(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、２、４、８、９、１４、１６、１８、２２、２５、２６、３０、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５３、６５、６６、７６、７９、８４、１０１、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、および１２４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド。
【請求項２】
１個または２個のアミノ酸が置換されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、２、４、８、９、１４、１６、１８、２２、２５、２６、３０、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４７、４８、４９、および５３からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、前記置換が以下の一方または両方の改変である、単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、２、４、８、９、１４、１６、１８、２２、２５、２６、３０、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４７、４８、４９、および５３からなる群より選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、１６、１８、２２、３８、３９、４１、４４、４５、４７、および４８である場合を除く）、チロシン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、２、４、８、９、３３、３４、３５、３６、および４３である場合を除く）、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるように改変されている、および
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、２、４、８、９、１４、１６、１８、２２、２５、２６、３０、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４７、４８、４９、および５３からなる群より選択されるアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、３３、３４、または４８である場合を除く）、ロイシン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、２、４、８、１４、１６、１８、２５、２６、３０、３８、３９、４１、４４、４５、４７、４９、または５３である場合を除く）、イソロイシン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、３５、または３６である場合を除く）、トリプトファン、およびメチオニン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３である場合を除く）からなる群より選択されるアミノ酸であるように改変されている。
【請求項３】
１個または２個のアミノ酸が置換されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、６６、７６、７９、８４、１０１、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、および１２４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ＣＴＬ誘導能を有する単離されたペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２との関連において、前記置換が以下の一方または両方の改変である、単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、６６、７６、７９、８４、１０１、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、および１２４からなる群より選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、６６、７６、７９、８４、１０１、１１０、１１１、１１２、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、または１２４である場合を除く）およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるように改変されている；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、６６、７６、７９、８４、１０１、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、および１２４からなる群より選択されるアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸が、バリン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、７６、８４、１０１、１１３、１１４、または１２１である場合を除く）およびロイシン（但し、該アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、７９、１１０、１１１、１１２、１１７、１２２、１２３、または１２４である場合を除く）からなる群より選択されるアミノ酸であるように改変されている。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＣＴＬを誘導するための組成物であって、請求項１〜３のいずれか一項記載の１種類もしくは複数種のペプチド、または請求項４記載の１種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項６】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、請求項１〜３のいずれか一項記載の１種類もしくは複数種のペプチド、または請求項４記載の１種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
【請求項７】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項８】
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）をインビトロで誘導する方法：
（ａ）ＡＰＣを、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとインビトロで接触させる段階、および
（ｂ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項９】
以下からなる群より選択される１つの段階を含む、ＣＴＬをインビトロで誘導する方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階、
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、および
（ｃ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階。
【請求項１０】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１１】
請求項８記載の方法によって誘導される、請求項１０記載のＡＰＣ。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１３】
請求項９記載の方法によって誘導される、請求項１２記載のＣＴＬ。
【請求項１４】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するための組成物であって、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１５】
請求項１〜３記載のペプチドのいずれかに対する抗体。
【請求項１６】
請求項１〜３記載のペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜３記載のペプチドのいずれか、請求項４記載のポリヌクレオチド、または請求項１５記載の抗体を含む診断キット。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項４記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞を誘導するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年４月１日に出願された米国仮特許出願第６１／２１１，７００号の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして有効な新規ペプチド、腫瘍を治療および予防するための薬物、ならびに腫瘍を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、主に免疫学的アプローチによって発見されている（非特許文献１／Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80；非特許文献２／Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9）。これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床適用が保証される（非特許文献３／Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55；非特許文献４／Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42；非特許文献５／Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9；非特許文献６／van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14；非特許文献７／Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8；非特許文献８／Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72；非特許文献９／Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66；非特許文献１０／Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94）。これまでに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながらこれまでのところ、これらのがんワクチンの治験では低い客観的奏功率しか観察されていない（非特許文献１１／Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80；非特許文献１２／Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42；非特許文献１３／Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15）。したがって、免疫療法の標的として有用であると予測される新規ＴＡＡの同定がなお必要とされている。
【０００５】
この目的のために、網羅的ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイを用いる遺伝子発現プロファイルの解析を通して、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（特許文献１／ＷＯ２００７／０１３６６５）および食道癌（特許文献２／ＷＯ２００７／０１３６７１）においていくつかの上方制御遺伝子が同定された。それらの中から免疫療法の標的として優れた候補を同定するという目的で、これらの遺伝子が詳細に調べられた。免疫療法においてがん細胞を特異的に標的化するには、好ましいＴＡＡは主にがん細胞によって発現され、正常な健常組織では発現が限定されているかまたは発現されないものである必要がある。
【０００６】
染色体６オープンリーディングフレーム１６７（Ｃ６ｏｒｆ１６７）は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのｃＤＮＡライブラリースクリーニングを通して同定された（非特許文献１４：MGC Program Team, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 24; 99(26):16899-903）。Ｃ６ｏｒｆ１６７は、前述の解析において同定された上方制御遺伝子の１つであった。しかしながら、がんの診断および／または治療へのその有効性は、いまだに確認されていない。
【０００７】
本発明は、新規がんマーカーであるＣ６ｏｒｆ１６７、ならびに抗原ペプチド、特にＣ６ｏｒｆ１６７を標的とする抗原ペプチドおよびがんワクチンを使用するがんの新規治療法を提供することにより、当技術分野におけるがんの診断および治療の向上の必要性に取り組む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０１３６６５
【特許文献２】ＷＯ２００７／０１３６７１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【非特許文献１４】MGC Program Team, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 24; 99(26):16899-903
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、がん治療に適した新規ペプチド、およびがんを検出または診断する方法に関する。
【００１１】
本発明は、免疫療法の標的として役立ち得る新規ペプチドの発見に少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは一般的に、免疫系により「自己」として認識され、したがって生得的な免疫原性を有さない場合が多いため、適切な標的の発見は極めて重要である。本発明を通して、Ｃ６ｏｒｆ１６７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１９８４６８．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）の遺伝子によってコードされるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）が、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがん細胞において特異的に過剰発現することが実証される。したがって本発明は、適切ながんマーカーおよび免疫療法の標的の候補としてＣ６ｏｒｆ１６７に着目する。
【００１２】
本発明はさらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７に特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する、Ｃ６ｏｒｆ１６７の遺伝子産物の特異的エピトープペプチドの同定に関する。以下に詳述するように、健常ドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合候補ペプチドを用いて刺激した。その後、各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対する特異的細胞傷害性を有するＣＴＬ株が樹立された。これらの結果から、これらのペプチドが、Ｃ６ｏｒｆ１６７を発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることが実証される。さらにこの結果から、Ｃ６ｏｒｆ１６７は免疫原性が強く、かつそのエピトープは腫瘍免疫療法の有効な標的であることが示される。
【００１３】
したがって、ＨＬＡ抗原に結合する単離されたペプチド、特にＣ６ｏｒｆ１６７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）またはその免疫原性断片を含むものを提供することは、本発明の１つの目的である。これらのペプチドはＣＴＬ誘導能を有すると予測され、したがってＣＴＬをエクスビボで誘導するために用いることができ、または、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍などであるがこれらに限定されないがんに対する免疫応答を誘導する目的で対象に投与するために用いることができる。好ましいペプチドはノナペプチドまたはデカペプチドであり、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１および６３〜１５１の中より選択されるアミノ酸配列を有するものである。これらのうち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、７、８、９、１４、１６、１８、２２、２５、２６、３０、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５３、６５、６６、７６、７９、８４、１０１、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、および１２４の中より選択されるアミノ配列を有するペプチドが最も好ましい。
【００１４】
本発明のペプチドは、結果として生じた改変ペプチドが元のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換または付加されているペプチドも包含する。
【００１５】
本発明はまた、本発明のペプチドのいずれか１つをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、本発明のペプチドとほぼ同様に、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために用いることができ、またはがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
【００１６】
対象に投与した場合、本発明のペプチドは、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するように、好ましくはＡＰＣの表面上に提示される。したがって、ＣＴＬを誘導する組成物であって、本発明の１種類もしくは複数種のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供することは、本発明のさらなる目的である。本発明はさらに、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんの治療および／または予防、ならびに術後のその再発の予防のために製剤化された、本発明の１種類もしくは複数種のペプチドまたはそのようなペプチドをコードする１種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を企図する。
【００１７】
ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法であって、ＡＰＣを本発明の１種類もしくは複数種のペプチドと接触させる段階、または本発明のペプチドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階を含む方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００１８】
本発明はまた、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明の１種類もしくは複数種のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明の１種類もしくは複数種のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、または本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードする１種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する段階を含む、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。
【００１９】
ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明はさらに、本発明のペプチドを標的とする単離されたＣＴＬを提供する。これらのＡＰＣおよびＣＴＬは、がん免疫療法に用いることができる。
【００２０】
がんに対する免疫応答を必要とする対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む方法を提供することは、本発明の別の目的である。
【００２１】
がんの診断を必要とする対象においてがんを診断する方法であって、（ａ）対象由来の生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する段階、および（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較して、段階（ａ）で測定された発現レベルが上昇していることを、該対象におけるがんの存在と関連づける段階を含む方法を提供することは、本発明のさらに別の目的である。好ましくは、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルは、Ｃ６ｏｒｆ１６７のｍＲＮＡもしくはタンパク質、またはＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の生物活性を検出することにより測定する。
【００２２】
がんを診断する際に用いるためのキットであって、Ｃ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡを検出するための試薬、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を検出するための試薬、またはＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の生物活性を検出するための試薬を含むキットを提供することは、本発明のなおさらなる目的である。
【００２３】
本発明の適用性は、がんなどの、Ｃ６ｏｒｆ１６７過剰発現に関連するか、またはＣ６ｏｒｆ１６７過剰発現から生じるいくつかの疾患のいずれにも及び、その例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
[本発明1001]
ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：159またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド。
[本発明1002]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ24またはＨＬＡ−Ａ2である、本発明1001の単離されたペプチド。
[本発明1003]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2、4、7、8、9、14、16、18、22、25、26、30、33、34、35、36、38、39、41、43、44、45、47、48、49、53、65、66、76、79、84、101、110、111、112、113、114、117、118、121、122、123、および124からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または1002の単離されたペプチド。
[本発明1004]
ノナペプチドまたはデカペプチドである、本発明1001〜1003のいずれかの単離されたペプチド。
[本発明1005]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2、4、7、8、9、14、16、18、22、25、26、30、33、34、35、36、38、39、41、43、44、45、47、48、49、53、65、66、76、79、84、101、110、111、112、113、114、117、118、121、122、123、および124からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチドであって、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されている、本発明1004の単離されたペプチド。
