(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーランチオキトリウムから脂質を抽出した後の脂質抽出残渣に対して、１８０℃乃至２３０℃で１０分乃至８０分間の熱水処理を行い、その処理物から液体成分の一部または全部を回収することを特徴とする藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法。
【請求項２】
請求項１記載の藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた前記液体成分を使用して、藻類の培養を行うことを特徴とする藻類の培養方法。
【請求項３】
請求項１記載の藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた前記液体成分を使用して、オーランチオキトリウムを培養することを特徴とする藻類の培養方法。
【請求項４】
請求項１記載の藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた前記液体成分を含むことを特徴とする藻類用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法、藻類の培養方法、および藻類用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油などの化石資源の枯渇への懸念から、化石資源に替わるものとして再生可能エネルギーの研究開発が盛んに行われている。その中でも、石油の起源の一つとされる微細藻類は、食糧と競合せず、バイオ燃料と成り得る多くの脂質を蓄えることから、石油資源の代替となる持続可能なバイオマス資源として期待されており、藻類に蓄えられた脂質を抽出するための方法が開発されている（例えば、特許文献１乃至３参照）。
【０００３】
従来、バイオマスからタンパク質やアミノ酸などの栄養分を回収し、その栄養分を利用する方法として、例えば、脱脂米ぬかを含む溶液を１００〜２２０℃で５〜３０分熱水処理することにより、脱脂米ぬか中のタンパク質やアミノ酸を抽出し、それらを栄養源として酵母を培養する方法（例えば、非特許文献１参照）や、酵母細胞を１００〜２５０℃で５〜３０分熱水処理することにより、酵母細胞中のタンパク質やアミノ酸を抽出する方法（例えば、非特許文献２参照）、藻類（クロレラ）を３００〜３５０℃の熱水で処理することにより窒素源を抽出し、その窒素源をリサイクルする方法（例えば、非特許文献３参照）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２４６４０７号公報
【特許文献２】特開２０１３−７０６８８号公報
【特許文献３】特開２０１４−５１０１６５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】I. Sereewatthanawut, S. Prapintip, K. Watchiraruji, M. Goto, M. Sasaki, A. Shotipruk, “Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysis”, Bioresource Technology, 2008, 99, p.555-561
【非特許文献２】W. Lamoolphak, M. Goto, M. Sasaki, M. Suphantharika, C. Muangnapoh, C. Prommuag, et al., “Hydrothermal decomposition of yeast cells for production of proteins and amino acids”, Journal of Hazardous Materials, 2006, B137 , p.1643-1648
【非特許文献３】P. Biller, A.B. Ross, S.C. Skill, A. Lea-Langton, B. Balasundaram, C. Hall, R. Riley, C.A. Llewellyn, “Nutrient recycling of aqueous phase for microalgae cultivation from the hydrothermal liquefaction process”, Algal Research, 2012, 1, p.70-76
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
バイオマス資源の一つである微細藻類から脂質を抽出した後の残渣には、タンパク質やアミノ酸、リンなどの栄養分が含まれているが、これらの栄養分を回収し、回収した栄養分を利用する技術は、未だ開発されていない。
【０００７】
例えば、非特許文献１に記載の方法は、栄養分を回収するバイオマスとして、米ぬかの脂質抽出残渣である脱脂米ぬかを使用しており、藻類の脂質抽出残渣を使用したものではない。また、非特許文献２および３に記載の方法は、栄養分を回収するバイオマスとして、脂質を抽出していない酵母や藻類を使用しており、藻類の脂質抽出残渣を使用したものではない。
