(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）とフィブロインタンパク質との融合タンパク質を発現させた絹糸を精練せずに溶解する工程と、
該工程で得られた前記融合タンパク質の溶解液に再構成処理を施す工程と、
を含むことを特徴とする、前記融合タンパク質、内在性の他のフィブロインタンパク質及びセリシンを含む複合体の製造方法。
【請求項２】
分子内又は分子間の水素結合を切断する性質を有する溶液で絹糸を溶解する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記再構成処理を施した融合タンパク質の溶解液を凍結乾燥して粉砕する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記フィブロインタンパク質が、フィブロインＬ鎖及びフィブロインＨ鎖からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記再構成処理が透析処理であることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の製造方法に関し、より詳しくは、ｓｃＦｖとフィブロインタンパク質との融合タンパク質を発現させた絹糸を精練せずに溶解し、再構成処理を施すことを特徴とする、ｓｃＦｖの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、抗原と結合するドメイン（Ｆａｂ）と免疫グロブリン受容体に結合するドメイン（Ｆｃ）より構成され、Ｆａｂドメインを介して病原体の抗原に結合し、それを排除して中和する免疫調節作用を発揮する。そして、その作用の根幹は、ペプチド、核酸、糖鎖、糖脂質、低分子化合物等の種々様々な抗原に対して特異的に結合できることにある。そのため、抗体は、前記免疫調節作用を目的とした医薬品（抗体医薬）のみならず、ウェスタンブロッティング、免疫沈降（プルダウンアッセイ）、フローサイトメトリー、免疫組織染色等の各種検出・精製方法に適したツールとしても利用され、開発が進められており、これらの市場は急速に拡大している。
【０００３】
通常、抗体は、検出・精製の対象とする抗原をウサギやマウス等の免疫動物に接種し、該動物の免疫系を刺激した後、その動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収することで得ることができる。また、このように免疫系を刺激した動物から脾臓細胞等の抗体産生細胞を回収し、該抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合し、得られたハイブリドーマを選択することにより所望の抗原のみを検出・精製することのできる抗体（モノクローナル抗体）を作製することもできる。しかしながら、かかる動物や動物細胞を利用した方法には、活性を有する抗体を安定的に取得できる反面、大量生産に適していない、生産コストが非常に高くなるといった欠点がある。
【０００４】
これに対し、所望の抗体をコードする遺伝子をクローニングすることにより、タンパク質の大量生産に適した大腸菌等で抗体を生産することも試みられている。しかし、大腸菌で生産した場合には、得られる抗体がしばしば不溶化することが知られており、その精製にあたっては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の変性剤でタンパク質を可溶化させる工程やその変性剤を取り除く透析等の工程が必要となる。さらにそのような多くの工程を経て得られた抗体は概して活性が低くなる傾向にあるため、大腸菌等を利用した方法には、活性を有する抗体を大量に生産しにくいという欠点がある。
【０００５】
一方、カイコは蛹化する際に自身を保護する目的で繭を作り出す。この繭はフィブロイン（Ｆｉｂｒｏｉｎ）という繊維構造とそれを取り巻くセリシンとの２種の構造からなる絹糸から作られている構造体である。絹糸は、およそ１．５ｋｍに達する単繊維として存在するため、人類はこれをほどいて繊維とし、衣類等に利用してきた。近年では、絹糸を構成するするフィブロイン及びセリシンをそれぞれ加工することによって、パウダー（特許文献１）やフィルム（特許文献２及び３）、及びスポンジ様構造体（特許文献４）として利用することも可能となってきた。
【０００６】
２０００年にカイコの遺伝子組換え技術が確立され（非特許文献１）、外来遺伝子を導入することによりカイコのシルクタンパク質を改変し、物性の向上や、機能性の付加を実現した新しいシルクを設計・創出することが可能となった。現在では目的のタンパク質を絹タンパク質の主成分であるフィブロイン層とセリシン層のどちらにでも発現させることが可能となり、これまでにフィブロインと蛍光タンパク質やサイトカイン等との融合タンパク質を発現する組換えカイコや（非特許文献２〜４）、またセリシン層にヒト血清アルブミンや抗体分子を発現する組換えカイコの作出に成功し（非特許文献５及び６）、蛍光絹糸としての利用や発現産物を絹糸から分離・精製して利用する試みが行われており、前述の抗体のみならず、機能的なタンパク質の生産の場としてカイコは注目を集めている。
【０００７】
例えば、飯塚らは、マウスモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖を中部絹糸腺細胞で発現させ、セリシン層にそれら抗体分子を分泌する組換えカイコを作製した。そして、該組換えカイコが作出した絹糸を３Ｍ  尿素（Ｕｒｅａ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液で処理し、抗体分子を含んだセリシン溶液を透析後、プロテインＧセファロースを用いてアフィニティー精製することにより、抗原特異的な結合活性を有する抗体分子を得ている（非特許文献６）。
【０００８】
また、外来タンパク質をフィブロインに発現させ、活性をもつ該タンパク質を調製するためには、一般的に絹糸を高濃度の臭化リチウム溶液やチオシアン酸リチウム溶液、又は塩化カルシウム／エタノール溶液で一度完全に溶解し、得られたシルク複合体から目的の外来タンパク質をプロテアーゼや還元剤を用いて遊離させ、再びリフォールディングすることが必要である。実際、日野らは、フィブロインＬ鎖にヒトｂＦＧＦを融合させた組換えタンパク質を絹糸に発現させ、絹糸を精練し、セリシン成分を除去した後、高濃度のチオシアン酸リチウムに溶解し、２−メルカプトエタノールを用いて内在性フィブロインから遊離させ、さらに透析を施し、変性剤の濃度を徐々に下げていくことで、活性のあるｂＦＧＦを獲得している（非特許文献４）。
【０００９】
このように、外来タンパク質を発現させた絹糸から活性を有する該タンパク質を調製するためには、アフィニティー精製、プロテアーゼ処理、還元剤の添加及び精練等を行い、外来タンパク質から内在性タンパク質を遊離・除去する工程が必要であった。また、絹糸から外来タンパク質を抽出するためには、変性剤（尿素、臭化リチウム溶液、塩化カルシウム／エタノール溶液、チオシアン酸リチウム、塩酸グアニジン、ＳＤＳ等）にて該タンパク質を変性させ可溶化する工程が必要となる。さらに、変性して可溶化させたタンパク質から変性剤を取り除き、該タンパク質が活性を有するようにするために、リフォールデイング処理を施す工程を要する。しかしながら、かかる多工程を経て調製されたタンパク質、特に抗体は概してその活性が低くなる傾向にあった。
【００１０】
そこで、絹糸から抗体等の外来タンパク質をその活性を維持させたまま、非常に簡便に調製する方法の開発が望まれているが、未だ実用化されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−１２３６８３号公報
【特許文献２】特開２００８−１７３３１２号公報
【特許文献３】特開平９−１９２２１０号公報
【特許文献４】特開２００２−１８６８４７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００年、１８巻、８１〜８４ページ
【非特許文献２】Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．ら、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００５年、３５巻、５１〜５９ページ
【非特許文献３】Ｋｏｊｉｍａ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００７年、７１巻、２９４３〜２９５１ページ
【非特許文献４】Ｈｉｎｏ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．、２００６年、２７巻、５７１５〜５７２４ページ
【非特許文献５】Ｏｇａｗａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年、１２８巻、５３１〜５４４ページ
【非特許文献６】Ｉｉｚｕｋａ，Ｍ．ら、ＦＥＢＳ  Ｊ、２００９年、２７６巻、５８０６〜５８２０ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、絹糸から抗体をその結合性や抗原特異性を維持させたまま、内在性タンパク質を遊離・除去する工程等を要せずに非常に簡便に調製することを可能とする、抗体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、抗体として一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を選択し、このｓｃＦｖをフィブロインタンパク質と融合させて絹糸に発現させ、これにより得られた絹糸に対し、精練せずに溶解と再構成の処理を行うことにより、結合性及び抗原特異性を高く保持した一本鎖抗体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
