(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、
ｎａｉ２又はＴＳＫ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＴＳＡ１）であるＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、当該植物細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項２】
前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、下記（ａ）〜（ｂ）のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
【請求項３】
前記標的タンパク質が、Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項４】
前記植物細胞が、植物個体中の細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【請求項５】
ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクター、又は、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを共に有する発現ベクターが導入されており、
前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、ｎａｉ２又はＴＳＫ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＴＳＡ１）であり、
前記標的タンパク質は、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有しており、
植物体中の少なくとも１の細胞において、当該細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積されていることを特徴とする形質転換植物。
【請求項６】
前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、下記（ａ）〜（ｂ）のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とする請求項５に記載の形質転換植物。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
【請求項７】
前記標的タンパク質が、Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質であることを特徴とする請求項５又は６に記載の形質転換植物。
【請求項８】
単子葉植物であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項９】
ユリ科植物又はイネ科植物であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１０】
イネであることを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか一項に記載の形質転換植物の後代個体又はクローン個体であることを特徴とする植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を植物細胞内の特定の細胞内小器官に蓄積させる方法、及び、当該方法により作製された形質転換植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換技術の進歩により、培養細胞や植物個体中の細胞に、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入し、当該タンパク質を細胞内に発現させることができるようになった。一般的には、植物の核ゲノムに遺伝子を導入してタンパク質を発現させる際に、目的タンパク質をコードする遺伝子領域のみを細胞内に導入した場合には、発現したタンパク質は細胞質に蓄積する。また、目的タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドと呼ばれる数アミノ酸を付加したタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、発現させたタンパク質を、ＥＲ（小胞体）、液胞、葉緑体などの細胞内小器官と呼ばれる箇所あるいは細胞外領域（アポプラスト）に移行・蓄積させることができる（非特許文献１参照。）。その他、目的タンパク質をコードする遺伝子を、葉緑体のゲノムそのものに導入し、葉緑体内で遺伝子発現からタンパク質蓄積までを行う技術もある（非特許文献２参照。）。
【０００３】
また、タンパク質を特異的に蓄積する細胞内小器官として、プロテインボディやＥＲボディなどが知られている（非特許文献３参照。）。プロテインボディは植物の種子にのみ局在しており、ＥＲボディはアブラナ科などを含むフウチョウソウ目植物の幼苗にのみ局在している。フウチョウソウ目アブラナ科に属するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において、ＥＲボディ形成不全変異体では、ｎａｉ２遺伝子に機能不全変異が生じており、この変異体に野生型のｎａｉ２遺伝子を導入することによってＥＲボディが形成されること、ＥＲボディにはβ−グルコシダーゼであるＰｙｋ１０が蓄積されているが、ＥＲボディ形成不全変異体では、Ｐｙｋ１０はＥＲ全体に分散して局在していることなどが報告されている（非特許文献４〜８参照。）。
【０００４】
一方で、タンパク質を既存の細胞内小器官に蓄積する従来の技術においては、タンパク質の種類によっては、蓄積した細胞内小器官及びその細胞の機能、ひいては植物体の生育に悪影響を及ぼす場合がある。例えば、植物細胞壁由来のセルロースを糖に加水分解する糖化酵素を発現・蓄積した植物は、バイオエタノール生産に好適な原料と成り得ることが期待されるが、このような糖化酵素を人工的に発現・蓄積させたイネでは、さまざまな生理的・形態的異常を生じることが報告されている（非特許文献９参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Twyman, et al., Trends Biotechnol. 2003, 21(12):570-578.
【非特許文献２】Verma, et al., Plant Physiol. 2007, 145(4):1129-1143.
【非特許文献３】Hara-Nishimura I, et al.,  Plant Physiol. 2004, 136(3):3435-3439.
【非特許文献４】Yamada, et al., Plant Cell. 2008, 20(9):2529-2540.
【非特許文献５】Yamada, et al.,  Plant Signal Behav. 2009, 4(9):849-852.
【非特許文献６】Matsushima R, et al., Plant J. 2003, 33(3):493-502.
【非特許文献７】Matsushima R, et al., Plant Physiol. 2002, 130(4):1807-1814.
