(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の結核菌群に属するマイコバクテリアの核酸を検出する方法であって、
（ａ）試料を一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
前記順方向プライマーがマイコバクテリア散在性反復単位（ＭＩＲＵ）反復エレメント内に位置し、配列番号２５〜３９から選択されるヌクレオチド配列の相補体である標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、
前記逆方向プライマーがマイコバクテリア散在性反復単位（ＭＩＲＵ）反復エレメント内に位置し、配列番号４０〜４６から選択される標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、
前記順方向プライマーが、配列番号４７若しくは４８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、又は前記順方向プライマーが、配列番号４７若しくは４８のヌクレオチド配列における少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなり、かつ、
前記逆方向プライマーが、配列番号４９〜５１のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、又は前記逆方向プライマーが、配列番号４９〜５１のいずれかのヌクレオチド配列における少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、ステップと、
（ｂ）前記順方向及び逆方向のプライマーを伸長させて増幅産物を得るステップと、
（ｃ）前記増幅産物を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
標的ヌクレオチド配列が、ＭＩＲＵ２反復エレメント、ＭＩＲＵ１０反復エレメント、ＭＩＲＵ１６反復エレメント、ＭＩＲＵ２３反復エレメント、ＭＩＲＵ２４反復エレメント、ＭＩＲＵ２６反復エレメント、ＭＩＲＵ２７反復エレメント、ＭＩＲＵ３１反復エレメント及びＭＩＲＵ３９反復エレメントから選択されるＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
順方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号４７若しくは４８のヌクレオチド配列における少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなり、かつ、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号４９〜５１のいずれかのヌクレオチド配列における少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
順方向プライマーが、配列番号４７若しくは４８のヌクレオチド配列における少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
順方向プライマーが、配列番号４７又は４８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
順方向プライマーが、配列番号４７又は４８のヌクレオチド配列からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
順方向プライマーが、配列番号４７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
順方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号４７のヌクレオチド配列、又は配列番号４７における少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
順方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号４７のヌクレオチド配列からなる、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
逆方向プライマーが、配列番号４９〜５１のいずれかのヌクレオチド配列における少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項１、２、及び４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
逆方向プライマーが、配列番号４９〜５１のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項１、２、及び４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
逆方向プライマーが、配列番号４９〜５１のいずれかのヌクレオチド配列からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
逆方向プライマーが、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項１、２、及び４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号４９のヌクレオチド配列、又は配列番号４９における少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項１、２、及び４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号４９のヌクレオチド配列からなる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
順方向プライマーが、配列番号４７若しくは４８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、逆方向プライマーが、配列番号４９〜５１のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１７】
順方向のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号４７のヌクレオチド配列からなり、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号４９のヌクレオチド配列からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
順方向及び逆方向のプライマーが、同じマイコバクテリア散在性反復単位（ＭＩＲＵ）反復エレメント内に位置する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、前記プライマーを伸長させることにより、３０〜５５個のヌクレオチドの長さである増幅産物を得る、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
増幅産物が、４３〜４５個のヌクレオチドの長さである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
順方向及び逆方向のプライマーが、同じマイコバクテリア散在性反復単位（ＭＩＲＵ）座位内の異なるＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、前記プライマーを伸長させることにより、前記同じＭＩＲＵ座位内の２個以上の隣接するＭＩＲＵ反復エレメントからのヌクレオチド配列を含む増幅産物を得る、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、異なるＭＩＲＵ座位内に位置する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、前記プライマーを伸長させることにより、前記異なるＭＩＲＵ座位からの２個以上のＭＩＲＵ反復エレメントからのヌクレオチド配列を含む増幅産物を得る、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることにより、同じ又は異なるＭＩＲＵ座位からの複数のＭＩＲＵ反復エレメントのコンカテマー形成を含むコンカテマー増幅産物を得、検出ステップが前記コンカテマー増幅産物を検出することを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
コンカテマー増幅産物が２ｋｂを超える長さである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
コンカテマー増幅産物が１１ｋｂを超える長さである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
コンカテマー増幅産物の検出が、前記コンカテマー増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化産物を検出することを含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
順方向プライマー及び／又は逆方向のプライマーが、タグ又は標識を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
増幅産物が、
（ｉ）試料を、存在する場合は増幅産物とハイブリダイゼーション複合体を形成するオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップと、
（ii）ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップと
を含む方法によって検出される、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドプローブが、５〜３０個のヌクレオチドの長さである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）配列番号５２〜５７から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
（ii）配列番号５２〜５７から選択されるヌクレオチド配列における少なくとも８個の連続したヌクレオチドを有する断片
を含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
試料が臨床試料である、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
試料が痰試料である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
所望の試料中の結核菌群マイコバクテリア量を定量するためのインビトロの方法であって、
（ａ）請求項１〜３１のいずれかに記載の検出方法を、所望の試料に対して実施するステップと、
（ｂ）前記方法を、予め定められた既知の結核菌マイコバクテリア量の試験試料に対して実施するステップと、
（ｃ）前記所望の試料から検出された増幅産物の量を、前記試験試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、
それにより、所望の試料中の結核菌群マイコバクテリア量を定量する方法。
【請求項３３】
薬物療法の期間中の抗結核菌群マイコバクテリア薬の有効性を決定するためのインビトロの方法であって、
（ａ）請求項１〜３１のいずれかに記載の検出方法を、薬物療法の期間内又は期間前の第１の時点に得られた第１の試料に対して実施するステップと、
（ｂ）前記方法を、薬物療法の期間内又は期間後の１又は複数の後の時点に得られた１又は複数の試料に対して実施するステップと、
（ｃ）第１の試料から検出された増幅産物の量を、１又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、
それにより、薬物療法の期間中の薬物有効性を決定する方法であって、１又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量が、第１の試料から検出された増幅産物の量と比較して減少していることにより、結核菌群マイコバクテリアに対する薬物の有効性が示される方法。
【請求項３４】
結核菌群マイコバクテリア感染症に対するワクチンの有効性を決定するためのインビトロの方法であって、
（ａ）請求項１〜３１のいずれかに記載の検出方法を、ワクチン接種前の第１の時点に患者から得た第１の試料に対して実施するステップと、
（ｂ）前記方法を、結核菌群マイコバクテリアを用いたワクチン接種及び追加接種後の１又は複数の後の時点に患者から得た試料に対して実施するステップと、
（ｃ）第１の試料から検出された増幅産物の量を、１又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、
それにより、ワクチンの有効性を決定する方法であって、１又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量が、第１の試料から検出された増幅産物の量と比較して減少していることにより、結核菌群マイコバクテリア感染症に対するワクチンの有効性が示される方法。
【請求項３５】
１８〜３０個のヌクレオチドの長さであり、配列番号２５〜３９から選択されるヌクレオチド配列の相補体である標的ヌクレオチド配列と特異性の高い結合条件下でハイブリダイズする、順方向オリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号４７若しくは配列番号４８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号４７若しくは配列番号４８のヌクレオチド配列における少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含有する断片を含む順方向オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３６】
１８〜３０個のヌクレオチドの長さであり、配列番号４０〜４６から選択される標的ヌクレオチド配列と高い特異性の結合条件下でハイブリダイズする、逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号４９〜５１から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号４９〜５１から選択されるヌクレオチド配列における少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含有する断片を含む逆方向オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３７】
