(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量が１，０００以上５，０００未満のヒアルロン酸および／またはその塩を含有する食品組成物の製造方法であって、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量分布が、分子量１，０００未満の成分の割合が２０質量％以上であり、分子量１，０００以上の成分の割合が４０質量％以上であり、かつ、分子量５，０００以上の成分の割合が４０質量％以下であり、かつ、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の０．１ｇ／ｍＬ水溶液（１０ｍＬ）に、０．５ｇ／ｍＬの塩化セチルピリジニウム水溶液（０．０５ｇ）を添加して得られた液の吸光度（Ａ６６０）が０．１Ａｂｓ以下、となるように
原料ヒアルロン酸および／またはその塩をｐＨ０．６以下の酸性水溶液中で加水分解することで得られる、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩を含有させることを特徴とする、食品組成物の製造方法。
【請求項２】
平均分子量が１，０００以上５，０００未満のヒアルロン酸および／またはその塩を含有する経口用皮膚改善剤の製造方法であって、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量分布が、分子量１，０００未満の成分の割合が２０質量％以上であり、分子量１，０００以上の成分の割合が４０質量％以上であり、かつ、分子量５，０００以上の成分の割合が４０質量％以下であり、かつ、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の０．１ｇ／ｍＬ水溶液（１０ｍＬ）に、０．５ｇ／ｍＬの塩化セチルピリジニウム水溶液（０．０５ｇ）を添加して得られた液の吸光度（Ａ６６０）が０．１Ａｂｓ以下、となるように
原料ヒアルロン酸および／またはその塩をｐＨ０．６以下の酸性水溶液中で加水分解することで得られる、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩を含有させることを特徴とする、経口用皮膚改善剤の製造方法。
【請求項３】
平均分子量が１，０００以上５，０００未満のヒアルロン酸および／またはその塩を含有する経口用皮膚含水量増加剤の製造方法であって、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量分布が、分子量１，０００未満の成分の割合が２０質量％以上であり、分子量１，０００以上の成分の割合が４０質量％以上であり、かつ、分子量５，０００以上の成分の割合が４０質量％以下であり、かつ、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の０．１ｇ／ｍＬ水溶液（１０ｍＬ）に、０．５ｇ／ｍＬの塩化セチルピリジニウム水溶液（０．０５ｇ）を添加して得られた液の吸光度（Ａ６６０）が０．１Ａｂｓ以下、となるように
原料ヒアルロン酸および／またはその塩をｐＨ０．６以下の酸性水溶液中で加水分解することで得られる、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩を含有させることを特徴とする、経口用皮膚含水量増加剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口摂取することによって皮膚の含水量を増し、皮膚を改善する作用を有する、新規なヒアルロン酸および／またはその塩、ならびにこれを用いた食品組成物および経口医薬品組成物、ならびに該ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する経口用皮膚改善剤または経口用皮膚含水量増加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（平均分子量：５０万〜２００万）は生体内の多くの組織（例えば皮下組織、眼球、関節）に多く存在するムコ多糖類であり、その高い保湿機能により、例えば化粧料の成分として広く利用されてきた。また、ヒアルロン酸を経口摂取することにより、生体本来の持つヒアルロン酸含量の低下を補い、皮膚の保湿、弾力性、および柔軟性を改善する効果が認められているため（例えば、特開２００２−３５６４３２号公報）、ヒアルロン酸およびその塩は様々な食品に添加されている。
