(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の連続ステップ、
ａ）齧歯類への腫瘍細胞の適用；
ｂ）経時的な前記齧歯類の腫瘍サイズが１００ｍｍ3超までの腫瘍サイズの測定；
ｃ）前記齧歯類へのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの適用；及び
ｄ）経時的な前記腫瘍形成齧歯類の腫瘍サイズの測定、
を含んでなる、モノクローナル抗体の抗腫瘍効果の決定方法。
【請求項２】
ａ）ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の抗腫瘍効果の評価のために請求項１に記載の方法を使用すること、且つ
ｂ）ａ）において抗腫瘍効果が評価された複数のモノクローナル抗体の中から、１〜３つのモノクローナル抗体を選択すること、
を特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前臨床的齧歯類検査におけるモノクローナル抗体の抗腫瘍効果の決定方法、及び付帯検査（side testing）の低減のための前記方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療的癌処置のためのモノクローナル抗体は、費用及び時間のかかる評価処置を受ける。通常これらは、例えば代表的な腫瘍抗原又はその断片での免役化に由来し、当該腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生み出す。さらなる調査評価の前に、時間のかかる精製処置を行わなければならず、その後、最初にインビトロにおいて（in vitro）、そしてその後前臨床的動物研究において評価される。インビトロ研究においては主に、それぞれの腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体の結合親和性、及び前臨床的動物検査に必須であるヒト腫瘍細胞への増殖阻害が決定される。しかしながら、インビトロ腫瘍細胞増殖阻害は、常にインビボ（in vivo）異種移植片動物研究における効果と相関するわけではないことがわかっている。インビトロでの良好な抗増殖活性を有する抗体は、前臨床的インビボモデルにおいて全体的に不活性化でき、一方で、インビトロ不活性化抗体が、顕著なインビボ効果を達成し得ることがわかっている。したがって、一般的に、かかる抗体のための前臨床的動物検査は、広範に及び且つ時間がかかり、且つインビトロ研究の予測可能性が不良であるために多数の異なる抗体を検査しなければならない。したがって、前臨床的動物検査の低減、及びより時間のかからない処置は、腫瘍疾患に対するモノクローナル抗体の開発において１つの重要な課題である。
【０００３】
Staquet及びGiles-Komar（Hybridoma 2006; 25: 68-74）は、モノクローナル抗体のインビボ評価の方法について記載している。彼等は、マトリゲル中のハイブリドーマをマウスへ皮下から注入した。４日後、腫瘍細胞を同じマウスに皮下から注入し、そして腫瘍増殖を経時で測定した。コントロールハイブリドーマと比較して低減した腫瘍増殖又は腫瘍無増殖により、それぞれのハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体の抗増殖効果が示唆された。この方法により、非抗腫瘍活性抗体と、抗腫瘍活性抗体を区別することができる。しかしながら、この方法は、抗体間の抗増殖潜在能力の識別ができないか、又は単に不良でしかなく、当該抗体はさらにハイブリドーマから精製しなければならず、且つ、その抗増殖潜在能力のさらなる評価のために再び検査しなければならない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の１つの態様は、以下の連続ステップ、
ａ）齧歯類への腫瘍細胞の適用；
ｂ）経時的な前記齧歯類の腫瘍サイズが１００ｍｍ3超までの腫瘍サイズの測定；
ｃ）前記齧歯類へのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの適用；及び
ｄ）経時的な前記腫瘍形成齧歯類の腫瘍サイズの測定、
を含んでなる、モノクローナル抗体の抗腫瘍効果の決定方法である。
【０００５】
本発明による方法は、精製及びインビトロ事前選択後に行われる従来の検査及び優先順位付けと比較して、免役化後の抗腫瘍効果を有する新規な治療抗体を、同定、識別、及び優先順位付けするために、より迅速且つ効率的な手法である。
【０００６】
本発明の別の態様は、前臨床的検査の低減のための前記方法の使用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Staquetらによる方法（実施例１）を適用した場合、Ｃａｌｕ−３異種移植片モデルにおける腫瘍増殖に対する抗体産生ハイブリドーマの効果。
【図２】本発明による新規な方法（実施例２）における、Ｃａｌｕ−３異種接移植片モデルにおける腫瘍増殖に対する抗体産生ハイブリドーマの効果。
