(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を備えるステップと；
ｂ）（ａ）のキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞をキシロースを含む流加増殖培地中で連続的に増殖させ、それによってエタノールを含む培養物を生産させるステップと；
ｃ）（ｂ）の培養物にアンモニアと酢酸、または酢酸アンモニウムを添加して、少なくとも２４ｍＭの酢酸アンモニウム濃度をもたらし、それによってエタノールおよび酢酸アンモニウムを含むストレス培養物を生産させるステップと；
ｄ）（ｃ）のストレス培養物を連続的に増殖させ、それによって改善されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を生産させるステップと；
ｅ）（ｄ）の培養物から１つまたはそれ以上の細胞を単離するステップと
を含み、ここで少なくとも１つまたはそれ以上の単離された細胞が酢酸アンモニウムおよびエタノールの存在下において、（ａ）の備えたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞と比較して改善されたキシロース資化性を示し、改善された細胞が株として成長する、改善されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を生産する方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）中に酢酸アンモニウム濃度を少なくとも１回増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）の部分において、培地中のキシロースが少なくとも５０ｇ／ｌの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法によって得られる、単離された改善キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株。
【請求項５】
対応する非馴化株と比較して、少なくとも１２％さらに多いキシロースが利用される、請求項４に記載の単離された改善キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株。
【請求項６】
対応する非馴化株と比較して、少なくとも２０％さらに多いキシロースが利用される、請求項５に記載の単離された改善キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株。
【請求項７】
対応する非馴化株と比較して、少なくとも３０％さらに多いキシロースが利用される、請求項６に記載の単離された改善キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株。
【請求項８】
ストレス発酵馴化キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株であって、０.１ＯＤ  ６００ｎｍの細胞密度で開始した場合に、６０ｇ／Ｌキシロース、８０ｇ／Ｌグルコース、および９.５４ｇ／Ｌ酢酸を含有し、ｐＨが５.８に調節された培地で、少なくとも７０％のキシロースを利用し、前記馴化とは請求項１に記載の方法によって生産されることを指す、ストレス発酵馴化キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株。
【請求項９】
キシロース資化性が８５％である、請求項８に記載のストレス発酵馴化キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株。
【請求項１０】
（ｂ）においてエタノールが少なくとも１８ｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）請求項４〜９のいずれか一項に記載の単離された改善キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を備えるステップと；
ｂ）ａ）の株を適した発酵条件下で発酵培地と接触させ、エタノールを生産させるステップと、
ｃ）場合によりエタノールを単離するステップと
を含む、エタノールを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、２００８年１２月２２日に出願され、その全体を参照によって援用する米国仮特許出願第６１／１３９８５２号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
米国政府の権利についての記述
本発明は、エネルギー省によって与えられた契約番号第０４−０３−ＣＡ−７０２２４号、および米国エネルギー省と国立再生可能エネルギー研究所を管理運営するアライアンス・フォー・サステーナブル・エナジー社（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ，ＬＬＣ）との間の契約番号第ＤＥ−ＡＣ３６−０８ＧＯ２８３０８号の下、米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および発酵の分野に関する。さらに具体的には、ストレス発酵条件下においてキシロース利用が改善されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の開発について記載される。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの生産は化石燃料の代替えエネルギー源を提供し、したがって最近の研究の重要な分野である。キシロースは加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖であり、したがって豊富に入手できる低価格の炭素基質を提供し得るので、エタノールならびにその他の有用な生成物を産生する微生物は、炭素源としてキシロースを利用できることが望ましい。天然ではキシロースを利用しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）およびその他の細菌エタノロジェンは、以下をコードする遺伝子の導入によってキシロース利用について遺伝子改変してもよい。
１）キシロースからキシルロースへの転換を触媒するキシロースイソメラーゼ；
２）キシルロースをリン酸化してキシルロース５−ホスフェートを形成するキシルロキナーゼ；
３）トランスケトラーゼ；および
４）トランスアルドラーゼ。
【０００５】
キシロース代謝のためのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞の遺伝子操作における成功があった（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献１、非特許文献２）、ならびにザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）株の遺伝子操作（非特許文献３）。 しかし典型的に、改変された株はキシロース上ではグルコース上のように成長せず、エタノールも産生しない。特許文献５、および同一譲受人の特許文献６に記載されるように、キシロース利用のために改変された株はキシロース培地上での連続継代培養によって適応されており、キシロース利用の改善された株がもたらされる。これらの改善は、キシロースイソメラーゼ遺伝子の発現を制御するｐＧＡＰプロモーターの発現を改善する、改変された配列に対する選択の結果であることが示されている。これらの配列、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中の導入遺伝子の発現改善におけるそれらの使用法は、同一譲受人の特許文献７および８で開示される。
