(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のポリペプチドまたは配列番号１の２５番〜１５２番のポリペプチドの配列を有する、単離ポリペプチド。
【請求項２】
−配列番号１のポリペプチドまたは配列番号１の２５番〜１５２番のポリペプチドと、その全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有し、
−１０００ｒｐｍで攪拌することによって３７℃において血小板凝集計にて３０％より大きいヒト血小板の凝集を誘導し得る
単離ポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも以下のペプチドモチーフを含んでなる、請求項２に記載の単離ポリペプチド：
−ＧＸ１Ｘ２ＧＥＲ（ここで、Ｘ１およびＸ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、およびＯから、独立して、選択されるアミノ酸を表す）、
−（ＧＰＸ３）ｎ（ここで、ｎは４〜１０であり、Ｘ３はＰまたはＯを表す）、−ＧＰＲＧＱＸ４ＧＶＭＧＦＸ５（式中、Ｘ４およびＸ５は、独立して、ＰまたはＯを表す）。
【請求項４】
少なくとも以下のペプチドモチーフを含んでなる、請求項２に記載の単離ポリペプチド：
−ＧＡＰＧＥＲ、
−ＫＰＧＥＰＧＰＫ、
−（ＧＰＰ）ｎ（ここで、ｎは４〜１０である）、
−ＲＧＤ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２のポリヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
転写方向に以下を含んでなる、発現カセット：
−宿主生物において機能的なプロモーター、
−請求項５〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、
−同じ宿主生物において機能的な終結配列。
【請求項８】
請求項５〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項７に記載の発現カセットを含んでなる、ベクター。
【請求項９】
請求項５〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載の発現カセット、および／または請求項８に記載のベクターにより形質転換された、ヒト以外の宿主生物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項５〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載の発現カセット、請求項８に記載のベクター、および／または請求項９に記載の宿主生物を含んでなる、薬剤として用いるための組成物。
【請求項１１】
血栓性疾患の処置のための、請求項１０に記載の薬剤として用いるための組成物。
【請求項１２】
止血障害の処置のための、請求項１０に記載の薬剤として用いるための組成物。
【請求項１３】
瘢痕形成剤として用いるための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んでなる、化粧用組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、血小板コラーゲン受容体との相互作用に関して記載されているペプチド配列の集合体からなる組換えタンパク質に関する。これらのタンパク質は三重らせんの形成に依存しない凝集誘導活性を有する。それらは細菌および哺乳類細胞において産生され得る。
【０００２】
背景技術
コラーゲンは、総ての多細胞生物の細胞外マトリックスの主要な構成成分である。それらは発達および組織のホメオスタシスに役割を果たす２８の異なる種類からなるタンパク質ファミリーである。それらはフィブリル、ミクロフィブリル、または網状組織の形成において種々の超分子構造に組み立てられる。
【０００３】
コラーゲンは、一緒にコイルを形成する３本のポリペプチド鎖すなわちα鎖からなる三重らせん構造を有する１以上のドメインを含むという共通の特徴を有する。三つ総てがアミノ酸であるので、この特徴は、Ｇ−Ｘ−Ｙ配列（ここで、Ｘは多くの場合プロリンであり、Ｙはヒドロキシプロリンである）の繰り返しからなるヘリコイダル(helicoidal)モチーフにおけるグリシンの存在により可能となる。このヒドロキシプロリンは三重らせんの安定化に不可欠であり、コラーゲンに特徴的である。プロリン残基は主としてプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ−４−Ｈ）によりヒドロキシル化されて、４−ヒドロキシプロリンとなる。Ｘ位にある場合にプロリンの水酸化を可能とする第二のヒドロキシラーゼプロリル−３−ヒドロキシラーゼが存在し、一方で、Ｙ位では、Ｐ−４−Ｈによりヒドロキシル化されたプロリンがすでに見出されている。コラーゲン分子では、α鎖は同一であっても異なっていてもよい。
【０００４】
コラーゲン分子は、Ｎ−プロペプチドおよびＣ−プロペプチドと呼ばれる非ヘリコイダルドメインに挟み込まれたヘリコイダルドメイン（またはコラーゲンドメイン）からなる。分子を形成する３本のα鎖の認識およびそれらの組み立ての開始はＣ末端（Ｃ−プロペプチド）の制御下にある。この工程は小胞体において行われる。次に、Ｎ−プロペプチドおよびＣ−プロペプチドはコラーゲン成熟中に切り出され、短い非ヘリコイダル配列、すなわちテロペプチドが残る。
【０００５】
コラーゲンは、血管壁でそれらの完全性およびそれらの弾性を維持することにより重要な役割を果たしている。この壁は繊維状であるＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンおよび網目状のＩＶ型コラーゲンからなる。また、ＩＩＩ型コラーゲンがアテローム斑において強く発現されることも述べておくべきであろう。さらに、コラーゲンは特定の細胞受容体との直接的相互作用により特定の細胞の機能を調節することができる。従って、コラーゲン、主としてＩ型およびＩＩＩ型は、血小板機能の強力なアクチベーターである。
【０００６】
ＩＩＩ型コラーゲンは三重らせんとして配置された３本のα１鎖かならなるホモ三量体である。そして、α１鎖のＣ末端に存在する二つのＧ−Ｐ−Ｐトリプレット（おそらくヒドロキシル化されている）は、核形成および三重らせんの折りたたみに十分かつ必要である(Bulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701)。他方、これら二つのトリプレットは、これら３本の鎖の最初の結束を可能とするには十分でない。Bulleidら(1997)が、三つのトリプレットが維持される場合に三重らせん形成の効率が高く、この効率は野生型分子の場合よりもはるかに高いことを見出したことに着目することが興味深い。単量体鎖：ＨＳＰ４７（熱ショックタンパク質）と、ＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）との組み立て工程にはいくつかのタンパク質が関与している。単量体鎖のＣ末端に位置するＣ−プロペプチドは、α鎖のアライメントと、タンパク質の安定化に必要なジスルフィド橋の形成に関与していると思われる(Bulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701)。従って、このＣ−プロペプチドは単量体鎖の結束の確保にのみ必要である。これに関して、以下の種々の点が思い出される。
-それがα１鎖の特定の標準的組み立てを決定するアミノ酸１５個の不連続配列からなること(Hulmes DJ, J Struct Biol. 2002 Jan-Feb; 137(1-2): 2-10)。
-Ｃ−プロペプチドの最初にあるコイルドコイルドメインはコラーゲンＩＩＩの三量体化に関与すること(Bulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701)。このドメインは４つのヘプタペプチドからなる(McAlinden et al., J Biol Chem. 2003 Oct 24; 278(43): 42200-7)。
-それはイントラカテナリーおよびインターカテナリー(intra- and intercatenary)ジスルフィド橋の形成を可能とする８つのシステイン残基を含む。
【０００７】
Ｃ−テロペプチドまたはＣ−プロペプチドにおける鎖間のジスルフィド橋の存在は、鎖の結束および三重らせんの形成には必要でない(Bulleid et al., Biochem J. 1996 Jul 1; 317(Pt 1): 195-202)。これらの実験は、Ｎ−プロペプチドを用いて行われたことに留意されたい。三量体の概念と、α三重らせんの概念とは、逆説的に独立であると思われる。Ｎプロペプチドの非存在下では、Ｃ−プロペプチドのシステイン２か、Ｃ−テロペプチドの二つのシステインのどちらかを残すことが賢明であると思われる。ｋｎｏｔ配列（ＧＰＣＣＧ）と呼ばれるこの後者のモチーフは、組み立ての前段階の現象と、α１鎖の折りたたみによってのみジスルフィド橋の形成とを可能とする(Boudko and Engel, J Mol Biol. 2004 Jan 30; 335(5): 1289-97)。
【０００８】
