(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づける方法であって、
マイクロプレートを提供するステップと、
特徴づけの対象となる少なくとも１つの生物細胞が前記マイクロプレートと接触した状態になるように、前記マイクロプレートの少なくとも１つの表面を液体中に水没させるステップと、
前記マイクロプレートを振動させるステップと、
前記マイクロプレートに取り付けられた、相互に隔てられた複数のセンサーを提供するステップと、
前記マイクロプレートが振動している間に、各センサーからそれぞれの時系列センサーデータを取得するステップであって、前記取得された時系列センサーデータが互いに独立しないように、前記マイクロプレート及び前記センサーが配置されている前記ステップと、
少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づけるように前記時系列センサーデータを処理するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記処理ステップが、
細胞の動的挙動分類を規定するステップと、
前記少なくとも１つの細胞の動的挙動が、前記規定された細胞の動的挙動分類に該当するかどうか決定するように、前記時系列センサーデータを処理するステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理ステップが、
細胞特性を規定するステップと、
前記少なくとも１つの細胞の前記規定された特性を測定するかどうか決定するように前記時系列センサーデータを処理するステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記処理ステップが、時間ドメイン、周波数ドメイン、及びウェーブレットドメインの１つ又は複数における前記時系列センサーデータを解析するステップを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記処理ステップが、周波数応答関数（FRF）を解析するステップを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記処理ステップが、１つ又は複数のニューラルネットワーク及びカルーネン・レーベ分解を用いるステップを含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロプレートを振動させるステップが、前記マイクロプレートを定期的に振動させるステップを含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロプレートを振動させるステップが、前記マイクロプレートをランダムに振動させるステップを含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づけるためのシステムであって、
液体用のコンテナーと、
前記コンテナーが少なくとも部分的に液体で満たされるときに、マイクロプレートの少なくとも１つの表面が、前記液体中に水没するように、前記コンテナー内に置かれた前記マイクロプレートと、
前記マイクロプレートを振動させるように作動可能な少なくとも１つのアクチュエーターと、
前記マイクロプレートに取り付けられた、相互に隔てられた複数のセンサーであって、各センサーが、前記マイクロプレートが振動している間、それぞれの時系列センサーデータを提供するように作動可能であり、前記マイクロプレート及び前記センサーが、前記提供された時系列センサーデータが互いに独立しないように配置されている前記センサーと、
前記センサーから前記時系列センサーデータを受け取るように、及び前記マイクロプレートに接触している少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づけるために、受け取った前記時系列センサーデータを処理するように作動可能なプロセッサーと、
を備えるシステム。
【請求項１０】
前記マイクロプレートの境界の状態が、クランプで固定された状態、カンチレバー、非固定状態、及び点支持状態から選択される、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記センサーが、ピエゾ抵抗素子ゲージセンサー、光学センサー、歪みセンサー、及び加速度センサーから選択される、請求項９又は請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのアクチュエーターが、圧電トランスデューサーを備える、請求項９から１１のいずれかに記載のシステム。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのアクチュエーターが、音波アクチュエーターを備える、請求項９から１１のいずれかに記載のシステム。
【請求項１４】
前記コンテナーがペトリ皿である、請求項９から１３のいずれかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づける方法及びシステムに関連する。当該方法及びシステムは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞伝播、細胞極性、細胞運動、細胞成長、細胞収縮、細胞移動、細胞増殖、細胞分化、及び病原菌の成長等の細胞の特性及び挙動を特徴づけるのに利用可能である。
【背景技術】
【０００２】
現在のところ、生物細胞の物理的特性及び挙動を測定するとき、それは顕微鏡検査画像システムを用いた顕微鏡に基づき主に実施される。細胞培養、それを監視及び操作する業務は単調であり、また時間がかかる可能性がある。外部の刺激に対する細胞の応答は、多くの場合、リアルタイムに可視化するのは困難である。
【０００３】
マイクロエレクトロメカニカルシステム（MEMS）用のセンサーを設計するために、機械式トランスデューサーの原理を利用することについて、技術者、物理学者、化学者、及び生物学者で関心が高まっている。最も幅広く応用されている機構は微小カンチレバーである。これは、ＭＥＭＳにおいて、異なる種類のセンサー、例えばＡＦＭ用の一体化したチップを備えた力センサー、バイメタル式温熱センサー、質量負荷センサー、媒体粘弾性センサー、及び熱重量センサー、及び応力センサー等を構築するのに用いられてきた。微細加工技術、表面機能化生化学、及びカンチレバーセンシング法を組み合わせることにより、臨床用途及び環境用途を目的としたバイオセンサーを開発する機会が提供される。Ｂａｓｅｌらの文献「Ａ  ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ」、（Biosensors and Bioelectronics, Volume 12, Issue 8, 1997, Page iv）では、微小カンチレバーを用いて、機能化表面に付着した、受容体がコーティングされたマグネットビーズの存在を検出することが提案されている。Ｆｒｉｔｚらの文献「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｎａｎｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ」（Science, Volume 288, Issue 5464, April 14, 2000, Pages 316-318）では、ｓｓＤＮＡハイブリダイゼーションが、平行に配置された２つの微小カンチレバーを用いてモニターされるが、この場合、両カンチレバーの差示的偏差により、２つ同一の、但し一塩基ミスマッチを有する１２マーオリゴヌクレオチドの識別が可能になる。
【０００４】