【０００６】
生体触媒によってエタノールを生産する発酵培地のための再生可能な糖原料として、セルロース加水分解産物を使用することが所望される。前処理および糖化によって生物由来資源から生成するセルロース加水分解産物は、典型的に生体触媒成長および生産に有害な物質を含有する。例えば酢酸はセルロース加水分解産物中に存在する一般的な生成物であり、加水分解産物に慣例的に見られる濃度で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に対して阻害性であることが示されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５５１４５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第５７１２１３３号明細書
【特許文献３】米国特許第６５６６１０７号明細書
【特許文献４】国際公開第９５／２８４７６号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願第２００３０１６２２７１号明細書
【特許文献６】同時係属米国特許公開第２００８／０２８６８７０−Ａ１号明細書
【特許文献７】同時係属米国特許公開第２００９／０２４６８７６−Ａ１号明細書
【特許文献８】同時係属米国特許公開第２００９／０２４６８４６−Ａ１号明細書
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９２年）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８：３５４〜３６１頁
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０〜２４３頁
【非特許文献３】ヤナセら（２００７年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２〜２５９９頁
【非特許文献４】Ｒａｎａｔｕｎｇａら（１９９７年）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６７：１８５〜１９８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生物由来資源糖化を通じて生成する不純な糖原料によって課せられるストレスの存在下で、キシロース利用が最大化されているザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株、およびその他の細菌エタノロジェンに対する必要性がなおも残されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ストレス発酵条件下におけるキシロース利用が改善されたキシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を得る方法、ならびにこの方法を使用して生成されるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供する。
【００１１】
したがって本発明は、
ａ）１つ以上のキシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を提供するステップと；
ｂ）（ａ）のキシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を少なくとも約５０ｇ／Ｌのキシロースを含んでなる補給増殖培地中で連続的に成長させ、それによってエタノールを含んでなる培養物が生成するステップと；
ｃ）（ｂ）の培養物に一定量のアンモニアと酢酸、または酢酸アンモニウムを添加し、それによってエタノールおよび酢酸アンモニウムを含んでなるストレス培養物が生成するステップと；
ｄ）（ｃ）のストレス培養物を連続的に成長させ、それによってキシロース利用が改善されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を生じさせるステップと；
ｅ）（ｄ）の培養物から１つ以上の細胞を単離するステップと
を含んでなり、少なくとも１つ以上の単離された細胞が酢酸アンモニウムおよびエタノールの存在下において、（ａ）で提供されるキシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞との比較で改善されたキシロース利用を示し、改善された細胞が株として成長する、改善されたキシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を生成する方法を提供する。
【００１２】
別の実施態様では本発明は、本明細書で開示される方法を使用して得られる、キシロース利用が改善されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞および株を提供する。
【００１３】
さらなる実施態様では、本発明は、対応する非適応株が、利用可能キシロースの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または最高約３０％までを利用する条件下で、６００ｎｍで０．１  ＯＤの細胞密度で開始した際に、例えばｐＨが５．８に調節された６０ｇ／Ｌのキシロース、８０ｇ／Ｌのグルコース、９．５４ｇ／Ｌのアセテートを含有する培地などの混合糖培地中の利用可能キシロースの少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を使用する、ストレス発酵適応キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株である。
【００１４】
さらなる実施態様では、本発明は、
ａ）改善されたストレス発酵適応キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供するステップと；
ｂ）ａ）の株を適切な発酵条件下で発酵培地と接触させ、エタノールを生成させるステップと；
ｃ）任意にエタノールを単離するステップと
を含んでなる、エタノールを生成する方法を提供する。
【００１５】
ストレス発酵適応細胞または株は、具体的にはエタノールおよび酢酸アンモニウムを含んでなる培地への適応に関して、本明細書中の適応処置によって提供されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ストレス発酵条件下でのキシロース利用が改善されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞（株に成長する）を生成および単離する方法について記載する。方法が適用されるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞はキシロース利用細胞であり、本発明に従ってそれを酢酸アンモニウムおよびエタノールストレス条件下で連続的に成長させ、ストレス発酵適応キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を生じさせる。本発明はまた、本方法を使用して単離され、ストレス発酵条件下において、連続成長過程前の同一株の細胞との比較で、投入キシロースをより高い百分率で利用する、ストレス発酵適応キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株も対象とする。ストレス発酵適応株は、糖を発酵させてエタノールを生成する方法で使用してもよい。本ストレス発酵適応ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によって生成されるエタノールは、化石燃料の代替えエネルギー源として使用してもよい。
