(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵プロセスにおいてメチオニンまたはその前駆体を生産するための方法であって、下記の工程：
炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適切な培養培地中で、メチオニン生産細菌から選択された遺伝子改変微生物であって、少なくとも１つのメチオニントランスアシラーゼ酵素の発現の減衰を含む遺伝子改変微生物を培養する工程；および
該培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
Ｎ−アシルメチオニンの蓄積が、メチオニン生産細菌から選択された非改変微生物を培養する工程を含んでなる方法と比較して低減される、方法。
【請求項２】
蓄積が低減されるＮ−アシルメチオニンが下記の群：Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−プロピオニル−メチオニン、Ｎ−ブチリル−メチオニンおよびそれらの組合せの中から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現が減衰されるメチオニントランスアシラーゼ酵素が、ｙｎｃＡ、ａｒｇＡ、ｙｊｄＪ、ｙｆａＰ、ｙｅｄＬ、ｙｊｈＱおよびそれらの組合せの中から選択される遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
発現が減衰されるメチオニントランスアシラーゼ酵素が遺伝子ｙｎｃＡによりコードされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−アシル−メチオニンの生産が、培地にＮ−アシルアミノ酸アシラーゼを添加することにより、さらに低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−アシル−メチオニンの生産が、メチオニントランスアシラーゼ酵素をコードする下記遺伝子：ｙｎｃＡ、ａｒｇＡ、ｙｊｄＪ、ｙｆａＰ、ｙｅｄＬ、ｙｊｈＱの少なくとも１つの発現を減衰すること、および培地にＮ−アシルアミノ酸アシラーゼを添加することにより低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培養培地中の硫黄源が、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、二硫化ジメチルまたはこれらの種々の供給源の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
培養培地中の硫黄源が、硫酸塩もしくはチオ硫酸塩または両者の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
炭素源が再生可能な供給原料に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
炭素源がグルコースまたはスクロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
窒素源がアンモニウムまたはアンモニアの形態で供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
任意に最終産物の一部または全量（０〜１００％）に留まっている発酵液および／またはバイオマスの目的アミノ酸／成分を単離する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
微生物が、リン酸塩および／またはカリウムに対して制限されているか、または飢餓状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
メチオニン生産細菌から選択された遺伝子改変微生物であって、
少なくとも１つのメチオニントランスアシラーゼ酵素の発現の減衰と、メチオニンレプレッサーｍｅｔＪ遺伝子の欠失と、ｃｙｓＥ遺伝子およびｍｅｔＨ遺伝子の過剰発現とを含む、遺伝子改変微生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、炭素源と硫黄源とを含んでなる適切な培養培地で微生物を培養することによりメチオニンまたはその誘導体を生産するための方法に関する。該微生物および／または培養培地はおよび／またはプロセスパラメーターは、副産物Ｎ−アシル−メチオニン（ＮＡＭ）の蓄積が低減されるように改変されたものである。また、発酵培地からのメチオニンまたはその誘導体の単離も提供される。
【０００２】
先行技術
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は細胞代謝に重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用するために工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。現在、Ｄ，Ｌ−メチオニンはアクロレイン、メチルメルカプタンおよびシアン化水素からの化学合成により生産されている。石油由来の前駆体であるアクロレインおよびメチルメルカプタンの価格の高騰とメチオニン需要の増加が相まって、メチオニンの微生物生産が注目されている。
【０００３】
Ｌ−メチオニンの合成経路は多くの微生物でよく知られている（Figge RM (2006), Wendisch VF編, Microbiol Monogr (5) Amino acid biosynthesis p 164-185に総説）。大腸菌(E. coli)およびＣ．グルタミクム(C. glutamicum)メチオニン生産株が特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０７７０４１、ＷＯ２００７／０１２０７８およびＷＯ２００７／１３５１８８に記載されている。
【０００４】
発酵により生産されたメチオニンは発酵液から精製する必要がある。コスト効率のよいメチオニンの精製は、発酵液中の副産物の量を最小化する生産株および製造プロセスにかかっている。「副産物」はメチオニン変換および／または分解経路に起源する。特に、これらの産物はＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）、チオ−メチル−リボースおよびＮ−アシル−メチオニン（ＮＡＭ）、例えば、Ｎ−アセチル−メチオニンおよびＮ−プロピオニル−メチオニンである。特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０４３３に示されているように、大腸菌メチオニン生産株はＮ−アセチル−メチオニンを生産する。大腸菌はまたＮ−プロピオニル−メチオニンも生産する。
【０００５】
ＮＡＭの生産は、メチオニン収量を減らし、メチオニンの精製を困難にするので望ましくない。ＮＡＭは、発酵工程の終了時にＮＡＭアシラーゼを添加することによりメチオニンおよび酢酸塩に変換することができるが、産物のコストが劇的に増大する。よって、発酵工程中のＮＡＭの蓄積を低減する、またはなくすことが必要となる。これにはＮＡＭの蓄積を担う反応を十分理解することが必要である。
【０００６】
同時翻訳プロセスとしてのメチオニンのＮ末端アセチル化は、真核生物で最も一般的なタンパク質修飾の１つである。しかしながら、メチオニンはメチオニン生産細菌では遊離アミノ酸としてアセチル化されるものと思われ、原核生物においては同時翻訳プロセスとしてのメチオニンアセチル化がまれである(Driessen et al. 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 281-325)ことから、Ｎ−アセチル−メチオニンがＮ末端アセチラーゼにより生産されるとは考えにくい（総説としては、Polevoda & Sherman 2000 JBC 275, 47, pp 36479-36482を参照）。Ｎ−アセチル−メチオニンは、遊離Ｌ−メチオニンをアセチル化することにより得られる可能性が最も高い。メチオニンをアセチル化できる可能性のあるＮ−アセチル化酵素はすでに記載されている。例えば、ＡｒｇＡは大腸菌においてＮ−アセチル−グルタミン酸シンターゼをコードする(Marvil & Leisinger 1977 JBC 252, 10 pp. 3295-3303)。
【０００７】
これまでに、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−プロピオニル−メチオニンまたはより長いアシル鎖を有する他のメチオニン誘導体の生合成生産を触媒することができる酵素は知られていない。よって、メチオニン生産微生物における主要なメチオニン−Ｎ−アシルトランスフェラーゼ活性およびそれらの減衰の同定は、ＮＡＭ生産の低減に極めて重要である。
【０００８】