外傷起源の場合であっても、アテローム性動脈硬化症の結果であっても、動脈壁への損傷には血管内皮の破壊およびコラーゲンなどの血栓性成分の露出を伴う。この後、損傷を受けた部位においてコラーゲンまたはコラーゲン断片に富んだ表面に接触して血小板の接着、それらの活性化および血栓の形成が起こる。このコラーゲンと接触した血小板の接着および安定化は、血小板の表面に存在する受容体とコラーゲンの間の、親和性の高い複数の相互作用によって可能となる。この接着は、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）のＡ１ドメインが、それ自体そのＡ３ドメインにより、または血小板受容体とコラーゲンの間の直接的相互作用によってコラーゲンに結合された糖タンパク質（Ｇｐ）ＧｐＩｂ−Ｖ−ＩＸからなる血小板複合体と結合した後に間接的に起こる。いくつかの受容体は特異性の高いペプチド配列、すなわち、コラーゲンと接触した血小板の安定化に重要な役割を果たすインテグリンα２β１、および血小板の活性化に最も重要な受容体と考えられるＧｐＶＩにおいてコラーゲン分子と結合することができる。別の受容体ＴＩＩＩＣＢＰ（ＩＩＩ型コラーゲン結合タンパク質）は、コラーゲンと直接結合し得ることが記載されている。
【０００９】
血管の流速は、動員される血小板コラーゲン受容体の種類を規定する主要な決定因子である。流速が速いと、血小板はＧｐｌｂ受容体を介するｖＷＦを介してコラーゲンと相互作用し、次いで、それらはＧｐＶＩを介した結合により活性化され、インテグリンα２β１のみが血小板−コラーゲン結合の安定剤として介入する。流速が遅いと、血小板はインテグリンα２β１を介してコラーゲンに結合した後、ＧｐＶＩに結合してそれらの活性化に至り、これが血小板凝集の準備を整える工程である。同様に、ＴＩＩＩＣＢＰなどの他の血小板コラーゲン受容体も関与する。いずれの場合にも、ＧｐＶＩが血小板の活性化に主要な役割を果たす。
【００１０】
血小板の接着は、今や、血小板の活性化から切り離された工程である。実際、コラーゲンの短いペプチドモチーフに相当する多くのペプチドがそれらの活性化をもたらすことなく血小板の接着を誘導することができる。しかしながらやはり、これらのペプチドのいくつかは血小板の活性化を誘導する能力を持ち、いわゆる凝集誘導活性を示す。それらの三重らせん構造は、この活性の不可欠な必須条件であると思われる。これらのペプチドのいくつかが単量体形態のままである場合、それらは、まだ特定されていないが、部位の占有（天然コラーゲンには利用できなくなる）が可能な機構により抗凝集活性を示すことを述べておくべきであろう。
【００１１】
ほとんどの研究が、血小板とＩＩＩ型コラーゲンの接着に関与するペプチド配列が最高の凝集活性を示すＣＮＢｒによる消化断片に相当する断片α１（ＩＩＩ）ＣＢ４を用いていることを確認することを目的としている。
【００１２】
ここ数年の間、種々のペプチドモチーフが結合および血小板を活性化することが可能であるという記載がなされている。それらは次の二つの可能性のある性質のペプチドの形態で試験されている。
−コラーゲンと同様に、ＩＩＩ型コラーゲンの天然配列には存在しない、ｎ回の保存されているＧＰＯモチーフの繰り返しにより形成されているもの、または
−主として化学合成により得られるα１（ＩＩＩ）ＣＢ４配列に存在するペプチドモチーフからなるペプチドに相当するもの(Famdale et al., Biochem Soc Trans. 2008 Apr; 36(Pt 2): 241-50)。
【００１３】
インテグリンα２β１は、内皮細胞および血小板を含む種々の細胞種におけるコラーゲン、ラミニン、および他のリガンドの受容体である。α２β１はそのドメインＩを介してコラーゲンと、繊維性コラーゲンの配列に存在するペプチドモチーフにおいて結合する。Ｉ型コラーゲンのα１鎖に存在するＧＦＯＧＥＲに対して最も高い親和性を有する種々のモチーフが記載されている。ＩＩＩ型コラーゲンでは、Ｉ型コラーゲンとは対照的に、いくつかのＧＸＹＧＥＲモチーフがＧＬＯＧＥＲ、ＧＭＯＧＥＲ、ＧＲＯＧＥＲ、およびＧＡＯＧＥＲとの最適な結合に必要であると思われる(Kim et al., J Biol Chem. 2005 Sep 16; 280(37): 32512-20)。ＧＬＯＧＥＮおよびＧＬＫＧＥＮなどの他のモチーフも記載されているが、α２β１との親和性は低い(Raynal et al., J Biol Chem. 2006 Feb 11; 281(7): 3821-31)。これらのモチーフから合成されるペプチドは総て、三重らせんの形態で構成された場合、接着活性を示すことは注目すべきである。
【００１４】
糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属す６０〜６５ｋＤａのＩ型トランスメンブラン糖タンパク質である。それは血小板の表面において、Ｉｇ受容体に共通のγ鎖（ＦｃＲγ）を有する非共有結合性複合体の形態で構成的に発現される。この受容体と相互作用すると記載されているペプチドは、４〜１０個のＧＰＯトリプレットの繰り返しから形成されるコラーゲンと類似のペプチドである(Morton et al., Biochem J. 1995 Mar 1; 306(Pt 2): 337-44 and Smethurst et al., J Biol Chem. 2007 Jan 12; 282(2): 1296-304)。１０％のＧＰＯモチーフを含んでなるが、このトリプレットの最大繰り返し数はＩＩＩ型コラーゲンの天然配列の場合の３回を超えない。さらに、システインまたはリシン残基の修飾後に化学的に得られる三重らせんまたはポリマー形態の形成はこれらのペプチドへの凝集誘導活性の付与に不可欠であることも述べておくべきであろう。さらに、３位におけるヒドロキシプロリンの存在もこの活性に不可欠である。逆に、それらが単量体形態である場合には、これらのペプチドは抗凝集活性を示す(Asselin et al., Biochem J. 1999 Apr 15; 339(Pt 2): 413-8)。最近、Jarvisらは、最も高い接着活性を示すＩＩＩ型コラーゲン配列中のペプチドモチーフを同定した。それは、α１（ＩＩＩ）ＣＢ４のアミノ酸５２３〜５４９に位置する残基GAOGLRGGAGPOGPEGGKGAAGPOGPOからなる(Jarvis et al., Blood. 2008 May 15; 111(10): 4986-96)。このペプチドモチーフは三つのＧＰＯからなる、それらは連続ではなく、ＧｐＶＩとの適切な相互作用に必要な最小数であると思われる。
【００１５】
血小板受容体ＧｐＩｂとコラーゲンの間の間接的相互作用は、血管損傷に応答して、または壁圧の増大の後に内皮細胞および血小板により分泌される血漿多量体タンパク質であるｖＷＦに依存する。それは流速の増大した血管領域の損傷部位に血小板を動員する主要な役割を果たす。この因子はＡ１、Ａ２、およびＡ３と呼ばれる三つのドメインからなる。それはそのＡ３ドメインを介してコラーゲンと結合し、そのＡ１ドメインによってＧｐＩｂ受容体と結合する。ＩＩＩ型コラーゲンは、ＩＩ型コラーゲンにも存在するｖＷＦのＡ３ドメインと親和性の高い単一の部位を持っていると思われる。このペプチドモチーフはアミノ酸４０３〜４１３の間に位置し、ｖＷＦとの結合に重要な特定のアミノ酸を有するGPRGQOVMGFOからなる(Lisman T et al., Blood. 2006 Dec 1; 108(12): 3753-6)。Verkleijらは、可能性のある結合部位としてGAAGPOGPOGSAGTOGLQからなるアミノ酸５４１〜５５８を同定した(Verkleij et al., Blood. 1998 May 15; 91(10): 3808-16)。このペプチドモチーフは、Lisman らにより記載されているｖＷＦモチーフとＧＭＯＧＥＲインテグリンα１β２結合モチーフの間に位置する。
【００１６】
Fauvel-Lafeveのチームは、断片α１（ＩＩＩ）ＣＢ４のアミノ酸６５５〜６６２の間に位置するオクタペプチドKOGEOGPKの存在を記載している。このオクタペプチドにより認識される血小板受容体が同定され、ＴＩＩＩＣＢＰ（ＩＩＩ型コラーゲン結合タンパク質）と呼ばれている(Monnet E et al., J Biol Chem. 2000 Apr 14; 275(15): 10912-7)。このオクタペプチドは、静止条件および流動条件の双方で、血小板とＩＩＩ型コラーゲンとの相互作用を阻害することができるが、Ｉ型コラーゲンとの相互作用は阻害することができない。より最近では、Piresらが、このオクタペプチドはホモ三量体形態である場合にのみ、凝集に対して阻害活性を有することを示している。これに対し、三重らせん形態のその構造は、これらの末端にシステインおよびＧＰＰを付加することによって、それに凝集誘導活性を与える(Pires et al., Eur JMed Chem. 2007 May; 42(5): 694-701)。
【００１７】
コラーゲンの生物学的および超構造的特性、特に、それらの膜受容体との結合能は、組織におけるそれらの多様な役割のための、幅広い適用分野を拓く。しかしながら、これらの適用は、これらのコラーゲンの均質な調製物が大量に、かつ再現性のある方法で得ることが可能な場合に初めて意味を持つ。
【００１８】