それにもかかわらず、基本的な生物学的プロセス、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞運動、収縮、移動、増殖、又は分化、及び病原菌の成長等の動的及び接触式測定を実現することができるマイクロセンシングシステムに対する必要性が存在する。かかるセンサーについて多くの適用可能な領域が提案されてきた。Ｂｈａｄｒｉｒａｊｕ及びＣｈｅｎの文献「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｔｅｓｔｉｎｇ」（DDT, Volume 7, Issue 11, Pages 612-620, June 2000）では、細胞に基づく薬物試験法を改善するために、細胞微環境の工学的構築法の利用が提案されている。Ｏｎｏらの文献「Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（Developmental neuroscience, Volume 23, Issue 4-5, Pages 346-355, 2001）では、希突起神経膠細胞系列細胞における形態学的変化、及び細胞の可動性及び増殖を含む当該細胞の動力学の研究が行なわれ、ＯＰＣが中枢神経系全体を通じて拡散分布する分子機構の可能性について見識がもたらされることが示唆されている。Ｌｕｄｔｋｅらの文献「Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｄｅｘｔｒａｎ」（Volume 5: 579~588 （2002）, Molecular Therapy, 6（1）, July 2002, Page 134）では、ＤＮＡ及びデキストランを微量注入したときに、細胞分裂が細胞の動力学に及ぼす影響が明らかにされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞測定において、顕微鏡以外の別の特質を提供するために、本発明では、細胞の成長及び動的特性、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの運動、収縮、形態変化、移動等について検出及びモニタリングが改善するように、マイクロセンシングする方法及びシステムを提供することを狙いとしている。本明細書に記載する方法及びシステムでは、現在利用可能な画像システムを補完することが意図されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づける方法が提供される。当該方法は、マイクロプレートを提供するステップ；特徴づけの対象となる少なくとも１つの細胞が前記マイクロプレートと接触した状態になるように、前記マイクロプレートの少なくとも１つの表面を細胞培養培地中に水没させるステップ；前記マイクロプレートを振動させるステップ；マイクロプレートに取り付けられた、相互に隔てられた複数のセンサーを提供するステップ；前記マイクロプレートが振動している間に、各センサーからそれぞれの時系列センサーデータを取得するステップであって、前記取得された時系列センサーデータが互いに独立しないように、前記マイクロプレート及び前記センサーが配置されている前記ステップ；少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づけるように前記時系列センサーデータを処理するステップを含む。
【０００７】
従って、顕微鏡検査画像システムを用いて生物細胞の物理特性及び挙動を測定することに関連した困難を克服するために、及び細胞の特性及び挙動について一貫性のある定量測定を可能にするために、本発明は、細胞培養液中に水没したプレートの動力学に由来する情報を用いることによる一体化した細胞モニタリング法、及び革新的なシステム同定技術を提供する。本発明は、顕微鏡検査画像システムを用いてリアルタイムに外部刺激に対する細胞の応答を可視化すること関連した多くの困難を克服する。プレートの動力学及び自動化された時系列解析を一体化することにより、連続的な画像モニタリングに全面的に依存せずに細胞の動力学に関する情報の履歴を提供することができる。本発明が提供できるような細胞情報を提供できる従来技術は存在しない。更に、本発明は、例えば蛍光又はレーザー漂白を用いない天然の細胞成長環境を提供する。また、本発明は生物細胞のリアルタイムな連続モニタリングも可能にする。本発明は高感度であり、及び応答時間は迅速である。
【０００８】
更に、マイクロプレートの動力学は、上記で議論した周知の微小カンチレバーの動力学よりも複雑である。より興味深い動力学的特徴により、微小カンチレバーと比較して、マイクロプレートは、マイクロセンシング媒体として更なる情報を提供することができる。また、細胞培養培地中において、生存細胞をマイクロプレート表面上に維持することができるという事実により、マイクロプレートは、細胞（及び病原菌）の天然の培養環境を維持するための新しいベネフィットを提供する。
【０００９】
本発明の１つの実施形態では、細胞を特徴づける方法の処理ステップは、細胞の動的挙動分類を規定するステップと、少なくとも１つの細胞の動的挙動が、前記規定された細胞の動的挙動分類に該当するかどうか決定するように、時系列センサーデータを処理するステップとを含む。別の実施形態では、処理ステップは、細胞特性を規定するステップと、少なくとも１つの細胞の規定された特性を測定するかどうか決定するように時系列センサーデータを処理するステップとを含む。
【００１０】
処理ステップは、時間ドメイン、周波数ドメイン、及びウェーブレットドメインの１つ又は複数における時系列センサーデータを解析するステップを含み得る。処理ステップは、周波数応答関数（FRF）を解析するステップを含み得る。処理ステップは、ニューラルネットワーク及び／又はカルーネン・レーベ分解（Karhunen-Loeve decomposition）を用いるステップを含み得る。
【００１１】
１つの実施形態では、マイクロプレートは定期的に振動を受ける。別の実施形態では、マイクロプレートはランダムに振動を受ける。
【００１２】
本発明の第２の態様によれば、少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づけるためのシステムが提供される。当該システムは、細胞培養培地用のコンテナー；前記コンテナーが少なくとも部分的に細胞培養培地で満たされるときに、マイクロプレートの少なくとも１つの表面が、前記細胞培養培地中に水没するように、前記コンテナー内に置かれた前記マイクロプレート；前記マイクロプレートを振動させるように作動可能な少なくとも１つのアクチュエーター；前記マイクロプレートに取り付けられた、相互に隔てられた複数のセンサーであって、各センサーが、前記マイクロプレートが振動している間、それぞれの時系列センサーデータを提供するように作動可能であり、前記マイクロプレート及び前記センサーが、前記提供された時系列センサーデータが互いに独立しないように配置されている前記センサー；及び前記センサーから前記時系列センサーデータを受け取るように、及び前記マイクロプレートに接触している少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づけるために、受け取った前記時系列センサーデータを処理するように作動可能なプロセッサーを備える。
【００１３】
マイクロプレートの境界状態は、例えばクランプで固定された状態、カンチレバー、非固定状態、及び点支持状態から選択され得る。
【００１４】
センサーは、ピエゾ抵抗素子ゲージセンサー、光学センサー、歪みセンサー、及び加速度センサーから選択され得る。
【００１５】
１つの実施形態では、少なくとも１つのアクチュエーターは圧電トランスデューサーを備える。別の実施形態では、少なくとも１つのアクチュエーターは音波アクチュエーターを備える。
【００１６】
１つの実施形態では、コンテナーはペトリ皿である。
【００１７】
本発明のその他の好ましい特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【００１８】
