(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、
ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＴＧＧ）が欠損したミロシン細胞が、維管束周辺以外の植物体内にも存在しており、かつｖａｍ３遺伝子が欠損している又はｖａｍ３遺伝子に機能不全を引き起こす変異が導入されている多重変異体に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを有し、かつＣ末端に液胞移行シグナルを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、当該多重変異体内のミロシン細胞の液胞内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項２】
前記多重変異体が、アブラナ科植物の変異体であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項３】
前記多重変異体が、ａｔｖａｍ３−３変異体又はａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体から、ｔｇｇ１遺伝子及びｔｇｇ２遺伝子がさらに欠損された植物体であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項４】
前記標的タンパク質が、セルロースを糖に加水分解する糖化酵素であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項５】
ａｔｖａｍ３−３変異体又はａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体から、ｔｇｇ１遺伝子及びｔｇｇ２遺伝子がさらに欠損していることを特徴とするシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）多重変異体。
【請求項６】
ｖａｍ３遺伝子、ｔｇｇ１遺伝子、及びｔｇｇ２遺伝子が欠損していることを特徴とするアブラナ科植物の多重変異体。
【請求項７】
請求項６に記載のアブラナ科植物の多重変異体の後代個体又はクローン個体であることを特徴とする植物。
【請求項８】
タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、ミロシン細胞の液胞内にｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＴＧＧ）が欠損しており、かつｖａｍ３遺伝子が欠損している又はｖａｍ３遺伝子に機能不全を引き起こす変異が導入されている多重変異体に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを有し、かつＣ末端に液胞移行シグナルを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、当該多重変異体内のミロシン細胞の液胞内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項９】
前記多重変異体が、アブラナ科植物であることを特徴とする請求項８に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項１０】
前記多重変異体が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）であることを特徴とする請求項８に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を植物細胞内の特定の細胞内小器官に蓄積させる方法、及び、当該方法により作製された形質転換植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換技術の進歩により、培養細胞や植物個体中の細胞に、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入し、当該タンパク質を細胞内に発現させることができるようになった。一般的には、植物の核ゲノムに遺伝子を導入してタンパク質を発現させる際に、目的タンパク質をコードする遺伝子領域のみを細胞内に導入した場合には、発現したタンパク質は細胞質に蓄積する。また、目的タンパク質のＮ末端及びＣ末端に移行シグナルと呼ばれる数アミノ酸を付加したタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、発現させたタンパク質を、ＥＲ（小胞体）、液胞、葉緑体などの細胞内小器官と呼ばれる箇所あるいは細胞外領域（アポプラスト）に移行・蓄積させることができる（非特許文献１参照。）。その他、目的タンパク質をコードする遺伝子を、葉緑体のゲノムそのものに導入し、葉緑体内で遺伝子発現からタンパク質蓄積までを行う技術もある（非特許文献２参照。）。
【０００３】
中でも液胞は、植物細胞内で最大の容積をもつ細胞内小器官であり、外来タンパク質蓄積の場所として期待される。目的タンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に液胞移行シグナルと呼ばれるアミノ酸配列を付加することにより、目的タンパク質を液胞に局在させることが可能である。実際に、種子では液胞に、発芽時に必要なタンパク質が特異的に蓄積されており、タンパク質蓄積型液胞と呼ばれている。例えば、外来のセルロース分解酵素を種子の蓄積型液胞に蓄積させた形質転換植物が知られている（例えば、非特許文献３参照。）。しかし、種子は植物バイオマスに占める割合が低く、生産される総バイオマスあたりのタンパク質は少ないという問題がある。
【０００４】
植物体でタンパク質大量生産を行なうためには、植物バイオマスの大部分を占める栄養器官、特に収穫が容易な葉や茎などの地上部組織において、細胞内で大容量を占める液胞にタンパク質を蓄積させることが望まれる。しかしながら、葉や茎などの栄養器官の細胞内では、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）に富むタンパク質分解型液胞として存在している。このため、タンパク質の蓄積には適しておらず、仮に液胞移行シグナルを用いて外来タンパク質を葉や茎の液胞に局在させたとしても、当該外来タンパク質を高濃度で蓄積させることは非常に困難である（例えば、非特許文献４及び５参照。）。
【０００５】
一方で、植物に存在する特殊な形状をもつ異型細胞の１種であるミロシン細胞は、葉に存在し、液胞にタンパク質を大量に蓄積することが可能である。アブラナ科を含むフウチョウソウ目植物の葉などに存在するミロシン細胞は、植物体の病害虫からの防御に関連すると考えられている酵素タンパク質であるｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＴＧＧ）（別名：ｍｙｒｏｓｉｎａｓｅ）を特異的に液胞に蓄積することが知られている（例えば、非特許文献６参照。）。フウチョウソウ目アブラナ科に属するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の野生型植物ではミロシン細胞は維管束周辺の限られた領域にしか存在しないが、ミロシン細胞が増加し、これに伴って内在するミロシナーゼが増加するシロイヌナズナの変異体ｖａｍ３−４／ｓｓｍやシロイヌナズナの変異体ｖａｍ３−３も見つかっている（例えば、非特許文献７及び８参照。）ａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体は、ｖａｍ３遺伝子の第６イントロン中で３４ｂｐが欠損したことによりフレームシフトが生じた変異体であり、ａｔｖａｍ３−３変異体はｖａｍ３遺伝子が欠損した変異体である。また、ミロシン細胞中の液胞に内在するミロシナーゼが欠損しているシロイヌナズナ変異体ｔｇｇ１ｔｇｇ２も知られている（例えば、非特許文献９参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Twyman, et al., Trends Biotechnol. 2003, 21(12):570-578.