【非特許文献８】Matsushima R, et al., Plant Cell. 2004, 16(6):1536-1549.
【非特許文献９】Nigorikawa M, et al., “Abs # P10033: Effects of overexpression of a cellulase gene on rice development”,[on line], 2009, Plant Biology,［２０１０年１２月６日検索］,インターネット＜URL: http://abstracts.aspb.org/pb2009/public/P10/P10033.html＞
【非特許文献１０】Cornelissen , et al., Nucleic Acids Res. 1987, 15(17):6799-6811.
【非特許文献１１】Chen, et al., Plant Mol Biol. 2006, 62(6):927-936.
【非特許文献１２】Nishimura et al.,  Nature Protocols 2006, 1:2796-2802.
【非特許文献１３】Kawazu et al., 1999,、Journal of bioscience and bioengineering, 88:421-425.
【非特許文献１４】Kimura et al., Applied microbiology and biotechnology, 2003, 62:374-379.
【非特許文献１５】Ziegler, et al., Mol Breed. 2000, 6:37-46.
【非特許文献１６】Kengen, et al.,  Eur J Biochem. 1993, 213:305-312.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
大量の目的のタンパク質を植物体に安定して蓄積させるためには、当該タンパク質が蓄積することによって、植物体に生育異常等の障害が生じないことが重要である。例えば、過剰発現させたタンパク質をプロテインボディやＥＲボディに蓄積させることにより、当該タンパク質による植物体自体に対する影響を十分に低減させつつ、高濃度のタンパク質を植物体に蓄積させられることが期待できる。しかしながら、プロテインボディやＥＲボディは、それらが形成される植物種、時期、器官が限定されているため、タンパク質大量生産のための蓄積器官としては適しているとはいえない。
【０００７】
本発明は、目的のタンパク質を、植物細胞や植物体に安定して蓄積させる方法、及び、タンパク質を蓄積させた形質転換植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、フウチョウソウ目アブラナ科植物以外の植物に対しても、ｎａｉ２遺伝子を導入することによりＥＲボディを形成し得ること、ＥＲボディを新たに形成した植物に、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドを付加したタンパク質を発現させることにより、当該タンパク質をＥＲボディに蓄積させられることを見出し、本発明を完成させた。  
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）  タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、
ｎａｉ２又はＴＳＫ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＴＳＡ１）であるＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、当該植物細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質から前記細胞内膜系移行シグナルペプチドが欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（２）  前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、下記（ａ）〜（ｂ）のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とする前記（１）に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法； 
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド、
（３）  前記標的タンパク質が、Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質であることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（４）  前記植物細胞が、植物個体中の細胞であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（５）  ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクター、又は、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを共に有する発現ベクターが導入されており、
前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、ｎａｉ２又はＴＳＫ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＴＳＡ１）であり、
前記標的タンパク質は、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有しており、
植物体中の少なくとも１の細胞において、当該細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積されていることを特徴とする形質転換植物、
（６）  前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、下記（ａ）〜（ｂ）のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とする前記（５）に記載の形質転換植物；