【０００８】
本発明は、このような課題に着目してなされたもので、藻類の脂質抽出残渣から栄養分を回収することができる藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法、ならびに、回収した栄養分を利用した藻類の培養方法および藻類用培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
微細藻類の培養には、糖などの炭素源、アミノ酸やタンパク質などの窒素源、およびリンなどの栄養源が必要であり、継続的な培養には、これらの安定的かつ多量の供給が重要となる。そこで、本発明者等は、脂質を抽出した後の藻類の残渣から栄養分を回収し、その栄養分を、藻類を培養するための栄養源としてリサイクルする循環型培養システムを検討している。本発明者等は、固体である藻類脂質抽出残渣を培養の栄養源として利用するためには、藻類脂質抽出残渣に含まれる栄養分を水に可溶化する必要があると考え、水は熱水条件下においてイオン積が増大するため、無触媒条件下で加水分解反応が可能となることに着目して、可溶化技術として熱水処理を採用することにより本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法は、オーランチオキトリウムから脂質を抽出した後の脂質抽出残渣に対して、１８０℃乃至２３０℃で１０分乃至８０分間の熱水処理を行い、その処理物から液体成分の一部または全部を回収することを特徴とする。
【００１１】
本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法は、藻類脂質抽出残渣に対して熱水処理を行うことにより、藻類脂質抽出残渣に含まれるタンパク質やアミノ酸や窒素やリンなどの栄養分を、処理物の液体成分中に可溶化することができる。このため、この液体成分の一部または全部を回収することにより、それらの栄養分を利用することができる。得られた栄養分は、例えば藻類の培養の栄養源としてリサイクルすることができ、循環型の培養システムを構築することができる。なお、液体成分を回収するためには、例えば、ろ過などの固液分離手段を用いてもよい。この場合、処理物から固体成分と液体成分とを分離して、液体成分を回収することができる。
【００１２】
本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法で、オーランチオキトリウムは、他の微細藻類と比較して増殖速度が速く、脂質生産性が高いため、特に脂質の抽出効率および栄養分の回収効率が高い。
【００１３】
本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法は、特に藻類の培養に適した栄養分を、効率良く回収することができる。
【００１４】
本発明に係る藻類の培養方法は、本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた前記液体成分を使用して、藻類の培養を行うことを特徴とする。
本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた液体成分中には、タンパク質やアミノ酸や窒素やリンなどの栄養分が含まれているため、本発明に係る藻類の培養方法により、その液体成分を使用して藻類を培養することができる。
【００１５】
本発明に係る藻類の培養方法で、前記培養を行う藻類は、前記熱水処理を行った藻類と同属のものから成ることが好ましい。この場合、異なる属の藻類を培養するよりも、効率良く増殖させることができる。特に、本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により、オーランチオキトリウムの脂質抽出残渣を利用して得られた前記液体成分を使用して、オーランチオキトリウムを培養することが好ましい。
【００１６】
本発明に係る藻類用培地は、本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた前記液体成分を含むことを特徴とする。
本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた液体成分中には、タンパク質やアミノ酸や窒素やリンなどの栄養分が含まれているため、その液体成分を含む本発明に係る藻類用培地は、藻類の培養に適している。
【００１７】
本発明に関する藻類培養システムは、本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた前記液体成分を使用して、藻類を培養可能に設けられていることを特徴とする。
本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法により得られた液体成分中には、タンパク質やアミノ酸や窒素やリンなどの栄養分が含まれているため、本発明に関する藻類培養システムにより、その液体成分を使用して藻類を培養することができる。
【００１８】