しかしながら、平均分子量が１万以下のような低分子ヒアルロン酸を経口摂取することにより、皮膚にどのような効果が出るかについては、これまで検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−３５６４３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、経口摂取により皮膚の含水量を増加し、皮膚を改善する効果を有する、新規なヒアルロン酸および／またはその塩、ならびにこれを用いた食品組成物および経口医薬品組成物、ならびに該ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する経口用皮膚改善剤または経口用皮膚含水量増加剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、低分子ヒアルロン酸について鋭意研究を重ねた結果、特定の平均分子量と分子量分布とを示すヒアルロン酸および／またはその塩を経口摂取するならば、意外にも、皮膚の含水量が増加し皮膚を改善することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）平均分子量が１，０００以上５，０００未満のヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法であって、
ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量分布が、分子量１，０００以上の成分の割合が４０質量％以上であり、かつ、分子量５，０００以上の成分の割合が４０質量％以下であり、
酸性水溶液中で原料ヒアルロン酸および／またはその塩を加水分解することを特徴とする、
ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法、
（２）（１）記載のヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法であって、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量分布が、分子量１，０００未満の成分の割合が２０質量％以上である、
ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法、
（３）（１）又は（２）に記載のヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法であって、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩の０．１ｇ／ｍＬ水溶液（１０ｍＬ）に、０．５ｇ／ｍＬの塩化セチルピリジニウム水溶液（０．０５ｇ）を添加して得られた液の吸光度（Ａ６６０）が０．１Ａｂｓ以下である、ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法、
（４）（１）乃至（３）のいずれかに記載の製造方法で得られたヒアルロン酸および／またはその塩を含有させることを特徴とする、食品組成物の製造方法、
（５）（１）乃至（３）のいずれかに記載の製造方法で得られたヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有させることを特徴とする、経口用皮膚改善剤の製造方法、
（６）（１）乃至（３）のいずれかに記載の製造方法で得られたヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有させることを特徴とする、経口用皮膚含水量増加剤の製造方法、
である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のヒアルロン酸および／またはその塩によれば、経口摂取を行うことにより、皮膚の含水量が増し、皮膚の水分量を高め、皮膚を瑞々しい状態にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、調製例１で得られたヒアルロン酸ナトリウムのクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の一実施形態に係るヒアルロン酸および／またはその塩を詳細に説明する。なお、本発明において「％」は「質量％」を意味する。
【００１０】
本発明のヒアルロン酸および／またはその塩は、平均分子量が１，０００以上５，０００未満である。
【００１１】
ここで、「ヒアルロン酸」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類をいう。また、「ヒアルロン酸の塩」としては、特に限定されないが、食品または医薬品として許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００１２】
本発明のヒアルロン酸またはその塩の平均分子量は、１，０００以上５，０００未満である。また、皮膚の含水量を増加する効果の優位性の点で、１，０００以上３，０００以下が好ましく、１，０００以上２，０００以下であるのがより好ましい。ヒアルロン酸またはその塩の平均分子量が前記値より大きいと、当該ヒアルロン酸および／またはその塩の経口摂取による皮膚の含水量の増加効果が小さいためである。ヒアルロン酸またはその塩の平均分子量が前記値より小さいと、当該ヒアルロン酸および／またはその塩の調製のための分解工程に長時間を要し、経済的でない。
