(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルが心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる患者由来か否かを検出するためのインビトロ法であって、以下の段階：
−アミノ末端ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸５０〜９０からなる中間領域内の異なる２つの部分配列に夫々特異的に結合する２つの抗体を用いて、前記サンプル中の前記アミノ末端ｐｒｏＡＮＰの中間領域、又はその部分ペプチドを決定すること、
−上記決定されたアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ値又はその部分ペプチドの値が、ＢＭＩとは独立のカットオフ値１９０〜２６０ｐｍｏｌ／ｌより高い場合に前記サンプルが前記患者由来であることを検出すること、
を含むインビトロ法。
【請求項２】
上記心疾患は慢性心不全、急性心不全、急性冠状動脈症候群及び心筋梗塞を含む群から選択される、請求項１に記載のインビトロ法。
【請求項３】
前記検出が医療診断のために使用される、請求項１又は２に記載のインビトロ法。
【請求項４】
上記患者は呼吸困難の症状を示し、及びそれゆえ心不全を有することが疑われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロ法。
【請求項５】
上記患者又は上記患者群は３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有し、及び上記サンプルは３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者により提供される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインビトロ法。
【請求項６】
上記検出が予測のために使用される、請求項５に記載のインビトロ法。
【請求項７】
上記疾患は慢性心不全である、請求項５又は６に記載のインビトロ法。
【請求項８】
患者の提供されたサンプルは血漿、血清、血液及び尿を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のインビトロ法。
【請求項９】
上記方法は他のマーカー及び／又は方法と共に行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のインビトロ法。
【請求項１０】
少なくとも１の他のマーカーは患者のサンプルにおいて決定され、上記マーカーは炎症マーカー、心血管マーカー、及び虚血マーカーを含む群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のインビトロ法。
【請求項１１】
上記炎症マーカーはＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、サイトカイン、インターロイキン、プロカルシトニン１−１１６、又は１２−１１６アミノ酸若しくは１００−１１６アミノ酸を有するそのペプチド、及び接着分子を含む群から選択される、請求項１０に記載のインビトロ法。
【請求項１２】
上記心血管マーカーはミエロペルオキシダーゼ、ｐｒｏＢＮＰ全体又はＢＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含む長さが少なくとも１２アミノ酸残基のｐｒｏＢＮＰのペプチド断片、ｐｒｏ−エンドセリン−１、ｐｒｏアドレノメヂュリン、ｐｒｏバソプレッシン、ｐｒｏ−ガストリン−放出ペプチド（ｐｒｏＧＲＰ）、ｐｒｏレプチン、ｐｒｏ−神経ペプチド−Ｙ、ｐｒｏ−ソマトスタチン、ｐｒｏ神経ペプチド−ＹＹ、ｐｒｏ−オピオメラノコルチンを含む群から選択される、請求項１０に記載のインビトロ法。
【請求項１３】
上記虚血マーカーはトロポニンＩ又はＴ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビンを含む群から選択される、請求項１０に記載のインビトロ法。
【請求項１４】
上記方法は免疫クロマトグラフィーとして行われる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のインビトロ法。
【請求項１５】
上記サイトカインがＴＮＦ−アルファである、請求項１１に記載のインビトロ法。
【請求項１６】
上記インターロイキンがＩＬ−６である、請求項１１に記載のインビトロ法。
【請求項１７】
上記接着分子がＶＣＡＭである、請求項１１に記載のインビトロ法。
【請求項１８】
上記接着分子がＩＣＡＭである、請求項１１に記載のインビトロ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる患者のための医療診断、予測及び治療フォローアップのためのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）法であって、以下の段階：
−心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる患者のサンプルを提供すること、
−アミノ末端ｐｒｏＡＮＰの部分配列に特異的に結合する少なくとも１の抗体を用いて前記サンプル中のアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ又は１２〜９８アミノ酸を有するその部分ペプチドを決定すること、
−上記決定されたアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ値又はその部分ペプチドの値を臨床像に帰属させること、ここで、上記帰属は上記患者のＢＭＩに独立に行われること
を含むインビトロ法に関する。
【０００２】
本発明は本発明に係る方法を行うための迅速試験アッセイ及び本発明にしたがう方法及びアッセイに好適な抗体の使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
心不全（ＨＦ）は一般的で、高い罹患率及び死亡率に関連し、及び特に救急部（ＥＤ）において診断することが難しい［Ｃｌｅｌａｎｄ，  Ｊ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ，  ２００３．  ２４（５）：ｐ．４４２−６３；  Ｍｏｓｔｅｒｄ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅａｒｔ，  ２００７．  ９３（９）：ｐ．１１３７−４６］。呼吸困難はほとんどのＨＦ患者の主な症状である。残念ながら、患者の病歴も身体的検査もＨＦのための呼吸困難を肺疾患の如き他の原因のための呼吸困難から正確に区別することはできない［Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ，  ２００５．２１（１１）：ｐ．９２１−４；Ｗａｎｇ，  Ｃ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊａｍａ，  ２００５，  ２９４（１５）：ｐ．１９４４−５６］。しかしながら、正確な診断は最も適切な治療選択のために必須である。
【０００４】
Ｂ−型ナトリウム利尿ペプチドはＨＦの診断において非常に有用であることが示されているＨＦの定量的マーカーである。Ｂ−型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）及びそのアミノ末端断片、Ｎ末端ｐｒｏ−Ｂ−型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）の使用はＥＤにおける診断の正確さを顕著に増加させ［Ｊａｎｕｚｚｉ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｊｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ，  ２００５．  ９５（８）：ｐ．９４８−５４；  Ｍａｉｓｅｌ，  Ａ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００２．  ３４７（３）：  ｐ．１６１−７］、及びそれにより患者の診察及び治療を改善する［Ｍｏｅ，  Ｇ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ２００７．  １１５（２４）：ｐ．３１０３−１０；  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００４．  ３５０（７）：ｐ．６４７−５４］。
【０００５】