本発明は、より詳しくは、下記を提供するものである。
＜１＞  一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）とフィブロインタンパク質との融合タンパク質を発現させた絹糸を精練せずに溶解する工程と、該工程で得られた前記融合タンパク質の溶解液に再構成処理を施す工程と、を含むことを特徴とする、前記融合タンパク質、内在性の他のフィブロインタンパク質及びセリシンを含む複合体の製造方法。
＜２＞  分子内又は分子間の水素結合を切断する性質を有する溶液で絹糸を溶解する、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  前記再構成処理を施した融合タンパク質の溶解液を凍結乾燥して粉砕する工程をさらに含むことを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞  前記フィブロインタンパク質が、フィブロインＬ鎖及びフィブロインＨ鎖からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質であることを特徴とする、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜５＞  前記再構成処理が透析処理であることを特徴とする、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、絹糸から一本鎖抗体をその結合性や抗原特異性を維持させたまま、非常に簡便に調製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗ＷＡＳＰモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ  ｍＡｂ）を基に一本鎖抗体（抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ（ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ））を得た過程と、フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ（フィブロインＬ鎖−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ融合タンパク質）をカイコが産生する絹糸に発現させるためのベクター（ｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］−ＬＬＬ−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ）のコンストラクトとを示す、概要図である。
【図２】組換えカイコ（Ｓ０１）産生繭におけるフィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの発現を、ウェスタンブロッティングによって検出した結果を示す図である。なお、図中の「ｗ１」は非組換え体カイコ（ｗ１−ｐｎｄ、陰性対照）産生繭における結果であることを示し、「♯１４〜１６」はＳ０１系統内の異なる個体由来の繭における結果であることを示す。また、ａ）は抗フィブロインＬ鎖抗体（ａｎｔｉ−ＦｉｂＬ  ｐＡｂ）を用いたウェスタンブロッティングの結果を示し、ｂ）は抗Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体（ａｎｔｉ−Ｍｙｃ  ｐＡｂ）を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図３】組換えカイコ（Ｓ０１）産生繭（ＴＧカイコ繭）から融合タンパク質  フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖを有するシルクパウダーを調製するための３種類の方法（実施例１、比較例１〜２）の概略、並びにこれらの方法によって得られたシルクパウダーを電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図４】組換えカイコ（Ｓ０１）産生繭（ＴＧカイコ繭）から融合タンパク質  フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖを有するシルクパウダーを調製するための３種類の方法（実施例１、比較例１〜２）の概略、及びこれらの方法によって得られたシルクパウダーと抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの抗原であるＷＡＳＰタンパク質との複合体形成を調べるためのプルダウンアッセイの概略を示す図である。
【図５】抗ＧＳＴ抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した、図４に示したプルダウンアッセイの結果を示す図である。なお、図中の「Ｗ１」は非組換え体カイコ（ｗ１−ｐｎｄ、陰性対照）産生繭における結果であることを示し、「Ｗ」及び「Ｇ」は「ＷＡＳＰタンパク質（ＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴ）」及び「ＧＳＴタンパク質（陰性対照、ＧＳＴ）」を用いたプルダウンアッセイの結果であることを各々示す。また、ａ）は比較例１の方法によって得られたシルクパウダーの分析結果であることを示し、ｂ）は実施例１の方法によって得られたシルクパウダーの分析結果であることを示す。
【図６】本発明（実施例１）の方法によって得られたシルクパウダーと、各種プローブタンパク質との複合体形成をプルダウンアッセイ並びにウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す図である。
【図７】比較例２に記載の方法によって得られたシルクパウダーと、各種プローブタンパク質との複合体形成をプルダウンアッセイ並びにウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す図である。
【図８】本発明（実施例１）の方法によって得られたフィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖを有するシルクパウダーと、抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの元になった抗ＷＡＳＰモノクローナル抗体とを、結合性及び抗原特異性の点において、各種プローブタンパク質を用いたプルダウンアッセイ並びにウェスタンブロッティングによって分析して比較した結果を示す図である。
【図９】抗ＷＡＳＰモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ  ｍＡｂ）を基に一本鎖抗体（抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ（ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ））を得た過程と、フィブロインＨ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ（フィブロインＨ鎖−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ融合タンパク質）をカイコが産生する絹糸に発現させるためのベクター（ｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］−ＨＣ−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ）のコンストラクトとを示す、概要図である。
【図１０】本発明（実施例２）の方法によって得られた組換えカイコ（Ｓ０２）産生繭由来シルクパウダーにおけるフィブロインＨ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの発現を、ウェスタンブロッティングによって検出した結果を示す図である。なお、図中の「＊（アスタリスク）」は内在性フィブロインＬ鎖の位置を示す。
【図１１】本発明（実施例２）の方法によって得られたシルクパウダーと、各種プローブタンパク質との複合体形成をプルダウンアッセイ並びにウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、機能的な一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）の製造方法であって、ｓｃＦＶとフィブロインタンパク質との融合タンパク質を発現させた絹糸を精練せずに溶解する工程と、該工程で得られた前記融合タンパク質の溶解液に再構成処理を施す工程と、を含むことを特徴とする方法である。
【００１９】
