(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて乳原料を発酵させることを含む発酵食品の製造方法であって、該ラクトコッカス・ラクティスはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723 (NITE BP-1204)、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764(NITE BP-1205)からなる群より選択される乳酸菌であることを特徴とする方法。
【請求項２】
発酵後の産物にフルーツプレザーブを添加してｐＨを４．４５〜４．６５に低下させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキーからなる群より選択される乳酸菌を発酵に用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723 (NITE BP-1204)及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764(NITE BP-1205)からなる群より選択される乳酸菌と、ビフィドバクテリウム属細菌とを含有する発酵食品。
【請求項７】
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723 (NITE BP-1204)、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764(NITE BP-1205)からなる群より選択される乳酸菌を含むビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。
【請求項８】
前記ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項７
に記載の乳原料発酵用スターター。
【請求項９】
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株である請求項８に記載の乳原料発酵用スターター。
【請求項１０】
さらに、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキーからなる群より選択される乳酸菌を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の乳原料発酵用スターター。
【請求項１１】
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723(NITE BP-1204)及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764(NITE BP-1205)からなる群より選択される乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティスとビフィドバクテリウム属細菌とを用いて乳原料を共発酵させることにより得られる発酵食品の製造方法、及び該方法に用いられるラクトコッカス・ラクティスの新規菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌（以下、「ビフィズス菌（bifidobacteria）」という）は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つである。ビフィズス菌は、腸内細菌のバランスを回復させる整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の、生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。
【０００３】
ビフィズス菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、例えば１×１０7ＣＦＵ（colony forming unit）／ｍＬのビフィズス菌を含有させるために、通常、様々な生育促進物質を添加することが行われている。
【０００４】
しかし、前記生育促進物質は一般的に高価であり、かつ、食品の風味を損なう恐れもある。また、ビフィズス菌は、酸性条件下での保存が難しく、死滅し易い。このため、発酵乳製品等の製造中にビフィズス菌が一旦増殖しても、発酵乳製品等が流通する過程で、発酵乳製品中の生きているビフィズス菌量は加速度的に減少してしまう。
【０００５】
そこで、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィズス菌を多く含有する発酵乳を製造するとともに、生きているビフィズス菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造することが課題となっている。
【０００６】
ビフィズス菌を、それ以外の乳酸菌と混合発酵させることにより、前記のような生育促進物質等を添加することなく、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。
【０００７】
発酵乳製造におけるビフィズス菌の生育性を改善させる方法については、例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus 
lactis subsp. cremoris）、およびビフィズス菌を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
その他、発酵乳のビフィズス菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスを混合培養することを特徴とするビフィズス菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００９】
また、例えば、細胞壁局在性タンパク質分解酵素（cell wall-enveloped proteinase, PrtP）を有するラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法（例えば、特許文献３、４参照）や、細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸
菌から分画された前記酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィドバクテリウム属細菌を接種することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌含有組成物の製造方法（例えば、特許文献４参照）が開示されている。さらには、10%還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を３０％以上とすることができるような保存生残性改善効果およびビフィドバクテリウム・ロンガムの増殖促進効果を有するラクトコッカス属細菌を用いることを特徴とする、発酵乳の製造方法、及び該製造方法により製造された発酵乳が開示されている（例えば、特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３３６４４９１号公報
