(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳn測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳnスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳn-1測定により求まるＭＳn-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳn測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳn-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた少なくとも１つの分画試料に対するＭＳn-1測定が終了した状況で、そのＭＳn-1測定により求まったＭＳn-1ピークの中で、プリカーサイオンの候補となる複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出するピークＳＮ比算出ステップと、
c)前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記ピークＳＮ比算出ステップで算出されたＭＳn-1ピークのＳＮ比から該ＭＳn-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定ステップと、
d)前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の優先順位を決定するＭＳn測定順位決定ステップと、
を有することを特徴とする物質同定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の物質同定方法であって、
前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳn-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、同一のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の増加度合である同定確率増分推定値を求める同定確率増分推定ステップをさらに有し、
前記ＭＳn測定順位決定ステップでは、前記同定確率推定ステップによる各ＭＳn-1ピークの同定確率推定値と、前記同定確率増分推定ステップによる同定確率増分推定値とに基づいて、同一ＭＳn-1ピークに対する複数回のＭＳn測定を許容する条件の下で複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の優先順位を決定することを特徴とする物質同定方法。
【請求項３】
請求項２に記載の物質同定方法であって、
１つの分画試料に対するＭＳn測定実行回数の上限の下で、前記ＭＳn測定順位決定ステップで決定された優先順位と各ＭＳn-1ピークのＳＮ比とに基づいて、複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を実行するための測定シーケンスを決定するＭＳn測定シーケンス決定ステップを有することを特徴とする物質同定方法。  
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の物質同定方法であって、
前記目的試料に対する測定に先立って前記所定の試料に対する測定を実行し、前記同定確率モデル構築ステップではその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することを特徴とする物質同定方法。
【請求項５】
請求項２又は３に記載の物質同定方法であって、
前記分画試料に対するＭＳn測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出ステップ、前記同定確率推定ステップ、前記ＭＳn測定順位決定ステップ、及びＭＳn測定シーケンス決定ステップによる一連の処理により該分画試料に対するＭＳn測定の測定シーケンスを決定することを特徴とする物質同定方法。
【請求項６】
請求項５に記載の物質同定方法であって、
前記分画試料に対するＭＳn測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出ステップ、前記同定確率推定ステップ、前記ＭＳn測定順位決定ステップ、及びＭＳn測定シーケンス決定ステップによる一連の処理により該分画試料に対するＭＳn測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳn測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更することを特徴とする物質同定方法。
【請求項７】
各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳn測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳnスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定するために用いられる質量分析システムであって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳn-1測定により求まるＭＳn-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳn測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して求められた、同種試料に由来するＭＳn-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶しておく同定確率推定モデル情報記憶手段と、
b)同定対象である目的試料から得られた少なくとも１つの分画試料に対するＭＳn-1測定が終了した状況で該分画試料に対するＭＳn測定を実行するに先立って、そのＭＳn-1測定により求まったＭＳn-1ピークの中で、プリカーサイオンの候補となる複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出するピークＳＮ比算出手段と、
c)前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記ピークＳＮ比算出手段で算出されたＭＳn-1ピークのＳＮ比から該ＭＳn-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定手段と、
d)前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の優先順位を決定するＭＳn測定順位決定手段と、
を備え、前記ＭＳn測定順位決定手段で決定された優先順位に従って前記分画試料に対するＭＳn測定を実行することを特徴とする質量分析システム。
【請求項８】
請求項７に記載の質量分析システムであって、
前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳn-1ピークについて前記同定確率推定手段においてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、同一のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の増加度合である同定確率増分推定値を求める同定確率増分推定手段をさらに有し、
前記ＭＳn測定順位決定手段は、前記同定確率推定手段による各ＭＳn-1ピークの同定確率推定値と、前記同定確率増分推定手段による同定確率増分推定値とに基づいて、同一ＭＳn-1ピークに対する複数回のＭＳn測定を許容する条件の下で複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の優先順位を決定することを特徴とする質量分析システム。
【請求項９】
請求項８に記載の質量分析システムであって、
