(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物において、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、イネ科植物の高温障害を低減させる方法：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子；
（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子。
【請求項２】
イネ科植物において、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡが含む遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、イネ科植物の高温障害を低減させる方法：
（Ａ）配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列の１個又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子を含むＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子を含むＤＮＡ。
【請求項３】
上記遺伝子に対し、塩基の欠失、置換及び挿入から選択される少なくとも一つを生じさせることで、当該遺伝子の発現を抑制することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記挿入は、Ｔ−ＤＮＡの挿入であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記遺伝子の発現をＲＮＡｉ法により抑制することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
上記イネ科植物は、イネであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記高温障害は、登熟期に高温に曝された場合における白未熟粒の形成であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により高温障害が低減されていることを特徴とするイネ科植物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により高温障害が低減されていることを特徴とするイネ。
【請求項１０】
上記高温障害は、登熟期に高温に曝された場合における白未熟粒の形成であることを特徴とする請求項９に記載のイネ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ科植物の高温障害を低減させる方法、高温耐性イネ科植物作出用ベクター、及び高温障害が低減されているイネ科植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水稲は、登熟期に高温に曝されると白未熟粒を形成するという品質障害（以下、「高温障害」ともいう。）を起こすことが知られている。このような品質障害が起こると、米の一等米比率が著しく低下してしまうという問題がある。そのため、これまでに、高温障害が起こりにくい品種の選抜、栽培法の研究等が行なわれている（非特許文献１）。また、イネについて、高温下での遺伝子発現解析が試みられている（非特許文献２）。
【０００３】
また、特許文献１には、ホスホリパーゼＤ欠失性であるイネ系統について記載されており、特許文献２には、植物由来のホスホリパーゼＤ遺伝子について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２４５６３８号公報（２００８年１０月１６日公開）
【特許文献２】国際公開第９５／０９２３４号パンフレット（１９９５年４月６日公開）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】千葉ら，２００９，日作紀  ７８：４５５５−４６４
【非特許文献２】Yamakawa H., Kuroda M., Hirose T., Yamaguchi T. 2007. Comprehensive expression profiling of rice grain filling-related genes under high temperature using DNA microarray. Plant Physiol. 144:258-277.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来における高温障害を低減させるための技術は、品種改良等に頼ったものが多く、高温障害を大幅に低減させることができるような顕著な成果を得られる技術ではない。特に、遺伝子を改変したり、ある一つの遺伝子の発現を抑制したりすることによって、イネの高温障害を低減させるような技術は、これまで全く報告されていない。そのため、確実に高温障害を低減させるためのさらなる技術の開発が望まれている。
【０００７】
また、上述した特許文献１及び２には、イネのホスホリパーゼＤと高温障害との関連性については一切記載も示唆もされていない。
【０００８】
本発明は、上述した問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、イネ科植物の高温障害を低減させることができる新たな技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上述した課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、イネ科植物の登熟過程の種子組織においてホスホリパーゼ（ＰＬＤ）が活性化されること、及び高温条件下において通常の５倍以上のＰＬＤ活性が検出されることを見出した。そこで、イネ科植物のホスホリパーゼＤについてさらに解析を進めたところ、複数のホスホリパーゼＤのうちの１つの遺伝子の発現を抑制させた場合に、高温障害が大幅に低減されることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明に係るイネ科植物の高温障害を低減させる方法は、イネ科植物において、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制することを特徴とする：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子；
（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子。
【００１１】
本発明に係るイネ科植物の高温障害を低減させる方法は、イネ科植物において、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡが含む遺伝子の発現を抑制することを特徴とする：