請求項３５に記載の順方向プライマーと請求項３６に記載の逆方向プライマーとを含む、一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３８】
順方向プライマーが配列番号４７のヌクレオチド配列を含み、逆方向プライマーが配列番号４９のヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３９】
試料中の結核菌群に属するマイコバクテリアを検出するためのキットであって、請求項３７又は３８に記載の一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマー、結核菌群に特異的なヌクレオチド配列を増幅するための試薬及び／又は増幅産物を検出するための試薬を含むキット。
【請求項４０】
増幅産物を検出するための試薬が、前記増幅産物とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
プローブが、
（ｉ）配列番号５２〜５７から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
（ii）配列番号５２〜５７から選択されるヌクレオチド配列における少なくとも８個の連続したヌクレオチドを有する断片
を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
増幅産物を検出するための試薬が、前記増幅産物を消化する酵素を含む、請求項３９〜４１のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のマイコバクテリアを迅速に検出する方法、並びにそのための試薬及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核感染症（ＴＢ，tuberculosis infection）の病原学的因子として、結核菌（Mycobacterium tuberculosis（M. tuberculosis））は、世界中において感染性疾患による主な死因であり、潜伏感染は世界人口の３分の１ほどに及ぶ。世界保健機関（ＷＨＯ，World Health Organization）は、約９百万件の新規ＴＢ及び約２百万件の死亡が毎年世界中で発生していると推定している。２００５年の新規ＴＢ症例の最大数は東南アジアで発生し（世界中で発生する症例の３４％）、サハラ以南のアフリカにおける推定発生率は、人口１００，０００人当たり約３５０件である。
【０００３】
しかし、ＴＢ感染症は発展途上世界に限定されない。ＵＫでは１９８０年代後半から結核が復活しており、現在では毎年８０００件を超える新規症例が存在し、これは人口１００，０００人当たり１４．０件の割合である。これらの新規症例のうちの約４０％はロンドン地域で発生しており、その感染率は人口１００，０００人当たり４４．８件である。高リスクの集団には、一部の季節労働者集団、ホームレス、囚人及び薬物乱用者が含まれる。
【０００４】
ＴＢ感染症は、通常は抗生物質の６カ月コースによって処置することができる。しかし、薬物処置に対する患者コンプライアンスは多様であり、患者はその症状が止んだ際にしばしば治療を停止する。さらに、ＴＢ率は季節労働者集団間で高く、経過観察処置の投与がより困難となる。未処置のままにした場合、活性ＴＢ疾患に罹患しているそれぞれの人は、毎年平均して１０〜１５人を感染させる。ＷＨＯによって承認された、「短期直接監視下治療」（ＤＯＴＳ，Directly Observed Therapy Short-course）と呼ばれる包括的な戦略は、薬物コンプライアンスを増加させ、多剤耐性結核菌株の発生を低減させる手法である。ＷＨＯ手法の１つの側面は、ＴＢの排除が新規の診断学、薬物及びワクチンに依存することを認識し、研究を可能にして助成することを焦点としている。
【０００５】
最適な患者管理には、薬物療法を早期開始し、感染個体を可能な限り早く隔離することを要するため、当分野では迅速かつ信頼性のある検出技術の必要性が存在する。
【０００６】
しかし、ＴＢ感染症を診断するための旧来の方法は、長引くか（生物培養）、又は潜在的に感度を欠く（抗酸スメア顕微鏡観察）。肺外ＴＢの診断は、既知の技術を用いて検査するために十分な材料を得ることが困難なことによって複雑となる。
【０００７】
より詳細には、マイコバクテリアを検出するための現在の標準方法には精通した技術者が必要であり、その結果、診断結果に８週間までの遅れが生じる場合がある。現在のＷＨＯ指針では、ＴＢの罹患が疑われる人は、活性ＴＢを検出する可能性を高めるために少なくとも３つの痰試料（別々の時点で生じたもの）を提出することが推奨されている。
【０００８】
チールネールゼン染色によって痰中のマイコバクテリアを検出するためには、光学顕微鏡観察によって桿菌を可視化するために１ｍｌの痰当たり５，０００個を超える生物が必要である。したがって、「スメア」試験は、しばしば感度及び特異性をどちらも欠く。さらに、活性肺ＴＢに罹患している患者では、痰の顕微鏡観察によっては感染症の推定４５％しか検出されない（Dye C. et al. (2005) JAMA Vol. 293: 2767-2775）。
【０００９】
マイコバクテリアの培養は、診断及び薬物感受性試験のどちらにおいても依然として最も信頼できる基準であり、１ｍｌの痰当たりわずか１０個の生物を検出することができる。しかし、この技術は、長いインキュベーション時間（診断のためには数週間まで）及び当分野において実装することの困難さの両方によって妨げられている（Kent P.T. and Kubica G.P. (1985) Public health mycobacteriology: A guide for the level III laboratory. Atlanta: Department of Health and Human Services）。
【００１０】
結核菌複合体（ＭＴＢｃ，Mycobacterium tuberculosis complex）は５つの種、すなわち、結核菌、ネズミ型結核菌（M. microti）、ウシ型結核菌（M. bovis）、マイコバクテリウム・カネッティ（M. canetti）、及びアフリカ型結核菌（M. africanum）を含み、これらは、世界中における結核菌感染症（ＴＢ）の症例の大多数の原因因子である。これらの種間の高いレベルのＤＮＡ配列同一性（sequence identity）により、ＭＴＢｃのメンバー間を区別するためにＤＮＡ配列を使用することが制限されている。
【００１１】
診断的マイコバクテリア学の分野における核酸増幅アッセイの導入以降、いくつかの内製及び市販のアッセイが開発されている。例として、RocheのAMPLICOR（登録商標）ＭＴＢシステムは、すべてのマイコバクテリアに共通する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の５８４ｂｐの領域を増幅する。
【００１２】
ＭＴＢ複合体「ＭＴＢｃ」のマイコバクテリアを検出及び分類するための現在の分子的方法には、転位因子ＩＳ６１１０の増幅が含まれる（Thierry D. et al., J. Clin. Microbiol. Vol. 28, No. 12: 2668-2673、Yuen K.Y. et al. (1995) J Clin Pathol. Vol. 48(10): 924-928）。しかし、ＩＳ６１１０に基づいた方法では、再現性及び感度が乏しい。
【００１３】
この点において、ＩＳ６１１０のコピー数はＭＴＢｃのメンバー間で変動し、株に依存性であると考えられる（Poulet S. and Cole S. T. (1995) Arch. Microbiol., Vol. 163: 79-86）。ＭＴＢｃの多くのメンバーはゲノム全体にわたって点在する８〜１５個のＩＳ６１１０のコピーを含有する一方で、結核菌株の約４０％はこのエレメントの１又は２個のコピーのみを保有し、ウシ型結核菌は（平均して）単一のコピーしか含有しない。
【００１４】
１９９０年代後半には、マイコバクテリアの同時の検出及び株区別が、ＭＴＢｃ株中に排他的に存在する３６ｂｐの直接反復（ＤＲ，direct repeat）座位内の２５〜４１ｂｐの４３個の既知の多型「スペーサー」領域の存在又は非存在の検出に基づいた「スペーサーオリゴタイピング」（スポリゴタイピング）と呼ばれるＰＣＲに基づいた技術を用いて報告されている（Kamerbeek J. et al., (1997) J. Clin. Microbiol. Vol. 35: 907-914）。株は、ゲノム中のＤＲの全量及び特定のスペーサー領域の存在又は非存在が変動する。したがって、ＩＳ６１１０に基づいた方法と同様、スポリゴタイピングは識別力が不足している。
【００１５】
「マイコバクテリア散在性反復単位」（ＭＩＲＵ，Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit）とは、ＭＴＢｃマイコバクテリアのゲノム全体に位置する約４１座位にわたって点在する可変数タンデム反復配列（ＶＮＴＲ，variable number tandem repeat sequence）である。それぞれのＭＩＲＵ座位は、可変数のＭＩＲＵ反復配列エレメントをタンデムで含有する（１つの座位当たり約１３個までの反復エレメント）。
【００１６】
（Supply P. et al., J. Clin. Microbiol. Vol. 39, No. 10: 3563-3571）は、結核菌ゲノム中のＭＩＲＵ座位でのタンデム反復の数の決定に基づいた、結核菌株を遺伝子型同定する方法を記載している。（Supply P. et al., J. Clin. Microbiol. Vol. 39, No. 10: 3563-3571）に記載されている方法は、ＭＩＲＵ座位に隣接する結核菌ゲノムの領域に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅を含む。得られたアンプリコンの大きさが、それぞれのＭＩＲＵ座位での反復の数を反映する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】（Dye C. et al. (2005) JAMA Vol. 293: 2767-2775）
【非特許文献２】（Kent P.T. and Kubica G.P. (1985) Public health mycobacteriology: A guide for the level III laboratory. Atlanta: Department of Health and Human Services）
【非特許文献３】（Thierry D. et al., J. Clin. Microbiol. Vol. 28, No. 12: 2668-2673）
【非特許文献４】（Yuen K.Y. et al. (1995) J Clin Pathol. Vol. 48(10): 924-928）
【非特許文献５】（Poulet S. and Cole S. T. (1995) Arch. Microbiol., Vol. 163: 79-86）
【非特許文献６】（Kamerbeek J. et al., (1997) J. Clin. Microbiol. Vol. 35: 907-914）
【非特許文献７】（Supply P. et al., J. Clin. Microbiol. Vol. 39, No. 10: 3563-3571）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
当分野では、痰及び呼吸器検体などの試料中のマイコバクテリアを、わずか単一のゲノムコピーのレベルで検出する、迅速、簡便、特異的かつ高感度な分子的方法、好ましくは、現場、たとえば発展途上世界に容易に運搬される「即刻の」技術の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、試料中のＭＴＢ複合体に属するマイコバクテリアを検出する方法であって、
（ａ）試料を一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
前記順方向プライマーがマイコバクテリア散在性反復単位（ＭＩＲＵ）反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズし、
前記逆方向プライマーがマイコバクテリア散在性反復単位（ＭＩＲＵ）反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズするステップと、
（ｂ）前記順方向及び逆方向のプライマーを伸長させて増幅産物を得るステップと、
（ｃ）増幅産物を検出するステップと
を含む方法を提供することによって、この必要性を満たす。
【発明の効果】
【００２０】
本方法は、結核菌又はウシ型結核菌などの結核菌複合体（ＭＴＢｃ）のマイコバクテリアの、高感度、迅速かつ頑強な分子的診断アッセイを有利に提供する。
【００２１】
ＭＴＢｃマイコバクテリアのゲノム全体にわたるＭＩＲＵ反復の特定の配置は、アッセイの感度を大幅に増加させる。
【００２２】
一実施形態では、２時間未満でアッセイから結果を有利に得ることができる。一実施形態では、本アッセイは、痰から直接単一分子を検出することを有利に可能とする。一実施形態では、時間を消費する核酸抽出手順を必要とせずに、微小体積の患者試料（たとえば痰）から結果を直接、有利に得ることができる。
【００２３】
したがって、一実施形態では、本アッセイは待ち時間を劇的に短縮し、理論的には患者の近くでの試験が可能となる。
【００２４】
本発明の特許請求したアッセイのさらなる利点は、その簡便さである。好ましくは、これは専門家でない人員によって実行及び読取することができ、重労働ではない。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ＭＩＲＵ反復エレメントは、ＭＴＢ複合体のメンバーに特異的な核酸配列を含む。
【００２６】
したがって、一実施形態では、本発明の検出方法は、このＭＴＢｃに特異的な核酸配列の増幅に基づいている。
【００２７】
一実施形態では、順方向プライマーがハイブリダイズする標的核酸配列は、ＭＴＢ複合体のマイコバクテリアに特異的である。一実施形態では、逆方向プライマーがハイブリダイズする標的核酸配列は、ＭＴＢ複合体のマイコバクテリアに特異的である。
【００２８】
一実施形態では、順方向及び逆方向のプライマーの伸長により、ＭＴＢ複合体に特異的な核酸配列を含む増幅産物が得られる。
【００２９】