１つの分画試料に対するＭＳn測定実行回数の上限の下で、前記ＭＳn測定順位決定手段により決定された優先順位と各ＭＳn-1ピークのＳＮ比とに基づいて、複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を実行するための測定シーケンスを決定するＭＳn測定シーケンス決定手段と、
決定された前記測定シーケンスに従って前記分画試料に対するＭＳn測定を実行するＭＳn測定実行制御手段と、
をさらに備えることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の質量分析システムであって、
前記目的試料に対する測定に先立って前記所定の試料に対する測定を実行し、前記同定確率モデル構築手段はその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載の質量分析システムであって、
前記分画試料に対するＭＳn測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出手段、前記同定確率推定手段、前記ＭＳn測定順位決定手段、及びＭＳn測定シーケンス決定手段による一連の処理により該分画試料に対するＭＳn測定の測定シーケンスを決定することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１２】
請求項１１に記載の質量分析システムであって、
前記分画試料に対するＭＳn測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出手段、前記同定確率推定手段、前記ＭＳn測定順位決定手段、及びＭＳn測定シーケンス決定手段による一連の処理により該分画試料に対するＭＳn測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳn測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更することを特徴とする質量分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＳn測定（ただしｎは２以上の整数）を行うことが可能な質量分析装置を用いて試料に含まれる物質を同定する物質同定方法、及び、該方法により試料中の物質を同定するための質量分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学の研究や医療、医薬品開発などの分野においては、生体試料を対象として、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖など様々な物質を網羅的に同定することがますます重要になってきている。特にタンパク質やペプチドを対象とするこうした網羅的な解析手法はショットガン・プロテオミクス（Shotgun Proteomics）と呼ばれている。こうした解析のためには、ＬＣ（液体クロマトグラフ）やＣＥ（キャピラリ電気泳動）などのクロマトグラフィと、ＭＳn型質量分析装置（タンデム型質量分析装置）とを組み合わせた分析手法が非常に威力を発揮している。
【０００３】
ＭＳn型質量分析装置を用いた生体試料中の各種物質の一般的な網羅的同定法の手順は次のとおりである。
［ステップ１］分析対象である試料に含まれる各種物質をＬＣ、ＣＥ等により分離し、その溶出液を分取・分画して多数のサンプルを調製する（以下、分取・分画により得られた個々のサンプルを「分画試料」と呼ぶ）。なお、試料を分取・分画する際には、予め決めた一定の時間間隔で分画を行う又は一定量の試料液を採取するように分画を行うことにより、該試料中の物質ができるだけ漏れなくいずれかの分画試料に含まれるようにする。
【０００４】
［ステップ２］各分画試料に対しＭＳ1測定をそれぞれ行ってＭＳ1スペクトルを取得し、該ＭＳ1スペクトル上で同定対象の物質群に由来すると推測し得るピークを選択する。
［ステップ３］上記ステップ２で選択されたピークをプリカーサイオンに設定して当該分画試料に対しＭＳ2測定を実行し、その測定結果に基づくデータベース検索やデノボシーケンスサーチを行い、その分画試料に含まれる物質を同定する。
【０００５】
［ステップ４］充分な確度で特定の物質が同定されなかった場合には、ＭＳ1スペクトル上で見つけた別のピークをプリカーサイオンに設定してＭＳ2測定を実行するか、或いは、ＭＳ2スペクトル上で観測される特定のイオンをプリカーサイオンとしたさらに高次（つまりｎが３以上）のＭＳn測定を実行し、その測定結果に基づくデータベース検索やデノボシーケンスサーチなどにより、分画試料に含まれる物質を同定する。
［ステップ５］上記ステップ２〜４の処理を複数の分画試料に対してそれぞれ行い、元の試料に含まれている様々な物質を網羅的に同定する。
【０００６】
上記のような網羅的同定において、高い確度で以て物質を同定するには、同一の分画試料に含まれる物質の種数が少ない（できれば１種類のみである）ことが望ましい。しかしながら、そのためには１つの分画の時間を短くする必要があり、そうすると分画数自体が非常に多くなってしまう。そこで、限られた測定時間又は測定回数でできるだけ多くの物質を同定するためには、つまり、網羅的同定のスループットを向上させるためには、ＭＳ1スペクトル上で観測される複数のピークの中で、同定に成功する確率（以下「同定確率」という）が高いピークを優先的にプリカーサイオンとして選択し且つ適切な測定条件で以てＭＳn測定を行う必要がある。
【０００７】
或る試料に対して得られたＭＳ1スペクトル上で観測されるピークの中からＭＳ2測定のためのプリカーサイオンを選択する方法としては、ピーク強度が高いものから順に選択する方法が従来知られている（特許文献１参照）。或る１つの試料に対してＭＳ2測定を実行する時間や回数に制約がある場合には、ピーク強度の高い順に所定個数のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択する等の制御が行われている。他方、測定時間又は測定回数が充分に確保できる場合には、プリカーサイオンの選択個数に制約を設けずに、信号強度が所定閾値以上であるピークを全て抽出してプリカーサイオンとする方法も知られている。
【０００８】
これらの方法はあくまでも、ピーク強度の高いイオンが同定確率が高いとの仮定に基づいていると考えられる。この仮定自体は定性的に誤りであるというわけではないが、ピーク強度の高さは必ずしも同定確率の高さを示すものではない。そのため、プリカーサイオン候補であるピークが複数存在するときに、いずれのピークでも同程度の高い確率で以て同定に至る場合と、一部のピークしか同定に至ることが期待できない場合とがあるが、ピーク強度からそうした状況の相違を充分に識別することはかなり困難である。即ち、ＭＳ1スペクトル上の各ピークに対する同定確率を事前に、つまりＭＳ2測定の実行前に、定量的に評価する方法は従来確立されておらず、このことが網羅的同定の効率を下げる大きな要因となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３７６６３９１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】アレクセイ・ナコルチェフスキー（Aleksey Nakorchevsky）、ほか１名、「エクスプローリング・データ-デペンデント・アクイジション・ストラテジーズ・ウィズ・ジ・インストゥルメント・コントロール・ライブラリーズ・フォー・ザ・サーモ・サイエンティフィック・インストゥルメンツ（Exploring Data-Dependent Acquisition Strategies with the Instrument Control Libraries for the Thermo Scientific Instruments）」、58th ASMS Conference、2010年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
