(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体をコードするポリヌクレオチドライブラリーの調製方法であって、
（ａ）各核酸配列が抗体重鎖可変領域の（ｉ）ＣＤＲ３ドメイン、（ｉｉ）フレームワーク３領域（ＦＲ３）の一部、および（ｉｉｉ）フレームワーク４領域（ＦＲ４）の全部をコードするが、抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１ドメイン又はＣＤＲ２ドメインをコードしない合成核酸配列の第一のライブラリーを調製すること、
（ｂ）各核酸配列が抗体軽鎖可変領域の（ｉ）ＣＤＲ３ドメイン、（ｉｉ）フレームワーク３領域（ＦＲ３）の一部、および（ｉｉｉ）フレームワーク４領域（ＦＲ４）の全部をコードするが、抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１ドメイン又はＣＤＲ２ドメインをコードしない合成核酸配列の第二のライブラリーを調製すること、
（ｃ）各核酸配列が、（ｉ）内因性生殖系列ＣＤＲ１ドメイン、（ｉｉ）内因性生殖系列ＣＤＲ２ドメイン、（ｉｉｉ）内因性生殖系列フレームワーク１領域（ＦＲ１）、（ｉｖ）内因性生殖系列フレームワーク２領域（ＦＲ２）、および（ｖ）内因性生殖系列フレームワーク３領域（ＦＲ３）の一部を含み、かつ、内因性ＣＤＲ３ドメインを欠くテンプレート重鎖可変領域ドメインをコードする合成核酸配列の第三のライブラリーを調製すること、
（ｄ）各核酸配列が、（ｉ）内因性生殖系列ＣＤＲ１ドメイン、（ｉｉ）内因性生殖系列ＣＤＲ２ドメイン、（ｉｉｉ）内因性生殖系列フレームワーク１領域（ＦＲ１）、（ｉｖ）内因性生殖系列フレームワーク２領域（ＦＲ２）、および（ｖ）内因性生殖系列フレームワーク３領域（ＦＲ３）の一部を含み、かつ、内因性ＣＤＲ３ドメインを欠くテンプレート軽鎖可変領域ドメインをコードする合成核酸配列の第四のライブラリーを調製すること、
（ｅ）各核酸配列が抗体定常領域テンプレートをコードする合成核酸配列の第五のライブラリーを調製すること、
（ｆ）（ａ）、（ｃ）及び（ｅ）のライブラリーの核酸配列を第一の発現ベクターに作動可能に連結して、該第三のライブラリーのＣＤＲ１ドメイン及びＣＤＲ２ドメイン並びに該第一のライブラリーのＣＤＲ３ドメインを含む抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを作製すること、
（ｇ）（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）のライブラリーの核酸配列を第二の発現ベクターに作動可能に連結して、該第四のライブラリーのＣＤＲ１ドメイン及びＣＤＲ２ドメイン並びに該第二のライブラリーのＣＤＲ３ドメインを含む抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを作製すること、並びに
（ｈ）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリー及び抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーで、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現するか、或いは発現するように誘導され得る宿主細胞を形質転換し、それによって抗体をコードするポリヌクレオチドのライブラリーが作製されること
を含む方法。
【請求項２】
テンプレート重鎖可変領域が、ＩＧＨＶ６−１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ１−２又はＩＧＨＶ１−６９である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
テンプレート軽鎖可変領域が、ＩＧＫＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ２−１１又はＩＧＬＶ３−２１である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞が真核細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
所望の特性を有するヒト抗体の製造方法であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により調製された抗体をコードするポリヌクレオチドのライブラリーで、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現するか、或いは発現するように誘導され得る宿主細胞を形質転換すること、
（ｂ）宿主細胞内でＡＩＤを発現させることによって、ＡＩＤが抗体をコードするポリヌクレオチドのライブラリーの１以上の変異を誘発し、該宿主細胞により１以上のヒト抗体が産生されること、並びに
（ｃ）所望の特性を有する１以上のヒト抗体を宿主細胞から同定すること
を含む方法。
【請求項６】
任意で、（ｄ）所望の特性を有するヒト抗体を発現する宿主細胞のクローン性コロニーを樹立し、培養することを含む、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２００７年３月１日に出願された米国仮出願第６０／９０４，６２２号（代理人整理番号３３５４７−７０６．１０１）、２００８年１月９日に出願された米国仮出願第６１／０２０，１２４号（代理人整理番号３３５４７−７０６．１０２）、２００７年２月２０日に出願された米国仮出願第６０／９０２，４１４号（代理人整理番号３３５４７−７０５．１０１）及び２００７年９月２８日に出願された米国仮出願第６０／９９５，９７０号（代理人整理番号３３５４７−７０８．１０１）の利益を主張し、それらの出願の各々は、参照することにより、全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリヌクレオチドシードライブラリーの生成方法、並びに、組換えタンパク質の新規変異体の生成におけるこれらのライブラリーの使用、より具体的には、組換えヒト抗体の集中的なライブラリーの生成及び標的遺伝子との親和性結合についてのスクリーニングのための、これらのライブラリーの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
組換えタンパク質治療の使用の市場は、ここ四半世紀で着実に増加してきた。２００５年には、上位２０の薬品のうち６つがタンパク質であり、全体としては、バイオ医薬品は、国家の歳入のおよそ４００億ドルを占め、そのうちおよそ１７０億ドルが、モノクローナル抗体の売り上げに基づくものであった。
【０００４】
モノクローナル抗体は、バイオ治療法の確固としたクラスであり、多大な将来性を有している。抗体スキャフォールドは臨床において耐用性良好であり、また、グリコシル化されたＩｇＧ分子は、好ましい薬物動態学特性及び薬力学特性を有している。認可された抗体医薬並びに開発中の抗体医薬の配列を比較すると、個々の医薬分子のいくつかは互いに非常に似ており、免疫グロブリンの可変領域に位置する数個のアミノ酸残基の変化による差異だけであることが実証される。
【０００５】
典型的なモノクローナル抗体は、天然に存在する抗体と同様、「Ｙ」型構造の外見を有し、抗原結合部分は、Ｙの短い両アームの末端に位置する。典型的な抗体分子は、４つのポリペプチド（一般式Ｈ２Ｌ２を形成する、２つの相等しいコピーの重（Ｈ）鎖及び２つの相等しいコピーの軽（Ｌ）鎖）から構成される。各々の重鎖は、１つのＮ末端の可変（ＶＨ）領域及び３つのＣ末端の定常（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）領域を含み、各々の軽鎖は、１つのＮ末端の可変（ＶＬ）領域及び１つのＣ末端の定常（ＣＬ）領域をそれぞれ含むことが知られている。種々の可変及び定常領域は、重鎖又は軽鎖のいずれであっても、ほぼ同じ長さ（領域当たりおよそ１１０アミノ残基）である。各々の軽鎖は、ジスルフィド結合によって重鎖に連結されており、２つの重鎖は、互いにジスルフィド結合によって連結されている。各々の重鎖は、その一端に可変ドメインを有し、それに続いて多数の定常ドメインを有し、また、各々の軽鎖は、その一端に可変ドメインを有し、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと揃って並んでいる。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の１つ目の定常ドメインと揃って並んでいる。重鎖の残りの定常ドメインは、互いに揃って並んでいる。軽鎖及び重鎖の定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しない。
【０００６】
抗体は、典型的には、その定常領域の構造に基づいて、異なるクラスに分けられる。例えばヒトでは、５つの主要な構造的なクラス、免疫グロブリンＧもしくはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥが同定され得る。各々のクラスは、免疫系における免疫グロブリンの機能に関する物理的及び生物学的な特徴に基づいて区別されている。ＩｇＧは、生物学的振る舞いの差異をもたらす、重鎖のアミノ酸組成及びジスルフィド結合における相違に基づいて、４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に更に分類することができる。クラス及びサブクラスについての説明は、”Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、Ｉｖａｎ  Ｒｏｉｔｔ著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓに示されている。
【０００７】
軽鎖及び重鎖の各ペアの可変ドメインが、抗原結合部位を形成する。それらは、同様の一般構造を有し、配列が比較的保存された４つの領域のフレームワークを含む各ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結されている。４つのフレームワーク領域（ＦＷ又はＦＲ）は、主としてベータシートのコンフォメーションをとり、またＣＤＲはベータシート構造を連結し、ベータシートの一部を形成することもある、ループを形成する。ＣＤＲは、フレームワーク領域によって、他のドメインからのＣＤＲと近接して保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【０００８】
脊椎動物の免疫系は、転写される前に分離した遺伝子セグメントをつなぎ合わせるという驚くべき経済的な方法で、殆ど無限の数の異なる軽鎖及び重鎖を生成することのできる、独特の遺伝的メカニズムを進化させた。抗体鎖は、異なる染色体上の３つの別々の遺伝子座にある遺伝子によってコードされている。１つの遺伝子座は、重鎖のアイソタイプをコードし、また、カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖アイソタイプ鎖のための別々の遺伝子座が存在するが、Ｂリンパ球は、これらの軽鎖の遺伝子座の１つのみから転写を行う。Ｉｇ鎖の各タイプ（重鎖、ラムダ（λ）軽鎖及びカッパ（κ）軽鎖）について、最終的に単一のペプチド鎖が合成される由来となる遺伝子セグメントの別々のプールが存在する。各々のプールは異なる染色体上にあり、通常はＩｇ鎖のＶ領域をコードする多数の遺伝子セグメント及びＣ領域をコードする少数の遺伝子セグメントを含む。より具体的には、Ｈ鎖の可変領域は、３つの遺伝子フラグメント、即ちＶ、Ｄ及びＪ遺伝子フラグメントを含み、一方でＬ鎖の可変領域は、当該Ｌ鎖がラムダ（λ）鎖に属するかカッパ（κ）鎖に属するかに関わらず、２つの遺伝子フラグメント、即ちＪ及びＶ遺伝子フラグメントを含む。Ｂ細胞の成長の際に、合成されるべき２つのＩｇ鎖の各々のための完全なコード配列は、部位特異的な遺伝子組換えによって集められて、Ｖ領域をコードする配列全体及びＣ領域をコードする配列がまとめられる。
【０００９】
Ｉｇ鎖をコードするために利用可能な多数の遺伝的なＶ、Ｊ及びＤ遺伝子セグメントは、それ自体が抗体の多様性に相当の寄与をするが、これらのセグメントの組み合わせによる連結が、この寄与を大きく増加させる。更には、遺伝子セグメントの正確でない連結、及び前Ｂ細胞ステージにおけるＶ−Ｄ−Ｊセグメントの連結の際に導入される体細胞超変異により、Ｖ領域の多様性は大きく増加する。
【００１０】
これらの構造的な特徴に加えて、天然抗体の配列の解析は、構造研究と共に、抗体がどのように働くのかを明らかにするのに有益であった（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９−８１７；Ｋａｂａｔ、１９８２、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．、３４：２３−３８；Ｋａｂａｔ、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．））。これらの研究から、抗原の認識は、抗体の可変ドメインの一端に位置し、β−シートのフレームワークによって連結されている相補性決定領域（ＣＤＲ）によって主に仲介されることが示された（Ｗｕ及びＫａｂａｔ、１９７０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１３２：２１１−２５０；Ｋａｂａｔ及びＷｕ、１９７１、Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、１９０：３８２−３９３）。
【００１１】
天然抗体の配列の多様性は、フレームワークと比較してＣＤＲは超可変的であり、特定の抗体の抗原特異性を決定しているのはＣＤＲ配列であることを示している（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５；Ａｍｉｔら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７４７−５３）。またこれらの研究から、部位特異的な様式で及びＣＤＲの全体的構成の観点からの両方で、特定のアミノ酸への偏りが生じていることから、殆どのＣＤＲ位置での天然の配列多様性は完全にランダムではないことも明らかにされた（Ｄａｖｉｅｓ及びＣｏｈｅｎ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：７−１２；Ｋａｂａｔら、１９７７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２：６６０９−１６；Ｚｅｍｌｉｎら、２００３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３４：７３３−４９；Ｍｉａｎら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１７：１３３−５１；Ｐａｄｌａｎ、１９９４、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１：１６９−２１７）。
【００１２】
伝統的な小分子に基づくアプローチとは対照的に、治療抗体は、（ｉ）迅速に生成及び検証され得る；（ｉｉ）副作用がより少なく、安全性が改善されている、（ｉｉｉ）薬物動態的な特性がよく理解されており、投与頻度が低減された半減期の長い製品を生成するために最適化され得る；（ｉｖ）用途が広く、薬の機能において柔軟性を示す；（ｖ）スケールアップ及び製造プロセスがロバストであり、よく理解されている；及び（ｖｉ）臨床上及び薬事規制上の成功実績が実証されている；といったことに挙げられるように著しい利点を有する。
【００１３】
モノクローナル抗体の成功を鑑みたとしても、薬剤モダリティとしての抗体は、発達し続けており、非効率になりがちである。更には、自然免疫系に内在する生物学的偏りが、しばしば、改善された治療剤のより早い開発に不利に働く。こういった制約としては、ｉ）治療能力のある親和定数を有する生物学的に活性な抗体の単離に長い開発時間がかかること、ｉｉ）あるクラスのタンパク質標的（手に負えない（ｉｎｔｒａｃｔａｂｌｅ）標的）に対して、抗体産生が不可能であること、及びｉｉｉ）免疫系に基づく親和性の選択に内在する、固有の親和性の上限、などが挙げられる。
【００１４】
具体的には、改善された薬物動態、交差反応性、安全性、及び優れた投与レジメンを持つ抗体を、より迅速に開発する方法が必要とされている。この必要性に対して、あるタンパク質の潜在的なエピトープの体系的な解析を可能とし、且つ所望の選択性特性を持つ抗体の選択的な開発を可能とする方法の開発が重要である。
【００１５】
多数の会社によって用いられるアプローチとしては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分子進化と併用したランダム又はセミランダムな変異誘発の使用（例えば、エラープローンＰＣＲの使用）が挙げられる。このアプローチは、タンパク質構造中にランダムな変更を作り出し、且つ、通常、コードされるタンパク質を生細胞内で発現させることによって、後に改善された変異型のためにスクリーニングされる変異ポリヌクレオチドの巨大なライブラリーを生成することに基づく。これらのライブラリーから、少数の改善されたタンパク質が更なる最適化のために選択され得る。
【００１６】
このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異のアプローチは、配列空間の重要なフラクションを体系的にサーチすることが不可能であることによって、及び大きな変異誘発負荷で非常にまれな改善変異を検出するのが比較的難しいことによって、一般に限定的である。この根本的な問題は、適度なサイズのタンパク質に対して可能な変異の総数が膨大であるために生じる。例えば、１００アミノ酸のタンパク質の潜在的な多様性は、２０１００の異なるアミノ酸配列であり、一方、既存のハイスループットスクリーニングの方法論では、典型的には、最大で、１週間に１０７−１０８サンプルのスクリーニング能力に限られる。更には、こういったアプローチは、コドン用法が重複しており、１００アミノ酸残基のタンパク質に対して可能な最大約３１００のヌクレオチド配列が、実際に同一のアミノ酸及びタンパク質をコードしているため、相対的に非効率である（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（２００４）Ｃｏｄｏｎ  Ｂｉａｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（７）３４６−３５３））。
【００１７】
より洗練されたアプローチでは、改善されたタンパク質の選択のために、タンパク質ドメイン間での組換えによるランダムな変異誘発の組み合わせが用いられる（Ｓｔｅｍｍｅｒ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１（２２）１０７４７−５１））。このアプローチは、タンパク質ファミリーに渡ってタンパク質構造に特有の自然な設計概念を利用するが、これもまた、まれな改善を同定するには、かなりの組換えＤＮＡ操作や、多数の配列をスクリーニングする能力が必要とされる。両アプローチとも、大規模なフォローアップの変異誘発、並びに各変異の重要性を理解するための解析、及び何千若しくは何百万もの同定された変異体の最良の組み合わせを同定するための解析を必要とする。
【発明の概要】
【００１８】
発明の要旨
本発明は、合成ライブラリー、半合成ライブラリー及び／又はシードライブラリーなどのポリヌクレオチドライブラリーの生成のための方法、並びに、組換えタンパク質の新規変異体の生成におけるこれらのライブラリーの使用を提供することにより、前述した及び関連する要求を満たす。特定の実施形態において、本明細書中にて提供される方法は、組換えヒト抗体の集中的なライブラリーの生成、及び標的抗原とのそれらの親和性結合についてのスクリーニングのために有用である。１つの態様において、合成遺伝子は、Ｂ細胞中にて発現された際に、天然にＳＨＭを起こす遺伝子（即ち抗体遺伝子）である。別の態様において、合成遺伝子は、Ｂ細胞中にて発現された際に、天然にはＳＨＭを起こさない遺伝子（即ち非抗体遺伝子）である。特定の実施形態において、本明細書にて提供される方法は、組換えの非抗体タンパク質の集中的なライブラリーの生成、及び機能の増強又は体細胞超変異への感受性の減少についてのスクリーニングのために有用である。
【００１９】
本発明の特定の態様において、本明細書において、ポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む組成物であって、該ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードし、該ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、該少なくとも１つの目的の領域をコードし且つＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む、前記組成物が提供される。
【００２０】
本発明の特定の態様において、本明細書において、１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む組成物であって、該ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によってＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドを含む、前記組成物が提供される。別の態様において、少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドは、好ましくないコドンの密度を低下させることによって、ＳＨＭのために最適化されている。合成ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法を用いて、ＳＨＭに対して耐性にすること又はＳＨＭに対して感受性にすることができる。
【００２１】
特定の態様において、本発明の組成物は、体細胞超変異モチーフの挿入によってＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変された合成核酸配列を含み得る。１実施形態において、合成核酸配列は、１つ以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。別の実施形態において、合成核酸配列は、１以上のＷＡＣモチーフ、ＷＲＣモチーフ又はそれらの組み合わせの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。
【００２２】
特定の別の態様において、本発明の組成物は、抗体である目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む。１実施形態において、目的のタンパク質は、抗体重鎖又はそのフラグメントである。別の実施形態において、抗体重鎖は、図２０Ａに示すものから選択される可変領域を含む。なお別の実施形態において、抗体重鎖は、ＩＧＨＶ６−１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ１−２又はＩＧＨＶ１−６９からなる群から選択される可変領域を含む。
【００２３】
別の実施形態において、目的のタンパク質は、抗体軽鎖又はそのフラグメントである。１実施形態において、抗体軽鎖は、図２０Ｂに示すものから選択される可変領域を含む。なお別の実施形態において、抗体軽鎖は、ＩＧＫＶ２Ｄ−３０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９又はＩＧＫＶ３−２０からなる群から選択される、κ軽鎖可変領域を含む。更に別の実施形態において、抗体軽鎖は、図２０Ｃに示すものから選択される可変領域を含む。なお更なる別の実施形態において、抗体軽鎖は、ＩＧＫＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ２−１１又はＩＧＬＶ３−２１からなる群から選択されるλ軽鎖可変領域を含む。
【００２４】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗体重鎖又は軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３ドメインを含む少なくとも１つの目的の領域を含む。別の実施形態において、該組成物は、抗体重鎖又は軽鎖のＣＤＲ３を含む少なくとも１つの該目的の領域を含む。
【００２５】
特定の別の態様において、本発明の組成物は、受容体である目的のタンパク質を含む。別の態様において、目的のタンパク質は酵素である。なお別の態様において、目的のタンパク質は、補因子である。更に別の態様において、目的のタンパク質は、転写因子である。
【００２６】
また本発明は、所望の特性を有する目的のタンパク質を作成する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：ａ．目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、少なくとも１つの目的の領域をコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｂ．目的のタンパク質の複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；ｃ．目的のタンパク質の複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーの発現によって目的のタンパク質が産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる）；ｄ．必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程又はシードライブラリーにＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程；ｅ．所望の特性を有する変異タンパク質を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；並びにｆ．工程（ｅ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【００２７】
他の実施形態において、本明細書には、所望の又は同定された特性を有する目的のタンパク質を作成する方法が提供され、この方法は以下の工程を含む：（ａ）１以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｂ）ポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；（ｃ）ポリヌクレオチドのシードライブラリーの発現によって該１以上のタンパク質が産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤ活性を示すか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤ活性を示すように誘導できる）；（ｄ）必要に応じて、ＡＩＤ活性を誘導する工程；（ｅ）所望の又は同定された特性を有する１以上の変異タンパク質を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及び（ｆ）工程（ｅ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【００２８】
他の実施形態において、所望の特性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを作成する方法が本明細書中に提供され、この方法は以下の工程を含む：ａ．少なくとも１つのＣＤＲを有する複数の１以上の抗体重鎖タンパク質又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、これらのポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＤＲをコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｂ．少なくとも１つのＣＤＲを有する複数の１以上の抗体軽鎖タンパク質又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、少なくとも１つのＣＤＲをコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｃ．複数の抗体重鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー、及び複数の抗体軽鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；ｄ．同じ又は異なる発現ベクター上の、複数の抗体重鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー由来の重鎖配列と、複数の抗体軽鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー由来の軽鎖配列との共発現によって、抗体又はその抗原結合フラグメントが産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、この宿主細胞は、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる）；ｅ．必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程又はポリヌクレオチドのシードライブラリー上にＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程；ｆ．所望の特性を有する変異した抗体又はその抗原結合フラグメントを発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及びｇ．工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【００２９】
他の実施形態において、所望の又は同定された特性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを作成する方法が本明細書中に提供され、この方法は以下の工程を含む：（ａ）少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを有する複数の１以上の抗体重鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードする第一のポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの第一の合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｂ）少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを有する複数の１以上の抗体軽鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの第二の合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｃ）ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーを、作動可能な組合せで発現ベクター中に連結する工程；（ｄ）（同じ又は異なる発現ベクター上の、）ポリヌクレオチドの第一のシードライブラリー由来の重鎖配列及びポリヌクレオチドの第二のシードライブラリー由来の軽鎖配列の共発現によって、抗体又はその抗原結合フラグメントが産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤ活性を示すか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤ活性を示すように誘導できる）；（ｅ）必要に応じて、ＡＩＤ活性を誘導する工程；（ｆ）所望の又は同定された特性を有する１以上の変異した抗体又はその抗原結合フラグメントを発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及び（ｇ）工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【００３０】
なお他の実施形態において、複数のタンパク質を同時進化させる方法が本明細書中に提供され、この方法は以下の工程を含む：ａ．第一の目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、少なくとも１つの目的の領域をコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｂ．第二の目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、少なくとも１つの目的の領域をコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｃ．第一の目的のタンパク質の複数の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー、及び第二の目的のタンパク質の複数の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；ｄ．第一及び第二の目的のタンパク質が、同じ又は異なる発現ベクター上の、ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーの共発現によって産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる）；ｅ．必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程又はポリヌクレオチドのシードライブラリー上にＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程；ｆ．所望の特性を有する第一又は第二の変異した目的のタンパク質を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及びｇ．工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【００３１】
１態様において、複数のタンパク質を同時に進化させる方法が本明細書中に提供され、この方法は以下の工程を含む：（ａ）１以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された少なくとも１つの第一の合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｂ）１以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された少なくとも１つの第二の合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｃ）ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；（ｄ）１以上の第一及び第二のタンパク質が、同じ又は異なる発現ベクター上の、ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーの共発現によって産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤ活性を示すか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤ活性を示すように誘導できる）；（ｅ）必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程；（ｆ）所望の又は同定された特性を有する１以上の変異したタンパク質を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及び（ｇ）工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【００３２】
特定の態様において、本明細書中に記載する方法は、体細胞超変異モチーフの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変された、少なくとも１つの合成核酸配列を含む。特定の実施形態において、この少なくとも１つの合成核酸配列は、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。他の実施形態において、この少なくとも１つの合成核酸配列は、１以上のＷＡＣモチーフ、ＷＲＣモチーフ又はそれらの組合せの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。
【００３３】
これらの方法のいずれかの１実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、保存的アミノ酸置換を導入する好ましい（標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ））ＳＨＭコドン又は好ましい（標準的な）ホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。これらの方法のいずれかの別の実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、アミノ酸レベルで半保存的な変異を導入する好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。これらの方法のいずれかの別の実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、アミノ酸レベルで非保存的な変異を導入する好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。１実施形態において、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入は、目的の領域中の１以上のアミノ酸置換の挿入によるものであり、このアミノ酸置換は、サイレント、保存的、半保存的、非保存的又はそれらの組合せである。本明細書中に記載する方法を使用してなされるポリヌクレオチドに対する改変により、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を、ＳＨＭに対して感受性又は耐性にすることができる。
【００３４】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、原核生物細胞である宿主細胞を含む。１実施形態において、原核生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００３５】
特定の他の実施形態においては、本明細書に記載の方法は、真核生物細胞である宿主細胞を含む。１実施形態において、真核生物細胞は、哺乳動物細胞である。別の実施形態において、宿主は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞、又はリンパ球由来細胞である、哺乳動物細胞である。なお他の実施形態において、宿主細胞は、ＲＡＭＯＳ（ＣＲＬ−１５９６）細胞、Ｄａｕｄｉ（ＣＣＬ−２１３）細胞、ＥＢ−３（ＣＣＬ−８５）細胞、ＤＴ４０（ＣＲＬ−２１１１）細胞、１８−８１細胞、Ｒａｊｉ（ＣＣＬ−８６）、又はそれらに由来するものである、リンパ球由来細胞である。
【００３６】
別の実施形態において、本明細書に記載の方法は、酵母細胞である、真核生物細胞である宿主細胞を含む。
【００３７】
本発明は更に、非ヒト抗体をヒト化する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：ａ．ヒト化すべき非ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の配列を決定する工程；ｂ．非ヒト抗体重鎖タンパク質由来の少なくとも１つのＣＤＲ又はその一部をコードする少なくとも１つの合成核酸配列を含む複数の１以上のヒト抗体重鎖タンパク質スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、該核酸配列は、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている）；ｃ．非ヒト抗体軽鎖タンパク質由来の少なくとも１つのＣＤＲ又はその一部をコードする少なくとも１つの合成核酸配列を含む複数の１以上のヒト抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、該核酸配列は、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている）；ｄ．複数の抗体重鎖タンパク質スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー、及び複数の抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組み合わせで、発現ベクター中に連結する工程；ｅ．抗体又はその抗原結合フラグメントが、同じ又は異なる発現ベクター上の、複数の抗体重鎖タンパク質スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー由来の重鎖配列及び複数の抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー由来の軽鎖配列の共発現によって産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる）；ｆ．必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程又はシードライブラリー上にＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程；ｇ．非ヒト抗体に特徴的な結合を有するヒト化抗体を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及びｈ．工程（ｇ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【００３８】
特定の実施形態において、非ヒト抗体をヒト化する方法は、図２０Ａから選択される可変領域を含む、ヒト抗体重鎖タンパク質スキャフォールドを含む。他の実施形態において、ヒト抗体重鎖タンパク質スキャフォールドは、該非ヒト抗体に対して最も高いアミノ酸相同性を示す、図２０Ａから選択される可変領域を含む。なお他の実施形態において、抗体重鎖タンパク質スキャフォールドは、ＩＧＨＶ６−１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ１−２又はＩＧＨＶ１−６９からなる群から選択される可変領域を含む。
【００３９】
特定の他の実施形態において、非ヒト抗体をヒト化する方法は、図２０Ｂから選択される可変領域を含む、ヒト抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドを含む。他の実施形態において、ヒト抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドは、該非ヒト抗体に対して最も高いアミノ酸相同性を示す、図２０Ｂから選択される可変領域を含む。なお他の実施形態において、抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドは、ＩＧＫＶ２Ｄ−３０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９又はＩＧＫＶ３−２０からなる群から選択される可変領域を含む。
【００４０】
特定の他の実施形態において、非ヒト抗体をヒト化する方法は、図２０Ｃから選択される可変領域を含む、ヒト抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドを含む。他の実施形態において、ヒト抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドは、該非ヒト抗体に対して最も高いアミノ酸相同性を示す、図２０Ｃから選択される可変領域を含む。なお他の実施形態において、抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドは、ＩＧＫＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ２−１１又はＩＧＬＶ３−２１からなる群から選択される可変領域を含む。
【００４１】
他の態様において、本明細書に記載された非ヒト抗体をヒト化する方法は、体細胞超変異モチーフの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変された、少なくとも１つの合成核酸配列を含む。他の実施形態において、この少なくとも１つの合成核酸配列は、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。なお他の実施形態において、この少なくとも１つの合成核酸配列は、１以上のＷＡＣモチーフ、ＷＲＣモチーフ又はそれらの組合せの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。
【００４２】
他の実施形態において、本明細書に記載された非ヒト抗体をヒト化する方法は、該非ヒト抗体の重鎖タンパク質由来のＣＤＲ３ドメインをコードする合成核酸配列を含む、複数の１以上のヒト抗体重鎖タンパク質スキャフォールドを含み、ここで該核酸配列は、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。
【００４３】
なお他の実施形態において、本明細書に記載された非ヒト抗体をヒト化する方法は、該非ヒト抗体の軽鎖タンパク質由来のＣＤＲ３ドメインをコードする合成核酸配列を含む、複数の１以上のヒト抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドを含み、ここで該核酸配列は、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。
【００４４】
他の実施形態において、本明細書に記載された非ヒト抗体をヒト化する方法は、該非ヒト抗体の重鎖タンパク質由来のＣＤＲ３ドメインの一部をコードする合成核酸配列を含む、複数の１以上のヒト抗体重鎖タンパク質スキャフォールドを含み、ここで該核酸配列は、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。
【００４５】
なお他の実施形態において、本明細書に記載された非ヒト抗体をヒト化する方法は、該非ヒト抗体の軽鎖タンパク質由来のＣＤＲ３ドメインの一部をコードする合成核酸配列を含む、複数の１以上のヒト抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドを含み、ここで該核酸配列は、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている。
【００４６】
参照による組み込み
本明細書中で言及する全ての刊行物及び特許出願は、参照することにより、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的に且つ個々に示した場合と同程度に、本明細書に組み込まれる。
【００４７】
図面の簡単な説明
本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な記述、及び添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点のよりよい理解を得ることができる。
【００４８】
図１及び図２は、ＳＨＭ介在性の親和性成熟の間にＣＤＲ及びＦＷにおいて観察された、最も一般的な２０のコドン遷移を示しており、単純なフレームシフトがどのようにして、ＣＤＲ及びＦＷにおいて見られる、２つの根本的に異なる変異誘発のパターンを決定し得るのかを示している。これらの観察から、親和性成熟の間の機能的な選択とリーディングフレームの構成との両方が、ＳＨＭホットスポットコドンにおいて生成されるアミノ酸多様性を決定しているという仮説が直接的に導かれる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＣＤＲ内で、（コドンＡＧＣ、ＴＡＴ及びＴＡＣ（チロシン及びセリンアミノ酸をコードする）が、）アミノ酸多様性を生成する１次、２次及び３次のＳＨＭ事象の指向された流れを与えることを示している。ＣＤＲ内で、観察された最も一般的なコドン遷移は、セリンからアスパラギンへの変換に繋がる、ＡＧＣからＡＡＣである（７８５例）。この遷移はフレームワーク領域においても一般的であるが（３５４例）、同一のホットスポットモチーフ（．．ＴＡＣＡＧＣＴＡＴ．．；配列番号１）の構成における同一の変異の単一のフレームシフトは、ＣＡＧからＣＡＡへのサイレント変異をもたらし、これは、フレームワーク領域において一般的であるが（２８８例）、ＣＤＲにおいては一般的には観察されない。
【図２】図１とは対照的に、フレームワーク領域において最も一般的に観察されたコドン（アミノ酸）遷移事象は、サイレント変異を生成することを示している（図２）。
【図３】ＳＨＭ介在性の変異を誘起（正のｚスコア）又は防止（負のｚスコア）する能力を示す、可能な全ての６マーヌクレオチドのｚスコアのヒストグラムである。ＷＡＣライブラリー中に見られるヌクレオチド配列もまた、（対応するｚスコアで）分布上に示している。破線は、ＳＨＭをリクルートする全ホットスポットモチーフについての上位５％の境界を示している。図に見られるように、ＷＡＣライブラリーに含まれるヌクレオチド配列は、高密度のホットスポットを与える。縮重コドン（ＷＡＣＷ）のアセンブリーは、Ｒｏｇｏｚｉｎらに記載される可能な４マーホットスポット（ＷＲＣＨ；ここで、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、及びＷ＝Ｔ又はＡ）のサブセットをもたらす。
【図４】好ましいＳＨＭホットスポットコドンＡＡＣ及びＴＡＣ（これらは、合成ライブラリー（例えばシードライブラリー）の基礎となり得る）は、Ｉｇ重鎖抗体において観察される等価なＳＨＭ変異事象による判断で、かなりのアミノ酸の多様性を生じる、一次及び二次の変異事象のセットを生じ得る。これら２つのコドンから、塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、アルギニン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸）、親水性アミノ酸（セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン）、疎水性アミノ酸（アラニン及びフェニルアラニン）、及びグリシンが、ＳＨＭ事象の結果として生じる。
【図５】ＳＨＭ介在性の変異を誘起（正のｚスコア）又は防止（負のｚスコア）する能力を示す、可能な全ての６マーヌクレオチドのｚスコアのヒストグラムである。ＷＲＣライブラリー中に見られるヌクレオチド配列もまた、（対応するｚスコアで）分布上に示している。破線は、ＳＨＭをリクルートする全ホットスポットモチーフについての上位５％の境界を示している。図に見られるように、ＷＲＣライブラリーに含まれるヌクレオチド配列は、高密度のホットスポットを与える。縮退コドン（ＷＲＣＷ）のアセンブリーは、Ｒｏｇｏｚｉｎらに記載される可能な４マーホットスポット（ＷＲＣＨ；ここで、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、及びＷ＝Ｔ又はＡ）のサブセットをもたらす。
【図６】親和性成熟したＩＧＶ重鎖配列中で観察されるような、「好ましいＳＨＭホットスポットコドン」ＡＧＣ及びＴＡＣから開始する、アミノ酸多様性の生成を導く一連の変異事象である。アスパラギン及びチロシンをコードするコドンから開始する、ＮＣＢＩデータベースから同定及び解析された、４２００の一次及び二次のＳＨＭ変異事象は、機能的に多様なアミノ酸のセットを導く。
【図７】ＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎプログラムを用いた進行性の置換の反復による、配列最適化の収束を示している。この図は、ネイティブのイヌＡＩＤヌクレオチド配列から出発した場合の、理想化されたホット配列及びコールド配列への最適化の両方を示している。
【図８】ネイティブのブラストサイジン遺伝子のアミノ酸配列（Ａ；配列番号２）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号３）を与えている。ホットスポット（Ｃ）、コールドスポット（Ｄ）及びＣｐＧの発生（Ｅ）の初期解析も示している。
【図９】合成のＳＨＭ耐性型のブラストサイジン遺伝子のアミノ酸配列（Ａ；配列番号２）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号４）を与えている。合成配列におけるホットスポット（Ｃ）、コールドスポット（Ｄ）及びＣｐＧの発生（Ｅ）の解析も示している。
【図１０】合成のＳＨＭ感受性型のブラストサイジン遺伝子のアミノ酸配列（Ａ；配列番号２）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号５）を与えている。合成配列におけるホットスポット（Ｃ）、コールドスポット（Ｄ）及びＣｐＧの発生（Ｅ）の解析も示している。
【図１１−１】Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；配列番号６）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；配列番号７）、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号８）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ｎｏｒｖ−）（ラット；配列番号：９）、及びＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー；配列番号：１０）からの、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の配列比較を与えている。種間での変動を、太字のアミノ酸で表す。
【図１１−２】Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；配列番号６）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；配列番号７）、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号８）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ｎｏｒｖ−）（ラット；配列番号：９）、及びＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー；配列番号：１０）からの、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の配列比較を与えている。種間での変動を、太字のアミノ酸で表す。
【図１２】ネイティブのイヌシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）（Ｌ１９８Ａ）のアミノ酸配列（Ａ；配列番号１１）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号１２）を与えている。ネイティブの配列におけるホットスポット（Ｃ）、コールドスポット（Ｄ）及びＣｐＧの発生（Ｅ）の解析も示している。
【図１３】合成のＳＨＭ感受性型のイヌＡＩＤのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号１３）を与えている。ホットスポット（Ｂ）、コールドスポット（Ｃ）及びＣｐＧの発生（Ｄ）の解析も示している。
【図１４】合成のＳＨＭ耐性型のイヌＡＩＤのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号１４）を与えている。ホットスポット（Ｂ）、コールドスポット（Ｃ）及びＣｐＧの発生（Ｄ）の解析も示している。
【図１５−１】Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号１５）及びＳＨＭ最適化（コールド）Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号１６）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；配列番号１７）、及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；配列番号１８）ｍＲＮＡの活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）配列のｃＤＮＡ配列の比較を与えている。ＧＡＧ配列を太字・下線で示している。種間での変動は、太字のアミノ酸残基で示している。
【図１５−２】Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号１５）及びＳＨＭ最適化（コールド）Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号１６）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；配列番号１７）、及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；配列番号１８）ｍＲＮＡの活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）配列のｃＤＮＡ配列の比較を与えている。ＧＡＧ配列を太字・下線で示している。種間での変動は、太字のアミノ酸残基で示している。
【図１６】蛍光タンパク質などの変異する終止コドンを含むタンパク質を用いた、復帰頻度に対するＡＩＤ活性の効果の予測を示している（１６Ａ）。図１６Ｂは、ＡＩＤを発現可能で且つ安定してＧＦＰを発現する発現ベクターを、２つの異なる濃度でトランスフェクトした細胞で達成された、蛍光の実質的な減少率（ＧＦＰの消光として示している）を示している。図１６Ｃは、野生型のヒトＡＩＤ及びコールドのイヌＡＩＤにより介在された、初期のＧＦＰ復帰率を示している。復帰率に対するＩｇエンハンサーの効果も示している。
【図１７】ベクターフォーマット１（１７Ａ）及び２（１７Ｂ）の概要を与えている。
【図１８】ベクターフォーマット３（１８Ａ）及び４（１８Ｂ）の概要を与えている。
【図１９】ベクターフォーマット５（１９Ａ）及びＡＢ１８４（１９Ｂ）の概要を与えている。
【図２０Ａ】種々の免疫グロブリン重鎖可変（ＩｇＶＨ）遺伝子がＧｅｎｂａｎｋ及びＰＤＢデータベースに見出される頻度を示す（２０Ａ）。図２０Ｂ及び図２０Ｃは、カッパ及びラムダ軽鎖可変領域についての同様のデータをそれぞれ与えている。
【図２０Ｂ】種々の免疫グロブリン重鎖可変（ＩｇＶＨ）遺伝子がＧｅｎｂａｎｋ及びＰＤＢデータベースに見出される頻度を示す（２０Ａ）。図２０Ｂ及び図２０Ｃは、カッパ及びラムダ軽鎖可変領域についての同様のデータをそれぞれ与えている。
【図２０Ｃ】種々の免疫グロブリン重鎖可変（ＩｇＶＨ）遺伝子がＧｅｎｂａｎｋ及びＰＤＢデータベースに見出される頻度を示す（２０Ａ）。図２０Ｂ及び図２０Ｃは、カッパ及びラムダ軽鎖可変領域についての同様のデータをそれぞれ与えている。
【図２１Ａ】（Ａ）重鎖、（Ｂ）カッパ及び（Ｃ）ラムダ軽鎖のライブラリーを生成するための工程を示している。
【図２１Ｂ】（Ａ）重鎖、（Ｂ）カッパ及び（Ｃ）ラムダ軽鎖のライブラリーを生成するための工程を示している。
【図２１Ｃ】（Ａ）重鎖、（Ｂ）カッパ及び（Ｃ）ラムダ軽鎖のライブラリーを生成するための工程を示している。
【図２２】２つのノナマーの理想的なコールドスポット（ＧＴＣＧＴＣＧＴＣ；配列番号２０）の間に含まれる、巡回して順序を変えた２つの理想的なホットスポット（ＡＧＣＴＡＣ；配列番号１９）を含む、合成のＣＤＲ３を示している。ここで「Ｖ」は可変ドメインに由来する配列を表し、「Ｄ」は、ＳＨＭに最適化されているが、対応する野生型抗体のＣＤＲ３から天然に得られたものである、合成ポリヌクレオチド配列を表し、「Ｊ」は結合ドメインに由来する配列を表し、「Ｃ」は定常ドメインに由来する配列を表している。実施例４〜７により十分記載するように、該合成ＣＤＲ３は、ヒトＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＪ１、ＩｇＧ１生殖系列の配列の構成内に置かれている。ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４及び定常領域の一部のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、配列番号２１及び２４にそれぞれ示している。代替的なＣＤＲ３ヌクレオチド配列を、配列番号２２及び２３として示している。ホットスポットには下線を示しており、２つのノナマーの理想的なコールドスポット（斜字体）の間に含まれている。代替的なアミノ酸配列を、配列番号２５及び２６として示している。
【図２３】配列番号２７〜３０として示したアミノ酸配列を示すナイシン（Ｎｉｓｉｎ）の合成及び成熟のダイアグラムを示している（２３Ａ）。図２３Ｂは、ｐｄｂの構造２Ｇ０Ｄ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）に記載されるタンパク質ＮｉｓＣの主鎖のトレースを、結合ポケット中の残基を強調表示しつつ示している。亜鉛金属、並びにいくつかのシステイン、ヒスチジン及びアスパラギン酸残基が、ＮｉｓＡの環化を行う残基である。ここでは、触媒部位から１０オングストローム（Å）内にある残基をラベルし、サーフェス表示で示している。
【図２４】ネイティブのＮｉｓＢのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３１）を与えている。該ネイティブ配列におけるホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの発生の解析も示している。
【図２５】ＳＨＭ耐性型のＮｉｓＢのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３２）を与えている。該合成配列におけるホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの発生の解析も示している。
【図２６】ネイティブのＮｉｓＰのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３３）を与えている。該ネイティブ配列におけるホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの発生の解析も示している。
【図２７】ＳＨＭ耐性型のＮｉｓＰのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３４）を与えている。該合成配列におけるホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの発生の解析も示している。
【図２８】ネイティブのＮｉｓＴ（２８Ａ；配列番号３５）及びＳＨＭ耐性型のＮｉｓＴ（２８Ｂ；配列番号３６）のポリヌクレオチド配列を与えている。
【図２９】ネイティブのＮｉｓＡのポリヌクレオチド配列（２９Ａ；配列番号３７）、並びにホットスポット（２９Ｂ）及びコールドスポット（２９Ｃ）の初期解析を与えている。合成型のＮｉｓＡ（２９Ｄ；配列番号３８）も示しており、ＳＨＭ耐性配列（下線）及びＳＨＭ感受性配列の領域を示している。また、ホットスポット（２９Ｅ）及びコールドスポット（２９Ｆ）の解析も示している。
【図３０】ネイティブのＮｉｓＣのポリヌクレオチド配列（配列番号３９）、並びにホットスポット（３０Ｂ）及びコールドスポット（３０Ｃ）の初期解析を与えている。
【図３１】合成型のＮｉｓＣ（３１Ａ；配列番号４０）を示しており、また、ホットスポット（３１Ｂ）及びコールドスポット（３１Ｃ）の解析を示している。
【図３２】ＤＮＡ配列と接触する３つのジンクフィンガータンパク質の概略を与えている。各フィンガーは、亜鉛金属イオンを配位した、小さなβシート及びαヘリックスから構成される。２つのヒスチジン及び２つのシステインが亜鉛に結合しているとき、重要なアミノ酸の側鎖がαヘリックスの先頭から出て来て、塩基特異的な接触を行う。これらの位置は、ＳＨＭホットスポットとして標的化され得、アミノ酸の多様性を生成する変異が所望される。フィンガーの構造的位置及び亜鉛結合位置は、それに対応してコールドとされるべきである。ＡＴＣＧＧＣＧＧＣ（配列番号４１）；ＴＡＧＣＣＧＣＣＧ（配列番号４２）。
【図３３】個々のフィンガーの概略を与えており、構造的に保存されている位置を太字で示し、ＤＮＡと接触する残基を灰色の背景と共に示している（配列番号４３）。ホット又はコールドにすべきアミノ酸配列の部分を、全ての可能な対応する核酸配列と共に示している。VC        配列番号GTATGC    44GTATGT    45GTCTGC    46GTCTGT    47GTGTGC    48GTGTGT    49GTTTGC    50GTTTGT    51EH        配列番号GAACAC    52GAACAT    53GAGCAC    54GAGCAT    55   各ヌクレオチド配列に添えられたｚスコアは、その部位に対してその配列がＳＨＭ機構をリクルート又は防止する程度を示している。これらのリストからの個々の配列は、各部位におけるＳＨＭ介在性の変異を増強又は制限するように選択され得る。
【図３４】３マーヌクレオチドモチーフＡＧＣは、体細胞超変異事象のための好ましい部位を表している。図中、抗体の重鎖及び軽鎖について、フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）に見られるＡＧＣモチーフの各位置における、本解析において観察された変異の数が見られる（線グラフ）。当該モチーフの各ヌクレオチド位置についての文字の大きさは、各ヌクレオチドがコドンリーディングフレームの１番目の位置となっている頻度を示している。フレームワーク領域内においては、いずれのリーディングフレームも支配的ではないが、一方でＣＤＲ内においては、ＡＧＣモチーフの１番目の位置（Ａ）が、ほぼ普遍的にコドンの１番目の位置として使用されている。
【図３５】重鎖抗体のＦＲ領域及びＣＤＲ領域内における、２０の最もホットなスポットのコドン超変異遷移事象を示しており、矢印に示した番号は、コドン遷移事象が観察された頻度を示している。親和性成熟した抗体で観察された変異の発生のうち、コドンＡＧＣ及びＡＧＴ（セリン）、並びにより少ない程度でのＴＡＣ及びＴＡＴ（チロシン）が、〜５０％を占める。正しいリーディングフレーム内でのこれらのホットスポットコドンの使用は、親和性成熟と組み合わさって、フレームワーク領域と比べて、ＣＤＲ内において観察されるサイレント変異を大きく減小させている（図中では、点線の丸で強調表示されている）。
【図３６Ａ】代表的なＳＨＭ系についての遷移頻度の遷移マトリクスを示しており、ここでｙ軸は出発時のコドンの状態を表し、ｘ軸は１ラウンドのＳＨＭ介在性の進化での終了時のコドンの状態を表している。非対角線上の灰色の値は、コドン状態間での可能な遷移を表し、対角線上の項目は自己遷移（又は非遷移）を表し、マトリックス全体は、１世代当たり０．５％の非対角線上の正規化された進化率を有している（理想上の文献値に基づいて適宜選択した）。遷移頻度は、グレースケールの使用によってコード化されており、実際の数値は図３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄ及び３６Ｅに示されている。
【図３６Ｂ】代表的なＳＨＭ系についての遷移頻度の遷移マトリクスを示しており、ここでｙ軸は出発時のコドンの状態を表し、ｘ軸は１ラウンドのＳＨＭ介在性の進化での終了時のコドンの状態を表している。非対角線上の灰色の値は、コドン状態間での可能な遷移を表し、対角線上の項目は自己遷移（又は非遷移）を表し、マトリックス全体は、１世代当たり０．５％の非対角線上の正規化された進化率を有している（理想上の文献値に基づいて適宜選択した）。遷移頻度は、グレースケールの使用によってコード化されており、実際の数値は図３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄ及び３６Ｅに示されている。
【図３６Ｃ】代表的なＳＨＭ系についての遷移頻度の遷移マトリクスを示しており、ここでｙ軸は出発時のコドンの状態を表し、ｘ軸は１ラウンドのＳＨＭ介在性の進化での終了時のコドンの状態を表している。非対角線上の灰色の値は、コドン状態間での可能な遷移を表し、対角線上の項目は自己遷移（又は非遷移）を表し、マトリックス全体は、１世代当たり０．５％の非対角線上の正規化された進化率を有している（理想上の文献値に基づいて適宜選択した）。遷移頻度は、グレースケールの使用によってコード化されており、実際の数値は図３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄ及び３６Ｅに示されている。
【図３６Ｄ】代表的なＳＨＭ系についての遷移頻度の遷移マトリクスを示しており、ここでｙ軸は出発時のコドンの状態を表し、ｘ軸は１ラウンドのＳＨＭ介在性の進化での終了時のコドンの状態を表している。非対角線上の灰色の値は、コドン状態間での可能な遷移を表し、対角線上の項目は自己遷移（又は非遷移）を表し、マトリックス全体は、１世代当たり０．５％の非対角線上の正規化された進化率を有している（理想上の文献値に基づいて適宜選択した）。遷移頻度は、グレースケールの使用によってコード化されており、実際の数値は図３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄ及び３６Ｅに示されている。
【図３６Ｅ】代表的なＳＨＭ系についての遷移頻度の遷移マトリクスを示しており、ここでｙ軸は出発時のコドンの状態を表し、ｘ軸は１ラウンドのＳＨＭ介在性の進化での終了時のコドンの状態を表している。非対角線上の灰色の値は、コドン状態間での可能な遷移を表し、対角線上の項目は自己遷移（又は非遷移）を表し、マトリックス全体は、１世代当たり０．５％の非対角線上の正規化された進化率を有している（理想上の文献値に基づいて適宜選択した）。遷移頻度は、グレースケールの使用によってコード化されており、実際の数値は図３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄ及び３６Ｅに示されている。
【図３７】好ましいＳＨＭコドンであるコドンＡＧＣ（セリン）の進化、及び、マルコフ連鎖モデルで計算した、５０ラウンドにわたるＳＨＭ介在性の変異誘発で得られたコドン頻度を示している。
【図３８】好ましいＳＨＭコドンであるコドンＡＧＣ（セリン）の進化、及び、マルコフ連鎖モデルで計算した、５０ラウンドにわたるＳＨＭ介在性の変異誘発で得られた、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたコドンによってコードされるアミノ酸頻度を示している。
【図３９】好ましくないＳＨＭコドンであるコドンＴＣＧ（セリン）の進化、及び、マルコフ連鎖モデルで計算した、５０ラウンドにわたるＳＨＭ介在性の変異誘発で得られたコドン頻度を示している。
【図４０】好ましくないＳＨＭコドンであるコドンＴＣＧ（セリン）の進化、及び、マルコフ連鎖モデルで計算した、５０ラウンドにわたるＳＨＭ介在性の変異誘発で得られた、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたコドンによってコードされるアミノ酸頻度を示している。
【図４１】「ＷＲＣモチーフ」（セリン及びチロシンをコードする好ましいＳＨＭコドンを含む）であるコドンＡＧＣ／ＴＡＣの進化、及び、マルコフ連鎖モデルで計算した、５０ラウンドにわたるＳＨＭ介在性の変異誘発で得られたコドン頻度を示している。
【図４２】「ＷＲＣモチーフ」（セリン及びチロシンをコードする好ましいＳＨＭコドンを含む）であるコドンＡＧＣ／ＴＡＣの進化、及び、マルコフ連鎖モデルで計算した、５０ラウンドにわたるＳＨＭ介在性の変異誘発で得られた、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたコドンによってコードされるアミノ酸頻度を示している。
【図４３】好ましいＳＨＭコドンであるＧＧＴコドン（グリシン）の進化、及び、マルコフ連鎖モデルで計算した、５０ラウンドにわたるＳＨＭ介在性の変異誘発で得られたコドン頻度を示している。この図は、ＧＡＴ（アスパラギン酸）、ＧＣＴ（アラニン）及びＡＧＴ（セリン）などの、単一の変異事象によって直ちに生じるコドン進化を示す。これらの新規コドンに作用する第２の変異事象は、コドンの第３のセットを生じる。例えばＡＧＴとＧＧＴの両方ともに、ＳＨＭの下でコドンＡＡＴを生じ、この位置におけるアスパラギンの獲得をもたらす。
【図４４】ＧＧＴコドン（グリシン）の進化、及び、マルコフ連鎖モデルで計算した、５０ラウンドにわたるＳＨＭ介在性の変異誘発での、ＧＡＴ（アスパラギン酸）、ＧＣＴ（アラニン）及びＡＧＴ（セリン）などの、単一の変異事象によって直ちに生じるアミノ酸進化を示す。
【図４５】安定トランスフェクション及び選択後（パネルＡ及びＣ）又は再トランスフェクションしたＡＩＤ発現ベクターの添加と共に一過的に（パネルＢ及びＤ）、低親和性の抗ＨＥＬ抗体（軽鎖の変異Ｎ３１Ｇを含む）及び構成的なＡＩＤ発現ベクターでトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞を、５０ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣ（Ａ及びＢ）又は５００ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣ（Ｃ及びＤ）のいずれかと共にインキュベートし、生存するＨＥＬ−ＦＩＴＣ結合細胞を選別し、別のラウンドの選択及び配列解析のために培養物中で増幅した。
【図４６】安定トランスフェクション及び選択後（Ａ及びＣ）又は再トランスフェクションしたＡＩＤ発現ベクターの添加と共に一過的に（パネルＢ及びＤ）、抗ＨＥＬ抗体及び構成的なイヌＡＩＤを発現している予め選別したＨＥＫ−２９３細胞を、５０ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣ（Ａ及びＢ）又は５００ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣ（Ｃ及びＤ）のいずれかと共にインキュベートし、生存するＨＥＬ−ＦＩＴＣ結合細胞を選別し、別のラウンドの選択及び配列解析のために培養物中で増幅した。
【図４７】低親和性抗ＨＥＬ抗体でトランスフェクションされ、４ラウンドにわたる選択及び進化により進化したＨＥＫ−２９３細胞を、実施例１３に記載のように、５０ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣとインキュベートして解析した。パネルＡは、４ラウンドの進化にわたり、ＦＡＣＳの散布図（パネルＡ）並びにゲートされた陽性細胞の総数（パネルＢ）の両方において、陽性細胞の明らかな増加が明白であることを示す。
【図４８】パネルＡは、ＨｙＨＥＬ１０軽鎖のＣＤＲ１周辺のアミノ配列の選択を示しており（配列番号５６、５７及び５８）、出発コンストラクトに導入されたＡｓｎ３１変異の部位周囲の進化した配列を示している。パネルＢは、対応する核酸配列（配列番号：５９、６０及び６１）を示している。パネルＣは、進化した変異体の親和性の測定を示している。
【図４９】実施例１５に記載のように、５ラウンドの選択にわたるインタクトなタンパク質の使用を通じて選択されたＮＧＦに対する抗体の単離のためのＦＡＣＳ散布図を示す。パネルＡ及びＢは、ビーズに結合したＮＧＦを使用したＦＡＣＳの結果を示し、パネルＣ、Ｄ及びＥは、５０ｎＭ（パネルＣ）又は２０ｎＭ（パネルＤ若しくはＥ）のＮＧＦを使用して得られたＦＡＣＳの散布図を示す。グラフ中の挿入図は、対照細胞を用いて行った対照のインキュベートを示す。これらのグラフ中において、Ｘ軸は、細胞のＩｇＧ発現の度合いを示し、Ｙ軸は、実施例に記載のように、細胞によるビーズ結合の規模を明記している。
【図５０】実施例１５に記載のように、ＮＧＦを用いた表面提示抗体ライブラリーのスクリーニングで単離された代表的な抗体のＢｉａｃｏｒｅ解析の結果を示す。これらのデータを多変量適合させると、６７０ｎＭの予想解離定数（Ｋｄ）が得られる。
【図５１】未改変型のティール蛍光タンパク質（Ｔｅａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＴＦＰ）遺伝子のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号４５８）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析についても示している。４０のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図５２】合成のＳＨＭ感受性（ホット）型のティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号４５９）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析についても示している。１４のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図５３−１】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号４６０）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析についても示している。２１のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。  図５３Ｄは、ホット及びコールドのＴＦＰコンストラクトの代表的なセグメントの変異を示している。中央の行は、ＴＦＰのアミノ酸配列（残基５９から８７）を一文字形式で示し（配列番号４６１）、この二つのコンストラクトをコードする「ホット」及び「コールド」の出発核酸配列を、当該アミノ酸配列の上（ホット；配列番号４６２）及び下（コールド）に示す（配列番号４６３）。ホット配列において観察された変異を並べて遺伝子配列の上に積み上げ、コールドＴＦＰ配列における変異は下に示している。この結果は、コード配列への「サイレント」な変化が、観察されたＡＩＤ介在性のＳＨＭの率に、どれほど劇的な変化を生み出すのかを示しており、設計配列を効果的に最適化してＳＨＭの速い又は遅い率を生成することができることを実証している。  図５３Ｅは、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養系においてＡＩＤにより生成された変異の分布が、他の研究において観察されたもの、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの親和性成熟の間に見られるものに酷似していることを示す。図５３Ｅは、本研究において生成された変異を示し（ボックス（ｉ）左上、ｎ＝１１８）、それをＺａｎら（ボックス（ｉｉ）右上、ｎ＝７０２）、Ｗｉｌｓｏｎら（左下、ｎ＝２５０００；ボックス（ｉｉｉ））によって観察された変異、並びに親和性成熟を経たＩＧＨＶ鎖の大規模解析（右下、ｎ＝１０１，９２６；ボックス（ｉｖ））と比較している。各々の図のＹ軸は出発ヌクレオチドを示し、Ｘ軸は結果のヌクレオチドを示し、各々の四角の中の数字は、ヌクレオチドの遷移が観察された回数のパーセンテージ（％）を示している。本研究において、変異のトランジション及びトランスバージョンの頻度は、他のデータセットにおいて見られたものに類似していた。ＣからＴへ、及びＧからＡへの変異は、シチジンにおけるＡＩＤ活性の直接的な結果であり、全ての変異事象の４８％を占める。更に、塩基Ａ及びＴにおける変異は、変異事象の〜３０％を占める（即ち、他のデータセットにおいて観察された頻度よりやや少ない）。  図５３Ｆは、変異事象が、ホットＴＦＧ遺伝子のＳＨＭ最適化ヌクレオチド配列の全体に分布していることを示し、１世代当たり、１０００ヌクレオチド当たり約０．０８事象という最大の瞬間の率は、オープンリーディングフレームの始まりから３００ヌクレオチドに集中していた。ＡＩＤを持つ遺伝子の安定トランスフェクション及び選択（３０日間）は、４８０ヌクレオチド当たり１事象という最大の変異率を生じた。結果として、遺伝子は、遺伝子当たり０、１、２またはそれより多くの変異を含み得る。  図５３Ｇは、ホットＴＦＰ配列の遺伝子にて観察されたＳＨＭ介在性事象の分布を示しており、これは、コールドＴＦＰにおいて見られる変異（図５３Ｈ）の有意に減小したパターンと比較される。
【図５３−２】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号４６０）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析についても示している。２１のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。  図５３Ｄは、ホット及びコールドのＴＦＰコンストラクトの代表的なセグメントの変異を示している。中央の行は、ＴＦＰのアミノ酸配列（残基５９から８７）を一文字形式で示し（配列番号４６１）、この二つのコンストラクトをコードする「ホット」及び「コールド」の出発核酸配列を、当該アミノ酸配列の上（ホット；配列番号４６２）及び下（コールド）に示す（配列番号４６３）。ホット配列において観察された変異を並べて遺伝子配列の上に積み上げ、コールドＴＦＰ配列における変異は下に示している。この結果は、コード配列への「サイレント」な変化が、観察されたＡＩＤ介在性のＳＨＭの率に、どれほど劇的な変化を生み出すのかを示しており、設計配列を効果的に最適化してＳＨＭの速い又は遅い率を生成することができることを実証している。  図５３Ｅは、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養系においてＡＩＤにより生成された変異の分布が、他の研究において観察されたもの、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの親和性成熟の間に見られるものに酷似していることを示す。図５３Ｅは、本研究において生成された変異を示し（ボックス（ｉ）左上、ｎ＝１１８）、それをＺａｎら（ボックス（ｉｉ）右上、ｎ＝７０２）、Ｗｉｌｓｏｎら（左下、ｎ＝２５０００；ボックス（ｉｉｉ））によって観察された変異、並びに親和性成熟を経たＩＧＨＶ鎖の大規模解析（右下、ｎ＝１０１，９２６；ボックス（ｉｖ））と比較している。各々の図のＹ軸は出発ヌクレオチドを示し、Ｘ軸は結果のヌクレオチドを示し、各々の四角の中の数字は、ヌクレオチドの遷移が観察された回数のパーセンテージ（％）を示している。本研究において、変異のトランジション及びトランスバージョンの頻度は、他のデータセットにおいて見られたものに類似していた。ＣからＴへ、及びＧからＡへの変異は、シチジンにおけるＡＩＤ活性の直接的な結果であり、全ての変異事象の４８％を占める。更に、塩基Ａ及びＴにおける変異は、変異事象の〜３０％を占める（即ち、他のデータセットにおいて観察された頻度よりやや少ない）。  図５３Ｆは、変異事象が、ホットＴＦＧ遺伝子のＳＨＭ最適化ヌクレオチド配列の全体に分布していることを示し、１世代当たり、１０００ヌクレオチド当たり約０．０８事象という最大の瞬間の率は、オープンリーディングフレームの始まりから３００ヌクレオチドに集中していた。ＡＩＤを持つ遺伝子の安定トランスフェクション及び選択（３０日間）は、４８０ヌクレオチド当たり１事象という最大の変異率を生じた。結果として、遺伝子は、遺伝子当たり０、１、２またはそれより多くの変異を含み得る。  図５３Ｇは、ホットＴＦＰ配列の遺伝子にて観察されたＳＨＭ介在性事象の分布を示しており、これは、コールドＴＦＰにおいて見られる変異（図５３Ｈ）の有意に減小したパターンと比較される。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
発明の詳細な説明
Ｉ．体細胞超変異系
関連の優先出願である米国仮出願第６０／９０２，４１４号（表題「ＳＯＭＡＴＩＣ  ＨＹＰＥＲＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭＳ」、出願日２００７年２月２０日）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ体細胞超変異（ＳＨＭ）系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ体細胞超変異を、指向された進化及びバイオインフォマティクス解析と組み合わせて使用して、以下に限定されないが、ライブラリー設計、スクリーニング、選択のための最適化され制御された系及びデータマイニングのための統合された系を含む、統合された系を生成することを伴う。これらの系として以下が挙げられる：
【００５１】
Ｉ．細胞環境内又は無細胞環境内でＳＨＭ感受性及び又はＳＨＭ耐性のＤＮＡ配列を作り出すように設計された発現系。該系は、構造タンパク質、転写調節領域及び選択マーカーにおける非特異的な変異誘発を有意に防ぎつつ、目的の遺伝子テンプレートにおける高レベルで標的化されたＳＨＭを提供する変異誘発系の安定な維持を可能にする。
【００５２】
ＩＩ．サイズ及び特異性において集中的なポリヌクレオチドライブラリー。これらのライブラリーは、合成ライブラリー、半合成ライブラリー、及び／又はシードライブラリーであり得る。特定の態様において、該ポリヌクレオチドライブラリーは、ｉｎ  ｓｉｔｕでの多様性創出の起点となるよう、ＳＨＭのための特質が高められたものであり得る。１つのそのような実施形態において、ポリヌクレオチドライブラリーは、ＳＨＭのための基質として作用するように改変された目的のタンパク質の機能的な部分をコードする核酸配列を有する複数のポリヌクレオチドを含むことで、ＳＨＭのための特質が高められたものであり得る。
【００５３】
ＩＩＩ．優れた選択性、異種間の反応性及びブロッキング活性を有する抗体の選択を与える最適なエピトープを選択するための、タンパク質構造、種内及び種間の配列バリエーションのコンピューターによる解析並びにタンパク質活性の機能解析に基づくプロセス。
【００５４】
これらのアプローチの統合の全体的な結果が、標的化された多様性をｉｎ  ｓｉｔｕで創出するため、並びに改善された形質を持つタンパク質の自動化された解析及び選択のための統合された系である。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明は、部分的には、ポリヌクレオチド配列のリーディングフレーム内での複数回のＳＨＭという状況についての理解の向上、及びその基礎となるコドン用法パターンに固有の論理的関係についての理解の向上に基づく。
【００５６】
より具体的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＳＨＭのための上記の系は、改善されたタンパク質の進化及び選択のためにＳＨＭのための基質として効率的に働き得る「シード」ライブラリーを創出するための新規の設計の可能性を提供する。
【００５７】
ｉ．定義
本明細書中及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、用語「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそれとは異なることを示していない限り、例えば、ある単位の１つ以上、又は少なくとも１つを意味し得る。従って、例えば「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」に対する言及は、複数のそのような抗体を含み、また、「可変領域（ａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」への言及は、１つ以上の可変領域及び当業者に公知のその同等物が含まれる、などである。本明細書中の用語に対して複数の定義がある場合は、別段の記載がない限り、このセクションでの定義が優先する。
【００５８】
値の範囲が与えられた場合、その範囲の上端と下端との間に入る各値が、文脈が明らかにそれとは異なることを示していない限りはその最小単位の十分の一まで、同様に具体的に開示されていることが理解される。記載された範囲の中の任意の記載された値若しくは間に入る値と、該記載された範囲の中の任意の記載された他の値若しくは間に入る値との間のより小さい各範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上端及び下端は、独立して、該範囲に含まれ得るか又は除外され得、また、該より小さい範囲に両端のいずれかが含まれる、いずれの端も含まれない、又は両端とも含まれる各範囲もまた本発明に包含されるが、記載された範囲内に具体的に除外された端があればそれに従う。記載された範囲が一端又は両端を含む場合、それらの含められた端のいずれか又は両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００５９】
用語「含む」又は「含んでいる」は、開かれた、非限定的な意味において使用され、即ち、挙げられた特徴又は構成要素に加えて、１つ以上の特徴又は構成要素の存在を許容している。
【００６０】
用語「本質的に〜からなる」は、より大きな生成物に共有結合的に結合していない、確定した個数の残基の生成物、特にペプチド配列、を意味する。しかしながら、上で述べた本発明のペプチドの場合、該ペプチドのＮ又はＣ末端への微小な修飾（保護基などを付加する末端の化学修飾（例、Ｃ末端のアミド化）など）も予期され得ることが当業者に理解されよう。
【００６１】
用語「単離された」は、特異的結合メンバー若しくは本発明の他の特異的なタンパク質、又はそのような結合メンバー若しくはタンパク質をコードする核酸が、本発明に従っている状態を意味する。結合メンバー又は他のタンパク質、及びそれらをコードする核酸は、それらの本来の環境において、或いは調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術によるものであるときはそれらが調製された環境（例、細胞培養物）において、それらと共に見出される他のポリペプチド又は核酸といった本来関連がある物質を含まない、又は実質的に含まないであろう。しかしながら、結合メンバー若しくは他のタンパク質、及びそれらをコードする核酸は、希釈剤又はアジュバントと共に製剤化されてもよく、且つ実際的な目的のために単離されてもよい（例えば、結合メンバーは、通常は、免疫アッセイでの使用のためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合、ゼラチン又は他の担体と混合され、或いは、診断又は治療において使用される場合、医薬上許容される担体又は希釈剤と混合されるであろう）。特異的結合メンバー又は他の特異的なタンパク質は、自然に又は異種真核生物細胞系によってのいずれかによりグリコシル化されていてもよく、或いは（例えば、原核生物細胞での発現により生成される場合）、グリコシル化されていなくてもよい。
【００６２】
用語「選択」は、ポリヌクレオチド、タンパク質又は細胞などの１以上のメンバーを、そのようなメンバーのライブラリーから分離することを意味する。選択は、検出及び選択の両方を伴ってよく、例えば、レポーター遺伝子を検出し、次いでそれに従って細胞をソーティングする蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を使用することにより、細胞は選択される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」又は「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」又は「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｕＭ」又は「μＭ」はマイクロモーラーを意味し、「ｎＭ」はナノモーラーを意味し、「ｐＭ」はピコモーラーを意味し、「ｆＭ」はフェムトモーラーを意味する。
【００６４】
語句「医薬上許容される」は、ヒトに投与した場合に、生理的に耐容され、且つアレルギー反応又は有害反応（胃の不調、目眩など）を典型的には引き起こさない分子的実体及び組成物を意味する。
【００６５】
抗体の用語
用語「抗体」は、天然であるか又は部分的若しくは全体的に合成により製造されたものである免疫グロブリンを表す。該用語はまた、抗原結合ドメインであるか又はそれに相同である結合ドメインを有する、任意のポリペプチド又はタンパク質も包含する。ＣＤＲグラフト抗体もまた、この用語によって意図される。
