(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病またはメタボリックシンドローム治療において使用する医薬組成物であって、当該医薬組成物が式（Ｇ２）のＩＳＡまたはその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする医薬組成物。
0005722632.tif 000035
（Ｇ２）
【請求項２】
請求項１に記載の糖尿病またはメタボリックシンドローム治療において使用する医薬組成物であって、前記糖尿病が１型糖尿病であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の糖尿病またはメタボリックシンドローム治療において使用する医薬組成物であって、前記糖尿病が２型糖尿病であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項１において定義される式（Ｇ２）の化合物の使用であって、糖尿病またはメタボリックシンドローム治療用医薬の製造のためであることを特徴とする使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用において、前記糖尿病が１型糖尿病であることを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項４に記載の使用において、前記糖尿病が２型糖尿病であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばメタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームに関連するあらゆる疾病又は疾患、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病及びインスリン耐性を含む中心性肥満、トリグリセリド量の上昇及び糖尿病も含む）などのエネルギー利用疾病の治療用組成物、様々な植物性材料から前記組成物を生産するプロセス、それに基づいた様々な製品、化合物、組成物、医療的使用及び方法に関する。
【０００２】
本発明は、植物性食品添加剤の品質をモニターする方法、植物性食品添加剤を生産するプロセス、並びに、そのようなプロセスによって入手可能な植物性食品添加剤、食品及び飲料にも関する。
【背景技術】
【０００３】
イミノ糖酸（ＩＳＡ）は、イミノ糖として知られているより広く分布するクラスの植物性化学物質のサブクラスを構成する。多くの知られているイミノ糖酸が、植物性化学物質であり、植物組織中に２次代謝産物として存在する（植物組織中でイミノ糖酸は防御機能を発揮することがある）。構造的にイミノ糖酸は非常に多様である。多くのイミノ糖酸は、２５０ダルトンより小さい分子量を有する小分子である。その骨格は、Ｎ−複素環の構造に基づいて構造的に分類することができる糖酸に由来する：Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：２６５−２９５は、とりわけ、ピペリジン、ピロリン、ピロリジン、ピロリジン、インドリジン及びノルトロパンイミノ糖酸などのポリヒドロキシ化されたアルカロイドの包括的な範囲を分類している（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）の図１−７を参照されたい）。その開示はここで言及することによって本明細書に組み込まれている。
【０００４】
イミノ糖は植物に広く分布している（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）が、イミノ糖酸はあまり広く分布していない。本明細書に記載するように、本発明者らは、イミノ糖酸の植物学的分布が、糖尿病、肥満、及び、メタボリックシンドロームに関連する他の疾患を含むエネルギー利用疾病のコントロールに用いられる薬用植物に関連していることを発見した。
【０００５】
エネルギー利用疾病
エネルギー利用疾病は、広範囲の疾病を包含し、例えば、恒常性の疾患、代謝病、糖質代謝機能不全及び食欲障害を含む。
【０００６】
従って、エネルギー利用疾病の例はインスリン耐性、様々な形態の糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、消耗症候群（例えば、癌に関連する悪液症）、筋障害、胃腸疾患、成長遅延、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化及び年齢に関連する代謝作用の機能不全を含む。
【０００７】
エネルギー利用疾病には、例えば、高血中グルコース、耐糖能低下、高インスリン血症、糖尿病、代謝的酸性血症、白内障、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、糸球体硬化症、糖尿病性心筋症、インスリン耐性、グルコース代謝の低下、関節炎、高血圧、高脂血症、骨粗鬆症、骨減少症、骨喪失、脆弱骨症候群、急性冠症候群、不妊症、短腸症候群、慢性疲労、摂食障害及び腸運動機能不全を含む、メタボリックシンドローム、肥満、及び／又は、糖尿病に関連した病状も含まれる。
【０００８】
インスリン耐性、メタボリックシンドローム及び糖尿病
健康な個体においては、血中グルコース濃度が、２つの膵臓ホルモン：インスリン（膵臓のβ細胞によって生産される）及びグルカゴン（膵臓のα細胞によって生産される）によって狭い範囲内に維持される。膵臓のβ細胞は、血中グルコース濃度の増加を感知し、インスリンの分泌によって応答する。インスリンは、身体の組織によるグルコース取り込みを促進し、それによって、血中グルコース濃度を生理的範囲に戻す。グルカゴンは、相互的に作用し、主として肝臓におけるグルコース生産を促進することによって、絶食条件下において血中グルコース濃度を増加させる。
【０００９】
インスリン耐性は、正常な量のインスリンが、組織の細胞からの正常なインスリン反応を生じさせるのに不適当となる程度に、骨格筋、脂肪細胞及び肝細胞中のインスリンの作用が低下することを特徴とする。脂肪細胞において、インスリン耐性は、保存されているトリグリセリドの加水分解を生じさせ、血漿中遊離脂肪酸の増加に至る。筋肉において、インスリン耐性は、グルコース取り込みを減少させる。一方で、肝細胞においてはインスリン耐性によってグルコース貯蔵が減少する。後の両方の場合において、結果的に血中グルコース濃度が上昇する。
【００１０】
インスリン耐性によって血漿量中のインスリン及びグルコースの量が増加すると、多くの場合、メタボリックシンドローム及び２型糖尿病に進行する。
【００１１】
メタボリックシンドロームは、心臓血管疾患及び糖尿病の危険を増大させる異常及び疾患の集合である。多くの先進国において発生率が非常に高い：ある研究は、アメリカにおいて最大で人口の２５％の罹患率を示している。この疾患は、（メタボリック）シンドロームＸ、インスリン抵抗性シンドローム、メタボリックシンドローム及びカオスとしても知られている。以下の症状：中心性肥満（男性については４０インチ以上及び女性については３５インチ以上のウエスト）；高レベルのトリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄＬ以上）；低レベルのＨＤＬ（男性については４０ｍｇ／ｄＬ未満及び女性については５０ｍｇ／ｄＬ未満）及び高血圧（１３０／８５ｍｍＨｇ以上）が３つ以上あればメタボリックシンドロームと診断してもよい。関連する疾患と兆候は：脂肪肝（多くの場合、非アルコール性脂肪肝疾病に進行する）、多嚢胞性卵巣症候群、ヘモクロマトーシス（鉄過剰）及び黒色表皮肥厚症（暗色皮膚パッチ）である。
【００１２】
メタボリックシンドロームの最も重要な治療は、ライフスタイルを変えること（カロリー制限及び身体活動）である。しかしながら、多くの場合には薬物療法が必要である。通常は、メタボリックシンドロームを含む個々の疾病を別々に治療する（例えば、利尿薬と、高血圧用のＡＣＥ阻害薬）。ＬＤＬコレステロール及びトリグリセリドが増加すれば、コレステロール薬剤を用いてＬＤＬコレステロール及びトリグリセリドの量を低下させてもよく、ＬＤＬコレステロール及びトリグリセリドが少なければ、ＨＤＬ量を上昇させてもよい。インスリン耐性を低下させる薬剤（例えば、メトホルミン及びチアゾリジンジオン）にはは賛否両論がある。最近の研究によれば、有酸素運動は、３１％未満のケースにおいて治療効果がみられ、最も有望な恩恵はトリグリセリド量に対してであり、４３％が改善し；反対に、対象の９１％は、空腹時血漿グルコース又はインスリン耐性が低下しなかった。
【００１３】
２型糖尿病は、血中グルコース濃度が永続的に高くなる（高血糖）のが特徴の慢性疾患である。膵臓のβ細胞からのインスリン分泌障害を伴うインスリン耐性が２型糖尿病の特徴である。インスリン耐性から２型糖尿病への進行は、膵臓のβ細胞が正常な血中グルコース濃度（正常血糖）を維持するのに充分なインスリンを生産することができないときに、食後に高血糖が生じることを特徴とする。
【００１４】
現在、２型糖尿病の治療に用いられている最も重要な薬剤は、メトホルミン（グルコファージ、ダイアベックス、ダイアホルミン、フォルタメット、リオメット、グルメッツァ、シドファージなど）である。メトホルミンは、経口抗高血中グルコース薬剤のビグアニド種からなる。他のビグアニドには、フェンホルミン及びブホルミン（現在は回収された）が含まれる。メトホルミンは、第１に、肝臓のグリコーゲン貯蔵から血中グルコースへの放出を減少させることによって機能し、グルコースの取り込みを増加させる効果もある。他の広く使用されている薬剤種には、スルホニル尿素誘導体族（グリベンクラミド及びグリクラジドを含む）のものが含まれる。これらの薬剤は、グルコースで促進される膵臓によるインスリン分泌を増加させる。さらに新しい薬剤種には、チアゾリジンジオン（例えばロシグリタゾン、ピオグリタゾン及びトログリタゾン）が含まれる。これらの薬剤は、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）（細胞核内の１グループの受容体分子）に結合することによって作用する。他の種には、α−グルコシダーゼ阻害薬（アカルボース及びミグリトール）、メグリチニド（インスリン放出を促進する）（ナテグリニド、レパグリニド及びこれらの類似化合物が含まれる。）、ペプチド類似化合物（例えば、インスリン分泌促進薬として機能するインクレチン疑似分子）、グルカゴン用ペプチド類似化合物（例えばエクセナチド）、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤（インクレチンの量を増加させる）（例えばシタグリプチン）、及び、アミリンアゴニスト類似化合物（胃内容排出を遅らせ、グルカゴンを抑制する）（例えばプラムリンチド）が含まれる。
【００１５】
しかしながら、様々な形態の２型糖尿病用の既存の治療法には、β細胞における重要な内因性因子の機能を改善するものは存在しない。既存の治療法のすべては、時間経過に伴う悪化を止めることができず、また、グルコース濃度を通常に戻すこと及び／又は後遺症を防ぐこともできない。既存の治療も望ましくない副作用を伴う。例えば、インスリン分泌促進薬及びインスリン注射液は、低血糖症及び体重増加を引き起こす可能性がある。時間経過に伴って、患者がインスリン分泌促進薬に反応しなくなることもある。メトホルミン及びα−グルコシダーゼ阻害薬は、しばしば胃腸障害を生じさせ、ＰＰＡＲアゴニストは、体重増加やむくみを引き起こす傾向がある。エクセナチドも悪心嘔吐を引き起こすことが報告されている。
【００１６】
１型糖尿病（又はインスリン依存型糖尿病）は、インスリンを生成する膵臓ランゲルハンス島のβ細胞の消失を特徴とし、インスリンの欠乏に至る。このβ細胞消失の主要な原因は、Ｔ細胞によって媒介される自己免疫性攻撃である。１型糖尿病に対して行うことができる知られた予防的手段は存在しない。１型糖尿病は、北アメリカ及びヨーロッパにおける糖尿病ケースの最大１０％を構成している。発病が始まるときに、大部分の患者は、他の点において健康であり、健康な体重である。インスリンに対する感受性及び反応性は、一般に、特に初期段階において、正常である。
【００１７】
１型糖尿病の主な治療法は、血液試験モニターを用いて、最早期段階から血中グルコース濃度を注意深くモニタリングしながら、インスリンを補給することである。インスリンがなければ、ケトーシス及び糖尿病性ケトアシドーシスが進行して、結果的に昏睡になるか又は死亡するであろう。一般の皮下注射とは別に、ポンプによってインスリンを送達し、それによって、事前に設定した濃度におけるインスリンの持続的な注入が１日２４時間に渡って可能になり、食事時間中に求められるインスリン用量（ボーラス）をプログラムすることも可能である。インスリンの吸入形態（エクスベラ）は、ＦＤＡによって最近認可された。
【００１８】
１型糖尿病の治療は、無期限に継続する必要がある。治療によって日常生活は損なわれないが、深い理解、適切な注意及び試験における訓練、薬剤投与を遵守しなければならない。
【００１９】
従って、新規及び／又は代替の抗糖尿病薬剤治療、特にβ細胞機能を回復することができるものが必要である。特に、既存の薬物療法よりも副作用が少ない２型糖尿病及び１型糖尿病の両方並びに関連症状を治療することができる、効果的な薬剤、並びに、メタボリックシンドロームの治療、特に、肥満及び／又はトリグリセリド濃度上昇に対する有効な治療に対して現実的で実際は要求が満たされていない臨床的な要求がある。
【００２０】
植物性食品添加剤及び植物性生薬
近年、植物性生薬及びサプリメントの使用に高い関心が寄せられ、植物性製品に価値があり、確立された製剤及び治療を補うことができるという見解が、食料メーカー、ヘルスケア会社及び医療専門家に受け入れられつつある。現在、植物性食品添加剤及びサプリメントが広く用いられている。特に、天然甘味料において低炭水化物かつ低糖の食料代替物の需要に高い関心が寄せられている。また、ステビオールグリコシド（ステビア植物（ステビアレバウディアナ）の葉の甘味の要因である）は、天然甘味料としてコカコーラ社によって開発されている。
【００２１】
しかしながら、植物性食品添加剤の品質管理は、植物性材料の複雑な性質及び固有の不均一性により困難である。植物性食品添加物及び植物をベースとする食品添加物に用いられる材料は、通常、植物の全体又は一部分又はそれらの抽出物である。植物性材料は様々な化学成分を含んでいるので、植物性材料は複雑な混合物である。このことは、材料の品質を規格化して制御することを非常に困難にする。さらに、多くの植物性食品添加剤は、植物をベースとする２以上の成分の混合物であり、従って、混合物の混合物であるので、さらなるレベルの複雑さを生じさせている。更に、用いられる配合及び製造方法は、多くの場合一定でなく、公表されていない場合もある。これらの要因によって、異なる出所から得た、表向きは同一の規定の製品の２つのサンプルが、実際に、成分の同じ混合物を含んでいることを保証することが非常に困難である。そのような材料の品質の制御を困難にするこの問題によって、植物の専門家であっても特定の植物抽出物の使用が限定される。
【００２２】
特定のステビオシドは、変異原作用を有している可能性があると報告されており、従って、ステビア由来植物性材料を分画してそのような物質を除去することが特に重要であるので、そのような問題は、ステビア由来製品のケースにおいて特に深刻である。
【００２３】
その他の問題は、植物性食品添加剤の実施において用いられる植物がしばしば局所的に入手不可能であり、従って、最終使用者から遠い出所から得る必要があるという事実から生じる。しかしながら、特に、そのような多数の植物についての同一性及び品質の基準を含む詳細な研究が存在しないので、そのような植物の遠隔からの供給は不安定であり、不正確である。薬用植物中にみられる成分の複雑な混合物は、植物源、植物が成長する場所、その近くで他のどんな植物又は微生物が生息しているか、植物を収穫する時期、材料を保存及び処理する条件、及び、用いる抽出方法を含む多数の要因に依存して、タイプ及び濃度が大幅に変化する。
【００２４】
従って、植物性製品をプロファイリングして、活性に関連し得る薬用植物材料のための標準規格を確立することができ、それによって、植物性食品添加剤の生産における品質管理を可能にし、理想的には既知成分又は活性であると思われる成分の量を定量することができる高感度なプロセスが必要である。
【００２５】
イミノ糖酸は、環酸素が窒素で置換された糖酸の類似化合物である。イミノ糖は、植物に広く分布しているが（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：２６５−２９５）、イミノ糖酸は、あまり広く分布していない。本発明者らは、イミノ糖酸の植物学的分布は、糖尿病及び肥満の制御に用いられる薬用植物に関連していることを新たに発見した。おそらく、従来のＨＰＬＣ分析システムを用いて炭水化物様化合物を分析するのが難しかったことにより、従来はこれらの植物からイミノ糖酸が報告されておらず、これらの植物中の糖認知に影響する化合物により強い関心が寄せられていた。従って、イミノ糖酸についての植物性材料の質的及び／又は定量的分析は、材料調達における品質管理法や、植物性食品添加剤の調製及び加工や、それらをベースとする食品／飲料、特に、低カロリー又は低糖食品の一部を形成するために配合された食品及び飲料の基礎を形成することができる。ある用途においては、不適当であるか又は望ましくない薬剤活性が追加した食料又は飲料から除去されたことを確実にするために、イミノ糖酸が植物性材料中に存在しないことを確認することが重要である可能性がある。
【発明の概要】
【００２６】
本発明は、少なくとも一部において、イミノ糖酸の植物学的分布が、糖尿病、肥満及び他のメタボリックシンドローム関連疾患の制御に用いられる薬用植物に関連しているという驚くべき発見に基づいている。従って、イミノ糖酸は、確立された抗肥満及び抗糖尿病漢方薬中の重要な生物活性成分であると初めて確認された。
【００２７】
従って、本発明は、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性を含むメタボリックシンドロームといったエネルギー利用疾病の治療用の単離されたイミノ糖酸、及び、単離されたイミノ糖酸を含む栄養補給組成物又は医薬品組成物を提供する。
【００２８】
従って、本発明は、エネルギー利用疾病（例えばメタボリックシンドローム（１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性を含む）の治療用組成物を生産するプロセスであって、（ａ）植物性材料を提供するステップと；（ｂ）前記植物性材料から１以上のイミノ糖酸を単離する（さらに、選択的に潜在的毒素を除去又は低減する）ステップと；次いで、（ｃ）前記単離したイミノ糖酸を、ヒト対象者のエネルギー利用疾病を治療するのに充分な量で医薬品賦形剤と共に配合して抗メタボリックシンドローム組成物を生産するステップと、を具えるプロセスを提供する。
【００２９】
本発明は、本明細書中に記載されている天然に存在するイミノ糖酸の合成類似化合物を意図する。そのような合成類似化合物は、以下のステップ：（ａ）植物性材料から１つ以上のイミノ糖酸を単離するステップと；（ｂ）前記イミノ糖酸の構造を決定するステップと；次いで、（ｃ）前記合成イミノ糖酸類似化合物を合成するステップとを具えるプロセスによって生産することができる。従って、本発明は、メタボリックシンドローム及び／又は糖尿病（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）の治療用のイミノ糖酸を生産するプロセスであって、以下のステップ：（ａ）植物性材料から１つ以上のイミノ糖酸を単離するステップと；（ｂ）前記イミノ糖酸の構造を決定するステップと；次いで、（ｃ）前記イミノ糖酸を合成して、メタボリックシンドローム及び／又は糖尿病（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）の治療に使用される合成イミノ糖酸を得るステップと、を具えるプロセスを意図する。
【００３０】
本発明は、本明細書中に記載されている天然に存在するイミノ糖酸の合成誘導体を意図する。そのような合成誘導体は、以下のステップ：（ａ）植物性材料から１つ以上のイミノ糖酸を単離するステップと；次いで、（ｂ）前記単離されたイミノ糖酸を（例えば化学的に又は酵素的に）誘導して合成イミノ糖酸誘導体を得るステップと、を具えるプロセスによって生産することができる。従って、本発明は、メタボリックシンドローム及び／又は糖尿病（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）の治療用のイミノ糖酸を生産するプロセスであって、以下のステップ：（ａ）植物性材料から１つ以上のイミノ糖酸を単離するステップと；次いで、（ｂ）前記単離されたイミノ糖酸を（例えば化学的に又は酵素的に）誘導して合成イミノ糖酸誘導体を得るステップと、を具えるプロセスを意図する。
【００３１】
