(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアルファ９サブユニット、ヒトベータ１サブユニットおよびヒトベータ２サブユニットを含むＮａＶを発現するように改変された細胞又は細胞株。
【請求項２】
前記ＮａＶのサブユニットの発現レベルが、継続した細胞培養の少なくとも１５日、３０日、４５日、６０日、７５日、１００日、１２０日、又は１５０日の間、１０％を超えて変化しない、請求項１に記載の細胞又は細胞株。
【請求項３】
細胞を用いたアッセイにおいて、ＮａＶの調節因子に応答して少なくとも０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、又は０．８５のＺ’ファクターを生じる、請求項２に記載の細胞又は細胞株。
【請求項４】
前記細胞又は細胞株が選択圧のない条件で生育する、又は維持される、請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞又は細胞株。
【請求項５】
少なくとも１種の前記サブユニットが、前記サブユニットをコードする導入された核酸から発現する、請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞又は細胞株。
【請求項６】
少なくとも１種の前記サブユニットが、遺伝子活性化によって活性化された内生の遺伝子から発現する、請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞又は細胞株。
【請求項７】
前記細胞又は細胞株が、改変に先立って内生ＮａＶを発現しない、請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞又は細胞株。
【請求項８】
前記ＮａＶがいずれのポリペプチドタグをも含まない、請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞又は細胞株。
【請求項９】
前記ＮａＶが４つのサブユニットを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の細胞又は細胞株。
【請求項１０】
前記細胞又は細胞株が異なる形状のＮａＶを発現するコレクション中に含まれる、請求項１に記載の細胞又は細胞株のコレクション。
【請求項１１】
前記細胞又は細胞株を、並行処理を可能にする同じ生理学的特性を有するように同調させた、請求項１０に記載のコレクション。
【請求項１２】
前記細胞又は細胞株が全て同じ細胞型である、請求項１０に記載のコレクション。
【請求項１３】
前記生理学的特性が成長速度である、請求項１０に記載のコレクション。
【請求項１４】
前記生理学的特性が組織培養表面への付着である、請求項１０に記載のコレクション。
【請求項１５】
前記生理学的特性がＺ’ファクターである、請求項１０に記載のコレクション。
【請求項１６】
前記生理学的特性がＮａＶの発現レベルである、請求項１０に記載のコレクション。
【請求項１７】
ＮａＶ調節因子を同定する方法であって、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞又は細胞株、又は請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のコレクションに試験化合物を接触させる工程；及び
試験化合物に接触していない細胞と比較して、細胞におけるＮａＶ機能の変化を検出する工程を含み、ここで前記機能の変化は該試験化合物がＮａＶ調節因子であることを示す、方法。
【請求項１８】
前記試験化合物が小分子、ポリペプチド、ペプチド、又は抗体若しくはその抗原結合部位である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験化合物が化合物のライブラリーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ライブラリーが小分子ライブラリー、組み合わせライブラリー、ペプチドライブラリー又は抗体ライブラリーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出工程が、膜電位アッセイ、電気生理学的アッセイ、及び結合アッセイから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程がハイスループット法で実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２に記載の細胞又は細胞株であって、
ａ）ＮａＶをコードするｍＲＮＡを発現する複数の細胞を準備する工程；
ｂ）前記細胞を個別の培養ベッセル中に個々に分散させ、それにより複数の別個の細胞培養を準備する工程；
ｃ）それぞれの別個の細胞培養における条件が実質的に同一であることを特徴とする自動化された細胞培養法を用いて、一連の所望の培養条件下で細胞を培養する工程（この培養期間においては別個の細胞培養当たりの細胞数は標準化され、及び別個の細胞培養は同じスケジュールで継代される）；
ｄ）ＮａＶの発現を測定するために、別個の細胞培養を少なくとも２回アッセイする工程；及び
ｅ）２回のアッセイの両方において、継続した細胞培養の少なくとも１５日、３０日、４５日、６０日、７５日、１００日、１２０日、又は１５０日の間、１０％を超えて変化しないレベルでＮａＶを発現する別個の細胞培養を同定し、それにより前記細胞又は細胞株を得る工程、
を含む方法によって作出された細胞又は細胞株。
【請求項２４】
請求項３に記載の細胞又は細胞株であって、
ａ）ＮａＶをコードするｍＲＮＡを発現する複数の細胞を準備する工程；
ｂ）前記細胞を個別の培養ベッセル中に個々に分散させ、それにより複数の別個の細胞培養を準備する工程；
ｃ）それぞれの別個の細胞培養における条件が実質的に同一であることを特徴とする自動化された細胞培養法を用いて、一連の所望の培養条件下で細胞を培養する工程（この培養期間においては別個の細胞培養当たりの細胞数は標準化され、及び別個の細胞培養は同じスケジュールで継代される）；
ｄ）ＮａＶの発現を測定するために、別個の細胞培養を少なくとも２回アッセイする工程；及び
ｅ）２回のアッセイの両方において、継続した細胞培養の少なくとも１５日、３０日、４５日、６０日、７５日、１００日、１２０日、又は１５０日の間、１０％を超えて変化しないレベルでＮａＶを発現し、２回のアッセイの両方において、細胞を用いたアッセイでＮａＶの調節因子に応答して少なくとも０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、又は０．８５のＺ’ファクターを生じる、別個の細胞培養を同定し、それにより前記細胞又は細胞株を得る工程、
を含む方法によって作出された細胞又は細胞株。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＮａＶと呼ばれる電位依存性ナトリウムイオンチャネルファミリーは、大きく、かつ複雑な分子であり、脳を含む中枢神経系、末梢神経系、及び心筋を含む筋肉において発現する。このファミリーに含まれる全てのメンバーは、癲癇、筋麻痺及び痛みを含む様々な状態を管理するための重要な臨床標的である。ＮａＶチャネルは１つのアルファサブユニットと１以上のベータサブユニットを含む、細胞膜に埋め込まれたタンパク質である。アルファサブユニットをコードする１０の遺伝子とベータサブユニットをコードする４つの遺伝子が同定されている（例えばＣａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．  ５５：５７５〜５７８（２００３）；Ｉｓｏｍ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，７：４２〜５４（２００１）を参照のこと）。アルファサブユニットはイオンポアを形成し、そして選択的なナトリウムの流入並びに電位依存性活性化及び不活性化に関与していると考えられている（例えばＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈ，４（１）：３７〜４８（２００６）を参照のこと）。いくつかのアルファサブユニットの発現レベルと生物物理学的な特徴をベータサブユニットが調節することが示されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。アルファ及びベータサブユニットの両方は、異なる組織において異なって発現する（同上）。
【０００２】
ＮａＶファミリーのメンバーを特異的に標的とした新規及び改良された治療法の発見は、細胞を用いたシステムの欠如、特にＮａＶの調節因子をハイスループット式に同定及び試験するための細胞を用いたシステムの欠如によって妨げられてきた。結合アッセイのみを提供する無細胞系とは対照的に、細胞を用いたシステムは化合物に対する機能的アッセイを提供するために、創薬及び検証に好ましい。さらに、細胞を用いたシステムは、同時に細胞毒性を試験するという利点を有する。本発明はこの要求に応えるものである。
【発明の概要】
【０００３】
我々は、機能的なＮａＶ及び様々な組み合わせのＮａＶのサブユニットを含む、多様な形態のＮａＶを発現する、新規で有用な細胞及び細胞株を見いだした。これらの細胞及び細胞株は細胞を用いたアッセイ、特にＮａＶの機能を試験するための、及びＮａＶ調節因子をスクリーニングするためのハイスループットアッセイにおいて有用である。
【０００４】
従って、本発明は、細胞又は安定してＮａＶを発現するように改変された（変化した）細胞株に関し、これらの細胞又は細胞株のアッセイにおけるＺ’ファクターは、少なくとも０．５である。いくつかの実施形態においては、Ｚ’ファクターは少なくとも０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、又は０．８５になる可能性がある。本発明の細胞及び細胞株は選択圧のない培養中で生育する（例えば維持される）可能性があり、そして選択圧がないにも関わらず、少なくとも１５日、３０日、４５日、６０日、７５日、１００日、１２０日、又は１５０日の間、ＮａＶを発現し続ける可能性がある。いくつかの実施形態においては、選択圧なしに生育している細胞又は細胞株が、少なくとも１５日、３０日、４５日、６０日、７５日、１００日、１２０日、又は１５０日の間、一定のレベルのＮａＶを発現する。
【０００５】
いくつかの実施形態においては、本発明の細胞及び細胞株において発現するＮａＶは、１つのアルファサブユニットと１つのベータサブユニットを含み、さらに任意にさらなる別のベータサブユニットを含む場合もある。いくつかの実施形態においては、ＮａＶは、導入されたサブユニットをコードする核酸によって発現する少なくとも１つのサブユニットを含み、及び／又は遺伝子の活性化によって活性化された内生の遺伝子によって発現する少なくとも１つのＮａＶサブユニットを含む。いくつかの実施形態においては、ＮａＶは天然の、例えばポリペプチドタグを含まないものである。
【０００６】
本発明の細胞又は細胞株は真核細胞（例えば哺乳類細胞）であってもよく、さらに任意に内生的にはＮＡＶを発現しない（又は遺伝子活性化の例においては、遺伝子活性化の前にはＮＡＶを内生的に発現しない）。細胞は初代又は不死化細胞であってもよく、及び例えば霊長類（例えばヒト又はサル）、齧歯類（例えばマウス、ラット、又はハムスター）、又は昆虫（例えばショウジョウバエ）由来の細胞であってもよい。
【０００７】
本発明の細胞及び細胞株で発現するＮａＶは、２つ、３つ、又は４つのサブユニットを含んでいてもよい。ＮａＶはヒトのＮａＶであってもよい。ＮａＶはアルファ１、アルファ２、アルファ３、アルファ４、アルファ５、アルファ７、アルファ８、アルファ９、アルファ１０、又はアルファ１１サブユニットを含んでいてもよい。ＮａＶは、ベータ１サブユニット、ベータ２サブユニット、ベータ３サブユニット、又はベータ４サブユニットからなる群よりそれぞれ独立して選択される、１つ、２つ、又はそれ以上のベータサブユニットを含んでいてもよい。ＮａＶが１以上のベータサブユニットを有する場合、このベータサブユニットは同じであっても異なっていてもよい。ＮａＶタンパク質中のサブユニットは同じ又は異なる種由来のものであってもよい。
【０００８】
さらなる実施形態においては、ＮａＶアルファサブユニットは、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するアルファ１サブユニット；
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するアルファ２サブユニット；
配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するアルファ３サブユニット；
配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するアルファ４サブユニット；
配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するアルファ５サブユニット；
配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するアルファ７サブユニット；
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するアルファ８サブユニット；
配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するアルファ９サブユニット；
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するアルファ１０サブユニット；
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するアルファ１１サブユニット；
配列番号２０〜２９のいずれか１つと配列が少なくとも９５％同一である、又は実質的に同一であり、電位依存性イオンチャネルを形成することができるポリペプチド；及び
配列番号２０〜２９のいずれか１つの対立遺伝子変異体であるポリペプチド、からなる群より選択される。
【０００９】
さらなる実施形態においては、ＮａＶアルファサブユニットは、配列番号６〜１５；配列番号６〜１５のいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；配列番号６〜１５のいずれか１つと配列が少なくとも９５％同一な又は実質的に同一な核酸配列、及び配列番号６〜１５のいずれか１つの対立遺伝子変異体である核酸配列、からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００１０】
いくつかの実施形態においては、ＮａＶベータサブユニットは、
配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するベータ１サブユニット；
配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するベータ２サブユニット；
配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するベータ３サブユニット；
配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するベータ４サブユニット；
配列番号３０〜３３のいずれか１つと配列が少なくとも９５％同一又は実質的に同一であり、電位依存性イオンチャネルを調節する可能性があるポリペプチド；及び
配列番号３０〜３３のいずれか１つの対立遺伝子変異体であるポリペプチド、からなる群より選択される。
【００１１】
さらなる実施形態においては、ベータサブユニットは、配列番号１６〜１９；配列番号１６〜１９のいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；配列番号１６〜１９のいずれか１つと配列が少なくとも同一な又は実質的に同一な核酸；及び配列番号１６〜１９のいずれか１つの対立遺伝子変異体であるヌクレオチドからなる群より個別に選択される核酸配列によってコードされる。。
【００１２】
ＮａＶの一例は、ヒトＮａＶアルファ９サブユニット、ヒトベータ１サブユニット、及びヒトベータ２サブユニットを含んでいてもよい。ヒトアルファ９サブユニットは、（１）配列番号２７に示されるアミノ酸配列；又は（２）配列番号１３に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、を含んでいてもよい。ヒトベータ１サブユニットは、（１）配列番号３０によって示されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１６に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、を含んでいてもよい。ヒトベータ２サブユニットは、（１）配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又は（２）配列番号１７に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、を含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、天然のＮａＶは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含んでいてもよい。
【００１３】
