(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方の面に溝部が形成されている第１のマイクロチップ基板と表面に金属薄膜が成膜されている第２のマイクロチップ基板とからなり、第１のマイクロチップ基板の溝部が形成されている面と第２のマイクロチップ基板の金属薄膜が成膜されている側の面とが接合されてなり、
第１のマイクロチップ基板の溝部と第２のマイクロチップ基板表面とにより形成される流路内に上記金属薄膜が内包されていて、上記第２のマイクロチップ基板の上記金属薄膜が形成されている面とは反対側の面から上記金属薄膜に対して光照射し、上記金属薄膜上の試料に対して表面プラズモン共鳴測定を行う際に使用されるマイクロチップにおいて、
上記流路は、２つの流路からなり、一方の流路内には比較参照部となる金属薄膜が設けられ、他方の流路内には測定部となる金属薄膜が設けられ、
試料を設置する検出部となる上記比較参照部と測定部の金属薄膜とは別に、第１のマイクロチップ基板もしくは第２のマイクロチップ基板上であって上記流路外に参照部となる金属薄膜が設けられていて、この参照部となる金属薄膜は一様な媒質で覆われている
ことを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
参照部となる金属薄膜を覆う一様な媒質を空気とする
ことを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
参照部となる金属薄膜を第１のマイクロチップ基板と第２のマイクロチップ基板の接合により形成される閉空間内に含む
ことを特徴とする請求項１、２のいずれか１項に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
固体撮像素子の有効エリア内で参照部となる金属薄膜を、流路の長手方向に垂直かつ検出部となる金属薄膜の中心を通る仮想線上からずれた位置に設ける
ことを特徴とする請求項１、２、３のいずれか１項に記載のマイクロチップ。
【請求項５】
光源と、請求項１、２、３、４のいずれか１項に記載のマイクロチップと、上記マイクロチップを保持する試料固定部と、プリズムと、光検出器と制御部とを備え、光源から放出される光を上記マイクロチップの金属薄膜に対して照射し、上記金属薄膜からの反射光を光検出器で検出して金属薄膜上の試料特性を求める表面プラズモン共鳴センサ装置において、
上記試料固定部は、上記光源からの光が上記マイクロチップの第２のマイクロチップ基板表面において裏面側より照射される領域である測定領域に検出部となる上記比較参照部と測定部の金属薄膜と、参照部となる金属薄膜とが位置するように上記マイクロチップを固定するものであって、
上記制御部は、参照部となる金属薄膜に照射され反射された光を受光した光検出器からの参照部となる金属薄膜に対する画像情報を解析し、検出部となる金属薄膜に照射され反射された光を受光した光検出器からの検出部となる金属薄膜に対する画像情報に含まれる光源から発せられた光の時間に対する強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動の影響を除去するように演算する機能を含む
ことを特徴とする表面プラズモン共鳴センサ装置。
【請求項６】
請求項１、２、３、４のいずれか１項に記載のマイクロチップにおける検出部となる上記比較参照部と測定部の金属薄膜と参照部となる金属薄膜で反射した同一の光源から発せられた光を光検出器で受光し、
上記光検出器で得られた検出部からの反射光測定結果から金属薄膜の光反射面とは反対側の表面の状態を測定する表面プラズモン共鳴による測定方法であって、
上記光検出器で得られた参照部に対する画像情報の解析により、光源から発せられた光の時間に対する強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動を算出し、算出された光の時間に対する強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動に基づき、検出部からの反射光測定結果から光源の強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動の影響を取り除くことを特徴とする表面プラズモン共鳴による測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴測定を行う際に使用されるマイクロチップ、および、該マイクロチップ内の検査体を検査するための測定装置である表面プラズモン共鳴測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、ＳＰＲともいう）現象を利用した様々な表面プラズモン共鳴センサ（以下、ＳＰＲセンサともいう）が提案されている。
ＳＰＲ現象は、金属薄膜上に存在する表面プラズモンと呼ばれるプラズマ波と金属薄膜裏面から照射した光が全反射した際に当該金属表面に生じるエバネッセント波との共鳴により、ある角度（共鳴角度）における反射光強度が減衰する現象である。この共鳴角度は金属表面の屈折率に依存する。
【０００３】
図１２は、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎにより提案されたＳＰＲセンサの構成を説明する図である。
センサ本体は、大気中より屈折率の高いガラスからなるプリズム２１上に金属薄膜１３が設けられた構造を有する。そしてプリズム２１と金属薄膜１３との境界面に対して、レーザ光等の単色光が入射される。光の入射角θｉは、境界面にて全反射が発生する臨界角以上の角度に設定される。単色光は境界面にて全反射されてプリズム２１外へと進行するが、このときエバネッセント波が金属薄膜１３表面に滲み出す。上記エバネッセント波の波数が、金属表面で発生し得る表面プラズモンの波数と一致した場合、両者の共鳴（以下、表面プラズモン共鳴ともいう）が発生し、入射光のエネルギーの一部が表面プラズモン波のエネルギーに変化する。結果として上記境界面からの反射光が減衰する。
なお、表面プラズモンは金属表面において、光の進行方向と平行な方向に電子の疎密波として伝播するので、表面プラズモン共鳴を発生させるためには、この方向に電場の振動成分を有するＰ偏光の光を入射する必要があり、Ｐ偏光と電場の振動が互いに垂直であるＳ偏光の光では入射しても表面プラズモン共鳴が発生する事は無い。
【０００４】
表面プラズモン共鳴は、入射する光の波長、入射角、金属薄膜１３の表面の屈折率分布等に依存する。よって、金属薄膜１３表面に試料Ｓが設置された場合、金属薄膜１３の表面の屈折率が変化するので、表面プラズモン共鳴が発生する際の上記入射する光の入射角も変化する。  
すなわち、反射光強度をモニタして、反射光強度が減衰するときの入射角（以下、共鳴角ともいう）を測定し解析することにより、金属薄膜１３表面の状態を特定することが可能となる。
【０００５】
このようなＳＰＲセンサは様々な測定に利用されている。例えば特許文献１に記載されているように、ＳＰＲセンサは、誘電体物質の表面近傍の情報や誘電体薄膜の膜厚分布を高感度で測定する顕微鏡として使用される。
また、特許文献２に記載されているように、ＳＰＲセンサは、金属薄膜１３に接触した溶液（例えば、血液、尿等の試料）などの屈折率やその変動を検出し溶液中の物質量の変動を観測したり、金属薄膜１３上に固定された抗体が特異的に結合するタンパク質、核酸、その他の生体関連物質などを検出・定量する（抗体抗原反応をモニタリングする）のにも使用される。すなわち、ＳＰＲセンサは、生化学や分子生物学や医療検査等の分野で使用されるバイオセンサとして使用される。
【０００６】
以下、抗体抗原反応をモニタリングするバイオセンサを例に取り、ＳＰＲセンサ装置の構成例を説明する。図１３にＳＰＲセンサの構成例を示す。
【０００７】
被検査体は、マイクロチップ１０として構成される。マイクロチップ１０は、典型的には一対の基板（第１のマイクロチップ基板１１、第２のマイクロチップ基板１２）が対向して接合された構造を有し、少なくとも１つの上記基板の表面に微細な流路１４（マイクロチャンネル：例えば、幅１０〜数１００μｍ、深さ１０〜数１００μｍ程度）が形成されている。
【０００８】
第２のマイクロチップ基板１２に金属薄膜１３が施され、当該金属薄膜１３上に抗体Ｉｇ（抗原受容体）が固定される。流路１４が第１のマイクロチップ基板１１に形成されている。第１のマイクロチップ基板１１と第２のマイクロチップ基板１２とを接合して構成されるマイクロチップ１０において、金属薄膜１３および金属薄膜１３に固定された抗体Ｉｇは、上記流路１４内に存在する。
【０００９】
上記マイクロチップ１０は、ＳＰＲセンサ装置の試料保持部２７に設置される。上記したように、表面プラズモン共鳴を用いて測定するには、大気中より屈折率の高いガラスからなるプリズム２１上に金属薄膜１３が設けられる。よって、本来は図１３における第２のマイクロチップ基板１２はプリズムである必要がある。しかし、この場合、各マイクロチップ１０毎にプリズム２１を用意する必要があり、コストが増大する。
