(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２２４、配列番号２３０、配列番号２３３、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４５、または配列番号２４８に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、ＰＰ１を阻害する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項５】
細胞内でＰＰ１を阻害する方法であって、請求項３に記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクションするステップと、少なくとも１のコピーを生成するのに適した条件下で、トランスフェクションした宿主細胞を培養するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項６】
局在シグナル、エピトープタグまたはレポーターの１又はそれ以上と結合することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
リン酸化可能なアミノ酸残基を含有しないことを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列が、配列番号２２４、配列番号２３０、配列番号２３３、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４５、または配列番号２４８に少なくとも９５％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列が、配列番号２２４、配列番号２３０、配列番号２３３、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４５、または配列番号２４８に少なくとも９６％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列が、配列番号２２４、配列番号２３０、配列番号２３３、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４５、または配列番号２４８に少なくとも９７％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、配列番号２２４、配列番号２３０、配列番号２３３、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４５、または配列番号２４８に少なくとも９８％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列が、配列番号２２４、配列番号２３０、配列番号２３３、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４５、または配列番号２４８に少なくとも９９％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃセクション１２０に従い、２００７年５月２日に出願した米国仮特許出願第６０／９１５，６１１号、米国仮特許出願第６０／９１５，６１８号、米国仮特許出願第６０／９１５，６２２号、および、２００７年１１月１４日に出願した米国仮特許出願第６０／９８８，０２１号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は哺乳類ＰＰ１リガンドおよびモジュレータである。特に、本発明は、ポリペプチドと、ポリペプチド組成物と、ＰＰ１のリガンドおよび／またはモジュレータであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとに関する。さらに、本発明は、ＰＰ１活性を調節するホモポリリガンドまたはヘテロポリリガンドであるポリリガンドに関する。また、本発明は細胞領域に局在化したリガンドおよびポリリガンドに関する。
【０００３】
この出願は、出願番号第６０／９１５，６１１号、第６０／９１５，６１８号、第６０／９１５，６２２号、第６０／９８８，０２１号、第１０／７２４，５３２号（米国特許第７，０７１，２９５号）、第１０／６８２，７６４号（ＵＳ２００４／０１８５５６，ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３５１７，ＷＯ２００５／０４０３３６）、第１１／２３３，２４６号およびＵＳ２００４０５７２０１１Ｐ（ＷＯ２００５１１６２３１）；米国特許第７，０９１，０３８号；ＵＳ２００４００３３６００；ＵＳ２００６０２００４１６；ＵＳ２００６０１７２３７７に関連する主題を有する。これらの特許および出願はそれぞれ参照することによって組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００４】
ホスファターゼは、分子からリン酸を除去する酵素である。リン酸の除去は脱リン酸化と呼ばれている。キナーゼは、分子へのリン酸付加を触媒する酵素である。キナーゼによるリン酸の付加は、リン酸化と呼ばれている。キナーゼの基質がタンパク質分子であるとき、一般的に、リン酸化されるアミノ酸はセリン、スレオニンおよびチロシンである。キナーゼとホスファターゼは、細胞内で競合している力を示しており、細胞シグナルおよび細胞制御機構を伝達、減弱または調節する。キナーゼおよびホスファターゼは双方とも重複する特有の天然の基質である。キナーゼ、ホスファターゼおよびこれらの天然基質により調節されるように、細胞シグナルおよび制御機構は研究手段の計画とドラッグデザインの対象である。
【０００５】
ＰＰ１すなわちタンパク質ホスファターゼ１は心機能を含む多数の細胞プロセスの調節に関与する。自然発生的ＰＰ１インヒビタ１（ＩＮＨ−１）の機能的不活性はヒト患者の心疾患に関連して示されている（Ｅｌ−Ａｒｍｏｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．６１：８７−９３）。ＰＰ１インヒビタの不活性化によってＰＰ１の活性は増大する。この点と一致して、研究結果（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００６ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２０：１１９７−９）は自然発生的インヒビタ、ＩＮＨ−２のアデノウィルスを介した発現が、心疾患の進行を遅らせ、動物の生存率を改善することを示している。ＰＰ１による心機能の調節は、ＰＰ１を介したホスホランバン（Ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ）の脱リン酸化を介しておこり、次いで、筋肉細胞の筋小胞体（小胞体）（ＳＲ）中のカルシウムポンプＳＥＲＣＡ２の活性を制御する（Ｎｅｕｍａｎｎ  ２００２  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．９７Ｓｕｐｐｌ  １：Ｉ９１−５）。さらに、ＩＮＨ−２を過剰発現するトランスジェニック動物の心機能が改善し、リン酸化ＰＬＢの濃度が上昇した（Ｋｉｒｃｈｈｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ６８：９８−１０８）。
【０００６】
哺乳類タンパク質ホスファターゼ１は、ＰＰ１としても周知である。ＰＰ１触媒サブユニットの酵素活性が研究されている（Ｔｅｒｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｎａｔｕｒｅ  ４２９：７８０−４参照）。より明確な基質特異性を有するキナーゼとは違い、ＰＰ１触媒サブユニットは、多くのリン酸化−タンパク質を脱リン酸化可能である。ホスファターゼ基質特異性はホスファターゼ結合パートナー、非触媒サブユニットおよび／または調節サブユニットによって大半が決定されることが現在では認められている（例えば、Ｃｏｈｅｎ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５：２４１−２５６，２００２；Ｃｅｕｌｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８４：１−３９，２００４）。
【０００７】
ホスホランバン、オーロラβキナーゼ、ＴＰ５３、ＭＹＰＴ１、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、網膜芽細胞腫、ＭＳＴ１Ｒ、ｃｄｃ２５、ＥＦ２、ＢＡＤ、ＢＲＣＡ、ヒストンＨ２ＡＸおよびＩＰ３レセプタを含む、ＰＰ１に関する多数のリン酸化タンパク質基質が同定された。さらに、ｓｃａｐｉｎｉｎ、ＰＮＵＴＳ、ＰＰＰＩＲＡ、ｎｅｕｒａｂｉｎＩ、ＮＩＰＰ１、ＣＰＩ１７、ＤＡＲＰＰ３２、ｎｅｕｒａｂｉｎＩＩおよびＰＰＰＩＲ２を含む、ＰＰ１のいくつかの細胞タンパク質レギュレータが同定された。いくつかのＰＰ１基質、レギュレータおよびＰＰ１バイオロジーに関するその他の研究は、以下の文献に記載されている。
【０００８】
【非特許文献１】Ammosova et al. 2005 Retrovirology 2:47;
【非特許文献２】Ayllon et al. 2000 EMBO J. 19:2237-2246;
【非特許文献３】Carr et al. 2002 MoI. Cell Biol. 22:4124-4135;
【非特許文献４】Egloff et al. 1997 EMBO J. 16: 1876-1887;
【非特許文献５】Eto et al. 2004 PNAS 101 :8888-8893;
【非特許文献６】Jideama et al. 2006 Int. J. Biol Sci. 2:1-9;
【非特許文献７】Lees-Miller et al. 1991 MoI. Cell Biol. 12:5041-5049;
【非特許文献８】Li et al. 2006 Oncogene 25:3006-3022;
【非特許文献９】Liu et al. 2005 Eur. J. Neurosci. 22: 1942-1950;
【非特許文献１０】Liu et al. 2002 Cancer Res. 62:6357-6361;
【非特許文献１１】Margolis et al. 2003 EMBO J. 22:5734-5745;
【非特許文献１２】Champion 2005 Circ. Res. 96:708-710;
【非特許文献１３】Ohki et al. 2003 J MoI Biol 326:1539-47;
【非特許文献１４】Pathak et al. 2005 Circ. Res. 96:756-766;
【非特許文献１５】Quevedo et al. 2003 J. Biol. Chem. 278:16579-16586;
【非特許文献１６】Rubin et al. 2001 Oncogene 20:3776-3785;
【非特許文献１７】Santoro et al. 2003 Biochem. J. 376:587-594;
【非特許文献１８】Shmueli et al. 2006 MoI. Cell. Neurosci. 32:15-26;
【非特許文献１９】Strack et al. 1997 J. Neurochem. 68:2119-2128;
【非特許文献２０】Szatmari et al. 2005 J. Biol. Chem. 280:37526-37535;
【非特許文献２１】Tang et al. 2003 J. Neurosci. 23:403-415;
【非特許文献２２】Tsukada et al. 2006 BBRC 343:839-847;
【非特許文献２３】Uematsu et al. 2005 J. Neurochem. 95: 1642-1652;
【非特許文献２４】Walter et al. 2000 Oncogene 19:4906-4916;
【非特許文献２５】Washington et al. 2002 J. Biol. Chem. 277:40442-40448;
【非特許文献２６】Yamada et al. 2006 FASEB J. 20: 1197-9;
【非特許文献２７】Zhan et al. 2003 J. Immunology 171:3785-3793;
【非特許文献２８】Siino et al. 2002 BBRC 297:1318-1323;
【非特許文献２９】Welsh et al. 1997 Analyt. Biochem. 244:16-21;
【非特許文献３０】Rameau et al. 2004 J. Biol. Chem. 279:14307-14314;
【非特許文献３１】Toyoshima et al. 2003 PNAS 100:467-472;
【非特許文献３２】Toyofuko et al. 1994 J. Biol. Chem. 269:22929-22932;
【非特許文献３３】Hagiwara et al. 1992 Cell 70: 105-113;
【非特許文献３４】Ji et al. 2003 J. Biol. Chem. 278:25063-25071;
【非特許文献３５】Kimura et al. 1998 FEBS Letters 425:509-512;
【非特許文献３６】Kimura et al. 1997 J. Biol. Chem. 272:15061-15064;
【非特許文献３７】Kimura et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:21726-21731;
【非特許文献３８】Haghighi et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:24145-24152;
【非特許文献３９】Jin et al. 2003 J. Biol. Chem. 28:30677;
【非特許文献４０】Beullens et al. 2000 Biochem. J. 352:651;
【非特許文献４１】Sagara et al. 2003 J. Biol. Chem. 278:45611;
【非特許文献４２】Bibb et al. 1999 Nature 402:669;
【非特許文献４３】Huang et al. 1999 J. Biol. Chem. 274:7870;
【非特許文献４４】Landsverk et al. 2005 Biochem. J. 390:709;
【非特許文献４５】Kim et al. 2003 J. Biol. Chem. 278:13819;
【非特許文献４６】Endo et al. 1996 Biochemistry 35:5220;
【非特許文献４７】Weiser et al. 2004 J. Biol. Chem. 279:48904;
【非特許文献４８】Park et al. 1994 J. Biol. Chem. 269:944;
【非特許文献４９】Oliver et al. 2002 MoI. Cell. Biol. 13:4690;
【非特許文献５０】Yamawaki et al. 2001 BBRC 285:1040-1045;
【非特許文献５１】Deng et al. 2002 Biochem. J. 36:17
【０００９】
ＰＰ１の小分子インヒビタは当分野で周知であり、オカダ酸およびマイクロスタチンを含む。さらに、ＰＰ１活性を評価するキットは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスイッチ、マサチューセッツ）およびＰｒｏｍｅｇａ（マディソン、ウィスコンシン）などから市販されている。
【００１０】
［ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の説明］
配列番号１〜５６は、ポリリガンドおよびこれらポリリガンドをコードしているポリヌクレオチドの例である。
【００１１】
特に、配列番号１のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されており、配列番号３および配列番号４は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１は構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号９２であり（ＸａａはＡｌａである）、Ｂは配列番号６８であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｃは配列番号９３であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＧＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００１２】
配列番号５のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号６、配列番号７および配列番号８によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されており、配列番号７および配列番号８は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号５は、構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号９５であり、Ｂは配列番号６９であり（ＸａａはＳｅｒである）、Ｃは配列番号９６（ＸａａはＴｈｒである）、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＧＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００１３】
配列番号９のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化され、配列番号１１および配列番号１２は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号９の構造体Ｘ−Ｓ３−Ｙ−Ｓ２−Ｚのポリリガンドの実施例であり、Ｘは配列番号１０２であり（ＸａａはＳｅｒである）、Ｙは配列番号７２であり（ＸａａはＡｓｐである）、Ｚは配列番号１００であり（ＸａａはＴｈｒである）、Ｓ３はアミノ酸配列ＰＧＧＡＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ｘ−Ｓ３−Ｙ−Ｓ２−Ｚのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００１４】
配列番号１３のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されており、配列番号１５および配列番号１６は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１３は、構造体Ｘ−Ｓ３−Ｙ−Ｓ２−Ｚのポリリガンドの実施例であり、Ｘは配列番号１０１であり、Ｙは配列番号７４であり（ＸａａはＡｓｐである）、Ｚは配列番号７９であり（ＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒである）、Ｓ３は、アミノ酸配列ＰＧＧＡＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ｘ−Ｓ３−Ｙ−Ｓ２−Ｚのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００１５】
配列番号１７のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によってコードされ、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化され、配列番号１９および配列番号２０はモジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１７は、構造体Ｘ−Ｓ４−Ｙ−Ｓ２−Ｚのポリリガンドの実施例であり、Ｘは配列番号９３であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｙは配列番号７５であり（ＸａａはＳｅｒまたはＡｓｐである）、Ｚは配列番号９２であり（ＸａａはＡｌａである）、Ｓ４はアミノ酸配列ＰＧＡＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ｘ−Ｓ４−Ｙ−Ｓ２−Ｚのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００１６】
配列番号２１のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化され、配列番号２３および配列番号２４は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２１は、構造体Ｄ−Ｓ３−Ｅ−Ｓ２−Ｆのポリリガンドの実施例であり、Ｄは配列番号７３であり（ＸａａはＡｓｐである）、Ｅは配列番号９５であり、Ｆは配列番号９８であり（ＸａａはＧｌｕまたはＴｈｒである）、Ｓ３はアミノ酸配列ＰＧＧＡＧのスペーサーであり、Ｓ２は、アミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ｄ−Ｓ３−Ｅ−Ｓ２−Ｆのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００１７】
配列番号２５のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化され、配列番号２７および配列番号２８は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２５は、構造体Ｄ−Ｓ３−Ｅ−Ｓ２−Ｆのポリリガンドの実施例であり、Ｄは配列番号１０１であり、Ｅは配列番号７９であり（ＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒである）、Ｆは配列番号１０８であり（ＸａａはＧｌｕまたはＡｓｐである）、Ｓ３はアミノ酸配列ＰＧＧＡＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ｄ−Ｓ３−Ｅ−Ｓ２−Ｆのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００１８】
配列番号２９のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号３１および配列番号３２は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２９は、構造体Ｄ−Ｓ３−Ｅ−Ｓ２−Ｆのポリリガンドの実施例であり、Ｄは配列番号９６であり（ＸａａはＴｈｒである）、Ｅは配列番号６９であり（ＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒである）、Ｆは配列番号９５であり、Ｓ３はアミノ酸配列ＰＧＧＡＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ｄ−Ｓ３−Ｅ−Ｓ２−Ｆのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００１９】
配列番号３３のポリリガンドＰＰ１は、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されており、配列番号３５および配列番号３６は、モジュール式クローニング方法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号３３は、構造体Ｈ−Ｓ３−Ｊ−Ｓ２−Ｋのポリリガンドの実施例であり、Ｈは、配列番号８０であり（ＸａａはＡｓｐ、ＳｅｒまたはＴｈｒである）、Ｊは配列番号１０９であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｋは配列番号１１０であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｓ３はアミノ酸配列ＰＧＧＡＧのスペーサーであり、Ｓ２は、アミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ｈ−Ｓ３−Ｊ−Ｓ２−Ｋのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００２０】
配列番号３７のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号３８、配列番号３９および配列番号４０によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されており、配列番号３９および配列番号４０は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号３７は、構造体Ｈ−Ｓ３−Ｊ−Ｓ２−Ｋのポリリガンドの実施例であり、Ｈは配列番号８０であり（Ｘａａは、ＧｌｕまたはＳｅｒまたはＴｈｒである）、Ｊは配列番号１０９であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｋは配列番号１１０であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｓ３はアミノ酸配列ＰＧＧＡＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ｈ−Ｓ３−Ｊ−Ｓ２−Ｋのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００２１】
