(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルから作製され、かつ、安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに結合することが可能である抗体であって、
（ｉ）該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、α−シヌクレインの非安定化プロトフィブリルよりも非可溶性凝集形態への形成率が低く、
（ｉｉ）該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、マロンジアルデヒド、４−オキソ−２−ノネナールおよびアクロレイン、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択されるアルデヒドで修飾されたα−シヌクレインを含み、かつ、
（ｉｉｉ）該抗体が、α−シヌクレインモノマーに対する結合強度に比較して、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する結合強度が高い、
抗体。
【請求項２】
前記α−シヌクレインが野生型α−シヌクレイン（配列番号１）を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記α−シヌクレインが、Ａ３０Ｐ（配列番号２）、Ｅ４６Ｋ（配列番号３）およびＡ５３Ｔ（配列番号４）、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される突然変異体を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記α−シヌクレインが、１またはそれ以上のＳｅｒおよび／またはＡｌａアミノ酸が部位指定突然変異誘発によってＣｙｓで置換された野生型α−シヌクレインを含む請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、α−シヌクレインプロトフィブリルへのモノクローナル抗体である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ヒト、ヒト化である、またはヒトにおける抗原性を低減するように修飾されている請求項１乃至５のいずれか１項に記記載の抗体。
【請求項７】
前記抗原性の低減が、抗体のＴ細胞エピトープを修飾するまたは排除することによって為された請求項６記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ＩｇＧクラスである請求項１乃至７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブクラスである請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、低い補体活性を有する請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
前記の低い補体活性が、重鎖のアミノ酸配列の２９７位または３３１位で抗体のＦｃ部分を突然変異させることによって達成された請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
前記の低い補体活性が、抗体を酵素的に脱グリコシル化することによって達成された請求項１０記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がＦａｂフラグメントである請求項５記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２およびダイアボディから選択される請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、ポリクローナルである請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、一本鎖抗体である請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
前記一本鎖抗体が、ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｓｃＦａｂから選択される請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、Ｆａｂフラグメントである請求項１５記載の抗体。
【請求項１９】
前記Ｆａｂフラグメントが、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２およびダイアボディから選択される請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
α−シヌクレインモノマーに対する抗体のＩＣ５０結合強度と可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する抗体のＩＣ５０結合強度との比は、１：５０〜１：２０００の範囲にある請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、不溶性α−シヌクレインフィブリルに対する結合強度に比較して可溶性α−シヌクレインオリゴマーに対する結合強度が高い請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
不溶性α−シヌクレインフィブリルに対する抗体のＩＣ５０結合強度と可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する抗体のＩＣ５０結合強度との比は、１：２〜１：２０００の範囲にある請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
抗体を作製する方法であって、該抗体またはそのフラグメントが可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに結合し、該方法が、抗原を非ヒト動物に投与すること、および抗原に対して形成された抗体を収集することを含み、該抗原が、α−シヌクレインの非安定化プロトフィブリルよりも非可溶性凝集形態への形成率が低い、安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルを含み、該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、マロンジアルデヒド、４−オキソ−２−ノネナールおよびアクロレイン、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択されるアルデヒドで修飾されたα−シヌクレインを含み、かつ、該抗体が、α−シヌクレインモノマーに対する結合強度に比較して、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する結合強度が高い
方法。
【請求項２４】
請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の抗体、ならびにヒトまたは動物での使用のために医薬的に許容される抗菌剤、アジュバント、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される１またはそれ以上の賦形剤を含有する抗体組成物。
【請求項２５】
前記組成物が凍結乾燥されている請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、凍結乾燥の間および／または凍結乾燥後の抗体の安定性を高めるために賦形剤と共に凍結乾燥されている請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
前記賦形剤が、マンニトールおよび／またはトレハロースである請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の抗体を、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルを含有するまたは含有することが疑われる生物学的試料に添加すること、および該抗体と可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルとの間で形成された任意の複合体を検出し、その濃度を測定することを含む、インビトロでα−シヌクレインプロトフィブリルを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体およびワクチン、ならびにα−シヌクレイン関連疾患、すなわちレビー小体および／またはレビー神経突起の形態で凝集した不溶性α−シヌクレインの蓄積が脳内に存在する、α−シヌクレイン病についての治療および診断方法におけるそれらの使用に関する。そのような疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、レビー小体型のアルツハイマー病、多系統委縮症およびα−シヌクレイン病変を有する他の神経変性疾患などの神経変性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０００２】
より具体的には、本発明は、α−シヌクレインの非安定化オリゴマーよりも非可溶性凝集形態への形成率が低い、単離された安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーを含有するワクチンに関する。安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーは、例えば、プロトフィブリルと称される大型オリゴマーの形態であり得る。本発明はまた、可溶性α−シヌクレインに結合する抗体に関する。
【０００３】
本発明はまた、インビトロまたはインビボでα−シヌクレインを検出する方法、ならびにパーキンソン病、レビー小体型認知症、レビー小体型のアルツハイマー病および多系統委縮症などの、しかしこれらに限定されないα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させる、α−シヌクレイン関連疾患を治療するまたは予防するための方法を対象とする。能動免疫および受動免疫の両方法が開示される。
【背景技術】
【０００４】
パーキンソン病（ＰＤ）およびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）は、α−シヌクレイン脳病変を有する神経変性疾患の２つの最も一般的な例である。
【０００５】
ＰＤは最も一般的な運動障害であり、硬直、運動低下、振せんおよび姿勢保持障害によって特徴づけられる。世界中でおよそ４百万から６百万人がＰＤに罹患していると考えられる。
【０００６】
ＤＬＢはすべての認知症の５〜１５％を占める。健忘症およびしばしば変動する他の認知症症状に加えて、ＤＬＢ患者は、典型的には転倒再発および幻視を経験する。
【０００７】
α−シヌクレインの神経細胞内蓄積は、円形の１０〜２０μｍの大型好酸性ヒアリン封入体であるレビー小体、または細長い糸状のジストロフィ軸索および樹状突起であるレビー神経突起の形成を生じさせる。ＰＤの脳では、レビー小体およびレビー神経突起の沈着は、黒質と線条体を連絡する神経細胞に限定される。これらの細胞は運動と姿勢制御機能の遂行のために極めて重要であり、ＰＤ症状の特質を説明する。ＤＬＢの脳では、レビー小体とレビー神経突起の広範囲な沈着が中脳および皮質領域の両方で認められる。
【０００８】
