(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞様細胞を含むクラスターを調製する方法であって、
ｉ）未分化ヒト由来胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞を培地中で懸濁及び解離するステップと、
ｉｉ）こうして解離した凝集体を強制凝集にかけるステップと、
ｉｉｉ）こうして強制凝集した細胞凝集体を、ＧＳＫ−３インヒビターと、アクチビンと、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）とを含む培地でインキュベートして、１つ以上の３Ｄ構造体を得るステップと、
ｉｖ）１つ以上の３Ｄ構造体を１つ以上のプレートに移し、前記３Ｄ構造体を培地でインキュベートして、収縮細胞を含む１つ以上のクラスターに成長させるステップとを含む方法。
【請求項２】
１つ以上のクラスターを前記プレートから採取することによって、１つ以上のクラスターを単離するステップを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記強制凝集を遠心分離によって行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
遠心分離を１００〜８００ｘｇで２〜２０分間行う請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１〜３６時間の沈殿によって強制凝集を行う請求項１に記載の方法。
【請求項６】
沈殿及び／又は遠心後に得た細胞を、３Ｄ構造体の形成のために、ステップｉｉｉ）で１〜１０日間インキュベートする請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
沈殿及び／又は遠心後に得た細胞を、３Ｄ構造体の形成のために、ステップｉｉｉ）で３日間インキュベートする、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｉｖ）でのクラスターの成長工程が、心筋細胞様細胞クラスターの形成まで、１〜３０日間である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）において用いられる前記培地が細胞培養用基本培地である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培養用基本培地が、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又は改変イーグル培地（ＭＥＭ）である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地に、血清と、血清代替物と、ペニシリン−ストレプトマイシンと、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）と、−メルカプトエタノールと、非必須アミノ酸とのうちいずれか１つまたはそれ以上を添加する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｉ）の解離を機械的に行う請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
アクチビンと線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のそれぞれの濃度が５〜４０ｎｇ／ｍｌである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｉｉｉ）において用いられる前記培地に添加される前記アクチビンがアクチビンＡである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地に添加するアクチビンＡの濃度が５〜４０ｎｇ／ｍｌである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｉｉｉ）において用いられる前記培地に添加される前記ＦＧＦがｂＦＧＦである請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記培地に添加するｂＦＧＦの濃度が５〜４０ｎｇ／ｍｌである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｉ）で用いる前記培地が、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及び／又はウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＳＫ−３インヒビターがＳＢ２１６７６３である請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｉｉｉ）において用いられる前記培地に添加するＧＳＫ−３インヒビターの濃度が１〜２５μＭである請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｉｉｉ）及び／又はステップｉｖ）で用いる前記培地が更に、ＬＩＦを１００〜２０００Ｕ／ｍｌ含む請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＬＩＦを含む培地を、インキュベーションの２〜８日後に、ＬＩＦを含まない培地と交換する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップｉｉｉ）のプレート（単一又は複数）がゼラチンコート面を有する請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈＢＳ細胞由来の新規な心筋細胞様細胞クラスター（ＣＭＬＣ）と、この心筋細胞様細胞クラスターを、例えば、医薬品の創薬及び開発、毒性試験、細胞治療、並びに医療で利用できる可能性に関する。このクラスターは、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー、及び心臓マーカーを発現する細胞を含む。本発明は、上記のクラスターを調製する方法と、治療及び毒性試験で用いられる１つ以上のＣＭＬＣを含む組成物にも関する。この組成物は、少なくとも−８０℃の温度で少なくとも２年間保管した後、安定している。すなわち、上記のクラスターの特徴及び生存能力は、この保管期間中においては実質的に変わらない。
【背景技術】
【０００２】
成熟心筋細胞は、最終分化細胞と考えられ、それ自体に増殖能はないか又は増殖能はかなり低い。ヒトの心筋細胞は心臓生検試料から単離できるが、その手順は複雑で、生存可能な細胞調製物を得るのは困難である。これに加えて、ヒトの心臓組織を入手する機会は非常に限られているため、多数の細胞を単離するのは不可能である。ヒトの心筋細胞の表現型を有する細胞を簡単に入手する手段は、心臓病に対する細胞治療介入の開発のためには極めて重要である。更に、ドナー材料の不足、及び何らかの問題のある細胞単離手順が原因で、現在は、ヒトの初代心筋細胞は、前臨床創薬中のインビトロ試験には利用できない。
【０００３】
ヒト多能性幹細胞の集団は、胚盤胞の内細胞塊から単離することができ、これらの細胞は、インビトロで無限に未分化増殖するための能力を有する（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｈｅｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞の分化は、インビトロで、特に未分化細胞に対する次善の培養条件の中で、自然に発生することがある（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。これに加えて、ｈＢＳ細胞は、特定のパスウェイに沿って一方向に分化するように誘導され、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、インシュリン産生β細胞、及び造血細胞を含む様々な特殊化した細胞型を形成することができる（Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００５で概説されている）。しかし、現在は、ｈＢＳ細胞の分化を制御及び操作して、特定の細胞型の排他的な集団を産生する方法については、比較的わずかしか知られていない。
【０００４】
ｈＢＳ細胞からの心筋細胞の誘導では、原則的に、２つの異なる手順が報告されている。第１の手順は、ｈＢＳ細胞を懸濁液で培養して胚様体（ＥＢ）を形成させると開始されるｈＢＳ細胞の分化によるのものである（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０００，  Ｋｅｈａｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。これらの混合細胞集団内では、心筋細胞の機能特性を有する収縮領域を観察できる。第２の手順は、ｈＢＳ細胞とＥＮＤ−２細胞（内臓内胚葉様細胞株）との共培養に基づくものであり、この共培養の結果、拍動する細胞クラスターが形成され、この細胞も、心筋細胞の特徴を示す（Ｍｕｍｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，  Ｐａｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）。上記のプロトコールの別の変種としては、強制凝集（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）と懸滴法（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）が挙げられた。使用されるプロトコールの変種と、ｈＢＳ細胞が心筋細胞に分化する効率に基づき、ｈＢＳ細胞株は、大きく異なる挙動をみせるようであり、これは、利用される実際のｈＢＳ細胞株が、最終的な成果に影響を及ぼす場合のあることを示唆している。したがって、各細胞株は、心臓発生の誘導のための特殊な分化プロトコールを必要とすることがある。
【０００５】
ここ数年の間、多くの論文に、様々な方法で、ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞の基本的特徴が記載されてきた。これらの論文では、細胞解析は、心筋細胞の分子マーカーの発現、構造的構成、及び機能性に基づいていた（Ａｍｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００７  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌで概説されている）。ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞の形態と超微細構造は、成体の心筋細胞と類似点を共有しているが、筋原線維及びサルコメア組織は、幹細胞由来の集団内で、未熟な表現型を示している（Ｋｅｈａｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，  Ｓｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，  Ｎｏｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ  ２００６，  Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）。分子レベルでは、転写因子、構造タンパク、ホルモン、イオンチャネル、及び密着結合タンパクを含め、心筋細胞によって発現される数個のマーカーも、ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞によって発現する（Ｋｅｈａｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００２，  Ｍｕｍｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，  Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，  Ｐａｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００５，  Ｎｏｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ  ２００６，  Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）。
【０００６】
総合すると、ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞の分子的及び構造的特性は、その細胞が、対応する成体細胞と類似点を共有していることを示す。しかし、更に重要なのは、この細胞の機能的特徴であり、これらの特性を調べるために、種々の薬理学的及び電気生理学的アプローチが用いられてきている。ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞の１つの大きな利点は、自発収縮能を失うことなく、培養液中で長期間にわたって維持できる点である。これにより、同じ細胞調製物の非侵襲検査を繰り返すことができるようになる。いくつかの研究では、ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞が、α／β−アドレナリン刺激及びムスカリン刺激に反応することが論証されており、イオンチャネル、膜トランスポーター、及び筋フィラメントタンパクを活性化する、シグナル伝達パスウェイと共役する特異的な表面膜受容体をこの細胞が発現することを示唆している（Ｋｅｈａｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００２，  Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００５，  Ｎｏｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）。これに加えて、細胞内の電気生理学的測定を用いて、結節様、心房様、及び心室様器官の指標となる活動電位が、ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞で確認されている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００２，  Ｍｕｍｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，  Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）。総合すると、これらの結果は、インビトロで発生させた幹細胞由来の心筋細胞が、創薬での適用可能性の観点での更なる評価対象として魅力的なものになる基本的な機能性を有することを示している。
【０００７】
組織様構造体である、ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞様細胞クラスターはとりわけ、心筋細胞内の活動電位及び伝導のような機能的属性の測定のためのプラットフォームを作り上げれば、いくつかのインビトロ用途において大いなる可能性を有する。これに加えて、発生中のクラスターは、ヒトの心臓発生中の初期イベントについて研究するためのインビトロモデルとして働くこともある。更には、このクラスターは、組織の類似点に基づき、損傷又は疾患後の心臓機能の修復のためにインビボで用いるのに最適であることもある。本発明は、上記に従って用いられる、ｈＢＳ細胞由来の独自の心筋細胞様細胞クラスターを提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、新規な心筋細胞様細胞クラスター（ＣＭＬＣ）と、このクラスターをｈＢＳ細胞から調製する方法に関する。本発明のＣＭＬＣは特に、創薬及び毒性試験での使用に非常に適している。
【０００９】
本発明によるクラスターは心筋細胞様細胞を含み、このクラスターは、
ｉ）収縮細胞と、
ｉｉ）電気的に連結されている細胞と、
を有し、
ｉｉｉ）Ｎｋｘ．２．５、トロポニン、及びミオシンを含む心臓マーカーと、
ｉｖ）機能的アドレナリン受容体のマーカーと、
ｖ）機能的ムスカリン受容体のマーカーと、
ｖｉ）ｈＥＲＧ、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、及びＫ＋チャネルを含む機能的イオンチャネルのマーカーと、
ｖｉｉ）ＡＦＰ、ＴＦ、ＡＰＯＡ２、ＡＨＳＧ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＴＴＲ、ＡＰＯＢ、及びＲＢＰ４からなる群から選択される１つ以上の内胚葉マーカーと、
を発現する。
【００１０】
上記の細胞間の電気的連結は、ギャップ結合によるものであってよい。
【００１１】
１つの具体的な実施形態では、実施例１３に記載されているように、前記クラスターは、未分化細胞のマーカーのＯＣＴ−３／４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０のうちの１つ以上を発現しない。
【００１２】
β−アドレナリン刺激（イソプロテレノール、アドレナリン）、α−アドレナリン刺激（フェニレフリン）、ムスカリン刺激（カルバコール、アセチルコリン、アトロピン）、カルシウムチャネルの遮断（ベラパミル）、ｈＥＲＧチャネルの遮断（Ｅ４０３１）、及び、ファニーチャネルの阻害のような薬理学的刺激に反応する細胞をクラスターが含むことが重要である。
【００１３】
本発明によるクラスターは、心筋細胞様細胞と、アップレギュレートしている遺伝子で、
ｉ）発現値が５００以上であり、
ｉｉ）心筋細胞様細胞クラスターと未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現値のフォールド・チェンジ（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）（ＦＣＣＭＬＣ）が１０以上である
遺伝子を含むクラスターとを含む。
【００１４】
本発明の実施例に、上記の値を測定するのに適した方法が示されている。
【００１５】
例えば医学的用途、薬物スクリーニング、及び心臓毒性研究での使用に適した心筋細胞様細胞を、再現可能な形、かつ更に分化させて心筋細胞にする必要なしに、比較的簡単に調製されるクラスターの形状で単離できることを本発明者は見出した。このクラスターは、心臓マーカーに加えて、例えば内胚葉系統のマーカーも含み、心臓毒性試験で広く使用されている１つ以上のイオンチャネルを発現し、転写因子を発現する。
【００１６】
したがって、本発明は、成熟心筋細胞の精製及び完全分化の必要なしに、医学的用途、並びに、薬物スクリーニング及び薬物試験に適した心筋細胞様細胞産物を得るための比較的単純な手段を提供する。
【００１７】
更に、本発明は、エンドユーザーが利用しやすい形状でＣＭＬＣを提供する組成物をもたらす。この組成物は、クラスターの凍結／ガラス化、保管、解凍、及び使用中にＣＭＬＣの安定性を確保する作用剤を特に含む水性培地中で、ＣＭＬＣを懸濁することによって調製される。従って、クラスターの調製からエンドユーザーによる使用に至るまでクラスターを処理するのに適している単独の培地を得るためには、上記の４つの異なるプロセスの全てを考慮して、上記の水性培地の特性を選択しなければならない。この産物は、生又は凍結形態で提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で使用する場合、「胚盤胞由来幹細胞」という用語は、ＢＳ細胞として示され、そのヒト形態は、「ｈＢＳ細胞」と称する。文献では、この細胞は、胚性幹細胞、更に具体的にはヒト胚性幹細胞と呼ばれることが多い。したがって、本発明で用いられる多能性幹細胞は、例えば国際公開第０３／０５５９９２号及び国際公開第２００７／０４２２２５号に記載されているように、胚盤胞から調製した胚性幹細胞であるか、又は、市販のｈＢＳ細胞若しくは細胞株であることができる。しかし、例えば、Ｊｕｎｙｉｎｇ  Ｙｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７に開示されているように、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８のような特定の転写因子で分化成体細胞を処理することによって、多能性細胞に再プログラムされる分化成体細胞を含め、あらゆる多能性ヒト幹細胞を本発明で利用できることが更に想定される。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「ＤＭＳＯ」という用語は、ジメチルスルホキシドを意味するように意図されている。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「心筋細胞様細胞」という用語は、成熟心筋細胞と特徴を共有する細胞を意味するように意図されている。心筋細胞様細胞は更に、形態的特性、及び、特異的マーカー特性によって定義される。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「心筋細胞様細胞クラスター」（ＣＭＬＣ）という用語は、相互に付着しあっている少なくとも２つの心筋細胞様細胞を含む集団を意味するように意図されており、このクラスターは、他の細胞型も含む。クラスターは、拍動する細胞を含む。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「結節様細胞」という用語は、下記の活動電位特性を有する細胞を意味するように意図されている。
静止膜電位（ＭＲＰ）：−４０〜−６０ｍＶ
持続時間：８０〜１３０ｍｓ
第４相の顕著な脱分極
【００２３】
本明細書で使用する場合、「心房様細胞」という用語は、下記の活動電位特性を有する細胞を意味するように意図されている。
静止膜電位（ＭＲＰ）：−５０〜−８０ｍＶ
持続時間：＜１５０ｍｓ
【００２４】
本明細書で使用する場合、「心室様細胞」という用語は、下記の活動電位特性を有する細胞を意味するように意図されている。
静止膜電位（ＭＲＰ）：−５０〜−８０ｍＶ
持続時間：＞１５０ｍｓ
顕著なプラトー相
【００２５】
本明細書の文脈では、「発現」という用語は、遺伝子及び／又はタンパクの発現（いずれが該当するかは文脈でわかるはずである）に用いる。
【００２６】
本願では、「低温保存」という用語は、生体物質を超低温で保存することを示す。
【００２７】
本明細書の文脈では、「混合分化ｈＢＳ細胞」という用語は、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉という３つの全ての胚葉に由来する細胞が存在する、自発分化ｈＢＳ細胞の集団に用いる。この試料は、多くのタイプの分化細胞でアップレギュレートする遺伝子を、心筋細胞様細胞クラスターで特異的にアップレギュレートする遺伝子から区別するためのコントロール材として用いる。本発明の実施例に、混合分化ｈＢＳ細胞を得る方法が教授されている。
【００２８】
本明細書の文脈では、「強制凝集」という用語は、遠心力による遠心分離、又は重力による沈殿のような外力による細胞の３Ｄ凝集に用いる。
【００２９】
フィーダー細胞
本明細書で使用する場合、フィーダー細胞は、単独又は組み合わせて用いられる支持細胞型を意味するように意図されている。これらの細胞型は更に、ヒト由来であっても、他の種由来のものであってもよい。フィーダー細胞の由来元にできる組織としては、胚、胎児、新生児、若年者、又は成人の組織が挙げられ、更には、包皮、臍帯、筋肉、肺、上皮、胎盤、ファローピウス管、腺、支質、又は胸部を含む皮膚に由来する組織が挙げられる。フィーダー細胞は、ヒトの線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、及び上皮細胞からなる群に関わる細胞型に由来してもよい。フィーダー細胞の抽出に用いてよい特定的な細胞型の例としては、胚性線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞及び／又は線維細胞、胎児筋細胞、胎児皮膚細胞、胎児肺細胞、胎児内皮細胞、胎児上皮細胞、臍帯間葉細胞、胎盤線維芽細胞及び／又は線維細胞、胎盤内皮細胞が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「ＭＥＦ細胞」という用語は、マウス胚性線維芽細胞を意味するように意図されている。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「ＴＧＦ−β」という用語はトランスホーミング増殖因子β、好ましくはヒト及び／又は組換え体由来のトランスホーミング増殖因子βを意味する。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３と呼ばれる３つのアイソフォームを取るタンパクである。ＴＧＦ−βファミリーは、トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーとして知られるタンパクのスーパーファミリーの一部であり、このスーパーファミリーには、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形態形成タンパク、デカペンタプレジック、及びＶｇ−１が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ＦＧＦ」という用語は線維芽細胞増殖因子、好ましくはヒト及び／又は組換え体由来の線維芽細胞増殖因子を意味し、この因子に属するサブタイプは例えば、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ２と称されることもある）及びＦＧＦ４である。
【００３３】
「ＢＭＰ２」という用語は、ＢＭＰファミリーの増殖因子のメンバーの１つである骨形態形成タンパク−２を意味するように意図されている。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「ゼノフリー」という用語は、ヒト以外の動物の成分への直接的又は間接的暴露を完全に回避することを意味するように意図されている。
【００３５】
心臓幹細胞マーカー
ｃ−キット及び心臓前駆細胞マーカー：Ｉｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４。本明細書では、初期心臓マーカーとみなす。
【００３６】
心筋細胞のマーカー：ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ（心臓トロポニンＩ及びＴ）、α−ＭＨＣ（アルファ−ミオシン重鎖）、コネキシン−４３。
【００３７】
他のマーカーは、本発明の実施例から明らかである。
【００３８】
ＣＭＬＣ
本発明によるクラスターは心筋細胞様細胞を含み、このクラスターは、
ｉ）収縮細胞と、
ｉｉ）電気的に連結されている細胞と、
を有し、
ｉｉｉ）Ｎｋｘ．２．５、トロポニン、及びミオシンを含む心臓マーカーと、
ｉｖ）機能的アドレナリン受容体のマーカーと、
ｖ）機能的ムスカリン受容体のマーカーと、
ｖｉ）ｈＥＲＧ、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、及びＫ＋チャネルを含む機能的イオンチャネルのマーカーと、
ｖｉｉ）ＡＦＰ、ＴＦ、ＡＰＯＡ２、ＡＨＳＧ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＴＴＲ、ＡＰＯＢ、及びＲＢＰ４からなる群から選択される１つ以上の内胚葉マーカーと、
を発現する。
【００３９】
上記の細胞間の電気的連結は、ギャップ結合によるものであってよい。
【００４０】
本発明のクラスターは、未分化細胞のマーカーのＯＣＴ−３／４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０のうちの１つ以上を発現しないのが好ましい。１つの具体的な実施形態では、このクラスターは、未分化細胞のマーカーを全く発現しない。