ステップ（ａ）で出発物質として用いられる植物性材料は、好ましくは、以下：（ａ）ステビア種（例えばステビアレバウディアナ）；（ｂ）ギムネマ種（例えばＧ．シルベストレ）；（ｃ）アンドログラフィス種（例えばＡ．パニキュラータ）；（ｄ）マメ種（例えばＡｓｐａｌａｎｔｈｕｓ  ｌｉｎｅａｒｉｓ（ルイボス）、バフィア種、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ダイズ）、アレクサ種、カスタノスペルマムオーストレール、ハス種；（ｅ）ミカン科（例えば柑橘類の種（例えばダイダイ））の植物、（ｆ）ウリ科（例えばアジアのパンプキン、ククルビタフィキフォリア及びツルレイシ）の植物又は（ｇ）ナス科（例えばリキウム属バルバラム、ゴジ）から選択される植物源に由来する。
【００３２】
イミノ糖酸は、好ましくは、ピペリジン、ピロリジン、ピロリン、ピロリジジン、インドリジン及びノルトロパンイミノ糖酸から選択される構造クラスからなる。
【００３３】
他の一態様において、本発明は、上記プロセスによって得ることができる、抗メタボリックシンドローム及び／又は抗糖尿病（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）として用いるための、抗メタボリックシンドローム剤及び／又は抗糖尿病剤（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）を意図する。
【００３４】
他の一態様においては、本発明は、抗メタボリックシンドローム組成物及び／又は抗糖尿病組成物（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）を意図する。
【００３５】
他の一態様においては、本発明は、医薬品組成物を生産するプロセスであって、前記組成物のサンプル中のイミノ糖酸の存在若しくは不存在を検出するか又はイミノ糖酸の量を測定することによって前記組成物の品質をモニターするステップを具えるプロセスを意図する。このような実施形態は、天然植物源からの精製に基づいて抗糖尿病薬剤を生産するプロセスにおいて特別な用途が見いだされる。
【００３６】
他の一態様においては、本発明は、医薬品組成物の品質をモニターする方法であって、以下のステップ：（ａ）組成物のサンプルを提供するステップと；（ｂ）前記サンプル中のイミノ糖酸の存在若しくは不存在を検出するか又はイミノ糖酸の量を測定するステップと、を具える方法を意図する。同様に、このような実施形態は、天然植物源からの精製に基づいて抗糖尿病薬剤を生産するプロセスにおいて特別な用途が見いだされる。
【００３７】
後の２つの実施形態は、ギムネマ種（例えばＧ．シルベストレ属、ルイボス属、ダイズ属、リキウム属、モモルディカ属又はカボチャ属）からの単離に基づいた抗糖尿病薬剤の生産において特別な用途が見いだされる。
【００３８】
本明細書に記載されているいくつかのイミノ糖酸は新規である。本発明に従って、新規なイミノ糖酸自体を製品として提供する。また、それらのイミノ糖酸の生産プロセス、それらのイミノ糖酸を含む組成物、及び、それらのイミノ糖酸の医薬品としての使用も提供する。本明細書に記載されているイミノ糖酸のいくつかは、それ自体は周知であるが、医薬品としては知られていない。本発明に従って、それ自体は当業界において知られているものの、医薬品用途としてはまだ開示されていないイミノ糖酸について特許を求める。
【００３９】
本発明の植物性品質モニタリング態様
本発明の他の態様によれば、植物性食品添加剤を生産するプロセスであって、前記植物性食品添加剤のサンプル中のイミノ糖酸の存在若しくは不存在を検出するか又はイミノ糖酸の量を測定することによって前記植物性食品添加剤の品質をモニターするステップを具えるプロセスを提供する。
【００４０】
他の一態様においては、本発明は、植物性食品添加剤の品質をモニターする方法であって、以下のステップ：（ａ）植物性食品添加剤のサンプルを提供するステップと；（ｂ）前記サンプル中のイミノ糖酸の存在又は不存在を検出するか又はそのイミノ糖酸の量を測定するステップとを具える方法を提供する。
【００４１】
本文脈において、品質という用語は、その意図した使用における植物性食品添加剤の全般的適格性を定義するために用いられ、例えば、特定の材料源の使用、条件、純度、及び、許容可能又は許容不能な汚染度を、望ましくない添加物及び／又は汚染物質と共に示す、１つ以上の植物性化学物質の（適正濃度での）存在又は不存在を含んでもよい。
【００４２】
望ましい生物活性がイミノ糖酸に関連する状況（例えば抗肥満又は抗糖尿病活性）において、本発明は、好ましくは、前記植物性食品添加剤のサンプル中のイミノ糖酸の存在を検出するか又はそのイミノ糖酸の量を測定することによって、前記植物性食品添加剤の品質をモニターするステップを具える。
【００４３】
しかしながら、生物活性がイミノ糖酸に関連している（例えばグリコシダーゼ抑制活性、抗肥満又は抗糖尿病活性）が、食品添加物からそのような活性を除去することが望まれる状況において、本発明のプロセスは、好ましくは、前記植物性食品添加剤のサンプル中のイミノ糖酸の不存在を検出することによって前記植物性食品添加剤の品質をモニターするステップを具える。本発明のそのような実施形態は：（ａ）他の植物性化学物質と共にイミノ糖酸を含むことが知られている植物源に植物性食品添加剤が由来している状況、及び、（ｂ）イミノ糖酸ではない他の植物性化学物質が必要な状況において特別な用途が見いだされる。そのような状況は、例えば、植物性食品添加剤がイミノ糖酸とステビオールグリコシドとの両方を含むステビア由来材料で構成されている場合、及び、イミノ糖酸を含まないステビオールグリコシドで構成されている食品添加物が必要な場合（例えば、いかなる生物活性も付加することなく天然甘味料として機能させるために）に、生じる可能性がある。
【００４４】
後者の実施形態においては、前記植物性食品添加剤のサンプル中のイミノ糖酸の不存在を検出することによって前記植物性食品添加剤の品質をモニターするステップは、通常、イミノ糖酸被検体の濃度についての上限値を与える分析的ステップの形態をとり、イミノ糖酸の絶対的な不存在を確認するような必要はない。多くの場合において、このステップは、サンプル中のイミノ糖酸の濃度が特定の限界値よりも低いことを保証するために用いることができる値を与えるようなものである。そのような状況における限界値は、植物性食品添加剤を用いる用途に依存するであろう。大部分の場合において、その限界値は、植物性添加剤を使用するときに、イミノ糖酸の生物学的作用が許容可能である（例えば、検出不可能な）よりも低い濃度を反映するであろう。
【００４５】
更なる一態様において、本発明は、補われた食料又は飲料を生産するプロセスであって、以下のステップ：（ａ）植物性食品添加剤を提供するステップと；（ｂ）本発明の方法に従ってステップ（ａ）の前記植物性食品添加剤の品質をモニターするステップと；（ｃ）前記植物性食品添加剤を食料又は飲料に加えて、補われた食料又は飲料を生産するステップと、を具えるプロセスを提供する。
【００４６】
本発明のこの態様は、あらゆる補われた食料若しくは飲料の生産に幅広い実用性があり、チルド食品及び飲料、熱い食品及び飲料、加糖食品及び飲料、炭酸飲料、アルコール飲料及びノンアルコール飲料を含むあらゆる食料若しくは飲料を用いてもよい。補われた食料又は飲料は、好ましくは炭酸飲料である。
【００４７】
特に好ましいものは、１以上のステビオールグリコシドで甘味付けられた飲料又は食料である。そのような実施形態において、ステビオールグリコシドは、好ましくは以下：（ａ）ステビオシド；（ｂ）レバウジオシド；及び（ｃ）ダルコシドＡから選択される。例えば、ステビオールグリコシドは、好ましくは、単離されたレバウジオシドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及び／又はＥを含んでいるか又はこれらから実質的になる。特に好ましいものは、レバウジオシドＡから実質的になる飲料又は食料である。
【００４８】
本発明に従ってあらゆる植物性食品添加剤を用いてもよいが、好ましいものは、ステビア種、ギムネマ種（例えばギムネマシルベストレ）、シトラス種、Ａｓｐａｌａｎｔｈｕｓ  ｌｉｎｅａｒｉｓ種（ルイボス）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ種（ダイズ）、パンプキン種（ククルビタフィキフォリア及び他のウリ科種（例えばツルレイシ）、リキウム属バルバラム（ゴジ）、これらの混合物から由来した植物性食品添加剤である。
【００４９】
本発明のプロセス及び方法は、好ましくは、植物性食品添加剤の前記サンプル中のイミノ糖の存在若しくは不存在を検出するか又はイミノ糖の量を測定するステップをさらに具える。そのような実施形態において、イミノ糖及び／又はイミノ糖酸は、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジジン、インドリジン及びノルトロパンからなっていてもよい。好ましい実施形態において、イミノ糖は、グリコシダーゼ阻害剤（例えばαグルコシダーゼ又はグルクロニダーゼ阻害剤）である。
【００５０】
本発明に従ってイミノ糖又はイミノ糖酸の存在又は不存在を検出する実施形態において、好ましいのは、ピロリジンイミノ糖又はイミノ糖酸の存在又は不存在を検出するプロセスである。特に好ましいものは、２，５−ジヒドロキシメチル−３，４−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）又はその誘導体である。後者の実施形態は、植物性食品添加剤がＤＭＤＰ及び誘導体とステビオールグリコシドとの両方を含むステビア由来材料を含む場合、及び、ＤＭＤＰ又は誘導体がないステビオールグリコシドを具える食品添加物が必要である場合（例えば、いかなる生物活性も付加することなく天然甘味料として機能させるため）に、特に好ましい。
0005722632.tif 000002
イミノ糖酸の例（左上のデオキシノジリマイシン、ＤＮＪ；左下のＤＭＤＰ）及びこれらが由来したイミノ糖
【００５１】
本発明のプロセス及び方法において被検体として用いられるイミノ糖酸は、ピペリジン、ピロリン、ピロリジン、ピロリジジン、インドリジン及びノルトロパンイミノ糖酸を含むあらゆるイミノ糖酸であってもよい。好ましいものは、ピペリジンイミノ糖酸（例えばピペコリン酸）である。
【００５２】
本発明のプロセス及び方法において被検体として用いられるイミノ糖及び／又はイミノ糖酸は、好ましくは、ポリヒドロキシ化されたものである。
【００５３】
植物性食品添加剤は、好ましくは、ステビア種（例えばステビアレバウディアナ）に由来する植物性材料又は１つ以上の植物性化学物質である。
【００５４】
本発明は、本発明の方法及びプロセスに従って得ることができる植物性食品添加剤をも意図する。
【００５５】
発明の詳細な説明
定義及び一般設定
以下の用語は、ここで用いられて、別段の定めがなければ、その用語が当業界で有するよりも広い（又はより狭い）任意の意味に加えて、以下の意味を有するように意図される。
【００５６】
ここで用いているように、「エネルギー利用疾病」という用語は、異常なエネルギー利用から生じるあらゆる疾病又は疾患を包含する。従って、この用語は、恒常性の疾患及び疾病、代謝性疾患、糖質代謝機能不全、及び、食欲障害を包含する。従って、この用語は、インスリン耐性、様々な形態の糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、消耗症候群（例えば、癌に関連する悪液症）、筋障害、胃腸疾患、成長遅延、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化及び年齢に関連した代謝機能不全を含む。この用語は、例えば、高血糖、耐糖能低下、高インスリン血症、糖尿、代謝的酸性血症、白内障、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、糸球体硬化症、糖尿病性心筋症、インスリン耐性、グルコース代謝の低下、関節炎、高血圧、高脂血症、骨粗鬆症、骨減少症、骨喪失、脆弱骨症候群、急性冠症候群、不妊症、短腸症候群、慢性疲労、摂食障害及び腸運動機能不全を含む、メタボリックシンドローム、肥満、及び／又は糖尿病に関連した病状を包含する。
【００５７】
本明細書中におけるメタボリックシンドロームの治療への言及は、メタボリックシンドロームに関連した疾患、特に、肥満（例えば中心性肥満）、並びに、（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）血清トリグリセリド及び糖尿病の上昇を含むいずれか又はすべての治療を包含するように解釈する。
【００５８】
イミノ糖酸という用語は、環酸素を窒素で置換した糖酸類似化合物を意味する。Ｎ−酸イミノ糖酸という用語は、カルボン酸基が環窒素上に位置しているイミノ糖酸を意味する。Ｎ−酸誘導体という用語は、環窒素をカルボン酸基で置換したイミノ糖類似化合物を意味する。
【００５９】
好ましいイミノ糖酸は、以下の構造のクラス：ピペリジン（（ポリ）ヒドロキシピペコリン酸を含む）；ピロリン；ピロリジン（（ポリ）ヒドロキシプロリンを含む）；ピロリジジン；インドリジン及びノルトロパンから選択される。
【００６０】
本明細書中で用いられているように、「ポリヒドロキシ化された」という用語は、イミノ糖酸に適用されるように、環系原子上に少なくとも２個の（好ましくは少なくとも３個の）遊離水酸基（又はヒドロキシアルキル基）を有するイミノ糖酸を意味する。
【００６１】
本明細書において、「単離された」という用語は、本発明のイミノ糖酸に適用されるように、イミノ糖酸が自然に生じる環境とは異なった物理的環境にそのイミノ糖酸が存在する（あるいは、合成物の場合には、天然に存在しないイミノ糖酸が精製された）ことを示すために用いられる。例えば、単離された材料は、自然に生じる複雑な細胞環境に対して実質的に単離された（例えば、精製された）ものであってもよい。
【００６２】
単離された材料（例えば、天然に存在しない合成イミノ糖酸）を精製するときに、純度の絶対的レベルは重要ではなく、当業者は、材料を用いる用途に従って純度の適切なレベルを容易に決定できる。しかしながら、９０％（重量対重量）、９９％（重量対重量）以上の純度レベルであることが好ましい。ある状況においては、単離されたイミノ糖酸は、組成物（例えば、多数の他の物質を多少含んでいる粗抽出液）又は緩衝系の一部を構成していていてもよく、この組成物又は緩衝系は、例えば、他の成分を含んでいてもよい。他の状況においては、ＮＭＲ又はクロマトグラフィー（例えばトリメチルシリル誘導体のＧＣ−ＭＳ）によって、例えば、分光測光法で測定したときに、単離されたイミノ糖酸を実質的に均一に精製することができる。
【００６３】
本明細書中において、植物化学物質という用語は、高分子及び小分子を含む植物のあらゆる化学成分を包含するように広い意味で用いられる。重要な例には、アルカロイド（例えばイミノ糖及びイミノ糖酸、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピロリジジン、インドリジン、トロパン及びノルトロパンの構造クラスから選択される）、炭水化物類似化合物、フェノール類、テルペノイド、酵素抑制因子、グリコシド、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質及び糖が含まれる。
【００６４】
誘導体及び薬学的に許容可能な誘導体という用語は、本発明のイミノ糖酸に適用されているように、本発明の親イミノ糖酸を化学的に誘導することによって得た（あるいは得ることができる）イミノ糖酸を意味する。薬学的に許容可能な誘導体は、過度の毒性、刺激又はアレルギー反応を生じさせない（すなわち、合理的な利益／リスク比と釣り合う）ので、ヒト組織に投与するか又は接触させて使用するのに好適である。好ましい誘導体は、本発明の親イミノ糖酸のアルキル化、エステル化又はアシル化によって得られる（又は得ることができる）ものである。特に好ましいものは、アシル（例えばブチル）誘導体、例えばＯ−アシル（例えばＯ−ブチル）誘導体である。Ｎ−酸イミノ糖酸も好ましい。
【００６５】
誘導体は、それ自体が抗糖尿病性であってもよいし、又はインビボで処理されるまで不活性であってもよい。後の場合においては、本発明の誘導体がプロドラッグとして機能する。特に好ましいプロドラッグは、遊離水酸基の１つ以上がエステル化され、インビボ加水分解によって活性化されるエステル誘導体である。本発明の薬学的に許容可能な誘導体は、親イミノ糖酸の抗糖尿病活性の一部又は全部を保持している。ある場合においては、誘導体化することによって活性が増大する。誘導体化は、例えば、生体有用性、及び／又はグリコシダーゼ抑制活性、及び／又は、グリコシダーゼ抑制特性といった、イミノ糖酸の他の生物活性を増大させる可能性もある。例えば、誘導体化は、グリコシダーゼ抑制能力を低下させ、及び／又は、特異性を増大させる可能性がある。
【００６６】
グルコシダーゼ活性を抑制しない（又はグルコシダーゼ活性を臨床的に意味のある程度まで抑制しない）本発明のイミノ糖酸は、検出可能な抑制活性を示さないか、弱い阻害剤であってもよく、例えば、μＭ若しくはｍＭの範囲又はそれより高いＩＣ５０値を示す。一般に、化合物がマイクロモルの範囲よりも小さいＩＣ５０値を有するときにだけ、臨床的に意味のあるグルコシダーゼ阻害が生じる。そのような実施形態において、グルコシダーゼは、哺乳類α−グルコシダーゼ、例えば、α−グルコシダーゼ及び／又は消化作用のあるα−グルコシダーゼ（例えばサッカラーゼなどのジサッカリダーゼ）であってもよく、その結果、イミノ糖酸は、これらの酵素クラスに関して検出可能な抑制活性を示さない（あるいは、μＭ又はｍＭの範囲又はそれより高いＩＣ５０値を示す）。
【００６７】
グルコシダーゼ活性を抑制しない（又はグルコシダーゼ活性を臨床的に意味のある程度まで抑制しない）本発明のイミノ糖酸には、インビボにおける望ましいグルコシダーゼ活性の活性が残されていてもよく、特に、周知の抗糖尿病イミノ糖薬剤（ミグリトールなど）の使用と共にみられる有害な胃の副作用が低減されるか又はなくなる程度まで消化性グルコシダーゼ活性が残されていてもよい。
【００６８】
薬学的に許容可能な塩という用語は、本発明のイミノ糖酸に適用されるように、遊離塩基化合物の無毒な有機塩又は無機酸付加塩のあらゆるものであって、過度の毒性、刺激又はアレルギー反応を生じさせない、すなわち、合理的な利益／リスク比と釣り合う、ヒト及び下等動物の組織に接触させて使用するのに適しているものを意味する。適切な薬学的に許容可能な塩は当業界において周知である。具体例は、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫黄及びリン酸）、有機カルボン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン、ジヒドロキシマレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、４−アミノ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、サリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸及びマンデル酸）、及び、有機スルホン酸（例えばメタンスルホン酸及びｐ−トルエンスルフォン酸）との塩である。本発明のイミノ糖酸薬剤を、例えば塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化リチウムなどのアルカリ金属ハロゲン化物との反応によって塩に変換してもよい。好ましくは、本発明のイミノ糖酸を、アセトンなどの溶媒の存在下で化学量の塩化ナトリウムとの反応によって塩に変換する。
【００６９】
これらの塩及び遊離塩基化合物は、水和された形態又は実質的に無水の形態のいずれで存在していてもよい。本発明の化合物の結晶形態も意図されており、一般に、本発明のイミノ糖酸の酸付加塩は、水及び様々な親水性有機溶剤に可溶性であり、それらの遊離塩基形態と比較してより高い融点及び高い溶解度を示す結晶質である。
【００７０】
本明細書において、植物性薬剤という用語は、少なくとも１つの有効成分が、化学的に合成されたものではなく、植物の植物化学的成分である医薬品組成物を意味するように用いられる。ほとんどの場合、この非合成有効成分は、（本明細書中で定義されているように）単離されていないが、その非合成有効成分が出所植物において伴う他の植物化学物質と共に存在する。しかしながら、ある場合においては、植物由来の生物活性成分が、濃縮した画分中に存在していてもよいし又は単離されていてもよい（高程度の精製を必要とすることもある）。そのような場合には植物（又は植物の一部）を少なくとも乾燥又は破砕するのが普通であるが、しかしながら、多くの場合において、植物性薬剤は、多少の粗抽出液、植物の浸出液若しくは破片又は処理されていない植物全体（又はその一部）を含んでいる。
【００７１】
本明細書において、植物性食品添加剤という用語は、少なくとも１つの成分が化学的に合成されたものではなく、植物の植物化学成分である組成物を意味するように用いられる。ほとんどの場合、非合成成分は、精製されていおらず、その非合成成分が植物源中に伴う他の植物化学成分と共に存在している。しかしながら、ある場合においては、植物由来成分が、濃縮した画分中に存在していてもよいし又は単離されていてもよい（時には、高程度の精製を必要とする）。そのような場合には植物（又は植物の一部）を少なくとも乾燥又は破砕するのが普通であるが、しかしながら、多くの場合において、植物性食品添加剤は、多少の粗抽出液、植物の浸出液若しくは破片又は処理されていない植物全体（又はその一部）を含んでいる。
【００７２】