本発明に関する藻類培養システムは、藻類から脂質を抽出した後の脂質抽出残渣に対して熱水処理を行う熱水処理手段と、前記熱水処理手段の処理物から液体成分の一部または全部を回収する回収手段と、前記回収手段で得られた前記液体成分を使用して、藻類を培養可能に設けられた培養手段とを、有していてもよい。この場合、本発明に係る藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法および本発明に係る藻類の培養方法を実施することができる。培養手段により脂質を抽出する藻類を培養することにより、循環型の培養システムを構築することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、藻類の脂質抽出残渣から栄養分を回収することができる藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法、ならびに、回収した栄養分を利用した藻類の培養方法および藻類用培地を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施の形態の藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法を示す説明図である。
【図２】図１に示す藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法による水可溶物収率の、熱水処理の反応温度および反応時間依存性を示すグラフである。
【図３】図１に示す藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法による水可溶物中のタンパク質収率（図中の実線）およびアミノ酸収率（図中の破線）の、（ａ）熱水処理の反応温度が１５０℃および１７５℃、（ｂ）２００℃、（ｃ）２５０℃および３５０℃のときの、反応時間依存性を示すグラフである。
【図４】図１に示す藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法による水可溶物中の形態別窒素収率の、熱水処理の反応温度毎の反応時間依存性を示すグラフである。
【図５】図１に示す藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法による水可溶物中の全リン・リン酸収率の、熱水処理の反応温度毎の反応時間依存性を示すグラフである。
【図６】本発明の実施の形態の藻類の培養方法による、Aurantiochytrium SR21株の脂質抽出残渣を熱水処理して得られた水可溶物を含む培地（200_10培地、250_60培地）を用いて、Aurantiochytrium SR21株の培養を行ったときの、培養日数による濁度（ＯＤ６６０）の変化を示すグラフである。
【図７】本発明の実施の形態の藻類の培養方法による、Aurantiochytrium SR21株の脂質抽出残渣を熱水処理して得られた水可溶物を含む培地（150_10培地、150_30培地、150_60培地、200_30培地、200_60培地）を用いて、Aurantiochytrium SR21株の培養を行ったときの、培養日数による濁度（ＯＤ６６０）の変化を示すグラフである。
【図８】本発明の実施の形態の藻類の培養方法による、Aurantiochytrium SR21株の脂質抽出残渣を熱水処理して得られた水可溶物を含む培地（200_120培地、250_10培地、250_30培地、250_60培地）を用いて、Aurantiochytrium SR21株の培養を行ったときの、培養日数による濁度（ＯＤ６６０）の変化を示すグラフである。
【図９】本発明の実施の形態の藻類の培養方法による、Aurantiochytrium SR21株の脂質抽出残渣を熱水処理して得られた水可溶物を含む培地（200_10培地）を用いて、Aurantiochytrium sp.9w-5a株の培養を行ったときの、培養日数による濁度（ＯＤ６６０）の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、藻類脂質抽出残渣の熱水処理実験および藻類の培養実験の実験結果に基づいて、本発明の実施の形態の藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法、藻類の培養方法および藻類用培地の構成、作用効果について説明する。
【００２２】
［藻類脂質抽出残渣の熱水処理実験］
様々な反応温度および反応時間で藻類脂質抽出残渣の熱水処理を行い、反応温度および反応時間が、抽出される液体成分の収率や液体成分中の栄養分の収率に与える影響について検討を行った。藻類として、Aurantiochytrium SR21株を用い、このSR21株から有機溶媒を用いたFolch法により脂質を抽出して、実験に用いる藻類脂質抽出残渣を作製した。脂質抽出前のSR21株の元素組成を表１（ａ）に、脂質抽出後のSR21株の元素組成を表１（ｂ）に、脂質抽出残渣の化学組成を表２に示す。なお、表２中のタンパク質組成は、表１（ｂ）中の窒素の割合に、窒素タンパク質換算係数の4.78を乗ずることにより算出した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
【表２】
0005747360.tif 000003
【００２５】
