(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性高シュウ酸尿症Ｉ型の治療において使用するための治療薬であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）（ａ）において定義したとおりのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、及び
（ｃ）（ｂ）において定義したとおりの核酸分子を含むウイルス遺伝子療法ベクターのビリオン
からなる群から選択される、
上記治療薬。
【請求項２】
（ｂ）の核酸分子が配列番号１の核酸配列を含む、請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
請求項１に規定するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型の治療において使用するための治療薬であって、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞における発現のためのプロモーターと操作可能に連結している、上記治療薬。
【請求項４】
前記プロモーターがヒトＡＧＸＴ遺伝子由来のプロモーターではない、請求項３に記載の治療薬。
【請求項５】
前記プロモーターが肝臓特異的なプロモーターである、請求項３又は４に記載の治療薬。
【請求項６】
肝臓特異的なプロモーターが、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと組み合わされたＡＡＴプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターから成る群から選択される、請求項５に記載の治療薬。
【請求項７】
前記プロモーターが配列番号３の配列を有する、請求項６に記載の治療薬。
【請求項８】
前記コンストラクトがウイルス遺伝子療法ベクターである、請求項３から７までのいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項９】
ウイルス遺伝子療法ベクターがパルボウイルスベクターである、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１０】
前記コンストラクトが、パルボウイルスビリオンに含まれている、請求項３から９までのいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の治療薬と薬学的に許容される担体とを含む、
原発性高シュウ酸尿症Ｉ型の治療において使用するための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の治療薬の、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型の治療において使用するための医薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学及び分子生物学の分野に属する。より具体的には、本発明は、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、とりわけＡＧＸＴの変異体をベースにした、タンパク質と核酸との新規の治療薬（遺伝子療法により送達される治療薬を含む）、並びに、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型など、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの不在又は欠損が原因で生じる状態の治療及び予防におけるこの治療薬の使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性高シュウ酸尿症Ｉ型（ＰＨ１）（ＯＭＩＭ番号２５９９００）は、常染色体劣性の形で遺伝する稀な代謝障害である。ＰＨ１は、肝臓の酵素であるアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ又はＡＧＴ、ＥＣ２．６．１．４４）の欠損を特徴とし、その欠損は、２ｑ３６−ｑ３７上でコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００３０、バージョン１４、２００８年６月）内の突然変異が原因で生じるのが普通である。ＡＧＸＴが欠損していると、グリオキシレートを解毒できなくなりオキサレートが過剰産生する。ＡＧＸＴは、アミノ基のドナーとしてのアラニンと、補因子ピリドキサールリン酸とを用いて、グリオキシレートをグリシンに転換させる。ＰＨ１患者における高レベルのオキサレートは、腎臓により排出され、腎臓は、シュウ酸カルシウムが沈着する結果、進行性の劣化を起こす。腎不全の後、オキサレートレベルは、全身性シュウ酸症の段階、すなわち、生命を脅かす状態まで上昇する。現在、最も有効なＰＨ１治療は、先制的な肝移植又は肝腎同時移植である。しかし、この治療には、適当な臓器供給の不足、著しい罹病率及び死亡率、並びに免疫抑制薬への慢性的な曝露など、自ら限界がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、ＰＨ１のための新しい治療が必要である。本発明の目的は、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）の変異体をベースにした、新規のタンパク質治療薬及び核酸治療薬、並びに、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型など、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの不在又は欠損が原因で生じる状態の治療及び予防におけるこれらの治療薬の使用の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、医薬として使用するため又は治療の方法において使用するための、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬などのＡＧＸＴ治療薬に関する。そのような治療薬は、ＡＧＸＴ応答性の状態の治療において使用してもよく、好ましくは、ＡＧＸＴ応答性の状態は原発性高シュウ酸尿症Ｉ型である。
【０００５】
このＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬は、好ましくは、ａ）ＧＡＰプログラムを用いてその全長にわたり最適にアラインさせたときに配列番号２に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の３４０位に対応する位置のメチオニンを含むＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質、ｂ）ａ）で定義したとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、及びｃ）ｂ）で定義したとおりの核酸分子を含むウイルス遺伝子療法ベクターのビリオンから成る群から選択される。
【０００６】
野生型をベースにしたＡＧＸＴ治療薬は、配列番号２の３４０位に対応する位置のイソロイシン（又は、メチオニン以外のアミノ酸）を含むことになること以外は、前述のＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬と同様の様式で定義できる（すなわち、ＡＧＸＴ野生型配列をベースにしていてもよい）。本発明においては、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬に関して説明するものを、野生型のＡＧＸＴ配列をベースにしたＡＧＸＴ治療薬にも同様に適用できる。
【０００７】
本発明によるＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬は、ａ）配列番号２の１１位に対応する位置のロイシン、ｂ）配列番号２の４１位に対応する位置のアルギニン、ｃ）配列番号２の１５２位に対応する位置のイソロイシン、ｄ）配列番号２の１７０位に対応する位置のアルギニン、ｅ）配列番号２の２４４位に対応する位置のトレオニン、ｆ）配列番号２の２９４位に対応する位置のトレオニン、ｇ）配列番号２の３２６位に対応する位置のイソロイシン、ｈ）アミノ酸置換基ｂ）からｇ）までの１つ又は複数の組合せ、及びｉ）置換基ａ）とｆ）との組合せから成る群から選択されるアミノ酸置換基をさらに含むか又はコードしてもよい。
【０００８】
本発明は、本発明のＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトであって、該ヌクレオチド配列がヒト細胞における発現のためのプロモーターと操作可能に連結しており、場合により、該プロモーターがヒトＡＧＸＴ遺伝子由来のプロモーターではない、該核酸コンストラクトにも関する。好ましくは、該プロモーターは、肝臓特異的なプロモーターである。該肝臓特異的なプロモーターは、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと組み合わされたＡＡＴプロモーター、アポリポタンパク質Ｅプロモーター及び配列番号３の配列を有するプロモーターから成る群から選択されてもよい。この態様による核酸コンストラクトは、好ましくは、ウイルス遺伝子療法ベクター、より好ましくはパルボウイルスベクターである。
【０００９】
本発明は、さらに、本ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬をコードする核酸コンストラクトを含むパルボウイルスビリオンに関する。
【００１０】
又、本発明は、本発明のＡＧＸＴ治療薬、核酸コンストラクト又はパルボウイルスビリオンと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１１】
本発明は、ＡＧＸＴ応答性の状態を治療する方法であって、有効量の本発明のＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬、核酸コンストラクト、パルボウイルスビリオン又は医薬組成物を、前記ＡＧＸＴ応答性の状態、例えば原発性高シュウ酸尿症Ｉ型を有する対象に投与するステップを含む該方法も提供する。
【００１２】
加えて、本発明は、ＡＧＸＴ応答性の状態、例えば原発性高シュウ酸尿症Ｉ型の治療において使用するための医薬の製造における、本発明のＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬、核酸コンストラクト、パルボウイルスビリオン又は医薬組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】使用するｒＡＡＶベクターの概略図である。ｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的なＥａｌｂＡＡＴハイブリッドプロモーターの制御下で、ヒトＡＧＸＴのｃＤＮＡをプロ−ＡＡＶ２ベクタープラスミド中に挿入することにより構築した。ＡＧＸＴのｃＤＮＡ（又はＧＦＰ）の下流にｂＧＨポリアデニル化シグナルを含ませた。いくつかのコンストラクトには、ＷＰＲＥ転写後調節エレメントを含ませた。発現カセットにはＡＡＶ２由来の逆方向末端反復を隣接させた。
【図２】５×１０１２ｇｃ／ｋｇの治療用ベクターＡＡＶ８．Ｅａｌｂ−ｈＡＡＴ−ＡＧＸＴ−ＷＰＲＥ又は対照ベクターＡＡＶ８．Ｅａｌｂ−ｈＡＡＴ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥの投与後にエチレングリコール（ＥＧ）で処置したオスのＡＧＸＴ−／−マウスにおけるオキサレートの尿中排出量を示すグラフである。
【図３ａ】１ｋｇ当たり５×１０ｅ１２ベクターゲノムのＡＡＶ８又はＡＡＶ５ベクター（後者は、１０倍低い用量の５×１０１１ｖｇ／ｋｇでも投与した）の静脈内注射の８週後の、（両性の）ＡＧＸＴ−／−マウスの肝臓内でのＡＧＸＴ発現のウェスタンブロット分析を示す写真である。
【図３ｂ．ｃ】＜図３ｂ＞  ＡＡＶ８．Ｅａｌｂ−ｈＡＡＴ−ＡＧＸＴ−ＷＰＲＥを注射したオスのＡＧＸＴ−／−マウスの肝臓試料中でのＡＧＴの発現を示す写真（倍率１００倍）である。    ＜図３ｃ（挿入図）＞  対照ベクターＡＡＶ８．Ｅａｌｂ−ｈＡＡＴ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥを注射したオスのＡＧＸＴ−／−マウスの肝臓試料中でのＡＧＴの発現を示す写真（倍率１００倍）である。
【図３ｄ】凍結肝臓切片の免疫組織化学染色により得られた結果を示す写真であり、形質導入された肝細胞の比率（％）はＡＡＶ８及び最高用量のＡＡＶ５の場合は９０％前後、５×１０１２ＡＡＶ５粒子／ｋｇの場合は６０％であり、５×１０１１ＡＡＶ５粒子／ｋｇの場合は１０％（メスにおいては１％未満）にまで下がった。