本明細書において、生物活性成分という用語は、その成分が含まれている植物性医薬剤の薬剤的効能に必要であるか又は充分である植物化学物質を意味するように用いられる。本発明の場合、生物活性成分は、本発明の抗糖尿病性イミノ糖酸で構成される（例えば式（Ｇ２）の化合物）。
【００７３】
本明細書において、標準規格という用語は、植物性薬剤の合格品質に関連した特性又は植物化学的側面を意味するように用いられる。この文脈において、品質という用語は、意図した使用についての植物性医薬品の全般的な適合性を意味するように用いられ、１以上の上記生物活性成分の（適正濃度での）存在、又は、１以上の生物活性のマーカーの存在、又は、１以上の生物活性成分の（適正濃度での）存在と関連する植物化学的特性を含む。
【００７４】
本明細書において、植物化学的側面は、異なる植物化学成分に関する１セットの特性を定義するように用いられる。
【００７５】
その最も広い態様において、本発明は、本発明のイミノ糖酸の、すべての光学異性体、ラセミ体形態及びジアステレオマーを意図する。当業者は、本発明のイミノ糖酸に存在する非対称に置換された炭素原子に起因して、本発明のイミノ糖酸は、光学活性形態及びラセミ体形態で、存在し、合成され、及び／又は、単離される可能性があることを理解するであろう。従って、本発明のイミノ糖酸への言及は、ジアステレオマーの混合物としてのイミノ糖酸、個々のジアステレオマーとしてのイミノ糖酸、及び、エナンチオマーの混合物としてのイミノ糖酸、個々のエナンチオマーの形態としてのイミノ糖酸を包含する。
【００７６】
従って、本発明は、本発明のイミノ糖酸の光学異性体及びそのラセミ体形態をすべて意図しており、（例えばダッシュ−楔構造式の使用によって）別段の定めがない限り、ここに示されている化合物は、そのように表された化合物のあらゆる光学異性体を包含するように意図される。イミノ糖酸の立体化学的形態が薬剤の実用性にとって重要である場合、本発明は、単離したユートマーの使用を意図する。従来の技術（例えばクロマトグラフィー、単離結晶）を用いてジアステレオ異性体を単離してもよい。例えば、単離結晶、ＨＰＬＣといった従来の技術を用いたラセミ体又は他の化合物の混合物の単離によって、様々な光学異性体を単離してもよい。代替的に、ラセミ化を生じさせない条件下で、適切な光学的活性出発物質を反応させることによって望ましい光学異性体を作成してもよい。
【００７７】
本発明のイミノ糖酸
イミノ糖酸（ＩＳＡ）は、環酸素を窒素で置換した糖酸の類似化合物である。イミノ糖は植物に広く分布しているが（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：２６５−２９５）、イミノ糖酸はあまり広く分布していない。
【００７８】
イミノ糖酸は、Ｎ−複素環の構造に基づいて構造的に分類することができる。具体例には、ピペリジン、ピロリン、ピロリジン、ピロリジジン、インドリジン及びノルトロパンイミノ糖酸が含まれる（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）の図１−７を参照されたい）。その開示はここで言及することによって組み込まれている。
【００７９】
特に好ましいものは、以下の構造のクラス：（ａ）ピペリジンイミノ糖酸（（ポリ）ヒドロキシピペコリン酸を含む）；（ｂ）ピロリンイミノ糖酸；（ｃ）ピロリジンイミノ糖酸（（ポリ）ヒドロキシプロリンを含む）；（ｄ）ピロリジジンイミノ糖酸；（ｅ）インドリジンイミノ糖酸；及び、（ｆ）ノルトロパンイミノ糖酸から選択されるイミノ糖酸である。
【００８０】
しかしながら、上に一覧されている１つ以上のクラスを代表する２つ以上の異なるイミノ糖酸代表を含むイミノ糖酸混合物又は組み合わせを用いてもよい。
【００８１】
ポリヒドロキシ化されたイミノ糖酸が好ましい。特に好ましいものは、望ましい薬物動態を示すので、小さな分子量を有するイミノ糖酸である。従って、イミノ糖酸は、１００〜４００ダルトンの分子量を有していてもよく、好ましくは１５０〜３００ダルトン、最も好ましくは２００〜２５０ダルトンの分子量である。
【００８２】
１つ以上のヒドロキシメチル基がカルボキシル基と置換されるヒドロキシメチルに置換されたイミノ糖の類似化合物であるイミノ糖酸も好ましい。
【００８３】
例示的ピペリジンイミノ糖酸
本発明のイミノ糖酸は、環構造原子上に少なくとも３個の遊離水酸基（又はヒドロキシアルキル基）を有するピペリジンイミノ糖酸であってもよい。例示的ピペリジンイミノ糖酸は、ヒドロキシピペコリン酸である。特に好ましいヒドロキシピペコリン酸は、環構造原子上に少なくとも２個の（例えば３個）遊離水酸基（又はヒドロキシアルキル基）を有する多価ピペコリン酸である。上述したもののＮ−酸誘導体、及び、１−デオキシノジリマイシンなどのピペリジンイミノ糖のＮ−酸誘導体も意図されている。
【００８４】
本発明の例示的ピペリジンイミノ糖酸は、式（Ｉ）の化合物：
0005722632.tif 000003
ここで、Ｒ１は存在しないか又はＣ１〜Ｃ６アルキルである；カルボキシル基の位置を環炭素から環窒素に移して、式（Ｉ）の化合物のＮ−酸類似化合物を生産してもよい；又はアシル（例えばＯ−アシル）誘導体又は１個以上の環水酸基が欠損している脱ヒドロキシル化された類似化合物；
であるか又は薬学的に許容可能なその塩又は誘導体である。
【００８５】
従って、本発明の例示的ピペリジンイミノ糖酸は、以下に示されている構造：
0005722632.tif 000004
0005722632.tif 000005
から選択してもよい。
【００８６】
（ａ）カルボキシル基の位置が環炭素から環窒素に移っている、上記構造（Ｇ１）−（Ｇ４）のＮ−酸類似化合物；（ｂ）上記構造のアシル（例えばＯ−アシル）誘導体（又は（ａ）のＮ−酸類似化合物）；（ｃ）１個以上の環水酸基が欠損している、上記構造の脱ヒドロキシル化類似化合物（又は（ａ）及び（ｂ）のＮ−酸類似化合物）を特に意図する。
【００８７】
式（Ｇ２）の化合物は、豆果バフィアレセモサ（マメ科）から初めて単離された（Booth et al., 2007:(2R, 3R, 4R, 5S)-3,4,5-trihydroxypipecolic acid dihydrate [(2S,3R,4R,5S-trihydroxypiperidine-2-carboxylic acid dihydrate Acta Crystalographica Section E63, 3783-3784）及びこの文献に含まれている参考文献を参照されたい。しかし、本発明者らは、それがギムネマシルベストレ（ガガイモ科）の主成分であることを新たに発見した。Ｇ．シルベストレは、広く、抗糖尿病性及び体重管理活性を有しているとされているが、一時的に糖味をブロックすることができるギムネマ酸にほとんどの注目が集まっていた。これらのギムネマ酸及び他のグリコシド（サポニン）は、動物モデルで試験すると、ある程度、植物の抗糖尿病活性を有しているようである。類似の化学的性質により、イミノ糖酸は知られることなく存在していたと考えられるが、これらの化合物の活性は、インビトロにおいては膜透過性対する効果によるものと考えられる。本発明者らの見解において、膜透過性に対するこの効果がインビボにおいて膵臓に作用するかは明らかではない（Ｐｅｒｓａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．：１６３：２０７−１２）。
【００８８】
本発明の使用のためのピペリジンイミノ糖酸は、例えばギムネマ種（例えばＧ．シルベストレ）から単離することができる（下記実施例１参照）。
【００８９】
例示的ピロリジンイミノ糖酸
本発明のイミノ糖酸は、環構造原子上に少なくとも１個（好ましくは少なくとも２個又は３個）の遊離水酸基（又はヒドロキシアルキル基）を有するピロリジンイミノ糖酸であってもよい。好ましいピロリジンイミノ糖酸はヒドロキシプロリンである。特に好ましいヒドロキシプロリンは、環構造原子上に少なくとも２個（例えば少なくとも３個）の遊離水酸基（又はヒドロキシアルキル基）を有するポリヒドロキシプロリンである。上述したもののＮ−酸誘導体も意図されている。
【００９０】
本発明の例示的ピロリジンイミノ糖酸は、以下に示される構造から選択してもよい。
0005722632.tif 000006
【００９１】
下記のもの：（ａ）カルボキシル基の位置が環炭素から環窒素（例えばＴ４）に移った、上記構造Ｓ３及びＳ４のＮ−酸類似化合物；（ｂ）上記構造のアシル（例えばＯ−アシル）誘導体（又は（ａ）のＮ−酸類似化合物）；及び、（ｃ）１個以上の環水酸基が欠損している、上記構造の脱ヒドロキシル化類似化合物（又は（ａ）及び（ｂ）のＮ−酸類似化合物）（モノヒドロキシ化されたＳ３及びＳ４の脱ヒドロキシル化された類似化合物が意図されていないことを除く）を特に意図する。
【００９２】
本発明の使用のためのピロリジンイミノ糖酸は、例えばステビア種（例えばステビアレバウディアナ）から単離することができる（下記実施例２参照）。
【００９３】
例示的ピロリジンイミノ糖酸
本発明のイミノ糖酸は、環構造原子上に少なくとも２個（好ましくは少なくとも３個、４個又は５個）の遊離水酸基（又はヒドロキシアルキル基）を有するピロリジジンイミノ糖酸であってもよい。
【００９４】
本発明の例示的ピロリジジンイミノ糖酸は、以下に示される構造：
0005722632.tif 000007
から選択してもよい。
【００９５】
（ａ）上記構造のアシル（例えばＯ−アシル）誘導体、（ｂ）１個以上の環水酸基が欠損している、上記構造の脱ヒドロキシル化類似化合物を特に意図する。
【００９６】
本発明の使用のためのピロリジジンイミノ糖酸は、例えば、ミカン科（例えばシトラス種（例えばダイダイ）の植物から単離することができる（下記実施例３参照）。
【００９７】
例示的インドリジンイミノ糖酸
本発明のイミノ糖酸は、環構造原子上に少なくとも２個（好ましくは少なくとも３個、４個又は５個）の遊離水酸基（又はヒドロキシアルキル基）を有するインドリジンイミノ糖酸であってもよい。
【００９８】
本発明の例示的インドリジンイミノ糖酸は、以下に示される構造：
0005722632.tif 000008
から選択してもよい。
【００９９】
（ａ）上記構造のアシル（例えばＯ−アシル）誘導体、及び、（ｂ）１個以上の環水酸基が欠損している、上記構造の脱ヒドロキシル化類似化合物を特に意図する。
【０１００】
本発明の使用のためのインドリジンイミノ糖酸は、例えば、シトラス類（ミカン科）、ハス類、カスタノスペルマム及びアレクサ類（マメ科）；ユーゲニア及びフトモモ類（フトモモ科）及びカボチャ類（ウリ科）から単離してもよい。
【０１０１】
例示的ノルトロパンイミノ糖酸
本発明のイミノ糖酸は、環構造原子上に少なくとも２個（好ましくは少なくとも３個）の遊離水酸基（又はヒドロキシアルキル基）を有するノルトロパンイミノ糖酸であってもよい。上述したもののＮ−酸誘導体も意図される。本発明による例示的ノルトロパンイミノ糖酸は、以下に示される構造を有する。
【０１０２】
本発明の使用のためのノルトロパンイミノ糖酸は、例えば、ナス科（例えばナス属及びリキウム属）及びクワ科（クワ）の植物から単離してもよい。
0005722632.tif 000009
【０１０３】
例示的開環イミノ糖
化合物Ｐ１及び化合物Ｐ２（カボチャ類でみられる）及び化合物Ｐ３などのイミノ環を開環することによって形成されるアミノ糖類酸も意図されている。そのような化合物は、イミノ糖酸の生物学的前駆物質であってもよい。
0005722632.tif 000010
【０１０４】
本発明のイミノ糖酸の生物活性及び機能的な特質
本発明のイミノ糖酸は、好ましくは、グルコシダーゼ活性を抑制しない（又は臨床的に意味がある程度までグルコシダーゼ活性を抑制しない）。いかなる理論によっても拘束されないことを意図するものであるが、本発明のイミノ糖酸は、インビボにおいて直接的に又は間接的に膵臓のβ細胞活性及び／又は再生を促進する可能性があると考えられる。従って、本発明の使用のための好ましいイミノ糖酸は、インビボにおいて直接的に又は間接的に膵臓のβ細胞活性及び／又は再生を促進し、インスリン応答を改善する。そのような実施形態において、（ギムネマ抽出物についてShanmugasundaram et al. (1990) Use of Gymnema sylvestre leaf extract in the control of blood glucose in insulin-dependent diabetes mellitus. J Ethnopharmacol. 1990 Oct; 30(3): 281-94)によって報告されているように）イミノ糖酸が膵臓β細胞の機能的再生を促進する可能性があるので、イミノ糖酸は、１型（又はインスリン依存性）糖尿病の治療に特別な用途が見いだされる。
【０１０５】
いかなる理論によっても拘束されないことを意図するものであるが、上記化合物は、グルクロニダーゼ、イズロニダーゼ、シアリダーゼ又はヘキソサミニダーゼを抑制するものであってもよい。グルクロニダーゼ活性を低下させることは、例えば、グルクロニドのような毒素の除去を改善することを通して、直接的に又は間接的にβ細胞機能を改善する可能性がある。
【０１０６】
インビボにおいて膵臓β細胞活性及び／又は再生を促進する化合物は、インビボ及びエクスビボにおける細胞をベースとする分析を含めて、当業界で知られている様々な方法によって容易に識別することができる。例えば、単離された膵臓β−島細胞からのインスリン放出は、刺激活性のインデックスとして用いられてもよく、下記方法によって測定される。
【０１０７】
ＳＤラットを頸椎脱臼によって屠殺し、次いで、膵臓内の肝臓に通じる胆管の岐管とその管の十二指腸端を締めた。次いで、コラゲナーゼ溶液（タイプＶ、５０ｍｇ／ｍｌ）を胆管に注入して膵臓を膨張させ、次いで、その膵臓を除去して３７℃で１２分間培養した。１０ｍｌの冷却したハンクバッファーを加え、懸濁液を１分間激しく攪拌した。氷上に５分間置き、沈降した膵島を氷冷ハンクバッファーで３回洗浄し、顕微鏡下で適当な大きさの膵島を選択して洗浄装置に移した（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３３９，６９−７６）。次いで、いくつかのラットから得た膵島を貯蔵し、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及びグルコースと共に、酸素処理（９５％のＯ２／５％のＣＯ２）されたＧｅｙ＆Ｇｅｙバッファーを含むそれぞれの洗浄チャンバに２０個を選択した。膵島を４ｍＭのグルコースを含む媒体中で１時間洗浄して平衡化し、次いで、２分の時間間隔で洗浄液を回収した（初めの５つの画分を用いてインスリン濃度のベースラインを確立した）。次いで、洗浄包装容器内の媒体を、さらに１時間に渡って回収した後の画分と共に試験濃度のグルコース及び試験化合物を含むものに交換する。次いで、洗浄液中に放出されたインスリンの濃度を９６ウェルＥＬＩＳＡで分析する。
【０１０８】
インスリン応答を改善する本発明の使用のための化合物は、インビボ及びエクスビボにおける細胞をベースとする分析を含む、当業界で知られている様々な方法によって容易に確認することができる。例えば、炭水化物耐性を調節する本発明の化合物の能力は、モデルとしての痩せマウスにおいて以下のインビボ分析によって決定することができる。
【０１０９】
雄のｄｄｙマウス（２９〜３３ｇ）又はＣ５７ＢＬ／６Ｊ（４〜６週齢）マウスを一晩絶食させ、次いで、急激な炭水化物負荷試験に用いた。グルコース（体重１ｋｇ当たり２．５ｇ）、マルトース（体重１ｋｇ当たり２．５ｇ）、スクロース（体重１ｋｇ当たり２．５ｇ）、イソスクロース（体重１ｋｇ当たり２．５ｇ）又はデンプン（体重１ｋｇ当たり１ｇ）、及び、試験化合物を０．９％のＮａＣｌ溶液中に溶解させ、胃管を通してマウスに投与した。コントロールグループには食塩水のみを与えた。投与前及び投与後の異なる時点の両方に、血液サンプルを尾静脈からリチウムヘパリンで処理したチューブ内に回収し、遠心単離によって血漿を単離した。市販キットを用いて血漿グルコース及びインスリンを測定する。
【０１１０】
肥満治療において特別な実用性がある化合物は、インビボ及びエクスビボにおける細胞をベースとした分析を含む、当業界で知られている様々な方法によって容易に確認することができる。例えば、食餌性肥満マウスにおける本発明の化合物の効果を、以下のように決定することができる。
【０１１１】
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ（４〜６週齢）マウスに高脂肪食（脂肪から４５％のｋｃａｌが得られる、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  米国）及び水を無制限に摂取させた。７日間の環境順化の後に、１０頭のマウスを１グループとして、異なる濃度試験化合物又は媒体をマウスに経口で３２日間与えた。グルコースを用いた供餌及び絶食炭水化物試験を２８日間実施し、血漿グルコース及びインスリンを測定した。次いで、すべての動物を通常食に戻した。試験終了時に、血漿グルコース、インスリン、トリグリセリド、コレステロールを測定した。屠体の体脂肪、タンパク、水分量及び灰分量を標準的な化学分析技術を用いて測定した（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００１．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ７４，４２５−４３３）。
【０１１２】
代謝機能不全の治療に特別な実用性がある化合物は、インビボ及びエクスビボにおける細胞をベースとする分析を含む、当業界で知られている様々な方法によって容易に確認することができる。例えば、以下に説明するように、ｄｂ／ｄｂマウスは、、代謝機能不全の慢性的モデルとして用いることができる。
【０１１３】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから入手したｄｂ／ｄｂマウスを、標準試験飼料及び水を無制限に摂取させる１４日間の環境順化に供し、試験前に体重を測定した。血漿グルコース及びインスリン並びにＨｂＡ１ｃのベースライン濃度を測定してグループ帰属を決定し、次いで、１２頭のマウスを１グループとして、マウスに異なる濃度の試験化合物又は溶媒を経口で６週間与えた。週１回ＨｂＡ１ｃを測定すると共に、飼料摂取量及び水分摂取量並びに体重を毎日測定した。グルコースを用いた供餌及び絶食炭水化物試験を、試験中の異なる時に実行し、血漿グルコース及びインスリンを測定した。
【０１１４】
化学合成
本明細書に記載されているイミノ糖酸は、従来の方式で作ることができる。ヘテロ芳香族化合物環構造を作る方法は、当業界において周知である。特に、合成方法は、「Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Vol. 1 (Eds.: AR Katritzky, CW Rees), Pergamon Press, Oxford, 1984 and Comprehensive Heterocyclic Chemistry II: A Review of the Literature 1982-1995 The Structure, Reactions, Synthesis, and Uses of Heterocyclic Compounds, Alan R. Katritzky (Editor), Charles W. Rees (Editor), E.F.V. Scriven (Editor), Pergamon Pr, June 1996」において検討されている。対象化合物の合成を助ける他の一般的な資料には、「March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Wiley-lnterscience; 5th edition (January 15, 2001)」が含まれる。本発明の使用のためのイミノ糖酸を生産するいくつかの例示的合成機構を以下に示す。
0005722632.tif 000011
【０１１５】
さらなる関連情報を以下の参考文献中に見つけることができる。これらの内容はここで言及することによって組み込まれている。
Synthesis of 2S-carboxy-3R,4R,5S-trihydroxypiperidine, a naturally occurring inhibitor of β -D-glucuronidase. Bernotas, Ronald C; Ganem, Bruce. Dep. Chem., Cornell Univ., Ithaca, NY, USA. Tetrahedron Letters (1985), 26(41), 4981-2
Enantiospecific syntheses of 2S,3R,4R,5S-trihydroxypipecolic acid, 2R,3R,4R,5S- trihydroxypipecolic acid, 2S,4S,5S-dihydroxypipecolic acid, and bulgecinine from D- glucuronolactone. Bashyal, B. P.; Chow, H. F.; Fleet, G. W. J. Dyson Perrins Lab., Oxford Univ., Oxford, UK. Tetrahedron Letters (1986), 27(27), 3205-8.
