(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライム・ブースト免疫療法に使用される複合薬剤であって、該複合薬剤が、
ａ．全長組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）インディアナ（Indiana）抗原型（ｒＶＳＶInd）を含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、
ｂ．全長ｒＶＳＶニュージャージイ(New Jersey) 抗原型（ｒＶＳＶＮＪ）を含む他のワクチン又は免疫抗原性組成物と、  
を有してなり、
該ｒＶＳＶIndが、位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ51Ｒ置換）インディアナ抗原型Ｍたんぱく質を発現するものであり、該ｒＶＳＶＮＪが、位置48においてアルギニンに変化したメチオニンを有すると共に位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ48Ｒ−Ｍ51Ｒ置換）ニュージャージイ抗原型Ｍたんぱく質を発現する突然変異Ｍ遺伝子を含むことを特徴とするもの。
【請求項２】
２つのｒＶＳＶ抗原型が関連する１又はそれ以上のたんぱく質を発現可能であることを特徴とする請求項１に記載の複合薬剤。
【請求項３】
２つのｒＶＳＶ抗原型が１又はそれ以上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）たんぱく質を発現可能であることを特徴とする請求項１に記載の複合薬剤。
【請求項４】
前記ｒＶＳＶInd抗原型を有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物が、プライムワクチンとして使用され、前記ｒＶＳＶＮＪを有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物がブーストワクチンとして使用されるものであることを特徴とする請求項１に記載の複合薬剤。
【請求項５】
前記の双方のｒＶＳＶ抗原型が、病原体の1又はそれ以上のたんぱく質を発現可能であることを特徴とする請求項１に記載の複合薬剤。
【請求項６】
前記病原体が、ＨＣＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウエスト・ナイルウイルス、ハンタウイルス（Hantaviruses）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、デング出血熱ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびＳＡＲＳコロナウイルスからなる群から選択されるものである請求項５に記載の複合薬剤。
【請求項７】
前記ワクチン又は免疫抗原性組成物が更に、適当な希釈剤、佐剤、薬理学的に許容できるキャリア又はそれらの組合せを含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の複合薬剤。
【請求項８】
前記病原体により生じた感染の予防又は治療に使用されることを目的とする請求項５に記載の複合薬剤。
【請求項９】
前記ＨＣＶにより生じた感染の予防又は治療に使用されることを目的とする請求項３に記載の複合薬剤。
【請求項１０】
哺乳動物（但し、ヒトを除く、以下同様）においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる方法であって、
ａ．全長組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）インディアナ（Indiana）抗原型（ｒＶＳＶInd）を含むワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を該哺乳動物に投与するステップと、
ｂ．全長ｒＶＳＶニュージャージイ(New Jersey) 抗原型（ｒＶＳＶＮＪ）を含む他のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を該哺乳動物に投与するステップと、
を含み、
該ｒＶＳＶIndが、位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ51Ｒ置換）インディアナ抗原型Ｍたんぱく質を発現するものであり、該ｒＶＳＶＮＪが、位置48においてアルギニンに変化したメチオニンを有すると共に位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ48Ｒ−Ｍ51Ｒ置換）ニュージャージイ抗原型Ｍたんぱく質を発現する突然変異Ｍ遺伝子を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記ｒＶＳＶInd抗原型を有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物をプライム用量として前記哺乳動物に投与し、前記ｒＶＳＶＮＪを有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物がブースト用量として前記哺乳動物に使用されるものであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｒＶＳＶIndを含む前記ワクチン又は免疫抗原性組成物の少なくとも１用量を前記哺乳動物に投与することを更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｒＶＳＶＮＪ抗原型を有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物をプライム用量として前記哺乳動物に投与し、前記ｒＶＳＶIndを有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物がブースト用量として前記哺乳動物に使用されるものであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｃとして、前記ｒＶＳＶＮＪを含むワクチン又は免疫抗原性組成物の少なくとも１用量を前記哺乳動物に投与することを更に含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫反応が体液性及び/又は細胞質免疫反応を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｒＶＳＶIndおよび前記ｒＶＳＶＮＪ抗原型が、細胞媒介及び/又は体液性免疫反応を誘起させる能力を有するウイルス様粒子を生産することができるものであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｒＶＳＶIndおよび前記ｒＶＳＶＮＪ抗原型が、外因性ウイルスの１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができるものであり、前記免疫反応が更に該１又はそれ以上の外因性ウイルスタンパク質に対する免疫反応を含み、該外因性ウイルスが、ＨＣＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウエスト・ナイルウイルス、ハンタウイルス（Hantaviruses）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、デング出血熱ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびＳＡＲＳコロナウイルスからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｒＶＳＶIndおよび前記ｒＶＳＶＮＪ抗原型が、１又はそれ以上のＨＣＶたんぱく質を発現することができるものであり、前記免疫反応が更に該１又はそれ以上のＨＣＶたんぱく質に対する免疫反応を含むものであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
病原体に対する免疫反応を誘起させるのに有用な複合薬剤であって、該複合薬剤が、
ａ．病原体の1又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる全長組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）インディアナ抗原型（ｒＶＳＶInd）を含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、