【図４】１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０１１ｇｃ／ｋｇ及び３×１０１１ｇｃ／ｋｇの、治療用ベクターＡＡＶ５．Ｅａｌｂ−ｈＡＡＴ−ＡＧＸＴ−ＷＰＲＥ又は対照ベクターＡＡＶ５．Ｅａｌｂ−ｈＡＡＴ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥのいずれかの投与後（注射当日及び２７日後）、エチレングリコール（ＥＧ）で処置したオスのＡＧＸＴ−／−マウスにおけるオキサレートの尿中排出量を示すグラフである。試験した３つの用量全てで処置したマウスにおいてシュウ酸尿の顕著な減少が観察されるが、用量が高くなると統計的に最も有意な減少を示し、野生型マウスと同様のオキサレート排出レベルに達した。予想通り、ＧＦＰ−ＡＡＶ５対照ウイルス粒子を注射したＡｇｘｔＫＯマウスは、有意なシュウ酸尿の減少を示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
「核酸コンストラクト」は、本明細書中では、組換えＤＮＡ技術を用いる結果得られる人工の核酸分子を意味すると理解される。核酸コンストラクトは、核酸セグメントを含有するように改変され、天然には他に存在しないと思われる様式で組み合わせ、並べられている、一本鎖又は二本鎖いずれかの核酸分子である。核酸コンストラクトは、通常は、「ベクター」、すなわち、外因的に作り出された核酸（ＤＮＡなど）を宿主細胞中に送達するために使用できる核酸分子である。
【００１５】
核酸コンストラクトの一種が、「発現カセット」又は「発現ベクター」である。これらの用語は、当該配列と適合する宿主細胞又は宿主生物において遺伝子の発現を実現させることが可能なヌクレオチド配列を指す。発現カセット又は発現ベクターは、典型的には、少なくとも適当な転写調節配列と、場合により３’転写終結シグナルとを含む。発現エンハンサーエレメントなど、発現の実現において必要又は役立つ追加的な因子も存在してもよい。
【００１６】
用語「相同の」は、所与の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と所与の宿主生物又は宿主細胞との間の関係を指すために使用する場合、自然界では当該核酸又はポリペプチド分子は同種の宿主細胞又は生物により産生されることを意味すると理解される。用語「異種の」は、自然界では当該核酸又はポリペプチド分子は異なる種の宿主細胞又は生物により産生されることを指すために使用できる。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、用語「操作可能に連結している」は、ポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントが、機能的な関係で連結していることを指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係をもつように配置されているとき、「操作可能に連結している」。例えば、転写調節配列は、この配列がコード配列の転写に影響をもつ場合、コード配列に操作可能に連結している。操作可能に連結しているとは、連結しているＤＮＡ配列が、典型的には近接しており、２つのタンパク質コード領域を結合させることが必要な場合は近接しており、且つ読み枠がインフレームであることを意味する。
【００１８】
「発現制御配列」は、自身が操作可能に連結しているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を指す。ある発現制御配列が、あるヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節する場合、この発現制御配列は、このヌクレオチド配列と「操作可能に連結している」。したがって、発現制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンについてのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含めることができる。用語「発現制御配列」は、少なくとも、その存在が発現に影響するように設計されている配列を含むことを意図しており、追加的な有利な成分を含むこともできる。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は、発現制御配列である。この用語は、望ましくない、インフレーム及びアウトオブフレームの潜在的な開始コドンが配列から取り除かれるような核酸配列の設計も包含できる。この用語は、望ましくない潜在的なスプライス部位が取り除かれるような核酸配列の設計も包含できる。この用語は、ｐｏｌｙＡテール（すなわち、ｍＲＮＡの３’末端の一続きのアデニン残基）配列（ｐｏｌｙＡ配列と呼ばれる）の付加を指示する配列又はポリアデニル化配列（ｐＡ）を包含する。発現制御配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるようにも設計できる。転写及び翻訳の安定性に影響する発現制御配列（例えばプロモーター）だけでなく、翻訳を実現する配列（例えばコザック配列）は、昆虫細胞において公知である。発現制御配列は、より低い発現レベル又はより高い発現レベルが達成されるように、当該配列が操作可能に連結しているヌクレオチド配列を調整するような性質のものであってもよい。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置しており、ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位、並びに、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位を含むがこれらに限定されない任意の他のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される核酸断片、並びに、プロモーターからの転写量を調節するように直接又は間接的に作用することが当業者に公知の任意の他のヌクレオチド配列（例えば、アテニュエーター又はエンハンサーだけでなくサイレンサーも含む）を指す。
【００２０】
「構成的」プロモーターは、大部分の生理学的及び発生的な条件下の大部分の組織中で活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、例えば、化学誘導物質の施用により生理学的又は発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、具体的な型の組織又は細胞においてのみ活性であるか、そうした組織又は細胞においてのみ実質的に活性又は優勢に活性である。
【００２１】
「３’ＵＴＲ」又は「３’非翻訳配列」（３’非翻訳領域又は３’末端と呼ばれることも多い）は、遺伝子のコード配列の下流で見出される核酸配列を指し、例えば、転写終結部位及び（大部分ではあるが全てではない真核生物ｍＲＮＡ中では）ポリアデニル化シグナル（例えばＡＡＵＡＡＡ又はその変異体など）を含む。転写終結後、ｍＲＮＡ転写物をポリアデニル化シグナルの下流で切断してもよく、細胞質（ここで翻訳が行われる）へのｍＲＮＡの輸送に関与するポリ（Ａ）テールを加えてもよい。
【００２２】
用語「実質的に同一の」、「実質的な同一性」又は「本質的に類似の」又は「本質的な類似性」は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列が、初期設定パラメーターを用いたＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴのプログラムなどによって最適にアラインされたとき、本明細書中の別の箇所で定義するとおりの少なくともある比率（％）の配列同一性を共有することを意味する。ＧＡＰは、２つの配列をその全長にわたりアラインさせるＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを用い、マッチ数を最大化させギャップ数を最小化させる。一般的に、ギャップ創出ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸張ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰ初期設定パラメーターを使用する。ヌクレオチドの場合、使用する初期設定スコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、初期設定スコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ８９、９１５〜９１９頁）である。ＲＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と本質的に類似であるか又はある程度の配列同一性を有すると言われている場合には、ＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等しいとみなされることは明らかである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータープログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ９２１２１−３７５２、ＵＳＡから入手可能）又はオープンソースソフトウェアのＥｍｂｏｓｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（最新バージョン２．７．１−０７）を用いて、配列アラインメント、及び、配列同一性比率（％）のスコアを決定してもよい。或いは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースを検索することにより、類似性又は同一性の比率（％）を決定してもよい。
【００２３】
発明の詳細な説明
ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ（一般集団において稀に見られる変異体）は、最も一般的なメジャー対立遺伝子より顕著に高い活性をもたらす。本明細書中では、ＡＧＸＴをコードする核酸を組み込んでいるＡＡＶ遺伝子療法ベクターをＩ３４０Ｍと共に単回尾静脈投与すると、マウスモデルにおいて原発性高シュウ酸尿症Ｉ型（ＰＨ１）表現型が持続的に修正され、肝臓損傷又は毒性の証拠は見られないことが示される。
【００２４】
このＡＡＶベースの遺伝子移入法を用いた結果、形質導入されていない肝細胞の継続的なオキサレート産生により生じる潜在的な問題を克服するだけ十分に強くヒトＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍが肝臓で発現した。さらに、この発現遺伝子は、マウス肝細胞中のペルオキシソームを正確に標的とし、マウスＡｇｘｔ１ＫＯモデルの欠損を補完する。
【００２５】
したがって、本発明は、ＡＧＸＴ治療薬、好ましくはＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬に関する。つまり、本発明には、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質などのＡＧＸＴタンパク質と、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質などのＡＧＸＴタンパク質をコードする核酸配列とに由来する治療薬の投与を含む治療処置を通じて得ることができる重要な利点の認識が関与している。
【００２６】
本発明に関する場合、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬などのＡＧＸＴ治療薬は、ＡＧＸＴ（ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍを含む）ペプチド、それをコードする核酸配列、そのようなペプチド又は核酸を発現する細胞、及びそのようなペプチドの誘導体を含んでもよく、このとき、前記治療薬は、典型的には、予防上又は治療上有効な投与量で投与された場合に疾患を改善又は治療する。
【００２７】
本発明のＡＧＸＴ治療薬（ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬を含む）としては、ＡＧＸＴ（又はＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ）ペプチドの改変体、誘導体及びアナログ、並びに、そのようなペプチドをコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬などの本発明のＡＧＸＴ治療薬は、天然に存在する野生型ＡＧＸＴペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチド、又は配列番号２に記載するとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍペプチドであってもよい。
【００２８】
ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬など本発明のＡＧＸＴ治療薬としては、ＡＧＸＴ（又はＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ）のペプチド断片、改変ペプチド断片、アナログ又は薬理学的に許容される塩などの実質的に精製された化合物を挙げることができる。そのような化合物を、本明細書中ではＬＰＬ  Ｓ４４７Ｘペプチドと総称する。ＡＧＸＴ（又はＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ）ペプチドとしては、ヒト以外の種由来のホモログ（このようなホモログは、動物臨床的な用途を有してもよい）を含め、野生型の成熟ＡＧＸＴ配列のホモログ（又はＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ配列のホモログ）を挙げることができる。
【００２９】
ＡＧＸＴ（又はＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ）ペプチドとしては、野生型ＡＧＸＴ若しくはＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍの天然に存在するアイソフォーム又は遺伝的変異体を挙げることができる。
【００３０】
一実施形態では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬は、ＧＡＰプログラムを用いてその全長にわたり最適にアラインさせたときに配列番号２に対し少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の３４０位に対応する位置のメチオニンを含むＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質である。「配列番号２のある位置に対応する位置」（例えば３４０）は、本明細書中では、ＧＡＰプログラムを用いて全長にわたり配列番号２と最適にアラインさせたときに、配列番号２以外のＡＧＸＴアミノ酸配列の、配列番号２の当該位置に対応する位置と理解される。
【００３１】
一実施形態では、このＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質は、Ｒｕｍｓｂｙら（Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９７年７月、３４（パート４）、４００〜４頁）により記載されている要領でアッセイできるように、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ、ＥＣ２．６．１．４４）活性を有するタンパク質である。好ましい一実施形態では、このＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質は、活性部位残基、基質結合、補因子（ピリドキサール５’−リン酸）結合及び／又はサブユニット相互作用に関与する残基が保存されているアミノ酸配列を有するタンパク質である。そのような残基は、それぞれ、Ｚｈａｎｇら（２００３年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、３３１（３）、６４３〜５２頁）及びＨａｎら（２００５年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．、５８（４）、９７１〜５頁）により記載されているように、８１位（Ｓ）、８２位（Ｇ）、８３位（Ｈ）、１０８位（Ｗ）、１５８位（Ｓ）、１８３位（Ｄ）、１８６位（Ａ）２０８位（Ｑ）及び２０９位（Ｋ）の活性部位残基を同定することを含め、配列番号２のアミノ酸配列をヒト及びアナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）のＡＧＸＴタンパク質の３Ｄ結晶構造と比較することにより誘導できる。Ｆｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＦＦＡＳ；Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ  Ｌ、Ｌｉ  Ｗ、Ｇｏｄｚｉｋ  Ａ、２００２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ、１１、１７０２〜１７１３頁）によれば、ＡＧＸＴファミリーは、原核生物及び真核生物のプロテオームにおいて何百もの相同的な配列を有する。ＡＧＸＴホモログについてのモデルは、http://www1.jcsg.org/cgi-bin/models/get_mor.pl?key_17130350でアクセスできる。配列番号２とこれらの公知のＡＧＸＴアミノ酸配列との配列アラインメントは、保存領域及びアミノ酸位置を示唆すると思われ、その保存は、構造及び酵素活性にとって重要である。これらの領域及び位置は、一切のアミノ酸置換基を許容しないか、又は保存されているアミノ酸置換基のみを許容することになろう。これらの領域及び位置以外のアミノ酸置換基は、ＡＧＸＴ活性に大きく影響しそうにないと考えられる。
【００３２】
好ましい一実施形態では、このＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬は、ａ）配列番号２の１１位に対応する位置のロイシン、ｂ）配列番号２の４１位に対応する位置のアルギニン、ｃ）配列番号２の１５２位に対応する位置のイソロイシン、ｄ）配列番号２の１７０位に対応する位置のアルギニン、ｅ）配列番号２の２４４位に対応する位置のトレオニン、ｆ）配列番号２の２９４位に対応する位置のトレオニン、ｇ）配列番号２の３２６位に対応する位置のイソロイシン、ｈ）アミノ酸置換基ｂ）からｇ）までの１つ又は複数の組合せ、及びｉ）置換基ａ）とｆ）との組合せから成る群から選択されるアミノ酸置換基を含むＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質である。好ましい一実施形態では、このＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質、及びｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含み、先にａ）からｉ）までに定義したとおりのアミノ酸置換基を含むＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質から成る群から選択されるＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質である。
【００３３】
別の実施形態では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬は、本明細書中で先に定義したとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は、該核酸分子を含むウイルス遺伝子療法ベクターのウィルス粒子（ビリオン）である。
【００３４】
本発明の好ましい一実施形態では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、転移酵素をコードする天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞についての改善されたコドン使用頻度を有する。
【００３５】
ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、ヒト細胞のコドン使用に対する適合性は、コドン適合指数（ＣＡＩ）として表すことができる。コドン適合指数は、本明細書中では、高度に発現したヒト遺伝子のコドン使用に対するある遺伝子のコドン使用の相対的な適合性の測定値と定義する。各コドンの相対的な適合性（ｗ）は、同じアミノ酸についての最も大量のコドン使用に対する各コドンの使用の比率である。ＣＡＩは、これらの相対的な適合性の値の幾何平均と定義される。非同義コドン及び終止コドン（遺伝暗号に依存する）は除外する。ＣＡＩ値は０〜１の範囲であり、値が高ければ、最も大量のコドンの比率がより高いことを示唆している（Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｌｉ、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５、１２８１〜１２９５頁を参照のこと。さらに、Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ．、１９９７年、１９９、２９３〜３０１頁；ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０００年、７４、２６２８〜２６３５頁も参照のこと）。好ましくは、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列のＣＡＩは、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９０、少なくとも約０．９２、少なくとも約０．９４、少なくとも約０．９５、少なくとも約０．９６又は少なくとも約０．９７である。コード配列は、ＷＯ２００４／０５９５５６に記載されている方法により、又、ＷＯ２００６／０１５７８９に記載されているようにコード配列のＣｐＧの内容を改変することにより、昆虫宿主細胞中での発現改善にさらに適合させることができる。そのようなさらなる適合は、第１のヌクレオチド配列中の共通のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中の全てのコドンが共通のコドンであるわけではない事態を引き起こす可能性があることは理解される。
【００３６】
発明の一実施形態では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。
【００３７】
本発明は、本明細書中で先に定義したとおりの本発明のＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトにも関する。この核酸コンストラクトにおいては、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、哺乳動物細胞に適合する発現制御配列、例えば、プロモーター、好ましくは哺乳動物細胞に適合するプロモーターと操作可能に連結している。多くのそのようなプロモーターは、当技術分野で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ、２００１年、前記文献を参照のこと）。ＣＭＶプロモーターなど多くの細胞型において広く発現する構成的プロモーターを使用してもよい。しかし、より好ましいのは、誘導的、組織特異的、細胞型特異的又は細胞周期特異的なプロモーターであろう。好ましい一実施形態では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、肝臓特異的なプロモーターと操作可能に連結している。肝臓特異的なプロモーターは、赤血球以外のデアミナーゼとの併用の場合にとりわけ好ましい。
【００３８】
好ましくは、本発明のコンストラクトにおいては、肝臓特異的な発現のための発現制御配列は、例えば、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと組み合わされたＡＡＴプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターから成る群から選択される。他の例としては、腫瘍選択的、とりわけ神経細胞腫瘍選択的に発現させるためのＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒら、１９９７年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３、１１４５〜９頁）、又は、単核血球中で使用するためのＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈら、１９９７年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１８５、２１０１〜１０頁）が挙げられる。本発明のとりわけ好ましい一実施形態では、プロモーターは、配列番号３の配列を有してもよい。この核酸コンストラクトの別の実施形態では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＡＧＸＴ遺伝子由来のプロモーターではない、例えば、ヒトＡＧＸＴ遺伝子由来のプロモーターではない、ヒト細胞中で発現させるためのプロモーターと操作可能に連結している。
【００３９】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に３’ＵＴＲ（又は３’非翻訳配列）を含む。適当な３’ＵＴＲ配列は、当業者には入手可能である。３’ＵＴＲ配列は、任意の哺乳動物、好ましくはヒト遺伝子に由来するものであってもよく、通常は、転写終結部位及びポリアデニル化シグナル（例えばＡＡＵＡＡＡ又はその変異形など）を含むと思われる。とりわけ好ましい一実施形態では、この核酸コンストラクトは、例えば配列番号４などのヒトポルホビリノーゲンデアミナーゼ遺伝子由来の３’ＵＴＲを含む。
