(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分裂しても染色体の数が変化しない所定個数の細胞に少なくとも染色体を発光させる蛍光タンパク質を導入する工程と、
前記蛍光タンパク質が導入された細胞のうち複数個を被検査物に曝す工程と、
前記被検査物に曝された複数個の細胞のうちの少なくとも１個をライブ観察し、１回目以降の分裂間時間（Ａ）を測定する工程と、
前記被検査物がない状態において、前記蛍光タンパク質が導入された細胞のうちの少なくとも１個の１回目以降の分裂間時間（Ｂ）を測定する工程と、
前記分裂間時間（Ａ）と前記分裂間時間（Ｂ）を比較する工程を有する細胞毒性検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に被検査物を曝して、細胞の変化を観察する細胞毒性検査方法であって、被検査物に曝した細胞をライブ観察することで、細胞がどのように変化するか、特に分裂時間および分裂から分裂までの間を示す分裂間時間を調べる事で、被検査物の毒性を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内組織や血液に直接触れる薬剤や医療機器は、安全性が求められる。そのため、体内組織や血液に対してどれほどの影響があるかは、使用される前に検査される必要がある。一方、ほとんどの物質は体組織にとって毒にも薬にもなりえる。そこで、問題はどれほどの量が体に入れば、毒としての効果を示すかという点である。このような検査では、被検査物を体組織に曝す若しくは摂取させる量を変えて、結果を観察する必要があるので、膨大な検体が必要となる。
【０００３】
動物を使った検査は信頼性は高いが１次サーチ用としては、費用がかかりすぎるという問題も発生する。そこで、確立された細胞株を用いたスクリーニングが行われている。これらは、細胞毒性試験と呼ばれる試験方法であり、例えば、培地抽出法、細胞増殖抑制試験、直接接触法等が挙げられる。
【０００４】
これらの試験の原理は多数の培養細胞を用いて、細胞の生死で毒性を評価することにある。有害物質の影響を受けた細胞は、ネクローシス若しくはアポトーシスによって死に至るため、多くの培養細胞に被検査物を与えて、その後の細胞の死亡率若しくは生存率を調べる。つまり、細胞個々には有害物質に対する感受性に違いがあったとしても、多くの細胞について同一の被検査物の影響を調べる事で、統計的には毒性が評価できるという技術思想に基づくものである。
【０００５】
このような方法に関する技術はすでに開示されているものがあり、特許文献１（特開平０５−３３６９９６号）には、コラーゲンマトリックスに表皮細胞と繊維芽細胞とを一緒に培養する場合は、生存細胞の数をカウントするのが極めて困難という課題に対して、生存細胞の数のカウントをより容易にできる方法が開示されている。
【０００６】
また、特許文献２（特開平１０−３２７８５４号）にも、培養細胞の生死細胞を直接計数するのは不可能であるとして、接着性細胞を基板上で培養した後、被検査物に曝して、染色した後計数する方法が開示されている。この方法では、１個１個の細胞の生死を正確にカウントすることができるとされている。さらに、特許文献２では、観察に自動ステージとカメラを用いることで接着性細胞の生存率の決定を自動化できることが開示されている。
【０００７】
一方、細胞の一つ一つに着目し、より詳細に薬剤が細胞に及ぼす影響を視覚的に観察する方法も提案されている。特許文献３（特表２００５−５３５３４８号）では、単一の蛍光タンパク質を導入した細胞に対して発光強度を時間関数として観察することで、増殖速度や薬剤感受性を生体外でリアルタイムに判定する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０５−３３６９９６号公報
【特許文献２】特開平１０−３２７８５４号公報
【特許文献３】特表２００５−５３５３４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細胞を使った毒性試験は、細胞の生死によって被検査物の毒性を評価する方法であり、比較的容易で多くのロットの試験ができるため、一次スクリーンの目的には合致したものである。しかし、評価が細胞の生死であるため、細胞がどのような過程で死んでしまったのかは明確でない。また、細胞は被検査物が作用した直後に死んだのか、ある程度細胞分裂をしてから死んだのかという点についても判断できない。
【００１０】
さらに、例えば、被検査物によって、細胞の分裂過程が停止してしまい、実際には死んでいると判断すべき場合、つまり、アポトーシスでもなくネクローシスでもない状態で、あたかも生きているように見えるような状態は、誤って生きていると判断してしまうという課題があった。
【００１１】
特許文献３の実施例９や実施例１０には、蛍光タンパク質を導入した細胞の分裂過程やアポトーシスの状態を時間毎に撮影して、認識できる点が開示されているが、ある細胞の分裂過程若しくはアポトーシスの場面を蛍光タンパク質を用いて観察した点が開示されているのみであり、試験若しくは検査にどのように使えるかについてはなんら開示されていない。
【００１２】
すなわち、同じ細胞株とはいえ、個々の細胞の被検査物に対する感受性の違いをどのように判断するかという点がなんら考慮されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記の課題に鑑みて想到されたものであり、細胞の内部で生じる変化まで追跡することで、被検査物の細胞に与える効果を評価することを目的とする。より具体的には、本発明は、