（Ａ）配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列の１個又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子を含むＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子を含むＤＮＡ。
【００１２】
また、本発明に係るイネ科植物の高温障害を低減させる方法では、上記遺伝子に対し、塩基の欠失、置換及び挿入から選択される少なくとも一つを生じさせることで、当該遺伝子の発現を抑制することが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係るイネ科植物の高温障害を低減させる方法では、上記挿入は、Ｔ−ＤＮＡの挿入であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明に係るイネ科植物の高温障害を低減させる方法では、上記遺伝子の発現をＲＮＡｉ法により抑制することが好ましい。
【００１５】
また、本発明に係るイネ科植物の高温障害を低減させる方法では、上記イネ科植物は、イネであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係るイネ科植物の高温障害を低減させる方法では、上記高温障害は、登熟期に高温に曝された場合における白未熟粒の形成であることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る高温耐性イネ科植物作出用ベクターは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの遺伝子に対し、塩基の欠失、置換及び挿入から選択される少なくとも一つを生じさせることにより、当該遺伝子の発現を抑制することを特徴とする：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子；
（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子。
【００１８】
本発明に係る高温耐性イネ科植物作出用ベクターは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡが含む遺伝子に対し、塩基の欠失、置換及び挿入から選択される少なくとも一つを生じさせることにより、当該遺伝子の発現を抑制することを特徴とする：
（Ａ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１個又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子を含むＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子を含むＤＮＡ。
【００１９】
本発明に係る高温耐性イネ科植物作出用ベクターは、配列番号４に示す塩基配列における少なくとも一部のセンス鎖配列と、当該センス鎖配列に相補的なアンチセンス鎖配列とを含み、当該塩基配列が含む遺伝子の発現をＲＮＡｉ法により抑制することを特徴とする。
【００２０】
本発明に係るイネ科植物は、上述したいずれかの方法により高温障害が低減されていることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係るイネは、上述したいずれかの方法により高温障害が低減されていることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係るイネでは、上記高温障害は、登熟期に高温に曝された場合における白未熟粒の形成であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、イネ科植物の高温障害を低減させることができる新たな方法、高温耐性イネ科植物作出用ベクター、及び高温障害が低減されているイネ科植物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】イネのゲノムＤＮＡにおけるＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子領域の構成を示す図である。
【図２】ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子のｍＲＮＡの構成を示す図である。
【図３】ＲＮＡｉによるＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子の発現抑制用ベクターのコンストラクトを示す図である。
【図４】ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２の定量ＰＣＲにおいて増幅した領域の位置を示す図である。
【図５】ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統とベクターコントロールとのそれぞれにおける、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２の発現量（ｍＲＮＡ量）を示すグラフである。
【図６】ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統における高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を示すグラフである。
【図７】ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統におけるＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子領域を示す図である。
【図８】ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統を閉鎖系温室において栽培した場合の、高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を示すグラフである。
【図９】ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統を圃場栽培した場合の、高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を示すグラフである。
【図１０】イネのホスホリパーゼＤ遺伝子の各抑制系統における高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
〔高温障害を低減させる方法〕
本発明に係る方法は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はその相同遺伝子の発現を抑制することにより、イネ科植物の高温障害を低減させる方法である。イネ科植物には、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ等が含まれる。
【００２６】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、イネのホスホリパーゼＤの１つであり、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２とも称される。