一実施形態では、ＭＴＢ複合体に特異的な核酸配列を含む増幅産物が検出される。
【００３０】
一実施形態では、順方向プライマーがハイブリダイズする標的核酸配列は、ＭＩＲＵ４反復エレメント（ＥＴＲＤ反復エレメントとしても知られる）内に位置しない。一実施形態では、逆方向プライマーがハイブリダイズする標的核酸配列は、ＭＩＲＵ４反復エレメント（ＥＴＲＤ反復エレメントとしても知られる）内に位置しない。一実施形態では、順方向プライマーも逆方向プライマーも、ＭＩＲＵ４反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズしない。一実施形態では、増幅産物は、ＭＩＲＵ４反復エレメントの核酸配列を含まない。
【００３１】
一実施形態では、ＭＩＲＵ反復エレメントは、ＭＩＲＵ２反復エレメント、ＭＩＲＵ１０反復エレメント、ＭＩＲＵ１６反復エレメント、ＭＩＲＵ２３反復エレメント、ＭＩＲＵ２４反復エレメント、ＭＩＲＵ２６反復エレメント、ＭＩＲＵ２７反復エレメント（ＱＵＢ５反復エレメントとしても知られる）、ＭＩＲＵ３１反復エレメント（ＥＴＲＥ反復エレメントとしても知られる）及びＭＩＲＵ３９反復エレメントから選択されるＭＩＲＵ反復エレメントに対して、少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性）を有する。
【００３２】
したがって、一実施形態では、順方向プライマーは、ＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズし、前記ＭＩＲＵ反復エレメントは、ＭＩＲＵ２反復エレメント、ＭＩＲＵ１０反復エレメント、ＭＩＲＵ１６反復エレメント、ＭＩＲＵ２３反復エレメント、ＭＩＲＵ２４反復エレメント、ＭＩＲＵ２６反復エレメント、ＭＩＲＵ２７反復エレメント（ＱＵＢ５反復エレメントとしても知られる）、ＭＩＲＵ３１反復エレメント（ＥＴＲＥ反復エレメントとしても知られる）及びＭＩＲＵ３９反復エレメントから選択されるＭＩＲＵ反復エレメントに対して、少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性）を有する。一実施形態では、前記標的核酸配列は、ＭＴＢ複合体のマイコバクテリアに特異的である。
【００３３】
一実施形態では、逆方向プライマーは、ＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズし、前記ＭＩＲＵ反復エレメントは、ＭＩＲＵ２反復エレメント、ＭＩＲＵ１０反復エレメント、ＭＩＲＵ１６反復エレメント、ＭＩＲＵ２３反復エレメント、ＭＩＲＵ２４反復エレメント、ＭＩＲＵ２６反復エレメント、ＭＩＲＵ２７反復エレメント（ＱＵＢ５反復エレメントとしても知られる）、ＭＩＲＵ３１反復エレメント（ＥＴＲＥ反復エレメントとしても知られる）及びＭＩＲＵ３９反復エレメントから選択されるＭＩＲＵ反復エレメントに対して、少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性）を有する。一実施形態では、前記標的核酸配列は、ＭＴＢ複合体のマイコバクテリアに特異的である。
【００３４】
例として、結核菌のＣＤＣ１５５１株のゲノムは、ＭＩＲＵ２座位に３個のタンデム反復エレメント、ＭＩＲＵ１０座位に５個のタンデム反復エレメント、ＭＩＲＵ１６座位に３個のタンデム反復エレメント、ＭＩＲＵ２３座位に５個のタンデム反復エレメント、ＭＩＲＵ２４座位に１個のタンデム反復エレメント、ＭＩＲＵ２６座位に５個のタンデム反復エレメント、ＭＩＲＵ２７／ＱＵＢ５座位に４個のタンデム反復エレメント、ＭＩＲＵ３１／ＥＴＲＥ座位に３個のタンデム反復エレメント、及びＭＩＲＵ３９座位に２個のタンデム反復エレメントを含む。
【００３５】
したがって、一実施形態では、順方向プライマーは、ＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズし、前記ＭＩＲＵ反復エレメントは、以下から選択されるＭＩＲＵ反復エレメント（結核菌のＣＤＣ１５５１株に関する）に対して、少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性）を有する：
ＭＩＲＵ２反復エレメント１、２及び３；
ＭＩＲＵ１０反復エレメント１、２、３、４及び５；
ＭＩＲＵ１６反復エレメント１、２及び３；
ＭＩＲＵ２３反復エレメント１、２、３、４及び５；
ＭＩＲＵ２４反復エレメント１；
ＭＩＲＵ２６反復エレメント１、２、３、４及び５；
ＭＩＲＵ２７／ＱＵＢ５反復エレメント１、２、３及び４（好ましくはＭＩＲＵ２７／ＱＵＢ５のタンデム反復エレメント２、３及び４）；
ＭＩＲＵ３１／ＥＴＲＥ反復エレメント１、２及び３（好ましくはＭＩＲＵ３１／ＥＴＲＥの反復エレメント２及び３）；並びに
ＭＩＲＵ３９反復エレメント１及び２。
【００３６】
一実施形態では、逆方向プライマーは、ＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズし、前記ＭＩＲＵ反復エレメントは、以下から選択されるＭＩＲＵ反復エレメント（結核菌のＣＤＣ１５５１株に関する）に対して、少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性）を有する：
ＭＩＲＵ２反復エレメント１、２及び３；
ＭＩＲＵ１０反復エレメント１、２、３、４及び５；
ＭＩＲＵ１６反復エレメント１、２及び３；
ＭＩＲＵ２３反復エレメント１、２、３、４及び５；
ＭＩＲＵ２４反復エレメント１；
ＭＩＲＵ２６反復エレメント１、２、３、４及び５；
ＭＩＲＵ２７／ＱＵＢ５反復エレメント１、２、３及び４（好ましくはＭＩＲＵ２７／ＱＵＢ５のタンデム反復エレメント２、３及び４）；
ＭＩＲＵ３１／ＥＴＲＥ反復エレメント１、２及び３（好ましくはＭＩＲＵ３１／ＥＴＲＥの反復エレメント２及び３）；並びに
ＭＩＲＵ３９反復エレメント１及び２。
【００３７】
一実施形態では、前記ＭＩＲＵ反復エレメントは、配列番号１〜２４（以下の表１に示す）から選択されるヌクレオチド配列又はその相補体に対して、少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む（かつそれからなり得る）。
【００３８】
【表１】
0005750369.tif 000002
0005750369.tif 000003
【００３９】
或いは、ＭＩＲＵ反復エレメントヌクレオチド配列のバリアントは、バリアントの配列と上記の表１に提供するリファレンスＭＩＲＵ反復エレメントヌクレオチド配列の配列番号との間で異なるヌクレオチドの数を列挙することによって定義し得る。したがって、一実施形態では、ＭＩＲＵ反復エレメントは、５個以下のヌクレオチドの位置、好ましくは４、３、２又は１個以下のヌクレオチドの位置が、配列番号１〜２４（又はその相補体）と異なるヌクレオチド配列を含む（かつそれからなり得る）。
【００４０】
一般に、逆方向プライマーは、標的核酸のコード（センス）鎖内の標的核酸配列とハイブリダイズするように設計されており、順方向プライマーは、標的核酸の相補的（すなわちアンチセンス）鎖内の標的核酸配列とハイブリダイズするように設計されている。
【００４１】
用語「核酸配列の相補体」とは、相補的なヌクレオチド配列を有し、リファレンスヌクレオチド配列と比較して逆方向の配向を有する核酸配列をいう。
【００４２】
順方向プライマーは、ＭＩＲＵ反復エレメントの配列内に位置する標的核酸配列（「順方向プライマー標的配列」）とハイブリダイズする。
【００４３】
一実施形態では、順方向プライマー標的配列の長さは、ＭＩＲＵ反復エレメントの１０〜４０個の連続したヌクレオチドの範囲、好ましくはＭＩＲＵ反復エレメントの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個の連続したヌクレオチド、好ましくはＭＩＲＵ反復エレメントの３８、３５、３２、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３又は２２個までの連続したヌクレオチドである。より好ましくは、順方向プライマー標的配列は、ＭＩＲＵ反復エレメントの１７〜２７個の連続したヌクレオチドの長さ、最も好ましくはＭＩＲＵ反復エレメントの約２２個の連続したヌクレオチドの長さを有する。
【００４４】
一実施形態では、順方向プライマー標的配列は、ＭＴＢ複合体のマイコバクテリアに特異的である。
【００４５】
逆方向プライマーは、ＭＩＲＵ反復エレメントの配列内に位置する標的核酸配列（「逆方向プライマー標的配列」）とハイブリダイズする。
【００４６】
一実施形態では、逆方向プライマー標的配列の長さは、ＭＩＲＵ反復エレメントの１０〜４０個の連続したヌクレオチドの範囲、好ましくはＭＩＲＵ反復エレメントの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチド、好ましくはＭＩＲＵ反復エレメントの３８、３５、３２、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０個までの連続したヌクレオチドである。より好ましくは、逆方向プライマー標的配列は、ＭＩＲＵ反復エレメントの１５〜２５個の連続したヌクレオチドの長さ、最も好ましくはＭＩＲＵ反復エレメントの約２０個の連続したヌクレオチドの長さを有する。
【００４７】
一実施形態では、逆方向プライマー標的配列は、ＭＴＢ複合体のマイコバクテリアに特異的である。
【００４８】
一実施形態では、順方向プライマーは、以下の表２に示す配列番号２５〜３９から選択されるヌクレオチド配列の相補体、又はそれに対して少なくとも９０％同一（好ましくは、それに対して９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％同一）であるヌクレオチド配列、又はその断片を含む（又はそれからなる）標的核酸配列とハイブリダイズする。
【００４９】
【表２】
0005750369.tif 000004
【００５０】
一実施形態では、配列番号２５〜２７、２９〜３１、３３〜３４若しくは３６〜３８（又は上記に定義したそのバリアント配列）の相補体の断片は、少なくともその１９、２０又は２１個の連続したヌクレオチドを有する。一実施形態では、配列番号２８（又は上記に定義したそのバリアント配列）の相補体の断片は、少なくともその１６、１７又は１８個の連続したヌクレオチドを有する。一実施形態では、配列番号３２、３５若しくは３９（又は上記に定義したそのバリアント配列）の相補体の断片は、少なくともその１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドを有する。
【００５１】
一実施形態では、逆方向プライマーは、配列番号４０〜４６（以下の表３に示す）から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％同一（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一）であるヌクレオチド配列、又はその断片を含む（又はそれからなる）標的核酸配列とハイブリダイズする。
【００５２】
【表３】
0005750369.tif 000005
【００５３】
一実施形態では、配列番号４０〜４６（又は上記に定義したそのバリアント配列）の断片は、少なくともその１７、１８又は１９個の連続したヌクレオチドを有する。
【００５４】
一実施形態では、順方向プライマーは、１５〜３０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個のヌクレオチドの長さ、好ましくは２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３又は２２個までのヌクレオチドの長さである。より好ましくは、順方向プライマーは、約２０〜２４個のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約２２個のヌクレオチドの長さである。
【００５５】
一実施形態では、逆方向プライマーは、１５〜３０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも１６、１７、１８、１９又は２０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０個までのヌクレオチドの長さである。より好ましくは、逆方向プライマーは、１８〜２２個のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約２０個のヌクレオチドの長さである。
【００５６】
一実施形態では、順方向プライマーは、配列番号２５〜３９（上記の表２に示す）から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の同一性（好ましくは少なくとも８２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む（又はそれからなる）。保存的置換が好ましい。
【００５７】
一実施形態では、順方向プライマーは、配列番号４７又は４８（以下の表４Ａに示す）から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の同一性（好ましくは少なくとも８２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む（又はそれからなる）。保存的置換が好ましい。
【００５８】
【表４】
0005750369.tif 000006
【００５９】
或いは、上記に提供した特定の順方向プライマー配列のバリアントは、バリアント配列と上記に提供した特定の順方向プライマーリファレンス配列の配列番号との間で異なるヌクレオチドの数を列挙することによって定義し得る。したがって、一実施形態では、順方向プライマーは、４個以下のヌクレオチドの位置、好ましくは３、２又は１個以下のヌクレオチドの位置が、配列番号２５〜３９又は４７〜４８と異なるヌクレオチド配列を含み得る（又はそれからなり得る）。保存的置換が好ましい。
【００６０】
上述の順方向プライマー配列（及び上記に定義したそのバリアント配列）の断片も用い得る。
【００６１】
一実施形態では、順方向プライマーは、配列番号２５〜３９、４７又は４８（及び上記に定義したそのバリアント配列）の断片を含み得る（又はそれからなり得る）。前記断片は、好ましくは少なくともその１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくともその１６、１７、１８、１９、２０又は２１個の連続したヌクレオチドを含む。
【００６２】