循環中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の濃度はＢＮＰより約５０〜１００倍高い［Ｐａｎｄｅｙ，  Ｋ．  Ｎ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ２００５．  ２６（６）：ｐ．９０１−３２］。それゆえ、増加されたＡＮＰにより反映される生物学的シグナルは病態生理的に及びそれゆえ診断的にＢＮＰのシグナルよりさらにより重要でありうる。これにかかわらず、ＡＮＰ及びその前駆体の診断パフォーマンスについてはほとんど知られていない［Ｃｏｗｉｅ，  Ｍ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  １９９７．  ３５０（９０８８）：ｐ．１３４９−５３］。成熟ＡＮＰは前駆体Ｎ末端−ｐｒｏＡＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）に由来し、それは上記成熟ペプチドより循環中で顕著により安定であり、及びそれゆえより信頼性のある分析物であると考えられる［Ｖｅｓｅｌｙ，  Ｄ．Ｌ．，  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，  ２００２．５３（３）：ｐ．１５３−９］。それにもかかわらず、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰはさらなる断片化を受けうるという事実のために［Ｃａｐｐｅｌｌｉｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，  ２００１．３１０（１）：ｐ．４９−５２］、中間領域ｐｒｏＡＮＰ（ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ）の計測のための免疫分析は利点を有しうる［Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ，  Ｎ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，  ２００４．５０（１）：ｐ．２３４−６］。
【０００６】
慢性心不全（ＣＨＦ）、急性心不全、急性冠状動脈症候群及び心筋梗塞の如き心疾患は広く広がり、及びしばしば破壊的な予後を有する。心疾患の初期予測は折よい予防的な及び治療的な計測をとおして患者の転帰を改善しうる［Ｊｏｒｔａｎｉ，  Ｓ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：２６５−２７８］。豊富なデータは、ナトリウム利尿ペプチドの評価が疑わしい心疾患についての臨床診断及び予測を確実にすることにおける胸部Ｘ−線、心電図、及びドップラー超音波心臓検査への有用な追加を示すことを示唆する［Ｃｏｗｉｅ，  Ｍ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ２００３；２４：１７１０−１７１８］。ナトリウム利尿ペプチドのファミリーの最も重要なメンバーは心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）及びＢ−型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である。両方とも心臓機能のマーカーである。ＣＨＦの診断の確立を助けることにおける使用に加えて［Ｃｏｗｉｅ，  Ｍ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  １９９７．３５０（９０８８）：ｐ．１３４９−５３；  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００４．  ３５０（７）：ｐ．６４７−５４］、それらは安定な又は近頃代償不全になったＣＨＦを有する［Ｏｍｌａｎｄ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９６；９３：１９６３−１９６９；，  Ａｎａｎｄ，  Ｉ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００３；１０７：１２７８−１２８３；  Ｃｈｅｎｇ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２００１，  ３７：３８６−３９１］又は急性冠状動脈症候群を有する［Ｍｏｒｒｏｗ，  Ｄ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＭＡ  ２００５，  Ｄｅｃ．  １４；  ２９４（２２）：２８６６−７１］患者の危険層別において使用され、及びさらに、ＣＨＦ治療におけるフォローアップ及びガイダンスにおいて使用される［Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎ，  Ｒ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ２０００，  ３５５：１１２６−１１３０］。
【０００７】
ＢＮＰ及びその前駆体の他の切断生成物、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）はＣＨＦを有する患者の診断において現在使用される。ＡＮＰはその前駆体ｐｒｏＡＮＰの切断から生ずる。他の切断生成物、Ｎ末端ｐｒｏＡＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）はＡＮＰより循環中で顕著により安定である。それゆえ、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰは先行技術においてより信頼性のある分析物であることが示唆されている［Ａｌａ−Ｋｏｐｓａｌａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，  ２００４．  ５０（９）：ｐ．１５７６−８８］。しかしながら、Ｎ末端ｐｒｏ−ペプチドのＮ及びＣ末端領域は酵素分解をとおして変えられうる［Ｓｅｉｄｌｅｒ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９９，２５５：４９５−５０１］。一般に、ＢＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰはＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＡＮＰより心不全を有する患者における診断及び予測に、より好適であると考えられる。この理由はＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの決定はあまり再現性がないと考えられること、及びほとんどの適用されるアッセイ設計における概念上の不備は循環分析物の量の部分的な過小評価を導くことでありうる［Ｙｏｓｈｉｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９６；１３５：２６５−２６８；  Ｖｅｓｅｌｙ，  Ｄ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，  ２００２．  ５３（３）：ｐ．１５３−９］。
【０００８】
通常、１２８アミノ酸を含むｐｒｏ−ホルモン（ｐｒｏＡＮＰ；配列ＩＤ番号：２）のＣ末端部分の２８アミノ酸（９９−１２６）を含むペプチドは実際のホルモンＡＮＰと呼ばれる。そのｐｒｏ−ホルモンｐｒｏＡＮＰからのＡＮＰの放出に際して、等モル量のｐｒｏＡＮＰの残りのより大きな部分ペプチド、９８アミノ酸から成るＮ末端ｐｒｏＡＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ；ｐｒｏＡＮＰ（１−９８））は循環中に放出される。ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰは顕著により大きな半減期及び安定性を有するので、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰは心疾患における診断、フォローアップ及び治療制御のための研究室パラメーターとして使用されうる。上記主題へのより深い洞察については：Ｌｏｔｈａｒ  Ｔｈｏｍａｓ（Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｌａｂｏｒ  ｕｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｅ，  ５ｔｈ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｅｄ．，  ｓｕｂ−ｃｈａｐｔｅｒ  ２．１４  ｏｆ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  Ｋａｒｄｉａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ，  ｐａｇｅｓ．  １１６−１１８、及びその中に引用される文献を参照のこと。
【０００９】