【００１３】
本発明に使用するヒアルロン酸および／またはその塩は、その分子量分布において、分子量１，０００以上の成分の割合が４０％以上であり、かつ、分子量５，０００以上の成分の割合が４０％以下であって、好ましくは、分子量１，０００未満の成分の割合が２０％以上である。また、皮膚の含水量を増加する効果の優位性の点で、分子量１，０００未満の成分の割合が３０％以上であり、かつ、分子量５，０００以上の成分の割合が２０％以下であることがより好ましく、分子量１，０００未満の成分の割合が４０％以上であり、かつ、分子量５，０００以上の成分の割合が１０％以下であることがさらに好ましい。このような分子量分布のヒアルロン酸および／またはその塩を使用することにより、特に経口摂取した場合に、皮膚の含水量を効果的に増加させることができる。
【００１４】
本発明で規定される平均分子量および分子量分布の測定方法について説明する。
【００１５】
本発明で規定される平均分子量および分子量分布は、ゲル濾過カラムを用いてヒアルロン酸および／またはその塩を液体クロマトグラフィー分析することにより得られる。ヒアルロン酸および／またはその塩は、反復構造単位（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸）の数によって異なる分子量を有する複数の成分の混合物である。したがって、ゲル濾過カラムを用いてヒアルロン酸および／またはその塩の水溶液について液体クロマトグラフィー分析を行うことにより、ヒアルロン酸および／またはその塩を構成する成分を分子サイズにより分離することができる。
【００１６】
本発明におけるヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量および分子量分布は、ＨＰＬＣ分析装置（商品名「アライアンスＰＤＡシステム」、日本ウォーターズ株式会社製）にゲル濾過カラム（商品名「Ｄｉｏｌ−１２０」、株式会社ワイエムシイ製）を接続して、ヒアルロン酸および／またはその塩の０．１％（ｗ／ｖ）水溶液を分析サンプルとして、この分析サンプルを液体クロマトグラフィー分析することにより測定することができる。
【００１７】
液体クロマトグラフィー分析の条件は以下の通りとする。
カラム温度：４０℃
流速：１ｍＬ／分
ヒアルロン酸および／またはその塩の０．１％（ｗ／ｖ）水溶液の注入量：２０μＬ
移動相：０．００３ｍｏｌ／Ｌ  リン酸バッファー（０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．０）
紫外線検出器：λ＝２１０ｎｍで測定
本発明に係るゲル濾過カラムを用いた液体クロマトグラフィーでは、保持時間が長いものほど低分子である。保持時間の長い順に、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−グルクロン酸、ヒアルロン酸（二糖：繰り返し構造単位１つ）、ヒアルロン酸（四糖：繰り返し構造単位２つ）、ヒアルロン酸（六糖：繰り返し構造単位３つ）、ヒアルロン酸（八糖：繰り返し構造単位４つ）・・・のピークが得られる。
【００１８】
一例として、図１に示すクロマトグラムから得られた各分子量成分の繰り返し単位数および保持時間の関係を表１に示す。
【００１９】
【表１】
0005723919.tif 000002
【００２０】
本発明で規定される平均分子量は、所定の分子量に対応する保持時間によりピークを分割することにより、所定の分子量を有する成分の割合を求めることによって算出される。また、各ピークが示す分子量は、分子量が既知のヒアルロン酸および／またはその塩の最小構成単位（二糖）について同様の方法で液体クロマトグラフィー分析して得られたクロマトグラム中のピークと照会することにより同定される。所定の分子量と、所定の分子量を有する成分の割合（面積％）の積を、各ピークごとに算出し、全てのピークについての積の和を求めることにより、平均分子量を求めることができる。
【００２１】
本発明で規定される分子量分布は、所定の分子量（１，０００または５，０００）に対応する保持時間によりピークを分割することにより、所定の分子量範囲にある成分の割合を求める。
【００２２】
例えば、分子量１，０００以上の成分の割合は、分子量１，０００に対応する保持時間以前の成分の吸収面積を全吸収面積で除すことにより求めることができる。同様に、分子量５，０００以上の成分の割合は、分子量５，０００に対応する保持時間以前の成分の吸収面積を全吸収面積で除すことにより求めることができる。
【００２３】