ｂ．病原体の1又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる全長ｒＶＳＶニュージャージイ抗原型（ｒＶＳＶＮＪ）を含む他のワクチン又は免疫抗原性組成物と、
を有してなり、
該ｒＶＳＶIndが、位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ51Ｒ置換）インディアナ抗原型Ｍたんぱく質を発現するものであり、該ｒＶＳＶＮＪが、位置48においてアルギニンに変化したメチオニンを有すると共に位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ48Ｒ−Ｍ51Ｒ置換）ニュージャージイ抗原型Ｍたんぱく質を発現する突然変異Ｍ遺伝子を含むことを特徴とするもの。
【請求項２０】
哺乳動物（但し、ヒトを除く、以下同様）において病原体による感染を予防又は治療する為の方法であって、
ａ．病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる全長組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）インディアナ（Indiana）抗原型（ｒＶＳＶInd）を含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を該哺乳動物に投与するステップと、
ｂ．病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる全長ｒＶＳＶニュージャージイ(New Jersey) 抗原型（ｒＶＳＶＮＪ）からなるワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を該哺乳動物に投与するステップと、
を含み、
該ｒＶＳＶIndが、位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ51Ｒ置換）インディアナ抗原型Ｍたんぱく質を発現するものであり、該ｒＶＳＶＮＪが、位置48においてアルギニンに変化したメチオニンを有すると共に位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ48Ｒ−Ｍ51Ｒ置換）ニュージャージイ抗原型Ｍたんぱく質を発現する突然変異Ｍ遺伝子を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記ｒＶＳＶInd抗原型を有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物をプライム用量として前記哺乳動物に投与し、前記ｒＶＳＶＮＪを有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物がブースト用量として前記哺乳動物に使用されるものであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｒＶＳＶIndを含む前記ワクチン又は免疫抗原性組成物の少なくとも１用量を前記哺乳動物に投与することを更に含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｒＶＳＶＮＪ抗原型を有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物をプライム用量として前記哺乳動物に投与し、前記ｒＶＳＶIndｒを有する前記ワクチン又は免疫抗原性組成物がブースト用量として前記哺乳動物に投与されるものであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｃとして、前記ｒＶＳＶＮＪを含むワクチン又は免疫抗原性組成物の少なくとも１用量を前記哺乳動物に投与することを更に含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（a）全長組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）インディアナ（Indiana）抗原型（ｒＶＳＶInd）を含むワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量の少なくとも１投与量と、（ｂ）全長ｒＶＳＶニュージャージイ(New Jersey) 抗原型（ｒＶＳＶＮＪ）を含むワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量の少なくとも１投与量とを含むキットであって、
該ｒＶＳＶIndが、位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ51Ｒ置換）インディアナ抗原型Ｍたんぱく質を発現するものであり、該ｒＶＳＶＮＪが、位置48においてアルギニンに変化したメチオニンを有すると共に位置51においてアルギニンに変化したメチオニンを有する（Ｍ48Ｒ−Ｍ51Ｒ置換）ニュージャージイ抗原型Ｍたんぱく質を発現する突然変異Ｍ遺伝子を含むことを特徴とするもの。
【請求項２６】
前記（a）および（ｂ）が薬理学的に許容できるキャリア中に調剤されていることを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの異なる抗原型(血清型（serotypes）)の組換え水疱性口内炎ウイルスを含むワクチン又は免疫抗原性組成物（immunogenic compositions）の新規なプラットホーム、並びに該組成物における該新規なプラットホームの使用並びにヒトの病原体に対する予防用および治療用ワクチン接種の為の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願明細書中において、本発明に関連する従来技術をより完全に説明するため種々の参考文献を角カッコ内に引用している。これらの参考文献の開示は本発明の開示内に参照として組み込まれるものである。
【０００３】
ＣＤ８＋ＣＴＬを接種する最良の方法は、ウイルス又はバクテリアベクターを使用するＤＮＡトランスフェクション又は感染により標的抗原を合成することである。ウイルスワクチンベクターとして要求されることは、広範な宿主および関係する遺伝子の良好な発現である。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は殆どの哺乳動物細胞（mammalian cells）を感染させ、感染された細胞の全たんぱく質の６０％までのウイルスたんぱく質を発現させる［Kim，G．N．およびC. Y. Kang. Virology 357:41, 2007（非特許文献１）。自然界において、ＶＳＶは豚、牛、馬を感染させ、口および足の周りに小胞性疾患を生じさせる。ＶＳＶによるヒトの感染も報告されているが、ＶＳＶは重篤な症状を生じさせるものではない［Fields，B．N．およびK. Hawkins. N Engl J Med 277:989, 1967（非特許文献２）; Johnson, K.M.ら,Am J Trop Med Hyg 15:244, 1966（非特許文献３）］。
【０００４】
ＶＳＶはネガティブ鎖ＲＮＡウイルスであり、５つのたんぱく質、ヌクレオカプシドたんぱく質（Ｎ）、リンたんぱく質（Ｐ）、マトリックスたんぱく質（Ｍ）、表層糖たんぱく質（Ｇ）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリミラーゼ（Ｌ）を符号化する。これらＶＳＶのＮ，ＰおよびＬたんぱく質は、ポジティブおよびネガティブセンスゲノムＲＮＡｓおよびｍＲＮＡの合成に必要なものであり、これらＲＮＡはＶＳＶたんぱく質およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）たんぱく質のような関係する遺伝子の合成に必要なものである。
【０００５】
ｃＤＮＡから組換えＶＳＶｓを発生させるＶＳＶ逆行遺伝子システム（reverse genetics system）［Lawson，N．D．ら,Proc Natl Acad Sci USA 92:4477,1995（非特許文献４）; Whelan, S.P.ら,Proc Natl Acad Sci USA 92:8388, 1995（非特許文献５）］の発展以来、ＶＳＶは種々の病原体の免疫のためのウイルスワクチンベクターとして研究されてきた［Brandsma，J．L．ら,J Virol 81:5749,2007（非特許文献６）; Daddario-DiCaprio, K.M.ら, J Virol 80:9659,2006（非特許文献７）; Kohl,W.ら, J Gen Virol 88:157, 2007（非特許文献８）; Kuate,S.ら, Virology 362:26,2007（非特許文献９）; Palin,A.ら, Vaccine 25:741,2007（非特許文献１０）; Schwartz,J.A.ら, Virology 366:166,2007（非特許文献１１）］。