作製した脂質抽出残渣を用いて熱水処理を行った。図１に示すように、脂質抽出残渣試料０．３ｇと水２．７ｇとをＳＵＳ３１６製の回分式反応器（内容積６ｃｍ３）１に仕込み、回分式反応器１の内部をＡｒでパージした。反応温度に設定した流動砂浴（サンドバス）２に回分式反応器１を投入することで反応開始とし、所定の反応時間経過後、回分式反応器１を取り出して水浴で冷却することで反応を停止させた。実験では、反応温度を１５０℃、１７５℃、２００℃、２５０℃、３５０℃の５通り、反応時間を１０分、３０分、６０分、９０分の４通りとした。
【００２６】
熱水処理による反応後、図１に示すように、回分式反応器１の内容物を水で回収し、減圧ろ過することにより、液体成分の水可溶物（ＷＳ）３と水不溶物４とに分離した。さらに水不溶物４をアセトン洗浄・ろ過することにより、アセトン可溶物（オイル）５および熱水残渣６に分画した。水可溶物３の収率、水可溶物３中のタンパク質収率・アミノ酸収率、形態別窒素収率、全リン・リン酸収率をそれぞれ図２〜図５に示す。アミノ酸はニンヒドリン法、タンパク質はＬｏｗｒｙ法にて窒素基準で評価し、全リンおよびリン酸はペルオキソ二硫酸カリウム分解法およびモリブデン青吸光光度法にてリン基準で評価している。なお、実験は各実験条件で３回ずつ行っており、その平均値を各実験条件での値としている。また、各収率は、以下の式で定義したものである。
【００２７】
【数１】
0005747360.tif 000004
【００２８】
図２に示すように、ＷＳの収率は、２００℃、３０分で最大の約９０％となった。ＷＳの収率は、全ての反応時間において２００℃で極大となり、さらに反応温度を増大させると減少した。また、ＷＳの収率は、２００℃以下の反応温度では、反応時間の増大にともない増加したが、２５０〜３５０℃では、３０分において極大を示し、さらに反応時間が増大すると減少した。これは、２５０〜３５０℃では、ＷＳからのガスやオイルの生成が進行するためと考えられる。
【００２９】
図３に示すように、タンパク質収率は、２００℃、３０分で最大の約４４％となった。タンパク質収率は、反応時間増大にともない、１５０〜１７５℃では増加傾向を示し、２００℃では３０分で極大となり、２５０〜３５０℃では減少した。これは，反応温度の増大により脂質抽出残渣からのタンパク質の可溶化が促進される一方で、２００℃以上でタンパク質のアミノ酸への加水分解が促進されたためと考えられる。
【００３０】
また、図３に示すように、アミノ酸収率は、２５０℃、９０分で最大の約１３％となった。アミノ酸収率は、反応時間増大にともない、１５０〜２５０℃では増加し、３５０℃では減少した。これは、図３および図４の結果から、アミノ酸収率は、２５０℃までは、反応温度の増大によりタンパク質の加水分解によるアミノ酸生成が促進されるため増加し、３５０℃以上になると、反応時間の増大とともにアミノ酸のアンモニアなどへの分解が進行するため減少したものと考えられる。
【００３１】
図５に示すように、全リンおよびリン酸収率は、２５０℃、１０分で、それぞれ最大の約９９％および約９３％となった。１５０〜２００℃では、全リン収率は反応時間依存を示さなかったが、リン酸収率は反応時間増大にともない増加傾向を示した。２５０〜３５０℃では、全リン収率およびリン酸収率は反応時間の増大とともに減少傾向を示した。これは、反応温度が２５０℃以上では、二次反応によりリン酸がオイルや熱水残渣となるためであると考えられる。
【００３２】
［藻類の培養実験］
Aurantiochytrium SR21株の脂質抽出残渣を熱水処理して得られた液体成分の水可溶物（ＷＳ）を利用して、藻類の培養実験を行った。実験に使用する試料は、以下のようにして作製した。まず、試料１〜１０として、表２に示す脂質抽出残渣を用いた。この脂質抽出残渣試料３ｇと水９７ｇとをＳＵＳ３１６製の回分式反応器（スウエージロック  Co.製「316L-HDF4-150」、内容積１５０ｃｍ３）に仕込み、図１に示す方法で熱水処理を行い、水可溶物（ＷＳ）を抽出した。培養実験には、熱水処理の反応温度が１５０℃、２００℃、および２５０℃、反応時間が１０分、３０分、６０分、および１２０分のＷＳを使用した。また、試料１１および１２として、上記の熱水処理実験で得られたＷＳのうち、熱水処理の反応温度２００℃、反応時間１０分、および反応温度２５０℃、反応時間６０分のものを培養実験に用いた。使用したＷＳの熱水処理条件、ならびにリン酸態リン収率、窒素収率、リン酸態リン濃度および全窒素濃度を表３に示す。
【００３３】
【表３】
0005747360.tif 000005
【００３４】
実験に用いる培地を調製するために、ＧＴＹ培地を用いた。ＧＴＹ培地は、Aurantiochytrium の標準的な培養に用いられており、５０％の（人工）海水、２％のグルコース、１％のトリプトン（プロテオースペプトン）および０．５％の酵母エキスを混合して調製されている。ＧＴＹ培地では、これらの構成成分の内、トリプトンおよび酵母エキスが培地の窒素およびリン源となっている。実験には、ＧＴＹ培地の中のトリプトンおよび酵母エキスの代替として、表３に示すＷＳを添加して調製した培地を用いた。なお、反応温度が１５０℃のＷＳは、熱水処理後の回収時からさらに２．３倍に希釈したものを、反応温度が２００℃および２５０℃のＷＳは、熱水処理後の回収時からさらに３倍に希釈したものを調製に用いた。調製した各培地の構成成分および組成を、それぞれ表４および表５に示す。なお、試料１〜１０のＷＳを用いた培地については、表５中のアミノ態窒素濃度（Amino-N）の測定を行っていない。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