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド、
（７）  前記標的タンパク質が、Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質であることを特徴とする前記（５）又は（６）に記載の形質転換植物、
（８）  単子葉植物であることを特徴とする前記（５）〜（７）のいずれか一つに記載の形質転換植物、
（９）  ユリ科植物又はイネ科植物であることを特徴とする前記（５）〜（７）のいずれか一つに記載の形質転換植物、
（１０）  イネであることを特徴とする前記（５）〜（７）のいずれか一つに記載の形質転換植物、
（１１）  前記（５）〜（１０）のいずれか一つに記載の形質転換植物の後代個体又はクローン個体であることを特徴とする植物、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、過剰発現による植物細胞や植物個体に対する影響を充分に低減させつつ、目的のタンパク質を植物細胞内に蓄積させることができる。
また、本発明の形質転換植物は、外来タンパク質をＥＲボディに比較的安定して蓄積させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１及び２において、作製された各発現カセットを模式的に示した図である。
【図２】実施例１において、各発現ベクターが導入された細胞の蛍光顕微鏡の観察像である。
【図３】実施例２において、各発現ベクターが導入された細胞の蛍光顕微鏡の観察像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法は、形質転換によって新たに形成させた細胞内小器官内に、同じく形質転換によって発現させた目的のタンパク質を蓄積させることを特徴とする。具体的には、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を植物細胞に導入することにより、ＥＲボディを当該植物細胞内に形成させ、このＥＲボディ内に目的のタンパク質を蓄積させる。このようなタンパク質蓄積に特化した新たな細胞内小器官を作製する技術は、現在までに報告されていない。
【００１３】
すなわち、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法は、タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（ＥＲボディ形成関連遺伝子）と、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、当該植物細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする。ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、細胞内に新たにＥＲボディが形成される。また、ＥＲボディが形成された植物細胞内に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させると、発現されたタンパク質をＥＲボディ内部に蓄積させることができる。
【００１４】
なお、本発明及び本願明細書において、遺伝子とは、タンパク質をコードする塩基配列を含み、細胞に導入されることにより、コードされたタンパク質が、細胞が備える転写・翻訳機構によって合成される核酸を意味する。遺伝子は、生物が有する天然の遺伝子のみならず、遺伝子組換技術を用いて人工的に設計・合成された遺伝子も含まれる。
【００１５】
ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質としては、シロイヌナズナのｎａｉ２（配列番号１）や、ＴＳＫ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＴＳＡ１）／Ａｔ１ｇ５２４１０、Ａｔ３ｇ１５９６０にコードされるタンパク質、及びこれらのタンパク質のホモログタンパク質等が挙げられる。ｎａｉ２は、Ｎ末端から順に、細胞内膜系移行シグナルペプチド（配列番号１の１〜２４番目の領域）と、１０個のＥＦＥリピート（９８〜４７２番目の領域）と、ｎａｉ２ドメイン（４７３〜７７２番目の領域）とを有している。ＴＳＡ１は、ｎａｉ２と同様に、細胞内膜系移行シグナルペプチドと、１０個のＥＦＥリピートと、ｎａｉ２ドメインとを有しており、アミノ酸配列で８０％の相同性を有している。ｎａｉ２やそのホモログタンパク質等を発現させることにより、アブラナ科などを含むフウチョウソウ目以外の植物にもＥＲボディを形成させられることは、本発明者らにより初めて見出された知見である。
【００１６】
本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法に用いられるＥＲボディ形成機能を有するタンパク質としては、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかから選択されるポリペプチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのアミノ酸配列上の相同性は、Ｂｌａｓｔ等の公知のプログラムを用いて求めることができる。
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４７３番目から７７２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
【００１７】
なお、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質（ポリペプチド）とは、植物細胞内において、当該タンパク質が発現されることにより、ＥＲボディが形成されるタンパク質である。あるポリペプチドがＥＲボディ形成機能を有するか否かは、例えば、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、植物細胞に電気穿孔法等の公知の遺伝子導入法によって導入した後、当該植物細胞にＥＲボディが形成されたか否かを顕微鏡等で観察することにより判断することができる。
【００１８】
Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドがあることにより、リボソームで合成されたタンパク質は、ＥＲ内部へ移行する。また、Ｃ末端にＥＲ保留シグナルペプチドがあることにより、タンパク質がＥＲ内部に留まることができる。すなわち、発現させたタンパク質をＥＲボディの内部に蓄積させるためには、当該タンパク質のＮ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドがあり、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドがあることを要する。
【００１９】
本発明において、標的タンパク質が備える細胞内膜系移行シグナルペプチドとしては、ＥＲをはじめとする細胞内膜への移行能（以下、ＥＲ移行能）を有するペプチドであれば、特に限定されるものではなく、分泌タンパク質のＮ末端に存在するシグナルペプチドの中から適宜選択して用いることができる。また、公知の細胞内膜系移行シグナルペプチドに対して、ＥＲ移行能を損なうことなく、１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加したペプチドであってもよい。細胞内膜系移行シグナルペプチドとしては、具体的には、タバコモザイクウイルスのＰｒ１ａタンパク質が有する細胞内膜系移行シグナルペプチド（非特許文献１０参照。）、シロイヌナズナのＰｙｋ１０（配列番号２）が有する細胞内膜系移行シグナルペプチド（１番目から２４番目のアミノ酸）、シロイヌナズナのｎａｉ２（配列番号１）が有する細胞内膜系移行シグナルペプチド（１番目から２４番目のアミノ酸）等が挙げられる。
【００２０】
本発明において、標的タンパク質が備えるＥＲ保留シグナルペプチドとしては、ＥＲ保留能を有するペプチドであれば、特に限定されるものではなく、ＥＲ内部に保留されるタンパク質のＣ末端に存在するシグナルペプチドの中から適宜選択して用いることができる。ＥＲ保留シグナルペプチドとしては、具体的には、アミノ酸一文字表記でＫＤＥＬやＨＤＥＬ等が挙げられる。
【００２１】
ＥＲ内部に保留されるタンパク質の中には、Ｎ末端の細胞内膜系移行シグナルペプチドの少なくとも一部がＥＲ内部の酵素によって切断されるものがある。本発明においても、標的タンパク質が備える細胞内膜系移行シグナルペプチドの種類によっては、標的タンパク質ではなく、標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が、形成されたＥＲボディ内部に蓄積される。なお、ＥＲ内部の酵素による切断部位は、標的タンパク質の種類、特に、細胞内膜系移行シグナルペプチドに連結させたポリペプチドのアミノ酸配列等により異なる。多くの場合では、細胞内膜系移行シグナルペプチドのみが切断により欠損されるが、細胞内膜系移行シグナルペプチドを含むより広いＮ末端領域が欠損する場合や、細胞内膜系移行シグナルペプチドの一部のみが欠損する場合もある。
【００２２】
細胞内に蓄積させたい目的のタンパク質が、細胞内膜系移行シグナルペプチドやＥＲ保留シグナルペプチドを元々備えている場合には、当該タンパク質をコードする遺伝子をＥＲボディ形成関連遺伝子と共発現させることにより、当該タンパク質又は当該タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質をＥＲボディ内部に蓄積させることができる。一方で、細胞内に蓄積させたい目的のタンパク質が、細胞内膜系移行シグナルペプチドやＥＲ保留シグナルペプチドを備えていない場合には、当該タンパク質のＮ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを、Ｃ末端にＥＲ保留シグナルペプチドをそれぞれ付加したタンパク質を標的タンパク質とすることにより、当該標的タンパク質又は当該タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質をＥＲボディ内部に蓄積させることができる。
【００２３】
本発明においては、標的タンパク質として、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを元々備えるタンパク質のＣ末端に、細胞内に蓄積させたい目的のタンパク質にＥＲ保留シグナルペプチドを付加させたタンパク質を、直接又は適当なスペーサーを介して融合させたキメラタンパク質であってもよい。例えば、Ｐｙｋ１０のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質を標的タンパク質とすることができる。
【００２４】
植物細胞にＥＲボディ形成機能を有するタンパク質と標的タンパク質とを共発現させる方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知のいずれの方法で行ってもよい。例えば、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターとを、植物細胞に導入することにより、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質と標的タンパク質とを共発現させた形質転換細胞を作製することができる。ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを共に有する発現ベクターを導入してもよい。
【００２５】
ＥＲボディ形成関連遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを共発現させる植物細胞は、植物個体中の細胞であってもよく、植物個体から採取された細胞であってもよく、脱分化処理等の処理が施された細胞であってもよく、培養細胞であってもよい。脱分化処理により得られたカルスに、ＥＲボディ形成関連遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを導入することにより、形成されたＥＲボディの内部に標的タンパク質又は標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積された細胞を有する植物個体を得ることができる。
【００２６】