【０００６】
ＶＳＶは急速に複製されるウイルスであるが、最終的には、他の全てのウイルスベクターのように、ＶＳＶに対する体液性および細胞免疫反応（cellular immune responses）が動物宿主において誘発される［Yewdell，J．W．ら,J Exp Med 163:1529-1938,1986（非特許文献１２）; Puddington, L.ら, J Virol 60:708-717,1986（非特許文献１３）; Kalinke,U.ら, Immunity 5:639-652, 1996（非特許文献１４）］。ＶＳＶで感染された動物は、中和抗体を含めて１又は２週間で免疫反応（immune response）を発現させ［Kalinke,U.ら, Immunity 5:639-652, 1996（非特許文献１４）］、これは同じベクターでの予防接種のための追加免疫の効能を妨害することになる。ＶＳＶはウイルス性表層糖たんぱく質Ｇに対する抗原型特定抗体により中和される。ＶＳＶの２つの異なる抗原型、すなわちＶＳＶ-インディアナ（ＶＳＶＩｎｄ）抗原型およびｒＶＳＶニュージャージイ（ＶＳＶNJ）抗原型は糖たんぱく質において５０％のアミノ酸一致を示す［Gallione，C．J．およびRose,J.K. J. Virol. 46:162-169,1983（非特許文献１５）］。ＶＳＶの１つの抗原型に対し生起された抗体はＶＳＶの他の抗原型を中和することはない［Cartwright，B．およびBrown,F.J. Gen. Virol. 16:391-398,1972（非特許文献１６）］。従って、ＶＳＶＩｎｄをワクチンベクターとして使用することが行われているが、この場合、糖たんぱく質はＶＳＶNJのものと置換し、ウイルスベクターに対するこの免疫反応から生じる問題を抑制している［Rose,N.F.ら, J. Virol. 74:10903-10910,2000（非特許文献１７）; Rose,N.F.ら, Cell 106:539-549,2001（非特許文献１８）］。
【０００７】
ＶＳＶNJ抗原型のＧたんぱく質を有するＶＳＶＩｎｄは体液性免疫反応を回避するのに有用であるが、Ｎ，Ｐ，ＭおよびＬたんぱく質を含む他のＶＳＶたんぱく質により誘起される細胞免疫反応を防止することはできない。Ｇたんぱく質以外のＶＳＶたんぱく質に対する細胞免疫反応は関係する抗原に対する不完全な免疫反応を生じることになる。従って、他の抗原型からの追加組換えＶＳＶの発生は、生ウイルスワクチンベクターとしてＶＳＶを使用する効能を増大させることができる。
【０００８】
興味深いことに、完全ｒＶＳＶNJ抗原型ベクターの発生は、インディアナ抗原型とニュージャージイ抗原型との間の交差反応性細胞毒Ｔ-リンパ球反応についての可能性のため、試みられることがなかったということが従前から示唆されてきた［Clarkeら, Springer Semin Immun 28:239,2006（非特許文献１９）］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kim，G．N．およびC. Y. Kang. Virology 357:41, 2007
【非特許文献２】Fields，B．N．およびK. Hawkins. N Engl J Med 277:989, 1967
【非特許文献３】Johnson, K.M.ら,Am J Trop Med Hyg 15:244, 1966
【非特許文献４】Lawson，N．D．ら,Proc Natl Acad Sci USA 92:4477,1995
【非特許文献５】Whelan, S.P.ら,Proc Natl Acad Sci USA 92:8388, 1995
【非特許文献６】Brandsma，J．L．ら,J Virol 81:5749,2007
【非特許文献７】Daddario-DiCaprio, K.M.ら, J Virol 80:9659,2006
【非特許文献８】Kohl,W.ら, J Gen Virol 88:157, 2007
【非特許文献９】Kuate,S.ら, Virology 362:26,2007
【非特許文献１０】Palin,A.ら, Vaccine 25:741,2007
【非特許文献１１】Schwartz,J.A.ら, Virology 366:166,2007
【非特許文献１２】Yewdell，J．W．ら,J Exp Med 163:1529-1938,1986
【非特許文献１３】Puddington, L.ら, J Virol 60:708-717,1986
【非特許文献１４】Kalinke,U.ら, Immunity 5:639-652, 1996
【非特許文献１５】Gallione，C．J．およびRose,J.K. J. Virol. 46:162-169,1983
【非特許文献１６】Cartwright，B．およびBrown,F.J. Gen. Virol. 16:391-398,1972
【非特許文献１７】Rose,N.F.ら, J. Virol. 74:10903-10910,2000
【非特許文献１８】Rose,N.F.ら, Cell 106:539-549,2001
【非特許文献１９】Clarkeら, Springer Semin Immun 28:239,2006
【非特許文献２０】Petersen,J.M.ら, Mol Cell Biol 20:8590,2000
【非特許文献２１】von Kobbe,C.,ら, Mol Cell 6:1243,2000
【非特許文献２２】Buchholz, U.J.ら,J Virol 73:251, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の背景に鑑みて、体液性および細胞免疫システムの双方を利用する免疫防御および免疫療法のためのアプローチを提供することは有益なものであろう。そのため、本出願人は感染性病原体に対し反応を誘起させる複数のワクチンの組合せからなるシステムを開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１つの形態は、プライム（抗原刺激）・ブースト(追加)免疫療法に使用される免疫プラットホーム（immunization platform）であって、（a）１つの抗原型の組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）を含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、（ｂ）他の抗原型のｒＶＳＶを含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物とを有することを特徴とする免疫プラットホームを提供することである。
【００１２】
本発明の他の形態は、前記免疫プラットホームにおいて、１つの抗原型がインディアナ（Indiana）であり、他の抗原型がニュージャージイ(New Jersey)であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の他の形態は、前記免疫プラットホームにおいて、２つのｒＶＳＶ抗原型の夫々が突然変異マトリックスたんぱく質（Ｍ）遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の他の形態は、前記免疫プラットホームにおいて、１つの抗原型が、他の抗原型の表層糖タンパク（Ｇ）遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明の他の形態は、前記免疫プラットホームにおいて、２つのｒＶＳＶ抗原型が関連する１又はそれ以上のたんぱく質を発現可能であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の他の形態は、前記免疫プラットホームにおいて、２つのｒＶＳＶ抗原型が１又はそれ以上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）たんぱく質を発現可能であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の更なる形態は、被検体に対し、第１の抗原型ｒＶＳＶを含むワクチン又は免疫抗原性組成物をプライム投与し、ついで、第２の抗原型ｒＶＳＶを含むワクチン又は免疫抗原性組成物をブースト投与することを特徴とする免疫レジメンを提供することである。