換言すれば、ＭＳn-1スペクトル上の各ピークに対する同定確率を定量的に評価することが可能であれば、そうした定量的な評価結果に基づいて、より適切なピークをプリカーサイオンとして選択したりより適切な順序で複数のピークをプリカーサイオンとして選択したりすることが可能である。こうした課題に対し、本願出願人は、既に特願２０１１−２４４６００号において、ＭＳ2測定を実行する前にそのＭＳ2測定結果を利用した物質同定の確率を定量的に推定する新規の手法を提案している。
【００１２】
本発明は上記提案の同定確率推定手法の技術思想を利用して、試料中に含まれる多数の物質を効率的に、つまりはできるだけ少ない測定回数で以て又はできるだけ短い測定時間で以て得られた質量分析データに基づき高い確度で同定することができる、物質同定方法、及び該方法に用いられる質量分析システムを提供することを主たる目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために成された第１発明は、各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳn測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳnスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定する物質同定方法であって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳn-1測定により求まるＭＳn-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳn測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して、同種試料に由来するＭＳn-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを求め、該同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶する同定確率推定モデル構築ステップと、
b)同定対象である目的試料から得られた少なくとも１つの分画試料に対するＭＳn-1測定が終了した状況で、そのＭＳn-1測定により求まったＭＳn-1ピークの中で、プリカーサイオンの候補となる複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出するピークＳＮ比算出ステップと、
c)前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記ピークＳＮ比算出ステップで算出されたＭＳn-1ピークのＳＮ比から該ＭＳn-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定ステップと、
d)前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の優先順位を決定するＭＳn測定順位決定ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１４】
また上記課題を解決するために成された第２発明は、各種物質が含まれる試料を分離用パラメータに従って分離し分画することで得られた複数の分画試料に対しＭＳn測定（ｎは２以上の整数）をそれぞれ実行することで得られたＭＳnスペクトルに基づいて、各分画試料に含まれる物質を同定するために用いられる質量分析システムであって、
a)所定の試料から得られた複数の分画試料に対するＭＳn-1測定により求まるＭＳn-1ピークのＳＮ比、及び該各ＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとして実行されたＭＳn測定の結果に基づく物質同定の結果を利用して求められた、同種試料に由来するＭＳn-1ピークのＳＮ比と複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できたピークの累積数との関係を示す同定確率推定モデルを表現する同定確率推定モデル情報を記憶しておく同定確率推定モデル情報記憶手段と、
b)同定対象である目的試料から得られた少なくとも１つの分画試料に対するＭＳn-1測定が終了した状況で該分画試料に対するＭＳn測定を実行するに先立って、そのＭＳn-1測定により求まったＭＳn-1ピークの中で、プリカーサイオンの候補となる複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれＳＮ比を算出するピークＳＮ比算出手段と、
c)前記同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、前記ピークＳＮ比算出手段で算出されたＭＳn-1ピークのＳＮ比から該ＭＳn-1ピークの同定確率推定値を算出する同定確率推定手段と、
d)前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳn-1ピークについてそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の優先順位を決定するＭＳn測定順位決定手段と、
を備え、前記ＭＳn測定順位決定手段で決定された優先順位に従って前記分画試料に対するＭＳn測定を実行することを特徴としている。
【００１５】
本発明において、試料に含まれる各種物質を分離する手段はＬＣ、ＣＥなどである。該手段がＬＣなどカラムを用いたものである場合には、上記分離用パラメータとは時間（保持時間）である。即ち、或る１つの分画試料は所定の時間範囲内にカラムから溶出してきた１乃至複数の物質を含む。また、試料に含まれる各種物質を分離する手段がＣＥである場合には、上記分離用パラメータとは移動度である。
【００１６】
また、ＭＳnスペクトルに基づいて物質を同定する同定方法は特に限定されず、例えばデノボシーケンスサーチ、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ、など任意のアルゴリズムを用いることができる。ただし、同定確率推定モデル構築ステップ（及び手段）において同定を実行するときと、目的試料から得られた同定試料に対して同定を実行するときとでは、同じアルゴリズムを使用する必要がある。
【００１７】
第１発明に係る物質同定方法において同定確率推定モデル構築ステップでは、ＭＳn-1測定、ＭＳn測定、及びその測定結果を利用した同定結果（同定の成否）が全て得られているデータを用いて、同定確率推定モデル情報を求める。同定確率推定モデルは、複数（通常はかなり多数）のＭＳn-1ピークのＳＮ比と、その複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比の高い順又は低い順に従ってプリカーサイオンとして選択してＭＳn測定及び同定を実行していったときに充分な確度で何らかの物質が同定できた、つまりは同定に成功したピークの累積数と、の関係を示す。したがって、この同定確率推定モデルは、全てのＭＳn-1ピークの中で、或るＳＮ比を示す１つのＭＳn-1ピークよりもＳＮ比が高い又は低いＭＳn-1ピークが同定成功となる割合を示している。なお、或るＭＳ1ピークのＳＮ比は、そのＭＳ1ピークの信号強度と、該ピークが存在するＭＳ1スペクトル（ノイズ除去などの加工がされていないプロファイル）から求めたノイズレベルとから求まるものとすることができる。
【００１８】
具体的には、複数のＭＳn-1ピークをＳＮ比の高い順又は低い順に１つずつ選択した累積数と、その中で同定に成功したＭＳn-1ピークの総数との関係は、階段状に増加する形状になる。そこで、上記同定確率推定モデル構築ステップでは例えば、ＭＳnピークの累積数と同定成功数との連続的な関係を求めるべくフィッティングを行って滑らかなフィッティングカーブを求め、このカーブの形状を示す関数式又はその関数式に含まれる係数、定数を同定確率推定モデル情報とすればよい。
【００１９】
なお、適切な同定確率推定モデルは試料の種類、より厳密には試料に含まれる各種物質の種類に依存する。換言すれば、同定対象の物質の種類が同一又は類似していれば、同一の同定確率推定モデル情報を用いることができる。例えば生体試料中のタンパク質を同定するといった目的に対しては、同定済みのタンパク質を各種物質として含む試料について得られたＭＳn-1ピーク等に基づいて同定確率推定モデル情報を取得しておけばよい。