さらに本発明は、異なる又は同じ形態のＮａＶを発現する、本発明の細胞又は細胞株のコレクションを提供する。このコレクションは、制御タンパク質を発現する細胞をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、並行処理及び正確なアッセイの読み出しを可能にするために、コレクション中の細胞又は細胞株の生理的特性（例えば、細胞型、代謝、細胞継代（齢）、成長速度、細胞培養表面への付着、Ｚ’ファクター、ＮａＶの発現レベル）が一致するように同調させる。この同調は、例えば細胞及び細胞株を、例えば自動化によって達成可能な同一の条件で発生及び生育させることによって達成することができる。
【００１４】
本発明はさらに、本発明の細胞、細胞株、又は細胞（株）コレクションを試験化合物と接触させる工程；及び、試験化合物と接触していない細胞と比較して、試験化合物がＮａＶ調節因子であることを示す細胞中のＮａＶ機能の変化を検出する工程を含む、ＮａＶ調節因子の同定法を提供する。試験化合物は、小分子、ポリペプチド、ペプチド、又は抗体若しくはその抗原結合部位であってもよい。試験化合物は化合物のライブラリー中にあってもよい。ライブラリーは、小分子ライブラリー、組み合わせライブラリー、ペプチドライブラリー、又は抗体ライブラリーであってもよい。本方法においては、検出工程は、膜電位アッセイ、電気生理的アッセイ、結合アッセイなどから選択されてもよく、またこの方法はハイスループット法において実施されてもよい。
【００１５】
さらに本発明は、（ａ）ＮａＶをコードするｍＲＮＡを発現している複数の細胞を準備する工程；（ｂ）個別の培養管に細胞をそれぞれ分散させ、これにより、複数の別個の細胞培養を準備する工程；（ｃ）それぞれの別個の細胞培養における条件が実質的に同一であることを特徴とする自動化された細胞培養法を用いて、一連の所望の培養条件下で細胞を培養する工程（この培養期間においては別個の細胞培養当たりの細胞数は均一化され、及び別個の細胞培養は同じスケジュールで継代される）；（ｄ）別個の細胞培養におけるＮａＶの発現を測定するためのアッセイを少なくとも２回行う工程；及び（ｅ）２回のアッセイの両方において一定のレベルでＮａＶを発現する別個の細胞培養を同定し、その結果により前記細胞を得る工程を含む方法によって作成した、長期間、一定のレベルでＮａＶを安定して発現するように改変された細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】安定にＮａＶ１．７を発現する細胞株における、異種ヒトＮａＶ１．７α、β１、及びβ２サブユニットの相対的な発現を図示する棒グラフである。発現レベルを定量ＲＴ−ＰＣＲで試験し、そして対照のＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルに合わせて標準化した。（＋）のレーンは逆転写酵素を添加した場合の反応を示し、そして（−）のレーンは逆転写酵素を添加しない場合の反応を示す。
【図２】補助的なβサブユニットによる、ＮａＶ１．７αサブユニット発現の制御を示す。比較ＲＴ−ＰＣＲにより、３つ全てのＮａＶ１．７サブユニットを共に導入した場合には、薬剤選択的細胞におけるαサブユニットの発現が、αサブユニットのみを導入した細胞と比較して増加していることが示された。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、作出した３つ全てのＮａＶ１．７サブユニットを安定に発現する細胞株における、ＮａＶ１．７に対する特徴的な反応を表す電気生理学的データを示す。図３Ａは、２０ｍｓの−８０ｍＶから＋５０ｍＶの脱分極パルスに反応したナトリウムの流れを示す。図３Ｂは、最大時のナトリウムチャネルの流れよって生じた電流電圧の関係（Ｉ−Ｖ）を示す。図３Ｃは、ナトリウムチャネルの不活化グラフを示す。
【図４】既知の２つのＮａＶ活性化剤であるベラトリジン及びサソリ毒に対し、３つ全てのＮａＶ１．７サブユニットを安定に発現する細胞は反応したが、対照細胞は反応しなかったことを示す。この反応は機能的な膜電位の細胞を用いたアッセイによって測定した。
【図５】ＮａＶ１．７を安定に発現する細胞における、試験化合物に反応した活性化を示す。図５Ａは、クローンＣ４４（３つ全てのＮａＶ１．７サブユニットを発現する細胞）を試験化合物Ｃ１８及びＫ２１に曝露した場合の活性化反応を図示する。図５Ｂは、クローン６０（ＮａＶ１．７アルファサブユニットのみを発現する細胞）では同じ試験化合物への反応が完全に阻害されたことを図示する。％対照は、２つのクローンの緩衝液のみ（すなわち試験化合物を添加しない）に対する反応と比較して算出した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
別段の指定のない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載された方法及び材料と同様又は等価なものもまた本発明の実施又は試験において使用することができるが、方法及び材料の一例を下記に記載する。本明細書において言及された全ての出版物及びその他の文献は、引用することによりその全文が組み込まれる。不一致がある場合には、定義を含めて本明細書が優先される。数多くの書類が本明細書中に引用されるが、この引用は、これら書類のいずれもが当該分野における一般的で基本的な知識の一部分を形成するという承認を規定しない。本明細書及び請求項を通じて、「含む」という語、又は「含む」若しくは「含んでいる」などのその変形が、示された整数又は整数の群を包含するが、その他のいずれの整数又は整数の群を排除しないことを意味することを理解されたい。材料、方法、及び実施例は説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図しない。
【００１８】
本発明をより容易に理解できるようにするために、始めに特定の用語を定義する。さらなる定義は明細書を通じて示される。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「天然の」タンパク質（例えばイオンチャネルタンパク質）という用語は、付加された又は挿入された異種アミノ酸配列を有さないタンパク質を意味する。本明細書で使用される場合、例えば「天然のＮａＶ」は、ポリペプチドレベルで発現するタグ配列を有さないＮａＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態においては、天然のＮａＶは、サブユニットが完全で正確に配置された天然に生じるＮａＶの全てのサブユニットを含む。
【００２０】
「安定な」又は「安定して発現する」という用語は、「安定した発現」及び「一過性の発現」という用語が当業者によって理解されるように、本発明の細胞及び細胞株を一過性の発現を有する細胞から区別するために用いられる。
【００２１】
「細胞株」又は「クローン細胞株」という用語は、その細胞集団の全てが単一の細胞由来であることを意味する。本明細書で使用される場合、細胞株はインビトロでの細胞培養において維持され、そしてクローン細胞の貯蔵物を確立するためにその一部が凍結されてもよい。
【００２２】
「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸試料に１つ以上の核酸プローブをハイブリダイズさせるための、並びに試料中の標的核酸に特異的に結合していないプローブを洗浄するための温度及び塩条件を記述する。ストリンジェントな条件は当業者に周知であり、かつ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１〜６．３．６において見ることができる。水性及び非水性の方法が文献に記載されており、このいずれをも用いることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、６ＸＳＳＣ中、約４５℃でハイブリダイゼーションを行い、その後０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で少なくとも１回洗浄を行うことが挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例としては、６ＸＳＳＣ中、約４５℃でハイブリダイゼーションを行い、その後０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で少なくとも１回洗浄することが挙げられる。ストリンジェントな条件には、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中、６５℃でハイブリダイゼーションを行い、その後少なくとも１回洗浄することが含まれる。
【００２３】
アミノ酸及び／又は核酸配列に関連した「パーセント同一な」又は「パーセントの同一性」という句は、少なくとも２つの異なる配列間の相同性を意味する。この同一性のパーセンテージは例えばＡｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０）によって記載されたＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズム（（１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，４８：４４４〜４５３）；又はＭｅｙｅｒｓらのアルゴリズム（（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１〜１７）などの標準的な整列アルゴリズムによって決定することができる。一連のパラメーターは、ギャップペナルティが１２、ギャップ伸張ペナルティが４、及びフレームシフトギャップペナルティが５のＢｌｏｓｕｍ６２スコア付けマトリックスになり得る。２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性のパーセンテージはまた、ＡＬＩＧＮｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれたＥ．  Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１〜１７）により、ＰＡＭ１２０残基重量表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いて決定することができる。同一性のパーセンテージは、通常類似した長さの配列を比較することによって算出される。タンパク質解析ソフトウェアは、様々な置換、欠損、及び保存的アミノ酸置換を含むその他の修飾に割り付けられた相同性を測定することによって、類似した配列を一致させる。例えばＧＣＧは、生物の異なる種由来の相同なポリペプチド又は野生型タンパク質とその変異体などの近似したポリペプチド間の配列相同性又は配列同一性を決定するためのデフォルトのパラメーターと共に用いることができる、「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。例えばＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１を参照のこと。ポリペプチド配列もまた、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡを用いて、デフォルトの又は推奨されるパラメーターを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー及び検索配列の間において最も重複している領域のアライメント及び配列同一性のパーセンテージを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９（２０００））。相同性を比較するポリペプチド配列の長さは、通常少なくとも約１６アミノ酸残基であり、通常少なくとも約２０残基、より一般的には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、及び好ましくは約３５残基より長い。
【００２４】
「実質的に示されたように」、「実質的に同一な」又は「実質的に相同な」という句は、示された配列と比較して、関連したアミノ酸又はヌクレオチド配列が同一である、又は（保存的アミノ酸置換を介した）ごく僅かな差を有することを意味する。ごく僅かな差には、特定の領域の５０アミノ酸中に１つ又は２つの置換があるような、少数のアミノ酸変化が含まれる。
【００２５】
ＮａＶ「調節因子」は、ＮａＶの生物学的活性、例えばＮａＶを介したイオン伝導を変化させる化合物を意味する。ＮａＶ調節因子は、ＮａＶ又はＮａＶサブユニットの全て、又はその特定の部分集合において作用する可能性がある。調節因子には、アゴニスト（増強剤又は活性化剤）及びアンタゴニスト（阻害剤又は遮断薬）が含まれるがこれらには限定されない。ＮａＶアゴニストはＮａＶの生物学的活性を上昇させる化合物を意味する。ＮａＶアンタゴニストはＮａＶの生物学的活性を低下させる化合物を意味する。
【００２６】
「機能的なＮａＶ」は、天然に生じる又は内生的に発現するＮａＶの生物学的活性を１つ以上有するＮａＶを意味する。ＮａＶの生物学的活性には、電位依存性のナトリウム伝導が含まれるがこれには限定されず、そしてリドカイン及びテトロドトキシン（ＴＴＸ）の阻害などの薬理学的反応を介して評価することができる。ＮａＶに対して薬理学的に活性であり、そのため導入されたＮａＶの機能を評価するために使用することができるその他の化合物には、ベラトリジン及びサソリ又はその他の様々な毒などのチャネルを開いた状態に保持する化合物である、ナトリウムチャネル開口薬がある。
【００２７】
「異種」又は「導入された」ＮａＶサブユニットは、宿主細胞に導入されたポリヌクレオチド、又はその発現が転写制御エレメントなどの外部から導入された因子によって活性化される（例えば遺伝子活性化技術によって）内生のＮａＶをコードする配列によってコードされる、ＮａＶサブユニットを意味する。「異種ＮａＶ」は、１つ以上の異種ＮａＶサブユニットを含んでいるＮａＶを意味する。
【００２８】
第一の観点においては、本発明は、細胞（例えば単離された細胞、クローン細胞、又はクローン細胞の混合物）及び、１つ以上の異種（導入された）ＮａＶサブユニット（例えば天然のＮａＶサブユニット）を（例えば安定して）発現する細胞株を提供する。細胞及び細胞株は、ＮａＶサブユニットを構成的に発現してもよい。細胞及び細胞株はベラトリジン及びサソリ毒などのチャネル開口薬、又は膜電位の変化によって調節されてもよい。細胞又は細胞株は１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の異種ＮａＶサブユニット（１つのアルファサブユニット及び２つの型のベータサブユニット）を発現してもよい。関連した実施形態においては、細胞又は細胞株は機能的な異種ＮａＶを安定して発現する。本発明のＮａＶ細胞及び細胞株は、標準的な方法によって作成された細胞及び細胞株と比較して増強された特性を有する。例えば、ＮａＶ細胞及び細胞株は増強された発現の安定性（抗生物質などの選択圧を含まない培養において維持されば場合でさえも）を有し、及び細胞を用いたアッセイにおける高いＺ’値を有する。本発明の細胞及び細胞株は検出可能な信号対雑音比、例えば１：１より高い信号対雑音比を提供する。本発明の細胞及び細胞株は、膜電位アッセイなどのハイスループットアッセイにおいて使用した場合、当該分野における代表的なアッセイだと考えられるがハイスループット法において実施するには非常に大きな労働力を必要とするアッセイ（例えば電気生理学的アッセイ）による結果と一致する結果を生じる、信頼性のある測定値を提供する。
【００２９】
様々な実施形態においては、本発明の細胞又は細胞株は、一定のレベルのＮａＶを少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００日間又は２００日以上発現し、ここで一定の発現とは、発現レベルが、継続した細胞培養の２から４日間にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％９％又は１０％；継続した細胞培養の５から１５日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％又は１２％；継続した細胞培養の１６から２０日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％又は２０％；継続した細胞培養の２１から３０日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％；継続した細胞培養の３０から４０日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％又は３０％；継続した細胞培養の４１から４５日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％又は３０％；継続した細胞培養の４５から５０日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％又は３０％；継続した細胞培養の４５から５０日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％又は３５％；継続した細胞培養の５０から５５日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％又は３０％；継続した細胞培養の５０から５５日間にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％又は３５％；継続した細胞培養の５５から７５日間にわたって１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％；継続した細胞培養の７５日から１００日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又は４５％；継続した細胞培養の１０１日から１２５日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又は４５％；継続した細胞培養の１２６日から１５０日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又は４５％；継続した細胞培養の１５１日から１７５日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又は４５％；継続した細胞培養の１７６日から２００日にわたっ１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又は４５％；又は継続した細胞培養の２００日間以上において１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又は４５％、よりも多様でないことを意味する。