【非特許文献２】Verma, et al., Plant Physiol. 2007, 145(4):1129-1143.
【非特許文献３】Hood, et al., Plant Biotechnol J. 2007, 5(6):709-19.
【非特許文献４】Marty, Plant Cell. 1999, 11(4):587-600.
【非特許文献５】Dai, et al., Molecular Breeding, 2000, 6:277-285.
【非特許文献６】Rask, et al., Plant Mol Biol. 2000, 42(1):93-113.
【非特許文献７】Ohtomo, et al., Plant Cell Physiol. 2005, 46(8):1358-65.
【非特許文献８】Ueda, et al., Plant Cell Physiol. 2006, 47(1):164-75.
【非特許文献９】Barth, et al.,  Plant J. 2006, 46(4):549-62.
【非特許文献１０】Cornelissen , et al., Nucleic Acids Res. 1987, 15(17):6799-6811.
【非特許文献１１】Shimada, et al., Plant Cell Physiol. 1997, 38(12):1414-20.
【非特許文献１２】Chen, et al., Plant Mol Biol. 2006, 62(6):927-936.
【非特許文献１３】Kawazu et al., 1999,、Journal of bioscience and bioengineering, 88:421-425.
【非特許文献１４】Kimura et al., Applied microbiology and biotechnology, 2003, 62:374-379.
【非特許文献１５】Ziegler, et al., Mol Breed. 2000, 6:37-46.
【非特許文献１６】Tucker, et al., Nature Biotechnology, 1989, 7: 817 - 820.
【非特許文献１７】Kengen, et al.,  Eur J Biochem. 1993, 213:305-312.
【非特許文献１８】Nakagawa, et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2008, 72(2):624-9.
【非特許文献１９】Van Larebeke, et al., Nature. 1974, 252(5479):169-70.
【非特許文献２０】Bechtold, et al., Methods Mol Biol. 1998, 82:259-66.
【非特許文献２１】Ziegelhoffer, et al., Molecular Breeding 2000, 8:147-158.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ミロシン細胞は形成される組織が限定されており、タンパク質生産のための蓄積器官としては適しているとは言い難い。また、ミロシン細胞には酵素をはじめとする内在性のタンパク質が大量に蓄積しているため、これらに加えて外来の目的タンパク質を同時に大量蓄積させるのは困難であると考えられる。
【０００８】
本発明は、目的のタンパク質を、植物細胞や植物体に安定して蓄積させる方法、及び、タンパク質を蓄積させた形質転換植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＴＧＧ１やＴＧＧ２等の内在性タンパク質が欠損したミロシン細胞が、維管束周辺のみならずその他の部位にも多く存在する植物体に、細胞内膜系移行シグナルと液胞移行シグナルを付加したタンパク質を発現させることにより、当該タンパク質をミロシン細胞に内包された状態で植物体内に蓄積させられることを見出し、本発明を完成させた。  
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）  タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、
ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＴＧＧ）が欠損したミロシン細胞が、維管束周辺以外の植物体内にも存在しており、かつｖａｍ３遺伝子が欠損している又はｖａｍ３遺伝子に機能不全を引き起こす変異が導入されている多重変異体に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを有し、かつＣ末端に液胞移行シグナルを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、当該多重変異体内のミロシン細胞の液胞内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（２）  前記多重変異体が、アブラナ科植物の変異体であることを特徴とする前記（１）に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（３）  前記多重変異体が、ａｔｖａｍ３−３変異体又はａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体から、ｔｇｇ１遺伝子及びｔｇｇ２遺伝子がさらに欠損された植物体であることを特徴とする前記（１）に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（４）  前記標的タンパク質が、セルロースを糖に加水分解する糖化酵素であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（５）  ａｔｖａｍ３−３変異体又はａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体から、ｔｇｇ１遺伝子及びｔｇｇ２遺伝子がさらに欠損していることを特徴とするシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）多重変異体、
