(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＰＥＲ．Ｃ６細胞を正に荷電されたマイクロキャリアに付着させること、  
ｂ）前記細胞を培地において培養すること、および
ｃ）前記細胞をマイクロキャリアから分離し、そして次いで前記細胞をさらに培養すること
を含む、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を接着させて培養するための方法。
【請求項２】
正荷電マイクロキャリアはＮ，Ｎ，−ジエチルアミノエチル基を含む、先行する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロキャリアはデキストラン系である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は生成物を生産する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生成物はタンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生成物は血液凝固因子である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
さらに、ｄ）前記産物を収集すること
のステップを含む、請求項４、５および６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、接着性ヒト細胞の培養および生成物の生産のための拡張可能なプロセスに関する。とくに、それは、ヒト細胞の培養に関する。さらにとりわけ、それは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の接着培養に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類細胞は、細胞の種類によって、接着させて、または懸濁状態のいずれかで培養される。スケーラビリティ（拡張可能性）のため、懸濁培養に接着性細胞を用いる傾向がある。懸濁培養に対する多数の細胞の種類の適応能力、およびせん断損傷を減らすために重合体（高分子）添加剤の利用は、大規模での応用に最適なシステムである懸濁培養の幅広い応用を可能にした〔Ｃｈｕ（チュー）およびＲｏｂｉｎｓｏｎ（ロビンスン），２００１〕。
【０００３】
接着性細胞のスケールアップは、達成するのがずっと困難であり、広範囲の代替培養システムを生み出した。接着性細胞のスケールアップを可能にするある特定のシステムは、マイクロキャリア培養である。この方法論の利点は、細胞を、小さなキャリア上で増殖させるとき、大きな単位のスケールアップ、均質性およびたやすく制御される環境条件のすべての利点を有する懸濁培養として扱うことができることである〔Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（グリフィス），２００１〕。また、マイクロキャリア培養は、高い細胞密度および高濃度の細胞産物を得る可能性をもたらす高い表面積対体積率を与える。
【０００４】
マイクロキャリア技術において、いくつかの進歩がなされた。マイクロキャリアの荷電基容量およびビーズサイズ（径）を、細胞増殖を促進するのに最適化した。コラーゲン／ゼラチン、ガラス、プロネクチン（ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ）およびポリリジン（Ｐｏｌｙ‐Ｌｙｓｉｎｅ）のようなコーティング材をマイクロキャリア表面に適用した。ＤＥＡＥデキストラン、コラーゲン／ゼラチン、ガラス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、およびセスロースを含む、より多くのキャリアマトリクス材を導入した〔Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ（コンら），１９９９〕。
【０００５】
接着細胞培養は、バイオ製薬産業において、例えば、組換え血液凝固因子の生産〔例えば、ＵＳ（米国特許出願公開第）２００６／０１９４２８９号明細書またはインフルエンザワクチンの生成〔Ｂｒａｎｄｓ（ブランズ）ら，１９９９〕に、広く用いられる。これらのプロセスには、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫおよびＶｅｒｏを含む、異なる細胞系が用いられる〔Ｂｒｕｈｌ(ブリュール)ら，２００７；Ｒｏｕｒｏｕ（ロールロー）ら，２００７〕。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多数のマイクロキャリアが商業上入手可能であり、マイクロキャリア上でうまく増殖する細胞の能力を各細胞系のために試験しなければならない。
【０００７】