The synthesis of polyhydroxylated amino acids from glucuronolactone: enantiospecific syntheses of 2S,3R,4R,5S-trihydroxypipecolic acid, 2R,3R,4R,5S- trihydroxypipecolic acid and 2R,3R,4R-dihydroxyproline. Bashyal, Bharat P.; Chow, Hak Fun; Fellows, Linda E.; Fleet, George W. J. Dyson Perrins Lab., Oxford Univ., Oxford, UK. Tetrahedron (1987), 43(2), 415-22.
Synthesis of deoxymannojirimycin, fagomine, and deoxynojirimycin, 2-acetamido-1,5-imino-1,2,5-trideoxy-D-mannitol,2-acetamido-1,5-imino-1,2,5-trideoxy-D-glucitol, 2S,3R,4R,5R-trihydroxypipecolic acid and 2S,3R,4R,5S-trihydroxypipecolic acid from methyl 3-O-benzyl-2,6-dideoxy-2,6-imino-α-D-mannofuranoside. Fleet, George W. J.; Fellows, L. E.; Smith, Paul W. Dyson Perrins Lab., Oxford Univ., Oxford, UK. Tetrahedron (1987), 43(5), 979-90.
Preparation of 2-carboxy-3,4,5-trihydroxypiperidines as allergy inhibitors, antiarthritics, and for control of mucous production. Lockhoff, Oswald; Hayauchi, Yutaka. (Bayer A.-G., Fed. Rep. Ger.). Ger. Often. (1988), 16 pp. CODEN: GWXXBX DE 3628486 A1 19880225 Patent written in German.
Synthesis of aza sugars as potent inhibitors of glycosidases. Le Merrer, Yves; Poitout, Lydie; Depezay, Jean-Claude; Dosbaa, Isabelle; Geoffroy, Sabine; Foglietti, Marie- Jose. Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques, Universite Rene Descartes, associe au CNRS, Paris, Fr. Bioorganic & Medicinal Chemistry (1997), 5(3), 519-533.
A new asymmetric synthesis of (2S,3R,4R,5S)-trihydroxypipecolic acid. Tsimilaza, Andriamihamina; Tite, Tony; Boutefnouchet, Sabrina; Lallemand, Marie-Christine; Tillequin, Francois; Husson, Henri-Philippe. Laboratoire de Pharmacognosie, Faculte des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, UMR 8638 Associee au CNRS, I'Universite Paris- Descartes, Paris, Fr. Tetrahedron: Asymmetry (2007), 18(13), 1585-1588.
Synthesis of both enantiomers of hydroxypipecolic acid derivatives equivalent to 5-azapyranuronic acids and evaluation of their inhibitory activities against glycosidases. Yoshimura, Yuichi; Ohara, Chiaki; Imahori, Tatsushi; Saito, Yukako; Kato, Atsushi; Miyauchi, Saori; Adachi, Isao; Takahata, Hiroki. Faculty of Pharmaceutical Sciences, 4-4-1, Komatsushima, Tohoku Pharmaceutical University, Aoba-ku, Miyagi, Sendai, Japan. Bioorganic & Medicinal Chemistry (2008), 16(17), 8273-8286.
【０１１６】
植物源からの精製
本明細書に記載されているイミノ糖酸を天然材料源から単離してもよい。例えば、以下の植物源に由来する植物性材料：ステビア、ギムネマ、シトラス、アンドログラフィスパニキュラータ、リキウム種、マメ種、例えばＡｓｐａｌａｎｔｈｕｓ  ｌｉｎｅａｒｉｓ（ルイボス）、ダイズ、ハス種、及び、カスタノスペルマムオーストレール（マメ）及びウリ種は、本発明による使用のためのイミノ糖酸の単離及び精製のための出発物質として用いることができる。本発明のイミノ糖酸は水溶性であり、陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーによって濃縮することができる。サイズ排除法を用いても本発明のイミノ糖酸を濃縮することができる。従って、当業者は、標準的な技術を用いて本発明のイミノ糖酸を容易に精製及び単離することができることを理解するであろう。
【０１１７】
医学的応用
本発明はあらゆるエネルギー利用疾病の治療において広い用途が見いだされる。従って、本発明に従って治療することができる疾病には、例えば、恒常性疾患、代謝病、糖質代謝機能不全及び食欲障害が含まれる。
【０１１８】
好ましい実施形態において、本発明は、インスリン耐性、様々な形態の糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、消耗症候群（例えば、癌に関連する悪液症）、筋障害、胃腸疾患、成長遅延、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化及び年齢に関連する代謝機能不全の治療に用途が見いだされる。
【０１１９】
本発明は、例えば、高血糖、耐糖能低下、高インスリン血症、糖尿、代謝的酸性血症、白内障、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、糸球体硬化症、糖尿病性心筋症、インスリン耐性、グルコース代謝の低下、関節炎、高血圧、高脂血症、骨粗鬆症、骨減少症、骨喪失、脆弱骨症候群、急性冠症候群、不妊症、短腸症候群、慢性疲労、摂食障害、腸運動機能不全及び糖質代謝機能不全を含む、メタボリックシンドローム、肥満、及び／又は、糖尿病に関連した病状の治療に用いてもよい。
【０１２０】
本発明を用いて食欲を抑制してもよい。
【０１２１】
特に好適なものは、インスリン耐性、メタボリックシンドローム、肥満及び糖尿病（特に２型糖尿病）の治療である。
【０１２２】
インスリン耐性、メタボリックシンドローム及び糖尿病
本発明はインスリン耐性の治療に用途が見いだされる。インスリン耐性は、骨格筋、脂肪細胞及び肝細胞中のインスリン作用が低下し、正常量のインスリンがこれらの組織の細胞からの正常なインスリン反応を生じさせるのに不適当になることを特徴とする。脂肪細胞において、インスリン耐性は、貯蔵されているトリグリセリドの加水分解を生じさせ、血漿中の遊離脂肪酸を上昇させる。筋肉において、インスリン耐性はグルコース取込みを低下させ、一方で、肝細胞において、インスリン耐性はグルコース貯蔵量を減少させる。後の両方の場合に、結果的に血中グルコース濃度が上昇する。インスリン耐性によってインスリン及びグルコースの血漿中濃度が上昇すると、多くの場合、メタボリックシンドローム及び２型糖尿病に進行する。
【０１２３】
本発明は、（本明細書において定義されている）メタボリックシンドロームの治療に用途が見いだされる。この疾患は、（メタボリック）Ｘシンドローム、インスリン抵抗性シンドローム、リーブンドローム及びＣＨＡＯＳとしても知られている。
【０１２４】
本発明は、例えば、脂肪肝（多くの場合、非アルコール性脂肪肝疾病に進行する）、多嚢胞性卵巣症候群、ヘモクロマトーシス（鉄過剰）及び黒色表皮肥厚症（黒色皮膚パッチ）を含むメタボリックシンドロームに関連した疾病の治療に用途が見いだされる。
【０１２５】
本発明は、２型糖尿病の治療に用途が見いだされる。２型糖尿病は、血中グルコース濃度が永続的に高くなること（高血糖）を特徴とする慢性疾患である。膵臓β細胞からのインスリン分泌障害を伴うインスリン耐性によってこの病気が特徴付けられる。インスリン耐性から２型糖尿病への進行は、膵臓のβ細胞が正常な血糖値（正常血糖）を維持するのに十分なインスリンを生産することができないときに、食後に高血糖が生じることを特徴とする。
【０１２６】
本発明は、１型糖尿病（又はインスリン依存型糖尿病）の治療に用途が見いだされる。１型糖尿病は、膵臓ランゲルハンス島のインスリンを生産するβ細胞が欠損し、インスリンが欠乏することを特徴とする。このβ細胞欠損の主たる要因は、Ｔ細胞によって媒介される自己免疫攻撃である。１型糖尿病に対して取り得る周知の予防方法は存在しない。１型糖尿病は、北アメリカ及びヨーロッパの真正糖尿病症例の最大１０％を構成している。発病時に、大部分の患者は、他の点において健康であり、健康な体重である。インスリンに対する感受性及び反応性は、一般に、特に初期段階には、正常である。従って、本発明は、メタボリックシンドローム、及び／又は、特に肥満（特に中心性肥満）及び血清トリグリセリド濃度の上昇を含む、糖尿病（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）の治療及び／又は予防に広い用途が見いだされる。
【０１２７】
これらの医学的応用は、ヒトを含むあらゆる温血動物に適用してもよい。この応用は獣医学的応用を含んでおり、前記イミノ糖酸は、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ及びヒツジを含むヒト以外の動物に投与される。
【０１２８】
植物品質管理態様
食品添加物サンプル
本発明の方法において用いられる食品添加物サンプルは、乾燥した植物性材料であってもよいし、又は、そのサンプルが食料及び飲料に加えられる形態の植物性食品添加剤の分割量であってもよい。代替的に、広範なあらゆる方法によって特性評価前にそのサンプルを前処理してもよい。前処理は、例えば、粉末化、粉砕、凍結、蒸散、濾過、プレッシング、スプレー乾燥、押出、超臨界溶媒抽出、及び、チンキ剤生産といった物理的な又は化学的な前処理を含んでいてもよい。
【０１２９】
好ましくは、食品添加物サンプルを特性評価前に単離する。液液抽出法を含むあらゆる適切な単離の方法を用いることができる。好ましい実施形態においては、（ａ）濃縮された極性化合物と残存量の無極性化合物とを含む抽出物をイオン交換クロマトグラフィーによって作るステップ、及び、次いで、（ｂ）クロマトグラフィーによってステップ（ａ）の濃縮抽出物を単離することによって１つ以上の極性を有する植物性化学物質を含む極性画分を得るステップによってサンプルを単離する。そのような実施形態において、クロマトグラフィーによる単離は、好ましくは、例えばＧＣ−ＭＳといったガス液体クロマトグラフィー（ＧＣ）で構成される。ＧＣを用いるときは、クロマトグラフィー前に濃縮抽出物を誘導してもよい。
【０１３０】
植物性食品添加剤を植物全体（又はその一部）の形態で投与又は販売する場合は、使用前に植物性材料を乾燥させてもよい。凍結乾燥、スプレー乾燥、又は、空気乾燥を含む、都合のよいあらゆる形態の乾燥を行うことができる。
【０１３１】
イミノ糖酸及びイミノ糖の検出
食品添加物サンプルの特性評価は、限定されるものではなく、（サンプル中のイミノ糖酸／イミノ糖の存在又は不存在を検出するか又はそれらの量を測定するのに充分な）機能的特性評価及び／又は物理的特性評価及び／又は化学的特性評価を含むあらゆる適切な形態を用いることができる。
【０１３２】
サンプルの物理的特徴を分析する場合は、特性評価を：（ａ）植物性化学成分の定量；及び／又は（ｂ）成分の純度測定；及び／又は（ｃ）分子量（又は、複数の異なる植物性化学成分を含む画分の場合には、分子量分布又はその様々な統計関数）の測定；及び／又は（ｄ）分子式（ｅ）の決定（例えば核磁気共鳴による）；及び／又は（ｅ）分光分析；から選択することができる。
【０１３３】
分光分析が特に好ましく、以下のスペクトルのいずれか又はすべてを作成してもよい。
（ａ）質量スペクトル（例えば、質量電荷比（ｍ／ｚ）値対強度）、及び／又は、
（ｂ）クロマトグラフィーのデータ（例えばスペクトル、カラム保持時間、溶出プロフィルなど）、及び／又は、
（ｃ）フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）スペクトル（例えばＵＶ範囲及び可視範囲の両方）、及び／又は、
（ｄ）電気化学検出、及び／又は、
（ｅ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（例えば、１Ｈ  ＮＭＲ及び／又は１３Ｃ  ＮＭＲによって得られるスペクトルのデータセット）
【０１３４】
本発明に従って用いるとき、分光分析を、例えば、ＧＣ−ＭＳ及び／又はＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを用いたサンプル単離と一体的に行うことができる。
【０１３５】
ＧＣ−ＭＳを用いてサンプル中のイミノ糖酸／イミノ糖の存在又は不存在を検出するか又はそれらの量を測定することが特に好ましい。
【０１３６】
サンプルの化学的特徴を分析する場合は、特性評価は、植物性化学成分の化学反応性、植物性化学成分の溶解性、植物性化学成分の安定性及び融点、又は、これらの任意の組合せの測定から選択することができる。
【０１３７】
サンプルの機能的特徴を分析する場合は、特性評価は、例えば、インビボ又はインビトロでの分析、酵素阻害分析（例えば、グリコシダーゼ及び／又はリパーゼの阻害）、レセプタ結合分析、細胞の分析（例えば細胞複製、病原性細胞、細胞間相互作用及び細胞分泌物の分析）、免疫測定、抗微生物活性（例えば、バクテリア及びウイルスの細胞結合及び／又は複製）分析、毒性分析（例えばＬＤ５０分析）又はこれらの任意の組合せから選択される生物学的分析方法で構成されていてもよい。
【０１３８】
溶媒抽出法
本発明のプロセスに用いるのに好適な極性溶媒は、限定されるものではないが、有機アルコールなど有機溶媒を含む。好ましいものは、エタノール及びメタノール、並びに、エタノール／水混合物、又は、メタノール／水混合物である。好ましくは、その極性溶媒は、５１〜８０％のエタノール／水、３１〜５０％のエタノール／水、及び、３０％のエタノール／水から選択される。特に好ましいものは、約５０％のエタノール／水である極性溶媒である。本発明のプロセスに用いるのに好適な無極性溶媒は、限定されるものではないが、ヘキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）又はクロロホルムなどの有機溶媒を含む。特に好ましいものはジクロロメタンである。抽出を行う条件（時間、温度、撹はんの程度など）は、経験に基づいて容易に決定することができ、サンプルの性質、任意の前処理の性質、及び、選択した溶剤系に応じて変化し得る。
【０１３９】
クロマトグラフィーによる分画
クロマトグラフィーによる分画は、ガス液体クロマトグラフィーで構成されていてもよい。ガス液体クロマトグラフィーは、圧力下の不活性ガスと加熱したカラム内の不活性支持体上にコーティングされた不揮発性液体の薄層と間でサンプルを分画することによって、揮発性物質の複雑な混合物を各成分に分画するプロセスである。混合物中の特定の化合物をうまく分画するためには、正確な指標と共にカラムを用いることが重要である。固体支持体の性質、液相の種類及び量、パッキングの方法、全長、並びに、カラム温度が、重要な要因である。
【０１４０】
当業者は、ルーティン的試行錯誤及び通常の一般的知識を用いることによって、特に、研究対象の抽出物、抽出で用いる溶媒の性質、及び、それらの溶媒中に予想される化学物質のタイプを含む状況に従って、適切なカラム特性を容易に決定することができるであろう。特に好ましく、かつ、多くの状況において有用であるものは、無極性液相でコーティングされたキャピラリーカラム（２５ｍ×０．２２ｍｍ  ｉｄ×０．２５μｍ  ＢＰＸ５固定相、ＳＧＥ株式会社製又はその同等物）である。
【０１４１】
多くの化合物は、強い極性、低揮発性又は熱的不安定のせいで、ガスクロマトグラフィ内に直接的に注入するのには適していない。高度にヒドロキシ化された化合物は、分子間水素結合のせいで気体化するのが困難である。しかしながら、水酸基の水素を他の化学基に置換することによって、ＧＣ分析を行うのに充分な揮発性をそれらの化合物に与えることができる。水酸基を誘導体化する最も一般的な２つの手段はアセチル化及びシリル化であり、それらの反応において、アセチレート［ＣＨ３ＣＯ−Ｏ−Ｒ］又はシリルエーテル、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテル［（ＣＨ３）３Ｓｉ−Ｏ−Ｒ］が形成される。従って、濃縮抽出物を分析的規模でクロマトグラフィーによる分画を行う実施形態において、好ましくは、その濃縮抽出物の植物製化学成分を、例えばアシル化又はシリル化を行うにことよって誘導体化する。特に好ましいものは、トリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化である。
【０１４２】
クロマトグラフィーによる分画はイオン交換クロマトグラフィーで構成されていてもよい。イオン交換クロマトグラフィーは、イオン種を部分的に精製して濃縮し、汚染物質を除去する。当業者は、ルーティン的試行錯誤及び通常の一般的知識を用いることによって、適切なカラム充填剤及び移動相を容易に特定することができるだろう。その適切なカラム充填剤及び移動相は、特に、単離する量、研究対象の抽出物、及び、抽出で用いる溶媒の性質に依存するであろう。本発明の方法において特に好ましいものは、遊離酸若しくは水素（Ｈ＋）形態又はアンモニウム（ＮＨ４＋）塩形態のいずれかで用いることができる強酸性陽イオン交換樹脂である。これらの形態は、溶液から陽イオンを吸着し、同数の対イオン（用いる形態に応じてＨ＋又はＮＨ４＋イオンのいずれか）を溶液中に放出する。強塩基性陰イオン交換樹脂も好ましく、ヒドロキシド形態（ＯＨ−）で用いると、イミノ糖酸を強く拘束するであろう。次いで、酢酸（例えば２Ｍの溶液）などの酸を用いることによってイミノ糖酸を放出させることができる。
【０１４３】
画分特性評価
特性評価がとる形態は、研究対象の植物性食品添加剤及び使用する特性評価技術の性質に依存する。通常、以下のアプローチのいずれか又はすべてを用いることができる。
【０１４４】
（ａ）機能的な特性評価
機能的特性評価は生物学的分析で構成されていてもよい。生物学的分析は、インビボ又はインビトロで実行することができ、酵素阻害分析（例えば、グリコシダーゼ及び／又はリパーゼ阻害）を含んでいてもよい。他の生物学的分析には、レセプタ結合アッセイ、細胞の分析（細胞複製、病原製細胞及び細胞間相互作用及び細胞分泌物分析を含む）、免疫測定、抗微生物活性（例えば、バクテリア及びウイルスの細胞結合及び／又は複製）分析、及び、毒性分析（例えばＬＤ５０分析）が含まれる。
【０１４５】
機能的特性評価は、生物学的活性の１個以上の指標の同定を可能にする特性評価の形態によって間接的に実行することもできる。