配列番号４１のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号４３および配列番号４４は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号４１は、構造体Ａ−Ｓ５−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号９２であり（ＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒである）、Ｂは配列番号６８であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｃは配列番号９３であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｓ５はアミノ酸配列ＰＧＡＧＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ５−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドもヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００２２】
配列番号４５のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号４７および配列番号４８は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号４５は、構造体Ａ−Ｓ５−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号９３であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｂは配列番号８２であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｃは配列番号１１１であり（ＸａａはＡｌａである）、Ｓ５はアミノ酸配列ＰＧＡＧＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ５−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００２３】
配列番号４９のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号５１および配列番号５２は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号４９は、構造体Ａ−Ｓ５−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号１０５であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｂは配列番号７６であり（ＸａａはＡｓｐまたはＧｌｕである）、Ｃは配列番号１０６であり（ＸａａはＳｅｒである）、Ｓ５はアミノ酸配列ＰＧＡＧＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ５−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００２４】
配列番号５３のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６によって符号化されており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号５５および配列番号５６は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号５３は構造体Ａ−Ｓ５−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号１０８であり（ＸａａはＡｓｐまたはＧｌｕまたはＡｌａである）、Ｂは配列番号６７であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｃは配列番号１００であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｓ５はアミノ酸配列ＰＧＡＧＧのスペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ５−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｇに概略的に示されている。
【００２５】
配列番号５７〜６６および配列番号８３〜９１は、それぞれ全長ＰＰ１タンパク質基質およびレギュレータである。これらの配列は、以下の公開データベースアクセス番号を有する：ＮＰ＿０５４８２９、ＮＰ＿００３５９１、ＮＰ＿１５０２８１、ＢＡＣ８２３４８、ＮＰ＿０００５３７、ＮＰ＿００６７３２、ＮＰ＿１１５９８４、ＮＰ＿００２４７１、Ｑ９ＵＤ７１、ＮＰ＿００２７０５、ＮＰ＿０００９２８、ＮＰ＿００５３８９、ＮＰ＿０００３１２、ＮＰ＿００２４３８、ＮＰ＿００２６５８、ＮＰ＿００６２３２、ＮＰ＿０６０１２０、ＮＰ＿００１９５２、および、ＮＰ＿００１７８１。これらのアクセス番号が示す配列の各々は、参照することで本明細書に組み込むものとする。配列番号５７〜６６において、ＰＰ１による脱リン酸化可能なアミノ酸の位置はＸａａとして示す。親のワイルドタイプ基準配列においては、Ｘａａはセリンまたはスレオニンである。本発明のリガンドにおいては、Ｘａａは任意のアミノ酸である。いくつかの実施例においては、Ｘａａはアラニンである。さらに、配列番号８３〜９１においては、親のワイルドタイプ基準配列から修飾されたアミノ酸の位置はＸａａとして示す。いくつかの実施例においては、本発明のリガンドにおいては、Ｘａａは任意のアミノ酸である。Ｘａａはアスパラギン酸塩および／またはグルタミン酸塩である。
【００２６】
配列番号６７〜８２は、ポリペプチドリガンド配列の例を示す配列番号５７〜６６の部分配列であり、ここで、天然の親ペプチドにおいて、ＰＰ１が脱リン酸化可能なセリンまたはスレオニンの位置は、Ｘａａとして示す。
【００２７】
配列番号９２〜１１１は、ポリペプチドリガンド配列の例を示す配列番号８３〜９１の部分配列であり、ここで、親ワイルドタイプ基準配列から修飾されたアミノ酸の位置は、Ｘａａとして示す。
【００２８】
Ｘａａを含むアミノ酸配列は、Ｘａａが任意のアミノ酸であるポリペプチドを包含する。
【００２９】
以下は、本発明のいくつかのヘテロポリリガンドの実施例の説明的な注釈である。
配列番号１：部分的ＮＩＰＰ１−スペーサー−部分的オーロラβキナーゼ−スペーサー−部分的ＣＰＩ１７
配列番号５：部分的Ｓｃａｐｉｎｉｎ−スペーサー−部分的ＴＰ５３−スペーサー−部分的ＰＰＰ１Ｒ１Ａ
配列番号９：部分的ＮｅｕｒａｂｉｎＩＩ−スペーサー−部分的ＭＹＰＴ１−スペーサー−部分的ＤＡＲＰＰ３２
配列番号１３：部分的ＰＮＵＴＳ−スペーサー−部分的ＲＮＡＰＩＩ−スペーサー−部分的ＰＴＧ
配列番号１７：部分的ＣＰＩ１７−スペーサー−部分的Ｒｂ−スペーサー−部分的ＮＩＰＰ１
配列番号２１：部分的ＭＳＴ１Ｒ−スペーサー−部分的Ｓｃａｐｉｎｉｎ−スペーサー−部分的ＤＡＲＰＰ３２
配列番号２５：部分的ＰＮＵＴＳ−スペーサー−部分的ＰＴＧ−スペーサー−部分的ＰＰＰＩＲ１Ａ
配列番号２９：部分的ＰＰＰＩＲ１Ａ−スペーサー−部分的ＴＰ５３−スペーサー−部分的Ｓｃａｐｉｎｉｎ
配列番号３３：部分的ＰＬＮ−スペーサー−部分的ＰＰＰＩＲ１Ａ−スペーサー−部分的ＰＰＰＩＲ２
配列番号３７：部分的ＰＬＮ−スペーサー−部分的ＰＰＰＩＲ１Ａ−スペーサー−部分的ＰＰＰＩＲ２
配列番号４１：部分的ＮＩＰＰ１−スペーサー−部分的オーロラβキナーゼ−スペーサー−部分的ＣＰＩ１７
配列番号４５：部分的ＣＰＩ１７−スペーサー−部分的ＲＮＡＰＩＩ−スペーサー−部分的ＮＩＰＰＩ
配列番号４９：部分的ＰＰＰＩＲ２−スペーサー−部分的ＣＤＣ２５−スペーサー−部分的ＮｅｕｒａｂｉｎＩ
配列番号５３：部分的ＰＰＰＩＲ１Ａ−スペーサー−部分的ＥＦ２−スペーサー−部分的ＤＡＲＰＰ３２
【００３０】
配列番号１１２は、全長ＰＰ１基質、ヒトホスホランバン、データベースアクセス番号ＮＰ＿００２６５８の別の例である。
【００３１】
配列番号１１３〜１３６は、モノマーＰＰ１リガンドであり、位置１６または１７でのＸａａはセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり；他の位置でのＸは、配列番号１１２の対応する位置においてみられる以外のアミノ酸である。
【００３２】
配列番号１３７〜１５６は、モノマーＰＰ１リガンドであり、位置１６または１７でのＸａａはセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸である。
【００３３】
配列番号１５７〜１６０は、モノマーＰＰ１リガンドであり、位置７または８でのＸａａはセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸である。
【００３４】
配列番号１６１〜１６４は、モノマーＰＰ１リガンドであり、位置６または７でのＸａａはセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸である。
【００３５】
配列番号１６５〜１７６は、ポリリガンドおよびこれらをコードするポリヌクレオチドのさらなる例である。
【００３６】
特に、配列番号１６５のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１６６、配列番号１６７および配列番号１６８によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１６７および配列番号１６８は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１６５は、構造体Ａ−Ｓ１−Ｂのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号１３９であり（ＸａａはＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｌａである）、Ｂは配列番号１３６であり（ＸａａはＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｌａである）、Ｓ１はアミノ酸配列ＧＧＧＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ１−Ｂのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ａに概略的に示されている。
【００３７】
配列番号１６９のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１７０、配列番号１７１および配列番号１７２によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１７１および配列番号１７２は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１６５は、構造体Ａ−Ｓ１−Ｂのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号１５２であり（ＸａａはＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｌａである）、Ｂは配列番号１３６（ＸａａはＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｌａである）、Ｓ１はアミノ酸ＧＧＧＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ１−Ｂのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ａに概略的に示されている。
【００３８】
配列番号１７３のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１７５および配列番号１７６は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１７３は、構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ１−Ｃ−Ｓ１−Ｄのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号１４５であり（ＸａａはＡｓｐまたはＧｌｕである）、Ｂは配列番号１５７であり（ＸａａはＡｓｐまたはＧｌｕである）、Ｃは配列番号１６１であり（ＸａａはＡｓｐまたはＧｌｕである）、Ｄは配列番号１６４であり（ＸａａはＡｓｐまたはＧｌｕである）、Ｓ１はアミノ酸配列ＧＧＧＧのスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ１−Ｃ−Ｓ１−Ｄのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｄに概略的に示されている。
【００３９】
配列番号１１３〜１６４において、ＰＰ１が脱リン酸化可能なアミノ酸の位置は、配列番号１１２の位置１６および１７に対応しており、Ｘａａとして示される。ワイルドタイプタンパク質におけるアミノ酸１６および１７に対応する位置では、Ｘａａはセリンまたはスレオニンである。本発明のリガンドにおいては、Ｘａａは任意のアミノ酸である。いくつかの実施例においては、Ｘａａは、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸である。他の実施例においては、ＸａａはＧｌｕ、ＡｓｐまたはＡｌａである。
【００４０】
配列番号１１３〜１３６は、Ｃ末端で筋小胞体（小胞体）局在シグナルを含むモノマーペプチドリガンド配列の例を示す。
【００４１】
配列番号１３７〜１６４は、特異的な局在シグナルを欠くモノマーペプチドリガンド配列の例を示す。
【００４２】
配列番号１７７〜２００は、ポリリガンドおよびこれらのポリリガンドをコードするポリヌクレオチドの更なる例である。
【００４３】
特に、配列番号１７７のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１７８、配列番号１７９および配列番号１８０によってコードされており、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１７９および配列番号１８０は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１７７は、構造体Ａ−Ｂのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２１５であり（ＸａａはＡｓｐである）、Ｂは配列番号２１７である（ＸａａはＡｓｐである）。構造体Ａ−Ｂのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図３Ａに概略的に示されている。
【００４４】
配列番号１８１のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１８３および配列番号１８４は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１８１は、構造体Ａ−Ｂのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２１４であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｂは配列番号２１７である（ＸａａはＡｓｐである）。構造体Ａ−Ｂのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドとも呼ばれ、図３Ａに概略的に示されている。
【００４５】
配列番号１８５のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１８６、配列番号１８７および配列番号１８８によってコードされ、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１８７および配列番号１８８は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１８５は、構造体Ａ−Ｂのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２１６であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｂは配列番号２１８であり（ＸａａはＧｌｕである）。構造体Ａ−Ｂのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図３Ａに概略的に示されている。
【００４６】
配列番号１８９のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１９０、配列番号１９１および配列番号１９２によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１９１および配列番号１９２は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１８９は、構造体Ａ−Ｂのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２１２であり（ＸａａはＡｓｐである）、Ｂは配列番号２１３であり（ＸａａはＡｓｐである）。構造体Ａ−Ｂのポリリガンドは本明細書においてはヘテロポリリガンドと呼ばれ、図３Ａに概略的に示されている。
【００４７】
配列番号１９３のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１９４、配列番号１９５および配列番号１９６によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１９５および配列番号１９６は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１９３は、構造体Ａ−Ｂのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２２３であり（ＸａａはＡｌａである）、Ｂは配列番号２２２であり（ＸａａはＡｌａである）。構造体Ａ−Ｂのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図３Ａに概略的に示されている。  
【００４８】
配列番号１９７のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号１９８、配列番号１９９および配列番号２００によってコードされ、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号１９９および配列番号２００は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号１９７は構造体Ａ−Ｂのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２２１であり、Ｂは配列番号２２０である。構造体Ａ−Ｂのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図３Ａに概略的に示されている。
【００４９】
配列番号２０１〜２０７および配列番号２０８〜２１１は、それぞれ全長ＰＰ１タンパク質基質およびレギュレータである。これらの配列は、以下の公開データベースアクセス番号を有する：ＮＰ＿００３５９１、ＢＡＣ８２３４８、ＮＰ＿００６７３２、ＮＰ＿００２４７１、ＮＰ＿００２７０５、ＮＰ＿０６０１２０、ＮＰ＿００４３１３、ＮＰ＿６２０２２１、ＮＰ＿００２０９６、ＮＰ＿００１００７２３６およびＮＰ＿００９２２５である。これらのアクセス番号が示す配列の各々は、参照することによって本明細書に組み込まれる。配列番号２０１〜２０７において、ＰＰ１が脱リン酸化可能なアミノ酸の位置は、Ｘａａとして示す。親のワイルドタイプ基準配列において、Ｘａａはセリンまたはスレオニンである。本発明のリガンドにおいては、Ｘａａは任意のアミノ酸である。いくつかの実施例においては、Ｘａａはアラニンである。本発明の他の実施例においては、Ｘａａはアスパラギン酸塩および／またはグルタミン酸塩である。
【００５０】
さらに、配列番号２０８〜２１１においては、親のワイルドタイプ基準配列から修飾されたアミノ酸の位置はＸａａとして示す。本発明のリガンドにおいては、Ｘａａは任意のアミノ酸である。いくつかの実施例においては、Ｘａａはアスパラギン酸塩および／またはグルタミン酸塩である。
【００５１】
配列番号２１２〜２１９は、ポリペプチドリガンド配列の例を示す配列番号２０１〜２０７の部分配列であり、天然の親ポリペプチドにおいて、ＰＰ１が脱リン酸化可能なセリンまたはスレオニンの位置はＸａａとして示す。
【００５２】
配列番号２２０〜２２３は、ペプチドリガンドの例を示す配列番号２０８〜２１１の部分配列であり、親ワイルドタイプ基準配列から修飾されたアミノ酸の位置はＸａａとして示す。
【００５３】
配列番号２１２〜２２３は、モノマーＰＰ１リガンドのさらなる例である。
【００５４】
Ｘａａを含むアミノ酸配列は、Ｘａａが任意のアミノ酸であるポリペプチドを包含する。
【００５５】
配列番号２２４〜２５０は、ポリリガンドおよびこれらのポリリガンドをコードするポリヌクレオチドの更なる例である。
【００５６】
特に、配列番号２２４のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２２５および配列番号２２６によってコードされ、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２２６は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２２４は、構造体Ａ−Ｓ−Ｂ−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５１であり、Ｂは配列番号２５６であり、Ｃは配列番号２６２であり、Ｓは配列番号２６３のスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ−Ｂ−Ｃのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｅに概略的に示されている。
【００５７】
配列番号２２７のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２２８および配列番号２２９によってコードされていて、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２２９はモジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２２７は、構造体Ａ−Ｓ−Ｂ−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５２であり、Ｂは配列番号２５６であり、Ｃは配列番号２６２であり、Ｓは配列番号２６３のスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ−Ｂ−Ｃのポリリガンドは、本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｅに概略的に示されている。
【００５８】
配列番号２３０のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２３１および配列番号２３２によってコードされており、コドンは、哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２３２は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２３０は、構造体Ａ−Ｂ−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５７であり、Ｂは配列番号２６２であり、Ｃは配列番号２５３である。構造体Ａ−Ｂ−Ｃのポリリガンドは本明細書においてはヘテロポリリガンドと呼ばれ、図３Ｂに概略的に示されている。
【００５９】
配列番号２３３のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２３４および配列番号２３５によって符号化され、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２３５はモジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２３３は構造体Ａ−Ｂ−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５７であり、Ｂは配列番号２６２であり、Ｃは配列番号２５４である。構造体Ａ−Ｂ−Ｃのポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図３Ｂに概略的に示されている。