[本発明1006]
以下の特徴の一方または両方を有する、本発明1005の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている、および
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている。
[本発明1007]
ＨＬＡ−Ａ2との関連において、以下からなる群より選択される少なくとも1つの置換を有する、本発明1005の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から2番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。
[本発明1008]
本発明1001〜1007のいずれかの単離されたペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1009]
ＣＴＬを誘導するための組成物であって、本発明1001〜1006のいずれかの1種類もしくは複数種のペプチド、または本発明1008の1種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1010]
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、本発明1001〜1006のいずれかの1種類もしくは複数種のペプチド、または本発明1008の1種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
[本発明1011]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ＊2402またはＨＬＡ−Ａ＊0201である対象への投与のために製剤化される、本発明1010の薬学的組成物。
[本発明1012]
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
（ａ）ＡＰＣを、本発明1001〜1007のいずれかのペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
（ｂ）本発明1001〜1007のいずれかのペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
[本発明1013]
以下からなる群より選択される1つの段階を含む、ＣＴＬを誘導する方法：
（ａ）ＣＤ8陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明1001〜1007のいずれかのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階、
（ｂ）ＣＤ8陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明1001〜1007のいずれかのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、および
（ｃ）本発明1001〜1007のいずれかのペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階。
[本発明1014]
ＨＬＡ抗原と本発明1001〜1007のいずれかのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
[本発明1015]
本発明1013の方法によって誘導される、本発明1014のＡＰＣ。
[本発明1016]
本発明1001〜1007のいずれかのペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
[本発明1017]
本発明1014の方法によって誘導される、本発明1016のＣＴＬ。
[本発明1018]
本発明1001〜1007のいずれかのペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
[本発明1019]
以下の段階を含む、がんを診断する方法：
（ａ）以下からなる群より選択される方法により、対象由来の生体試料中の遺伝子の発現レベルを測定する段階：
（ｉ）Ｃ6ｏｒｆ167遺伝子のｍＲＮＡを検出すること、
（ｉｉ）Ｃ6ｏｒｆ167遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、および
（ｉｉｉ）Ｃ6ｏｒｆ167遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性を検出すること；ならびに
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較して、段階（ａ）で測定された発現レベルが上昇していることが、がんの存在と関連づけられる段階。
[本発明1020]
段階（ａ）で測定された発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも10％高い、本発明1019の方法。
[本発明1021]
がんが、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍の群より選択される、本発明1019の方法。
[本発明1022]
段階（ａ）で測定される発現レベルが、Ｃ6ｏｒｆ167遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定される、本発明1019の方法。
[本発明1023]
段階（ａ）で測定される発現レベルが、Ｃ6ｏｒｆ167タンパク質に対する抗体の結合を検出することにより測定される、本発明1019の方法。
[本発明1024]
対象由来の生体試料が生検材料、痰、血液、胸水、または尿を含む、本発明1019の方法。
[本発明1025]
がんの診断に使用するためのキットであって、以下からなる群より選択される試薬を含む、キット：
（ａ）Ｃ6ｏｒｆ167遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）Ｃ6ｏｒｆ167遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬、および
（ｃ）Ｃ6ｏｒｆ167遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
[本発明1026]
本発明1001〜1007のいずれかのペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
[本発明1027]
本発明1001〜1007のペプチドのいずれかに対する抗体またはその断片。
[本発明1028]
本発明1001〜1007のペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
[本発明1029]
本発明1001〜1007のペプチドのいずれか、本発明1008のヌクレオチド、または本発明1027の抗体を含む診断キット。
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明の様々な局面および適用は、図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【図１ａ−ｊ】図１ａ〜ｊは、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ａ）〜（ｊ）から構成される。以下のウェル番号中のＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で刺激したウェル＃１（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−４０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）で刺激した＃１および＃３（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）で刺激した＃４（ｃ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−４８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）で刺激した＃１および＃７（ｄ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１１７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）で刺激した＃７（ｅ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激した＃５（ｆ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−５３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）で刺激した＃３および＃４（ｇ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−３１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）で刺激した＃５（ｈ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）で刺激した＃３（ｉ）、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−８５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）で刺激した＃１および＃７（ｊ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図１ｋ−ｔ】図１ｋ〜ｔは、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ｋ）〜（ｔ）から構成される。以下のウェル番号中のＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）で刺激した＃３および＃６（ｋ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）で刺激した＃１および＃２（ｌ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−６２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）で刺激した＃４および＃８（ｍ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−４２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）で刺激した＃１（ｎ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）で刺激した＃１および＃５（ｏ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−４７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）で刺激した＃４および＃５（ｐ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−２５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）で刺激した＃４（ｑ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−１９４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）で刺激した＃２（ｒ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）で刺激した＃７（ｓ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−５１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）で刺激した＃３（ｔ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図１ｕ−ｚ】図１ｕ〜ｚは、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ｕ）〜（ｚ）から構成される。以下のウェル番号中のＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−３１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）で刺激した＃３（ｕ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−５９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）で刺激した＃２（ｖ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）で刺激した＃１および＃３（ｗ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）で刺激した＃７（ｘ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）で刺激した＃３（ｙ）、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−８５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）で刺激した＃２（ｚ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２ａ−ｈ】図２ａ〜ｈは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ａ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ｂ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ｃ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（ｄ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ｅ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ｆ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２（ｇ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５（ｈ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｈ）から構成される。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２ｉ−ｎ】図２ｉ〜ｎは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（ｉ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（ｊ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３（ｋ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（ｌ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４（ｍ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９（ｎ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（ｉ）〜（ｎ）から構成される。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図３】図３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ａ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ｂ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ｃ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ｄ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ｅ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（ｆ）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈により樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｆ）から構成される。結果から、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ａ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ｂ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ｃ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ｄ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ｅ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（ｆ）による刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ａ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ｂ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ｃ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ｄ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ｅ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（ｆ）をパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図４】図４は、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｄ）から構成される。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、または全長Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１１７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）（ｃ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−６２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）（ｄ）を用いて樹立されたＣＴＬ株は、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２（三角）またはＣ６ｏｒｆ１６７（丸）のいずれか一方を発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【図５】図５は、腫瘍組織、細胞株、および正常組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７発現の解析結果を示す。パートＡは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって検出された、臨床肺癌試料１５例［肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および肺小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；上部］、臨床食道癌試料１０例（上部パネル）、肺癌細胞株１５例、および食道癌細胞株１０例（下部パネル）におけるＣ６ｏｒｆ１６７の発現を示す。パートＢは、正常ヒト組織１６例におけるＣ６ｏｒｆ１６７転写産物のノーザンブロット分析を示す。陽性のシグナルは、精巣および小腸においてのみ観察された。
【図６ａ−ｆ】図６ａ〜ｆは、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ａ）〜（ｆ）から構成される。以下のウェル番号中のＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）で刺激したウェル＃４（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−１３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）で刺激した＃６（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）で刺激した＃４（ｃ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）で刺激した＃６（ｄ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）で刺激した＃７（ｅ）、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）で刺激した＃１、＃３、および＃６（ｆ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。対照的に、陰性データの典型であるが、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−９１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）で刺激したＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生は観察されなかった（ｓ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図６ｇ−ｌ】図６ｇ〜ｌは、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ｇ）〜（ｌ）から構成される。以下のウェル番号中のＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）で刺激した＃１（ｇ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）で刺激した＃３（ｈ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５７７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）で刺激した＃５（ｉ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）で刺激した＃５および＃７（ｊ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）で刺激した＃４（ｋ）、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）で刺激した＃１（ｌ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。対照的に、陰性データの典型であるが、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−９１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）で刺激したＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生は観察されなかった（ｓ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図６ｍ−ｒ】図６ｍ〜ｒは、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ｍ）〜（ｒ）から構成される。