【００４１】
１つの態様では、本発明は、心筋細胞様細胞を含むクラスターを提供し、このクラスターは、アップレギュレートしている遺伝子で、
ｉ）発現値が５００以上であり、
ｉｉ）心筋細胞様細胞クラスターと未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現値のフォールド・チェンジ（ＦＣＣＭＬＣ）が１０以上である
遺伝子を含む。
【００４２】
上記の値は、本明細書の実施例２に記載されているように測定することができる。本発明者は、フォールド・チェンジ値を得るための下記の２つの具体的方法を適用した。
ｉ）ＣＭＬＣと未分化細胞との間の遺伝子発現値のフォールド・チェンジを測定することによる方法。
ｉｉ）ＣＭＬＣと混合分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現値のフォールド・チェンジを測定することによって補うこと以外は、上記と同じ方法（下記参照）。
【００４３】
これら２つの方法による結果はわずかに異なり、方法ｉｉ）、すなわち、更なる選択を行う方法を用いると、特定の用途での使用に更に適した特性を有するクラスターをもたらすことができると考えられる。
【００４４】
したがって、１つの具体的な実施形態では、本発明は、心筋細胞様細胞を含むクラスターを提供し、このクラスターは、アップレギュレートしている遺伝子で、
ｉ）発現値が５００以上であり、
ｉｉ）心筋細胞様細胞クラスターと未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現値のフォールド・チェンジ（ＦＣＣＭＬＣ）が１０以上であり、
ｉｉｉ）ＦＣＣＭＬＣとＦＣＭＣとの比率が１００以上である
遺伝子を含む。
【００４５】
ＦＣＭＣは、混合分化ｈＢＳ細胞集団のフォールド・チェンジを意味する。本明細書の文脈では、「混合分化ｈＢＳ細胞」という用語は、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉という３つの全ての胚葉に由来する細胞が存在する自発分化ｈＢＳ細胞の集団に関して用いる。この試料は、あらゆるタイプの分化細胞でアップレギュレートする遺伝子を、心筋細胞様細胞培養液で特異的にアップレギュレートする遺伝子から区別するためのコントロール材として用いる。
【００４６】
更には、発現値は、本明細書の実施例２に詳述されているように、特定のチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  （米国カリフォルニア州サンタクララのアフィメトリクス社）を用いる測定によって求める。他のチップを用いると、異なる値が得られることがあるため、本明細書の値との比較対照はいずれも、同じ種類のチップ、又は同様の結果をもたらすチップを用いて行わなければならない。
【００４７】
本発明の更なる特定的な実施形態では、アップレギュレートしている遺伝子で、
ｉ）発現値が２０００以上であり、
ｉｉ）ＦＣＣＭＬＣの値が１００以上であり、
ｉｉｉ）ＦＣＣＭＬＣとＦＣＭＣとの比率が１００以上である
遺伝子を含むクラスターを提供する。
【００４８】
本明細書の実施例には、当業者が、上記の値を測定するために、どうやって実験を行うことができるかに関する詳細が示されている。
【００４９】
上記のクラスターは、ＢＳ細胞、特にｈＢＳ細胞から抽出する。したがって、出発物質は、市販のＢＳ細胞又は細胞株であってよく、あるいは、出発物質は、国際公開第０３／０５５９９２号及び国際公開第２００７／０４２２２５号に記載されているように調製してもよい。このような物質は、セルアーティス・アーベー（ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ）から得ることができ、また、ＮＩＨの幹細胞レジストリー（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ）を通じて、及び、英国幹細胞バンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｋｓｔｅｍｃｅｌｌｂａｎｋ．ｏｒｇ．ｕｋ）からも入手可能である。
【００５０】
上述のとおり、クラスターに含まれる個々の細胞の全てが、上記の要件を満たすわけではないことがある。要件は、クラスターが満たしているのであって、必ずしも、個々の全ての細胞が満たしているとは限らない。更には、クラスターに含まれる細胞は、分化の程度が異なることがあり、心筋細胞様細胞に完全に分化したものもあれば、内胚葉細胞のような特徴を有するものもある場合がある。しかし、いずれにしても、クラスターは収縮細胞を含まなければならない。本明細書の実施例に記載されているように、クラスターは典型的には、強制凝集によってＢＳ、特にｈＢＳ細胞を自発的に分化させて、未分化細胞を含む３Ｄ構造体を得ることによって調製する。この３Ｄ構造体を最長で２２日間、更に培養した後、心筋細胞様細胞クラスターが生じる。
【００５１】
更に、異なる細胞がクラスターに含まれること、及び、クラスターに含まれる細胞の分化の程度が異なることは、ＣＭＬＣの利用に際して有益であると想定される。例えば、インビトロでＣＭＬＣが様々な表面（例えば、コート又は非コートの培養皿又はガラス表面）に付着及び結合するのを高めるためには、種々の細胞型があることが重要となることがある。また、上記の事象は、低温保存中の細胞生存数の増加と、ＣＭＬＣをインビトロ用途（例えば細胞移植）に用いるときの細胞生着の向上に寄与できるであろう。したがって、本発明の目的は、ｈＢＳ細胞から心筋細胞への発生段階において、すなわち、分化のごく初期段階から、中間分化段階を介して、心筋細胞に完全分化した細胞になるまで、様々な細胞型を含むクラスターを提供することである。本明細書の実施例に示されているように、クラスター内の細胞はいずれも、未分化細胞でないことが分かっている。したがって、かつ実施例及び図面に示されているように、本発明のクラスターは、様々なマーカーを有する。
【００５２】
通常、このクラスターは、複数の細胞、例えば、約１０個〜約５０００個の細胞を含む。
【００５３】
１つの具体的な実施形態では、本発明によるクラスターは、（未分化細胞と比べて）アップレギュレートした遺伝子を有する細胞を含み、その発現値は約７５０以上であり、例えば、約１０００以上、約１５００以上、約２０００以上、約２５００以上、又は約３０００以上といった発現値である。この代わりに、又は更に、本発明によるクラスターは、ＦＣ（ＣＭＬＣ）値が約２０以上、例えば約５０以上、約１００以上、約５００以上、約７５０以上、約１０００以上等であるアップレギュレート遺伝子を有する細胞を含む。この代わりに、又はこれに加えて（混合分化ｈＢＳ細胞を伴う方法を用いるとき）、ＦＣＣＭＬＣ／ＦＣＭＣの比率は、約１５以上、例えば、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約５００以上、約７５０以上、約１０００以上である。アップレギュレート遺伝子の含量が異なるクラスターを選択するために、一連の基準を設定することができる。
【００５４】
クラスターで同定される遺伝子のいくつかは、通常は心筋細胞様細胞と関連しない遺伝子である（表ＩＩで「白」で示されている遺伝子を参照）。これらの発見は、興味深いものであるように思われ、医学的用途及び試験に関わるＣＭＬＣの機能で重要な役割を果たすことがある。具体的には、内胚葉由来の細胞及び組織は、心臓の初期発生において不可欠な役割を果たすようである。ＣＭＬＣは、初期発生段階の心臓組織を擬似する組織様構造体を作り上げる。
【００５５】
本明細書の実施例に示されているように、本発明によるクラスターは、下記の特徴（表ＩＩ及びＩＩＩ）を有する。
【００５６】
表ＩＩ：ＣＭＬＣで特異的にアップレギュレートする遺伝子の一覧。表中のＦＣ値はいずれも、上記のとおり、未分化ｈＢＳ細胞に対して算出したものである。遺伝子は、ＣＭＬＣの発現値に基づき、降順にソートされている。
【００５７】
【表１−１】
0005722628.tif 000002
【００５８】
【表１−２】
0005722628.tif 000003
【００５９】
特に留意すべきなのは、表ＩＩの遺伝子の大半を２つの異なるグループに分類できる点である。第１のグループは、既に心臓細胞と関連付けられている遺伝子からなり、第２のグループは、既に肝実質細胞のような内胚葉細胞と関連付けられている遺伝子からなる。第１のグループに属する遺伝子の例は、ＭＹＨ６、ＭＹＬ７、ＭＹＬ４、ＴＮＮＣ１、ＴＮＮＴ２、ＰＬＮ、ＴＴＮ、ＭＹＨ７、ＬＤＢ３、ＮＰＰＢ、ＧＡＴＡ６、ＭＹＬ３、ＣＳＲＰ３、ＡＣＴＮ２、ＭＢ、ＭＹＯＺ２、ＴＢＸ５、及びＨＳＰ２７（表ＩＩで薄い灰色で示されているもの）である。第２のグループに属する遺伝子の例は、ＡＦＰ、ＴＦ、ＡＰＯＡ２、ＡＨＳＧ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＬＢ、ＡＰＯＣ３、ＴＴＲ、ＡＰＯＢ、及びＲＢＰ４（表ＩＩで濃い灰色で示されているもの）である。
【００６０】
ＣＭＬＣで特異的にアップレギュレートする遺伝子の更に厳密な選択結果を得るために、基準を下記まで狭めた。
ｉ）ＣＭＬＣでの発現値が２０００未満の遺伝子を除外した。
ｉｉ）ＦＣＣＭＬＣが１００未満の遺伝子を除外した。
ｉｉｉ）ＦＣＣＭＬＣ／ＦＣＭＣの比率が１００未満の遺伝子を除外した。
【００６１】
残った９個の遺伝子は表ＩＩＩに示されており、これらは、ＣＭＬＣに適したマーカー遺伝子の典型である。
【００６２】
表ＩＩＩ：ＣＭＬＣで特異的にアップレギュレートする遺伝子のうち、より厳密な基準による選択後に残った遺伝子の一覧。表中のＦＣ値はいずれも、上記のとおり、未分化ｈＢＳ細胞に対して算出したものである。遺伝子は、ＣＭＬＣの発現値に基づき、降順にソートされている。
【００６３】
【表２】
0005722628.tif 000004
【００６４】
この選択結果は、クラスターで発現する内胚葉遺伝子と中胚葉遺伝子との均等な分布を示している。表ＩＩＩでは、中胚葉遺伝子は薄い灰色で、内胚葉遺伝子は濃い灰色で示されている。
【００６５】
別の具体的な実施形態では、本発明によるクラスターは、心臓細胞と関連付けられている遺伝子であるアップレギュレート遺伝子を２個以上、例えば、４個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１２個以上、若しくは１６個以上有し、及び／又は、
【００６６】
内胚葉細胞と関連付けられている遺伝子であるアップレギュレート遺伝子を２個以上、例えば、４個以上、６個以上、８個以上有し、及び／又は、
【００６７】
本明細書の表ＩＩに記載されているように、非心臓細胞又は非内胚葉細胞と関連付けられている遺伝子であるアップレギュレート遺伝子を２個以上、例えば４個以上、６個以上、８個以上有し、及び／又は、
【００６８】
アップレギュレート遺伝子は、本明細書の表ＩＩに列挙されている１０個以上、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、５５個以上、若しくは全ての遺伝子を含む。
【００６９】
本発明の更なる具体的な実施形態では、アップレギュレートしている遺伝子で、
ｉ）発現値が２０００以上であり、
ｉｉ）ＦＣＣＭＬＣ値が１００以上であり、
ｉｉｉ）ＦＣＣＭＬＣとＦＣＭＣとの比率が１００以上である
遺伝子を含むクラスターを提供する。
【００７０】
本発明の更なる実施形態では、アップレギュレートしている遺伝子であって、
ｉ）発現値が２０００以上であり、
ｉｉ）ＦＣＣＭＬＣ値が１００以上である
遺伝子を含むクラスターを提供する。
【００７１】
このクラスターは通常、例えばｈＢＳ細胞のようなＢＳ細胞から抽出し、クラスター内の細胞の数は通常、１０〜約５０００細胞、又は１０〜約２０００細胞である。
【００７２】
更に、本発明によるクラスターは、１つ以上のイオンチャネルを発現する。留意すべきことに、同定されたイオンチャネルは、心臓毒性試験で広く用いられているイオンチャネルである。これは、ＣＭＬＣの心臓毒性試験への適合性の更なる指標である。
【００７３】
イオンチャネルは典型的には、電位依存性Ｋチャネル、内向き整流性Ｋチャネル、電位依存性Ｎａチャネル、リガンド依存性Ｎａチャネル、及び／又は電位依存性ＣａチャネルのようなＫ、Ｎａ、及び／又はＣａイオンチャネルである。更に特定的なイオンチャネルは、図７ａ及びｂのポスターの表１に列挙されている。１つの特定的な実施形態では、クラスターは、図７ａ及びｂのポスターの表１に列挙されているイオンチャネルのうちの少なくとも３個、例えば、少なくとも４個、少なくとも５個、又は全てを発現する。
【００７４】
ある非常に具体的な実施形態では、本発明によるクラスターは、表ＩＩ、ＩＩＩのいずれにも列挙されているか、並びに／又は、図７ａ及びｂのポスターの表１に列挙されている遺伝子を全て有する。
【００７５】
更なる具体的な実施形態は、添付のアイテム及び特許請求の範囲から明らかである。
【００７６】
上記の心筋細胞様細胞のクラスターは、その膜内外活動電位を測定することによっても特徴付けることができる。実施例１１に詳述されているように、クラスターに入る先鋭な微小電極を用いることによって、特徴的な活動電位を記録し、５０％、７０％、及び９０％の再分極点でのＡＰ持続時間（ｄｕｒ５０（ＡＰＤ５０）、ｄｕｒ７０（ＡＰＤ７０）、ｄｕｒ９０（ＡＰＤ９０））、ＡＰ振幅（ａｍｐ）、静止膜電位（ＭＲＰ）、及びＡＰ立ち上がり最大速度（Ｖｍａｘ）を割り出した。
【００７７】
続いて、膜内外活動電位（ＴＡＰ）の記録結果に基づき、クラスターを、主に結節様、心房様、又は心室様として特徴付けた。次いで、クラスター、又はクラスターの懸濁液が、結節様細胞を少なくとも１０％（例えば、少なくとも１３％、少なくとも１５％、若しくは約１７％）、及び／又は、心房様細胞を少なくとも３０％（例えば、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、若しくは約５０％）、及び／又は、心室様細胞を少なくとも２０％（例えば、少なくとも２３％、少なくとも２６％、少なくとも３０％、若しくは約３３％）含むことを見出した。
【００７８】
上記の表から分かるように、クラスターは、非心臓マーカーを有する細胞を含むと共に、これまでに報告された研究結果を超える遺伝子数を発現する。つまり、本発明によるクラスターは典型的に、下記の遺伝子のうちの１つ以上、例えば、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は全てを発現する細胞を含む。
【００７９】
【表３】
0005722628.tif 000005
【００８０】
更に具体的には、かつ、上記のように更に制限された要件を用いると、本発明のクラスターは、下記の遺伝子のうちの１つ以上、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、又は全てを発現する細胞を含む。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
更なる詳細は、本明細書の図１１に示されている。この目的を達成するために、１つの具体的な実施形態では、本発明のクラスターは、図１１に示されているマーカーのうちの少なくとも１０個、例えば、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、又は少なくとも４００個を発現する細胞を含む。更に具体的には、本発明のクラスターは、下記のマーカーのうちの少なくとも１０個、例えば、少なくとも２０個、少なくとも４０個、少なくとも６０個、又は全てを発現する細胞を含む。
【００８３】
【表５−１】
0005722628.tif 000007
【００８４】
【表５−２】
0005722628.tif 000008
【００８５】
【表５−３】
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【００８６】
心筋細胞様クラスターの懸濁液又は組成物は、結節様細胞を含むクラスターと、心房様細胞を含むクラスターと、心室様細胞を含むクラスターとの混合物を含んでもよい。
【００８７】
つまり、１つの実施形態では、本発明は、心筋細胞様クラスターの懸濁液又は組成物であって、結節様細胞を含むクラスターの数と、心房様細胞を含むクラスターの数との比率が、約１：１００〜約５０：１００の範囲、例えば、約１０：１００〜約４０：１００、約２０：１００〜約４０：１００、約３０：１００〜約４０：１００、又は約３３：１００〜３４：１００である懸濁液又は組成物に関する。
【００８８】
別の実施形態では、本発明は、心筋細胞様クラスターの懸濁液又は組成物であって、結節様細胞を含むクラスターの数と、心室様細胞を含むクラスターの数との比率が、約１：１００〜約８０：１００の範囲、例えば、約１０：１００〜約７０：１００、約３０：１００〜約７０：１００、約４５：１００〜約５５：１００、又は約５０：１００である懸濁液又は組成物に関する。
【００８９】
更なる実施形態では、本発明は、心筋細胞様クラスターの懸濁液又は組成物であって、心室様細胞を含むクラスターの数と、心房様細胞を含むクラスターの数との比率が、約１：１００〜約９０：１００の範囲、例えば、約４０：１００〜約８０：１００、約５０：１００〜約７５：１００、又は約６６：１００である懸濁液又は組成物に関する。
【００９０】
更に別の実施形態では、本発明は、心筋細胞様クラスターの懸濁液又は組成物であって、結節様細胞を含むクラスターと、心房様細胞を含むクラスターと、心室様細胞を含むクラスターとの比率が１７：５０：３３である懸濁液又は組成物に関する。
【００９１】
１つ以上のクラスターを含む組成物
本発明の別の態様は、クラスター含有組成物に関し、すなわち、上記のような心筋細胞様細胞の１つ以上のクラスターは、例えば水性培地のようなキャリアを含む組成物中に存在してよい。この組成物は更に、１つ以上の凍結保護剤、１つ以上の安定剤、及び／又は１つ以上の粘度調整剤を含む１つ以上の添加剤を含んでよい。この組成物は、液体形態であっても凍結形態であってもよい。
【００９２】
１つ以上の凍結保護剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、プロパンジオール、及びメチルペンタンジオール、並びに／又はこれらの混合物からなる群から選択してよい。また添加剤は、スクロース、トレハロース、マルトース、若しくはラクトースを含む糖又は糖アルコールであってよい。
【００９３】
１つの特殊な実施形態では、凍結保護剤は、濃度約０．０２Ｍ〜約１Ｍ、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１５Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．２５Ｍ〜約０．６Ｍのトレハロースである。トレハロースの濃度は、約０．３Ｍであるのが好ましい場合がある。
【００９４】
別の特殊な実施形態では、凍結保護剤は、濃度約０．０２Ｍ〜約１Ｍ、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１５Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．２５Ｍ〜約０．６Ｍのスクロースである。スクロースの濃度は、約０．３Ｍであるのが好ましい場合がある。
【００９５】
更なる実施形態では、凍結保護剤は、濃度が少なくとも２．５％ｖ／ｖ、例えば、約２．５％〜約４０％ｖ／ｖ、約５％〜約３５％ｖ／ｖ、約７％〜約３０％ｖ／ｖ、約７％〜約２５％ｖ／ｖ、約７％〜約２０％ｖ／ｖ、約１５％〜約２５％ｖ／ｖ、又は約５％〜約１５％ｖ／ｖであるＤＭＳＯであってよい。
【００９６】
更なる実施形態では、凍結保護剤は、濃度が少なくとも２．５％ｖ／ｖ、例えば、約２．５％〜約３０％ｖ／ｖ、約５％〜約２５％ｖ／ｖ、約５％〜約２０％ｖ／ｖ、約１０％〜約２０％ｖ／ｖ、約７％〜約１０％ｖ／ｖ、又は約２．５％〜約５％ｖ／ｖであるエチレングリコールであってよい。
【００９７】
上記の組成物は更に、フィコール、パーコール、ヒアルロン酸、アルブミン、ポリビニルピロリドン、アルギニン酸、ゼラチン、及びグリセロールからなる群から選択した粘度調整剤を含んでもよい。
【００９８】
１つの特殊な実施形態では、粘度調整剤は、濃度が最大で約１５０ｍｇ／ｍｌ、例えば最大で約１００ｍｇ／ｍｌ、最大で約５０ｍｇ／ｍｌ、最大で約２５ｍｇ／ｍｌ、最大で約１５ｍｇ／ｍｌ、又は最大で約１０ｍｇ／ｍｌのフィコールであってよい。
【００９９】
上記の組成物の更なる構成成分は、濃度が約２ｎｇ／ｍｌ、例えば、約３ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ、又はそれ以上である１つ以上の増殖因子、例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）であってよい。
【０１００】
また、上記の組成物は、適切な濃度の１つ以上の必須及び／又は非必須アミノ酸も含んでよい。必須アミノ酸の例は、例えば、濃度が約０．０１ｍＭ、例えば、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約０．２ｍＭ、又はそれ以上に及ぶＬ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンである。
【０１０１】
上記の組成物は更に、例えば、塩化カルシウム（無水）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ）、硫酸第二鉄（ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化マグネシウム（無水）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、二塩基性リン酸ナトリウム（無水）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）のような無機塩を１つ以上、及び／又は、ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、若しくはビタミンＢ１２のようなビタミンを１つ含んでもよい。
【０１０２】
上記の物質は、市販の混合物、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ培地、又はＲＰＭＩ培地中で、入手可能であることもある。
【０１０３】
ＣＭＬＣは、国際公開第２００４／０９８２８５号に記載されているように、クローズドストロー内でガラス化し、液体Ｎ２中で保存した。１０％エチレングリコール及び１０％ＤＭＳＯを添加したｖｉｔｒｏ−ＰＢＳ（ビトロライフ社）、並びに、０．３Ｍトレハロース、２０％エチレングリコール、及び２０％ＤＭＳＯを添加したｖｉｔｒｏ−ＰＢＳ（ビトロライフ社）を含む濾過滅菌済みガラス化溶液を使用した。培地（２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍモル／ｌβ−メルカプトエタノール、及び１％非必須アミノ酸を添加したノックアウトＤＭＥＭ）で解凍後、細胞を回収した。
【０１０４】
１つの具体的な実施形態では、ＣＭＬＣのサイズは通常、約２０μｍ〜約３０μｍである。更に、クラスター中の細胞の５０〜８０％は、心臓マーカーを発現する。
【０１０５】
輸送に適した産物は、２〜２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍモル／ｌβ−メルカプトエタノール、及び１％非必須アミノ酸を添加したノックアウトＤＭＥＭ培地（全てカリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン製）中に１つ以上のクラスターを含む。
【０１０６】
本発明による組成物は、少なくとも−８０℃の温度で少なくとも２年間保管後に、クラスターが、記載されている特徴の少なくとも９５％を保持する組成物を提供する。更には、組成物を少なくとも−８０℃の温度で少なくとも２年間保管後、細胞の少なくとも約５０％以上、例えば、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、又は約９５％以上が、生存可能である。
【０１０７】
キット
本発明は更に、特定の物質の心臓毒性試験で用いるキットを提供し、このキットは、
ｉ）上記のような心筋細胞様細胞の１つ以上のクラスター又は組成物と、
ｉｉ）このクラスター又は組成物のうち該当する方の使用法に関する具体的な取扱説明書と、
を含む。
【０１０８】
１つの具体的な実施形態では、このキットは、上記で定義のとおり、結節様細胞、及び／又は心房様細胞、及び／又は心室様細胞の心筋細胞様クラスターからなる組成物を含んでもよい。
【０１０９】
キットは更に、
ｉｉｉ）キットの使用前に特定の物質を分散させる培地
を含んでもよい。
【０１１０】
更なる実施形態では、本発明は、特定の物質の創薬中にインビトロ試験で用いるキットを提供し、このキットは、
ｉ）上記のような心筋細胞様細胞の１つ以上のクラスター又は組成物と、
ｉｉ）このクラスター又は組成物のうち該当する方の使用法に関する具体的な取扱説明書と、
を含む。
【０１１１】
１つの具体的な実施形態では、このキットは、上記で定義のとおり、結節様細胞、及び／又は心房様細胞、及び／又は心室様細胞の心筋細胞様クラスターからなる組成物を含んでもよい。
【０１１２】
キットは更に、
ｉｉｉ）キットの使用前に特定の物質を分散させる培地
を含んでもよい。
【０１１３】
更に別の実施形態では、本発明は、
ｉ）上記のような組成物、及び／又は１つ以上の心筋細胞様細胞クラスターと、
ｉｉ）例えば、既製のシリンジのような投与形態の細胞など、該組成物又は細胞を患者に投与するためのツールと、
を含む再生医療用キットも提供する。
【０１１４】
１つの具体的な実施形態では、このキットは、上記で定義のとおり、結節様細胞、及び／又は心房様細胞、及び／又は心室様細胞からなる心筋細胞様クラスターの組成物を含んでもよい。
【０１１５】
心筋細胞様細胞クラスターの低温保存は、緩慢凍結法を用いるか、又は、オープン若しくはクローズトプルドストローを用いるガラス化によって、行ってよい。
【０１１６】
ガラス化溶液
ガラス化溶液（第１及び第２の溶液）の少なくとも１つは、１つ以上の凍結保護剤、又は凍結保護剤の混合物を含んでよい。当然ながら、無毒性の凍結保護剤が好ましい。凍結保護剤は、非凍結水中に残存する他の溶質のモル分率を低下させることによって、収縮を最小限に抑える補助をする。凍結保護剤は、結晶氷の形成を抑制し、それによって、非凍結水の凝固点を降下させる。また、結合水との水素結合によって、タンパクの変性を防ぐこともできる。細胞が冷えると、溶媒水は細胞外氷晶に転化し、透過しない電解質又は非電解質の細胞外濃度の上昇によって、細胞が損傷する。凍結保護剤で処理すると、細胞は、未処理時よりもかなり低い温度に到達するまでは、未処理細胞の塩濃度に達しない。このような低い温度では、化学反応は非常にゆっくり進行し、その結果、細胞の損傷が最小限に抑えられる。通常は、それぞれ異なるタイプによって相違点が存在する場合があるので、凍結保護剤を組み合わせたものを用いる方がよい。また、凍結保護剤は、浸透活性剤としての役割も果たすことができる。好適な凍結保護剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、プロパンジオール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトースを含む糖、及びメチルペンタンジオールからなる群から選択することができる。
【０１１７】
ガラス化の手順は、
ｉ）心筋細胞様細胞クラスターを第１の溶液に移すステップと、
ｉｉ）任意により、第１の溶液中の心筋細胞様クラスターをインキュベートするステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）又はｉｉ）で得られた心筋細胞様クラスターを第２の溶液に移すステップと、
ｉｖ）任意により、第２の溶液中の心筋細胞様クラスターをインキュベートするステップと、
