(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１によりコードされるＳＩＶＡ２の配列と少なくとも９０％の同一性を有し、翻訳後修飾Ｏ−ＧｌｃＮアシル化を含む安定性が改善されたＳＩＶＡ２の製造方法であって、真核細胞中で組換えまたは内因性ＳＩＶＡ２を過剰発現させること、および該細胞において、（ａ）Ｏ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼ、（ｂ）Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害剤、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組合せのレベルを増加させることを含む方法。
【請求項２】
エクソビボで行われ、さらに、前記細胞を前記安定性が改善されたＳＩＶＡ２の産生を可能とする条件下で培養すること、および得られたＳＩＶＡ２を培養物から回収することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号１１によりコードされるＳＩＶＡ２の配列と少なくとも９０％の同一性を有するＳＩＶＡ２を安定化する方法であって、エクソビボにより行われ、ＳＩＶＡ２を、Ｏ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害剤、またはそれらの組合せと接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患、障害または症状の治療または予防におけるＳＩＶＡ２安定性のモジュレーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーは、ほとんど全ての種類の細胞において発現され、広範囲に渡る多様な細胞活性を制御している。それらは、タンパク質合成とは独立した細胞の変化、最もよく知られているものとしてはカスパーゼ介在性細胞死（外因性細胞死経路）を誘導する能力、ならびに転写および転写後レベルの両方において遺伝子発現パターンをモジュレートする能力の両方を有する。これらの効果は、免疫防御のほとんどすべての態様や胚発生および組織恒常作用の制御に貢献する。それらは、細胞の種類および活性化受容体の正体ならびに多数の他の決定因子に依存し、いくつかの作用は他のものと対立さえし得る。この広範囲に及ぶ活性は、むしろ少ない数のシグナル伝達タンパク質により媒介される。そのうち最も特徴付けられているのが、２つのデスドメイン含有アダプター、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１およびＴＲＡＤＤ、インデューサーカスパーゼ、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０、ＴＲＡＦリング−フィンガータンパク質のメンバー、ならびにアポトーシスタンパク質１の細胞阻害剤（ｃＩＡＰ１）およびｃＩＡＰ２（ＩＡＰモチーフを有するリング−フィンガータンパク質）である。（Wallachら、1999）（Locksleyら、2001）。この限られたタンパク質が受容体の多方面にわたる様々な作用をどのように媒介するのか、また誘導された作用の性質をどのように必要に応じたものに調整するのかは、まだほとんど理解されていない。
【０００３】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーの近位シグナル伝達活性に関与することが示唆されている付加的なタンパク質であるＳＩＶＡは、イーストツーハイブリッド試験におけるＣＤ２７受容体へのその結合に基づいて同定された（Prasadら、1997）。ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのいくつかの他のメンバーとのＳＩＶＡの関連性については、いくつかの証拠も示された（NocentiniおよびRiccardi、2005）。ＳＩＶＡの存在は、数年間にわたり知られており、長期間過剰発現した場合このタンパク質が細胞を殺すことが示された（Prasadら、1997）。しかしながら、これがＳＩＶＡの真の唯一の活性かどうかは知られていない。ＳＩＶＡは、他の既知のタンパク質のいずれとも、近接した構造的類似性は有していない。初めにデスドメインと類似していると思われたＳＩＶＡ内のある領域は、そのドメインとして特徴付けられるような構造的特徴は有していない。その領域のＣ末端では、タンパク質はシステイン残基が比較的豊富であり、これは明らかにいくつかの亜鉛イオンの結合に寄与している（Nestlerら、2006）。しかしながら、この領域のアミノ酸配列は、既知の亜鉛結合モチーフのいずれとも厳密には適合しない。このタンパク質の中心の短いα−へリックス領域は、抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−ＸLに結合するが（Xueら、2002）、そのシステインリッチ領域（ＣＲＲ）により保存される機能は知られていない。
【０００４】
ＳＩＶＡは、２つの択一的スプライスアイソフォームまたはスプライス変異体、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２として存在することが知られている。ＳＩＶＡ１はより長く、その中心部分に推定両親媒性へリックスを有するデスドメインホモロジー領域（ＤＤＨＲ）を含む。ＳＩＶＡ２はより短く、ＤＤＨＲを欠く。両アイソフォーム共にＢ−ボックス様リング−フィンガーとＣ−末端にジンクフィンガー様ドメインを含む。ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の両方の強制発現は、アポトーシスを誘導することが示されている（Prasadら、1997、Yoonら、1998、Spinicelliら、2003、Pyら、2004）。ＳＩＶＡ１誘導アポトーシスは、その両親媒性へリックス領域を介する抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーへの結合と阻害によりなされると示唆されている（Chuら、2005；Chuら、2004；Xueら、2002）。そのアポトーシス促進的役割と一致して、ＳＩＶＡは、腫瘍サプレッサーｐ５３およびＥ２Ｆ１の直接的な転写ターゲットである（Fortinら、2004）。証拠における様々な点から、ＳＩＶＡがストレス誘導タンパク質であり、急性虚血性傷害において（Padanilamら、1998）、コクサキーウイルス感染において（Henkeら、2000）、およびシスプラチン治療によって（Qinら、2002）、ならびにアポトーシスを誘導するＴＩＰ３０の発現によって（Xiaoら、2000）もアップレギュレートされるということが示唆される。近年、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２のデスドメインではない共通Ｎ−およびＣ−末端が、カスパーゼ依存性ミトコンドリア経路の活性化によりリンパ系細胞におけるアポトーシスを媒介するのに十分可能であることが示された（Pyら、2004）。
【０００５】
最近、ＳＩＶＡがＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）に結合し、その機能を制御し（Ramakrishnanら、2004）、ユビキチン化関連活性を有し、自己ユビキチン化、ＴＲＡＦ２（ＴＮＦ受容体関連アダプタータンパク質２）のユビキチン化を直接誘導することができること、およびＳＩＶＡ２がＥ３リガーゼである（国際公開第２００７／７０８０５９３号パンフレット）ということが見出された。
【０００６】
ユビキチン化は、タンパク質がユビキチンという名の小さいタンパク質（本来は、ユビキタスイムノポイエティックポリペプチド（ＵＢＩＰ））の共有結合により翻訳後修飾される真核生物に特有のプロセスを意味する。ユビキチンリガーゼは、ユビキチンを標的タンパク質のリジン残基に共有結合させるタンパク質である。ユビキチンリガーゼは、通常、ポリユビキチン化、すなわち二番目のユビキチンが一番目のユビキチンに結合し；三番目のユビキチンが二番目のユビキチンに結合するなどのポリユビキチン化に関与している。ユビキチンリガーゼは、「Ｅ３」と呼ばれ、ユビキチン活性化酵素（本明細書では「Ｅ１」という）およびユビキチン複合酵素（本明細書では「Ｅ２」という）と共に機能する。１つの主要なＥ１酵素は、すべてのユビキチンリガーゼによって共有され、ＡＴＰを用いて結合のためにユビキチンを活性化し、Ｅ２酵素にユビキチンを引き渡す。Ｅ２酵素は、特異的Ｅ３パートナーと相互作用し、ユビキチンを標的タンパク質に移す。多重タンパク質複合体でもあり得るＥ３は、ユビキチン化を特定の基質タンパク質へ標的化しなければならない。Ｅ３は、Ｅ２酵素からユビキチンを受け取り、標的タンパク質または基質タンパク質にそれを渡す場合もあれば、他のケースでは、Ｅ３はＥ２酵素と基質との両方と相互作用することにより作用する場合もある。
【０００７】
ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）は、ＴＲＡＦ２に結合するタンパク質のスクリーニングにおいて発見された（Malininら、1997）。ＮＩＫの過剰発現の際のＮＦ−κＢの著しい活性化と、触媒的に不活性なＮＩＫ突然変異体の発現の際の多様な誘導薬剤に応答するＮＦ−κＢ活性化の効果的な阻害は、ＮＩＫがＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達に関与していることを示唆した（Malininら、1997）。
【０００８】
リンパ器官におけるＮＦ−κＢ種のパターン評価から、Ｒｅｌタンパク質およびＩκＢを含むＮＦ−κＢ複合体の制御におけるその役割とは別に、ＮＩＫは、他のＮＦ−κＢ種の発現／活性化の制御にも関与しているということが示唆された。実際、ＮＩＫは、ｐ１００の部位特異的リン酸化に関与していることが示されており、ｐ１００のユビキチン化およびｐ５２を形成するための活性なプロセッシングを誘発する分子としての機能を果たす。このｐ１００プロセッシング活性は、ＮＩＫのａｌｙ変異により除去されることが見出された（Xiaoら、2001b）。
【０００９】
胸腺ストローマにおいてＮＩＫは、免疫寛容を維持するのに必須なＴｒｅｇ細胞の正常な産生にとって重要である。ＮＩＫの突然変異は、ａｌｙマウスにおける、胸腺構造の破壊、Ｔｒｅｇ細胞の産生障害をもたらす（Kajiuraら、2004）。一貫して、ＮＩＫ−欠損マウスの研究は、Ｔｒｅｇ細胞の成長および拡大の制御におけるＮＩＫの役割も示唆している（Luら、2005）。この知見は、ストローマ依存的な自己寛容確立におけるＮＩＫの必須の役割を示唆している。ＮＩＫは、ウイルス感染の結果としてＮＦ−κＢ活性化にも参加する。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳウイルス）感染は、ＮＩＫのキナーゼ活性の増加、胞（alveolus）様ａ５４９細胞における活性化ＮＩＫ、ＩＫＫ１、ｐ１００および処理ｐ５２を含む複合体の形成をもたらす。この場合、ＮＩＫ自体はｐ５２に結合した核に移行し、驚くべきことに、この事象は正準ＮＦ−κＢ経路活性化の活性化に先行する（Choudharyら、2005）。この知見は、ＮＩＫが実際にＮＦ−κＢのメディエータとしての機能を果たすが、他の機能も果たし得るということ、ならびにＮＩＫが細胞および受容体特異的にこれらの機能を発揮するということを示している。
【００１０】
ＮＩＫは、ＮＩＫ分子内の「活性化ループ」のリン酸化の結果として活性化される。実際、このループ内のリン酸化部位（Ｔｈｒ−５５９）の変異により、ＮＩＫ過剰発現時のＮＦ−κＢの活性は妨げられる（Linら、1999）。加えて、ＮＩＫの活性は、そのキナーゼモチーフの上流および下流領域が互いに結合する能力を通して制御されているようである。ＮＩＫのキナーゼモチーフの下流のＣ−末端領域は、直接ＩＫＫ１（Regnierら、1997）ならびにｐ１００（Xiaoら、2001b）に結合できることが示されており、これらの相互作用は、ＮＦ−κＢシグナル伝達におけるＮＩＫ機能に必要とされるようである。ＮＩＫのＮ末端領域は、塩基性のモチーフ（ＢＲ）およびプロリンリッチ繰り返しモチーフ（ＰＲＲ）から成る、負の調節ドメイン（ＮＲＤ）を含む（XiaoおよびSun、2000）。Ｎ−末端ＮＲＤは、ＮＩＫのＣ−末端領域とシスで相互作用し、それによりＮＩＫのその基質（ＩＫＫ１およびｐ１００）への結合を阻害する。異所的に発現したＮＩＫは、自発的にオリゴマーを形成し、このオリゴマーにおいては、各ＮＩＫ分子におけるＮ−末端領域のＣ−末端領域へのこれらの結合が崩壊するようであり、高レベルの構造的活性化が示される（Linら、1999）。ＮＩＫのＣ−末端領域のＴＲＡＦ２（ならびに他のＴＲＡＦ類）への結合が、最も活性化プロセスに関与するようである。しかしながら、その関与の正確な様式は知られていない。
【００１１】
近年、ＮＩＫ調節の新規な機序が大きな注目を集めている。これは、ＮＩＫのプロテアソーム介在性分解を導く、ＮＩＫとＴＲＡＦ３との動的相互作用に関する。興味深いことに、ＣＤ４０およびＢＬｙＳのようなＮＦ−κＢの代替的経路の誘導因子は、ＴＲＡＦ３の分解とＮＩＫ発現の同時増強を誘導することが示されている（Liaoら、2004）。
【００１２】
ＮＩＫ作用における下流の機序はかなり限定された情報しかない。ＮＩＫは、そのＣ−末端領域のＩＫＫ１への結合を通して、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体を活性化できるということを示す証拠が提示されている。実際、ＩＫＫ１の活性化ループにおいけるセリン−１７６をリン酸化し、それにより活性化できることが示されている（Lingら、1998）。
【００１３】
ＮＩＫは、正準ＮＦ−κＢ経路には全く関与せず、むしろ代替的経路を活性化するためにもっぱら機能するということが示唆された（総説としてPomerantzおよびBaltimore参照）。しかしながら、リンパ球におけるＴＮＦによるＩκＢ分解の誘導はＮＩＫと無関係であるが、いずれもＮＦ−κＢ２／ｐ１００プロセッシングも誘導する、ＣＤ７０、ＣＤ４０リガンドおよびＢｌｙＳ／ＢＡＦＦによるＩκＢ分解の誘導は、ＮＩＫ機能に依存するということが最近示された（Ramakrishnanら、2004）。ＣＤ７０およびＴＮＦの両方は、ＩＫＫキナーゼ複合体のその受容体への動員を誘導する。ＣＤ７０の場合、ＴＮＦとは異なり、このプロセスはＮＩＫ動員と関連しており、その後にまさにＩＫＫ１とＮＩＫとの長期に渡る受容体会合が続く。ＩＫＫ複合体のＣＤ７０への動員は、ＮＩＫの動員とは異なり、ＮＩＫキナーゼ機能に依存する。この知見から、ＮＩＫは、標準および非標準ＮＦ−κＢ二量体の両方を活性化する特異的誘導因子により開始される独自の近位シグナル伝達事象に関与することが示される。
【００１４】
YamamotoおよびGaynorは、ヒト疾患の原因におけるＮＦ−κＢの役割を概説している（YamamotoおよびGaynor、2001）。ＮＦ−κＢ経路の活性化は、喘息、リウマチ性関節炎（TakおよびFirestein、this perspectiveseries ref. Karinら、2000参照）および炎症性大腸炎などの慢性炎症性疾患の原因に関係している。加えて、ＮＦ−κＢ調節の改変は、アテローム性動脈硬化症（CollinsおよびCybulsky、this series, ref. Leonardら、1995参照）、アルツハイマー病（Mattson Camandola、this series, ref. Linら、1999参照）などの炎症性応答が少なくとも部分的に関与している他の疾患に関係し得る。また、ＮＦ−κＢ経路の異常は、しばしば多様なヒト癌にも見られる。
【００１５】
いくつかの系統の証拠が、サイトカイン遺伝子のＮＦ−κＢ活性が、肺における炎症の浸潤と多くのサイトカインおよびケモカインの脱制御に特徴付けられる喘息の病因への重要な一因であるということを示唆している（Lingら、1998）。同様に、ＮＦ−κＢ経路の活性化も、リウマチ性関節炎の病因において役割を果たしているようである。ＴＮＦ−などのサイトカインは、ＮＦ−κＢを活性化し、リウマチ性関節炎の患者の滑液中で増加し、慢性炎症性変化およびこれらの患者の間接に見られる滑膜の過形成の一因となる（Malininら、1997）。ＴＮＦ−に対する抗体や、ＴＮＦ−に結合する切断型ＴＮＦ−受容体の投与は、リウマチ性関節炎の患者の症状を顕著に改善できる。
【００１６】
リンパ球およびマクロファージの両方による炎症性サイトカインの産生の増加も、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性大腸炎の病因に関係があるとされている（Matsumotoら、1999）。ＮＦ−κＢ活性化は、活性クローン病の患者および潰瘍性大腸炎の患者由来の粘膜生検標本に見られる。炎症性大腸炎の患者のステロイドによる治療は、生検標本におけるＮＦ−κＢ活性を減少させ、臨床症状を軽減する。これらの結果から、ＮＦ−κＢ経路の刺激は、これらの疾患に関連して増強される炎症性応答に関与し得るということを示唆する。
【００１７】
アテローム性動脈硬化症は、損傷した血管壁の内皮および平滑筋に対するおびただしい数の傷害（insults）によって誘発される（Matsushimaら、2001）。内皮細胞、平滑筋、マクロファージおよびリンパ球から放出される多数の成長因子、サイトカインおよびケモカインは、この慢性の炎症性線維増殖性プロセスに関与している（Matsushitaら、2001）。炎症性応答および細胞増殖の制御に関与する遺伝子のＮＦ−κＢ調節は、アテローム性動脈硬化症の開始および進行において重要な役割を果たすようである。
【００１８】
また、ＮＦ−κＢ経路の調節異常は、アルツハイマー病の病因にも関与し得る。たとえば、ＮＦ−κＢの免疫反応性は、大部分はアルツハイマー病の初期の老人斑型中または周囲に見られ、一方、成熟斑型は非常に減少したＮＦ−κＢ活性を示す（Mercurioら、1999）。したがって、ＮＦ−κＢ活性化は、アルツハイマー病の初期段階のあいだの老人斑および神経細胞アポトーシスの開始に関与し得る。これらのデータから、ＮＦ−κＢ経路の活性化は、病因に関係した炎症性要素を有する多数の疾患においてある役割を果たし得る。
【００１９】
宿主免疫および免疫応答の増加により特徴付けられる疾患の病因における役割に加え、ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化は、いくつかのヒト癌の病因にも関係する。ＮＦ−κＢ経路の調節異常は、白血病、リンパ腫、および固形腫瘍などの多種多様なヒト悪性腫瘍に頻繁に見られる（Miyawakiら、1994）。これらの異常は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および結腸癌などの多様な腫瘍の核における構造的に高いレベルのＮＦ−κＢをもたらす。これらの変画の大部分は、ＮＦ−κＢ経路の活性化を誘導するシグナル伝達経路を活性化する調節タンパク質における変化によるもののようである。しかしながら、ＮＦ−κＢファミリーメンバーをコードする遺伝子の増幅および再配列に加え、ＩＢタンパク質を不活性化する突然変異は、いくつかの腫瘍で見られるＮＦ−κＢの核レベルを増強させることができる。
【００２０】
免疫系の発達および機能の調節への寄与とは別に、ＮＩＫは、乳腺発達などの様々な非免疫機能の調節にも関与していると思われる（Miyawakiら、1994）。ＮＩＫは、リンパ系器官の発達にもある役割を有する（Shinkuraら、1999）。インビトロ研究は、骨格筋細胞分化を導くシグナル伝達（Canicioら、2001）、およびニューロンの生存および分化（Foehrら、2000）にＮＩＫが関係しているとみなされた。
【００２１】
悪性腫瘍疾患や、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、免疫性疾患および移植関連疾患などの病的免疫応答と関連付けられる疾患などの、ＳＩＶＡ、ＮＩＫおよび／またはＮＦ−κＢ分子の調節を欠いた活性と関連付けられる多数の命に関わる病気および／または消耗性疾患のための満足のいく治療が必要とされている。
【発明の概要】
【００２２】
１つの側面において、本発明は、以下の翻訳後修飾、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）セリン残基５、５０および５１のリン酸化；（iii）Ｋ１７および／またはＫ９９残基におけるユビキチン化；または（iv）（ｉ）〜（iii）の組合せを含むことにより特徴付けられる、安定性の改善されたＳＩＶＡ２またはその塩を提供する。
【００２３】
本発明の１つの実施態様では、安定性が改善されたＳＩＶＡ２は、セリン残基２１、２６および３５もリン酸化されている。
【００２４】
別の側面において、本発明は、以下の翻訳後修飾、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）セリン残基５、５０および５１のリン酸化；（iii）Ｋ１７および／またはＫ９９残基におけるユビキチン化；または（iv）（ｉ）〜（iii）の組合せを含むことにより特徴付けられる、安定性が改善されたＳＩＶＡ２の製造方法であって、真核細胞中で組換えまたは内因性ＳＩＶＡ２を過剰発現させること、および該細胞において、（ａ）ＴＲＡＦ２、（ｂ）ｃＩＡＰ１のリングフィンガー突然変異体、（ｃ）Ｏ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼ、（ｄ）Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害剤、（ｅ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の組合せ、または（ｇ）ＮＦ−κＢ誘導キナーゼおよび（ａ）〜（ｆ）のいずれか、のレベルを増加させることを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明の１つの実施態様において、エクソビボで行われ、さらに、前記細胞を前記安定性が改善されたＳＩＶＡ２の生産を可能とする条件下で培養すること、および得られたＳＩＶＡ２を培養物から回収することを含む、安定性が改善されたＳＩＶＡ２の製造方法が提供される。また、本発明によれば、安定性が改善されたＳＩＶＡ２を含む宿主細胞、および本発明の方法により製造された単離された安定性が改善されたＳＩＶＡ２も提供される。
【００２６】
さらなる側面において、本発明は、薬学的に許容され得る担体および、以下の翻訳後修飾、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）セリン残基５、５０および５１のリン酸化；（iii）Ｋ１７および／またはＫ９９残基におけるユビキチン化；または（iv）（ｉ）〜（iii）の組合せを含むことにより特徴付けられる、安定性が改善されたＳＩＶＡ２またはその塩を含む医薬組成物を提供する。本発明の１つの実施態様において、医薬組成物は、ＳＩＶＡ２の低い活性または低いレベルに関連するか、または細胞におけるＳＩＶＡ２の活性を増加させることにより軽減される疾患、障害または症状を治療するため；および／またはＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによって活性化されるシグナル伝達経路が病因や経過に関係する疾患、障害または症状、たとえば癌、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を治療するために使用することができる。
【００２７】