【００３０】
ＮａＶは、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、イヌ、ウシ、ブタ又は霊長類のいずれの哺乳類由来であってもよい。アルファサブユニット及びそれぞれのベータサブユニットは同じ又は異なる種由来であってもよい。好ましい実施形態においては、ＮａＶは、ヒトＮａＶ１．１、ＮａＶ１．２、ＮａＶ１．３、ＮａＶ１．４、ＮａＶ１．５、ＮａＶ１．６、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８、及びＮａＶ１．９を含む、ヒトＮａＶである。
【００３１】
様々な実施形態においては、ＮａＶアルファサブユニットは、いずれのヒトＮａＶアルファサブユニットを含む、いずれのＮａＶアルファサブユニットであってもよい。従って、いくつかの実施形態においては、本発明の細胞は、ＮａＶアルファ１（ＳＣＮ１Ａ）（配列番号２０）；ＮａＶアルファ２（ＳＣＮ２Ａ）（配列番号２１）；ＮａＶアルファ３（ＳＣＮ３Ａ）（配列番号２２）；ＮａＶアルファ４（ＳＣＮ４Ａ）（配列番号２３）；ＮａＶアルファ５（ＳＣＮ５Ａ）（配列番号２４）；ＮａＶアルファ７（ＳＣＮ７Ａ）（配列番号２５）（アルファ６及びアルファ７サブユニットは同義である）；ＮａＶアルファ８（ＳＣＮ８Ａ）（配列番号２６）；ＮａＶアルファ９（ＳＣＮ９Ａ）（配列番号２７）；ＮａＶアルファ１０（ＳＣＮ１０Ａ）（配列番号２８）；又はＮａＶアルファ１１（ＳＣＮ１１Ａ）（配列番号２９）をコードする核酸を含む可能性がある。いくつかの実施形態においては、ＮａＶアルファサブユニットをコードする核酸は、配列番号６〜１５からなる群より選択される。
【００３２】
ＮａＶアルファサブユニットのいずれか１つは共に導入されてもよく、又は順次導入されてもよく、及び本発明の細胞を生成するためにいずれの１以上のＮａＶベータサブユニットと共に発現されてもよい。いくつかの実施形態においては、細胞は、ヒトＮａＶベータサブユニット、例えばヒトＮａＶベータ１サブユニット（ＳＣＮ１Ｂ）（配列番号３０）、ヒトＮａＶベータ２サブユニット（ＳＣＮ２Ｂ）（配列番号３１）、ヒトＮａＶベータ３サブユニット（ＳＣＮ３Ｂ）（配列番号３２）及びヒトＮａＶベータ４サブユニット（ＳＣＮ４Ｂ）（配列番号３３）を安定して発現する。いくつかの実施形態においては、ＮａＶベータサブユニットは、配列番号１６〜１９からなる群より選択される核酸によってコードされる。いくつかの実施形態においては、細胞は、ヒトＮａＶアルファ９／ＳＣＮ９Ａサブユニット、ヒトＮａＶベータ１／ＳＣＮ１Ｂサブユニット及びヒトＮａＶベータ２／ＳＣＮ２Ｂサブユニットをコードする核酸を用いて３度形質転換され、そしてこれらを発現する。いくつかの実施形態においては、導入されるＮａＶサブユニットをコードする２つ以上の配列が、同じベクター中に配置される。別の実施形態においては、それぞれのサブユニットをコードする配列は異なるベクター中に配置される。
【００３３】
いくつかの実施形態においては、本発明の細胞及び細胞株はアルファ１〜１１のいずれか１つより選択され、導入されたアルファサブユニット、及びベータ１〜４のいずれか１つより選択され、導入されたベータサブユニットを、下記の表中で「＋」で表されるそれぞれの組み合わせにおいて発現する。
【表１】
0005809065.tif 000002
【００３４】
これらの細胞及び細胞株は、ベータ１〜４のいずれか１つよりそれぞれ独立して選択され、導入された１以上のベータサブユニットをさらに発現することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の細胞及び細胞株は上記の表に示されたようなアルファ及びベータの組み合わせを含むＮａＶチャネルを発現し、そしてさらなる実施形態においては、これらの細胞株におけるＮａＶチャネルは、ベータ１〜４のいずれか１つより選択される１以上のベータサブユニットをさらに含む。
【００３５】
ＮａＶサブユニットをコードする核酸はゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡであってよい。いくつかの実施形態においては、ＮａＶサブユニットをコードする核酸は、アミノ酸置換を生じ得る１以上の置換、挿入、又は欠損を含む。本発明の範囲内の修飾を含むＮａＶサブユニットは、少なくとも１つの生物学的特性、例えばベラトリジンなどのイオンチャネル開口薬、並びにリドカイン及びテトロドトキシン（ＴＴＸ）などのサソリやその他の毒及びチャネル遮断薬に反応して電位依存性ナトリウムチャネルとして機能する、又は電位依存性ナトリウムチャネルを調節するその機能を保持する。従って、本明細書において開示された配列と実質的に同一な（例えば少なくとも配列が約８５％同一）又は相同の（例えば少なくとも配列が約８５％相同な）核酸配列もまた本発明に包含される。いくつかの実施形態においては、配列同一性は約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超えるものである可能性がある。また、実質的な同一性又は相同性は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件）下で核酸断片が参照配列の相補鎖にハイブリダイズする場合に存在する。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、ヌクレオチドの変異がアミノ酸置換を含む場合、天然のアミノ酸は保存又は非保存置換によって置き換えられてもよい。いくつかの実施形態においては、本来のポリペプチド配列と修飾されたポリペプチド配列との間の配列同一性は少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える可能性がある。当業者は、保存的アミノ酸置換においてはアミノ酸側鎖の構造及び／又は化学的特性が類似であり、及びその置換が野生型配列の構造的な特徴を実質的に変化させない置換であることを理解するだろう。変異を含む核酸を用いる実施形態においては、変異はランダム変異又は部位特異的変異であってよい。
【００３７】
保存的な修飾は、修飾されていないＮａＶ受容体と類似の機能及び化学的特徴を有するＮａＶ受容体を産生するだろう。「保存的アミノ酸置換」とは、その置換において、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を有し、側鎖（Ｒ基）をもつ別のアミノ酸残基によって置換されるものである。通常、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存置換によってそれぞれ異なる場合、配列同一性のパーセンテージ又は類似性の度合いは、置換の保存的な性質により上方に調整される。この調整手段は当業者において周知である。例えばＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２４３：３０７〜３１（１９９４）を参照のこと。
【００３８】
類似の化学的特性を有する側鎖をもつアミノ酸群の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；２）脂肪族−水酸基側鎖：セリン及びトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；並びに７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンがある。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。また、保存的な置換は、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜４５（１９９２）において開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。
【００３９】
いくつかの実施形態においては、ＮａＶサブユニットをコードする核酸配列はエピトープタグをさらに含む。それらのタグは、例えば黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、６ｘ−ＨＩＳ(配列番号３５）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、又は血球凝集素（ＨＡ）、Ｓタグ、チオレドキシン、自家蛍光タンパク質、ＧＳＴ、Ｖ５、ＴＡＰ、ＣＢＰ、ＢＣＣＰ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐタグ、又は前述のタグの変異体をコードしてもよい。タグは、発現レベル、細胞内局在、タンパク質−タンパク質相互作用、ＮａＶ又はそのサブユニットの制御及び機能を決定するためのマーカーとして使用される場合もある。タグはタンパク質の精製及び分画を促進するために使用される場合もある。これらの及びその他のタグ配列は当業者において周知であり、典型的には発現タンパク質産物中に組み込まれてもよく、そしてしばしば抗体又はタンパク質の存在を示すために使用され得るロバストな抗体又はタンパク質検出試薬の性能に基づいて選択される。しかしながら、本明細書において記載されるタグ配列は、アミノ酸レベルにおいて修飾するために用いられ得る配列、タグを有するＲＮＡによってコードされるタンパク質産物、又は相当する抗体又はタンパク質検出試薬の使用を介してその後行われる任意のそれら修飾タンパク質産物の検出を補助する配列のみを意味するものではない。例えば、「分子指標」として使用されるＲＮＡタグの使用に関する以下の議論を参照のこと。
【００４０】
本発明の細胞株を作出するために使用される宿主細胞は、１つ以上の内生ＮａＶタンパク質を発現していてもよく、又は１つ以上のいずれのＮａＶタンパク質の発現を欠失していてもよい。宿主細胞は、初代、胚、又は胚幹細胞を含む幹細胞であってもよい。宿主細胞はまた、不死化細胞であってもよい。宿主細胞は中胚葉、外肺葉、若しくは内胚葉層からの初代又は不死化細胞由来であってもよい。宿主細胞は、内皮、表皮、間葉、神経、腎臓、肝臓、造血、又は免疫細胞であってもよい。例えば宿主細胞は、腸陰窩又は絨毛細胞、クララ細胞、結腸細胞、腸管細胞、杯細胞、腸管クロム親和細胞、腸管内分泌細胞であってもよい。宿主細胞は、真核、原核、哺乳類、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、齧歯類、有袋類、ネズミ又はその他の細胞であってもよい。宿主細胞はまた、酵母、昆虫、真菌、植物、下等な真核生物及び原核生物などの非哺乳類であってもよい。それら宿主細胞は、細胞が標的と相互作用することによって発現産物が欠如する可能性がより高くなる場合のある、試験における様々なバックグラウンドを生じる可能性がある。好ましい実施形態においては、宿主細胞は哺乳類細胞である。本発明の細胞株様に使用され得る宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、確立されたニューロン細胞株、褐色細胞腫、神経芽細胞腫繊維芽細胞、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ヒーラ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ−細胞、ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、ＰＣ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）、ＲＢＬ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１３７８）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）、ＳＪ−ＲＨ３０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ  ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ  ８５０５０３０２）、ベロ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８１）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ３７）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２４３）、ジャーカット（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）、Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、  Ｌｅｉｄｅｎ、  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｈｕｖｅｃ（ＡＴＣＣ  ヒト初代ＰＣＳ  １００〜０１０、マウスＣＲＬ  ２５１４、ＣＲＬ  ２５１５、ＣＲＬ  ２５１６）、ＨｕＨ−７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ  ０１０４２７１２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８５）、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８６）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣ  ＨＴＢ−２２）、Ｕ−２  ＯＳ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６）、Ｔ８４（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２４８）、又はいずれの確立した（極性のある又は極性のない）細胞株、若しくは、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌ���ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．  Ｍａｎａｓｓａｓ、  Ｖａ．  ２０１１０〜２２０９  ＵＳＡ）若しくはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ  Ｅｎｇｌａｎｄ）などのリポジトリから入手可能ないずれの細胞株が挙げられるがこれらには限定されない。宿主細胞型の選択によっては、既知の又は知られていない異なる補助的な因子が、標的と相互作用し得る又は標的の機能若しくは発現を変化させ得ることを当業者は理解するだろう。
【００４１】
１つの実施形態においては、宿主細胞は、その後トランスジェニック動物を作出するための基礎として使用される胚幹細胞である。少なくとも１つのＮａＶサブユニットと、好ましくは機能的な異種ＮａＶ受容体を安定に発現する胚幹細胞を生物に直接移植してもよく、又はそれらの核をその他の受容細胞に転移させ、その後これらを成長及び発達をインビトロで試験するために移植してもよい。胚幹細胞をまた、トランスジェニック動物を作出するために使用してもよい。
【００４２】