分裂しても染色体の数が変化しない所定個数の細胞に少なくとも染色体を発光させる蛍光タンパク質を導入する工程と、
前記蛍光タンパク質が導入された細胞のうち複数個を被検査物に曝す工程と、
前記被検査物に曝された複数個の細胞のうちの少なくとも１個をライブ観察し、１回目以降の分裂間時間（Ａ）を測定する工程と、
前記被検査物がない状態において、前記蛍光タンパク質が導入された細胞のうちの少なくとも１個の１回目以降の分裂間時間（Ｂ）を測定する工程と、
前記分裂間時間（Ａ）と前記分裂間時間（Ｂ）を比較する工程を有する細胞毒性検査方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、分裂しても染色体の数が変化しない細胞を用いるので、集団の中の任意の細胞がほぼ集団全体の細胞の性質を反映する。つまり、細胞分裂時間や細胞分裂に至るまでの時間（細胞分裂間時間）が、全ての細胞においてほぼ同じである。したがって、被検査物に曝した細胞集団の中から選んだ数個の細胞の変化を調べることで、集団全体の結果を判断できる。これによって、被検査物による細胞の変化をより詳細に追跡することができる。
【００１５】
また、ライブ観察によって、細胞分裂の時間や細胞分裂間時間を測定し、同じ集団の細胞で被検査物に曝されなかった細胞の場合と比較することで、詳細な検査であるにも関わらず、被検査物の毒性を評価することができる。
【００１６】
さらに、細胞分裂の停止によって、あたかも生きているように見える状態も、同じ性質
を有して被検査物に曝されなかった細胞と比較することで、確認することができ、そのよ
うな被検査物の毒性を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に用いる事のできる細胞の染色体数と本発明に用いる事のできない細胞の染色体数を示すグラフである。
【図２】本発明に用いる事のできる細胞の分裂時間と本発明に用いる事のできない細胞の分裂時間を比較する資料である。
【図３】本発明に用いる事のできる細胞にＭＭＣで処理をした場合の各細胞の分裂時間の関係を示すグラフである。
【図４】本発明に用いることのできる、ｐＶｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａ−Ｃ１を作製する過程を示す図である。
【図５】本発明に用いた細胞を観察することで得た系譜図を示す図である。
【図６】本発明に用いた細胞をＭＭＣに曝した後に得た系譜図を示す図である。
【図７】ＭＭＣに曝した細胞の他の系譜図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（実施の形態１）
本発明の細胞毒性検査方法で用いる細胞は、分裂によって染色体の本数が変化せず、不死の細胞である。さらに、癌化していない細胞であるのが好ましい。このような細胞の候補の１つは、幹細胞であるが、すでに株化された公知の細胞も使用できる可能性がある。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３は、マウスの胎児皮膚から分離したものであり、正常細胞の性質と無限に分裂する性質を併せ持つ。Ｖｅｒｏ細胞は、アフリカミドリザル由来の細胞で、不死の性質を持つが、癌化していない。
【００１９】
本明細書ではｍ５ｓという京都大学放射線生物研究センター佐々木正夫教授による細胞（大阪府立大学先端科学イノベーションセンター児玉靖司教授より分与）を用いた。この細胞は、染色体構成が安定的に維持されていることがよく知られている。なお、分裂によって染色体数が変化しないというのは、細胞分裂によって染色体が異なる細胞の発生率が４０％以下をいうものとする。
【００２０】
また、本発明に用いる細胞は、接着性の細胞であるのがよい。本発明では、数回の細胞分裂を追う必要があるので、浮遊細胞では追跡できない場合もあるからである。
【００２１】
本発明の検査方法では、このような細胞に蛍光タンパク質を導入する。導入の方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。導入できる蛍光タンパク質も特に制限されない。より具体的には、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、やＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などが好適に利用できる。これらのタンパク質は、コードする塩基配列が確立されているので、プラスミドに組み込みやすい。
【００２２】
また、これらの蛍光タンパク質は、細胞中で目標とするタンパク質をコードする塩基配列に続けてプラスミド中に組み込み、細胞に導入する。目標とするタンパク質が生成された際に観察できるようにするためである。
【００２３】
また、本発明の検査方法に用いる細胞には、少なくとももう１箇所に蛍光タンパク質を導入してもよい。この蛍光タンパク質は、細胞の分裂を観察するためである。したがって、この蛍光タンパク質は、細胞核や、細胞壁といった細胞の外観に関わる部分のタンパク質に対して発光させる。また、この蛍光タンパク質は、先程の蛍光タンパク質とは発光の波長が異なるものが良い。これらを区別できるようにするためである。
【００２４】