（６）  ｖａｍ３遺伝子、ｔｇｇ１遺伝子、及びｔｇｇ２遺伝子が欠損していることを特徴とするアブラナ科植物の多重変異体、
（７）  前記（６）に記載のアブラナ科植物の多重変異体の後代個体又はクローン個体であることを特徴とする植物、
（８）  タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、ミロシン細胞の液胞内にｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＴＧＧ）が欠損しており、かつｖａｍ３遺伝子が欠損している又はｖａｍ３遺伝子に機能不全を引き起こす変異が導入されている多重変異体に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを有し、かつＣ末端に液胞移行シグナルを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、当該多重変異体内のミロシン細胞の液胞内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（９）  前記多重変異体が、アブラナ科植物であることを特徴とする前記（８）に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（１０）  前記多重変異体が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）であることを特徴とする前記（８）に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、目的の外来タンパク質をより多くのミロシン細胞内に蓄積させることができる。
また、本発明の多重変異体は、外来タンパク質を葉や茎等の植物バイオマスに占める割合の高い部位の細胞中の液胞に、比較的安定して蓄積させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、作製された各発現カセットを模式的に示した図である。
【図２】実施例１において、抗ＨＡタグ抗体を用いたイムノブロット解析の結果のうち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の抗ＨＡタグ抗体によるウェスタンブロットの染色像を示した図である。
【図３】実施例１において、抗ＨＡタグ抗体を用いたイムノブロット解析の結果のうち、図２の染色像を画像解析することによって得られた、ＨＡタグ融合タンパク質のタンパク質試料中の存在量を示した図である。
【図４】実施例１において、非形質転換体と形質転換体（液胞蓄積型）の酵素活性の測定結果を示した図である。
【図５】実施例２において、各形質転換体の抗ＨＡタグ抗体を用いたウェスタンブロットの染色像を示した図である。
【図６】実施例２において、抗ＨＡタグ抗体を用いたイムノブロット解析の結果のうち、図５の染色像を画像解析することによって得られた、ＨＡタグ融合タンパク質のタンパク質試料中の存在量を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法は、タンパク質発現・蓄積のための標的遺伝子を導入する植物体として、ミロシン細胞数が増加しており、かつ液胞内在性タンパク質が欠損した多重変異体を用いたことを特徴とする。当該多重変異体では、ミロシン細胞の液胞内在性タンパク質が欠損しているため、ミロシン細胞内に外来タンパク質を蓄積させることができる。また、当該多重変異体は、ミロシン細胞が維管束周辺のみならず、葉や茎の広い部位において存在しており、ミロシン細胞の細胞数が顕著に増大している。このため、当該多重変異体のミロシン細胞を蓄積部位にすることにより、従来よりも多くの標的タンパク質を蓄積することができる。さらに、目的の標的タンパク質をミロシン細胞内に蓄積させるため、過剰発現による植物細胞や植物個体に対する影響を充分に低減させつつ、目的の標的タンパク質を植物細胞内に蓄積させることができる。つまり、本発明において用いられる多重変異体は、本来はタンパク質蓄積が困難な葉や茎などのミロシン細胞を、タンパク質蓄積器官として形成させたものである。
【００１４】
すなわち、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法は、タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、液胞内在性タンパク質が欠損したミロシン細胞が、維管束周辺以外の植物体内にも存在している多重変異体（以下、本発明の多重変異体）に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを有し、かつＣ末端に液胞移行シグナルを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、当該多重変異体内のミロシン細胞の液胞内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする。
【００１５】
なお、本発明及び本願明細書において、遺伝子とは、タンパク質をコードする塩基配列を含み、細胞に導入されることにより、コードされたタンパク質が、細胞が備える転写・翻訳機構によって合成される核酸を意味する。遺伝子は、生物が有する天然の遺伝子のみならず、遺伝子組換技術を用いて人工的に設計・合成された遺伝子も含まれる。
【００１６】
本発明の多重変異体は、ミロシン細胞を元々有している植物であれば特に限定されるものではない。本発明においては、アブラナ科植物であることが好ましい。アブラナ科植物としては、例えば、キャベツ、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、カリフラワー、シロイヌナズナ、クレソン、ワサビ、アブラナ等が挙げられる。
【００１７】