よって、第２のマイクロチップ基板１２はプリズム２１と同じ材質のガラス基板とし、第２のマイクロチップ基板１２とプリズム２１との間に、ガラスと同一の屈折率をもった媒質であるマッチングオイルＭＯを介在させる。このようにして、マイクロチップ１０とプリズム２１とは光学的に接合される。本構成によれば、各マイクロチップ１０毎にプリズム２１を用意する必要がなく、複数の測定を行う場合、マイクロチップ１０を交換するだけでよい。
【００１０】
なお、第２のマイクロチップ基板１２ならびにプリズム２１の材質は必ずしもガラスである必要はなく、大気中より屈折率の高い樹脂であってもよい。具体的には、シクロオレフィンポリマー （Ｃｙｃｌｏ  Ｏｌｅｆｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ:ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｏｌｅｆｉｎ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ：ＣＯＣ）といった環状オレフィン構造を有する樹脂を採用してもよい。この場合、マッチングオイルＭＯとしては、当該マッチングオイルの屈折率が環状オレフィン構造を有する樹脂の屈折率と同一となるようなものを使用する。
マッチングオイルＭＯとしては、例えば、オリンパス社製、米国ＣＡＲＧＩＬＬＥ研究所製のものが使用される。上記製造メーカからは所望の屈折率に応じたマッチングオイルを入手可能であり、対応可能範囲は、例えば、屈折率＝１．５１５〜１．７００である。
【００１１】
金属薄膜１３に対して光を照射する光源２２は例えば半導体レーザ装置であり、例えば波長７６０ｎｍのレーザビームが放出される。光源２２からの光照射は制御部４０により制御される。光源２２から放出されるレーザビームは、図示を省略した偏光素子を通過後Ｐ偏光のレーザビームとなり金属薄膜１３に照射される。
金属薄膜１３からの反射光はＣＣＤ（固体撮像素子）受光器２３により受光される。ＣＣＤ受光器２３からの画像情報は制御部４０に送出され、ＣＣＤ受光器２３からの画像情報を受信した制御部４０は、当該画像情報を解析して抗体抗原反応をモニタリングする。
【００１２】
光源２２およびＣＣＤ受光器２３の位置、レーザビームの出射方向、試料保持部２７の基準面Ｌの高さは、試料保持部２７の所定位置（マイクロチップ１０の測定位置）にマイクロチップ１０を載置して光源２２からレーザビームを出射した際、当該レーザビームがマイクロチップ１０の流路１４内に位置する金属薄膜１３に照射され、その反射光がＣＣＤ受光器２３受光面に到達するようにそれぞれ設定されている。
【００１３】
抗体Ｉｇが固定された金属薄膜１３表面に対して光源２２からのＰ偏光レーザビームを照射すると、当該金属薄膜１３からの反射光がＣＣＤ受光器２３の受光面に到達する。
このとき、抗体Ｉｇが固定された金属薄膜１３表面の屈折率に対応した共鳴角にて入射したレーザビームによる反射光は、表面プラズモン共鳴が発生するのでその強度が減衰する。すなわち、このように強度が減衰した反射光のＣＣＤ受光器２３の受光面上の位置は、ある特定された位置となる。ここで、上記した抗体Ｉｇが固定された金属薄膜１３表面の屈折率は、マイクロチップ１０の流路１４に細菌、ウイルスや微生物に感染した細胞等の検体が注入される前の屈折率である。
【００１４】
そして、上記検体がマイクロチップ１０の検体流入口１４１より流路１４に注入されると、抗体Ｉｇは検体を抗原として認識して結合し抗体抗原反応が起こる。そのため金属薄膜１３に固定された抗体Ｉｇの状態が変化するので金属薄膜１３表面の屈折率が変化し、この屈折率変化に伴い共鳴角も変化する。よって、強度が減衰した反射光のＣＣＤ受光器２３の受光面上の位置も変化する。
【００１５】
制御部４０は、ＣＣＤ受光器２３の受光面における強度が減衰した反射光の受光位置変化情報を画像情報として受信し、強度の変化から共鳴角の変化を求める解析を行うことにより、金属薄膜１３表面にて発生した抗体抗原反応の状態（抗体と抗原との結合特性等）を特定する。
【００１６】
以上のように、上記したＳＰＲセンサ装置は、マイクロチップ１０を用いたマイクロ・トータル・アナリシス・システム（μＴＡＳ）として機能し、高速かつ高精度の反応分析を行い、コンパクトで自動化されたシステムを実現することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開平６−１６７４４３号公報
【特許文献２】特開２０００−５５８０５号公報
【特許文献３】特開２００６-１８７７３０号公報
【特許文献４】特許３７１４３３８号公報
【特許文献５】特開２００７−９３５８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記したように、ＳＰＲセンサ装置に使用するマイクロチップ１０は、例えば、微細な流路１４を施された第１のマイクロチップ基板１１と、表面の一部に金属薄膜１３が施されている第２のマイクロチップ基板１２とを、流路１４の形成面と金属薄膜１３の形成面が対向するように接合して構成される。
図１３に示すように、ＳＰＲセンサ装置において、上記マイクロチップ１０は、第２のマイクロチップ基板１２の下面（金属薄膜１３が施されている面と反対側の面）から、第２のマイクロチップ基板１２を透過して金属薄膜１３に光が照射されるように保持されている。
マイクロチップ１０の第２のマイクロチップ基板１２側に照射される光源２２からの光は、金属薄膜１３の所定位置に到達し、金属薄膜１３によって反射され、ＣＣＤ受光器２３の受光面に到達する。光源２２装置の光出射方向、ＣＣＤ受光器２３の位置は固定されており、金属薄膜１３表面上の状態が不変で屈折率が一定であるならば、ＣＣＤ受光器２３受光面が受光する光の強度も変化せず一定となる。
しかしながら、光源２２から発せられる光の強度は時間の経過に対して一定でなく、周辺の温度、電力供給など環境に起因した、ある程度のばらつきを持って変化している。
【００１９】
金属薄膜１３上に抗体Ｉｇが固定されたマイクロチップ１０に対し、抗原を含んだ検体を流路１４に流すことで起こる抗体抗原反応を計測する場合を考える。ここで、ＳＰＲ装置の光源２２、ＣＣＤ受光器２３の位置は一定である。図１４（ａ）に示すように、金属薄膜１３の表面状態が一定であるならば、図１４（ｂ）のように抗体抗原反応を起こす前、時刻ｔ=０〜ｔ１の間に検出される共鳴角θは時間に関係なくθｉで一定となるが、実際には光源２２から発せられる光の強度はばらつき、ＣＣＤ受光器２３の受光面上における光の強度も変化するため、図１４（ｃ）の時刻ｔ‘=０〜ｔ１の間のように共鳴角を正確に定められない状態になっている。
このような状態で抗原の入った検体を時刻ｔ=ｔ１でマイクロチップ１０の流路１４に流し、金属薄膜１３上において抗体抗原反応を起こした場合、図１４（ｂ）のように光源２２の強度にばらつきが無い状態であれば反応の結果、最終的に一定の割合Δθだけ変化するが、実際には図１４（ｃ）のように光源２２の強度ばらつきを反映するため安定せず、抗体抗原反応前のばらつきとあわせて正確な共鳴角変化量Δθを求めることが出来ない。
すなわち、光源２２の強度がばらつく分だけ、共鳴角検出が正確に行われず、観測結果データに誤差が生じるという不具合が発生する。
【００２０】
上記問題の解決手段として、特許文献５では、表面プラズモン共鳴発生の入射光の偏光方向依存性に注目し、光源２２から発せられ金属薄膜１３で反射された前の光をＰ偏光とＳ偏光に分離し、表面プラズモン共鳴が発生せず光源２２の強度ばらつきの影響のみを受けるＳ偏光強度の検出結果を用いて、表面プラズモン共鳴と光源２２の強度ばらつき両方の影響を受けるＰ偏光強度の検出結果を補正する手段が記載されている。
【００２１】
しかしながら、特許文献５に開示されている上記解決手段では、測定に用いられる光の光路上に存在するプリズム２１やチップ１０の基板から成る多層構造内の干渉や、金属薄膜１３での反射によって光の偏光特性が変化する。また、ＳＰＲセンサ装置に位置決め・固定されているマイクロチップの第２のマイクロチップ基板１２がガラスである場合、ガラスへの光入射によりガラスが加熱されて熱膨張等のガラスの変形が生じ、ガラスの応力歪みが発生し、その結果、ガラスの複屈折性が発現する。よって、第２のマイクロチップ基板を光が通過すると光の偏光特性が変化する。このガラスの複屈折性は、ガラスメーカーのガラス製造工程やガラスの製造ロット毎によってもばらつくので、結果的にマイクロチップ毎に上記した偏光特性がばらつくことになる。
以上のように、偏光特性は光路上に存在する各物質の状態に依存し、Ｓ偏光とＰ偏光の変化の比率は常に一定ではないため、Ｓ偏光の結果を用いて正確にＰ偏光の結果を正確に補正し、高精度な測定を行うことは難しいという問題が存在する。
【００２２】
