(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分析物を検出するための飽和アッセイを実施する方法であって、
ａ．標識結合試薬と未標識分析物アナログを提供するステップと、
ｂ．第１捕獲ゾーンにおいて、前記標識結合試薬に対する分析物と未標識分析物アナログとの競合的結合の結果として生じる結合画分を濃縮するステップと、
ｃ．前記第１捕獲ゾーンの下流に位置する第２捕獲ゾーンにおいて、前記未標識分析物アナログもしくは前記標識結合試薬の遊離画分または未結合画分を濃縮するステップと、
ｄ．第２捕獲ゾーンにおいて濃縮された前記標識結合試薬を検出するステップと
を含み、
前記第１捕獲ゾーンは、反応混合物から前記結合画分を排除する孔径の毛細管膜を含み、
前記第２捕獲ゾーンは、前記遊離画分または未結合画分を、さらに下流の吸収パッドへ通過する前記反応混合物の残りから排除する孔径の毛細管膜を含み、かつ、
前記第２捕獲ゾーンにおいて濃縮された標識結合試薬の量が、サンプル中の分析物の量を示す、方法。
【請求項２】
サンプル中の分析物を検出するための飽和アッセイを実施する方法であって、
ａ．未標識結合試薬と標識分析物アナログを提供するステップと、
ｂ．第１捕獲ゾーンにおいて、前記未標識結合試薬に対する分析物と標識分析物アナログとの競合的結合の結果として生じる結合画分を濃縮するステップと、
ｃ．前記第１捕獲ゾーンの下流に位置する第２捕獲ゾーンにおいて、前記標識分析物アナログもしくは前記未標識結合試薬の遊離画分または未結合画分を濃縮するステップと、
ｄ．第２捕獲ゾーンにおいて濃縮された前記標識分析物アナログを検出するステップと
を含み、
前記第１捕獲ゾーンは、反応混合物から前記結合画分を排除する孔径の毛細管膜を含み、
前記第２捕獲ゾーンは、前記遊離画分または未結合画分を、さらに下流の吸収パッドへ通過する前記反応混合物の残りから排除する孔径の毛細管膜を含み、かつ、
前記第２捕獲ゾーンにおいて濃縮された標識分析物アナログの量が、サンプル中の分析物の量を示す、方法。
【請求項３】
前記飽和アッセイは、
ａ．標識結合試薬に対する分析物と未標識分析物アナログとの競合的結合ステップと、
ｂ．分析物アナログに結合した標識結合試薬の画分を、結合していない標識結合試薬の遊離画分から分離するステップと、
ｃ．標識結合試薬の前記遊離画分を固定化および濃縮するステップと、
ｄ．固定化および濃縮した標識結合試薬の遊離画分を検出するステップと
を含むイムノアッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記飽和アッセイは、
ａ．標識結合試薬に対する前記分析物と未標識多価分析物アナログとの競合的結合ステップと、
ｂ．標識結合試薬の凝集画分と非凝集画分とを分離するステップと、
ｃ．標識結合試薬の前記非凝集画分の固定化および濃縮するステップと、
ｄ．固定化および濃縮した標識分析物結合試薬を検出するステップと
を含む凝集アッセイである、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
前記飽和イムノアッセイは、
ａ．未標識結合試薬に対する前記分析物と標識分析物アナログとの競合的結合ステップと、
ｂ．未標識結合試薬に結合した標識分析物アナログの画分を、結合していない標識分析物アナログの遊離画分から分離するステップと、
ｃ．標識分析物アナログの前記遊離画分の固定化および濃縮するステップと、
ｄ．固定化および濃縮した標識分析物アナログの遊離画分を検出するステップと
を含むイムノアッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記飽和イムノアッセイは、
ａ．未標識結合試薬に対する前記分析物と標識多価分析物アナログとの競合的結合ステップと、
ｂ．標識多価分析物アナログの凝集画分と非凝集画分とを分離するステップと、
ｃ．標識多価分析物アナログの前記非凝集画分を固定化および濃縮するステップと、
ｄ．固定化および濃縮した標識多価分析物アナログの非凝集画分を検出するステップと
を含む凝集アッセイである、請求項２または５に記載の方法。
【請求項７】
前記標識試薬は、検出可能な成分を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第２捕獲ゾーンによって固定化および濃縮された前記標識分析物結合試薬の未凝集画分または未結合遊離画分は、視覚的に検出可能な指標である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出可能な分析物は抗体であり、前記分析物結合試薬は抗原、抗原アナログ、ハプテン、ハプテンアナログまたは測定対象の抗体に対する特異性を備える２次抗体からなるリストから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中の分析物を検出するために飽和アッセイを実施するためのキットであって、
ａ．結合試薬に対する分析物アナログと分析物との競合的結合ステップの反応混合物から、分析物アナログの結合画分を排除する孔径の毛細管膜を備える、第１捕獲ゾーンを含む多孔性担体と、
ｂ．結合試薬または分析物アナログの遊離画分または未結合画分を、前記反応混合物の残りから排除する孔径の毛細管膜を含む、前記第１捕獲ゾーンの下流に配置される第２捕獲ゾーンと、
ｃ．反応混合物の残りを流し込む、第２捕獲ゾーン下流に配置される吸収パッドと
を含むキット。
【請求項１１】
生物学的または非生物学的である検出可能な成分を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記検出可能な成分は、微生物、細胞、高分子、金属ゾル粒子、ビーズ、木炭、カオリナイト、ベントナイト、またはラテックスビーズを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記検出可能な成分は、金コロイドを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記飽和アッセイは凝集イムノアッセイであり、前記第１捕獲ゾーンは凝集画分を固定化するための手段を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
前記検出可能な成分は、凝集可能である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
ｄ．複数の分析物結合成分が結合しているハブと、
ｅ．前記分析物結合成分に結合できる複数の分析物結合試薬と
をさらに含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
ｆ．複数の分析物結合試薬が結合しているハブと、
ｇ．前記分析物結合試薬に結合できる複数の分析物アナログ成分を含むシグナル粒子と
をさらに含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
緩衝液、取扱説明書、チャート、乾燥剤、対照サンプル、色素、バッテリーおよび／またはシグナル処理／ディスプレイ手段をさらに含む、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記多孔性担体は、固体マトリックスである、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記多孔性担体は、繊維性である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記第１捕獲ゾーンの上流の孔径は、ハブ、標識試薬、サンプルおよび凝集物の自由な移動を許容するために十分な大きさである、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
サンプル中の分析物を検出するために飽和凝集アッセイを実施するためのデバイスであって、前記デバイスは担体を含み、前記担体はサンプルを受け入れるための近位端と、前記サンプルが前記担体に従って移動できる方向にある遠位端とを含み、このとき前記担体は、