【００４０】
本発明の核酸コンストラクトの別の好ましい実施形態では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結している発現制御配列の上流にはポリＡインスレーターが先行し、可能な上流の転写単位からの一連の転写を終結させる。上述のとおりの、又、好ましくは少なくとも転写終結配列を含む３’ＵＴＲは、この目的のために使用してもよい。好ましいポリＡインスレーターは、配列番号５の配列を有する合成のポリＡインスレーターである。
【００４１】
好ましい一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの周囲にコザックコンセンサス配列を含む。
【００４２】
コザックコンセンサス配列は、本明細書中では、ＧＣＣＲＣＣ（ＡＵＧ）Ａ（配列番号６）と定義され、このとき、Ｒはプリン（すなわち、Ａ：アデノシン又はＧ：グアノシン）であり、（ＡＵＧ）はＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質コード配列の開始コドンを表す。好ましい一実施形態では、コザックコンセンサス配列には別のＧＣＣトリプレットが先行していてもよい。
【００４３】
本発明は、本明細書中で先に定義したとおりの発現制御配列と操作可能に連結している、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、哺乳動物の遺伝子療法、好ましくはヒトの遺伝子療法に適した発現ベクターである、核酸コンストラクトも提供する。本発明による好ましい核酸コンストラクトは、ウイルス遺伝子療法ベクターである。ウイルス遺伝子療法ベクターは当技術分野では周知であり、このようなベクターとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのパルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスをベースにしたベクターが挙げられる。好ましいウイルス遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ、アデノウイルス又はレンチウイルスのベクターである。
【００４４】
とりわけ好ましい遺伝子療法ベクターは、本発明に関する場合、パルボウイルスベクターである。したがって、この好ましい態様では、本発明は、哺乳動物細胞におけるＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列の導入及び／又は発現のためのベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、とりわけ、ヒト又はサルの感染性ＡＡＶなどのディペンドウイルス、及びその成分（例えば、動物パルボウイルスのゲノム）の使用に関する。
【００４５】
パルボウイルス科のウイルスは、小型ＤＮＡの動物ウイルスである。パルボウイルス科は、２つの亜科、すなわち、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と、昆虫に感染するデンソウイルス亜科とに分けることができる。パルボウイルス亜科に属するものを本明細書中ではパルボウイルスと呼び、このようなものとしては、ディペンドウイルス属が挙げられる。その属名から推測できるとおり、ディペンドウイルスに属するものは、細胞培養物において増殖性感染するにはアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染を通常必要とするという点で独特である。ディペンドウイルス属としては、普通はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５及び６）又は霊長動物（例えば、サルを起源としていると考えられるがヒトにも感染する血清型１及び４）に感染するＡＡＶ、並びに、他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ及びヒツジのアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
【００４６】
ＡＡＶ血清型について、又、ＡＡＶ血清型由来のハイブリッドＡＡＶベクターの工学技術戦略についてのさらなる情報は、Ｗｕら（２００６年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１４、３１６〜３２７頁）において記載されている。便宜のために、ＡＡＶに言及しながら、本明細書において本発明をさらに例証及び説明する。しかし、本発明はＡＡＶに限定されることなく、２つ以上の異なるＡＡＶ血清型に由来するハイブリッドＡＡＶベクター、並びに、他のパルボウイルス及びそのハイブリッドにも等しく適用できることは理解される。
【００４７】
全ての公知のＡＡＶ血清型のゲノムの構成は非常によく似ている。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直鎖状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造的な複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造的な（ＶＰ）タンパク質のための独特なコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）は、カプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字型のヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖を形成できるように構成される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として機能し、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体のためのプライマーとして働く。哺乳動物細胞におけるｗｔＡＡＶ感染に次ぎ、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）がＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターからそれぞれ発現し、Ｒｅｐタンパク質は両方ともウイルスゲノムの複製における機能を有する。Ｒｅｐ  ＯＲＦにおいてスプライシングが生じる結果、実際には４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）が発現する。しかし、哺乳動物細胞においては、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡがあれば、ＡＡＶベクターの産生には十分であることが示されている。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質があればＡＡＶベクターの産生には十分である。
【００４８】
「組換えパルボウイルスベクター又はＡＡＶベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）は、本明細書中では、１つ又は複数の所望のポリヌクレオチド配列、所望の遺伝子、又は、少なくとも１つのパルボウイルス又はＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している「導入遺伝子」を含むベクターを指す。そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子産物及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性のウイルス粒子中にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターをより大きい核酸コンストラクト中に（例えば、染色体中、又は、クローニング若しくは形質移入に使用されるプラスミド若しくはバキュロウイルスなど別のベクター中に）組み込む場合には、ｒＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＡＶのパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下での複製及びカプシド形成により「救出」できる「プロベクター」と呼ばれる。
【００４９】
したがって、本発明は、本明細書中で先に定義したとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、組換えパルボウイルスベクター又はＡＡＶベクターであり、したがって、少なくとも１つのパルボウイルス又はＡＡＶのＩＴＲを含む核酸コンストラクトに関する。好ましくは、この核酸コンストラクト中では、ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列には、両側にパルボウイルス又はＡＡＶのＩＴＲが隣接している。本発明のコンストラクト中では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ５由来のＩＴＲなど、任意のパルボウイルス又はＡＡＶのＩＴＲを使用できる。ＡＡＶ２のＩＴＲが最も好ましい。本発明の好ましい核酸コンストラクト中で使用するための好ましいＩＴＲ配列の例は、示してある配列番号７（左又は上流のＩＴＲ）及び配列番号８（右又は下流のＩＴＲ）である。
【００５０】
ＡＡＶは、数種の哺乳動物細胞に感染することが可能である。例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年、Ｍｏｌ．ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５、３２５１〜３２６０頁）及びＧｒｉｍｍら（１９９９年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１０、２４４５〜２４５０頁）を参照のこと。しかし、ＡＡＶの細胞指向性は、血清型間で異なる。例えば、哺乳動物のＣＮＳ細胞指向性及び形質導入効率に関してＡＡＶ２、ＡＡＶ４及びＡＡＶ５間の差を考察しているＤａｖｉｄｓｏｎら（２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、３４２８〜３４３２頁）を参照のこと、又、ＡＡＶ指向性の改変体へのアプローチを考察しているＧｏｎｃａｌｖｅｓ、２００５年、Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．、２（１）、４３頁を参照のこと。肝細胞の形質導入については、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８及びＡＡＶ５のカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンが好ましく（Ｎａｔｈｗａｎｉら、２００７年、Ｂｌｏｏｄ、１０９（４）、１４１４〜１４２１頁；Ｋｉｔａｊｉｍａら、２００６年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１８６（１）、６５〜７３頁）、中でもＡＡＶ５又は８のカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンが最も好ましい。
【００５１】
昆虫細胞における組換えＡＡＶベクターの作製のために本発明において使用できるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来するものであってもよい。一般的にＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著な相同性のゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝機能を備え、本質的に物理的及び機能的に等価なビリオンを産生し、事実上同一の機序により複製及び集合する。多様なＡＡＶ血清型のゲノム配列、及び、ゲノムの類似性の概要については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒ．、７１、６８２３〜３３頁）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３年、Ｊ．Ｖｉｒ．、４５、５５５〜６４頁）、Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒ．、７３、１３０９〜１３１９頁）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒ．、７２、３０９〜３１９頁）及びＷｕら（２０００年、Ｊ．Ｖｉｒ．、７４、８６３５〜４７頁）を参照のこと。ＡＡＶ血清型１、２、３、４及び５は、本発明に関して使用する場合、好ましいＡＡＶヌクレオチド配列源である。好ましくは、本発明に関して使用する場合のＡＡＶのＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４に由来する。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０）コード配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及び／又はＡＡＶ４に由来する。しかし、本発明に関して使用する場合のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のカプシドタンパク質をコードする配列は、公知の４２血清型のいずれかから、より好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９、又は、例えばカプシドシャッフリング法により得られる新しく開発されたＡＡＶ様の粒子及びＡＡＶカプシドライブラリーから得てもよい。
