(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人体又は動物体の関節又は器官における軟骨欠損を予防的又は治療的に処置するための充填済みシリンジであって、それにより、液体ゲル化性コラーゲン組成物が、軟骨欠損の空洞に投与され、該充填済みシリンジは、シリンジに結合した混合装置内で合流する少なくとも二つの別々のチャンバーを含み、各チャンバーの内容物を前記混合装置を通して同時に放出でき、少なくとも一つの第一のチャンバーが、8mg/ml超のコラーゲン含有量を有し、pH値が(21℃に関して)6以下である液体コラーゲン溶液で充填されており、少なくとも一つのそれとは別の第二のチャンバーが、中和性の緩衝溶液で充填されていることを特徴とする、充填済みシリンジ。
【請求項２】
液体ゲル化性コラーゲン組成物の投与による、椎間板ヘルニア後に起こる髄核中の組織喪失の治療のための、皮膚軟部組織欠損の治療のための、骨欠損及び腱欠損の治療のための、歯肉欠損の再建のための、歯科学及び顎顔面外科における別の用途のための、並びに形成外科での用途のための充填済みシリンジであって、該充填済みシリンジは、シリンジに結合した混合装置内で合流する少なくとも二つの別々のチャンバーを含み、各チャンバーの内容物を前記混合装置を通して同時に放出でき、少なくとも一つの第一のチャンバーが、8mg/ml超のコラーゲン含有量を有し、pH値が(21℃に関して)6以下である液体コラーゲン溶液で充填されており、少なくとも一つのそれとは別の第二のチャンバーが、中和性の緩衝溶液で充填されていることを特徴とする、充填済みシリンジ。
【請求項３】
混合装置が静的ミキサーである、請求項1又は2に記載のシリンジ。
【請求項４】
製造されるコラーゲン組成物が、6mg/ml以上のコラーゲン含有量を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のシリンジ。
【請求項５】
前記コラーゲン溶液が、101〜105mPa・sの動的粘度を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直ちにコラーゲンマトリックスを形成する、ゲル化性コラーゲン組成物の製造及び供給、並びにその製造手段、並びに特に治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体又は動物体における退行性又は外傷性の関節疾患との関連で、軟骨欠損は、欠けている摩耗した軟骨質(Knorpelmaterial)の形態で生じる。損傷した関節軟骨は、限られた自己再生能力しか示さない。治療は、欠けている軟骨質を代替するために、軟骨欠損を「充填する」ことを必要とする。これは、侵襲性外科的処置により行われる。軟骨欠損のよく知られた治療は、欠損部で新たなヒアリン軟骨(軟骨移植片)の形成を引き起こすための、軟骨細胞などの軟骨形成性の細胞、特に自家細胞の欠損部への移植である。別の、特に無細胞法は、人工軟骨(軟骨インプラント)として機能し得る特定の材料及び材料組成物を使用する。公知の軟骨インプラントはマトリックス又は足場を形成し、その中に周囲の損傷していない軟骨組織の軟骨細胞が移入し、そうすることで新たな軟骨質構造を形成することができる。
【０００３】
DE 10 026 789 A1から、コラーゲンベースのバイオマトリックス、及びその製造方法が公知である。コラーゲンバイオマトリックスはラット尾腱から抽出したコラーゲンから製造される。このためには、抽出後に存在する酸性コラーゲン溶液を冷温において血清含有緩衝液で中和し、場合によっては細胞の存在下で、注いでコラーゲンゲルとし、このゲルは後にゲル化するか又は交差架橋して、すなわち硬化して、コラーゲン含有バイオマトリックスを形成し、こうして、既成の無細胞コラーゲンインプラント、又は包埋された軟骨細胞を含む細胞含有コラーゲン移植片としてコラーゲン含有バイオマトリックスを得ることができる。