本発明において、ＥＲボディ形成関連遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを共発現させる植物細胞の種類は、植物であれば特に限定されるものではないが、野生型ではＥＲボディが形成されていない植物種の細胞であることが好ましい。中でも、単子葉植物であることが好ましく、ユリ科植物又はイネ科植物であることがより好ましい。ユリ科の植物として、例えば、タマネギ等が挙げられる。また、イネ科の植物として、例えば、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、エリアンサス、サトウキビ、スイッチグラス、ミスカンサス、ネピアグラス等が挙げられる。
【００２７】
ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質や標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターは、これらのタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを、周知の遺伝子組換技術を用いて発現ベクターに組み込むことにより作製することができる。市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００２８】
発現ベクターとしては、植物細胞において転写が可能なプロモーター配列と、ポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を有する発現ベクターであって、植物細胞に導入した場合に、組み込まれたポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されるものではなく、形質転換植物細胞や形質転換植物の作製のために通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。なお、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを一の発現ベクターに組み込む場合には、両タンパク質が独立して細胞内に発現されるように、プロモーター配列を有するＤＮＡ、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現用カセットと、プロモーター配列を有するＤＮＡ、標的タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現用カセットを備えていることが必要である。
【００２９】
発現ベクターとしては、例えば、ＭｕｌｔｉＲｏｕｎｄ  Ｇａｔｅｗａｙ（非特許文献１１参照。）エントリーベクターや、ｐＩＧ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等のバイナリーベクター等がある。使用可能なプロモーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーター、トウモロコシｕｂｉ１のプロモーター等がある。また、使用可能なターミネーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター等がある。その他、組織や器官に特異的なプロモーターを用いてもよい。例えば、葉特異的な発現プロモーターとして、イネｒｂｃＳのプロモーター等が挙げられる。このような組織又は器官特異的プロモーターを用いることにより、植物全体ではなく、特定の組織や器官にのみ標的タンパク質を発現させることができる。例えば、食用植物にＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターとを導入して形質転換植物を作製した場合に、当該形質転換植物の非食用部分にのみ標的タンパク質を発現させることができる。
【００３０】
当該発現ベクターは、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質や標的タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組み込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００３１】
本発明において、発現ベクターを用いて形質転換植物を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換植物細胞や形質転換植物を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、アグロバクテリウム法で行うことが好ましい。なお、形質転換植物細胞や形質転換植物は、薬剤耐性等を指標として選抜することができる。また、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。
【００３２】
周知の植物組織培養法等を用いることにより、形質転換された植物細胞やカルス等から形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
【００３３】
例えば、ＥＲボディ形成関連遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを共発現させるように形質転換させたイネは、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターとを、Nishimuraらの方法（非特許文献１２参照。）等の常法により形質転換することにより作成することができる。 具体的には、例えば、外皮を除去した後表面殺菌した完熟種子を培養して得られたカルスを、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターとにより形質転換されたアグロバクテリウムの溶液に浸漬して感染させた後、抗生物質等を用いて形質転換されたカルスを選抜することにより、本発明の形質転換植物であるイネを得ることができる。
【００３４】
このようにして得られた本発明の形質転換植物は、形質転換前の植物個体と同様に栽培したり、挿し木をしたり、交配等により後代個体を得ることができる。また、公知のクローニング技術によりクローン個体を得ることもできる。
【００３５】
本発明の形質転換植物では、タンパク質蓄積器官として新たに形成されたＥＲボディ内に標的タンパク質又は標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積されている。このため、標的タンパク質等を、例えば液胞に存在するタンパク質分解酵素などから保護し、安定的に蓄積することができる。と同時に、標的タンパク質等が他の細胞内小器官、ひいては植物の成長に与える悪影響を十分に低減させることができる。