本発明の１つの目的は、以下の翻訳後修飾、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）セリン残基５、５０および５１のリン酸化；または（iii）Ｋ１７および／またはＫ９９残基におけるユビキチン化の１つ以上を含むことにより特徴付けられる、安定性が改善されたＳＩＶＡ２の、ＳＩＶＡ２の低い活性または低いレベルに関連するか、または細胞におけるＳＩＶＡ２の活性を増加させることにより軽減される疾患、障害または症状を治療するためまたは治療するための医薬の製造における；および／またはＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによって媒介されるシグナル伝達経路が病因や経過に関係する疾患、障害または症状、たとえば癌、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を治療するためまたは治療するための医薬の製造における使用を提供することである。
【００２８】
本発明のもう１つの目的は、ＳＩＶＡ２を、Ｏ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼ、ＴＲＡＦ２、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害剤、ＣＩＡＰ１活性阻害剤、Ｈ５８８ＡなどのｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体、またはそれらの組合せと接触させることを含むＳＩＶＡ２を安定化する方法を提供することである。前記接触は、インビボ、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化をモジュレートできる薬剤、（ii）ＴＲＡＦ２活性をモジュレートできる薬剤、（iii）ＣＩＡＰ１活性をモジュレートできる薬剤、（iv）Ｈ５８８ＡなどのｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体から選択されるＳＩＶＡ２の安定性を改変できる薬剤の、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達経路が病因や経過に関係する疾患、障害または症状の治療のための使用を提供することである。
【００３０】
本発明の１つの実施態様において、ＳＩＶＡ２の安定性の改変は、ＳＩＶＡ２の安定性の改善であり、ＳＩＶＡ２の安定性を改善するために使用することができる薬剤は、たとえば、Ｏ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃなどのＯ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼの誘導因子、ＴＲＡＦ２、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害剤、ＣＩＡＰ１活性阻害剤、Ｈ５８８ＡなどのｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体、またはそれらの組合せである。ＳＩＶＡ２の安定性の改善は、癌、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を治療するために使用することができる。
【００３１】
本発明の別の実施態様においては、ＳＩＶＡ２の安定性の改変は、ＳＩＶＡ２の安定性の消滅または減少であり、使用できる薬剤は、Ｏ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼの阻害剤、ＴＲＡＦ２の阻害剤、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ、ＣＩＡＰ１またはその組合せである。ＳＩＶＡ２の安定性の消滅または減少は、免疫不全または虚血／再灌流の治療のために使用することができる。
【００３２】
別の側面において、本発明は、ＳＩＶＡ２または安定性が改善されたＳＩＶＡ２とｃＩＡＰとの複合体を提供する。本発明のさらなる実施態様においては、ＳＩＶＡ２とｃＩＡＰ１との複合体が提供される。
【００３３】
さらなる側面において、本発明は、疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をモジュレートできる分子のスクリーニング方法であって、ＳＩＶＡ２をｃＩＡＰおよび／またはＴＲＡＦ２と接触させること、候補分子の存在下および非存在下においてＳＩＶＡ２とｃＩＡＰおよび／またはＴＲＡＦ２との複合体のレベルをモニターすることを含み、該候補分子の存在下におけるＳＩＶＡ２−ｃＩＡＰおよび／またはＳＩＶＡ２−ＴＲＡＦ２複合体のレベルの変化が、該候補分子がＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をモジュレートすることの指標となる方法を提供する。
【００３４】
本発明の１つの実施態様では、その方法は、自己免疫疾患、障害または症状、または腎虚血における疾患、障害または症状などの、疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をダウンレギュレートできる分子をスクリーニングするためのものであり、候補分子が複合体のレベルを増加させるものである。
【００３５】
本発明の別の実施態様では、その方法は、免疫抑制に関連する疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達を延長することができる分子をスクリーニングするためのものであり、候補分子が複合体のレベルを減少させるものである。
【００３６】
本発明のなおさらなる側面では、疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をモジュレートできる分子のスクリーニング方法であって、候補分子の存在下および非存在下においてＳＩＶＡ２の安定性を誘導することを含み、該候補分子の存在下における安定性の誘導されたＳＩＶＡ２のレベルの変化が、該候補分子がＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をモジュレートできることの指標となる方法が提供される。
【００３７】
本発明の１つの実施態様において、その方法は、自己免疫疾患、障害または症状、または腎虚血における疾患、障害または症状などの、疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をダウンレギュレートできる分子をスクリーニングするためのものであり、候補分子が安定化されたＳＩＶＡ２のレベルを増加させるものである。
【００３８】
別の実施態様において、その方法は、たとえば免疫抑制に関連する疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達を延長することができる分子をスクリーニングするためのものであり、候補分子が安定化されたＳＩＶＡ２のレベルを減少させる。
【００３９】
本発明はまた、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達経路が病因または経過に関係する疾患、障害または症状の治療方法であって、治療的に有効量の（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化をモジュレートできる薬剤、（ii）ＴＲＡＦ２活性をモジュレートできる薬剤、（iii）ＣＩＡＰ１活性をモジュレートできる薬剤、（iv）Ｈ５８８ＡなどのｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体から選択されるＳＩＶＡ２の安定性を改変できる薬剤を投与することを含む方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。種々の細胞株におけるＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の発現を示す。各細胞株について、細胞性タンパク質（３０μｇ）を１３．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗−ＳＩＶＡ抗体で調べた。右の２つのレーンは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において過剰発現されたＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２を示す（各タンパク質について、６ウェルプレートで、２μｇｃＤＮＡ／ウェル）。
【図１Ｂ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。いくつかのＳＩＶＡアイソフォームがＰＢＭＣにおいて発現されている。ＲＴ−ＰＣＲは、静止ＰＢＭＣにおけるＳＩＶＡ１、ＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ３の発現を示す。
【図１Ｃ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。リガンドの活性化が静止ＰＢＭＣにおいてＳＩＶＡ２の量を増加させる。細胞（２×１０6）を表示するリガンドで８時間処理し、細胞ライセートをウエスタンブロッティングにより分析した。
【図１Ｄ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。リガンド活性化とプロテアソーム阻害は、遺伝毒性ストレスではないが、ＳＩＶＡ２レベルを活性化ＰＢＭＣにおいて増加させる。細胞はＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激され、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄され、そしてＰＨＡなしで１８時間さらにインキュベートされた。ついで、リガンドおよび遺伝毒性薬剤（カンプトセシン（ＣＰＴ）１０μＭおよびシスプラチン（ＣＩＳ）５０μＭ）を１８時間適用した。ＭＧ１３２を処理の最後の４時間に適用した。その他表示されているところを除いて、ＭＧ１３２は、本研究においては２５μＭの濃度で適用した。「ｎｓ」は、ローディング対照として機能する非特異的バンドを示す。
【図１Ｅ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。ＳＩＶＡ２のメッセージは、リガンド活性化後に増加しない。ＰＢＭＣは、図１Ｄのように活性化された。リガンドは、表示した細胞型に１８時間適用した。ＳＩＶＡメッセージに対する半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、方法の項に記載されるように行った。ＧＡＰＤＨが標準化の基礎として使用された。
【図１Ｆ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。ＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７およびＥｃＲ−２９３−ＣＤ４０細胞において、ＴＮＦファミリーのリガンドにより一時的に発現したＳＩＶＡ２の安定化を示す。ＳＩＶＡ２またはＳＩＶＡ１プラスミド（０．５μｇ）がトランスフェクトされ、１８時間後にリガンドを８時間適用した。全細胞ライセートを抗−ＳＩＶＡ抗体を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。ＴＮＦ−誘導ＳＩＶＡ２安定化は、ＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７細胞において評価した。
【図１Ｇ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。誘導により発現されたＳＩＶＡ２は、ＣＤ７０により安定化される。ＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ２細胞（方法の項参照）は、表示したようにポナステロンおよびＣＤ７０で処理した。全細胞ライセートをローディング対照としてＬＤＨを用い（下段パネル）、ウエスタンブロッティングにより分析した。
【図１Ｈ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。プロテアソーム阻害は、一時的に発現したＳＩＶＡ２を安定化し、ポリユビキチン化されたタンパク質の蓄積を強化した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２でトランスフェクトされ、トランスフェクション後２４時間分析した。ＭＧ１３２を処理の最後の４時間適用した。ＴＣＬは全細胞ライセート。
【図１Ｉ】ＳＩＶＡ２がＴＮＦファミリーのいくつかのリガンドにより安定化されるということを示す。遺伝毒性薬剤のＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の発現に対する差動効果を示す。最上段：ＨｅｐＧ２細胞をＣＰＴで１８時間処理した。表示されている場合は、ｐＳＵＰＥＲＳＩＶＡでＣＰＴ適用の３０時間前にトランスフェクトされた。細胞ライセートは、抗−ＳＩＶＡ抗体を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。中段：ＨｅｐＧ２細胞をＵＶＣ（２０Ｊ／ｍ2）にさらし、ＳＩＶＡタンパク質のレベルを処理の１８時間後に測定した。最上段および中間部のパネルにおける最終レーン（「対照」）は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞においてＮＩＫおよび内因性ＳＩＶＡ１により過剰発現したＳＩＶＡ２を示す。下段：ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を０．５μｇのＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２でトランスフェクトした。ＣＰＴおよびＣＤ４０Ｌをトランスフェクションの８時間後に、さらに１８時間適用した。
【図２Ａ】ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立してＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方、ｃＩＡＰ１はその分解を促進することを示す。ＮＩＫであるが酵素的には不活性なＮＩＫがＳＩＶＡを安定化する。ＳＩＶＡ２は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において、野生型ＮＩＫまたは酵素的に不活性なＮＩＫ突然変異体ＫＤ−ＮＩＫと、同時トランスフェクトされ、ライセートはトランスフェクション後２４時間ＳＩＶＡおよびＮＩＫ発現について分析された。
【図２Ｂ】ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立してＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方、ｃＩＡＰ１はその分解を促進することを示す。ＴＲＡＦ２はＳＩＶＡ２をＮＩＫとは独立して安定化させる。プラスミドがＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中に表示されたようにトランスフェクトされ、ライセートをトランスフェクション後２４時間分析した。
【図２Ｃ】ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立してＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方、ｃＩＡＰ１はその分解を促進することを示す。ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２は共にＣＤ７０誘導ＳＩＶＡ２安定化に不可欠である。プラスミドをＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７細胞に、ＴＲＡＦ２  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション２４時間後にトランスフェクトした。ＣＤ７０を、最初のトランスフェクションの時間から開始される４８時間の処理期間の最後の１８時間に適用した。
【図２Ｄ】ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立してＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方、ｃＩＡＰ１はその分解を促進することを示す。ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２は共にＣＤ７０誘導ＳＩＶＡ２安定化に不可欠である。ＳＩＶＡ２およびＫＤ−ＮＩＫをＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７細胞に一時的に同時トランスフェクトし、２８時間のトランスフェクションの最後の１８時間ＣＤ７０で処理した。
【図２Ｅ】ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立してＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方、ｃＩＡＰ１はその分解を促進することを示す。ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２は共にＣＤ４０誘導ＳＩＶＡ２安定化に不可欠である。ＥｃＲ−２９３−ＣＤ４０細胞を、表示したプラスミドでトランスフェクトし、８時間後、ＣＤ４０を１８時間適用した。トランスフェクションにおける全プラスミド濃度は、空ベクターの使用により維持した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドは、トランスフェクションの均一性をモニターするために使用した。
【図２Ｆ】ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立してＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方、ｃＩＡＰ１はその分解を促進することを示す。ＮＩＫではなくＴＲＡＦ２は、ＴＮＦ−誘導ＳＩＶＡ２安定化に寄与する。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をＳＩＶＡ２およびｐＳＵＰＥＲ  ＮＩＫまたはＴＲＡＦ２  ｓｉＲＮＡで上述したようにトランスフェクトした。ＴＮＦを、細胞が回収される前に表示した時間適用した。
【図２Ｇ】ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立してＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方、ｃＩＡＰ１はその分解を促進することを示す。ＮＩＫはＴＲＡＦ２と独立してＳＩＶＡ２を安定化する。プラスミドをＨＥＫ−２９３細胞に、ＴＲＡＦ２  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション２４時間後にトランスフェクトした。ライセートを最初のトランスフェクションの４８時間後に調製し、ＳＩＶＡ２およびＴＲＡＦ２について分析した。
【図２Ｈ】ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立してＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方、ｃＩＡＰ１はその分解を促進することを示す。ｃＩＡＰ１およびそのＨ５８８Ａ突然変異体のＳＩＶＡ２発現に対する効果を示す。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種し、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２およびＦＬＡＧｃＩＡＰ１またはＦＬＡＧｃＩＡＰ１（Ｈ５８８Ａ）プラスミドと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２８時間後、細胞を回収し、ＳＩＶＡ２およびｃＩＡＰ１のレベルをウエスタンブロッティングにより評価した。矢印は、ｃＩＡＰ１（Ｈ５８８Ａ）でトランスフェクトされた細胞に蓄積するＳＩＶＡ２の修飾形態を指し示す。
【図３Ａ】ＳＩＶＡがＯ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンで修飾され、この種の修飾がＴＲＡＦ２およびＮＩＫによるその安定化に寄与することを示す。ＳＩＶＡ２は、細胞にアジドＧｌｃＮＡｃを組み込む。ＮＩＫおよびＳＩＶＡ２で同時トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、アジド−ＧｌｃＮＡｃで代謝的に標識され、インビトロでビオチニル化され、免疫沈降された。ＳＩＶＡ２のビオチン標識ＧｌｃＮＡｃ部位は、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で検出された。
【図３Ｂ】ＳＩＶＡがＯ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンで修飾され、この種の修飾がＴＲＡＦ２およびＮＩＫによるその安定化に寄与することを示す。ＳＩＶＡはコムギ胚芽凝集素に結合する。ＳＩＶＡ２単独用、またはＳＩＶＡとＮＩＫまたはＴＲＡＦ２と用のプラスミドをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において一時的に発現させた。ラクタシスチンを２４時間処理期間の最後の６時間適用した。ライセートをＳＩＶＡ２の発現（右パネル）およびＷＧＡ結合（左パネル）について分析した。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（０．５Ｍ）をＷＧＡ結合の競合物質として添加した。
【図３Ｃ】ＳＩＶＡがＯ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンで修飾され、この種の修飾がＴＲＡＦ２およびＮＩＫによるその安定化に寄与することを示す。β−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理はＳＩＶＡ２のＷＧＡへの結合を無効にする。ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２をｍｙｃ−ＮＩＫとＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２ビーズと免疫沈降した。免疫沈降したビーズを１％ＳＤＳで煮沸し、溶離したタンパク質をβ−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで記載されているように（Whelan、2006）処理した。試料を、４、８および２０時間の処理後回収し、ＷＧＡ結合緩衝液で希釈し、レクチンの結合を方法の項に記載するようにアッセイした。前述した８時間の処理後の抗−ＦＬＡＧ−Ｍ２ビーズとのタンパク質の免疫沈降と続くウエスタン分析により、ＷＧＡに結合する能力を失っているにもかかわらず、そのタンパク質はインタクトなままであったことが確認された。「Ｓｕｐ」は、反応後結合していないままのＳＩＶＡタンパク質。
【図３Ｄ】ＳＩＶＡがＯ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンで修飾され、この種の修飾がＴＲＡＦ２およびＮＩＫによるその安定化に寄与することを示す。Ｏ−グルコシル化の阻害は、ＴＲＡＦ２誘導ＳＩＶＡ２安定化を妨害するが、ＭＧ１３２誘導安定化には影響しない。プラスミドがＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で一時的に発現された。２８時間処理期間の最後の１６時間ＤＯＮ（５０μＭ）を、最後の６時間ＭＧ１３２を適用した。