蛍光タンパク質を導入した細胞は、適量を検査用とコントロール用に分け、検査用の細胞は被検査物に曝す。被検査物は、検査用の細胞を培養している容器中に投入したまま、検査を行ってもよいし、検査用の細胞を、被検査物に所定の期間曝してから再び培地中で培養してもよい。
【００２５】
被検査物に曝された細胞は、ライブ観察によって状態を観察する。ライブ観察とは、細胞を生きたまま観察し記録することをいう。この際、細胞には励起光をあてて、導入された蛍光タンパク質が発光する光を顕微鏡を介して観察・記録する。
【００２６】
使用する細胞が接着性の細胞であれば、この観察の際に、移動することが少ないので、長期間に渡り同一の細胞を観察することができる。
【００２７】
観察は、染色体が凝縮を始めてから分離するまでの時間である細胞分裂時間と、細胞の分裂と分裂の間を表す、細胞分裂間時間の２種類の時間を少なくとも観察・記録する。細胞は被検査物から影響を受けると、細胞分裂時間が変化するからである。したがって、同じ集団から培養された細胞を比較のために観察しておくことが必要である。
【００２８】
また、本発明では、被検査物の影響が少なくて、細胞分裂を複数回行った後に被検査物の影響がでる場合も観察・記録することができる。
【実施例】
【００２９】
本発明では、分裂しても染色体の数が変化しない細胞を用いる。以下にそのような細胞について説明する。
【００３０】
以下のように、ヒストンＨ３と共に発現する蛍光タンパク質用プラスミドの例として、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙとＶｅｎｕｓについて作製した。
【００３１】
＜＜実施例の可視化細胞の作製と観察＞＞
＜（１）プラスミドＤＮＡの作製＞
（ａ）ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３
ヒストンＨ３−赤色蛍光蛋白質発現プラスミド（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３）は、ｐＲＳＥＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ（カリフォルニア大学  Ｔｓｉｅｎ博士より寄贈）を鋳型とし、プライマーＣとＨを用いてＰＣＲ法を利用して増幅させ、ｍｃｈｅｒｒｙ断片を得た。それぞれのプライマーは表１に示す。なお、プライマーＣは配列番号１、プライマーＨは配列番号２である。ｐＥＣＦＰ−Ｈ３をＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩで切断しＥＣＦＰ部分を取り除いた部位に、ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩで切断したｍＣｈｅｒｒｙ断片を挿入することによりｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３を作製した。
【００３２】
（ｂ）ｐＶｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａ−Ｈ３
黄緑色蛍光タンパク質融合タンパク質の発現ベクターとして、黄緑色蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａ）の遺伝子を含むベクターである哺乳動物細胞用発現ベクターｐＶｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａ−Ｃ１を使用した。なお、Ｖｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａは、黄緑色蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓのプラスミドであるｐＣＳ２−Ｖｅｎｕｓ（理化学研究所脳科学総合研究センター  宮脇敦史博士より寄贈）を鋳型にメガプライマー法を用いて、そのＮ末端から２０１番目のロイシンをアラニンに置き換えたものである。
【００３３】
具体的には、１回目のＰＣＲでは、Ｃｈｅｒｒｙ−Ｆｗ（Ｐｒｉｍｅｒ−１）とＶｅｎｕｓ−Ｃ−Ｌ２０１Ａ（Ｐｒｉｍｅｒ−２）の間を増幅した。Ｐｒｉｍｅｒ−１により、Ｖｅｎｕｓのコーディング領域の上流に制限酵素Ｎｈｅ  Ｉの認識部位を作製した。また、Ｐｒｉｍｅｒ−２により、アミノ酸残基２０１番目のロイシンをアラニンに変異（Ｌ２０１Ａ）させた。この変異導入時に、アミノ酸残基２０２番目セリンのアミノ酸配列は変えずに、塩基配列を変えることにより、制限酵素Ｍｌｕ  Ｉの認識部位を作製した。
【００３４】
２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲ産物をメガプライマーとして、Ｖｅｎｕｓ−Ｃ−Ｒｅｖ−２（Ｐｒｉｍｅｒ−３）との間を増幅した。Ｐｒｉｍｅｒ−３により、ストップコドンを取り除き、さらに、Ｖｅｎｕｓのコーディング領域の下流に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識部位を作製した。プライマーの塩基配列を表１に示す。塩基配列は左から５´末端で、右端は３´末端である。また、プライマー１は配列番号３、プライマー２は配列番号４、プライマー３は配列番号５である。
【００３５】
【表１】
0005728201.tif 000002
【００３６】
そして、Ｖｅｎｕｓのコーディング領域の上流と下流にそれぞれ作成した制限酵素認識部位を、ＮｈｅＩとＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、インサートを作製した。
