(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４、ＡＰＥＸヌクレアーゼ及びアクチン関連タンパク質２の５種の大腸がんマーカーの組み合わせで構成されるマルチプレックス大腸がんマーカーパネル。
【請求項２】
個体由来の生体試料中の、癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４、ＡＰＥＸヌクレアーゼ及びアクチン関連タンパク質２の５種の大腸がんマーカーの測定値をそれぞれ取得することと、
前記５種の大腸がんマーカーの測定値を正規化して前記５種の大腸がんマーカーの確率スコアをそれぞれ導出し、前記確率スコアの平均値を導出することと、
前記５種の大腸がんマーカーの基準値に基づき、前記確率スコアの平均値の高低に関する評価を行うこととを含む、大腸がんマーカーの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸がんの臨床での診断及び検診の技術に関し、具体的には、マルチプレックス大腸がんマーカーパネルに関する。より具体的には、本発明は、大腸がんの判別能力が高い大腸がんマーカーの組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的な大腸がんマーカーとして、癌胎児性抗原（CEA；Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5）や糖鎖抗原１９−９（CA19-9；Carbohydrate Antigen 19-9）が知られている。これらの大腸がんマーカーは、実際に臨床現場で利用されているものの、早期診断には適していないことが実証されている。
特開２００８−１４９３７号公報（特許文献１）及びOncology Reports 2011, 25:1217-26（非特許文献１）においては、大腸がん組織のプロテオーム解析によって、新たに大腸がん関連タンパク質が同定されている。さらに、非特許文献１においては、ガレクチン１、ガレクチン３及びガレクチン４が大腸がんの血漿マーカーとして有効であることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−１４９３７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】オンコロジー・レポーツ（Oncology Reports）、２０１１年、第２５巻、ｐ．１２１７−１２２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまで報告されている大腸がんマーカーは、シングルマーカーとして用いられた場合、がん患者検出率（具体的にはSensitivity）は十分なものではない。
一方、診断の信頼性を上げる目的で、マーカーが単純に組み合わされて使用されることがある。確かに、マーカーを組み合わせることによって、がん患者検出率は向上するものの、特異度（Specificity: 健常者を健常者として正しく診断する割合）が低下する。従って、特異度の低下を最小限にとどめることが必要である。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、特異度を高く保ちながら、より早期段階に、より多くの大腸がん患者を検出することができる、統計学的知見に基づいた大腸がんマーカーの特定の組み合わせを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、特定の組み合わせにおいて、高い特異度を保ちつつ、高いがん患者検出率が認められることを見出した。このような知見は本発明において初めて見出されたものである。
本発明は、以下の発明を含む。
【０００８】
（１）
癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４、ＡＰＥＸヌクレアーゼ及びアクチン関連タンパク質２の５種の大腸がんマーカーの組み合わせで構成されるマルチプレックス大腸がんマーカーパネル。
（２）
癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４、ＡＰＥＸヌクレアーゼ及びアクチン関連タンパク質２の５種の大腸がんマーカーから任意に選択される４種の大腸がんマーカーの組み合わせで構成されるマルチプレックス大腸がんマーカーパネル。
（３）
癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９及びＡＰＥＸヌクレアーゼ；
癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９及びアクチン関連タンパク質２；
癌胎児性抗原、ガレクチン４及びＡＰＥＸヌクレアーゼ；
糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４及びＡＰＥＸヌクレアーゼ；
糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４及びアクチン関連タンパク質２；又は