本発明の実施形態は、以下に示す添付図面を参照しながら例示目的で記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】本発明に基づくバイオセンシングシステム用のバイオセンシングプラットフォームの概略的な平面図である。
【図１ｂ】図１ａのバイオセンシングプラットフォームに関する概略的な側面図である。
【図２】本発明に基づくバイオセンシングシステム用のバイオセンシングプラットフォームの概略的な斜視図である。
【図３】自動的なバイオセンシングシステムの構成に関する概略的な図であり、非線形処理モデルを構築するのに用いられる主要な機能及び要素を示している。
【図４】一体化したバイオセンシングプラットフォームの走査型電子顕微鏡（SEM）画像である。
【図５】バイオセンシングプラットフォームのマイクロプレート表面上にコーティングされた内皮細胞の、レーザー走査型マイクロメーター（LSM）画像である。
【図６】バイオセンシングプラットフォーム用の動的試験デバイスを示す図である。
【図７】３つの異なる細胞密度における、１００μｍ角の正方形Ｃ−Ｆ−Ｆ−Ｆマイクロプレートに関する周波数応答関数（FRF）を表す図である。（ａ）及び（ｂ）はマイクロプレート表面上の内皮細胞コーティング を示し、及び（ｃ）は、細胞密度より標準化された速度振幅を示している。
【図８】３つの異なる細胞密度における、２００μｍ角の正方形Ｃ−Ｆ−Ｃ−Ｆマイクロプレートに関する周波数応答関数（FRF）を表す図である。（ａ）及び（ｂ）はマイクロプレート表面上の内皮細胞コーティング を示し、及び（ｃ）は、細胞密度より標準化された速度振幅を示している。
【図９】３つの異なる細胞密度における、３００μｍ角の正方形Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃマイクロプレートに関する周波数応答関数（FRF）を表す図である。（ａ）及び（ｂ）はマイクロプレート表面上の内皮細胞コーティングを示し、及び（ｃ）は、細胞密度より標準化された速度振幅を示している。
【図１０】試験対象マイクロプレート（Ｎｏ．Ｉ）における細胞の量の増加に従ったＦＤＲｎの傾向を示す図である。ＦＤＲｎは、測定された共鳴モードｎにおける、細胞が負荷されたメンブレン及び細胞が負荷されないメンブレンの間の標準化された共鳴周波数の差として評価された周波数差の比である。
【図１１】試験対象マイクロプレート（Ｎｏ．ＩＩ）における細胞の量の増加に従ったＦＤＲｎの傾向を示す図である。
【図１２】試験対象マイクロプレート（Ｎｏ．ＩＩＩ）における細胞の量の増加に従ったＦＤＲｎの傾向を示す図である。
【図１３】図１０、１１、及び１２の３つのマイクロメンブレンのＡＦＤＲインデックスを各実験バッチについて示す図である。ＡＦＤＲは、全測定ＦＤＲｎの平均値である。
【図１４】単純な画像処理技術に基づく細胞集団の定量結果を示す図である。
【図１５】細胞の同定に用いられたＢＰニューラルネットワークの概略図である。
【図１６】サンプル１〜１４を用いて訓練を受けたＢＰニューラルネットワークを用いたときのサンプル番号１５〜１８のＣＤＲに関する予測結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に基づくマイクロ／ナノスケールバイオセンシングシステムには、細胞培養培地（例えば、細胞培養液）用のコンテナー（図示せず）が含まれる。バイオセンシングプラットフォームは、細胞培養培地コンテナー内に配置される。
【００２１】
図１ａ及び１ｂは、バイオセンシングプラットフォーム１０の１つの実施形態に関する平面図及び側面図を表している。若干異なる実施形態が、斜視図で図２に示されている。
【００２２】
バイオセンシングプラットフォーム１０は、主としてＳＩＯ基材１２から形成される。バイオセンシングプラットフォーム１０には、マイクロプレート１４、圧電トランスデューサー（PZT）１６の形態の２つアクチュエーター、相互に隔てられた４つのセンサー１８、及び電力入力（図示せず）が含まれる。当該バイオセンシングシステムには、バイオセンシングシステムの一部を形成し得るプロセッサー（図示せず）が更に含まれる。バイオセンシングプラットフォーム１０は、高減衰性条件下で良好なバイオ感度を保持しつつ液体（例えば、水）中で作動可能なように設計される。バイオセンシングプラットフォーム１０は、天然の細胞生存環境を維持するように、液体コンテナー内の細胞培養液中に一方の側面又は両面について浸漬され得る。バイオセンシングプラットフォーム１２では、前記プラットフォームが細胞培養培地中に水没したときに、生物細胞がこれを天然の増殖基盤として利用可能なように、例えばシリコン及び金等の生体適合性を有する材料が使用される。
【００２３】
マイクロプレート１４は、薄いマイクロマシンドメンブレン（micromachined membrane）であり、マイクロ／ナノスケールセンシングプラットフォームとして働く。マイクロマシンドメンブレン（プレート／ダイアフラム）は有望な質量センシング構造物であり、微小カンチレバーに置き換わる。微小カンチレバーと比較して、マイクロメンブレンは、より大きなセンシング領域を有し、液体内でより高い感度を示し、かつ脆弱性が低減している可能性がある。更に、マイクロメンブレンは、質量センシングの用途において微小カンチレバーと同様の長所を有する。マイクロプレート１４は変形可能である。マイクロプレート１４は、Ｘ−方向及びＹ−方向で数十〜数百ミクロンの範囲の寸法を有する。例えば、マイクロプレート１４は、Ｘ−方向及びＹ−方向で数十〜数千ミクロン（例えば、１００〜４００μｍ）の寸法を有し得る。Ｚ−方向のプレートの深度は、図１ｂに示す通り約３μｍであるが、数ナノメータから最大数十ミクロンの範囲の深度も適切であろう。これらの寸法は制限ではなく、代表例として意図されている。マイクロプレート１４は、様々な異なる境界状態（例えば、クランプで固定された状態、カンチレバー、非固定状態、及び点支持状態）を手段として支持され得る。図２の実施形態では、マイクロプレート１４は長方形である。マイクロプレート１４は、４つのヒンジ２０により支持されており、各ヒンジはマイクロプレート１４の４つある側面について、各１側面の中央に位置している。これはマイクロプレートの境界状態に関する１つの例である。
【００２４】
アクチュエーター（すなわち、励起源）は、細胞培養培地内でマイクロプレート１４を振動させるのに用いられる。図１ａ及び１ｂの実施形態では、アクチュエーターは、２つのＰＺＴ（チタン酸ジルコン酸鉛）の薄層１６である。ＰＺＴ１６は、マイクロプレート１４の領域の内側又は近傍に配置されて、限られたエネルギー消費で強力な励起力を発揮する。従って、バイオセンシングシステムは自己励起が可能なように設計される。ＰＺＴアクチュエーターの使用に対する代替法として、マイクロプレート１４は、これに替わり音響励起により作動可能である。アクチュエーター１６は、バイオセンシングプラットフォーム１０と一体化することができる。アクチュエーター１６は、マイクロプレート１４と一体化することができる。
【００２５】
バイオセンシングシステムは、自己センシング可能なように設計される。４つの離散性ピエゾ抵抗素子−ゲージ（PZR）センサー１８が、図１ａ及び２に示されている。センサー１８は、マイクロプレート１４の全ドメイン動力学的情報／振動情報が得られるように十分に選択された場所に配置されている。センサー１８はマイクロプレート１４内に組み込まれ得る。図２に示すセンシング要素１４及び関連する接続トラック２２を作り出すために、革新的な微細加工技術が用いられる。ＰＺＲセンサーを使用する替わりに、異なるセンサータイプ、例えば、光学センサー、歪みセンサー、又は加速度センサーが利用可能である。センサー１８は、バイオセンシングプラットフォーム１０と一体化することができる。センサー１８は、マイクロプレート１４と一体化することができる。センサー１８の位置は、識別感度が最大となるように、及びマイクロプレート表面全体にわたり、高い性能を発揮する範囲が最大となるように最適化可能である。
【００２６】