生物学的液体（血清、血漿、尿）中のＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの決定についてはもちろん、ＡＮＰそれ自体の決定についても両方とも、さまざまな免疫分析が過去に開発されており、及び臨床研究及び実施において適用されている。ＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの決定のための上記免疫分析の主要な部分は拮抗免疫分析の既知の原理に基づき、その最もよく知られるものは放射性免疫分析（ＲＩＡ）である。ｐｒｏＡＮＰ及びＡＮＰの決定のための拮抗免疫分析は例えば、［Ｃａｐｐｅｌｌｉｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，  ２００１．  ３１０（１）：ｐ．４９−５２］及び［Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９８８，  ６（ｓｕｐｐｌ  ４）Ｓ３０９−Ｓ３１９；Ｍｅｌｅａｇｒｏｓ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｖｏｌ．１０，５４５−５５０，１９８９；  Ａｍｉｒ  Ｌｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  １９９３，  ３４１：１１０５−０９，１９９３；Ｊｏｈｎ  Ｇ  Ｆ  Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅａｒｔ  １９９６，  ７５：４１０−４１３；Ｍａｒｔｉｎ  Ｇ．  Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）９７：６８９−６９５］中で示され又は使用される。
【００１０】
拮抗免疫分析でのＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの決定のためのＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ  １−９８；配列ＩＤ番号：１）のさまざまな配列を認識するさまざまな抗体の使用により、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（ｐｒｏＡＮＰ  １−９８）の分解生成物に対応するさまざまなペプチドが生物学的液体、詳細には血液又は尿中に現れることが解釈された。特に、低分子断片、詳細にはｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列１−３０、３１−６７及び７９−９８がそれらの免疫活性のために示されている断片がＮＴ−ｐｒｏＡＮＰから形成されることが解釈されている（ｃｆ．  例えば、Ｍ．  Ｇ．  Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  １９１（１９９０）１−１４；  Ｊ．Ｂ．  Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９５，  ５５：４４７−４５２；  Ｒｏｓｅ  Ｍ．  Ｏｖｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  Ｓｅｒｕｍ；  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｖｏｌ．１７，  １１５５−１１６２，  １９９６；Ｓｒｅｅｄｅｖｉ  Ｄａｇｇｕｂａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６（１９９７）２４６−２５５；Ｅ．  Ｆ．  Ｍａｃａｕｌａｙ  Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９８；５８：２０５−２１６；  Ｍａｒｔｉｎａ  Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｖｏｌ．５８（２０００），３７４−３８３，  Ｆｕｍｉａｋｉ  Ｍａｒｕｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  Ｕｒｉｎｅ；  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １３７：２３１−２３６（１９８５）及び  Ｅｎｇｅｌｂｅｒｔ  Ｈａｒｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２０００，  ３８（１９）：２７−３２）。
【００１１】
上記に挙げられる配列を特異的に認識する拮抗免疫分析は同じ様式で−異なるアビディティに基づく影響又は可能性のあるコンフォメーション上の影響を無視して−全長ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰをいつも認識し、及びそれゆえＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ及びその断片を区別しない。
【００１２】
拮抗免疫分析とは対照的に、非拮抗サンドウィッチ免疫分析はいくつかの利点を示す。例えば、それらはより容易に固体相分析（不均一分析）として解釈されることができ、よりエラー強く、より大きな感度を有する計測結果を提供し、ほとんどクロス−反応性を示さず、及び自動化及び連続計測により好適である。さらに、上記サンドウィッチ形成のために使用される抗体についての両方の結合基が同じ分子内に存在する分子及び／又はペプチドのみを認識することにより、サンドウィッチ免疫分析は１つの型のみの抗体を適用する拮抗免疫分析に比較してわずかに異なる結論を導きうる。例えば、上記結合領域が異なる部分ペプチド（分解生成物、断片）上に位置される場合、上記断片への上記抗体の結合は完全な「サンドウィッチ」について典型的な計測シグナルを導かないであろう。
【００１３】
分解生成物及び断片の影響なしに完全なＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのみを選択的に計測する可能性のためはもちろん、原理におけるサンドウィッチ免疫分析の既知の利点のために、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの決定のためのサンドウィッチ免疫分析は臨床研究及び実施において既に示され及び適用されている。例えば、ＥＰ  ７２１  １０５  Ｂ１は２つのモノクローナル抗体を用いた、詳細には心疾患及び慢性腎不全の診断領域におけるｐｒｏＡＮＰの決定のためのサンドウィッチ免疫分析を示し、上記２つのモノクローナル抗体のうちの１つはｐｒｏＡＮＰのアミノ酸１−２５に結合し（ＥＰ  ３５０  ２１８  Ｂ１と比較せよ）、及びそのうちの他方はｐｒｏＡＮＰのアミノ酸４３−６６に結合する。この種類のサンドウィッチ免疫分析により、少なくともｐｒｏＡＮＰ配列のはじめの６６アミノ酸を含む、ｐｒｏＡＮＰ部分ペプチドのみが検出され又はｐｒｏＡＮＰ（１−９８）の存在下で共検出される。
【００１４】
この点で同様である他のサンドウィッチ免疫分析は［Ｍａｔｓ  Ｓｔｒｉｄｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ  １０２，  ９９−１０８，  Ｖｏｌ．  １８：１２０１−１２０３］中に示される。このサンドウィッチ免疫分析もまた２つのモノクローナル抗体を使用し、そのうちの１つはｐｒｏＡＮＰのアミノ酸１−３０に結合し、一方で他方はアミノ酸７９−９８に結合する。ｐｒｏＡＮＰ（１−９８）の末端での結合領域の選択のために、このサンドウィッチ免疫分析は無傷のｐｒｏＡＮＰ（１−９８）のみを検出するであろうことが想定されうる。
【００１５】
ＷＯ  ００／１９２０７はｐｒｏＡＮＰ（１−９８）の決定方法を示し、ここでｐｒｏＡＮＰ（１−９８）配列のアミノ酸配列８−２７、３１−６４又は７９−９８に結合する３つのポリクローナル抗体のうちの２つが使用される。ＷＯ  ００／１９２０７の出願者により商業的に提供されるｐｒｏＡＮＰ（１−９８）の決定のためのアッセイはその固定された抗体がｐｒｏＡＮＰのアミノ酸１０−１９を認識し、一方でアミノ酸（８５−９０）を認識する二次ポリクローナル抗体は検出のために使用される、１対のアフィニティ精製ポリクローナルヒツジ抗体を用いる酵素免疫分析である（ＢＩＯＭＥＤＩＣＡ，  Ａ−１２１０  ＷｉｅｎによるサンドウィッチアッセイｐｒｏＡＮＰ（１−９８）の操作マニュアルと比較せよ）。したがって、このアッセイもまた全長ｐｒｏＡＮＰ（１−９８）の末端を含むペプチド種、すなわち、完全な又はほぼ完全なＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのみを認識する。
【００１６】
先行技術中に示される全ての拮抗アッセイ又はサンドウィッチ原理を適用するアッセイは心臓診断についてのアッセイとして基本的に開発され、又は心臓診断の文脈において使用されていて、それにより慢性腎不全はさらなる診断適用として挙げられている（ＥＰ  ７２１  １０５  Ｂ１及び引用［Ｂｕｃｋｌｅｙ  ＭＧ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＭ．  Ｊ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  １９９０  Ｄｅｃ．，  ３（１２Ｐｔ１）：９３３−９３５］と比較せよ）。
【００１７】
さらに、ｐｒｏＡＮＰの中心領域（アミノ酸５３−７３）の決定のための新規サンドウィッチ免疫分析が開発されており、その計測結果は上記ペプチドの推定末端トランケーションにより影響されない［Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０，  Ｎｏ．１，  ２００４，  ｐａｇｅｓ  ２３４−２３６］。
【００１８】
特に救急部（ＥＤ）における医療実施者に信頼性のある情報を提供する、心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる患者についての医療診断、予測及び治療フォローアップのためのインビトロ法を提供することが本発明の目的であった。