以下のウェル番号中のＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）で刺激した＃１（ｍ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１１５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）で刺激した＃３（ｎ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）で刺激した＃７（ｏ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）で刺激した＃６（ｐ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）で刺激した＃６（ｑ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−９６５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）で刺激した＃８（ｒ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。対照的に、陰性データの典型であるが、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−９１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）で刺激したＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生は観察されなかった（ｓ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図６ｓ】図６ｓは、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す写真から構成される。陰性データの典型であるが、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−９１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）で刺激したＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生は観察されなかった（ｓ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図７ａ−ｄ】図７ａ〜ｄは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって検出された、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−１３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）（ｃ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）（ｄ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｄ）から構成される。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図７ｅ−ｊ】図７ｅ〜ｊは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって検出された、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）（ｅ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）（ｆ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）（ｇ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）（ｈ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５７７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）（ｉ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）（ｊ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ｅ）〜（ｊ）から構成される。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図７ｋ−ｎ】図７ｋ〜ｎは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって検出された、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）（ｋ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）（ｌ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）（ｍ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）（ｎ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ｋ）〜（ｎ）から構成される。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図８ａ−ｆ】図８ａ〜ｆは、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−１３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）（ｃ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）（ｄ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）（ｅ）、および  Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）（ｆ）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈により樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｆ）から構成される。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図８ｇ−ｊ】図８ｇ〜ｊは、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）（ｇ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）（ｈ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）（ｉ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）（ｊ）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈により樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフ（ｇ）〜（ｊ）から構成される。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしなかった標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図９】図９は、６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフ、（ａ）および（ｂ）から構成される。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１または全長Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）を用いて樹立されたＣＴＬ株（ａ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）を用いて樹立されたＣＴＬクローン（ｂ）は、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。対照的に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角）またはＣ６ｏｒｆ１６７（丸）のいずれか一方を発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
【００２７】
Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも１つ」を意味する。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２９】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
【００３０】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
【００３１】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。
【００３２】
本明細書で使用する「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、および特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。薬学的組成物に関するそのような用語は、有効成分と担体を構成する不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することにより作製される任意の組成物を包含する。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、本発明の足場構造ポリファーマコフォアをある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
【００３３】
特記しない限り、「がん」という用語は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を過剰発現するがんまたは腫瘍を指し、その例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球の亜群を指す。
【００３５】
特記しない限り、「ＨＬＡ−Ａ２４」という用語は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２などのサブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２４型を指す。
【００３６】
特記しない限り、本明細書で使用する「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６などのサブタイプを指す。
【００３７】
特記しない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の物質の組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
【００３８】
本発明の方法および組成物ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、広がり、もしくは転移能の減少などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」と見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００３９】
本発明の方法および組成物ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられて、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含み得る。
【００４０】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の成長の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００４１】
本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
【００４２】
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている用語と同じ意味を有する。
【００４３】
ＩＩ．ペプチド
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、Ｃ６ｏｒｆ１６７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）由来のペプチドを分析して、それらが、通常見られるＨＬＡ対立遺伝子であるＨＬＡ−Ａ２４またはＡ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。
【００４４】
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２４に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。候補ペプチドは以下のペプチドである：
0005728759.tif 000002
。
【００４５】
さらに、これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した：
0005728759.tif 000003
。
【００４６】
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下のペプチドを、免疫療法の候補ペプチドと見なす：
0005728759.tif 000004
0005728759.tif 000005
。
【００４７】
さらに、これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した：
0005728759.tif 000006
。
【００４８】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書におけるこれらの結果から、Ｃ６ｏｒｆ１６７がＣＴＬによって認識される抗原であること、および前記ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２によって拘束されるＣ６ｏｒｆ１６７のエピトープペプチドであることが実証される。
【００４９】
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子は、例えば、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍のがん細胞および組織を含むがん細胞および組織で過剰発現するが、ほとんどの正常器官では発現しないため、これは免疫療法のための優れた標的である。したがって本発明は、ＣＴＬに認識されるＣ６ｏｒｆ１６７由来のエピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個からなるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個からなるペプチド）を提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１および６３〜１５１の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。
【００５０】
一般的に、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75およびNielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17に記載されているソフトウェアプログラムのような、例えばインターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラムを用いて、インシリコで様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性を算出することができる。例えば、Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220等に要約されているParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75、Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81、Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424、Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003、Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17、およびNielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796に記載されているように、ＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性を決定する方法は、例えば、Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190；Protein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって、そのようなソフトウェアプログラムを使用して、ＨＬＡ抗原と高い結合親和性を有するＣ６ｏｒｆ１６７由来の断片を選択することができる。したがって本発明は、そのような公知のプログラムによってＨＬＡ抗原と結合すると判定される、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来の任意の断片から構成されるペプチドを包含する。さらに、そのようなペプチドは、全長Ｃ６ｏｒｆ１６７からなるペプチドを含み得る。
【００５１】
本発明のノナペプチドおよびデカペプチドには、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドを含む、ＨＬＡ抗原に対する結合親和性を有するペプチドを包含する。そのようなペプチドは、例えば約４０アミノ酸未満であり、多くの場合には約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００５２】
一般的に、あるペプチド中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、付加、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能、ならびに１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加および／または置換されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１および６３〜１５１の中より選択されるアミノ酸配列の双方を有する。
【００５３】
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。したがって、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質の類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存するのが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８４を参照されたい）。
【００５４】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
【００５５】
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（挿入、付加、および／または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個もしくは３個またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満、または１〜５％である。
【００５６】
免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、ＣＴＬを誘導するばかりでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（J Immunol 1994, 152: 3913；Immunogenetics 1995, 41: 178；J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。
【００５７】
例えば、ＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を増大させるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシンもしくはメチオニンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をバリンもしくはロイシンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１のアミノ酸配列のＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。
【００５８】
あるいは、ＨＬＡ−Ａ２結合親和性を増大させるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３〜１５１のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されている、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３〜１５１のアミノ酸配列のＣ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３〜１５１の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。
【００５９】
末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元のものと同等であるかまたはより優れたものであり得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
【００６０】
本発明はまた、１個、２個、または数個のアミノ酸の付加もまた、本発明のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加することができることを企図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００６１】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、まず第一に、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
【００６２】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００６３】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。
【００６４】
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、７、８、９、１４、１６、１８、２２、２５、２６、３０、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５３、６５、６６、７６、７９、８４、１０１、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、および１２４によって示されるアミノ酸配列の中より選択されるノナペプチドまたはデカペプチドが、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが判明した。したがって、これらのペプチドは本発明の例示的な好ましい態様である。
【００６５】