【００３７】
また、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１をＮｈｅＩとＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、ＥＧＦＰのコーディング領域を取り除いて、ベクターを作製した。そして、インサートとベクターのライゲーションを行い、ｐＶｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａ−Ｃ１を作製した。これらの過程を図４に示す。
【００３８】
次に上記ｐＶｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａ−Ｃ１をＭＣＳ内にある制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、該切断部位に上記のプラスミドＤＮＡであるｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３を同じ制限酵素で切断することで得られたヒストンＨ３のｃＤＮＡ断片を導入することにより、黄緑色蛍光タンパク質融合タンパク質を発現させるためのプラスミドＤＮＡであるｐＶｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａ−Ｈ３を作製した。プラスミドＤＮＡの精製には、「Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用した。
【００３９】
＜（２）プラスミドＤＮＡの導入および安定形質転換細胞の取得＞
次に、上記のプラスミドＤＮＡを細胞に導入して、安定形質転換細胞を得た。上記プラスミドＤＮＡを導入する細胞として、マウス胎児線維芽細胞株ｍ５ｓ細胞を用いた。１５％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地（日水製薬製）にて上記ｍ５ｓ細胞を３７℃、５％炭酸ガス空気下で培養した。対数増殖期にある細胞をトリプシン溶液ではがし、ファルコンチューブに回収した。遠心分離（１０００ｒｐｍ／５分）し１×ＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞数が１．２×１０７ｃｅｌｌｓ／  ｍｌになるよう１×Ｋ−ＰＢＳ（３０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １２０ｍＭ  ＫＣｌ，  ８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，  １．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，  ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に懸濁した。
【００４０】
この細胞懸濁液４８０μｌをマイクロチューブに移し氷中で５分静置後、上記プラスミドＤＮＡ２０μｌを添加し、氷中で１０分静置した。その後懸濁液を冷却した４ｍｍ幅シングルキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に移し、パルス発生装置「Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて２７０Ｖ、１０５０μＦの条件で、上記プラスミドＤＮＡをｍ５ｓ細胞に導入し直ちに１０分間氷冷した。氷冷後無血清Ｄ−ＭＥＭを０．５ｍｌ加えて室温で１０分静置し、パスツールピペットで回収した細胞を９０ｍｍシャーレ数枚に播いた。
【００４１】
細胞を播いたシャーレに選択培地Ｇ４１８（ナカライ社製）を２００〜６００μｇ／ｍｌとなるように添加し、３〜５日毎に培地交換をして培養を続けた。約２週間経過後、形成されたコロニーをクローニングリングを用いて個々に回収し、カバーグラスを入れた１２穴マイクロプレートに移して培養した。次の操作（形質転換細胞での目的とする構造の可視化の確認）により、各蛍光タンパク質が核で発現し、かつ大核など異常な核が少ないと確認された細胞を安定形質転換細胞株とし、９０ｍｍシャーレにて培養し、液体窒素中にて保存した。安定形質転換細胞株として得る事ができたのは、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３導入株が５クローンと、Ｖｅｎｕｓ−Ｌ２０１Ａ−Ｈ３導入株が４クローンであった。取得した蛍光細胞を表２に示す。
【００４２】
【表２】
0005728201.tif 000003
【００４３】
＜（３）形質転換細胞での目的とする構造の可視化の確認＞
上記のカバーグラス上で培養された細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００で５分間処理した。細胞核をＤＡＰＩ溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、対物レンズ「ＰｌａｎＡｐｏ  ６０ｘ」（ＮＡ１．４０、ニコン社製）を備えた蛍光顕微鏡「Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００」（ニコン社製）を用いて観察した。ＤＡＰＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｖｅｎｕｓはそれぞれの蛍光を観察するにあたってＵＶ−１Ａ（ＥＸ  ３６５  ／  １０  ＤＭ４００  ＢＡ４００）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＥＸ  ５４０−５８０  ＤＭ５９５  ＢＡ６００−６６０）、Ｙｅｌｌｏｗ  ＧＦＰ（ＥＸ  ４６５−４９５  ＤＭ５０５  ＢＡ５１５−５５５）を使用した。目的とする細胞構造（核）がそれぞれの蛍光を放っていることを確認した。