【００２７】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列、又は配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列の１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡが含む遺伝子であってもよい。
【００２８】
配列番号２に示す塩基配列は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子（ＲＡＰ  ｌｏｃｕｓ  ＩＤ：Ｏｓ０３ｇ０１１９１００）を含む配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ４１１２２１）であり、この遺伝子のエキソン配列とイントロン配列とを含む。
【００２９】
図１は、イネのゲノムＤＮＡにおけるＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子領域の構成を示す図である。図１には、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子のエキソン領域を黒く塗りつぶした四角で示し、イントロン領域を細線で示し、５’側と３’側とにある非翻訳領域（ＵＴＲ）を太線で示す。
【００３０】
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡは、全長４５７２ｂｐであり、図１に示すように、１０個のエキソンと、このエキソン間にある９個のイントロンとを含んでいる。なお、配列番号２に示す塩基配列のうち、２１３−１３３７、１５５７−１６７３、１８３２−２０２６、２１２６−２３７４、２４５９−２５７２、２６１５−２７６２、２９８９−３１３７、３２６９−３４３９、３５４１−３７３８、３８１６−４１０９ｂｐがエキソンである。
【００３１】
配列番号３に示す塩基配列は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子の翻訳領域（２７１５ｂｐ）のみを含む塩基配列である。また、配列番号４に示す塩基配列は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡの塩基配列である。
【００３２】
図２は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子のｍＲＮＡの構成を示す図である。図２に示すように、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子のｍＲＮＡは、翻訳領域と、その翻訳領域の５’側と３’側とにある非翻訳領域（ＵＴＲ）とを含む配列からなる。
【００３３】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の相同遺伝子としては、当該遺伝子の塩基配列と相同の塩基配列からなり、イネ科植物において発現が抑制された場合に高温障害を低減させる遺伝子であればよい。
【００３４】
相同遺伝子としては、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００３５】
アミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このアミノ酸配列からなるタンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３６】
また、相同遺伝子は、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００３７】
また、相同遺伝子は、配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列の１個又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡが含む遺伝子であっていてもよい。
【００３８】
また、相同遺伝子は、配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが含む遺伝子であってもよい。
【００３９】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件が意図される。
【００４１】
また、相同遺伝子は、配列番号２〜４のいずれかに示す塩基配列と７０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含む遺伝子であってもよい。
【００４２】
本明細書中、「ＤＮＡ」とは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの形態を含む。また、ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖であってもよく、アンチセンス鎖であってもよい。また、ＤＮＡは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列、ベクター配列（発現用ベクター配列を含む）などを含むものであってもよい。
【００４３】
ＤＮＡを取得するための供給源としては、特に限定されないが、植物であることが好ましく、より好ましくはイネ科植物であり、さらに好ましくはイネである。
【００４４】
「イネ科植物において、遺伝子の発現を抑制する」とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、又はｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の少なくとも一方のステップを人為的に抑制することをさす。
【００４５】
遺伝子の発現を抑制する方法としては、（ａ）抑制したい遺伝子に対し、塩基の欠失、置換及び挿入から選択される少なくとも一つを生じさせる方法、（ｂ）ＲＮＡｉにより抑制する方法、などの公知の方法を用いることができる。
【００４６】
抑制したい遺伝子に対し、塩基の欠失、置換又は挿入を生じさせる場合、欠失、置換又は挿入は、遺伝子のコード領域（特にエキソン）内でなされることにより、この遺伝子を機能破壊するものであってもよい。また、欠失、置換又は挿入は、遺伝子の転写調節領域内でなされることにより、この遺伝子の転写を抑制するものであってもよい。
【００４７】
塩基の欠失又は置換を生じさせる場合には、例えば従来公知の突然変異体誘導方法を用いてもよい。また、塩基の挿入を生じさせる場合には、例えば従来公知のＴ−ＤＮＡを挿入する方法を用いてもよい。目的の遺伝子に対して塩基の欠失、置換又は挿入がなされたかどうかは、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法、ＤＮＡシークエンス解析等の従来の方法により調べることができる。
【００４８】