ａ．前記分析物と、前記分析物に対する多価結合試薬との競合的結合の結果として生じる凝集画分を排除する孔径の毛細管膜を含む第１捕獲ゾーンと、
ｂ．前記第１捕獲ゾーンの下流に配置される、前記多価結合試薬の非凝集画分を排除する孔径の毛細管膜を含む第２捕獲ゾーンと、
ｃ．前記第２捕獲ゾーンの下流に配置される、反応混合物の残りを流し込む吸収パッドと
を含むデバイス。
【請求項２３】
前記担体は、多孔性である、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
外箱または容器内に収容される、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記デバイスは、手持ち型である、請求項２４に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の分析物を検出するための改良されたアッセイに関する。詳細には、本発明は、アッセイデバイス、そのようなアッセイを実施するための手段を含むキット、一般的には分析物結合試薬上の結合部位に対する、分析物と分析物アナログとの間の結合競合に基づいてサンプル中の分析物を検出するためのアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結合アッセイは、サンプル中の分析物を検出および定量するために明確に確立された技術である。結合アッセイは特に、疾患の診断および予後診断のための補助として生物学的サンプル中の物質を検出および／または測定するために、ならびに療法への患者の応答を予測するために有用である。結合アッセイは、分析物結合試薬が抗体もしくはその機能的フラグメントである、様々なフォーマットにあるイムノアッセイの形状を取る。
【０００３】
そのようなアッセイの大半は、２部位もしくは「サンドイッチ」フォーマットに基づき、このフォーマットは２つ以上の抗体もしくは受容体へ同時に結合できるがハプテンに対しては適合しない分析物（それらは、それらのサイズのために一度に１つの抗体にしか結合できないことが多い）のために極めて有用である。ハプテンアッセイのためには、通常は、典型的には抗原抗体アッセイのために使用される飽和型アッセイを利用することが必要である。これらは、それによりサンプル分析物が、分析物結合試薬（例えば、抗体）上の限定された数の結合部位に対して定量の試薬分析物（または、例えば、検出可能であるように、もしくは固定化されるように、化学修飾されている分析物アナログ）と競合するアッセイである。飽和アッセイでは、分析物および分析物アナログ分子の総数は、分析物結合試薬上の結合部位の総数より大きい。
【０００４】
これらのアッセイは、直接競合フォーマット（この場合はサンプル分析物、アナログおよび分析物結合試薬が同時に反応する）または間接競合フォーマット（それによりサンプル分析物と分析物結合試薬は、まず最初に一緒に相互作用させられ、次に分析物アナログと反応させられる）であってよい。この後者のフォーマットは、逐次もしくは逆滴定アッセイとしても公知である。競合アッセイは、一般に検出可能なシグナル成分および未標識抗体（固相へ付着していることが多い）で標識された分析物アナログを利用する。密接に関連する１部位免疫測定法フォーマットは一般に、検出可能な成分で標識された抗体および固相上に固定化された分析物アナログを利用する。
【０００５】
そこで該分析物結合試薬へ結合できる分析物アナログの量は、サンプル中の分析物の量に反比例し、そして結合した分析物アナログ（競合アッセイの場合）または結合した分析物結合試薬（１部位免疫測定法アッセイの場合）によって、サンプル中の分析物の存在および／または量を決定できる。シグナルの減少の検出は、陰性バックグラウンドからのシグナルの増加よりはるかに困難であり、そして特に検出が視覚的である場合は、感受性の消失を生じさせることが多い。遊離もしくは未結合シグナルの測定はこれを克服するが、しかし通常は該遊離画分は大量に存在していて拡散性であり、同様に感受性の消失を生じさせる。
【０００６】
患者のより近くでアッセイを実施する必要が増大しているが、これは主として結果を得るために要する時間を短縮するためである。そのようなアッセイは、ポイントオブケア（Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ）アッセイとして公知であり、それらのアッセイは非検査室状況において熟練していないスタッフによって実施されることが多いため、典型的には厳正かつ実施が簡便である必要がある。理想的には、ポイントオブケアアッセイは十分に自己完結型でなければならず、付属的装置（予想される読取り装置を除いて）を必要とすべきではない。ポイントオブケアアッセイが臨床使用されようとする場合は、検査室ベースのアッセイと同様の感受性を必要とする。しかし、従来型のイムノアッセイは、複雑なプロトコールおよび検出システムを含むことが多く、これは、それらがポイントオブケアタイプの使用には適合しないことが多いことを意味する。
【０００７】
特殊なポイントオブケアアッセイが開発されてきた。最も一般的であるのは、ラテラルフローアッセイである。これらは標識された可動性成分（例えば、着色粒子標識抗体）、固定化成分（例えば、抗体ストライプもしくはドット）およびサンプルが毛管作用によって通過移動することを誘発する膜に基づいていることが多い。分析物の存在下では、「サンドイッチ」は、該固定化された抗体捕獲ゾーンで形成され、着色ラインもしくはドットの発生をもたらす。従来型のラテラルフローアッセイは、例えば米国特許第５，６５６，５０３号（Ｕｎｉｌｉｖｅｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ  Ｂ．Ｖ）によって例示されている。これらのアッセイは、Ｇｅｉｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２８：１８９４）によって教示されたラジアルフォーマットではなくラテラルフローフォーマットではあるが、固定化された抗体捕獲ゾーンについて規定している。
【０００８】
基礎的なラテラルフローフォーマットは、競合タイプのアッセイを実施することを可能にするために修正されてきた。そのように修正されたラテラルフローアッセイは、標識された可動性成分（例、着色粒子標識抗体）、固定化成分（例、ストライプもしくはドットの形状にある分析物アナログ）およびサンプルが毛管作用によって通過移動する膜に基づいていてよい。分析物の非存在下では、抗体標識粒子は固定化された分析物アナログに結合し、着色ラインもしくはドットの発生をもたらすが、分析物の存在下では、抗体上の該結合部位は、該粒子標識抗体の該結合が減少もしくは消失するように占有され、それに伴って色が減少もしくは消失する。そのようなアッセイは、例えば米国特許第５，１４３，８５２号（Ｂｉｏｓｉｔｅ）によって教示されている。しかし、色の減少の検出は、上述したように問題となる可能性がある。
【０００９】
ラテラルフローアッセイは、速度、便宜性、および比較的低コストである等、多数の利点を提供する。しかし、幾つかの欠点もある。捕獲成分（例えば、抗体）は、一般に膜上への吸着によって固定化されるが、そこで膜および／または抗体バッチにおける変動は固定化された抗体の量における変動をもたらす可能性がある。さらに、抗体の一部は単に緩やかに結合しているだけであり、流体正面が通過すると可動性になり、シグナルの消失を招くことがある。また、１つの抗体が固定化されるので、それが該分析物と反応するための時間は、該サンプルが流れすぎる時間と同一となるため、短いインキュベーション時間に起因して感受性が減少する可能性がある。さらにまた、各分析物に合わせて特別に被覆された膜を製造することも必要であるので、そこで製造コストが増加する。
【００１０】