【００４４】
＜染色体数の確認＞
次に上記の操作で得る事のできた安定形質転換細胞株の染色体の数を確認した。
【００４５】
＜（１）染色体展開標本の作製＞
対数増殖期にあるｍ５ｓ蛍光細胞にコルセミドを終濃度０．０６μｇ／ｍｌになるよう添加し、２時間３７℃、５％炭酸ガス空気下で培養した。その後トリプシン溶液で細胞をはがしてファルコンチューブに回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ／５分）した。その上澄みを捨て、０．０７５Ｍ塩化カリウム水溶液２ｍｌを加えて穏やかに懸濁し、２５分間室温において低張処理を行った。処理後、氷冷したカルノア液（酢酸：メタノール＝１：３）２ｍｌを重層し、穏やかに撹拌した。遠心分離（１０００ｒｐｍ／５分）し上澄みを捨てた後、カルノア液４ｍｌを加え穏やかに撹拌し氷中に５分間静置した。その後遠心分離（１０００ｒｐｍ／５分）し上澄みを捨て、カルノア液４ｍｌで再度撹拌、氷冷を行った。
【００４６】
カルノア液１ｍｌを加えた細胞懸濁液を２０μｌとり、染色体メタフェーズ標本作製用装置ＨＡＮＡＢＩ（ＡＤＳＴＥＣ社製）を用いて、スライドグラス上に滴下した。標本の乾燥後、ＤＡＰＩ溶液（１μｇ／ｍｌ）で核・染色体を染色し、グリセロールで標本を封入した。
【００４７】
＜（２）染色体数の測定＞
上記の標本を、対物レンズ「ＰｌａｎＡｐｏ  ６０ｘ」（ＮＡ１．４０、ニコン社製）を備えた蛍光顕微鏡「Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００」（ニコン社製）を用いて観察した。ＤＡＰＩが観察可能なフィルターを用いて、展開された染色体について観察した。染色体が展開しているもののうち、明らかに染色体数が形質転換前と異なる２クローン、即ち、４割が６０本以上の染色体をもつクローン（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ｃ１８）と、８割が７０〜８０本の染色体をもつクローン（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ２０）、を除き、各クローンの細胞５０個分についてその染色体数をカウントした。
【００４８】
得られた蛍光細胞には、染色体数が形質転換前のｍ５ｓ細胞の染色体数に近いクローン（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４，  Ｖｅｎｕｓ−Ｈ３  Ａ１４など）もあれば、染色体数がばらついているクローン（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ｂ２−１２）もあった。図１でｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４，  Ｂ２−１２、Ｖｅｎｕｓ−Ｈ３  Ａ１４の染色体数の分布図を示す。
【００４９】
図１は、縦軸が細胞数を表し、横軸が染色体数を表す。図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）がそれぞれｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４，  Ｂ２−１２、Ｖｅｎｕｓ−Ｈ３  Ａ１４の結果である。
【００５０】
本発明の検査方法には、分裂後の染色体数が変わらない細胞を使用するので、例えば、クローン（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ｂ２−１２）は、利用することができない。以下の実施例では、クローン（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４）を用いた。もちろん、クローン（Ｖｅｎｕｓ−Ｈ３  Ａ１４）を用いることもできる。
【００５１】
この細胞を３５ｍｍガラスボトムデイッシュ（イワキ社製）へ接種し、ＩＮＵ−ＮＩ−ＦＩ顕微鏡保温装置「ステージトップインキュベーター」（東海ヒット社製）で培養した。
【００５２】
次に比較例として用いた細胞について説明する。
【００５３】
＜＜比較例の可視化細胞の作製と観察＞＞
＜（１）プラスミドＤＮＡの作製＞
（ａ）ｍＰｌｕｍ−Ｈ３
ｐＢＡＤ−ｍＰｌｕｍ（カリフォルニア大学  Ｔｓｉｅｎ博士より寄贈）を鋳型とし、プライマーＣおよびＭを用いてＰＣＲ法を利用して増幅させ、蛍光タンパク質ｍＰｌｕｍ遺伝子断片を得た。なお、プライマーＭは配列番号６であるｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社）をＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩで切断し、ＥＧＦＰ遺伝子を取いた部位に、あらかじめＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩで処理したｍＰｌｕｍ遺伝子断片を挿入することにより、ｐｍＰｌｕｍ−Ｃ１を作製した。
【００５４】