本発明において「一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ：ｓｃＦｖ）」とは、抗体分子の抗原と結合するドメイン（Ｆａｂ）を構成する重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）から可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を取り出して、リンカーを介して結合させた分子を意味する。本発明にかかる一本鎖抗体には、単一のポリペプチド鎖中に複数のＶＨとＶＬとを有している抗体も含まれる。かかる抗体としては、例えば、二つのＶＨと二つのＶＬとを前記リンカー等で結合した一本鎖抗体（ｓｃ（ＦＶ)２）が挙げられる。かかる抗体においては、通常複数のリンカーが必要となるが、全て同じリンカーであってもよく、異なるリンカーであってもよい。また、本発明にかかる一本鎖抗体には、リンカーペプチドの長さを短く（例えば５アミノ酸程度）に設定して、同一ポリペプチド鎖内でのＶＨとＶＬとの結合を抑制することにより形成される二量体（ダイアボディ、ｄｉａｂｏｄｙ）も含まれる。
【００２０】
本発明にかかる一本鎖抗体におけるリンカーは、その両端に連結されたＶＨ及びＶＬの発現や、ＶＨとＶＬとの結合を阻害するものでなければ特に制限されない。リンカーペプチドの長さは、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜５０アミノ酸、より好ましくは１〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば１５アミノ酸）である。本発明においては、「（ＧＧＧＧＳ）×３」という１５アミノ酸からなるポリペプチドをリンカーとして好適に用いることができる（なお、ＧはグリシンをＳはセリンを表わす）。
【００２１】
一本鎖抗体の調製は、例えば、次のようにして行うことができる。まず、目的の抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体を発現しているハイブリドーマよりｍＲＮＡを単離し、そのｍＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーから、そのモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれ単離する。次いで、ＶＨをコードするｃＤＮＡとＶＬをコードするｃＤＮＡの間にリンカーをコードするＤＮＡを挿入し、遺伝子組換え技術により、一本鎖抗体をコードする組換えＤＮＡを構築する。
【００２２】
ｃＤＮＡライブラリーを作製せずに、ｍＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＴを用いて、ＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を直接増幅させ、こうして増幅して得られた断片を用いて、遺伝子組換え技術により、一本鎖抗体をコードするＤＮＡを構築することもできる。
【００２３】
本発明にかかる「フィブロインタンパク質」とは、フィブロインＬ鎖、フィブロインＨ鎖及びフィブロインヘキサメリン（Ｐ２５）からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質を意味する。フィブロインタンパク質は、フィブロインＬ鎖とフィブロインＨ鎖とがジスルフィド結合し、この結合した分子６個に対し１つの割合でフィブロインヘキサメリンが結合し、複合体（フィブロイン複合体）が形成されることが知られている。
【００２４】
本発明にかかる「フィブロインＬ鎖」は、分子量が約３万Ｄａのフィブロインタンパク質であり、典型例として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３７４８８．１で特定されるタンパク質のうちの１７〜２６２番目のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＭ＿００１０４４０２３．１で特定されるＤＮＡのうちの９０〜８２７番目の塩基配列からなる遺伝子）が挙げられる。また、このタンパク質は、シグナルペプチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３７４８８．１で特定されるタンパク質のうちの１〜１６番目のアミノ酸配列からなるタンパク質）が前駆体より切断、除去されることにより得られる成熟型であるから、本発明にかかる「フィブロインＬ鎖」としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３７４８８．１で特定されるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＭ＿００１０４４０２３．１で特定される遺伝子）が挙げられる
本発明にかかる「フィブロインＨ鎖」は、分子量が約３５万Ｄａのフィブロインタンパク質であり、典型例として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０６７３３．１で特定されるタンパク質のうちの２２〜５２６３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１１３２６２．１で特定されるＤＮＡのうちの６４〜１５７８９番目の塩基配列からなる遺伝子）が挙げられる。また、このタンパク質は、シグナルペプチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０６７３３．１で特定されるタンパク質のうちの１〜２１番目のアミノ酸配列からなるタンパク質）が前駆体より切断、除去されることにより得られる成熟型であるから、本発明にかかる「フィブロインＬ鎖」としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０６７３３．１で特定されるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１１３２６２．１で特定される遺伝子）が挙げられる
本発明にかかる「フィブロインヘキサメリン」は、分子量が約２．５万Ｄａのフィブロインタンパク質であり、「Ｐ２５」とも称されるフィブロインタンパク質である。その典型例として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１３９４１３．１で特定されるタンパク質のうちの１７〜２２０番目のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１４５９４１．１で特定されるＤＮＡのうちの４９〜６６０番目の塩基配列からなる遺伝子）が挙げられる。また、このタンパク質は、シグナルペプチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１３９４１３．１で特定されるタンパク質のうちの１〜１６番目のアミノ酸配列からなるタンパク質）が前駆体より切断、除去されることにより得られる成熟型であるから、本発明にかかる「フィブロインＬ鎖」としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１３９４１３．１で特定されるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１４５９４１．１で特定される遺伝子）が挙げられる
また、タンパク質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明にかかる「フィブロインタンパク質」には、このような天然の変異体も含まれる。さらに、本発明にかかる「フィブロインタンパク質」としては、前記天然のフィブロインタンパク質やその天然の変異体の全長のみならず、これらの部分的な断片であってもよい。
【００２５】
さらに、本発明にかかる「フィブロインタンパク質」としては、本発明にかかる融合タンパク質がフィブロイン複合体の一部になれればよく、前記「フィブロインＬ鎖」、「フィブロインＨ鎖」又は「フィブロインヘキサメリン」の部分的断片も本発明にかかる「フィブロインタンパク質」に含まれる。かかる部分的断片としては、例えばフィブロインＬ鎖−ＧＦＰ融合タンパク質において、下記部分的断片の有効性が実証されていることから、「フィブロインＬ鎖」においては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３７４８８．１で特定されるタンパク質のうちの１（メチオニン残基）〜２４２番目（アラニン残基）のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。また、「フィブロインＨ鎖」においては、フィブロインＬ鎖とヘテロダイマーを形成して（Ｓ−Ｓ結合を形成して）フィブロインタンパク質として分泌可能なことが確認されたフィブロインＨ鎖の最小単位であるという観点から、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０６７３３．１で特定されるタンパク質のうちの、１（メチオニン残基）〜１５３番目（アラニン残基）のアミノ酸配列からなるタンパク質及び５２０５（セリン残基）〜５２６３番目（システイン残基）のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。
【００２６】
本発明にかかる「一本鎖抗体とフィブロインタンパク質との融合タンパク質」としては、前記一本鎖抗体と、フィブロインＬ鎖、フィブロインＨ鎖及びフィブロインヘキサメリンからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質とが融合しているタンパク質であればよい。一本鎖抗体が前記フィブロイン複合体の表面上に配置され易く、より高い抗原特異性の一本鎖抗体が得られ易くなるという観点から、前記一本鎖抗体と融合させるフィブロインタンパク質は、フィブロインＬ鎖及びフィブロインＨ鎖からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質であることが好ましい。