ｖ）ステップｉｉｉ）又はｉｖ）で得られた細胞を、１つ以上のオープンストロー、少なくとも片側がクローズドなストロー、又は完全にクローズドなストローに移すステップと、
ｖｉ）この１つ以上のオープンストロー、少なくとも片側がクローズドなストロー、又は完全にクローズドなストローをガラス化するステップと、
を含んでよい。
【０１１８】
第１及び又は第２の溶液に含まれる個々の作用剤の濃度は通常、５〜５０％ｖ／ｖの範囲、例えば、約５％〜４０％ｖ／ｖ、例えば約５％〜約２５％ｖ／ｖ（第１の溶液）、及び約５％〜約３０％ｖ／ｖ（第２の溶液）である。通常、第２の溶液中の凍結保護剤の総濃度（すなわち、ｖ／ｖ、ｗ／ｖ、又はＭで算出した濃度）は、第１の溶液のものよりも高い。第１及び第２の溶液は、同じか又は異なる１つ以上の凍結保護剤を含んでもよい。第１及び第２の溶液中の１つ以上の凍結保護剤の濃度は、同じであることも異なることもでき、通常は、第２の溶液中の凍結保護剤の総濃度は、第１の溶液のものよりも高い。
【０１１９】
本発明の１つの具体的な実施形態では、凍結保護剤はトレハロースである。第１及び／又は第２の溶液に含まれるトレハロースの濃度は通常、約０．０２Ｍ〜約１Ｍの範囲内、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４５Ｍ〜約０．５５Ｍである。通常、同様の用途では、スクロースを用いる。トレハロースは独特な天然の二糖であり、何百もの植物及び動物の中に存在する。トレハロースは重要なエネルギー源であり、凍結時に有機体を安定化させる主な要因であることが明らかになっている。トレハロースは、膜の相転移温度を下げて、乾燥したときでも膜が液晶状態を保つようにできることが分かっている。いずれの理論にも束縛されなければ、これによって、再水和中の膜漏れを防ぎ、その結果、細胞の生存能が保護されると仮定される。タンパクに対しては、トレハロースは、細胞が水和状態にあるときに、タンパクの表面から水を排除することによって、タンパクの変性を抑制することが明らかになっている。
【０１２０】
本発明の別の実施形態では、凍結保護剤はスクロースである。第１及び／又は第２の溶液に含まれるスクロースの濃度は通常、約０．０２Ｍ〜約１Ｍの範囲内、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４５Ｍ〜約０．５５Ｍである。
【０１２１】
本発明の更に別の実施形態では、第１及び第２の溶液の少なくとも１つが、凍結保護剤を含む。
【０１２２】
第１及び第２の溶液の少なくとも１つは、粘度調整剤を含んでよい。本発明の文脈における使用に適した粘度調整剤は、フィコール、パーコール、ヒアルロン酸、アルブミン、ポリビニルピロリドン、アルギニン酸、ゼラチン、及びグリセロールからなる群から選択してよい。第１及び第２の溶液は、同じか又は異なる１つ以上の粘度調整剤を含んでよい。第１及び第２の溶液中の１つ以上の粘度調整剤の濃度は、同じであっても異なっていてもよい。
【０１２３】
本発明の１つの具体的な実施形態では、粘度調整剤はフィコールである。第１及び／又は第２の溶液に含まれるフィコールの濃度は、最大で約１５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、最大で約１００ｍｇ／ｍｌ、最大で約５０ｍｇ／ｍｌ、最大で約２５ｍｇ／ｍｌ、最大で約１５ｍｇ／ｍｌ、又は最大で約１０ｍｇ／ｍｌである。
【０１２４】
本発明の１つの実施形態では、第１及び第２の溶液の少なくとも１つは水溶液である。
【０１２５】
本発明の１つの実施形態では、心筋細胞様細胞クラスターの治療的利用のために、ゼノフリーのｈＢＳ細胞株及び培養法を利用する。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態では、ｈＢＳ細胞株は、過剰な１３番染色体を有するＳＡ００２のようなトリソミー細胞株の性質である。この細胞株は、心筋細胞様細胞クラスターへと効率的に成長する強い傾向と、クラスターの高収量を示している。ｈＢＳ株ＳＡ００２を用いてＣＭＬＣを発生させる１つの利点は、他の供与源から抽出又は単離した非トリソミー細胞の混合物中で（標準的なゲノム技法を用いて）容易に検出できる固有の「標識」（すなわち、３本の１３番染色体）を細胞が持っている点である。
【０１２７】
ｈＢＳ細胞からのＣＭＬＣの収量の増大
本発明の別の態様は、ｈＢＳ細胞からＣＭＣＬＣを調製する方法に関する。この新規な方法は、拍動クラスターの収量を著しく増大させるので、ＥＢ形成を用いる従来技術の方法と比べて有益であることが明らかになっている。また、この新たな方法は、従来の方法よりも大規模産生に適している。この方法で用いる細胞株は、例えば、スウェーデン、イェーテボリのセルアーティス・アーベーから入手可能なＳＡ００２、ＳＡ１２１、ＳＡ００１、ＳＡ００２．５、及びＳＡ４６１のような市販の細胞株から得てもよい。
【０１２８】
すなわち、本発明は、心筋細胞様細胞を含むクラスターを調製する方法を提供し、この方法は、
ｉ）未分化ｈＢＳ細胞を培地中で懸濁及び解離するステップと、
ｉｉ）こうして解離した凝集体を強制凝集にかけるステップと、
ｉｉｉ）こうして強制凝集した細胞凝集体を、１つ以上の増殖因子を任意に含む培地でインキュベートして、１つ以上の３Ｄ構造体を得るステップと、
ｉｖ）１つ以上の３Ｄ構造体を１つ以上のプレートに移し、この３Ｄ構造体を、１つ以上の増殖因子を任意に含む培地でインキュベートして、収縮細胞を含む１つ以上のクラスターに成長させるステップと、
を含む。
【０１２９】
この方法は、上記の１つ以上のクラスターを前記プレートから剥がすことによって、この１つ以上のクラスターを単離する更なるステップも含んでよい。
【０１３０】
１つの実施形態では、心筋細胞様クラスターを得る方法は、
１）未分化ｈＢＳ細胞の懸濁液を得るステップと、
２）トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーの１つ以上のメンバー、及び／又は、線維芽細胞増殖因子ファミリーの１つ以上のメンバーを任意に含む適切な培地で、前記細胞懸濁液を再懸濁するステップと、
３）任意により、前記細胞懸濁中の細胞を凝集体に解離するステップと、
４）ステップ２又は３から得た細胞懸濁液を適切な培養皿（単一又は複数）に移すステップと、
５）これらの細胞を心筋細胞様細胞クラスターに成長させるステップと、
を含む。
【０１３１】
これらの細胞株をフィーダー層の上で増殖させる場合には、細胞は、機械的処理、又は好ましくは酵素処理を用いて、フィーダー層から分離してよく、それによって、主に未分化のｈＢＳ細胞の懸濁液が得られる。酵素処理は、コラーゲナーゼのようなタンパク分解酵素を用いて、適切な時間、例えば、２〜２０分間、５〜１５分間、又は１０〜１５分間行ってよい。しかし、本発明では、細胞懸濁液を得るためのいずれの細胞処理も用いることができると想定される。
【０１３２】
上記のステップ１で得られる細胞は、主に未分化であると想定され、これは、細胞の約７０％以上、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上が未分化であることを意味する。
【０１３３】
その後、細胞懸濁液は、細胞を支える適切な培地で再懸濁してもよく、この培地は例えば、ＦＢＳ（好ましくは１５〜２５％の範囲、例えば２０％）を添加したノックアウトＤＭＥＭであることができる。この培地には、実験中の様々な時点に、タンパク増殖因子、化学化合物、ミネラル、又はその他のシグナル伝達分子といった様々な因子を添加することができる。このような因子の例は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＴＧＦ−β１、アクチビンＡ、成長ホルモン、ＬＩＦ、及びＰＤＧＦである。懸濁ステップは比較的短く、胚様体を発生させないことに留意することが重要である。本発明の方法では、懸濁ステップは、単なる移転ステップである。細胞が大きい凝集体（例えば０．５ｍｍ超）を形成する場合には、任意により、後で、再懸濁した細胞を、未分化細胞の小凝集体に更に解離してもよい。この解離作業は、細胞が０．２〜０．４ｍｍのサイズの小凝集体を形成するまで、手動で、例えばピペットを用いて行うことができる。
【０１３４】
その後、前記細胞を、適切な培地（例えば、上記と同様に、様々な因子を添加したもの）の適切な培養皿（単一又は複数）に移し、その細胞を１〜３０日間、例えば、１〜１５日間、１〜１０日間、１〜５日間、又は好ましくは３日間インキュベートすることによって、収縮心筋細胞様クラスターの自発的クラスターが現れた。用いる培養皿（単一又は複数）は、細胞を支えるいずれの種類のものであってよいが、好ましい実施形態では、培養皿（単一又は複数）はゼラチンコートディッシュである。
【０１３５】
ステップ２）又は３）で得られた細胞凝集体を、強制凝集及び／又は沈殿にかけてから、ステップ４）及び５）の培養皿（単一又は複数）に細胞を移す。この方法を用いて、強制凝集による遠沈時に、３Ｄ構造体が形成される。この３Ｄ構造体は胚様体とは異なる。その利点は、例えば、バラバラになる傾向がある胚様体と比べたときに、依存性の高い構造体が形成される点であり、したがって、本発明の方法では、用いた未分化細胞の数と、得られた心筋細胞様クラスターの数との間の収率が高くなる。また、この方法は、従来技術のＥＢプロトコールと比べて、速くて、信頼性が高く、拡張性が大きく、自動化に利用可能である点でも有益である。
【０１３６】
心筋細胞様クラスターを得るための好ましい方法は、
１）主に未分化のｈＢＳ細胞の懸濁液を得るステップと、
２）トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーの１つ以上のメンバー、及び／又は線維芽細胞増殖因子ファミリーの１つ以上のメンバーを任意に含む適切な培地で、前記細胞懸濁液を再懸濁するステップと、
３）任意により、前記細胞懸濁中の細胞を凝集体に解離するステップと、
４）任意により、ステップ１又は２で得た細胞を遠心分離及び／又は沈殿させるステップと、
５）任意により、ステップ４から得た細胞をインキュベートするステップと、
６）ステップ２又は３から得た細胞懸濁液を適切な培養皿（単一又は複数）に移すステップと、
７）これらの細胞を心筋細胞様クラスターに成長させるステップと、
を含む。
【０１３７】
強制凝集を用いることによって、ステップ２）又は３から得た約４〜６個のコロニーを、遠心分離に適したプレート又はチューブ、例えば、９６ウェルのｖボトムプレート（米国ニューヨーク州のコーニング社）に移す。続いて、細胞を２〜２０分間、１００〜８００ｘｇで（例えば、２００〜６００ｘｇで５〜１０分間、又は３００〜５００ｘｇで５〜１０分間、又は４００ｘｇで５分間）遠心分離する。遠心分離したこれらの細胞は、ステップ６）に記載の移転作業の前に、更に、１〜１０日間（例えば１〜７日間、又は１〜５日間）インキュベートして、３Ｄ構造体を形成してもよく、次いで、この構造体を上記のステップ６）に従って移してもよい。
【０１３８】
ステップ６）に進む前に、追加として、強制凝集を、ステップ２）又は３）で得られた細胞懸濁液を１〜３６時間（例えば、２〜２４時間、又は３〜１２時間）沈殿させる作業と組み合わせるか、又はこの沈殿作業と置き換えてもよい。
【０１３９】
上述のとおり、用いる培地に、タンパク増殖因子、化学化合物、ミネラル、又はその他のシグナル伝達分子といった様々な因子を添加することによって、ｈＢＳ細胞から得られるＣＭＬＣの収量を更に増大させることができる。とりわけ、例えばこの好ましい方法のステップ５及び／又はステップ７（並びに／又は、本発明の方法の第１の実施形態のステップ２）において、培地（例えばＤＭＥＭ）が、トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバー（例えばアクチビンＡ）、及び／又は線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー（例えばｂＦＧＦ）を含むときに、収量が増大することを本発明者は見出した。図６及び実施例９に示されているように、この収量は、ｂＦＧＦ又はアクチビンＡが添加されていない同じ培地で増殖させたコントロールに比べて、４．７倍増える。
【０１４０】
培地に添加するアクチビンＡの濃度としては、約５〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、又は１２ｎｇ／ｍｌが挙げられ、培地に添加するｂＦＧＦの濃度としては、約５〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、又は１４ｎｇ／ｍｌが挙げられる。
【０１４１】
有益なことに、この好ましい方法のステップ５及び／又は７で、濃度約２０％（例えば１５〜２５％）のＦＢＳを添加すると、収量が増大することも分かっている。
【０１４２】
１つの具体的な実施形態では、したがって、心筋細胞様クラスターを得るための方法は、下記のステップを含む。
【０１４３】
【表６−１】
0005722628.tif 000010
【０１４４】
【表６−２】
0005722628.tif 000011
【０１４５】
上述のとおり、本発明は、遠心分離の代わりに、細胞を沈殿させることによっても行うことができる。したがって、本発明の具体的な実施形態は、下記のステップを含む。
【０１４６】
【表７】
0005722628.tif 000012
【０１４７】
この好ましい方法のステップ５及び／又は６で使用する培地に、ＳＢ２１６７６３のようなＧＳＫ−３インヒビターのメンバー、及び／又は、ＳＫＦ−８６０００２のようなｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターのメンバーを（単独で、又は、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及び／若しくはＦＢＳと組み合わせて）更に添加すると、（例えば図１５に示されているように）収量が増えることも明らかになっている。実施例１０及び図１５に示されているように、この好ましい方法のステップ５の培地に、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及び、ＳＢ２１６７６３又はＳＫＦ−８６０００２を添加すると、アクチビンＡ及びｂＦＧＦのみを添加したコントロールと比べて、収量が２〜３倍増えた。本方法のいずれの段階でも、この培地を与えてよいが、１つの実施形態では、この好ましい方法のステップ５）における遠心分離後、インキュベーション中に、培地を細胞に与える。
【０１４８】
培地に添加するＧＳＫ−３インヒビターの濃度は、約１〜２５μＭの範囲、例えば２〜１０μＭ又は５μＭであってよく、培地に添加するｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターの濃度は、約１〜２５μＭの範囲、例えば２〜１０μＭ又は５μＭであってよい。
【０１４９】
したがって、本発明の更なる具体的な実施形態は、下記のステップを含む。
【０１５０】
【表８−１】
0005722628.tif 000013
【０１５１】
【表８−２】
0005722628.tif 000014
【０１５２】
また、例えば図１４及び実施例１０に示されているように、この好ましい方法のステップ７（又は、本方法のうち最初に言及した実施形態の、対応するステップ５）の培地で、アクチビンＡ及び／又はｂＦＧＦを含む培地に、ＬＩＦを添加することによって、収量が、培地のみを与えられたコントロールと比べて、約２倍増えたことも本発明者は示している。ＬＩＦの濃度としては、１００〜２０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ、例えば、５００〜１５００Ｕ／ｍｌ、又は１０００Ｕ／ｍｌが挙げられる。１つの具体的な実施形態では、ＬＩＦを含む培地は、この好ましい方法のステップ７）（又は、本方法のうち最初に言及した実施形態の、対応するステップ５）において、２〜８日後、例えば４〜５日後に、心筋細胞様細胞クラスターの発生中に、ＬＩＦを含まない培地と交換する。
【０１５３】
したがって、本発明の更なる具体的な実施形態は、下記のステップを含む。
【０１５４】
【表９−１】
0005722628.tif 000015
【０１５５】
【表９−２】
0005722628.tif 000016
【０１５６】
上述のとおり、本発明によるクラスターは、例えば、実施例１１及び１４に記載されているようなファニーチャネルに関する電気生理学的な測定値に基づき、（例えば、創薬、薬物試験、ターゲットの同定、ターゲットバリデーションにおける）インビトロ研究で用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、ｈＢＳ由来ＣＭＬＣの形態図である。未分化ｈＢＳ細胞は、実施例１に記載されているように維持及び分化させた。続いて、３Ｄ構造体を、ゼラチンコート細胞培養皿にプレーティングし、細胞の付着と更なる分化をもたらした。パネルＡは、培養皿へのプレーティング後１日目の３Ｄクラスターを示している。パネルＢは、プレーティングから３日後に、３Ｄ構造体の増殖体に存在する自発拍動領域（円の部分）を示している。パネルＣは、機械的に単離した拍動領域であって、新たな細胞皿で単離してから１２日間継代培養した拍動領域を示している。
【図２】図２は、核（丸い物体）と心臓トロポニン１（構造体のような線）が見えるように染色したＣＭＬＣの形態図である（倍率６００倍）。このＣＭＬＣは、実施例１に記載されているように抽出した。
【図３】図３は、ＣＭＬＣの拍動周波数分布である。ＣＭＬＣは、実施例１に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させ、１０９個の異なる自発収縮クラスターを評価した。この図は、細胞調製時の拍動周波数分布を示している。
【図４ａ−１】図４ａは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＡは、ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ−４）、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＩ３、ＤＥＳ、ＳＣＮ５Ａ、及びＳＣＮ１ＢのＲＮＡレベルを示している。
【図４ａ−２】図４ａは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＡは、ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ−４）、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＩ３、ＤＥＳ、ＳＣＮ５Ａ、及びＳＣＮ１ＢのＲＮＡレベルを示している。
【図４ａ−３】図４ａは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＡは、ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ−４）、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＩ３、ＤＥＳ、ＳＣＮ５Ａ、及びＳＣＮ１ＢのＲＮＡレベルを示している。
【図４ａ−４】図４ａは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＡは、ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ−４）、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＩ３、ＤＥＳ、ＳＣＮ５Ａ、及びＳＣＮ１ＢのＲＮＡレベルを示している。
【図４ｂ−１】図４ｂは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＢは、ＳＣＮ２Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＢ１、ＣＡＣＮＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＫＣＮＱ１、及びＫＣＮＥ１の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｂ−２】図４ｂは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＢは、ＳＣＮ２Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＢ１、ＣＡＣＮＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＫＣＮＱ１、及びＫＣＮＥ１の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｂ−３】図４ｂは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＢは、ＳＣＮ２Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＢ１、ＣＡＣＮＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＫＣＮＱ１、及びＫＣＮＥ１の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｂ−４】図４ｂは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＢは、ＳＣＮ２Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＢ１、ＣＡＣＮＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＫＣＮＱ１、及びＫＣＮＥ１の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｃ−１】図４ｃは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＣは、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＡ５、ＫＣＮＡＢ１、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ１２、及びＫＣＮＪ３の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｃ−２】図４ｃは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＣは、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＡ５、ＫＣＮＡＢ１、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ１２、及びＫＣＮＪ３の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｃ−３】図４ｃは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＣは、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＡ５、ＫＣＮＡＢ１、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ１２、及びＫＣＮＪ３の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｃ−４】図４ｃは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＣは、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＡ５、ＫＣＮＡＢ１、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ１２、及びＫＣＮＪ３の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｄ−１】図４ｄは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＤは、ＫＣＮＪ５、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ９、ＫＣＮＤ３、ＫＣＮＡ４、Ｋｃｎｉｐ２、ＨＣＮ４、及びＫＣＮＫ１の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｄ−２】図４ｄは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＤは、ＫＣＮＪ５、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ９、ＫＣＮＤ３、ＫＣＮＡ４、Ｋｃｎｉｐ２、ＨＣＮ４、及びＫＣＮＫ１の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｄ−３】図４ｄは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＤは、ＫＣＮＪ５、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ９、ＫＣＮＤ３、ＫＣＮＡ４、Ｋｃｎｉｐ２、ＨＣＮ４、及びＫＣＮＫ１の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｄ−４】図４ｄは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＤは、ＫＣＮＪ５、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ９、ＫＣＮＤ３、ＫＣＮＡ４、Ｋｃｎｉｐ２、ＨＣＮ４、及びＫＣＮＫ１の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｅ−１】図４ｅは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＥは、ＣＦＴＲ、ＧＪＡ５、ＧＪＡ１、ＧＪＡ７、ＡＴＰ２Ａ２、ＳＬＣ８Ａ１、ＲＹＲ２、及びＦＫＢＰ１Ｂの遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｅ−２】図４ｅは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＥは、ＣＦＴＲ、ＧＪＡ５、ＧＪＡ１、ＧＪＡ７、ＡＴＰ２Ａ２、ＳＬＣ８Ａ１、ＲＹＲ２、及びＦＫＢＰ１Ｂの遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｅ−３】図４ｅは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＥは、ＣＦＴＲ、ＧＪＡ５、ＧＪＡ１、ＧＪＡ７、ＡＴＰ２Ａ２、ＳＬＣ８Ａ１、ＲＹＲ２、及びＦＫＢＰ１Ｂの遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｅ−４】図４ｅは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＥは、ＣＦＴＲ、ＧＪＡ５、ＧＪＡ１、ＧＪＡ７、ＡＴＰ２Ａ２、ＳＬＣ８Ａ１、ＲＹＲ２、及びＦＫＢＰ１Ｂの遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｆ−１】図４ｆは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＦは、ＳＬＣ９Ａ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬＫ、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｆ−２】図４ｆは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＦは、ＳＬＣ９Ａ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬＫ、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７の遺伝子発現レベルを示している。