【特許文献２】特許第３０６８４８４号公報
【特許文献３】特許第４４４８８９６号公報
【特許文献４】特開２００９−２９６９１０号公報
【特許文献５】国際公開第２００８／０９９５４３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前記のように、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されているが、さらに改善の余地がある。例えば、上記特許文献１の方法では、ビフィズス菌の生育が促進され、発酵時間を短縮することができるものの、ビフィズス菌の保存生残性については一切記載がない。
【００１２】
一方、上記特許文献２の方法では、特定のビフィズス菌と特定の乳酸菌とからなる混合菌を用いることにより、増殖促進効果と生残性改善効果の両方が認められるものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベ以外のビフィズス菌、例えば食品に汎用されているビフィドバクテリウム・ロンガムについては、一切記載がない。
【００１３】
また、前記特許文献３、４に記載の方法では、使用できるラクトコッカス・ラクティスは、細胞壁局在性タンパク質分解酵素(PrtP)を有する菌株に限られるという問題があった。
【００１４】
ところで、特許文献１および２によると、この方法で得られる発酵乳には副原料として甘味料、果実、果汁、香料などを添加しても良いとの記載があるが、フルーツプレザーブのような添加物は一般的に強酸性で、添加することにより発酵乳自体のｐＨを低下させる。一般的にビフィズス菌は酸耐性が低く、ｐＨが低くなるほど保存生残性も低下する傾向があるため、製造における発酵乳のｐＨの管理は非常に重要となる。特許文献５には、前述のラクトコッカス属細菌とビフィズス菌を用いて発酵させた発酵乳は、ブルーベリープレザーブを添加してｐＨが４．４５に低下した後でもビフィズス菌の生残率が高かったことが記載されているが、更なる改良の余地がある。
【００１５】
本発明は、乳原料を発酵させて得られる発酵食品、特にフルーツプレザーブなどを混合した発酵食品においてもビフィズス菌の保存生残性を改善させ得る乳酸菌を用いた、風味の良い発酵食品の製造方法、及び、前記製造方法により製造された発酵食品、並びに前記乳酸菌を含むビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ビフィズス菌と混合発酵させた後に発酵産物のｐＨを低下させても、ビフィズス菌の生残性を向上させ得るラクトコッカス・ラクティスの新規菌株を見出し、さらに、該菌株を用いるとビフィズス菌の生残性が向上するだけでなく、風味のよい発酵食品が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
すなわち、本発明は、ラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて乳原料を発酵させることを含む発酵食品の製造方法であって、該ラクトコッカス・ラクティスはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723 (NITE BP-1204)、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764(NITE BP-1205)からなる群より選択されることを特徴とする方法である。
また、本発明は、前記方法により製造された発酵食品を提供する。
また、本発明は、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723 (NITE BP-1204)、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764(NITE BP-1205)からなる群より選択される乳酸菌とビフィドバクテリウム属細菌とを含む乳原料発酵用スターターを提供する。
【００１８】
本発明の発酵食品の製造方法は、発酵後の産物にフルーツプレザーブを添加してｐＨを４．４５〜４．６５に低下させる工程を含むことを好ましい態様としている。
【００１９】
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを好ましい態様としている。
【００２０】
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株であることを好ましい態様としている。
【００２１】
また、本発明の方法は、さらに、ストレプトコッカス・サーモフィラスおよびラクトバチルス・デルブルッキーからなる群より選択される乳酸菌とを発酵に用いることを好ましい態様としている。
【００２２】
また、本発明は、新規な菌株であるラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723(NITE BP-1204)及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764（NITE BP-1205）を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の発酵食品の製造方法により、フルーツプレザーブを含んでいてもビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを多く含有する発酵食品を製造することができる。本発明の方法により得られる発酵食品は、ビフィズス菌を多く含んでおり健康管理上も有用である。また、本発明により得られる発酵食品は、フルーツプレザーブを含んでおり嗜好性に優れ、かつ、風味に優れている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の発酵食品の製造方法に用いるラクトコッカス・ラクティスは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723(NITE BP-1204)、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764（NITE BP-1205）から選ばれる菌株である。
上記各菌株は、２０１２年１月１７日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、各々NITE BP-1204、及びNITE BP-1205の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００２５】
上記各菌株は、好ましい態様では、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、各々の菌株を培地１ｍｌ当たり２．０×１０5〜２．０×１０7 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり２．０×１０6〜５．０×１０7 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．５〜５．５に達した時点で培養温度から１０℃に急冷して、ｐＨを４．４５〜４．６５に下げた後、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上、好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上に維持する性質を有している。