【００６６】
「ネイティブ抗体」及び「ネイティブ免疫グロブリン」は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から成る。各軽鎖は、典型的には、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されており、一方、ジスルフィド結合の個数は、様々な免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の間で様々である。各々の重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（「ＶＨ」）を有し、多数の定常ドメイン（「ＣＨ」）がそれに続く。各軽鎖は、一端にある可変ドメイン（「ＶＬ」）及び他端にある定常ドメイン（「ＣＬ」）を有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の一つ目の定常ドメインと揃い、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと揃っている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
【００６７】
用語「可変ドメイン」は、ファミリーのメンバーの間で（即ち、異なるアイソフォームの間で、または異なる種間で）、配列として幅広く異なるタンパク質のドメインを意味する。抗体に関して、用語「可変ドメイン」は、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に用いられる、抗体の可変ドメインを意味する。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しない。可変性は、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方における、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含み、これらは主としてβシート構造をとり、βシート構造を連結し且つ場合によってはβシートの部分を形成するループを形成する３つの超可変領域によって連結される。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって共に近接して保持され、且つ、他鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）、第６４７〜６６９頁を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性への抗体の関与など、種々のエフェクター機能を示す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、相補的な様式で抗原に直接結合し、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として知られる、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。
【００６９】
軽鎖の可変ドメインでは、ＣＤＲは、典型的には、残基２４−３４（ＣＤＲＬ１）、５０−５６（ＣＤＲＬ２）及び８９−９７（ＣＤＲＬ３）に対応し、重鎖の可変ドメインでは、ＣＤＲは、典型的には、残基３１−３５（ＣＤＲＨ１）、５０−６５（ＣＤＲＨ２）及び９５−１０２（ＣＤＲＨ３）に対応し（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））、且つ／又は、「超可変ループ」からの残基（即ち、軽鎖の可変ドメインでは、残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、重鎖の可変ドメインでは、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３））に対応する（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「可変フレームワーク領域」又は「ＶＦＲ」は、抗原結合ポケット及び／又は抗原と接触し得る溝の一部を形成する、フレームワーク残基を意味する。ある実施形態では、フレームワーク残基は、抗原結合ポケット又は溝の一部であるループを形成する。ループ中のアミノ酸残基は、抗原と接触してもよく、接触しなくてもよい。１つの実施形態では、ＶＦＲのループアミノ酸は、抗体、抗体重鎖、又は抗体軽鎖の三次元構造を調べることで決定される。溶媒がアクセス可能なアミノ酸部位について三次元構造を解析することができるが、これはそのような部位が、ループを形成しやすく、且つ／又は抗体の可変ドメインにおける抗原接触を提供しやすいためである。溶媒がアクセス可能な部位のなかには、アミノ酸配列の多様性を許容するものもあり得、多様性がより少ないもの（例、構造的な部位）もあり得る。抗体の可変ドメインの三次元構造は、結晶構造又はタンパク質モデリングから導き出してよい。ある実施形態では、ＶＦＲは、Ｋａｂａｔら、１９９１に従って定義された部位である、重鎖の可変ドメインのアミノ酸部位７１から７８に対応するアミノ酸部位を含み、それらから実質的になり、又はそれらからなる。ある実施形態では、ＶＦＲは、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３との間に位置するフレームワーク領域３の一部を形成する。好ましくは、ＶＦＲは、標的抗原と接触するため又は抗原結合ポケットの一部を形成するために適切に位置するループを形成する。
【００７１】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、５つの主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、そのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２）に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖の定常ドメイン（Ｆｃ）は、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンについて、サブユニットの構造及び三次元の構成が周知である。
【００７２】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ若しくは（「κ」）及びラムダ若しくは（「λ」）と呼ばれる、２つのはっきり異なるタイプのうちの１つに割り振ることができる。
【００７３】
用語「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合フラグメント」、「抗原結合ドメイン」、「抗体フラグメント」又は「抗体の機能的フラグメント」は、本発明では交換可能に使用され、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上のフラグメントを意味する（一般には、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１２９（２００５）を参照）。これに限定されないが抗体についての用語「抗原結合部分」に含まれる抗体フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる単価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４  ５４６）；並びに（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更には、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、これらは、組換えの方法を用いて、それらをＶＬ及びＶＨ領域がペアになって単価分子を形成している単一のタンパク質鎖とすることができる合成リンカーによって、連結することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３  ４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；及びＯｓｂｏｕｒｎら（１９９８）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：７７８を参照）。このような単鎖抗体もまた、抗体についての用語「抗原結合部分」に包含されることが意図される。完全なＩｇＧ分子又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを作成するために、特定のｓｃＦｖの任意のＶＨ及びＶＬ配列が、ヒト免疫グロブリンの定常領域のｃＤＮＡ又はゲノム配列に連結され得る。ＶＨ及びＶＬはまた、タンパク質化学又は組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、Ｆａｂ、Ｆｖ又は免疫グロブリンの他のフラグメントの作成にも使用され得る。二重特異性抗体（ダイアボディ）などの他の形態の単鎖抗体もまた、包含される。
【００７４】
「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ」部分は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を、ペプシン及びパパインなどのプロテアーゼで処理することによって作製することができ、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の近くで免疫グロブリンを消化することにより生成される抗体フラグメントを含む。例えば、パパインは、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断し、ＶＬ（Ｌ鎖の可変領域）及びＣＬ（Ｌ鎖の定常領域）からなるＬ鎖と、ＶＨ（Ｈ鎖の可変領域）及びＣＨγ１（Ｈ鎖の定常領域におけるγ１領域）からなるＨ鎖フラグメントとが、ジスルフィド結合によってそれらのＣ末端領域において繋がっている、２つの相同な抗体フラグメントを生成する。これらの２つの相同な抗体フラグメントの各々は、Ｆａｂ’と呼ばれる。ペプシンもまた、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断し、上記２つのＦａｂ’がヒンジ領域において繋がったフラグメントよりもわずかに大きい抗体フラグメントを生成する。この抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる。
【００７５】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン、及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）もまた含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む数個の残基が加えられていることにより、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を意味する。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々は、間にヒンジのシステインを有するＦａｂ’フラグメントのペアとして生成された。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。
【００７６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合的に堅固に会合した、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインのダイマーからなる。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に、抗原結合部位を規定する。全体としては６つの超可変領域が、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は、抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含む、半分のＦｖ）であっても、結合部位全体よりも親和性が低いとはいえ、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００７７】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般には、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、それにより、ｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することが可能となる。ｓＦｖの総説としては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９  ３１５（１９９４）を参照されたい。
【００７８】
用語「Ａｖｉｍｅｒ（商標）」は、ヒト由来の新たなクラスの治療タンパク質であって、抗体及び抗体フラグメントとは関係なく、且つＡ−ドメインと呼ばれる（クラスＡモジュール、補体型リピート（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｙｐｅ  ｒｅｐｅａｔ）若しくはＬＤＬ受容体クラスＡドメインとも呼ばれる）、いくつかのモジュラー式且つ再利用可能な結合ドメインから構成されるものを意味する。これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏエクソンシャッフリング及びファージディスプレイによって、ヒトの細胞外受容体ドメインから開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３−９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。得られたタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比べて、改善された親和性（場合によってはサブナノモーラー）及び特異性を示し得る複数の独立した結合ドメインを含み得る。例えば、米国特許出願公開公報第２００５／０２２１３８４号、同第２００５／０１６４３０１号、同第２００５／００５３９７３号並びに同第２００５／００８９９３２号、同第２００５／００４８５１２号及び同第２００４／０１７５７５６号を参照されたい。これらの各々は、本明細書中で参照することにより、全体として本明細書に組み込まれる。
【００７９】
公知の２１７個のヒトＡ−ドメインの各々は、〜３５アミノ酸（〜４ｋＤａ）を含み、ドメインは、長さとして平均５アミノ酸であるリンカーによって分離されている。ネイティブのＡ−ドメインは、主にカルシウムの結合及びジスルフィドの形成に介在されて、均一で安定な構造へと、素早く且つ効率よく折りたたまれる。１２アミノ酸のみの保存されたスキャフォールドモチーフが、この共通構造のために必要である。最終的な結果として、その各々が別個の機能を表すような複数のドメインを含む、単一のタンパク質鎖となる。該タンパク質の各ドメインは、独立して結合し、また、各ドメインのエネルギー的な寄与は相加的である。これらのタンパク質は、結合活性マルチマー（ａｖｉｄｉｔｙ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）にちなんで「Ａｖｉｍｅｒ（商標）」と呼ばれた。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「天然の」又は「天然に存在する」抗体又は抗体の可変ドメインは、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにて又は対応するハイブリドーマ細胞株から又は動物の血清から得られる分化した抗原特異的なＢ細胞からといった、非合成の供給源から同定された、抗体又は抗体の可変ドメインの配列を有する抗体又は抗体の可変ドメインを意味する。これらの抗体には、天然のものであっても、他の方法で誘導されたものであっても、任意の種類の免疫応答で産生された抗体が含まれ得る。天然の抗体には、例えばＫａｂａｔのデータベースにおいて特定されるような抗体を構成又はコードする、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列が含まれる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「合成ポリヌクレオチド」「合成遺伝子」又は「合成ポリペプチド」は、対応するポリヌクレオチド配列若しくはその部分又はアミノ酸配列若しくはその部分が、設計された、又はｄｅ  ｎｏｖｏで合成された、又は同等の天然に存在する配列と比較して改変された配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド又は合成遺伝子は、以下に限定されないが、核酸配列若しくはアミノ酸配列の化学合成又はＰＣＲ（若しくは同様の酵素的な増幅系）による増幅を含む、当該分野で公知の方法によって調製され得る。合成遺伝子は、典型的には、アミノ酸レベル若しくはポリヌクレオチドレベルのいずれかにおいて（又は両方において）、未改変の遺伝子若しくは天然に存在する遺伝子とは異なり、典型的には、合成の発現調節配列の構成内に位置する。例えば、合成遺伝子の配列には、例えば１以上のアミノ酸又はヌクレオチドの置換、欠失又は付加によって変化されたことによって、元の配列とは異なる抗体アミノ酸配列又は配列をコードするポリヌクレオチドを与える、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列が含まれ得る。合成遺伝子又はポリヌクレオチド配列は、天然の遺伝子と比較して、異なるアミノ酸を有するタンパク質を必ずしもコードしなくても良く、例えば、異なるコドンを組み込んでいるが、同一のアミノ酸をコードする（即ち、ヌクレオチドの変化がアミノ酸レベルではサイレント変異として現れる）合成ポリヌクレオチド配列をも包含し得る。１つの実施形態では、合成遺伝子は、天然に存在する又は未改変の遺伝子と比較して、ＳＨＭに対する感受性の変化を示す。合成遺伝子は、本明細書に記載の方法を用いて、反復で改変され得、且つ、その各連続的な反復において、対応するポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、全体的又は部分的に、設計された、又はｄｅ  ｎｏｖｏで合成された、又は同等の未改変の配列と比較して改変された配列に由来する。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「半合成ポリヌクレオチド」又は「半合成遺伝子」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は増幅反応のための出発物質として天然のドナー（即ち、末梢血単球）を利用する他の同様の酵素的な増幅系によって得られた核酸配列から部分的になる、ポリヌクレオチド配列を意味する。残りの「合成」ポリヌクレオチド、即ち、ＰＣＲ又は他の同様の酵素的な増幅系によって得られたものではない半合成ポリヌクレオチドの部分は、これに限定されないが核酸配列の化学合成を含む、当該技術において公知の方法を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで合成され得る。
【００８３】
用語「合成可変領域」は、ＡＩＤ活性及び／又は１つ以上のエラープローンポリメラーゼと組み合わさったときに各位置において可能な広範なアミノ酸多様性を生成し得る、最適なＳＨＭホットスポット及びホットコドンから実質的になる、合成ポリヌクレオチド配列を意味する。合成可変領域は、ＳＨＭを特異的に標的化しない、又はＳＨＭに対して耐性であるが変異誘発のための最適化された構成を与えるコドンを包含する、合成のフレームワーク配列によって分離されていてよい。
【００８４】
用語「二重特異性抗体（ダイアボディー）」は、同一のポリペプチド鎖中に、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントを意味する。同一鎖上の２つのドメインの間でペアになるのを許容するには短すぎるリンカーを使用することにより、該ドメインは、他鎖の相補的なドメインとペアになることを余儀なくされて、２つの抗原結合部位を作り出す。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；並びにＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４  ６４４８（１９９３）に、より完全に記載されている。
【００８５】
本発明の抗体はまた、ラクダ科動物及びサメの抗体などの重鎖ダイマーも含む。ラクダ科動物及びサメの抗体は、Ｖ様ドメイン及びＣ様ドメインの２つの鎖のホモダイマー対を含む（いずれも軽鎖を有さない）。ラクダ科動物の重鎖ダイマーＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用をする必要がないため、通常軽鎖と接触する重鎖中の領域は、ラクダ科動物においては、親水性のアミノ酸残基に変化している。重鎖ダイマーＩｇＧのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインと呼ばれる。サメのＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと称される）及び５つのＣ様の定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）のホモダイマーを含む。
【００８６】
ラクダ科動物においては、抗体レパートリーの多様性は、ＶＨ又はＶＨＨ領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３によって決定される。ラクダのＶＨＨ領域中のＣＤＲ３は、平均１６アミノ酸と、比較的長い長さであることを特徴とする（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（９）：１１２９）。これは、多くの他種の抗体のＣＤＲ３領域とは対照的である。例えば、マウスＶＨのＣＤＲ３では、平均９アミノ酸である。
【００８７】
ラクダ科動物の可変領域のｉｎ  ｖｉｖｏでの多様性を維持している、ラクダ科動物由来の抗体可変領域のライブラリーは、例えば、２００５年２月１７日に公開された米国特許出願第２００５００３７４２１号に記載の方法により、作製することができる。
【００８８】
「ヒト化」型の非ヒト（例、マウス）抗体は、非ヒトの免疫グロブリンに由来する最少配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、その殆どの部分について、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ若しくは非ヒト霊長類などの非ヒト種由来（ドナー抗体）の超可変領域の残基で置換されたヒトの免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒトの免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒトの残基で置換される。更には、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能を更に洗練させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に一致し、且つＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲに一致している、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み得る。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（例えば、ヒトの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部）もまた含むであろう。更なる詳細のためには、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  ３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ２：５９３  ５９６（１９９２）を参照されたい。
【００８９】
本発明の「ヒト化抗体」としては、ライブラリー由来のポリヌクレオチドの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ体細胞超変異による親和性成熟によって調製された、合成及び半合成の抗体が挙げられる。特に、モノクローナル抗体であって、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域の一部又は全部が、非ヒトモノクローナル抗体に由来し、可変領域の実質的に全ての残りの部分が、本明細書に記載されるように、ヒト可変領域の鋳型に由来し（重鎖と軽鎖の両方）、且つ定常領域が、同様に本明細書に記載されるように、ヒト定常領域の鋳型由来である、前記モノクローナル抗体が挙げられる。１つの態様において、そのような非ヒトＣＤＲ配列は、体細胞超変異に最適化された合成ポリヌクレオチド配列を含み、且つ例えば好ましいＳＨＭホットスポットコドンといった、好ましいＳＨＭコドンを含む。１つの実施形態において、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、非ヒト抗体に由来する。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体（即ち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る自然に生じ得る変異を除いて同一である）の集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位を対象とする。更には、異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含む従来の（ポリクローナルな）抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるような抗体の性質を示しており、何らかの特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作製され得る。特定の実施形態において、「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４  ６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１  ５９７（１９９１）に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００９１】
他の実施形態では、モノクローナル抗体は、飽和硫酸アンモニウム沈殿、オイグロブリン沈殿法、カプロン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ若しくはＤＥ５２）、又は抗免疫グロブリンカラム若しくはプロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、上述の培養上清又は腹水から単離及び精製され得る。
【００９２】
本発明のポリクローナル抗体（抗血清）又はモノクローナル抗体は、公知の方法により作製され得る。即ち、哺乳類、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ若しくはウシ、又はより好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット若しくはウサギを、例えば上で述べた抗原で、必要であればフロインドアジュバントとともに、免疫する。ポリクローナル抗体は、こうして免疫された動物から得られた血清から得ることができる。モノクローナル抗体は、以下のようにして作製される。こうして免疫された動物から得られた抗体産生細胞を、自己抗体を産生できないミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製する。続いて該ハイブリドーマをクローン化し、該哺乳動物を免疫するのに使用した抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンをスクリーニングする。
【００９３】
「単離された特異的結合メンバー」とは、その天然環境の成分から、同定され、分離及び／又は回収された特異的結合メンバーである。天然環境での混入成分は、特異的結合メンバーの診断又は治療用途を妨げる物質であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性若しくは非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、（１）Ｌｏｗｒｙ又は類似のアッセイ方法による測定で、９５重量％を超えて、最も好ましくは９９重量％を超えて、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することにより、Ｎ末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー、又は好ましくは銀染色を用いた、非還元条件下又は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性にまで、精製される。単離された特異的結合メンバーとしては、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕのものが挙げられる。これは、特異的結合メンバーの天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないであろうためである。しかしながら、通常は、単離された特異的結合メンバーは、少なくとも１つの精製工程により調製されるであろう。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「細胞内抗体又はそのフラグメント」は、細胞内で発現及び機能する抗体を意味する。細胞内抗体は、典型的には、ジスルフィド結合を欠き、その特異的結合活性を通じて、標的遺伝子の発現又は活性を調節することができる。細胞内抗体は、単離されたＶＨ及びＶＬドメイン並びにｓｃＶＶのような、単一のドメインフラグメントを含む。細胞内抗体は、標的タンパク質が位置する細胞内区画において高濃度で該細胞内抗体が発現されるのを可能とする、該細胞内抗体のＮ末端又はＣ末端に取り付けられた細胞内輸送シグナルを含み得る。標的遺伝子との相互作用で、細胞内抗体は、標的タンパク質の分解の加速、標的タンパク質の非生理的な細胞内区画への隔離などの機構により、標的タンパク質の機能を調節し、且つ／又は表現型／機能のノックアウトを達成する。細胞内抗体介在性の遺伝子不活性化の他の機構は、標的タンパク質上の触媒部位への結合、又はタンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、若しくはタンパク質−ＲＮＡの相互作用に関与するエピトープへの結合など、細胞内抗体が対象とするエピトープに依存し得る。１つの実施形態では、細胞内抗体は、ｓｃＦｖである。
【００９５】
本発明の「タンパク質又はそのフラグメントに反応する抗体を産生する細胞」とは、上記本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを産生する任意の細胞を意味する。
【００９６】
用語「生殖系列遺伝子セグメント」は、生殖系列（一倍体の配偶子及びそれらが形成される由来である二倍体細胞）の遺伝子を意味する。生殖系列のＤＮＡは、単一の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖をコードする多数の遺伝子セグメントを含む。これらの遺伝子セグメントは生殖細胞中に保有されるが、それらが機能的な遺伝子にされるまでは、重鎖又は軽鎖への転写及び翻訳はされ得ない。骨髄におけるＢ細胞分化の間に、これらの遺伝子セグメントは、１０８を超える特異性を生み出すことが可能な、動的な遺伝子系により、ランダムにシャッフルされる。これらの遺伝子セグメントの殆どは公開され、生殖系列のデータベースによって集められている。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ライブラリー」は、２つ又は２つ以上の同一でないが関連するメンバーの集まりを含む、複数のポリヌクレオチド、タンパク質又は細胞を意味する。「合成ライブラリー」は、複数の合成ポリヌクレオチド、又は複数の合成ポリヌクレオチドを含む細胞集団を意味する。「半合成ライブラリー」は、複数の半合成ポリヌクレオチド、又は複数の半合成ポリヌクレオチドを含む細胞集団を意味する。「シードライブラリー」は、ＳＨＭ（例、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異）のための基質として作用するように改変されており、且つ体細胞超変異が作用したときに、ｉｎ  ｓｉｔｕでポリヌクレオチド、タンパク質又は細胞のライブラリーを作り出すことができる１つ以上の配列又はその部分を含む、１以上の合成若しくは半合成ポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含む細胞の複数を意味する。
【００９８】
「抗原」は、適切な条件下で、特異的な免疫応答を誘導でき、且つ該応答の産生物（即ち、特異的抗体又は特異的に感作されたＴリンパ球、或いはその両方）と反応できる物質を意味する。抗原は、毒素及び外来タンパク質などの可溶性物質、又は細菌及び組織細胞などの粒子であり得る。しかしながら、抗原決定基（エピトープ）として知られるタンパク質又は多糖類分子の一部分のみが、抗体又はリンパ球上の特異的受容体と結合する。より広範には、用語「抗原」は、免疫原性であろうがなかろうが、抗体が結合するか又は抗体が所望される任意の物質を意味するために使用され得る。そのような抗原に対して、抗体は、どんな免疫応答とも無関係に、組換えの方法によって同定され得る。
【００９９】
用語「親和性」は、２つの物質の可逆的な結合の平衡定数を意味し、Ｋｄとして表される。エピトープに対する抗体の親和性など、リガンドに対するタンパク質の結合の親和性は、例えば約１００ナノモーラー（ｎＭ）から約０．１ｎＭ、約１００ｎＭから約１ピコモーラー（ｐＭ）、又は約１００ｎＭから約１フェムトモーラー（ｆＭ）であり得る。用語「結合活性」は、２以上の物質の複合体についての希釈後の解離に対する抵抗を意味する。
【０１００】
「エピトープ」は、抗原又は他の巨大分子における、抗体の可変領域の結合ポケットと結合相互作用を形成し得る部分を意味する。エピトープは、直鎖状のペプチド配列（即ち、「連続的」）であり得るか、又は、不連続なアミノ酸配列（即ち、「コンフォメーショナル」若しくは「不連続的」）から構成され得る。抗体又は抗原結合フラグメントは、１つ以上のアミノ酸配列を認識し得る。それゆえエピトープは、１つより多くの異なるアミノ酸配列を規定し得る。抗体又は抗原結合フラグメントによって認識されるエピトープは、ペプチドマッピング及び当業者に周知の配列解析技術によって決定され得る。典型的には、そのような結合相互作用は、ＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基との分子間接触として明示される。抗原の結合には、しばしば、ＣＤＲ３又はＣＤＲペアが関与する。
【０１０１】
「潜在性（ｃｒｉｐｔｉｃ）エピトープ」又は「潜在的な結合部位」とは、ポリペプチドの少なくとも１つの天然のコンフォメーションにおいては、露出されていないか若しくは認識から実質的に保護されているが、ポリペプチドの第２のコンフォメーションにおいては、又は変性され若しくはタンパク質分解されたポリペプチドにおいては、抗体又は抗原結合フラグメントによって認識され得る、エピトープ又はタンパク質配列の結合部位である。ポリペプチド構造の１つの特定の天然のコンフォメーションにおいてのみ、露出されていないか、又は一部のみが露出されているアミノ酸配列は、潜在性エピトープの可能性がある。エピトープが露出されていないか、又は一部のみが露出されている場合、エピトープは、ポリペプチドの内部に埋もれているか、又は巨大分子構造との相互作用により隠されている可能性がある。潜在性エピトープの候補は、例えば、天然のポリペプチドの三次元構造を調べることによって特定することができる。
【０１０２】
用語「特異的」は、特異的結合ペアの１つのメンバーが、その特異的結合パートナー以外の分子には、何らの有意な結合を示さない状況を表すために使用され得る。該用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが多数の抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも適用され、この場合、該抗原結合ドメインを保有する特異的結合のメンバーは、該エピトープを保有する種々の抗原に対して結合することができるであろう。
【０１０３】
用語「結合」は、例えば共有的、静電的、疎水的、及びイオン性及び／又は水素結合の相互作用による、生理的条件下での２分子間の直接的な会合を意味し、塩橋及び水架橋などの相互作用を含む。
【０１０４】
用語「特異的結合メンバー」とは、互いに対して結合特異性を有する分子ペアのメンバーを表す。特異的結合ペアのメンバーは、天然に由来するものであっても、又は全体的若しくは部分的に合成により生成されたものであってもよい。分子ペアの１つのメンバーは、分子ペアの他方のメンバーの特定の立体的及び極性の機構に特異的に結合し、従って相補的である領域を、その表面又は空洞に有する。従って、ペアのメンバーは、互いに対して特異的に結合する特性を有する。特異的結合ペアの種類の例としては、抗原−抗体、Ａｖｉｍｅｒ（商標）−基質、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、タンパク質−タンパク質、及び酵素−基質が挙げられる。
【０１０５】
用語「アジュバント」は、免疫応答（特に抗原に対する免疫応答）を増強する、化合物又は混合物を意味する。アジュバントは、抗原を徐放する組織デポとして、及び非特異的に免疫応答を増強するリンパ系のアクチベーターとしても、機能し得る（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、１９８４、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｐ．３８４）。アジュバントの非存在下での抗原のみでの最初のチャレンジでは、液性又は細胞性免疫応答は引き起こされないことがしばしばである。既に知られ且つ利用されているアジュバントとしては、以下に限定されないが、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの表面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、油性若しくは炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用であるヒトアジュバントが挙げられる。無機塩アジュバントとしては、以下に限定されないが：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、水酸化亜鉛及び水酸化カルシウムが挙げられる。好ましくは、アジュバント組成物は、約１０％（重量比）の植物油及び約１−２％（重量比）のリン脂質を含む脂肪エマルジョンの脂質を更に含む。好ましくは、アジュバント組成物は、連続的な水相中に分散した油状粒子を有し、エマルジョンを形成するポリオールを約０．２％（重量比）から約４９％（重量比）の量で有し、エマルジョンを形成する最大１５％（重量比）の量の代謝可能な油を任意に有し、且つエマルジョンを安定化させる最大約５％（重量比）の量のグリコールエーテルベースの界面活性剤を任意に有する、エマルジョン形態を任意で更に含む。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「免疫調節剤」は、免疫応答を調節することができる剤を意味する。そのような調節の例は、抗体産生の増強である。
【０１０７】
抗原からなる組成物又はワクチンへの「免疫学的応答」とは、宿主内における、目的の組成物又はワクチンに対する細胞介在性及び／又は抗体介在性の免疫応答の発達である。通常、そのような応答は、目的の組成物又はワクチンに含まれる抗原を特異的に対象とする、抗体を産生する主体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞からなる。
【０１０８】
分子生物学の用語
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、複素環塩基、糖、及び１以上のリン酸基からなる、ポリヌクレオチドのモノマー単位を意味する。天然に存在する塩基（グアニン、（Ｇ）、アデニン、（Ａ）、シトシン、（Ｃ）、チミン、（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ））は、典型的には、プリン又はピリミジンの誘導体であるが、天然に存在する及び天然に存在しない塩基アナログも含まれることを理解すべきである。天然に存在する糖は、ペントース（５炭素の糖）デオキシリボース（ＤＮＡを形成する）又はリボース（ＲＮＡを形成する）であるが、天然に存在する及び天然に存在しない糖アナログも含まれることを理解すべきである。核酸は、典型的には、リン酸結合を介して結合し、核酸又はポリヌクレオチドを形成するが、他の多くの結合が当該分野において公知である（以下に限られないが、ホスホロチオエート及びボラノリン酸など）。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかである。これらの用語は、分子の一次構造に関し、従って、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。該用語は、同等のものとして、ヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログ、並びに以下に限定されないがメチル化及び／又はキャップポリヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含む。
【０１１０】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形又は二本鎖ヘリックスのいずれかの、デオキシヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）のポリマー形態を意味する。この用語は、分子の一次構造及び二次構造のみについて言及しており、いかなる特定の三次的な形態に限るものではない。従ってこの用語は、とりわけ、直鎖ＤＮＡ分子（例、制限酵素フラグメント）、ウイルス、プラスミド及び染色体で見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合、配列は、ＤＮＡの転写されない鎖（即ち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与える通常の慣例に従って本明細書では記載され得る。
【０１１１】
ＤＮＡの「コード配列」又は「コード領域」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、適当な発現調節配列の調節下に置かれた場合に、転写され且つポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列（「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」）の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、以下に限定されないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得る。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。用語「非コード配列」又は「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないポリヌクレオチド配列の領域（例、５’及び３’非翻訳領域）を意味する。
【０１１２】
用語「リーディングフレーム」は、二本鎖ＤＮＡ分子についての各方向毎に３つの、可能な６つのリーディングフレームのうちの１つを意味する。使用されるリーディングフレームが、ＤＮＡ分子のコード配列内において、アミノ酸をコードするのにどのコドンを使うかを決定する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「アンチセンス」核酸分子は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的（例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的、又は、遺伝子のコード鎖に相補的）な、ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンスの核酸分子は、センスの核酸分子に水素結合することができる。
【０１１４】
用語「塩基対」又は（「ｂｐ」）：二本鎖ＤＮＡ分子における、アデニン（Ａ）のチミン（Ｔ）とのパートナーシップ、又はシトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）とのパートナーシップである。ＲＮＡでは、ウラシル（Ｕ）がチミンの代わりになる。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「コドン」は、転写及び翻訳された場合に、単一のアミノ酸残基をコードする；又はＵＵＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧの場合は停止シグナルをコードする、３ヌクレオチドを意味する。アミノ酸をコードするコドンは当該技術分野で周知であり、本明細書での便宜のため、表１にて与えられる。
【０１１６】
【表１−１】
0005675109.tif 000002
【０１１７】
【表１−２】
0005675109.tif 000003
【０１１８】
ＡＡ：アミノ酸；Ａｂｂｒ；略称。上に明記したコドンは、ＲＮＡ配列のためのものであることを理解すべきである。ＤＮＡのための対応するコドンは、Ｕの代わりにＴとなる。最適なコドン用法は、例えば、ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．からのプログラム“Ｈｕｍａｎ−Ｈｉｇｈ．ｃｏｄ”からのコドン用法表に示されるように、発現される遺伝子についてのコドン利用頻度により示される。コドン用法は、例えば、Ｒ．Ｎｕｓｓｉｎｏｖ、“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ”、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １４９：１２５−１３１（１９８１）にも記載されている。高度に発現するヒト遺伝子において最も頻繁に使用されるコドンは、ヒト宿主細胞における発現のための最適なコドンであって、合成のコード配列を構築するための基礎となると推測される。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「揺らぎ位置」は、コドンの三番目の位置を意味する。コドンの揺らぎ位置におけるＤＮＡ分子内の変異は、典型的には、アミノ酸レベルでは、サイレント変異又は保存的変異となる。例えばグリシンをコードするコドンは４つ、即ち、ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ及びＧＧＧであるため、いかなる揺らぎ位置ヌクレオチドの任意の他のヌクレオチドへの変異も、コードされるタンパク質のアミノ酸レベルでの変化をもたらさず、従って、サイレント置換である。
【０１２０】
即ち、「サイレント置換」又は「サイレント変異」とは、コドン内のヌクレオチドが改変されているが、該コドンによってコードされるアミノ酸残基の変化を生じないものである。例としては、コドンの３番目の位置での変異、並びにＡＧＧに変異してもなおアミノ酸のアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）をコードするコドン「ＣＧＧ」など、特定のコドンの１番目の位置における変異が挙げられる。
【０１２１】
語句「保存的アミノ酸置換」又は「保存的変異」は、あるアミノ酸を、共通の特性を持つ別のアミノ酸で置き換えることを意味する。個々のアミノ酸の間の共通の特性を定義する有効な方法は、同種生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化した頻度を解析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような解析に従って、グループ内のアミノ酸が優先的に互いに交換され、従って、タンパク質の全体構造に対する影響が互いに最も似ているアミノ酸のグループが、定義され得る（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。
【０１２２】
このようにして定義されたアミノ酸グループの例としては：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる「荷電／極性グループ」；Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる「芳香族又は環状グループ」；並びにＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓからなる「脂肪族のグループ」が挙げられる。
【０１２３】
各グループ内でサブグループも特定することができ、例えば、荷電／極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる「正に荷電したサブグループ」；Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる「負に荷電したサブグループ」、並びにＡｓｎ及びＧｌｎからなる「極性サブグループ」からなるサブグループに更に分類され得る。
【０１２４】
芳香族又は環状グループは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる「窒素環サブグループ」；並びにＰｈｅ及びＴｙｒからなる「フェニルサブグループ」からなるサブグループに更に分類され得る。
【０１２５】
脂肪族グループは、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる「大きい脂肪族の非極性サブグループ」；Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓからなる「脂肪族のわずかに極性のサブグループ」；並びにＧｌｙ及びＡｌａからなる「小さい残基のサブグループ」からなるサブグループに更に分類され得る。
【０１２６】
保存的変異の例としては、上記のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換が挙げられ、例えば、ＬｙｓをＡｒｇにする及びその逆（正電荷が維持され得る）；ＧｌｕをＡｓｐにする及びその逆（負電荷が維持され得る）；ＳｅｒをＴｈｒにする（遊離の−ＯＨが維持され得る）；並びに、ＧｌｎをＡｓｎにする（遊離の−ＮＨ２が維持され得る）、といったものである。
【０１２７】
「半保存的変異」としては、上で挙げた同じグループであって、同一のサブグループを共有しないアミノ酸のアミノ酸置換が挙げられる。例えば、Ａｓｎに対するＡｓｐ、又はＬｙｓに対するＡｓｎの変異は全て、同一グループ内であるが異なるサブグループ内のアミノ酸を伴う。
【０１２８】
「非保存的変異」は、例えばＬｅｕに対するＬｙｓ又はＳｅｒに対するＰｈｅなど、異なるグループ間でのアミノ酸置換を伴う。
【０１２９】
用語「アミノ酸残基」は、カルボキシル基のＯＨ部分及びアルファアミノ基のＨ部分を除去することにより、対応するアルファアミノ酸から得られるラジカルを意味する。殆どの部分について、本願において使用されるアミノ酸は、アミノ基及びカルボキシル基を含む、タンパク質に見られる天然に存在する、又はそのようなアミノ酸の天然に存在する同化若しくは異化生成物である。或いは、他のタンパク質、毒素、小有機化合物又は抗癌剤への化学的結合を促進するために、非天然のアミノ酸をタンパク質に組み入れることもできる（Ｄａｔｔａら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．（２００２）１２４（２０）：５６５２−３）。一般に、アミノ酸及び保護基を記載するために本明細書で用いられる略称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコミッション推奨の生化学命名法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７２）１１：１７２６−１７３２を参照）に基づく。用語「アミノ酸残基」にはまた、本明細書で言及される任意の特定のアミノ酸のアナログ、誘導体及び同類物（コンジェナー）、並びにＣ末端若しくはＮ末端を保護されたアミノ酸誘導体（例、Ｎ末端若しくはＣ末端保護基にて修飾されたもの）も含まれる。例えば、本発明は、カルボキシル基、アミノ基、又は環化のための他の反応性の前駆体官能基を与えながらも、側鎖を長く又は短くしたアミノ酸アナログ、並びに適当な官能基を持つ変種側鎖を有するアミノ酸アナログの使用を意図する。
【０１３０】
用語「アミノ酸側鎖」は、Ｋ．Ｄ．Ｋｏｐｐｌｅによる“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ”、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＡｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９６、第２頁及び３３頁にて定義されたように、−ＣＨ−（ＮＨ２）ＣＯＯＨ部分を除いたアミノ酸の部分である；一般的なアミノ酸のそのような側鎖の例としては、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニンの側鎖）、−ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２ＣＨ３（イソロイシンの側鎖）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖）又はＨ−（グリシンの側鎖）である。
【０１３１】
本明細書にて記載されるアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」異性体である。しかしながら、抗体（免疫グロブリン）結合の所望の機能特性がポリペプチドによって維持される限り、任意のＬアミノ酸残基を「Ｄ」異性体の残基で置換することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を意味する。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシル基を意味する。
【０１３２】
「アミノ酸モチーフ」とは、アミノ酸の配列で、特定の機能的活性に関連するアミノ酸であり、場合によっては、保存されたアミノ酸の総称的な集合である。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、隣接するアミノ酸残基のアルファアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結された任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを意味するために交換可能に使用される。ポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、直鎖ポリマー、分岐鎖ポリマー又は環状形で存在し得る。これらの用語はまた、翻訳後にｉｎ  ｖｉｖｏで修飾される形態又は合成中に化学的に修飾される形態も含む。
【０１３４】
本明細書において、全てのアミノ酸残基配列は、その左右の方向がアミノ末端からカルボキシル末端へという慣習的な方向である式によって表現されていることに留意すべきである。更には、アミノ酸残基配列の始まり又は終わりのダッシュは、１以上のアミノ酸残基の更なる配列へのペプチド結合を示すことを留意すべきである。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」、「組換え遺伝子」及び「遺伝子コンストラクト」は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子の部分を意味する。ＤＮＡ分子は、（エクソン配列として）タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み得、且つイントロン配列を更に含み得る。本明細書で使用される場合、用語「イントロン」は、タンパク質に翻訳されず、一般にエクソンの間に見出される、所与の遺伝子中に存在するＤＮＡ配列を意味する。通常、望ましくは、遺伝子は、１以上のプロモーター、エンハンサー、リプレッサー及び／又は遺伝子の活性若しくは発現を調節するための当該分野で周知の他の調節配列に対して作動可能に連結され得る（或いは、それらを有し得る）。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、用語「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」には、ｍＲＮＡの逆転写によって合成され且つ介在する配列（イントロン）が取り除かれた組換えポリヌクレオチドが含まれる。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、機能的に関係するような又は互いに連結されているような、二つのポリヌクレオチド領域間の関係を示す。例えば、プロモーター（又は他の発現調節配列）は、コード配列の転写を調節している（且つ、それを生じさせ得る）場合、該コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたプロモーターは、一般にコード配列の上流に位置するが、必ずしもそれに隣接している必要はない。
【０１３８】
「発現調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの、宿主細胞におけるコード配列の発現を与えるＤＮＡ調節配列である。例示的な発現調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。
【０１３９】
「プロモーター」は、細胞内でのＲＮＡポリメラーゼとの結合及び下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本明細書で使用される場合、プロモーター配列は、その３’末端では転写開始部位が境界となり、且つバックグランドよりも高く検出され得るレベルの転写を開始させるのに必要な、最小数の塩基又はエレメントを含むように、上流（５’方向）へ広がる。転写開始部位（簡便には、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより定義される）、並びに、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）は、プロモーター配列内に見出されるであろう。真核生物のプロモーターは、常にではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含むであろう。原核生物のプロモーターは、−１０及び−３５のコンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガノ配列を含む。
【０１４０】
種々の異なる由来からの、構成的、誘導性及び抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当該技術分野で周知である。代表的な由来としては、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母及び細菌細胞の種類）が挙げられ、これらの由来からの好適なプロモーターは容易に入手可能であるか、或いは、オンライン又は例えばＡＴＣＣなどの寄託機関、並びに他の商業的若しくは個人的なソースから一般に入手可能な配列に基づいて合成により作製することができる。プロモーターは、一方向性（即ち、一方向で転写を開始させる）であっても、二方向性（即ち、３’若しくは５’のいずれの方向でも転写を開始させる）であってもよい。プロモーターの非限定的な例としては、例えば、Ｔ７バクテリア発現系、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）バクテリア発現系、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、Ｔｅｔ系（米国特許５，４６４，７５８号及び５，８１４，６１８号）、エクダイソン誘導系（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３（８）：３３４６−３３５１；Ｔ−ＲＥＸＴＭ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌａｃ  Ｓｗｉｔｃｈ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））並びにＣｒｅ−ＥＲＴ  タモキシフェン誘導性リコンビナーゼ系（Ｉｎｄｒａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９９）２７（２２）：４３２４−４３２７；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（２３）ｅ９９；米国特許第７，１１２，７１５号）（一般には、Ｋｒａｍｅｒ及びＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３０８：１２３−１４４）を参照）、或いは所望の細胞での発現に好適な、当該技術分野で公知の任意のプロモーターが挙げられる。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「最小プロモーター」は、転写開始部位を規定するが、それ自体では、たとえ出来たとしても、効率的に転写を開始させることができない、部分的なプロモーター配列を意味する。このような最小プロモーターの活性は、テトラサイクリン調節性トランスアクチベーターなどのアクチベーターの、作動可能に連結された結合部位への結合に依存する。
【０１４２】
用語「ＩＲＥＳ」又は「内部リボソーム侵入部位」は、ポリシストロニックなメッセンジャーＲＮＡでコードされるコード配列の翻訳を増強するように作用する、ポリヌクレオチドのエレメントを意味する。ＩＲＥＳエレメントは、典型的なリボソームスキャニングに関与する７−メチルグアノシンキャップをバイパスして、リボソームをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に直接集めて結合させることにより、翻訳の開始を仲介する。ＩＲＥＳ配列の存在により、所望のタンパク質のキャップ非依存的な翻訳のレベルが増加され得る。初期の刊行物においては、ＩＲＥＳ配列は、記述として「翻訳エンハンサー」と呼ばれている。例えば、カルジオウイルスＲＮＡの「翻訳エンハンサー」が、Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇらに対する米国特許第４，９３７，１９０号、及びＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅに対する米国特許第５，７７０，４２８号に記載されている。
【０１４３】
用語「核局在化シグナル」及び「ＮＬＳ」は、タンパク質又はポリヌクレオチドの核移行、又は細胞の核内でのその保持を仲介することができるドメイン（単数又は複数）を意味する。「強力な核移行シグナル」とは、目的のタンパク質に作動可能に連結された場合に、細胞内局在の９０％より多くを核内に仲介できるドメイン（単数又は複数）を表す。ＮＬＳの代表例としては、以下に限定されないが、単極性（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）核局在化シグナル、二極性（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）核局在化シグナル並びにＮ及びＣ末端モチーフが挙げられる。Ｎ末端の塩基性ドメインは、通常、ＳＶ４０ラージＴ抗原で最初に発見され単極性ＮＬＳを示す、コンセンサス配列Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒに従う。Ｎ末端の塩基性ドメインＮＬＳの非限定的な１つの例は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４３９）である。ヌクレオプラスミンのＮＬＳ：ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号４５０）に例示される、約１０アミノ酸のスペーサーで分離された２つの塩基性アミノ酸クラスターを含む、二極性核局在化シグナルもまた知られている。Ｎ及びＣ末端モチーフとしては、例えば、ｈｎＲＮＰ  Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母の転写リプレッサーＭａｔα２における配列ＫＩＰＩＫ（配列番号４６４）及びＵ ｓｎＲＮＰの複合シグナルが挙げられる。これらのＮＬＳの大部分は、インポーチンβファミリーの特異的受容体によって直接認識されるようである。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、用語「エンハンサー」は、例えば、それが作動可能に連結されている遺伝子又はコード配列の転写を増加させるＤＮＡ配列を意味する。エンハンサーは、コード配列から何キロベースも離れて位置していてもよく、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化パターン、又はＤＮＡ構造の変化を仲介し得る。種々の異なる由来からの多数のエンハンサーが当該分野において周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、又はクローニングされたポリヌクレオチド内で、（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関並びに他の商業的若しくは個人のソースから）入手可能である。（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなどの）プロモーターを含む多数のポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含む。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、又は下流に位置し得る。用語「Ｉｇエンハンサー」は、Ｉｇ遺伝子座内にマップされたエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメントを意味する（そのようなエンハンサーとしては、例えば、重鎖（ミュー）５’エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’エンハンサー、カッパ及びミューのイントロンエンハンサー、並びに３’エンハンサーなどが挙げられる（一般には、Ｐａｕｌ  ＷＥ（編）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）第３５３−３６３頁；米国特許第５，８８５，８２７号を参照）。
【０１４５】
「転写終結配列（ターミネーター配列）」とは、転写の終結をもたらす配列である。転写終結配列は当該分野で公知であり、これに限定されないが、ポリＡ（例、ＢｇｈポリＡ及びＳＶ４０ポリＡ）ターミネーターが挙げられる。転写終結シグナルは、典型的には、３’非翻訳領域（即ち、「３’ｕｔ」）、任意のイントロン（介在配列又は「ＩＶＳ」とも呼ばれる）及び１以上のポリアデニル化シグナル（「ｐ（Ａ）」又は「ｐＡ」の領域を含むであろう。転写終結配列はまた、「ＩＶＳ−ｐＡ」、「ＩＶＳ＋ｐ（Ａ）」、「３’ｕｔ＋ｐ（Ａ）」又は「３’ｕｔ／ｐ（Ａ）」とも呼ばれることがある。ターミネーター領域としては、天然又は合成のターミネーターが使用され得る。
【０１４６】
用語「ポリアデニル化」、「ポリアデニル化配列」及び「ポリアデニル化シグナル」、「ポリＡ」、「ｐ（Ａ）」又は「ｐＡ」は、ポリアデニル転移酵素の存在下において転写物がポリアデニル化されるのを可能とする、ＲＮＡ転写物中に存在する核酸配列を意味する。多くのポリアデニル化シグナルが当該分野において知られている。非限定的な例としては、ヒトバリアント成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、用語「スプライス部位」は、真核生物細胞のスプライス機構によって、切断及び／又は対応するスプライス部位へのライゲーションのために好適であると認識され得るポリヌクレオチドを意味する。スプライス部位は、プレｍＲＮＡ転写物中に存在するイントロンの切断を可能とする。典型的には、スプライス部位の５’部分は、スプライスドナーと呼ばれ、対応する３’スプライス部位は、アクセプタースプライス部位と呼ばれる。スプライス部位という用語には、例えば、天然に存在するスプライス部位、遺伝子工学的なスプライス部位、例えば合成のスプライス部位、標準的即ちコンセンサスのスプライス部位、及び／又は、例えば潜在性スプライス部位といった非標準的なスプライス部位が含まれる。
【０１４８】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれ得る。この配列は、ポリペプチドのＮ末端側のシグナルペプチドをコードし、宿主細胞に対して、該ポリペプチドを細胞表面へ向かわせること、又は該ポリペプチドを培地中へ分泌させることを知らせ、また、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に、宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物及び真核生物に由来する種々のタンパク質と関連して見出すことができる。
【０１４９】
「翻訳語修飾」は、翻訳が完了した後に、及びリボソームから放出された後に、或いは新生ポリペプチドの翻訳と同時にタンパク質が被る、共有結合性の修飾を含むいずれか１つの修飾又はその組み合わせを包含し得る。翻訳後修飾としては、以下に限定されないが、リン酸化、ミリスチル化、ユビキチン化、グリコシル化、コエンザイム付加、メチル化、Ｓ−ニトロシル化及びアセチル化が挙げられる。翻訳語修飾は、タンパク質の活性、細胞内若しくは細胞外の行き先、安定性若しくは半減期、及び／又はリガンド、受容体若しくは他のタンパク質による認識を調節し得るか、或いはそれらに影響し得る。翻訳後修飾は、細胞オルガネラ内、核内又は細胞質内、或いは細胞外で起こり得る。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチドであって、精製された制限消化物として天然に存在するものであれ、合成により生成されたものであれ、核酸鎖に相補的なプライマーの伸長生成物の合成が誘導される条件下、即ち、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導因子が存在し、且つ適切な温度及びｐＨの条件下に置かれた時に、合成の開始位置として機能し得る、前記オリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいが、誘導因子の存在下で所望の伸長生成物の合成を開始させるのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの由来、及び方法の使用など、多くの要因に依存するであろう。例えば、診断用途のためには、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、それより少ないヌクレオチドを含み得るが、典型的には、１５から約２５又はそれより多くのヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドプライマーは、例えば、ホスホトリエステル法又は（ｏｎ）ホスホジエステル法などのような任意の適切な方法を用いて調製することができる（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０（１９７９）；米国特許第４，３５６，２７０号；及びＢｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９（１９７９）を参照）。
【０１５１】
本明細書でのプライマーは、特定の標的ポリヌクレオチド配列の異なる鎖に対して、「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーが、それぞれの鎖に対してハイブリダイズするために十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映していなくてもよい。例えば、残りのプライマー配列が鎖に相補的であるようにしつつ、非相補的なヌクレオチドフラグメントをプライマーの５’末端に取り付けることができる。或いは、プライマー配列が、鎖の配列とハイブリダイズし、それによって伸長生成物の合成のための鋳型を形成するために十分相補的であれば、非相補的な塩基又はより長い配列をプライマー中に散在させてもよい。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」は、細菌の酵素であって、その各々が、二本鎖のＤＮＡを、特定のヌクレオチド配列において又はその近くで切断するものを意味する。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、用語「多重クローニング部位」は、１つ以上の異なる制限酵素を認識し得る、ベクターポリヌクレオチドのセグメントを意味する。
【０１５４】
「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡ複製の自律的な単位として機能する；即ち、それ自身の制御下で複製が可能であり且つ自律的な複製配列を含む、任意の遺伝エレメント（例、プラスミド、エピソーム、染色体、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルス）である。
【０１５５】
「ベクター」又は「クローニングベクター」は、それに対して別のポリヌクレオチドセグメントを導入して、該挿入されたセグメントの複製を惹起することができる、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、典型的には、環状、二本鎖ＤＮＡとして存在し、数キロベース（ｋｂ）から（ｆｏｒｍ）数百ｋｂのサイズに及ぶ。好ましいクローニングベクターは、ポリヌクレオチド配列のクローニング及び組換え操作を容易にするため、天然に存在するプラスミドから改変されたものである。そのような多くのベクターが、当該分野において周知である；例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８９））、Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｖｏｌ．３、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ｐｐ．５６３−６０８（１９８０））を参照されたい。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、宿主細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系において、あるポリヌクレオチドを発現するために使用される因子を意味する。該用語は、プラスミド、エピソーム、コスミド、レトロウイルス又はファージを含み；発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させるために使用することができ、１つの態様では、発現調節配列のアセンブリーを含む転写ユニットを含む。プロモーター及び他の調節エレメントの選択は、一般には、対象とする宿主細胞又はｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現系により異なる。
【０１５７】
「エピソーム発現ベクター」は、宿主細胞において複製可能であり、適切な選択圧の存在下で、宿主細胞内において、ＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する（例えば、Ｃｏｎｅｓｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１  １７３５−１７４２（２００４）を参照のこと）。代表的な市販のエピソーム発現ベクターとしては、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソームプラスミドが挙げられるがこれに限定されない。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３．１、並びにＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１及びｏｒｉＰの代わりにＴ抗原及びＳＶ４０複製起点を使用するエピソームベクターの非限定的な例を示す。
【０１５８】
「組込み発現ベクター」は、宿主細胞のＤＮＡ中にランダムに組み込まれ得るか、発現ベクターと宿主細胞染色体との間の特異的組換えを可能にする組換え部位を含み得る。このような組込み発現ベクターは、所望のタンパク質の発現をもたらすために、宿主細胞染色体の内因性発現制御配列を利用できる。部位特異的な様式で組み込まれるベクターの例としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｆｌｐ−ｉｎ系（例えば、ｐｃＤＮＡＴＭ５／ＦＲＴ）又はｃｒｅ−ｌｏｘ系（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６  Ｃｏｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ中に見出され得る）の成分が挙げられる。ランダムな様式で宿主細胞染色体中に組み込まれるベクターの例としては、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入する場合）、ＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩ又はｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）が挙げられる。
【０１５９】
代表的な市販のウイルス発現ベクターには以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．から入手可能なアデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なレンチウイルスベースのｐＬＰ１、並びにＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なレトロウイルスベクターｐＦＢ−ＥＲＶ及びｐＣＦＢ−ＥＧＳＨ。
【０１６０】
或いは、発現ベクターは、目的の内因性遺伝子の発現を調節するために、細胞中の遺伝子座に強力なプロモーター又はエンハンサー配列を導入し及び組み込むために使用され得る（Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．（２００５）；６（６）：５０７−１２；Ｓｃｈｉｎｄｅｈｕｔｔｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００５）；２３（１）：１０−５）。このアプローチは、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター（米国特許第５，４６４，７５８号及び同第５，８１４，６１８号））を、目的の内因性遺伝子の誘導性の発現を提供するために、細胞のゲノムＤＮＡ中に挿入するためにも、使用できる。活性化コンストラクトは、目的の遺伝子に特異的な所望の遺伝子座への活性化配列の相同組換え又は非相同組換えを可能にするための標的化配列も含むことができる（例えば、Ｇａｒｃｉａ−Ｏｔｉｎ及びＧｕｉｌｌｏｕ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．（２００６）１１：１１０８−３６を参照のこと）。或いは、誘導性リコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ＥＲ系）が、４−ヒドロキシタモキシフェンの存在下で導入遺伝子を活性化するために使用され得る（Ｉｎｄｒａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９９）２７（２２）４３２４−４３２７；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（２３）ｅ９９；米国特許第７，１１２，７１５号）。
【０１６１】
発現ベクターはまた、標的配列の発現を低減するために、アンチセンス、リボザイム又はｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含んでいてもよい（一般には、Ｓｉｏｕｄ  Ｍ及びＩｖｅｒｓｅｎ、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ（２００５）６（６）：６４７−５３；Ｓａｎｄｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００５）３９（２）：２１５−２４を参照されたい）。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「組換え系」は、目的の遺伝子の組み込みのための、本出願のベクターと染色体との間の組換えを可能とする系を意味する。組換え系は当該分野において公知であり、例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系及びＦＬＰ−ＩＮ系が挙げられる。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現系」は、ＤＮＡ鋳型の転写又は共役転写及び翻訳を可能にする無細胞系を意味する。このような系としては、例えば、古典的なウサギ網状赤血球系並びに新規の無細胞合成系（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）１１０（３）：２５７−６３；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．（２００４）１０  １−３０）が挙げられる。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「Ｃｒｅ／Ｌｏｘ」系は、バクテリオファージＰ１の部位特異的な組み換え系についてＡｂｒｅｍｓｋｉら（Ｃｅｌｌ、３２：１３０１-１３１１（１９８３））によって記載されたようなものを意味する。Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系の使用方法は、当該分野において公知である；例えば、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる米国特許第４，９５９，３１７号を参照されたい。該系は、ｌｏｘＰで示される組換え部位及びＣｒｅで示されるレコンビナーゼからなる。真核生物細胞においてＤＮＡの部位特異的組換えを作り出す方法では、第一及び第二のｌｏｘ部位を有するＤＮＡ配列を、典型的には真核生物細胞に導入してＣｒｅと接触させることにより、ｌｏｘ部位にて組換えを生成する。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＰ−ＩＮ」組換えは、ポリヌクレオチドの活性化／不活性化及び部位特異的組込み系が哺乳動物細胞のために開発されている系を意味する。該系は、サッカロミセス属由来のリコンビナーゼであるＦＬＰによってトランスフェクトされた配列の組換えに基づく。ＦＬＰは、いくつかの細胞株では、特定の標的配列のコピーを迅速且つ正確に組換えることが示されている。ＦＬＰ−ＩＮ系は、例えば、米国特許第５，６５４，１８２号及び同５，６７７，１７７号に記載されている。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクション（形質移入）」「トランスフォーメーション（形質転換）」又は「トランスダクション（形質導入）」は、１つ又は物理的又は化学的な方法を使用して、宿主細胞に１以上の外来ポリヌクレオチドを導入することを意味する。以下に限定されないが、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照）；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；カチオン性リポソーム介在トランスフェクション；タングステン粒子促進性の微粒子照射（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：７７６−７７７（１９９０））；並びにリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿（Ｂｒａｓｈ  Ｄ．Ｅ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２０３１−２０３４（１９８７））を含む多くのトランスフェクション技術が、当業者に周知である。ファージ又はレトロウイルスベクターは、市販のパッケージ細胞内での感染粒子の成長後に、宿主細胞に導入することができる。
【０１６７】
用語「細胞」、「細胞培養物」、「細胞株」、「組換え宿主細胞」、「レシピエント細胞」及び「宿主細胞」は、しばしば交換可能に使用され、それらが使用される文脈から明らかとなるであろう。これらの用語は、初期の対象細胞及びその任意の子孫を含み、移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）の回数は問わない。全ての子孫が、（意図的若しくは意図的でない変異又は環境の相違に起因して）親細胞と正確に同一であるわけではないことを理解すべきである。しかしながら、これらの変化した子孫も、元々の形質転換された細胞の機能と同じ機能を保持している限り、これらの用語に含まれる。そのような特徴は、例えば、これに限定されないが、特定の組換えタンパク質を産生する能力であるかもしれない。「ミューテーター陽性細胞株」とは、他のベクターエレメントとの組み合わせで超変異を及ぼすために機能するのに十分な細胞因子を含む細胞株である。該細胞株は、当該分野において公知のもの及び本明細書に記載されるもののいずれであってもよい。「クローン」とは、単一の細胞から又は有糸分裂により共通の祖先から得られた細胞集団である。
【０１６８】
「レポーター遺伝子」は、典型的には、目的の細胞で発現させた場合に、特異的に検出（即ち、検出及び選択）される能力を付与するポリヌクレオチドを意味する。数多くのレポーター遺伝子系が当該分野において知られ、例えば、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  ６６：１−１０（１９８８）；Ｋａｉｎ，ＳＲ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６３：４９−６０（１９９７））、ベータ・ガラクトシダーゼ（米国特許第５，０７０，０１２号）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ２：１０４４−５１（１９８２））、ベータ・グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、ベータ・ラクタマーゼ（米国特許第５，７４１，６５７号、第５，９５５，６０４号）、触媒抗体、ルシフェラーゼ（米国特許第５，２２１，６２３号；第５，６８３，８８８号；第５，６７４，７１３号；第５，６５０，２８９号；第５，８４３，７４６号）、並びに天然の蛍光タンパク質（Ｔｓｉｅｎ，ＲＹ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７  ５０９−５４４（１９９８））が挙げられる。用語「レポーター遺伝子」には、目的のペプチドと相互作用し得る又はそれが所望される（若しくは所望されない）ことにより検出可能なシグナルを作り出す１以上の抗体、エピトープ、結合パートナー、基質、修飾酵素、受容体、又はリガンドの使用に基づいて特異的に検出され得る任意のペプチドも含まれる。レポーター遺伝子には、細胞の表現型を改変し得る遺伝子もまた含まれる。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」は、ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドを保有する細胞が、対応する選択試薬の存在下で、特異的に選択されるように又はされないようにすることを可能にする前記ポリヌクレオチドを意味する。選択マーカーは、陽性、陰性又は二機能性であり得る。陽性の選択マーカーは、該マーカーを保有する細胞の選択を可能とし、陰性の選択マーカーは、該マーカーを保有する細胞が選択的に除かれることを可能とする。選択マーカーのポリヌクレオチドは、発現されるポリヌクレオチドに直接連結されていてもよく、又は、共トランスフェクションにより同一細胞に導入されていてもよい。種々のそのようなマーカーポリヌクレオチドが、二機能性（即ち、陽性／陰性）マーカー（例えば、１９９２年５月２９日公開のＷＯ９２／０８７９６号、及び１９９４年１２月８日公開のＷＯ９４／２８１４３号を参照；これらは、本明細書で参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる）を含めて、記載されてきた。薬剤耐性遺伝子の選択マーカーの具体例としては、以下に限定されないが、アンピシリン、テトラサイクリン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ウアバイン又はカナマイシンが挙げられる。選択マーカーの具体例としては、例えば、メトトレキセートへの耐性を付与するＤＨＦＲタンパク質（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸への耐性を付与するＧＰＦタンパク質（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９８１））；ハイグロマイシンへの耐性を付与するハイグロマイシンタンパク質（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ、３０：１４７（１９８４））、ウアバインへの耐性を付与するマウスＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅアルファサブユニット（Ｋｅｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７：９０１-９０３（１９８７））；並びにＺｅｏｃｉｎ（商標）耐性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より商業的に入手可能）など、細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするものである。更には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ及びＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４８：２０２６（１９６２））及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ、２２：８１７（１９８０））を、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞において用いることができる。グルタミン合成酵素は、グルタミン（ＧＳ）フリー培地での細胞の増殖を可能とする（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号；第５，７７０，３５９号；及び第５，８２７，７��９号を参照）。他の選択マーカーは、例えば、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、又はアデノシンデアミナーゼをコードする。