【図３Ｅ】ＳＩＶＡがＯ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンで修飾され、この種の修飾がＴＲＡＦ２およびＮＩＫによるその安定化に寄与することを示す。Ｏ−グルコシル化の阻害は野生型ＳＩＶＡ２のＮＩＫ介在性安定化を阻止するが、ＳＩＶＡ２６ＳＡ突然変異体のＮＩＫによる残りの安定化には影響しない。図３Ｄに示したように、実験をおこなった。
【図３Ｆ】ＳＩＶＡがＯ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンで修飾され、この種の修飾がＴＲＡＦ２およびＮＩＫによるその安定化に寄与することを示す。Ｏ−ＧｌｃＮアシル化の特異的阻害は、ＮＩＫ誘導ＳＩＶＡ２安定化を阻止する。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をＮＩＫおよびＳＩＶＡ２で同時トランスフェクトし、ついで、２８時間の処理の最後の１６時間に０．７、１．４または２．０ｍＭのＢＡＤＧＰで処理した。第一のレーンは、ＢＡＤＧＰ溶媒のみで処理した細胞におけるＳＩＶＡ２の発現を示す。
【図４Ａ】ＳＩＶＡ２がそのＮ−末端の複数のセリン残基でリン酸化され、このリン酸化も同様にＳＩＶＡ２の安定化に寄与すると思われることを示す。ＳＩＶＡ２は細胞中でリン酸化される。一時的にｍｙｃ−ＮＩＫおよびＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、［32Ｐ］オルトリン酸塩で代謝的に標識化した。ＭＧ１３２を処理の最後の６時間適用した。
【図４Ｂ】ＳＩＶＡ２がそのＮ−末端の複数のセリン残基でリン酸化され、このリン酸化も同様にＳＩＶＡ２の安定化に寄与すると思われることを示す。ＮＩＫを過剰発現する細胞から単離されたＳＩＶＡ２のリン酸化部位の配置。ＳＩＶＡ２のリン酸化された残基を含むペプチドを、ｍ／ｚ  −７９の陰イオンモードでプレカーサーイオンスキャンにより位置付けた。リン酸化残基は、陽性モードにおけるタンデムナノ電子スプレーＭＳ分析により、より遅れて決定された（表ＳＩ参照）。上段に、ＳＩＶＡ２における、リン酸化された可能性の高い残基（太字体）および確認されたリン酸化残基（太字体およびｐＳnと指定）の図式的表示を含むＳＩＶＡ２のアミノ酸配列を示す。
【図４Ｃ】ＳＩＶＡ２がそのＮ−末端の複数のセリン残基でリン酸化され、このリン酸化も同様にＳＩＶＡ２の安定化に寄与すると思われることを示す。ＳＩＶＡ２のインビトロリン酸化。セリン突然変異の効果。ｍｙｃ−ＮＩＫおよびＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２およびその表示したセリン突然変異体（３ＳＡ：残基５、５０および５１のアラニンによる置換、および６ＳＡ：残基５、２１、２６、３５、５０および５１のアラニンによる置換）を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、免疫沈降したＳＩＶＡをインビトロキナーゼアッセイ（Ramakrishnan、2004）にかけた。最下段のパネルは、キナーゼ反応におけるＳＩＶＡ２およびその突然変異体の規格化した総量を示す。共沈降したＮＩＫのウエスタンブロット分析により、沈降のその量は３ＳＡまたは６ＳＡ突然変異により減少されないことが確認された。
【図４Ｄ】ＳＩＶＡ２がそのＮ−末端の複数のセリン残基でリン酸化され、このリン酸化も同様にＳＩＶＡ２の安定化に寄与すると思われることを示す。ＮＩＫの発現またはプロテアソームの阻害は、ＳＩＶＡのＮ末端を安定化する。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、表示したようにＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２（１〜５８）およびｍｙｃ−ＮＩＫでトランスフェクトした。ＭＧ１３２（２５μＭ）を２４時間処理の最後の６時間適用した。細胞を回収し、溶解し、ＳＩＶＡ２レベルを抗−ＦＬＡＧ抗体により評価した。
【図４Ｅ】ＳＩＶＡ２がそのＮ−末端の複数のセリン残基でリン酸化され、このリン酸化も同様にＳＩＶＡ２の安定化に寄与すると思われることを示す。ＮＩＫ共発現は、ＳＩＶＡ２（１〜５８）のリン酸化を増強する。細胞におけるＳＩＶＡ２（１〜５８）のリン酸化は、表示したプラスミドのトランスフェクション２２時間後に、［32Ｐ］オルトリン酸塩による代謝的標識化で評価した。オカダ酸（１μＭ）を最後の４５分添加した。
【図５Ａ】ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与するＳＩＶＡ２のアミノ酸残基の同定を示す。個々のセリン突然変異はＮＩＫ誘導ＳＩＶＡ２安定化を妨害しない。種々のセリン突然変異体ＳＩＶＡ２プラスミドを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にＮＩＫと同時トランスフェクトし、細胞ライセートをトランスフェクションの２４時間後に分析した。
【図５Ｂ】ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与するＳＩＶＡ２のアミノ酸残基の同定を示す。ＳＩＶＡ２のチロシン３４は、そのリン酸化またはＮＩＫによる安定化に関与しない。表示したプラスミドをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２４時間後にライセート中のＳＩＶＡ２およびＮＩＫを測定した（上の２つのパネル）。最下段のパネル：ＮＩＫを共発現する細胞から免疫沈降したＳＩＶＡおよびＳＩＶＡ突然変異体タンパク質を用い、図４Ｃに記載したように行われたインビトロキナーゼアッセイからのリン酸化ＳＩＶＡ２。
【図５Ｃ】ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与するＳＩＶＡ２のアミノ酸残基の同定を示す。リン酸化されることができるＳＩＶＡ２のいくつかの残基の複合突然変異は、そのタンパク質のＮＩＫ誘導安定化を妨害する。表示した各プラスミドをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、細胞ライセート中のＳＩＶＡ２およびＮＩＫの量をトランスフェクションの２４時間後に測定した。
【図５Ｄ】ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与するＳＩＶＡ２のアミノ酸残基の同定を示す。ＴＲＡＦ２およびプロテアソーム阻害は、ＮＩＫにより安定化できないＳＩＶＡ２セリン突然変異体を安定化する。プラスミドを上述のようにトランスフェクトした。ＭＧ１３２を１８時間後に添加し、さらに６時間後に細胞タンパク質を抽出した。
【図５Ｅ】ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与するＳＩＶＡ２のアミノ酸残基の同定を示す。ＳＩＶＡ２における複合セリン突然変異は、ＣＤ４０Ｌによるその安定化を危険にさらす。ＥｃＲ−２９３−ＣＤ４０細胞を、ＳＩＶＡ２プラスミド０．７５μｇ、またはＳＩＶＡ２  ６ＳＡ突然変異体プラスミド１．５μｇでトランスフェクトした。ＣＤ４０Ｌを、細胞回収（トランスフェクションの３０時間後に行った）の前に表示した時間適用した。
【図５Ｆ】ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与するＳＩＶＡ２のアミノ酸残基の同定を示す。ＳＩＶＡ２のリジンは、ＴＲＡＦ２によるその安定化に関与する。表示したプラスミドをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。全細胞ライセートをトランスフェクションの２４時間後に調製し、ウエスタンブロッティングにより分析した。
【図５Ｇ】ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与するＳＩＶＡ２のアミノ酸残基の同定を示す。ＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与するリジンは、ＮＩＫによるその安定化には関与しない。ＳＩＶＡ２およびＮＩＫ発現レベルは上記のように測定した。
【図６Ａ】ＳＩＶＡ２は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に動員され、特異的にＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、およびｃＩＡＰ１に結合することを示す。トランスフェクトされたＳＩＶＡ２は内因性ＴＲＡＦ２に結合する。ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２またはＨＩＳ−ＳＩＶＡ２（対照）をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＳＩＶＡ２は抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２ビーズを用いて免疫沈降し、共沈降した細胞ＴＲＡＦ２をウエスタンブロッティングによりアッセイした。ＴＲＡＦ２の全細胞レベルは、最下段に示す。
【図６Ｂ】ＳＩＶＡ２は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に動員され、特異的にＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、およびｃＩＡＰ１に結合することを示す。ＳＩＶＡ２はＴＲＡＦ２誘導的に結合する。細胞ＥｃＲ２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ２のポナステロンによる２時間の処理によりＳＩＶＡ２を誘導し、表示したようにＣＤ７０で処理し、その後ＴＲＡＦ２を免疫沈降した。
【図６Ｃ】ＳＩＶＡ２は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に動員され、特異的にＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、およびｃＩＡＰ１に結合することを示す。ＳＩＶＡ２はインビトロでＴＲＡＦ２に結合する。ＦＬＡＧ−タグ化ＴＲＡＦ２を、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２ビーズで免疫沈降し、ＦＬＡＧペプチドを用いてビーズから溶離し、ＧＳＴ−ＳＩＶＡ２またはその突然変異体とインキュベートし、その後、表示したように免疫沈降とウエスタンブロッティングにかけた。
【図６Ｄ】ＳＩＶＡ２は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に動員され、特異的にＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、およびｃＩＡＰ１に結合することを示す。ＳＩＶＡ２はそのＮ−末端でｃＩＡＰ１に結合する。左パネル：インビトロ結合。組換えｃＩＡＰ１をＧＳＴ−ＳＩＶＡ２またはその突然変異体とインキュベートした。右および下段パネルは、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞における結合を表現する。右パネル：細胞をＨＩＳ−ＳＩＶＡ２、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２（１〜５８）またはＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２でトランスフェクトした。２８時間後、内因性ｃＩＡＰ１を免疫沈降した。ＭＧ１３２をインキュベーションの最後の６時間適用した。下段パネル：細胞を、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２（１〜５８）または特異性対照としてＦＬＡＧ−ＧＳＴ−ＢＲ３−ＩＣＤ*（ＢＡＦＦ受容体の細胞内ドメインがそのＴＲＡＦ３−結合領域で突然変異されている（ＰＶＰＡＴ＞ＡＶＡＡＡ））でトランスフェクトした。２８時間後、トランスフェクトされたタンパク質を免疫沈降し、共沈降した内因性ｃＩＡＰ１を調べた。ＭＧ１３２をインキュベーションの最後の６時間適用した。
【図６Ｅ】ＳＩＶＡ２は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に動員され、特異的にＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、およびｃＩＡＰ１に結合することを示す。図６Ｄおよび図６Ｈに示されたｃＩＡＰ１、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２に結合するＳＩＶＡ２の欠失分析の図表示である。左：使用した欠失変異体。右：観察された結合。Ｎ／Ａは分析されず。アスタリスクは、イーストツーハイブリット試験における評価を意味する（他の試験はすべてトランスフェクトされた哺乳類細胞において行われた。）。
【図６Ｆ】ＳＩＶＡ２は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に動員され、特異的にＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、およびｃＩＡＰ１に結合することを示す。ＳＩＶＡ２へのＮＩＫの結合（上段パネル）およびＴＲＡＦ２の結合（下段パネル）は、ＳＩＶＡ２のＣ−末端領域（システイン−リッチ領域）に作用する。表示したプラスミドをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。ライセートをトランスフェクションの２４時間後に調製し、図に表示したように分析した。このプラスミドのみでトランスフェクトされた細胞においてＳＩＶＡ２の発現をさらに増加させるために、これらの細胞をＭＧ１３２（２５μＭ）で回収前の最後の４時間処理した。ＷＢ：抗−ＨＩＳ。ＣＲＲ自体に相当する欠失構造体は、むしろ発現されにくく、したがって、この領域へのタンパク質の結合を評価するために使用することができなかった。
【図７Ａ】ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ２−およびＮＩＫ−媒介シグナル伝達を阻害することを示す。ラモスＴ−ＲＥｘ−ＳＩＶＡ２細胞におけるＳＩＶＡ２の誘導は、ＣＤ７０による正準経路および代替経路の両方の誘導（それぞれ中央および左パネル）およびＴＮＦによる正準ＮＦ−κＢ経路の誘導（右パネル）を抑制する。
【図７Ｂ】ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ２−およびＮＩＫ−媒介シグナル伝達を阻害することを示す。ＥｃＲ２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ２細胞におけるＳＩＶＡ１（右パネル）ではなくＳＩＶＡ２（左パネル）の誘導は、ＣＤ７０による代替的ＮＦ−κＢ経路の活性化を抑制する（ＩκＢα分解なく、または核へのｐ６５移行が、ＣＤ７０処理ＥｃＲ２９３−ＣＤ２７細胞において識別され得る）。ＳＩＶＡのウエスタンブロット分析により、ＳＩＶＡ２の誘導のレベルは、ＳＩＶＡ１のものより非常に低いということが証明される。プロテアソーム阻害によりさらに増強されない限り、ＳＩＶＡ２は検出レベル以下であった。
【図７Ｃ】ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ２−およびＮＩＫ−媒介シグナル伝達を阻害することを示す。ＳＩＶＡの抑制は、ＮＩＫ発現を増加させ、また代替的ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化を引き起こし、正準経路の応答性を増加させる。左パネル：ｐＳＵＰＥＲ  ＳＩＶＡプラスミドの混合物（２×ｐＳＵＰＥＲ  ２７５＋１×ｐＳＵＰＥＲ  ＮＣ３）を、レトロウイルスにより形質導入したＮＩＫを発現するＥｃＲ２９３−ＣＤ２７細胞に一時的にトランスフェクトした。４０時間後、細胞をＣＤ７０で８時間処理し、ついで細胞質および核抽出物をＮＦ−κＢタンパク質とＮＩＫについてアッセイした。ｓｉＲＮＡによるＳＩＶＡ発現の効果的な抑制は、ＳＩＶＡメッセージのＲＴ−ＰＣＲによりパネルＣ、ＤおよびＥに示した実験において確認された。実験は材料および方法の項に記載するように行った。右パネル：レンチウイルスにより形質導入されたＳＩＶＡｓｈＲＮＡ  ＮＣ３を安定的に発現するラモス細胞（ＳＩＶＡ−ノックダウン）を、ＣＤ７０で表示した時間処理し、核抽出物をＮＦ−κＢタンパク質について分析した。Ｏｃｔ１をローディング対照とした。
【図７Ｄ】ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ２−およびＮＩＫ−媒介シグナル伝達を阻害することを示す。ＳＩＶＡの抑制はＣＤ７０誘導ＮＦ−κＢの活性化を増強した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、ＣＤ２７、ｐＳＵＰＥＲ−ＳＩＶＡプラスミドの混合物、およびルシフェラーゼレポータープラスミドで一時的に同時トランスフェクトした。２６時間後、細胞をＣＤ７０で４時間処理した。ライセートを２つの独立した実験で三重に分析し、結果は平均誘導倍率を表す。
【図７Ｅ】ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ２−およびＮＩＫ−媒介シグナル伝達を阻害することを示す。ＳＩＶＡの抑制は、ＣＤ７０およびＴＮＦによるＭＡＰＫ活性を増強する。左：対照およびＳＩＶＡ−ノックダウンラモス細胞を図７Ｃの右パネルで示したように処理した。右：ｐＳＵＰＥＲ  ＳＩＶＡをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において一時的に発現させ、トランスフェクションの４８時間後にＴＮＦを教示した持続時間適用した。全細胞ライセートをリン酸化ＪＮＫおよびｐ３８、ならびに全ＪＮＫおよびｐ３８について分析した。
【図８Ａ】ＳＩＶＡ２は、ｃＩＡＰ１と協働して、ＣＤ２７に応答してＴＲＡＦ２のユビキチン化および分解を媒介することを示す。ＳＩＶＡ２は、ＣＤ２７受容体複合体におけるＴＲＡＦ２のユビキチン化および分解を促進する。左パネル：ＳＩＶＡ２ノックダウンによる、ＴＲＡＦ２の受容体複合体への動員の抑制、ならびにそのユビキチン化の抑制。ＥｃＲ２９３−ＣＤ２７細胞をｐＳＵＰＥＲ  ＳＩＶＡプラスミドの混合物でトランスフェクトし、４８時間後ＣＤ７０で表示した時間処理した。免疫沈降した受容体複合体におけるＣＤ２７のウエスタンブロット分析を内部対照とした。ＳＩＶＡ抑制の有効性は、材料および方法の項に記載したように、ＳＩＶＡメッセージのＲＴ−ＰＣＲによりこの実験およびＣにおいて評価した。他のパネル：ＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）またはＳＩＶＡ１ではなく、誘導的に発現されたＳＩＶＡ２は、受容体複合体におけるＴＲＡＦ２ユビキチン化を増強する。ラモスＴ−Ｒｅｘ−ＳＩＶＡ２細胞、ラモスＴ−Ｒｅｘ−ＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）細胞、またはラモスＴ−Ｒｅｘ−ＳＩＶＡ１細胞（５×１０7細胞）をドキシサイクリンで２時間誘導し、ついでＣＤ７０を表示した時間適用した。細胞におけるタンパク質のユビキチン化をアッセイする全ての実験において、ユビキチンアルデヒド（５μＭ）を細胞ライセートに添加した。
【図８Ｂ】ＳＩＶＡ２は、ｃＩＡＰ１と協働して、ＣＤ２７に応答してＴＲＡＦ２のユビキチン化および分解を媒介することを示す。ＳＩＶＡの抑制がＣＤ７０誘導ＴＲＡＦ２分解を阻止する。ＥｃＲ２９３−ＣＤ２７細胞を図８Ａの左パネルのようにトランスフェクトし、表示した時間ＣＤ７０で処理した。
【図８Ｃ】ＳＩＶＡ２は、ｃＩＡＰ１と協働して、ＣＤ２７に応答してＴＲＡＦ２のユビキチン化および分解を媒介することを示す。ＮＩＫ−またはＮＩＫ（Ｋ６７０Ａ）−発現細胞のＣＤ７０への応答に対するＳＩＶＡ２の効果。レトロウイスルで形質導入されたＮＩＫまたはＮＩＫ（Ｋ６７０Ａ）突然変異体を構造的に発現するＥｃＲ２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ２細胞をＣＤ７０で処理し、表示した場合ポナステロンでも８時間処理した。
【図８Ｄ】ＳＩＶＡ２は、ｃＩＡＰ１と協働して、ＣＤ２７に応答してＴＲＡＦ２のユビキチン化および分解を媒介することを示す。ＳＩＶＡ２を発現する細胞のＣＤ２７受容体複合体におけるＴＲＡＦ２のＫ４８−結合ユビキチン化。ＥｃＲ２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ２細胞を表示したＨＡ−タグユビキチン突然変異プラスミドでトランスフェクトし、ＳＩＶＡ２をポナステロン２時間で誘導した。ついで、ＣＤ７０を１５分間適用し、ＣＤ２７受容体複合体を抗−ＦＬＡＧにより沈降させた。免疫沈降物を１％ＳＤＳで煮沸し、溶解緩衝液で２０倍に希釈し、抗−ＨＡ抗体で再−免疫沈降し、抗−ＴＲＡＦ２抗体で分析した。
【図８Ｅ】ＳＩＶＡ２は、ｃＩＡＰ１と協働して、ＣＤ２７に応答してＴＲＡＦ２のユビキチン化および分解を媒介することを示す。ＣＤ７０−誘導ＴＲＡＦ２分解にはｃＩＡＰ１が必要とされる。ＥｃＲ２９３−ＣＤ２７細胞をｃＩＡＰ１  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にＣＤ７０で表示した時間処理した。
【図９Ａ】ＳＩＶＡ２は、ＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰ１の両方のユビキチン化を媒介することを示す。細胞におけるＳＩＶＡ２−媒介ＴＲＡＦ２ユビキチン化にはｃＩＡＰ１が必要とされる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｃＩＡＰ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、２４時間後、表示した他のプラスミドでトランスフェクトした。これらの細胞のライセートから免疫沈降したＴＲＡＦ２のユビキチン化の程度、ならびに内因性ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２およびトランスフェクトされたユビキチンの細胞レベルが、ウエスタンブロット分析により測定された。
【図９Ｂ】ＳＩＶＡ２は、ＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰ１の両方のユビキチン化を媒介することを示す。ＳＩＶＡ１ではなくＳＩＶＡ２は、細胞におけるＴＲＡＦ２のＫ４８−結合ポリユビキチン化を増強する。９０ｍｍプレートに増殖させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム法により４μｇのＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２（Ｃ３４Ａ）で、６μｇのＨＡ−ユビキチン突然変異体プラスミドおよび６μｇのＨＩＳ−ＳＩＶＡ２またはＨＩＳ−ＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）またはＨＩＳ−ＳＩＶＡ１と一緒にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの２４時間後に溶解し、ＴＲＡＦ２を表示したように沈降させテ分析した。野生型ＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ１、ならびにＳＩＶＡ（Ｃ７３Ａ）突然変異体をＴＲＡＦ２と共沈降させた（下段パネル）。