これらの欠点に対処するために、固定化捕獲抗体の使用を回避することによって努力が重ねられてきた。例えば、欧州特許第２９７２９２号（Ｍｉｌｅｓ）、欧州特許第３１０８７２号（Ｈｙｇｅｉａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および欧州特許第０９６２７７１号（Ｍｉｚｕｈｏ）は、捕獲ゾーンを備える膜とともに２つの抗体被覆粒子（１つは未標識であるが該ゾーンによって捕獲されるように大きく、もう１つは小さくて該ゾーンを通って通過でき、かつ標識されている）を含むシステムについて記載している。分析物の存在下では、該小さなビーズは該捕獲された大きなビーズに結合するようになり、着色ラインの形成をもたらす。これらの方法は事前に固定化された捕獲抗体の使用を回避するが、捕獲ゾーンに加えて２種類の抗体被覆粒子を必要とする。そのような粒子は、本質的に疎水性であるため、生物学的流体の存在下では非特異的方法で凝集が誘発され得ることが多い。
【００１１】
他の研究者らは、膜を通して自由に移動できる抗体被覆粒子が、それらの移動が阻止されるように分析物の存在下で凝集するような、より単純なフォーマットを試みてきた。そのような凝集に基づくイムノアッセイは、当技術分野において公知であり、抗原もしくは抗体が結合することによってサンプル中の抗体もしくは抗原の存在を指示する粒子の凝集によるものである。より単純な凝集アッセイ形態の１つでは、特定の分析物に対する抗体は、ビーズもしくは他の可視材料に結合する。
【００１２】
詳細には、米国特許第４，６６６，８６３号（Ａｍｅｒｓｈａｍ）は、クロマトグラフィー手段によって遊離標識と結合標識とを分離するための方法を開示している。１つの変形では、それらは、膜に沿った流動を用いた凝集および非凝集抗体被覆着色粒子の分離を教示している。分離の前に、反応混合物は、凝集物を安定化させるために架橋剤と反応させられる。欧州特許第２９３７７９号（Ｄａｉｉｃｈｉ）もまた、着色ラテックス凝集反応を開示し、この場合には、非凝集ラテックスの通過を許容する一方で凝集物は捕獲する毛細管によって、凝集粒子と非凝集粒子が分離される。欧州特許第２８０５５９号（Ｋｏｄａｋ）は、分析物の非存在下では標識がフィルターを通過できるが、分析物の存在下では捕獲される凝集物が形成されることによる、多価分析物についてのアッセイについて記載している。米国特許第６，４７２，２２６号（Ｇｅｎｏｓｉｓ）は、極めて大量の分析物のための、固定化抗体を用いないラテラルフローアッセイについて記載している。それらは、一方は大きな孔を有し、一方は小さな孔を有する２ゾーンシステムであって、分析物は大きな孔を通過できるが孔の小さなゾーンに到達すると捕獲される２ゾーンシステムについて記載している。これは、両方のゾーンを通過できる小さな標識（例、抗体が付着した金ゾル）と結び付けて使用される。分析物の存在下では、抗体標識金ゾルの画分は該分析物に結合されるようになり、該孔の小さなゾーンで捕獲されるようになる。
【００１３】
一般的に、これらの凝集に基づくアッセイは、大きな安定性凝集物の形成を可能にする複数エピトープを備えた大きな分析物の検出に制限される。より小数のエピトープを有する小さな分析物を用いた場合、または利用可能なエピトープが極めて限定数しか使用されない場合には、結合事象数が減少するために凝集体の弱化および感受性の消失を生じ、有効性が損なわれることがある。
【００１４】
代替法としては、分析物の存在下で捕獲されて検出可能なシグナルを生成する標識シグナル成分を含有する凝集物が形成されるように、毛細管膜内での免疫凝集に基づくいわゆる膜凝集システム（英国特許出願第０５２３１２４．６号（Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社））がある。この技術は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社によって以前のシステムに比して改良されたものであるが、一層改善できる一部の態様が残っている。第一に、捕獲された凝集物によって形成される「ライン」は、若干幅が広い。それ自体は問題ではないが、より一般的な従来型のラテラルフローアッセイにおいて観察されるものとはわずかに相違する。これはおそらく、このシステムは様々なサイズの粒子凝集物を捕獲しなければならず、小さなサイズの粒子はおそらく該捕獲ゾーン内へさらに移動するためである。第二に、非分析物媒介性相互反応によって生じる標識粒子調製物中にみられる任意の凝集物は、バックグラウンドのシグナルおよび偽陽性結果を引き起こす可能性がある（同じことが従来型ラテラルフローアッセイに当てはまる）。これは粒子を調製および適用するために適合する条件によって克服することができるが、製造を単純化してより堅固なシステムを作製することで、上記の必要を回避したシステムを有することは有益である。
【００１５】
しかし一般に、先行技術の膜凝集アッセイは、凝集反応を促進するためのサンドイッチ原理に依存している。競合もしくは凝集阻害アッセイ（例えば、初期妊娠検査のための赤血球凝集反応阻害アッセイ）は当技術分野において公知であるが、主としてスライド上もしくは反応ウェル内で実施され、粒子のパターンにおける変化を観察することによって赤血球凝集反応が視覚的に検出されるアッセイに限定されている。凝集および非凝集粒子の分離を行わないので、例えば毛細管力などの強度の剪断力に曝露されないときには、強力で安定な凝集物の形成は必要とされない。
【００１６】
該分離ゾーンでのシグナルの減少を検出する必要を回避するために、粒子の該遊離もしくは該非凝集画分を検出する競合膜凝集アッセイを実施することが試みられてきた。米国特許第４，４５９，３６１号（Ａｎｇｅｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）は、凝集および非凝集粒子がフィルターによって分離され、濾液（非凝集）画分中の増加または濃縮水（凝集）画分中の減少いずれかを測定できる粒子免疫凝集システムについて記載している。欧州特許第５５６２０２号（Ａｋｅｒｓ社）は、表面上に分析物特異的受容体を有する着色粒子とサンプルとを接触させることによって、試験混合物が形成される類似のシステムについて記載している。該試験混合物は、該着色粒子より大きいが該粒子と分析物の凝集体よりは小さな孔を有し、その結果該凝集体が捕獲されるフィルターを通過させられる。混合物中の分析物の存在は、該濾液の色をチェックすることによって決定される。
【００１７】
本明細書に記載した競合膜凝集システムの多くを含む先行技術の競合アッセイの大半に関する重要な別の問題は、該結合標識のシグナルの減少を終点とすることである。これは該シグナルを定量するための器具を用いると正確に評価できる一方で、とりわけシグナルの減少が小さい場合に、低分析物濃度では視覚的検出に依存するアッセイ（例えば、大多数のポイントオブケアアッセイ）を用いて達成することはより困難である。このため、シグナル減少に依存するアッセイは、上記のような用途のためには一般的ではない。該非凝集もしくは遊離画分を測定する該膜凝集システムは、シグナルが散乱し、他のアッセイフォーマットにおける該遊離画分の測定と共通の感受性消失を被る。
【００１８】
先行技術の欠点を克服する、抗体標識シグナル粒子および分析物もしくは分析物アナログを被覆したハブ（または逆もまた同様）を利用する競合膜凝集フォーマットが考案されてきた。サンプル分析物の非存在下では、ハブ分子は該標識粒子と架橋結合し、安定性凝集物（すなわち着色ライン）を生成し、膜内に捕獲されるようになる。サンプル分析物の存在下では、抗体部位の一部は占有され、凝集反応（すなわちシグナル）が減少もしくは消失する。
【００１９】
溶媒の正確な流動および標識された検出粒子の存在を確証するための陽性対照を提供するために設計された、固定化された抗体もしくは他の結合剤を含むアッセイストリップの端部に位置するゾーン（いわゆる「試験完了ライン」）において過剰の標識試薬が検出されるイムノアッセイは公知である。しかし、そのようなインジケータは、該標識試薬が常に過剰にあるフォーマットでの該試験の完了を確実に報告するためにしか使用できない。このためそのようなイムノアッセイは、分析物の非存在下では、該標識試薬の大部分もしくは全部が競合結合ステップにおいて結合される飽和アッセイフォーマットのためには適合しない。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、現行技術に伴う多数の問題に対処する飽和アッセイの改良形を提供する。本発明は、標識試薬の遊離もしくは未結合画分（これにより分析物の存在下ではシグナルの増加が生じる）の測定に基づき、感受性の消失を回避するために該標識試薬の未結合もしくは遊離画分を濃縮するための機序を使用する。そのような飽和アッセイは、任意の適切なフォーマットであってよいが、好ましくは膜アッセイである。