本発明は上記事情によりなされたものであり、その課題は光源から発せられる光の強度にばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動が存在する場合でも、ＳＰＲセンサ装置による観測結果から容易にその影響を取り除き、精度の高い測定を行うことができるマイクロチップ、および当該マイクロチップを使用する表面プラズモン共鳴測定装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
図１は、本発明のマイクロチップ１０の構造断面と、ＳＰＲセンサ装置において当該マイクロチップ１０を用いた測定方法を説明する図である。
図１に示すように、本発明のマイクロチップ１０は、微細な流路１４が施された第１のマイクロチップ基板１１と第２のマイクロチップ基板１２とが接合されて構成され、第２のマイクロチップ基板１２上の、第１のマイクロチップ基板１１との接合面の一部に金属薄膜１３が施されている。
従来のマイクロチップ１０では、基板に施された微細な流路１４に内包される位置にのみ、表面プラズモン共鳴を発生させるための検出部となる金属薄膜１３を設けた構造であった。これに対し、本発明のマイクロチップ１０は、図１に示すように流路１４に内包された検出部となる金属薄膜１３のほかに、流路１４に内包されない位置にも光源２２の強度をモニタリングするための参照部となる金属薄膜１５を有する。ＳＰＲセンサ装置において当該マイクロチップ１０は流路１４に内包された金属薄膜１３と流路１４に内包されない金属薄膜１５が光源２２から同時に照射される位置に固定・保持される。
【００２４】
図１から明らかなように、測定において、参照部となる金属薄膜１５へは表面に抗体Ｉｇなどを固定させることなく、空気や水など一様な媒質で覆うことで、表面の状態が一定に保たれている。この状態にある参照部では抗体抗原反応が起こり得ないため、受光面が受光する参照部となる金属薄膜１５からの反射光の変化は、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動によってのみ生じることになる。
また、参照部と検出部を分けることで、それぞれの金属薄膜１３からの反射光強度を同じ偏光成分で評価することが出来るため、従来のような光路上において発生する反射、干渉による偏光特性の変化の影響を受けることも無い。
そのため、検出部となる金属薄膜１３からの反射光の観測結果から、参照部となる金属薄膜１５からの反射光の観測結果を割り引くことで、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響を取り除いた、精度の高い共鳴角の検出を行うことが出来る。
【００２５】
ここで参照部の観測結果を用いて、検出部の観測結果から光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響を取り除く方法について述べる。
図２（ａ）は検出部の反射光を観測しつづけた時の変化を表すグラフである。図中のｔ１およびｔ２は流路１４への試薬の送液開始時間と終了時間を表しており、０〜ｔ１とのシグナル強度と比較して、ｔ１〜ｔ２では金属薄膜１３表面を流れる液体が切り替わったことによる表面の変化、ｔ２以降は金属薄膜１３表面に試薬内の抗原が抗原抗体Ｉｇ反応によって結合したことによる表面の変化を表している。図２（ａ）に示すグラフはこのような送液プロセスによる大きなシグナル変化に加えて、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動に起因するノイズがのった形をしている。
一方、参照部には試薬は流さないので、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動がノイズとして反映されただけとなり、参照部の反射光を観測したときの変化は、図２（ｂ）に示すように、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動を表す信号のみとなる。
なお、例えば、第２のマイクロチップ基板１２がガラスである場合、ＳＰＲ測定開始時とある程度の時間が経過した際のガラス温度は相違するので、ガラスの温度変化は時間依存性を有する。よって、ガラスの応力歪みに起因する偏光特性は時間依存性を有する。すなわち、光路上に存在する各物質の状態に依存する偏光特性は時間依存性を有することになる。
【００２６】
今、抗体抗原反応を含む送液プロセスがシグナルへ及ぼす影響の時間依存性をｈ（ｔ）とし、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動がシグナルへ及ぼす影響の時間依存性を上記のようにｇ（ｔ）とする。
図２（ａ）で表される検出部の観測シグナルＩSensingの時間変化ｆ（ｔ）は上記した時間依存性ｈ（ｔ）とｇ（ｔ）の両方を含むので、ＩSensingの時間変化ｆ（ｔ）=ｈ（ｔ）＊ｇ（ｔ）と表すことができる。
一方、図２（ｂ）で表される参照部の観測シグナルＩRefは光源２２の上述のように、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性（以下、光路における偏光特性とも言う）の変動のみを含むため、ＩRefの時間変化＝ｇ（ｔ）と表すことが出来る。
ＩSensingの時間変化を表す式およびＩRefの時間変化を表す式の中に含まれる光源２２の強度ばらつきおよび光路における偏光特性の変動に相当する式ｇ（ｔ）は全く同一であることから、ＩSensingの時間変化を表す式をＩRefの時間変化を表す式で割れば、抗原抗体Ｉｇ反応を含む送液プロセスがシグナルへ及ぼす影響の時間依存性、即ちｈ（ｔ）のみを取り出すことが出来る。
すなわち、光源２２の強度ばらつきおよび光路における偏光特性の変動を補正した検出部の観測シグナルＩcorrectedの時間変化＝ＩSensingの時間変化／ＩRefの時間変化＝ｈ（ｔ）となり、図２（ｃ）に示すような光源２２の光の強度ばらつきおよび光路における偏光特性の変動を補正した検出部の観測シグナルのグラフを得ることが出来る。
【００２７】
図２に示した例では、参照部となる金属薄膜１５は、第１のマイクロチップ基板１１と第２のマイクロチップ基板１２が接合されることで形成される閉空間１６内に含まれているが、必ずしもこれに限るものではない。例えば、図３に示すように第１のマイクロチップ基板１１を貫通させた貫通部を設け、参照部となる金属薄膜１５を空間に露出させてもよい。
図３から明らかなように、本構成においても参照部となる金属表面の状態は一様な媒質（空間的に一様であって、かつ時間的にも変化がない媒質）で覆われ一定に保たれる。そのため、当該参照部からの反射光の測定結果は、図１と同様、検出部の測定結果から光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響を取り除くために使用することが出来る。
【００２８】
また、後述するように、上記閉空間１６や貫通部を設けずに、金属薄膜１５を第２のマイクロチップ基板１２において、第１のマイクロチップ基板が接合されていない面（図２において下側の面）に設けたり、あるいは、上記閉空間１６内の第１のマイクロチップ基板１１側の面上に設ける等、第１のマイクロチップ基板１１もしくは第２のマイクロチップ基板１２上であって上記流路１４外の位置に設けてもよい。
しかしながら、図３のように第１のマイクロチップ基板１１を貫通し、参照部となる金属薄膜１５を外界に露出させたり、第２のマイクロチップ基板１２において、第１のマイクロチップ基板が接合されていない面に設けた場合、空気中の埃や測定中に使用する試薬、マイクロチップ１０および装置使用者から発せられる唾液、汗等の飛沫により、参照部となる金属薄膜１３表面に異物が付着し、測定中金属薄膜１５の表面状態が測定中に変化する可能性がある。
【００２９】
一方、図１のように第１のマイクロチップ基板１１を貫通させること無く加工し、参照部を閉空間１６に含ませる構造においては、埃や飛沫などの異物が金属薄膜１５表面に付着することはない。そのため、上記のような金属薄膜１５の表面状態が測定中に変化するという問題が起こることはない。
したがって、参照部となる金属薄膜１５は図１に示すように、第１のマイクロチップ基板１１を貫通させず、第１のマイクロチップ基板１１と第２のマイクロチップ基板１２との接合によって成る閉空間１６内に含ませる構造にすることが望ましい。
【００３０】
以上に基づき、本発明においては、以下のように前記課題を解決する。
（１）一方の面に溝部が形成されている第１のマイクロチップ基板と表面に金属薄膜が成膜されている第２のマイクロチップ基板とからなり、第１のマイクロチップ基板の溝部が形成されている面と第１のマイクロチップ基板の金属薄膜が成膜されている側の面とが接合されてなり、第１のマイクロチップ基板の溝部と第２のマイクロチップ基板表面とにより形成される流路内に上記金属薄膜が内包されていて、上記第２のマイクロチップ基板の上記金属薄膜が形成されている面とは反対側の面から上記金属薄膜に対して光照射し、上記金属薄膜上の試料に対して表面プラズモン共鳴測定を行う際に使用されるマイクロチップを次のように構成する。