【００６０】
配列番号２３６のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２３７および配列番号２３８によってコードされており、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２３８は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２３６は、構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２のポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５２であり、Ｂは配列番号２６１であり、Ｓ１は配列番号２６４のスペーサーであり、Ｓ２は配列番号２６５のスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２のポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｂに概略的に示されている。
【００６１】
配列番号２３９のＰＰ１ポリリガンドは配列番号２４０および配列番号２４１によってコードされており、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２４１は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２３９は、構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２のポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５５であり、Ｂは配列番号２５８であり、Ｓ１は配列番号２６４のスペーサーであり、Ｓ２は配列番号２６５のスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２のポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｂに概略的に示されている。
【００６２】
配列番号２４２のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２４３および配列番号２４４によってコードされており、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２４４は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２４２は構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２のポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５５であり、Ｂは配列番号２５９であり、Ｓ１は配列番号２６４のスペーサーであり、Ｓ２は配列番号２６５のスペーサーである。構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２のポリリガンドは本明細書においてヘテロリガンドと呼ばれ、図４Ｂに概略的に示されている。
【００６３】
配列番号２４５のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２４６および配列番号２４７によってコードされており、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２４７はモジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２４５は構造体Ａ−Ｂ−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５６であり、Ｂは配列番号２６２であり、Ｃは配列番号２５４である。構造体Ａ−Ｂ−Ｃのポリリガンドは本明細書においてヘテロリガンドと呼ばれ、図３Ｂに概略的に示されている。
【００６４】
配列番号２４８のＰＰ１ポリリガンドは、配列番号２４９および配列番号２５０によってコードされており、コドンは哺乳類発現およびベクタ挿入に最適化されていて、配列番号２５０は、モジュール式クローニング法に適用可能な代替フランキング制限部位を含む。配列番号２４８は構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２のポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号２５５であり、Ｂは配列番号２６１であり、Ｓ１は配列番号２６４のスペーサーであり、Ｓ２は配列番号２６５のスペーサーである。Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２のポリリガンドは本明細書においてヘテロポリリガンドと呼ばれ、図４Ｂに概略的に示される。
【００６５】
配列番号２６６〜２６８は、全長ＰＰ１触媒サブユニット結合タンパク質である。これらの配列は、以下の公開データベースアクセス番号を有する：ＮＰ＿９９０４５４．１、ＮＰ＿１５０２８１．１、ＮＰ＿００１０８２６９５．１。これらのアクセス番号が示す配列の各々は、参照することで本明細書に組み込むものとする。
【００６６】
配列番号２６７の切断フラグメントが使用される本発明の一実施例においては、配列番号２６７の位置３８、６６および６７に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸に任意選択的に変異可能である。一実施例においては、変異は、アスパラギン酸またはグルタミン酸などの酸性アミノ酸で置換することなどにより、疑似（ｐｓｅｕｄｏ）リン酸化ポリペプチドを生成可能である。特定の実施例においては、変異は、Ｔ３８Ｄおよび／またはＧ６６Ｅおよび／またはＭ６７Ａである。
【００６７】
配列番号２６８のフラグメントが使用される本発明の別の実施例においては、配列番号２６８の位置３５および３８に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸に任意選択的に変異可能である。一実施例においては、変異は、アスパラギン酸またはグルタミン酸などの酸性アミノ酸で置換することによって疑似（ｐｓｅｕｄｏ）リン酸化ポリペプチドを生成可能である。特定の実施例においては、変異はＴ３５Ｄおよび／またはＴ３８Ｄである。
【００６８】
配列番号２５１〜２５８は配列番号２６６〜２６８の部分配列（切断フラグメント）である。
【００６９】
配列番号２５９〜２６２は、配列番号２６７〜２６８の変異型部分配列（変異型切断フラグメント）である。
【００７０】
配列番号２６３〜２６５は短いペプチドスペーサーのアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号２５１〜２６２はモノマーＰＰ１リガンドの更なる実施例である。
【００７２】
当分野で周知のように、３文字のアミノ酸コドンおよび１文字のアミノ酸コドンが本明細書に使用されている。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
この特許または出願ファイルは、色つきの少なくとも１の図面を含む。色つき図面を有する本特許または特許出願公報のコピーは、リクエストおよび必要な料金とともに、特許庁によって提供されるであろう。
【図１−１】図１−１は、それぞれの配列番号に対応した本発明のポリリガンドの例を示す。
【図１−２】図１−２は、それぞれの配列番号に対応した本発明のポリリガンドの例を示す。
【図２】図２Ａ−Ｆは、スペーサー有り、無しのホモポリマーリガンドの例を示す。
【図３】図３Ａ−Ｅは、スペーサー無しのヘテロポリマーリガンドの例を示す。
【図４】図４Ａ−Ｉは、スペーサー有りのヘテロポリマーリガンドの例を示す。
【図５】図５Ａ−Ｈは、任意のエピトープタグに結合したリガンドおよびポリマーリガンドの例を示す。
【図６】図６Ａ−Ｈは、任意のレポータに結合したリガンドおよびポリマーリガンドの例を示す。
【図７】図７Ａ−Ｉは、任意の局在シグナルに結合したリガンドおよびポリマーリガンドの例を示す。
【図８】図８Ａ−Ｋは、任意の局在シグナルおよび任意のエピトープタグに結したリガンドおよびポリリガンドの例を示す。
【図９】図９Ａ−Ｇは、リガンドおよびポリリガンドが任意の局在シグナルおよび任意のエピトープタグ、および／または任意のレポータに結合している遺伝子コンストラクトの例を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターの例を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターの例を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターの例を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターの例を示す。
【図１１】図１１は、ポリリガンドの組み合わせの合成について有益な配列クローニングプロセスの例を示す。
【図１２】図１２は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図１３】図１３は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図１４】図１４は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図１５】図１５は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図１６】図１６は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図１７】図１７は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図１８】図１８は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図１９】図１９は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図２０】図２０は、図３１のデータを得るためのインビトロ転写／翻訳用のベクターを示す。
【図２１】図２１は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）およびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図２２】図２２は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込みおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図２３】図２３は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込みおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図２４】図２４は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込みおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図２５】図２５は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込みベクターおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図２６】図２６は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込みベクターおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図２７】図２７は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込みベクターおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図２８】図２８は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込みベクターおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図２９】図２９は、筋小胞体（小胞体）局在シグナルと融合した本発明のポリリガンドについての、ＡｔｔＳｉｔｅを介したゲノム組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）ベクターおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能発現のためのベクターを示す。
【図３０】図３０Ａ−Ｄは、Ｐ１９細胞を示す。図３０Ａは未分化のＰ１９細胞を示す。図３０ＢはＤＭＳＯを作用させて４８時間後のＰ１９細胞を示す。図３０ＣはＤＭＳＯを用いて分化させた８日後の脈動しているＰ１９心筋細胞の静止画（写真）である。図３０Ｄは、心筋トロポニン（赤）を発現している分化したＰ１９心筋細胞を示す。ウサギ抗心筋トロポニンＩおよびヤギ抗ウサギ２次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６と抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）した。核は、ＤＡＰＩ（青）で対比染色した。具体的には、Ｐ１９細胞を生物学的ペトリ皿に播種し、４８時間ＤＭＳＯを作用させた。これに続く胚様態（大きな細胞塊）を通常の培地の哺乳類組織培養プレートに移した。５日後、細胞はそのプレートでコンフルエントに達した。８日目までに、細胞は同期し、培養皿内で脈動した。分化した細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗トロポニンＩで培養し、それからＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６と抱合したヤギ抗ウサギＩｇＧ２次抗体とともに培養した。細胞核をＤＡＰＩで対比染色した。細胞を適宜なフィルタおよびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎＭ２カメラを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ上で撮像した。
【図３１】図３１は、インビトロアッセイ中のＰＰ１の阻害率％を示す。ポリリガンドは、Ａｍｂｉｏｎ’ｓＳＰ６メガスクリプトキットを用いてプラスミドＤＮＡからインビトロで翻訳された（ＡＭ１３３０；製造者プロトコルに従って）。続いて、Ａｍｂｉｏｎ’ｓ  Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ（ＡＭ１２００；製造者プロトコルに従って）を用いてインビトロでＲＮＡを翻訳し、ＰｉｅｒｃｅのＰｒｏｆｏｕｎｄ  ＨＡ  Ｔａｇ  ＩＰ  Ｋｉｔ（２３６１０；製造者プロトコルに従って）を使用する網状赤血球（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ）ライセートで免疫沈降反応を行った。翻訳産物をＰｉｅｒｃｅのＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（１８５６２１０；マイクロプレート工程）を用いて定量化した。定量化後、２ウェルの低結合マイクロタイタプレート（ＴＲＰ  ９６１９６）内で酵素反応を行った。ＰＰ１基質は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートであり、切断されたリン酸塩分子の出現によって、４０５ｎｍで読み取り可能な発色性生成物が形成される。
【図３２】図３２は、図２４に示されるベクターのＰ１９細胞での一過性発現を示す。ＳＲ局在シグナルと融合した配列番号２３３の発現は、２４時間、ジアシルヒドラジン活性化ドラッグ（Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−第３級−ブチルヒドラジンを付加することによって、誘導される。赤色はホスホランバンの局在を示す。緑色は、ポリリガンドデコイ（ｄｅｃｏｙ）配列番号２３３の位置を示す。青色は核である。この顕微鏡写真は、赤色と緑色のオーバーラップ（黄色）が、ホスホランバンおよびＰＰ１デコイの共局在の指標となる合成画像である。抗ホスホランバン抗体とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６（赤色）と抱合される２次抗体を用いてホスホランバンを撮像した；細胞核をＤＡＰＩ（青色）で染色した；ＨＡ−タグ付デコイをラット抗ＨＡ抗体、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（緑色）と抱合した２次抗体を用いて撮像した。２０，０００のＰ１９マウスの胚性腫瘍細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレートに播種した。細胞に０．４μｇベクタ（ＶＶＮ８４６４）および１．２μｇのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をトランスフェクションした。１μＭのアクチベータ薬剤を作用させる前に、細胞を４８時間インキュベータに戻した。誘導した細胞を２４時間インキュベータに戻した。これらの細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗ＰＬＢで染色し、続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６と抱合するヤギ抗ウサギＩｇＧで染色した。次いで、細胞をウサギ抗ＨＡで染色し、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４４８と抱合されるウサギ抗ラットＩｇＧ抗体で染色した。最終的に、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。青色蛍光（ＤＡＰＩ）、緑色蛍光（Ａｌｅｘａ４８８）、または、赤色蛍光（Ａｌｅｘａ５４６）を検出するように設計されたＡｘｉｏＣａｍＭＲ２カメラおよびエピ蛍光フィルタを取り付けたＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで染色した細胞を撮像した。
【図３３】図３３Ａおよび図３３Ｂは、ＡｔｔＳｉｔｅ組み替え技術を用いてＰ１９細胞のゲノムに組み込んだ後（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＳＦ３７０．１リコンビナーゼＶＶＮ−３２１７を保持するプラスミドの共トランスフェクション）、アクチベータ有りおよび無しで、ＳＲ局在デコイ（ＶＶＮ８４６４）の発現を示す。２４時間、５００μＭアクチベータを作用させることによって、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導可能プロモータから上記ポリリガンドデコイを発現させた。赤色は、ホスホランバンの位置を示す。緑色は我々のポリリガンド（ＳＲ局在シグナルと融合した配列番号２３９）の局在を示す。青色は核を示す。合成画像中の赤色と緑色のオーバーラップ（黄色）は、共局在を示す。図３３Ａはアクチベータドラッグなし。図３３Ｂはアクチベータドラッグあり。合成フィールドは、ＤＡＰＩ（青色）で染色した細胞核、ラット抗ＨＡと、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（緑色）が抱合される２次抗体とで撮像されたＨＡ−タグ付きのポリリガンド、ウサギ抗ＰＬＢ−ホスホスレオニン抗体と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６（赤色）が抱合される２次抗体とで染色されることによって撮像されるホスホＰＬＢ−Ｔｈｒ１７である。
【図３４】図３４は、安定的に組み込まれ、心筋細胞に分化される誘導可能ポリリガンドコンストラクトを有するＰ１９細胞を示す。本発明のポリリガンドを検出するために、セリン１６（赤色）でリン酸化されたホスホランバンと、ＨＡエピトープ（緑色）とに対する免疫染色の代表的合成画像が示されている。さらに細胞をＤＡＰＩで対比染色して核を示した。黄色はリン酸化ホスホランバンおよびポリリガンドの共局在を示す。
【図３５−１】図３５Ａ−Ｂは、それぞれワイルドタイプのホスホランバンおよび疑似リン酸化されたホスホランバンの図を示す。
【図３５−２】図３５Ｃ−Ｅは、本発明のＰＰ１リガンドの図を示す。
【図３６】図３６は、ＰＰ１インヒビタリガンドを有するワイルドタイプのホスホランバンの配列アライメントを示しており、ここで、ワイルドタイプのホスホランバンの位置１６および／または１７に対応するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異され、位置３１−５２（Ｘとして指定）に対応するアミノ酸は、ワイルドタイプ以外の任意のアミノ酸に変異される。一実施例においては、Ｘはアラニンまたはグリシンである。
【図３７】図３７はＰＰ１インヒビタを有するワイルドタイプのホスホランバンの配列アライメントであり、ワイルドタイプホスホランバンの位置１６および／または１７に対応するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異し、他のアミノ酸は、図示されるように、置換体を有するか、または、削除される。
【図３８】図３８Ａ−ＢはポリリガンドＰＰ１インヒビタの例示的な図を示す。
【図３９】図３９は、ウサギ由来のＰＰ１を使用して、図３１のデータを得るために使用されるものと同様のインビトロアッセイの結果を示す。
【図４０】図４０は、安定的に組み込まれたポリリガンドコンストラクトを有しない、セリン１６（赤色）でのリン酸化されたホスホランバンについて免疫染色されたｐ１９細胞を示す。
【図４１】図４１は、図３９のデータを生成する貯めに使用されるインビトロ転写／翻訳に関するベクターを示す。
【図４２】図４２は、図３９のデータを生成する貯めに使用されるインビトロ転写／翻訳に関するベクターを示す。
【図４３】図４３は、図３９のデータを生成する貯めに使用されるインビトロ転写／翻訳に関するベクターを示す。
【図４４】図４４は、図３９のデータを生成する貯めに使用されるインビトロ転写／翻訳に関するベクターを示す。
【図４５】図４５は、図３９のデータを生成する貯めに使用されるインビトロ転写／翻訳に関するベクターを示す。
【図４６】図４６は、図３９のデータを生成する貯めに使用されるインビトロ転写／翻訳に関するベクターを示す。
【図４７】図４７は、図３９のデータを生成する貯めに使用されるインビトロ転写／翻訳に関するベクターを示す。
【図４８】図４８は、図３９のデータを生成する貯めに使用されるインビトロ転写／翻訳に関するベクターを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
［本発明の簡単な説明］
新規ＰＰ１ポリリガンドおよび該ポリリガンドの製造方法および使用方法を開示する。ポリリガンドデコイは、任意選択的に、局在シグナルに結合している。インビトロ酵素アッセイおよび生細胞アッセイをＰＰ１モジュレート活性を試験するために使用した。
【００７５】
ＰＰ１は魅力的な治療ターゲットを示すにも関わらず、ヒト治療における一般的なＰＰ１インヒビタの使用は、ＰＰ１のパンセルラ（ｐａｎｃｅｌｌｕｌａｒ）阻害が、細胞分裂サイクルの調節を解除させるので、問題となっている（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３１９１７−２４）。この問題を克服するために、米国特許第７，０７１，２９５号に開示されている筋小胞体（小胞体）局在シグナルは、心臓のＳＲにＰＰ１リガンドを局在化する１つの方法が示されている。
【００７６】
本発明のＰＰ１リガンドを、業界標準のタンパク質ベースのＰＰ１インヒビタとインビトロアッセイで比較した。さらに、我々は、ＰＰ１リガンドをＳＲ局在シグナルに結合し（７，０７１，２９５）、Ｐ１９心筋細胞で発現させた。
【００７７】
本発明の側面は、切断および／またはアミノ酸置換を介して、天然基質および／またはレギュレータを修飾することによる、ＰＰ１活性の新規なインヒビタを提供する。本発明の別の側面は、新規インヒビタとその変形体を互いに結合させることによって、ＰＰ１活性のモジュール式ポリリガンドインヒビタを提供することである。本発明のさらなる態様は、ＰＰ１インヒビタ、リガンドまたはポリリガンドの細胞性局在である。
【００７８】
本発明の側面は、心臓組織でカルシウム吸収を上昇させる手段としてのＰＰ１インヒビタを包含する。ＰＰ１を阻害することによって、筋小胞体（小胞体）カルシウムポンプの阻害は、軽減される。疾患のある心臓の筋小胞体（小胞体）内へのカルシウム吸収の上昇は、心不全の潜在的な治療法を示している。