【図９Ｃ】ＳＩＶＡ２は、ＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰ１の両方のユビキチン化を媒介することを示す。ＳＩＶＡ２は、インビトロでＩＡＰ１をユビキチン化する。Ｅ２酵素として使用されるＵｂｃＨ５ｂまたはＵｂｃ１３／Ｕｅｖｌａのいずれかによるユビキチン化反応において、組換えｃＩＡＰ１がＳＩＶＡ２またはＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）突然変異体とインキュベートされた。反応後、タンパク質を図８ＤでのようにＳＤＳで処理し、ついで表示したように免疫沈降し、ウエスタンブロッティングにより分析した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明による知見は、ＳＩＶＡ２がＴＮＦ／ＮＧＦ受容体シグナル伝達のフィードバック調節因子であるということ、およびＳＩＶＡ２安定化のモジュレーションが、これらの受容体の活性と関係する疾患、障害または症状の治療において使用できるということを示す。
【００４２】
本発明は、治療に使用することができる安定性が改善されたＳＩＶＡ２またはその塩であって、以下の翻訳後修飾、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）ＳＩＶＡ２のセリン残基５、５０および５１のリン酸化；（iii）Ｋ１７および／またはＫ９９残基におけるＳＩＶＡ２上のユビキチン化；または（iv）（ｉ）〜（iii）の組合せの１つ以上を含むことにより特徴付けられる、安定性の改善されたＳＩＶＡ２またはその塩を提供する。本発明はまた、安定化されたＳＩＶＡ２ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、断片、円順列変異誘導体に関し、本明細書においてまとめて安定化ＳＩＶＡ２と総称する。
【００４３】
ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体によるシグナル伝達に関与することが知られているタンパク質のなかで、それらは、（ｉ）シグナル伝達を媒介するタンパク質と（ii）受容体の種々の活性のうちのいずれかに、どのような強度およびどのくらいの長さかを命令する、シグナル伝達を調節するタンパク質との２つの機能的グループに区分けすることができる。第１のグループのタンパク質は通常、構造的に細胞中に存在し、リガンド結合に際し受容体にいつでも動員される。しかしながら、シグナル伝達を制御するタンパク質の発現は、しばしばそれ自体がシグナル伝達に依存する。すなわち、それらの細胞レベルはＴＮＦ／ＮＧＦ受容体により、ならびにこれらの受容体の機能に影響を及ぼす他の薬剤により増強される。ＳＩＶＡの初期の研究は、このタンパク質はシグナル伝達を媒介するということ、およびこのタンパク質は特異的に細胞死を促進させるように作用するということを示唆していると解釈された。これは実際ＳＩＶＡ１の場合であると思われる。ＳＩＶＡ２については、本発明により、このタンパク質はむしろシグナル伝達の調節因子として機能し、必ずしも細胞死を促進させるものではなく、実際、受容体誘導シグナル伝達を調節するタンパク質に典型的に、それ自身の細胞におけるレベルがＴＮＦ／ＮＧＦ受容体により生み出されるシグナルにより影響される。その機能において、およびその形成の調節において、ＳＩＶＡ２は本発明によりＳＩＶＡ１とは異なることが示される。後者はＳＩＶＡ２と異なり、ＳＩＶＡ２よりも多量に種々の細胞に構造的に存在し、さらに、細胞ストレスにより誘導される。また、ＳＩＶＡ１とＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体のシグナル伝達複合体との関係は検出されず、ＳＩＶＡ２により示されるシグナル伝達に対する効果もない。
【００４４】
ＳＩＶＡ１の短い変異体であるＳＩＶＡ２は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に特異的に動員され、それらのいくつかの非アポトーシス性作用についてのシグナル伝達を阻害も増強もできる。本発明により、（ａ）ＳＩＶＡの細胞内含有量は刺激のない状態では非常に低く、これらの受容体が誘発されたあと非常に増加されること；（ｂ）この増加は、ＳＩＶＡ２に結合するシグナル伝達タンパク質、ＴＲＡＦ２およびＮＩＫによるその安定性の増強を反映すること；および（ｃ）該安定性の増強が、Ｏ−ＧｌｃＮアシル化、特定のリジンにおけるユビキチン化、特定のセリンにおけるリン酸化などの、ＳＩＶＡ２の翻訳後修飾を含むということが見出された。また、本発明により、ＳＩＶＡ２が抗アポトーシス性タンパク質ｃＩＡＰ１に結合およびユビキチン化し、ＴＲＡＦ２に結合しその分解を誘発するということも見出された。最近、本発明者らにより、ＳＩＶＡ２はＮＩＫおよびＴＲＡＦ３のユビキチン化およびプロテアソーム処理もモジュレートすることが見出された（国際公開第２００７／０８０５９３号パンフレット）。全体で、これらの知見はＳＩＶＡ２が、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体シグナル伝達のフィードバック調節因子であるということ、およびＳＩＶＡ３の安定性のモジュレーションがＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体によるシグナル伝達において重要な役割を果たしているということを強調している。
【００４５】
本発明により、フィードバックループがＳＩＶＡ２の受容体シグナル伝達複合体への動員、ならびにＳＩＶＡ２が結合する２つのシグナル伝達タンパク質ＴＲＡＦ２およびタンパク質キナーゼＮＩＫの活性化により誘導されるＳＩＶＡ２の劇的な安定化により開始されるということが見出された。それゆえに、ＳＩＶＡ２は、受容体に動員されるいくつかのシグナル伝達タンパク質のユビキチン化を義務付け、したがってそのプロテアソーム処理をモジュレートする。
【００４６】
これまで、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体によるシグナル伝達を調節するタンパク質の細胞レベルの増加の誘導の根底にあると報告されている機序は、転写レベルへの作用である。対照的に、本発明により、リガンド刺激後のＳＩＶＡ２レベルの増加は、転写後に生じるということが見出された。本発明により証明されたＳＩＶＡ２のレベルを増加させるためのＳＩＶＡ２の翻訳後修飾は、特定のセリン残基のリン酸化、Ｏ−ＧｌｃＮアシル化、およびユビキチン化などが含まれ、本発明により示すように、これらの修飾はＳＩＶＡ２の安定性のモジュレーションに寄与する。少なくとも２つのシグナル伝達タンパク質が、ＮＩＫはそのプロテインキナーゼ機能に依存することにより、そしてＴＲＡＦ２はそのユビキチンリガーゼ機能を含む機序により、サイトカイン誘導ＳＩＶＡ２安定化に関与していると思われた。
【００４７】
より詳細には、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の以下の相違点が本発明により見出された。（ａ）ＳＩＶＡ２は、種々の細胞株においてＳＩＶＡ１スプライス変異体よりもほとんど発現されず、ＣＤ７０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦなどのＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのサイトカインは、休止ＰＢＭＣにおいてＳＩＶＡ２の量を増加した；（ｂ）遺伝毒性ストレスではない、リガンド活性化およびプロテアソーム阻害は、活性化ＰＢＭＣにおいてＳＩＶＡ２レベルを増加させ、そのＳＩＶＡ２レベルの増加は、ＳＩＶＡ２の安定性の増加に起因するのであって、ＳＩＶＡ２発現の増加に起因するのではない；（ｃ）サイトカイン安定化は、ＳＩＶＡ１の安定性は不変のままであるので、ＳＩＶＡ２に特異的であった；（ｄ）ＳＩＶＡ２は、ＣＤ７０による処理によりＣＤ２７に動員され、一方ＳＩＶＡ１は動員されず、さらにＳＩＶＡ２はＣＤ４０およびＴＮＦＲ１に動員されることも示された；（ｅ）遺伝毒性薬剤はＳＩＶＡ１の発現を増強する一方、ＳＩＶＡ２の発現には影響しない；（ｆ）細胞におけるＳＩＶＡ２のＣＤ４０による安定化は遺伝毒性薬剤ＣＰＴで処理した場合減少した。これらのＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の相違点は、治療においてＳＩＶＡ２活性を特異的に誘導するために有利に使用できる。
【００４８】
本発明により細胞におけるその安定化に寄与することが見出されたＳＩＶＡ２の修飾の１つは、セリン残基のリン酸化、特にセリン残基５、５０および５１すべて（３Ｓ）におけるリン酸化、とりわけセリン残基５、２１、２６、３５、５０および５１すべて（６Ｓ）におけるリン酸化である。たとえば、３Ｓの突然変異体（ＳＩＶＡ３ＳＡ）は、ＳＩＶＡ２の安定化を有意に減少し、６Ｓ突然変異（ＳＩＶＡ６ＳＡ）は、ほぼ完全にＮＩＫにより誘導されるＳＩＶＡ２の安定化を減少する。注目すべきは、個々のセリン突然変異は、ＮＩＫ誘導ＳＩＶＡ２安定化を妨害せず、ＳＩＶＡ２のチロシン３４はＮＩＫによるそのリン酸化および安定化に関与していなかった。ＳＩＶＡ２は、ＳＩＶＡ３ＳＡの一部のみが、ＮＩＫを共発現する細胞から免疫沈降したＳＩＶＡタンパク質により行われるインビトロキナーゼアッセイからもリン酸化され、ＳＩＶＡ６ＳＡ突然変異体のほとんどがリン酸化されないということが見いだされた。ＮＩＫと異なり、ＴＲＡＦ２およびプロテアソーム阻害がＳＩＶＡ６ＳＡ突然変異体を安定化することが見出された。注目すべきは、ＳＩＶＡ２のセリン突然変異はサイトカインＣＤ４０Ｌによるその安定化を脅かす。また、本発明による知見は、ＳＩＶＡ２のリジンがＴＲＡＦ２によるその安定化に関与していることを示す。対照的に、ＳＩＶＡ２のリジンは、ＮＩＫによるその安定化に関与していないということを見出した。
【００４９】
本発明により細胞におけるその安定化に寄与することが見出されたＳＩＶＡ２のもう１つの修飾は、Ｏ−ＧｌｃＮアシル化である。たとえば、（ａ）ＳＩＶＡが糖タンパク質である；（ｂ）ＳＩＶＡ２は、ＮＩＫおよびＳＩＶＡ２で同時トランスフェクトされた細胞においてアジド−ＧｌｃＮＡｃを取り込む；（ｃ）β−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理が、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）基およびシアル酸に選択的に結合するコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）への、ＮＩＫと共発現された細胞から抽出したＳＩＶＡ２の結合を無効にした；（ｄ）Ｏ−グルコシル化の阻害も、ＴＲＡＦ２誘導ＳＩＶＡ２安定化を妨害したが、ＭＧ１３２誘導安定化には影響しなかった；（ｅ）Ｏ−グルコシル化の阻害は、野生型ＳＩＶＡ２のＮＩＫ媒介安定化を阻止するが、ＳＩＶＡ２  ６ＳＡ突然変異体のＮＩＫによる残りの安定化には効果がなかった；および（ｆ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化の特異的な阻害は、ＮＩＫ誘導ＳＩＶＡ２安定化を阻止した、ということを見出した。
【００５０】
さらに、本発明により、ＳＩＶＡ２のＳＩＶＡ２残基Ｋ１７および／またはＫ９９上のユビキチン化は、ＳＩＶＡ２の安定化に寄与するということが見出された。このユビキチン化による安定化は、ＴＲＡＦ２により誘導されるようである。
【００５１】
したがって、本発明は、治療におけるＳＩＶＡ２安定性の特異的モジュレーションの使用を提供する。ＳＩＶＡ２モジュレーションは、インビトロで、たとえば細胞を含まない系で、または細胞内で、たとえばインビボもしくはエクスビボで実施または誘導することができる。ＳＩＶＡ２安定性のモジュレーションは、疾患細胞または調節されていないレベルのサイトカインを産生する細胞において誘導することができる。ＳＩＶＡ２安定性のモジュレーションを誘導することができる細胞の例としては、単核細胞、リンパ系細胞、Ｔｒｅｇ細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、リンパ球、胚腎臓細胞、リンパ腫細胞、Ｂ−リンパ芽球腫細胞、肝細胞肝臓癌細胞、調節されていないレベルのＣＤ２７、ＣＤ４０、および／またはＴＮＦ受容体発現細胞などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明の１つの実施態様において、ＳＩＶＡ安定性のモジュレーションは、化学療法または放射線治療などの遺伝的毒性薬剤での治療の前、治療中、および／または後に細胞において誘導される。
【００５２】
本発明の１つの実施態様では、ＳＩＶＡ安定性のモジュレーションは、ＳＩＶＡ２の安定性の増加である。安定化されたＳＩＶＡ２は、以下の翻訳後修飾、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）ＳＩＶＡ２のセリン残基５、５０および５１のリン酸化；（iii）ＳＩＶＡ２残基、Ｋ１７および／またはＫ９９におけるユビキチン化；または（iv）（ｉ）〜（iii）の組合せの１つ以上を含むことにより特徴付けられる。
【００５３】
安定化されたＳＩＶＡ２は、たとえば細胞において、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１、Ｈ５８８ＡなどのｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害剤などの組換え体または内因性タンパク質（下記ＥＧＡ参照）の１つ以上を過剰発現することにより該細胞において誘導することができる。安定化されたＳＩＶＡ２は、ＳＩＶＡ２を前記タンパク質、たとえば下記の実施例に示すようなタンパク質と一緒に過剰発現させることにより細胞において誘導することができる。あるいは、Ｏ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼのアクチベーター、ＴＲＡＦ２、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの阻害剤、ｃＩＡＰ１活性阻害剤および／またはＨ５８８ＡなどのｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体を使用してもよい。
【００５４】
安定化されたＳＩＶＡ２は、ＳＩＶＡ２の低い活性に関連するか、または細胞におけるＳＩＶＡ２の活性を増加させることにより軽減される疾患、障害または症状を治療するためまたは治療するための医薬の製造において；および／またはＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのいくつかのメンバーによってタンパク質合成の方向へ活性化されるシグナル伝達経路が病因や経過に関係する疾患、障害または症状、たとえば癌、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を治療するためまたは治療するための医薬の製造において使用することができる。当該治療は、インビボまたはエクスビボで実施することができる。
【００５５】
本明細書中において用語「塩」は、本発明のポリペプチドのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、本技術分野において既知の手段により形成することができ、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛の塩などの無機塩、ならびにたとえばトリエタノールアミン、アルギニン、リジンなどのアミン、ピペラジン、プロカインと形成されるものなどの有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩は、たとえば、塩酸または硫酸などの塩鉱物酸との塩、酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。もちろん、いずれの塩もＳＩＶＡ２と実質的に同様の活性を有さなければならない。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「断片」は、ポリペプチド分子の一部または一部分（part or fraction）を意味し、ただし、そのより短いペプチドは、ＳＩＶＡ２の所望の生物学的活性を保持することを条件とする。断片は、ポリペプチドのいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片の生物学的活性、たとえばｃＩＡＰ１への結合、ＴＲＡＦ２への結合、ＮＩＫ分解の誘導、および／またはＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化を細胞において試験することにより容易に調製され得る。一度に１つのアミノ酸をポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかから除去するプロテアーゼは当技術分野において知られており、所望の生物学的活性を保持する断片は、そのようなプロテアーゼにより通常の実験で得ることができる。
【００５７】
タンパク質の「活性画分」として、本発明は、その化合物自体のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体単独、またはそこに結合された関連分子または残基との組合せであって、このような断片または前駆体が、医薬としてＳＩＶＡ２と同じ活性を示す、たとえば糖またはリン酸エステルの残基、またはポリペプチド分子の集合体を意味する。「前駆体」は、ヒト体内または動物体内においてＳＩＶＡ２に変換できる化合物である。
【００５８】
本明細書において使用する場合、定義「機能的誘導体」は、既知の方法によりアミノ酸部分の側鎖に、または末端Ｎ−またはＣ−基上に存在する官能基から製造される誘導体を意味し、それらが薬学的に許容され得る、すなわちそれらがタンパク質の活性を破壊することなく、それらを含む医薬組成物に毒性を与えることのない場合本発明に包含される。このような誘導体は、たとえば、カルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミド、およびたとえばアルカノイル−もしくはアロイル−基などのアシル基と形成される、遊離のアミノ基のＮ−アシル誘導体もしくは遊離のヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む。ＳＩＶＡ２は、安定性、半減期、バイオアベイラビリティー、人体による寛容、または免疫原性などのタンパク質の性質を改善するためにポリマーと結合されても良い。したがって、本発明の１つの実施態様は、アミノ酸残基の１つ以上の側鎖として存在する１つ以上の官能基に結合された少なくとも１つの部分を含むＳＩＶＡ２の機能的誘導体に関する。本発明の１つの実施態様は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合されたＳＩＶＡ２ポリペプチドに関する。ＰＥＧ化は、たとえば、国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載された方法などの既知の方法により実施され得る。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「円順列変異誘導体」は、直鎖状分子を意味し、終端が、直接またはリンカーを介して一緒に連結されて環状分子を生成し、ついでその環状分子が別の位置で開環され、元の分子とは異なる終端を有する新しい直鎖状分子を生成する。環状変異は、構造が環化され、ついで開環された分子と等価である分子を含む。したがって、円順列変異分子は、直鎖状分子として、環化および開環工程を経ることなくデノボ合成されてもよい。円順列変異誘導体の製造法は国際公開第９５／２７７３２号パンフレットに記載されている。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「ムテイン」は、ＳＩＶＡ２の類似体を意味する。本発明は、本発明の前記ＳＩＶＡ２タンパク質の類似体であって、本質的にＳＩＶＡ２の天然に存在する配列のみを有するＳＩＶＡ２タンパク質と同じ生物学的活性を本質的に保持する類似体にも関する。そのような「類似体」は、約３０個までのアミノ酸残基が、この種の修飾が実質的にタンパク質自体に関するタンパク質類似体の生物学的活性を変化しないように、ＳＩＶＡ２タンパク質において欠失、付加または他のアミノ酸残基によって置換されているものであっても良い。したがって、元のＳＩＶＡ２と比較した場合に得られた生成物の活性が大幅に変化させることなく、ＳＩＶＡ２の天然に存在する構成成分の１つ以上のアミノ酸残基は、異なるアミノ酸残基により置換されるかまたは欠失され、または１つ以上のアミノ酸残基がＳＩＶＡ２の元の配列に付加される。これらのムテインは、既知の合成技術および／または部位特異的突然変異誘発法、または任意のほかの好適な技術により製造される。
【００６１】
あらゆるそのようなムテインは、好ましくは、基本のＳＩＶＡ２と実質的に同様の活性を有するように、基本のＳＩＶＡ２と充分に重複したアミノ酸配列を有する。したがって、任意の所定のムテインが、本発明の基本のＳＩＶＡ２と実質的に同じ活性を有するかどうかを、そのような類似体を以下の実施例に説明する生物学的活性試験に付すこと、たとえばｃＩＡＰ１への結合、ＴＲＡＦ２への結合、ＮＩＫへの結合、ＮＩＫ分解の誘導、ＴＲＡＦ２のユビキチン化、自己ユビキチン化、ｃＩＡＰ１のユビキチン化、または細胞におけるＮＩＫ媒介ＮＦκＢ活性化の阻害などを含む日常の実験により決定することができる。
【００６２】
本発明にしたがって使用することができるＳＩＶＡ２タンパク質のムテイン、またはそれをコードする核酸は、日常的に過度の実験を伴うことなく、本願明細書に示された教示および助言に基づき当業者により得ることができる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして、実質的に対応する配列の有限集合を含む。タンパク質の化学および構造の詳しい説明については、Schulz, G.E.ら、Principle of Protein Structure, Spring-Verlag, New York, 1978; およびCreighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983を参照。これらの文献は参考文献として本明細書に組み込まれる。コドン選択などのヌクレオチド配列置換の提示については、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene PublicationsおよびWiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989参照。
【００６３】
本発明によれば、ムテインの好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。本質的に天然に存在するＳＩＶＡ２配列を有するＳＩＶＡ２タンパク質における保存的なアミノ酸置換は、充分同様の物理化学的性質を有するグループ内の同義アミノ酸を含み、そのグループのメンバー間の置換はその分子の生物学的機能を保存する（Granthem, Science, Vol. 185, pp. 862-864（1974））。アミノ酸の挿入および欠失は、特に挿入または欠失が、数個のアミノ酸、たとえば３０個以下および好ましくは１０個以下を伴い、また機能的コンフォメーションに絶対不可欠な、たとえばシステイン残基などのアミノ酸を除去または取換えない場合、前記定義された配列においてその機能を変化させることなくなされ得るということが明らかである（Anfinsen, “Principles That Govern The Folding of Protein Chains”, Science, Vol. 181, pp. 223-230（1973））。そのような欠失および／または挿入により作製された類似体は本発明の範囲に入る。
【００６４】
好ましくは、同義的アミノ酸のグループは表Ｉに定義されるものである。より好ましくは、同義的アミノ酸のグループは表IIに定義されるものであり、最も好ましくは、同義的アミノ酸のグループは表IIIに定義されるものである。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