【００１８】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、ブースト投与の後、第１の抗原型ｒＶＳＶを含むワクチン又は免疫抗原性組成物の少なくとも１以上の投与を行うことを特徴とする。
【００１９】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、第１の抗原型がインディアナ（Indiana）であり、第２の抗原型がニュージャージイ(New Jersey)であることを特徴とする。
【００２０】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、第１の抗原型がニュージャージイ(New Jersey)であり、第２の抗原型がインディアナ（Indiana）であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、第１および第２のｒＶＳＶ抗原型が突然変異Ｍ遺伝子を含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、第２のｒＶＳＶ抗原型が第１のｒＶＳＶ抗原型のＧ遺伝子を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、第１および第２のｒＶＳＶ抗原型が関連する１又はそれ以上のたんぱく質を発現可能であることを特徴とする。
【００２４】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、前記の関連する１又はそれ以上のたんぱく質が、ＨＣＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウエスト・ナイルウイルス、ハンタウイルス（Hantaviruses）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、デング出血熱ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびＳＡＲＳコロナウイルスからなる群から選択される外因性ウイルスの１又はそれ以上のたんぱく質であることを特徴とする。
【００２５】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、第１および第２のｒＶＳＶ抗原型が１又はそれ以上のＨＣＶたんぱく質を発現可能であることを特徴とする。
【００２６】
本発明の他の形態は、前記免疫レジメンにおいて、第１の抗原型がインディアナであり、第２の抗原型がニュージャージイであり、このｒＶＳＶインディアナおよびｒＶＳＶニュージャージイの双方が突然変異Ｍ遺伝子を含み、かつ、このｒＶＳＶインディアナおよびｒＶＳＶニュージャージイが外因性ウイルスの１又はそれ以上のたんぱく質を発現可能であることを特徴とする。
【００２７】
本発明の更なる形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる方法であって、（ａ）第１のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、ここで該第１のワクチン又は免疫抗原性組成物が第１の抗原型のｒＶＳＶを含み、（ｂ）第２のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、ここで該第２のワクチン又は免疫抗原性組成物が第２の抗原型のｒＶＳＶを含むことからなることを特徴とする方法を提供することである。
【００２８】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、更に（ｃ）第１のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、第１の抗原型がインディアナであり、第２の抗原型がニュージャージイであることを特徴とする。
【００３０】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、第１の抗原型がニュージャージイであり、第２の抗原型がインディアナであることを特徴とする。
【００３１】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、第１および第２のｒＶＳＶ抗原型が突然変異Ｍ遺伝子を含むことを特徴とする。
【００３２】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、第２のｒＶＳＶ抗原型が第１のｒＶＳＶ抗原型のＧ遺伝子を含むことを特徴とする。
【００３３】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、前記免疫反応が体液性及び/又は細胞質免疫反応を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、第１および第２のｒＶＳＶ抗原型が、細胞媒介及び/又は体液性免疫反応を誘起させる能力を有するウイルス様粒子を生産することができるものであることを特徴とする。
【００３５】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、第１および第２のｒＶＳＶ抗原型が、外因性ウイルスの１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができるものであり、前記免疫反応が更に該１又はそれ以上の外因性ウイルスたんぱく質に対する免疫反応を含み、該外因性ウイルスが、ヒトＨＣＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウエスト・ナイルウイルス、ハンタウイルス（Hantaviruses）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、デング出血熱ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびＳＡＲＳコロナウイルスからなる群から選択されるものであることを特徴とする。
【００３６】
本発明の他の形態は、哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる前記方法において、第１および第２のｒＶＳＶ抗原型が、１又はそれ以上のＨＣＶたんぱく質を発現することができるものであり、前記免疫反応が更に該１又はそれ以上のＨＣＶたんぱく質に対する免疫反応を含むものであることを特徴とする。
【００３７】
本発明の更なる形態は、病原体に対する免疫反応を誘起させるのに有用な複合薬剤であって、（a）病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる１つの抗原型のｒＶＳＶを含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、（ｂ）病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる他の抗原型のｒＶＳＶを含む他のワクチン又は免疫抗原性組成物とを含むことを特徴とする複合薬剤を提供することである。
【００３８】
本発明の他の形態は、前記複合薬剤において、１つの抗原型がｒＶＳＶインディアナであり、他の抗原型がｒＶＳＶニュージャージイであり、これらｒＶＳＶインディアナおよびｒＶＳＶニュージャージイが突然変異Ｍ遺伝子を含むことを特徴とする。
【００３９】
本発明の更なる形態は、病原体による感染を予防又は治療する為の方法であって、（a）病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる第１の抗原型のｒＶＳＶを含む第１のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を被験者に投与すること、（ｂ）病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる第２の抗原型のｒＶＳＶを含む第２のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を被験者に投与することからなる方法を提供することである。
【００４０】
