(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に１，２−プロパンジオールを生産するように操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）大腸菌であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｆｕｃＯ）をコードする遺伝子、ならびにグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｄＡ）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）及びメチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓＡ）をコードする遺伝子を、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、大腸菌。
【請求項２】
グリセロールが８０％〜９０％の純度を有する、請求項１に記載の大腸菌。
【請求項３】
グリセロールデヒドラターゼをコードする追加遺伝子を、前記グリセロールデヒドラターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性、ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性及びメチルグリオキサールシンターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、請求項１または２に記載の大腸菌。
【請求項４】
アルド−ケトレダクターゼをコードする追加遺伝子を、前記アルド−ケトレダクターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性、ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性及びメチルグリオキサールシンターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、請求項１または２のいずれか１つに記載の大腸菌。
【請求項５】
少なくとも、
ｉ）アラビノース
ｉｉ）メチルグリオキサール
ｉｉｉ）ジヒドロキシアセトンリン酸
からなる群より選択される化合物の代謝に欠陥を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の大腸菌。
【請求項６】
グリオキシラーゼ系Ｉ（ｇｌｏＡ）をコードする遺伝子が、グリオキシラーゼ系Ｉ活性の発現が減少するかまたは完全に阻害されるように不活化されることにより、メチルグリオキサールの代謝に欠陥を有する、請求項５記載の大腸菌。
【請求項７】
グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に１，２−プロパンジオールを生産するが、１，３−プロパンジオールは本質的に生産しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の大腸菌。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の大腸菌を、グリセロールを含有する適当な増殖培地で増殖させた後、生産された１，２−プロパンジオールを回収し、そして場合によっては、それを精製することを含む、１，２−プロパンジオールの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞中でグリセロールから1，2−プロパンジオールを生産するための方法に関する。より具体的に述べると、本発明は、グリセロールの純粋調製物及び粗調製物からプロパンジオールのもっぱら1，2−異性体だけを合成することを可能にする組換え酵素活性を記載する。本発明は、1，2−プロパンジオールの生産にとって鍵となる活性の過剰発現と不活化との適切な組合せも提供する。
【背景技術】
【０００２】
1，2−プロパンジオール（プロピレングリコール；1，2−PD）は、不飽和ポリエステル樹脂、医薬製剤及び化粧品、液状洗剤、冷却剤及び不凍液又は防氷液の構成要素として広く使用される重要なバルクケミカルである。1，2−PDは光学活性であるから、1，2−PDのエナンチオマー的に純粋な調製物は、医学的、農学的又は生理学的応用に、特別な関心が持たれる可能性がある。
【０００３】
現在、1，2−プロパンジオールは、エピクロルヒドリンやヒドロペルオキシドのような毒性化合物を大量に取り扱う必要がある化学合成によって、石油化学製品から生産されている。従来の化学合成では、プロピレンから生産されるプロピレンオキシドの水和反応によって、1，2−PDが得られる。この化学合成はラセミ1，2−PDを与え、ポリグリコールの形成を防ぐために、大量の水を要求する。従来の化学合成は化石資源に依存し、大量の副産物の生成につながるため、環境面及び経済面で問題があると思われる。
【０００４】
1，2−プロパンジオールは、糖類を基質として、そこから微生物によって生産され得ることが知られている（Kluyver及びSchellen, 1937）（Heath, E. C., 1962）（Altaras, N. E, 2001）（Tran Din, K, 198）（Cameron, D. C., 1986）（Cameron, D. C, 1998）（Park, Y. H., 2006；米国特許第7,049,109B2号明細書）。
【０００５】
米国特許第6087140号明細書及び米国特許第6303352号明細書には、組換え生物による、6−デオキシヘキソース類を除く糖類からの1，2−PDの生産が記載されている。
【０００６】
国際公開第2005/073364号、米国特許出願公開第2007/072279号明細書には、不特定炭素源からの1，2−PDの生産について強化された能力を示す微生物を生じさせ、それを選択する方法が記載されている。より具体的に述べると、一組の遺伝子を不活化することによる単一の又は複数の突然変異を有する株の作出（これらの突然変異は、引き続いて、ケモスタット発酵による選択手法の根拠になる）が教示されている。応用の焦点はaldA及びgloA活性をコードする遺伝子の不活化にある。開示されている実施例は全て、少なくとも次に挙げる2つの遺伝子中に突然変異を有する大腸菌（E. coli）MG1655に関するものである：トリオースリン酸イソメラーゼ（tpiA）、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflAB）の両サブユニット。さらにまた、実施例では、発酵のための炭素源として、グルコースが具体的に挙げられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第7049109号明細書
【特許文献２】米国特許第6087140号明細書
【特許文献３】米国特許第6303352号明細書
【特許文献４】国際公開第2005/073364号
【特許文献５】米国特許出願公開第2007/072279号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kluyver及びSchellen, 1937
【非特許文献２】Heath, E. C., 1962；The Journal of Biological Chemistry（237）, 2423-2426
【非特許文献３】Altaras, N. E, 2001；Biotechnology Progress（17）, 52−56
【非特許文献４】Tran Din, K, 1985；Archives of Microbiology（142）, 87-92
【非特許文献５】Cameron, D. C., 1986；Bio/Technology（4）, 651-654
【非特許文献６】Cameron, D. C, 1998；Biotechnology Progress（14）, 116-125
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当分野では、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するための生物工学的プロセスを改善することが必要とされながら、その必要はまだ満たされていない。また、そのようなプロセスに使用することができる改良された微生物株が必要とされながら、その必要もまだ満たされていない。
【００１０】
本発明は、この分野における意義ある改良を今まで妨げてきた課題に対する解決策を提供することによって、この未だ満たされていない必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの課題を解決するために、本発明は、非発酵性の安価な炭素基質から1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するための改良された生物工学的プロセスであって、その炭素基質がバイオマスの生産を持続させつつ、同時に1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するための基質としても役立つようなプロセスを提供する。さらに本発明は、この手法の特別な要件に特に適合し、したがって本発明のプロセスにおける使用に特に適した、改良された微生物株を提供する。
【００１２】
特に本発明は、炭素基質がバイオマスの生産を持続させつつ、同時に1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するための基質としても役立つように、非発酵性炭素基質で増殖させた場合に、特にグリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に、高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するように操作された（engineered）宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、少なくとも70％、特に少なくとも75％、特に少なくとも80％、特に少なくとも85％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、特に少なくとも99％、且つ100％まで（前記範囲内の整数も全てここに含まれるものとする）の純度を有するグリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に、高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するように操作された宿主細胞、特に微生物又は株が提供される。
【００１４】
ある特定の実施形態では、グリセロールが80％〜90％の純度、特に約85％の純度を有する。
【００１５】
本発明の一実施形態では、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産ことができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）を過剰発現させるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子を導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株が提供される。
【００１６】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）からなる群より選択される少なくとも一つの酵素タンパク質が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）からなる群より選択される酵素活性をコードする少なくとも一つの追加遺伝子を、前記活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された前記宿主細胞、特に前記微生物又は株を提供する。
【００１７】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性をコードする遺伝子を、前記グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性をコードする遺伝子を、前記ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００１９】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、メチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性をコードする遺伝子を、前記メチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００２０】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性をコードする遺伝子を、前記グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性をコードする遺伝子を、前記グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００２２】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性をコードする遺伝子を、前記ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００２３】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性をコードする遺伝子を、前記グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００２４】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドラターゼ活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、グリセロールデヒドラターゼ活性をコードする遺伝子を、前記グリセロールデヒドラターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００２５】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にアルド−ケトレダクターゼ活性、特にdkgA、dkgB、yeaE及びyghZからなる群より選択される遺伝子（特に微生物遺伝子）によって付与されるアルド−ケトレダクターゼ活性が共発現されるように、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子と一緒に、アルド−ケトレダクターゼ活性をコードする遺伝子、特にdkgA、dkgB、yeaE及びyghZからなる群より選択される微生物遺伝子を、前記アルド−ケトレダクターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に発現されるような形で前記宿主細胞に共導入することによって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００２６】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる宿主細胞、特に微生物又は株であって、組換えDNA技法によって操作された宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。