【表２】
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【００６７】
【表３】
0005774313.tif 000004
【００６８】
ＳＩＶＡ２のムテインを得るために使用することができるタンパク質におけるアミノ酸置換の製造例には、Markらの米国特許ＲＥ３３，６５３号明細書、米国特許第４，９５９，３１４号明細書、米国特許第４，５８８，５８５号明細書および米国特許第４，７３７，４６２号明細書；Kothsらの米国特許第５，１１６，９４３号明細書；Namenらの米国特許第４，９６５，１９５号明細書、Chongらの米国特許第４，８７９，１１１号明細書；およびLeeらの米国特許第５，０１７，６９１号明細書に示されたもの；ならびに米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Strawら）に示されたリジン置換タンパク質などのあらゆる既知の方法工程が含まれる。
【００６９】
本発明のもう１つの好ましい実施態様において、本発明において使用するためのＳＩＶＡ２タンパク質のあらゆるムテインは、本発明の前記ＳＩＶＡ２タンパク質の配列と本質的に対応するアミノ酸配列を有する。用語「本質的に対応する」とは、特に、ＳＩＶＡ２に対するその影響が懸念される限りにおいてその基本の特徴に影響しない、基本のＳＩＶＡ２タンパク質の配列に対して変化の少ないムテインを包含することが意図される。通常、「本質的に対応する」という言葉に該当するとみなされる変化の種類は、本発明のＳＩＶＡ２タンパク質をコードするＤＮＡの従来の突然変異誘発技術から生じるものであり、数個の重要でない修飾、および所望の活性について前述した方法でスクリーニングに帰着する。
【００７０】
本発明の１つの実施態様において、このムテインはいずれも、ＳＩＶＡ２の配列と少なくとも４０％の同一性を有し、より好ましくは、ＳＩＶＡ２の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有する。
【００７１】
同一性は、配列を比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を示す。概して、同一性とは、比較される配列の長さにわたって、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの、それぞれヌクレオチド対ヌクレオチドのまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な一致を意味する。
【００７２】
正確に一致していない配列に対して、「％の同一性」が決定され得る。概して、比較すべき２つの配列は、配列間の最大の相関が生じるように並べられる。これには、アライメントの程度を高めるために、配列の片方または両方どちらかに「ギャップ（gap）」の挿入を含んでもよい。％同一性は、比較される配列それぞれの長さ全体にわたって決定され得（いわゆるグローバルアラインメント）、これは同一かかなり類似した配列に特に適しており、またはより短い定義された長さにわたって決定され得（いわゆるローカルアラインメント）、これは不揃いな長さの配列に適している。
【００７３】
本明細書において使用される場合、用語「配列同一性」は、アミノ酸配列が、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントプログラムのウインドウズインターフェースである（Thompsonら、1994）、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムを用いる低ホモロジー領域の改良版で、HanksおよびQuinn（1991）によるアライメントにより比較されるということを意味する。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムは、ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/clustalx/でインターネットにより利用可能である。もちろん、このリンクが使えなくなった場合は、当業者は過度の実験をすることなく標準的なインターネット検索技術を用いて他のリンクからこのプログラムのバージョン類を見つけることができるということが理解されるべきである。他に特段の定めがない限り、本明細書において引用されるプログラムはいずれも、本願の有効出願日現在で、最新バージョンが本発明を実施するために使用されるものである。
【００７４】
「配列同一性」を決定するための前記方法が、何らかの理由により有効でないと判断される場合、次の技術により配列同一性を決定することができる。配列は、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ‘ｓ  ＧＤＡＰ（グローバルアライメントプログラム）のバージョン９を用いて、−１２のギャップオープンペナルティー（ギャップの最初の空値について）と−４のギャップ拡張ペナルティー（ギャップにおける付加的な連続した空値それぞれ毎に）とを有する初期値（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックス（−４〜＋１１の値）を用いて整列される。アラインメント後、％同一性が一致数を請求する配列におけるアミノ酸数の割合として表現することにより計算される。
【００７５】
本発明によるムテインは、ストリンジェントな条件下で本発明によるＳＩＶＡ２タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、本質的にＳＩＶＡ２をコードする天然に存在する配列の全てを含むＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるものを含む。たとえば、そのようなハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡは、ＳＩＶＡ２の配列などを有する本発明の同じタンパク質をコードするものであるが、しかしそのヌクレオチドは、遺伝コードの縮重のために天然由来のヌクレオチド配列とはヌクレオチド配列が異なる、すなわち、多少異なるヌクレオチド配列がなお、この縮重により同じアミノ酸配列をコードし得る。
【００７６】
本発明による知見により、安定化されたＳＩＶＡ２の製造が可能となる。たとえば、安定化されたＳＩＶＡ２または安定性の改善されたＳＩＶＡ２は、タンパク質におけるＯ−ＧｌｃＮアシル化を増加させることにより、たとえば、タンパク質をＯ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼと接触させることおよび／またはＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性を阻害することにより得られ得る。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの誘導は、たとえば、細胞におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのレベルを増加させることにより達成することができる（Slawsonら、Journal of cellular Biochemistry 97:71-83, 2006）。また、ＳＩＶＡ２の安定化は、タンパク質のセリン残基５、５０および５１でのリン酸化を誘導することにより得ること、またはさらに増強させることが可能である。安定性の増加は、たとえばＳＩＶＡ２をＮＩＫと接触させることにより、セリン残基５、５０、５１、２１、２６および３５のリン酸化により得られ得る。加えて、ＳＩＶＡ２の安定化は、たとえばタンパク質をＴＲＡＦ２と接触させることにより、ＳＩＶＡ２のユビキチン化を増加させることにより得ること、またはさらに増強させることが可能である。ユビキチン化によるＳＩＶＡ２の安定化に関与するリジン残基は、Ｋ１７およびＫ９９の２つの残基のいずれか一方である。これらの残基における突然変異はＮＩＫによるＳＩＶＡ２の安定化には影響しない。ＳＩＶＡ２を安定化するためのもう１つの方法は、ＳＩＶＡ２を、Ｈ５８８ＡなどのｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体と接触させることによる。ＳＩＶＡ２と他の言及されたタンパク質との接触は、インビボ（たとえば、細胞内）およびインビトロ（たとえば、細胞を含まない系）で実施することができる。本発明の１つの実施態様において、ＳＩＶＡ２の安定性を特異的に増加させるために、細胞を操作し、１つ以上の以下のタンパク質、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２またはＨ５８８ＡなどのｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体を過剰発現させることができる。内因性タンパク質の過剰発現は、たとえば内因性遺伝子の活性化により実施することができる（ＥＧＡ、下記参照）。外因性タンパク質の過剰発現は、たとえば発現ベクターなどを用いて、そのタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入することにより実施することができる（下記参照）。本発明のさらなる実施態様において、ＳＩＶＡ２はそのタンパク質と共過剰発現される。安定化されたＳＩＶＡ２がエクスビボで製造される場合、細胞は、該安定性の改善されたＳＩＶＡ２を製造可能な条件下で培養され、得られたＳＩＶＡ２を培養物から回収する。たとえば、低栄養環境または過剰栄養環境でストレスをかけられた細胞は、Ｏ−ＧｌｃＮａｃレベルを上昇させることが示され、安定化ＳＩＶＡ２の製造に使用することができる。また、これまで試験された全ての種類のストレス（浸透圧、エタノール、酸化および熱ショック）は、細胞内のＯ−ＧｌｃＮａｃレベルを迅速に上昇させる（Slawsonら、2006）。
【００７７】
さらに、本発明は、哺乳類、昆虫類および酵母細胞などの真核細胞から選択される、安定化されたＳＩＶＡ２を含む宿主細胞を提供する。本発明の１つの実施態様において、その細胞は、ＨｅＬａ、２９３ＴＨＥＫまたはＣＨＯ細胞である。あるいは、本発明は、トランスジェニック動物の作製および該動物の体液からの産生されたタンパク質の単離を含む本発明の安定化されたＳＩＶＡ２を製造する方法を提供する。
【００７８】
安定化されたＳＩＶＡ２は、ＳＩＶＡ２をコードするベクターによりトランスフェクト、形質導入または感染された真核宿主細胞において、またはトランスジェニック動物において産生され得る。トランスジェニック動物を用いる場合、その乳中に異種ポリペプチドを産生することが特に有利である。
【００７９】
哺乳類細胞におけるタンパク質の過剰発現は、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを、プロモータ、任意にはイントロン配列およびスプライシングドナー／アクセプターシグナル、およびさらに任意には終止配列および分泌シグナルペプチドを含むベクターに、周知の技術（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、１６章に記載されている）により挿入することにより実施してもよい。
【００８０】
哺乳類細胞におけるタンパク質の過剰発現は、たとえばＳＩＶＡ２ポリペプチドおよび／またはＯ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２をコードする内因性遺伝子の発現の増加を誘導することにより実施してもよい。内因性のＳＩＶＡ２および／またはＯ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼおよび／またはＯ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＮＩＫ、およびＴＲＡＦ２の発現を変化させることも採用することができる。必要に応じて、化合物は、遺伝子の発現レベルまたは内因性タンパク質の活性を増加させ得る。そのような化合物は、充分でない量のタンパク質を発現する細胞においてタンパク質の内因性産生を誘導するためのベクターであり得る。そのベクターは、タンパク質の発現を望まれる細胞において機能する調節配列を含み得る。そのような調節配列は、たとえば、プロモータまたはエンハンサであり得る。ついで、調節配列は、相同組換えによりゲノムの正しい遺伝子座に導入され、調節配列は、発現の誘導または増強が必要とされる遺伝子と作動可能に連結され得る。その技術は、通常、「内因性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【００８１】
当業者には、ペプチドが過剰発現され、細胞中に過剰量のポリペプチドが生じた場合、またはペプチド発現を閉鎖することが望まれた場合、直接的にペプチド発現を閉鎖することも可能であるということが理解されるであろう。たとえば、細胞におけるＯ−ＧｌｃＮアシル化（Acidated）ＳＩＶＡ２を増加させるために、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの発現をＥＧＡにより小さくさせ得る。そうするために、サイレンシングエレメントなどの負の調節エレメントがタンパク質の遺伝子座に導入され、ゆえにタンパク質発現のダウンレギュレーションまたは抑制を導く。当業者は、そのようなタンパク質発現のダウンレギュレーションまたはサイレンシングは阻害剤の使用と同じ効果を有するということを理解するであろう。
【００８２】
本発明はまた、薬学的に許容され得る担体および、以下の翻訳後修飾、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）セリン残基５、５０および５１のリン酸化；（iii）Ｋ１７および／またはＫ９９残基におけるユビキチン化；または（iv）（ｉ）〜（iii）の組合せの１つ以上を含むことにより特徴付けられる、安定性が改善されたＳＩＶＡ２またはその塩を含む医薬組成物を提供する。
【００８３】
本発明により、ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１およびＮＩＫなどの、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体によるシグナル伝達を媒介することが知られている種々の他のタンパク質に結合することが見出された。ＴＲＡＦ２は、ＮＩＫ同様ＳＩＶＡ２のＣＲＲに結合し、ｃＩＡＰ１は、本発明によりＳＩＶＡ２のＮ−末端部分（ＣＲＲの上流）に結合することが見出された。ＳＩＶＡ２の誘導が、ＣＤ７０による代替および正準両方のＮＦ−κＢ経路の活性化ならびにＴＮＦによる正準経路の活性化を抑制するため、ＳＩＶＡ２はＴＲＡＦ２およびＮＩＫ媒介シグナル伝達を阻害できることも見出された。一方、ＳＩＶＡ１はＳＩＶＡ２よりも非常に高いレベルで発現されているが、そのような作用はもたなかった。反対に、ＳＩＶＡ発現がノックダウンされている細胞は、代替ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化を示し、また、正準ＮＦ−κＢ経路の基礎レベルの幾分の増加も示し、ＣＤ７０による活性化に対するこの経路の反応性を高めた。ＳＩＶＡのノックダウンはまた、ＣＤ７０によるおよびＴＮＦによる両方のＪＮＫおよびｐ３８キナーゼリン酸化の誘導を増強した。ＳＩＶＡ２は、ｃＩＡＰ１と協力して、ＣＤ７０に応答してＴＲＡＦ２のユビキチン化および分解を媒介した。また、以前に、ＣＤ７０に動員されたＴＲＡＦ２分子は、大量に（massively）ユビキチン化されるということが報告された（Ramakrishnanら、2004）。ＳＩＶＡのノックダウンはＴＲＡＦ２のＣＤ７０ユビキチン化を弱めた。対照的に、ＳＩＶＡ１ではなくＳＩＶＡ２の誘導がそれを増強した。
【００８４】
ＳＩＶＡ２は固有のユビキチン−リガーゼ活性を有するということ、およびＳＩＶＡ２はインビトロでのＴＲＡＦ２のユビキチン化を促進したということ（国際公開第２００７／０８０５９３号パンフレット）が以前に見出された。ＳＩＶＡ２のＣＲＲ内の７３位のシステイン残基がＴＲＡＦ２のユビキチン化に必要とされることが見出された。ＳＩＶＡ１ではなく野生型ＳＩＶＡ２の過剰発現が、ＴＲＡＦ２のＫ４８結合（Ｋ６３結合ではないが）ポリユビキチン化を、ＴＲＡＦ２が単独で発現された場合に観測される程度を越えて顕著に増強させ、一方ＳＩＶＡ（Ｃ７３Ａ）は、ほとんどユビキチン化に影響しなかったということが、トランスフェクトされた細胞を用いて証明された。ＳＩＶＡ２のインビトロでの自己ユビキチン化は、この突然変異により影響されなかったが、ＣＲＲの完全な欠失によっては劇的に減少した。ＳＩＶＡ２  Ｃ７３Ａ突然変異体の細胞における発現は、ＣＤ２７複合体におけるＴＲＡＦ２のユビキチン化に対するＳＩＶＡ２の効果を増強できることが見出された。
【００８５】
ＴＲＡＦ２に加えて、本発明により、ｃＩＡＰ１もＳＩＶＡ２により効果的にユビキチン化されたこと、およびこのユビキチン化はまたＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）突然変異により損なわれたことが見出された。ｃＩＡＰ１のノックダウンは、ＳＩＶＡ２発現に応答したＴＲＡＦ２のユビキチン化を劇的に減少させた。したがって、ＳＩＶＡ２は、インビトロでＴＲＡＦ２を直接ユビキチン化する能力を有するが、細胞内におけるＴＲＡＦ２のユビキチン化のＳＩＶＡ２による促進は、ｃＩＡＰ１のユビキチン化能力の増強を通して媒介されるかまたは許容的役割を果たすためにｃＩＡＰ１を必要とする。ＣＤ２７の誘発は、細胞のＴＲＡＦ２の量を有意に減少する結果となり、受容体複合体内でのそのユビキチン化は分解の標的とされることを示している。ＴＲＡＦ２へのライゲーションがＳＩＶＡ２により促進されるユビキチン鎖は、通常のプロテオソーム分解を促進するユビキチン化と同様に、最初にＫ４８に結合され、このＳＩＶＡ２作用がＣＤ２７によるＴＲＡＦ２文化の誘導に寄与する可能性を上昇させる。一貫して、ＳＩＶＡ発現のノックダウンは、ＣＤ２７によるＴＲＡＦ２のダウンレギュレーションを防止し、一方ＳＩＶＡ２の誘導はそれを増強した。
【００８６】
上述のように、ＳＩＶＡのノックダウンは代替的ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化ももたらした。ｃＩＡＰ１発現の抑制はＮＦ−κＢ活性化ももたらし（Varfolomeevら、2007）（Vinceら、2007）、さらに、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの別の受容体であるＴＮＦ−ＲＩＩによるＴＲＡＦ２のダウンレギュレーションを低下させる（Liら、2002）。本発明によれば、ｃＩＡＰ１のノックダウンは（ＳＩＶＡ２のノックダウン同様）、代替的ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化と一緒に、ＣＤ２７によるＴＲＡＦ２のダウンレギュレーションも低下させた。これらの知見により、ＳＩＶＡ２およびｃＩＡＰ１は、ＣＤ２７によるＴＲＡＦ２分解の誘導およびＮＦ−κＢの調節において共通の役割を果たしているということが示唆される。
【００８７】
ＳＩＶＡ２の機能に関するこれらの知見を考慮すると、ＳＩＶＡ２安定化の特異的モジュレーションは、ＳＩＶＡ２のレベルまたは活性が関係する状況の治療（予防または処置）または診断において、および／またはＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのいくつかの受容体メンバーによるタンパク質合成の方向へ活性化されるシグナル伝達経路、そして特に代替経路を活性化するものがその病因または経過に関係する状況において使用することができる。
【００８８】
したがって、本発明の１つの実施態様において、安定化されたＳＩＶＡ２は、疾患、障害または症状が不適切なＮＩＫ−媒介活性またはＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性により特徴付けられる、たとえば発達障害、細胞増殖性障害および免疫障害などにおいて、ＮＩＫおよびＮＦ−κＢの活性をモジュレートするのに有用である。１つの実施態様において、疾患、障害または症状は、ＮＩＫおよびＮＦ−κＢ活性の増加により媒介される、宿主免疫の増加、炎症性応答および／または細胞増殖により特徴付けられ、したがって、安定化したＳＩＶＡ２は当該疾患の治療に使用することができる。
【００８９】
ＳＩＶＡ２の安定性のモジュレーションが有益であるそのような状況には、発達障害；たとえば癌、黒色腫、肉腫、腎腫瘍、結腸腫瘍などの腫瘍性疾患などの細胞増殖性障害；遺伝性障害；神経系障害；代謝異常；感染症および他の病的症状；変形性関節症、自己免疫疾患、リウマチ性関節症、乾癬、全身性多発性硬化症、およびエリテマトーデスなどの免疫障害；糸球体腎炎、アレルギー、鼻炎、結膜炎、ブドウ膜炎、消化系炎症、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性大腸炎、重症筋無力症、膵炎、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、筋肉痛、強直性脊椎炎、喘息、気道炎症などの炎症性障害；創傷治癒；皮膚病；老化；ならびに、原虫（plasmodium）感染症、細菌感染症およびウイルス感染症などの感染症がある。したがって、安定化したＳＩＶＡ２は、そのような状況の治療のための医薬の製造において使用することができる。
【００９０】
本発明の１つの実施態様において、細胞におけるＳＩＶＡ２の減少、ＮＩＫ活性および／またはＮＦ−κＢ活性の増加が関係する、原発腫瘍および転移の両方を含む悪性腫瘍、喘息、リウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、炎症などの疾患、障害または症状は、細胞におけるＮＩＫの活性および／またはＮＦ−κＢ活性をダウンレギュレーション／阻害できる本発明の安定化されたＳＩＶＡ２を投与することにより治療され得る。
【００９１】
本発明は、細胞におけるその活性をモジュレートするため、そしてＳＩＶＡ２の活性が、直接的または他のＴＮＦ／ＮＧＦ経路のモジュレータ／メディエータを介して間接的に関与する炎症、細胞死または細胞生存経路に対する細胞内効果をモジュレート／媒介するために、ＳＩＶＡ２の安定性のモジュレーションを可能にする。ＳＩＶＡ２活性をモジュレーションするために、細胞を、該細胞に安定化されたＳＩＶＡ２を導入することにより、または細胞内でＳＩＶＡ２のモジュレーションを誘導することにより処理することができる。本発明の１つの実施態様において、ＳＩＶＡ２ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入を、該配列が該細胞において発現されるようにできる好適なベクターに担持される。そのベクターは、発現されたＳＩＶＡ２を安定化するために、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、および／またはＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１のリング−フィンガー突然変異体（Ｈ５８８Ａ）、またはＧｌｃＮアシル化（acidase）の阻害剤などのタンパク質のＧｌｃＮＡｃ部分を増加することができる酵素をコードする配列も担持するウイルスベクターであってよい。その処理は、細胞をベクターで感染させることより成すことができる。インビボにおけるＳＩＶＡ２の過剰発現は、Ｏ−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼ（ＯＧＴ）の発現または活性が高い、またはＯ−ＧｌｃＮａｃａｓｅの発現または活性が減少した結果タンパク質のＯ−ＧｌｃＮａｃ含量の増加を示す特定の病状または特定の条件下で有利である。そのような細胞がＯ−ＧｌｃＮａｃ含量の増加を示す特定の病状の例は、II型糖尿病である（Slawsonら、2006）。たとえば、処理すべき細胞に、たとえば低体温条件によりストレスを与えることにより、ＯＧＴ誘導と一緒のインビボでのＳＩＶＡ２の過剰発現が有利である（Slawsonら、2006）。