さらに、相同性分析の結果から、これらのペプチドが任意の他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意な相同性を有していないことが示された。そのため、免疫療法に用いた場合に、未知のまたは望ましくない免疫応答が起きる可能性は低くなっている。したがって、この局面からもまた、これらのペプチドはがん患者においてＣ６ｏｒｆ１６７に対する免疫を誘発するのに使用される。よって、本発明のペプチドは、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、７、８、９、１４、１６、１８、２２、２５、２６、３０、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５３、６５、６６、７６、７９、８４、１０１、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、および１２４の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００６６】
上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他のペプチドに連結させることもできる。適切なペプチドの例には、本発明のペプチド、または他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。ペプチド間の適切なリンカーは当技術分野で周知であり、これには、例えばＡＡＹ（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315）、またはＫ（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715）が含まれる。
【００６７】
例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを介する免疫応答を増大させるために、Ｃ６ｏｒｆ１６７ではない腫瘍関連抗原ペプチドを実質的に同時に使用することもできる。がん細胞が２種類以上の腫瘍関連遺伝子を発現し得ることは、十分に確立されている。したがって、特定の対象がさらなる腫瘍関連遺伝子を発現するかどうかを判定すること、ならびに続いて本発明によるＣ６ｏｒｆ１６７組成物またはワクチン中に、そのような遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含めることは、当業者の慣例的な実験法の範囲内である。
【００６８】
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの例は当業者に公知であり（例えば、Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995を参照されたい）、本明細書に開示したものと同様の様式で本発明において用いることができる。したがって当業者は、１種類もしくは複数種のＣ６ｏｒｆ１６７ペプチドおよびＣ６ｏｒｆ１６７ではないペプチドの１種類もしくは複数種を含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を、分子生物学の標準的な手順を用いて容易に調製することができる。
【００６９】
そのような上記の連結ペプチドを本明細書では「ポリトープ」と称し、これはすなわち、様々な配置（例えば、連鎖状、重複）で連結され得る、２つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性または免疫応答刺激性ペプチドの群である。ポリトープ（または該ポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫化プロトコールで例えば動物に投与して、免疫応答の促進、増強、および／または誘発における該ポリトープの有効性を試験することができる。
【００７０】
ペプチドを直接的にまたは隣接配列の使用により連結してポリトープを形成することができ、またポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である（例えば、Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995；Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997；Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996；Tarn et al., J Exp. Med. 171(1):299-306, 1990を参照されたい）。様々な数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免疫応答の増大における有効性について試験することができる。
【００７１】
本発明のペプチドはまた、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。適切な物質の例には、例えば、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。このような種類の修飾を行って、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはペプチドを安定化することができる。
【００７２】
例えば、ペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のペプチドに適合させることもできる。ペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生体媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
【００７３】
さらに、上述したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基により置換、欠失、または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例示的な方法は以下の段階を含む：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
ｂ：該ペプチドの活性を決定する段階、
ｃ：元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
【００７４】
本明細書において、アッセイする活性には、ＭＨＣ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬ誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
【００７５】
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「Ｃ６ｏｒｆ１６７ペプチド」または「Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチド」と記載することもできる。
【００７６】
ＩＩＩ．Ｃ６ｏｒｆ１６７ペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
【００７７】
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えば当該ペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
【００７８】
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）, 丸善, 1975；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）, 丸善, 1985；
（ｖ）「続医薬品の開発」（日本語）, 第１４巻（ペプチド合成）, 広川書店, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００７９】
あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.編) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００８０】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１９８４６８．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定される任意の位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に記載されている。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適切に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００８３】
組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することもできる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されている固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することもできる。
【００８４】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報  特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
【００８５】
前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ＊２４０２ならびにＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が広く一般的であり、したがって日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現するＡ２４型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、Ａ２４０２、Ａ＊０２０１、およびＡ＊０２０６などのサブタイプもまた使用される。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを取得するために、天然のＣ６ｏｒｆ１６７部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または付加を行うことができる。
【００８６】
本発明のエキソソームに対してＡ２４型ＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１の中より選択される配列を有するペプチドが使用される。
【００８７】
あるいは、本発明のエキソソームに対してＡ２型ＨＬＡ抗原を用いる場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３〜１５１の中より選択される配列を有するペプチドが使用される。
【００８８】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成された複合体を自身の表面上に提示する単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してもよく、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、ワクチンとして投与することができる。
【００８９】
前記ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００９０】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。「ＡＰＣを誘導する」という語句は、細胞を本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成された複合体を細胞の表面上に提示させることを含む。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
【００９１】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００９２】
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。あるいは、本発明によれば、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供する。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドを提供する。段階ｂによって得られたＡＰＣは、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍などであるがこれらに限定されないがんを治療および／または予防するためのワクチンとなり得る。
【００９３】
本発明の１つの局面によると、前記ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語における高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などの、当分野において従来より実施されている様々な方法が含まれる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を経て本発明の部分ペプチドが提示される。
【００９４】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれか１つに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれか１つによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
【００９５】
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）こと、または（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と前記ペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させること、または（４）本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入することによって得ることができる。そのようなＡＰＣまたはエキソソームは上記の方法によって調製することができ、（４）の方法の詳細は「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において以下に記載する。
【００９６】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と併用して投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、がん細胞のようにＣ６ｏｒｆ１６７を内因的に発現する細胞、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子をトランスフェクトした細胞であってよく、かつ本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。
【００９７】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、Ｃ６ｏｒｆ１６７を提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１種類または複数種のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＴＣＲを分析するためにはＰＣＲ法が好ましい。分析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）、および３'側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（5'-tcagaaatcctttctcttgac-3'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）であってよいが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、Ｃ６ｏｒｆ１６７ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
【００９８】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする既成の組成物を提供する。
【００９９】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に入手可能な組成物を提供する。
【０１００】
特異的ＴＣＲとは、ＴＣＲがＴ細胞の表面上に存在する場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対するＴ細胞特異的活性を付与し得る受容体である。上記複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、その好ましい例には、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いるＨＬＡ多量体染色分析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法が含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、細胞表面上にＴＣＲを発現しているＴ細胞がＴＣＲによって細胞を認識すること、およびシグナルが細胞内で伝達されることを確認することができる。上記の複合体がＴ細胞表面上に存在する場合に、該複合体がＴ細胞細胞傷害活性を付与し得るという確認もまた、公知の方法によって行うことができる。好ましい方法には、例えば、クロム放出アッセイ法などのＨＬＡ陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が含まれる。
【０１０１】
また本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ペプチド、例えばＨＬＡ−Ａ２４との関連ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１、およびまたＨＬＡ−Ａ２との関連ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３〜１５１のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を形質導入することによって調製されるＣＴＬを提供する。
【０１０２】
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知のインビトロ培養法によって増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＣＴＬは、治療または予防を必要としている患者におけるがんの治療または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（その内容が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２００６／０３１２２１を参照されたい）。
【０１０３】
予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減する任意の働きを含む。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させること、血管新生を軽減することを目的とした広範囲の予防的治療を含む。
【０１０４】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【０１０５】
ＩＸ．薬学的組成物
Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現は、正常組織と比較して、例として膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって本発明は、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの１種類または複数種を有効成分として含む組成物を提供する。あるいは、薬学的組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれか１つを標的とする前述のＣＴＬもまた、本発明の薬学的な物質および組成物の有効成分として用いることができる。
【０１０６】
本発明の薬学的な物質および組成物はまた、ワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
【０１０７】
本発明の薬学的組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんを治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。
【０１０８】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０９】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療または予防において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１１０】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質を製造するための方法または工程であって、有効成分としての以下の中より選択される有効成分と、薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１１１】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１１２】
本発明により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープペプチドまたはその候補であることが判明し、またＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３〜１５１の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドまたはその候補であることが判明した。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３〜１５１のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的組成物は、ＨＬＡ抗原がそれぞれＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２である対象への投与に特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的組成物にも当てはまる。
【０１１３】
本発明の薬学的組成物によって治療されるがんは、非限定的に、例えば膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７が関与するあらゆる種類のがんを含む。
【０１１４】
本発明の薬学的組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、これに限定されない。
【０１１５】
必要に応じて、本発明の薬学的組成物は、その他の治療物質が、例えば本発明のペプチドのいずれかなどの有効成分の抗腫瘍効果を阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症組成物、鎮痛剤、化学療法薬等を含み得る。医薬自体にその他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数のその他の薬理学的組成物と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的組成物の量は、例えば、使用する薬理学的組成物の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に依存する。
【０１１６】
本明細書において具体的に言及される成分に加えて、本発明の薬学的組成物は、問題の製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的なその他の組成物も含み得ることが理解されるべきである。
【０１１７】
本発明の一態様において、本発明の薬学的組成物を、例えばがんなどの治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【０１１８】
本発明の薬学的組成物を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた添付文書を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
【０１１９】