この目的で二つの生産方法が使用された。これらの二つの領域で行われた研究および開発は一般に、所定の適用に対して標的性が高い。従って、化学合成は、タンパク質の小さな部分、一般に、ペプチドモチーフにのみ存在する短いペプチドを作製することができる。その主要な適用は、止血、より正確にはコラーゲンと血小板との間の結合の修飾に関連する。
【００１９】
しかしながら、これらのペプチドは一般に求められる活性を一つだけ有し、これはペプチドの、特に三重らせんの形成の三次元コンフォメーションに依存する可能性がある。従って、高い生産性を与える生物系により産生され得る機能性組換えコラーゲンタンパク質の開発の大きな必要性がある。主要な障害は、これらのコラーゲン由来タンパク質の生産および精製がそれらの凝集および接着傾向のために難しいということである。
【００２０】
これまでに、短いペプチド配列（アミノ酸５０個未満）は総て化学合成によっては生産されているが、細胞生産系によっては生産されていない(Farndale et al., Biochem Soc Trans. 2008 Apr; 36(Pt 2): 241-50)。さらに、これらのモチーフは、単独の方法でも合成されている。逆に、血小板結合活性を示す組換えＩＩＩ型コラーゲンの合成は細胞生産系により行われており、用いられているのは、例えば、プロα１（ＩＩＩ）などの完全な配列である。求められる目的は、三重らせんへと構成可能な完全なプロコラーゲンの合成である（ＷＯ９３０７８８９号公報）。これらの組換えコラーゲンは、基本的に複数の適用、すなわち、完全なコラーゲン配列のそれを有する。
【００２１】
よって、これは、生産に関する要求が少なく、天然タンパク質の着目される生物活性を保存する、より簡単な構造のより小さいタンパク質を合成するという問題である。
【００２２】
従って、本発明は、三重らせんの形態へ構成され得ない単量体の形態で合成される、凝集誘導活性を得るために必要なモチーフを発現する組換えタンパク質に関する。この三重らせん形成ができないのは、Ｉ）それらの間のα鎖認識モチーフ、ＩＩ）非ヘリコイダルコラーゲンＮ末端およびＣ末端ドメイン、ならびにＩＩＩ）三重らせんの誘発に必要な二つのＧＰＯトリプレットが存在しない結果である。驚くべきことに、三重らせんの形成の非存在下で凝集誘導活性が得られる。
【００２３】
本出願人は、驚くべき方法において、凝集誘導活性を有する単一の単量体タンパク質内に三つの種類のペプチド配列を一緒にすることが可能であることを示した。
よって、本発明の組換えタンパク質は、以下を一緒にする：
−４つのＧＰＯトリプレットの少なくとも１回の繰り返しを有するペプチドモチーフ、
−天然コラーゲン配列に存在する種々の血小板受容体に対して結合活性を有することが記載されているペプチド配列、
−ＧＸＹトリプレットの繰り返しからなるこれらのモチーフ間の結合配列。
【００２４】
細菌および哺乳類細胞によるこれらのタンパク質の生産は、コラーゲンと類似のペプチド配列と天然型のコラーゲンに存在する配列との組合せの所産であるこれらの新規生成組換えコラーゲンを大量に得ることを可能とする。これらの種類のタンパク質は、この生産のための宿主細胞として、コラーゲンを構成的に産生しない好都合の細胞を必要としない。実際、それらの配列は種々の天然コラーゲンのα鎖の認識が可能でない。これに対し、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）およびＨＳＰ４７などのコラーゲン成熟の鍵酵素を発現する好適なコラーゲン産生細胞が必要である。
【００２５】
対照的に、現行の組換えコラーゲン生産系はコラーゲンを本来産生しない細胞を用いている(Olsen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2003 Nov 28; 55(12): 1547-67およびRuggiero and Koch, Methods. 2008 May; 45 (1): 75-85)。これは、Ｐ４Ｈなどの酵素をコードする遺伝子を同時トランスフェクトすることを含む。
【００２６】
本発明による組換えタンパク質は、以下を含む多くの利点を有する：
−細胞生産系を用いた生産が容易な小タンパク質内に目的のモチーフを一緒すること、
−三重らせん構造の非存在下での凝集誘導活性、
−それらの配列内にコラゲナーゼ認識部位が存在しないが、コラーゲン産生細胞によるそれらの産生を可能とするＨＳＰ４７認識部位が存在すること、
−現行抗血小板処置を測定するため、また、血小板機能の検査に用いられる参照試験（血小板凝集試験）により示されるそれらの生物活性。
【００２７】
本発明による組換えタンパク質の生物学的特性は、多くの適用を予見することを可能とする。
【００２８】
第一の適用は、血栓性疾患の検査、すなわち、血小板凝集試験、in vitro血栓症モデルならびに現行の抗血小板処置（アスピリン、クロピドグレル）および今後の処置の有効性の評価における診断手段としてのこれらのタンパク質の使用に関する。産生されるタンパク質はヒトタンパク質に由来し、それらの配列に、血小板の接着および活性化におけるそれらの役割に関して記載されている特定の血小板受容体に対する結合部位を有する。現行の試験は、その配列がヒトのものと完全な相同性を持たない動物起源のコラーゲンを使用する。さらに、種々のタンパク質間で血小板受容体相互作用部位の数および位置が異なるので、より適切な標的バリデーション試験を提案することが可能になる。各血小板受容体に対してより特異的に働くことを可能にするペプチド断片が存在するが、それらの生産方法は、細胞による本来の生産に対して化学合成というように、本発明の方法とは異なる（翻訳後修飾の重要性）。
【００２９】
本発明は、止血包帯（従って、血管病変の場合にその部位への血小板の動員を強化する）、または出血の危険を回避するための止血接着剤（外科術用）の組成物の一部として働き得る。動物起源のコラーゲンであるが、現在製品が市販されている。
【００３０】
別の態様として、瘢痕形成を活性化するためのこれらのタンパク質の使用がある。特定の創傷の瘢痕形成には、血小板を含む特定の細胞集団の、その部位への移動、接着および分化が必要である。これらの工程はこれらの細胞の表面インテグリンに依存する。従って、本発明のタンパク質の構造に存在する特定のペプチドモチーフは、瘢痕形成を促進することによりこれらのインテグリンと相互作用することができる。
【００３１】
極めて限定された分野においては、これらの組換えタンパク質はある種の皮膚用クリームの組成物として提案され得る。
【００３２】
血小板機能を阻害するタンパク質の別の適用として、アテローム血栓症の処置である。血小板受容体はアテローム血栓症の合併症と闘うための将来性を有する治療標的である。これまでに、内皮下層において初期の血小板接着を遮断することができる分子は無い。本発明のタンパク質の種々のタンパク質構造はそれらとこれらの受容体の相互作用を可能とし、血小板抗接着作用（部位のマスキング）および／または血小板接着誘導作用をもたらす。
【００３３】
これらの種々の作用は、同じタンパク質で、その物理化学的特性を調節することによって得られる。
【発明の概要】
【００３４】
よって、本発明は、血小板機能を評価するため、止血不全の診断のために細胞分化を活性化させるため、繊維症の領域を画像化により検出するために、キットの組成の一部として働き得る多くの適用を有する生物学的試薬を提供する。本発明は、その部位への血小板の動員のための止血包帯（血管病変の場合）、出血の危険を回避するための止血接着剤、または皮膚用クリームの組成物中に配合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、一時的様式でトランスフェクトされた接着性ＣＨＯ−Ｓ細胞における、当該タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現を表す。
【図２】図２は、エピネフリンの存在下での、一時的様式でトランスフェクトされた接着性ＣＨＯ−Ｓ細胞の細胞馴化培地（ＣＭ）のより誘導された血小板凝集を表す。
【図３】図３は、安定な細胞クローンにおける、当該タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現を表す。
【図４】図４は、精製後に得られた種々の細菌画分中のタンパク質−６Ｘ−ヒスチジンの存在のウエスタンブロット法による検出を示す。
【図５】図５は、細菌で産生された当該タンパク質により誘導された血小板凝集を示す。
【図６】図６は、８９日の免疫後に得られたウサギ血清の特異性のウエスタンブロット法によるバリデーションを示す。
【発明の具体的説明】
【００３６】
配列の説明
配列番号１：Ｃｏｌｌ−ＩＩＩ様組換えタンパク質
配列番号２：Ｃｏｌｌ−ＩＩＩ様組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
配列番号３〜６：プライマー
【００３７】
本発明は、配列番号１のポリペプチドまたは配列番号１の２５番〜１５２番のポリペプチドの配列を有する単離ポリペプチドに関する。
【００３８】
本発明はまた、それらの全長にわたって配列番号１のポリペプチドまたは配列番号１の２５番〜１５２番のポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有し、３７℃にて１０００ｒｐｍで攪拌することによって血小板凝集計で３０％を超えるヒト血小板の凝集を誘導することができる単離ポリペプチドに関する。
【００３９】