【００２１】
詳細には、本発明は、競合アッセイフォーマットの修正形であって、第１捕獲ゾーンの下流での第２捕獲ゾーンの使用を含み、該第２捕獲ゾーンは未結合、もしくは遊離の標識試薬粒子を捕獲できる競合アッセイフォーマットの修正形を提供する。すなわち、サンプル分析物の非存在下では、本質的に全ての標識試薬粒子は該第１捕獲ゾーンで捕獲され、該第２捕獲ゾーンは空となる。しかし、サンプル分析物の存在下では、該標識試薬粒子の一部は未結合、もしくは遊離したままとなるので、該第１捕獲ゾーンから該第２捕獲ゾーンへ通過し、そこで捕獲されてラインの形成を生じる。
【００２２】
当業者には明白であるように、任意の飽和アッセイの結果として生じる未結合画分を捕獲して濃縮するこの原理は、未結合画分のような遊離画分を、検出可能なシグナル（好ましくは視覚的に検出可能である）を含有する結合画分から分離することが可能であり、そして遊離画分のサイズが測定対象となる元の分析物の尺度であるようなアッセイの任意のフォーマットに適用可能である。この原理は、該凝集画分が非凝集粒子から分離される凝集アッセイに適用することができる。
【００２３】
本明細書で使用する「飽和アッセイ」は、特異的分析物結合試薬（通常は抗体であるが、必ずしも抗体ではない）が限定されている、過剰の分析物および／または分析物アナログが存在する任意のアッセイを意味する。
【００２４】
「競合アッセイ」は、未標識抗体（もしくは一部の他の特異的分析物結合試薬）が、標識分析物アナログと（限定数の結合部位に対してサンプル分析物と競合する）一緒に使用される、広汎に使用されている飽和アッセイの１バージョンであるという意味で使用されている。
【００２５】
「分析物アナログ」は、該分析物結合試薬上の結合部位について該分析物と競合する試薬である。分析物アナログは、単純に固定化され、何らかの方法で標識もしくは化学修飾された結果として識別可能であってよく、またはアッセイフォーマットによっては、分析物の合成同等物もしくは多価同等物であってよい。
【００２６】
飽和凝集アッセイの場合には、多孔性担体内で安定である検出可能な凝集反応が形成されるのが望ましい。合理的な凝集は、複数の結合事象が可能である大きな多エピトープ性分析物を用いて達成できるが、ほんの少数のエピトープしか含有していない小さな分析物との安定性凝集を達成するのは困難なことがある。実際に、特異性の理由から、１つの分析物上の１もしくは２個のエピトープだけを利用するのが望ましいことが多い。
【００２７】
これを克服するためには、別名ハブとして公知である、担体にしっかりと結合した複数の結合パートナー（例えば、分析物アナログ分子）を含む多価担体分子を使用できる。結果として生じるハブは、次に結合反応を増幅させることができる。この方法で、小さな分析物のために強力で安定性の凝集を得ることが可能であり、および／または分析物上で限定数のエピトープしか使用されない状況では、外部安定化剤の必要が減少する。
【００２８】
したがって、多価分析物アナログは、分析物結合試薬に対して複数の結合部位を提示する任意の成分である。１つの例は、便宜的には結合パートナー、例えば抗体によって複数の分析物アナログが付着しているハブ分子である。または、分析物アナログは、例えば直接共有結合、化学架橋結合、または他の高親和性結合手段、例えばビオチン化分子のアビジンもしくはストレプトアビジン結合の使用などの他の手段によってハブ分子に付着されてよい。
【００２９】
結合反応の増幅は、多価ハブ分子の使用によって達成される。ハブは、好ましくは一様で安定性であって、結合パートナーを付着させることのできる任意の適切な材料から形成されてよい。ハブは、可溶性もしくは不溶性であってよいが、前者が好ましい。ハブの例には、ラテックスビーズ、ポリスチレン微粒子、ガラスビーズ、金コロイド、赤血球などの細胞、セルロースなどの繊維性材料、ならびに多糖類およびタンパク質などの高分子が含まれる。好ましいハブは、デキストラン、好ましくはアミノデキストランを含む多糖類、アガロース、微結晶セルロース、デンプンである。その他の適切な材料には、ポリエチレンイミン、ポリビニルトルエン、もしくはスチレンブタジアミンコポリマー、ポリアクロレインミクロスフェア、ポリウレタン、花粉粒子、スポロポレニン、ポリクリシジルメタクリレートのシェルに取り囲まれたポリスチレンもしくはポリビニルナフタレンコア、微結晶セルロースもしくはそれの組み合わせ、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートおよびメチルメタクリレートのコポリマー、シリコーンおよびシリカ、ガラス、ゴム、ナイロン、珪藻土、シリカなどが含まれる。可溶性ハブは、低い非特異的結合および高い柔軟性、ならびに抗体もしくは抗体にその他の結合分子が共有結合するための基の利用可能性の増加という利点を有する。好ましい可溶性ハブは、上述したものを含む可溶性タンパク質および多糖類であり、特別にはアミノデキストランおよびその誘導体である。該ハブのサイズは、因子、例えば表面上に適応しなければならない結合パートナーの数、該アッセイを通して該ハブの安定性を保証するための立体因子、ならびに該アッセイがその中で実施されなければならない該多孔性担体の性質によって決定される。例えば、該ハブは、好ましくは凝集事象の不在下では膜の最小の孔を通って移動するのに十分小さい。該ハブが不溶性ビーズから形成される場合は、これらは径が０．０３〜１０μｍ、好ましくは０．０５〜８μｍの範囲内である。可溶性ハブについては、例えばアミノデキストラン分子については、これらは２５０〜２，５００ｋＤａ、より好ましくは５００〜２，５００ｋＤａの範囲内であってよい。
【００３０】
「分析物結合試薬」は、特定かつ再現性のある方法において、十分な親和性で分析物に結合することができる任意の試薬を意味し、それによりアッセイが機能することを可能にする。アッセイの大多数においては、該分析物結合試薬は抗体または抗体の有効な抗原結合フラグメントもしくは誘導体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、規定エピトープへの一貫性のある定量可能な結合特性を示すという利点を有する。しかし、多数のアッセイのためには、例えば、一定の範囲のエピトープ特異性を有し、該分析物中の立体配座変化もしくは立体障害に低感受性であり得るポリクローナルＩｇＧ画分がより効率的である。それらは、多エピトープ分析物が多エピトープへ結合することを許容し、分析物分子が高結合力で結合できるという結果を生じる。しかし、該分析物の性質に依存して、他の隣接結合分子、例えば受容体（リガンドに対して）、リガンドもしくはリガンドアナログ（受容体に対して）、アプタマー、リボザイムもしくはポリヌクレオチドなどを使用できる。
【００３１】
当業者には、一部の用途およびアッセイフォーマットについては、多価分析物結合試薬を、より好ましくは、多価分析物アナログよりむしろ複数の分析物結合部位を提示するハブの形状で使用するのが有益なことは明白である。多数のアッセイフォーマットでは、分析物アナログおよび分析物結合試薬が果たす役割が固定化されること、ハブ内に組み込まれること、シグナル粒子で標識されることおよび／またはシグナル粒子へ付着することに関して無効にされる変形を考案することは当業者の技術の範囲内に含まれ、そのような変形および翻案は、本発明によって想定されている。
【００３２】
