(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に少なくとも金属部材、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）及びリガンドを備え、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用する蛍光測定装置用センサチップを用いたアッセイ方法において、
前記自己組織化単分子膜上に親水性高分子層を形成し、前記親水性高分子層の層中および／または外面に前記リガンドが固定化された蛍光測定装置用センサチップを用い、前記親水性高分子層に保湿剤を接触させることを特徴とするアッセイ方法。
【請求項２】
前記親水性高分子層は、０．００１ｎｇ／ｍｍ2以上３０ｎｇ／ｍｍ2以下の高分子を含有する請求項１に記載のアッセイ方法。
【請求項３】
前記親水性高分子層は、０．２ｎｇ／ｍｍ2以上６ｎｇ／ｍｍ2以下の高分子を含有する請求項１に記載のアッセイ方法。
【請求項４】
前記親水性高分子層は、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種類の高分子を含む請求項１〜３の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項５】
前記ポリサッカライドは、デキストランまたはデキストラン誘導体である請求項４に記載のアッセイ方法。
【請求項６】
前記ポリサッカライドは、カルボキシメチルデキストランである請求項５に記載のアッセイ方法。
【請求項７】
前記保湿剤は、尿素、エチレングリコール、グリセリン、アンモニウム乳酸塩、カルボン酸ピロリドン、ジオール、乳酸、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸からなる群から選択される少なくとも一種類の物質である請求項１〜６の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項８】
前記保湿剤は、尿素、エチレングリコール、グリセリンおよびアンモニウム乳酸塩からなる群から選択される少なくとも一種類の物質である請求項１〜６の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項９】
前記親水性高分子層は、平均膜厚が３ｎｍ以上１３０ｎｍ以下である請求項１〜８の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
前記親水性高分子層は、平均膜厚が５０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である請求項１〜８の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１１】
前記保湿剤は、Ｒｉｖｉｅｒｅ法による再水和標本水分が４０〜２００％である請求項１〜１０の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１２】
前記リガンドは前記親水性高分子層に固定化され、前記固定化されたリガンドは、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ2以下である請求項１〜１１の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１３】
前記保湿剤は、アナライトを含む溶液に予め添加され、前記保湿剤が予め添加された前記アナライトを含む溶液を前記親水性高分子層に接触させることにより、前記保湿剤を前記親水性高分子層に接触させる請求項１〜１２の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１４】
前記保湿剤が予め添加されたアナライト溶液中の前記保湿剤の濃度が５〜３０％である請求項１３に記載のアッセイ方法。
【請求項１５】
前記保湿剤は、アナライトを含む溶液を前記リガンドと接触させる前に前記蛍光測定装置用センサチップ内を洗浄する洗浄液に予め添加され、前記保湿剤が予め添加された洗浄液を前記親水性高分子層に接触させることにより、前記保湿剤を前記親水性高分子層に接触させる請求項１〜１２の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１６】
前記保湿剤が予め添加された洗浄液中の前記保湿剤の濃度が５〜３０％である請求項１５に記載のアッセイ方法。
【請求項１７】
前記支持体は、透明支持体である請求項１〜１６の何れか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７の何れか一項に記載のアッセイ方法に用いられ、支持体上に少なくとも金属部材、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）及び親水性高分子層を備えた蛍光測定装置用センサチップと、保湿剤とを含むことを特徴とするアッセイ用キット。
【請求項１９】
前記親水性高分子層の乾燥膜厚は、１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である請求項１８に記載のアッセイ用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ〕を利用する蛍光測定装置用センサチップを用いたアッセイ方法、および当該蛍光測定装置用センサチップを含むアッセイ用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（以下、単に「ＳＰＦＳ」という）は、誘電体上に形成された金属膜表面に全反射減衰〔ＡＴＲ〕が生じる条件においてレーザ光等の励起光を照射し、金属膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強される表面プラズモン共鳴を利用して、金属膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光色素を効率的に励起させ、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。
【０００３】
このようなＳＰＦＳに用いるセンサ基板が、特許文献１に記載されている。特許文献１には、図２に示すようなセンサ・ユニット１００が開示されており、センサ・ユニット１００には、ガラスやプラスチックその他の透明な材料で作られた透明プレートと、該プレートの片面にスパッタリングで形成された金属フィルムと、該金属フィルムに結合したデキストラン層（デキストラン・フィルム）と、該デキストラン・フィルムに結合されたリガンド（抗体）とが包含されている。このリガンドは、サンプル溶液内に存在する特定のバイオ分子（例えば、抗原）と相互作用（抗原抗体反応）するものであり、特許文献１には可変角内部全反射蛍光発光なるＳＰＦＳを利用した蛍光測定等を行うことについて記載されている。
【０００４】
ここで、特許文献１では、上述したように、抗原抗体反応を用いてアナライトを検出している。しかしながら、特許文献１に記載の当該抗原抗体反応では、抗体と抗原との免疫反応が未だ十分ではないという問題がある。一般に、抗体と抗原との免疫反応の反応性を増強させることで、それに比例して検出すべきアッセイ発光シグナルが増強され、抗体と抗原との反応性が向上する。
【０００５】
しかし、その一方で抗体と抗原との免疫反応の反応性が向上する分、非特異的反応も増強されてノイズ成分であるアッセイノイズシグナルも向上してしまい、結果としてアナライトの測定感度向上にはつながっていなかった。そこで、このアッセイノイズシグナルの向上を抑制して測定感度を向上させるために、抗原または抗体をポリエチレングリコール及び尿素の両者と混合し、これらポリエチレングリコール及び尿素の共存下に抗原と抗体とを反応させる方法が特許文献２に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２０１０−１４５２０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載のポリエチレングリコール及び尿素を混合して抗原抗体反応を行うことは、測定感度が従来よりも向上するものの、この技術をＳＰＦＳに転用したとしても、ＳＰＦＳにおける極微量および／または極低濃度のアナライトの高精度検出を実現するには不十分であり、アッセイ発光シグナルとアッセイノイズシグナルとの比であるＳ（アッセイ発光シグナル）／Ｎ（アッセイノイズシグナル）比（測定感度）の向上が限定的であることが解った。
【０００８】
また、特許文献２に記載のように、ポリエチレングリコールを溶液中に混合させる形態では、その濃度に限界がある。
すなわち、例えば、あまりに高濃度でポリエチレングリコールを溶液中に混合させると、当該溶液の粘度が高くなり過ぎてしまい反応性が低下し、Ｓ（アッセイ発光シグナル）が低下する。
【０００９】
