(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における寄生虫性疾患を診断するためのリボソームタンパク質抽出物（ＲＰＥ）の使用であって、
当該ＲＰＥが、少なくとも２つのリボソームタンパク質、および／またはリボソームタンパク質の少なくとも２つの抗原、および／またはリボソームタンパク質の少なくとも２つのタンパク質断片を含み、
当該リボソームタンパク質抽出物が、対象において存在するときに寄生虫性疾患を引き起こすリーシュマニア種由来の寄生細胞を使用して以下の工程を行うことにより得られる、使用：
ａ．寄生細胞と溶解緩衝液とを混合すること、
ｂ．得られた混合物を遠心分離して細胞質抽出物を得ること、
ｃ．当該得られた細胞質抽出物からリボソームタンパク質抽出物を調製すること。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、当該タンパク質断片が、リボソームタンパク質に対応する少なくとも２、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む断片である使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用であって、当該リーシュマニア種がリーシュマニア・メジャーである使用。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の使用であって、当該寄生虫性疾患がリーシュマニア症またはマラリアである使用。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の使用であって、当該寄生虫性疾患がリーシュマニアまたはプラスモディウム種により引き起こされる使用。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の使用であって、当該寄生虫性疾患が、当該リボソームタンパク質抽出物を誘導する当該種とは異なる種により引き起こされる使用。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載のＲＰＥを使用して、対象における寄生虫性疾患を診断する方法であって、対象から得られた試料において、前記ＲＰＥから得られた抗原に対する免疫応答が存在するか否かを決定することを含む方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載のＲＰＥを含む、対象における寄生虫性疾患を診断するためのアッセイであって、前記アッセイは、対象から得られた試料を前記ＲＰＥと接触させ、続いて前記ＲＰＥから得られた抗原に対する免疫応答を測定する工程を含む、アッセイ。
【請求項９】
請求項８に記載のアッセイであって、当該アッセイがＥＬＩＳＡであるアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ＲＰＥを使用するリーシュマニア症などの寄生虫性疾患の診断に関する。
【０００２】
［発明の背景］
イヌの内臓リーシュマニア症（ＣＶＬ）は、地中海沿岸地方周辺の国々、中近東およびメキシコにおける重要な新生の動物原性感染症である（２０）。この重症疾患は、地中海地方、中東およびアジア諸国においては、リーシュマニア・インファンツム（Leishmania infantum）、中南米およびメキシコにおいてはＬ．チャガシ（L. chagasi）に起因する（２０、２１）。それらの遺伝子型の関係のために、異なる大陸において両種が引き起こすＣＶＬは同じものであると考えられる（２６）。
【０００３】
感染において、イヌは、異なる種類の疾患、無症候性、症状の乏しいまたは症候性の疾患を発現し得る（４）。症候性感染は死亡を齎し、その臨床徴候は、皮膚の変化、例えば、脱毛症、皮膚炎、爪鉤形症などを含み（３、１１）、また、内臓徴候は、腎臓、肝臓および脳の変化を有する（１８、２８）。ある感染したイヌは、無症候性を維持するか、僅かな軽度の徴候を発現し、症状の乏しいものに分類される（４）。感染したイヌが（例え無症候性のものであったとしても）ヒト感染のための主な家庭内の寄生生物の貯蔵体であることから、ＣＶＴは獣医学的な疾患と看做されるものであるだけではない（１）。従って、イヌからヒトへのリーシュマニアの感染を減少するために、できるだけ早期にイヌリーシュマニア症の診断することが必要である。
【０００４】
無症候性、症状の乏しい、および症候性の感染したイヌにおける抗リーシュマニア特異的抗体の存在（４、９、３４）は、免疫蛍光抗体試験（ＩＦＡＴ）、ウェスタンブロット、イムノクロマトグラフィ試験および酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む（２３に総説される）血清学的試験の開発を可能にしている。粗可溶性リーシュマニア抗原に基づくＥＬＩＳＡアッセイを使用するＣＶＬの診断は、高い感受性を有しているように見えているが、リーシュマニアと他の病原性原生動物との間の抗原性関連（１６）のために特異性が低い。ＣＶＬに対して特異的な血清診断試験を開発するための戦略として、異なる寄生生物抗原が組み換えタンパク質として得られている（５、１０、２４）。しかしながら、異なる寄生生物抗原に対する個々の感染したイヌの体液性応答において観察される高い変動性のために（１９、３１）、組み換えタンパク質に基づく有効な診断は、組み換えタンパク質の混合物または幾つかの非関連性の寄生生物抗原を含むキメラタンパク質の使用を必要とされる（６、３１、３６）。ＣＶＬの特異的診断はまた、ウェスタンブロットにより分析された粗寄生生物断片または寄生生物から精製された調製物を使用しても開発される（８、１７）。例えば、可溶性リーシュマニア抗原（ＳＬＡ）に基づくＥＬＩＳＡアッセイが既に開発されている（２７、３１）。しかしながら、このＳＬＡに基づくアッセイは、無症候性リーシュマニア症を診断するための十分な特異性がない。加えて、リーシュマニア症とは異なる他の寄生生物疾患を有する対象からの血清は、ＳＬＡに基づくアッセイにより偽陽性反応を生ずるであろう。
【０００５】
従って、現存の方法の全ての欠点を有しない、リーシュマニア症などの寄生虫性疾患の診断方法の改善が未だに必要である。
【０００６】
［発明の説明］
この研究において、我々は、ＲＰＥ、特に、リーシュマニアＲＰＥ（ＬＲＰＥ）がリーシュマニア症などの寄生虫性疾患の診断のために有利に使用できることと；この新規の診断方法が公知の診断方法、例えば、例において示すようなＳＬＡに基づく方法などに比べて、より特異的であることとを示す。この新規の方法は、リーシュマニア症の前症候性診断を可能にし、これは、イヌからヒトへのリーシュマニアの感染を防止または減少するために極めて重要である。
【０００７】
本発明は以下で更に説明される。
【０００８】
［使用］
第１の態様において、対象における寄生虫性疾患を診断するためのリボソームタンパク質抽出物の使用が提供される。
【０００９】
ここにおいて定義されるとき、リボソームタンパク質抽出物は、対象に存在する寄生虫性疾患を引き起こす寄生生物を使用して以下の工程を行うことにより得られる：
ａ．寄生細胞と溶解緩衝液とを混合物すること、
ｂ．得られた混合物を遠心分離し、細胞質抽出物を得ること、
ｃ．得られた細胞質抽出物からリボソームタンパク質抽出物を調製すること。
【００１０】
工程ａにおいて、寄生生物は、好ましくは原生動物を意味する。好ましくは寄生生物はここにおいて後述する。より好ましくは、原生動物は、プロマスティゴートの段階にある。当業者は、所望の量のＲＰＥを調製するために大凡必要とされる寄生細胞の量が分かるだろう。典型的に５００マイクログラムのＲＰＥを調製するためには、ある者は３．１０９寄生細胞を使用するだろう。溶解緩衝液は緩衝液であり、寄生細胞の少なくとも幾つかを破壊するだろう。少なくとも一部分は、好ましくは細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を意味する。好ましい溶解緩衝液は、非イオン界面活性剤を含む。好結果は、非イオン界面活性剤としてのノニデットＰ４０（Nonidet P 40 (NP40)）により得られた。しかしながら、他の非イオン界面活性剤が使用されてもよい。使用される好ましい溶解緩衝液は以下（緩衝液Ａ）の通りである：１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．５％のＮＰ４０（ロッシュ）、並びに好ましくはプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦ１ｍＭ、ロイペプチン８μｇ／ｍｌ、アプロチニン４μｇ／ｍｌおよびペンタチン８μｇ／ｍｌが追加される。寄生細胞の適切な量（緩衝液Ａの１ｍｌ当たり１０９細胞）が