「標識試薬」は、検出可能な成分と分析物結合試薬（またはアッセイのフォーマットによっては分析物もしくは分析物アナログ）とを含む粒子を意味する。通常は、該検出可能な成分は、シグナル粒子の固定化された濃縮物を肉眼で容易に検出され得る視覚的に検出可能な成分である。その他の検出の形状、例えば蛍光、化学発光、磁性もしくは放射標識は排除されない。該検出可能な成分は、さらにまた該標識試薬を固定化する手段も提供できる。例えば、ラテックスビーズを含む標識試薬は、該ラテックスビーズが通過できない小孔径の毛細管膜の捕獲ゾーンから排除されてもよい。該検出可能な成分は、生物学的もしくは非生物学的のいずれであってもよい。標識試薬の成分として使用できる適切な成分の例には、微生物、細胞、高分子、金属ゾル粒子、ビーズ、ならびに木炭、カオリナイト、もしくはベントナイト粒子が含まれる。最も好ましくは、該シグナル粒子は、着色ラテックスビーズを含む。高度に好ましい実施形態では、該検出可能な成分は凝集可能である。
【００３３】
「捕獲ゾーン」は、好ましくは該反応混合物の残留画分からの分離によって、画分を濃縮および固定化する任意の手段である。そこで、捕獲ゾーンでは、該反応混合物の画分、例えば該未結合画分は、そのゾーンで濃縮および固定化することによって該反応混合物からそれを分離することができ、その間に該反応混合物の残りは該捕獲ゾーンを通過し続けることができる。この方法で、該画分は下流から排除される。したがって、該捕獲ゾーンは、好ましくは１つの画分を他の画分から分離するための手段を含む。
【００３４】
競合的結合ステップは、分析物結合試薬（抗体であることが多い）に結合した分析物を生じさせる。凝集アッセイの場合には、該生成物は架橋分析物と１つまたは複数の形状の分析物結合試薬の不溶性複合体であり、この場合には、便宜的には未凝集遊離画分から物理的濾過によって分離させることができる。膜結合アッセイの場合には、不溶性複合体は、その間に未凝集分析物および標識分析物結合試薬が通過するのを許容しながら、そのような不溶性多分子複合体を捕獲するために適合する、小孔径の膜内を通過する流体の流動によって達成できる。そのような特徴は、第１捕獲ゾーンと呼ぶことができる。該第１捕獲ゾーンは、その他に、偽反応を引き起こし得る非分析物媒介手段によって形成される任意の凝集体をさらに捕獲することができる。
【００３５】
「第２捕獲ゾーン」は、競合的結合ステップの結果として生じる該未凝集および未結合画分を濃縮および固定化する任意の手段を意味する。第２捕獲ゾーンは、上記で記載したような標識試薬の該未結合もしくは遊離画分を濃縮および固定化するために、第１捕獲ゾーンの下流、もしくは遠位に配置されてよい。該第２捕獲ゾーンは、未凝集分析物をさらに濃縮および固定化することができる。該標識試薬は、視覚的検出を可能にすることとは別に、該第２捕獲ゾーンで未凝集粒子を固定化する物理的手段を提供できる。未凝集分析物は、例えば、該第１捕獲ゾーンのために使用されるより小さな孔径のまた別の膜を含む第２捕獲ゾーンによって捕獲でき、そして使用した標識試薬粒子のサイズを捕獲するために適合する金コロイドもしくはラテックスビーズの粒子を含んでよい。
【００３６】
アッセイのその他のフォーマットは、直接結合機能を有する第１捕獲ゾーンを含む。単純な捕獲アッセイの場合には、固定化された抗体（またはその他の分析物結合試薬）を含んでよい。または、１部位競合アッセイは、標識抗体に結合するために固定化分析物もしくは分析物アナログを使用する。いずれの場合にも、機能的第１捕獲ゾーンは、該競合的結合ステップの１つの生成物を固定化し、遊離画分が通過するのを許容する。そのようなアッセイの場合には、該第２捕獲ゾーンは、固定化された分析物結合試薬、分析物、分析物アナログ、もしくは使用するフォーマットに適切な遊離シグナル試薬を固定化するその他の結合成分のまた別のゾーンを含んでよい。
【００３７】
好ましくは、画分は、該第１および／または第２捕獲ゾーンで結合せずに、例えばサイズもしくはその他の物理的パラメーター、例えば電荷に基づくフィルタリングによって該捕獲ゾーンを通る流動を制限することによって捕獲される。好ましくは、第１および／または第２捕獲ゾ−ンは非免疫学的であり、これはそれらが該画分を捕獲するために免疫学的結合剤を含んでいないことを意味する。結合機能を有していない捕獲ゾーンは、捕獲される画分の量に関して制限がないという利点を有するが、これは結合剤、例えば抗体が画分を捕獲するために使用される場合には制限があるからである。これは、該捕獲ゾーンを通過する残留画分の量を減少させる、そしてこのため該捕獲ゾーンを越える「バックグラウンド」シグナルを減少させるという結果を有する。
【００３８】
したがって、本発明は、サンプル中の分析物を検出するための飽和結合アッセイを実施する方法であって、競合的結合事象に由来する標識試薬の未結合遊離画分が、指定された捕獲ゾーンにおいて濃縮されるステップを含むことを特徴とする方法を提供する。好ましくは、該標識試薬は、検出可能な成分を含む。
【００３９】
好ましくは、該飽和結合アッセイは、
ａ．限定量の標識分析物結合試薬に対する該分析物と未標識分析物アナログとの競合的結合ステップと、
ｂ．分析物アナログに結合した標識分析物結合試薬の画分を、結合していない標識分析物結合試薬の遊離画分から分離するステップと、
ｃ．分析物結合試薬の該遊離画分を固定化および濃縮するステップと、
ｄ．固定化および濃縮した標識分析物結合試薬の遊離画分を検出するステップと
を含むイムノアッセイである。
【００４０】
または、該イムノアッセイは、
ａ．限定量の未標識分析物結合試薬に対する該分析物と標識分析物アナログとの競合的結合ステップと、
ｂ．該分析物結合試薬に結合した標識分析物アナログの画分を、結合していない標識分析物アナログの遊離画分からの分離するステップと、
ｃ．標識分析物アナログの遊離画分を固定化および濃縮するステップと、
ｄ．固定化および濃縮した標識分析物アナログの遊離画分を検出するステップと
を含む。
【００４１】
好ましい実施形態では、該飽和イムノアッセイは、
ａ．限定量の標識分析物結合試薬に対する該分析物と未標識多価分析物アナログとの競合的結合ステップと、
ｂ．標識分析物結合試薬の凝集画分と非凝集画分とを分離するステップと、
ｃ．標識分析物結合試薬の該非凝集画分を固定化および濃縮するステップと、
ｄ．固定化および濃縮した標識分析物結合試薬を検出するステップと
を含む凝集アッセイである。
【００４２】
または、該凝集アッセイは、
ａ．限定量の未標識分析物結合試薬に対する該分析物と標識多価分析物アナログとの競合的結合ステップと、
ｂ．標識多価分析物アナログの凝集画分と非凝集画分とを分離するステップと、
ｃ．標識多価分析物アナログの該非凝集画分の固定化および濃縮するステップと、
ｄ．固定化および濃縮した標識多価分析物アナログの非凝集画分の検出するステップと
を含む。
【００４３】
好ましくは、結合もしくは凝集画分および遊離もしくは非凝集画分は、該結合もしくは凝集画分の固定化によって分離される。より好ましくは、該結合画分は、該結合画分を排除する孔径の毛細管膜によって固定化される。または、該結合画分は、固定化された分析物結合試薬、結合パートナーまたは他の同族リガンドによって固定化される。いずれの場合においても、該結合画分は第１捕獲ゾーンで効果的に固定化される。
【００４４】
また別の実施形態では、該凝集画分および非凝集画分は、多孔性膜を通る溶媒流によるクロマトグラフィーにより分離される。この実施形態は、それらの粒径に基づいて凝集画分および非凝集画分を分離する適切な毛細管膜を使用することによって、該凝集画分を固定化する別個の特定の第１捕獲ゾーンを省略する。粒子が毛細管膜を通る流体流とともに移動する速度は、それらのサイズに反比例する。したがって、凝集物が反応ゾーンを通過する速度はそれらのサイズに左右され、大きな凝集物は緩徐に移動し、小さな凝集物および単一粒子はより高速で移動する。ラテラルフローフォーマット・アッセイでは、毛細管流動は、溶媒先端が毛細管膜の末端に到達するまで進行し、そこで流体および粒子の流動は停止するが、粒子が移動する距離は該凝集体のサイズに依存する。そこで、該「第２」捕獲ゾーン（すなわち、すべての粒子および凝集物を捕獲する領域）を、分析物の非存在下で生成される該大きな凝集物が到達する位置より遠位の膜に沿った位置に配置することによって、シグナルは分析物の存在下では該捕獲ゾーンでしか発生しなくなる。