【図４ｆ−３】図４ｆは、未分化ｈＢＳ細胞及びヒト成体心臓組織と比較した場合のＣＭＬＣの遺伝子発現値のＱＰＣＲ解析結果である。ＣＭＬＣは、実施例３に記載されているようにｈＢＳ細胞から分化させた。初期ＣＭＬＣ（培養液中で最長で２週間維持したもの）と、後期ＣＭＬＣ（培養液中で少なくとも６週間維持したもの）という２つの異なる発生段階のＣＭＬＣを調製した。ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。ＱＰＣＲは、実施例３に記載されているように行った。各ＰＣＲ反応は４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現値に対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。パネルＦは、ＳＬＣ９Ａ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬＫ、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７の遺伝子発現レベルを示している。
【図５Ａ】図５は、アステミゾール（抗ヒスタミン薬）及びドフェチリド（クラスＩＩＩ抗不整脈薬）の添加後に心臓電場電位の遅延再分極として測定した場合の、薬剤濃度を増やしていったとき（０、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ）の累積用量反応曲線を示している。図５ａに示されているように、アステミゾールは、低ナノモル濃度での再分極成分の選択的遮断と持続的延長を引き起こした。ドフェチリドを用いたときも同様の効果が観察された（図５ｂ）。加えて、図５ｃは、電場活動電位持続時間に対するテルフェナジンの用量依存効果を示しており、図５ｄは、用量依存的な活動電位延長を引き起こすカリウムチャネル遮断薬シサプリドの効果を示している。
【図５Ｂ】図５は、アステミゾール（抗ヒスタミン薬）及びドフェチリド（クラスＩＩＩ抗不整脈薬）の添加後に心臓電場電位の遅延再分極として測定した場合の、薬剤濃度を増やしていったとき（０、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ）の累積用量反応曲線を示している。図５ａに示されているように、アステミゾールは、低ナノモル濃度での再分極成分の選択的遮断と持続的延長を引き起こした。ドフェチリドを用いたときも同様の効果が観察された（図５ｂ）。加えて、図５ｃは、電場活動電位持続時間に対するテルフェナジンの用量依存効果を示しており、図５ｄは、用量依存的な活動電位延長を引き起こすカリウムチャネル遮断薬シサプリドの効果を示している。
【図５Ｃ】図５は、アステミゾール（抗ヒスタミン薬）及びドフェチリド（クラスＩＩＩ抗不整脈薬）の添加後に心臓電場電位の遅延再分極として測定した場合の、薬剤濃度を増やしていったとき（０、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ）の累積用量反応曲線を示している。図５ａに示されているように、アステミゾールは、低ナノモル濃度での再分極成分の選択的遮断と持続的延長を引き起こした。ドフェチリドを用いたときも同様の効果が観察された（図５ｂ）。加えて、図５ｃは、電場活動電位持続時間に対するテルフェナジンの用量依存効果を示しており、図５ｄは、用量依存的な活動電位延長を引き起こすカリウムチャネル遮断薬シサプリドの効果を示している。
【図５Ｄ】図５は、アステミゾール（抗ヒスタミン薬）及びドフェチリド（クラスＩＩＩ抗不整脈薬）の添加後に心臓電場電位の遅延再分極として測定した場合の、薬剤濃度を増やしていったとき（０、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ）の累積用量反応曲線を示している。図５ａに示されているように、アステミゾールは、低ナノモル濃度での再分極成分の選択的遮断と持続的延長を引き起こした。ドフェチリドを用いたときも同様の効果が観察された（図５ｂ）。加えて、図５ｃは、電場活動電位持続時間に対するテルフェナジンの用量依存効果を示しており、図５ｄは、用量依存的な活動電位延長を引き起こすカリウムチャネル遮断薬シサプリドの効果を示している。
【図６−１】図６では、ＣＭＬＣは、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した。３Ｄ形成（プレプレーティング）中に、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）とｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加した。コントロールには、因子を添加していない培地を与えた。ポストプレーティングでは、双方のグループにおいて、２０％ＦＢＳ以外の因子を含まない培地を用いた。データを内在性コントロールに対して正規化した。データは、コントロールを１００％とした場合の相対的な遺伝子発現値として表してある。示されているデータは、Ａ）Ｎｘｋ２．５、Ｂ）ＧＡＴＡ４、Ｃ）トロポニンＴ２、及びＤ）α−心臓アクチンの２回の実験における遺伝子発現値の平均値である。
【図６−２】図６では、ＣＭＬＣは、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した。３Ｄ形成（プレプレーティング）中に、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）とｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加した。コントロールには、因子を添加していない培地を与えた。ポストプレーティングでは、双方のグループにおいて、２０％ＦＢＳ以外の因子を含まない培地を用いた。データを内在性コントロールに対して正規化した。データは、コントロールを１００％とした場合の相対的な遺伝子発現値として表してある。パネルＥは、３回の実験において発生した拍動ＣＭＬＣの数の平均値を示している。エラーバーは標準偏差を表している。
【図７ａ】図７は、ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞様クラスターの網羅的遺伝子発現プロファイリングと特徴に関するポスターである。図７ａは、このポスターを示しており、図７ｂは、表１の拡大図を示している。図７ａ−１〜３は、図７ａのテキストの詳細を示している。
【図７ａ−１】図７は、ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞様クラスターの網羅的遺伝子発現プロファイリングと特徴に関するポスターである。図７ａは、このポスターを示しており、図７ｂは、表１の拡大図を示している。図７ａ−１〜３は、図７ａのテキストの詳細を示している。
【図７ａ−２】図７は、ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞様クラスターの網羅的遺伝子発現プロファイリングと特徴に関するポスターである。図７ａは、このポスターを示しており、図７ｂは、表１の拡大図を示している。図７ａ−１〜３は、図７ａのテキストの詳細を示している。
【図７ａ−３】図７は、ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞様クラスターの網羅的遺伝子発現プロファイリングと特徴に関するポスターである。図７ａは、このポスターを示しており、図７ｂは、表１の拡大図を示している。図７ａ−１〜３は、図７ａのテキストの詳細を示している。
【図７ｂ】図７は、ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞様クラスターの網羅的遺伝子発現プロファイリングと特徴に関するポスターである。図７ａは、このポスターを示しており、図７ｂは、表１の拡大図を示している。図７ａ−１〜３は、図７ａのテキストの詳細を示している。
【図８】図８は、過出現した遺伝子オントロジーアノテーション、すなわち、ｈＢＳＣ由来ＣＭＣＬ中の５３０個のアップレギュレート遺伝子において有意に過出現した遺伝子オントロジーアノテーションである。有意に過出現したアノテーション（ｐ＜０．０１）のみが図に示されている。パネルＡは「生物学的プロセス」、パネルＢは「分子機能」、パネルＣは「細胞の構成要素」を示している。Ｘ軸は、特定のアノテーションを有する遺伝子の数を示している。
【図９】図９はタンパク相互作用マップである。パネルＡは、ｈＢＳＣ由来ＣＭＣＬ中で有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子の遺伝子産物の相互作用マップを示しており、パネルＢは、無作為に生成したタンパク群のうちの１つの対応する相互作用マップを示している。
【図１０】図１０は、ｈＢＳＣ由来ＣＭＣＬにおけるハブタンパクネットワークである。タンパク質は、アップレギュレート遺伝子の産物の中に、実験で判断されたタンパク相互作用を少なくとも５個有する場合、ハブとみなされる。
【図１１−１】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−２】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−３】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−４】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−５】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−６】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−７】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−８】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−９】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−１０】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−１１】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１１−１２】図１１は、未分化ｈＢＳと比べて、ＣＭＣＬで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子（ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定）の完全なリストである。「平均ＦＣ」の列は、２回の実験結果の平均フォールド・チェンジを示しており、右隣りの列は、様々な試料全体にわたるフォールド・チェンジの算出値の範囲を示している。右端の列は、これらの遺伝子が心臓組織内でどのように発現するかに関する過去の報告と関連する種々のカテゴリーを表している。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定された４１７個の遺伝子のうち、３３１個は、心臓で発現するものとして以前に報告されている。心臓で発現しないものと報告されているか、又はＷｅｂＧｅｓｔａｌｔの文献に組織発現記録がない遺伝子（例えばＭＹＬ６）には、Ｘという印をつけた（８６個の遺伝子）。有意に過剰発現することが報告されている遺伝子にはＯという印をつけ（１００個の遺伝子）、  有意に過少発現する遺伝子にはＵという印をつけた（２５個の遺伝子）。Ｎという印の遺伝子（２０６個の遺伝子）は、心臓で発現するが、発現の有意性がないと報告されている。ダッシュ（−）という印の遺伝子は、合わせて１１３個の遺伝子であるが、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールボックスによって、ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子を表している。
【図１２−１】図１２は、未分化ｈＢＳＣと比べて、ｈＢＳＣ由来ＣＭＣＬで有意にダウンレギュレートする遺伝子である。これらの４０個の遺伝子の中には、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＬＥＦＴＹ１、及びＤＮＭＴ３Ｂのような周知の多分化能マーカーがある。
【図１２−２】図１２は、未分化ｈＢＳＣと比べて、ｈＢＳＣ由来ＣＭＣＬで有意にダウンレギュレートする遺伝子である。これらの４０個の遺伝子の中には、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＬＥＦＴＹ１、及びＤＮＭＴ３Ｂのような周知の多分化能マーカーがある。
【図１３】図１３では、ＣＭＬＣは、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した。３Ｄ形成（プレプレーティング）中に、グラフに示されているように異なるタイプのＦＢＳを培地に添加した（２０％）。コントロールには標準ＦＢＳを与え、これを、透析ＦＢＳ及びチャコール処理ＦＢＳと比較した。ポストプレーティングでは、全てのグループにおいて、２０％標準ＦＢＳを含む培地を用いた。光学顕微鏡を用いて、拍動ＣＭＬＣの数をポストプレーティングから１４日後に計数し、コントロールと比較した。示されているデータは、３回の実験で生成された拍動ＣＭＬＣの数の平均値である。エラーバーは標準偏差を表している。
【図１４】図１４では、ＣＭＬＣは、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した。３Ｄ形成（プレプレーティング）中に、アクチビンＡとｂＦＧＦを培地に添加した（Ｆ）。コントロール（Ｃ）には、標準培地のみを与えた。ポストプレーティングでは、あるグループには、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦを添加した培地を与え（Ｆ＋ＬＩＦ）、他方のグループには、標準培地のみを与えた。ポストプレーティングから４日後に、全てのグループに標準培地を与えた。ポストプレーティングの７日目及び１４日目に、光学顕微鏡を用いて拍動ＣＭＬＣの数を計数し、コントロールと比較した。示されているデータは、コントロールを１とした場合の、３回の実験で生成された拍動ＣＭＬＣの数の平均値である。エラーバーは標準偏差を表している。
【図１５】図１５は、ＳＢ２１６７６３及びＳＫＦ−８６００２が拍動ＣＭＬＣの収量に及ぼす効果である。ＣＭＬＣは、実施例９に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した。３Ｄ形成（プレプレーティング）中に、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍｌ）に加えて、ＳＢ２１６７６３（５μｍ）又はＳＫＦ−８６００２（５μｍ）を培地に添加した。コントロールには、アクチビンＡとｂＦＧＦのみを添加した培地を与えた。ポストプレーティングでは、全てのグループにおいて、因子を含まない標準培地を用いた。グラフは、実験で用いたｈＢＳ細胞コロニーの数に対する拍動領域の累計を示している。ＡＦはアクチビンＡ＋ｂＦＧＦ、ＳＢはＳＢ２１６７６３、ＳＫＦはＳＫＦ−８６００２である。
【図１６】図１６は、分化ｈＢＳ細胞の３Ｄ凝集体を９６ウェルプレートから新たな細胞皿に移す日が、生成できる拍動ＣＭＬＣの数に有意に影響することを示している。これらの実験では、ＣＭＬＣは、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した。７日目に移したものよりも、早い時期に移した３Ｄ凝集体からの方が、ＣＭＬＣが多く産生される。示されているデータは、コントロール（７日目）を１００とした場合の、様々なプレーティング日（５日目、４日目、及び３日目）で生成された拍動ＣＭＬＣの数の平均値である。エラーバーは標準偏差を表している。
【図１７】図１７では、微小電極記録によって、心室様、心房様、及び結節様という３つの異なるタイプの活動電位形態を示した。
【図１８】図１８は、９７ｍＶの振幅、３４２ｍｓという長いＡＰＤ９０を有する心室様ＡＰの例である。
【図１９】図１９では、主なＡＰ形態によって、各ＣＭＬＣクラスターを特徴付けた。グラフは、１６個の異なるクラスターのＡＰＤ９０を示しており、これらのクラスターは、同じクラスター内で繰り返し測定した場合、類似の値を示す。
【図２０】図２０は、１、２、及び３Ｈｚの場刺激への暴露中におけるＣＭＬＣクラスターの拍動適応性である。左のパネルは、１８０ｍｓを超える初期ＡＰＤ９０を有するクラスターが、ペーシング周波数の向上に応じて拍動適応性を示したことを示すプロットである。右のパネルは、１、２、及び３Ｈｚのペーシング時のＡＰのオーバーレイプロットである。
【図２１】図２１は、ザテブラジンと共にＣＭＬＣをインキュベーション中に、微小電極記録によって、活動電位測定を行ったものである。右の図は、オーバーレイプロットを示している。
【図２２】図２２は、ＩＫｒ阻害薬（Ｅ−４０３１）がＡＰに及ぼす効果である。Ｅ−４０３１の投与によって、ＣＭＬＣクラスターにおいてＡＰＤの延長、三角形化、及びＥＡＤが発生した。
【図２３】図２３は、ＩＫｒ阻害薬がＡＰに及ぼす効果である。左上のパネルでは、Ｅ−４０３１の投与によって、全てのケースでＡＰＤの延長と、ＡＰの形から明らかなように、三角形化の明確な兆候と、ＡＰＤ５０と比べてＡＰＤ９０のかなりの長期化が発生した。右上のパネルでは、大半のケースにおいて、ＡＰＤ延長に続いて、撃発活動が生じた。一番下のパネルでは、早期後脱分極（ＥＡＤ）も記録した。
【図２４】図２４は、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＳＢ２１６７６３、及びＳＫＦ−８６００２が拍動ＣＭＬＣの収量に及ぼす効果である。ＣＭＬＣは、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した。３Ｄ形成（プレプレーティング）中に、様々な濃度のアクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＳＢ２１６７６３、及びＳＫＦ−８６００２を培地に更に添加した。ポストプレーティングでは、全てのグループにおいて、因子を含まない培地を用いた。図は、１つのグループ当たりの１つのディッシュ中で用いたコロニーの数に対する拍動領域の累計を示している。実験は３回繰り返した。ＡＦはアクチビンＡ＋ｂＦＧＦ、ＳＢはＳＢ２１６７６３、ＳＫＦはＳＫＦ−８６００２である。
【図２５】図２５は、ｈＢＳＣ由来ＣＭＬＣで、ｈＢＳ細胞マーカーのＯｃｔ−３／４が発現していないことを示している。増殖しているｈＢＳ細胞コロニー（Ａ〜Ｂ）、及びｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣ（Ｃ〜Ｈ）における幹細胞マーカーＯｃｔ−３／４の発現の免疫組織化学的検査結果である。（Ａ）核が、４’，６−ジアミニジン−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）で青く染色されている。（Ｂ）ｈＢＳ細胞コロニーが、Ｏｃｔ−３／４に対する抗体によるポジティブ染色を示している（緑色）。少なくとも１０個のＣＭＬＣから採った切片（図では３つのみが示されている）を、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）に対する抗体（赤色）、Ｏｃｔ−３／４に対する抗体（緑色）、及び核用のＤＡＰＩ（青色）で標識した。左のパネル（Ｃ、Ｅ、及びＧ）は、ｃＴｎＩ（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の染色画像をオーバーレイしたものを示しており、右のパネル（Ｄ、Ｆ、及びＨ）は、Ｏｃｔ−３／４（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）の染色画像をオーバーレイしたものを示している。全てのＣＭＬＣは、ｃＴｎＩによるポジティブ染色を示したが（Ｃ、Ｅ、及びＧ）、ｈＢＳ細胞マーカーＯｃｔ−３／４の検出可能な染色は、当該クラスターでは観察できなかった（Ｄ、Ｆ、及びＨ）。スケールバーは１００μｍである。
【図２６】図２６は、ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣで、ｈＢＳ細胞マーカーのＳＳＥＡ−４が発現していないことを示している。増殖しているｈＢＳ細胞コロニー（Ａ〜Ｂ）、及びｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣ（Ｃ〜Ｈ）における幹細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現の免疫組織化学的検査結果である。（Ａ）核が、４’，６−ジアミニジン−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）で青く染色されている。（Ｂ）ｈＢＳ細胞コロニーが、ＳＳＥＡ−４に対する抗体によるポジティブ染色を示している（緑色）。少なくとも１０個のＣＭＬＣの切片（図では３つのみが示されている）を、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）に対する抗体（赤色）、ＳＳＥＡ−４に対する抗体（緑色）、及び核用のＤＡＰＩ（青色）で標識した。左のパネル（Ｃ、Ｅ、及びＧ）は、ｃＴｎＩ（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の染色画像をオーバーレイしたものを示しており、右のパネル（Ｄ、Ｆ、及びＨ）は、ＳＳＥＡ−４（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）の染色画像をオーバーレイしたものを示している。全てのＣＭＬＣクラスターは、ｃＴｎＩによるポジティブ染色を示したが（Ｃ、Ｅ、及びＧ）、ｈＢＳＣ細胞マーカーＳＳＥＡ−４の検出可能な染色は、当該クラスターでは観察できなかった（Ｄ、Ｆ、及びＨ）。スケールバーは５０μｍである。
【図２７】図２７は、ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣで、ｈＢＳ細胞マーカーのＴＲＡ−１−６０が発現していないことを示している。増殖しているｈＢＳ細胞コロニー（Ａ〜Ｂ）、及びｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣ（Ｃ〜Ｈ）における幹細胞マーカーＴＲＡ−１−６０の発現の免疫組織化学的検査結果である。（Ａ）核が、４’，６−ジアミニジン−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）で青く染色されている。（Ｂ）ｈＢＳ細胞コロニーが、ＳＳＥＡ−４に対する抗体によるポジティブ染色を示している（緑色）。少なくとも１０個のＣＭＬＣの切片（図では３つのみが示されている）を、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）に対する抗体（赤色）、ＴＲＡ−１−６０に対する抗体（緑色）、及び核用のＤＡＰＩ（青色）で標識した。左のパネル（Ｃ、Ｅ、及びＧ）は、ｃＴｎＩ（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の染色画像をオーバーレイしたものを示しており、右のパネル（Ｄ、Ｆ、及びＨ）は、ＴＲＡ−１−６０（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）の染色画像をオーバーレイしたものを示している。全てのＣＭＬＣは、ｃＴｎＩによるポジティブ染色を示したが（Ｃ、Ｅ、及びＧ）、ｈＢＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−４の検出可能な染色は、当該クラスターでは観察できなかった（Ｄ、Ｆ、及びＨ）。スケールバーは１００μｍである。
【図２８−１】図２８は、ザテブラジンが、ｈＢＳ細胞由来の収縮ＣＭＬＣの拍動周波数に及ぼす効果である。パネルＡは、細胞齢が異なる３２個の個々の自発拍動ＣＭＬＣに、５μｍのザテブラジンを投与した実験の結果を示している。ザテブラジンの投与前及び投与後に、収縮速度を目視により記録することによって、拍動周波数の変化を算出した。値は、毎分拍動数（±の値＝ＳＥＭ、ｎ＝３２、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）で示されている。統計的有意性は、ペアｔ検定を用いて算出した。パネルＢは、拍動周波数と、ＨＣＮ４のｍＲＮＡ発現値との相関関係を示している（ｐ＝０．０１１６）。パネルＣは、拍動周波数と、トロポニンＴ２のｍＲＮＡ発現値との相関関係を示している（ｐ＝０．０３１４）。パネルＤは、ＨＣＮ４のｍＲＮＡ発現値と、ＣＭＬＣの細胞齢との相関関係を示している（ｐ＝０．０２６２）。ＨＣＮ４及びトロポニンＴ２のｍＲＮＡ発現値は、リアルタイムＲＴ定量ＰＣＲを用いて測定し、内在性コントロールＣＲＥＢＢＰの発現に関連付けた。値は、基準試料を１００％として基準試料と比較した相対的遺伝子発現値として示されている（ｎ＝３２）。統計的解析は、線形回帰解析を用いて行った。
【図２８−２】図２８は、ザテブラジンが、ｈＢＳ細胞由来の収縮ＣＭＬＣの拍動周波数に及ぼす効果である。パネルＡは、細胞齢が異なる３２個の個々の自発拍動ＣＭＬＣに、５μｍのザテブラジンを投与した実験の結果を示している。ザテブラジンの投与前及び投与後に、収縮速度を目視により記録することによって、拍動周波数の変化を算出した。値は、毎分拍動数（±の値＝ＳＥＭ、ｎ＝３２、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）で示されている。統計的有意性は、ペアｔ検定を用いて算出した。パネルＢは、拍動周波数と、ＨＣＮ４のｍＲＮＡ発現値との相関関係を示している（ｐ＝０．０１１６）。パネルＣは、拍動周波数と、トロポニンＴ２のｍＲＮＡ発現値との相関関係を示している（ｐ＝０．０３１４）。パネルＤは、ＨＣＮ４のｍＲＮＡ発現値と、ＣＭＬＣの細胞齢との相関関係を示している（ｐ＝０．０２６２）。ＨＣＮ４及びトロポニンＴ２のｍＲＮＡ発現値は、リアルタイムＲＴ定量ＰＣＲを用いて測定し、内在性コントロールＣＲＥＢＢＰの発現に関連付けた。値は、基準試料を１００％として基準試料と比較した相対的遺伝子発現値として示されている（ｎ＝３２）。統計的解析は、線形回帰解析を用いて行った。
【図２９】図２９は、ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣの免疫組織化学的解析結果である。この図は、ｈＥＲＧイオンチャネル（ＫＣＮＨ２）に対する抗体（パネルＡ）、核（ＤＡＰＩ）（パネルＢ）、及び心臓トロポニンＩ（パネルＣ）のポジティブ染色を示している。スケールバーは５０μＭである。
【図３０Ａ】図３０は、ｈＥＳ細胞由来の心筋細胞の微小電極アレイ（ＭＥＡ）解析結果である。パネルＡは、ＭＥＡ（ドイツ、マルチチャンネルシステムズ）上で直接培養したｈＥＳ細胞由来の心筋細胞クラスター（ｈＥＳ−ＣＭＣ（商標）、セルアーティス・アーベー）を示している。ＭＥＡ技術によって、多数の電場電位波形を同時に記録できるようになり、波動及び伝達速度の解析が可能になる（パネルＢ）。パネルＣは、薬剤濃度を増やしていった（０、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μｍ）ときの、アステミゾール（既知のＱＴ延長効果を有する抗ヒスタミン薬）添加後の累積用量反応曲線を示している。心臓電場電位の遅延再分極によって測定したところ、ナノモル濃度での再分極成分の選択的遮断及び持続的延長が明らかである。