【００７９】
本発明の更なる側面は、任意の組織で有用なＰＰ１インヒビタを包含する。本発明の更なる実施例は、細胞領域に標的化された局在シグナルに結合させることによって、様々な細胞位置に局在するＰＰ１インヒビタを包含する。
【００８０】
本発明は、ポリペプチドリガンドおよびＰＰ１ポリリガンドに関する。
【００８１】
ＰＰ１リガンドの各種実施例およびポリリガンドは、配列番号１〜１１１で示される。より具体的には、本発明は、配列番号６７〜８２および／または配列番号９２〜１１１の任意の１又はそれ以上を具える、リガンド、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号５７〜６６および配列番号８３〜９１またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上の部分配列を具えるリガンドおよびポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号６７〜８２および配列番号９２〜１１１またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上を具えるポリリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％配列同一性を有するポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号５７〜６６および配列番号８３〜９１の１又はそれ以上の部分配列を含むポリリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％配列同一性を有するポリリガンドに関する。
【００８２】
ＰＰ１リガンドおよびポリリガンドの更なる実施例は、配列番号１１３〜１７６に示される。より具体的には、本発明は、配列番号１１３〜１６４またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上の任意のものを含むリガンド、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号１１３〜１６４またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上を具えるポリリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリリガンドに関する。
【００８３】
ＰＰ１リガンドおよびポリリガンドのさらなる実施例は、配列番号１７７〜２２３に示される。より具体的には、本発明は、配列番号２１２〜２２３の任意の１又はそれ以上を具えるリガンド、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号２０１〜２１１またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上の部分配列を具えるリガンドおよびポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号２１２〜２２３またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上を具えるポリリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号２０１〜２１１またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上を具えるポリリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリリガンドに関する。
【００８４】
ＰＰ１リガンドおよびポリリガンドの更なる実施例は、配列番号２２４〜２６２に示される。より具体的には、本発明は、配列番号２５１〜２６２の任意の１又はそれ以上を具えるリガンド、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号２６６〜２６８またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上の部分的配列（切断フラグメント）を具えるリガンドおよびポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号２５１〜２６２またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上を具えるポリリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリリガンドに関する。さらに、本発明は、配列番号２６６〜２６８またはこれらの任意の部分の１又はそれ以上を具えるポリリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリリガンドに関する。
【００８５】
ホモポリリガンドまたはヘテロポリリガンドでもよいポリリガンドは、２又はそれ以上のモノマーポリペプチドリガンドからなるキメラリガンドである。モノマーリガンドの例は、配列番号６７によって示されるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号６７は、親の全長配列番号６６から選択された部分配列であり、親配列のＸａａに対応するアミノ酸は、ＰＰ１によって脱リン酸化可能であるセリン又はスレオニンである。ホモポリリガンドの例は、配列番号６７のダイマーまたはマルチマーを具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号６７と、１又はそれ以上の配列番号６８〜８２または配列番号９２〜１１１とを具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号６７〜８２および配列番号９２〜１１１を組み合わせ、ホモポリマーまたはヘテロポリマーリガンドとする多数の方法がある。さらに、配列番号５７〜６６および配列番号８３〜９１のさらなる部分配列を、互いに組み合わせて、および、配列番号６７〜８２および配列番号９２〜１１１と組み合わせてポリマーリガンドを作る方法が多数ある。
【００８６】
モノマーのリガンドの別の例は、配列番号１３６によって示されるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。ホモポリリガンドの例は、配列番号１５３のダイマーまたはマルチマーを具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号１６４と、１又はそれ以上の配列番号１１３〜１６３を具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号１１３〜１６４を組み合わせてホモポリマーまたはヘテロポリマーリガンドにする方法は多数ある。さらに、配列番号１１３のさらなる部分配列を、互いに組み合わせて、または、配列番号１１３〜１６４と組み合わせて、ポリマーリガンドを作る方法が多数ある。
【００８７】
モノマーリガンドの別の例は、配列番号２１２によって示されるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号２１２は、親の全長配列番号２０１から選択された部分配列であり、親配列中のＸａａに対応するアミノ酸は、ＰＰ１によって脱リン酸化可能なセリンまたはスレオニンである。ホモポリリガンドの例は、配列番号２１２のダイマーまたはマルチマーを具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号２１２と、１又はそれ以上の配列番号３７〜４７を具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号２１２〜２２３を組み合わせて、ホモポリマーまたはヘテロポリマーリガンドにする方法は多数ある。さらに、配列番号２０１〜２１１のさらなる部分配列を互いに組み合わせて、および、配列番号２１２〜２２３と組み合わせて、ポリマーリガンドを作る方法が多数ある。
【００８８】
モノマーリガンドの別の例は、配列番号２５１によって示されるポリペプチドである。配列番号２５１は、親の全長配列番号２６６から選択された部分配列である。ホモポリリガンドの例は、配列番号２５１のダイマーまたはマルチマーを具えるポリペプチドである。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号２５１と、１又はそれ以上の配列番号２５２〜２６２を具えるポリペプチドである。配列番号２５１〜２６２を組み合わせてホモポリマーまたはヘテロポリマーリガンドにする方法は多数ある。さらに、配列番号２６６〜２６８のさらなる部分配列を互いに組み合わせて、および、配列番号２５１〜２６２と組み合わせてポリマーリガンドを作る方法は多数ある。
【００８９】
本発明のポリリガンドは、モノマーの前、後、またはその間にスペーサーアミノ酸を任意選択的に具える。配列番号１は、構造体Ａ−Ｓ１−Ｂ−Ｓ２−Ｃのポリリガンドの実施例であり、Ａは配列番号９２であり（ＸａａはＡｌａである）、Ｂは配列番号６８であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｃは配列番号９３であり（ＸａａはＧｌｕである）、Ｓ１はアミノ酸配列ＰＧＡＧＧの５つのアミノ酸スペーサーであり、Ｓ２はアミノ酸配列ＰＧＡＡＧの５つのアミノ酸スペーサーである。この発明は、上述した例または後述される例に限定されるものではない、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドの組み合わせの全てを包含する。この説明において、用語「リガンド」の使用は、モノマーリガンド、ポリマーリガンド、ホモポリマーリガンド、および／またはヘテロポリマーリガンドを包含する。さらに、用語「リガンド」は、用語「デコイ」、「インヒビタ」および「モジュレータ」を包含する。
【００９０】
モノマーリガンドは、ポリペプチドの少なくとも一部がＰＰ１によって認識されるポリペプチドである。認識可能なポリペプチドの部分は、認識モチーフに基づいている。本発明においては、認識モチーフは、天然または合成でもよい。認識モチーフの例は、当分野で周知であり、限定するものではないが、自然発生的なＰＰ１基質、疑似基質モチーフ、およびＰＰＩ調節結合タンパク質およびその修飾体に存在する相互作用ドメインを含む。
【００９１】
ポリマーリガンド（ポリリガンド）は、２又はそれ以上のモノマーリガンドを具える。
【００９２】
ホモポリマーリガンドは、セリン、スレオニンまたはチロシンなどの脱リン酸化可能な残基が１又はそれ以上のモノマーリガンドで置換または修飾されている場合を除いて、各々のモノマーリガンドがアミノ酸配列と同一であるポリマーリガンドである。修飾は、限定するものではないが、疑似リン酸化残基（酸性アミノ酸）への置換、または中性残基への置換を含む。
【００９３】
ヘテロポリマーリガンドは、モノマーリガンドのいくつかが同一アミノ酸配列を有しないポリマーリガンドである。
【００９４】
本発明のリガンドは、エピトープタグ、レセプタ、および／または細胞局在シグナルを提供するさらなる分子またはアミノ酸に任意選択的に結合される。細胞局在シグナルは、細胞領域に対するリガンドを標的にする。エピトープタグおよび／またはレポータおよび／または局在シグナルは同一分子でもよい。エピトープタグおよび／またはレセプタおよび／または局在シグナルは、異なる分子でもよい。
【００９５】
さらに、本発明は、リガンド、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドをコードするポリヌクレオチド配列を具えるポリヌクレオチドを包含する。本発明の核酸は、エピトープタグ、レポータおよび／または細胞局在シグナルなど、さらなる特性を有するポリペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列に任意選択的に結合される。これらのポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ活性に必要な他のヌクレオチドを具えるヌクレオチド配列によって任意選択的にフランキング（ｆｌａｎｋ）される。これらのフランキング配列は、ベクター内の特有のクローニングサイトを任意選択的に提供し、次のクローニングの方向性を選択的に付与する。さらに、本発明の核酸は、ベクターのポリヌクレオチド内に任意選択的に組み込まれる。本発明のリガンド、ポリリガンドおよびポリヌクレオチドは、リサーチツールおよび／または治療法としての有用性がある。
【００９６】
［本発明の詳細な説明］
本発明は、ＰＰ１モジュレータであるリガンドおよびポリリガンドに関する。リガンドおよびポリリガンドの各種実施例は、配列番号１〜１１１に示される。ポリリガンドは２又はそれ以上のモノマーポリペプチドリガンドを具えるキメラリガンドである。モノマーリガンドの例は、配列番号９２によって示されるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号９２は、親の全長配列番号８３の選択された部分配列であり、親の配列中のＸａａに対応するアミノ酸はセリンまたはスレオニンである。モノマーリガンドの別の例は、配列番号７５によって示されるポリペプチドである。配列番号６７〜８２および配列番号９２〜１１１の各々は、モノマー形態において、個々のポリペプチドリガンドを示し、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号６７〜８２および配列番号９２〜１１１は、それぞれ、配列番号８３〜９１および配列番号５７〜６６の部分配列の選択された例であるが、しかしながら、他の配列番号８３〜９１および／または配列番号５７〜６６の他の部分配列も、モノマーリガンドとして使用することができる。配列番号８３〜９１および配列番号５７〜６６のモノマー部分配列は、親のポリペプチドの一部と同一である。さらに、配列番号８３〜９１および／または配列番号５７〜６６のモノマー部分配列は、アミノ酸置換体を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、配列番号６７〜８２および配列番号９２〜１１１の１又はそれ以上においてアミノ酸配列を具えるリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、配列番号８３〜９１および配列番号５７〜６６の部分配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してもよい。
【００９７】
リガンドおよびポリリガンドの更なる実施例は、配列番号１１３〜１７６に示される。ポリリガンドは、２又はそれ以上のモノマーポリペプチドリガンドを具えるキメラリガンドである。モノマーリガンドの例は、配列番号１６１によって示されるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。モノマーリガンドの別の例は、配列番号１３７によって示されるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号１１３〜１６４の各々は、モノマー形態において、個々のポリペプチドリガンドを示し、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号１３７〜１６４は、配列番号１１３の部分配列の選択された例であるが、しかしながら、配列番号１１３の他の部分配列もモノマーリガンドとして使用可能である。配列番号１１３のモノマーリガンド部分配列は、親ワイルドタイプの基準配列と同一であってもよい。さらに、配列番号１１３のモノマーリガンドの部分配列は、他のアミノ酸によって置換されたＰＰ１脱リン酸化可能アミノ酸を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、配列番号１１３〜１６４の１又はそれ以上のアミノ酸配列を具えるリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、配列番号１１３の部分配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してもよい。
【００９８】
リガンドおよびポリリガンドのさらなる実施例は、配列番号１７７〜２２３に示されている。ポリリガンドは、２又はそれ以上のモノマーポリペプチドリガンドを具えるキメラリガンドである。モノマーリガンドの例は、配列番号２３３によって示されるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号２２３は、親全長配列番号２１０の選択された部分配列であり、親配列中のＸａａに対応するアミノ酸は、セリンまたはスレオニンである。モノマーリガンドの別の例は、配列番号２１９によって示されるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号２１２〜２２３の各々は、モノマー形態における個々のポリペプチドリガンドを示しており、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号２１２〜２２３は、配列番号２０１〜２１１の部分配列の選択された実施例であるが、しかしながら、配列番号２０１〜２１１の他の部分配列もモノマーリガンドとして使用可能である。配列番号２０１〜２１１のモノマー部分配列はモノマーリガンドとして使用可能である。配列番号２０１〜２１１のモノマー部分配列は親ポリペプチドの一部と同一であってもよい。さらに、配列番号２０１〜２１１のモノマー部分配列は、アミノ酸置換体を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、配列番号２１２〜２２３の１又はそれ以上のアミノ酸を具えるリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、配列番号２０１〜２１１の１又はそれ以上のアミノ酸を具えるリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してもよい。
【００９９】
リガンドおよびポリリガンドの更なる実施例は、配列番号２２４〜２６８で示される。ポリリガンドは、２又はそれ以上のモノマーポリペプチドリガンドを具えるキメラリガンドである。モノマーリガンドの例は、配列番号２５７によって示されるポリペプチドである。配列番号２５７は親の全長配列番号２６７の選択された部分配列である。モノマーリガンドの別の例は、配列番号２６１によって示されるポリペプチドであえる。配列番号２５１〜２６２の各々は、モノマー形態における個々のポリペプチドリガンドを示す。配列番号２５１〜２６２は、配列番号２６６〜２６８の親配列の選択された例であるが、しかしながら、配列番号２６６〜２６８の他の部分配列もモノマーリガンドとして使用されてもよい。配列番号２６６〜２６８のモノマー部分配列は親ポリペプチドの一部と同一であってもよい。配列番号２６６〜２６８のモノマー部分配列は、アミノ酸置換体を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、配列番号２５１〜２６２の１又はそれ以上のアミノ酸を具えるリガンドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、配列番号２６６〜２６８の部分配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有してもよい。
【０１００】
ホモポリリガンドの例は、配列番号７１のダイマーまたはマルチマーを具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号６７と、配列番号６８〜８２または配列番号９２〜１１１の１又はそれ以上を具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号６７〜８２および配列番号９２〜１１１を組み合わせてホモポリマーまたはヘテロポリマーリガンドにする方法が多数ある。さらに、配列番号５７〜６６および／または配列番号８３〜９１のさらなる部分配列を互いに組み合わせて、および、配列番号６７〜８２および／または配列番号９２〜１１１と組み合わせてポリマーリガンドを作る方法が多数ある。
【０１０１】
ホモポリリガンドの別の例は、配列番号１５４のダイマーまたはマルチマーを具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号１６４と、１又はそれ以上の配列番号１１３〜１６３を具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号１１３〜１６４を組み合わせてホモポリマーまたはヘテロポリマーリガンドにする方法は多数ある。さらに、配列番号１１３のさらなるサブシークエンスを互いに組み合わせて、および、配列番号１１３〜１６４と組み合わせてポリマーリガンドを作る方法が多数ある。
【０１０２】
ホモポリリガンドの別の例は、配列番号２１７のダイマーまたはマルチマーを具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号２２３と、１又はそれ以上の配列番号２１２〜２２２を具えるポリペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号２１２〜２２３を組み合わせてホモポリマーまたはヘテロポリマーリガンドにする多数の方法がある。さらに、配列番号２０１〜２１１のさらなる部分配列を互いに組み合わせて、および、配列番号２１２〜２２３と組み合わせてポリマーリガンドを作る方法が多数ある。本発明は、限定するものではないが、ホモポリリガンドとヘテロポリリガンドの可能な全ての組み合わせに関する。
【０１０３】
ホモポリリガンドの別の例は、配列番号２６０のダイマーまたはマルチマーを具えるポリペプチドである。ヘテロポリリガンドの例は配列番号２５１と、１又はそれ以上の配列番号２５２〜２６２を具えるポリペプチドであり、配列番号２５１〜２６２を組み合わせてホモポリマーリガンドまたはヘテロポリマーリガンドとする方法が多数ある。さらに、配列番号２６６〜２６８のさらなる部分配列を互いに組み合わせて、および、配列番号２５１〜２６２と組み合わせて、ポリマーリガンドを作る方法が多数ある。本発明は、限定するものではないが、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドの可能な全ての組み合わせに関する。本発明のリガンドおよびポリリガンドは、１又はそれ以上のＰＰ１アイソフォームの内在性効果を調節するように設計される。
【０１０４】
ポリリガンドは、配列番号６７〜８２および／または配列番号９２〜１１１のいずれかの２又はそれ以上を具えてもよく、Ｘａａは任意のアミノ酸である。配列番号１０９のダイマーまたはマルチマーは、ホモポリリガンドの例である。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号１１１と、配列番号９２〜１１０および／または配列番号６７〜８２の１又はそれ以上を具えるポリペプチドである。ポリリガンドは、配列番号１１３〜１６４のいずれかの２又はそれ以上を具える。配列番号１４２のダイマーまたはマルチマーはホモポリリガンドの例である。ヘテロポリリガンドの例は、配列番号１３６と、配列番号１３７〜１６４の１又はそれ以上を具えるポリペプチドである。ポリリガンドは、配列番号２１２〜２２３、または配列番号２５１〜２６２のいずれか２又はそれ以上を更に具え、Ｘａａは任意のアミノ酸である。本発明は、限定するものではないが、ホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドの可能な全ての組み合わせに関する。
【０１０５】
配列番号５７〜６６は、ＰＰ１によって脱リン酸化可能な少なくとも１つのセリンまたはスレオニン残基を含むタンパク質を示しており、それらの位置はＸａａとして示されている。配列番号６７〜８２は、ＰＰ１が脱リン酸化可能な残基の位置がＸａａとして示されている配列番号５７〜６６の部分配列である。配列番号１１３〜１６４は、ＰＰ１によって脱リン酸化可能な少なくとも１つのセリンまたはスレオニン残基を含むタンパク質を示しており、それらの位置はＸａａとして示されている。配列番号１３７〜１６４は、ＰＰ１脱リン酸化可能な残基の位置がＸａａとして示されている配列番号１１３のサブシークエンスである。配列番号２１２〜２１９はＰＰ１が脱リン酸化可能の少なくとも１のアミノ酸残基を含むタンパク質を示しており、それらの位置は、Ｘａａとして示されている。配列番号２１２〜２１９はＰＰ１脱リン酸化可能残基の位置がＸａａとして示される配列番号２０１〜２０７の部分配列である。天然において、Ｘａａは、一般的に、セリンまたはスレオニンである。本発明の一実施例においては、Ｘａａは任意のアミノ酸でもよい。Ｘａａがセリンまたはスレオニンであるリガンドは、ポリリガンドの一部として使用可能であるが、一実施例においては、少なくとも１のセリンまたはスレオニンは、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンを含む天然アミノ酸の１つなど、別のアミノ酸で置換される。Ｘａａは非天然のアミノ酸でもよい。別の実施例では、ＰＰ１が脱リン酸化可能なセリンまたはスレオニンはアラニンによって置換可能である。本発明のリガンドおよびポリリガンドは、１又はそれ以上のＰＰ１アイソフォームの内在性効果を調節するように設計されている。