α−シヌクレインは、主として神経細胞内で認められるタンパク質である。神経細胞内で、α−シヌクレインは主にシナプス前部に位置し、それ故、シナプス活動の調節に関与すると推測されてきた。α−シヌクレインの３つの主要アイソフォームが同定されており、そのうちで最も長く、最も一般的な形態は１４０アミノ酸を含む。
【０００９】
α−シヌクレインに加えて、レビー小体は広範囲にわたる分子から成り、その１つは、α，β−不飽和ヒドロキシアルケナールである、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）である（Ｑｉｎら、２００７）。ＨＮＥはα−シヌクレインを修飾することができ、それによってα−シヌクレインのオリゴマー化を促進し得ることがインビトロで示された。特に、ＨＮＥは、プロトフィブリル、すなわち可溶性の大型オリゴマー形態のα−シヌクレインの形成を増大させ、安定化することが示された（Ｑｉｎら、２００７）。同様に、α，β−不飽和アルケナールである４−オキソ−２−ノネナール（ＯＮＥ）も、α−シヌクレインを修飾し、それによってα−シヌクレインのオリゴマー化を誘導することが示された（Ｎａｓｓｔｒｏｍら、２００９）。
【００１０】
ＨＮＥはシステイン、ヒスチジンおよびリシンの側鎖と反応して修飾し、一方ＯＮＥはシステイン、ヒスチジン、リシンおよびアルギニンの側鎖と反応し、修飾する。ＨＮＥおよびＯＮＥはどちらも、これらの側鎖の構造と物理的性質を実質的に変化させる。従って、ＨＮＥおよびＯＮＥは、Ｃ−３炭素またはアルデヒド基と、またはそれらの組合せと反応し得る。それ故、ＨＮＥは、分子間または分子内でタンパク質を共有結合的に修飾することができる。
【００１１】
酸化ストレスは、誤って折りたたまれたα−シヌクレインの病的蓄積を特徴とする多くの神経変性疾患に関係づけられてきた。様々な反応性酸素種が、細胞膜またはリポタンパク質などの脂質の過酸化を誘導することができ、同時に多不飽和脂肪酸からの高反応性アルデヒドの生成も生じさせ得る（Ｙｏｒｉｔａｋａら、１９９６）。
【００１２】
アルツハイマー病（ＡＤ）の徴候である脳病変、すなわちアミロイド斑および神経原線維変化は、ＤＬＢを有する症例の約５０％で認められる。並行する病変の存在は、２つの異なる疾患を意味するのかまたは各々それぞれの疾患の変形であるのかは不明である。時として、そのような同時病変を有する症例は、ＡＤのレビー小体型を有すると表される（Ｈａｎｓｅｎら、１９９０）。
【００１３】
ＰＤおよびＤＬＢのまれな優性遺伝形態は、α−シヌクレイン遺伝子の点突然変異または重複によって引き起こされ得る。病原性突然変異、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔ（Ｋｒｕｇｅｒら、１９９８）（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９８）ならびにこの遺伝子の重複（Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、２００４）は、家族性ＰＤを引き起こすことが記述されているが、もう１つのα−シヌクレイン突然変異、Ｅ４６Ｋ（Ｚａｒｒａｎｚら、２００４）ならびにα−シヌクレイン遺伝子の三重複（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、２００３）は、ＰＤまたはＤＬＢのいずれかを引き起こすことが報告された。
【００１４】
α−シヌクレイン突然変異の病的影響は部分的にしか理解されていない。しかし、インビトロデータは、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔ突然変異が凝集の割合を高めることを示した（Ｃｏｎｗａｙら、２０００）。広範囲にわたる異なる構成のα−シヌクレイン種が凝集過程で形成され、そのすべてが異なる毒性を有し得る。α−シヌクレイン病における神経病理学的変化を別にして、脳の罹患領域では一般にα−シヌクレインタンパク質のレベルが上昇する（Ｋｌｕｃｋｅｎら、２００６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
α−シヌクレイン病変を伴う神経変性疾患の危険性および／または初期段階を同定するための改善された診断ツールおよび方法が求められている。現在、より進行した症候性疾患段階が明らかになるまでは、臨床医による患者の診断を助ける生化学的方法は存在せず、その段階では脳への実質的な損傷が既に起こっている。新しい、初期段階での治療の可能性が出現すると共に、正確な診断アッセイの重要性がより大きくなりつつある。現在、ＰＤ患者に対しては対症療法（例えば脳内の活性ドーパミンの喪失を置き換えることによる）だけが使用可能である。ＤＬＢについては、使用できる治療の選択肢はさらに一層少ない。それでもなお、臨床医はしばしば、ＡＤのための標準的な治療、すなわちコリンエステラーゼ阻害剤によるＤＬＢ患者への有益な作用の可能性を評価しているが、実質的な改善は一般に認められない。α−シヌクレイン病に対する既存の治療法のいずれもが、それぞれの根底にある疾患過程を対象としていない。加えて、疾患の進行と治療効果を観測する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、α−シヌクレイン関連疾患、すなわちレビー小体および／またはレビー神経突起の形態で凝集した不溶性α−シヌクレインの蓄積が脳内に存在するα−シヌクレイン病のための治療および／または診断方法における使用のための抗体およびワクチンを提供することが本発明の目的である。そのような疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、レビー小体型のアルツハイマー病、多系統委縮症およびα−シヌクレイン病変を伴う他の神経変性疾患などの１またはそれ以上の神経変性疾患を含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明によれば、安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーから作製され、かつ、安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーに結合することが可能である抗体であって、該安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーが、α−シヌクレインの非安定化オリゴマーよりも非可溶性凝集形態への形成率が低い抗体が提供される。
本発明によれば、安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルから作製され、かつ、安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに結合することが可能である抗体であって、
（ｉ）該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、α−シヌクレインの非安定化プロトフィブリルよりも非可溶性凝集形態への形成率が低く、
（ｉｉ）該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、マロンジアルデヒド、４−オキソ−２−ノネナールおよびアクロレイン、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択されるアルデヒドで修飾されたα−シヌクレインを含み、かつ、
（ｉｉｉ）該抗体が、α−シヌクレインモノマーに対する結合強度に比較して、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する結合強度が高い、
抗体が提供される。
１つの実施形態では、本発明は、個体においてα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させるためまたはα−シヌクレイン関連疾患を治療するためのワクチンであって、α−シヌクレインの非安定化オリゴマーよりも非可溶性凝集形態への形成率が低い、単離された安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーの治療有効量を含有するワクチンを対象とする。もう１つの実施形態では、本発明は、本発明によるワクチンを個体に投与することを含む、個体においてα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させるためまたはα−シヌクレイン関連疾患を治療するための方法を対象とする。さらなる実施形態では、本発明は、可溶性α−シヌクレインに対する抗体を作製するための、本発明によるワクチンの使用を対象とする。
【００１８】
もう１つの実施形態では、本発明は、可溶性α−シヌクレインに結合する、個体においてα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させるためまたはα−シヌクレイン関連疾患を治療するための抗体を対象とする。もう１つの実施形態では、本発明は、本発明による抗体を個体に投与することを含む、個体においてα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させるためまたはα−シヌクレイン関連疾患を治療するための方法を対象とする。
【００１９】
もう１つの実施形態では、本発明は、個体においてα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させるためまたはα−シヌクレイン関連疾患を治療するための抗体を作製する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントが可溶性α−シヌクレインに結合する、前記方法を対象とする。前記方法は、抗原を非ヒト動物に投与すること、および抗原に対して形成された抗体を収集することを含み、前記抗原は、α−シヌクレインの非安定化オリゴマーよりも非可溶性凝集形態への形成率が低い、安定化された可溶性α−シヌクレインオリゴマーを含有する。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明は、それぞれ本発明による抗体またはワクチン、ならびにヒトおよび／または動物での使用のために医薬的に許容される抗菌剤、アジュバント、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される１またはそれ以上の賦形剤を含有する、抗体組成物およびワクチン組成物を対象とする。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明は検出方法を対象とする。１つの実施形態では、α−シヌクレインオリゴマーをインビトロで検出する方法は、本発明による抗体を、可溶性α−シヌクレインを含有するまたは含有することが疑われる生物学的試料に添加すること、および前記抗体と可溶性α−シヌクレインの間で形成された任意の複合体を検出し、その濃度を測定することを含む。もう１つの実施形態では、α−シヌクレインオリゴマーをインビボで検出する方法は、検出可能なマーカで標識されている、本発明による抗体を、可溶性α−シヌクレインを保持することが疑われる個体に投与すること、および前記マーカの検出によって抗体と可溶性α−シヌクレインの間で形成された任意の複合体の存在を検出することを含む。
【００２２】
本発明のワクチン、抗体および方法は、α−シヌクレイン関連疾患を対象とする診断および治療技術のために有益である。本発明のさらなる実施形態および態様は「詳細な説明」に示されており、本発明のさらなる利点はそれより明らかである。
【００２３】