【００５２】
ＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列は、大部分の血清型間でとりわけ保存される。多様なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば８９％超同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ及びＡＡＶ６間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列の同一性は８２％前後である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（２）、９３９〜９４７頁）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の作製において、他の血清型由来の対応する配列を効率的に交差補完（すなわち、機能的に置換）することが公知である。ＵＳ２００３１４８５０６では、ＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列は、昆虫細胞における他のＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列も効率的に交差補完すると報告されている。
【００５３】
ＡＡＶのＶＰタンパク質はＡＡＶビリオンの細胞指向性を決定することが公知である。ＶＰタンパク質コード配列は、異なるＡＡＶ血清型間のＲｅｐタンパク質及び遺伝子より顕著に少なく保存される。Ｒｅｐ配列及びＩＴＲ配列が他の血清型の対応する配列を交差補完する能力は、１つの血清型（例えばＡＡＶ５）のカプシドタンパク質と、別のＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ２）のＲｅｐ配列及び／又はＩＴＲ配列とを含む偽型ｒＡＡＶ粒子の作製を可能にする。そのような偽型ｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。
【００５４】
改変された「ＡＡＶ」配列は、本発明に関する場合、例えば、昆虫細胞中でのｒＡＡＶベクターの作製にも使用できる。そのような改変配列としては、例えば、野生型ＡＡＶのＩＴＲ配列、Ｒｅｐ配列又はＶＰ配列の代わりに使用できるＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９のＩＴＲ、Ｒｅｐ又はＶＰに対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれより高いヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の同一性を有する配列（例えば、約７５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）が挙げられる。
【００５５】
多くの点で他のＡＡＶ血清型と似ていても、ＡＡＶ５は、他の公知のヒト及びサルの血清型以上に、他のヒト及びサルのＡＡＶ血清型とは異なる。それを考慮すると、ｒＡＡＶ５の作製は、昆虫細胞における他の血清型の作製と異なる場合がある。本発明の方法を用いてｒＡＡＶ５を作製する場合、１つ又は複数のコンストラクトは、（２つ以上のコンストラクトの場合は集合的に）ＡＡＶ５のＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５のＲｅｐコード配列を含むヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶ５のＲｅｐ７８を含むヌクレオチド配列）を含むことが好ましい。そのようなＩＴＲ配列及びＲｅｐ配列を必要に応じ改変して、昆虫細胞中でｒＡＡＶ５又は偽型ｒＡＡＶ５ベクターを効率的に作製することができる。例えば、昆虫細胞中でのｒＡＡＶ５ベクターの作製を改善するためには、Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変してもよく、ＶＰのスプライス部位を改変又は除去してもよく、及び／又は、ＶＰ１の開始コドン及び隣接するヌクレオチドを改変してもよい。
【００５６】
本発明においてアデノウイルスベクターを使用する場合、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８１、２５７３〜２６０４頁）により総説されているように、又は、ＵＳ２００８０００８６９０に、又、Ｚａｌｄｕｍｂｉｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｅｂｅｎ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８年、２３９〜２４６頁）により記載されているように、好ましいアデノウイルスベクターを改変して宿主応答を減らしてもよい。
【００５７】
したがって、本発明は、本明細書中で先に定義したとおりの核酸コンストラクトと、本明細書中で先に定義したとおりのパルボウイルスのカプシドタンパク質とを含む、パルボウイルスビリオンに関する。
【００５８】
本発明は、昆虫細胞中で組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン（先に定義したとおりの組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む）を作製する方法も提供する。好ましくは、この方法は、（ａ）組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが作製されるような条件下で、本明細書中で先に定義したとおりの昆虫細胞を培養するステップ、及び（ｂ）該組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを回復するステップを含む。本明細書では、この方法において作製される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、好ましくは、該組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター核酸を含む感染性のパルボウイルス又はＡＡＶのビリオンであることは理解される。培養物における昆虫細胞のための生育条件、及び、培養物における昆虫細胞中の異種産物の作製は、当技術分野で周知であり、例えば、昆虫細胞の分子工学について先に引用した参考文献中に記載されている。本発明のｒＡＡＶビリオンの作製のための好ましい方法及びコンストラクトは、例えば、ＷＯ２００７／０４６７０３及びＷＯ２００７／１４８９７１に開示されている。
【００５９】
好ましくは、組換えパルボウイルスビリオンを作製する方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化抗体を用いて、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（を含むビリオン）を親和性精製するステップをさらに含む。抗ＡＡＶ抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。とりわけ適当な抗体は、例えば、ラクダ又はラマから入手可能であるようなラクダ科の動物の単鎖抗体又はその断片である（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４、２７７〜３０２頁を参照のこと）。ｒＡＡＶの親和性精製のための抗体は、好ましくは、ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープを特異的に結合させる抗体であり、それによると、好ましくは、該エピトープは、２つ以上のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質上に存在するエピトープである。例えば、抗体は、ＡＡＶ２のカプシドとの特異的な結合に基づいて産生又は選択してもよいが、それだけでなく同時に、抗体は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３及びＡＡＶ５のカプシドと特異的に結合してもよい。
【００６０】
本発明は、さらに、医薬として使用するため又は治療の方法において使用するためのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬に関する。医薬として使用するためのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬は、本明細書中で先に定義したとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍタンパク質又は核酸分子、又は、例えばパルボウイルスビリオンなど、先に定義したとおりの遺伝子療法ベクターのビリオンであってもよい。
【００６１】
又、本発明は、ＡＧＸＴ応答性の状態の治療において使用するための、本明細書中で定義するとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬に関する。
【００６２】
ＡＧＸＴ応答性の状態は、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの欠損（例えば、部分的な欠損又は完全な欠損（又は実質的に完全な欠損））が原因で生じる状態であってもよい。アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの欠損は、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの（部分的な、完全な若しくは実質的に完全な）不在又は細胞内誤局在を包含すると理解される。ＡＧＸＴ欠損は、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型と呼ばれる疾患（シュウ酸症Ｉとも呼ばれる）、グリコール酸尿症、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損、並びにペルオキシソーム及び／又は肝臓のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損を引き起こす。したがって、本発明は、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型の治療に関する。本発明による治療としては、そのような適応症の１つ又は複数の症状の治療（その改善など）が挙げられる。
【００６３】
本発明は、本明細書中で先に定義したとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬、核酸コンストラクト又はパルボウイルスビリオンを含む医薬組成物にも関する。この医薬組成物は、さらに、好ましくは、薬学的に許容される担体を含む。任意の適当な薬学的に許容される担体又は添加剤を、本発明の組成物中で使用できる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編者）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９７年４月を参照のこと）。
【００６４】
好ましい医薬形態は、滅菌済の生理食塩水、デキストロース溶液、若しくは緩衝化溶液、又は他の薬学的に許容される滅菌済の液体と組み合わせることになろう。或いは、例えばマイクロキャリアビーズなどの固形担体を使用してもよい。
【００６５】
又、本発明は、ＡＧＸＴ応答性の状態を治療する方法であって、有効量の本明細書中で定義するとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬、核酸コンストラクト、パルボウイルスビリオン又は医薬組成物を、該ＡＧＸＴ応答性の状態を有する対象に投与するステップを含む該方法を提供する。該ＡＧＸＴ応答性の状態は、例えば原発性高シュウ酸尿症Ｉ型などのアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損であってもよい。