本発明の他の形態は、病原体による感染を予防又は治療する為の前記方法において、更に（ｃ）第１のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を被験者に投与することを含むことを特徴とする。
【００４１】
本発明の他の形態は、病原体による感染を予防又は治療する為の前記方法において、第１の抗原型がｒＶＳＶインディアナであり、第２の抗原型がｒＶＳＶニュージャージイであることを特徴とする。
【００４２】
本発明の他の形態は、病原体による感染を予防又は治療する為の前記方法において、第１の抗原型がｒＶＳＶニュージャージイであり、第２の抗原型がｒＶＳＶインディアナであることを特徴とする。
【００４３】
本発明の更なる形態は、（ａ）１つの抗原型のｒＶＳＶを含むワクチンの有効量の少なくとも１投与量と、（ｂ）他の抗原型のｒＶＳＶを含むワクチンの有効量の少なくとも１投与量とを含むキットを提供することである。
【００４４】
本発明の他の形態は、前記キットにおいて、前記（ａ）および（ｂ）が薬理学的に許容できるキャリア中に調剤されていることを特徴とする。
【００４５】
ワクチンベクターとして、ＶＳＶおよびＶＳＶの２つの抗原型を使用する利点として以下のことが含まれる。すなわち、
（１）ＶＳＶの２つの抗原型を利用することにより、このＶＳＶをより効果的なワクチンベクターとすることができる。なぜならば、ＶＳＶの１つの抗原型（第１のワクチン）はＶＳＶの他の抗原型（第２のワクチン）を中和することがなく、あるいは、このＶＳＶの他の抗原型で感染された細胞を容易に死滅させることがないからである。
（２）ＶＳＶはヒトにおいて重大な病気を生じさせることはなく、感染する殆どの人は病気の動物を取扱う獣医師であるか、あるいはＶＳＶについて従事している科学者である。従って、一般の人々での血清抗体陽性の割合は極めて低く、そのことがこのＶＳＶを魅力的なワクチンベクターとさせている。
（３）ＶＳＶは感染した個人において自己制御的に複製するが、依然として強力な細胞および体液性免疫反応を誘起させる。
（４）ＶＳＶは培養において殆どの哺乳動物細胞において良好に複製し、高いウイルス力価（viral titer）を生じさせる。
【００４６】
本発明は此処に記載した詳細な説明並びに添付図面から、より十分に理解されるであろうが、これらは単に説明の為のものであり、意図する本発明の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、インディアナ（Ind）抗原型耐熱（ＨＲ）種およびニュージャージイ（NJ）抗原型ヘーズルハースト（Hazlehurst）種（Ｈａｚ）の遺伝子組織を示す図。
【図２】ｃＤＮＡからＶＳＶを回収するための逆行遺伝子システムを示す図。
【図３】関係する遺伝子を有しない組換えＶＳＶｓの生長動態を示す図。
【図４】組換えＶＳＶｓで感染されたベビーハムスターの腎臓細胞におけるＶＳＶたんぱく質の発現を示す図。
【図５】単一ウイルス３投与スケジュールＶＳＶワクチンを投与されたBalb/cマウスにおけるＶＳＶペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を示す図。
【図６】ニュージャージイ-インディアナ-ニュージャージイの順でＶＳＶワクチンの連続的投与スケジュールで投与されたBalb/cマウスにおけるＶＳＶペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を示す図。
【図７】インディアナ-ニュージャージイ-インディアナの順でＶＳＶワクチンの連続的投与スケジュールで投与されたBalb/cマウスにおけるＶＳＶペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を示す図。
【図８Ａ】ＶＳＶワクチンの１又は２抗原型を投与されたBalb/cマウスにおけるＶＳＶペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を比較して示す図。
【図８Ｂ】ＶＳＶＩｎｄ-Ｍ（Ｍ５１Ｒ）＋ＨＣＶ-Core△ERで、ついでＶＳＶNJ-Ｍ（Ｍ４８/５１Ｒ）＋ＨＣＶ-Core△ERで接種され、更に３週間後にＶＳＶＩｎｄ-Ｍ（Ｍ５１Ｒ）＋ＨＣＶ-CoreΔERで追加投与されたマウスの一団（コホート）(n=2)において、ＨＣＶ ＭＨＣクラスＩペプチドでex vivo刺激が与えられた後のＣＤ８＋Ｔ細胞の再活性化を比較して示す図（パネルの右側の1セットのバー）。
【図９】失欠変異を伴った又は伴合わないＨＣＶコア遺伝子のＶＳＶNJのｃＤＮＡクローンへのクローニングを示す図。
【図１０】失欠変異を伴った又は伴合わないＨＣＶコア遺伝子のＶＳＶＩｎｄのｃＤＮＡクローンへのクローニングを示す図。
【図１１】組換えＶＳＶNJ-Ｍ野生型およびＭ突然変異体からのＨＣＶコアたんぱく質の発現を示す図（Ａ）。同じ細胞からのこのＶＳＶたんぱく質の発現も検出された（Ｂ）。この発現はコア抗体又はＶＳＶNJ抗体を使用するウェスターンブロット分析により判定された。
【図１２】組換えＶＳＶＩｎｄ-Ｍ野生型およびＭ突然変異体からのＨＣＶコアたんぱく質の発現を示す図（Ａ）。同じ細胞からのこのＶＳＶたんぱく質の発現も検出された（Ｂ）。この発現はコア抗体又はＶＳＶNJ抗体を使用するウェスターンブロット分析により判定された。
【図１３】ＨＣＶコア遺伝子を有するｒＶＳＶNJおよびｒＶＳＶＩｎｄからのＨＣＶコアの発現を示す図。ＨＣＶコアたんぱく質は、感染された細胞を３Ｈ-Leu（ロイシン）で１時間ラベリングし、ＨＣＶコアに対する抗体でこのコアたんぱく質を免疫沈降させることにより検出された。
【図１４】ｒＶＳＶNJ（MWT）、ｒＶＳＶNJ（MM48R-M51R）、ｒＶＳＶInd（MWT）およびｒＶＳＶInd（MM51R）のｃＤＮＡクローンへのＨＣＶ  ＮＳ３遺伝子のクローニングを示す図。
【図１５】ＮＳ３を発現するｒＶＳＶNJ（MWT）、ｒＶＳＶNJ（MM48R-M51R）、ｒＶＳＶInd（MWT）およびｒＶＳＶInd（MM51R）の回収を示す図。回収されたｒＶＳＶのＮＳ３、抗原型およびＭ表現型の発現はＨＣＶ  ＮＳ３抗体および抗原型特異的ＶＳＶ抗体を使用するウェスターンブロット分析により確認された。
【図１６】ｒＶＳＶNJ（MWT）、ｒＶＳＶNJ（MM48R-M51R）、ｒＶＳＶInd（MWT）およびｒＶＳＶInd（MM51R）のｃＤＮＡクローンへのＨＣＶ  ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ遺伝子のクローニングを示す図。
【図１７】ＮＳ５Ａを発現する回収されたｒＶＳＶNJ（MWT）、ｒＶＳＶNJ（MM48R-M51R）を示す図。回収されたｒＶＳＶのＮＳ５Ａ、抗原型およびＭ表現型の発現はＨＣＶ  ＮＳ５Ａ抗体および抗原型特異的ＶＳＶNJ抗体を使用するウェスターンブロット分析により確認された。
【図１８】ＮＳ５Ａを発現する回収されたｒＶＳＶＩｎｄ（MWT）、ｒＶＳＶInd（MM51R）を示す図。回収されたｒＶＳＶのＮＳ５Ａ、抗原型およびＭ表現型の発現はＨＣＶ  ＮＳ５Ａ抗体および抗原型特異的ＶＳＶＩｎｄ抗体を使用するウェスターンブロット分析により確認された。
【図１９】ＮＳ５Ｂを発現する回収されたｒＶＳＶNJ（MWT）、ｒＶＳＶNJ（MM48R-M51R）を示す図。回収されたｒＶＳＶのＮＳ５Ｂ、抗原型およびＭ表現型の発現はＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ抗体および抗原型特異的ＶＳＶNJ抗体を使用するウェスターンブロット分析により確認された。
【図２０】ＮＳ５Ｂを発現する回収されたｒＶＳＶInd（MWT）およびｒＶＳＶInd（MM51R）を示す図。回収されたｒＶＳＶのＮＳ５Ｂ、抗原型およびＭ表現型の発現はＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ抗体および抗原型特異的ＶＳＶＩｎｄ抗体を使用するウェスターンブロット分析により確認された。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
１．定義：
便宜上、本明細書、実施例および特許請求の範囲に使用されている用語および表現の意味するところを説明する。別途断りのない限り、ここに記載した全ての技術的、科学的用語は、本発明に属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味のものである。
【００４９】
ここに記載されている冠詞は文法上の目的において１又はそれ以上（すなわち、少なくとも１）を示すものである。
【００５０】
ここに記載されている「動物」および「被験者」とは、哺乳動物、好ましくはヒトを含む動物界の全てのメンバーを包含するものである。