図面を参照して本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、実施例１で述べる、ＴｈＴ（チオフラビンＴ）アッセイによって測定した野生型および突然変異型α−シヌクレインの凝集率の比較を示す。チオフラビンＴは、凝集形態のα−シヌクレイン、すなわちβシート構造に結合する試薬である。種々のα−シヌクレイン種は以下の凝集傾向を示す：Ｅ４６Ｋ＞Ａ３０Ｐ／Ａ５３Ｔ＞Ａ５３Ｔ＞  ｗｔ（野生型）＞Ａ３０Ｐ。最も速く凝集するα−シヌクレイン種は、従ってＥ４６Ｋであり、一方Ａ３０Ｐ突然変異型は、野生型α−シヌクレインよりもさらに一層緩やかな凝集速度を示す。
【００２５】
【図２Ａ】図２Ａは、２４時間および４１時間インキュベートしたα−シヌクレインＥ４６Ｋ製剤で処置したヒト胚腎（ＨＥＫ−２９３）細胞における生存率の低下を示す。約２４時間インキュベートしたα−シヌクレインＥ４６Ｋ製剤が最も高い毒性を示した。インキュベートしていない（ゼロ時間）α−シヌクレインをＨＥＫ２９３細胞に添加した場合、毒性作用を認めなかった。
【００２６】
【図２Ｂ】図２Ｂは、α−シヌクレインＥ４６Ｋ製剤が２４時間のインキュベーション後に中等度のＴｈＴシグナルを示した、すなわち線維化の程度が中等度であることを示す。これに対し、原線維形態のα−シヌクレインを含有し、高いＴｈＴシグナルを示す、４１時間インキュベートした試料は、ほとんど毒性作用を示さなかった。
【００２７】
【図３】図３は、ＯＮＥおよびＨＮＥで安定化した野生型α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーをヒト胚腎（ＨＥＫ−２９３）細胞に外因的に添加し、４８時間インキュベートして処置したヒト胚腎細胞における生存率の低下を示す。対照のパーセントとして、細胞生存率の有意の低下が、３μＭ  ＯＮＥ修飾α−シヌクレインで処置した細胞（ｐ＜０．００１）および３μＭ  ＨＮＥ修飾α−シヌクレインで処置した細胞（ｐ＜０．０００１）に関して検出された。データはビヒクル対照のパーセンテージとして表しており、３つの別々の実験についての平均値±ＳＥＭを示す。
【００２８】
【図４】図４は、ＨＮＥとα−シヌクレインの間で３０：１の化学量論を使用して３７℃で２０時間インキュベートしたＨＮＥ修飾α−シヌクレイン製剤のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。１９分で溶出する主要ピーク（Ｐ／Ｏ）は、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーに対応する。３７分で溶出する２番目のピーク（Ｍ）は、α−シヌクレインモノマーに対応する。
【００２９】
【図５】図５は、ＯＮＥとα−シヌクレインの間で３０：１の化学量論を使用して３７℃で２０時間インキュベートしたＯＮＥ修飾野生型α−シヌクレインのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。１つの主要ピーク（Ｐ／Ｏ）が１９分で認められ、これは可溶性α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーに対応する。３７分で溶出する付加的なピーク（Ｍ）が認められ、これはα−シヌクレインモノマーに対応する。
【００３０】
【図６】図６は、ＨＮＥで修飾した、単離された可溶性α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーの原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）の画像を示す。例えば、中空コアを有する直径約５０〜３００ｎｍのリング様構造を示すプロトフィブリル／オリゴマーが認められる。スケールバーは１００ｎｍを示す。
【００３１】
【図７】図７は、ＯＮＥで修飾した、単離された可溶性α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーのＡＦＭ分析を示す。典型的な試料では、無定形外観を有する直径約３０〜１５０ｎｍのプロトフィブリル／オリゴマーが認められる。スケールバーは１００ｎｍを示す。
【００３２】
【図８】図８は、ＨＮＥで修飾した野生型ヒトα−シヌクレインの可溶性プロトフィブリル／オリゴマー製剤で免疫したマウスからの血清（１／１００００〜１／２７００００希釈）に関するＥＬＩＳＡを示す。ＨＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーを認識する抗体が血清中で検出される。
【００３３】
【図９】図９は、可溶性のＯＮＥ修飾野生型α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーで免疫したマウスからの血清（１／１００００〜１／３０００００希釈）に関する間接ＥＬＩＳＡを示す。α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーを認識する抗体が血清中で検出される。
【００３４】
【図１０】図１０は、α−シヌクレインプロトフィブリル反応性モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡを示す。ＯＮＥで修飾した野生型α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーを抗原として使用した場合、ハイブリドーマ４０：２からの細胞培地の３つの希釈（１／９、１／２７および１／８２）すべてに関して陽性シグナルが得られた。バックグラウンドシグナルをすべてのＯＤ値から推定した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、レビー小体型のアルツハイマー病、多系統委縮症（ＭＳＡ）およびα−シヌクレイン病変を有する他の神経変性疾患の１またはそれ以上のようなα−シヌクレイン関連疾患を診断し、対抗する（前記疾患の発症の遅延化、治療および／または予防を含む）ための様々な方法における使用のための抗体（受動免疫）およびワクチン（能動免疫）を提供する。加えて、前記抗体およびワクチンは、アルツハイマー病、ダウン症候群、筋委縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、ハンチントン病、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群、クールー、致死性家族性不眠症、脳血管アミロイドーシス、緑内障、加齢性黄斑変性、精神症候群、統合失調症および／または統合失調症様障害などの他の神経変性疾患の発症の遅延化、治療および／または予防において使用し得る。抗体およびワクチンはまた、中でも特に、診断、観測または治療目的のための検出方法においても使用し得る。
【００３６】
α−シヌクレイン病における主要病変は細胞内であり、これは免疫治療アプローチに難しい課題を課す。しかし、能動的に誘導されたまたは受動的に投与された抗体の分画が神経細胞内でもそれらの標的抗原に結合し得る可能性がある。さらに、血漿および脳脊髄液の両方でのα−シヌクレインの同定（Ｅｌ−Ａｇｎａｆら、２００６）は、このタンパク質が排他的に神経細胞内で認められるわけではないことを明らかにする。理論に束縛されるものではないが、細胞外α−シヌクレインを低減することは、細胞内と細胞外のタンパク質プールの間の平衡をシフトさせ、同時に細胞内α−シヌクレインの低下を生じさせ得る。溶液中のα−シヌクレインが細胞膜内の脂質二重層に浸透し、それによってインターナライズされるかまたは細胞から外に輸送され得ることが証拠によって示唆されている。最後に、α−シヌクレインが細胞外間隙においても毒性作用を及ぼし得る可能性は排除できない。
【００３７】
本発明は、α−シヌクレインの安定化された可溶性オリゴマーの使用に基づく。ヒトα−シヌクレインモノマーの分子量は１４ｋＤａである。２またはそれ以上のα−シヌクレインモノマーが凝集して、広い範囲の分子量を有する可溶性α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーを形成し得る。支配的なオリゴマーは約２０００ｋＤの分子量を有し、プロトフィブリルと称される。しかし、これらの可溶性α−シヌクレイン形態は不安定であり、自然発生的に不溶性フィブリルへと重合する。本発明は、α−シヌクレインの可溶性オリゴマー形態を安定化し、安定化された可溶性オリゴマーを、好ましくは高度に精製された形態で、抗体およびワクチン開発のために単離する。本発明による安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーは、α−シヌクレインの非安定化オリゴマーよりも低い、非可溶性凝集形態、すなわちフィブリルへの形成率を示す。これらの形態は、高い毒性を示すため、特に興味深い。
【００３８】
本発明は、α−シヌクレインの誘導体などの、しかしそれらに限定されない、様々な形態のα−シヌクレインならびに選択されたα−シヌクレインペプチドフラグメントを使用する。１つの実施形態では、α−シヌクレインオリゴマーは、合成もしくは野生型ヒトα−シヌクレイン（配列番号１）またはその突然変異体から作製される。ヒトα−シヌクレインの突然変異体の例として、Ａ３０Ｐ（配列番号２）、Ｅ４６Ｋ（配列番号３）、Ａ５３Ｔ（配列番号４）突然変異のいずれか、または（Ａ３０Ｐ／Ｅ４６Ｋ（配列番号５）、Ａ３０Ｐ／Ａ５３Ｔ（配列番号６）、Ｅ４６Ｋ／Ａ５３Ｔ（配列番号７）またはＡ３０Ｐ／Ｅ４６Ｋ／Ａ５３Ｔ（配列番号８））を含む、それらの任意の組合せが使用できる。
【００３９】
配列番号１
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
【００４０】
配列番号２
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAP GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
【００４１】
配列番号３
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKKGVVH
GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
【００４２】
配列番号４
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
GVTTVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
【００４３】
配列番号５
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAP GKTKEGVLYV GSKTKKGVVH
GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
【００４４】
配列番号６
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAP GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
GVTTVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
【００４５】
配列番号７
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKKGVVH
GVTTVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
【００４６】
配列番号８