本発明のヒアルロン酸および／またはその塩は、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）と結合することによる沈殿や濁りを生じないことを特徴とする。ＣＰＣ沈殿法は、ムコ多糖類の確認試験として用いられている試験方法である。ヒアルロン酸に代表されるムコ多糖類は、ＣＰＣ等の四級アンモニウム塩と結合して沈殿を起こすことが知られている。本発明においては、ＣＰＣ沈殿法で得られた液を、本発明の低分子ヒアルロン酸および／またはその塩の特徴を評価するための指標の一つとして用いることができる。
【００２４】
本実施形態に係るヒアルロン酸および／またはその塩は、上記低分子ヒアルロン酸および／またはその塩の０．１ｍｇ／ｍＬ水溶液（１０ｍＬ）に、０．５ｇ／ｍＬのＣＰＣ水溶液（０．０５ｇ）を添加して得られた液の吸光度（Ａ６６０）が０．１Ａｂｓ以下であることが好ましい。すなわち、吸光度（Ａ６６０）は、波長６６０ｎｍの光に対する吸光度であり、液の「濁り」を同定するための指標として広く用いられている。
【００２５】
ここで、本実施形態に係るヒアルロン酸および／またはその塩は、その分子量および分子量分布の特性により、上記混合液を調製した場合、沈殿を形成せず、白濁も生じない。すなわち、上記吸光度の値は、本実施形態に係るヒアルロン酸および／またはその塩の特徴を示す指標となる。
【００２６】
本発明で用いる上記ヒアルロン酸および／またはその塩の代表的な製造方法を以下に述べる。なお、本発明で用いるヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法は、これに限定するものではない。
【００２７】
上記ヒアルロン酸および／またはその塩の原料であるヒアルロン酸および／またはその塩（以下、「原料ヒアルロン酸およびその塩」ともいう）は一般に、鶏冠、臍の緒、眼球、皮膚、軟骨等の生物組織、あるいはストレプトコッカス属の微生物等のヒアルロン酸生産微生物を培養して得られる培養液等を原料として、これらの原料から抽出（さらに必要に応じて精製）して得られるものである。例えば、鶏冠より抽出される原料ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量は通常２００万から８００万である。
【００２８】
上記ヒアルロン酸および／またはその塩の低分子化は、酸やアルカリ、酵素等によって、上記原料ヒアルロン酸および／またはその塩を加水分解することにより行うことができ、特に酸性水溶液中で加水分解を行うことが好ましい。酸性水溶液中でヒアルロン酸および／またはその塩の加水分解を行うことにより、経済的に、褐変のないヒアルロン酸および／またはその塩を得ることができる。ここで、加水分解中に、攪拌速度や攪拌時間を調整することにより、低分子化の度合いを調整することができる。また、上述の加水分解工程を加熱条件下で行うことにより、目的の分子量まで安定に低分子化することができる。例えば、原料ヒアルロン酸および／またはその塩を、酸やアルカリ、酵素等を含む水溶液中に攪拌しながら添加し、得られた水溶液を加熱することができる。あるいは、酸やアルカリ、酵素等を含む水溶液を予め加熱し、これに原料ヒアルロン酸および／またはその塩を添加し、温度を保持してもよい。
【００２９】
上記製造方法において、加水分解を行うために使用する酸としては、塩酸や硫酸、酸性陽イオン交換樹脂等が挙げられる。アルカリとしては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等が挙げられる。酵素としては、ヒアルロニダーゼ等が挙げられる。
【００３０】
上記製造方法において、酸性水溶液中でヒアルロン酸および／またはその塩を加水分解する場合、好ましくはｐＨを０．６以下、より好ましくは０．４以下とすることにより、特に効率的に加水分解を行うことができ、他の方法に対して短時間で本発明のヒアルロン酸および／またはその塩を得ることができる。
【００３１】
上記製造方法において、酸性水溶液は、水および酸を含む液体に、ヒアルロン酸および／またはその塩を溶解した液をいう。酸性水溶液中に含まれるその他の成分は特に限定されないが、例えば液体であって、水に溶解する性質を有し、かつ、医薬品または食品の製造工程において使用できるものが好ましい。例えば、アルコール系媒体（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコールなど）、ケトン系媒体（例えば、アセトン、メチルエチルケトンなど）、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を挙げることができ、これらを単独または組み合わせて使用することができる。
【００３２】
なお、上記ヒアルロン酸からヒアルロン酸の塩へと変換する方法、ならびに上記ヒアルロン酸の塩からヒアルロン酸へと変換する方法は、特に限定されるわけではない。上記ヒアルロン酸からヒアルロン酸の塩へと変換する方法としては、例えば、アルカリ水溶液（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アンモニウム等の水溶液）を用いて処理する方法が挙げられる。また、上記ヒアルロン酸の塩からヒアルロン酸へと変換する方法としては、例えば、酸水溶液（例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の水溶液）を用いて処理する方法や、酸性陽イオン交換樹脂を用いる方法が挙げられる。