【００１７】
明細書および特許請求の範囲を解釈するために、以下の略語および定義を使用する。
【００１８】
本明細書での用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と言う用語、またはあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含をカバーすることが意図される。例えば要素の一覧を含んでなる、組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素だけに限定されず、明示的に列挙されないその他の要素、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または」は排他的論理和でなく包含的論理和を指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真であり（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽であり（または存在せず）Ｂが真であり（または存在し）、ＡおよびＢの双方が真であり（または存在する）。
【００１９】
また本発明の要素または構成要素に先立つ不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または構成要素の事例（すなわち発生）数に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むと解釈すべきであり、要素または構成要素の単数形は、数値が明らかに単数を意味する場合を除き、複数もまた含む。
【００２０】
本明細書での用法では「連続的に成長させる」とは、細胞が成長し続けて生成物を生じられるように、新しい培地を投入して溶出物を流出させて成長させることを指す。
【００２１】
本明細書での用法では「ストレス培養物」とは、培養中で使用される生体触媒にストレスを引き起こす物質を培地中に含む培養物を指す。生体触媒のストレスは、ストレスを引き起こす物質のない発酵で使用される生体触媒の機能と比較して、成長速度低下、生成物産生低下、炭水化物利用低下、またはその他の困難さとして認識されてもよい。特に興味深いのは、エタノール生成のための糖利用に影響を及ぼすザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株に対するストレッサーである。このようなストレッサーとしては、アセテート、アンモニア、およびエタノールの存在が挙げられる。さらなる関心対象は、このようなストレッサーがエタノール生成のためのキシロース利用に及ぼす影響である。
【００２２】
本明細書での用法では「キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞）」とは、遺伝子改変されて、発酵のための炭水化物源としてキシロースを利用する能力を与える酵素を発現する株の細胞を指す。
【００２３】
本明細書での用法では「対応する非適応株」とは、本明細書で開示されるストレス適応過程を使用して、改善された株がそれから生じる株である、キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）原株を指す。
【００２４】
本明細書での用法では「補給増殖培地」とは、連続培養容器に添加される培地を指す。
【００２５】
本明細書での用法では「生物由来資源加水分解産物」および「セルロース加水分解産物」とは、典型的に前処理および糖化過程を通じて、セルロース系材料である生物由来資源から生じる生成物を指す。発酵性糖は、加水分解産物ならびにその他の生成物中に存在する。
【００２６】
キシロース利用の増大
出願人らは、キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株をストレス状態下における連続的成長を伴う過程を通じて株を適応させることで、ストレス発酵条件下で増大する量のキシロースを利用するようにできることを発見した。キシロース利用の増大は、本明細書に記載される適応過程を受けていないキシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるキシロース利用と比較される。本明細書でザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の適応中に使用されるストレス状態は、生物由来資源の加水分解産物を含んでなる培地中でザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を成長させる場合に存在するのと類似した、ストレス状態を提供する。したがって本適応株は、生物由来資源の加水分解産物を含んでなる培地中で成長する際にキシロース利用が増大していてもよく、それによってより効率的な成長と生成物の形成を提供する。
【００２７】
炭素源としてキシロースを利用できるあらゆるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、本方法で適応のために提供される原株または出発株であってもよく、本発明に従って改善されたキシロース利用を示すストレス発酵適応キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を調製するために使用される。キシロースからエタノールへの発酵について改変されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、特に有用である。内在性遺伝子は、代謝経路の一部を提供してもよく、またはキシロース代謝に有用な酵素活性があるタンパク質を提供する、あらゆる既知の遺伝的操作技術によって改変されていてもよい。例えば内在性トランスケトラーゼが、キシロース利用経路の創出において、その他の導入酵素活性を補完してもよい。参照によって本明細書に援用する米国特許第５５１４５８３号明細書に記載されるように、キシロース代謝に関与する４種の酵素の発現のために、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株に典型的に４個の遺伝子を導入してもよい。これらにはキシロースからキシルロースへの転換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化してキシルロース５−ホスフェートを形成するキシルロキナーゼをコードする遺伝子が含まれる。さらに五炭糖ホスフェート経路の２種の酵素であるトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼはキシルロース５−ホスフェートを中間体に転換し、それは五炭糖代謝を解糖作用エントナー−ドウドロフ経路に連結して、キシロースからエタノールへの代謝を可能にする。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、そして一部の酵母および真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得てもよい。コード領域の起源としては、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。特に有用なのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域である。
【００２８】