必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【０１２０】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的組成物
本発明のペプチドは、薬学的組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化することもできる。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【０１２１】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種類またはそれ以上から構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いに結合させてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、対象からＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を取り出し、次に本発明のペプチドにより刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再度投与して、該対象においてＣＴＬを誘導し、結果として、腫瘍関連内皮細胞に対する攻撃性を増大させることができる。
【０１２２】
有効成分として本発明のペプチドを含む、がんの治療および／または予防のための薬学的組成物は、細胞性免疫を効率的に確立することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒へ製剤化することによって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。本明細書において企図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【０１２４】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。
【０１２５】
いくつかの態様において、本発明の薬学的組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る組成物として同定された。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【０１２６】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【０１２７】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的組成物
本発明の薬学的組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ  ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１２８】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１２９】
ポリヌクレオチドの患者内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【０１３０】
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al.編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【０１３１】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が使用される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【０１３２】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、ＡＰＣおよびＣＴＬを誘導することができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、それらのＣＴＬ誘導能を任意の他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的組成物のいずれかを用いてＣＴＬを誘導することができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に考察されるように、ＡＰＣを誘導することもできる。
【０１３３】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
【０１３４】
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階：、および
ｂ：段階ａのＡＰＣを該ペプチドと接触させる段階。
【０１３５】
前記ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣはＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有するため、好ましくはＤＣを用いることができる。本発明の任意のペプチドを単独で、または本発明の他のペプチドと共に用いることができる。
【０１３６】
一方、本発明のペプチドを対象に投与した場合、ＡＰＣは該ペプチドとインビボで接触し、結果的に、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって本発明は、本発明のペプチドを対象に投与する段階を含む。同様に、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与した場合、本発明のペプチドが発現し、これがＡＰＣとインビボで接触し、結果的に、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与する段階を含む。「発現可能な形態」については、「ＩＸ．薬学的組成物  （２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的組成物」の章において上述した。
【０１３７】
本発明はまた、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することを含む。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；、および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように行うことができる。
【０１３８】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはエキソソームもしくはＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。
【０１３９】
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与すると、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む。
【０１４０】
あるいは、それらをエクスビボで用いることによってＣＴＬを誘導し、ＣＴＬの誘導後に活性化ＣＴＬを対象に戻すこともできる。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ．対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ．段階ａのＡＰＣを前記ペプチドと接触させる段階、および
ｃ．段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
【０１４１】
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効率的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
【０１４２】
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち、本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを共培養する段階を含み得る。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。
【０１４３】
さらに、本発明のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することもできる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
【０１４４】
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
【０１４５】
ＸＩ．がんを検出または診断する方法：
本発明はまた、がんを検出または診断する方法を提供する。Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現が、いくつかの種類のがん細胞株および臨床がん組織において特異的に上昇することが見出された（表１および図５）。したがって、本明細書において同定された遺伝子、ならびにそれらの転写産物および翻訳産物には、がんのマーカーとしての、および細胞試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現を測定することによる、診断的有用性がある。
【０１４６】
具体的には、本発明は、生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを測定し、測定された発現レベルを、がん性である（以下「がん性対照」と称する）かまたは非がん性である（以下「正常対照」と称する）ことが判明している試料において測定された対照レベルと比較することにより、生体試料または生体試料の由来元である対象におけるがんの存在を検出する方法を提供する。本方法によっておよび本発明の方法の組成物によって検出されるがんは、Ｃ６ｏｒｆ１６７の上方制御に関連する任意のがんであってよい。そのようながんの例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
別の局面において、本発明はまた、対象におけるがんを診断する方法を提供する。上記のがんを検出する方法によって得られた結果に基づいて、診断を行うことができる。
【０１４８】
本発明に従って、対象の状態を調べるための中間結果が提供されてもよい。そのような中間結果をさらなる情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患している可能性があると診断する上で、医師、看護師、または他の医療従事者を補助することができる。あるいは、本発明を用いて対象由来の組織中のがん性細胞を検出し、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。
【０１４９】
具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［１０］を提供する：
［１］以下の段階を含む、がんを検出または診断する方法：
（ａ）生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７のアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを測定する段階；および
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較して、測定された発現レベルが上昇していることが、疾患の存在と関連づけられる段階。
［２］発現レベルが正常対照レベルより少なくとも１０％高い、［１］記載の方法。
［３］発現レベルが、以下の中より選択される方法によって測定される、［１］記載の方法：
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、および
（ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性を検出すること。
［４］がんが、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍の群より選択される、［１］記載の方法。
［５］発現レベルが、該遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定される、［３］記載の方法。
［６］発現レベルが、該遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を該遺伝子の発現レベルとして検出することにより測定される、［３］記載の方法。
［７］生体試料が生検材料、痰、血液、胸水、または尿を含む、［１］記載の方法。
［８］対象由来の生体試料が上皮細胞を含む、［１］記載の方法。
［９］対象由来の生体試料ががん細胞を含む、［１］記載の方法。
［１０］対象由来の生体試料ががん性上皮細胞を含む、［１］記載の方法。
【０１５０】
あるいは、本発明は、対象由来の膀胱組織、子宮頸部組織、胆管組織（肝内胆管組織）、白血球、食道組織、胃組織、肺組織、リンパ組織、骨組織、腎組織、肺組織、軟部組織、または精巣組織試料中のがん細胞を検出または同定する方法であって、対象由来の生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する段階を含み、該発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該組織中のがん細胞の存在または疑いが示される方法を提供する。
【０１５１】
そのような結果をさらなる情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患していると診断する上で、医師、看護師、または他の医療従事者を補助することができる。換言すれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば、本発明に従って、対象から得られた組織中のがん細胞の存在に関して疑問がある場合には、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、血中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む疾患の異なる局面を考慮して、臨床決定に至ることができる。例えば、血中のいくつかの周知の診断的腫瘍マーカーは、以下の通りである。
【０１５２】
膀胱癌；
ＩＡＰ、ＳＣＣ、ＮＭＰ、ＢＦＰ、およびＴＰＡ
子宮頸癌；
ＳＣＣ、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡ、またはＣＡ１２５
胆管細胞癌；
ＣＥＡ、またはＣＡ１９−９
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；
ＴＫ活性
食道癌；
ＣＥＡ、ＤＵＰＡＮ−２、ＩＡＰ、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＬＸ、または  Ｓｐａｎ−１
胃癌；
ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、またはＮＣＣ−ＳＴ−４３９
びまん性胃癌；
ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ｈｓＣＲＰ、またはＰＧ  Ｉ／ＩＩ
肺癌；
ＡＰ、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＫＭＯ−１、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＴＰＡ、ＣＳＬＥＸ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、またはＣＹＦＲＡ
リンパ腫；
ＩＡＰ、Ｓｐａｎ−１、またはＴＰＡ
骨肉腫；
ＣＤ４４、またはＡＬＰ
腎癌；
ＢＦＰ、またはＩＡＰ
肺腺癌（ＡＤＣ）；
ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＥＡ、またはＳＬＸ
肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）；
ＳＣＣ、またはＣｙｆｒａ
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；
Ｐｒｏ−ＧＲＰ、またはＮＳＥ
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）；
ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＳＣＣ、またはＣｙｆｒａ
精巣腫瘍；
ＡＦＰ、またはＢＦＰ。
【０１５３】
すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間結果として役立つ。
【０１５４】
別の態様において、本発明は、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍の診断マーカーとして、対象由来の生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を検出する段階を含む、がんの診断マーカーを検出する方法を提供する。
【０１５５】
がんを検出または診断する方法を、以下、さらに詳細に説明する。
【０１５６】
本発明の方法によって診断される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
診断される対象から生体試料を採取して、診断を行うことが好ましい。目的のＣ６ｏｒｆ１６７の転写産物または翻訳産物を含む限り、測定のための生体試料として任意の生体材料を使用することができる。生体試料には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、生体試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがんの疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要に応じて、得られた身体組織および体液から細胞を精製し、その後これを生体試料として用いてもよい。
【０１５８】
本発明によれば、対象由来の生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写産物（すなわち、ｍＲＮＡ）レベルで測定することができる。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。アレイの使用は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながん特異的遺伝子）の発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、Ｃ６ｏｒｆ１６７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１９８４６８．２）の配列情報を使用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７のｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識で標識してもよく、該遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【０１５９】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によりプライマーを用いて、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写産物を定量してもよい。そのようなプライマーもまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、「実施例」で使用するプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４、１５５、１５６、および１５７）を、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出に使用することができるが、本発明はこれらに限定されない。
【０１６０】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、Ｃ６ｏｒｆ１６７のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化組成物の添加によって達成してもよい。
【０１６１】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物（すなわち、タンパク質）を検出してもよい。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の量を測定してもよい。翻訳産物として当該タンパク質の量を測定する方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。タンパク質を検出するためのこの種の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【０１６２】
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的分析により、染色強度を観察してもよい。すなわち、強力な染色の観察により、該タンパク質の存在の増加が示され、それと同時にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の高い発現レベルが示される。
【０１６３】
さらに、翻訳産物は、その生物活性に基づいて検出することもできる。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質はがん細胞の増殖に関与するようである。したがって、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の細胞増殖活性を、生体試料中に存在するＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の指標として用いることができる。
【０１６４】
さらに、診断の精度を向上させるために、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルに加えて、その他のがん関連遺伝子、例えばがんにおいて示差的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルをアッセイすることもできる。
【０１６５】
生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルよりも例えば１０％、２５％、もしくは５０％上回るか、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇している場合に、「上昇している」と見なされる。
【０１６６】
対照レベルは、試験生体試料と同時に、または疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、測定することができる。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象由来の試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の予め測定された発現レベルを分析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースであってよい。さらに、本発明の１つの局面によれば、生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定された複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生体試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態であることが判明している集団におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値＋／−２Ｓ．Ｄ．または平均値＋／−３Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
【０１６７】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生体試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、がん性生体試料から測定された対照レベルは、「がん性対照レベル」と称される。
【０１６８】
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、対象をがんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクがあると診断することができる。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることにより、対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクがあることが示される。