ＰＺＴアクチュエーター１６及びピエゾ抵抗素子−ゲージセンサー１８は、ＣＭＯＳ回路との適合性が良好であり、またその他の電子的な構成部材と容易に一体化する。バイオセンシングプラットフォーム１０の電子部品（例えば、電極ワイヤー、金パッド、及び接続プローブ）は生体適合性材料により密閉される。バイオセンシングプラットフォーム１０全体は、標準的なＤＩＬ（デュアルインライン）を用いて、パッケージされる。シグナルの流れ（インプット及びアウトプットシグナル）は、外部処理装置又は内部電子チップを経由して処理可能である。
【００２７】
革新的なツール及びプロセスが、バイオセンシングプラットフォームのマイクロ／ナノスケールでの加工に用いられ、これには光学、及び電子ビームリトグラフィー、プラズマエッチング、並びにナノスケールでの加工において迅速に試作するためにエッチング及び蒸着する能力を有する集束イオンビームツールが含まれる。
【００２８】
使用する際には、バイオセンシングシステムは単一細胞又は収集された細胞群の特性又は挙動を区別するのに用いられる。
【００２９】
細胞培養培地コンテナーは、部分的に、又は完全に細胞培養培地で満たされる。バイオセンシングプラットフォーム１０のマイクロプレート１４は、細胞培養培地内にマイクロプレート１４の少なくとも１つの表面が水没する又は浸漬されるように、細胞培養培地コンテナー内に配置される。例えば、マイクロプレート１４は細胞培養培地内に完全に水没し得る。あるいは、マイクロプレート１４の底面のみが細胞培養培地中に水没し得る。細胞培養培地中にマイクロプレート１４を水没させれば、細胞培養培地中の生物細胞がマイクロプレート１４を天然の増殖基盤として使用できるようになる。従って、マイクロプレート１４と接触した状態の少なくとも１つの生物細胞が存在し、その特性／挙動はバイオセンシングシステム及び同方法により特徴づけられることとなる。
【００３０】
次に、マイクロプレート１４はアクチュエーター（例えば、PZT１６）により振動を受ける。マイクロプレート１４は、定期的に（例えば、シヌソイド関数を用いて）、又は広周波数帯域ランダム信号（例えば、擬似ランダム２進信号、ホワイトノイズ、又はバーストランダム等）を用いてランダムに励起可能である。励起／振動のタイプは、実施目的に応じて変化する。接触している生物細胞は、それ自身マイクロプレート１４上に有意な力をもたらさないので、マイクロプレート１４には振動が加えられる。接触している生物細胞は、マイクロプレート１４の質量、剛性、及び歪みの各特性に影響を及ぼす。従って、これらの変数の測定（例えば、歪みゲージ測定）は、マイクロプレート１４上に接触している生物細胞の影響を定量するのに利用可能であり、そしてこれにより、特徴づけの対象となる細胞の特性／挙動を推測するのに用いることができる。静止したマイクロプレート１４を用いると、接触している細胞によるマイクロプレート１４の歪みは非常に小さく、これは、例えばマイクロプレート１４内の歪みのある領域内のシグナル検出を困難にする。その結果、特徴づけの対象となる細胞の特性／挙動を推測することが困難となる可能性がある。従って、細胞の存在に起因するマイクロプレート１４内の歪みのある領域からより強いシグナルが生み出されるように、マイクロプレート１４には、接触している生物細胞に向かって、及び遠ざかるように振動が加えられるのが有利である。二者択一的に／付加的に、マイクロプレート１４は、もっぱら接触している生物細胞に向かい、及び遠ざかるのではなく、これ以外の方向で振動を受けることも可能であろう。マイクロプレート１４を振動させることは、その他の長所も有する：振動することにより、マイクロプレート１４の動力学的特徴に関する追加情報（例えば、固有周波数変化、モード形状変化、及びその他の非線形カップリング効果）がもたらされる。また、この追加の動力学的な情報は、接触している細胞の特性又は挙動を特徴づけるのにも利用可能である。
【００３１】
マイクロプレートに振動が加えられている間、それぞれの時系列センサーデータが各センサー１８から得られる。マイクロプレート１４は、接触している生物細胞及びセンサー１８の間の非線形カップリングをもたらす連続的な媒体である。従って、センサー１８は、時系列センサーデータが互いに独立しないように、マイクロプレート１４に接触している生物細胞に対するマイクロプレート１４の変形応答を通じて連動する。これは、センサー１８はマイクロプレート１４から局所的なセンサーデータを受けるけれども、１つの特定のセンサー１８から得られた時系列センサーデータは、当該センサー１８から離れた細胞の動きを表し得ることを意味する。換言すれば、センサー１８は、マイクロプレート１４を介して生物細胞の特性／挙動を間接的に感知する。バイオセンシングプラットフォームは、表面に接触している生物細胞及び粒子を感知するための情報源として、その動的／振動上の特徴の変化を使用する。同時に収集されたセンサー１８の感知応答を解釈することにより、接触している生物細胞の特性又は挙動を判別するような方法で、あらゆる細胞障害の性質を区別することができる。センサー１８の間においてカップリング機構として機能するマイクロプレート１４が存在することから、センサー１８は非独立的な（すなわち、連動した）様式で応答する。システムの連動的性質により、マイクロプレート１４には、比較的小数の独立したセンサー１８が必要とされる。バイオセンシングプラットフォーム１０の解像度は、センサー１８を隔てるピッチに限定されず、従って、最小の製造スケールよりもかなり小さな変動を検知するのに利用可能である。更に、システムの連動的性質により、センサー１８は、細胞が接触している表面以外のマイクロプレート１４の表面上に取り付け可能である。これは本アプローチのロバスト性を高める。
【００３２】
時系列センサーデータを取得したら、少なくとも１つの生物細胞の特性又は挙動を特徴づけるように、これらの時系列は、革新的なシステム同定法、及び組み込み型ＩＴツールを用いて処理される。処理ステップ期間中、各センサーから得られた時系列センサーデータは、その他の各センサーから得られた時系列センサーデータと一緒に処理される（すなわち、データはまとめて処理される）。処理は非線形である。時間又は周波数ドメインのいずれかにおいて、連動した同時時系列を処理するのに、例えば、ニューラルネットワーク又はカルーネン・レーベ分解等の非線形シグナル処理技術が利用可能である。
【００３３】
非線形処理モデルは、細胞の特性及び挙動を検知するために、時系列センサーデータ中の動力学的情報を利用する。マイクロプレート１４から得られた空間的な動力学的情報（例えば、モード形状、センサー間のカップリング等）は、マイクロプレート１４上の細胞に関する空間的な動力学的情報（例えば、極性、幹細胞の成長）を導出するために用いられる。システム同定ツールは、処理ステップのアウトプットを、特徴づけすることが望まれる１つの細胞／複数の細胞／組織の特性又は挙動と関連付けるのに用いられる。換言すれば、動力学的な情報は、動力学的細胞特性の状態及び特徴と関連付けられる。例えば、対象物の特性又は挙動は、薬物開発、微生物学的スクリーニング及び腫瘍スクリーニング、又は幹細胞の生物学において必要不可欠なものであり得る。これには、静的又は動的な特性又は挙動、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの伝播、極性、細胞運動／成長、収縮、移動、増殖、又は分化、及び病原菌の成長が含まれ得る。現在のシステム及び方法は、細胞培養、細胞操作、及び細胞手術のプロセス期間中に、１つの細胞又は複数の細胞の接触について、サイズ、形状、及び運動の情報を導出するのに配備することができる。バイオセンシング法及びシステムの１つの目的は、細胞培養及び成長プロセス期間中に、細胞形態、移動、増殖、分化、及び収縮性に生ずる変化を検知することである。マイクロプレート１４の動的な特徴（例えば、速度及び加速度）は、比較的少ないセンシング要素１８を用いながら、システム同定アルゴリズムを介して必要とされる情報を推測するのに用いられる。マイクロプレート１４の動的応答シグナル（すなわち、感知された時系列データ）は、所望の細胞特性又は挙動に関する情報を導出するために、インテリジェントな時系列同定アルゴリズムの適用対象となる。組み込み型情報ツールを用いることにより、細胞特性／挙動の識別が実現する。アウトプットは、利用目的に基づき様々なデスクリプターを伴う独立した形態、又は連続した形態であり得る。