上記流路は、２つの流路からなり、一方の流路内に比較参照部となる金属薄膜を設け、他方の流路内に測定部となる金属薄膜を設け、試料を設置する検出部となる上記比較参照部と測定部の金属薄膜とは別に、第１のマイクロチップ基板もしくは第２のマイクロチップ基板上であって上記流路外に参照部となる金属薄膜を設ける。この参照部となる金属薄膜は一様な媒質で覆われている。
（２）上記（１）において、参照部となる金属薄膜を覆う一様な媒質を空気とする。
（３）上記（１）（２）において、参照部となる金属薄膜を第１のマイクロチップ基板と第２のマイクロチップ基板の接合により形成される閉空間内に含むように構成する。
（４）上記（１）（２）（３）において、固体撮像素子の有効エリア内で参照部となる金属薄膜を、流路の長手方向に垂直かつ検出部となる金属薄膜の中心を通る仮想線上からずれた位置に設ける。
（５）光源２２と、上記（１）（２）（３）または（４）のマイクロチップと、上記マイクロチップを保持する試料固定部と、プリズムと、光検出器と制御部とを備え、光源から放出される光を上記マイクロチップの金属薄膜に対して照射し、上記金属薄膜からの反射光を光検出器で検出して金属薄膜上の試料特性を求める表面プラズモン共鳴センサ装置において、上記試料固定部は、上記光源からの光が上記マイクロチップの第２のマイクロチップ基板表面において裏面側より照射される領域である測定領域に、検出部となる上記比較参照部と測定部の金属薄膜と参照部となる金属薄膜とが位置するように上記マイクロチップを固定するように構成し、上記制御部には、参照部となる金属薄膜に照射され反射された光を受光した光検出器からの参照部となる金属薄膜に対する画像情報を解析し、検出部となる金属薄膜に照射され反射された光を受光した光検出器からの検出部となる金属薄膜に対する画像情報に含まれる光源から発せられた光の時間に対する強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動の影響を除去するように演算する機能を設ける。
（６）上記（１）（２）（３）または（４）のマイクロチップにおける検出部となる上記比較参照部と測定部の金属薄膜と参照部となる金属薄膜で反射した同一の光源から発せられた光を光検出器で受光し、上記光検出器で得られた検出部からの反射光測定結果から金属薄膜の光反射面とは反対側の表面の状態を測定する表面プラズモン共鳴による測定方法であって、上記光検出器で得られた参照部に対する画像情報の解析により、光源から発せられた光の時間に対する強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動を算出し、算出された光の時間に対する強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動に基づき、検出部からの反射光測定結果から光源の強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動の影響を取り除く。
【発明の効果】
【００３１】
本発明においては、以下の効果を得ることができる。
（１）試料を設置する検出部となる金属薄膜とは別に、第１のマイクロチップ基板もしくは第２のマイクロチップ基板上であって上記流路外に参照部となる金属薄膜を設けたので、検出部となる金属薄膜に照射される光の強度のばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動が存在しても、参照部で反射された光の強度の測定結果から上記光のばらつきおよび偏光特性の変動を求め、これに基づき、同時に測定される検出部の測定結果から、このばらつきおよび偏光特性の変動の影響を排除することができる。このため、精度の高い共鳴角変化を検出することができる。
（２）参照部となる金属薄膜を一様な媒質で覆うことにより、金属薄膜の表面の状態を一定に保つことができ、参照部となる金属薄膜の反射光から光源の強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動のみを検出することができる。
（３）参照部となる金属薄膜を第１のマイクロチップ基板と第２のマイクロチップ基板の接合により形成される閉空間内に含むように構成することにより、埃や飛沫などの異物が、参照部の金属薄膜表面に付着することはない。そのため、参照部の金属薄膜の表面状態が測定中に変化するという問題が起こるのを防ぐことができる。
（４）参照部となる金属薄膜を、流路の長手方向に垂直かつ検出部となる金属薄膜の中心を通る仮想線上からずれた位置に設けることにより、検出部となる流路と流路の間に、参照部となる金属薄膜が設けられる領域は存在せず、流路と流路の間の部分における両マイクロチップ基板同士の接合面積を比較的大きくすることができる。このため、両マイクロチップ基板間に、接合が不充分な部分が生ずるのを抑制することができる。
（５）上記マイクロチップ基板を使用する表面プラズモン共鳴センサ装置を、検出部と参照部を同時に照射する測定領域を実現する光源と、検出部と参照部からの反射光を同時に受光できる受光部となるＣＣＤ受光器から構成し、参照部からの反射光から光源から発せられた光の時間に対する強度ばらつきおよび上記光源からＣＣＤ受光器（光検出器）までの光路における偏光特性の変動を算出し、算出された光の時間に対する強度ばらつきおよび光路における偏光特性の変動に基づき、検出部からの反射光測定結果から光源の強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動の影響を取り除くようにしたので、光源から発せられる光の強度ばらつきおよび上記光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動が存在する場合でも、参照部の測定結果から強度ばらつきおよび偏光特性の変動のみを表すデータを得ることができ、同時に測定された検出部の測定結果から強度ばらつきおよび偏光特性の変動の影響を排除することができる。そのため、観測結果から精度の高い共鳴角変化を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明のマイクロチップの構造断面と、当該マイクロチップを用いた測定方法を説明する図である。
【図２】本発明における光強度のばらつきおよび光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動の補正方法を説明する図である。
【図３】図１において参照部となる金属薄膜を空間に露出させた場合の構成を示す図である。
【図４】本発明の実施例のマイクロチップの外観図である。
【図５】本発明の実施例のマイクロチップ各部分の詳細説明図である。
【図６】図５において検出部となる金属薄膜の中心を通る仮想線上に参照部となる金属薄膜を設けた場合を示す図である。
【図７】参照部となる金属薄膜を流路長手方向に垂直かつ検出部となる金属薄膜の中心を通る仮想線上からずれた位置に設けた場合を説明する図である。
【図８】本発明の実施例のマイクロチップの変形例を示す図である。
【図９】本発明の実施例のマイクロチップを用いたＳＰＲセンサ装置の構成例を示す図である。
【図１０】位置決め機構の詳細図である。
【図１１】ＳＰＲセンサ装置のおけるマイクロチップの位置決めを説明する図である。
【図１２】ＳＰＲセンサの原理を説明する図である。
【図１３】ＳＰＲセンサの構成例を示す図である。
【図１４】光源からの光の強度のばらつきおよび光源から光検出器までの光路における偏光特性の変動により生ずる誤差を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
図４に本発明の実施例のマイクロチップの外観図、図５にマイクロチップ各部分の詳細説明図を示す。
従来のマイクロチップと同様、本発明のマイクロチップ１０は一対の基板（第１のマイクロチップ基板１１、第２のマイクロチップ基板１２）が対向して接合された構造を有する。第１のマイクロチップ基板１１は、例えば、ポリジメチルシロキサン（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ：ＰＤＭＳ）などのシリコーン樹脂からなる。一方、上記したように第２のマイクロチップ基板１２は、プリズム２１と同じ材質のガラス基板からなる。なお、第２のマイクロチップ基板１２、プリズム２１の材質として環状オレフィン構造を有する樹脂を採用してもよい。
【００３４】
マイクロチップ基板１１，１２の接合は、第１のマイクロチップ基板１１表面に真空紫外光を照射して当該表面を活性化させた後、第２のマイクロチップ基板１２を貼り合わせて行われる。具体的には、例えば特許文献３や特許文献４に示されているように、第１のマイクロチップ基板１１に波長１７２ｎｍに輝線を有するエキシマランプからの光を照射して当該表面に改質処理（酸化処理）を施し、ガラス基板である第２のマイクロチップ基板１２を第１のマイクロチップ基板１１の被改質処理表面に密着させて、両基板を接合する。
【００３５】