コードするＤＮＡ配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のプロモーター（ＧＡＰプロモーター）、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼのプロモーター（ＥＮＯプロモーター）などのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞中で発現されるプロモーターと作動的に連結する。コード領域はプロモーターから個々に発現されてもよく、または２つ以上のコード領域がオペロン中で連結して同一プロモーターから発現されてもよい。得られたキメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に導入してプラスミド上に維持してもよく、または例えば相同的組換え、部位特異的組み込み、またはランダム組み込みを使用して、ゲノムに組み込んでもよい。特定用途があるキシロース利用株としては、ＺＭ４（ｐＺＢ５）（参照によって本明細書に援用する米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書、および米国特許第５５７１２１３３号明細書に記載される）、８ｂ（米国特許公開第２００３０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉら，（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１〜３２５頁）、ならびにＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−５、およびＺＷ８０１−６（参照によって本明細書に援用する同一譲受人の同時係属米国特許公開第２００８−０２８６８７０−Ａ１号明細書）が挙げられる。
【００２９】
天然の基質でないその他の糖を利用するようにさらに改変されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株もまた、本過程で使用してもよい。一例は、参照によって本明細書に援用する米国特許第５８４３７６０号明細書に記載されるアラビノース利用のために改変されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株である。
【００３０】
適応方法
本方法では、ストレス発酵条件下において、キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株（上述のような出発株または原株）を、キシロースを含んでなる培地中で連続的に成長させる。培地は唯一の糖としてキシロースを含有してもよく、またはそれはキシロースと、グルコースなどのその他の糖との混合物を含有してもよい。好ましいのは、例えばそれぞれ少なくとも約５０ｇ／Ｌのキシロースおよびグルコースなどの培地中の高い糖濃度である。片方または双方の糖がより多量にあってもよい。
【００３１】
キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）原株を最初にストレス状態なしに連続的に生育させ、エタノールを生成させる。連続培養を維持する希釈率で、補給増殖培地を添加する。典型的に培養物は安定化し、それには約９〜１２日間かかるかもしれないが、培養物によっては安定化により長期間を要するかもしれない。安定化は、発酵槽からの溶出物中で測定されるＯＤ６００、糖利用、およびエタノール生成に関するものである。安定化培養物中のエタノールは、約１８ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ以上のレベルで生成されてもよい。次に追加的構成要素を発酵培地に添加して、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の代謝にストレス状態を引き起こす。これらの構成要素は、培養物の安定化直後に添加しても、または安定条件下で培養物がさらに長時間発酵した後に添加してもよい。ストレッサーとして添加してもよい構成要素としては、酢酸アンモニウムを含有する培地をもたらすアンモニアと酢酸、または酢酸アンモニウムが挙げられる。発酵培地中の酢酸アンモニウムおよびエタノールの存在はザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞にストレスを与え、それは典型的にＯＤ６００の低下、キシロース利用の低下、およびエタノール生成の低下を引き起こす。希釈率を増大または低下させて、ＯＤ６００、キシロース利用、およびエタノール濃度を操作してもよい。ストレス状態下の培養物を連続的に成長させる。ストレス培養物の連続発酵中に、より多くのアンモニアと酢酸、または酢酸アンモニウムを少なくとも１回以上添加してもよい。発酵培地中の酢酸アンモニウム濃度を段階的に徐々に増大させるなど、添加は２回以上であってもよい。
【００３２】
アンモニアおよび酢酸を当初は酢酸アンモニウムとして添加して、約２４ｍＭの酢酸アンモニウムまたは約４８ｍＭの酢酸アンモニウムの濃度を達成してもよい。アンモニアと酢酸、または酢酸アンモニウムを１回以上の増大で添加して、約６４ｍＭ〜２１０ｍＭの酢酸アンモニウム濃度を達成してもよい。典型的にアンモニアと酢酸、または酢酸アンモニウムを経時的に４段階以上で添加して、ストレス培養の発酵培地中の濃度を徐々に増大させる。ストレス培養物中のエタノールはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によって生成され、生成速度に応じて変動してもよく、典型的にエタノールは約１３ｇ／Ｌ〜５４ｇ／Ｌである。ＯＤ６００は変動してもよく、典型的に約１．５〜約４．８である。
【００３３】
約２ヶ月以上の総連続発酵期間に続いて、適応ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株をストレス培養物から単離してもよい。サンプルを培養物から採取してプレート上に画線塗抹し、コロニーを単離してもよく、または培養物中で成長させて次にプレート上に画線塗抹し、コロニーを単離してもよい。個々のコロニーからの細胞は、高い糖濃度、アンモニアおよびアセテートを含有する培地中で、単離された細胞または細胞から成長した株がキシロースを利用し、エタノールを生成する能力について試験する。エタノールは、適応ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によって培養物中に生成される。適応前の原株または出発キシロース利用株との比較で、キシロース利用の増大およびエタノール生成の増大を示す株を試験された単離株中で同定する。当業者は、異なる単離株中で、利用されるキシロースおよび生成するエタノール量に多様性があることを十分承知している。しかしキシロース利用およびエタノール生成が増大している株は、ストレス発酵培養物からの分離株中で容易に識別可能であり、認識される。
【００３４】
適応株
本明細書で開示されるのは、キシロース利用が改善された、ストレス発酵適応キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株である。これらの株は、発酵培地がエタノール、酢酸アンモニウム、および高い糖濃度を含有するストレス状態で成長した際に、対応する非適応株との比較で、少なくとも約１２％のキシロース利用の増大によって特徴付けられてもよい。適応株は、少なくとも約１２％、１７％、２０％、２５％、または３０％さらに多くのキシロースを利用してもよい。これらの特徴を有するキシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、開示される方法を使用して慣例的に単離してもよい。キシロース利用の量は、原株、発酵条件、および特定適応株それ自体をはじめとする要因に左右される。
【００３５】