また、ＮＡＭの蓄積は蓄積されたＮＡＭを脱アセチル化してメチオニンを得ることによっても低減可能である。アミノ酸からのＮ−アシル基の脱アセチル化は細菌において実証されている。例えば、ＡｒｇＥによりコードされるＮ−アセチルオルニチンデアセチラーゼは広い基質域を有し、Ｎ−アセチルメチオニンを効率的に脱アセチル化する(Javid-Majd & Blanchard 2000 Biochemistry 39, 1285-93)。よって、ａｒｇＥまたは他のアミノ酸デアセチラーゼ、例えば腎臓アシラーゼＩ(Giardina et al 2000 Eur. J. Biochem. 267, 6249-55)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)またはブタ腎臓由来のアミノ酸アシラーゼ(Gentzen et al. 1980 Z. Naturforsch 35 c, 544-50)などの過剰発現はＮＡＭの蓄積を低減し得る。
【０００９】
ＮＡＭは細胞外間隙に露出しているので、ＮＡＭアシラーゼの周辺質または細胞外間隙への輸送は有利であり得る。大腸菌では、例えばＴＡＴ系およびＳｅｃ系など、周辺質への輸送を可能とするいくつかの輸送系が知られている（Manting & Driessen 2000 Mol Microbiol 37, 226-38, Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635に総説）。ＴＡＴまたはＳｅｃ経路による輸送には特定のシグナルペプチドの存在が必要である。細胞外間隙への輸送が有利であれば、目的タンパク質を、該媒質に通常輸送されるＯｍｐＦまたは溶血素などの担体タンパク質と融合させればよい(Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635)。また、このタンパク質は、淋菌(A. gonorrhoeae)由来のＩｇＡ１または大腸菌由来のＡＩＤＡ−Ｉなど、オートトランスポータータンパク質の輸送に必要とされるタンパク質ドメインとそれを融合させることにより、該媒質に輸送し、細胞表面に提示することができる。タンパク質はまた、２パートナー経路またはファージディスプレーによっても輸送可能である(Jacob-Dubuisson et al. 2004 Biochim et Biophys Act 1694 235-257, Jose & Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol Rev 71, 600-19)。また、プロセス設計がある種のタンパク質の輸送に影響を与えることも示されている(Shokri et al 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60, 654-64)。
【発明の概要】
【００１０】
本出願者らは、メチオニン生産株において副産物Ｎ−アシル−メチオニン（ＮＡＭ）の蓄積を低減するという課題を解決した。
【００１１】
本発明者らは、メチオニンからＮＡＭへの変換を触媒する主要なメチオニンＮ−アシルトランスフェラーゼ活性（ＭＮＡＴ）が大腸菌において遺伝子ｙｎｃＡによりコードされていることを確認した。
【００１２】
本明細書で、遺伝子ｙｎｃＡの発現の減衰、従ってＮＡＭの生産の低減を示す改変微生物を開示する。
【００１３】
本発明者らは、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)アミノ酸アシラーゼまたはブタ腎臓アミノ酸アシラーゼなどの、ＮＡＭをメチオニンに変換する脱アシル化酵素の過剰発現はＮＡＭ量の低減をもたらすことを示した。好適には、該脱アシル化酵素は周辺質または細胞外間隙に輸送される。
【００１４】
別の態様では、ＮＡＭの生産および／または蓄積の低減が得られるように培養条件を適合させた。
【００１５】
ＮＡＭの蓄積を低減するこれら３つの手段を、ＮＡＭの蓄積を低減するために、個々にまたは組み合わせて適用した。
【００１６】
グルコースをモデル基質として用い、組換え型大腸菌をモデル生物として用いるが、本発明はこれらの特徴に限定されない。
【００１７】
よって、本発明の目的は、ＮＡＭの蓄積を低減するために、主要なＭＮＡＴ（メチオニンＮ−アシル−トランスフェラーゼ）をコードする遺伝子の発現が減衰された、好適には、対応する遺伝子が欠失された、および／または同種または異種ＮＡＭ脱アシル化酵素が過剰発現された微生物を提供することである。
【００１８】
ＮＡＭの生産および／または蓄積が低減されたこの微生物は、炭素源に対するメチオニン生産収率の改善を示す。
【発明の具体的説明】
【００１９】
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その誘導体または前駆体を生産するための方法であって、下記の工程：
炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適切な培養培地中で改変微生物を培養する工程；および
該培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
非改変微生物または方法と比較して、該微生物または方法が副産物Ｎ−アシルメチオニンの蓄積を低減するように改変されている方法に関する。
【００２０】
本発明の特定の態様において、その蓄積が低減されるＮ−アシルメチオニンが、下記の群：Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−プロピオニル−メチオニン、Ｎ−ブチリル−メチオニン、およびそれらの組合せの中から選択される。
【００２１】
副産物Ｎ−アシルメチオニンの蓄積は下記の改変：
微生物における少なくとも１つのメチオニンＮ−アシルトランスフェラーゼ（すなわち、トランスアシラーゼ）の発現の減衰、および／または
微生物における少なくとも１つのメチオニン特異的アミノアシラーゼの発現（または発現の増強）；および／または
ｐＨ、酸素供給、温度、および／または培養培地へのＮＡＭアシラーゼの添加、およびそれらの組合せなどの培養条件の変更
の少なくとも１つによって得ることができる。
【００２２】
本発明によれば、「培養」、「発酵」または「発酵プロセス」とは、単純炭素源を含有する適切な増殖培地での細菌の増殖を表すために互換的に用いられる。
【００２３】
「適切な培養培地」とは、微生物の培養および増殖に適切な培地である。このような培地は、培養する微生物に応じて、微生物発酵の分野で周知である。
【００２４】
「培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する」とは、メチオニン、およびおそらくはＳＡＭおよびＮＡＭおよび有用であり得る他の全ての誘導体を回収する行為を表す。
【００２５】
「微生物」とは、細菌、酵母または真菌を表す。好適には、微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌（Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム種のいずれかである。
【００２６】
「改変微生物」とは、発酵液におけるＮＡＭの蓄積を低減する目的で遺伝的に改変された微生物を表す。当業者ならば、どのようにして特定の遺伝子の発現を調整すればよいかが分かる。通常の改変としては、遺伝子の欠失、遺伝子置換、プロモーターの改変および異種遺伝子の発現のためのベクターの導入を含む、遺伝エレメントで微生物を形質転換することを含む。
【００２７】
本発明者らは、ＮＡＭがメチオニンのアシル化により形成されることを示し、主要なＮＡＭ生成酵素として遺伝子ｙｎｃＡを同定した。大腸菌遺伝子ｂｌ４４８としても知られるｙｎｃＡは特許出願ＷＯ２００１０７０７７６に述べられている。それは多剤耐性に関与するレギュレーターＭａｒにより誘導される遺伝子群の一部である。
【００２８】
デアセチラーゼとも呼ばれるアミノ酸アシラーゼ酵素（ＥＣ３．５．１．１４）は、アシルアミノ酸の加水分解切断を触媒して遊離アミノ酸とアシル残部に相当する炭酸を生成する。より具体的には、Ｎ−アシルメチオニンアシラーゼはＮＡＭのメチオニンおよび対応するカルボン酸への反応を触媒する。
【００２９】
「Ｎ−アシルメチオニン」とは、Ｎ−ホルミル−メチオニン、Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｎ−プロピオニル−メチオニン、Ｎ−ブチリルメチオニンおよび一般にはヒドロキシル官能基を欠いた任意のカルボン酸に由来する官能基を含んでなる任意のメチオニン誘導体を表す。
【００３０】
Ｎ−アセチル−メチオニンの蓄積を測定するためには、発酵液において屈折率測定ＨＰＬＣを用い、Ｎ−アセチル−メチオニン（Sigma、Ｒｅｆ０１３１０）を標品として、Ｎ−アセチル−メチオニンの量を測定する。Ｎ−プロピオニル−メチオニンは、発酵液において、Ｎ−アセチル−メチオニンを標品として、ＧＣ−ＭＳにより測定する。
【００３１】
ＮＡＭの蓄積は、非改変生物を用いたプロセスまたは非改変プロセスにおいて蓄積された量の少なくとも２０％、好適には５０％、より好適には８０％およびいっそうより好適には９５％低減されるべきである。
【００３２】