本発明は、以上のような従来技術の問題に鑑み、従来よりもさらにＳ／Ｎ比を向上できる、ＳＰＦＳを利用する蛍光測定装置用センサチップを用いたアッセイ方法およびアッセイ用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[1]支持体上に少なくとも金属部材、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）及びリガンドを備え、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用する蛍光測定装置用センサチップを用いたアッセイ方法において、前記自己組織化単分子膜上に親水性高分子層を形成し、前記親水性高分子層の層中および／または外面に前記リガンドが固定化された蛍光測定装置用センサチップを用い、前記親水性高分子層に保湿剤を接触させることを特徴とするアッセイ方法。
【００１１】
[2]前記親水性高分子層は、０．００１ｎｇ／ｍｍ2以上３０ｎｇ／ｍｍ2以下の高分子を含有する[1]に記載のアッセイ方法。
[3]前記親水性高分子層は、０．２ｎｇ／ｍｍ2以上６ｎｇ／ｍｍ2以下の高分子を含有する[1]に記載のアッセイ方法。
【００１２】
[4]前記親水性高分子層は、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種類の高分子を含む[1]〜[3]の何れかに記載のアッセイ方法。
【００１３】
[5]前記ポリサッカライドは、デキストランまたはデキストラン誘導体である[4]に記載のアッセイ方法。
[6]前記ポリサッカライドは、カルボキシメチルデキストランである[5]に記載のアッセイ方法。
【００１４】
[7]前記保湿剤は、尿素、エチレングリコール、グリセリン、アンモニウム乳酸塩、カルボン酸ピロリドン、ジオール、乳酸、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸からなる群から選択される少なくとも一種類の物質である[1]〜[6]の何れかに記載のアッセイ方法。
【００１５】
[8]前記保湿剤は、尿素、エチレングリコール、グリセリンおよびアンモニウム乳酸塩からなる群から選択される少なくとも一種類の物質である[1]〜[6]の何れかに記載のアッセイ方法。
【００１６】
[9]前記親水性高分子層は、平均膜厚が３ｎｍ以上１３０ｎｍ以下である[1]〜[8]の何れかに記載のアッセイ方法。
[10]前記親水性高分子層は、平均膜厚が５０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である[1]〜[8]の何れかに記載のアッセイ方法。
【００１７】
[11]前記保湿剤は、Ｒｉｖｉｅｒｅ法による再水和標本水分が４０〜２００％である[1]〜[10]の何れかに記載のアッセイ方法。
[12]前記リガンドは前記親水性高分子層に固定化され、前記固定化されたリガンドは、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ2以下である[1]〜[11]の何れかに記載のアッセイ方法。
【００１８】
[13]前記保湿剤は、アナライトを含む溶液に予め添加され、前記保湿剤が予め添加された前記アナライトを含む溶液を前記親水性高分子層に接触させることにより、前記保湿剤を前記親水性高分子層に接触させる[1]〜[12]の何れかに記載のアッセイ方法。
【００１９】
[14]前記保湿剤が予め添加されたアナライト溶液中の前記保湿剤の濃度が５〜３０％である[13]に記載のアッセイ方法。
[15]前記保湿剤は、アナライトを含む溶液を前記リガンドと接触させる前に前記蛍光測定装置用センサチップ内を洗浄する洗浄液に予め添加され、前記保湿剤が予め添加された洗浄液を前記親水性高分子層に接触させることにより、前記保湿剤を前記親水性高分子層に接触させる[1]〜[12]の何れかに記載のアッセイ方法。
【００２０】
[16]前記保湿剤が予め添加された洗浄液中の前記保湿剤の濃度が５〜３０％である[15]に記載のアッセイ方法。
[17]前記支持体は、透明支持体である[1]〜[16]の何れかに記載のアッセイ方法。
【００２１】
[18][1]〜[17]の何れかに記載のアッセイ方法に用いられ、支持体上に少なくとも金属部材、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）及び親水性高分子層を備えた蛍光測定装置用センサチップと、保湿剤とを含むことを特徴とするアッセイ用キット。
【００２２】
[19]前記親水性高分子層の乾燥膜厚は、１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である[18]に記載のアッセイ用キット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のアッセイ方法及びアッセイ用キットによって、Ｓ／Ｎ比が向上し、従来よりもアナライトの高感度検出を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明に係るＳＰＦＳを利用する蛍光測定装置用センサチップの好ましい一態様を模式的に示した縦断面図。
【図２】特許文献１に開示されているセンサ・ユニットの縦断面図を模式的に示した図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）上に親水性高分子層を形成したＳＰＦＳを利用する蛍光測定装置用センサチップを用い、当該層中および／または外面にリガンドが固定化された親水性高分子層に保湿剤を接触させてリガンドとアナライトとの相互作用（好ましくは抗原抗体反応）を行うアッセイ方法を特徴とする。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、このような実施形態とすることによって、抗原抗体反応を利用した免疫反応の反応性を飛躍的に増強させることができる。さらに、親水性高分子の量に制限させることなく、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。
【００２７】
親水性高分子を溶液等に混合させて、抗原抗体反応を行う形態では、当該親水性高分子の濃度に制限が掛かってしまう。高濃度の親水性高分子が混合した溶液では、タンパク質等の沈殿を起こして抗原抗体反応に影響を及ぼし測定結果の再現性が失われたり、Ｓ（アッセイ発光シグナル）向上と同時にＮ（アッセイノイズシグナル）の反応性も向上してしまったりする。さらに高濃度にすると、上述したように、高粘度の溶液になり、Ｓ（アッセイ発光シグナル）が低下する。
【００２８】
このように、親水性高分子を溶液等に混合させて、抗原抗体反応を行う形態では、Ｓ／Ｎ比を向上させるといっても、当該親水性高分子の濃度に制限があった。つまり、親水性高分子の濃度を高くしたとしても、Ｓ／Ｎ比の向上には限界があった。
【００２９】
本発明は、親水性高分子を溶液に混合等させるのではなく、親水性高分子を層として用いるので、親水性高分子の量（濃度や密度等）に制限されずに、親水性高分子を使用することができる。そして、結果として従来と比較してＳ（アッセイ発光シグナル）の値が向上するので高いＳ／Ｎ比が得られる。
【００３０】
メカニズムとしては、以下が考えられる。
親水性高分子層を形成する親水性高分子に保湿剤を添加すると、これらの相互作用により、親水性高分子近辺に、水和層が形成される。すなわち、ＳＡＭ上に親水性高分子を抗体固相支持体（親水性高分子層）として用いることによって、保湿剤の添加時に、抗体固相支持体近辺に水和層が形成される。この水和層は、生体物質間の疎水性相互作用を促進すると考えられ、結果的に、抗原抗体反応を利用した免疫反応の反応性を飛躍的に増強させることができる。
【００３１】
以下、本発明のＳＰＦＳを利用する蛍光測定装置用センサチップを用いたアッセイ方法およびアッセイ用キットについて具体的に説明する。
〈ＳＰＦＳを利用する蛍光測定装置用センサチップ〉
本発明に用いられる、ＳＰＦＳを利用する蛍光測定装置用センサチップ（以下、単に「センサチップ」ともいう）の好ましい一態様を図１に示す。図１に示すように、本発明に用いられるセンサチップは、支持体１上に少なくとも金属部材２（後述の金属膜）、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）３及びリガンド４を備え、当該ＳＡＭ３上に親水性高分子層５を有する。
【００３２】
なお、図１に示す親水性高分子層５は３次元構造を備えるものであるが、親水性高分子層５を形成する親水性高分子１本１本がそれぞれ垂直に近い状態で支持体１上に固定化されていてもよく、デキストラン等の親水性高分子の１本が複数箇所で支持体１上に固定化されていてもよく、本発明はいずれの態様にも限定されるものではない。
【００３３】
（支持体）
センサチップの支持体としては、透明支持体が好ましく用いられる。センサチップの支持体として透明支持体が好ましく用いられるのは、後述する金属部材への光照射をこの透明支持体を通じて行うからである。
【００３４】
透明支持体は、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明支持体はガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕、シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。
【００３５】
また、透明支持体は、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３６】
なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎd〕１．５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎd〕１．８５）、（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎd〕１．８４）、「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎd〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎd〕１．９０）、ならびに（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００３７】
支持体は、その表面に金属部材を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｍ（モル）／リットルの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００３８】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
（金属部材）
センサチップは、上述した支持体上に金属部材を有する。金属部材は、光源からの照射光により表面プラズモンまたは局在プラズモンを発生させる役割を有する。金属部材としては、例えば金属膜または金属粒子を用いることができ、金属膜として上記支持体の表面に形成することが好ましい。この金属膜は、光源から照射された励起光により表面プラズモンを誘起させ、蛍光色素を効率的に励起させる役割を有する。
【００３９】
上記支持体の表面に形成された金属膜の金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金および亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。また、金属膜は、これらの金属の幾つかの合金からなる形態であってもよく、また金属膜を複数積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつプラズモン共鳴による電場増強が大きくなることから好適である。
【００４０】
なお、支持体としてガラス製の支持体を用いる場合には、ガラスと上記金属膜とをより強固に接着するために、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を支持体上に形成することが好ましい。
【００４１】
支持体上に金属膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ法、無電解メッキ法などが挙げられる。膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法により金属膜を形成することが好ましい。また、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を支持体上に形成する場合も同様である。
【００４２】
金属膜の厚さとしては、金の場合５〜５００ｎｍ、銀の場合５〜５００ｎｍ、アルミニウムの場合５〜５００ｎｍ、銅の場合５〜５００ｎｍ、白金の場合５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金の場合５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００４３】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍおよびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００４４】
金属膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属膜であれば、面積（縦×横）は特に限定されない。
一方、金属部材として金属粒子を用いる場合は、局在プラズモンを誘起させることが可能である。金属粒子に用いる金属の種類としては、プラズモンを誘起させる粒子を調製できる限り特に限定されるものではないが、金、銀、銅、アルミニウム、白金及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属またはこれら２種以上の合金が好ましい。また、金属粒子の粒径は、局在プラズモンを生じる範囲であれば特に限定されるものではないが、１０〜１００ｎｍが好ましく、平均粒径がそのような範囲にある金属粒子の集団を利用することが好適である。
【００４５】
例えば、金属粒子は、上述した支持体上に分散された態様で用いることができる。
（自己組織化単分子膜（ＳＡＭ））
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、後述する親水性高分子層を固相化する足場として、また蛍光測定の際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、上記金属部材の、上記支持体とは接していないもう一方の表面に形成される。
【００４６】
ＳＡＭを形成する単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００４７】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属部材が形成された支持体を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。この場合、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属部材の金属と結合して固定化され、金属部材の表面上で自己組織化することにより、ＳＡＭが形成される。
【００４８】
また、ＳＡＭを形成する前に「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、ＳＡＭを形成する単分子としては、加水分解でシラノール基〔Ｓｉ−ＯＨ〕を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、一端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。
【００４９】
このような「誘電体からなるスペーサ層」に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーなどを用いることができる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ2〕、二酸化チタン〔ＴｉＯ2〕または酸化アルミニウム〔Ａｌ2Ｏ3〕を含む誘電体を用いることが好ましい。
【００５０】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。
【００５１】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００５２】
（親水性高分子層）
本発明に係る親水性高分子層は、上記ＳＡＭの、上記金属部材とは接していないもう一方の表面に形成され、２次元構造または３次元構造を有するものである。
【００５３】
この「３次元構造」とは、後述するリガンドの固定化を、支持体表面の２次元に限定することなく、該支持体表面から遊離した３次元空間にまで広げられる親水性高分子層の構造をいう。
【００５４】
このように、後述する親水性高分子を層として用いることによって、本発明に係る親水性高分子層は、当該親水性高分子の量（濃度や密度）に制限なく、使用することができる。
【００５５】
本発明に係る親水性高分子層の高分子とは、分子量が５０００以上の化合物を指す。
このような親水性高分子は、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種の高分子であってもよい。ポリサッカライドは、グルコースおよび／またはカルボキシメチル化グルコースに由来する構造単位を含んでなり、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸（これらを合わせて「ポリ(メタ)アクリル酸」ともいう。）は、(メタ)アクリル酸（すなわち、アクリル酸およびメタクリル酸）に由来する構造単位を含んでなるが、以下の単量体に由来する構造単位を適宜含むことができる。その単量体とは、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００５６】
前記ポリサッカライドとしては、デキストランおよび／またはデキストラン誘導体などの親水性高分子であることが好ましく、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などのデキストランで構成された親水性高分子層であることが、生体親和性の向上や非特異的な吸着反応の抑制性の向上、あるいは高い親水性の確保の観点から特に好適である。
【００５７】
ＣＭＤの分子量は、１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下が好ましく、４ｋＤａ以上１，０００ｋＤａがより好ましい。