抗体、ワクチンおよび組換えタンパク質の生産のために用いられるヒト細胞系ＰＥＲ．Ｃ６〔Ｊｏｎｅｓ（ジョウンズ）ら，２００３；ＷＯ（国際公開第）００／６３４０３号；ＷＯ  ０１／３８３６２〕は、懸濁培養にとくに適している〔Ｙａｌｌｏｐ（ヤロップ）ら，２００５〕。しかしながら、いくつかの産物の生成のために、ＰＥＲ．Ｃ６細胞は接着して培養させることが好ましいことがある。ＰＥＲ．ＣＲ６細胞はフラスコにおいて小スケールで接着培養されてきたが、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の接着培養の拡張可能（スケーラブル）なプロセスはこれまで説明されていない。
【０００８】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を接着培養する可能性は、培養をスケールアップする能力と組み合わさって、ＰＥＲ．Ｃ６細胞系の応用範囲を広げるであろう。
本発明の概略
【０００９】
意外にも、ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、正に荷電されたマイクロキャリアを除いて、目下商業上入手可能な大部分のマイクロキャリア上ではあまりよく接着および増殖しないことが発見された。さらに、ＦＥＲ．Ｃ６細胞は意外にも、これらのキャリア（担体）から難なく分離することができる。これはＰＥＲ．Ｃ６細胞が、あるバイオリアクターから別のバイオリアクターへ継代培養されることを可能にし、それはプロセスのスケールアップのために有利となる。
【００１０】
本発明は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の接着培養方法であって、ａ）前記細胞を１またはそれよりも多くの正に荷電されたマイクロキャリアの表面に付着させること、およびｂ）前記細胞を培地において培養することを含む方法を提供する。
【００１１】
一定の具体化では、前記正荷電マイクロキャリアはデキストラン系である。他の具体化では、本発明の方法はさらに、ｃ）前記細胞をマイクロキャリアから分離し、その後前記細胞をさらに培養することを備える。
【００１２】
本発明の別の具体化では、前記細胞は産物を生成する。好適な具体化では、前記産物はタンパク質である。別の好適な具体化では、前記産物は血液凝固因子である。
【００１３】
また、ＰＥＲ．Ｃ６細胞によって生成物を生産するために方法であって、本発明の前記方法を備え、さらにｄ）その産物を収集（収穫）することを備える方法を提供することも本発明の目的である。
【００１４】
本発明はまた、マイクロキャリアに付着したＰＥＲ．Ｃ６細胞を含む細胞培養物であって、前記マイクロキャリアが正に荷電されている、細胞培養物も提供する。好適な具体化では、前記正荷電マイクロキャリアはデキストラン系である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】細胞が担体に付着しなかった培養の表示である（例２参照）。
【図２】細胞が非均質に分散し、および１またはそれよりも多くの担体に付着した大きな凝集塊に増殖する傾向があった培養の表示である（例２参照）。
【図３】Ｃｙｔｏｄｅｘ‐１マイクロキャリア上のＰＥＲ．Ｃ６細胞の表示である。
【図４】正荷電Ｃｙｔｏｄｅｘ‐１マイクロキャリア上のＰＥＲ．Ｃ６細胞の増殖である。
【図５】Ｃｙｔｏｄｅｘ‐１マイクロキャリア上で接着により増殖するＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養における代謝産物濃度である。
【図６】Ｃｙｔｏｐｏｒｅ‐１マイクロキャリア上で接着により増殖するＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養における代謝産物濃度である。
【図７】Ｃｙｔｏｐｏｒｅ‐２マイクロキャリア上で接着により増殖するＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養における代謝産物濃度である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
これらおよび他の目的に基づいて、本発明は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の接着培養方法であって、前記細胞を正荷電マイクロキャリアの表面に接着するステップと、前記細胞を培地において培養するステップと、前記細胞をマイクロキャリアから分離するステップと、前記細胞をさらに培養するステップとを備える方法を提供する。
【００１７】
「接着（性）細胞」は、哺乳類細胞を含む細胞であり、表面、例えば組織培養フラスコ表面またはマイクロキャリア粒子表面に接着し、組織培養において複製するものである。
【００１８】