典型的には、エッペンドルフピペットを使用してこの溶解緩衝液と穏やかに混合される。
【００１１】
工程ｂにおいて、少なくとも１つの工程の４℃での遠心分離が、工程ａで得られた当該混合物に適用される。通常、第１の遠心分離工程は、３０００ｇで２分間行われる。得られた上清は、好ましくは１３０００ｇで１５分間、４℃で１回または２回、再度の遠心分離される。
【００１２】
工程ｃにおいて、得られた上清は、（４５）に記載されるようなＲＰＥを調整するために使用される。即ち、得られた上清を９０,０００ｒｐｍで３０分間、４℃での高速遠心分離に供される。使用されるローターは、好ましくはベックマンＴＬ１００．３ローターである。得られたペレットは粗リボソームペレットであり、これは適切な緩衝液、例えば、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＡｃＮＨ４、１００ｍＭのＭｇＣＬ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）に再懸濁され、適切な緩衝液、例えば、緩衝液Ａ中での非連続性のスクロースのグラジエント（２０／４０％）を経て、９０，０００ｒｐｍ、４℃で遠心される。ここで再度、好ましいローターはＴＬ１００．３ローターである。得られたペレットはリボソームを含む。このペレットは、好ましくはＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解され、超音波処理され、−７０℃で貯蔵される。
【００１３】
リボソームタンパク質は、良好に保存されている細胞質タンパク質である。従って、ここで定義される通りＲＰＥは、何れの真核生物から調製されてもよく、それは植物または動物であってもよく、哺乳類、爬虫類、魚類、昆虫に由来してもよく、または何れかの他の染色体を有する有機体、例えば、原生動物などであってもよい。好ましくはＲＰＥは、疾患に密接な有機体、好ましくは系統樹において寄生虫性疾患を引き起こす有機体から得られる。従って、寄生虫性疾患の治療において使用されるべきＲＰＥの起源として特別に興味深いものは、原生動物、例えば、プラスモディウム(Plasmodium)など、特に、トリパノソーマ科のもの、更に詳しくはトリパノソーマの異なる種、リーシュマニアまたはトリパノソーマである。リーシュマニアの公知の種は２０を超え、亜族リーシュマニアの種および亜種ビアンニア（Viannia）含み、亜族リーシュマニアはＬ．メジャー（L. major）を含むコンプレックスＬ．メジャー、Ｌ．チャガシ（L. chagasi）、Ｌ．ドノバニ（L. donovani）およびＬ．インファンツム（L. infantum）を含むコンプレックスＬ．ドノバニ（L. Donovani）、Ｌ．アマゾネンシス（L. amazonensis）およびＬ．メキシカナ（L. mexicana）を含むコンプレックスＬ．メキシカナを含み、並びに亜種ビアンニア（Viannia）は、Ｌ．ブラジリエンシス（L. braziliensis）およびＬ．ペルビアナ（L. peruviana）を含むコンプレックスＬ．ブラジリエンシス、およびＬ．グヤネンシス（L. guyanensis）およびＬ．パナメンシス（L. panamensis）を含むコンプレックスＬ．グヤネンシスを含む。特定の興味のあるプラスモディウム種は、プラスモディウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum）およびプラスモディウム・ビバックス(Plasmodium vivax）である。好ましい実施形態において、ＲＰＥは、リーシュマニア種、好ましくはリーシュマニア・メジャーおよび／またはリーシュマニア・インファンツムから得られる。もう１つの好ましい実施形態において、ＲＰＥは、プラスモディウム種から得られる。当業者は、ＲＰＥが、ここにおいて記載されたような幾つかの異なる有機体からのＲＰＥを混合することにより調製されてもよいことを理解するであろう。ＲＰＥが大量の異なる抗原を含むことから、問題のタンパク質の使用に代わる本発明の診断方法におけるＲＰＥの使用は、非常に魅力的である。これらの抗原の各々は、対象における免疫応答の存在を強力に診断できる。更に、抗原Ａに対して応答し、Ｂに対しては応答しない患者およびその逆の患者もある。従って、ここにおいて使用されるとき、それが多くの数の異なる抗原を含むことから、ＲＰＥは、対象の広範な個体群に対して使用されることを目的とする。好ましい実施形態において、ＲＰＥは、少なくとも１つのリボソームタンパク質および／またはリボソームタンパク質の少なくとも１つの抗原および／またはリボソームタンパク質の少なくとも１つのタンパク質断片を含む。より好ましい実施形態において、ＲＰＥは、少なくとも２つのリボソームタンパク質および／またはリボソームタンパク質の少なくとも２つの抗原および／またはリボソームタンパク質の少なくとも２つのタンパク質断片を含む。ここで定義されるとき、タンパク質断片は、好ましくはリボソームタンパク質に対応する少なく���も２、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む断片である。実施形態において、ここで定義されるとき、ＲＰＥは、リーシュマニア・インファンツムの酸性リボソームタンパク質および／またはリーシュマニア・ブラジリエンシスからのリボソーム抗原ＬｂｅＦ４Ａを含まず、またはリーシュマニア・インファンツムの酸性リボソームタンパク質Ｐ０および／またはリーシュマニア・ブラジリエンシスからのリボソーム抗原ＬｂｅＦ４Ａからならない。もう１つの実施形態において、ここで定義されるとき、ＲＰＥは、ＥＰ８２４６９９に開示されるようなリーシュマニア・チャガシからの酸性リボソームタンパク質ＬｃＰｏを起源とするエピトープを含まず、またはＥＰ８２４６９９に開示されるようなリーシュマニア・チャガシからの酸性リボソームタンパク質ＬｃＰｏを起源とするエピトープからならない。更に好ましくは、ＲＰＥは、ＬｃＰｏのＣ末端に位置する１７アミノ酸、即ち、ＥＰ８２４６９９における配列番号２で示されるアミノ酸３０６〜３２２を含まず、またはＬｃＰｏのＣ末端に位置する１７アミノ酸、即ち、ＥＰ８２４６９９における配列番号２で示されるアミノ酸３０６〜３２２からならず、これはまた配列表の配列番号１としても記載される。
【００１４】
本発明の１つの利点は、広いスペクトルの寄生虫性疾患の特異的且つ早期の診断を達成することを可能にすることである。寄生虫性疾患の１つの例は、リーシュマニア症の症例である。好ましい実施形態において、寄生虫性疾患は、リーシュマニア症またはマラリアである。より好ましくは、寄生虫性疾患は、リーシュマニアまたはプラスモディウム種により引き起こされる。更に好ましい実施形態において、寄生虫性疾患は、ＲＰＥが由来する種とは異なる種により引き起こされる。特に、リーシュマニア属からの１つの種により引き起こされるリーシュマニア症が、もう１つのリーシュマニア種からのＲＰＥに基づく組成物を使用することにより診断されてもよい。１つの実施形態において、Ｌ．メジャーにより引き起こされるリーシュマニアは、Ｌ．インファンツムからのＲＰＥを含む組成物により成功裏に診断される。或いは、他の寄生虫性疾患、例えば、マラリアなどは、他の種のＲＰＥに基づく組成物、例えば、Ｌ．インファンツムのＲＰＥに基づく組成物により成功裏に診断されてよい。
【００１５】