ヒストンＨ３−赤色蛍光蛋白質発現プラスミド（ｍＰｌｕｍ−Ｈ３）は、ｐｍＰｌｕｍ−Ｃ１をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで切断した部位に、ｐＥＣＦＰ−Ｈ３をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで切断して得られたヒストンＨ３遺伝子断片を挿入することにより作製した。
【００５５】
＜（２）プラスミドＤＮＡの導入および安定形質転換細胞の取得＞
上記プラスミドＤＮＡを導入する細胞として、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ４３５）由来の４色可視化細胞株ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦ（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５７，  ５６−６２，  ２００８、）を用いた。１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地（日水製薬製）にて上記細胞株を３７℃、５％炭酸ガス空気下で培養した。対数増殖期にある細胞をトリプシン溶液ではがし、ファルコンチューブに回収した。遠心分離（１０００ｒｐｍ／５分）し１×ＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞数が１．２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう１×Ｋ−ＰＢＳに懸濁した。
【００５６】
この細胞懸濁液４８０μｌをマイクロチューブに移し氷中で５分静置後、上記プラスミドＤＮＡ２０μｌを添加し、氷中で１０分静置した。その後懸濁液を冷却した４ｍｍ幅キュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に移し、パルス発生装置「Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて２００Ｖ、９５０μＦの条件で、上記プラスミドＤＮＡを薬剤耐性遺伝子（ｂｌｅ）発現プラスミドＤＮＡとともにＭＤＡ細胞に導入し直ちに１０分間氷冷した。氷冷後無血清Ｄ−ＭＥＭを０．５ｍｌ加えて室温で１０分静置し、パスツールピペットで回収した細胞を９０ｍｍシャーレ数枚に播いた。
【００５７】
細胞を播いたシャーレに選択培地Ｚｅｏｃｉｎ（インビトロゲン社製）を１５μｇ／ｍｌとなるように添加し、３〜５日毎に培地交換をして培養を続けた。約２週間経過後、形成されたコロニーをクローニングリングを用いて個々に回収し、カバーグラスを入れた１２穴マイクロプレートに移して培養した。上記で説明した形質転換細胞での目的とする構造の可視化の確認の操作により、赤色の蛍光を放つｍＰｌｕｍ蛍光タンパク質が核に局在する細胞株７株（Ｎｏ．３，６，７，９，１３，３０，３１）をｍＰｌｕｍ−ヒストンＨ３安定形質転換細胞株として取得し、９０ｍｍシャーレにて培養し、液体窒素中にて保存した。
【００５８】
比較例として用いた細胞は得られたｍＰｌｕｍ−ヒストンＨ３安定形質転換細胞株（Ｎｏ．９）を用いた。細胞を３５ｍｍガラスボトムデイッシュ（イワキ社製）へ接種し、ＩＮＵ−ＮＩ−ＦＩ顕微鏡保温装置「ステージトップインキュベーター」（東海ヒット社製）で培養した。
【００５９】
次に可視化細胞のライブ観察について説明する。
【００６０】
＜＜可視化細胞のライブ観察＞＞
ライブ観察には以下の装置を用いた。ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ３００（ニコン社製）へ、ＰｌａｎＡｐｏ  ＶＣ  ６０Ｘ対物レンズ（ニコン社製）とＯＲＣＡ−ＥＲ  ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）、さらに、励起、吸収フィルターホイールとＺ軸モータ（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を備えたＭＡＣ５０００コントローラーを取り付けた。
【００６１】
１００Ｗのハロゲンランプを光源にし、励起、吸収フィルターの波長特性は、それぞれ、５７２をピークに３５ｎｍ幅のものと６３２をピークに６０ｎｍ幅のもので、ダイクロイックミラーは８９００６ｂｓ  （８９００６  ＣＦＰ／ＹＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＴ、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。
【００６２】
生細胞のタイムラプス画像は、ＭａｃＯＳ  Ｘ（三谷コーポレーション社製）用ルミナビジョンソフトウェアを用いて、焦点面を２μｍずつ移動させつつ、２〜４分のタイムラプスで取得した。
【００６３】
得られたＺ軸画像スタックは、ルミナビジョンソフトウェアを用いて最大値投影法にて変換し、画像解析した。
【００６４】
上記の観察装置を用いて、実施例クローン（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４）と比較例クローン（ｍＰｌｕｍ−ヒストンＨ３−Ｎｏ３）のライブ観察を行った。観察はそれぞれ複数個の細胞についてライブ観察し、所定時間毎に写真撮影した。得られた写真から細胞の分裂時間（染色体が凝縮してから２極に分かれるまでの時間）を判定した。実施例クローン（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４）の分割時間を図２（ａ）に、また比較例クローン（ｍＰｌｕｍ−ヒストンＨ３−Ｎｏ３）の分割時間を図２（ｂ）に示す。
