(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真皮由来の無細胞マトリックス（ＡＴＭ）から内殖又は移植用の修飾型無細胞マトリックス（ｍＡＴＭ）を生成する方法であって、前記ＡＴＭをエラスターゼにある期間曝露するステップを具え、その曝露によって修飾型ＡＴＭ（ｍＡＴＭ）が生じ、張力量に起因する前記ｍＡＴＭの伸張率が、当該張力量に起因する前記ＡＴＭの伸張率以下であることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記エラスターゼが溶液中にあり、前記方法が、張力量の下で前記ｍＡＴＭの所望の伸張率を取得するために、前記溶液における前記曝露の時間及びエラスターゼの濃度を制御するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記ｍＡＴＭの所望の伸張率が１４％ないし２４％の範囲にあり、前記張力量が５ニュートン／ｃｍであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記ｍＡＴＭの所望の伸張率が１９％であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法において、前記エラスターゼの濃度が０．１ユニット／ミリリットルないし０．５ユニット／ミリリットルの範囲にあることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記エラスターゼの濃度が０．２ユニット／ミリリットルないし０．２５ユニット／ミリリットルの範囲にあることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記期間が１２時間ないし２４時間の範囲にあることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記期間が１８時間ないし２４時間の範囲にあることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法が、前記ＡＴＭをエラスターゼに期間曝露する間に、前記ＡＴＭと前記溶液とを攪拌するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記ＡＴＭがヒト組織から生成されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記ＡＴＭがヒト以外の哺乳類組織から生成されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記ヒト以外の哺乳類組織がブタ組織であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記ヒト以外の哺乳類組織がウシ組織であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１の方法によって生成されることを特徴とする修飾型無細胞組織マトリックス。
【請求項１５】
内殖又は移植用の修飾型無細胞マトリックスを生成するために、真皮由来の無細胞組織マトリックスの群（ＡＴＭｓ）を処理する方法であって、等しい張力量が前記群中の前記ＡＴＭｓの各々に印加される場合に、前記群中の前記ＡＴＭｓの少なくとも一部が前記群中の他のＡＴＭｓと異なる伸張率を有する方法において、当該方法が：前記群の１以上のＡＴＭｓをエラスターゼにある期間曝露するステップであって、その曝露によって１以上の修飾型ＡＴＭｓ（ｍＡＴＭｓ）が生じるステップを具え、張力量に起因する前記ｍＡＴＭｓのうちの１以上の伸張率が、同一の前記張力量に起因する対応するＡＴＭｓの伸張率以下となることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記エラスターゼが、溶液中に提供され、エラスターゼの濃度を構成することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法において、前記ｍＡＴＭにわたる伸張率における変化は前記ＡＴＭにわたる伸張率における変化よりも小さいことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法において、前記ｍＡＴＭのうちの１以上の複数の伸張率は１４％ないし２４％の範囲にあり、前記張力量が５ニュートン／ｃｍであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法において、前記ｍＡＴＭのうちの１以上の複数の伸張率は１９％であり、前記張力量が５ニュートン／ｃｍであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法において、前記エラスターゼの濃度が０．１ユニット／ミリリットルないし０．５ユニット／ミリリットルの範囲にあることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記エラスターゼの濃度が０．２ユニット／ミリリットルないし０．２５ユニット／ミリリットルの範囲にあることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法において、前記期間が１２ないし２４時間の範囲にあることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記期間が１８時間ないし２４時間の範囲にあることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１５に記載の方法が、前記群の１以上のＡＴＭをエラスターゼに期間曝露する間に、前記群の１以上のＡＴＭと前記溶液とを攪拌するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載の方法において、前記ＡＴＭのうちの１以上がヒト組織から生成されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載の方法において、前記ＡＴＭのうちの１以上がヒト以外の哺乳類組織から生成されることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、前記ヒト以外の哺乳類組織がブタ組織であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法において、前記ヒト以外の哺乳類組織がウシ組織であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１５に記載の方法によって修飾型無細胞組織の群を処理することによって作られた、修飾型無細胞組織マトリックス。
【請求項３０】
内殖又は移植用の修飾型無細胞組織マトリックス（ｍＡＴＭ）であって、前記ｍＡＴＭが真皮由来の無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）から生成される、修飾型無細胞組織マトリックスにおいて：破壊されたエラスチンネットワークと；コラーゲンマトリックス；とを含み、５ニュートン／ｃｍの張力に起因する前記ｍＡＴＭの伸張率が１４％ないし２４％の範囲になるように前記エラスチンネットワークが十分に破壊され、前記コラーゲンマトリックスが無傷であることを特徴とするｍＡＴＭ。
【請求項３１】
請求項３０に記載のｍＡＴＭにおいて、前記コラーゲンマトリックスが架橋結合を含まないことを特徴とするｍＡＴＭ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年６月６日出願の米国仮特許出願第６１／０５９，６０４号に対する米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張し、全体を引用によって本明細書中に組み込む。
【０００２】
本開示は、脊椎動物対象に対する内植（ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ）又は移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）用の無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）に関する。特に、ＡＴＭの構造上又は機能上の完全性に実質的に影響を与えることなく、ＡＴＭにおける伸張性を低減し、ＡＴＭの群にわたる伸張性における変化を低減することに関する。
【背景技術】
【０００３】
内植又は移植可能な組織の機械的特性は大きく変化しうる。このような変化のために、外科医は時として内植又は移植前に組織マトリックスをあらかじめ伸張させる。更には、特に大きな組織欠損症の修復のために、組織移植片の多数の小片は相互に縫合することが必要となる。それらの例においては、機械的特性における変化は、縫合手段及び内植又は移植手段を複雑化しうる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、ＡＴＭの構造上又は機能上の完全性に実質的に影響を与えることなく、ＡＴＭにおける伸張性を低減し、ＡＴＭの群にわたる伸張性における変化を低減することに関する。
【０００５】
ある態様においては、方法は：無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）を提供するステップと；ＡＴＭをエラスターゼにある期間曝露するステップと；を具える。例えば、ＡＴＭは、エラスターゼの濃度を構成する溶液にある期間曝露してもよい。曝露によってＡＴＭと比較して伸張性が低い修飾型ＡＴＭ（ｍＡＴＭ）が生じる。言い換えると、特異的な張力量に由来するｍＡＴＭの伸張率（又は歪み）は同一の張力量に由来するＡＴＭの伸張率（又は歪み）より小さい。いくつかの実施においては、曝露時間及びエラスターゼの濃度は、ｍＡＴＭの所望の伸張性を取得するように制御される。ｍＡＴＭの所望の伸張性は、約５ニュートン／ｃｍの張力の印加の下で、ｍＡＴＭの伸張率が１４％ないし２４％の範囲になるようにできる。例えば、約５ニュートン／ｃｍの張力の下でのｍＡＴＭの伸張率は約１９％である。いくつかの実施においては、エラスターゼの濃度は約０．１ユニット／ミリリットルないし０．５ユニット／ミリリットルであるか、あるいは約０．２ユニット／ミリリットルないし０．２５ユニット／ミリリットルである。エラスターゼの曝露時間は一般的には約１２ないし２４時間の間であり、更に一般的には少なくとも１８時間である。本方法の特定の実施形態は、曝露の間にＡＴＭと溶液とを攪拌するステップを具える。このような攪拌は静かにしてもよく、あるいは更に強くしてもよい。攪拌は、組織とエラスターゼ溶液とを保持する容器を徐々に振盪することによって、あるいは繰返し容器を反転させることによって実施してもよい。振盪の速度及び振幅は変えることができ、容器を反転する速度も同様にできる。
【０００６】
ＡＴＭは、例えば、総ての、あるいは実質的に総ての生存細胞が除去された組織（例えば、真皮）であってもよい。組織は例えば、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靱帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、及び／又は腸管組織であってもよい。いくつかの実施形態においては、ＡＴＭは、ヒト組織、ヒト以外の哺乳類組織、又はブタ組織から生成してもよい。ヒト以外の哺乳類組織はウシ組織であってもよい。
【０００７】
別の実施形態は、前述の方法のいずれかによって生成される修飾型無細胞組織マトリックスを含む。
【０００８】
更に別の態様によると、方法は：無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）の群を提供するステップであって、等しい張力量が群中のＡＴＭの各々に印加される場合に、群中のＡＴＭの少なくとも一部が群中の他のＡＴＭと異なる伸張性（伸張率）を有するステップと；ＡＴＭのうちの１以上をエラスターゼにある期間曝露するステップと；を具える。エラスターゼは溶液の形態で、エラスターゼの濃度を構成してもよい。いくつかの実施形態においては、エラスターゼの曝露によって、１以上の修飾型ＡＴＭ（ｍＡＴＭ）が生じる。ｍＡＴＭのうちの１以上はその各々に対応するＡＴＭよりも伸張性が小さい。いくつかの実施形態においては、ある張力量に由来するｍＡＴＭのうちの１以上の伸張率は、同一の張力量に由来するその対応するＡＴＭの伸張率よりも小さい。いくつかの実施においては、ｍＡＴＭにわたる伸張性における変化は、ＡＴＭにわたる伸張性における変化よりも有意に小さくなる。
【０００９】
いくつかの実施形態においては、ｍＡＴＭにわたる伸張性における変化は、約５ニュートン／ｃｍの張力の下で、ｍＡＴＭの少なくとも一部が約１４％ないし２４％伸張するようになる。いくつかの実施形態においては、ｍＡＴＭにわたる伸張性における変化は、約５ニュートン／ｃｍの張力の下で、複数のｍＡＴＭが約１９％伸張するようになる。
【００１０】
特定の実施は、約０．１ユニット／ミリリットルないし０．５ユニット／ミリリットル、又は約０．２ユニット／ミリリットルないし０．２５ユニット／ミリリットルのエラスターゼの濃度を提供するステップを具える。曝露時間は一般的には約１２ないし２４時間であり、一般的には少なくとも約１８時間である。
【００１１】
いくつかの実施においては、群の１以上のＡＴＭは溶液への曝露の際に攪拌される。
【００１２】
ＡＴＭは、例えば、総ての、あるいは実質的に総ての生存細胞が除去された組織（例えば、真皮）を含んでもよい。組織は例えば、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靱帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、及び／又は腸管組織を含んでもよい。ＡＴＭはヒト組織、ヒト以外の哺乳類組織（例えば、ブタ組織あるいはウシ組織）から生成してもよい。
【００１３】
更に別の態様は、前述の１以上の方法によって処理される修飾型無細胞組織マトリックスの群を具える。
【００１４】
更なる態様は：無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）を提供するステップと；ＡＴＭをエラスターゼにある期間曝露するステップと；を具える方法を含む。一般的には、エラスターゼは溶液中にあり、エラスターゼの濃度を構成する。曝露によって、ＡＴＭと比較して伸張性が低い修飾型ＡＴＭ（ｍＡＴＭ）が生じる。本方法は更に：修復又は寛解を必要とする器官又は組織を有するとして脊椎動物対象を同定するステップと；組織又は器官の中又は上にｍＡＴＭ（又は相互に縫合された２以上のｍＡＴＭ）を配置するステップと；を具える。