【０１４６】
（ｂ）物理的特性評価
物理的特性評価は、所定の画分中に又は上記プロセス中の他のあらゆる段階に存在する植物製化学成分の定量、成分の純度測定、分子量測定（又は、複数の異なる植物製化学成分を含む画分の場合には、分子量分布又は様々な統計関数）、分子式（ｅ）（例えば核磁気共鳴によるもの）の決定、及び、様々な分光分析の形態をとることができる。
【０１４７】
特に有用なスペクトル特性評価には：
・質量スペクトル（例えば、質量電荷比（ｍ／ｚ）値対強度）、及び／又は、
・クロマトグラフィーによるデータ（例えばスペクトル、カラム保持時間、溶出像など）、及び／又は、
・フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）スペクトル（例えばＵＶ範囲及び可視範囲の両方）、及び／又は、
・核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（１Ｈ  ＮＭＲ及び／又は１３Ｃ  ＮＭＲによって得られるスペクトルのデータセットを含む）、
が含まれる。
【０１４８】
スペクトル特性評価を分画ステップと一体的に行うことができる。例えば、ＧＣ−ＭＳ及びＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを（本明細書に記載されているように）用いて、分画を、質量スペクトル、ＵＶ−可視スペクトル及びクロマトグラフィースペクトルデータの取得と一体化することができる。
【０１４９】
上記特性評価のいずれか又はすべてを用いて、所定のサンプル（又は、そのサンプルのあらゆる画分若しくは植物性化学成分）について、「化学的特徴」を明らかにすることができる。
【０１５０】
（ｃ）化学的特性評価
化学的特性評価は、特に、植物製化学成分の化学反応性、それらの成分の溶解度、安定性、及び、融点の測定の形態をとることができる。
【０１５１】
薬量学
本発明のイミノ糖酸は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮的、気道（エアロゾル）、直腸、膣、及び、局所（口腔及び舌下腺を含む）への投与を含む、経口又は非経口の経路で投与することができる。好ましいものは経口投与である。
【０１５２】
投与するイミノ糖酸の量は、使用する特定の計量装置、治療の期間、治療する患者の年齢及び性別、治療する疾患の性質及び範囲、並びに、選択した特定のイミノ糖酸に従って大幅に変化し得る。
【０１５３】
さらに、本発明のイミノ糖酸は、メタボリックシンドローム及び／又は（１型糖尿病及び２型糖尿病及びインスリン耐性を含む）糖尿病の治療に有用であると知られている他の薬剤と共に用いることができ、そのような実施形態においては、用量を適宜調整することができる。
【０１５４】
一般に、投与するイミノ糖酸の有効量は、通常１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇまで変化するであろう。単位用量は、０．０５〜５００ｍｇのイミノ糖酸を含んでいてもよいし、１日当たり１回以上摂取させることができる。以下に述べるように、イミノ糖酸は、従来の容量単位形態を用いて、医薬担体と共に経口的に、非経口的に又は局所的に投与することができる。
【０１５５】
好ましい投与経路は経口投与である。一般に、適切な量は、レシピエントの体重１キログラムにつき１日当たり０．０１〜５００ｍｇの範囲であり、好ましくは体重１キログラムにつき１日当たり０．１〜５０ｍｇの範囲であり、最も好ましくは体重１キログラムにつき１日当たり１〜５ｍｇの範囲である。
【０１５６】
望ましい用量は、好ましくは、連日投与のための１回用量として示される。しかしながら、１日を通じて適切な時間間隔で、２回、３回、４回、５回、若しくは、６回以上多い分割量で投与してもよい。これらの分割量は、単位投与形態当たり、例えば、０．００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ、最も好ましくは０．５〜１．０ｍｇの活性成分を含む単位投与形態で投与してもよい。
【０１５７】
製剤
本発明の組成物は、本発明のイミノ糖酸を、選択的に、薬学的に許容可能な添加剤と共に含む。
【０１５８】
本発明のイミノ糖酸はいかなる形態を取っていてもよい。天然源（例えば、以下から選択される植物源：（ａ）ステビア種（例えばステビアレバウディアナ）；（ｂ）ギムネマ種（例えばＧ．シルベストレ）；（ｃ）アンドログラフィス種（例えばＡ．パニキュレート）；（ｄ）マメ種（例えばＡｓｐａｌａｎｔｈｕｓ種、バフィア種、ダイズ、アレクサ種カスタノスペルマムオーストレール）、ハス種；（ｅ）ミカン科の植物（例えばシトラス種、例えばダイダイ）；（ｆ）リキウムバルバラム種（ゴジ）及び（ｇ）ウリ科の植物（例えばククルビタフィキフォリア、サイアムパンプキン及びツルレイシ）を含む、例えば本明細書で確認されたいずれかの植物源から、イミノ糖酸を合成、精製、又は、単離してもよい。
【０１５９】
天然源から単離する場合は、本発明のイミノ糖酸を精製してもよい。しかしながら、上記に定義されているように、本発明の組成物は、植物性薬剤の形態であってもよい。そのような植物性薬剤を使用前に分析して、標準規格を満たしているか否か判断することが好ましい。
【０１６０】
本発明の使用のための植物性薬剤は、乾燥した植物性材料であってもよい。代替的に、植物性薬剤は加工した植物性材料であってもよく、その加工には、例えば、粉末化、粉砕、凍結、蒸散、濾過、プレッシング、スプレー乾燥、押出、超臨界溶媒抽出及びチンキ生産を含む物理的又は化学的な前処理が含まれる。植物性薬剤を植物全体の形態（又はその一部）で投与又は販売する場合には、植物性材料を使用前に乾燥させてもよい。凍結乾燥、スプレー乾燥又は空気乾燥含む乾燥のあらゆる都合のよい形態を用いてもよい。
【０１６１】
本発明のイミノ糖酸が薬学的に許容可能な添加剤と共に調剤される実施形態においては、例えば、不活性賦形剤、崩壊剤、結着剤、平滑剤、甘味剤、調味料薬剤、着色剤及び保存剤を含むあらゆる適切な添加剤を用いてもよい。適切な不活性賦形剤には、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、並びに、ラクトースが含まれる。一方で、適切な崩壊剤は、コーンスターチ及びアルギン酸である。結着剤には、デンプン及びゼラチンが含まれていてもよい。一方で、平滑剤は、存在する場合には、通常、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又は、滑石であろう。
【０１６２】
医薬品組成物は、あらゆる適切な形態を取っていてもよく、例えば、錠剤、エリキシル剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、粉末、顆粒及びエアゾール剤を含む。
【０１６３】
医薬品組成物は、部品のキットの形態を取っていてもよい。このキットは、使用説明書及び／又は単位投与形態の複数の異なる成分と共に、本発明の組成物を具える。
【０１６４】
経口用途のための錠剤は、本発明のイミノ糖酸を、単独で又は（植物性薬剤実施形態の場合には）植物源に伴う他の植物性材料と共に含んでいてもよい。錠剤は、不活性賦形剤、崩壊剤、結着剤、平滑剤、甘味剤、調味料薬剤、着色剤及び保存剤などの薬学的に許容可能な添加剤と混合された本発明のイミノ糖酸を含んでいてもよい。適切な不活性賦形剤には、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、並びに、ラクトースが含まれる。適切な崩壊剤は、コーンスターチ及びアルギン酸である。結着剤は、デンプン及びゼラチンを含んでいてもよい。一方で、平滑剤は、存在していれば、通常、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又は滑石であろう。必要に応じて、モノステアリン酸グリセリン又はグリセリルジステアラートなどの材料で錠剤をコーティングして、胃腸管における吸収を遅延させることができる。
【０１６５】
経口使用のためのカプセル剤には、本発明のイミノ糖酸が固体の賦形剤と混合された硬ゼラチンカプセルと、前記活性成分が、水、又は、ピーナッツ油、流動パラフィン若しくはオリーブオイルなどの油脂と混合された軟ゼラチンカプセル剤と、が含まれる。経口投与のために、本発明のイミノ糖酸を、カプセル、ピル、錠剤、トローチ、ロゼンジ、溶解物、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、分散液、又は、エマルション（溶液、懸濁液、分散液又はエマルションは水性又は非水性であってもよい）などの固体製剤又は液状製剤中に調剤することができる。固体の単位投与形態は、例えば、界面活性剤、潤滑剤、並びに、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチなどの不活性充填剤を含む、硬いシェル又は柔らかいシェルで覆われた通常のゼラチンタイプであり得るカプセルであってもよい。別の実施形態において、本発明のイミノ糖酸は、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンなどのバインダー、ジャガイモデンプン、アルギン酸、コーンスターチ及びグアーガムなどの投与後に錠剤の分解及び溶解を助けるための崩壊剤、例えば滑石、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、又は、ステアリン酸亜鉛などの、錠剤顆粒の流動を改善し、タブレットダイ及びパンチの表面へのタブレット材料の付着を防止する目的の潤滑剤、錠剤の美的な品質を高めて、錠剤を患者により受け入れられるようにする目的の、染料、着色剤、及び、香味剤と組み合わせて、ラクトース、スクロース、及び、コーンスターチなどの従来のタブレット基剤を用いて錠剤にされる。経口液体投与形態に用いられる適切な添加剤は、薬学的に許容可能な界面活性剤、沈澱防止剤、又は、乳化剤を共に含むか又は含まずに、水及びアルコール（例えばエタノール、ベンジルアルコール、ポリエチレンアルコール）などの賦形剤を含む。
【０１６６】
本発明のイミノ糖酸を、非経口的に、すなわち、皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内に投与してもよい。
【０１６７】
そのような実施形態において、イミノ糖酸は、生理学的に許容可能な賦形剤中に、医薬担体（この担体は無菌性液体又は液体混合物であり得る）と共に注射可能な用量で提供される。適切な液体は、薬学的に許容可能な界面活性剤（セッケン又は洗浄など）、懸濁化剤（ペクチン、カルホーマー（ｃａｒｈｏｍｅｒ）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースなど）又は乳化剤、及び、その他の薬学的添加物を共に含むか又は含まずに、水、食塩水、水性デキストロース及び関連糖溶液、アルコール（エタノール、イソプロパノール又はヘキサデシルアルコールなど）、グリコール（プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）、グリセロールケタール（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなど）、エーテル（ポリ（エチレングリコール）４００など）、油脂、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくは脂肪酸グリセリド、又は、アセチル化された脂肪酸グリセライドを含む。本発明の非経口製剤に用いることができる適切な油脂は、例えば、ピーナッツ油、大豆油、胡麻油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム、鉱油といった、原油、動物、植物又は合成由来のものである。
【０１６８】
適切な脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸を含む。適切な脂肪酸エステルは、例えばエチルオレート及びイソプロピルミリステートである。
【０１６９】
適切なセッケンは、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩及びトリエタノールアミン塩を含む。適切な洗浄剤は、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライド、及び、アルキルアミンアセテートなどの陽イオン性洗浄剤；例えば、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、オレフィン硫酸塩、エーテル硫酸塩、モノグリセリド硫酸塩、及び、スルホサクシネートなどの陰イオン性洗浄剤；例えば、脂肪族アミン酸化物、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体などの非イオン系洗浄剤；及び、例えばアルキル−β−アミノプロピオネート及び２−アルキルイミダゾリン第４級アンモニウム塩並びに混合物などの両性洗浄剤を含む。
【０１７０】
本発明の非経口組成物は、通常、溶液中に本発明のイミノ糖酸を約０．５〜約２５重量％含む。保存剤及びバッファーを用いてもよい。そのような組成物は、注射部位において炎症を最小限にするか又はなくすために、約１２〜約１７の親水性親油性比（ＨＬＢ）を有する非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。そのような製剤中の界面活性剤の量は、約５〜約１５重量％である。界面活性剤は、上記ＨＬＢを有する単一成分であってもよいし、又は、望ましいＨＬＢを有する２以上の成分の混合物であってもよい。非経口製剤において用いられる界面活性剤の具体例は、例えばソルビタンモノオレアートなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及び、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、エチレンオキシドと疎水性骨格とからなる高分子量付加物のクラスである。
【０１７１】
補助的に用いられたとき、本発明のイミノ糖酸は１つ以上の他の薬剤と共に使用するように調剤されてもよい。特に、本発明のイミノ糖酸を、（本明細書に記載されている）抗糖尿病薬剤と組み合わせて用いてもよい。
【０１７２】
例えば、本発明のイミノ糖酸を、以下の薬剤クラスから選択される抗糖尿病薬剤：ビグアニド、スルホニル尿素誘導体、チアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害薬、メグリチニド、ペプチド類似化合物、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤及びアミリンアゴニストと共に用いてもよい。補助的使用は、他の薬剤と共存可能である（又は相乗作用を示す）ように設計された特別な単位投与用量に、又は、イミノ糖酸が１以上の抗糖尿病薬剤と混合される（又は、単一の単位用量内で他の薬剤と物理的に組み合わされる）製剤に反映されていてもよい。また、本発明のイミノ糖酸の補助的使用は、本発明の医薬品キットの組成物に反映されていてもよく、本発明のイミノ糖酸は、（例えば、単位用量の多くのものの一部として）抗糖尿病薬剤と共にパッケージされる。補助的使用は、抗糖尿病薬剤とイミノ糖酸との共投与に関する情報及び／又は説明書に反映されていてもよい。
【０１７３】
また、本発明のイミノ糖酸を、飲料又は食料の栄養価補助を形成する一部として調剤してもよい。
【０１７４】
実施例
以下において特定の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は、例示的なものに過ぎず、説明のみを目的とする。すなわち、これらの実施例は、請求する独占権の範囲又は記載されている本発明を、いかようにも限定することを意図するものではない。これらの実施例は、本発明の実施について現在考えられるベストモードを構成する。
【０１７５】
実施例１：ギムネマ中の式（Ｇ２）の化合物の検出
ギムネマシルベストレは、最大８ｍの長さの茎を有する蔓生植物又は攀縁植物である。ギムネマシルベストレは、インド、中国、インドネシア、日本、マレーシア、スリランカ、ベトナム及び南アフリカの標高１００〜１０００ｍの開いた森林及び低木林地に生育する。葉及び根のいずれもがアユルベーダ医療で用いられる。糖の味を消失する特性に起因して、ギムネマシルベストレは、「糖を破壊するもの」を意味する、グルマール及びマドフナシニというヒンディー語の名前が付けられている。この植物は、伝統的にメタボリックシンドロームの治療に用いられ、ギムネマ抽出物は、日本で肥満のコントロール用に販売されている。
【０１７６】
インスリン依存性糖尿病に関する比較試験によって、水溶性ギムネマ抽出物（１日当たり４００ｍｇ）が（約５０％）インスリン必要量を減少させることが明らかになった(Shanmugasundaram et al. (1990), J Ethnopharmacol. 30:281-294)。治療期間中に、ギムネマは、ベースライン値から、絶食時平均血糖値（約３５％低下）、グリコヘモグロビン及びグリコシル化血漿タンパク濃度を低下させた。コレステロールは、正常濃度近くまで有意に低下した。トリグリセリド、遊離脂肪酸及び血清アミラーゼも低下した。治療期間は６〜３０カ月間の範囲であった。６〜８カ月のギムネマ治療後にグリコヘモグロビンの有意な低下が生じたが、正常値より有意に高いままであった。これらの低下のいずれもは、１０〜１２カ月の期間に渡って試験を行ったインスリン療法のみのコントロール患者において観察されなかった。著者らは、ギムネマによって、インスリンからプロインスリンへの変換の副産物であるＣ−ペプチドの見かけの濃度が（インスリンのみのグループ被検体及び通常被検体の両方に対する比較において）上昇したので、おそらく膵臓の再生によって、内因性インスリン生産を高めることを提唱した。
【０１７７】
同じ研究グループによる第２の試験において、同じギムネマ製剤（１日当たり４００ｍｇ）がインシュリン非依存性の糖尿病患者において同様の結果を生じさせることを明らかにした(Baskaran et al. (1990) J Ethnopharmacol. 30:295-300)。空腹時血糖値、グリコシル化されたグリコヘモグロビン、及び、血漿タンパクは、１８〜２０カ月の治療後にベースライン値と比較して有意に低下した（ｐ＜０．００１）。これらの低下のいずれもが、１０〜１２カ月の期間に渡って試験を行った従来の療法のみを受けた患者では観察されなかった。治療期間の終了時までに、コレステロール、トリグリセリド、リン脂質及び遊離脂肪酸濃度も、ギムネマを摂取した者のベースライン値と比較して有意に低下した（ｐ＜０．００１）。従来の療法のみを受けたコントロール患者は、コレステロール、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が低下した（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．００１）。絶食時血中インスリン濃度及び食後血中インスリン濃度は、従来の薬剤のみを摂取したグループと比較して、ギムネマグループにおいて有意に上昇した（ｐ＜０．０１）。２２人の患者のうちの２１人は、血糖降下剤の摂取量を低減させることができた；これらのうちの５人は、血糖降下剤を完全に中止し、ギムネマ抽出物のみによって血糖恒常性を保持した。ギムネマによってβ細胞の再生又は修復が容易になるという著者らの提案は、ギムネマ摂取後に患者の血中インスリン濃度が高くなったことによってサポートされた。健康なボランティアへのギムネマ投与は、空腹時血糖値濃度の急激な低下を生じさせなかった。
【０１７８】
図１（ａ）に示されている軌跡は、糖の除去後に９．２６分において主成分として式（Ｇ２）の化合物（トリメチルシリル誘導体）を示している、ギムネマ水抽出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムである。
【０１７９】
実施例２：ギムネマシルベストレの経口投与後のＧ２の取り込み