【００４５】
このクロマトグラフィーフォーマットは、本発明の他の実施形態のすべての利点を、修正された第１捕獲ゾーン（すなわち、膜の孔径、または結合した抗体もしくは他の試薬における変更）が全く必要とされず、このために製造が単純化されかつ安価になるというまた別の改良点をも有する。
【００４６】
このフォーマットのさらなる利点は、改良された感受性を提供することである。物理的第１捕獲ゾーンは、分析物の非存在下で形成される大きな凝集物と、低レベルの分析物の存在下で生成されるわずかに小さな凝集物との両方を捕獲できる。２つの間を明確に識別できる該第１捕獲ゾーンのための材料を選択するのは困難な可能性がある。しかし、動的なクロマトグラフィーフォーマットを使用し、適切な場所に該第２捕獲ゾーンを配置することによって、低レベルの分析物を弁別し、したがって検出することが可能である。
【００４７】
本明細書に記載したいずれの実施形態についても、標識試薬の該未凝集画分もしくは未結合遊離画分は、該標識試薬を排除もしくは捕獲する孔径の毛細管膜を含む第２捕獲ゾーンによって固定化および濃縮することができる。
【００４８】
または、該第２捕獲ゾーンは、未凝集もしくは未結合標識試薬の該遊離画分を効果的に固定化させ、視覚的に検出可能な指標、例えば着色ラインもしくはゾーンを生成するために、十分に高親和性で結合できる固定化した分析物結合試薬または他の同族結合パートナーもしくはリガンドを含むことができる。視覚的シグナルの性質および色は、該試薬に付着した該標識の性質に依存する。金コロイド、ラテックス粒子もしくはその他の色素産生標識が使用されてよい。そのような付着した標識、ならびに該視覚的シグナルを提供するステップもまた、適当な大きさのシグナル粒子を形成することにより捕獲する手段を提供することができる。
【００４９】
いずれの代替法でも、その結果は選択された分析物の当初の存在および／または濃度の適当な視覚的指標を提供する第２捕獲ゾーンである。該第２捕獲ゾーンで捕獲された、もしくは結合した標識試薬の量は、該分析物の量および該個々のアッセイの能力によって決定される限度内で、測定される当初の分析物濃度に比例している。
【００５０】
本発明の方法、アッセイ、キットおよびデバイスは、分析物結合試薬によって結合され得る任意の分析物の検出に適合する。好ましい分析物には、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチド、炭水化物、ハプテンおよび核酸が含まれる。特に好ましい生物学的に重要な例には、抗体、ホルモン、ホルモン受容体、抗原、成長因子受容体、ビタミン、ステロイド、代謝産物、アプタマー、全生体（例えば、真菌、細菌、ウイルス、原生動物および多細胞寄生虫）、治療薬もしくは非治療薬、またはそれらの任意の組み合わせもしくはフラグメントが含まれる。該検出可能な分析物が抗体である場合、該分析物結合試薬は抗原、抗原アナログ、ハプテン、ハプテンアナログもしくは測定対象の該抗体に対する特異性を備える二次抗体であってよい。
【００５１】
好ましくは、分析物は、免疫学的に活性なタンパク質もしくはポリペプチド、例えば抗原性ポリペプチドもしくはタンパク質であってよい。本発明によって検出するために最も好ましい分析物には、ｈＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、およびＨＩＶに対する抗体が含まれる。
【００５２】
本発明は、単一アッセイにおいて、より好ましくは単一サンプルにおいても、２つ以上の分析物を検出するために使用できる。すなわち、任意のアッセイにおいて、各々が特定の標識試薬を捕獲するために特異的である複数の第２捕獲ゾーンが用意されてよい。該標識試薬は、任意の適切な手段、例えば、色によって識別可能なであってもよい。
【００５３】
また別の態様では、本発明は、サンプル中の分析物を検出するために飽和アッセイを実施するためのキットであって、
ａ．競合的結合ステップの結合画分と未結合画分とを分離するための手段と、
ｂ．第２捕獲ゾーンと
を含むキットを提供する。
【００５４】
好ましくは、該キットは、多孔性担体をさらに含む。
【００５５】
より好ましくは、競合的結合ステップの結合画分と未結合画分とを分離するための手段は、第１捕獲ゾーンを含む。
【００５６】
１つの好ましい実施形態では、該飽和アッセイは凝集イムノアッセイであり、該第１捕獲ゾーンは凝集画分を固定化するための手段を含む。好ましくは、該第１捕獲ゾーンは、結合画分もしくは凝集画分を排除する孔径の毛細管膜を含む。
【００５７】
または、競合的結合ステップの結合画分と未結合画分とを分離するための手段は、粒径に基づいて結合生成物と未結合生成物とをクロマトグラフィーできる孔径の毛細管膜を含む。特に好ましい実施形態では、該競合的結合ステップは凝集ステップであり、クロマトグラフィー分離は未凝集成分から凝集複合体を分離する。
【００５８】
好ましくは、該キットは、上記したように、標識試薬を含む。
【００５９】
該第２捕獲ゾーンは標識結合試薬の遊離画分を固定化して濃縮させるための手段を含むのが好ましい。１つの実施形態では、該第２捕獲ゾーンは、遊離もしくは未凝集標識試薬を排除する孔径の毛細管膜を含む。または、該第２捕獲ゾーンは、該遊離もしくは未凝集画分を効果的に固定化させ、そして視覚的に検出可能な指標、例えば着色ラインもしくはゾーンを生成するために、十分に高親和性で結合できる固定化した分析物結合試薬または他の同族結合パートナーもしくはリガンドを含むことができる。
【００６０】
好ましくは、該キットは、
ａ．好ましくは複数の分析物アナログ成分が結合しているハブを含む多価分析物アナログと、
ｂ．該分析物アナログ成分に結合できる複数の標識分析物結合試薬と
をさらに含む。
【００６１】
または、該キットは、
ａ．２つ以上の分析物結合試薬が結合しているハブと、
ｂ．該分析物結合試薬に結合できる複数の標識分析物アナログ成分と
をさらに含む。
【００６２】
好ましくは、該キットは、緩衝液、適用手段（例えば、ピペット）、取扱説明書、チャート、乾燥剤、対照サンプル、色素、バッテリーおよび／またはシグナル処理／ディスプレイ手段からなるリストから選択される１つまたは複数のまた別の構成成分をさらに含む。
【００６３】
さらにまた、該多孔性担体は、固体マトリックスであり、好ましくは繊維状である。
【００６４】
より好ましくは、該第１捕獲ゾーンの上流の孔径は、該ハブ、標識試薬、サンプルおよび任意の結合画分もしくは凝集物の自由な移動を許容するために十分な大きさである。
【００６５】
最後の態様では、本発明は、サンプル中の分析物を検出するために飽和アッセイを実施するためのデバイスであって、該デバイスは担体を含み、該担体はサンプルを受け入れるための近位端と、該サンプルが該担体に従って移動できる方向にある遠位端とを含み、このとき該担体は、
ａ．結合画分を排除する手段を含む第１捕獲ゾーンと、
ｂ．標識試薬を排除する手段を含む第２捕獲ゾーンと
を含むデバイスをさらに提供する。
【００６６】
好ましくは、該担体は多孔性である。好ましくは、該第１および／または第２捕獲ゾーンは、結合画分もしくは標識試薬を各々排除する孔径の毛細管膜を含む。
【００６７】
好ましくは、該デバイスは、乾燥した、再構成可能な形状にある、複数の分析物結合試薬またはその代わりに分析物アナログ成分が結合しているハブをさらに含む。該デバイスは、好ましくは、外箱もしくは容器内に収容され、より好ましくは携帯型である。
【００６８】
以下では、本発明を非限定的な実施例によって、そして図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】第１凝集物捕獲膜を備える試験ストリップの組立品を示す図である。
【図２】クロマトグラフィー凝集物分離膜を備える試験ストリップの組立品を示す図である。
【図３】陽性試験結果と陰性試験結果の実施例の写真である。
【実施例１】
【００７０】
＜抗体被覆ポリスチレン微粒子の調製＞