【０１７０】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間での配列の類似性を意味する。相同性及び同一性は、比較の目的のためにアラインされ得る各配列内の位置を比較することによってそれぞれ決定され得る。比較された配列における対応する位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、該分子は、その位置において同一である；対応する部位が、同一又は類似のアミノ酸残基（例えば立体的及び／又は電気的な性質が類似する）で占められている場合、該分子は、その位置において相同（類似）であるということができる。相同性／類似性又は同一性のパーセンテージとしての表現は、比較された配列により共有される位置における同一又は類似のアミノ酸の個数の関数を参照する。「関連しない」又は「非相同的な」配列は、本発明の配列と、４０％未満の同一性、３５％未満の同一性、３０％未満の同一性、又は２５％未満の同一性を共有する。二つの配列の比較において、残基（アミノ酸又は核酸）の不在又は余分な残基の存在もまた、同一性及び相同性／類似性を減少させる。
【０１７１】
用語「相同性」は、類似の機能又はモチーフを持つ遺伝子又はタンパク質を同定するために使用される、数学に基づく配列類似性の比較を示す。本発明の核酸及びタンパク質の配列は、例えば、他のファミリーのメンバー、関連する配列又はホモログを同定するために、公共のデータベースに対するサーチを行うための「クエリ配列」として使用され得る。そのようなサーチは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２でＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて行って、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチを、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３でＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて行って、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためのギャップを入れたアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されたようにしてＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各々のプログラム（例、ＸＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「同一性」は、配列のマッチングが最大になるように、即ちギャップ及び挿入を考慮に入れて、配列をアライメントしたときの、２つ以上の配列における対応する位置での同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。同一性は、以下に限定されないが、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及び、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；並びに、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載の方法を含む公知の方法により、容易に計算することができる。同一性を決定する方法は、テストされた配列の間で最大のマッチを与えるように設計されている。更には、同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムにおいてコード化されている。２つの配列間での同一性を決定するコンピュータープログラムの方法としては、以下に限定されないが、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０）、並びにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））が挙げられる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他のソースから公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０））。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性の決定のために使用され得る。
【０１７３】
ＤＮＡコンストラクトの「異種」領域とは、より長いＤＮＡ分子内の特定可能なＤＮＡのセグメントであって、本来は、そのより長いＤＮＡ配列と関連して見出されないものを意味する。従って、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、該遺伝子は、由来となる生物のゲノムにおいて通常該哺乳動物のゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡによって隣接されるであろう。異種コード配列の別の例は、該コード配列それ自体が天然には見出されないコンストラクトである（例えば、ゲノムコード配列が、天然の遺伝子と異なるコドンを有するイントロン若しくは合成配列を含むｃＤＮＡ）。アレル変異体又は自然に生じる変異事象は、本明細書で定義されるようなＤＮＡの異種領域を生じない。
【０１７４】
ＳＨＭ関連の用語
用語「活性化誘導シチジンデアミナーゼ」又は（「ＡＩＤ」）は、ＤＮＡ配列内で、シチジンのウラシルへの脱アミノ化を仲介することのできる、ＲＮＡ／ＤＮＡエディテイングシチジンデアミナーゼのＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーのメンバーを意味する。（一般には、Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．  ２２  Ｎｏ  ２  ３６７−３７７（２００５）、“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  （Ｄｅｏｘｙ）ｃｙｔｉｄｉｎｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ”；米国特許第６，８１５，１９４号を参照）。好適なＡＩＤ酵素としては、当該酵素の、例えば霊長類、げっ歯類、鳥類及び硬骨魚類を含む、あらゆる脊椎動物の型のものが挙げられる。ＡＩＤ酵素の代表例としては、以下に限定されないが、ヒト（アクセッション番号ＮＰ＿０６５７１２）、ラット、ニワトリ、イヌ及びマウス（アクセッション番号ＮＰ＿０３３７７５）の型が挙げられる。１つの実施形態において、ＡＩＤ酵素は、変異Ｌ１９８Ａを含む。
【０１７５】
用語「ＡＩＤホモログ」は、Ａｐｏｂｅｃファミリーの酵素を意味し、例えばＡｐｏｂｅｃ−１、Ａｐｏｂｅｃ３Ｃ又はＡｐｏｂｅｃ３Ｇが挙げられる（例えばＪａｒｍｕｚら、（２００２）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７９：２８５−２９６）（２００２）などに記載されている）。ＡＩＤ及びＡＩＤホモログとしては更に、以下に限定されないが、天然のＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣポリペプチドの活性を保持した、改変型ポリペプチド又はその部分であって、ポリヌクレオチド配列を脱アミノ化する能力を保持したもの（例、ミュータント又はムテイン）が更に挙げられる。用語「ＡＩＤ活性」には、ＡＩＤ及びＡＩＤホモログにより仲介される活性が含まれる。
【０１７６】
用語「ＳＨＭのための基質」は、ＡＩＤ及び／又はエラープローンＤＮＡポリメラーゼによって、合成又は半合成のポリヌクレオチド配列の核酸配列が変化するように作用される、合成又は半合成のポリヌクレオチド配列を意味する。
【０１７７】
用語「トランジション変異」は、ＤＮＡ配列における塩基の変化であって、ピリミジン（シチジン（Ｃ）又はチミジン（Ｔ）が別のピリミジンによって置換される、或いはプリン（アデノシン（Ａ）又はグアノシン（Ｇ）が別のプリンに置換されるものを意味する。
【０１７８】
用語「トランスバージョン変異」は、ＤＮＡ配列における塩基の変化であって、ピリミジン（シチジン（Ｃ）又はチミジン（Ｔ）がプリン（アデノシン（Ａ）又はグアノシン（Ｇ）によって置換される、或いはプリンがピリミジンによって置換されるものを意味する。
【０１７９】
用語「塩基除去修復」は、シチジンの脱アミノ化により生じたウリジンヌクレオチドなどの単一の塩基を、ＤＮＡから除去するＤＮＡ修復経路を意味する。修復は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡからウラシルを認識して除去し、脱塩基部位とするウラシルグリコシラーゼによって開始される。
【０１８０】
用語「ミスマッチ修復」は、典型的には染色体ＤＮＡの複製のエラーにより生じるものなど、ミスマッチ塩基を認識して訂正する修復経路を意味する。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、用語「ＳＨＭホットスポット」又は「ホットスポット」は、３〜６ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列又はモチーフであって、抗体遺伝子におけるＳＨＭ変異の統計解析による決定で、体細胞超変異を起こす傾向の増加を示すものを意味する（ＳＨＭについて種々のモチーフの相対的な順位を与える表２及び３、並びに標準的なホットスポット及びコールドスポットを挙げている表６を参照）。該統計解析は、本明細書の他の箇所に記載されるように、非抗体遺伝子におけるＳＨＭ変異の解析にも当てはめられ得る。ホットスポットを図中にグラフィカルに表示する目的のために、標準的ホットスポットの最初のヌクレオチドを、文字「Ｈ」で表す。
【０１８２】
同様に、本明細書で使用される場合、「ＳＨＭコールドスポット」又は「コールドスポット」は、３〜６ヌクレオチドのポリヌクレオチド又はモチーフであって、抗体遺伝子におけるＳＨＭ変異の統計解析による決定で、体細胞超変異を起こす傾向の減小を示すものを意味する（ＳＨＭについて種々のモチーフの相対的な順位を与える表２及び３、並びに標準的なホットスポット及びコールドスポットを挙げている表６を参照）。該統計解析は、本明細書の他の箇所に記載されるように、非抗体遺伝子におけるＳＨＭ変異の解析にも当てはめられ得る。コールドスポットを図中にグラフィカルに表示する目的のために、標準的コールドスポットの最初のヌクレオチドを、文字「Ｃ」で表す。
【０１８３】
用語「体細胞超変異モチーフ」又は「ＳＨＭモチーフ」は、１以上のホットスポット及び／又はコールドスポットを含むか、又は含むように改変され得、且つ規定されたアミノ酸の集合をコードする、ポリヌクレオチド配列を意味する。ＳＨＭモチーフは任意のサイズであり得るが、サイズとして約２から約２０ヌクレオチド、又は約３から約９ヌクレオチドに基づくことが好都合である。ＳＨＭモチーフは、ホットスポット及びコールドスポットの任意の組み合わせを含むことができ、或いはホットスポット及びコールドスポットの両方を欠いてもよい。
【０１８４】
用語「好ましいＳＨＭモチーフ」は、１以上の好ましい（標準的な）ＳＨＭコドンを含むＳＨＭモチーフを意味する（下記の表６及び表９を参照）。
【０１８５】
用語「好ましいホットスポットＳＨＭコドン」、「好ましいホットスポットＳＨＭモチーフ」、「好ましいＳＨＭホットスポットコドン」及び「好ましいＳＨＭホットスポットモチーフ」は全て、以下に限定されないが、コドンＡＡＣ、ＴＡＣ、ＴＡＴ、ＡＧＴ又はＡＧＣを含むコドンを意味する。そのような配列は、より大きなＳＨＭモチーフの構成内に埋め込まれている可能性もあり得、ＳＨＭ介在性の変異誘発をリクルートし得、且つ該コドンにおける標的化されたアミノ酸多様性を生成し得る。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列は、該ポリヌクレオチド又はその部分が、該ポリヌクレオチド内でのホットスポット及び／又はコールドスポットの頻度及び／又は位置を増加又は減少させるように改変されている場合、「ＳＨＭのために最適化され」ている。ポリヌクレオチド又はその部分が、該ポリヌクレオチド内でのホットスポットの頻度及び／又は位置を増加させるように、或いは該ポリヌクレオチド内でのコールドスポットの頻度（密度）及び／又は位置を減小させるように改変されている場合、「ＳＨＭ感受性」にされているポリヌクレオチドである。反対に、ポリヌクレオチド配列又はその部分が、該ポリヌクレオチド内のオープンリーディングフレーム内において、ホットスポットの頻度（密度）及び／又は位置を減小させるように改変されている場合、「ＳＨＭ耐性」にされているポリヌクレオチド配列である。一般に、コドン用法、及び／又はポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸を改変することにより、ＳＨＭ介在性の変異誘発を起こす傾向（又は率）が高い又は低い配列を作製することができる。
【０１８７】
ポリヌクレオチド配列の最適化は、ポリヌクレオチド配列における、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、１００％、又はそれらの中の任意の範囲のヌクレオチドを改変することを意味する。ポリヌクレオチド配列の最適化はまた、ポリヌクレオチド配列における、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、約２０個、約２５個、約５０個、約７５個、約９０個、約９５個、約９６個、約９７個、約９８個、約９９個、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約７５０個、約１０００個、約１５００個、約２０００個、約２５００個、約３０００個、又はそれより多い、或いはそれらの中の任意の範囲のヌクレオチドを、ヌクレオチドの一部又は全てがＳＨＭ介在性の変異誘発のために最適化されるように改変することを意味する。ホットスポット及び／又はコールドスポットの頻度（密度）の減小は、ポリヌクレオチド配列における、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、１００％、又はそれらの中の任意の範囲のホットスポット又はコールドスポットの減小を意味する。ホットスポット及び／又はコールドスポットの頻度（密度）の増加は、ポリヌクレオチド配列における、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、１００％、又はそれらの中の任意の範囲のホットスポット又はコールドスポットの増加を意味する。
【０１８８】
ホットスポット又はコールドスポットの位置又はリーディングフレームは、ＳＨＭ介在性の変異誘発が、生成するアミノ酸配列に関して、サイレントな変異をもたらし得るものであるのかどうか、或いは、アミノ酸レベルでは、保存的、半保存的又は非保存的な変化を引き起こすものであるのかどうかを支配する要因でもある。以下で論じるように、これらの設計パラメーターは、核酸配列のＳＨＭに対する相対的な感受性又は耐性を更に高めるように操作され得る。従って、ＳＨＭのリクルートの程度及びモチーフのリーディングフレームの両方が、ＳＨＭ感受性及びＳＨＭ耐性のポリヌクレオチド配列の設計において考慮される。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、「体細胞超変異」又は「ＳＨＭ」は、ポリヌクレオチド配列の変異であって、該ポリヌクレオチド配列に対する活性化誘導シチジンデアミナーゼ、ウラシルグリコシラーゼ及び／又はエラープローンポリメラーゼの作用によって開始される或いはそれと関連するものを意味する。該用語は、ミスマッチ修復機構及び関連する酵素が介在する変異誘発を含む、初期損傷のエラープローン修復の結果として生じる変異誘発を含むことが意図される。
【０１９０】
本明細書で使用される場合、用語「ＵＤＧ」は、種々の損傷したＤＮＡ塩基を認識し、ゲノムの複製前にそれらを除去するいくつかのＤＮＡグリコシラーゼのうちの１つである、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを意味する。典型的には、ＤＮＡグリコシラーゼは、細胞毒性である又はＤＮＡポリメラーゼにエラーを引き起こさせるＤＮＡ塩基を除去し、また、ＤＮＡの塩基除去修復経路の一部である。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、シチジンの脱アミノ化生成物であるＤＮＡ中のウラシルを認識し、その除去を引き起こし、且つ新たな塩基での置換を引き起こし得る。
【０１９１】
用語「ｐｏｌイータ（ｐｏｌη）」（ＰｏｌＨ、ＲＡＤ３０Ａ、ＸＰＶ、ＸＰ−Ｖとも呼ばれる）は、忠実性の低いＤＮＡポリメラーゼであって、例えばＵＶ誘発性チミジンダイマーを通過する複製といった、損傷を通過する複製において役割を果たすものを意味する。色素性乾皮症のバリアント型タンパク質ＸＰＶでは、ｐｏｌイータの遺伝子が欠損している。損傷していないＤＮＡでは、ｐｏｌイータは、１００ｂｐあたり約３つの割合で正しくないヌクレオチドを組み込み、そして、ＷＡジヌクレオチド（Ｗ＝Ａ又はＴ）を含む鋳型を通過して複製するときに特にエラーを起こしやすい（Ｇｅａｒｈａｒｔ及びＷｏｏｄ、２００１）。ｐｏｌイータは、免疫グロブリンの可変遺伝子におけるＳＨＭの間のＡ／Ｔミューテーターとして重要な役割を果たすことが示されてきた（Ｚｅｎｇら、２００１）。ｐｏｌイータの代表例としては、以下に限定されないが、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ８１６６６）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１０６６７４３）、ニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００１３０４）、イヌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿５３２１５０）及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１０９６４０）の型が挙げられる。
【０１９２】
用語「ｐｏｌシータ（ｐｏｌθ）」（ＰｏｌＱとも呼ばれる）は、忠実性の低いＤＮＡポリメラーゼであって、架橋修復（クロスリンク修復）における役割を果たし得（Ｇｅａｒｈａｒｔ及びＷｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：１８７-１９２（２００１））、且つ内因性のＡＴＰａｓｅ−ヘリカーゼドメインを含む（Ｋａｗａｍｕｒａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０９（１）：９−１６（２００４））ものを意味する。該ポリメラーゼは、誤対合挿入因子及び誤対合伸長因子の両方として機能することにより、脱塩基部位を通過する複製を効率的に行うことができる（Ｚａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２４、３７５７-３７６９（２００５））。ｐｏｌシータの代表例としては、以下に限定されないが、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９５５４５２）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿２２１４２３）、ニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿４１６５４９）、イヌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿５４５１２５）及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０８４２５３）の型が挙げられる。ｐｏｌイータ（Ｐｏｌ  ｅｔｅ）及びＰｏｌシータは、総称して「エラープローンポリメラーゼ」と呼ばれることもある。
【０１９３】
ファージディスプレイの用語
「ファージディスプレイ」とは、変異体ポリペプチドを、コートタンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてファージ（例、繊維状ファージ、粒子）の表面上に提示（ディスプレイ）させる技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダムなタンパク質変異体の大きなライブラリーを、標的分子と高い親和性で結合する配列について迅速且つ効率的にソーティングできるという事実にある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーのファージ上への提示は、特異的な結合特性を持つポリペプチドのために何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されてきた。多価ファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかとの融合を通じて小さなランダムペプチド及び小さなタンパク質を提示するために用いられてきた。Ｗｅｌｌｓ及びＬｏｗｍａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３：３５５−３６２（１９９２）及び当該文献中にて引用される参考文献。一価ファージディスプレイにおいては、タンパク質又はペプチドライブラリーを、遺伝子ＩＩＩ又はその一部と融合させ、ファージ粒子が融合タンパク質の１コピーを提示するか又は提示しないように、野生型の遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下にて低レベルで発現させる。結合活性の効果が多価ファージに比べて低減するため、固有のリガンド親和性に基づいてソーティングされ、またファージミドベクターが使用されるため、ＤＮＡ操作が簡単である。Ｌｏｗｍａｎ及びＷｅｌｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３：２０５−０２１６（１９９１）。
【０１９４】
「ファージミド」とは、細菌の複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１）及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、繊維状バクテリオファージ及びラムダバクテリオファージを含む、任意の公知のバクテリオファージで使用され得る。一般にプラスミドは、抗生物質耐性の選択マーカーも含むであろう。これらのベクター中にクローニングされたＤＮＡセグメントは、プラスミドとして繁殖させることができる。これらのベクターを保有する細胞に、ファージ粒子の生成に必要な全ての遺伝子を与えたとき、プラスミドの複製様式がローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの１鎖のコピー及びパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは、感染性又は非感染性のファージ粒子を形成し得る。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるような遺伝子融合として異種ポリペプチド遺伝子に連結されたファージコートタンパク質遺伝子又はそのフラグメントを含むファージミドを含む。
【０１９５】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含み且つ複製可能な、バクテリオファージの二本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージの複製及びファージ粒子の形成を可能とする、ファージの複製起点を有する。ファージは、好ましくは、繊維状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージ若しくはそれらに由来するもの）又はラムダファージ（例えば、ラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４など、若しくはそれらに由来するもの）である。
【０１９６】
用語「コートタンパク質」は、少なくともその一部がウイルス粒子の表面上に存在するタンパク質を意味する。機能的な観点からは、コートタンパク質は、宿主細胞中でのウイルス集合のプロセスの間にウイルス粒子と結合し、集合体のウイルスが別の宿主細胞に感染するまで、該集合体のウイルスに結合したままである、任意のタンパク質である。コートタンパク質は、メジャーコートタンパク質であっても、マイナーコートタンパク質であってもよい。「メジャー」コートタンパク質は、一般に、ウイルスコート中に、好ましくは少なくとも約５コピー、より好ましくは少なくとも約７コピー、なお好ましくは少なくとも約１０コピー又はそれより多くのコピーのタンパク質で存在する、コートタンパク質である。メジャーコートタンパク質は、ビリオン当たり、数十コピー、数百コピー、又は更には数千コピーで存在してもよい。メジャーコートタンパク質の例としては、繊維状ファージのｐ８タンパク質である。
【０１９７】
「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、共有結合的に連結された２つの部分を有するポリペプチドであって、該部分の各々が異なる特性を有するポリペプチドであるものを意味する。該特性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性又はｉｎ  ｖｉｖｏ活性などの生物学的な特性であり得る。また該特性は、標的分子への結合や反応の触媒などの単純な化学的又は物理的な特性であり得る。該２つの部分は、単一のペプチド結合によって直接的に、又は１つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを通じて、連結され得る。一般に、該２つの部分及びリンカーは、互いと共にリーディングフレーム中にあるであろう。
【０１９８】
ＩＩ．体細胞超変異（ＳＨＭ）の概論
抗体の多様性を生み出す天然の機構は、体細胞超変異（ＳＨＭ）のプロセスを利用して進化してきた。体細胞超変異（ＳＨＭ）は、免疫グロブリン遺伝子の可変領域の多様化を引き起こして、抗体の二次レパートリーを作り出し、それによって液性応答の親和性成熟を可能にする。従って、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質スキャフォールドの確定した超可変領域に超変異を指示し、改善された抗体を特定するよう選択圧を加えることにより、免疫系は、抗原曝露から約３週間以内に、高親和性の抗体を迅速に進化させることができる多様化ストラテジーを発達させた。
【０１９９】
ＡＩＤは、活性化Ｂ細胞内で発現され、ＳＨＭ、並びにクラススイッチ組換え及び遺伝子変換のための必須のタンパク質因子である（Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、２０００；Ｒｅｖｙら、２０００）。ＡＩＤは酵素のファミリーであるＡＰＯＢＥＣファミリーに属し、このＡＰＯＢＥＣファミリーは、代謝性のシチジンデアミナーゼと一部の特徴を共有するが、ＡＩＤは１本鎖ポリヌクレオチド内のヌクレオチドを脱アミノ化し、遊離のヌクレオチドを基質として利用できないという点においてそれらとは異なる。ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーの他の酵素もまた、１本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ上のシチジンを脱アミノ化するために作用し得る（Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏら（２００５））。
【０２００】
ヒトＡＩＤタンパク質は、１９８のアミノ酸からなり、予想分子量２４ｋＤａを有する。ヒトＡＩＤ遺伝子は、ＡＰＯＢＥＣ−１に近い、遺伝子座１２ｐ１３に位置する。ＡＩＤタンパク質は、シチジン／デオキシシチジンデアミナーゼモチーフを有し、亜鉛に依存し、また、シチジンデアミナーゼの特異的阻害剤である、テトラヒドロウリジン（ＴＨＵ）によって阻害され得る。
【０２０１】
ＡＩＤの発見前にも、ＷＲＣＹ（ＡＴ／ＧＡ／Ｃ／ＡＴ）モチーフの構成内にあるシチジンにおいて、より頻繁にＳＨＭが生じることが指摘されていた。ＳＨＭのためのこのモチーフは、ＡＩＤ脱アミノ化のため、並びにＤＮＡポリメラーゼｐｏｌイータ及びｐｏｌシータによるエラープローン修復の開始のためのホットスポットモチーフの複合体を表すらしいとする証拠が現在集積されている（Ｒｏｇｏｚｉｎら（２００４）；Ｚａｎら（２００５））。
【０２０２】
ＡＩＤ介在性の変異誘発のためには、高レベルのＤＮＡ転写が必要であるが、それだけでは十分ではないことが示されてきた。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＳＨＭは、転写開始部位から約８０から約１００ヌクレオチドで始まるが、その頻度は、プロモーターからの距離の関数として減少する。ＡＩＤは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、転写伸長複合体と直接相互作用するが、転写開始複合体とは直接相互作用しないことが示されており、この相互作用は、転写開始複合体が、完全に進行性で伸長能力のある転写伸長複合体に変わるときに生じる、開始因子の解離に依存する可能性がある（Ｂｅｓｍｅｒら、２００６）。
【０２０３】
ＡＩＤは、１本鎖ＤＮＡ上のシチジンのみ脱アミノ化できるため、転写のための必須条件は、転写バブルによる１本鎖領域の生成を反映するようである。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの精製されたＡＩＤの研究は、ＡＩＤの結合は、配列に依存せず、遺伝子のアクティブな転写により引き起こされるホットスポットの捕捉のためのスキャンする様式を可能とし得ることを示唆している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究は、ＡＩＤが１本鎖ＤＮＡに対して０．３から２ｎＭの範囲の見かけのＫｄを有すること、及び該複合体が４〜８分の半減期を有することを示唆している。精製されたＡＩＤの１本鎖ＤＮＡに対する代謝回転数は、おおよそ、４分毎に１つの脱アミノ化である（Ｌａｒｉｊａｎｉら（２００６））。
【０２０４】
ＡＩＤは、転写されているＤＮＡ分子のいずれの鎖上でもシチジン残基をウラシル残基へ脱アミノ化するように、ＤＮＡに対して作用する。初期（Ｃ→Ｕ）の損傷が、ＤＮＡ複製の前又は間に更に修正されない場合、アデノシン（Ａ）が、このＵヌクレオチドの反対側に挿入され得、最終的には、Ｃ→Ｔ又はＧ→Ａのトランジション変異をもたらす。この変化のアミノ酸レベルでの意義は、リーディングフレーム内のコドンの中での該ヌクレオチドの位置に依存する。この変異がコドンの１番目又は２番目の位置にて生じた場合、結果としては恐らく、非保存的なアミノ酸置換である。それに対し、この変化が、コドンリーディングフレームの３番目の位置、揺らぎ位置内で生じた場合、ヌクレオチドの変化の効果はサイレント、即ち保存的なアミノ酸置換となるであろうため、該変異のアミノ酸レベルでの実際の効果はわずかであろう。
【０２０５】
或いは、Ｃ→Ｕの損傷、及び潜在的には隣接する塩基は、ＳＨＭにおいてエラープローンの様式での修復に繋がるＤＮＡ修復機構によって作用され得る。ノックアウトマウスでの研究によって、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を介した塩基除去修復が、ホットスポットモチーフ近くのＡ及びＴ残基の変異を仲介する役割を果たすことが確立された；（Ｓｈｅｎら（２００６））。加えて、ＵＤＧによる脱塩基部位の創出により、ｐｏｌイータ及びｐｏｌシータなどのエラープローンポリメラーゼが集められるという証拠、並びに、これらのポリメラーゼが、周囲の配列の全ての塩基位置において、更なる変異を導入するという証拠が増加している（Ｗａｔａｎａｂｅら（２００４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（２００５））。ｐｏｌイータが、ＳＨＭの際のＡ変異の創出の中心であり、また、優先的にＧへと変異される、コード鎖のＡ又はＴの後のアデノシン（Ｗ／Ａ）に対して特にエラーを起こしやすいと考えられている。
【０２０６】
抗体遺伝子において、コドン用法、並びにそれぞれＣＤＲ及びＦＲにおけるＡＩＤ活性及びｐｏｌイータのエラーに付随する正確なホットスポット／コールドスポットの標的化は、可変領域における変異を最大化し且つフレームワーク領域における変異を最小化する選択圧の下で進化してきたことが観察されており（Ｚｈｅｎｇら、ＪＥＭ  ２０１（９）：１４６７−１４７８（２００５））、例えば、抗体遺伝子内で優先的に使用されるコドン内のＣ及びＧヌクレオチドの正確なアライメントは、殆どのＣからＴ及びＧからＡへの変異を、サイレント又は保存的なものにしていることが観察されている。Ｃ及びＧの正確な配置と並べて、Ｚｈｅｎｇらはまた、Ａ及びＴは可変領域内のｐｏｌイータのホットスポットに優先的に配置され、フレームワーク領域内のそれらの部位からは除外されていることも観察した。
【０２０７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＨＭの調節、及び、ＳＨＭをＩｇ遺伝子座に指示し且つＩｇ遺伝子座に限定する決定因子については、激しい議論及び実験研究の対象であった。ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されるＳＨＭの率は、少なくとも部分的には、例えば以下の要因に依存することが示されている：１）特定の細胞タイプ内でのＡＩＤの発現レベル及びＡＩＤの活性レベル；（Ｍａｒｔｉｎら（２００２）、Ｒｕｃｃｉら（２００６））、２）ＡＩＤの翻訳後修飾の度合い及び核内局在の度合い；（ＭｃＢｒｉｄｅら（２００６）、Ｐａｓｑｕａｌｕｃｃｉら（２００６）、Ｍｕｔｏら（２００６））、３）免疫遺伝子座に特異的なエンハンサー領域、Ｅ−ｂｏｘモチーフ、又は関連するシスに作用する結合因子の存在；（Ｋｏｍｏｒｉら（２００６），Ｓｃｈｏｅｔｚら（２００６））、４）標的配列の、翻訳開始部位／プロモーター領域への近さ；（Ｒａｄａら（２００１））、５）標的配列の転写率；（Ｓｔｏｒｂら（２００１））、６）標的遺伝子のメチル化の度合い；（Ｌａｒｉｊａｎｉら（２００５））、７）細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている場合は、標的遺伝子の遺伝的背景；８）ｐｏｌイータ、ＭＳＨ２などの補助因子の存在又は不在；（Ｓｈｅｎら（２００６））、９）標的配列内のホットスポット配列又はコールドスポット配列の存在；（Ｚｈｅｎｇら（２００５））、１０）阻害因子の存在；（Ｓａｎｔａ−Ｍａｒｔａら（２００６））、１１）対象とする細胞タイプ内でのＤＮＡ修復速度（Ｐｏｌｔｏｒａｔｓｋｙ（２００６））、１２）局所的なＤＮＡ又はＲＮＡヘアピン構造の形成；（Ｓｔｅｅｌｅら（２００６））、並びに１３）ヒストンＨ２Ｂのリン酸化の状態（Ｏｄｅｇａｒｄら（２００５））。
【０２０８】
ＩＩＩ．体細胞超変異のためのポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド配列又はモチーフが、どの程度ＳＨＭの「ホットスポット」又は「コールドスポット」であるかの度合いは、優先の米国出願第６０／９０２，４１４号に記載のように、抗体配列において同定されたＳＨＭ変異の統計解析から導出され、以下の表２及び表３に示した。これらの表は、ＳＨＭ介在性の変異誘発を引き付ける能力について、ｚスコアによりランク付けされた、３マー、４マー及び６マーのモチーフを示す。
【０２０９】
【表２−１】
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【０２１０】
【表２−２】
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【０２１１】
【表２−３】
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【０２１２】
【表３−１】
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【０２１３】
【表３−２】
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【０２１４】
【表３−３】
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【０２１５】
【表３−４】
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【０２１６】
【表３−５】
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【０２１７】
【表３−６】
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【０２１８】
【表３−７】
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【０２１９】
【表３−８】
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【０２２０】
【表３−９】
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【０２２１】
【表３−１０】
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【０２２２】
【表３−１１】
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【０２２３】
【表３−１２】
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【０２２４】
【表３−１３】
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【０２２５】
【表３−１４】
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【０２２６】
【表３−１５】
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【０２２７】
【表３−１６】
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【０２２８】
【表３−１７】
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【０２２９】
【表３−１８】
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【０２３０】
【表３−１９】
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【０２３１】
【表３−２０】
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【０２３２】
【表３−２１】
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【０２３３】
【表３−２２】
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【０２３４】
【表３−２３】
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【０２３５】
【表３−２４】
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【０２３６】
【表３−２５】
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【０２３７】
【表３−２６】
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【０２３８】
【表３−２７】
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【０２３９】
【表３−２８】
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【０２４０】
【表３−２９】
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【０２４１】
【表３−３０】
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【０２４２】
当業者であれば理解するように、上記したＳＨＭモチーフのランク付けは、任意の特定のＳＨＭモチーフをＳＨＭ介在性の変異誘発の確率がより高いもので置換することにより、出発配列と比べてＳＨＭに対してより感受性である合成遺伝子コンストラクトを作成することを可能とする方法を提供する。反対に、任意の特定のＳＨＭモチーフをＳＨＭ介在性の変異誘発の確率がより低いもので置換することにより、出発配列と比べてＳＨＭに対してより耐性である合成遺伝子コンストラクトを作成できる。
【０２４３】
特定の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、上位５％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「ホットスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ感受性にすることができる。特定の他の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、上位１０％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「ホットスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ感受性にすることができる。なお他の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、上位１５％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「ホットスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ感受性にすることができる。更に他の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、上位２０％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「ホットスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ感受性にすることができる。更になお他の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、上位２５％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「ホットスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ感受性にすることができる。
【０２４４】
同様に、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、下位５％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「コールドスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ耐性にすることができる。他の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、下位１０％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「コールドスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ耐性にすることができる。なお他の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、下位１５％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「コールドスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ耐性にすることができる。更に他の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、下位２０％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「コールドスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ耐性にすることができる。更になお他の実施形態において、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、下位２５％に入るランク付けされたｚスコアを有するポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「コールドスポット」と考えることができ、それを遺伝子に挿入して、ポリヌクレオチド配列をよりＳＨＭ耐性にすることができる。
【０２４５】
ホットスポット又はコールドスポットの位置又はリーディングフレームは、ＳＨＭ介在性の変異誘発が、生成するアミノ酸配列に関して、サイレントな変異をもたらし得るものであるのかどうか、或いは、アミノ酸レベルでは、保存的、半保存的又は非保存的な変化を引き起こすものであるのかどうかを支配する重要な要因でもある。以下で論じるように、これらの設計パラメーターは、核酸配列のＳＨＭに対する相対的な感受性又は耐性を更に高めるように操作され得る。
【０２４６】
従って、ＳＨＭのリクルートの程度及びモチーフのリーディングフレームの両方が、ＳＨＭ感受性及びＳＨＭ耐性のポリヌクレオチド配列の設計において考慮される。
【０２４７】
最適化されたポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列又はその部分が、野生型のポリヌクレオチド配列と比較して、オープンリーディングフレーム内でのホットスポットの頻度及び／又は位置を増加させるように改変又は設計され、且つ／又は、該ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム内でのコールドスポットの頻度及び／又は位置を減小させるように改変又は設計されている場合、「ＳＨＭ感受性」又は「ホット」にされている。
【０２４８】
反対に、最適化されたポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列又はその部分が、野生型のポリヌクレオチド配列と比較して、該ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム内でのホットスポットの頻度及び／又は位置を減少させるように改変され、且つ／又は、該ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム内でのコールドスポットの頻度及び／又は位置を増加させるように改変又は設計されている場合、「ＳＨＭ耐性」又は「コールド」にされている。
【０２４９】
ポリヌクレオチドがＳＨＭを起こす傾向を最大化又は最少化すると同時に、タンパク質の発現、ＲＮＡの安定性、及び好都合に位置する制限酵素部位の存在を最大化するヌクレオチドテンプレートを設計するストラテジーが本明細書では提供される。
【０２５０】
あるポリヌクレオチドの合成バージョンであって、該ポリヌクレオチドの変異生成率に対するＳＨＭの影響を、野生型がＳＨＭを起こす感受性と比較して、増強又は低減するように改変された（即ち、ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性）ものもまた、本明細書では提供される。
【０２５１】
あるポリヌクレオチドの合成バージョンであって、ポリヌクレオチドの特定の領域がＳＨＭ耐性又はＳＨＭ感受性になるように最適化されたものもまた、本明細書では提供される。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドの機能的な部分及び／又は領域がホットであり得（例えば、リガンド結合、酵素領域など）、ポリヌクレオチドの他の領域（例えば、構造的な折りたたみやコンフォメーションに必要な領域など）がコールドにされ得る。
【０２５２】
ＳＨＭ感受性配列は、タンパク質の迅速な進化及び改善された変異体の選択を促進し、当該系は、合理的な設計の力を、加速されたランダム変異誘発及び指向された進化と結合させる。
【０２５３】
本発明にはまた、保存された領域がＳＨＭ介在性の変異誘発に耐性であるのを可能とすると同時に、所望の配列をＳＨＭ介在性の変異誘発への感受性が増加するように標的化し得るものである、ＳＨＭ耐性ポリヌクレオチド配列も含まれる。従って、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の機能的属性に直接関与するように思われる、ポリヌクレオチドの特定の機能的な部分及び／又は領域を最適化することが可能である。
【０２５４】
１つの非限定的な例において、最適化されるヌクレオチドは、目的の特定の機能的又は構造的属性の内側、又はその約５Å以内に存在し得るアミノ酸をコードし得る。機能的な部分及び／又は領域の具体例としては、抗体のＣＤＲ内、受容体の結合ポケット内、酵素の触媒クレフト内、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン内、補因子の、アロステリック結合部位などの、アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５５】
これらの方法を適用可能なポリヌクレオチドとしては、転写され得、且つスクリーニングのための機能的アッセイを備え得る、任意のポリヌクレオチド配列が挙げられる。好ましいポリヌクレオチド配列としては、例えば、特異的結合メンバー、抗体又はそのフラグメント、抗体重鎖又はその部分、抗体軽鎖又はその部分、細胞内抗体、選択マーカー遺伝子、酵素、受容体、ペプチド成長因子及びホルモン、補因子及び毒素などの、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドをコードするものが挙げられる。
【０２５６】
本明細書において使用するための分子の他の非限定的な例としては、タンパク質又はペプチド配列への翻訳を必要とせずに酵素活性又は結合活性を有するポリヌクレオチドが挙げられ、そのようなポリヌクレオチドとしては、例えば、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ＲｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、ａｂｄアプタマーが挙げられる。
【０２５７】
本発明の生物学的に活性な分子には、他の生物学的に活性なタンパク質分子の薬物動態及び／又は薬力学を調節可能な分子も含まれ、例えば、脂質及びポリマー（例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及び他のポリエーテル）が含まれる。例えば、ポリペプチドは、例えば以下のようなポリペプチドである：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ毒素サブユニットＡ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素、ＣＣケモカイン（例えば、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８）、ＣＸＣケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１６）、Ｃケモカイン（例えば、ＸＣＬ１及びＸＣＬ２）及びＣＸ３Ｃケモカイン（例えば、ＣＸ３ＣＬ１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ヒト増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、核補因子、Ｊａｋ及びＳｔａｔファミリーメンバー、Ｇタンパク質シグナル伝達分子（例えば、ケモカイン受容体、ＪＮＫ、Ｆｏｓ−Ｊｕｎ、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ７、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４）。
【０２５８】
ＩＶ．ＳＨＭ耐性又はＳＨＭ感受性であるポリヌクレオチド配列を設計するためのストラテジー
ＳＨＭに最適化された配列の設計及び使用は、優先の米国出願第６０／９０２，４１４号に記載されている。
【０２５９】
ポリヌクレオチドがＳＨＭを起こす能力を改変するための一つのストラテジーは、コドン用法を改変してＳＨＭホットスポット及び／又はコールドスポット密度を調節することを通じるものであり、このアプローチは、目的のタンパク質の主要なアミノ酸配列に影響を与えることなく、ホットスポット密度を増加又は減少させることができる。
【０２６０】
ホットスポット及び／又はコールドスポット密度を最適化することに加えて、最適化されたポリヌクレオチドが効率的に翻訳され且つ宿主系において安定であるように、以下の特徴を考慮することも望ましい。以下で論じるように、これらの設計パラメーターは、反復のコンピュータアルゴリズムを用いて、好都合に最適化することができる。
【０２６１】
ＣｐＧジヌクレオチドモチーフの密度：過剰のＣＧモチーフは、遺伝子サイレンシングに繋がる遺伝子メチル化をもたらし得、対象としている宿主系で高度に転写されている遺伝子において見出される密度に正規化され得る（例えば、Ｋａｍｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  （２００６）３４９（４）：１２６９−１２７７を参照）。
【０２６２】
１本鎖配列がステムループ構造を形成する能力：ステムループ構造の形成は、特にコーディングフレームの５’領域の近くに位置する場合、非効率的な転写及び又は翻訳をもたらし得る（例えば、Ｚｕｋｅｒ  Ｍ．、Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  （２００３）；３１（１３）：３４０６−３４１５を参照）。ステムループ構造の形成は、例えば５’末端の近くで、６ヌクレオチドより長い重複又は回文のストレッチを避けることによって最小化され得る。或いは、ループが約２５ヌクレオチド（ｎｔ）よりも多くを含む場合には、より長いステムが許容される。
【０２６３】
コドン用法：適切なコドン用法、即ち、非常にまれなｔＲＮＡではなく、より一般的且つ頻繁に使用されるｔＲＮＡをコードするコドンを使用することは、使用している発現系における効率的な翻訳を可能とするために重要である（一般には、２０００年現在でのＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ配列データベース中の全タンパク質配列の各々のコドン頻度表を挙げたＮａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（１）：２９２、“Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００”を参照されたい）。一般に、コドン用法は、ポリヌクレオチドの転写が開始される遺伝子の５’末端近くにおいてより重要であり、この領域では、レアコドンは極力避けるべきである。目的の生物における発現遺伝子のコーディングフレーム内において１０％未満の回数で使用されるコドンの約８０％以上を除去することが好ましい。
【０２６４】
ＧＣ含量：これは一般に、宿主生物において高度に発現している遺伝子のＧＣ含量にあわせるべきであり、例えば哺乳動物の系においては、ＧＣ含量は約６０％未満であるべきである。
【０２６５】
制限部位：制限部位は、所望される場合には熟考して置かれるべきである。同様に、ポリヌクレオチド内の重要な制限部位（即ち、全遺伝子又は他の遺伝子をクローニングするために使用されることが意図される制限部位）は、所望でなければ、揺らぎ位置を改変することによって取り除くべきである。
【０２６６】
同一ヌクレオチドのストレッチ：同一ヌクレオチドのストレッチを、６未満の連続ヌクレオチドまで最小化又は除去する。
【０２６７】
加えて、開始コドンにおいて、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列〔即ち、（ａ／ｇ）ｃｃ（ａ／ｇ）ｃｃＡＴＧｇ〕を含めることにより、発現は更に最適化され得る。この目的のために有用なＫｏｚａｋ配列は、当該分野において公知である（Ｍａｎｔｙｈら、ＰＮＡＳ  ９２：２６６２−２６６６（１９９５）；Ｍａｎｔｙｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．＆Ｐｕｒｉｆ．  ６，１２４（１９９５））。
【０２６８】
好ましくないコドン用法：終止コドンを生成するように１ステップで変異され得る特定のコドン（「好ましくないＳＨＭコドン」）の使用を回避又は最少化する。「好ましくないコドン」には、ＵＧＧ（Ｔｒｐ）、ＵＧＣ（Ｃｙｓ）、ＵＣＡ（Ｓｅｒ）、ＵＣＧ（Ｓｅｒ）、ＣＡＡ（Ｑ）、ＧＡＡ（Ｇｌｕ）及びＣＡＧ（Ｇｌｎ）が含まれる。
【０２６９】
ＳＨＭへの感受性が改変されたポリヌクレオチド配列を設計するための、目的のポリヌクレオチドのコード配列内での配列特異的な制約を超えた更なる設計基準としては、以下の要素が挙げられる：
【０２７０】
プロモーターの選択；強力なプロモーターは、一般により高い割合で転写を誘導し、全体として、より弱いプロモーターと比べ、より高い変異誘発率を生じる。更には、ｔｅｔ−プロモーターなどの誘導性プロモーターは、発現、従ってＳＨＭが、目的のポリヌクレオチドの転写及び変異誘発をオン又はオフに切り換えるように誘導的に制御されることを可能とする。Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９２  Ｊｕｎ  １５；８９（１２）：５５４７−５１；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９５  Ｊｕｎ  ２３；２６８（５２１８）：１７６６−９。
【０２７１】
転写開始点に対するコード配列の位置；一般に高レベルの変異誘発のためには、目的のポリヌクレオチドは、転写開始部位から、約５０ヌクレオチドと２ｋｂとの間に位置しているべきである。
【０２７２】
ポリヌクレオチド配列をＳＨＭに対して最適化する１つの簡便なアプローチは、目的の対応するアミノ酸配列をコードするための選択的なコドン用法によって使用され得る可能な選択的なヌクレオチド配列を（上記パラメーターに従って）比較及びスコア付けするコンピュータアルゴリズムを通じて、目的の該アミノ酸配列を解析することを伴う。コドン又はコドン群（タイル又はＳＨＭモチーフ）を漸進的に好ましい配列で繰り返し置換することにより、所望の特性を有するポリヌクレオチド配列をコンピューター上で進化させることが可能である。具体的には、例えば、ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性であるが、それでもなお、妥当な翻訳効率、安定性を示し、制限部位を最小化し、且つ対象としている特定の生物におけるレアコドンを回避している配列である。
【０２７３】
このアプローチを使用して、出発アミノ酸又はポリヌクレオチド配列に基づいたファイルのライブラリーを作成できる。この解析及び最適化ストラテジーの１つの非限定的な例において、当該ライブラリーは、３コドンに対応する、９ヌクレオチドの群（「タイル」）の解析に基づいて作成できる。各タイルは、上記の属性に関してスコア付けされて、何十万もの９マー順列及びそれら各々のスコアを含む、タイルの初期ライブラリーデータセットを生成し得る。
【０２７４】
ライブラリーファイルのセクションの代表的なサンプルを表４に示しており、これは、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）及びロイシン（Ｌ）の３つのアミノ酸のみについて、選択的なコドン用法から生じるヌクレオチド配列における潜在的な多様性を示している。当業者であれば、全ての可能なアミノ酸の組み合わせに対して、公知のコドン用法パターンを使用して、ファイルの完全なセットを容易にまとめることが出来ることを容易に理解する。
【０２７５】
【表４−１】
0005675109.tif 000037
【０２７６】
【表４−２】
0005675109.tif 000038
【０２７７】
【表４−３】
0005675109.tif 000039
【０２７８】
【表４−４】
0005675109.tif 000040
【０２７９】
【表４−５】
0005675109.tif 000041
【０２８０】
各ポリヌクレオチド配列は、以下の属性に基づいてランク付けされている；ＳＨＭホットモチーフ及びコールドモチーフの数、ＣｐＧモチーフの数、ＭａｘＮｔ（単一ストレッチ内の最大のヌクレオチド数）及び使用される宿主細胞におけるコドン利用頻度。表４の最後の列に含まれる用語「Ｌｏｇ（πｐ（ＡＡ）」とは、トリマー内にアミノ酸の各々を観察した個々の確率の積の対数として計算され、以下の式にて与えられる：
【０２８１】
Ｌｏｇ（πｐ（ＡＡ）＝ｌｎ（ｐ（コドンｉ−１｜アミノ酸ｉ−１）＊ｐ（コドンｉ｜アミノ酸ｉ）＊ｐ（コドンｉ＋１｜アミノ酸ｉ＋１）
【０２８２】
各アミノ酸に対する個々の確率は、対象としている生物（この場合、哺乳動物細胞）における、公表されているコドン用法パターンに基づいた（一般にはＮａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  （２０００）２８（１）：２９２  Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００を参照）。
【０２８３】
上記の表から容易にわかるように、配列内に存在するホットスポット又はコールドスポットの数での評価で、コドン用法多様性のみで、体細胞超変異に対する感受性が幅広く異なるポリヌクレオチド配列を作成することが可能である。
【０２８４】
この解析から、ＳＨＭに最適化され、ＣｐＧを最少化し、且つ効率的な翻訳のための最適なコドンを使用する、可能なコドンの組み合わせが容易に同定される。例えば、以下に挙げる配列は、最大のホットスポット数を含みコールドスポットを含まないため、上位ランクのホット配列を示している。
【０２８５】
【表５】
0005675109.tif 000042
【０２８６】
これらのうち、哺乳動物細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを含むため、配列ＡＧＴＡＧＧＣＴＧ（配列番号２８５）及びＡＧＣＡＧＧＣＴＧ（配列番号２８９）が好ましい。
【０２８７】
可能な全ての９マーヌクレオチドタイルを規定してスコア付けすることで、出発アミノ酸又はヌクレオチドテンプレートをスキャンして、タイルライブラリーからの置換によって改善され得るような遺伝子／タンパク質の位置を同定することが可能である。このプロセスは、ｐｅｒｌプログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎ．ｐｌのようなコンピュータアルゴリズムを用いることで簡便に完了され得る；そのコードを以下に示す：
0005675109.tif 000043
0005675109.tif 000044
0005675109.tif 000045
0005675109.tif 000046
0005675109.tif 000047
0005675109.tif 000048
0005675109.tif 000049
【０２８８】
上に示した可能な３アミノ酸タイルのファイルに加えて、プログラムは、以下に概要したホットスポット及びコールドスポットのファイル、並びにポリヌクレオチド配列に対してアミノ酸配列を翻訳するための遺伝コードリストもまた、必要とする：
【０２８９】
【表６】
0005675109.tif 000050
【０２９０】
出発アミノ酸テンプレートが与えられる場合には（例えば、元となるＤＮＡ配列が公知でない場合）、所与のアミノ酸配列及びその生物における公知のコドン用法の両方と一致するＤＮＡヌクレオチド配列を先ず生成することによってアルゴリズムが始まる。出発ヌクレオチドテンプレートは、ホット又はコールド部位が所与の位置に組み込まれるべきかどうかをｐｅｒｌプログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎ．ｐｌに指示する更なるラインを含み、これによって、ＳＨＭを、例えば抗体分子のＣＤＲを標的化するための領域に向かわせるのと同時に、進化しているタンパク質の部分におけるＳＨＭを抑制又は最小化することが可能となる。ポリヌクレオチド中の所与の９マーは、その位置で同一の３アミノ酸をコードするであろう可能な他の全てのノナマーオリゴヌクレオチドと比較され得る。
【０２９１】
配列又はその部分が、ＳＨＭのために最適化されている（「ホット」にされている）場合、アミノ酸配列と一致する全てのヌクレオチド配列の網羅的な検索がなされ、進化しているコンストラクトのヌクレオチド配列は、以下の条件を満たす場合、新たなヌクレオチド配列により置換される：（１）新たな９マー（ＳＨＭモチーフ）が、既存の配列よりも多いホットスポットを含む、（２）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のコールドスポットを含む、（３）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のＣｐＧ配列モチーフを含む、（４）進化している配列が、その位置での公知の集合コドン用法（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）と同等又は改善されたコドン用法スコアを有する、及び（５）配列が、４残基を超えるどの１ヌクレオチドストレッチも含まない。
【０２９２】
配列又はその部分が、ＳＨＭに対して耐性とされている（「コールド」にされている）場合、アミノ酸配列と一致する全てのヌクレオチド配列の網羅的な検索がなされ、進化しているコンストラクトのヌクレオチド配列は、以下の条件を満たす場合、新たなヌクレオチド配列により置換される：（１）新たな９マー（ＳＨＭモチーフ）が、既存の配列よりも多いコールドスポットを含む、（２）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のホットスポットを含む、（３）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のＣｐＧ配列モチーフを含む、（４）進化している配列が、その位置での公知の集合コドン用法と同等又は改善されたコドン用法スコアを有する、及び（５）新たな９マーヌクレオチド配列が、４残基を超えるどの１ヌクレオチドストレッチも含まない。
【０２９３】
配列がＳＨＭ以外の他の因子のために最適化されている（「中立」にされている）場合、アミノ酸配列と一致する全てのヌクレオチド配列の網羅的な検索がなされ、進化しているコンストラクトのヌクレオチド配列は、以下の条件を満たす場合、新たなヌクレオチド配列により置換される：（１）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のＣｐＧ配列モチーフを含む、（２）進化している配列が、その位置での公知の集合コドン用法と同等又は改善されたコドン用法スコアを有する、及び（３）新たな９マーのヌクレオチド配列が、４残基を超えるどの１ヌクレオチドストレッチも含まない。
【０２９４】
関連の優先出願第６０／９０２，４１４号にさらに記載されるように、任意の所与のポリヌクレオチド配列から開始し、本明細書中に記載する特性について最適化された少数の可能な配列に迅速に収束するポリヌクレオチド配列を生成するためにこのアプローチを使用することが可能である。
【０２９５】
コンピュータ分析後、最終的な最適化ポリヌクレオチドは、標準的な方法論を使用して合成でき、正確な合成を確認するために配列決定され得る。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、このポリヌクレオチドはベクター中に挿入することができる。このベクターは、本明細書中に記載するように、宿主細胞中に導入され得、発現、活性、又はＳＨＭに対する感受性の増加若しくは減少に関して試験され得る。
【０２９６】
当業者は、ホットスポット又はコールドスポットの密度を最大化するのに最良のコドン用法を見出すために使用できる多くの可能なアプローチ及びコンピュータによる方法が存在すること、並びに本発明が最適な配列を決定するいずれか１つの特定の方法に限定されることを意図しないことを、認識するであろう。
【０２９７】
以下にさらに記載するように、ＳＨＭ耐性配列及び又はＳＨＭ感受性配列を有する合成ポリヌクレオチド配列の作製は、ポリヌクレオチドライブラリー（例えば、シードライブラリー）を生成する新規多様性の発達を可能にする。
【０２９８】
Ｖ．ＳＨＭ介在性の多様化のための合成標的化ライブラリー（「シードライブラリー」）の構築
静的ライブラリーは典型的に、そのサイズ及び範囲において限定されている。例えばファージディスプレイライブラリーは１０１２ほどの多くのメンバーをディスプレイでき、約１０１６のメンバーを潜在的に含むリボソームライブラリーが構築されている。細菌細胞及び哺乳動物細胞の表面上に提示されたライブラリーは、通常はこれほど複雑ではなく、典型的には１０９よりも少ないメンバーである。さらに、強固なライブラリーの構築及び選択は通常、この理論的複雑性をさらに制限し、全ライブラリーのスクリーニングを、遅くてコストがかかり、ある場合には実用的でないものにする数倍の冗長性を、ライブラリーが含むことを必要とする。
【０２９９】
これらのレベルの複雑性にもかかわらず、このような静的ライブラリーは、ほんの僅かな可能な配列空間（即ち、目的のポリヌクレオチド領域内の可能な順列の潜在的な数）のみを調査できる。例えば、重鎖ＩｇＧ配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の相補性領域内に３０より多いアミノ酸を含み得、この単一鎖に２０３０より多い可能な順列を与え、可能性のある静的ライブラリーの最大のものさえも小さくする。この制限に起因して、研究者らは、進化するタンパク質配列及びライブラリーのための方法論を調査してきた。本出願で扱うＳＨＭは、親和性成熟を受ける抗体配列を進化させるための機構として、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）及びエラープローンポリメラーゼを使用する。このような系は、所与の遺伝子のポリヌクレオチドライブラリー内の目的の各位置における進行性の（ｏｎ−ｇｏｉｎｇ）変異誘発及び選択を促進でき、機能的配列空間の選択的調査を提供できる。このような検索ストラテジーにより、配列空間のかなり生産性の高い領域の調査が可能となり、それにより、本明細書中に記載した方法を、新たな機能性及び治療剤の迅速な開発にとって非常に魅力的なものにする。
【０３００】
さらに、以下に議論するように、ＳＨＭは、定量可能な頻度で「ホットスポット」モチーフの各位置において特異的なヌクレオチド遷移を導入する。ヌクレオチド遷移のこのスペクトルは、３つの可能なリーディングフレームのどれが使用されるかに依存して、種々の可能なサイレント又は非サイレントのアミノ酸遷移を生じる。ＳＨＭにより介在される最も可能性の高いコドン遷移と、変異事象の連続的な流れとを規定することによって、「好ましいホットスポットＳＨＭコドン」を、各アミノ酸位置でライブラリーの機能性を増強するために利用できる特定のアミノ酸遷移群を生成するように、選択できる（例えば、図１、２、４及び６を参照のこと）。
【０３０１】
従って、ＳＨＭ耐性領域及びＳＨＭ感受性領域の予め検討された領域を有する合成ポリヌクレオチドシードライブラリーの生成は、タンパク質の選択的な指向された進化及び選択を可能にし、ＳＨＭの多様性生成特性及び標的化特性を最大限に利用する。
【０３０２】
抗体の場合、これは、目的のエピトープへの結合を改善するか、又は新たな若しくは変更されたエピトープが結合できるようにＣＤＲを変更するための、相補性決定領域（ＣＤＲ）の標的化した多様化を、典型的には意味する。４つの、そして実に２つのアミノ酸のアルファベット（セリン及びチロシン）を含む単純化したＣＤＲライブラリーもまた記載されており、高い親和性及び選択性で抗原に結合できることが見出されている。例えば、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ  ＦＡ、Ｌｉ  Ｂ、Ｃｏｍｐａａｎ  ＤＭ、Ｐｅｄｅｎ  ＡＡ、Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ＳＧ、Ｓｉｄｈｕ  ＳＳ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｂｉｎａｒｙ  ｃｏｄｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２００５）３４８：１１５３−６２；及びＦｅｌｌｏｕｓｅ  ＦＡ、Ｗｉｅｓｍａｎｎ  Ｃ、Ｓｉｄｈｕ  ＳＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆｏｕｒ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｃｏｄｅ：ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（２００４）１０１：１２４６７−７２を参照のこと。
【０３０３】
１つの態様において、合成遺伝子は、Ｂ細胞中で発現されると天然にＳＨＭを受ける遺伝子（即ち、抗体遺伝子）である。別の態様において、合成遺伝子は、Ｂ細胞中で発現されると天然にはＳＨＭを受けない遺伝子（即ち、非抗体遺伝子）である。非抗体ポリペプチド（例えば、酵素及び他のタンパク質クラス）の場合、これは、目的の酵素又はタンパク質の機能的活性又は生物学的活性（例えば、結合特異性、酵素機能、蛍光又は他の特性であるがこれらに限定されない）を調節する、該酵素又はタンパク質の領域の標的化された多様化をいう。ライブラリーは通常、ライブラリーの改善された又は機能的なメンバーがライブラリーの非機能的メンバーから分離されるのを可能にする、以下に開示するような１以上の選択ストラテジーと組合される。
【０３０４】
１つの態様において、本発明は、ＡＩＤ介在性の変異誘発を介した迅速な進化が可能な、合成シードライブラリーを含む。この合成シードライブラリーは、以下の特性を有し得る：ｉ）このライブラリーは合成が容易であり、限定数の別個の機能的配列に基づく；ｉｉ）このライブラリーは、ＳＨＭの基質として作用する１以上の合成可変領域を含み且つ高密度の好ましいＳＨＭコドン（例えば、好ましいＳＨＭホットスポットコドン（以下の表９を参照のこと））を含む、合成ポリヌクレオチド配列を含む；ｉｉｉ）このライブラリーは、ＳＨＭ介在性の変異誘発に対して耐性の１以上の合成フレームワーク領域を含み且つ低密度のＳＨＭホットスポットを含む、合成ポリヌクレオチド配列を含む；ｉｖ）このライブラリーは、ＳＨＭを介して１ステップで終止コドンに変異し得る特定のコドン（「好ましくないコドン」）（ＵＧＧ（Ｔｒｐ）、ＵＧＣ（Ｃｙｓ）、ＵＣＡ（Ｓｅｒ）、ＵＣＧ（Ｓｅｒ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＧＡＡ（Ｇｌｕ）及びＣＡＧ（Ｇｌｎ）が含まれる）を含まない又は最小数で含む；ｖ）タンパク質の必須領域での変化及び終止コドンの生成を最小化しつつ、ＳＨＭ介在性の変異誘発は、コドンの出発セットから、変異誘発のために選択された各位置において、大きな潜在的多様性を生じる。
【０３０５】
Ａ．ライブラリー設計
特定の目的のタンパク質に関するライブラリーは、任意の従来の技術及び／又は構造と活性との関係に関する情報、異なる種間の相同性、及びそのタンパク質のＸ線又はＮＭＲ構造情報、或いは問題のタンパク質ファミリーを考慮して、設計できる。具体的な設計基準は以下及び関連出願である第６０／９０２，４１４号（表題「Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」）に提供される。
【０３０６】
本発明の特定の実施形態において、最初のライブラリー設計は以下の工程を含み得る：
１．目的のタンパク質のアミノ酸配列を同定し、対応するポリヌクレオチド配列を決定するか、概念的に逆転写する。
２．目的のタンパク質、及び関連タンパク質、又は目的の相同タンパク質に関する任意の適切な構造情報を得る。
３．目的のタンパク質に対して配列比較を実施し、密接に関連した種由来の全ての他のタンパク質及び既知のアイソフォームに対して比較を行なう。特定の実施形態において、配列アラインメントが、保存されたアミノ酸配列及び可変性のアミノ酸配列を同定するために作成されるであろう。
【０３０７】
この情報は、特定のアミノ酸又はタンパク質領域が、目的のタンパク質の機能的又は構造的な属性において重要である可能性があるかどうか、タンパク質ファミリーを横断したタンパク質の機能的アイソフォームにわたってそれが保存されているか又はバリアントであるかどうかを確立するために、使用できる。
【０３０８】
この情報に基づいて、目的のタンパク質の機能的属性に直接関与するように思われる、目的の特定の領域を確立することが可能である。例えば、これらのアミノ酸は、目的の特定の機能的又は構造的属性の内側、又はその５Ａ以内に存在するであろう。具体的な例としては、抗体のＣＤＲ内、受容体の結合ポケット内、酵素の触媒クレフト内、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン内、補因子の、アロステリック結合部位などの、アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０９】
本明細書中に示される構造及び配列分析に基づいて、１以上のポリヌクレオチドが、ＳＨＭ介在性の変異誘発のための改善されたテンプレートを生成するように設計され得る。特定の実施形態において、本発明は、以下の概念を１以上取り込み得る：
ｉ）高度に保存されたアミノ酸、又は重要な結合エネルギーに直接寄与することが知られている若しくはそう考えられているアミノ酸は、最初は保存され、それらの近傍内のコドン用法を、コールドスポットモチーフを生成するように変化させるか、ＳＨＭの間の大抵の保存的なアミノ酸変化を促進するように変更する。
ｉｉ）タンパク質のコア構造フレームワークを維持するのに関与すると思われるアミノ酸ドメインは最初は保存され、それらのコドン用法を、ＳＨＭの間に大抵の保存的なアミノ酸変化を促進するよう変化させる。特に重要なフレームワーク領域中のアミノ酸残基は、より高い割合のコールドスポットを使用するように、及び耐性であるか又はＳＨＭの間にサイレント変異を生じるコドンを利用するように、変更できる。
ｉｉｉ）目的の領域中のアミノ酸は、以下に記載するように、高効率のＳＨＭを可能にする合成可変領域を組み込むように変化させることができる。
ｉｖ）明確に特定された役割を果たすと同定されないアミノ酸は、効果的なＳＨＭを可能にする（即ち、ＳＨＭホットスポットの頻度が最大化でき、ＳＨＭコールドスポットの頻度が最小化できる）ために最適化されるコドンであり得る。
【０３１０】
Ｂ．ＳＨＭの基質として作用する合成可変領域の設計
ＡＩＤ及び／又はエラープローンポリメラーゼのための全てのＳＨＭホットスポットの、変異原性に対する感受性の序列は、上記及び優先の米国出願第６０／９０２，４１４号のセクションＩＩＩに記載されている。本発明者らはさらに、サイレント変異対非サイレント変異の生成に重要なリーディングフレーム構成を同定した。本明細書中で、本発明者らは、変異が所望される各ライブラリー位置における多様なアミノ酸の生成を導き得る、ＳＨＭの基質として作用し得る高密度の好ましいホットスポットコドンの使用を含む、合成シードライブラリーアプローチを記載する。このような高密度のＳＨＭモチーフは、効率的な変異誘発を確実にするために、合成可変領域の境界において特に重要である。
【０３１１】
ｉ．ＷＡＣベースのモチーフ
配列ＷＡＣ（ＷＡＣ、ここで、Ｗ＝Ａ又はＴが同じ割合でコードされ、参照のリーディングフレームは、各コドンのゆらぎ即ち３番目の位置にＣをおく）のみを含むポリヌクレオチド配列は、高密度のホットスポットを提供する。このパターンは、２つのアミノ酸（アスパラギン及びチロシン）をコードする２つのコドンだけを含む４つの可能な６マーヌクレオチドパターンのみを生じる。
【０３１２】
【表７】
0005675109.tif 000051
【０３１３】
３つの可能なリーディングフレームのいずれかで与えられたＷＡＣライブラリーがコードする全てのモチーフは、ホットスポットの連結を生じる。図３は、ＳＨＭ介在性の機構をリクルートする能力について、これらのモチーフを、全ての他の可能な４０９６の６マーヌクレオチドの組み合せと比較する。より長いアセンブリーは、「コールドスポット」なしの同じ高密度のＳＨＭ「ホットスポット」を生じる。縮重コドンのこのアセンブリー（ＷＡＣＷ）は、Ｒｏｇｏｚｉｎらが記載した可能な４マーのホットスポットのサブセット（ＷＲＣＨ（ここで、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、及びＷ＝Ｔ又はＡ））を生じることも、注目に値する。
【０３１４】
図４に示されるように、好ましいＳＨＭホットスポットコドンＡＡＣ及びＴＡＣ（これらは、本明細書中に記載するような合成ライブラリーの基礎となり得る）は、Ｉｇ重鎖抗体において観察される等価なＳＨＭ変異事象による判断で、かなりのアミノ酸の多様性を生じる、一次及び二次の変異事象のセットを生じ得る。これら２つのコドンから、塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、アルギニン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸）、親水性アミノ酸（セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン）、疎水性アミノ酸（アラニン及びフェニルアラニン）、及びグリシンが、ＳＨＭ事象の結果として生じる。
【０３１５】
ｉｉ．ＷＲＣベースのモチーフ
本明細書中でＷＲＣモチーフと名づけた第二の可能な合成高密度ＳＨＭモチーフ（ＷＲＣ、ここで、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｒ＝Ｇ又はＡ、Ｃ＝シチジンであり、参照のリーディングフレームは、各コドンのゆらぎ即ち３番目の位置にＣをおく）は、２つの可能なコドン（ＡＧＣ及びＴＡＣ）を含むモチーフであろう。再び、４つの可能な６マーヌクレオチドが可能である：
【０３１６】
【表８】
0005675109.tif 000052
【０３１７】
ＳＨＭ介在性の変異に対するこのモチーフのホットさ又はコールドさを記述する、全４０９６の６マーヌクレオチドのｚスコアの分布を、図５に示す。ＷＲＣ合成ライブラリー中の６マーの全ての順列についてのｚスコアがこの分布上に重ねられており、点線は全ての可能なモチーフの上位５％を示す。
【０３１８】
親和性成熟したＩＧＶ重鎖配列中で観察されるような、「好ましいＳＨＭホットスポットコドン」ＡＧＣ及びＴＡＣから開始する、アミノ酸多様性の生成を導く一連の変異事象を、図６に示す。アスパラギン及びチロシンをコードするコドンから開始する、４２００の一次及び二次の変異事象は、機能的に多様なアミノ酸のセットを導く。
【０３１９】
再び、このモチーフは、図５に示されるように、全ての他の６マーヌクレオチドモチーフと比較すると、非常に高密度の最適なＳＨＭホットスポット及びホットコドンを生じる。ＷＡＣ合成モチーフと同様、ＷＲＣ合成モチーフは、ＡＩＤ及び１以上のエラープローンポリメラーゼのＳＨＭ活性と組み合わせたとき、各位置において可能なアミノ酸多様性の広いスペクトルを生じる、好ましいＳＨＭホットスポットコドンを与える（図６）。
【０３２０】
従って、１態様において、このような合成の好ましいＳＨＭモチーフ（例えば、ＷＡＣベースのモチーフ及びＷＲＣベースのモチーフ）は、ＳＨＭの基質として作用し、且つ高い程度の多様性が所望される、目的の特定のドメイン又はサブドメインをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）内の目的の特定の領域へと標的化され得る。
【０３２１】
別の態様において、好ましいＳＨＭモチーフ（例えば、ＷＡＣモチーフ又はＷＲＣモチーフ）は、目的のタンパク質のオープンリーディングフレームの全体にわたって、体系的に挿入できる。例えば、１００アミノ酸残基のタンパク質について、好ましいＳＨＭモチーフ（例えば、ＷＡＣモチーフ又はＷＲＣモチーフ）がそのタンパク質内の全ての可能な位置に一旦個別に導入される、３００の別個のポリヌクレオチドが生成され得る。次いで、これら１００個のポリヌクレオチドの各々が、個別に又はライブラリー中にプールした後のいずれかにスクリーニングされ、各位置での最適なアミノ酸置換を同定できる。次いで、各位置での改善された変異が組換えられて、各位置で同定された最良の個々のアミノ酸の全てを含む次世代のコンストラクトを生成できる。
【０３２２】
ｉｉｉ．領域変異誘発
より大きいドメイン内の効果的な変異誘発を提供するために、以前に議論したように、コドン用法が、アミノ酸配列を変更することなくホットスポットの密度を増加させるように、目的の領域（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）の全体にわたって改変され得る。このアプローチは、ＳＨＭをどこに標的化すべきか、又はどの特定のアミノ酸が活性に必須であるかについて、先入観を必要としないという利点を有する。
【０３２３】
別の態様において、効率的なＳＨＭが必要とされる領域について、改善されたホットスポット密度を有するコドンを挿入するために、コドン用法を変化させること及び保存的アミノ酸置換を行なうことの両方によって合成可変領域を生成して、標的化した領域内のＳＨＭホットスポットの密度をさらに増強できる。適切なアミノ酸置換は、安定な遺伝子生成及びドメイン構造に関する同じ全般的な基準に注意しながら、以下の表９に列挙するものから選択できる。
【０３２４】
【表９】
0005675109.tif 000053
【０３２５】
いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｔｒｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｙは、それらの位置が機能的又は構造的役割を示唆する場合、保存される。これらのアミノ酸以外は、最適化すべきアミノ酸が列挙されていない場合、上に列挙したのと同じサブグループ又はグループからアミノ酸が選択される。
【０３２６】
特定の実施形態において、このような合成可変領域では、以前に記載されたように（一般には、米国出願第６０／９０２，４１４号、表題「Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」を参照のこと）設計できる、主にＳＨＭ耐性配列を含むフレームワーク領域が散在し得る。
【０３２７】
利用可能な情報の量に依存して、好ましいＳＨＭモチーフ（例えば、ＷＡＣモチーフ又はＷＲＣモチーフ）の使用に基づく非常に意欲的な標的化アプローチから、きわめて選択的なアミノ酸置換を使用するより保守的なストラテジーまで、そしてコドン用法のみが変化する慎重なストラテジーにまで及ぶ、多数の異なるライブラリー設計ストラテジーを使用してもよい。本発明の利点は、各アプローチが１つの独自のヌクレオチド配列のみの生成を生じることであり；したがって、これらのストラテジーは全て、重大なさらなる負担なしに、平行してＳＨＭ介在性の多様性に供することができる。
【０３２８】
Ｃ．改善されたバリアントのサブライブラリー
さらに、目的のタンパク質（抗体又は結合タンパク質を含む）の改善されたバリアントを生成及び選択するための動的進化系の使用は、本明細書中に開示するように、改善されたタンパク質の逐次の指向された進化を可能にする。これは、例えば、ＡＩＤによって変異されるべき、特定の所望の形質（例えば、抗体の場合、改善された親和性又は交差反応性）に対する直接的影響を有する、出発配列又は生殖系列配列中の以前に同定された位置又はその周囲にＳＨＭ最適化配列を含む、二次シードライブラリーの生成を介して、達成できる。
【０３２９】
重要なことに、このような系は、単離すべき種々のクローンの可変ドメインの配列を分析する継続的な能力；及び分析されるクローン内でのそれらの分布を決定するための各場合において、体細胞超変異を介してタンパク質中に導入される変異を決定する継続的な能力を可能にする；例えば、抗体の場合、重鎖及び軽鎖のコード領域内の変異の位置、及びそれらの構造的構成。こうして同定した変異は、従って、タンパク質の構造内でのそれらの位置に基づいて分析できる。特定の実施形態において、異なる進化するクローン間に生じる重要な変異を、ＳＨＭのために最適化することができ、且つ次いでファミリー間又はファミリー内で組換えて、観察された全ての変異の全て又はサブセットの合計を示す、親和性又は選択性における有利な増加を示すハイブリッド抗体を迅速に生成することができる。それにより、集団内の有用な多様性の分析が最大化され、かつＳＨＭを介したタンパク質のさらなる進化が可能になる。このような概念的組換えアプローチは、選択された抗体及び結合タンパク質の迅速な進化を可能にし、集団内の中立又は不利な変異の体系的な蓄積を回避し、従って、全般的プロセスにおける効率及び有効性の両方における有意な改善を提供する。
【０３３０】
さらに、目的のタンパク質内の特定の部位に体細胞超変異機構を標的化する因子の理解は、アミノ酸多様性を生成するのにこれらの配列を如何に利用するかについての具体的な洞察と合わせて、ＳＨＭを受ける異種の系における、予測できる多様性の生成を提供する、特定のアルゴリズムの開発を可能にする。このようなアプローチは、コドンに対するＳＨＭ作用の結果として生成される又は生成されない可能性のあるアミノ酸の理解、並びに特定の又は縮重コドン、又は好ましいＳＨＭコドン、又は好ましくないＳＨＭコドン、又は任意の特定のＳＨＭモチーフに対するＳＨＭ作用の結果として生じる、生成されたアミノ酸の一時的配列、の両方に基づく。この分析は、ＳＨＭ系において変異を促進又は拒絶し、ｉｎ  ｓｉｔｕで多様性を生成する効率的かつ予測可能な変異誘発を示す、ＤＮＡコンストラクトの開発を可能にする。
【０３３１】
この理解を、高度に選択された進化系から実際に同定された変異のための最も有利な位置についての知見と組み合わせることによって、迅速かつ効果的なタンパク質の変異誘発を可能にする系の作成が可能である。
【０３３２】
実施例１２及び１３に示すように、このアプローチは、いくつかの利点（機能的に改善された形態において富化される大きな理論的複雑性を生成することになる、ＳＨＭを介して進化され得る複雑性の低いシードライブラリーを効率的に設計する能力を含む）を有する改善されたシードライブラリーの分析及び設計を可能にする。
【０３３３】
即ち、１態様において、本発明は、複数の１以上のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む組成物を含み、このポリヌクレオチドは少なくとも１以上のコドンを含み、このコドンは、ＡＩＤ介在性の変異誘発によって、該１以上のポリペプチドの所望の特性に影響を与えるように変異していると同定されており、該１以上のコドンの全て又は全体のサブセットは、野生型形態から変更されて、体細胞超変異のために最適化されている。
【０３３４】
この方法の１つの非限定的な実施形態において、該１以上のコドンの全て又は全体のサブセットは、そのＡＩＤで変異された形態から変更されて、さらなる体細胞超変異のために最適化されている。
【０３３５】
本発明はまた、所望の特性を有する目的のタンパク質を作成する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：ａ．目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、少なくとも１つの目的の領域をコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｂ．目的のタンパク質の複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；ｃ．目的のタンパク質の複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーの発現によって目的のタンパク質が産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる）；ｄ．必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程又はシードライブラリーにＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程；ｅ．所望の特性を有する変異タンパク質を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；並びにｆ．工程（ｅ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【０３３６】