【００２７】
フィブロインタンパク質は、一本鎖抗体のＮ末側、Ｃ末側のいずれに融合させてもよく、またＮ末側及びＣ末側、両方に融合させてもよい。さらに、直接的に一本鎖抗体に融合させてもよく、リンカーを介して間接的に融合させてもよい。リンカーペプチドの長さは、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜５０アミノ酸、より好ましくは１〜３０アミノ酸である。「一本鎖抗体とフィブロインタンパク質との融合タンパク質」には、また他の機能性タンパク質が融合されていてもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側、又は一本鎖抗体とフィブロインタンパク質との間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、融合タンパク質に付与したい機能が該融合タンパク質の精製や検出等であれば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼタンパク質、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。
【００２８】
前記融合タンパク質の絹糸における発現は、当業者は公知の手法により行うことができる。かかる公知の手法としては、前記融合タンパク質を発現させるためのベクターを構築し、該ベクターをカイコに導入して前記融合タンパク質を発現させる方法が挙げられる。
【００２９】
フィブロインタンパク質を合成・分泌するカイコの後部絹糸腺において、前記融合タンパク質を発現させる場合、前記ベクターにおいて、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡは、カイコの後部絹糸腺における発現を保証するプロモーターの下流に連結されている必要がある。このようなプロモーターとしては、例えば、フィブロインＬ鎖遺伝子、フィブロインＨ鎖遺伝子又はフィブロインヘキサメリン（Ｐ２５）遺伝子のプロモーターを好適に用いることができる。ベクターは、その他の発現制御領域、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡシグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ）等を有していてもよい。
【００３０】
また、前記ベクターにおいて、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡとその制御領域とを備えた発現カセット以外に、他のタンパク質をコードするＤＮＡ及びその発現制御領域を備えていてもよい。かかる他のタンパク質をコードするＤＮＡとしては特に制限はなく、例えば、ＧＦＰやＤｓＲｅｄ等のレポータータンパク質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子が挙げられる。他のタンパク質をコードするＤＮＡの発現制御領域は、配列内リボソーム進入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ、ＩＲＥＳ）を介して、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡのプロモータ−やエンハンサーを共有していてもよく、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現制御領域とは異なるプロモーター等を備えていてもよい。発現制御領域としては、例えば、３×Ｐ３プロモーター、カイコアクチンプロモーター、ショウジョウバエ由来のＨＳＰ７０プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡシグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ）が挙げられる。
【００３１】
前記ベクターにおける発現カセット等をカイコの染色体内に挿入することができるベクターとしては、例えば、トランスポゾンを利用したベクターを好適に用いることができる。トランスポゾンを利用したベクターとしては、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｍｉｎｏｓ、Ｍａｒｉｎｅｒ等のＤＮＡトランスポゾンを利用したベクターが挙げられる。なお、前記ベクターにおいて、かかるＤＮＡトランスポゾンの一対の末端反復配列（逆位末端反復配列）の間に前記発現カセットを配置することにより、転移酵素によって前記ベクターから該末端反復配列に挟まれた前記発現カセットが切り出され、カイコの染色体内の特定の配列（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃを用いた場合には、ＴＴＡＡ配列）を標的としてランダムに挿入されるようになる。
【００３２】
従って、かかるトランスポゾンを利用したベクターを用いる場合には、各トランスポゾンに対応した転移酵素もカイコに導入する必要がある。かかる転移酵素はそのままカイコに導入してもよく、かかる転移酵素をコードするｍＲＮＡ又はかかる転移酵素をコードするプラスミドベクター（ヘルパープラスミド）を導入してもよい。かかるヘルパープラスミドにおいて、前記転移酵素を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、内在性の転移酵素遺伝子のプロモーター、カイコアクチンプロモーター、ショウジョウバエ由来のＨＳＰ７０プロモーターが挙げられる。
【００３３】
本発明において、このように構築した前記融合タンパク質を発現させるためのベクターを導入し、該融合タンパク質が発現している絹糸を産生するカイコを調製する方法としては、例えば、該ベクター等をカイコの卵に注入し、該卵から孵化して成育させ得られたＦ０カイコを同胞交配又は野生型カイコと交配し、得られるＦ１カイコから前記融合タンパク質を絹糸に発現するカイコを選択する方法が挙げられる。
【００３４】
前記ベクター等のカイコの卵への注入は、当業者に公知の手法を適宜選択して行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＤＮＡ注入用の管を用いてカイコの発生初期卵に直接注入（マイクロインジェクション）する方法や、針やレーザー等を利用して物理的又は化学的に卵殻に穴を空けた後に、該穴から前記ベクター等を注入する方法が挙げられる。また、かかる前記ベクターをカイコの卵の注入する際に、前記転移酵素や前記ヘルパープラスミドを併せて注入してもよい。
【００３５】
Ｆ１カイコから前記融合タンパク質を絹糸に発現するカイコを選択する方法としては、例えば、前記発現ベクターとしてＧＦＰやＤｓＲｅｄ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を備えているものを用いた場合には、Ｆ１世代の卵や幼虫に励起光を照射することにより卵や幼虫から発せられる蛍光を指標に選択する方法が挙げられる。特に、３×Ｐ３プロモーターによって発現が制御されている蛍光タンパク質を利用した場合には、３×Ｐ３プロモーターは神経系統（特に眼）での遺伝子発現を促す作用を有するため、Ｆ１世代の卵や幼虫の神経系統や眼において蛍光を発する個体を選択することにより、前記融合タンパク質が発現している絹糸を産生するカイコを選択することができる。
【００３６】
このように調製した前記カイコから、一本鎖抗体とフィブロインタンパク質との融合タンパク質を発現させた絹糸を調製する方法としては、例えば、カイコの絹糸腺内腔内に蓄積された絹糸を回収する方法、カイコが吐糸した絹糸を回収する方法、またはカイコが形成した繭を回収する方法が挙げられる。
【００３７】
なお、後部絹糸腺で合成されたフィブロイン繊維は、中部絹糸腺に送られて濃縮され、さらに、ここで合成されているセリシンに包まれることになる。そして、このようにして合成された絹糸（液状絹糸）は吐糸口につながる前部絹糸腺に送られることになる。従って、絹糸腺内腔内に蓄積された絹糸（液状絹）は、絹糸腺をカイコから採取し、回収した絹糸腺から絹糸腺を構成する細胞（絹糸腺細胞）を除去することにより調製することができる。絹糸腺細胞の除去する方法としては、例えば、絹糸腺を純水に浸漬し、絹糸腺細胞をふやけさせた後に該細胞を取り除く方法、抽出した絹糸腺を３０〜１００％エタノールに浸漬し、フィブロイン及びセリシンを固定化した後に、絹糸腺細胞を除去する方法が挙げられる。
【００３８】
本発明においては、こうして調製した、一本鎖抗体とフィブロインタンパク質との融合タンパク質を発現させた絹糸を溶解する。「絹糸」は、カイコの後部絹糸腺で合成・分泌される３種のフィブロインタンパク質からなるフィブロイン繊維と、該繊維とを包むセリシン層とからなる動物繊維である。また、本発明において溶解する対象となる「絹糸」は、セリシン層が除去（精練）されていないことが必要である。
【００３９】
一本鎖抗体とフィブロインタンパク質との融合タンパク質を発現させた絹糸の溶解においては、分子内又は分子間の水素結合を切断する性質を有する溶液を好適に用いることができる。
【００４０】