【００２０】
含有物質が未知である試料から得られた或る１つの分画試料に対してＭＳn-1測定を行うことで得られたＭＳn-1スペクトル上で観測される複数のＭＳn-1ピークについて、例えばＭＳn測定を実行する前に、ピークＳＮ比算出ステップでは各ＭＳn-1ピークのＳＮ比を算出する。ＳＮ比の算出方法は同定確率推定モデル作成時と同方法とする。同定確率推定ステップでは、同定確率推定モデル情報より求まる同定確率推定モデルを参照して、各ＭＳn-1ピークのＳＮ比から同定確率推定値をそれぞれ算出する。これにより、実際に或るＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を行うことなく、そのＭＳn測定を実行した結果に基づく同定成否の推定確率が定量的に求まる。さらにＭＳn測定順位決定ステップでは、プリカーサイオン候補となる複数のＭＳn-1ピークについて上述したようにそれぞれ推定された同定確率推定値を用いて、該複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の優先順位を決定する。
【００２１】
例えば、１つの分画試料に対してプリカーサイオン候補として抽出されるＭＳn-1ピークの個数が１つの分画試料に対して実施されるＭＳn測定実行回数を超えている場合には、上記優先順位に従って順に所定個数のプリカーサイオン候補に対してＭＳn測定を実行すればよい。この場合、優先順位の低い１乃至複数個のプリカーサイオン候補についてはＭＳn測定が実行されない。
【００２２】
１つの分画試料に対して実施が許可されるＭＳn測定実行回数が１つの分画試料に対してプリカーサイオン候補として抽出されるＭＳn-1ピークの個数を超えている場合には、１つのＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を複数回実行し、その各ＭＳn測定で得られたＭＳnスペクトルデータを積算することが可能である。ＭＳnスペクトルデータ積算によって積算前に比べてＭＳnスペクトルのＳＮ比が向上し、それによって同定確率の改善が期待できる。その同定確率の改善の程度は元の同定確率が高いほど大きいとは限らない。即ち、ＭＳn-1ピークに対する２回目又は３回目（或いはそれ以上の回数）のＭＳn測定を実行する場合にそのときの優先順位は、同定確率推定値ではなく同定確率の改善の程度に基づいて決められることが好ましい。
【００２３】
そこで、第１発明に係る物質同定方法では、好ましくは、
前記プリカーサイオン候補となる複数のＭＳn-1ピークについて前記同定確率推定ステップにおいてそれぞれ推定された同定確率推定値に基づいて、同一のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を複数回行ってその測定結果を積算したときの同定確率の増加度合である同定確率増分推定値を求める同定確率増分推定ステップをさらに有し、
前記ＭＳn測定順位決定ステップでは、前記同定確率推定ステップによる各ＭＳn-1ピークの同定確率推定値と、前記同定確率増分推定ステップによる同定確率増分推定値とに基づいて、同一ＭＳn-1ピークに対する複数回のＭＳn測定を許容する条件の下で複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の優先順位を決定するとよい。
また、第２発明に係る質量分析システムでも同様である。
【００２４】
さらにまた、上記物質同定方法では、１つの分画試料に対するＭＳn測定実行回数の上限の下で、前記ＭＳn測定順位決定ステップで決定された優先順位と各ＭＳn-1ピークのＳＮ比とに基づいて、複数のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定を実行するための測定シーケンスを決定するＭＳn測定シーケンス決定ステップを有するものとするとよい。
ここでいう測定シーケンスとは、同一のＭＳn-1ピークに対する複数回のＭＳn測定の実行を含めた同一分画試料に対する全てのＭＳn測定の手順のことである。
【００２５】
この発明によれば、１つの分画試料に対するＭＳn測定回数に拘わらず、同定される物質数の期待値が常に最大となるように測定シーケンスが定められる。これにより、同じ測定時間又は測定回数の下で最大限の数の物質の同定が可能となる。
【００２６】
また、第１発明に係る物質同定方法では、前記目的試料に対する測定に先立って前記所定の試料に対する測定を実行し、前記同定確率モデル構築ステップではその測定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成することが好ましい。同定確率モデル構築用の所定試料に対する測定を目的試料に対する測定の直前に実行することにより、例えばノイズ環境が殆ど同一である等、測定条件がほぼ揃う。それにより、所定試料について求めた同定確率推定モデルの適用精度が向上し、同定確率推定値自体の精度も向上して、より的確な優先順位を求めることが可能となる。
【００２７】
また、第１発明に係る物質同定方法では、分画試料に対するＭＳn測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出ステップ、前記同定確率推定ステップ、前記ＭＳn測定順位決定ステップ、及びＭＳn測定シーケンス決定ステップによる一連の処理により該分画試料に対するＭＳn測定の測定シーケンスを決定するとよい。この場合、１つの分画試料に対して決められた測定シーケンスに従って複数のＭＳn-1ピークのそれぞれをプリカーサイオンとしたＭＳn測定を実行すればよいので、ＭＳn測定の制御は簡単で済む。
【００２８】
また、第１発明に係る物質同定方法では、分画試料に対するＭＳn測定の実行に先立って、前記ピークＳＮ比算出ステップ、前記同定確率推定ステップ、前記ＭＳn測定順位決定ステップ、及びＭＳn測定シーケンス決定ステップによる一連の処理により該分画試料に対するＭＳn測定の測定シーケンスを決定するとともに、該測定シーケンスに従ってＭＳn測定を開始しその測定の途中段階で得られた同定結果を利用してその測定シーケンスを変更するようにしてもよい。
【００２９】
例えば、測定シーケンスに従って順次異なる又は同一のＭＳn-1ピークについてＭＳn測定を実行する途中で、ＭＳn測定結果に基づく同定ができない状態が続いたならば、その時点でその測定シーケンスに従ったＭＳn測定を中止し、次の分画試料に対するＭＳn測定及び同定処理に移行してもよい。これにより、同定確率推定モデルと実際の同定結果との乖離がある程度存在する場合に、無駄なＭＳn測定の実行をできるだけ少なくし、同定効率が下がることを回避することができる。
【発明の効果】
【００３０】
第１発明に係る物質同定方法及び第２発明に係る質量分析システムによれば、ＭＳn-1測定結果から複数のＭＳn-1ピークがプリカーサイオン候補として抽出された場合に、そのＭＳn測定や同定処理を行う前に、同定される物質数の期待値が最大になるようにプリカーサイオンを選択したり、異なる又は同一のＭＳn-1ピークに対するＭＳn測定の順序を定めたりすることができる。それにより、例えば、従来と同程度の数の物質の同定を成功させるのに要する測定時間を短縮する又は測定回数を減らすことができる。また、従来と同じ測定時間や測定回数であれば、それだけ多くの物質を同定することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る物質同定方法を実施する質量分析システムの概略ブロック構成図。
【図２】本発明に係る物質同定方法における同定確率推定モデル構築の際の処理フローチャート。
【図３】本発明に係る物質同定方法において同定確率推定モデルに基づくＭＳ2測定シーケンス最適化処理のフローチャート。
【図４】ノイズレベル評価処理を説明するためのＭＳ1プロファイル（マススペクトル）の一例を示す図。
【図５】２つのＭＳ1プロファイルに対するノイズレベル算出結果例を示す図。
【図６】質量電荷比m/zとＳＮ比とに対するＭＳ1ピークの分布状況の一例を示す図。
【図７】ＭＳ1ピークをＳＮ比で順位付けしたときの、同定に成功したＭＳ1ピークの経験累積分布関数の概念を示す模式図。