【００６５】
図２（ａ）のグラフを参照して、実施例の細胞は、平均的な分裂時間は３６．５分であり、観察した１６個の細胞すべてが、ほぼ±４分以内（±３．８３分）と細胞分裂時間がよくそろっていた。一方、図２（ｂ）を参照して、比較例クローン（ｍＰｌｕｍ−ヒストンＨ３−Ｎｏ３）では、観察した３２個の細胞の分裂時間はそれぞれまちまちであった。
【００６６】
実施例クローンの分裂時間がそろっているのは、分裂した後の染色体の数が変化しないことに起因すると考えた。すなわち、実施例クローンのような細胞株の細胞は、分裂時間がよくそろっている。その特徴の一つが分裂しても染色体に変化が少ないということであると考えた。一方、比較例クローンの場合のように、分裂後の染色体の数が細胞毎にバラバラであると、細胞の分裂時間もまちまちとなってしまう。逆に言うと、分裂しても染色体の数に大きな変化のない細胞は、その株に属する全ての細胞について、ほぼ同じ分裂時間を有すると考えられる。本発明は、このような性質を利用し、被検査物に曝す細胞を分裂しても染色体の数に変化のない細胞として、そのうち、数個の細胞を詳細に観察し、分裂時間等を観察することで、細胞毒性を検査するものである。
【００６７】
＜＜分裂時間の変化＞＞
ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３−Ａ１４−６株を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（イワキ社製）に播き、一日培養後、薬剤マイトマイシンＣ（以後ＭＭＣと表記する）を終濃度３００ｎＭ（ＩＣ５０濃度の約３倍で、投与後２４時間後に小核発生頻度が約３倍になる濃度）になるよう投与した。投与後４時間経過した後、培地を新しいものに交換し薬剤を除去し、細胞を記述のライブ観察装置に設置し観察を行った。結果を図３に示す。縦軸は細胞数を表し、横軸は分裂時間（分）である。
【００６８】
分裂時間は、２４分から１０８分まで広がった。ライブ観察した６８細胞での分裂時間の平均は４０分であり、ＳＤは±１８分であった。これは、薬剤に曝されなかったコントロールが平均３６．５分±４分であったことを考えると、ばらつきが大きくなったと判断できる。また、分裂時間が２４分から４８分までのグループと、６０分から１０８分までのグループに分かれたという見方もできる。
【００６９】
しかも、この細胞は、集団として特性がそろっているので、分裂時間が長くなり、その分散も長くなったのは、個々の細胞自体の特性ではなく、薬の影響であったと判断できる。このことから、影響のわからない薬剤に対して、数十個単位の細胞をライブ観察し、コントロールの細胞と比較することで、薬剤の影響を分裂時間の変化として捉えることができる。
【００７０】
また、本発明の毒性検査では、細胞の分裂状態を直接観察するので、細胞の生き死にだけでなく、細胞に生じた変化も確認することができる。例えば、図３のグラフにおいて、黒の部分は、細胞に小核が生じたものである。
【００７１】
（実施の形態２）
＜細胞系譜図＞
観察には得られた蛍光細胞のうち、染色体数が形質転換前のｍ５ｓ細胞の染色体数に近いクローンｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４−６株を用いた。細胞を３５ｍｍガラスボトムデイッシュ（イワキ社製）へ接種し、ＩＭＦ−Ｉ−Ｗ  蒸留水供給装置（東海ヒット社製）  を取り付けた、ＩＮＵ  Ｇ２−ＷＤＳ−Ｐ顕微鏡保温装置（東海ヒット社製）で培養した。
【００７２】
ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ顕微鏡（ニコン社製）へ、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ４０Ｘ対物レンズ（ニコン社製）とＩｍａｇＥＭ  ＥＭ−ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）とさらに、ＰｒｏＳｃａｎ  ＩＩ  ステージ・Ｚ軸コントローラー（ＰＲＩＯＲ社製）を取り付けた。
【００７３】
１００Ｗのハロゲンランプを光源にし、適切な波長の光を得るために、波長特性が５７２をピークに３５ｎｍ幅と６３２をピークに６０ｎｍ幅の、ダイクロイックミラー（Ｓｅｍｒｏｋ社製）を用いた。
【００７４】
生細胞のタイムラプス画像は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ社製）を用いて、焦点面を２μｍずつ移動させつつ、６分のタイムラプスで取得した。
【００７５】
この細胞の分裂時間と分裂間時間がどの程度安定しているかを表３に示す。表３でＭＤＡは５色可視化したヒト由来の癌細胞である。このＭＤＡ細胞とＡ１４−６株を６５時間まで調べた際の分裂時間と分裂間時間を比較したものである。ライブ撮影は上記のように６分間隔で撮影しているので、例えばＡ１４−６株は、６５時間後であっても分裂時間が写真２コマ程度の差しかない。すなわち、５１個の細胞について、６５時間経過した後であっても、ほぼ同じ分裂時間で分裂が行われていることを示している。
【００７６】