本発明による「炭素源」とは、微生物の正常な増殖を支持するために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、ヘキソース（グルコース、ガラクトースまたはラクトースなど）、五炭糖、単糖類、二糖類（スクロース、セロビオースまたはマルトースなど）、オリゴ糖、糖蜜、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。特に好ましい炭素源はグルコースである。別の好ましい炭素源はスクロースである。
【００３３】
本発明の特定の実施態様では、炭素源は再生可能な供給原料に由来する。再生可能な供給原料は、短い遅滞内で、目的産物へのその変換を可能とするのに十分な量で再生することができる、ある特定の工業プロセスに必要な原料として定義される。
【００３４】
窒素源とは、アンモニウム塩またはアンモニアガスのいずれかに相当する。窒素源はアンモニウムまたはアンモニアの形態で供給される。
【００３５】
Ｌ−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物の発酵生産に用いられる硫黄源は下記：硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、二硫化ジメチルまたはそれらの組合せのいずれであってもよい。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様では、硫黄源は硫酸塩および／またはチオ硫酸塩である。
【００３７】
発酵は一般に、使用する微生物に適合した、少なくとも１つの単純炭素源、および必要であれば代謝産物の生産のための補助基質を含有する適切な培養培地を用いるファーメンターで行う。
【００３８】
当業者ならば、本発明による微生物の培養条件を定義することができる。特に、細菌を２０℃〜５５℃の間、好適には２５℃〜４０℃の間、より具体的には、Ｃ．グルタミクムでは約３０℃、大腸菌では約３７℃の温度で発酵させる。
【００３９】
大腸菌の既知の培養培地の例として、培養培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)によって定義されているような培地と同じまたは類似の組成のものであり得る。
【００４０】
Ｃ．グルタミクムの既知の培養培地の例として、培養培地は、ＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)によって記載されているものなどの培地と同じまたは類似の組成のものであり得る。
【００４１】
本発明の特定の実施態様では、Ｎ−アシル−メチオニンの生産は、少なくとも１つのメチオニントランスアシラーゼを減衰することにより低減される。メチオニントランスアシラーゼはメチオニンＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＮＡＴ）とも呼ばれる。ａｒｇＡが推定されるメチオニントランスアセチラーゼ活性を有する酵素をコードする。本発明者らはａｒｇＡ欠失を有する大腸菌株からＭＮＡＴ活性を精製し、その精製タンパク質の配列決定を行い、精製タンパク質ＹｎｃＡがＭＮＡＴ活性を有することを示した（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０９９９）。遺伝子ｙｎｃＡの発現を減衰させると、残留していた多量のＭＮＡＴ活性が消失し、ＮＡＭ生産、特に化合物Ｎ−アセチル−メチオニンおよびＮ−プロピオニル−メチオニンの劇的な現象が起こる。本発明の好ましい実施態様では、ＹｎｃＡは大腸菌ゲノムから完全に欠失される。
【００４２】
減衰された際にＮＡＭ生産の低減が得られる、活性のより低い他のＮ−アシルトランスフェラーゼが同定されており、これらの酵素は下記遺伝子：ｙｊｄＪ、ｙｆａＰ、ｙｅｄＬ、ｙｊｈＱによりコードされている。記載されているメチオニンＮ−アシルトランスフェラーゼはいずれも、個々に減衰されてもよいし、あるいは他と組み合わせて減衰されてもよい。
【００４３】
本発明による「遺伝子を減衰する」または「遺伝子の発現の減衰」とは、遺伝子の発現の部分的または完全な抑制（この場合、減衰されると言われる）を表す。この発現の抑制は遺伝子発現の阻害、遺伝子発現に必要なプロモーター領域への挿入、またはそのプロモーター領域の全部もしくは一部の欠失、遺伝子のコード領域における欠失もしくは挿入、または野生型プロモーターの、より弱い天然もしくは合成プロモーターとの交換のいずれかであり得る。好適には、遺伝子の減衰は本質的にその遺伝子の完全な欠失であり、これは本発明による株の同定、単離および精製を助ける選択マーカー遺伝子により置換することができる。遺伝子は好適には相同組換えの技術によって不活性化される(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)。
【００４４】
本発明の別の特定の実施態様では、Ｎ−アシル−メチオニンの蓄積は、
・コウジカビＮ−アシルアミノ酸アシラーゼ
・ブタＮ−アシルアミノ酸アシラーゼ
・Ｎ−アセチルメチオニンにも作用するアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする大腸菌ａｒｇＥ
などの天然または異種メチオニン特異的アミノアシラーゼ酵素を微生物に発現させることにより低減させることができる。
【００４５】
メチオニン特異的アミノアシラーゼ発現の増強は、酢酸、プロピオン酸(priopionate)または酪酸などの対応するカルボン酸１分子の同時生産を伴うＮＡＭからメチオニンへの変換率を上昇させる。遺伝子ａｃｓ、ｐｔａ−ａｃｋＡ、またはグリオキシル酸シャントをコードする遺伝子を過剰発現することにより酢酸消費を有利にすることも本発明の一部である。
【００４６】
本願明細書において「増強される」または「過剰発現される」とは、例えば、より強いプロモーターを使用するか、または活性が増強された対立遺伝子を使用し、また、おそらくはこれらの手段を組み合わせて、遺伝子のコピー数を増やすことにより、対応するＤＮＡによってコードされる酵素活性の細胞内活性を増大させることを表す。
【００４７】
「増大された発現」、「増強された発現」または「過剰発現」は本明細書において互換的に用いられ、同様の意味を有する。
【００４８】
遺伝子の発現を増大させるためには、その遺伝子は染色体内にコードされていても、あるいは染色体外にコードされていてもよい。染色体内では、当業者に公知の組換え法により導入可能な１コピーまたは数コピーがゲノムに存在し得る。染色体外では、遺伝子は、それらの複製起点が、よって細胞内でのそれらのコピー数が異なる、様々なタイプのプラスミドにより担持されてもよい。それらは１〜５コピー、約２０または最大５００コピーとして存在してもよく、これらは複製が厳密な低コピー数のプラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数のプラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数のプラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ）に相当する。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、この遺伝子は誘導可能な、様々な強度のプロモーターを用いて発現させることができる。これらのプロモーターは同種であっても異種であってもよい。当業者ならば、どのプロモーターが最も便宜か分かり、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはλプロモーターｃＩが広く用いられる。
【００５０】
酵素の発現は対応するメッセンジャーＲＮＡ(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)またはタンパク質（例えば、ＧＳＴタグ、Amersham Biosciences）を安定化または脱安定化するエレメントにより増進または低減することができる。
【００５１】
本発明はまた、本発明に従って増強される遺伝子の１つまたはいくつかの対立遺伝子を含む微生物に関する。
【００５２】
微生物を形質転換するための総ての技術、および本発明のタンパク質の生産を増大させるために用いられる調節エレメントは当技術分野で周知であり、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００８／０５２９７３、ＷＯ２００８／０５２５９５、ＷＯ２００８／０４０３８７、ＷＯ２００７／１４４３４６、ＷＯ２００７／１４１３１６、ＷＯ２００７／０７７０４１、ＷＯ２００７／０１７７１０、ＷＯ２００６／０８２２５４、ＷＯ２００６／０８２２５２、ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００５／０７３３６４、ＷＯ２００５／０４７４９８、ＷＯ２００４／０７６６５９など、種々の微生物における生合成経路の改変に関する出願者所有の特許出願を含む文献で入手可能である。
【００５３】
Ｎ−アシル−メチオニンアシラーゼ酵素は細胞内間隙で発現され、細胞内間隙に留まるか、または周辺質へ輸送されるか、または細胞外間隙へ輸送され得る。当業者ならば、タンパク質を周辺質へ向かわせる手段を特定することができる。また、輸送は、ファージディスプレー、または２パートナー経路もしくは自動輸送などのタンパク質輸送系により、Ｎ−アセチル−メチオニンアシラーゼをＯｍｐＦのようなタンパク質と融合させることに基づくものでもよい。本発明の好ましい実施態様では、ＮＡＭアシラーゼ酵素は、ＮＡＭとメチオニン間の無用な環化を避けるために周辺質または細胞外コンパートメントへ輸送される。