【図３】本発明の新規な方法（実施例３）における、Ｃａｌｕ−３異種移植片モデルにおける腫瘍増殖に対する精製抗体の効果。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の１つの実施態様は、以下の連続ステップ、
ａ）齧歯類への腫瘍細胞の適用；
ｂ）経時的な前記齧歯類の腫瘍サイズが１００ｍｍ3超までの腫瘍サイズの測定；
ｃ）前記齧歯類へのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの適用；及び
ｄ）経時的な前記腫瘍形成齧歯類の腫瘍サイズの測定、
を含んでなる、モノクローナル抗体の抗腫瘍効果の決定方法である。
【０００９】
ステップａ）において、適用は、好ましくは、皮下、同所的又は静脈内注入であり、より好ましくは、皮下注入であり、腫瘍細胞はヒトであり、齧歯類は好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスである。
【００１０】
ステップｂ）において、腫瘍サイズは、１００ｍｍ3と３００ｍｍ3の間である。
【００１１】
ステップｃ）において、適用は、好ましくはマトリゲル中又は中空繊維中、好ましくはマトリゲル中のハイブリドーマの皮下注入である。
【００１２】
副作用のために、齧歯類を犠牲にし、且つさらに調べる、任意のさらなるステップｅ）が追加される。
【００１３】
かかるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、腫瘍細胞の細胞表面に発現される腫瘍抗原に結合する抗体であり、本発明の方法において使用される。
【００１４】
本明細書において使用される場合「モノクローナル抗体」なる用語は、単一のアミノ酸組成物の抗体分子調製物のことを言う。これは、それぞれの腫瘍抗原で免役化後、「ハイブリドーマ」により産生される。抗原は、免役化のために、例えばマウスもしくはラット、又はその他の動物に任意の好適な手段で導入されてよい。好ましくは、動物は、単独又は適切な免疫調節剤（例えば、ＣＦＡ）との組合せで、脾臓内、静脈内、腹腔内、皮内、筋肉内、皮下から免疫化される。各々の抗原の用量は、好ましくは、１〜５００μｇの範囲である。得られるマウスリンパ球を、単離し、そしてハイブリドーマ作製のための標準的プロトコールに基づき、ＰＥＧ又は電気融合を用いて、ヒトもしくは異種骨髄腫細胞と融合させる。電気融合は、電場の影響により引き起こされ、且つ新規で生存可能な生細胞を創出するための完全な構造（構造、膜、細胞小器官、細胞原形質）を含む、同種もしくは異種起源の２以上の細胞の融合のための、細胞の広範囲のスペクトルのための利用可能である、細胞膜の可逆的な構造的電荷に基づく。これは、本発明による方法に適するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをもたらす。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「結合」又は「特異的結合」なる用語は、インビトロアッセイにおける、好ましくはＣＨＯ細胞発現野生型抗原での細胞ベースのＥＬＩＳＡにおける、腫瘍抗原のエピトープへの抗体の結合のことを言う。結合は、１０-8Ｍ以下、好ましくは１０-13Ｍ〜１０-9Ｍの結合親和性（ＫD）のことを意味する。抗原への抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）により調べることができる。結合の親和性は、ｋa（抗体／抗原複合体から抗の抗体の結合速度定数）、ｋD（解離定数）、及びＫD（ｋD／ｋa）なる用語により定義される。
【００１６】
本発明による方法は、複数の理由から精製抗体の従来的な検査よりも改善を呈する（表１も参照されたい）：抗体精製前の優先順位付けにより、最も有効で、最も注目されるハイブリドーマのみがさらなる特徴付けのために精製されるだけでよく、これは、（多くの精製抗体が試験されなければならない場合と比較して）抗体精製数の顕著な低減を意味し、新規な治療抗体の開発を加速し、且つ治療抗体開発のために必要な一般的な検査労力を低減させる。低産生性ハイブリドーマの抗体は、さらなる評価については無視されることが多く（この無視は、十分に精製された抗体の取得を困難にさせるハイブリドーマの作製率が低いことに起因し、治療的特性に起因するものではない）、治療特性の評価のためにより容易に利用可能である。
【００１７】
【表１】
0005722780.tif 000002
【００１８】
本発明のさらなる態様は、前臨床齧歯動物検査の低減のための方法であり、
ａ）ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の抗腫瘍効果の評価のために、上記のモノクローナル抗体の抗腫瘍効果の決定のための方法を使用すること、及び
ｂ）１〜３つのモノクローナル抗体、好ましくは１つのモノクローナル抗体を、さらなる前臨床的評価のために優先順位付けすること、
を特徴とする。
【００１９】
