、１０秒後から１５秒後までの５秒間２００ｍＶの電圧を印加することにより行った。その結果を表１及び図３のグラフに示す。
【００６８】
【表１】
0005684767.tif 000002
【００６９】
表１及び図３に示す通り、実施例１の乳酸センサは、比較例１から６の乳酸センサに比較して十分な応答電流値が検出された。また、実施例１の乳酸センサによれば、検体点着検知後５秒という極めて短い測定時間で測定できることが確認できた。
【００７０】
［実施例２］
第２の試薬液がデキストラン（分子量：５０００−１００００、商品名「デキストラン」、ナカライテスク社）０．５重量％を含む以外は、実施例１と同様に乳酸センサを作製した。実施例１及び２の乳酸センサを用い、試料としては乳酸濃度を調整した静脈全血（乳酸濃度：４，６，１０，１８，２４ｍｇ／ｄＬ）を使用し、測定温度条件を２５℃又は１０℃とした以外は、実施例１と同様に乳酸の測定を行った。その結果を図４に示す。図４Ａが測定温度条件２５℃のグラフであり、図４Ｂが測定温度条件１０℃のグラフである。図４Ａ及びＢにおいて四角のマーカーが実施例１の乳酸センサのグラフを示し、ひし形のマーカーが実施例２の乳酸センサのグラフ示す。
【００７１】
実施例１及び２のいずれの乳酸センサも、検体点着検知後５秒という極めて短い測定時間で測定できることが確認できた。また、図４Ａのグラフに示すように、デキストランを含む実施例２の乳酸センサによれば、乳酸濃度が高濃度（例えば、１０ｍｍｏ／Ｌを超える濃度、好ましくは１８ｍｍｏｌ／Ｌを超える濃度）であっても、短い反応時間（検体点着検知後１０秒）で、より精度よく測定できることが確認できた。また、図４Ｂのグラフに示すように、デキストランを含む実施例２の乳酸センサによれば、測定温度条件が１０℃と低温であっても、短い反応時間（検体点着検知後１０秒）で、より精度よく測定できることが確認できた。また、実施例２の乳酸センサを用い、測定温度条件を５℃又は０℃として同様の測定を行ったところ、１０℃の場合と同様に、短い反応時間（検体点着検知後１０秒）で、より精度よく測定できることが確認できた（データ示さず)。
【００７２】
［実施例３］
使用するデキストランの分子量を１００〜５００、１０００〜２０００、又は１００００〜２００００に変更した以外は、実施例２と同様に乳酸センサを作製し、それを用いて乳酸の測定を行った。その結果、分子量が５０００−１００００のデキストランを使用した実施例２の乳酸センサと同様の結果が得られた（データ示さず)。
【００７３】
［比較例７］
第２の試薬液におけるＡＣＥ緩衝液をリン酸水素２ナトリウム緩衝液とした以外は、実施例２と同様に乳酸センサを作製した。
【００７４】
実施例２及び比較例７の乳酸センサを用いて実施例２と同様に乳酸の測定を行った。その結果を図５のグラフに示す。
【００７５】
図５Ａが測定温度条件２５℃のグラフであり、図５Ｂが測定温度条件１０℃のグラフである。図５Ａ及びＢにおいて四角のマーカーが実施例２の乳酸センサのグラフを示し、ひし形のマーカーが比較例７の乳酸センサのグラフ示す。図５Ａ及びＢに示すように、緩衝剤としてリン酸水素２ナトリウムを使用した比較例７の乳酸センサは、測定温度条件が２５℃及び１０℃のいずれにおいても、十分な電流を検出できず、検体検知後１０秒間では反応時間が十分ではないという結果が得られた。これに対し、実施例２の乳酸センサは、測定温度条件が２５℃及び１０℃のいずれにおいても、十分な電流を検出され、短い反応時間で、かつ精度よく測定できることが確認できた。
【００７６】
［実施例４］
第２の試薬液がデキストラン（分子量：５００００〜７００００、商品名「デキストラン」、ナカライテスク社）０．５重量％、シクロデキストリン（分子量：１１３４．９８、商品名「β‐シクロデキストリン」、ナカライテスク社）０．５重量％、又はマルトース（分子量：３６０．３１、商品名「マルトース一水和物」、ナカライテスク社）０．５重量％を含む以外は、実施例１と同様に乳酸センサを作製した。得られた乳酸センサを用い、試料としては乳酸濃度を調整した静脈全血（乳酸濃度：１０，２０ｍｇ／ｄＬ）を使用し、測定温度条件を１０℃とした以外は、実施例１と同様に乳酸の測定を行った。リファレンスは、実施例１の乳酸センサと同様の構成の試作品で測定した。これらの結果を図６に示す。
【００７７】
図６において、ひし形のマーカーがデキストランを含む乳酸センサのグラフを示し、黒四角のマーカーがシクロデキストリンを含む乳酸センサのグラフを示し、三角のマーカーがマルトースを含む乳酸センサのグラフを示し、白抜きの四角のマーカーがリファレンスのグラフを示す。図６に示すように、いずれの乳酸センサも、低温の測定条件下であっても、乳酸濃度が低濃度（１０ｍｇ／ｄＬ）及び高濃度（２０ｍｇ／ｄＬ）のいずれも十分な電流が検出され、短い反応時間で、かつ精度よく測定できた。中でも、マルトースを含む乳酸センサについては、低濃度において優れた感度を示し、高い精度測定できた。デキストランを含む乳酸センサについては、低濃度及び高濃度のいずれにおいても優れた感度を示し、非常に高い精度で測定できた。
【００７８】
本開示は、医療分野、及び／又は、医療を目的としない医学、生化学、生物学等の学術分野で有用である。
【符号の説明】
【００７９】
１１              絶縁性基板
１２              作用極
１３              対極
１２ａ，１３ａ    リード部
１４              絶縁層
１５              検出部
１６              第１の試薬層
１７              第２の試薬層
１８              スペーサー
１９              カバー
２０              貫通孔
２１              試料供給口
【図１】
0005684767.tif 000003
【図２】
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【図３】
0005684767.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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