【００５４】
本発明の別の実施態様では、本発明者らは、ＮＡＭの生産を低減するために発酵プロセスのパラメーター、すなわち、培養条件を適合させた。これは発酵液ｐＨの変更、酸素供給または基質供給パラメーターの改変により達成される。もう１つの選択肢としては、培養培地にＮＡＭ特異的アシラーゼを添加することである。
【００５５】
一つの実施態様では、発酵パラメーターの変更には、リン酸塩、カリウム、マグネシウムなどの無機基質に対して微生物を飢餓状態にすることは含まない。
【００５６】
ＮＡＭの蓄積を調整するこれら３つの手段は単独で用いることもできるし、あるいは１または２つの他の手段と組み合わせて用いることもできる。
【００５７】
よって、ＭＮＡＴ活性の減衰は、下記遺伝子：ｙｎｃＡおよび／またはａｒｇＡおよび／またはｙｊｄＪ、ｙｆａＰ、ｙｅｄＬ、ｙｊｈＱ（これらの遺伝子はメチオニン−Ｎ−アシルトランスフェラーゼを伴う酵素をコードする）の発現を減衰させることにより得られる。この減衰は、コウジカビＮ−アミノ酸アシラーゼ、ブタＮ−アミノ酸アシラーゼまたはａｒｇＥ遺伝子によりコードされるアセチルオルニチンデアセチラーゼなどのＮ−アシル−メチオニンデアシラーゼ酵素の発現の増強と組み合わせてもよい。
【００５８】
同様に、上記のように、少なくとも１つのＭＮＡＴ酵素の減衰は、ｐＨ、酸素供給、温度などのプロセスパラメーターの適合および／またはＮＡＭアシラーゼの発酵液への添加と組み合わせて、ＮＡＭの蓄積の低減を伴わせることができる。
【００５９】
同様に、ＮＡＭアシラーゼ酵素の発現をプロセスの適合と組み合わせてもよい。両手段の詳細は上記されている。
【００６０】
最後に、ＭＮＡＴ活性の減衰、ＮＡＭアシラーゼ酵素発現の増強およびプロセス条件の適合の３つの手段を総て組み合わせてもよい。
【００６１】
本発明の記載において、遺伝子およびタンパク質は大腸菌における対応する遺伝子の名称を用いて識別される。しかしながら、特に断りのない限り、これらの名称の使用は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総てを包含する。
【００６２】
ＰＦＡＭ（protein families database of alignments and hidden Markov models；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。
【００６３】
主要な系統発生系を示す完全に配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することにより、ＣＯＧ（clusters of orthologous groups of proteins；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）が得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系から定義されるので、前に保存されたドメインを同定することができる。
【００６４】
相同配列およびそれらの相同性％を同定する手段は当業者によく知られており、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに利用することができる。次いで、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://bioinfo. genotoul.fr/multalin/multalin.html)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて、得られた配列を活用する（例えば、整列させる）ことができる。
【００６５】
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋで得られる既知の遺伝子に関する参照を用いて、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける同等の遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができるコンセンサス配列を使用して行われる。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 第２版 Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００６６】
本発明はまた、上記のようなものなどの微生物に関する。Ｎ−アシルメチオニンの蓄積および／または生産が低減された微生物は特に高収量でメチオニンを生産するために有用である。好適には、本発明による微生物は、本発明によるプロセスで用いられる前にすでにメチオニンの高生産株である。
【００６７】
メチオニンの効率的な生産には、メチオニン特異的経路といくつかの前駆体供給経路の至適化が必要である。メチオニン生産株は特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０７７０４１およびＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０４３３に記載されており、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６８】
その阻害剤ＳＡＭとメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ対立遺伝子を過剰発現するメチオニン生産株が特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている。この出願にはまた、特許出願ＪＰ２０００／１５７２６７に示唆されたようにメチオニンレギュロンのダウンレギュレーションを担うメチオニンレプレッサーＭｅｔＪ（ＧｅｎＢａｎｋ  １７９０３７３）の欠失を有するこれらの対立遺伝子の組合せも記載されている。さらに、アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現を伴う２つの改変の組合せが特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている。
【００６９】
遺伝子ｃｙｓＥ、ｍｅｔＨおよびｍｅｔＦの過剰発現はＷＯ２００７／０７７０４１に示唆されている。
【００７０】
メチオニンの生産は、好適には、または排他的にＨ２Ｓを用いる、従って、引用することにより本明細書の一部とされる特許出願ＷＯ２００４／０７６６５９に記載されているようなＯ−スクシニル−ホモセリンからホモシステインを生産する改変型ｍｅｔＢ対立遺伝子を使用することによってさらに増大させることができる。
【００７１】
メチオニン生産のさらなる増大は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０４３３に記載されているような遺伝子ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦおよび／またはｐｕｒＵを欠失させることにより得ることができる。この出願はまた、オペロンｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨおよびｇｃｖＴＨＰと遺伝子ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｌｐｄおよびｇｌｙＡが過剰発現されるメチオニン生産株も記載している。
【００７２】
大腸菌では、メチオニンの生産を増大させるために他の酵素の活性を増強することもできる（後に受託番号および対応するポリペプチドの機能が記載されている）。
【００７３】
硫黄同化に関与する遺伝子の発現を増強させることができる。
遺伝子    受託番号      機能
cysK      1788754       システインシンターゼ
CysZ      g1788753      cysKの上流のＯＲＦ
CysZ      g1789108      ＡＴＰスルフリラーゼ
cysD      g1789109      硫酸塩アデニリルトランスフェラーゼ
cysC      g1789107      アデニリル硫酸キナーゼ
cysZ      1788753       硫酸輸送
sbp       1790351       周辺質硫酸結合タンパク質
【００７４】
補充反応は以下を発現させることにより増進させることができる。
ppc       1790393       ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
pps       1787994       ホスホエノールピルビン酸シンターゼ
【００７５】
酢酸消費反応は以下を過剰発現させることにより増進させることができる。
acs       1790505       アセチル−ＣｏＡシンセターゼ