【図８】同定に成功したＭＳ1ピークの経験累積分布関数、該分布関数に対するフィッティング関数、及び該フィッティング関数に基づく同定確率推定値の変化を示す図。
【図９】通常のデータ積算回数（１回）における同定確率の推定値とＭＳ1ピークのＳＮ比との関係、並びに２及び３倍のデータ積算時の同定確率増分推定値とＭＳ1ピークのＳＮ比との関係を示す図。
【図１０】ＳＮ比が相違する５個のＭＳn-1ピークに対する同定確率推定値並びに２及び３倍のデータ積算による同定確率増分推定値を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明に係る物質同定方法の一実施例、及び該方法による物質同定を実施するための質量分析システムの一実施例について、添付の図面を参照して詳細に説明する。
【００３３】
本発明に係る物質同定方法は、目的試料からＬＣ等により分離・分画されることで得られた多数の分画試料に対し、それぞれＭＳn-1測定を実行して得られるＭＳn-1スペクトル上に現れる１又は複数のＭＳn-1ピークをプリカーサイオンに選出して該プリカーサイオンに対するＭＳn測定を行い、それにより得られるＭＳnスペクトルを利用して目的試料に含まれる各種物質を同定する質量分析システム（又は化合物同定システム）において、実際にＭＳn測定を実行する前に、ＭＳn-1スペクトル上のＭＳ1ピークについて物質の同定が成功する確率を定量的に推定し、それに基づいてＭＳnピークの選択の順序等を含むＭＳn測定シーケンスを最適化又はそれに近い状態とするための処理に特徴を有する。
【００３４】
まず、本発明におけるＭＳn測定シーケンス最適化方法を１つの具体例を挙げて説明する。
この例による方法では、予備的に、つまり同定対象である目的試料の測定及び同定処理に先立って、多くの物質を含む同定確率推定モデル構築用試料（以下、単に「モデル構築用試料」という）に対する測定及び同定処理の結果を利用して、同定確率推定モデルを作成しておく。この同定確率推定モデルは、ＭＳ2測定及び同定実行前のＭＳ1ピークをプリカーサイオンとしてＭＳ2測定及び同定処理を実行したと仮定したときに同定が成功する確率を推測するための参照データである。モデル構築用試料は目的試料と同種、例えば目的試料がペプチド混合物である場合にはモデル構築用試料もペプチド混合物であることが好ましい。
【００３５】
図２は同定確率推定モデル構築処理の手順を示すフローチャートである。図２により同定確率推定モデルを作成する手順を詳細に説明する。
【００３６】
［ステップＳ１１］同定確率推定モデル構築用データの収集
まず、モデル構築用試料をＬＣで分離して、所定の分画時間毎に分取された多数の分画試料を調製する。そして、各分画試料に対しＭＳ1測定が実施され、ＭＳ1スペクトルデータが収集される。さらに、このＭＳ1スペクトルデータに基づいて抽出される各ＭＳ1ピークに対して、１回のＣＩＤ操作を加えたＭＳ2測定が実施されてＭＳ2スペクトルデータが収集され、そのＭＳ2スペクトルデータを用いた同定処理が試みられる。
【００３７】
上述したように保持時間に応じて分画された各分画試料に含まれる物質を同定する場合には、各分画試料のＭＳ1スペクトルを保持時間の順に並べて３次元的なＭＳ1スペクトルを求める。そして、該３次元ＭＳ1スペクトルに対して質量電荷比m/z−保持時間の２次元平面上でピーク検出を行ってＭＳ1ピークを抽出し、該ＭＳ1ピークの質量電荷比をプリカーサイオンとしてＭＳ2測定を行いＭＳ2スペクトルを取得する。そして、そのＭＳ2スペクトルに基づいて所定の同定アルゴリズム（例えばデノボシーケンスサーチやＭＳ／ＭＳイオンサーチなど）により物質の同定を試みる。この同定はＭＳ1ピーク毎に行われるから、３次元ＭＳ1スペクトルから抽出されるＭＳ1ピーク毎に同定の成功又は失敗（同定できず）が決まる。
【００３８】
［ステップＳ１２］ＭＳ1スペクトルのノイズレベルの評価
後述する同定確率はＭＳ1スペクトルのノイズレベルの影響を受ける。そこで、モデル構築用試料に対するＭＳ1スペクトルのノイズレベルを評価する。本例では、次のステップＳ１２１〜Ｓ１２３の手順により、 ＭＳ1測定により得られた生データ（加工されていないデータ）であるＭＳ1ロー（raw）プロファイル（以下、単に「ロープロファイル」という）からノイズレベルを分画試料毎に、つまりＭＳ1スペクトル毎に評価する。以下の説明では、離散化されたロープロファイルの信号強度をＲmとおく。ただし、ｍ＝０、１、…は、評価対象である試料のロープロファイルの、サンプリング点における質量電荷比の順序を示す番号である。ロープロファイルに含まれるサンプリング点全体の集合はＭで表すものとする。
【００３９】
［ステップＳ１２１］ピーク部分及びピーク近傍の情報の除外
ロープロファイルの最大ピーク強度をＰ(max)とおく。つまり、次の(1)式のようにおく。
Ｐ(max)＝ max Ｒm      …(1)
（ただしｍ∈Ｍ）
ここで、ピーク近傍の判定用閾値μ（０＜μ＜１）を適宜に選び、信号強度が最大ピーク強度Ｐ(max)のμ倍以上であるサンプリング点をピーク部分であるとみなす。そして、ピーク部分に含まれるサンプリング点、つまり信号強度がμ・Ｐ(max)以上であるサンプリング点からの距離がｗ以内であるサンプリング点、を除いたサンプリング点の集合Ｍ’(ｗ，μ)を求める。図４（ａ）はm/z 1060-m/z 1080の範囲についてＭＳ1スペクトルのロープロファイルに対しサンプリング点集合Ｍ’(ｗ，μ)を求めた例であり、図４（ｂ）は（ａ）のm/z 1070-m/z 1075の範囲の拡大図である。
【００４０】
［ステップＳ１２２］局所的な信号変動量の算定
次に、上記ピーク部分とピーク近傍とを除外したサンプリング点集合Ｍ’(ｗ，μ)において、通過帯域が半値幅ｗであるフィルタによりロープロファイルを平滑化した、平滑化プロファイル*Ｒm(ｗ，μ)を求める。つまり、*Ｒm(ｗ，μ)は次の(2)式で求まる。
*Ｒm(ｗ，μ)＝｛１／（２ｗ＋１）｝ΣＲm'      …(2)
（ただしｍ∈Ｍ’(ｗ，μ)）
ここで、Σはｍ’＝−ｗからｗまでの総和である。この平滑化プロファイル*Ｒm(ｗ，μ)と元のロープロファイルとの差を局所的な信号変動量と定義し、ΔＲm(ｗ，μ)で表す。つまり、ΔＲm(ｗ，μ)は次の(3)式で求まる。
ΔＲm(ｗ，μ)＝Ｒm−*Ｒm(ｗ，μ)      …(3)
【００４１】
［ステップＳ１２３］局所的な信号変動量に基づくノイズレベルの算定
ここでは、上記局所的な信号変動量ΔＲm(ｗ，μ)の２乗平均のｃ倍をノイズレベルＮ(Ｒm；ｗ，μ)と定義する。ｃはノイズレベルを定義するための適当な定数である。つまり、Ｎ(Ｒm；ｗ，μ)の定義式は次の(4)式である。
Ｎ(Ｒm；ｗ，μ) ＝ｃ・√｛ΣΔＲm(ｗ，μ)2｝      …(4)
なお、ノイズレベルの定義は上記説明のものに限定されるわけではなく、ＭＳ1スペクトルのノイズレベルを適切に定義できる方法でありさえすればよい。
実際の２つのＭＳ1ロープロファイルに基づいて、上記方法によりノイズレベルＮ(Ｒm；ｗ，μ)を算定した結果の例を図５に示す。
【００４２】
［ステップＳ１３］同定成功ＭＳ1ピークの抽出
図６は、モデル構築用試料由来の全てのＭＳ1ピークの質量電荷比m/zとＳＮ比とをプロットした結果の例である。ここで、ＳＮ比はピーク強度とステップＳ１２で求めたノイズレベルとの比である。図６に□印で示したプロット点はＭＳ1ピークを示している。また、●印で示したプロット点は、そのＭＳ1ピークをプリカーサイオンとしたＭＳ2測定によって物質同定が可能であった、即ち、同定に成功したＭＳ1ピークを示している。図６を見ると、この例では、ＳＮ比が大きいほど同定に成功するＭＳ1ピークの割合が大きくなる傾向にあることが分かる。これは本例に限らず、一般的な傾向である。
【００４３】
［ステップＳ１４］ＭＳ1ピークのＳＮ比と同定成功ＭＳ1ピーク累積数との関係付け