【００１５】
更なる別の態様は：無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）の群を提供するステップであって、群中のＡＴＭの少なくとも一部が、群中の他のＡＴＭと異なる伸張性を有するステップと；群の１以上のＡＴＭをエラスターゼ（例えば、エラスターゼの濃度を構成する溶液）にある期間曝露するステップと；を具え、その曝露によって１以上の修飾型ＡＴＭ（ｍＡＴＭ）が生じ、ｍＡＴＭのうちの１以上が、その各々に対応するＡＴＭより伸張性が小さい。本方法は更に：修復又は寛解を必要とする器官又は組織を有するとして脊椎動物対象を同定するステップと；組織又は器官の中又は上にｍＡＴＭを配置するステップと；を具える。
【００１６】
更に、別の態様はエラスチンネットワークとコラーゲンマトリックスとを含む修飾型無細胞組織マトリックス（ｍＡＴＭ）を有し、ｍＡＴＭの伸張性を約５ニュートン／ｃｍの張力の印加の下で、ｍＡＴＭが約１４％ないし２４％伸張するようにすべく、エラスチンネットワークが破壊されており、コラーゲンネットワークは実質的に無傷である。特定の実施においては、コラーゲンネットワークは架橋結合を含まない。
【００１７】
一般的な実施においては、ｍＡＴＭの伸張性を約５ニュートン／ｃｍの張力の印加の下で、ｍＡＴＭが約１４％ないし２４％伸張するようにすべく、組織のエラスチンネットワークが十分に破壊され、ｍＡＴＭのコラーゲンネットワークは実質的に無傷である。いくつかの実施形態においては、ｍＡＴＭのコラーゲンネットワークは、ＡＴＭのコラーゲンネットワークと実質的に同様の特性を有する。例えば、ｍＡＴＭの組織、温度及び材料の特性はＡＴＭと同様である。
【００１８】
過剰な伸張性を有する組織は、特異的に所望される伸張性のレベルを有する組織を取得するように処理できる。更に、組織サンプルごとの伸張性における変化が低減できる。このことは、組織又は器官を修復及び／又は寛解するために、相互に２以上の組織片を連結することを要求する手段において特に有用となりうる。組織サンプルの伸張性の均一性は理解されよう。
【００１９】
別段に規定されない限り、本明細書中で用いられる総ての技術的及び化学的用語は、本開示が属する当該技術分野の当業者によって共通に理解されるのと同一の意味を有する。競合がある場合、本文書は、定義を含むことによって調整される。好適な方法及び材料は以下に記載されるが、本明細書中に記載のものと同様又は等価な方法及び材料は本開示の実施又は試験に用いることができる。本明細書中に記載の総ての刊行物、特許出願、特許及びその他の文献は、全体を引用することによって組み込まれる。本明細書中に開示の材料、方法及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図しない。
【００２０】
本開示の他の特徴及び利点は以下の説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、一般的な十分に水分を含む組織サンプルの応力−歪み線図を示す線グラフである。
【図２】図２は、無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）をエラスターゼで処理し、処理したＡＴＭを器官又は組織の中又は上に配置する方法のフローチャートである。
【図３】図３は、５ニュートン（５Ｎ）の外力を受けた場合に、約１センチメートル長の、多様なエラスターゼ処理された組織サンプル又はエラスターゼ処理されていない組織サンプルが受ける伸張率を示す散布図である。
【図４Ａ】図４Ａは、エラスターゼ処理されていない組織サンプル、及びエラスターゼ処理された組織サンプルについて染色したサンプルを示す顕微鏡写真であり、染色部は組織サンプルのエラスチン含有量を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、エラスターゼ処理されていない組織サンプル、及びエラスターゼ処理された組織サンプルについて染色したサンプルを示す顕微鏡写真であり、染色部は組織サンプルのエラスチン含有量を示す。
【図５】図５は、エラスターゼ処理を受けた場合に、多様な組織サンプルが受ける面積の増加率を示す棒グラフである。
【図６】図６は、定規の一部の隣に処理されていない動脈組織のサンプルと、エラスターゼ処理された組織サンプルとを示す写真である。
【図７】図７は、処理されていない組織サンプル（通常のＡＬＬＯＤＥＲＭ）、及びエラスターゼ処理された組織サンプルについて、Ｖｅｒｈｏｅｆｆ染色した一連のサンプルを示す一連の写真である。
【図８】図８は、処理されていない組織サンプル（通常のＡＬＬＯＤＥＲＭ）、及びエラスターゼ処理された組織サンプルについて、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色した組織サンプルを示す一連の顕微鏡写真である。
【図９】図９は、エラスターゼ処理されていない組織サンプル、及びエラスターゼ処理された組織サンプルについて、温度に対する熱流を示す線グラフである。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、経時的にエラスターゼ処理を受けた２の組織サンプルの面積変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示は、例えば脊椎動物対象に内植又は移植できる無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）に関する。特に、この開示はその対応するＡＴＭと比較して伸張性が低い修飾型ＡＴＭ（ｍＡＴＭ）を生成することに関し、組織の付随する構造上又は機能上の完全性を実質的に損なわない。更に、本開示はＡＴＭの群からｍＡＴＭの群を生成することに関し、ｍＡＴＭの群における組織の伸張性は、ＡＴＭの群における組織の伸張性よりも変化が小さい。言い換えると、特異的な張力量の下でのｍＡＴＭの群における組織の伸張率は、同一の張力量の下でのＡＴＭの群における組織の伸張率よりも変化が小さい。
【００２３】
本明細書で用いられるように、「伸張性（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｅｓｓ）」という用語は一般的には、引張り応力の印加の下で、組織又は組織マトリックスが伸張（ｓｔｒｅｔｃｈ、あるいはｅｘｐａｎｄ）する能力のことである。図１は、十分に水分を含む真皮組織マトリックスに対する一般的な応力−ひずみ曲線を示す。縦軸はメガパスカル（ＭＰａ）で引張り応力を表わし、横軸は引張り歪みを表わす。「引張り応力（ｔｅｎｓｉｌｅ  ｓｔｒｅｓｓ）」はＳ＝Ｆ／Ａｏで定義され、Ｆは張力であり、Ａｏは試験サンプルの断面積である。「引張り歪み（ｔｅｎｓｉｌｅ  ｓｔｒａｉｎ）」は（Ｌｆ−Ｌｏ）／Ｌｏ（すなわち、ΔＬ／Ｌｏ）で定義され、Ｌｏは組織マトリックスの元の長さであり、Ｌｆは引張り応力の下での組織マトリックスの長さであり、ΔＬは組織マトリックスが受ける長さの変化である（すなわち、Ｌｆ−Ｌｏ＝ΔＬ）。更に本明細書で用いられるように、「伸張率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」は（Ｌｆ−Ｌｏ）／Ｌｏ×１００％（すなわち、ΔＬ／Ｌｏ×１００％）で定義され、ひいては、明細書全体にわたって「引張り歪み」という用語と互換的に用いられる。
【００２４】
多くの軟部組織で一般的な表示された非線形性の関係は、３の明確な引張り応答の位相からなる。第１の位相は先端（ｔｏｅ）領域であり、第２の位相は応力の下でのコラーゲン原線維の伸張に対応し、最後の位相は組織材料の降伏及び最終破壊によって生じる。組織の伸張性は先端領域の長さによって表わされ、ｘ軸と交差するように曲線の第２の位相を外挿することによって決定される。これは一次方程式ｙ＝ａ＋ｂｘを用いて数学的になされうる。ｘ軸の切片は−ａ／ｂである。
【００２５】
代替的に、約５ニュートン／ｃｍの小さな力の下でのｍＡＴＭとＡＴＭとの間での引張り歪み（又は伸張率）の比較が、ｍＡＴＭ及びＡＴＭの伸張性を比較する方法として提供される。
【００２６】
本明細書で用いられるように、「十分に水分を含む（ｆｕｌｌｙ  ｈｙｄｒａｔｅｄ）」ＡＴＭ又は組織は、そのＡＴＭ又は組織が大気圧の下で含むことが可能な、最大量の結合性及び非結合性の水を含むＡＴＭ又は組織である。十分に水分を含む２以上のＡＴＭ中の（非結合性及び／又は結合性の）水の量を比較する場合、任意の特定の組織から生成されるＡＴＭの最大量の水はＡＴＭの温度と共に変化するため、２（又は３以上）のＡＴＭに対する測定が同一の温度でなされるべきことは当然ながら重要である。十分に水分を含むＡＴＭの例は限定しないが、実施例１に記載の脱細胞化プロセスの終了時のもの、及び本明細書中に記載のような事前の凍結乾燥プロセス後に、室温（すなわち、約１５℃ないし約３５℃）で４時間、０．９％塩化ナトリウム溶液で再度水分補給されたＡＴＭを含む。ＡＴＭにおける結合性の水は、水及びＡＴＭの分子間の分子間相互作用（例えば、水素結合）ならびに／又はＡＴＭにおける水の運動性を制限する他の現象（例えば、表面張力及び幾何学的制限）によって（膨張性のある純水と比較して）分子運動性（回転性及び並進性）が低減したＡＴＭにおける水である。ＡＴＭ内部の非結合性の水は、例えば生体液といった希釈水溶液中の膨張性のある水と同様の分子運動特性を有する。本明細書で用いられるように、「部分的に水分を含むＡＴＭ（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｈｙｄｒａｔｅｄ  ＡＴＭ）」は、同一のＡＴＭが十分に水分を含む場合に大気圧で含む非結合性及び／又は結合性の水の、１００％未満であるが３０％を超える量（例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％を超える量）を大気圧で含むＡＴＭであり、更に部分的に水分を含むＡＴＭ及び十分な水分を含むＡＴＭにおける水の量の測定は、同一温度でなされるべきである。
【００２７】
図２はエラスターゼ処理方法のある実施を示すフローチャートである。本方法は：ＡＴＭを提供するステップ（符号１０２）と；ＡＴＭを（以下に記載の）エラスターゼ処理に曝露するステップ（符号１０４）と；を具える。エラスターゼ処理によって、ＡＴＭと比較して伸張性が低減したｍＡＴＭが生成される（符号１０６）。例示された実施に示されるように、脊椎動物対象（ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｓｕｂｊｅｃｔ）における器官又は組織が修復又は寛解が必要であるとして同定された場合（符号１０８）に、取得されたｍＡＴＭは同定された器官又は組織の中又は上に配置できる（符号１１０）。エラスターゼ処理はＡＴＭ中のペプチド結合を破壊して、破壊されたエラスチンネットワークを有するｍＡＴＭを生成すると考えられる。一般的には、十分な数のペプチド結合が破壊されて、ＡＴＭと比較してｍＡＴＭにおける伸張性の度合の低下を生じさせる。一般的には破壊されるペプチド結合の数は、特異的な張力量の下でのｍＡＴＭの伸張率（又は、歪み）が同一張力量の下でのＡＴＭの伸張率（又は、歪み）の９５％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は２％未満）となる範囲で十分である。
【００２８】
本明細書で用いられるように、「無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ：ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｔｒｉｘ）」は：総ての又は実質的に総ての生存細胞と；細胞を死滅させることによって生成される、総ての検出可能な細胞内成分及び／又は細片と；を除去することによって生成される組織由来の構造である。本明細書で用いられるように、「実質的に総ての生存細胞（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ａｌｌ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ）」を欠いたＡＴＭは、その生存細胞の濃度が、ＡＴＭが生成された組織又は器官における濃度の１％未満（例えば、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、又は０．０００００１％未満）であるＡＴＭである。本明細書で用いられるように、「修飾型無細胞組織マトリックス（ｍＡＴＭ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｔｒｉｘ）」はエラスターゼ処理を受けたＡＴＭである。他に明確に述べられている場合を除いて、ＡＴＭの使用、特徴等に関する本明細書中の様々な記載は、ｍＡＴＭに同様に適用される。
【００２９】
本開示のＡＴＭは上皮基底膜を欠いてもよい。上皮基底膜は、上皮細胞の基底面に隣接する薄い細胞外物質のシートである。凝集した上皮細胞のシートは上皮を形成する。従って例えば、皮膚の上皮は表皮と称され、皮膚の上皮基底膜は表皮と真皮との間にある。上皮基底膜はバリア機能と、上皮様細胞の接着面とを提供する特異的な細胞外マトリックスである。上皮基底膜の固有成分は例えば、ラミニン、ＶＩＩ型コラーゲン、及びニドジェンを含む。
【００３０】
上皮基底膜の固有な時間的及び空間的構成によって、それは皮膚細胞外マトリックスから区別される。本開示のＡＴＭにおける上皮基底膜の存在は、上皮基底膜が無細胞マトリックスの異種移植片のレシピエントにおいて、抗体の生成を誘発し、形成された抗体に結合する、多様な種特異的な成分を含みうる点で弱点となり得るであろう。更に、上皮基底膜は細胞及び／又は可溶因子（例えば、化学誘引物質）の拡散に対する、及び細胞浸潤に対するバリアとして作用しうる。従って、ＡＴＭ移植片におけるその存在によって、レシピエント動物における無細胞組織マトリックスから新しい組織の形成を遅延できる。本明細書で用いられるように、上皮基底膜を「実質的に欠いた（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｌａｃｋ）」ＡＴＭは、無細胞組織マトリックス由来の、処理がされていない対応する組織で所有される上皮基底膜のうちの５％未満（例えば、３％、２％、１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、又は更には０．００１％未満）を含む無細胞組織マトリックスである。