【００３６】
本発明の形質転換植物からは、新たに形成されたＥＲボディ内に蓄積されている標的タンパク質又は標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を回収することができる。本発明の形質転換植物から標的タンパク質等を回収する方法としては、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織から組換えタンパク質を抽出・精製する場合に通常用いられている方法の中から適宜選択して行うことができる。当該方法として、例えば、Kawazuらの方法（非特許文献１３参照。）や、Kimuraらの方法（非特許文献１４参照。）等がある。
【００３７】
また、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法における標的タンパク質として、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来エンドグルカナーゼＥ１遺伝子触媒領域（Ｅ１−ｃａｔ）（非特許文献１５参照。）やＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来β−グルコシダーゼＣｅｌＢ遺伝子（非特許文献１６参照。）等の超好熱性グルカナーゼのような、植物細胞壁由来のセルロースを糖に加水分解する糖化酵素を用いることにより、バイオエタノール生産に好適なバイオマス原料となる形質転換植物を作製することができる。得られた形質転換植物は、糖化酵素は形質転換植物内では、ＥＲボディに蓄積されているため、形質転換の際に宿主となった植物と同様に栽培することができる。その上、当該形質転換植物をバイオマス原料とする場合には、バイオエタノール生産のための前処理に供することにより、ＥＲボディから蓄積されている糖化酵素が放出される結果、当該形質転換植物中のセルロースが分解されやすくなる。
【実施例】
【００３８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
［実施例１］
タマネギ表皮細胞に、ｎａｉ２遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子を一過性に共発現させることにより、新たに形成されたＥＲボディに標的タンパク質を蓄積させた。
＜遺伝子発現ベクターの作製＞
レポーターであるオワンクラゲ蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、単独、若しくは糖化酵素であるＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来エンドグルカナーゼＥ１遺伝子触媒領域（Ｅ１−ｃａｔ）（非特許文献１５参照。）又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来β−グルコシダーゼＣｅｌＢ遺伝子（非特許文献１６参照。）との融合タンパク質として、トウモロコシｕｂｉ1プロモーター及びアグロバクテリムｎｏｓターミネーターとＰＣＲ法により連結し、遺伝子発現カセットを作製した。各遺伝子のコード領域５’末端にはタバコモザイクウイルスＰｒ１ａタンパク質シグナルペプチド（非特許文献１０参照。）を付加し、コード領域３’末端にはＥＲ保留シグナルペプチドであるアミノ酸４残基（ＨＤＥＬ）を付加した。また、トウモロコシｕｂｉ1プロモーター、ＧＦＰ遺伝子、及びアグロバクテリムｎｏｓターミネーターをＰＣＲ法により連結し、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドのいずれも含まない遺伝子発現カセット（ＧＦＰ発現カセット）を作製した。さらに、シロイヌナズナＥＲボディ形成関連遺伝子であるｎａｉ２遺伝子の発現カセット（ｎａｉ２発現カセット）を同様に作製した。
【００４０】
図１は、作製された各発現カセットを模式的に示した図である。図１中、「Ｐｕｂｉ1」はトウモロコシｕｂｉ1プロモーターを、「Ｔｎｏｓ」はアグロバクテリムｎｏｓターミネーターを、「ＨＤＥＬ」はＥＲ保留シグナルペプチドを、「ＳＰ」はタバコモザイクウイルスＰｒ１ａタンパク質シグナルペプチドを、「ＧＦＰ」はＧＦＰを、「Ｅ１」はＥ１−ｃａｔを、「ＣｅｌＢ」はＣｅｌＢを、それぞれ示す。
【００４１】
これらの発現カセットを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（クロンテック社製）を用いてＭｕｌｔｉＲｏｕｎｄ  Ｇａｔｅｗａｙ（非特許文献１１参照。）エントリーベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。
【００４２】
＜パーティクルガン法による遺伝子導入＞
作製した発現ベクターを、遺伝子組み換え装置（パーティクルガン）（製品名：ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、インストラクションマニュアルに従ってタマネギ鱗茎に導入した。
【００４３】
＜発現ベクターを導入した細胞の観察＞
発現ベクターを導入した細胞は、蛍光実体顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡により観察した。具体的には、ＧＦＰの蛍光を検出することにより、細胞中に発現しているＧＦＰ又はＧＦＰ融合タンパク質の局在を観察した。蛍光実体顕微鏡画像を図２に示す。図２中、上段（ｎａｉ２共発現なし）は、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった細胞の画像であり、下段（ｎａｉ２共発現あり）は、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入した細胞の画像である。
【００４４】