他の実施形態において、本明細書には、所望の又は同定された特性を有する目的のタンパク質を作成する方法が提供され、この方法は以下の工程を含む：（ａ）１以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｂ）ポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；（ｃ）ポリヌクレオチドのシードライブラリーの発現によって該１以上のタンパク質が産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤ活性を示すか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤ活性を示すように誘導できる）；（ｄ）必要に応じて、ＡＩＤ活性を誘導する工程；（ｅ）所望の又は同定された特性を有する１以上の変異タンパク質を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及び（ｆ）工程（ｅ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【０３３７】
他の実施形態において、所望の特性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを作成する方法が本明細書中に提供され、この方法は以下の工程を含む：ａ．少なくとも１つのＣＤＲを有する複数の１以上の抗体重鎖タンパク質又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、これらのポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＤＲをコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｂ．少なくとも１つのＣＤＲを有する複数の１以上の抗体軽鎖タンパク質又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、少なくとも１つのＣＤＲをコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｃ．複数の抗体重鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー、及び複数の抗体軽鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；ｄ．同じ又は異なる発現ベクター上の、複数の抗体重鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー由来の重鎖配列と、複数の抗体軽鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー由来の軽鎖配列との共発現によって、抗体又はその抗原結合フラグメントが産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、この宿主細胞は、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる）；ｅ．必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程又はポリヌクレオチドのシードライブラリー上にＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程；ｆ．所望の特性を有する変異した抗体又はその抗原結合フラグメントを発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及びｇ．工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【０３３８】
他の実施形態において、所望の又は同定された特性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを作成する方法が本明細書中に提供され、この方法は以下の工程を含む：（ａ）少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを有する複数の１以上の抗体重鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードする第一のポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの第一の合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｂ）少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを有する複数の１以上の抗体軽鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの第二の合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｃ）ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーを、作動可能な組合せで発現ベクター中に連結する工程；（ｄ）（同じ又は異なる発現ベクター上の、）ポリヌクレオチドの第一のシードライブラリー由来の重鎖配列及びポリヌクレオチドの第二のシードライブラリー由来の軽鎖配列の共発現によって、抗体又はその抗原結合フラグメントが産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤ活性を示すか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤ活性を示すように誘導できる）；（ｅ）必要に応じて、ＡＩＤ活性を誘導する工程；（ｆ）所望の又は同定された特性を有する１以上の変異した抗体又はその抗原結合フラグメントを発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及び（ｇ）工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【０３３９】
なお他の実施形態において、複数のタンパク質を同時進化させる方法が本明細書中に提供され、この方法は以下の工程を含む：ａ．第一の目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、少なくとも１つの目的の領域をコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｂ．第二の目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドのシードライブラリーは、少なくとも１つの目的の領域をコードし、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変されている、少なくとも１つの合成核酸配列を含む）；ｃ．第一の目的のタンパク質の複数の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリー、及び第二の目的のタンパク質の複数の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；ｄ．第一及び第二の目的のタンパク質が、同じ又は異なる発現ベクター上の、ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーの共発現によって産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる）；ｅ．必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程又はポリヌクレオチドのシードライブラリー上にＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程；ｆ．所望の特性を有する第一又は第二の変異した目的のタンパク質を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及びｇ．工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【０３４０】
１態様において、複数のタンパク質を同時に進化させる方法が本明細書中に提供され、この方法は以下の工程を含む：（ａ）１以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された少なくとも１つの第一の合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｂ）１以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーを合成する工程（ここで、ポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーは、ＳＨＭのために最適化された少なくとも１つの第二の合成ポリヌクレオチドを含む）；（ｃ）ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程；（ｄ）１以上の第一及び第二のタンパク質が、同じ又は異なる発現ベクター上の、ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーの共発現によって産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程（ここで、宿主細胞は、ＡＩＤ活性を示すか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤ活性を示すように誘導できる）；（ｅ）必要に応じてＡＩＤ活性を誘導する工程；（ｆ）所望の又は同定された特性を有する１以上の変異したタンパク質を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及び（ｇ）工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【０３４１】
特定の態様において、本明細書中に記載する方法は、体細胞超変異モチーフの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異の基質として作用するように改変された、少なくとも１つの合成核酸配列を含む。特定の実施形態において、この少なくとも１つの合成核酸配列は、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異の基質として作用するように改変されている。他の実施形態において、この少なくとも１つの合成核酸配列は、１以上のＷＡＣモチーフ、ＷＲＣモチーフ又はそれらの組合せの挿入によって、ＡＩＤ介在性の体細胞超変異の基質として作用するように改変されている。
【０３４２】
これらの方法のいずれかの１実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、保存的アミノ酸置換を導入する好ましい（標準的な）ＳＨＭコドン又は好ましい（標準的な）ホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。これらの方法のいずれかの別の実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、アミノ酸レベルで半保存的な変異を導入する好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。これらの方法のいずれかの別の実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、アミノ酸レベルで非保存的な変異を導入する好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。１実施形態において、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入は、目的の領域中の１以上のアミノ酸置換の挿入によるものであり、このアミノ酸置換は、サイレント、保存的、半保存的、非保存的又はそれらの組合せである。本明細書中に記載する方法を使用してなされるポリヌクレオチドに対する改変により、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を、ＳＨＭに対して感受性又は耐性にすることができる。
【０３４３】
別の態様において、本発明は、複数の１以上のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む組成物を含み、このポリヌクレオチドは、ＡＩＤ介在性の変異誘発によって該１以上のポリペプチドの所望の特性に影響を与えるように変異していると同定された、少なくとも１以上のコドンを含み、この１以上のコドンの全て又は全体のサブセットは、野生型形態から変更されて、体細胞超変異に対して耐性にされている。
【０３４４】
本発明の特定の態様において、１以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む組成物が本明細書中に提供され、このポリヌクレオチドのシードライブラリーは、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によってＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドを含む。他の態様において、少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドは、好ましくないコドンの密度を低下させることによって、ＳＨＭのために最適化されている。合成ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した方法を使用して、ＳＨＭに対して耐性にすること又はＳＨＭに対して感受性にすることができる。
【０３４５】
この方法の非限定的な１つにおいて、この１以上のコドンの全て又は全体のサブセットは、そのＡＩＤ変異形態から変更されて、体細胞超変異に対して耐性にされている。
【０３４６】
別の態様において、本発明は、複数の１以上のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む組成物を含み、このポリヌクレオチドは、ＡＩＤ介在性の変異誘発によって該１以上のポリペプチドの所望の特性に影響を与えるように変異していると同定された、少なくとも１以上のコドンを含み、この１以上のコドンの第一のサブセットは、野生型形態から変更されて、体細胞超変異のために最適化されており、この１以上のコドンの第二のサブセットは、そのＡＩＤ変異形態から変更されて、体細胞超変異に対して耐性にされている。
【０３４７】
別の態様において、本発明は、複数の１以上のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む組成物を含み、このポリヌクレオチドは、ＡＩＤ介在性の変異誘発によって該１以上のポリペプチドの所望の特性に影響を与えるように変異していると同定された、少なくとも１以上のコドンを含み、この１以上のコドンの第一のサブセットは、そのＡＩＤ変異形態から変更されて、体細胞超変異のために最適化されており、この１以上のコドンの第二のサブセットは、野生型形態から変更されて、体細胞超変異に対して耐性にされている。
【０３４８】
これらの方法又は本明細書中に開示した任意の方法の１態様において、同定されたコドンは、より高い又はより低いＳＨＭの確率を有するコドンによる同定されたコドンの置換を介して、それがコードするアミノ酸を変化させることなく、変更され得る。１態様において、同定されたコドンは、好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。別の態様において、同定されたコドンが好ましくないコドンである場合、同定されたコドンは、より高い、より低い又は同等のＳＨＭの確率のコドンで置換してもよいが、但し、置換コドンも好ましくないコドンであることはない。
【０３４９】
或いは、これらの方法の別の態様において、同定されたコドンは、ＳＨＭに対するその感受性及びそれがコードするアミノ酸の両方を変化させるように変更してもよい。１態様において、同定されたコドンは、好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。
【０３５０】
これらの方法のいずれかの１実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、保存的アミノ酸置換を導入する好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。これらの方法のいずれかの別の実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、アミノ酸レベルで半保存的な変異を導入する好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。これらの方法のいずれかの別の実施形態において、同定されたコドンは、野生型コドン又はＡＩＤ改変コドンのいずれかと比較して、アミノ酸レベルで非保存的な変異を導入する好ましいＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭコドンで置換してもよい。
【０３５１】
ＶＩ．目的のタンパク質
一般に、用語「目的のタンパク質」は、そのタンパク質の改善されたバリアントを迅速に生成、選択及び同定するために、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドをＡＩＤによりＳＨＭのために改変することが所望される、タンパク質又はその部分に関する。このような改変ポリヌクレオチドは、ＳＨＭに対してより感受性にすることができ、それにより、ポリヌクレオチドがＡＩＤに供されたときにコドン用法の結果としてアミノ酸変化を誘導し、及び／又はＡＩＤ介在性のＳＨＭのための基質として作用する、改善された機能のためにスクリーニングされるＳＨＭモチーフの付加を誘導する。
【０３５２】
アミノ酸又は対応するヌクレオチド配列が公知であるか又は利用可能であり（例えば、本発明のベクター中にクローニングできる）、表現型又は機能が改善され得る任意のタンパク質は、本明細書中に提供するベクター及びＳＨＭ系において使用するための候補である。目的のタンパク質としては、例えば、任意の天然に存在する又は合成の供給源由来の、表面タンパク質、細胞内タンパク質、膜タンパク質及び分泌タンパク質が挙げられる。本明細書中に提供される合成ライブラリー、半合成ライブラリー及び／又はシードライブラリーにおいて使用するためのタンパク質の例示的であるが非限定的なタイプには、抗体重鎖又はその部分、抗体軽鎖又はその部分、酵素、受容体、構造タンパク質、補因子、ポリペプチド、ペプチド、細胞内抗体、選択マーカー、毒素、増殖因子、ペプチドホルモンが含まれ、最適化できる任意の他のタンパク質が含まれる意図である。
【０３５３】
生物学的に活性なタンパク質（分子）には、他の生物学的に活性なタンパク質（分子）の薬物動態及び／又は薬力学を調節可能な分子も含まれ、例えば、脂質及びポリマー（例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及び他のポリエーテル）が含まれる。例えば、ポリペプチドは、例えば以下のようなポリペプチドである：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ毒素サブユニットＡ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素、ＣＣケモカイン（例えば、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８）、ＣＸＣケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１６）、Ｃケモカイン（例えば、ＸＣＬ１及びＸＣＬ２）及びＣＸ３Ｃケモカイン（例えば、ＣＸ３ＣＬ１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ヒト増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、核補因子、Ｊａｋ及びＳｔａｔファミリーメンバー、Ｇタンパク質シグナル伝達分子（例えば、ケモカイン受容体、ＪＮＫ、Ｆｏｓ−Ｊｕｎ、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ７、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４）。
【０３５４】
さらに、種々の他の成分ヌクレオチド配列（例えば、ある実施形態においては系全体の完全性を維持するために超変異させることが好まれないコアとなる系を形成できる、コード配列及び遺伝エレメント）が存在する。これらの成分ヌクレオチド配列には以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｉ）選択マーカー（例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、アンピシリンなど）；ｉｉ）レポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質、エピトープタグ、レポーター酵素）；ｉｉｉ）遺伝子調節シグナル（例えば、プロモーター、誘導可能な系、エンハンサー配列、ＩＲＥＳ配列、転写又は翻訳ターミネーター、ｋｏｚａｋ配列、スプライス部位、複製起点、リプレッサー）；ｉｖ）高レベル増強ＳＨＭ又はその調節、又は測定のために使用される、酵素又は補助因子（例えば、ＡＩＤ、ｐｏｌη、転写因子及びＭＳＨ２）；ｖ）シグナル伝達成分（キナーゼ、受容体、転写因子）、並びにｖｉ）タンパク質のドメイン又はサブドメイン（例えば、核局在化シグナル、膜貫通ドメイン、触媒ドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、並びに他のタンパク質ファミリーの保存されたモチーフ、ドメイン及びサブドメイン）。
【０３５５】
一般に、当業者は、本明細書中の教示に基づいて、ＳＨＭに対するポリペプチドの感受性を最適化するための改変の適切な候補として目的のタンパク質を選択し、目的のタンパク質の所望の形質をモニタリングするために適切なアッセイを考案することが、容易にできるであろう。
【０３５６】
目的のタンパク質の性質及び目的のタンパク質に関する利用可能な情報の量に依存して、実務者（ｐｒａｃｔｉｏｎｅｒ）は、出発ポリヌクレオチドを生成するための変異誘発の前に、以下のストラテジーの任意の組合せに従うことができる。
【０３５７】
１．コドンの最適化なし：目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列内のホットスポットの数を増強させることが望ましいことが典型的であり得るが、任意の野生型タンパク質は、何らかの量のＳＨＭを受けると予測され、コドンの最適化も実際の配列の何らの具体的な知識もなしに本発明において使用され得ることに、留意すべきである。さらに、ある種のタンパク質（例えば抗体）は、適切なコドン用法を進化させたポリヌクレオチド配列を天然に含み、コドン改変を必要としない。
【０３５８】
２．グローバルなホットスポット最適化：ある態様では、タンパク質をコードするポリヌクレオチド中のホットスポットの数は、本明細書中に記載するように、増加させることができる。このアプローチは、遺伝子のコード領域全体に適用でき、それにより、タンパク質全体を、ＳＨＭのためのより効率的な基質にする。本明細書中で議論するように、タンパク質内又は関連のタンパク質アイソタイプ間の構造活性関係について比較的あまり知られていない場合に、このアプローチが好まれ得る。
【０３５９】
３．選択的ホットスポット改変：或いは、本明細書中で議論するように、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＨＭの基質として作用でき特定の遺伝子座での最大の多様性をＳＨＭを介して生じ得る高密度のホットスポット又は好ましいＳＨＭモチーフを提供する合成可変領域による、目的の領域（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）の標的化した置換を介して、選択的及び又は体系的に改変できる。
【０３６０】
当業者は、本明細書中に提供される教示に基づいて、上記のアプローチのいずれか又は全てが本発明を使用して行なわれ得ることを理解するであろう。しかし、本発明の特定の実施形態において、グローバルなホットスポット改変及び選択的ホットスポット改変を一緒に用いて、目的の特定の領域内及びタンパク質全体を通じての両方で、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列中の多様性のより速くより効率的な生成を導く可能性がある、合成、半合成及び／又はシードライブラリーを生成することができる。
【０３６１】
目的のタンパク質をコードする必要な最適化されたポリヌクレオチドの設計後、このポリヌクレオチドは標準的方法論を使用して合成され得、正確な合成を確認するために配列決定され得る。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、このポリヌクレオチドは本発明のベクター中に挿入され得、次いでこのベクターは本明細書中に記載したように宿主細胞中に導入されて、変異誘発をもたらし得る。
【０３６２】
一旦適切な宿主細胞中に導入されると、細胞は、ＳＨＭを開始するためにＡＩＤ及び／又は他の因子を発現するように誘導され得、それにより、目的のタンパク質の進行性の配列多様化を誘導することができる。適切な期間（例えば、２〜５細胞分裂）後、目的のタンパク質のバリアントを含む得られた宿主細胞がスクリーニングされ、改善された変異体が同定されて細胞集団のために分離され得る。このプロセスは、目的のタンパク質の特性を選択的に改善するために、反復され得る。
【０３６３】
細胞表面にディスプレイされたタンパク質は、適切な膜貫通ドメインにインフレームでカップリングされた目的のタンパク質のキメラ分子の生成を介して、生成できる。哺乳動物細胞発現の場合、例えば、ＭＨＣタイプ１膜貫通ドメイン、例えば、Ｈ２ｋｋ由来のもの（ペリ膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む；ＮＣＢＩ遺伝子アクセッション番号ＡＫ１５３４１９）が使用できる。同様に、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、昆虫細胞及び酵母におけるタンパク質の表面発現は、当該分野で充分確立されている。総説については、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：４３３−５５；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１；Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ７８  １３４１−１３４６；Ｇｈｉａｓｉら、（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５  １８７−１９４；Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ、（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５  ５５３−５５７；並びにＭａｚｏｒら、（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（５）５６３−５６５を参照のこと。
【０３６４】
表面ディスプレイされた抗体又はタンパク質は、細胞表面上の分泌タンパク質の分泌及び続く結合（又は会合）を介して、生成できる。抗体又はタンパク質の細胞膜へのコンジュゲート化は、タンパク質合成の間又はタンパク質が細胞から分泌された後のいずれかに生じ得る。コンジュゲート化は、共有結合、結合相互作用（例えば、特異的結合メンバーにより介在される）又は共有結合と非共有結合との組合せによって、生じ得る。
【０３６５】
なお別の態様において、タンパク質は、細胞表面上へのディスプレイに特有の第二の結合メンバーに融合した目的の標的に特異的に結合する第一の特異的結合メンバーを含む、抗体又は結合タンパク質融合タンパク質の生成を介して、細胞にカップリングされ得る（例えば、プロテインＡとＦｃドメインとの結合を利用する場合：プロテインＡは、細胞表面上に発現されてそこに結合し、分泌された抗体（又はＦｃ融合タンパク質として発現された目的のタンパク質）に結合し、それを局在化させる）。
【０３６６】
対応するポリヌクレオチド配列を含む適切な発現ベクターの、適切なミューテーター陽性細胞へのトランスフェクションは、任意の当該分野で認識された又は公知のトランスフェクションプロトコルを使用して実施できる。タンパク質の例示的な表面発現されたライブラリーは、実施例４及び５に記載する。
【０３６７】
上記トランスフェクション由来の複数の抗体又は結合タンパク質を発現する細胞は、必要に応じて、従来のアッセイ（ＦＡＣＳを含むがこれに限定されない）を使用して、細胞表面上での特定の範囲の該タンパク質の表面発現を示す細胞を選択するために、特徴付けられ得る。
【０３６８】
軽鎖及び重鎖の発現の染色は、例えば、市販のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）コンジュゲート化ラット抗マウスＩｇ、κ軽鎖、及びＦＩＴＣ又はＲ−ＰＥコンジュゲート化ラット抗マウスＩｇ  Ｇ１モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用することによって、達成できる。染色は、製造業者が示したプロトコルを使用して、通常は、氷上での３０分間にわたる、標識抗体の存在下での試験細胞のインキュベーションによって、実施できる。細胞抗原発現の発現レベルは、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、ＩＬ）を使用して定量できる。
【０３６９】
特定の範囲の発現を示すトランスフェクトされた細胞集団が選択できる。例えば、１細胞当たり約１０，０００、約５０，０００、約１００，０００又は約５００，０００個のタンパク質よりも多い表面コピー数を有する細胞が選択され得、次いで、効率的な親和性プロファイリングのために使用され得る。
【０３７０】
安定にトランスフェクトされた細胞の集団は、例えば、適切な選択剤の存在下での２〜３週間の増殖を介して生成できる。得られた細胞ライブラリーは、細胞バンクとして凍結及び保存できる。或いは、細胞は、一過的にトランスフェクトされ、トランスフェクションの数日以内に使用され得る。
【０３７１】
ある場合には、さらなる特徴付けのために、表面ディスプレイされたタンパク質を分泌タンパク質に変換することが所望され得る。変換は、選択的プロテアーゼ（例えば、第Ｘ因子、トロンビン又は任意の他の選択的タンパク分解剤）とのインキュベーションによって切断され得る特異的リンカーの使用によって達成できる。ベクター中のコードされたタンパク質の遺伝子操作を可能にする（即ち、タンパク質のリーディングフレームからの表面結合シグナルの切り出しを可能にする）ポリヌクレオチド配列を含むことも可能である。例えば、随意に目的のタンパク質の結合シグナルの選択的除去及び引き続く細胞内蓄積（又は分泌）を可能にする、１以上の独自の制限部位、又はｃｒｅ／ｌｏｘエレメント、又は他の組換えエレメントの挿入。さらなる例には、目的のタンパク質の効率的な細胞表面発現を可能にする、結合シグナル（例えば、膜貫通ドメイン）の周囲の隣接するｌｏｘＰ部位の挿入が含まれる。しかし、細胞におけるｃｒｅリコンビナーゼの発現の際、ＬｏｘＰ部位間で組換えが生じ、結合シグナルの喪失を生じ、それにより目的のタンパク質の分泌を導く。
【０３７２】
一旦ポリペプチドが所定の程度まで最適化されると、目的の最適化されたポリペプチドを発現する細胞又は細胞集団が、単離又は濃縮され得、最適化されたポリペプチドの表現型（機能）が、当該分野で認識されたアッセイを使用してアッセイされ得る。
【０３７３】
次いで、細胞は再増殖され、ＳＨＭ再誘導され、多数のサイクルにわたって再スクリーニングされて、所望の機能における改善を繰り返しもたらし得る。任意の時点で、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、進行性の変異誘発をモニタリングするために、レスキュー及び／又は配列決定され得る。
【０３７４】
例えば、エピソームプラスミドＤＮＡが、抽出（又はＳＶ４０  Ｔ抗原との共発現によって増幅（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６））され得、次いで抽出されて、標準的な方法論を用いて、ポリヌクレオチド又は目的又は隣接領域に特異的なＤＮＡプライマーを使用するＰＣＲによって増幅され得る。或いは、総ＲＮＡが、フローサイトメトリー又は磁気ビーズによって単離された種々の細胞集団から単離され得る。エピソームＤＮＡ及び／又は総ＲＮＡは、標準的な方法論を用いて、ポリヌクレオチド又は目的又は隣接領域に特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって、増幅され得る。クローンは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの会社からの自動化ＤＮＡ配列（ＡＢＩ−３７７又はＡＢＩ  ３７３０  ＤＮＡシーケンサー）を使用して、配列決定され得る。配列は、出発配列と比較した、ヌクレオチドの挿入及び欠失の頻度について、分析され得る。
【０３７５】
Ａ．抗体及びそのフラグメント
抗体に関して、本発明は、標的タンパク質の機能に対する最も大きい生物学的影響を生じることと結びついた重要な表面エピトープに結合する抗体を選択するためのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫の必要性を回避する能力を提供する。さらに、哺乳動物抗体は、標的化ＳＨＭのための最適なコドン用法パターンを本来的に処理し、テンプレート設計ストラテジーを大いに単純化する。特定の抗原について、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫は、標的の機能に影響を与えないエピトープ選択を導き、それにより、強力かつ有効な抗体候補の選択を妨害する。なお他の実施形態において、本発明は、標的タンパク質の機能を決定する際のそのエピトープの役割の性質により、強力な活性を有する部位特異的抗体の迅速な進化を提供できる。これは、最適なエピトープ位置について標的タンパク質をスキャンし、臨床で使用するためのそのクラスで最高の抗体薬物を産生する能力を提供する。
【０３７６】
本明細書中に記載するように、全ての天然に存在する生殖系列の親和性成熟した合成又は半合成の抗体、並びにそれらのフラグメントが、本発明において使用され得る。一般に、このような抗体は、ＳＨＭを介して変更されて、以下の機能的形質の１以上を改善できる：親和性、結合活性、選択性、熱安定性、タンパク分解安定性、溶解度、折り畳み、免疫毒性及び発現。抗体形式に依存して、抗体ライブラリーは、宿主細胞において共発現され得る、別個の重鎖ライブラリー及び軽鎖ライブラリーを含むことができる。特定の実施形態において、全長抗体が分泌され得、及び／又は宿主細胞の細胞膜で表面ディスプレイされ得る。なお他の実施形態において、重鎖ライブラリー及び軽鎖ライブラリーは、同じ発現ベクター中又は異なる発現ベクター中に挿入でき、両方の抗体鎖の同時共進化を可能にする。
【０３７７】
特定の実施形態において、天然に存在するヒト又は非ヒトのいずれかの抗体の全長ｃＤＮＡライブラリーが使用でき、本発明の系を使用した進行性の選択及びＳＨＭ介在性の変異誘発に供され得る。他の実施形態において、天然に存在する抗体の全て又は一部（例えば、単離されたＣＤＲ）が増幅され得、得られたライブラリーが既存の天然に存在する又は合成の抗体テンプレートに挿入されて、集中的な（ｆｏｃｕｓｅｄ）ライブラリーが作成され得る。１実施形態において、天然に存在するＣＤＲ３領域のライブラリーが作成され、合成抗体又はそのフラグメント中に挿入され、それによって半合成抗体ライブラリーが作成できる。
【０３７８】
１実施形態において、抗体又はそのフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ又は単鎖結合ポリペプチド）の特定のサブ領域中のホットスポット密度を増加させることは、改善された特徴（例えば、結合親和性の増大、結合活性の増大及び／又は非特異的結合の減少のうち１以上）を有するタンパク質の進化及び選択を導く、その領域の標的化された変異誘発を生じ得る。別の実施形態において、定常領域（例えばＦｃ）中のホットスポットが増加した合成抗体の使用は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合親和性の増大を生じ得、それにより、シグナルカスケードが調節される。重鎖及び軽鎖、又はそれらの一部は、本明細書中に記載する手順を使用して、同時に改変できる。
【０３７９】
本明細書中に提供する方法において使用される細胞内抗体は、細胞質の還元環境における重鎖及び／又は軽鎖のフォールディングを改善又は増強するために、改変され得る。或いは、又はさらに、ｓＦｖ細胞内抗体は、ドメイン内ジスルフィド結合の非存在下で適切に折り畳まれ得るフレームワークを安定化するために、改変され得る。細胞内抗体は、例えば、以下の特徴のうち１以上を増大させるためにも、改変され得る：結合親和性、結合活性、エピトープ接近可能性、標的エピトープについての内因性タンパク質との競合、半減期、標的隔絶、標的タンパク質の翻訳後修飾など。細胞内抗体は細胞の内部で作用するので、それらの活性は、酵素活性アッセイに必要とされるアッセイ方法論により類似している。これは以下のセクションＢで議論する。
【０３８０】
１．ポリヌクレオチドの同定及び設計
標的化抗体ライブラリーの生成及び進化のための簡便な出発点は、任意の適切なドナー細胞から容易に入手可能であり、予め規定された合成ヒト抗体スキャフォールドにライゲーションされ得る天然に存在するＣＤＲ配列由来のＣＤＲを含む、半合成ライブラリーの使用である。さらに、高いホットスポット密度を有する天然に存在するＣＤＲが進化したので、これらは、シードライブラリーの開発のための理にかなった出発地点を形成する。さらに、天然に存在するＣＤＲ３配列は、ターミナルトランスフェラーゼ活性の作用を介して導入され、例えば異なる長さのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３ドメインを使用する集中的なライブラリーの開発のために利用できる、有意なさらなる長さの多様性を含む。
【０３８１】
このようなライブラリーは、（ａ）λ、κ及びＨ鎖抗体アイソフォームの各々から選択される、複数の代表的なヒト可変ドメインテンプレートポリヌクレオチドフラグメント、（ｂ）λ、κ及びＨ可変ドメインの、複数のヒトＣＤＲ３ドメイン、及び（ｃ）λ、κ及びＨアイソフォームの各々について選択される、複数のヒト定常領域テンプレートフラグメント１つ、を含み、ここで、複数の（ａ）〜（ｃ）の各々からのフラグメントはライゲーションされて、全長の軽鎖及び重鎖のサブライブラリーを生成し、これらは引き続き、マスターライブラリーを作成するために組み合わされ得る。
【０３８２】
他の実施形態において、抗体ライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる成熟組換え抗体の一般に使用される先祖である生殖系列配列を最もよく表す、複数の代表的ヒト可変ドメインテンプレートを含む。
【０３８３】
他の実施形態において、抗体ライブラリーは、ＰＣＲ増幅されたλ、κ及びＨ可変ドメインのＣＤＲ領域を含む。他の実施形態において、ＣＤＲ領域は合成であり、１つの態様では非ヒトＣＤＲ領域に由来する。
【０３８４】
本明細書中に記載する半合成抗体ライブラリーは、λ、κ及びＨアイソフォームの各々についてのヒト定常領域テンプレートをさらに含むことができる。
【０３８５】
可変ドメインのポリヌクレオチドフラグメント
実施例４で議論するように、限定数のヒト生殖系列ポリヌクレオチド配列が、成熟抗体を生成するために実際に使用される大部分のλ、κ及びＨ抗体遺伝子に寄与する。これらの最適化されたスキャフォールドの使用は、任意の特定の標的クラスに最も適切であり、ヒト治療抗体に最も類似した、最適な可変ドメイン及び定常領域の選択を可能にする。
【０３８６】
各ポリヌクレオチド配列テンプレートの可変ドメインは、サブクローニング及びＣＤＲと定常ドメインとのライゲーションのための独自の適切な制限部位を含むように設計される。ポリヌクレオチドは、市販の供給元（例えば、ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使用して標準的な方法論を使用して合成でき、正確な合成を確認するために配列決定される。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、そのポリヌクレオチドは、抗体鎖全体のアセンブリーに適したクローニングベクター中に挿入され得る。１実施形態において、このテンプレート可変ドメインはＣＤＲ３領域を欠く。
【０３８７】
ＣＤＲの増幅
免疫学的遺伝子レパートリーの実質的な部分を含むポリヌクレオチドの組成物を調製するために、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドをコードする遺伝子を有する出発供給源材料が必要とされる。好ましくは、この供給源は、抗体産生細胞（即ち、Ｂリンパ球（Ｂ細胞））の不均一集団であろう。特定の実施形態において、再編成されたＢ細胞（例えば、脊椎動物の循環（例えば、末梢血単球）、脾臓、扁桃腺又は骨髄において見出されるもの）が、この出発供給源材料であり得る。（再編成されたＢ細胞は、免疫グロブリン遺伝子のＶ、Ｄ及びＪ領域の転写物が近位に位置するｍＲＮＡの細胞中での存在によって証明されるように、免疫グロブリン遺伝子の転座（即ち再編成）が生じたＢ細胞である。）
【０３８８】
特定の実施形態において、例えば、年齢、健康状態及び免疫応答についての種々の段階のいずれかにある脊椎動物由来の細胞（供給源細胞）を核酸の供給源として使用することによって、予め選択された活性についてレパートリーを偏らせることが望ましい。１実施形態において、健康な動物は、再編成されたＢ細胞を収集する前に繰り返し免疫されて、高い親和性のリガンド結合標的ポリペプチドを産生する遺伝物質について富化されたレパートリーを得ることができる。他の実施形態において、その免疫系が最近チャレンジを受けていない健康な動物が、再編成されたＢ細胞を収集するために使用され、それにより、標的ポリペプチドに対する高い親和性を有する遺伝物質の産生に向かう偏りがないレパートリーを産生する。
【０３８９】
ポリヌクレオチドを得る細胞集団の遺伝的不均一性が大きくなるにつれ、本発明の方法に従う最初のスクリーニングに利用可能となるであろう免疫学的レパートリーの多様性が増大することに、留意すべきである。従って、異なる個体、特に免疫学的に有意な年齢の差異を有する個体由来の細胞、並びに異なる系統、性別、人種又は種の個体由来の細胞を、最初のレパートリーの不均一性を増大させるために、有利に組合わせることができる。
【０３９０】
本発明の特定の実施形態において、供給源細胞は、それに対する活性が求められる抗原性リガンド（抗原）（即ち、予め選択された抗原）で免疫されたか又は部分的に免疫された、脊椎動物、好ましくは哺乳動物から得られる。免疫は通常の方法で実施できる。動物における抗体力価は、所望される免疫の段階を決定するためにモニタリングでき、この段階は、所望のレパートリーの富化又は偏りの量に対応する。部分的に免疫される動物は典型的に、一回だけ免疫を受け、応答が検出された直後にその動物から細胞が収集される。完全に免疫される動物はピーク力価を示し、これは、通常２〜３週間間隔での、宿主哺乳動物への抗原の１回以上の反復注射で達成される。通常最後のチャレンジの３〜５日後、脾臓が取り出され、脾細胞（そのうち約９０％が再編成されたＢ細胞）の遺伝子レパートリーが、標準的な手段を使用して単離される。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹを参照のこと。
【０３９１】
ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭを産生する細胞、最も好ましくはＩｇＭ及びＩｇＧを産生する細胞から誘導できる。
【０３９２】
免疫グロブリン可変領域遺伝子が多様な集団としてクローニングされ得るゲノムＤＮＡのフラグメントを調製する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：１８０−１８３、（１９８７）；Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：１８３−１９０（１９８７）；Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：１９０−１９９（１９８７）；及びＤｉＬｅｌｌａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：１９９−２１２（１９８７）を参照のこと。（本明細書中で挙げた参考文献の教示は、参照により本明細書中に組み込まれる。）
【０３９３】
所望の遺伝子レパートリーは、可変領域を発現する遺伝子を含む遺伝物質又は可変領域の転写物に相当するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいずれかから単離できる。再編成されていないＢリンパ球以外のものに由来するゲノムＤＮＡを使用する際の困難は、イントロンによって分離された、可変領域をコードする配列を並べることにある。適切なエクソンを含むＤＮＡフラグメントが単離され、イントロンが切り出され、次いでエクソンが適切な順序及び適切な方向でスプライシングされなければならない。ほとんどの部分についてこれは困難であり得、その結果、再編成されたＢ細胞を使用する代替的技術が最適な方法である。なぜなら、ＣＤ及びＪ免疫グロブリン遺伝子領域は転座して隣接し、その結果、配列が可変領域全体にわたり連続的（イントロンを含まない）になるからである。
【０３９４】
ｍＲＮＡが利用される場合、細胞は、ＲＮａｓｅ阻害条件下で溶解されるであろう。１実施形態において、第一工程は、オリゴ−ｄＴセルロースカラムへのハイブリダイゼーションによって、総細胞ｍＲＮＡを単離することである。次いで、重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在が、適切な遺伝子のＤＮＡ一本鎖とのハイブリダイゼーションによって評価され得る。出発供給源材料の可変領域遺伝子をコードする遺伝物質の転写物に相当するｍＲＮＡの単離の際に、出発供給源材料内のＣＤＲ３の多様性を示すｃＤＮＡポリヌクレオチドの集団を生成するために、単一の工程で又は最適に組み合わせた逆転写／ＰＣＲ手順で、逆転写が実施され得る。
【０３９５】
特定の実施形態において、本発明は、半合成抗体ライブラリーの生成方法を含み、このライブラリーは、（ａ）λ、κ及びＨ鎖抗体アイソフォームの各々から選択される複数の可変ドメインポリヌクレオチドフラグメント、（ｂ）λ、κ及びＨ可変ドメインの、複数のＣＤＲ３ドメイン、及び（ｃ）λ、κ及びＨアイソフォームの各々について選択される、複数の定常領域テンプレートフラグメント１つ、を含み、ここで、複数の（ａ）〜（ｃ）の各々由来のフラグメントがライゲーションされて、全長の軽鎖及び重鎖ライブラリーを生成する。１実施形態において、半合成抗体ライブラリーは、λアイソフォームに特異的である。別の実施形態において、半合成抗体ライブラリーは、κアイソフォームに特異的である。なお別の実施形態において、半合成抗体ライブラリーは、Ｈアイソフォームに特異的である。
【０３９６】
他の実施形態において、半合成抗体ライブラリーは、ＰＣＲ増幅及び／又は化学合成のために選択された、λ、κ及びＨアイソフォームの各々由来の、複数の代表的可変ドメインテンプレートを含む。生殖系列配列空間を最もよく示し、配列及び構造データベースにおいて見出される成熟組換え抗体の一般に使用される先祖であるいくつかの可変ドメインによってλ、κ及びＨアイソフォームの各々が表示されるように、これらのテンプレートが選択される。
【０３９７】
特定の実施形態において、代表的可変ドメインは、λアイソフォームであり得る。特定の他の実施形態において、代表的可変ドメインは、κアイソフォームであり得る。なお他の実施形態において、代表的可変ドメインは、Ｈアイソフォームであり得る。
【０３９８】
本発明の１実施形態において、可変ドメインテンプレートは、ＰＣＲ増幅によって生成される。別の実施形態において、可変ドメインテンプレートは、化学合成によって生成される。
【０３９９】
なお他の実施形態において、半合成抗体ライブラリーは、３番目のフレームワーク領域及び定常領域に特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅した、λ、κ及びＨ可変ドメインのＣＤＲ３領域を含む。１実施形態において、プライマーは、λアイソフォームのＣＤＲ３領域に特異的である。別の実施形態において、プライマーは、κアイソフォームのＣＤＲ３領域に特異的である。なお別の実施形態において、プライマーは、ＨアイソフォームのＣＤＲ３領域に特異的である。
【０４００】
本明細書中に記載される半合成抗体ライブラリーは、ＰＣＲ増幅及び／又は化学合成のために選択されたλ、κ及びＨアイソフォームの各々についての定常領域テンプレートをさらに含むことができる。特定の実施形態において、この定常領域はλアイソフォームであり得る。他の特定の実施形態において、この定常領域はκアイソフォームであり得る。なお他の実施形態において、この定常領域はＨアイソフォームであり得る。本発明の１実施形態において、この定常領域テンプレートはＰＣＲ増幅によって生成される。別の実施形態において、この定常領域テンプレートは化学合成によって生成される。
【０４０１】
本発明の他の実施形態において、抗体は、天然に存在するＣＤＲ配列ではなく合成のＣＤＲ配列を使用して、作成できる。このアプローチは、より合理的な設計ストラテジーが使用されるのを可能にし、例えば、特定のクラスの抗原に対する集中的ライブラリーの開発を可能にする。
【０４０２】
特定の実施形態において、プライマー伸長によってＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを生成するために、プライマーのヌクレオチド配列は、ＣＤＲ３コード領域に実質的に隣接する部位において複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子とハイブリダイズするように選択される。複数の異なるＣＤＲ３核酸鎖にハイブリダイズするために、プライマーは、異なる鎖間で保存されたヌクレオチド配列の実質的な相補体でなければならない。好ましい実施形態において、ライブラリーをテンプレートの可変領域及び選択された定常ドメインの３’末端とアニーリングさせるために次いで使用され得る制限部位を含むか又は導入するプライマーが、構築される。
【０４０３】
ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって産生される場合、増幅すべき核酸の各コード鎖について２つのプライマーを使用しなければならない。第一のプライマーは、センス（プラス又はコード）鎖の一部となり、レパートリー内のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域の上流にあるか又はその一部にかかるポリヌクレオチド間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。従って、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを産生するために、第一のプライマーは、免疫グロブリンＨアイソフォーム遺伝子などのＦＲ３領域内の保存された領域にハイブリダイズするように（即ち、相補的であるように）、選択される。同様に、ＶＬλ及びＶＬκ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを産生するために、第一のプライマーは、ＦＲ３領域内の、又はＶＬλ及びＶＬκアイソフォームのＣＤＲ３領域の５’部分にかかる、保存された領域にハイブリダイズするように（即ち、相補的であるように）、選択される。
【０４０４】
第二のプライマーは、非コード（マイナス又は相補）鎖の一部となり、プラス鎖間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。従って、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを産生するために、第二のプライマーは、ＣＨをコードする免疫グロブリン遺伝子の５’末端で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズするように選択される。従って、同様に、ＶＬλ及びＶＬκ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを産生するために、第二のプライマーは、ＣＬをコードする免疫グロブリン遺伝子の５’末端で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズするように選択される。
【０４０５】
ＣＤＲ３領域ライブラリーの調製
単離されたレパートリー内のＩｇ  ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドをクローニングする（即ち、実質的に複製する）ために使用されるストラテジーは、当該分野で周知のとおり、レパートリーを形成するポリヌクレオチドのタイプ、複雑性及び純度に依存するであろう。
【０４０６】
特定の実施形態において、この方法は、ポリヌクレオチドコード鎖（例えば、ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡの適切なコード領域）からなる遺伝子レパートリー由来のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドのクローニングを含む。
【０４０７】
１実施形態において、遺伝子レパートリーは二本鎖ゲノムＤＮＡの形態であり、典型的には融解によって、通常最初に一本鎖に変性される。ゲノムＤＮＡは、予め選択されたヌクレオチド配列を有する第一のポリヌクレオチド合成プライマーでＤＮＡを処理する（接触させる）ことによる、第一の一次伸長反応に供される。第一のプライマーは、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長の、レパートリー内の保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることによって、第一のプライマー伸長反応を開始できる。第一のプライマーはしばしば、本明細書中で「センスプライマー」と呼ぶ。なぜなら、第一のプライマーは、核酸の非コード鎖即ちアンチセンス鎖にハイブリダイズし、１ラウンドのプライミング及び伸長の後、センス（即ちコード）鎖の一体化された一部となるからである。さらに、第二のプライマーはしばしば、本明細書中で「アンチセンスプライマー」と呼ぶ。なぜなら、第二のプライマーは、核酸のコード鎖即ちセンス鎖にハイブリダイズし、１ラウンドのプライミング及び伸長の後、アンチセンス（即ち非コード）鎖の一体化された一部となるからである。
【０４０８】
第一のプライマー伸長は、第一のプライマー（好ましくは、その所定量）を、レパートリーのポリヌクレオチド（好ましくは、その所定量）と混合し、第一のプライマー伸長反応混合物を形成することによって、実施される。この混合物を、一定期間（これは典型的には、第一のプライマー伸長反応産物の形成に充分な所定の期間である）ポリヌクレオチド合成条件下で維持し、それにより、複数の異なるＣＤＲ３領域のポリヌクレオチド相補体が産生される。次いで、これらの相補体を、予め選択されたヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチド合成プライマーでそれらを処理することによる、第二のプライマー伸長反応に供する。第二のプライマーは、複数の異なるＶＨをコードする遺伝子相補体間で保存された、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長の、ヌクレオチド配列（例えば、第一のプライマー伸長反応により産生されたもの）にハイブリダイズすることによって、第二の反応を開始できる。これは、第二のプライマー（好ましくは、その所定量）を、相補核酸（好ましくは、その所定量）と混合し、第二のプライマー伸長反応混合物を形成することによって、達成される。この混合物を、一定期間（これは典型的には、第一の プライマー伸長反応産物の形成に充分な所定の期間である）ポリヌクレオチド合成条件下で維持し、それにより、ＣＤＲ３領域をコードする複数の異なるポリヌクレオチドを含む遺伝子ライブラリーが産生される。
【０４０９】
複数の第一のプライマー及び／又は複数の第二のプライマーが、各増幅において使用され得るか、或いは第一及び第二のプライマーの個々の対が使用され得る。いずれの場合も、同じ又は異なる組み合わせの第一及び第二のプライマーを使用した増幅の産物が、遺伝子ライブラリーの多様性を増大させるために組合わされ得る。
【０４１０】
代替的実施形態において、この方法は、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡを得るための逆転写反応に供することによる、ｍＲＮＡからなる遺伝子レパートリーからのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドのクローニングを含む。このようなｃＤＮＡを産生する方法は当該分野で周知である。このｃＤＮＡは、上記第二のプライマー伸長反応に類似したプライマー伸長反応（即ち、複数の異なるＶＨをコードする遺伝子相補体間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズできるポリヌクレオチド合成プライマーを使用したプライマー伸長反応）に供される。
【０４１１】
プライマー伸長反応は、任意の適切な方法を使用して実施される。一般に、この反応は、好ましくは７〜９のｐＨ、最も好ましくは約８のｐＨの、緩衝化水溶液中で行なう。好ましくは、モル過剰（ゲノム核酸については、通常約１０６：１のプライマー：テンプレート）のプライマーを、テンプレート鎖を含む緩衝液に混合する。プロセスの効率を改善するには大きいモル過剰が好ましい。
【０４１２】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰもまた、プライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応混合物に適切な量で混合され、得られた溶液は、約１〜１０分間、好ましくは０．５〜４分間、約９０℃〜約１００℃に加熱される。この加熱期間後、プライマーのハイブリダイゼーションに好ましい、オリゴヌクレオチドの計算されたアニーリング温度、又はしばしば計算されたアニーリング温度よりも２℃〜６℃低い温度まで、この溶液を冷却させる。この冷却混合物に、プライマー伸長反応を誘導又は触媒するのに適切な因子を添加し、当該分野で公知の条件下で反応を生じさせる。合成反応は、室温から、それを超えると誘導因子がもはや効率的に機能しない温度までで、生じ得る。従って、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを誘導因子として使用する場合、この温度は一般に約４０℃以下である。
【０４１３】
誘導因子は、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能するであろう任意の化合物又は系であり得、酵素が含まれる。この目的のために適切な酵素としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及び他の酵素（熱安定性酵素を含む）が挙げられ、これらは、各核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するのに適した様式での、ヌクレオチドの結合を促進する。一般に、合成は、各プライマーの３’末端で開始して、合成が停止するまで、テンプレート鎖に沿って５’方向に進み、異なる長さの分子を産生する。しかし、上記と同じプロセスを使用して、５’末端で合成を開始して、上記の方向で進む誘導因子が、存在し得る。
【０４１４】
新たに合成された鎖及びその相補的核酸鎖は、増幅プロセスの引き続く工程において使用できる二本鎖分子を形成する。
【０４１５】
出発供給源材料の免疫学的レパートリー内のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域をコードする複数のポリヌクレオチドを示すＤＮＡホモログを産生した後、これらのホモログは典型的に、適切なＶＨ及びＶＬの合成コンストラクトへのライゲーションに充分な量を産生するために増幅される。増幅方法は当該分野で公知であり、ＤＮＡホモログを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、その後の適切なＶＨ及びＶＬの合成コンストラクトへのライゲーションとに供することを含む。１つのこのような実施形態において、遺伝子ライブラリーを生成するために使用される第一及び／又は第二のプライマー伸長反応は、ポリメラーゼ連鎖反応における第一及び第二のプライマー伸長反応である。
【０４１６】
ＰＣＲは通常、上記第一及び第二のプライマー伸長反応を循環（サイクル）させる（即ち、１つの混合物中で同時に実施する）ことによって実施され、各サイクルは、ポリヌクレオチド合成と、引き続く形成された二本鎖ポリヌクレオチドの変性とを含む。ＤＮＡホモログを増幅するための方法及び系は、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号（共にＭｕｌｌｉｓら）に記載されている。
【０４１７】
好ましい実施形態において、増幅反応１回につき、一対の第一及び第二のプライマーのみが使用される。次いで、複数の異なる増幅（各々が、複数の異なるプライマー対を使用する）から得られた増幅反応産物が、組み合わされる。
【０４１８】
ＰＣＲ増幅によって産生された、ＣＤＲ３領域をコードする複数のポリヌクレオチドを示すＤＮＡホモログは、典型的に二本鎖形態であり、それらの末端の各々に連続的に又は隣接して、エンドヌクレアーゼ制限部位を規定するヌクレオチド配列を有する。制限部位をそれらの末端又はその近傍に有するＣＤＲ３領域をコードする複数のポリヌクレオチドを示すＤＮＡホモログの、１以上の適切なエンドヌクレアーゼによる消化は、所定の特異性の付着末端を有するＤＮＡホモログの産生を生じる。
【０４１９】
合成ＣＤＲの調製
既に議論したように、合成ＣＤＲ配列は、効率的な標的化変異のための基質として作用する好ましいＳＨＭモチーフを含むように改変できる。１態様において、このようなＳＨＭモチーフは、ランダム、半ランダム、又は「ＷＡＣ」モチーフ若しくは「ＷＲＣ」モチーフの設計された組み合わせに基づき得る。このようなモチーフの例としては、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＡｓｎをコードする好ましいＳＨＭコドンの任意の組合せが挙げられる。
【０４２０】
１実施形態において、このような合成ＣＤＲは、ｉ）〜ｖｉ）から選択される少なくとも１つの配列を含む：
ｉ）−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５−（配列番号６２）
ｉｉ）−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−（配列番号６３）
ｉｉｉ）−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７−（配列番号６４）
ｉｖ）−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８−（配列番号６５）
ｖ）−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９−（配列番号６６）
ｖｉ）−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０−（配列番号６７）
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９及びＸ１０は、それぞれ独立して、アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＡｓｎから選択される。
【０４２１】
１態様において、このようなモチーフの任意の１つはまた、特に目的とするアミノ酸残基をコードする１以上のポリヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。１態様において、このようなアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ及びＭｅｔからなる群より独立して選択される。
【０４２２】
別の態様において、このような合成ＣＤＲは、約５０アミノ酸までの、ランダム、半ランダム又は設計された、繰り返し又は繰り返しでない、Ｓｅｒ、Ａｓｎ及びＴｙｒの配列からなりうる。
【０４２３】
別の態様において、このような合成ＣＤＲは、好ましいＳＨＭコドンから構成され得る。１実施形態において、このようなコドン（即ち、上記Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３などに対応する）は、ＡＧＣ、ＵＡＵ、ＵＡＣ、ＵＵＵ、ＵＵＡ、ＵＵＣ、ＧＣＵ、ＧＣＡ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＧＡＧ、ＣＡＧ、ＡＡＵ、ＡＡＣ、ＣＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＡＵＵ、ＡＵＡ及びＡＵＣからなる群から独立して選択される。
【０４２４】
合成ＣＤＲは、約５アミノ酸長〜約４０アミノ酸長の範囲のサイズとすることができる。より長いＣＤＲ、具体的には約２５〜約６０アミノ酸のＣＤＲもまた意図される。本発明の特定の実施形態において、このような合成ＣＤＲは、少なくとも５０％の好ましいＳＨＭコドン、又はより好ましくは、少なくとも７０％の好ましいＳＨＭコドン、又は最も好ましくは少なくとも８０％の好ましいＳＨＭコドンを含むことができる。
【０４２５】
本発明の１態様において、ＣＤＲ中のいくつかの位置又は全ての位置に好ましいＳＨＭコドンがランダムに割り当てられた、多様な合成ＣＤＲのシードライブラリーが構築され得る。典型的には、このような合成ＣＤＲライブラリーの各々の多様性は、約３５（５つ全ての位置に３つのコドンがそれぞれランダムに割り当てられる）から、３１０（１０個全ての位置に３つのコドンがそれぞれランダムに割り当てられる）、１３５（５つ全ての位置に上位１３のコドンがそれぞれランダムに割り当てられる）、１３１０（１０個全ての位置に上位１３のコドンがそれぞれランダムに割り当てられる）までの範囲となるであろう。
【０４２６】
別の実施形態において、重鎖及び軽鎖の１以上の合成ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域は、非ヒト抗体に由来する。別の実施形態において、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域のみが、非ヒト抗体由来である。１態様において、このような非ヒトＣＤＲ配列は、体細胞超変異のために最適化された合成ポリヌクレオチド配列を含み、好ましいＳＨＭコドン及び／又は好ましいＳＨＭホットスポットコドンを含む。このような合成ＣＤＲ配列は、本発明のヒトライブラリー中に組み込まれると、以下に記載するように、ＳＨＭ介在性の変異誘発及びスクリーニングを介して、非ヒト抗体を迅速にヒト化する方法を提供する。
【０４２７】
本明細書での使用のために、各合成可変領域は、サブクローニング及びＣＤＲと定常ドメインとのライゲーションに適した独自の制限部位を含むように設計することもできる。
【０４２８】
ポリヌクレオチドは、市販の供給元（例えば、ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使用して標準的な方法論を使用して合成でき、正確な合成を確認するために配列決定される。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、このポリヌクレオチドは、上記のように、必要に応じて、抗体重鎖又は軽鎖のサブライブラリー全体のアセンブリーのために適切なクローニングベクター中に挿入され得る。１実施形態において、合成ＣＤＲは、半合成全長抗体ライブラリーに関して本明細書中で記載したように、コンセンサスＣＤＲ領域を欠く合成可変ドメインテンプレートに挿入され、次いで、合成定常ドメイン中にライゲーションされる。
【０４２９】
各サブライブラリーが一旦ＳＨＭに適切な１以上の発現ベクター中にアセンブリされると、それらは、本明細書中に記載したように宿主細胞中に導入されて、変異誘発をもたらし得る。
【０４３０】
以下に記載するように、改善された形質を有する、表面露出された抗体又は分泌された抗体を検出及び選択するための具体的なスクリーニングは、全般的に最良の抗体を進化させるために、複数のパラメータ（例えば、親和性、結合活性、選択性及び熱安定性）の同時選択に基づく数ラウンドの変異及び選択を典型的に含む。
【０４３１】
特定のタイプのライブラリー（例えば、異なるタイプの抗原に対する結合特異性を有する抗体を含むライブラリー又は異なる長さのＣＤＲを含むライブラリー）からの情報は、続く集中的なライブラリーのための設計プロセスを助けるために使用できる。
【０４３２】
２．テンプレート定常ドメイン
異なる抗体クラス（即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）又はサブクラス（アイソタイプ；例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２）に対応する任意の哺乳動物重鎖定常ドメイン（Ｆｃ）が、抗体の所望の機能性に依存して、スキャフォールドとして使用できる。好ましい定常ドメインには、ＩｇＧクラスのヒト定常ドメイン、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスのヒト定常ドメインが含まれる。適切な軽鎖定常ドメインとしては、κ及びλが挙げられる。好ましい軽鎖定常ドメインはヒトである。
【０４３３】
各ポリヌクレオチドテンプレート定常ドメインは、サブクローニング及びＣＤＲと可変ドメインとのライゲーションに適した独自の制限部位を含むように設計される。ポリヌクレオチドは、市販の供給元（例えば、ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使用して標準的な方法論を使用して合成でき、正確な合成を確認するために配列決定される。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、このポリヌクレオチドは、抗体鎖全体のアセンブリのために適切なクローニングベクター中に挿入され得る。
【０４３４】
３．ライブラリーアセンブリ
特定の実施形態において、抗体ライブラリーアセンブリは、種々のエレメントを一緒にライゲーションすることにより、１以上のサブライブラリーのアセンブリを全てそろえる（ｃｏｍｐｌｅｔｉｎｇ）ことを含む。
【０４３５】
具体的には、重鎖ライブラリーは、テンプレート重鎖可変ドメインの一部（即ち、その内因性のＣＤＲ３ドメインを欠く）をコードする化学合成された複数のポリヌクレオチドの１以上及びテンプレート重鎖定常ドメインをコードする化学合成されたポリヌクレオチドを含むクローニングベクター中への、Ｉｇ  ＶＨ  ＣＤＲ３領域ライブラリーのライゲーションを伴い、再編成された全長重鎖の多様性を示す半合成抗体ライブラリーを生じる。
【０４３６】
κ軽鎖ライブラリーアセンブリは、テンプレートκ軽鎖可変ドメインの一部（即ち、その内因性のＣＤＲ３ドメインを欠く）をコードする化学合成された複数のポリヌクレオチドの１以上及びκ軽鎖定常ドメインをコードする化学合成されたポリヌクレオチドを含むクローニングベクター中への、Ｉｇ  ＶＬκＣＤＲ３領域ライブラリーのライゲーションを伴い、再編成された全長κ軽鎖の多様性を示す半合成抗体ライブラリーを生じる。
【０４３７】
λ軽鎖ライブラリーアセンブリは、テンプレートλ軽鎖可変ドメインの一部（即ち、その内因性のＣＤＲ３ドメインを欠く）をコードする化学合成された複数のポリヌクレオチドの１以上及びλ軽鎖定常ドメインをコードする化学合成されたポリヌクレオチドを含むクローニングベクター中への、Ｉｇ  ＶＬλＣＤＲ３領域ライブラリーのライゲーションを伴い、再編成された全長λ軽鎖の多様性を示す半合成抗体ライブラリーを生じる。
【０４３８】
各サブライブラリーが一旦１以上の発現ベクター中にアセンブリされると、サブライブラリーは、本明細書中に記載したように適切な宿主細胞中に導入され得る。特定の実施形態において、サブライブラリーの各々は、ＳＨＭに適した１以上の発現ベクター中にアセンブリされ、その後、サブライブラリーの各々を含む、ＳＨＭに適した１以上の発現ベクターは、本明細書中に記載したように宿主細胞中に導入されて、変異誘導をもたらし得る。
【０４３９】
４．スクリーニング方法論
改善された形質を有する、表面露出された抗体又は分泌された抗体を検出及び選択するための具体的なスクリーニングは、当該分野で周知であり、以下のセクションＸに詳細に記載される。一般に、このようなスクリーニングは、全般的に最良の抗体を進化させるために、複数のパラメータ（例えば、親和性、結合活性、選択性及び熱安定性）の同時選択に基づく数ラウンドの選択を含むであろう。
【０４４０】
一旦抗体又はそのフラグメントがＳＨＭを使用して最適化されると、最適化された抗体又はそのフラグメントの表現型／機能が、当該分野で認識されたアッセイを使用してさらに分析され得る。抗体又はそのフラグメントのためのアッセイとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：結合親和性、結合活性などを決定できる、酵素結合免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ）測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）、変異したＩｇＨ鎖のゲル検出及び蛍光検出、スキャッチャード分析、ＢＩＡＣＯＲ分析、ウエスタンブロット、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析、ラジオイムノアッセイなど。このようなアッセイは、以下のセクションＸにおいてより充分に記載される。
【０４４１】
一旦最適化された抗体が同定されると、エピソームＤＮＡが、抽出（又はＳＶ４０  Ｔ抗原との共発現によって増幅（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６））され得、次いで抽出されて、可変重鎖（ＶＨ）リーダー領域及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）リーダー領域特異的なセンスプライマー並びにアイソタイプ特異的なアンチセンスプライマーを使用するＰＣＲに供され得る。或いは、選択されたソートされた細胞集団から総ＲＮＡが単離され、可変重鎖（ＶＨ）リーダー領域及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）リーダー領域特異的なセンスプライマー並びにアイソタイプ特異的なアンチセンスプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲに供され得る。クローンは標準的な方法論を使用して配列決定され得、得られた配列は、ヌクレオチドの挿入及び欠失の頻度、受容体のリビジョン（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）並びにＶ遺伝子選択について分析され得る。得られたデータは、１以上の所望の特性における変化と特定のアミノ酸置換とを連結するデータベースに投入するために使用され得る。次いで、このようなデータベースは、好都合な変異を組換えるため、又は新たに同定された目的の領域（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）中に標的化された多様性を有する次世代のポリヌクレオチドライブラリーを設計するために、使用され得る。
【０４４２】
Ｂ．目的の非抗体タンパク質
非抗体タンパク質に関して、本発明は、最も大きい生物学的影響を生じるか又は改善された所望の特性／活性を示す改変されたタンパク質を迅速に選択するための、ランダムに改変されたタンパク質のライブラリーのｉｎ  ｖｉｖｏ導入の必要性を回避する能力を提供する。従って、本発明は、最適な機能的及び／又は構造的領域について標的タンパク質をスキャンし、本明細書中に記載した方法を使用してこのような領域を進化させることによって、改善されたタンパク質の迅速な進化を可能にする。これにより、最適な機能的領域について標的タンパク質をスキャンする能力及び臨床で使用するためのこのクラスで最良のタンパク質薬物を産生する能力が提供される。
【０４４３】
１．酵素
酵素及びプロ酵素は、迅速に改善でき、ＳＨＭが有用な、ポリペプチドの別のカテゴリーを示す。２つ以上の酵素の同時変異を含む、複数の酵素経路の同時進化への本発明の適用は、特に興味深い。１態様において、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの２つの合成ライブラリーの発現（ここで、両方の合成ポリヌクレオチドライブラリーは、プロモーターの近位に位置し、同じ細胞中で同時に発現され及び同時進化される）。１実施形態において、このプロモーターは、二方向性ＣＭＶプロモーターなどの二方向性プロモーターである。別の実施形態において、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの２つの合成ライブラリーは、２つの一方向性プロモーターの前に配置される。２つのプロモーターは、同じプロモーターでも異なるプロモーターでもよい。目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの２つの合成ライブラリーは、同じベクター中又は異なるベクター上に存在し得る。特に留意すべき酵素及び酵素系には、例えば、微生物学的発酵、代謝経路工学、タンパク質製造、バイオレメディエーション、並びに植物の成長及び発達、に関連する酵素が挙げられる。
【０４４４】
改善された形質を有する酵素を測定、選択及び進化させるための多数のハイスループットスクリーニングアプローチが当該分野で周知であり、セクションＸに概説される。一般に、このようなスクリーニングは、複数のパラメーター（例えば、ｐＨ安定性、Ｋｍ、Ｋｃａｔ、熱安定性、溶解度、タンパク分解安定性、基質特異性、補因子依存性、及びヘテロ二量体化又はホモ二量体化の傾向）の同時選択に基づく数ラウンドの選択を含む。
【０４４５】
ａ．ポリヌクレオチドの同定及び設計
既に記載したように、変異誘発のための出発点は、典型的に、目的の遺伝子のｃＤＮＡクローン又はそのアミノ酸若しくはポリヌクレオチド配列のいずれかである。ライブラリー開発に有用な出発点は、いくつかの公に利用可能なデータベースの１つ（例えば、ＰＤＢデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ））を使用して、この出発配列との配列比較検索を実行することである。このようなデータベースは、事実上全ての公知の配列情報を含み、適切な分析ツールを含む。
【０４４６】
このような検索は典型的に、目的の遺伝子の関連するアイソフォーム間及び異なる生物中の同じ遺伝子間での、同一及び相違する領域に関する情報を生む。
【０４４７】
さらに、例えば、例えば目的の特定のクラス又はファミリー内の全ての酵素を同定することにより、テンプレートポリヌクレオチドの開発を助けるために関連の配列の進化に対する重要な洞察を提供できるｐｈｙｌｉｐ  ３．６５  ＰｒｏｔＭＬＫプログラム（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｒｅｅｓ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５７：３７９−４０４を参照のこと）を使用することによる、異なるポリヌクレオチド配列の関連性の程度を示す分岐図の作成。
【０４４８】
このような遺伝子は、そのような酵素を含む宿主細胞中にＡＩＤ及び又は他の補助酵素を共発現させることによって、同時に進化させることができる。好ましい場合、このような酵素はＳＨＭのためにコドンが最適化されている。
【０４４９】
このアプローチは、問題の特定のサブシステムに利点を与えるだけでなく、細胞の増殖及び生存に関連する全般的な系にポジティブな影響を与える変異を同定する能力を開発する。
【０４５０】
ｂ．スクリーニング方法論
多くのハイスループットスクリーニングアプローチが当該分野で周知であり、改善された酵素を同定及び選択するために容易に適用できる（一般には、Ｏｌｓｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）２３０  ３２９−３４９；Ｔｕｒｎｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）２１（１１）４７４−４７８；Ｚｈａｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）１３（２）１０４−１１０；Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．（２００５）１２（１２）１２９１−３００を参照のこと）。一般に、使用されるスクリーニングの様式は、酵素の性質、及び目的の酵素が細胞内であるか細胞外であるか、そしてさらには膜結合型であるか自由に分泌されるか、に依存するであろう。
【０４５１】
一般に、広い動的ウインドウにわたって有用な定量情報を提供し、高いスクリーニング能力を有する最初のスクリーニングが、好ましい。代表的なスクリーニングアプローチには、例えば、細胞内蛍光発生反応産物の存在又は変更されたレポーター遺伝子発現を検出できるフローサイトメーターを使用した、改善された細胞の変更された能力又は増殖速度に基づくアッセイ、及び／又は細胞のソーティングに基づくアッセイが挙げられる（酵素活性のＦＡＣＳベースの最適化のための具体的なプロトコルは、以下の参考文献に総説がある；Ｆａｒｉｎａｓら、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ（２００６）９（４）３２１−８；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）１５（４）３２３−９；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４３（１−２）２１１−２２７）。
【０４５２】
一旦酵素又は酵素のセットがＳＨＭを使用して最適化されると、最適化された酵素の完全な生化学的分析が、当該分野で認められたアッセイを使用して、さらに分析され得る。さらに、既に議論したように、一旦最適化された酵素が同定されると、エピソームＤＮＡが、抽出又はＳＶ４０  Ｔ抗原との共発現によって増幅され得（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６）、次いで、抽出され、特異的プライマーを使用するＰＣＲに供され得る。或いは、選択された細胞集団から総ＲＮＡが取得され得、特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲに供され得る。クローンが、標準的な方法論を使用して配列決定され得、得られた配列は、ヌクレオチド変異の頻度について分析され得る。得られたデータは、１以上の所望の特性における変化と特定のアミノ酸置換とを連結するデータベースに投入するために使用され得る。次いで、このようなデータベースは、好都合な変異を組換えるため、又は新たに同定された目的の領域（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）中に標的化された多様性を有する次世代のポリヌクレオチドライブラリーを設計するために、使用され得る。
【０４５３】
２．受容体
受容体はリガンドに結合し、細胞結合受容体（例えば、抗体（Ｂ細胞受容体）、Ｔ細胞受容体、Ｆｃ受容体、Ｇ共役タンパク質受容体、サイトカイン受容体、糖鎖受容体、及びＡｖｉｍｅｒベースの受容体）が挙げられるがこれらに限定されない特異的結合メンバーをコードする、天然に存在する及び合成のポリペプチドの広い属を包含する。
【０４５４】
一般に、このような受容体は、以下の形質の１以上を改善するためにＳＨＭを介して変更されるであろう：親和性、結合活性、選択性、熱安定性、タンパク分解安定性、溶解度、二量体化、折り畳み、免疫毒性、シグナル伝達カスケードへのカップリング及び発現。
【０４５５】
ａ．ポリヌクレオチドの同定及び設計
上述のように、変異誘発の出発点は典型的に、目的の遺伝子のｃＤＮＡクローン又はそのアミノ酸若しくはポリヌクレオチド配列のいずれかである。ＳＨＭの有効性を最大化するために、（必須ではないが、）出発ポリヌクレオチド配列は、ホットスポットの密度を最大化し、コールドスポットの密度を減少させるように改変することが好ましい。このような方法は、本明細書のセクションＩＶ及びＶに開示される。
【０４５６】
一般に、このような受容体は、ＳＨＭにより最適化された配列の使用を介して変異誘発のために標的化されるか、ＳＨＭ耐性配列の使用を介して変異誘発の間に保存されるかのいずれかであり得る、明確に規定された領域を保有する。変異誘発のために典型的に標的化される領域としては、翻訳後修飾の部位、表面露出されたループドメイン、種間のバリエーションの位置、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン及び結合ドメインが挙げられる。変異誘発の間に典型的に保存される領域としては、膜貫通ドメイン、不変アミノ酸位置、シグナル配列及び細胞内輸送ドメインが挙げられる。或いは、スクリーニングアプローチを使用して、以前に記載したように、目的の受容体のリーディングフレームを通じてホットスポットモチーフを体系的に挿入できる。
【０４５７】
ｂ．スクリーニング方法論
多数のハイスループットスクリーニングアプローチが当該分野で周知であり、改善された受容体を同定及び選択するために容易に適用できる。一般に、ハイスループットスクリーニングアプローチは好ましい。代表的なスクリーニングアプローチとしては、例えば、結合アッセイ、増殖アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ及びＦＡＣＳベースのアッセイが挙げられる。
【０４５８】
一旦酵素又は酵素のセットがＳＨＭを使用して最適化されると、最適化された受容体の完全な薬理学的分析が、当該分野で認められたアッセイを使用してさらに分析され得る。さらに、既に議論したように、一旦最適化された受容体が同定されると、エピソームＤＮＡが、抽出又はＳＶ４０  Ｔ抗原との共発現によって増幅され得（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６）、次いで、抽出され、特異的プライマーを使用するＰＣＲに供される。或いは、総ＲＮＡが、選択された細胞集団から取得され、特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲに供され得る。クローンは標準的な方法論を使用して配列決定され得、得られた配列は、ヌクレオチド変異の頻度について分析され得る。得られたデータは、１以上の所望の特性における変化と特定のアミノ酸置換とを連結するデータベースに投入するために使用され得る。次いで、このようなデータベースは、好都合な変異を組換えるため、又は新たに同定された目的の領域（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）中に標的化された多様性を有する次世代のポリヌクレオチドライブラリーを設計するために、使用され得る。
【０４５９】
ＶＩＩ．抗体ヒト化のための方法
上述のように、モノクローナル抗体は、大いに有望な生物治療剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の独自のクラスを示す。しかし、ヒト臨床治療において使用するためのモノクローナル抗体の開発はしばしば、非ヒト供給源由来のモノクローナル抗体（即ち、マウスモノクローナル抗体）の免疫原性に関連する問題に起因して、遅延又は阻止される。ヒトのスキャフォールドへ非ヒト抗体のＣＤＲを移植することは可能であるが、これは典型的に結合親和性における有意な低下をもたらし、結果として、出発非ヒト抗体に匹敵する結合特徴を有する高親和性のヒト化抗体を作成するために、広範な部位特異的変異誘発を必要とする。この問題を考慮して、それらの免疫原性活性を低下させ、それによってヒト治療剤としてのそれらの使用を可能にするために、非ヒトモノクローナル抗体を迅速にヒト化する方法が、本明細書中に提供される。
【０４６０】
特定の態様において、本発明は、非ヒト抗体をヒト化する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：ａ）非ヒト抗体重鎖タンパク質由来の少なくとも１つのＣＤＲドメインの全て又は一部をコードする少なくとも１つの合成核酸配列を含む１以上のヒト抗体重鎖タンパク質スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程；ｂ）非ヒト抗体軽鎖タンパク質由来の少なくとも１つのＣＤＲドメインの全て又は一部をコードする少なくとも１つの合成核酸配列を含む複数の１以上のヒト抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程；ｃ）抗体重鎖タンパク質スキャフォールド及び抗体軽鎖タンパク質スキャフォールドを、発現ベクター中にクローニングする工程；ｄ）抗体が、抗体重鎖タンパク質スキャフォールド由来の重鎖及び軽鎖タンパク質スキャフォールド由来の軽鎖の共発現によって産生されるように、宿主細胞を発現ベクターで形質転換する工程；ｅ）必要に応じて宿主細胞においてＡＩＤ活性を誘導する工程又はシードライブラリー上にＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程；ｆ）上記非ヒト抗体に特徴的な結合を有するヒト化抗体を発現する、細胞集団内の細胞（単数又は複数）を同定する工程；及びｇ）工程（ｆ）で同定した細胞（単数又は複数）から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程。
【０４６１】
抗体ヒト化のためのライブラリー構築は、セクションＶ及びＶＩにおいて合成及び半合成の抗体ライブラリーの作成について既に議論したのと同じ全般的方法論を使用する。
【０４６２】
Ａ．テンプレート可変ドメインの同定
非ヒトモノクローナル抗体をヒト化するのに適切な可変ドメインテンプレートとして使用するためのポリヌクレオチド配列の同定は、典型的に、既知のヒト生殖系列可変ドメイン配列に対する非ヒト抗体の相同性に基づく。具体的には、非ヒト抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインに対して最大程度の相同性を示すヒト可変ドメインが最初に選択されることが好ましい。
【０４６３】
１態様において、上位１０個の最も関連する重鎖可変ドメインテンプレート及び上位１０個の最も関連する軽鎖可変ドメインテンプレートが、最初のシードライブラリーを生成するために使用される。
【０４６４】
別の態様において、上位５個の最も関連する重鎖可変ドメインテンプレート及び上位５個の最も関連する軽鎖可変ドメインテンプレートが、最初のシードライブラリーを生成するために使用される。
【０４６５】
１態様において、上位２個の最も関連する重鎖可変ドメインテンプレート及び上位２個の最も関連する軽鎖可変ドメインテンプレートが、最初のシードライブラリーを生成するために使用される。
【０４６６】