親水性高分子層の高分子の密度（ＳＡＭ上に形成された親水性高分子層の単位面積当たりの質量）は、用いる高分子の種類や、層形成方法に応じて適宜調整することができるが、例えば、その密度として０．００１ｎｇ／ｍｍ2以上３０ｎｇ／ｍｍ2以下を挙げることができる。そして、親水性高分子層の膜厚にもよるが、０．２ｎｇ／ｍｍ2以上６ｎｇ／ｍｍ2以下の範囲を満たすことが好ましい。前記密度の調整方法としては、例えば、親水性高分子層を形成するための高分子含有溶液の高分子濃度を調整して密度を調整する方法、親水性高分子に用いる高分子の分子量を調整して密度を調整する方法が挙げられる。
【００５８】
特に、デキストランまたはデキストラン誘導体を含む親水性高分子層は、その高分子の密度がこの範囲を満たすことが好ましい。親水性高分子が上記ＳＡＭにこのような密度の範囲内で固相化されたセンサチップを用いて、アッセイを行うと、アッセイ発光シグナルが安定化しかつ増加するため好適である。
【００５９】
親水性高分子層の平均膜厚は、用いる高分子の種類や層の密度に応じて適宜調整することができる。例えば、３ｎｍ以上３００ｎｍ以下を挙げることができる。この中でも、３ｎｍ以上１３０ｎｍ以下が好ましく、５０ｎｍ以上１００ｎｍ以下の範囲であることが特に好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕などを用いて測定することができる。親水性高分子層の平均膜厚がこのような範囲内であると、アッセイ蛍光シグナルが安定化しかつ増加するため好適である。なお、上記平均膜厚の範囲は、後述するアナライト溶液等の溶液中の平均膜厚である。
【００６０】
本発明の親水性高分子層は、リガンドを金属部材に固定する際の土台としての役割を有することはもちろんであるが、その他に、後述する保湿剤との反応において、親水性高分子層がＳＡＭ上に形成されている状態でその保湿剤と反応することによって、抗原抗体反応を利用した免疫反応の反応性を飛躍的に増強させることができる。
【００６１】
親水性高分子層の形成方法は、特に限定されないが、例えば、親水性高分子層を形成したい基板を高分子含有溶液に所定の時間浸漬して形成する方法、スピンコータを用いて塗布して焼結（例えば７０〜８０℃）する方法が挙げられる。
【００６２】
（リガンド）
リガンドは、検体中のアナライトを固定（捕捉）させる目的で用いられるものであり、上記親水性高分子層に固定化される。親水性高分子層が２次元構造の場合、リガンドは親水性高分子層の外面に固定化され、親水性高分子層が３次元構造の場合、リガンドは親水性高分子層の層中および／または外面に固定化される。親水性高分子層が３次元構造の場合、一般にはリガンドの多くは親水性高分子層の３次元構造の中に分散して固定化される。
【００６３】
本明細書においては、上記リガンドすなわち検体中のアナライトを捕捉するために親水性高分子層に固定化されるリガンドと、蛍光色素とのコンジュゲートのために用いることが有るリガンドとを区別するために、親水性高分子層に固定化されるリガンドを以下「第１のリガンド」とし、蛍光色素とのコンジュゲートに用いるリガンドを以下「第２のリガンド」とする。なお、第１のリガンドと第２のリガンドとして用いられる分子または分子断片は同じであっても異なっていてもよい。
【００６４】
なお、第１のリガンドは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片であり、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００６６】
なお、本明細書において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
第１のリガンドを親水性高分子層に固定化する方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、第１のリガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
【００６７】
なお、上記第１のリガンドを固定化させた後に、後述する検体等がセンサチップに非特異的に吸着することを防止するため、センサチップの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
【００６８】
上記親水性高分子層に固定化されたリガンドの密度は、１フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１ナノｍｏｌ／ｃｍ2以下が好ましく、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ2以下がより好ましい。リガンドの密度が上記範囲内であると、アッセイ蛍光シグナルの信号強度が大きくなるため好適である。
【００６９】
（保湿剤）
保湿剤は、非特異的反応（アッセイノイズシグナル）を低減する機能を持つ物質であり、例えば、尿素、エチレングリコール（ＥＧ）、グリセリン、アンモニウム乳酸塩、カルボン酸ピロリドン、ジオール、乳酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などであり、好ましくは、Ｒｉｖｉｅｒｅ法（参考文献：Ｍ．Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗａｔｅｒ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ｔｈｅｒｍａｌ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７、１６５〜１７２（１９９５））により、保湿剤の再水和標本水分が４０〜２００％の範囲にあり、例えば、尿素、エチレングリコール（ＥＧ）、グリセリン、Ｌｅｃｔｉｌまたはアンモニウム乳酸塩である。保湿剤は一種単独であっても二種以上併用してもよい。
【００７０】
保湿剤は、抗原抗体反応の開始時に上述した親水性高分子層と共存していればよく、保湿剤の親水性高分子層への接触は、抗原抗体反応を行う際と同時までであれば、いかなるタイミングも順序も限定されるものではない。
【００７１】
当該保湿剤の親水性高分子層への接触は、保湿剤を後述するアナライト溶液に混合し、混合されたアナライト溶液を親水性高分子層へ接触させる方法や、保湿剤をセンサチップ内を洗浄する後述する洗浄液に混合し、混合された洗浄液を親水性高分子層へ接触させる方法等があるが、保湿剤のみの溶液、または保湿剤含有溶液を親水性高分子層へ接触させても良い。
【００７２】
保湿剤は、上述のＲｉｖｉｅｒｅ法により、保湿剤の再水和標本水分が４０〜２００％であることが好ましい。保湿剤の再水和標本水分が４０〜２００％であると、固相抗体上に水和層が形成されやすく、これによって抗原抗体反応が促進されるので好ましい。
【００７３】
また、保湿剤を溶液等に含有させる場合、その濃度は、５〜３０％であることが好ましい。
〈アッセイ〉
本発明のアッセイ方法においては、ＳＡＭ上に親水性高分子層が形成されたセンサチップに、保湿剤を接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする。
【００７４】
詳細には、下記の工程（ａ）〜（ｄ）及び必要により洗浄工程（１）、（２）を含んでよい。
工程（ａ）：本発明のセンサチップに、アナライト溶液を接触させる工程
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたセンサチップに、さらに、該センサチップに含まれる第１のリガンドとは同じであっても異なっていてもよい第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート物を反応させる工程
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたセンサチップに、上記支持体の、上記金属部材を形成していないもう一方の表面にプリズムを経由してレーザ光を照射し、照射光により励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、アナライト溶液に含有されるアナライト量を算出する工程
洗浄工程（１）：上記工程（ａ）を経て得られたセンサチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
洗浄工程（２）：上記工程（ｂ）を経て得られたセンサチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
本発明では、少なくとも上記工程（ａ）のアラナイト溶液または上記洗浄工程（１）の洗浄液の少なくとも一方に、保湿剤を混合させることが好ましい。
【００７５】
［工程（ａ）］
工程（ａ）は、親水性高分子層に固定化された第１のリガンドに、アナライト溶液を接触させる工程である。
【００７６】
（アナライト溶液）
本発明において、「アナライト溶液」とは、測定対象となる種々のアナライトを含む溶液をいう。
【００７７】
アナライト溶液としては、アナライトを含む溶液であれば何れでもよいが、例えば、検体が挙げられる。検体としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