ＲＮＡｉ法により抑制する場合には、従来公知の方法を用いることができる。例えば、抑制したい遺伝子のｍＲＮＡに相当する塩基配列における少なくとも一部のセンス鎖配列と、当該センス鎖配列に相補的なアンチセンス鎖配列とが、逆方向反復塩基配列構造となっているベクターを用いてもよい。このベクターを公知の方法によりイネ科植物に導入することによって、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子の発現をＲＮＡｉ法により抑制することができる。
【００４９】
ベクターをイネ科植物に導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などを用いることができる。
【００５０】
「高温障害」とは、イネ科植物が高温に曝されることにより発生する品質障害をさす。例えばイネであれば、高温障害とは、登熟期に高温に曝された場合における白未熟粒の形成をさす。「高温に曝される」とは、気温の平均が約２８℃以上の環境に置かれることをいう。また、登熟期とは、出穂後約４０日の間をいう。
【００５１】
「高温障害を低減させる」とは、イネ科植物が高温に曝されることにより発生する品質障害を低減させることをいう。例えばイネであれば、上述した遺伝子の発現を抑制していない植物と比較して、登熟期に高温に曝された場合における白未熟粒の形成割合を低減させることをいう。
【００５２】
白未熟粒の形成割合とは、採取した米の全数に対する白未熟粒の割合（％）である。白未熟粒か否かの判断は、玄米の外観を目視することにより、あるいは穀粒判別機を用いて、行なうことができる。「白未熟粒の形成割合を低減させる」とは、少なくとも親植物における白未熟粒の形成割合よりも低減させることをいう。
【００５３】
なお、本発明に係る方法は、下記の本発明に係る高温耐性イネ科植物作出用ベクターを用いて実現することが可能である。
【００５４】
〔高温耐性イネ科植物作出用ベクター〕
本発明は、本発明に係る方法に用いるための高温耐性イネ科植物作出用ベクターを提供する。本発明に係る高温耐性イネ科植物作出用ベクターは、イネ科植物において、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はその相同遺伝子の発現を抑制させるためのベクターである。
【００５５】
本発明に係る高温耐性イネ科植物作出用ベクターを用いれば、イネ科植物の高温障害を低減させることができるので、高温耐性のイネ科植物を作出することが可能である。すなわち、後述する本発明に係るイネ科植物を作出することができる。
【００５６】
高温耐性イネ科植物作出用ベクターに用いるベクターとしては、公知の中間ベクター、バイナリーベクター等を用いることができる。
【００５７】
本発明に係る高温耐性イネ科植物作出用ベクターは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はその相同遺伝子に対し、塩基の欠失、置換及び挿入から選択される少なくとも一つを生じさせることにより、当該遺伝子の発現を抑制するものであってもよい。
【００５８】
また、本発明に係る高温耐性イネ科植物作出用ベクターは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はその相同遺伝子の発現を、ＲＮＡｉ法により抑制するものであってもよい。
【００５９】
このような高温耐性イネ科植物作出用ベクターの例として、例えばプロモーター配列の下流に、抑制したい遺伝子の転写領域の少なくとも一部のセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列とが逆方向反復塩基配列構造をとっているベクターが挙げられる。この高温耐性イネ科植物作出用ベクターをイネ科植物に導入することによって、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子の発現をＲＮＡｉ法により抑制することができる。
【００６０】
プロモーター配列としては、植物細胞内で転写可能なプロモーターであればよく、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター等を用いることができる。
【００６１】
センス鎖配列及びアンチセンス鎖配列としては、例えば配列番号４に示す塩基配列における少なくとも一部のセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列であってもよい。センス鎖配列としては、配列番号４に示す塩基配列における任意の部分の配列であってよく、またセンス鎖配列の長さについても特に限定されない。好ましくは、センス鎖配列は、配列番号４における、転写開始点を１としたときの２９００ｂｐ〜３２４０ｂｐに相当する３４１ｂｐの配列である。
【００６２】
アンチセンス鎖配列は、組み合わせられるセンス鎖配列に相補的な配列であればよい。
【００６３】
センス鎖配列とアンチセンス鎖配列との間のスペーサー配列は、特に限定されないが、例えばイントロン配列等であることが好ましい。
【００６４】
〔イネ科植物〕
本発明は、本発明に係る方法により高温障害が低減されているイネ科植物を提供する。特に、本発明は、高温障害が低減されているイネを提供する。
【００６５】
なお、本明細書中「イネ科植物」又は「イネ」とは、種子又は植物体そのものだけでなく、植物体をなす細胞、組織、器官、ならびに誘導カルス、プロトプラスト、スフェロプラストなどをも含む概念とする。
【００６６】
本発明に係るイネ科植物は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はその相同遺伝子の発現が抑制されていることにより、高温障害が低減されている。
【００６７】
「高温障害が低減されている」とは、イネ科植物において、高温に曝されることにより発生する品質障害が低減されていることをいう。例えばイネであれば、上述した遺伝子の発現が抑制されていない植物と比較して、登熟期に高温に曝された場合における白未熟粒の形成割合が低減されていることをいい、好ましくは、白未熟粒の形成割合が４０％以下に低減されていることをいう。
【００６８】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００６９】
〔実施例１〕
本実施例では、イネのホスホリパーゼＤ遺伝子ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２の発現がＲＮＡｉにより抑制されている系統（ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統）を作製した。
【００７０】
（ＲＮＡｉによる発現抑制用ベクターの構築）
まず、以下の方法により、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による発現抑制用のベクターを構築した。
【００７１】