【図３０Ｂ】図３０は、ｈＥＳ細胞由来の心筋細胞の微小電極アレイ（ＭＥＡ）解析結果である。パネルＡは、ＭＥＡ（ドイツ、マルチチャンネルシステムズ）上で直接培養したｈＥＳ細胞由来の心筋細胞クラスター（ｈＥＳ−ＣＭＣ（商標）、セルアーティス・アーベー）を示している。ＭＥＡ技術によって、多数の電場電位波形を同時に記録できるようになり、波動及び伝達速度の解析が可能になる（パネルＢ）。パネルＣは、薬剤濃度を増やしていった（０、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μｍ）ときの、アステミゾール（既知のＱＴ延長効果を有する抗ヒスタミン薬）添加後の累積用量反応曲線を示している。心臓電場電位の遅延再分極によって測定したところ、ナノモル濃度での再分極成分の選択的遮断及び持続的延長が明らかである。
【図３０Ｃ】図３０は、ｈＥＳ細胞由来の心筋細胞の微小電極アレイ（ＭＥＡ）解析結果である。パネルＡは、ＭＥＡ（ドイツ、マルチチャンネルシステムズ）上で直接培養したｈＥＳ細胞由来の心筋細胞クラスター（ｈＥＳ−ＣＭＣ（商標）、セルアーティス・アーベー）を示している。ＭＥＡ技術によって、多数の電場電位波形を同時に記録できるようになり、波動及び伝達速度の解析が可能になる（パネルＢ）。パネルＣは、薬剤濃度を増やしていった（０、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μｍ）ときの、アステミゾール（既知のＱＴ延長効果を有する抗ヒスタミン薬）添加後の累積用量反応曲線を示している。心臓電場電位の遅延再分極によって測定したところ、ナノモル濃度での再分極成分の選択的遮断及び持続的延長が明らかである。
【０１５８】
本発明について、下記の非限定的な実施例で更に説明する。
【実施例】
【０１５９】
実施例１：ｈＢＳ細胞の心筋細胞様細胞クラスターへの分化
ＭＥＦ細胞上で培養した未分化ｈＢＳ細胞から、自発収縮細胞を抽出した（Ｈｅｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００４  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）。この実験で用いた細胞株は、ｈＢＳ細胞株のＳＡ００２、ＳＡ１２１、ＳＡ００１、ＳＡ００２．５、ＳＡ４６１（スウェーデン、イェーテボリのセルアーティス・アーベー、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ）であることができ、これらは、Ｈｅｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４に記載されているように増殖させることができる。これらの細胞株は、ＮＩＨの幹細胞レジストリー、及び英国幹細胞バンクに列挙されている。コラーゲナーゼＩＶ（２００Ｕ／ｍｌ）と共に１０〜１５分間、３７℃でインキュベートすることによって、ｈＢＳ細胞をフィーダー層から分離した。この細胞懸濁液を１５ｍｌのチューブに移し、細胞を沈殿させた後、浮遊物を取り除いた。２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｍｏｌ／ｌのβメルカプトエタノール、及び１％非必須アミノ酸を添加したノックアウトＤＭＥＭ（全てカリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン製）中で、コロニーを再懸濁し、ピペットを用いて機械的に解離させて未分化細胞の小凝集体（０．２〜０．４ｍｍ）にした。この細胞懸濁液を、１ウェル当たり約４〜６コロニーの濃度で、９６ウェルのｖボトムプレート（米国ニューヨーク州のコーニング社）に（２００μｌ／ウェルで）分注し、５分間、４００ｘｇで遠心分離した。続いて、このプレートを３７℃で３〜８日間インキュベートした。次いで、形成された３Ｄ構造体を、培地（上記と同じ）の入ったゼラチンコートディッシュに移した。培養から数日（通常１〜４日）後、収縮細胞（ＣＭＬＣ）のクラスターを有する自発収縮領域が発生し、この領域は、光学顕微鏡を用いて視覚的に確認することができた。培地は、２〜３日ごとに変えた。プレーティング後、最長で２０日間、新たな自発拍動領域が現れ続けた。これらのクラスターを、３Ｄ構造体から、目視検査下で光学顕微鏡を用いて、機械的剥離によって単離し、更なる特徴把握を行う。図１ａ、ｂ、及びｃは、ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣの外観の代表的な実例を示している。ｈＢＳ由来ＣＭＬＣは、上記のように分化させた。続いて、これらを周囲の細胞から手動で単離し、ラミニンコートガラス上にプレーティングした。培養の３日後、クラスターを固定し、核、及びタンパク質の心臓トロポニンＩ（心臓組織に特異的であることが知られている）を染色した。次いで、これらのクラスターを共焦点顕微鏡で調べた。図２の顕微鏡写真は、核（丸い物体）、及び心臓トロポニンＩ（線のような構造体）が見えるように染色したＣＭＬＣを示している（倍率６００倍）。
【０１６０】
１０９個の異なる自発収縮領域の毎分拍動数（ｂｐｍ）を割り出すことによって、拍動周波数の分布を評価した。平均拍動周波数は、４４ｂｐｍ±２４（標準偏差）であった。全体的な分布は、図３に示されている。
【０１６１】
ｈＢＳ細胞から得られるＣＭＬＣの収量を増やすために、実験中の様々な時点で、培地に、タンパク増殖因子、化学化合物、ミネラル、又はその他のシグナル伝達分子のような様々な因子を添加することができる。このような因子の例は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＴＧＦ−β１、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、成長ホルモン、ＬＩＦ、及びＰＤＧＦである。
【０１６２】
実施例２．ｈＢＳ細胞由来の心筋細胞様細胞クラスター（ＣＭＬＣ）のマイクロアレイ解析
細胞の培養及び分化
ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２（スウェーデン、イェーテボリのセルアーティス・アーベー、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ）をＨｅｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４に記載されているように増殖させた。これらの細胞株は、ＮＩＨの幹細胞レジストリー、及び英国幹細胞バンクに列挙されている。ｈＢＳ細胞の分化は、上記の実施例１に記載されているように実施した。このプロトコールを通じてｈＢＳ細胞を分化させると、光学顕微鏡で、自発的に収縮する心筋細胞様細胞クラスターのクラスターが観測されることが多い。マイクロアレイ実験のために、ＣＭＬＣの３つの別々の試料（生物学的複製物）を集めた。また、比較目的で、未分化ｈＢＳ細胞から２つの独立した試料及び、分化細胞（すなわち、収縮ＣＭＬＣが存在しないもの）の混合集団から１つの試料を解析用に集めた。この混合集団は、実施例１に記載されているように分化させた培養液中の自発収縮ＣＭＬＳを選択及び除去した後に、分化細胞の残存集団として集めた。下に示されているように、３つの独立したランから得た試料をプールした。したがって、混合集団をコントロールとして用いることは、ＣＭＬＣを取り除いた分化細胞集団を表し、全ての分化細胞でアップレギュレートする遺伝子を除去したものが利用可能になる。
試料：１．未分化ｈＢＳ細胞（継代３３代目、３６代目、３７代目、３９代目、及び４０代目からプールしたもの）
２．未分化ｈＢＳ細胞（継代３５〜３７代目からプールしたもの）
３．ＣＭＬＣ１（継代２３〜２５代目、２９代目、及び３５代目からプールしたもの）
４．ＣＭＬＣ２（継代３９〜４１代目からプールしたもの）
５．ＣＭＬＣ３（継代２３〜２８代目、３２〜３４代目、３６〜４０代目、及び４９代目からプールしたもの）
６．分化ｈＢＳＣの混合集団（継代２２代目、２８代目、及び３２代目からプールしたもの）
【０１６３】
ＲＮＡの抽出、及びマイクロアレイ実験
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて、未分化及び分化ｈＢＳ細胞から全ＲＮＡを抽出し、その後、５４，６７５個の転写物をターゲットとしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０（米国カリフォルニア州サンタクララのアフィメトリクス社）を用いたマイクロアレイ実験に、この全ＲＮＡを用いた。ＲＮＡの量が少ないために、この実験のいくつかの試料は、２サイクルのインビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて増幅させた。バイオアナライザーＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００を用いてＲＮＡの品質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００を用いてＲＮＡの濃度を測定した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｔｗｏ−ｃｙｃｌｅ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ＊＊の説明書（米国カリフォルニア州サンタクララのアフィメトリクス社）に従って、全ＲＮＡを処理し、二本鎖のｃＤＮＡを産生した。これを鋳型として用いて、メーカーの仕様書に従って、ビオチン標識ｃＲＮＡを生成させた。１５マイクログラムのビオチン標識ｃＲＮＡを断片化して、長さ３５〜２００塩基の鎖にし、そのうちの１０マイクログラムを、標準的な手順を用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｏｖｅｎ  ６４００内において、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０（米国カリフォルニア州サンタクララのアフィメトリクス社）の上で一晩かけてハイブリダイズした。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０で、このアレイを洗浄し、続いて染色した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００を用いてスキャニングを行い、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使って画像解析を行った。ＳＣＩＢＬＵ（ルンド大学、統合生物学スウェジーンセンター（Ｓｗｅｇｅｎｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｔｈ．ｓｅ／ｓｃｉｂｌｕ））が、品質管理、ＲＮＡプロセシング、及びアレイのハイブリダイゼーションを行った。未分化ｈＢＳ細胞、分化収縮ＣＭＬＣ、及び分化細胞の混合集団を表す試料を、アレイとハイブリダイズさせた。アレイは、２連で行った。
【０１６４】
データ解析
ＣＭＬＣでアップレギュレートする遺伝子のファミリーを定義するために、未分化ｈＢＳ細胞と、ＣＭＬＣの３つの異なる生物学的複製物との間の遺伝子発現値のフォールド・チェンジ（ＦＣ）を算出した。留意すべきことに、これらの算出時には、増幅ＲＮＡ試料と非増幅ＲＮＡ試料を別々にしておいた。全ての試料においてＭＡＳソフトウェアによってＡｂｓｅｎｔとして呼び出された遺伝子をフィルター処理し、更なる解析には含めなかった。増幅試料では、全ての試料において、１７，４３６個のプローブがＡｂｓｅｎｔとして呼び出され、非増幅試料では、全ての試料において、１８，５３４個のプローブがＡｂｓｅｎｔとして呼び出され、これらの遺伝子をデータセットからフィルター処理した。各ＣＭＬＣ試料についてＦＣ値を算出したときに、ＦＣ値の平均（増幅及び非増幅、双方のＦＣ値）を割り出し、その後、遺伝子をフィルター処理するときに、その平均値を利用した。未分化ｈＢＳ細胞試料と比較したときに、全てのＣＭＬＣ試料にわたって、平均ＦＣ値が２未満である遺伝子をデータセットからフィルター処理し、更なる解析では、残りの９，８０１個の遺伝子のみについて考察した。表Ｉは、アップレギュレート遺伝子の分布を示しており、特定のＦＣレベル（２、３、５、及び１０）の遺伝子の数がまとめられている。
【０１６５】
表Ｉ．データセットに様々なフィルターをかけた後に残った遺伝子の数
【０１６６】
【表１０】
0005722628.tif 000017
【０１６７】
選択方法を更に精緻化するために、「混合分化ｈＢＳ細胞」の集団をコントロール材として含めて、全てのタイプの分化細胞でアップレギュレートする遺伝子を、心筋細胞様細胞クラスターで特異的にアップレギュレートする遺伝子から区別した。すなわち、「混合分化ｈＢＳ細胞」は、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉という３つの全ての胚葉由来の細胞が存在し得る自発分化ｈＢＳ細胞の集団を表す。
【０１６８】
ＣＭＬＣで特異的にアップレギュレートしたが、混合分化ｈＢＳ細胞集団ではアップレギュレートしなかった遺伝子を同定するために、以下のパラメーターを算出した。
【０１６９】
１）ＣＭＬＣと未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現値のフォールド・チェンジ（ＦＣ）（ＦＣＣＭＬＣ）
２）混合分化ｈＢＳ細胞と未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現値のＦＣ（ＦＣＭＣ）
【０１７０】
全ての計算において、ＣＭＬＣの３つの複製物の平均を用いた。下記の基準を用いて、ＣＭＬＣで特異的にアップレギュレートした遺伝子のみをソートした。
１）ＣＭＬＣでの発現値が５００未満の遺伝子を除去した。
２）ＦＣＣＭＬＣが１０未満の遺伝子を除去した。
３）ＦＣＣＭＬＣ／ＦＣＭＣの比率が１０未満の遺伝子を除去した。
【０１７１】
残った５６個の遺伝子は表ＩＩに列挙されており、これらは、ＣＭＬＣに適したマーカー遺伝子の典型である。
【０１７２】
表ＩＩ．ＣＭＬＣで特異的にアップレギュレートする遺伝子の一覧。表中のＦＣ値はいずれも、上記のとおり、未分化ｈＢＳ細胞に対して算出したものである。遺伝子は、ＣＭＬＣの発現値に基づき、降順にソートされている。
【０１７３】
【表１１−１】
0005722628.tif 000018
【０１７４】
【表１１−２】
0005722628.tif 000019
【０１７５】
特に留意すべきなのは、表ＩＩの遺伝子の大半を２つの異なるグループに分類できる点である。第１のグループは、既に心臓細胞と関連付けられている遺伝子からなり、第２のグループは、既に肝実質細胞のような内胚葉細胞と関連付けられている遺伝子からなる。第１のグループに属する遺伝子の例は、ＭＹＨ６、ＭＹＬ７、ＭＹＬ４、ＴＮＮＣ１、ＴＮＮＴ２、ＰＬＮ、ＴＴＮ、ＭＹＨ７、ＬＤＢ３、ＮＰＰＢ、ＧＡＴＡ６、ＭＹＬ３、ＣＳＲＰ３、ＡＣＴＮ２、ＭＢ、ＭＹＯＺ２、ＴＢＸ５、及びＨＳＰ２７（表ＩＩで薄い灰色で示されているもの）である。第２のグループに属する遺伝子の例は、ＡＦＰ、ＴＦ、ＡＰＯＡ２、ＡＨＳＧ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＬＢ、ＡＰＯＣ３、ＴＴＲ、ＡＰＯＢ、及びＲＢＰ４（表ＩＩで濃い灰色で示されているもの）である。
【０１７６】
ＣＭＬＣで特異的にアップレギュレートする遺伝子の更に厳密な選択結果を得るために、基準を下記まで狭めた。
ｉｖ）ＣＭＬＣでの発現値が２０００未満の遺伝子を除外した。
ｖ）ＦＣＣＭＬＣが１００未満の遺伝子を除外した。
ｖｉ）ＦＣＣＭＬＣ／ＦＣＭＣの比率が１００未満の遺伝子を除外した。
【０１７７】
残った９個の遺伝子は表ＩＩＩに示されており、これらは、ＣＭＬＣに適したマーカー遺伝子の典型である。
【０１７８】
表ＩＩＩ：ＣＭＬＣで特異的にアップレギュレートする遺伝子のうち、より厳密な基準による選択後に残った遺伝子の一覧。表中のＦＣ値はいずれも、上記のとおり、未分化ｈＢＳ細胞に対して算出したものである。遺伝子は、ＣＭＬＣの発現値に基づき、降順にソートされている。
【０１７９】
【表１２】
0005722628.tif 000020
【０１８０】
この選択結果は、クラスターで発現する内胚葉遺伝子と中胚葉遺伝子との均等な分布を示している。表ＩＩＩでは、中胚葉遺伝子は薄い灰色で、内胚葉遺伝子は濃い灰色で示されている。
【０１８１】
マイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）アルゴリズムを用いた心筋細胞様クラスターのマイクロアレイ解析
【０１８２】
上記の分化法及びＲＮＡ抽出法を用いることによって、収縮開始後の様々な時点（２２日未満）でＲＮＡをプールした。
【０１８３】
未分化ｈＢＳは、ＲＮＡ抽出のための継代後４〜５日目に採取するか、又は、継代２３〜４１代目の細胞を用いて分化させてＣＭＬＣを得た。自発収縮クラスターは、光学顕微鏡を用いて目視検査によって確認し、機械的剥離によって採取した。特別な注意を払って、周囲の非拍動細胞を最小限しか有さない拍動領域を採取した。
【０１８４】
各実験では、材料は、未分化ｈＢＳの１つのプール試料と、プールクラスターの２つの異なる生物学的複製物から構成させた。
【０１８５】
データ解析
特異的に発現した遺伝子の同定
未分化ｈＢＳと比べて、ｈＢＳ由来のクラスターで有意にアップ又はダウンレギュレートした遺伝子を、ＳＡＭアルゴリズム（Ｔｕｓｈｅｒ  ＶＧ，  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ，  Ｃｈｕ  Ｇ．  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００１；  ９８：５１１６−５１２１）を用いて同定した。簡潔には、このアルゴリズムは、反復測定値の標準偏差と相対的な条件間の発現差に基づき、各遺伝子にスコアを割り当てる。反復測定値の並べ替えを用いることによって、ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ（ＦＤＲ）を割り出し、偶然同定された遺伝子の割合を推定する。別々に、ＦＤＲ＜０．０４を用いて、２つの実験結果から得た各データセットに、このアルゴリズムを適用する。その後、双方のデータセットで、有意にアップ又はダウンレギュレートしたと特徴付けられた遺伝子のみを、未分化ｈＢＳと比べてＣＭＬＣで特異的に発現したものとみなした。
【０１８６】
結果
ＳＡＭアルゴリズム、及びＦＤＲ＜０．０４を用いて、未分化ｈＢＳと比べてクラスターで有意にアップレギュレートした５３０個の遺伝子を同定した（図１１）。図１１に示されているフォールド・チェンジ（ＦＣＣＭＬＣ）は、上記のマイクロアレイ解析で得られた結果（表ＩＩ及びＩＩＩ）に相当する。フォールド・チェンジの数値の差はいずれも、計算で用いた統計的方法の差によるものである。いくつかの遺伝子では、表ＩＩに示されている結果と、表ＩＩＩに示されている結果の間でＦＣ値が異なる。これらの数字は、同じ生データを用いて計算したものであるが、平均ＦＣを算出するためのアプローチが、全く同じという訳ではなかった。表ＩＩの遺伝子では、各遺伝子に対応するＧｅｎｅＣｈｉｐｓ上の各プローブを別々に使用し、その後、組み入れ基準に達したプローブのみを、平均ＦＣ値の計算に用いた。一方、表ＩＩＩの値では、１つの遺伝子に対応するプローブの平均をまず計算してから、その値を更なる計算に用いるために、全てのプローブを用いた。
【０１８７】
加えて、我々は、未分化ｈＢＳＣと比べて、ｈＢＳＣ由来ＣＭＬＣで有意にダウンレギュレートした４０遺伝子という更に小さいグループも同定した（図１２）。これらの中には、ＮＡＮＯＧ、ＴＤＧＦ１、ＰＯＵ５Ｆ１、ＬＥＦＴＹ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、及びＳＯＸ２のように、多能性ｈＢＳと関連付けられているいくつかの遺伝子があり、ＣＭＬＣが分化細胞集団の典型であることが示されている。上記のアップレギュレート遺伝子が、ヒト心臓組織で過剰発現することが既に知られていたかを調べるために、（Ｚａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５に記載されているように、）ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔのＴｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ解析を用いた。図１１の５３０個の遺伝子のうち、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって４１７個が同定され、３３１個が、ヒト心臓組織で「発現する」ものとして特徴付けられた。これらの遺伝子のうち１００個（２４％）が、心臓組織で有意に過剰発現するものとして定められている（図１１ではカテゴリーＯと示されている）。これに加えて、２５個の遺伝子（６％）が、心臓組織で有意に過少発現するものとして定められた（図１１ではカテゴリーＵと示されている）。興味深いことに、これらの遺伝子の一部（例えば、ＴＦ、ＦＧＧ、ＴＴＲ、及びＳＥＲＰＩＮＡ１）は、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって、ヒトの肝臓で有意に過剰発現するものとして記録され、ＣＭＬＣに内胚葉派生物が存在することを示唆している。特に留意すべきなのは、ＭＹＨ６遺伝子が、組織発現記録の不足が原因で、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔによって同定されなかった点である。この理由から、かつ一貫性を保つために、上記の表のいずれでも、ＭＨＹ６は、ヒトの心臓で有意に過剰発現するものとしては示されていない。しかし、ＭＹＨ６は、他の研究では、心臓に特異的な遺伝子であることが報告されている。
【０１８８】
ｈＢＳＣ由来ＣＭＬＣでアップレギュレートする遺伝子ファミリーの特徴を示すために、我々は、遺伝子オントロジー解析（ＧＯ）解析を行った。遺伝子オントロジー（ＧＯ）アノテーションを用いて、生物学的プロセス、分子機能、及び細胞の構成要素に従って、遺伝子をグループ化した。基準リストと比較することによって、遺伝子セットにおけるアノテーションの過出現をＯ／Ｅとして計算することができ、Ｏ／ＥのＯは、特定のアノテーションを有する遺伝子の観察数であり、Ｅは、そのアノテーションを有する遺伝子の予想数である。Ｅは、Ｅ＝Ｒ×Ｉ／Ｒとして計算し、式中、Ｒは基準遺伝子の数であり、Ｉは関心遺伝子の数である。アレイ上で示された全ての遺伝子を基準リストとして用いた。ＧＯアノテーションデータベースのレベル５にある３つの全てのアノテーションカテゴリーから、アップレギュレート遺伝子の中で有意に過出現したアノテーション（ｐ＜０．０１）を、超幾何検定を用いて同定した。
【０１８９】
留意すべきことに、図８に示されている有意に過出現したＧＯアノテーションタームのいくつかは、心筋細胞の特性及び機能と関連付けられている。例えば、アップレギュレート遺伝子の約１０％には、分子機能カテゴリーの「カルシウムイオン結合」というアノテーションが割り当てられた。加えて、生物学的プロセス及び細胞の構成要素のカテゴリーにおける結果も、ｈＢＳＣ由来ＣＭＬＣにおける心臓系統の存在を裏付けている。例えば、アップレギュレート遺伝子は典型的に、「筋収縮」、「細胞分化」、及び「発生」のようなプロセスと関連付けられている。加えて、細胞成分のアノテーションは、心筋細胞で活性を示す収縮装置に特徴的な「細胞骨格画分」及び「筋原線維構造体」の優位性を有する。
【０１９０】
ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートした遺伝子に由来するタンパク間における考え得る相互作用を調べるために、ＳＴＲＩＮＧ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｉｎｇ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／）というサーチツールを用いて、隣接遺伝子の連続発現についてマイニングした（Ｓｎｅｌ  Ｂ，  Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｇ，  Ｂｏｒｋ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  ＳＴＲＩＮＧ：  ａ  ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ  ｔｏ  ｒｅｔｒｉｅｖｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０００；  ２８：３４４２−３４４４）。ＳＴＲＩＮＧは、直接的（物理的）及び間接的（機能的）関連性を含め、様々なタイプのタンパク間の関連性を収集、予測、及び統合化することを目的としている。ＣＭＬＣのアップレギュレート遺伝子のリストをＳＴＲＩＮＧへのインプットデータとして用いたところ、４３１個がマッチし、更に、これらの遺伝子由来の産物間における潜在的相互作用を調査した。これらの遺伝子産物からタンパク相互作用マップを作成し、無作為に生成した１０個の異なる遺伝子セット（すべて同じサイズ）から作成したタンパク相互作用マップと比較した。各タンパクについて、ｎ×２／Ｎとして相互作用スコアを計算した。式中、ｎは、対象のタンパクにおける相互作用（マップの稜線）の数であり、Ｎは、インプットタンパクの総数である。更に、ハブタンパクの数を割り出した。Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．に従って、我々は、他のタンパクとの相互作用が≧５である場合に、そのタンパクをハブと定めた（Ｈａｎ  ＪＤ，  Ｂｅｒｔｉｎ  Ｎ，  Ｈａｏ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００４；４３０：８８−９３）。また、同時にパートナーの大半と相互作用する「パーティーハブ」と、異なる時点又は場所でパートナーと相互作用する「デートハブ」との間の区別も行った。我々のデータセットには、時系列データが含まれていないので、「パーティーハブ」のみを同定した。ＳＴＲＩＮＧは、デフォルトでは、ゲノムコンテクスト、ハイスループット実験、共発現、及び既知の知識という４つの異なるソースを用いて、タンパク相互作用マップを導き出す。しかし、我々は、結果の妥当性を向上させるために、解析を限定して、実験で割り出されたタンパク相互作用のみを含め、例えばテキストマイニングは除外した。
【０１９１】
図９に示されているように、タンパク相互作用は実質的に、ｈＢＳＣ由来ＣＭＬＣでアップレギュレートする遺伝子によってコードされるタンパク間の方が、無作為に生成した同サイズのタンパクセットで観察されるものよりも複雑である。例えば、無作為のデータセットよりもかなり多くのハブタンパク（他のタンパクとの相互作用が≧５であることによって特徴付けられる）が同定され、そのハブタンパクの全てが、直接又は間接的に相互作用し合っており、その結果、完全接続ネットワークが形成された（図１０）。無作為に生成した遺伝子セットから得られた相互作用ネットワークでは、我々は典型的には、上記ネットワークよりも小さく、かつ相互作用し合っていないサブネットワークをいくつか観察した。
【０１９２】
特異的に発現した遺伝子におけるタンパク相互作用ネットワークの特定に加えて、我々は、多くの細胞パスウェイの有意なアップレギュレーションについても本明細書で報告する。特筆すべきことに、フォーカルアドヒージョンパスウェイの２３個の遺伝子は、ｈＢＳＣ由来ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートする。フォーカルアドヒージョンパスウェイは、組織リモデリング、細胞移動、胚発生、増殖因子のシグナル伝達、細胞周期の進行、細胞生存を含む多様な一連の細胞プロセスに関連付けられている（Ｐａｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，  Ｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）。加えて、最近、心筋細胞のメカノトランスダクションにおけるフォーカルアドヒージョンの役割に焦点が当てられている（Ｓａｍａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）。興味深いことに、メカノトランスダクションは、心筋能の拍動間調節への作用に加えて、ヒト心筋層を構成する細胞成分の増殖、分化、発育、生存にも影響を及ぼす。更に、新生ラットの心室筋細胞では、フォーカルアドヒージョンキナーゼが、心筋細胞における機械的にストレスによる肥大化の遺伝プログラムの初期活性化において重要な役割を有するＭＥＦ２及びＪＮＫ／ｃ−Ｊｕｎパスウェイの活性を調節することが報告されている（Ｎａｄｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）。