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAP GKTKEGVLYV GSKTKKGVVH
GVTTVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
【００４７】
加えて、野生型配列から逸脱した配列を有する他のα−シヌクレイン形態も利用できる。例えば、野生型α−シヌクレインを、例えば部位指定突然変異誘発によって、Ｓｅｒ／ＡｌａをＣｙｓで置換することによって修飾できる。そのような一例が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｇの米国特許出願公開第２００６／００１８９１８Ａ１号によって記述されている。
【００４８】
さらに、α−シヌクレインタンパク質のＮ末端、中央部分および／またはＣ末端からのフラグメントも、安定化α−シヌクレインオリゴマーを作製するために使用できる。加えて、１〜１０、１〜２５、１〜３５、１〜４５、１〜７９または１〜９５アミノ酸長を有する野生型または突然変異型α−シヌクレインのフラグメントが、オリゴマーを作製するために任意の組合せで使用できる。そのようなペプチドは、以下の位置番号のアミノ酸配列、１〜９５、６１〜１４０、９５〜１４０、９５〜１３０、９５〜１２０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０および１３０〜１４０に対応し得るが、これらに限定されない。フラグメントはまた、完全長α−シヌクレインと組み合わせることもできる。フラグメントはまた、オリゴマーを作製する前には分枝または環状であってもよい。
【００４９】
組換えタンパク質または合成ペプチドを使用することに加えて、α−シヌクレインは、α−シヌクレイン病の症例から死後剖検で採取されたヒト脳組織中に存在するレビー小体から直接取り出すことができる。可溶性（すなわちＴｒｉｓ緩衝液食塩水に可溶性の標本）および不溶性（すなわちＴｒｉｓ緩衝液食塩水に不溶性の標本）の両方のα−シヌクレイン分画を精製する。これらの試料標本は、そのままマウスに注射されるかまたは注射の前にクロマトグラフィ法によって分画される。生成された抗体は、本明細書でさらに詳細に述べるように受動ワクチン接種スキームにおいてまたは診断的免疫検定法において患者の治療のために使用される。
【００５０】
あるいは、α−シヌクレインは、レビー小体を視覚化して標的する、免疫組織化学とレーザー捕捉顕微鏡検査の組合せによって単離することができる。例えば、レビー小体含有神経細胞を、レーザー捕捉顕微鏡検査と非変性ゲル系の併用によってα−シヌクレインを含む死後脳組織から入手する。この適用のために、α−シヌクレイン種をポリアクリルアミドゲルから抽出する（実施例３参照）。より具体的には、クロマトグラフィ法および非変性ゲル系を使用して、捕捉した組織材料からα−シヌクレインを精製し、モノクローナル抗体の産生のためにマウスに注入する抗原標本として使用する。このアプローチにより、マウスにおける非常に多様な免疫原性応答が得られ、多くの異なる抗原親和性および特異性を有する抗体が生成される。後者の方法を用いた場合の多様な応答にもかかわらず、このアプローチは、合成α−シヌクレインに対して標的される抗体では標的されない可能性が高い、パーキンソン患者の脳内に存在するα−シヌクレインオリゴマー高次構造（レビー小体）を標的する場合に有利であると考えられる。これらのマウスは、α−シヌクレインオリゴマー特異的モノクローナル抗体を得るために使用できる。
【００５１】
さらに、マウスの免疫およびモノクローナル抗体開発のために使用されるα−シヌクレインはまた、健常個体またはα−シヌクレイン病を有する患者からの生体組織または、血液、脳脊髄液、尿もしくは唾液などの生体液からも単離することができる。
【００５２】
可溶性オリゴマー形態のα−シヌクレインの安定化は、例えば構造修飾などの、様々な方法で達成され得る。１つの実施形態では、構造修飾は安定化剤に結合することによって達成される。結合は架橋の形態であり得る。安定化剤は、非可溶性フィブリル高次構造へのさらなる凝集を防止するように可溶性オリゴマー形態を安定化する。特定の実施形態では、可溶性オリゴマーはプロトフィブリルであり、より特定の実施形態では、プロトフィブリルは約２０００ｋＤまたはそれ以上の分子量を有する。
【００５３】
特定の実施形態では、安定化剤は疎水性有機物質である。様々な実施形態において、疎水性有機物質は、飽和、不飽和もしくは多不飽和脂肪酸、またはそれらの誘導体、またはそれらの任意の組合せ、すなわちそれらの任意の２またはそれ以上の組合せを含む。さらなる実施形態では、疎水性有機物質は反応性アルデヒドを含む。アルデヒドは、例えば、α，β−不飽和アルデヒドなどのアルケナールであり得る。適切な反応性アルデヒドは、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、４−オキソ−２−ノネナール（ＯＮＥ）、マロンジアルデヒドおよびアクロレインを含むが、これらに限定されない。アルデヒドはまた、アルデヒド基を連結する２〜２５個の炭素原子の一不飽和または多不飽和炭素鎖を有するジアルデヒドであり得る。疎水性有機物質は、非可溶性フィブリル構造へのさらなる凝集を防止するように可溶性オリゴマー構造を安定化する。
【００５４】
さらなる実施形態では、α−シヌクレインは、非イオン性および両性イオン性界面活性剤などの、しかしこれらに限定されない疎水性界面活性剤によって修飾され得る。そのような界面活性剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ−８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）およびＢｒｉｊ界面活性剤（脂肪族アルコールのポリオキシエチレンエーテル）などの非イオン性界面活性剤、ならびにＣＨＡＰＳ（３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）などの両性イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
他の適切な安定化剤は胆汁酸誘導体を含み、その例としては、コール酸塩、デオキシコール酸塩およびタウロコール酸塩、ならびにそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
安定化剤はまた、天然の生物学的分子の群からも選択でき、その例としては、トリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、コレステロール、コレステロールエステル、長鎖（例えば約６〜３０個の炭素原子を含む）アルコールおよび前記物質の任意の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
安定化はまた、酒石酸ジスクシンイミジル、スベリイミド酸ビススルホスクシンイミジル、３，３−ジチオビス−スルホスクシンイミジルプロピオネートおよびそれらの任意の組合せなどの、しかしこれらに限定されないタンパク質架橋剤を使用して達成され得る。
【００５８】
もう１つの実施形態では、安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーは、１−α−ヒドロキシ−セコステロールを安定化剤として含有する。
【００５９】
安定化剤は、安定化された可溶性オリゴマーを形成するために、架橋による場合を含めて、α−シヌクレインのモノマーおよび／またはオリゴマーまたはそれらの組合せに結合され得る。例えば、ＨＮＥおよび／またはＯＮＥなどの反応性アルデヒドは、アルデヒド基または二重結合またはその両方によってオリゴマーに結合し得る。後者は、その結果オリゴマーの架橋を生じさせる。ＨＮＥは、例えば、オリゴマーのヒスチジンおよびリシンに共有結合的に結合し得る。同様に、ＯＮＥはヒスチジンおよびリシンに共有結合的に結合し得る。アルデヒドがシッフ塩基を介してリシンに結合し得るか、またはヒスチジンが、不飽和炭素鎖内の二重結合の炭素原子への求核攻撃を介して結合し得る。安定化剤、例えばＨＮＥおよびＯＮＥなどの反応性アルデヒドとα−シヌクレインの間の化学量論は、２：１〜５０：１またはそれ以上の広い範囲内で変動し得る。特定の実施形態では、２０：１を上回る、例えば２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１およびさらに一層高いＨＮＥ修飾値（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅｓ）は、望ましい高プロトフィブリル形成を有する生成物を提供する。加えて、ＯＮＥに関しては、なお一層低い比率が使用でき、例えば５：１から、例えば１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１およびさらに高い比率が使用できる。
【００６０】
特に明記しない場合は、上述した安定化剤はすべて、α−シヌクレインに結合することによってそれらの安定化作用を及ぼし、安定化反応は、実施例に示すように、例えばインキュベーションによって実施され得る。安定化剤はまた、所望に応じて２またはそれ以上の組合せでも使用され得る。
【００６１】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、安定化された可溶性α−シヌクレインオリゴマーは、β−アミロイド（Ａβ）、タウまたはホスホ−タウの１またはそれ以上を含み得る。これらのα−シヌクレインオリゴマーは、Ａβ４０および／またはＡβ４２から作られるβ−アミロイド（Ａβ）オリゴマー、例えばプロトフィブリルとα−シヌクレインオリゴマーを組み合わせることによって作製され得る。本発明のさらにもう１つの実施形態では、これらのα−シヌクレインオリゴマーは、β−アミロイドプロトフィブリルおよびタウおよび／またはホスホ−タウとα−シヌクレインオリゴマーを任意の組合せで組み合わせることによって作製され得る。もう１つの実施形態では、これらのα−シヌクレインオリゴマーは、α−シヌクレイン、Ａβ４０、Ａβ４２、タウおよび／またはホスホ−タウの個々のモノマーの任意の組合せを組み合わせること、任意の組合せでこれらのタンパク質をそれらのオリゴマー形態で組み合わせること、または任意のオリゴマーをモノマーと組み合わせることによって作製される。これらの混合物は、付加的な成分が、例えばレビー小体型のアルツハイマー病などの、しかしこれらに限定されない認知症を有する患者において認められ、それ故これらの疾患の抗体またはワクチン治療のために治療上重要なネオエピトープを提供するという点で有利である（Ｔｓｉｇｅｌｎｙら、２００８）。もう１つの利点は、付加的な成分がα−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーの安定性を高めることである。
【００６２】