Ｇ２が胃腸管から容易に吸収されるか否かを判断するための１人の男性のボランティアによる予備試験において、７ｍｇのＧ２を含む商業的に入手したギムネマ葉の水抽出物を飲ませ、Ｇ２について尿を４時間モニターした（０〜２時間、及び、２〜４時間）。陽イオン交換樹脂（Ｈ＋形態のＩＲ１２０）に適用する前に、２つの尿サンプルに１ｍｇのカスタノスペルミンの内部標準を加えた。多量の水で樹脂を洗浄した後に、結合した物質を、過剰量の２Ｍ  ＮＨ４＋溶液を用いて排出させ、ＧＣ−ＭＳ分析のために乾燥させた。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｒｉ−Ｓｉｌを用いてサンプルを誘導して、イミノ糖及びイミノ糖酸のトリメチル−シリル−誘導体を作製した。ＧＣ−ＭＳは、四重極イオンフィルターシステムを用いてパーキンエルマーのターボマスゴールド質量分析計によって実行し、分析中は２５０℃で一定に作動させた。検出器の質量範囲を１００〜６５０ａｍｕに設定した。移送ライン（ＧＣからＭＳへの）の温度を２５０℃に保持した。ＧＣカラムは、高極性融解石英カラム（Ｖａｒｉａｎ「Ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｕｒ」ＶＦ−５ｍｓカラム、２５ｍ×０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．、０．２５μｍ相厚さ）であった。キャリヤーガス（ヘリウム）流速を１ｍｌ／分−１とした。Ｇ２は、ｔｍｓ誘導体のように特徴的な質量スペクトルを与え、定量可能に適切に決定された。
【０１８０】
Ｇ２は、両方の期間の尿中に検出され、４時間以内に７ｍｇが回収されると考えられる。
【０１８１】
イミノ糖酸Ｇ２の特徴的な質量スペクトル（ｔｍｓ）を図１（ｂ）に示す。
【０１８２】
実施例３：ステビアレバウディアナ中のイミノ糖酸の検出
ステビアレバウディアナ（キク科）は、ステビオシドと呼ばれる甘味料及び関連化合物を含んでいことが広く知られている。ステビアは、肥満及び高血圧などの病状の治療のための医学的研究において将来性を示した。ステビオールグリコシドは、血糖に対して無視できる効果が小さいことが報告されている（例えば、Ｂａｒｒｉｏｃａｎａｌ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１：３７−４１）。インビボにおけるラットを用いたいくつかの研究において、ステビオシドは、抗高血糖効果、インスリン分泌促進効果、及び、グルカゴン分泌抑制効果を誘導することが示されている。しかしながら、ステビオシド自体は、突然変異を生じさせる活性を有する可能性があることが報告されており、従って、ステビア由来材料を分割してステビオシドを除去することによって抗糖尿病又は肥満用途の製品を改善することができる。
【０１８３】
図１（ｃ）に示されている軌跡は、ステビアレバウディアナの水抽出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムであり、糖の除去後に、いくつかのイミノ糖酸を示し、７．２９分（ＤＭＤＰ）に１つのイミノ糖を示している。
【０１８４】
ステビアレバウディアナ中の主要なイミノ糖酸は、以下に示されているものなどの新規なピロリジンである。窒素上の酸性炭素鎖の長さは、確認された親化合物の質量スペクトルにおいて示された１４質量単位（ＣＨ２）の付加を有するものよりも長いこともわかった。構造Ｔ１及び構造Ｇ６に示されているような１−デオキシノジリマイシンと構造的に関係するピペリジンも存在している。これらの炭素連鎖長は変化してもよいが、化合物のＯ−ブチル形態もステビア中に存在している。イミノ糖ＤＭＤＰは、窒素上に酸を有しない化合物Ｓ２である。
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【０１８５】
実施例４：シトラス種中のイミノ糖酸の検出
シトラス種（ミカン科）は、新規なＮ−及びＯ−ブチル誘導体と共に、式（Ｇ２）の化合物に関連するピペリジンイミノ糖酸を含むだけでなく、常に上記式（Ｃ１）の化合物（エピアレクサフロリン）などのピロリジジン酸を含むと考えられる。このイミノ糖酸は、アレクサ種（マメ科）から最初に単離された(Pereira et al. (1991): Isolation of 7a-epialexaflorine from leaves of Alexa grandiflora - a unique pyrrolizidine amino acid with a carboxylic acid substituent at C-3. Tetrahedron 47 (29): 5637-5640)。ピロリジジン酸は、すべてのシトラス種に遍在していると考えられる。シトラス種は、ギムネマ及びステビアと比較して少量のイミノ糖酸を含む。中国のダイダイ（シトラスオーランティウム）及びグレープフルーツは、糖尿病薬又は体重管理のための逸話的な要求がある。イミノ糖酸Ｓ９は、Ｃ１よりもダイダイのさらに主要な成分であることがわかった。
【０１８６】
実施例５：イミノ糖酸によるグリコシダーゼの阻害
下記表に示す結果は、商業的に入手可能なグリコシダーゼ及びｐ−ニトロフェニル基質を用い、例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９７）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６  ２５５−２５９によって記載されている標準的方法を用いて得られた。酵素及び基質のすべてをＳｉｇｍａから購入した。ｐＨ最適条件値のリン酸ナトリウムバッファーを用いて酵素及び基質溶液を作製した。用いた酵素は、α−Ｄ−グルコシダーゼビール酵母菌、バチルス−ステアロテルモフィルス、イネ、β−Ｄ−グルコシダーゼ（アーモンド）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（ジャックビーン）、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ（緑色コーヒーマメ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ウシ肝臓）、α−Ｌ−フコシダーゼ（ウシ腎臓）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ウシ腎臓、ジャックビーン、アスペルギルスオリゼー）、ナリンギナーゼ（ペニシリウムデカンベンス）、及び、アミログルコシダーゼ（黒色麹菌クロカビ）であった。すべての酵素を適切なｐ−ニトロフェニル基質（５ｍＭ）と共に用いた。ガラスびん中でリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）と混合したアミロペクチン（０．１％）（Ｍｅｒｃｋ）を用いてアミログルコシダーゼ活性を測定し、２０分間沸騰水浴中で加熱して放出されたグルコースを溶解させ、トリンダーグルコース検出溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて測定した。
【０１８７】
特に興味深いのは、ＤＡＢ（１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール）及びＤＮＪ（１−デオキシノジリマイシン）などのイミノ糖グルコシダーゼ阻害薬の酸による、哺乳類ヘキソサミニダーゼを抑制する能力である。これは親化合物が持っていない能力である。この酵素活性の高濃度は、糖尿病患者の尿において生じることが示されている（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｃａｒｅ  ２１：６１９−６２４）が、この酵素活性の阻害が糖尿病患者でみられる代謝障害を抑制するのを助ける可能性がある。また、α−グルコシダーゼの阻害は、イミノ糖（ＤＭＤＰ、ＤＡＢ及びＤＮＪ）への酸置換基の付加によって低下した。
【０１８８】
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０．８ｍＭで試験した化合物による％阻害
ＮＩ＝最高濃度において５０％未満の阻害
イタリック＝ＩＣ５０（酵素の５０％を阻害する化合物の濃度）
【０１８９】
特に興味深いのは、イミノ糖酸がβ−グルクロニダーゼを抑制する能力であった。分析は、Ｓｉｇｍａから購入したｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを用いたウシ肝臓β−グルクロニダーゼの使用を含んでいた。０．１Ｍクエン酸／ｐＨ５．０の０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムバッファー中で２７℃で酵素を分析した。インキュベーション混合物は、３０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ酵素溶液の１０μｌと、１ｍｇ／ｍｌ水性阻害剤溶液の１０μｌと、ｐＨ５．０のバッファー中に作製したパラニトロフェニルβ−Ｄ−グルクロニド（５ｍＭ）の５０μｌとからなっていた。反応の対数期に０．４Ｍグリシン（ｐＨ１０．４）を７０μｌ加えることによってその反応を停止させた。その反応の対数期は、水で阻害剤を置換した非阻害分析を用いて最初に決定した。ヴェルサマックスマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４０５ｎｍにおいて最終吸収度を読み込んだ。分析を３回繰り返して実行した。与えられている値は、各分析当たり３回の繰り返しによる平均値である。結果は、ＩＣ５０値（酵素活性の５０％を阻害する化合物の濃度）として上記されている。コントロールは、阻害剤の代わりに水を含んでいた。
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【０１９０】
実施例６：式（Ｇ２）の化合物によるグリコシダーゼ酵素の阻害
ＤＮＪは、多様なα−グルコシダーゼの有力な阻害剤であり、消化性グルコシダーゼをμＭ範囲以下のＫｉ値で抑制する（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。抗糖尿病薬剤（Ｇｌｙｓｅｔ  ａｎｄ  Ｍｉｇｌｉｔｏｌ）は、ＢａｙｅｒによってＤＮＪから抽出された。これらの薬剤は、血液中へのグルコースの取り込みを減少させることによって機能するが、消化管の阻害などの副作用もある。対照的に、Ｇ２は、α―グルコシダーゼの非常に弱い阻害剤であり、ほとんどｍＭ濃度で５０％の阻害に達するのみであり、従って、同じ方法では機能する見込みがない。Ｇ２は、グルクロニダーゼ及びイズロニダーゼの弱い阻害剤であることも報告されている（Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｅ６３，  ｏ３７８３−ｏ３７８４、及び、この文献に含まれている引用文献）。これらの酵素の阻害が体重抑制又はメタボリックシンドロームのコントロールに関与し得る否かは明らかではない。イミノ糖ファゴミンは、インスリン放出を強めることが示されているが、そのメカニズムは解明されておらず、グルコシダーゼ阻害によるものである可能性もある（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．３０：６７９−６８３）。ＤＮＪ及びファゴミンなどの化合物は、潜在的抗糖尿病薬剤として興味深いが、グルコシダーゼ阻害は、おそらく、これらのイミノ糖のインビボにおける抗糖尿病活性のいくつかに対して実際に重要ではないだろう。インビボにおける小量の酸の生成は、グルクロニダーゼ阻害を示す化合物を生じさせる可能性がある。いかなる理論によって縛られることを意図しないものであるが、メタボリックシンドロームにおける高いグルクロニダーゼ活性を阻害することは、毒素の除去を支援し、一般的な及び特異的な代謝の調整、β細胞機能、及び、成長を改善する可能性がある。
【０１９１】
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０．８ｍＭにおいて試験した化合物の％阻害
イタリック＝ＩＣ５０
ＮＩ＝阻害なし
【０１９２】
実施例７：インビボにおける式（Ｇ２）の化合物による血漿インスリン濃度の上昇
４２頭の１０週間齢のオスのｏｂ／ｏｂマウスを用いてこの試験を開始した。全試験期間中、マウスに通常の飼料を与えた。１週間の環境順化後に、体重、血漿グルコース及びインスリン（４時間の絶食後）に基づいてマウスを対応付け、１０頭のマウスの３つのグループに分けた（ｔ＝０日）。続く６日間に、１２．００時頃に強制飼養（５ｍｌ／ｋｇマウス）によって、溶媒（コントロールグループ１）、又は、式（Ｇ２）の化合物（試験化合物）の５ｍｇ／ｋｇ／日（グループ２）、又は、式（Ｇ２）の化合物の５０ｍｇ／ｋｇ／日（グループ３）をマウスに摂取させた。７日目に、マウスに、８．００時に絶食させ、１２．００時に最後の強制飼養を摂取させた（グループ１に溶媒、又は、グループ２に５ｍｇ／ｋｇ／日の試験化合物、又は、グループ３に５０ｍｇ／ｋｇ／日の試験化合物）。続いて、マウスに、１３．００時に、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）のスタートとして、強制飼養によってグルコースボーラス（マウス１ｋｇ当たり２ｇ、マウス１ｋｇ当たり５ｍｌ）を摂取させた。血糖値の測定及び血漿回収は、グルコースボーラスからｔ＝０（グルコースの強制飼養の直前）、及び、ｔ＝５、１５、３０、４５、６０及び１２０分後に行った。ＯＧＴＴの後に、マウスをＣＯ２によって屠殺し、さらなる血液を心臓に開けた穴からヘパリンコーティングしたチューブ内に回収し（１００μｌを超える血漿が得られた）、ヘパリン−血漿サンプルを分析した。
【０１９３】
第０日に、体重並びに４時間絶食させたときの血漿グルコース及びインスリンの濃度に基づいてマウスを無作為化した（表３．１．ａ）。４２頭のマウスのうちの１２頭のマウスを除外することにより、体重、血漿グルコース及びインスリンに関してより均一なグループを作った。
【０１９４】
コントロール（溶媒）グループと比較して、体重（図３．２．１）及び食物摂取量（図３．２．２）のいずれもが、５ｍｇ／ｋｇ／日又は５０ｍｇ／ｋｇ／日のＧ２を用いた治療後に、有意に変化しなかった。
【０１９５】
コントロールグループと比較して低下が有意ではなかったものの、０分（グルコース経口負荷の直前）における血漿インスリン濃度は、試験化合物治療グループの両方においてやや低下したようであった。３グループ間において、１５分、３０分、４５分及び６０分に有意な変化は、認められなかった。グルコースボーラスの２時間後に、血漿インスリン濃度は、コントロールグループと比較して、５ｍｇ／ｋｇの試験化合物で治療したグループ及び５０ｍｇ／ｋｇの試験化合物で治療したグループにおいて有意に増加した。
【０１９６】
このデータは、おそらく、改善された膵臓β細胞機能の結果として、グルコース経口ボーラスの１２０分後に、両方の試験化合物治療グループにおいて、血漿インスリン濃度が有意に増加したことを示した。
【０１９７】
実施例８：式（Ｇ２）の化合物の特性
化学的性質
式（Ｇ２）の化合物は、分子量１７７のイミノ糖酸である。この化合物は水に無限に可溶する。この化合物は、すべての通常の研究室的保存条件下において安定である。
【０１９８】
生起及び暴露データ
式（Ｇ２）の化合物は、アーユルベーダ及びヨーロッパの植物薬局方において知られている一連の植物の極性抽出物中に存在する天然物である。本発明者らは、ヒトの肥満及び糖尿病のコントロールで使用されるいくつかの植物性医薬品において、ｃａ．０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で化合物を検出した。そのような製品は、一般に安全であると考えられており、通常用量において、その摂取量からの式（Ｇ２）の化合物への暴露は、１日当たり約１ｍｇである。
【０１９９】
１つの植物製剤の抗糖尿病効果及び抗肥満効果は、実験動物モデルにおいて確認されている。そのモデルにおいては、高脂血症のウィスターラットに、マウス１ｋｇにつき０．６ｍｇの式（Ｇ２）の化合物に相当する一回用量、又は、マウス１ｋｇにつき１日当たり最大０．４ｍｇ／ｋｇを摂取させた。毒性は報告されなかった。その結果は、体重増加を低減し、血漿トリグリセリド及び高エネルギー食による動物における絶食時及び食後の血糖の濃度を低下させる植物製剤の能力を示した。他の研究においては、最大５２週間に渡って５〜５０ｍｇ／ｋｇに相当すると考えられる量の植物抽出物をラットに毎日投与したが、顕著な中毒作用は認められなかった。
【０２００】
予測中毒学的検査
式（Ｇ２）の化合物は有効になった急性毒性分析を用いて、毒性負荷について検査した。受精卵を成虫のテュービンゲン（Ｔｕ）ゼブラフィッシュのつがいから得て、発生の２〜４個の細胞段階で新鮮な０．３×Ｄａｎｉｅａｕ溶液を含む２４ウェル培養皿中に置いた。評価前に湿度制御環境においてプレートを２８．５℃で定温放置した。１００％ＤＭＳＯ中で階段希釈することによって化合物の貯蔵濃縮物を作製した（幼虫に暴露させた最終濃度、０．５％）。検査は、ＶＡＳＴｏｘ内部コントロール及び溶媒と共に、７つの用量（１ｍＭ、５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ及び５００ｍＭ）で行った。受精から７２時間後に化合物の投薬をに実行し（受精後の時間は、胚発生の完了時からである）、受精から９６時間後に致命傷及び全体的形態を視覚的に評価した（２４時間のインキューベーション）。１４匹の幼虫を各濃度の化合物に暴露させ、（コントロール以外に）合計８４匹の幼虫を評価した。受精から９６時間後に、幼虫を観察し、解剖実体顕微鏡を用いて下記：（１）心臓の鼓動；（２）循環；（３）ネクローシス；及び（４）運動性（接触反応）の存在又は不存在について検査した。４つの基準のすべてが満たされていたときに、幼生を死亡したものとして分類した。化合物について盲検試験を行った。
【０２０１】
１ｍＭ、５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭの濃度で得られた結果は、水性用量で暴露させたときに、式（Ｇ２）の化合物がゼブラフィッシュ幼虫に急性毒性を生じさせなかったことを示した。
【０２０２】
実施例９：品質管理プロセス
２５０ｍｌの三角フラスコに１０ｇの乾いた植物性食品添加剤を入れ、次いで、５０％のエタノール／水を充分に加えて植物性材料を浸し、頂部の余分な溶媒を２ｃｍとする。これを１５時間又は一晩放置して抽出する。ブフナー漏斗でその抽出物をろ過する。それほど極性ではない成分を例えばＨＰＬＣ解析のための抽出してもよい。植物性材料は、廃棄されるか又はジクロロメタン（ＤＣＭ）による順次抽出のための保持する。好ましくは、新鮮な材料をＤＣＭステップに用いるが、入手可能なものが不十分であれば、順次抽出を行うことができ、又は、順次抽出を用いて成分を特徴をさらに明らかにしてもよい。ＨＰ２０樹脂を用いてその抽出物を浄化することによって、その抽出物をＨＰＬＣ分析により適したものにしてもよい。
【０２０３】
Ｄｏｗｅｘ５０樹脂（５０〜１００メッシュ）（又はアンバーライトＩＲ１２０のように相当物）は、過剰な２Ｍ  ＨＣｌを加え、最低１５分間浸すことにより調製される。次いで、過剰な脱イオン水で樹脂をｐＨ７まで洗浄する。１０×１ｃｍカラムに調製した樹脂を注入し、貯蔵容器を取り付ける。カラムを２５ｍｌの５０％水性エタノールで洗浄して、樹脂と、植物性サンプルを調製するのに用いられるのと同じ溶媒とを平衡に保つ。各カラムについて、樹脂をゆっくり通過する抽出物で溶液が満たされる。
【０２０４】
約１又は２であるべき溶出液のｐＨをモニターする。ｐＨが６又は７に上昇すれば、樹脂が消耗している。これが生じたら、少量の樹脂をカラムの頂部に追加する。必要であれば、全サンプルを再度カラムに適用して、イオン成分のすべての結合を確かにする。すべてのサンプルをカラムに適用した後に、カラムを７５ｍｌの５０％水性エタノールで洗浄し、次いで７５ｍｌの水で洗浄する。これらの洗浄液は、通常、イミノ糖酸分析のために廃棄されるが、フラボノイド及び糖などの保持されていない成分について分析することができる。結合成分を溶出させる前に、水を用いて、アルコール及び他の保持されていない成分を除去する。
【０２０５】