【０１０６】
一般的に、天然のＰＰ１レギュレータに基づいたリガンドモノマーは、仮想ＰＰ１相互作用ドメイン認識モチーフを識別し、単離することによって構築される。細胞性キナーゼによって影響を受けるセリンおよび／またはスレオニン残基での相互作用ドメインを修飾することが望ましい場合もある。さらなるモノマーは、ＰＰ１認識モチーフ、ならびにこのＰＰ１相互作用ドメイン認識モチーフの側面に隣接および接触するアミノ酸を具える。従って、モノマーがＰＰ１認識モチーフを含む場合、モノマーリガンドは任意の長さでもよい。例えば、モノマーは、ＰＰ１認識モチーフと、この認識モチーフに隣接する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または１００あるいはそれ以上のアミノ酸とを具えてもよい。更なる設計の検討は、リガンドの３次元モデルと、ＰＰ１との結合相互作用のモデルから得られる。リガンドまたはポリリガンドのプライマリーシークエンスの修飾は、このようなモデルに基づいている。
【０１０７】
例えば、一実施例においては、本発明は、
ａ）配列番号５７のアミノ酸残基２８５〜２９５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号５７のアミノ酸残基２８８に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｂ）配列番号５７のアミノ酸残基２８１〜２９９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があるペプチドであって、配列番号５７のアミノ酸残基２８８に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｃ）配列番号５７のアミノ酸残基２７９〜３０２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があるペプチドであって、配列番号５７のアミノ酸残基２８８に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｄ）配列番号５７のアミノ酸残基２７７〜３０３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があるペプチドであって、配列番号５７のアミノ酸残基２８８に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つのコピーを含むＰＰ１のインヒビタを具える。
【０１０８】
別の実施例においては、本発明は、
ａ）配列番号１１２のアミノ酸残基１〜５１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号１１２のアミノ酸残基１６および１７に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｂ）配列番号１１２のアミノ酸残基２〜５１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号１１２のアミノ酸残基１６および１７に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｃ）配列番号１１２のアミノ酸残基８〜３０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号１１２のアミノ酸残基１６および１７に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｄ）配列番号１１２のアミノ酸残基１１〜２７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号１１２のアミノ酸残基１６および１７に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つのコピーを含むＰＰ１のインヒビタを具える。
【０１０９】
別の実施例においては、本発明は、
ａ）配列番号２０６のアミノ酸残基１１４〜１４３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号２０６のアミノ酸残基１４０に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｂ）配列番号２０６のアミノ酸残基１２０〜１４３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号２０６のアミノ酸残基１４０に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｃ）配列番号２０６のアミノ酸残基１２７〜１４３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号２０６のアミノ酸残基１４０に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｄ）配列番号２０６のアミノ酸残基１３０〜１４２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号２０６のアミノ酸残基１４０に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つのコピーを含むＰＰ１インヒビタを具える。
【０１１０】
別の実施例においては、本発明は、
ａ）配列番号２６７のアミノ酸残基３５〜４７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号２６７のアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｂ）配列番号２６７のアミノ酸残基３０〜４７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号２６７のアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｃ）配列番号２６７のアミノ酸残基４８〜６７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号２６７のアミノ酸残基６６に対応するアミノ酸残基が、グリシン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
ｄ）配列番号２６７のアミノ酸残基４８〜６７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性があり、配列番号２６７のアミノ酸残基６７に対応するアミノ酸残基が、メチオニン以外のアミノ酸残基に変異されるペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つのコピーを含むＰＰ１インヒビタを具える。
【０１１１】
本明細書で使用されるように、用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」および「対応している」は、例えば、ＰＰ１サブユニット１４Ａ  ＮＰ＿１５０２８１．１（配列番号２６７）など、基準タンパク質内の列挙された位置、および、基準タンパク質の位置と整合（ａｌｉｇｎ）する上記位置を意味する。従って、対象ペプチドのアミノ酸配列が、例えば配列番号２６７など、基準ペプチドのアミノ酸配列と整合されるとき、基準ペプチド配列の所定の列挙された位置に「対応する」対象ペプチド配列中のアミノ酸は、基準ペプチド配列の上記位置と整合するものであるが、基準配列の正確な番号の位置であることを必要としない。配列間のアミノ酸の対応を決定するための配列アライメント方法は、下記に示す。
【０１１２】
本発明の更なる実施例は、例えば、配列番号５７〜６６、８３〜９１、２０１〜２１１および２６６〜２６８で識別される全長のタンパク質など、推定されるまたは実際の任意のＰＰ１またはＰＰ１結合タンパク質に対する基質あるいはレギュレータに基づいたモノマー（上述）を含む。さらに、基質が２以上の認識モチーフを有する場合、２以上のモノマーが同定される。
【０１１３】
別の実施例においては、ＰＰ１インヒビタは、ホスホランバン（図３５Ａ、配列番号１１２）、筋小胞体（小胞体）に位置される５２アミノ酸タンパク質、に基づいており、分子の細胞質ドメイン中のセリン１６およびスレオニン１７位置での細胞性キナーゼによってリン酸化可能である。ホスホランバンは、筋小胞体（小胞体）カルシウムポンプの周知の可逆的モジュレータである。脱リン酸化される場合、ホスホランバンはカルシウムポンプのカルシウム吸収活性を阻害し、リン酸化ホスホランバンは筋小胞体（小胞体）カルシウムポンプを阻害しない。カルシウム吸収の欠損は、心不全の研究でみつかった。従って、ホスホランバンのリン酸化または疑似リン酸化を制御することによって、心臓組織におけるカルシウム処理を調節することが望ましい。疑似リン酸化されたホスホランバンは、セリン１６およびスレオニン１７に対応するアミノ酸を、アスパラギン酸またはグルタミン酸などのアミノ酸に変異させることによって作製される（図３５Ｂ）。心筋症のハムスタ中で、疑似リン酸化ホスホランバンの発現によって、カルシウム吸収の上昇が示された（Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２  ８：８４６−７１，ｅＰｕｂ  ２００２  Ｊｕｌｙ  ２２）。ホスホランビンに基づいた本発明のＰＰ１リガンドは、図３５Ｃ−Ｅおよび図３６−３７に示される。
【０１１４】
本発明の別の実施例は、リガンドペプチドの少なくとも１つのコピーをコードするポリヌクレオチド配列を具える核酸分子である。  
【０１１５】
本発明の別の実施例は、ポリヌクレオチド配列が１又はそれ以上のペプチドリガンドの１又はそれ以上のコピーをコードする、核酸分子である。
【０１１６】
本発明の別の実施例は、ポリヌクレオチド配列が２、３、４、５、６、７、８、９または１０からなる群から選択されるペプチドの少なくともいくつかのコピーをコードする、核酸分子である。
【０１１７】
本発明の別の実施例は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも１のコピーをコードする核酸分子を含むベクターである。
【０１１８】
本発明の別の実施例は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも１のコピーをコードする核酸分子を含むベクターを具える組み替え宿主細胞である。
【０１１９】
本発明の別の実施例は、細胞内でＰＰ１を阻害する方法であり、当該方法は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも１のコピーをコードする核酸分子を具えるベクターを宿主細胞内にトランスフェクションするステップと、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも１つのコピーを産生するのに適した条件下で前記トランスフェクションした宿主細胞を培養するステップとを具える。
【０１２０】
さらに、本発明は、基準インヒビタに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性のある修飾されたインヒビタに関する。「修飾されたインヒビタ」は、インヒビタタンパク質またはポリペプチドのプライマリー構造（アミノ酸配列）内に１又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠損または置換によって形成可能であるペプチドを意味するのに使用される。「修飾された認識モチーフ」は、モチーフのプライマリー構造（アミノ酸配列）内に１又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠損または置換によって修飾された自然発生的ＰＰ１認識モチーフである。例えば、修飾されたＰＰ１認識モチーフは、リン酸化可能なアミノ酸が非リン酸化可能なアミノ酸に修飾されるところのモチーフでもよい。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」および「ペプチド」は本明細書において交換可能に使用される。基準インヒビタは、ワイルドタイプタンパク質またはその一部である必要はない。従って、基準インヒビタは、その配列がワイルドタイプタンパク質に対して既に修飾されているタンパク質またはペプチドでもよい。基準インヒビタは、特定の組織から得たワイルドタイプタンパク質であっても、そうでなくてもよい。
【０１２１】
例えば、基準アミノ酸配列に対して少なくとも約９５％「同一である（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、アミノ酸配列が基準ペプチドをコードする基準アミノ酸配列の１００アミノ酸毎に、最大で約５つの修飾を含んでもよいことを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が基準配列と同一であることを意味すると理解されたい。すなわち、基準アミノ酸配列に少なくとも約９５％同一なアミノ酸配列を有するペプチドを得るために、基準配列の最大約５％のアミノ酸残基が、削除されるか、別のアミノ酸に置換されてもよく、基準配列中の総アミノ酸の最大５％までのアミノ酸数が、基準配列に挿入されてもよい。基準配列のこのような修飾は、基準アミノ酸配列のＮ末またはＣ末位置、あるいは、基準配列中のアミノ酸中に個々に散在するか、基準配列中の１又はそれ以上のグループとして散在する上記末端位置同士間の任意の位置で生じてもよい。
【０１２２】
本明細書に使用されるように、用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、基準ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較して、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一の程度である。一般的に、順番の合致（ｏｒｄｅｒ  ｍａｔｃｈ）が最も高くなるように配列は並べられる。「同一性」それ自体は、技術で認識される意味を有しており、公開されている技術を使用して計算可能である（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；バイオコンピューティング：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；および、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍａｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｒｅｒｅｒｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）、参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、用語「同一性」は当分野の当業者に十分に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８））。限定するものではないが、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９４）およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８）で開示されたものを含む、２つの配列間の同一性または類似度を判定するのに一般的に使用される。さらに、コンピュータプログラムは、同一性および類似度を計算する方法およびアルゴリズムを含んでもよい。２つの配列間の同一性および類似度を判定するためのコンピュータプログラムの方法の例は、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３（１９９０））およびＦＡＳＴＤＢを含む。同一性および類似度を判定する方法の例は、参照することで本明細書に組み込む、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  １，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２０００）におけるＭｉｃｈａｅｌｓ，ＧおよびＧａｒｉａｎ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓで検討されている。本発明の一実施例においては、２又はそれ以上のポリペプ��ド間の同一性を判定するのに使用されるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰである。
【０１２３】
本発明の別の実施例においては、２又はそれ以上のポリペプチド間の同一性を判定するのに使用されるアルゴリズムは、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，のアルゴリズムに基づいているＦＡＳＴＤＢである（本明細書に組み込むＣｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）参照）。ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントにおいて、クエリおよび対象配列はアミノ酸である。配列アラインメントの結果は、同一性の割合である。同一性の割合を計算するアミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアライメントに使用可能なパラメータは、限定するものではないが、Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランドミゼーショングループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００またはどちらが短くても対象アミノ酸配列の長さ、を含む。
【０１２４】
ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性の割合を計算するときに対象配列のＮ末端およびＣ末端切断または付加を考慮していないので、対象配列が、中間部での付加または削除によらずＮ末端またはＣ末端の付加または削除によって、クエリ配列よりも短い若しくは長い場合は、手動修正がなされてもよい。クエリ配列に対して両端で切断された対象配列について、同一性の割合は、クエリ配列の総塩基数中の割合として、マッチ／アラインされていない基準配列に対するＮ−およびＣ−末端であるクエリ配列の塩基数を計算することによって修正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果は、マッチング／アライメントを決定する。次いで、アライメントの割合は、特定されたパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性の割合から減算され、最終的な同一性割合スコアに到達する。このように修正されたスコアは、どのようにアライメントが互いに「対応する」か決定する目的、ならびに、同一性の割合を決定する目的のために使用可能である。基準または対象配列のそれぞれのＮ−またはＣ−末端を超えて延在するクエリ（対象）配列または基準配列の残基は、同一性割合スコアを手動で調節する目的として考慮されている。すなわち、比較配列のＮ−またはＣ−末端とマッチング／アラインされない残基は、同一性割合スコアまたはアライメントナンバリングを手動で調節するときに、カウントされてもよい。
【０１２５】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性の割合を決定するために、１００残基基準配列とアライメントされる。欠損は、対象配列のＮ−末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ−末端での第１の１０残基のマッチング／アライメントを示していない。１０の不対残基は、配列の１０％を示しており（Ｎ−末端およびＣ−末端での残基数は、クエリ配列中の残基総数とマッチングしない）、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性割合スコアから減算される。残りの９０％の残基が完全にマッチングした場合、最終的な同一性の割合は９０％である。別の実施例においては、９０残基の対象配列が１００基準配列と比較される。今回は、欠損が内部にある欠損であり、クエリとマッチング／アライメントしない対象配列のＮ−またはＣ−末端に残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算される同一性割合は手動で修正されない。
【０１２６】
本発明のポリリガンドは、モノマーの前後、またはモノマー間にあるスペーサーアミノ酸配列を任意選択的に具える。スペーサーの長さと組成は変化してもよい。スペーサの例は、グリシン、アラニン、ポリグリシンまたはポリアラニンである。ポリペプチドの第２の構造を阻害する目的としてスペーサ中にプロリンを使用することが望ましい場合もある。スペーサーアミノ酸が、任意のアミノ酸でもよく、アラニン、グリシンおよびプロリンに限定されない。本発明は、スペーサあり、または、スペーサなしのホモポリリガンドおよびヘテロポリリガンドの組み合わせの全てに関するが、上記または下記の例に限定されるものではない。
【０１２７】
本発明のリガンドおよびポリリガンドは、エピトープタグ、レポータを提供し、かつ／または、細胞の領域にリガンドを局在化する付加的な分子またはアミノ酸に任意選択的に結合される（図５Ａ−５Ｈ、図６Ａ−６Ｈ、図７Ａ−７Ｉおよび図８Ａ−８Ｋ参照）。エピトープタグの非限定的な例は、ＦＬＡＧＴＭ、ＨＡ（赤血球凝集素）、ｃ−ＭｙｃおよびＨｉｓ６である。レポーターの非限定的な例は、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質である。細胞位置の非限定的な例は、筋小胞体、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体、ペルオキシダーゼ、リソソーム、核、核小体、エンドソーム、エキソソーム、他の細胞内ビークル、プラズマメンブラン、頂端膜（ａｐｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）および側低膜（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）である。エピトープ、レポータおよび局在シグナルは、限定するものではないが、例示されるように提供される。エピトープタグ、レポータおよび／または局在シグナルは、同一分子でもよい。また、エピトープタグ、レポータおよび／または局在シグナルは、異なる分子でもよい。
【０１２８】
リガンドとポリリガンド、およびこれらに結合される選択的なアミノ酸は、当分野の周知技術を用いて、化学的または組み替え的に合成可能である。化学合成技術は、限定するものではないが、自動ペプチド合成器を用いて頻繁に実行されるペプチド合成を含む。さらに、ペプチドは、当分野の周知な非自動ペプチド合成方法を使用して合成可能である。組み換え技術は、発現ベクタ内にリガンドコーディング核酸の挿入を含み、核酸発現生成物は、細胞因子およびプロセスを使用して合成される。
【０１２９】
細胞局在シグナル、エピトープタグ、または、レセプターのリガンドまたはポリリガンドへの結合は、リガンドへの共有結合または酵素的結合を含む。局在シグナルは、脂質または炭水化物など、ポリペプチド以外の材料を具えるとき、結合分子に対する化学反応が使用されてもよい。さらに、非標準アミノ酸、脂質で修飾されたアミノ酸、炭水化物、リン酸塩または他の分子は、ペプチド合成の前駆体として使用されてもよい。本発明のリガンドは、局在シグナルあり、または、なしで治療的用途を有する。なお、局在シグナルに結合したリガンドは、細胞内ツールまたは治療法として用途がある。心筋組織の筋小胞体（小胞体）に興味のある細胞内局在シグナルの例は、米国特許第７，０７１，２９５号に開示されている。
【０１３０】
ＰＰ１リガンド含有遺伝子コンストラクトは、遺伝子治療を介して送達される。図１０Ｂおよび１０Ｃは、インビボにおいてポリペプチド発現を送達および制御するための遺伝子治療ベクターの実施例を示す。図１０Ｂおよび１０Ｃ中の遺伝子コンストラクトに結合されたポリヌクレオチド配列は、ウィルス性ゲノムおよび／またはホストゲノム内にトランスジーンの組み込みを促進するためのゲノム組み込みドメインを具える。ＡｔｔＰおよびＡｔｔＢ配列は、ゲノム組み込み配列の非限定的な例である。
【０１３１】