かかる溶液としては、例えば、臭化リチウム水溶液、塩化カルシウム水溶液、塩化エチレンジアミン水溶液、チオシアン酸ナトリウム水溶液、チオシアン酸リチウム水溶液、硝酸マグネシウム水溶液、塩化カルシウム／エタノール、ＭＭＮＯ（Ｎ−メチルモルホリン  Ｎ−オキシド）、塩化リチウム／Ｎ，Ｎ−ＤＭＡｃ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）、ヘキサフルオロイソプロパノール、硝酸カルシウム／メタノール、又はこれらの混合溶液が挙げられる。これら水溶液の中では、溶解中にタンパク質分子の分解が確認されず、溶解時に加熱の必要がなく、また溶解にかかるコストが低いという観点から、臭化リチウム水溶液を本発明の方法において用いることが好ましい。
【００４１】
また、分子内又は分子間の水素結合を切断する性質を有する溶液のｐＨとしては特に制限はないが、ｐＨ２〜１２の溶液であることが好ましい。さらに、前記絹糸の溶解に用いられる溶液の濃度としては、通常８〜１０Ｍ、好ましくは９〜９．３Ｍである。また、前記絹糸の溶解は、２０〜１００℃で１０分〜１２時間かけて攪拌しながら行うことが好ましく、９Ｍ  臭化リチウム水溶液を用いて室温（２０〜３０℃）にて４時間程度攪拌しながら行うことがより好ましい。
【００４２】
本発明においては、こうして得られた前記融合タンパク質の溶解液に再構成処理を施す。かかる再構成処理としては、溶解により変性した前記融合タンパク質を脱塩することによって非変性状態に戻し、且つ前記融合タンパク質中のフィブロインタンパク質が内在性の他のフィブロインタンパク質（フィブロインＬ鎖、フィブロインＨ鎖、フィブロインヘキサメリン）、さらにはセリシンと複合体を構成し、フィブロインタンパク質が繊維化（ゲル化）できる処理であれば特に制限はない。かかる脱塩は、例えば、透析処理、限外濾過処理、ゲル濾過クロマトグラフィー処理、脱塩カラム処理、希釈処理、およびこれらの組合せにより行うことができる。これらの中では、フィブロインタンパク質の濃度を維持し、一定の性質のゲル化フィブロインを安価に、大量に得ることが容易であるという観点から、透析処理が好ましい。また、本発明にかかる再構成処理は、前記融合タンパク質の変性、分解、凝集等が生じにくいという観点から、４〜６０℃の条件下で実施することが好ましい。
【００４３】
「透析処理」においては、例えば、セルロース製の透析膜、多孔性のポリテトラフルオロエチレン製の透析膜、セルロースアセテート製の透析膜、セルロースナイトレート製の透析膜、再生セルロース透析膜、電解透析膜又は逆浸透膜を用いることができる。これら膜を用いて区画した前記融合タンパク質の溶解液を、任意の量の溶媒（例えば、精製水（ＲＯ水、Ｅｌｉｘ水等）、緩衝液）に１〜２４時間浸漬させる工程をシルクがゲル化するまで繰り返すことにより、透析処理を実施することができる。また、かかる緩衝液としてはその種類、ｐＨ等においても特に制限はなく、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ハンクス液が挙げられる。これらの中では、再生セルロース透析膜を用いて区画した前記融合タンパク質の溶解液（シルク溶液）を、該溶液に対して１００〜５００倍量の純水（Ｅｌｉｘ）に１２時間浸漬させる工程を５〜１０回繰り返すことが好ましい。
【００４４】
なお、かかる透析処理によって、通常、前記融合タンパク質の溶解液はゲル状（シルクゲル）となるが、ゲル化しない場合は、透析膜のまま空中に放置してタンパク質を濃縮させ、ｐＨ３〜７の緩衝液に対して透析し、又は１〜５０％の水溶性有機溶剤（エタノール、メタノール、２−プロパノール、ＤＭＳＯ，グリセリンなど）若しくはｐＨ５程度のバッファー（酢酸ナトリウム等）を加えることにより、ゲル化させることが出来る
また、本発明においては、一度再構成した抗体分子の機能（立体構造）を保持したままパウダー化できるという観点から、前記再構成処理を施した融合タンパク質の溶解液をさらに凍結乾燥して粉砕することが好ましく、また、前記再構成処理を施した融合タンパク質の溶解液をスプレードライしてパウダー化することも好ましい。さらに、前記再構成処理を施した融合タンパク質の溶解液を−２０℃に一晩、次いで−８０℃に１時間以上おいて凍結させ、さらに凍結乾燥機を用いて４８時間凍結乾燥させた後、得られた乾燥シルクをワンダーブレンダーで粉砕し、一辺が１〜４０μｍのブロック状にパウダー化することがより好ましい。
【００４５】
こうして再構成された絹糸においては、「機能的な一本鎖抗体」が発現している。ここで「機能的な一本鎖抗体」とは、抗原に対する結合性を有している一本鎖抗体を意味する。本発明により製造される一本鎖抗体は、その元になったモノクローナル抗体（親抗体）と比較して、少なくとも１０％以上（好ましくは、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上）の結合性を有する。結合性は、免疫学的手法を用いて得られる測定値（例えば、後述の図８に示すウェスタンブロッティング解析によって得られるバンドの濃さ）によって評価することができる。
【００４６】
また、本発明によれば、その元になったモノクローナル抗体（親抗体）と同程度の結合特異性を有している「機能的な一本鎖抗体」を製造することができる。結合特異性は、免疫学的手法（例えば、ウェスタンブロッティング解析）を実施した際のバックグラウンドを指標に、評価することができる。すなわち、後述の図５に示すように、バックグラウンドが少ないほど特異性が高いと評価することができる。
【００４７】
また、本発明の方法において、前記融合タンパク質の溶解の際又は前記再構成処理の際に、前記融合タンパク質の溶解液又は前記融合タンパク質を含むシルクゲルに酸化鉄ナノ粒子を添加してもよい。このように調製された酸化鉄ナノ粒子を含むシルクゲルを凍結乾燥等して粉砕することにより、酸化鉄ナノ粒子を含むシルクパウダーを得ることができ、該シルクパウダーは、磁気ビーズ抗体として目的とする抗原、ウィルス及び菌体を分離する用途等に好適に用いることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
（調製例１）
＜フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を発現する遺伝子組換えカイコベクターの構築＞
先ず、Ｓａｔｏ，Ｍ．ら、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２００５年、２７２巻、６１３１〜６１４４ページの記載に沿って、マウス  ウィスコット−アルドリッチ症候群タンパク質（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＷＡＳＰ）のＮ末端領域のＥｎａ／ＶＡＳＰ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  １（ＥＶＨ１）ドメインに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングし、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域（ＶＨ、ＶＬ）をフレキシブルなリンカー配列（アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳ×３）でつないだ一本鎖抗体（抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ）を構築した。次いで、得られたｓｃＦｖのＣ末側に発現チェック用のＭｙｃ−ｔａｇ（アミノ酸配列：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を付加した。そして、この抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントをｐＬＬＬベクターのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、フィブロインＬ鎖と抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃとの融合タンパク質を発現するＤＮＡコンストラクトを作製した。さらに、この融合タンパク質（以下「フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ」とも称する）の発現ユニットを遺伝子組換えカイコ用ベクターｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌIIサイトに挿入し、目的タンパク質を発現する組換えカイコ用プラスミドベクターｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］−ＬＬＬ−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃを構築した（図１  参照）。なお、ｐＬＬＬベクターについては非特許文献２の記載を、ｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］については非特許文献１の記載を参照のこと。また、図１に記載のＥｃｏＲＩサイトからＢｇｌIIサイトまでの塩基配列を配列表の配列番号：１にて示し、また該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号：２にて示す。なお、配列番号：１に記載の塩基配列において、１〜６ｂｐはＥｃｏＲＩサイトであり、７〜６７７ｂｐはＦｉｂ−Ｌ  Ｐｒｏ（フィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーター配列）であり、６７８〜１４０２ｂｐはＦｉｂ−Ｌ  ＯＲＦ（フィブロインＬ鎖の１位（メチオニン残基）〜２４２位（アラニン残基）からなるタンパク質をコードする塩基配列）であり、１４０３〜１７７２ｂｐはＶＨ（抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖのＶＨをコードする塩基配列）であり、１７７３〜１８１７ｂｐはｌｉｎｋｅｒ（「フレキシブルなリンカー配列（アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳ×３）」をコードする塩基配列）であり、１８１８〜２１６５ｂｐはＶＬ（抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖのＶＬをコードする塩基配列）であり、２１７２〜２２０１ｂｐはｍｙｃ−ｔａｇ（Ｍｙｃ−ｔａｇをコードする塩基配列）であり、２２０５〜２２１０ｂｐはＨｉｄIIIサイトであり、２２１１〜２６７８ｂｐはＦｉｂ−Ｌｐ（Ａ）（フィブロインＬ鎖遺伝子の３’ＵＴＲ及びポリＡシグナル）であり、２６７９〜２６８４ｂｐはＢｇｌIIサイトである。