本発明の事情において、対象は、ヒトまたは動物を意味する。本発明の範囲内に包含される動物は、哺乳類、好ましくはヒトまたはイヌを含む。原理上、何れの対象も本願発明を使用して診断できる。診断方法は、対象において必要である度ごとに適用されてよい。好ましくは、診断される対象は、寄生虫性疾患を引き起こす寄生生物に感染している危険性を有することが疑われる対象である。寄生生物に感染している危険性が疑われる対象は、流行地に在住であってもよく、または流行地に訪れたことがあってもよい。流行地は、アルジェリアからサウジアラビアまでの北アフリカ、スーダン、エチオピアを含む。それは更に、南欧：地中海諸国、スペイン、フランス、ギリシャなどを含む。またそれは、中央（全国）および南アメリカ：ブラジル、ベネズエラ、ペルー、ボリビア、コロンビア、アルゼンチンの北部、パラグアイ、ウルグアイ、中央から南西アジア：インド、イラン、イラク、モンゴル、ネパール、バングラディッシュを含む。
【００１６】
本発明の事情において、ここで定義されるとき、使用は、好ましくはインビトロまたはエキソビボでの使用である。好ましくは、前記使用が、対象からの試料において行われることを意味する。好ましい試料は、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液または尿を含む。より好ましくは、試料は、対象から得られた血液または血清試料である。
【００１７】
好ましい実施形態において、診断は、寄生虫性疾患の症状の出現以前に行われ、所謂、前症候性診断または無症候性対象の診断である。この文脈において、「全症候性」は好ましくは、最初の症状の出現の前の少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日または３０日以上を意味する。寄生虫性疾患、例えば、リーシュマニア症などに関連する最初の症状または最初の臨床的徴候は、以下の一覧から選択されてよい：発熱、脾腫、肝腫脹、リンパ節腫脹、結膜炎、皮膚炎、爪鉤形症、角結膜炎、感情鈍麻および悪液質。それらの大部分は、単純に身体外部診察により検出できる。結膜炎、皮膚炎、爪鉤形症、角結膜炎のそれぞれは、皮膚性変化の形態である。
【００１８】
好ましくは、リーシュマニア症に関連する最初の症状は、リンパ節腫脹である。それは、触診などの身体外部診察により検出できる。
【００１９】
もう１つの好ましい実施形態において、診断は、寄生虫性疾患の幾つかの症状が出現する以前に行われ、所謂、症状の乏しい対象の診断である。この文脈において、「症状の乏しい」は、好ましくは、上述において明確にされたような症状の最大限３つを有する対象を意味する。
【００２０】
もう１つの好ましい実施形態において、診断は、寄生虫性疾患の前症状の発現の以前に行われ、所謂、症候性対象の診断である。この文脈において、「症候性」は、上述において明確にされたような症状を少なくとも３つ有する対象を意味し、上述で明確にされた皮膚性の変化の形態を含む。
【００２１】
それが疾患の拡大を防止することを助け、そのような段階で診断されれば、無症候性対象が、より効果的に助かり、治療されることから、当業者は、最も重要な種類の診断が無症候性対象の診断であることを理解するであろう。
【００２２】
［方法］
第２の態様において、対象においてＲＰＥを使用して寄生虫性疾患を診断するための方法を提供し、当該方法は、対象から得られた試料においてＲＰＥを認識する抗体が存在するか否かを決定することを含む。本発明の好ましい方法は、本発明の好ましい使用に関する場合と同様に、好ましくはインビトロまたはエキソビボにおいて行われる。定義は、より早期にここにおいて示されている。
【００２３】
好ましい方法において、ＲＰＥは組成物中に存在する。ＲＰＥは、より早期にここにおいて定義されている。好ましい実施形態において、もう１つの化合物が前記組成物中に存在する。
【００２４】
或いは、他の化合物は前記組成物中に存在しない。
【００２５】
好ましい実施形態において、他の化合物は、本方法の特異性を改善するためにＲＰＥと連続して、または同時に使用される。例えば、無症候性、症状の乏しい、または症候性対象とワクチン接種された対象とを識別することが可能である他の化合物を使用することは有利である。更に好ましくは、そのような化合物は、ＲＰＥと共に単一の組成物中に存在しなくともよい。例えば、寄生虫性疾患、例えば、リーシュマニア症を引き起こす寄生生物の他の非関連性抗原（３１）が使用されてもよい。もう１つの例は、幾つかの寄生生物抗原を含むポリタンパク質の使用である（６、３６）。好ましい抗原は、ヒストンタンパク質またはその断片またはヒストンをコードする核酸分子を含む。より好ましくは、ヒストンタンパク質は、ＥＰ１６８７０２３において分類されているようなＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４である。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、良好に保存された核タンパク質であり、それらの配列は当該技術分野において周知であり、例えば、リクエナらの文献（Requena et al., Trends in Parasitol. (2000) 16:246）を参照されたい。好ましくは、ヒストンは、系統樹において疾患を引き起こす有機体に密接な有機体から得られる。従って、寄生虫性疾患、例えば、リーシュマニア症の治療において使用されるべきヒストンの起源として特別に興味深いものは、原生動物であり、特に、トリパノソーマ科のもの、例えば、プラスモディウム、より詳しくは他の種のトリパノソーマ属の原生生物リーシュマニアである。
【００２６】
より好ましい診断方法において、ＲＰＥを認識する抗体の検出可能な量が存在するときに、および／または増大した量で前記抗体が存在するときに、寄生虫性疾患が診断される。コントロールまたは健康な対象において、前記抗体は通常は検出されない。
【００２７】
抗体の存在の検出は、当業者に公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡなどを使用して行われる。好ましい検出の方法は、アッセイの表題の項において記載される。
【００２８】
ＲＰＥを認識する抗体は、好ましくは、ＲＰＥ中に存在する少なくとも１の化合物を認識できる１つの少なくとも１つの抗体が存在することを意味する。前記化合物は、リボソームタンパク質またはリボソームタンパク質断片またはリボソームタンパク質のリボソーム抗原であってよい。
【００２９】
［アッセイ］
第３の態様において、対象における寄生虫性疾患を診断するためのアッセイデバイスまたはアッセイが提供され、デバイスまたはアッセイは、ＲＰＥを含む。ＲＰＥを明確に認識する抗体の存在は、当業者に公知の何れかの標準方法により検出されてよい（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい。この文献は、引用によりここに組み込まれる）。適切な方法は、アフィニティクロマトグラフィコエレクトロフォレシス（ＡＣＥ）アッセイおよび（酵素結合性免疫吸着アッセイ）ＥＬＩＳＡを含む。好ましくはアッセイはＥＬＩＳＡを含む。幾つかのアッセイが、より広範に以下で記載される。
【００３０】
好ましい実施形態において、アッセイは、試料からの抗体に対して結合および除去するための固体支持体に固定化されたＲＰＥの使用を含む。次に結合された抗体は、抗体／ＲＰＥ複合体に対して結合する検出可能なレポーター基を含む検出試薬を使用して検出されてよい。適切な検出試薬は、抗体／ＲＰＥ複合体に対して結合する抗体およびレポーター基で標識された遊離ポリペプチド（例えば、半競合的アッセイにおいて）を含む。或いは、競合的アッセイが使用されてもよく、そこにおいて、ＲＰＥに対して結合する抗体は、レポーター基で標識され、ＲＰＥの試料とのインキュベーションの後に固定化されたＲＰＥに対する結合を可能にする。試料の成分が標識された抗体のＲＰＥに対する結合を阻害する範囲は、固定化されたＲＰＥとの試料の反応性を示す。
【００３１】