一方、ＭＤＡの場合は、分裂時間の平均からの上下の広がり幅が１４０分近くあり、平均の８５．７分よりも大きくなる。これらの細胞でこれだけ分裂時間に差ができると、任意に選んだ細胞が全体を代表しているとは言い難い。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
細胞分裂時に染色体が分離する画像が取得できた。取得画像より、染色体が凝縮してから２極に分かれるまでの時間を調べたところ、染色体の分裂時間のばらつきが少なく、ほぼそろっていることが分かった。さらに長時間（約６５時間）の撮影で、最高で５回の連続する分裂像が取得でき、染色体が分裂してから再び分裂するまでの分裂間時間も、ばらつきが少なかった。
【００７９】
図５は、上記のｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４−６の特定した細胞についての、分裂の世代を示す系譜図である。それぞれの代の細胞には、最初の親をＣ１とし、その後Ｃ２、Ｃ３・・、と番号を付与した。同じ世代の細胞には、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂなどのように数字の後にアルファベットを付与して区別する。
【００８０】
図中丸で囲んだ数字は、これらの細胞の分裂の回数を表す。また、世代間をつなぐ線の長さは、大まかに分裂間時間の長さを反映させている。この系譜図を見ると、最初の細胞Ｃ１が分裂して２つのＣ２（Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ）ができ、それぞれの細胞からさらに分裂してＣ３（Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄ）を生んでいることを順次観測できていることが分かる。
【００８１】
図中で、「ＯＵＴ」は顕微鏡の視野から外れ、観測出来なくなったことを示す。本発明の細胞は壁面に固着しやすいので、顕微鏡を視野を動かすことで、ある程度追跡することができる。しかし、分裂の際には、大きく動くことがあり、すると、追跡できる視野範囲からはずれてしまう。
【００８２】
なお、特定の細胞は複数個を選んで観測している。５回の分裂まで観測し、観測した全ての細胞の分裂時間と分裂間時間の平均を求めると、分裂時間は平均２３．９±４．８８分（ｎ＝６３）であり、分裂間時間の平均は１３．２±２．５３時間（ｎ＝４０）であった。このように、分裂しても染色体の数が変わらない細胞は、培地中で順調に分裂し、その分裂の系譜図を追跡することができる。
【００８３】
なお、分裂時間と分裂間時間のｎ数に違いがあるのは、分裂回数が多くなると、視野の外に出て観測できなくなる細胞が増えるからである。
【００８４】
＜ＭＭＣ処理細胞のライブ観察＞
ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ３  Ａ１４−６株を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（イワキ社製）に播き、一日培養後、薬剤マイトマイシンＣ  （以後ＭＭＣと表記する）を終濃度３００ｎＭ  （ＩＣ５０濃度の約３倍）になるよう投与した。投与後４時間経過した後、培地を新しいものに交換し薬剤を除去し、細胞を記述のライブ観察装置に設置し観察を行った。その結果、小核が形成される様子が観察でき、連続する分裂において小核が続けてできるもの、２回目以降の分裂で小核ができるもの、小核をもつ細胞のその後の様子を追うことができた。
【００８５】
図６には、ＭＭＣで処理した細胞の系譜図を示す。図中丸で囲んだ数字は図５と同じく分裂の回数である。同じ世代の分裂には丸で囲んだ数字の後にハイフンをつけアルファベットで区別した。また、細胞を示す丸の左肩に小さな丸がついているものは、小核が発生した事を表す。図５のＭＭＣにさらされていない細胞の場合と比較すると、分裂間時間が延びているのがわかる。また、丸５で示す細胞は、初代から４代目で初めて小核が発生しており、初代の細胞が蒙った影響が、２代目、３代目で発現しなくても、４代目以降で発現することが観察された。
【００８６】
一度小核ができた細胞は、さまざまな変化を起こすが、例えば図７に示すようにある親からの子が２つとも小核を発生し、その後分裂しきれないまま繋がってしまうといったケース（図７（ｂ）参照）であったり、分裂した細胞の片方にだけ小核ができて、小核ができた細胞はその後死んでしまったり（図７（ｃ）参照）といったケースがある。もちろん、図６に示したように、小核を発生したまま分裂を続ける細胞もあった。なお、図７（ａ）は、細胞Ｃ２ｂが２つに分裂し（Ｃ３ｃおよびＣ３ｄ）、その後小核部分同士で結合する（Ｃ４ｃ、Ｃ４ｄ）ところを撮影した連続写真である。左上から右、左下から右下と時間は過ぎてゆく。
【００８７】
このように、本発明で用いた細胞を薬剤に曝し、特定の細胞についてその系譜図を薬剤に曝さなかった細胞と比較することで、薬剤の細胞に対する世代を通じた影響をアッセイすることができる。特に、薬剤の濃度が薄い場合において、どの程度の影響があるのかは、この系譜図を比較することで、これまでにないアッセイが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、培養細胞を用いた薬剤の細胞に対する影響について、詳細な確認が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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