本発明の多重変異体のミロシン細胞は、少なくとも１種類の液胞内在性タンパク質が欠損している。１種類の液胞内在性タンパク質が欠損していてもよく、２種類以上の液胞内在性タンパク質が欠損していてもよい。さらに、多重変異体中の少なくとも１の細胞において液胞内在性タンパク質が欠損していればよく、多重変異体の植物個体を構成する全細胞で欠損している必要はない。また、欠損している液胞内在性タンパク質は、野生型の植物体のミロシン細胞内の液胞中に存在しているものであれば、特に限定されるものではないが、ミロシン細胞の液胞に内在するタンパク質の組成以外は、植物体全体に対する変異の影響を抑制することができるため、ミロシン細胞特異的なタンパク質であることが好ましい。
【００１８】
本発明の多重変異体において欠損している液胞内在性タンパク質は、酵素であることが好ましく、ＴＧＧ（ＥＣ３．２．１．１４７）であることがより好ましい。ミロシン細胞の液胞に含まれる酵素の含有量を低減させることにより、内在性タンパク質に影響されることなく、発現させた標的タンパク質をより安定的に蓄積させることが可能になる。
【００１９】
例えば、本発明の多重変異体がシロイヌナズナの場合、ＴＧＧ１（Ａｔ５ｇ２６０００）及びＴＧＧ２（Ａｔ５ｇ２５９８０）の少なくとも一方が欠損していることが好ましく、両タンパク質が欠損していることがより好ましい。ＴＧＧ１及びＴＧＧ２は、葉や茎の地上部の組織のミロシン細胞の液胞内に存在しているＴＧＧであり、これらが欠損していることにより、葉や茎のミロシン細胞の液胞内に標的タンパク質を蓄積させることができる。その他、シロイヌナズナにおいて、根のミロシン細胞の液胞内に標的タンパク質を蓄積させる場合には、ＴＧＧ４（Ａｔ１ｇ４７６００）及びＴＧＧ５（Ａｔ１ｇ５１４７０）の少なくとも一方が欠損していることが好ましく、両タンパク質が欠損していることがより好ましい。
【００２０】
本発明の多重変異体のミロシン細胞は、維管束周辺に加えてその他の部位にも存在している。このため、本発明の多重変異体のミロシン細胞は、野生株よりも植物体当たりのミロシン細胞数が増大している。例えば、ｖａｍ３遺伝子等のミロシン細胞の分化に影響を与える遺伝子を欠損させたり、機能不全を引き起こす変異を導入することにより、ミロシン細胞数を増大させることができる。
【００２１】
本発明の多重変異体がシロイヌナズナの場合、ｖａｍ３遺伝子の機能不全を引き起こす変異としては、非特許文献７及び８に記載されているａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体のｖａｍ３遺伝子のように、ＳＮＡＲＥモチーフと膜貫通ドメインとの間に１９アミノ酸が欠損する変異等が挙げられる。
【００２２】
本発明の多重変異体は、例えば、野生体のｖａｍ３遺伝子とｔｇｇ遺伝子とを欠損させたり、ｖａｍ３遺伝子に機能不全を引き起こす変異を導入し、かつｔｇｇ遺伝子を欠損させることにより、得ることができる。なお、遺伝子の欠損や変異の導入は、当該技術分野で公知の遺伝子改変技術により実施することができる。
【００２３】
ミロシン細胞が維管束周辺以外の植物体内にも存在している変異体から、ミロシン細胞の液胞内に存在する液胞内在性タンパク質をコードする遺伝子を欠損させることにより、本発明の多重変異体を作製することができる。また、ＴＧＧ等の液胞内在性タンパク質が欠損した変異体に対して、ｖａｍ３遺伝子を欠損させたり、当該遺伝子に機能不全を引き起こす変異を導入することによっても本発明の多重変異体を作製することができる。その他、ミロシン細胞が維管束周辺以外の植物体内にも存在している変異体と、ミロシン細胞の液胞内に存在する液胞内在性タンパク質が欠損した変異体とを交配し、得られた雑種第１世代の個体を自家交配さることによっても作製することができる。
【００２４】
本発明の多重変異体がシロイヌナズナの場合には、非特許文献７及び８に記載のａｔｖａｍ３−３変異体又はａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体から、ｔｇｇ１遺伝子やｔｇｇ２遺伝子を欠損させることにより作製することができる。また、非特許文献９に記載のａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体からｖａｍ３遺伝子を欠損させることにより作製することができる。その他、ａｔｖａｍ３−３変異体又はａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体と、ａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体とを交雑させ、得られた雑種第１世代を自家交配させて得られた雑種第２代の植物個体から、ミロシン細胞が維管束周辺のみならず、葉や茎の広い部位において存在しており、かつＴＧＧ１とＴＧＧ２が欠損している多重変異体を作製することができる。
【００２５】
その他、非特許文献９に記載のａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体のように、液胞内在性タンパク質は欠損しているが、ミロシン細胞の局在や数は野生株と同様である変異体に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを有し、かつＣ末端に液胞移行シグナルを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、ミロシン細胞に標的タンパク質を蓄積させることができる。
【００２６】
本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法は、本発明の多重変異体に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを有し、かつＣ末端に液胞移行シグナルを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させる。Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルがあることにより、リボソームで合成された標的タンパク質は、ＥＲ内部へ移行する。また、Ｃ末端に液胞移行シグナルがあることにより、当該標的タンパク質をＥＲからミロシン細胞へ移行させることができる。
【００２７】