【００２７】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる、上述した本発明の宿主細胞、特に微生物又は株であって、アラビノース代謝に欠陥を有する宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。ある実施形態において、前記宿主細胞、特に前記微生物又は株は、リブロースキナーゼ活性が低下しているか欠損しているために、アラビノース代謝に欠陥を有する。
【００２８】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる、上述した本発明の宿主細胞、特に微生物又は株であって、メチルグリオキサールの代謝に欠陥を有する宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。ある実施形態において、前記宿主細胞、特に前記微生物又は株は、グリオキシラーゼ（glyoxylase）系I活性、グリオキシラーゼ系II活性、乳酸デヒドロゲナーゼA活性、グリオキシラーゼ系III活性、アルデヒドデヒドロゲナーゼA活性からなる群より選択される酵素活性が低下しているか欠損しているために、とりわけグリオキシラーゼ系I活性が低下しているか欠損しているために、メチルグリオキサールの代謝に欠陥を有する。
【００２９】
ある実施形態において、本発明は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができる、上述した本発明の宿主細胞、特に微生物又は株であって、ジヒドロキシアセトンリン酸の代謝に欠陥を有する宿主細胞、特に微生物又は株を提供する。ある実施形態において、前記宿主細胞、特に前記微生物又は株は、トリオースリン酸イソメラーゼ活性が低下しているために、ジヒドロキシアセトンリン酸の代謝に欠陥を有する。
【００３０】
ある実施形態において、本発明は、上述した本発明の宿主細胞、特に微生物又は株であって、大腸菌である微生物を提供する。
【００３１】
ある実施形態において、本発明は、単純炭素源（simple carbon source）、特に粗グリセロール調製物を含有する適当な増殖培地で、本発明の宿主細胞、特に微生物株を増殖させてから、生産された1，2−プロパンジオールを回収し、必要であれば、それを精製するという、1，2−プロパンジオールの製造方法を提供する。
【００３２】
特に本発明は、本発明の宿主細胞、特に微生物又は株を非発酵性炭素基質で増殖させることによって1，2−プロパンジオールを生産する方法であって、
i）プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性を過剰発現させる、上述した本発明の前記宿主細胞、特に前記微生物又は株を、非発酵性炭素基質を含有する培地で培養すること（ここでは、炭素基質がバイオマスの生産を持続させつつ、同時に1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するための基質としても役立ち、非発酵性炭素源が本発明の宿主細胞、特に微生物又は株によって1，2−プロパンジオールに代謝される）；
ii）段階i）に従って生産された1，2−プロパンジオールを回収すること；及び、場合によっては、
iii）回収された1，2−プロパンジオールを精製すること
を含む方法を提供する。
【００３３】
本発明の一実施形態では、前記非発酵性炭素基質が粗グリセロール調製物、特に少なくとも70％、特に少なくとも75％、特に少なくとも80％、特に少なくとも85％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、特に少なくとも99％、且つ100％までの純度を有するグリセロールを含有する調製物である。
【００３４】
ある特定の実施形態では、グリセロールが80％〜90％の純度、特に約85％の純度を有する。
【００３５】
ある実施形態では、非発酵性炭素基質、特に上述の粗グリセロール調製物が、1，2−プロパンジオールに選択的に代謝される。
【００３６】
ある実施形態において、本発明は、上述の1，2−プロパンジオール生産方法であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）を過剰発現させるように操作された上述の本発明の宿主細胞、特に微生物又は株が、前記プロセスにおいて使用される方法を提供する。
【００３７】
ある実施形態において、本発明は、上述の1，2−プロパンジオール生産方法であって、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）からなる群より選択される少なくとも一つの追加酵素タンパク質が共発現されるように操作された上述の本発明の宿主細胞、特に微生物又は株が、前記プロセスにおいて使用される方法を提供する。
【００３８】
本発明の一実施形態では、1，2−PD生産と競合する非生産的経路に関与する少なくとも一つの酵素活性を失活させた、上述の本発明の宿主細胞、特に微生物又は株が使用される。
【００３９】
特に、グリオキシラーゼ系I及びII（gloA及びgloB）、乳酸デヒドロゲナーゼA（ldhA）、グリオキシラーゼ系III（マスター調節因子（master regulator）rpoSの不活化によって間接的に）、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の1つ又は２つ以上を失活させた微生物突然変異体、特に大腸菌の突然変異体が使用される。
【００４０】
もう一つの実施形態では、gloA活性をコードする遺伝子が部分的に又は完全に不活化された微生物突然変異体又は株、特に大腸菌突然変異体が使用される。
【００４１】
もう一つの実施形態では、アラビノース代謝が不活化された微生物突然変異体又は株が、本発明のプロセス内で使用される。
【００４２】
本発明の一実施形態では、大腸菌株、特に大腸菌MG1655株及びDH5α株がそれぞれ、宿主生物として使用される。
【００４３】
本発明の一実施形態では、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）からなる群より選択される酵素活性並びにプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）をコードする遺伝子の少なくとも一つが、誘導性プロモーター、特にアラビノース誘導性プロモーター、特にparaBADプロモーターの制御を受ける。
【００４４】
本発明の一実施形態では、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性からなる群より選択される少なくとも一つの酵素活性を共発現させる宿主細胞、特に微生物又は株を得るために、合成オペロンが提供され、その合成オペロンが本発明の方法において使用される。本発明の一実施形態では、上記活性をコードする遺伝子が、誘導性プロモーター、特にアラビノース誘導性プロモーター、とりわけparaBADプロモーターの制御を受ける。
【００４５】
ある実施形態では、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）をコードする遺伝子とグリセロールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）からなる群より選択される酵素タンパク質をコードする少なくとも一つの追加遺伝子とを含む合成オペロン、特にプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）をコードする遺伝子を含む合成オペロンが提供される。
【００４６】
ある実施形態では、本発明の合成オペロンが誘導性プロモーター、特にアラビノース誘導性プロモーターの制御を受ける。
【００４７】
本発明の一実施形態では、前記オペロンから誘導時に転写される一続きの遺伝子が、次のとおりである：mgsA、gldA、dhaK、fucO。
【００４８】
さらに本発明は、上述した本発明の合成オペロンを含むポリヌクレオチド分子又はコンストラクト、特にプラスミド及びベクター分子に関すると共に、前記ポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞、特に微生物宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】培養ブロスに加えられた、異なる量のメチルグリオキサールによる、大腸菌の野生型（黒いバー）及び突然変異体株（□gloA突然変異体、灰色のバー；□gloB突然変異体、斜線入りのバー）の増殖阻害を表す図である。
【図２】糖類又はグリセロールが炭素基質である場合に1，2−PDを生成させる経路の模式図である。
【図３ａ】本発明において記載するプラスミドのマップを表す図である。
【図３ｂ】本発明において記載するプラスミドのマップを表す図である。
【図４】本発明において記載するプラスミドのマップを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書では、糖、リン酸及びプリン又はピリミジンのどちらか一方である塩基を含有するモノマー（ヌクレオチド）から構成される、一本鎖でも二本鎖でもよい、高分子量のポリマー分子を指すと理解される。したがって、用語「ポリヌクレオチド」は、主として、一本鎖でも二本鎖でもよいDNA又はRNAのポリマーを指し、これらは、場合によっては、DNAポリマー中又はRNAポリマー中に組み込むことができる合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含有する。別段の表示がない限り、本発明の特定の核酸配列は、明示的に示した配列を包含するだけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば縮重コドン置換）及び相補的配列も暗黙的に包含する。具体的に述べると、縮重コドン置換は、1つ又は２つ以上の選ばれた（又は全ての）コドンの3番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成することができる（Batzer, et al. （1991）；Ohtsuka, et al., （1985）；及びRossolini, et al. （1994））。用語ポリヌクレオチドは核酸、ヌクレオチド配列と互換的に使用され、遺伝子、cDNA、及び遺伝子によってコードされるmRNAなどを包含し得る。
【００５１】
用語「コンストラクト」は、任意の供給源から得られる、一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAの、プラスミド、ウイルス、自律複製配列、ファージ、又は線状若しくは環状のヌクレオチド配列であって、プロモーターフラグメントと本発明の酵素活性をコードする選ばれた遺伝子産物のDNA配列とを適当な3’非翻訳配列と共に細胞中に導入する能力を有するユニークな構成になるように、いくつかのヌクレオチド配列が接合され又は組換えられているものを指す。
【００５２】
用語「形質転換」又は「トランスフェクション」は、核酸の取り込み後の、細胞における新しい遺伝子の獲得を指す。
【００５３】
用語「発現」は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの、その遺伝子産物への転写及び翻訳を指す。発現の際は、遺伝子産物の配列をコードするDNA鎖がまず最初に相補的RNAに転写され、この相補的RNAは、多くの場合、メッセンジャーRNAであり、遺伝子産物がタンパク質である場合は、次に、そうして転写されたメッセンジャーRNAが上記の遺伝子産物に翻訳される。
【００５４】
本明細書で使用される用語「プラスミド」又は「ベクター」又は「コスミド」は、多くの場合、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運搬し、通常は環状二本鎖DNA分子の形態をとる、染色体外要素を指す。
【００５５】
本明細書で使用される用語「調節因子」は、機能的プロモーター及び任意の関連転写要素（例えばエンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SPI成分など）を有する塩基配列を指す。
【００５６】
本明細書で使用される用語「作動可能に連結」とは、遺伝子発現を制御するプロモーター、エンハンサーなどのさまざまな調節要素と、関心対象の遺伝子とが、宿主細胞内で作動可能な状態で、前記関心対象遺伝子の発現が可能になるように接続されていることを意味する。調節因子のタイプ及び種類が宿主に依存してさまざまであり得ることは、当業者にとっては周知の事柄である。
【００５７】
用語「欠失」は、遺伝子の活性の抑制（これは一般に、不活化、阻害であることができる活性の抑制からなる）を表すか、当該遺伝子の少なくとも一部の欠失（例えばその発現に必要なプロモーター領域の全部又は一部の欠失）であって、当該遺伝子が発現されないか非機能的になるようなもの、又は発現産物がその機能を失うようなもの（例えば当該遺伝子のコード部分の欠失）であることができる。好ましくは、遺伝子の欠失は、基本的には、その遺伝子の抑制であり、その遺伝子は、本発明による株の同定、単離及び精製を容易にする選択マーカー遺伝子で置き換えることができる。例えば遺伝子は、大腸菌などのrecAタンパク質によって媒介される相同組換えによって不活化することができる（Cunningham, et al. （1980））。
【００５８】