【００９２】
ＳＩＶＡ２の安定化を減少させることは、ＳＩＶＡ２のレベルの増加、ＮＦ−κＢまたはＮＩＫの活性の減少が関係する疾患、障害または症状を治療するために達成できる。細胞におけるＮＦ−κＢまたはＮＩＫのレベルの増加が望まれる場合、ＳＩＶＡ２安定化の低下は、以下の、ＳＩＶＡ２の翻訳後修飾、（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）ＳＩＶＡ２のセリン残基５、５０および５１のリン酸化；（iii）ユビキチン化；または（iv）（ｉ）〜（iii）の組合せを減少させることにより行われる。ＳＩＶＡ２の安定性の低下は、たとえばＳＩＶＡ３ＳＡおよびＳＩＶＡ６ＳＡ突然変異体におけるようにこれらの残基を突然変異させることによる、ＳＩＶＡ２のセリン残基５、５０および５１（３Ｓ）、および特にセリン残基５、２１、２６、３５、５０および５１（６Ｓ）におけるリン酸化の減少により；またはＳＩＶＡ２活性に競合するためにこれらの突然変異体を用いることにより、たとえばβ−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ処理により、たとえばＯ−ＧｌｃＮアシル化を弱めることにより、ＡｃトランスフェラーゼＯ−グルコシル化の阻害およびＯ−ＧｌｃＮアシル化の特異的な阻害、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性の減少、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性化、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのレベルの低下、およびｃＩＡＰ１の使用により達成することができる。ＳＩＶＡ２の安定性の低下は、たとえば免疫障害を有する対象などで免疫応答を破壊するために使用され得る。また、ＳＩＶＡ２の安定性の低下は、虚血／再灌流において使用され得る。なぜなら、この症状はＳＩＶＡのレベルの増加に伴うものであるからである（Padanilamら、1998）。ＳＩＶＡ２安定性の減少は、たとえば正常細胞におけるアポトーシスを減少するためなど、アポトーシスの減少が望まれる場合に使用され得る。
【００９３】
本発明は、対象における疾患を診断するための方法および／またはキットであって、該対象由来の組織におけるＳＩＶＡ２の翻訳後修飾（ｉ）Ｏ−ＧｌｃＮアシル化；（ii）ＳＩＶＡ２のセリン残基５、５０および５１のリン酸化；（iii）ＳＩＶＡ２のＫ１７および／またはＫ９９残基におけるユビキチン化；または（iv）（ｉ）の組合せを評価すること、および翻訳後修飾の前記レベルを対照レベルと比較することを含む方法および／またはキットを提供する。その対照レベルは、健康な個体におけるレベルである。対照レベルと異なる対象におけるＳＩＶＡ２の翻訳後修飾のレベルが、疾患の指標となる。また、本発明は、治療的処置の前、後および／または中に患者由来の組織における翻訳後修飾のレベルをモニターすることにより、患者における疾患の治療的処置をモニターするための同様の方法を提供する。治療的処置の前の患者のＳＩＶＡ２の翻訳後修飾のレベルと異なる治療的処置の後の患者のＳＩＶＡ２の翻訳後修飾のレベルが、治療の有用性の指標となる。組織におけるＳＩＶＡ２の翻訳後修飾は、たとえば以下の実施例に示すように測定することができる。本発明の特定の方法およびキットを使用し、ＳＩＶＡ２の翻訳後修飾を、ＳＩＶＡ２の翻訳後修飾のレベルとヒト疾患、障害または症状との関連性を見出すために使用され得、該疾患、障害または症状は、その後ＳＩＶＡ２の翻訳後修飾を調節できる薬剤を投与することにより予防、治療または軽減され得る。
【００９４】
これらのツールのいくつかの、治療にまたは診断にまたは調査に関連した使用は、生きている生物の細胞中へのそれらの導入を余儀なくさせる。この目的のために、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの膜透過性を改善することが望まれる。新油性構造との誘導体化は、増強された膜透過性を有するペプチドおよびタンパク質の作製に使用され得る。たとえば、前述のように既知の膜向性ペプチドの配列が、ペプチドまたはタンパク質の配列に追加され得る。さらに、ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つの極性または荷電された基で置換されている、前記炭化水素鎖などの部分的に新油性の構造により誘導体化され得る。たとえば、ペプチドのラウロイル誘導体は、Muranishiら１９９１年に説明されている（Lipophilic peptides: synthesis of lauroyl thyrotropin-releasing hormone and its biological activity. Pharm Res. 1991 May; 8(5):649-52）。ペプチドおよびタンパク質のさらなる修飾には、Zachariaら１９９１年により説明されているように、スルホキシド基を作り出すメチオニン残基の酸化が含まれる（Eur J Pharmacol. 1991 Oct 22;203(3):353-7）。Zachariaおよび共同研究者らは、比較的疎水性のペプチド結合がそのケトメチレンイソエステル（ＣＯＣＨ2）に置き換えられたペプチドまたは誘導体も記載している。これらの修飾そしてタンパク質およびペプチド化学の分野において当業者に知られた他の修飾が、膜透過性を向上させる。
【００９５】
膜透過性を向上させる別の方法には、ペプチドまたはタンパク質の細胞取り込みを誘導するために細胞表面上のウイルスレセプターなどのレセプターの使用がある。この機序は、ウイルスにより頻繁に使用され、特定の細胞表面分子に特異的に結合する。結合すると、細胞はウイルスをその内部に取り込む。細胞表面分子は、ウイルスレセプターと呼ばれる。たとえば、インテグリン分子ＣＡＲおよびＡｄＶは、アデノウイルスに対するウイルスレセプターとして記載されている、Hemmiら１９９８年（Hum Gene Ther. 1998 Nov 1;9(16):2363-73）およびその参考文献参照。ＣＤ４、ＧＰＲ１１、ＧＰＲ１５およびＳＴＲＬ３３分子は、ＨＩＶに対するレセプター／コレセプターとして同定されている、Edingerら、１９９８年（Virology. 1998 Sep 30;249(2):367-78）およびその参考文献参照。
【００９６】
したがって、細胞表面レセプターに結合することが知られている分子へ、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドをコンジュゲートすることは、該ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を向上させる。コンジュゲートを形成するための好適な群の例は、糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質などの分子である。Lowら（米国特許第５，１０８，９２１号明細書）は、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの膜透過性を向上させる目的でのこれらの分子の使用とそのコンジュゲートの製造方法を記載している。
【００９７】
Lowおよび共同研究者は、さらに葉酸またはビオチンなどの分子がそのコンジュゲートを生物における多数の細胞への標的とするために使用することができる。これは、これらの分子のレセプターが豊富にかつ非特異的に発現しているためである。
【００９８】
本発明のペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を向上させるための非細胞表面タンパク質の前記使用は、本発明の該ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを特定の種類の細胞または組織に標的化するのにも使用され得る。たとえば、癌細胞を標的化したい場合、それらの細胞の表面により豊富に発現される細胞表面タンパク質を使用することが好ましい。そのような例としては、葉酸レセプター、ムチン抗原ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５ＢおよびＭＵＣ７、糖タンパク質抗原ＫＳＡ、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン−ベータがある。前記Wangら、１９９８年（J Control Release. 1998 Apr 30;53(1-3):39-48. Review.）には、癌細胞を標的化するための葉酸の使用が教示されており、そしてZhangら、１９９８年（Clin Cancer Res. 1998 Nov;4(11):2669-76およびClin Cancer Res. 1998 Feb;4(2):295-302）には、様々な種類の癌および正常細胞において前述の他の各抗原の相対存在量が記載されている。
【００９９】
ＳＩＶＡ２および／またはその安定性を変更することのできるタンパク質は、したがって、前記コンジュゲーション技術を用い、要望通りに特定の細胞種に標的化され得る。たとえば、リンパ球系統の細胞においてＮＩＫを阻害したい場合、本発明ＳＩＶＡ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは化合物が、たとえばこれらの細胞上に発現されるＭＨＣクラスII分子を用いることによってそのような細胞を標的とし得る。これは、前記ＭＨＣクラスII分子の定常領域に対する抗体またはその抗原結合部位を本発明のタンパク質またはペプチドとカップリングさせることにより達成される。さらに、様々なサイトカインに対する多数の細胞表面レセプターおよび他の細胞コミュニケーション分子が記載されており、これらの分子の多くは、多かれ少なかれ組織または細胞の種類に制限された様式で発現される。したがって、Ｔ細胞のサブグループを標的化したい場合、ＣＤ４  Ｔ細胞表面分子を本発明のコンジュゲートの生産に使用してもよい。ＣＤ４−結合分子はＨＩＶウイルスにより提供され、その表面抗原ｇｐ４２はＣＤ４分子に特異的に結合することができる。
【０１００】
１つの実施態様において、ペプチドおよびポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを使用することにより細胞に導入し得る。この目的のためのワクシニアベクターの使用は、Current Protocols in Molecular Biologyの第１６章に詳しく述べられている。アデノウイルスベクターの使用は、たとえばTeohら（Blood. 1998 Dec 15;92(12):4591-601）、Narumiら、１９９８年（Blood. 1998 Aug 1;92(3):822-33およびAm J Respir Cell Mol Biol. 1998 Dec;19(6):936-41）、Pedersonら、１９９８年（J Gastrointest Surg. 1998 May-Jun;2(3):283-91）、Guang-Linら、１９９８年（Transplant Proc. 1998 Nov;30(7):2923-4）およびそのなかの参考文献、Nishidaら、１９９８年（Spine. 1998 Nov 15;23(22):2437-42）、Schwarzenbergerら、１９９８年（J Immunol. 1998 Dec 1;161(11):6383-9）、ならびにCaoら、１９９８年（Gene Ther.1998 Aug;5(8):1130-6）により説明されている。アンチセンス配列のレトロウイルス導入は、Danielら、１９９８年（J Biomed Sci.1998 Sep-Oct;5(5):383-94）により説明されている。
【０１０１】
ベクターとしてウイルスを使用する場合、ウイルス表面タンパク質が通常そのウイルスの標的化に使用される。上記のアデノウイルスなどの多くのウイルスはその向細胞性がかなり非特異的であるため、細胞型または組織特異的プロモータを使用することによりさらに特異性を与えることが望ましい。Griscelliら、１９９８年（Hum Gene Ther. 1998 Sep 1;9(13):1919-28）は、導入がアデノウイルスにより媒介される遺伝子の心臓特異的標的化のための心室特異的心臓ミオシン軽鎖２プロモータを教示している。
【０１０２】
あるいは、ウイルスベクターは、その表面に付加的タンパク質を発現するように設計されてもよく、またはウイルスベクターの表面タンパク質は所望のペプチド配列を組み込むように変更してもよい。したがって、ウイルスベクターは、該ウイルスベクターを標的化するために使用され得る１つ以上の付加的なエピトープを発現するように設計されていても良い。たとえば、サイトカインエピトープ、ＭＨＣクラスII−結合ペプチド、またはホーミング分子由来のエピトープは、本発明の教示に従い、ウイルスベクターを標的化するために使用することができる。ＳＩＶＡ２およびその安定性を改変できるタンパク質は、特定の細胞における選択的な発現を可能にするプロモータを導入することにより標的化することができる。
【０１０３】
本発明の知見は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターが誘発される場合、ＳＩＶＡ２が安定化し（ＴＲＡＦ２およびＮＩＫ）、そしてこれはＳＩＶＡ２細胞レベルの増加という結果をもたらすということを示す。このＳＩＶＡ２レベルの増加が起こると、ＳＩＶＡ２はＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１およびＮＩＫに結合する。この結合とＳＩＶＡ２  Ｅ３活性の結果として、ＴＲＡＦ２はダウンレギュレートされる。ＴＲＡＦ２のダウンレギュレーションの結果として、レセプターによるシグナル伝達（正準および代替経路の両方の活性化のためのシグナル伝達、ならびにＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼのためのシグナル伝達）が停止する。したがって、ＳＩＶＡ２の安定化を阻害する分子およびＳＩＶＡ２のｃＩＡＰ１またはＴＲＡＦ２との相互作用を阻害できる分子の両方が、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターによるシグナル伝達の延長を誘導するであろう。そのようなＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターによるシグナル伝達の延長の潜在的な用途は、抗体の作出などの免疫機能の増強に関するものです。そのようなＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターによるシグナル伝達の延長を得ることが望まれる対象の例は、ＡＩＤＳ患者、免疫抑制された癌患者、および高齢者である。反対に、ＳＩＶＡ２の安定化またはそのｃＩＡＰ１またはＴＲＡＦ２との相互作用を促進できる分子は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターによるシグナル伝達をダウンレギュレートするであろう。ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターによるシグナル伝達のダウンレギュレーションを誘導することが望まれる例は、ＳＬＥ  ＲＡなどの自己免疫疾患、または腎虚血である。したがって、本発明は、ＳＩＶＡ２とＴＲＡＦ２との複合体およびＳＩＶＡ２とｃＩＡＰ１との複合体、ならびに疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターによるシグナル伝達を改変することができる分子をスクリーニングするためのこれらの複合体の使用を提供する。
【０１０４】
１つの実施態様において、本発明は、ＳＩＶＡ２とｃＩＡＰまたはＴＲＡＦ２とを接触させること、候補分子の存在下および非存在下でＳＩＶＡ２とｃＩＡＰまたはＴＲＡＦ２との複合体のレベルをモニターすることを含む、疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をモジュレートできる分子のスクリーニング方法であって、候補分子の存在下でのＳＩＶＡ２−ｃＩＡＰまたはＳＩＶＡ２−ＴＲＡＦ２複合体のレベルの変化が、該候補分子がＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をモジュレートするということの指標となる方法を提供する。
【０１０５】
別の側面では、本発明は、候補分子の存在下および非存在下でＳＩＶＡ２の安定性を誘導することを含む、疾患、障害または症状においてＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をモジュレートできる分子のスクリーニング方法であって、候補分子の存在下で安定化されたＳＩＶＡ２のレベルの変化が、該候補分子がＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をモジュレートするということの指標となる方法を提供する。
【０１０６】
そのような方法で選抜され、ＳＩＶＡ２の安定性を遮断することが見出され、またＳＩＶＡ２とｃＩＡＰ１またはＴＲＡＦ２の相互作用を遮断できることが見出される分子は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のメンバーによるシグナル伝達の延長に有用である。反対に、そのようなアッセイで選抜され、ＳＩＶＡ２の安定性またはＳＩＶＡ２のｃＩＡＰ１またはＴＲＡＦ２との相互作用を促進できることが見出される分子は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーによるシグナル伝達をダウンレギュレートするのに有用である。
【０１０７】
ＳＩＶＡ２とｃＩＡＰ１またはＴＲＡＦ２とのレベルをモニターするアッセイや、ＳＩＶＡ２の安定性をモニターするアッセイの例は、以下の実施例において提供する。
【０１０８】
本発明のスクリーニング方法において選抜され得る候補分子の例は、低分子量有機分子、ペプチド（抗体など）、核酸、および天然の抽出物由来の分子、炭水化物または他の任意の物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。検査薬は、たとえばコンビナトリアルケミストリーにより作り出される合成有機化合物を含む。検査化合物は、コンビナトリアルケミストリーによってのみならず、他のハイスループット合成法によっても得ることができる。オートメーション化された技術は、選抜され得る分子のライブラリ、個別化合物（discrete compounds）の多数のコレクションの迅速合成を可能にする。大規模かつより多様な化合物ライブラリの製造により、ライブラリ内に有用な薬物を発見する可能性が増大する。ハイスループットスクリーニングでは、何千もの分子を検査するためにロボットを使用することができる。
【０１０９】
本発明の組成物は、多種多様な方法で患者に投与することができる。肝臓内、皮内、経皮（たとえば徐放製剤などで）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内投与などの任意の好適な投与経路が本発明により予想されるが、これらに限定されるものではない。組成物は、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することもできる。
【０１１０】
「薬学的に許容され得る」との定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつ投与される宿主に対して毒性がない、あらゆる担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与については、本発明の物質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液などのビヒクル中で注射用単位剤形に製剤され得る。
【０１１１】
「治療的に有効量」とは、その量が投与されると、本発明の物質が治療に有益な効果を誘導する量である。単回投与または複数回投与として個体に投与される投薬量は、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、および大きさ）、症状の範囲と重症度、併用療法、治療の頻度および所望の効果などの様々な因子によって変わり得る。確立された投与量の調整と取り扱いは、十分当業者の能力の範囲内である。
【０１１２】
用語「投薬量（dosage）」は、投与頻度および投与回数の決定および制御と関係する。
【０１１３】
本明細書において引用される、論文、要約、公開もしくは未公開特許出願、発行特許または他のあらゆる参考文献を含むすべての参考文献は、本明細書に参考文献として完全に組み込まれる。
【０１１４】
ここで、本発明を以下の非制限的な実施例により説明する。
【実施例】
【０１１５】
材料および方法
試薬：ｍＣＤ７０、ｈＣＤ４０Ｌは、関連発現構築物によるヒト胚性腎臓ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の大スケールトランスフェクションにより製造した（下記参照）。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、オーストリア、ビエナのボーリンガー研究所のＧ．アドルフ博士から提供されたものを、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に適用した。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ）、カンプトテシン（ＣＰＴ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびシスプラチン（ＣＩＳ）は、シグマ社から購入した。ＭＧ１３２、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ（ＢＡＤＧＰ）、ラクタシスチンおよびポナステロンは、カルビオケム社（Clbiochem）から購入した。ピューロマイシンはインビトロジェン社（Invitrogen）から、アガロース−結合コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）はベクターラボラトリー社（Vector Laboratories）から、そしてβ−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼはＶ−ラブ社（V-Lab）から購入した。Ｅ１およびＥ２酵素はボストンバイオケム社（Boston Biochem）およびアレキシスバイオケミカル社（Alexis Biochemicals）から購入した。［32Ｐ］オルトリン酸はアマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences）から、ストレプトアビジンＨＲＰはピアス社（Pierce）から購入した。
【０１１６】