【００２６】
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地は、還元脱脂粉乳が１０％（Ｗ／Ｗ）となるように、水に溶解し、殺菌することによって製造することができる。殺菌は、例えば、８０〜１２２℃で４０〜５分間、好ましくは８５〜９５℃で３５〜５分間の加熱処理により行うことができる。
【００２７】
培養温度から１０℃への急冷は、好ましくは１時間以内、より好ましくは３０分以内、特に好ましくは１０分以内に行うことが望ましい。培養温度としては、３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃がより好ましく、３７℃が特に好ましい。以下の記載においても同様である。
【００２８】
培地のｐＨは、例えばフルーツプレザーブを添加することにより下げることができる。
【００２９】
本発明のラクトコッカス・ラクティスは、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵食品を製造するためのスターターとして好適である。本発明の「ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター」とは、このような、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵食品を製造するためのスターター、すなわち、発酵食品を製造するためにビフィドバクテリウム属細菌とともに乳原料に接種される細菌をいう。
【００３０】
本発明の方法は、上記ラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて、乳原料を発酵させることにより、発酵食品を製造する方法である。
【００３１】
ビフィドバクテリウム属細菌としては、特に制限されないが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、及び、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスに再分類されている）が挙げられる。これらの中では、ビフィドバクテリウム・ロンガムが好ましい。
また、ビフィドバクテリウム・ロンガムとしてより具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株が挙げられる。同菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から購入することができる。
【００３２】
乳原料（milk raw material）としては、乳由来の原料であって、ラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌を用いて発酵させることにより、発酵食品を製造することができるものであれば特に制限されず、乳又はその分画物又は加工品、例えば牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、及び脱脂粉乳、又はこれらを水に混合、溶解または懸濁させたもの等が挙げられる。
【００３３】
ラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の乳原料への接種量は特に制限されないが、ラクトコッカス・ラクティスについては好ましくは１０4〜１０8Ｃ
ＦＵ／ｍｌ乳原料、より好ましくは１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、ビフィドバクテリウム属細菌については好ましくは１０5〜１０9ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、より好ましくは１０7〜１０8ＣＦＵ／ｍｌ乳原料である。また、ラクトコッカス・ラクティスとビフィドバクテリウム属細菌の接種量の比率（菌数比）は特に制限されないが、１：１０００〜１０：１が好ましく、１：１０〜１：１がより好ましい。
【００３４】
乳原料に接種するラクトコッカス・ラクティスは、MCC1723(NITE BP-1204)株、及びMCC1764（NITE BP-1205）株の任意の一方であってもよく、両方の菌株であってもよい。また、ビフィドバクテリウム属細菌も、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。さらに、本発明の効果を損ねない限り、MCC1723(NITE BP-1204)株、及びMCC1764（NITE BP-1205）株以外のラクトコッカス・ラクティスを含んでいてもよい。
【００３５】
乳原料に接種するラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌は、予め他の培地で種培養又は前培養しておくことが好ましい。培地としては、ラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌の培養に適した培地であれば特に制限されないが、例えば、還元脱脂粉乳を含む培地が挙げられる。還元脱脂粉乳の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。また種培養又は前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加してもよい。特にビフィドバクテリウム属細菌は、還元脱脂粉乳を含む培地での増殖性が低いため、生育促進物質、例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有する培地を用いることが好ましい。培地の殺菌条件は、前記と同様である。
【００３６】
必要に応じて、乳原料に、ラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌に加えて、他の乳酸菌を加えて発酵を行ってもよい。他の乳酸菌としては、食品の製造に用いられ得るものであって、ラクトコッカス・ラクティス及びビフィドバクテリウム属細菌の生育を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば発酵食品がヨーグルトの場合、ストレプトコッカス・サーモフィルス、および、ラクトバチルス・デルブルッキー等が挙げられる。これらの乳酸菌は、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。
【００３７】
ラクトコッカス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌を用いて乳を発酵させた場合、通常、ｐＨが５付近であり、ドリンクヨーグルトが得られる。さらにストレプトコッカス・サーモフィルスやラクトバチルス・デルブルッキー等の乳酸菌を併用して発酵させると、ｐＨが低下し、よりしっかりとした組織を有したヨーグルト（スプーンで摂取できるヨーグルト）を製造することができる。