好ましい実施形態では、これらのポリペプチドは以下のペプチドモチーフを含んでなる：
−ＧＸ１Ｘ２ＧＥＲ（ここで、Ｘ１およびＸ２は、独立して、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、およびＯから選択されるアミノ酸を表す）、
−（ＧＰＸ３）ｎ（ここで、ｎは４〜１０であり、Ｘ３はＰまたはＯを表す）、
−ＧＰＲＧＱＸ４ＧＶＭＧＦＸ５（式中、Ｘ４およびＸ５は、独立して、ＰまたはＯを表す）。
Ｐはプロリンであり、Ｏはヒドロキシプロリンである。
【００４０】
別の好ましい実施形態においては、これらのポリペプチドは以下のペプチドモチーフを含んでなる：
−ＧＡＰＧＥＲ、
−ＫＰＧＥＰＧＰＫ、
−（ＧＰＰ）ｎ（ここで、ｎは４〜１０である）、
−ＲＧＤ。
【００４１】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【００４２】
好ましい実施形態においては、該ポリヌクレオチドは配列番号２のポリヌクレオチド配列を有する。
【００４３】
本発明はまた、配列番号１のポリペプチドと特異的に結合する抗体に関する。
【００４４】
本発明はまた、転写方向に以下をを含んでなる発現カセット(expression cassette)に関する：
−宿主生物において機能的なプロモーター、
−本発明によるポリヌクレオチド、
−同じ宿主生物において機能的な終結配列。
【００４５】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチドおよび／または本発明による発現カセットを含んでなるベクターに関する。
【００４６】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による発現カセット、および／または本発明によるベクターで形質転換された宿主生物に関する。
【００４７】
本発明はまた、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による発現カセット、本発明によるベクター、および／または本発明による宿主生物を含んでなる、薬剤として用いるための組成物に関する。
【００４８】
好ましい実施形態においては、本発明は、血栓性疾患の処置のための組成物に関する。
【００４９】
別の好ましい実施形態においては、本発明は、止血障害の処置のための組成物に関する。
【００５０】
本発明はまた、これらの組成物の瘢痕形成剤(cicatrisation agent)としての使用に関する。
【００５１】
最後に本発明は、上記のものなどのポリペプチドを含んでなる化粧用組成物に関する。
【００５２】
本発明は、配列番号１のポリペプチドまたは配列番号１の２５番〜１５２番のポリペプチドの配列を有する単離ポリペプチドに関する。
【００５３】
配列番号１の１番〜２４番のペプチドは、宿主細胞による組換えタンパク質の分泌を可能とするシグナルペプチドに相当する。このシグナルペプチドは存在しなくてもよいし、あるいは当業者に周知の技術に従って別のシグナルペプチドに置換してもよい。当業者ならば、種々の原核生物または真核生物発現系において本発明のポリペプチドの発現および分泌に好適な同種または異種シグナルペプチドを選択することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは真核細胞または生物、特に、哺乳類細胞で産生される。本発明の特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは細胞外培地へのそれらの分泌を可能とするシグナルペプチドを含んでなる。別の実施形態では、本発明は、シグナルペプチドの切断後に得られる成熟ポリペプチドに関する。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、参照技術(Born, 1962)に従って血小板凝集計(Regulest, Florange, France)を用いて検出されるヒト血小板に対する生物活性、特に、凝集誘導活性を有する。多血小板血漿（ＰＲＰ）をアゴニストと接触させ（ＰＲＰ  ２９０μｌ中１０μｌ）、媒体の明澄度（試験管の底に沈んでいる凝集塊の形成に関して）をリアルタイムで測定する（凝集曲線）。血小板凝集が無ければ、シグナルはフラットなままである（持続的に濁った媒体）。測定の終了時に試験管を調べることにより、凝集塊の有無を確認することができる。血小板凝集試験反応の評価は、３７℃で連続攪拌（１０００ｒｐｍ）することによって行う。この装置は次のように較正する：多血小板血漿（低速遠心分離を行い、濃度を３００×１０９／Ｌに調整することにより得られる調製物）の場合を０％凝集、少血小板血漿（高速遠心分離によって得られる調製物）の場合を１００％凝集とする。血小板調製物の量は、抗血小板治療薬の開発に用いられた参照アゴニスト（５μＭ  ＡＤＰおよび１μｇ／ｍｌコラーゲン）に対する反応を確認することにより確認した。タンパク質は３０％を超える凝集を不可逆的に誘導し得る場合に凝集誘導性があると見なされる。
【００５５】
多くの細胞種の表面で発現される受容体認識ペプチドモチーフは、ポリペプチドに以下の種類の活性：
・細胞接着
・細胞動員
を付与する。その三重らせん構造によらず、このポリペプチドの凝集誘導作用は血小板表面に存在する１以上の受容体（α１β２、ＴＩＩＩＣＢＰおよびＧＰＶＩ）の活性化の結果である。
【００５６】
本発明はまた、配列番号１のポリペプチドの少なくとも一つの活性を保存している配列番号１のポリペプチドの断片に関する。ポリペプチドの「断片」とは、由来するポリペプチドの全部ではなく一部を含んでなるポリペプチドを示す。よって、本発明は、配列番号１のポリペプチドの少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０個のアミノ酸の断片を含んでなるポリペプチドに関する。
【００５７】
配列番号１のポリペプチドのこれらの断片は、配列番号１のポリペプチドの少なくとも一つの活性、特に、ヒト血小板に対する凝集誘導活性を保存している。よって、本発明は、配列番号１のポリペプチドの生物学的に活性な断片に関する。「生物学的に活性な断片」とは、由来するポリペプチドの機能を保存しているポリペプチドの断片を示す。よって、配列番号１のポリペプチドの生物学的に活性な断片はこのポリペプチドの少なくとも一つの機能を保存しており、好ましくは、配列番号１のポリペプチドの総ての生物活性を保存している。ポリペプチド断片を作製するための方法ならびに本発明のポリペプチドの生物活性を測定するための技術は当業者に周知である。
【００５８】
本発明はまた、配列番号１のポリペプチドの少なくとも一つの活性を有し、かつ、配列番号１のポリペプチドと少なくとも７０％同一なアミノ酸を有するポリペプチドに関する。好ましくは、これらのポリペプチドは配列番号１のポリペプチドと同じ特性、特に、同じ生物活性を有する。本発明は、配列番号１のポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、好適には少なくとも９９％同一なアミノ酸を有するポリペプチドに関する。「同一のアミノ酸」とは、二つの配列間で変異していない、または変化していないアミノ酸を意味する。これらのポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドと比較した場合に少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加、または置換を持ち得る。
【００５９】
本発明はまた、配列番号１のポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、好適には、少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドに関する。「相同性」とは、タンパク質配列間の類似性の測定値を意味する。これらのポリペプチドは配列番号１のポリペプチドと比較した場合に少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加、または置換を持ち得る。スコアにより数値化される２配列間の相同性の程度は、それらの配列の同一性および／または保存的置換の割合に基づく。
【００６０】
配列番号１のポリペプチドとある程度の相同性を有する本発明のポリペプチドは少なくとも１００または１５０個のアミノ酸を含んでなる。
【００６１】
ポリペプチド間の同一性の程度および相同性の程度を測定および特定するための方法は当業者に知られている。例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉ  ９．１．０ソフトウエアパッケージ(Invitrogen INFORMAX, http: //www.invitrogen.com)のＡｌｉｇｎＸアライメントツール（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム）を、好ましくは、デフォルト設定を用いて使用することができる。
【００６２】
本発明によるポリペプチドはそれらの天然環境から単離または精製される。これらのポリペプチドは種々の方法によって作製することができる。これらの方法は、特に、好適な宿主細胞による組換えポリペプチドの生産とそれらのその後の精製、化学合成による製造、または最後にこれらの種々のアプローチの組合せである。これらの種々の製造方法は当業者に周知である。好ましくは、本発明のポリペプチドは組換え原核または真核細胞により生産される。よって、本発明のポリペプチドは細菌または哺乳類細胞で産生させることができる。