【００５１】
ここに使用されている「有効量」とは、所望の結果を達成するのに要する投与量および期間において効果的な量を意味する。
【００５２】
ここに使用されている“インディアナ”および“IND”の用語はＶＳＶ抗原型インディアナ（ＶＳＶＩｎｄ）を指している。
ここに使用されている“MWT”および“M(WT)”の用語は野生型Ｍ遺伝子を有するＶＳＶを指している。同じく使用されている“M51R”の用語は、位置５１でアルギニンに変化したメチオニンを有するＶＳＶＩｎｄ中のＭ遺伝子を指している。同じく使用されている“M48R-M51R”の用語は、位置４８および５１でアルギニンに変化したメチオニンを有するＶＳＶNJ中のＭ遺伝子を指している。
【００５３】
ここに使用されている“ニュージャージイ”および“NJ”の用語はＶＳＶ抗原型ニュージャージイ（ＶＳＶNJ）を指している。
ここに使用されている“Ind-M(M51R)/NJ G”の用語は突然変異Ｍ遺伝子を有しＶＳＶ抗原型ニュージャージイ（ＶＳＶＮＪ）Ｇたんぱく質を発現するＶＳＶＩｎｄを指している。同じく使用されている“Ind-M(WT)/NJ G”の用語は、野生型Ｍたんぱく質を有しＶＳＶＮＪＧたんぱく質を発現するＶＳＶＩｎｄを指している。
【００５４】
ここに使用されている“NJ-M(M48R-M51R)/Ind G”の用語は突然変異Ｍ遺伝子を有しＶＳＶＩｎｄＧたんぱく質を発現するＶＳＶＮＪを指している。同じく使用されている“NJ-M(WT)/Ind G”の用語は、野生型Ｍ遺伝子を有しＶＳＶＩｎｄＧたんぱく質を発現するＶＳＶＮＪを指している。
【００５５】
ここに使用されている「たんぱく質」とは、通常、所定の配列を有するアミノ酸残渣の連鎖として規定される。ここに使用されているたんぱく質の用語は“ペプチド”および“タンパク”を包含するものである。更に、この用語は変性されたアミノ酸ポリマーをも包含するものである。
ここに使用されている“ｒＶＳＶ”とは、組換え水疱性口内炎ウイルスを指すものである。
【００５６】
２．発明の概要：
本発明は、被験者における免疫反応を誘起させたり、被験者における病原性感染を予防ないし治療するのに有用な免疫プラットホーム、免疫レジメンおよび薬剤を提供することを特徴とするものであり、ここで、これら免疫プラットホーム、免疫レジメンおよび薬剤は１つの抗原型の組換えＶＳＶと、他の抗原型の組換えＶＳＶとを具備してなる。本発明の以前において、他の研究者グループはプライムウイルスにより誘起された抗体によるブースターウイルスの中和を防止するため第２の免疫のためのＶＳＶｓに変換した表層糖タンパク（Ｇ）遺伝子を使用していた。しかし、本発明の以前においては、プライム・ブースト免疫機構又は療法においてｒＶＳＶの２つの異なる抗原型を使用する研究者グループは存在しなかった。
【００５７】
従って、１形態として、本発明はプライム・ブースト免疫療法に使用される免疫プラットホームを提供するものであって、この免疫プラットホームが、
（ａ）１つの抗原型の組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）を含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、
（ｂ）他の抗原型のｒＶＳＶを含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、
を有することを特徴とする。
【００５８】
他の形態として，本発明は病原体に対する免疫反応を誘起させるのに有用な複合薬剤を提供するものであって、この複合薬剤が、
（ａ）病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる１つの抗原型のｒＶＳＶを含む１つのワクチン又は免疫抗原性組成物と、
（ｂ）病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる他の抗原型のｒＶＳＶを含む他のワクチン又は免疫抗原性組成物と、
を含むことを特徴とする。
【００５９】
本発明者はｃＤＮＡからＶＳＶＮＪを回収する逆行遺伝子システムを初めて開発した（図１および２；非特許文献１参照）。この組換えＶＳＶＮＪは外因遺伝子（すなわち、外因ウイルスの遺伝子）の発現にとってＶＳＶＩｎｄと共に効果的なウイルスベクターであり、これはＶＳＶ自体に対する先在する免疫反応と関連する問題を抑制するのに使用することができる。ＶＳＶＮＪベクターシステムに加えて、本発明者は更にＶＳＶＩｎｄの全長クローンを発生させたものであり（図１）、これはブースト免疫の後、ＶＳＶベクターの中和を回避する発現ベクターとして使用することができる。
【００６０】
本発明のｒＶＳＶ免疫プラットホームの特徴は、１形態として、ＶＳＶの２つの異なる抗原型を使用することであり、他の形態として、野生型Ｍ遺伝子および突然変異Ｍ遺伝子を有するＶＳＶｓを使用することである。本発明の態様として、この２つの異なるＶＳＶ抗原型はＶＳＶＩｎｄおよびＶＳＶＮＪである。
【００６１】
ＶＳＶＭたんぱく質は細胞質たんぱく質合成を非常に効率的に抑制するが、ＶＳＶＩｎｄＭの位置５１において、又、ＶＳＶＮＪＭの位置４８および５１においてメチオニンがアルギニンに変化したとき、Ｍたんぱく質はホスト細胞質たんぱく質発現に対する抑制作用を失う（非特許文献１、Petersen,J.M.ら, Mol Cell Biol 20:8590,2000（非特許文献２０）；von Kobbe,C.,ら, Mol Cell 6:1243,2000（非特許文献２１））。この突然変異Ｍ遺伝子を有するｒＶＳＶは従って野生型Ｍを有するｒＶＳＶよりも、より良好な発現ベクターとなり得る。なぜならば、これらは抗原提供細胞におけるケモカイン（chemokines）のような免疫関連たんぱく質の発現を阻止することがないからである。
【００６２】
３．本発明のワクチン又は免疫抗原性組成物：
本発明は更に上述のように、第１の抗原型のｒＶＳＶを含むワクチン又は免疫抗原性組成物および第２の抗原型のｒＶＳＶを含むワクチン又は免疫抗原性組成物を提供することを特徴とするものである。本発明のこれらワクチン又は免疫抗原性組成物は、相容性的形態でin vivoで被験者に投与するのに適している。此処で使用されている“相容性的形態でin vivoでの投与に適している”の表現は、如何なる毒性作用も治療的効果により打ち負かされるような投与されるべき物質の形態を意味している。このような物質は動物、被験者、好ましくはヒトに投与することができる。本発明のワクチンは凍結乾燥された調剤として提供することもできる。更に、本発明のワクチンは、輸送のため凍結することができる溶液として提供することもできる。更に、このワクチンはグリセロールのような適当な保存剤を含むもの、あるいは含まないものとして調剤することができる。所望に応じて（すなわち、ワクチン中のＶＳＶにダメージを与えない）、これらワクチンは適当な希釈剤、佐剤及び/又はキャリアを含んでいてもよい。
【００６３】
ワクチンの投与量は、個々の症状の状態、年齢、性別、体重などのファクター、個々における所望の反応を誘起させる抗体の能力などにより変化させることができる。投薬レジメンは最適治療反応が提供されるよう調整することができる。このワクチンの投与量は状況に従って最良の予防的投与反応が提供されるよう変化させることができる。
【００６４】
４．使用方法：
本発明は更に、被験者に免疫反応を誘起させる方法、被験者の病原性感染を防止ないし治療するための方法を提供することを特徴とするものであって、その方法は、ワクチン又は免疫抗原性組成物の組合せの有効量を被験者に投与することからなる。
【００６５】
従って、１形態として、本発明は哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる方法であって、以下のステップを具備してなる。
（ａ）第１のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、ここで該第１のワクチン又は免疫抗原性組成物が第１の抗原型のｒＶＳＶを含み、
（ｂ）第２のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、ここで該第２のワクチン又は免疫抗原性組成物が第２の抗原型のｒＶＳＶを含む、
ことからなることを特徴とする
【００６６】