いずれの場合でも、乳原料を発酵させた直後のｐＨは、通常４．４〜５．５である。本発明においては、発酵終了後のｐＨは特に制限されないが、４．４〜４．７、４．４〜４．６、又は４．４〜４．５であってもよい。
【００３８】
ラクトコッカス・ラクティス及びビフィドバクテリウム属細菌の接種量と、上記他の乳酸菌の接種量の比率（菌数比）は特に制限されないが、１０００：１〜１：１が好ましい。
【００３９】
ラクトコッカス・ラクティス、ビフィドバクテリウム属細菌、及び他の乳酸菌を乳原料に接種する順序は特に問わず、全てを同時に投与してもよい。また、これらの細菌のうち任意の細菌を、複数回接種してもよい。
【００４０】
培養温度、培養時間等の発酵条件は、通常の乳原料からの発酵食品の製造と同様の条件を採用することができる。例えば、培養温度は３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８
℃がより好ましい。培養時間は、製造する発酵食品の種類によって適宜設定することができるが、通常、３〜１８時間が好ましい。
【００４１】
本発明の方法の好ましい態様では、発酵後の産物に、フルーツプレザーブを添加して、ｐＨを４．４５〜４．６５に低下させる。フルーツプレザーブとは果実又は果肉の砂糖煮であり、形状は問わず、果肉の形態が残らない通常ジャムに分類されるものであってもよい。特に、フルーツプレザーブは、発酵食品に添加することによりｐＨが低下するものが、本発明には好適であり、果実又は果肉の原料としては、イチゴ、リンゴ、ミカン、バナナ、アロエ、ブルーベリー、グレープフルーツ、モモ等が挙げられる。具体的には、それ自体のｐＨが４．５以下、４．０以下、又は３．５以下のフルーツプレザーブが好ましい。
【００４２】
フルーツプレザーブの添加量は、ｐＨが上記の範囲となる量であれば特に制限されないが、通常、発酵食品全量に対して、好ましくは５〜１５％（Ｗ／Ｗ）、１５〜２５％（Ｗ／Ｗ）、又は２５〜４０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００４３】
発酵食品には、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合してもよい。乳原料は、発酵前に、常法に従って殺菌、均質化、冷却等を施してもよい。また、発酵食品は、適宜、容器に充填してもよい。
【００４４】
上記のようにして得られる発酵食品は、保存中に、ｐＨが通常４．２〜４．３程度まで低下し、フルーツプレザーブを添加しない場合に比べて、通常、ビフィズス菌の生残率が低下する。また、通常のラクトコッカス・ラクティスを用いた場合、又はラクトコッカス・ラクティスを用いない場合は、フルーツプレザーブの添加の有無にかかわらず、ビフィズス菌の生残性は著しく低い。それに対して、低ｐＨでも本発明のラクトコッカス・ラクティスを用いると、ビフィズス菌の生残率が高く維持される。また、上記のようにして得られる発酵食品は、風味に優れている。
【実施例】
【００４５】
次に、試験例及び実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４６】
〔試験例１〕ラクトコッカス・ラクティス菌株の取得
本発明者らは、ラクトコッカス・ラクティスに属する菌株を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを滅菌した０．８５％生理食塩水で希釈し、下記組成のDifcoTM Lactobacilli MRS Agar（Becton Deckinson and Company）に塗布し、３０℃で嫌気培養した。
【００４７】
〔DifcoTM Lactobacilli MRS Agar〕
プロテオース  ペプトン No.3    10.0 g
牛肉エキス                     10.0 g
酵母エキス                      5.0 g
デキストロース                 20.0 g
ポリソルベート８０              1.0 g
クエン酸アンモニウム            2.0 g
酢酸ナトリウム                  5.0 g
硫酸マグネシウム                0.1 g
硫酸マンガン                    0.05 g
リン酸二カリウム                2.0 g
寒天                           15.0 g
精製水                        1000 ml
pH 6.5±0.2
121℃で15分滅菌後、シャーレに分注して平板とする。
【００４８】
そして得られたコロニーの中で球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。これらの菌を、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。
【００４９】
〔ＢＬ寒天培地〕
肉エキス               3.0 g
肝臓エキス             5.0 g
酵母エキス             5.0 g
ペプトン              15.0 g
ソイペプトン           3.0 g
可溶性デンプン         0.5 g
ブドウ糖              10.0 g
リン酸二カリウム       1.0 g
リン酸一カリウム       1.0 g
硫酸マグネシウム       0.2 g
塩化ナトリウム         0.01 g
硫酸マンガン           0.00674 g
L-システイン塩酸塩     0.5 g
硫化第一鉄             0.01 g
ポリソルベート８０     1.0 g
寒天                  15.0 g
精製水                1000 ml
pH 7.2±0.2
121℃で15分滅菌後、50℃に冷却し、５％（Ｖ／Ｖ）馬無菌脱繊血を加え、シャーレに分注して平板とする。
【００５０】
これらの菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列を常法により同定した。ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information、国立バイオテクノロジー情報センター）の国際塩基配列データベース（GenBank）上で、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による16S リボソーマルRNA（rRNA）遺伝子配列の全長についての相同性検索を行い、それぞれのタイプストレインと９８％以上の相同性を有するラクトコッカス属細菌を６１５株同定した。ラクトコッカス・ラクティスと９８％以上の相同性を有していた５５０菌株のうち、ラクトースを資化し、かつラクトコッカス・ラクティス亜種のタイプストレインのうちラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスに最も相同性が高い群の菌株をラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスと同定した。得られた菌株はすべて無芽胞、非運動性の通性嫌気性グラム陽性球菌で、カタラーゼおよびガス産生はいずれも陰性であった。得られた菌株のうち、MCC1723、及びMCC1764と名付けられた菌株のrRNA遺伝子の塩基配列を、各々配列番号１及び２に示す。ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスのタイプストレイン（ATCC19435株）の16S rRNA遺伝子の塩基配列は、GenBankにaccession No. M58837で登録されている。MCC1723及びMCC1764と、ATCC19435との16S rRNA遺伝子の相同性は、それぞれ９９．７％および９９．６％であった。