【００７６】
さらに、メチオニンを分解する経路（以下のリストを参照）またはメチオニン生産経路から外れる経路の遺伝子の発現を減衰させることもでき、あるいはこれらの遺伝子を欠失させることもできる。
【００７７】
本明細書において減衰とは、その発現の低減、その酵素の安定性の低減、その分解の増加および／または当業者に公知の他の解決策などの手段による酵素の細胞内活性の低減を表す。
遺伝子      Genbank登録番号    活性
ackA        1788633            酢酸キナーゼ
pta         1788635            ホスホトランスアセチラーゼ
aceE        1786304            ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１
aceF        1786305            ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ２
lpd         1786307            ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ３
sucC        1786948            スクシニル−ＣｏＡシンセターゼ、βサブユニット
sucD        1786949            スクシニル−ＣｏＡシンセターゼ、αサブユニット
pck         1789807            ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ
poxB        1787096            ピルビン酸オキシダーゼ
ilvB        1790104            アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ、大サブユニット
ilvN        1790103            アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ、小サブユニット
ilvG        1790202            アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ、大サブユニット
1790203
ilvM        1790204            アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ、小サブユニット
ilvI        1786265            アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩＩ、大サブユニット
ilvH        1786266            アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩＩ、小サブユニット
aroF        1788953            ＤＡＨＰシンセターゼ
aroG        1786969            ＤＡＨＰシンセターゼ
aroH        1787996            ＤＡＨＰシンセターゼ
thrB        1786184            ホモセリンキナーゼ
thrC        1786185            トレオニンシンターゼ
sdaA        1788116            セリンデアミナーゼ
sdaB        1789161            セリンデアミナーゼ
speD        g1786311          Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ
speC        g1789337          オルニチンデカルボキシラーゼ
astA        g1788043          アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ
dapA        g1788823          ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
【００７８】
本発明はまた、上記のメチオニン生産株の発酵、メチオニン、その前駆体または誘導体の濃度、および発酵液の所望の産物の単離を含んでなる、Ｌ−メチオニン、その前駆体または化合物それに由来する化合物の生産方法に関する。
【００７９】
当業者ならば、本発明による微生物の培養条件を定義することができる。特に、細菌を２０℃〜５５℃の間、好適には２５℃〜４０℃の間、より具体的には、Ｃ．グルタミクムでは約３０℃、大腸菌では約３７℃の温度で発酵させる。
【００８０】
発酵は一般に、使用する微生物に適合した、少なくとも１つの単純炭素源、および必要であれば代謝産物の生産に必要とされる補助基質を含有する既知の定義された組成の無機培養培地を用いるファーメンターで行う。
【００８１】
特に、大腸菌の無機培養培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)によって定義されたものなどの培地と同じまたは類似の組成のものであり得る。
【００８２】
同様に、Ｃ．グルタミクムの無機培養培地は、ＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)によって記載されているものなどの培地と同じまたは類似の組成のものであり得る。この培地は突然変異により導入された栄養要求性を補うように添加を行うことができる。
【００８３】
発酵後、Ｌ−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物を回収し、必要であれば精製する。培養培地におけるメチオニンなどの生産された化合物の回収および精製のための方法は当業者によく知られている。
【００８４】
場合により、発酵産物の精製の際には、０〜１００％、好適には少なくとも９０％、より好適には９５％、いっそうより好適には少なくとも９９％のバイオマスが除去され得る。
【００８５】
本発明の好ましい実施態様では、メチオニンの生産方法は、任意に最終産物の一部または全量（０〜１００％）に留まっている発酵液および／またはバイオマスの目的アミノ酸／成分を単離する工程を含んでなる。
【００８６】
ＮＡＭの量を低減する手段は、リン酸塩および／またはカリウムに対する制限または飢餓と組み合わせてもよい。当業者ならば、選択された生物の成長に必要なリン酸塩またはカリウムの量を決定することができる。
【００８７】
「生物が無機基質の制限を受ける」とは、その微生物の増殖が、なお弱い増殖を許容しつつ、供給された無機化学物質の量により支配される条件を定義する。これらの基質の例は、リン酸塩、カリウム、マグネシウムまたはこれらの組合せである。
【００８８】
ある無機基質に対して微生物を飢餓状態にするとは、その無機基質が存在しないために微生物の増殖が完全に停止する条件を定義する。これらの基質の例は、リン酸塩、カリウム、マグネシウムまたはこれらの組合せである。
【００８９】
本発明はまた、ＮＡＭの蓄積が低減された、すなわち、非改変微生物と比較してＮＡＭの蓄積量が少ない、メチオニンの発酵生産に関して至適化された、従前に記載されているものなどの微生物、および上記の遺伝子改変を含んでなる微生物に関する。
【実施例】
【００９０】
実施例１
ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｆＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓΕ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）株の構築物
メチオニン生産株において推定アシルトランスフェラーゼｙｎｃＡ遺伝子を欠失させるために、本発明者らは、慶応ミュータントコレクション(Baba et al., 2006)の大腸菌(Escherichia coli)ＢＷ２５１１３  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ株を用いた。このΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ欠失をＰ１ファージ形質導入（下記参照）によりＢＷ２５１１３ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ株からＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ株（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０４３３に記載）へ導入した。カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドＹｎｃＡＦおよびＹｎｃＡＲ（ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５  ｍｅｔ  Ａ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍと呼称した。