細胞：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、軟膜試料から単離され、記載されたように培養した（Ramakrishnanら、2004）。ＳＩＶＡ２またはＳＩＶＡ１を発現するエクジソン誘導性ＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７細胞株（ＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ２またはＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ１）とＥｃＲ−２９３−ＣＤ４０を、製造者（インビトロジェン）の使用説明書に従い、リン酸カルシウム法を用いたトランスフェクションにより作製した。全ての接着細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＥｃＲ−２９３（インビトロジェン）、ＨｅＬａ、ＨｅＬａ  Ｔ−ＲＥｘ（インビトロジェン）、およびＨｅｐＧ２は、ダルベッコ改変イーグル培地で培養された。培養培地は１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを補足した。ヒトリンパ芽球様細胞株、ラモス（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）およびＢＪＡＢ（Ｂ−リンパ芽球腫細胞株）はＲＰＭＩ培地で培養された。エクジソン誘導性ＥｃＲ２９３−ＣＤ２７およびＥｃＲ２９３−ＣＤ４０細胞株は、ヒトＣＤ２７およびＣＤ４０それぞれに対するｃＤＮＡによるそれらの安定なトランスフェクションにより作製された。ＳＩＶＡ２またはＳＩＶＡ１を発現するＥｃＲ２９３−ＣＤ２７細胞株（ＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ２またはＥｃＲ−２９３−ＣＤ２７−ＳＩＶＡ１）は、リン酸カルシウム法を用いたトランスフェクションにより作製し、ｍｙｃＮＩＫおよびｍｙｃＮＩＫ（Ｋ６７０Ａ）を後にこれらの細胞にレトロウイルスによる形質導入と１μｇ／ｍｌピューロマイシンによる選択で導入した。構造的にｍｙｃ−ＮＩＫを発現するラモス細胞は、レトロウイルスによる形質導入で作製し、１μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択した。ｍｙｃ−ＮＩＫを安定的に発現するＢＪＡＢ細胞は、エレクトロポーレーションおよび０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８による選択により作製した。その後、ＳＩＶＡ２は、これらの細胞へのレトロウイルスによる形質導入および１μｇ／ｍｌピューロマイシンでの選択により導入した。ブラストサイジン選択下でＴｅｔリプレッサ（インビトロジェン）を安定的に発現するラモス  Ｔ−ＲＥｘ細胞は、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲプラスミドおよびアマクサヌクレオフェクション（Amaxa nucleofection）を用いて作製した。これらの細胞は、ｐｃＤＮＡ４ベクター（インビトロジェン）のテトラサイクリンオペレータおよびＣＭＶプロモータ下の、ＳＩＶＡ２（ラモス  Ｔ−ＲＥｘ−ＳＩＶＡ２）、ＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）（ラモス  Ｔ−ＲＥｘ−ＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ））、またはＳＩＶＡ１（ラモス  Ｔ−ＲＥｘ−ＳＩＶＡ１）ｃＤＮＡで、記述されているようなレンチウイルスシステムにより導入した（Loisら、2002; Ramakrishnanら、2004）。Ｔ−ＲＥｘ細胞は、テトラサイクリン不含血清（インビトロジェン）で培養された。ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２は、ＥｃＲ２９３細胞ではポナステロン（５μｇ／ｍｌ）で、そしてラモス  Ｔ−ＲＥｘ細胞ではドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）で誘導された。
【０１１７】
酵母ツーハイブリッド試験
ＮＩＫ、ＳＩＶＡおよびＴＲＡＦ２のｃＤＮＡを、ｐＧＢＫＴ７またはｐＧＢＴ９（ベイトベクターとして）、ｐＧＡＤＴ７（プレイベクターとして）で発現させた。結合は、供給者（クローンテック）の取扱説明書にしたがってＳＦＹ５２６レポーター酵母株で評価した。
【０１１８】
哺乳類発現ベクター
ＳＩＶＡ２、ＳＩＶＡ１をＰＣＲでＥＳＴｓからクローニングした。ＳＩＶＡ配列をＮＣＢＩ配列ＮＭ＿００６４２７（ＳＩＶＡ１、配列番号１０）およびＮＭ＿０２１７０９（ＳＩＶＡ２、配列番号１１）と確認した。ＣＤ７０およびｈＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン用の発現ベクター、ｍｙｃ−タグ化野生型および「キナーゼデッド」ＮＩＫ（ＫＤ−ＮＩＫ）用の発現ベクター、およびヒトＣＤ２７用の発現ベクターは、すでに記述されている（Ramakrishnan, 2004）。レトロウイルス形質導入のために、ｍｙｃ−ＮＩＫをｐＢＡＢＥ５ｐｕｒｏベクターにクローニングした。ｐＥＧＦＰはクローンテックから購入した。ＳＩＶＡ２、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ、およびＵｂｃ１３における点突然変異は、ＰｆｕターボＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を用い位置指定突然変異技術により作出された。ＦＬＡＧ−ＧＳＴ−ＢＲ３−ＩＣＤ*（ＴＲＡＦ３の結合を防ぐ変異［ＰＶＰＡＴ＞ＡＶＡＡＡ］を有するＢＡＦＦ受容体の細胞内ドメイン［アミノ酸１００〜１８４］）をＣＤ７０およびｈＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインに使用されるベクターと、後者ではリーダー配列が除去されている以外は同じベクターで発現された。ユビキチン突然変異体のためのｃＤＮＡは記述されている（Kovalenkoら、2003）。増強された緑色蛍光タンパク質プラスミド（ｐＥＧＦＰ）は、クローンテックから購入した。Ｎ−末端ＦＬＡＧ−タグｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ１  Ｈ５８８Ａ（ｃＩＡＰ１ｍｕｔ）は、レスター大学のGerry M Cohen博士のご厚意により提供されたｃＩＡＰ発現ベクターからサブクローニングにより作出した。
【０１１９】
ＲＮＡ干渉によるタンパク質合成の抑制のために使用されるオリゴヌクレオチド配列
以下のｓｉＲＮＡ配列は、ｐＳＵＰＥＲベクター（Brummelkampら、2002）中にスペーサーとして使用される配列ttcaagaga（配列番号１）と共に導入された。ヒトＳＩＶＡ−ＮＣ３用、センス鎖5'-gatcccctgaataaacctctttatatttcaagagaatataaagaggtttattcatttttggaaa-3'（配列番号２）およびアンチセンス鎖5'-agcttttccaaaaatgaataaacctctttatattctcttgaaatataaagaggtttattcaggg-3'（配列番号３）；ＳＩＶＡ２７５用、センス鎖5'-gatccccactgcagtgacatgtacgattcaagagatcgtacatgtcactgcagttttttggaaa-3'（配列番号４）およびアンチセンス鎖5'-agcttttccaaaaaactgcagtgacatgtacgatctcttgaatcgtacatgtcactgcagtggg-3'（配列番号５）；ＧＦＰ用、センス鎖5'-gatccccgctacctgttccatggccattcaagagatggccatggaacaggtagctttttggaaa-3'（配列番号６）およびアンチセンス鎖5'-agcttttccaaaaagctacctgttccatggccatctcttgaatggccatggaacaggtagcggg-3'（配列番号７）。
【０１２０】
抗体
ヒトＳＩＶＡ２に対するモノクローナル抗体は、細菌的に作出したＧＳＴ−ＳＩＶＡ２での免疫化によりマウスで起こし、Ｔｒｘ−ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２でアフィニティー精製した。この抗体はＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の両方を認識した。抗−ＨＩＳ、抗−ＦＬＡＧ、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２−ビーズ、および抗−β−アクチンはシグマから購入した。抗−ユビキチンおよび抗−ＧＳＴは、コーヴァンス（Covance）からであり、抗−ＧＦＰはロッシュ（Roche）から購入し、抗ＣＤ２７ＣＤ２７、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＦ２、Ｏｃｔ−１およびＨＡはサンタクルーズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology）から購入した。抗−ＮＩＫモノクローナル抗体は、以前に記述されている（Ramakrishnan, 2004）。ウエスタン分析に使用された抗−ＨＡモノクローナル抗体（クローン−１２ＣＡ５）と、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体（クローン−９Ｅ１０）とは、それらの対応するペプチドを結合させたアフィニティーカラム上でマウスの腹水から精製された。
【０１２１】
組換えタンパク質の発現
細菌の発現について、ＳＩＶＡ２のＧＳＴ−融合タンパク質を、製造業者（ファルマシア  バイオテック（Pharmacia Biotech））のＧＳＴ遺伝子融合システムプロトコールにしたがって、ｐＧＥＸ２Ｔベクター中にクローニングし、発現させた。一過性のトランスフェクション、全タンパク質抽出、核および細胞質タンパク質分離、免疫沈降、免疫ブロッティング、およびインビトロキナーゼアッセイは、記述されている（Ramakrishnanら、2004）ように行った。ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２は、ｐＥＴ４４ベクターを用いて発現され、そしてＴＲＡＦ３（Ｔｒｘ−ＨＩＳ−ＴＲＡＦ３）およびＳＩＶＡ２（Ｔｒｘ−ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２）は、ＢＬ−２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（ノバジェン（Novagen））においてｐＥＴ３２ベクター（ノバジェン）を用いてＴｒｘ融合として発現された。すべてのタンパク質の誘導は、０．２ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノで、０．４〜０．５のＯＤ６００で実施された。
【０１２２】
ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２×１０5細胞）を６ウェルプレートに播種し、カルシウム−リン酸沈殿法によりトランスフェクトした。ヒト免疫不全ウイルス長い末端反復配列（ＨＩＶ−ＬＴＲ）ＮＦ−κＢプロモータの制御下ルシフェラーゼｃＤＮＡをレポータープラスミドとして使用した。表示時間で、細胞を溶解緩衝液１２０μｌ中で記載されているように溶解し、１０〜２０μｌのライセートを２５℃で４時間Ｌｕｍａｃ  ＢｉｏｃｏｕｎｔｅｒサイドにおいてＤ−ルシフェリン基質を用いるアッセイに使用した。
【０１２３】
インビトロタンパク質結合アッセイ
精製されたタンパク質を、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０μｌの緩衝液中、３０℃で１時間インキュベートした。後で、結合混合物を、１％トリトンＸ−１００と１ｍＭ  ＥＤＴＡとを加えた同じ緩衝液で１ｍｌまで希釈し、ついで免疫沈降に付した。
【０１２４】
ｓｉＲＮＡおよびレンチウイルス形質導入
ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１、およびｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非標的ｓｉＲＮＡはダーマコン（Dharmacon）から購入した。ｓｉＲＮＡは前述したレンチウイルス形質導入により安定に発現した（Ramakrishnanら、2004）。ｓｉＲＮＡはリポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン）で一時的にトランスフェクトされた。
【０１２５】
インビトロユビキチン化
インビトロでのユビキチン化は、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸クレアチン、０．２μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼおよび５μＭユビキチンアルデヒドを含む緩衝液中において、組換えユビキチン（８μｇ）、Ｅ１酵素（０．２μｇ）、表示されたＥ２酵素（０．５μｇ）、およびグルタチオンアガロースに結合した組換えＧＳＴ−ＳＩＶＡ２またはＧＳＴ−ＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）１〜２μｇを含む５０μｌ反応容量でアッセイされた。反応は、断続的なかく拌下３７℃で２時間インキュベートされた。反応上清は、溶液中に形成された遊離のポリユビキチン鎖について分析された。ＳＩＶＡ２の自己ユビキチン化のアッセイのために、グルタチオンビーズを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、１％トリトンＸ−１００、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete Protease Inhibitor Cocktail）を含む緩衝液で３回洗浄し、ＬＤＳサンプル緩衝液（インビトロジェン）で煮沸し、そしてウエスタンブロッティングで分析した。インビトロ基質ユビキチン化アッセイに対して、０．５〜１μｇの組換えＧＳＴ−ＴＲＡＦ２、Ｔｒｘ−ＨＩＳ−ＴＲＡＦ３、細胞性ＴＲＡＦ２（Ｃ３４Ａ）またはｃＩＡＰ１を反応に添加した。インキュベーション後、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むサンプル緩衝液中で煮沸することにより反応を停止させた。煮沸したサンプルを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む緩衝液で１ｍｌまで希釈した。特定のタンパク質を４℃で２時間免疫沈降し、４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン）を用いてウエスタンブロッティングでアッセイした。
【０１２６】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡは、製造業者の取扱説明書にしたがい、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて製造された。ＳＩＶＡ２メッセージに対する半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー（プロメガ）でおこなった。ＳＩＶＡ１、ＳＩＶＡ２、およびＳＩＶＡ３は、以下のプライマー：ＢａｍＨＩ部位を含むセンス鎖、5'-cgcggatccaacatgcccaagcggagctgcccc-3'（配列番号８）、およびＸｈｏＩ部位を含むアンチセンス鎖5'-ccgctcgaggccagcctcaggtctcgaacatgg-3'（配列番号９）を用いて増幅された。
【０１２７】
インビボ［32Ｐ］オルトリン酸標識化
細胞でのＳＩＶＡ２のリン酸化は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において［32Ｐ］オルトリン酸での代謝的標識化により評価された。細胞は、トランスフェクション後２２時間、１０％透析血清を含むリン酸不含培地で培養された。血清は、１０ｍＭトリシン緩衝生理食塩水ｐＨ７．４に対して４８時間透析した。リン酸不含培地において９０分間の飢餓の後、［32Ｐ］オルトリン酸（０．４ｍＣｉ／ｍｌ）を９０分の付加期間に添加した。ＭＧ１３２を１つのサンプルに最後の２時間添加した。細胞をトランスフェクションの２５時間後に回収し、リン酸不含培地で２回洗浄し、そしてキナーゼ溶解緩衝液に溶解した（Ramakrishnanら、2004）。ＳＩＶＡ２は、ＦＬＡＧタグを介して免疫沈降され、そしてリン酸の取り込みをオートラジオグラフィーにより評価した。
【０１２８】
クーマシーブルー染色ゲルからのＳＩＶＡ２の電気溶出
ＳＩＶＡ２は、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２およびＮＩＫで同時トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の抽出物から、抗−ＦＬＡＧ−Ｍ２ビーズとの免疫沈降により単離し、ＧｅＢＡｆｌｅｘ−ｔｕｂｅ（ジーンバイオアプリケーション）において１５０Ｖで２時間電気溶出した。溶出緩衝液は０．０２５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２５ｍＭトリス緩衝液、および２５０ｍＭトリシン緩衝液（ｐＨ８．５）を含有した。電気溶出に続いて、ＳＤＳは冷５０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸中で、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウムの存在下で沈殿により除去され（Montigny, C.ら、Fe2+-catalyzed oxidative cleavages of Ca2+-ATPase reveal novel features of its pumping mechanism. J Biol Chem 279, 43971-43981 (2004)）、サンプルは質量分析法（ＭＳ）により分析された。
【０１２９】
ゲル内消化
タンパク質のバンドをＳＤＳゲルから切り出し、ゲルコードで染色し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の５０％アセトニトリルで複数回洗浄することにより脱染色した。そのタンパク質のバンドは、その後還元され、アルキル化され、そして説明されているように３７℃で、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム中、１２．５ｎｇ／μｌの濃度でウシトリプシン（配列決定等級、ロッシュ）、Ｌｙｓ  Ｃ、およびエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｖ８）（共にベーリンガーマンハイム）によるゲル内消化に付された（Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem 68, 850-858 (1996)）。抽出されたペプチド溶液を次のマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−Ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）のために乾燥した。
【０１３０】
サンプル調製
０．１％トリフルオロ酢酸に溶解された抽出ペプチド混合物のアリコートは、高速エバポレーション法（Jensen, O.N., Podtelejnikov, A. & Mann, M. Delayed extraction improves specificity in database searches by matrix-assisted laser desorption/ionization peptide maps. Rapid Commun Mass Spectrom 10, 1371-1378 (1996)）または液滴法（Kussmann, M., Lassing, U., Sturmer, C.A., Przybylski, M. & Roepstorff, P. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric peptide mapping of the neural cell adhesion protein neurolin purified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis or acidic precipitation. J Mass Spectrom 32, 483-493 (1997)）のいずれかによるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのために使用した。α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（ＨＣＣＡ）または２，５−ジヒドロキシ安息香酸または両方は、マトリクスとして分析に使用された。サンプルは精製され、ＥＳＩ−ＭＳのために以前に説明されているように調製された（Wilm, M., Neubauer, G. & Mann, M. Parent ion scans of unseparated peptide mixtures. Anal Chem 68, 527-533 (1996)）。マイクロカラムはＲ２逆相材料（material）（パーセプティブバイオシステムズ（PerSeptive Biosystem）、フレーミングハム）で調製した。ペプチドは６０％メタノール／５％ギ酸で直接ナノエレクトロスプレー毛細管に溶出された。
【０１３１】
完全（intact）質量測定
これは、ディレイドエクストラクションイオン源、反射器、および３３７−ｎｍ窒素レーザーを備えたＲｅｆｌｅｘ  III  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（ブルカー（Bruker））で行った。電子溶出されたタンパク質を８０％ギ酸１〜２μｌに溶解し、ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ2Ｏで最終濃度１０％まで直ちに希釈した。サンプルを２５℃で５〜１０分間超音波処理した。サンプルの一部（５％〜２５％）が分析に使用された。ＤＨＢをマトリックスとして使用した。
【０１３２】
ペプチド質量マッピングおよびナノ液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ナノ−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によるタンパク質の同定
これらの手法は、Ｒｅｆｌｅｘ  III  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計および、ナノ−エレクトロスプレー源（ＭＤＳプロテオミクス）を備えた四重極衝突セル（MDS-Sciex）を有するAPI Q-STAR Pulsari エレクトロスプレー四重極ＴＯＦタンデム質量分析計で行った。
【０１３３】
プリカーサーイオンスキャンおよびナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