【００３３】
本発明の一実施形態に係る食品組成物は、上記ヒアルロン酸および／またはその塩を含有する。上記食品組成物の態様は特に限定されないが、例えば、ガム、キャンディー、グミキャンディー、トローチ様食品、ゼリー飲料、米飯加工食品、製パン類、レトルト缶詰、冷凍食品、惣菜、乾燥食品、マヨネーズ等調味料、飲料、菓子、デザート類、サプリメント類等の一般食品全般、生理機能を表現することを許可された特定保健用食品全般が挙げられる。上記食品組成物が上記ヒアルロン酸および／またはその塩を含有することにより、上記食品組成物を経口摂取することによって、皮膚の含水量を増加する効果を発揮することができる。
【００３４】
本発明の一実施形態に係る食品組成物中に配合する上記ヒアルロン酸および／またはその塩は、０．００１〜５０％程度が好ましく、０．００５〜３０％程度がより好ましい。ヒアルロン酸および／またはその塩の配合量が、前記範囲より多くなると、ヒアルロン酸および／またはその塩の風味が強くなり、食品組成物本来のおいしさが損なわれるおそれがあるため、好ましくない。一方、前記範囲より少なくなると、ヒアルロン酸および／またはその塩の皮膚含水量増加効果が現れにくく、商品価値が低くなるため好ましくない。
【００３５】
本発明の一実施形態に係る経口医薬品組成物は、上記ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する。上記経口医薬品組成物の態様は特に限定されないが、内服剤等が挙げられ、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤、内服液剤、シロップ剤、チュアブル剤、乳剤等が挙げられる。上記経口医薬品組成物が上記ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有することにより、上記経口医薬品組成物を経口摂取することによって、皮膚の含水量を増加し、皮膚を瑞々しい状態に改善する効果を発揮することができる。
【００３６】
本発明の経口用皮膚改善剤または経口用皮膚含水量増加剤の摂取量は、ヒアルロン酸および／またはその塩として、１０〜２，０００ｍｇ／日が好ましく、５０〜５００ｍｇ／日がより好ましい。上記ヒアルロン酸の摂取量が前記範囲より多くなると、皮膚の含水量を効果的に増加させる摂取量を超える場合があり、経済的でない。一方、前記範囲より少なくなると、ヒアルロン酸および／またはその塩が有する、皮膚の含水量の増加効果や皮膚改善効果が現れにくく、商品価値が低くなるため好ましくない。
【００３７】
本発明の経口用皮膚改善剤ならびに経口用皮膚含水量増加剤は、上記ヒアルロン酸および／またはその塩をそのまま経口用皮膚改善剤または経口用皮膚含水量増加剤として用いるのが好ましいが、精製水等の溶媒、デキストリン等の賦形剤あるいは他の食品または医薬品として許容される原料を添加してもよい。その際、上記ヒアルロン酸および／またはその塩の含有量は、食品または医薬品への配合量や配合し易さを考慮し、０．１％以上が好ましく、１％以上がより好ましい。
【００３８】
以下、本発明で用いる平均分子量１，０００以上５，０００未満であるヒアルロン酸および／またはその塩について、実施例等に基づき具体的に説明する。なお、本発明は、これらに限定するものではない。
【実施例】
【００３９】
〔調製例１〕
本調製例では、原料として、鶏冠より抽出、精製したヒアルロン酸ナトリウム（以下「ＨＡＮａ」ともいう）微粉末を準備した。この原料ＨＡＮａの平均分子量は約２１０万、純度９７％であった。
【００４０】
まず、攪拌機およびジャケットを装備した５００Ｌ容タンクに、蒸留水２００Ｌを満たし、３５％塩酸を１８ｋｇ加えてｐＨを０．３に調整した。攪拌しながら液温が７０℃となるよう加熱し、達温後、攪拌しながら、準備した原料ＨＡＮａ微粉末１１．５ｋｇをタンクに投入した。液温を７０℃に維持するよう加熱を行いながら、原料ＨＡＮａ微粉末を溶解した。
【００４１】
次に、７時間攪拌してからヒアルロン酸溶液を冷却し、酸性水溶液中での分解反応を停止した。得られたヒアルロン酸溶液を、２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に中和した。
【００４２】
次いで、中和した溶液を脱塩処理した後、スプレードライを行い、白色微粉末のヒアルロン酸ナトリウム７．５ｋｇ（収率約６５％）を得た。このヒアルロン酸ナトリウムは、平均分子量が１，１００であり、分子量分布において、分子量１，０００以上の成分の割合が４７％でかつ分子量５，０００以上の成分の割合が０％であった。また、分子量１，０００未満の成分の割合が５３％であった。また、得られたヒアルロン酸ナトリウムの０．１ｇ／ｍＬ水溶液（１０ｍＬ）に、０．５ｍｇ／ｍＬの塩化セチルピリジニウム水溶液（０．０５ｇ）を添加して得られた液の吸光度（Ａ６６０）は０．０１Ａｂｓであった。