【００９１】
ＹｎｃＡＦ：GTTTGCCGATTTGCCCCACCG（ｙｎｃＡ領域１５１７５６４〜１５１７５４４と相同）（配列番号０１）
ＹｎｃＡＲ：CGCCCATCACGGTCGCAAGC（ｙｎｃＡ領域１５１５８２７〜１５１５８４６と相同）（配列番号０２）
【００９２】
次に、プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１およびｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣをＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ株に導入し、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡｙ：：Ｋｍ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）を得た。
【００９３】
ファージ溶解液Ｐ１の調製：
・カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、グルコース（０．２％）およびＣａＣｌ２（５ｍＭ）を添加した１０ｍＬ  ＬＢにＢＷ２５１１３  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ株の一晩培養物１００μＬを植菌し、振盪しながら３７℃で３０分間インキュベーションする。
・ＢＷ２５１１３  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ株で調製した１００μＬのファージ溶解液を加える（約１．１０９ファージ／ｍＬ）。
・総ての細胞が溶解するまで３７℃で３時間振盪する。
・２００μＬのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、２００μＬのクロロホルムを加える。
・溶解液を４℃で保存する。
【００９４】
形質導入：
・ＬＢ培地中、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ株の一晩培養物５ｍＬを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・細胞ペレットを２．５ｍＬの１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭ  ＣａＣｌ２に懸濁させる。
・対照試験管：１００μＬの細胞
１００μＬ  ＢＷ２５１１３  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ株のファージＰ１
・供試試験管：１００μＬの細胞＋１００μＬ  ＢＷ２５１１３  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ株のファージＰ１
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢペトリ皿に拡げる。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【００９５】
株の確認
カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ改変の存在を、上記で定義されたオリゴヌクレオチドＹｎｃＡＦおよびＹｎｃＡＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００９６】
ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ  ΔａｒｇＡ：：Ｃｍ株の構築
アミノ酸アセチルトランスフェラーゼａｒｇＡ遺伝子を不活性化するために、Datsenko & Wanner (2000)が記載している相同組換え戦略を用いた。この戦略によれば、関連する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコール耐性カセットを挿入することができる。この目的で、２つのオリゴヌクレオチドＤａｒｇＡＦおよびＤａｒｇＡＲを用いた（ウェブサイトhttp ://ecogene.org/に参照配列）。
【００９７】
ＤａｒｇＡＦ（配列番号０３）
・ａｒｇＡ領域２９４７２６４〜２９４７３４４に相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, KA. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）を有する
gtggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctatatcaatacccaccggggaaaaacgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
【００９８】
ＤａｒｇＡＲ（配列番号０４）
・ａｒｇＡ領域２９４８５９２〜２９４８５１１と相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, KA. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）を有する
ccctaaatccgccatcaacactttggatttacgctggtagttgtacaactgctttttgctctcgggcagtaaatcaatatccCATATGAATATCCTCCTTAG
【００９９】
オリゴヌクレオチドＤａｒｇＡＦおよびＤａｒｇＡＲを用いて、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションにより、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ（ｐＫＤ４６）株に導入した（ここで、発現されるＲｅｄレコンビナーゼ酵素により相同組換えが可能である）。クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドＡｒｇＡＦおよびＡｒｇＡＲを用いたＰＣＲ分析により確認した（ウェブサイトhttp://ecogene .org/に参照配列）。保有株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ  ΔａｒｇＡ：：Ｃｍと呼称した。
【０１００】
ＡｒｇＡＦ：cagctgacgatttgattcc（ａｒｇＡ領域２９４６８５９〜２９４６８７７と相同）（配列番号０５）
ＡｒｇＡＲ：gggttgtttaatggcgatatcgg（ａｒｇＡ領域２９４９０１０〜２９４８９８８と相同）（配列番号０６）
【０１０１】
ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔａｒｇＡ株の構築
クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットを除去するために、クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するレコンビナーゼＦＬＰを有するｐＣＰ２０プラスミドを、エレクトロポレーションにより、組換え株ＭＧ１６５５  ｍｅｔ  Ａ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｖｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ：：Ｋｍ  ΔａｒｇＡ：：Ｃｍに導入する。４２℃で一連の培養を行った後、クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットの消失を、上記のオリゴヌクレオチドＹｎｃＡＦ／ＹｎｃＡＲおよびＡｒｇＡＦ／ＡｒｇＡＲを用いたＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｖｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔａｒｇＡと呼称した。
【０１０２】
ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔａｒｇＡ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）株の構築
プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１およびｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Δｍｅｔ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔａｒｇＡ株に導入し、ＭＧ１６５５  ｍｅｔ  Ａ＊１１  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｖｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔａｒｇＡ（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）を得る。