簡単に述べると、不活化プロトコールは次のとおりであることができる。DNAの線状フラグメントを細胞中に導入する。このフラグメントはインビトロで得られ、遺伝子に隣接する2つの領域と、それら2つの隣接領域の間に配置される選択可能な遺伝子産物をコードする遺伝子（一般的には抗生物質耐性遺伝子）とを含む。したがってこのフラグメントは不活化された遺伝子を表す。組換え事象を受けて合成フラグメントを組み込んだ細胞は、選択増殖培地に蒔くことによって選択される。二重組換え事象を受けて、ネイティブ遺伝子が不活化された遺伝子によって置き換えられている細胞が、選択される。
【００５９】
用語「炭素基質」は、微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味し、ここで、基質は少なくとも一つの炭素原子を含有する。
【００６０】
本発明において使用される用語「非発酵性炭素基質」（non-fermentable carbon substrate）は、所与の生物の酸化還元（redox）プロセスを持続させて外来電子受容体の非存在下でバイオマスを生成させることのない炭素基質を指す。
【００６１】
1，2−プロパンジオール（プロピレングリコール；1，2−PD）は、不飽和ポリエステル樹脂、医薬製剤及び化粧品、液状洗剤、冷却剤及び不凍液又は防氷液の構成要素として広く使用される重要なバルクケミカルである。1，2−プロパンジオール（1，2−PD）は光学活性であるから、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）のエナンチオマー的に純粋な調製物は、医学的、農学的又は生理学的応用には、特別な関心が持たれる可能性がある。
【００６２】
1，2−プロパンジオール（1，2−PD）は、糖類を基質及び唯一の炭素源として、そこから微生物によって生産され得る。近年、例えば糖類炭素源の代わりに発酵基質として使用されるグリセロールなどの代替基質が、かなりの注目を集めている。グリセロールへの関心は、基本的に、バイオディーゼル又はバイオエタノールの生産量が著しく増加した結果である。どちらのプロセスも、例えば生産されるバイオディーゼルの10％（w/w）を構成する主要副産物として、グリセロールを生成する。
【００６３】
本発明は、ここに、非発酵性の安価な炭素基質、特に粗グリセロール調製物から1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するための改良された生物工学的プロセスであって、その炭素基質がバイオマスの生産を持続させつつ、同時に1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するための基質としても役立つようなプロセスを提供する。さらに本発明は、この手法の特別な要件に特に適合し、したがって本発明のプロセスにおける使用に特に適した、改良された微生物株を提供する。
【００６４】
ある好ましい実施形態において、本発明は、グリセロールからの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）の生産経路に関与する1つ又は2つ以上の遺伝子を含有するように操作された宿主細胞、特に微生物又は株を使って、非発酵性炭素源としてのグリセロール又は粗グリセロール調製物を、1，2−プロパンジオールに直接、生物変換することを可能にする。特に、本発明の宿主細胞、特に微生物又は株は、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）の生産経路における2つの鍵前駆体化合物であるジヒドロキシアセトンリン酸及びメチルグリオキサールの代謝に関与する遺伝子を含む組換え宿主細胞、特に組換え微生物又は株が作出されるように、組換えDNA技法によって操作されている。特に、グリセロールを1，2−プロパンジオール（1，2−PD）に高い選択性で変換することができる酵素である、グリセロール−デヒドロゲナーゼ活性、ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性、メチルグリオキサールシンターゼ活性及びプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を示す酵素をコードする遺伝子からなる群より選択される遺伝子を有する宿主細胞、特に微生物又は株が提供される。
【００６５】
ある好ましい実施形態では、操作された大腸菌株、特に組換え大腸菌株が、本発明の範囲内で使用される。
【００６６】
本発明では、驚いたことに、バイオディーゼル生産から得られる一般的な粗グリセロール（純度85％）を、有酸素条件下及び無酸素条件下で、さまざまな起源を有する多種多様な生物の増殖に、基質として使用できることが見いだされた。試験した生物の大半は、純粋なグリセロールと比較して粗グリセロールでも、バイオマス生産に関して損なわれないことを証明することができた。これは、粗グリセロールを利用することができ、粗グリセロールは一般に微生物にとって毒性でないことを示している。バイオマス生産は粗グリセロール調製物中に見いだされる不純物による影響を受けなかった。したがって、バイオディーゼル生産又は代替供給源から得られる粗グリセロールは、微生物により炭素源として同様に十分利用されることが可能であり、よって、バイオマス生産のための発酵プロセスに、一般的な再生可能炭素源として、さらなる加工を施さずに使用することができる。
【００６７】
したがって、粗グリセロール調製物、特にバイオディーゼル又はバイオエタノール生産から得られる粗グリセロール調製物は、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するために、本発明のプロセスにおいて使用することができる。
【００６８】
1，2−プロパンジオール（1，2−PD）に至る生産経路における最初の鍵前駆体化合物はジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）である。DHAPは、メチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）の活性によって、第2の基本的前駆体化合物であるメチルグリオキサールに変換される。メチルグリオキサールは最終的にS−ラクトアルデヒドに変換されることになる。今のところまだ同定されていないグリセロールデヒドラターゼ活性により、グリセロールは、R−又はS−ラクトアルデヒド（これらはさらにそれぞれR−又はS−1，2−PDに代謝される）に変換され得る。宿主細胞の内在性還元活性がR−ラクトアルデヒドからR−1，2−PDを生産すると提唱されているのに対し、S−ラクトアルデヒドはS−ラクトアルデヒドをS−1，2−PDに変換し得るプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）の基質となるようである（Altaras, N. E., 1999；Applield and Environmental Microbiology（65）, 1180-1185）。
【００６９】
そこで、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）を宿主生物に導入すれば、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）への変換にラクトアルデヒドのS−エナンチオマーが受け入れられることにより、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）生産ネットワークの柔軟性が拡大され得るという仮説を立てた。さらにまた、メチルグリオキサール経路に依存せずにグリセロールから1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するには、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性が必要である可能性があると推断した。
【００７０】
それゆえに、培養条件にはかかわりなくグリセロールから検出し得る量の1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産しない野生型株に、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを補足した。
【００７１】
本発明の一実施形態では、グリセロールから検出し得る量の1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産しない宿主生物中に、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子をクローニングし、有酸素条件下及び半無酸素（semi anoxic）条件下、グリセロールを含有する最少培地において、前記宿主中で過剰発現させた。プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性の過剰発現は1，2−プロパンジオール（1，2−PD）の生産をもたらした。
【００７２】
1，2−プロパンジオール（1，2−PD）に至る生産経路におけるもう一つの鍵前駆体化合物はジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）である。本発明の一実施形態では、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）合成の前駆体としてジヒドロキシアセトンリン酸を得るための代替経路を、微生物株中、特に大腸菌株中に工作する。この経路は、グリセロールリン酸キナーゼ（glpK）に作用する内在性調節ネットワークとは無関係に、基本的前駆体DHAPを生産する。
【００７３】
特に、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性をコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子を、宿主生物、特に大腸菌宿主に導入する。グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）をコードする遺伝子は、大腸菌株、特に大腸菌K12から単離し、適切なプラスミド中にクローニングすることができる。
【００７４】
ある実施形態では、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）をコードする遺伝子を、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性をコードする遺伝子と共に、適切なプラスミド中にクローニングすることができる。ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性をコードする遺伝子は、シトロバクター（Citrobacter）属の株、特にシトロバクター・フロインデイ（Citrobacter freundii）株から単離することができる。
【００７５】
本発明のもう一つの実施形態では、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）遺伝子を、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）とは独立して、別個に、適切なプラスミド中にクローニングする。
【００７６】
本発明の一実施形態では、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及び／又はジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性をコードする導入されたコード配列が、誘導性プロモーター、特にアラビノース誘導性プロモーター（paraBAD）の制御を受ける。
【００７７】
それぞれグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性をコードする、ジヒドロキシアセトンリン酸を得るためのこの代替経路の遺伝子は、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと一緒に、個別の発現カセットとして別々に（この場合、コード配列はそれぞれのプロモーター及び終止シグナルの制御を受け、発現カセットは異なるプラスミド上にあってもよいし、単一のプラスミド上にあってもよい）、又は共通のプロモーター及び終止配列の制御を受ける前記遺伝子の2つ又はそれ以上を含む合成オペロンの形態で、野生型宿主生物に導入することができる。
【００７８】
本発明の一実施形態では、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性をコードする遺伝子を、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性をコードする遺伝子を既に含んでいる単一のプラスミドにクローニングすることで、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）をコードする遺伝子を含むプラスミド、又はプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）をコードする遺伝子を含むプラスミドを作成する。
【００７９】
ある実施形態では、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）をコードする遺伝子を含むプラスミドが作成される。
【００８０】
プロモーター及びポリアデニル化配列を含む共通調節配列の制御下に2つ又はそれ以上の遺伝子が配置された合成オペロンが作成されるように、異なる酵素活性をコードするさまざまな遺伝子配列を、プラスミド上に配置することができる。ある実施形態では、合成オペロンが、誘導性プロモーター、特にアラビノース誘導性プロモーターの制御を受ける。
【００８１】
DHAPは、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生成する経路における最初の中間体である。解糖経路のトリオースリン酸イソメラーゼ（tpi）は、DHAPに関して、メチルグリオキサールシンターゼと競合する。1，2−プロパンジオール（1，2−PD）生産を駆動するために、そのバランスを1，2−プロパンジオール（1，2−PD）生産側にシフトさせる目的で、メチルグリオキサールシンターゼをコードするmgsAを、合成オペロンに組み入れることができる。
【００８２】
したがって、本発明の一実施形態では、ジヒドロキシアセトンリン酸経路に関与する遺伝子に加えて、メチルグリオキサールの生産に関わる追加遺伝子、特に大腸菌のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子を含む、拡張された合成オペロンが提供される。
【００８３】