一実施形態では、逆方向プライマーは、上記の表３に示す配列番号４０〜４６から選択されるヌクレオチド配列の相補体に対して、少なくとも８０％の同一性（好ましくは８２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む（又はそれからなる）。保存的置換が好ましい。
【００６３】
一実施形態では、逆方向プライマーは、以下の表４Ｂに示す配列番号４９、５０又は５１から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の同一性（好ましくは８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列含む（又はそれからなる）。保存的置換が好ましい。
【００６４】
【表５】
0005750369.tif 000007
【００６５】
或いは、上記に提供した特定の逆方向プライマー配列のバリアントは、バリアント配列と上記に提供した特定の逆方向プライマーリファレンス配列の配列番号との間で異なるヌクレオチドの数を列挙することによって定義し得る。一実施形態では、逆方向プライマーは、４個以下のヌクレオチドの位置、好ましくは３、２又は１個以下のヌクレオチドの位置が、配列番号４９、５０若しくは５１（又は配列番号４０〜４６の相補体）と異なるヌクレオチド配列を含み得る（又はそれからなり得る）。この点において、保存的置換が好ましい。
【００６６】
上述の逆方向プライマー配列（及び上記に定義したそのバリアント配列）の断片も用い得る。
【００６７】
一実施形態では、逆方向プライマーは、配列番号４９〜５１の断片、又は配列番号４０〜４６（及び上記に定義したそのバリアント配列）の相補体の断片を含み得る（又はそれからなり得る）。前記断片は、好ましくは少なくともその１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくともその１６、１７、１８又は１９個の連続したヌクレオチドを含む。
【００６８】
本発明の順方向及び逆方向のプライマーは、Primer Express（Applied Biosystems社製）などの従来のソフトウェアを用いて、所望のパラメータの選択に基づいて標的核酸配列と結合するように設計されている。
【００６９】
順方向プライマーは、好ましくは配列特異的であり、好ましくはＭＩＲＵ反復エレメント内の標的核酸配列と特異的にハイブリダイズする。逆方向プライマーは、好ましくは配列特異的であり、好ましくはＭＩＲＵ反復エレメント内の標的核酸配列と特異的にハイブリダイズする。
【００７０】
用語「ハイブリダイズする」とは、用語「結合する」と等価かつ相互変換可能である。
【００７１】
結合条件は、高レベルの特異性がもたらされるものであることが好ましい。順方向及び逆方向のプライマーの融解温度（Ｔｍ値，melting temperature）は、好ましくは６８℃を超える温度であり、最も好ましくは約７２℃である。
【００７２】
一実施形態では、順方向及び逆方向のプライマーの配列間にはヌクレオチド配列の相補性の領域が存在する。これらの相補的な配列領域により、プライマーが相補的塩基対合によって互いにハイブリダイズして「プライマー二量体」を形成することが可能となる。一実施形態では、これらのプライマー−プライマーの二量体は、検出アッセイにおける内部コントロールを提供する。
【００７３】
一実施形態では、順方向及び逆方向のプライマー間には１〜１０個の相補的塩基が存在する。したがって、一実施形態では、順方向及び逆方向のプライマーは、１〜１０個の位置、好ましくは１〜１０個の連続したヌクレオチドの位置で相補的塩基対合を介して互いにハイブリダイズすることができる。一実施形態では、順方向及び逆方向のプライマーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の相補的塩基（好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の連続した相補的塩基）を有する。相補的塩基は、順方向及び逆方向のプライマー内の任意の場所、たとえば順方向及び逆方向のプライマーの３’末端付近に位置していてよい。一実施形態では、順方向及び逆方向のプライマーの３’末端に最も近い１〜１０個のヌクレオチドが相補的である。好ましくは、順方向及び逆方向のプライマーの３’末端に最も近い２、３、４、５又は６個のヌクレオチドが相補的であり、最も好ましくは、順方向及び逆方向のプライマーの３’末端に最も近い３個のヌクレオチドが相補的である。
【００７４】
一実施形態では、順方向及び逆方向のプライマーのプライマー−プライマーのハイブリダイゼーションにより、１５〜４５ｂｐの長さ、好ましくは少なくとも２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６ｂｐの長さ、好ましくは４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７又は３６ｂｐまでの長さの二量体が形成される。好ましくは、順方向プライマー−逆方向プライマーの二量体は、３０〜４０ｂｐの長さ、より好ましくは約３４〜３８ｂｐの長さ、最も好ましくは約３６ｂｐの長さである。
【００７５】
一実施形態では、順方向プライマー及び／又は逆方向のプライマーは、タグ又は標識を含む。一実施形態では、前記タグ又は標識は、プライマーを伸長した際に増幅産物内に取り込まれる。タグ又は標識は、好ましくは順方向及び／又は逆方向のプライマーの５’又は３’末端、最も好ましくは逆方向プライマーの５’末端に位置する。
【００７６】
適切な標識の例には、放射標識又は蛍光若しくは有色分子などの検出可能な標識が含まれる。例として、標識は、ジゴキシゲニン、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ，fluorescein-isothiocyanate）又はＲ−フィコエリスリンであり得る。標識は、写真用又はＸ線フィルムへの露光によるものなどの、直接検出されるレポーター分子であり得る。或いは、標識は、直接検出可能でないが、間接的に、たとえば２相系で検出し得る。間接標識検出の一例は、抗体と標識との結合である。
【００７７】
適切なタグの例には、ビオチン及びストレプトアビジンが含まれる。他の例示的なタグには、受容体、リガンド、抗体、抗原、ハプテン及びエピトープが含まれる。
【００７８】
試料は、好ましくは、痰、気管支肺胞洗浄液、気管吸引液、肺組織試料、脳脊髄液、考古学的試料などの臨床試料である（又は臨床試料に由来する）。
【００７９】
増幅は、当分野で知られている方法及びプラットフォーム、たとえば、リアルタイムＰＣＲ、遮断に基づいたＰＣＲなどのＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、ガラス毛管、ループ媒介等温増幅を含めた等温増幅方法、ローリングサークル増幅転写媒介増幅、核酸配列に基づいた増幅、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅、鎖置換増幅、等温複数置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマー等温増幅、及び環状ヘリカーゼ依存性増幅を用いて実施し得る。
【００８０】
一実施形態では、増幅は、任意の増幅プラットフォームを用いて実施することができる。したがって、本アッセイのこの実施形態の一利点は、これはプラットフォームに依存せず、どの特定の装置にも縛られないことである。
【００８１】
適切なポリメラーゼ並びにＤＮＡ前駆体（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）の存在下では、順方向及び逆方向のプライマーが５’から３’の方向で伸長され、それにより、標的ＭＴＢｃに特異的な核酸の個々の鎖に相補的な新しい核酸鎖の合成が開始される。その結果、プライマーがＭＴＢｃに特異的な核酸配列の増幅を駆動し、それにより前記ＭＴＢｃに特異的な核酸配列を含む増幅産物が得られる。当業者は、増幅を促進するための適切な条件を決定できるであろう。
【００８２】
本出願中、表現「増幅産物」、「増幅した核酸配列」及び「アンプリコン」は互換性があるように使用し、同じ意味を有する。
【００８３】
個々のＭＩＲＵ反復エレメントは、本明細書中で定義した順方向プライマーの標的配列及び本明細書中で定義した逆方向プライマーの標的配列を含む。
【００８４】
したがって、一態様では、順方向及び逆方向のプライマーは、同じＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズする。この態様によれば、順方向及び逆方向のプライマーの伸長により、その全体が前記個々のＭＩＲＵ反復エレメントに由来する（すなわち、その全体がそれ内に位置する）核酸配列を含む増幅産物が得られる。
【００８５】
純粋に例として、一実施形態では、順方向及び逆方向のプライマーはどちらも、ＭＩＲＵ１０反復エレメント１内のその標的核酸配列と結合することができる。これらのプライマーからの伸長により、その全体がＭＩＲＵ１０反復１に由来する核酸配列を含む増幅産物が得られる。
【００８６】
一実施形態では、増幅産物は、約３０〜５５個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５又は４４個までのヌクレオチドの長さである。より好ましくは、増幅産物は、４０〜５０個のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約４４個のヌクレオチドの長さである。
【００８７】
増幅の最初のサイクルのほとんどでは、順方向及び逆方向のプライマーは同じＭＩＲＵ反復エレメントとハイブリダイズし、したがって、上述のように、単一のＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する核酸配列が増幅される。
【００８８】
しかし、複数反復のＭＩＲＵ座位では、複数の反復配列が順方向プライマーの標的核酸配列及び逆方向プライマーの標的核酸配列をどちらも含む。したがって、それぞれの複数反復ＭＩＲＵ座位は、順方向及び逆方向のプライマーの複数の標的核酸配列を含む。
【００８９】
したがって、ＭＴＢ複合体マイコバクテリアのゲノムは、順方向プライマーの複数の標的核酸配列及び逆方向プライマーの複数の標的核酸配列を含む。
【００９０】
増幅の成功は、ハイブリダイズした順方向プライマーの、ハイブリダイズした逆方向プライマーに５’から３’の方向で向かう「下流」での伸長及び前記ハイブリダイズした逆方向プライマーの、前記順方向プライマーに５’から３’の方向で向かう「上流」での伸長によって起こる。すなわち、プライマーは互いに向かって伸長される。この点において、逆方向プライマー標的配列は、ハイブリダイズした順方向プライマーの３’末端が逆方向プライマー標的配列を指しており、かつ前記ハイブリダイズした順方向プライマーの５’から３’の伸長が逆方向プライマー標的配列に向かう方向である場合に、順方向プライマー標的配列の「下流」であると言われる。同様に、順方向プライマー標的配列は、ハイブリダイズした逆方向プライマーの３’末端が順方向プライマー標的配列を指しており、かつ前記ハイブリダイズした逆方向プライマーの５’から３’の伸長が順方向プライマー標的配列に向かう方向である場合に、逆方向プライマー標的配列の「上流」であると言われる。
【００９１】
一態様では、順方向及び逆方向のプライマーは、異なるＭＩＲＵ反復エレメント内に、同じＭＩＲＵ座位で位置する標的配列とハイブリダイズする。
【００９２】
図１に例示したように、５個の反復エレメントをタンデムで含むＭＩＲＵ座位は、順方向プライマーのハイブリダイゼーションのための５個の潜在的な標的核酸配列及び逆方向プライマーのハイブリダイゼーションのための５個の潜在的な標的核酸配列を含む。この点において、ＭＩＲＵ座位の反復４及び５は反復３の「下流」であり、ＭＩＲＵ座位の反復１及び２は反復３の「上流」である。
【００９３】
したがって、５個の反復座位の反復１とハイブリダイズした順方向プライマーは、反復１、２、３、４又は５とハイブリダイズした逆方向プライマーを用いた増幅のために対合する場合があり、その一方で、５個の反復座位の反復３とハイブリダイズした順方向プライマーは、反復３、４又は５とハイブリダイズした逆方向プライマーを用いた増幅のために対合する場合がある。
【００９４】
しかし、順方向プライマーは、さらに上流でハイブリダイズした逆方向プライマーを用いた増幅のために対合が成功することができない。この点において、５個の反復座位の反復３とハイブリダイズした順方向プライマー及び反復１又は２とハイブリダイズした逆方向プライマーは、互いから離れる逆の方向で伸長され、これは増幅の成功をもたらさない。
【００９５】
例として（図１に例示したように）、増幅は、５個の反復のＭＩＲＵ座位の第１の反復中のその標的核酸配列とハイブリダイズする順方向プライマーからの伸長及び５個の反復座位の第１、第２、第３、第４又は第５の反復中のその標的核酸配列とハイブリダイズする逆方向プライマーからの伸長によって起こり得る。
【００９６】
具体的には、増幅の成功は、順方向及び逆方向のプライマー標的核酸配列の以下の組合せを（同じＭＩＲＵ座位内で）用いることによって起こり得る：
【００９７】
【表６】
0005750369.tif 000008
0005750369.tif 000009
【００９８】
本発明のこの態様によれば、順方向及び逆方向のプライマーからの伸長により、同じ座位中の複数の隣接ＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる核酸配列が増幅される。したがって、本発明のこの態様によれば、増幅産物は、同じ座位中の複数の隣接ＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる核酸配列を含む。
【００９９】
一実施形態では、ハイブリダイズした順方向及び逆方向のプライマーの伸長により、座位中の２個の隣接ＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる核酸配列が増幅される。したがって、本実施形態によれば、増幅産物は、同じ座位中の２個の隣接ＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる核酸配列を含む。
【０１００】
一実施形態では、ハイブリダイズした順方向及び逆方向のプライマーの伸長により、座位中のすべてのＭＩＲＵ反復エレメントまでにまたがる（たとえば、座位中の少なくとも２、３、４又は５個のＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる）核酸配列が増幅される。したがって、本実施形態によれば、増幅産物は、座位中のすべてのＭＩＲＵ反復エレメントまでにまたがる（たとえば、座位中の少なくとも２、３、４又は５個のＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる）核酸配列を含む。