【００７８】
（アナライト）
本発明において「アナライト」は、親水性高分子層に固定化された第１のリガンドに特異的に認識され（または、第１のリガンドを特異的に認識し）結合し得る分子または分子断片を意味する。このような「分子」または「分子断片」として、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチドを含む）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、癌胎児性抗原等の腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されるものではない。
【００７９】
（アナライト溶液の接触）
センサチップには流路が形成されていることが好ましく、流路中の少なくとも一部が支持体上に金属部材、ＳＡＭ上に親水性高分子層及び第１のリガンドを備えた構成とされ、アナライト溶液を前記流路中に送液して第１のリガンドがアナライト溶液で浸漬されることにより、アナライトを第１のリガンドに接触させる態様であることが好ましい。
【００８０】
「流路」の形状は、角筒（管）状であっても丸筒（管）状であってもよく、アナライトと第１のリガンド等を結合させ、蛍光測定する反応部・測定部は角筒状であることが好ましく、それ以外の薬液等の送液のみに利用される流路部分は丸筒状であることが好ましい。
【００８１】
センサチップの外壁をなす部材、例えば流路基板と流路天板とで構成される場合等、それら部材の反応部・測定部に対応する部分（支持体）または流路天板の材料としては、メチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、流路部分はシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いることが好ましい。
【００８２】
反応部・測定部においては、アナライトとの接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、流路の断面として、縦と横がそれぞれ１００ｎｍ〜１ｍｍ程度であることが好ましい。
【００８３】
センサチップに流路を形成する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、センサチップの金属部材として例えば金属膜が形成されている表面側に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該センサチップの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとセンサチップとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。
【００８４】
工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、センサチップに流路を形成する方法としては、センサチップに流路基板と流路天板に相当するプラスチックの一体成形品を形成する方法、または別途作製した金属膜が形成された支持体に流路基板を形成し、金属薄膜表面に（好ましくは誘電体からなるスペーサ層）ＳＡＭ、親水性高分子層およびリガンドの固定化を行った後に、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により、流路基板を形成されたセンサチップに蓋をする方法がある。
【００８５】
流路に送液するアナライト溶液として、アナライトを希釈するために用いる溶媒は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００８６】
第１のリガンドに多くのアナライトを捕捉させるために、送液されたアナライト溶液を流路中に循環させることが好ましいが、その際のアナライト溶液の温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃で１〜６０分間、好ましくは３７℃で５〜１５分間である。
【００８７】
アナライト溶液（検体）を流路に送液する場合、該アナライト溶液中に含有されるアナライトの初期濃度（送液前の濃度）は、１００μｇ／ｍｌ〜０．００１ｐｇ／ｍｌであってもよい。
【００８８】
流路に送液するアナライト溶液の総量は、通常０．００１〜２０ｍｌ、好ましくは０．１〜１ｍｌである。
また、流路に送液するアナライト溶液の流速は、通常１〜５，００００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５，０００〜１，００００μｌ／ｍｉｎである。
【００８９】
［洗浄工程］
洗浄工程としては、上記工程（ａ）を経た後にセンサチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程（１）と、上記工程（ｂ）を経てた後にセンサチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程（２）がある。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様として、親水性高分子層に接触させる保湿剤を上記工程（ａ）のアラナイト溶液に混合させて用いることの他、或いはそれと併用して、上記洗浄工程（１）の洗浄液に混合させて用いることができる。
【００９１】
これら洗浄工程（１）および（２）に使用される洗浄液としては、例えば、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を好ましくは０．００００１〜１質量％含有するよう溶解させたもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１０〜５００ｍＭ含有させたものが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＨＣｌでｐＨが１．５〜４．０のものを洗浄液として用いてもよい。
【００９２】
洗浄工程における洗浄液の温度および流速は、上記工程（ａ）におけるアナライト溶液の送液時の温度および流速と同じであることが好ましい。
洗浄工程（洗浄液による洗浄時間）は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【００９３】
［工程（ｂ）］
工程（ｂ）は、上記工程（ａ）の後、好ましくは上記洗浄工程（１）を経た後に、さらに、親水性高分子層に固定化されているリガンド（第１のリガンド）とは同じであっても異なっていてもよいリガンド（第２のリガンド）と蛍光色素とのコンジュゲート物を反応させる工程である。
【００９４】
（蛍光色素）
「蛍光色素」は、所定の励起光を照射することによって、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００９５】
本発明で用いられる蛍光色素は、金属部材による吸光に起因して完全に消光しない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【００９６】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６，４０６，２９７号、同第６，２２１，６０４号、同第５，９９４，０６３号、同第５，８０８，０４４号、同第５，８８０，２８７号、同第５，５５６，９５９号および同第５，１３５，７１７号に記載の蛍光色素を用いることもできる。
【００９７】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００９８】
【表１】
0005772612.tif 000002
【００９９】
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も用いることができる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【０１００】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属部材に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属部材として金を用いる場合には、金部材による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属部材として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
【０１０１】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
（第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート）
「本発明の親水性高分子層に固定化されているリガンド（第１のリガンド）とは同じであっても異なっていてもよいリガンド（第２のリガンド）と蛍光色素とのコンジュゲート」は、この第２のリガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得ることが好ましい。
【０１０２】