【００６３】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドを含んでなる融合タンパク質、タンパク質、またはキメラタンパク質に関する。「ポリペプチド」とは、タンパク質ならびに修飾ポリペプチドを示す。
【００６４】
本発明の一つの実施形態においては、本発明によるポリペプチドはグリコシル化されている。配列番号１のポリペプチドは特に、１０２番と１４１番に存在するリシンアミノ酸上（ＧＸＹトリプレットの３番）にＯ−グリコシル化部位を有する。好ましい実施形態においては、配列番号１のポリペプチドの９３番のアスパラギン残基がグリコシル化されている。
【００６５】
本発明はまた、上記で定義されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明によれば、「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖ヌクレオチド鎖またはそのＤＮＡもしくはＲＮＡ相補物、または相補的もしくはゲノムＤＮＡであり得る二本鎖ヌクレオチド鎖を意味する。
【００６６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ、特に、二本鎖ＤＮＡである。「ポリヌクレオチド」とはまた、修飾されたポリヌクレオチドも意味する。本発明のポリヌクレオチドはそれらの天然環境から単離または精製される。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)により記載されている従来の分子生物学的技術または化学合成によって作製することができる。
【００６７】
第一の実施形態においては、本発明は配列番号２のポリヌクレオチドに関する。第二の実施形態においては、本発明は、その配列が配列番号１の７３番〜４５９番の間にある配列番号２のポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは上記で定義されたポリペプチドをコードしている。
【００６８】
本発明はまた、配列番号２のポリヌクレオチドと、またはその配列が配列番号２の７３番〜４５９番の間にあるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは好ましくは配列番号１のポリペプチドの生物活性を保存しているポリペプチドをコードする。
【００６９】
「同一のヌクレオチド」とは、二つの配列間で変異していない、または変化していないヌクレオチドを意味する。これらのポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドと比較した場合に少なくとも一つのヌクレオチドの欠失、付加、または置換を有し得る。
【００７０】
本発明はまた、配列番号２のポリヌクレオチドと、またはその配列が配列番号２の７３番〜４５９番の間にあるポリヌクレオチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、好ましくは、少なくとも９９％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは好ましくは配列番号１のポリペプチドの生物活性を保存しているポリペプチドをコードする。
【００７１】
「相同性」とは、核酸配列間の類似性の測定値を意味する。これらのポリヌクレオチドは、参照するポリヌクレオチドと比較した場合に少なくとも一つのヌクレオチドの欠失、付加、または置換を有し得る。スコアにより数値化される２配列間の相同性の程度は、それらの配列の同一性および／または保存的置換の割合に基づく。
【００７２】
核酸配列間の同一性の程度および相同性の程度を測定および特定するための方法は当業者に知られている。例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉ  ９．１．０ソフトウエアパッケージ(Invitrogen INFORMAX, http: //www.invitrogen.com)のＡｌｉｇｎＸアライメントツール（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム）を、好ましくは、デフォルト設定を用いて使用することができる。
【００７３】
本発明はまた、配列番号２のポリヌクレオチドと、またはその配列が配列番号２の７３番〜４５９番の間にあるポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。好ましくは、選択的ハイブリダイゼーションは、中ストリンジェンシーの条件下、好適には高ストリンジェンシーの条件下で行う。これらのポリヌクレオチドは好ましくは、配列番号１のポリペプチドの生物活性を有するポリペプチドをコードする。「選択的にハイブリダイズすることができる配列」とは、本発明によれば、バックグラウンドノイズよりも有意に高いレベルで参照する配列とハイブリダイズする配列を意味する。選択的にハイブリダイズすることができる配列と、参照する配列の間の相互作用により生じるシグナルレベルは一般に、バックグラウンドノイズを生じる他のＤＮＡ配列の相互作用の場合よりも１０倍高い強度、好ましくは１００倍高い強度である。選択的ハイブリダイゼーションを可能とするストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。一般に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、所定のｐＨおよび所定のイオン強度において、参照する配列のＴｍよりも少なくとも５℃低い。一般に、ハイブリダイゼーション温度は、ヌクレオチド１５〜５０個のポリヌクレオチドでは少なくとも３０℃であり、ヌクレオチドが５０個を超えるポリヌクレオチドでは少なくとも６０℃である。例えば、ハイブリダイゼーションは以下のバッファー：６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ、５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中で行われる。洗浄は、例えば、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳバッファー中の低いストリンジェンシー条件、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳバッファー中の中程度のストリンジェンシー条件、および０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳバッファー中の高いストリンジェンシー条件で順次行う。
【００７４】
ハイブリダイゼーションは、当然のことながら、当業者に周知の他の一般的な方法に従っても行うことができる（特に、Sambrook et al., Molecular Cloning: At Laboratory Manual, 1989を参照）。好ましくは、参照ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドはその参照する配列の機能を保存している。
【００７５】
本発明は一般に本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝コードの縮重のために、異なるポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードする場合がある。
【００７６】
本発明はまた、配列番号１のポリペプチドと特異的に結合する抗体に関する。
【００７７】
「特異的に結合する」とは、これらの抗体が配列番号１のポリペプチドとのみ結合することを意味する。特に、これらの抗体は他の抗原、特に、他のコラーゲンタンパク質とは結合しない。
【００７８】
本発明による抗体は好ましくは、当業者に周知の標準的な方法に従って得ることができる、特異的モノクローナル抗体、特にネズミ起源、キメラ型、またはヒト化型のものである。
【００７９】
一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的断片、特に、ネズミ起源のものを作製するための技術は、特に、ハンドブックAntibodies (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, p. 726, 1988)に記載されているもの、または当業者に周知のハイブリドーマに基づく作製から選択することができる。
【００８０】
「抗体」はまた、キメラまたはヒト化抗体も意味する。
【００８１】
本発明はまた、転写方向に下記を含んでなる発現カセットに関する：
−宿主生物において機能的なプロモーター、
−本発明によるポリヌクレオチド、
−同じ宿主生物において機能的な終結配列。
【００８２】
本発明の一つの実施形態によれば、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは当業者に周知のクローニング技術を使用することにより発現カセットに挿入される。この発現カセットは、本発明によるポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳に必要な要素を含んでなる。