１００ｍｌの２Ｍ水酸化アンモニウムでカラムを溶出させる、これを２５０ｍｌの丸下部フラスコ内に回収する。これを回転蒸発装置によって４０℃未満で３〜５ｍｌになるまで蒸発させ、重さを測った７ｍｌのバイアル瓶に移す。乾燥は、窒素及び／又は凍結乾燥で吹き落とすことによって完了する。化合物の分解が生じ得るので、サンプルを同じ日に乾燥させ、必要以上に長くアンモニア水のままにしておかない（一般的には１５分未満）ことに注意する。各乾燥試料の１〜３ｍｇをＧＣバイアル瓶内に置き、分析用に誘導体化する前に、再度凍結乾燥させる。
【０２０６】
注釈
（ａ）ＨＰ−２０樹脂
Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（住友株式会社製）は、スチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂である。この樹脂は疎水性であり、脂肪親和性化合物及び弱酸を吸着する。合成吸着剤ＨＰ及びＳＰシリーズは、マクロ細孔を有する不溶性の３次元橋架重合体である。これらの合成吸着剤は、イオン交換基又は他の官能基を有していないが、表面積が大きく、ファンデルワールス力によって様々な有機物質を吸着することができる。ポリマーマトリクスは、芳香族（スチレン−ジビニルベンゼン）タイプ又はアクリル樹脂（メタクリル酸）タイプのいずれかに分類することができる。
【０２０７】
化合物が吸着されれば、適切な溶媒を用いることよってその化合物を樹脂から洗い流すことができる。ＨＰ−２０は、植物のジクロロメタン（ＤＣＭ）抽出物から過剰量の脂肪及びクロロフィルを取り除くために、以下の方法で用いられる。
【０２０８】
可溶化された抽出物を真空下で樹脂上に乾燥させる。樹脂は、増加する量のアセトン（３０％以内のアセトン）を含むメタノールで溶出される。これは、ＨＰ−２０樹脂上に吸着された脂肪及びクロロフィルをそのままにして、すべての対象化合物を洗い流すのに充分である。アセトン及びヘキサンで洗浄することによって、ＨＰ−２０樹脂を再利用のために浄化する。これによってすべての不要な化合物が洗い流され、樹脂は、メタノールで最終洗浄した後に再度用いることができる。
【０２０９】
（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー
約５０％の水性アルコールを用いた抽出によってサンプルをまず処理し、その処理によって、各植物の極性がより小さい成分から極性成分が単離され、抽出物中に存在し得るあらゆるタンパクが変性される。次いで、抽出物をイオン交換クロマトグラフィーによって処理し、抽出物中存在する非イオンの化合物（主として、糖、脂肪及びフェノール類の大部分）から、各抽出物中のイオン化合物（主として、アルカロイド、アミノ酸及び小分子アミン）を単離及び濃縮する。次いで、ＧＣ−ＭＳ又はＨＰＬＣによってサンプルを酵素的分析で分析する。
【０２１０】
ろ過された抽出物をＤｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８樹脂にロードする。Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８樹脂は、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチロール樹脂である。この樹脂は、遊離酸、又は、水素（Ｈ＋）形態、又は、例えばアンモニウム（ＮＨ４＋）塩などの塩形態で用いることができる強酸性陽イオン交換体である。樹脂の両方の形態は、溶液から陽イオンを吸着し、同数の対イオン（用いる樹脂の形態に応じてＨ＋又はＮＨ４＋イオンのいずれか）を溶液中に放出する。Ｈ＋形態では、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８樹脂は、イオン化合物の電荷に関係なく、（非常に強い酸を除き）すべてのイオン化合物を溶液から吸着する。そして、これが好ましい形態である。
【０２１１】
抽出物からの陽イオンの吸着においては、樹脂から陽子が排出されて、サンプルの濃度に応じて溶出液のｐＨがｐＨ６．０（使用前に樹脂を洗浄するために用いる蒸留水のｐＨ）から約ｐＨ２．０まで下落する。サンプルが薄いほど、ｐＨの低下は小さい。しかしながら、樹脂容量が限界になると、継続的なサンプルローディングによって、ｐＨが粗抽出物自体のｐＨまで上昇する。
【０２１２】
Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８樹脂（５０〜１００メッシュサイズ）を２Ｍ  ＨＣｌで洗浄することによって使用のための調製し、Ｈ＋形態への完全転換を確実に行う。蒸留水を用いて広く水洗することによって余剰な酸を除去する。粗抽出物を樹脂にロードした後に、蒸留水でカラムを洗浄して、溶出液のｐＨが水自体のｐＨに上昇するまで、結合していないあらゆる材料を除去する。水酸化アンモニウム（ＮＨ４＋ＯＨ−）の２Ｍ溶液で結合した化合物を溶出させる。ｐＨ６．０になるまでカラムを水で洗浄し、回転蒸発装置を用いた蒸散によって減圧下において４０℃でサンプルからアンモニアを除去する。
【０２１３】
本発明のイミノ糖酸は、ヒドロキシド形態のアンバーライトＣＧ４００などの陰イオン交換樹脂にそれらのイミノ糖酸を結合させることによって、さらに精製され得る。イミノ糖酸を１Ｍ酢酸などの酸で排出させ、乾燥させることができる。ｐＨ８になるまで水で洗浄する前に、１Ｍ  ＮａＯＨ中に１時間浸すことによって、使用する樹脂を調製する。
【０２１４】
（ｃ）ガスクロマトグラフィ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）
ガス液体クロマトグラフィーは、圧力下の不活性ガスと加熱したカラム内の不活性支持体上にコーティングされた不揮発性液体の薄層と間でサンプルを分離することによって、揮発性物質の複雑な混合物を各成分に分離するプロセスである。混合物中の特定の化合物をうまく分離するためには、適切な特性を有するカラムを用いることが重要である。固体支持体の性質、液相の種類及び量、パッキングの方法、全長及びカラム温度が重要な要因である。好ましくは、無極性液相でコーティングされたキャピラリーカラム（２５ｍ×０．２２ｍｍ  ｉｄ×０．２５μｍ  ＢＰＸ５固定相、ＳＧＥ株式会社製又はその同等物）を用いる。
【０２１５】
多くの化合物は、強い極性、低揮発性又は熱的不安定のせいで、ガスクロマトグラフィ内に直接的に注入するのには適していない。高度にヒドロキシ化された化合物は、分子間水素結合のせいで気体化するのが困難である。しかしながら、水酸基の水素を他の化学基に置換することによって、ＧＣ分析を行うのに充分な揮発性をそれらの化合物に与えることができる。水酸基を誘導体化する最も一般的な２つの手段はアセチル化及びシリル化であり、それらの反応において、アセチレート［ＣＨ３ＣＯ−Ｏ−Ｒ］又はシリルエーテル、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテル［（ＣＨ３）３Ｓｉ−Ｏ−Ｒ］が形成される。Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙによって生産されるＳｉｇｍａ  Ｓｉｌ  Ａ（トリメチルクロロシラン、ヘキサメチルジシラザン及びピリジンの１：３：９の混合物）を用いて、分析前にサンプルをシリル化することが好ましい。代替物は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｒｉ−Ｓｉｌである。誘導体化は、密封したバイアル瓶内の乾燥した材料１ｍｇに対して１００μｌのトリメチルシリル化剤を添加することによって達成され（この試剤は水の存在下で分解する）、この反応は、サンプルを６０℃で１５分間加熱することによって完了する。
【０２１６】
各誘導されたサンプル中のトリメチルシリルエーテルは、温度プログラムを用いたカラムによって単離される。温度プログラムをこのように用いることによって、非常に広い沸点範囲の化合物の迅速な単離が可能になる。
【０２１７】
電子衝撃質量分析において、単離及び気化された化合物を含むガスクロマトグラフからの流出液は、高真空下の質量分析計のイオンチャンバ内に入る。分子は、フィラメントからの加速された電子のビームに衝突し、イオン化及び断片化される。まず、各分子から１個の電子が脱離し、正に帯電した分子イオン（Ｍ＋、すなわち、ラジカルカチオン）が生じる。結合強度に関連した結合の切断が分子イオン内で急速に生じて、断片イオンが生じる。分子断片が非常に特有である方法は、「特徴」認識の形態として使用できる。様々なイオンは、加速されて質量分析計の解析器部分中に入り、断片の分子量に相当する質量電荷比率（ｍ／ｚ値）に従って分類される。イオン信号は電子増倍管によって増幅され、質量スペクトルは低質量から高質量へとプロットされる。ｍ／ｚ値は、イオンの相対存在量に対してプロットされ、視覚的な「特徴」が与えられる。
【０２１８】
（ｄ）ＨＰＬＣ−ＰＤＡ／ＭＳ／ＥＬＳ（蒸発光散乱検出）
この技術を用いると、サンプルは、適切な溶媒中に溶解され、カラムから加圧下で注入される混合溶媒を用いたカラムによって単離される。３つの検出器：上述した質量分析計と；化合物がＵＶ及び可視範囲の両方の波長で吸光するか否かを判定するフォトダイオードアレイ系と；光散乱検出器（ＥＬＳ）とを用いる。ＥＬＳは、一般に発色基を有しないイミノ糖酸及びイミノ糖を検出するために、特に好適である。
【０２１９】
逆相Ｃ８  ＨＰＬＣカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ  ｉｄ×３．５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）が取り付けられたＷａｔｅｒｓ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ（商標）ＨＰＬＣ−ＰＤＡ／ＭＳシステムを用いて、ＤＣＭによって抽出されてＨＰ２０樹脂を用いて洗浄された非極性化合物を分析した。カラムを通る溶媒フローの速さは、０．３５ｍｌ／分であった。また、９０％の水と１０％のアセトニトリル（トリフルオロ酢酸を０．０１％含む）で始まり、６分間で１００％のアセトニトリルまで上昇し、さらに６．５分間保持される直線濃度勾配を用いた。
【０２２０】
吸収度（フォトダイオードアレイ−ＰＤＡ）データを２００〜６００ｎｍから回収し、質量スペクトルデータを７１〜６００ｍ／ｚにおいて回収した。イミノ糖酸は、そのようなＨＰＬＣシステムによって適切に測定又は検出されないが、植物化学物質の他の多くのグループは、植物製剤中にイミノ糖酸と共に存在する可能性があるものである。ＥＬＳ検出によってイミノ糖及びイミノ糖酸を観察することができる。しかしながら、炭水化物とイミノ糖とイミノ糖酸の検出により適したＨＰＬＣの他の形態を利用することができる。具体例は、例えば電気化学検出器、質量分析計、又は、ＥＬＳ検出器に連結されたＤｉｏｎｅｘ炭水化物ＨＰＬＣシステム及びＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）である。
【０２２１】
イミノ糖及びイミノ糖酸に適したＨＩＬＩＣ系の一例は、水：アセトニトリル：１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．７）が４０：５５：５の移動相及び０．５ｍｌ／分の流速を用いた、ＳｅＱｕａｎｔ  ＨＰＬＣカラム（ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣパッキング、１５０×４．６ｍｍ、３．５μｍ粒子径、２００Ａ細孔径）が取り付けられたＨＰＬＣである。Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＰＬ−ＥＬＳ１０００（光散乱検出器）を用いた検出は、イミノ糖及びイミノ糖酸の分解能に優れていた。
【０２２２】
ＨＩＬＩＣ  ＨＰＬＣシステムを用いたアミノ酸、イミノ糖及びイミノ糖酸の単離の例を示す表である。
0005722632.tif 000017
【０２２３】
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イミノ糖及びイミノ糖酸の単離及び検出に用いたＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣシステムは、ＩＯＮＰＡＣ  ＣＧ１０  ４×５０ｍｍガードカラムを備えたＤｉｏｎｅｘＩＯＮＰＡＣ  ＣＳ１０  ４×２５０ｍｍカラム、並びに、８０ｍＭに希釈したメタンスルホン酸及び水の移動相からなっていた。必要とされる溶出液Ａ（８０ｍＭ  ＭＳＡ）及び溶出液Ｂ（水、超高純度）を１ｍｌ／分の合計流量で届けるためのポンプは、ＤｉｏｎｅｘＰ６８０であった。注射器は、Ｒｈｅｏｄｙｎｅの手動注射器であった。オーブン、ＤｉｏｎｅｘＬＣ３０を用いて、カラム及びガードを３０℃に維持した。空気圧制御装置（ＤｉｏｎｅｘＰＣ１０、（ヘリウムガス、〜１．５ｍｌ／分  ＮａＯＨ  ６０ｐｓｉ））を用いて、カラムと検出器との間の溶出液フローに３００ｍＭ  ＮａＯＨを加えた。検出器は、ＤｉｏｎｅｘＥＤ４０電気化学検出器であった。そのデータをＤｉｏｎｅｘ  Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いて分析した。
【０２２４】
実施例１０：化合物Ｇ２による消化性グルコシダーゼの阻害の欠如
デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ（Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標））、及び、Ｂａｙｅｒによって２型糖尿病の治療用に開発されたＮ−ヒドロキシメチル誘導体（Ｍｉｇｌｉｔｏｌ、Ｇｌｙｓｅｔ（登録商標））は、グルコシダーゼの強力な阻害剤である（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：２６５−２９５を参照されたい）。グルコシダーゼの阻害は、胃腸障害（薬剤の副作用）、及び、胃腸管におけるグルコースの放出及び取り込みを遅延させることによって機能し、従って、食後の血中グルコース濃度を制御するＧｌｙｓｅｔ（登録商標）を摂取する糖尿病患者の利益の両方の原因となる。Ｇ２などの本発明のイミノ糖酸は、消化性グルコシダーゼの阻害に関与しないメカニズムで血中グルコース濃度を制御することができ、従って、そのイミノ糖酸が由来したＤＮＪ及び薬剤の副作用を回避することができるという長所がある。
【０２２５】
0005722632.tif 000019
ラット腸管のグリコシダーゼに対するＧ２及びＤＮＪの阻害作用
ＮＤ＝未測定；
＊は、Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｎａｔ．ｐｒｏｄ．６５，１９８−２０２から。
ＬＩ＝１ｍＭにおいて５０％未満の阻害；ＮＩ＝１ｍＭにおいて阻害がない
Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００２．に記載されているように二糖類を基質として用いて、ラット小腸の刷子縁膜から酵素活性を調製した。
【０２２６】
グルコース放出及び取り込みを減少させる２型糖尿病に用いられる他のグルコシダーゼ阻害剤であるアカルボースは、ラット小腸マルターゼ（ＩＣ５００．１６μＭ）及びスクラーゼ（ＩＣ５０２．９μＭ）の強力な阻害剤であることも報告されている（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５６，８２０６−８２１１）。
【０２２７】
本発明の化合物Ｇ２、Ｓ２、Ｔ１及びＴ２並びにＤＮＪ及びＺａｖｅｓｃａのウサギ消化性ジサッカリダーゼに対する活性の比較も行った。この比較の結果を下記表に示す。Ｇ２、Ｓ２及びＴ２は、０．８ｍＭにおいてジサッカリダーゼの阻害作用を示さなかったが、Ｔ１は、ＤＮＪ及びＺａｖｅｓｃａと比較して、マルターゼ及びスクラーゼの非常に弱い阻害作用を示した。Ｓ２及びＴ１についてはイソマルターゼ阻害を測定しなかった。
【０２２８】
ウサギ腸管グリコシダーゼに対する本発明の化合物並びにＤＮＪ及びＺａｖｅｓｃａの阻害作用
0005722632.tif 000020
【０２２９】
ウサギジサッカリダーゼ阻害分析方法
０．２Ｍ  Ｍａｃｌｌｖａｉｎｅ（シトラートホスフェート）バッファー、ｐＨ６．０を用いて、スクロース（８．３ｍＭ）基質、マルトース（５ｍＭ）基質、及び、イソマルトース（６．３ｍＭ）基質を作製した。供給者の説明書（Ｍｅｇａｚｙｍｅ株式会社）に従ってグルコース検出試薬を調製した。グルコース検出試薬とグルコースとの反応の経時変化の直線性は、グルコースの段階希釈液を用いて試験した。
【０２３０】
哺乳動物ジサッカリダーゼ調製
哺乳動物小腸粘膜のジサッカリダーゼを調製する方法は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９８）に基づいており、硫酸アンモニウム単離ステップを省略した。小腸を、メスの野生ウサギから切除し、メスで長手方向に開いた。粘膜層を清潔なスライドグラスの縁を用いてそぎ落とし、３ｍｌの蒸留水中に置いた。粘膜層懸濁液を約１０００ｒｐｍで３０秒間遠心単離して、組織破片を沈殿させた。上澄み（６ｍｌ）を除去し、３５００ｒｃｆで再び１分間遠心単離し、懸濁液から微細な微粒子を除去した。上澄みを希釈して０．２〜０．２５ｍｇ／ｍｌのタンパクを得て、−３０℃で貯蔵した。
【０２３１】
５〜１５μｌの酵素製剤、５μｌの試験化合物（又はコントロールの蒸留水）及び１５〜２５μｌの基質溶液を用いて酵素分析を実行した。反応系を１枚のプレート封口膜で覆い、３７℃で６０分間インキュベートした。（二糖類加水分解に由来する）グルコースの量を、２００μｌのグルコース検出試薬を加え、さらに２５分間その反応系をインキュベートすることによって定量した。コントロールブランクに対して５１０ｎｍで吸収度を測定した。
【０２３２】
このように、哺乳動物小腸粘膜のスクラーゼ、マルターゼ及びイソマルターゼの酵素阻害作用を測定することができる。
【０２３３】
実施例１１：抗糖尿病活性を有するとされている植物におけるイミノ糖酸の存在の相関
イミノ糖酸は、植物中において希少であるが、ハス種（マメ類）、パンプキン（カボチャ類）、Ａｓｐａｌａｎｔｈｕｓ  ｌｉｎｅａｒｉｓ（ルイボス）、アレクサ種及びカスタノスペルマムオーストレール（マメ科）、フトモモ属種（フトモモ科）、リキウムバルバラム（ゴジ、ナス科）、及び、アンドログラフィスパニキュレート（キツネノマゴ科）で確認されている。
【０２３４】
ギムネマシルベストレは、抗糖尿病又は抗肥満活性を有するとされている植物であり、活性の臨床的な証拠がある（例えば、Ｂａｓｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｌｅａｆ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｇｙｍｎｅｍａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３０：２９５−３００  ａｎｄ  Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｇｙｍｎｅｍａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  ｌｅａｆ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３０：２８１−９４を参照されたい）。本発明者らは、ギムネマシルベストレの葉、種子及び茎がイミノ糖酸Ｇ２を含むことを新たに発見した。Ｆｌｏｒｅｓｓａｎｃｅ社の「シトラス、マンゴスチン、ギムネマｃｏｎｃｅｎｔｒｅ」カプセル剤などの商業的に販売されている減量用製品も、Ｇ２を含んでいる（ロット８２０５ｃｃにおいて１カプセル当たり２．４ｍｇ）。ギムネマ中のＧ２又は他のイミノ糖酸の存在は、他のいかなる研究者によっても報告されていない。現在までに公表された研究は、ギムネマ酸などの、甘味に影響を与えるギムネマの他の成分に集中してきた。その成分は、Ｇ２とは違って、経口的に利用できることが示されていない。
【０２３５】