本発明において、標的タンパク質が備える細胞内膜系移行シグナルとしては、ＥＲをはじめとする細胞内膜への移行能（以下、ＥＲ移行能）を有するアミノ酸配列であれば、特に限定されるものではなく、分泌タンパク質のＮ末端に存在するシグナルの中から適宜選択して用いることができる。また、公知の細胞内膜系移行シグナルに対して、ＥＲ移行能を損なうことなく、１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加したペプチドであってもよい。細胞内膜系移行シグナルとしては、具体的には、タバコモザイクウイルスのＰｒ１ａタンパク質が有する細胞内膜系移行シグナル（非特許文献１０参照。）等が挙げられる。
【００２８】
本発明において、標的タンパク質が備える液胞移行シグナルとしては、液胞移行能を有するアミノ酸配列であれば、特に限定されるものではなく、液胞に移行するタンパク質のＣ末端に存在するシグナルの中から適宜選択して用いることができる。液胞移行シグナルとしては、具体的には、カボチャ２ＳアルブミンＣ末端液胞移行シグナル（２ＳＣ）（例えば、非特許文献１１参照。）等が挙げられる。
【００２９】
液胞内部に蓄積されるタンパク質の中には、Ｎ末端の細胞内膜系移行シグナルの少なくとも一部が切断されるものがある。本発明においても、標的タンパク質が備える細胞内膜系移行シグナルの種類によっては、標的タンパク質ではなく、標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が、ミロシン細胞内部に蓄積される。なお、Ｎ末端の切断部位は、標的タンパク質の種類、特に、細胞内膜系移行シグナルに連結させたポリペプチドのアミノ酸配列等により異なる。多くの場合では、細胞内膜系移行シグナルのみが切断により欠損されるが、細胞内膜系移行シグナルを含むより広いＮ末端領域が欠損する場合や、細胞内膜系移行シグナルの一部のみが欠損する場合もある。
【００３０】
本発明の多重変異体の細胞内に蓄積させる目的のタンパク質が、細胞内膜系移行シグナルや液胞移行シグナルを元々備えている場合には、当該タンパク質を標的タンパク質とし、当該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、当該タンパク質又は当該タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質をミロシン細胞内に蓄積させることができる。一方で、細胞内に蓄積させたい目的のタンパク質が、細胞内膜系移行シグナルや液胞移行シグナルを備えていない場合には、当該タンパク質のＮ末端に細胞内膜系移行シグナルを、Ｃ末端に液胞移行シグナルをそれぞれ付加したタンパク質を標的タンパク質とすることにより、当該標的タンパク質又は当該タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質をミロシン細胞内に蓄積させることができる。
【００３１】
本発明においては、標的タンパク質として、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを元々備えるタンパク質のＣ末端に、細胞内に蓄積させたい目的のタンパク質に液胞移行シグナルを付加させたタンパク質を、直接又は適当なスペーサーを介して融合させたキメラタンパク質であってもよい。
【００３２】
本発明の多重変異体に、標的タンパク質を発現・蓄積させる方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知のいずれの方法で行ってもよい。例えば、形質転換植物細胞や形質転換植物を作製する場合に通常用いられている方法により、標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターを本発明の多重変異体の細胞へ導入することにより、ミロシン細胞の液胞内に当該標的タンパク質が蓄積された植物体（以下、本発明の形質転換体、ということがある。）を作製することができる。
【００３３】
標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターは、これらのタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを、周知の遺伝子組換技術を用いて発現ベクターに組み込むことにより作製することができる。市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００３４】
発現ベクターとしては、植物細胞において転写が可能なプロモーター配列と、ポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を有する発現ベクターであって、植物細胞に導入した場合に、組み込まれたポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されるものではなく、形質転換植物細胞や形質転換植物の作製のために通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。なお、標的タンパク質をコードする塩基配列をその他のタンパク質をコードする塩基配列と共に一の発現ベクターに組み込む場合には、両タンパク質が独立して細胞内に発現されるように、プロモーター配列を有するＤＮＡ、標的タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現用カセットと、プロモーター配列を有するＤＮＡ、その他のタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現用カセットとを備えていることが必要である。
【００３５】
発現ベクターとしては、例えば、ＭｕｌｔｉＲｏｕｎｄ  Ｇａｔｅｗａｙ（非特許文献１２参照。）エントリーベクターや、ｐＩＧ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等のバイナリーベクター等がある。使用可能なプロモーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーター、トウモロコシｕｂｉ１のプロモーター等がある。また、使用可能なターミネーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター等がある。その他、組織や器官に特異的なプロモーターを用いてもよい。例えば、葉特異的な発現プロモーターとして、イネｒｂｃＳのプロモーター等が挙げられる。このような組織又は器官特異的プロモーターを用いることにより、植物全体ではなく、特定の組織や器官にのみ標的タンパク質を発現させることができる。