第２のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上述したように上記第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドとして用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【０１０３】
さらに、アナライト溶液中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光量（アッセイ蛍光シグナル）と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。
【０１０４】
第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート物の作製方法としては、第２のリガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【０１０５】
このように作製された第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート物を含む溶液をセンサチップに送液して反応させる際、送液される当該溶液の濃度は、０．００１〜１０，０００μｇ／ｍｌが好ましく、１〜１，０００μｇ／ｍｌがより好ましい。
【０１０６】
この溶液を送液する際の溶液の温度、流速および工程（ｂ）の時間（送液時間）は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
［工程（ｃ）］
工程（ｃ）は、上記工程（ｂ）を経た後のセンサチップに、上記支持体の、上記金属部材を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
【０１０７】
（光学系）
蛍光量を測定する際に照射される光源は、金属部材にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１０８】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属部材の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、支持体の屈折率、金属部材の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
【０１０９】
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１１０】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤ；波長２３０〜８００ｎｍ（金属部材に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【０１１１】
「プリズム」は、必要に応じて用いられる光学フィルタ、偏光フィルタ及びカットフィルタ等の各種フィルタを介したレーザ光が、金属部材に効率よく入射されることを目的としており、屈折率が透明支持体と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明支持体」の市販品と同様のものが挙げられる。
【０１１２】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光〔ＮＤ〕フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１１３】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサチップ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ、および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１１４】
「集光レンズ」は、蛍光量を測定する検出器に、蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光レンズでよい。簡易な集光レンズとして、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１１５】
「検出器」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１１６】
［工程（ｄ）］
工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、アナライト溶液中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
【０１１７】
より具体的には、工程（ｄ）は、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（標的抗原）量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１１８】
［Ｓ／Ｎ比の算出］
さらに、工程（ｄ）においては、上記工程（ｂ）の前に測定した"ブランク発光シグナル"、上記工程（ｄ）で得られた"アッセイ発光シグナル"、および何も修飾していない金属基板を流路に固定し、超純水を流しながら測定して得られた"初期ノイズシグナル"を用いて、下記式（１ａ）で表されるＳ／Ｎ比を算出することができる：
Ｓ／Ｎ＝｜Ｉａ／Ｉｏ｜／Ｉｎ        （１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉａはアッセイ発光シグナル、Ｉｏはブランク発光シグナル、Ｉｎは初期ノイズシグナルである）。
【０１１９】
ただし、Ｓ／Ｎを算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、アナライト溶液中に含まれるアナライトの濃度が０の場合における"アッセイノイズシグナル"を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
Ｓ／Ｎ＝｜Ｉａ｜／｜Ｉａｎ｜        （１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉａｎはアッセイノイズシグナル、Ｉａは上記式（１ａ）の場合と同様にアッセイ発光シグナルである）。
【０１２０】
〔キット〕
本発明に係るアッセイ用キットは、本発明のアッセイ方法を実施するにあたり、アナライト溶液を除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましく、すなわち、本発明のキットに含まれるものは、少なくともセンサチップ（支持体上に少なくとも金属部材、ＳＡＭ、親水性高分子層及びリガンドを有する）、及び保湿剤である。より好ましい本発明に係るアッセイ用キットは、本発明のアッセイ方法を実施するにあたり、アナライト溶液およびリガンドを除く必要とされるものすべてを含む。すなわち、より好ましい本発明のキットに含まれるものは、少なくとも、リガンドを固定化していないセンサチップ（支持体上に少なくとも金属部材、ＳＡＭおよび親水性高分子層）ならびに保湿剤である。このような本発明のキットを使用する者は、所望のリガンド（例えば、特定の抗体など）を、本明細書の記載に従い当該センサチップが有する親水性高分子層に容易に固定化することができるから、本発明のキットの汎用性がより高くなるため好適である。
【０１２１】
当該センサチップに含まれる親水性高分子層の平均の乾燥膜厚の範囲は、特に限定されるものではないが、１ｎｍ以上５０ｎｍ以下が好ましい。なお、当該乾燥膜厚は、市販の光干渉膜厚測定機を用いて測定することができる。また、測定の際に、リガンド等が親水性高分子層に形成している場合には、当該リガンド等を除いて測定する。
【０１２２】
これらアッセイ用キットと、例えば、アラナイト溶液としてアナライトである血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１２３】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数アナライトの同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
【実施例】
【０１２４】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
（標識２次抗体溶液の準備）
第２のリガンドとして、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５ｍｇ／ｍｌ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を、市販のビオチン化キット（（株）同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した抗体を用いた。ビオチン化の手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。
【０１２５】
次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。
【０１２６】