培地が６０ｇ／Ｌのキシロース、８０ｇ／Ｌのグルコース、９．５４ｇ／Ｌのアセテート、および１６０ｍＭのＮＨ４ＯＨを含有する、本明細書の実施例３に記載される一連の条件下では、６００ｎｍで０．１  ＯＤの細胞密度で出発した場合、原株が約１７％のキシロースを利用するのに対し、改善された適応株は、少なくとも約７０％、８０％、８５％、または８９％のキシロースを利用できる。様々な条件下では、適応株は、本明細書に記載されるストレス発酵によって適応されていない株による３０％以下と比較して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％のキシロースを利用してもよい。
【００３６】
本発明の適応株は、糖を発酵してエタノールなどの発酵産物を生成するために使用してもよい。株は、ストレス発酵条件を提供する構成要素を含有する、生物由来資源の加水分解産物を含有する培地中での発酵に、特に有用である。リグノセルロース性生物由来資源は典型的に、発酵性糖を生成する特定方法の対象である。これらの方法は、予備加工、前処理、および糖化を含んでもよい。予備加工は、生物由来資源が前処理をより被りやすくするあらゆる措置である。前処理は、生物由来資源が糖化をより被りやすくするあらゆる処理である。糖化は、生物由来資源炭水化物を加水分解して発酵性糖にする、あらゆる処理を含む。発酵性糖は、生体触媒が発酵のために利用し得る単糖類およびオリゴ糖類を含む。生物由来資源を予備加工および前処理するために、予備加工なしおよび／または前処理なしをはじめとするあらゆる一般に知られている方法を使用してもよい。酵素加水分解および／または自己または化学加水分解をはじめとする利用のために糖を使用できるように、一般に知られている糖化技術を用いて発酵のための加水分解産物を生成してもよい。例えば同一譲受人の同時係属米国特許公開第２００７／００３１９１８−Ａ１号明細書に記載されるように、生物由来資源を前処理して糖化してもよい。
【００３７】
エタノール生成のための発酵
エタノール生成のために、キシロースをはじめとする混合糖を含有する培地に、本発明のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を接触させる。成長が阻害される程に混合糖濃度が高い場合、培地はソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物を含んでもよい。ガラクチトールまたはリビトールがソルビトールまたはマンニトールを置換してもよく、またはそれと組み合わせられてもよい。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、発酵が起きてエタノールが生成される培地中で成長する。（嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）発酵は、空気、酸素、またはその他のガスの補給なしに少なくとも約２４時間実施され、３０時間以上実施されてもよい。最大のエタノール生成に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、培地中に阻害物質が存在する場合、より長時間の発酵期間が必要である。発酵はｐＨ約４．５〜約７．５において、約３０℃〜約３７℃の温度で実施されてもよい。
【００３８】
キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）など）は、実験室規模の発酵槽内において、および商業的量のエタノールが生産される大規模発酵内において、キシロースをはじめとする混合糖を含有する培地中で成長してもよい。エタノールの商業生産が所望される場合、本明細書に記載される適応株を使用してエタノールを生成するために、多様な培養法を応用してもよい。例えば大規模生産は、バッチおよび連続培養法の双方によって実施してもよい。古典的バッチ培養法は閉鎖系であり、培地組成は培養開始時に設定され、培養過程において人為的改変を受けない。したがって培養工程開始時に、培地に所望生物を接種して、何も添加することなく成長または代謝活動が起きるようにする。しかし典型的に「バッチ」培養物は炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を調節することが頻繁に試みられる。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物由来資源組成物は、培養物の終結時まで常に変化する。バッチ培養内では、静止遅滞期から高成長対数期、最後に成長速度が低下しまたは停止する定常期を通過して細胞は弱まる。処置しなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、システムによっては最終産物または中間体生成の大半に関与することが多い。その他のシステムでは、静止期または対数期後の生成も得られる。
【００３９】
標準バッチシステムの変法が、流加システムである。流加培養法はまた、本株の成長にも適しており、培養の進行中に基質を増大させて添加することを除いては、典型的なバッチシステムを包含する。流加システムは、異化代謝産物抑制が細胞代謝を阻害する傾向があり、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加システム中の実際の基質濃度の測定は困難であり、したがってｐＨや、ＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能要素の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は一般的であり、当該技術分野で良く知られており、例は参照によって本明細書に援用するＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，およびＢｒｏｃｋ，第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ；またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，ＭｕｋｕｎｄＶ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７頁，（１９９２年）にある。
【００４０】
エタノールの商業生産はまた、連続培養でも達成される。連続培養は開放系であり、規定培養液がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が処理のために同時に除去される。連続培養は一般に一定の高液相密度に細胞を保ち、そこでは細胞は主として対数成長期にある。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、そこでは炭素および栄養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物が細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、当業者に知られているように、天然および／または合成材料から構成される多様な固体担体を使用して実施してもよい。
【００４１】
連続または半連続培養物は、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす１つの要素またはいくつもの要素を調節できるようにする。例えば一方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、その他の全てのパラメーターを調節できるようにする。他のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼすいくつかの要素を連続的に改変し得る。連続系は定常状態成長条件を維持しようと努力し、したがって培地が取り除かれることによる細胞損失は、培養中の細胞成長速度に対する平衡を保たなくてはならない。連続培養法のために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で良く知られており、多様な方法がＢｒｏｃｋ、前出で詳述されている。