【００３４】
バイオセンシングシステムで用いられる非線形処理モデルは、トレーニングデータを用いて訓練される。マイクロプレート１４は、負荷条件が異なればこれに応じて異なって振動する。従って、非線形処理モデルは、液体環境中のマイクロプレート１４の既知の動力学を考慮する。例えば、マイクロプレートの動力学は、マイクロプレート１４が細胞培養培地（一般的に水よりわずかに高い密度を有する）と相互作用することにより引き起こされる音圧波により影響を受ける。従って、非線形処理モデルは、液体中のマイクロプレート１４の動力学及び音響照射に対するマイクロスケーリング効果を調べるためにマイクロスキャニングレーザー振動計を利用し、それから得られた結果を用いて構築される。マイクロスキャニングレーザー振動計は、液体中のマイクロプレート１４の動力学及び音響照射、例えば固有振動数、固有モード、所定の強制条件における強制応答を測定するのに用いられる。従って、マイクロスキャニングレーザー振動計を使用すれば、適切な非線形処理モデル（例えば、ニューラルネットワーク）の構築が可能となる。換言すれば、マイクロスキャニングレーザー振動計を用いて得られた結果は、例えばニューラルネットワークのためのトレーニングデータとして用いられる。水没させたマイクロプレートの動力学をシミュレーションすることにより、振動するマイクロプレート１４の時系列センサーデータから負荷状態を推測するように、非線形処理モデルの構築が可能である。モデルリングプロセスでは、異なるセンシング位置における変位／速度／加速度が、シミュレーションを通じて取得可能である。動的シグナル（すなわち、時系列センサーデータ）から抽出されるパラメータを外部の力／負荷に関連付ける非線形処理モデルは、システム同定技術、例えばカルーネン・レーベ分解、ウェーブレット解析、及び人工的ニューラルネットワーク法を用いて構築される。非線形処理モデルは、擬似ランダム２進法シーケンス（PRBS）励起・同定法を用いた実験により試験され及び妥当性確認され得る。ＰＲＢＳシグナルの長所として、同シグナルの自己相関関数はインパルス関数と緊密に近似するような特性を同シグナルが有することが挙げられる。全ての周波数の動力学はＰＲＢＳシグナルにより励起される。従って、任意の強制条件下にあるマイクロプレート１４の動力学が導出可能である。次に、マイクロプレート１４上に加わる力／負荷を、マイクロプレート１４上の異なる場所における振動がもたらす時系列センサーデータより推測するために、妥当性確認済みのモデルが利用可能である。システム同定技術が細胞／組織モニタリングに適用される場合には、細胞の動力学の状況及び状態が推測される。マイクロプレート１４が水没しているときには、マイクロプレート１４の加速度振幅は小さめであるが、これは、各モードはマイクロプレート１４の面内に音圧を発生させ、正規モードは液体中で連動するようになるという事実による。更に、センサー１８を適切な位置に配置することにより、適切なシステム同定技術を通じて、主要モード形状をマイクロプレート１４上の負荷及び動的状態と関連付けることができる。細胞挙動と検知された過渡的状態との相関関係、及びマイクロプレ��トセンシング表面に由来する情報が、非線形処理モデルにおいて考慮される。顕微鏡システムを介して設置されるＣＣＤカメラが、可視的挙動をモニターするために用いられ、またシンクロナイズドビジョンプロセッシングシステムを通じて、当該アウトプットがバイオセンシングシステムに由来する情報及びセンサーデータアウトプットと関連付けられる。図３には、実験装置の機能が概略的に示されている。
【００３５】
上記のように、外部刺激は、既存の顕微鏡検査画像システムを用いてリアルタイムに可視化することが多くの場合困難であるが、生物細胞はこの刺激に起因して様々な応答を示す。本明細書に記載するバイオセンシング法及び同システムは、顕微鏡検査画像システムより入手可能な測定を強化し、及び細胞生物学者にとって入手可能な情報レベルを顕著に高める。現在のマイクロプレート動力学法、及び同システムの考えられる３つの応用例を以下に記載する。下記の各応用例では、バイオセンシングプラットフォームを培養培地中に水没させる。次に、細胞はマイクロプレートに結合し、その上で成長する。
【００３６】
第１の考えられ得る応用は膜極性に関連する。単球や好中球等の白血球は、休止状態では何ら極性を示さないが、しかし走化性の刺激に応答して、膜受容体は分極化し、そして刺激の方向に移動する。同様に、新しい部位を分極化し、コロニー化する能力として、腫瘍転移能が定義可能である。細胞の移動を解析する現在の技術は、トリガーに応答して多孔性メンブレンを通過する移動に基づくが、この場合、手順の感度が不足しており、移動を可視化するために大きなサンプルサイズを必要とする。腫瘍の転移阻害剤に対する応答を解析する際には、わずかなサンプルサイズしか入手できないので、解析感度を改善する必要性が存在する。様々な走化性薬に対して好中球が示す応答性の指標マーカーとして、及び転移能を阻害し得るマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬（例えば、TAPI）に対する腫瘍の指標マーカーとして、本発明のシステム及び方法を用いて、細胞膜の再分布及びマイクロプレート全体にわたる移動を調べることができる。かかる技術を開発することにより、十分に高められた感度及び薬剤開発スピードがもたらされる。
【００３７】
第２の考えられ得る応用は、細胞の増殖、分化、及びアポトーシスに関連する。胚形成期間及び腫瘍等の活発に再生する組織内において、常在細胞は継続的に分裂する。細胞増殖は細胞数が増加するに連れて可視化され、数千個の細胞が任意の時点で試験可能である。やはり、かかる技術は洗練されておらず、また多数の細胞を必要とし、試験対象細胞の混合物となってしまうのは不可避である。小さいサンプルサイズを用いて、細胞の成長を高感度に調べることを可能にする、簡便技術の必要性が存在する。これを実現するために、顕微解剖が、腫瘍から単一細胞を抽出するのに利用可能であり、また細胞分裂の速度が、本発明の方法及びシステムに基づくマイクロプレートの動力学を用いて、サイズ及び質量の変化として求められる。時間及び用量範囲が色々変化した時の、メトトレキサートを含む様々な化学療法薬に対する応答性が、分化又はアポトーシスの期間中に誘発された細胞形状の変化として試験可能である。
【００３８】
３番目に考えられ得る応用は、幹細胞からの筋肉細胞の発現に関連する。幹細胞には前駆体が定義されていないのでこれが様々な成熟細胞型に発達することが可能となる。こうしたことから、幹細胞生物学は、幹細胞生物工学の急速な成長分野、すなわち細胞の生存、増殖、自己再生及び分化に影響を及ぼす環境シグナル操作に貢献する。このように、多変量解析アプローチが用いられ、異なる幹細胞培養プロセスの最適化に成功した。やはり、このプロセスも、収縮性の表現型を伴う変化を含め、形態及び機能に生じた小さな変化を感知する技術を利用することにより強化することができる。幹細胞の平滑筋細胞への成熟は誘発可能であり、次いで収縮筋への成熟効率が、本発明の方法及びシステムに基づくマイクロプレートの動力学を用いて、単一細胞を基準として解析可能である。
実験結果
【００３９】