【０１０１】
例として、一実施形態では、順方向プライマーは、ＭＩＲＵ１０の反復１内のその標的配列と結合し、逆方向プライマーは、ＭＩＲＵ１０の反復２、３、４又は５内のその標的配列と結合する。これらのプライマーからの伸長により、ＭＩＲＵ１０の反復１及び２にまたがる核酸配列（逆方向プライマーがＭＩＲＵ１０の反復２内で結合する場合）、又はＭＩＲＵ１０の反復１、２及び３にまたがる核酸配列（逆方向プライマーがＭＩＲＵ１０の反復３内で結合する場合）、又はＭＩＲＵ１０の反復１、２、３及び４にまたがる核酸配列（逆方向プライマーがＭＩＲＵ１０の反復４内で結合する場合）、又はＭＩＲＵ１０の反復１、２、３、４及び５にまたがる核酸配列（逆方向プライマーがＭＩＲＵ１０の反復５内で結合する場合）が増幅される。
【０１０２】
一実施形態では、２個のＭＩＲＵ反復にまたがる増幅産物は、７０〜１２０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６又は９７個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約１１０、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８又は９７個までのヌクレオチドの長さである。最も好ましくは、２個のＭＩＲＵ反復にまたがる増幅産物は、９０〜１０５個の範囲のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約９７個のヌクレオチドの長さである。
【０１０３】
一実施形態では、３個のＭＩＲＵ反復にまたがる増幅産物は、１００〜２００個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５４、１５３、１５２、１５１又は１５０個までのヌクレオチドの長さである。最も好ましくは、２個のＭＩＲＵ反復にまたがる増幅産物は、１３５〜１６５個の範囲のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約１５０個のヌクレオチドの長さである。
【０１０４】
一実施形態では、４個のＭＩＲＵ反復にまたがる増幅産物は、１４５〜２４０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２又は２０３個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約２３５、２３０、２２５、２２０、２１５、２１０、２０９、２０８、２０７、２０６、２０５、２０４又は２０３個までのヌクレオチドの長さである。最も好ましくは、２個のＭＩＲＵ反復にまたがる増幅産物は、１８５〜２２５個の範囲のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約２０３個のヌクレオチドの長さである。
【０１０５】
一実施形態では、５個のＭＩＲＵ反復にまたがる増幅産物は、１８５〜３１０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５又は２５６個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、２７０、２６５、２６０、２５９、２５８、２５７又は２５６個までのヌクレオチドの長さである。最も好ましくは、２個のＭＩＲＵ反復にまたがる増幅産物は、２３５〜２８５個の範囲のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約２５６個のヌクレオチドの長さである。
【０１０６】
一態様では、順方向及び逆方向のプライマーは、異なるＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的配列とハイブリダイズする。
【０１０７】
一実施形態では、異なるＭＩＲＵ反復エレメントは、ＭＴＢｃマイコバクテリアのゲノム全体にわたって点在する様々なＭＩＲＵ座位内に位置する。本発明のこの態様によれば、順方向及び逆方向のプライマーからの５’から３’の伸長により、隣接ＭＩＲＵ座位のＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる核酸配列が増幅される。したがって、本発明のこの態様によれば、増幅産物は、隣接ＭＩＲＵ座位のＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる核酸配列を含む。
【０１０８】
一実施形態では、増幅産物は、２ｋｂを超える長さであってよく、５ｋｂを超える長さであってよく、さらには１０ｋｂを超える長さ（典型的には１１〜１２ｋｂの範囲の長さ）である、非常に大きな分子である。一実施形態では、増幅産物はコンカテマー分子である。
【０１０９】
これらのコンカテマー増幅産物の形成は、適切な増幅条件の選択によって促進し得る。
【０１１０】
例として、コンカテマー分子の形成は、プライマーと核酸とのハイブリダイゼーションを制限し、それによりすべての潜在的なプライマー標的配列がプライマーによって占有される可能性を低減させる増幅プロトコルを選択することによって、促進し得る。プライマーがそのすべての潜在的な標的核酸配列とハイブリダイズする確率を低減させることによって、単一のＭＩＲＵ反復配列内に位置する核酸配列が増幅される確率も低減される。
【０１１１】
したがって、一態様では、コンカテマー分子の形成は、飽和濃度以下のプライマーを用いることによって促進される。
【０１１２】
一態様では、コンカテマー分子の形成は、Ｔｍ値を上昇させることによって促進される。一実施形態では、アニーリングＴｍ値は伸長Ｔｍ値と実質的に同じである（たとえば約７２℃）。ＭＴＢｃ核酸はＧＣに非常に富むため、高いアニーリングＴｍ値の使用が有利である。高いＴｍ値（たとえば約７２℃）では、非常に少ない非特異的な伸長しか起こらない。
【０１１３】
一実施形態では、プライマー伸長に許容される時間が短縮される（たとえば、約２秒間、１．５秒間又はさらには１秒間まで）。プライマー伸長時間の短縮により、プライマー−プライマーの二量体のアーティファクトの発生も低減され得る。
【０１１４】
一態様では、コンカテマー分子の形成は、順方向及び／又は逆方向のプライマーの不完全な伸長を促進する増幅条件を選択することによって促進される。
【０１１５】
この点において、本発明者らは、プライマー伸長産物（特に変性した不完全／部分的なプライマー伸長産物）が、続く増幅の一巡において長いプライマーとして挙動し得ることを観察した。例として、３個のＭＩＲＵ反復にまたがる核酸配列を含む不完全な伸長産物は、２個のＭＩＲＵ反復を含有するＭＩＲＵ座位とアニーリングし、伸長されたプライマーとして作用し得る。不完全な伸長産物／長いプライマーの伸長によって得られた増幅産物は、４個のＭＩＲＵ反復又は５個のＭＩＲＵ反復（長いプライマーが、２個の反復のＭＩＲＵ座位中の第１又は第２のどちらのＭＩＲＵ反復と結合するかに依存する）にまたがるコンカテマー産物となる。
【０１１６】
一態様では（図２に例示）、順方向プライマーからの伸長産物（変性した部分的な伸長産物が含まれる）は、任意のＭＩＲＵ座位のＭＩＲＵ反復内の順方向プライマー標的配列とハイブリダイズし、伸長された順方向プライマーとして作用する。
【０１１７】
同様に、一態様では、逆方向プライマーからの伸長産物（変性した部分的な伸長産物が含まれる）は、任意のＭＩＲＵ座位のＭＩＲＵ反復内の逆方向プライマー標的配列とハイブリダイズし、伸長された逆方向プライマーとして作用する。
【０１１８】
したがって、これらの伸長されたプライマーの伸長によって産生されたコンカテマー増幅産物は、同じＭＩＲＵ座位及び／又は異なるＭＩＲＵ座位からの複数のＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する核酸配列を含み得る。
【０１１９】
検出ステップは、任意の既知の手段によって実施し得る。
【０１２０】
一態様では、増幅産物をタグ付け又は標識し、検出方法はタグ又は標識を検出するステップを含む。タグ又は標識は、好ましくは、増幅ステップ中に増幅産物内に取り込まれる。一実施形態では、順方向及び／又は逆方向のプライマーはタグ又は標識を含み、タグ又は標識は、プライマーが増幅ステップ中に伸長される際に増幅産物内に取り込まれる。タグ又は標識は、好ましくは順方向又は逆方向のプライマーの５’又は３’末端、最も好ましくは逆方向プライマーの５’末端に位置する。
【０１２１】
したがって、一実施形態では、増幅産物を標識し、アッセイは、標識を検出し（好ましくはプライマーを除去した後）、標識の存在を増幅産物の存在、したがってＭＴＢｃのマイコバクテリアの存在と相関させることを含む。標識は、放射標識又は蛍光若しくは有色分子などの検出可能な標識を含み得る。例として、標識は、ジゴキシゲニン、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はＲ−フィコエリスリンであり得る。標識は、写真用又はＸ線フィルムへの露光によるものなどの、直接検出されるレポーター分子であり得る。或いは、標識は、直接検出可能でないが、間接的に、たとえば２相系で検出し得る。間接標識検出の一例は、抗体と標識との結合である。
【０１２２】
一実施形態では、増幅産物をタグ付けし、アッセイは、タグを捕捉し（好ましくはプライマーを除去した後）、タグの存在を増幅産物の存在、したがってＭＴＢｃのマイコバクテリアの存在と相関させることを含む。一実施形態では、タグは、膜又は磁気ビーズなどの基質又は固体担体上に付着（たとえばコーティング）し得る捕捉分子を用いて捕捉する。
【０１２３】
磁気ビーズを用いた捕捉方法は、ビーズ（＋捕捉された、タグ付けされた増幅産物）は、当分野で知られている従来の技術を用いて試料から容易に濃縮及び分離することができるため、有利である。
【０１２４】
適切なタグの例には「相補体／抗相補体の対」が含まれる。用語「相補体／抗相補体の対」とは、適切な条件下で非共有結合した安定な対を形成する、同一でない部分を示す。たとえば、ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）が相補体／抗相補体の対のメンバーである。他の例示的な相補体／抗相補体の対には、受容体／リガンドの対、抗体／抗原（又はハプテン若しくはエピトープ）の対などが含まれる。続いて相補体／抗相補体の対の解離が望ましい場合、相補体／抗相補体の対は、好ましくは１０９Ｍ−１未満の結合親和性を有する。
【０１２５】
一実施形態では、タグはビオチン及びストレプトアビジンから選択される。この点において、ビオチンタグは、ビーズ（たとえば磁気ビーズ）又は膜などの基質又は支持体上にコーティングできるストレプトアビジンを用いて捕捉し得る。同様に、ストレプトアビジンタグは、ビーズ（たとえば磁気ビーズ）又は膜などの基質又は支持体上にコーティングできるビオチンを用いて捕捉し得る。タグと捕捉分子の他の例示的な対には、受容体／リガンドの対及び抗体／抗原（又はハプテン若しくはエピトープ）の対が含まれる。
【０１２６】
したがって、一実施形態では、増幅産物はビオチンタグを取り込み、検出ステップは、試料を、ビオチンをタグ付けした増幅産物を捕捉する、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズと接触させることを含む。その後、磁気ビーズ（＋捕捉された、タグ付けされた増幅産物）を試料から分離し、それにより増幅産物を試料から分離することができる。その後、増幅産物を任意の既知の手段によって検出することができる。
【０１２７】
一実施形態では、増幅産物の核酸配列を決定する。増幅産物の配列決定は、任意の既知の手段によって実施し得る。たとえば（ＤＮＡの標識されていない鎖を水酸化ナトリウムで融解して除去した後）、Trimgen Mutector（商標）検出システムなどの比色配列決定系を用い得る。
【０１２８】
一態様では、増幅産物は、プローブと増幅産物との間のハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で、試料をオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップと、ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップとを含む方法によって検出する。一実施形態では、プローブは増幅産物に特異的である。
【０１２９】
プローブは、好ましくは５〜３０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも６、７、８、９又は１０個のヌクレオチドの長さである。好ましくは、プローブは、２５個までのヌクレオチドの長さ、より好ましくは２０、１８、１６、１５、１４、１３、１２、１１又は１０個までのヌクレオチドの長さである。プローブは、より好ましくは８〜１２個のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約１０個のヌクレオチドの長さである。この点において、短いプローブの使用により、より速い標的核酸へのアニーリングが可能となる。
【０１３０】
プローブが増幅産物内でハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオチドの長さである。好ましくは、プローブの標的配列は、３０個までのヌクレオチドの長さ、より好ましくは２５、２０、１８、１６、１５、１４、１３、１２、又は１１個までのヌクレオチドの長さである。プローブの標的配列は、より好ましくは８〜１２個のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約１０個のヌクレオチドの長さである。
【０１３１】
一実施形態では、プローブはＰＮＡプローブである。
【０１３２】
プローブは、従来のソフトウェアを用いて、所望のパラメータの選択に基づいて増幅産物内のその標的配列とハイブリダイズするように設計されている。結合条件は、高レベルの特異性がもたらされるものであることが好ましい、すなわち、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションは「ストリンジェントな条件」下で起こる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ値，melting point）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍ値とは、標的配列の５０％が完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度である（定義されたイオン強度及びｐＨの下）。この点において、約０．０２Ｍ以下の塩濃度、ｐＨ７における本発明のプローブのＴｍ値は、好ましくは６０℃を超え、より好ましくは約７０℃である。