【００３１】
ＡＴＭによって保持される生物学的機能は細胞認識及び細胞結合、ならびに細胞伸展、細胞増殖、及び細胞分化を支持する能力を含む。このような機能は：非変性コラーゲンタンパク質（例えば、Ｉ型コラーゲン）と；多様な非コラーゲン性の分子（例えば、インテグリン受容体のような分子、グリコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）又はプロテオグリカンといった高電荷密度を有する分子、あるいは他の付着因子のいずれかに対するリガンドとして作用するタンパク質）と；によって提供される。有用な無細胞マトリックスによって保持される構造上の機能は：組織学的構造の維持と；組織の成分の３次元配列、ならびに強度、弾性、及び耐久性といった物理学的特性の維持と；規定された有孔性と；高分子の保持と；を含む。ＡＴＭの生物学的機能の効果は、例えばＡＴＭの細胞増殖を支持する能力によって測定でき、ＡＴＭが生成する天然の組織又は器官の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、１００％、又は１００％超）になる。
【００３２】
移植されたマトリックス物質は、できるが、周囲の宿主の組織又は器官と同一の組織又は器官から生成する必要はなく、関連する宿主組織の分化細胞といった細胞、間葉系幹細胞といった幹細胞、又は前駆細胞を侵入又は浸潤させることによって、単純に再構築を受け入れられるようにすべきである。再構築は上述のＡＴＭ成分及び周囲の宿主組織からのシグナル（サイトカイン、細胞外マトリックス成分、生体力学的刺激、及び生体電気的刺激といった）によって指示される。骨髄及び末梢循環における間葉系幹細胞の存在は文献中に記載され、多様な筋骨格系組織を再生することを示した［Ｃａｐｌａｎ（１９９１）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．９：６４１−６５０、Ｃａｐｌａｎ（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．２１：４２９−４３５、及びＣａｐｌａｎら（１９９７）Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ．３４２：２５４−２６９］。更に、移植片は再構築プロセス時に、ある度合いの（しきい値を超える）張力及び生体力学的強度を提供すべきである。
【００３３】
ＡＴＭは上述の特性がマトリックスによって保持される限り、任意のコラーゲン含有性の軟部組織及び筋骨格（例えば、真皮、筋膜、心膜、硬膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靱帯、腱、血管組織（動脈、及び伏在静脈といった静脈）、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、又は腸管組織）から生成できることは理解されよう。更に、その中又は上にＡＴＭが配置される組織は実質的に、細胞を侵入又は浸潤させることによって再構築されうる任意の組織を含む。関連する組織は限定しないが、骨のような骨格組織、軟骨（例えば、関節軟骨）、靱帯、筋膜、及び腱を含む。上述の同種移植片のいずれかが配置されうる他の組織は限定しないが、皮膚、歯肉、硬膜、心筋、血管組織、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱壁、尿管組織、腸管、及び尿道組織を含む。
【００３４】
更に、ＡＴＭは一般的にはＡＴＭ移植片のレシピエントと同一種の１以上の個体から生成されるが、この場合は必ずしも必要としない。従って、例えば、ＡＴＭはブタ組織から生成し、ヒト患者に内植できる。ＡＴＭのレシピエント及びＡＴＭの生成用の組織又は器官のドナーとして作用しうる種は限定しないが、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えばサル、ヒヒ、又はチンパンジー）、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、又はマウスを含む。例えばドナーは末端ガラクトースであるα−１，３ガラクトース部分を欠くように遺伝学的に操作された動物（例えば、ブタ）であってもよい。好適な動物の記載については、その総ての開示が全体の引用によって本明細書中に組み込まれる、同時係属中の米国特許出願第１０／８９６，５９４号及び米国特許第６，１６６，２８８号参照。
【００３５】
ＡＴＭが提供される形態は、由来する組織又は器官、及びレシピエントの組織又は器官の性質、ならびにレシピエントの組織又は器官における損傷又は欠損の性質に依存する。従って例えば、心臓弁に由来するマトリックスは：弁全体としてか；小さなシート又は条片としてか；多様な形状及び／又は寸法のいずれかに切除された小片として；あるいは、粒子形態で；提供できる。同一の概念は上に列挙した組織及び器官のいずれかから生成されるＡＴＭに適用される。
【００３６】
ＡＴＭは多様な方法によって生成できる。その生成で用いられるステップによって上述の生物学的及び構造上の特徴を有するマトリックスが生じることが、要求される総てである。有用な生成方法は、米国特許第４，８６５，８７１号及び第５，３６６，６１６号、ならびに同時係属中の米国特許出願第０９／７６２，１７４号、第１０／１６５，７９０号、及び第１０／８９６，５９４号に記載のものを含み、その総ては全体の引用によって本明細書中に組み込まれる。
【００３７】
手短に言うと、ＡＴＭの生成に関連するステップは一般的には、ドナー（例えば、ヒトの死体又は上に列挙した哺乳類のいずれか）から組織を収集する際の、生物学的及び構造上の機能を同様に維持する条件下での細胞除去と同時又はその前の、組織を安定化し、かつ生物化学的及び構造上の分解を防止するための化学的処理を含む。任意の生体不適合性の細胞除去剤と同様に、炎症を生じさせうる死細胞及び／又は溶解細胞の成分の全体的な除去後に、マトリックスは本開示のエラスターゼ処理方法を受けうる。代替的にＡＴＭは、マトリックスの生物学的及び構造上の記載された特性を維持するのに必要な条件下で更に、凍結保存剤で処理し、凍結保存し、選択的に凍結乾燥できる。凍結乾燥後、組織は同様の機能保存条件下で、選択的に微粉砕又は微粒子化されて、粒子状のＡＴＭを生成する。凍結保存又は凍結乾燥（及び選択的には、微粉砕又は微粒子化）の後に、ＡＴＭはそれぞれ解凍されるか、あるいは再度水分補給され、次いで本開示のエラスターゼ処理方法を受ける。総てのステップは一般的に、無菌又は滅菌条件下で行われる。
【００３８】
初期の安定化溶液は、浸透圧性、低酸素性、自己溶解性、及びタンパク分解性の分解を抑止及び予防し、微生物汚染に対し保護し、例えば平滑筋構造（例えば血管）を含む組織で生じうる機械的な損傷を低減する。安定化溶液は一般的には、好適な緩衝剤と、１以上の抗酸化剤と、１以上の膨張剤と、１以上の抗生物質と、１以上のプロテアーゼ阻害剤と、いくつかの場合においては平滑筋弛緩薬とを含む。
【００３９】
組織はその後、コラーゲンマトリックスの生物学的及び構造上の一体性を損傷することなく、マトリックスの構造から生存細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、及び線維芽細胞）を除去するために、処理溶液中に配置される。処理溶液は一般的には、好適な緩衝剤、塩、抗生物質、１以上の界面活性剤、架橋結合を防止するための１以上の薬剤、１以上のプロテアーゼ阻害剤、及び／又は１以上の酵素を含む。組織の処理はマトリックスの構造上の一体性が維持されるように、ある濃度及びある期間、活性剤を含む処理溶液ですべきである。
【００４０】
組織が脱細胞化された後で、本開示のエラスターゼ処理方法を受けるか、あるいは以下に述べるように凍結保存されうる。
【００４１】
代替的に、組織はエラスターゼ処理を受ける前に凍結保存されうる。その場合は脱細胞化後に、細胞は凍結保存溶液においてインキュベートされる。この溶液は一般的には１以上の抗凍結剤を含み、凍結中に生じうるマトリックスの構造に対する氷晶損傷を最小化する。組織が凍結乾燥される場合、溶液は一般的には更に、１以上の抗乾燥成分を含み、乾燥中の構造の損傷を最小化し、凍結中に伸張も収縮も受けない有機溶剤及び水の組合せを含んでもよい。抗凍結剤及び抗乾燥剤は同一の１以上の物質にできる。組織が凍結乾燥されない場合、約−８０℃でフリーザーに（滅菌容器に）配置することによってか、あるいは滅菌液体窒素に投入することによって凍結でき、使用まで−１６０℃未満の温度で保存する。サンプルは、例えば約３７℃で水浴を含む非透過性の滅菌容器に浸漬することによって、あるいは周囲条件下で組織が室温になるのを可能にすることによって、使用前に解凍できる。
【００４２】
組織が凍結及び乾燥凍結される場合、凍結保存溶液におけるインキュベーションに続き、組織は水蒸気に対して透過性があるが、細菌に対して透過性がない滅菌容器、例えば水蒸気透過性のポーチ又はガラスバイアルの内部にパッケージングされる。好適なポーチの片側は医療用で多孔性の、デラウェア州ウィルミントンのＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社の商標製品であるＴＹＶＥＫ（登録商標）膜からなる。この膜は水蒸気に対して多孔性であり、細菌及び粉塵に対して不透過性である。ＴＹＶＥＫ（登録商標）膜は不透過性のポリエチレン製ラミネートシートに熱融着され、片側が開放され、ひいてはポーチを両側に形成する。開放ポーチは使用前に照射（例えば、ガンマ線照射）によって滅菌される。組織は滅菌ポーチ内に開放端を通して無菌で配置される。開放端はその後無菌で熱融着されて、ポーチを閉止する。パッケージングされた組織は以降、次の処理ステップにわたって微生物汚染から保護される。
【００４３】
組織を含む容器は、特異的な抗凍結剤の剤形と適合性があり、凍結損傷を最小限にする特異的な速度で低温に冷却される。好適な冷却プロトコルは例えば米国特許第５，３３６，６１６号参照。組織はその後、水蒸気が各氷晶の相から経時的に除去されるように、真空条件の下で低温で乾燥される。
【００４４】
水蒸気透過性容器におけるサンプルの乾燥の完了時に、凍結乾燥装置の真空は窒素、ヘリウム、又はアルゴンといった乾燥不活性ガスで置き換えられる。同一の気体環境で維持される一方で、半透過性容器は不透過性（すなわち、水蒸気ならびに微生物に対して不透過性）の容器（例えば、ポーチ）内部に配置され、例えば熱及び／又は圧力によって密封される。組織サンプルがガラスバイアルで凍結及び乾燥される場合、バイアルは好適な不活性栓（ｉｎｅｒｔ  ｓｔｏｐｐｅｒ）で真空下で密封され、乾燥装置の真空は無負荷になる前に不活性ガスで置き換えられる。いずれの場合においても、最終生成物は不活性ガスのガス体中に密閉される。凍結乾燥された組織は、エラスターゼで処理されるまで冷却条件下で保存できる。
【００４５】
以下に述べるように、エラスターゼ処理されたＡＴＭの再度の水分補給後、組織適合性のある生存細胞はＡＴＭに回復して、宿主によって再構築されうる永続的に受容可能な移植片を生成できる。これは一般的には、哺乳類対象においてＡＴＭを配置する直前になされる。マトリックスが凍結乾燥された場合、再度の水分補給後になされる。ある実施形態においては、組織適合性のある生存細胞は、移植前の標準的なインビトロでの細胞培養技術によって、あるいは移植後のインビボでの再増殖によってマトリックスに追加される。インビボでの再増殖は、レシピエント固有の細胞がＡＴＭ内に移動することによって、あるいはインサイチューで他のドナーからＡＴＭにレシピエントから取得される細胞又は組織適合性のある細胞を注入又は注射することによってなされうる。
【００４６】
再構成のために用いられる細胞型は、ＡＴＭが再構築されている組織又は器官の性質に依存する。例えば、ＡＴＭでの総ての皮膚層の再構築のための主要な要求は、表皮細胞又はケラチノサイトの修復である。例えば、直接的な対象のレシピエント由来の細胞はＡＴＭを再構成するのに用いることができ、得られた組成物はメッシュ状の分層植皮片の形態でレシピエントに移植できる。代替的に、培養した（自己又は同種の）細胞はＡＴＭに追加できる。このような細胞は例えば、標準的な組織培養条件の下で増殖でき、ＡＴＭに追加できる。別の実施形態においては、細胞は組織培養時にＡＴＭの中及び／又は上に増殖できる。組織培養時にＡＴＭの中及び／又は上に増殖された細胞は、好適なドナー（例えば、対象のレシピエント、又は同種のドナー）から直接的に取得でき、あるいは、ＡＴＭがない状態で組織培養時に最初に増殖できる。
【００４７】
心臓弁及び血管性の導管の再構成に最も重要な細胞が内皮細胞であり、それは組織の内面を覆っている。内皮細胞は更に培養時に伸張でき、直接的に、対象のレシピエント患者あるいは臍動脈又は臍静脈の由来になりうる。
【００４８】
マトリックスが共に再配置されうる他の細胞は限定しないが、線維芽細胞、胚性幹細胞、成体又は胚体の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、前軟骨芽細胞（ｐｒｏｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ）、軟骨芽細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、単核細胞、前心筋芽細胞（ｐｒｏ−ｃａｒｄｉｏｍｙｏｂｌａｓｔ）、周皮細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、歯肉上皮細胞、又は歯周靱帯幹細胞を含む。当然ながら、ＡＴＭはこれらの細胞型のうちの２以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の組合せと共に再配置できる。
【００４９】
上述のステップの総てを実行するための試薬及び方法は当該技術分野において周知である。好適な試薬及び方法は例えば、米国特許第５，３３６，６１６号に記載されている。
【００５０】
粒子状のＡＴＭは、上述の粒子状でないＡＴＭのいずれかから、上述の生物学的及び構造上の機能の維持を生じさせる、任意のプロセスによって生成され、コラーゲン線維に対する損傷は、せん断された線維端を含めて、最小化すべきである。粒子状のＡＴＭを生成するための多くの既知の湿式及び乾式のプロセスは、コラーゲン線維の構造上の一体性をそのように維持しない。
【００５１】
粒子状のＡＴＭを生成するための１の好適な方法は米国特許第６，９３３，３２６号に記載されている。そのプロセスは手短に、凍結乾燥させた皮膚のＡＴＭについて以下に述べるが、当該技術分野の当業者は容易に、本明細書中に列挙した他の組織のうちのいずれかに由来する凍結乾燥させたＡＴＭで用いる方法を構成できるであろう。