次に、その結果得られたプラスミドを、培養条件にはかかわりなくグリセロールから検出し得る量の1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産することができない宿主細胞、特に微生物宿主細胞又は株、特に大腸菌株に導入する。
【００８４】
本発明の一実施形態では、宿主生物が活性なアラビノース代謝作用を持たないか、アラビノース代謝に関与する必須遺伝子の少なくとも一つ（例えばリブロースキナーゼ活性（araB）をコードする遺伝子など）を欠失させるか不活化することによってアラビノース代謝が前もって不活化されている。対応する株を、グリセロールを含有する最少培地において、有酸素条件下及び半無酸素条件下で培養し、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を上清から単離して、分析する。
【００８５】
プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子（fucO）の過剰発現は、粗グリセロール調製物からの、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）の生産をもたらす。1，2−プロパンジオール（1，2−PD）の量は、プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子（fucO）と一緒にジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及び／又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（gldA）を共発現させることによって増加させることができる。プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子（fucO）と一緒にジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及び／又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（gldA）及び／又はメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子（mgsA）を共発現させること、及び／又は1，2−プロパンジオール生産経路中の鍵前駆体化合物に関して競合する非生産的経路の少なくとも一つに欠陥を有する宿主細胞、特に微生物宿主細胞又は株を使用することによって、さらなる改良を達成することができる。
【００８６】
ここに記載する5’−mgsA、gldA、dahK、fucO−3’のような、触媒作用に関与する遺伝子の配置は好ましいが、本発明は、この指定された配置に制限されるわけではない。ここに記載する遺伝子は、どの順序でも、1，2−プロパンジオール（1，2−PD）生産に適し得る。
【００８７】
1，3−プロパンジオールは検出されなかったので、この経路は、プロパンジオールの1，2−プロパンジオール（1，2−PD）異性体の生産に関して特異的であることが明らかになった。
【００８８】
細菌ゲノムから所望の遺伝子を取得する方法は、分子生物学の分野では、広く一般に、よく知られている。例えば遺伝子の配列が既知である場合は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なゲノムライブラリーを作成し、それを、所望の遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、適当なベクターを用いる形質転換に適した量のDNAを得るために、そのDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの標準的なプライマーによる増幅法（米国特許第4，683，202号）を使って増幅することができる。あるいは、ゲノムDNAの大きなセグメント（35〜45kb）をベクター中にパッケージングすることができるコスミドライブラリーを作成し、それを使って、適当な宿主を形質転換することもできる。コスミドベクターは、大量のDNAに対応できる点で、ユニークである。一般にコスミドベクターは、外来DNAのパッケージングとそれに続く環状化に必要なcos DNA配列を少なくとも1コピーは持っている。cos配列に加えて、これらのベクターは、ColE1などの複製起点と薬物耐性マーカー、例えばアンピシリン又はネオマイシンに対して耐性な遺伝子なども含有するだろう。適切な細菌宿主の形質転換にコスミドベクターを使用する方法は、Sambrook et al. （1989）に詳述されている。通例、コスミドをクローニングするには、外来DNAを単離し、それを、適当な制限エンドヌクレアーゼを使って、コスミドベクターのcos領域の隣にライゲートする。次に、線状化された外来DNAを含有するコスミドベクターを、バクテリオファージ1などのDNAパッケージング媒体（DNA packaging vehicle）と反応させる。パッケージングプロセスでは、cos部位が切断され、外来DNAが細菌ウイルス粒子の頭部中にパッケージングされる。次に、これらの粒子を使って、大腸菌などの適切な宿主細胞をトランスフェクトすることができる。細胞内に注入されると、外来DNAはcos付着末端の作用で環状化する。このようにして、外来DNAの大きなセグメントを組換え宿主細胞に導入し、そこで発現させることができる。
【００８９】
遺伝子が単離され、その配列がパブリックドメインに置かれたら、当業者は、それらの既知遺伝子について、例えばGenBankなどを参照することにより、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳動物及び植物などにおける等価な遺伝子を決定することができる。このルーチンワークは、他の微生物に由来する遺伝子との配列アラインメントを使って決定することができるコンセンサス配列を使用し、対応する遺伝子を別の生物においてクローニングするために使用することができる縮重プローブを設計することによって行うと、好都合である。これら分子生物学の定型的技法は当分野では周知であり、例えばSambrook et al. （1989）などに記載されている。
【００９０】
もう一つの実施形態において、本発明は、本発明の酵素活性のクローニング、形質転換及び発現に適した、さまざまなベクター並びに形質転換カセット及び発現カセットを提供する。
【００９１】
前記ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターであることができる。レトロウイルスベクターは複製能を持っていてもよいし、複製欠損性であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に相補的宿主／細胞中でのみ起こるだろう。
【００９２】
本発明のポリヌクレオチド又は遺伝子は、宿主における増殖のために、選択可能なマーカーを含有するベクターに接合することができる。一般にプラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿又は塩化ルビジウム沈殿などの沈殿物として導入するか、荷電脂質との複合体として導入するか、又はフラーレンなどの炭素系クラスターに入れて導入することができる。ベクターがウイルスである場合は、宿主細胞への適用に先だって、適当なパッケージング細胞株を使ってインビトロでパッケージングすることができる。
【００９３】
本発明のベクターのより好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドが、原核細胞若しくは真核細胞又は単離されたその画分における発現を可能にする発現制御配列に作動的に連結される。
【００９４】
前記ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの（好ましくは翻訳可能なmRNAへの）転写を含む。細菌細胞若しくは真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、又はヒト細胞などの真核細胞における発現を保証する調節要素、特に細菌細胞又は真菌細胞における発現を保証する調節要素は、当業者にはよく知られている。それらは通常、転写の開始を保証する調節配列を含み、場合によっては、転写の終結及び転写物の安定化を保証するポリAシグナルを含む。他の調節要素として転写エンハンサー及び翻訳エンハンサーを挙げることができる。原核宿主細胞における発現を可能にする調節要素として考えられるものには、例えば大腸菌におけるlac、trp又はtacプロモーターなどが含まれ、真核宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例には、酵母におけるAOX1又はGAL1プロモーターがある。転写の開始を担う要素の他に、そのような調節要素には、ポリヌクレオチドの下流にある転写終結シグナルも含まれ得る。
【００９５】
これに関連して、Okayama−Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（In−vitrogene）、pSPORT1（GIBCO BRL）、pSE380（In-vitrogene）、又は任意のpBR322由来若しくはpUC18由来プラスミドなど、適切な発現ベクターが当分野では知られている。好ましくは、前記ベクターは発現ベクター及び／又は遺伝子導入ベクター若しくは遺伝子ターゲティングベクターである。本発明のポリヌクレオチド又はベクターを標的細胞集団中に送達するために、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを使用してもよい。組換えウイルスベクターを構築するには、当業者によく知られている方法を使用することができる。例えばSambrook（1989）及びAusubel（1994）に記載されている技法を参照されたい。あるいは、ターゲット細胞に送達するために、本発明のポリヌクレオチド及びベクターを、リポソーム中に再構成することもできる。
【００９６】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子又は本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞に関する。1，2−プロパンジオールの組換え生産に適した宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、活性な酵素を発現させるという宿主細胞の能力によってのみ限定される。
【００９７】
前記宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であることができる。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチド又はベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、染色体外に維持されていてもよい。この点において、本発明は、相同組換えによって突然変異型遺伝子を修復し、又は突然変異型遺伝子を作出するための、「遺伝子ターゲティング」及び／又は「遺伝子置換」に使用することができる組換えDNA分子に関すると理解されるべきでもある。例えば、Mouellic（1990）；Joyner, 「Gene Targeting, A Practical Approach」, Oxford University Pressを参照されたい。
【００９８】
宿主細胞は、細菌細胞若しくは真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞など、任意の原核細胞又は真核細胞であることができ、特に細菌細胞又は真菌細胞であることができる。好ましい宿主は、グリセロール又は1，2−プロパンジオールの生産に通例、役立つものであるだろう。好ましい真菌細胞は、例えばアスペルギルス（Aspergillus）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、ザイゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ケカビ（Mucor）属及びトルロプシス（Torulopsis）属の真菌細胞、特に種、サッカロミセス・セレビシェ（S.cerevisiae）の真菌細菌である。用語「原核」は、本発明の酵素活性を発現させるためのポリヌクレオチドで形質転換又はトランスフェクトすることができる全ての細菌及び古細菌を包含するものとする。原核宿主としては、例えばシトロバクター（Citrobacter）、エンテロバクター（Enterobacter）、クロストリジウム（Clostridium）、クレブシエラ（Klebsiella）、エアロバクター（Aerobacter）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、メチロバクター（Methylobacter）、エシェリキア（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、バチルス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）及びシュードモナス（Pseudomonas）などのグラム陰性菌及びグラム陽性菌を挙げることができる。本発明において最も好ましいのは、大腸菌、ネズミチフス菌（S.typhimurium）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）及び枯草菌（Bacillus subtilis）、クレブシエラ属の種及びサッカロミセス属の種であり、大腸菌種は特に好ましい。
【００９９】
その具体例には、大腸菌（Escherichia coli）MG1655（ATCC700926；Neidhardt et al., 1996のBachmann, B., p. 2460-2488）、大腸菌XL1-Blue MRF’［Stratagene製、Strategies, 5, 81（1992）］、大腸菌C600［Genetics, 39, 440（1954）］、大腸菌Y1088［Science, 222, 778（1983）］、大腸菌Y1090［Science, 222, 778（1983）］、大腸菌NM522［J. Mol. Biol., 166, 1（1983）］、大腸菌K802［J. Mol. Biol., 16, 118（1966）］、大腸菌JM109［Gene, 38, 275（1985）］、大腸菌DH5a［J. Mol. Biol., 166, 557（1983）］などがある。
【０１００】