【００４３】
〔試験例１〕
本試験例においては、本発明のヒアルロン酸ナトリウムをマウスに経口投与して、皮膚への効果を調べた。
【００４４】
マウスは雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系マウス（ＳＰＦ）６週齢を使用した（日本チャールズリバー株式会社より購入）。なお、マウスは搬入後６日間訓化させてから試験に用いた。
【００４５】
試料は以下の３種類を使用した。
試料１：上記調製例１で得られたヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量１，１００）
試料２：ヒアルロン酸（平均分子量３０，０００）
試料３：蒸留水（対照）
なお、試料２は市販品を用い、分子量は動粘度を測定し、常法に従い求めた。
【００４６】
訓化後のマウスの体重を測定し、それを指標に以下の３群に分けた。
試料群１：試料１を２００ｍｇ／ｋｇ／日経口摂取する群    ５匹
試料群２：試料２を２００ｍｇ／ｋｇ／日経口摂取する群    ５匹
試料群３：蒸留水（対照）を経口摂取する群                ５匹
【００４７】
まず、試料１、２を１．１ｇ／Ｌとなるように蒸留水に溶解し、この試料水溶液を各試料群に対して、１日あたり３ｍＬ（ヒアルロン酸として２００ｍｇ／ｋｇ／日）を経口投与した。試料群３には、蒸留水を１日あたり３ｍＬ経口投与した。１４日間の投与試験後、マウスを開腹して後大動脈から採血し、採血後に安楽死せしめた。次いで、マウス背部の皮膚全層を採取し、生検トレパン（先端径φ８ｍｍ）を使用して、皮膚全層を同一の大きさとなるよう、マウス１匹あたり２箇所を採取した（単位面積：１００．５ｍｍ２）。
【００４８】
得られた皮膚全層サンプルについて、皮膚の厚さ、皮膚の湿重量、皮膚乾燥重量、皮膚水分重量、皮膚中ヒアルロン酸濃度を測定した。皮膚の厚さは、マイクロメータを使用して測定した。皮膚乾燥重量は、皮膚湿重量を測定後、皮膚を凍結乾燥し、皮膚水分重量および皮膚乾燥重量を測定した。皮膚中のヒアルロン酸濃度は、皮膚をホモジナイズしてから蛋白質分解酵素処理を行い、ヒアルロン酸を抽出し、濾過した後、ヒアルロン酸結合性蛋白質（ＨＡＢＰ）を用いたマイクロタイターアッセイ法にて測定した。
【００４９】
得られた血液は、１時間放置後に３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、血清を採取した。これを限外濾過した後、蛋白質分解酵素で処理し、濾過した後、ヒアルロン酸結合性蛋白質（ＨＡＢＰ）を用いたマイクロタイターアッセイ法にて血清中のヒアルロン酸濃度を測定した。
【００５０】
それぞれの試料群について、測定結果の平均値を算出した。試料群１〜３の実測値、および試料群３の平均値を１００としたときの試料群１、２の平均値を表２に示す。
【００５１】
【表２】
0005723919.tif 000003
【００５２】
表２より、試料群１のマウスは、試料群２、３のマウスに比べ、血清中のヒアルロン酸濃度はほぼ同等である一方、皮膚中ヒアルロン酸濃度、皮膚の厚さ、皮膚湿重量、皮膚乾燥重量、皮膚水分重量が増加していた。したがって、試料１のヒアルロン酸ナトリウムの経口摂取を行うことにより、皮膚重量や皮膚中の水分重量、皮膚の厚さを効果的に増加することがわかった。
【００５３】
〔調製例２〕
調製例１と同様の方法にて、ＨＡＮａを酸性水溶液中で加水分解を行い、反応開始から２時間攪拌後に冷却することにより、分解反応を停止した。次いで、ヒアルロン酸溶液をフリーズドライし、得られたヒアルロン酸含有乾燥物を５００Ｌ容タンクに戻した。そこへ８０％含水エタノールを２００Ｌ加え、塩酸除去の目的で攪拌を１５分間行った。ここで、８０％含水エタノールは、エタノールを８０％含有し、水を２０％含有するものである。１５分間攪拌後に静置した後、上澄みの含水エタノールをデカンテーションにより除去し、残留物を得た。塩酸の残留がなくなるまでこの操作を繰り返した。
【００５４】
塩酸除去後の残留物について、遠心分離を行うことにより含水エタノールをさらに除去した後、真空乾燥機を用いて常温、シリカゲル存在下、減圧下で１２時間乾燥した。以上の工程により、白色微粉末のヒアルロン酸７．９ｋｇ（収率約６９％）を得た。このヒアルロン酸は、平均分子量が４，６００であり、分子量分布において、分子量１，０００以上の成分の割合が９４％であって、分子量５，０００以上の成分の割合が３７％であり、また、分子量１，０００未満の成分が６％であった。また、得られたヒアルロン酸の０．１ｇ／ｍＬ水溶液（１０ｍＬ）に、０．５ｇ／ｍＬの塩化セチルピリジニウム水溶液（０．０５ｇ）を添加して得られた液の吸光度（Ａ６６０）は０．０６Ａｂｓであった。