各ポリヌクレオチド配列テンプレート可変ドメインは、サブクローニング及びＣＤＲと定常ドメインとのライゲーションに適した独自の制限部位を含むように設計される。ポリヌクレオチドは、市販の供給元（例えば、ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使用して標準的な方法論を使用して合成でき、正確な合成を確認するために配列決定される。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、このポリヌクレオチドは、抗体鎖全体のアセンブリのために適切なクローニングベクター中に挿入され得る。１実施形態において、このテンプレート可変ドメインはＣＤＲ領域を欠く。
【０４６７】
Ｂ．テンプレート定常ドメイン
異なる抗体クラス（即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）又はサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２）に対応するヒト重鎖定常ドメイン（Ｆｃ）をコードする任意のポリヌクレオチド配列が、抗体の所望の機能性に依存して、スキャフォールドとして使用できる。好ましい定常ドメインには、ＩｇＧクラス並びに特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスのヒト定常ドメインが挙げられる。適切なヒト軽鎖定常ドメインは、κ及びλを含む。
【０４６８】
各ポリヌクレオチドテンプレート定常ドメインは、サブクローニング及びＣＤＲと可変ドメインとのライゲーションに適した独自の制限部位を含むように設計される。ポリヌクレオチドは、市販の供給元（例えば、ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使用して標準的な方法論を使用して合成でき、正確な合成を確認するために配列決定される。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、このポリヌクレオチドは、抗体鎖全体のアセンブリのために適切なクローニングベクター中に挿入され得る。
【０４６９】
Ｃ．非ヒトモノクローナル抗体のＣＤＲ領域
任意の非ヒトモノクローナル抗体のＣＤＲ領域が、本明細書中に記載するヒト化のための方法において使用するのに適切である。好ましい実施形態において、合成により産生されたＣＤＲ領域は、本明細書中に記載するヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインへのＣＤＲ領域のライゲーションのための独自の制限部位を含む。
【０４７０】
特定の実施形態において、特徴づけられた非ヒトモノクローナル抗体のＣＤＲ３領域の全て又は一部をコードするポリヌクレオチド配列は、そのモノクローナル抗体のＣＤＲ３領域の既知のアミノ酸配列に基づいて、合成により産生できる。好ましい態様において、ＣＤＲ３ポリヌクレオチド配列は、体細胞超変異のために最適化されている。１態様において、ＳＨＭ最適化配列は、体細胞超変異モチーフの挿入によってＳＨＭのために最適化される。別の態様において、ＳＨＭ最適化配列は、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によって、ＳＨＭのために最適化される。別の態様において、ＳＨＭ最適化配列は、１以上のＷＡＣモチーフ、ＷＲＣモチーフ、又はそれらの１以上の組み合わせの挿入によって、ＳＨＭのために最適化される。
【０４７１】
他の実施形態において、非ヒトモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって産生され得る。当業者に公知なように、２つのプライマーを、増幅すべき核酸の各コード鎖について使用しなければならない。第一のプライマーは、センス（プラス又はコード）鎖の一部となり、レパートリー内のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域の上流にあるか又はその一部にわたるポリヌクレオチド間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。従って、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを産生するために、第一のプライマーは、免疫グロブリンＨアイソフォーム遺伝子などのＦＲ３領域内の保存された領域にハイブリダイズするように（即ち、相補的であるように）、選択される。同様に、ＶＬλ及びＶＬκ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを産生するために、第一のプライマーは、ＦＲ３領域内の、又はＶＬλ及びＶＬκアイソフォームのＣＤＲ３領域の５’部分にかかる、保存された領域にハイブリダイズするように（即ち、相補的であるように）、選択される。
【０４７２】
第二のプライマーは、非コード（マイナス又は相補）鎖の一部となり、プラス鎖間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。従って、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを産生するために、第二のプライマーは、ＣＨをコードする免疫グロブリン遺伝子の５’末端で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズするように選択される。同様に、ＶＬλ及びＶＬκ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドを産生するために、第二のプライマーは、従って、ＣＬをコードする免疫グロブリン遺伝子の５’末端で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズするように選択される。
【０４７３】
目的のモノクローナル抗体のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチド配列を生成するために使用される方法に関わらず、一旦ＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチド配列が単離されると、そのポリヌクレオチド配列は次いで、本明細書中に記載するヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列とライゲーションされて、全長ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド配列を得ることができる。
【０４７４】
Ｄ．ヒト化モノクローナル抗体ライブラリーのアセンブリ
１態様において、重鎖抗体をヒト化するための本明細書中に記載する方法は、複数のヒトテンプレート重鎖可変ドメイン（即ち、全ての内因性ＣＤＲドメインを欠くか、又は１態様ではＣＤＲ３だけ）をコードする本明細書中に記載のポリヌクレオチドとヒトテンプレート重鎖定常ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含む複数のクローニングベクター中への、非ヒトＩｇ  ＶＨ  ＣＤＲドメイン（又は１態様ではＣＤＲ３ドメインだけ）の全てのライゲーションを含み、目的のモノクローナル抗体のヒト化全長重鎖サブライブラリーが得られる。
【０４７５】
κ軽鎖をヒト化する方法は、複数のヒトテンプレートκ可変ドメイン（即ち、内因性ＣＤＲドメインを欠くか、又は１態様ではＣＤＲ３だけ）をコードする本明細書中に記載の化学合成されたポリヌクレオチドとκ軽鎖定常ドメインをコードする化学合成されたポリヌクレオチドとを含む複数のクローニングベクター中への、Ｉｇ  ＶＬκＣＤＲ（又は１態様ではＣＤＲ３だけ）のライゲーションを含み、目的のモノクローナル抗体のヒト化全長κ軽鎖サブライブラリーが得られる。
【０４７６】
λ軽鎖をヒト化する方法は、複数のヒトテンプレートλ可変ドメイン（即ち、内因性ＣＤＲドメインを欠くか、又は１態様ではＣＤＲ３だけ）をコードする本明細書中に記載の化学合成されたポリヌクレオチドとλ軽鎖定常ドメインをコードする化学合成されたポリヌクレオチドとを含む複数のクローニングベクター中への、Ｉｇ  ＶＬλＣＤＲ（又は１態様ではＣＤＲ３だけ）のライゲーションを含み、目的のモノクローナル抗体のヒト化全長λ軽鎖サブライブラリーが得られる。
【０４７７】
一旦目的のモノクローナル抗体の全長ヒト化重鎖及び軽鎖（κ又はλのいずれか）のサブライブラリーが１以上の発現ベクターへとアセンブリされると、これらは、セクションＶＩＩＩにおいて本明細書中で記載するように、適切な宿主細胞中に導入できる。特定の実施形態において、目的のモノクローナル抗体の全長ヒト化重鎖及び軽鎖（κ又はλのいずれか）遺伝子は、ＳＨＭに適した１以上の発現ベクターへとアセンブリされ、その後、このモノクローナル抗体の全長ヒト化重鎖及び軽鎖（κ又はλのいずれか）遺伝子のそれぞれを含む、ＳＨＭに適した１以上の発現ベクターが、本明細書中に記載するように宿主細胞中に導入されて、ＳＨＭ介在性の変異誘発をもたらし得る。
【０４７８】
Ｅ．スクリーニング方法論
改善された形質を有する、表面露出された又は分泌されたヒト化抗体を検出及び選択するための具体的なスクリーニングは、当該分野で周知であり、以下のセクションＸにおいて詳述する。一般に、このようなスクリーニングは、全般的に最良のヒト化抗体を進化させるために、複数のパラメーター（例えば、親和性、結合活性、選択性及び熱安定性）の同時選択に基づく数ラウンドの選択を含むであろう。
【０４７９】
ＶＩＩＩ．ポリヌクレオチドライブラリーの発現のための系
本明細書中で使用するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系及び超変異系としては、転写、又はＤＮＡテンプレートの連動した転写及び翻訳を可能にし、並びに特定の実施形態ではＳＨＭを介した進行性の変異誘発を可能にする、無細胞系が挙げられる。１実施形態において、このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系は、リボソームディスプレイと組み合わせて使用されて、タンパク質の進行性の変異誘発及び選択を可能にすることができる。
【０４８０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系としては、例えば、古典的なウサギ網状赤血球系、並びに新規無細胞合成系が挙げられる（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）１１０（３）２５７−６３；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．（２００４）１０  １−３０）。リボソームディスプレイのための系は、例えば、Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．２００６  ３１３（１−２）１４０−１４８）に記載されている。
【０４８１】
特定の実施形態において、本明細書中に記載する合成ライブラリー、半合成ライブラリー及び／又はシードライブラリーは、生物学的に機能的なタンパク質分子をその表面上に発現及びディスプレイするバクテリオファージの能力を利用することによる、ファージディスプレイ技術を利用できる。一般に、ファージライブラリーは、Ｍ１３ファージ又はＴ７ファージの遺伝子３中に、上記合成ライブラリー又は半合成ライブラリーを挿入することによって、生成できる。合成ライブラリー又は半合成ライブラリーから構成される各挿入物は、遺伝子３産物（ファージのマイナーコートタンパク質）のＮ末端に発現される。結果として、多様なペプチドを含むペプチドライブラリーが構築できる。次いで、ファージライブラリーは、固定化された目的の標的分子（例えば抗原）に対してアフィニティスクリーニングされ得、特異的に結合したファージが回収され、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ宿主細胞への感染によって増幅される。典型的には、受容体（例えば、ポリペプチド、糖鎖、糖タンパク質、核酸）などの目的の標的分子が、アフィニティクロマトグラフィーによって反応性ファージについて富化するために、クロマトグラフィー樹脂への共有結合によって固定化され、及び／又はプラーク若しくはコロニーリフトについてのスクリーニングのために標識される。この手順はバイオパニングと呼ばれる。最後に、増幅されたファージは、具体的なペプチド配列の推定のために配列決定され得る。
【０４８２】
プラスチックＥＬＩＳＡプレート又はコーティングされていない細胞培養皿、磁気粒子、ガラスビーズ及びビーズ化アガロースを含む種々の固相が、ファージディスプレイライブラリーによるバイオパニングのために首尾よく使用されている。最も簡便で一般に使用される固相はプラスチックであり、コーティングのために最も一般に使用される方法は、非共有結合吸着である。しかし、プラスチック表面上へのタンパク質の吸着は疎水性相互作用を含むと考えられているので、ある種のリガンド、特に高度に親水性のタンパク質又は低分子量化合物は、共有結合的方法を使用しない限り、プラスチックに充分結合しない可能性がある。ＥＬＩＳＡプレートの調製に使用される方法は、バイオパニングに直接適用可能であり、詳細なリガンド固定化プロトコルは、酵素イムノアッセイ研究室マニュアル中に見出すことができる。結合を増強するために、プラスチックにあまり吸着しないタンパク質は、グアニジン、尿素若しくはチオシアネートなどのカオトロピック剤、又は酸若しくは熱で、部分的に変性され得る。さらに、標的脂質又はリポタンパク質は、デオキシコレートの存在下でプラスチックに吸着できる。標的リガンドの固定化のために使用される固相は、通常、スクリーニングされるファージ溶解物の容量に依存する。ほとんどの適用のために、プラスチックの９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｏ．２５８０１）が、単一ウェル中の、スクリーニングすべきファージの上限１０１０を可能にする。しかし、より大きい容積（＞０．２ｍｌ）をスクリーニングすべき場合、コーティングされていない６〜２４ウェルのプラスチック細胞培養プレートが使用できる。非常に大きい溶解物容積（＞２ｍｌ）をスクリーニングする場合、プラスチックのペトリ皿が使用できる。充分に代表的なサンプルが標的リガンドに曝されたことを確実にするために、バイオパニングの最初のラウンドで、より大きい容積が必要とされ得る。
【０４８３】
各パニング工程はファージの混合物から開始し、ディスプレイされたタンパク質が標的受容体に結合する混合ファージを選択することを追及する。これらのファージは、固体表面上に受容体（本発明の場合、細胞全体）を固定化することによって特異的に「捕捉」され；未結合のファージは洗浄して除かれ、捕捉されたファージは溶出されて（感染性形態のまま）、「溶出物」と呼ばれる元のファージ混合物の選択されたサブセットが得られる。通常、第一ラウンドの選択由来の溶出物は、新たな細胞にファージを感染させることによって増幅され、増幅された溶出物は次いで、別のラウンドの選択への投入物として使用される。つまり、２又は３ラウンドの選択が、良好なバインダーと目されるものの高度に富化された集団について選択するのに通常は充分であり、勿論、最初のライブラリーはこのようなバインダーを含む。
【０４８４】
他の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系は、目的の遺伝子をコードする複数の合成又は半合成のポリヌクレオチドの発現のための発現カセットを含む、合成又は半合成のポリヌクレオチドのライブラリーを含む。特定の実施形態において、配列を含む合成又は半合成の遺伝子は、ＳＨＭのために最適化されている。リボソームディスプレイのために、ポリヌクレオチドは、翻訳後にリボソームに付着したままになるように、終止コドンを欠くべきである。
【０４８５】
目的の遺伝子の転写及び又は翻訳をもたらすために、この系は、例えば、精製された７０Ｓリボソームとの組換え因子の使用を介したｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写及び翻訳のための、精製又は半精製の成分を含むことができる。進行性のＳＨＭを利用する発現系において、この系は、組換えの又は精製されたＡＩＤ及び又はＳＨＭ／ＤＮＡ修復のための他の因子をさらに含むであろう。
【０４８６】
細胞ベースの発現及び超変異系は、任意の適切な原核生物又は真核生物の発現系を含む。特定の実施形態において、細胞ベースの発現系は、ＡＩＤを発現するのに使用でき、容易且つ確実に増殖でき、合理的に速い増殖速度を有し、充分特徴付けられた発現系を有し、容易且つ効率的に形質転換又はトランスフェクトできる、発現系である。
【０４８７】
Ａ．原核生物発現系
これらの一般的ガイドラインにおいて、有用な微生物宿主としては、属Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ由来の細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、種々の株のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ  ＮＯ．３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ  ＮＯ．５３３３８））が挙げられる。
【０４８８】
Ｂ．真核生物発現系
ｉ．酵母
当業者に公知の多くの酵母細胞株もまた、ポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能であり、これには、属Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ並びに他の真菌由来のものが挙げられる。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０４８９】
ｉｉ．昆虫細胞
さらに、所望の場合、昆虫細胞系が本発明の方法において利用できる。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０−８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４：５６４−５７２（１９９３）；及びＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６−４５７９（１９９３）に記載されている。好ましい昆虫細胞としては、Ｓｆ−９及びＨＩ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０４９０】
ｉｉｉ．哺乳動物発現系
多数の適切な哺乳動物宿主細胞もまた当該分野で公知であり、多くがＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９から入手可能である。例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１）ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：４２１６−４２２０（１９８０））、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３若しくは２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞、又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ９２）。形質転換、培養、増幅、スクリーニング並びに産物の産生及び精製に適切な哺乳動物宿主並びに方法の選択は、当該分野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞系（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、並びにＣＶ−１細胞系（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、形質転換された細胞系を含む、霊長類細胞系及びげっ歯類細胞系が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物由来の細胞株、並びに初代外植片もまた、適切である。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型欠損であり得、又は優性に作用する選択遺伝子を含んでもよい。他の適切な哺乳動物細胞株には、以下が挙げられるがこれらに限定されない：マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ若しくはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３系、ＢＨＫ若しくはＨａＫハムスター細胞系（これらは、ＡＴＣＣから入手可能である）。これらの細胞系の各々は公知であり、タンパク質発現のために利用可能である。
【０４９１】
リンパ系、又はリンパ系由来細胞系（例えば、プレＢリンパ球起源の細胞系）もまた目的のものである。具体的な例としては、限定なしに、ＲＡＭＯＳ（ＣＲＬ−１５９６）、Ｄａｕｄｉ（ＣＣＬ−２１３）、ＥＢ−３（ＣＣＬ−８５）、ＤＴ４０（ＣＲＬ−２１１１）、１８−８１、（Ｊａｃｋら、ＰＮＡＳ（１９８８）８５  １５８１−１５８５）、Ｒａｊｉ細胞、（ＣＣＬ−８６）及びそれらに由来するものが挙げられる。
【０４９２】
本明細書中に記載する合成ライブラリー、半合成ライブラリー、又はシードライブラリーの発現に適したベクターは、任意の公知のエピソームベクター組込みベクター（本明細書中に記載したもの、当該分野で公知のもの、又は将来発見若しくは設計されるものを含む）に基づき得る。ＳＨＭ系で使用するために、本明細書中に記載される合成又は半合成のライブラリーの発現に適したベクターは、優先の米国仮特許出願第６０／９０２，４１４号に記載されたベクターのいずれかに基づき得、これは、ＡＩＤを内因性に発現している宿主細胞中に共トランスフェクトされ得る。ＳＨＭ系において有用な他の実施形態において、本明細書中に記載する合成ライブラリー、半合成ライブラリー又はシードライブラリーの発現に適したベクターは、優先の米国仮特許出願第６０／９０２，４１４号に記載されたベクターのいずれかに基づき得、これは、ＡＩＤの核酸配列を含む別個のベクターと共に、宿主細胞中に共トランスフェクトされ得る。
【０４９３】
発現ベクターはまた、目的のタンパク質ライブラリーの分泌又は表面結合を発揮するために、適切な分泌シグナル又は膜貫通ドメインを含むことができる。ある場合には、表面ディスプレイされたタンパク質は、分泌タンパク質をさらに特徴付けることができるように、分泌タンパク質へと変換され得る。変換は、例えば、第Ｘ因子、トロンビン又は任意の他の選択的タンパク溶解剤などの選択的プロテアーゼのインキュベーションによって切断され得る特異的切断可能リンカーの包含及び使用を介して、達成され得る。ベクター中にコードされたタンパク質の遺伝子操作を可能にする（即ち、タンパク質リーディングフレーム由来の表面結合シグナルの切り出しを可能にする）ポリヌクレオチド配列を含めることも可能である。例えば、結合シグナルの選択的除去を可能にする、１以上の独自の制限部位、ｃｒｅ／ｌｏｘエレメント又は他の組換えエレメントの挿入。さらなる例としては、発現ベクター中の結合シグナル（例えば、膜貫通ドメイン）周囲の隣接するｌｏｘＰ部位の挿入が挙げられる。
【０４９４】
ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードするプラスミド（ＤＮＡ２．０により合成され、発現ベクター中に挿入されたオープンリーディングフレーム）は、目的の細胞集団に、一過的にトランスフェクトされるか、ウイルスにより形質導入され得る。発現されたｃｒｅリコンビナーゼタンパク質による作用は、さらなる研究のために次に使用され得る、トランスフェクトされた細胞集団における分泌形態のタンパク質の翻訳及び産生を生じるコード領域の膜貫通ドメイン部分のｉｎ  ｓｉｔｕ除去を導く。
【０４９５】
代表的な市販のウイルス性発現ベクターには以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．から入手可能なアデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なレンチウイルスベースのｐＬＰ１、並びにＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なレトロウイルスベクターｐＦＢ−ＥＲＶ及びｐＣＦＢ−ＥＧＳＨ。
【０４９６】
本明細書中に記載する合成ライブラリー、半合成ライブラリー又はシードライブラリーの発現に適したエピソーム発現ベクターは、宿主細胞中で複製可能であり、適切な選択圧の存在下で宿主細胞内の染色体外エピソームとして存続する（例えば、Ｃｏｎｅｓｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１  １７３５−１７４２（２００４）を参照のこと）。代表的な市販のエピソーム発現ベクターとしては、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソームプラスミドが挙げられるがこれに限定されず、具体例としては、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７が挙げられる。このようなＯｒｉＰベースのベクターの増幅は、ベクター中のＳＶ４０複製起点のさらなる組込み及びＳＶ４０  Ｔ抗原の一過的な発現を介して達成できる。
【０４９７】
ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、ＥＢＮＡ１及びｏｒｉＰの代わりにＴ抗原及びＳＶ４０複製起点を使用するエピソームベクターの非限定的な例を示す。
【０４９８】
本明細書中に記載する合成ライブラリー、半合成ライブラリー又はシードライブラリーの発現に適した組込み発現ベクターは、宿主細胞のＤＮＡ中にランダムに組み込まれ得るか、発現ベクターと宿主細胞染色体との間の特異的組換えを可能にする組換え部位を含み得る。このような組込み発現ベクターは、所望のタンパク質の発現をもたらすために、宿主細胞染色体の内因性発現制御配列を利用できる。部位特異的な様式で組み込まれるベクターの例としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｆｌｐ−ｉｎ系（例えば、ｐｃＤＮＡＴＭ５／ＦＲＴ）又はｃｒｅ−ｌｏｘ系（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６  Ｃｏｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ中に見出され得る）の成分が挙げられる。ランダムな様式で宿主細胞染色体中に組み込まれるベクターの例としては、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入する場合）、ＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩ又はｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）が挙げられる。
【０４９９】
或いは、発現ベクターは、目的の内因性遺伝子の発現を調節するために、細胞中の遺伝子座に強力なプロモーター又はエンハンサー配列を導入し及び組み込むために使用され得る（Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．（２００５）；６（６）：５０７−１２；Ｓｃｈｉｎｄｅｈｕｔｔｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００５）；２３（１）：１０−５）。このアプローチは、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター（米国特許第５，４６４，７５８号及び同第５，８１４，６１８号））を、目的の内因性遺伝子の誘導性の発現を提供するために、細胞のゲノムＤＮＡ中に挿入するためにも、使用できる。活性化コンストラクトは、目的の遺伝子に特異的な所望の遺伝子座への活性化配列の相同組換え又は非相同組換えを可能にするための標的化配列も含むことができる（例えば、Ｇａｒｃｉａ−Ｏｔｉｎ＆Ｇｕｉｌｌｏｕ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．（２００６）１１：１１０８−３６を参照のこと）。或いは、誘導性リコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ＥＲ系）が、４−ヒドロキシタモキシフェンの存在下で導入遺伝子を活性化するために使用され得る（Ｉｎｄｒａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９９）２７（２２）４３２４−４３２７；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（２３）ｅ９９；米国特許第７，１１２，７１５号）。
【０５００】
本発明での使用のために発現ベクター中に含むべきエレメントは当該分野で周知であり、任意の既存のベクターが、本発明での使用のために、例えば、上記合成ポリヌクレオチド配列を有する１以上のポリヌクレオチド配列の挿入又は置換によって、容易に改変され得る。
【０５０１】
ＩＸ．体細胞超変異系
１態様において、本発明のポリヌクレオチドライブラリー（例えば、合成ライブラリー、半合成ライブラリー及び／又はシードライブラリー）が、優先の米国仮特許出願第６０／９０２，４１４号に記載したような体細胞超変異系に導入される。
【０５０２】
本発明は、変異を、目的の特定の遺伝子又は領域に向ける（「ホット」又はＳＨＭ感受性にする）ことを可能にし、全般的な系の機能性及び／又は安定性を維持するために細胞又はエピソーム内に機能的に必要とされる構造遺伝子又はマーカー遺伝子から離れた方向に向ける（「コールド」又はＳＨＭ耐性にする）ことを可能にする系を提供する。このような系は、構造タンパク質、転写制御領域及び選択マーカーの非特異的変異誘発を充分に防止しながら、目的のポリヌクレオチドライブラリー中の高レベルな標的化ＳＨＭを提供する変異誘発系の、安定な維持を可能にする。
【０５０３】
一部、このような系は、高レベルで持続するＳＨＭを提供できる、より安定なバージョンのシチジンデアミナーゼの生成に基づく。さらに、この系は、種々の他の成分ヌクレオチド配列（例えば、体細胞超変異のために最適化され、全般的な系の一体性を維持するコアの系を形成し得る、コード配列及び遺伝エレメント）を含む。これらの成分ヌクレオチド配列には以下が含まれるが限定されない：ｉ）選択マーカー（例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、アンピシリンなど）、ｉｉ）レポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質、エピトープタグ、レポーター酵素）；ｉｉｉ）遺伝子調節シグナル（例えば、プロモーター、誘導可能な系、エンハンサー配列、ＩＲＥＳ配列、転写又は翻訳ターミネーター、ｋｏｚａｋ配列、スプライス部位、複製起点、リプレッサー）；ｉｖ）高レベルの増強されたＳＨＭ又はその調節、又は測定に使用される酵素又は補助因子（例えば、ＡＩＤ、ｐｏｌイータ、転写因子、及びＭＳＨ２）；ｖ）シグナル伝達成分（キナーゼ、受容体、転写因子）、及びｖｉ）タンパク質のドメイン又はサブドメイン（例えば、核局在化シグナル、膜貫通ドメイン、触媒ドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、並びに他のタンパク質ファミリーで保存されたモチーフ、ドメイン及びサブドメイン）。
【０５０４】
１態様において、本発明の合成又は半合成のライブラリーを含む本明細書中に記載するベクターは、内因性ＡＩＤを含む宿主細胞にトランスフェクトされ得る。別の態様において、本発明の合成又は半合成のライブラリーを含む本明細書中に記載するベクターは、ＡＩＤが細胞中で過剰発現されるように、ＡＩＤの核酸配列を含む別個のベクターと共に、内因性ＡＩＤを含む宿主細胞中に共トランスフェクトされ得る。なお別の実施形態において、本発明の合成又は半合成のライブラリーを含む本明細書中に記載するベクターは、内因性ＡＩＤを含む又は含まない宿主細胞中へのトランスフェクションのために、コールドＡＩＤの配列を含むように改変され得る。
【０５０５】
１実施形態において、コールドＡＩＤは、ミューテーター活性の増加を示す、酵素の変異体形態である。ＡＩＤの変異体形態は、強力な核内輸送シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナルの活性を変更する変異、或いはその両方を含み得る。
【０５０６】
１態様において、変異したＡＩＤは、ＡＩＤ（配列番号１１）の位置１８０〜１９８で独立して選択された１以上の変異（この１以上の変異は、改変されたＡＩＤのミューテーター活性を増強する）によって生成された、改変された核外輸送配列を含む。
【０５０７】
１実施形態において、改変されたＡＩＤタンパク質は、Ｌ１８１Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｌ１８９Ａ、Ｌ１９６Ａ及びＬ１９８Ａから選択される少なくとも１の変異を含む、改変された核外輸送配列を有する。別の実施形態において、改変されたＡＩＤタンパク質は、Ｌ１８１Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｌ１８９Ａ、Ｌ１９６Ａ及びＬ１９８Ａから選択される少なくとも２、少なくとも３又は少なくとも４の変異を含む、改変された核外輸送配列を有する。
【０５０８】
別の態様において、改変されたＡＩＤタンパク質は、Ｄ１８７Ｅ、Ｄ１８８Ｅ、Ｄ１９１Ｅ、Ｔ１９５Ｉ及びＬ１９８Ａから選択される少なくとも１の変異を含む、改変された核外輸送配列を有する。別の態様において、改変されたＡＩＤタンパク質は、Ｄ１８７Ｅ、Ｄ１８８Ｅ、Ｄ１９１Ｅ、Ｔ１９５Ｉ及びＬ１９８Ａから選択される少なくとも２、少なくとも３又は少なくとも４の変異を含む、改変された核外輸送配列を有する。
【０５０９】
変異したＡＩＤポリペプチドは、Ｎ末端でもＣ末端でもよい、核局在化シグナルもまた含むことができる。１つの非限定的な例において、変異したＡＩＤは、例えばＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４３９）であるがこれに限定されない強力な核局在化シグナルを含み得る。別の非限定的な例において、ＮＬＳは、モチーフＫ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒに合致する配列であり得る。
【０５１０】
本明細書中に記載される変異したＡＩＤポリペプチドは、強力なＮＬＳ及び改変された核外輸送配列の両方を含み得る。１実施形態において、改変された核外輸送配列は、１以上の以下の変異を含み得る：Ｌ１８１Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｌ１８９Ａ、Ｌ１９６Ａ及びＬ１９８Ａ。別の実施形態において、改変された核外輸送配列は、１以上の以下の変異を含み得る：Ｄ１８７Ｅ、Ｄ１８８Ｅ、Ｄ１９１Ｅ、Ｔ１９５Ｉ及びＬ１９８Ａ。
【０５１１】
ＡＩＤのこれらの変異体形態のいずれかにおいて、遺伝子はＳＨＭ耐性、ＳＨＭ感受性であってもよいか、又はＳＨＭへの感受性に関係なく、選択した宿主細胞におけるＡＩＤ発現に適切な最適コドン用法を含むことができる。目的のタンパク質にＳＨＭを標的化するための発現系において使用する場合、ＡＩＤの変異体形態は、ＳＨＭ耐性であり得る。
【０５１２】
好ましい実施形態において、本明細書中に記載する合成ライブラリー、半合成ライブラリー、又はシードライブラリーを含むＳＨＭ系は、以下の１以上を含む：ｉ）そのポリヌクレオチドが経験するＳＨＭの率に正の影響を与えるように変更されたポリヌクレオチド、及びｉｉ）ＳＨＭの率に負の影響を与えるように変更されたポリヌクレオチド。
【０５１３】
典型的に、このような系は、ミューテーター細胞系における１以上の目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする発現制御配列を有する発現ベクターと共に使用されるであろう。適切な発現ベクターは、任意の公知のウイルス性又は非ウイルス性のベクター或いは人工染色体に基づき得る。発現系は、ＳＨＭのための協調した系を生成するために合わせて使用され得る種々のレプリコンの任意の組合せを含み得る。
【０５１４】
別の態様において、本明細書中に記載する合成ライブラリー又は半合成ライブラリーを含むＳＨＭ系は、以下から選択されるさらなるエレメントを１以上有する、１以上の発現ベクターをさらに含み得る：ｉ）ＡＩＤ又はＡＩＤホモログの発現を調節するための誘導性の系、ｉｉ）１以上のＩｇエンハンサー、ｉｉｉ）１以上のＥ−ボックス、ｉｖ）ＳＨＭに関する１以上の補助因子、ｖ）安定なエピソーム発現のための１以上の因子（例えば、ＥＢＮＡ１、ＥＢＰ２及び／又はｏｒｉ−Ｐ）、ｖｉ）１以上の選択マーカー遺伝子、ｖｉｉ）ベクターの選択的増幅を可能にする１以上の因子（即ち、ＳＶ４０  ｏｒｉ、及びＳＶ４０  Ｔ抗原を発現するための手段）及びｖｉｉｉ）それらの任意の組合わせ。
【０５１５】
誘導性の系（例えば、Ｔｅｔ制御された系）が使用される場合、ドキシサイクリンが、目的のポリヌクレオチド又はＡＩＤの発現を誘導するために一定期間にわたって（例えば、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間又は任意の他の時間）培地に添加され得、その後、適切なアッセイによる分析がなされる。細胞は、進行性の多様化を提供するための特定の時間にわたって、例えば、１〜３細胞世代、又は特定の場合には３〜６世代、又はある場合には６〜１０世代、又はそれより長く、増殖させることができる。
【０５１６】
細胞は、本明細書中に記載したように、繰り返し増殖、アッセイ及び選択されて、所望の特性を示す目的のポリヌクレオチドを発現する細胞を選択的に濃縮することができる。適切なアッセイ及び濃縮ストラテジー（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）；アフィニティ分離、酵素活性、毒性、受容体結合、増殖刺激など）を以下に記載する。
【０５１７】
一旦目的の細胞集団が得られると、目的のポリヌクレオチドがレスキューされ得、対応する変異が配列決定され同定される。例えば、総ｍＲＮＡ又は染色体外プラスミドＤＮＡは、ＳＶ４０  Ｔ抗原の共発現によって増幅され得（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６）、及び／又は細胞から抽出され得、適切なプライマーを使用する、改変されたポリヌクレオチドをクローニングするためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲのためのテンプレートとして使用され得る。変異体ポリヌクレオチドは、ベクター中にサブクローニングされ得、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され得る。タグ（例えば、Ｈｉｓ−６タグ）が、クロマトグラフィーを使用したタンパク質精製を促進するために、カルボキシ末端に付加され得る。
【０５１８】
Ｘ．スクリーニング系及び濃縮系
本明細書中に記載するポリヌクレオチドの合成ライブラリー、半合成ライブラリー又はシードライブラリーの発現により生成されるポリペプチドは、種々の標準的な生理学的手順、薬理学的手順及び生化学的手順を使用して、改善された表現型についてスクリーニングされ得る。このようなアッセイとしては、例えば以下が挙げられる：生化学的アッセイ（例えば、結合アッセイ、蛍光偏光アッセイ、溶解度アッセイ、折り畳みアッセイ、熱安定性アッセイ、タンパク分解安定性アッセイ、及び酵素活性アッセイ（一般には、Ｇｌｉｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、７  Ｎｏ．１  ３−１０（２００２）；Ｓａｌａｚａｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０  ８５−９７（２００３）を参照のこと））、並びにある範囲の細胞ベースのアッセイ（シグナル伝達、遊走性、全細胞結合、フローサイトメトリー及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイが含まれる）。本明細書中に記載する合成ライブラリー又は半合成ライブラリーがコードする目的のポリペプチドを発現する細胞は、任意の当該分野で認められたアッセイ（ペプチドを微粒子にカップリングする方法が挙げられるが、それらに限定されない）で濃縮され得る。
【０５１９】
ハイスループット様式でこれらのアッセイを実施することを可能にする、多数のＦＡＣＳ及びハイスループットスクリーニング系が市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、Ｍａｓｓ．；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｍｅｎｔｏｒ、Ｏｈｉｏ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．を参照のこと）。これらの系は典型的に、全てのサンプル及び試薬のピペッティング、液体分配時限式インキュベーション、及びアッセイに適した検出器におけるマイクロプレートの最終的な読み取りを含む、手順全体を自動化する。これらの設定可能な系は、ハイスループット及び迅速なスタートアップ、並びに高い程度の柔軟性及びカスタマイズ性を提供する。このような系の製造者は、種々のハイスループット系に関する詳細なプロトコルを提供している。即ち、例えばＺｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニング系を記載する技術告示を提供している。
【０５２０】
Ａ．活性を測定するための細胞ベースの方法
１．シグナル伝達ベースのアッセイ
例えば、増殖因子、酵素、受容体及び抗体などのタンパク質は、細胞又は細胞集団内のシグナル伝達に影響を与え得、それにより、レポーター遺伝子アッセイを使用して検出され得る転写活性に影響を与え得る。このようなモジュレーターは、完全アゴニスト又は部分アゴニスト、完全アンタゴニスト又は部分アンタゴニスト、或いは完全インバースアゴニスト又は部分インバースアゴニストとして、機能的に挙動し得る。
【０５２１】
従って、１つのアッセイ形式において、シグナル伝達アッセイは、目的のタンパク質によって直接又は間接的に発現が調節されるレポーター遺伝子（これは、種々の標準的な手順によって測定できる）を含む細胞の使用に基づき得る。
【０５２２】
レポータープラスミドは、レポーター遺伝子をコードするｃＤＮＡを、レポーター遺伝子のコード配列に対して５’側に存在する適切な最小プロモーター（即ち、真核生物細胞における転写開始を支持する任意の配列）の下流に配置することによって、標準的な分子生物学的技術を使用して構築できる。最小プロモーターは、ウイルス供給源由来であり得るか（例えば、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター）；又は真核生物細胞プロモーター由来であり得る（例えば、βアクチンプロモーター（Ｎｇ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：６０１−６１５、１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９５３９−９５４５、１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５０９２−５０９６、１９８８、Ｅｒｃｏｌａｎｉ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５３３５−１５３４１、１９８８）、ＴＫ−１（チミジンキナーゼ）プロモーター、ＨＳＰ（ヒートショックプロテイン）プロモーター、又はＴＡＴＡボックスを含む任意の真核生物プロモーター）。
【０５２３】
レポータープラスミドはまた、モニタリングが所望されるシグナル伝達経路の適切なブランチに対し、通常２回〜７回反復して連結されるコンセンサス認識配列を含む、最小プロモーターに対して５’側のエレメントを典型的に含む。例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：サイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なファージミドベクターｐＣＲＥ−Ｌｕｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０７６中、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化に応答する）、血清応答エレメント（ＳＲＥ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅファージミドベクターｐＳＲＥ−Ｌｕｃ．Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０８０）、核因子Ｂ応答エレメント（ＮＦ−ｋＢ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅファージミドベクターｐＮＦＫＢ−Ｌｕｃ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０７８）、活性化タンパク質１応答エレメント（ＡＰ−１、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅファージミドベクターｐＡＰ−１−Ｌｕｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０７４）、血清応答因子応答エレメント（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅファージミドベクターｐＳＲＦ−Ｌｕｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０８２）、又はｐ５３結合部位。
【０５２４】
多数のレポーター遺伝子系が当該分野で公知であり、例えば、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．ら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６６  １−１０；Ｋａｉｎ，Ｓ．Ｒ．（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６３  ４９−６０）、β−ガラクトシダーゼ（米国特許第５，０７０，０１２号（１９９１年１２月３日に、Ｎｏｌａｎらに対して発行された）及びＢｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．Ｂｉｏｌｕｍ．４  ９９−１１１を参照のこと）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８２）２  １０４４−５１を参照のこと）、β−グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ（米国特許第５，７４１，６５７号及び同第５，９５５，６０４号）、触媒的抗体、ルシフェラーゼ（米国特許第５，２２１，６２３号；同第５，６８３，８８８号；同第５，６７４，７１３号；同第５，６５０，２８９号；同第５，８４３，７４６号）及び天然に蛍光なタンパク質（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７  ５０９−４４）が挙げられる。
【０５２５】
或いは、遺伝子調節に近接した中間シグナル伝達事象もまた、例えば、細胞内変化（細胞内貯蔵からの放出に起因するカルシウム濃度の変動、膜電位又はｐＨの変化、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）又はｃＡＭＰ濃度の増加、或いはアラキドン酸の放出が挙げられるが、これらに限定されない）に応答するレポーター分子からの蛍光シグナルを測定することによって、観察できる。
【０５２６】
本明細書中で使用する場合、アゴニストとは、シグナル伝達を刺激するモジュレーターをいい、上で挙げたコンストラクトのエレメントの種々の組合せを使用して測定できる。本明細書中で使用する場合、部分アゴニストとは、バックグラウンドよりも高いが、完全アゴニストと比較して１００％未満であるレベルまで、シグナル伝達を刺激できるモジュレーターをいう。スーパーアゴニストは、完全アゴニスト参照標準と比較して、１００％を超えて、シグナル伝達を刺激できる。
【０５２７】
本明細書中で使用する場合、アンタゴニストとは、それら自体ではシグナル伝達に対して影響を有さないが、アゴニスト（又は部分アゴニスト）誘導性のシグナル伝達を阻害できるモジュレーターをいう。本明細書中で使用する場合、部分アンタゴニストとは、それら自体ではシグナル伝達について影響を有さないが、アゴニスト（又は部分アゴニスト）誘導性のシグナルを、１００％未満であるが測定可能な程度まで、阻害できるモジュレーターをいう。
【０５２８】
本明細書中で使用する場合、インバースアゴニストとは、アゴニスト（又は部分アゴニスト）誘導性のシグナル伝達を阻害でき、単独で添加した場合にもシグナル伝達を阻害できるモジュレーターをいう。
【０５２９】
２．遊走性アッセイ
細胞表面分子のいくつかのカテゴリー（例えば、ＧＰＣＲ（例えば、ケモカイン受容体、ヒスタミンＨ４、カンナビノイド受容体など））に対するアゴニスト活性は、細胞運動を導き得る。従って、試験分子の部分又は完全アゴニスト又はアンタゴニスト活性は、例えば、走化性アッセイ（Ｇｈｏｓｈら、（２００６）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｍａｙ  ４；４９（９）：２６６９−２６７２）、ケモキネシス（Ｇｉｌｌｉａｎら、（２００４）ＡＳＳＡＹ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．２（５）：４６５−４７２）又は走触性（Ｈｉｎｔｅｒｍａｎｎら、（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（９）：８００４−８０１５）において、細胞の遊走性に対する影響を介してモニタリングできる。
【０５３０】
３．全細胞結合アッセイ
受容体、膜結合抗体及び細胞表面タンパク質を利用する結合アッセイが、目的のタンパク質の活性又は結合選択性をモニタリングするために、全細胞（膜調製物の対語として）を使用して実施され得る。このようなアッセイは、ＦＡＣＳの使用を介して、所望の細胞集団を直接選択するためにも使用できる（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．１９９８  Ｎｏｖ；２８７（２）：４４８−４５６；Ｂａｋｅｒ、（２００５）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｆｅｂ；１４４（３）：３１７−２２）。
【０５３１】
多数の蛍光タグ化化合物が、全細胞結合アッセイを実施するために利用可能である。さらに、膜結合抗体の結合親和性及び選択性をプロファイリングするために、特定のペプチドが容易に標識され得る。一般に、ペプチドは、広範な種々の蛍光色素、クエンチャー及びハプテン（例えば、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリトリン及びビオチン）にコンジュゲート化され得る。コンジュゲート化は、ペプチド合成の間又はペプチドが合成及び精製された後のいずれかに、行なうことができる。
【０５３２】
ビオチンは、小さい（２４４キロダルトン）のビタミンであり、アビジン及びストレプトアビジンタンパク質に高い親和性で結合し、ほとんどのペプチドに対して、それらの生物学的活性を変更することなくコンジュゲート化できる。ビオチン標識したペプチドは、固定化したストレプトアビジン及びアビジンアフィニティゲルを使用して、未標識のペプチドから容易に精製され、ストレプトアビジン又はアビジンとコンジュゲート化されたプローブは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット又はウエスタンブロット適用において、ビオチン化ペプチドを検出するために使用できる。
【０５３３】
ビオチンのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルは、最も一般に使用されるタイプのビオチン化剤である。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド活性化ビオチンは、生理的緩衝液中で一級アミノ基と効率的に反応して、安定なアミド結合を形成する。ペプチドはＮ末端に一級アミンを有し、また、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド活性化ビオチン試薬を用いて標識するための標的として利用可能なリジン残基の側鎖中に数個の一級アミンを有することができる。特性及びスペーサーアームの長さが異なるいくつかの異なるビオチンのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルが利用可能である（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル試薬は水溶性であり、有機溶媒の非存在下での反応の実施を可能にする。
【０５３４】
或いは、ペプチドは、Ｒ−フィコエリトリン（赤色蛍光タンパク質）とコンジュゲート化され得る。Ｒ−フィコエリトリンは、海藻から単離されたフィコビリンタンパク質である。Ｒ−フィコエリトリンをペプチドを標識するのに理想的なものにしている特性がいくつか存在し、これには、広範な潜在的励起波長を含む吸収スペクトル、水性緩衝液中の溶解度、及び低い非特異的結合が含まれる。Ｒ−フィコエリトリンはまた、広い範囲にわたって温度及びｐＨに非依存的な、高い蛍光量子収量（５７８ナノメートルで０．８２）を有する。Ｒ−フィコエリトリンとペプチドとのコンジュゲート化は、例えば、Ｇｌａｚｅｒ，ＡＮ及びＳｔｒｙｅｒ  Ｌ．（１９８４）．Ｐｈｙｃｏｆｌｕｏｒ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．９：４２３−７；Ｋｒｏｎｉｃｋ，ＭＮ及びＧｒｏｓｓｍａｎ，ＰＤ（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９：１５８２−６；Ｌａｎｉｅｒ，ＬＬ及びＬｏｋｅｎ，ＭＲ（１９８４）Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ−ｃｏｌｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｕ−２，Ｌｅｕ−３，Ｌｅｕ−７，ａｎｄ  Ｌｅｕ−１１  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２：１５１−１５６；Ｐａｒｋｓ，ＤＲら（１９８４）Ｔｈｒｅｅ−ｃｏｌｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ５：１５９−６８；Ｈａｒｄｙ，ＲＲら（１９８３）ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｔｈｒｅｅ−ｃｏｌｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：２７０−２；Ｈａｒｄｙ  ＲＲら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１１６９−８８；並びにＫｒｏｎｉｃｋ，ＭＮ（１９８６）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．９２：１−１３に記載された、当該分野で認められた技術を使用して達成され得る。
【０５３５】
多数の架橋剤が、フィコビリンタンパク質コンジュゲートを産生するために使用でき、これには、Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド、（スクシンイミジル  ６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート、又は（スルホスクシンイミジル  ６−（３−［ピリジルジチオ］−プロピアンアミド）ヘキサノエートが挙げられるがこれらに限定されない。このような架橋剤は、フィコビリンタンパク質の表面露出した一級アミンと反応し、遊離スルフヒドリル基又は一級アミンのいずれかを含むペプチドと反応し得るピリジルジスルフィド基を生成する。
【０５３６】
別の選択肢は、フルオレセインイソチオシアネート（分子量３８９）でペプチドを標識することである。フルオレセイン上のイソチオシアネート基は、ペプチド上のアミノ、スルフヒドリル、イミダゾイル（ｉｍｉｄａｚｏｙｌ）、チロシル又はカルボニル基と架橋されるが、一般に、一級及び二級アミンの誘導体だけが安定な生成物を生じる。フルオレセインイソチオシアネートは、それぞれ４９４ナノメートル及び５２０ナノメートルの励起波長及び発光波長、並びにｐＨ８の水性緩衝液中で７２，００００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を有する（Ｄｅｒ−Ｂａｌｉａｎ  Ｇ，Ｋａｍｅｄａ，Ｎ及びＲｏｗｌｅｙ，Ｇ．（１９８８）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｆａｂ  ｗｈｉｌｅ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｔｈｉｏｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：５９−６３）。
【０５３７】
４．全細胞活性アッセイ
多くのタンパク質（酵素、細胞内抗体及び受容体を含む）は、生きた細胞内で、又は表面上に表面ディスプレイされた場合に、直接的にアッセイできる。典型的には、首尾よいＦＡＣＳベースのスクリーニングのために、蛍光又は蛍光発生膜透過性物質が必要とされ、多くのこのような試薬は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）から市販されている。酵素活性の増加は典型的に、細胞内に捕捉される蛍光産物の産生の増加を生じ、蛍光が低い細胞から例えばＦＡＣＳによって分離され得る、より高い蛍光を有する細胞を生じる。さらに、多くのハイスループットのマイクロプレートスクリーニングが、酵素活性の事実上任意の既存のアッセイを利用する、タンパク質ライブラリーのスクリーニングのために存在する（一般には、Ｇｅｄｄｉｅ，ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８  １３４−１４５（２００４）を参照のこと）。
【０５３８】
５．細胞増殖アッセイ
種々のタンパク質（例えば、増殖因子、酵素、受容体及び抗体など）の発現又は活性は、アッセイとして又は改善されたタンパク質を分離する手段として利用される宿主細胞の増殖速度に影響を与え得る。
【０５３９】
従って、１つのアッセイ形式において、細胞は、限界希釈まで希釈され得、より迅速に増殖する細胞が検出及び選択され得る。１態様において、このような増殖ベースのアッセイは、改善された酵素的代謝経路が必要とされる新規基質（例えば、新たな炭素供給源）の存在下で増殖する能力を含み得る。別の実施形態において、増殖アッセイは毒素の存在下での選択を含み得、この場合、毒素の活性解除機構が必要とされる。別の場合、増殖は、特異的リガンドの存在に応答して所望され得、この場合、リガンドの高親和性の結合が必要とされる。
【０５４０】
Ｂ．選択及び濃縮のストラテジー
１．フローサイトメトリー及びＦＡＣＳ
フローサイトメトリー及び関連のフローソーティング（蛍光活性化セルソーティング即ちＦＡＣＳとしても知られる）は、蛍光レポーターによる染色に基づいて、特定の成分又は成分バリアントの存在について個々の細胞が定量的にアッセイされ得る方法である。フローサイトメトリーは、生きた細胞の定量的なリアルタイム分析を提供し、５０，０００細胞／秒の効率的なセルソーティング速度を達成でき、個々の細胞又は規定された集団を選択することが可能である。多くの市販のＦＡＣＳ系（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ）、Ｃｙｔｏｐｅｉａ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ））が利用可能である。
【０５４１】
ＦＡＣＳは、複数のパラメータ分析のため及び異なるフルオロフォアとの使用のための、利用可能な広範な波長を発生させることができる、種々のレーザーを備え得る。古典的に、アルゴン、クリプトン、又は両者の混合を使用する水冷イオンレーザーは、いくつかの特異的な線を生じ得る。４０８ｎｍ、５６８ｎｍ及び６４７ｎｍは、例えば、クリプトンについての主要な輝線であり、４８８ｎｍ、４５７ｎｍ及びその他は、アルゴンの線である。これらのレーザーは、高電圧多相電源及び冷却水を必要とするが、高い出力を生じ得る。さらに、波長可変（ｔｕｎａｂｌｅ）及び非可変ダイオードレーザーが存在し、例えば、４０８ｎｍの線は、発光ダイオード（ＬＥＤ）を介して安定に生成され得、これは、容易にソーターに追加できる。さらに、色素レーザーを使用して、ＦＡＣＳ分析に利用可能な波長の利用可能な範囲をさらに拡張することができる。
【０５４２】
ＦＡＣＳ分析の間に、細胞は特異的レポーターで染色され、次いで、蛍光部分を励起するレーザーによる照合のための単一細胞ストリームへと、水力学的に集中させられる。蛍光発光は、波長制限された光学経路を介して検出され、個々の細胞に対応する数値データに変換される。フローソーティングの場合、予め規定された発光基準のサブセットが満たされ得、目的の細胞が、静電反発又は機械的作用により、さらなる使用のために収集レセプタクル中へと方向転換される（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ＬＡ、Ｓｗｅｅｔ  ＲＧ、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ＬＡ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｓｃｉ  Ａｍｅｒ  ２３４（３）：１０８、Ｍａｒ  １９７６）。
【０５４３】
ＦＡＣＳベースのアプローチは、シグナル伝達ベースのアッセイ、活性ベースのアッセイ及び結合アッセイと適合し、広範な目的のタンパク質（例えば、抗体、受容体、酵素及び任意の表面ディスプレイされたタンパク質が挙げられる）と適合する。ＦＡＣＳは、ほとんどの哺乳動物、酵母及び細菌細胞、並びに蛍光タグ化ビーズに対して、有効に適用できる。
【０５４４】
１実施形態において、ＦＡＣＳは、ＳＨＭ介在性の多様性を受けているか又は既に受けた、表面ディスプレイされたタンパク質（例えば、表面ディスプレイされた抗体）を発現する細胞のライブラリーをスクリーニングするために使用できる。このアプローチにおいて、細胞表面ディスプレイされたライブラリーが使用され、ディスプレイされたタンパク質は、溶液中で蛍光タグ化抗原と共に最初にインキュベートされる。ＦＡＣＳ装置は、ライブラリーのより低い親和性のメンバーから、より高い蛍光強度を有する、ライブラリーの高親和性タンパク質メンバーを分離することができる。ＦＡＣＳベースの選択と組み合わせた最適化された結合プロトコルの使用は、フェムトモルレベルまでの親和性を有する抗体を進化させることが可能であると示されている。例えば、Ｂｏｄｅｒら  ＰＮＡＳ、（２０００）９７：１０７０１−１０７０５；Ｂｏｄｅｒら、（２０００）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３２８：４３０−４４４；ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０００）１６：３１−３７）を参照のこと。
【０５４５】
目的の抗原に対する高い親和性を有する抗体及び結合タンパク質を効率的に選択し迅速に進化させるために、目的の抗原に対する広範な親和性を有する抗体の単離を促進でき、標識試薬又はカップリング試薬に結合するタンパク質をなお排除できるプロトコルが、確立され得る。これらのプロトコルは、選択された細胞集団の厳密さにおける前進、並びに細胞に提示される標的抗原の濃度及び密度の低下の両方を含む。
【０５４６】
各ラウンドの選択の間に収集された総細胞集団の厳密さ又は分画に関して、最初のスクリーニングは一般に、結合特徴における小さい漸進的改善を有するタンパク質を可能な限り多く捕捉するために、比較的低い選別の係数（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を使用するであろう。例えば、典型的な初回ソーティングは、標的に結合する全細胞の上位１０％、上位５％又は上位２％を捕捉し得る。親和性における大きい改善は、そのそれぞれが全体的親和性に対して小さい付加的効果を与える変異の組合わせの結果であり得る（Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：９５８−９６４）。従って、例え僅かであっても改善された親和性（２〜３倍）を有する全てのライブラリークローンの回収が、ライブラリースクリーニングの初期段階の間には所望され、ソーティングゲートは、濃縮における犠牲を最小にして可能な限り多くのクローンを回収するために最適化され得る。
【０５４７】
これらの選択された細胞は引き続いて回収されて、その集団がＦＡＣＳソーティング、分析、変異誘発、細胞バンキングの引き続くラウンドが可能になるのに、又は配列情報を決定するのに合理的な数に達するまで、何日もの間標準的な培養条件を使用して増殖され得る。以下に議論するように、より高い親和性のバインダーを同定するための選択の引き続くラウンドは、ＦＡＣＳ分析前のプレインキュベーション工程で使用される標識された結合ペプチドの密度及び濃度を漸進的に低下させることによって、達成できる。
【０５４８】
ソーティングの首尾よい第一ラウンドの後に、収集された細胞は、集団を増幅するために再増殖され、次いで再ソーティングされ得る。各所望のクローンのより多いコピーが試験した細胞集団内に存在するので、ソーティングのこの段階及び引き続く段階で、より高い濃縮が可能である。例えば、集団中の細胞の上位約１％、上位約０．５％、上位約０．２％、又は上位約０．１％だけが、有意に改善されたクローンを同定するために選択され得る。最適な結合及び選択ストラテジーを確立することに関して、生殖系列抗体を含む第一世代のヒットは、典型的に、低い親和性及び比較的迅速な解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を有する。例えば、Ｓａｇａｗａら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３９：８０１−８０８（２００３））は、生殖系列Ａｂについての見かけの親和性は、典型的に２×１０４〜５×１０６Ｍ−１の範囲であるが、この親和性は、親和性成熟の間に約１０９Ｍ−１まで増加する（即ち、解離速度（Ｋｏｆｆ）を低下させることによって主に介在される効果）ことを観察している。
【０５４９】
弱い結合抗体の結合特徴は、初期世代の非最適化ライブラリーのスクリーニングを遅くし得る。なぜなら、特異的だが低い親和性の結合抗体は、典型的に、迅速な解離速度を有し、従って洗浄工程の間に失われる傾向が高いからである。これらの特異的バインダーの喪失は、選択プロセスで使用される成分に非特異的に結合する抗体の単離を生じ得る（Ｃｕｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２Ｎｏｖ；２０（１１）：１１２９−１１３）。
【０５５０】
比較的低い親和性を有する（即ち、約５００ｎＭより高いＫｄを有する）タンパク質の選択を最大化するために、結合相互作用は、スクリーニングプロセスの間の結合ペプチドの解離を防止するために安定化され、カップリング試薬及び支持マトリクスへの結合を排除するための適切なブロッキング試薬を含む。この目的を達成するために、最初のスクリーニングは、非特異的結合を排除するための、カップリング試薬及び標識試薬（例えば、ストレプトアビジン、アビジン及びネイキッドビーズなど）とのプレインキュベーションをも含みつつ、低親和性相互作用の結合強度を増加させるための複数の結合相互作用の使用に基づく結合活性効果を利用するために、高密度の抗原を負荷（ロード）した蛍光タグ化ビーズを使用すべきである（一般には、Ａｇｇａｒｗａｌら、（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１７  ３３５−３４０；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３  ４５８−６４；Ｔｅｒｓｋｉｋｈら（１９９７）ＰＮＡＳ  ９４  １６６３−８；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６  １６９６−９；及びＷａｎｇら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９４  ２３−３５を参照のこと）。
【０５５１】
ビーズ負荷密度、洗浄及びプレインキュベーション条件の注意深い制御により、このような低い親和性の結合相互作用でさえ再現性良くモニタリングできることが実証されている（Ｗｅｒｔｈｅｎら、（１９９３）ＢＢＡ  ３２６−３３２）。重要なことに、結合効率に関するこれらの改善は、非特異的反応性の何らの有意な増加なしに生じることが実証されている（Ｇｉｏｒｄａｎｏら、（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７  １２４９−５３）。既に議論したように、選択はまた一般に、これらの弱い結合のライブラリーメンバーの全てが選択されるのを確実にするために、ＦＡＣＳの間に比較的低い厳密さのカットオフを使用することに基づくであろう。
【０５５２】
ライブラリーの非特異的メンバー（即ち、結合ペプチドではなく、ビーズ又はカップリング試薬に結合するもの）をさらに排除するために、得られた細胞集団は、別個のカップリング試薬を使用して、ポリマー性結合ペプチド又はインタクトなポリマー性抗原のいずれかを用いて直接スクリーニングされる（例えば、抗原−ストレプトアビジン蛍光複合体を形成するための、ストレプトアビジン−フルオロフォアコンジュゲートにカップリングされたビオチン化抗原の使用を介して）。ビオチン又はフルオロフォアへの結合ペプチドのカップリング又は標識化は、本明細書中及び実施例に記載したように、標準的な当該分野で認められたプロトコルを使用して達成できる。
【０５５３】
ストレプトアビジンは、フェムトモルレベルの親和性でビオチンと結合し、生理学的条件下でテトラマーを形成し、それにより、１つのビオチンでビオチン化された抗原とプレインキュベートした場合、４価の複合体（これ以降、以下に記載するように、ストレプトアビジン微小凝集体と呼ぶ）を生成する。ストレプトアビジンのプレローディングは、有効抗原濃度を５００倍まで増加させることができ、抗原に特異的に結合する弱い抗原バインダーを単離するために有用である。ストレプトアビジン微小凝集体の使用は、非常に弱い親和性から中程度の親和性（約２００ｎＭより高いＫｄ）までの範囲の親和性の抗体を単離するために有用である。さらに、細胞集団との接触前に微小凝集体を生成するために、ビオチン化エピトープを、室温で１０〜１５分間、ストレプトアビジン−フルオロフォアと予め反応させることができる。微小凝集体を引き続いて、二次試薬（例えば、抗ヒトＩｇＧ−フルオロフォアコンジュゲート）の添加の前に、１５〜３０分間にわたり同時に細胞と接触させる。１つの実験的アプローチにおいて、細胞は、１５００×ｇで５分間遠心分離され、小容量（典型的には５００μＬ〜１ｍＬ）のＤＡＰＩ（ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ、２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ）中に再懸濁される。「均一なアッセイ条件」と称する第二のアプローチにおいて、細胞は、抗原−ストレプトアビジン微小凝集体及びヤギ抗ヒトＩｇＧ−フルオロフォアが添加されるＤＡＰＩ中に直接再縣濁される。この第二のアプローチは特に、解離時間を最小化することがより適切であり得る場合、より弱く相互作用する抗体（約２００ｎＭより高いＫｄ）にとって望ましい。
【０５５４】
より高い親和性（Ｋｄ＞１０ｎＭであるが約１００ｎＭ未満のＫｄ）で、ライブラリーは、出発（野生型）相互作用のＫｄ（見かけのＫｄは、ソーティングの前に、ある範囲の抗原濃度で実施した一連の分析的ＦＡＣＳ実験によって容易に決定できる）よりも理想的には低い結合ペプチドのある濃度での平衡結合条件下で、モノマー結合ペプチド又は全長標的タンパク質と共にライブラリーをインキュベートすることによって、改善された親和性についてより容易に直接スクリーニングされる。これらの条件下で、より高い親和性を有する抗体及び結合タンパク質を保有する細胞は、より弱いバインダーよりもより有意に蛍光標識された結合ペプチドを保有して、集団中の最も蛍光性の細胞がさらなる最適化のために容易に選択されるのを可能にするであろう。典型的に、上位約０．５％〜約０．１％の細胞を選択するＦＡＣＳソーティングゲートが確立できる。１つの非限定的な方法において、上位約０．２％の細胞が選択される。
【０５５５】
Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（１９９８）１４  ５５−６２）により認識されるように、非常に高い親和性（Ｋｄ＜１０ｎＭ）のタンパク質−リガンド相互作用のスクリーニングは、親和性について直接スクリーニングするのではなく、低下した解離速度についてスクリーニングすることによって、達成できる。このアプローチにおいて、細胞は、蛍光結合ペプチドで飽和まで標識され、その後過剰の非蛍光リガンドが添加される。細胞に会合した蛍光は、時間と共に指数関数的に減衰してバックグラウンドレベルに達し、解離反応は、通常冷緩衝液での大規模な希釈により、一定の持続時間の後停止させる。競合反応の持続時間は、異なるライブラリークローンについて、観察された蛍光における差異を決定し、従って、ライブラリーから選択される可能性の高い動力学的改善の範囲を決定する。競合的解離反応について、過剰の非蛍光リガンドの存在は、ゼロの有効正反応速度を生じ得る。競合反応の開始後所与の時間での平均蛍光強度は、解離速度（Ｋｏｆｆ）の関数である（ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ及びＷｉｔｔｒｕｐ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６  ３１−３７；Ｂｏｄｅｒら（２０００）ＰＮＡＳ  ９７  １０７０１−１０７０５；並びにＦｏｏｔｅ及びＥｉｓｅｎ（２０００）ＰＮＡＳ  ９７  １０６７９−１０６８１）。改善された親和性及びより安定な結合を有する抗体を発現する、集団中の細胞は、競合反応の時間の長さを漸増させ、次いで、さらなる最適化のために集団中に残存する最も蛍光性の細胞を選択することによって、体系的に同定できる。
【０５５６】
これらの条件下で、より高い親和性を有する、表面ディスプレイされた抗体及び結合タンパク質を保有する細胞は、ほとんど又は全く結合がないタンパク質を発現する細胞と比較して、有意により多くのビーズ又はストレプトアビジン−ビオチン化抗原微小凝集体結合を示すであろう。最も蛍光標識された細胞（最も高い親和性を有するタンパク質をディスプレイする）は次いで、標準的なＦＡＣＳソーティングプロトコルを使用して、例えば実施例９に記載するように、集団中の細胞の残部から分離できる。
【０５５７】
結合ペプチドへの再現性の良い結合を示すタンパク質を発現する選択された細胞集団が一旦作成されると、これは、抗体又は結合タンパク質が、所望のパターンの交差反応性及び／若しくは特異性（例えば、目的のタンパク質のマウス及びヒト両方のバリアントに対する）、又は関連の遺伝子ファミリーの２つの異なるメンバーに対する（しかし、関連がないか関連性が遠いタンパク質に対してではない））を示すことを確認するために、２以上のインタクトなタンパク質を用いて特徴付けされ得る。
【０５５８】
１実施形態において、これは、フローサイトメーターで同時に分析できる２つの異なる色の検出可能なタグ（例えば、ＦＩＴＣ及びフィコエリトリン）で標識した２以上のタンパク質種を使用した、マルチパラメータＦＡＣＳを使用して達成できる。このアプローチを使用して、一方のタンパク質のみへの結合を示すか又は両方のタンパク質に結合可能な細胞を同定することが可能である。求められる二重特異的結合を示す細胞集団は、ソートされた細胞の数に基づいてＦＡＣＳ操作者によって選択され得、多特異性を示す細胞の割合が同定され得る。既に記載したように、これらの選択された細胞は、引き続いて回収され、その集団がＦＡＣＳソーティング、分析、細胞バンキングの引き続くラウンドを可能にし、又は配列情報を決定するのに合理的な数に達するまで、何日もの間標準的な培養条件を用いて増殖され得る。
【０５５９】
ライブラリーから選択されたバインダーはさらに、本明細書中に記載したように特徴付けでき、抗体又は結合タンパク質の配列が、細胞ＤＮＡのＰＣＲ、選択された細胞集団から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ又はエピソームレスキューの後に決定され得る。
【０５６０】
候補抗体及び結合タンパク質は、本明細書中に記載するように、増強された結合特性を有する抗体又は結合タンパク質を発現する細胞の集団を進化させるために、超変異及び選択のラウンドに繰り返し供され得る。より高い親和性を有する結合ペプチドに優先的及び／又は選択的に結合する細胞が選択され、増幅される。必要に応じて、別のラウンドの変異誘発が繰り返され、再度、改善された選択的かつ高い親和性の結合を示す細胞が、さらなる増幅及び増殖のために保持される。得られた新規改善されたバリアントはさらに、本明細書中に記載したように特徴付けでき、ＲＴ−ＰＣＲ又はエピソームレスキューの後に、重鎖及び軽鎖の配列が決定され得る。
【０５６１】
超変異／選択の最初の１、２又は３ラウンドで同定された変異は、元の親骨格の背景内の新たなテンプレートのセットへと、コンビナトリアルに組換えられ得、得られたテンプレートの全て又はサブセットは、その後、細胞中にトランスフェクトされ得、この細胞が次いでＦＡＣＳソーティングによって選択される。変異の最良の組み合わせはこうして単離及び同定され、超変異／選択の引き続くラウンドで使用されるか、又は新たに同定されたテンプレートが充分に強力な親和性を示す場合には、さらなる機能的特徴付けのために、実験において代わりに使用されるかのいずれかである。
【０５６２】
別の実施形態において、ＦＡＣＳは、ＳＨＭ介在性の多様性生成を受けているか又は既に受けた細胞内タンパク質を発現する細胞のライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。このアプローチにおいて、膜透過性の蛍光発生又は蛍光試薬が使用され、試薬の取り込み及び変換を可能にするために、細胞のライブラリーと共に最初にプレインキュベートされる。ＦＡＣＳ機器は、より高い割合の試薬を変換でき、かつより低い活性のメンバーを含む細胞よりも蛍光が強い、ライブラリーの高活性タンパク質メンバーを分離することができる（例えば、Ｆａｒｉｎａｓ、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．（２００６）９：（４）３２１−３２８を参照のこと）。
【０５６３】
検出される蛍光部分としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：フルオレセイン（一般にＦＩＴＣと呼ばれる）、フィコビリタンパク質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ｋｒｏｎｉｃｋ，Ｍ．Ｎ．Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．９２：１−１３（１９８６）））、蛍光半導体ナノ結晶（例えば、超高感度非同位体検出のための量子ドット（ＱＤｏｔ）バイオコンジュゲート（Ｃｈａｎ  ＷＣ、Ｎｉｅ  Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１６−８（１９９８）））、及びクマリン誘導体（例えば、７−ヒドロキシクマリン由来のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｙｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ）などの化合物。
【０５６４】
蛍光はまた、Ｔｅａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＦＰ）などの蛍光タンパク質から、ＤＮＡに結合したＤＡＰＩなどの細胞成分の化学染色から、細胞性産物を認識する抗体に共有結合によりコンジュゲート化された蛍光部分から、細胞性受容体のリガンドに共有結合によりコンジュゲート化された蛍光部分から、及び細胞性酵素の基質に共有結合によりコンジュゲート化された蛍光部分から、報告され得る。
【０５６５】
膜不透過レポーター（例えば抗体）で染色された細胞は、遺伝子、エピソーム又は目的のタンパク質などの成分を回収するための引き続く処理のためにソーティングされ得る。増幅についてインタクトな、表面発現成分について染色された細胞又は細胞膜透過レポーターで染色された細胞もまた、ソーティングされ得る。
【０５６６】
２．アフィニティ分離
微粒子の使用に基づくアフィニティ分離は、特定の化合物又は目的の配列への親和性に基づいた、表面ディスプレイされたタンパク質の分離を可能にする。このアプローチは迅速であり、スケールアップが容易に可能であり、生きた細胞を用いて繰り返し使用できる。
【０５６７】
官能基で修飾されたか又は種々の抗体若しくはリガンド（例えば、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチン）でコーティングされた微粒子表面へ、化合物又はペプチドをカップリングする、常磁性ポリスチレン微粒子が市販されている（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ、ＩＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
【０５６８】
１態様において、微粒子の常磁性の特性により磁石を使用した溶液からの分離が可能な常磁性ビーズが、使用され得る。微粒子は、磁石から外されると容易に再縣濁でき、それにより、付着したプローブを見出す、細胞の選択的分離を可能にする。
【０５６９】
１実施形態において、ペプチドは、チューブ中で、ポリウレタン層でコーティングされた常磁性ポリスチレン微粒子にカップリングされ得る。微粒子表面上のヒドロキシル基は、ｐ−トルエンスルホニルクロライドとの反応によって活性化される（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｋ及びＭｏｓｂａｃｈ  Ｋ．「ｐ−Ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ａｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｏｆ  ａｇａｒｏｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０：１１２：３９７−４０２）。得られたスルホニルエステルはその後、ペプチドのアミノ基又はスルフヒドリル基と、共有結合により反応できる。ペプチドは、活性化された微粒子の表面上に迅速に吸収され、その後、さらなるインキュベーションにより、共有アミン結合が形成される。微粒子（２０９微粒子／ミリリットル）は、微粒子１ミリリットル（ｍｌ）を含むチューブを磁石上に配置し、微粒子をチューブの磁石側に移動させ、上清を除去し、１００ミリモル濃度（ｍＭ）のホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌ中に微粒子を再縣濁することによって、２回洗浄される。洗浄後、微粒子は、１００ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に１０９微粒子／ｍｌの濃度で再縣濁される。１１ナノモルのペプチドを微粒子に添加し、微粒子／ペプチド混合物を１分間ボルテックスして混合する。少なくとも４８時間、ゆっくりした傾斜回転で室温で、微粒子をペプチドとインキュベートする。微粒子上へのペプチドの最適な方向付けを保証するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、インキュベーションが１０分間進行した後に、０．１％（重量／体積）の最終濃度になるように、微粒子／ペプチド混合物に添加する。インキュベーション後、微粒子／ペプチド混合物を含むチューブを、微粒子がチューブの磁石側に移動するまで、磁石上に配置する。上清を除去し、微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のリン酸緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）１ｍｌで、４回洗浄する。最後に、微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中に再縣濁する。
【０５７０】
或いは、表面カルボン酸を含む常磁性ポリスチレン微粒子は、カルボジイミドで活性化され得、その後ペプチドにカップリングされ、ペプチドの一級アミノ基と微粒子表面上のカルボン酸基との間の安定なアミド結合を生じる（Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｎ及びＩｋａｄｅ  Ｙ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｍｉｄｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｅｄｉａ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９５、６（１）、１２３−１３０；Ｇｉｌｌｅｓ  ＭＡ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＡＱ及びＢｏｒｄｅｒｓ  ＣＬ  Ｊｒ、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０  Ｆｅｂ  １；１８４（２）：２４４−２４８；Ｓｅｈｇａｌ  Ｄ及びＶｉｊａｙ  ＩＫ、ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｉｄａｔｉｏｎ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４  Ａｐｒ；２１８（１）：８７−９１；Ｓｚａｊａｎｉ  Ｂら、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１  Ａｕｇ；３０（２）：２２５−２３１）。微粒子（２９微粒子／ミリリットル）を、２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｐＨ５）１ｍｌで１０分間、室温でゆっくりした傾斜回転で２回洗浄する。洗浄した微粒子を、２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｐＨ５）７００マイクロリットル（μＬ）中に再縣濁し、その後、２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｐＨ５）中に再縣濁したペプチド２１ナノモルを、微粒子溶液に添加する。微粒子／ペプチド混合物をボルテックスによって混合し、室温で３０分間ゆっくりした傾斜回転でインキュベートする。この最初のインキュベーション後、２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｐＨ５）中に１００ミリグラム（ｍｇ）／ｍＬで再縣濁した氷冷１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３００μＬを、ペプチド／微粒子混合物に添加し、４℃で一晩ゆっくりした傾斜回転でインキュベートする。ペプチドがカップリングした微粒子を、１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＢＳＡで、室温で１５分間、ゆっくりした傾斜回転で４回洗浄する。洗浄後、ペプチドがカップリングした微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中１９微粒子の濃度で再縣濁する。
【０５７１】
別の選択肢は、その表面がストレプトアビジンの単層と共有結合した常磁性ポリスチレン微粒子に、ビオチン化ペプチドをカップリングすることである。簡潔に述べると、１ｍｌのストレプトアビジン微粒子を、微量遠心分離チューブに移し、チューブを磁石上に配置し、チューブの磁石側に微粒子を集めることによって４回洗浄する。次いで、溶液を除去し、微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中に穏やかに再縣濁する。最後の洗浄後、微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中に再縣濁し、３３ピコモルのビオチン化ペプチドを、微粒子溶液に添加する。微粒子／ペプチド溶液を、ゆっくりした傾斜回転で、室温で３０分間インキュベートする。カップリング後、未結合のビオチン化ペプチドを、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）で４回洗浄することによって、微粒子から除去する。最後の洗浄後、微粒子／ペプチド混合物を、１９微粒子／ｍｌの最終ビーズ濃度になるよう再縣濁する（Ａｒｇａｒａｎａ  ＣＥ、Ｋｕｎｔｚ  ＩＤ、Ｂｉｒｋｅｎ  Ｓ、Ａｘｅｌ  Ｒ、Ｃａｎｔｏｒ  ＣＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｇｅｎｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８６；１４（４）：１８７１−８２；Ｐａｈｌｅｒ  Ａ、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＷＡ、Ｇａｗｉｎｏｗｉｃｚ  Ｋｏｌｋｓ  ＭＡ、Ａｒａｇａｎａ  ＣＥ、Ｃａｎｔｏｒ  ＣＲ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｅ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８７：２６２（２９）：１３９３３−７）。
【０５７２】
本発明において使用するための特定のペプチド配列の同定、選択及び使用は、共有に係る優先出願第６０／９９５，９７０号（代理人書類番号３３５４７−７０８．１０１）（２００７年９月２８日出願）に開示されている。
【０５７３】
ＸＩ．医薬製剤
本発明の方法によって同定された目的のタンパク質（例えば抗体）を含む医薬製剤は、所望の純度を有するタンパク質を、任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、保存のために製剤化され得る。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、これには以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン）；モノサッカリド、ジサッカリド及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロール、マンニトール、トレハロース又はソルビトール）；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０５７４】
本明細書中に記載する製剤はまた、治療される特定の適応症にとって必要な場合、１より多い活性化合物を含み得る。このような分子は、意図した目的に有効な量で併用されて適切に存在する。
【０５７５】
１実施形態において、医薬製剤は、本明細書中に記載する方法によって同定された抗体を含み得る。特定の実施形態において、医薬製剤は、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルであり得る（例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）中に開示されている。
【０５７６】