本発明の細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞のように、Ｅｌ−不死化ＨＥＲ細胞から誘導する。本出願のためのＰＥＲ．Ｃ６細胞は、米国特許第５,９９４,１２８号に記載されており、ＥＣＡＣＣ第９６０２２９４０号の下で寄託されたような、細胞の上流もしくは下流継代からの細胞または上流もしくは下流継代の子孫を意味する。
【００１９】
「マイクロキャリア」は、培養において接着細胞の接着および増殖に有用である粒子、ビーズ、またはペレットを指す。マイクロキャリアは次の特性を有する：（ａ）それらは（マイクロキャリアまたは細胞に重大なせん断損傷を与えない撹拌速度を有する）懸濁培養に用いることが可能なほど十分に小さい；（ｂ）それらは固体である、または表面を多孔質コーティングした固体核を有する；および（ｃ）それらの表面（多孔質担体の場合は、外側および内側表面）は正荷電、負荷電または非荷電であり得る。マイクロキャリアは、例えば、制限されないが、ポリスチレン、セルロース、ポリエチレンまたはデキストラン系であり得るが、これは担体のマトリクスを異なる物質、例えばポリスチレン、セルロース、ポリエチレンまたはデキストランから生成することができることを意味する。さらに、マイクロキャリアは、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチンまたはテネイシンのような、接着因子でコーティングすることができる。これら独特の特徴は、異なる細胞の種類（型）のマイクロキャリアへの結合能力および細胞のマイクロキャリア上で増殖する能力に影響を与える。
【００２０】
ある見地では、マイクロキャリアは約１５０および３５０μｍの間の全粒径を有する。ある見地では、約０．８および３．０ｍｅｑ／ｇの間の正電荷密度を有する。いくつかの具体化では、正電荷はＤＥＡＥ（Ｎ，Ｎ，−ジエチルアミノエチル）基によりもたらされる。正電荷は他の基によりもたらすこともでき、例えばＤＥＡＥ基は、アニオン交換クロマトグラフィーにも用いられることが知られているが、第４アンモニウム基のような代替正荷電基も用いられる。したがって、このような代替正荷電基は、本発明によって、マイクロキャリアと結合され、用いることができると思われる。有用なマイクロキャリアは、例えばＣｙｔｏｄｅｘ（サイトデックス）１、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（サイトポア）１およびＣｙｔｏｐｏｒｅ  ２という名称で市販されている〔ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥヘルスケア社）から〕。一定の具体化では、マイクロキャリアは固体担体（例えばＣｙｔｏｄｅｘ‐１）である。担体粒子は多孔質マイクロキャリア（例えばＣｙｔｏｐｏｒｅ  １およびＣｙｔｏｐｏｒｅ  ２）でもあり得る。
【００２１】
本発明では、異なる細胞系（細胞株）を市販されているマイクロキャリアのいくつかの型への接着能力について試験した。ＣＨＯ細胞は試験したマイクロキャリアのすべての型上でうまく培養することができることを発見した。対照的に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、正荷電マイクロキャリアを除いて、これらのマイクロキャリアのいずれにも結合することができなかった。実際、ＰＥＲ．Ｃ６細胞が正荷電マイクロキャリアとのみ結合することができることは意外な発見である。したがって、本発明の方法によって用いられるマイクロキャリアは、正電荷を帯びている。一定の具体化では、マイクロキャリアは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞と結合され、正荷電Ｎ,Ｎ-ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基で置き換えた架橋デキストランマトリクスを含む。荷電基はマイクロキャリアマトリクス中に分散する。架橋デキストランマトリクスを含むマイクロキャリアを、本明細書では「デキストラン系」と称する。本発明の他の具体化では、正荷電マイクロキャリアは「セルロース系」である。一定の具体化では、マイクロキャリアは接着因子で被覆されない。
【００２２】
本発明の方法は、接着細胞が慣習的な培地において増殖することを可能にする〔ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．  Ｍａｃｒｏ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ（マクロ・キャリア・セル・カルチャー）．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ（原理および方法）．１８‐１１４０‐６２〕。好適な具体化では、培地は血清を含む。培地を補完するために用いる血清は、いろいろなソースから入手することができ、そして０．１％から３０％（ｖ／ｖ）までの範囲の濃度で用いる。血清はいくつかの機能を果たす。まず、細胞が培養表面に接着するのを補助する。次に、血清中の増殖因子およびホルモンが細胞増殖を促進する。血清はまた、細胞および産物の保護作用も有する。血清のさらなる機能は、ルーチン継代培養に用いるタンパク質分解酵素を不活性化するプロテアーゼ阻害剤を提供することである。