図１０Ａは、ＰＰ１リガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターを示し、リガンド遺伝子コンストラクトは、トランスジェニックアニマルを生成するのに有用なユニットとしてベクターから放出可能である。例えば、リガンド遺伝子コンストラクトまたはトランスジーンは、制限エンドヌクレアーゼ消化によってベクターバックボーンから放出される。放出されたトランスジーンは、次いで、受精マウス卵の前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ）内に注入される；あるいは、トランスジーンは、胚性幹細胞をトランスフォームするために使用される。図１０Ａのリガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターは、さらに、トランスジーンの一過性トランスフェクションに有用であり、トランスジーンのプロモータおよびコドンはホスト組織に最適化される。図１０Ａのリガンド遺伝子コンストラクトを含むベクターは、小スケールまたは大スケール生成に適用可能なように、発酵性生物において、ポリペプチドの組み替え発現に有用であり、トランスジーンのプロモータおよびコドンは、発酵ホスト生物に最適化される。
【０１３２】
図１０Ｄは、適切な細胞株を生成するのに有用なＰＰ１遺伝子コンストラクトを含むベクターを示す。
【０１３３】
さらに、本発明は、リガンドおよびポリリガンドをコードするヌクレオチド配列を具えるポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、エピトープ、レポータおよび／または局在シグナルをコードするさらなるヌクレオチド配列に選択的に結合される。さらに、本発明の核酸は、ベクターポリヌクレオチド内に選択的に組み込まれる。ポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ部位と、制限エンドヌクレアーゼ活性に必要な他のヌクレオチドを具えるヌクレオチド配列によって選択的にフランキングされる。フランキング配列は、ベクター内にクローニング部位を選択的に提供する。制限部位は、限定するものではないが、最も商業的に入手可能なクローニングベクタにおいて一般的に使用される部位のいずれかを含む。ホーミングエンドヌクレアーゼを含む、他の制限酵素による開裂部位は、この目的に使用される。また、ポリヌクレオチドフランキング配列は、サブシークエンスクローニングの方向性を選択的に付与する。好ましくは、５’および３’制限エンドヌクレアーゼ部位は互いに異なり、二本鎖ＤＮＡは、クローニングベクタの対応する相補性部位内に、方向性を維持してクローニング可能である。
【０１３４】
局在シグナル、エピトープまたはレポータあり、または、なしのリガンドおよびポリリガンドは、リコンビナント技術によって代替的に合成される。所望の成分を含むポリヌクレオチド発現コンストラクトが作製され、発現ベクター内に挿入される。発現ベクターは、細胞内にトランスフェクションされ、ポリペプチド生成物が発現され、単離される。リコンビナントＤＮＡ技術によって作製されるリガンドは、リサーチツールおよび／または治療法に有用である。
【０１３５】
以下は、どのようにポリヌクレオチドがリガンドをコーディングし、ポリリガンドが生成されるかの例である。リガンドおよびフランキング配列をコードする相補的なオリゴヌクレオチドが合成され、アニールされる。得られた二重鎖ＤＮＡ分子は、当分野に周知な技術を使用してクローニングベクター内に挿入される。リガンドおよびポリリガンドが、タンパク質生成物内に翻訳されるトランスジーンコンストラクト内における配列に隣接したインフレームに配置されるとき、リガンドおよびポリリガンドは、細胞またはトランスジェニックアニマル内で発現される場合、融合タンパク質の一部を形成する。
【０１３６】
本発明の別の実施例は、所望の細胞または有機体において、トランスジーン発現の選択的制御に関する。組み替え遺伝子のプロモータ部分は、連続的プロモータ、非連続的プロモータ、組織特異的プロモータ（連続的または非連続的）または選択的に制御されたプロモータでもよい。異なるように選択的に制御されるプロモータは、異なる機構によって制御される。例えば、プロモータと他の必須の細胞因子を含む細胞がテトラサイクリンで処理される場合、テトラサイクリン誘導可能プロモータが活性化され、下流コード配列を発現する。他の誘導可能プロモータは、他の薬剤または因子によって活性化される。ＲＨＥＯＳＷＩＴＨＣは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能な誘導可能プロモータシステムである。温度感受性プロモータは、遺伝子発現を増大または減少するように使用可能である。本発明の実施例は、リガンドまたはポリリガンド遺伝子コンストラクトの発現が、誘導可能プロモータシステムによって制御されるリガンドまたはポリリガンド遺伝子コンストラクトを具える。図２１〜２９のベクターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＨＣ誘導可能遺伝子発現システムを実装する。
【０１３７】
ポリリガンドは本質的にモジュール式である。本発明の態様は、開示されたポリリガンドの組み合わせ的モジュール方式である。本発明の別の態様は、容易かつ簡便に上記モジュール式ポリリガンドを作成する方法である。この点において、本発明の実施例は、遺伝子発現成分のモジュール式クローニング方法を具える。リガンド、ホモポリリガンド、ヘテロポリリガンドおよび選択的にアミノ酸の発現成分が組み替え法を用いて合成されるとき、各々のクローニング可能なエレメントをモジュールとして考えることができる。クローニングの速度と利便性に関して、付着端に適合し、挿入してからクローニングすることが容易なモジュール式エレメントを作製することが望ましい。このことは、制限エンドヌクレアーゼ部位認識および開裂に関する天然の特性を探索することによってなされる。本発明の一態様は、モジュールの一端で、一回だけ制限酵素消化に使用され、他端で、所望される回数だけ制限酵素消化に使用されるフランキング配列を包含する。すなわち、モジュールの一端で制限部位は、モジュール式エレメントのシークエンシャルクローニングに効果があるように、使用されて消失する。コーディング領域モジュールにフランキングする制限部位の例は、制限酵素、ＮｇｏＭ  ＩＶおよびＣｌａ  Ｉ；またはＸｍａ  ＩおよびＣｌａ  Ｉによって認識される配列である。ＮｇｏＭ  ＩＶおよびＣｌａ  Ｉで第１の環状ＤＮＡを切断し、５’ＮｇｏＭ  ＩＶオーバーハングと３’Ｃｌａ  Ｉオーバーハングを有する線状ＤＮＡを得ること；Ｘｍａ  ＩおよびＣｌａ  Ｉで第２の環状ＤＮＡを切断し、５’Ｃｌａ  Ｉオーバーハングおよび３’Ｘｍａ  Ｉオーバーハングを有する線状ＤＮＡを得て、適合可能な付着端を有する第１および第２のＤＮＡフラグメントを得る。第１および第２のＤＮＡフラグメントが互いに混合され、アニールされ、ライゲーションされ、第３の環状ＤＮＡフラグメントを形成されるとき、第１のＤＮＡだったＮｇｏＭ  ＩＶ部位と、第２のＤＮＡだったＸｍａ  Ｉ部位は、第３の環状ＤＮＡで消失される。ここで、このようなＤＮＡの痕跡領域は、さらなるＸｍａ  ＩまたはＮｇｏＭ  ＩＶの消化から保護されるが、第３の環状ＤＮＡ中に依然として保持されるそのままの５’ＮｇｏＭ  ＩＶおよび３’Ｃｌａ  Ｉ部位を含んでいる。このようなプロセスは、方向性、シークエンス・モジュール式クローニングイベントを達成するように、たくさん繰り返されてもよい。ＮｇｏＭ  ＩＶ、Ｘｍａ  ＩおよびＣｌａ  Ｉエンドヌクレアーゼによって認識される制限部位は、フランキング配列として使用されるとき、シークエンシャルクローニングを可能とする部位の群を示している。
【０１３８】
方向性をもち、シークエンシャルにコーディング領域モジュールを集成するための別の方法は、環状ＤＮＡを加えて、線状ＤＮＡを使用することである。例えば、上述したシークエンスクローニングプロセスのように、コーディング領域モジュールにフランキングする制限酵素は、ＮｇｏＭ  ＩＶおよびＣｌａ  Ｉ；またはＸｍａ  ＩおよびＣｌａ  Ｉによって認識される配列である。第１の環状ＤＮＡは、ＮｇｏＭ  ＩＶおよびＣｌａ  Ｉで切断され、５’ＮｇｏＭ  ＩＶオーバーハングおよび３’Ｃｌａ  Ｉオーバーハングを有する線状ＤＮＡを得る。第２の線状二本鎖ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅によって、あるいは、相補性オリゴヌクレオチドの合成およびアニーリングによって得られる。第２の線状ＤＮＡは、５’Ｃｌａ  Ｉオーバーハングと３’Ｘｍａ  Ｉオーバーハングを有し、これらは、線状化された第１のＤＮＡと適合する付着端である。これらは第１および第２のＤＮＡフラグメントが互いに混合され、アニーリングされ、ライゲーションされ、第３の環状ＤＮＡフラグメントを形成するとき、第１のＤＮＡ中にあったＮｇｏＭ  ＩＶと、第２のＤＮＡ中にあったＸｍａ  Ｉ部位は、第３の環状ＤＮＡ中では消失する。第３の環状ＤＮＡ中に残るフランキング配列は、５’ＮｇｏＭ  ＩＶおよび３’Ｃｌａ  Ｉ部位を依然として含んでいる。このようなプロセスは、方向性、シークエンス・モジュール式クローニングイベントを行うために、たくさん繰り返し可能である。ＮｇｏＭ  ＩＶ，Ｘｍａ  ＩおよびＣｌａ  Ｉエンドヌクレアーゼによって認識される制限部位は、フランキング配列として使用されるとき、シークエンス式クローニングを可能とする部位群を示す。このプロセスは、図１１に記載されている。
【０１３９】
当分野の当業者は、他の認識部位群は、本明細書に記載されるように、シークエンス式方向性クローニングを行うことができる。制限エンドヌクレアーゼ選別についての好適な基準は、適合可能な付着端を得るが、その部位は互いにライゲーションする際に消滅されるエンドヌクレアーゼ対を選択する。別の基準は、第１の２つのいずれかに適合可能な付着（ｓｔｉｃｋｙ）端を生成しない第３のエンドヌクレアーゼ部位を選択することである。このような基準は、シークエンス式方向性クローニングシステムとして使用されるとき、リガンド、ポリリガンドおよび他のコーディング領域または発現成分が、所望のように、組み合わせ可能に集成される。同一のシークエンスプロセスは、エピトープ、レセプタおよび／または局在シグナルに使用可能である。
【０１４０】
ＰＰ１活性を調節するポリリガンドと、そのポリリガンド作成方法が開示されている。治療法は、細胞に対する局在シグナルあり又はなしの精製されたリガンドまたはポリリガンドの送達を含む。代替としては、局在シグナルあり又はなしのリガンドおよびポリリガンドは、アデノウィルス、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス、または細胞中にタンパク質生成物を発現する他のウィルスもしくはレトロウィルスコンストラクトなど、ウィルスまたはレトロウィルスコンストラクトを介して送達される。
【０１４１】
［実施例］
アッセイ、方法、結果
本発明のリガンドは、以下の１又はそれ以上の方法を用いて、ＰＰ１モジュール活性を評価した。
【０１４２】
方法１．
生化学アッセイは、市販されているＰＰ１酵素、市販されているＰＰ１基質、市販されているＰＰ１インヒビタ（コントロール）、本発明の半精製インヒビタリガンド（デコイ）を使用して行われる。ＰＰ１酵素は、Ｂｉｏｂｏｌ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）またはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入できる。リン酸除去に際し、蛍光または色の付いたフルオロジェニックまたはクロモジェニック基質は、便利な検出システムを表している。蛍光基質の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なフルオレセインジホスフェートである。クロモジェニック基質の例は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能なｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）である。リガンドは、例えば、マイクロタイタプレート上において、固定用のポリペプチドの一端で、エピトープタグに結合される。タグ付きリガンドは、当分野で周知の網状赤血球のライセートシステムなど、インビトロ転写／翻訳システムを用いて実験される。Ｔ７および／またはＴ３および／またはＳＰ６プロモータなどのプロモータ、リガンドコーディング配列、エピトープタグコーディング配列を備えるベクターポリヌクレオチドは、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、タグ付きリガンドを合成するのに使用される。インビトロ転写／翻訳プロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ，２００４年版）および分子クローニング：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１，第３版）、などの参考マニュアルに開示されている。ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降法などの免疫試薬含有方法は：Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）である。
【０１４３】
特に、インビトロ転写／翻訳システムを使用して合成したタグ付きデコイリガンドは、エピトープタグの免疫沈降を介して、半精製された。このような材料のタンパク質含有量は、定量化され、複数ウェルにおいて、ホスファターゼ酵素および基質を含むマイクロタイタプレートに加えられる。反応は、水酸化ナトリウムを加えることによって停止される。ホスファターゼ活性は、ホスファターゼによる基質、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）の脱リン酸化の度合である。ＰＰ１による無色ｐ−ニトロフェニルホスフェートの触媒作用によって、４０５ｎｍの最大吸光度で、黄色の生成物となる。コントロール実験は、ホスファターゼ酵素なし、および／または、デコイリガンドなし、および／または、周知のホスファターゼインヒビタの有り／無しを含む。アッセイに有用な周知のＰＰ１インヒビタは、オカダ酸、ミクロステインまたはＩＮＨ−２（Ｉ−２ペプチド）を含む。
【０１４４】
方法２．
同様のアッセイは、ウサギ由来のＰＰ１を使用して、上述したように、同一薬剤を用いて実行される。
【０１４５】
方法３．
同様の細胞ベースのアッセイは、上述した同一薬剤を使用するが、インビトロ転写／翻訳システムの代わりに哺乳類細胞システムにおけるリガンド合成を利用して実行される。デコイリガンドは、ウェスタンブロットにおいて、固定用、および／または、精製用、および／または、識別用ポリペプチドの一端でエピトープタグに結合される。選択的に、タグ付きリガンドは、パンセルラ（ｐａｎ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）のフェノタイプおよび局在化ＰＰ１モジュレーションのフェノタイプ比較に関して、細胞局在シグナルに結合される。ＣＭＶプロモータなど連続的プロモータ、リガンドコーディング配列、エピトープタグコーディング配列、および選択的に局在シグナルコーディング配列を具えるベクターポリヌクレオチドを使用して、細胞中にリガンドを発現する。トランスフェクションおよび発現プロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ，２００４年版）および分子クローニング：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１，第３版）など、基準マニュアルに開示されている。ウェスタンブロットおよび免疫試薬含有方法は、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）に開示されているように行われる。
【０１４６】
特に、細胞において合成されるタグ付きリガンドは半精製され、抗タグ抗体でコーティングされたマイクロタイタ−プレートに固定化される。マイクロタイタ−プレートは、非固定化成分を実質的に除去するように洗浄される。次いで、ＰＰ１酵素およびフルオロジェニック基質を加え、蛍光の出現を測定する。コントロール実験は、ＰＰ１酵素の不在、および／または、デコイリガンドの不在、および／または、周知のＰＰ１インヒビタの存在／不在、を具える。アッセイに有用な周知のＰＰ１インヒビタは、オカダ酸、マクロステインまたはインヒビタ−２（Ｉ−２／ＩＮＨ−２）を含む。
【０１４７】
方法４．
細胞ベースのアッセイは、誘導可能な、筋小胞体に局在化されるデコイリガンドを用いて実行される。細胞中の分子交換は、デコイに提示されるエピトープタグに対する特異的な抗体を用いて可視化されるときに、デコイリガンドの出現として識別される。デコイリガンドは、免疫検出において、固定化、および／または、精製、および／または、識別用のポリペプチドの一端でエピトープタグに結合される。さらに、デコイリガンドの局在は、ホスホランバン（ＰＬＢ）、筋小胞体（ＳＲ）の周知のマーカを用いた共局在によって示される。誘導プロモータ、デコイリガンドコーディング配列、ＳＲ−ローカリゼーション配列（アミノ酸配列：ＱＡＲＱＮＬＱＮＡＦＩＡＦＣＬＩＬＩＣＬＬＬＩＣＩＩＶＭＬＬ；ヌクレオチド配列：ｃａｇｇｃｃａｇｇｃａｇａａｃｃｔｃｃａｇａａｔｇｃｔｔｔｃａｔｔｇｃｔｔｔｔｔｇｔｃｔｇａｔｔｃｔｃａｔｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇａｔｔｔｇｃａｔｔａｔｃｇｔｃａｔｇｃｔｃｃｔｇ）、および、ＨＡなどのエピトープコーディング配列を具えるベクタポリヌクレオチドを使用して、細胞中にデコイリガンドを発現させる。トランスフェクションおよび発現プロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ，２００４年版）、および、分子クローニング：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１，第３版）。Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）に記載されるように、免疫検出および免疫試薬含有方法が行われる。免疫蛍光は、製造者プロトコルに従って行われる。
【０１４８】
特に、ベクターポリヌクレオチドコンストラクトは、インテグレースおよび抗体セレクションを使用して、Ｐ１９マウス胚性細胞内に安定的に組み込まれる。次いで、ステーブルなトランスフェクションをしたＰ１９細胞に、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）を作用させて、心筋細胞へと分化させた。これは、Ｐ１９細胞は、ＳＲ構造を通常含まないが、心筋細胞はＳＲ構造を含むので必須である。培養中の細胞の鼓動が同期することが示され、心筋細胞分化が完了したら、これらの細胞は、２４時間、誘導可能リガンド（ＲＳＬ１）を添加して、ＳＲ局在化デコイリガンドを発現するように誘導される。細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、ＨＡ（ラット抗ＨＡ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）またはＰＬＢ（ＡＢＲ）に特異的な抗体を作用させる。赤色または緑色フルオロフォア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する２次抗体は、細胞内において各々のタンパク質の位置を示す。両方のタンパク質があるところは、得られる画像は、オレンジから黄色を有する。
【０１４９】
このようなアッセイを行うために以下の技術を使用した：ＵｌｔｒａＶｅｃｔｏｒＴＭ（ＵＳ２００４／０１８５５５６、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３５１７、ＷＯ２００５／０４０３３６）、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）（米国特許第７，０９１，０３８号、ＵＳ２００４００３３６００；ＵＳ２００６０２００４１６）、ＡｔｔＳｉｔｅＴＭ組み替え法（ＵＳ２００６０１７２３７７）。ＵｌｔｒａＶｅｃｔｏｒは、拡大縮小可能な（ｓｃａｌａｂｌｅ）フォーマットにおいて、新規遺伝子プログラムの迅速で効率的なアッセンブリが可能である。ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈは、対象となる選択遺伝子の誘導発現を可能にし、時間制御および投与量依存的制御を提供する。これは、２つの工学的レセプタタンパク質、対象となる遺伝子（ＧＯＩ）に対する誘導可能プロモータ、合成アクチベータドラッグ（ジアシルヒドラジン低分子）からなる。ＡｔｔＳｉｔｅ組み替えは、ＤＮＡ組み替えを触媒する部位特異的酵素に基づいている。ランダムな組み替えとは対照的に、ＡｔｔＳｉｔｅ組み替えは、ゲノム中における限られた数の部位に統合され、極めて重要な遺伝子を阻害するリスクを低減する。組み込みは、リコンビナーゼ酵素（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  Ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｓｔｒａｉｎ  ＳＦ３７０．１ｓｅｒｏｔｙｐｅＭ１から得られる）を含有するプラスミド（ＶＶＮ−３２１７、ｐＲＥＣ０２７）を有したプラスミド（図２１〜２９に示される）の同時トランスフェクションによってなされ、ＡｔｔＳｉｔｅ組み替えが可能となる。
【０１５０】
Ｐ１９心筋細胞を使用して、ＳＲ局在およびＰＰ１阻害機能を実証した。Ｐ１９細胞は、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）またはオキシトシン（図３０Ａ〜Ｄ参照）の作用によって、心筋細胞に分化可能であるマウス胚性心筋細胞である。これらの化合物に応答して、Ｐ１９細胞は、培養皿において心筋と同様に、ゆっくりした単収縮（ｔｗｉｔｃｈ）特性を獲得して、培養皿中において心筋のように鼓動する。筋肉細胞に分化するプロセスにおいて、筋小胞体（小胞体）が形成される。Ｐ１９細胞を微生物用のペトリ皿に播種し、４８時間、ＤＭＳＯを作用させた。続いて胚様体（大きな細胞塊）を、標準培地の哺乳類組織培養プレートに移した。５日後、細胞は、プレート中でコンフルーエントに達した。８日目までに、細胞は同期して培養皿で鼓動した。分化した細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ウサギ抗体トロポニンＩとともに培養し、続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６−抱合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ２次抗体とともに培養した。細胞の核をＤＡＰＩで対比染色した。これらの細胞を、適宜なフィルタとＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｍ２カメラを有するＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ上で撮像した。
【０１５１】
図３１に開示されているＰＰ１ポリリガンドを、線状かつ３次元空間で設計してモデル化して、コンピュータ内でＰＰ１相互作用について最適化した。ポリリガンド（デコイ）に関する実施例の成分および配列は、図１および配列リストに示されている。各実施例についてのコンストラクトを含むベクターは、インビトロ翻訳実験についての図１２〜２０およびＰ１９細胞実験についての図２１〜２９に示されている。図３１に示される全てのベクターは、ＶＶＮ−８３９４およびＶＶＮ−８３９５を除いて、配列有効性があった。ポリリガンドを、市販されているＰＰ１酵素を用いて、方法１に記載される生化学アッセイで試験した（図３１）。このアッセイによって、リガンドのＰＰ１モジュール式活性を定量的に測定した。アッセイしたリガンドの８つの中の７つは、中程度のナノモル濃度（約４６〜９７ｎｍ）でＰＰ１活性を阻害し、これは、同程度の阻害効果を得るために１０００ｎＭを必要としたＩＮＨ−２よりも、概算にして１０〜２０倍の効果であった（図３１）。
【０１５２】
図３１のデータを得るために使用したアッセイは以下の通りである。ポリリガンドは、インビトロで、ＡｍｂｉｏｎのＳＰ６Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（ＡＭ１３３０；製造者プロトコルに従って）を用いてプラスミドＤＮＡ（図１２〜２０）から転写される。続いて、ＲＮＡを、ＡｍｂｉｏｎのＲｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴキット（ＡＭ１２００；製造者プロトコルに従って）を用いて翻訳し、Ｐｉｅｒｃｅから得られるＰｒｏｆｏｕｎｄＨＡタグＩＰキット（２３６１０；製造者プロトコルに従って）を使用して、網状赤血球ライセートから免疫沈降した。次に、翻訳した生成物を、ＰｉｅｒｃｅのＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（１８５６２１０；マイクロプレート工程）を用いて定量化した。定量化後、酵素反応を、３０分間、３０℃、低結合用マイクロタイター（ＴＲＰ  ９６１９６）の二重ウェル中で、以下のように行った：