最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた標識２次抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
【０１２７】
［実施例１］
（センサチップ（Ａ）の製造）
屈折率〔ｎd〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金属部材である金薄膜をスパッタリング法により該透明支持体に金属膜を形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４２〜４７ｎｍであった。
【０１２８】
こうして金薄膜が形成された支持体を、１ｍＭに調製した１０−アミノ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍｌに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。その後、この支持体をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
【０１２９】
続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成した支持体を１時間浸漬し、ＳＡＭに親水性高分子層としてＣＭＤを固定化し、１モル／リットルのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。ＣＭＤ層の平均膜厚は７０ｎｍであり、密度は５．０ｎｇ／ｍｍ2であった。
【０１３０】
続いて、ＮＨＳを５０ｍＭと、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＭＥＳに１時間浸漬させた後に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５μｇ／ｍｌ、（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液に３０分間浸漬することで、ＣＭＤに第１のリガンドとして１次抗体を固定化した。
【０１３１】
さらに、１質量％の牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳにて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行なった。
非特異的吸着防止処理を行なった第１のリガンドが固定化された支持体上に、流路高さ０．５ｍｍを有し、かつ適当な形状および大きさを有する穴のあいたポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを設け、さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは流路に送液する溶液に触れない状態にある）。該ＰＤＭＳ製シートおよび該シリコーンゴム製スペーサの上に、送液導入用の穴および送液排出用の穴を予めそれぞれ形成してあるＰＭＭＡ基板を、ＰＤＭＳ製シートで囲まれた領域の内側にこれらの穴が位置するように配置した（このとき、抗体を固定化した表面が流路の内側となるように、ＰＭＭＡ基板が配置されている）。これらを流路の外側から圧着し、ビスを用いて、ＰＭＭＡ基板と流路シート（すなわち、前記ＰＤＭＳ製シート）、該流路シートと支持体を固定し、センサチップ（Ａ）を製造した。
【０１３２】
（アッセイの実施）
上述のように製造したセンサチップ（Ａ）を用いて、以下の工程によりアッセイを実施した。
【０１３３】
工程（ａ）として、上述のようにして得られたセンサチップ（Ａ）の流路に、標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ及び尿素を２Ｍ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液（アナライト溶液）を２５分間循環させた。
【０１３４】
洗浄工程（１）として、工程（ａ）の後、センサチップ（Ａ）の流路にＴｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕を送液させ１０分間循環させることによって洗浄した。
【０１３５】
工程（ｂ）として、洗浄工程（１）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、上記で準備したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体（２μｇ／ｍｌとなるように調製したＰＢＳ溶液）０．１ｍｌを送液させ５分間循環させた。
【０１３６】
洗浄工程（２）として、工程（ｂ）の後、センサチップ（Ａ）の流路にＴｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液させ１０分間循環させることによって洗浄した。
工程（ｃ）として、工程（ｃ）まで経たセンサチップ（Ａ）の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を光電子増倍管〔ＰＭＴ〕で検出した光量（シグナル値）を計測し「アッセイ発光シグナル」とした。
【０１３７】
一方、前記工程（ａ）〜（ｃ）において、上記工程（ａ）でＡＦＰを全く含まない（０ｎｇ／ｍｌ）尿素２Ｍ、０．１ｍｌＰＢＳ溶液をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「アッセイノイズシグナル」とした。
【０１３８】
［実施例２］
実施例１のセンサチップ（Ａ）を用い、実施例１のアッセイの実施において、実施例１の工程（ａ）のアナライト溶液の代わりに、標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液（アナライト溶液）用い、工程（ａ）の前に、洗浄液Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕に尿素を２Ｍ入れた混合液を送液として１０分間循環させることによって洗浄した以外は、実施例１と同様にアッセイを実施した。
【０１３９】
［実施例３］
（センサチップ（Ｂ）の製造）
屈折率〔ｎd〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金属部材である金薄膜をスパッタリング法により該透明支持体に金属膜を形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４２〜４７ｎｍであった。
【０１４０】
こうして金属膜が形成された支持体を、１ｍＭに調製した１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍｌに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。この支持体を、該エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
【０１４１】
続いて、ＰＥＧ鎖部分の平均分子量が５０００のＡＭＩＮＥ−ＰＥＧ−Ｃａｒｂｏｘｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ（一般式：ＮＨ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ  但し、ｍ＝１〜２０）を１ｍｇ／ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成した支持体を１時間浸漬し、ＳＡＭに親水性高分子層としてＰＥＧを固定化した。ＰＥＧ層の平均膜厚は３０ｎｍであり、密度は４．０ｎｇ／ｍｍ2であった。
【０１４２】
続いて、実施例１と同様にしてＰＥＧ層に抗体（第１のリガンド）を固定化し、非特異吸着防止処理を行なった。
非特異吸着防止処理を行なった第１のリガンドが固定化された支持体上に、流路高さ０．５ｍｍを有し、かつ適当な形状および大きさを有する穴のあいたポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを設け、さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは流路に送液する溶液に触れない状態にある）。該ＰＤＭＳ製シートおよび該シリコーンゴム製スペーサの上に、送液導入用の穴および送液排出用の穴を予めそれぞれ形成してあるＰＭＭＡ基板を、ＰＤＭＳ製シートで囲まれた領域の内側にこれらの穴が位置するように配置した（このとき、抗体を固定した表面が流路の内側となるように、ＰＭＭＡ基板が配置されている）。これらを流路の外側から圧着し、ビスを用いて、ＰＭＭＡ基板と流路シート（すなわち、前記ＰＤＭＳ製シート）、該流路シートと支持体を固定し、センサチップ（Ｂ）を製造した。
【０１４３】
（アッセイの実施）
上述のようにして作成したセンサチップ（Ｂ）を用いて、実施例１と同様にアッセイを実施した。
【０１４４】
［実施例４］
（センサチップ（Ｃ）の製造）
実施例１のセンサチップ（Ａ）の製造において、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍｌの代わりに、分子量５０００のポリアクリル酸を１ｍｇ／ｍｌを用いた以外は、実施例１と同様にしてセンサチップ（Ｃ）の製造を行った。ポリアクリル酸層の平均膜厚は３０ｎｍであり、密度は２．０ｎｇ／ｍｍ2であった。