当業者によって理解されるように、宿主細胞と共に使用することに適しているいずれのベクターを、ＮａＶアルファ又はベータサブユニットをコードしている核酸を宿主細胞に導入するために使用することもできる。アルファ及びそれぞれのベータサブユニットを含むベクターは、同じ型であっても異なる型であってもよい。ＮａＶサブユニットをコードする核酸を宿主細胞に導入するために使用され得るベクターの例としては、プラスミド、レトロウイルス及びレンチウイルスを含むウイルス、コスミド、人工染色体が挙げられるがこれらには限定されず、並びに、例えばｐＦＮ１１Ａ（ＢＩＮＤ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＧＬ４．３１、ｐＦＣ１４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶ  Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＣ１４Ｋ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶ  Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３  Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ｋ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３  Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ＨａｌｏＴａｇ（商標）ｐＨＴ２、ｐＡＣＴ、ｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ（商標）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）−ＭＡＸ、ｐＢＩＮＤ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｂａｓｉｃ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶＴＮＴ（商標）、ｐＧ５ｌｕｃ、ｐＳＩ、ｐ標的（商標）、ｐＴＮＴ（商標）、ｐＦ１２ＡＲＭＦｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦ１２ＫＲＭＦｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＲｅｇｎｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクター、ｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（商標）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）２７ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐｃＤＮＡ（商標）−ＤＥＳＴ４７ベクター、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄベクター、ｐＥＦ６／ＨｉｓＡ、Ｂ、＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ（商標）６．２−ＤＥＳＴ、ｐＬｅｎｔｉ６／ＴＲ、ｐＬＰ−ＡｃＧＦＰ１−Ｃ、ｐＬＰＳ−ＡｃＧＦＰ１−Ｎ、ｐＬＰ−ＩＲＥＳｎｅｏ、ｐＬＰ−ＴＲＥ２、ｐＬＰ−ＲｅｖＴＲＥ、ｐＬＰ−ＬＮＣＸ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−ＨＡ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−Ｍｙｃ、ｐＬＰ−ＲｅｔｒｏＱ、ｐＬＰ−ＣＭＶｎｅｏ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ｐｕｒｏ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ  ｐｕｒｏ、及びｐＳＶ２  ｚｅｏが含まれる場合もある。いくつかの実施形態においては、ベクターは、構成的又は条件付きプロモーターなどの発現制御配列を含む。当業者はそれらの配列を選択することができるだろう。例えば好適なプロモーターには、ＣＭＶ、ＴＫ、ＳＶ４０及びＥＦ−１αが含まれるがこれらには限定されない。いくつかの実施形態においては、プロモーターは、誘導可能、温度により制御される、組織特異的、抑制可能、熱ショック、発生的、細胞株齢特異的、原核及び／又は真核発現可能な、又は一過性のプロモーターであり、又は、非修飾、変異を受けた、ランダム化された、シャッフルされた、前述した１以上の任���の配列の組み合わせ若しくは組換えである。ＮａＶサブユニットをコードする核酸は構成的に発現することが好ましい。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、ベクターは選択マーカー又は薬剤耐性遺伝子を欠損している。その他の実施形態においては、ベクターは任意に、薬剤又は抗生物質耐性を付与するタンパク質など、選択マーカーをコードする核酸を含む。異なるＮａＶサブユニットをコードする配列に対するそれぞれのベクターは、同じ若しくは異なる薬剤耐性、又はその他の選択マーカーを含んでいてもよい。１つ以上の薬剤耐性マーカーが同じである場合、同時選抜は薬剤のレベルを上げることによって達成され得る。好適なマーカーは当業者に周知であり、ネオマイシン／Ｇ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、メトトレキサート及びブラストシジンのいずれか１つに対する耐性を付与する遺伝子を含むがこれらには限定されない。薬剤選抜（又はその他の好適な選択マーカーを使用した選抜）が必要とされる工程でない場合にも、所望される場合には、形質転換した構築物に薬剤耐性を付与するように設計することで、安定に形質転換された細胞の割合を上げるために薬剤選抜を使用することができる。シグナル伝達プローブを用いて選抜を行う場合には、形質転換の後、あまりにもすぐに選抜を実施した場合に、安定してではなく一過的に形質転換されたいくつかの陽性細胞を生じる場合がある。しかしながらこのことは、十分に細胞を継代すること、一過的に形質転換された細胞、導入されたＤＮＡを発現していない安定な統合細胞、又はシグナル伝達プローブによって効果的に検出できない可能性のあるＲＮＡを生成する細胞を希釈することによって、最小限にすることができる。
【００４４】
本発明の別の観点においては、本発明の細胞及び細胞株はＮａＶ又はＮａＶサブユニットを安定して発現する。安定した発現を同定するためには、細胞株におけるそれぞれのＮａＶサブユニットの発現を時間経過を追って測定し、そして発現レベルを比較する。安定な細胞株は、時間経過を通じて実質的に同じレベル（例えば、ばらつきがわずか４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、又は２％程度）でＮａＶサブユニットを発現し続けるだろう。本発明のいくつかの観点においては、時間経過は、少なくとも１週間、２週間、３週間、若しくは４週間；又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９カ月間、又は少なくともその範囲のいずれかの長さの期間になる可能性がある。発現しているそれぞれのＮａＶサブユニットの絶対的な及び／又は相対的な量を決定するためのｑＲＴ−ＰＣＲ及びエンドポイントＲＴ−ＰＣＲなど、又はそのほかの任意の標準的なタンパク質発現解析法によって、単離した細胞をさらに特徴付けることができる。
【００４５】
本発明の細胞及び細胞株は、それらのＺ’ファクターによって明らかなように、高い再現性のあるアッセイを提供するさらに有利な特性を有する。Ｚｈａｎｇ  ＪＨ，Ｃｈｕｎｇ  ＴＤ，Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ＫＲ「Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ．」Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１９９９；４（２）：６７〜７３を参照のこと。Ｚ’値が、細胞又は細胞株が調節因子に一定して反応するであろう度合いを反映することから、Ｚ’値は細胞又は細胞株の質に関係する。Ｚ’は、マルチウェルプレート全体にわたって、参照化合物に対する機能的な反応のシグナル対ノイズ幅及びシグナルのばらつき（すなわちウェル間の）を考慮する統計的な計算である。Ｚ’は、ポジティブコントロールを含むマルチウェルプレート及びネガティブコントロールを含むマルチウェルプレートから得られたデータを用いて算出される。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールの標準偏差の和に３を乗じた数値と、それらの平均の差との比を１から引いた値がＺ’ファクターを示す。従って、下記の式となる。
Ｚ’ファクター＝１−（（３σｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ＋３σｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）／（μｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ−μｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ））
【００４６】
理論的には、Ｚ’ファクターの最大は１．０であり、これは、ばらつきがなく、かつ、変動幅に制限がない理想的なアッセイを示すものである。本明細書で使用される場合、「高Ｚ’」は、Ｚ’ファクターのＺ’が少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．７５若しくは少なくとも０．８、又は０．６と１．０の間の任意の小数であることを意味する。０よりも小さいスコアは、それがポジティブ及びネガティブコントロールの間に重複があることを示すことから望ましくない。業界では、単純な細胞を用いたアッセイにおいては、０．３までのＺ’スコアが下限に近いと考えられ、０．３から０．５の間のＺ’スコアが許容範囲であると考えられ、そして０．５以上のＺ’が非常に良いと考えられている。無細胞又は生物化学的アッセイはより高いＺ’スコアに達する可能性があるが、細胞を用いたシステムは複雑であることから、細胞を用いたシステムでのＺ’スコアはより低くなる傾向にある。
【００４７】
当業者は、歴史的にみて、一本鎖タンパク質を発現する細胞を使用した、細胞を用いたアッセイにおいては典型的には０．５から０．６を超えるＺ’を達成しないことを認めるだろう。それらの細胞をアッセイにおいて使用することは、結果を再現できないことから、信頼性がない。一方本発明の細胞及び細胞株は、アッセイにおいて高いＺ’値を有し、かつ、一定の結果を有利に生じる。本発明のＮａＶ細胞及び細胞株は、通常それらが少なくとも０．７のＺ’ファクターを有するため、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）コンパチブルアッセイの基礎を提供する。本発明のいくつかの観点においては、細胞及び細胞株は少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、又は少なくとも０．８のＺ’を生じる。本発明のその他の観点においては、本発明の細胞及び細胞株は、複数回の継代の間、例えば５から２０の間のいずれの整数を含む５〜２０回の継代の間維持される、少なくとも０．７、少なくとも０．７５又は少なくとも０．８のＺ’を生じる。本発明のいくつかの観点においては、細胞及び細胞株は、１、２、３、４若しくは５週間、又は２、３、４、５、６、７、８若しくは９カ月間、及びそれらの範囲間のいずれの期間の間維持される、少なくとも０．７、少なくとも０．７５若しくは少なくとも０．８のＺ’を生じる。
【００４８】
また本発明によると、天然に生じるＮａＶヘテロマルチマー（非天然に生じる、アルファ及びベータサブユニットの組み合わせ又はアルファ若しくはベータサブユニットのみを発現する細胞株とは異なり）の組換え型を発現する細胞及び細胞株のＮａＶ機能、例えばナトリウムイオン伝導を特徴付けることができる。いくつかの実施形態においては、本発明の細胞及び細胞株は、導入されたイオンチャネルの「生理学的に関連のある」活性を表示する。本明細書で使用される場合、「生理学的に関連のある」は、例えば調節因子に反応して、天然に生じる同じ型のチャネル、例えば同じ組み合わせのアルファ及びベータサブユニットを有する天然に生じる受容体と実質的に同じ様式で作用する導入されたイオンチャネルを発現する細胞又は細胞株の特性を意味する。本発明の細胞及び細胞株は好ましくは、ＮａＶ活性化剤としてナトリウムを用いる膜電位アッセイ、電気生理学的アッセイ、及び結合又はパニングアッセイなどの好適なアッセイにおいて、通常内生の（天然の）ＮａＶを発現する細胞（例えば初代細胞）と同程度の機能を示す。それらの比較は細胞又は細胞株の生理学的関連を決定するために用いられる。
【００４９】
本発明の別の観点においては、本発明の細胞を用いて同定された調節因子を、機能を確認するためのさらなるアッセイにおいて使用することができる。本発明の細胞及び細胞株さらに有利な特性は、最初のスクリーニングにおいて同定された調節因子が、膜電位アッセイ又は電気生理学的アッセイなどの二次的な機能アッセイにおいても機能することである。当業者が認めるように、最初のスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物は、典型的には、二次的な機能アッセイにおいて機能する誘導体又はアナログを得るために、コンビナトリアルケミストリー、医薬品化学又は合成化学などによって修飾する必要がある。しかしながら、本発明の細胞及び細胞株の高い生理学的関連により、これらを用いて同定した化合物はそのような「粗」同調を必要としない。
【００５０】
いくつかの実施形態においては、本発明の細胞及び細胞株はＮａＶ調節因子に対する高い感受性を有する。本発明の細胞及び細胞株は、ＮａＶに対してＥＣ５０又はＩＣ５０の値の生理学的範囲を有する調節因子に反応する。本明細書で使用される場合、ＥＣ５０は、細胞又は細胞株において半値活性化反応を誘導するのに必要とされる、化合物又は基質の濃度を意味する。本明細書で使用される場合、ＩＣ５０は、細胞又は細胞株において半値阻害反応を誘導するのに必要とされる、化合物又は基質の濃度を意味する。ＥＣ５０及びＩＣ５０の値は、当該分野において周知の技術、例えばＮａＶを発現する細胞株の反応に対する化合物又は基質の濃度に関連する用量反応曲線を用いて決定することができる。例えば、本発明の細胞株におけるテトロドトキシン（ＴＴＸ）に対するＩＣ５０は約１〜１００ｎＭ、例えば１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０ｎＭである。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、安定性、生理学的関連、アッセイにおける再現性（Ｚ’）、又は生理学的なＥＣ５０若しくはＩＣ５０値などの本発明の細胞及び細胞株の特性は、特定の培養条件下で達成できる。いくつかの実施形態においては、培養条件は標準化され、かつ、例えば自動化による変更なしに、厳密に維持される。培養条件には、その条件下で細胞又は細胞株が生育できるいずれの好適な条件、及び当該分野において知られるいずれの好適な条件が含まれていてもよい。様々な培養条件は、ＮａＶ、又はその変異体若しくは対立遺伝子変異体における有利な生物学的特性を生じる可能性がある。
【００５２】
その他の実施形態においては、安定性、生理学的関連、アッセイにおける再現性（Ｚ’）、又は生理学的なＥＣ５０若しくはＩＣ５０値などの所望の特性を有する本発明の細胞及び細胞株、を１か月以内に得ることができる。例えば、細胞又は細胞株を２、３、４、５、若しくは６日間以内、又は１、２、３若しくは４週間以内、又はその範囲内のいずれの長さの期間で得ることができる。
【００５３】
本細胞及び細胞株をコレクション又はパネル、１つの型のＮａＶを発現するそれぞれの細胞セット又は細胞株［例えばアルファ及びベータサブユニット若しくはサブユニットの変異体（例えば変異体、断片、若しくはスプライスされた変異体）の様々な組み合わせからなるＮａＶ（例えば二量体、三量体など）、又はアルファ若しくはベータサブユニットのみの単量体若しくは多量体］、において使用することができる。コレクションには例えば、２つ以上の前述したＮａＶ受容体を発現する細胞株が含まれてもよい。いくつかの実施形態においては、コレクション又はパネルは、同一のＮａＶを発現する又は制御タンパク質を発現するメンバーをさらに含んでもよい。
【００５４】
例えば薬剤スクリーニングのための細胞又は細胞株のコレクション又はパネルを産生した場合、コレクション又はパネル中の細胞又は細胞株を、１つ以上の選択的生理学的特性に関しては同じ（実質的に同じであることを含む）になるように、同調させる可能性がある。この文脈における「同じ生理学的特性」は、選択的生理学的特性が、コレクション又はパネル中のメンバー間において十分に類似し、そのため細胞コレクション又はパネルが薬剤スクリーニングアッセイにおいて信頼できる結果、例えば細胞固有のばらつきよりも、異なる型のＮａＶを発現する細胞における試験化合物の異なる生物学的活性による、例えば薬剤スクリーニングアッセイおける読み出しのばらつきを生じることを意味する。例えば、細胞又は細胞株を、同じ成長速度、すなわち細胞コレクション又はパネル中のメンバー間において１、２、３、４、又は５時間を超える差のない成長速度を有するように同調させる可能性がある。このことは、例えば細胞を成長速度によって５、６、７、８、９、又は１０のグループに分類し、そして同じ分類グループ由来の細胞を用いてパネルを作出することによって達成される。細胞の成長速度を決定する方法は当該分野において周知である。パネル中の細胞又は細胞株を、同じＺ’ファクター（例えば差が０．１以内のＺ’ファクター）、ＮａＶ発現レベル（例えば５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は３０％を超える差のないＮａＶ発現レベル）、組織培養表面への付着などを有するように同調させる可能性がある。同調した細胞及び細胞株は、選択的生理学的特性を維持するように、例えば自動化並列処理によって達成される同一の条件下で生育させることができる。
【００５５】
本発明の同調した細胞パネルは、例えばＮａＶへの定義された活性を有する調節因子（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）の同定；異なる型のＮａＶにわたる化合物活性の分析；１つの型のＮａＶにのみ活性な調節因子の同定；及びＮａＶのサブセットのみに活性な調節因子の同定に用いることができる。本発明の同調した細胞パネルはハイスループットスクリーニングを可能にする。完了するまでに数ヶ月を要したスクリーニングを、今では数週間以内で完了させることができる。