【０００４】
公知の外科的処置では、軟骨欠損はまず切開され、損傷した軟骨組織はこの過程ですでに選択的に除去される。この結果、空洞が生じ、次いでこの空洞が軟骨インプラントで選択的に充填されることになる。軟骨インプラントと周囲組織との間の密な接触が、軟骨細胞の移入を可能にし、それゆえ軟骨の再生を可能にする。このためには、既成の形態で供給される公知の軟骨インプラントは、手術の最中にさらに切断してサイズを調整し、調製してある空洞に適合させなければならない。特に、関節軟骨内でのインプラントの安定した固定が達成されるように、軟骨インプラントの周縁部は、空洞の周縁部と噛み合う必要がある。既成のインプラントを空洞へ適合させるには、手間と時間がかかる。この手間のかかる処置により、手術時のコンタミネーション又は合併症のリスクが高まる。さらに、それゆえ手術上の手間をかけないと、完全な適合を達成することができず、術後の合併症又は治療の成果が得られないというリスクが存在する。したがって、軟骨欠損を治療するための従来の方法及び手段には改善の必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、特に、人体又は動物体での軟骨欠損の治療に使用可能であり、かつ従来技術から公知の不利点を回避することが可能である、コラーゲンベースのマトリックスを製造するための新規の方法及び手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的を達成するため、本発明は、液体緩衝溶液と組み合わせた液体濃縮コラーゲン溶液から、即時ゲル化性コラーゲン組成物が得られる方法を提供する。この組成物は、好ましくは、軟骨欠損の空洞に直接注入することが可能であり、そこで直ちに硬化しコラーゲンマトリックスとなり、次いでこのコラーゲンマトリックスが軟骨インプラントを直接にin situで形成する。液体ゲル化性コラーゲン組成物の空洞への導入は、空洞の形状への改善された適合を可能にし、まだ液体のままのコラーゲン組成物は、空洞の周縁部及びその底部と直接に接触することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明による方法を実施するための手段としての、本発明による充填済みシリンジの一実施形態を図示する。
【０００８】
図示される実施形態では、統合された容器内において、一方にはコラーゲン溶液を、他方には緩衝溶液を収容するための、平行する二つの別々のシリンダ状チャンバー(11、12)が形成されている。両方のチャンバーとも、前面側で、混合用邪魔板を備えた静的ミキサー(16)を有する、共通の流出路(18)へと合流する。コラーゲン組成物の投与及び製造のため、チャンバー(11、12)を空にするために、連結されたシリンジプランジャー(14)が設けられている。このシリンジプランジャーは、チャンバーの体積の裏面側での境界を形成し、それ自身公知の方法でプランジャー(14)に圧力をかけることによって、両方とものチャンバー(11、12)から同時に内容物を押し出すことができる。構造上設定されている、チャンバー(11、12)の体積の比率に応じて、押し出し時に、チャンバー(11、12)内に存在する液体の、その体積比での均一な混合が起こる。図示される実施形態では、チャンバー(11、12)の体積比は、1:1である。
【図２】コラーゲンゲルを用いたレオロジー検査の結果、すなわち、前もって様々に調温されたダブルチャンバーシリンジにおける検査振動数に依存した弾性率(平均値及び標準偏差)を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明によると、本方法は、少なくとも以下のステップを含む:互いに別々に供給された、特に前もって冷温で保管されていた液体濃縮コラーゲン溶液及び液体緩衝溶液を、一緒に、20℃〜約37℃、好ましくは約30℃までの温度に調温する;調温したコラーゲン溶液及び調温した緩衝溶液を、好ましくはそれに続いて直ちに混合し、それによりゲル化可能なコラーゲン組成物が得られ、この組成物は、直ちにゲル化し始め、コラーゲンバイオマトリックスへと硬化することができる。