糖鎖抗原１９−９、ＡＰＥＸヌクレアーゼ及びアクチン関連タンパク質２
の３種の大腸がんマーカーの組み合わせで構成されるマルチプレックス大腸がんマーカーパネル。
（４）
糖鎖抗原１９−９及びＡＰＥＸヌクレアーゼの２種の大腸がんマーカーの組み合わせで構成されるマルチプレックス大腸がんマーカーパネル。
（５）
個体由来の生体試料中の、癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４、ＡＰＥＸヌクレアーゼ及びアクチン関連タンパク質２の５種の大腸がんマーカーの測定値をそれぞれ取得することと、
前記５種の大腸がんマーカーの測定値を正規化して前記５種の大腸がんマーカーの確率スコアをそれぞれ導出し、前記確率スコアの平均値を導出することと、
前記５種の大腸がんマーカーの基準値に基づき、前記確率スコアの平均値の高低に関する評価を行うこととを含む、大腸がんマーカーの分析方法。
（６）
個体由来の生体試料中の、癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４、ＡＰＥＸヌクレアーゼ及びアクチン関連タンパク質２の５種の大腸がんマーカーから任意に選択される４種の大腸がんマーカーの測定値をそれぞれ取得することと、
前記４種の大腸がんマーカーの測定値を正規化して前記４種の大腸がんマーカーの確率スコアをそれぞれ導出し、前記確率スコアの平均値を導出することと、
前記４種の大腸がんマーカーの基準値に基づき、前記確率スコアの平均値の高低に関する評価を行うこととを含む、大腸がんマーカーの分析方法。
（７）
個体由来の生体試料中の、
癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９及びＡＰＥＸヌクレアーゼ；
癌胎児性抗原、糖鎖抗原１９−９及びアクチン関連タンパク質２；
癌胎児性抗原、ガレクチン４及びＡＰＥＸヌクレアーゼ；
糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４及びＡＰＥＸヌクレアーゼ；
糖鎖抗原１９−９、ガレクチン４及びアクチン関連タンパク質２；又は
糖鎖抗原１９−９、ＡＰＥＸヌクレアーゼ及びアクチン関連タンパク質２
の３種の大腸がんマーカーの測定値をそれぞれ取得することと、
前記３種の大腸がんマーカーの測定値を正規化して前記３種の大腸がんマーカーの確率スコアをそれぞれ導出し、前記確率スコアの平均値を導出することと、
前記３種の大腸がんマーカーの基準値に基づき、前記確率スコアの平均値の高低に関する評価を行うこととを含む、大腸がんマーカーの分析方法。
（８）
個体由来の生体試料中の、糖鎖抗原１９−９及びＡＰＥＸヌクレアーゼの２種の大腸がんマーカーの測定値をそれぞれ取得することと、
前記２種の大腸がんマーカーの測定値を正規化して前記２種の大腸がんマーカーの確率スコアをそれぞれ導出し、前記確率スコアの平均値を導出することと、
前記２種の大腸がんマーカースコアの基準値に基づき、前記確率スコアの平均値の高低に関する評価を行うこととを含む、大腸がんマーカーの分析方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、特異度を高く保ちながら、より早期段階に、より多くの大腸がん患者を検出することができる、統計学的知見に基づいた大腸がんマーカーの特定の組み合わせを提供することができる。より具体的には、被験者からの採血試料（血漿試料）中の特定の複数の大腸がんマーカーの発現定量を行うことにより、大腸がん患者を高感度に検出することができる。がん患者を高感度に検出することによって、早期判断及び適切ながん治療法の選択が可能となり、結果として患者のＱＯＬ向上に資する。また、本発明の大腸がんマーカーパネルは、大腸がん診断試薬や大腸がん診断装置へ応用することも期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）健常者（Control）及び大腸がん患者（CRC）におけるGalectin4のマーカー値分布を示したヒストグラムである。健常者についてのヒストグラムは灰色で、大腸がん患者についてのヒストグラムは黒色で示す。横軸にマーカー値、縦軸に試料数を示す。（ｂ）前記（ａ）における極値分布の累積分布関数に基づき変換されたマーカー値の確率スコアの曲線を示す。横軸にマーカー値（raw value）、縦軸に確率スコア（probability score）を示す。
【図２】マーカーの組み合わせ数の評価を示す。横軸にマーカーの組み合わせ数（Numbers of markers）、縦軸にAUC（ROC曲線下面積）値を示す。
【図３】参考例３における１００回解析におけるマーカーの組み合わせ数を５とした場合の、各マーカーの選択頻度を示す円グラフである。
【図４】参考例３における１００回解析におけるマーカーの組み合わせ数を４とした場合の、各マーカーの選択頻度を示す円グラフである。
【図５】参考例３における１００回解析におけるマーカーの組み合わせ数を３とした場合の、各マーカーの選択頻度を示す円グラフである。
【図６】参考例３における１００回解析におけるマーカーの組み合わせ数を２とした場合の、各マーカーの選択頻度を示す円グラフである。