【００１９】
したがって、本発明は、心疾患を有する又は心疾患を発展すること又は有することが疑われる患者についての医療診断、予測及び治療フォローアップのためのインビトロ法であって、以下の段階：
−心疾患を有する又は心疾患を発展すること又は有することが疑われる患者のサンプルを提供すること、
−アミノ末端ｐｒｏＡＮＰの部分配列に特異的に結合する少なくとも１の抗体を用いて前記サンプル中でアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ又は１２〜９８アミノ酸を有するその部分ペプチドを決定すること、
−上記決定されたアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ値又はその部分ペプチドの値を臨床像に帰属させること、ここで上記帰属は上記患者のＢＭＩに独立に行われること
を含むインビトロ法からなる。
【００２０】
好ましくは、本発明にしたがうインビトロ法は行われ、ここで臨床像への帰属はＢＭＩに独立のカットオフ値を活用して行われる。
【００２１】
臨床像への帰属は、上記決定されたアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ値又はその部分ペプチドの値が心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる患者についての医療診断、予測又は治療フォローアップに使用されることを意味し、ここで上記使用は上記患者のＢＭＩに独立に行われる。
【００２２】
上記患者の心疾患は、非限定的に、慢性心不全、急性心不全、急性冠状動脈症候群又は心筋梗塞から選択されうる。
【００２３】
本発明の１つの態様において、上記疾患は診断され、したがって、前記方法は医療診断のための方法である。
【００２４】
本発明の１つの好ましい態様において、上記心疾患は心不全である。本発明にしたがうインビトロ法は特に呼吸困難の症状を示し、それゆえ心不全を有することが疑われる患者についてよく適し、且つ信頼性があり、及び上記臨床像は診断される。救急部を訪れる患者の診察及び対応は本発明にしたがう方法により促進される。正確な診断は上記患者にとって最も適切な治療選択のために必須である。それゆえ、本発明は肺疾患の如き他の原因による呼吸困難から心不全による呼吸困難を正確に区別する要求を満たす。本発明にしたがう方法はそれゆえ、心不全についての診断の正確さを顕著に改善する。
【００２５】
ＢＮＰの濃度はもちろんＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの濃度は健康な集団中で増加するＢＭＩと共に減少されることが示されている［Ｗａｎｇ，  Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ２００４．  １０９（５）：ｐ．５９４−６００］。上記著者はそれゆえ、ナトリウム利尿ペプチドはむしろ肥満患者におけるマーカーとして好適でないことを推理する（「第２に、研究に値する推測だが、血しょうナトリウム利尿ペプチド濃度は肥満者における心不全又は左心室機能障害の有用性の低いマーカーであり得る。」“Ｓｅｃｏｎｄ，  ｐｌａｓｍａ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｍａｙ  ｂｅ  ａ  ｌｅｓｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｒ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｂｅｓｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，  ａ  ｓｐｅｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｍｅｒｉｔｓ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．”）。
【００２６】
驚くべきことに、心疾患（慢性心不全）を有するある患者のサブ集団、すなわち、３０ｋｇ／ｃｍ2以上のＢＭＩ（ボディマスインデックス）を有するサブ集団について、詳細にはこれらの患者から生ずる生物学的サンプル中のアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ又はそれに由来する部分ペプチドの決定は信頼性のある予測を可能にすることが本発明の文脈中で発見されている。これはまさにＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．がナトリウム利尿ペプチドがあまり有用でないマーカーでありうることを推理したサブ集団である。ＢＮＰもまた慢性心不全の入院患者中の肥満患者のサブ群において予測価値を有することが近年の出版物中で示されている［Ｈｏｒｗｉｃｈ，  Ｔ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２００６，  Ｊａｎ．  ３，  ４７（１）：８５−９０；Ｅｐｕｂ  ２００５，  Ｄｅｃ．  １５］。本発明の文脈において、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰはＢＮＰアナログＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに比較して患者の前記サブ集団の予測の点でより信頼性があったことが驚くべきことに発見されている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの配列を示す。
【図２】ｐｒｏＡＮＰの配列を示す。
【図３−１】２８７人の患者の基礎的な特徴を示す表；ｃＧＲＦ＝見積もられた腎糸球体ろ過率；ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ＝中間領域ｐｒｏ−心房性ナトリウム利尿ペプチド；ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ＝Ｎ末端ｐｒｏ−Ｂ−型ナトリウム利尿ペプチド
【図３−２】図３−１の続き。
【図４】心不全により引き起こされる呼吸困難を有する患者（ｎ＝１５４）及び他の原因に帰することができる呼吸困難を有する患者（ｎ＝１３３）についてのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ及びＭＲ−ｐｒｏＡＮＰの値を示すボックスプロット；全てｐ＜０．００１。
【００２８】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ＝Ｎ末端ｐｒｏ−Ｂ−型ナトリウム利尿ペプチド；ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ＝中間領域ｐｒｏ−心房性ナトリウム利尿ペプチド。
【００２９】
ボックスは２５パーセント〜７５パーセントを示すが、一方で線は、分離された点として示されるアウトライアーを除いた、最小〜最大濃度を示す。
【図５】ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰによる心不全の予測についてのロジスティック回帰分析を示す表；ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ＝中間領域ｐｒｏ−心房性ナトリウム利尿ペプチド；ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ＝Ｎ末端ｐｒｏ−Ｂ−型ナトリウム利尿ペプチド。ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰによる心不全の予測についてのロジスティック回帰分析を示す表。
【図６ａ】呼吸困難を有する患者における心不全を診断するためのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ及びＭＲ−ｐｒｏＡＮＰの正確さについてのレシーバー操作特徴的（ＲＯＣ）曲線。曲線下領域（ＡＵＣ）：ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰについて＝０．９２；ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰについて＝０．９２（比較のためにｐ＝０．７９１）。
【図６ｂ】心不全の検出における救急部（ＥＤ）可能性、ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ、及び両方についてのレシーバー操作特徴的（ＲＯＣ）曲線。（曲線下領域（ＡＵＣ）：ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰについて＝０．９２；ＥＤ可能性について＝０．９０；組み合わせについて＝０．９６；ＥＤ可能性及びＥＤ可能性とＭＲ−ｐｒｏＡＮＰの組み合わせの比較についてｐ＝０．０１６）
【図７】心不全の検出における臨床判断（心不全についての高い救急部可能性）、２０６ｐｍｏｌ／Ｌのカットオフ値を用いたＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ、及び両方の組み合わせの診断の正確さ（ｐ＜０．００１）。