【００８３】
有利には、この発現カセットは、宿主細胞にポリペプチドとその発現の調節に必要な要素を産生させる同期要素を含んでなる。
【００８４】
どんな種類のプロモーター配列も、本発明による発現カセットに使用可能である。プロモーターの選択は、特に、目的遺伝子の発現のために選択された宿主生物に依存する。ある特定のプロモーターは構成的発現が可能であり、これに対して他のプロモーターは誘導型である。細菌の機能的プロモーターとしては、特に、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを挙げることができる。酵母において機能的なプロモーターとしては、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)のＧＡＬ１遺伝子プロモーターまたはＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーターを挙げることができる。高等真核細胞、特に哺乳類細胞において機能的なプロモーターとしては、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＳＶ４０、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ヒトまたはニワトリβ−アクチン、β−グロビン、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＥＦ１α、チミジンキナーゼ、およびＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス）を挙げることができる。これらのプロモーターは総て文献に記載されており、当業者に周知である。
【００８５】
本発明による発現カセットは、例えば、調節要素または宿主生物により産生されたポリペプチドの分泌を可能とするシグナル配列など、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現に必要な他の配列をさらに含み得る。特に、発現カセットに挿入されたコード配列の発現レベルを増強するいずれの調節配列も使用可能である。本発明によれば、特に、転写アクチベーター（「エンハンサー」）などの、プロモーターとコード配列の間にある他の調節配列をプロモーター調節配列と組み合わせて使用することができる。
【００８６】
本発明による発現カセットでは多様な終結配列を使用することができ、これらの配列は転写の終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化を可能とする。選択された宿主生物において機能的ないずれの終結配列も使用可能である。
【００８７】
本発明はまた、本発明による発現カセットを含んでなるポリヌクレオチドに関し、有利には、本発明による発現カセットはベクターに挿入される。
【００８８】
よって、本発明はまた、本発明による少なくとも一つのポリヌクレオチドまたは発現カセットを含んでなる宿主生物の形質転換のための複製または発現ベクターに関する。このベクターは、特に、本発明によるポリヌクレオチドまたは発現カセットが挿入されているプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスに相当し得る。これらのベクターを構築する技術およびこれらのベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する技術は当業者に周知である。一般に、特にポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を誘導するために宿主細胞中で維持可能であるか、複製可能であるか、または増殖可能であるベクターはいずれも使用可能である。当業者ならば、形質転換される宿主生物に応じて、また、用いる形質転換技術に応じて好適なベクターを選択することができる。
【００８９】
本発明のベクターは特に、宿主生物でのベクターの複製および／または本発明によるポリペプチドの発現のために宿主生物を形質転換させるのに使用される。
【００９０】
本発明はまた、以下の工程を含んでなる、本発明によるポリペプチドの作製方法に関する：
−宿主生物を、本発明による発現カセットを含んでなる発現ベクターで、および／または本発明によるポリヌクレオチドで形質転換させる工程および
−宿主生物により産生されたポリペプチドを単離する工程。
。
【００９１】
本発明はまた、宿主生物に本発明による少なくとも一つのポリヌクレオチドまたは発現カセットまたはベクターを挿入することによって、宿主生物を形質転換させる方法に関する。ポリヌクレオチドは宿主生物のゲノムに挿入することができるか、または宿主生物内で安定に複製することができる。宿主生物を形質転換する方法は当業者に周知であり、文献に広く記載されている。
【００９２】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターで形質転換さされた宿主生物に関する。「宿主生物」とは、特に、本発明によれば、特に、細菌、酵母、および高等真核生物の細胞、特に、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓細胞系統）、ＮＳＯ（マウス骨髄腫細胞系統）、Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、およびＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ｎｏ．  ＣＲＬ１６６２）から選択される、任意の単細胞または多細胞、下等または高等生物を意味する。「宿主生物」はヒト以外の生物を意味する。
【００９３】
本発明はまた、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による発現カセット、本発明によるベクターおよび／または本発明による宿主生物を含んでなる、薬剤として用いるための組成物に関する。よって、本発明はまた、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による発現カセット、本発明によるベクターおよび／または本発明による宿主生物を含んでなる医薬組成物に関する。
【００９４】
好ましい実施形態においては、本発明は、血栓症の予防および／または治療のための組成物に関する。
【００９５】
別の実施形態においては、本発明は、止血障害の予防または治療のための組成物に関する。
【００９６】
本発明はまた、瘢痕形成剤として用いるための前記組成物に関する。
【００９７】
別の実施形態では、本発明の組成物はまた、
・ある特性の血小板機能不全、
・血液性疾患
を検出するための診断試薬、
止血包帯ならびに皮膚科および化粧品クリームの組成物における接着剤の有効成分
として使用することもできる。
【００９８】
本発明はまた、有効量の本発明によるポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による発現カセット、本発明によるベクター、および／または本発明による宿主生物を個体へ投与することを含んでなる、血栓症を処置するための治療法に関する。
【００９９】
本発明は最後に、薬剤の製造のための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および形質転換宿主生物の使用に関する。
【０１００】
本発明は、本発明で定義されたものなどのポリペプチド、ポリヌクレオチド、または形質転換宿主生物と、好適な医薬賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する。
【０１０１】
前記組成物は、ヒトを含む哺乳類への投与のために処方することができる。用量計画は対象の処置および疾患に応じて異なる。前記組成物は消化経路または非経口経路により投与され得るように調製される。
【０１０２】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、または直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分は、従来医薬担体と混合して単位投与形で動物またはヒトに投与することができる。好適な単位投与形は、錠剤、ゼラチンカプセル剤、散剤、顆粒剤、および経口溶液または懸濁液などの経口経路、舌下および口内投与形、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内または眼内投与形、および直腸投与を含む。
【０１０３】
錠剤形態の固体組成物を調製する場合には、主要な有効成分をゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガム、または類似のものなどの医薬賦形剤と混合する。錠剤は、サッカロースまたは他の好適な材料でコーティングすることもできるし、あるいはそれらが延長されたまたは遅延型の活性を有するように、また、所定量の有効成分を継続的に放出するように処理することもできる。
【０１０４】
ゼラチンカプセル中の製剤は、有効成分を希釈剤と混合し、得られた混合物をゼラチン軟または硬カプセルに注ぐことにより得られる。
【０１０５】