固体支持体は、それに対してＲＰＥが付着される、当業者に公知の何れかの材料であってよい。例えば、支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースまたは他の適切なメンブランであってよい。或いは、支持体は、ビーズまたはディスク、例えば、ガラス、グラスファイバー、ラテックスまたはプラスティック材料、例えば、ポリスチレン若しくはポリ塩化ビニルなどであってよい。支持体はまた、磁性粒子または光ファイバーセンサ、例えば、ＵＳ特許５３５９６８１に開示されているものなどであってもよい。
【００３２】
ＲＰＥは、当業者に公知の多様な技術を使用して固体支持体に対して結合されてよい。本発明の状況において、用語「結合」は非共有的な関連付け、例えば、吸着および共有結合性の付着（これは支持体上の抗原および官能基との間の直接的な連結、または架橋剤による連結であってもよい）の両方をいう。マイクロタイタープレート内のウェルまたはメンブランに対する吸着による結合は好ましい。そのような場合において、吸着は、適切な緩衝液中のＲＰＥが適切な長さの時間に亘り固体支持体と接触することにより達成されてよい。接触時間は、温度により異なるが、典型的には、１時間から１日の間である。一般的に、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルなど）のウェルと１０ｎｇ〜１ｇの範囲の量、好ましくは１０ｎｇのＲＰＥとの接触は、ＲＰＥの適切な量の結合に十分である。
【００３３】
ＲＰＥの固体支持体への共有結合性の付着は、一般的に、第１に支持体とポリペプチド上の水酸基またはアミノ基などの官能基との両方に反応する二官能基試薬と支持体を反応させることにより達成されてよい。例えば、ＲＰＥは、ベンゾキノンを使用して、または支持体上のアルデヒド基とポリペプチド上のアミンおよび活性水素との縮合により、適切なポリマーコーディングを有する支持体に対して結合されてよい（例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (1991) at A12-A13を参照されたい）。
【００３４】
ある実施形態において、アッセイは、酵素結合性免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイは、第１に、固体支持体、一般的にはマイクロタイタープレートのウェルに固定化されているＲＰＥと、試料、例えば、試料中のＲＰＥに対して特異的な抗体とを接触させることにより行われ、固定化されたＲＰＥに対して結合されてよい。未結合の試料を次に固定化ＲＰＥから除去し、抗体−ＲＰＥ複合体に対して結合できる検出試薬を添加する。固体支持体に対して結合されたままの検出試薬の量を次に、特異的な検出試薬に適切な方法を用いて測定する。
【００３５】
ＲＰＥが支持体に固定化された時点で、支持体上の残りのタンパク質結合部位は典型的にブロックされる。当業者に公知の何れかの適切なブロック試薬、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツウィーン２０（Tween 20、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）が使用されてもよい。固定化されたＲＰＥは、次に試料とインキュベートされ、（試料中に抗体が存在している場合に）工程はＲＰＥとの結合が可能になる。試料は、適切な希釈剤、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などにより、インキュベートに先駆けて希釈されてもよい。一般的に、適切な接触時間（即ち、インキュベート時間）は、試料中の抗体の存在を検出することを可能にするために十分な長さの時間である。好ましくは、接触時間は、結合抗体と未結合抗体との平衡が達成される少なくとも９５％の結合レベルが達成されるために十分な時間である。当業者は、ある時間に亘り生じる結合レベルをアッセイすることにより、平衡が達成されるために必要な時間を容易に決定され得ることを認めるであろう。室温で、約３０分のインキュベート時間で一般的には十分である。
【００３６】
未結合の試料は次に、固体支持体を適切な緩衝液、例えば、０．１％のツウィーン２０ｔｏｍを含むＰＢＳなどで洗浄することにより除去されてよい。次に、検出試薬が固体支持体に添加されてよい。適切な検出試薬は、固定化された抗体−ＲＰＥ複合体に対して結合し、当業者に公知の種々の手段の何れかにより検出できる何れかの化合物である。好ましくは、検出試薬は、レポーター基に対して結合された結合試薬（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ，イムノグロブリン、レクチンまたは遊離抗原など）を含む。好ましいレポーター基は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補助因子、阻害物質、色素、放射線核種、発光基、蛍光基およびビオチンを含む。レポーター基との結合試薬の結合は、当業者に公知の標準方法を使用して達成されればよい。一般的な結合試薬はまた、多くの供給源（例えば、Zymed Laboratories, San Francisco, CA and Pierce, Rockford, IL）からの多様なレポーター基に対して結合されたものが購入されてもよい。
【００３７】
次に、検出試薬は、結合された抗体を検出するために十分な長さの時間に亘り、固定化された抗体ＲＰＥ複合体とインキュベートされる。適切な時間の長さは、一般に、製造業者の取扱説明書から決定されてもよく、またはある時間に亘り生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定されてもよい。未結合の検出試薬は次に除去され、結合した検出試薬がレポーター基を使用して検出される。
【００３８】
レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射能活性基については、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィ法が一般に適切である。分光法が使用され、色素、発光基および蛍光基が検出されてもよい。ビオチンは、異なるレポーター基（一般に、放射能活性または蛍光基または酵素）と連結されたアビジンを使用して検出されてよい。酵素レポーター基は、一般的に、基質を（一般に、特異的な時間に亘り）添加されることと、それに続く、その反応産物の分光学的または他の分析とにより検出されてよい。
【００３９】
試料中のリーシュマニア症などの寄生虫性疾患のために特異的な抗体の存在または不在を検出するために、固体支持体に対して結合したままのレポーター基から検出される信号は一般に既定の境界値に対応する信号と比較される。１つの好ましい実施形態において、境界値は、好ましくは、固定されたＲＰＥが未感染対照からの試料とインキュベートされたときに得られる平均信号である。一般的に、既定の境界値を上回る３標準偏差である試料が生じる信号は、陽性と看做される（即ち、ＲＰＥと反応する）。代替の好ましい実施形態において、境界値は、サケットらの方法に従うレシーバーオペレーターカーブを使用して決定される（Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, p. 106-7 (Little Brown and Co., 1985））。即ち、この実施形態において、境界値は、診断試験結果のための各予想境界値に対応する真陽性率（即ち、感受性）と偽陽性率（１００％−特異性）との組み合わせのプロットから決定されてよい。
【００４０】
左上隅に最も近いプロット上の境界値（即ち、最も大きな範囲を含む値）が、最も正確な境界値であり、この方法により決定された境界値よりも高い試料から生じる信号が、陽性であると看做されてよい。或いは、境界値は、偽陽性率を最小化するために、プロットに沿って左側にシフトされてもよく、偽陰性率を最小化するために右側にシフトされてもよい。
【００４１】