なお他の実施形態において、徐放性製剤が製剤化できる。徐放性製剤の適切な例としては、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物品（例えば、フィルム又はマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸リュープロリドからなる注射可能なミクロスフェア））、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸）が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間よりも長きにわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化されたタンパク質が長期にわたって体内に残留する場合、それらは、３７℃で湿気に曝された結果として変性又は凝集して、生物学的活性の喪失及び免疫原性における可能な変化を生じ得る。合理的なストラテジーが、関与した機構に依存した安定化のために工夫され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介した分子内Ｓ−Ｓ結合形成にあると判明した場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成を開発することによって、達成され得る。
【０５７７】
ＸＩＩ．非治療的使用
本発明の方法によって同定された目的のタンパク質（例えば、抗体）は、非治療剤（例えば、アフィニティ精製剤）として使用できる。このような実施形態において、目的のタンパク質は、当該分野で周知の方法を使用して、固相（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂又は濾紙）上に固定化される。固定化されたタンパク質を、精製すべき目的の標的（又はそのフラグメント）を含むサンプルと接触させ、その後、支持体を、固定化された抗体に結合した標的タンパク質以外のサンプル中の実質的に全ての物質を除去するであろう適切な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を、標的タンパク質を放出するであろう別の適切な溶媒（例えば、グリシン緩衝液（ｐＨ５．０））で洗浄する。
【０５７８】
本発明の方法によって同定されたタンパク質は、標的タンパク質に関する診断アッセイ（例えば、特定の細胞、組織又は血清におけるその発現の検出）においても有用であり得る。このような診断方法は、癌診断において有用であり得る。
【０５７９】
診断適用のために、タンパク質は典型的に、検出可能な部分で標識されるであろう。特定の実施形態において、検出可能な部分は、以下のカテゴリーから選択できる：（ａ）放射性同位体（例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ）。抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ１及び２、Ｃｏｌｉｇｅｎら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、出版（１９９１）に記載された技術を使用して放射性同位体で標識でき、放射活性は、シンチレーションカウントを使用して測定できる；（ｂ）蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリン並びにＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ）が利用可能である；（ｃ）酵素−基質標識。
【０５８０】
種々の酵素基質標識が当該分野で公知であり、米国特許第４，２７５，１４９号は、これらのいくつかの総説を提供している。酵素は一般に、種々の技術を使用して測定できる、発色基質の化学的変更を触媒する。例えば、酵素は、分光測定で測定できる、基質における色の変化を触媒できる。或いは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変更できる。蛍光の変化を定量するための技術は上記している。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、次いで、（例えばケミルミノメータを使用して）測定できる光を発光できるか、又は蛍光アクセプターにエネルギーを与える。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ））、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲート化するための技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ及びＨ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７３：１４７  １６６（１９８１）に記載されている。
【０５８１】
特定の実施形態において、酵素−基質組み合わせとしては、例えば以下を挙げることができる：（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と、基質としての水素ペルオキシダーゼ（ここで、水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ））を酸化する）；（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、発色基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェート；及び（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ。
【０５８２】
多数の他の酵素−基質組み合わせが当業者に利用可能である。これらの一般的総説については、米国特許第４，２７５，１４９号及び同第４，３１８，９８０号を参照のこと。
【０５８３】
本発明の方法によって同定されたタンパク質は、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイ）で使用され得る。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．１４７  １５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９８７）。
【０５８４】
抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイのためにも使用できる。一般に、抗体は、腫瘍の場所がイムノシンチグラフィを使用して特定できるように、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓ）で標識される。
【０５８５】
ＸＩＩＩ．治療的使用
治療適用のために、本発明の方法によって同定されたタンパク質（抗体が含まれるがこれに限定されない）は、哺乳動物（好ましくはヒト）に、医薬的に許容される剤形（例えば、上で議論したもの）（所定の期間にわたってボーラスとして又は持続注入によりヒトに静脈内投与できるもの、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、経口、局所又は吸入経路で投与できるものが含まれる）で、投与できる。本発明の方法によって同定されたタンパク質（抗体が含まれるがこれに限定されない）は、局所的並びに全身的治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内又は病巣周囲経路によっても、適切に投与できる。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の治療において、特に有用であると予測される。
【０５８６】
疾患の予防又は治療のために、治療タンパク質の適切な投薬量は、上記したような治療すべき疾患のタイプ、疾患の重篤度及び過程、そのタンパク質の投与が予防目的であるのか若しくは治療目的であるのか、以前の治療、患者の臨床歴及びそのタンパク質への応答、並びに担当医の裁量に依存するであろう。抗体は、一時に、又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。
【０５８７】
ＸＩＶ．データベース
本発明は、特定のタンパク質の配列及び同定された変異（結合ドメインの配列、又は活性部位、並びにそれらの結合特徴、活性、安定性特徴及び３次元分子構造が含まれるが、これらに限定されない）を含む、コンピュータ可読データベースを生成する方法を含む。具体的には、本発明は、目的のタンパク質又はその関連のタンパク質若しくはその部分から生成した変異のデータベースに基づいた、目的のタンパク質の設計及び最適化を助けるための、このようなデータベースの使用を含む。
【０５８８】
他の実施形態において、本発明のデータベースは、スクリーニングによって特異的標的に結合することが同定されたタンパク質（単数又は複数）の変異、又はこのようなタンパク質の他の表示（例えば、図的表示又は名称など）を含み得る。
【０５８９】
「データベース」とは、読み出し可能なデータの収集を意味する。本発明は、本明細書中に記載するような、タンパク質（単数又は複数）のアミノ酸及び核酸構造（例えば、その配列、構造、及び活性又は結合活性）に関する情報が組み込まれたか又はそのような情報を含む、機械可読媒体を包含する。このような情報は、サブユニット、ドメイン及び／又はそれらの部分（例えば、リガンド結合（結合）若しくはリガンド未結合（未結合）のいずれかの、活性部位、補助結合部位、及び／又は結合ポケットを含む部分）に関するものであり得る。
【０５９０】
或いは、情報は、タンパク質中に見出される特定の構造を示す識別子の情報であり得る。本明細書中で使用する場合、「機械可読媒体」とは、コンピュータ又はスキャナにより読み取られ直接アクセスされ得る、任意の媒体をいう。このような媒体は、多くの形態をとり得、これには、不揮発性媒体、揮発性媒体及び伝送媒体が挙げられるが、これらに限定されない。不揮発性媒体（即ち、電源の非存在下で情報を保持できる媒体）には、ＲＯＭが含まれる。揮発性媒体（即ち、電源の非存在下で情報を保持できない媒体）には、メインメモリが含まれる。
【０５９１】
伝送媒体としては、同軸ケーブル、銅線及び光ファイバー（バスを含むワイヤが含まれる）が挙げられる。伝送媒体は、搬送波（即ち、情報信号を伝達するために、周波数、振幅又は位相などにおいて調節され得る、電磁波）の形態をとることもできる。さらに、伝送媒体は、音波又は光波（例えば、電波及び赤外線通信の間に発生するもの）の形態をとり得る。
【０５９２】
このような媒体には以下も挙げられるがこれらに限定されない：磁気記憶媒体（例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク記憶媒体及び磁気テープ）；光学記憶媒体（例えば、光ディスク又はＣＤ−ＲＯＭ）；電気記憶媒体（例えば、ＲＡＭ又はＲＯＭ）、ＰＲＯＭ（即ち、プログラム可能なリードオンリメモリ（ＲＯＭ））、ＥＰＲＯＭ（即ち、消去可能ＰＲＯＭ）（ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭを含む）、任意の他のメモリチップ又はカートリッジ、搬送波、又はプロセッサが情報を読み出せる任意の他の媒体、及びこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体）。このような媒体にはさらに、スキャン装置によって読み取られ得、コンピュータ若しくは本明細書中に記載する任意のソフトウェアプログラム（例えば、光学式文字認識（ＯＣＲ）ソフトウェア）によって容易にアクセスされるフォーマットに変換され得る、アミノ酸又はポリヌクレオチドの配列の表示が記録された、紙が含まれる。このような媒体には、穴のパターンを有する物理的媒体（例えば、パンチカード及び紙テープなど）も含まれる。
【０５９３】
具体的には、目的のタンパク質の設計及び最適化を助けるための、データベースから伝送媒体を介した第三者サイトへのデータの伝送が、本発明に含まれる。
【０５９４】
種々のデータ記憶構造が、本発明のアミノ酸配列若しくはポリヌクレオチド配列又はそれらの部分及び／或いは活性データが記録された、コンピュータ可読媒体を作成するために利用可能である。データ記憶構造の選択は、記憶された情報にアクセスするために選択される手段に基づき得る。本明細書中に記載するアミノ酸配列若しくはポリヌクレオチド配列又はそれらの部分の全てのフォーマットの表示が、本発明によって企図される。本発明の配列が記憶されたコンピュータ可読媒体を提供することによって、改善されたタンパク質を生成するための、モデリングプログラム及び設計プログラムにおいて使用するためのアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列におけるＳＨＭ介在性の変化並びに関連情報に、日常的にアクセスできる。
【０５９５】
コンピュータは、本発明のタンパク質若しくはペプチド構造の配列又はその部分（例えば、リガンド結合形態若しくはリガンド未結合形態のいずれかの、活性部位、補助結合部位及び／又は結合ポケットを含む部分）を表示するために使用され得る。用語「コンピュータ」には以下が挙げられるがこれらに限定されない：データを保存でき、１以上のアプリケーション（即ちプログラム）を独立して実行できる、メインフレームコンピュータ、パーソナルコンピュータ、携帯用ラップトップコンピュータ、及び携帯情報端末（「ＰＤＡ」）。コンピュータとしては、例えば、本発明の機械可読記憶媒体、機械可読記憶媒体中にコード化された機械可読データを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリ、機械可読情報を処理するための、ワーキングメモリ及び機械可読記憶媒体に作動可能に連結された中央演算処理装置、及び構造座標又は三次元表示を表示するための、中央演算処理装置に作動可能に連結されたディスプレイ、を挙げることができる。
【０５９６】
本発明のコンピュータとしては、例えば以下も挙げることができる：中央演算処理装置、例えばランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は「コアメモリ」であり得るワーキングメモリ、大容量記憶装置（例えば、１以上のディスクドライブ又はＣＤ−ＲＯＭドライブ）、１以上のブラウン管（「ＣＲＴ」）ディスプレイターミナル又は１以上のＬＣＤディスプレイ、１以上のキーボード、１以上の入力線、及び１以上の出力線（これらは全て、従来の双方向システムバスによって相互接続される）。本発明の機械可読データは、電話回線又は専用データ回線（そのいずれも、例えばワイヤレスモードの連絡を含み得る）によって接続されたモデム（単数又は複数）を介して、入力及び／又は出力できる。入力ハードウェアもまた（又はその代わりに）、ＣＤ−ＲＯＭドライブ又はディスクドライブを含み得る。入力デバイスの他の例は、キーボード、マウス、トラックボール、フィンガーパッド又はカーソル指示キーである。出力ハードウェアもまた、従来のデバイスにより実装され得る。例えば、出力ハードウェアとして、ＣＲＴ、又は任意の他のディスプレイターミナル、プリンター、又はディスクドライブを挙げることができる。ＣＰＵは、種々の入力デバイス及び出力デバイスの使用を調整し、大容量記憶装置からのデータアクセス並びにワーキングメモリへの及びワーキングメモリからのアクセスを調整し、データ処理工程の順序を決定する。コンピュータは、本発明のデータを処理するために、種々のソフトウェアプログラムを使用できる。多数のこれらのタイプのソフトウェアの例は、本出願を通じて議論されている。
【実施例】
【０５９７】
本発明の多数の実施形態を本明細書中に示し記載してきたが、このような実施形態は、例としてのみ提供されている。本明細書中に記載した本発明の実施形態に対する種々の代替法を、本発明を実施する際に利用してもよいことを、理解すべきである。添付の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲及びそれらの等価物の範囲内の方法及び構造が特許請求の範囲によりカバーされることを意図する。
【０５９８】
実施例１
ブラストサイジンをコードする合成ポリヌクレオチドの生成
ベクターのエレメント（例えば、選択マーカー、ＳＨＭに関与する酵素又はレポーター遺伝子）における体細胞超変異の可能性を減少させることによって、ＳＨＭを行使及び追跡するためのベクター及び系がより安定になり、それにより、体細胞超変異を、目的のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのライブラリーに対して、より効率的に標的化することが可能となる。
【０５９９】
Ａ．ポリヌクレオチド設計
一般的に、配列を本明細書中に記載の教示を用い、そして「体細胞超変異システム(Systems for Somatic Hypermutation)」と題した米国特許出願番号第６０／９０２，４１４号のセクションＩＩＩ及びセクションＩＶ中に詳述した通りＳＨＭ用に工夫する。以下の実施例において、配列の最適化はコンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用い、本明細書中表６）中に列挙したホットスポット及びコールドスポットの記述に基づく。
【０６００】
このプログラムを用い、配列内のどの位置も「＋」、「−」、又は「．」のいずれかの記号で注記し、その特定位置でＳＨＭ感受性においてよりホット、よりコールド、又はニュートラルな変化が所望かどうか指定する。ここで「＋」はホットスポット、「−」はコールドスポット、及び「．」はニュートラルポジションを指定する。例えば、ブラストサイジン遺伝子のどの位置でもＳＨＭ耐性型を同定するためには以下のブラストサイジンの入力配列が用いられる。
【０６０１】
【化１】
0005675109.tif 000054
【０６０２】
それに比べて、当該遺伝子のどの位置でもＳＨＭにより感受性の、ブラストサイジン遺伝子のよりホットな型を同定するためには以下の入力ファイルが用いられる。
【０６０３】
【化２】
0005675109.tif 000055
【０６０４】
以前に記載された通り、この過程の間に、野生型タンパク質のアミノ酸配列に一致する９塩基に渡る領域の全てのヌクレオチド配列を列挙し、ホットスポット、コールドスポット、ＣｐＧモチーフ、コドン使用頻度、及び同一ヌクレオチドのストレッチの数について記録する。次いで、当該プログラムによりいずれかの無作為配列を、同一の３アミノ酸をコードするよりホット、よりコールド、又はニュートラルなポリヌクレオチドタイルと置換できるかどうか決定する。
【０６０５】
図７に示す通り、このアプローチは、イヌＡＩＤに迅速に適用した場合に、当該ヌクレオチド配列の１５〜２０％の置換により元の配列と相違するコールドに最適化した新たなイヌＡＩＤ配列の同定に（数百のタイル置換内で）収束する。変化の大半が、反復サイクルの初期に起こり、通常、反復約５００回の後に完了する。予想されるとおり、より大きな遺伝子では完全最適化配列に到達するためにより多くの反復回数が必要となる。通常、大半の遺伝子については、反復２０００〜３０００回の使用で十二分である。
【０６０６】
多くの未改変遺伝子の無作為解析により、たいていの哺乳動物遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり平均約９〜１５コールドスポットを創出し、メジアン密度が約１３．８コールドスポット／１００ヌクレオチドを有し、１００ヌクレオチド当たり約７〜１３ホットスポットのホットスポット密度（メジアン密度が１００ヌクレオチド当たり約８．３ホットスポット）を有するコドンを使用することが示されている。
【０６０７】
未改変ブラストサイジン遺伝子についての初期の出発配列、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの頻度を図８に示す。
【０６０８】
１．コールドブラストサイジン
このアプローチを用いて作製したＳＨＭ耐性（コールド）型のブラストサイジンについての最適化配列を、結果生じるホットスポット及びコールドスポット頻度における変化と共に図９中に示す。ブラストサイジン配列をより体細胞超変異に耐性にするための当該配列の最適化により約１８８％のコールドスポット数増加（７３増加）、及び約５７％のホットスポット数減少（１５減少）がもたらされた。全体のコールドスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約２８コールドスポットの平均密度へと増加し、全体のホットスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約９ホットスポットから、ＳＨＭ耐性型中の１００ヌクレオチド当たり約５ホットスポットへと減少した。
【０６０９】
２．ホット  ブラストサイジン
このアプローチを用いて作製したＳＨＭ感受性型のブラストサイジンについての最適化配列を、結果生じるホットスポット及びコールドスポット頻度における変化と共に図１０に示す。ブラストサイジン配列をより体細胞超変異に感受性にするための当該配列の最適化により約１９７％のホットスポット数増加（３４増加）、及び約５６％のコールドスポット数減少（２６減少）がもたらされた。全体のホットスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約９ホットスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１７ホットスポットの平均密度へと増加し、全体のコールドスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットから、ＳＨＭ感受性型中の１００ヌクレオチド当たり約９コールドスポットへと減少した。
【０６１０】
Ｂ．クローニング及び解析
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が合成ポリヌクレオチド配列に確実に無いことを最終的に点検した後、完全なポリヌクレオチド配列を合成し(DNA2.0,MenloPark,CA)、ＤＮＡ２．０のクローニングベクターのうちの１つにクローニングし（以下表１０参照）、正しく合成されていることを確認するため配列決定する。
【０６１１】
【表１０】
0005675109.tif 000056
【０６１２】
例えばＥボックスモチーフ又はＩｇエンハンサーエレメントといった他のエレメントは、「体細胞超変異系」と題し、２００７年２月２０日に出願され、その全体がここに明確に組み込まれる米国特許出願番号第６０／９０２，４１４号に記載されるように、オリゴ合成又はＰＣＲ増幅のいずれかにより作り出される。
【０６１３】
新たな合成インサートの機能性を試験するため、上記表１０に列挙した制限酵素を用いてＤＮＡ２．０ソースベクターからコーディング領域を切り出し、標準的な組み換え分子生物学的技法を用いて発現ベクター（表１０）に挿入する。ＡＢシリーズベクターへの選択マーカー（即ち、コールドブラストサイジン、コールドハイグロマイシン、及びネイティブピューロマイシン）の挿入によりそれらをＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列（ＡＢ１５０、ＡＢ１０２、ＡＢ１７９；図１７Ａ参照）の下流又はｐＳＶプロモーター（ＡＢ１６１、ＡＢ１５３、ＡＢ１６３；図１７Ｂ参照）の下流に配置する。
【０６１４】
最適化された合成遺伝子の機能活性を試験するために、Ｈｅｋ２９３細胞を６ウェルマイクロタイターディッシュ中、４ｘ１０５／ウェルで播種する。２４時間後、Roche Applied Sciences(Indianapolis,IN)のＦｕｇｅｎｅ６試薬を用い、試薬とＤＮＡの比率をウェル当たり３μＬ：１μｇＤＮＡとしてトランスフェクションを行う。この比率は複数のプラスミドを用いたトランスフェクションについても維持される。トランスフェクションは製造元のプロトコールに従って行う。
【０６１５】
体細胞超変異に対する各コンストラクトの相対的安定性／感受性を測定するために、トランスフェクトされた各細胞集団の安定な細胞系を作製し、それらがＳＨＭ介在性の変異を蓄積する相対速度を測定するために試験した。これらの変異の大半は機能の損失をもたらすので、相対的変異誘発負荷はＦＡＣＳを介して蛍光欠失として簡便に測定できる（以下及び実施例２を参照）。
【０６１６】
ＦＡＣＳ解析。ＦＡＣＳ解析前に、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。１試料当たり最大百万個の細胞を取得する。ＤＡＰＩ蛍光を４６０／５０バンドパスフィルターを通して測定する。ＧＦＰ蛍光を５２８／３８バンドパスフィルターを通して測定する。細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出できず、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして、パーセントＧＦＰ発現を報告する。
【０６１７】
イヌＡＩＤ遺伝子の機能を試験するための復帰アッセイ。ＧＦＰ＊（部位特異的変異誘発により８２位に導入した終止コドン［Ｙ８２ｓｔｏｐ］を伴うＧＦＰ）をＡＢ１７４（コールド  イヌＡＩＤ）と共トランスフェクションし、トランスフェクションから３日後に細胞をフローサイトメトリーで解析し、抗生物質による選択下に置き、１３〜１５日間、隔日で更にフローサイトメトリーで解析する。
【０６１８】
抗生物質による選択。Ｈｅｋ２９３細胞の選択に用いられる抗生物質の濃度は殺菌曲線を実行する（即ち、トランスフェクションしていない−従って抗生物質感受性の−細胞を全て殺す最少抗生物質濃度の測定）ことによって経験的に決定する。トランスフェクションから３日後、細胞を４ｘ１０５／ウェルで播種し、以下の濃度：１．５μｇ／ｍｌピューロマイシン(Clontech,Mountain View,CA)；１６μｇ／ｍＬブラストサイジン(Invitrogen,Carlsbad,CA)；及び３６０μｇ／ｍＬハイグロマイシン(Invitrogen,Carlsbad,CA)、で選択する。
【０６１９】
機能性を測定するために耐性マーカー遺伝子を、１６μｇ／ｍＬブラストサイジン(Invitrogen,Carlsbad,CA)；及び３６０μｇ／ｍＬハイグロマイシン(Invitrogen,Carlsbad,CA)存在下で２週間の薬剤耐性細胞増殖を促進するその能力に基づき、適切な発現プラスミド（即ち、ブラストサイジンについてはＡＢ１０２、ハイグロマイシンについてはＡＢ１７９）でＨｅｋ２９３細胞をトランスフェクトすることにより試験する。
【０６２０】
コールド  ブラストサイジンを含有するＡＢ１０２でトランスフェクトすることにより、野生型遺伝子に匹敵する割合で、トランスフェクトされたｈｅｋ２９３細胞の薬剤耐性コロニーが結果的に作り出された。
【０６２１】
実施例２
ＳＨＭに関与する酵素をコードする合成ポリヌクレオチドの作製
シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）
哺乳動物種（ラット、チンパンジー、マウス、ヒト、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、カエル、ゼブラフィッシュ、フグ及びテトラオドン（パッファーフィッシュ））間のシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の配列変異を解析しヒトと比較すると、ヒト及びカエルほど遠縁の生物が驚くほど高い（７０％）配列同一性及び＞８０％の配列類似性を示すことが証明される。更に、体細胞超変異（ＳＨＭ）において他の生物由来のＡＩＤがヒトＡＩＤと置換でき、全ての哺乳動物種のＡＩＤが機能的に均等であることが示されている。
【０６２２】
図１１に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＨＭ用の考えられる開始コンストラクトを同定するためヒトＡＩＤと地球上の他のＡＩＤとの比較を示す。当該図にはヒト（Ｈ＿ｓａｐ／１−１９８）、マウス（Ｍ＿ｍｕｓｃ／１−１９８）、イヌ（Ｃ＿ｆａｍ／１−１９８）、ラット（Ｒ＿ｎｏｒｖ／１−１９９）、及びチンパンジー（Ｐ＿ｔｒｏｇ／１−１９９）由来ＡＩＤの配列アラインメントを提供する。図１５ではヒト、イヌ及びマウスＡＩＤタンパク質間の配列同一性を図解する。
【０６２３】
図１１によって示されるように、イヌＡＩＤは全体でヒト及びマウスＡＩＤと９４％のアミノ酸同一性を有し、従ってコドン最適化用の開始点として選択する。コドン使用頻度を最適化するために、イヌのアミノ酸配列を逆翻訳し、次いで反復して最適化する。
【０６２４】
ＡＩＤはＣ末端の１０アミノ酸内に含有される核外搬出シグナルを含有することが知られている(McBride et al.,Somatic hypermutation is limited by CRM1-dependent nuclear export of activation-induced deaminase,J Exp Med.2004 May 3;199(9):1235-44;Ito et al.,Activation-induced cytidine deaminase shuttles between nucleus and cytoplasm like apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide 1,PNAS 2004 Feb 17;101(7):1975-80)。下記の実験の目的でイヌＡＩＤは１９８位でロイシンからアラニンへの変異を含有し、一方ヒトＡＩＤコンストラクトは無変異でインタクトな核外搬出移行シグナルを保持する。
【０６２５】
Ａ．ポリヌクレオチド設計
実施例１中に記載の通り、表６に列挙したホットスポット及びコールドスポットの記載に基づき、コンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用いてＳＨＭ配列の最適化を完了し、生じるイヌＡＩＤのホット及びコールド型を、それぞれ図１３及び１４に示す。イヌＡＩＤについての出発配列を図１２に、ホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析と共に示す。
【０６２６】
１．ホットＡＩＤ
ＡＩＤ配列をより体細胞超変異に感受性にするための当該配列の最適化により約２００％のホットスポット数増加（４３増加）、及び約３０％のコールドスポット数減少（２３減少）がもたらされた。全体のホットスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約７ホットスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１４ホットスポットの平均密度へと増加し、全体のコールドスポット頻度はネイティブ遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約１３コールドスポットから、ＳＨＭ感受性型中の１００ヌクレオチド当たり約９コールドスポットへと減少した（図１３を参照）。
【０６２７】
２．コールドＡＩＤ
ＡＩＤ配列をより体細胞超変異に耐性にするための当該配列の最適化により約１８６％のコールドスポット数増加（６８増加）、及び約３５％のホットスポット数減少（１４減少）がもたらされた。全体のコールドスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約１３コールドスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約２５コールドスポットの平均密度へと増加し、全体のホットスポット頻度はネイティブ遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約７ホットドスポットから、ＳＨＭ耐性型中の１００ヌクレオチド当たり約５ホットスポットへと減少した（図１４を参照）。
【０６２８】
Ｂ．クローニング及び解析
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が確実に無いことを最終的に点検した後、完全なポリヌクレオチド配列を合成し(DNA2.0,Menlo Park,CA)、ＤＮＡ２．０のクローニングベクターのうちの１つにクローニングし（実施例１中表１０を参照）、正しく合成されていることを確認するため配列決定し、活性について下記及び実施例１の通り試験した。
【０６２９】
イヌＡＩＤ活性を測定するため、コールド型又は野生型のＡＩＤを、標的ベクター配列内のＩｇエンハンサーエレメント存在下又は非存在下のいずれかで、そのコーディング領域内に（実施例１中に記載の通り）終止コドンを含有するＧＦＰ＊コンストラクトを発現させる発現ベクターと共に共トランスフェクトする。ＡＩＤによる当該終止コドンの変異で、ＡＩＤ活性の直接的な指標である機能的蛍光タンパク質が作り出される。
【０６３０】
本実験においては、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁した。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析した。１試料当たり最大百万個の細胞を取得し、リバータントは細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出でき、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして測定される。
【０６３１】
図１６Ａにこの種のアッセイにおけるＡＩＤ活性の、タンパク質機能への予想される効果を示す。注目すべきは、変異誘発により初めに機能を回復又は改善し後に機能を低減又は無くす変異が生み出され得るという観察結果である。これら２つの比率のバランスにより、これらのタンパク質において、機能を回復する初期の稀少な変異事象、それに続く機能を破壊する第二及び第三の変異事象が生じる。集団中の機能獲得型事象の観察結果におけるこれら競合する割合の正味の効果は、図１６Ａに見ることができる。サイレンス型ＧＦＰに必要な不活性型変異の数に関して３つの異なる仮説を考えると、ＡＩＤの酵素活性の率に依存した、時間の関数としての、非常に異なる復帰事象のプロファイルが３通り観察されると予想される。
【０６３２】
従って、初期復帰率はＡＩＤ活性の正確な評価を提供できるが、活性の長期的研究では蛍光の復帰よりもむしろ活性の消失率の解析が必要である。
【０６３３】
この可能性を試験するために、蛍光タンパク質を安定して発現する細胞系を、コールド  イヌＡＩＤを含有する２通りの濃度の発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を培養中に安定的に維持し、表示した時間後全体の蛍光について試料をアッセイする。
【０６３４】
ＦＡＣＳ解析前に、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。ＤＡＰＩ蛍光を４６０／５０バンドパスフィルターを通して測定する。ＧＦＰ蛍光を５２８／３８バンドパスフィルターを通して測定する。細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出できず、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして、パーセントＧＦＰ発現を報告する。
【０６３５】
図１６Ｂに示す結果により、定常的且つ持続的に進行する、（ＧＦＰの消光増加として示される）ＧＦＰ発現の濃度依存的な減少が、コールドＡＩＤ量を増加させて共発現させる時間と共に示される。当該データは、コールドＡＩＤが標的遺伝子に複数の変異を導入でき、「コールド型」で数日間発現させたとき機能的であり安定でもあるという仮説と整合する。
【０６３６】
コールド  イヌＡＩＤの、変異誘発を発揮する能力を直接比較するために、コールド  イヌＡＩＤと野生型ヒトＡＩＤとを比較する初期復帰アッセイを用意する。Ｈｅｋ２９３細胞を、上記の通りのＧＦＰ＊又はＣＭＶプロモーターの５’側に挿入されたカッパＥ３及びイントロン性エンハンサーを伴うＧＦＰ＊のいずれかを含有する（上記実施例１中の通りの）発現ベクターで、ヒト又はコールド  イヌＡＩＤのいずれかと共にトランスフェクトする。トランスフェクションから３日後に安定的な発現についての選択を開始した。ＦＡＣＳ解析前に、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。１試料当たり最大百万個の細胞を取得する。ＤＡＰＩ蛍光を４６０／５０バンドパスフィルターを通して測定した。ＧＦＰ蛍光を５２８／３８バンドパスフィルターを通して測定する。細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出できず、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして、パーセントＧＦＰ発現を報告する。
【０６３７】
当該結果（図１６Ｃ）により、イヌＡＩＤがヒトＡＩＤと比較して有意に亢進された復帰活性を示したことが示される。この実験においては、カッパ３’Ｅ及びイントロン性のエンハンサーを発現ベクター中に含めたとき、標的遺伝子に起こる復帰率へのこれらの効果も示される。示される通り、エンハンサーエレメントを含むことにより更に復帰頻度が亢進された。
【０６３８】
実施例３
体細胞超変異用ベクター
ＤＮＡ２．０(Menlo Park,CA)により合成された各サブフラグメントからベクターを構築する。ベクターは複数のオープンリーディングフレームを同時に発現でき、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）含有ベクターの複製についてもとから許容状態にあるか、又は許容状態となるようにされた（即ち、ヒトＥＢＰ２の共発現を介して(Habel et al.,2004;Kapoor et al.,2001)哺乳動物細胞において安定なエピソーム複製ができる。
【０６３９】
ベクターの至る所で、別個の(discreet)断片間で１以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（制限部位）の戦略的配置を通してプラスミドを、高度にモジュールにする。
【０６４０】
Ａ．ベクターフォーマット。
最初のフォーマット（図１７Ａ）において、ベクターには脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有させる。図１７Ａに示す通り、ベクター内に含有させるエレメントは互いに機能可能に連結し、ある場合には以下の機能的エレメント：１）ＣＭＶプロモーター；２）マルチクローニングサイト；３）目的の遺伝子；４）ＩＲＥＳ；５）ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｄ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）又はピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ等の真核生物の選択マーカー；６）ターミネーター配列、（３′非翻訳領域、ＳＶ４０由来の小イントロン及びポリＡシグナル（“ＩＶＳ  ｐＡ”））；７）エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）（任意の遺伝子間スペーサー領域が先行する）；８）原核生物の複製起点ＣｏｌＥ１；９）ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子又はカナマイシン（ｋａｎ）等の原核生物の選択マーカー；１０）（ベータアクチン又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）等のコピー数判定のための遺伝子断片、及びＩｇエンハンサー、を含める（番号はこのセクション中以下に更に見られる、対応の配列情報を指す）。
【０６４１】
第二のフォーマット（図１７Ｂ）においては、発現ベクターにはＩＲＥＳは無いが、代わりに選択マーカー遺伝子を発現させるための独立した遺伝子カセットを含有させる。この発現カセットには上記の通り、１１）ＳＶ４０即時型初期プロモーター（ｐＳＶ）及び真核生物の選択マーカー、並びに上記のようにＩＶＳ  ｐＡを含めることができる。ベクター内に含有させるエレメントは図１７に示す通り互いに機能可能に連結し、以下の機能的エレメント：ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、目的の遺伝子、ＩＶＳ  ｐＡ；エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）、ｐＳＶ、選択マーカー、ＩＶＳ  ｐＡ、原核生物の複製起点ＣｏｌＥ１、ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子又はカナマイシン（ｋａｎ）等の原核生物の選択マーカー、コピー数判定のための遺伝子断片、Ｉｇエンハンサー及びマルチクローニングサイト、を含めた。
【０６４２】
第三のフォーマット（図１８Ａ）においては、ベクターには逆方向に向けられた２つの異なる遺伝子の発現を駆動する二方向性プロモーターを含有させる。１又は２の２又は３シストロン性のメッセージを生成するために、このベクターにはＩＲＥＳ配列も含有させる。ベクター内に含有させるエレメントは図１８に示す通り、以前に記載された機能的エレメントと同じ機能的エレメントを用いて、互いに機能可能に連結させる。
【０６４３】
第四のフォーマット（図１８Ｂ）においては、二方向性プロモーター、２又は３シストロン性のメッセージを発現させる１以上のＩＲＥＳ配列、及びそこから真核生物の選択マーカーが発現する独立したシス−連結型カセットを含有させる。
【０６４４】
ハイブリッドを形成するために、いずれのベクターも互いに置き換わることができる。更に、所望の遺伝子の条件的発現を達成するため、エピソームベクター上に含有させる構成的で強力な真核生物のプロモーターは、誘導性プロモーター（即ち、リバーステトラサイクリントランスアクチベータープロモーターシステム［ｐｒｔＴＡ］）に置換できる。この場合、目的の他の遺伝子の１つが、（図１９に示すように）同一エピソーム上でｃｉｓに発現できるトランス活性化因子タンパク質をコードするか、又はトランスフェクトされた別のエピソームベクター上でｔｒａｎｓに供給されなければならない。
【０６４５】
選択可能な原核生物のマーカー及び複製起点ｃｏｌＥＩについての方向性は、以下のセクション８及びセクション９（配列番号３１３、３１４及び３１５）及び図１７−１９で記載されるが、絶対的ではわけではなく、ベクターの残りの部分に関しては逆転させることができる。同様に、独立した発現カセット（ｐＳＶ−選択マーカー（又は目的の他の遺伝子）−ＩＶＳ  ｐＡ）の方向性も、ベクターの残りの部分に関しては逆転させることができる（即ち、転写がｏｒｉＰから離れる現在の描写ではなく、ｏｒｉＰに向かう転写）。更に、Ｉｇエンハンサー等のエンハンサーエレメントは目的の遺伝子の５’側又は３’側に置いてもよいか、或いは排除してもよい。
【０６４６】
Ｂ．機能的エレメントの代表的な配列
１．真核細胞中で働く強力な転写プロモーター。図１７−１９においては、ＣＭＶプロモーターを用い、該配列は配列番号３０４として提供される（ＴＡＴＡボックス配列を下線で示す）。ＣＭＶプロモーターはＳａｃＩ及びＢｓｒＧＩサイトを除去するため改変される。
AGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATCTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTA(配列番号３０４)。
【０６４７】
２．マルチクローニングサイト（ｍｃｓ）領域と称せられる複数の制限部位をコードする領域：
TTCCCTGCAGGATTGTTTAAACACCAGATCTGCTTGAATCCGCGGATAAGAGGACTAGTATTCGTCTCACTAGGGAGAGCTCCTA(配列番号３０５)。
【０６４８】
３．例えば、目的の遺伝子は、特異的結合メンバー、抗体又はその断片、抗体重鎖又は軽鎖、酵素、受容体、ペプチド性増殖ホルモン又は転写因子であり得る。
【０６４９】
４．図１７−１９における脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の２シストロン性の同時発現（一方はそれ自身に対して５’側から、もう一方はそれ自身に対して３’側から）を可能にする。２つの制限部位（ＢｓｒＧＩ及びＡｓｃＩ）を含有する領域を、ＩＲＥＳに対して５’側に示す（小文字）。ＩＲＥＳの３’端はＮｇｏＭＩＶサイトを含む。
tgtacaatccgcgtgagacgatcggcgcgccCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCGGC(配列番号３０６)。
【０６５０】
５．例えば、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｄ）（配列番号３０８）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）（配列番号３０９）、又はピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（配列番号３１０）等の、哺乳動物の選択マーカー遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）。開始及び終止コドンを下線で示す。各ＯＲＦの３’側にクローニング工程で用いられるＸｂａＩサイト（ＴＣＴＡＧＡ；配列番号３０７）がある。
【０６５１】
ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｄ；コールドスポット最適化）
ATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAGGGCCACTGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACTCTGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCCTCTGACGGGAGAATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGCGCAGAGCTTGTGGTCCTGGGGACTGCTGCTGCTGCTGCAGCCGGAAACCTGACTTGTATCGTCGCCATAGGGAATGAGAACAGAGGCATCTTGAGCCCCTGTGGGAGATGCAGACAAGTCCTCCTGGACCTCCATCCTGGGATCAAAGCCATAGTGAAGGACAGTGATGGACAGCCCACAGCCGTTGGGATCAGGGAGTTGCTGCCATCTGGTTATGTGTGGGAGGGCTAATCTAGA(配列番号３０８)。
【０６５２】
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ；コールドスポット最適化）
ATGAAAAAGCCTGAACTGACTGCCACCTCTGTTGAGAAGTTTTTAATAGAGAAGTTTGACTCTGTGTCAGACCTCATGCAGCTTTCTGAGGGAGAGGAGTCTAGAGCCTTTAGCTTTGATGTGGGGGGGAGAGGCTATGTCCTGAGAGTCAATAGCTGTGCAGATGGTTTCTACAAAGATAGGTATGTCTATAGACATTTTGCATCCGCCGCCCTCCCCATTCCAGAGGTCCTTGACATTGGGGAATTCTCAGAGAGCCTGACCTATTGCATTTCCCGGAGAGCCCAGGGTGTGACTCTTCAAGACCTGCCTGAGACAGAACTCCCTGCAGTGCTCCAGCCCGTCGCCGAGGCCATGGATGCAATCGCCGCCGCAGACCTCAGCCAGACCTCGGGGTTTGGGCCCTTTGGCCCCCAGGGGATAGGCCAATACACTACATGGAGAGATTTCATATGCGCTATTGCTGACCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACAGTCTCAGCCTCTGTCGCACAAGCCCTGGACGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCAGAGGTCAGACATCTCGTCCATGCCGACTTTGGGTCAAACAATGTCCTGACGGACAATGGGAGAATCACTGCTGTCATTGACTGGAGCGAGGCCATGTTTGGGGACTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGACCCTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACCCGTTACTTTGAGAGGAGGCATCCAGAGCTCGCTGGGAGCCCTAGATTGAGGGCCTATATGCTCAGGATAGGGCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTTGATGACGCAGCTTGGGCTCAGGGGAGATGCGACGCCATAGTGAGGAGTGGGGCCGGGACTGTCGGGAGAACTCAGATCGCCAGGAGGTCAGCTGCCGTCTGGACTGACGGCTGTGTAGAAGTCTTAGCCGACTCTGGGAACAGGAGACCCAGCACTCGTCCAGAGGCCAAGGAATGATCTAGA(配列番号３０９)。
【０６５３】
ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｐｕｒ；野生型配列）。
【０６５４】
開始コドンのすぐ５’側にＫｏｚａｋコンセンサス配列を含有する（下線）。終止コドンも下線で示す。
CACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTTCGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTGGACCCGGACAGGCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCTGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCTACCGTCGGAGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCTGCCGAGCGTGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTCGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGATCTAGA(配列番号３１０)。
【０６５５】
６．ターミネーター配列、ＩＶＳ−ｐＡ（３’側のＢａｍＨ  Ｉと共に示す）。
GGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTGTGGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTTATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGGTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTATCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCC(配列番号３１１)。 
【０６５６】
７．ＥＢＶ  ｏｒｉＰ配列。このエレメントは、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）を発現するＥＢＶ  ｏｒｉＰ許容細胞においてエピソームの複製を可能にする。任意の遺伝子間スペーサー領域（小文字）がｏｒｉＰ配列に先行する：
actgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccctggccgggtccGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTAGTGGTTTTGTGGGCAAGTGGTTTGACCGCAGTGGTTAGCGGGGTTACAATCAGCCAAGTTATTACACCCTTATTTTACAGTCCAAAACCGCAGGGCGGCGTGTGGGGGCTGACGCGTGCCATCACTCCACAATTTCAAGAGAAAGAGTGGCCACTTGTCTTTGTTTATGGGCCCCATTGGCGTGGAGCCCCGTTTAATTTTCGGGGGTGTTAGAGACAACCAGTGGAGTCCGCTGCTGTCGGCGTCCACTCTCTTTCCCCTTGTTACAAATAGAGTGTAACAACATGGTTCACCTGTCTTGGTCCCTGCCTGGGACACATCTTAATAACCCCAGTATCATATTGCACTAGGATTATGTGTTGCCCATAGCCATAAATTCGTGTGAGATGGACATCCAGTCTTTACGGCTTGTCCCCACCCCATGGATTTCTATTGTTAAAGATATTCAGAATGTTTCATTCCTACACTAGGATTTATTGCCCAAGGGGTTTGTGAGGGTTATATTGGTGTCATAGCACAATGCCACCACTGAACCCATCGTCCAAATTTTATTCTGGATGCGTCACCTGAAACCTTGTTTTCGAGCACCTCACATACACCTTACTGTTCACAACTCAGCAGTTATTCTATTAGCTAAACGAAGGAGAATGAAGAAGCAGGCGAAGATTCAGGAGAGTTCACTGCCCGCTCCTTGATCTTCAGCCACTGCCCTTGTGACTAAAATGGTTCACTACCCTCGTGGAATCCTGACCCCATGTAAATAAAACCGTGACAGCTCATGGGGTGGGAGATATCGCTGTTCCTTAGGACCCTTTTACTAACCCTAATTCGATAGCATATGCTTCCCGTTGGGTAACATATGCTATTGAATTAGGGTTAGTCTGGATAGTATATACTACTACCCGGGAAGCATATGCTACCCGTTTAGGGTTAACAAGGGGGCCTTATAAACACTATTGCTAATGCCCTCTTGAGGGTCCGCTTATCGGTAGCTACACAGGCCCCTCTGATTGACGTTGGTGTAGCCTCCCGTAGTCTTCCTGGGCCCCTGGGAGGTACATGTCCCCCAGCATTGGTGTAAGAGCTTCAGCCAAGAGTTACACATAAAGG(配列番号３１２)。
【０６５７】
８．ＤＮＡ２．０(Menlo Park,CA)由来のベクターｐＪ１５及びｐＪ３１由来のEscherichia coli複製起点、ｃｏｌＥＩ配列：ｃｏｌＥ１
AAAAGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTG(配列番号３１３)。
【０６５８】
９Ａ．耐性のためのベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子の配列。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は逆方向で示される。
CTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGCGCTGCGATGATACCGCGAGAACCACGCTCACCGGCTCCGGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATCGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGCAGTGCGACTAACGGCATGAAGCTCGTCGGGGCGTACG(配列番号３１４)。
【０６５９】
９Ｂ．ＤＮＡ２．０(Menlo Park,CA)由来のベクターｐＪ３１由来のカナマイシン配列（ｋａｎ）。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は逆方向で示される。
CTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGCAGTGCGACTAACGGCATGAAGCTCGTCGGGGAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGGCATTATAAAAAAGCATTGCTCATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTT(配列番号３１５)。
【０６６０】
１０．細胞当たりのエピソームコピー数を判定するために用いる部分。理想的には、当該部分はゲノム中特有に存在する配列を含有すべきである。以下に当該技術において公知の、又は本明細書中に記載するベクターにおいて使用できる２種の断片、ベータアクチン及びＧ６ＰＤＨを示す。ＢｓｉＷＩ及びＣｌａ  Ｉサイトが各断片の境界になる。
【０６６１】
ベータアクチン部分。
CGTACGTACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGAGGCCAGGATGGAGCCGCCGATCCACACGGAGTACTTGCGCTCAGGAGGAGCAATGAAGCTTATCTGAGGAGGGAAGGGGACAGGCAGTGAGGACCCTGGATGTGACAGCTCCAAGCTTCCACACACCACAGGACCCCACAGCCGACCTGCCCAGGTCAGCTCAGGCAGGAAAGACACCCACCTTGATCTTCATTGTGCTGGGTGCCAGGGCAGTGATCTCCTTCTGCATCCTGTCATCGAT（配列番号３１６)。
【０６６２】
ヒトグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｈＧ６ＰＤＨ）部分。
CGTACGAGGTGAGGCTGCAGTTCCATGATGTGTCCGGCGACATCTTCCACCAGCAGTGCAAGCGCAACGAGCTGGTGATCCGCGTGCAGCCCAACGAGGCCGTGTACCAGAGAAGGAGCAGTGTGGAGGGTGGGCGGCCTGGGCCCGGGGGACTCCACATGGTGGCAGGCAGTGGCATCAGCAAGACACTCTCTCCCTCACAGAACGTGAAGCTCCCTGACGCCTACGAGCGCCTCATCCTGGACGTCTTCTGCGGGAGCCAGATGCACTTCGTGCGCAGGAATCGAT(配列番号３１７)。
【０６６３】
１１．ｐＳＶ、ＳＶ４０由来の即時型初期プロモーター。ＢｓｔＢＩサイトが当該配列に先行し、ＮｇｏＭＩＶサイトがその後に続く。
TTCGAAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCTGACCCCTCACAAGGAGCCGGC(配列番号３１８)。
【０６６４】
Ｉｇエンハンサー。
【０６６５】
代表的なＩｇエンハンサー配列としては、重鎖又は軽鎖エンハンサーが挙げられる。カッパ３’エンハンサー領域（Ｅｋ３’）(Meyer,K.B.and Neuberger,M.S.,EMBO J.8(7),1959-1964(1989)を参照)、及びカッパイントロン性エンハンサー領域、Ｅｋｉ  ＬＯＣＵＳ  Ｌ８００４０  ７４６６ｂｐ  ＲＯＤ  ０２−ＳＥＰ−２００３を例示する目的で以下に示す。エンハンサー領域内の少なくとも１種の、活性を有する主要なエレメントがＥボックス配列：CAGGTG(N)13CAGGTG（配列番号３１９）［コア配列：CANNTG（配列番号３２０）］Storb et al.,Immunity 19:235-242,2003)である。Ｅｋ３’及びＥｋｉエンハンサーエレメントはＤｒ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（ＭＲＣ，ＵＫ）より入手する。Ｅｋ３’配列を、クローニング用に用いるＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩサイトをそれぞれ含有する以下のプライマー：GACTACCTCGAGccagcttaggctacacagag及びGTAGTCGAATTCCCACATGTCTTACATGGTATATG（配列番号３２１）を用い、識別番号１３５２のＮｅｕｂｅｒｇｅｒプラスミドからＰＣＲにより増幅する。
【０６６６】
ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位をそれぞれコードするオリゴヌクレオチドGACTACGAATTCtcctgaggacacagtgatag（配列番号３２２）及びGTAGTCGCGGCCGCCTAGTTCCTAGCTACTTCTTTA（配列番号３２３）を用い、Ｅｋｉエンハンサー配列をＤｒ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒのベクター（識別番号Ｍｅ１２３）から増幅する。結果生じる断片を適切な制限酵素により消化し、続けてｍｃｓ２（以下に記載）へクローニングする：Ｅｋ３’はｍｃｓ２のＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩサイトへクローニングし、次いで結果生じるプラスミドをＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し、そこへ続けてＥｋｉ断片をライゲーションしてベクターＡＢ１５６を生成する。
【０６６７】
上記の通り、Ｅボックスはカッパエンハンサー領域中に存在することが知られている。それ故、アニーリングされるとＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ突出部を含有する相補的なオリゴヌクレオチドAATTCaggtgctggggtagggagcaggtgctacactgcagaccaggtgctGC（配列番号３２４）及びggccgcagcacctggtctgcagtgtagcacctgctccctaccccagcacctg（配列番号３２５）用い、縦列する３つのＥボックスから成る合成カセットを合成する。こうしてアニーリングされたオリゴ産物をｍｃｓ２のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩサイトへクローニングし、ベクターＡＢ１５７を生成する。
【０６６８】
代表的なＩｇ−カッパ遺伝子座３’エンハンサーエレメントを以下に列挙する（アクセッション番号Ｘ１５８７８）。
CCAGCTTAGGCTACACAGAGAAACTATCTAAAAAATAATTACTAACTACTTAATAGGAGATTGGATGTTAAGATCTGGTCACTAAGAGGCAGAATTGAGATTCGAAGCCAGTATTTTCTACCTGGTATGTTTTAAATTGCAGTAAGGATCTAAGTGTAGATATATAATAATAAGATTCTATTGATCTCTGCAACAACAGAGAGTGTTAGATTTGTTTGGAAAAAAATATTATCAGCCAACATCTTCTACCATTTCAGTATAGCACAGAGTACCCACCCATATCTCCCCACCCATCCCCCATACCAGACTGGTTATTGATTTTCATGGTGACTGGCCTGAGAAGATTAAAAAAAGTAATGCTACCTTATTGGGAGTGTCCCATGGACCAAGATAGCAACTGTCATAGCTACCGTCACACTGCTTTGATCAAGAAGACCCTTTGAGGAACTGAAAACAGAACCTTAGGCACATCTGTTGCTTTCGCTCCCATCCTCCTCCAACAGCCTGGGTGGTGCACTCCACACCCTTTCAAGTTTCCAAAGCCTCATACACCTGCTCCCTACCCCAGCACCTGGCCAAGGCTGTATCCAGCACTGGGATGAAAATGATACCCCACCTCCATCTTGTTTGATATTACTCTATCTCAAGCCCCAGGTTAGTCCCCAGTCCCAATGCTTTTGCACAGTCAAAACTCAACTTGGAATAATCAGTATCCTTGAAGAGTTCTGATATGGTCACTGGGCCCATATACCATGTAAGACATGTGG(配列番号３２６)。
【０６６９】
代表的なカッパイントロン性エンハンサー領域、Ｅｋｉを以下に示す：
TCCTGAGGACACAGTGATAGGAACAGAGCCACTAATCTGAAGAGAACAGAGATGTGACAGACTACACTAATGTGAGAAAAACAAGGAAAGGGTGACTTATTGGAGATTTCAGAAATAAAATGCATTTATTATTATATTCCCTTATTTTAATTTTCTATTAGGGAATTAGAAAGGGCATAAACTGCTTTATCCAGTGTTATATTAAAAGCTTAATGTATATAATCTTTTAGAGGTAAAATCTACAGCCAGCAAAAGTCATGGTAAATATTCTTTGACTGAACTCTCACTAAACTCCTCTAAATTATATGTCATATTAACTGGTTAAATTAATATAAATTTGTGACATGACCTTAACTGGTTAGGTAGGATATTTTTCTTCATGCAAAAATATGACTAATAATAATTTAGCACAAAAATATTTCCCAATACTTTAATTCTGTGATAGAAAAATGTTTAACTCAGCTACTATAATCCCATAATTTTGAAAACTATTTATTAGCTTTTGTGTTTGACCCTTCCCTAGCCAAAGGCAACTATTTAAGGACCCTTTAAAACTCTTGAAACTACTTTAGAGTCATTAAGTTATTTAACCACTTTTAATTACTTTAAAATGATGTCAATTCCCTTTTAACTATTAATTTATTTTAAGGGGGGAAAGGCTGCTCATAATTCTATTGTTTTTCTTGGTAAAGAACTCTCAGTTTTCGTTTTTACTACCTCTGTCACCCAAGAGTTGGCATCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGAGGCCATCTGGCAGTTGCTTAAGATCAGAAGTGAAGTCTGCCAGTTCCTCCCAGGCAGGTGGCCCAGATTACAGTTGACCTGTTCTGGTGTGGCTAAAAATTGTCCCATGTGGTTACAAACCATTAGACCAGGGTCTGATGAATTGCTCAGAATATTTCTGGACACCCAAATACAGACCCTGGCTTAAGGCCCTGTCCATACAGTAGGTTTAGCTTGGCTACACCAAAGGAAGCCATACAGAGGCTAATACCAGAGTATTCTTGGAAGAGACAGGAGAAAATGAAAGCCAGTTTCTGCTCTTACCTTATGTGCTTGTGTTCAGACTCCCAAACATCAGGAGTGTCAGATAAACTGGTCTGAATCTCTGTCTGAAGCATGGAACTGAAAAGAATGTAGTTTCAGGGAAGAAAGGCAATAGAAGGAAGCCTGAGAATATCTTCAAAGGGTCAGACTCAATTTACTTTCTAAAGAAGTAGCTAGGAACTAG(配列番号３２７)。
【０６７０】
ベクター構築は優先権の基礎となる米国特許出願番号第６０／９０２，４１４号中に記載する。
【０６７１】
実施例４
代表的なヒトスキャフォールド抗体可変ドメインの同定
組み換え、ＳＨＭ、及び選別の過程の間での成熟抗体の産生においてもっとも頻繁に用いられる生殖細胞系列の抗体可変ドメインを同定するため、３９種のλ軽鎖、４４種のκ軽鎖、及び５５種の重鎖の生殖細胞系列可変ドメイン配列につきＰＤＢデータベースから入手可能な８５０の抗体重鎖及び軽鎖配列を比較する。
【０６７２】
更に、２１，０００のＧｅｎｂａｎｋヒト(www.ncbi.nih.gov/genbank)ＩｇＧ重鎖及び軽鎖配列で同様の比較をする。比較用のソースとしてＰＤＢデータベースを使用することには、いくつかの利点がある：ペプチド及びタンパク質、多くは治療目的となるタンパク質のほぼ全部に結合する抗体を含有し、結合した抗体の多くはそれらの標的に高親和性で結合し、抗体配列が多くのソース及びライブラリーに由来する。Ｇｅｎｂａｎｋの配列に可変ドメインをマッピングすることで、一般的に用いられる生殖細胞系列配列の統計的に有意な解析が提供される。
【０６７３】
可変ドメイン鋳型の同定は、ｐｈｙｌｉｐ  ３．６５  ＰｒｏｔＭＬＫ  ｐｒｏｇｒａｍ(“Numerical methods for inferring evolutionary trees.”Quarterly Review of Biology 57:379-404)を用い、可変ドメインアイソフォームの各３クラスについて分岐図を創出することにより行う。このプログラムは、推定された系統樹が分子時計と整合しなければならないという制約、系統樹の端は全てその根から分枝長において等距離にあるという仮定、の下にタンパク質アミノ酸配列用の最尤法を実装する。それは、アミノ酸間の変化のＤａｙｈｏｆｆ確率モデルを以下の仮定：ａ）配列中の各位置が独立して進化する；ｂ）異なる系統は独立して進化する；ｃ）一連の特定の率（各々出現確率と共に）から選択される期待される率で各位置の置換が起こる；ｄ）変化したものか、又は「系統発生学的に有益な」ものだけでなく、関連する全ての位置が配列中に含まれ、そしてｅ）アミノ酸間の変化の確率がJones,Taylor,and Thornton(1992),the PMB model of Veerassamy,Smith and Tillier(2003)、又はthe PAM model of Dayhoff(Dayhoff and Eck,1968;Dayhoff et.al.,1979)のモデルにより与えられる、と共に用いる。
【０６７４】
更に、各生殖細胞系列可変ドメインがどの程度の頻度で、配列又は構造データベースにおいて観察された成熟抗体の前駆体であり得たのかを決定するために、各生殖細胞系列可変ドメインを評価する。恐らくこれらの各可変ドメインは、異なる抗原クラス（タンパク質、ハプテン、多糖など）との結合には異なる寄与をする。どの可変配列がタンパク質標的との結合に共通の寄与をするかを理解し、これらの可変鋳型領域を取り込むことで、機能が豊富な抗体ライブラリーの創出がもたらされる。
【０６７５】
この比較によりλ軽鎖、κ軽鎖、及び重鎖アイソフォームについての可変領域が、高度に関連する少数のサブクレードに分かれることが示された。これらサブクレードのある種のメンバーがＰＤＢ及びＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいて見られる抗体に何度も寄与していることが観察されている（図２０（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ））が、他の生殖細胞系列可変領域が寄与することは滅多に観察されない。例えば、可変ドメインＩＧＬＶ４−ＩＧＬＶ１１はＰＤＢからの抗体配列への寄与は観察されず、Ｇｅｎｂａｎｋでは稀にしか観察されない。一方で、ＩＧＬＶ１−ＩＧＬＶ３可変ドメインの使用はＩＧＬ軽鎖を含有するほぼ全ての成熟抗体配列を説明する。
【０６７６】
たいていのλ、κ、及びＨサブクレードを代表し、且つ組み換え、ＳＨＭ、選択という過程で成熟抗体が産生されるにあたってよく用いられる１８の生殖細胞系列可変配列が確認されている。図２０中に、重鎖、κ軽鎖、及びλ軽鎖アイソフォーム可変ドメインの分岐図及び生殖細胞系列の使用についての度数分布を、本明細書中に記載する半合成的抗体ライブラリーに関する鋳型可変領域として使用するために選択したメンバーを＠で強調するとともに示す。表１１に、下記の通り合成用に同定された、選択した鋳型可変領域を列挙する。ライブラリー構築のためによく用いられる、代表的な鋳型可変領域(variabletemplate regions)を一セット選択したが、メンバー間で異なる可変領域の小さな差異及び同一エピトープを認識するための異なる可変領域を採用する抗体の能力により、他の生殖細胞系列可変領域、表１１で選択されたそれら領域のサブセット、又はいくつかの両方の組み合わせも、本明細書中に記載する抗体ライブラリー用の鋳型として用い得ることが示唆される。
【０６７７】
例えば、重鎖ＩＧＨＶ４−５５、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−６６、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ１−４６及びＩＧＨＶ７．４−１；カッパ軽鎖ＩＧＫＶ２．２４、ＩＧＫＶ２Ｄ−３０、ＩＧＫＶ２．２９、ＩＧＫＶ２．２８、ＩＧＫＶ７−３、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３、ＩＧＫＶ１−９及びＩＧＫＶ６Ｄ−４１；及びラムダ軽鎖ＩＧＬＶ４−６９、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＬＶ１−４１、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ３−１及びＩＧＬＶ３−１０。
【０６７８】
【表１１】
0005675109.tif 000057
【０６７９】
実施例５
ヒトスキャフォールド抗体可変ドメインの合成及びクローニング
初期重鎖ライブラリーレパートリーの構築において用いるために選択された９種の可変領域スキャフォールドのアミノ酸配列及びＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ、カッパ軽鎖ライブラリーレパートリーの構築において用いるために選択された５種の可変領域スキャフォールド、ラムダ軽鎖ライブラリーレパートリーの構築において用いるために選択された４種の可変領域スキャフォールドを以下の表１２に示す。遺伝子識別子であるＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤはwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=geneで見ることができる。
【０６８０】
【表１２−１】
0005675109.tif 000058
【０６８１】
【表１２−２】
0005675109.tif 000059
【０６８２】
【表１２−３】
0005675109.tif 000060
【０６８３】
【表１３】
0005675109.tif 000061
【０６８４】
Ｈ２ｋｋ表在性膜貫通、膜貫通及び細胞質ドメインをコードする配列は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（終止コドンを含まない）に付加して、キメライムノグロブリン遺伝子を生成した。結果生じるキメラタンパク質は、細胞表面上に保持されるＩｇＧ１イムノグロブリン分子をコードする。
【０６８５】
ｃｒｅリコンビナーゼの制御された発現によって表面発現性の抗体を分泌性の抗体へと変換するコンストラクトを開発するために、Ｈ２ｋｋ膜貫通ドメイン配列を隣接するＬｏｘＰサイトの挿入（以下に示されるように）を介して改変できる。以下の核酸配列（配列番号４５１）中、Ｈ２ｋｋ膜貫通ドメイン（大文字）に隣接する２つのｌｏｘＰサイト（下線）の位置を示して、ＩｇＧ重鎖定常ドメインのＣ末端部分を示す。関係する制限部位を囲んで示す。
【０６８６】
【化３】
0005675109.tif 000062
【０６８７】
ｌｏｘＰが改変された改変膜貫通ドメインに対応するアミノ酸配列を以下に示す。ｌｏｘＰサイトを下線で示し；終止コドン（＊）後の配列は示さない。
…LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLEITSYSIHYTKLSPPPSTVSNMATVAVLVVLGA*(配列番号452)
【０６８８】
細胞中のｃｒｅリコンビナーゼの発現により、組み換え及び膜貫通ドメインの喪失がもたらされ、結果的にトランスフェクトされた細胞集団中ｉｎ  ｓｉｔｕで分泌型タンパク質が作り出され、次いでそれを更なる研究に用いることができる。
【０６８９】
Ｃｒｅリコンビナーゼ（アクセッション番号：Ｐ０６９５６、ＡＡＹ７２４０４、及びＹＰ＿００６４７２）
MSNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD(配列番号453)
【０６９０】
アクセッション番号。ＮＣ＿００５８５６（ＹＰ＿００６４７２由来）。
atgtccaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccggtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgttttctgagcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcagaacctgaagatgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttgggccagctaaacatgcttcatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggttatgcggcggatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacgtgcaaaacaggctctagcgttcgaacgcactgatttcgaccaggttcgttcactcatggaaaatagcgatcgctgccaggatatacgtaatctggcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacggtgggagaatgttaatccatattggcagaacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtagagaaggcacttagcctgggggtaactaaactggtcgagcgatggatttccgtctctggtgtagctgatgatccgaataactacctgttttgccgggtcagaaaaaatggtgttgccgcgccatctgccaccagccagctatcaactcgcgccctggaagggatttttgaagcaactcatcgattgatttacggcgctaaggatgactctggtcagagatacctggcctggtctggacacagtgcccgtgtcggagccgcgcgagatatggcccgcgctggagtttcaataccggagatcatgcaagctggtggctggaccaatgtaaatattgtcatgaactatatccgtaacctggatagtgaaacaggggcaatggtgcgcctgctggaagatggcgattag(配列番号454)。
【０６９１】
以下に提示する、これらの遺伝子に対応する、対応する核酸配列をＤＮＡ  ２．０(Menlo Park,CA)により作製し、配列解析により正しく合成されていることを確認する。
【０６９２】
核酸クローンはＤＮＡ２．０ベクター（即ちｐＪ３１又はｐＪ５１）中に提供されるが、それらはたいていの６ｂｐの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を欠く。イムノグロブリンライブラリーを構築する目的のためには、好適なベクターには以下のいずれの制限部位も含めてはならない：ＡｃｌＩ（ＡＡＣＧＴＴ；配列番号３５０），ＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ；配列番号３５１），ＢｂｓＩ（ＧＡＡＧＡＣ［配列番号３５２］；ＧＴＣＴＴＣ［配列番号３５３］），ＢｓｍＢＩ（ＣＧＴＣＴＣ［配列番号３５４］；ＧＡＧＡＣＧ［配列番号３５５］），ＥａｇＩ（ＣＧＧＣＣＧ；配列番号３５６），ＦｓｅＩ（ＧＧＣＣＧＧＣＣ；配列番号３５７），ＭｆｅＩ（ＣＡＡＴＴＧ；配列番号３５８），ＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ；配列番号３５９），ＳｂｆＩ（ＣＣＴＧＣＡＧＧ；配列番号３６０），ＳｇｒＡＩ（ＣＲＣＣＧＧＹＧ；配列番号３６１）。
【０６９３】
本発明の１実施形態のポリヌクレオチドライブラリー構築に用いる重鎖可変ドメインスキャフォールドのポリヌクレオチド配列を以下に提供する。これらの配列中、重鎖配列の以下の目印は：
【０６９４】
【化４】
0005675109.tif 000063
【０６９５】
重鎖可変領域
配列Ｈ１；配列番号３６２。ＩｇＨＶ１−２−スタッファー領域−ＩｇＧ１定常−Ｈ２ｋｋ表在性膜貫通、膜貫通及び細胞質ドメイン。（１５７０ｂｐ）（Ｖｈ１）。制限部位の目印を囲んだ文字で示す。（下線小文字で示すスタッファー領域を、ヒト末梢血リンパ球ＲＮＡのＰＣＲにより入手した正真正銘のＣＤＲ３領域配列で置換した。）
【０６９６】
【化５】
0005675109.tif 000064
【０６９７】
配列Ｈ２；配列番号３６３。ＩＧＨＶ１−６９（３４７ｂｐ）（Ｖｈ２）
【０６９８】
【化６】
0005675109.tif 000065
【０６９９】
配列Ｈ３；配列番号３６４。ＩＧＨＶ３−７（３４７ｂｐ）（Ｖｈ３）
【０７００】
【化７】
0005675109.tif 000066
【０７０１】
配列Ｈ４；配列番号３６５。ＩＧＨＶ３−２３（３４７ｂｐ）（Ｖｈ４）
【０７０２】
【化８】
0005675109.tif 000067
【０７０３】
配列Ｈ５；配列番号３６６。ＩＧＨＶ３−３０−３（３４７ｂｐ）（Ｖｈ５）
【０７０４】
【化９】
0005675109.tif 000068
【０７０５】
配列Ｈ６；配列番号３６７。ＩＧＨＶ４−３４（３４４ｂｐ）（Ｖｈ６）
【０７０６】
【化１０】
0005675109.tif 000069
【０７０７】
配列Ｈ７；配列番号３６８。ＩＧＨＶ４−５９（３４４ｂｐ）（Ｖｈ７）
【０７０８】
【化１１】
0005675109.tif 000070
【０７０９】
配列Ｈ８；配列番号３６９。ＩＧＨＶ５−５１（３４７ｂｐ）（Ｖｈ８）
【０７１０】
【化１２】
0005675109.tif 000071
【０７１１】
配列Ｈ９；配列番号３７０。ＩＧＨＶ６−１（３５９ｂｐ）（Ｖｈ９）
【０７１２】
【化１３】
0005675109.tif 000072
【０７１３】
カッパ可変領域軽鎖
【０７１４】
【化１４】
0005675109.tif 000073
【０７１５】
配列Ｋ１；配列番号３７１。ＩＧＫＶ４−１（６５０ｂｐ）（Ｖκ１）
【０７１６】
【化１５】
0005675109.tif 000074
【０７１７】
配列Ｋ２；配列番号３７２。ＩＧＫＶ３−２０（３４２ｂｐ）（Ｖκ２）
【０７１８】
【化１６】
0005675109.tif 000075
【０７１９】
配列Ｋ３；配列番号３７３。ＩＧＫＶ２Ｄ−３０（３５４ｂｐ）（Ｖκ３）
【０７２０】
【化１７】
0005675109.tif 000076
【０７２１】
配列Ｋ４；配列番号３７４。ＩＧＫＶ１Ｄ−３９（３４５ｂｐ）（Ｖκ４）
【０７２２】
【化１８】
0005675109.tif 000077
【０７２３】
配列Ｋ５  配列番号３７５。ＩＧＫＶ１−３３（３４５ｂｐ）（Ｖκ５）
【０７２４】
【化１９】
0005675109.tif 000078
【０７２５】
ラムダ軽鎖
【０７２６】
【化２０】
0005675109.tif 000079
【０７２７】
配列Ｌ１；配列番号３７６。ＩＧＬＶ１−４０（６３９ｂｐ）（Ｖλ１）
【０７２８】
【化２１】
0005675109.tif 000080
【０７２９】
配列Ｌ２；配列番号３７７。ＩＧＬＶ２−１１（３２９ｂｐ）（Ｖλ２）
【０７３０】
【化２２】
0005675109.tif 000081
【０７３１】
配列Ｌ３；配列番号３７８。ＩＧＬＶ３−２１（３２０ｂｐ）（Ｖλ３）
【０７３２】
【化２３】
0005675109.tif 000082
【０７３３】
配列Ｌ４；配列番号３７９。ＩＧＬＶ７−４３（３２９ｂｐ）（Ｖλ４）
【０７３４】
【化２４】
0005675109.tif 000083
【０７３５】
クローニング
重鎖、カッパ軽鎖、及びラムダ軽鎖ライブラリーを図２１に示すとおり、Ｈ１、Ｌ１及びＫ１可変ドメインから出発してベクターｐＪ３１中にアッセンブリする。プロトタイプの各ライブラリーは（ａ）置換可能な可変領域（Ｖｈ１、Ｖκ１、又はＶλ１）；（ｂ）合成又はＰＣＲ増幅した重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖に由来するＣＤＲ３領域が挿入された制限部位が境界となる小スタッファー領域；（実施例６、７及び８を参照）及び（ｃ）重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖定常領域をそれぞれ含有する。（これらのクローニングベクター及びクローニング戦略全体を模式的に図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃにそれぞれ示す。）
【０７３６】
切断したベクターのバックグラウンドライゲーションを最少にするため、６７１ｂｐのより長いスタッファーをプラスミドｐＪ３１−Ｖｈ１のＥａｇＩ＋ＮｈｅＩサイトにクローニングしてベクターｐＪ３１−Ｖｈ１ｓを生成し（図２１Ａ工程２）、ｐＪ３１−Ｖκ１のＢｓｍＢＩ＋ＭｆｅＩサイトにクローニングしてｐＪ３１−Ｖκ１ｓを生成し（図２１Ｂ工程７）、そしてｐＪ３１−Ｖλ１のＢｂｓＩ＋ＡｃｌＩサイトにクローニングしてｐＪ３１−Ｖκ１ｓを生成する（図２１Ｃ工程１２）。
【０７３７】
この工程により単切断しかされていない、あるいは二重切断が不完全であるかもしれないすべてのベクターからの二重切断されたベクターの、分取アガロースゲルからの切り出しを容易にし、ＣＤＲ３クローニング工程の間のバックグラウンドが最小になる。
【０７３８】
制限部位ＳｇｒＡＩ及びＥａｇＩに隣接する重鎖可変領域を含むＨ２（Ｖｈ２）からＨ９（Ｖｈ９）の配列を、ベクターｐＪ３１−Ｖｈ１中のＨ１（Ｖｈ１）の代わりにクローニングし、ｐＪ３１−Ｖｈ２ｓから−Ｖｈ９ｓのコンストラクトを生成する（図２１Ａ工程３）；同様に、カッパ軽鎖可変領域Ｋ２−Ｋ５（Ｖκ２−Ｖκ５）をＫ１（Ｖκ１）の代わりにクローニングし、ｐＪ３１−Ｖｋ２ｓから−Ｖκ５ｓのコンストラクトを生成する（図２１Ｂ工程８）；そしてラムダ軽鎖Ｌ２−Ｌ４（Ｖλ２−Ｖλ４）をＬ１（Ｖλ１）の代わりにクローニングし、ｐＪ３１−Ｖλ２ｓから−Ｖλ４ｓのコンストラクトを生成する（図２１Ｃ工程１３）。
【０７３９】
従って、この過程で９種の重鎖スキャフォールド、５種のカッパ軽鎖スキャフォールド及び４種のラムダ軽鎖スキャフォールドの各々をプラスミドｐＪ３１に挿入した合計１８種の中間クローニングベクターを創出する。次いでこれらの中間プラスミドを、ＰＣＲ増幅ＣＤＲ３を導入するために用いたが、下記の通り完全合成ＣＤＲを導入するためにも使用できる。
【０７４０】
そのようなライブラリーコンストラクトの結果生じる理論的多様性は、考えられる全ての可変領域を用いるものでの予測に比べ大幅に減少する。本発明のライブラリーでは、人工的な組み換え及びアッセンブリの後１１，０１６（９Ｖｘ２０４Ｄｘ６Ｊ）（ＩＧＨＶ）の重鎖が観察されると考えられ得る。同様に、２５（５Ｖｘ５Ｊ）のカッパ鎖及び２８（４Ｖｘ７Ｊ）のラムダ鎖が観察される可能性があり得る。ドメイン結合部で起こりうる鋳型無しでの変異を無視すると、合計５８３８４８のメンバー（１１０１６Ｈｘ（２５Ｋ＋２８Ｌ））の予想複雑度となる。対照的に、６７３２０重鎖（５５Ｖｘ２０４Ｄｘ６Ｊ）、２２０カッパ鎖（４４Ｖｘ５Ｊ）、及び２７３ラムダ鎖（３９Ｖｘ７Ｊ）で、全体的な理論的複雑度が３．３１８ｘ１０７メンバーとなる、ヒトＩｇＧのナイーブな遺伝子座を完全に説明することが期待される。従って、我々のライブラリーの全体の抗原結合能を、その全体の複雑度を推定５６．８倍（３．３１８ｘ１０７／５８３８４８）まで減少させる一方で維持しながら、選択のために全ライブラリーメンバーのロバストで且つ余剰な提示を提供する。
【０７４１】
実施例６
ＣＤＲのＰＣＲ増幅
ＣＤＲ３領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの調製
プライマーのヌクレオチド配列の選択は一般的には、所望の配列をコードする領域からの核酸上の距離、用いられる任意の二番目のプライマーと関連するその核酸上のハイブリダイゼーション位置、それがハイブリダイズするレパートリー中の遺伝子数など等の要因に依存する。
【０７４２】
Ｉｇλ、κ、及びＨ鎖アイソフォームＣＤＲ３領域がＰＣＲ増幅されるように、フレームワーク３の領域の３’末端及び適切な定常ドメインの５’末端内でプライマーを設計し選択する。制限部位はいくつかの判断基準に基づいて選択する：制限部位はＣＤＲ３領域のできるだけ近くでなくてはならないが、重複してはならない；しかしＰＣＲ産物の消化でライブラリー全体の多様性が減少するような、ＣＤＲ３を構成する生殖細胞系列の配列のＤ及びＪ領域中の公知のサイトをいずれも含んではならず、それらが挿入されるクローニングベクター、具体的には例えば、上記実施例３、４及び５に記載のベクターに適合させるべきである；且つ図２１中に概説する通りである。
【０７４３】
多様性に富んだ、自然発生的なＣＤＲ３領域を下記の通りＰＣＲ介在性の増幅を介して生成する：
【０７４４】
７人の異なるドナー由来の全ＲＮＡを末梢血単核球(PBMC’s;AllCells,Inc.,Emeryville,CA)から単離し、プールする。
【０７４５】
ＨＰＬＣ精製したオリゴヌクレオチドをＡｌｌｅｌｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ,(San Diego,CA)から取寄せる。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ(Carlsbad,CA)により提供された通りのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ３プロトコールを用い、それぞれオリゴＨ８ａ、Ｈ９ａ、Ｋ７ａ、Ｌ８ａ（下記表１４の通り）を用いて全ＲＮＡを逆転写して、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇκ及びＩｇλに対する増幅ｃＤＮＡを生成する。
【０７４６】
標準的なＰＣＲ増幅条件を用い、以下に列記するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、極めて多様なＣＤＲ３集団の二重鎖ｃＤＮＡコピーをＰＣＲにより増幅する。
【０７４７】
ＰＣＲ増幅用の重鎖オリゴヌクレオチド
H1b.  ggaatcCGGCCGtgtattactgtgcaaga (IGHV6-1用重鎖センスオリゴ、EagIサイト;配列番号380)
H2b.  ggaatcCGGCCGtgtattactgtgcgaaa (IGHV3-30-3用重鎖センスオリゴ、EagIサイト;配列番号381)
H3b.  ggaatcCGGCCGtgtattactgtgcgaga (IGHV4-34(1ミスマッチ)、IGHV3-7)(1ミスマッチ)、IGHV4-59、IGHV1-69、IGHV1-2及びIGHV5-51(1ミスマッチ)用重鎖センスオリゴ、、EagIサイト;配列番号382) 
H4b.  ggaatcCGGCCGtatattactgtgcgaaa (IGHV3-23用重鎖センスオリゴ、EagIサイト;配列番号383)
H5b.  ggaatcgGCTAGCgggaagacggatgggcccttg (IgG定常領域由来の重鎖アンチセンス、NheIサイト;配列番号384)
H6b.  ggaatcgGCTAGCgggaagaccgatgggcccttg (IgG定常領域由来の重鎖アンチセンス、NheIサイト;配列番号385)
H7b.  ggaatcgGCTAGCgggaaaagggttggggcgga (IgM定常領域由来の重鎖アンチセンス、NheIサイト;配列番号386)
H8a.  gaagtagtccctgaccaggc (IgG用逆転写プライマー;配列番号387)
H9a.  aagtcctgtgcgaggcagc  (IgM用逆転写プライマー;配列番号388)
制限部位を大文字で示す。
【０７４８】
ＰＣＲ増幅用のカッパ軽鎖オリゴヌクレオチド
K1b.  ggaatcCGTCTCgTATtactgtcagcaatattatag (IGKV4-1用カッパＣＤＲ３センス、BsmBIサイト;配列番号389)
K2b.  ggaatcCGTCTCgTATtactgtcagcagtatggtag (IGKV3-20用カッパＣＤＲ３センス、BsmBIサイト;配列番号390)
K3b.  ggaatcCGTCTCgTATtactgcatgcaaggtacaca (IGKV2D-30用カッパＣＤＲ３センス、BsmBIサイト;配列番号391)
K4b.  ggaatcCGTCTCgTATtactgtcaacagagttacag (IGKV1D-39用カッパＣＤＲ３センス、BsmBIサイト;配列番号392)
K5b.  ggaatcCGTCTCgTATtactgtcaacagtatgataa (IGKV1-33用カッパＣＤＲ３センス、BsmBIサイト;配列番号393)
K6b.  ggaatcCAATTGctcatcagatggcgggaag (全カッパ軽鎖用カッパＣＤＲ３アンチセンス(MfeIサイト;配列番号394)
K7a.  ggcctctctgggatagaag  (IgK用カッパＣＤＲ３逆転写プライマー;配列番号395).