【０１６９】
試験生体試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
ＸＩＩ．がんを検出または診断するためのキット：
本発明はまた、本発明のＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドで治療され得るがんに罹患しているか、またはその疑いがある対象を診断または判定するための診断キットを提供し、このキットはまた、がんの予後を評価する際に、またはがん療法、特にがん免疫療法の有効性もしくは適用性をモニターする際にも使用され得る。診断または判定されるがんの例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。より詳細には、キットは、対象由来の細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み得ることが好ましく、そのような試薬は以下の群より選択される：
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬；および
（ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【０１７１】
Ｃ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、Ｃ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、Ｃ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＣ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれる。このような種類のオリゴヌクレオチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、Ｃ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０１７２】
一方、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を検出するのに適した試薬の例には、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識、および抗体を標識してそれらの標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０１７３】
さらに、例えば、生体試料中の発現したＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質による細胞増殖活性を測定することにより、生物活性を測定することもできる。例えば、生体試料の存在下で細胞を培養することができ、次に、例えば増殖の速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、生体試料の細胞増殖活性をアッセイすることができる。必要に応じて、Ｃ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の生物活性を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０１７４】
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。キットはさらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対するプローブまたはＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、がんでないことが判明している対象から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を備えた包装封入物（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、例えばガラスまたはプラスチックといった様々な材料から形成され得る。
【０１７５】
本発明の一態様として、試薬がＣ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を例えば多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより大量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＣ６ｏｒｆ１６７  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１７６】
さらなる態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその免疫原性断片を特異的に認識することができるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
【０１７７】
本明細書において企図する本発明のタンパク質の部分ペプチドおよび免疫原性断片の例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のペプチドまたはタンパク質を調製する方法は、上記の通りである。
【０１７８】
抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体の量との差を測定することにより、本発明のがんを診断する方法を行うことができる。対象の生体試料が該遺伝子の発現産物（Ｃ６ｏｒｆ１６７）に対する抗体を含み、この抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体の量が正常対照中の抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんに罹患していることが疑われる。
【０１７９】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合しているＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出する適切な方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
【０１８０】
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子と本発明のペプチドの四量体などのオリゴマー複合体を調製することができる。当該複合体を用いて、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することができる。
【０１８１】
本発明はさらに、本明細書に記載されるペプチドエピトープを用いて、対象の免疫応答を評価するための方法および診断薬を提供する。本発明の一態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いることができる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導され得る。特定の態様において、試薬として使用する組成物は、ペプチドエピトープを認識してこれに結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る任意の組成物であってよい。ペプチド試薬を免疫原として使用する必要はない。そのような分析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカインの染色、およびインターフェロン放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法などの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
【０１８２】
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174 : 94-96, 1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下に記載するように作製することができる。
【０１８３】
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシ末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンからなる四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンによって、四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような分析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１８４】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997、およびPenna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体からの患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬの有無について分析することができる。ＰＢＭＣを培養し、当該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について分析することができる。
【０１８５】
本ペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いることもできる。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて分析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を分析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい）、この抗体は、がんを診断、検出、またはモニターするための試薬として使用され得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１８６】
本発明のペプチドおよび組成物はさらなる用途をいくつか有し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７免疫原性ポリペプチドの発現または提示を特徴とする障害を診断または検出する方法を提供する。そのような方法は、生体試料中でのＣ６ｏｒｆ１６７  ＨＬＡ結合ペプチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７  ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現または提示を測定する段階を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現または提示は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドまたは該複合体を認識してこれに特異的に結合する抗体であってよい。腫瘍生検材料などの生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現は、Ｃ６ｏｒｆ１６７プライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、Ｃ６ｏｒｆ１６７増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示は、ＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
【０１８７】
好ましい診断法は、対象から単離された生体試料をＣ６ｏｒｆ１６７  ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な物質と接触させて、該生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７  ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触させる」とは、薬剤と生体試料中に存在するＣ６ｏｒｆ１６７  ＨＬＡ結合ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように、生体試料を、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、薬剤に十分に近接させて配置することを意味する。一般的に、薬剤と生体試料を接触させるための条件は、分子と生体試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための例示的な条件は、Low et al.に対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
【０１８８】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生体試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生体試料はインビボの組織であってよく、かつＣ６ｏｒｆ１６７免疫原性ポリペプチドに特異的な薬剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生体試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検材料、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生体試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療する対象から得られた腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０１８９】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法を用いて、診断を行うこともできる（例えば、Altman, J. D. et al., 1996, Science 274 : 94；Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法もまた提供されている。多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法はすべて、より慣例的なアッセイ法より少なくとも１０倍感度が高いようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177；Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859；Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413）。五量体（例えば、ＵＳ  ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ  ０２／０７２６３１）、およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Nature medicine 6. 631-637 (2002)）を使用することもできる。
【０１９０】
ＸＩＩＩ．免疫応答を誘導する方法
さらに本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７に関連する疾患に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患にはがんが含まれ、その例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９１】
本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む物質または組成物を投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与を企図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的組成物」の項、特に本発明の薬学的組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエキソソームおよびＡＰＣは、前記の「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項において詳述されている。
【０１９２】
本発明はまた、免疫応答を誘導する薬学的な組成物または物質を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含み得る方法を提供する。
【０１９３】
あるいは、本発明の方法は、以下を含むワクチンまたは薬学的な組成物もしくは物質を投与する段階を含み得る：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；または
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１９４】
本発明との関連において、Ｃ６ｏｒｆ１６７を過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。そのようながんの例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。したがって、有効成分を含むワクチンまたは薬学的な組成物もしくは物質を投与する前に、治療する対象におけるＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルが増強されているかどうかを確認することが好ましい。したがって一態様において、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７を（過剰）発現するがんの治療を必要とする患者において該がんを治療する方法を提供し、そのような方法は以下の段階を含む：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から得られた生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＣ６ｏｒｆ１６７を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
【０１９５】
あるいは、本発明はまた、Ｃ６ｏｒｆ１６７を過剰発現するがんを有する対象に投与するための、上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的な組成物もしくは物質を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドで治療する対象を同定する方法であって、対象由来の生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを測定する段階を含んでよく、該レベルが前記遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、対象が本発明のＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドで治療され得るがんを有している可能性があることが示される方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を、以下、より詳細に説明する。
【０１９６】
本発明に従って、対象から得られた生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを測定することができる。発現レベルは、例えば前記の「ＸＩ．がんを検出または診断する方法」に記載される方法に従って、測定することができる。
【０１９７】
一態様において、本発明は、（ｉ）対象が治療すべきがんを有する疑いがあるかどうかを診断する、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、そのような方法は以下の段階を含む：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを測定する段階；
ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、該対象をがん治療のために選択する段階。
【０１９８】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた生体試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを測定する段階；
ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルががん性対照レベルと比較して類似しているかまたは同等である場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、該対象をがん治療のために選択する段階。
【０１９９】
ＸＩＶ．抗体
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないものには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および／または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）は、Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現が関与するがんの治療において治療的に使用することができ、そのようながんの例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
本発明はまた、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１および６３〜１５１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイ法を提供する。そのようなアッセイ法は、必要に応じて、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはその断片を認識してそれと結合し得る１種類または複数種の抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体を含み得る。本発明との関連において、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体は、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１および６３〜１５１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験で確認することができる。すなわち、分析する抗体と全長Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとの間の結合が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１および６３〜１５１のアミノ酸配列からなる任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体が該断片に特異的に結合することが示される。本発明との関連において、そのような免疫学的アッセイ法は、様々な型の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
【０２０１】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイ法には、Ｔ細胞免疫原性アッセイ法（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイ法もまた含まれ得る。加えて、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７を発現するがんを検出し得る免疫学的画像化法を企図し、その例には、本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されない。そのようなアッセイ法は、Ｃ６ｏｒｆ１６７を発現するがんの検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に使用され、そのようながんの例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体をさらに含み得る。
【０２０３】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