関連する実施形態において、アッセイが流水式またはストリップテストフォーマットで行われ、ここにおいて、ＲＰＥはニトロセルロースなどのメンブランに固定化される。流水式試験において、試料がメンブランを通過したときに、試料中の抗体が固定化されたＲＰＥに対して結合する。次に、検出試薬を含む溶液がメンブランを通って流れたときに、検出試薬（例えば、タンパク質Ａコロイド金など）が抗体ＲＰＥ複合体に結合する。次に、結合した検出試薬の検出は、上述の通り行ってよい。ストリップテストフォーマットにおいて、ＲＰＥが結合されているメンブランの一端が試料を含む溶液中に浸漬される。試料は、検出試薬を含む領域を通って、固定化されたポリペプチドの領域にまでメンブランに沿って移動する。ＲＰＥでの検出試薬の濃度は、試料中のリーシュマニア症などの寄生虫性疾患を引き起こす寄生生物の抗原に特異的な抗体の存在を示す。典型的に、ラインなどのパターンを生じる部位での検出試薬の濃度は、視覚的に読み取ることが可能である。そのようなパターンの不在は陰性の結果を示す。一般に、メンブランに固定化されたＲＰＥの量が選択され、試料が上述したようなＥＬＩＳＡにおける陽性信号を生じるために十分であろうレベルの抗体を含むときに、視覚的に認識できるパターンを生じる。好ましくは、メンブランに固定化されたＲＰＥの量は、２５ｎｇ〜５００ｎｇの範囲に及ぶ。そのような試験は、典型的に極めて少量（例えば、１滴）の対象血清または血液で行われる。
【００４２】
何れの対象または医師が、このデバイスをオフィス／自宅で使用でき、必要の度にそのようなデバイスまたはアッセイの使用が繰り返されてもよい。
【００４３】
通常、更なる分子が陽性または陰性コントロールとしてアッセイにおいて使用される。典型的な陽性コントロールは、試験されるべき試料において存在することが知られた抗体認識分子であってよい。典型的には、陰性コントロールは、試験されるべき試料において存在しないことが知られた抗体認識分子であってよい。
【００４４】
この書類および特許請求の範囲において、動詞「含む（to comprise）」およびその活用は、非限定的な意味において、その語に続く事項を含むことを意味するが、しかしながら、明確に言及されていない事項が排除されるものではない。加えて、動詞「からなる」は、「本質的にからなる」により置換可能であり、ここで定義される通りの製品、アッセイデバイス、それぞれの方法または使用が、明確に記載されているものを除いて更なる単数または複数の構成要素、それぞれの更なる単数または複数の工程を含んでもよいことを意味するものであり、前記更なる構成要素、それぞれの工程が、本発明の独自の構成を変えるものではない。
【００４５】
更に、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による構成要素についての言及は、その文脈が１つのおよびただ１つの構成要素の存在を明らかに必要とする場合を除いて、１よりも多くの構成要素が存在する可能性を排除するものではない。従って、漠然とした事項「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００４６】
本明細書において引用される全ての特許および文献は、参照することによりその全体がここに組み込まれる。
【００４７】
本発明は更に、以下の例により説明され、それらが本発明の範囲を制限するものであるとは解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】（Ａ）Ｌ．インファンツムリボソームタンパク質を、リニア１０−１４％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースメンブランに移し、健康なイヌの血清（レーン１〜３）および症候性ＣＶＬを有するＬ．インファンツムに自然感染したイヌからの血清（レーン４〜１３）とインキュベートした。個々の血清は、１：２００希釈で使用された。（Ｂ）Ｌ．インファンツムリボソームタンパク質の２Ｄ−ＰＡＧＥ。左側のパネルは、代表的な銀染色ゲルを示す。同様のゲルをニトロセルロースメンブラン上に移し、（Ａ）において使用されたＣＶＬ血清（１：２００）のプールとインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗イヌＩｇＧ抗体を二次試薬として使用した。
【図１ｂ】（Ａ）Ｌ．インファンツムリボソームタンパク質を、リニア１０−１４％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースメンブランに移し、健康なイヌの血清（レーン１〜３）および症候性ＣＶＬを有するＬ．インファンツムに自然感染したイヌからの血清（レーン４〜１３）とインキュベートした。個々の血清は、１：２００希釈で使用された。（Ｂ）Ｌ．インファンツムリボソームタンパク質の２Ｄ−ＰＡＧＥ。左側のパネルは、代表的な銀染色ゲルを示す。同様のゲルをニトロセルロースメンブラン上に移し、（Ａ）において使用されたＣＶＬ血清（１：２００）のプールとインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗イヌＩｇＧ抗体を二次試薬として使用した。
【図２ａ】ＬＲＰおよびＳＬＡの診断感受性の比較評価。（Ａ）症候性ＣＶＬを有するイヌからの血清およびコントロール血清とＬＲＰおよびＳＬＡとのＥＬＩＳＡ反応性。（Ｂ）症状の乏しいＣＶＬおよび無症候性ＣＶＬのイヌからの血清とＬＲＰおよびＳＬＡとのＥＬＩＳＡ反応性。ＣＶＬ血清の平均値が示される。破線は、健康なコントロールからの血清で得られた平均光学濃度＋その値の３標準偏差として規定された境界値を示す。
【図２ｂ】ＬＲＰおよびＳＬＡの診断感受性の比較評価。（Ａ）症候性ＣＶＬを有するイヌからの血清およびコントロール血清とＬＲＰおよびＳＬＡとのＥＬＩＳＡ反応性。（Ｂ）症状の乏しいＣＶＬおよび無症候性ＣＶＬのイヌからの血清とＬＲＰおよびＳＬＡとのＥＬＩＳＡ反応性。ＣＶＬ血清の平均値が示される。破線は、健康なコントロールからの血清で得られた平均光学濃度＋その値の３標準偏差として規定された境界値を示す。
【図３ａ】ＬＲＰおよびＳＬＡの診断特異性の比較評価。（Ａ）Ｔ．ゴンジイまたはＴ．クルジに感染したイヌからの血清とＬＲＰおよびＳＬＡとのＥＬＩＳＡ反応性。（Ｂ）レイシュムーン（Leishmune（登録商標））またはレイシュテック（Leishtec（登録商標））でワクチン接種したイヌからの血清とＬＲＰおよびＳＬＡとのＥＬＩＳＡ反応性。ＣＶＬ血清の平均値が示される。破線は、健康なコントロールからの血清で得られた値の平均光学濃度＋その値の３標準偏差として規定された境界値を示す。
【図３ｂ】ＬＲＰおよびＳＬＡの診断特異性の比較評価。（Ａ）Ｔ．ゴンジイまたはＴ．クルジに感染したイヌからの血清とＬＲＰおよびＳＬＡとのＥＬＩＳＡ反応性。（Ｂ）レイシュムーン（Leishmune（登録商標））またはレイシュテック（Leishtec（登録商標））でワクチン接種したイヌからの血清とＬＲＰおよびＳＬＡとのＥＬＩＳＡ反応性。ＣＶＬ血清の平均値が示される。破線は、健康なコントロールからの血清で得られた値の平均光学濃度＋その値の３標準偏差として規定された境界値を示す。
【００４９】
［例］
材料および方法
寄生生物．  リーシュマニア・チャガシ（ＭＯＭ／ＢＲ／１９７０／ＢＨ４６）およびＬ．・インファンツム（ＭＣＡＮ／ＥＳ／１９９６／ＢＣＮ／１５０、ＭＯＮ−１）を２０％加熱非働化胎仔ウシ血清(Sigma, St. Louis, MO, USA)、２０ｍＭのＬ−グルタミン、２００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで補足されたｐＨ７．４のシュナイダー培地（Sigma, St. Louis, MO, USA）中、２４℃で培養した。
【００５０】