【００５５】
〔試験例２〕
調製例１で得られたヒアルロン酸ナトリウムを使用して、下記の配合のゼリー飲料を製した。得られたゼリー飲料の風味・食感は良好であった。
＜配合割合＞  
調製例１のヒアルロン酸ナトリウム      ０．０５％
洋梨果汁（濃縮還元）                １０．０％
ブドウ糖果糖液糖                      ８．０％
甘味料                                ０．１％
酸味料                                ０．３％
ゲル化剤                              ０．７％
洋梨香料                              ０．１％
精製水                              残量
――――――――――――――――――――――――
１００％
【００５６】
〔試験例３〕
調製例２で得られたヒアルロン酸を使用して、下記の配合の清涼飲料を製した。得られた清涼飲料の風味は良好であった。
＜配合割合＞  
調製例２のヒアルロン酸                ０．１％
ブドウ糖果糖液糖                    １２．０％
酸味料                                ０．２％
甘味料                                ０．１％
アスコルビン酸                        ０．１％
グレープフルーツ香料                  ０．１％
精製水                              残量
――――――――――――――――――――――――
１００％
【００５７】
〔試験例４〕
調製例１で得られたヒアルロン酸ナトリウムを使用して、下記の配合の分離液状調味料を製した。得られた分離液状調味料の風味は良好であった。
＜配合割合＞
調製例１のヒアルロン酸ナトリウム      ０．５％
サラダ油                            ３５％
食酢（酸度４％）                    ２２％
レモン果汁                          １０％
ブドウ糖果糖液糖                      ５％
食塩                                  ３％
砂糖                                  ２％
グルタミン酸ソーダ                    ０．２％
香辛料                                ０．１％
キサンタンガム                        ０．０５％
清水                                残量
――――――――――――――――――――――――
１００％
【００５８】
〔試験例６〕
調製例２で得られたヒアルロン酸を使用して、内容物が下記の配合であるソフトカプセルを製した。
＜配合割合＞
調製例２のヒアルロン酸              ２０％
オリーブ油                          ５０％
ミツロウ                            １０％
中鎖脂肪酸トリグリセリド            １０％
乳化剤                              １０％
――――――――――――――――――――――――
１００％
【００５９】
〔試験例６〕
調製例１で得られたヒアルロン酸ナトリウムを使用して、下記の配合の散剤（顆粒剤）を製した。
＜配合割合＞  
調製例１のヒアルロン酸ナトリウム    １０％
乳糖                                ６０％
トウモロコシデンプン                ２５％
ヒプロメロース                        ５％
――――――――――――――――――――――――
１００％
【００６０】
〔試験例７〕
調製例２で得られたヒアルロン酸を使用して、下記の配合の錠剤を製した。
＜配合割合＞  
調製例２のヒアルロン酸              １５％
ヒアルロン酸（分子量１００万）      １０％
乳糖                                ２４％
結晶セルロース                      ２０％
トウモロコシデンプン                １５％
デキストリン                        １０％
乳化剤                                ５％
二酸化ケイ素                          １％
――――――――――――――――――――――――
１００％
【図１】
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