【図７】本発明のがんマーカーパネルを構成する５種類のマーカーをそれぞれ単独で用いた場合にがんと判断された試料と、全てを組み合わせて用いた場合にがんと判断された試料とを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１．大腸がんマーカーパネル］
本発明は、特定の複数の大腸がんマーカーから構成される大腸がんマーカーパネルである。本発明の大腸がんマーカーパネルを構成する大腸がんマーカーは２〜５種類であり、いずれも、大腸がんにおいて発現亢進を示すものである。
【００１２】
５種類の大腸がんマーカーから構成される大腸がんマーカーは、癌胎児性抗原（Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5；以下「CEA」と記載する）、糖鎖抗原１９−９（以下「CA19-9」と記載する）、ガレクチン４（以下「Galectin4」と記載する）、ＡＰＥＸヌクレアーゼ（DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase；以下「APEX1」と記載する）及びアクチン関連タンパク質２（Actin-related protein 2；以下「ACTR2」と記載する）である。
【００１３】
４種類の大腸がんマーカーから構成される大腸がんマーカーは、上記の５種類の中から任意に選ばれるものである。従って、具体的には、CEA、CA19-9、Galectin4及びAPEX1と；CEA、CA19-9、Galectin4及びACTR2と；CEA、CA19-9、APEX1及びACTR2と；CEA、Galectin4、APEX1及びACTR2と；CA19-9、Galectin4、APEX1及びACTR2とが挙げられる。
【００１４】
３種類の大腸がんマーカーから構成される大腸がんマーカーは、上記の５種類の中から選ばれる特定の大腸がんマーカーである。具体的には、CEA、CA19-9及びGalectin4と；CEA、CA19-9及びAPEX1と；CEA、CA19-9及びACTR2と；CEA、Galectin4及びAPEX1と；CA19-9、Galectin4及びAPEX1と；CA19-9、Galectin4及びACTR2と；CA19-9、APEX1及びACTR2とが挙げられる。
【００１５】
２種類の大腸がんマーカーから構成される大腸がんマーカーは、上記の５種類の中から選ばれる特定の大腸がんマーカーである。具体的にはCA19-9及びGalectin4と；CA19-9及びAPEX1とが挙げられる。
【００１６】
［２．大腸がんマーカーの分析方法］
［２−１．解析対象試料］
本発明の方法においては、解析対象は個体（ヒト個体）に由来する生体試料であればよい。好ましくは、解析対象となる生体試料は採血試料である。しかしながら、採血試料以外の体液試料や組織試料を除外するものではない。
【００１７】
採血試料としては、全血、血漿、血清などが含まれる。個体から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から採血試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば、抗凝血処理及び遠心分離などが行われうる。また、マーカー値測定に直接的に供される採血試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程後に、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において採血試料は、由来元の個体に戻すことなく破棄される。
【００１８】
［２−２．測定すべき大腸がんマーカー］
本発明の方法は、上述の大腸がんマーカーパネルを構成する大腸がんマーカーの測定を行う工程を必須とする。
さらに、上述の大腸がんマーカーパネルを構成する大腸がんマーカーを測定する工程に加え、複数の大腸がんマーカーを測定する工程を行っても、高い検出率が期待できる。その一方で、組み合わすマーカーの数を増やして高い検出率を達成したとしても、特異度が低ければ臨床的に意味がなくなる。故に、各マーカー数において、100回繰り返し解析(後述)において得られたAUC(Area under the curve)値の中央値を指標として最適なマーカー数を決定することができる。
【００１９】
［２−３．大腸がんマーカー値の分析］
本発明によるがんマーカー値の分析は、大腸がんマーカーパネルを構成する各大腸がんマーカーの測定値を取得し、測定値を極値分布に基づいてシグモイド正規化したものを用いて行われる。
極値分布におけるパラメータは健常者試料のマーカー値のみを用いて決定される。各マーカーの測定値は極値分布の累積分布関数により「確率スコア」へ変換される。確率スコア（以降、単にスコアと表記する場合がある）は、あるマーカー値における大腸がん患者の確率であり、０から１まで間の値に正規化されているものである。
各マーカー測定値から導出された各スコアからは、平均値が導出される。このようにして導出されたスコア平均値が、大腸がんの判断基準となる。スコア平均値が基準値より大きければ陽性とし、スコア平均値が基準値より小さければ陰性とする。スコアの平均値が陽性であれば、試料の由来元であるヒト個体が大腸がんに罹患していると判定することができる。