非生産的経路に関与する酵素活性の一部又は全部が減少しているか排除されている適切な微生物突然変異体を使用することにより、1，2−PD生産のさらなる改良を達成することができる。例えば、mgsAとtpiによってコードされる酵素活性はDHAPに関して競合する。メチルグリオキサールシンターゼ活性（MgsA）は二リン酸塩によって不活化されることが示されている（Hopper, D. J. 1972）。メチルグリオキサールへのDHAPの変換を改良するために、mgsAのコード配列内に変異を生じさせる任意の方法（例えばエラープローンPCR）で得られる変異体ライブラリーをスクリーニングすることにより、MgsAのリン酸非感受性突然変異体を同定することができる。トリオースリン酸イソメラーゼ（tpiA）及び内在性mgsAが前もって不活化された微生物株、特に大腸菌クローンを、mgsA変異体のプラスミドライブラリーで形質転換し、非選択的固形培地で増殖させる。高濃度のグリセロール又はDHAPを含有する寒天プレート（プレートB）又は高濃度の二リン酸塩及びグリセロール又はDHAPを含有する寒天プレート（プレートC）での初回形質転換体（プレートA）のレプリカ平板培養により、プレートA及びBでは増殖できるが、プレートCでは増殖することができないクローンを選択することができる。これらのクローンは、高濃度のリン酸塩の存在下で毒性レベルのメチルグリオキサールを生産する著しい活性を有するmgsA変異体をコードする。
【０１０１】
トリオースリン酸イソメラーゼ突然変異体は、メチルグリオキサールシンターゼ突然変異体について説明したのと同様に生成させることができる。天然培地（complex medium）（例えばルリアブロス、LB）、グルコース及びグリセロールでの増殖速度を比較して、増殖速度が著しく損なわれているtpi突然変異体が同定される。興味ある突然変異体は、無改変株と比較して、グリセロールを唯一の炭素及びエネルギー源とした場合は、遅い増殖を示すか、増殖しないのに対して、LB又はグルコースを炭素源とした場合は増殖速度に影響がない。
【０１０２】
MGを解毒するための主要経路は他にも2つ存在し、それらは1，2−PD生合成に関して生産的である。これらは、第1段階として、いわゆるMGレダクターゼによって触媒される。いくつかの酵素がこの活性をコードすると提唱されており、この活性は、競合する非生産的経路の不活化によって増強されるはずである。
【０１０３】
本発明の一実施形態では、グリオキシラーゼ系I及びII（gloA及びgloB）、乳酸デヒドロゲナーゼA（ldhA）、グリオキシラーゼ系III（マスター調節因子rpoSの不活化によって間接的に）、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼA（aldA）をコードする遺伝子の1つ又は2つ以上が、例えば単一遺伝子ノックアウトなどによって、機能的酵素活性の発現が著しく減少するか完全に阻害されるように不活化された微生物突然変異体、特に大腸菌の突然変異体が構築される。これにより、上述の遺伝子の1つ又は2つ以上が不活化された微生物突然変異体、特にグリオキシラーゼ系I（gloA）、グリオキシラーゼ系II（gloB）、乳酸デヒドロゲナーゼA（ldhA）、グリオキシラーゼ系III（マスター調節因子rpoSの不活化によって間接的に）、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼA（aldA）をコードする遺伝子からなる群より選択される遺伝子の2つ、特に3つ、特に4つ、特に5つが不活化された突然変異体を得ることができる。
【０１０４】
本発明の一実施形態では、gloA活性をコードする遺伝子が部分的に又は完全に不活化された微生物突然変異体、特に大腸菌突然変異体が提供される。
【０１０５】
本発明のある実施形態において、宿主細胞、特に微生物又は株、特に原核微生物、例えば大腸菌は、メチルグリオキサール（MG）をD−及び／又はL−乳酸に代謝（MG−乳酸代謝（MG-to-lactate metabolism））するその能力が不活化される。これは、例えばグリオキシラーゼAの不活化を、好ましくは、グリオキシラーゼB、代替シグマ因子（alternative sigma-factor）rpoS及びアルデヒドレダクターゼAをコードする遺伝子の1つ又は2つ以上の不活化と組み合わせて行うことによって達成される。好ましい一実施形態では、株が、上に列挙した活性及び／又は遺伝子の全てに欠陥を有する。
【０１０６】
もう一つの実施形態では、アラビノース代謝及びMG−乳酸代謝が例えばグリオキシラーゼAの不活化によって不活化された株を、メチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性からなる群より選択される酵素活性をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドで、特にプラスミドpDP_mgdfで、形質転換する。ただし、合成オペロン中の遺伝子の配置は、プラスミドpDP_mgdfに示すものに限定されるわけではなく、どの順番でもよい。本発明は、アラビノース代謝が損なわれていない株、例えば野生型大腸菌にも関係する。
【０１０７】
もう一つの実施形態では、ある株（好ましくはMG−乳酸代謝が不活化されているもの、ただし必ずしもそうでなくてもよい）を、プラスミド−コード遺伝子（アルド−ケトレダクターゼ活性を付与する）で形質転換する。該活性コード遺伝子は、dkgA、dkgB、yeaE及びyghZを含む大腸菌遺伝子群から選ばれる。
【０１０８】
好ましい一実施形態では、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）及びメチルグリオキサールシンターゼを（例えばプラスミドpDP_mgdfによって）発現させる株を、アルド−ケトレダクターゼ活性（例えば大腸菌のDkgA）をコードするプラスミドで形質転換し、炭素源として粗グリセロールを含有する培地で培養する。
【０１０９】
特に好ましい実施形態では、MG−乳酸代謝が不活化されており、且つ（例えばプラスミドpDP_mgdf上にコードされた）グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）及びメチルグリオキサールシンターゼを発現させる株が、アルド−ケトレダクターゼ活性（例えばプラスミドpCR2.1上にコードされた大腸菌のdkgA）を発現させ、炭素源として粗グリセロールを含有する培地で培養される。
【０１１０】
本発明は、アラビノース代謝が損なわれていない株、及び／又は本発明で言及された問題の酵素活性をその微生物の染色体から発現させる株にも関係する。
【０１１１】
本発明の酵素活性をコードするポリヌクレオチドは、当業者に広く一般に知られている技法のいずれかを使って宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。
【０１１２】
これらの遺伝子を株に導入するために優先的に使用される技法は、当業者に周知のエレクトロポレーションである。簡単に述べると、エレクトロポレーションプロトコールは、次のとおりであることができる。関心対象の異種遺伝子を、発現ベクターのプロモーターとターミネーターの間にクローニングする。このベクターは、それを含有する細胞を選択するための抗生物質耐性遺伝子や、それが維持され得るように宿主細胞株中で機能する複製部位も有する。このプロトコールでは、エレクトロコンピテントな宿主細胞を調製する必要があり、次にそれが、エレクトロポレーションにより、ベクターで変換される。本発明によれば、エレクトロポレーションによって導入される遺伝子は、好ましくは、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）、メチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）及びプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性からなる群より選択される酵素活性をコードする本発明の遺伝子である。
【０１１３】
融合され作動可能に連結された遺伝子を作成し、それらを細菌又は動物細胞中で発現させるための方法は、当分野ではよく知られている（Sambrook，前掲）。そこに記載されている遺伝子コンストラクト及び方法は、本発明のポリペプチドを、例えば原核生物宿主中で発現させるために利用することができる。一般的には、挿入されたポリヌクレオチドの効率のよい転写を助長するプロモーター配列を含有する発現ベクターを、宿主に合わせて使用する。発現ベクターは、通例、複製起点、プロモーター、及びターミネーター、並びに形質転換された細胞の表現型選択をもたらすことができる特異的遺伝子を含有する。形質転換された原核生物宿主は、発酵槽で増殖させることができ、最適な細胞増殖が得られるように、当分野において知られる技法に従って培養することができる。
【０１１４】
通例、細胞は、適当な培地中、30℃で増殖させる。本発明において好ましい増殖培地は、炭素源としてグリセロールを含有する、既知組成（defined）培地又は合成培地、例えば最少培地M9である。一般的な市販の培地、例えばルリア・ベルターニ（LB）ブロス、サブロー・デキストロース（SD）ブロス又は酵母エキス・麦芽エキス（YM）ブロスなども使用することができ、個々の微生物の増殖にとって適当な培地は、微生物学分野又は発酵科学分野の当業者にはわかるだろう。異化代謝産物抑制を直接的又は間接的に調整することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン2’：3’−一リン酸又は環状アデノシン2’:5’−一リン酸などの使用も、反応培地に組み入れることができる。同様に、1，2−PD生産の強化につながる酵素活性を調整することが知られている薬剤（例えば亜硫酸塩、亜硫酸水素塩及びアルカリ）の使用も、遺伝子操作と一緒に、又は遺伝子操作の代替として用いることができる。
【０１１５】
発酵に適したpH範囲はpH5.0〜pH9.0であり、初期条件の範囲としてはpH6.0〜pH8.0が好ましい。反応は、好気的、微好気的又は嫌気的条件下で行うことができ、好気的又は微好気的条件は好ましい。
【０１１６】
バッチ発酵及び連続発酵：本プロセスではバッチ発酵法を使用する。古典的バッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵中は人工的に変更されることがない、閉じた系である。したがって、発酵の開始時に所望の生物又は生物群を接種し、その系に何も加えずに発酵させる。しかし通例、バッチ発酵は炭素源の添加に関して「バッチ式」なのであって、pHや酸素濃度などの因子を制御する試みはなされることが多い。バッチ系の代謝産物組成及びバイオマス組成は、発酵を停止させる時まで、絶えず変化する。バッチ培養では、細胞は、静止誘導期から高増殖対数期を経て、最後に、増殖の速度が低下するか増殖が停止する定常期に移行する。何も処置しなければ、定常期の細胞は最終的には死ぬことになる。対数期の細胞は一般に最終産物又は中間体の生産の大部分を担っている。標準的なバッチ系の変形にフェドバッチ（Fed-Batch）発酵系があり、これも本発明に適している。典型的なバッチ系のこの変形では、発酵が進行するにつれて基質を少しずつ追加する。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害しがちである時、及び培地中の基質の量を制限することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の測定は困難なので、測定可能な因子、例えばpH、溶存酸素及びCO2などの廃ガスの分圧の変化に基づいて推定される。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は当分野では広く一般によく知られており、その例は前掲のBrockに見いだすことができる。また、本方法は、連続発酵法に適用することもできるだろうと考えられる。連続発酵は開いた系であり、ここでは、既知組成発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、それと同時に等量の条件培地が加工のために取り出される。連続発酵では、一般に、培養物が一定の高密度に維持され、そこでは細胞が主として対数期増殖状態にある。連続発酵では、細胞増殖又は最終産物濃度に影響を及ぼす1つの因子又はいくつもの因子を調整することが可能である。例えば、ある方法では、炭素源又は窒素レベルなどの制限的栄養素を、固定した割合に維持し、他の全てのパラメータを加減する。他の系では、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつもの因子を連続的に変化させることができる。連続系では、定常状態増殖条件を維持しようと努めるので、培地が排出されることによる細胞の損失は、発酵における細胞増殖速度と釣り合わせなければならない。連続発酵プロセスのために栄養素及び増殖因子を調整する方法及び生成物の形成速度を最大化するための技法は、工業微生物学の分野ではよく知られており、さまざまな方法が前掲のBrockに詳述されている。本発明は、バッチプロセス、フェドバッチプロセス又は連続プロセスのいずれか一つを使って実施することができ、既知の発酵モードはどれでも適し得る。また、細胞を全細胞触媒として基材上に固定化し、1，2−プロパンジオール生産用の発酵条件に供してもよい。
【０１１７】
次に、1，2−プロパンジオール生成物を増殖培地又は細胞溶解物から単離することができる。微生物によって又は他の方法によって生産されたプロパンジオールの単離及び精製は、従来の任意の手段によって行うことができる。プロパンジオールを発酵培地又は培養培地から精製するための方法は当分野では知られている。例えばプロパンジオールは、反応混合物を有機溶媒による抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに供することによって、細胞培地から得ることができる（米国特許第5,356,812号）。このプロセスにとって特に良い有機溶媒はシクロヘキサンである（米国特許第5,008,473号）。
【０１１８】