ＳＮ比の大きい順にＭＳ1ピークを抽出して「１」から順位付けし（つまりＭＳ1ピークをＳＮ比が大きい順にソートして順位を付け）、その順位毎にそれまでに同定に成功したＭＳ1ピークの数（累積数）を求めると、図７に示すように、累積数が右上がりの階段状に変化するグラフが描ける。図７中の実線で示す階段状の折れ線は、例えば、順位１のＳＮ比を示すＭＳ1ピークは同定に成功し、順位１よりも低いＳＮ比である順位３のＳＮ比を示すＭＳ1ピークは同定に失敗したことを意味している。この折れ線は、或るＳＮ比以上を示すＭＳ1ピークのうち幾つのＭＳ1ピークが同定に成功したのかを示す経験累積分布関数である。
【００４４】
ただし、図６から分かるように、この例では、同一の質量電荷比に対する複数のＭＳ1ピーク（ＳＮ比は同一とは限らない）に対してそれぞれ個別に同定が行われている。そのため、質量電荷比の重なりが多いと、同定の成否に対する質量電荷比の重なりの影響が相対的に強くなり過ぎるおそれがある。そこで、これを避けるために、同一の質量電荷比であるＭＳ1ピークＮ個（Ｎは２以上の整数）に対してそれぞれ同定がなされた場合には、個々の同定は１／Ｎ回であるとみなして経験累積分布関数を求めるほうが好ましい。図７に示した例では、順位１、２、４、５、及び８において同定に成功した場合を表しているが、図７中の実線は質量電荷比の重複を考慮しない経験累積分布関数である。ここで、順位２及び８に含まれる同定に成功した複数のＭＳ1ピークが同一質量電荷比を有していた場合には、重複を考慮してその順位２、８のＭＳ1ピークをそれぞれ１／２とカウントして、経験累積分布関数を図７中に一点鎖線で示すように修正する。
【００４５】
図６に示したＭＳ1ピークの同定成否分布の例について、上述したように質量電荷比の重複を考慮した経験累積分布関数を求めると、図８中に示すような階段状のプロファイルが得られる。順位が大きくなるほど、つまりはＭＳ1ピークのＳＮ比が下がるほど、同定に成功するＭＳ1ピークの数は減るため、同定成功累積数は頭打ちになることが分かる。
【００４６】
［ステップＳ１５］同定確率推定モデルとパラメータの算出
ステップＳ１４で得られた階段状のプロファイルに対し解析的な関数を用いてフィッティングを行うことにより、ＳＮ比に従ったＭＳ1ピークの累積数と同定成功累積数との滑らかなカーブ状の関係を求める。ここでは、フィッティング関数の形状として、次の(5)式の双曲線関数を用いた。
Ｎ(ident)tanh（ｎ／Ｎ(all)σ）      …(5)
ただし、ｎは或る順位よりも上位順位であるＭＳ1ピークの総数であり、Ｎ(all)及びＮ(ident)はそれぞれＭＳ1ピークの総数及び同定に成功したＭＳ1ピークの総数である。また、σはフィッティング関数の立ち上がりの速さを定めるパラメータであり、先に求めた階段状のプロファイルにフィットするように算出する。図８中に階段状のプロファイルにフィットさせたフィッティング関数を一点鎖線で示している。このフィッティング関数のカーブが同定確率推定モデルであり、σはこのモデルを規定するパラメータである。
【００４７】
なお、(5)式のフィッティング関数の傾きが１であるということは１００％、その傾きが０．５であるということは５０％の確率で以て同定に成功することを示している。したがって、フィッティング関数の微分である次の(6)式により、或るＭＳ1ピークに対し、その順位値ｎから同定に成功する確率を推定することができる。
（Ｎ(ident)／Ｎ(all)σ）sech2（ｎ／Ｎ(all)σ）      …(6)
図８には上記微分関数で示される推定同定確率も重ねて示してある。
【００４８】
以上のような手順で、同定確率推定モデルを定めるパラメータσを算出することができるから、同定確率を推定するためにはこのパラメータσを記憶しておけばよい（ステップＳ１６）。
【００４９】
次に、上記のような同定確率推定モデルのパラメータが予め用意されている状況の下で、目的試料をＬＣで分離し分取することで得られた分画試料をＭＳ1測定して求まるＭＳ1スペクトルに基づいて、プリカーサイオンとして適切なＭＳ1ピークを選択するとともに最適なＭＳ2測定のための測定シーケンスを決定する際の処理手順を、図３に示すフローチャートに従って説明する。
【００５０】
［ステップＳ２１］目的試料由来のＭＳ1測定データの収集
まず、目的試料から調製された多数の分画試料に対してそれぞれＭＳ1測定が実行され、ＭＳ1スペクトルデータが収集される。そして、各分画試料のＭＳ1スペクトルを保持時間の順に並べて３次元的なＭＳ1スペクトルを求め、該３次元ＭＳ1スペクトルに対して質量電荷比m/z−保持時間の２次元平面上でピーク検出を行ってＭＳ1ピークを抽出する。これは試料の相違はあるものの、基本的にはステップＳ１１と同じ処理である。
【００５１】
［ステップＳ２２］ＭＳ1スペクトルのノイズレベルの評価
次に、ステップＳ１２（Ｓ１２１〜Ｓ１２３）と同様の処理を行うことで、各分画試料に対するＭＳ1スペクトルのノイズレベルをそれぞれ評価する。
【００５２】
［ステップＳ２３］ＭＳ1ピークのＳＮ比の算出
ステップＳ２１で抽出されたＭＳ1ピーク毎に、そのピーク強度と該ピークが存在する分画試料に対してステップＳ２２で算出されたノイズレベルとからＳＮ比を算出する。
【００５３】
［ステップＳ２４］同定確率推定モデルに基づくＳＮ比からの同定確率の推定
上述したようにパラメータσに基づいて同定確率推定モデル、つまりは図８に示したフィッティング関数が求まる。そして、このフィッティング関数の横軸を各順位に対応するＳＮ比に変換すれば、与えられたＳＮ比に対応する同定確率推定値ｐ1（ｒ(1)）が求まるカーブが得られる。ここで ｒ(1)はＭＳ1ピークのＳＮ比である。各順位をＳＮ比に変換するためには、例えば、ＭＳ1ピークをＳＮ比に応じてソートする際に得られる順位とＳＮ比との関係を示す情報をテーブル等の形式で保持しておき、このテーブルを用いればよい。図９には、図８に示したフィッティング関数から求めた同定確率推定値ｐ1（ｒ(1)）のカーブを示す。このカーブを用いて、ＭＳ1ピーク毎にそのＳＮ比から同定確率推定値を算出する。なお、この同定確率推定値ｐ1（ｒ(1)）のカーブが滑らかでないのは、同定確率推定モデル作成に使用したＭＳ1ピークのＳＮ比が規則的なものでないからである。
【００５４】
［ステップＳ２５］データ積算回数を増加させたときの同定確率増分の推定
ステップＳ２４で得られる同定確率推定値ｐ1（ｒ(1)）は、通常の、つまりは同定確率推定モデル作成に用いたＭＳ2スペクトルデータと同条件のデータ積算回数で求めたＭＳ2スペクトルデータを用いた場合の同定確率である。即ち、同定確率推定モデル作成時にはＭＳ2スペクトルデータの積算を行っていないから、１回のＭＳ2測定により得られたデータである。それに対し、同じプリカーサイオンに対してＭＳ2測定をｕ回実行して、それら測定で得られたデータを積算すると、つまりデータ積算回数をｕ倍にすると、ＭＳ2スペクトルのＳＮ比は√ｕ倍になり、同定確率が向上することが期待される。このときの同定確率はＭＳ1ピークのＳＮ比が√ｕ倍になった場合の同定確率にほぼ等しいと考えられる。すると、同じＭＳ1ピークに対してＭＳ2スペクトルデータ積算回数を２倍（ｕ＝２）及び３倍（ｕ＝３）にした際の同定確率は、それぞれｐ1（√２ｒ(1)）、ｐ1（√３ｒ(1)） と表される。したがって、２回目、３回目のＭＳ2スペクトルデータ積算による同定確率の増分推定値はそれぞれ、(7)、(8)式に示すようになる。
ｐ2（ｒ(1)）＝ｐ1（√２ｒ(1)）−ｐ1（ｒ(1)）         …(7)
ｐ3（ｒ(1)）＝ｐ1（√３ｒ(1)）−ｐ1（√２ｒ(1)）     …(8)
この同定確率増分推定値ｐ2（ｒ(1)）及びｐ3（ｒ(1)）を示すカーブを図９に示す。
【００５５】
［ステップＳ２６］各ＭＳ1ピークに対するＭＳ2測定の優先順位の決定
ステップＳ２４において得られた通常のＭＳ2スペクトルデータ積算（この例では積算なし）における各ＭＳ1ピークに対する同定確率推定値と、ステップＳ２５で得られた２回目及び３回目のＭＳ2スペクトルデータ積算における各ＭＳ1ピークに対する同定確率増分推定値とを用いて、ＭＳ2測定を実行する上でプリカーサイオンとして選択するＭＳ1ピークの優先順位を決定する。
【００５６】