【０７４９】
ＰＣＲ増幅用のラムダ軽鎖オリゴヌクレオチド
L1b.  ggaatcGAAGACGAGGCTgattattactgccagtcct (BbsIサイトを伴うIGLV1-40用ラムダＣＤＲ３センス;配列番号396)
L2b.  ggaatcGAAGACGAGGCTgattattactgctgctcat (BbsIサイトを伴うIGLV2-11用ラムダＣＤＲ３センス;配列番号397)
L3b.  ggaatcGAAGACGAGGCTgactattactgtcaggtgt (BbsIサイトを伴うIGLV3-21用ラムダＣＤＲ３センス;配列番号398)
L4b.  ggaatcGAAGACGAGGCTgagtattactgcctgctct (BbsIサイトを伴うIGLV7-43用ラムダＣＤＲ３センス;配列番号399)
L5b.  ggaatcAACGTTaccgtggggttggccttg  (AclIサイトを伴う定常領域由来のラムダＣＤＲ３アンチセンス;配列番号400)
L6b.  ggaatcAACGTTaccgagggggcagccttg (AclIサイトを伴う定常領域由来のラムダＣＤＲ３アンチセンス;配列番号401)
L7b.  ggaatcAACGTTaccgatggggcagccttg (AclIサイトを伴う定常領域由来のラムダＣＤＲ３アンチセンス;配列番号402)
L8a.  gctcccgggtagaagtcac (ラムダＣＤＲ３用逆転写プライマー(全ラムダ軽鎖をプライムする);配列番号403)
【０７５０】
ＰＣＲ条件は以下の通りである：
カッパ、Ｋ６ｂと共にＫ２ｂ、Ｋ３ｂに用いるＰＣＲ条件Ａ：
９５℃ｘ３’１サイクル；次いで９５℃ｘ３０”、６０℃ｘ３０”、７２℃ｘ３０”３サイクル；次いで９５℃ｘ３０”、７０℃ｘ３０”、７２℃ｘ３０”３０サイクル；次いで７２℃ｘ５’。
カッパ、Ｋ６ｂと共にＫ１ｂ、Ｋ４ｂ及びＫ５ｂに用いるＰＣＲ条件Ｂ：
９５℃ｘ３’１サイクル；次いで９５℃ｘ３０”、５５℃ｘ３０”、７２℃ｘ３０”３サイクル；次いで９５℃ｘ３０”、６８℃ｘ３０”、７２℃ｘ３０”３０サイクル；次いで７２℃ｘ５’。
ラムダ用ＰＣＲ条件：
９５℃ｘ３’１サイクル；次いで９５℃ｘ３０”、５８℃ｘ３０”、７２℃ｘ３０”３サイクル；次いで９５℃ｘ３０”、６６℃ｘ３０”、７２℃ｘ３０”３３サイクル；次いで７２℃ｘ５’。
ＩｇＧ及びＩｇＭ用ＰＣＲ条件：
９５℃ｘ３’１サイクル；次いで９５℃ｘ３０”、６０℃ｘ３０”、７２℃ｘ３０”３サイクル；次いで９５℃ｘ３０”、６８℃ｘ３０”、７２℃ｘ３０”３３サイクル；次いで７２℃ｘ５’。
【０７５１】
これらの各反応由来のＰＣＲ増幅産物における最終的な全多様性は、ヒト免疫系における抗体レパートリーに直接関係するが、非常に大きなものである。実にＰＣＲに起因するバンドは、１００〜２００ｂｐの範囲でアガロースゲルでスメアーとして現れる。可視化したバンドの濃さ（即ち、集団のサイズがいかに不均一であったか）の序列はミュー＞ガンマ＞カッパ＝ラムダであった。
【０７５２】
オリゴＨ２ｂ＋Ｈ７ｂを用いるＰＣＲの結果生じる、ＩｇＭ由来の３４の独立ＣＤＲ３クローンの配列を取得した（データ示さず）。２つの配列が同一であることはなく、インサートがコードするサイズは３〜２７アミノ酸にわたった。
【０７５３】
ＣＤＲ３領域の良好なＰＣＲ増幅の後、結果生じるＰＣＲ産物をゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼ消化した産物を、下記の通り、予め存在するスタッファー断片（それぞれ図２１Ａ工程４、図２１Ｂ工程９及び図２１Ｃ工程１４）の代わりに実施例７に記載したｐＪ３１クローニングベクター中の抗体重鎖、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖スキャフォールドにライゲートする。
【０７５４】
【表１４】
0005675109.tif 000084
【０７５５】
実施例７
ＰＣＲ増幅したＣＤＲの抗体スキャフォールドへのライゲーション
Ａ．ＰＣＲ増幅したＣＤＲの重鎖及び軽鎖スキャフォールドへのライゲーション及びサブクローニングは下記の通りにして行う：
以下のプロトコールを用いてエレクトロポレーションにより細菌の形質転換を行う：ライゲートしたＤＮＡ（５〜４０ｎｇ）を、ＢｉｏＲａｄのＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸＣｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用い、１．８ｋＶ、キャパシタンス２５μＦ、及び抵抗２００ｏｈｍの設定で、０．１ｃｍギャップのキュベット中、ＢｉｏＲａｄ(Hercules,CA)由来の２０μＬのＥＰ−Ｍａｘ  １０ｂ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓについてエレクトロポレーションを行う、エレクトロポレーション後、６００μＬのＳＯＣを各チューブに添加し内容物を全部、１５ｃｍのアンピシリン含有寒天プレート上に播種した。
【０７５６】
上記実施例６由来のＰＣＲ増幅ＩｇＧ及びＩｇＭ  ＣＤＲ３及び実施例５由来の９種の重鎖中間クローニングベクター（即ち、ＶＨ１−９−スタッファー−ＩｇＧ定常領域）を制限酵素ＥａｇＩ＋ＮｈｅＩ（図２１Ａ工程４）で消化しゲル精製する。
【０７５７】
上記実施例６由来のＰＣＲ増幅カッパ軽鎖ＣＤＲ３及び実施例５由来の５種のκ軽鎖中間クローニングベクターを制限酵素ＢｓｍＢＩ＋ＭｆｅＩ（図２１Ｂ工程９）で切断しゲル精製する。
【０７５８】
上記実施例６由来のＰＣＲ増幅ラムダ軽鎖ＣＤＲ３及び実施例５由来の４種のλ軽鎖中間クローニングベクターを制限酵素ＢｂｓＩ＋ＡｃｌＩ（図２１Ｃ工程１４）で切断しゲル精製する。
【０７５９】
次いで消化したＣＤＲ３を全て、それらに適切な切断中間クローニングベクターにライゲートし、完全な重鎖、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖半合成ポリヌクレオチドサブライブラリーを生成する（即ち、スタッファー領域を極めて多様な、ＰＣＲ増幅ＣＤＲ３領域と置換した）。
【０７６０】
ライゲーション前に、実施例５由来の中間クローニングベクターはプールでき、例えば９種の重鎖ベクター（ＶＨ１−９−スタッファー−ＩｇＧ定常領域）、５種のκ軽鎖ベクター（Ｖκ１−５−スタッファー−ＩＧＫＣカッパ定常領域）、及び４種のλ軽鎖ベクター（Ｖλ１−４−スタッファー−ＩＧＬＣ３ラムダ定常領域）をＣＤＲ３の添加及びライゲーション前に、３つ別々にプール（即ち、重鎖、κ、及びλ中間クローニングベクターのそれぞれ１プール）できる。又は、ベクターは別々に保持でき、その場合１８の別々のライゲーションを用意できる。
【０７６１】
極めて多様な、自然発生的な、上記のＣＤＲ３コレクションを含有する、９種の別々（又はプール）の完全な重鎖ポリヌクレオチドライブラリーベクターを消化し、次いで最終の真核生物エピソーム発現ベクター、ｐＡＢＬｈ（図２１Ａ工程５）のＳｇｒＡＩ及びＦｓｅＩサイトにサブクローニングする。
【０７６２】
完全なκ及びλ軽鎖ポリヌクレオチドライブラリーは２つの独立プールとして保持する。各セットのインサート、κ及びλを消化し、次いで最終の真核生物エピソーム発現ベクター、ｐＡＢＬκ（図２１Ｂ工程１０）及びｐＡＢＬλ（図２１Ｃ工程１５）のＳｂｆＩ及びＡｓｃＩサイトにサブクローニングする。
【０７６３】
ライブラリーのインテグリティー及び多様性を、代表的且つ統計的に有意な数のクローン（即ち、各重鎖、κ鎖及びλ鎖サブライブラリー由来の５０〜２００試料）由来のＣＤＲ３インサートを配列決定することにより確認する。
【０７６４】
標準的な手順を用いてライブラリーの発現ベクターのプラスミドストックを調製し、必要になるまで凍結保存した。
【０７６５】
Ｂ．細胞表面発現ライブラリーの創出
トランスフェクションの１日前に、Ｔ７５フラスコあたり３百万細胞の密度でＨＥＫ−２９３細胞を１０％胎仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中に播種する。トランスフェクション用に全部で５０フラスコ調製し、続けて組織培養インキュベータ中、３７℃、５％二酸化炭素で一晩インキュベートする。
【０７６６】
翌日、３０ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、１．２  ｍＬ  ＨＤ−Ｆｕｇｅｎｅ(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)、９０μｇのＩｇ重鎖ＤＮＡ（即ち、ベクターｐＡＢＬｈ）及び９０μｇのＩｇ軽鎖（即ち、ベクターｐＡＢＬκ及び／又はベクターｐＡＢＬλ）ＤＮＡを混合し室温で２５〜３０分インキュベートする。体積おおよそ５４０μｌを、ＨＥＫ−２９３細胞を含有する各Ｔ７５フラスコに添加し、細胞を３７℃、５％二酸化炭素でインキュベートする。
【０７６７】
トランスフェクションから３日後、細胞を１０％胎仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地２５ｍＬを含有するＴ２２５フラスコに移す。首尾よくトランスフェクトされた細胞を選別するために、細胞接着後ブラストサイジン（１５μｇ／ｍＬ）、及びピューロマイシン（１．５μｇ／ｍＬ）を添加する。２〜４週間の選択過程の間、細胞を３７℃、５％二酸化炭素でインキュベートする。この間、増殖について細胞をモニターし、培地を交換し、細胞を必要に応じて更なるＴ２２５フラスコで増殖させる。
【０７６８】
選択後、高レベルの抗体表面発現を確認するために下記の通り細胞をスクリーニングし、次いで細胞バンクを創出するために用いる。細胞バンクは１００個のＴ２２５フラスコ由来の細胞プールから創出する。
【０７６９】
細胞をトリプシン処理により回収し、次いで穏やかな遠心によりペレットにする。細胞ペレットを細胞凍結培地中に５．８ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。細胞１ｍＬを９０の各クライオバイアルに分注する。バイアルを−８０℃で一晩インキュベートし、次いで長期間の貯蔵のため液体窒素に移す。
【０７７０】
Ｃ．動的細胞表面抗体ライブラリーの創出
トランスフェクションの１日前に、ハイグロマイシンで選択マーカー遺伝子（実施例３で記載されるように）を伴う誘導性又は構成的なＡＩＤ発現ベクターを含むＨＥＫ−２９３細胞をＴ７５フラスコあたり３百万細胞の密度で１０％胎仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中に播種する。トランスフェクション用に全部で５０フラスコ調製し、続けて組織培養インキュベータ中、３７℃、５％二酸化炭素で一晩インキュベートする。
【０７７１】
翌日、３０ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ、１．２ｍＬ  ＨＤ−Ｆｕｇｅｎｅ、９０μｇのＩｇ重鎖ＤＮＡ（即ち、ベクターｐＡＢＬｈ）及び９０μｇのＩｇ軽鎖（即ち、ベクターｐＡＢＬκ及び又はベクターｐＡＢＬλ）ＤＮＡの混合物を混合し室温で２５〜３０分インキュベートする。体積おおよそ５４０μｌを、ＨＥＫ−２９３細胞を含有する各Ｔ７５フラスコに添加し、細胞を３７℃、５％二酸化炭素でインキュベートする。
【０７７２】
トランスフェクションから３日後、細胞を１０％胎仔ウシ血清及び１ｍＬ当たり５０マイクログラムの抗生物質Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ培地２５ｍＬを含有するＴ２２５フラスコに移す。首尾よくトランスフェクトされた細胞を選別するために、細胞接着後ハイグロマイシン（３５０μｇ／ｍＬ）、ブラストサイジン（１５μｇ／ｍＬ）、及びピューロマイシン（１．５μｇ／ｍＬ）を添加する。２〜４週間の選択過程の間、細胞を３７℃、５％二酸化炭素でインキュベートする。この間、増殖について細胞をモニターし、培地を交換し、細胞を必要に応じて更なるＴ２２５フラスコへと増殖させる。
【０７７３】
上記した最初の選択で得られる、重鎖及び軽鎖（すなわち、機能性抗体）を安定して発現する細胞をＦＡＣＳにより特性解析して細胞表面上に発現する抗体のコピー数を明らかにする。簡単に言えば、トランスフェクトしたライブラリー由来の細胞試料を染色するため、市販のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Sigma)を用い、重鎖及び軽鎖に対する蛍光タグ抗体を用いる。製造元提示のプロトコールを用い、通常標識抗体存在下、試験細胞の氷上での３０分のインキュベーションを介して染色を行う。規定されたヒトＩｇＧ結合容量を伴う５つの異なるマイクロビーズ集団を伴うＢａｎｇ  Ｂｅａｄｓ(Bang Laboratories Inc.,Fishers,IN)を用いて発現レベルを定量する。各集団の幾何平均蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定し、それらの個々のＩｇＧ結合容量に対してプロットし、線形回帰曲線を作成する。次いで各細胞系の蛍光の幾何平均を平均ＩｇＧ発現レベルへ変換するために、この曲線を用いることができる。本明細書中に記載の方法を用いて設計した重鎖及び軽鎖は実施例１３において更に説明する。
【０７７４】
Ｄ．細胞バンクの創出
百個のＴ２２５フラスコ由来の細胞のプールから細胞バンクを創出する。簡単に言えば、細胞をトリプシン処理によりプレートから回収し、次いで穏やかな遠心によりペレットにする。細胞ペレットを細胞凍結培地中に５．８ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。細胞１ｍＬを９０の各クライオバイアルに分注する。バイアルを−８０℃で一晩インキュベートし、長期間の貯蔵のため液体窒素に移す。
【０７７５】
Ｅ．表面ディスプレイライブラリーから分泌ライブラリーへの変換
ＩｇＧ１定常領域、マウス組織適合性２由来の膜近傍部分、並びに完全膜貫通及び細胞質ドメインのＤＮＡ断片、Ｋ領域（Ｈ２ｋｋ，ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＫ１５３４１９）を（DNA 2.0 Menlo Park,CA）により合成する。合成の間にＩｇＧ定常領域の５’端付近にサイレント変異を導入して便利なＮｈｅＩサイトを作り出す。部位特異的変異誘発により２つのＸｈｏＩ制限部位が導入される：以下に示す通り、最初のは２つの合成断片の間に導入され、そして２番目のＸｈｏＩ制限部位及び隣接するインフレームの終止コドンが細胞質ドメイン配列の遠位側に導入される。
【０７７６】
連続するＨ２ｋｋ膜貫通ドメインを伴うＩｇＧ１定常領域配列。
【０７７７】
【化２５】
0005675109.tif 000085
【０７７８】
５’から３’の順で示す特徴は以下の通りである：ＮｈｅＩサイト（囲んだ小文字）、ＩｇＧ１定常領域コーディング配列（小文字）、ＸｈｏＩサイト（定常領域と膜近傍領域の間に導入される、囲んだ小文字）；膜近傍小領域並びに膜貫通及び細胞質ドメイン（大文字、ネイティブな終止コドンに下線）を含有するマウスＨ２ｋｋ配列、第二ＸｈｏＩサイト配列（囲んで大文字）、及び隣接インフレーム終止コドン（下線小文字）；更なるクローニングサイトを小文字で示し、後のクローニング工程において用いるＥｃｏＲＩサイトを囲んだ斜体で示す。
【０７７９】
この断片をＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩで回収し、標準的なクローニング方法論を用いて発現ベクターＡＮＡ３２７（ブラストサイジン耐性を伴うベクターフォーマット１）のコグネイトサイトにクローニングする。ＸｈｏＩでベクターを消化し、続いて膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン及び細胞質ドメイン（上記配列中大文字）を除去するためセルフ再ライゲーションし、タンパク質を分泌して産生するためベクターＡＮＡ３４６を作り出す。この場合、第二の終止コドン（上記配列中、下線で示すｔｇａ）が分泌型ＩｇＧ１重鎖のためのインフレーム翻訳の終止として役割を果たす。上記発現ベクターと、所望のカッパ又はラムダ軽鎖用の適切な発現ベクターとをＨＥＫ  ２９３細胞中に共トランスフェクションすることにより、続くタンパク質の組織培養培地への分泌が、かなりの収率で可能となった。結果生じる分泌タンパク質を、標準的な方法論及び更に本明細書中に記載の通りの方法論を用いて、結合又は機能特性を測定するために産生及び精製できる。
【０７８０】
上記実施例４、５及び６に示す通り、このライブラリーフォーマットにより、多様なレパートリーの高親和性抗体の容易な選別及び親和性成熟が可能になる。このライブラリーのスクリーニング結果より、＜１０６を下回るメンバーの比較的レパートリーの少ないライブラリーが、好ましい結合及び／又は機能特性を表す進行中の抗体超変異と組み合わされる場合、高親和性抗体の創出にうまく使用できることが示される。
【０７８１】
実施例８
合成ＣＤＲ
本発明の合成ポリヌクレオチド配列を模式的に図２２中に示す。本実施例では、好ましいホットスポット（ＡＧＣＴＡＣ；配列番号４０４）を伴う好ましいＳＨＭコドンを含有する環状に順序を変えられた２つのＷＲＣモチーフを含有する合成ＣＤＲ３ドメインが、ＳＨＭ耐性配列の境界を創出すべく、２つのノナマーの理想的コールドスポット（ＧＴＣＧＴＣＧＴＣ；配列番号４０５）内に含まれる。下記に示す通り、ホットスポット（太字）のリーディングフレーム状況を、ホットスポットモチーフを３つの入手可能な各リーディングフレームの各々に導入できるように操作（下線）し得る。
【０７８２】
【化２６】
0005675109.tif 000086
【０７８３】
図２２中に示す通り、この合成ＣＤＲ配列により、好ましい合成ＳＨＭモチーフがＳＨＭ耐性配列中の変異を最少にする一方で、アミノ酸レベルで標的化された多様性生成を選択的に駆動する能力を実証する機会が提供される。各リーディングフレームにおけるホットスポットの体系的な配置により、アミノ酸変異生成におけるリーディングフレーム状況の影響が実証される。当該コンストラクトにより、ネイティブな配列を認識する制限酵素の使用を通して変異していないベクターを除去する能力が更に提供され、（変異していない配列が除去されるため）変異配列の解析がより効率的になる。更に当該実験は、任意の特定の変異事象について、あるいはそれに対して選択するための選択圧の非存在下で行うことができる。
【０７８４】
Ａ．合成及びクローニング
３種の合成ＣＤＲ３抗体コンストラクトのうちの１種の完全なポリヌクレオチド配列を以下に示す。この配列中、合成ＳＨＭ最適化配列は大文字で示し；ホットスポットは太字の大文字で示し、コールドスポットは斜体の大文字で示す。またあらかじめ作られた抗体スキャフォールドにＰＣＲ増幅した、自然発生的なＣＤＲ３配列をライゲートするのに用いられる、実施例３、４、５、６、及び７中で用いられるＢｂｓＩとＡｃｌＩ制限消化サイトの位置が太字の小文字で示される：
【０７８５】
【化２７】
0005675109.tif 000087
【０７８６】
クローニング及び構築に用いる合成ＣＤＲ３配列全ての実際の合成配列を以下に示す：
【０７８７】
【化２８】
0005675109.tif 000088
【０７８８】
これら配列に対応する、上記提示の対応する核酸配列はＤＮＡ  ２．０(Menlo Park,CA)により作製でき、配列解析により正しく合成されているかを確認する。
【０７８９】
これらの配列は、自然発生的なＰＣＲ増幅ＣＤＲ３と共に実施例５、６及び７中に記載した通りの重鎖スキャフォールド中に記載されたのと同じ方法論及びクローニング工程を用い、前に記載の重鎖スキャフォールドに挿入できる。
【０７９０】
Ｂ．解析及び試験
上記に示す各置換において、理想的なＣＤＲ３ホットスポットには、単一のＳｆｃＩ制限部位が含まれ、これはその位置でＳＨＭを起こしていないライブラリー集団内の全ての配列除去することを可能にする。このことは、変異していない配列がレスキューされ、そしてクローニングされることがないようにすることによって解析が簡易化され、スピードアップする。
【０７９１】
当該コンストラクトにおける選択的な変異誘発及び多様性生成を確立するために、以下の工程を行う。
【０７９２】
１．細胞のトランスフェクション
Ｈｅｋ  ２９３細胞を６ウェルマイクロタイターディッシュ中、約４ｘ１０５／ウェルの密度で播種する。２４時間後、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(Indianapolis,IN)のＦｕｇｅｎｅ６試薬を用い、試薬とＤＮＡの比率をウェル当たり３μＬ：１μｇＤＮＡとしてで、それぞれブラストサイジン及びハイグロマイシン耐性を付与する合成重鎖及び代表的な軽鎖を含む発現ベクターと共にトランスフェクションを行う。トランスフェクションは製造元ーのプロトコールに従って行う。
【０７９３】
合成重鎖コンストラクトを安定して(stabling)発現する細胞を上記の通りの標準的な方法論を用いて創出し、ＦＡＣＳにより特性解析して細胞表面上に発現する抗体のコピー数を明らかにする。簡単に言えば、トランスフェククトした細胞を染色するため重鎖及び軽鎖に対する蛍光タグ抗体を用い、５００，０００を上回るインタクトな重鎖及び軽鎖のコピー数を示すものを選択する。
【０７９４】
軽鎖及び重鎖発現の染色は例えば、市販のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合ラット抗マウスＩｇカッパ軽鎖及びＦＩＴＣ又はＲ−ＰＥ結合ラット抗マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体(BD Pharmingen)を用いることにより実施することができる。製造元提示のプロトコールを用い、通常標識抗体存在下、試験細胞の氷上での３０分のインキュベーションを介して染色を行うことができる。
【０７９５】
発現レベルは、測定する細胞抗原の発現の定量解析を可能にするＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ(Spherotech,IL)を用いて定量化できる。
【０７９６】
安定して高レベルで重鎖及び軽鎖を発現する細胞は標準的なフロー及び選別プロトコールを用いてＦＡＣＳ選別により単離でき、選別した細胞は解析用の基質として用いるために続けて増殖させることができる。
【０７９７】
上記の通りの、重鎖及び軽鎖を発現する選別された細胞は、次いで上記の通りの標準的なトランスフェクション条件を用いて誘導型コールドＡＩＤを含有する発現ベクターでトランスフェクトできる。トランスフェクションから３日後、選択圧がかかり、誘導型ＡＩＤ発現ベクターを含む新たな安定な細胞集団が増殖する。
【０７９８】
この細胞集団が増殖し、テトラサイクリン又はそのアナログの添加を介してＡＩＤ発現を約６〜２４時間誘導する。細胞を約２〜５日間増殖させ、サイクルを２〜５回繰り返して合成ＣＤＲに多様性を生み出す。
【０７９９】
適切な時間、例えば２〜３週間、の後、ベクターを細胞からレスキューすることができ、対応する重鎖ｃＤＮＡ配列を解析して各合成ＣＤＲにもたらされる変異のパターンを決定する。例えば、ＰＣＲ増幅断片はＳｆｃＩで消化でき、次いで恐らくＡＩＤの作用によりＳｆｃＩサイトが除去されたＤＮＡのクローニングを可能にするために、当該断片を再増幅する。
【０８００】
２．エピソームレスキュー
エピソームベクターはインテグレートされないままに残り、宿主細胞の染色体物質から容易に分離できるので、プラスミドをＨｉｒｔ(Hirt,1967;Kapoor and Frappier,2005;Yates et al.,1984)の方法により回収でき、コンピテントな細菌に形質転換でき、更にコードされたポリペプチドの配列、アイデンティティー及び／又は特性を確認するために操作できる。
【０８０１】
推定で、各細胞当たり平均３個の８，０００ベースペアー（ｂｐ）の内在エピソームを用いると、細胞百万個当たりおおよそ３０ピコグラム（ｐｇ）の収率が期待できる（例、式１参照）。エレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉへの形質転換効率を、弛緩型環状ＤＮＡ１μｇ当たり１０７コロニーと仮定すれば、それぞれが単一の回収エピソームを表すおおよそ３００個のＥ．ｃｏｌｉコロニーが、百万個の哺乳動物細胞当たり生じることが期待できる。
【０８０２】
式１：
（１０６細胞ｘ３エピソーム／細胞）ｘ（６６０ｇ／モル／ｂｐ）ｘ（８０００ｂｐ／エピソーム）ｘ（１０６コロニー／μｇ）ｘ（１０６μｇ／ｇ），（６ｘ１０２３エピソーム／モル）＝２．６ｘ１０−１１ｇ（１０６細胞当たりのＤＮＡ）
【０８０３】
プラスミドは、標準的な（例、Qiagen,Inc.のプロトコール（手順については、例、www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/PlasmidDNAPurification/PLS_QP_Miniprep/1034641_HB_QIAprep_112005.pdf;及びWade-Martins et al.,Nuc Acids Res 27:1674-1682(1999)を参照）のような）アルカリ溶解の手順を用いても回収できる。１つの側面において、トランスフェクトされた哺乳動物細胞をＱｉａｇｅｎプロトコール中に記載のＥ．ｃｏｌｉと同様にして処理する。最終溶出液中に存在するエピソームを上記の通りコンピテントなＥ．ｃｏｌｉへ形質転換する。Ｈｉｒｔ上清又はアルカリ溶解法のいずれかの使用では、内在エピソームの単離のため、かなりの細胞集団から始める必要がある。１つの非限定的な例において、形質転換したＥ．ｃｏｌｉコロニーで明らかなように、クローン的に派生した細胞５０，０００個から開始して、１０〜２０個の回収エピソームを得ることを期待し得る。
【０８０４】
トランスフェクトされた遺伝子を特性解析する為の別の標準的な方法には、エピソーマルであるか、インテグレートされたかに関わらず、関係する細胞集団で直接ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を行い、続いて得られる個々のＰＣＲ断片をクローニングし、特性解析することを包含する。この方法は大量の細胞集団から開始する必要が無いという利点を有する。内在性の活性を持つ抗体のオープンリーディングフレームのＰＣＲ増幅は、細胞１個程度で首尾よく行うことができる。これには、目的の細胞の単離から、原因となるオープンリーディングフレームの配列決定の時点までの時間を短縮する効果がある。
【０８０５】
更に別の選択肢は、単離細胞で逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うこと、したがって発現しているｍＲＮＡを介して内在性ポリペプチドの同定及び特性解析を行うことである。
【０８０６】
又は当該ライブラリーは抗体の、例えば以下実施例９に記載の通りの、目的とするいずれかの特定の標的抗原又はエピトープに対する親和性成熟の出発点として使用できる。
【０８０７】
実施例９
核酸ライブラリー由来抗体の選択及び親和性成熟
以前に記載したとおり、抗体は増強された特性を伴う変異タンパク質を作り出すための、ＳＨＭが適用できる未改変の鋳型を提供する。そのような改良された抗体は、親和性選択に基づき、例えばＦＡＣＳを介して、又は磁気ビーズへの結合を介して選択し得る。
【０８０８】
Ａ．合成及びクローニング
プロトタイプの重鎖及び軽鎖並びに軽鎖コンストラクトの構築を実施例４〜８中に記載する。
【０８０９】
細胞表面上に抗体を発現させるため、重鎖をマウスＨ２ｋｋ（ＭＨＣタイプＩ）細胞膜表在性貫通タンパク質、膜貫通タンパク質、及び細胞質ドメインとのキメラ分子として開発する。Ｈ２ｋｋ配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のヌクレオチドデータベースのアクセッション番号ＡＫ１５３４１９から決定する。
【０８１０】
細胞表面結合性キメラ重鎖スキャフォールド全長のヌクレオチド配列を実施例５に列挙する。カッパ及びラムダ重鎖スキャフォールドのヌクレオチド配列を実施例５に示す。
【０８１１】
１．細胞のトランスフェクション
Ｈｅｋ  ２９３細胞を６ウェルマイクロタイターディッシュ中、約４ｘ１０５／ウェルの密度で播種する。２４時間後、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(Indianapolis,IN)由来のＦｕｇｅｎｅ６試薬を用い、試薬とＤＮＡの比率はウェル当たり３μＬ：１μｇＤＮＡで、所望の組み合わせの重鎖及び軽鎖発現ベクターと共にトランスフェクションを行う。重鎖及び軽鎖発現ベクターは、それぞれブラストサイジン及びハイグロマイシン耐性を付与する。トランスフェクションは製造元のプロトコールに従って行う。
【０８１２】
２．ペプチドによる選別
単純なテスト例の抗体は、十分特性解析された抗原であるニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）に対して選択され得る。大多数のニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）結合表面を含む、未標識且つビオチン化したペプチドモノマー配列を合成する。当該ペプチドをダイマーとして提示することが、抗体−ペプチド相互作用の親和性を増大させることにより抗体の結合を増強させるかどうか比較するために、ペプチドダイマー配列も合成できる。タンデムなダイマー及び分枝多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）ダイマーも試験できる。ペプチド及びビオチン化又は未標識ＨＥＬタンパク質を、官能基で修飾されているか、又はストレプトアビジンでコーティングされている常磁性ポリスチレンミクロ粒子表面(Invitrogen,1600 Faraday Ave.PO Box 6482,Carlsbad,CA 92008)にカップリングできる。
【０８１３】
３．ＨＥＬタンパク質及びペプチドのトシル基活性化ミクロ粒子へのカップリング
ＨＥＬタンパク質及びペプチドは、１．５ｍｌの微小遠心チューブ内で２．８ミクロンのトシル基活性化常磁性ポリスチレンミクロ粒子にカップリングする(Nilsson K and Mosbach K.Eur.J.Biochem.1980:112:397-402)。ミクロ粒子（２ｅ０９ミクロ粒子／ミリリットル）を洗浄し、１ｅ０９ミクロ粒子／ｍｌの濃度で１００ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５中に再懸濁する。１１ナノモルのペプチド又は６ｕｇ／ｍｌのＨＥＬをミクロ粒子に添加し、ミクロ粒子／ペプチド混合物を室温で少なくとも４８時間、低速で傾斜回転させつつインキュベートした。インキュベートの後、上清を除去し、ミクロ粒子を１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する１ｍｌリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２で洗浄する。最後に、ミクロ粒子を１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する１ｍｌ  ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁する。
【０８１４】
４．ビオチン化ＨＥＬタンパク質及びペプチドのストレプトアビジン結合ミクロ粒子へのカップリング
別の選択肢では、その表面が単層のストレプトアビジンに共有結合で連結している常磁性ポリスチレンミクロ粒子にビオチン化ペプチドをカップリングする。簡単に言えば、ストレプトアビジンミクロ粒子を洗浄し、１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する１ｍｌ  ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁し、３３ピコモルのビオチン化ペプチド又はおおよそ１０ｕｇ／ｍｌのビオチン化ＨＥＬをミクロ粒子溶液に添加する。ミクロ粒子／ペプチド溶液を室温で３０分間、低速で傾斜回転させつつインキュベートできる。カップリング後、ミクロ粒子洗浄でき、再懸濁してミクロ粒子の最終濃度を１ｅ０９ミクロ粒子／ｍｌにできる(Argarana et al.,1986;14(4):1871-82;Pahler et al.,J Biol Chem 1987:262(29):13933-7)。
【０８１５】
５．細胞の選別
ペプチド結合常磁性ミクロ粒子に結合する細胞を単離するために、トランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３細胞をスクリーニングする。選別用に、抗体を発現しない類似の対照細胞株をネガティブコントロールとして用いる。
【０８１６】
細胞を等体積のＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で洗浄し、１％（重量／体積）ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁して最終濃度を１ｅ０７細胞／ｍｌにする。１ｅ０６個のネイキッドなミクロ粒子を細胞に添加し、ローテーター上、４℃で３０分インキュベートすることにより細胞をプレクリアにする。未結合の細胞を静かに新たなチューブへ移す。ペプチド結合又はネイキッドなミクロ粒子（１ｅ０７）を当該細胞入りのチューブへと移し、細胞：ミクロ粒子混合物をローテーター上、４℃で３０分インキュベートできる。未結合の細胞を除去し、ミクロ粒子：細胞混合物を冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄できる。ミクロ粒子及び付着細胞を１００ｕｌ細胞培養培地中に再懸濁し、当初は９６ウェルプレートの１ウェルで増殖させることができる。ミクロ粒子に結合した細胞数が測定でき、細胞を次回のセレクションまで増殖させることができる。ペプチド結合ミクロ粒子上で選別したミクロ粒子に結合した細胞の数を、ネイキッドなミクロ粒子に結合した細胞及び抗体を発現しない細胞に結合した細胞と比較する。
【０８１７】
６．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟
上記した最初の選択で得られる、重鎖及び軽鎖を安定して発現する（即ち、機能性抗体を発現する）細胞を、ＦＡＣＳにより特性解析して細胞表面上に発現する抗体のコピー数を明らかにする。簡単に言えば、トランスフェクトした細胞を染色するため重鎖及び軽鎖に対する蛍光タグ抗体を用い、５００，０００を超えるインタクトな重鎖及び軽鎖コピー数を示すものを選別する。
【０８１８】
軽鎖及び重鎖発現の染色は例えば、市販のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合ラット抗マウスＩｇカッパ軽鎖及びＦＩＴＣ又はＲ−ＰＥ結合ラット抗マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体(BD Pharmingen)を用いることにより行うことができる。製造元提示のプロトコールを用い、通常標識抗体存在下、試験細胞の氷上での３０分のインキュベーションを介して染色を行うことができる。
【０８１９】
発現レベルは、測定する細胞抗原の発現の定量解析を可能にするＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ(Spherotech,IL)を用いて定量化できる。
【０８２０】
安定して高レベルで重鎖及び軽鎖を発現する細胞は標準的なフロー及び選別プロトコールを用いてＦＡＣＳ選別により単離でき、選別した細胞は親和性成熟用の基質として用いるために続けて増殖させることができる。
【０８２１】
上記の通りの、重鎖及び軽鎖を発現する選別された細胞は、次いで上記の通りの標準的なトランスフェクション条件を用いて誘導型コールドＡＩＤポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターでトランスフェクトできる。トランスフェクションから３日後、選択圧がかかり、誘導型ＡＩＤ発現ベクターを含む新たな安定な細胞集団が増殖する。
【０８２２】
この細胞集団が増殖し、テトラサイクリン又はそのアナログの添加を介してＡＩＤ発現を約６〜２４時間誘導する。細胞を約２〜５日間増殖させ、次いで上記の通りビーズとカップリングしたＨＥＬタンパク質又はペプチドを用いて選別する。
【０８２３】
より高い親和性を伴ってＨＥＬタンパク質又はペプチドに好ましく及び／又は選択的に結合する細胞を、選別して増殖させる。必要であれば、上記の通りＡＩＤ誘導及び変異誘発のラウンドを更に繰り返し、再び、改良された、選択的で、かつ高親和性結合を示す細胞を、さらなる繁殖及び増殖のために保持する。
【０８２４】
得られた新たに改良された変異体は、本明細書中に記載の通り更に特性解析でき、実施例８に記載の通り重鎖及び軽鎖の配列を、ＲＴ−ＰＣＲ又はエピソームレスキュー後に決定できる。
【０８２５】
実施例１０
酵素経路の指示された進化へのＳＨＭライブラリーの適用
既存の治療法への耐性を伴う細菌の進化は、新規抗生物質の発見及び開発において注目されるきっかけとなる。更なる研究のための理想的な候補は、複合的な作用様式を介して作用し、耐性の獲得を有意に、そしてより困難にするものである。そのような抗生物質の１つが、ナイシンである。
【０８２６】
ナイシンはLactococcus lacticの天然産物であるランチビオティクスであり、グラム陽性細菌に対して広範な活性を有し、食物の保存においてListeria monocytogenes及びClostridium botulinum等の病原体に対して一般的に使用される。(Bavin et al.,Lancet.1952 Jan 19;1(3):127-9)ナイシンはリボソームで翻訳され、ポスト翻訳されたペプチドであるが、食物産業において数十年使用されてきたにもかかわらず、共通の耐性機構の誘導が見られていない。この知見は２つの事実の結果のようである：１つはナイシンの殺菌活性の作用様式が、そのＬｉｐｉｄ  ＩＩへの結合及び二次的な孔形成の誘導に由来することである(Breukink et al.,(2006))。Ｌｉｐｉｄ  ＩＩは、グラム陽性細菌によっては容易に改変されない細菌の細胞壁成分であり、その使用は細菌の細胞壁生成の律速段階を形成する。ナイシンは胞子形成阻害にも作用する。
【０８２７】
ナイシンは現在、数種の細菌病原体の処置のための臨床前の開発途上にある。ナイシンは、多剤耐性のStreptococcus pneumoniae、バンコマイシン耐性のEnterococcus faecium、及びStrepococcus pyogenes等の数種の病原体への一定範囲の活性を示すが、それらすべてが、新たな治療が是非とも必要な領域である(Goldstein et al.,(1998))。ある研究では（マウスにおける）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの処置において、ナイシンがバンコマイシンよりも８〜１６倍強力であることが示された(Brumfitt et al.,2002)。
【０８２８】
これらの有望な特徴にもかかわらず、ナイシン及び他のランチビオティクスはいくつかの重大な限界をかかえている。細菌は、密接に関連する（同系の）種でさえ、ナイシン及び他のランチビオティクスに対する感受性に有意な多様性を示す。第二に、ナイシンは哺乳動物の循環系から迅速に一掃される。ナイシンが真に効果的な治療薬となるには、広範な殺菌活性を伴う改善された薬理動態特性を有することが必要である。ここで、質的改善を伴うナイシンを設計するのにＳＨＭを適用することを検討する。
【０８２９】
生物活性を持つナイシンの生合成はたった５つのＬ．ｌａｃｔｉｓのタンパク質、ＮｉｓＡ，ＮｉｓＢ，ＮｉｓＣ，ＮｉｓＰ、及びＮｉｓＴに依存することが示されている(Kuipers et al.,2004,Rink et al.,(2005))。ＮｉｓＡは、いくつかのセリン及びスレオニン部位でＮｉｓＢにより脱水される前駆体ペプチドをコードし、ＮｉｓＣにより５箇所で環状化される修飾ペプチドとなる。最後に、プロテアーゼのＮｉｓＰにより当該抗生物質前駆体のリーダーペプチドが切断され、トランスポーターのＮｉｓＴにより培地へと排出される（図２３参照）。それぞれがＮｉｓＣにより触媒される５つのチオエステル環は、ランチオニンと称され、修飾ペプチド抗生物質であるランチビオティクスファミリーを定義づける。
【０８３０】
本経路のモジュール特性、生物活性の容易なアッセイ、広範な特異性及びデヒドラターゼ及びシクラーゼのＮｉｓＢ及びＮｉｓＣの活性により、これを、ＳＨＭによって駆動される共進化に対する理想的な標的とし、新規抗生物質コンストラクトが製造される。１つのアプローチにおいて、そのような戦略はある種の遺伝子、又は遺伝子の部分をＳＨＭに対してより感受性とすることに基づき得るが、一方では他の遺伝子、又はそのような遺伝子の部分をＳＨＭに耐性とすることに基づき得る。
【０８３１】
ナイシン生合成に関わる５つの遺伝子のアミノ酸配列を以下に示す：これらの配列においては、太字の残基はそれらの位置がＳＨＭに対してホットにされるものであることを示すが、一方で下線の残基は、ＳＨＭに対してコールドにされるものであることを示している。
【０８３２】
ＮｉｓＡ，ネイティブ遺伝子>NisA|gi|530218|gb|AAA26948.1|ナイシン[Lactococcuslactis];配列番号413
【０８３３】
【化２９】
0005675109.tif 000089
【０８３４】
ＮｉｓＣ，ネイティブ遺伝子>NisC|gi|44045|emb|CAA48383.1|nisC[Lactococcus lactis];配列番号414
【０８３５】
【化３０】
0005675109.tif 000090
【０８３６】
ＮｉｓＢ，ネイティブ遺伝子>gi|473018|emb|CAA79468。1|NisBタンハ゜ク質[Lactococcus lactis];配列番号415
MIKSSFKAQPFLVRNTILSPNDKRSFTEYTQVIETVSKNKVFLEQLLLANPKLYNVMQKYNAGLLKKKRVKKLFESIYKYYKRSYLRSTPFGLFSETSIGVFSKSSQYKLMGKTTKGIRLDTQWLIRLVHKMEVDFSKKLSFTRNNANYKFGDRVFQVYTINSSELEEVNIKYTNVYQIISEFCENDYQKYEDICETVTLCYGDEYRELSEQYLGSLIVNHYLISNLQKDLLSDFSWDTFLTKVEAIDEDKKYIIPLKKVQKFIQEYSEIEIGEGIEKLKEIYQEMSQILENDNYIQIDLISDSEINFDVKQKQQLEHLAEFLGNTTKSVRRTYLDDYKDKFIEKYGVDQEVQITELFDSTFGIGAPYNYNHPRNDFYESEPSTLYYSEEEREKYLSMYVEAVKNHNVINLDDLESHYQKMDLEKKSELQGLELFLNLAKEYEKDIFILGDIVGNNNLGGASGRFSALSPELTSYHRTIVDSVERENENKEITSCEIVFLPENIRHANVMHTSIMRRKVLPFFTSTSHNEVQLTNIYIGIDEKEKFYARDISTQEVLKFYITSMYNKTLFSNELRFLYEISLDDKFGNLPWELIYRDFDYIPRLVFDEIVISPAKWKIWGRDVNNKMTIRELIQSKEIPKEFYIVNGDNKVYLSQENPLDMEILESAIKKSSKRKDFIELQEYFEDENIINKGQKGRVADVVVPFIRTRALGNEGRAFIREKRVSVERREKLPFNEWLYLKLYISINRQNEFLLSYLPDIQKIVANLGGKLFFLRYTDPKPHIRLRIKCSDLFLAYGSILEILKRSQKNRIMSTFDISIYDQEVERYGGFDTLELSEAIFCADSKIIPNLLTLIKDTNNDWKVDDVSILVNYLYLKCFFQNDNKKILNFLNLVSPKKVKENVNEKIEHYLKLLKVDNLGDQIFYDKNFKELKHAIKNLFLKMIAQDFELQKVYSIIDSIIHVHNNRLIGIERDKEKLIYYTLQRLFVSEEYMK
【０８３７】
ＮｉｓＰ，ネイティブ遺伝子>gi|730155|sp|Q07596|NISP_LACLAナイシンリーダーペプチドをプロセッシングするセリンプロテアーゼｎｉｓＰ前駆体；配列番号４１６
MKKILGFLFIVCSLGLSATVHGETTNSQQLLSNNINTELINHNSNAILSSTEGSTTDSINLGAQSPAVKSTTRTELDVTGAAKTLLQTSAVQKEMKVSLQETQVSSEFSKRDSVTNKEAVPVSKDELLEQSEVVVSTSSIQKNKILDNKKKRANFVTSSPLIKEKPSNSKDASGVIDNSASPLSYRKAKEVVSLRQPLKNQKVEAQPLLISNSSEKKASVYTNSHDFWDYQWDMKYVTNNGESYALYQPSKKISVGIIDSGIMEEHPDLSNSLGNYFKNLVPKGGFDNEEPDETGNPSDIVDKMGHGTEVAGQITANGNILGVAPGITVNIYRVFGENLSKSEWVARAIRRAADDGNKVINISAGQYLMISGSYDDGTNDYQEYLNYKSAINYATAKGSIVVAALGNDSLNIQDNQTMINFLKRFRSIKVPGKVVDAPSVFEDVIAVGGIDGYGNISDFSNIGADAIYAPAGTTANFKKYGQDKFVSQGYYLKDWLFTTANTGWYQYVYGNSFATPKVSGALALVVDKYGIKNPNQLKRFLLMNSPEVNGNRVLNIVDLLNGKNKAFSLDTDKGQDDAINHKSMENLKESRDTMKQEQDKEIQRNTNNNFSIKNDFHNISKEVISVDYNINQKMANNRNSRGAVSVRSQEILPVTGDGEDFLPALGIVCISILGILKRKTKN
【０８３８】
ＮｉｓＴ，ネイティブ遺伝子>gi|44044|emb|CAA48382.1|nisT[Lactococcus lactis]；配列番号４１７
MDEVKEFTSKQFFYTLLTLPSTLKLIFQLEKRYAIYLIVLNAITAFVPLASLFIYQDLINSVLGSGRHLINIIIIYFIVQVITTVLGQLESYVSGKFDMRLSYSINMRLMRTTSSLELSDYEQADMYNIIEKVTQDSTYKPFQLFNAIIVELSSFISLLSSLFFIGTWNIGVAILLLIVPVLSLVLFLRVGQLEFLIQWQRASSERETWYIVYLLTHDFSFKEIKLNNISNYFIHKFGKLKKGFINQDLAIARKKTYFNIFLDFILNLINILTIFAMILSVRAGKLLIGNLVSLIQAISKINTYSQTMIQNIYIIYNTSLFMEQLFEFLKRESVVHKKIEDTEICNQHIGTVKVINLSYVYPNSNAFALKNINLSFEKGELTAIVGKNGSGKSTLVKIISGLYQPTMGIIQYDKMRSSLMPEEFYQKNISVLFQDFVKYELTIRENIGLSDLSSQWEDEKIIKVLDNLGLDFLKTNNQYVLDTQLGNWFQEGHQLSGGQWQKIALARTFFKKASIYILDEPSAALDPVAEKEIFDYFVALSENNISIFISHSLNAARKANKIVVMKDGQVEDVGSHDVLLRRCQYYQELYYSEQYEDNDE
【０８３９】
ＮｉｓＢ，ＮｉｓＰ及びＮｉｓＴ
上記した通り、ＳＨＭ耐性（コールド）型の必須遺伝子ＮｉｓＰ及びＮｉｓＴが作り出されることは、これらの遺伝子が、多様性を生み出すための標的となるＳＨＭ感受性遺伝子よりも低い割合で変異する傾向にあるであろうことを意味する。ＮｉｓＰ及びＮｉｓＴは両方とも、現在ナイシンに対して広範な特異性を有し、且つ翻訳後修飾されたペプチドに潜在的な多様性を付加しない。この冒頭の例においては、ＮｉｓＢもＳＨＭ耐性にされるが、ＮｉｓＡについて以下に概説される指針と同じ指針に従って、選択的に変異させることもできる。対応するこれら遺伝子の野生型及びコールド型を図２４、２５、２６、２７及び２８に示す。
【０８４０】
ＮｉｓＡペプチド
上記に示す通り、ＮｉｓＡペプチドのリーダーペプチド領域の大半は、この配列がＮｉｓＢＣＰＴによる基質認識に絶対的に必要であるため、ＳＨＭ介在性の変異誘発にコールドとするべきである。残りのＮｉｓＡペプチド配列の大部分はＳＨＭ介在性の変異誘発にホットにすべきであり、あるいは上記に示すとおりランチオニン類の生成に関与する鍵となる残基はＳＨＭに耐性としてもよく、それによってそれらの変異誘発の割合を低減できる。
【０８４１】
ＮｉｓＡポリヌクレオチド配列の対応する野生型及びコールド型ポリヌクレオチドをそれぞれ図２９中に示す。ＮｉｓＡのコドンを最適化することによって、リーダー配列中２０個のコールドスポットが作り出され、１個以外は全てホットスポットが除去される。そして当該分子の残りの部分において、野生型配列でははホットスポットが８個なのに比べ１７個のホットスポットが作り出される。
【０８４２】
ＮｉｓＣタンパク質
上記（太字の残基、上記、及び図２３Ｂ）に概説したような、基質認識及び環状化に関わるＮｉｓＣの領域は、ＳＨＭ介在性の変異にホットとすることができ、それらは活性及び特異性の変化を伴う変異体を作出する蓋然性が高まり、よって改変された修飾及び生物活性を伴う成熟ナイシン分子が作り出される。当該タンパク質の安定性のみを支配する構造領域はコールドにできる。ＮｉｓＣポリヌクレオチド配列の対応する野生型ポリヌクレオチド及びコールド型ポリヌクレオチドをそれぞれ図３０及び３１に示す。
【０８４３】
この遺伝子中の標的化ホットスポット作成の具体例を以下に示す
【０８４４】
本実施例中では、更なるホットスポットが目的の領域（ＬＳＴＧ）中へと挿入され、且つコールドスポットが除去されている。更に、フランキング配列は有意に、よりＳＨＭ耐性とされている。
【０８４５】
【化３１】
0005675109.tif 000091
【０８４６】
野生型ポリヌクレオチド配列：
【０８４７】
【化３２】
0005675109.tif 000092
【０８４８】
最適化ポリヌクレオチド配列：
【０８４９】
【化３３】
0005675109.tif 000093
【０８５０】
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が確実に無いことを最終的に点検した後、完全な合成ポリヌクレオチド配列を合成し(DNA2.0,Menlo Park,CA)、適切なクローニングベクターにクローニングし、そして正しく合成されていることを確認するために配列決定することができる。
【０８５１】
次いで合成遺伝子を発現ベクターに導入し、及び適切な細菌株、例えば以前に記載されたLactococcus lactis株(Mota-Meira et al.,1997)にＡＩＤ(Besmer et al.,2006)又はＡｐｏｂｅｃ−１酵素等のＡＩＤホモログと共に、形質転換してもよい。
【０８５２】
スクリーニングは、ＳＨＭを介して生じる多様性が、現在はほとんどナイシンによって標的化されていないグラム陽性細菌標的と共培養されたL. lactisを進化させることにより遂行され得る。結果的に、選別された標的細菌に対する活性が増強した変異型ナイシン遺伝子を含むL. lactis株が生じるであろう。
【０８５３】
工程の進行を評価するために、生じた細胞培養物の培養液上清の質量分析を用いることができる（即ち、病原体への活性が向上した新規ランチビオティクスの同定）。
【０８５４】
実施例１０−参考文献
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【０８５５】
実施例１１
体細胞超変異を介した酵素の迅速な進化のための合成ライブラリー設計
改変されたＤＮＡ結合特異性を示すジンクフィンガータンパク質
転写因子はＤＮＡ及びＲＮＡに結合し、真核生物の核内に位置する。転写因子は、当該因子の活性を最適化するための、本明細書中に記載の通りの体細胞超変異の候補である。
【０８５６】
真核生物中にはいくつかの転写因子ファミリーがあるが、そのうちＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質は最も一般的である。ジンクフィンガードメインは２つのヒスチジン及び２つのシステイン残基によってコーディネートされた配位した単一の金属亜鉛により安定化される。各ドメインはおおよそ３０アミノ酸残基を含有し；各ドメインはβシートとαへリックスが混合した二次構造を含有し、αへリックス中の残基がＤＮＡ又はＲＮＡとの接触結合を仲介する（図３２）。タンパク質は共通してタンデムなフィンガーアレイ中で構成され、各フィンガーが隣接するトリヌクレオチドサブサイト（図３２）又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの主溝内領域に結合し、特定のアミノ酸が特定のＤＮＡ又はＲＮＡ塩基と接触する（例えば、図３３を参照）。
【０８５７】
工夫されたＤＮＡ結合特異性を伴う転写因子により科学的及び治療的機能を伴う、強力で広範に適用できる技術が提供される。例えば、標的遺伝子への特異性を示すジンクフィンガータンパク質は転写を亢進又は阻害し得るか、又はまだ翻訳されていないのｍＲＮＡメッセージを隔離し得る。同様に、ジンクフィンガータンパク質と、例えば酵素活性、治療活性、又は診断活性を有するタンパク質ドメインとの融合により診断及び治療用タンパク質の設計に関して別の生産的な手段を提供し得る。ジンクフィンガータンパク質の例としては、癌特異的ＤＮＡ損傷の認識において結合し蛍光を発するもの、又は特定のゲノム領域を治療剤部分の標的にするものが挙げられるが、これらに限定されない。１つの側面において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）は植物、昆虫、及びヒトにおいてゲノム改変を標的にする強力なツールとなる可能性を有する。ＺＦＮは非特異的エンドヌクレアーゼドメインに結合した工夫したジンクフィンガータンパク質を組み入れ、相同又は非相同組み換えを促進する二重鎖損傷を導入できる。目的とする特定ゲノム領域又は治療標的を修飾する能力はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの研究及び遺伝子治療適用の用途を有する。この技術の適用は、目的とするゲノム遺伝子座を標的にするジンクフィンガードメインを設計する能力に依存する。
【０８５８】
ネイティブな、及び設計された無数のジンクフィンガーＤＮＡ複合体の構造がＸ線結晶解析により決定され、単一のジンクフィンガーによるＤＮＡトリヌクレオチドモチーフの認識について説明する基本的な法則が確立されている(Wolfe SA,Grant RA,Elrod-Erickson M,Pabo CO Beyond the“recognition code”:structures of two Cys2His2 zinc finger/TATA box complexes Structure(2001)9(8):717-23.)。より大きなＤＮＡモチーフに結合するジンクフィンガータンパク質の理論的なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計が継続して研究され、より高い特異性を伴うより大きな結合部位を創出し、そして選択するために種々のライブラリーアプローチ採用されており、いくつかは複数ラウンドの選択及びコンストラクト操作を包含する(Rebar et al.1994)。ホモ  サピエンスゲノムの単一領域に特異性を示すジンクフィンガータンパク質の結合を標的とするために、典型的には少なくとも約１８ヌクレオチドの認識部位が必要である。各フィンガーは最大４又は５アミノ酸をトリヌクレオチドモチーフとの結合に利用でき、ファージ又はリボソームライブラリーの複雑度を優に超える最大（２０４）５、即ち〜１ｘ１０２６メンバーの静的ライブラリーが最適なＤＮＡ結合配列を見出すのに必要である(Roberts,RW,1999)。
【０８５９】
標的変異誘発を起こすことができるジンクフィンガータンパク質ライブラリーへのＳＨＭの適用及び選択により、この設計の問題に理想的な解決がもたらされる。体細胞超変異は、最初はライブラリー中に存在しない新規の変異を所望の位置及び所望でない位置（１以上のコドン）で生成できるので、新規結合タンパク質の生成及び選択用にいくつかの戦略が利用可能である。
【０８６０】
タンパク質の各フィンガーはそれらの構造的な安定に必須の領域から構成される。可能な程度に、これらの位置における残基を、機能欠損になり得る変異を避けるためＳＨＭにコールドにしなければならない。この例を図３３に示す：ジンクフィンガーの結合機能の保持のため保存しなければならない位置は、金属亜鉛に結合するシステイン及びヒスチジン残基、並びに保存された芳香族及び疎水性アミノ酸である。本実施例において、アミノ酸のバリンが、図３３に示すフィンガー中で各システインに先行する。当該バリンもシステインも、ＤＮＡ結合及び認識に何の役割も果たさない。これら２種のアミノ酸をコードするために８通りの可能なコドンの組み合わせが使用できる。可能な全ての４０９６の２コドンの組み合わせを評価し、ヘキサヌクレオチドの組み合わせ、ＧＴＧＴＧＣを、４０９６の可能な配列中、そのＳＨＭをリクルートする能力において４０６０番目に序列する；即ちＳＨＭに対する「コールドスポット」は、ＳＨＭが介在する変異誘発を防止するために優先的に選択できる。
【０８６１】
各ジンクフィンガーは、アミノ酸、ヌクレオチド塩基の直接的な接触を介してＤＮＡへの結合に関与する領域及び残基を含有し、これらは典型的には、結合変異体を創出するため静的ライブラリーにおいて変化させる位置である。ＳＨＭを用いてこれらの位置に多様性を生み出すための、静的ライブラリーのアプローチと組み合わせた、又はそれとは別の、以下に検討する可能性のある２つの戦略が利用できる：
【０８６２】
ジンクフィンガー設計の最初のアプローチにおいて、図３２に見られるような既存のジンクフィンガーのＤＮＡ結合コンストラクトに近い変異体を同定するのは実行可能である。１つの側面において、ただ１つのＤＮＡ塩基又は１箇所の結合サブサイトが相違するＤＮＡ配列に結合させるために、結合する既存のジンクフィンガーを変化させなくてはならない。この例において、単一フィンガー内又は局所領域内の１箇所又は数箇所のアミノ酸び位置のみが相違するジンクフィンガー結合変異体を創出及び選択し得る。１つの非限定的な実施形態において、ＳＨＭ介在性の変異誘発法のリクルートに最適化した既存のジンクフィンガー配列を用い、一方で残りの、不変フィンガーをＳＨＭにコ−ルドにすることが、１つの設計を意味する。例えば、図３２にはフィンガー１の詳しい図を示すが、連続する残基のグルタミン酸（Ｅ）及びヒスチジン（Ｈ）がＤＮＡに接触する。ＥＨをコードする、考えられる４種のヘキサペプチド(hex peptides)のうちの１つ、ＧＡＧＣＡＣ（配列番号４１９）は、他の３通りの可能性よりもＳＨＭ介在性の変異誘発に対して有意により「ホット」（感受性）である。ＳＨＭ用に対して「ホットスポット」を作り出すＤＮＡ暗号の基礎となるサイレント置換が望ましい。同様に、選択過程の間不変のままと期待されるジンクフィンガー２及び３のＤＮＡ結合残基及び領域に対するサイレントな「コールドスポット」置換も採用できる。
【０８６３】
ＤＮＡに結合する接触を仲介することが知られる部位で、且つ多様性を生み出すべき部位での「好ましいホットスポットＳＨＭコドン」の導入が、ライブラリー設計への二番目のアプローチである。リファレンスのリーディングフレーム中に提示されるいくつかのＳＨＭホットスポットモチーフが多様性を生み出す役割を果たすというのが、ＳＨＭ「ホットスポット」解析の知見の１つである。図１及び図２中に示すとおり、同一のホットスポットモチーフに（選択圧下）作用する同一のＳＨＭ介在性変異誘発活性のスペクトルにより、イムノグロブリン重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（図１）及びフレ−ムワーク領域（図２）内で見る場合、異なった結果が生じる。この知見は、リファレンスのホットスポット用のコドンリーディングフレームが、導入された変異がサイレント（アミノ酸における変化を生じないコドン中での変化で、フレームワーク領域で最も一般的）か否か、又は当該変異がアミノ酸の多様性を生じるか否かに影響を有するということに基づく。この観察の結果として、ＡＧＣ（セリン）、ＴＡＴ、（チロシン）、ＴＡＣ（チロシン）、及びＡＡＣ（アスパラギン）、等のいくつかのコドンが、無作為にアッセンブリされたライブラリー中に配置された場合（図３（ＷＡＣ）及び図５（ＷＲＣ））、親和性成熟抗体中に見られる通り、アミノ酸の多様性を自然に生じさせる、密接に交互配置したホットスポットを生み出す（図４及び図６）。次いで、同様のアプローチをジンクフィンガーアレイのライブラリー設計に適用する。ＤＮＡ結合及び特異性に寄与することが知られる領域、特に各フィンガーのαへリックスのｎ末端側残基は、単純化したこれらのコドンアルファベットからすべて構築されてもよい。図４及び図６に見られる通りこのアプローチは、ＳＨＭ介在性変異誘発と組み合わせる場合、各位置で迅速にアミノ酸の多様性（２０のうちの１５アミノ酸）を生み出す。このアプローチを、３種のジンクフィンガーコンストラクトの静的ライブラリーのより典型的なコンストラクションと対比すると、結果生じるライブラリーの複雑度における相違は明瞭である。単純なＮＮＫコドンベースのライブラリーは、フィンガー当たり５つのＮＮＫライブラリー位置、そして合計３つのフィンガーを伴いは：（４＊４＊２）＾（５＊３）＝３．７７＊１０２２のあり得るメンバーを有するであろう。対照的に、３つのフィンガーにわたる５つの無作為な位置を伴う同一のジンクフィンガーライブラリーのＷＲＣライブラリー製作では、たった２＾（５＊３）＝３２７６８のメンバーしか有しないであろう。次いで、当該相違は、いずれの選択技法を用いても部分的にすら提示できない静的ライブラリーと、標準的な選択方法を用いて容易且つリダンダントに提示できるＳＨＭベースのライブラリーとの相違である。最後に、これらのＷＡＣ及びＷＲＣライブラリーの方法論は以上概説した通り、機能的に保存され、且つ重要な領域をＳＨＭ介在性の変異誘発にコールドにするために戦略により組み合わされてもよい。
【０８６４】
実施例１１−参考文献：
1.Bae,K.H.,Do Kwon,Y.,Shin,H.C.,Hwang,M.S.,Ryu,E.H.,Park,K.S.,Yang,H.Y.,Lee,D.K.,Lee,Y.,Park,J.,Sun Kwon,H.,Kim,H.W.,Yeh,B.I.,Lee,H.W.,Hyung Sohn,S.,Yoon,J.,Seol,W.& Kim,J.S.(2003)Human zinc fingers as building blocks in the construction of artificial transcription factors Nat.Biotech.21,275-80.
2.Bae,K.H.& Kim,J.S.(2006)One-step selection of artificial transcription factors using an in vivo screening system Mol Cells 21:376-380.
3.Jamieson,A.C.,Miller,J.C.& Pabo,C.O.(2003)Drug Discovery with Engineered Zinc-Finger Proteins Nature Reviews Drug Discovery 2,361-368.
4.Hurt,J.A.,Thibodeau,S.A.,Hirsh,A.S.,Pabo,C.O.& Joung,J.K.(2003)Highly specific zinc finger proteins obtained by directed domain shuffling and cell-based selection Proc Natl Acad Sci USA 100,12271-6.
5.Greisman,H.A.& Pabo,C.O.(1997)A general strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites Science 275,657-61.
6.Joung,J.K.,Ramm,E.I.& Pabo,C.O.(2000)A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions Proc Natl Acad Sci USA 97,7382-7.
7.Rebar,E.J.& Pabo,C.O.(1994)Zinc finger phage:affinity selection of fingers with new DNA-binding specificities Science 263,671-3.
8.Wolfe,S.A.,Greisman,H.A.,Ramm,E.I.& Pabo,C.O.(1999)Analysis of zinc fingers optimized via phage display:evaluating the utility of a recognition code J Mol Biol 285,1917-34.
9.Bibikova,M.,Beumer,K.,Trautman,J.K.& Carroll,D.(2003)Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases Science 300,764.
10.Bibikova,M.,Golic,M.,Golic,K.G.& Carroll,D.(2002)Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases Genetics 161,1169-75.
11.Porteus,M.H.& Baltimore,D.(2003)Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells Science 300,763.
12.Roberts,R.W.(1999)Totally in vitro protein selection using mRNA-protein fusions and ribosome display Curr Opin Chem Biol 3(3):268-73.