【００５６】
本発明の細胞及び細胞株を作出するためには、例えば米国特許第６、６９２、９６５号及び国際公開第２００５／０７９４６２号に記載された技術を用いる事ができる。これら両方の文献は、参照することによりその全文が本明細書に組み込まれる。この技術は、所望される任意の数のクローン（数百から数千のクローン）である、何百万もの細胞のリアルタイムの評価を提供する。フローサイトメトリーによる細胞分類（例えばＦＡＣＳ機械を用いた）又は磁気を用いた細胞分類（例えばＭＡＣＳ機械を用いた）などの細胞分類技術を用いて、培養容器（９６ウェル培養プレートなど）中の１つのウェル当たりに１つの細胞が自動的に、高い統計的信頼度で入れられる。この技術の速度及び自動化は多重遺伝子組換え細胞株の単離を容易にすることができる。
【００５７】
この技術を用い、分子指標又は蛍光性プローブとも称されるシグナル伝達プローブを使用して、それぞれのＮａＶサブユニットに対するＲＮＡ配列を検出することができる。いくつかの実施形態においては、ＮａＶサブユニットをコードする配列を含有するベクターは、ＲＮＡタグ配列をコードするさらなる配列を有する。「タグ配列」は、発現されるＲＮＡ又はシグナル伝達プローブによって検出されるＲＮＡの一部分である核酸配列を意味する。シグナル伝達プローブは、上述したペプチド及びタンパク質タグをコードするＲＮＡを含む、タグをして使用される可能性のある様々なＲＮＡ配列のいずれかを検出し得る。タグ配列に相補する一部分を含むようにプローブを設計することにより、シグナル伝達プローブがタグに対するものになる可能性もある。タグ配列がＮａＶ転写産物と共に転写されるプラスミドの３’非翻訳領域で、及びシグナル伝達プローブが結合する標的配列を含む可能性がある。産生されるタンパク質にタグを付加することが望まれるかどうかに依存して、タグ配列が遺伝子のメッセージにおけるタンパク質をコードする部分にインフレーム、又はインフレームでなくなる場合がある。従って、シグナル伝達プローブによる検出においては、タグ配列が翻訳される必要はない。タグ配列は、シグナル伝達プローブがそれぞれの標的にハイブリダイズする、同じ又は異なる複数の標的配列を含んでいてもよい。タグ配列は目的とする遺伝子をコードするＲＮＡの中に局在してもよく、又はタグ配列は５’−若しくは３’−非翻訳領域中に局在してもよい。タグ配列は二次構造を有するＲＮＡであってもよい。この構造は、３アーム連結構造である可能性がある。いくつかの実施形態においては、シグナル伝達プローブはＮａＶサブユニットをコードする配列中の配列を検出する。
【００５８】
ＮａＶサブユニットをコードする配列、任意にタグ配列をコードする配列、及び任意に選択マーカーをコードする核酸、を含む核酸は、周知の方法によって選択された宿主細胞に導入される可能性がある。その方法には形質転換、ウイルスを用いた送達、タンパク質若しくはペプチドを介した挿入、共沈法、脂質を用いた送達試薬（リポフェクション）、サイトフェクション（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）を用いた送達、デンドリマー送達試薬、エレクトロポレーション又は機械的な送達が含まれるがこれらには限定されない。形質転換試薬の例としては、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ２、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ、ＧＥＮＥＳＨＵＴＴＬＥ、ＴＲＯＪＥＮＥ、ＧＥＮＥＳＩＬＥＮＣＥＲ、Ｘ−ＴＲＥＭＥＧＥＮＥ、ＰＥＲＦＥＣＴＩＮ、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ、ＳＩＰＯＲＴ、ＵＮＩＦＥＣＴＯＲ、ＦＵＧＥＮＥ  ６、ＦＵＧＥＮＥ  ＨＤ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２０、ＴＦＸ−５０、ＳＩＦＥＣＴＯＲ、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ１、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ２、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＥＸＰＲＥＳＳ、ＩＦＥＣＴ、ＲＮＡＩＳＨＵＴＴＬＥ、ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ、ＬＹＯＶＥＣ、ＬＩＰＯＴＡＸＩ、ＧＥＮＥＥＲＡＳＥＲ、ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ、ＣＹＴＯＰＵＲＥ、ＪＥＴＳＩ、ＪＥＴＰＥＩ、ＭＥＧＡＦＥＣＴＩＮ、ＰＯＬＹＦＥＣＴ、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＡＮＧＥＲ、ＲＮＡｉＦＥＣＴ、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ、ＴＦ−ＰＥＩ−ＫＩＴ、ＣＬＯＮＦＥＣＴＩＮ、及びＭＥＴＡＦＥＣＴＩＮＥが挙げられる。
【００５９】
ＤＮＡ構築物の細胞への導入及びその後の薬剤選抜（使用する場合）、又は続く上述の遺伝子活性化の後、それぞれが異なるタグ配列を標的とし、かつ、異なって標識されている分子指標（例えば蛍光性プローブ）が細胞に導入される場合があり、そしてそれらのシグナルに陽性な細胞を単離するためにフローサイトメトリー細胞分別機が用いられる場合がある（複数回の細胞分別が実施される場合がある）。１つの実施形態においては、フローサイトメトリー細胞分別機はＦＡＣＳ機械である。ＭＡＣＳ（磁気を用いた細胞分類）又はレーザーが使用可能な解析及び処理を用いた陰性細胞のレーザーでの除去もまた使用可能である。ハイスループットスクリーニングに適合するものを含めた、その他の蛍光プレートリーダーもまた使用可能である。シグナル陽性細胞は、それらのゲノム中に少なくとも１コピーの導入されたＮａＶ配列を取り込んでおり、及び融合した可能性がある。１以上のＮａＶサブユニットが導入された細胞が同定される。一例として、ＮａＶサブユニット配列が細胞中の異なる位置のゲノム中に融合される場合がある。ＮａＶサブユニットをコードする導入された遺伝子の発現レベルはコピー数又は融合部位に基づいて多様になる可能性がある。さらに、導入された遺伝子がエピソームである又は遺伝子活性化によって生じる、１以上のＮａＶサブユニットを含む細胞が得られる可能性もある。
【００６０】
本発明において有用なシグナル伝達プローブは当該分野において周知であり、そして通常は標的配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、そしてシグナル放出システムは、プローブが標的配列に結合しない場合にはいずれのシグナルも放出しないように準備されており、かつ、シグナルはプローブが標的配列に結合した場合に放出される。制限のない例として、シグナル伝達プローブは、消光剤と蛍光色素分子が共に、結合していないプローブ中に取り込まれるように、プローブ中に位置する蛍光色素分子と消光剤を含んでいてもよい。プローブと標的配列との間の結合に際しては、消光剤と蛍光色素分子が離れ、シグナルの放出を生じる。例えば国際公開第２００５／０７９４６２号には、本細胞及び細胞株の産生において使用可能な、数多くのシグナル伝達プローブが記載されている。前述の核酸を細胞に導入するための方法は、シグナル伝達プローブを導入するためにも使用可能である。
【００６１】
タグ配列が使用される場合、それぞれのＮａＶサブユニットのベクターは、同じまたは異なるタグ配列を含んでもよい。タグ配列が同じであっても又は異なっていても、それぞれのサブユニットの発現を個別に検出できるように、シグナル伝達プローブは異なる色の蛍光色素分子などの異なるシグナル放出体を含む場合がある。例としては、ＮａＶアルファサブユニットｍＲＮＡを特異的に検出するシグナル伝達プローブが赤色の蛍光色素分子を含み、第一のＮａＶベータサブユニットを検出するプローブは緑色の蛍光色素分子を含み、そして、第二のＮａＶベータサブユニットを検出するプローブが青色の蛍光色素分子を含む場合がある。当業者は、３重に形質転換した細胞においてシグナル伝達プローブを用いて３つのサブユニットの発現を別々に検出するその他の手段を理解するだろう。
【００６２】
１つの実施形態においては、シグナル伝達プローブは、ＮａＶサブユニットをコードするＲＮＡの一部分またはその５’若しくは３’非翻訳領域のいずれかに相補するように設計される。目的のＲＮＡのメッセンジャーを認識するように設計されたプローブが、誤って内生的に発現する標的配列を検出できる場合でさえも、形質転換細胞によって産生される目的の配列の割合と比較して、内生的に発現する標的配列の割合は細胞分別機が２つの細胞型を識別することができる程度である。
【００６３】
導入されたＮａＶサブユニットの発現レベルは細胞株毎に多様になる可能性がある。細胞株における発現レベルは、ＤＮＡメチル化などのエピジェネティックな変化並びに遺伝子抑制及び導入遺伝子のコピーの欠失によって、時間とともに減少する可能性がある。これらの変化の原因としては、例えば、細胞に取り込まれた導入遺伝子のコピー数、ゲノムにおける導入遺伝子が組み込まれた部位、及びゲノムに組み込まれた後の導入遺伝子の完全性などの様々な因子が考えられる。発現レベルの評価には、ＦＡＣＳを用いることができる。所望のレベルで導入されたＮａＶサブユニットを発現する細胞を、例えばＦＡＣＳによって単離することができる。例えば、細胞が最初に単離された任意の１つ以上のＲＮＡに対してまだ陽性であるか、及びどの程度陽性であるかを決定するために、先に生成した細胞又は細胞株にシグナル伝達プローブを再度使用することもできる。
【００６４】
３つ全てのＮａＶサブユニットを発現する細胞を単離した場合、所望の全てのサブユニットを安定して発現しているかを確認するために、それらを十分な長さの期間培養する場合がある。本発明の別の実施形態においては、細胞分別及び単一細胞の単離の前又は後に接着細胞を懸濁状態に適応させる場合がある。その他の実施形態においては、単離した細胞を個別に生育させてもよく、又は細胞集団を生じさせるためにプールしてもよい。また、単一の又は多重の細胞株を個別に生育させてプールしてもよい。細胞株のプールが所望の活性を産生する、又は所望の特性を有する場合、この効果を有する細胞株又は細胞株のセットを同定するまで、この細胞株をさらに分画する場合もある。プールしている細胞又は細胞株は、それぞれ個別に維持するための必要条件なしに、数多くの細胞株の維持を容易にする可能性がある。従って、細胞又は細胞株のプールにおいては陽性の細胞が濃縮される可能性がある。濃縮されたプールは、所望の特性または活性に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％陽性である可能性がある。
【００６５】
さらなる観点においては、本発明は、本発明の細胞及び細胞株の生産方法を提供する。１つの実施形態においては、この方法は、ａ）ＮａＶをコードするｍＲＮＡを発現している複数の細胞を準備する工程；ｂ）個々の細胞を個別の培養ベッセル中に分散させ、それにより、複数の別々の細胞培養を準備する工程；ｃ）それぞれの別個の細胞培養における条件が実質的に同一なことを特徴とする自動化された細胞培養法を用いて、一連の所望の培養条件下で細胞を培養する工程（この培養期間中、それぞれの別個の細胞培養における細胞数は均一化され、及び別個の培養は同じスケジュールで継代される）；ｄ）少なくとも１つのＮａＶタンパク質の所望の特徴（例えば安定な発現）について、少なくとも２回、別個の細胞培養をアッセイする工程；及びｅ）２回のアッセイの両方において所望の特徴を有する、別個の細胞培養を同定する工程を含む。
【００６６】
この方法に従って、細胞を一連の所望の条件下で培養する。条件はいずれの所望の条件であってよい。一連の培養条件にどの指標が含まれるかを当業者は理解するだろう。例えば、培養条件には、培地（基礎となる培地（ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、血清を含まない、血清を含む、完全に化学的に同定された、動物由来の成分を含まない）、一価及び二価イオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム）濃度、さらに添加される成分（アミノ酸、抗生物質、グルタミン、グルコース又はその他の炭素源、ＨＥＰＥＳ、チャネル遮断薬、その他の標的の調節因子、ビタミン、微量元素、重金属、補因子、増殖因子、抗アポトーシス試薬）、新しい又は馴化培地、ＨＥＰＥＳを含む、ｐＨ、特定の栄養素が枯渇した又は制限された（アミノ酸、炭素源））、分割／継代する前に細胞が達してもよい密集度のレベル、支持細胞層、又はガンマ線を照射した細胞、ＣＯ２、３成分ガス系（酸素、窒素、二酸化炭素）、湿度、温度、静置若しくはシェーカー上など当業者に周知の条件が含まれるがこれらには限定されない。
【００６７】
培養条件は、標準的に、又は特定の所望の細胞の利用によって選択される可能性がある。本発明は、特定の所望の利用に最適な細胞及び細胞株を有利に提供する。すなわち、特定の所望の利用への条件かで細胞を培養する本発明の実施形態においては、所望の特徴を有する細胞が所望の利用への条件下で選択される。例としては、細胞が付着することが所望される、プレート上でのアッセイに細胞用いられる場合、アッセイの条件下で付着を示す細胞が選択され得る。同様に、細胞をタンパク質産生に使用する場合、タンパク質産生に適した条件で細胞を培養し、そしてその利用において有利な特性を有する細胞を選択することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態においては、この方法は、別個の細胞培養における成長速度を測定するさらなる工程を含む。成長速度は、当業者に周知の様々な技術的手段のいずれを用いて決定され得る。それらの技術には、ＡＴＰ、細胞密集度、光散乱、吸光度（例えばＤＮＡにはＯＤ２６０が用いられる）、の測定が含まれるがこれらには限定されない。細胞が選択された培養条件外に置かれる時間を最小限にする手段を用いて成長速度を決定することが好ましい。
【００６９】
いくつかの実施形態においては、細胞密集度を測定し、その密集度の値から成長速度を算出する。いくつかの実施形態においては、信頼性を向上させるために、細胞密集度の測定に先立ち、細胞を分散させ、かつ、凝集を除去する。細胞を個別に分散させる手段は周知であり、例えば、測定する培養に分散試薬を添加することによって達成することができる。分散剤は周知であり、かつ、容易に入手可能である。分散剤には、トリプシンなどの酵素的分散剤、及びＥＤＴＡを用いた分散剤が含まれるがこれらには限定されない。ＨＡＭＩＬＴＯＮ  ＶＥＣＴＯＲなどの成長速度を算出するための市販されているソフトウェアを用いて、密集度のデータから成長速度を算出することができる。自動化された顕微的プレートリーダーを用いるなどの、自動化密集度測定は特に有用である。密集度を測定するプレートリーダーは市販されており、それらにはＣＬＯＮＥ  ＳＥＬＥＣＴ  ＩＭＡＧＥＲ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）が含まれるがこれには限定されない。典型的には、成長速度を算出する前に、少なくとも２回の細胞密集度の測定が行われる。成長速度の決定に用いられる密集度の値の数値は、標準的な又は培養に適したいずれの値になってもよい。例えば、１週間、２週間、３週間などの任意の期間にわたって、所望の頻度で密集度を複数回測定する場合がある。
【００７０】
成長速度が既知の場合、この方法に従って、成長速度の類似性によって複数の別個の細胞培養をいくつかの群に分類する。成長速度瓶によって培養を分類することにより、同じ群の培養を同時に操作することができ、それによって、培養間の多様性を減少させる別のレベルの標準化を提供することができる。例えば、瓶中の培養を同時に継代することができること、同時に所望の試薬で処理することができること、などである。さらに、機能分析の結果は、典型的にはアッセイウェル中の細胞密度に依存する。個々のクローンの真の比較は、それらを同じ密度で播種し、かつ、試験することによってのみ達成される。特定の成長速度コホートに分類することは、ハイスループット法においてクローンの機能的な特徴付けを可能にする、クローンの特定の密度での播種を可能にする。
【００７１】
それぞれの群における成長速度の範囲は、適切ないずれの範囲になる可能性がある。細胞を同時に継代できる、かつ、細胞数の頻繁は再均一化を避けることのできる成長速度を選択することが、特に有用である。狭い分類においては、成長速度の群は非常に狭い範囲、例えばそれぞれの平均倍加時間が１時間以内であること、を含むことができる。しかしこの方法によると、それぞれの範囲は最大２時間、最大３時間、最大４時間、最大５時間、若しくは最大１０時間、又はさらにそれを超える範囲であってもよい。いくつかの培養における細胞数がその他の培養よりも早く増加するように、瓶における成長速度が異なる場合、再均一化の必要性が生じる。瓶中の全ての培養における条件を実質的に同一に維持するために、瓶の細胞数を再均一化するために細胞を定期的に除去することが必要である。成長速度がより異なる場合には、より頻繁に再均一化することが必要とされる。
【００７２】