【００５０】
（調製例２）
＜遺伝子組換えカイコの作出＞
次に、構築したプラスミドｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］−ＬＬＬ−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃと、ｐｉｇｇｙＢａｃヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧのＤＮＡ溶液（ＤＮＡの濃度が０．２μｇ／μｌになるよう０．５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０），５ｍＭ  ＫＣｌにて調製）とを、産卵後４〜１０時間のカイコ（品種：ｗ１−ｐｎｄ）の受精卵７９４個にマイクロインジェクションした。
【００５１】
なお、ｐｉｇｇｙＢａｃヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧについては非特許文献１の記載を参照のこと、また該ヘルパープラスミドには、カイコアクチンＡ３プロモーターで制御したｐｉｇｇｙＢａｃの転移酵素遺伝子がクローニングされている。そのため、前記２種類のプラスミドＤＮＡをカイコ受精卵に注入すると、ヘルパープラスミドから転移酵素が転写・翻訳され、この働きでベクタープラスミドから末端反復配列に挟まれたフラグメントが切り出され、ゲノム中のＴＴＡＡ配列を標的としてランダムに挿入されるようになる。
【００５２】
次いで、前記２種類のプラスミドＤＮＡを注入した受精卵を２５℃でインキュベーションして、幼虫を孵化させた。孵化した６５５頭の幼虫を人工飼料（日本農産工業）で飼育し、成虫に育てた。得られた成虫を兄妹交配して、１６２組の受精卵を得た。これらを産卵後６〜１０日目に蛍光顕微鏡下で観察し、胚の神経系統で赤色蛍光タンパク質の発現が認められる個体すなわち目的の組換えカイコを識別した。そして、得られた遺伝子組換えカイコ個体（以下「Ｓ０１系統」又は「Ｓ０１」とも称する）飼育を続けた。
【００５３】
（調製例３）
＜組換えカイコ産生繭におけるフィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの発現＞
前記の通りにして得られた「Ｓ０１」等由来の繭を２ｍｍ角程度に切り、繭２０ｍｇに対して９Ｍ  臭化リチウム（ＬｉＢｒ）溶液１ｍＬを加え、ローテーターで、室温、３時間撹拌して完全に溶解した。そして、１０，０００×ｇで２０分間（室温）遠心後、上清を回収し、水で２倍希釈した後、等量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加えて、６５℃で３０分間インキュベートした。調製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした後、抗フィブロインＬ鎖抗体（ａｎｔｉ−ＦｉｂＬ  ｐＡｂ、本発明者小島作製）および抗Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体（ａｎｔｉ−Ｍｙｃ  ｐＡｂ、ＭＢＬ社製）と室温で１時間反応後、ＨＲＰ−標識抗ウサギ抗体と室温で１時間反応させ、ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用いて検出した。得られた結果を図２に示す。
【００５４】
図２に示した結果から明らかなように、抗フィブロインＬ鎖抗体を用いたウェスタンブロットにおいて、遺伝子組換えカイコ  Ｓ０１由来の繭では、内在性（天然）のフィブロインＬ鎖（２７ｋＤａ）と共に抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃが融合した約６０ｋＤａのタンパク質（フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ）が強く検出された（図２のａ  参照）。さらに、抗Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロットにおいても同様に６０ｋＤａのタンパク質が強く検出されたことから（図２のｂ  参照）、今回作出した組換えカイコが産生した絹糸において、目的とする融合タンパク質（フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ）が非常に多く発現していることが確かめられた。
【００５５】
このようにして得られた遺伝子組換えカイコ  Ｓ０１由来の繭から以下に示す３種類の方法にて、融合タンパク質  フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖを調製した（図３及び図４  参照）。
【００５６】
（実施例１）
＜未精練シルクパウダーの調製方法＞
非組換え体であるｗ１−ｐｎｄ（以下「ｗ１」とも称する）由来、Ｓ０１由来及びフィブロインＬ鎖−緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の融合タンパク質（ＥＧＦＰ−Ｆｉｂ−Ｌ）を発現する組換えカイコ（未発表、以下「Ｋ２７系統」又は「Ｋ２７」とも称する）由来の繭をそれぞれ３ｇ用意し、裁断した後９Ｍ  ＬｉＢｒ溶液３０ｍＬに浸し、４時間撹拌して完全に溶解した。得られたシルク溶液を透析膜（再生セルロース膜、製品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ  ６−８０００）に入れ、精製水（ＲＯ水）８Ｌに対して１２時間×６回透析を行った。透析により得られたシルクゲルを−２０℃に一晩、次いで−８０℃に１時間以上おいて凍結させ、さらに凍結乾燥機を用いて４８時間凍結乾燥した。得られた乾燥シルクを粉砕器（製品名：ワンダーブレンダー、大阪ケミカル株式会社製）で粉砕し、未精練シルクパウダーとした。
【００５７】
（比較例１）
（繭をそのまま粉砕してパウダーにする方法）
ｗ１由来及びＳ０１由来の繭それぞれ３ｇをＲＯ水に１日浸し、−８０℃で凍結・乾燥後、そのままワンダーブレンダーを用いて粉砕した。
【００５８】
（比較例２）
＜精練シルクパウダーの調製方法＞
ｗ１由来、Ｓ０１由来及びＫ２７由来の繭をそれぞれ４ｇ用意し、８Ｍ  Ｕｒｅａ，０．５％  ２−メルカプトエタノールに浸して８０℃で３０分間撹拌してセリシンを除去した（尿素精練）。そして、ｗ１由来、Ｓ０１由来及びＫ２７由来の未精練の繭３ｇの代わりに得られた精練シルク（フィブロインのみを含む）３ｇを用いた以外は、実施例１と同様の操作によりシルクパウダー（精練シルクパウダー）を作製した。
【００５９】
このように異なる調製方法（実施例１、比較例１〜２）によって調製されたシルクパウダーについて、下記の方法にて評価した。
【００６０】
＜電子顕微鏡による観察＞
実施例１及び比較例１〜２で得られたシルクパウダーの形状に関して電子顕微鏡観察したところ、比較例１で得られた粉砕しただけのパウダーはまだ繊維状の構造をとっているが（直径１０〜１５μｍ、長さ数ｍｍ）、実施例１及び比較例２で得られた、一度溶解し、凍結乾燥・粉砕したパウダーは一辺が１〜４０μｍのブロック状の構造をとっていることが確認された（図３  参照）。
【００６１】
＜シルクパウダーの抗原特異的な結合解析＞
実施例１及び比較例２にて調製したシルクパウダーと、抗原であるＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴ及びコントロールであるＧＳＴとを各々反応させ、その後プルダウンアッセイにより、フィブロインＬ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖを有するシルクパウダーと抗原との複合体が形成されているかを調べた（図４  参照）。すなわち、各方法にて調製したシルクパウダーをそれぞれ１０ｍｇずつ量り取り、１．５ｍＬチューブに入れ、２０％エタノール溶液１ｍＬを加えてよく懸濁し、分散させた。分散後、遠心して上清のエタノール溶液を捨て、続けてブロッキング液（製品名：ブロッキングワン、ナカライテスク社製）１ｍＬを加えて室温、９０分間ローテーターにて撹拌しながらインキュベートし、非特異的な結合を抑える操作（ブロッキング）を施した。ブロッキング後、大腸菌で発現させてアフィニティー精製した組換えタンパク質ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴ（抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの抗原）をプローブタンパク質（それぞれ２０μｇ／ｍＬの濃度になるようブロッキング液にて調製）として、シルクパウダーと共に室温で６０分間ローテーターにて撹拌しながらインキュベートした。次いで、ＴＢＳＴ溶液（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で５回洗浄することにより、プルダウンアッセイを行った（図４  参照）。得られたサンプルに２×ＳＤＳサンプルバッファーを加えて１００℃で１０分間ボイルした。そして、ボイルしたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーして、抗ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。得られた結果を図５に示す。