他の形態として、本発明は病原体による感染を予防又は治療する為の方法を提供するものであって、その方法は、（ａ）病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる第１の抗原型のｒＶＳＶを含む第１のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を被験者に投与すること、（ｂ）病原体の１又はそれ以上のたんぱく質を発現することができる第２の抗原型のｒＶＳＶを含む第２のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を被験者に投与することからなる。
【００６７】
他の形態として、本発明は哺乳動物においてＶＳＶに対する免疫反応を誘起させる方法および病原体による感染を予防又は治療する為の方法を提供するものであって、これらの方法は更に、第１のワクチン又は免疫抗原性組成物の有効量を哺乳動物に投与するステップ（ｃ）を更に含む。このステップ（ｃ）は免疫反応を誘起させる過程、感染を予防又は治療する過程において１回以上繰返してもよい。
【００６８】
以上の記載は本発明の概要を説明するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することにより得られるであろう。これらの実施例は単に説明を目的としたものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況に応じて、又はより得策な場合は、形態の変更、均等物の置換などが適宜考えられる。なお、ここでは具体的な用語が使用されているが、それらの用語は記述的感覚を意図するものであり、制限を意図するものではない。
【００６９】
実施例：
以下の実施例は説明を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１−逆行遺伝学によるＶＳＶの回収：
本発明者は逆行遺伝子システムによりｃＤＮＡから組換えＶＳＶｓを発生した。これはRoseおよびWertzにより別々に先に確立されている（非特許文献４，５）。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ、すなわちBHK-T7細胞を発現するベビーハムスター腎臓細胞（Buchholz, U.J.ら,J Virol 73:251, 1999（非特許文献２２））を、ＶＳＶ、インディアナ抗原型又はニュージャージイ抗原型の全長ゲノムを符号化したDNAプラスミドおよびＶＳＶ  Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子を符号化したプラスミドを用いてトランスフェクトさせた。新規に発生させたウイルスを含む細胞培養基をトランスフェクションの48〜72時間後、この組換えＶＳＶによる細胞病理学的作用の度合いに応じて採取した。図２はｃＤＮＡからＶＳＶを回収するための逆行遺伝子システムを示している。
【００７０】
図１は本発明者により発生させたＶＳＶＩｎｄおよびＶＳＶＮＪのｃＤＮＡクローンを示している。図１には遺伝子順序（Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｇ，Ｌ）およびＶＳＶゲノムの全長ＤＮＡクローンにおける制限酵素部位（Pac I, Not I, Kpn I, Spe I）が示されている。これは関係する遺伝子（外因遺伝子）をＶＳＶゲノムにクローニングするのに使用することができる。ＶＳＶのＭ遺伝子（ＶＳＶＩｎｄ中のＭ５１ＲおよびＶＳＶＮＪ中のＭ４８Ｒ−Ｍ５１Ｒ）に導入された突然変異体も示されている。
【００７１】
図３についてみると、組換えＶＳＶが３連続的プラークピッキングにより精製されベビーハムスター腎臓細胞中で増殖されている。組換えＶＳＶｓの複製動態を判定するため、我々はＢＨＫ細胞を３の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、感染後１０時間まで２時間毎に感染された細胞から細胞培養基を採取した。この採取された培養基中のウイルス力価はプラーク検定により判定した。
【００７２】
実施例２−組換えＶＳＶｓで感染されたベビーハムスター腎臓細胞中でのＶＳＶたんぱく質の発現：
組換えＶＳＶｓ（２つの抗原型、ＶＳＶＩｎｄおよびＶＳＶＮＪ、Ｍ野生型およびＭ突然変異体のＶＳＶｓおよび切換えられたＧ遺伝子を有するＶＳＶｓ）からのたんぱく質の発現を、ＶＳＶＩｎｄおよびＶＳＶＮＪに対する抗体を使用したウェスタンブロット分析により検査した。ＶＳＶＩｎｄおよびＶＳＶＮＪに対する我々の抗体はＶＳＶの４つのたんぱく質（Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｇ）を検出した。図４は３つのたんぱく質帯域を示している。なぜならば、Ｎたんぱく質およびＰたんぱく質は同じサイズのたんぱく質としてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に移行するからである。
【００７３】
ＶＳＶＩｎｄ又はＶＳＶＮＪに対する抗体は、単一抗原型から発現された４つの全てのＶＳＶのたんぱく質、Ｎ，Ｐ，ＭおよびＧを検出することができた。ＶＳＶＩｎｄＮＪＧ中のＧ遺伝子の交換はＶＳＶＩｎｄ抗体によるＧたんぱく質検出欠乏により確認された。なぜならば、ＶＳＶＩｎｄ抗体はＶＳＶＮＪのＧたんぱく質と交差反応しないからである（レーン２および４）。ＶＳＶＮＪＩＧ中のＧ遺伝子の交換はＶＳＶＩｎｄＧおよびＶＳＶＮＪＧでのサイズの差異により確認された。レーン６および８に見られるように、ＶＳＶＩｎｄＧはＶＳＶＮＪのＧよりも若干ゆっくりと移行する。Ｍ遺伝子（ＶＳＶＩｎｄＭプロテイン中のＭ５１ＲおよびＶＳＶＮＪＭプロテイン中のＭ４８Ｒ−Ｍ５１Ｒ）における突然変異は、Ｍたんぱく質を、双方の抗原型の野生型Ｍたんぱく質より若干速く移行させる。これはレーン３，４，７および８で実証されている。このＭたんぱく質の移行パターンは突然変異体ＶＳＶｓ内での突然変異を確認させるものである。
【００７４】
実施例３−ウイルス接種の最良組合せを見出す為の予防接種レジメン又はスキーム：
図５乃至８および表１を参照すると、本発明者の１つの目的が動物を免疫するためプライムおよびブーストレジメンを利用することであるから、本発明者はプライムおよびブースト免疫スキームのため、組換えＶＳＶ抗原型の最良なオーダを決定した。（１）２つの異なる抗原型(ＶＳＶＩｎｄ又はＶＳＶＮＪ)に基づくベクター、（２）代わりの抗原型のＧたんぱく質を発現するＶＳＶベクター、又は（３）細胞毒性野生型又は非細胞病理学的突然変異ＶＳＶ  Ｍたんぱく質での予防接種がＶＳＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生に如何なる優位性を提供するかについて研究した。表１は全ての可能な抗原型の組合せを示している。
【００７５】
マウスのグループを、３投与予防接種スケジュールで、ｒＶＳＶｓで予防接種した。マウスの１３グループからなるこの予防接種の研究において、目的はＶＳＶ  Ｎペプチド、ＶＳＶ  Ｎ２７５（ＶＳＶ  Ｎにおけるアミノ酸配列を標的としたMHC I H2d特異的ペプチド）での刺激後のインターフェロンガンマー（IFNγ）生産に基づいて、ＶＳＶヌクレオカプシド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を最も高い率で発生させる組換えＶＳＶワクチン構成を決定することである。特に我々は、（１）２つの異なる菌株(ＶＳＶＩｎｄ又はＶＳＶＮＪ)に基づくベクター、（２）代わりの抗原型のＧたんぱく質を発現するベクター、又は（３）細胞毒性野生型又は非細胞病理学的突然変異ＶＳＶ  Ｍたんぱく質での予防接種がＶＳＶ  Ｎ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生に如何なる優位性を提供するかについて研究した。
【００７６】
６匹の６週齢メスBalb/cマウス（ＭＨＣ型Ｈ２ｄ）からなるグループに対し、投与１において１ｘ１０６pfu(プラーク形成ユニット)を投与した。この投与は後方腿部筋肉に筋肉内注射により行われ、総容量５０μLのPBSで希釈した。更に投与２においてマウスに対し１ｘ１０６pfuのｒＶＳＶを、更に投与３においてマウスに対し５ｘ１０６pfuのｒＶＳＶを投与した。なお、投与１と投与２との時間的間隔は４週間とし、投与２と投与３との時間的間隔は更に１０週間とした。３回目の投与後７日目にマウスを安楽死させ、ＶＳＶヌクレオカプシドペプチド（ＶＳＶ  Ｎ２７５）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の検出のため脾細胞を採取した。
【００７７】