工程ｄ）においては、細胞及び細胞株は任意の生理学的特性を試験され、そしてその特性に基づいて選択され得る。任意の生理学的特性には、ゲノムによってコードされる細胞内プロセスにおける変化；ゲノムによって制御される細胞内プロセスにおける変化；染色体活性のパターンにおける変化；染色体抑制のパターンにおける変化；遺伝子抑制のパターンにおける変化；遺伝子活性化のパターン又は効果における変化；遺伝子発現のパターン又は効果における変化；ＲＮＡ発現にのパターン又は効果における変化；ＲＮＡｉ発現のパターン又は効果における変化；ＲＮＡプロセッシングのパターン又は効果における変化；ＲＮＡ輸送のパターン又は効果における変化；タンパク質翻訳のパターン又は効果における変化；タンパク質折りたたみのパターン又は効果における変化；タンパク質の配置パターン又は効果における変化；タンパク質修飾のパターン又は効果における変化；タンパク質輸送のパターン又は効果における変化；成長速度によって変化する、細胞表面への膜タンパク質の輸送のパターン又は効果における変化；細胞サイズの変化；細胞形状の変化；細胞形態における変化；％でのＲＮＡ含量の変化；％でのタンパク質含量の変化；％での水分含量の変化；％での脂質含量の変化；リボソーム含量の変化；ミトコンドリア含量の変化；ＥＲ量の変化；原形質膜表面積の変化；細胞体積の変化；原形質膜の脂質組成における変化；核膜の脂質組成における変化；原形質膜のタンパク質組成における変化；核膜のタンパク質組成における変化；分泌小胞の数の変化；リソソームの数の変化；液胞の数の変化；タンパク質生産、タンパク質分泌、タンパク質折りたたみ、タンパク質配置、タンパク質修飾、タンパク質の酵素的修飾、タンパク質グリコシル化、タンパク質リン酸化、タンパク質脱リン酸化、代謝産物生合成、脂質生合成、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、栄養素の吸収、細胞成長、有糸分裂、減数分裂、細胞分裂、脱分化するための、幹細胞へ導入するための、多能性細胞へ導入するための、全能性細胞へ導入するための、任意の組織型（すなわち、肝臓、肺、皮膚、筋肉、膵臓、脳、精巣、卵巣、血液、免疫系、神経系、骨、心血管系、中枢神経系、胃腸管、胃、甲状腺、舌、胆嚢、腎臓、鼻、眼、爪、頭髪、味蕾）の幹細胞へ導入するための、分化した任意の細胞型（すなわち、筋肉、心筋、ニューロン、皮膚、膵臓、血液、免疫、赤血球、白血球、キラーＴ細胞、腸内分泌細胞、味、分泌細胞、腎臓、上皮細胞、内皮細胞、核酸配列の導入に使用することができる動物またはヒトの既に挙げた任意の細胞型もまた含む）に導入するための、ＤＮＡを取り込むための、小分子を取り込むための、蛍光性プローブを取り込むための、ＲＮＡを取り込むための、固体表面に付着するための、血清を含まない条件に適応するための、血清を含まない懸濁条件に適応するための、大規模細胞培養に適応するための、大規模細胞培養に用いるための、創薬において使用するための、ハイスループットスクリーニングにおいて使用するための、細胞を用いた機能分析において使用するための、膜電位アッセイにおいて使用するための、レポーター細胞を用いたアッセイにおいて使用するための、ＥＬＩＳＡ試験において使用するための、インビトロアッセイにおいて使用するための、インビボでの適用において使用するための、二次的な試験において使用するための、化合物試験において使用するための、結合アッセイにおいて使用するための、パニングアッセイにおいて使用するための、抗体パニングアッセイにおいて使用するための、画像解析において使用するための、顕微鏡画像解析において使用するための、マルチウェルプレートにおいて使用するための、自動化細胞培養に適応させるための、小型自動化細胞培養に適応させるための、大規模自動化細胞培養に適応させるための、マルチウェル（６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６又はそれより高い密度の）プレートにおける細胞培養に適応させるための、細胞チップにおいて使用するための、スライド上で使用するための、スライドグラス上で使用するための、スライド又はスライドグラス上のマイクロアレイ用の、生物学的生産において使用するための、及び研究用試薬の生産において使用するための、細胞の容量若しくは能力における変化、が含まれるがこれらには限定されない。
【００７３】
本発明の細胞及び細胞株及び／又は本発明の同調したパネルの特徴付けに用いることができる試験には、アミノ酸解析、ＤＮＡシークエンス、タンパク質シークエンス、ＮＭＲ、タンパク質輸送の試験、核原形質輸送の試験、タンパク質の細胞内局在の試験、核酸の細胞内局在の試験、顕微鏡的解析、超顕微鏡的解析、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、レーザーアブレーション技術、細胞数の計測及び透析が含まれるがこれらには限定されない。当業者は、上に挙げた任意の試験の利用方法を理解するだろう。
【００７４】
成長速度の測定の前に細胞又は細胞株が個別の培養に分散される限りにおいて、本方法によって、細胞をいずれの細胞培養の形式において培養することができる。例えば、便宜的には、最初は所望の条件下で細胞をプールしておき、その後個々の細胞を１ウェル又は１ベッセル当たり１細胞になるように分離することができる。いずれの都合のよい数のウェルを有するマルチウェル組織培養プレート中で細胞を培養することができる。それらのプレートは容易に業者から入手可能であり、当業者においては周知である。いくつかの例においては、好ましくは、細胞はバイアル又はその他の任意の適した形式中で培養される可能性がある。様々な形式が当業者に知られており、そして容易に業者から入手できる。
【００７５】
成長速度を測定する工程を含む実施形態においては、成長速度の測定に先立って、細胞が培養条件に適応するのに十分な期間、細胞を培養する。当業者においては理解されるように、その期間は細胞型、選択された条件、培養形式によって多様になり、かつ、１日から数日、１週間以上のいずれの長さの期間になってもよい。
【００７６】
好ましくは、複数の別個の細胞培養におけるそれぞれの個別の培養は、標準化された維持スケジュールを含む、以下で議論された実質的に同一な条件で維持される。本発明の別の有利な特徴は、一連の所望の特性、それが非常に稀少であったとしても、を有する細胞が同定できるように、同時に数多くの個別の培養を維持できることである。それら及びその他の理由から、本発明では、それぞれのウェルにおいて条件が実質的に同一になるように、自動化された細胞培養を用いて複数の別個の細胞培養を培養する。自動化された細胞培養は、手動での細胞培養に不随する避けることのできないばらつきを防ぐ。
【００７７】
本発明の方法においては、いずれの自動化細胞培養システムをも使用してもよい。数多くの自動化細胞培養システムが市販されており、また当業者に周知である。いくつかの実施形態においては、自動化されたシステムはロボットによるシステムである。好ましくは、システムは、それぞれ独立して動くチャネル、マルチチャネルヘッド（例えば９６の先端を有するヘッド）及びグリッパー又はチェリーピッキング（良いものだけを選択する）アーム並びに処理中の無菌性を維持するためのＨＥＰＡフィルター装置を含む。ピペッター中のチャネルの数は培養の形式に適したものである必要がある。標準的なピペッターは、例えば、９６又は３８４のチャネルを有する。それらのシステムは周知であり、かつ、市販されている。例えば、ＭＩＣＲＯＬＡＢＳＴＡＲ（商標）装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を本発明の方法において使用しても良い。自動化されたシステムは、様々な所望の細胞培養の作業を行うことができる。それらの作業は当業者に周知である。それらには培地の除去、培地の交換、試薬の添加、細胞の洗浄、洗浄液の除去、分散剤の添加、培養ベッセルからの細胞の除去、培養ベッセルへの細胞の添加、などが含まれるがこれらには限定されない。
【００７８】
本発明の細胞又は細胞株の生産はいずれの数の別個の細胞培養を含んでもよい。しかしながら、本発明によってもたらされる利点は、細胞の数が多くなるほど増加する。理論的には、本発明で扱うことのできる細胞又は別個の細胞培養の数の上限はない。本発明によれば、別個の細胞培養の数は２つ以上であってよく、より有利には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上、例えば少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも４８、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも９６、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも３８４、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００又はそれ以上の別個の細胞培養となる。
【００７９】
所望の特性（例えば適切なレベルで所望のＲＮＡを発現している）を有する細胞集団の混合からの単離及び再単離の容易性は、薬剤選択圧のない、又は薬剤選択圧が最小限下での細胞株の維持を可能にする。選択圧は、所望の配列又は特性を有する細胞を選択するために細胞培養に適用され、通常は、目的のポリペプチドの発現と相当する選択剤または圧への耐性を細胞に付与する選択マーカーの発現とを関連させることによって達成される。抗生物質での選択には、抗生物質（例えばピューロマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシンなど）の使用が含まれるがこれらは限定されない。非抗生物質での選択には、栄養枯渇の使用、選択温度への暴露、変異原性条件への暴露及び、蛍光マーカーの発現、ここで選択マーカーは例えばグルタミン合成酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ウアバイン、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はＧＦＰなどの蛍光タンパク質であってもよい、が含まれるがこれらには限定されない。本発明のこの観点においては、培養における細胞に、これらの選択工程は適用されない。いくつかの好ましい実施形態においては、本発明の細胞及び細胞株はいずれの選択圧のない培養中で維持される。さらなる実施形態においては、細胞及び細胞株はいずれの抗生物質も含まずに維持される。本明細書で使用される場合、細胞の維持とは、例えば細胞分別を介してＮａＶの発現を指標に細胞を選択したあとに、細胞を培養することを意味する。維持は、細胞分別に先立って、選択薬剤（例えば抗生物質）中で細胞を生育させるさらなる工程、ここで細胞内に導入された薬剤選択マーカーは混合された集団において安定な形質転換体を濃縮することを可能にする、を意味しない。
【００８０】
薬剤を含まない細胞の維持は数多くの利点を提供する。導入遺伝子の有無に関わらず、選択が薬剤耐性遺伝子を取り込んだ細胞の生存に依存するために、例えば薬剤耐性細胞は、必ずしも共に導入された目的の導入遺伝子を適切なレベルでは発現しない。さらに、選択薬はしばしば変異原性であり、又はそうでなくても細胞の生理を干渉し、細胞を用いたアッセイにおいて偏った結果を生じる。例えば、選択薬はアポトーシスへの感受性を低下させ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（３７）：１１１６９〜１１１７８  （１９９７））、ＤＮＡ修復及び薬剤代謝を上昇させ（Ｄｅｆｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８（１３）：３５９５〜３６０２（１９８８））、細胞のｐＨを上昇させ（Ｔｈｉｅｂａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３８（５）：６８５〜６９０（１９９０）；Ｒｏｅｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２（４１）：１１０４２〜１１０５６（１９９３）；Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９１（３）：１１２８〜１１３２（１９９４））、リソソーム及びエンドソームのｐＨを低下させ（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３５（９）：２８１１〜２８１７（１９９６）；Ａｌｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８７（１０）：１５８３〜１５９８（１９９８））、原形質膜の電位を低下させ（Ｒｏｅｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２（４１）：１１０４２〜１１０５６（１９９３））、塩化物（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．７１（１）：２３〜３２（１９９２））及びＡＴＰ（Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０（１）：３１２〜３１６（１９９３））の原形質膜伝導を上昇させ、及び小胞輸送率を上昇させる（Ａｌｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６（８）：４４３２〜４４３７（１９９９））可能性がある。一般的に使用される非抗生物質選択マーカーであるＧＦＰは、特定の細胞においては細胞死を誘導する可能性がある（Ｈａｎａｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（１１）：１３１３〜１３１９（１９９７））。従って、本発明の細胞及び細胞株は選択薬又はマーカーによって引き起こされるいずれの人工物を含まないスクリーニングアッセイを可能にする。いくつかの好ましい実施形態においては、濃縮された細胞集団を用いて分別を開始しなくとも所望の特性を有する細胞が単離されるように、細胞を細胞分別の前又は後に抗生物質などの選択薬を含まない培養においては培養しない。
【００８１】
別の観点においては、本発明は、本発明の細胞及び細胞株に使用方法を提供する。本発明の細胞及び細胞株は、機能的なＮａＶサブユニット又は完全なＮａＶイオンチャネルが必要とされるいずれの適用においても用いることができる。細胞及び細胞株は、例えば、細胞を用いたインビトロアッセイ若しくは例えばＮａＶ調節因子のスクリーニングなどの、細胞が動物（例えば非ヒト哺乳類）に組み込まれた場合のインビボアッセイ；結晶学及び結合試験のためのタンパク質生産；並びに化合物の選択性と投与、受容体／化合物結合動態と安定性、及び細胞生理（例えば電気生理学的、タンパク質輸送、タンパク質折りたたみ、及びタンパク質制御）における受容体発現の効果の調査において用いられ得る。本細胞及び細胞株は、特定のＮａＶサブユニットの機能を試験するためのノックダウン試験においてもまた用いられ得る。
【００８２】
アルファ及びベータサブユニットの様々な組み合わせ（例えば天然に生じるヘテロ三量体又は非天然に生じるヘテロ三量体）を発現する細胞株を、特定のＮａＶに特異的な、ＮａＶの特定のサブユニット、又はＮａＶサブユニットの特定の組み合わせのものを含むＮａＶ調節因子を同定するために、及び個別のサブユニットの活性についての情報を得るために別個に又はコレクションとして共に用いることができる。本発明は、特定の修飾された形体に特異的な調節因子の使用方法をもまた提供する。それらの情報は、ＮａＶが天然に生じる修飾された形体かどうかを決定するために有用となる可能性がある。本細胞及び細胞株の使用は、異なる形体のＮａＶが異なるＮａＶの病理に関与しているのかどうかの決定を補助する可能性があり、そして特に標的とされているＮａＶ関連病理における疾患又は組織特異的ＮａＶ調節因子の選抜を可能にする。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「調節因子」は、少なくとも１つのＮａＶサブユニットに関する調節活性を有する、いずれの基質又は化合物をも含む。調節因子は、部分的アゴニスト若しくはアンタゴニスト、選択的アゴニスト若しくはアンタゴニスト及び逆作動薬を含むＮａＶアゴニスト（増強剤若しくは活性化剤）又はアンタゴニスト（阻害剤若しくは遮断薬）であってもよく、及びアロステリックな調節因子であってもよい。基質又は化合物は、それらの調節活性がたとえ異なる条件又は濃度下では変化するとしても、調節因子である。本発明のいくつかの観点においては、調節因子はイオンチャネルの選択性を変化させる。例えば、調節因子はどのイオンがイオンチャネルを通過できるかに影響を及ぼす可能性がある。
【００８４】
ＮａＶ調節因子を同定するために、ＮａＶが機能すると予測される条件下で本発明の細胞株を試験化合物に曝露し、適切な対照と比較して、例えば試験化合物と接触させていない細胞株からの細胞と比較して、ＮａＶ活性における統計学的に有意な変化（例えばｐ＜０．０５）を検出することができる。それとはまた別に又は加えて、既知のアゴニスト又はアンタゴニストを用いたポジティブ及び／又はネガティブコントロール、異なる組み合わせのＮａＶサブユニットを発現している細胞を用いてもよい。いくつかの実施形態においては、検出される及び／又は測定されるＮａＶ活性は、膜脱分極、膜電位における変化、又はそれら膜の変化によって生じる蛍光である。
【００８５】