抗原調製．  ＳＬＡは、以前に（１２）に記載されたように、液体培養中での数代の継代の後にＬ．チャガシおよびＬ．インファンツムの定常期プロマスティゴートから調製された。すなわち、５ｍＬの体積中にて、１ｍＬあたり２×１０８プロマスティゴートを冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回水洗した。冷凍および解凍の６サイクルと、それに続く超音波処理（超音波プロセッサ、GEX600）の３８ＭＨｚ、３０秒の５サイクルの後に、懸濁液を４℃、３０分間に亘って８０００ｇで遠心分離し、ＳＬＡを含む上清を収集した。タンパク質濃度をブラッドフォード法（７）により測定し、５００μＬの一定分量を−７０℃で貯蔵した。
【００５１】
ＬＲＰは、以前に記載（２２）のように、Ｌ．インファンツムの対数期プロマスティゴートから調製された。すなわち、１×１０９プロマスティゴートを収穫し、予冷蔵ＰＢＳで２回水洗し、１ｍＬのＮＰ４０溶解緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．５％のＮＰ４０）中に再懸濁し、１０回ピペッティングした。溶解後、試料を４℃、２分間、３０００×ｇで微量遠心し、核をペレットにした。上清を４℃、１５分間、１３０００×ｇで、２回、微量遠心した。精製された細胞質上清をベックマンＴＬ１００．３ローターにて４℃、３０分間に亘って９０，０００ｒｐｍで高速遠心に供した。粗リボソームペレットを緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＡｃＮＨ４、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）中に再懸濁し、緩衝液Ａ中の非連続的なスクロースのグラジエント（２０／４０％）を通してＴＬ１００．３ローター中で４℃、９０，０００ｒｐｍで遠心した。
【００５２】
血清試料．  血清試料をスペインおよびブラジルで採集した。スペインからのＣＶＬ血清をエストレマドラ地方の２８例の臨床的症候性のイヌから採集した。Ｌ．インファンシム感染動物をスペイン、カセレス、エストレマドラ大学、獣医学部の寄生虫学研究室で臨床学的および分析学的に評価した。動物は、次の症候の３つまたは３つよりも多くを発症したときに症候性と看做した：体重減少、脱毛症、アデノパシー、爪鉤形症、肝腫、結膜炎、並びに鼻、尾部および耳先端における剥脱性皮膚炎。全ての血清は、間接免疫蛍光法によって試験され、寄生生物の無鞭毛型形態陽性の存在が膝窩および肩前リンパ節で直接観測による確認されたとき陽性であった。コントロール血清は、８例の健康動物（エストレマドラ大学、寄生虫学研究室）から得た。
【００５３】
ブラジル、ミナスゲライス、ベロホリゾンテ地方からの５８例のＬ．チャガシに感染したイヌ（４４例の臨床的症候性、７例の症状の乏しいおよび７例の無症候性）からの血清試料を用いた。前述したように、動物はそれらが３つまたは３つよりも多くの臨床的徴候が出現した場合に症候性、１つのみまたは２つの徴候が現れた場合に症状の乏しい、臨床的徴候がないイヌの場合に無症候性と看做した。上記の通り、ＶＬの診断は、無鞭毛型が骨髄吸引物のギムザ染色スメアにおいて見られたとき、またはプロマスティゴートが末梢血または骨髄吸引物の培養物において同定されたときに確定された。ブラジルのイヌからの血清は、エビルド・ナスキメントおよびメリア・ノルマ・メロ（Evaldo Nascimento and Maria Norma Melo (Department of Parasitology, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil)）から提供された。ＶＬからの流行地に住む臨床的症候を示さず、イヌリーシュマニア症の疑いがなく、寄生虫学的および血清学的試験後に陰性である４７例のイヌからの血清でコントロール群を構成した。他の寄生生物感染を有するイヌからの１４例の血清試料を使用して、交差反応を以下の通りに分析した：トキソプラズマ・ゴンジイ（ｎ＝５）およびトリパノソーマ・クルジ（ｎ＝９）。健康でレイシュムーン（登録商標）（ｎ＝１８）またはレイシュテック（登録商標）（ｎ＝２３）ワクチンでワクチン接種されたイヌからの血清試料を実験において使用した。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ．  マイクロタイターイムノアッセイプレート（ファルコン）を１００μＬのコーティング緩衝液ｐＨ９．６中のＬ．インファンツムまたはＬ．チャガシのＳＬＡまたはＬ．インファンツムのＬＲＰ（各１ウェル当たり０．５μｇ）により４℃で１８時間に亘りコーティングした。力価曲線を作り、使用されるべき最良のタンパク質濃度および抗体希釈を決定した。自由結合部位をＰＢＳ−ツウィーン２０の０．０５％（ＰＢＳＴ）および３％のカゼイン溶液で２時間、３７℃でブロックした。３回のＰＢＳＴでの洗浄の後、プレートを１００μＬのカゼイン血清で１時間３７℃でインキュベートした。血清試料をＰＢＳＴおよび０．３％カゼイン中に１：２００に希釈した。プレートを７回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合された抗イヌＩｇＧ抗体（シグマ、St. Louis, USA）と１：１０，０００でインキュベートした。反応は、Ｈ２Ｏ２およびオルト−フェニレンジアミンおよびリン酸クエン酸緩衝液ｐＨ５．０との暗所での３０分間のインキュベーションにより展開し、２０μＬのＨ２Ｏ２２Ｎの添加により停止した。光学濃度をＩＬＩＳＡマイクロプレート分光光度計（Molecular Devices, Spectra Max Plus. Concord, ON, Canada）内で４９２ｎｍにて読み取った。
【００５５】
ウェスタンブロット．ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、Ｌ．インファンツムＬＲＰ（１５μｇ）をレムリ緩衝液（Laemmli’s buffer）中に再懸濁し、プレパレーティブコームを有する１０〜１４％のグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにＢｉｏＲａｄタンパク質電気泳動ミニゲルシステム（Hercules, CA, USA）を用いて溶解した。２Ｄ−ＰＡＧＥのために、Ｌ．インファンツムのＬＲＰを２００μＬの溶解緩衝液（０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、および１ｍＭのＤＴＴ）中に溶解し、等体積のフェノールで抽出した。有機相中に存在するタンパク質を５体積の酢酸アンモニウム緩衝液（メタノール中に溶解された０．１Ｍの酢酸アンモニア）で沈殿し、８０％のアセトンで３回洗浄した。乾燥ペレットを補水緩衝液（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、０．５％のＩＰＧ緩衝液（３−１０）、４％のＣＨＡＰＳ、４０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．８および０．００２％のブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、遠心して不溶性物質を除去した。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（登録商標）ドライストリップ、ｐＨ３−１０、１１ｃｍ（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）上に吸着させた。補水および等電点電気泳動法（ＩＥＦ）をＩＰＧｐｈｏｒシステム（GE Healthcare）を使用して製造者の取扱説明書に従って行った。ＩＥＦの後、ＩＰＧストリップを２０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴを加えた平衡緩衝液（６Ｍの尿素、２％のＳＤＳ、０．３７５ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０％のグリセロール、０．００２％のブロモフェノールブルー）中で１５分間に亘り平衡化し、次に、１５ｍｇ／ｍＬのヨードアセタミドを追加した平衡緩衝液で更に１５分間に亘り平衡化した。平衡化されたＩＰＧストリップを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル（ＢｉｏＲａｄ）上に配置した。２Ｄ−ＰＡＧＥゲルを銀染色キット（ＧＥヘルスケア）を使用して硝酸銀で染色した。