【００５２】
皮膚の無細胞マトリックスは（例えば、非断続型の「連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）」切削ホイールに装着されるＺｉｍｍｅｒ社のメッシャーを用いて）条片に切除される。得られた長い条片は次いで、約１ｃｍないし約２ｃｍの長さに切除される。ホモジナイザー及び滅菌されたホモジナイザープローブ（例えば、バージニア州ウォレントンのＯＭＮＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社から入手可能なＬａｂＴｅｃｋ  Ｍａｃｒｏホモジナイザー）が構成され、ホモジナイザーの塔部に注入される滅菌液体窒素を用いて極低温（すなわち、約１９６℃未満ないし約−１６０℃）に冷却される。ホモジナイザーが極低温に到達した時点で、ＡＴＭの切除小片は、液体窒素を含み、均質化を行う塔部に添加される。ホモジナイザーは次いでＡＴＭの小片を極低温で破砕すべく作動する。極低温で破砕するステップの時間及び期間は、用いられるホモジナイザー、均質化を行うチャンバの大きさ、及びホモジナイザーが動作する速度及び時間に依存する。代替例として、低温破砕するプロセスは極低温に冷却される低温粉砕機において行うことができる。
【００５３】
低温破砕された粒子状の無細胞組織マトリックスは選択的に、更に極低温に冷却した金属スクリーンの列を通して滅菌液体窒素で均質化した生成物を洗浄することによって、粒径で選別される。一般的には、小さい孔径を有する１以上のスクリーンに進む前に、比較的大きな孔径を有するスクリーンで所望されない大きな粒子を除去することが有用である。分離された時点で、粒子は手順中に吸収されうる任意の残留水分を確実に除去するように凍結乾燥できる。最終生成物は一般的には、約１ミクロンないし約９００ミクロン、約３０ミクロンないし約７５０ミクロン、又は約１５０ないし約３００ミクロンの最長寸法の粒径を有する（通常は白色又は白色に近い色の）粉末である。この材料はノーマルセーラインでの懸濁液、又は当該技術分野で周知のその他の好適な再度の水分補給用の薬剤によって容易に再度の水分補給がされる。更に任意の好適な当該技術分野で周知の担体中に懸濁してもよい（例えば、全体の引用によって本明細書中に組み込まれる米国特許第５，２８４，６５５号参照）。高濃度で（例えば約６００ｍｇ／ｍｌで）懸濁された場合、粒子状のＡＴＭは「パテ（ｐｕｔｔｙ）」を形成でき、若干低い濃度（例えば、約３３０ｍｇ／ｍｌ）で懸濁された場合、「ペースト（ｐａｓｔｅ）」を形成できる。このようなパテ及びペーストは、例えば組織及び器官中の任意の形状の孔、間隙、又は腔の内部に、このような孔、間隙、又は腔を実質的に満たすべく、好都合に充填できる。
【００５４】
１の非常に好適な凍結乾燥させたＡＴＭはＬｉｆｅＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（ニュージャージー州ブランチバーグ）でヒト真皮から生成され、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）として小さなシートの形態で市販されている。このようなシートは、例えば１ｃｍ×２ｃｍ、３ｃｍ×７ｃｍ、４ｃｍ×８ｃｍ、５ｃｍ×１０ｃｍ、４ｃｍ×１２ｃｍ、及び６ｃｍ×１２ｃｍの寸法を有する矩形のシートとしてＬｉｆｅＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社で市販されている。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）を凍結及び乾燥するのに用いられる抗凍結剤は、３５％のマルトデキストリン及び１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の溶液である。従って最終的な乾燥生成物は約６０重量パーセントのＡＴＭと、約４０重量パーセントのマルトデキストリンとを含む。ＬｉｆｅＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社によって更に、類似生成物が、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）と同一比率のＡＴＭ及びマルトデキストリンを有するブタ真皮（ＸｅｎｏＤｅｒｍと称する）から生成されている。更に、ＬｉｆｅＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社は、ＣＹＭＥＴＲＡ（登録商標）という名称の下でＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）を（上述のように）低温破砕することによって生成される粒子状の皮膚の無細胞マトリックスを市販している。ＣＹＭＥＴＲＡ（登録商標）の粒径は集団で定量すると、約６０ミクロンないし約１５０ミクロンの範囲内となる。加えて、別の好適なＡＴＭは、更にＬｉｆｅＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から入手可能なブタ真皮から生成される水を含むＡＴＭ：ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（登録商標）である。
【００５５】
粒子状、あるいは粉砕した（粉末化した）本開示のＡＴＭの粒子は最長寸法が１．０ｍｍ未満となる。これより大きな寸法を有するＡＴＭの小片は粒子状ではない無細胞マトリックスである。
【００５６】
［エラスターゼ処理］
本明細書で用いられるように、「エラスターゼ処理（ｅｌａｓｔａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は一般的には、組織のエラスターゼネットワークを破壊する方法で、組織サンプル（又は複数のサンプル）をエラスターゼに曝露し、このようにして１以上の組織サンプルの伸張性を低減することである。エラスターゼ処理は一般的には、組織サンプルが脱細胞化された後に随時（例えば、すぐ後、数時間後、又は数日後）行われる。上に示したように、それは脱細胞化し、次いで長期間（例えば、数週、数箇月、又は更に数年）保存、凍結、又は凍結乾燥された組織で行ってもよい。
【００５７】
エラスターゼは広範で多様な供給源から取得できる。従って、動物（例えば、ブタといった哺乳類）、植物、又は微生物（例えば、細菌）の供給源から取得できる。本開示の方法で用いられうるエラスターゼの特異的で限定されない例は以下の通りである。
【００５８】
（ａ）ブタ膵臓のエラスターゼ（酵素委員会番号ＥＣ３．４．２１．３６）（膵ペプチダーゼＥ）
２４０のアミノ酸残基の単鎖ポリペプチドであり、４のジスルフィド架橋を含む。広範な特異性を有し、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、及びＬｅｕといった小さな疎水性アミノ酸のカルボキシル側でタンパク質を開裂する。更にアミドとエステルとを加水分解する。ブタ膵臓のエラスターゼは、トリプシン、キモトリプシン、又はペプシンによって攻撃されない基質である、天然エラスチンを加水分解する能力においてプロテアーゼの中でも特有である。ダイズトリプシン阻害剤及びカリクレイン阻害剤を添加することによって、エラスチン分解活性ではなく、タンパク質分解活性が抑制される。
【００５９】
（ｂ）ヒト好中球（白血球）エラスターゼ（酵素委員会番号ＥＣ３．４．２１．３７）
リソソームエラスターゼ、好中球エラスターゼ、多形核白血球エラスターゼ、セリンエラスターゼ、リソソームエラスターゼ、又は顆粒球エラスターゼとしても周知である。２９ＫＤａのセリンエンドプロテアーゼは４のジスルフィド結合を有する、２３８のアミノ酸の単鎖ペプチドであり、ブタ膵臓のエラスターゼと約４３％の配列相同性を共有する。白血球エラスターゼは好適にはバリンのカルボキシル側で開裂し、それほどではないにせよ、アラニンの末端（すなわち、カルボキシル側）を更に開裂する。エラスチンの他に、白血球エラスターゼは：軟骨プロテオグリカンと；Ｉ、ＩＩ、ＩＩ及びＩＶ型コラーゲンと；フィブロネクチンと；を開裂する。
【００６０】
（ｃ）ヒトマトリックスのメタロプロテイナーゼ１２（ＭＭＰ−１２）（酵素委員会番号ＥＣ３．４．２４．６５）
ＭＭＰ−１２はマクロファージエラスターゼとしても周知である。ヒト白血球エラスターゼより広範な範囲の細胞で発現し、不活性酵素（チモーゲン）として分泌される。チモーゲンはプロペプチドドメインを除去することによって活性化される。ＭＭＰ−１２はエラスチン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ならびに、α１プロテイナーゼ阻害剤、α２抗プラスミン、及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤２を分解するが、間質コラーゲンを分解しない。
【００６１】
（ｄ）緑膿菌エラスターゼ等の微生物エラスターゼ
不溶性のエラスチン、コラーゲン、免疫グロブリン、血清α１プロテイナーゼ阻害剤、α２マクログロビン、ラミニン、及びフィブリンを加水分解するメタロプロテイナーゼである。
【００６２】
対象のエラスターゼは：（ｉ）全長の野生型成熟ポリペプチドと；（ｉｉ）機能的な（ｉ）のフラグメントと；（ｉｉｉ）機能的な（ｉ）及び（ｉｉ）の変異体と；を含む。本明細書で用いられるように、エラスターゼのポリペプチドの「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は対応する全長の野生型成熟エラスターゼより短い、対応する全長の野生型成熟エラスターゼのフラグメントである。エラスターゼの変異体は：１ないし５０、１ないし２５、１ないし１５、１ないし１０、１ないし８、１ないし５、又は１ないし３（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は５０）のアミノ酸のうちの１以上の内部欠失か；任意の数のアミノ酸の内部付加又は末端付加（例えば、内部欠失について上で得られた同一数）か；あるいは、３０以下（例えば、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１以下）のアミノ酸置換か；を含む、全長の野生型成熟エラスターゼ又はエラスターゼのフラグメントにできる。アミノ酸置換は保存的置換であってもよい。保存的置換は一般的には、以下の基との置換を含む：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニン；リジン、ヒスチジン、及びアルギニン；ならびに、フェニルアラニン及びチロシン。エラスターゼの「機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」なフラグメント及び「機能的」な変異体は、対応する全長の野生型成熟エラスターゼのエラスターゼ活性のうちの少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、１００％、更に１００％超）を有する。上述から変異体が対立遺伝子の変異体となりうることが理解されよう。
【００６３】
いくつかの実施形態においては、タンパク質分解阻害剤（例えば、ダイズトリプシン阻害剤及びカリクレイン阻害剤）は、広範で非特異的なタンパク質分解活性を低減するが、総て又は相当なレベル（例えば、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、又は９９％超）の、その非特異的なタンパク質分解活性を維持するために、ＡＴＭを処理するように用いられるエラスターゼ含有培地に含むことができる。更に、例えば、非特異的なタンパク質分解活性が低減するが、エラスチン分解活性が維持されるか、最小限に低減するか、あるいは更に増加されるエラスターゼの機能的変異体は有用となりうる。
【００６４】
上述の総ての野生型エラスターゼのポリペプチド、フラグメント、及び変異体（以下では「エラスターゼのポリペプチド」と一括りにして称される）は、標準的な生物化学的及び化学的方法によって任意の関連する天然供給源から取得できる。代替的に、形質転換した宿主細胞（哺乳類、昆虫、若しくは酵母細胞を含む真菌といった真核細胞、又は細菌細胞といった原核細胞）を用いて標準的な組換え方法によって生成される組換え分子にできる。このような組換え方法は当該技術分野で公知である。
【００６５】
エラスターゼのポリペプチドは未精製形態で（例えば、細胞溶解物又は組織破砕物として）、半精製形態で、あるいは実質的に純粋な形態で用いることができる。いくつかの実施形態においては分離してもよい。本明細書で用いられるように、「分離したエラスターゼのポリペプチド（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、天然に発生する対応物がないか；あるいは、例えば、膵臓、肝臓、脾臓、卵巣、精巣、筋肉、関節組織、神経組織、胃腸組織、若しくは腫瘍組織といった組織、又は、血液、血清、若しくは尿といった体液、又は、白血球、単核球細胞、リンパ球細胞、若しくは微生物細胞といった細胞において、天然に同時発生する成分から分離又は精製されるか；のいずれかである、エラスターゼのポリペプチドのことである。一般的にはエラスターゼのポリペプチドは、天然に同時発生するタンパク質及び他の天然の有機分子がなく、乾燥重量で少なくとも７０％である場合に、「分離（ｉｓｏｌａｔｅ）」されたと見なされる。多様な実施形態においては、エラスターゼのポリペプチドの調合物は乾燥重量で少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％のエラスターゼのポリペプチドである。化学的に合成されたエラスターゼのポリペプチドは元来、天然に同時発生する成分から分離されているため、合成したエラスターゼのポリペプチドは「分離」されている。更に、エラスターゼのポリペプチドは、培養培地又はインキュベーション緩衝液が含む哺乳類の血清（又は、その他の体液）中にあるために、（例えば、ＡＴＭを処理するのに用いられる）培養培地又はインキュベーション緩衝液に存在でき、分離したエラスターゼのポリペプチドではない。
【００６６】
上述のように、本開示の方法を行うのに有用な、分離したエラスターゼのポリペプチドは：天然供給源から（例えば、組織から）の抽出によって；ポリペプチドをコード化する組換え型核酸の発現によって；あるいは、化学合成によって；取得できる。天然に発生する供給源と異なる細胞系で生成されるエラスターゼのポリペプチドは「分離」されているが、それは必然的に天然に同時発生する成分がないためである。分離又は精製の度合は、任意の好適な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００６７】