【０２０４】
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片を含み得る。
【０２０５】
本明細書では、抗体を、Ｃ６ｏｒｆ１６７ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６１および６３〜１５１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるＣ６ｏｒｆ１６７の断片ペプチドを認識し得る。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明との関連において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
【０２０６】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
【０２０７】
任意の哺乳動物を前記抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【０２０８】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
【０２０９】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【０２１０】
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させるもう一方の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
【０２１１】
公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞を融合させることができる。
【０２１２】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
【０２１３】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
【０２１４】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
【０２１５】
あるいは、免疫したリンパ球などの、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
【０２１６】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
【０２１７】
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドの１種類または複数種に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
【０２１８】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０２１９】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０２２０】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０２２１】
上記のようにして得られた抗体は、均一になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０２２２】
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０２２３】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチドの断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
【０２２４】
本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
【０２２５】
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
【０２２６】
ＸＶ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用され得る。
【０２２７】
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に用いる場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１  Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1989)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０２２８】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０２２９】
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
【０２３０】
本発明をその特定の態様に関して本明細書において詳細に説明してきたが、前述の説明は事実上、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、慣例的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることを容易に理解するであろう。したがって本発明は、上記の説明によって規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって規定されることが意図される。
【実施例】
【０２３１】
材料および方法
実験１
細胞株および臨床試料
２３種類のヒト肺癌細胞株は、１９種類のＮＳＣＬＣ（Ａ４２７、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＬＣ３１９、ＰＣ−１４、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＮＣＩ−Ｈ１６６６、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＬＵ６１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＥＢＣ−１、ＬＸ１、およびＮＣＩ−Ｈ２１７０）、および４種類のＳＣＬＣ（ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、およびＳＢＣ−５）を含んでいた。ヒト食道癌細胞株は、９種類の扁平上皮癌（ＳＣＣ：ＴＥ１、ＴＥ２、ＴＥ３、ＴＥ４、ＴＥ５、ＴＥ６、ＴＥ８、ＴＥ９、およびＴＥ１０）、および１種類の腺癌（ＡＤＣ：ＴＥ７）を含んでいた。細胞はすべて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した適切な培地中で単層で培養し、５％ＣＯ２を含む加湿大気の雰囲気中で３７℃で維持した。
【０２３２】
ヒト小気道上皮細胞、ＳＡＥＣ（Cambrex Bio Science Inc., East Rutherford, NJ）もまた、使用した細胞のパネルに含めた。原発性ＮＳＣＬＣ試料は、インフォームドコンセントを得て予め入手していた。
【０２３３】
エプスタイン・バーウイルスをＨＬＡ−Ａ２４陽性ヒトＢリンパ球に形質転換することにより、Ａ２４リンパ芽球様細胞株（Ａ２４ＬＣＬ）を樹立した。アフリカミドリザル腎細胞株であるＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入した。
【０２３４】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
β−アクチン（ＡＣＴＢ）発現のレベルを定量的対照として、臨床肺癌試料および臨床食道癌試料のｍＲＮＡから調製した各一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈物を調製した。増幅用のプライマーセットは以下の通りであった：ＡＣＴＢに関して、
0005728759.tif 000007
および
0005728759.tif 000008
、Ｃ６ｏｒｆ１６７に関して、
0005728759.tif 000009
および
0005728759.tif 000010
。
【０２３５】
反応はいずれも、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）における、９５℃で５分の最初の変性、それに続く９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で６０秒の２２サイクル（ＡＣＴＢの場合）または３０サイクル（Ｃ６ｏｒｆ１６７の場合）を含んだ。
【０２３６】
ノーザンブロット分析
ヒト多組織ブロット（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、白血球を含む１６種類の正常組織；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を、Ｃ６ｏｒｆ１６７の３２Ｐ標識ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。Ｃ６ｏｒｆ１６７の部分長ｃＤＮＡは、プライマー
0005728759.tif 000011
および
0005728759.tif 000012
を用いてＲＴ−ＰＣＲによって調製した。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感スクリーンを用いて、−８０℃で７日間、ブロットのオートラジオグラフィーを行った。
【０２３７】
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に結合するＣ６ｏｒｆ１６７由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒのペプチドを、結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind）（Parker et al. (J Immunol 1994, 152(1): 163-75)、Kuzushima et al. (Blood 2001, 98(6): 1872-81)）を用いて予測した。これらのペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＳＩＧＭＡ（Ｓａｐｐｏｒｏ，  ＪＡＰＡＮ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０２３８】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常ボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非動化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２３９】
ＣＴＬ増殖手順
Riddell ら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２４０】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２４１】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０２４２】
プラスミドのトランスフェクション
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４の陰性細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０２４３】
結果
がんにおけるＣ６ｏｒｆ１６７発現の増強
ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて様々ながんから得られた広範な遺伝子発現プロファイルデータから、Ｃ６ｏｒｆ１６７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１９８４６８．２；例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５８）の発現が上昇していることが明らかになった。Ｃ６ｏｒｆ１６７発現は、対応する正常組織と比較して、膀胱癌中１３例、子宮頸癌２例中２例、胆管細胞癌１１例中８例、ＣＭＬ  ３３例中２０例、食道癌１５例中１１例、胃癌８例中５例、びまん性胃癌２例中２例、肺癌２例中１例、リンパ腫２例中２例、骨肉腫３例中２例、腎癌１２例中５例、ＳＣＬＣ４例中４例、軟部組織腫瘍１例中１例、および精巣腫瘍２例中１例において確かに上昇していた（表１）。
【０２４４】
（表１）正常対応組織と比較してがん組織においてＣ６ｏｒｆ１６７の上方制御が観察された症例の比率
0005728759.tif 000013
【０２４５】
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの予測
表２ａおよび２ｂは、Ｃ６ｏｒｆ１６７のＨＬＡ−Ａ２４結合９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する合計６１種類のペプチドを選択し、エピトープペプチドを決定するために調べた。
【０２４６】
（表２ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７に由来するＨＬＡ−Ａ２４結合９ｍｅｒペプチド
0005728759.tif 000014
開始位置は、Ｃ６ｏｒｆ１６７のＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」から導き出している。
【０２４７】
（表２ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７に由来するＨＬＡ−Ａ２４結合１０ｍｅｒペプチド
0005728759.tif 000015
開始位置は、Ｃ６ｏｒｆ１６７のＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」から導き出している。
【０２４８】
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性のＣ６ｏｒｆ１６７由来予測ペプチドによるＣＴＬの誘導、およびＣ６ｏｒｆ１６７由来ペプチドで刺激したＣＴＬ株の樹立
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１ａ〜ｚ）。以下のウェル番号は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：
Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で刺激した＃１（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−４０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）で刺激した＃１および＃３（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）で刺激した＃４（ｃ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−４８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）で刺激した＃１および＃７（ｄ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１１７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）で刺激した＃７（ｅ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激した＃５（ｆ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−５３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）で刺激した＃３および＃４（ｇ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−３１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）で刺激した＃５（ｈ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）で刺激した＃３（ｉ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−８５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）で刺激した＃１および＃７（ｊ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）で刺激した＃３および＃６（ｋ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）で刺激した＃１および＃２（ｌ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−６２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）で刺激した＃４および＃８（ｍ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−４２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）で刺激した＃１（ｎ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）で刺激した＃１および＃５（ｏ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−４７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）で刺激した＃４および＃５（ｐ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−２５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）で刺激した＃４（ｑ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−１９４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）で刺激した＃２（ｒ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）で刺激した＃７（ｓ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−５１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）で刺激した＃３（ｔ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−３１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）で刺激した＃３（ｕ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−５９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）で刺激した＃２（ｖ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）で刺激した＃１および＃３（ｗ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）で刺激した＃７（ｘ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）で刺激した＃３（ｙ）、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−８５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）で刺激した＃２（ｚ）。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で刺激した陽性ウェル番号＃１中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−４０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）で刺激した＃１中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）で刺激した＃４中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−４８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）で刺激した＃７中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１１７０（ＳＥＱ  ���Ｄ  ＮＯ：９）で刺激した＃７中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−５３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）で刺激した＃３中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）で刺激した＃３中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−８５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）で刺激した＃１中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）で刺激した＃６中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）で刺激した＃２中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−６２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）で刺激した＃８中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）で刺激した＃１中の細胞、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−３１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）で刺激した＃３中の細胞、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−９１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）で刺激した＃３中の細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した。それらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ａ〜ｎ）。それにより、すべてのＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが示された。一方、表２に示した他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊２４０２との結合活性を有する可能性があるものの、それらのペプチドによる刺激によって強力なＩＦＮ−γ産生は検出され得なかった（データは示さず）。結果として、これにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来の２６種類のペプチドが、強力なＣＴＬを誘導し得るペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
【０２４９】
Ｃ６ｏｒｆ１６７特異的ペプチドに対するＣＴＬクローンの樹立
「材料および方法」に記載したように、ＣＴＬ株から限界希釈によりＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図３において、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−４０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（ｃ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１１７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）（ｄ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−５３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）（ｅ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）（ｆ）で刺激したＣＴＬクローンから、強力なＩＦＮ−γ産生が測定された。