脾細胞の単一の細胞懸濁液を完全RPMI内に作製し、ついで１ｘ１０６細胞をU-ボトム９６穴プレート内の適当な穴に移した。ＶＳＶ  Ｎ特異的ペプチド、ＶＳＶ  Ｎ２７５、ＮＨ２−ＭＰＹＬＩＤＦＧＬ−ＣＯＯＨ（GenScript社、Piscataway NJ）および共興奮性抗CD28(クローン37.51、BD Biosciences, San Jose CA)混合物を添加し、その混合物を２時間培養した。ブレフェルジンＡ（BD Biosciences）を製造元の指示に従ってブロックサイトカイン分泌液に添加し、細胞を更に３時間培養した。ハツカネズミＣＤ８(FITC-CD8a,BD バイオサイエンスクローン53-6.7)を認識する抗体又は適当なアイソタイプ制御抗体で細胞を染色した。これら細胞を洗浄し、製造元の指示に従ってCytofix/cytopermキット試薬（BD Biosciences）で浸透化させ、IFNγ（APC‐IFNγ、BD Biosciences、クローンXMG1.2）の為染色をおこなった。この染色した細胞をFACS Calibur フローサイトメータ（BD Biosciences）およびFlowJoソフトウエア(Tree Star社、Ashland OR)を用いて同定した。そのデータは各ワクチンにつき、４〜６マウス群におけるCD8＋IFNγ＋脾細胞の平均％（平均値の＋/-標準誤差、ＳＥＭ）として表わされている。統計的意義は、Bonferroni修正を伴ったワンウェイANOVAを用いて判定した（Prism 4.0 ソフトウエア、GraphPad Software社、San Diego, CA）。
【００７８】
結果：
これらの結果は、２回目の投与についてＶＳＶ抗原型を代替することは、ＶＳＶ  Ｎ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生のため、単一のＶＳＶ抗原型を３投与することよりもすぐれていることを示している。ここに示した結果から見て、ＶＳＶ  Ｎ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘起させるための手法は、ＶＳＶＩｎｄ−突然変異体Ｍの第１の投与、次にＶＳＶＮＪ−突然変異体Ｍの投与、最後にＶＳＶＩｎｄ−突然変異体Ｍの投与ということになる（図８Ａ）。
【００７９】
実施例４−ＨＣＶたんぱく質を発現する組換えＶＳＶを用いた免疫化の研究：
（背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はヒトにおけるＣ型肝炎の原因となる物質である。Ｃ型肝炎の患者は世界中で約１億７千万人いると推測されている。世界の人口の約３％がこのウイルスにより慢性的に感染されている。米国においては、約３百万人がＨＣＶで慢性的に感染されている。その感染の大多数は３０乃至５０歳の人々である。
【００８０】
ＨＣＶでの感染は極めて深刻である。最初の感染は全く病気を生じさせないか、あるいは黄疸を伴った肝炎を生じさせ、劇症肝不全は稀である。しかし、殆どのＨＣＶ感染は慢性となる。この慢性感染は、或る場合は耐えられるものの、肝臓病、肝硬変、肝細胞癌となる。これらの慢性感染患者は殆ど全ての新たな感染の源となる。
【００８１】
ＨＣＶゲノムは１０年以上前から単離され配列化されているが、ＨＣＶ感染を防止したり、急性又は慢性ＨＣＶを治療するための効果的なワクチンは未だに開発されていない。
【００８２】
理想的なＨＣＶワクチン又は予防接種療法は、体液性又は細胞免疫反応を誘起させるものである。従って、本出願人により開発された新規な組換えＶＳＶ免疫化療法は２つの異なるＶＳＶ抗原型を利用するものであり、ＨＣＶワクチンシステムを得るためのプラットホームを提供するものとなる。
【００８３】
ＨＣＶたんぱく質を発現する組換えＶＳＶの発生：
図９ないし２０を参照すると、ＶＳＶ遺伝子間接合配列を導入するため、ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ遺伝子が最初にpBluescript II KSベクター（Stratagen）にクローン化された。これは上流遺伝子において転写末端が、又、ＶＳＶの下流遺伝子において転写再開が関与する。全長コアおよび４つのＨＣＶコア遺伝子であって核局在化に関連しER膜に繋がった領域で欠失を伴ったものがpBluscript II KSベクターにクローン化された。全長NS3遺伝子が変性することなくpBluescript IIベクターにクローン化された。全長ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ並びにER膜繋留領域で欠失を伴ったＮＳ５ＡおよびＮＳ５ＢがpBluescript II KSベクターにクローン化された。各クローンにおける補正配列の確認後、全長ＮＳ５Ｂ以外のＶＳＶ遺伝子間接合配列を有するＨＣＶ遺伝子は制限酵素、Kpn1を用いて切断され、Ｇ遺伝子とＬ遺伝子との間でｐＶＳＶＮＪ-Ｍ（ＷＴ）およびｐＶＳＶＮＪ-Ｍ（Ｍ４８Ｒ−Ｍ５１Ｒ）にクローン化された。ＶＳＶ遺伝子間接合配列を有するＨＣＶ遺伝子のカットPacＩがｐＶＳＶInd-Ｍ（ＷＴ）およびｐＶＳＶInd-Ｍ（Ｍ５１Ｒ）においてＧ遺伝子とＬ遺伝子との間のPacＩ部位にクローン化された。全長ＮＳ５ＢはSpeＩを用いてpBluescript IIベクターから切断され、クレノウフラグメントで平滑末端として（blunt ended）、ｐＶＳＶＮＪに繋がれた。このｐＶＳＶＮＪはKpn Iを用いて切断されクレノウフラグメントで平滑末端とされていた。ＮＳ５ＢのｐＶＳＶＮＪへの挿入はPacＩでプラスミドを消化することにより確認された。なお、その部位はＮＳ５Ｂクローンの両端に導入された。ＨＣＶコア遺伝子は、コア遺伝子内の１つの付加的Kpn I部位の存在のため、Kpn Iを用いて部分的に消化された。ＨＣＶ遺伝子、コア、ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５ＢをｐＶＳＶInd-Ｍ（ＷＴ）およびｐＶＳＶInd-Ｍ（Ｍ５１Ｒ）にクローン化するため、pBluescript IIベクター内の同じクローンを制限酵素、PacＩを用いて切断した。ＨＣＶ遺伝子のｐＶＳＶｓへの挿入はKpn I 又はPacＩでプラスミドを消化することにより、並びにＤＮＡ配列により確認された。
【００８４】
ＨＣＶコア(図１１，１２，１３)、ＮＳ３(図１５)、ＮＳ５Ａ(図１７，１８)およびＮＳ５Ｂ(図１９，２０)を発現する組換えＶＳＶＩｎｄおよびＶＳＶＮＪはＶＳＶ逆行遺伝手法によりｃＤＮＡクローンから回収された。組換えウイルスが３連続的プラークピッキングにより精製され、0.1の感染多重度（MOI）を有するＢＨＫ細胞を感染させることにより増殖された。これらウイルスからのＨＣＶたんぱく質の発現は、ウイルス感染細胞分離物および各ＨＣＶたんぱく質に対する抗血清を使用したウェスターンブロット分析により判定された。ＶＳＶＩｎｄおよびＶＳＶＮＪに対する抗血清を使用した同じ細胞分離物のウェスターンブロット分析により、各ＨＣＶたんぱく質を発現するＶＳＶベクターの抗原型およびＭ遺伝子表現型が判定された。ＶＳＶInd（ＭＭ５１Ｒ）およびＶＳＶＮＪ（ＭＭ４８Ｒ−Ｍ５１Ｒ）の突然変異Ｍたんぱく質は、野生型Ｍたんぱく質よりも若干速くＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に移行した。
【００８５】
結果：
図８Ｂを参照すると、まず、ＶＳＶInd-ＭＭ５１Ｒ＋ＨＣＶ-Core△ERで接種され、ついでＶＳＶＮＪ-ＭＭ４８/５１Ｒ＋ＨＣＶ-Core△ERで接種され、更に３週間後にＶＳＶInd-ＭＭ５１Ｒ＋ＨＣＶ-Core△ERの追加投与で接種されたマウスのコホート（ｎ＝２）に対し、ＨＣＶ  ＭＨＣクラスＩペプチドを用いex vivoで刺激を与えたところ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な再活性が認められた。この再活性はＨＣＶペプチドに特異的であることが示された。なぜならば、ＶＳＶベクター単独で免疫化された対照マウスはＨＣＶペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を示さなかったからである(パネルの左側の１セットのバー)。２ＶＳＶヌクレオカプシド・エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の再活性化を全てのマウスにおいてポジティブコントロールとして使用した。
【００８６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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