いくつかの実施においては、エラスターゼ処理は、得られたｍＡＴＭにおいて所望の伸張性を取得する方法で制御される。それらの実施において、得られた所望のｍＡＴＭの伸張性は、約５ニュートン／ｃｍの張力の印加の下で、ｍＡＴＭが約１４％ないし２４％、約１５％ないし２３％、約１６％ないし２２％、約１７％ないし２１％、約１８％ないし２０％、又は約１９％で伸張するようにできる。代替的に、所望の伸張性は、約５ニュートン／ｃｍの張力の印加の下で、得られたｍＡＴＭが同様に約２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、又は１９％以下で伸張するようにしてもよい。
【００６８】
所望の伸張性を有するｍＡＴＭを生成するステップは、例えば、１以上の組織サンプルが曝露される溶液中において曝露の期間及びエラスターゼの濃度を制御するステップを具えることができる。曝露の期間は例えば、約１２ないし２４時間、１３ないし２３時間、１４ないし２２時間、１５ないし２１時間、１６ないし２０時間、１７ないし１９時間、又は約１８時間にできる。代替的に、曝露の期間は少なくとも３時間、６時間、９時間、又は１２時間であってもよい。代替的に、曝露の期間は３０時間、１８時間、又は９時間以下であってもよい。
【００６９】
溶液中のエラスターゼの濃度は、約０．１ユニット／ミリリットルないし０．５ユニット／ミリリットル、あるいは約０．２ユニット／ミリリットルないし０．４ユニット／ミリリットルであってもよい。溶液中のエラスターゼの濃度は、約０．２ユニット／ミリリットル、約０．２５ユニット／ミリリットル、あるいは約０．３ユニット／ミリリットルであってもよい。
【００７０】
一般的に、１以上の組織サンプルを処理するのに用いられるエラスターゼ溶液の量は湿組織１グラムにつき約３ミリリットルである。他のエラスターゼ溶液の量は同様に許容される。例えば、湿組織１グラムにつき３ミリリットルを超える量は確実に作用するであろう。
【００７１】
エラスターゼ処理は周囲温度で行うことができる。本明細書で用いられるように、「周囲温度（ａｍｂｉｅｎｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」という用語は２０ないし２５℃の温度を意味する。
【００７２】
一般的には、１以上の組織サンプル及びエラスターゼ溶液は、エラスターゼの曝露の期間の総てではないが、少なくとも一部の間、攪拌される。
【００７３】
［治療の方法］
任意の特定の例で用いられるＡＴＭ又はｍＡＴＭの形態は適用すべき組織又は器官に依存する。
【００７４】
ＡＴＭのシート（所望の寸法に選択的に切削された）は例えば：（ａ）損傷されたか、あるいは欠損を含む組織又は器官の周囲に巻かれるか；（ｂ）損傷されたか、あるいは欠損を有する組織又は器官の表面に配置されるか；あるいは、（ｃ）組織又は器官における窩、間隙、又は腔に巻取られ、挿入される。このような窩、間隙、又は腔は例えば：（ｉ）外傷起源；（ｉｉ）患部組織の除去によるもの（例えば、梗塞した心筋組織）；あるいは、（ｉｉｉ）悪性腫瘍又は良性腫瘍の除去によるもの；にできる。ＡＴＭを用いて、未発達の組織又は器官を増大又は寛解させることか、あるいは変形した組織又は器官を増大又は再構成することができる。１以上のこのような条片は任意の特定の部位で用いることができる。移植片は例えば、当該技術分野で周知の縫合、ステープル、鋲、又は組織接着剤若しくは組織充填剤によって適所に保持できる。代替的に、例えば欠損又は窩に十分に強固に充填される場合は、固定デバイスを要しなくともよい。粒子状のＡＴＭは薬学的に許容可能な滅菌した担体（例えば、ノーマルセーライン）に懸濁され、対象部位に皮下注射針を介して注射できる。代替的に、乾燥粉末化したマトリックス又は懸濁液は対象部位の上又は中に噴霧できる。懸濁液は更に特定部位の中又は上に注いでもよい。更に、粒子状のＡＴＭを比較的少量の液体担体と混合することによって、「パテ」を生成できる。このようなパテ、あるいは更に乾燥した粒子状のＡＴＭは、上述の器官又は組織における間隙、窩、又は腔のいずれかに層状化、充填、又は包入することができる。更に粒子状でないＡＴＭは、粒子状のＡＴＭと組合わせて用いることができる。例えば、骨における窩はパテで充填し、ＡＴＭのシートで覆うことができる。
【００７５】
ＡＴＭは組織又は器官に対して、あるいはその上に、その組織又は器官及び隣接する組織又は器官を再生するために適用される。このように、例えばＡＴＭの条片が長骨の重大な間隙の欠損の周囲を包んで、間隙の欠損の周囲に骨膜等価物を生成でき、骨膜等価物は次いで、骨の間隙内での骨の生成を刺激できる。同様に、抜歯ソケットにおけるＡＴＭを内植することによって、損傷した歯肉組織は修復及び／又は置換でき、「新しい」歯肉組織は、例えば抜歯の結果として喪失しうるソケットの底部において任意の骨の修復及び／又は再生の助けとなる。歯肉組織（歯肉）に関しては、後退する歯肉は更に、懸濁液の注入によって、あるいは粒子状のＡＴＭのパテの好適な歯肉組織への充填によって置換できる。更に歯肉組織を修復するのに加えて、この治療は歯周病及び／又は抜歯の結果として喪失した骨の再生を生じさせることができる。上の歯肉の欠損のいずれかを治療するのに用いられる組成物は、本明細書中で列挙する１以上の他の成分、例えば鉱質除去された骨粉、増殖因子、又は幹細胞を含むことができる。
【００７６】
粒子状でないＡＴＭ及び粒子状のＡＴＭの双方は、他の骨格又は物理学的な支持成分と組合わせて用いることができる。例えば、１以上のＡＴＭのシートはＡＴＭ以外の生物学的材料、例えば、ヴァージニア州ヴァージニアビーチのＬｉｆｅＮｅｔといった組織バンクによって供給される放射線照射した軟骨、あるいは例えば、ニュージャージー州エデンタウン（Ｅｄｅｎｔｏｗｎ）のＯｓｔｅｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社によって供給されるボーンウェッジ及び骨型から生成される１以上のシートで層化できる。代替的には、このようなＡＴＭ以外のシートは合成材料、例えばジョージア州アトランタのＢｉｏｃｕｒｅ社によって供給されるようなポリグリコール酸又はヒドロゲルから生成できる。他の好適な骨格又は物理学的な支持材料は米国特許第５，８８５，８２９号に開示され、その開示は全体の引用によって本明細書中に組み込まれる。このような更なる骨格又は物理学的な支持成分は、任意の都合のよい寸法又は形状、例えば、シート、立方体、矩形、円板、球、又は粒子（粒子状のＡＴＭで上述したような）にできることは理解されよう。
【００７７】
粒子状のＡＴＭと混合され、粒子状でないＡＴＭに含浸されうる活性物質は骨粉、鉱質除去された骨粉、及び上述のいずれかを含む。
【００７８】
マトリックスに組み込まれうるか、ＡＴＭ移植片の配置部位に投与されうるか、あるいは全身投与されうる因子は、当該技術分野に周知の広範な細胞増殖因子、血管新生因子、分化因子、サイトカイン、ホルモン、及びケモカインのいずれかを含む。因子の２以上の任意の組合せは、以下に列挙された手段のいずれかによって対象に投与できる。関連する因子の例は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ１ないし１０）、上皮増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＶＥＧＦ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮ−α、β、又はγ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦα又はβ）、腫瘍壊死因子α、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１ないしＩＬ−１８）、Ｏｓｔｅｒｉｘ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（例えば、ソニックヘッジホッグ又はデザートヘッジホッグ）、ＳＯＸ９、骨形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、カルシトニンプロスタグランジン、あるいはアスコルビン酸を含む。
【００７９】
タンパク質の因子は更に、対象：（ａ）タンパク質である上の因子のうちの任意の１以上をコード化する核酸配列を含む発現ベクター（例えば、プラスミド又はウイルスベクター）；あるいは、（ｂ）このような発現ベクターで（安定して、又は一時的に）形質移入又は形質導入された細胞；に投与することによって、レシピエント対象に送達できる。発現ベクターにおいては、コード配列は１以上の転写調節要素（ＴＲＥ）に動作可能に結合される。形質移入又は形質導入用に用いられる細胞はレシピエントに由来させ、レシピエントと組織適合性にできる。しかしながら、因子に対する短い曝露のみを要求することが可能であり、ひいては組織不適合性ではない細胞が更に用いられうる。細胞はマトリックスが対象に配置される前に、（粒子状の、あるいは粒子状でない）ＡＴＭに組み込まれうる。代替的に、対象において既に適所にあるＡＴＭに、対象において既に適所にあるＡＴＭに近い部位に、あるいは全身的に注入できる。
【００８０】
当然ながら、上述のＡＴＭ及び／又は他の物質又は因子のうちのいずれかの投与は単回又は複数回にできる。複数回の場合、投与は当該技術分野の当業者によって容易に決定可能な時間間隔にできる。多様な物質及び因子の用量は対象の種、年齢、体重、サイズ、及び性別によって大きく変化し、更に、当該技術分野の当業者によって容易に決定可能である。
【００８１】
マトリックスが用いられうる状態は複数である。従って例えば、上述の損傷又は欠損のうちのいずれかを有する骨及び／又は軟骨の修復のために用いることができる。粒子状のＡＴＭと粒子状でないＡＴＭとの双方は、上に列挙した形態のいずれかで、あるいはプロセスのいずれかによって用いられうる。このような治療方法が適用できる骨は限定しないが、長骨（例えば、脛骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、又は腓骨）、手足部の骨（例えば、踵骨又は舟状骨）、頭部又は首部の骨（例えば、側頭骨、頭頂骨、前頭骨、上顎骨、下顎骨）、あるいは椎骨を含む。上述のように、骨の重大な間隙の欠損はＡＴＭで治療できる。このような重大な間隙の欠損においては、間隙は例えばパテ又は充填したＡＴＭのシートで満たすことができ、ＡＴＭのシートで包むことができる。代替的に、間隙はＡＴＭのシートで包むことができ、他の材料（以下参照）で満たすことができる。総てのこれらの骨及び／又は軟骨の治療において、更なる材料は修復プロセスを更に手助けするように用いることができる。例えば、間隙は海綿骨及び／又は硫酸カルシウムのペレットで満たすことができ、粒子状のＡＴＭは、鉱質除去された骨粉と混合して、骨の損傷又は骨の欠損の部位に送達できる。更に、ＡＴＭはレシピエントからの骨髄及び／又は骨細片と組合わせることができる。
【００８２】
ＡＴＭは更に、筋膜、例えば腹壁筋膜又は骨盤底筋膜を修復するのに用いることができる。このような方法においては、ＡＴＭの条片は一般的に、例えば周囲の筋膜又は宿主組織、あるいはクーパー靱帯といった安定性のある靱帯又は腱に縫合することによって、腹腔又は骨盤底に結合される。
【００８３】
ＡＴＭはヘルニアの修復に非常に好適である。ヘルニアは、体腔の含有物の体腔の外側への突出であり、通常その含有物は体腔において見出される。これらの含有物は多くの場合、体腔内部に並ぶ薄膜に取り囲まれ、全体として膜及び含有物は「ヘルニア嚢（ｈｅｒｎｉａｌ  ｓａｃ）」と称される。最も一般的には、ヘルニアは腹壁における脆弱性が腸突出が生じる局所的な孔又は欠損に拡大するとき、腹部において発症する。腹壁におけるこれらの脆弱性は一般的には、天然に腹壁の薄い位置、すなわち、腹部から末端及び他の器官へ延在する血管用の導管の通過を可能にすべく、天然の開口部が存在する部位で生じる。脆弱性の可能性がある他の領域は、任意の既往の腹腔手術の部位である。脂肪組織は通常、最初にヘルニアになり、腸管又は他の腹腔内器官の断片化が後に続く。器官への血液供給が低下するように、内臓器官の断片がヘルニア嚢内部に捕捉された場合、患者は、腸閉塞、壊疽及び死を含む重篤な合併症のおそれがある。ヘルニアは自然治癒せず、多くの場合病状を治療するのに外科的修復が必要とされるため、経時的に大きさが増える。一般的にヘルニアは、ヘルニア嚢を体腔へ再挿入し、その後脆弱化した筋肉組織を修復することによって修復される。
【００８４】
多くの種類のヘルニアが存在する。男性のみに現れる鼠径及び陰嚢ヘルニアを除いて、ヘルニアは任意の年齢又は性の個体において見出される。ヘルニアの例は：腸管が鼠径管の後壁を介して鼠径管に突出しうる直接鼠径ヘルニア；腸管が鼠径管の尖部での脆弱性を介して鼠径管に突出しうる間接鼠径ヘルニア；大腿血管の下側の末端への通過によって生成される脆弱領域に腹腔含有物が通過する大腿ヘルニア；腸管含有物が陰嚢に突出する陰嚢ヘルニア；腹直筋の縁に沿ってヘルニアが生じるスピゲリウスヘルニア；腹腔含有物（例えば、腸管又は他の腹腔器官）が閉鎖管に突出する閉鎖孔ヘルニア；ヘルニアが下腰三角であるプチ三角（Ｐｅｔｉｔ’ｓ  ｔｒｉａｎｇｌｅ）を通るプティヘルニア、及びヘルニアが上腰三角であるグランフェルト−レスハフト三角（Ｇｒｙｎｆｅｌｔｔ−Ｌｅｓｓｈａｆｔ  ｔｒｉａｎｇｌｅ）を通るグランフェルトヘルニア（Ｇｒｙｎｆｅｌｔｔ’ｓ  ｈｅｒｎｉａ）等の腰ヘルニア；腸の一方の側壁のみが絞扼されるリヒターヘルニア；ヘルニアがヘッセルバッハ三角（Ｈｅｓｓｅｌｂａｃｈ’ｓ  ｔｒｉａｎｇｌｅ）を通るヘッセルバッハヘルニア；下腹壁血管のいすれかの側面でヘルニア嚢が突出して、複合型の直接鼠径ヘルニア及び間接鼠径ヘルニアを提供するパンタロンヘルニア；クーパーヘルニア；上腹壁ヘルニア（腹部の正中線における臍と胸郭下部との間にヘルニアが生じる）；胃の一部が横隔膜の食道裂孔を通って突出する、ボホダレクヘルニア及びモルガーニヘルニア（Ｍｏｒｇａｇｎｉ’ｓ  ｈｅｒｎｉａ）等の横隔膜ヘルニア又は裂孔ヘルニア；並びに、突出が臍を通る臍ヘルニアを含む。
【００８５】
先天的起源のヘルニアと対照的に、腹壁ヘルニア又は再発性ヘルニアとしても周知の切開創ヘルニアは、古い手術痕領域において腹腔内で生じる。切開創ヘルニアには、先天性ヘルニアよりも、外科的修復後のより高い再発のリスクがある。更に、多発性である再発性ヘルニア、すなわち、２以上の修復がおこなわれた後に再発するヘルニアの場合においては、修復成功の尤度は後の各手順で低下する。