シロップまたはエリキシル中の製剤は、有効成分を甘味剤、抗菌剤、および香味剤、ならびに好適な着色剤とともに含み得る。
【０１０６】
水分散性の粉末または顆粒は、有効成分を分散剤もしくは湿潤剤、または懸濁剤、ならびに矯味剤または甘味剤と混合して含み得る。
【０１０７】
本発明はまた、上記のようなポリペプチドを含んでなる化粧用組成物に関連する。
【０１０８】
これらの組成物は保湿剤、水和有効成分、皮膚障壁改造剤(cutaneous barrier restructuring agents)、抗刺激剤(anti-irritants)、および鎮静剤(soothing-agents)などの皮膚科で従来用いられている有効成分をさらに含んでなってもよい。
【０１０９】
本発明による化粧用組成物は局所適用に好適な種々の製剤の形態で処方することができる。好ましい実施形態によれば、種々の製剤が局所適用に好適であり、クリーム、エマルション、ミルク、ポマード、ローション、オイル、水性もしくはヒドロアルコールまたはグリコール溶液、粉末、スプレー、ジェリー、ゲル、ヒドロゲルまたは他のいずれかの外用製品を含む。これらの化粧用組成物はまた、抗酸化剤、保存剤なども含み得る。本発明はさらに、本発明による組成物を適用することからなることを特徴とする、化粧的処置、保健衛生または装飾の方法、および／または標準的な、乾燥性の、脂性の、混合型の、脱水した、老化した、敏感な、炎症を有する、不快感のある、不耐性の、内因性、外因性、またはホルモン性の老化に関連する、または外因性の攻撃（汚染物質、ＵＶ、ストレスなど）に関連する不均衡を有する、アレルギー傾向を有する、または色素沈着性障害を有する粘膜および／または皮膚に芳香をつける方法に関する。
【実施例】
【０１１０】
Ａ．哺乳類細胞による一時的生産
１．ベクターの構築
プラスミド１（ＮＶＨ００１−Ａ）
プラスミドＮＶＨ００１−Ａは、次の要素を含む：
プラスミドｐＣＩｎｅｏ（Promega：pCIneo Mammalian Expression Vector）由来のイントロン、
ベクターｐＵＣ５７−ＮＶＨ００１（GeneCustから発注）に由来し、ＩＩＩ型コラーゲンシグナルペプチド（ＮＰ＿００００８１）を有する本発明のタンパク質ＮＶＨ００１、
ｈＧＨ  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００５１５）由来のポリＡテール、および
ｐＣＤＦ１−ＭＣＳ１−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（System Biosciences：pCDF cDNA Cloning and Expression Lentivectors)由来のＣＭＶプロモーター。
【０１１１】
プラスミド２（ＮＶＨ００１−Ｂ１）、３（ＮＶＨ００１−Ｂ２）、４（ＮＶＨ００１−Ｃ１）および（ＮＶＨ００１−Ｃ２）
プラスミドＮＶＨ００１−Ｂ１およびＮＶＨ００１−Ｃ１は、以下の要素：
プラスミドｐＳＶ２−Ｎｅｏに由来するＳＶ４０オリジン（ｏｒｉ  ＳＶ４０：ベクターＡＴＣＣ３７１４９中の１−９８９）、
Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されているものの一つであり得るプロモーター／エンハンサー、
ｐＭｏｎｏ−ｈｙｇｒｏ−ｍｃｓ(Invivogen)由来のハイグロマイシンカセット、
ベクターｐＵＣ５７−ＮＶＨ００１（GeneCustから発注)に由来し、ＩＩＩ型コラーゲンシグナルペプチド（ＮＰ＿００００８１）を含む本発明のタンパク質ＮＶＨ００１、
プラスミドｐＵＣ５７−ｐｒｏＣ（GeneCustから発注)由来のＣ−プロペプチド、
ｈＧＨ  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００５１５）由来のポリＡテール
を含む。
【０１１２】
プラスミドＮＶＨ００１−Ｂ２およびＮＶＨ００１−Ｃ２は、プラスミドＮＶＨ００１−Ｂ１およびＣ−プロペプチドを除くＣ１と同じ要素を含む。
【０１１３】
最終的なプラスミドは総て、目的タンパク質のＤＮＡおよび提供された要素中に突然変異が導入されていないことを確認するために配列決定する。
【０１１４】
２．哺乳類細胞のトランスフェクション
プラスミド１（ＮＶＨ００１−Ａ）
１．ベクターＮＶＨ００１−Ａを、接着性としたＣＨＯ−Ｓ細胞に一時的様式でトランスフェクトし、Invitrogenからのリポフェクタミン２０００キットを用い、５％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地で培養する。
【０１１５】
２．３日目と４日目に培養上清を回収し、産生されたタンパク質を精製した後、それらの血小板結合活性を、凝集計を用いて調べる。
プラスミド２（ＮＶＨ００１−Ｂ１）、３（ＮＶＨ００１−Ｂ２）、４（ＮＶＨ００１−Ｃ１）、および（ＮＶＨ００１−Ｃ２）
【０１１６】
１．ベクターＮＶＨ００１−Ｂ１、ＮＶＨ００１−Ｂ２、ＮＶＨ００１−Ｃ１、およびＮＶＨ００１−Ｃ２を、接着性としたＣＨＯ−Ｓ細胞に一時的様式でトランスフェクトし、Invitrogenからのリポフェクタミン２０００キットを用い、５％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地で培養する。
１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に、８００μｌのＴＲＴＺＯＬ(Invitrogen)を加えることにより、トランスフェクト細胞のＲＮＡを抽出する。対応するｃＤＮＡは、総ＲＮＡ  １μｇからの逆転写により得られる。このｃＤＮＡで、ＰＣＲによる増幅を行った。次に、増幅物を、１２５Ｖにて３０分の２％アガロースゲル上での泳動後に検出する。陽性対照（トランスフェクトプラスミド）および陰性対照も行った。増幅物の大きさを確認するために分子量マーカー（左）を用いる。
１日目に、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞における発現を調べる。この発現は経時的にわずかに増加し、５日後も維持される。ｍＲＮＡ発現の進行を図１に示す。
【０１１７】
２．３日目と４日目に培養上清を回収し、産生されたタンパク質を精製した後、それらの血小板結合活性を、凝集計を用いて試験する。
【０１１８】
３．本発明のタンパク質の生物活性：血小板凝集
本発明のタンパク質の血小板結合活性を凝集測定により評価する。同意書を取った後の健康なボランティアドナーから採取したクエン酸試験管中の血液サンプルを１５０ｇで１５分遠心分離して多血小板血漿（ＰＲＰ）を得る。濃度を３００ギガ／Ｌに調整する。凝集試験を、３７℃で攪拌（１０００ｒｐｍ）することによって、Ｒｅｇｕｌｅｓｔ（商標）血小板凝集計を用いて行う。この技術は、血小板機能アクチベーターに応答した、濁った媒体ＰＲＰの光透過の増大を測定することからなるＢｏｒｎ法に従った光度計の読み取りに基づく。血小板凝集が生じていれば、媒体は明澄化し、光透過の増大が見られる。分子は、この明澄化に相当する傾きの分岐点を伴ってこの透過率に３０％を超える増加が見られる場合に、凝集誘導効果を有するとみなされる。
【０１１９】
図２は、エピネフリンの存在下または非存在下において、一時的様式でトランスフェクトされた接着性ＣＨＯ−Ｓ細胞の細胞馴化培地により誘導された血小板凝集を表す。
この反応混合物は、０．１μＭのエピネフリンの存在下または非存在下に３０μｌの細胞馴化培地を加えた２９０μｌのＰＲＰからなる。血小板の応答を１０分間測定する。自己凝集（−Ｏ−）をベースラインとする。０．１μＭのエピネフリンを添加すると、ベースラインが若干シフトし、１０分間安定である（−●−）。３０μｌの細胞馴化培地を加えると、２分後に限定された応答（１８％）が誘導される（−▽−）。このシフトは１０分の観察中、安定である。２分間エピネフリンを加えた後に３０μｌの細胞馴化培地を加えると、５分で完全な血小板凝集が誘導された（−▼−）。この凝集は可逆的ではなく、生じた凝集が安定であることを示唆する。
トランスフェクトされていない接着性ＣＨＯ−Ｓ細胞の細胞馴化培地３０μｌを加えても凝集は誘導されない（結果は示されていない）。
【０１２０】
Ｂ．哺乳類細胞による安定な生産
１．ベクターの構築
プラスミド１（ＮＶＨ００１−Ａ）
１．一時的発現用に構築されたベクターからイントロン−ＮＶＨ００１−ｈＧＨｐＡユニットを取り出し、ｐＭｏｎｏ−ｈｙｇｒｏ−ｍｃｓ(Invivogen)由来のハイグロマイシンカセットを含む生産ベクターにクローニングする。
【０１２１】
２．最終的なベクターを配列決定して、目的のタンパク質のＤＮＡに、また、提供された要素に突然変異が導入されていないことを確認する。
【０１２２】
３．線状化したベクターを、Invitrogenからのリポフェクタミン２０００キットを用いて接着性としたＣＨＯ細胞に、安定な様式でトランスフェクトする。トランスフェクト細胞をハイグロマイシンＢの進行性レベルにより選択する。
【０１２３】
図３は、安定な細胞クローンにおける、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現を表す。
【０１２４】