【００１０】
特に、コラーゲン溶液及び緩衝溶液は、投与時にはじめて混合され、すなわち特にコラーゲン組成物を投与する際に混合され、投与中にはじめて、まずはまだ液体のままのゲル化性コラーゲン組成物が形成されることが想定される。つまり、本発明によると、ゲル化性であるが、まだ液体のままのコラーゲン組成物が生成時の状態で投与され、それが次いで投与箇所で硬化することができる。
【００１１】
未混合状態、しかし統合された容器中で一緒に保管することが可能であって、詳細には、それ自身公知の方法により冷温、特に約0℃〜約4℃の温度において保管可能である濃縮コラーゲン溶液及び緩衝溶液が提供される。本発明による方法の枠内では、これらの溶液を、コラーゲンバイオマトリックスを製造するためにそれを使用する直前に、例えば、室温に、すなわち特に20℃以上、又は体温に、すなわち特に約30℃に調温するが、37℃超の変性温度には調温しない。
【００１２】
特に、コラーゲン溶液及び緩衝溶液の調温は、同時に、詳細には、特に、本発明による混合及び適用の直前にはじめて行われる。それは、加熱キャビネット中に短時間保管することにより、又は場合によっては手の中で温めることによって行い得る。本発明では、特に、37℃超というコラーゲン組成物の温度を回避する。
【００１３】
本発明によると、調温された溶液は、空洞又はその他の適用場所への投与に際し、又は投与のためにはじめて混合され、その際に、投与すると直ちにゲル化し始めて投与場所でゲル化し終わる(ausgelieren)、つまり硬化するコラーゲン組成物が形成される。
【００１４】
コラーゲン溶液も緩衝溶液も使用又は投与前は、液状で存在する。その低い粘性が、有利なことには、加熱などの付加的な変性処置なしに、その直接の混合を可能にする。緩衝溶液の動的粘度は、好ましくは水又は易動性水性溶液の動的粘度の範囲、すなわち約1〜5mPa・sにある。濃縮コラーゲン溶液の動的粘度は、好ましくは、約101〜105mPa・sの桁の範囲にある。
【００１５】
コラーゲン溶液及び緩衝溶液は、まず互いに別々に、好ましくはマルチチャンバーシリンジ内で供給され、特に、シリンジ内でそれぞれ互いに別々に調温され、シリンジから放出される際に直ちに混合される。特に、コラーゲン溶液及び緩衝溶液の接触と混合は、シリンジのチャンバーから溶液を押し出し、シリンジ内の溶液流をシリンジに結合した混合装置内で合流させることにより行われ、製造されたばかりのコラーゲン組成物は、混合装置の出口から流出することが想定される。
【００１６】
本発明は、未変性の、交差架橋可能な天然構造コラーゲンの割合が高いコラーゲン含有バイオマトリックス又はコラーゲンインプラントの製造を可能にする。バイオマトリックス内において天然コラーゲンの割合が高いと、軟骨細胞は、コラーゲンバイオマトリックス内で特に良好に増殖し、その際、高率で自身のコラーゲン合成を示すことが示された。それゆえ、本発明は、コラーゲン変性処置を回避する。
【００１７】
本発明では、好ましくは、本発明による方法との関連で供給される濃縮コラーゲン溶液を、コラーゲン含有組織から直接に、そして変性ステップなしに得る。好ましいコラーゲン含有組織は、調製されたラット尾腱である。ラット尾腱から、好ましくは酸抽出、特に酢酸抽出を利用してコラーゲンを得る。濃縮コラーゲン溶液としては、8mg/ml超、特に約9mg/ml以上、又は好ましくは約16mg/mlまでのコラーゲン含有量(コラーゲン濃度)を有する酸性コラーゲン溶液が供給される。濃縮コラーゲン溶液は、特に、その粘性を得るために酸性である。その際、濃縮コラーゲン溶液のpH値は(21℃に関して)、pH6以下、特にpH5〜pH3.5である。
【００１８】