この結果、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドのいずれも含まないＧＦＰ発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞では、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入したか否かにかかわらず、ＧＦＰは細胞質全体に局在していた（図示せず。）。これに対して、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドをいずれも備えているＳＰ−ＧＦＰ−ＨＤＥＬ発現カセット、ＳＰ−Ｅ１：：ＧＦＰ−ＨＤＥＬ融合発現カセット、及びＳＰ−ＣｅｌＢ：：ＧＦＰ−ＨＤＥＬ融合発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞では、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった場合には、各ＧＦＰ又はＧＦＰ融合タンパク質はＥＲ全体に分散して局在していたが、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入した細胞では、楕円状で強い蛍光強度を示す細胞内小器官に局在していた。この細胞内小器官はＥＲボディであり、ｎａｉ２と細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドを備えるタンパク質とを共発現させることにより、新たにＥＲボディが形成し、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドを備えるタンパク質をＥＲボディに蓄積させられることが示された。
【００４５】
［実施例２］
Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質を標的タンパク質として、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、タマネギ表皮細胞に、ＥＲボディを形成させて標的タンパク質を蓄積させた。
＜遺伝子発現ベクターの作製＞
Ｐｙｋ１０のＣ末端にＧＦＰを連結させた融合タンパク質として、トウモロコシｕｂｉ1プロモーター及びアグロバクテリムｎｏｓターミネーターとＰＣＲ法により連結し、遺伝子発現カセットを作製した。当該遺伝子のコード領域３’末端にはＥＲ保留シグナルペプチドであるアミノ酸４残基（ＨＤＥＬ）を付加した。作製された発現カセット（Ｐｙｋ１０：：ＧＦＰ−ＨＤＥＬ融合発現カセット）の模式図を図１に示す。
Ｐｙｋ１０：：ＧＦＰ−ＨＤＥＬ融合発現カセットを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（クロンテック社製）を用いてＭｕｌｔｉＲｏｕｎｄ  Ｇａｔｅｗａｙ（非特許文献１１参照。）エントリーベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。
【００４６】
＜パーティクルガン法による遺伝子導入及び発現ベクターを導入した細胞の観察＞
実施例1と同様にして、Ｐｙｋ１０：：ＧＦＰ−ＨＤＥＬ融合発現カセットを含む発現ベクター、実施例１で用いたＳＰ−ＧＦＰ−ＨＤＥＬ発現カセットを含む発現ベクター、又は、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドのいずれも含まないＧＦＰ発現カセットを含む発現ベクター、並びにｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを、それぞれタマネギ鱗茎に導入した。さらに、実施例1と同様にして、発現ベクターを導入した細胞は、蛍光実体顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡により観察した。蛍光実体顕微鏡画像を図３に示す。図３中、上段（ｎａｉ２共発現なし）は、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった細胞の画像であり、下段（ｎａｉ２共発現あり）は、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入した細胞の画像である。
【００４７】
この結果、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった場合には、ＳＰ−ＧＦＰ−ＨＤＥＬ発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞とＰｙｋ１０：：ＧＦＰ−ＨＤＥＬ融合発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞のいずれも、ＧＦＰ蛍光はＥＲ全体に観察された。これに対して、ＳＰ−ＧＦＰ−ＨＤＥＬ発現カセットを含む発現ベクターとｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入させた場合には、ＧＦＰ蛍光が認められた細胞、すなわち遺伝子が導入された細胞の約半数でＥＲボディの形成が認められた。一方、Ｐｙｋ１０：：ＧＦＰ−ＨＤＥＬ融合発現カセットを含む発現ベクターとｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入させた場合には、ＧＦＰ蛍光が認められた細胞のほぼ全てでＥＲボディの形成が認められた。なお、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドのいずれも含まないＧＦＰ発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞では、実施例１と同様、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入したか否かにかかわらず、ＧＦＰは細胞質全体に局在していた。以上の結果から、目的タンパク質をＰｙｋ１０と融合して発現させると共に、ｎａｉ２を同時に発現させる事により、高頻度で細胞内にＥＲボディを形成させることが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、過剰発現による植物細胞や植物個体に対する影響を充分に低減させつつ、目的のタンパク質を植物細胞内に蓄積させることができるため、当該方法や、それにより得られる本発明の形質転換植物は、例えばタンパク質の大量生産や植物の形質改変等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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