かかるさらなる前臨床評価は、同じか又はその他のいずれかの前臨床的動物検査においてなされることができる。早期の優先順位付けの本方法を用いることにより、前臨床動物検査において精製抗体の広いスペクトルを広く検査するかわりに、少数のモノクローナル抗体薬物候補だけを、さらなる前臨床動物検査において評価するだけでよい。すなわち、齧歯類における前臨床動物検査のうち最大５０％までの低減が達成できる。
【００２０】
以下の例及び図は、本発明の理解の支援のために提供され、本発明の真の範囲は、添付の請求の範囲に示される。修正は本発明の要旨から逸脱することなく示される手法で行うことができる。
【実施例１】
【００２１】
ヒト肺腫瘍異種移植片における抗ＨＥＥ３抗体産生ハイブリドーマの効果（Sraquetらの方法）
【００２２】
Staquet及びGiles-Komarにより発表された方法に基づき、ＨＥＲ３に対する抗体を産生する４つの異なるハイブリドーマを、メスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに注入した。ハイブリドーマ（5×10e5）を１００マイクロリッターのマトリゲルと４℃で混合し、すぐに肩領域に皮下注入した。Ａｇ８細胞をコントロールとして容易した。その一週間後、細胞表面上でのＨｅｒ３抗原を発現するＣａｌｕ−３腫瘍細胞（5×10e6／１００マイクロリッター）を反対の方に皮下から注入した。その後、腫瘍容量を１０日間キャリパーで観測した。
【００２３】
図１は、ハイブリドーマから分泌される抗体が腫瘍増殖を抑制することを示唆する。しかしながら、腫瘍容量に基づき、差異が測定されないため、抗腫瘍効果に関して異なるハイブリドーマの優先順位付けすることができない。
【実施例２】
【００２４】
ヒト肺腫瘍異種移植片における抗ＨＥＲ３抗体産生ハイブリドーマの効果（新規な最適方法）
【００２５】
Ｃａｌｕ−３腫瘍細胞（5×10e6／１００マイクロリッター）をメスＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下注入した。４４日後、腫瘍保持マウスを無作為化し、そして異なる群に分割した。腫瘍容量の平均は１３０ｍｍ3であった。StaquetとGiles-Komarにより記載された方法とは対照的に、抗Ｈｅｒ３抗体を産生するハイブリドーマは、マトリゲルと混合され、腫瘍細胞注入とは逆の部位に皮下注入された。さらに、２つのハイブリドーマ（クローン３１及びクローン３３）をこの実験に含めた。抗原Ａｇ８細胞をハイブリドーマコントロールとして使用した。
【００２６】
図２は、２３日後、ハイブリドーマクローン３３、１２及び２９の注入が、最も強力な抗腫瘍効果を誘導することを実証する。対照的に、クローン１８、３０、及び３１は、腫瘍の増殖に効果を発揮せず、予想通り、ハイブリドーマＡｇ８を無効化した。この最適化方法は、その抗腫瘍効果に関して異なるハイブリドーマの選択を可能にする。
【００２７】
図１と図２の比較は、新規な方法は、Staquet及びGiles-Komarにより、記載される方法よりも優れていることを実証する。この出願は、確立した腫瘍を保持するマウスへのハイブリドーマの注入についての記載があり、ハイブリドーマにより分泌される抗体の効果について、臨床的状況をより適切に反映して結論を出すことができる。
【実施例３】
【００２８】
ヒト肺腫瘍異種接合片におけるハイブリドーマ上清から精製された抗体の抗腫瘍効果の評価
【００２９】
本実施例では、治療抗体の開発のための従来のアプローチについて記載し、且つ実施例２において記載された実験の結果を補助する。
【００３０】
Ｈｅｒ３抗原に対する抗体は、６つの異なるハイブリドーマの上清から精製されている。これらの抗体を、関連する異種移植片における抗腫瘍活性について試験した。
【００３１】
Ｃａｌｕ−３腫瘍細胞（5×10e6／１００マイクロリッター）をメスＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下注入した。３５日後、腫瘍保持マウスを無作為化し、そして異なる群に分割した。腫瘍容量の平均は８０ｍｍ3であった。マウスに、腹腔内注入により異なる抗体を、１週間に１回、５週間の処置をした。腫瘍容量を、全研究期間にわたってキャリパーで１週間に２回観測した。クローン１２に由来する抗体（腫瘍増殖阻害６６％）、クローン３３に由来する抗体（腫瘍増殖阻害５０％）、及びクローン２９に由来する抗体（腫瘍増殖阻害４７％）を、腫瘍増殖抑制について最も有効なものとして同定した。対照的に、クローン１８、３０、及び３１に由来する抗体は効果がなかった（図３）。
【００３２】
図２と図３の比較は、確立した腫瘍を有するマウスに注入されているハイブリドーマが、関連するハイブリドーマの上清から精製された精製抗体の治療効果と同等の抗腫瘍活性を発揮することを実証している。
【００３３】
さらに、効果のないハイブリドーマについて、ハイブリドーマ由来の精製抗体は、腫瘍増殖を縮小させなかった。これらの結果は、改善した方法の妥当性を実証している。
【００３４】
これは、当該精製には、評価及び優先順位付けがもはや必要ないという、治療抗体の評価について実験的成果の明確な低減を意味する。
【図１】
0005722780.tif 000003
【図２】
0005722780.tif 000004
【図３】
0005722780.tif 000005