【０２５０】
Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株を、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を内因的に発現する標的細胞を認識するそれらの能力について調べた。全長Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を外因的に発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株をエフェクター細胞として用いて試験した。全長Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊  ２４０２のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図４において、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１１７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−６２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）で刺激したＣＴＬは、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがってこれらのデータにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−２３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−９−１１７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ２４−１０−６２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）のペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子と共に標的細胞上に提示され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。この結果から、Ｃ６ｏｒｆ１６７に由来するこれらのペプチドが、Ｃ６ｏｒｆ１６７を発現する腫瘍を有する患者に対するがんワクチンとして適している可能性があることが示される。
【０２５１】
抗原ペプチドの相同性分析
0005728759.tif 000016
で刺激したＣＴＬは、有意でかつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、
0005728759.tif 000017
の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列について相同性分析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性分析の結果から、
0005728759.tif 000018
の配列は固有のものであることが示され、したがって本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある非関連分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどない。
【０２５２】
結論として、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来の新規なＨＬＡ−Ａ２４エピトープペプチドが同定された。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７のエピトープペプチドががん免疫療法に適用できる可能性があることが実証された。
【０２５３】
肺癌、食道癌、および正常組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７の発現
ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、大部分の肺癌（ＷＯ２００７／０１３６６５）および／または食道癌において高度にトランス活性化されていた成分をスクリーニングし、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子が、がんを診断および／または治療するための優れた候補標的であると同定された。この遺伝子は、肺癌および食道癌の大部分でより高いレベルの発現を示した。続いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により、ＮＳＣＬＣ症例１０例中７例（ＡＤＣ５例中３例およびＳＣＣ５例中４例）およびＳＣＬＣ症例５例中すべて（図５Ａ、右上パネル）、ならびにＮＳＣＬＣ細胞株１０例中すべておよびＳＣＬＣ細胞株５例中すべて（図５Ａ、右下パネル）において、そのトランス活性化が確認された。Ｃ６ｏｒｆ１６７の上方制御は、食道癌症例１０例中７例および食道癌細胞株１０例中９例においても検出された（図５Ａ、左上および左下パネル）。
【０２５４】
プローブとしてＣ６ｏｒｆ１６７  ｃＤＮＡを用いるノーザンブロット分析により、調べた１６種類のヒト組織のうち、専ら精巣および小腸において７．５−ｋｂの転写産物が同定された（図５Ｂ）。
【０２５５】
実験２
細胞株
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性Ｂリンパ芽球様細胞株であるＴ２、およびアフリカミドリザル腎細胞株であるＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入した。
【０２５６】
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合するＣ６ｏｒｆ１６７由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒのペプチドを、結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind）（Parker et al. (J Immunol 1994, 152(1): 163-75)、Kuzushima et al. (Blood 2001, 98(6): 1872-81)）を用いて予測した。これらのペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，  Ｔｅｘａｓ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定した。ペプチドをジメチルスルホキシドに２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０２５７】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非動化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２５８】
ＣＴＬ増殖手順
Riddell ら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２５９】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２６０】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０２６１】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ０２のいずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＡＧＧＳベクターおよびｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、カタログ番号６３１６０５）にクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１のヌル細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０２６２】
結果
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの予測
表３ａおよび３ｂは、Ｃ６ｏｒｆ１６７のＨＬＡ−Ａ０２結合９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ０２結合能を有する合計９０種類のペプチドを選択し、エピトープペプチドを決定するために調べた。
【０２６３】
（表３ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７に由来するＨＬＡ−Ａ２結合９ｍｅｒペプチド
0005728759.tif 000019
【０２６４】
（表３ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７に由来するＨＬＡ−Ａ２結合１０ｍｅｒペプチド
0005728759.tif 000020
0005728759.tif 000021
【０２６５】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣ６ｏｒｆ１６７由来予測ペプチドによるＣＴＬの誘導
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図６ａ〜ｒ）。以下のウェル番号は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）で刺激した＃４（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−１３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）で刺激した＃６（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）で刺激した＃４（ｃ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）で刺激した＃６（ｄ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）で刺激した＃７（ｅ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）で刺激した＃１、＃３、および＃６（ｆ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）で刺激した＃１（ｇ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）で刺激した＃３（ｈ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５７７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）で刺激した＃５（ｉ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）で刺激した＃５および＃７（ｊ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）で刺激した＃４（ｋ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）で刺激した＃１（ｌ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）で刺激した＃１（ｍ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１１５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）で刺激した＃３（ｎ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）で刺激した＃７（ｏ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）で刺激した＃６（ｐ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）で刺激した＃６（ｑ）、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−９６５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）で刺激した＃８（ｒ）。一方、表３ａおよび３ｂに示した他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があるものの、それらのペプチドによる刺激によって特異的ＣＴＬ活性は観察されなかった。陰性データの典型的な例として、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−９１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）で刺激したＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生は示されなかった（ｓ）。結果として、これにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来の１８種類のペプチドが、強力なＣＴＬを誘導し得るペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
【０２６６】
Ｃ６ｏｒｆ１６７由来ペプチドに対するＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの樹立
Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）で刺激したウェル番号＃４（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−１３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）で刺激した＃６（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）で刺激した＃４（ｃ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）で刺激した＃６（ｄ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）で刺激した＃７（ｅ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）で刺激した＃６（ｆ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）で刺激した＃１（ｇ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）で刺激した＃３（ｈ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５７７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）で刺激した＃５（ｉ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）で刺激した＃５（ｊ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）で刺激した＃４（ｋ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）で刺激した＃１（ｌ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）で刺激した＃６（ｍ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−２６２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）で刺激した＃６（ｎ）中の、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出されるペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図７ａ〜ｎ）。この結果から、ＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが示される。さらに、「材料および方法」に記載したように、ＣＴＬ株から限界希釈することによりＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）（ａ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−１３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）（ｂ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−８８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）（ｃ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）（ｄ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−４８４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）（ｅ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）（ｆ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−５２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）（ｇ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）（ｈ）、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−１２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）（ｉ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）（ｊ）で刺激したＣＴＬクローンから、強力なＩＦＮ−γ産生が測定された（図８ａ〜ｊ）。
【０２６７】
Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
各ペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株およびＣＴＬクローンを、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を内因的に発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を外因的に発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株およびＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いることにより試験した。全長Ｃ６ｏｒｆ１６７またはＨＬＡ−Ａ＊  ０２０１のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図９において、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）で刺激したＣＴＬ株（ａ）、およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）で刺激したＣＴＬクローン（ｂ）は、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがってこれらのデータにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−９−２６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ａ０２−１０−６２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）のペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子と共に標的細胞上に提示され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。これらの結果から、Ｃ６ｏｒｆ１６７に由来するこれらのペプチドが、Ｃ６ｏｒｆ１６７を発現する腫瘍を有する患者に対してがんワクチンを適用するために利用できる可能性があることが示された。
【０２６８】
抗原ペプチドの相同性分析
0005728759.tif 000022
で刺激したＣＴＬは、有意でかつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、
0005728759.tif 000023
の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこのペプチド配列について相同性分析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性分析の結果から、
0005728759.tif 000024
の配列は固有のものであることが示され、したがって本発明者らの知る限りでは、この分子が、ある非関連分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどない。
【０２６９】
結論として、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来の新規なＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープペプチドが同定された。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７のエピトープペプチドががん免疫療法に適用できる可能性があることが実証された。
【０２７０】
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができ、幅広いがんの種類に対する適用性を有し得る、Ｃ６ｏｒｆ１６７由来の新規ＴＡＡを提供する。このようなＴＡＡは、Ｃ６ｏｒｆ１６７に関連した疾患、例えばがんに対するペプチドワクチンとして有用であり得、そのようながんの例には、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肺癌、リンパ腫、骨肉腫、腎癌、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【図１ａ−ｊ】
0005728759.tif 000025
【図１ｋ−ｔ】
0005728759.tif 000026
【図１ｕ−ｚ】
0005728759.tif 000027
【図２ａ−ｈ】
0005728759.tif 000028
【図２ｉ−ｎ】
0005728759.tif 000029
【図３】
0005728759.tif 000030
【図４】
0005728759.tif 000031
【図５】
0005728759.tif 000032
【図６ａ−ｆ】
0005728759.tif 000033
【図６ｇ−ｌ】
0005728759.tif 000034
【図６ｍ−ｒ】
0005728759.tif 000035
【図６ｓ】
0005728759.tif 000036
【図７ａ−ｄ】
0005728759.tif 000037
【図７ｅ−ｊ】
0005728759.tif 000038
【図７ｋ−ｎ】
0005728759.tif 000039
【図８ａ−ｆ】
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【図８ｇ−ｊ】
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【図９】
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【配列表】
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