【００６２】
図５に示した結果から明らかなように、繭をそのまま粉砕したシルクパウダー（比較例１）においては、ｗ１由来及びＳ０１由来のパウダー共に非特異的なプローブタンパク質の結合が見られたが（図５のａ  参照）、実施例１で得られたシルクパウダーでは、非特異的な結合が抑制され、Ｓ０１由来のシルクパウダーのみに抗原であるＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴとの特異的な結合が検出された（図５のｂ  参照）。従って、本発明の方法によって調製された一本鎖抗体は、抗原への結合活性が維持されており、しかも非特異的な結合が抑制されていることが明らかになった。さらに、本発明の方法によって調製された一本鎖抗体は、融合しているフィブロインＬ鎖を介して、内在性の他のフィブロインタンパク質（フィブロインＬ鎖、フィブロインＨ鎖、フィブロインヘキサメリン）及びセリシンと複合体を再構成することによりシルクパウダーの表面上に発現していることが示唆された。しかも、前述の通り、一本鎖抗体の活性をシルクパウダーの表面上で再現でき、シルクパウダーを担体として利用することもできるため、本発明の方法によって調製された一本鎖抗体を有するシルクパウダーはそのままプルダウンアッセイに供することができることも明らかになった。
【００６３】
＜シルクパウダーの抗原特異的な結合活性の評価＞
実施例１で得られたシルクパウダーに関して、さらに抗原特異性を評価するために、抗原であるＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴ、抗原部位を欠損させたＷＡＳＰとＧＳＴとの融合タンパク質であるＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＣＴ、さらにＷＡＳＰと全く相同性のないマウスの免疫系細胞で発現しているＰ２Ｘ７レセプターの細胞内ドメインとＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−Ｐ２Ｘ７−ＣＴ２の３種類を大腸菌で発現させてアフィニティー精製し、プローブタンパク質（それぞれ２０μｇ／ｍＬになるようブロッキング液にて調製）として用意した。そして、前記同様に、ｗ１由来、Ｓ０１由来、Ｋ２７由来のシルクパウダーと反応させた後、プルダウンアッセイ、並びに抗Ｍｙｃ抗体及び抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロットにより抗原−抗体反応による複合体を形成しているかを確かめた。得られた結果を図６に示す。
【００６４】
また、比較例２で得られたシルクパウダーに関しても、前記実施例１と同様に、抗原特異性を評価するために、抗原であるＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴ、ＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＣＴ又はＧＳＴ−Ｐ２Ｘ７−ＣＴ２の３種類のプローブタンパク質を用いたプルダウンアッセイにて抗原−抗体反応による複合体を形成しているかを確かめた。得られた結果を図７に示す。
【００６５】
図６に示した結果から明らかなように、実施例１で得られたシルクパウダーにおいては、Ｓ０１由来のシルクパウダーのみに抗原であるＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴとの強い結合が確認され、他のプローブタンパク質との特異的な結合はほとんど見られなかった（図６のａ  参照）。さらに抗Ｍｙｃ抗体及び抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロットにより、結合解析に用いたそれぞれのシルクパウダーの性質及び量に関してほぼ同等であることが確認された（図６のｂ及びｃ  参照）。従って、本発明の方法によって調製された、シルクパウダー上の一本鎖抗体は、優れた抗原特異性を維持して、抗体分子として機能していることが確かめられた。
【００６６】
一方、図７に示した結果から明らかなように、比較例２で得られたシルクパウダーにおいては、ｗ１由来、Ｓ０１由来及びＫ２７由来のシルクパウダーのいずれも、ＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴ、ＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＣＴ及びＧＳＴ−Ｐ２Ｘ７−ＣＴ２と結合していた。従って、精練した繭をＬｉＢr溶液に溶解し、透析して調製したシルクパウダーでは、非特異的結合が強く、抗体分子として機能しているかどうか評価することが出来なかった。
【００６７】
＜抗ＷＡＳＰ−ＥＶＨ１モノクローナル抗体を用いた免疫沈降＞
抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの親抗体である完全長の抗ＷＡＳＰモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ  ｍＡｂ）とプロテインＧセファロースとの複合体を用いたプルダウンアッセイを行い、実施例１で得られた抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖにおいて確認された抗体活性（抗原特異性や結合性）と比較した。すなわち、組換えタンパク質ＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴ、ＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＣＴ及びＧＳＴ−Ｐ２Ｘ７−ＣＴ２をそれぞれＰＢＳバッファーで２０μｇ／ｍＬに調整し、プロテインＧセファロース（ＧＥヘルスケア社製）４０μＬを加え、４℃で６０分間ローテーターにてインキュベートして、プロテインＧセファロースに非特異的に吸着する成分を取り除いた（プレクリアー）。そして、１０，０００×ｇで１０分間遠心した後、上清を回収し、そこに抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの親抗体である抗ＷＡＳＰ−ＥＶＨ１モノクローナル抗体５μｇとプロテインＧセファロース４０μＬとを加え、４℃で３時間ローテーターにてインキュベートした。次いで、ＰＢＳで５回洗浄した後、２×ＳＤＳサンプルバッファーを加えて１００℃で１０分間ボイルした。このようにして得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーして、抗ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。得られた結果を図８に示す。
【００６８】
図８に示した結果から明らかなように、実施例１で得られた抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの抗体活性は、親抗体である抗ＷＡＳＰモノクローナル抗体とほぼ同等であることが確認された。従って、本発明の方法によって調製された一本鎖抗体は、元としたモノクローナル抗体と同等である程、抗原への特異性及び結合性が高く維持されていることが明らかになった。
【００６９】
（調製例４）
＜フィブロインＨ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を発現する遺伝子組換えカイコベクターの構築＞