【００３６】
当該発現ベクターは、標的タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組み込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００３７】
発現ベクターを本発明の多重変異体の細胞へ導入する方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、アグロバクテリウム法で行うことが好ましい。なお、発現ベクターが導入された形質転換細胞や形質転換体は、薬剤耐性等を指標として選抜することができる。
【００３８】
また、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。すなわち、標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させる植物細胞は、本発明の多重変異体の植物個体中の細胞であってもよく、当該植物個体から採取された細胞であってもよく、採取後さらに脱分化処理等の処理が施された細胞であってもよく、当該植物個体から樹立された培養細胞であってもよい。
【００３９】
本発明の多重変異体を脱分化処理することにより得られたカルスに標的タンパク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換細胞から、周知の植物組織培養法等を用いることにより、葉や茎のミロシン細胞の内部に標的タンパク質又は標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積された植物個体（形質転換体）を得ることができる。該植物組織培養法としては、例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
【００４０】
本発明の多重変異体に標的タンパク質を蓄積させた本発明の形質転換体は、形質転換前の本発明の多重変異体と同様に栽培したり、挿し木をしたり、交配等により後代個体を得ることができる。また、公知のクローニング技術によりクローン個体を得ることもできる。
【００４１】
本発明の形質転換体からは、ミロシン細胞の液胞内に蓄積されている標的タンパク質又は標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を回収することができる。本発明の形質転換体から標的タンパク質等を回収する方法としては、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織から組換えタンパク質を抽出・精製する場合に通常用いられている方法の中から適宜選択して行うことができる。当該方法として、例えば、Kawazuらの方法（非特許文献１３参照。）や、Kimuraらの方法（非特許文献１４参照。）等がある。
【００４２】
また、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法における標的タンパク質として、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来エンドグルカナーゼＥ１遺伝子の触媒領域（Ｅ１−ｃａｔ）（非特許文献１５及び１６参照。）やＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来β−グルコシダーゼＣｅｌＢ遺伝子（非特許文献１７参照。）等の超耐熱性グルカナーゼのような、植物細胞壁由来のセルロースを糖に加水分解する糖化酵素を用いることにより、バイオエタノール生産に好適なバイオマス原料となる形質転換植物を作製することができる。得られた形質転換植物では、糖化酵素はミロシン細胞の液胞内に蓄積されているため、形質転換の際に宿主となった植物と同様に栽培することができる。その上、当該形質転換植物をバイオマス原料とする場合には、バイオエタノール生産のための前処理に供することにより、ミロシン細胞の液胞から蓄積されている糖化酵素が放出される結果、当該形質転換植物中のセルロースが分解されやすくなる。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１］
ｖａｍ３遺伝子、ｔｇｇ１遺伝子、及びｔｇｇ２遺伝子が欠損しているシロイヌナズナ変異体の葉や茎のミロシン細胞の液胞に、超耐熱性グルカナーゼを蓄積させた。
【００４５】
＜遺伝子発現ベクターの作製＞
糖化酵素であるＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来エンドグルカナーゼＥ１遺伝子の触媒ドメインを含む領域（Ｅ１−ｃａｔ）（非特許文献１５及び１６参照。）のうちの、コード領域の５’末端にはタバコモザイクウイルスＰｒ１ａタンパク質シグナル（非特許文献１０参照。）を付加し、当該コード領域の３’末端にはＨＡタグ及びポリヒスチジンタグを連結したタグ配列（ｔａｇ）を付加したＤＮＡ断片を合成した。当該ＤＮＡ断片に、ミロシン細胞特異的プロモーター（ＴＧＧ１ｐｒｏ）を、バイナリーベクターＲ４ｐＧＷＢ４０１又はＲ４ｐＧＷＢ５０１（非特許文献１８参照。）上のアグロバクテリムｎｏｓターミネーター（ＮＯＳｔ）とリガーゼ反応により連結し、アポプラスト蓄積型Ｅ１発現カセット（ＳＰ−Ｅ１）を作製した。
同様に、アポプラスト蓄積型Ｅ１発現カセット（ＳＰ−Ｅ１）のタグ配列とターミネーター配列の間に、カボチャ２ＳアルブミンＣ末端液胞移行シグナル（２ＳＣ）（非特許文献１１参照。）を挿入した液胞蓄積型Ｅ１発現カセット（ＳＰ−Ｅ１−２ＳＣ）を作製した。
【００４６】
図１に、作製された各発現カセットを模式的に示す。