コントロール：０．５ユニットのＰＰ１（Ｂｉｏｍｏｌ，ＳＥ−４９７）、３０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＮＥＢ，Ｐ０７５７Ｓ）、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ中の２ｍＭ塩化マンガン（Ｆｌｕｋａ，４８７９５）、ｐＨ８．２、４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２０％のグリセロール。酵素なしの対応するコントロールも、２回試験した。
ＩＮＨ−２  インヒビタ：０．５ユニットのＰＰ１（Ｂｉｏｍｏｌ，ＳＥ−４９７）、３０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＮＥＢ，Ｐ０７５７Ｓ）、２ｍＭの塩化マンガン（Ｆｌｕｋａ，４８７９５）、１００ｍＭのトリスＨＣｌ中の１０００ｎＭのＩＮＨ−２（ＮＥＢ，Ｐ０７５５Ｓ）、ｐＨ８．２、４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２０％のグリセロール。酵素なしの対応するコントロールも２回試験した。
ポリリガンド反応：０．５ユニットのＰＰ１（Ｂｉｏｍｏｌ，ＳＥ−４９７）、３０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＮＥＢ，Ｐ０７５７Ｓ）、２ｍＭの塩化マンガン（Ｆｌｕｋａ，４８７９５）、１００ｍＭトリスＨＣｌ中の５μＬのポリリガンド、ｐＨ８．２、４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２０％のグリセロール。酵素なしの対応するコントロールも２回試験した。
【０１５３】
反応をＮＡＯＨ（ＪＴＢａｋｅｒ，５６７１−０２）で止め、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４０５ｎｍでプレートを読んだ。
【０１５４】
さらなるポリリガンドを、上述したものよりも基本的なＰＰ１阻害についての生化学アッセイにおいて試験した。しかしながら、このような基本的なアッセイからは決定的なデータは得られなかった。
【０１５５】
さらなるポリリガンドを、ウサギ由来のＰＰ１を用いて、方法２に記載される生化学アッセイにおいて試験した（図３９）。阻害の割合は、ポジティブコントロールのＯＤ４０５で、各デコイのＯＤ４０５を除算することによって得られる値を、１から減算して計算し；１００を掛けて得られる。Ｉ−２、タイプ１タンパク質ホスファターゼを特異的に阻害する２０４アミノ酸熱安定化タンパク質を、ＰＰ１阻害のコントロールとして使用した。図３９は、ウサギ由来ＰＰ１との相互作用がないことを示しており、このことは、ＰＰ１デコイが非ヒトＰＰ１を阻害しないことを示している。図３９に示される各実施例についてのコンストラクトを含むベクタは、図４１〜４８に示される。図３９に示される全てのベクターは、配列有効性があった。
【０１５６】
分化の前後で、Ｐ１９細胞中でＳＲ局在シグナルに融合したポリリガンドの誘導発現のための、ＵｌｔｒａＶｅｃｔｏｒバックボーン含有誘導可能ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステムをテストするために実験した。未分化のＰ１９細胞において、コンストラクト（図２１〜２９中に示されるものなど）の短期間（一過性）発現は、我々のポリリガンドが、アクチベータドラッグを用いたＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導に際し発現されることを確証した（図３２）。
【０１５７】
続いて、一過性発現に伴う変動を低減するために、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステムと対象となるポリリガンドを安定的にゲノムを組み込んだＰ１９細胞を作製した。ＡｔｔＳｉｔｅ組み替え技術を使用して、安定的に組み込んだ誘導可能ＰＰ１ポリリガンドコンストラクト（図２６）を有する、Ｐ１９をベースにした心筋細胞前駆体細胞の長期培養を確立した。代表的なデータ（図３３Ａ−Ｂ）は、我々の安定的な培養が、アクチベータドラッグなしでは検出可能なＳＲ局在化ポリリガンド発現を有しないが、アクチベータドラッグが付与されると、ポリリガンドの発現を誘導可能であることを示している。さらに、安定的に組み込まれたＰ１９細胞が心筋細胞に分化し、次いで、アクチベータドラッグが加えられ（図３４）、ＳＲ局在化ポリリガンド（図２４に示されるベクター）の誘導発現がみられる。図３４は、ＳＲ局在化ポリリガンドを検出するために、Ｐ１９細胞が、セリン１６（赤色）およびＨＡエピトープ（緑色）でリン酸化されたホスホランバンに対して免疫染色されるのを示している。核を明示するように、細胞をＤＡＰＩで対比染色した。黄色は、ホスホランビンとデコイとの共存を示していた。図４０は、セリン１６（赤色）でリン酸化されるホスホランバンに対し免疫染色されたＰ１９細胞のネガティブコントロール（ポリリガンドなし）の結果を示している。
【０１５８】
［さらなる実験例］
実験例１
ヘテロポリリガンド、小胞体細胞局在シグナルおよびＨｉｓ６エピトープを具えるポリペプチドを合成する。このようなポリペプチドの例は、図８Ａ、８Ｂ、８Ｄ、８Ｅおよび８Ｆによって概略的に示されている。ポリペプチドは、自動化ペプチド合成器で合成されるか、組み替え法を利用して発現され、精製される。精製されたポリペプチドは、培地に溶解され細胞に加えられる。このポリペプチドは、細胞によってエンドサイトーシスされ、小胞体に輸送される。確認は、抗Ｈｉｓ６抗体を使用した免疫組織化学染色によって行われる。
【０１５９】
実験例２
トランスジーンは、配列番号２５５、配列番号２６３および配列番号２６１（ポリリガンド）を具える融合タンパク質、緑色蛍光タンパク質（レポーター）および原形質膜局在シグナル（局在シグナル）を直接的に発現するサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータを使用してコンストラクト化される。このようなトランスジーンは、図９Ｃに概略的に示されている。トランスジーンを一過性発現のために細胞にトランスフェクションする。発現と位置の確認は、共焦点顕微鏡によって緑色蛍光タンパク質を視覚化することによって行われる。
【０１６０】
実験例３
トランスジーンのコンストラクトは、組織特異的プロモータによって駆動される発現を用いて、タンパク質生成物を生成するように構築される。トランスジーンは、３つのドメインをコードするように工学処理された合成遺伝子発現ユニットを具える。これら３つのドメインの各々は、溶液中でアニールされ、ライゲーションされ、ベクターに挿入される相補的なポリヌクレオチドの対として合成される。アミノ末端で開始され、発現ユニットにおける３つのドメインは、ＰＰ１リガンド、ＦＬＡＧエピトープおよび核局在シグナルをコードするヌクレオチド配列である。ＰＰ１リガンドは、本明細書で示すように、モノマーリガンド、ホモポリマーリガンドまたはヘテロポリマーリガンドである。ＦＬＡＧエピトープをコードするヌクレオチド配列は、ＰＰ１リガンドをコードするヌクレオチド配列の下流に配置される。最終的に、局在シグナルをコードするヌクレオチド配列は、ＦＬＡＧエピトープをコードするヌクレオチド配列の下流に配置される。集成された遺伝子発現ユニットは、図１０Ａに示されるように、続いて、発現ベクター内にサブクローニングされ、細胞に一過性的にトランスフェクションするのに使用される。確認は、抗フラッグ抗体を使用して免疫組織化学染色によって行った。
【０１６１】
実験例４
細胞内に局在化されたＰＰ１ポリリガンドによって、ＰＰ１細胞機能の調節を例示する。ポリリガンド融合タンパク質（デコイリガンド）、エピトープおよび筋小胞体（小胞体）局在シグナルをコードする核酸を含んだトランスジーンコンストラクトを作製する。発現ユニットは、配列番号２２４（ポリリガンド）、ｃ−Ｍｙｃエピトープ（エピトープ）および筋小胞体（小胞体）局在シグナル（局在シグナル）をコードするヌクレオチドを含む。続いてこの発現ユニットを、ＣＭＶプロモータとＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルとの間のベクター内にサブクローニングした（図１０Ａに概略的に示す）。完成したトランスジーン含有発現ベクターは、次いで、細胞にトランスフェクションするように使用した。ＰＰ１活性の阻害は、局在しない（ｎｏｎ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）、ニセモノ（ｍｏｃｋ）をトランスフェクションしたコントロールに対する表現型観察によって示される。
【０１６２】
実験例５
リガンドの機能および局在は、小胞体を標的としたリガンド融合タンパク質を発現するマウスを得るために使用される、トランスジーンコンストラクトを作製することによって、インビボで示される。トランスジーンコンストラクトは、図１０Ｂに概略的に示されている。発現ユニットは、配列番号２３３、赤血球凝集素エピトープおよび筋小胞体（小胞体）局在シグナルをコードするヌクレオチドを含む。この発現ユニットは、誘導プロモータおよびＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルを含むヌクレオチド配列間のベクターにサブクローニングされる。次に、完成したトランスジーンをマウス受精卵母細胞の前核内に注射した。得られた子供を、ＰＣＲによってトランスジーンの存在に関してスクリーニングした。遺伝子組み換え創始マウスを、ワイルドタイプマウスと交配させる。少なくとも３代経過したヘテロ接合性の遺伝子組み換え動物を、コントロールとしての非組み換えの同腹子とともに、以下のテストに使用した。
【０１６３】
試験１：コピー数を決定するためにサザンブロット解析を行った。サザンブロットは、トランスジーンのフラグメントから得た放射性ラベルプローブでハイブリダイズされる。このプローブは、遺伝子組み換えマウスからのＤＮＡを含むバンドを検出するが、非組み換えマウスからのＤＮＡを含むバンドを検出しない。組み替えマウスのバンドの強度を測定し、組み替えプラスミドコントロールバンドと比較してコピー数を推定する。これによって、この実験例におけるマウスが、マウスのゲノムにトランスジーンを含んでいることが示される。
【０１６４】
試験２：組織のホモジェネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）をウェスタンブロット分析用に調製する。この実験は、赤血球凝集素エピトープが組み替えホモジェネートでは検出されるが、非組み換えホモジェネートでは検出されないので、トランスジーンが組み替え体の組織で発現することを示している。
【０１６５】
試験３：機能は、表現型の観察またはコントロールに対する分析によって評価した。
【０１６６】
これらの例は、治療目的または実験目的のために、ＰＰ１リガンドの合成と細胞の局在領域への送達とを示している。精製されたポリペプチドリガンドは、経口投与または非経口投与、局所適用または、錠剤、カプセルまたは液状、経鼻用エアロゾルまたは吸入用エアロゾル、皮下注射、筋肉内注射、腹膜注射または他の注射；静脈内滴注；その他任意の経路を介した投与に対して製剤化可能である。さらに、リガンドをコードするヌクレオチド配列は、細胞内に送達して遺伝子生成物を発現するように設計されたベクター内への組み込み可能である。このようなベクターは、プラスミド、コスミド、人工的なクロモソームおよび修飾されたウィルスを含む。有核細胞への送達は、インビボまたはエキソビボで可能である。エキソビボ送達方法は、意図したレシピエント細胞またはドナー細胞の単離、これらの細胞へのベクターの送達、その後の上記細胞を用いたレシピエントの治療を含む。
【０１６７】
ＰＰ１活性を調節するリガンドおよびポリリガンドと、これらのリガンドの作製方法および使用方法が開示されている。これらのリガンドおよびポリリガンドは、化学的または組み替え的に合成され、リサーチツールまたは治療法として使用される。本発明は、細胞内治療のためのリガンドおよびポリリガンドの細胞局在シグナルへの結合を含む。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
配列番号１または配列番号５または配列番号９または配列番号１３または配列番号１７または配列番号２１または配列番号２５または配列番号２９または配列番号３３または配列番号３７または配列番号４１または配列番号４５または配列番号４９または配列番号５３と少なくとも約８０％同一性があるアミノ酸配列を具えることを特徴とする単離されたポリペプチド。
［２］
ＰＰ１活性を調節することを特徴とする単離されたポリペプチドホモポリリガンド。
［３］
ＰＰ１活性を調節することを特徴とする単離されたポリペプチドヘテロポリリガンド。
［４］
単離された融合ポリペプチドであって、配列番号６７−８２および／または配列番号９２−１１１のいずれかから選択される２又はそれ以上のポリペプチドを具え、Ｘａａとして示される少なくとも１のアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であることを特徴とする単離された融合ポリペプチド。
［５］
単離された融合ポリペプチドであって、配列番号６７−８２から選択される２又はそれ以上のポリペプチドを具え、Ｘａａとして示される少なくとも１のアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であることを特徴とする単離された融合ポリペプチド。
［６］
単離された融合ポリペプチドであって、配列番号９２−１１１から選択される２又はそれ以上ポリペプチドを具え、Ｘａａとして示される少なくとも１のアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であることを特徴とする単離された融合ポリペプチド。
［７］
単離されたポリペプチドホモポリリガンドであって、当該ホモポリリガンドのモノマーが、配列番号６７−８２および／または配列番号９２−１１１の任意の１つと少なくとも約８０％同一性のあるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択され、Ｘａａが任意のアミノ酸であることを特徴とする単離されたポリペプチドホモポリリガンド。
［８］
単離されたポリペプチドヘテロポリリガンドであって、当該ヘテロポリリガンドのモノマーが、配列番号６７−８２および／または配列番号９２−１１１の任意の１つと少なくとも約８０％同一性のあるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択され、Ｘａａが任意のアミノ酸であることを特徴とする単離されたポリペプチドヘテロポリリガンド。
［９］
局在シグナル、エピトープタグまたはレポーターに結合した請求項１乃至８の各々のポリリガンド。
［１０］
少なくとも２のモノマーリガンドを具える組成物であって、各々の前記リガンドの少なくとも一部が、ＰＰ１によって認識可能であり、前記リガンドの少なくとも１がＰＰ１による脱リン酸化可能なアミノ酸を含んでいないことを特徴とする組成物。
［１１］
ホモポリリマーリガンドであることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
［１２］
前記モノマーリガンドの少なくとも２つの間にスペーサーアミノ酸を更に具えることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
［１３］
局在シグナル、エピトープタグまたはレポーターを更に具えることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
［１４］
ヘテロポリマーリガンドであることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
［１５］
前記モノマーリガンドの少なくとも２の間にスペーサーアミノ酸を更に具えることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
［１６］
局在シグナル、エピトープタグまたはレポーターを更に具えることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
［１７］
ａ）配列番号５７のアミノ酸残基２８５−２９５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５７のアミノ酸残基２８８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号５７のアミノ酸残基２８１−２９９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５７のアミノ酸残基２８８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号５７のアミノ酸残基２７９−３０２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５７のアミノ酸残基２８８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号５７のアミノ酸残基２７７−３０３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５７のアミノ酸残基２８８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［１８］
ａ）配列番号５８のアミノ酸残基５−２３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基９、１５、１８および／または２０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号５８のアミノ酸残基４−２５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基９、１５、１８および／または２０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号５８のアミノ酸残基３−２６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基９、１５、１８および／または２０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号５８のアミノ酸残基２−２９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基９、１５、１８および／または２０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［１９］
ａ）配列番号５８のアミノ酸残基３１−５７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基３３、３７、４６および／または５５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号５８のアミノ酸残基３０−５８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基３３、３７、４６および／または５５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号５８のアミノ酸残基２８−５９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基３３、３７、４６および／または５５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号５８のアミノ酸残基２７−６０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基３３、３７、４６および／または５５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２０］
ａ）配列番号５８のアミノ酸残基２１０−２１８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基２１５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号５８のアミノ酸残基２０９−２２０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基２１５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号５８のアミノ酸残基２０８−２２２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基２１５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号５８のアミノ酸残基２０４−２２５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基２１５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２１］
ａ）配列番号５８のアミノ酸残基３６８−３８１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基３７１、３７６、３７８および／または３９２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号５８のアミノ酸残基３６６−３８３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基３７１、３７６、３７８および／または３９２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号５８のアミノ酸残基３６４−３８５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基３７１、３７６、３７８および／または３９２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号５８のアミノ酸残基３６１−３９３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５８のアミノ酸残基３７１、３７６、３７８および／または３９２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２２］
ａ）配列番号５９のアミノ酸残基１５−２４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５９のアミノ酸残基２０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号５９のアミノ酸残基１４−２６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５９のアミノ酸残基２０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号５９のアミノ酸残基１１−２８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５９のアミノ酸残基２０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号５９のアミノ酸残基８−３１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号５９のアミノ酸残基２０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２３］
ａ）配列番号６０のアミノ酸残基１６１１−１６８０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６０のアミノ酸残基１６１６、１６２３、１６３０、１６３７、１６４４、１６５１、１６５８、１６６５および／または１６７２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６０のアミノ酸残基１６８３−１７０３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６０のアミノ酸残基１６８６、１６９３および／または１７００に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６０のアミノ酸残基１８０１−１８３８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６０のアミノ酸残基１８０５、１８２６および／または１８３３に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６０のアミノ酸残基１９２２−１９５０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６０のアミノ酸残基１９２４、１９３１、１９４１および／または１９４８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２４］