【００４２】
特にエタノール生成に適しているのは、次のような発酵計画である。所望の適応株を軌道振盪機内で約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃で振盪フラスコ内の半天然培地中で成長させ、次に同様の培地を含有する１０Ｌの種発酵槽に移す。ＯＤ６００が３〜６になるまで種培養物を種発酵槽内で嫌気的に成長させ、その時点で発酵パラメーターがエタノール生成のために最適化されている生産発酵槽に移す。種タンクから生産タンクに移される典型的な接種菌液体積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズベース製品などの複合窒素源（０〜１０ｇ／ｌ）などの最少培地構成要素を含有する。培地中には、最終濃度約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが存在する。最初にバッチ添加された炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）が枯渇したら、炭素源を提供する、キシロースとグルコース（またはスクロース）などの少なくとも１つの追加的糖とを含む混合糖を発酵容器に連続的に添加して、エタノール比率および力価を最大化する。炭素源供給速度は動的に調節し、酢酸などの有毒副産物の蓄積をもたらし得る過剰なグルコースを培養物が蓄積しないことを確実にする。利用される基質から生成するエタノール収率を最大化するために、生物由来資源成長は、最初にバッチ添加されるかまたは発酵過程において供給されるかのどちらかであるホスフェート量によって制限される。発酵は、苛性溶液（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなど）および硫酸またはリン酸のどちらかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０に調節される。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃に調節される。気泡を最小限にするため、必要に応じて容器に消泡剤（シリコーンベース、有機ベースなどのあらゆる種類）を添加する。それに対する抗生物質抵抗性マーカーが株中にある、カナマイシンなどの抗生物質を使用して、任意に汚染を最小化してもよい。
【００４３】
上述のあらゆる条件の組、さらに当業者に良く知られているこれらの条件のバリエーションが、本発明の適応キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノール生成のための適切な条件である。
【００４４】
発酵中に生成されるエタノールは、当該技術分野で知られている様々な方法を使用して回収してもよい。特定例としては、生物生産されたエタノールをＡＢＥ発酵について当該技術分野で知られている技術を使用して、発酵培地から単離してもよい（例えばＤｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９〜６４８頁（１９９８年）；Ｇｒｏｏｔら，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１〜７５頁（１９９２年）、およびその中の参考文献を参照されたい）。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、発酵培地から固形物を除去してもよい。次に蒸留、共沸性蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または浸透気化法などの方法を使用して、発酵培地からエタノールを単離してもよい。
【実施例】
【００４５】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証の目的でのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その範囲と精神を逸脱することなく本発明に様々な変更および修正を施して、それを様々な用途および条件に適応させ得る。
【００４６】
略語の意味は次のとおり「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ／Ｌ」はリットルあたりグラム数を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍで測定される光学濃度を意味する。
【００４７】
一般方法
ＨＰＬＣ法
分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣおよびＬＣ  ３Ｄ用Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて実施した。カラムは、ＢｉｏＲａｄ  
Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（１２５−０１２９）を使用した、ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（ＨＰＬＣ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｌｕｍｎ  １２５−０１４０）であった。操作条件は次のとおりであった。
流量：０．６ｍＬ／分
溶媒：０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４
停止時間：２５分
注入量：５μＬ
オートサンプラー：１０℃または４℃で温度調節
カラム温度：５５℃
検出器：屈折率（４０℃）
外部標準較正曲線使用
【００４８】
実施例１
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のストレス発酵への適応
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ８０１−４の培養物を次のようなストレス条件下で成長させた。ＺＷ８０１−４は、参照によって本明細書に援用する同一譲受人の同時係属米国特許公開第２００８／０２８６８７０−Ａ１号明細書に記載されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組み換えキシロース利用株である。株ＺＷ８０１−４は株ＺＷ８００に由来し、それは株ＺＷ６５８に由来し、それらは全て米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書に記載される。ＺＷ６５８は、逐次遺伝子転位事象と、それに続くキシロースを含有する選択培地上での適応を通じて、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース利用遺伝子を含有するＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔの２つのオペロンをＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）のゲノムに組み込んで構築された。ＺＷ６５８はＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８として寄託された。ＺＷ６５８中で、宿主媒介二重交叉相同的組換えを使用し、スペクチノマイシン抵抗性を選択可能なマーカーとして、グルコース果糖酸化還元酵素をコードする遺伝子を挿入性に不活性化して、ＺＷ８００を作り出した。ｌｏｘＰ部位によって結合するスペクチノマイシン抵抗性マーカーをＣｒｅリコンビナーゼを使用した部位特異的遺伝子組み換えによって除去し、ＺＷ８０１−４を作り出した。