工業的応用の場合、大量の発酵槽ブロスから1，2−プロパンジオールを精製するには、非実験室規模の方法が必要である。克服すべき課題には、ブロスからの細胞物質の除去（清澄化）、抽出又は水除去のどちらかによる1，2−プロパンジオールの濃縮、及び部分精製されたモノマーからの残存不純物の分離が含まれる。ブロス清澄化は、通例、濾過、遠心分離又はクロスフロー精密濾過のいずれかによって行われるだろう。適切なフィルターは、例えばMillipore（Millipore Corporation，マサチューセッツ州ベッドフォード、アシュビーロード80）又はFilmtec（Dow Chemical Co.）によって製造されている。遠心分離では細胞の大半が効果的に除去されるが、ブロスの性質により、常に完全な細胞除去が達成されるわけではない。クロスフロー精密濾過では極めて清澄な濾液が得られる。濃縮物は高固形分ケーキではなくスラリーである。当業者は使用した発酵装置及び発酵条件に最も適した清澄化方法を適合させることができるだろう。清澄化したブロスの減水は、1，2−プロパンジオールの高い水溶性によって困難になる。清澄化したブロスからの1，2−プロパンジオールの抽出は、蒸発／蒸留、膜技術、有機溶媒による抽出及び吸着など、さまざまな方法で達成することができる。清澄化したブロスの水体積を減らすために、最初にロータリーエバポレーターを使用してもよい。本出願人らはこの方法で良い結果を得ている。不要なタンパク質及び塩類の沈殿は1，2−プロパンジオール回収率に影響しないようである。膜技術は蒸発とは別個に使用するか、蒸発と合わせて使用することができる。適切な膜は（i）水及び他の供給分子を保持しつつ、1，2−プロパンジオールを通過させるか、（ii）1，2−プロパンジオールを保持しつつ、水及び他の分子を通過させるか、又は（iii）他の分子を保持しつつ、水及び1，2−プロパンジオールを通過させるだろう。特に有用なのは、SW-30 2540（Filmtec、Dow Chemical Co.）並びにMillipore製のDL及びSHシリーズの逆浸透膜（Millipore Corporation，マサチューセッツ州ベッドフォード）などといった逆浸透膜である。蒸発及び膜濃縮に続いて、部分精製された1，2−プロパンジオールを有機溶媒中に抽出することができる。適切な溶媒には、tert−アミルアルコール、シクロペンタノール、オクタノール、プロパノール、メタノール、及びエタノールなどのアルコール類が含まれるだろう。オクタノン、シクロヘキサン及びバレルアルデヒドなどの非アルコール類も使用することができる。本発明に関して言えば、アルコール類が好ましく、エタノールは最も好ましい。あるいは、さまざまな工業用吸着剤への吸着によって、1，2−プロパンジオールをさらに濃縮することもできる。活性炭及びポリシクロデキストリン、例えばAmerican Maize Products Companyが生産しているものなどは特に適している。抽出又は吸着に続いて、部分精製された1，2−プロパンジオールを精密精製（refine）しなければならない。精密精製は、アニオン交換膜とカチオン交換膜の組合せ又は両極性（アニオン及びカチオン）膜を使った電気透析（脱塩には特に有用である）によって達成することができる（例えばGrandison, Alistair S. （1996）を参照されたい）。本発明における好ましい精密精製の方法は蒸留である。蒸留は、作業圧を周囲圧以下、例えば約25in.Hgの減圧にして、バッチ式に行うことができる。蒸留を監視したところ、物質は、最初から最後に向かって順に、軽質有機分から始まり、水、1，2−プロパンジオールを含むジオール類、そして最後にグリセロールなどの重質分が蒸発し、固形物を沈殿させることがわかった。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例に例示的実施形態を示す。この開示及び当分野の一般的技術水準に照らして、以下の実施例が例示を意図するに過ぎないこと、そして、本願請求項の内容の範囲から逸脱することなく、数多くの変更、変形、及び改変を使用できることは、当業者には理解されるだろう。
【０１２０】
本発明に記載する株を構築し増殖させるために必要な操作及び技法は全て当業者に知られている。技術的詳細は、Ausubelら, 1995、Sambrook, J, 2001及びMiller, J. H. 1992並びに本願で言及する関連刊行物に記載されている。
＜実施例１＞
【０１２１】
一般的方法
1．1  株培養
リン酸塩はメチルグリオキサールシンターゼの阻害剤であることがわかっているので、低レベルのリン酸塩を含有するように設計された既知組成の最少培地で、大腸菌を培養した。培地は1リットルにつき、以下の成分を含有した：
（NH4）2SO4：3g
酵母エキス：0.2g
CoCl2：1.9×10-6g
ビス−(2−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス−(ヒドロキシメチル）−メタン：10g
KH2PO4：0.002g
K2HPO4：0.0085g
MgSO4：0.225g
微量元素溶液［Pfennig, 1966］：1ml。
【０１２２】
適当な場合は抗生物質を培地に加えた。使用した濃度はゲンタマイシンが5μg/l、アンピシリンが10μg/lである。
【０１２３】
粗グリセロールはバイオディーゼル生産から得られたもので、純度は85％だった。
【０１２４】
大腸菌株は、常に、培養管（総体積30ml、接種物5ml）で、又は半無酸素条件になるように、ゴム栓で密封したガラス瓶（総体積12ml、接種物10ml）で、増殖させた。「有酸素条件下での培養」という用語は、非密封容器における、撹拌しながらの培養を含意する。この文脈において、半無酸素的とは、有酸素条件下で調製した培地中、例えば外から酸素が入り込むのを避けるために接種後直ちにゴム栓で密封した瓶などの閉じた容器における、撹拌なしでの株の培養を意味する。培養時間は、有酸素条件及び半無酸素条件について、それぞれ2日と5日の間で変化した。一般的には光学密度がもはや増加しなくなった時に実験を停止した。
【０１２５】
1．2  1，2−PD形成の分析
比色定量アッセイ、HPLC及びGC−MSを含む3つの異なる方法で、培養ブロスの上清中の1，2−PDのレベルを決定した。カチオン交換カラムを使ったHPLCではプロパンジオールの1，2−異性体と1，3−異性体とを区別することはできなかったが、比色定量アッセイは1，2−PDに特異的だった。GC−MS分析では、両方の異性体を別々に同時定量することができた。検出レベルは、HPLC分析では0.5g/l、比色定量アッセイでは50mg/l、GC−MS分析では10mg/lだった。
【０１２６】
ルーチン分析では、Jones及びRiddick｛Jones, 1957｝が記載した比色定量法で、上清中の1，2−PDを決定した。要するに、硫酸を無細胞上清試料に加え、混合し、加熱する。その後、ニンヒドリン溶液及び亜硫酸水素ナトリウムを加え、混合し、1時間インキュベートする。新たに硫酸を加え、1，2−PDの濃度に等価な595nmでの吸収を記録する。
【０１２７】
定量的分析では、試料中の1，2−PDをGC−MS分析によって測定した。1，2−PDは、標準物質と比較して保持時間が同じであることと、マスフィンガープリンティングとによって同定した。
＜実施例２＞
【０１２８】
組換え生物の構築
2．1  本発明で使用される株及びプラスミド
大腸菌MG1655（F- ラムダ- ilvG- rfb-50 rph-1）及びDH5α（F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF）U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk＋），phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1）並びにその派生株を、1，2−PDを生産するための宿主として使用した。さらにまた、MG1655のゲノムDNAを関連遺伝子の増幅源とした。シトロバクター・フロインデイ（DSM30040）由来のゲノムDNAをdhaK遺伝子を増幅するためのテンプレートとして使用した。
【０１２９】
2．2  遺伝子の単離とクローニング
第1ステップとして、グリセロールデヒドロゲナーゼgldAの大腸菌遺伝子（配列番号29）をプラスミドpB2araJ（図3a）又はプラスミドpCR2.1（図3b）に導入した。関心対象の遺伝子を増幅するために使用した全てのプライマーを表1に列挙する。プライマーgldH_for1及びgldH_rev1を使って、大腸菌から1，104bpのgldAフラグメントを増幅した。ゲル精製したPCRフラグメントをpB2araJベクターのAatII-SwaI部位に挿入して、pDP_gを得た。このプラスミドでは、gldA発現がプロモーターparaBADの制御を受けるので、Guzmanら（Guzman, L. M., 1995）が記述しているように、L−アラビノースによる緻密に調節された誘導性発現が可能である。dhaK遺伝子は、シトロバクター・フロインデイ（C.freundii）から、プライマーdhaK_for1及びdhaK_rev1を使って増幅した。得られた1659ntの配列を配列番号27に示し、対応するタンパク質配列を配列番号30に示す。ゲル精製したdhaKのフラグメントをpDP_gのSwaI-AscI部位に挿入して、gldAとdhaKの両方を共転写するpDP_gdを得た。プライマーfucO_for1及びfucO_rev1を使って、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）をコードする1152ntの遺伝子を大腸菌から増幅し（配列番号31）、それをpDP_gdのAvrII-SmaI部位にライゲートして、gldA、dhaK及びfucOを共転写するプラスミドpDP_gdfを得た。配列番号32に示す大腸菌メチルグリオキサールシンターゼをコードするmgsAの468bpフラグメントを、プライマーmgsA_xhoI_for及びmgsA_xhoI_revを使って大腸菌から増幅し、XhoI部位にセンス方向に導入して、pDP_mgdfを得た。したがって、誘導時にプラスミドpDP_mgdfから転写される一続きの遺伝子は、次のとおりである：mgsA、gldA、dhaK、fucO及びlacZ-α。ただし、残存するLacZαペプチドは適切な宿主株（例えばDH5α）における転写研究にのみ使用した。プラスミドpDP_mgdf全体のnt配列を配列番号28に示す。
【０１３０】
それぞれ多機能MGレダクターゼ（配列番号33）及び4−ニトロベンズアルデヒドレダクターゼ（配列番号34）をコードする遺伝子dkgA及びdkgBを、Taqポリメラーゼ並びにプライマーdkgB_up及びdkg_dw又はdkgA_up及びdkgA_dwを使って、大腸菌から増幅した。精製したPCR産物を、TAクローニング（Invitrogen）によって、ベクターpCR2.1中に導入した。
【０１３１】
表1：pB2araJ又はpCR2.1にクローニングされる遺伝子のPCR増幅に使用したプライマー
【表１】
0005750370.tif 000002
【０１３２】
2．3  大腸菌宿主株内でgloA、gloB、rpoS、aldA、ldhAによってコードされる活性の欠失
特異的遺伝子欠失の技法は当業者にはいくつか知られている。これらの技法には、改変グループIIイントロンによる遺伝子破壊（Karberg, M., 2001）、PCR増幅DNAを用いるファージリコンビナーゼによる遺伝子不活化（Datsenko, K. A., 2000）（Ellis, E. H., 2001）（Yu, D. , 2000）（Marx及びLidstrom, 2002）及び関心対象の遺伝子に相同な線状二本鎖DNAを宿主細胞中に導入すること（Cunningham, R. P., et al. （1980））などが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１３３】
これらの遺伝子を株に導入するために優先的に使用される技法は、当業者には周知のエレクトロポレーションである。
【０１３４】
本発明では、選択可能なマーカー遺伝子を有するPCR増幅DNAの相同組換えを使用した。プライマーは関心対象の遺伝子に対して特異的に設計した。プライマー配列を以下に列挙する。関心対象遺伝子の欠失に成功したことは、PCR解析及びDNA配列決定によって検証した。
【０１３５】
欠失させた遺伝子（1〜6）及び相同線状DNAの生成に使用したプライマーの表示：
1）名称：アルデヒドデヒドロゲナーゼAのサブユニット
遺伝子：aldA
アクセッション番号：Ecogene：EG10035
染色体位置：1486256→1487695
プライマー1：
AACAATGTATTCACCGAAAACAAACATATAAATCACAGGAGTCGCCCATG
（配列番号15）
プライマー2：
GAGGAAAAAACCTCCGCCTCTTTCACTCATTAAGACTGTAAATAAACCAC
（配列番号16）
2）名称：D−乳酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子：  ldhA
アクセッション番号：Ecogene：EG13186
染色体位置：1440867→1439878
プライマー1：
CTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGATTAAACCAGTTCGTTCGGGCA
（配列番号17）
プライマー2：
TATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATG
（配列番号18）
3）名称：RNAポリメラーゼ、σS（σ38）因子
遺伝子：  rpoS
アクセッション番号：Ecogene：EG10510
染色体位置：2865573→2864581
プライマー1：
TGAGACTGGCCTTTCTGACAGATGCTTACTTACTCGCGGAACAGCGCTTC
（配列番号19）
プライマー2：
CTTTTGCTTGAATGTTCCGTCAAGGGATCACGGGTAGGAGCCACCTTATG
（配列番号20）
4）名称：グリオキシラーゼI
遺伝子：  gloA
アクセッション番号：Ecogene：EG13421
染色体位置：1725861→1726268
プライマー1：
TACTAAAACAACATTTTGAATCTGTTAGCCATTTTGAGGATAAAAAGATG
（配列番号21）
プライマー2：
GGCGCGATGAGTTCACGCCCGGCAGGAGATTAGTTGCCCAGACCGCGACC
（配列番号22）
5）名称：グリオキシラーゼII
遺伝子：gloB
アクセッション番号：Ecogene：EG13330
染色体位置：234782→234027
プライマー1：
CGAACGGAGCCGATGACAAGAAAGTTTTATCAGAACCTATCTTTCTTTGA
（配列番号23）
プライマー2：
CTTGCCGGTTTCATCACAACCTTCCGTTTCACACTGAGAGGTAATCTATG
（配列番号24）
6）名称：L−リブロキナーゼ単量体