１つの実施形態では、本発明は、個体においてα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させるためまたはα−シヌクレイン関連疾患を治療するためのワクチンを対象とする。本開示において、ワクチンという用語は、能動免疫のためにヒトまたは動物に投与するための生理的に許容される形態である組成物を指すために使用される。ワクチンは、α−シヌクレインの非安定化オリゴマーよりも非可溶性凝集形態への形成率が低い、単離された安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーの治療有効量を含有する。単離されたという用語は、α−シヌクレインモノマーおよび未反応安定化剤を含む、調製培地、反応物等から分離された安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーを指す。ヒトへの投与を意図されるワクチンに関しては、α−シヌクレインはヒトα−シヌクレインである。動物での使用を意図されるワクチンに関しては、α−シヌクレインは、意図される受容者の動物種、すなわちイヌのためのワクチンについてはイヌα−シヌクレインである。特定の実施形態では、ワクチンは、約１０〜５００μｇ／用量の安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーを含有する。より特定の実施形態では、ワクチンは、約５０〜２５０μｇ／用量の安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーを含有する。
【００６３】
能動免疫のためのワクチンは、ワクチン技術分野において従来使用される１またはそれ以上の賦形剤を含有してもよく、その例としては、１またはそれ以上の抗菌剤、アジュバント、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されず、但し賦形剤は、意図されるワクチン受容者に依存して、ヒトおよび／または動物での使用のために医薬的に許容される。ワクチンはまた、例えば、凍結乾燥の間および／または凍結乾燥後のワクチンの安定性を高めるために単独でまたは１もしくはそれ以上の賦形剤と共に、凍結乾燥され得る。適切な賦形剤の具体的な例としては、マンニトールおよび／またはトレハロースを含むが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明はまた、可溶性α−シヌクレインモノマーおよび可溶性α−シヌクレインオリゴマーを含む、可溶性α−シヌクレインに結合する抗体を対象とする。安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーは、そのような抗体を作製するための抗原として使用でき、α−シヌクレインの毒性形態に対する特異的抗体の開発を最適化する。そのような方法では、抗原を非ヒト動物に投与し、該抗原に対して産生された抗体を収集する。治療効果を最大にするために、本発明による安定化α−シヌクレイン抗原に対して惹起される抗体は、好都合には、体内に存在する天然形態の可溶性α−シヌクレイン、特にプロトフィブリルを含む凝集可溶性形態に対して高い反応性を有するが、同時に可溶性α−シヌクレインモノマーに対しても高い反応性を有する。そのような抗体を選択する１つの方法は、最初に、修飾され、安定化されたα−シヌクレイン（特にオリゴマー、中でもプロトフィブリル）に良好に結合する抗体をスクリーニングし、その後、これらの抗体の中で野生型α−シヌクレインに良好に結合する抗体をスクリーニングすることである。
【００６５】
生じる抗体は、可溶性α−シヌクレイン、特にα−シヌクレインがフィブリルに凝集し得る前の可溶性α−シヌクレインに結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはその活性フラグメントであり得る。特定の実施形態では、安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマー抗原は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはその活性フラグメントを作製するおよび／または発生させるために、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイおよび細菌ディスプレイなどの方法において使用し得る。より具体的には、モノクローナルα−シヌクレイン抗体の生成のために、ハイブリドーマ技術および／またはファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイまたは細菌ディスプレイなどの従来の手法を使用し得る。そのような抗体は、マウス、ハムスターまたはラットなどのげっ歯動物において作製され得る。ひとたび生成されれば、クローンを単離し、それらのそれぞれの抗原特異性に関してスクリーニングする。スクリーニングのために、２つの原則が使用される。第一に、抗体を精製α−シヌクレインモノマー、プロトフィブリル／オリゴマーおよびフィブリルに対してプローブする。α−シヌクレインのこれらの異なる高次構造形態は、安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマー、例えばＨＮＥ修飾および／またはＯＮＥ修飾α−シヌクレインをインキュベートし、その後ＨＰＬＣによってまたは遠心ろ過装置を使用して分画することによって作製され得る。フィブリルは、インキュベーション混合物を５，０００×ｇ以上で遠心分離することによって単離し得る（実施例１参照）。スクリーニングは、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によってまたは同様の方法によって実施し得る。第二に、抗体を、α−シヌクレイントランスジェニック動物からの組織切片および／またはレビー小体およびレビー神経突起を含有する病的ヒト脳組織切片に関して評価する。
【００６６】
付加的な実施形態では、抗体は、修飾され、安定化されたα−シヌクレイン、およびモノマーまたは凝集可溶性α−シヌクレインの突然変異型または野生型形態の非修飾α−シヌクレインの両方、またはその任意の組合せと反応する。
【００６７】
１つの実施形態では、本発明による抗体は、特にα−シヌクレインモノマーおよび不溶性フィブリルへの結合強度と比較した場合、可溶性α−シヌクレインオリゴマーへのより高い結合強度を有し、より特定の実施形態では、α−シヌクレインプロトフィブリルへのより高い結合強度を有する。より特定の実施形態では、α−シヌクレインモノマーと比較したα−シヌクレインプロトフィブリルに対する結合強度（ＩＣ５０）は、例えば約１：５０〜２０００の範囲内である。もう１つの特定の実施形態では、α−シヌクレインフィブリルと比較したα−シヌクレインプロトフィブリルに対する結合強度（ＩＣ５０）は、例えば約１：２〜２０００の範囲内である。
【００６８】
抗体は、ヒト、ヒト化であり得るか、またはヒト患者における抗原性を低減するように修飾され得る。抗原性の低減は、例えば抗体のＴ細胞エピトープを修飾するまたは排除することによって為され得る。１つの実施形態では、抗体は、ＩｇＧクラスから、またはより好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブクラス（ヒト抗体）から選択される。
【００６９】
付加的な実施形態では、抗体はまた、低い補体活性および／または変化したＦｃ受容体結合特性を有し得る。これは、例えば、重鎖（ヒト）のアミノ酸配列の２９７位、３２２位または３３１位で抗体のＦｃ部分を突然変異させる、または、例えばマウスＩｇＧにおいて対応するアミノ酸配列を突然変異させることによって達成され得る。低い補体活性はまた、当技術分野において公知の技術に従って、抗体を酵素的に脱グリコシル化することによってまたは他の手段によっても達成され得る。抗体の変化したＦｃ受容体結合特性は、糖タンパク質に結合したオリゴ糖構造を変化させることによって達成され得る（Jeffries, Nature, 2009, 8:226-234）。抗体は、例えば血液脳関門の通過および神経細胞取込みを改善するために、例えばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２およびダイアボディから選択されるＦａｂフラグメント、または、例えばｓｃＦｖ−ＦｃおよびｓｃＦａｂから選択される一本鎖抗体であり得る。それ故、本明細書で使用される抗体が、抗原によって惹起される完全長タンパク質またはその活性フラグメントを指すことは明白である。
【００７０】
より特定の実施形態では、α−シヌクレインオリゴマー抗原をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分画し、単離する。分画を、細胞培養モデルにおいてそれらのそれぞれの毒性に関して評価し、最も強い毒性を有する抗原分画を抗体作製のためまたは能動免疫のための抗原として選択する。試料標本を、毒性を評価するために直接使用することもでき、最も顕著な毒性を示す試料を、抗体選択および／もしくは作製のための抗原としてまたは能動免疫のための抗原として好都合に使用し得る。
【００７１】
α−シヌクレイン抗体は、本発明による安定化可溶性α−シヌクレインを、直接患者に対して投与すること（能動免疫）、またはα−シヌクレイン病変を有する神経変性疾患、例えば少し例を挙げるとＰＤおよびＤＬＢを治療するための受動免疫プロトコールにおいて適用される、抗原に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を惹起するために、げっ歯動物、例えばマウスもしくはウサギを免疫することによって投与することに対する応答として形成される。受動免疫の場合、抗体は、ヒト患者に投与される前にヒト化される。
【００７２】
凝集形態のα−シヌクレインの毒性は、様々な細胞毒性アッセイによって測定され得る（図２〜３および実施例５参照）。簡単に述べると、ある細胞培養モデルは、ミトコンドリア機能不全の指標であるＭＴＴの評価に基づく。他の毒性アッセイ、例えば細胞死またはアポトーシスマーカを測定することも使用し得る。その例としては、アデニル酸キナーゼ分析、乳酸デヒドロゲナーゼ分析、アネキシンＶ染色、カスパーゼ活性、ＰＡＲＰ切断およびＤＮＡラダリングを含むが、これらに限定されない。
【００７３】
能動免疫プロトコール後、選択した安定化α−シヌクレイン抗原を投与して、著明な毒性を有するα−シヌクレイン種、特に可溶性プロトフィブリルおよび他のオリゴマーα−シヌクレインおよびα−シヌクレインモノマーに対する高次構造特異的抗体を生成する。受動免疫プロトコールに従って、そのようなα−シヌクレイン種に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、抗体の反復注射後にその作用を及ぼす。
【００７４】
選択的な実施形態では、可溶性α−シヌクレインに結合する抗体は、対照ヒト被験者またはα−シヌクレイン病を有する患者からの白血球に由来するヒト抗α−シヌクレインモノクローナル抗体であり得る。確立された技術に従って白血球からハイブリドーマを作製し、α−シヌクレインおよび安定化α−シヌクレイン（例えば可溶性オリゴマー）に結合するものに関してスクリーニングする。ヒト抗α−シヌクレインモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体ライブラリーを安定化α−シヌクレイン（例えば可溶性オリゴマー）への結合に関してスクリーニングすることによっても入手できる。ヒト対照被験者またはα−シヌクレイン病を有する患者からの血液中に存在する可溶性α−シヌクレインまたはα−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーに対する自己抗体も、使用のために単離し得る。自己抗体は、収率および経済性を改善するために、配列決定し、例えばＣＨＯ細胞における組換えＤＮＡ技術によって作製し得る。
【００７５】
特定の実施形態では、前述した抗体は、例えば投与に適する、組成物中で提供される。そのような組成物は、本明細書で述べる抗体および医薬組成物において従来使用される１またはそれ以上の賦形剤を含有し得る。抗体は治療有効量で含有される。特定の実施形態では、組成物は、意図される受容者の体重に対して約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、より具体的には約０．５〜２ｍｇ／ｋｇの量で抗体を含有する。