１．  １００μＬの２００ｎｍ青色ポリスチレン微粒子（１０％固体）（「ラテックス」）（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、英国シュロプシャー）、２００μＬの無水エタノール、４３μＬのヒツジＦＩＴＣ抗血清（Ｍｉｃｒｏｐｈａｒｍ社、英国カーマーゼンシャー）および６５７μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を混合する。
２．  抗体を吸着させるために、穏やかに攪拌しながら室温で２時間にわたりインキュベートする。
３．  １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２００μＬの６％  ＢＳＡを加え、１時間にわたり攪拌しながらインキュベーションを持続する。
４．  軟質ラテックスペレットを形成するために、２０分間にわたり４，０００ｇで、その後に８，０００ｇで５分間、吸着混合物を遠心分離させる。
５．  上清を取り除き、１ｍＬのラテックス希釈緩衝液（Ｏｍｅｇａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、英国アルバ）と置換する。ペレットを静かに再懸濁させる。
６．  ステップ５に記載したように遠心分離によってラテックスペレットを収集し、洗浄する。
７．  ステップ６をさらに２回繰り返し、最後にラテックスペレットを９００μＬラテックス希釈緩衝液中へ再懸濁させる。
８．  ラテックス固体は標準連続希釈液との比較によって１（ｗ／ｖ）％へ調整し、６９０ｎｍでの光線吸光度によって評価する。
９．  ２μＬの１％固体の抗ＦＩＴＣラテックスを、１０ｍＭリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）中の１μＬのＦＩＴＣ−デキストラン１０〜３００ｎｇ／μＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＦＤ２０００Ｓ）と混合するスライド凝集アッセイによって抗体吸着を確認する。
【実施例２】
【００７１】
＜抗体被覆ポリスチレン微粒子の調製＞
１．  １００μＬの２００ｎｍ青色ポリスチレン微粒子（１０％固体）（「ラテックス」）（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、英国シュロプシャー）、２００μＬの無水エタノール、１０ｍＭリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）中の７５０μｇのマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社、１５３８１）、１０ｍＭリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）中の１１０μｇの抗ｈＣＧ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、フィンランド国カウニアイネン、クローン番号５００６）を混合する。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて量を１ｍＬへ調整する。
２．  抗体を吸着させるために、穏やかに攪拌しながら室温で２時間にわたりインキュベートする。
３．  １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２００μＬの６％  ＢＳＡを加え、１時間にわたり攪拌しながらインキュベーションを持続する。
４．  軟質ラテックスペレットを形成するために、１０分間にわたり３，５００ｇで、吸着混合物を遠心分離させる。
５．  上清を取り除き、１ｍＬのラテックス希釈緩衝液（Ｏｍｅｇａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、英国アルバ）と置換する。ペレットを静かに再懸濁させる。
６．  ステップ５に記載したように８，０００ｇで２０分間にわたる遠心分離によってラテックスペレットを収集し、ペレットを洗浄する。
７．  ステップ６をさらに２回繰り返し、最後にラテックスペレットを５００μＬラテックス希釈緩衝液中へ再懸濁させる。
８．  ラテックス固体は標準連続希釈系列との比較によって１（ｗ／ｖ）％へ調整し、６９０ｎｍでの光線吸光度によって評価する。
９．  ここで調製した２．５μＬの１％固体の「試験」ラテックスを、適切な抗体「サンドイッチパートナー」（上記と同一法を使用して調製およびバリデートした）が被覆された等量の「対照」ラテックスと、さらに「合成」尿（すなわち、約４．５ｇ／ＬのＫＣＩ、７．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、４．８ｇ／Ｌのリン酸ナトリウム（一塩基性）、１８．２ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌのクレアチニン、５０ｍｇ／ＬのＨＡＳ）中の５μＬのｈＣＧ溶液（０〜２５０ＩＵ／ｍＬ）（４ｔｈ  Ｉ．Ｓ．，ＮＩＢＳＣに対して指定されたｈＣＧ濃度値）を加えてと混合するスライド凝集アッセイによって抗体吸着を確認する。
【実施例３】
【００７２】
＜ｈＣＧハブ試薬の調製＞
１．  １．６×１５ｃｍのＧ２５Ｍ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを使用して、該抗ｈＣＧ（αサブユニット）を０．１Ｍリン酸（ｐＨ７．５）緩衝液中へ脱塩させ、濃度および収率を決定する。
２．  ８モル等量のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを用いて、該抗ｈＣＧ抗体を活性化する。該反応混合液を２時間にわたり２０℃でインキュベートする。１００モル等量のグリシンを用いて該反応をクエンチさせ、１．６×１５ｃｍのＧ５０Ｆ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムの２ショットダウンを用いて５ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）緩衝液中へマレイミド活性化抗ｈＣＧを脱塩させる。活性化抗体の濃度および収率を決定する。
３．  １０００モル等量の２−イミノチオラン（２−ＩＴ）を用いて５００ｋＤａアミノデキストランを活性化する。該反応混合液を１１０分間にわたり２０℃でインキュベートする。Ｇ２５Ｍ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ培地を用いて５ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）内へ該チオール活性化アミノデキストランを脱塩させる。Ｅｌｌｍａｎアッセイを使用してチオール：アミノデキストランの取り込み比を決定する。
４．  ２５モル等量のマレイミド活性化抗ｈＣＧ抗体をチオール活性化アミノデキストランへ加え、この反応混合液を１６時間にわたり１５℃でインキュベートする。１，０００倍等量のＮ−エチルマレイミドを用いて該反応混合物をクエンチする。溶離剤として５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて２．６×５０ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＰＧカラム上でコンジュゲートを精製する。コンジュゲートの濃度および収率を決定し、次に０．２μｍのＭｉｎｉｓａｒｔフィルターに通して濾過する。
５．  最後に、７０μＬの抗ｈＣＧアミノデキストランコンジュゲート（２１．６ｎｇ／μＬ）を「合成尿」（すなわち、約４．５ｇ／ＬのＫＣＩ、７．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、４．８ｇ／Ｌのリン酸ナトリウム（一塩基性）、１８．２ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌのクレアチニン、５０ｍｇ／ＬのＨＡＳ）中の３０μＬのｈＣＧ溶液（１７８．５ＩＵ／ｍＬ）を結合することによってｈＣＧを用いて該抗ｈＣＧアミノデキストランコンジュゲートを「予備飽和」させ、４℃で３０分間インキュベートする。