【００６６】
加えて、本発明は、本明細書中で定義するとおりのＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ治療薬、核酸コンストラクト、パルボウイルスビリオン又は医薬組成物の、ＡＧＸＴ応答性の状態の治療において使用するための医薬の製造における使用に関する。
【００６７】
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「〜を含むこと（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用型は、当該単語に続く項目は包含されるが、具体的に述べられていない項目は排除されないことを意味する、その非限定的な意味で使用される。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素に言及した場合は、文脈により当該要素の１つ及び１つのみが存在することが明確に要求されない限り、２つ以上の当該要素が存在する可能性は排除されない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常は「少なくとも１つの」を意味する。
【００６８】
本明細書中に引用する特許及び参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６９】
以下の例は、例証の目的のみに提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものでは決してない。
【実施例】
【００７０】
（例１）
ヒトＡＧＸＴのｃＤＮＡ野生型及びいくつかのメジャー対立遺伝子及びマイナー対立遺伝子及びそれらの組合せを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｔｏｐ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｓ−ｔａｇに発現させた。発現したＡＧＸＴタンパク質を、標準的な手順による金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００７１】
精製したタンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析及びアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性アッセイ（Ｒｕｍｓｂｙら、Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９７年７月、３４（パート４）、４００〜４頁）にかけた。大腸菌において発現した際のＡＧＸＴタンパク質の平均活性値（全タンパク質１ｇ当たりμｍｏｌ／時間）を表１に示す。
【００７２】
表１  大腸菌において発現した際のＡＧＸＴタンパク質の平均活性値（全タンパク質１ｇ当たりμｍｏｌ／時間）。ｐＴｒｃＨｉｓ＝空ベクター、ｐＴｒｃＨｉｓＡＧＸＴ＊ＷＴ＝野生型ＡＧＸＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００３０）、ＴはＩ２４４Ｔ対立遺伝子を表し、ＭはＩ３４０Ｍ対立遺伝子を表し、＊ＬはＰ１１Ｌ対立遺伝子を表し、ＲはＧ１７０Ｒ対立遺伝子を表す。これらの文字の組合せは、１つのタンパク質における対応するアミノ酸置換基を有するタンパク質を表す。
【表１】
0005728389.tif 000002
【００７３】
Ｐ１１Ｌは、活性の顕著な低下を促進するのに十分である。したがって、突然変異の効果は、対立遺伝子の背景に顕著に依存する。Ｇ１７０Ｒ及びＩ２４４Ｔは両方とも、マイナーハプロタイプにおいて、活性の顕著な低下をもたらす。多形のＩ３４０Ｍは、いずれかの突然変異と併存する場合に、より良好な残存活性をもたらす。ＡＧＸＴ野生型をＩ３４０Ｍ（一般集団において稀に見られる変異体）と共に発現させると、最も一般的なメジャー対立遺伝子より顕著に高い活性がもたらされる。
【００７４】
（例２）
２．１  材料及び方法
２．１．１  動物実験、尿及び血液分析
全ての動物実験は、施設の動物実験倫理委員会により承認を受け、スペイン及び欧州の法律に従って実施した。Ｂ６；１２９ＳｖＡｇｘｔｔｍ１Ｕｌｌマウスについて、記載のとおりに［Ｓａｌｉｄｏら、ＰＮＡＳ、２００６年、１０３（４８）、１８２４９〜５４頁、ＰＭＩＤ：１７１１０４４３］遺伝子型同定し、育種し、標準的な固形飼料（Ａ０４、Ｓａｆｅ、フランス）及び水を自由に摂れる状態で、病原体のない施設内で維持した。マウスは、代謝ケージ内にマウス１匹として配置し（モデル３６００Ｍ、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）、採尿開始前３日間、順化させ、約４ｇ／日の粉末状のオキサレート不含食（０．４μｍｏｌ／ｇ未満のオキサレート、０．５％Ｃａ２＋及び０．２５％Ｍｇ２＋入り）（Ｈａｒｌａｎ  ＴＤ＃０１６９９、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．、ＵＳＡ）に慣れさせた。５０μｌの６Ｎ  ＨＣｌを含有する細い管中で、毎週、２４時間の採尿を２回実施した。オキサレートオキシダーゼアッセイ（http://www.greiner-diagnostic.com）を用いて尿中オキサレートを測定し、Ｊａｆｆｅアルカリ性ピクリン酸試験を用いて尿中クレアチニンを測定した。不完全な採尿のサインを示すケージにおいては、生後３カ月のマウスについて１ｍｌ未満の２４時間尿試料が典型的に見られたので、これを試験から除外した。同様に、食餌又は糞便の混入があった試料も除外した。試験終了時点でマウスを屠殺し、生化学的分析用に採血した。自動分析装置（Ａ２５、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、スペイン）で血清クレアチニン、ＢＵＮ、ＧＯＴ及びＧＰＴを測定した。組換えヒトＡＧＸＴタンパク質のウェスタンブロット分析では、抗ＡＧＸＴマウス抗体の存在を調べるために、血清試料も使用し、ＰＢＳ中で１：１００希釈した。
【００７５】
組織学的分析、酵素アッセイ、並びにノーザンブロット分析及びウェスタンブロット分析用に、肝臓試料を回収した。組織学的分析用に腎臓試料を回収した。脳、肺、心臓、胃、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、精巣及び精嚢を含めたより広範な組織学的試験用に、５匹のオスを選抜した。これらの組織からＤＮＡ及びタンパク質も抽出した。
【００７６】
遺伝子療法実験用に、生後１２〜１６週のマウスを拘束し、２７Ｇ針の付いた１ｍｌ注射器を用いて尾静脈中に注射した。ＡＡＶ粒子を５％ショ糖−ＰＢＳ溶液に溶解した。
【００７７】
２．１．２  組織学的分析
組織を４％緩衝化パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中で包埋するか、又は２０％ショ糖中で凍結保護するかいずれかを行い、液体窒素中で瞬間凍結した。全ての組織においてヘマトキシリン・エオシン染色を行い、腎臓切片上でシュウ酸カルシウム染色（Ｙａｓｕｅ、１９６９年、Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａ、２、８３〜９５頁）を実施した。腎石灰化症を有するＰＨ１患者の腎臓切片を、シュウ酸カルシウム染色についての陽性対照として使用した。沈着物を測定するため、ＣａＯｘについて染色した２つのランダム切片をデジタル画像化し、画像分析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＰｒｏ）を用いて処理した。陽性面積についての閾値を自動的に設定し、沈着物の面積を、デジタル化した総面積に対する比率（％）として表した。
【００７８】
２．１．３  ＡＧＴ酵素アッセイ、ウェスタンブロット及び免疫組織化学分析
ＡＧＴ活性及びウェスタンブロット分析を、記載のとおりに決定した［Ｓａｌｉｄｏら、ＰＮＡＳ、２００６年、１０３（４８）、１８２４９〜５４頁、ＰＭＩＤ：１７１１０４４３］。凍結切片上で免疫組織化学分析を実施し、１：５０００ウサギ抗ヒトＡＧＸＴ抗体（Ｃ．Ｄａｎｐｕｒｅ博士からの寄贈品）で２時間、次いで５分、インキュベートした。ＰＢＳ洗浄を３回、抗ウサギ血清（Ｄａｋｏ）を３０分間ＨＲＰコンジュゲートした。さらに３回のＰＢＳ洗浄後、ＤＡＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を色素原として使用して、いくつかの切片をヘマトキシリンで対比染色した。細静脈周囲の区域を標識するために、対照切片も１：５０００抗ＧＳ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。
【００７９】
２．１．４  組換えＡＡＶの構築、作製及びＤＮＡ分析
この試験で使用するＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶ２由来の２つのＩＴＲが隣接している発現カセットと、ゲノムサイズをＡＡＶについて記載されている最適なパッケージング能力に合わせるための適切なスタッファー配列とを含有する。発現カセットは、以下のエレメントを有する：ＡＡＶ２由来の５’ＩＴＲ、アルブミンエンハンサー由来の調節配列を有する肝臓特異的なプロモーターＥａｌｂＡＡＴｐ（Ｋｒａｍｅｒら、２００３年、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、７（３）、３７５〜８５頁）、ヒトＡＧＸＴのｃＤＮＡ（ＡＧＸＴ  Ｉ３４０Ｍ変異体をコードする−配列番号２）又は高感度ＧＦＰのｃＤＮＡのいずれか、ウシの成長ホルモンのポリアデニル化配列、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びＡＡＶ２由来の３’ＩＴＲ。ＷＰＲＥ配列をもたない類似の発現カセットも作製した。この試験で使用する４つのＡＡＶプラスミドを、ｓｓＡＡＶ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＡＧＴ−ｐｏｌｙＡ−ＷＰＲＥ、ｓｓＡＡＶ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＡＧＴ−ｐｏｌｙＡ（本治療薬の遺伝子を発現する）、ｓｓＡＡＶ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ−ＷＰＲＥ及びｓｓＡＡＶ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ（レポーター遺伝子ｅＧＦＰを発現する）と名付ける。
【００８０】
ＡＡＶ２／８ベクターを、３つの異なるプラスミド、すなわち、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８及び本治療薬（ＡＡＶ−ポリＡ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＡＧＴ−ＷＰＲＥ）又はレポーター遺伝子（ＡＡＶ−ポリＡ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ）の２９３細胞中でのリン酸カルシウムを介在させた同時形質移入により作製した（Ｈｅｒｍｅｎｓら、１９９９年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１０、１８８５〜９１頁、及び、Ｇａｏら、２００２年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９、１１８５４〜９頁）。同様に、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／５を代わりに用いてＡＡＶ２／５ベクターを作製した。簡潔に言えば、２９３細胞にｐＡｄＤｅｌｔａＦ６と、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８又はｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／５のいずれかと、標的ベクターとを、リン酸カルシウムにより同時形質移入し、形質移入の４８時間後、細胞の凍結融解によりウイルスを回収した。イオン交換カラムクロマトグラフィー及びイオジキサノール勾配遠心分離によりウイルスを精製し、次いで濾過し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−５％ショ糖に対してさらに濃縮した。３回実施されるＱ−ＰＣＲにより、ＴａｑＭａｎ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プロトコールと、ｈＡＡＴプロモーター領域の９５ｂｐ断片を増幅するプライマーｐｒ３００ｆｗ（５’−ＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡ−３’）及びｐｒ３０１ｒｖ（５’−ＧＴＣＣＧＴＡＴＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡ−３’）とを用いて、１ｍｌ当たりのゲノムコピーに関するウイルス力価を定量した。タンパク質の組成及び純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により定量した。