特別な一実施形態では、濃縮コラーゲン溶液は、細胞、細胞成分、サイトカインなどの成長因子、免疫刺激剤、抗生物質、又は多糖類などの安定化剤などのさらなる添加物又は助剤を含まない。別の実施形態では、コラーゲン溶液に少なくとも一種のそのような添加物又は助剤が含まれている。
【００１９】
ゲル化性コラーゲン組成物を得るためには、濃縮酸性コラーゲン溶液を中和性の緩衝液と混合する。中和性の緩衝液は、最も簡単な場合は、それ自身公知の緩衝塩溶液であって、それにより、コラーゲン組成物のpH値が中和領域、特に、pH7.0〜pH7.5(21℃に関して)になる。好ましくは、それ自身公知の方法で製造可能な、pH8.3のHEPES緩衝液を使用する。本発明によると、緩衝溶液はまた、濃縮コラーゲン溶液を希釈してゲル化性コラーゲン組成物中での最終濃度を達成するためにも利用される。緩衝組成物は、予定された、濃縮コラーゲン溶液との混合物での比率に応じて、好ましくは、少なくとも二倍濃縮(1+1の場合)、及び好ましくは最大限十倍濃縮(9+1の場合)されている。
【００２０】
特別な一実施形態では、緩衝溶液は、細胞、細胞成分、サイトカインなどの成長因子、免疫刺激剤、又は多糖類などの安定化剤などのさらなる添加物又は助剤を含まない。別の実施形態では、緩衝溶液中に、細胞、及び場合によっては少なくともさらに一種の添加物又は助剤が含まれ、これらは、本発明により濃縮コラーゲン溶液と混合すると、細胞含有ゲル化性コラーゲン組成物を形成し、この組成物は、細胞含有コラーゲン移植片へと硬化する。そのうちの特別な一変形形態では、細胞は、軟骨細胞、特に自家細胞及び幹細胞である。
【００２１】
コラーゲン溶液及び緩衝溶液を1+1〜9+1(コラーゲン溶液対緩衝溶液)の体積比で混合することが好ましい。4+1、すなわち四部のコラーゲン溶液対一部の緩衝溶液の混合比が好ましい。それによると、製造されたコラーゲン組成物中でのコラーゲン含有量は、好ましくは、少なくとも6mg/ml以上、特に6〜12mg/mlである。そのうちの好ましい一変形形態では、コラーゲン組成物中でのコラーゲン含有量は、約8mg/mlである。
【００２２】
好ましくは、マルチチャンバーシリンジを使用する。これは、特に、それ自身公知の使い捨てシリンジである。好ましい一変形形態では、シリンジは、混合装置として、それ自身公知の静的ミキサーを備え付ける。当業者は、それに加えて、別々の溶液を投与時に混合することを可能にする、別の、統合された混合装置に精通している。別の実施形態では、そのような別の構成も同様に本発明の対象である。
【００２３】
コラーゲン溶液及び緩衝溶液がマルチチャンバーシリンジ内で供給される場合、このシリンジは、特に、それぞれ約0.5〜約5mlのチャンバー体積を有する。その際、本発明による、溶液の調温は、シリンジ内で行われ、溶液をシリンジから放出する際の、コラーゲン溶液及び緩衝溶液の混合も同様にシリンジ内で行われる。シリンジの混合装置が、それ自身公知の静的ミキサーであることが好ましい。当業者は、シリンジと組み合わせて使用され得る、別の混合装置に精通している。適用プロセスは、シリンジ体積及び適用速度に応じて、約1〜60秒かかるものである。混合時間は、本発明によると、両方のチャンバーから流出するそれぞれ最小限の体積分率(infinitesimaler Volumenteil)に対して、好ましくは約0.5〜約2秒である。
【００２４】
生成中の組成物は、直ちに、詳細には、特に混合から10秒以内、好ましくは5秒以内にゲル化し始める。ゲル化性組成物は、まだ液体のままであって、特にまだ流動性である。ゲル化プロセスは、コラーゲン組成物が硬化して固体バイオマトリックスになると、完了である。バイオマトリックスへの硬化は、好ましくは、2〜4分以内に完了する。そのようにして、例えば、軟骨欠損の空洞に投与されたまずはまだ流動性であるコラーゲン組成物の硬化が、空洞内ではじめて起こるため、そこで、空洞にじかに適合した軟骨インプラントが生成する。