【表５】
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【００３７】
なお、表４および表５に示すように、比較のため、通常の組成通り調製したＧＴＹ培地（control）、および、全窒素濃度がＷＳを使用した各培地と同程度になるよう、トリプトンを加えず、所定量の酵母エキスのみを加えた培地（ＧＴＹ２）を調製して、同様の実験を行った。
【００３８】
各培地を用いてAurantiochytrium SR21株の培養を行った。培養するAurantiochytrium SR21株は、あらかじめＧＴＹ培地で３日間の前培養を行ったものを使用した。また、培養は、３００μリットルの培養液を各培地に接種し、大型振とう培養機（タイテック社製「BR-180LF」）を用いて、１０３ｒｐｍで振とう培養を行った。培養時の温度は２５℃である。実験では、培養開始から２４時間毎に、６６０ｎｍの波長の光を用いて、分光光度計（Eppendorf社製「BioSpectrometer」）にて濁度（ＯＤ６６０）を測定し、増殖性の評価を行った。なお、培養開始から４８時間後、７２時間後の培養液は５倍希釈、９６時間後の培養液は１０倍希釈して、測定を行った。実験結果を、図６〜図８に示す。
【００３９】
図６〜図８に示すように、ＧＴＹ培地と比べると増殖性は劣るものの、ＷＳを用いたいずれの培地でも、Aurantiochytrium SR21株を培養できることが確認された。特に、熱水処理の反応温度が２００℃、反応時間が１０〜６０分のもの（200_10培地、200_30培地、200-60培地、200_10_2培地）の増殖性が高いことが確認された。最も増殖性が高い反応温度２００℃、反応時間６０分の培地（200-60培地）で、乾燥重量換算で、ＧＴＹ培地の３８％のバイオマスが得られた。図６に示すように、ＧＴＹ培地とＧＴＹ２培地の増殖性がほぼ同じであることから、ＷＳを用いた各培地は、リン酸が不足しているため（表５参照）、または、ＷＳ中に細胞の増殖を阻害する化合物が存在するために、ＧＴＹ培地より増殖性が劣っているものと考えられる。
【００４０】
なお、反応温度が１５０℃のもの（150_10培地、150_30培地、150-60培地）は、反応温度が２００℃のもの（200_10培地、200_30培地、200-60培地、200_120培地、200_10_2培地）よりも全窒素濃度が低いため（表５参照）、培養時に窒素源が不足したものと考えられる。また、反応温度が２５０℃のもの（250_10培地、250_30培地、250-60培地、250_60_2培地）は、反応温度が２００℃のもの（200_10培地、200_30培地、200-60培地、200_120培地、200_10_2培地）よりも全窒素濃度はやや高いため、窒素源の不足ではなく、ＷＳ中に細胞の増殖を阻害する化合物が比較的多く生成していたのではないかと考えられる。
【００４１】
次に、熱水処理の反応温度が２００℃、反応時間が１０分の培地（200_10培地）を用いて、Aurantiochytrium sp.9w-5a株の培養を行い、その結果を図９に示す。実験方法および条件は、図６〜図８のものと同様である。図９に示すように、ＧＴＹ培地と比べると増殖性は劣るものの、Aurantiochytrium sp.9w-5a株を培養できることが確認された。また、同じ熱水処理条件の培地を用いてAurantiochytrium SR21株を培養した場合（図６中の「200_10_2」）と比べると増殖性は劣るものの、Aurantiochytrium sp.9w-5a株を培養できることが確認された。このことから、熱水処理を行ってＷＳを抽出した藻類と同属のものであれば、そのＷＳを利用して培養を行うことができるものと考えられる。
【符号の説明】
【００４２】
１  回分式反応器
２  流動砂浴（サンドバス）
３  水可溶物（ＷＳ）
４  水不溶物
５  アセトン可溶物（オイル）
６  熱水残渣
【要約】
【課題】藻類の脂質抽出残渣から栄養分を回収することができる藻類脂質抽出残渣の栄養分回収方法、ならびに、回収した栄養分を利用した藻類の培養方法、藻類用培地および藻類培養システムを提供する。
【解決手段】藻類から脂質を抽出した後の脂質抽出残渣に対して熱水処理を行い、その処理物から液体成分の一部または全部を回収する。回収された液体成分を使用して、藻類の培養を行う。熱水処理は、１５０℃乃至３５０℃で１０分乃至９０分間行うことが好ましい。
【選択図】図１【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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