【図８】ボディマスインデックス（ＢＭＩ）によりグループ化された、心不全を有する及び有しない患者における平均ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ及びＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ値。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に、本発明の好ましい態様はインビトロ法に関して示され、ここで上記患者又は上記患者群は３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有し、及び上記サンプルは３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者により提供される。
【００３１】
本発明の主題は本発明にしたがうインビトロ法であり、ここで上記患者又は上記患者群は３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有し、及び上記サンプルは３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者により提供される。
【００３２】
したがって、本発明の主題は以下の段階：
−心疾患を有する又は心疾患及び３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを来たすこと又は有することが疑われる患者のサンプルを提供すること、及び
−アミノ末端ｐｒｏＡＮＰの部分配列に特異的に結合する少なくとも１の抗体を用いて前記サンプル中のアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ又はその部分ペプチドを決定すること
を含む、心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる患者及び３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者についての医療診断、予測及び治療フォローアップのためのインビトロ法である。
【００３３】
本発明にしたがう方法は慢性心不全を有する患者における診断、予測及び治療フォローアップに特に好適である。
【００３４】
本発明にしたがう方法は慢性心不全を有する及び３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者における診断、予測及び治療フォローアップに特に好適である。本発明にしたがう方法は心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる及び３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者についての予測に、特に上記疾患が慢性心不全である場合、特によく適合される。
【００３５】
この患者群、すなわち、心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる及び３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者において、特に上記疾患が慢性心不全である場合、本発明にしたがう方法は好ましくは（推定上）無症候性でない患者について行われる。
【００３６】
特に好ましい態様において、３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者群における死亡率予測についての最適閾値は１９０〜２１０、好ましくは１９５〜２０５の範囲内、最も好ましくは１９９ｐｍｏｌ／ｌである。群ＢＭＩ＜３０についての最適閾値は２３１ｐｍｏｌ／ｌであった。自然に、閾値の絶対値は使用されるアッセイ及び較正方法に因り変化する。本明細書中で挙げられる閾値は［Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０，  Ｎｏ．１，  ２００４，  ｐａｇｅｓ２３４−２３６］中の結果を決定するために使用されたのと同じアッセイ及び同じ較正により見積もられた。
【００３７】
驚くべきことに、本発明にしたがう方法においてＢＭＩ＞３０の患者についての最適閾値はＢＭＩ＜３０の患者についてより低いことがわかった。したがって、本発明の主題の本質は詳細にはＢＭＩ＞３０の患者についての根底にある閾値がＢＭＩ＜３０の患者についてより低い本発明にしたがうインビトロ法である。
【００３８】
１つの反応バッチにおける１０倍の定量からある計測値をもたらす変化係数として定義される上記アッセイのイントラ−アッセイ変化係数は好ましくは全ての計測値について最大１０％である。この値を超えることは閾値についての計測値の誤った帰属を導き、それゆえ誤った結論を導きうるので、この値を超えることは不利益である。
【００３９】
それゆえ、本発明にしたがうインビトロ法は３０ｋｇ／ｍ2未満のＢＭＩを有する患者で及び３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者で行われうる。１９０〜２６０ｐｍｏｌ／ｌの、好ましくは１９５〜２４０ｐｍｏｌ／ｌの閾値は患者のＢＭＩに独立に本発明に係る方法に好適である。しかしながら、本発明の好ましい態様において、３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩの患者についての閾値はそれが１９０〜２１０、好ましくは１９５〜２０５の範囲内、最も好ましくは１９９ｐｍｏｌ／ｌであるように選択される。群ＢＭＩ＜３０についての最適閾値は２３１ｐｍｏｌ／ｌである。
【００４０】
詳細には、患者により提供されるサンプルは血漿、血清、血液又は尿である。
【００４１】
本発明にしたがって、上記抗体はポリクローナル抗体はもちろんモノクローナルである。したがって、少なくとも１つの抗体はモノクローナル又はポリクローナル抗体である。
【００４２】
ポリクローナル抗体、詳細にはアフィニティ精製ポリクローナル抗体が好ましい。
【００４３】
アミノ酸５０〜アミノ酸９０にまたがるアミノ末端ｐｒｏＡＮＰの中間領域がサンプル中のアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ又はその部分ペプチドの決定のために使用される、本発明にしたがう方法は特に好ましい。
【００４４】
他の特に好ましい態様において、サンプル中のアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ又はその部分ペプチドは２つの抗体を適用するサンドウィッチ免疫分析で決定される。詳細には、これはアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ又はその部分ペプチドがＮ末端ｐｒｏＡＮＰの異なる部分配列に特異的に結合する２つの抗体の使用により決定される場合好ましい。
【００４５】
上記抗体のうち１つはｐｒｏＡＮＰのアミノ酸５３−７２を含む合成ペプチド配列を含む抗原で動物に免疫性を与えることにより得られること、及び上記他方の抗体はｐｒｏＡＮＰのアミノ酸７３−９０を含む合成ペプチド配列を含む抗原で動物に免疫性を与えることにより得られることが特に好ましい。他の態様において、ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸５３−７２を含む合成ペプチド配列は追加のＮ末端システイン基を有する。他の好ましい態様において、上記他方の抗体は追加のＮ末端システイン基を伴うｐｒｏＡＮＰのアミノ酸７２−９０又は７３−８３を含む合成ペプチド配列を含む抗原で動物に免疫性を与えることにより得られる。ｐｒｏＡＮＰ配列の完全な中間領域部分を共に代表する、前記合成ペプチドの使用により得られる抗体はそれゆえ、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸５３−８３の範囲内の結合領域のみを認識し、及び完全にポリクローナル抗体の形態で前記範囲を検出しうる。
【００４６】
本発明にしたがうインビトロ法の好ましい態様において、上記抗体の１つは標識化され、もう１つのものは固体相に結合され又は選択的に結合されうる。
【００４７】
上記アッセイの特に好ましい態様において、上記抗体の１つは標識化され、一方で上記他方は固体相に結合される又は固体相に選択的に結合されうる。好ましい態様において、上記方法は不均一なサンドウィッチ免疫分析として実行され、ここで上記抗体の１つは任意に選択される固体相、例えば、コーティングされた試験管（例えば、ポリスチロール試験管；コーティングされた管；ＣＴ）の壁又は例えば、ポリスチロールから成るマイクロタイタープレート上に或いは例えば、磁気粒子の如き粒子に固定され、それにより上記他方の抗体は検出可能な標識に似ている又は標識への選択的結合を可能にする基を有し、及びそれは形成されたサンドウィッチ構造の検出に役立つ。好適な固体相を用いる一時的に遅延した又はそれに続く固定もまた可能である。
【００４８】