【００８６】
梗塞した心筋はＡＴＭによる修復を再構築するための別の候補である。以前の定説と対照的に、総ての心筋細胞が増殖性ひいては再生性の能力を喪失したわけではないことが現在周知である［例えば、Ｂｅｌｔｒａｍｉら（２００１）Ｎｅｗ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７５０−１７５７；Ｋａｊｓｔｕｒａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８８０１−８８０５］。更に、幹細胞は例えば骨髄及び血液中に、及び血管に付随する周皮細胞として存在し、心筋細胞に分化できる。梗塞した組織自体は除去され、かつ好適な大きさに切除されたＡＴＭのシートで置換されるか、あるいは、粒子状のＡＴＭの懸濁液が梗塞した組織に注入されうる。先天性の心臓形成不全、又は他の構造上の欠損は組織中に切開部を生成し、切開部によって形成された間隙を拡げ、所望の大きさに切削されたＡＴＭのシートを挿入することによって、あるいは心外膜面及び心内膜面にＡＴＭのシートを配置し、その間に粒子状のＡＴＭを配置することによって修復できる。特定の条件においては、切開部によって間隙を形成することは十分ではなく、いくつかの組織を切除することが必要となりうることは理解されよう。当然ながら当該技術分野の当業者は、ＡＴＭを同様に用いて、他の種類の筋肉、例えば尿管若しくは膀胱、又は二頭筋、胸筋、若しくは広背筋といった骨格筋の損傷又は欠損を修復できることは理解されよう。
【００８７】
更に、ＡＴＭのシートは食道、胃、ならびに小腸管及び大腸管を含む、損傷又は除去された腸管組織を修復又は置換するのに用いることができる。この場合においては、ＡＴＭのシートは腸管における穿孔又は孔を修復するのに用いることができる。代替的に、ＡＴＭのシートは腸管中の間隙（例えば、腫瘍又は腸管の患部断片を除去するために外科手術によって形成された間隙）を満たすように用いることができるシリンダに形成できる。このような方法は例えば横隔膜ヘルニアを治療するのに用いることができる。シート形態におけるＡＴＭは更に、この条件において、ならびに横隔膜が組織の修復若しくは置換、又は追加を要求する他の条件において、横隔膜自体を修復するのに用いられうることは理解されよう。
【００８８】
以下の実施例は、限定せずに本開示を例示するのに役立つ。
【００８９】
［実施例］
以下で別段に述べない限り、以下の実施例で用いられたＡＴＭはＬｉｆｅＣｅｌｌ社の固有の方法によって処理された。ＡＴＭを生成する方法は、この実施例において広範に記載され、個別の実験で用いられるＡＴＭの詳細は関連する実施例で提供される。以下の記載はヒト皮膚からのＡＴＭの生成に用いられるものである。
【００９０】
ヒトドナーの皮膚は、死亡したドナーから皮膚のサンプルを血縁者から同意を得た後に収集した、国家全体にある様々な米国の組織バンク及び病院から取得された。調達した皮膚は抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を含む組織培養用のＲＰＭＩ１６４０培地に配置され、水の氷（ｗｅｔ  ｉｃｅ）上、同一培地において、でニュージャージー州ブランチバーグにあるＬｉｆｅＣｅｌｌ社の設備に輸送された。到着すると同時に、皮膚組織の容器の温度が測定され、温度が１０℃を超える場合は廃棄する。ＲＰＭＩ１６４０培地は無菌状態下で交換され、皮膚は４℃で保存される一方、血清学的試験（例えば、ＲＰＲ、ＶＤＲＬ、ＨＩＶ  Ｉ及びＩＩ、Ｂ型肝炎表面抗体、Ｃ型肝炎ウイルス、ならびにＨＴＬＶ  Ｉ及びＩＩ）が行われた。皮膚は次いで、事前凍結した体積濃度で３５％のマルトデキストリン水溶液に移された。２ないし４時間後、皮膚は−８０℃のフリーザーで以下に記載のように処理されるまで凍結及び保存された。
【００９１】
凍結された皮膚は氷が見えなくなるまで、水浴において３７℃で解凍された。事前凍結された溶液は以下のステップからなる更なる処理の前に排出された：（ｉ）脱表皮化；（ｉｉ）脱細胞化；（ｉｉｉ）洗浄；（ｉｖ）抗凍結剤溶液におけるインキュベーション；（ｖ）凍結乾燥。
【００９２】
（ｉ）脱表皮化
皮膚の表皮は、室温で８ないし３２時間、ヒト皮膚用の脱表皮化溶液（１ＭのＮａＣ１、体積濃度で０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０ｍＭのＥＤＴＡ）において静かに攪拌して、組織サンプルをインキュベートすることによって除去された。表皮層は真皮から除去された。表皮は廃棄され、真皮は更なる処理のために保持された。
【００９３】
（ｉｉ）脱細胞化
細胞成分を除去するために、真皮は脱細胞化溶液（体積濃度で２％のデオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．８ないし８．２）を用いて５ないし６０分間すすがれ、次いで、室温で１２ないし３０時間、その溶液において静かに攪拌してインキュベートした。
【００９４】
（ｉｉｉ）洗浄
洗浄措置は前述の処理ステップを用いて、死細胞、細胞細片、及び残余の化学物質を洗い流すように作用する。脱細胞化した真皮は第１の洗浄溶液（体積濃度で０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１０ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））に移され、その後、室温で５ないし６０分間、静かに攪拌してインキュベートされた。真皮はその後、第２の洗浄溶液（１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）において室温で静かに攪拌して３の連続洗浄を受けた。最初の２の洗浄は短く（各々１５ないし６０分）、３番目の洗浄は長かった（６ないし３０時間）。
【００９５】
（ｉｖ）抗凍結剤溶液におけるインキュベーション
洗浄措置後、組織マトリックスは室温で５ないし２４時間、体積濃度で１５％のマルトデキストリンを含む抗凍結剤溶液に移した。インキュベーションの間、ＡＴＭ及び溶液は攪拌された。
【００９６】
（ｖ）凍結乾燥
抗凍結剤のインキュベーション後、得られたＡＴＭは好適な大きさに切削され、凍結乾燥され、次いで多様な試験に用いられた。
【００９７】
エラスターゼ処理は実施される場合、洗浄ステップ（ｉｉｉ）の後に行われた。用いたエラスターゼは天然であり、ブタ膵臓から抽出された。エラスターゼはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から取得された。凍結乾燥したエラスターゼは２００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ８．８）（例えば、貯蔵液）で再構成した。ステップ（ｉｉ）からのＡＴＭ材料は最初に１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）ですすがれ、緩衝剤が排出された。すすぎ後、１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）は組織１グラムにつき約３ｍＬの量でプラスチックボトルに添加された。エラスターゼ貯蔵液は１ｍＬにつき約０．１ないし０．５ユニットの最終酵素濃度まで添加され、組織材料及びエラスターゼ溶液の混合物は周囲温度（例えば、約２０ないし２５℃）で一晩（約１８ないし２２時間）処理された。
【００９８】
［組織伸長性に対するエラスターゼ処理の効果］
組織サンプルの伸長性に対するエラスターゼ処理の効果が調査された。その調査に基づいて、組織サンプルの伸長性は、エラスターゼ処理への曝露の結果として減少する可能性があると結論づけた。更に、組織伸長性における変化は組織サンプルの群をエラスターゼ処理に曝露することによって低減できる。
【００９９】
［実施例１］
エラスターゼ処理されたｍＡＴＭの伸張性は処理されないＡＴＭの伸張性と比較された。この実施例においては、３０の組織サンプル対が取得された。各々の組織サンプル対は、同一ドナーロットからの、１の処理されない組織サンプルと１のエラスターゼ処理された組織サンプルとを含んだ。総ての組織サンプルは上述のＬｉｆｅＣｅｌｌ社の固有の方法によって処理され、それと共に、組織の一部は組織洗浄（ステップ（ｉｉｉ））の後にエラスターゼ処理に曝露された。エラスターゼ処理は：０．２５ユニット／ｍＬのエラスターゼ溶液中に組織サンプルを配置するステップと；室温で約２０ないし２４時間、組織サンプル及びエラスターゼ溶液の混合物をインキュベートするステップと；を具えた。エラスターゼ処理後、組織サンプルは組織洗浄溶液で洗浄された。
【０１００】
エラスターゼ処理された組織サンプルは、エラスターゼ処理に曝露されなかった組織サンプルのコントロール群と比較された。この実施例においては、伸張性は、約１センチメートル長の組織サンプルが約５ニュートン（５Ｎ）の張力を受けた場合に生じる伸張率（％）によって示される。図３は多数のエラスターゼ処理されたＡＴＭ（黒丸）及びエラスターゼ処理されないＡＴＭについてのこのようなデータを提供するグラフである。このグラフは横軸（ｘ軸）でドナー年齢（年単位）を示し、及び縦軸（ｙ軸）で力の印加の下での伸張率を示す。エラスターゼ処理されたｍＡＴＭ（黒丸）のデータ点に対して、同一ドナーロットでの対応する処理されないＡＴＭ（白丸）のデータ点がある。
【０１０１】
グラフにおけるデータは、エラスターゼ処理されたｍＡＴＭが対応するその各々の処理されないＡＴＭでなされるよりも小さな伸張率を生じたことを示す。例としては、ちょうど２０歳のドナー年齢に対応するデータ点の対は、処理されないＡＴＭが張力の印加の下で６０％を超えて伸張するが、対応するエラスターゼ処理されたｍＡＴＭは２０％未満しか伸張しないことを示している。これは伸張性における有意な減少を示す。
【０１０２】
更に、グラフにおけるデータは、処理されないＡＴＭ（白丸）の母集団にわたる伸張性における変化の度合が比較的大きいことを示す。実際に、処理されないＡＴＭの一部は２０％未満しか伸張しないが、別のものは６０％を超えて伸張する。一般的には、老齢のドナーからの処理されないＡＴＭは若齢のドナーからの処理されないＡＴＭよりも伸張性が低い傾向にあった。
【０１０３】
実に対照的に、エラスターゼ処理されたｍＡＴＭ（黒丸）の母集団にわたる伸張性における変化の度合は比較的小さい。実際に張力の印加の下で、多くのエラスターゼ処理されたｍＡＴＭは約１９％伸張し、総てのエラスターゼ処理されたｍＡＴＭは約１４％ないし約２４％伸張する。エラスターゼ処理されたｍＡＴＭの伸張性（約１４％ないし約２４％）における変化は例示したグラフで陰影化された帯域で示される。
【０１０４】
［エラスターゼの濃度は０．１ユニット／ｍｌ程度の低さで十分であった］
多様なエラスターゼの濃度の有効性が試験された。０．１ユニット／ミリリットル程度に低いエラスターゼの濃度は皮膚組織サンプルの伸張性に影響を与えるのに十分であると定量された。
【０１０５】
［実施例２］
組織サンプルは、上に記載されているＬｉｆｅＣｅｌｌ社の固有の方法を用いて処理された。組織洗浄（ステップｉｉｉ）後、エラスターゼ処理に曝露された。エラスターゼ処理の間、組織サンプルはそれぞれ、約０．１ユニット／ミリリットル又は約０．５ユニット／ミリリットルのエラスターゼの濃度を有するエラスターゼ溶液に曝露された。エラスターゼ溶液は、湿性の組織サンプル１グラムにつき約３ミリリットルの溶液で組織サンプルと混合された。エラスターゼの曝露は約１８時間続いた。エラスターゼの曝露後、組織サンプルはトリスＨＣｌ緩衝剤ですすがれ、凍結乾燥溶液にインキュベートされ、凍結乾燥された。
【０１０６】
図４Ａ及び４Ｂはそれぞれ、処理されない組織サンプル（図４Ａ）と、０．１ユニット／ミリリットルの濃度でエラスターゼ溶液で処理される組織サンプル（図４Ｂ）を示す。双方のサンプルはＶｅｒｈｏｅｆｆ染色されている。エラスターゼ処理された組織サンプルは処理されない組織サンプルと同一のドナーロット由来である。染色の陰影は組織サンプルの各々のエラスチン含有量を示す。図４Ａ及び４Ｂの目視による比較によって、図４Ｂにおけるエラスチンネットワークが少なくとも部分的に破壊されているように見えることが明確になる。従って、少なくとも０．１ユニット／ミリリット程度に低いエラスターゼの濃度は組織サンプルの伸張性に影響を与えるのに十分であると思われる。
【０１０７】
エラスターゼ処理はＡＣＭ中のペプチド結合を破壊して、破壊されたエラスチンネットワークを有するｍＡＴＭを生成すると考えられている。一般的には、十分な数のペプチド結合が破壊されて、ＡＴＭと比較してｍＡＴＭにおける伸張性の度合の低下を生じさせる。一般的には、破壊されるペプチド結合の数は、特異的な張力量の下でのｍＡＴＭの伸張率（又は、歪み）が同一張力量の下での対応するＡＴＭの伸張率（又は、歪み）の９５％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は２％未満）となる範囲で十分である。
【０１０８】
［組織はエラスターゼ処理で大きさが増加する傾向にある］
エラスターゼ処理が組織サンプルの大きさに対して有する効果が調査された。この調査に基づいて、組織サンプルの大きさは、エラスターゼ処理への曝露の結果として増加する可能性があることが定量された。
【０１０９】
［実施例３］
３３の組織サンプル対の寸法が定量された。各々の組織サンプル対は、同一ドナーロットからの、１の処理されない組織サンプルと１のエラスターゼ処理された組織サンプルとを含んだ。手短に言うと、３３のドナーロットからの処理されないＡＴＭの物理的な寸法が測定され、各々のサンプルの面積（すなわち、長さ×幅）が定量された。処理されないＡＴＭはエラスターゼ処理を受け、エラスターゼ処理されたｍＡＴＭを生じさせた。エラスターゼ処理されたｍＡＴＭの同一の物理的な寸法が測定され、各々のエラスターゼ処理されたｍＡＴＭの面積（すなわち、長さ×幅）が定量された。各々のＡＴＭ及びｍＡＴＭの対でそれぞれに計算された面積は、エラスターゼ処理への曝露の結果として、各々の組織がどの程度大きさが増加したかを定量するために比較された。
【０１１０】
図５のグラフはこの実験の結果を提供し、３３の組織サンプルの各々でエラスターゼ処理の結果として得た棒グラフを示す。グラフは任意のドナーロット番号を横軸（ｘ軸）に、組織の棒グラフ（面積の割合）を縦軸（ｙ軸）に示す。
【０１１１】
データは、組織サンプルの一部では大きさの増加が生じないか、あるいはわずかに生じるかであることを示す。例えば、ドナーロット番号１ないし４に対応するデータは、それらの組織サンプルでは大きさの増加が実質的に生じなかったことを示す。しかしながら、他の組織サンプルでは大きさの有意な増加が生じた。例えば、ドナーロット番号３３に対応するデータはその組織サンプルで１００％を超える大きさの増加が生じたことを示す。