【００７６】
適切な賦形剤は、１またはそれ以上の抗菌剤、アジュバント、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤またはそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されず、但しそのような賦形剤は、意図されるワクチン受容者に依存して、ヒトおよび／または動物での使用のために医薬的に許容される。組成物は、例えば、凍結乾燥の間および／または凍結乾燥後の抗体の安定性を高めるために単独でまたは賦形剤と共に、凍結乾燥され得る。マンニトールおよび／またはトレハロースは、凍結乾燥に適する賦形剤の非限定的な例である。
【００７７】
本明細書で述べるワクチンおよび抗体は、個体においてα−シヌクレイン関連疾患を予防する、その発症を遅延させるまたは治療するための１またはそれ以上の方法において使用され得る。そのような方法は、本明細書で述べる抗体またはワクチンを個体に投与することを含む。個体は、例えば、α−シヌクレイン関連疾患を獲得していることが疑われるまたは獲得する危険性が高い被験者である。被験者は、以下の特徴のいずれかを示すことによってそのような疾患を有することが疑われ得る：疾患の初期症状、陽性脳イメージング結果、および／またはα−シヌクレインもしくはα−シヌクレインオリゴマーのレベル上昇（例えば本明細書で述べる検出方法において、例えば本明細書で述べる抗体を利用することによって測定される）。脳イメージング方法の例としては、本明細書で述べるモノクローナル抗体を使用することによるＤａＴｓｃａｎ（１２３Ｉ−イオフルパン）または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）イメージングを含むが、これらに限定されない。
【００７８】
α−シヌクレイン関連疾患を有する危険性があるまたは有することが疑われる被験者を同定することにより、本明細書で述べる本発明の治療によって、すなわちワクチン／抗原または抗体による能動または受動免疫を使用することによって、疾患のさらなる進展が防止される、または発症もしくは進行が遅延される。α−シヌクレイン関連疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、レビー小体型のアルツハイマー病、多系統委縮症（ＭＳＡ）または、アルツハイマー病、ダウン症候群、筋委縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、ハンチントン病、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群、クールー、致死性家族性不眠症、脳血管アミロイドーシス、緑内障、加齢性黄斑変性、精神症候群、統合失調症および／または統合失調症様障害などの他の神経変性疾患を含む、α−シヌクレイン病変を有する他の神経変性疾患であり得る。
【００７９】
本明細書で述べる本発明の抗体はまた、検出方法においても使用でき、その具体的な例としては、インビトロおよびインビボでα−シヌクレイン種のレベルの変化を検出するために抗体が使用される、診断的免疫検定法を含む。標的される形態のα−シヌクレインのレベルは、種々のα−シヌクレイン病または他の神経変性疾患を有する患者からの種々の組織および体液中で特異的に変化すると考えられ、それ故パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、レビー小体型のアルツハイマー病、多系統委縮症（ＭＳＡ）またはα−シヌクレイン病変を有する他の神経変性疾患についての初期生化学的マーカとして役立つ。
【００８０】
より具体的には、インビトロでα−シヌクレインオリゴマーを検出する方法は、本発明による抗体を、可溶性α−シヌクレインを含有するまたは含有することが疑われる生物学的試料に添加すること、および前記抗体と可溶性α−シヌクレインの間で形成された任意の複合体を検出し、その濃度を測定することを含む。生物学的試料は、例えば血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）または脳生検試料であり得る。もう１つの実施形態では、インビボでα−シヌクレインオリゴマーを検出する方法は、検出可能なマーカで標識されている、本発明による抗体を、脳内に健常でない可溶性α−シヌクレインオリゴマーレベルまたは種を保持することが疑われる個体に投与すること、およびマーカの検出によって抗体と可溶性α−シヌクレインの間で形成された任意の複合体の存在を検出することを含む。
【００８１】
オリゴマー特異的抗体の標識のために、当業者は、検出方法、例えば少し例を挙げると１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈまたは５８Ｇａなどの放射性リガンドの選択に依存して、様々な選択的技術を使用し得ることを認識する。特に、放射性標識オリゴマー特異的抗体によるＰＥＴは、診断、治療観測等のために極めて重要であると考えられる。従って、本発明は、診断および治療観測のための様々な方法における使用のための、従来の技術を使用して当業者によって容易に標識される抗体を提供する。
【００８２】
前述した方法および技術に従って、本明細書で述べる抗原および抗体を、細胞培養法および／またはα−シヌクレイン病変についてのトランスジェニック動物モデルにおいてそれらの潜在的治療能に関して評価し得る。α−シヌクレイン病についての２つの細胞培養モデルの例が使用できる。第一に、野生型または突然変異型のα−シヌクレインＤＮＡを神経芽細胞腫または神経膠腫細胞にトランスフェクトする。一過性および安定なトランスフェクションの両方を、レチン酸によって神経細胞様形態に分化される細胞で実施する。このようにして、細胞内α−シヌクレイン凝集体の形成を誘導することが可能である。第二に、α−シヌクレインＤＮＡベクターを担持するレンチウイルスおよび／またはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を神経芽細胞腫、神経膠腫の培養物および／または胚腎細胞培養物に形質導入する。ウイルスベクターによる形質導入は、一般により効率的であり、より多くの細胞にα−シヌクレイン凝集体を形成させるので、伝統的なトランスフェクション技術にとって好都合である。
【００８３】
生成されたα−シヌクレイン抗体はまた、ＰＤ、ＤＬＢまたは他のα−シヌクレイン病を診断するために、患者の試料中のα−シヌクレイン（特にプロトフィブリル／オリゴマー）レベルを測定するための免疫ベースのアッセイにおいても利用される。診断アッセイにおいて適用される検出方法は、主として、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）および／またはウエスタンブロット法などの免疫検定法に基づく。α−シヌクレイン病の初期徴候を有する患者またはこれらの疾患を発症する危険性が高い個体からの広い範囲の組織を、それらのα−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーのレベル、または高次構造が変化した可溶性α−シヌクレインの他の形態のレベルに関して検討する。そのような組織は、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）および脳生検試料を含むが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明の様々な態様を以下の実施例において説明する。
【実施例】
【００８５】
［実施例１］野生型および突然変異型α−シヌクレインの凝集動態
種々のα−シヌクレイン突然変異の影響をインビトロで検討する。野生型α−シヌクレインに加えて、以下の突然変異体：Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ／Ａ５３Ｔ、Ａ３０Ｐ／Ｅ４６Ｋ、Ｅ４６Ｋ／Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ／Ｅ４６Ｋ／Ａ５３Ｔを試験する。ＩＭＰＡＣＴ〔親和性キチン結合タグによるインテイン媒介精製（Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag）、New England Biolabs社、Ipswich、マサチューセッツ州、米国）〕システムを製造者の指示に従って使用することにより、組換えα−シヌクレインを発現させる。すべての組換えタンパク質を、０．０５Ｍ〜０．３Ｍの濃度範囲のＮａＣｌを含むまたは含まない、１０ｍＭ〜５０ｍＭにわたる濃度のＴｒｉｓ緩衝液またはリン酸緩衝液に溶解する。すべての組換えα−シヌクレインタンパク質を使用時まで−８０℃で保存する。
【００８６】
さらなる試験のために、組換えタンパク質を、０．０５Ｍ〜０．３Ｍの濃度のＮａＣｌを含むまたは含まない、３〜６のｐＨ範囲内の酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム緩衝液に溶解する。初期タンパク質濃度は３５μＭ〜７５０μＭにわたり、各々の実験においてすべてのタイプのα−シヌクレイン種に関して同様である。一部の実験では、チオフラビンＴ（５〜２０μＭ）を、１０μＭの最終α−シヌクレイン濃度で初期反応混合物に添加する。
【００８７】
凝集動態を試験する場合、α−シヌクレイン試料を平底または丸底ポリプロピレン９６穴プレート（Greiner Bio-One社、Frickenhausen、ドイツ）または平底非結合ポリスチレン９６穴プレート（Greiner Bio-One社、Frickenhausen、ドイツ）に保持し、撹拌しながらまたは撹拌せずに４℃〜６５℃でインキュベートする。同じ実験において、シリコンで被覆していないまたは被覆した、ポリプロピレンマイクロチューブ（５００〜２０００μｌ）を、撹拌しながらまたは撹拌せずに４℃〜６５℃でインキュベートする。撹拌を用いる場合の試験については、ポリプロピレン９６穴プレートまたは水平に置いたマイクロチューブ（５００〜２０００μｌ）を、３００ｒｐｍ〜９００ｒｐｍにわたる速度でＬａｂｎｅｔ  Ｐ４軌道振とう器（Labnet社、Edison、ニュージャージー州、米国）またはＴｉｔｒａｍａｘ  １０１（Heidolph Instruments GMBH & Co. KG社、Schwabach、ドイツ）でインキュベートする。すべての凝集試験において、各穴につき１００〜３００μｌの最終容量を使用する。マイクロチューブを使用する凝集実験では、最終容量は１００〜２０００μｌの範囲である。ＴｈＴ測定のために、ポリスチレンまたはポリプロピレン９６穴プレートを、４４５ｎｍの励起フィルタと４８５ｎｍの発光フィルタを備えたＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ２（PerkinElmer社、Waltham、マサチューセッツ州、米国）で読み取る。これらの突然変異の一部を特徴とするα−シヌクレインからの結果を図１に示す。
【００８８】
［実施例２］α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーの合成