【０１３３】
事前に混合された結合溶液が入手可能であり（たとえば、CLONTECH Laboratories, Inc.社製EXPRESSHYBハイブリダイゼーション溶液）、ハイブリダイゼーションは製造者の指示にしたがって行うことができる。或いは、当業者はこれらの結合条件の適切な変形を考案することができる。
【０１３４】
自己相補性及び二量体形成（プローブ−プローブの結合）を最小限にするためにプローブをスクリーニングすることが好ましい。本発明の好ましいプローブは、ヒトＤＮＡと最小限の相同性を有するように選択する。選択プロセスは、候補プローブ配列をヒトＤＮＡと比較し、相同性が５０％よりも高い場合はプローブを拒絶することが含まれ得る。この選択プロセスの目的は、プローブと汚染ヒトＤＮＡ配列とのアニーリングを低減させ、それによりアッセイの特異性の向上を可能にすることである。
【０１３５】
一実施形態では、プローブの配列は、プローブがハイブリダイズする増幅産物の配列に対して１００％相補的である。或いは、一実施形態では、プローブ核酸の約３０％まで（好ましくは約２５、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％まで）が増幅産物の核酸配列と比較してミスマッチであっても、増幅産物の存在の検出が可能であり得る。
【０１３６】
一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、以下の表３に示す配列番号５２〜５７から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の同一性（好ましくは少なくとも８５、９０、９５又は１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む（かつそれからなる）。この点において、保存的置換が好ましい。
【０１３７】
【表７】
0005750369.tif 000010
【０１３８】
バリアントプローブ配列を定義するための代替手段は、バリアント配列とリファレンスプローブ配列との間で異なるヌクレオチドの数を定義することによる。したがって、一実施形態では、本発明のプローブは、２個以下のヌクレオチド、好ましくは１個以下のヌクレオチドによって配列番号５２〜５７と異なる核酸配列を含む（又はそれからなる）。この点において、保存的置換が好ましい。
【０１３９】
上述のプローブ配列の断片も用いてよく、断片は、配列番号５２〜５７の少なくとも８又は９個の連続したヌクレオチドを含む。したがって、一実施形態では、本発明のプローブは、配列番号５２〜５７（又は上記に定義したそのバリアント配列）の断片を含む（又はそれからなる）。前記断片は、好ましくは少なくともその８又は９個の連続したヌクレオチドを含む。
【０１４０】
結合後、ストリンジェント（好ましくは高度にストリンジェント）な条件下で洗浄することで、結合していないオリゴヌクレオチドが除去される。典型的なストリンジェントな洗浄条件には、０．１％のＳＤＳを含む０．５〜２×ＳＳＣの溶液中、５５〜６５℃で洗浄することが含まれる。典型的な高度にストリンジェントな洗浄条件には、０．１％のＳＤＳを含む０．１〜０．２×ＳＳＣの溶液中、５５〜６５℃で洗浄することが含まれる。当業者は、たとえば洗浄溶液中のＳＳＣをＳＳＰＥに置き換えることによって、等価な条件を容易に考案することができる。
【０１４１】
一実施形態では、プローブは標識を含む。したがって、一実施形態では、標識したプローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの後、標識は結合した増幅産物と関連づけられる。したがって、一実施形態では、アッセイは、標識を検出することと（好ましくは結合していないプローブを除去した後）、標識の存在を結合した増幅産物の存在、したがってＭＴＢｃのマイコバクテリアの存在と相関づけることとを含む。
【０１４２】
標識は、放射標識、蛍光分子、酵素マーカー又は色素原マーカー、たとえば、プローブのハイブリダイゼーションの際に目に見える色変化を生じる色素などの、検出可能な標識を含み得る。例として、標識は、ジゴキシゲニン、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はＲ−フィコエリスリンであり得る。標識は、写真用又はＸ線フィルムへの露光によるものなどの、直接検出されるレポーター分子であり得る。或いは、標識は、直接検出可能でないが、間接的に、たとえば２相系で検出し得る。間接標識検出の一例は、抗体と標識との結合である。
【０１４３】
一実施形態では、プローブはタグを含む。したがって、タグ付けしたプローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの後、タグは結合した増幅産物と関連づけられる。したがって、一実施形態では、アッセイは、タグを捕捉することと（好ましくは結合していないプローブを除去した後）、タグの存在を結合した増幅産物の存在、したがってＭＴＢｃのマイコバクテリアの存在と相関づけることとを含む。
【０１４４】
一実施形態では、タグは、膜又は磁気ビーズなどの基質又は固体担体上に付着（たとえばコーティング）し得る捕捉分子を用いて捕捉する。
【０１４５】
ビーズ（＋増幅産物と結合した、捕捉されたタグ付けしたプローブ）は、当分野で知られている従来の技術を用いて試料から容易に分離することができるため、磁気ビーズを用いた捕捉方法が有利である。
【０１４６】
適切なタグの例には、ビオチン及びストレプトアビジンが含まれる。この点において、ビオチンタグは、ビーズ（たとえば磁気ビーズ）又は膜などの基質又は支持体上にコーティングできるストレプトアビジンを用いて捕捉し得る。同様に、ストレプトアビジンタグは、ビーズ（たとえば磁気ビーズ）又は膜などの基質又は支持体上にコーティングできるビオチンを用いて捕捉し得る。タグと捕捉分子の他の例示的な対には、受容体／リガンドの対及び抗体／抗原（又はハプテン若しくはエピトープ）の対が含まれる。
【０１４７】
したがって、一実施形態では、プローブをビオチンでタグ付けし、検出ステップは、試料を、増幅産物と結合した、ビオチンをタグ付けしたプローブを捕捉する、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズと接触させることを含む。その後、磁気ビーズ（＋増幅産物と結合した、捕捉されたタグ付けしたプローブ）を試料から分離することによって、増幅産物を試料から分離する。その後、増幅産物を任意の既知の手段によって検出することができる。
【０１４８】
一態様では、プローブを支持体又はプラットフォーム上に固定する。プローブの固定によりプローブの物理的な位置が提供され、プローブを所望の位置に固定する及び／又はプローブの回収若しくは分離を容易にする役割を果たし得る。支持体は、たとえば、ビーズ（たとえば磁気ビーズ）などのガラス又はプラスチック製の強固な固体担体であり得る。或いは、支持体は、ナイロン又はニトロセルロース膜などの膜であり得る。また、たとえばポリアクリルアミド又はＰＥＧゲルなどの三次元マトリックスも、本発明で使用するための適切な支持体である。
【０１４９】
支持体／プラットフォームへの固定は、様々な従来の手段によって達成し得る。例として、ナイロン膜などの支持体上への固定は、ＵＶ架橋結合によって達成し得る。ビオチンで標識した分子（たとえばプローブ）をストレプトアビジンでコーティングした基質と結合させてよく（及びその逆）、アミノリンカーを用いて調製した分子をシラン化処理した表面上に固定し得る。プローブを固定する別の手段は、たとえば３’又は５’末端のポリＴテイル又はポリＣテイルを介するものである。
【０１５０】
一実施形態では、プローブは増幅産物とハイブリダイズするが、プライマー−プライマーの二量体の配列とはハイブリダイズしない。代替の実施形態では、プローブは、増幅産物に対するプローブの結合親和性と比較してより低い結合親和性で、プライマー−プライマーの二量体とハイブリダイズする。
【０１５１】
一実施形態では、プローブが増幅産物内でハイブリダイズする標的核酸配列は、プライマー二量体の配列中に存在しない。代替の実施形態では、プローブが増幅産物内でハイブリダイズする標的核酸配列がプライマー二量体の配列中に存在するが、プローブに対して接近可能性が乏しい、好ましくは接近不可能である。
【０１５２】
したがって、一実施形態では、プローブのハイブリダイゼーションにより、増幅産物をプライマー二量体と区別することが可能となる。
【０１５３】
一実施形態では、プローブが増幅産物内でハイブリダイズする標的核酸配列は、順方向及び逆方向のプライマーがハイブリダイズする標的核酸配列の間に位置するヌクレオチド配列を含む（又はそれからなる）。この標的核酸配列は、好ましくはプライマー二量体の配列中に存在しない（又はプローブに対して接近可能性が乏しい若しくは接近不可能である）。したがって、一実施形態では、プローブは、プライマー二量体とハイブリダイズしない（又は増幅産物と比較してより低い親和性でハイブリダイズする）。
【０１５４】
一実施形態では、プローブが増幅産物内でハイブリダイズする標的核酸配列は、GCGC、TCGC、GGGA、ATTC又はTTGCから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０１５５】
一態様では、増幅産物は二本鎖核酸分子であり、融解曲線の分析を含む方法によって検出される。融解曲線の分析とは、加熱中の二本鎖核酸（たとえばＤＮＡ）の解離特徴の評価である。融解曲線の分析は、図３、４、８及び１０〜１２に例示されている。一実施形態では、増幅産物は、９０〜９５℃の範囲、好ましくは９２〜９３℃の範囲、最も好ましくは約９２．５℃のＴｍを有する。
【０１５６】
また、融解曲線の分析を用いて増幅産物をプライマー二量体と区別することもできる。したがって、一実施形態では、プライマー二量体のＴｍは増幅産物のＴｍとは異なる。一実施形態では、プライマー二量体は、８２〜８９℃の範囲、好ましくは８４〜８８℃の範囲、最も好ましくは約８６℃のＴｍを有する。
【０１５７】
一態様では、増幅産物は、試料を、増幅産物を消化する酵素（制限エンドヌクレアーゼなど）と接触させるステップと、消化産物を同定するステップと含む方法によって検出される。
【０１５８】
この態様では、制限エンドヌクレアーゼは、増幅産物の配列内に位置する制限部位を認識する。
【０１５９】
また、制限エンドヌクレアーゼ消化は、増幅産物をプライマー二量体と区別するために用いることができる。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは増幅産物を消化するが、プライマー二量体を消化しない。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、増幅産物の配列内に位置するが、プライマー二量体の配列中に存在しない制限部位を認識する。或いは、制限部位がプライマー二量体の配列内に位置するが、制限エンドヌクレアーゼに対して接近可能性が乏しい又は接近不可能である。
【０１６０】
一実施形態では、増幅産物内の制限部位は、順方向及び逆方向のプライマーがハイブリダイズする標的核酸配列の間に位置する。この核酸配列は、好ましくはプライマー二量体の配列中に存在しない（又は制限エンドヌクレアーゼに対して接近可能性が乏しい若しくは接近不可能である）。
【０１６１】
一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、GCGC、TCGC、GCGA、CTTC、GAAG、GCAA、TTGC、CTTT又はAAAGから選択される標的配列を認識して切断する。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼはHhaIである。
【０１６２】
したがって、一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは増幅産物を消化するが、プライマー二量体を消化しない。本実施形態では、消化産物の存在により、増幅産物が存在することが確認され、したがってＭＴＢｃマイコバクテリアの存在が確認される。対照的に、消化産物の非存在により、増幅産物が存在しないことが確認され、したがってＭＴＢｃマイコバクテリアの非存在が確認される。
【０１６３】
代替の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、異なる位置であるが、増幅産物及びプライマー二量体の両方を消化する。本実施形態では、制限エンドヌクレアーゼの制限部位は、異なる位置であるが、増幅産物及びプライマー二量体の両方中に存在する。したがって、増幅産物の消化産物及びプライマー二量体の消化産物は異なり、互いに区別し得る。
【０１６４】
消化産物は、任意の既知の手段によって、たとえば、上述の検出技術のいずれかを含む方法によって検出し得る。
【０１６５】
一実施形態では、増幅産物の消化産物は、その大きさによって、たとえばゲル電気泳動を含む方法によって検出される（及び／又はプライマー二量体、若しくはその消化産物と区別される）。
【０１６６】
一実施形態では、増幅産物の消化産物は、１５〜２７個のヌクレオチドの範囲の長さ、好ましくは少なくとも１６、１７、１８、１９又は２０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは２６、２５又は２４個までのヌクレオチドの長さである。好ましくは、消化産物は、２０〜２５個の範囲のヌクレオチドの長さ、より好ましくは約２１、２２又は２３個のヌクレオチドの長さである。
【０１６７】
本発明の方法により、決定するマイコバクテリア量の定量的推定が可能となる。ＭＴＢｃマイコバクテリア量の決定には、臨床的指針のため、並びに治療の決定、患者管理及びワクチン有効性の評価のためなどの、多くの有用な適用がある。
【０１６８】
一態様では、検出された増幅産物の量の測定により、試料中のＭＴＢｃ核酸の量の定量が可能となる。
【０１６９】
一実施形態では、増幅産物を標識し、増幅産物の量は、標識を検出し、標識の量を測定することによって測定する。一実施形態では、増幅産物をタグ付けし、増幅産物の量は、タグを捕捉し、捕捉されたタグの量を測定することによって定量する。
【０１７０】
一実施形態では、増幅産物をオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ、プローブ−増幅産物のハイブリダイゼーション複合体の量を測定することによって、増幅産物の量を測定する。一実施形態では、プローブをタグ付け又は標識し、標識を検出する又はタグを捕捉することによってプローブ−増幅産物のハイブリダイゼーション複合体の量を測定し、標識又は捕捉されたタグの量を測定する。