図４、図５に示すマイクロチップ１０において、第２のマイクロチップ基板１２の表面に、例えば、幅１０〜数１００μｍ、深さ１０〜数１００μｍ程度の微細な流路１４および、幅１０〜数１００μｍ、深さ１０〜数１００μｍ程度の微細な閉空間１６が複数個形成されている。具体的には、第１のマイクロチップ基板１１に形成された微細な溝部および凹部と第２のマイクロチップ基板１２表面とにより、上記流路１４および閉空間１６が構成される。流路１４は、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）のそれぞれに設けられ、流路１４内には金属薄膜１３が設けられる。
以下では、比較参照部Ｍ１の流路、金属薄膜をそれぞれ流路１４ａ、金属薄膜１３ａといい、測定部Ｍ２の流路、金属薄膜をそれぞれ流路１４ｂ、金属薄膜１３ｂという。また、閉空間１６内に金属薄膜１５が設けられた部分を参照部Ｎという。なお、比較参照部Ｍ１については後述する。
また、マイクロチップ１０には位置決め用穴部１７Ａ，１７Ｂが設けられており、図４、図５においては、上側（比較参照部Ｍ１側）に設けられた位置決め用穴部を１７Ａといい、下側（測定部Ｍ２側）に設けられた位置決め用穴部を１７Ｂという。
【００３６】
ここでマイクロチップ１０に構成する流路１４および閉空間１６の数は１つでも複数でもよい。しかしながら複数回の測定を行う場合、流路１４および閉空間１６が１つの場合は測定の都度マイクロチップ１０を交換する必要があるので測定に要する時間が長くなる。
一方、１つのマイクロチップ１０に複数の流路１４および閉空間１６を設ける場合は、マイクロチップ１０の測定位置を測定の都度ずらすだけで複数回の測定を短時間で行うことが可能となる。また、第１の基板１１に溝部および凹部を１箇所成型する場合も複数箇所成型する場合も製造コストに差はあまりなく、１つのマイクロチップ１０に複数の流路１４および閉空間１６を設ける場合、マイクロチップ１０の接合工程が１回でよいので、流路１４および閉空間１６が１つのマイクロチップ１０を複数個用意するよりもコストダウンとなる。よって、マイクロチップ１０には複数個の流路１４および閉空間１６が形成される場合が多い。
【００３７】
図５（ａ）に示すように、本実施例のマイクロチップ１０には１０個の流路１４と５個の閉空間１６が設けられている。詳細には、上記マイクロチップ１０には、１列５個の流路１４が２列設けられおり、各列の流路１４および閉空間１６は等間隔、かつ、ほぼ直線状に配置されている。
後で述べる測定例のように１回の測定で２つの流路１４内の金属薄膜１３と１つの閉空間１６内の金属薄膜１５を使用する場合、このマイクロチップ１０では５回の測定を行うことが可能となっている。
【００３８】
図５（ｂ）（図５（ａ）のＡ−Ａ断面図）に示すように、流路１４（１４ｂ，１４ａ）は検体流入口１４１、検体流出口１４２を有し、流路１４（１４ｂ，１４ａ）内には検出部（比較参照部Ｍ１，測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３（１３ｂ，１３ａ）が設置される。金属薄膜１３（１３ｂ，１３ａ）は流路１４（１４ｂ，１４ａ）内の第２のマイクロチップ基板１２の表面（すなわち、第１および第２のマイクロチップ基板１１，１２の接合面側の面）上に設けられる。金属薄膜１３（１３ｂ，１３ａ）はクロム（Ｃｒ）薄膜上に金（Ａｕ）薄膜が積層された構造を有する。
抗体抗原反応をモニタリングする場合、金属薄膜１３（１３ｂ，１３ａ）上に抗体Ｉｇ（抗原受容体）が設置される。まず金属薄膜１３（１３ｂ，１３ａ）として採用した上記したＡｕ薄膜と例えばアルカンチオールとを反応させて当該Ａｕ薄膜上に自己組織化膜（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：ＳＡＭ膜）が形成される。そしてこのＳＡＭ膜と抗体Ｉｇとを化学的に結合させることにより、抗体ＩｇがＳＡＭ膜上に固定される。すなわち、金属薄膜１３（１３ｂ，１３ａ）上に抗体Ｉｇが固定される。
【００３９】
図５（ｃ）（図５（ａ）のＢ−Ｂ断面図）に示すように、上記マイクロチップ１０には閉空間１６内にも参照部Ｎとなる金属薄膜１５が５箇所設置される。金属薄膜１５は閉空間１６内の第２のマイクロチップ基板１２表面（すなわち、第１および第２のマイクロチップ基板１１，１２の接合面側の面）上に設けられる。金属薄膜１５はクロム（Ｃｒ）薄膜上に金（Ａｕ）薄膜が積層された構造を有する。これら参照部Ｎとなる金属薄膜１５は、測定中表面状態が一定になるよう保たれ、少なくとも一つの参照部となる金属薄膜１５が、測定時、上記検出部となる金属薄膜１３（１３ｂ，１３ａ）と同時に図５（ａ）で示される測定領域Ｒ内に含まれることが必要となる。
例えば、１回の測定で２流路１４ａ，１４ｂ内の金属薄膜１３ａ，１３ｂと１閉空間１６内の金属薄膜１５を使用する場合、検出部（比較参照部Ｍ１，測定部Ｍ２）となる２流路１４ａ，１４ｂ内の金属薄膜１３ａ，１３ｂと参照部Ｎとなる１閉空間１６内の金属薄膜１５とが測定領域Ｒ内に含まれることが必要となる。
ここで、測定領域Ｒとは、光源２２からの光がプリズム２１を介して第２のマイクロチップ基板１２の金属薄膜１３ａ，１３ｂ，１５が形成されている面を裏面側から照射する領域である。
ＳＰＲ測定装置において、光源２２からの光をこの検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）と参照部Ｎの金属薄膜１３ａ，１３ｂ，１５に同時に照射し、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）と参照部Ｎからの反射光を光検出器であるＣＣＤ（固体撮像素子）受光器２３で受光することにより、それぞれの反射光強度変化を画像情報として同時に検出でき、画像情報の解析より得られた参照部Ｎの測定結果を用いて、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）の測定結果から光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響を取り除くことが出来る。
【００４０】
図５に示した例では、閉空間１６内の参照部Ｎとなる金属薄膜１５を、流路１４ａ，１４ｂの長手方向に垂直かつ検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる流路１４ａ，１４ｂ内の金属薄膜１３ａ，１３ｂ（１回の測定で２流路内の金属薄膜を使用する場合、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜は１３ａ，１３ｂの２つとなる）の中心を通る仮想線上からずれた位置に設けているが、必ずしもこれに限るものではない。例えば、図６（ａ）に示すように検出部となる金属薄膜１３ａ，１３ｂの中心を通る仮想線上に参照部Ｎとなる金属薄膜１５を設けてもよい。
この場合は、図６（ｂ）に示す図６（ａ）のＥ−Ｅ断面拡大図から明らかなように、一つの断面上に検出部（比較参照部Ｍ１）を含む流路１４ａ、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動を取り除くための参照部Ｎを含む閉空間１６、検出部（測定部Ｍ２）を含む流路１４ｂが並列することになる。
【００４１】
ここで、例えば製造時に発生するばらつきにより、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３ａ，１３ｂや参照部Ｎとなる金属薄膜１５の第２のマイクロチップ１０表面上に占める面積が、設計における当該面積よりも一回り大きくなると、図６（ｃ）のように検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３ａ、１３ｂと参照部Ｎとなる金属薄膜１５の一部が、第１のマイクロチップ基板１１と第２のマイクロチップ基板１２に挟まれてなる接合阻害部Ｈが形成されることになり、結果として両マイクロチップ基板同士の接合面積が小さくなる。
特に、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３ａや金属薄膜１３ｂの中心を通る仮想線上に参照部Ｎとなる金属薄膜１５を設ける場合、図６（ｃ）に示すように、流路１４ａと閉空間１６とを分離する部位や、流路１４ｂと閉空間１６とを分離する部位における両マイクロチップ基板同士の接合面積は著しく小さくなる。
このような状態では、測定時のハンドリングで生じる衝撃や薬液の送液などによる負荷が流路１４ａ，１４ｂと閉空間１６とを分離する部位に加えられると、当該部位の接合が容易に破られ、検出部を内包する流路１４ａや流路１４ｂから試薬等が閉空間１６内に流入する可能性がある。
【００４２】
一方、図５（ａ）に示すように、参照部となる金属薄膜１５を流路１４ａ，１４ｂの長手方向に垂直かつ検出部となる金属薄膜１３ａ，１３ｂの中心を通る仮想線上からずれた位置に設けた場合、図７（ｄ）に示す図５（ａ）のＣ−Ｃ断面拡大図から明らかなように、流路１４ａと流路１４ｂとを含む一つの断面上において流路１４ａと流路１４ｂとの間に閉空間１６は存在せず、流路１４ａと流路１４ｂとを分離する部位における両マイクロチップ基板同士の接合面積も比較的大きくなる。