【０１９３】
留意すべきことに、カルシウムシグナル伝達パスウェイの１６個の遺伝子も、ｈＢＳＣ由来ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートする。細胞内情報伝達物質であるＣａ２＋は、心収縮の開始及び調節にとって重要な成分であるので、この観察結果は予想通りである（Ｆｅｒｒｉｅｒ  ＧＲ，  Ｈｏｗｌｅｔｔ  ＳＥ．  Ｃａｒｄｉａｃ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００１；  ２８０：Ｈ１９２８−１９４４．）。加えて、Ｃａ２＋は、受精プロセスの仲介をするために、すでに生命の誕生時点で重要であることが明らかになっており、受精後は、初期発生中に、細胞周期イベントの一部を調節する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）。この点で、数多くの発生プロセスにおいて不可欠であることが知られているヘッジホッグシグナル伝達パスウェイ（Ｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）も、ｈＳＢＣ由来ＣＭＬＣで有意にアップレギュレートする。具体的には、ソニックヘッジホッグが、Ｐ１９細胞における心発生にとって不可欠なシグナル伝達因子であると思われる（Ｇｉａｎａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）。加えて、ヘッジホッグシグナル伝達が欠失した実験用マウスは、Ｎｋｘ２．５の発現の遅延を示す（Ｇｉａｎａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）。
【０１９４】
実施例３．ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣのリアルタイムＱＰＣＲ
細胞培養、及びＲＮＡの抽出
自発収縮ＣＭＬＣを未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した（実施例１参照）。コラーゲナーゼＩＶ（２００Ｕ／ｍｌ）と共に１０〜１５分間、３７℃でインキュベートすることによって、ｈＢＳをＭＥＦフィーダー層から分離した。この懸濁液を１５ｍｌのチューブに移し、細胞を沈殿させた後、浮遊物を取り除いた。培地中でコロニーを再懸濁し、ピペットを用いて機械的に解離させて未分化細胞の小凝集体にした。この細胞懸濁液を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ、コーニング、未処理、ｖボトム）に（２００μｌ／ウェルで）分注し、５分間、４００ｘｇで遠心分離した。続いて、このプレートを３７℃で６〜８日間インキュベートした。次いで、形成された３Ｄ構造体を、培地の入ったゼラチンコートディッシュに移した。数日後、自発収縮細胞のクラスター（ＣＭＬＣ）が観察された。これらのクラスターの一部を、収縮開始から０〜２週間後に採取し（「初期ＣＭＬＣ」）、その他のクラスターは、少なくとも６週間培地で維持してから採取した（「後期ＣＭＬＣ」）。平行して、その後のＲＮＡ抽出のために、未分化ｈＢＳ細胞を採取した。
試料：１．未分化ｈＢＳ（継代３５〜３７代目）
２．「初期ＣＭＬＣ」（継代２３〜２８、３２〜３４、３６〜４０、及び４９代目）
３．「後期ＣＭＬＣ」（継代３５、３６、３９、４０、４３、４６、及び４８代目）
オンカラムＤＮアーゼ処理（キアゲン）と共にＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、未分化ｈＢＳ細胞及びＣＭＬＣから全ＲＮＡを抽出した。
【０１９５】
定量リアルタイムＰＣＲ
ＣＭＬＣ及び未分化ｈＢＳ細胞の特異的イオンチャネルの遺伝子発現レベルを調べるために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄｓ、アプライドバイオシステムズ）を用いた。対照用に、ヒト成体正常心臓組織（６人の異なる男性ドナーからプールしたもの）由来の市販の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））を平行して解析した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ３（カタログ番号１８０８０−０５１、インビトロジェン）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。各ＰＣＲ反応は、４連で行った。相対的な遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現レベルに対して正規化し、ΔΔＣｔ法に従って算出した。ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ−４）、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＩ３、ＤＥＳ、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＢ１、ＣＡＣＮＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＡ５、ＫＣＮＡＢ１、ＫＣＮＡＢ２、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ１２、ＫＣＮＪ３、ＫＣＮＪ５、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ９、ＫＣＮＤ３、ＫＣＮＡ４、Ｋｃｎｉｐ２、ＨＣＮ４、ＫＣＮＫ１、ＣＦＴＲ、ＧＪＡ５、ＧＪＡ１、ＧＪＡ７、ＡＴＰ２Ａ２、ＳＬＣ８Ａ１、ＲＹＲ２、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＳＬＣ９Ａ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬＫ、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７という遺伝子を解析した。ＰＣＲ解析の結果は、図４にまとめられている。遺伝子のパネルでは、心筋細胞の機能で重要な役割を果たすイオンチャネルの発現に焦点を当てている。例えば、心臓のイオンチャネルに特異的な薬剤をＣＭＬＣで試験することができる。活動電位、拍動周波数、及び形態的外観のような指標を解析することができる。
【０１９６】
実施例４．ガラス化を利用したＣＭＬＣの低温保存及び解凍
心筋細胞様細胞クラスター（ＣＭＬＣ）は、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞から抽出した。自発収縮細胞のクラスターを手動で解離し、更に、より小さいクラスター（直径約０．２〜０．３ｍｍ）に分割した。このＣＭＬＣを、特許出願「Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（国際公開第２００４／０９８２８５号）に記載されているように、閉じたストロー内でガラス化し、液体Ｎ２で保管した。１０％エチレングリコール及び１０％ＤＭＳＯを添加したｖｉｔｒｏ−ＰＢＳ（ビトロライフ社）、並びに、０．３Ｍトレハロース、２０％エチレングリコール、及び２０％ＤＭＳＯを添加したｖｉｔｒｏ−ＰＢＳ（ビトロライフ社）を含む濾過滅菌済みガラス化溶液を使用した。培地（２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｍｏｌ／ｌβ−メルカプトエタノール、及び１％非必須アミノ酸を添加したノックアウトＤＭＥＭ）で解凍後、細胞を回収し、結果を以下にまとめた。
【０１９７】
実験１：１０個のＣＭＬＣをガラス化した。
７個のＣＭＬＣをストローから回収した。
５個のＣＭＬＣが自発収縮を回復させた。
→回復率７０％
【０１９８】
実験２：１２個のＣＭＬＣをガラス化した。
８個のＣＭＬＣをストローから回収した。
６個のＣＭＬＣが自発的修復を回復させた。
→回復率７５％
【０１９９】
実験３：結果は、下記の表ＩＶにまとめられている。
【０２００】
表ＩＶ．ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣの低温保存及び解凍の結果
【０２０１】
【表１３】
0005722628.tif 000021
【０２０２】
追加の実験も行った。その実験については、以下にまとめられている。下記の表には、４回の別々のガラス化実験から収集したデータが記録されている。このデータは、解凍から３日、７日、又は１４日後における、接着した心筋細胞クラスターと、接着し、かつ自発収縮していた心筋細胞クラスターの割合を示している。
【０２０３】
【表１４】
0005722628.tif 000022
【０２０４】
実施例５．クラスターの特徴
コラーゲナーゼ（２００Ｕ／ｍｌ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地中）を用いて、未分化ｈＢＳ細胞のコロニーをフィーダー細胞から分離する。コロニーは、受動的沈殿又は遠心分離のいずれかによって集める。続いて、優しくピペッティングすることによって、コロニーを多少分散させ、再懸濁して、培地（培地１）２００μｌ当たりに４個の平均サイズコロニーという最終濃度を得る。次いで、コロニーを９６ウェル、ｖボトムの未コーティングプレート（コーニング物品番号：３８９６）で、５分間、４００ｘｇ、ウェル当たり２００μｌ（４個のコロニー）で遠心分離する。続いて、このプレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに保管して、３〜８日間の期間にわたって、分化細胞を含む３Ｄ構造体を形成させる。上記期間の経過後、３Ｄ構造体をゼラチンコートペトリ皿に移し、下記の培地２で２週間培養する。その際、培地は２〜３日おきに変える。
【０２０５】
３Ｄ構造体を形成させるための培地１：
グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む３９．４ｍｌのＤＭＥＭ
５００μｌの非必須アミノ酸
１００μｌのβ−メルカプトエタノール
１０ｍｌのウシ胎仔血清
【０２０６】
３Ｄ構造体をプレーティング及び培養して、自発的分化を可能にするための培地２：
一層の分化をもたらすために２０％又は２％ＦＢＳを加える以外は培地１と同じ
【０２０７】
クラスターの特徴
３Ｄ構造体を細胞齢７日目に、２０％ウシ胎仔血清を含む培地のゼラチン上にプレーティングするとき、収縮細胞を有するクラスター（ＣＭＬＣ）は、下記の特徴を有する（ｎ＝５５）。
【０２０８】
拍動周波数
毎分平均拍動数：４５．４±２５．９
毎分拍動数の中央値：４０
【０２０９】
長さ
平均値：６１９±４４０μｍ
中央値：５００μｍ
【０２１０】
幅
平均値：３３０±２９８μｍ
中央値：２６０μｍ
【０２１１】
拍動周波数の分布は、心筋細胞様細胞クラスターの採取元である３Ｄ構造体のプレーティング時期と、３Ｄ構造体のプレーティング後の培養条件の両方の影響を受ける。
【０２１２】
実施例６．緩慢凍結を用いた心筋細胞様細胞クラスターの低温保存
心筋細胞様細胞クラスター（ＣＭＬＣ）は、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞から抽出した。自発収縮細胞のクラスターを手動で解離し、更に、より小さいクラスター（直径約０．２〜０．３ｍｍ）に分割した。一方の実験では、細胞クラスターを低温保存し、他方の実験では、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて（３７℃で１５分）、クラスターを単一細胞懸濁液に解離した。この細胞懸濁液又は細胞クラスターを低温保存培地に移した。下記の異なる培地組成物を試験し、解凍後の生存細胞の回復率に関して同等の結果を得た。
１．（ＫＯ−ＤＭＥＭ、ＮＥＡＡ、β−ＭｅＯＨ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＰＥＳＴ、２０％ＦＢＳ）＋１０％ＤＭＳＯ
２．９０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ
３．９５％ＦＢＳ＋５％ＤＭＳＯ
４．４５％ＫＯ−ＤＭＥＭ＋４５％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ
５．５０％ＫＯ−ＤＭＥＭ＋４５％ＦＢＳ＋５％ＤＭＳＯ
６．５０％トリプシン／ＥＤＴＡ＋４０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ
７．２０％ＫＯ−ＤＭＥＭ＋５０％トリプシン／ＥＤＴＡ＋２０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ
【０２１３】
実施例７．インビトロでの薬理試験での心筋細胞様細胞クラスターの利用
心筋細胞様細胞クラスター（ＣＭＬＣ）は、実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞から抽出し、実施例４に記載されているように低温保存した。このＣＭＬＣを解凍し、微小電極アレイ、電圧固定法による解析、膜内外活動電位（ＴＡＰ）の測定、及びＱＴ−スクリーンシステムといった異なるプラットフォームを用いて、薬理試験を行った。機能クラスターの利用については、図３０に更に詳しく示されている。
【０２１４】
実施例８：ＣＭＬＣにおけるｈＥＲＧチャネルの機能性解析
自発拍動ＣＭＬＣを、実施例１に記載されているようにｈＢＳ細胞から抽出及び単離した。このＣＭＬＣを微小電極アレイ（ＭＥＡ）上にプレーティングした。ＣＭＬＣがＭＥＡ表面に接着後、ＭＥＡの基板集積型電極によって、電気活動を細胞外電場電位として記録した。心臓の電場電位特性に関しては、既に研究がなされており、それらの心臓活動電位データとの相関性については、十分に説明されている（Ｂａｎａｃｈ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００３，  ２８４（６）：  Ｈ２１１４−Ｈ２１２３）。ＱＴ延長薬Ｅ−４０３１の添加によってもたらされるｈＥＲＧチャネルの遮断を、心臓電場電位の遅延再分極として測定した。薬剤濃度の上昇（０、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ）を追加的に行って、累積用量反応曲線を得た。留意すべきことに、Ｅ−４０３１は、実験全体にわたって拍動周波数に影響を及ぼさなかったが、心臓電場電位の低ナノモル濃度における持続的な延長を引き起こした。これは、この化合物によって生じることが知られるｈＥＲＧチャネルの遮断を示すものである。この実施例は、ポスターの図２ｂ（図７ａ及びｂ参照）に示されている。
【０２１５】
加えて、アステミゾール（抗ヒスタミン薬）及びドフェチリド（クラスＩＩＩ抗不整脈薬）のような他の物質を用いて、同様の実験を行った。図５ａに示されているように、アステミゾールは、低ナノモル濃度での再分極成分の選択的遮断と持続的延長を引き起こした。ドフェチリドを用いたときも同様の効果が観察された（図５ｂ）。更には、テルフェナジン（抗ヒスタミン薬、ＱＴ延長効果が原因で、１９９７年に米国市場から撤退）、及びシサプリド（セロトニン受容体アゴニスト、ＱＴ延長効果が原因で、２０００年に米国市場から撤退）も、用量依存性の活動電位延長性（心室再分極障害によるＱＴ延長の指標）を示した（図５ｃ及び５ｄ）。
【０２１６】
実施例９．アクチビンＡとｂＦＧＦとの併用処理が心筋細胞様細胞クラスターに及ぼす効果
基本的に実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞（細胞株ＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２、継代２１、２２、４４及び５１代目）からＣＭＬＣを抽出した。ｈＢＳ細胞から得られるＣＭＬＣの収量を増やすために、３Ｄ構造体のプレーティングの前に（プレプレーティング）用いる培地に、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍｌ）を添加した。
【０２１７】
形成された３Ｄ構造体をプレーティング後、６〜７日目に、収縮ＣＭＬＣの数を目視により割り出した。３つの実験で、プレプレーティング期間中にアクチビンＡ及びｂＦＧＦで処理した培地では、この処理を行わなかったコントロール培地に比べて平均で４．７倍多い拍動ＣＭＬＣが見られた（図６Ｅ）。ある１つの実験では、２０％ＦＢＳの代わりに２％ＦＢＳを添加したＣＭ培地に３Ｄ構造体をプレーティングした。この実験では、アクチビンＡとｂＦＧＦを併用したプレプレーティング処理によって、プレーティングから７日後の収縮ＣＭＬＣの収量が、２．５倍増えた（データは不図示）。この処理が拍動領域の特徴に及ぼす効果を、２つの実験（１つは、２０％ＦＢＳを含むプレーティング培地を用いたもの、１つは、２％ＦＢＳを含むプレーティング培地を用いたもの）における拍動周波数、長さ、幅、算出面積、及び構造の分布の観点で割り出した。実験の設定と、収縮ＣＭＬＣの特徴を下記の表に示す（ｎ＝７〜１４）。
【０２１８】
【表１５】
0005722628.tif 000023
【０２１９】
上記実験で、プレーティング後７日目に得られた混合培地（ＣＭＬＣを含む）から全ＲＮＡを単離し、転写させてｃＤＮＡを得た。Ｔａｑｍａｎの標識システムを用いて定量リアルタイムＰＣＲを行い、データを内在性コントロールＣＲＥＢＢＰに対して正規化した。２０％ＦＢＳ（図６Ａ〜Ｄ）及び２％ＦＢＳ（データは不図示）を添加したＣＭ培地へのプレーティングと併せて、プレプレーティング期間中にアクチビンＡ及びｂＦＧＦを培地に添加することによって、初期心臓分化に関わる遺伝子（Ｎｋｘ２．５及びＧＡＴＡ４）、並びに、後期心臓分化に関わる遺伝子（トロポニンＴ２及びα−心臓アクチン）の発現量が増えた。これは、アクチビンＡとｂＦＧＦによる処理によって、心筋細胞の数が増えたことを示している。これらの実験では、アクチビンＡとｂＦＧＦの併用処理によって、Ｆｌｋ１、ＣＤ３１、及びα−アクチンの遺伝子発現量も増えた（データは不図示）。
【０２２０】
実施例１０．培地組成物、添加剤、及びプレーティング日が、ｈＢＳ細胞からのＣＭＬＣの形成に及ぼす効果
実施例１に記載されている基本プロトコールに変更を加えることによって、ＣＭＬＣの収量を増やすことができる。この実施例では、その格好の条件の一部を例示する。
【０２２１】
用いる血清成分は、ｈＢＳ細胞から得られる拍動ＣＭＬＣの収量に影響を及ぼす。一連の実験では、標準ＦＢＳ（実施例１におけるもの）（インビトロジェン物品番号１０１０８−１６５）、透析ＦＢＳ（インビトロジェン物品番号２６４００−０３６）、チャコール処理ＦＢＳ（インビトロジェン物品番号１２６７６−０１１）という異なるＦＢＳ調製物を用いた。培養中、９６ウェルプレートにおいて、異なるＦＢＳ（２０％）の存在下で、細胞を維持した。形成された凝集体を、３日後に、ゼラチンでコーティングされている新たなディッシュにプレーティングし、その後の培養は、標準ＦＢＳ（２０％）の存在下で行った。プレーティングから１４日後、拍動ＣＭＬＣの数を割り出した。その結果は表１３に示されている。この結果は、チャコール処理ＦＢＳを用いることによって収量が増える傾向があること、及び、多くのＦＢＳバッチをスクリーニングすることによって、最適なバッチを同定可能なはずであることを示している。
【０２２２】
初期段階の分化を（すなわち９６ウェルプレート中で）調節することに加えて、後期段階の分化を刺激して、ｈＢＳ細胞から得られる収縮ＣＭＬＣの収量を増やすことも可能である。このケースにおいては、ｈＢＳ細胞は、実施例９に記載されているように、アクチビンＡ及びｂＦＧＦの不存在下又は存在下で、分化させた。７日目に、分化細胞（３Ｄ凝集体）を、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦを添加した培地にプレーティングした。４日後、培地を、ＬＩＦを含まない培地に変えた。プレーティング後７日目及び１４日目に、拍動ＣＭＬＣの数を計数した。その結果は図１４に示されている。留意すべきことに、アクチビンＡとｂＦＧＦによる処理は、ＣＭＬＣの収量を増やし、ＬＩＦによる追加的な処理は、拍動ＣＭＬＣの生成量を、特に早い時点（７日目）において、更に増やした。
【０２２３】
ｈＢＳ細胞の分化調節のためにタンパク増殖因子を用いる代わりに、低分子量化合物を用いることもできる。未分化ｈＢＳ細胞は、基本的に実施例９に記載されているように処理した。ｈＢＳ細胞から得られるＣＭＬＣの収量を増やすために、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍｌ）に加えて、プレーティングの前に用いる培地に、５μＭのＳＢ２１６７６３（ＧＳＫ−３インヒビター）又は５μＭのＳＫＦ−８６００２（ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビター）を添加した。形成された３Ｄ構造体をプレーティング後７日目に、収縮ＣＭＬＣの数を目視により割り出した。その結果は表１５に示されている。プレプレーティング期間中にＳＢ２１６７６３又はＳＫＦ−８６００２のいずれかで処理した培地では、拍動ＣＭＬＣの収量は、追加的な因子を与えなかったコントロール培地と比べてほぼ３倍多かった。この結果は、ＳＢ２１６７６３とＳＫＦ−８６００２のいずれも、ｈＢＳ細胞由来の拍動ＣＭＬＣの数に対してプラスの作用を与えることを示している。また、この２つの化合物を組み合わせると、ｈＢＳ細胞から得られるＣＭＬＣの収量を更に増やすことできる可能性がある。
【０２２４】
分化開始後、３Ｄ凝集体をプレーティングする日も、拍動ＣＭＬＣの収量に影響を及ぼす。一連の実験では、分化しているｈＢＳ細胞の３Ｄ凝集体を、実施例１に記載されているように生成した。その後、この３Ｄ凝集体を、７日目（コントロール）、又はそれよりも早く（３、４、若しくは５日目）、新たな培養皿にプレーティングした。自発拍動ＣＭＬＣの数を、光学顕微鏡を用いて目視により割り出した。そのデータは図１６にまとめられている。７日目よりも早い時点でプレーティングすると、ＣＭＬＣの最終収量が有意に増える。
【０２２５】
実施例１１．膜内外活動電位の測定：薬理試験及び安全性試験
方法
３ＭのＫＣｌで満たされている微小電極（抵抗１０〜２０ＭΩ）であって、Ａｇ／ＡｇＣｌ接点を介してハイインピーダンスアンプ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  ＩＥ−２１０、ワーナーインストゥルメント社（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に接続した微小電極を用いて、膜内外活動電位（ＴＡＰ）を記録した。ガラスを用いて先鋭な微小電極を準備し、マイクロマニピュレーターを用いて、電極を恒温槽の中まで下げ、クラスターの中に入れた。この刺した状態を可能な限り長く保った。ＰＣに活動電位を記録し（サンプリング周波数１及び２０ｋＨｚ）、カスタム設計のソフトウェア（Ｐｈａｒｍ−Ｌａｂ  ｖ６．０ｂ４、アストラゼネカ）を用いて、様々な活動電位特性を解析し、５０％、７０％、及び９０％の再分極点でのＡＰ持続時間（ｄｕｒ５０、ｄｕｒ７０、ｄｕｒ９０）、ＡＰ振幅（ａｍｐ）、静止膜電位（ＭＲＰ）、及びＡＰ立ち上がり最大速度（Ｖｍａｘ）を割り出した。自然に発生する周波数で、又は、１〜４Ｈｚの電気刺激中に、活動電位を定常状態で記録した。計算はいずれも、１０個（連続的）の活動電位の平均として行った。恒温槽は、１３０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、４ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．８ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４ｘＨ２Ｏ、１８ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ３、５．５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース、１．８ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２からなるタイロード溶液で持続的にかん流すると共に、３７℃に保った。
【０２２６】
実施例１及び９に記載されているように、ＣＭＬＣをｈＢＳ細胞から抽出し、そのクラスターを、ゼラチンでコーティングしたシリコン片及びカバーガラスの上で増殖させて、恒温槽に移しやすくし、同じ位置にクラスターを保つという問題を取り除いた。移動電極による場刺激を用いて、ＣＭＬＣの電気刺激を行った。
【０２２７】
速活性型整流カリウム電流ＩＫｒを遮断する効果を試験するために、０．５〜１μＭのＥ−４０３１を使用した。ＡＰＤの変化を計算し、この変化を用いて、延長を割り出すと共に、三角形化をアセスメントした。
【０２２８】
自発収縮ＣＭＬＣにおけるファニー電流（Ｉｆ）の役割を調べるために、１０μＭのザテブラジンを投与した。
【０２２９】
結果
膜内外活動電位（ＴＡＰ）の記録結果に基づき、細胞を、結節様、心房様、又は心室様のいずれかとして特徴付けた。拍動ＣＭＬＣから記録を取った活動電位の特徴は、図１７に示されていると共に、下記の表にまとめられている。データでは、±の数値は標準偏差であり、ｎは、該当するタイプのクラスターの数を示しており、ｂｐｍは毎分拍動数であり、ＲＲはＡＰ間の距離であり、ＡＰＤ５０／ＡＰＤ７５／ＡＰＤ９０は、５０％、７５％、又は９０％の再分極時点で測定した持続時間であり、ａｍｐはＡＰ振幅であり、Ｖｍａｘは、脱分極の立ち上がり最大速度である。
【０２３０】
【表１６】
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【０２３１】
ｈＢＳ細胞由来の拍動ＣＭＬＣから記録を取った活動電位の特徴
【０２３２】
個々のＣＭＬＣ間でばらつきはあるが、ほぼ完全に成熟した心室のＡＰの例が見られた。一例として、図１８は、ｄｕｒ９０が３４１ｍｓ、振幅が９７ｍＶである心室活動電位を示している。１４５個の異なるクラスターから取った記録のうち、２４個が、２００ｍｓを超えるＡＰＤ（９０）を示した。
【０２３３】
同じ拍動ＣＭＬＣクラスターの様々な位置で、繰り返し記録を取ったところ、クラスター内のばらつきは小さかった（図１９）。
【０２３４】
本来の心臓では、心筋細胞は、ＡＰＤの短縮による拍動周波数の上昇に反応する。この拍動適応性は基本的なものであり、一部の疾患で損なわれることがある。ｈＢＳ由来ＣＭＬＣが拍動周波数の変化に均一に反応する能力を試験するために、電場刺激によってクラスターをペーシングさせ、様々な周波数でＡＰＤ９０を比較した。図２０は、ＡＰＤ９０が周波数依存性であること、及び、ペーシング周波数が高くなると（１〜３Ｈｚ）、初期ＡＰＤ９０が１８０ｍｓ超であるクラスターが、拍動適応性を見せたことを示している。ＡＰＤ９０が短いクラスターは、ペーシング周波数の変化からは限られた影響しか受けなかった。
【０２３５】
ＣＭＬＣクラスターにおける自発収縮活動は、ファニー電流（Ｉｆ）によるものである。Ｉｆは、ザテブラジンによって遮断することができる。１０μＭのザテブラジンを塗布することによって、図２１に示されているように、拍動周波数は遅くなり、持続時間は長くなる。この結果は、下記の表にもまとめられている。
【０２３６】