ここで、更なる詳細内容が、本発明に基づくバイオセンシングプラットフォーム１０を用いて実施された実験に関して記載される。特に、長方形のマイクロマシンドシリコンメンブレン（すなわち、マイクロプレート１４）に基づくバイオセンシングシステムについて研究された。離散性のセンシングスキームはセンシング構造物の動力学をモニターする。人工ニューラルネットワークアルゴリズムが、測定データを処理し、並びに細胞の存在及び密度を識別するのに用いられる。従って、これらの実験では、特徴づけの対象となる細胞特性は、細胞の存在と密度である。何らかの具体的なバイオ用途を規定することなく、研究は、主に一般的なバイオセンシングプラットフォームとして、この種のバイオセンサーを性能試験することに重点が置かれた。微細加工されたメンブレン上でのバイオセンシング実験には、メンブレンのセンシング表面上に異なる細胞密度で播種するステップ、及び各試験対象シリコンメンブレンの対応する動力学情報を一連の周波数応答関数（FRF）の形式で測定するステップが含まれる。全ての実験は、実用的な作動環境をシミュレートするように細胞培養培地中で実施された。ＥＡ．ｈｙ９２６内皮細胞系統がバイオ実験用に選択された。ＥＡ．ｈｙ９２６内皮細胞系統は、生物学的粒子の特定のクラスを代表するが、同粒子は、従来型のバイオセンサーを用いたのでは感知するのが困難な、不規則な形状、不均一な密度、及び不明確な成長挙動を有する。最終的な予測結果から、離散性のセンサー測定から細胞の特徴を同定するための、ニューラルネットワークに基づくアルゴリズムからなる方法は、バイオセンサーの用途において強大な潜在能力を有することが明らかとなる。
【００４０】
これらの実験は、例示手段としてのみ提示されており、またその態様は、いずれも添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲に制限を加えるものとしてみなされるべきではないことに留意されたい。
１．メンブレンバイオセンシングデバイスの組立て
【００４１】
これらの実験では、シリコンメンブレン（すなわち、マイクロプレート１４）は、シリコンオンインシュレーター（SOI）ウェファーから標準的なマイクロマシン製造技術を用いて作製された。メンブレンは、ＳＯＩウェファー（すなわち、SOI基材１２）の裏面から深掘反応性イオンエッチング（DRIE）プロセスを用いて、誘導結合プラズマ（ICP）により作製されたが、但し、埋込み酸化物層で停止した。メンブレンの境界状態も、埋込み酸化物層を停止層として用いながら、ウェファー先端側からＤＲＩＥにより規定された。埋込み酸化物層は、境界孔を形成するように最終的に除去された。マイクロメンブレンについて３つの異なる境界状態が作製され、試験された：２つの対向する端部がクランプで固定され、それ以外の２つの端部が、非固定状態（Ｃ−Ｆ−Ｃ−Ｆ）、カンチレバー（Ｃ−Ｆ−Ｆ−Ｆ）、及び全ての端部がクランプで固定された状態（Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ）。全てのメンブレンは、長さが１００μｍ、２００μｍ、又は３００μｍの正方形となるように設計されている。
【００４２】
上記メンブレン構造物の動的試験を行うために、外部アクチュエーターが励起用として用いられ、またレーザー振動計が振動測定用として用いられた。非常に多くの生物学的実験が、これらのメンブレンについてそのバイオセンシング性能を調べるために実施された。
【００４３】
図４は、１００μｍ角の正方形センシングメンブレンに基づく一体化マイクロシステム（すなわち、バイオセンシングプラットフォーム１０）の走査型電子顕微鏡（SEM）画像であり、同システムは離散性のピエゾ抵抗素子センサー（すなわち、センサー１８）及びＰＺＴアクチュエーター（すなわち、アクチュエーター１６）を用いて製造された。かかるマイクロシステムは、デバイスが自己センシング及び自己励起する能力を有することを可能にする。このマイクロシステムは、ラボ・オン・チップシステムを構築するために、電子回路内に組み込み可能である。
【００４４】
離散性ピエゾ抵抗素子センサーを組立てる場合、５００ｎｍの厚さのポリ−シリコン層が、減圧化学蒸着法（PCVD）により、ＳＯＩウェファーの酸化デバイス層上に蒸着された。次に、この層は、ピエゾ抵抗素子の偏向感度を増強するために、１ｅ１５のドーピング密度を与える５０Ｋｅｖのボロン源を用いてイオンビーム注入法によりドープされた。２つのセンサーの形状は、写真平板及びこれに続く反応性イオンエッチング（RIE）により形成された。
【００４５】
ＰＺＴフィルムの組立てでは、１００ｎｍの厚さのＰｔ／Ｔｉ下部電極、１μｍＰＺＴフィルム、及び１００ｎｍの厚さのＰｔ上部電極からなるサンドイッチ構造がＳＯＩ上に蒸着された。上部及び下部電極は、ｅ−ビーム蒸着システムを用いて蒸着され、蒸着されたＰＺＴは、ゾル−ゲル上にスピンとして蒸着されたが、次にこれは、必要とされるＰＺＴフィルムを生成するためにアニーリングされる。上部及び下部電極は、イオンビームミリングによりパターン化され及びエッチングされる。余分のＰＺＴ材料はウェットエッチングされた。
２．生物学的実験
【００４６】
これらの実験で用いられるヒトハイブリッドＥＡ．ｈｙ９２６細胞は、ヒト臍帯血管内皮細胞とＡ５４９／８ヒト肺癌細胞系統との融合物に由来する。ＥＡ．ｈｙ９２６は、ヒト血管内皮細胞に特徴的な高度に分化した機能を発現する永久ヒト内皮細胞系統である。ヒトＥＡ．ｈｙ９２６内皮細胞系統は、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、及びペニシリン１００Ｕ／ｍｌが補給されたダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）３０ｍｌ、並びにＨＡＴ（１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン）１０ｍｌ中で維持された。細胞は、５％ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気を用い、３７℃のインキュベータ内で培養された。細胞は、７５ｃｍ２フラスコ中で成長し、及び約９０％のコンフルエンスに達するまで継代された。細胞がおよそ９０％のコンフルエンスに達したら、培地が除去され、そして細胞はリン酸緩衝化された生理食塩水（PBS）５ｍｌを用いて洗浄された。ＥＡ．ｈｙ９２６細胞の継代プロセスでは、端的には、細胞培養培地が細胞から除去され、そして次に、細胞は培地に色が認められなくなるまで滅菌ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄された。次に、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞は、トリプシン２．５ｍｌを添加し、３分間、標準的なインキュベーションを行うことにより引き離された。細胞集塊物も、均一に分布するように、新しいＤＭＥＭ培地５ｍｌを用いてピペッティングを繰返すことにより分散された。
【００４７】
図５は、マイクロメンブレンの表面上にコーティングされた内皮細胞のレーザー走査型マイクロメーター（LSM）画像である。内皮細胞は緊密にシリコン表面に接着し、典型的な展開パターンを示している。
【００４８】
生物学的実験は２段階に分けられる：（１）メンブレン上に所定量の細胞を播種する、及び（２）対応するメンブレンの動力学を測定する。動的試験デバイスが図６に図解されている。同一のマイクロメンブレンが、異なる細胞密度を用いた一まとまりの実験結果を得るために、数回反復して用いられた。各実験は下記のように実施された：
１．最初に、シリコンマイクロメンブレンが洗浄され、そして洗浄液（エタノール及びアセトン混合物）、オートクレーブ処理、及びＵＶ光照射を用いて滅菌された。
２．マイクロメンブレン上に細胞を播種する前に、継代プロセス期間中に懸濁液の細胞密度が規定された。生存細胞数が、細胞懸濁液２０μｌを取り出し、そしてこれをトリパンブルー２０μｌと混合することにより見積もられた。次に、細胞数の計測が改良されたＮｅｕｂａｕｅｒ血球計算器を用いて、この新しい混合物について実施された。細胞密度が規定されたら、密度が既知のＥＡ．ｈｙ９２６細胞からなる細胞懸濁液５ｍｌが、培地を用いて調製された。インキュベーション時間を制御することにより、メンブレン表面上に様々な細胞密度及び分布を実現することができる。