【００５１】
〔試験例２〕ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験
まず、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エ
キス及び１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳を含む培地に、培地1mlあたり1.0×107〜5.0×108 CFU接種し、３７℃で４〜６時間培養して、シードカルチャーを得た。
【００５２】
また、０．３％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１０％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳を含む培地に、試験例１で得られたラクトコッカス・ラクティスの各菌株、及び対照として特許第3068484号に記載されているラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスのタイプストレインATCC19435株、並びに国際公開第2008/099543号（特許第4772131号）に記載のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC866株を、培地1mlあたり1.0×106〜5.0×107 CFU接種し、３０℃で１６時間培養し、シードカルチャーを得た。
【００５３】
得られたラクトコッカス・ラクティスの各菌株のシードカルチャーを培地 1mlあたり2.0×106〜2.0×107 CFUと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を培地 1mlあたり1.0〜5.0×107 CFU、さらにストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含むヨーグルトスターター（ダニスコ社製）を、それぞれ培地 1mlあたり2.0×106、2.0×105 CFUを接種し、３７℃で８時間〜１６時間培養した。この発酵乳を培養温度から１０℃に急冷した。発酵乳のｐＨ、及び含有されるビフィズス菌数を測定した。ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で４０℃、２〜３日の嫌気培養にて行った。
【００５４】
急冷した発酵乳をポリスチレン製の容器に分取し、１０℃にて３週間保存した。発酵乳のｐＨ、及び含有されるビフィズス菌数を測定した。複数回試験を行ったところ、発酵終了後のｐＨは４．４〜４．９であった。ｐＨが約４．８〜４．９の場合の結果を表１に、ｐＨが約４．４の場合の結果を表２に示した。表中、「nE+m」は、n×10mを示す。
【００５５】
前記と同様にして培養し、急冷した発酵乳といちごプレザーブを、発酵乳：プレザーブ＝８８：１２（Ｗ／Ｗ）で均一になるように混合した。いちごプレザーブは、長谷川香料社製の製品を使用した。これらのいちごプレザーブ混合発酵乳はポリスチレン製の容器に分取し、１０℃にて２週間保存した。発酵乳のｐＨ、及び含有されるビフィズス菌数を測定した。結果を表３に示した。前記いちごプレザーブ混合発酵乳の官能試験の結果を表４に示した。官能評価は風味が良い（５）〜悪い（１）の５段階評価とし、５人のパネラーによる平均値を示した。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
【表２】
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【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
異なるｐＨにて培養が終了した発酵乳において、１０℃での保存生残性試験の結果、表１に示したｐＨ４．８〜４．９で発酵終了した場合には、ラクトコッカス・ラクティスを添加しない系ではビフィズス菌数は３週間後にはほぼ死滅しているが、MCC1723株、MCC1764株、及び特許文献２でビフィズス菌の保存生残性効果が示されているATCC19435株を添加した系ではビフィズス菌数が３週間後も高く維持されていた。しかし、表２に示したｐＨ４．４付近で発酵終了した場合においては、ATCC19435株を添加した系では3週間後のビフィズス菌数は非常に低い値となったが、MCC1723株及びMCC1764株を添加した系では２週間後及び３週間後のビフィズス菌数が依然維持されていることが示された。MCC1723及びMCC1764は低いｐＨの条件下でもビフィズス菌に酸耐性を付与し、保存生残性を向上させる効果を有していると考えられる。
【００６１】
表３に示したように、発酵乳ベースにいちごプレザーブを混合した発酵乳ではプレザーブに含まれる酸によりｐＨが０．１〜０．３程度低下するため混合直後（保存０日後）のｐＨが４．６付近となり、保存中もｐＨ４．２〜４．３の低いｐＨとなっていた。MCC1723株では、いちごプレザーブ混合下でも２週間保存後のビフィズス菌数が高く維持されていた。MCC866株（FERM BP-10746）でもある程度ビフィズス菌数は維持されたが、MCC1723株の場合に比べて生残率は低かった。さらに表４に示したように、MCC1723株で作製したいちごプレザーブ混合発酵乳は、５人のパネラーによる官能試験においてもMCC866株よりもヨーグルトの風味としてはあまり好まれない苦味や雑味が少なく感じられ、総じて風味が良好であるとされた。
【００６２】
〔実施例１〕ドリンクヨーグルトの製造
０．３％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養した。一方、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス、及び１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で４時間培養した。
【００６３】