本発明にしたがう方法はさらに抗体／抗体及び検出されるべきｐｒｏＡＮＰ又はｐｒｏＡＮＰ部分ペプチドにより形成されるサンドウィッチ複合体が液相中に懸濁されたままである、均一な方法として具体化されうる。この場合、２つの抗体が使用されるとき、両方の抗体が単一のサンドウィッチに統合される場合、両方の抗体はシグナルの生成又はシグナルの誘発を引き起こす検出系の部分で標識化されることが好ましい。上記技術は詳細には蛍光エンハンシング又は蛍光クエンチング検出法として具体化されるべきである。特に好ましい態様は例えば、ＵＳＡ−４  ８８２  ７３３、ＥＰ−Ｂ１  ０  １８０  ４９２又はＥＰ−Ｂ１  ０  ５３９  ４７７及びその中に引用される先行技術中で示されるものの如き、対様式で使用されるべき検出試薬の使用に関する。このようにして、直接的に上記反応混合物中で単一の免疫複合体中に標識化成分両方を含む反応生成物のみが検出される計測は可能になる。例えば、上記技術は上記に引用される適用の教示を実行して、商標ＴＲＡＣＥ（商標）（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ）又はＫＲＹＰＴＯＲ（商標）下で提供される。
【００４９】
原則として、詳細にはＰｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ（ＰＯＣ）又は迅速試験において使用される、放射性同位体、酵素、蛍光−、化学発光−又は生物発光標識での標識化及び金原子及び色素粒子の如き直接的光学的に検出可能な色標識の如き、前記型のアッセイにおいて適用されうる全ての標識化技術が使用されうる。不均一なサンドウィッチ免疫分析の場合、両方の抗体は均一なアッセイの文脈中の本明細書中に示される型にしたがう検出系の部分を示しうる。
【００５０】
好ましい代替において、上記一次及び二次抗体は両方とも液体反応媒体中に分散され、それにより蛍光−又は化学発光クエンチング又はエンハンスメントに基づく標識化システムの部分である一次標識化成分は一次抗体に結合され、及びそれによりこの標識化システムの二次標識化成分は二次抗体に結合され、それにより検出されるべきアミノ末端ｐｒｏＡＮＰへの両方の抗体の結合後、上記計測溶液中で形成されたサンドウィッチ複合体の検出を可能にする検出可能なシグナルが生成される。この代替の１つの態様は蛍光又は化学発光色素を伴う標識化システム希土類クリプテート又はキレートを含む。特に好ましい態様において、上記標識化システムは蛍光又は化学発光色素を伴う希土類クリプテートを含む。
【００５１】
さらに好ましい態様において、上記検出は拮抗免疫分析で行われる。特に好ましい態様において、放射性免疫分析が使用される。
【００５２】
本発明にしたがう方法は他のマーカー及び／又は方法と共に行われうる。これは本発明にしたがう計測方法は多パラメーター診断として特に有利に行われうることを意味する。これによって、好ましくは炎症マーカー、心血管マーカー又は虚血マーカーの群から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーはさらに決定される。
【００５３】
上記方法の好ましい態様において、上記炎症マーカーはＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＴＮＦ−アルファの如きサイトカイン、ＩＬ−６の如きインターロイキン、プロカルシトニン（１−１１６又はその部分ペプチド）及びＶＣＡＭ又はＩＣＡＭの如き接着分子を含む群から選択される。
【００５４】
上記方法の好ましい態様において、上記心血管マーカーは群ミエロペルオキシダーゼ、ｐｒｏＢＮＰ、ｐｒｏ−エンドセリン−１、ｐｒｏアドレノメヂュリン、ｐｒｏバソプレッシン、ｐｒｏ−ガストリン−放出ペプチド（ｐｒｏＧＲＰ）、ｐｒｏ−レプチン、ｐｒｏ−神経ペプチド−Ｙ、ｐｒｏ−ソマトスタチン、ｐｒｏ−神経ペプチド−ＹＹ、ｐｒｏ−オピオメラノコルチンの完全ペプチド又は部分ペプチドの少なくとも１つのマーカーを含む群から選択される。
【００５５】
上記方法の好ましい態様において、上記虚血マーカーは群トロポニンＩ又はＴ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビンの少なくとも１つのマーカーを含む群から選択される。
【００５６】
それにより、上記マーカーは本発明にしたがう方法において並行して又は同時に決定されうる。上記に挙げられる多パラメーター決定において、いくつかのパラメーターについての計測結果は例えば、パラメーターの診断的に有意な相関を用いてコンピュータープログラムの助けを伴って、同時に又は並行して評価されることが構想されうる。
【００５７】
本発明にしたがう方法において、超音波心臓検査又は心電図は追加の方法として記録されうる。
【００５８】
上記に概略されるように、上記患者の心疾患は、非限定的に、慢性心不全、急性心不全、急性冠状動脈症候群又は心筋梗塞でありうる。
【００５９】
上記に議論されるように、それゆえ、迅速試験−アッセイとして本発明にしたがう方法を開発することは本発明の範囲内である。
【００６０】
それにより、心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる及び場合により３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者により提供されるサンプルは：
−迅速試験システムのサンプル適用ゾーンに適用され、
−反応ゾーン中でアミノ末端ｐｒｏＡＮＰの部分配列に特異的に結合する少なくとも１つの抗体と接触され、及びそれにより
−上記抗体（単数）／抗体（複数）が結合されるアミノ末端ｐｒｏＡＮＰ又はそれに由来する部分ペプチドは検出ゾーンで検出される。
【００６１】
好ましくは、上記迅速試験システムは微量流体試験システムでありうる。
【００６２】
さらに好ましい態様において、上記迅速試験システムは側流試験装置でありうる。この迅速試験システムは固体相側流試験装置でありうる。
【００６３】
本発明にしたがう方法は免疫移動及び／又はクロマトグラフィーに基づく迅速試験システムにおいて実行されうる。
【００６４】
したがって、本発明のさらなる態様は心疾患を有する又は心疾患を発症すること又は有することが疑われる及び場合により３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者のサンプル中のアミノｐｒｏＡＮＰ又はその部分ペプチドの決定について本明細書中に示される全ての態様における本発明にしたがう方法の実行のための迅速試験システムであり、ここでアミノ末端ｐｒｏＡＮＰの部分配列に特異的に結合する少なくとも１つの抗体が使用される。好ましくは、上記部分配列は長さが少なくとも１２アミノ酸である。より好ましくは、上記部分配列は長さが５０〜９８アミノ酸である。
【００６５】
したがって、本発明のさらなる主題はまた心疾患を有すること又は発症することが疑われる及び場合により３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩを有する患者についての医療診断、予測及び治療フォローアップのためのアミノ末端ｐｒｏＡＮＰの部分配列に特異的に結合する少なくとも１つの抗体の使用である。
【００６６】
以下に、本発明は患者の生物学的サンプル中のＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＰ−ｐｒｏＢＮＰの決定の得られた結果の説明により、より詳細に説明される。
実施例
実施例１
［Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ，  Ｎ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，２００４．  ５０（１）：ｐ．２３４−６１］中に示されるアッセイをアミノ末端ｐｒｏＡＮＰの計測に使用した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰをマニュアルにしたがってＲｏｃｈｅによる商業的に入手可能な試験（Ｅｌｅｃｓｙｓ）を用いて決定した。
【００６７】
両方のマーカーを慢性心不全を有する患者の血漿サンプル中で決定した。詳細には、ボディマスインデックス＞＝３０ｋｇ／ｍ2の患者のサブ群（ｎ＝１４４）をさらに調査した。これらの１４４人の患者のうち、２６人の患者は心血管事件のために２４ヶ月の過程中に亡くなった。両方のマーカーの予測効率の評価のために、データをＣｏｘ−回帰（ＳｔａｔＶｉｅｗ  ５．０ウィンドウズ（登録商標）用ソフトウェア；Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｂｅｒｋｌｅｙ，  ＣＡ）により分析した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰについての値（ｐｇ／ｍｌで）の中央値はアミノ末端ｐｒｏＡＮＰについて（ｐｍｏｌ／ｌで）より５倍大きかった。それゆえ、ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰに比較したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰについての危険率はＣｏｘ−分析において濃度における５倍大きな増加と計算された。
【００６８】
単変量  Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓの結果：
ＭａｒｋｅｒＣｈｉＳｑｕａｒｅ／ＲｉｓｋＲａｔｉｏ（９５％  Ｃｌ）／ｐ
ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（１００ｐｍｏｌ／ｌ増加）／１４．４１４  １．５０３（１．２１７−１．８５５）／＜０．０００１
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（５００ｐｇ／ｍｌ増加）／０．６６２  １．０２４（０．９６３−１．０９４）／０．４１６
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰについて顕著な結果が得られなかった（ｐ＝０．４１６）という事実に独立して、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１．０２４）に比較したＮＴ−ｐｒｏＡＮＰについての１．５０３の危険率はＢＭＩ＞＝３０の患者のサブ群における利点を明らかに示す。１．０００の危険率は濃度単位当たりの死の危険は増加しないことを示す。ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰについて、１．５０３の危険率はそれゆえ濃度単位（ここでは１００ｐｍｏｌ／ｌ）当たりの死の危険は５０．３％増加することを意味する。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに比較して、これは上記危険の２１倍大きな増加である。
【００６９】
多変量  Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓの結果：
ＭａｒｋｅｒＣｈｉＳｑｕａｒｅ／ＲｉｓｋＲａｔｉｏ（９５％  Ｃｌ）／ｐ
ＬＮ  ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ／７．１９８  ２．７７６（１．３１７−５．８５４）／０．００７
ＬＮ  ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ／０．００５  ０．９８５（０．６４４−１．５０６）／０．９４３
再び、上記結果は、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰがＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを伴うモデルにおいてＢＭＩ＞＝３０の患者のサブ群における死の独立した予測変数として持続するので、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの利点を示す（ｐ＝０．００７）。それとは対照的に、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは独立した予測変数ではない。
【００７０】
ＲＯＣ分析でもまた、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰは０．６６のＡＵＣでＢＭＩ＞＝３０の患者のサブ群の死亡率予測についてＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ＡＵＣ＝０．６１）にまさった。上記予測についてのＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの最適閾値は１９９ｐｍｏｌ／ｌであった。
実施例２
研究集団
私たちはＥＤへ連続して搬送される患者を予想して登録した。上記研究について適格であるために、患者は最も顕著な症状として呼吸困難を有しなければならなかった。１８歳未満の患者、血液透析中の患者及び外傷患者を除外した。上記研究はヘルシンキ宣言（Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）の原則にしたがって行われ、及び地域の倫理委員会により承認された。
患者の臨床評価
患者は病歴、身体検査、ＥＣＧ、パルス酸素測定、動脈血ガス分析（示されるとき）を含む血液試験及び胸部ｘ−線を含む初期臨床評価を受けた。超音波心臓検査及び肺機能試験は外来患者基礎についてはＥＤで又は上記患者が入院した場合院内で強く推奨された。上記研究に登録された各患者について、ＥＤ医師は身体検査、ＥＣＧ、胸部ｘ−線及びＢＮＰを含む血液試験の全ての入手可能な情報を含めて、彼の又は彼女の呼吸困難の原因として（０〜１００パーセント臨床確実性の値を割り当てることにより）上記患者がＨＦを有した可能性を評価した。
心不全のリファレンス（「金」）標準定義
実際の診断を決定するために、２人の独立した心臓学者は上記患者に属する全ての医療記録を検討し、及びＨＦのための呼吸困難又はＨＦ以外の他の原因のための呼吸困難として上記診断を独立に分類した。両方の心臓学者はＥＤチャート及びＥＤ内での評価中又は評価後に入手可能になる追加の情報へのアクセスを有した。この情報はＢＮＰ値、胸部ｘ−線、ＥＤ医師に入手可能でなかった病歴、超音波心臓検査、放射性核種イメージング又は心臓カテーテル挿入時に行われる左心室造影の如き続く試験の結果、肺機能試験、ＣＴスキャン、肺塞栓症の評価についての加圧超音波診断、右心カテーテル挿入、上記病院に入院した患者についての入院過程、治療への応答、死亡した患者における解剖データ及び臨床事件又は９０日フォローアップ中の再入院についての情報を含んだ。上記ＢＮＰ値はＨＦの定量的マーカーと考えられ、それゆえこの試験により提供される情報を最もうまく使用するための連続的な変数として解釈された。上記ＢＮＰ値が高ければ高いほど、ＨＦが存在する及びＨＦが呼吸困難の原因である可能性は高い。絶対ＢＮＰ値を診断の正確さを最大限にするために腎臓病及び肥満の存在について調節した（Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ  Ｗｋｌｙ，  ２００７．１３７（１−２）：ｐ．４−１２）。
ナトリウム利尿ペプチドの計測
初期評価中、血液サンプルをカリウムＥＤＴＡを含む管に回収した。ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを分析まで−８０℃で直ちに凍結された血漿サンプルから分析した。ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰの検出を他の箇所に詳細に示されるように（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ，  Ｎ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，  ２００４．  ５０（１）：ｐ．２３４−６）サンドウィッチ免疫分析（ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ  ＬＩＡ，  Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ，  Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ／Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。以前の調査における３２５人の健康な個体における中央値ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰは４５ｐｍｏｌ／ｌ（９５％信頼区間（ＣＩ）４３〜４９ｐｍｏｌ／ｌ）であった（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ，  Ｎ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，  ２００４．  ５０（１）：ｐ．２３４−６）。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ値を定量的電気化学発光免疫分析（Ｅｌｅｃｓｙｓ  ｐｒｏＢＮＰ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＡＧ，  Ｚｕｇ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により決定した。ＢＮＰを微粒子酵素免疫分析（ＡｘＳｙｍ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＩＬ，  ＵＳＡ）により計測した。
統計分析