我々は、植物グラナ（グアラナとも呼ばれる）ポーリニアキュパナが、ポンガミアグラブラに由来するグラブリン（この構造は、報告された立体化学を有していなかった）としても報告されている、Ｇ２のＮ−メチル−３−デオキシ−形態を含んでいることも発見した。グラナは、体重を減少させるとされている。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｔ  ａｎｄ  Ｆｏｇｈｔ  Ｊ，２００１，Ｗｅｉｇｈｔ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｍｐｔｙｉｎｇ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｃｉａ  ｈｅｒｂａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ  １４，２４３．を参照されたい。グラナは、２型糖尿病の発病をある程度の予防するされているカフェインを含むことが知られているが、化合物Ｇ２に関連するイミノ糖酸は、抗糖尿病活性及び抗肥満活性を有するグラナの重要な成分である。ポンガミアは、他の成分のせいで経口的に有毒である。
【０２３６】
また、本発明者らは、下に示されている例のような様々なスタキドリンを含むダイダイなどの、抗糖尿病活性を有するとされている他の植物類からピロリジン構造のイミノ糖酸を単離した。
0005722632.tif 000021
【０２３７】
本発明者らは、シトラスから、ピロリジジンアルカロイドの酸であると確認され、下に示されているエピアレクサフロリンに関連する化合物を新たに単離した（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１を参照されたい）。また、シトラスは、Ｇ２のＮ−ブチル誘導体及びＯ−ブチル誘導体である化合物、及び、化合物及びトリメチルシリル誘導体のようなシトラス抽出物の半合成及びＧＣ−ＭＳ分析によって証明されたデオキシノジリマイシン様化合物のＯ−ブチル−Ｎ−酸誘導体（例えばＴ３）を含む。
0005722632.tif 000022
【０２３８】
中国カボチャ（又はサイアムパンプキン）は、糖尿病ラットにおいてβ細胞を増加させるとされている（Ｘｉａ，Ｔ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ８７，１７５３−１７５７）。本発明者らは、開鎖イミノ糖酸性化合物（例えば、例Ｐ３）がヨーロッパパンプキン（セイヨウカボチャ）の種子及び果実中に存在することを示した。ＧＣ−ＭＳによって、並びに、グルクロニダーゼ及びヘキソサミニダーゼ分析における特徴的な活性によって分析したＣＧ４００  ＯＨ結合画分中に、イミノ糖酸と考えられるいくつかのものを示すツルレイシ（ニガウリ）を含めて、いくつかのウリ科種は、抗糖尿病活性を有するとされている。
【０２３９】
イミノ糖酸と糖尿病又は体重管理との治療的関連性は、血中グルコース濃度を制御し、インスリン量を調節することが示されたステビアレバウディアナの例によって示される。他者による研究努力がステビオシド及びレバウジオシド及び関連グリコシドに集中する一方で、これらは、薬理活性を有していないと考えられていた。例えば、（Ｂａｒｒｉｏｃａｎａｌ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｐｐａｒｅｎｔ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｕｓｅｄ  ａｓ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１：３７−４１を参照されたい）。しかしながら、この植物は、抗血糖活性があることが証明されており、南アメリカにおいて糖尿病を治療するために伝統的に用いられた（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＥＢ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ｌｅａｖｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ  ｏｎ  ｇｌｙｃａｅｍｉａ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．７２：６９１を参照されたい）。従って、ステビア中のＳ２などのイミノ糖酸の発見は、これらの化合物の除去がステビアの抗糖尿病活性をなくしてしまうことを示唆する。
【０２４０】
実施例１２：抗糖尿病活性又は抗肥満活性を有するとされている植物中のイミノ糖酸のグリコシダーゼ活性の測定
イミノ糖酸は、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、ミグリトール、及び、ＤＡＢ（１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール）などの他のイミノ糖が示さない、グルクロニダーゼ及び／又はヘキソサミニダーゼ活性の特殊な阻害を示し得る。これらのイミノ糖化合物は、グルコシダーゼ及びグリコーゲンフォスフォリラーゼの阻害によって糖尿病股は肥満において潜在的治療活性を示すが、それゆえ、消化性ジサッカリダーゼ活性の阻害によって副作用を引き起こすと考えられる。
【０２４１】
本発明の化合物Ｇ２は、哺乳動物グルクロニダーゼに対するＩＣ５０が１０７μＭであり、一方で、Ｇ２のＮ−ヒドロキシエチル誘導体は、グルクロニダーゼ（ＩＣ５０は６０μＭ）及び哺乳動物β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＩＣ５０は１２．２μＭ）に対してより強力である。ＤＮＪは、０．８ｍＭにおいていずれの酵素活性も抑制しないが、Ｎ−プロピオン酸ＤＮＪは、グルクロニダーゼ（ＩＣ５０は５０μＭ）及びヘキソサミニダーゼ（ＩＣ５０は３２μＭ）のいずれもを抑制する。
【０２４２】
イミノ糖ＤＮＪ及びミグリトールと本発明の３個のイミノ糖酸とのグリコシダーゼ阻害プロフィルの比較を示す表である（０．８ｍＭ−ＩＣ５０値における％阻害として示される阻害をイタリックで示す。）。
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０．８ｍＭ−ＩＣ５０値における阻害はイタリック体で表わす。
０．８ｍＭにおいてＮ．Ｂ．阻害が５０％以下であることは、非常に弱い阻害を示す。
【０２４３】
哺乳動物グルクロニダーゼ又はヘキソサミニダーゼ活性を抑制する能力について、抗糖尿病活性を有するとされているいくつかの植物を評価した。植物は、非特異的なタンパク結合活性を有し得るか、又は、標準的な比色定量グリコシダーゼ分析の使用を不可能にする強い色を有し得る、フラボノイド及びポリフェノールなどの多数の芳香族成分を含んでいる。従って、陽イオン交換及び陰イオン交換の方法の組合せを用いて植物の水性エタノール抽出物を単離し、イミノ糖酸成分を精製した。この方法は、当業者に周知であり、アミノ酸及びアルカロイドを強酸性陽イオン交換樹脂（例えばＨ＋形態のＩＲ１２０）に結合させるステップと、水で洗浄するステップと、結合した成分を２Ｍアンモニア水で排出させるステップと、減圧下で濃縮してアンモニアを除去するステップと、次いで、水で洗浄した後に強塩基性陰イオン交換樹脂（例えばＯＨ−においてアンバーライトＣＧ４００、形態」）にイミノ糖酸を結合させるステップと、１Ｍ酢酸でイミノ糖酸を排出させるステップとを含む。過剰なアセタートの除去後には、これらの画分がグリコシダーゼ分析用に適している。
【０２４４】
グリコシダーゼ分析方法
ベータマンノシダーゼをＭｅｇａｚｙｍｅから得た以外は、すべての酵素及びパラニトロフェニル基質をＳｉｇｍａ社から購入した。酵素は、酵素に最適ｐＨの０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムバッファー中において２７℃で分析した。インキュベーション混合物は、酵素溶液１０μｌと、１ｍｇ／ｍｌの抽出物水溶液１０μｌと、酵素に最適なｐＨにおいてバッファー中で作製した適切な５ｍＭパラニトロフェニル基質５０μｌとで構成されていた。反応の対数期に０．４Ｍグリシン（ｐＨ１０．４）を７０μｌ加えることによってその反応を停止させた。その反応の対数期は、水で阻害剤を置換した非阻害分析を用いて最初に決定した。ヴェルサマックスマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４０５ｎｍで最終吸収度を読みだした。分析を３回繰り返して実行した。与えられている値は、各分析当たり３回の繰り返しによる平均値である（Watson, A.A., Nash, R.J., Wormald, M. R., Harvey, D.J., Dealler, S., Lees, E., Asano, N., Kizu, H., Kato, A., Griffiths, R.C., Cairns, A.J. and Fleet, G.W.J. (1997). Glycosidase-inhibiting pyrrolidine alkaloids from Hyacinthoides non- scripta. Phytochemistry 46 (2):255-259を参照されたい。)
【０２４５】
下記表は、使用した酵素及び個々の分析の条件の詳細を示す。
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【０２４６】
結果
植物であるステビアレバウディアナ及びギムネマシルベストレの陰イオン交換樹脂（ＣＧ４００  ＯＨ−）結合画分は、１．４３ｍｇ／ｍｌでグルクロニダーゼ活性を完全に阻害した。この阻害は、おそらく、ギムネマ中の化合物Ｇ２、及び、ステビア中のＳ２のような化合物が高濃度であることに起因している。
【０２４７】
抗糖尿病活性及び／又は抗肥満活性を有していると研究された他の植物の例は、ゴジ果物（リキウムバルバラム）、テオブロマカカオニブ、Ａｓｐａｌａｎｔｈｕｓ  ｌｉｎｅａｒｉｓ（ルイボス茶）、フーディアゴードニー、高麗人参（チョウセンニンジン）及び大豆（ダイズ）である。分析前にこれらのすべてをＣＧ４００  ＯＨ−結合画分中に単離した。下記２つの表中の結果は、カカオニブに対するコントロール化合物として１４３ｕｇ／ｍｌで実行したカフェインを除いて、１．４３ｍｇ／ｍｌによる％阻害として表されている。
【０２４８】
カカオニブ及びカフェインのイミノ糖酸画分によって示された平均％阻害
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【０２４９】
抗糖尿病特性又は体重制御特性を有するとされている植物のイミノ糖酸画分によって示された平均％阻害
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【０２５０】
上記植物を用いて得た結果から、これらが、ウシのグルクロニダーゼ又はヘキソサミニダーゼのいずれかをある程度阻害することがわかった。ＣＧ４００  ＯＨ−（陰イオン交換樹脂）結合画分のＧＣ−ＭＳ分析によって、これらのサンプル中においてあり得るイミノ糖酸の量はステビア又はギムネマほど高くなくいこと、及び、そのような複雑な混合物に阻害剤を薄めることになるタンパクアミノ酸などの他の多数の主成分が存在することが示された。しかしながら、例えば、ダイズは、両方の酵素活性の阻害作用が驚くほど強い。ルイボス及びゴジベリーは、酵素の阻害作用が比較的小さいが、両者において活性を示している。高麗人参は、試験した２つの異なるサンプルにおいてグルクロニダーゼ活性を強く阻害しているが、一方で、フーディアは、両方の酵素活性を阻害している。阻害作用を与えるこれらのイミノ糖酸画分中の成分の特性を完全に明らかにするためには、さらなる精製作業及び単離作業が必要である。精製すれば、阻害強度が大幅に増大するはずである。
【０２５１】
実施例１３：インビボにおける化合物Ｇ２の活性−ｄｄｙマウスにおけるインスリン濃度の上昇
方法
７週齢のｄｄｙマウス（体重３０〜３１ｇ）を４つのグループ（グループ１〜４）に分けた。各グループにはそれぞれ３〜４頭のマウスがいた。試験化合物を与える１６時間前に、すべての試験マウスを絶食させた。
【０２５２】
この試験の目的は、Ｇ２（ここにおいてＢＲ１とコードする）がインスリン放出を促進できるか否かを判定することであった。
【０２５３】
グループ１：コントロール、治療していないマウス（グルコース及びＧ２を用いない）
グループ２：グルコースのみを経口投与
グループ３：Ｇ２のみを経口投与
グループ４：グルコース及びＧ２を経口投与
【０２５４】
３０分後に血清インスリン量を測定した（図２参照）。
【０２５５】
結果
グループ１（治療していない）及びグループ３（Ｇ２のみを経口投与）と比較すると、Ｇ２がインスリン濃度に影響しないことは明らかである。しかしながら、グルコースとＧ２との組合せは、グルコースのみよりも非常に有効である。これらの結果は、Ｇ２がインスリン放出自体には影響しないが、濃度を上昇させるようであることを示唆している。
【０２５６】
図３  血清インスリン量に対するＧ２（ＢＲ１）（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ）の効果
Ｄ−グルコース（体重１ｋｇ当たり２．５ｇ）を含むか又は含まない経口負荷の３０分後のオスのｄｄｙマウスの血清インスリン濃度
各値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３−４）を表す。
＊Ｐ＜０．０５  ＊＊Ｐ＜０．０１
【０２５７】
実施例１４：化合物Ｇ２のインビボ活性−ｄｄｙマウスにおける血中グルコース濃度の制御
方法
７週齢のｄｄｙマウス（体重３０〜３１ｇ）を４つのグループ（グループ１〜４）に分けた。各グループにはそれぞれ５頭のマウスがいた。この試験のためにすべての試験マウスを１６時間絶食させた。
【０２５８】
この試験の目的は、Ｇ２（ここにおいてＢＲ１としてコードされる）が食後の高血糖を抑制できるかどうかを示すことであった。従って、Ｂａｙｅｒのグルコシダーゼ阻害剤グルコバイに用いられているように、負荷を与える糖としてマルトースを選択した。マルトース（２．５ｇ／ｋｇ）又はスクロース（２．５ｇ／ｋｇ）又はデンプン（１．０ｇ／ｋｇ）のいずれかを使用できるが、マルトースが最も一般的である。
【０２５９】
Ｇ２が血液グルコース濃度を抑制できるのであれば、仮説として以下の可能性がある。
１）マルターゼの阻害（マルトースからグルコースへの変換の阻害）
２）グルコース輸送の阻害
３）インスリン放出の促進
４）グリコーゲンフォスフォリラーゼの阻害
５）他の活性
【０２６０】
従って、４つのグループを作製した（図４参照）。
【０２６１】
グループ１：マルトース負荷のみのコントロール（Ｇ２を用いない条件）
グループ２：マルトース及びＧ２の経口投与（同時）
グループ３：Ｇ２の腹腔内投与、及び、マルトースの経口投与（同時）
グループ４：マルトース負荷の３０分前にＧ２を経口投与（摂食の３０分前にグルコバイを摂取させた）
【０２６２】
結果
各グループにおいてＧ２が高血糖を抑制できることが示された。グループ２（経口投与）及びグループ３（腹腔内投与）のカーブはほとんど同じである。Ｇ２の抑制機構が「マルターゼの阻害」及び／又は「グルコース輸送体の阻害」であれば、腹腔内投与経路が高血糖を抑制することはないので、この結果は非常に重要である。従って、Ｇ２の作用部位は、胃腸管内ではなく、おそらく膵臓である。更に、この結果は、Ｇ２が血液中に非常に速く吸収されることを示した。
【０２６３】
血中グルコース濃度に対するＧ２（ＢＲ１）の効果については、図５を参照されたい。
Ａ）経口経路（経口投与）によって与えたＧ２を示す。
Ｂ）腹膜腔内注入（腹腔内投与）の３０分前に経口投与によって与えたＧ２を示す。
Ｃ）マルトース負荷を与える３０分前に経口投与によって与えたＧ２を示す。
【０２６４】
各値は、平均値±ＳＥＭを表す（ｎ＝５）。
＊＊は、有意差（ｐ＜０．０１）を表す。＊は、有意差（ｐ＜０．０５）を表す。
食塩水をロードしたグループと比較して。
【０２６５】
実施例１５：イミノ糖酸による哺乳動物β−グルクロニダーゼ及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの阻害
次の表は、商業的に入手可能な（Ｓｉｇｍａ）ウシβ−グルクロニダーゼ（肝臓）及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（腎臓）に対する、０．８ｍＭにおけるイミノ糖酸及びアミノ酸による相対的な％阻害を示す。強い阻害がみられた場合に、ＩＣ５０値を算出し、％阻害値の隣にＩＣ５０値をμＭとして示す。グルクロニダーゼ及びヘキソサミニダーゼの活性を抑制する能力は、イミノ糖酸以外には、このグループの多数の化合物においてみられないことがわかる。上述したようにｐ−ニトロフェニル基質を用いて分析を行った。
【０２６６】
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【０２６７】
実施例１６〜２１：イミノ糖酸の合成
一般的なアルキル化手順
イミノ糖（０．３１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）にハロゲン化アルキル（０．４６ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（０．６１ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を６０℃で１６時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、その残留物を、Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ８−４００とＰＯＨ又はＩｓｏｌｕｔｅ  ＳＣＸ−２などのＳＰＥカートリッジとの組合せを用いて、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【０２６８】
一般的なアルキル化手順によって以下の化合物を調製した。
【０２６９】
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【０２７０】
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【０２７１】
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【０２７２】
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【０２７３】
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【０２７４】
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【０２７５】
等価物
本発明の好ましい実施形態は、先の説明によって詳細に説明されている。これらの実施において、当業者は、これらの説明を考慮して多数の修飾及び変形を思いつくと予想される。その修飾及び変形は、本明細書に添付した特許請求の範囲に包含されるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】図１（ａ）は、糖の除去後に９．２６分において主成分として式（Ｇ２）の化合物（トリメチルシリル誘導体）を示しているギムネマ水抽出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムの軌跡を示す。図１（ｂ）は、イミノ糖酸Ｇ２の特徴的な質量スペクトル（ｔｍｓ）を示す。図１（ｃ）は、ステビアレバウディアナの水抽出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムであり、糖の除去後に、いくつかのイミノ糖酸を示し、７．２９分（ＤＭＤＰ）に１つのイミノ糖を示している。
【図２】図２は、３０分後の血清インスリン量の測定値を示す。
【図３】図３は、血清インスリン量に対するＧ２（ＢＲ１）（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ）の効果を示す。
【図４】図４は、実施例１４において作製した４つのグループを示す。
【図５】図５は、血中グルコース濃度に対するＧ２（ＢＲ１）の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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