【表１７】
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【０２３７】
心房様ｈＥＳＣ−ＣＭクラスターに１０μＭのＩｆ遮断薬サテブラジンを投与後の変化（％）（ｎ＝４）
【０２３８】
強力なＩＫｒ遮断薬であるＥ−４０３１を用いて、不整脈電位をアッセイした。Ｅ−４０３１は、下記の表にまとめられているように、全てのＣＭＬＣ表現型において収縮依存性の活動電位延長を誘発した。また、この薬剤の効果としての三角形化、すなわち撃発活動も引き起こし、いくつかのケースでは、ＥＡＤが検出された（図２２及び２３）。
【０２３９】
【表１８】
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【０２４０】
心室様、心房様、及び結節様ＣＭＬＣのＡＰのＡＰＤ９０の平均変化（％）（±の数値は標準偏差、（）内の数値はｎ）
【０２４１】
実施例１２
３Ｄ凝集体の形成中におけるアクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＳＢ２１６７６３、及びＳＫＦ−８６００２の添加
基本的に実施例１に記載されているように、未分化ｈＢＳ細胞から３Ｄ凝集培養物を抽出した。抽出で用いた細胞株は、ＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代２５、６２、及び６８代目）であった。ｈＢＳ細胞から得られるＣＭＬＣの収量を増やすために、１〜２０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び１．２〜２４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦに加えて、プレーティング前に用いる培地に、１〜２５μＭのＳＢ２１６７６３（ＧＳＫ−３インヒビター）と１〜２５μＭのＳＫＦ−８６００２（ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビター）を様々に組み合わせたものを添加した。下記のスキームに従って、各範囲の３つの濃度を試験した。収縮ＣＭＬＣの数を目視により割り出し（図２４）、形成された３Ｄ構造体をプレーティング後５〜７日目に、リアルタイムＲＴ定量ＰＣＲによって、心臓関連遺伝子のトロポニンＴ２、Ｎｋｘ２．５、及びＧＡＴＡ４の発現を測定した。この実験を３回繰り返した。
【０２４２】
実験の設定
【０２４３】
【表１９】
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【０２４４】
出発材料の量に対して最も多い数の拍動領域を生じさせた因子の組み合わせは、２０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、２４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２５μＭのＳＢ２１６７６３、及び１μＭのＳＫＦ−８６００２（グループ４、図２４）であった。しかし、他の濃度の上記因子も、同等のプラス作用を有するか、又は、上記よりも更に強力である可能性がある。トロポニンＴ２、Ｎｋｘ２．５、及びＧＡＴＡ４の遺伝子発現量は、コロニー当たりの拍動領域の数に密接に関連していた（データは不図示）。
【０２４５】
実施例１３．ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣの免疫組織化学的解析
基本的に実施例１に記載されているように、自発収縮ＣＭＬＣを未分化ｈＢＳ細胞（ＳＡ００２）から抽出した。コラーゲナーゼＩＶ（２００Ｕ／ｍｌ）と共に１０〜１５分間、３７℃でインキュベートすることによって、ｈＢＳ細胞をＭＥＦフィーダー層から分離した。この懸濁液を１５ｍｌのチューブに移し、細胞を沈殿させた後、浮遊物を取り除いた。培地中でコロニーを再懸濁し、ピペットを用いて機械的に解離させて未分化細胞の小凝集体にした。この細胞懸濁液を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、コーニング、未処理、ｖボトム）に（２００μｌ／ウェルで）分注し、５分間、４００ｘｇで遠心分離した。続いて、このプレートを３７℃で３〜４日間インキュベートした。次いで、形成された３Ｄ構造体を、培地の入ったゼラチンコートディッシュに移した。数日後、自発収縮細胞のクラスター（ＣＭＬＣ）が観察され、それから４〜６週間後、全てのＣＭＬＣクラスターを、凍結切片作製のために採取した。すなわち、手動で単離し、１×ＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）緩衝液中で２回洗浄し、１０％スクロースで１０分間インキュベートし、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（ヒストラブ（Ｈｉｓｔｏｌａｂ））に包埋し、最後に−８０℃中で凍結した。４〜６週目のＣＭＬＣクラスターの凍結切片（１８μｍ）、及び、ＩＶＦプレート上の未分化ｈＢＳ細胞を４％ＰＦＡで固定し、１×ＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）緩衝液中の１％ＢＳＡ／０．０１％トリトンＸ−１００でブロックした。この一次抗体をブロッキング緩衝液で希釈し、一晩かけて４℃でインキュベートした。１×ＤＰＢＳ緩衝液中で５分間の洗浄を３回行った後、希釈した二次抗体を２時間、室温でインキュベートした。
【０２４６】
青色蛍光体の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１：１０００）を用いて、核を視覚化した。ＤＰＢＳで３回洗浄した後、スライドをＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ）で封入し、蛍光顕微鏡Ｎｉｋｏｎ  Ｅ４００で像を得た。各マーカーに関して、少なくとも１０〜１５個の異なるＣＭＬＣクラスターから得た切片を解析したところ、その結果は、全試料にわたって一致していた。全ての抗体を以下のように希釈した。すなわち、ウサギモノクローナル抗心臓トロポニンＩ抗体（アブカム、ａｂ５２８６２）は１：２５０、マウスＩｇＧ２ｂ抗Ｏｃｔ−３／４抗体（サンタクルーズ、ＳＣ−５２７９）は１：５００、マウスＩｇＧ３抗ＳＳＥＡ−４抗体（サンタクルーズ、ＳＣ−２１７０４）は１：２００、マウスＩｇＭ抗ＴＲＡ−１−６０抗体（サンタクルーズ、ＳＣ−２１７０５）は１：２００に希釈した。二次抗体を以下のように希釈した。すなわち、ロバ抗ウサギ抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４は１：５００、ロバ抗マウス抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８は１：５００（いずれもモレキュラープローブ社（米国オレゴン州）から購入）に希釈した。
【０２４７】
結論としては、３つの明確なｈＢＳ細胞マーカー（Ｏｃｔ−３／４、ＳＳＥＡ−４、及びＴＲＡ−１−６０）の発現は、ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣでは検出できなかった（図２５〜２７）。ｈＢＳ細胞マーカーのポジティブコントロールとして、ｈＢＳ細胞の未分化コロニーを、同じ条件で、同じプロトコールを用いて染色したところ、これらの細胞は、全てのマーカーに対して強陽性に染色された。また、我々は、ＣＭＬＣを特徴付けるために、特異的な心臓細胞マーカーの心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）に対する抗血清を用いた。
【０２４８】
実施例１４．ザテブラジンがＣＭＬＣに及ぼす効果
基本的に実施例１に示されているように、細胞株ＳＡ００２を用いて、ＣＭＬＣを未分化ｈＢＳ細胞から抽出した。ザテブラジンは、心筋細胞の収縮と心拍数の調節に関わるいわゆるファニーチャネル、すなわち過分極活性化サイクリックヌクレオチド依存性（ＨＣＮ）チャネル１〜４をブロックすることが知られている物質である。ザテブラジンがｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣに及ぼす効果を調べると共に、この効果を細胞齢及び遺伝子発現量と関連付けるために、ザテブラジンを濃度５μＭで、異なる細胞齢の３２個の自発拍動クラスターに投与した。この物質の効果が低下するまで、１分おきに収縮速度を目視により記録した。リアルタイムＲＴ定量ＰＣＲを用いて、遺伝子発現量を定量的に測定した。一部のクラスターの拍動は、ザテブラジンの投与によって完全にブロックされた。平均で、ザテブラジンは、ＣＭＬＣの拍動周波数を約５０％低下させた（図２８）。４つの既知の哺乳類ＨＣＮアイソフォームのうち、ＨＣＮ４は、洞房結節で最も多く発現されるアイソフォームであるので、ペースメーカー活動の発生及び測定において最も重要であるとみなされている。ＨＣＮ４、及びトロポニンＴ２の遺伝子発現量は、拍動周波数と正相関していた。すなわち、ＨＣＮ４又はトロポニンＴ２の発現量が多いほど、収縮速度が速くなる（図２８）。更には、ＨＣＮ４の発現量は、ｈＥＳ−ＣＭＣの加齢と共に減少し（図２８）、一方で、トロポニンＴ２と細胞齢との間には相関性はなかった（データは不図示）。予想どおり、ＨＣＮ４の遺伝子発現量は、トロポニンＴ２の発現量と正相関していた（データは不図示）。
【０２４９】
実施例１５．ｈＢＳ細胞由来ＣＭＬＣの免疫組織化学的解析
実施例１３に記載されているように、ＣＭＬＣクラスターの凍結切片を作製して、免疫組織化学的解析で用いた。青色蛍光体の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて、核を視覚化した。用いた一次抗体は、ウサギポリクローナル抗ＫＣＮＨ２抗体（アブカム、ａｂ３２５８５）、及びウサギモノクローナル抗心臓トロポニンＩ（アブカム、ａｂ５２８６２）であった。結果は図２９に示されており、特異的な心臓細胞マーカーの心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を共発現するＣＭＬＣクラスターの領域内で、抗ｈＥＲＧ（ＫＣＮＨ２）抗体を用いて、陽性染色を得た。
【０２５０】
実施例１６．機能的受容体
細胞クラスターが機能的受容体を有するか否かを試験するには、Ｎｏｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ．ａｌ．  ２００６に記載されている下記の方法を用いることができる。薬理作用物質は、ノルアドレナリン及びアドレナリン（スウェーデン、ウーメオのアポテケット）、フェニレフリン及びフォルスコリン（米国ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルズ）、フェノキシベンザミン及びアセチルコリン（スウェーデン、イェーテボリのケラブ（ＫｅＬａｂ））、アテノロール及びアトロピン（スウェーデン、タビーのＮＭファーマ社（ＮＭ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＢ））、ラベタロール（スウェーデン、モルンダルのグラクソ・スミスクライン）、並びに、ベラパミル（スウェーデン、ソールナのアボットスカンジナビア社）を用いる。
【０２５１】
α１−アドレナリン受容体アゴニストであるフェニレフリンを、３０分間隔で、濃度を高めながら収縮領域に投与する。収縮活動は、用量依存的に刺激される（Ｎｏｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．の表１参照）。この刺激効果は、基礎収縮周波数の低い種において、より顕著である。フェニレフリンに反応しない拍動領域がいくつあるか書き留める。拍動停止領域に投与されたフェニレフリン（１０〜７Ｍ）は、収縮活動を即座に開始させる。フェニレフリンの刺激効果を、α１−及びα２−受容体遮断薬であるフェノキシベンザミンによって中和する。フェニレフリンによる最大刺激時に、不規則な収縮が時折観察されることがあるが、通常は、フェノキシベンザミンによる阻害の結果、正常な拍動に戻る。フェノキシベンザミンを細胞の収縮クラスターに最初に投与すると、フェノキシベンザミンは、収縮周波数を下げると予測される。この効果は即時的であり、次に収縮周波数の回復が続くことがある。この阻害作用は、フェニレフリンによって反転させることができる。
【０２５２】
心筋層でβ１−アドレナリン受容体アゴニスト作用を主に示すアドレナリンを用いて、刺激を受けた収縮活動を試験することができる。刺激効果は数分以内に記録され、最大刺激は、特定の時点に起こる。低い収縮周波数（＜２０ｂｐｍ）を示す種では、周波数の上昇が、特定の濃度で観察されることがある。刺激効果は、β−受容体遮断薬のアテノロールの投与から数分以内で低下する。同様に、β−及びα１−受容体遮断薬のラベタロールを用いて、アドレナリンがもたらす収縮周波数の刺激効果を低下させることができる。アテノール（１０〜７Ｍ）は、２分以内で、自発収縮活動を低下させる場合がある。
【０２５３】
α−及びβ１−アドレナリン受容体アゴニストのノルアドレナリンは、通常は濃度反応的に収縮活動を刺激する。１０分以内に最大刺激に達し、この反応は、フェノキシベンザミンによって反転させることができる。拍動停止細胞に投与したノルアドレナリン（１０〜７Ｍ）は、数分以内に収縮活動を開始させることができる。
【０２５４】
心筋層でムスカリン様効果を見せるアセチルコリンは、収縮活動を低下させる。１０〜４〜１０〜３Ｍのアセチルコリンの投与後、完全阻害が観察されることがあり、この状態は数時間続く場合がある。ムスカリン受容体上の共通の結合部位をめぐってアセチルコリンと競合するアトロピンは、アセチルコリンによる阻害作用を中和する。最初に投与されたアストロピン（１０〜６Ｍ）は、自発収縮活動を刺激する。
【０２５５】
Ｃａ２＋イオンの膜間流動の遮断薬、かつ、細胞内Ｃａ２＋の可動化のインヒビターであるベラパミルは、最初に投与された濃度に応じて、収縮活動を低下又は停止させる。３０分以内に培地を洗浄及び交換した後に、基礎周波数の自発収縮を回復させることができる。
【０２５６】
フォルスコリンは、アデニレートシクラーゼの刺激物質及びサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の形成を促す物質として一般に認識されている。刺激反応は、基準周波数と比べた場合において、１０〜１０〜１０〜６Ｍのフォルスコリンによる処置から３０分後に記録されることがある。２つの拍動領域をピコモル濃度のフォルスコリンに暴露する。これらの領域では、収縮活動が、５〜３０分の記録時の間に、１０〜１２Ｍで阻害される場合があるが、これよりも高いフォルスコリン濃度で刺激される。ただし、投与から５分後、初期であるが一過性の阻害作用が観察されることがある。
【０２５７】
様々なＥＢから得た細胞クラスターの自発収縮周波数の変動に基づくと、これらの細胞は、心房、心室、及び結節の心筋細胞に相当すると仮定される可能性が高い。とは言っても、これらの細胞の変時作用物質に対する反応は基本的にはよく似ていたが、一般的には、低い拍動周波数を呈している細胞クラスターでは、アドレナリン受容体アゴニストに対する反応が、より顕著であった。したがって、我々の結果（表１）は、上で示したように（３、４、６）、胚の心筋細胞への分化における初期イベントとして、アドレナリン作動性機構及びコリン作動性機構双方の機能が発生するという考えの裏付けとなる。基本収縮活動が洗浄後に回復し、薬理反応は、培養数週間後に、繰り返すことができたので、内在性の自発収縮活動と、薬理作用物質に対する反応は、繰り返し実験による影響を受けないようであった。例外的に、受容体分化の阻害作用を示すことのあるいずれの変時作用物質にも、収縮クラスターは反応しなかった。アドレナリン受容体アゴニストに対する反応は、時間依存性であり、分化の進んだ心筋細胞ほど、はっきりと認識されることが既に示されている（４）。
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Ｍｕｍｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １０７：  ２７３３−２７４０，  ２００３
【０２７１】
Ｎａｄｒｕｚ  Ｗ，  Ｊｒ．，  Ｃｏｒａｔ  ＭＡ，  Ｍａｒｉｎ  ＴＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＭＥＦ２  ａｎｄ  ｃ−Ｊｕｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｒｅｔｃｈ：  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．  ２００５；６８：８７−９７．
【０２７２】
Ｎｏｒｓｔｒｏｍ  Ａ，  Ａｋｅｓｓｏｎ  Ｋ，  Ｈａｒｄａｒｓｏｎ  Ｔ，  Ｈａｍｂｅｒｇｅｒ  Ｌ，  Ｂｊｏｒｑｕｉｓｔ  Ｐ，  Ｓａｒｔｉｐｙ  Ｐ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  （Ｍａｙｗｏｏｄ）．  ２００６  Ｄｅｃ；２３１（１１）：１７５３−６２．
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Ｐａｓｓｉｅｒ  Ｒ，  Ｍｕｍｍｅｒｙ  Ｃ．，  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５  Ｏｃｔ；  １６（５）：４９８−５０２．  Ｒｅｖｉｅｗ
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【０２７６】
Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ，  Ｐｅｒａ  ＭＦ，  Ｆｏｎｇ  ＣＹ，  Ｔｒｏｕｎｓｏｎ  Ａ，  Ｂｏｎｇｓｏ  Ａ．，  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ：  ｓｏｍａｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０００  Ａｐｒ；  １８（４）：３９９−４０４．  Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０００  Ｍａｙ；  １８（５）：５５９．
【０２７７】
Ｓａｍａｒｅｌ  ＡＭ．  Ｃｏｓｔａｍｅｒｅｓ，  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００５；２８９：Ｈ２２９１−２３０１．
【０２７８】
Ｓｉｎｇｈ  ＡＭ，  Ｔｅｒａｄａ  Ｎ．  Ｂｙｐａｓｓｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ．  ２００７；１７：９６−１０１
【０２７９】
Ｓｊｏｇｒｅｎ−Ｊａｎｓｓｏｎ  Ｅ，  Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ，  Ｍｏｙａ  Ｋ，  Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ  Ｊ，  Ｓｔｒｅｈｌ  Ｒ，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ＰＳ．  Ｌａｒｇｅｓｃａｌｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．  ２００５  Ａｕｇ；２３３（４）：１３０４−１４．
【０２８０】
Ｓｎｉｒ  Ｍ，  Ｋｅｈａｔ  Ｉ，  Ｇｅｐｓｔｅｉｎ  Ａ，  Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｒ，  Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ，  Ｌｉｖｎｅ  Ｅ，  Ｇｅｐｓｔｅｉｎ  Ｌ．，  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．，
Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００３  Ｄｅｃ；  ２８５（６）：Ｈ２３５５−６３．
【０２８１】
Ｓｔｅｎｏｉｅｎ  ＤＬ，  Ｋｎｙｕｓｈｋｏ  ＴＶ，  Ｌｏｎｄｏｎｏ  ＭＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ  ａｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００７；２９２：Ｃ２０８４−２０９４．
【０２８２】
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，  Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ，  Ｓｈａｐｉｒｏ  ＳＳ，  Ｗａｋｎｉｔｚ  ＭＡ，  Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ  ＪＪ，  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＶＳ，  Ｊｏｎｅｓ  ＪＭ．，  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９８  Ｎｏｖ  ６；２８２（５３９１）：１１４５−７．  Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８  Ｄｅｃ  ４；  ２８２（５３９５）：１８２７．
【０２８３】
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，  ９１：  ５０１−５０８，  ２００２
【０２８４】
Ｘｕｅ  Ｔ，  Ｃｈｏ  ＨＣ，  Ａｋａｒ  ＦＧ，  Ｔｓａｎｇ  ＳＹ，  Ｊｏｎｅｓ  ＳＰ，  Ｍａｒｂａｎ  Ｅ，  Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ  ＧＦ，  Ｌｉ  ＲＡ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐａｃｅｍａｋｅｒｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２００５  Ｊａｎ  ４；１１１（１）：１１−２０．
【０２８５】
Ｚｈａｎｇ  Ｂ，  Ｋｉｒｏｖ  Ｓ，  Ｓｎｏｄｄｙ  Ｊ．  ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔ：  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｓｅｔｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｅｘｔｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００５；３３：Ｗ７４１−７４８．
【０２８６】
Ｊｕｎｙｉｎｇ  Ｙｕ，  Ｍａｘｉｍ  Ａ．  Ｖｏｄｙａｎｉｋ，  Ｋｉｍ  Ｓｍｕｇａ−Ｏｔｔｏ，  Ｊｅｓｓｉｃａ  Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｃｚ−Ｂｏｕｒｇｅｔ，  Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｌ．  Ｆｒａｎｅ，  Ｓｈｕｌａｎ  Ｔｉａｎ，  Ｊｅｆｆ  Ｎｉｅ，  Ｇｕｄｒｕｎ  Ａ．  Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ，  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｒｕｏｔｔｉ，  Ｒｏｎ  Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｉｇｏｒ  Ｉ．  Ｓｌｕｋｖｉｎ，  Ｊａｍｅｓ  Ａ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ．  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ２０  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００７  ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．
【０２８７】
Ｙｏｏｎ  ＢＳ，  Ｙｏｏ  ＳＪ，  Ｌｅｅ  ＪＥ，  Ｙｏｕ  Ｓ，  Ｌｅｅ  ＨＴ，  Ｙｏｏｎ  ＨＳ．，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  ２００６  Ａｐｒ；７４（４）：１４９−５９．  Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  ２００６  Ｊｕｌ；７４（６）：３２２
【０２８８】
・国際公開第２００４／０９８２８５号、Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｓｅｄ  ｓｔｒａｗｓ  ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ
【０２８９】
・国際公開第０３／０５５９９２号、Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、セルアーティス・アーベー
【０２９０】
・国際公開第２００４／０９８２８５号、Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｓｅｄ  ｓｔｒａｗｓ  ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ
【０２９１】
・国際公開第２００４／０９９３９４号、Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆｅｅｄｅｒ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｔｏ  ａ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ
【０２９２】
・国際公開第２００５／０１２５１０号、Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｐｓｙ
【０２９３】
・国際公開第２００６／０５２９２５号、Ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ
【０２９４】
具体的な実施形態は、以下のとおりである。
【０２９５】
アイテム
１．心筋細胞様細胞を含むクラスターであって、アップレギュレートしている遺伝子で、
ｉ）発現値が５００以上であり、
ｉｉ）心筋細胞様細胞と未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現値のフォールド・チェンジ（ＦＣＣＭＬＣ）が１０以上である
遺伝子を含むクラスター。
【０２９６】
２．アップレギュレートしている遺伝子で、更に、
ｉｉｉ）ＦＣＣＭＬＣとＦＣＭＣ（すなわち、混合分化ｈＢＳ細胞と未分化ｈＢＳ細胞との間のフォールド・チェンジ）との比率が１０以上である
遺伝子を含む、アイテム１及び２に記載のクラスター。
【０２９７】
３．例えばｈＢＳ細胞のようなＢＳ細胞から抽出した、アイテム１〜２のいずれか１つに記載のクラスター。
【０２９８】
４．前記抽出ＢＳ細胞が、過剰な１３番染色体を有するＳＡ００２のような、過剰な１３番染色体を有するトリソミーｈＢＳ細胞である、アイテム１〜３のいずれか１つに記載のクラスター。
【０２９９】
５．前記抽出ＢＳ細胞が、ゼノフリーｈＢＳ細胞のようなゼノフリーＢＳ細胞である、アイテム１〜４のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３００】