遺伝子：araB
アクセッション番号：Ecogene：EG10053
染色体位置：70048→68348
プライマー1：
AATTATCAAAAATCGTCATTATCGTGTCCTTATAGAGTCGCAACGGCCTG
（配列番号25）
プライマー2：
ACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTTGGATGGAGTGAAACGATG
（配列番号26）
＜実施例３＞
【０１３６】
12−PD生産
3．1  粗グリセロール−最少培地における微生物の培養
異なる微生物による粗グリセロール調製物（純度約85％）の利用を、本質的に純粋なグリセロール調製物（純度＞99％）と比較して調べた。大腸菌MG1655と共に、異なるタクソンを代表する多種多様な微生物を、異なる量の純グリセロール及び粗グリセロールを補足した最少培地中、有酸素条件下でpHを調節せずに増殖させた。表2及び表3は、純粋なグリセロールの代わりに粗グリセロール調製物を唯一の炭素源及びエネルギー源として使用しても、バイオマス生産に阻害効果は観察されなかったことを実証している。さらにまた、粗グリセロールを炭素源及びエネルギー源とした場合、既知組成最少培地中のリン酸塩の量は、70％減らすことができる（表4）。
【０１３７】
表2：粗グリセロール調製物によって持続されるバイオマス生産。有酸素条件下又は無酸素条件下で純グリセロール調製物（純度＞99％）又は粗グリセロール調製物を増殖のための炭素源（10g/l）とした場合のバイオマス生産量を比較した。環境試料から単離された異なるタクソンを代表する株を、指定した雰囲気条件下、撹拌せずに、マイクロタイタープレート中で培養した。
【表２】
0005750370.tif 000003
【０１３８】
表3：粗グリセロール調製物又は純グリセロール調製物によって得られる大腸菌MG1655のバイオマス生産量の比較。有酸素条件下で、pHを調節せずに、純グリセロール調製物（純度＞99％）又は粗グリセロール調製物を増殖のための炭素源とした場合のバイオマス生産量を比較した。株を培養管中、有酸素条件下で培養した。Φ，平均；stdev，標準偏差。
【表３】
0005750370.tif 000004
【０１３９】
表4：粗グリセロール（10g/l）中に存在する不純物が最少培地の多量元素の代わりになる可能性。有酸素条件下で、pHを調節せずに、純グリセロール調製物（純度＞99％）又は粗グリセロール調製物を増殖のための炭素源及び多量元素源とした場合のバイオマス生産量を比較した。Φ，平均；stdev，標準偏差。
【表４】
0005750370.tif 000005
【０１４０】
3．2  グリセロールキナーゼ及びグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼを迂回してジヒドロキシアセトンリン酸を与える機能的経路の構築
グリセロールデヒドラターゼをコードする大腸菌由来の遺伝子gldA、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）をコードするシトロバクター・フロインデイ由来のdhaK、及びプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする大腸菌由来のfucOをプラスミドpB2araJにクローニングしてプラスミドpDP_gdfを得た。プラスミドpDP_mgdfは、さらに大腸菌由来のメチルグリオキサールシンターゼを含有する。既知の生化学経路によれば、プロパンジオールオキシドレダクターゼは、この実施例には関係がない。しかし、プラスミドpDP_gdfとその誘導体pDP_mgdfは組換え1，2−PD生産に関係するので、本発明者らは、これらのプラスミドを、glpKノックアウトの機能的相補性について調べた。
【０１４１】
アッセイにより、プラスミドpDP_gdf又はpDP_mgdfの存在は、グリセロールが唯一の炭素源である場合に、大腸菌のglpK突然変異体における増殖の阻害を軽減することが実証された（表5）。こうして、グリセロールを代謝するための、内在性経路に依存しない誘導性非調節（unregulated）経路が樹立された。最終的に得られるバイオマスは、対照株（DH5α□araB）の増殖と比較して、又はグルコースが増殖のための基質である場合と比較して、同等又はそれ以上だった。
【０１４２】
表5：炭素源として10g/lのグルコース又はグリセロールを含有する最少培地で、大腸菌DH5αのaraBノックアウト及びその派生株を培養した。異なる株を、培養管中、有酸素条件下で5日間、37℃において培養した。バイオマスは実験の最後に580nmにおける光学密度として決定した。stdev，標準偏差。
【表５】
0005750370.tif 000006
【０１４３】
3．3  グリセロールからの組換え1，2−PD生産に不可欠な最小遺伝子セットの確定
大腸菌DH5αのaraB突然変異体を、表6に列挙する関心対象の遺伝子を含有する異なるプラスミドでトランスフェクトした。10g/lの粗グリセロールを含有する最少培地中、有酸素条件下で、株が定常期に入るまで3〜5日間、野生型株（対照）及び組換え株を培養した。1，2−PD含有量のGC−MS分析によって上清を分析した。結果を表6に示す。
【０１４４】
表6：10g/lの粗グリセロールを含有する最少培地で大腸菌株を培養した時の上清に確認された1，2−PD含有量
【表６】
0005750370.tif 000007
【０１４５】
3．4  合成オペロンにコードされるグリセロールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、メチルグリオキサールシンターゼ及びプロパンジオールオキシドレダクターゼを発現させる組換え大腸菌株によるプロパンジオールの1，2−異性体の排他的生産
大腸菌MG1655□araBをプラスミドpDP_mgdfで形質転換するか、形質転換せずに、炭素源として10又は15g/l粗グリセロールを含有する最少培地で培養した。インキュベーションは、培養管中、有酸素条件下で行うか、密封したガラスバイアル中で撹拌せずに（半無酸素条件下で）行った。プラスミドを持たない大腸菌MG1655□araBを対照株とした。インキュベーション期間は5日間、インキュベーション温度は37℃とした。
【０１４６】
実験の最後に、増殖を光学密度（OD580）として決定し、1，2−PDレベル又は1，3−PDレベルをGC−MS分析によって決定した。アッセイは二つ一組にして行った。結果（表7）は、大腸菌が粗グリセロールから1，2−PDを生産することを可能にする操作された経路の導入の成功（これにより、プロパンジオールの1，2−異性体が排他的に生産される）を実証している。
【０１４７】
表7：大腸菌MG1655のaraBノックアウト株をプラスミドpDP_mgdfで形質転換するか、又は形質転換せずに、濃度が10又は15g/lの粗グリセロールを炭素源として含有する最少培地で培養した。培養は、有酸素条件下及び半無酸素条件下、37℃で行った。実験（5日間）の最後に580nmにおける光学密度としてバイオマスを決定し、上清中の1，2−PD含有量をGC−MS分析によって決定した。Φ，検出されなかった。検出限界10mg/l。Φ，平均；stdev，標準偏差。
【表７】
0005750370.tif 000008
【０１４８】
3．5  大腸菌の野生型株及び突然変異体株に対するメチルグリオキサールの毒性
大腸菌MG1655の野生型又はそれぞれ遺伝子gloA及びgloBが不活化された突然変異体を、純グリセロール（10g/l）を炭素源及びエネルギー源とし、異なる量のメチルグリオキサールを含有する、最少培地で培養した。メチルグリオキサールに関する検査により、少なくとも72時間の化学的安定性が示された。大腸菌を湿潤雰囲気下、マイクロタイタープレートにおいて撹拌せずに37℃で培養した。接種の48.5時間後にOD580で増殖を決定した（図1；黒いバー、大腸菌MG1655野生型；灰色のバー、大腸菌MG1655 gloA突然変異体；斜線入りのバー、大腸菌MG1655 gloB突然変異体）。メチルグリオキサールの細胞外濃度が2.5mM以上の場合、野生型株の増殖の阻害が観察された。感受性は突然変異体株の方が有意に高く、特にグリオキシラーゼI突然変異体（gloA）ではそうだったことから、gloAが細胞内メチルグリオキサールの主要排出経路であるという本発明者らの発見が立証された（4.6参照）。これらの結果は、さらに、高レベルのメチルグリオキサールが大腸菌の増殖を阻害することも実証しており、これがメチルグリオキサールシンターゼのリン酸非感受性変異体の同定の根拠である。
【０１４９】
3．6  主要MG除去活性の同定
大腸菌MG1655を、メチルグリオキサール（MG）代謝、例えばMGの解毒に関与する遺伝子産物を有する遺伝子について不活化した（遺伝子ノックアウト）。それらの遺伝子を表8に列挙する。野生型株及び突然変異体株を、培養管中、有酸素条件下で撹拌しながら、増殖が止まるまで培養した。バルク液中の1，2−PDのレベルをGC−MS分析によって決定し、グルコース（陰性対照）を炭素源及びエネルギー源にした場合に見いだされるレベルと比較した。グリセロールを増殖のための基質とした場合、約20mg/ml 1，2-PDのバックグラウンドレベルが検出された。しかし、gloA突然変異体でのみ、有意に上昇した1，2−PDレベルが観察された。
【０１５０】
表8：メチルグリオキサール代謝に関与する遺伝子を突然変異させた大腸菌MG1655の株を、グリセロール又はグルコース（10g/l）を含有する最少培地で培養した。培養は有酸素条件下、37℃で、増殖が止まるまで行った。増殖は光学密度（OD580）として決定し、プロパンジオールレベルはGC−MS分析によって決定した。Φ，平均；stdev，標準偏差。
【表８】
0005750370.tif 000009
【０１５１】
3．7  高レベルの1，2−PDを生産する組換え生物
大腸菌MG1655を、遺伝子araBについて、又は遺伝子aldA及びgloAについて、不活化した（遺伝子ノックアウト）。対応する突然変異体をプラスミドpDP_mgdfで形質転換した。プラスミドpDP_mgdfを有するaraB突然変異体を、さらに、アルド−ケトレダクターゼ活性を付与する遺伝子（例えば大腸菌のdkgA又はdkgB）をコードするプラスミドpCR2.1で形質転換した。細胞を、粗グリセロール（15g/l）の存在下、有酸素条件又は半無酸素条件で、37℃において、光学密度がもはや増加しなくなるまで、2〜5日間培養した。上清を、GC−MS分析により、1，2−PD含有量について分析した（表9）。
【０１５２】
表9：グリセロールを1，2−PDに変換する遺伝子を発現させる大腸菌MG1655の突然変異体株を、グリセロール又はグルコース（15g/l）を含有する最少培地で培養した。培養は、有酸素条件下又は半無酸素条件下、37℃で、増殖が止まるまで行った。上清中のプロパンジオールレベルをGC−MS分析によって決定した。Φ，平均；stdev，標準偏差。
【表９】
0005750370.tif 000010
【０１５３】
結果
表2及び表3に示すように、グリセロールの粗調製物は、それ以上加工しなくても、大腸菌及びその類縁種に限らず、多種多様な生物によって利用され得る。粗グリセロールを利用することによって得られるバイオマス生産量は、純粋なグリセロールを炭素基質とした場合と比較して、同等以上である。このように、粗グリセロールは、グリセロールの発酵に基づく事実上任意のプロセスにおいて、純粋なグリセロール調製物の代わりになる。
【０１５４】
表4に示すように、粗グリセロール中に存在する不純物は、宿主細胞の実質的増殖を持続させるリン源になる。したがって、培養ブロスに加えるリンを約70％減らすことができる。
【０１５５】
表6に示すように、グリセロールからの1，2−PDの合成には、プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性が不可欠である。グリセロールデヒドロゲナーゼを発現させる宿主細胞は1，2−PDを生産しない。グリセロールデヒドロゲナーゼとメチルグリオキサールシンターゼを発現させるがプロパンジオールオキシドレダクターゼを欠く細胞が、検出できる量の1，2−PDを生産しないのに対して、プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性が追加して存在すると、有意な1，2−PD生産が起こる。
【０１５６】
表7に示すように、メチルグリオキサールシンターゼ、グリセロール−デヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ及びプロパンジオールオキシドレダクターゼを共発現させる組換え株では、有酸素条件下で、グリセロールから高力価の1，2−PDが得られる。本発明に基づくプロパンジオールの合成は、プロパンジオールの1，3−異性体ではなく、もっぱら1，2−異性体の合成をもたらす。
【０１５７】
表8に示すように、大腸菌において、gloAによってコードされるグリオキシラーゼI活性を不活化すると、グリセロールから1，2−PDの有意な生産が起こる。したがって、gloAによってコードされる酵素活性は、宿主細胞における1，2−PDの高レベル生産を妨害する主要な競合的活性である。
【０１５８】
発明の実施形態
1．グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオールを生産するように操作された（engineered）宿主細胞。
2．グリセロールが少なくとも70％、特に少なくとも75％、特に少なくとも80％、特に少なくとも85％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、特に少なくとも99％、且つ100％までの純度を有する、上記実施形態の宿主細胞。
3．グリセロールが80％〜90％の純度を有する、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
4．グリセロールが約85％の純度を有する、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
5．グリセロールがバイオディーゼル生産及び／又はバイオエタノール生産から得られる粗グリセロール調製物である、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
6．組換えDNA技法によって操作された、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