【０１７１】
一実施形態では、増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、増幅産物の消化産物を検出し消化産物の量を測定することによって増幅産物の量を測定する。
【０１７２】
したがって、一態様では、本発明は、所望の試料中のＭＴＢｃマイコバクテリア量（たとえば結核菌の量又はウシ型結核菌の量）を定量するためのインビトロの方法であって、（ａ）本発明による検出方法を前記所望の試料に対して実施するステップと、（ｂ）前記方法を、予め定められた既知のＭＴＢマイコバクテリア量の試験試料に対して実施するステップと、（ｃ）所望の試料から検出された増幅産物の量を、試験試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、それにより、所望の試料中のＭＴＢｃマイコバクテリア量を定量する方法を提供する。
【０１７３】
別の態様では、本発明の方法は、一定期間にわたる結核菌又はウシ型結核菌などのＭＴＢｃマイコバクテリアの治療経過、たとえば、ワクチン療法などの薬物療法経過の有効性の決定に有用である。
【０１７４】
したがって、一態様では、本発明は、薬物療法の期間中の抗ＭＴＢｃマイコバクテリア薬（抗結核菌薬又は抗ウシ型結核菌薬）の有効性を決定するためのインビトロの方法であって、（ａ）本発明による検出方法を、薬物療法の期間内又は期間前の第１の時点に得られた第１の試料に対して実施するステップと、（ｂ）前記方法を、薬物療法の期間内又は期間後の１又は複数の後の時点に得られた１又は複数の試料に対して実施するステップと、（ｃ）第１の試料から検出された増幅産物の量を、１又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、それにより、薬物療法の期間中の薬物有効性を決定する方法を提供する。
【０１７５】
一実施形態では、１又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量が、第１の試料から検出された増幅産物の量と比較して減少していることにより、ＭＴＢｃマイコバクテリアに対する薬物の有効性が示される。
【０１７６】
別の態様では、本発明は、結核菌又はウシ型結核菌などのＭＴＢｃマイコバクテリアの感染症に対するワクチンの有効性の決定に有用である。
【０１７７】
したがって、一態様では、本発明は、ＭＴＢｃマイコバクテリアに対するワクチンの有効性を決定するためのインビトロ方法であって、（ａ）本発明による検出方法を、ワクチン接種前の第１の時点に患者から得た第１の試料に対して実施するステップと、（ｂ）前記方法を、ＭＴＢｃマイコバクテリアを用いたワクチン接種及び追加接種後の１又は複数の後の時点に前記患者から得た試料に対して実施するステップと、（ｃ）第１の試料から検出された増幅産物の量を、１又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、それにより、ワクチンの有効性を決定する方法を提供する。
【０１７８】
一実施形態では、１又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量が、第１の試料から検出された増幅産物の量と比較して減少していることにより、ＭＴＢｃマイコバクテリア感染症（たとえば結核菌感染症又はウシ型結核菌感染症）に対するワクチンの有効性が示される。
【０１７９】
また、本発明は、本発明の上述の方法で使用するための、順方向プライマー、逆方向プライマー、プローブ、その組合せなどの試薬、及び前記試薬を含むキットも提供する。
【０１８０】
一実施形態では、順方向及び／又は逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、完全長ＭＩＲＵ反復エレメント又はその相補体の核酸配列全体を含まない、又はそれからならない。
【０１８１】
一態様では、本発明は、ＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズする順方向オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。一実施形態では、前記標的核酸配列は、配列番号２５〜３９から選択されるヌクレオチド配列の相補体に対して、少なくとも９０％同一（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一）であるヌクレオチド配列、又は上記に定義したその断片を含む（又はそれからなる）。一実施形態では、前記標的核酸配列は、ＭＴＢ複合体のマイコバクテリアに特異的である。
【０１８２】
一実施形態では、順方向プライマーは、配列番号４７又は４８から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の同一性（好ましくは８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む（又はそれからなる）。
【０１８３】
一実施形態では、順方向プライマーは、配列番号４７若しくは４８（又は上記に定義したそのバリアント配列）の断片を含み（又はそれからなり）、前記断片は、少なくともその１５個の連続したヌクレオチドを含む。好ましくは、前記断片は、少なくともその１６、１７、１８、１９、２０又は２１個の連続したヌクレオチドを含む。
【０１８４】
一態様では、本発明は、ＭＩＲＵ反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズする逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。一実施形態では、前記標的核酸配列は、配列番号４０〜４６から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％同一（好ましくは９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一）であるヌクレオチド配列を含む（又はそれからなる）。一実施形態では、前記標的核酸配列は、ＭＴＢ複合体のマイコバクテリアに特異的である。
【０１８５】
一実施形態では、逆方向プライマーは、配列番号４９〜５１から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の同一性（好ましくは８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列、又は上記に定義したその断片を含む（又はそれからなる）。
【０１８６】
一実施形態では、逆方向プライマーは、配列番号４９、５０若しくは５１（又は上記に定義したそのバリアント配列）の断片を含み（又はそれからなり）、前記断片は、少なくともその１５個の連続したヌクレオチドを含む。好ましくは、前記断片は、少なくともその１６、１７、１８又は１９個の連続したヌクレオチドを含む。
【０１８７】
一実施形態では、順方向プライマー及び／又は逆方向のプライマーは、上述のようにタグ又は標識を含む。
【０１８８】
本発明は、上記に定義した順方向プライマー及び上記に定義した逆方向プライマーを含む、一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに提供する。
【０１８９】
また、本発明は、上記に定義した一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、試料中のＭＴＢ複合体に属するマイコバクテリアを検出するためのキットも提供する。キットは、ＭＴＢ複合体に特異的な核酸配列を増幅するための試薬を含んでいてもよい。キットは、増幅産物を検出するための試薬を含んでいてもよい。
【０１９０】
一実施形態では、増幅産物を検出するための試薬は、前記増幅産物とハイブリダイズする上述のオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【０１９１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの配列は、完全長ＭＩＲＵ反復エレメント又はその相補体の核酸配列全体を含まない、又はそれからならない。
【０１９２】
一実施形態では、前記プローブは、配列番号５２〜５７から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の同一性（好ましくは少なくとも８５、９０、９５又は１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列、又は少なくともその８若しくは９個の連続したヌクレオチドを有するその断片を含む（又はそれからなる）。
【０１９３】
一実施形態では、プローブは、上述のタグ又は標識を含む。
【０１９４】
一実施形態では、増幅産物を検出するための試薬は、上述のように増幅産物を消化する制限エンドヌクレアーゼ（HhaIなど）などの酵素を含む。
【０１９５】
以下に記載する実施例及び図面によって本発明をさらに詳述する。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】複数の順方向及び逆方向のプライマー標的配列並びに５個までの隣接ＭＩＲＵ反復エレメントにまたがる核酸配列を含む増幅産物の形成の詳細を示す、同じＭＩＲＵ座位の５個までの隣接ＭＩＲＵ反復エレメントの増幅を例示する図である。
【図２】複数のＭＩＲＵ反復エレメントからの核酸配列のコンカテマー形成を含む増幅産物の生成を例示する図である。
【図３−４】融解曲線を例示する図である。蛍光を融解温度（Ｔｍ）に対して測定する。陰性試料＝８６℃の融点、陽性試料＝９２℃の融点。図３は、８個の陽性融解を用いた、低顕微鏡観察試料（１ｍｌの痰当たり約３０〜１０００個の細菌）からの融解曲線である。
【図５】リアルタイムＰＣＲによって得られた産物のアガロースゲル分析を例示する図である。レーン７は、約１１Ｋｂのコンカテマーを例示する。符号は以下のとおりである。                                                                    レーン    １      ２        ３        ４      ５      ６        ７      ８         ニート  １０−６  １０−５  １０−４  陰性  １０−２  １０−１  陰性 Ｔｍ    92.6     86.5      92.9      93.2    86.2    92.6     92.6    86.11 Ｃｔ    16.7     34.6      33.2      30.1    36.0    23.7     20.3    35.1
【図６】（遮断に基づいた）痰のアンプリコンの消化を例示する図である。符号は以下のとおりである。  レーン１＝痰ａ：１〜１０個のロッドＴｂ  レーン２＝痰ｂ：９０個のロッドＴｂを超える  レーン３＝痰ｃ：９０個のロッドＴｂを超える  レーン４＝痰ｄ：１〜１０個のロッドＴｂ  レーン５＝マイコバクテリウム・マルモエンス（M. malmoense）（１〜１０個のロッド）  レーン６＝マイコバクテリウム・ケロネー（M. chelonae）（１０〜９０個のロッド）  レーン７＝Ｈ３７Ｒ  ＤＮＡ  レーン８＝陰性  レーン９＝消化したＰＧｅｍ  レーン１０＝痰ｂ、非消化  レーン１１＝ＰＧｅｍ、非消化
【図７】痰のアンプリコンの消化を例示する図である。符号は以下のとおりである。  レーン１＝痰６４４４  レーン２＝痰ｂ  レーン３＝痰ｃ  レーン４＝痰ｄ  レーン５＝陰性（プライマー二量体）  レーン６＝非消化６４４４  レーン７＝ＰＧｅｍ、消化  レーン８＝ＰＧｅｍ、非消化
【図８】低陽性顕微鏡観察痰試料の融解ピーク及び増幅曲線のデータを例示する図である（プレートは５０％の陰性、５０％の陽性を含む）：７２℃のアニーリングを１秒間、傾斜速度１℃／秒、（伸長なし）。
【図９】Ｔｍに対するＣｔ（産物が検出されるために十分な量で蓄積され始めるサイクル数）を例示する図である。
【図１０−１２】３つの別個のアッセイにおいて低顕微鏡観察陽性痰から得られた融解曲線を例示する図である。
【図１３】ウシ型結核菌ＰＣＲ産物の電気泳動を例示する図である。符号は以下のとおりである。  レーン１：低分子量ラダー  レーン２：ウシ型結核菌「６２」  レーン３：ウシ型結核菌「６４」  レーン４：ウシ型結核菌「６５」  レーン５：陰性対照  レーン６：Ｍｔｂ陽性対照  レーン７：低分子量ラダー
【図１４】ウシ型結核菌産物の制限エンドヌクレアーゼ消化を例示する図である。符号は以下のとおりである。  レーン１：低分子量ラダー  レーン２：ウシ型結核菌「６２」、消化  レーン３：ウシ型結核菌「６２」、非消化  レーン４：ウシ型結核菌「６４」、消化  レーン５：ウシ型結核菌「６４」、非消化  レーン６：ウシ型結核菌「６５」、消化  レーン７：ウシ型結核菌「６５」、非消化  レーン８：陰性対照、消化  レーン９：陰性対照、非消化  レーン１０：ＰＧｅｍベクター対照、消化  レーン１１：ＰＧｅｍベクター対照、非消化  レーン１２：低分子量ラダー
【図１５】約８６℃のＴｍを有するすべての陰性対照及び約９３．５℃の陽性Ｔｍを有するすべてのウシ型結核菌試料を示す融解曲線を例示する図である。
【図１６】ウシ型結核菌パネルの融解曲線のデータを異なる様式で例示し、ｃｔ（産物が検出されるために十分な量で蓄積され始めるサイクル数）を示す図である。
【０１９７】
［実施例］
【実施例１】
【０１９８】
結核菌：増幅
痰試料は、英国のニューカスル地域ＨＰＡ研究所（Newcastle Regional HPA laboratory）、王立ロンドン病院（Royal London Hospital）の両方から寄付されたものである。
【０１９９】
国家標準の操作手順プロトコルを用いて痰を処理した。すべての試料は、カテゴリーIII実験室のクラスＩキャビネット内で処理した。１ｍｌの痰を１０５℃まで１０分間加熱し、実験室外に取り出す前にはチューブの外側を消毒した。
【０２００】
以下のプライマーがMWGEurofins Ltd.から合成されている：
Ｍｔｂ  ｄｅｔ逆方向：5' CGC CGG CGA CGA TGC AGA GC 3'
Ｍｔｂ  ｄｅｔ順方向：5' GGC GCC GCT CCT CCT CAT CGC T 3'
【０２０１】
遮断に基づいた方法：
ＰＣＲ反応混合物は、２５μｌのReadyMix（商標）（最終濃度：１．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ）（Sigma社製、英国）、５ｐｍｏｌの逆方向プライマー、５ｐｍｏｌの順方向プライマー（MWGEurofins社製、英国）、２００ｎｇの鋳型ＤＮＡ又は１μｌの失活痰、及び合計５０μｌまでのヌクレアーゼ非含有水からなっていた。