フィブロインＬ鎖の時と同様に、抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−ＭｙｃのＤＮＡコンストラクトをｐＨＣベクターのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩサイトへ挿入し、フィブロインＨ鎖のＮ末側の一部（ＮＴＤ）とＣ末側の一部（ＣＴＤ）の間に抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃが挟まれたような形状で融合タンパク質を発現するＤＮＡコンストラクトを作製した。さらにこの融合タンパク質の発現ユニットを遺伝子組換えカイコ用ベクターｐＢａｃ［３ＸＰ３−Ｄｓｒｅｄ２ａｆｍ］のＡｓｃＩ−ＦｓｅＩサイトに挿入し、目的タンパク質を発現する組換えカイコ用プラスミドベクターｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］−ＨＣ−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃを構築した（図９  参照）。なお、ｐＨＣベクターについては非特許文献３の記載を、ｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］については非特許文献１の記載を参照のこと。また、図９に記載のＡｓｃＩサイトからＦｓｅＩサイトまでの塩基配列を配列表の配列番号：３にて示し、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号：４にて示す。なお、配列番号：３に記載の塩基配列において、１〜８ｂｐはＡｓｃＩサイトであり、９〜１１３３ｂｐはＦｉｂ−Ｈ  Ｐｒｏ（フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーター配列）であり、１１３４〜１１７５ｂｐはＦｉｂ−Ｈ  ＮＴＤ（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ（Ｎ末端領域））の第１エクソン（フィブロインＨ鎖の１位（メチオニン残基）〜１４位（グルタミン残基）からなるタンパク質をコードする塩基配列）であり、１１７６〜２１４４ｂｐはフィブロインＨ鎖遺伝子の第１イントロンであり、２１４５〜２５６１ｂｐはＦｉｂ−Ｈ  ＮＴＤの第２エクソン（フィブロインＨ鎖の１５位（チロシン残基）〜１５３位（アラニン残基）からなるタンパク質をコードする塩基配列）であり、２５６２〜２５６７ｂｐはＢａｍＨＩサイトであり、２５６８〜２９３６ｂｐはＶＨ（抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖのＶＨをコードする塩基配列）であり、２９３７〜２９８１ｂｐはｌｉｎｋｅｒ（「フレキシブルなリンカー配列（アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳ×３）」をコードする塩基配列）であり、２９８２〜３３２９ｂｐはＶＬ（抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖのＶＬをコードする塩基配列）であり、３３３６〜３３６５ｂｐはｍｙｃ−ｔａｇ（Ｍｙｃ−ｔａｇをコードする塩基配列）であり、３３６６〜３３７１ｂｐはＳａｌＩサイトであり、３３７２〜３５５１ｂｐはＦｉｂ−Ｈ  ＣＴＤ（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ（Ｃ末端領域））（フィブロインＨ鎖の５２０５位（セリン残基）〜５２６３位（システイン残基）からなるタンパク質をコードする塩基配列）であり、３５５２〜３８５１ｂｐはＦｉｂ−Ｈｐ（Ａ）（フィブロインＨ鎖遺伝子の３’ＵＴＲ及びポリＡシグナル）であり、３８５２〜３８５９ｂｐはＦｓｅＩサイトである。
【００７０】
（調製例５）
＜遺伝子組換えカイコの作出＞
次に、構築したプラスミドｐＢａｃ［３ＸＰ３−ＤｓＲｅｄ２ａｆｍ］−ＨＣ−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃと、ｐｉｇｇｙＢａｃヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧのＤＮＡ溶液（ＤＮＡの濃度が０．２μｇ／μｌになるよう、０．５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）,５ｍＭ  ＫＣｌにて調製）を産卵後４〜１０時間のカイコ（品種：ｗ１−ｐｎｄ）の受精卵３９６個にマイクロインジェクションした。これを２５℃でインキュベーションして幼虫を孵化させた。孵化した１２６頭の幼虫を人工飼料（日本農産工業）で飼育し、成虫に育てた。得られた成虫を兄妹交配して、８５組の受精卵を得た。これらを産卵６〜１０日目に蛍光顕微鏡下で観察し、胚の神経系統で赤色蛍光タンパク質の発現が認められる個体すなわち目的の組換えカイコを識別した。得られた遺伝子組換えカイコ個体を、Ｓ０２系統又はＳ０２と呼称し、飼育を続けた。
【００７１】
（実施例２）
＜未精練シルクパウダーの調製方法＞
実施例１に記載の方法（フィブロインＬ鎖とｓｃＦｖとの融合タンパク質において抗体活性が保持されていたパウダー化の方法）に従って、未精練のＳ０２由来の繭からシルクパウダーを調製した。
【００７２】
＜組換えカイコ産生繭におけるフィブロインＨ鎖−抗ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖの発現＞
実施例１及び２にて得られた未精練シルクパウダー１０ｍｇに対して９Ｍ臭化リチウム（ＬｉＢｒ）溶液５００μＬを加え、ローテーターで室温にて３時間撹拌して完全に該シルクパウダーを溶解させた。次いで、１０，０００ｘｇ、室温にて２０分間遠心して上清を回収し、水で２倍希釈した後、等量の２ｘＳＤＳサンプルバッファーを加えて、６５℃で３０分間インキュベートした。このように調製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした後、抗フィブロインＨ鎖（ＦｉｂＨ）抗体（本発明者小島作成）、抗Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体（ＭＢＬ社製）、抗フィブロインＬ鎖（ＦｉｂＬ）抗体又は抗ＧＦＰ抗体と室温にて１時間反応させた後、ＨＰＲ−標識抗ウサギ抗体等の前記一次抗体に対応する各二次抗体と室温にて１時間反応させ、ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用いて検出した。得られた結果を図１０に示す。
【００７３】
図１０に示した結果から明らかなように、抗Ｍｙｃ抗体及び抗フィブロインＨ鎖抗体を用いたウェスタンブロットにおいて、約７０ｋＤａの大きさに目的とするＦｉｂＨ−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ融合タンパク質がＳ０２由来の未精練シルクパウダーには発現していることが確認された。なお、内在性のフィブロインＨ鎖タンパク質は３５０ｋＤａの巨大なタンパク質なので、本ウェスタンブロット解析では検出されなかった。また、ＦｉｂＨ−ａｎｔｉ−ＷＡＳＰ−ｓｃＦｖ−Ｍｙｃ融合タンパク質を構成していないフィブロインＬ鎖やＧＦＰに対する抗体を用いたウェスタンブロットにおいて、Ｓ０２由来の未精練シルクパウダーには特異的なバンドは検出されなかった。
【００７４】
＜シルクパウダーの抗原特異的な結合解析＞
実施例１及び２にて得られた未精練シルクパウダー（Ｗ１由来、Ｓ０１由来、Ｓ０２由来）を１０ｍｇずつ測り取り、１．５ｍＬチューブに入れ、２０％エタノール１ｍＬを加えよく懸濁し、分散させた後、遠心して上清のエタノール溶液を捨て、続けて、非特異的な結合を抑えるために、ブロッキング液（製品名：ブロッキングワン、ナカライテスク社製）１ｍＬを加えて室温にて９０分間ローテーターを用いて撹拌しながらインキュベートした。ブロッキング後、大腸菌で発現させた組換えタンパク質ＧＳＴ及びＧＳＴ−ＷＡＳＰ−ＮＴ（ｓｃＦｖの抗原）をプローブタンパク質（各々２０μｇ／ｍＬになるようブロッキング液にて調製）として、シルクパウダーと室温にて６０分間ローテーターを用いて撹拌しながらインキュベートした。次いで、ＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）にて５回洗浄した後、２ｘＳＤＳサンプルバッファーを加えて１００℃にて１０分間ボイルした。このように調製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーして、抗ＧＳＴ抗体、抗Ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。得られた結果を図１１に示す。
【００７５】
図１１に示した結果から明らかなように、Ｓ０１由来の未精練シルクパウダーのみならず、Ｓ０２由来の未精練シルクパウダーにおいても抗原特異的な結合活性が確認された（図１１上部パネル  ＷＢ：抗ＧＳＴ抗体  参照）。また、かかる結合活性の強さは、各々のパウダーにおける一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の発現量に比例していることが示唆された（図１１下部パネル  ＷＢ：抗Ｍｙｃ抗体  参照）。
【００７６】
以上の結果から、本発明の方法によって調製されたシルクパウダー上の一本鎖抗体は、フィブロインタンパク質のＬ鎖及びＨ鎖のいずれに融合させた形で発現させても、優れた抗原特異性を維持して、抗体分子として機能していることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
以上説明したように、本発明によれば、抗体をその結合性や抗原特異性を維持させたまま、非常に簡便に絹糸から調製することが可能となる。しかも、本発明の製造方法によって得られる一本鎖抗体は、該一本鎖抗体の元になったモノクローナル抗体（親抗体）と同程度の極めて高い結合性及び抗原特異性を有しており、さらには該一本鎖抗体に融合しているフィブロインタンパク質等から構成されるシルクパウダーを担体として利用することもできる。したがって、抗体生産・精製・担体への固定化のプロセスが簡略化され、従来の方法と比較して安価な抗体活性を利用したアフィニティー担体を提供することが可能となり、様々な病原体の検出・同定や疾病診断を目的とした新しいバイオマテリアルとしての有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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