なお、本実施例では、ベクターとしてｐＺＨ２Ｂｉｋベクター（Kuroda M, Kimizu M, Mikami C. 2010. A Simple Set of Plasmids for the Production of Transgenic Plants. Biosci. Biotech. Biochem. 74: 2348-2351）を用いた。このベクターは、アグロバクテリウムによる形質転換に用いることができるバイナリーベクターである。
【００７２】
まず、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子のｍＲＮＡの一部の配列からなるＤＮＡ断片ａを調製した。調製したＤＮＡ断片ａは、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号４）における、転写開始点を１としたときの２９００ｂｐ〜３２４０ｂｐに相当する配列からなる、３４１ｂｐのＤＮＡ断片ａである。
【００７３】
ＳＤＳ−Ｐｈｅｎｏｌ法を用いて、イネ（日本晴）の葉身より全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて一本鎖ＤＮＡを調製した。この一本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、プライマー１Ｆ（配列番号５：GCCCATCCAAGAAAACCTCAC）及びプライマー１Ｒ（配列番号６：CGGAGAACCCTAATCCCTCA）を用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片ａを調製した。
【００７４】
調製したＤＮＡ断片ａを、ｐＺＨ２Ｂｉｋベクター上の２つの領域に、互いに逆方向となるように挿入し、ＲＮＡｉによる発現抑制用ベクターを構築した。図３は、ＲＮＡｉによるＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子の発現抑制用ベクターのコンストラクトを示す図である。
【００７５】
なお、図３中、ＬＢ及びＲＢは、Ｔ−ＤＮＡ左右境界領域（約０．７ｋｂｐ）を示す。Ｐ−ＣＡＭＶ３５Ｓは、カリフラワーウイルス３５Ｓプロモーター（約０．８ｋｂｐ）を示す。ＨＰＨは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（約１．０ｋｂｐ）を示す。ＮｏｓＴは、Ｎｏｓターミネーター（約０．３ｋｂｐ）を示す。ＯｓｍＵｂｉＰは、改変イネポリユビキチンプロモーター（約１．８ｋｂｐ）を示す。ＲＡＰ  ｉｎｔｒｏｎは、イネアスパラギン酸プロテアーゼ（Ｏｒｙｚａｓｉｎ１）遺伝子（Ｄ３２１６５）のイントロン（約１．０ｋｂｐ）を示す。
【００７６】
（ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統の作製）
次に、作製した発現抑制用ベクターを用いて、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統を作製した。
【００７７】
発現抑制用ベクターを、アグロバクテリウム法（国際公開第０１／０６８４４号パンフレットを参照）により日本晴カルスに導入し、再分化させた植物体からＴ０世代の種子を取得した。世代促進により導入された遺伝子を固定し、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統を確立した。
【００７８】
（定量ＰＣＲ）
作製したＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統におけるＯｓＰＬＤｂｅｔａ２の発現を定量ＰＣＲにより解析した。また、コントロールとして、ベクターコントロール（日本晴にｐＺＨ２Ｂｉｋベクターのみを導入したイネ）を用いた。
【００７９】
ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統とベクターコントロールとの種子をＭＳ培地に無菌播種し、１５日後のそれぞれの苗（Ｓｅｅｄｌｉｎｇ）から全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡから、１本鎖ＤＮＡを作製し、定量ＰＣＲを行なった。定量ＰＣＲでは、プライマー２Ｆ（配列番号７：TTCCAATGTGGCCTGAAGGT）及びプライマー２Ｒ（配列番号８：CTAGGACTGCCGCCTGCTTC）を用いた。図４は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２の定量ＰＣＲにおいて増幅した領域の位置を示す図である。
【００８０】
定量ＰＣＲの結果を図５に示す。図５は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統とベクターコントロールとのそれぞれにおける、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２の発現量（ｍＲＮＡ量）を示すグラフである。なお、ｍＲＮＡ量は、イネのポリユビキチン遺伝子（ＲＵＢＩＱ１）（Wang et al. 2000 Plant Science 156:201-211）の発現量を１００（％）として示した。
【００８１】
定量ＰＣＲの結果、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統では、ベクターコントロールと比較してＯｓＰＬＤｂｅｔａ２の発現が大幅に低下していることが示された（図５）。
【００８２】
（高温処理による白未熟粒の形成）
次に、作製したＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統について、高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を調べた。コントロールとして、野生株の日本晴を用いた。
【００８３】
ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統と野生株の日本晴とを、閉鎖系温室（隔離温室）において平温（２７℃／２５℃）で栽培し、出穂後、高温（３３℃／２８℃）で栽培した。出穂後４０日後に種子を採取し、米の白未熟粒の形成割合を計測した。なお、白未熟粒か否かは、玄米の外観を目視することにより、あるいは穀粒判別機（静岡精機）を用いて自動的に計測することにより、判断した。目視する方法を用いた場合には、少しでも乳白が存在する場合に白未熟粒と認定した。また、白未熟粒の形成割合は、採取した米の全数に対する白未熟粒の割合（％）として算出した。
【００８４】
この結果を図６に示す。図６は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統における高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を示すグラフである。また、グラフ上に示した数字は、栽培試験回数を表す。
【００８５】
ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−ＲＮＡｉ系統における高温処理による白未熟粒の形成割合は、野生株の日本晴に比べて大幅に低減していた（図６）。このことから、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２の発現抑制によって、高温による品質障害を低減させることができることが示された。