7．プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性（fucO）をコードする遺伝子を導入することによって操作された、上記実施形態のいずれか一つ（特に実施形態6）の宿主細胞。
8．グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）からなる群より選択される酵素活性をコードする少なくとも一つの追加遺伝子を、前記活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性（fucO）と共に発現されるように導入することによって操作された、実施形態7の宿主細胞。
9．グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする追加遺伝子を、前記グリセロールデヒドロゲナーゼ活性が、プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、実施形態7の宿主細胞。
10．ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする追加遺伝子を、前記ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、実施形態7の宿主細胞。
11．メチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）をコードする追加遺伝子を、前記メチルグリオキサールシンターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、実施形態7の宿主細胞。
12．グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする追加遺伝子を、前記グリセロールデヒドロゲナーゼ及びジヒドロキシアセトンキナーゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、実施形態7の宿主細胞。
13．グリセロールデヒドロゲナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼをコードする追加遺伝子を、前記グリセロールデヒドロゲナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、実施形態7の宿主細胞。
14．ジヒドロキシアセトンキナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼをコードする追加遺伝子を、前記ジヒドロキシアセトンキナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、実施形態7の宿主細胞。
15．グリセロールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼをコードする追加遺伝子を、前記グリセロールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ及びメチルグリオキサールシンターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、実施形態7の宿主細胞。
16．グリセロールデヒドラターゼをコードする追加遺伝子を、前記グリセロールデヒドラターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、上記実施形態のいずれか一つ（特に実施形態7）の宿主細胞。
17．アルド−ケトレダクターゼをコードする追加遺伝子を、前記アルド−ケトレダクターゼ活性がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性と共に発現されるように導入することによって操作された、上記実施形態のいずれか一つ（特に実施形態7）の宿主細胞。
18．前記アルド−ケトレダクターゼ活性がdkgA、dkgB、yeaE及びyghZからなる群より選択される遺伝子によって付与される、実施形態17の宿主細胞。
19．アラビノース代謝に欠陥を有する、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
20．前記欠陥が、リブロースキナーゼ活性が低下しているか欠損していることによる、上記実施形態の宿主細胞。
21．メチルグリオキサールの代謝に欠陥を有する、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
22．前記欠陥がグリオキシラーゼ系I、グリオキシラーゼ系II、乳酸デヒドロゲナーゼA、グリオキシラーゼ系III、アルデヒドデヒドロゲナーゼA活性からなる群より選択される酵素活性（特にグリオキシラーゼ系I活性）が低下しているか欠損していることによる、上記実施形態の宿主細胞。
23．前記宿主細胞がジヒドロキシアセトンリン酸の代謝に欠陥を有する、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
24．前記欠陥がトリオースリン酸イソメラーゼ活性が低下しているか欠損していることによる、上記実施形態の宿主細胞。
25．グリセロールを唯一の炭素源として増殖させた場合に高レベルの1，2−プロパンジオールを生産するが、1，3−プロパンジオールは本質的に生産しない、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
26．微生物宿主細胞又は真菌宿主細胞である、上記実施形態のいずれか一つの宿主細胞。
27．大腸菌である、実施形態26の微生物宿主細胞。
28．誘導性プロモーターの制御を受ける合成オペロンを含むポリヌクレオチド分子であって、前記オペロンがグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）及びプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）をコードする遺伝子を含む、ポリヌクレオチド分子。
29．誘導性プロモーターの制御を受ける合成オペロンを含むポリヌクレオチド分子であって、前記オペロンがグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）をコードする遺伝子を含む、ポリヌクレオチド分子。
30．合成オペロンがメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）をコードする遺伝子をさらに含有するように拡大されている、実施形態29のポリヌクレオチド。
31．それぞれグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）；プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）をコードする遺伝子は大腸菌から得ることができ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）をコードする遺伝子はシトロバクター・フロインデイ（C freundii）から得ることができる、実施形態29及び30のポリヌクレオチド。
32．プラスミドである、上記実施形態のいずれか一つのポリヌクレオチド。
33．合成オペロン中の遺伝子の配置が5’-mgsA-gldA-dahK-fucO-3’である、上記実施形態のいずれか一つのポリヌクレオチド。
34．誘導性プロモーターがアラビノース誘導性プロモーターである、上記実施形態のいずれか一つのポリヌクレオチド。
35．実施形態28〜34のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む上記実施形態のいずれか一つの微生物。
36．高いリン酸塩濃度下で、特に培養培地中、0.7mMより高いリン酸塩濃度下で、又は細胞の細胞質中、9.3×10-5mMより高いリン酸塩濃度下で、完全に作動し得るリン酸非感受性mgsA遺伝子を含む、上記実施形態のいずれか一つの微生物。
37．実施形態1〜27のいずれか一つの宿主細胞を、単純炭素源、特に粗グリセロール調製物を含有する適当な増殖培地で増殖させた後、生産された1，2−プロパンジオールを回収し、そして場合によっては、それを精製することを含む、1，2−プロパンジオールの生産方法。
38．i）プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性を過剰発現させる実施形態1〜27のいずれか一つの宿主細胞を、非発酵性炭素基質を含有する培地で培養すること（ここでは、炭素基質がバイオマスの生産を持続させつつ、同時に1，2−プロパンジオール（1，2−PD）を生産するための基質としても役立ち、非発酵性炭素源が宿主細胞により、1，2−プロパンジオールに代謝される）；
ii）段落i）に従って生産された1，2−プロパンジオールを回収すること；及び、場合によっては、
iii）回収された1，2−プロパンジオールを精製すること
を含む、実施形態37の方法。
39．前記非発酵性炭素基質が粗グリセロール調製物、特に少なくとも70％、特に少なくとも75％、特に少なくとも80％、特に少なくとも85％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、特に少なくとも99％、且つ100％までの純度を有するグリセロールを含有する調製物である、上記実施形態のいずれか一つの方法。
40．グリセロールが80％〜90％、特に約85％の純度を有する、上記実施形態のいずれか一つの方法。
41．非発酵性炭素基質、特に粗グリセロール調製物が、1，2−プロパンジオールに選択的に代謝される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
42．プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）を過剰発現させるように操作された宿主細胞が使用される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
43．プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共に、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）からなる群より選択される少なくとも一つの酵素が共発現されるように操作された宿主細胞が使用される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
44．1，2−PD生産と競合する非生産的経路に関与する少なくとも一つの酵素活性を失活させた細胞が使用される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
45．特に、グリオキシラーゼ系I及びII（gloA及びgloB）、乳酸デヒドロゲナーゼA（ldhA）、グリオキシラーゼ系III（マスター調節因子rpoSの不活化によって間接的に）、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の1つ又はそれ以上を失活させた微生物突然変異体、特に大腸菌の突然変異体が使用される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
46．gloA活性をコードする遺伝子が部分的に又は完全に不活化された微生物突然変異体又は株、特に大腸菌突然変異体が使用される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
47．アラビノース代謝が不活化された微生物突然変異体又は株が使用される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
48．大腸菌株、特に大腸菌MG1655株及びDH5α株がそれぞれ、宿主生物として使用される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
49．グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）からなる群より選択される酵素活性並びにプロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）をコードする遺伝子の少なくとも一つが、誘導性プロモーター、特にアラビノース誘導性プロモーター、特にparaBADプロモーターの制御を受ける、上記実施形態のいずれか一つの方法。
50．プロパンジオールオキシドレダクターゼ（fucO）活性と共にグリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）活性、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（dhaK）活性及びメチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）活性からなる群より選択される少なくとも一つの酵素活性を共発現させる宿主細胞を得るために本発明の方法において合成オペロンが使用される、上記実施形態のいずれか一つの方法。
51．上記活性をコードする遺伝子が、誘導性プロモーター、特にアラビノース誘導性プロモーター、とりわけparaBADプロモーターの制御を受ける、上記実施形態のいずれか一つの方法。
52．前記オペロンから誘導時に転写される一続きの遺伝子がmgsA、gldA、dhaK、fucOである、上記実施形態のいずれか一つの方法。
53．1，2−プロパンジオールを生産するために実施形態37〜52のいずれか一つの方法で使用することができる宿主細胞を作成するための方法であって、実施形態27〜33のいずれか一つのポリヌクレオチドで前記宿主細胞を形質転換することを含む方法。
54．前記宿主細胞が微生物宿主細胞、特に大腸菌である、実施形態53の方法。
55．形質転換がエレクトロポレーションによって達成される、実施形態53の方法。
56．実施形態53〜55のいずれか一つの方法によって作出される宿主細胞。
【０１５９】
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【０１６０】
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米国特許出願公開第2007/072279号
米国特許第7049109号
国際公開第2005/073364号
米国特許第6087140号
米国特許第6303352号
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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