【０２０２】
Applied Biosystems社製の９７００熱サイクラーのＰＣＲサイクリングパラメータは以下のとおりであった：９５℃で１２分間、続いて４５サイクルの９４℃で３０秒間、６４℃で１分間、及び７２℃で２分間。
【０２０３】
リアルタイム方法：
ＰＣＲ反応混合物は、１０μｌの２×Lightcycler 480（登録商標）SYBR green Iマスターミックス（FastStartＴａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、SYBR green I色素、及び３．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有）、０．５μＭの順方向及び逆方向のプライマーを両方、５μｌの鋳型ＤＮＡ及び並びに合計２０μｌまでのヌクレアーゼ非含有水からなっていた。
【０２０４】
Roche社製のLightcycler 480（LC480）のＰＣＲサイクリングパラメータは以下のとおりであった：９５℃で１２分間、続いて４５サイクルの９５℃で１０秒間、６４℃で１秒間、及び７２℃で１分間。傾斜速度は、それぞれ４．４、２．２、及び４．４℃／秒であった。
【０２０５】
代替ＰＣＴサイクリングパラメータには、別のアニーリング温度が含まれない：９５℃で１２分間の初期変性後（４．４℃／秒の傾斜）、リアルタイムサイクリングパラメータは、４５サイクルの９５℃で１０秒間、７２℃で１秒間、傾斜速度は１秒当たり１℃であった。
【実施例２】
【０２０６】
結核菌：ＰＣＲ産物の分析
遮断に基づいた分析
ＰＣＲ産物は、１．５％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル（Invitrogen社製、英国）中の電気泳動（６５Ｖで１２０分間）によって分析した。ゲルを２００ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液（Invitrogen社製）中の２０μｌのSYBR green I核酸ゲル染色（１０，０００×；Sigma Aldrich社製、英国）で３０分間染色し、紫外線照射（BioRad社製）によって可視化した。
【０２０７】
反復エレメントの性質が原因で、プライマーはゲル上に大きな非特異的なスメアを形成する増幅産物をもたらした。
【０２０８】
図１に例示したように、増幅産物は単一のＭＩＲＵ反復エレメントに由来する場合があり（両方のプライマーも同じ反復エレメント内で結合した場合）、この場合、増幅産物は約４４ｂｐとなる。
【０２０９】
或いは、増幅産物は同じ座位内のいくつかの隣接ＭＩＲＵ反復エレメントに由来する場合があり、この場合、増幅産物は約６８０ｂｐであり得る（１３個のコピーのエレメントを有する座位の場合）。
【０２１０】
しかし、アガロースゲル電気泳動によって判断して、はるかにより大きな産物／コンカテマーの増幅の証拠が存在する。図２中に図示するように、反応中の初期産物が追加のプライマーとして作用し、はるかにより大きな産物（１２Ｋｂを超えるもの）の形成を許容していることが仮定される。
【０２１１】
したがって、産物を様々な方法によってさらに特徴づけした。
【０２１２】
図５を参照すると、ゲル写真は１１Ｋｂを超えるコンカテマーを示す。Hhalで消化した後、この大きな産物は予測された小断片へと分解される。図６及び７を参照されたい。
【０２１３】
陰性試料（プライマー二量体）は、約４０ｂｐの大きさのバンドを形成した。産物の大きさは、１Ｋｂのラダー（Promega社製、英国）と直接比較することによって決定した。
【０２１４】
リアルタイム分析
増幅曲線は、LC480ソフトウェアから導いたAbsolute Quantification/2nd Derivative Maxの方法によって分析した。融解曲線の分析は、LC480ソフトウェア内のNegative first derivative（−ｄＦ／ｄＴ）の方法を用いて自動的に行った。
【０２１５】
融解曲線のプロトコルは以下のとおりである：９９℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、及び最後に９９℃まで再加熱、１℃あたり５個のデータを獲得。傾斜速度は、それぞれ４．４及び２．２℃／秒であった。
【０２１６】
図３、４、８及び１０〜１２に例示した結果は異なる痰試料からのものである。結果は、陰性（プライマー二量体）は約８６℃で融解する一方で、増幅産物は約９１℃で融解することを示している。
【０２１７】
図９の表は、融解曲線のデータを異なる様式で表し、ｃｔ（産物が検出されるために十分な量で蓄積され始めるサイクル数）を示す。
【実施例３】
【０２１８】
ウシ型結核菌：増幅
約２００ｎｇの抽出したウシ型結核菌のＤＮＡを、以下のリアルタイムＰＣＲにおいて鋳型として使用した。
【０２１９】
以下のプライマーがMWGEurofins Ltd.から合成されている：
Ｍｔｂ  ｄｅｔ逆方向：5' CGC CGG CGA CGA TGC AGA GC 3'
Ｍｔｂ  ｄｅｔ順方向：5' GGC GCC GCT CCT CCT CAT CGC T 3'
【０２２０】
リアルタイム方法：
ＰＣＲ反応混合物は、１０μｌの２×Lightcycler 480（登録商標）SYBR green Iマスターミックス（FastStartＴａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、SYBR green I色素、及び３．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有）、０．５μＭの順方向及び逆方向のプライマーを両方、２００ｎｇの鋳型ＤＮＡ並びに合計２０μｌまでのヌクレアーゼ非含有水からなっていた。
【０２２１】
Roche社製のLightcycler 480（LC480）で使用した代替ＰＣＲサイクリングパラメータは以下のとおりであった：９５℃で１２分間、続いて４５サイクルの９５℃で１０秒間及び７２℃で１秒間。傾斜速度は、それぞれ４．４及び１．０℃／秒であった。
【実施例４】
【０２２２】
ウシ型結核菌：ＰＣＲ産物の分析
ＰＣＲ産物は、２．０％のＥＧｅｌ（Invitrogen社製、英国）中の電気泳動（６５Ｖで３０分間）によって分析した。ゲルは、紫外線照射（BioRad社製）によって可視化した。
【０２２３】
陰性試料（プライマー二量体）は約４０ｂｐの大きさのバンドを形成した。
【０２２４】
反復エレメントの性質が原因で、プライマーはゲル上に大きな非特異的なスメアを形成する増幅産物をもたらした（図１３を参照）。アガロースゲル電気泳動によって判断して、増幅産物は大きなコンカテマーとして現れる。反応中の初期産物が追加のプライマーとして作用し、はるかにより大きな産物（１２Ｋｂを超えるもの）の形成を許容していることが仮定される。
【０２２５】
ＰＣＲ産物を様々な方法によってさらに特徴づけした。図１４を参照すると、ゲル写真は、それぞれ、消化していないウシ型結核菌ＰＣＲ産物を、１１Ｋｂを超えるコンカテマーとして示す。Hhalで消化した後、この大きな産物は予測された小断片へと分解される。
【０２２６】
リアルタイム分析
増幅曲線は、LC480ソフトウェアから導いたAbsolute Quantification/2nd Derivative Maxの方法によって分析した。融解曲線の分析は、LC480ソフトウェア内のNegative first derivative（−ｄＦ／ｄＴ）方法を用いて自動的に行った。
【０２２７】
融解曲線のプロトコルは以下のとおりである：９９℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、及び最後に９９℃まで再加熱、１℃あたり５個のデータを獲得。傾斜速度は、それぞれ４．４及び２．２℃／秒であった。
【０２２８】
図１５に例示した結果はウシ型結核菌試料からのものである。これらは、陰性（プライマー二量体）は約８６℃で融解する一方で、増幅産物は約９３．５℃で融解することを示している。
【０２２９】
図１５に例示した結果を、以下に個々の融解温度として示す。
【０２３０】
ウシ型結核菌パネルのＴｍ（融解温度）値
位置        名称          Ｔｍ１        Ｔｍ２
Ａ１    ウシ型結核菌        ６２          ９３．７４
Ａ２    ウシ型結核菌        ６２          ９４．２３
Ａ３    ウシ型結核菌        ６４          ９３．６３
Ａ４    ウシ型結核菌        ６５          ９３．６５
Ａ５    ウシ型結核菌        ６５ニート    ９３．１０
Ａ６    Ｍｔｂ陽性対照                    ９３．１１
Ｂ１    ウシ型結核菌        ６２          ９３．５８
Ｂ２    ウシ型結核菌        ６２          ９３．４７
Ｂ３    ウシ型結核菌        ６４          ９３．５７
Ｂ４    ウシ型結核菌        ６５          ９３．４５
Ｂ５    陰性対照                          ８５．９６
Ｂ６    Ｍｔｂ陽性対照                    ９３．７９
Ｃ１    ウシ型結核菌        ６２          ９３．６３
Ｃ２    ウシ型結核菌        ６４          ９３．６２
Ｃ３    ウシ型結核菌        ６４          ９３．２４
Ｃ４    ウシ型結核菌        ６５          ９３．５１
Ｃ５    陰性対照                          ８５．７６
Ｄ１    ウシ型結核菌        ６２          ９３．６９
Ｄ２    ウシ型結核菌        ６４          ９３．２３
Ｄ３    ウシ型結核菌        ６４          ８６．１９
Ｄ４    ウシ型結核菌        ６５          ９３．５４
Ｄ５    陰性対照                          ８５．９２
Ｅ１    ウシ型結核菌        ６２          ９３．５９
Ｅ２    ウシ型結核菌        ６４          ９３．９７
Ｅ３    ウシ型結核菌        ６５          ９３．７２
Ｅ４    ウシ型結核菌        ６５          ９３．８５
Ｅ５    陰性対照                          ８５．８９
Ｆ１    ウシ型結核菌        ６２          ９３．５６
Ｆ２    ウシ型結核菌        ６４          ９３．２０
Ｆ３    ウシ型結核菌        ６５          ９３．４８
Ｆ４    ウシ型結核菌        ６５          ９３．４４
Ｆ５    陰性対照                          ８５．８５
Ｇ１    ウシ型結核菌        ６２          ９３．６３
Ｇ２    ウシ型結核菌        ６４          ９３．１０
Ｇ３    ウシ型結核菌        ６５          ９３．３６
Ｇ４    ウシ型結核菌        ６２ニート    ９２．９４
Ｇ５    陰性対照                          ８５．７６
Ｈ１    ウシ型結核菌        ６２          ９３．７６
Ｈ２    ウシ型結核菌        ６４          ９３．１８
Ｈ３    ウシ型結核菌        ６５          ９３．９３
Ｈ４    ウシ型結核菌        ６４ニート    Ｎ／Ａ
Ｈ５    陰性対照                          ８６．１０
【０２３１】
図１６の表は、ウシ型結核菌パネルの融解曲線のデータを異なる様式で表し、ｃｔ（産物が検出されるために十分な量で蓄積され始めるサイクル数）を示す。
（参考文献）
Dye C. et al. (2005) JAMA Vol. 293: 2767-2775
Kamerbeek J. et al., (1997) J. Clin. Microbiol. Vol. 35: 907-914
Kent P.T. and Kubica G.P. (1985) Public health mycobacteriology: A guide for the level III laboratory. Atlanta: Department of Health and Human Services
Poulet S. and Cole S. T. (1995) Arch. Microbiol., Vol. 163: 79-86
Supply P. et al., J. Clin. Microbiol. Vol. 39, No. 10: 3563-3571
Thierry D. et al., J. Clin. Microbiol. Vol. 28, No. 12: 2668-2673
Yuen K.Y. et al. (1995) J Clin Pathol. Vol. 48(10): 924-928
【図１】
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【図２】
0005750369.tif 000012
【図３】
0005750369.tif 000013
【図４】
0005750369.tif 000014
【図５】
0005750369.tif 000015
【図６】
0005750369.tif 000016
【図７】
0005750369.tif 000017
【図８Ａ】
0005750369.tif 000018
【図８Ｂ】
0005750369.tif 000019
【図８Ｃ】
0005750369.tif 000020
【図９】
0005750369.tif 000021
【図１０】
0005750369.tif 000022
【図１１】
0005750369.tif 000023
【図１２】
0005750369.tif 000024
【図１３】
0005750369.tif 000025
【図１４】
0005750369.tif 000026
【図１５】
0005750369.tif 000027
【図１６】
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【配列表】
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