【００５６】
両方の場合において、電気泳動の後に、ゲルをニトロセルロースメンブラン（GE Healthcare）に移した。ブロットをＬ．インファンツムで感染したイヌからの血清（１：２００）と個々に探査する（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）か、プールとして（２Ｄ−ＰＡＧＥ）探査した。二次抗体としてノルディック・イムノロジカル・ラボラトリーズ（Nordic Immunological Laboratories (Tilburg, The Netherlands)）から購入した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗イヌＩｇＧを使用した。
【００５７】
統計学的解析．  全てのデータ比較は、対応のないスチューデントｔ検定を使用することにより有意性について検定し、Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と看做した。
【００５８】
結果
イヌ感染中のＬ．インファンツムＬＲＰの抗原性．  イヌ感染中のＬＲＰの抗原性を分析するために、Ｌ．インファンツムに自然感染した１０例のイヌからの血清を、この寄生生物からのＬＲＰ抽出物を含むニトロセルロースメンブランとインキュベートした。全ての感染動物の血清が、この寄生生物精製タンパク質断片を認識した（図１Ａ、レーン４〜１３）。健康なイヌからの血清は、陰性であるか、粗リボソーム調製物中の幾つかのポリペプチドを微かに染色した（図１Ａ、レーン１〜３）。大部分のＣＶＬ血清は、多数のタンパク質バンドを認識したが、認識パターンの複雑度および強度は、個々のイヌ血清間で異なっていた。観察された変動性にも拘らず、２つの免疫優性領域がウェスタンブロットにおいて観察された：それぞれ４５〜３６ｋＤａおよび２５〜２２ｋＤａポリペプチド。
【００５９】
より詳細に認識されたタンパク質のパターンを分析するために、ＬＲＰ抽出物を高解像度２Ｄ−ＰＡＧＥにより分離した。図１Ｂに示す通り、右側のパネル、調製用のタンパク質負荷（２０μｇ）で調製されたゲルは、最も基本的なタンパク質について最小限の縞のみを有する良好な解像度を示した。２Ｄ−ＰＡＧＥゲルが上記で使用された同じ血清のプールでインキュベートされたときに、２０の抗原性スポットの存在が検出された。
【００６０】
ＣＶＬの血清学的診断のためのＬＲＰおよびＳＬＡの比較．  ＬＲＰ抽出物がＣＶＬの血清学的診断のために有益な手段であると考えることができるか否かを決定するために、我々は、１２７例のイヌ血清試料のＬＲＰおよびＳＬＡに対する反応性を分析した。第１の血清群はＬ．インファンツム（ｎ＝２８）またはＬ．チャガシ（ｎ＝４４）に感染した症候性イヌから得た７２例の血清試料から構成された。第２の群は、健康な５５例のイヌからの血清により構成された。図２Ａは、症候性ＣＶＬおよびコントロール血清からの吸光度を示す。両方のタンパク質調製物について、ＣＶＬおよびコントロール血清の間での差は、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。ＬＲＰおよびＳＬＡからの吸光度のスペクトルは異なり、それらに対するＣＶＬの反応性はＳＬＡ（平均＝１．７９±０．６４）で得られた方がＬＲＰ（平均＝０．９０±０．６３）から得られたよりも高かった。標準偏差により示される通り、個々の血清試料からの吸光度値における高い変動性が両者の抗原性調製物について観察されたが、ＳＤはＳＬＡが抗原として使用されたときにより大きかった。健康な血清の反応性もまた、ＳＬＡ（平均＝０．３８±０．１３）に対する方が、ＬＲＰ（平均＝０．０９５４±０，０４７）に対するよりも高かった。材料および方法において記載されたＥＬＩＳＡ条件において、両方の抗原についての境界値（健康な血清からの平均反応性値＋３ＳＤとして規定される）は、ＬＲＰについては０．２３７であり、ＳＬＡについては０．７７４であった。これらの境界値は、我々が陽性および陰性血清を同定すること、およびその結果としてＥＬＩＳＥの性能パラメータを評価することを可能にする（表１）。ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＬＲＰがＳＬＡと同様な性能（高い感受性および特異性値）を示したことから、リーシュマニアリボソームタンパクが症候性ＣＶＬの診断のために適切な抗原であることが結論付けられる。
【００６１】
次に、症状の乏しい（ｎ＝７）および無症候性（ｎ＝７）のイヌからの血清を試験した（図２Ｂ）。両群と健康なコントロールとの血清からのＬＲＰおよびＳＬＡに対する反応性は、統計学的に有意であることが分かった（Ｐ＜０．００１）。限られた数の血清が使用されたにも拘らず、得られたデータは、一方で、症状の乏しいイヌからの血清はＬＲＰおよびＳＬＡ調製物を認識し（１００％感受性）、３０％の無症候性イヌ（３／７）からの血清は境界値よりも高いＳＬＡに対する吸光度値を示すという結果が得られた（図２Ｂ）。他方で、試験された全ての無症候性のイヌからの血清は、境界値よりも高いＬＲＰに対する吸光度値を示した。従って、我々の結果は、ＬＲＰの使用がＣＶＬの血清学的診断のための良好な手段と看做せることを示す。
【００６２】
ＬＲＰとＳＬＡとの交差反応性．  ＬＲＰが進化的に保存されたタンパク質で構成されることから、我々は、他の単細胞原生動物：トキソプラズマ・ゴンジイ（ｎ＝５）およびトリパノソーマ・クルジ（ｎ＝９）に感染したイヌからの血清からのＬＲＰ抽出物の潜在的な交差反応について分析した。図３において、ＬＲＰに対する各群についての個々の血清の反応性値を示す。Ｔ．ゴンジイ（平均値＝０．１０１２±０，０５６）またはＴ．クルジ（平均値＝０．１０１±０．０６）に感染したイヌからの血清は、健康な血清による境界値を越える反応性を示さなかった（上記参照）。コントロールとして、同じ血清の反応性をＳＬＡに対してアッセイした。これらの血清のＳＬＡに対する平均反応性（Ｔ．ゴンジイ感染イヌについては０．６２９±０．２１、およびＴ．クルジ感染イヌについては０．９９±０．２９）は、ＬＲＰに対して観察された値よりも高いものであった。これらの幾つかの反応性は、境界値よりも高いものであった（Ｔ．ゴンジイ感染イヌについては１／５、およびＴ．クルジ感染イヌについては７／９）。
【００６３】
ブラジルにおいて認可された２つのリーシュマニア予防ワクチン：レイシュムーン（Leishmune（登録商標））（２９）およびレイシュテック（Leishtec（登録商標））（１５）でワクチン接種されたイヌからの血清のＬＲＰおよびＳＬＡ抽出物に対する反応性についてもアッセイされた。我々は、ＬＲＰ抽出物がＥＬＩＳＡアッセイについて使用されたときに、レイシュムーン（登録商標）でワクチン接種された健康なイヌからの血清の２２．２％（４／１８）が境界値を越える光学濃度を示したことを見出した（図３Ｂ）。同じ血清をＥＬＩＳＡアッセイに基づくＳＬＡについて分析したときには、１６．６％（３／１８）の血清がまた境界値を越えた（図３Ｂ）。レイシュテック（登録商標）ワクチンでワクチン接種されたイヌから得られた２３例の血清は、ＳＬＡに対する反応性を示さなかった。これらの血清の１例のみが、ＬＲＰに対する反応性を示し、図２Ａにおいて分析された陰性健康コントロール血清により規定された境界値に近いＯ．Ｄ．値を有した。
【００６４】
考察
多くの細胞内細胞質性または核性のリーシュマニアタンパク質様ヒストン、ヒストンプロテイナーゼまたはキネシンが、ヒトまたはイヌ内臓リーシュマニア症（ＶＬ）における抗原性であると同定されている（２、１３、１４、３０、３２、３５）。本研究において、我々は、寄生生物リボソームタンパク質もまたＣＶＬ疾患中の抗原性であることを示す。幾つかの個々の変動性が個々のイヌ間で観察されたが、症候性イヌからの全ての血清は、寄生生物リボソーム抗生物質の幾つかに対して反応性を示した。寄生生物のリボソームタンパク質の抗原性がまた、２つの異なる皮膚リーシュマニア症のマウスモデルにおいて示されたことから（２２）、我々の結果は、寄生生物リボソームが、リーシュマニア自然感染および実験感染中の脊椎動物ホストの免疫系と相互作用することを示す。