そのため、製造時に発生するばらつきにより、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３ａ、１３ｂや参照部Ｎとなる金属薄膜１５の第２のマイクロチップ１０表面上に占める面積が設計における当該よりも大きくなって、図７（ｅ）に示すように接合阻害部Ｈが形成されたとしても、流路１４ａと流路１４ｂとを分離する部位における両マイクロチップ基板同士の接合面積は比較的大きいため、上記接合阻害部がもたらす接合面積の減少の影響は小さくなる。
【００４３】
また、図７（ｆ）に示す図５（ａ）のＤ−Ｄ断面拡大図から明らかなように、閉空間１６を含む一つの断面上において、閉空間１６の両側には流路１４ａおよび流路１４ｂは存在するが、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３ａ、１３ｂは存在しない。
そのため、製造時に発生するばらつきにより、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３ａ，１３ｂや参照部Ｎとなる金属薄膜１５の第２のマイクロチップ１０表面上に占める面積が設計における当該よりも大きくなって、図７（ｇ）に示すように、接合阻害部Ｈが形成されたとしても、閉空間１６を含む一つの断面上には検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３ａ、１３ｂが存在しない。よって、当該断面上において形成され得る接合阻害部Ｈは、金属薄膜１５に起因するもののみとなる。
よって、図６（ａ）に示すような検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる金属薄膜１３ａ，１３ｂの中心を通る仮想線上に参照部Ｎとなる金属薄膜１５を設ける場合と比較すると、接合阻害部がもたらす流路１４ａと閉空間１６とを分離する部位や、流路１４ｂと閉空間１６とを分離する部位における両マイクロチップ基板同士の接合面積の減少は抑制され、閉空間１６は比較的強固に保たれることになる。
したがって、参照部Ｎとなる金属薄膜１５は、流路１４ａ，１４ｂの長手方向に垂直かつ検出部となる金属薄膜１３ａ，１３ｂの中心を通る仮想線上からずれた位置に設ける方が望ましい。
【００４４】
図８に前記実施例のマイクロチップの変形例を示す。本変形例のマイクロチップは、図４、図５に示したマイクロチップと同様に一対の基板接合された構造を有し、比較参照部Ｍ１測定部Ｍ２と、参照部Ｎを備えており、基本的構成は図４、図５に示したものと同様である。
図８（ａ）のＡ−Ａ断面は、図８（ｂ）に示すように図５（ｂ）に示したものと同様であるが、図８（ａ）のＢ−Ｂ断面に示すように、参照部Ｎの構造が図５（ｂ）に示したものと相違している。
すなわち、参照部Ｎを構成する金属薄膜１５が、閉空間１６の上側の面、すなわち、閉空間１６内であって第１のマイクロチップ基板１１面上に設けられている。
本実施例のマイクロチップにおいて、前記図４、図５に示したマイクロチップと同様、光源からの光が第２のマイクロチップ基板１２を介して、参照部Ｎの金属薄膜１５に入射して、反射し、比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２の金属薄膜１３ａ，１３ｂで反射した光とともに、光検出器であるＣＣＤ（固体撮像素子）受光器２３で受光される。
【００４５】
図９に、上記本発明の実施例のマイクロチップ１０を用いたＳＰＲセンサ装置の構成例を示す。なおここでは、上記ＳＰＲセンサ装置を、抗体抗原反応をモニタリングするバイオセンサとして使用する場合を例に取る。
ここで図９（ａ）はＳＰＲセンサ装置の側面図、図９（ｂ）はＳＰＲセンサ装置の上面図、図９（ｃ）は図９（ｄ）のＢ−Ｂ断面図、図９（ｄ）は図９（ｂ）のＡ−Ａ断面図である。
【００４６】
図９に示すＳＰＲ装置は、底面側に設けられた底板３３（図９（ｃ）（ｄ）参照）と、側面側に設けられた２枚の長手方向側板３２（図９（ｂ）（ｃ）参照）および２枚の側板３１（図９（ａ）（ｂ）参照）と、上面側に設けられた２枚の試料固定部２４（図９（ｂ）（ｃ）参照）とから構成される筐体構造を有する。
なお、図９において、２枚の試料固定部２４の間隔は、第２のマイクロチップ基板１２の短手方向の長さよりも狭く、測定領域内に含まれる第二のマイクロチップ基板上の金属薄膜１３ａ，１３ｂ，１５への光照射を妨げない程度に広く設定されている。
【００４７】
ＳＰＲセンサ装置上に設置されたマイクロチップ１０は、マイクロチップ１０に設けられた流路１４ａ，１４ｂおよび閉空間１６が、所定の測定領域Ｒに位置するよう位置決めされる。
試料固定部２４の裏面側には、プリズム保持部２１ａにより保持されたプリズム２１、光源２２、偏光子２２ａ、レンズ２２ｂ、ＣＣＤ受光器２３が設けられ、流路１４ａ，１４ｂおよび閉空間１６が所定の測定領域Ｒに位置決めされると、プリズム駆動機構２１ｂによりプリズム２１がマイクロチップ１０の下面に接触し、光源２２から放出され偏光素子２２ａによりＰ偏光となった光は、流路１４ａ，１４ｂ内の金属薄膜１３ａ，１３ｂおよび参照部Ｎに相当する閉空間１６内の金属薄膜１５に照射され、反射光がＣＣＤ受光器２３に入射する。
【００４８】
前記図５（ａ）に示したように、本実施例のマイクロチップ１０には１０個の流路１４ａ，１４ｂと５個の閉空間１６が設けられている。図５に示す例においては、１０個の流路１４ａ，１４ｂのうちの検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）となる２個の流路１４ａ，１４ｂ内の金属薄膜１３ａ，１３ｂと、５個の閉空間１６のうちの１つの参照部Ｎに光が照射されるように、上記測定領域Ｒは設定されている。すなわち、１つのマイクロチップ１０で５回の測定が可能となっている。なお、後で述べるように、２個の流路１４ａ，１４ｂ内の各金属薄膜１３ａ，１３ｂはそれぞれ比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２として用いられる。
【００４９】
マイクロチップ１０の位置決めは図９に示す位置決め機構２５によって行われる。
図１０に位置決め機構の詳細図を示す。
位置決め機構２５は、位置決め機構本体２５ａと位置決めピン２５ｂと固定用ねじ２５ｃとからなる。位置決めピン２５ｃは位置決め機構本体２５ａに嵌め込まれており、位置決めピン２５ｃの一部は位置決め機構本体２５ａの下面より突出している。ここで、突出長さをｄ、試料固定部の厚みをｔ１、第１のマイクロチップ基板１１の厚みをｔ２、第２のマイクロチップ基板１２の厚みをｔ３としたとき、これらの長さにはｔ２＋ｔ３＜ｄなる関係がある。また、位置決めを確実にするためには、ｄ≧ｔ１＋ｔ２＋ｔ３なる関係を満足することが望ましい。一方、固定用ねじ２５ｃは位置決め機構本体２５ａに設けられた固定用ねじ貫通穴部２５ｄに挿入される。
【００５０】
図４、図５（ａ）、図８（ａ）に示したように、マイクロチップ１０の長手方向側の両側において、一方には位置決め用穴部１７Ａ（Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５）が所定の間隔Ｌで複数個設けられ、他方には位置決め用穴部１７Ｂ（Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５）が所定の間隔Ｌで複数個設けられている。位置決め用穴部１７Ａと位置決め用穴部１７Ｂは、それぞれ1個ずつ、各穴部の中心が、マイクロチップ１０の長手方向に直交する直線上にほぼ位置するように設定されている。すなわち、位置決め用穴部Ａ１と位置決め用穴部Ｂ１との中心、位置決め用穴部Ａ２と位置決め用穴部Ｂ２との中心、位置決め用穴部Ａ３と位置決め用穴部Ｂ３との中心、位置決め用穴部Ａ４と位置決め用穴部Ｂ４との中心、位置決め用穴部Ａ５と位置決め用穴部Ｂ５との中心が、それぞれ、マイクロチップ１０の長手方向に直交する直線上にほぼ位置するように設定されている。この直線上の位置決め用穴部１７Ａと位置決め用穴部１７Ｂを、以下、一対の位置決め用穴部と称することにする。
【００５１】
図５（ａ）、図８（ａ）に示すように、一対の位置決め穴部１７Ａ，１７Ｂと検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）における流路１４ａ（ａ１，ａ２，ａ３，ａ４，ａ５），流路１４ｂ（ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４，ｂ５）中の金属薄膜１３ａ（ｃ１．ｃ２．ｃ３．ｃ４．ｃ５）、金属薄膜１３ｂ（ｄ１，ｄ２，ｄ３，ｄ４，ｄ５）および参照部Ｎにおける閉空間１６（ｘ１，ｘ２，ｘ３，ｘ４，ｘ５）の金属薄膜１５（ｙ１，ｙ２，ｙ３，ｙ４，ｙ５）との位置関係は一定に設定されている。