【００８１】
異なる組織由来の細胞１個当たりのＡＡＶベクターゲノム数を、ＡＧＸＴ配列及びＷＰＲＥ配列に対応するプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ分析により定量した。異なるマウス組織（肝臓、心臓、脳、腎臓、肺、脾臓、精巣及び精嚢）由来のゲノムＤＮＡを、プロテイナーゼＫ処置及びフェノール抽出により単離した。約１００ｎｇのゲノムＤＮＡをＰＣＲ用のテンプレートとして使用した。ｒＡＡＶベクタープラスミドの希釈物を使用して、ベクターゲノムコピーの定量用の検量線を作製した。
【００８２】
２．２  結果及び考察
ｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的なＥａｌｂＡＡＴハイブリッドプロモーターの制御下で、ヒトＡＧＸＴ−ｃＤＮＡをＡＡＶ２ベクタープラスミド中に挿入することにより構築した。ｃＤＮＡの後に、ｂＧＨポリアデニル化シグナル、及び、いくつかのコンストラクトにおいてはＷＰＲＥ転写後調節エレメントを続けた（図１）。
【００８３】
発現カセットにはＡＡＶ２由来の逆方向末端反復を隣接させた。ＡＡＶ２／８及びＡＡＶ２／５ベクターを３つの異なるプラスミド、すなわち、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６と、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８又はｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／５のいずれかと、本治療薬（ＡＡＶ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＡＧＴ−ｐｏｌｙＡ−ＷＰＲＥ若しくはＡＡＶ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＡＧＴ−ｐｏｌｙＡのいずれか）又はレポーター遺伝子（ＡＡＶ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ−ＷＰＲＥ若しくはＡＡＶ−ＥａｌｂＡＡＴ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡのいずれか）の、２９３細胞中でのリン酸カルシウムを介在させた同時形質移入により作製した（Ｈｅｒｍｅｎｓら、１９９９年、及び、Ｇａｏら、２００２年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９、１１８５４〜９頁）。
【００８４】
第１の一連の実験では、本発明者らは、オスのＡｇｘｔ１ＫＯマウス（１群当たりｎ＝１０動物）の肝細胞の大部分に形質導入する目的で、ＡＡＶ８ベクターを体重１ｋｇ当たり５×１０１２ウイルス粒子の用量で使用した。本発明者らの目的は、５０日の追跡における高シュウ酸尿の持続的な修正であった。加えて、本発明者らは、エチレングリコール、グリオキシレート前駆体への曝露後の遺伝子移入によりもたらされる機能的予備能を試験したいと考えた。
【００８５】
マウスは代謝ケージ内に配置し、オキサレート不含食及び水を自由に与え、３日間順応させた。オキサレートオキシダーゼベースのキットを使用して、酸性化した管中に採取した２４時間尿中で、基底オキサレート排出量を測定した。アルカリ性ピクリン酸法によりクレアチニン濃度も測定した。１日の平均オキサレート排出量は２．０６±０．７４μｍｏｌ／２４時間であった。ｒＡＡＶ２−ＡＧＸＴ−２／８ベクターの高力価（１．７〜６．３×１０１１ウイルス粒子／ｍｌ）の精製調製物を、０．２ｍｌのＰＢＳ−ショ糖中、体重１ｋｇ当たり５×１０１２ウイルス粒子の用量での単回尾静脈注射により、生後１２〜１６週の成体のＡｇｘｔ１ＫＯマウスに投与した。一切のベクターを注射していない５Ａｇｘｔ＋／＋のオスの追加群を正常対照として使用した。
【００８６】
合計５０日の観察期間にわたり尿オキサレート排出量を追跡し、図２は、ヒトＡＧＸＴのｃＤＮＡ発現ベクター又はＧＦＰ発現対照のいずれかを注射した動物の平均オキサレート排出量を示すものである。試験の最初の２週間にわたり、強制経口投与によりマウスを０．２５ｍｌの０．５Ｍエチレングリコール（ＥＧ）に３回曝露させて、グリオキシレート経路の、不連続な過負荷に対する応答を追跡した。注射後わずか６日後明らかになったように、グリオキシレート前駆体（ＥＧ）の投与後の基底シュウ酸尿及びオキサレートレベルの増加は両方とも、治療群における方が対照と比較して有意に低く、注射後４週の処置動物における尿中オキサレートレベルは、野生型マウスにおいて正常に観察される範囲に低下した（それぞれ、２４時間当たり０．３７±０．１１μｍｏｌ対０．３１±０．１３μｍｏｌ、ｐ＝０．０２８）。
【００８７】
０．２５ｍｌの０．５Ｍエチレングリコールの投与に対する応答は、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ８で処置したマウスにおいて、ＧＦＰ−ＡＡＶ８の投与を受けたマウスと比較した場合、有意に鈍かった（それぞれ、０．３４±０．３７μｍｏｌ／２４時間対１．２４±０．５７μｍｏｌ／２４時間、ｐ＝０．００１）。４週後、飲料水中に０．５％ＥＧを含ませると、オキサレート排出量の増加は、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ８処置動物における方が、ＧＦＰ−ＡＡＶ８を注射した対照におけるより有意に小さく（それぞれ２４時間当たり０．１８±０．３４μｍｏｌ対２．１１±１．３１μｍｏｌの増加、ｐ＜０．００１）、さらには、同じ曝露を受けた野生型マウスにおけるより小さかった（０．５０±０．２１μｍｏｌ／２４時間、ｐ＝０．００５）。これらのデータは、野生型動物との比較でさえ処置マウスにおける方が機能的予備能が大きいことを説明するＡＧＸＴ−ＡＡＶ８注射と一致する。実験の最後の２週間にわたり、マウスを飲料水中の０．７％ＥＧに曝露させたところ、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ８処置動物においては、ＧＦＰ−ＡＡＶ８を注射した対照におけるより、シュウ酸尿の増加は有意に小さい結果となり（それぞれ２４時間当たり０．５４±０．５６μｍｏｌ対２．４６±０．７μｍｏｌの増加、ｐ＝０．０００）、０．７％エチレングリコールを飲用している野生型対照において観察されたものと有意差のない応答であった（０．９２±０．３３の増加、ｐ＝０．０６）。
【００８８】
試験期間の間、対照群の３匹の動物が死亡し、病理学的所見は腎石灰化症であった（以下を参照）。ＡＡＶ８−ＡＧＸＴ処置マウスは１匹も死亡しなかった。試験の第７週の終わりの時点でマウスを屠殺し、組織及び血液を回収した。ＡＡＶ８−ＧＦＰを注射したマウスの腎臓は全て、試験終了時点である程度の腎石灰化症を呈したが、ＡＡＶ８−ＡＧＸＴの投与を受けたマウスは１匹も呈さなかった。４匹のマウスが、髄質領域中のみにわずかなシュウ酸カルシウム（ＣａＯｘ）沈着物を示し、３匹のマウスが皮質及び髄質中に中程度のＣａＯｘ沈着物を呈し、死亡した３匹のマウスにおいては、重度且つ広範な腎石灰化症が見られた。血漿は、未成熟のうちに死亡したマウスからは得ることができなかったが、残り７匹のＡＡＶ８−ＢＵＮ処置マウスの間では、ＡＡＶ８−ＡＧＸＴの投与を受けたマウスと比較して血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度は有意に上昇した（それぞれ、２６．７±９．９ｍｇ／ｄｌ対１９．１±１．３ｍｇ／ｄｌ、ｐ＝０．０４）。
【００８９】
注射後第７週の終わりの時点で、ウェスタンブロット及び免疫組織化学分析により、屠殺した全ての動物において肝臓のＡＧＴ酵素活性及びタンパク質を定量した。ＡＧＴ活性は、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ２／８を注射したＡＧＸＴ−／−マウスにおける方が、ＧＦＰ−ＡＡＶ２／８対照におけるより有意に高かった（２４．９±１０．６ｎｍｏｌ／分＊ｍｇタンパク質対４．１±１．５ｎｍｏｌ／分＊ｍｇタンパク質、ｐ＝０．００２）。顕著な残存活性は、ＡＧＸＴ−／−動物の肝臓抽出物中に、主に、基質としてアラニンを用いた場合（ＡＧＴ活性）だけでなく、セリンを基質として使用した場合（ＳＧＴ活性）でも存在する［Ｓａｌｉｄｏら、「アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損マウス、アデノウイルスの遺伝子移入に応答する原発性高シュウ酸尿症のためのモデル。（Ａｌａｎｉｎｅ−ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、１０３、４８、（２００６年）、１８２４９〜５４頁］。
【００９０】
図３ａに示すように、肝臓におけるＡＧＴタンパク質のウェスタン分析から、ｒＡＡＶ処置マウス（第２〜１０レーン）においては、野生型（第１レーン）と比較して強いＡＧＴ発現が明らかになったが、ＧＦＰ−ＡＡＶ２／８で処置した対照Ａｇｘｔ１ＫＯマウスにおいては、タンパク質は検出できなかった。
【００９１】
処置動物の異なる組織におけるＡＧＸＴ−ＡＡＶ２／８の形質導入率及び発現をウェスタンブロットにより定量した。脳、肺、脾臓、腎臓、精嚢及び精巣は検出可能なＡＧＴタンパク質を含有しなかったが、心臓試料は、一貫して、低レベルのＡＧＴタンパク質を示し、フィルムのより長い露出後には明らかであった（データは示していない）。多様な組織中のＡＧＸＴ−ＡＡＶ２／８のＤＮＡの存在を、ＡＧＸＴコード配列及びＷＰＲＥ配列の３’領域にアニーリングするプライマーを用いて、ＰＣＲにより評価した。ＡＧＸＴ−ＡＡＶ８及びマウスインターロイキン２（ｍＩＬ２）プラスミドを用いて検量線を作製し、テンプレートＤＮＡの量のばらつきを、ｍＩＬ２遺伝子の並列増幅を行うことにより補正した。ＡＧＸＴ−ＡＡＶ８処置マウスの肝臓において、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲ分析を用いて、二倍体ゲノム当たり８９９±７４ベクターコピーを見出した。他の組織中のマウスゲノム当たりのベクターコピー数の推定値は、４．４±０．８（腎臓）、１．６±０．６（肺）、０．７±０．１（脾臓）、１．３±０．１（精巣）及び３．３±０．６（心臓）であった。したがって、マウス１匹当たり５×１０１２ウイルス粒子の注射の２カ月後、形質導入された肝細胞当たり１０００ｒＡＡＶコピー近くが検出され、これは、他の研究者らがこの種のベクターについて報告しているものと同様である［Ｎａｋａｉ  Ｈ、Ｆｕｅｓｓ  Ｓ、Ｓｔｏｒｍ  ＴＡ、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｓ、Ｎａｒａ  Ｙ、Ｋａｙ  ＭＡ、「マウスにおける非拘束性肝細胞へのアデノ随伴ウイルス血清型８ベクターの形質導入。（Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ８  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、２００５年、７９（１）、２１４〜２４頁、ＰＭＩＤ：１５５９６８１７］。
【００９２】
ウサギ抗ＡＧＴ抗体を用いた免疫組織化学分析により、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ２／８又はＧＦＰ−ＡＡＶ２／８のいずれかで処置したＡｇｘｔ１ＫＯマウスの肝臓間での著しい差を見ることができた（図３ｂ）。事実、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ２／８の粒子を注射したマウスの肝細胞の大部分は、特徴的な細胞質の顆粒状パターンを有するある程度の免疫染色を示した（図３ｃ）が、ｅＧＦＰ−ＡＡＶ２／８を注射した対照マウスにおいてはＡＧＴ染色は観察されず、逆に、ＵＶ顕微鏡下で肝臓組織切片において大量の緑色の蛍光を示した（図示せず）。
【００９３】
単離肝細胞の初代培養物（各群からの１匹のマウスにおいて実施した）を使用して、共焦点顕微鏡観察法により、発現したＡＧＴタンパク質の細胞内局在化を確認した（データは示していない）。ＡＧＸＴ−ＡＡＶ２／８処置した肝細胞のペルオキシソームにおいては強いＡＧＴ免疫蛍光が観察され、このことから、ペルオキシソームのタンパク質ＰＭＰ７０とは共存するが、ミトコンドリアのマーカー（ミトトラッカー）とは共存しないことが示された。
【００９４】