個体群統計及び臨床的特徴についての単変量データを適切なように非パラメーターＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験又はＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ試験によりＨＦのために呼吸困難を有する患者及びＨＦのためではなく呼吸困難を有する患者の間で比較した。ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを連続的な変数として考え、及び正規性を達成するためにｌｏｇ変換した。第一の目的はＭＲ−ｐｒｏＡＮＰの正確さをＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのそれと比較することであった。ＢＮＰ値はＨＦのリファレンス（「金」）標準診断について入手可能であったので、ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰのＢＮＰとの比較はＢＮＰに偏りがあると考えられ、それゆえＢＮＰはＲＯＣ分析に含まれなった。第二の目的は、胸部ｘ−線及びＢＮＰ情報を含むＥＤにおける臨床判断へのＭＲ−ｐｒｏＡＮＰの追加は診断の正確さをさらに増加させうるかどうかを調査することであった。ＨＦについてのＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの診断の正確さを決定するために、レシーバー操作特徴的（ＲＯＣ）曲線を分析し、及び曲線下領域（ＡＵＣｓ）を両方のマーカーについて計算した。ＡＵＣｓをＨａｎｌｅｙ  ａｎｄ  ＭｃＮｅｉｌによる方法（Ｈａｎｌｅｙ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，  １９８３．  １４８（３）：ｐ．８３９−４３）にしたがって比較した。最適カットオフ点は感度及び特異性の両方を最大限にするＲＯＣ曲線上の点を選択することにより達せられた。ＨＦのＥＤ臨床正確さについての最適カット点は≧８０％で選択された（ａ  ｃｕｔ  ｐｏｉｎｔ  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ  ｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ，  Ｐ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ２００２．  １０６（４）：ｐ．４１６−２２）。ＲＯＣ分析により決定される最適カットオフ濃度での両方のアッセイの診断の正確さをＭｃＮｅｍａｒ試験により比較した（不正確な生化学的分類の一致しない対の比較）。最も高い診断の正確さのＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ閾値についてのＨＦの検出の確率を決定するために、ロジスティック回帰分析を顕著な共通変量（年齢、以前のＣＨＦ、以前の心筋梗塞、見積もられた腎糸球体ろ過率、ヘモグロビン、肺水泡音、末梢浮腫及び頸静脈膨張）について調節しないで及び調節して行った。ランク相関のＳｐｅａｒｍａｎ’ｓ係数を上記研究集団中のＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度の関係を評価するために使用した。ボディマスインデックス（ＢＭＩ）を身長（メートル）の二乗で割った体重（キログラム）の慣用の式を用いて計算した。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の定義にしたがって、正常体重をＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ2として、超過体重を２５ｋｇ／ｍ2〜２９．９ｋｇ／ｍ2のＢＭＩとして及び肥満を３０ｋｇ／ｍ2以上のＢＭＩとして定義した。腎糸球体ろ過率をＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｅｔ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＭＤＲＤ）式を用いて計算した（Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｌ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００６．  ３５４（２３）：ｐ．２４７３−８３）。データをＳＰＳＳ１５．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ，  Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  ＵＳＡ）及びＭｅｄＣａｌｃ  ９．３．９．０  ｐａｃｋａｇｅ（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）で統計的に分析した。全ての可能性を両側検定し、及びｐ＜０．０５を有意とみなした。
結果
全部で２８７人の患者をこの研究に登録した（図３）。中央年齢は７７歳であった。１４９人の男性（５２％）及び１３８人の女性（４８％）がいた。動脈性高血圧は上記患者の６８％に存在し、２８％は冠状動脈心疾患を有し、及び３４％は慢性閉塞性肺疾患を有した。利尿薬（５２％）は最もよく処方された長期医薬であり、続いてＡＣＥ−阻害剤又はＡＴ−ＩＩ−受容体−ブロッカー（４９％）及びベータ−ブロッカー（３９％）であった。検査に際して、５４％の患者は肺下部領域内に水泡音を有し、４２％は下肢の浮腫を有し、及び２８％は頸静脈膨張を有した。
【００７１】
金標準診断の判定は１５４人（５４％）の患者においてＨＦ、７１人（２５％）の患者において慢性閉塞性肺疾患、３３人（１１％）の患者において肺炎、１０人（３％）の患者において悪性疾患、８人（３％）の患者において肺塞栓症、７人（２％）の患者において過度呼吸及び１４人（５％）の患者において間隙性肺疾患、喘息又は気管支炎の如き他の原因であった。慢性閉塞性肺疾患の悪化及び肺炎の如き呼吸困難について２つの主な理由を有する何人かの患者がいた。
【００７２】
ＨＦの金標準診断の判定を伴う又は伴わない患者におけるＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの値は図４中に示される。ＨＦを有するそれらの患者の中央値ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ濃度（４００ｐｍｏｌ／Ｌ、ＩＱＲ  ２４６−６４２ｐｍｏｌ／ｌ）はＨＦを有しない患者のそれ（９２ｐｍｏｌ／Ｌ、ＩＱＲ  ９２−１７３ｐｍｏｌ／ｌ；差についてｐ＜０．００１）より顕著に高かった。ＨＦを有する患者における中央値ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度は５７５７ｐｇ／ｍｌ（ＩＱＲ  １９２４−１３２４３ｐｇ／ｍｌ）であり、それに対してＨＦを有しない患者においては３００ｐｇ／ｍｌ（ＩＱＲ  ７６−９７４ｐｇ／ｍｌ）であった（差についてｐ＜０．００１）。ランク相関のＳｐｅａｒｍａｎ’ｓ係数はＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの間で０．８９９であった（ｐ＜０．００１）。
【００７３】
ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰのＡＵＣはＨＦの診断について０．９２（９５％  ＣＩ  ０．８８−０．９５）であり、０．９２（９５％  ＣＩ  ０．８９−０．９５；ｐ＝０．７９１；図６ａ）のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのＡＵＣと同一であった。ＲＯＣ分析に基づいて、最も高い診断の正確さに達するためのＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰについての最適診断カットオフ値はそれぞれ、２０６ｐｍｏｌ／ｌ及び１５４０ｐｇ／ｍｌであった。このカットオフで、ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰについての正確さ、感度及び特異性は全て８４％であった。ロジスティック回帰分析はＭＲ−ｐｒｏＡＮＰを単変量及び多変量分析の両方においてＨＦの有力な予測変数として確認した（図５）。
【００７４】
ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰとＥＤ可能性の組み合わせについてのＡＵＣはＥＤ可能性単独についてより顕著に高かった（ｐ＝０．０１６、図６ｂ）。ＨＦの高いＥＤ可能性（８０％〜１００％臨床確実性）を伴う臨床判断についての診断の正確さは７９．４％であった。それゆえ、診断値の全体的な計測として、ＥＤ可能性に加えられたＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ値＞２０６ｐｍｏｌ／Ｌは８７．８％までかなり診断の正確さを増加させうる（ｐ＜０．００１、図７）。全体として、２０６ｐｍｏｌ／Ｌのカットオフ値でのＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及び≧８０％確実性のＥＤ可能性は０．４７のＣｏｈｅｎｓ  Ｋａｐｐａ値により反映されるように、比較的独立した表示であった（ｐ＜０．００１）。
【００７５】
図８中に示されるように、ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰはＢＭＩとのそれらの関係に関して異なった。ＨＦを有する患者において、平均ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ値は正常ＢＭＩの個体と比較して超過体重及び肥満患者において異ならなかったが（両方についてｐ＝０．３４６）、一方でＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ値は正常体重患者におけるより超過体重及び肥満患者において低かった（両方についてｐ＝０．０２５）。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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