すなわち、一対の位置決め穴部Ａ１，Ｂ１と流路ａ１中の金属薄膜ｃ１，流路ｂ１中の金属薄膜ｄ１，閉空間ｘ１中の金属薄膜ｙ１との位置関係と、一対の位置決め穴部Ａ２，Ｂ２と流路ａ２中の金属薄膜ｃ２，流路ｂ２中の金属薄膜ｄ２，閉空間ｘ２中の金属薄膜ｙ２との位置関係とは同一である。
同様に、これらの位置関係は、一対の位置決め穴部Ａ３，Ｂ３と流路ａ３中の金属薄膜ｃ３，流路ｂ３中の金属薄膜ｄ３，閉空間ｘ３中の金属薄膜ｙ３との位置関係、一対の位置決め穴部Ａ４，Ｂ４と流路ａ４中の金属薄膜ｃ４，流路ｂ４中の金属薄膜ｄ４，閉空間ｘ４中の金属薄膜ｙ４との位置関係、一対の位置決め穴部Ａ５，Ｂ５と流路ａ５中の金属薄膜ｃ５，流路ｂ５中の金属薄膜ｄ５，閉空間ｘ５中の金属薄膜ｙ５との位置関係と同一である。
【００５２】
一方、図９、図１０に示すように、ＳＰＲ装置の試料固定部２４には、位置決めピン貫通穴部２４ｂと固定用ねじ穴部２４ａが設けられている。これらの穴部は各試料固定部２４にそれぞれ一箇所ずつ設けられている。そして図９（ｂ）に示すように、２つの位置決めピン貫通穴部２４ｂの中心が試料固定部２４の長手方向に直交する直線上にほぼ位置するように、各試料固定部２４における上記位置決めピン貫通穴部２４ｂの位置が設定されている。
この各試料固定部２４に設けられたほぼ同一直線上にある２つの位置決めピン貫通穴部２４ｂの各中心位置と、マイクロチップ１０に設けられた一対の位置決め用穴部１７Ａ，１７Ｂの各中心位置とを略一致させることにより、マイクロチップ１０の位置決めが行われる。
【００５３】
マイクロチップ１０の位置決めは以下のように行われる。まず、ＳＰＲセンサ装置の試料固定部２４に設置されたマイクロチップ１０の一対の位置決め用穴部１７Ａ，１７Ｂと各試料固定部２４にそれぞれ設けられた位置決めピン貫通穴部２４ｂとの位置を合わせる。次に、位置決め機構本体２５ａの下面から突出した位置決めピン２５ｂが位置決め用穴部１７Ａ，１７Ｂおよび位置決めピン貫通穴部２４ｂの双方に挿入されるように、マイクロチップ１０の位置を調整する。この後固定用ねじ２５ｃと試料固定部２４に設けられている固定用ねじ穴部２４ａとにより各位置決め機構２５をねじ止めする。
【００５４】
ここで、マイクロチップ１０に設けられた一対の位置決め用穴部１７Ａ，１７Ｂの位置と試料固定部２４に設けられた位置決めピン貫通穴部２４ｂの位置は、マイクロチップ１０が位置決めされたときこのマイクロチップ１０の２つの流路１４ａ，１４ｂおよび１つの閉空間１６が測定領域Ｒに位置するように各々設定されている。
すなわち、図５における一対の位置決め用穴部Ａ１およびＢ１と、各位置決めピン貫通穴部２４ｂとが位置決めされると、検出部（後述する比較参照部Ｍ１）に相当する流路ａ１内の金属薄膜ｃ１と検出部（後述する測定部Ｍ２）に相当する流路ｂ１内の金属薄膜ｄ１と参照部Ｎに相当する閉空間ｘ１内の金属薄膜ｙ１とが測定領域Ｒ内に位置決めされる。
【００５５】
同様に、一対の位置決め用穴部Ａ２およびＢ２と各位置決めピン貫通穴部２４ｂとが位置決めされると流路ａ２内の金属薄膜ｃ２と流路ｂ２内の金属薄膜ｄ２と閉空間ｘ２内の金属薄膜ｙ２とが測定領域Ｒ内に位置決めされ、一対の位置決め用穴部Ａ３およびＢ３と各位置決めピン貫通穴部２４ｂとが位置決めされると流路ａ３内の金属薄膜ｃ３と流路ｂ３内の金属薄膜ｄ３と閉空間ｘ３内の金属薄膜ｙ３とが測定領域Ｒ内に位置決めされ、一対の位置決め用穴部Ａ４およびＢ４と各位置決めピン貫通穴部２４ｂとが位置決めされると流路ａ４内の金属薄膜ｃ４と流路ｂ４内の金属薄膜ｄ４と閉空間ｘ４内の金属薄膜ｙ４とが測定領域内に位置決めされ、一対の位置決め用穴部Ａ５およびＢ５と各位置決めピン貫通穴部とが位置決めされると流路ａ５内の金属薄膜ｃ５と流路ｂ５内の金属薄膜ｄ５と閉空間ｘ５内の金属薄膜ｙ５とが測定領域内に位置決めされる。
【００５６】
以下、ＳＰＲ装置を用いて、試薬中の抗原濃度を測定する場合の測定手順の例を示す。
測定には２つの流路１４（１４ａ，１４ｂ）と１つの閉空間１６を用いる。図５（ａ）に示すように、測定領域に位置する２つの流路１４ａ，１４ｂのうち、一方の流路１４ａは比較参照部Ｍ１として用いられ、他方の流路１４ｂは検体中の抗原濃度を測定するための測定部Ｍ２として用いられる。すなわち、図５において検出部とは比較参照部Ｍ１と測定部Ｍ２の２つの金属薄膜１３ａ，１３ｂをまとめて表している。一方、閉空間１６は得られた測定結果から光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響を排除するための参照部Ｎとして用いられる。
【００５７】
（１）まず、プリズム保持部２１ａに設置されたプリズム２１表面にマッチングオイルＭＯを塗布する。
制御部４０によりプリズム駆動機構２１ｂの駆動を制御して、プリズム保持部２１ａの位置を上方に移動させ、マッチングオイルＭ０が塗布されたプリズム２１表面と、マイクロチップ１０の下面（第２のマイクロチップ基板１２の下面）とを接触させる。上記したように、第２のマイクロチップ基板１２はプリズム２１と同じ材質のガラス基板であり、マッチングオイルはこのガラス材料と同一の屈折率をもった媒質であるので、マイクロチップ１０とプリズム２１とは光学的に接合される。
【００５８】
（２）制御部４０により光源２２を駆動する。光源２２は、例えば、半導体レーザ光源２２（以下、ＬＤ光源２２ともいう）であり、例えば波長７６０ｎｍの光を放出する。このＬＤ光源２２から放出された光は偏光素子２２ａによりＰ偏光の光となり、レンズ２２ｂによって平行光にコリメートされる。
（３）この平行光は、測定領域Ｒにある比較参照部Ｍ１に相当する流路１４ａ内の金属薄膜１３ａと測定部Ｍ２に相当する流路１４ｂ内の金属薄膜１３ｂおよび参照部Ｎに相当する閉空間１６内の金属薄膜１５に照射され、３箇所の金属薄膜１３ａ，１３ｂ，１５による反射光がＣＣＤ受光器２３に到達する。
【００５９】
（４）次に図示を省略した検体供給手段により、濃度が既知である抗原を含有する液体状の検体を比較参照部Ｍ１の流路１４ａの検体流入口１４１より注入し、検体流出口１４２より排出させる。これにより、流路１４ａ中の金属薄膜１３ａ上に固定されている抗体Ｉｇと抗原とが反応して結合する。
（５）一方、同じく図示を省略した検体供給手段により、抗原濃度が未知である抗原を含有する液体状の検体を測定部Ｍ２の流路１４ｂの検体流入口１４１より注入し、検体流出口１４２より排出させる。これにより、流路１４ｂ中の金属薄膜１３ｂ上に固定されている抗体Ｉｇと抗原とが反応して結合する。
（６）ここで比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２に注入・排出する検体は、含有する抗原の濃度が相違するので、比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２の各々の金属薄膜１３ａ，１３ｂに固定された抗体Ｉｇの状態も相違する。よって、各金属薄膜１３ａ，１３ｂ表面での屈折率変化や表面プラズモン共鳴角も相違するので、ＳＰＲにより強度が減衰した反射光のＣＣＤ受光器２３受光面上の強度も互いに相違する。
【００６０】
一方、閉空間１６内の参照部Ｎとなる金属薄膜１５は抗体抗原反応の間も、その表面の状態は一定に保たれているため、測定中、光源２２からの光の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動以外に受光面上の強度を変化させる要因を持たない。そのため、比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２の各々の金属薄膜１３ａ，１３ｂからの反射光は、抗原抗体反応による表面状態の変化と光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響が交じり合っているが、参照部Ｎの金属薄膜１５からの反射光は光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響のみを含んだものであるとみなすことが出来る。
【００６１】
制御部４０は、ＣＣＤ受光器２３受光面に到達した３つの金属薄膜１３ａ，１３ｂ，１５からの反射光の強度を画像情報として受信し、比較参照部Ｍ１と測定部Ｍ２の共鳴角変化を解析・比較して、金属薄膜１３ａ，１３ｂ表面にて発生した抗体抗原反応の状態（抗体Ｉｇと抗原との結合特性等）を特定する。例えば、測定部Ｍ２に注入した検体内の抗原濃度が算出されるが、この時参照部Ｎからの測定結果を用いて上記２つの測定結果から光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響を排除することで、さらに精度の高い結果を得ることができる。