これらの発現カセットを有するバイナリーベクターを、アグロバクテリウムＧＶ３１０１株（非特許文献１９参照。）に導入した。
【００４７】
＜シロイヌナズナ変異体の作製＞
ミロシン細胞数が増加したａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体（非特許文献７及び８参照。）と、ＴＧＧ１及びＴＧＧ２が欠損したａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体とを交雑し、ミロシン細胞数が増加しており、かつ当該ミロシン細胞内の液胞にＴＧＧ１及びＴＧＧ２が欠損している多重変異体（ｖａｍ３−４／ｓｓｍ×ｔｇｇ１ｔｇｇ２）を得た。
【００４８】
＜シロイヌナズナ形質転換体の作製＞
ａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ×ｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体を育成し、前述のバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムを用いてｉｎ  ｐｌａｎｔａ法（非特許文献２０参照。）により形質転換した。
【００４９】
＜イムノブロット解析＞
育成した形質転換体の葉をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中で破砕し、タンパク質試料とした。当該タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により分画した後に、ＰＶＤＦ膜に転写した。一次抗体としてＨＡタグに対するモノクローナル抗体（ＣＯＶＡＮＣＥ社製）、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用い、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア社製）によりイムノブロット解析を行った。
【００５０】
抗ＨＡタグ抗体を用いたイムノブロット解析の結果を図２及び３に示す。図２には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の抗ＨＡタグ抗体によるウェスタンブロットの染色像を示す。また、図３には、図２の染色像を画像解析することによって得られた、ＨＡタグ融合タンパク質のタンパク質試料中の存在量〔シグナル強度（ＡＵ）〕を示す。
【００５１】
この結果、アポプラスト蓄積型Ｅ１発現カセット（ＳＰ−Ｅ１）を有するバイナリーベクターを導入して得られた形質転換体（アポプラスト蓄積型）と、液胞蓄積型Ｅ１発現カセット（ＳＰ−Ｅ１−２ＳＣ）を有するバイナリーベクターを導入して得られた形質転換体（液胞蓄積型）の両方において、ＨＡタグ融合タンパク質（図２中、矢頭で示したバンド）の発現が確認された。すなわち、これまで蓄積が困難であるとされてきた栄養器官の液胞にエンドグルカナーゼＥ１タンパク質を蓄積させることができた。また、葉中におけるＨＡタグ融合タンパク質の蓄積量は、形質転換体（液胞蓄積型）のほうが形質転換体（アポプラスト蓄積型）よりも明らかに多かった。これにより、ａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ×ｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体は、ミロシン細胞内に外来タンパク質を大量に蓄積可能であることが明らかである。なお、形質転換体（アポプラスト蓄積型）と形質転換体（液胞蓄積型）で目的のＨＡタグ融合タンパク質の大きさが異なるのは、カボチャ２ＳアルブミンＣ末端液胞移行シグナル（２ＳＣ）の有無によるものである。
【００５２】
＜酵素活性測定＞
Ziegelhofferらの方法（非特許文献２１参照。）に基づき、ａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体（非形質転換体）及び形質転換体の実生から抽出した全可溶性タンパク質を用いて、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ  β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅ（ＭＵＣ）を基質として酵素活性（ｎｍｏｌ ４−ＭＵ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）を測定した。さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ産生Ｅ１の酵素活性（４０ｎｍｏｌ ４−ＭＵ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）を１００％とし、これと算出された各形質転換体の比活性を比較することによって、全可溶性タンパク質に占めるエンドグルカナーゼＥ１タンパク質の割合（蓄積濃度）を算出した。
【００５３】
エンドグルカナーゼＥ１タンパク質の酵素活性の測定結果及び蓄積濃度の算出結果を図４に示す。非形質転換体からは活性はほとんど認められず、エンドグルカナーゼＥ１タンパク質は蓄積されていなかった。これに対して、エンドグルカナーゼＥ１遺伝子の触媒ドメインを含む領域（Ｅ１−ｃａｔ）を導入した形質転換体では、エンドグルカナーゼ活性が認められ、エンドグルカナーゼＥ１タンパク質が植物体中に蓄積されていることがわかった。特に、測定した４系統の形質転換体のうちの一系統では、比活性が約０．１５ｎｍｏｌ ４−ＭＵ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎであり、全可溶性タンパク質に占めるエンドグルカナーゼＥ１タンパク質の割合は約０．３７５％と算出された。以上より、ミロシン細胞中の液胞に蓄積されたＥ１タンパク質は、エンドグルカナーゼ活性を保持していることが示された。
【００５４】
［実施例２］