【００４９】
２５０ｍｌの撹拌されるｐＨおよび温度調節発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ；Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で、ＺＷ８０１−４の連続培養を実施した。成長のための基礎培地は、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１５ｍＭのアンモニウムホスフェート、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、および１０ｍＭのソルビトールであった。出発培養物の温度を３３℃、ｐＨを５．８に調節した。４種の培養を開始した。基礎培地＋各５０ｇ／Ｌのグルコースおよびキシロースを２種（発酵槽Ｆ１ＣおよびＦ４Ｂ）、基礎培地＋１００ｇ／Ｌのグルコースおよび８０ｇ／Ｌのキシロースを１種（発酵槽Ｆ２Ｂ）、および基礎培地＋５０ｇ／Ｌのキシロース（後に８０ｇ／ｌキシロースに増大させた）を１種（Ｆ６）。全ての培養は、酢酸アンモニウムの添加なしに０．１のＯＤ６００で開始した。一般方法に記載されるように、下述する時点で溶出物をエタノール、キシロース、およびグルコースについてＨＰＬＣによって分析した。酢酸アンモニウムを添加した基礎培地をストレス培地として使用し、下の説明では、基礎培地中に存在する濃度を超える濃度の酢酸アンモニウムを使用する。
【００５０】
Ｆ６発酵槽は、０．０６５ｈ−１の希釈率で連続的に稼働させた。培養１２日目に、溶出物は約１８ｇ／Ｌのエタノール、ほぼ完全なキシロース利用、および約３．８のＯＤ６００で安定化して、希釈率を０．９ｈ−１に増大させながら２１日目まで一定に保たれた。２１日目に酢酸アンモニウムを添加して、基礎培地＋キシロース供給中に２４ｍＭを与えた。キシロースの出口濃度は１０ｇ／Ｌに増大し、ＯＤ６００は１．５に低下し、エタノール濃度は１４ｇ／Ｌに低下した。希釈率は０．０４５ｈ−１に低下した。希釈率低下後、溶出物中のキシロースはほぼ０に低下して、エタノールは２０ｇ／Ｌに増大し、ＯＤ６００は２．４に増大した。３０日目に、酢酸アンモニウム濃度を３２ｍＭに増大させた。溶出物中のキシロースおよびエタノール濃度は一定のままであったが、ＯＤ６００は１．８に低下した。３５日目に培養物の酢酸アンモニウム濃度を４０ｍＭに増大させた。培養条件を５０日目まで保って、キシロース濃度を８０ｇ／Ｌに増大させた。キシロース濃度が増大するとエタノール濃度は３０ｇ／Ｌ±４ｇ／Ｌに増大し、希釈率を０．０８ｈ−１に増大させてＯＤ６００を４に保った。酢酸アンモニウム濃度を７１日目および７８日目に２段階の等増分で増大させて、４８ｍＭの酢酸アンモニウムを与えた。酢酸アンモニウム増大に伴う、希釈率またはキシロースおよびエタノールの出口濃度の変化はなかった。アンモニウムおよびアセテート濃度を２段階の等増分で９２日目に６４ｍＭにさらに増大させた。希釈率とエタノール濃度は一定のままであったが、ＯＤ６００は９８日目に１．５に低下した。細胞は凝集するようになった。培養物を清潔な発酵槽に移した。ＯＤ６００を３．８に上昇させた。酢酸アンモニウム濃度を２段階の等増分で１０４日目に８０ｍＭに増大させた。残留キシロース濃度は３ｇ／Ｌに増大した。酢酸アンモニウム濃度を１０段階の等増分で最終濃度１６０ｍＭに増大させながら、連続培養を２０５日目まで実施した。ｐＨは５．８に保った。ＯＤ６００は１．４〜４のままであり、残留キシロース濃度は２〜７ｇ／Ｌの間で変動した。
【００５１】
Ｆ２Ｂ発酵槽は２５日間にわたり調節が困難であり、約３〜８のＯＤ６００、０〜３０ｇ／Ｌのグルコース、２０〜５０ｇ／Ｌのキシロース、および２２〜７０ｇ／Ｌのエタノールの間で変動した。グルコース変動は２５日目以降に減衰し、５〜６ｇ／Ｌで安定化した。このグルコース濃度、および０．０４ｈ−１の希釈率を４０日目まで保った。４３日目に培養物を清潔な発酵槽に移したところ、グルコースの変動が８日間にわたり再発したが、その後、７６日間の培養を通じて希釈率０．０６５ｈ−１で４ｇ／Ｌのグルコース、３０ｇ／Ｌ±３ｇ／Ｌのキシロース、および６０ｇ／Ｌのエタノールに戻った。
【００５２】
発酵槽Ｆ１Ｃは、培養１０日目に、非常に低いグルコースおよびキシロース、４０ｇ／Ｌのエタノール、ＯＤ６００  ６、および希釈率０．０７ｈ−１で安定化した。酢酸アンモニウムを４８ｍＭで添加した。キシロース濃度は６ｇ／Ｌに増大し、希釈率は０．０８ｈ−１に増大した。酢酸アンモニウムを１５日目〜２３日目にかけて４段階の等増分で８０ｍＭに増大させた。培養物を４１日目および６９日目に清潔な発酵槽に移した。酢酸アンモニウム濃度を９７日目までに段階的に１６０ｍＭに増大させる間、希釈率は０．０８〜０．１ｈ−１に保った。酢酸アンモニウム濃度を増大させた期間中に、ＯＤ６００は３．６〜５．３、エタノール濃度は３９〜４５ｇ／Ｌ、およびキシロース濃度は０〜８ｇ／Ｌであった。酢酸アンモニウム含有培地への水酸化アンモニウムの添加によって、アンモニウム濃度を段階的にさらに２１０ｍＭに増大させ、リン酸を添加して１３９日目までｐＨを５．８に保った。この期間中、ＯＤ６００は約３．２に低下してエタノール濃度は約５１ｇ／Ｌに増大し、残留キシロース濃度は２．２ｇ／Ｌであった。
【００５３】
発酵槽Ｆ４Ｂもまた、基礎培地および各５０ｇ／Ｌのグルコースおよびキシロースで開始して、ｐＨは５．８に保った。これは９日目に４０ｇ／Ｌのエタノール、希釈率０．１ｈ−１、および非常に低いグルコースおよびキシロースで安定化した。酢酸アンモニウム濃度を１２日目に４８ｍＭにした。希釈率を０．０７ｈ−１に低下させてＯＤおよび糖利用を維持し、酢酸アンモニウムを２２日目までに２段階の等増分で６４ｍＭに増大させた。希釈率は２８日目まで変動し、残留キシロースも同様であった。酢酸アンモニウムを４３日目までに４段階の等増分で９６ｍＭに増大させる間、希釈率は０．０８２で一定のままであった。この期間内に、エタノール濃度は約４２ｇ／Ｌにわずかに増大し、ＯＤ６００は約４．８から３．５に低下した。５１日目に８０ｇ／Ｌのグルコースおよび６０ｇ／Ｌのキシロースおよび９６ｍＭの酢酸アンモニウムを添加した基礎培地に、供給を変更した。エタノール濃度は日毎にいくらか変動しながら、４１から５１ｇ／Ｌに増大した。７０日目までに残留キシロースは１６ｇ／Ｌに増大し、希釈率は０．０９ｈ−１、ＯＤ６００は約４．９で安定化した。酢酸アンモニウムを１２６日目までに８段階の等増分で１６０ｍＭの濃度に添加した。希釈率とＯＤ６００が一定のままである間、エタノール濃度は６３ｇ／Ｌに増大した。
【００５４】
培養槽Ｆ１Ｃでは、アンモニウム濃度を段階的にさらに２１０ｍＭに増大させ、リン酸を添加して１６８日目までｐＨを５．８に保った。希釈率は０．０８ｈ−１に保った。この期間中、ＯＤ６００は３．７〜５．６の間で変動し、エタノール濃度は約６３ｇ／Ｌに増大し、残留キシロース濃度は１８ｇ／Ｌであった。培養物をこの条件に８日間保ち、次にさらに７日間ｐＨを５．６５に保った。エタノールおよびキシロース濃度が比較的一定を保つ間、ＯＤ６００は３．５に低下した。
【００５５】
実施例２
適応連続培養発酵槽に由来する培養物の評価
連続適応培養からのサンプルは、最初に発酵槽Ｆ１Ｃから７４日目に、発酵槽Ｆ４Ｂから６９日目に、発酵槽Ｆ６から７８日目に採取し、また最初の試料採取後の様々な時点で採取した。全て−８０℃で保存し、試験のためにＲＭＧ５培地中で復活させた。種培養物は、基礎培地＋７５ｇ／Ｌグルコースおよび２５ｇ／Ｌキシロース中で、ＯＤ６００が４．５になるまで３３℃で生長させた。