【００２０】
測定値と比較されるべき基準値の具体例としては、個々の大腸がんマーカースコアの平均値の閾値が挙げられる。本発明における閾値は、人種及び年齢等に応じて予め設定することができる。閾値は、健常者グループに属する個体及び大腸がん患者グループに属する個体に由来する試料中の各大腸がんマーカーの存在量を測定し、それらの測定値を前述の正規化でスコアに変換し、平均化したものを参照することによって設定することができる。
【００２１】
閾値には、高い正診率を示すカットオフ値が選択される。好ましくは、特異度が８０％以上、例えば９５％を示すカットオフ値の中から当業者が適宜決定する事ができる。上記特異度の範囲の上限は特に限定されないが、例えば９８％とすることができる。
閾値を設定する手法は、当業者によって適宜選択されるものである。一例として、ＲＯＣ  Ｃｕｒｖｅ（受信者動作特性曲線；Receiver Operating Characteristic Curve)分析が挙げられる。
【００２２】
［２−４．測定方法］
本発明の方法において、大腸がんマーカーの測定は、好ましくは、生体特異的親和性に基づく検査によって行われる。生体特異的親和性に基づく検査は当業者に良く知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay:サンドイッチイムノ法、競合法、直接吸着法を全て含む）、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、採血試料中の大腸がんマーカーに結合する抗体を検出する。この際、大腸がんマーカーパネルを構成する全てのタンパク質に対する抗体が１つの基板表面上に固定化された大腸がん検出チップを用いてもよい。
大腸がんマーカー測定においては、測定すべき大腸がんマーカータンパク質と、その大腸がんマーカータンパク質の抗体とが免疫複合体を形成しうる条件のもと、試料を抗体に接触させることによって行われる。
イムノアッセイのより具体的なプロトコルは、当業者であれば容易に選択することができるものである。
【００２３】
上記の他、大腸がんマーカーの測定は、質量分析法に基づいて行われてもよい。質量分析法としては、定量的分析が可能な方法であれば特に限定されず、当業者によって適宜行われる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００２５】
［参考例１］
以下の参考例２及び実施例１において、血漿試料を以下のように調製した。１人につき、約15mLの血液をBDバキュテイナ（Vacutainer）採血管CPTTMに採血した。採血後、直ちに遠心分離（1700×g、4℃、20分）を行い、上清を血漿成分として得た（約5mL）。得られた血漿試料は、−80℃にて保存した。
この血漿試料は測定時に解凍し、5000〜20000倍に希釈されることによって、本発明の大腸がんマーカー濃度が測定されるべき採血試料となる。
【００２６】
［参考例２］
特開２００８−１４９３７号公報において、がん組織を用いたプロテオーム解析によって同定されたタンパク質のうち、ＥＬＩＳＡ測定系が構築された４０種類のタンパク質を、大腸がんマーカー候補とした。４０種類のタンパク質を、表１〜表８に示す。表においては、４０種類のタンパク質についての、タンパク質名（Protein Name）、遺伝子名（Gene Name）、既存のＥＬＩＳＡキット（ELISA Kit）、標準タンパク質（Standard protein）、捕捉用抗体（Capture antibody）、検出用抗体（Detection antibody）、複合酵素（Conjugated enzyme）、二次抗体（Secondary antibody）及び基質（Substrate）を示す。なお、表中のProtein Name及びGene Nameは、UniProtデータベースに登録されている名前で示されている。表中のCA19-9は、carbohydrate antigen 19-9を示す。表中の3）で表されるリコンビナントタンパク質は、Transdirect insect cell" (（株）島津製作所製)によって合成されたものである。表中の4）で表される抗体は、合成ペプチドに対して免疫して作製したものである。
【００２７】
【表１】
0005805518.tif 000002
【００２８】
【表２】
0005805518.tif 000003
【００２９】
【表３】
0005805518.tif 000004
【００３０】
【表４】
0005805518.tif 000005
【００３１】
【表５】
0005805518.tif 000006
【００３２】
【表６】
0005805518.tif 000007
【００３３】
【表７】
0005805518.tif 000008
【００３４】
【表８】
0005805518.tif 000009
【００３５】