いま一例として、或る１つの分画試料に対するＭＳ1スペクトル上で、ＰA、ＰB、ＰC、ＰD、ＰEの５個のＭＳ1ピークがプリカーサイオン候補として抽出され、それらＭＳ1ピークのＳＮ比が図１０中に示す位置にある場合を考える。なお、図１０（ａ）は図９と同じグラフであり、図１０（ｂ）は図１０（ａ）に示した各曲線をスムージングして得られたグラフである。ここでは、図１０（ｂ）を用いてＭＳn測定の優先順位を決定するが、図１０（ａ）を用いてもよい。
【００５７】
図１０（ｂ）において、各ＭＳ1ピークＰA、ＰB、ＰC、ＰD、ＰEに対応して引かれた縦の破線とｐ1（ｒ(1)）、ｐ2（ｒ(1)）、ｐ3（ｒ(1)）の各曲線との交点が、それらＭＳ1ピークにおける同定確率推定値及び同定確率増分推定値である。そこで、同定に成功する確率が高い順に、つまりは図中に白抜き下向き矢印で示す順で、各ＭＳ1ピークの同定確率推定値又は同定確率増分推定値を抽出してゆき、それを、各ＭＳ1ピークをプリカーサイオンとしたＭＳ2測定の優先順位とする。ただし、或る１つのＭＳ1ピークについて同定確率増分推定値は２回目以降のＭＳ2測定にしか適用されないから、同定確率増分推定値が同定確率推定値を上回ってもその同定確率推定値が抽出された後に初めて同定確率増分推定値が抽出されることになる。
【００５８】
図１０（ｂ）の例では、同定に成功する確率が高い順に、まず、ｐ1（ｒ(1)）の曲線上で４個のＭＳ1ピーク、ＰA→ＰB→ＰC→ＰDが順に抽出される。なお、図１０（ｂ）においてｐ1（ｒ(1)）の曲線上で抽出された点（上記交点）は○印で示している。さらに同定確率が下がる方向に進むと、ｐ1（ｒ(1)）の曲線上のＰEに対応した同定確率推定値よりもｐ2（ｒ(1)）の曲線上のＰDに対応した同定確率増分推定値のほうが値が大きい。これは、ＭＳ1ピークＰEをプリカーサイオンとした１回目のＭＳ2測定を実行するよりも、ＭＳ1ピークＰDをプリカーサイオンとした２回目のＭＳ2測定を実行してＭＳ2スペクトルデータ積算を行ったほうが同定確率が高まることを意味している。そこで、ｐ2（ｒ(1)）の曲線上で１つのＭＳ1ピークＰDを抽出し、引き続いて、同じ理由でｐ2（ｒ(1)）の曲線上で２つのＭＳ1ピーク、ＰC→ＰBを順に抽出する。なお、図１０（ｂ）においてｐ2（ｒ(1)）の曲線上で抽出された点（上記交点）は□印で示している。
【００５９】
さらに同定確率が下がる方向に進むと、ｐ1（ｒ(1)）の曲線上のＰEに対応した同定確率推定値よりもｐ3（ｒ(1)）の曲線上のＰDに対応した同定確率増分推定値のほうが値が大きい。これは、ＭＳ1ピークＰEをプリカーサイオンとした１回目のＭＳ2測定を実行するよりも、ＭＳ1ピークＰDをプリカーサイオンとした３回目のＭＳ2測定を実行してＭＳ2スペクトルデータ積算を行ったほうが同定確率が高まることを意味している。そこで、ｐ3（ｒ(1)）の曲線上で１つのＭＳ1ピークＰDを抽出し、引き続いて、同じ理由でｐ3（ｒ(1)）の曲線上で２つのＭＳ1ピーク、ＰC→ＰBを順に抽出する。なお、図１０（ｂ）においてｐ3（ｒ(1)）の曲線上で抽出された点（交点）は△印で示している。
【００６０】
さらに同定確率が下がる方向に進むと、ｐ1（ｒ(1)）の曲線上のＭＳ1ピークＰEに対応した同定確率推定値が最も高いから、ここで初めてｐ1（ｒ(1)）の曲線上のＭＳ1ピークＰEを抽出する。引き続いて、ｐ2（ｒ(1)）の曲線上のＭＳ1ピークＰEに対応した同定確率推定値よりも高い同定確率を示す、ｐ1（ｒ(1)）の曲線上のＭＳ1ピークＰEを抽出し、同様の理由で次に、ｐ3（ｒ(1)）の曲線上のＭＳ1ピークＰEを抽出する。
【００６１】
即ち、図１０（ｂ）の同定確率推定値及び同定確率増分推定値に従ったＭＳ2測定の優先順位は次のようになる。
（ｉ）ＰA→ＰB→ＰC→ＰDの順に１回目のＭＳ2測定を実行。
（ii）ＰD→ＰC→ＰBの順に２回目のＭＳ2測定を実行し、得られたＭＳ2スペクトルデータを積算。
（iii）ＰD→ＰC→ＰBの順に３回目のＭＳ2測定を実行し、得られたＭＳ2スペクトルデータを積算。
（iv）ＰEに対するＭＳ2測定を実行。
（ｖ）ＰEに対する２回目のＭＳ2測定を実行し、得られたＭＳ2スペクトルデータを積算。
（vi）ＰEに対する３回目のＭＳ2測定を実行し、得られたＭＳ2スペクトルデータを積算。
以上のように、プリカーサイオン候補である複数のＭＳ1ピークのＳＮ比と、同定確率推定モデルに基づく、ＳＮ比と同定確率推定値及び同定確率増分推定値との関係を示す曲線とを用いて、各ＭＳ1ピークを対象とするＭＳ2測定の優先順位を決定することができる。
【００６２】
［ステップＳ２７］ＭＳ2測定シーケンスの最適化
ステップＳ２６ではＭＳ2測定の優先順位が決定されるが、常に、その優先順位に従って全てのＭＳ2測定を実行可能であるというわけではない。何故なら、一般に、１つの分画試料から得られたＭＳ1スペクトル上でプリカーサイオンとして抽出されるＭＳ1ピークの数は不定であるのに対し、測定時間や同定のためのデータ処理時間或いは測定回数などに制約があるのが一般的であるからである。そこで、１つの分画試料に対するＭＳ2測定回数の条件を与えることにより、複数のプリカーサイオンに対するＭＳ2測定の順序を規定するＭＳ2測定シーケンスの最適化を行う。ここでいう、最適なＭＳ2測定シーケンスとは、与えられたＭＳ2測定回数の制約の下で、同定される物質（この例ではペプチド）の総数の期待値が最大になるような測定シーケンスである。上述した、ＰA、ＰB、ＰC、ＰD、ＰEの５個のＭＳ1ピークがプリカーサイオン候補として存在する場合について例示する。
【００６３】
いま１つの分画試料に対して延べ９回のＭＳ2測定が可能であるとする。即ち、ＭＳ2測定回数の制約が９である。ステップＳ２６で定められた優先順位に従えば、（ｉ）〜（iii）のＭＳ2測定の実行が可能である。そこで、ＭＳ1ピークＰAに対しては１回のみのＭＳ2測定を行ってＭＳ2スペクトルデータ積算なしとし、ＭＳ1ピークＰBに対しては２回のＭＳ2測定を行って得られたＭＳ2スペクトルデータを積算（２倍積算）し、ＭＳ1ピークＰC、ＰDに対しては各３回のＭＳ2測定を行って得られたＭＳ2スペクトルデータをそれぞれ積算（３倍積算）するのが、最適なＭＳ2測定シーケンスである。ただし、例えばＭＡＬＤＩ等のイオン源では、同一の分画試料に対して繰り返しＭＳ2測定を行うとサンプルが劣化して信号強度が下がる傾向にあるため、ＳＮ比が相対的に小さいＭＳ1ピークに対して優先的にＭＳ2測定を実行することが好ましい。このようなサンプル劣化を考慮した９回のＭＳ2測定の順序、つまり測定シーケンスは、ＭＳ1ピークＰDに対して３回のＭＳ2測定→ＭＳ1ピークＰCに対して３回のＭＳ2測定→ＭＳ1ピークＰBに対して２回のＭＳ2測定→ＭＳ1ピークＰAに対して１回のみのＭＳ2測定、となる。
【００６４】
他の例として、１つの分画試料に対して延べ１２回のＭＳ2測定が可能である場合を考える。即ち、ＭＳ2測定回数の制約が１２である。上記優先順位に従えば、（ｉ）〜（ｖ）までのＭＳ2測定が可能である。そこで、ＭＳ1ピークＰAに対しては１回のみのＭＳ2測定を行ってＭＳ2スペクトルデータ積算なしとし、ＭＳ1ピークＰEに対しては２回のＭＳ2測定を行って得られたＭＳ2スペクトルデータを積算（２倍積算）し、ＭＳ1ピークＰB、ＰC、ＰDに対しては各３回のＭＳ2測定を行って得られたＭＳ2スペクトルデータをそれぞれ積算（３倍積算）するのが、最適なＭＳ2測定シーケンスである。また、サンプル劣化を考慮した１２回のＭＳ2測定の順序、つまり測定シーケンスは、ＭＳ1ピークＰEに対して２回のＭＳ2測定→ＭＳ1ピークＰDに対して３回のＭＳ2測定→ＭＳ1ピークＰCに対して３回のＭＳ2測定→ＭＳ1ピークＰBに対して３回のＭＳ2測定→ＭＳ1ピークＰAに対して１回のみのＭＳ2測定、となる。
【００６５】
即ち、ＭＳ2測定シーケンス最適化のための定性的な基準は次のとおりである。
（１）ＳＮ比が大きいＭＳ1ピークに対しては１回のみのＭＳ2測定を行い、図１０中のｐ2（ｒ(1)）の曲線のピーク付近にＳＮ比が位置するＭＳ1ピークは２回のＭＳ2測定による２倍積算を行い、ｐ3（ｒ(1)）の曲線のピーク付近にＳＮ比が位置するＭＳ1ピークは３回のＭＳ2測定による３倍積算を行うとよい。
（２）ＭＳ2測定実施可能延べ回数が少ないときには、ＭＳ2スペクトルデータ積算の不要な（つまり、ＳＮ比の大きな）ＭＳ1ピークをＭＳ2測定対象として選択する。ＭＳ2測定実施可能延べ回数が増えるに従い、最適なＭＳ2測定回数が２回又は３回である（つまりＳＮ比が相対的に小さい）ＭＳ1ピークについても選択する。