プリカーサーイオンスキャンは、ｍ／ｚ−６７、−７９および−９７でのリン酸化セリン、トレオニンおよびチロシンアミノ酸残基の特異的検出のために実験され（Neubauer, G. & Mann, M. Mapping of phosphorylation sits of gel-isolated proteins by nanoelectrospray tandem mass spectrometry: potentials and limitations. Anal Chem 71, 235-242 (1999)）、そしてホスホペプチドのＭＳ／ＭＳ配列決定は、API Q-STAR Pulsari エレクトロスプレー四重極ＴＯＦで行った。質量分解は、１０，０００〜１５，０００の範囲で通常得られ（従来の質量分析およびＭＳ／ＭＳの両方の操作モードに対して）、外部較正で少なくとも０．０２Ｄａの質量測定正確度が達成された。約２μｌのサンプルは、ナノエレクトロスプレーチップ中にロードされた。プリカーサーイオンスキャン実験のために、ペプチド混合物は、本質的に説明されたように6製造および操作されるＰｏｒｏｓ  Ｒ２およびＰｏｒｏｓ  オリゴＲ３吸着剤（パーセプティブバイオシステムズ）で満たされた脱塩毛細管の二重アライメントを用いて脱塩された。リン酸化部位の同定のために、負のモードにおいて多重プリカーサーイオンスキャン実験の間蓄積された全ペプチドのデータをまず解析し、ペプチドの荷電状態を与えるためにＥＳＩ−ＭＳＴＯＦスペクトル（正のイオンモードで記録された）と比較した。プリカーサーイオンスキャン実験に基づき仮定されたペプチド（Kalkum, M., Lyon, G.J. & Chait, B.T. Detection of secreted peptides by using hypothesis-driven multistage mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2795-2800(2003)）は、ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるさらなる分析に付された。
【０１３４】
ナノ−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
これは、ＦＡＭＯＳミクロ自動サンプラーおよびAPI Q-STAR Pulsari エレクトロスプレー四重極ＴＯＦタンデム質量分析計とつながったＳｗｉｔｃｈｏｓミクロカラムスイッチングモジュール（ＬＣパッキング（LC Packing）、ダイオネクス（Dionex））から構成される主要（Ultimate）キャピラリー／ナノＬＣシステムを組み込むナノ−液体クロマトグラフィーシステムで行われた。Ｃ18ナノカラム（内径（i.d.）７５μｍ、長さ１５ｍｍ、粒径５μｍ（ＬＣパッキング、ダイオネクス）が使用された。カラムを通る流量は、１５０ｎｌ／分であった。緩衝液ＡおよびＢ中にギ酸０．１％および２％をそれぞれ含む移動相でメタノール−アセトニトリル勾配が用いられた。使用された勾配は、４５分を通して５％〜５０％アセトニトリルであった。注入量は５μｌであった。ナノ−エレクトロスプレーイオン化源において、ナノ−ＬＣカラムからの毛細管の末端は、ピコチップシリカチューブ（i.d.２０μｍ（ニュー  オブジェクティブ））を有するエミッターに、オンラインナノ−ＬＣとナノスプレーを結合するためのＰＥＥＫスリーブとのステンレススチール融合（union）により接続された。エレクトロスプレーを生産するために、融合に適用した電話圧は２ｋＶで、およびコーン電圧は３Ｖであった。アルゴンが、衝突ガスとして１ｐｓｉの圧力で導入された。ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳおよびナノ−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより回収されたペプチドが同定され、そしてそれらのリン酸化残基の位置が、Ｍａｓｃｏｔソフトウェア（マトリクス  サイエンス）により検出された衝突誘導解離生成物から決定され、断片化系列の検査マニュアルにより確認された。
【０１３５】
代謝糖タンパク質標識化
ＮＩＫと共発現するＳＩＶＡ２のインビボでのＯ−ＧｌｃＮアシル化は、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＧｌｃＮＡｚ代謝糖タンパク質標識化試薬およびビオチン糖タンパク質検出キット（インビトロジェン）により製造業者の取り扱い説明者にしたがい検出した。標識化されたタンパク質は、ストレプトアビジンＨＲＰでウエスタンブロッティングにより検出された。
【０１３６】
コムギ胚芽凝集素−レクチン結合アッセイ
細胞を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００およびＥＤＴＡ−不含完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロッシュ）を含む緩衝液中に溶解した。ＷＧＡアガロースビーズを溶解緩衝液で２回洗浄し、ライセートに添加した。糖タンパク質のレクチンへの結合が４℃で２時間、回転器中で進められた。ＷＧＡへのＯ−ＧｌｃＮアセチル化ＳＩＶＡ２結合の特異性を確認するために、０．５Ｍ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをレクチン結合アッセイの競合相手として添加した。インキュベーション後、ＷＧＡビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、結合したＳＩＶＡ２をウエスタンブロッティングにより分析した。
【０１３７】
実施例１：ＳＩＶＡ２のサイトカイン−誘導安定化
多くの細胞型がＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２両方に対するｍＲＮＡを発現するが、本発明者らの種々の細胞株の実験においては、本発明者らは相当量のＳＩＶＡ１タンパク質を検出することができたのみであった（図１Ａ、左パネル）。さらに、一過性のトランスフェクション実験では、ＳＩＶＡ２のｃＤＮＡはＳＩＶＡ１と比較してほとんど発現されなかった（図１Ａ、右パネル）。
【０１３８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）におけるＳＩＶＡ発現のより詳しい実験では、両スプライス変異体の転写産物が見られ、そのうえ、エクソン１および４に相当するより短い変異体（「ＳＩＶＡ３」）まで見られたが、タンパク質自体はほとんど見られなかった（図１Ｂおよび未掲載データ）。しかしながら、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０Ｌ）またはＴＮＦによる細胞の処置は、結果としてＳＩＶＡ２発現の大きな増強をもたらしたが、ＳＩＶＡ１の発現には影響を及ぼさなかった（図１Ｃ）。ＳＩＶＡ２に限定される増加は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）での事前活性化に続くこれらのサイトカインによる処置細胞でも観察された。しかしながら、事前活性化された細胞におけるＳＩＶＡ２の見かけの分子サイズは、これはおそらく、いくつかのタンパク質の翻訳後修飾の結果として、ＳＩＶＡ２のｃＤＮＡでの細胞のトランスフェクションにより産生されるタンパク質のサイズよりも幾分大きかった（図１Ｄ）。ＳＩＶＡ２タンパク質におけるこの増加は、その転写レベルの変化とは何の関係もなく（図１Ｅ）、このこともそれが転写後に生じるということを示唆している。ＴＮＦファミリーの前記３つのリガンドは、対応するｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞において（図１Ｆ）、さらにＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２のいずれかの発現誘導を可能にする構造的ｃＤＮＡ構築物を発現する細胞において（図１Ｇ、および未掲載データ）、ＳＩＶＡ２の発現を増強するが、ＳＩＶＡ１の発現は増強しないことも見出された。プロテアソームの機能を遮断することも、ＰＢＭＣｓ（図１Ｄ）およびトランスフェクトされた細胞株（図１Ｈ）の両方において、ＳＩＶＡ２の発現の劇的な増強を引き起こした。プロテアソーム機能の遮断は、そのタンパク質のユビキチン化型の蓄積も増加させた（図１Ｈ）。遺伝毒性物質および酸化ストレスの適用は、ＳＩＶＡ１発現を増強させるが(（Xue, 2002; Padanilam, 1998; Qin, 2002; Daoud, 2003; Fortin, 2004; Jacobs, 2007）および（図１Ｉ、上段パネルおよび中段パネル）、ＳＩＶＡ２の発現は増強せず、実際サイトカインによるその増強を拮抗した（図１Ｄおよび図１Ｉ、下段パネル）。
【０１３９】
これらの知見は、ＴＮＦファミリーのリガンドが、ＳＩＶＡ２タンパク質を安定化させる能力を有するということを示唆している。
【０１４０】
実施例２：ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、独立して、ＳＩＶＡ２のリガンド誘導安定化に寄与し、一方ｃＩＡＰ１はＳＩＶＡ２の分解を促進する。
【０１４１】
ＳＩＶＡ２は、ＴＮＦファミリーのいくつかのレセプターのシグナル伝達複合体に補充され、これらのレセプターが採用する３つのシグナル伝達タンパク質：ユビキチンリガーゼＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰ１（以下の実施例参照）ならびにタンパク質キナーゼＮＩＫ（｛Ramakrishnan, 2004｝およびRamakrishnanら、提出）に特異的に結合することが見出された。これらのシグナル伝達タンパク質のＳＩＶＡ２に対する影響を評価することにより、このタンパク質の発現が、ＮＩＫと同時発現された場合に劇的にアップレギュレートされ（図２Ａ）、酵素的に不活性なＮＩＫ変異体や、ＫＤ−ＮＩＫではそうではない（図２Ａ）ことがわかった。ＳＩＶＡ２の発現は、ＴＲＡＦ２と同時発現される場合も強くアップレギュレートされた（図２Ｂ）。なお、ＴＲＡＦ２（Ｃ３４Ａ）、ユビキチンキナーゼ活性を欠いたＴＲＡＦ２変異体ではそうではなかった（図２Ｂ）ことから、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２活性がそのリガンド誘導安定化に寄与しているということが示唆される。この考えに沿って、ＳＩＶＡ２のＣＤ７０（図２Ｃ、２Ｄ）またはＣＤ４０（図２Ｅ）による安定化は、ＮＩＫまたはＴＲＡＦ２のいずれかの機能または発現を干渉することにより劇的に減少され、さらに、シグナル伝達活性がＮＩＫを用いず、かつＳＩＶＡ２との関係を誘導しないＴＮＦによるその安定化は、ＴＲＡＦ２の機能の干渉によってのみ減少した（図２Ｆ）。
【０１４２】
ＴＲＡＦ２（Ｃ３４Ａ）変異体の過剰発現とＴＲＡＦ２ ｓｉＲＮＡでの細胞のトランスフェクションは、ＳＩＶＡ２のＮＩＫ誘導安定化に影響がなく（図２Ｇ）、ＫＤ−ＮＩＫの過剰発現またはＮＩＫ発現のノックダウンもＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２安定化を干渉しなかった（図２Ｂ）。これらの知見は、２つのタンパク質は少なくとも部分的に別々の機序によりＳＩＶＡ２の安定性を増強させるということを示唆している。
【０１４３】
さらに、ｃＩＡＰ１結合のＳＩＶＡ２発現への影響を試験すると、ｃＩＡＰ１の過剰発現が結果として一時的に発現されたＳＩＶＡ２の量を劇的に減少させるということが見出された（図２Ｈ）。対照的に、ユビキチンリガーゼ活性を欠くｃＩＡＰ１のリング−フィンガー変異体（Ｈ５８８Ａ）の過剰発現は、ＳＩＶＡ２発現を増強させた。より大きい見かけの分子量を有するタンパク質の修飾型の蓄積も促進した（図２Ｈの矢印）。しかしながら、ｃＩＡＰ１のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＳＩＶＡ２発現に影響がなかった（未掲載データ）。これらの知見は、ｃＩＡＰ１はある状況においてＳＩＶＡ２分解を促進し得るが、このユビキチンリガーゼのみならず他のものも、本発明者らの試験細胞におけるＳＩＶＡ２の低い安定性に関与しているということを示唆した。ｃＩＡＰ１のＨ５８８Ａ変異体のＳＩＶＡ２発現を増強する能力は、ｃＩＡＰ１とまだ未知の他のユビキチンリガーゼとのＳＩＶＡ２上の共通の結合部位に対する競合を反映し得る。
【０１４４】
実施例３：ＳＩＶＡはＯ−ＧｌｃＮアシル化され、この修飾はＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２安定化に貢献するようである。
【０１４５】
タンパク質の安定性のモジュレーションは、セリン、トレオニン、またはチロシンのリン酸化、セリンまたはトレオニンのＯ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン修飾（Ｏ−ＧｌｃＮアシル化）、およびユビキチンまたはそのホモログの１つの、主にはリジン残基への連結などの、多種多様な共有結合性の修飾により誘導することができる。ＳＩＶＡ２は、インビボ標識化（図３Ａ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）結合（図３Ｂ）、およびβ−Ｄ−Ｎ−アセチル  ヘキソサミニダーゼ処置（図３Ｃ）により評価された場合、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン修飾型で細胞に存在することがわかった。Ｏ−ＧｌｃＮアシル化の阻害は、ＴＲＡＦ２（図３Ｄ）またはＮＩＫ（図３Ｅ、３Ｆ）によるＳＩＶＡ２の安定化を減少させるが、プロテアソーム阻害剤（図３Ｄ）による安定化は減少されず、したがってこの修飾は安定型でＳＩＶＡ２を維持するために必要とされるということが示唆される。
【０１４６】
実施例４：ＳＩＶＡ２は、そのＮ−末端の複数のセリン残基でリン酸化され、このリン酸化もその安定化に寄与するようである。
【０１４７】
ＮＩＫで同時トランスフェクトされた細胞におけるＳＩＶＡ２への32Ｐ取り込みの評価により、ＳＩＶＡ２はリン酸化されているということを明らかにした（図４Ａ）。ＮＩＫで同時トランスフェクトされた細胞から単離されたＳＩＶＡ２の質量分析（ＭＳ）において、リン酸がＮ−末端のいくつかのセリン残基に結合しているが（図４Ｂ、図Ｓ１およびＳ２および表Ｓ１）、以前に酸化ストレスに応答してリン酸化されると報告されていた｛Cao, 2001｝３４位のチロシンには結合していないことがわかった。
【０１４８】
酵素的に活性なＮＩＫのみがＳＩＶＡ２を安定化させ（図２Ａ）、ＮＩＫはＳＩＶＡ２に特異的に結合するので、ＮＩＫによるＳＩＶＡ２の安定化は、ＮＩＫによるその直接のリン酸化の結果として生じるというのがもっともらしい。実際、ＮＩＫを過剰発現する細胞からイムノ精製された場合、ＳＩＶＡ２調製品はインビトロでいくつかの関連タンパク質キナーゼにより効果的にリン酸化された（図４Ｃ）。しかしながら、ＳＩＶＡ２に対するＮＩＫ効果の欠失分析において、ＮＩＫも、ＳＩＶＡ２（１〜５８）、Ｃ−末端システインリッチ領域（ＣＲＲ）（他の場所で報告されているように（Ramakrishnanら、提出）ＮＩＫが結合するＳＩＶＡ２の領域）が欠失したＳＩＶＡ２の欠失変異体のリン酸化および発現を増強することが見出された（図４Ｄ、４Ｅ）。この知見は、ＮＩＫによるＳＩＶＡ２安定化が、それらの直接の会合を必要としないということを示唆した。これらの観察結果に対する説得力のある説明は、ＮＩＫは、別のＳＩＶＡ２関連タンパク質キナーゼの活性を増強し、その結果としてＳＩＶＡ２のＮ−末端部分のリン酸化がその安定性を増強するというものであった。
【０１４９】
実施例５：ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２によるＳＩＶＡ２の安定化に寄与する、ＳＩＶＡ２におけるアミノ酸残基の同定
【０１５０】
ＳＩＶＡ２の安定性の制御における、ＳＩＶＡ２のリン酸化とグリコシル化の関与、ならびにＴＲＡＦ２によるタンパク質のユビキチン化に必要とされるＴＲＡＦ２の領域の関与を示唆する知見を考慮し、ＳＩＶＡ２安定性に対するこれらの修飾に関するＳＩＶＡ２における潜在的標的部位の変異の影響を評価した。ＳＩＶＡ２においてリン酸化されることがわかっている個々のセリン残基の変異はいずれも、ＳＩＶＡ２安定化の程度に影響を与えなかった（図５Ａ）。ＮＩＫによるＳＩＶＡ２の安定化は、チロシン３４の変異により影響されないことがわかった（図５Ｂ）。しかしながら、リン酸化されることがわかっている３つのセリン残基（残基５、５０、５１；「３ＳＡ」）の組み合わせ変異、ましてや６つのセリン残基（残基５、２１、２６、３５、５０、５１；「６ＳＡ」）の組み合わせ変異は、インビトロでＳＩＶＡ２のリン酸化を効果的に減少させ（図４Ｃ）、またＮＩＫによるＳＩＶＡ２の安定化も減少させた（図５Ｃ）が、一方、プロテアソーム阻害剤によりなお安定化されることができた（図５Ｄ）。野生型タンパク質とは異なり、６ＳＡ変異体は、ＣＤ４０Ｌにより安定化できなかった（図５Ｅ）。しかしながら、ＴＲＡＦ２およびＮＩＫは、異なる機序によりＳＩＶＡ２を安定化するということを示唆する本発明者らの知見と一致して、前記６つのセリンの変異は、ＴＲＡＦ２による安定化効果を低下させなかった（図５Ｆ）。
【０１５１】
さらに、ＳＩＶＡ２の安定化におけるＳＩＶＡ２のリジン残基の関与を調べると、２つの残基Ｋ１７およびＫ９９のいずれか１つの変異が、ＴＲＡＦ２によるタンパク質の安定化を無効にするということがわかった（図５Ｆ）。しかしながら、これらの変異はＮＩＫによるＳＩＶＡ２の安定化には影響しなかった（図５Ｇ）。
【０１５２】
実施例６：ＳＩＶＡ２はＮＩＫ、ＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰに結合する。
【０１５３】
ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターによるシグナル伝達を媒介することが知られている多様な他のタンパク質へのＳＩＶＡ２の結合を調べると、ＴＲＡＦ２（図６Ａ〜６Ｃ）およびｃＩＡＰ１（図６Ｄ）にも結合するが、ＴＲＡＦ３には結合しない（未提示）ということがわかった。欠失分析では、ＴＲＡＦ２はＮＩＫと同様ＳＩＶＡ２のＣＲＲに結合するということが示唆された（図６Ｆ、下段パネル）。他方、ｃＩＡＰ１は、ＳＩＶＡ２のＮ−末端部分、ＣＲＲの上流に結合することがわかった（図６Ｄ、右下段パネル、および図６Ｅ）。
【０１５４】
実施例７：ＳＩＶＡ２はＴＲＡＦ２およびＮＩＫ介在シグナル伝達を阻害する。
【０１５５】
上述したタンパク質会合の機能的意義の評価において、ＳＩＶＡ２の誘導は、ＣＤ７０による代替および正準ＮＦ−κＢ経路の両方の活性化（図７Ａ、左中段パネルおよび図７Ｂ上段パネル）ならびにＴＮＦの正準経路の活性化（図７Ａ、右パネル）を抑制するということがわかった。他方、ＳＩＶＡ１はＳＩＶＡ２よりも非常に高いレベルで発現されるが、そのような効果は示さなかった（図７Ｂ、右パネル）。
【０１５６】
反対に、ＳＩＶＡ発現がノックダウンされている細胞は、代替的ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化を示した（図７Ｃ、左パネル）。それらは、ｐ６５ＮＦ−κＢタンパク質の核移行の程度（図７Ｃ、右パネル）およびルシフェラーゼレポーター試験（図７Ｄ）の両方に現れているように、正準ＮＦ−κＢ経路の規定レベルのある程度の増加、ＣＤ７０による活性化へのこの経路の反応性の上昇も示した。ＳＩＶＡのノックダウンはまた、ＣＤ７０およびＴＮＦの両方によるＪＮＫおよびｐ３８キナーゼリン酸化の誘導を増強した（図７Ｅ）。
【０１５７】
実施例８：ＳＩＶＡ２は、ｃＩＡＰ１と協働して、ＣＤ２７に応答してＴＲＡＦ２のユビキチン化および分解を媒介する。
【０１５８】
以前に、ＣＤ２７に補充されたＴＲＡＦ２分子は大量にユビキチン化されるということが報告された（Ramakrishnanら、2004）。ＣＤ２７誘導シグナル伝達に対するＳＩＶＡ２の効果に関する機序を探究するために、このユビキチン化に対するＳＩＶＡ２の影響を評価した。図８Ａに示すように、ＳＩＶＡのノックダウンは、ＴＲＡＦ２のＣＤ７０ユビキチン化を弱めた（左パネル）。対して、ＳＩＶＡ１（右パネル）ではなくＳＩＶＡ２（中間パネル）の誘導は、それを増強した。
【０１５９】
実施例９：ＳＩＶＡ２は、ＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰ１の両方のユビキチン化を媒介する。
【０１６０】
すでに、ＳＩＶＡ２は自己ポリユビキチン化を促進し、固有のユビキチン−リガーゼ活性を有し、インビトロで、ＳＩＶＡ２のＣＲＲ内の７３位のシステイン残基の変異はＳＩＶＡ２のＴＲＡＦ２への結合に影響を与えないが、この残基に依存してＴＲＡＦ２のユビキチン化を促進したということが見出された。ＳＩＶＡ２の残基７３の変異の効果は、トランスフェクトされた細胞においても証明され（図９Ａ）、そこでは、ＳＩＶＡ１ではなく野生型ＳＩＶＡ２の過剰発現が、ＴＲＡＦ２のみ発現された場合に観察されるよりも顕著にＴＲＡＦ２のＫ４８結合（Ｋ６３結合ではないが）ポリユビキチン化を増加させたのに対して、ＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）はユビキチン化にほとんど影響しなかった（図９Ｂ）。インビトロでのＳＩＶＡ２の自己ユビキチン化は、この変異によって影響されなかったが、ＣＲＲの完全な欠失により劇的に減少した（未提示）。
【０１６１】
ＳＩＶＡ２のこの活性の生理学的な意義を検証するために、細胞においてそのＣ７３Ａ変異体を誘導可能な方法で発現させた。その変異は、ＣＤ２７複合体におけるＴＲＡＦ２のユビキチン化に対するＳＩＶＡ２の増強効果を取り除くことがわかった（図８Ａ、右）。
【０１６２】
ＴＲＡＦ２に加えて、ｃＩＡＰ１もＳＩＶＡ２により効果的にユビキチン化されること、およびそのユビキチン化もＳＩＶＡ２（Ｃ７３Ａ）変異により低下させられることがわかった（図９Ｃ）。ＳＩＶＡ２のｃＩＡＰ１に対する効果とＴＲＡＦ２に対する効果との間の因果関係を究明する試みにおいて、ＳＩＶＡ２のＴＲＡＦ２に対する効果に対するｃＩＡＰ１ノックダウンの効果を調べた。図９Ａに示すように、ｃＩＡＰ１のノックダウンは、ＳＩＶＡ２発現に応答するＴＲＡＦ２のユビキチン化を劇的に減少させた。したがって、ＳＩＶＡ２は、インビトロでＴＲＡＦ２を直接ユビキチン化する能力を有するが、細胞内でのＴＲＡＦ２ユビキチン化のその円滑化は、ｃＩＡＰ１のそうする能力の増強を通して媒介されるか、または許容的役割を果たすためにｃＩＡＰ１を必要とする。
【０１６３】
試験細胞におけるＴＲＡＦ２の細胞質レベルの測定は、ＣＤ２７の誘発が結果としてＴＲＡＦ２の細胞内量に有意な減少を引き起こし（図８Ｂ、左上パネル）、レセプター複合体内でのＴＲＡＦ２のユビキチン化が分解に対する標的であるということを示唆した。ＴＲＡＦ２へのその連結がＳＩＶＡ２により促進されるユビキチン鎖は、通常プロテオソーム分解を刺激するユビキチン化での場合のように、主としてＫ４８に結合し（図８Ｄ）、このＳＩＶＡ２効果が、ＣＤ２７によるＴＲＡＦ２分解の誘導に寄与する可能性が高まる。一貫して、ＳＩＶＡ発現のノックダウンは、ＣＤ２７によるＴＲＡＦ２のダウンレギュレーションを防ぎ（図８Ｂ、右上パネル）、一方ＳＩＶＡ２の誘導はそれを増強する（図８Ｃ、左パネル）。
【０１６４】
上述したように、ＳＩＶＡのノックダウンは、代替的ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化ももたらした（図７Ｃ、左パネルおよび図８Ｂ、右パネル）。ｃＩＡＰ１発現の抑制も結果としてＮＦ−κＢ活性化を生じ（Varfolomeevら、2007）（Vinceら、2007）、加えてそれは、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの別のレセプターであるＴＮＦ−ＲＩＩによるＴＲＡＦ２のダウンレギュレーションを低下させる（Liら、2002）。図８Ｅに示すように、ｃＩＡＰ１のノックダウンは（ＳＩＶＡ２のノックダウンと同様）、ＣＤ２７によるＴＲＡＦ２のダウンレギュレーションを低下させ、さらには代替的ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化も伴った。
【０１６５】
これらの知見は、ＳＩＶＡ２およびｃＩＡＰ１が、ＣＤ２７によるＴＲＡＦ２分解の誘導において、およびＮＦ−κＢの制御において共通した役割を果たすということを示唆した。
【０１６６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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