【０１０３】
アミノ酸アシラーゼ活性を発現する合成遺伝子の構築
ＮＡＭをメチオニンに変換するために、メチオニン生産微生物においてＮＡＭアシラーゼ（アミノ酸アシラーゼ）を発現させた。
【０１０４】
この目的で、ブタおよびコウジカビアシルアミノ酸アシラーゼ遺伝子の合成遺伝子がCodon Devices社(www.eodondevices.com/)により作製された。これらの遺伝子のコドン利用とＧＣ含量を供給者のマトリックスに従って大腸菌に適合させた。至適化されたコドン利用を有する総ての配列を以下に示す。これらの合成遺伝子の発現を、オペレーター配列により制御されるＰｔｒｃプロモーターにより駆動された。転写ターミネーターをこれらの遺伝子の下流に付加した。これらの構築物をｐＵＣ１９ベクターにクローニングし、配列決定により確認した後、それらをメチオニン生産株に形質転換した。
【０１０５】
コウジカビアシルアミノアシラーゼ
プロモーターおよびオペレーター配列
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcatgacacaggaaacagacc（配列番号０７）
【０１０６】
コウジカビアシルアミノアシラーゼ配列（ＸＰ＿００１８２７５１９．１）（配列番号８）
Mttstwsllsslmqtqstseheqelahflddhltnlgytverlpiaegstrenvyaylgtqrktrvcltshldtvppyiplriegstiygrgacddkgpmaaqicaleelraegavkegdvgllfwgeekggpgmiaanhqdlsfegvifgeptegklwghkghlvfeligegkachsgypqhgvnanfalietlsdfvqtefpsssllgpstfnvgkieggvsynivpetskalcavrvatdmagikkivsdtvarhsnvrlefkfeypetlldhdvegsfnvrsccymnrsilvahgdneqieidelmegvraykkltmhalnsar
【０１０７】
（配列番号９）
atgaccacgtcgactgtcgtttctctgctgagttcactgatgcagacacaatccacctcggaacacgagcaggaactggcgcactttctggatgaccatctgacaaacctgggatatactgtcgagcgtctgccgattgcagaagggtccactcgcgagaacgtctacgcatatctggggacccaacgtaaaacgcgtgtatgtctgacctctcacctggatactgttccgccgtacatcccgctgcgtattgagggcagtacaatctatggtcgcggggcttgtgacgataagggcccgatggctgcacagatctgcgctctggaagagctgcgtgctgaaggtgcggtcaaagaaggcgacgtaggtctgctgttcgtcgttggggaggaaaaaggcggtccgggcatgatcgcagcgaaccaccaggatctgtcttttgaaggggttatttttggggaaccgacggaaggcaagctggtagtaggtcacaaagggcacctggtttttgagctgatcggtgagggaaaggcttgtcactccggctacccgcaacacggtgtgaacgcgaatttcgccctgattgagacactgtcggattttgtccagacggagtttcctagctctagtctgctggggccgtcaacatttaacgttggcaagatcgaaggtggcgtatcctataatattgtgccggaaacgtcgaaagccctgtgtgcagtgcgcgttgcgacggacatggccggtatcaaaaagattgtgagcgataccgtagcacgtcactctaacgtccgcctggagttcaagtttgaatatccagagacactgctggaccatgatgttgaagggagttttaatgtgcgttcctgctgttatatgaaccgctccatcctggttgcccacggagacaatgagcaaattgaaatcgatgaactgatggagggagtacgcgcctataaaaagctgacaatgcacgccctgaactcagcccgctaa
【０１０８】
転写ターミネーター配列：(ref: Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc（配列番号１０）
【０１０９】
ブタアシルアミノアシラーゼ
プロモーターおよびオペレーター配列
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcatgacacaggaaacagaac（配列番号１１）
【０１１０】
ブタアシルアミノアシラーゼ配列（ＮＰ＿９９９０６１．１）（配列番号１２）
Maskgregehpsvtlfrqylrirtvqpepdygaavafleerarqlglgcqkvewpghwtvltwpgtnptlssillnshtdwpvfkehwshdpfeg&dadgyiygrgaqdmkcvsiqyleavrrlkveghhfprtihmtfvpdeevgghqgmelfvkrpefqalragfaldeglasptdaftvfyserspwwlrvtstgkpghgsrf[iota]edtaaeklhkvinsilafrekekqrlqsnqlkpgavtsvnltmleggvaynwpatmsacfdfrvapdvdlkafeeqlqswcqaagegvtfefvqkwmetqvtstddsdpwwaafsgvflcdmklaleleicpastdaryiraagvpalgfspmnhtpvllhdhderlheavflrgvdiytqllsalasvpalpses
【０１１１】
（配列番号１３）
atggcgagcaaaggccgtgaaggtgagcatccgtctgtgaccctgtttcgccagtatctgcgtattcgcacggttcagcctgaaccggattacggagcagctgtggctttcctggaggaacgcgctcgtcagctgggtctgggttgccaaaaggtagaagttgtcccagggcacgtcgtaactgtactgacttggcctggaacgaatccgaccctgagttcaatcctgctgaactcccatacagatgtagtgccagtgttcaaggaacattggagtcacgaccctttcgaagggtttaaagatgccgatggctatatttacggtcgtggggcacaggacatgaagtgtgtatccattcaatatctggaagctgttcgccgtctgaaagttgaagggcaccactttccacgcactattcacatgactttcgtgcctgacgaggaagtcgggggtcaccaaggtatggaactgttcgtaaaacgccctgagtttcaggcactgcgtgcgggttttgctctggacgagggtctggcgagcccgacagacgcgtttaccgtgttttacagtgaacgttcgccttggtggctgcgcgttacttccacaggtaagccggggcacggctcgcgtttcatcgaggatacagccgctgaaaagctgcacaaagttattaatagcatcctggcctttcgcgagaaggaaaagcaacgtctgcagagcaaccagctgaaaccgggtgcggtcactagcgtgaatctgactatgctggaggggggtgtcgcctataacgttgtgccggcaactatgagcgcatgcttcgactttcgcgtagctccggatgttgacctgaaagccttcgaagaacaactgcagagctggtgtcaagcagcgggagaaggtgtaacctttgagttcgtccagaaatggatggaaacacaggttacctcgactgatgatagcgatccttggtgggcagccttttctggtgtgttcaaagatatgaagctggcgctggaactggaaatctgcccagcgagtacagacgctcgttacatccgcgccgcaggcgtaccagccctgggtttttcaccgatgaatcacacgccggtcctgctgcatgatcacgatgagcgcctgcatgaggcagttttcctgcgcggcgtcgacatttatacccaactgctgagtgcactggcttctgttcctgcgctgcca tcggaatca
【０１１２】
転写ターミネーター配列：(ref: Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc（配列番号１０）
【０１１３】
実施例２
発酵条件下でのメチオニン生産