【００６６】
なお、上述した最適なＭＳ2測定シーケンスは、その分画試料に対するＭＳ2測定開始前に、つまりは実際にＭＳ2測定を全く行うことなく求められるものであり、あくまでも既知の同定確率推定モデルを参照して求められたものである。したがって、推定の確度は高いとはいえ、或る分画試料に対して求まった最適なＭＳ2測定シーケンスが絶対的に正しいとは限らない。そこで、或る分画試料に対するＭＳ2測定が途中まで進んだ段階で、それまでの該分画試料に対する同定結果を踏まえて、以降のＭＳ2測定の順序を改めて最適化するようにしてもよい。
【００６７】
以上のように、本発明に係る物質同定方法によれば、同定確率推定モデルのパラメータを目的試料の測定に先立って求めておくことにより、該同定確率推定モデルを利用した簡易な演算及び処理によって、同定される物質数が最大又はそれに近い状態となるように、複数のＭＳ1ピークをプリカーサイオンとしたＭＳ2測定の適切な順序及び測定回数を、実際のＭＳ2測定実行前に定めることができる。したがって、定められたＭＳ2測定シーケンスに従ってプリカーサイオンを選択しながらＭＳ2測定を実行し、その測定結果を利用して物質同定を実施することにより、きわめて効率的に物質同定を行うことができる。
【００６８】
次に、上記物質同定方法を実施するための質量分析システムの一実施例を図１により説明する。図１は本実施例による質量分析システムの概略構成図である。
図１において、分析部１は、液体試料中の各種物質を保持時間に応じて分離するＬＣ部１１と、ＬＣ部１１で分離された物質を含む試料を分取・分画してそれぞれ異なる分画試料を調製する分取分画部１２と、複数の分画試料のうちの１つを選択して該分画試料に対する質量分析を実行するＭＳ部１３と、を含む。図示しないが、ＭＳ部１３は、ＭＡＬＤＩイオン源、イオントラップ、及び飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）を含むＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳであり、ＭＳ1測定だけでなく、イオントラップにおいてプリカーサイオン選択と衝突誘起解離（ＣＩＤ）操作とを１乃至複数回繰り返した後にＴＯＦＭＳで質量分析を行うＭＳn測定が可能となっている。ただし、ＭＳ1測定及びＭＳ2測定のみを実行すればよい場合（ｎが３以上のＭＳn測定が不要である場合）には、イオントラップとＴＯＦＭＳとの組み合わせに代えて、三連四重極型質量分析計のような、より簡単な構成の質量分析装置を利用することができる。
【００６９】
制御部２は上記分析部１中の各部の動作をそれぞれ制御する。分析部１のＭＳ部１３で得られたデータはデータ処理部３に入力され、データ処理部３で処理されて例えばその結果が表示部４に出力される。データ処理部３は機能ブロックとして、ＭＳ1スペクトルデータやＭＳnスペクトルデータなどの測定データを収集するスペクトルデータ収集部３１、上記ステップＳ１２〜Ｓ１６に対応した処理を実行する同定確率推定モデル構築部３２、同定確率推定モデル構築部３２により得られたパラメータを記憶しておく同定確率推定パラメータ記憶部３３、上記ステップＳ２２〜Ｓ２４に対応した処理を実行する同定確率推定値算出部３４、上記ステップＳ２５に対応した処理を実行する同定確率増分算出部３５、上記ステップＳ２６に対応した処理を実行するＭＳn測定優先順位決定部３６、上記ステップＳ２７に対応した処理を実行するＭＳn測定シーケンス最適化部３７、及び所定のアルゴリズムに従って同定処理を実行する同定処理部３８、を含む。なお、データ処理部３や制御部２は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該パーソナルコンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを実行することにより、上記のような各機能ブロックが具現化される構成とすることができる。
【００７０】
目的試料に対する網羅的同定を実行するに先立って、制御部２の制御の下に分析部１は同定確率推定モデル構築用試料から得られる各分画試料に対するＭＳ1測定、ＭＳ2測定を実行する。同定処理部３８は、収集されたＭＳ1、ＭＳ2スペクトルデータに基づいて同定処理を実行し、同定確率推定モデル構築部３２はそれらスペクトルデータ及び同定結果に基づいて同定確率推定モデルを作成する。そして、この同定確率推定モデルを再現するパラメータが同定確率推定パラメータ記憶部３３に格納される。
【００７１】
目的試料に対する網羅的同定時には、制御部２の制御の下に分析部１は、まず、目的試料から得られる各分画試料に対するＭＳ1測定を実行し、スペクトルデータ収集部３１はＭＳ1スペクトルデータを収集する。同定確率推定値算出部３４は、各分画試料に対するＭＳ1スペクトルデータ毎に、同定確率推定パラメータ記憶部３３から読み出したパラメータに基づき再現した同定確率推定モデルを利用して、プリカーサイオン候補である複数のＭＳ1ピークの同定確率推定値を算出する。また、同定確率増分算出部３５は、同じ同定確率推定モデルを利用して、ＭＳ1ピークに対する２回目、３回目のＭＳ2測定を実行してデータ積算を行ったと仮定した場合の同定確率増分推定値を算出する。そして、ＭＳn測定優先順位決定部３６は、分画試料毎に、複数のＭＳ1ピークに対する同定確率推定値及び同定確率増分推定値からＭＳ2測定の優先順位を決定する。ＭＳn測定シーケンス最適化部３７は与えられたＭＳn測定回数条件やサンプル劣化の考慮有無などの付加的な条件に従って、同定される物質数が最大となるような最適なＭＳ2測定シーケンスを分画試料毎に求める。
【００７２】
上述したように分画試料毎に求まった最適なＭＳ2測定シーケンスは制御部２に送出され、制御部２はこのＭＳ2測定シーケンスに従って分析部１を制御することにより、目的試料から得られる各分画試料に対するＭＳ2測定を実行する。同定処理部３８は、先に収集された目的試料由来の各分画試料に対するＭＳ1スペクトルデータと、新たに収集された目的試料由来の各分画試料に対するＭＳ2スペクトルデータとに基づいて同定処理を実行し、目的試料中の物質の同定を実行する。その同定結果は表示部４の画面上に表示される。以上のようにして、本実施例の質量分析システムでは、限られた測定時間又は測定回数で、より多数の物質の同定に至ることができる。
【００７３】
以上説明した実施例の動作は、最適なＭＳ2測定シーケンスが求まったあとに該シーケンスに従って自動的にＭＳ2測定が実行されるようにしたものであるが、最適なＭＳn測定シーケンスを表示部４の画面上に一旦表示し、ユーザ（分析担当者）によるＭＳ2測定実行指示を受けて初めて目的試料に対するＭＳ2測定及び同定処理を実行するようにしてもよい。こうした構成とすれば、ユーザが自らの判断や経験に従ってＭＳ2測定シーケンスを適宜に手直ししてＭＳ2測定を実行させるようにすることができる。
【００７４】
なお、上記実施例では説明を簡単にするためにＭＳ1ピークの同定確率を推定しその結果からＭＳ2測定シーケンスを求める場合について説明したが、これを拡張してＭＳn-1ピークをプリカーサイオンとしたＭＳn測定を実行する前に、そのＭＳn-1ピーク毎の同定確率を推定し、その結果からＭＳn測定シーケンスを求めることが可能であることは明らかである。
【００７５】
また、上記実施例は本発明の一実施例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００７６】
１…分析部
１１…ＬＣ部
１２…分取分画部
１３…ＭＳ部
２…制御部
３…データ処理部
３１…スペクトルデータ収集部
３２…同定確率推定モデル構築部
３３…同定確率推定パラメータ記憶部
３４…同定確率推定値算出部
３５…同定確率増分算出部
３６…ＭＳn測定優先順位決定部
３７…ＭＳn測定シーケンス最適化部
３８…同定処理部
４…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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