野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）、ミロシン細胞数が増大しているａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体、ＴＧＧ１及びＴＧＧ２が欠損しているａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体、及び実施例１で作製したａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ×ｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体に、エンドグルカナーゼＥ１を導入し、発現及び細胞内への蓄積量を調べた。
なお、液胞蓄積型Ｅ１発現カセット（ＳＰ−Ｅ１−２ＳＣ）を有するバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムは、実施例１と同じものを用いた。
【００５５】
具体的には、各植物個体を育成した後、実施例１で用いた液胞蓄積型Ｅ１発現カセット（ＳＰ−Ｅ１−２ＳＣ）を有するバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムを用いて、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ法（非特許文献２０参照。）により形質転換した。系統ごとに６植物個体を選抜し、イムノブロット解析へ進んだ。
実施例１と同様にして、育成した形質転換体の葉からタンパク質試料を調製し、当該タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により分画した後に、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＨＡタグ抗体を用いてイムノブロット解析を行った。
【００５６】
各形質転換体のイムノブロット解析の結果を図５及び６に示す。図５には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の抗ＨＡタグ抗体によるウェスタンブロットの染色像を示す。また、図６には、図５の染色像を画像解析することによって得られた、ＨＡタグ融合タンパク質のタンパク質試料中の存在量を示す。
【００５７】
この結果、ミロシン細胞が野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）を宿主とした場合では、ＨＡタグ融合タンパク質（液胞蓄積型Ｅ１タンパク質に相当）のバンドは薄く、当該タンパク質の蓄積は僅かであった。ミロシン細胞数が増加したａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体を宿主とした場合では、一個体を除き、野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）と同様にＨＡタグ融合タンパク質は蓄積されていなかった。これに対して、ａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体及びａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ×ｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体を宿主とした場合では、６個体中５個体において、ＨＡタグ融合タンパク質のバンドがはっきりと検出された。図６に示すように、各系統のＨＡタグ融合タンパク質の存在量の平均を比較すると、ややばらつきは大きいものの、野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）やａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ変異体を宿主とした場合よりも、ａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体を宿主とした場合のほうがＨＡタグ融合タンパク質の存在量が多く、ａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体を宿主とした場合よりもａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ×ｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体を宿主とした場合のほうが、形質転換体中により大量のＥ１タンパクが蓄積されていた。すなわち、これらの結果から、外来タンパク質をミロシン細胞の液胞中に高濃度に蓄積させるためには、ＴＧＧ１やＴＧＧ２等の液胞内在性タンパク質を欠損させる必要があることが分かった。また、ミロシン細胞数が増大しているａｔｖａｍ３−４／ｓｓｍ×ｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体は、ミロシン細胞が維管束周辺に限定されているａｔｔｇｇ１ｔｇｇ２変異体よりも、大量の外来タンパク質を蓄積可能であることが確認された。
【００５８】
以上の結果から、液胞内在性タンパク質が欠損したミロシン細胞が、維管束周辺以外の植物体内にも存在している多重変異体に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルを有し、かつＣ末端に液胞移行シグナルを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、当該標的タンパク質を高濃度に蓄積させられることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、過剰発現による植物細胞や植物個体に対する影響を充分に低減させつつ、目的のタンパク質をミロシン細胞の液胞内に蓄積させることができるため、当該方法は、例えばタンパク質の大量生産や植物の形質改変等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図２】
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【図５】
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