【００６５】
内臓に作用するリーシュマニア種での感染に伴う強い体液性反応のために、血清学的技術に基づく試験は、イヌおよびヒト内臓リーシュマニア症（ＶＬ）の診断のために最も頻出する方法である。ＣＶＬに罹患するイヌからの血清の寄生生物リボソームタンパク質抽出物に対して観察される高い反応性を考慮して、我々はＬＲＰ抽出物の診断特性を分析した。この技術がＶＬ疾患の診断のための多数の試料をスクリーニングするために正確且つ感知可能な技術であると考えたために（１６、３３）、寄生生物リボソームタンパク質がＥＬＩＳＡアッセイにおける抗原源として使用された。粗ＳＬＡに基づくＥＬＩＳＡアッセイの使用が通常ＶＬの診断のために高い感受性を有することが示されていることから（５、２５、３３）、ＬＲＰ抽出物とプロマスティゴート溶解物から得られた総寄生生物タンパク質との比較分析がなされた。ＬＲＰ抽出物の感受性および特異性値は、症候性および症状の乏しいものからの血清が分析されたときのＳＬＡにより示される値と同様であった。感受性における僅かな増大が、ＬＲＰによって、ＳＬＡと比較したときに得られ（それぞれ１００％および９６％）、健康なイヌから得られたただ１例の血清のみが、コントロール血清の反応性として規定される境界値を超えるＬＲＰに対する吸光度値を示した。従って、ＬＲＰに基づくＥＬＩＳＡ試験の診断性能は、症候性または症状の乏しいＣＶＬの診断においてＳＬＡ調製物で得られるものと同様であったことが結論付けられる。しかしながら、無症候性イヌにおける当該疾患の検出は、イヌ間での、また更にイヌおよびヒトの間での当該疾患の拡大を制御するための疫学的研究において重大であるかもしれない（３、２０）。ＳＬＡに基づくＥＬＩＳＡが非常に大きな割合でＣＶＬの無症候性症例を検出できないことから（２７、３１）、我々は、無症候性ＣＶＬの診断におけるＬＲＰ抽出物の感受性を分析した。ＬＲＰ抗原混合物が全ての無症候性症例を検出した（１００％）のに対して、ＳＬＡ調製物を使用したアッセイは、当該症例の約３０％のみを検出しただけであった。ＬＲＰに対する反応性は、より多くの症状の乏しいおよび無症候性の試料を使用する更なる確認を必要とするが、我々のデータは、ＣＶＬ疾患の全ての種類の診断において、ＳＬＡよりも感受性の高い抗原として、ＬＲＰが使用できることを示す。
【００６６】
ＳＬＡを使用するＥＬＩＳＡ試験の特異性は抗原調製物に大きく依存し、シャーガス病、マラリア、ハンセン氏病またはトキソプラズマ症などの共通の風土性疾患を有する患者またはイヌから得られた血清で、幾つかの偽陽性結果が得られた（１６、２３、３１）。その理由のため、幾つかの寄生生物組み換えタンパク質が、より特異的な診断試験の開発のためのＥＬＩＳＡアッセイにおける抗原として個々に使用されている（２４）。内臓性のヒト（２５）またはイヌのリーシュマニア症疾患（３１）の診断においてＳＬＡの代わりに個々の組み換え抗原が使用されたとき、比較ＥＬＩＳＡアッセイは一般的に高い特異性を示したが、感受性が低かった。低い感受性値は、各々の患者または感染イヌにおける寄生生物タンパク質に対して誘導される異種体液性応答において観察される変動性と関連するかもしれない。非関連抗原（３１）または幾つかの寄生生物抗原を含むポリタンパク質の産生物（６、３６）の組合せは、ＥＬＩＳＡ試験の性能を更に改善できた。或いは、異なる寄生生物抗原を含む精製寄生生物断片が使用できる。我々の結果は、ＬＲＰ抽出物がＴ．クルジまたはＴ．ゴンジイに感染したイヌからの血清によっては認識されないのに対して、これらの血清の幾つかはＳＬＡに対する高い反応性を示したことを実証する。
【００６７】
試験の診断特異性は、血清がワクチン接種イヌから得られた場合にも維持されるべきで
ある。認可された商業的なワクチンの存在のために（１５、２９）、ワクチン接種された
動物から、感染したイヌを識別することが望ましいであろう。我々の結果は、レイシュム
ーン（登録商標）をワクチン接種された動物の幾つかがＬＲＰに対してある程度の反応性
を示したのに対して、レイシュテック（登録商法）をワクチン接種された動物では反応性
が示されなかったことを示す。ここに提示された結果を総合すれば、ＬＲＰ抽出物が、Ｃ
ＶＬおよび主として流行地における疫学的研究のための無症候性動物のＥＬＩＳＡ診断に
おいて使用するための興味深い代替物と看做されることが証明される。
【表１】
0005805635.tif 000002
以下に本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
（１）
対象における寄生虫性疾患を診断するためのリボソームタンパク質抽出物（ＲＰＥ）の使用。
（２）
（１）に記載の使用であって、当該ＲＰＥが、少なくとも２つのリボソームタンパク質、および／またはリボソームタンパク質の少なくとも２つの抗原、および／またはリボソームタンパク質の少なくとも２つのタンパク質断片を含む使用。
（３）
（２）に記載の使用であって、当該タンパク質断片が、リボソームタンパク質に対応する少なくとも２、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む断片である使用。
（４）
（１）または（３）の何れか１項に記載の使用であって、当該ＲＰＥが、配列番号１で示されるＥＰ８２４６９９に開示されるリーシュマニア・チャガシからの酸性リボソーム抗原ＬｃＰｏを起源とするエピトープを含まない、または当該エピトープからなるものではなく、より好ましくは、当該ＲＰＥがＬｃＰｏのＣ末端に位置する１７アミノ酸、即ち、配列番号１で示されるＬｃＰｏのアミノ酸３０６−３２２を含まない、または当該アミノ酸からなるものではない使用。
（５）
（１）〜（４）の何れか１項に記載の使用であって、当該リボソームタンパク質抽出物が、対象において存在する寄生虫性疾患を引き起こす寄生細胞を使用して以下の工程を行うことにより得られる使用：
ａ．寄生細胞と溶解緩衝液とを混合すること、
ｂ．得られた混合物を遠心分離して細胞質抽出物を得ること、
ｃ．当該得られた細胞質抽出物からリボソームタンパク質抽出物を調製すること。
（６）
（１）〜（５）の何れか１項に記載の使用であって、当該リボソームタンパク質抽出物がリーシュマニア種、好ましくはリーシュマニア・メジャーから得られる使用。
（７）
（１）〜（６）の何れか１項に記載の使用であって、当該寄生虫性疾患がリーシュマニア症またはマラリアである使用。
（８）
（１）〜（７）の何れか１項に記載の使用であって、当該寄生虫性疾患がリーシュマニアまたはプラスモディウム種により引き起こされる使用。
（９）
（１）〜（８）の何れか１項に記載の使用であって、当該寄生虫性疾患が、当該リボソームタンパク質抽出物を誘導する当該種とは異なる種により引き起こされる使用。
（１０）
（１）〜（９）の何れか１項に記載のＲＰＥを使用して、対象における寄生虫性疾患を診断する方法であって、対象から得られた試料において、ＲＰＥを認識する抗体が存在するか否かを決定することを含む方法。
（１１）
対象における寄生虫性疾患を診断するためのアッセイであって、当該アッセイがＲＰＥ
を含むアッセイ。
（１２）
（１１）に記載のアッセイであって、当該アッセイがＥＬＩＳＡであるアッセイ。
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【００６８】
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【図１ａ】
0005805635.tif 000003
【図１ｂ】
0005805635.tif 000004
【図２ａ】
0005805635.tif 000005
【図２ｂ】
0005805635.tif 000006
【図３ａ】
0005805635.tif 000007
【図３ｂ】
0005805635.tif 000008
【配列表】
0005805635000001.app