【０８６５】
実施例１２
ＳＨＭ用に最適化したシードライブラリーの設計
変異部位に体細胞超変異（ＳＨＭ）をリクルートするヌクレオチドモチーフを特性解析するため、そしていずれかのＤＮＡコドン、モチーフ、又は配列ファミリーが時間と共にどのように進化し得るかを決定する１組の予測アルゴリズムを開発するために、親和性成熟抗体を解析した。これらの知見のｉｎ  ｖｉｔｒｏＳＨＭタンパク質進化、コンストラクト及びライブラリー設計への適用を検討する。
【０８６６】
材料及び方法
ＳＨＭ事象の同定
ヒトＩＧＨＶ、ＩＧＫＶ、及びＩＧＬＶ生殖系列抗体配列及びそれらの対立遺伝子型を、ＮＣＢＩ(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)、ＩＭＧＴ抗体データベース(imgt.cines.fr/)、及びヒト抗体遺伝子ＶＢＡＳＥデータベース(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)を含む複数のオンラインソースから集めた。合計２３２種のＩＧＨＶ、５６種のＩＧＫＶ、及び６６種のＩＧＬＶの可変ドメインの生殖細胞系列対立遺伝子を同定した。フレームワーク及び相補性決定領域（ＣＤＲ）に含まれるコドン、Ｋａｂａｔ番号、及びＣＤＲの標準的なループ・ターン構造等の更なる構造的な情報も注記した。
【０８６７】
以下の世界的なウェブサイト：ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/fasta/igSeqNt.gz、で見ることのできる国立生物工学情報(Bioinformatics)センター（ＮＣＢＩ）の抗体データベースから２００７年４月１日に、ヒト親和性成熟抗体配列を収集した。
【０８６８】
我々の戦略は最初に各親和性成熟抗体について元の生殖細胞系列配列らしい配列を同定し、続いてＳＨＭ介在性の親和性成熟の結果として改変が起こったそれらの残基を解析するものであった。生殖細胞系列の前駆体の可能性がある抗体と親和性成熟抗体との間のギャップ無しＢＬＡＳＴアラインメントは、抗体可変領域全長にわたり９４％を超える配列同一性が提供され、他の元の生殖細胞系列の可能性がある配列と比較してベストマッチが提供され、そして配列が同一でなかった場合に、許容された。このデータベースには生殖細胞系列及び親和性成熟抗体の両方から種々の抗体配列（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＭ及びそれらのサブタイプ）が含有されるので、ＳＨＭ介在性改変で生じたと思われる生殖細胞系列ＩＧＨＶ、ＩＧＫＶ及びＩＧＬＶ配列の変化を正確に同定するため、注意を払った。コーディング領域アラインメントの５’及び３’部分（３残基）で同定された変異はこの解析では、更には考慮しなかった。
【０８６９】
このように、生殖細胞系列の配列に対して１２９５６、４１６５及び３８１１のアラインメントでそれぞれ合計１０６９０９のＩＧＨＶ、２４３７８のＩＧＫＶ及び２４９６５のＩＧＬＶ変異を同定した。
【０８７０】
ＳＨＭ用ＤＮＡホットスポット／コールドスポットの同定
ＳＨＭを促進又は阻止するＤＮＡ配列は以下のやり方：ＳＨＭのホット及びコールドモチーフのサイズに関しては何の前提もつけない、で同定した。同様に、モチーフ部位に相対する変異位置を可変にした。上記の通り同定した各変異について、ＳＨＭマシナリー（活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）及びエラープローンポリメラーゼ）のリクルートに関与するいずれかのモチーフを包含するらしい通常９又は１５ヌクレオチド長のヌクレオチド「ウィンドー」を部位周辺に選択した。各Ｘマーのヌクレオチドウィンドー内で、長さｋの全モチーフについて徹底的に捜索したが、ｋマーのモチーフ内で最大ｃ位が変化している配列が出現する。
【０８７１】
ＳＨＭモチーフの出現の統計的有意性についての我々の測定では、全Ｎ個のＸマー変異ウィンドー中でｋマーモチーフが観察される回数（Ｎｓ）を、それが無作為（Ｎｐｓ）に発生する頻度の予測と比較する（式中、Ｎは変異の総数であり、ｐｓは各Ｘマーウィンドー内で１つ以上のモチーフの出現が観察される確率である）。ヒト生殖細胞系列のＩＧＨＶ配列から得たヌクレオチド遷移の確率を用い、以前(Tompa 1999)に記載の通り、各ｋマーモチーフについてｐｓを推定するため以下に示すマルコフ（Ｍａｒｋｏｖ）連鎖を用いた。
【０８７２】
【数１】
0005675109.tif 000094
【０８７３】
観察されたモチーフの出現数と予想されたモチーフの出現数との相違をＮｓ−Ｎｐｓにより与え（式中、
【０８７４】
【数２】
0005675109.tif 000095
【０８７５】
はＮｐｓの標準偏差を表す）、各モチーフのｚスコアを
【０８７６】
【数３】
0005675109.tif 000096
【０８７７】
（式中、Ｍｓは標準偏差の数である）で与えるが、これにより観察されたモチーフ出現数が予測値を超える。この測定基準はＳＨＭをリクルートし得るか、又ははじき得る可能性のあるモチーフ全てを序列化するために用いた。
【０８７８】
結果
親和性成熟を起こす抗体中の、ＳＨＭに由来する変異の解析により重要な洞察がいくつかもたらされる。ＳＨＭマシナリーを誘引するため、好ましいヌクレオチド配列をホットスポットで用い（例えば、表２、３、６及び９を参照）、これらホットスポットがコドンのリーディングフレームに関して特異的に位置する。図３４中に示すとおり、３マーのヌクレオチドモチーフＡＧＣが体細胞超変異イベントの好ましい部位（即ち、１つの好ましいＳＨＭコドン）を表す。図３４中では、本解析において観察される変異数を、抗体重鎖及び軽鎖についてのフレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）中に見出されるＡＧＣモチーフ中のコドンの各位置で、各小グラフ中に線グラフとして示す。モチーフの各ヌクレオチドの位置でのフォントサイズは、各ヌクレオチドがいかなる頻度でコドンリーディングフレーム第１位としての役目を果たすかを示す。フレームワーク領域内ではどのリーディングフレームも優先的でないが、ＣＤＲ内ではＡＧＣ  ＳＨＭモチーフの第１位（Ａ）が、コドンの第１位としてほぼ普遍的に用いられる。
【０８７９】
関連する特定のリーディングフレーム内にあるいくつかのホットスポットコドン（従ってアミノ酸）が体細胞超変異事象及びこれらの事象から結果的に創出される多様性の大部分の原因となるというのが結果である。図３５では、抗体重鎖のＦＲ及びＣＤＲ内で最もホットなスポットのコドン超変異遷移事象を２０示すが、コドンの遷移事象がどのくらい観察されたかを矢印を標識する数で示す。ＡＧＣ及びＡＧＴ（セリン）のコドン、並びに程度は小さいがＴＡＣ及びＴＡＴ（チロシン）が、親和性成熟抗体中に起こっていることが観察される変異の〜５０％の原因となる。親和性成熟と組み合わせた、正しいリーディングフレーム内でのこれらホットスポットコドンの使用によりＣＤＲ内であまり観察されないサイレント変異が多く観察されるようになる（図３５中点線の輪で強調）。また、ＡＧＣ又はＴＡＣコドンから始まる第２及び第３のＳＨＭ事象により可能な２０アミノ酸のうちの多くの創出がもたらされると考えられる。
【０８８０】
単一のヌクレオチドコドン、縮重コドン又はＳＨＭモチーフに作用するＳＨＭに起因する、ＳＨＭにより生み出される一過的な多様性を予測するためのマルコフ連鎖確率モデルを開発した。マルコフ連鎖はシステムの、将来の全時間の状態を計算するために使用できる、離散時間確率過程である。当該システムは時間の各点で、当該システムの直前の状態から状態を変化させていてもよく、又は当該システムは同じ状態に留まっていてもよい。これは公式には：
Ｐｒ（Ｘｎ＋１＝χ│Χη＝χη，……，Ｘ１＝χ１）＝Ｐｒ（Ｘｎ＋１＝χ│Ｘｎ＝χｎ）
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、．．．はマルコフ性を伴う確率変数の列、即ちある現在の状態から、将来及び過去の状態が独立であることを表す）と書くことができる。時間ステップｎで１つの状態ｉから状態ｊに行く確率は：
Ｐ（ｎ）ｉｊ＝Ｐｒ（Ｘｎ＝ｊ│Ｘ０＝ｉ）
で定義される。そして単一ステップの遷移は
Ｐｉｊ＝Ｐｒ（Ｘ１＝ｊ│Ｘ０＝Ｉ）
である。
考えられるＸｉの値は、連鎖の状態空間と呼ばれる１組の計数可能なＳを形成する。マルコフ連鎖はよく有向グラフにより記述され、エッジは１つの状態から他の状態に行く確率により標識される。
【０８８１】
状態の変化は遷移と呼ばれる。本実施例においては、当該システムが６４の可能なコドン状態のいずれか１つに存在し得、またいずれのコドン状態も異なるコドン状態からアクセスし得る場合（これら２状態を結ぶＳＨＭ事象の確率が０でなければ）に、ＳＨＭを起こすコドンにこの方法を適用することが選択される。マルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）、連続時間マルコフ連鎖、及び隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）等の他の等価な方法も、この時間依存的進化の問題を解決するために用いることができる。
【０８８２】
当該システムは出発コドン状態の確率分布から始まり、その全確率は１に等しい。例えば、唯一の出発状態としてＡＡＡから出発するシステムは行列形式で［ＡＡＡ，ＡＡＣ，ＡＡＧ，…，ＴＴＧ，ＴＴＴ］＝［１，０，０，…，０，０］と書かれる。
【０８８３】
同様に、ハーフＡＡＡ及びハーフＴＴＴで構成される縮重コドンから出発するシステムは行列形式で［ＡＡＡ，ＡＡＣ，ＡＡＧ，…，ＴＴＧ，ＴＴＴ］＝［０．５，０，０，…，０，０．５］と書かれる。
【０８８４】
図３６では、そのような当該システム用の遷移マトリクスを示すが、ｙ軸は出発コドン状態、及び可能なコドン全ての完全なリストを表し、ｘ軸は１ラウンドのＳＨＭ介在性の進化で与えられる終着コドン状態を表す。
【０８８５】
図３６に示す当該システムのコドン状態間の遷移確率を記述する行列は、抗体重鎖及び軽鎖配列中のＳＨＭ事象の解析に由来した（材料及び方法を参照）が、行列の各列は１に等しい、標準化された確率を有する。非対角の値はコドン状態間でありえる遷移を表し、対角の関係は自己遷移（又は非遷移）を表し、そして行列全体では世代当たり０．５％の非対角の標準化進化率（文献の理想的な値に基づいて任意に選択）を有する。遷移頻度はグレースケールの使用によりコード化され、実際の数値は図３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄ及び３６Ｅに提示する。
【０８８６】
周辺分布Ｐｒ（Ｘｎ＝ｘ）は時間ｎにおける状態間分布であり、初期分布はＰｒ（Ｘ０＝ｘ）である。１回のステップを通した進化過程はある基準により、式：
Ｐｒ（Ｘｎ＝ｊ）＝SｒIｓｐｒｊＰｒ（Ｘｎ−１＝ｒ）＝SｒIｓｐｒｊ（ｎ）Ｐｒ（Ｘ０＝ｒ）．
（式中、ｎは整数値であり、出発コドン分布は、所定の状態遷移確率に従ってｎ回の反復ラウンドにより進化している）により記述される。
【０８８７】
従ってこのシステムは、特定配列から出発するＳＨＭシステムが、任意の出発コドン確率分布を与える、複数ラウンドのの進化によりいかにして進化するかを記述する。
【０８８８】
図３７〜４４ではコドン状態の蓄積及びそれらに対応するアミノ酸頻度を、異なるセットの出発コドン頻度を与える、種々のラウンドでのＳＨＭ介在性進化の関数として示す。
【０８８９】
図３７及び３８では、好ましいＳＨＭコドンのＡＧＣ（セリン）コドンの進化及び５０ラウンドを超えるＳＨＭ介在性変異誘発の結果生じるアミノ酸頻度を、我がマルコフ連鎖モデルにおいて算出した通りに示す。数ラウンドの変異の範囲では、多くの他のアミノ酸は共通になる（図３６で与えたとおりの頻度スケール）。この知見により、単一コドン及びそれらのアミノ酸、特にＡＧＣ／ＡＧＴ（セリン）及びＴＡＣ／ＴＡＴ（チロシン）が、ＳＨＭにより利用され、天然ではたいていの他のアミノ酸の創出を駆動できることを示す図３５が支持される。
【０８９０】
ちなみに、やはりセリンをコードするが、好ましいコドンでないＴＣＧから出発して同じように計算してみると（図３９及び４０中に示す）、そのような好ましいコドンでは、ＳＨＭの基質として不十分なだけではなく、好ましいＳＨＭコドンに比べてより時間の関数としての多様性を生み出しにくいことが示される。
【０８９１】
図４１及び４２では、アミノ酸多様性の迅速且つ効果的な生成を行う、混合ＡＧＣ／ＴＡＣ（セリン及びチロシン用の好ましいＳＨＭコドンを含む「Ｗ（「ＷＲＣモチーフ」の迅速な進化を示す。
【０８９２】
図４３及び４４では、ＧＡＴ（アスパラギン酸）、ＧＣＴ（アラニン）、及びＡＧＴ（セリン）等の単一変異事象から生じるコドンの即座の進化を伴う、ＧＧＴコドン（グリシン）の進化を示す。これらの新たなコドンに作用する第２の変異事象で、３組目のコドンが生じる。例えば、ＡＧＴ及びＧＧＴは両方、ＳＨＭ下でコドンＡＡＴを生成し、この位置でアスパラギンの取得をもたらす。
【０８９３】
これらの結果により、コドンがＳＨＭに付される確率の完全な理解を、アミノ酸の多様性を生み出すためにこれらの配列がいかにして利用されるかについての具体的洞察と組み合わせて発展させることにより、ＳＨＭを起こす異種のシステムにおいて多様性創出の予測のため提供される具体的アルゴリズムの開発が可能になることが確認される。以下に示す通りこの理解を、極めて選択的な進化システムから実際に同定された変異についての最も好都合な位置の知識と組み合わせることにより、変異誘発のための迅速且つ効果的なシステムを開発することができる。
【０８９４】
実施例１３
ＳＨＭ介在性親和性成熟のＨｙＨＥＬ１０の例
多様性を創出するための、このＳＨＭ介在性のアプローチの利点は、選択及び進化の間で例外的に大規模な配列レパートリーを創出するために、比較的シンプルなライブラリーが使用できることである。このアプローチを実証するために、文献によく記載されている既存の抗体を親和性成熟させた。ＨｙＨＥＬ１０はニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）抗原に対するハイブリドーマにまず由来するマウスの抗体である。抗原抗体複合体は熱力学及び原子分解能の結晶構造により十分特性解析されている。
【０８９５】
例えば、表１５中に列挙したコンストラクトにより十分に定義付けられた配列及び親和性を有する１組の抗体及びそれらの配列変異体が定義づけられる(例、Pons et al.,(1999)Protein Science 8:958-68;and Smith-Gill et al.,(1984)J.Immunology 132:963)。
【０８９６】
【表１５】
0005675109.tif 000097
【０８９７】
太字のヌクレオチドは、以下に記載の通り、「野生型」（ＨｙＨＥＬ１０）配列（「ｗｔ」）に比して体細胞超変異を効率的にさせるために、示された変異がＳＨＭに最適化されたコドンに導入されるようなされているコドンを表す。ＬＣ＝軽鎖；ＨＣ＝重鎖
【０８９８】
これらの位置は結合に重要であり、体細胞超変異の間に、対応する生殖細胞系列配列から自然に変異してきたことが既に知られている。具体的には、ＨｙＨＥＬ１０の軽鎖配列は、ＣＤＲ１内に位置する残基、Ａｓｎ３１を含有し、これはＨＥＬ抗原の残基Ｌｙｓ９６に熱力学上重要な接触をなす。ＨｙＨＥＬ１０のＧｌｙ３１変異体（コドンＧＧＴ）は２．５ｎＭ前後の解離定数を有するが、ＨｙＨＥＬ１０のＡｓｐ３１変異体（コドンＧＡＴ）は１１０ｐＭ前後の解離定数を有し、ＨｙＨＥＬ１０の野生型Ａｓｎ３１（コドンは３０ｐＭ前後の解離定数を有する。ＨＥＫ２９３細胞表面に提示されたＨｙＨＥＬ１０のＧｌｙ３１変異体（ＧＧＴ）のクローン集団を下記の通りＳＨＭ存在下、５０ｐＭＦＩＴＣ-ＨＥＬに対するＦＡＣＳベースの選別に何ラウンドも繰り返しかけた。
【０８９９】
Ａ．（「野生型」）ＨｙＨｅｌ１０重鎖及び軽鎖コンストラクトの合成及びクローニング
ＨｙＨｅｌ１０重鎖及び軽鎖発現ベクターのプロトタイプを、実施例４に記載の通りのエピソーム発現ベクター（ベクターフォーマット１；「体細胞超変異システム」と題した米国特許出願番号第６０／９０２，４１４号）から出発し、以下の標準的な分子遺伝学的操作、を用いることにより作り出した：ベクターＡＢ１０２中の元のコールドピューロマイシン耐性マーカーを、ＮｇｏＭＩＶ及びＸｂａＩ制限部位を用いてコールドのｂｓｄ又はｐｕｒと置換し、ベクターＡＢ１８７及びＡＢ１９７をそれぞれ生成した。
【０９００】
ＮｈｅＩ（最もＣＭＶプロモーターに近いｍｃｓ２の制限部位）及びＳｂｆＩ（最もＣＭＶに近いｍｃｓ１部位）を用い、わずかに長く、転写がよりロバストな型のＣＭＶプロモーターと、ＡＢ１０２中に見られる元の配列を交換した。元のＡＢ１０２ＣＭＶプロモーターは、ＴＡＴＡボックスの最初のＴから上流の５５３ｂｐの未改変ＣＭＶ配列を含んでいたが、ＡＢ１８７及びＡＢ１９７型はＴＡＴＡボックスの最初のＴから上流の６４５ｂｐを含んでいた。
【０９０１】
「野生型」ＨｙＨＥＬ１０重鎖及び軽鎖(Pons et al.,(1999)Protein Science 8:958-68)（以下の配列）のヌクレオチド配列を、ＤＮＡ２．０(Menlo Park,CA)で合成した。クローニングの目的で、ＢｇｌＩＩ及びＡｓｃＩ制限部位を重鎖の境界にして、ＳａｃＩ及びＡｓｃＩ制限部位を軽鎖の境界にした。
【０９０２】
細胞表面上にＨｙＨｅｌ１０  ＩｇＧ及びその変異体を発現させるため、重鎖を以下の特徴を有するキメラ分子として作り出した：Ｋｏｚａｋコンセンサス配列；ＨｙＨＥＬ１０重鎖可変領域；マウスＩｇＧ定常領域全長；ＸｈｏＩサイト；マウスＨ２ｋｋ（ＭＨＣＩ型）膜表在性貫通ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン。Ｈ２ｋｋ配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のヌクレオチドデータベースのアクセッション番号ＡＫ１５３４１９から決定した。
【０９０３】
細胞表面結合したキメラＨｙＨＥＬ１０重鎖全長のヌクレオチド配列は以下に列挙する通りである：
【０９０４】
この配列において、ＢｇｌＩＩサイトを下線で示し；Ｋｏｚａｋ配列を下線と斜体で示し、終止コドンを下線と太字で示し；ＸｈｏＩサイトを囲んだヌクレオチドで示し；二重下線で示す配列はＨ２ｋｋ由来である。ＴＧＡ終止コドンの３’側のＡｓｃＩクローニングサイトは斜体のヌクレオチドで示す。
【０９０５】
【化３４】
0005675109.tif 000098
【０９０６】
細胞表面結合性キメラＨｙＨＥＬ１０重鎖のアミノ酸配列は以下に列挙する通りである。合成ＸｈｏＩサイトによりコードされる２つのアミノ酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）を太字及び下線でマークし；太字下線のＧｌｕはまた、Ｈ２ｋｋドメインの最もアミノ側のアミノ酸を表し；二重下線は推定上の膜貫通ドメインを示し；アスタリスクは終止コドンを示す。
【０９０７】
【化３５】
0005675109.tif 000099
【０９０８】
（「野生型」）ＨｙＨＥＬ１０カッパ軽鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列を以下に提供する。
【０９０９】
ＨｙＨＥＬ１０カッパ軽鎖のアミノ酸配列。アスタリスクは終止コドンを示す。
【０９１０】
MNKLLCCALVFLDISIKWTTQDIVLTQSPATLSVTPGNSVSLSCRASQSIGNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC*(配列番号４２２)。
【０９１１】
ＨｙＨＥＬ１０カッパ軽鎖のヌクレオチド配列。開始及び終止コドンを下線で示す。ＳａｃＩ及びＡｓｃＩクローニングサイトを太字で示す。
【０９１２】
【化３６】
0005675109.tif 000100
【０９１３】
上記表１５に記載されるこれら「野生型」重鎖及び軽鎖の変異体並びに生殖細胞系列配列を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ(Stratagene,CA)用いて作り出した；配列は配列決定により確認した。
【０９１４】
Ｂ．細胞のトランスフェクション
Ｔ７５培養フラスコで、１０％ＦＢＳを含有する１０ｍＬＤＭＥＭ培地(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)中に３ｘ１０６ＨＥＫ−２９３細胞を播種することにより、［Ｎ３１Ｇ  ＬＣ／ｗｔ  ＨＣ］抗ＨＥＬイムノグロブリン及びＡＩＤ活性を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株を生み出した。翌日、５００μＬＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)、２０μＬ  ＨＤ−Ｆｕｇｅｎｅ(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis、IN)、１μｇの最適化されたＡＩＤ発現ベクター（実施例５）、及び各１．５μｇの重鎖及び軽鎖発現ベクターを混合し室温でおおよそ２５〜３０分インキュベートした。インキュベート後、混合物を細胞培養培地に滴下して添加した。
【０９１５】
トランスフェクションからおおよそ３日後、細胞増殖培地を１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬゲネチシン、１０μｇ／ｍＬ抗真菌性抗生物質溶液、１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン、１５μｇ／ｍＬブラストサイジン、及び３５０μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含有する１０ｍＬＤＭＥＭ培地(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)と交換し、細胞をおおよそ４週間、周期的に再播種及び細胞培養培地交換しつつインキュベートした。選別期間の最後に、細胞培養を拡大し、保管し、Ｔ７５細胞培養フラスコで１０％ＦＢＳを含有する１０ｍＬＤＭＥＭ培地(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)中に［Ｎ３１Ｇ  ＬＣ／ｗｔ  ＨＣ］抗ＨＥＬイムノグロブリン及びＡＩＤ活性を発現する３ｘ１０６ＨＥＫ−２９３細胞を播種した。翌日、５００μＬＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)、２０μＬ  ＨＤ−Ｆｕｇｅｎｅ(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis、IN)、及び３μｇの上記ＡＩＤ発現ベクターＤＮＡ、を混合し室温でおおよそ２５〜３０分インキュベートした。インキュベート後、混合物を細胞培養培地に滴下して添加した。おおよそ１週間インキュベートした後、細胞ソーティング用に［Ｎ３１Ｇ  ＬＣ／ｗｔ  ＨＣ］抗ＨＥＬイムノグロブリン及びＡＩＤを発現する安定な元のＨＥＫ−２９３細胞及び追加のＡＩＤ発現ベクターで一過的にトランスフェクトされた培養物を調製した。
【０９１６】
Ｃ．より高親和性の変異体の選別
［Ｎ３１Ｇ  ＬＣ／ｗｔ  ＨＣ］抗ＨＥＬイムノグロブリン及びＡＩＤ活性を発現する、選別されたＨＥＫ−２９３細胞系及び追加のＡＩＤ発現ベクターで一過的にトランスフェクトされた培養物を、細胞を回収し、等体積のＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で洗浄、各培養液より１ｅ０７細胞を１％（重量／体積）ＢＳＡ及び５０ｐＭ又は５００ｐＭ  ＦＩＴＣ−ＨＥＬのいずれかを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に最終濃度２ｅ０５細胞／ｍｌで再懸濁することにより、細胞ソーティング用に調製した。
【０９１７】
ラウンド１
ＥＺ−Ｌａｂｅｌ（登録商標）ＦＩＴＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ(Pierce、Rockford、IL)を用い、製造元の指示に従ってニワトリ卵リゾチーム(Sigma Aldrich、MO)をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。
【０９１８】
４℃で３０分インキュベートした後、細胞を遠心してペレットとし、体積を２００μＬに減らした。３ｍＬ滅菌チューブに移した後、１：５００希釈のＰＥ結合ヤギ抗マウスイムノグロブリンを細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベーションを継続した。次いで、細胞を遠心によりペレットとし、１％（重量／体積）ＢＳＡと２ナノグラム／ミリリットルＤＡＰＩを含有する氷冷滅菌ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁した。ＦＩＴＣについて陽性（１５０ｍＷ  ４８８ｎｍレーザーで励起、５２８／３８フィルターにより回収）のＩｇＧ陽性の生細胞を、Ｃｙｔｏｐｉｅａ  Ｉｎｆｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて流速おおよそ１０，０００事象／秒で蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離した（図４５）。ＨｙＨＥＬ発現細胞を用いたこのアプローチを用いてより高親和性のクローンを確実に識別でき得るようＦＡＣＳウィンドーを較正した。
【０９１９】
結果ではすべての場合において、細胞の小集団が主なバルクの無変異細胞から明瞭に分離されることを示している。ＡＩＤ発現で新たにトランスフェクトした細胞（図４５のパネルＢ及びＤ）中では、この小細胞集団は一貫して、追加のＡＩＤ発現ベクターを受容しなかった細胞集団（図４５中、パネルＡ及びＣ）よりも大きなものであった。これらの細胞は下記の通り培養した。
【０９２０】
選別した細胞を６ウェルプレートのウェル１つの中で、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬゲネチシン、１０μｇ／ｍＬ抗真菌性抗生物質溶液、１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン、１５μｇ／ｍＬブラストサイジン、及び３５０μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含有する３ｍＬＤＭＥＭ培地(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)中に入れた。細胞をコンフルエントになるまで培養し、次いで保管し、細胞密度４ｘ１０５細胞／ｍＬで６ウェルプレートのウェル１つの中に再播種した。次の日、１００μＬＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)、４μＬ  Ｆｕｇｅｎｅ６(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis、IN)、及び１μｇのＡＩＤ発現ベクタープラスミドＤＮＡを混合し室温でおおよそ２５〜３０分インキュベートした。インキュベート後、混合物を細胞培養培地に滴下して添加し、細胞をおおよそ７日間培養し増殖させた。配列解析のために細胞の試料も分取した。
【０９２１】
ラウンド２
次いで、第１ラウンドで上記の通りＦＩＴＣ−ＨＥＬを用いて選別した細胞を同一の選択条件（即ち、５０又は５００ｐＭ  ＦＩＴＣ標識ＨＥＬのいずれかとのインキュベーション）で、第２ラウンドのＦＡＣＳ選別に付した。第１ラウンドで選別した細胞５０ミリリットル（１ｅ０７細胞）を１％（重量／体積）ＢＳＡ及びおおよそ５０ｐＭ又は５００ｐＭいずれかのＨＥＬ−ＦＩＴＣを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中、４℃で３０分インキュベートした。細胞混合物をペレットにし、体積を２００μＬに減らし、当該細胞を３ｍｌ滅菌チューブに移した。１：５００希釈のＰＥ結合ヤギ抗マウスイムノグロブリンを細胞に添加し、細胞を４℃で３０分インキュベートした。次いで、細胞をペレットとし、１％（重量／体積）ＢＳＡと２ナノグラム／ミリリットルＤＡＰＩを含有する氷冷滅菌ＰＢＳ溶液１ｍＬ、ｐＨ７．２中に再懸濁した。ＦＩＴＣについて陽性（１５０ｍＷ  ４８８ｎｍレーザーで励起、５２８／３８フィルターにより回収）のＩｇＧ陽性の生細胞を、Ｃｙｔｏｐｉｅａ  Ｉｎｆｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて流速おおよそ１０，０００事象／秒で蛍光活性化細胞選別により単離した（図４６）。
【０９２２】
２回目の選別の結果では、高親和性のＨＥＬ結合を示す細胞集団が有為に大きくなったことが示されたが、このことは増殖及び培養の間にＳＨＭにより高親和性の変異体が形成されたことと整合する。新たにＡＩＤ発現ベクターでトランスフェクトされ、次いで５００ｐＭ  ＨＥＬとインキュベートした細胞（図４６のパネルＤ）においては、これは明らかに、蛍光が強い細胞の相当大きな集団である。（追加のＡＩＤ発現ベクターを受容しなかった細胞６．８８％に比べ、２５．９％の集団、図４６のパネルＣ）。これらの結果より、ＡＩＤ発現ベクターによる再形質転換が変異誘発率の有為な改善の促進に有効なことが示される。
【０９２３】
選別した細胞において、ゲートを厳密にして、この工程をさらに２ラウンドの変異誘発の間継続すると（図４７、パネルＡ）、選別した細胞の結合特性に、重大で且つ有意な変化が生じた（図４７、パネルＢ）。
【０９２４】
Ｄ．機能解析用の分泌イムノグロブリン産生
目的の重鎖及び軽鎖は、更なる機能解析のため、下記の通り分泌型で産生されてもよい。表面ディスプレイライブラリーから得られる重鎖の場合は、膜貫通ドメインを除去して抗体を培地中に直接分泌できるようにするために、これらを実施例３に記載の通り（即ち、ＸｈｏＩによる消化、続いて再ライゲーション）に処理する。
【０９２５】
トランスフェクションのおおよそ１日前に、３ｘ１０６  ＨＥＫ−２９３細胞をＴ７５培養フラスコ中で１０ｍＬ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中に播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。トランスフェクション当日、５００μＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、２０μＬ  ＨＤ−Ｆｕｇｅｎｅ(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)及び１．５μｇの各重鎖及び軽鎖の発現ベクターを混合し室温でおおよそ２５〜３０分インキュベートした。インキュベーションの後、この混合物を細胞培養培地へ滴下して添加した。
【０９２６】
トランスフェクションからおおよそ３日後、細胞増殖培地を１０ｍＬ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)と交換し、更に７日間細胞をインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞培養液上清を回収し、０．２μｍ滅菌フィルターを通して濾過した。分泌されたイムノグロブリンは、下記の通りＢＩＡＣＯＲＥ解析前に標準的なプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを介して単離した。
【０９２７】
標準的なアミンカップリングを用い、ＨＥＬを研究グレードのＣＭ５センサーチップ上に固定した。３つの表面各々をまず０．１ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）及び０．４ｍＭ  １−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の１：１混合物を用いて７分間活性化した。次いでＨＥＬ密度が異なる３種類の表面を作り出すため、ＨＥＬ試料を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中で１倍から５０倍に希釈し、活性化チップ表面に時間の長さを変えて（１０秒〜２分）曝す。次いで、各表面を１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．２を７分注入してブロッキングした。又は、ビオチン化ＨＥＬを１００倍に希釈して、異なる３種の細胞密度（６０ＲＵ、４５ＲＵ、１２ＲＵ；レスポンスユニット（ＲＵ）はＢｉａｃｏｒｅにより称され、表面積当たりの標的分子に関する）で捕捉される時間を変えてストレプトアビジンを含有するセンサーチップ上へ注入した。実験はすべてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００又はＴ１００光バイオセンサー上で行った。抗ＨＥＬ抗体は１００μｇ／ｍＬで提供され、ＨＥＬ結合表面上で試料泳動緩衝液における３倍希釈系列で試験した。結合した抗ＨＥＬ抗体はセンサー再生溶液で５秒パルスして除去した。データは全て温度を２０℃に制御して収集した。抗体注入に対する動的応答を、非線形最小二乗解析プログラムＣＬＡＭＰ(Myszka,D.G.and Morton,T.A.(1998)Trends Biochem.Sci.,23:149-150)を用いて解析した。
【０９２８】
Ｅ．配列解析
最初の選別において単離された重鎖及び軽鎖の配列は、下記の通り重鎖及び軽鎖のＰＣＲ増幅により決定した。
【０９２９】
目的とする集団から分取した少なくとも５０，０００個の細胞を４℃、１１００ｘｇ、５分でペレットにした。ペレットにした細胞を１５μＬ蒸留Ｈ２Ｏ中に再懸濁し、すぐにＰＣＲ反応において使用するか、後の工程用に凍結するかいずれかにした。
【０９３０】
全体５０μＬについて２７．６μＬ  Ｈ２Ｏ、５μＬ  １０ｘＰｆｘ緩衝液、１μＬ上記細胞、８μＬの２．５μＭ各プライマー（以下に列記）及び０．４μＬ  Ｐｆｘポリメラーゼ(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)から成るＰＣＲ反応は以下のフォーマットを用いて行った：９５℃ｘ２分を１サイクル、続いて９５℃ｘ３０秒、５５℃３０秒間、６８℃４５秒間を３５サイクル、続いて６８℃１分間を１サイクル。オープンリーディングフレーム増幅に用いるＰＣＲプライマーは：
【０９３１】
オリゴ５４０：ＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣ（配列番号４２４）、これは重鎖及び軽鎖オープンリーディングフレームの両方についてのＡＴＧ開始コドンよりおおよそ１４０ヌクレオチド５’側の、ＣＭＶプロモーター領域の３’端にマップされるフォワードプライマーである。
【０９３２】
オリゴ５５４：ＣＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴ（配列番号４２５）、これはＩｇＧガンマ鎖定常領域中にマップされる重鎖特異的リバースプライマーである。
【０９３３】
オリゴ５５２：ＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴ（配列番号４２６）、これはカッパ定常領域のアミノ末端近くにマップされるカッパ軽鎖特異的リバースプライマーである。
【０９３４】
オリゴ５７７：ＡＧＴＧＴＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＧＡＡ（配列番号４２７）、これは５つの機能性ヒトラムダ遺伝子（ＩｇＬ１、２、３、６及び７）全てにより共有されるＮ付近側の定常領域配列へマップされるラムダ軽鎖特異的リバースプライマーである。
【０９３５】
重鎖を増幅するために、オリゴ５４０と５５４を用いた。
【０９３６】
（カッパ及びラムダ両方の軽鎖の混合物が存在するらしい）細胞集団から軽鎖を増幅するために、オリゴ５４０、５５２及び５７７を同時に用いた。この場合、ＰＣＲ反応混合物中の水体積を１９．６μＬに調節した。
【０９３７】
ＰＣＲ後、アガロースゲルでの解析のため試料を５μＬ分取した。次いで、ゲルで可視化したバンドについての反応物を、以下の条件でＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下、更にＰＣＲにかけた：
【０９３８】
全体５０μＬについて、２μＬ  Ｈ２Ｏ、０．５μＬ  Ｔａｑ、各２．５ｍＭの０．２μＬ  ｄＮＴＰｓ、及び１．５μＬｘ５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（又はＭｇＣｌ２の代わりに１μＬの１０ｘＴａｑ緩衝液を用い、一方Ｈ２Ｏを最終体積５０μＬを維持するため調節する）を４５μＬの残存ＰＣＲ反応物に直接添加した、。ＰＣＲサイクルは以下のように行った：９５℃ｘ２分を１サイクル、続いて９５℃ｘ３０秒、５５℃  ３０秒間、７２℃  ４５秒間を２サイクル、続いて７２℃  １分間を１サイクル。
【０９３９】
ゲルで可視化されなかったか、そうでなければ薄すぎて継続できないと判定されたかのいずれかのバンドについての反応物には、１μＬ  Ｐｆｘ緩衝液、３．７μＬ  Ｈ２Ｏ、及び０．３μＬ  Ｐｆｘポリメラーゼが補填され、そして９５℃ｘ２分を１サイクル、続いて９５℃ｘ３０秒、５５℃  ３０秒間、６８℃  ４５秒間を１０サイクル、続いて６８℃  １分間を１サイクル行った。
【０９４０】
アガロースゲルでの解析後可視化されたバンドについてのＰＣＲ反応物を、製造元提示のプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを用いてクローニングした。簡単に言えば、４μＬのＰＣＲ反応物を１μＬの（ＴＯＰＯ（登録商標）キット中で提供される）塩溶液と１μＬのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクターに添加した。室温で２０分インキュベート後、１又は２μＬを、プロトコールにより１００μＬ  ＸＬ１ｂｌｕｅを形質転換するために用いた。
【０９４１】
更に目的の配列の鋳型由来のリーディングフレームは、以下のようにして回収した：重鎖の鋳型はＴＯＰＯ（登録商標）クローンを、ＳｇｒＡＩ及びＮｈｅＩ（両方共元の重鎖配列全てに存在する）で消化することにより回収した。結果生じるおおよそ５００ｂｐの断片（ＣＤＲ３を全て含む可変領域全体を含有する）を、インタクトな連続する重鎖オープンリーディングフレームを生成するため、既に重鎖定常領域を含んでいる発現ベクターのコグネイト部位に、クローニングした。最終的なＩｇＧ分子の細胞表面上における保持を可能にするため、このベクターのある型では実施例３に記載される通り、ＩｇＧ１定常領域とインフレームで融合する、マウスＨ２ｋｋ遺伝子由来の膜貫通ドメイン及び細胞質テイルも含まれる。発現ベクターの代替型では、目的の抗体の直接分泌を可能にするため膜貫通領域を欠失させる。
【０９４２】
同様に、目的の軽鎖の鋳型をＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクターから、カッパについてはＳｂｆＩ及びＭｕｎＩで、又はラムダについてはＳｂｆＩ及びＡｃｌＩを用いて（これらは全て元の配列に存在する）除去した。結果生じる３５０〜４００ｂｐの断片（ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域全体を含有する）を、インタクトな連続する軽鎖オープンリーディングフレームを生成するため、発現ベクターのコグネイト部位に、クローニングした。
【０９４３】
当該結果により、配列決定したクローンのおおよそ２３％に、グリシン３１からアスパラギン酸（Aspartate）（Ｇ３１Ｄ）への変異をもたらす、軽鎖ＣＤＲ内の少なくとも１つの変異があることが示された。ＨＥＬに結合したＨｙＨＥＬ  １０の結晶構造(Pons et al.,(1999)Protein Science 8:958-68)に基づくと、この変異は抗原結合の間に更なる水素結合相互作用の形成をもたらすと予想され、それが５００ｐＭ  ＨＥＬ存在下及びＢｉａｃｏｒｅ測定で観察される結合の増大（図４６中）の明らかな原因となる。重要なことに、（図４８Ａ及びＢで）観察される変異の型は（図３５で示されるように）ＳＨＭ介在型の変異についての予想される変異パターンに従い、重鎖及び軽鎖のコーディング領域全体に大きく広がる非特異的変異をもたらさなかった。従って、これらの結果により、良好な親和性の区別、抗体及び結合タンパク質の改良変異体の選別を提供する本発明のシステムの能力、及び１種以上の標的タンパク質内で目的の特定領域に向けられた持続的及び単発的な超変異の両方を提供する能力が示される。更に、単一抗体のコンストラクトに組み換えられたとき、野生型タンパク質の親和性を３０ｐＭから４ｐＭを超えるまでに改良された少数の更なる変異が同定された（図４８Ｃ）。この実施例で、単一配列又はライブラリーが選択圧下、及びＳＨＭの存在下でいかに迅速により高親和性の変異体を生成できるか、及びこの変異事象の流れが、上で概要を示したコンピューターアルゴリズムによりいかに正確に予測できるかが示される。
【０９４４】
本明細書中で提示したデータにより、体細胞超変異について開示されたシステム及び種ポリヌクレオチドが、目的の標的タンパク質を高レベルで標的変異誘発できることが示される。重要なことに、当該システムでは、回を重ねた変異誘発を可能にし、中立の、及び有害な変異の蓄積を減らす一方、好ましい変異の指定された進化を可能にする選別が可能となる（ともに目的のタンパク質内及び発現系内で）。
【０９４５】
実施例１４
工学的に増強された変異体
活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）は、免疫系による親和性成熟の間に体細胞超変異（ＳＨＭ）、クラススイッチ組み換え（ＣＳＲ）及び遺伝子変換の事象を開始させる責を担う主要酵素である。当該酵素は進化の間にとりわけよく保存されてきており、ヒト、ラット、ウシ、マウス及びニワトリオルソログがイヌアミノ酸配列にそれぞれ９４．４％、９３．９％、９３．９％、９２．４％及び８９．４％の同一性を示す。
【０９４６】
ＡＩＤは予想されるタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、翻訳後修飾部位及び細胞内標的モチーフをいくつか含有し、当該酵素のカルボキシル末端アミノ酸中に局在する核外搬出シグナル（ＮＥＳ）は、それらのうちの１つである。核局在化シグナル（ＮＬＳ）がＡＩＤ内に存在するか否かという疑問に関しては、いくつかのグループがそのようなシグナルは存在すると主張するが(Ito et al.,PNAS 2004 Feb 17;101(7):1975-80)、別のグループは機能するＮＬＳは存在しないと主張し(Brar et al.,J.Biol.Chem.2004 Jun 8;279(25):26395-401;McBride et al.,J.Exp.Med.2004 May 3;199(9):1235-44)、意見が分かれている。
【０９４７】
ネイティブなＡＩＤは、細胞分画、ウェスタンブロット及び免疫組織化学により示されたように、主に細胞の細胞質コンパートメント中に見られる。ＮＥＳの除去又は無効化により、核における定常的な内在ＡＩＤの濃度、ＳＨＭレベルを高くできる傾向があるが、ＣＳＲを損なわせ、又は無くしもする(Brar et al,Id.;Durandy et al.,Hum.Mutat.2006 Dec;27(12):1185-91;Ito et al,Id.;McBride et al,Id.)。
【０９４８】
上記実施例２では、核外搬出を無効化し、それにより核内保持を促進するよう設計されたＮＥＳ内の変異（Ｌ１９８Ａ）を含むＳＨＭ耐性型ＡＩＤ（配列番号４２８）の設計及び構築を記載する。ＡＩＤの核局在、ひいては変異誘発因子活性を更に増強するために、アミノ末端近くにＳＶ４０  Ｔ抗原(Kalderon et al,(1984).Cell 39,499-509)由来の強力な核局在シグナル（ＮＬＳ；ＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号４３９）を挿入することにより、当該酵素の更なに工夫された型を作り出した。ＡＩＤ発現を追跡するため、ＦＬＡＧエピトープタグも挿入し、強力なＮＬＳ及び変異ＮＥＳ配列を両方含有するもの（配列番号４２９）を作り出した。
【０９４９】
Ｃ末端のＮＥＳを核外搬出を減らすよう更に改変することにより、更に工夫されたＡＩＤの型も作り出した。これらのコンストラクトはＳＶ４０  Ｔ抗原ＮＬＳ有り又は無しで調製した。
【０９５０】
最初のＮＥＳ変異体ペアにおいては、配列番号４２８（ＮＬＳ無し）及び配列番号４２９（ＮＬＳ有り）のポリヌクレオチド配列を、当該ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸残基Ｌ１８１、Ｌ１８３、Ｌ１８９、Ｌ１９６及びＬ１９８をアラニンに変異させるよう改変して、それぞれ配列番号４３１（ＮＬＳ無し）及び配列番号４３３（ＮＬＳ有り）のポリヌクレオチド配列、並びにそれぞれ配列番号４３２（ＮＬＳ無し）及び配列番号４３４（ＮＬＳ有り）のアミノ酸配列とした。
【０９５１】
ＰＣＲによりムテインを生成し、次いで親ＤＮＡを除去するためＤｐｎ１で処理した。
【０９５２】
アラニンを含有するムテインを生成するため、以下のオリゴを用いた：CAGCTCAGGAGAATCCTCGCCCCCGCTTATGAGGTCGACGACCTC(配列番号440)及びGAGGTCGTCGACCTCATAAGCGGGGGCGAGGATTCTCCTGAGCTG(配列番号441)。
【０９５３】
Ｐｆｕ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(Invitrogen)を製造元のキットの緩衝液及び２．５ｕＭの各デオキシヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ）と共に用い、配列番号４２８又は配列番号４２９として示したポリヌクレオチド配列を含有するベクターを鋳型ＤＮＡとして用い、別々のＰＣＲ反応を２通り計画した。ＰＣＲは、以下のサイクル条件で行った：９５℃３分間を１サイクル、続いて［９５℃４５秒間、５５℃４５秒間、６８℃１７分間］を２０サイクル、続いて６８℃５分間を１サイクル。完了後、反応成功を確認するためＰＣＲ反応物５μｌを１％アガロースゲルで泳動した。次いで、ＰＣＲ反応混合物を３７℃で少なくとも４時間Ｄｐｎ１(New England Biolabs)で処理して親ＤＮＡを除去した。
【０９５４】
５μｌのＤｐｎ１で処理したＰＣＲ反応物を１００μＬのＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ｓｕｐｅｒ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ(Invitrogen)に添加し、製造元提示のプロトコールにより形質転換した。配列を確認後、得られたＤＮＡ（４つの所望する変異のうち２つ；即ち１８１及び１８３、を含有する）を鋳型として用い、オリゴCCGCTTATGAGGTCGACGACGCCAGAGATGCCTTCCGGACCG(配列番号442)及びAGGGTCCGGAAGGCATCTCTGGCGTCGTCGACCTCATAAGCGG(配列番号443)と共に、上記したものと同じプロトコールを用いて、４つの変異のうちの３番目（即ち、１８９）を導入した。最後に、オリゴCCAGAGATGCCTTCCGGACCGCCGGGGCTTGATGTACAATC配列番号444)及びGATTGTACATCAAGCCCCGGCGGTCCGGAAGGCATCTCTGG(配列番号445)を用いて、４番目であり最後となるの変異（即ち、１９６）を導入した。
【０９５５】
最終的に得られたのアラニン含有ムテイン産物をＳａｃ１及びＢｓｒＧ１を用いて消化し、コグネイトな制限酵素で切断したベクター骨格へライゲーションしてそれぞれ配列番号４３１（ＮＬＳ無し）及び配列番号４３３（ＮＬＳ有り）を生成した。
【０９５６】
第二のムテインペアにおいては：配列番号４２８（ＮＬＳ無し）及び配列番号４２９（ＮＬＳ有り）のポリヌクレオチド配列を、当該ポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸残基Ａｓｐ１８７、Ａｓｐ１８８及びＡｓｐ１９１をグルタミン酸（Glutamate）に変異させ、当該ポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸残基Ｔｈｒ１９５をイソロイシンに変異させるよう改変して、それによりそれぞれ配列番号４３５（ＮＬＳ無し）及び配列番号４３７（ＮＬＳ有り）のポリヌクレオチド配列、並びにそれぞれ配列番号４３６（ＮＬＳ無し）及び配列番号４３８（ＮＬＳ有り）のアミノ酸配列を作り出した。
【０９５７】
アラニンムテインに関する一連の上記手順と同一の手順を、以下のオリゴ：TCCTCCCCCTCTATGAGGTCGAAGAACTCAGAGAAGCCTTCCGGACCCTCGGGGC(配列番号446)及びGCCCCGAGGGTCCGGAAGGCTTCTCTGAGTTCTTCGACCTCATAGAGGGGGAGGA(配列番号447)を最初のオリゴペアの代わりに用い、以下のオリゴ：AACTCAGAGAAGCCTTCCGGATCCTCGGGGCTTGATGTACAAT(配列番号448)及びATTGTACATCAAGCCCCGAGGATCCGGAAGGCTTCTCTGAGTT(配列番号449)を第二のオリゴペアの代わりに用いた（この場合、第三のＰＣＲ反応は不要であった）点を除いて繰り返し、配列番号４３５及び配列番号４３７のグルタミン酸含有ＡＩＤムテインを生成した。産物を上記の通り処理し、配列番号４３５（ＮＬＳ無し）及び配列番号４３７（ＮＬＳ有り）を生成した。
【０９５８】
結果及び考察
次いで、結果生じる６種のＡＩＤコンストラクトを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）復帰アッセイにおける活性及びイムノグロブリンＩｇＧ重鎖（ＨＣ）鋳型上の変異頻度について試験した。
【０９５９】
ＧＦＰ復帰アッセイを行うために、チロシン８２のＴＡＣコドンをＴＡＧ終止コドンに改変した（ＧＦＰ＊）。ＧＦＰ＊をＡｎａｐｔｙｓ  エピソーム発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ  ２９３に安定的にトランスフェクトした（注釈：この細胞系はＥＢＮＡ１を、一体化した当該遺伝子のコピーから発現させることに注意）。同様に、各ＡＩＤコンストラクトを、安定的にトランスフェクトされたＧＦＰ＊細胞系にトランスフェクトし、トランスフェクションから２日後までに細胞を選択（ＧＦＰ＊についてはブラストサイジン、各ＡＩＤコンストラクトについてはハイグロマイシン）下に置いた。終止コドンが元のチロシンに復帰するとエピソームを有する細胞に緑色蛍光が誘導された。選択から３、６、及び１０日後に蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）解析によりＧＦＰ復帰の頻度を測定した。
【０９６０】
【表１６】
0005675109.tif 000101
【０９６１】
結果から、６種のＡＩＤコンストラクトのそれぞれと共トランスフェクトするとバックグラウンドを有意に上回るＧＦＰリバータントが一貫して生じることが示されるが、このことは６種のＡＩＤムテインすべてが機能することを示している。
【０９６２】
ＧＦＰ復帰アッセイには、陽性の復帰細胞を生み出すためＡＩＤ初期活性及びそれに続くエラープローンポリメラーゼによる作用が共に必要なため、当該結果は機能に関して定性的なｙｅｓ／ｎｏを提供する。実際の復帰率を測定するために、より正確な鋳型変異誘発実験も行われた。従って当該ＧＦＰ復帰アッセイに加えて、ＡＩＤコンストラクト２種（配列番号４２８；ＮＥＳ中、Ｌ１９８Ａ変異を含有）及び配列番号４２９（Ｌ１９８Ａ  ＮＥＳ変異及びＳＶ４０  ＮＬＳを含有））を、ＨｙＨＥＬ１０  ＩｇＧのＨＣにおいて変異を誘発するそれらの能力について試験した(Pons et al,(1999)Protein Science 8:958-68;Smith-Gill et al.(1984)J.Immunology 132:963)。（前に記載した通り）ＨｙＨＥＬ１０のＨＣ、ＨｙＨＥＬ１０軽鎖（ＬＣ）のＮ３１Ｇムテインをコードするエピソームの発現コンストラクト、及び配列番号４２８を含有する発現ベクター又は配列番号４２９を含有する同じベクター骨格のいずれかをＨＥＫ  ２９３に共トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞集団に抗生物質の選択圧（即ち、ＨＣ、ＬＣ及びＡＩＤについて、それぞれブラストサイジン、ピューロマイシン及びハイグロマイシン）を加え、２ヶ月培養後細胞を回収した。配列番号４２８を含む発現ベクターでトランスフェクトした細胞から合計８３の鋳型ＩｇＧ  ＨＣを配列決定し、配列番号４２９を含む発現ベクターでトランスフェクトした細胞から６１の鋳型を配列決定した。ＡＩＤの型に対する鋳型当たりの変異のパーセンテージを以下の表１７中に示す。配列決定のデータから計算された変異頻度は、配列番号４２８では１４３８ｂｐ当たり１変異が生じ、配列番号４２９では１０５９ｂｐ当たり１変異が生じる、というものである。
【０９６３】
【表１７】
0005675109.tif 000102
【０９６４】
結果からＮＬＳを含有する型のＡＩＤ（配列番号４２９）が、鋳型ＨｙＨＥＬ１０  ＨＣ  ＩｇＧ中により多数の変異（１０５９ｂｐ当たり１に対してＮＬＳを含有しないホモログについては１４３８あたり１）を誘発し、同様に変異を複数含有する鋳型をより多くもたらした（ＡＩＤ−ＮＬＳでは２．４％であるのに対してＡＩＤ＋ＮＬＳでは鋳型の１０％）ことが示される。
【０９６５】
配列
コールド  イヌＡＩＤ。核外搬出シグナルを未改変のＣＴＴ（Ｌｅｕ１９８）コドンをＧＣＴ（ａｌａ、以下に下線で示す）に改変することにより無効にした。
ATGGACTCTCTCCTCATGAAGCAGAGAAAGTTTCTCTACCACTTCAAGAACGTCAGATGGGCCAAGGGGAGACATGAGACCTATCTCTGTTACGTCGTCAAGAGGAGAGACTCAGCCACCTCTTTCTCCCTCGACTTTGGGCATCTCCGGAACAAGTCTGGGTGTCATGTCGAACTCCTCTTCCTCCGCTATATCTCAGACTGGGACCTCGACCCCGGGAGATGCTATAGAGTCACTTGGTTTACCTCTTGGTCCCCCTGTTATGACTGCGCCAGACATGTCGCCGACTTCCTCAGGGGGTATCCCAATCTCTCCCTCCGCATATTCGCCGCCCGACTCTATTTTTGTGAGGACAGGAAAGCCGAGCCCGAGGGGCTCAGGAGACTCCACCGGGCCGGGGTCCAGATCGCCATCATGACATTTAAGGACTATTTCTATTGTTGGAATACATTTGTCGAGAATCGGGAGAAGACTTTCAAAGCCTGGGAGGGGCTCCATGAGAACTCTGTCAGACTCTCTAGGCAGCTCAGGAGAATCCTCCTCCCCCTCTATGAGGTCGACGACCTCAGAGATGCCTTCCGGACCCTCGGGGCTTGA(配列番号４２８)。
【０９６６】
以下のように、ポリヌクレオチド配列（又はアミノ酸配列）の特徴は、５’から３’（又は必要に応じて、Ｎ−からＣ−末端）の方へ、である：
【０９６７】
クローニング用に用いるＳａｃＩ制限部位、囲んだ文字；Ｋｏｚａｋコンセンサス、下線；ＡＴＧ開始コドン（太字大文字）；ＦＬＡＧエピトープタグ（一重下線）；ＮＬＳ（二重下線）；コールド  イヌＡＩＤ；ＴＧＡ終止コドン（太字大文字）；クローニング用に用いるＢｓｒＧＩ及びＡｓｃＩ制限部位（囲んだ文字）。＊はタンパク質配列中の終止コドンを示す。
【０９６８】
【化３７】
0005675109.tif 000103
【０９６９】
下線且つ大文字のＧＣＣコドン（ａｌａ）４つは、部位特異的変異誘発法により元の配列（ＬｅｕをコードするＣＴＣ）から変化させた。
【０９７０】
【化３８】
0005675109.tif 000104
【０９７１】
下線且つ大文字のＧＣＣコドン（ａｌａ）４つは、部位特異的変異誘発法により元の配列（ＬｅｕをコードするＣＴＣ）から変化させた。囲み及び下線は上記した通りである。
【０９７２】
【化３９】
0005675109.tif 000105
【０９７３】
下線且つ大文字のＧＡＡコドン（Ｇｌｕ）３つは、元の配列（アスパラギン酸をコードするコドン）から変化させた。更に１つの変異Ｔ１９５Ｉ、（ＡＣＣからＡＴＣ）も生成した。
【０９７４】
【化４０】
0005675109.tif 000106
【０９７５】
下線且つ大文字のＧＡＡコドン（Ｇｌｕ）３つは、元の配列（アスパラギン酸をコードするコドン）から変化させた。更に１つの変異Ｔ１９５Ｉ、（ＡＣＣからＡＴＣ）も生成した。囲み及び下線は上記した通りである。
【０９７６】
【化４１】
0005675109.tif 000107
【０９７７】
実施例１５
ＮＧＦ抗体の発見と最適化
神経成長因子（ＮＧＦ）は、末梢交感神経ニューロン及び胚性感覚ニューロン並びに前脳基底部のコリン作動性ニューロンの発生において、重要な生存因子及び維持因子であることが示されている(Smeyne,et al.,Nature 368:246-249(1994);Crowley,et al.,Cell 76:1001-1011(1994))。
【０９７８】
ＮＧＦ活性には２つの異なる膜結合受容体、ＴｒｋＡチロシンキナーゼ受容体及びｐ７５受容体（これらは、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの他のメンバーと構造的に関係する）が介在する(Chao,et al.,Science 232:518-521(1986))。ＮＧＦ受容体は神経系の他の種々のタイプの細胞上に見出されている。例えば、ＴｒｋＡはヒト単球、Ｔ及びＢリンパ球並びに肥満細胞上に見出されている。
【０９７９】
ＮＧＦレベルの上昇と種々の炎症状態との間の直接的な関係がヒト患者及びいくつかの動物モデルにおいて証明されている。これらとしては、全身性エリテマトーデス(Bracci-Laudiero,et al.,Neuroreport 4:563-565(1993))、多発性硬化症(Bracci-Laudiero,et al.,Neurosci.Lett.147:9-12(1992))、乾癬(Raychaudhuri,et al.,Acta Derm.l’enereol.78:84-86(1998))、関節炎(Falcimi,et al.,Ann.Rheum.Dis.55:745-748(1996))、間質性膀胱炎(Okragly,et al.,J.Urology 161:438-441(1991))及び喘息(Braun,et al.,Eur.J Immunol.28:3240-3251(1998))が挙げられる。
【０９８０】
一次交感神経ニューロンもＮＧＦに応答し、痛みのシグナル伝達にも関与することが知られている(Aley,et al.,Neuroscience 71:1083-1090(1996))。交感神経支配を除去することにより、通常ＮＧＦ処理への応答でみられる痛覚過敏が改変される。
【０９８１】
慢性的な痛みを治療するための抗ＮＧＦ抗体の使用が米国特許出願番号第２００４０２１９１４４号、第２００４０２２８８６２号、第２００４０２３７１２４号、第２００４０２５３２４４号、第２００５００７４８２１号、第２００５０２６５９９４号、第２００６００８８８８４号及び第２００６０１４７４５０号に記載されている。
【０９８２】
１．試薬の生成
細胞表面発現ライブラリーの調製
膜結合性ヒト抗体遺伝子のライブラリーを発現するＨＥＫ−２９３細胞系の調製及び細胞バンクの調製は実施例５−８に記載する。この細胞系は実施例３に記載の、ＡＩＤを構成的に発現できるＡＩＤ発現ベクターも含む。ＡＩＤを発現するが抗体ライブラリーを発現しないＨＥＫ−２９３細胞系を選別のためのネガティブコントロールとして用いた。
２．特定の結合メンバーの選別
インタクトなヒトＮＧＦタンパク質を用いる最初の２ラウンドの選別については、２００マイクロリットルの細胞をおおよそ１ｘ１０７の完全飽和ヒトＮＧＦ結合Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ａｖｉｄｉｎ  ｐｕｒｐｌｅ(Spherotech,Lake Forest,IL)ビーズと共に４℃で３０分インキュベートした。
【０９８３】
ＮＧＦ結合ビーズとのインキュベーションのに、細胞を回収し、等体積のＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で洗浄し、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に最終細胞濃度５Ｘ１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０９８４】
ビオチン化タンパク質を以前に記載された通り、ストレプトアビジンビーズと室温で３０分、低速で傾斜回転させつつインキュベートすることによりＮＧＦ結合ビーズを調製した。カップリング後、ミクロ粒子を洗浄し、再懸濁してミクロ粒子の最終濃度を１ｘ１０９ミクロ粒子／ｍｌにする。ビーズにカップリングする前に、スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）−６−ヘキサンアミドヘキサノエート（ビオチン試薬；Ｐｉｅｒｃｅ製品番号２１３３８，Pierce,Rockford,IL 61105)を用いてＮＧＦをビオチン化した。
【０９８５】
インキュベート後、以前に記載される通り、細胞：ビーズ混合物を１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で１回洗浄し、１：２００希釈の抗ＩｇＧ抗体を含有し１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する２００マイクロリットルの氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁する。細胞を４℃で３０分インキュベートし、次いで１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で１回洗浄し、１％（重量／体積）ＢＳＡと２ナノグラム／ミリリットルＤＡＰＩ(Sigma-Aldrich Corp)を含有する５００マイクロリットルの氷冷滅菌ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁した。ＮＧＦ結合ビーズに結合したＩｇＧ陽性の生細胞（２５ｍＷ  ５６１ｎｍレーザーで励起、それぞれ６２０／４０及び７５０ＬＰフィルターにより回収）を、Ｃｙｔｏｐｉｅａ  Ｉｎｆｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて流速おおよそ１０，０００事象／秒で蛍光活性化細胞選別により単離した。1ラウンド目の選別においては、ヒトＮＧＦに結合した全細胞集団を単離、６ウェルマイクロタイターディッシュ中に播種し、おおよそ２週間増殖させて次回の選別前におおよそ１ｘ１０７個の細胞集団とした（図４９（パネルＡ））。２ラウンド目のソーティングでは有意に濃縮されたＮＧＦ結合細胞の集団となり、そして殆どの蛍光細胞を分取し上記の通り増殖させた（図４９のパネルＢ）。これら実験のコントロールをより小さな挿入パネル中に示す。前に記載の通り、２ラウンド目由来の細胞試料は可変ドメインの配列を決定し、選択された重鎖及び軽鎖の多様性特性を解析するため処理され得る。
【０９８６】
ＮＧＦタンパク質による３ラウンド目の選別については、２００マイクロリットルの選別した２ラウンド目由来のＮＧＦ結合細胞をおおよそ５０ナノモルのビオチン化ヒトＮＧＦと共にインキュベートした。細胞混合物を１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で１回洗浄し、続いて４℃で３０分、１：２００希釈の１ｍｇ／ｍＬ  ＰＥ結合ストレプトアビジンと共にインキュベートした。細胞を１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で１回洗浄し、１：５００希釈（２μＬ）のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ(Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,MO)と共にインキュベートした。試料をボルテックスし、４度で３０分インキュベートした。次いで細胞を１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で１回洗浄し、１％（重量／体積）ＢＳＡと２ナノグラム／ミリリットルＤＡＰＩ(Sigma-Aldrich Corp)を含有する５００マイクロリットルの氷冷滅菌ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁した。ＩｇＧ陽性のフィコエリトリン陽性生細胞（２５ｍＷ  ５６１ｎｍレーザーで励起、５７９／３４により回収）を、Ｃｙｔｏｐｉｅａ  Ｉｎｆｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて流速おおよそ１０，０００事象／秒で蛍光活性化細胞選別により単離した。ヒトＮＧＦに結合した細胞の亜集団を図４９（パネルＣ）に示す。選別した、最も蛍光強度が高い細胞を６ウェルマイクロタイターディッシュ中に播種し、おおよそ２週間増殖させて次の選別前におおよそ１ｘ１０７個の細胞集団とした。
【０９８７】
４ラウンド目の選別については、上記の通り、同一の手順及びインキュベーションを用い、２０ｎＭビオチン化ヒトＮＧＦを用いて細胞を選別した。ＦＡＣＳ選別の結果を図４９（パネルＤ）に示す。
【０９８８】
５ラウンド目の選別については、２０ｎＭビオチン化ヒトＮＧＦを用い、上記ＦＡＣＳの手順及びインキュベーションと同一の手順及びインキュベーションを用いて細胞を選別した。ＦＡＣＳ選別の結果を図４９（パネルＥ）に示すが、当該結果によりコントロールのインキュベーション（図４９中の挿入パネル）と比較して結合における有意な濃縮が示される。図４９のパネルＥでは、インタクトなＮＧＦタンパク質を用いる選別によりＦＡＣＳ散布図中に別個の結合を示す突端の細胞が示されていることが明らかである。選別した細胞の亜集団を６ウェルマイクロタイターディッシュ中に播種し、おおよそ２週間増殖させて次の選別前におおよそ１ｘ１０７個の細胞集団とした。
【０９８９】
５ラウンド目由来の細胞試料を、２ラウンド目の結果と比較した可変ドメインの配列を決定するために処理した。以前に考察した通り、可変ドメインの配列及び体細胞超変異を介して抗体に導入された新たな変異は、解析したクローン内での分布及び具体的には重鎖及び軽鎖のコーディング領域内でのそれらの位置を決定するために解析できる。変異は重軽鎖内でのそれらの位置に基づいて評価できる：例えばＣＤＲ内の変異は高く評価され得るが、フレームワーク領域及び／又は定常ドメイン中のものはより好ましくないと評価され得る。異なる抗体ファミリー間で生じる鍵となる変異は、観察される変異の全部をあわせたもの、又はその全部の一部を表す親和性又は選択性において好ましい増加を示すハイブリッド抗体を迅速に生成するためにファミリー間で組みかえられてもよい。逆に、複数の余剰なクローンファミリーは、余剰な多様性を排除する一方で、有用な多様性を最大化し、且つ非生産的な進化経路を排除するため統合され得る。
【０９９０】
３．クローン解析
各細胞クローンについて、配列決定の鋳型をＰＣＲ又はエピソームレスキューのいずれかを介して、上記実施例１３に記載のようにして調製する。
【０９９１】
４．機能解析
目的とする重鎖及び軽鎖は、配列解析後、更なる機能解析のため、下記の通り分泌型で産生されてもよい。表面ディスプレイライブラリーから得られる重鎖の場合は、膜貫通ドメインを除去して抗体を培地中に直接分泌できるようにするために、これらを実施例１３に記載される通り（即ち、ＸｈｏＩによる消化、続いて再ライゲーション）に処理する。精製された抗体は、抗体活性を更に特性解析するために以下のいずれの機能アッセイにおいて試験してもよい。
【０９９２】
下記の通り、単離された抗体又は抗体プール内の有望な機能活性を明らかにするのに役立てるため、多くのアッセイを開発できる：
【０９９３】
５．親和性解析
配列解析後、目的とする５ラウンド目由来の重鎖及び軽鎖のペアを、更なる機能解析のため上記の通り分泌型で生成した。プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーにより問題になっている抗体を含有する馴化培地を精製し、Ｂｉａｃｏｒｅ親和性実験のための適切な泳動緩衝液、典型的にはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４へ透析した。
【０９９４】
５ラウンド目の抗ＮＧＦリード抗体の親和性解析を、ＢｉａｃｏｒｅシリーズＴ−１００表面プラズモン共鳴機器で以下の実験条件で行った。ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップを、スペクトルが広い抗ヒトＩｇＧ捕捉表面を作り出すためにプロテインＧを用いて条件設定した。一連の濃度のＮＧＦリガンドを、５００ＲＵの抗ＮＧＦ抗体が捕捉されているか、又は抗ＮＧＦ抗体が捕捉されていない（コントロール表面）かのいずれかのチップ表面を通過させた。当該検体であるＮＧＦの濃度依存的な会合及び解離の割合を時間の関数として、捕捉セルでコントロールフローセルと比較してモニターした。これらの実験結果は図５０で見られるが、それにより問題になっている抗体に対するＮＧＦの濃度依存的な会合及び解離が示される。
【０９９５】
図５０に示すこれらの結合データの動力学的多変量解析により、ＮＧＦの抗ＮＧＦ抗体への結合についての解離定数がＫｄ＝６７０ｎＭと予測される。解離(off-rate)（ｋｄ）は０．３６７（ｓ−１）と予測され、会合速度はｋｏｎ＝５．５ｘ１０５（ｓ−１Ｍ−１）である。これらのデータにより、上記のプロトコールを用いてｎＭの親和性を伴う、ＮＧＦに結合する抗ＮＧＦ抗体が単離されたことが示される。
【０９９６】
実施例１６
合成ＳＨＭ耐性及びＳＨＭ感受性遺伝子の創出及び試験
Ａ．ポリヌクレオチド設計
未改変ティール（Ｔｅａl）蛍光タンパク質（ＴＦＰ）の出発配列を図５１に、ホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析と共に示す。
【０９９７】
１．ホットＴＦＰ
実施例１に記載したとおり、表７に列挙したホットスポット及びコールドスポットモチーフに基づき、コンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用いて配列最適化を完了し；得られたＴＦＰのホット及びコールド型をそれぞれ図５２及び５３に示す。
【０９９８】
ＴＦＰ配列をより体細胞超変異に感受性にするための当該配列の最適化により約１７０％のホットスポット数増加（２８増加）、及び約２６％のコールドスポット数減少（２７減少）がもたらされた。全体のホットスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約６ホットスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１０ホットスポットの平均密度へと増加し、全体のコールドスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットから、ＳＨＭ感受性型中の１００ヌクレオチド当たり約１１コールドスポットへと減少した。
【０９９９】
２．コールドＴＦＰ
ＴＦＰ配列をより体細胞超変異に耐性にするための当該配列の最適化により約１２０％のコールドスポット数増加（２１増加）、及び約１０％のホットスポット数減少（４減少）がもたらされた。全体のコールドスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１８コールドスポットの平均密度へと増加し、全体のホットスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約６ホットスポットから、ＳＨＭ耐性型中の１００ヌクレオチド当たり約５ホットスポットへと減少した。
【１０００】
Ｂ．クローニング及び解析
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が確実に無いことを最終的に点検した後、完全なポリヌクレオチド配列を合成し（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）、本明細書中に記載の通りＤＮＡ２．０のクローニングベクターのうちの１つにクローニングし、正しく合成されていることを確認するため配列決定し、活性について下記に記載されるようにして試験する。
【１００１】
Ｈｅｋ２９３細胞を、同一のＣＭＶプロモーターにより発現が駆動されるホット又はコールドのいずれかの型のＴＦＰを含有する発現ベクター（上記されるようなＡＢ１０２及び１３６）でトランスフェクトする。トランスフェクションから３日後に安定した発現についての選別を開始した。ＦＡＣＳ解析前に、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。１試料当たり最大百万個の細胞を取得する。ＤＡＰＩ蛍光を４６０／５０バンドパスフィルターを通して測定する。ＧＦＰ蛍光を５２８／３８バンドパスフィルターを通して測定する。細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出できず、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして、パーセントＧＦＰ発現を表１８に報告する。
【１００２】
【表１８】
0005675109.tif 000108
【１００３】
これらの結果より、ホット及びコールド両型のＴＦＰの、バックグラウンドを上回る良好な発現が示される。この場合、配列を「コールド」にすることにより、タンパク質の相対的な発現が向上するという驚くべき結果がもたらされた。そのような発現の向上によりＳＨＭ耐性合成遺伝子の更なる利益がもたらされる。
【１００４】
体細胞超変異に対する各コンストラクトの相対的安定性／感受性を測定するために、トランスフェクトされた各細胞集団の安定な細胞系を作製し、それらがＳＨＭ介在性の変異を蓄積する相対速度を測定するために試験する。これらの変異の大半は機能の損失をもたらすので、相対的変異誘発負荷は、本明細書中に記載されるようにＦＡＣＳを介して蛍光欠失として簡便に測定できる。
【１００５】
ホットＴＦＰ又はコールドＴＦＰいずれかのＳＨＭ最適化コーディング配列を含むエピソーム性の発現コンストラクトを個々に、ＨＥＫ２９３にＡＩＤとともに安定的に共トランスフェクトし、３週間増殖及び生育させた（これらの実験において用いたコールド  イヌＡＩＤはＮＥＳを不活性化するＬ１９８Ａ変異を含有する；配列番号４２８を含有する）。次いで、細胞ストックを凍結し、ホットＴＦＰ及びコールドＴＦＰの各１バイアルを融解し、４日間培養して増殖させ、次いで、細胞ストックを凍結し、ホットＴＦＰ及びコールドＴＦＰの各１バイアルを融解し、４日間培養して増殖させ、次いで融解して４日培養したものを、一定分量の更なるオリジナルＡＩＤ発現コンストラクトで一過的にトランスフェクトすることにより補足的ＡＩＤでパルスした（「ＡＩＤパルシング」と称される）。ＡＩＤパルス後９日目に細胞をトリプシン処理により回収し、１１５０ｘｇで５分でペレットにし、後に使用するため凍結した。
【１００６】
続いて細胞ペレットを融解し、オリゴヌクレオチド（オリゴ）プライマーGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGC(配列番号456)及びGATCGTCTCACGCGGATTGTAC(配列番号457)を用いてＰＣＲによりＴＦＰ  ＯＲＦを回収した。前者のオリゴは、ＴＦＰ開始コドンの５’側１４２ｎｔに位置する、ＴＦＰｍＲＮＡ発現を駆動するために用いられるＣＭＶプロモーターの３’端近くから増幅し、後者のオリゴはＴＦＰ終止コドンの３’側１ｎｔで終わる配列と一致する。各ＰＣＲ反応（全体積５０μＬ）は以下の条件下で３５サイクル行った：９５℃５分間、３５サイクルの（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、６８℃４５秒間）、続いて４℃に冷却前に６８℃１分。増幅したＰＣＲ産物はTOPO(登録商標)TA cloning vector (Invitrogen,Carlsbad,CA)にクローニングし、インサートを配列決定した。合計ホット１６６及びコールド１１１のＴＦＰ  ＯＲＦをレスキューし、配列決定し、結果生じる変異のスペクトルを比較した。表１９中に、当該２組の配列中に観察された変異についての全体統計を示す。
【１００７】
【表１９】
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【１００８】
変異の頻度はホットスポットを最多にした型のＴＦＰ鋳型中ではホットスポットを最少にしたコールドＴＦＰ配列に比べておよそ３．８倍高い。本データにより、ポリヌクレオチド配列のＳＨＭ最適化が、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドによってもたらされる変異の頻度を増加又は減少のいずれかをさせるために使用できることが示される。
【１００９】
図５３Ｄにホット及びコールドのＴＦＰコンストラクトの代表的なセグメントについての変異を示す。中央列にはＴＦＰのアミノ酸配列（５９〜８７残基）が１文字表記で示され、２つのコンストラクトをコードする「ホット」及び「コールド」の出発核酸配列がアミノ酸配列の上（ホット）及び下（コールド）に示されている。ホットの配列中に観察された変異を並べて遺伝子配列の上端に重ね、コールドのＴＦＰ配列中の変異を下に示す。当該結果によりコーディング配列への「サイレント」な変化がいかにして、ＡＩＤ介在性のＳＨＭ率において観察される劇的変化を生み出すかが説明されるが、このことは、工夫された配列を、早い又は遅いＳＨＭ率をもたらすのに有効に最適化できることを示している。
【１０１０】
図５３Ｅには、本ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養システムにおいてＡＩＤにより生成された変異のスペクトルが、他の研究において観察されるもの及びｉｎ  ｖｉｖｏの親和性成熟の間に見られるものに酷似することが示されている。図５３Ｅには本研究において生成された変異（ボックス（ｉ）左上、ｎ＝１１８）が示され、それらがＺａｎら（ボックス（ｉｉ）右上、，ｎ＝７０２）、Ｗｉｌｓｏｎら（左下、ｎ＝２５０００；ボックス（ｉｉｉ））により観察された変異、及びより大規模な、親和性成熟を経たＩＧＨＶ鎖の解析（右下、ｎ＝１０１，９２６；ボックス（ｉｖ））と比較されている。各チャート中のＹ軸に出発ヌクレオチドを示し、Ｘ軸に最終のヌクレオチドを示し、各正方形中の数でヌクレオチドの遷移が観察される時間のパーセンテージを示す。本研究において、変異のトランジション及びトランスバージョンの頻度は他のデータセットにおいて見られるものに似ている。ＣからＴ及びＧからＡへの変異が、シチジンへのＡＩＤ活性の直接的な結果であり、変異事象全体の４８％を占める。更に、塩基Ａ及びＴでの変異が変異事象の３０％までを占める（即ち、他のデータセットにおいて観察される頻度よりわずかに少ない）。
【１０１１】
図５３Ｆには、変異事象がホットＴＦＰ遺伝子の、ＳＨＭに最適化したヌクレオチド配列の至る所に分布し、１世代、１０００ヌクレオチド当たり約０．０８事象の最大瞬間変化率が、オープンリーディングフレームの開始から３００ヌクレオチド前後に集中していることが示されている。ＡＩＤによる（３０日間の）遺伝子の安定したトランスフェクション及び選択により４８０ヌクレオチド当たり１事象の変異の最大変異率がもたらされる。結果として遺伝子は、１遺伝子当たり０、１、２又はそれ以上の変異を含有し得る。ホットのＴＦＰ配列の遺伝子において観察されるＳＨＭ介在性事象の分布を、コールドＴＦＰにおいて見られる有意に減少した変異のパターン（図５３Ｈ）と比較し、図５３Ｇにおいて見ることができる。
【１０１２】
したがって本研究により、通常は体細胞超変異を起こさないティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）等の非類似型の遺伝子の作製が、そのような遺伝子を高率の体細胞超変異の為に標的化するのに使用できることが示される。更に、（同一アミノ酸をコードするが）ＳＨＭ耐性遺伝子を作製することにより、体細胞超変異のホットスポット数が減少したタンパク質が生じ得、従ってＡＩＤ介在性の超変異レベルの劇的な減少が起きる。ＳＨＭ最適化の各例において、哺乳動物のコドン使用頻度及び遺伝子発現レベルに影響する他の因子が工夫された配列の生成において考慮され、それによって適度な翻訳及び発現レベルも示すタンパク質が生じる。従って当該結果により、ＳＨＭ最適化の本方法を（ｉ）ＡＩＤ活性を発現遺伝子の特定領域に標的化するためにうまく使用でき、（ｉｉ）ＳＨＭ率を速め、又は遅くするために使用できることが示され、（ｉｉｉ）この方法論を用いることによってＡＩＤにより生み出された変異のスペクトルがｉｎ  ｖｉｖｏで観察されるものと均等であることが示され、（ｉｖ）ＳＨＭの最適化が、目的の遺伝子上でその発現に有意な負の影響をもたらすことなく、そのＡＩＤ介在性のＳＨＭの率に正又は負のいずれかの影響を与えるために首尾よく行われ得ることが示される。
【１０１３】
本明細書中、本発明の好ましい実施形態が示され、そして記載されたが、そのような実施形態は単なる例示として提供される。本明細書中に記載される本発明の実施形態の様々な変更が、本発明の実施において採用され得ることを理解すべきである。以下のクレームが本発明の範囲を明示し、それらによってこれらクレームの範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物が包含されることが意図される。
【１０１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005675109.tif 000119
【図１１−１】
0005675109.tif 000120
【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
0005675109.tif 000123
【図１４】
0005675109.tif 000124
【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
0005675109.tif 000132
【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
0005675109.tif 000142
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
0005675109.tif 000147
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
0005675109.tif 000162
【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
0005675109.tif 000170
【図５２】
0005675109.tif 000171
【図５３−１】
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【図５３−２】
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【配列表】
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