【００２３】
細胞は、振盪フラスコ、ローラーボトル、バイオリアクターおよび同類のもの、慣習的な容器において培養する。培地および、培地のサプリメント、血清、温度、ｐＨ、撹拌速度、マイクロキャリア濃度、等のような最適な増殖条件を選定することはこの技術における熟練者の知識の範囲内である（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．  Ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．１８‐１１４０‐６２）。細胞培養開始時のマイクロキャリア濃度は１〜２ｇ／Ｌの範囲内であることが好ましい。培養の細胞密度は１０および３０万個の生存細胞／ｍＬの間にあるのが好ましい。
【００２４】
プロセスをスケールアップするためには、接着細胞を担体から分離し、より一層大容量に継代培養することができることが好ましい。接着細胞は、例えば、制限されないが、ディスパーゼ、コラゲナーゼまたはトリプシンのようなタンパク質分解酵素の培地への添加により、担体から分離することができる。一定の具体化では、本発明に従うタンパク質分解酵素はトリプシンである。
【００２５】
意外にも、トリプシン添加後、ＰＥＲ．Ｃ６細胞が正荷電マイクロキャリアから容易に分離することが見出された。これは、これら特定の担体が製造業者によって細胞株によってより一層強く結合されることが特定されていること、およびこれらが従って生産の最終段階用の担体として広く用いられていることを考えれば（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．  Ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．１８‐１１４０‐６２）、極めて予想外であった。
【００２６】
本発明の好適な具体化によると、接着細胞を担体から分離し、より一層高い容量の容器に移送することができる。好適な具体化では、細胞を再度マイクロキャリアに付着させ、そしてさらに培養する。この具体化は、一般にいくつかのスケールアップのステップ（工程）を要する産業プロセスにおける接着細胞の利用を可能にする。
【００２７】
本発明の別の見地は、接着性ＰＥＲ．Ｃ６細胞による産物の生成方法であって、ＰＥＲ．Ｃ６細胞をマイクロキャリアの表面に接着するステップと、前記細胞を培地で培養するステップであり、産物が前記細胞により放出されるステップと、その後生成された産物を収穫するステップとを備える方法を提供する。
【００２８】
本発明の方法のある具体化によると、本発明での接着性細胞により生成された産物は、例えば、制限されないが、血液凝固因子（例えば第Ｖ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ因子、ＡＰＣ−耐性第Ｖ因子）としてのタンパク質であり得る。タンパク質の生成には、本発明の細胞は、前記タンパク質の発現を促進することができる要素とともに動作可能に、前記タンパク質を符号化する、核酸を適当に含む（例えばＷＯ  ００／６３４０３号参照）。
【００２９】
さらに、いくつかのウイルスは、細胞が接着系であるとより一層効率的に感染することができるので、本発明の接着性細胞は細胞によるウイルスの生成のために用いることができる（例えばＷＯ  ０１／３８３６２号参照）。したがって、いくつかの具体化において本発明の方法により生成される産物は、ウイルスであってよい。
【００３０】
産物を収穫し、さらに精製するための方法は、細胞懸濁物から前記産物を回収するのに適した下流プロセスを設計することができるこの技術での熟練した者に知られている。
【００３１】
本発明は、初めて、マイクロキャリアと結合するＰＥＲ．Ｃ６細胞について開示する。それゆえ、本発明の別の見地は、マイクロキャリアに付着する接着性ＰＥＲ．Ｃ６細胞の細胞培養を提供し、前記マイクロキャリアは正電荷を帯びている。一定の具体化では、前記マイクロキャリアはデキストラン系である。他の具体化では、前記マイクロキャリアはセルロース系である。こうした細胞培養は、本発明によるプロセスおよび例えばスケールアップに用いることができる。
【００３２】