いくつかの実施形態においては、本発明の１以上の細胞株は複数の試験化合物、例えば試験化合物のライブラリーに曝露される。１つ以上の調節因子を同定するために、本発明の細胞株を用いて試験化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。試験化合物は小分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣剤、抗体又はその抗原結合部位を含む化学的部分であってもよい。抗体の場合、それらは非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体であってよい。抗体は、重及び軽鎖又は抗原結合部位（抗体断片（例えばＦａｂ及びＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂなど）、単一のサブユニット抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、重若しくは軽鎖の全て若しくは１つの抗原結合部位を含む）の完全な相補を含む完全抗体であってもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態においては、試験化合物に暴露する前に、例えば、哺乳類又はその他の動物の酵素、植物の酵素、細菌の酵素、タンパク質修飾酵素及び脂質修飾酵素、並びに口腔、胃腸管、胃若しくは唾液の酵素を含む、酵素用いた前処理によって細胞を改変する場合がある。それらの酵素には、例えばキナーゼ、プロテアーゼ、フォスファターゼ、グリコシダーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ハイドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどが含まれる可能性がある。例えばいくつかの実施形態においては、トリプシン又はフューリンなどの少なくとも１つのタンパク質分解酵素によって細胞を前処理する。それとはまた別に、細胞をまず最初に試験化合物に暴露し、その後、処理することによってＮａＶの修飾を変化する化合物を同定するために、処理する場合もある。
【００８７】
いくつかの実施形態においては、ＮａＶ調節活性を指標にして、大規模な化合物コレクションの細胞を用いた機能的なハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）、例えば９６、３８４、１５３６又はそれよりも高い密度のウェルを用いた形式の、を実施する。ＨＴＳスクリーニングによって得られた当たりを、続いて機能を確認するためのさらなるアッセイ（例えば、その化学構造の決定、活性及び特異性を最適化するための構造的に関連した化合物の試験、及び動物モデルにおけるさらなる試験）において試験する。いくつかの実施形態においては、ヒトの疾患及び状態の治療におけるそれらの有用性を評価するために、調節因子の治療上の可能性を動物モデルにおいて試験する。ヒトの疾患及び状態には癲癇、周期性四肢麻痺、心疾患、ＣＮＳ疾患、運動失調、及び痛み（慢性又は急性）、痛みを感じる機能の低下が含まれるがこれらには限定されない。例としては、痛みを低下させる又は除去する鎮痛剤として使用するためのＮａＶ１．７アンタゴニストを同定するために、本発明のヒトＮａＶ１．７を発現する細胞株を用いることができる。
【００８８】
本発明のこれら及びその他の実施形態を、以下の限定されない実施例においてさらに説明する。
【００８９】
実施例
実施例１
ＮａＶ１．７ヘテロ三量体を安定して発現する細胞株の作出
発現コンストラクトの作出
ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びこれに含まれるＣＭＶ及びＳＶ４０真核プロモーター；ＳＶ４０及びＨＳＶ−ＴＫポリアデニル化配列；複数のクローニング部位；コザック配列；並びにネオマイシン／カナマイシン耐性カセット（又はアンピシリン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン耐性カセット）などの目的の遺伝子の転写及び翻訳に必要な様々な要素に基づいて、最新式のクローニングを可能にするプラスミド発現ベクターをクローニングした。
【００９０】
細胞株の作出
ヒトＮａＶ１．７αサブユニット（配列番号１３）をコードするプラスミド、ヒトＮａＶ１．７β１サブユニット（配列番号１６）をコードするプラスミド及びヒトＮａＶ１．７β２サブユニット（配列番号１７）をコードするプラスミドの３つの別個のプラスミドを、標準的な方法を用いて２９３Ｔ細胞に共に導入した（核酸を宿主細胞に導入するために用いられ得る試薬の例にはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＴＦＸ（商標）試薬、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ又はＦＥＣＴＵＲＩＮ（商標）が挙げられるがこれらには限定されない）。
【００９１】
本発明の細胞又は細胞株の作出においては、薬剤を用いた選抜は任意選択であるが、１つのプラスミドにつき１つの薬剤耐性マーカーを組み込んだ。この配列はＣＭＶプロモーターの制御下にあった。シグナル伝達プローブによる検出のための標的配列をコードする非翻訳配列もまた、薬剤耐性マーカーをコードする配列と共に存在した。用いられた標的配列は、標的配列１（配列番号１）、標的配列２（配列番号２）及び標的配列３（配列番号３）であった。この実施例においては、ＮａＶ１．７αサブユニット遺伝子含有ベクターには標的配列１（配列番号１）を、ＮａＶ１．７β１サブユニット遺伝子含有ベクターには標的配列２（配列番号２）を、及びＮａＶ１．７β２サブユニット遺伝子含有ベクターには標的配列３（配列番号３）を含めた。
【００９２】
形質転換細胞をＤＭＥＭ−ＦＢＳ培地中で２日間、その後抗生物質を含むＤＭＥＭ−ＦＢＳ培地中で１０日間生育させた。抗生物質を含む期間においては、ピューロマイシン（０．１μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及びゼオシン（２００μｇ／ｍｌ）の抗生物質を培地に添加した。
【００９３】
抗生物質を使用した濃縮の後、選択された期間中は安定でなかった発現に要する時間を落ち着かせるために、細胞を抗生物質による選択のない条件で６〜１８回継代した。
【００９４】
細胞を回収し、シグナル伝達プローブ（配列番号４、５、３４）を用いて標準的な方法で形質転換した。（核酸を宿主細胞に導入するために使用され得る薬剤の例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＴＦＸ（商標）試薬、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ又はＦＥＣＴＵＲＩＮ（商標）が挙げられるがこれらには限定されない。）
【００９５】
シグナル伝達プローブ１（配列番号４）は標的配列１（配列番号１）に結合し；シグナル伝達プローブ２（配列番号５）は標的配列２（配列番号２）に結合し；及びシグナル伝達プローブ３（配列番号３４）は標的配列３（配列番号３）に結合した。細胞をその後分離し、解析のために回収し、そして蛍光活性化細胞分別器を用いて分類した
【００９６】
シグナル伝達プローブによって検出される標的配列
以下の配列はＮａＶ１．７サブユニット導入遺伝子のために用いられた。
【００９７】
標的配列１
５’−ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１）（ＮａＶ１．７αサブユニット）
【００９８】
標的配列２
５’−ＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣｇｔｔｃｔｇｃｇａｃ−３’（配列番号２）（ＮａＶ１．７β１サブユニット）
【００９９】
標的配列３
５’−ＧＴＴＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号３）（ＮａＶ１．７β２サブユニット）
【０１００】
シグナル伝達プローブ
１００μＭのストックとして提供された。
【０１０１】
シグナル伝達プローブ１−このプローブは標的配列１に結合する。
５’−Ｃｙ５ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧＣＢＨＱ３クエンチ−３’（配列番号４）
【０１０２】
シグナル伝達プローブ２−このプローブは標的配列２に結合する。
５’−Ｃｙ５．５ＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＣＧＣＢＨＱ３クエンチ−３’（配列番号５）
【０１０３】
シグナル伝達プローブ３−このプローブは標的配列３に結合する。
５’−ＦａｍＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＣＢＨＱ１クエンチ−３’（配列番号３４）
【０１０４】
シグナル伝達プローブ１及び２中のＢＨＱ３はＢＨＱ２又は金粒子に置き換えることができる。シグナル伝達プローブ３中のＢＨＱ１はＢＨＱ２、金粒子、又はＤＡＢＣＹＬに置き換えることができる。
【０１０５】
加えて、特定の実施例においては、Ｃｙ５と類似のスペクトル特性を有するＱｕａｓａｒ（登録商標）Ｄｙｅ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）を用いたプローブを使用した。いくつかの実施例においては、ＤＮＡプローブよりも、５−ＭｅｄＣと２−ａｍｉｎｏｄＡとのミクスマープローブを用いた。
【０１０６】
バックグラウンドよりも蛍光を発している細胞をゲーティングし、規定したゲートに落ちた細胞を直接９６ウェルプレートに単離するために、標準的な解析法を用いた。１つのウェルに単一の細胞が沈殿するように、フローサイトメトリーを用いて細胞分別を操作した。選別の後、細胞を薬剤を含まない培地に広げた。以下のゲーティング段階を用いた。
ゲーティングの一致→一重ゲート→ゲーティングの確認→ＦＡＭ対Ｃｙ５：生存細胞の０．１〜１．０％プロットにおけるゲーティングの分類
【０１０７】
数多くの細胞を得るために、上述の工程を繰り返した。上述の工程を独立して少なくとも４回行った。また、それぞれの回において、工程中に含まれる細胞継代及び単離を少なくとも２回行った。
【０１０８】
プレートをＭｉｃｒｏｌａｂｓｔａｒ自動分注システム（ＨａｍｉｌｔｏｎＲｏｂｏｔｉｃｓ）に移動した。細胞を新しい完全成長培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）の１：１混合物中で５〜７日間、その後、１００単位／ｍｌのペニシリンと０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した馴化成長培地で２〜３日間インキュベートした。その後、凝集を最小限にするために細胞をトリプシン処理によって分散させ、そして新しい９６ウェルプレートに移動した。クローンを分散した後、ウェル中の密集度を決定するためにプレートの画像を取得した（Ｇｅｎｅｔｉｘ）。プレート全体にわたって信頼性のある画像を取得するために、それぞれのプレートに焦点を合わせた。７０％を超えると報告された密集度は信頼性がない。密集度を、毎日３回９日間にわたって（すなわち分散の後、１日から１０日の間）測定し、そして成長速度の算出に用いた。
【０１０９】
工程７における分散工程の後、１０〜１１日間の成長速度により、細胞を瓶に分類した（コホートのように、独立してグループ分けし、配置した）。以降の操作のために、瓶をそれぞれ独立して回収し、個々の９６ウェルプレート中に入れた。いくつかの成長瓶は１つ以上の９６ウェルプレートに入れられた。瓶は、成長速度の拡散の検討及び細胞集団の総数が高いパーセンテージの細胞集団をまとめることによって算出した。工程５に記載した分類の繰り返しによって、５〜９日の成長瓶は１〜４日のものとは区別して使用した。さらに、繰り返しに依存して、それぞれの瓶は成長速度又は倍加時間が８〜１４．４時間である集団に相当した。
【０１１０】
細胞の倍加時間は１日未満から２週間以上になる可能性がある。同時に成長速度によって適正に瓶に分類できる最も差のあるクローンを処理するためには、それぞれの瓶当たり、倍加時間が０．２５から０．７日である、３〜９の瓶を用いることが好ましい。当業者は、瓶の厳密性及び瓶の数を特定の状況に応じて調整可能なこと、及び瓶の厳密性及び数を細胞が細胞周期に同調した場合には、さらに調節可能なことを理解するだろう。
【０１１１】
プレートを抗生物質を含まないＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培地中で、標準的かつ固定した条件（加湿、３７°Ｃ、５％ＣＯ２）下でインキュベートした。細胞のプレートを、４セットの標的プレートにするために分割した。最初のセットの４つの複製になるように、これら４セットのプレートには全ての成長瓶の全てのプレートが含まれた。最大３の標的プレートセットを凍結保存し（工程１０に記載）、そして残りのセットを拡大して、継代及び希望アッセイ実験用に、さらなる複製プレートを作成した。以降のプレートの複製には、別個の、かつ、独立した培養試薬、インキュベーター、担当者、及び二酸化炭素源を用いた。適正な生産及び全ての組織培養試薬の品質を確認するために、品質管理工程を設けた：１つの決められたフード内において、決められた担当者が使用のために準備された培地のそれぞれのボトルにそれぞれの構成要素を加えるようにし、その間１つの構成要素のみがフード内にあり、２番目の担当者がミスを防ぐために監視した。液体操作のための条件は、ウェル間の状態二次感染を除くように設定した。全ての工程において新しいチップを用い、又はストリンジェントなチップ洗浄プロトコールを用いた。正確な用量の移動、効果的な細胞操作、洗浄工程、ピペット操作の速度及び位置、細胞を分散させるためのピペット操作の回数、並びにプレートに対する相対的なチップの位置において液体操作条件を設定した。
【０１１２】
３セットのプレートを−７０〜−８０°Ｃで凍結した。それぞれのセットにおけるプレートの最初の密集度は７０〜８０％に達する場合があった。培地を吸引し、９０％ＦＢＳと５％〜１０％のＤＭＳＯを添加した。プレートをパラフィルムで密閉し、１〜５ｃｍの発泡体でそれぞれを個別に覆い、その後−８０°Ｃの冷凍庫に保存した。
【０１１３】
残りのセットのプレートは工程９に記載したように維持した。培地の除去、細胞洗浄、トリプシンの添加とインキュベーション、クエンチ、及び細胞分散工程を含む全ての細胞分割は自動液体分注装置を用いて行った。いくつかのアッセイにおける細胞を播種する工程においては、トリプシンよりも、細胞分離用緩衝液（例えばＣＤＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ又はＣｅｌｌＳｔｒｉｐｐｅｒ、ＣｅｌｌＧｒｏ）を用いて細胞を分離した。
【０１１４】
全ての細胞集団における同調性及び細胞の均一化、並びに培養条件を制御した。成長速度の僅かな差が原因のプレート間の差は、２〜８回の継代毎の定期的な標準化によって制御した。細胞集団から分離したものは検出し次第除去した。
【０１１５】
細胞のインビトロでの増殖を可能にするように、細胞をこれらの条件下で３〜８週間維持した。この期間の間に、サイズ、形態、脆弱性、トリプシン処理又は分離への反応、分離後の丸さ／平均円形度、生存率（パーセンテージ）、微小密集度への傾向、又は培養プレート表面への付着などのその他の細胞維持の観点を観察した。
【０１１６】
機能基準を用いて細胞集団を試験した。膜電位アッセイキット（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ／ＭＤＳ）を製造業者による使用方法に従って用いた。複数の異なる密度、９６又は３８４ウェルの、プレート中で細胞を試験し、反応を解析した。細胞をプレートに播種した後の様々な時点、例えば播種後１２〜４８時間、において試験を行った。反応の差のアッセイを行うために、異なる密度での播種もまた用いた。
【０１１７】
３〜９週間の範囲の規定された期間の間、最も一定して反応した細胞を同定するために、低い及びより高い継代回数で行った実験から得られた機能的反応を比較した。期間経過の間に変化した、その他の細胞の特徴もまた記録した。
【０１１８】
生存率が高く、安定で、そして機能的な細胞株を生産するのに最も適当な細胞集団を決定するために、機能及びその他の基準を満たした細胞集団のさらなる評価を行った。選択した細胞集団をより大きな組織培養ベッセルに拡大し、上述した特徴付けの工程をこれらの条件下で続け、又は繰り返した。この時点では、一定で信頼性のある継代を行うために、異なる細胞密度での播種；継代の時間；培養ディッシュ（サイズ／形状及びコーティング）；流動性の最適化；細胞分離の最適化（例えば型、用いる体積、及び期間の長さ）；及び洗浄工程などのさらなる工程を加えた。温度の差もまた均一化のために用いた（すなわち３０°Ｃ対３７°Ｃ）。
【０１１９】
加えて、それぞれの継代において、細胞の生存性を決定した。操作的介入を増加させ、細胞を近くから観察し、そしてモニターした。所望の特性を保持する細胞株の同定及び最終的な選択を補助するために、この情報を用いた。一定した成長、適切な付着、及び機能的反応を示す最終的な細胞株及び予備の細胞株を選択した。
【０１２０】
最終的な細胞株及び予備の細胞株に相当する、上述の継代した回数が少ない凍結したプレートを３７℃で溶解し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳを用いて２回洗浄し、そして湿潤、３７°Ｃ／５％ＣＯ２条件でインキュベートした。この細胞をその後、２〜３週間の期間をかけて拡大した。最終的な細胞株及び予備の細胞株それぞれにつき、１５〜２０本のバイアルからなる細胞バンクを構築した。
【０１２１】