【０１１２】
平均して、図５のグラフで表わされる組織サンプルで約３４．８％の大きさの増加が生じ、標準偏差は約＋／−２９．２％であった。
【０１１３】
［実施例４］
図６は、エラスターゼ処理されたｍＡＴＭ４０４に隣接する処理されないＡＴＭ４０２の平面図である。
【０１１４】
エラスターゼ処理に先立ち、組織サンプル４０２及び４０４は同一ドナーロット由来であった。同一動物の同一位置由来であり、互いに同様の物理的（すなわち、縦方向及び横方向の）寸法を有した。目視による観察及び定規の引用によって、エラスターゼ処理されたｍＡＴＭが処理されないＡＴＭよりも明確に大きくなることが明らかになる。実際に、処理されないＡＴＭ４０２は約３／８インチの長さを有するが、エラスターゼ処理されたｍＡＴＭ４０４は約５／８インチの長さを有する。更に、エラスターゼ処理されたｍＡＴＭ４０４は明らかに、処理されないＡＴＭ４０２よりも幅が広い。
【０１１５】
［実施例５］
表１は、エラスターゼ処理前及びエラスターゼ処理後の異なるドナーロット由来の３０の組織サンプル対の物理的寸法を示す。
【０１１６】
【表１】
0005675595.tif 000002
【０１１７】
物理的寸法は、エラスターゼ処理前及び後の組織サンプルについて、「Ｌｏｗｅｒ  Ｄ（ｃｍ）」と同定されるセンチメートル（ｃｍ）単位の小さい方の寸法と、「Ｈｉｇｈｅｒ  Ｄ（ｃｍ）」と同定されるセンチメートル（ｃｍ）単位の大きい方の寸法とを含む。
【０１１８】
データは、エラスターゼ処理によって、０％ないし５０％の範囲で小さい方の寸法又は大きい方の寸法が増加したことを示す。組織サンプルのほとんどについて、データは、測定した寸法のうちの少なくとも１つでエラスターゼ処理により大きさが増加したことを示す。小さい方の寸法の大きさの増加の平均値は１４．７％であり、標準偏差は１４．５％である。大きい方の寸法の大きさの増加の平均値は１７．３％であり、標準偏差は１３．０％である。
【０１１９】
［エラスチン含有量に対するエラスターゼ処理の効果］
組織におけるエラスチン含有量に対するエラスターゼ処理の効果が考察された。エラスチン含有量の分析は英国のＢｉｃｏｌｏｒ社から入手可能なＦＡＳＴＩＮ（登録商標）Ｅｌａｓｔｉｎ  Ａｓｓａｙを用いて行われ、合成ポルフィリン（スルホン酸形態の５，１０，１５，２０テトラフェニル−２１，２５ポルフィリン）を用いた特異的な染料結合と関連づけられる。
【０１２０】
［実施例６］
表２は、エラスターゼ処理前及びエラスターゼ処理後の３０の異なる対のドナーロットによる組織サンプル中のエラスチン含有量を示す。エラスチン含有量はＦＡＳＴＩＮ（登録商標）Ｅｌａｓｔｉｎ  Ａｓｓａｙを用いて測定された。エラスターゼ処理前は、エラスチン含有量は約１．６重量パーセントないし約５．１重量パーセントの範囲であった。エラスターゼ処理後は、エラスチン含有量は約１．４重量パーセントないし約６．１重量パーセントの範囲であった。
【０１２１】
【表２】
0005675595.tif 000003
【０１２２】
表２に示したデータは、エラスターゼ処理によって、エラスチン含有量がドナーロットの一部で増加し、他方では減少したことを示す。しかしながら、明確な増加は測定値の誤差／不確実性の範囲である。総ての材料の平均で見ると、エラスチン含有量は若干減少している。
【０１２３】
データによると、エラスターゼ処理前は、組織サンプル群におけるエラスチン含有量の平均値は２．７４％であり、標準偏差は＋／−０．７６％であった。エラスターゼ処理後は、組織サンプル群におけるエラスチン含有量の平均値は２．３８％であり、標準偏差は＋／−０．９２％であった。
【０１２４】
従って、エラスターゼ処理によって、統計上有意であるが、エラスチン含有量の小さな喪失が生じた。エラスターゼ処理後は、フラグメント化したエラスチンの形態でのエラスチンは組織サンプル中に存在したと考え得られる。
【０１２５】
［組織サンプルの引張り特性に対する効果］
組織サンプルの多様な引張り特性に対するエラスターゼ処理の効果が考察された。
【０１２６】
［実施例７］
本実施例においては、試験は３０の対となるドナーロット由来の組織サンプルで行われた。各々の組織サンプル対は、同一ドナーロットからの、１の処理されない組織サンプルと１のエラスターゼ処理された組織サンプルとを含んだ。言い換えると、各々のドナーロットについて、エラスターゼ処理された組織サンプルと、処理されないサンプルとがある。各々の組織サンプルは、最大負荷、引張り応力、歪みの割合、及びヤング率を定量するために試験を受ける。それらの試験結果は表３にまとめられる。
【０１２７】
【表３】
0005675595.tif 000004
【０１２８】
表３によると、最大負荷は１センチメートルあたりのニュートン（Ｎ／ｃｍ）単位で、組織サンプルが破壊までに耐久できる１センチメートルあたりの最大の力を反映する。表に示したように、エラスターゼ処理されていない組織サンプル（表では「通常のＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）」として同定される）が耐久しうる平均最大負荷は１７０ニュートン／センチメートルであり、標準偏差は１０９ニュートン／センチメートルであった。エラスターゼ処理された組織サンプル（表では「エラスターゼ処理されたＲＴＭ」として同定される）が耐久しうる平均最大負荷は１７６ニュートン／センチメートルであり、標準偏差は１１０ニュートン／センチメートルであった。収集された最大負荷データに対するｐ値は、変化により観察結果（又はより極端な結果）が生じうる可能性を一般的には示し、０．３３０であった。エラスターゼ処理が組織サンプルの最大負荷容量に不利に影響を与えうる尤度は小さいと思われる。
【０１２９】
引張り応力は、負荷の外部印加に平衡及び反応する単位面積あたりの力の内部分布の測定値を提供する。最大負荷での（又は引張り強さとして既知の）引張り応力は、組織が破壊前に耐久しうる最大引張り応力である。メガパスカル（ＭＰａ）単位の、エラスターゼ処理されていない組織サンプルの最大負荷での平均引張り応力は７．５であり、標準偏差は３．９であった。エラスターゼ処理された組織サンプルの最大負荷での平均引張り応力は７．９であり、標準偏差は４．４であった。収集された引張り応力データに対するｐ値は０．２２０であった。エラスターゼ処理が組織サンプルの引張り強さを有意に変えうる尤度は小さいと思われる
【０１３０】
歪み値は、負荷の外部印加の結果として組織サンプルに生じる変形の測定値を提供する。５ニュートン／センチメートルの力の下でのエラスターゼ処理されていない組織サンプルの歪みの割合（伸張率）の平均は３９％であり、標準偏差は１４％であった。同一負荷の下でのエラスターゼ処理された組織サンプルの歪みの割合（伸張率）の平均は１９％であり、標準偏差は５％であった。収集された歪みデータに対するｐ値は０．０００であった。上述を考慮すると、処理によって組織伸長性が低減し、組織の弾性及び剛性における整合性が増加する。
【０１３１】
ヤング率は、外力が印加される場合の伸長に対する組織サンプルの抵抗性を反映する。メガパスカル（ＭＰａ）単位での、エラスターゼ処理されていない組織サンプルに対する平均ヤング率は２４．７メガパスカルであり、標準偏差は１１．７メガパスカルであった。エラスターゼ処理された組織サンプルに対する平均ヤング率は３１．３メガパスカルであり、標準偏差は１７．３メガパスカルであった。収集されたヤング率データに対するｐ値は０．００４であった。上述を考慮すると、処理によって剛性が増加する。
【０１３２】
表３における最大負荷、引張り強さ、及びヤング率のデータは、それらの特性に対するエラスターゼ処理の効果が無視できることを示す。
【０１３３】
［実施例８］
２のドナーロット由来の組織サンプルは、上に記載されているＬｉｆｅＣｅｌｌ社の固有の方法によって処理された。組織洗浄（ステップ（ｉｉｉ））後、組織サンプルは複数の１センチメートル×７センチメートルの小片に切削された。これらの小片の一部はエラスターゼ処理に曝露された。
【０１３４】
２のドナーロット由来のエラスターゼ処理されていない組織サンプル、及びエラスターゼ処理された組織サンプルはその厚さ、最大負荷、引張り応力、弾性、歪みの割合、及びヤング率を定量するために試験を受けた。これらのパラメータの各々は、厚さ及び弾性を除いて上に詳述した。厚さは組織の物理的寸法であり、例示した表においてはミリメートル（ｍｍ）単位で測定される。弾性は一般的には、伸張又は圧縮した後に元の形状に戻る物体の性質であり、例示した表においては、ニュートン／センチメートル（Ｎ／ｃｍ）単位で測定される。
【０１３５】
前述の試験の結果は表４にまとめられる。その表におけるデータは、５ニュートン／センチメートルでの歪みを除外可能であれば、エラスターゼ処理は試験特性のいずれも有意に変えなかったことを示す。例えば、ドナーロット番号４０７６５における組織サンプルについては、エラスターゼ処理によって、０．３５％ないし０．２％の（５ニュートン／センチメートルでの）歪みの平均における変化が生じた（有意に減少）。ドナーロット番号２４７５０における組織サンプルについては、エラスターゼ処理によって、０．１９％ないし０．２２％の（５ニュートン／センチメートルでの）歪みの平均における変化が生じた（有意差はない）。
【０１３６】
【表４】
0005675595.tif 000005
【０１３７】
［組織サンプルの組織診断に対する効果］
組織サンプルの組織診断に対するエラスターゼ処理の効果は更に考察された。
【０１３８】
特に、多様な組織学的パラメータが１２の凍結乾燥された組織サンプル対で考察された。各々の組織サンプル対は、同一ドナーロットからの、１の処理されない組織サンプルと１のエラスターゼ処理された組織サンプルとを含んだ。
【０１３９】
［実施例１０］
表５は組織サンプルの組織診断試験の結果を示す。列中の各行は試験された１の組織サンプルに対応する。表の第１列は、任意の名称の対応する組織サンプルのドナーロット番号を同定する。表の第２列は対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたかどうかを示す。項目名「エラスターゼなし」は、対応する組織サンプルが処理されていなかったことを示す一方、項目名「エラスターゼ」は、対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたことを示す。第１の１２個の列におけるデータ及び第２の１２個の列におけるデータは、同一群のドナーロット由来の組織サンプルに対応する。
【０１４０】
表の第３、第４、第５、第６の列は、対応する組織サンプルにおける、孔の総数、コラーゲンの損傷、乳頭状と網状との間の遷移、及びコラーゲン分離を示す。
【０１４１】
組織サンプルにおける孔は、血管、脂肪細胞の空き部分、毛嚢の空き部分、及び凍結乾燥プロセスにおけるサンプル内部の気泡の膨張部を含む多様な構造を表わすことができる。組織学的に、その間を区別することは難しく、従って、サンプルの面積に対する、これらの構造によって占有される割合全体によって段階付けされる。点数化は以下の通り：
評点          評価
１ないし２    孔がサンプルの０％ないし１０％である
３ないし４    孔がサンプルの１１％ないし２５％である
５ないし６    孔がサンプルの２６％ないし４０％である
７ないし９    孔がサンプルの４１％ないし６０％である
１０          孔がサンプルの６０％を超える
【０１４２】
「コラーゲンの損傷（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄａｍａｇｅ）」とは、破壊されたコラーゲン線維、凝縮したコラーゲン線維、又は歪んだ線維の存在のことである。コラーゲンの損傷は総てのサンプルに対して視野での観察頻度として報告される。点数化は以下の通り：
評点          評価
１ないし２    損傷が試験された領域の０％ないし１０％にある
３ないし４    損傷が試験された領域の１１％ないし２５％にある
５ないし６    損傷が試験された領域の２６％ないし５０％にある
７ないし８    損傷が試験された領域の５１％ないし７５％にある
９ないし１０  損傷が試験された領域の７６％ないし１００％にある
【０１４３】
乳頭状ないし網状の遷移については、標準的なヒト真皮は、表在型基底膜領域と、厚く、明確に規定されるコラーゲン束を欠いた血管及び無定形構造の層とからなる乳頭層を含む。乳頭層のコラーゲン及びエラスチンの出現は微再網化のうちの１つである。網状層は、乳頭層と合併し、明確に規定されたコラーゲン束から構成される。組織の処理中に崩壊又は融解を生じさせてＡＴＭを生成した場合、乳頭層の凝縮があるであろう。皮膚が極端に瘢痕を残し、強皮症又は表皮剥離といった病理プロセスを受けた場合、乳頭層の喪失があるであろう。サンプルが乳頭層を欠いた場合、関連するロットは棄却された。点数化は以下の通り。
評点        評価  
０          標準的な二重層、明確に規定された血管網、明確な遷移
０ないし２  わずかにしか規定されない乳頭間隆起及び乳頭間突起の起伏
０ないし２  血管網を含む、表面の乳頭層における構造上の特徴の喪失
０ないし２  内側の乳頭層における構造上の特徴の喪失
０ないし２  乳頭層と網状層との間の遷移帯の損失
１０        無定形の凝縮層を有する乳頭層の不存在又は置換
【０１４４】
コラーゲン分離：ＡＴＭにおける通常のコラーゲンは線維構造の内部を有するべきであり、束同士の分離は１の線維から隣接する線維への段階的遷移を表すべきである。コラーゲン分離は、処理中に生じる認識すべき変化である。それが極端な場合、コラーゲン線維はその線維性の性質を失い、無定形になり、線維間の分離は急激な遷移となり、線維は多くの場合は角張ったものになる。動物及び臨床上の評価に基づく場合、機能上の重要性は現在のところこの出現を原因とできない。しかしながら、拒絶するためだけではないが、このことはマトリックスの一体性の評価の一部として含まれる。
評点        評価
１          人工的な分離なし、線維構造は明確
３          急激な分離、いくつかの線維性制限
５          角を形成する分離、無定型のコラーゲン出現
【０１４５】
前述のパラメータは、ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に基づいて定量された。表におけるデータは、エラスターゼ処理されていない組織サンプルと比較した場合、表示した組織学的パラメータにおいて顕著な差異を示さない。