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳、蔗糖及びペクチンを混合溶解して、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖８．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを調製し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。前記殺菌した乳原料に、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723株のカルチャー５００ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。
【００６４】
前記発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、アロエプレザーブを８％（Ｗ／Ｗ）添加混合した後、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．７４％、ｐＨ４．８０、３．６×１０8ＣＦＵ／ｍＬのビフィズス菌を含有していた。このドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は２．３×１０8ＣＦＵ／ｍＬであり、生残率は６４％であった。
【００６５】
〔実施例２〕ヨーグルトの製造（Ｉ）
還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地（１１５℃、２０分殺菌）１０００ｍＬに、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、１６時間培養した。一方、酵母エキス０．１％（Ｗ／Ｗ）、及び還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地（９０℃、３０分殺菌）１０００ｍＬにストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、５時間培養した。
【００６６】
なお、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105〜1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
【００６７】
また、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105〜1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
【００６８】
脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質を混合溶解して、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを調製し、７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。
【００６９】
この殺菌した乳原料に、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のカルチャーを５０ｍＬ、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のカルチャーを２２５ｍＬ、実施例１と同様の方法にて前培養を行ったラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723株のカルチャー２５０ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で４時間培養し、直ちに攪拌冷却し、いちごプレザーブを１２％（Ｗ／Ｗ）添加混合した後、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。
【００７０】
得られたヨーグルトは、乳酸酸度０．８４％、ｐＨ４．５３であり、１．５×１０8ＣＦＵ／ｍＬのビフィズス菌を含有していた。このヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は７．２×１０7ＣＦＵ／ｍＬであり、生残率は４８％であった。
【００７１】
〔実施例３〕ヨーグルトの製造（II）
脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質を混合溶解し、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを調製し、７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。
【００７２】
この殺菌した乳原料に、実施例１と同様にして得られたラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1764株のカルチャー３００ｍＬと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー４００ｍＬ、さらにストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含むヨーグルトスターター（ダニスコ社製）０．００２％を接種し、３７℃で８時間培養し、直ちに攪拌冷却し、ブルーベリープレザーブを１０％（Ｗ／Ｗ）添加混合した後、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。
【００７３】
得られたヨーグルトは乳酸酸度０．８５％、ｐＨ４．６４、２．２×１０8ＣＦＵ／ｍＬのビフィズス菌を含有していた。この発酵乳を１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は１．７×１０8ＣＦＵ／ｍＬであり生残率は７７％であった。
【００７４】
〔実施例４〕ヨーグルトの製造（III）
脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質を混合溶解し、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。
【００７５】
この殺菌した乳原料に、実施例１と同様にして得られたラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスMCC1723株のカルチャー５００ｍＬと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株の凍結菌体（森永乳業社製）1.5×1012 CFU 、さらにストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを含むヨーグルトスターター（ダニスコ社製）０．００２％を接種し、３７℃で６時間培養し、直ちに攪拌冷却し、りんごプレザーブを１４％（Ｗ／Ｗ）添加混合した後、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。
【００７６】
得られたヨーグルトは、乳酸酸度０．９０％、ｐＨ４．５４、３．２×１０8ＣＦＵ／ｍＬのビフィズス菌を含有していた。この発酵乳を１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は１．８×１０8ＣＦＵ／ｍＬであり生残率は５６％であった。
【配列表】
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