６．前記クラスターがゼノフリーである、アイテム１〜５のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３０１】
７．約１０個〜約５０００個の細胞を含む、アイテム１〜６のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３０２】
８．前記アップレギュレート遺伝子の前記発現値が、約７５０以上、例えば、約１０００以上、約１５００以上、約２０００以上、約２５００以上、又は約３０００以上の発現値である、アイテム１〜７のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３０３】
９．前記アップレギュレート遺伝子の前記ＦＣ（ＣＭＬＣ）値が、約２０以上、例えば、約５０以上、約１００以上、約５００以上、約７５０以上、約１０００以上である、アイテム１〜８のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３０４】
１０．前記アップレギュレート遺伝子の前記比率ＦＣＣＭＬＣ／ＦＣＭＣが、約１５以上、例えば、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約５００以上、約７５０以上、約１０００以上である、アイテム２〜９に記載のクラスター。
【０３０５】
１１．前記アップレギュレート遺伝子の２個以上、例えば、４個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１２個以上、又は１６個以上が、心臓細胞と関連付けられている遺伝子である（本明細書の表ＩＩに記載されている）、アイテム１〜１０のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３０６】
１２．前記アップレギュレート遺伝子の２個以上、例えば、４個以上、６個以上、８個以上が、内胚葉細胞と関連付けられている遺伝子である（本明細書の表ＩＩに記載されている）、アイテム１〜１１のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３０７】
１３．前記アップレギュレート遺伝子の２個以上、例えば、４個以上、６個以上、８個以上が、非心臓細胞又は非内胚葉細胞と関連付けられている遺伝子である（本明細書の表ＩＩに記載されている）、アイテム１〜１２のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３０８】
１４．前記アップレギュレート遺伝子が、本明細書の表ＩＩに列挙されている１０個以上、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、５５個以上、又は全ての遺伝子を含む、アイテム１〜１３のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３０９】
１５．前記クラスターが、アップレギュレートしている遺伝子で、
ｉ）発現値が２０００以上であり、
ｉｉ）ＦＣＣＭＬＣ値が１００以上である
遺伝子を含む、アイテム１〜１４のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３１０】
１６．前記クラスターが、アップレギュレートしている遺伝子で、更に、
ｉｉｉ）ＦＣＣＭＬＣとＦＣＭＣとの比率が１００以上である
遺伝子を含む、アイテム１５に記載のクラスター。
【０３１１】
１７．例えばｈＢＳ細胞のようなＢＳ細胞から抽出した、アイテム１５及び１６に記載のクラスター。
【０３１２】
１８．前記抽出ＢＳ細胞が、過剰な１３番染色体を有するＳＡ００２のような、過剰な１３番染色体を有するトリソミーｈＢＳ細胞である、アイテム１５〜１７に記載のクラスター。
【０３１３】
１９．約１０〜約２０００個の細胞を含む、アイテム１５〜１８に記載のクラスター。
【０３１４】
２０．前記アップレギュレート遺伝子の前記発現値が、約２５００以上、例えば、約３０００以上、約３５００以上、約４０００以上、約４５００以上、約５０００以上、約５５００以上、約６０００以上、約６５００以上、又は約７０００以上の発現値である、アイテム１５〜１９に記載のクラスター。
【０３１５】
２１．前記アップレギュレート遺伝子の前記ＦＣ（ＣＭＬＣ）値が、約２００以上、例えば、約４００以上、約６００以上、約８００以上、約１０００以上、約２０００以上である、アイテム１５〜２０に記載のクラスター。
【０３１６】
２２．前記アップレギュレート遺伝子の前記比率ＦＣＣＭＬＣ／ＦＣＭＣが、約１５０以上、例えば、約２００以上、約２５０以上、約４００以上、又は約５００以上である、アイテム１６〜２１に記載のクラスター。
【０３１７】
２３．前記アップレギュレート遺伝子の２個以上、例えば、４個以上、又は６個以上が、心臓細胞と関連付けられている遺伝子である（本明細書の表ＩＩＩに記載されている）、アイテム１５〜２２に記載のクラスター。
【０３１８】
２４．前記アップレギュレート遺伝子の２個以上、例えば、４個以上、又は６個以上が、内胚葉細胞と関連付けられている遺伝子である（本明細書の表ＩＩＩに記載されている）、アイテム１５〜２３に記載のクラスター。
【０３１９】
２５．  前記アップレギュレート遺伝子の５個以上が、心臓細胞と関連付けられている遺伝子であり、前記アップレギュレート遺伝子の４個以上が、内胚葉細胞と関連付けられている遺伝子である（本明細書の表ＩＩＩに記載されている）、アイテム１５〜２４に記載のクラスター。
【０３２０】
２６．前記アップレギュレート遺伝子が、本明細書の表ＩＩＩに列挙されている２個以上、例えば、４個以上、６個以上、８個以上、又は全ての遺伝子を含む、アイテム１５〜２５に記載のクラスター。
【０３２１】
２７．前記クラスターが１つ以上のイオンチャネルを発現する、アイテム１〜２６のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３２２】
２８．前記イオンチャネルが、Ｋ、Ｎａ、及び／又はＣａイオンチャネルである、アイテム２７に記載のクラスター。
【０３２３】
２９．前記イオンチャネルが、電位依存性Ｋ若しくはＮａチャネル、リガンド依存性Ｋ若しくはＮａチャネル、内向き整流性Ｋチャネル、及び／又は、電位依存性Ｃａチャネルである、アイテム２７又は２８に記載のクラスター。
【０３２４】
３０．前記１つ以上のイオンチャネルが、図７ａ及びｂのポスターの表１に列挙されているイオンチャネルから選択される、アイテム２７〜２９のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３２５】
３１．図７ａ及びｂのポスターの表１に列挙されているイオンチャネルの少なくとも３個、例えば、少なくとも４個、少なくとも５個、又は全てを発現する、アイテム３０に記載のクラスター。
【０３２６】
３２．少なくとも４個の遺伝子が心臓細胞と関連し、少なくとも４個の遺伝子が転写因子をコードし、少なくとも４個の遺伝子が、図７ａ及びｂのポスターの表１に列挙されているイオンチャネルをコードする、アイテム１〜３１のいずれか１つに記載のクラスター。
【０３２７】
３３．前記遺伝子が、図７ａ及びｂのポスターの表１に列挙されている遺伝子から選択される、アイテム３２に記載のクラスター。
【０３２８】
３４．前記クラスターの少なくとも１０％、例えば、少なくとも１３％、少なくとも１５％、又は約１７％が結節様細胞を含む、アイテム１〜３３のいずれか１つに記載の心筋細胞様クラスターの組成物。
【０３２９】
３５．前記クラスターの少なくとも３０％、例えば、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は約５０％が心房様細胞を含む、アイテム１〜３４のいずれか１つに記載の心筋細胞様クラスターの組成物。
【０３３０】
３６．前記クラスターの少なくとも２０％、例えば、少なくとも２３％、少なくとも２６％、少なくとも３０％、又は約３３％が心室様細胞を含む、アイテム１〜３５のいずれか１つに記載の心筋細胞様クラスターの組成物。
【０３３１】
３７．結節様細胞を含むクラスターと、心房様細胞を含むクラスターと、心室様細胞を含むクラスターとの混合物を含む、アイテム１〜３６のいずれか１つに記載の心筋細胞様クラスターの組成物。
【０３３２】
３８．結節様細胞を含むクラスターの数と、心房様細胞を含むクラスターの数との比率が、約１：１００〜約５０：１００の範囲、例えば、約１０：１００〜約４０：１００、約２０：１００〜約４０：１００、約３０：１００〜約４０：１００、又は約３３：１００〜３４：１００である、アイテム３７に記載の心筋細胞様クラスターの組成物。
【０３３３】
３９．結節様細胞を含むクラスターの数と、心室様細胞を含むクラスターの数との比率が、約１：１００〜約８０：１００の範囲、例えば、約１０：１００〜約７０：１００、約３０：１００〜約７０：１００、約４５：１００〜約５５：１００、又は約５０：１００である、アイテム３７に記載の心筋細胞様クラスターの組成物。
【０３３４】
４０．心室様細胞を含むクラスターの数と、心房様細胞を含むクラスターの数との比率が、約１：１００〜約９０：１００の範囲、例えば、約４０：１００〜約８０：１００、約５０：１００〜約７５：１００、又は約６６：１００である、アイテム３７に記載の心筋細胞様クラスターの組成物。
【０３３５】
４１．結節様細胞を含むクラスターと、心房様細胞を含むクラスターと、心室様細胞を含むクラスターとの比率が１７：５０：３３である、アイテム３７に記載の心筋細胞様クラスターの組成物。
【０３３６】
４２．アイテム１〜３３のいずれか１つに定義されている１つ以上のクラスターと、キャリアとを含む組成物。
【０３３７】
４３．前記キャリアが水性培地である、アイテム４２に記載の組成物。
【０３３８】
４４．液体又は凍結形態である、アイテム４２又は４３に記載の組成物。
【０３３９】
４５．前記水性培地が１つ以上の添加剤を含む、アイテム４２〜４４のいずれか１つに記載の組成物。
【０３４０】
４６．前記添加剤が、１つ以上の凍結保護剤、１つ以上の安定剤、及び／又は１つ以上の粘度調整剤である、アイテム４５に記載の組成物。
【０３４１】
４７．前記１つ以上の凍結保護剤が、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、プロパンジオール、及びメチルペンタンジオール、並びに又はこれらの混合物からなる群から選択される、アイテム４２〜４６のいずれか１つに記載の組成物。
【０３４２】
４８．前記１つ以上の添加剤が、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトースを含む糖又は糖アルコールである、アイテム４２〜４７のいずれか１つに記載の組成物。
【０３４３】
４９．前記凍結保護剤がトレハロースである、アイテム４２〜４８のいずれか１つに記載の組成物。
【０３４４】
５０．前記トレハロースの濃度が、約０．０２Ｍ〜約１Ｍ、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１５Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．２５Ｍ〜約０．６Ｍである、アイテム４９に記載の組成物。
【０３４５】
５１．前記凍結保護剤がスクロースである、アイテム４２〜５０のいずれか１つに記載の組成物。
【０３４６】
５２．前記スクロースの濃度が、約０．０２Ｍ〜約１Ｍ、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１５Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．２５Ｍ〜約０．６Ｍである、アイテム５１に記載の組成物。
【０３４７】
５３．前記凍結保護剤がＤＭＳＯである、アイテム３４〜５２のいずれか１つに記載の組成物。
【０３４８】
５４．前記ＤＭＳＯの濃度が、少なくとも２．５％ｖ／ｖ、例えば、約２．５％〜約４０％ｖ／ｖ、約５％〜約３５％ｖ／ｖ、約７％〜約３０％ｖ／ｖ、約７％〜約２５％ｖ／ｖ、約７％〜約２０％ｖ／ｖ、約１５％〜約２５％ｖ／ｖ、約５％〜約１５％ｖ／ｖである、アイテム３４〜５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０３４９】
５５．前記凍結保護剤がエチレングリコールである、アイテム３４〜５３のいずれか１つに記載の組成物。
【０３５０】
５６．前記エチレングリコールの濃度が、少なくとも２．５％ｖ／ｖ、例えば、約２．５％〜約３０％ｖ／ｖ、約５％〜約２５％ｖ／ｖ、約５％〜約２０％ｖ／ｖ、約１０％〜約２０％ｖ／ｖ、約７％〜約１０％ｖ／ｖ、約２．５％〜約５％ｖ／ｖである、アイテム５５に記載の組成物。
【０３５１】
５７．前記粘度調整剤が、フィコール、パーコール、ヒアルロン酸、アルブミン、ポリビニルピロリドン、アルギニン酸、ゼラチン、及びグリセロールからなる群から選択される、アイテム３４〜５６のいずれか１つに記載の組成物。
【０３５２】
５８．前記粘度調整剤がフィコールである、アイテム３４〜５７のいずれか１つに記載の組成物。
【０３５３】
５９．前記フィコールの濃度が、最大で約１５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、最大で約１００ｍｇ／ｍｌ、最大で約５０ｍｇ／ｍｌ、最大で約２５ｍｇ／ｍｌ、最大で約１５ｍｇ／ｍｌ、又は最大で約１０ｍｇ／ｍｌである、アイテム５８に記載の組成物。
【０３５４】
６０．前記組成物を少なくとも−８０℃の温度で少なくとも２年間保管後に、前記１つ以上のクラスターが、アイテム１〜３３で定義されている特徴の少なくとも９５％を保持する、アイテム３４〜５９のいずれか１つに記載の組成物。
【０３５５】
６１．前記組成物を少なくとも−８０℃の温度で少なくとも２年間保管後に、細胞の約５０％以上、例えば、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、又は約９５％以上が生存可能である、アイテム３４〜６０のいずれか１つに記載の組成物。
【０３５６】
６２．特定物質の心臓毒性試験で用いるキットであって、
ｉ）アイテム１〜３３のいずれか１つに定義されている１つ以上のクラスター、又は、アイテム３４〜６１のいずれか１つに定義されている組成物と、
ｉｉ）前記クラスター又は組成物のうち該当する方の使用法に関する具体的な取扱説明書と、
を含むキット。
【０３５７】
６３．ｉｉｉ）前記キットの使用前に前記特定の物質を分散させる培地
を更に含む、アイテム６２に記載のキット。
【０３５８】
６４．アイテム３４〜６１のいずれか１つに定義されている組成物を含む、アイテム６２又は６３のいずれか１つに記載のキット。
【０３５９】
６５．特定の物質の創薬中にインビトロ試験で用いるキットであって、
ｉ）アイテム１〜３３のいずれか１つに定義されている１つ以上のクラスター、又は、アイテム３４〜６１のいずれか１つに定義されている組成物と、
ｉｉ）前記クラスター又は組成物のうち該当する方の使用法に関する具体的な取扱説明書と、
を含むキット。
【０３６０】
６６．ｉｉｉ）前記キットの使用前に前記特定の物質を分散させる培地
を更に含む、アイテム６５に記載のキット。
【０３６１】
６７．アイテム３４〜６１のいずれか１つに定義されている組成物を含む、アイテム６５又は６６のいずれか１つに記載のキット。
【０３６２】
６８．ｉ）アイテム３４〜６１のいずれか１つに定義されている組成物、及び／又は、アイテム１〜３３のいずれか１つに定義されている１つ以上の心筋細胞様細胞クラスターと、
ｉｉ）例えば、既製のシリンジのような投与形態の細胞など、該組成物又は細胞を患者に投与するためのツールと、
を含む再生医療用キット。
【０３６３】
６９．アイテム３４〜６１のいずれか１つに定義されている組成物を含む、アイテム６８に記載のキット。
【０３６４】
７０．アイテム１〜３３に記載の１つ以上のクラスターを得るための方法であって、トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーの１つ以上のメンバー、及び／又は、線維芽細胞増殖因子ファミリーの１つ以上のメンバーを添加した培地での未分化ｈＢＳ細胞の３Ｄ形成を含む方法。
【０３６５】
７１．アイテム１〜３３に記載のクラスターを得るための方法であって、
１）未分化ｈＢＳ細胞の懸濁液を得るステップと、
２）トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーの１つ以上のメンバー、及び／又は、線維芽細胞増殖因子ファミリーの１つ以上のメンバーを含む適切な培地で、前記細胞懸濁液を再懸濁するステップと、
３）任意で、前記細胞懸濁中の細胞を凝集体に解離するステップと、
４）ステップ２又は３の細胞懸濁液を適切な培養皿（単一又は複数）に移すステップと、
５）これらの細胞を心筋細胞様細胞クラスターに成長させるステップと、
を含む方法。
【０３６６】
７２．アイテム１〜３３に記載のクラスターを得るための方法であって、
１）未分化ｈＢＳ細胞の懸濁液を得るステップと、
２）適切な培地で、前記細胞懸濁液を再懸濁するステップと、
３）任意により、前記細胞懸濁液中の細胞を凝集体に解離するステップと、
４）任意により、前記細胞を遠心分離及び／又は沈殿させるステップと、
５）任意により、前記細胞をインキュベートするステップと、
６）前記細胞懸濁液を適切な培養皿（単一又は複数）に移すステップと、
７）前記細胞を心筋細胞様細胞クラスターに成長させるステップと
を含む方法。
【０３６７】
７３．ステップ１における主に未分化のｈＢＳ細胞の懸濁液を、酵素処理によって得る、アイテム７１及び７２のいずれか１つに記載の方法。
【０３６８】
７４．ステップ３）における解離を手動で行う、アイテム７１〜７３のいずれか１つに記載の方法。
【０３６９】
７５．遠心分離を１００〜８００ｘｇで２〜２０分間、例えば、２００〜６００ｘｇで５〜１０分間、又は３００〜５００ｘｇで５〜１０分間、又は４００ｘｇで５分間行う、アイテム７２〜７４のいずれか１つに記載の方法。
【０３７０】
７６．約１〜３６時間、例えば、約２〜２４時間、又は約３〜１２時間沈殿を行う、アイテム７２〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０３７１】
７７．沈殿及び／又は遠心分離後に得た細胞を、３Ｄ構造体の形成のために、ステップ５）で１〜１０日間、例えば、１〜７日間、又は１〜５日間インキュベートする、アイテム７２〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【０３７２】
７８．沈殿及び／又は遠心分離後に得た細胞を、３Ｄ構造体の形成のために、ステップ５）で３日間インキュベートする、アイテム７２〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【０３７３】
７９．アイテム７１のステップ５）、及び／又はアイテム７２のステップ７）での成長工程が、心筋細胞様細胞クラスターの形成まで、１〜３０日間、例えば、１〜１５日間、１〜１０日間、又は１〜５日間である、アイテム７１〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【０３７４】
８０．アイテム７２のステップ５）及び／又は７）で用いる培地が、１５〜２５％のＦＢＳ、例えば２０％ＦＢＳを含む、アイテム７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【０３７５】
８１．アイテム７１のステップ２）、並びに／又は、アイテム７２のステップ５及び／若しくは７）で用いる培地が、トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバー、及び／又は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーを含む、アイテム７１〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【０３７６】
８２．前記トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバーがアクチビンＡであり、前記線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーがｂＦＧＦである、アイテム８１に記載の方法。
【０３７７】
８３．培地に添加するアクチビンＡの濃度が、約５〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、又は１２ｎｇ／ｍｌである、アイテム８２に記載の方法。
【０３７８】
８４．培地に添加するｂＦＧＦの濃度が、約５〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、又は１４ｎｇ／ｍｌである、アイテム８２に記載の方法。
【０３７９】
８５．アイテム７１のステップ２）、並びに／又は、アイテム７２のステップ５及び／若しくは７）で用いる培地が、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及び／又はＦＢＳを含む、アイテム７１〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０３８０】
８６．アイテム７２のステップ５及び／又は７）で用いる培地が、ＧＳＫ−３インヒビター、及び／又はｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターのメンバーを含む、アイテム７２〜８５のいずれか１つに記載の方法。
【０３８１】
８７．前記ＧＳＫ−３インヒビターファミリーのメンバーがＳＢ２１６７６３であり、前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターファミリーのメンバーがＳＫＦ−８６０００２である、アイテム８６に記載の方法。
【０３８２】
８８．培地に添加するＧＳＫ−３インヒビターの濃度が、約１〜２５μＭ、例えば、約２〜１０μＭ、又は約５μＭである、アイテム８６及び８７のいずれか１つに記載の方法。
【０３８３】
８９．培地に添加するｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターの濃度が、約１〜２５μＭ、例えば、約２〜１０μＭ、又は約５μＭである、アイテム８６〜８８のいずれか１つに記載の方法。
【０３８４】
９０．アイテム７１のステップ５）、及び／又は、アイテム７２のステップ７）で用いる培地が、ＬＩＦを１００〜２０００Ｕ／ｍｌ、例えば、５００〜１５００Ｕ／ｍｌ、又は１０００Ｕ／ｍｌ含む、アイテム７１〜８９のいずれか１つに記載の方法。
【０３８５】
９１．ＬＩＦを含む培地を、インキュベーションの２〜８日後、例えば４〜５日後に、ＬＩＦを含まない培地と交換する、アイテム９０に記載の方法。
【０３８６】
９２．アイテム７１のステップ５）、及び／又はアイテム７２のステップ７）の培養皿（単一又は複数）が、ゼラチンコート面を有する、アイテム７１〜９１のいずれか１つに記載の方法。
【図１】
0005722628.tif 000028
【図２】
0005722628.tif 000029
【図３】
0005722628.tif 000030
【図４ａ−１】
0005722628.tif 000031
【図４ａ−２】
0005722628.tif 000032
【図４ａ−３】
0005722628.tif 000033
【図４ａ−４】
0005722628.tif 000034
【図４ｂ−１】
0005722628.tif 000035
【図４ｂ−２】
0005722628.tif 000036
【図４ｂ−３】
0005722628.tif 000037
【図４ｂ−４】
0005722628.tif 000038
【図４ｃ−１】
0005722628.tif 000039
【図４ｃ−２】
0005722628.tif 000040
【図４ｃ−３】
0005722628.tif 000041
【図４ｃ−４】
0005722628.tif 000042
【図４ｄ−１】
0005722628.tif 000043
【図４ｄ−２】
0005722628.tif 000044
【図４ｄ−３】
0005722628.tif 000045
【図４ｄ−４】
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【図４ｅ−１】
0005722628.tif 000047
【図４ｅ−２】
0005722628.tif 000048
【図４ｅ−３】
0005722628.tif 000049
【図４ｅ−４】
0005722628.tif 000050
【図４ｆ−１】
0005722628.tif 000051
【図４ｆ−２】
0005722628.tif 000052
【図４ｆ−３】
0005722628.tif 000053
【図５Ａ】
0005722628.tif 000054
【図５Ｂ】
0005722628.tif 000055
【図５Ｃ】
0005722628.tif 000056
【図５Ｄ】
0005722628.tif 000057
【図６−１】
0005722628.tif 000058
【図６−２】
0005722628.tif 000059
【図７ａ】
0005722628.tif 000060
【図７ａ−１】
0005722628.tif 000061
【図７ａ−２】
0005722628.tif 000062
【図７ａ−３】
0005722628.tif 000063
【図７ｂ】
0005722628.tif 000064
【図８】
0005722628.tif 000065
【図９】
0005722628.tif 000066
【図１０】
0005722628.tif 000067
【図１１−１】
0005722628.tif 000068
【図１１−２】
0005722628.tif 000069
【図１１−３】
0005722628.tif 000070
【図１１−４】
0005722628.tif 000071
【図１１−５】
0005722628.tif 000072
【図１１−６】
0005722628.tif 000073
【図１１−７】
0005722628.tif 000074
【図１１−８】
0005722628.tif 000075
【図１１−９】
0005722628.tif 000076
【図１１−１０】
0005722628.tif 000077
【図１１−１１】
0005722628.tif 000078
【図１１−１２】
0005722628.tif 000079
【図１２−１】
0005722628.tif 000080
【図１２−２】
0005722628.tif 000081
【図１３】
0005722628.tif 000082
【図１４】
0005722628.tif 000083
【図１５】
0005722628.tif 000084
【図１６】
0005722628.tif 000085
【図１７】
0005722628.tif 000086
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0005722628.tif 000089
【図２１】
0005722628.tif 000090
【図２２】
0005722628.tif 000091
【図２３】
0005722628.tif 000092
【図２４】
0005722628.tif 000093
【図２５】
0005722628.tif 000094
【図２６】
0005722628.tif 000095
【図２７】
0005722628.tif 000096
【図２８−１】
0005722628.tif 000097
【図２８−２】
0005722628.tif 000098
【図２９】
0005722628.tif 000099
【図３０Ａ】
0005722628.tif 000100
【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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