１日目、２日目、３日目、および４日目に、８００μｌのＴＲＩＺＯＬ(Invitrogen)を加えることのより細胞ＲＮＡを抽出する。１μｇの全ＲＮＡから逆転写により、対応するｃＤＮＡを得る。5’-AGCTGGCGCGCCGCCACCATG-3’Ｓ）および5’-GCTTCCGGGAGGCCCTGGCTTCCCATC-3’（ＡＳ）プライマーを用い、ｃＤＮＡにてＰＣＲ増幅を行う。次に、２％アガロースゲル上での１２５Ｖにて３０分間の泳動後にアンプリコンを検出する。プラスミドＤＮＡに相当する陽性対照を用いる。分子量マーカー（右）を用いてアンプリコンの大きさを確認する。細胞クローンにおいて安定な発現が見られる。
【０１２５】
Ｃ．細菌における生産
１．構築
目的分子（ＮＶＨ００１）のＤＮＡを、タンパク質ＮＶＨ００１のＮ末端側への６Ｘ−ヒスチジンタグの付加を可能とするｔａｇＮＶＨ００１−センスプライマー：GCTGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGTCGCCCGGGAGCTCCTGGAGAGAGAGGATTGおよびｔａｇＮＶＨ００１−アンチセンスプライマー：GCACGGATCCTATTAGCCAGGGCAAGGTCCAGGGGCTCを用い、ベクターｐＵＣ５７−ＮＶＨ００１上でＰＣＲにより増幅する。これらのＰＣＲ産物を、細菌において該分子の生産が可能なベクターｐＥＴ３ｄ（ｐＥＴ３ｄ−ＮＶＨ００１）(New England Biolab)にクローニングする。
このＤＮＡの存在と正確な配列を配列決定により確認する。
【０１２６】
２．生産
１．ベクターｐＥＴ３ｄ−ＮＶＨ００１を、タンパク質の大量生産が可能なＢＬ２１細菌にトランスフェクトする。
２．細菌を１ｌの栄養培地に接種し、ＯＤ６００ｎｍが得られるまで（細菌が指数増殖期にある）３７℃でインキュベートする。
３．タンパク質生産を３０℃にて５時間、ＩＰＴＧにより誘導する。
４．細菌をペレットととし、溶解させ、本発明のタンパク質を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ抗６Ｘ−ヒスチジンタグカラムにて、細菌の可溶性（上清）画分および不溶性（封入体）画分中に精製する。
【０１２７】
図４は、精製後に得られた種々の細菌画分におけるタンパク質−６Ｘ−ヒスチジンの存在のウエスタンブロット法による検出を示す。
【０１２８】
抗６Ｘ−ヒスチジンタグカラムの溶出後に得られた各画分４０μｌを１６％ポリアクリルアミドゲルにのせる。Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ３泳動システム(Biorad)を用い、分子量マーカー(Amersham)の存在下、１８ｍＡにて、泳動バッファー（１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８および０．１％ＳＤＳ）中で電気泳動を行う。ゲルにおいて分離されたタンパク質を７０Ｖにて６０分間、ＰＶＤＦメンブラン(Biorad)に転写する。このメンブランを、５％脱脂乳を含むＴｒｉｓ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）の生理食塩水溶液中、攪拌することによって３７℃で１２０分間インキュベートすることにより非特異的結合を遮断する。次に、このメンブランをＴＢＳ−Ｔで１／１０００希釈した抗６Ｘヒスチジンタグモノクローナル抗体(Cell Signaling)とともに４℃で一晩インキュベートする。ＴＢＳ−Ｔで５分３回洗浄した後、メンブランを、１／１０，０００希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体(Jackson Laboratories)中、室温で６０分間インキュベートする。このメンブランを再びＴＢＳ中で５分３回洗浄する。結果を、ＥＣＬキット(Amersham)を用いた化学発光技術により可視化する。
【０１２９】
種々の画分にタンパク質の存在が見られる。ほぼ１９ｋＤａの分子量を有する、得られた主要なバンドは該タンパク質の単量体形態に相当する。２６ｋＤａ、４３ｋＤａ、および６０ｋＤａの分子量を有するタンパク質に相当する特定の画分にもバンドが見られる。
【０１３０】
３．その生物活性：血小板凝集の証明
本発明のタンパク質の血小板結合活性を凝集測定により評価する。同意書を取った後の健康なボランティアドナーから採取したクエン酸試験管中の血液サンプルを１５０ｇで１５分遠心分離して多血小板血漿（ＰＲＰ）を得る。濃度を３００ギガ／Ｌに調整する。凝集試験を、３７℃で攪拌（１０００ｒｐｍ）することによって、Ｒｅｇｕｌｅｓｔ（商標）血小板凝集計を用いて行う。この技術は、血小板機能アクチベーターに応答した、最初は濁った媒体であるＰＲＰの光透過の増大を測定することからなるＢｏｒｎ法に従った光度計の読み取りに基づく。血小板凝集が生じていれば、媒体は明澄化し、光透過の増大が見られる。分子は、この明澄化に相当する傾きの分岐点を伴ってこの透過率に３０％を超える増加が見られる場合に、凝集誘導効果を有するとみなされる。
【０１３１】
図５は、細菌で生産されたタンパク質により誘導された血小板凝集を示す。
【０１３２】
ウエスタンブロットにより検出されたタンパク質を含有する、抗６Ｘ−ヒスチジンタグカラムから溶出された種々の画分を回収し、遠心分離により凍結乾燥物を得る。この凍結乾燥物の一部を０．２５％グルタルアルデヒドの存在下、４℃で３時間インキュベートし、次に、４℃で一晩、１Ｘ  ＰＢＳに対して透析した後に凝集測定に用いる。
【０１３３】
反応混合物は、該タンパク質を含有する３０μｌのＰＢＳを加えた２９０μｌ  ＰＲＰからなる。血小板の応答を２５分間測定する。−○−および−▽−で示された線は、それぞれＰＢＳ溶液と透析ＰＢＳ−グルタルアルデヒドを加えた後に得られた応答を示すが、凝集は見られない。グルタルアルデヒド（−Ｔ−）により凝集しない（−▼−）またはグルタルアルデヒドにより凝集し、透析された（−●−）タンパク質を含有するＰＢＳは、それらを加えた１０分後に有意な凝集を示す。この凝集は２０分後にそれぞれ９０％（−▼−）および１００％（−●−）に達する。
【０１３４】
Ｄ．ウサギにおける目的抗体の抗タンパク質の生産
１．従前に記載したようにＢＬ２１細菌でタンパク質を大量生産する。
２．２匹のウサギを３週間おきに４回、すなわち、ＤＯ、Ｄ２１、Ｄ４２、およびＤ６３に免疫し、精製タンパク質にフロイントのアジュバントを加える（ｖ／ｖ）。
３．ウサギをＤ８９のプロトコールの終了時に犠牲にし、動物の放血後に遠心分離により血清を回収する。
４．血漿タンパク質を排除するための特異的カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧを精製する。
図６は、免疫８９日後に得られたウサギ血清の特異性のウエスタンブロット法によるバリデーションを示す。
【０１３５】
細菌において生産され、その凝集活性が凝集測定によりバリデートされた二つのタンパク質調製物１０μｌを１６％ポリアクリルアミドゲルにのせる。
【０１３６】
Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ３泳動システム(Biorad)を用い、分子量マーカー(Amersham)の存在下、１８ｍＡにて、泳動バッファー（１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８および０．１％ＳＤＳ）中で電気泳動を行う。ゲルにおいて分離されたタンパク質を７０Ｖにて６０分間、ＰＶＤＦメンブラン(Biorad)に転写する。このメンブランを、５％脱脂乳を含むＴｒｉｓ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）の生理食塩水溶液中、攪拌することによって３７℃で１２０分間インキュベートすることにより非特異的結合を遮断する。次に、このメンブランを、免疫プロトコールのＤ８９に採取し、１／１００希釈したウサギ血清またはＴＢＳ−Ｔで１／１０００希釈した抗６Ｘヒスチジンタグモノクローナル抗体(Cell Signaling)のいずれかとともに４℃で一晩インキュベートする。ＴＢＳ−Ｔで５分３回洗浄した後、メンブランを、１／１０，０００希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギ抗体(Jackson Laboratories)中、室温で６０分間インキュベートする。このメンブランを再びＴＢＳ中で５分３回洗浄する。結果を、ＥＣＬキット(Amersham)を用いた化学発光技術により可視化する。
【０１３７】
可視化したところ、６０ｋＤａの分子量を有する二つのタンパク質調製物中に存在する二本のバンドの存在が示される（Ａ、ウェル１および２）。このバンドはまた抗６Ｘ−ヒスチジンタグ抗体によっても検出され、それが実際に本発明のタンパク質であることを示す（Ｂ、ウェル１および２）。細菌の精製画分に抗６Ｘ−ヒスチジンタグ抗体により検出されたバンドは他には無かったことを述べておくべきであろう。この結果は、免疫は本発明のタンパク質の多量体形態に対してのみ有効であるか、あるいは本発明のタンパク質は精製されると多量体へと組み立てられることを示唆する。
【０１３８】
参考文献
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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【配列表】
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