細胞株が生存可能であり、安定であり、かつ、機能的であるかを確認するために、以下の工程もまた実施した。細胞バンク由来の少なくとも１本のバイアルを溶解し、培養中に拡大した。それらが本来選択されたものと同じ特徴を満たすがどうかを決定するために、得られた細胞を試験した。
【０１２２】
実施例２
ＮａＶ１．７を安定して発現する細胞株における、異種ＮａＶ１．７サブユニットの相対的な発現の解析
作成したＮａＶ１．７を安定して発現する細胞株における、異種ヒトＮａＶ１．７α、β１、及びβ２サブユニットの相対的な発現を決定するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いた。ＲＮＡ抽出用キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１〜３ｘ１０６の哺乳類細胞からトータルＲＮＡを精製した。ＤＮアーゼ処理プロトコール（ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）に厳密に従って、ＤＮアーゼ処理を行った。逆転写酵素キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、２０μＬ反応液中に１μｇのＤＮＡを含まないトータルＲＮＡと２５０ｎｇのランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えてファーストストランドｃＤＮＡ合成を行った。逆転写酵素を含まない試料とＲＮＡを含まない試料をこの反応におけるネガティブコントロールとして用いた。２５°Ｃ５分、５０°Ｃ６０分の条件でサーマルサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて合成を行い、反応の停止は７０°Ｃに１５分間置くことにより行った。
【０１２３】
遺伝子発現解析用には、標的配列（配列番号１〜３）に特異的にアニーリングするｑＲＴ−ＰＣＲ（ＭＧＢ  ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用のプライマー及びプローブを設計した。試料の標準化のためには、対照（グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ））及びＰｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＴａｑＭａＮ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ネガティブコントロール及びポジティブコントロール（プラスミドＤＮＡ）を含め、５０μＬ液中に４０ｎｇのｃＤＮＡ加えた反応を、３セット準備した。発現している３つのＮａＶ１．７サブユニットそれぞれの相対量を決定した。図１に示されるように，３つ全てのサブユニットが、作成したＮａＶ１．７を安定して発現する細胞株において成功裏に発現した。
【０１２４】
実施例３
電気生理学的アッセイを用いた、天然のＮａＶ機能に対するＮａＶ１．７を安定して発現する細胞株の機能解析
自動化パッチクランプシステムを用いて、作成したＮａＶ１．７α、β１、及びβ２サブユニットを発現する安定なＨＥＫ２９３Ｔ細胞株からのナトリウム伝導を記録した。以下に示したプロトコールは、ＱＰａｔｃｈ、Ｓｏｐｈｉｏｎ又はＰａｔｃｈｌｉｎｅｒ、Ｎａｎｉｏｎシステムにおいてもまた使用することができる。細胞外のリンガー液には１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、２．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１ｍＭ  グルコース及び５ｍＭ  ＨＥＰＥＳが含まれ、室温におけるｐＨは７．４だった。細胞内のリンガー液には１２０ｍＭ  ＣｓＦ、２０ｍＭ  Ｃｓ−ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳが含まれ、ｐＨは７．２であった。実験は室温において行った。
【０１２５】
ＮａＶ１．７α、β１、及びβ２サブユニットを安定して発現する細胞を、実施例１に記載したような標準的な培養プロトコールで培養した。細胞を回収し、パッチに関わる質又は能力には有意な変化を生じない状態で、撹拌を続けながら４時間まで懸濁液中に保存した。標準的なパッチプレートを用いて電気生理学的実験（ホールセル）を行った。パッチクランプの孔（微小なチップ中の孔）は直径が約１μｍであり、〜２ＭΩの抵抗をもつ。−１００ｍＶの電位を保持するように、膜電位が固定される。
【０１２６】
電流電圧関係及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で安定に発現する電位依存性ヒトＮａＶ１．７ナトリウムチャネルの不活性化特性を図３Ａ〜Ｃに示した。図３Ａは、−８０ｍＶから＋５０ｍＶでの２０ｍｓの脱分極パルスに反応した、ナトリウムの流入を示す。保持電位は−１００ｍＶであった。図３Ｂは、最大のナトリウムチャネル流入での、生じた電流電圧（Ｉ−Ｖ）関係を示す。活性化閾値は−３５ｍＶ（活性化の中間点、Ｖａ＝−２４．９ｍＶ＋／−３．７ｍＶ）、及び最大の流入振幅を−１０ｍＶで得た。図３Ｃは、ナトリウムチャネルの不活性化グラフを示す。膜電位を−１００ｍＶの保持電位に固定し、続いて１０００ｍｓのために−１１０ｍＶから＋１０ｍＶまでの範囲の調節電位に転換し、そして最終的に流入を０ｍＶまで工程毎に測定した。得られた流入振幅は、不活性化状態におけるナトリウムチャネルの画分を表す。−８５ｍＶ未満のよりマイナスの電位では、チャネルは主に閉じた状態であり、−５０ｍＶより高い電位ではチャネルは主に不活性な状態である。カーブはボルツマン分布を示し、これにより、定常状態不活性化におけるＶ１／２は−７４ｍＶになると予測した。作出したＮａＶ１．７を安定して発現する細胞株における電流電圧プロファイルは、既に報告されている電流電圧プロファイル（Ｖａ＝−２８．０ｍＶ±１．１ｍＶ；Ｖ１／２＝−７１．３ｍＶ±０．８ｍＶ）（Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５８１（Ｐｔ３）：１０１９〜１０３１．（２００７））と一致した。
【０１２７】
実施例４
膜電位アッセイを用いた、天然のＮａＶ機能に対するＮａＶ１．７を安定して発現する細胞株の機能解析
作成したＮａＶ１．７α、β１、及びβ２サブユニットを発現する安定した細胞を、標準的な条件下で、１０％ウシ胎仔血清、グルタミン及びＨＥＰＥＳを加えたダルベッコ改変イーグル培地を用いて維持した。アッセイを行う前日に、例えばＣＤＢ（ＧＩＢＣＯ）又はｃｅｌｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｒ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）などの細胞分離緩衝液を用いて保存プレートから細胞を回収し、そして増殖培地を加えた３８４ウェルプレートに、１ウェル当たり１０，０００〜２５，０００個の細胞を播種した。アッセイプレートを、３７°Ｃの細胞培養インキュベーター中、５％ＣＯ２条件下で２２〜２４時間維持した。その後アッセイプレートから培地を除去し、そしてロードバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  グルコース）で希釈した青色蛍光膜電位色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を加えた。細胞を青色蛍光膜電位色素と共に１時間、３７℃でインキュベートした。アッセイプレートをその後、ハイスループット蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｓｔｕ  ＦＤＳＳ）にセットした。この蛍光プレートリーダーは、セルプレートの画像における細胞の蛍光を１秒に１回測定し、そしてそのデータを相対的な蛍光単位として表示する。
【０１２８】
図４は、緩衝液及びチャネル活性化剤（すなわちベラトリジン及びサソリ毒（ＳＶ））への添加に対する安定なＮａＶ１．７を発現する細胞及び対照細胞（すなわちＨＥＫ２９３Ｔ親細胞）の反応におけるアッセイの結果を示す。最初の添加工程（図４における添加１）では、試験化合物を含まない緩衝液のみを添加した。必要に応じて、試験化合物をこの工程で添加する場合もある。第二の添加工程において、ナトリウムチャネル活性化剤であるベラトリジン及びサソリ毒をアッセイバッファーを用いて所望の濃度に希釈し（すなわち２５μＭベラトリジン及び５〜２５μｇ／ｍｌサソリ毒）、そして３８４ウェルポリプロピレンプレート中に添加した。結合すると、ベラトリジン及びサソリ毒タンパク質は、活性化及び不活性化動態の変更を含む、作用の組み合わせを介して電位依存性ナトリウムチャネルの活性を変化させる。安定なＮａＶ１．７を発現する細胞において生じたナトリウムチャネルの活性化が細胞の膜電位を変化させ、そして蛍光シグナルが上昇する。ＮａＶ１．７イオンチャネルにおける試験化合物の相対的な能力を解析するためには、上述の機能的アッセイもまた用いることができる。
【０１２９】
実施例５
ＮａＶ１．７アルファサブユニットのベータサブユニットによる制御の解析
アルファサブユニット遺伝子発現のベータサブユニットによる制御
それぞれのプラスミドＤＮＡ又はα及びコントロールプラスミドのモル比を操作することにより、様々な比率のα及びβサブユニットを発現する（例えばα：β１：β２＝１：１：１）ようにＨＥＫ２９３Ｔ細胞プールを改変した。薬剤選択の後、異なる６つの細胞プールにおけるサブユニットの発現を、実施例２に記載したようにｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。比較ｑＲＴ−ＰＣＲによって、αサブユニットとコントロールプラスミドのみを形質転換した場合（図２、右列）と比較して、３つ全てのヒトＮａＶ１．７サブユニット（すなわちα、β１、及びβ２）を共に形質転換した場合に（図２、左列）、薬剤選抜した細胞において検出されるαサブユニットの発現の上昇が見られた。βサブユニット転写産物の存在がαサブユニットの遺伝子発現に影響を及ぼすことは、機能解析における生理学的な関連には、３つ全てのＮａＶ１．７サブユニットが共に発現することが重要であることを示している。
【０１３０】
ベータサブユニットによる薬理学特性の制御
３つ全てのＮａＶ１．７サブユニット（すなわちα、β１、及びβ２）を安定して共に発現している細胞、及びＮａＶ１．７αサブユニットのみを安定して発現しているコントロール細胞の、試験化合物への反応を測定するためには細胞を用いた膜電位アッセイを用いた。実施例４のプロトコールに実質的に従って行った膜電位アッセイによって、２つの化合物（図５）（すなわちＣ１８及びＫ２１）を試験した。具体的には、この実施例においては試験化合物を最初の添加工程において添加した。
【０１３１】
図５に示されるように、Ｃ１８及びＫ２１はクローンＣ４４の反応を促進し（ＮａＶ１．７α、β１、及びβ２サブユニットを発現する、図５Ａ）、クローン６０の反応を阻害した（ＮａＶ１．７αサブユニットのみを発現する、図５Ｂ）。２種類の試験化合物に対する２つそれぞれのクローンのアッセイにおける反応を、緩衝液のみへの反応を用いて標準化した。
配列表
標的配列１
５’−ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１）
標的配列２
５’−ＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣｇｔｔｃｔｇｃｇａｃ−３’（配列番号２）
標的配列３
５’−ＧＴＴＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号３）
シグナル伝達プローブ１（標的１に結合する）
５’−Ｃｙ５ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧＣＢＨＱ２クエンチ−３’（配列番号４）
シグナル伝達プローブ２−（標的２に結合する）
５’−Ｃｙ５．５ＧＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＣＧＣＢＨＱ２クエンチ−３’（配列番号５）
ホモ  サピエンス（Ｈ．ｓ．）ＳＣＮ１Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ２Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ３Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ４Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ５Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ７Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ１１Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ１Ｂ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ２Ｂ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ３Ｂ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ４Ｂ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ１Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ２Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ３Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ４Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ５Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ７Ａ（ｏｃｃａｓｉｏｎａｌｌｙｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏａｓＳＣＮ６Ａ）
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ８Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ１０Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ１１Ａ
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Ｈ．ｓ．ＳＣＮ１Ｂ
Ｍｇｒｌｌａｌｖｖｇａａｌｖｓｓａｃｇｇｃｖｅｖｄｓｅｔｅａｖｙｇｍｔｆｋｉｌｃｉｓｃｋｒｒｓｅｔｎａｅｔｆｔｅｗｔｆｒｑｋｇｔｅｅｆｖｋｉｌｒｙｅｎｅｖｌｑｌｅｅｄｅｒｆｅｇｒｖｖｗｎｇｓｒｇｔｋｄｌｑｄｌｓｉｆｉｔｎｖｔｙｎｈｓｇｄｙｅｃｈｖｙｒｌｌｆｆｅｎｙｅｈｎｔｓｖｖｋｋｉｈｉｅｖｖｄｋａｎｒｄｍａｓｉｖｓｅｉｍｍｙｖｌｉｖｖｌｔｉｗｌｖａｅｍｉｙｃｙｋｋｉａａａｔｅｔａａｑｅｎａｓｅｙｌａｉｔｓｅｓｋｅｎｃｔｇｖｑｖａｅ（配列番号３０）
Ｈ．ｓ．ＳＣＮ２Ｂ
Ｍｈｒｄａｗｌｐｒｐａｆｓｌｔｇｌｓｌｆｆｓｌｖｐｐｇｒｓｍｅｖｔｖｐａｔｌｎｖｌｎｇｓｄａｒｌｐｃｔｆｎｓｃｙｔｖｎｈｋｑｆｓｌｎｗｔｙｑｅｃｎｎｃｓｅｅｍｆｌｑｆｒｍｋｉｉｎｌｋｌｅｒｆｑｄｒｖｅｆｓｇｎｐｓｋｙｄｖｓｖｍｌｒｎｖｑｐｅｄｅｇｉｙｎｃｙｉｍｎｐｐｄｒｈｒｇｈｇｋｉｈｌｑｖｌｍｅｅｐｐｅｒｄｓｔｖａｖｉｖｇａｓｖｇｇｆｌａｖｖｉｌｖｌｍｖｖｋｃｖｒｒｋｋｅｑｋｌｓｔｄｄｌｋｔｅｅｅｇｋｔｄｇｅｇｎｐｄｄｇａｋ（配列番号３１）
Ｈ．ｓ．ＳＣＮ３Ｂ
Ｍｐａｆｎｒｌｆｐｌａｓｌｖｌｉｙｗｖｓｖｃｆｐｖｃｖｅｖｐｓｅｔｅａｖｑｇｎｐｍｋｌｒｃｉｓｃｍｋｒｅｅｖｅａｔｔｖｖｅｗｆｙｒｐｅｇｇｋｄｆｌｉｙｅｙｒｎｇｈｑｅｖｅｓｐｆｑｇｒｌｑｗｎｇｓｋｄｌｑｄｖｓｉｔｖｌｎｖｔｌｎｄｓｇｌｙｔｃｎｖｓｒｅｆｅｆｅａｈｒｐｆｖｋｔｔｒｌｉｐｌｒｖｔｅｅａｇｅｄｆｔｓｖｖｓｅｉｍｍｙｉｌｌｖｆｌｔｌｗｌｌｉｅｍｉｙｃｙｒｋｖｓｋａｅｅａａｑｅｎａｓｄｙｌａｉｐｓｅｎｋｅｎｓａｖｐｖｅｅ（配列番号３２）
Ｈ．ｓ．ＳＣＮ４Ｂ
Ｍｐｇａｇｄｇｇｋａｐａｒｗｌｇｔｇｌｌｇｌｆｌｌｐｖｔｌｓｌｅｖｓｖｇｋａｔｄｉｙａｖｎｇｔｅｉｌｌｐｃｔｆｓｓｃｆｇｆｅｄｌｈｆｒｗｔｙｎｓｓｄａｆｋｉｌｉｅｇｔｖｋｎｅｋｓｄｐｋｖｔｌｋｄｄｄｒｉｔｌｖｇｓｔｋｅｋｍｎｎｉｓｉｖｌｒｄｌｅｆｓｄｔｇｋｙｔｃｈｖｋｎｐｋｅｎｎｌｑｈｈａｔｉｆｌｑｖｖｄｒｌｅｅｖｄｎｔｖｔｌｉｉｌａｖｖｇｇｖｉｇｌｌｉｌｉｌｌｉｋｋｌｉｉｆｉｌｋｋｔｒｅｋｋｋｅｃｌｖｓｓｓｇｎｄｎｔｅｎｇｌｐｇｓｋａｅｅｋｐｐｓｋｖ（配列番号３３）
シグナル伝達プローブ３−（標的３に結合する）
５’−ＦａｍＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＣＢＨＱ１クエンチ−３’（配列番号３４）
【図１】
0005809065.tif 000003
【図２】
0005809065.tif 000004
【図３Ａ】
0005809065.tif 000005
【図３Ｂ】
0005809065.tif 000006
【図３Ｃ】
0005809065.tif 000007
【図４】
0005809065.tif 000008
【図５】
0005809065.tif 000009
【配列表】
0005809065000001.xml