【０１４５】
（アッセイの実施）
実施例１のアッセイの実施において、上述のようにして製造したセンサチップ（Ｃ）を用いて、尿素を２Ｍの代わりに、アンモニウム乳酸塩を２Ｍ用いた以外は、実施例１と同様にアッセイを実施した。
【０１４６】
［実施例５］
（センサチップ（Ｄ）の製造）
実施例１のセンサチップ（Ａ）の製造において、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍｌの代わりに、分子量５０００のポリメタクリル酸を１ｍｇ／ｍｌを用いた以外は、実施例１と同様にしてセンサチップ（Ｄ）の製造を行った。ポリメタクリル酸層の平均膜厚は３０ｎｍであり、密度は０．９ｎｇ／ｍｍ2であった。
【０１４７】
（アッセイの実施）
実施例１のアッセイの実施において、上述のようにして作成したセンサチップ（Ｄ）を用いて、尿素を２Ｍの代わりに、グリセリンを２Ｍ用いた以外は、実施例１と同様にアッセイを実施した。
【０１４８】
[実施例６]
（センサチップ（Ｅ）の製造）
実施例１のセンサチップ（Ａ）の製造において、ＣＭＤ層の平均膜厚を７０ｎｍから１００ｎｍとし、密度を５．０ｎｇ／ｍｍ2から６．０ｎｇ／ｍｍ2に変更した以外は、実施例１と同様にしてセンサチップ（Ｅ）の製造を行った。
【０１４９】
(アッセイの実施)
実施例１のアッセイの実施において、上述のようにして作成したセンサチップ（E）を用いた以外は、実施例１と同様にアッセイを実施した。
【０１５０】
[実施例７]
（センサチップ（Ｆ）の製造）
実施例１のセンサチップ（Ａ）の製造において、ＣＭＤ層の平均膜厚を７０ｎｍから１０ｎｍとし、密度を５．０ｎｇ／ｍｍ2から０．４ｎｇ／ｍｍ2に変更した以外は、実施例１と同様にしてセンサチップ（Ｆ）の製造を行った。
【０１５１】
(アッセイの実施)
実施例１のアッセイの実施において、上述のようにして作成したセンサチップ（Ｆ）を用いた以外は、実施例１と同様にアッセイを実施した。
【０１５２】
［比較例１］
（センサチップ（Ｇ）の製造）
屈折率〔ｎd〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金属部材である金薄膜をスパッタリング法により該透明支持体に金属膜を形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４２〜４７ｎｍであった。
【０１５３】
こうして金属膜が形成された支持体を、１ｍＭに調製した１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍｌに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。この支持体を、該エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
【０１５４】
続いて、ＮＨＳを５０ｍＭ（モラー）と、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＭＥＳに１時間浸漬させた後に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５μｇ／ｍｌ、（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液に３０分間浸漬することで、ＳＡＭ上に１次抗体（第１のリガンド）を固相化した。
【０１５５】
さらに、１質量％の牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳにて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行なった。
非特異吸着防止処理を行なった第１のリガンドが固相化された支持体上に、流路高さ０．５ｍｍを有し、かつ適当な形状および大きさを有する穴のあいたポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを設け、さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは流路に送液する溶液に触れない状態にある）。該ＰＤＭＳ製シートおよび該シリコーンゴム製スペーサの上に、送液導入用の穴および送液排出用の穴を予めそれぞれ形成してあるＰＭＭＡ基板を、ＰＤＭＳ製シートで囲まれた領域の内側にこれらの穴が位置するように配置した（このとき、抗体を固相化した表面が流路の内側となるように、ＰＭＭＡ基板が配置されている）。これらを流路の外側から圧着し、ビスを用いて、ＰＭＭＡ基板と流路シート（すなわち、前記ＰＤＭＳ製シート）、該流路シートと支持体を固定し、センサチップ（Ｇ）を製造した。
【０１５６】
（アッセイの実施）
上述のように製造したセンサチップ（Ｇ）を用いて、工程（ａ）において、標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液（アナライト溶液）を用いた以外は、実施例１と同様にアッセイを実施した。
【０１５７】
［比較例２］
実施例１のアッセイ法において、実施例１で製造したセンサチップ（Ａ）を用いて、上記実施例１の工程（ａ）において、標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液（アナライト溶液）を用いた以外は、実施例１と同様にアッセイ法を実施した。
【０１５８】
［比較例３］
実施例１のアッセイ法において、比較例１で製造したセンサチップ（Ｇ）を用いて、標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ、分子量５０００のポリエチレングリコ−ル〔ＰＥＧ〕４％及び尿素を２Ｍ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液を用いた以外は、実施例１と同様にアッセイ法を実施した。
【０１５９】
[比較例４]
実施例１のアッセイ法において、比較例１で製造したセンサチップ（Ｇ）を用いて、標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ及び尿素を２Ｍ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液に分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を実施例６のセンサチップ（Ｅ）で使用したＣＭＤの量と同じようになるよう（膜厚１００ｎｍ、密度２ｎｇ／ｍｍ2に含まれるＣＭＤ量に相当するように）に調整して（約８％）入れ、当該溶液を用いた以外は、実施例１と同様にアッセイ法を実施した。
【０１６０】
[比較例５]
実施例１のアッセイ法において、比較例１で製造したセンサチップ（Ｇ）を用いて、標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ及び尿素を２Ｍ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液に分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を実施例７のセンサチップ（Ｆ）で使用したＣＭＤの量と同じようになるよう（膜厚１０ｎｍ、密度０．４ｎｇ／ｍｍ2に含まれるＣＭＤ量に相当するように）に調整して（約０．１％）入れ、当該溶液を用いた以外は、実施例１と同様にアッセイ法を実施した。
【０１６１】
［Ｓ／Ｎ比の評価］
実施例１〜７及び比較例１〜５で実施したそれぞれのアッセイについて、アッセイ蛍光シグナルおよびアッセイノイズシグナルから下記式によりＳ／Ｎを算出し、比較例１のＳ／Ｎ比を基準として、以下の通り評価した。結果を表２に示した。
Ｓ／Ｎ＝｜（アッセイ発光シグナル）｜／｜（アッセイノイズシグナル）｜
５：比較例１のＳ／Ｎに比較し１０倍を超える値である場合
４：比較例１のＳ／Ｎに比較し７倍以上〜１０倍未満である値である場合
３：比較例１のＳ／Ｎに比較し４倍以上〜７倍未満である値である場合
２：比較例１のＳ／Ｎに比較し２倍以上〜４倍未満である値である場合
１：比較例１のＳ／Ｎに比較し１倍以上〜２倍未満である値である場合
【０１６２】
【表２】
0005772612.tif 000003
【０１６３】
表２から明らかなように、実施例１〜７のＳ／Ｎ比は、比較例１のＳ／Ｎ比に比べ４倍以上（相対評価では３以上に相当）の顕著な向上がみられた。比較例３では、親水性高分子及び保湿剤を共に使用しているが、親水性高分子は層として形成されておらず、第一のリガンドの固定化が効率的に行われないために、Ｓ／Ｎ比が本発明の実施例と比べそれほど向上されなかった。
【０１６４】
また、比較例４においては、添加する溶液中の親水性高分子の濃度が高すぎるために、当該溶液の粘度が高くなり過ぎてしまった結果、反応性（Ｓ（アッセイ発光シグナル））の向上が低下してしまいＳ／Ｎ比が非常に低かった。
【符号の説明】
【０１６５】
１  支持体
２  金属部材
３  自己組織化単分子膜
４  リガンド
５  親水性高分子膜
１０  センサチップ
【図１】
0005772612.tif 000004
【図２】
0005772612.tif 000005