３．メンブレンセンシング表面上の細胞分布がＬＳＭ（レーザースキャン顕微鏡検査）画像を用いて記録された。細胞の密度又は分布は、このＬＳＭ画像に基づき定量可能である。
４．接着細胞を伴うメンブレンの動力学は、図６の基礎励起装置により測定された。細胞情報を推測するために、細胞を伴う及び細胞を伴わない個々のマイクロメンブレンそれぞれに関するＦＲＦデータが比較され、その情報はＬＳＭスキャン画像に記録された。
５．最終的に、細胞はマイクロメンブレン表面から除去され、そしてステップ１の洗浄プロセスを繰り返した後、再滅菌されたマイクロメンブレンは次の実験に用いられた。
【００４９】
図７、８、及び９は、３つの異なる細胞密度における、３つの異なるタイプのマイクロメンブレンに関する周波数応答関数（FRF）を示す。図７は、１００μｍ角の正方形Ｃ−Ｆ−Ｆ−Ｆマイクロメンブレンを使用；図８は２００μｍ角の正方形Ｃ−Ｆ−Ｃ−Ｆマイクロメンブレンを使用；及び図９は３００μｍ角の正方形Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃマイクロメンブレンを使用する。各場合において、（ａ）及び（ｂ）はマイクロメンブレン表面上の内皮細胞コーティングを示し、及び（ｃ）は細胞密度に基づく標準化された速度振幅を表す。
【００５０】
細胞が負荷したことにより誘発されて、メンブレンの動力学に生じた最も支配的な変化は、共鳴周波数ｆｎのシフトである。第１のモード形状はほぼ一定のままであり、及び各ＦＲＦの振幅は、第１の共鳴モードの振幅に関して自己標準化された。共鳴モードの相対的な振幅は細胞負荷後に顕著に変化することが判明する。これは、メンブレン表面上に細胞が結合して質量が更に負荷されると、振動形状の歪みも引き起こすことを意味する。標的細胞の質量ｍ又は量は、共鳴周波数のシフトΔｆｎを検知することにより見積もり可能である。式（１）は、剛性ｋは一定のままと仮定した時の、質量変化Δｍと動的システムの周波数シフトΔｆとの間の関係を示している。このアプローチは微小カンチレバーに基づくバイオセンサーで幅広く用いられている。
【００５１】
【数１】
0005750102.tif 000002
【００５２】
図７、８、及び９で提示したＦＲＦの変化を比較すれば、長方形シリコンマイクロメンブレンのタイプ（寸法及び境界状態）が異なれば、これを反映してバイオセンシング性能も非常に異なると結論づけられる。それは、第１のタイプのメンブレン（１００μｍ角の正方形Ｃ−Ｆ−Ｆ−Ｆ）が、共鳴周波数シフトΔｆｎに関して上記３つのメンブレンの中で最高感度を有することを意味する。また、非線形性が、液体が負荷されたマイクロメンブレンの動力学においても生ずることが指摘される。一般的に、これらの実験結果は、マイクロメンブレンが高減衰性の液体環境に浸漬されたとしても、同メンブレンはバイオセンシングにおいて高い潜在能力を有することを実証する。
【００５３】
式（２）の２つ共鳴周波数に基づくインデックスが、実験結果について予備的解析を行うのに用いられる。ＦＤＲｎ（周波数差の比）が、各測定共鳴モードにおいて、細胞が負荷されたメンブレンと負荷されないメンブレンとの間の標準化された共鳴周波数の差として評価される。ＡＦＤＲは、全ての測定されたＦＤＲｎの平均である。
【００５４】
【数２】
0005750102.tif 000003
【００５５】
ＦＤＲｎ及びＡＦＤＲのインデックスの評価が、３つの異なるマイクロメンブレンを用いた３バッチのバイオ実験結果について実施されたが、同メンブレンは全て約２００μｍ角の正方形Ｃ−Ｆ−Ｃ−Ｆメンブレンである。３つのマイクロメンブレンは、Ｎｏ．Ｉ、Ｎｏ．ＩＩ及びＮｏ．ＩＩＩとそれぞれラベル表示される。実験の各バッチでは、同一の膜が４回反復して用いられ、また細胞培養密度は２５×１０３／μｌから２００×１０３／μｌへ徐々に増加させた。図１０、１１、及び１２は、各試験対象マイクロメンブレン（それぞれＮｏ．Ｉ、Ｎｏ．ＩＩ、及びＮｏ．ＩＩＩ）について、細胞の量の増加に従ったＦＤＲｎの傾向を表している。図１３は、各実験バッチにおいて、上記３つのマイクロメンブレンのＡＦＤＲインデックスを比較している。
【００５６】
まず第１に、１つの又は２つモードにおけるインデックスＦＤＲｎの傾向は、一部、細胞量の増加と同一ではない。この現象は、基本モードのＦＤＲ０が常に細胞数と直線関係を有する、微小カンチレバーのバイオ実験結果とは全く異なる。この現象に対する考え得る理由は：（ａ）マイクロメンブレンは、通常かなり大き目のセンシング領域を有し、またバイオ実験では微小カンチレバーより多くの細胞を担持する。質量変化とは別に、細胞の蓄積は構造的剛性変化も引き起こし得る。そのような場合には、ＦＤＲの線形関係は成立しない。（ｂ）マイクロメンブレンに関するこれらのバイオ実験は関連する環境でも維持され、例えばマイクロプレートの動力学は細胞培養培地中で測定される。（ｃ）ランダムに分布した細胞を伴うマイクロメンブレンを水没させた時に認められる、その動力学の非線形性はほとんどの実験測定において存在する。
【００５７】
一方、インデックスＡＦＤＲは、細胞量の近似的予測をもたらすことができる。上記３つのマイクロメンブレンに関するＡＦＤＲの感度は全く異なる。Ｎｏ．Ｉ及びＮｏ．ＩＩのメンブレンに関するＡＦＤＲの数値は非常に近いが、Ｎｏ．ＩＩＩの数値はかなり低目である。これは、Ｎｏ．Ｉ及びＮｏ．ＩＩのメンブレンは同一のウェファーに由来し、一方Ｎｏ．ＩＩＩは異なるウェファーに由来するという事実に起因する。従って、バイオセンシングプラットフォームとしてマイクロメンブレンを採用した場合、そのためにインデックスＡＦＤＲを使用するのは、ロバストな方法とはならない。細胞密度の見積もりを行う前には、常にかかるバイオセンシングデバイスについてキャリブレーションを行うのが好ましい。一般的なオシレーション構造として水没したセンシングメンブレンを検討する場合、共鳴周波数ｆｎは、その剛性ｋ及び質量ｍによってのみ近似的に求めることができる（（１）の最初の式を参照）。システム剛性ｋが一定であると仮定すると、質量変化の比は、周波数変化の比と比例する（（１）の第２式を参照）。従って、インデックスＦＤＲｎ及びＡＦＤＲは、細胞密度を大まかに反映し得ると考えられる。しかし、現実的な状況においては、細胞、特に内皮細胞の結合は、センシングマイクロメンブレンの剛性にも多かれ少なかれ影響を及ぼす。従って、状況によっては、ＦＤＲｎ及びＡＦＤＲは細胞密度を表す場合には有用性に劣るなど、問題はより複雑となる。
３．ニューラルネットワーク法
【００５８】
概して、共鳴周波数に基づくインデックスであるＦＤＲｎ又はＡＦＤＲは、いずれも細胞密度を予測することができるが、その正確性は限られている。これは、主にマイクロメンブレンセンシングシステムの複雑性及び非線形性に起因する。測定された動力学データから細胞分布に関するより正確で信頼性のある同定を実施するには、その他のアルゴリズムが望ましい。本セクションでは、センサーデータと細胞分布との間の関係を構築するための人工ニューラルネットワーク技術を使用する簡便な試みが実施される。
【００５９】
上記実験結果では、マイクロメンブレンセンシングドメインにおいて細胞集団を直感的に示すのに、ＬＳＭ画像が用いられた。しかし、より正確な解析を行うためには、細胞量を示すのに定量的なインデックスも必要である。これは特に、細胞数の計測が非常に困難な内皮細胞に当てはまる。各ＬＳＭ画像について、単純な画像処理手技が、ＭＡＴＬＡＢ画像処理ツールボックスを用いてこれを２値画像に変換するために実施された。最初にＬＳＭ画像がロードされ、そして反射モードで撮影されたＬＳＭ画像には通常３つの層が含まれるので、最も透明な層が後続のプロセスのために選択される。次に、このＬＳＭ画像のバックグラウンド画像がモルフォロジカルオープニング技術を用いて構築される。その後、細胞が占める領域を高輝度表示することを目的として、バックグラウンド画像がオリジナルの画像から差し引かれ、そして画像コントラストが強調される。最終的に対応する２値画像が構築され、この画像ではバックグラウンドが黒く、また移植細胞部分は白い。従って、センシングドメイン上の細胞集団は、この２値画像中の白い領域の比から近似的に見積もり可能である。この比は、本明細書において以後細胞密度比（CDR）と呼ぶ。図１４は、４つの異なるＬＳＭ画像に関する本評価プロセスの結果を示しており、これらは同一バッチのバイオ実験について得られている。この２値画像では若干の局所的エラーが存在するものの、各２値画像の白い領域は内皮細胞分布形状を大まかに表していることを認めることができる。評価された白い領域の比は図１４の下部にも掲載されている。