血清トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ／ＧＰＴ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ／ＧＯＴ）は上昇せず（非処置マウスにおいてそれぞれ、５８．７±６．２Ｕ／Ｌ及び３９±６．９Ｕ／Ｌ対５６．３±１０．８Ｕ／Ｌ及び３７．９±４．１Ｕ／Ｌ）、Ｈ＆Ｅ切片上では肝臓病変は検出されなかった。このことは、この種のｒＡＡＶベクターを同様の用量で用いて他の研究者らにより報告された肝臓損傷又は毒性の欠如と一致する［Ｎａｋａｉ  Ｈ、Ｆｕｅｓｓ  Ｓ、Ｓｔｏｒｍ  ＴＡ、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｓ、Ｎａｒａ  Ｙ、Ｋａｙ  ＭＡ、「マウスにおける非拘束性肝細胞へのアデノ随伴ウイルス血清型８ベクターの形質導入。（Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ８  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、２００５年、７９（１）、２１４〜２４頁、ＰＭＩＤ：１５５９６８１７］、［Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ  Ｐ、Ｂｌａｎｋｉｎｓｈｉｐ  ＭＪ、Ａｌｌｅｎ  ＪＭ、Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＲＷ、Ｍｅｕｓｅ  Ｌ、Ｍｉｌｌｅｒ  ＤＧ、Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＪＳ、「アデノ随伴ウイルスベクターを用いた横紋筋への遺伝子の全身送達。（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｓｔｒｉａｔｅｄ  ｍｕｓｃｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．）」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２００４年８月、１０（８）、８２８〜３４頁、Ｅｐｕｂ、２００４年７月２５日、ＰＭＩＤ：１５２７３７４７］。加えて、本発明者らは、ウェスタンブロットによっては、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ２／８処置マウスの血清試料において、顕著な力価のＡＧＸＴ抗体を一切検出しなかった。
【００９５】
本発明者らが、組織学的分析を含め、手持ちのマウスの肝臓全てを慎重に検査したところ、５０日の追跡後では癌遺伝子の証拠は見出されず、これは、ＡＡＶ処置マウスにおいて腫瘍形成の証拠を見出さなかった大規模な長期的試験と一致した［Ｂｅｌｌら、「マウスの大規模試験においてＡＡＶベクターの腫瘍形成の証拠は見られない。（Ｎｏ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）」、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１２．２、（２００５年）、２９９〜３０６頁］。
【００９６】
以前の試験においては、ＡＡＶ５はヒト肝臓の形質導入用のより良好なベクターであることが示されている。第２の一連の実験では、本発明者らは、ＷＰＲＥ配列が欠如しているいくつかの用量のＡＡＶ５ベクターを、雌雄両方のＡｇｘｔ１ＫＯマウス（１群当たりｎ＝５動物）において、体重１ｋｇ当たり１．５×１０１３ウイルス粒子、５×１０１２ウイルス粒子又は５×１０１１ウイルス粒子のいずれかで、又、ＷＰＲＥを有するＡＡＶ８ベクターを５×１０１２ウイルス粒子／ｋｇで使用した。この一連の実験の目的は、マウスの大部分の肝細胞に形質導入する能力のある血清型、すなわちＡＡＶ８を用いて達成される結果に関し、遺伝子移入の効果をＡＡＶ５と比較することであった。本発明者らは、応答における性差の可能性を評価したいとも考えた。Ａｇｘｔ１ＫＯマウスを代謝ケージ内に配置し、オキサレート不含食及び水を自由に与え、３日間順応させてから、２４時間尿中でオキサレート排出量を測定した。
【００９７】
ｒＡＡＶ２−ＡＧＸＴ−２／５及び−２／８ベクター並びにｒＡＡＶ２−ｅＧＦＰ−２／５ベクターの高力価（４．５〜１０×１０１１ウイルス粒子／ｍｌ）の精製調製物を、０．２〜０．３ｍｌのＰＢＳ−ショ糖中の単回尾静脈注射により、生後１２〜１６週の成体のＡｇｘｔ１ＫＯマウスに投与した。
【００９８】
合計３５日の観察期間にわたり尿オキサレート排出量を追跡し、図４は、多様な用量のＡＡＶ５での、ヒトＡＧＸＴのｃＤＮＡ発現ベクター又はＧＦＰ発現対照のいずれかを注射した動物の平均オキサレート排出量を示すものである。試験したＡＧＸＴベクター用量は全て、ＧＦＰ対照と比較して、オキサレート排出量の顕著な減少を誘導した。試験の最後の週の間、オスのマウスを飲料水中の０．５％エチレングリコール（ＥＧ）に曝露させて、グリオキシル酸回路の過負荷に対する応答を追跡した。グリオキシレート前駆体の投与後のオキサレート排出量の増加は、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ８（０．４４±０．４９μｍｏｌ／２４時間）及び最高用量のＡＧＸＴ−ＡＡＶ５（１．４１±１．０９μｍｏｌ／２４時間）の投与を受けている群における方が、ＧＦＰ−ＡＡＶ５（４．４９±１．４１μｍｏｌ／２４時間）を注射した群におけるより有意に低かった（両側対比較において、ｐ＝０．００８）。これに対し、ＡＧＸＴ−ＡＡＶ８及び最高用量のＡＧＸＴ−ＡＡＶ５の投与を受けたマウスの曝露後の投与に次ぐオキサレート排出量の増加は、野生型マウスにおいて観察されたもの（０．５５±０．２４μｍｏｌ／２４時間）と有意差はなかった。
【００９９】
これらの結果は、試験終了時点での肝臓におけるＡＧＸＴ発現の分析と一致する。ＡＧＴ活性及びウェスタンブロット分析の両方から、雌雄両方において、ＡＡＶ８ベクターを用いた場合の発現レベルの方がＡＡＶ５ベクターと比較して高いことが示された。それにもかかわらず、体重１ｋｇ当たり１．５×１０１３ＡＡＶ５粒子で達成された発現レベルは、野生型マウスにおいて観察されたものより一貫して高かった。より低用量（５×１０１２ＡＡＶ５粒子／ｋｇ及び５×１０１１ＡＡＶ５粒子／ｋｇ）では、依然としてオスの肝臓において顕著なＡＧＴ発現がもたらされたが、これらの用量では、メスの肝臓においては比較的低いシグナルがもたらされた。
【０１００】
凍結肝臓切片の免疫組織化学染色により並行した結果を得たところ、形質導入された肝細胞の比率（％）は、ＡＡＶ８及び最高用量のＡＡＶ５の場合は９０％前後、５×１０１２ＡＡＶ５粒子／ｋｇの場合は６０％であり、５×１０１１ＡＡＶ５粒子／ｋｇの場合は１０％（メスにおいては１％未満）まで下がった（図３ｄ）。
【０１０１】
本発明者らの実験から、ｒＡＡＶ２／８及びｒＡＡＶ２／５など、大部分の肝細胞に形質導入する能力のあるベクターを用いた遺伝子移入は、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型のための有望な新しい療法であることが立証される。形質導入されていない肝細胞がオキサレートを産生し続けると思われるこの種の疾患においては、この治療薬の目的は、治療を受けた肝臓によるオキサレートの総産生量が腎臓のオキサレート排出能力をはるかに下回る量を保つように、十分な肝細胞に形質導入された場合にのみ達成できる。体重１ｋｇ当たり１３ｍｌ／分前後と推定される、マウスの比較的大きい糸球体濾過速度（ＧＦＲ）［Ｍｅｎｅｔｏｎ  Ｐ、Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｉ、Ｉｎａｇａｍｉ  Ｔ、Ｓｃｈｎｅｒｍａｎｎ  Ｊ、「マウスの腎臓生理（Ｒｅｎａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．）」、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０００年３月、２７８（３）、Ｆ３３９〜５１頁、Ｒｅｖｉｅｗ、ＰＭＩＤ：１０７１０５３７］から、Ａｇｘｔ１ＫＯマウスにおいては、グリオキシレート前駆体に曝露されない限り腎石灰化症が見られないことが説明できると考えられる。マウスにおいて腎傷害を引き起こさない用量でエチレングリコールを投与すると、オキサレート排出量は、Ａｇｘｔ１ＫＯマウスにおいては腎石灰化症を引き起こすレベルに増加するが、野生型対照においてはそのレベルに増加しない［Ｓａｌｉｄｏ  ＥＣ、Ｌｉ  ＸＭ、Ｌｕ  Ｙ、Ｗａｎｇ  Ｘ、Ｓａｎｔａｎａ  Ａ、Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  Ｎ、Ｔｏｒｒｅｓ  Ａ、Ｓｈａｐｉｒｏ  ＬＪ、Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  Ｊ、「アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損マウス、アデノウイルスの遺伝子移入に応答する原発性高シュウ酸尿症のためのモデル。（Ａｌａｎｉｎｅ−ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ、  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、２００６年、１０３（４８）、１８２４９〜５４頁］。体重１ｋｇ当たり５×１０１１ウイルス粒子超の用量では、ｒＡＡＶ２／８及びｒＡＡＶ２／５は両方とも、０．５％エチレングリコールを飲用しているマウスにおいて観察された増加を、野生型マウスにおいて観察されたものと似たレベルに低下させることが可能である。食餌中で０．５％グリコレートを与えたマウスでも同様の結果（図示せず）が得られた。
【０１０２】
ＡＡＶ８及び高用量のＡＡＶ５は、雌雄において同様にオキサレート排出を修正するようであるが、より低用量のＡＡＶ５コンストラクトを注射したメスのマウスにおいては、それより実質的に悪い修正が得られた。ＡＡＶベクターの発現の性差は、これまでに報告されている［Ｄａｖｉｄｏｆｆ  ＡＭ、Ｎｇ  ＣＹ、Ｚｈｏｕ  Ｊ、Ｓｐｅｎｃｅ  Ｙ、Ｎａｔｈｗａｎｉ  ＡＣ、「性別は、アンドロゲン依存性経路を通じた組換えアデノ随伴ウイルスベクターのマウス肝臓への形質導入に顕著に影響する（Ｓｅｘ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）」、Ｂｌｏｏｄ．、２００３年７月、１５、１０２（２）、４８０〜８頁；Ｐａｎｅｄａ  Ａ、Ｖａｎｒｅｌｌ  Ｌ、Ｍａｕｌｅｏｎ  Ｉ、Ｃｒｅｔｔａｚ  ＪＳ、Ｂｅｒｒａｏｎｄｏ  Ｐ、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ＥＪ、Ｂｅａｔｔｉｅ  ＳＧ、Ｔｗｉｓｋ  Ｊ、ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ  Ｓ、Ｐｒｉｅｔｏ  Ｊ、Ｆｏｎｔａｎｅｌｌａｓ  Ａ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｅｎａ  ＭＳ  ａｎｄ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｇｕｉｎｏｌａｚａ  Ｇ、「ＡＡＶ血清型及びゲノム構造が両性のマウスの肝臓形質導入及び生体内分布に及ぼす効果。（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＡＡＶ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｖｅｒ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｇｅｎｄｅｒｓ．）」、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００９年、２０（８）、９０８〜１７頁］が、関与する機序についてはほとんど知られていない。
【０１０３】
まとめると、本発明者らは、ｒＡＡＶ２−ＡＧＸＴ−２／５又は２／８を単回尾静脈投与した結果、ＰＨ１マウス表現型は持続的に修正され、肝臓損傷又は毒性の証拠は見られなかったことを示した。
【０１０４】
このＡＡＶベースの遺伝子移入法を用いた結果、形質導入されていない肝細胞の継続的なオキサレート産生により生じる潜在的な問題を克服するだけ十分に強くヒトＡＧＸＴのｃＤＮＡが肝臓発現した。本発明者らは、ヒトＡＧＸＴ遺伝子産物は、マウス肝細胞中のペルオキシソームを正確に標的とし、マウスＡｇｘｔ１ＫＯモデルの欠損を補完することも実証した。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ．ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【配列表】
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