大阪大学医学部の倫理規定に沿って患者の同意が得られた血漿試料について、以下の解析を行った。以下の解析において、検出感度(Sensitivity)は、大腸がん患者を大腸がん患者と判定する割合を表し、特異度(Specificity)は、健常者を健常者と判定する割合を表し、偽陽性度は、健常者を大腸がんと判定する割合を表す。
血漿試料は、大腸がん患者１０５名及び健常者１００名から採取した血液から参考例１に従って調製した。表１〜表８のＥＬＩＳＡ系を用い、タンパク質４０種について、大腸がん患者と健常者とにおける血漿試料中の濃度測定を行った。
【００３６】
４０種のマーカーのうち１３種類のタンパク質が、大腸がん患者と健常者との間で統計的有意差 (p < 0.05) を示した。統計的有意差を示した１３種類のタンパク質の具体的な解析結果について、表９に示す。表９においては、健常者対大腸がん患者（Control vs CRC）における、それぞれのマーカーについてのROC曲線下の面積（AUC: Area Under the Curve）及びＰ値（P value）；濃度（Concentration）及び確率スコア（Probability Score）で表したカットオフ値（Cutoff Value）；及びそのカットオフ値を用いた場合の大腸がんの各ステージ（Stage 0, Stage I, Stage II, Stage III, Stage IV）及び全てのステージ（All Stages）における感度（Sensitivity）を示している。なお、カットオフ値及び感度は、特異度(Specificity)が９５％の場合（すなわち５％の偽陽性度を許容した場合）の値を示している。また、濃度値の有意差は、Mann-Whitney testを用いた検証に基づく。大腸がんの各ステージは、ＴＭＮ分類に基づくものであり、原発性がんをStage 0（上皮内がん）、Stage I及びStage IIと表記し、リンパ節転移がんをStage IIIと表記し、Stage IVと表記する（以下においても同じ）。
表９が示すように、これら１３種類のタンパク質をそれぞれ単独で用いた場合、全がん患者（All Stages）における検出感度（Sensitivity）は最高でも４０％程度であった。すなわち、シングルマーカーとして用いた場合、検出感度が不十分であるといえる。
【００３７】
【表９】
0005805518.tif 000010
【００３８】
［参考例３］
大腸がん患者の検出率を向上させるための、組み合わせられた大腸がんマーカーの有効性について検証した。
参考例２で得られた１３種類のマーカーのほとんど全てについて、健常者におけるマーカー値は比較的低い値を示していた。一方、がん患者におけるマーカー値は比較的高い値を示したが、一部の血漿試料において極めて高い値（すなわち外れ値）を示したものも確認された。例として、図１（ａ）に、健常者及びがん患者におけるガレクチン４の濃度（マーカー値）についてのヒストグラムを示す。図１（ａ）において、横軸はガレクチンのマーカー値、縦軸は試料数を示す。図１（ａ）に示されるように、健常者群のマーカー値は極値分布関数（図１（ａ）中に曲線として示す）に良く適合している。一方、がん患者群では、一部の血漿試料において極めて高いマーカー値が確認された。このため、線形分類などを用いた単純な判別は難しいと考えられる。
【００３９】
そこで、マーカー値について極値分布に基づくシグモイド正規化を行った。極値分布におけるパラメータは、健常者試料のマーカー値のみを用いて決定し、各試料のマーカー値を極値分布の累積分布関数により、「確率スコア」（以降、単にスコアと表記する場合がある）へ変換した。得られた確率スコアの曲線を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）において、横軸はガレクチンのマーカー値（raw value）、縦軸は確率スコア（probability score）を示す。確率スコアは、あるマーカー値における大腸がん患者の確率であり、０から１まで間の値に正規化されている。従って、健常者群では観測されにくいような高いマーカー値であるほど確率スコアは１に近づく。
【００４０】
各マーカー値について同様に正規化した後、正規化された複数のスコアの平均値を大腸がん患者と健常者とを区別する指標として用いた。大腸がん患者と健常者との識別に効果的なマーカーの組み合わせを、以下のようにモンテカルロ法を用いて決定した。
例えば、マーカーを２個組み合わせた場合の解析においては、健常者試料１００のうち５０試料を選択して正規化のためのパラメータ推定を行い、残りの健常者試料５０とがん患者試料１０５のうちの５３試料とを選んで判定を行う工程を１００回繰り返した（１００回解析）。このようにして、表１〜表８の４０種類のマーカーからランダムに選択された２個のマーカーを組み合わせた場合のスコアの平均値を算出した。
また、マーカーを３個組み合わせた場合の解析においては、健常者試料１００のうち５０試料を選択して正規化のためのパラメータ推定を行い、残りの健常者試料５０とがん患者１０５試料のうちの５３試料とを選んで判定を行う工程を１００回繰り返した（１００回解析）。このようにして、表１〜表８の４０種類のマーカーからランダムに選択された３個のマーカーを組み合わせた場合のスコアの平均値を算出した。