【００６０】
しかし、これらの評価されたＣＤＲは、以下に示す事項により、解析で直接用いるにはふさわしくない：（１）成長表面上の各細胞の高さとは別に、内皮細胞は培地表面全体にわたり薄膜も生成する。従って、各評価されたＣＤＲは、細胞の負荷が全くない場合と区別するために、この薄膜負荷効果を考慮して１０％〜１５％高く見積もられる。；（２）細胞がほぼ全てのセンシングドメインを覆うような場合（すなわち、図１４の画像のうち４番目の組）には、通常、ＣＤＲの予測値は実際の状況よりもかなり低目になる。従って、予測値を高めにする必要がある。次に、ニューラルネットワークアプリケーションにおける目標値として、各実験サンプルについて修正されたＣＤＲが用いられる。
【００６１】
ここでＦＲＦデータの標準化及び次数削減について検討する。各動的実験において全ての実験設定は同一であるものの、実験環境及び外乱によりＦＲＦ測定の振幅は変化する。従って、比較及び解析するために、測定されたＦＲＦを標準化し、またＦＲＦを同一レベルに合わせるのがより好ましい。一方、各動力学測定では複数のＦＲＦデータセットが存在し、また各ＦＲＦデータセットには非常に多数の周波数スペクトル線が含まれる。この研究では、周波数スペクトル線は各ＦＲＦについて６４００となるように設定されており、また４つのセンサーＦＲＦが記録された。かかるＦＲＦデータセットは大きすぎてニューラルネットワークに直接当て嵌めることはできない。従って、各ＦＲＦの次元はニューラルネットワークを適用する前に削減される。
【００６２】
ＦＲＦを標準化する場合、各スペクトルは、これが有する最初の共鳴モードの振幅に関して標準化される。最初の共鳴モードを基準として選択する理由は、質量負荷は長方形メンブレンの最初の共鳴モードに対して最も小さな効果を有することを証明する理論的解析結果に基づく。
【００６３】
次元数削減については、カルーネン・レーベ（K-L）分解法が、複数のＦＲＦデータセットについて主要な成分を抽出するのに用いられる。Ｋ−Ｌ分解法は、動力学的システムについて低次元の次元削減モデルを構築するのに有用な方法である。メンブレンの動力学測定それぞれについて、周波数ＮのＭ個のＦＲＦが存在すると仮定すると、このデータセットはＭ×Ｎ個のマトリックス［Ｈ（ω）］Ｍ×Ｎを形成する。Ｋ−Ｌ法を用いてマトリックス［Ｈ（ω）］の主要成分を抽出するプロセスは、下記のステップを有する：
１．最初に、ＦＲＦマトリックス［Ｈ（ω）］Ｍ×Ｎに基づき、相関マトリックス［Ｃ］ＭＸＭが構築される。
【００６４】
【数３】
0005750102.tif 000004
２．次に、マトリックス［Ｃ］の固有値及び対応する固有ベクトルを計算して、それから主要成分が得られる。
［ＣＩＸ］＝λ［Ｘ］（３）
３．最終的に、Ｍ個の抽出された固有値が調べられ、そして最初の数個の最大固有値が取り出される。次に、これらの最大固有値に関連した固有ベクトルが主要な成分であると考えられ、またオリジナルのＦＲＦデータセットの最も重要な情報に該当し得るとみなされる。
【００６５】
ここでデータセットの構築について検討する。細胞が負荷されない４つの異なる使用済みのメンブレンの動力学（FRF）も参考としてデータセットに提供される。２つの追加サンプルも妥当性を確認する目的で提供される。従って、合計１８個の異なるサンプルが、ニューラルネットワークのトレーニング用及び妥当性確認用として構築される。各サンプルのＦＲＦデータセットのうち、最大の固有値に関連する固有ベクトルがニューラルネットワークインプットとして抽出され、及び各サンプルのＣＤＲが、ニューラルネットワーク目標値として計算される。
【００６６】
ここでネットワークの設計及びトレーニングについて検討する。幅広く用いられる逆伝播（BP）ニューラルネットワークが細胞密度を予測するのに選択された。図１５は、ＣＤＲ値を予測するためのＢＰニューラルネットワーク利用の概念について説明する。ＦＲＦデータセットから抽出された主要成分の他に、各サンプルのインデックスＡＦＤＲの値は、ニューラルネットワークに対して追加のインプットを提供する。前のセクションで、ＡＦＤＲのインデックスは、細胞分布と高度に関連していることが証明されたように、同インデックスは、次に高速コンバージェンス及び良好な予測を実現するように、ニューラルネットワークを支援することができる。データセット内の１８サンプルのうち、最初の１４サンプルはニューラルネットワークをトレーニングするために用いられ、そして残りの４サンプルは妥当性を確認するために用いられる。サンプル数は限られているので、複雑なものよりも単純なニューラルネットワークを設計し、及び使用ことの方がより賢明である。ここで用いられるＢＰニューラルネットワークは、数個のニューロンを含む１つの隠れ層のみを有するように設計されている。標準化されたシステムエラーについて相違を試験するために、異なる数の隠れ層ニューロンを用いて数回のトレールが実施された。５つのニューロンを含む隠れ層が最高性能を発揮する。設定目標（平均二乗誤差）を満たすように、ネットワークの重み及びバイアスを繰り返し調整することにより、本明細書によるＢＰネットワークのトレーニングプロセスは、インプットと目標値との間の近似関数（非線形回帰）を規定する。トレーニングパラメータは、ネットワークコンバージェンススピード、並びに最終プレディケーション正確度に影響を及ぼす可能性がある。不適切なパラメータでは、トレーニングプロセスが非常に遅くなり、又は過学習結果が得られるおそれがある。次に、合理的なトレーニングパラメータを見出すために数回の試験が実施された。本発明で用いられる最終的なトレーニングパラメータは、モーメントレートが０．９、学習率が０．１、最大誤差が０．００１、及び最大反復数が３０００として選択される。
【００６７】
図１６は、ＢＰネットワークのトレーニング結果から得られた、サンプル番号１５〜１８に関するＣＤＲの予測結果を示している。予測結果は、対応するＬＳＭ画像から計算されたＣＤＲ値と非常に良好な一致性を示す。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態が記載されてきたが、それらは例示目的に限られ、様々な修正形態も検討可能であると理解されるはずである。
【図１ａ】
0005750102.tif 000005
【図１ｂ】
0005750102.tif 000006
【図２】
0005750102.tif 000007
【図３】
0005750102.tif 000008
【図４】
0005750102.tif 000009
【図５】
0005750102.tif 000010
【図６】
0005750102.tif 000011
【図７】
0005750102.tif 000012
【図８】
0005750102.tif 000013
【図９】
0005750102.tif 000014
【図１０】
0005750102.tif 000015
【図１１】
0005750102.tif 000016
【図１２】
0005750102.tif 000017
【図１３】
0005750102.tif 000018
【図１４】
0005750102.tif 000019
【図１５】
0005750102.tif 000020
【図１６】
0005750102.tif 000021