【００２５】
本発明による方法は、製造されたコラーゲン組成物をまだ液状のままで投与場所、例えば空洞に運搬することを可能にするため、その場所で必要とされるアクセスはあまり大きくない。このことは、関節鏡又は内視鏡によるアクセスの枠内での手術を容易にする。従来は不可欠であった、公知のすでに硬化した既成の軟骨インプラントの、内視鏡アクセスによるその場所への運搬はもはや行われない。本発明は、関節鏡又は低侵襲性外科学の改善を可能にし、それにより、外科的処置により引き起こされる外傷を軽減する。
【００２６】
本発明はまた、この関連で、すぐに使える充填済みのシリンジを、特に使い捨てシリンジの形態でキットとして提供し、ただし、このシリンジは、少なくとも二つの別々のチャンバーを含み、これらのチャンバーは、シリンジに結合した注射装置内で合流し、その注射装置を通して各チャンバーの内容物を好ましくは同時に放出することができる。本発明によると、シリンジは、少なくとも一つの第一のチャンバーが液体濃縮コラーゲン溶液で充填され、少なくとも一つのそれとは別の第二のチャンバーが緩衝溶液で充填されていることを少なくとも特徴とする。それに加えて、さらなるそのようなチャンバーが、シリンジに設けられていてもよく、そのチャンバーは、添加物又は助剤で充填されていてもよい。少なくとも本発明によるコラーゲン溶液及び緩衝溶液で充填されたシリンジは、即時ゲル化性コラーゲン組成物を製造するために使用することができるキットを構成する。
【００２７】
それに加えて、本発明は、本方法の、充填済みマルチチャンバーシリンジ内での使用には制限されない。濃縮コラーゲン溶液及び緩衝溶液の別々の保管、並びにゲル化性コラーゲン組成物を製造するための、続いて行われるこれらの溶液のじかの混合を可能にする別の実施形態も可能である。別の一実施形態は、特に、一回限り使用するためのマルチチャンバー式混合カプセルであって、このカプセルは、それ自身公知のカプセルミキサーと組み合わせて使用することが可能である。
【００２８】
医学療法に適用するための、本発明による充填済みシリンジの使用も、本発明の対象である。特別な一用途は、人体又は動物体の軟骨欠損の、予防的処置又は治療的処置である。この軟骨欠損は、特に関節に現れる。しかしながら、この使用は、関節軟骨欠損に限られるものではない。本発明は、むしろ、人体又は動物体のさらなる軟骨欠損及び別の組織欠損の治療に使用することも可能である。
【００２９】
本発明による方法又は本発明による充填済みシリンジの別の医学的用途は、椎間板ヘルニア後に起こる髄核中の組織喪失の治療、及び皮膚軟部組織欠損、骨欠損、腱欠損の治療、並びに歯肉欠損の再建、並びに歯科学及び歯科矯正学における別の用途、並びに特に欠損又は空洞を充填することが問題になっている場合の形成外科での用途を含む。
【００３０】
組織培養用のコラーゲン含有バイオマトリックスを製造するための、本発明による方法及び本発明による充填済みシリンジの非医学的使用もまた、本発明のさらなる一対象である。特別な一実施形態では、本発明による方法を利用して、細胞培養用のバイオマトリックスをじかに製造することができる。これは特に、細胞又は組織をその中に包埋するために、細胞又は組織が、コラーゲン含有バイオマトリックスで覆われることになるサンドイッチ培養の製造に適している。別の医学的適用の他に、即時ゲル化性コラーゲンゲルの単純かつ確かな製造が要求される多数の非医学的適用もある。
【００３１】
本発明を、図及び以下の例示的実施形態により詳細に記載するが、それらは制限的に理解されるものではない。
【実施例】
【００３２】
例1:即時ゲル化性コラーゲン組成物の製造