本発明によると、前記細胞培養は培地とマイクロキャリアとを含む。最大の細胞増殖および産物生成を可能にするのに適当な培地成分を選定することは、この技術での熟練者の知識の範囲内である（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．  Ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．１８‐１１４０‐６２）。一定の具体化では、培地は血清を含む。血清成分は、不安定である傾向がある産物、例えば抗体または血液凝固因子（例えば第Ｖ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ因子、ＡＰＣ−耐性第Ｖ因子）のための保護機能を有することができる。細胞培養はさらに細胞によって生産される生成物を含むことができる。
【００３３】
ここまでこの発明について一般的に説明してきたが、以下の例を参照して、同様のことが理解されるであろうし、これらの例は、ただ例示の目的で本明細書に提供され、とくに指定の無い限り、制限されることを意図しない。
【実施例】
【００３４】
例１：普通に用いられるマイクロキャリア上のＣＨＯ細胞の培養
【００３５】
ＣＨＯ細胞のＣｙｔｏｄｅｘ‐１およびＣｙｔｏｄｅｘ‐３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；２Ｄ  ＭｉｃｒｏｈｅｘおよびＢｉｏｓｉｌｏｎ（Ｎｕｎｃ）；ＨｙＱｓｐｈｅｒｅ  ＣＧＥＮ  １０２‐Ｌ、Ｐｒｏ‐Ｆ  １０２‐Ｌ、Ｐ１０２‐Ｌ、Ｆａｃｔ  １０２‐Ｌ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むいくつかのマイクロキャリアへの接着能力を試験した。ＣＨＯ細胞は標準方法によって前記マイクロキャリア上で培養した。製造業者が推奨する量（１〜２０ｇ／Ｌ）の担体を滅菌し、培地で洗浄し、適した設定でスピナーフラスコにおいて３０分間インキュベーションした。Ｔ‐フラスコ培養物のトリプシン処理により得た細胞を、製造業者が推奨するように、０．１〜０．２×１０６個細胞／ｍＬの密度で接種した。細胞は、加湿した培養器インキュベーター内の１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補完した７５ｍＬのＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を含むスピナーフラスコにおいて３７℃、５％のＣＯ２、３０ｒｐｍで培養した。上記マイクロキャリアと結合したＣＨＯ‐Ｋｌ細胞の培養に成功した。すべての例において、細胞は担体によく接着し、担体上でコンフルエントな状態まで増殖し、均質な培養を得た。
例２：普通に用いられるマイクロキャリア上のＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養
【００３６】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、前例と同様のマイクロキャリア（表１）上で、同様の方法によって試験した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、次のいずれの担体上でもうまく培養することができなかったようだ：Ｃｙｔｏｄｅｘ‐３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；２Ｄ  ＭｉｃｒｏｈｅｘおよびＢｉｏｓｉｌｏｎ（Ｎｕｎｃ）；ＨｙＱｓｐｈｅｒｅ  ＣＧＥＮ  １０２‐Ｌ、Ｐｒｏ‐Ｆ  １０２‐Ｌ、Ｐ１０２‐Ｌ、Ｆａｃｔ  １０２‐Ｌ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）。いくつかのケースでは、細胞は担体に接着せず（こうした培養の図を図１に示す）、他のケースでは、細胞は非均質に分散し、１つ以上の担体に接着した大きな凝集塊に増殖する傾向があった（こうした培養の図を図２に示す）。
例３：正荷電マイクロキャリア上のＰＥＲ．Ｃ６細胞の成功した培養
【００３７】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、例１に記載した方法によって、正荷電マイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ‐１）上でも試験した。細胞は、約４〜５日でコンフルエンスまで増殖し（３日目のサブコンフルエントな培養を図３に示す）、培養の十分な均質性（すなわち細胞はマイクロキャリア一面に均等に分散した）を達成した。異なる糖タンパク質を発現する４つの異なるＰＥＲ．Ｃ６細胞系を試験した。それらすべては、正荷電マイクロキャリア上で好首尾に培養された。
【００３８】
細胞は正荷電マイクロキャリアに強力に接着するので、製造業者は生成の最終段階の培養にはこの型の担体の利用を推奨する（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．  Ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．１８‐１１４０‐６２）。生存細胞がこれらマイクロキャリアから分離する可能性を試験したところ、実際ＣＨＯ細胞は正荷電マイクロキャリアから取り外すことができなかった。