すなわち、制御部４０は、前記したように検出部（測定部Ｍ２および比較参照部Ｍ１）の観測シグナルＩSensingの時間変化を参照部Ｎの観測シグナルＩRefの時間変化を用いて光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動を補正した検出部の観測シグナルＩcorrectedの時間変化を求める。そして、測定部の光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の補正シグナルと、比較参照部Ｍ１の光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の補正シグナルとを用いて、比較参照部Ｍ１と測定部Ｍ２の共鳴角変化を解析・比較して、金属薄膜１３ｂ表面にて発生した抗体抗原反応の状態（抗体Ｉｇと抗原との結合特性等）を特定する。
【００６２】
（７）図５の流路ａ１とｂ１および閉空間ｘ１の隣に位置する流路ａ２とｂ２および閉空間ｘ２を用いて２回目の測定を行う場合は、以下の手順で行う。まず、制御部４０によりプリズム駆動機構２１ｂの駆動を制御して、プリズム保持部２１ａの位置を下方に移動させ、マッチングオイルが塗布されたプリズム２１表面と、マイクロチップ１０の下面（第２のマイクロチップ基板１２の下面）とを離間させる。
（８）次に、マイクロチップ１０の位置決めを行う。図１１に２回目以降の位置決め手順を示す。図１１（ａ）は１回目の測定におけるマイクロチップ１０の配置を示す。測定領域には、比較参照部Ｍ１および測定部Ｍ２の流路に相当する流路ａ１とｂ１と参照部用の閉空間１６に相当するｘ１が位置している。
図１１（ｂ）に示すように、まず位置決め機構２５が解除され、次に流路ａ２とｂ２および閉空間ｘ２が測定領域に位置するようマイクロチップ１０が矢印方向に移動する。そして、一対の位置決め用穴部Ａ２およびＢ２（図５（ａ）参照）の各中心位置と、各試料固定部２４に設けられた２つの位置決めピン貫通穴部２４ｂ（図９（ａ）、図１０参照）の各中心位置とを略一致させる。次に、図１１（ｃ）に示すように、位置決め機構２５により、マイクロチップ１０の位置決めを行う。
【００６３】
（９）その後、上記した手順（１）〜（６）を実行することにより２回目の測定が行われる。
（１０）流路ａ３とｂ３および閉空間ｘ３を用いた３回目の測定、流路ａ４とｂ４および閉空間ｘ４を用いた４回目の測定、流路ａ５とｂ５および閉空間ｘ５を用いた５回目の測定も、上記した２回目の測定と様な手順を経て行われる。すなわち、試料固定部２４の長さは、マイクロチップ１０の流路ａ１とｂ１および閉空間ｘ１を測定する場合も、マイクロチップ１０の流路ａ５とｂ５および閉空間ｘ５を測定する場合もマイクロチップ１０を上記試料固定部上面に設置することが可能な長さとなっている。
【００６４】
２回目〜５回目の測定においても、それぞれの測定時に測定領域内にある閉空間１６内の参照部Ｎから得られる測定結果を用いて、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動に関するデータを得ることができ、それを用いて測定部と比較参照部からの反射光による測定結果から強度ばらつきおよび偏光特性の変動の影響を排除し、精度の高い共鳴角の検出および抗原濃度検出などの測定を行うことが出来る。
【００６５】
以上のように、本発明のマイクロチップ１０は、一方の面に溝部が形成されている第１のマイクロチップ基板１１と第２のマイクロチップ基板１２とを接合した構造であって、第２のマイクロチップ基板１２の接合面上に表面プラズモン共鳴を用いた測定用の金属薄膜１３が施される以外に、第１のマイクロチップ基板１１と第２のマイクロチップ基板１２とを接合することで外界から遮断した閉空間１６内に金属薄膜１５が設けられる構造を有しているため、光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動のみを測定することができる。そのため、閉空間１６内の金属薄膜１３からの反射光の測定結果を用いて、検出部となる金属薄膜１３の反射光の測定結果から光源２２の強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動の影響を排除し、精度の高い観測結果を得ることができる。
【００６６】
特に、第２のマイクロチップ基板１２がガラスもしくは環状オレフィン構造を持つ樹脂からなり、第１のマイクロチップ基板１１と比較して第２のマイクロチップ基板１２の方が大きくなるように構成すると、両者を接合した際、第２のマイクロチップ基板１２の接合面は第１のマイクロチップ基板１１から突出した状態となる。マイクロチップ１０の支持は、第２のマイクロチップ基板１２と試料固定部上面とにより行われる。第２のマイクロチップ基板１２はガラスや環状オレフィン構造を有する樹脂といった比較的硬い材質からなるので、マイクロチップ１０に作用する重力の影響を受けても変形せず、また、マッチングオイルを介したプリズム２１接合時や検体供給手段の検体送液用チューブをマイクロチップ１０の流路１４に接続する際にプリズム２１やチューブを介してマイクロチップ１０に対してある程度の力が作用しても変形しない。そのため、第２のマイクロチップ基板１２上にある金属薄膜１３の位置が測定中にずれてしまう可能性は生じない。
【００６７】
ここで、マイクロチップ１０に金属薄膜１３を内部に内包する流路１４を複数設ける場合、各流路１４内の金属薄膜１３の位置が同一直線上に配置されていると、各測定を行う場合のマイクロチップ１０の位置決めは、この同一直線と同じ方向にずらすことにより行うことができる。すなわち、図５（ａ）に示すように、金属薄膜ｃ１、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５の位置をほぼ同一線上に配置し、金属薄膜ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４、ｄ５の位置をほぼ同一線上に配置し、金属薄膜ｙ１、ｙ２、ｙ３、ｙ４、ｙ５の位置をほぼ同一線上に配置することにより、マイクロチップ１０をこの直線と同方向の一次元方向に移動させることにより、金属薄膜ｃ１とｄ１とｙ１、ｃ２とｄ２とy２、ｃ３とｄ３とｙ３、ｃ４とｄ４とｙ４、ｃ５とｄ５とｙ５をそれぞれ測定領域内に配置することができる。
【００６８】
本発明のマイクロチップ基板を使用するＳＰＲセンサ装置は、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）と参照部Ｎを同時に照射する測定領域を実現する光源２２と、検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）と参照部Ｎからの反射光を同時に受光できる受光部となるＣＣＤ受光器２３を有している。よって、光源２２から発せられる光に強度ばらつきおよび光源２２からＣＣＤ受光器２３までの光路における偏光特性の変動が存在する場合でも、参照部Ｎの測定結果から強度ばらつきおよび偏光特性の変動のみを表すデータを得ることができ、同時に測定された検出部（比較参照部Ｍ１、測定部Ｍ２）の測定結果から強度ばらつきおよび偏光特性の変動の影響を排除することができる。そのため、観測結果から精度の高い共鳴角変化を検出することができる。
【符号の説明】
【００６９】
１０      マイクロチップ
１１      第１のマイクロチップ基板
１２      第２のマイクロチップ基板
１３，１３ａ，１３ｂ  金属薄膜
１４，１４ａ，１４ｂ  流路
１４１    検体流入口
１４２    検体流出口
１５      金属薄膜
１６      閉空間
１７Ａ，１７Ｂ  位置決め用穴部
２０      ＳＰＲセンサ装置（表面プラズモン共鳴測定装置）
２１      プリズム
２１ａ    プリズム保持部
２２      光源
２２ａ    偏光子
２２ｂ    レンズ
２３      ＣＣＤ受光器
２４      試料固定部
２４ａ    固定用ねじ穴部
２４ｂ    位置決めピン貫通穴部
２５      位置決め機構
２５ａ    位置決め機構本体
２５ｂ    位置決めピン
２５ｃ    固定用ねじ
２５ｄ    固定用ねじ貫通穴部
３１      側板
３２      長手方向側板
３３      底板
３４      マイクロチップ搬入・退出部
３５      押付け機構
３５ａ    押付け機構保持部
４０      制御部
Ｉｇ      抗体
Ｌ        基準面
Ｍ１      比較参照部
Ｍ２      測定部
Ｎ        参照部
ＭＯ      マッチングオイル
Ｒ        測定領域
【図１】
0005772238.tif 000002
【図２】
0005772238.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005772238.tif 000007
【図７】
0005772238.tif 000008
【図８】
0005772238.tif 000009
【図９】
0005772238.tif 000010
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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