【実施例４】
【００７３】
＜第１凝集物捕獲膜を備えた試験ストリップの調製＞
膜材料は、以下のサイズに切断した：
１．  ウイック、例えばコンジュゲートリリースパッド８９６４（Ａｈｌｓｔｒｏｍ社）、２０ｍｍ×５０ｍｍ。
２．  第１凝集捕獲膜、例えばＦｕｓｉｏｎ  ５（Ｗｈａｔｍａｎ社）、４ｍｍ×５０ｍｍ。
３．  中間膜、例えばコンジュゲートリリースパッド８９６４（Ａｈｌｓｔｒｏｍ社）、１０ｍｍ×５０ｍｍ。
４．  遊離画分濃縮膜、例えば、Ｚ−ｂｉｎｄ  ＰＥＳ膜０．２μｍ（ＰＡＬＬ社）、３ｍｍ×５０ｍｍ。
５．  吸収シンク、例えば、吸収パッド２２２（Ａｈｌｓｔｒｏｍ社）、５０ｍｍ×５０ｍｍ。
６．  粘着性プラスチック（×２）、例えばＤ／Ｃ親水性ＰＳＡを備える０．０４’’の透明ポリエスエル（Ｇ＆Ｌ社）  ７０ｍｍ×１００ｍｍ。
【００７４】
上記の材料の複合「カード」を図１に示したように組み立てた。隣接膜材料は、ストリップの連続区間の良好な流体移動を保証するために、図示したように整列させた。粘着性プラスチックの第２シートは、サンプル／試薬の適用を可能にするために、およそ１０ｍｍのウイックを露出させたまま残して上面へしっかりと適用させた。結果として生じる「カード」を４ｍｍストリップに薄片化し、過剰なプラスチックはトリミングした。
【実施例５】
【００７５】
＜クロマトグラフィー凝集分離膜を備えた試験ストリップの調製＞
膜材料は、以下のサイズに切断した：
１．  ウイック／分離膜、例えばコンジュゲートリリースパッド８９６４（Ａｈｌｓｔｒｏｍ社）、１００ｍｍ×５０ｍｍ。
２．  遊離画分濃縮膜、例えば、Ｚ−ｂｉｎｄ  ＰＥＳ膜０．２μｍ（ＰＡＬＬ社）、４ｍｍ×５０ｍｍ。
３．  吸収シンク、例えば、吸収パッド２２２（Ａｈｌｓｔｒｏｍ社）、１０ｍｍ×５０ｍｍ。
４．  粘着性プラスチック（×２）、例えばＤ／Ｃ親水性ＰＳＡを備える０．０４’’の透明ポリエスエル（Ｇ＆Ｌ社）７０ｍｍ×１２０ｍｍ。
【００７６】
上記の材料の複合「カード」を図２に示したように組み立てた。隣接膜材料は、ストリップの連続区間の良好な流体移動を保証するために図示したように整列させた。粘着性プラスチックの第２シートは、サンプル／試薬の適用を可能にするために、およそ１０ｍｍのウイックを露出させたまま残して上面へしっかりと適用させた。結果として生じる「カード」を４ｍｍストリップに薄片化し、過剰なプラスチックはトリミングした。
【実施例６】
【００７７】
＜第１凝集物捕獲膜を備えた試験ストリップを使用する、フルオレセインについての試験＞
１．  ２μＬの１（ｗ／ｖ）％固体の抗ＦＩＴＣラテックス（実施例１に記載したように社内で調製した）を１μＬのフルオレセイン溶液と混合し、室温で１０分間インキュベートした。
２．  リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）中の１μＬの３０ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ−デキストラン「ハブ」を上記の混合液に加え、さらに５分間インキュベートした。
３．  上記の反応混合液を次に第１凝集捕獲膜（実施例４に記載したように組み立てた）を備える試験ストリップの近位「ウイック」端に適用し、次に約３００μＬのラテックス希釈緩衝液（Ｏｍｅｇａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、英国アルバ）を、１００μＬずつ３ショットで適用した。
【００７８】
該遊離画分濃縮膜で読み取った以下の結果が得られた。
【００７９】
【表１】
0005774064.tif 000002
【実施例７】
【００８０】
＜クロマトグラフィー凝集物分離膜を備えた試験ストリップを使用する、フルオレセインについての試験＞
試験は、クロマトグラフィー凝集物分離膜（実施例５に記載したように調製した）を備える試験ストリップを使用して、実施例６に記載したように実施した。
【００８１】
該遊離画分濃縮膜で読み取った以下の結果が得られた。
【００８２】
【表２】
0005774064.tif 000003
【実施例８】
【００８３】
＜第１凝集物捕獲膜を備えた試験ストリップを使用する、抗ＦＩＴＣについての試験＞
１．  ヒツジＦＩＴＣ抗血清は、（下記に示すように）正常ヒツジ血清（Ｍｉｃｒｏｐｈａｒｍ社、英国カーマーゼンシャー）中で希釈した。
２．  １μＬの各希釈抗血清を１μＬのＦＩＴＣ−デキストラン「ハブ」（リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）中の１０ｎｇ／μＬ）と混合し、室温で１０分間にわたりインキュベートした。
３．  ２μＬの１（ｗ／ｖ）％固体の抗ＦＩＴＣラテックス（実施例１に記載したように社内で調製した）を上記の混合液に加え、さらに５分間インキュベートした。
４．  上記の反応混合液を次に第１凝集物捕獲膜（実施例４に記載したように組み立てた）を備える試験ストリップの近位「ウイック」端に適用し、次に約３００μＬのリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）を、１００μＬずつ３ショットで適用した。
【００８４】
該遊離画分濃縮膜で読み取った以下の結果が得られた。
【００８５】
【表３】
0005774064.tif 000004
【実施例９】
【００８６】
＜第１凝集物捕獲膜を備えた試験ストリップを使用する、抗ＦＩＴＣについての試験＞
１．  ヒツジＦＩＴＣ抗血清は、（下記に示すように）正常ヒツジ血清（Ｍｉｃｒｏｐｈａｒｍ社、英国カーマーゼンシャー）中で希釈した。
２．  １μＬのＦＩＴＣ−デキストラン「ハブ」（リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）中の３０ｎｇ／μＬ）を１μＬの１：１００のＦＩＴＣ抗血清と混合し、室温で１０分間にわたりプレインキュベートした。
３．  １μＬの各希釈抗血清を２μＬのプレインキュベートしたＦＩＴＣ−デキストラン「ハブ」（上記）へ加え、室温で１０分間にわたりインキュベートした。
４．  ２μＬの１（ｗ／ｖ）％固体の抗ＦＩＴＣラテックス（実施例１に記載したように社内で調製した）を上記の混合液に加え、さらに５分間インキュベートした。
５．  上記の反応混合液を次に第１凝集物捕獲膜（実施例４に記載したように組み立てた）を備える試験ストリップの近位「ウイック」端に適用し、次に約３００μＬのリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）を、１００μＬずつ３ショットで適用した。
【００８７】
該遊離画分濃縮膜で読み取った以下の結果が得られた。
【００８８】
【表４】
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【実施例１０】
【００８９】
＜第１凝集物捕獲膜を備えた試験ストリップを使用する、ｈＣＧについての試験＞
１．  抗ｈＣＧラテックス（２μＬ）（実施例２に記載したように調製した）を、ｈＣＧ（「サンプル」）を含有する２μＬの合成尿（実施例３を参照されたい）と混合し、室温で１０分間にわたりインキュベートした。
２．  予備飽和させたｈＣＧハブ試薬（４μＬ）（実施例３に記載したように調製した）を上記の混合液と結合し、２〜５分間反応させた。
３．  上記の反応混合液を次に該第１凝集物捕獲膜（第１凝集物捕獲膜のサイズを３ｍｍ×５０ｍｍに縮小したことを除けば、実施例４に記載したように組み立てた）を備える試験ストリップの該近位「ウイック」端に適用し、次に約３００μＬのラテックス希釈緩衝液（上記参照）を、１００μＬずつの３ショットで適用した。
【００９０】
該遊離画分濃縮膜で読み取った以下の結果が得られた。
【００９１】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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