濃縮コラーゲン溶液を製造するために、ラット尾を約マイナス20℃で保管し、続いて数分間約70%のアルコール中で表面的に消毒する。皮膚を引きはがし、個々のコラーゲン繊維を分離する。コラーゲン繊維をもう一度アルコール中で表面的に消毒してからPBSで洗浄し、続いて約0.1%の(0.5mol/l)酢酸溶液に移してその中でインキュベートする。コラーゲン繊維を酢酸溶液中で少なくとも7日間、冷温で(約0〜4℃において)撹拌する。不溶性のコラーゲン部分をインキュベーション時間の終了時に分離してから、コラーゲンをろ過し、沈殿させる。沈殿物(Prazipitor)を緩衝溶液ですすぎ、凍結してから、凍結乾燥する。凍結乾燥したコラーゲンを0.1%酢酸中に所定通り吸着させ、9〜16mg/mlのコラーゲン含有量を得る。濃縮コラーゲン溶液のpH値は、約4.0である。
【００３３】
四部のコラーゲン溶液を一部の中和性緩衝溶液と混合するために(4+1)、五倍濃縮緩衝溶液を調合する。特に、NaCl 35.6gを超純水937.5ml及び3mol/lのHEPES溶液62.5mlに溶かした溶液を、五倍濃縮緩衝溶液とする。使用前に、緩衝溶液をNaOHでpH8.3に調整する。
【００３４】
チャンバー体積比1:4を有するマルチチャンバーシリンジのそれぞれ別々のチャンバーに、コラーゲン溶液及び緩衝溶液を充填し、さらに使用するまで、冷温、約-15℃以下で保管する。
【００３５】
コラーゲン含有バイオマトリックスを製造するために、マルチチャンバーシリンジを短時間加熱キャビネット又は水浴に入れ、緩衝溶液及びコラーゲン溶液を約30℃の温度に加温する。両溶液を混合するために、連結されたシリンジプランジャーを介してこれらの溶液をマルチチャンバーシリンジから押し出す。その際、両方の溶液とも、チャンバーと結合された混合装置を通る。シリンジからは、混合された、即時ゲル化性コラーゲン組成物が流出する。この組成物をまだ液体のままで鋳型に注入する。適用するとコラーゲン組成物はこの鋳型を完全に充填し、数分以内に硬化して固体のコラーゲン含有バイオマトリックスになる。混合により生成したコラーゲン組成物の、約8mg/mlというコラーゲン含有量及び約30℃の温度では、この組成物は、2分以内に完全に硬化する。
【００３６】
例2:コラーゲン組成物のゲル化
例1に基づき製造可能なコラーゲン組成物をレオロジー検査する。ダブルチャンバーシリンジ(例えば、Medmix Systems社、スイス)内に、コラーゲン溶液(10mg/ml)及び緩衝溶液を、例1に基づき充填し(コラーゲンチャンバー:4部のコラーゲン溶液、2ml;緩衝液チャンバー:1部の五倍濃縮緩衝液、0.5ml)、凍結する。
【００３７】
室温(20.5℃)での1時間かけた穏やかな解凍に続いて、20〜40℃の範囲の、異なる温度の水浴中でシリンジの10分間の調温を行う(表1)。
【表１】
0005805791.tif 000002
【００３８】
調温に続き両成分を混合するために、シリンジの栓を混合用アダプタと交換し、12ウェル組織培養プレートのウェルに内容物を慎重に放出し、その際、流出する最初の二滴を捨てる。
【００３９】
コラーゲン組成物(8mg/mlのコラーゲン)の完全なゲル化、すなわち固体ゲルへの硬化は、20.5℃において15分以内に起こった。続いて、質感の目視評価を行った(表2)。
【００４０】
続いて、ウェル外部でのゲルの弾性率を、振動数法により算出する(Bohlin CVO R 150、Malvern Instruments GmbH社、ドイツ)(図2)。
【表２】
0005805791.tif 000003
【００４１】
図2から、算出された弾性率平均値の最高値は、20℃と30℃との間の温度範囲にあることが読み取れる。37℃に温められたコラーゲンの曲線は、いくぶん下方を延びるが、このゲルも目視観察では堅い質感を示す。38℃に加熱すると、ゲルは、半固体でしかなく、振動測定では、揺れの大きい、非常に低い値を示した。40℃のコラーゲンは、もはやゲル化しない。
【図１】
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【図２】
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