α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマー抗原（すなわちプロトフィブリルおよび他のオリゴマーを含む抗原）を作製するため、前述したように、それぞれの野生型、突然変異型または断片化α−シヌクレインを３５〜７５０μＭの濃度で使用する。α−シヌクレインがＨＮＥおよび／またはＯＮＥ（Cayman Chemical社、Ann Arbor、ミシガン州、米国）に結合している試料では、これらの化合物を０．０１〜６５ｍＭの濃度で使用する。典型的な実験では、ＨＮＥおよび／またはＯＮＥとα−シヌクレインのモル比は、１：１〜１００：１の範囲にわたるが、それぞれの化合物の割合はこの化学量論に限定されない。一部の実験では、ＨＮＥ修飾および／またはＯＮＥ修飾試料を還元するために水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を０．１〜１００ｍＭの濃度で使用する。一部の場合には、α−シヌクレインアミノ酸は、ＨＮＥ修飾の間に、ＨＮＥと結合する不安定で可逆性のシッフ塩基を形成するアミノ酸（リシンなど）を含み得る。また別の場合には、α−シヌクレインアミノ酸は、ＯＮＥ修飾の間に、ＯＮＥと結合する不安定で可逆性のシッフ塩基を形成するアミノ酸（リシンなど）を含み得る。水素化ホウ素ナトリウム還元はシッフ塩基結合を安定化する。試料を、撹拌しながらまたは撹拌せずに３７℃で３０分間から３０日間インキュベートする。試料の分子組成を確認するため、いくつかの方法を利用する。非修飾α−シヌクレインまたはＨＮＥ修飾および／もしくはＯＮＥ修飾α−シヌクレインまたは他の反応性アルデヒドで修飾されたα−シヌクレインを、任意の不溶性フィブリルを除去するために２１℃にて１６，９００×ｇで５分間遠心分離する。その後、α−シヌクレインプロトフィブリルオリゴマーおよびモノマーを単離するために２１４ｎｍ〜２８０ｎｍのＵＶ検出を伴うＳＥＣ−ＨＰＬＣシステムを用いて上清を分画する（以下で詳細に述べる）。もう１つの実験では、５〜１０００ｋＤａの分子量カットオフ値を有する遠心ろ過装置を使用してα−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーおよびモノマーを分離する。典型的実験では、試料であるＨＮＥおよび／またはＯＮＥ修飾α−シヌクレイン５００μｌを、１００ｋＤａのカットオフ値を有するＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過装置（Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州）またはＶｉｖａｓｐｉｎ５００遠心分離装置（Sartorius社、Goettingen、ドイツ）のいずれかを用いて遠心する。試料を１０００〜１５０００×ｇにわたる速度で５〜３０分間遠心して、保持液を収集し、この保持液はα−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーの大部分を含有する。
【００８９】
ＨＮＥ修飾α−シヌクレイン
典型的な実験では、１４０μＭのヒト野生型α−シヌクレインを５．６ｍＭのＨＮＥと共に（すなわちＨＮＥとα−シヌクレインは４０：１の比率）３７℃で２０時間インキュベートし、その後過剰の非結合ＨＮＥを、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００遠心分離装置（Sartorius社、Goettingen、ドイツ）またはＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過装置（Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州）のいずれかを製造者の指示に従って使用して除去する。この初期ＨＮＥ修飾工程後、試料を直接分析する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の前に、すべての試料を２２℃にて１６，９００×ｇで５分間の遠心分離に供し、可溶性分画だけを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＰＣ３．２／３０カラムを使用したＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析する。α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーは１９分でピーク中に溶出し、一方α−シヌクレインモノマーは３７分で溶出する（図４）。
【００９０】
ＯＮＥ修飾α−シヌクレイン
典型的な実験では、ヒト野生型α−シヌクレイン（１４０μＭ）を４．２ｍＭのＯＮＥと共に（すなわちＯＮＥとα−シヌクレインは４０：１の比率）３７℃で２０時間インキュベートし、過剰の非結合ＯＮＥを、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００遠心分離装置（Sartorius社、Goettingen、ドイツ）またはＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過装置（Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州）を製造者の指示に従って使用して除去する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の前に、すべての試料を２２℃にて１６，９００×ｇで５分間の遠心分離に供し、可溶性分画だけを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＰＣ３．２／３０カラムを使用したＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析する。α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーは２０分で主要ピークとして溶出し、一方少量のα−シヌクレインモノマーは３７分で溶出する（図５）。
【００９１】
ＨＮＥおよびＯＮＥ修飾α−シヌクレイン
典型的な実験では、ヒト野生型α−シヌクレイン（１４０μＭ）を４．２ｍＭのＨＮＥおよび４．２ｍＭのＯＮＥと共に３７℃で２０時間インキュベートし、過剰の非結合ＨＮＥおよびＯＮＥを、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００遠心分離装置（Sartorius社、Goettingen、ドイツ）またはＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過装置（Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州）を製造者の指示に従って使用して除去する。すべての試料を２２℃にて１６，９００×ｇで５分間の遠心分離に供し、可溶性分画だけを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＰＣ３．２／３０カラムを使用したＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析する。
【００９２】
［実施例３］α−シヌクレイン種のＨＰＬＣ分離
α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマー、モノマーおよびフィブリルを単離するため、α−シヌクレインを前述したようにインキュベートする。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＰＣ３．２／３０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＰＣ３．２／３０またはＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＰＣ３．２／３０カラム（GE Healthcare社、Uppsala、スウェーデン）に連結した、ダイオードアレイ検出器Ｌ−７４５５型、Ｌ−７２００型オートサンプラーおよびＬ−７１００型ポンプを有するＭｅｒｃｋ  Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｄ−７０００  ＬａＣｈｒｏｍ  ＨＰＬＣシステムをクロマトグラフィ分離および純度分析のために使用する。試料を、２０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．０〜８．０）、０．１５ＭのＮａＣｌまたは２０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０〜８．０）、０．１５ＭのＮａＣｌのいずれかを使用して０．０２ｍｌ／分〜０．０８ｍｌ／分にわたる流速で溶出する。あるいは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １００／３００  ＧＬまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １００／３００  ＧＬに連結した、Ｌ−２１３０型ポンプ、ダイオードアレイ検出器Ｌ−７４５０型、Ｌ−２２００型オートサンプラーを有するＨｉｔａｃｈｉ  ＬａＣｈｒｏｍｅ  Ｅｌｉｔｅ  ＨＰＬＣシステムを使用する。試料を、２０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．０〜８．０）、０．１５ＭのＮａＣｌまたは２０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０〜８．０）、０．１５ＭのＮａＣｌのいずれかを使用して０．１ｍｌ／分〜０．５ｍｌ／分にわたる流速で溶出する。さらに、試料は、０．１５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ３〜６の酢酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出することができる。一部のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析では、α−シヌクレインプロトフィブリルオリゴマーのカラムマトリックスへの非特異的付着を低減するため、０．１％〜２．０％Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０を溶出緩衝液に添加する。２１４ｎｍ〜２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定することによってクロマトグラムを得る。２０〜１００μｌの分画をＡｄｖａｎｔｅｃ  ＳＦ−３１２０（Advantec社、柏、日本）フラクションコレクターで収集する。５０〜５００μｌの分画もＢｉｏ−Ｒａｄ  ２１２８型（Bio-Rad社、Hercules、カリフォルニア州）フラクションコレクターで収集できる。球状分子量標準品（Globular molecular weight standards）を使用して標準曲線を得、その標準曲線から様々なα−シヌクレイン種の保持時間を分子量に相関させる。
【００９３】
［実施例４］α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーの特徴づけ
単離したα−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーの形態をさらに特徴づけるため、低温電子顕微鏡検査および原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）を実施する。１〜１００μｌのタンパク質アリコートを１０μＭ〜３５０μＭにわたる最終濃度に希釈し、雲母表面またはＨＯＰＧ表面（Veeco instruments SAS社、Dourdan cedex、フランス）に添加して、標準プロトコールに従って分析する。ＨＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーのＡＦＭ分析は、直径５０〜３００ｎｍにわたるリング様構造およびより線状で丸い構造の両方の不均質な集団を明らかにする。例えば、５０〜３００ｎｍの直径を有するリング様構造の環状分子種が観測できる（図６）。ＯＮＥ修飾α−シヌクレインのＡＦＭ分析は、幅で約３０〜１５０ｎｍの直径を有する不定形構造を明らかにする（図７）。