上述の１００回解析を、マーカーを４個、５個、６個、・・・及び４０個組み合わせた場合についても同様に行い、スコアの平均値を算出した。
【００４１】
得られた結果は、受信者動作特性曲線（Receiver Operating Characteristic Curve (ROC)）を元に再評価した。マーカーの組み合わせ数（Number of markers）とROC曲線下面積（Area Under the ROC Curve (AUC)）平均値との関係を、図２に箱ひげ図で示す。図２においては、１個のマーカーを選択した場合も示している。箱ひげ図において、箱で示した範囲は選択された１００試料のうちAUC平均値のばらつきが７５％以内に収まる検体を示す。
図２より、５種類のマーカーを組み合わせた場合が最も効率的にがんを判別することが予想される結果となった。
【００４２】
上記の５種類のマーカーについての１００回解析における各マーカーの選択頻度を示したグラフを図３に示す。同様に、４種類のマーカーについては図４に、３種類のマーカーについては図５に、２種類のマーカーについては図６に示す。いずれにおいても、上位５位以内に挙がったマーカーは、糖鎖抗原１９−９（CA19-9）、ガレクチン４（Galectin4）、ＡＰＥＸヌクレアーゼ（APEX1）、癌胎児性抗原（CEA）及びアクチン関連タンパク質２（ACTR2）であった。
【００４３】
［実施例１］
参考例３において上記５位以内の高頻度で選択された５種のマーカー（CA19-9、Galectin4、APEX1、CEA及びACTR2）から２〜５種類を組み合わせたがんマーカーパネルを用い、それぞれの場合におけるがんマーカーパネルの判定能を調べた。その結果を表１０に示す。表１０においては、健常者対大腸がん患者（Control vs CRC）におけるそれぞれの組み合わせにおけるROC曲線下の面積（AUC: Area Under the Curve）；確率スコアで表したカットオフ値（Cutoff Value）；及びそのカットオフ値を用いた場合の大腸がんの各ステージ（Stage 0, Stage I, Stage II, Stage III, Stage IV）及び全てのステージ（All Stages）における感度（Sensitivity）を示している。なお、カットオフ値及び感度は、特異度が９５％の場合（すなわち５％の偽陽性度を許容した場合）の値を示している。また、本発明のがんマーカーパネルは、アスタリスクを付して示している。
【００４４】
【表１０】
0005805518.tif 000011
【００４５】
表１０における判定においては、”各マーカーでの確率スコア（Probability score）の平均値”がCut off値を上回った検体を陽性とみなしている。
AUC値は、５種類のマーカー（CA19-9、CEA、Galectin4、APEX1及びACTR2）を組み合わせた場合が最も大きく、がんと健常者の判別能力が最も高いことを確認した。その他にも、アスタリスクを付した本発明のマーカーの組み合わせ全てにおいて、従来のマーカーCEA及びCA19-9を組み合わせた場合よりも高いAUC値が確認された。
また、感度（Sensitivity）を比較すると、特に、上記の５種のマーカーを組み合わせた時に最も感度が向上した。
【００４６】
さらに、上記５種類のマーカーをそれぞれ単独で用いた場合と、組み合わせて用いた場合とで、陽性を示した血漿試料の比較を行った。その結果を図７に示す。図７中、エントリ１〜５はそれぞれマーカーを単独で用いた場合に陽性を示した試料（比較用）、エントリ６はCEA及びCA19-9の少なくともいずれかによって陽性を示した試料（CEA>5 ng/mL 及び／又はCA19-9>37 U/ mL；比較用）、エントリ７は５種類のマーカーを全て組み合わせた（all combined）場合に陽性を示した試料を、塗りつぶしたバーによって示している。星印を付した試料は、CEA及びCA19-9によって検出できなかった大腸がん試料（CRC samples could not be detected by CEA and CA19-9）を示す。なお、エントリ７においては、各マーカーの確率スコアの平均値がカットオフ値を上回る検体を陽性とみなしている。
【００４７】
図７が示すように、５種類のマーカーを全て組み合わせた場合においては、CEA及びCA19-9の少なくともいずれかを用いた場合に比べ、特に早期ステージ（Stage 0及びStage I）のがん患者において感度が著しく向上することが分かった。従って、Galectin4、APEX1及びACTR2を用いることによって、確立された大腸がんマーカーであるCEAやCA19-9では検出できない比較的早期ステージの検体を相補的に検出できていることがわかった。
【図３】
0005805518.tif 000012
【図４】
0005805518.tif 000013
【図５】
0005805518.tif 000014
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図７】
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