【００５６】
試験のための基礎培地は、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１５ｍＭのリン酸水素二アンモニウム、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１０ｍＭのソルビトール、および４ｇ／Ｌの炭酸水素カリウムであった。炭素源は、８０ｇ／Ｌのグルコースおよび６０ｇ／Ｌのキシロースであった。培地は低ストレス対照のためにそのまま、または８０ｍＭ、１２０ｍＭまたは１６０ｍＭの酢酸アンモニウムを添加して、リン酸でｐＨを５．８に調節して使用した。
【００５７】
発酵体積は１００ｍｌであり、発酵は１２０ｒｐｍで振盪しながら３３℃で実施した。種増殖培地から調製された細胞を０．１の出発ＯＤ６００に添加にして、成長を開始した。種増殖培地からの細胞を遠心分離によって収集し、試験培地で洗浄した。６００ｎｍでのＯＤによって成長をモニターした。エタノール、キシロース、およびグルコースは全てＨＰＬＣによってモニターした。適用培養を開始するのに使用したＺＷ８０１−４株を対照として使用した。
【００５８】
３種の適応培養物は全て酢酸アンモニウム非添加培地上で成長し、ＺＷ８０１−４と同率でグルコースを使用した。１６０ｍＭの酢酸アンモニウムでは、ＺＷ８０１−４が長期にわたる誘導期後に成長したのに対し、３種の適応培養物は全て４２時間以内に全部のグルコースを使用した。
【００５９】
全ての培養物が酢酸アンモニウム非添加培地中の６０ｇ／Ｌのキシロースを同様の速度で使用した一方、３種の適応培養物は１２０ｍＭの酢酸アンモニウム添加培地中のキシロースを４６時間以内に全部利用したが、ＺＷ８０１−４では６０時間を要した。
【００６０】
連続発酵槽のさらなる適応時間において、バルク試験手順を繰り返した。
【００６１】
実施例３
単離された適応株の性能
グルコース含有プレート上に播種することで単一コロニーを単離し、表１に示す様々な段階の適応培養物からの純化株を成長させるのに使用した。１６０ｍＭの酢酸アンモニウム中での培養物全体の試験について記載される培地および条件を使用して、単一コロニー由来株を試験した。
【００６２】
種培養物は、７５ｇ／Ｌのグルコースおよび２５ｇ／Ｌのキシロースを添加した上述のＤＰ１培地中で成長させた。種培養物を０．１の初期ＯＤ６００ｎｍに添加して、混合糖試験発酵を開始した。初期ｐＨは５．８であった。温度は３３℃で、１００ｍｌの培養物を振盪機恒温器内で１２０ｒｐｍで撹拌した。
【００６３】
ＺＷ８０１−４は、連続適応培養物から単離された異なる株を試験した各一連の発酵で、非適応培養物対照として使用した。初回試験でＦ４Ｂ発酵槽から単離され、高レベルの酢酸アンモニウム存在下でＺＷ８０１４非適応株と比較して試験すると、繰り返しより多くのキシロースを利用してより多くのエタノールを生成する、ＮＳ１３０２−２と命名された第２の株を各一連の試験発酵で陽性対照として使用した。
【００６４】
株は全て混合糖発酵中に全部のグルコースを４４時間以内に使用したが、全て異なる残留キシロース量を有したので、発酵４４時間目の残留キシロースをストレス状態に対する適応の指標として使用した。結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
0005723290.tif 000002
【００６６】
ＮＳ１３６９、ＮＳ１３７０、ＮＳ１３７２、ＮＳ１３７３、およびＮＳ１３７５株は全て、ＺＷ８０１よりも少量のキシロースを残し、陽性対照、ＮＳ１３０２と同様に機能した。参照によって本明細書に援用する同一譲受人の同時係属米国特許公開２００７／００３１９１８−Ａ１に全て記載されるように、希釈アンモニアおよび熱処理によって前処理され、次に２５％の前処理トウモロコシ穂軸固形分、ｐＨ５．３および４８℃で９６時間、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ酵素製剤の混合物によって酵素的に加水分解された粉砕トウモロコシ穂軸から生成された６０体積％の加水分解産物を含有する培地中でさらに評価するために、それらを選択した。得られた加水分解産物中の主要な糖およびアセテート濃度は次のとおりであった。
グルコース：６２．３ｇ／Ｌ
キシロース：４０．２ｇ／Ｌ
アラビノース：５．７ｇ／Ｌ
セロビオース：９．６ｇ／Ｌ
アセテート：６．４ｇ／Ｌ
残る４０％の試験培地は、次のような最終培地濃度に調節された。
５ｇ／Ｌの酵母抽出物
２ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム
１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム
１００ｇ／Ｌのグルコース
８０ｇ／Ｌのキシロース
７ｇ／Ｌのアセテート
【００６７】
発酵は３３℃で、ＫＯＨの添加により５．８に調節されたｐＨで実施した。開始接種は、上の規定培地中での試験発酵について記載されるように、７５ｇ／Ｌのグルコースおよび２５ｇ／Ｌのキシロース添加基礎培地中で生成された接種菌液のＯＤからの計算で、０．２であった。
【００６８】
ＺＷ８０１−４をはじめとする全ての株は、これらの条件下で培地中の全てのグルコースを使用できる。全てのグルコースが使用された頃（４３時間）の残留キシロース、その時点でのエタノール、次にキシロース利用速度が０に低下した（６７時間）後の残留キシロースおよび生成エタノールに関する結果を下の表２に示す。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
６７時間目には、高糖、高アセテート成長条件下で、ＮＳ−１３７５以外の全ての単離株は、出発株ＺＷ８０１−４より多くのキシロースを利用し、ＮＳ−１３７５およびＮＳ−１３６９以外の全ての単離株はより多くのエタノールを生成した。ＮＳ−１３０２−２、ＮＳ−１３７０、ＮＳ−１３７２、ＮＳ−１３７３−１、およびＮＳ−１３７３−５株は、それぞれＺＷ８０１−４よりも少なくとも約１０ｇ／Ｌさらに多くのキシロースを利用した。ＮＳ１３７３−１株をＺＷ７０５と改名し、同一プロトコルを使用してＺＷ８０１−４を比較株として数回試験した。ＺＷ７０５は一貫して、糖補給されたトウモロコシ穂軸加水分解産物から出発してより多くのエタノールを生成した。より良いエタノール生成の主な理由は、利用可能キシロースのより完全な利用であった。ＺＷ７０５は一貫して９９〜１００％のグルコース、８７〜９０％の利用可能キシロースを使用して８０〜８５ｇ／Ｌのエタノール力価を生じた。同一条件でＺＷ８０１−４は、約９８％のグルコース、５９〜７０％のキシロースを利用して、６６〜７０ｇ／Ｌのエタノール力価を生じた。
【００７１】
実施例４
ＺＷ７０５適応株の評価
１５０ｍｌの撹拌されるｐＨおよび温度調節フラスコ内で、ＺＷ７０５、および対照としてのＺＷ８０１−４のバッチ培養物を成長させた。出発温度は３０℃であり、２７℃まで変動した。ｐＨは５．８に保った。培地は、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１．８ｇ／Ｌのソルビトールを含有するｍＲＭ３であった。表３に列挙されるように、アセテート、グルコース、およびキシロースを培地に添加した。
【００７２】
６５．５時間後、キシロース、グルコース、およびエタノールについて培養物を分析した。表３に示す結果は、ＺＷ８０１−４原株との比較で、適応ＺＷ７０５株による２８％のキシロース利用の増大、および１８％のエタノール生成の増大を示す。
【００７３】
【表３】
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