【００３９】
意外にも、ＰＥＲ．Ｃ６細胞はトリプシン処理により正荷電担体から取り外すことができることを発見した。
【００４０】
【表１】
0005684122.tif 000002
【００４１】
一般に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、正荷電マイクロキャリアを除いて、現在市販されている大部分のマイクロキャリア上ではよく増殖しないと結論づけることができる。また、ＰＥＲ．Ｃ６細胞はトリプシン処理によりこれら担体から取り外すことができる。これは継代培養および、ひいては産業プロセスに要するプロセスのスケールアップを可能にする。
【００４２】
さらに、固体正荷電マイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ‐１、２つのマクロ多孔質正荷電マイクロキャリア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ‐１およびＣｙｔｏｐｏｒｅ‐２）を試験したところ、ＰＥＲ．Ｃ６細胞はこれら代替正荷電マイクロキャリア上でうまく培養することができたことを示した。図５、６および７は、正荷電マクロ多孔質マイクロキャリア上で接着により増殖するＰＥＲ．Ｃ６細胞のグルコース消費量および乳酸塩生成量を示す。各継代後に減少するグルコース濃度および増加する乳酸塩生成量は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞がこれらマイクロキャリア上で好首尾に培養されたことを示す。
例４：スピナーにおける正荷電担体上のＰＥＲ．Ｃ６細胞のバッチ培養
【００４３】
この例では、ＰＥＲ．Ｃ６細胞をスピナーフラスコにおける正荷電担体上で培養した。細胞を、０．１〜０．２×１０６個細胞／ｍＬの密度で、１０％のＦＢＳによって補完したＤＭＥＭ培地に接種した。図４に示すように、接種時、各ビーズは１０および９０個細胞の間を含んだ。９日後、約１０００個細胞／ビーズ（コンフルエントな培養）とともに、約５×１０６ｖｃ／ｍＬの細胞濃度に達した。成功した細胞培養は、撹拌器速度（２０〜８０ＲＰＭ）および可動範囲（working volume）（１５０〜２５０ｍＬ）のような広範囲の標準操作パラメータで取得した。
例５：バイオリアクターにおける正荷電担体上のＰＥＲ．Ｃ６細胞のバッチ培養
【００４４】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を２Ｌバイオリアクターにおける正荷電担体上で培養した。細胞はうまく培養された。細胞は担体に良好に接着し、担体上でコンフルエントな状態にまで増殖し、均質な培養が得られた。
例６：正荷電担体上のＰＥＲ．Ｃ６細胞による組換えタンパク質の生産
【００４５】
正荷電マイクロキャリア上のＰＥＲ．Ｃ６細胞により生成されるいくつかの産物の生成レベル（スピナーフラスコにおける）を測定した。これらタンパク質の生成レベルは参照システム（Ｔ‐フラスコ）において前に取得したレベルの範囲内であることを発見した。（スピナーフラスコにおける）正荷電担体上の第Ｖ因子タンパク質の生成レベルは、Ｔ−フラスコにおける１５００〜３０００ｎｇ／ｍＬと比べて、１０００〜２０００ｎｇ／ｍＬの間であった。同様のマイクロキャリア上の第ＸＩ因子タンパク質の生成レベル（スピナーフラスコにおける）は、Ｔ−フラスコにおける約１５０００ｎｇ／ｍＬと比べて、７０００〜１２０００ｎｇ／ｍＬの間であった。
例７：期待されるプロセス
【００４６】
上記結果に基づいて、次のプロセスが提案される。接着性ＰＥＲ．Ｃ６細胞の前培養をＣｙｔｏｄｅｘ‐１マイクロキャリアを用いる生産規模までスケールアップする。しかる後、培地交換による１または複数（例えば３〜６）の反復バッチ培養において（例えば組換えタンパク質の）生産を行う。この最終生産工程には、Ｃｙｔｏｄｅｘ‐１マイクロキャリアを用いる。代わりに、この工程のためにはマクロ多孔質マイクロキャリアを用いることもできる。これは高細胞密度を得ることができるので有利であり得、本発明者らは、これら担体上のＰＥＲ．Ｃ６細胞の増殖は成功の見込みが高いことを観測した。しかしながら、細胞をこれら担体から取り外すことができないため、それらは中規模の前培養／スケールアップ工程には適さない。
【００４７】
参考文献
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【図１】
0005684122.tif 000003
【図２】
0005684122.tif 000004
【図３】
0005684122.tif 000005
【図４】
0005684122.tif 000006
【図５】
0005684122.tif 000007
【図６】
0005684122.tif 000008
【図７】
0005684122.tif 000009