実質的な量の目的代謝産物を生産した株を、リン酸飢餓を伴う流加戦略を用い、２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)での生産条件下で試験した。
【０１１４】
細胞濃度３０ｇ／Ｌで増殖を停止させるため、無機培地Ｂ１ｂにリン酸塩を２８．７ｍＭまで加えた。流加培地Ｆ１はリン酸塩不含とした。要するに、２．５ｇ／Ｌのグルコースを含む１０ｍＬのＬＢ培地で８時間増殖させた培養物を用いて、最少培地Ｂ１ａ中２４時間前培養物に植菌した。これらの培養物を、３７℃、ロータリーシェーカー（２００ＲＰＭ）にて、５０ｍＬの最少培地（Ｂ１ａ）の入った５００ｍＬのバッフル付きフラスコ内で増殖させた。
【０１１５】
【表１】
0005805533.tif 000002
【０１１６】
【表２】
0005805533.tif 000003
【０１１７】
次に、２．５Ｌの発酵槽(Pierre Guerin)に６００ｍＬの最少培地（Ｂ１ｂ）を充填し、２５〜４５ｍＬの範囲の前培養容量でバイオマス濃度が０．１ｇ／Ｌとなるように植菌した。
【０１１８】
培養温度を３７℃で一定に維持し、ｐＨは、ＮＨ４ＯＨ溶液（ＮＨ４ＯＨは１０％で１０時間、培養終了まで２４％）の自動添加により実施値（６．８）に維持した。バッチ段階での最初の攪拌速度は２００ｒｐｍに設定し、流加段階で最大１２００ｒｐｍに引き上げた。バッチ段階での最初の通気速度は４０ＮＬ／ｈに設定し、流加段階の初めに１００ＮＬ／ｈに引き上げた。溶存酸素濃度は攪拌を高めることで２０〜４０％飽和の間の値、好適には３０％飽和に維持した。
【０１１９】
細胞塊が５ｇ／Ｌ付近の濃度に達した際に、流加を初期流速５ｍＬ／ｈで開始した。供給溶液は流速を増しながら（２１時間後には２１ｍＬ／ｈに達した）Ｓ字状に注入した。厳密な供給条件は式：
【数１】
0005805533.tif 000004
［式中、Ｑ（ｔ）はバッチ容量６００ｍＬに対する供給流速（ｍＬ／ｈ）であり、ｐ１＝１．１５、ｐ２＝１８．３２、ｐ３＝０．２７０、ｐ４＝５である］
により計算した。
【０１２０】
流加２１時間後、細胞濃度は３０ｇ／Ｌに達し、リン酸塩は培地から枯渇し、細胞はリン酸塩飢餓状態に入った。この時点で、供給溶液の注入を４時間、３７ｍＬ／ｈの一定値まで高めた。その後、一定流速を１０ｍＬ／ｈに引き下げ、この流速値を流加の終了時まで維持した（５０時間）。
【０１２１】
【表３】
0005805533.tif 000005
【０１２２】
メチオニン／グルコース収量（Ｙｍｅｔ）の測定
細胞外のメチオニン濃度はＯＰＡ／ＦＭＯＣ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量した。Ｎ−アセチル−メチオニン濃度および残留グルコース濃度は、屈折率測定検出とともにＨＰＬＣを用いて分析した。Ｎ−プロピオニル−メチオニン濃度はシリル化後にＧＣ−ＭＳにより測定し、Ｎ−アセチル−メチオニン当量として表した。
【０１２３】
発酵槽容量は、初期容量にｐＨを調節するため、また、培養物に供給するために加えた溶液の量を加え、サンプリングに用いた容量と蒸発による損失を差し引くことによって算出した。
【０１２４】
流加容量は供給原料を秤量することにより絶えず追跡した。次に、注入されたグルコースの量を注入重量と溶液密度とＢｒｉｘ（［グルコース］）の方法によって制御されたグルコース濃度に基づいて計算した。メチオニン収量は次のように表した。
【数２】
0005805533.tif 000006
【０１２５】
メチオニン０およびメチオニンｔはそれぞれ初期および時間（ｔ）でのメチオニン濃度であり、Ｖ０およびＶｔは初期およびｔ時点の容量である。
【０１２６】
ＹＮ−アセチル−メチオニンは次のように計算した。
【数３】
0005805533.tif 000007
【０１２７】
Ｎ−アセチル−メチオニンｔは、ｔ時点での濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【０１２８】
ＹＮ−プロピオニル−メチオニンは次のように計算した。
【数４】
0005805533.tif 000008
【０１２９】
Ｎ−プロピオニル−メチオニンｔは、ｔ時点での濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【０１３０】
ＹＭｅｔ＋Ｎ−アセチル−メチオニン＋Ｎ−プロピオニル−メチオニン（ＹＭｅｔ＋ＮＡＭ）は次のように計算した。
【数５】
0005805533.tif 000009
【０１３１】
メチオニンｔはメチオニン濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｎ−アセチル−メチオニンｔおよびＮ−プロピオニル−メチオニンｔはｔ時点でのそれぞれの濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【０１３２】
消費グルコースは次のように計算した。
【数６】
0005805533.tif 000010
【０１３３】
注入グルコースｔ＝流加容量ｔ＊［グルコース］
消費グルコースｔ＝［グルコース］０＊Ｖ０＋注入グルコース−［グルコース］残留＊Ｖｔ
【０１３４】
［グルコース］０、［グルコース］、［グルコース］残留はそれぞれ初期、流加および残留グルコース濃度である。
【０１３５】
実施例３
発酵培地へのアミノ酸アシラーゼ添加による培養条件の適合
Ｎ−アセチル−メチオニンをメチオニンおよび酢酸塩に変換するために、１６０ＵのＮ−アミノ酸アシラーゼ（ブタ腎臓、Sigma）を、株１の発酵後（上記のように実施）の２００μｌの発酵液に加えた。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。次に、メチオニン濃度およびＮ−アセチル−メチオニン濃度を上記のように測定した。この酵素処理により、７５〜９５％のＮ−アセチル−メチオニンがメチオニンに変換した。
【０１３６】
非特許参照文献
- Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbiol Monogr (5) Amino acid biosynthesis pi 64- 185, 
- Polevoda & Sherman 2000 JBC 275, 47, pp 36479-36482, 
- Driessen et al. 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 281-325, 
- Marvil & Leisinger 1977 JBC 252, 10 pp. 3295-3303, 
- Javid-Majd & Blanchard 2000 Biochemistry 39, 1285-93, 
- Giardina et al 2000 Eur. J. Biochem. 267, 6249-55, 
- Gentzen et al. 1980 Z. Naturforsch 35 c, 544-50, 
- Manting & Driessen 2000 MoI Microbiol 37, 226-38, 
- Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635, 
- Jacob-Dubuisson et al. 2004 Biochim et Biophys Act 1694 235-257, 
- Jose & Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol Rev 71 , 600- 19, 
- Shokri et al 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60, 654-64, 
- Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128, 
- Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, - Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96), 
- Liebl et al, 1989, Appl Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210, 
- Riedel et al (2001, J. MoI Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583), 
Datsenko, K.A. & Wanner, B. L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645, 
- Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64, 
- Sambrook et al (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2<nd> ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
【配列表】
0005805533000001.app