【００９４】
［実施例５］α−シヌクレインの毒性評価
インビトロで凝集した非修飾α−シヌクレインならびにＨＮＥおよび／もしくはＯＮＥ修飾α−シヌクレインオリゴマーの作用を、一般に使用されるＭＴＴ（Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国）生存能アッセイを使用して細胞培養モデルで分析する。試験で使用される細胞型は、ＨＥＫ−２９３、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＨ４細胞を含む。試験で使用される細胞死およびアポトーシスマーカを測定する他のアッセイは、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（Lonza社、Basel、スイス）および乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ（Cayman Chemical社、Ann Arbor、ミシガン州、米国）を含む。野生型α−シヌクレインを以下の突然変異体：Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ａ３０Ｐ／Ｅ４６Ｋ、Ａ３０Ｐ／Ａ５３Ｔ、Ａ３０Ｐ／Ｅ４６ＫおよびＡ３０Ｐ／Ｅ４６Ｋ／Ａ５３Ｔと比較する。細胞を、１０％胎仔ウシ血清（Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国）を添加したＤＭＥＭ（Invitrogen社、La Jolla、カリフォルニア州、米国）中で増殖させる。１つのタイプの実験では、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベータに保持する。毒性アッセイを開始する前日、ＨＥＫ−２９３細胞を９６穴ポリスチレン被覆プレート（Sarstedt社、ノースカロライナ州、米国）に１００００細胞／穴の密度で接種する。次に、細胞培地を取り出し、３μＭ〜６μＭの範囲の最終濃度で新鮮馴化培地に希釈した凝集形態の非修飾α−シヌクレインで細胞を処理する。もうひと組の実験では、ＯＮＥおよび／またはＨＮＥ修飾α−シヌクレインオリゴマーを３μＭ〜６μＭの範囲の最終濃度で新鮮馴化培地に希釈する。４８時間のインキュベーション後、リン酸緩衝食塩水（Invitrogen社、La Jolla、カリフォルニア州、米国）に希釈したＭＴＴを３５μＭの最終濃度で細胞に添加する。４時間半のインキュベーション後、細胞を５０％ＤＭＦと２０％ＳＤＳの混合物（Sigma-Aldrich社、St Louis、ミズーリ州、米国）で処理し、この混合物をさらに２４時間インキュベートする。最後に、代謝された基質の測定のために、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  １９０分光光度計（Molecular Devices Corporation社、カリフォルニア州、米国）を使用し、５７０ｎｍで検出を実施する。
【００９５】
［実施例６］α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーで免疫したマウスにおけるα−シヌクレイン抗体
【００９６】
免疫／ポリクローナル抗体
免疫スキームにおいてＢａｌｂ／Ｃマウスを使用する。初回免疫のために、フロイント完全アジュバント５０μｌならびにＨＮＥ修飾および／またはＯＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマー製剤（最終濃度３５μＭ）５０μｌをマウスに注射する。初期免疫（例えば３〜６回）のために、フロイント不完全アジュバント５０μｌならびにＨＮＥ修飾および／またはＯＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマー製剤（最終濃度３５μＭ）５０μｌをマウスに注射する。その後の免疫（例えば１〜３回）のために、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４に希釈したＨＮＥ修飾および／またはＯＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマー製剤（最終濃度３５μＭ）５０μｌをマウスに注射する。ＨＮＥ修飾および／またはＯＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマー製剤（最終濃度７０μＭ）５０μｌを含有する２回のブースター注射を実施した後、マウスを犠死させる。
【００９７】
免疫マウスからの血液を、ＨＮＥ修飾（図８）およびＯＮＥ修飾（図９）α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーに対する反応性に関して分析する。ポリクローナル抗体応答の特異性をＥＬＩＳＡによって分析する。典型的な実験では、平底高結合９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートを、モノマーα−シヌクレイン（非修飾、またはＨＮＥおよび／もしくはＯＮＥまたは他のアルデヒドで修飾）、プロトフィブリル／オリゴマーα−シヌクレイン（非修飾、またはＨＮＥおよび／もしくはＯＮＥまたは他のアルデヒドで修飾）、またはフィブリルα−シヌクレインにより４００ｎｇ／穴の最終濃度で被覆する。穴を２％ＢＳＡでブロックし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄して、検討するポリクローナル抗体からの細胞培地上清（未希釈またはリン酸緩衝食塩水で１：１希釈）を一次抗体として穴に添加する。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国）を１／１０００の希釈で二次抗体として使用する。ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Sigma-Aldrich社、ミズーリ州、米国）を使用して免疫反応性を視覚化する。
【００９８】
血清中で、α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーを特異的に認識する抗体が検出される（図８および９）。
【００９９】
ハイブリドーマ／モノクローナル抗体
脾細胞を単離し、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で摩砕して、１２００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞に富むペレットを収集する。細胞をＰＢＳでさらに洗浄し、１２００×ｇで１０分間遠心分離する。細胞ペレットを、１％抗生物質を添加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen社、La Jolla、カリフォルニア州、米国）に再懸濁する。脾細胞をＤＭＥＭ中でＳｐ２／０細胞（マウス骨髄腫細胞株）と１：１の比率で混合する。細胞融合を促進するため、ポリエチレングリコール（Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国）１ｍｌを細胞混合物に添加し、ＤＭＥＭを添加して反応を停止させる。細胞を採集し、１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国）を添加した、同時に１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国）、１％（ｖ／ｖ）抗生物質（Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン（Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国）を含有する、ＤＭＥＭ中にペレットを再懸濁する。遠心分離後、最終細胞ペレットを再懸濁する。生成されたハイブリドーマによって産生される抗体を検討するため、ＥＬＩＳＡプロトコールを使用する。典型的な実験では、平底高結合９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートを、モノマーα−シヌクレイン（非修飾、またはＨＮＥおよび／もしくはＯＮＥまたは他のアルデヒドで修飾）、オリゴマー／プロトフィブリルα−シヌクレイン（非修飾、またはＨＮＥおよび／もしくはＯＮＥまたは他のアルデヒドで修飾）、またはフィブリルα−シヌクレインにより４００ｎｇ／穴の最終濃度で被覆する。穴を２％ＢＳＡでブロックし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄して、検討するハイブリドーマからの細胞培地上清（未希釈またはリン酸緩衝食塩水で１：１希釈）を一次抗体として穴に添加する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国）を１／５０００の希釈で二次抗体として使用する。強化Ｋ−Ｂｌｕｅ（登録商標）基質（ＴＭＢ）を使用して免疫反応性を視覚化し、２ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させる。１０％ウシ胎仔血清を添加した、同時に５％（ｖ／ｖ）ＢＭ馴化培地（Roche Diagnostics Scandinavia社、Bromma、スウェーデン）および２％（ｖ／ｖ）ＨＡＴ培地添加物（Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国）を含有するＤＭＥＭと細胞を９６穴細胞培養プレートに塗布する。
【０１００】
先に述べたようにＯＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマー製剤を注射することによってハイブリドーマを生成した。具体的には、ハイブリドーマ４０：２はＥＬＩＳＡプロトコールにおいてＯＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマー製剤を認識した。ハイブリドーマ４０：２からの細胞培地上清を１／９、１／２７および１／８２に希釈し、４００ｎｇ／穴のＯＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーで被覆した平底高結合９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートで前述のように分析した（図１０）。
【０１０１】
本明細書で述べる特定の実施例および実施形態は、本質的に単なる例示であり、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定することを意図しない。さらなる実施形態および実施例ならびにそれらの利点は、本明細書を考慮して当業者に明白であり、特許請求される本発明の範囲内である。
【０１０２】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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