【０１４６】
【表５】
0005675595.tif 000006
【０１４７】
［実施例１１］
図７は、実施例１０における（及び、表５に示した）ドナーロットのうちの２つからの組織サンプル対に対する、例示的なＶｅｒｈｏｅｆｆ染色を示す。上に示したように、各々の組織サンプル対は、１の処理されない組織サンプル（図７で「通常のＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）」として同定される）と、１のエラスターゼ処理された組織サンプル（図７で「エラスターゼ処理された」として同定される）とを含む。染色の暗い部分は組織のエラスチン構造を示す。各々の組織サンプル対については、エラスターゼ処理が組織サンプルの複合型エラスチン構造の実質的なフラグメント化又は破壊を生じないことをＶｅｒｈｏｅｆｆ染色は示唆する。
【０１４８】
［実施例１２］
図８は、実施例１０における（及び、表５に示した）ドナーロットのうちの２つからの組織サンプル対に対する、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色の例を示す。各々の組織サンプル対は、１の処理されない組織サンプル（図８で「通常のＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）」として同定される）と、１のエラスターゼ処理された組織サンプル（図８で「エラスターゼ処理された」として同定される）とを含む。
【０１４９】
各々の組織サンプル対について、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色は、対応するエラスターゼ処理されていない組織サンプルと比較した場合に、エラスターゼ処理された組織サンプルにおいて染色強度のわずかな低下を示す。この染色強度の低下は、恐らくは延ばされた時間による、処理水溶液におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の部分的な喪失を示唆する。
【０１５０】
［組織サンプルの熱安定性に対するエラスターゼ処理の効果］
［実施例１３］
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析は、１２の対となるドナーロットにおけるエラスターゼ処理後の組織サンプルの熱安定性の変化を調査するのに用いられた。表６は、多様なドナーロットからの組織サンプルに対する、摂氏（℃）単位で測定される変性開始温度（Ｏｎｓｅｔ  Ｔｍ）と、乾燥重量１ｇ当たりのジュール（Ｊ／ｇｄｗ）単位で表わされる変性エンタルピーとを示す。変性は、例えば熱の印加による組織構造の変化のことである。変性開始温度は変性が生じ始める温度である。変性エンタルピーは組織のコラーゲン及び他のタンパク質を変性するのに必要なエネルギーの測定値である。
【０１５１】
列における各々の行は試験された特定の組織サンプルに対応する。表の第１列は、対応する組織サンプルのドナーロット番号を同定する。表の第２列は対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたかどうかを示す。項目名「エラスターゼなし」は、対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されなかったことを示す。項目名「エラスターゼ」は、対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたことを示す。最初の１２のデータ列はエラスターゼ処理に曝露されなかった組織サンプルに対応する。最後の１２のデータ列はエラスターゼ処理に曝露された組織サンプルに対応する。第１の１２個の列におけるデータ及び第２の１２個の列におけるデータは、同一群のドナーロット由来の組織サンプルに対応する。
【０１５２】
表の第３及び第４の列は各々の対応する組織サンプルに対する、変性開始温度と変性エンタルピーとを示す。
【０１５３】
表におけるデータは、エラスターゼ処理された組織サンプルについてエラスターゼ処理されていない組織サンプルと比較した場合に、変性開始温度又は変性エンタルピーにおいて有意な差異を示さない。エラスターゼ処理されていない組織サンプルに対する平均変性開始温度は６０．９℃であり、標準偏差は約＋／−１．３℃であった。エラスターゼ処理された組織サンプルに対する平均変性開始温度は６０．８℃であり、標準偏差は約＋／−１．２℃であった。エラスターゼ処理されていない組織サンプルに対する変性エンタルピーの平均は２５．８Ｊ／ｇｄｗであり、標準偏差は＋／−２．７Ｊ／ｇｄｗであった。エラスターゼ処理された組織サンプルに対する変性エンタルピーの平均は２８．１であり、標準偏差は＋／−３．５であった。
【０１５４】
【表６】
0005675595.tif 000007
【０１５５】
図９は、エラスターゼ処理されていない組織サンプル（実線）及びエラスターゼ処理された組織サンプル（破線）の対となるサンプルに対する、ＤＳＣサーモグラムの例を示すグラフである。グラフは摂氏単位（℃）で温度を横軸（ｘ軸）に、１ｇ当たりのワット単位（Ｗ／ｇ）で熱流を縦軸（ｙ軸）に示した。
【０１５６】
例示されたグラフにおいては、各々の４のドナーロットからの組織サンプル対に対応するデータが示される。各々の組織サンプル対について、エラスターゼ処理は組織サンプルの熱応答に対し最小限の効果を及ぼすことを、データは示唆している。
【０１５７】
一般的には、ＤＳＣは組織マトリックスの熱化学特性を測定する。コラーゲンが特定の温度に加熱された場合、その熱不安定性の分子内架橋結合が破壊され、タンパク質は高度に組織化された結晶構造からゲル状の無秩序状態に遷移を起こす。それは変性と称される。ＤＳＣサーモグラムはマトリックスの構造及びその安定性についての情報を与える。例えば、組織が滅菌のためにガンマ線照射された場合、変性開始温度は組織のガンマ線による損傷のために低くなりうる。他方、架橋結合は一般的には変性開始温度を増加させる。
【０１５８】
［酵素分解への感受性に対するエラスターゼ処理の効果］
組織サンプルの酵素分解への感受性に対するエラスターゼ処理の効果が考察された。
【０１５９】
［実施例１４］
組織サンプルのコラゲナーゼ分解への感受性に対するエラスターゼ処理の効果が考察された。１５の異なるドナーロット由来の組織サンプル対が試験された。各々のサンプル対は、エラスターゼ処理を受けた１の組織サンプルと、エラスターゼ処理を受けていない１の組織サンプルとを含んだ。総ての組織サンプルはエラスターゼ処理後に抗凍結剤とともに凍結乾燥を受けた。試験は約６時間、組織サンプルをコラゲナーゼに曝露するステップを具えた。表７は試験の結果を含む。特に、表はコラゲナーゼ曝露後の残余する組織（「残余組織」）の割合（％）を示す。
【０１６０】
表７における各々の行は試験された組織サンプルのうちの特定の１つに対応する。例示された表の第１列は、対応する組織サンプルが由来するドナーロット番号を同定する。第２列は対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたかどうかを同定する。項目名「エラスターゼなし」は、対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されなかったことを示す。項目名「エラスターゼ」は、対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたことを示す。最初の１５のデータ列はエラスターゼ処理に曝露されなかった組織サンプルに対応する。最後の１５のデータ列はエラスターゼ処理に曝露された組織サンプルに対応する。第３列はコラゲナーゼに対する曝露後に残った組織の割合を示す。
【０１６１】
表における最初の１５のデータ列はそれぞれ、表における最後の１５のデータ列と同一群のドナーロット番号に対応する。
【０１６２】
エラスターゼ処理された組織サンプルが、エラスターゼ処理されていない組織サンプルよりもコラゲナーゼ分解に対する感受性がわずかに良かったことを、表におけるデータは示す。平均してエラスターゼ処理されていない組織サンプルのうちの約４０．５％がコラゲナーゼ分解後に残った一方、平均してエラスターゼ処理された組織サンプルのうちの約３４．２％がコラゲナーゼ分解後に残った。従って、エラスターゼ処理されたＡＴＭは、エラスターゼ処理されたＡＴＭよりもインビボでのコラーゲン分解に対する感受性がわずかに良いだけであると思われる。
【０１６３】
【表７】
0005675595.tif 000008
【０１６４】
［実施例１５］
組織サンプルのトリプシン分解への感受性に対するエラスターゼ処理の効果が更に考察された。更に、１５の異なるドナーロット由来の組織サンプル対が試験された。各々のサンプル対は、エラスターゼ処理を受けた１の組織サンプルと、エラスターゼ処理を受けていない１の組織サンプルとを含んだ。総ての組織サンプルは抗凍結剤とともに凍結乾燥を受けた。試験はある設定期間、組織サンプルをトリプシンに曝露するステップを具えた。表８は試験の結果を含む。特に、表はトリプシン曝露後の残余する組織（「残余組織」）の割合（％）を示す。
【０１６５】
例示した表における各々の行は試験された組織サンプルのうちの同定の１つに対応する。例示された表の第１列は、対応する組織サンプルが由来するドナーロット番号を同定する。第２列は対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたかどうかを同定する。項目名「エラスターゼなし」は、対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されなかったことを示す。項目名「エラスターゼ」は、対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたことを示す。第３列はトリプシンに対する曝露後に残った組織の割合を示す。
【０１６６】
表８における最初の１５のデータ列はそれぞれ、表における最後の１５のデータ列と同一群のドナーロット番号に対応する。最初の１５のデータ列はエラスターゼ処理に曝露されなかった組織サンプルに対応する。最後の１５のデータ列はエラスターゼ処理に曝露された組織サンプルに対応する。
【０１６７】
エラスターゼ処理が、組織サンプルのトリプシン分解への感受性に対して非常にわずかな効果しか有しないことを、表８におけるデータは示す。
【０１６８】
【表８】
0005675595.tif 000009
【０１６９】
［経時的なエラスターゼ処理に対する組織の反応］
別の実験は、経時的なエラスターゼ処理に対する組織サンプルの反応を考察するために行われた。
【０１７０】
［実施例１６］
この実験においては、２の組織のドナーロット由来の組織サンプルが組織洗浄（ステップ（ｉｉｉ））まで、上述のＬｉｆｅＣｅｌｌ社の固有の方法によって処理された。組織はその後多数の３センチメートル×７センチメートルの小片に切削された。それらの小片の一部はトリスＨＣｌ緩衝剤ですすがれ、エラスターゼで処理された。その後、組織サンプルの寸法の変化が３０時間の期間にわたって３時間おきに測定された。エラスターゼは全期間にわたって提供された。エラスターゼで処理されなかった対応する組織サンプルの寸法は更に測定された。これらの寸法は図１０Ａ及び１０Ｂにおいて「コントロール」測定値として同定された
【０１７１】
図１０Ａ及び１０Ｂにおけるグラフは、２のドナーロット由来の組織サンプルに対するこの試験結果を示す。グラフの横軸は時間に対応し、縦軸は組織サンプルの表面積に対応する。グラフは３０時間の期間にわたる、エラスターゼ処理された組織サンプルの面積（白丸（ｕｎｓｈａｄｅｄ  ｃｉｒｃｌｅ）で示された）と、エラスターゼ処理されていない組織サンプルの面積（黒丸（ｓｈａｄｅｄ  ｃｉｒｃｌｅ）で示された）とに対応するデータを含む。
【０１７２】
エラスターゼ処理されない組織サンプルが３０時間の期間にわたって面積の有意な変化を受けなかったことを、図１０Ａは示している。しかしながら、エラスターゼ処理された組織サンプルは、３０時間の期間にわたって表面積の増加を明らかに受けた。最も顕著な増加は約９時間ないし２１時間で生じた。その後、エラスターゼ処理された組織サンプルの大きさにわずかな変化しか生じなかった。
【０１７３】
エラスターゼ処理されない組織サンプルが３０時間の期間にわたって面積の有意な変化を受けなかったことを、図１０Ｂは更に示している。しかしながら、エラスターゼ処理された組織サンプルは、３０時間の期間にわたって表面積の増加を明らかに受けた。最も顕著な増加は約３時間ないし１５時間で生じた。その後、エラスターゼ処理された組織サンプルの大きさにわずかな変化しか生じなかった。図１０Ａ及び１０Ｂの双方において、組織サンプルは、約１８時間の増殖が非常にわずかであった。エラスターゼ処理後、組織サンプルは組織洗浄溶液ですすがれたが、後の寸法の変化は観察されなかった。
【０１７４】
多数の本開示の実施形態が記載されてきた。それにも拘わらず、多様な変更が本開示の精神及び範囲から離れることなくなされうることは理解されよう。
【０１７５】
例えば、多様な型の組織はエラスターゼで処理してもよい。エラスターゼ処理された組織の使用は、本明細書中に述べたものよりも膨張性であってもよい。エラスターゼは多様な他の物質と混合して、組織に適用される溶液を形成してもよい。組織は、エラスターゼ溶液に浸漬するか、溶液をその上に注ぐか、エラスターゼ溶液でコーティングするか、あるいはその他の方法を用いることによって処理してもよい。エラスターゼは組織の特定の領域に選択的に配置してもよい。移植片又は組織移植片は複数の組織の小片を用いて実施してもよく、そのうちの１以上はエラスターゼで処理され、そのうちの１以上は処理されずに維持される。タイミング、濃度、攪拌の度合、周囲温度及び圧力の条件は総て、相当に変えてもよい。
【０１７６】
従って、他の実施は以下の請求項の範囲内にある。
【図１】
0005675595.tif 000010
【図２】
0005675595.tif 000011
【図３】
0005675595.tif 000012
【図４Ａ】
0005675595.tif 000013
【図４Ｂ】
0005675595.tif 000014
【図５】
0005675595.tif 000015
【図６】
0005675595.tif 000016
【図７】
0005675595.tif 000017
【図８】
0005675595.tif 000018
【図９】
0005675595.tif 000019
【図１０】
0005675595.tif 000020