【００８６】
〔実施例２〕
本実施例では、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子にレトロトランスポゾンＴｏｓ１７が挿入されたＯｓＰＬＤｂｅｔａ２欠損系統（ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統）を作製した。
【００８７】
（ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統の作製）
日本晴において、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７を増幅させた突然変異集団（ミュータントパネル）の中から、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子にＴｏｓ１７が挿入された系統（ＮＥ３８１７）について、独立行政法人農業生物資源研究所ゲノムリソースセンターより譲渡を受けた。この系統の世代促進による遺伝子固定系統（Ｍｕｔａｎｔ  ｈｏｍｏ）を、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統とした。
【００８８】
図７は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統におけるＯｓＰＬＤｂｅｔａ２遺伝子領域を示す図である。ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統では、配列番号２に示す塩基配列の２０７５ｂｐの位置にＴｏｓ１７が挿入されている。
【００８９】
（高温処理による白未熟粒の形成−閉鎖系温室）
このＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統を用いて、実施例１と同様の方法により、閉鎖系温室において栽培した後高温処理を行ない、白未熟粒の形成割合を計測した。
【００９０】
この結果を図８に示す。図８は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統を閉鎖系温室において栽培した場合の、高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を示すグラフである。また、グラフ上に示した数字は、栽培試験回数を表す。
【００９１】
ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統を閉鎖系温室において栽培した場合の、高温処理による白未熟粒の形成割合は、野生株の日本晴に比べて大幅に低減していた（図８）。このことから、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２を欠損させることによって、高温による品質障害を低減させることができることが示された。
【００９２】
（高温処理による白未熟粒の形成−圃場）
次に、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統について、圃場栽培した場合の高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を調べた。コントロールとして、野生株の日本晴を用いた。
【００９３】
ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統と日本晴とを圃場栽培した。その際、出穂直前（約１０日前）に高さ１．８メートルのビニールで栽培区を囲むことにより、高温処理を行なった（播種：２０１０年４月１０日、圃場移植：２０１０年５月１８日、高温処理開始：２０１０年８月２日、出穂日：日本晴  ８月９〜１１日；ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統  ８月１２〜１３日）。出穂後４０日後に種子を採取し、実施例１と同様の方法により米の白未熟粒の形成割合を計測した。
【００９４】
この結果を図９に示す。図９は、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統を圃場栽培した場合の、高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を示すグラフである。また、グラフ上に示した数字は、出穂後２０日間の平均気温を表す。
【００９５】
ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２−Ｔｏｓ１７系統を圃場栽培した場合の、高温処理による白未熟粒の形成割合は、野生株の日本晴に比べて大幅に低減していた（図９）。このことから、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２を欠損させることによって、圃場栽培においても高温による品質障害を低減させることができることが示された。
【００９６】
したがって、本発明は、農業の実用形質としても有望であり、高温耐性素材の開発に有用であることが示唆された。
【００９７】
〔比較例〕
イネにおけるＯｓＰＬＤｂｅｔａ２以外の以下の７個のホスホリパーゼＤ遺伝子について、それぞれ発現がＲＮＡｉにより抑制されている系統を作製した。なお、それぞれの遺伝子のＲＡＰ  ｌｏｃｕｓ  ＩＤを括弧内に示す。
ＯｓＰＬＤａｌｆａ１（Ｏｓ０１ｇ０１７２４００）
ＯｓＰＬＤａｌｆａ３（Ｏｓ０６ｇ０６０４４００）
ＯｓＰＬＤａｌｆａ４（Ｏｓ０６ｇ０６０４２００）
ＯｓＰＬＤａｌｆａ５（Ｏｓ０６ｇ０６０４３００）
ＯｓＰＬＤｂｅｔａ１（Ｏｓ１０ｇ０５２４４００）
ＯｓＰＬＤｄｅｌｔａ２（Ｏｓ０３ｇ０８４０８００）
ＯｓＰＬＤｅｐｓｉｌｏｎ（Ｏｓ０９ｇ０４２１３００）
これらの抑制系統の作製については、実施例１と同様の方法を用いた。
【００９８】
作製した各抑制系統について、実施例１と同様の方法により、高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を計測した。コントロールとしては、野生株の日本晴を用いた。この結果を図１０に示す。図１０は、イネのホスホリパーゼＤ遺伝子の各抑制系統における高温処理による白未熟粒の形成割合（％）を示すグラフである。
【００９９】
図１０に示すように、今回調べたホスホリパーゼＤ遺伝子のうち、ＯｓＰＬＤｂｅｔａ２以外の遺伝子については、発現を抑制しても高温障害を低減させることができないか、その効果が低いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、イネの高温障害を効率的に低減させることができるため、実用的な農業技術の開発に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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