ａ）配列番号６１のアミノ酸残基８９−１０３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６１のアミノ酸残基９０、９４、９６および／または１０２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６１のアミノ酸残基８８−１０４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６１のアミノ酸残基９０、９４、９６および／または１０２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６１のアミノ酸残基８６−１０６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６１のアミノ酸残基９０、９４、９６および／または１０２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６１のアミノ酸残基８３−１０９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６１のアミノ酸残基９０、９４、９６および／または１０２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２５］
ａ）配列番号６２のアミノ酸残基２４６−２５６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６２のアミノ酸残基２４９および／または２５２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６２のアミノ酸残基２４５−２５７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６２のアミノ酸残基２４９および／または２５２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６２のアミノ酸残基２４３−２５９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６２のアミノ酸残基２４９および／または２５２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６２のアミノ酸残基２４０−２６１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６２のアミノ酸残基２４９および／または２５２に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２６］
ａ）配列番号６２のアミノ酸残基８０４−８２７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６２のアミノ酸残基８０７、８１１、８２１および／または８２６に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６２のアミノ酸残基８０３−８２８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６２のアミノ酸残基８０７、８１１、８２１および／または８２６に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６２のアミノ酸残基８０１−８３１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６２のアミノ酸残基８０７、８１１、８２１および／または８２６に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６２のアミノ酸残基８００−８３２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６２のアミノ酸残基８０７、８１１、８２１および／または８２６に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２７］
ａ）配列番号６３のアミノ酸残基１３８５−１３９６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６３のアミノ酸残基１３９４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６３のアミノ酸残基１３８４−１３９７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６３のアミノ酸残基１３９４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６３のアミノ酸残基１３８１−１３９８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６３のアミノ酸残基１３９４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６３のアミノ酸残基１３８０−１３９９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６３のアミノ酸残基１３９４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２８］
ａ）配列番号６４のアミノ酸残基４６−６８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基４８または６７に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６４のアミノ酸残基４５−６９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基４８または６７に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６４のアミノ酸残基４４−７０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基４８または６７に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６４のアミノ酸残基４３−７２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基４８または６７に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［２９］
ａ）配列番号６４のアミノ酸残基１２１−１３１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１２２または１３０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６４のアミノ酸残基１２０−１３２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１２２または１３０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６４のアミノ酸残基１１９−１３３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１２２または１３０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６４のアミノ酸残基１１８−１３４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１２２または１３０に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３０］  
ａ）配列番号６４のアミノ酸残基１６４−１７３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１６８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６４のアミノ酸残基１６３−１７５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１６８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６４のアミノ酸残基１６２−１７７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１６８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６４のアミノ酸残基１６１−１７９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１６８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３１］
ａ）配列番号６４のアミノ酸残基１９０−２００に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１９１および／または１９８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６４のアミノ酸残基１８９−２０２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１９１および／または１９８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６４のアミノ酸残基１８５−２０４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１９１および／または１９８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６４のアミノ酸残基１８１−２０６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基１９１および／または１９８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３２］
ａ）配列番号６４のアミノ酸残基２１１−２２１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基２１４および／または２１６に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６４のアミノ酸残基２１０−２２２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基２１４および／または２１６に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６４のアミノ酸残基２０８−２２５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基２１４および／または２１６に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６４のアミノ酸残基２０４−２２８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６４のアミノ酸残基２１４および／または２１６に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３３］
ａ）配列番号６５のアミノ酸残基７−２１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６５のアミノ酸残基１６および／または１７に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６５のアミノ酸残基６−２２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６５のアミノ酸残基１６および／または１７に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６５のアミノ酸残基５−２３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６５のアミノ酸残基１６および／または１７に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６５のアミノ酸残基４−１９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６５のアミノ酸残基１６および／または１７に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３４］
ａ）配列番号６６のアミノ酸残基４９−６１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６６のアミノ酸残基５４、５７および／または５９に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号６６のアミノ酸残基４６−６４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６６のアミノ酸残基５４、５７および／または５９に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号６６のアミノ酸残基４１−６７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６６のアミノ酸残基５４、５７および／または５９に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号６６のアミノ酸残基３９−７１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号６６のアミノ酸残基５４、５７および／または５９に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３５］
ａ）配列番号８３のアミノ酸残基１５７−１８２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基１６１および／または１７８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８３のアミノ酸残基１５６−１８４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基１６１および／または１７８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８３のアミノ酸残基１５４−１８６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基１６１および／または１７８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８３のアミノ酸残基１５２−１８８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基１６１および／または１７８に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３６］
ａ）配列番号８３のアミノ酸残基１９６−２０７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基１９９および／または２０４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８３のアミノ酸残基１９４−２０９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基１９９および／または２０４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８３のアミノ酸残基１９１−２１２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基１９９および／または２０４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８３のアミノ酸残基１８９−２１５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基１９９および／または２０４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３７］
ａ）配列番号８３のアミノ酸残基２５８−２６７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基２６４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８３のアミノ酸残基２５５−２６９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基２６４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８３のアミノ酸残基２５３−２７１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基２６４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８３のアミノ酸残基２５１−２７４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基２６４に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３８］
ａ）配列番号８３のアミノ酸残基３２９−３４０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基３３５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８３のアミノ酸残基３２８−３４２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基３３５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８３のアミノ酸残基３２６−３４４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基３３５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８３のアミノ酸残基３２３−３４９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８３のアミノ酸残基３３５に対応する前記アミノ酸残基が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［３９］
ａ）配列番号８４のアミノ酸残基４３９−５１８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドと少なくとも８０％同一なペプチドと、
ｂ）配列番号８４のアミノ酸残基４５１−５１１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドと少なくとも８０％同一なペプチドと、
ｃ）配列番号８４のアミノ酸残基４５６−５０７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドと少なくとも８０％同一なペプチドと、
ｄ）配列番号８４のアミノ酸残基４６０−４９７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドと少なくとも８０％同一なペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えるとともに、配列番号８４のフラグメントであることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４０］
ａ）配列番号８５のアミノ酸残基１−１４７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８５のアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８５のアミノ酸残基２−１４７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８５のアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８５のアミノ酸残基７−１４０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８５のアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８５のアミノ酸残基１１−１３０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８５のアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４１］
ａ）配列番号８６のアミノ酸残基２７−３８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８６のアミノ酸残基３４に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８６のアミノ酸残基２４−３９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８６のアミノ酸残基３４に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８６のアミノ酸残基２２−４１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８６のアミノ酸残基３４に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８６のアミノ酸残基１９−４４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８６のアミノ酸残基３４に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４２］
ａ）配列番号８６のアミノ酸残基７０−８１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８６のアミノ酸残基７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８６のアミノ酸残基６８−８３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８６のアミノ酸残基７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８６のアミノ酸残基６４−８７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８６のアミノ酸残基７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８６のアミノ酸残基６１−９０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８６のアミノ酸残基７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４３］
ａ）配列番号８８のアミノ酸残基２９−４０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８８のアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８８のアミノ酸残基２７−４４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８８のアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８８のアミノ酸残基２４−４５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８８のアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８８のアミノ酸残基１９−５０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８８のアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４４］
ａ）配列番号８８のアミノ酸残基６４−８１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８８のアミノ酸残基６７および／または７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８８のアミノ酸残基６１−８２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８８のアミノ酸残基６７および／または７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８８のアミノ酸残基５９−８５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８８のアミノ酸残基６７および／または７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８８のアミノ酸残基５５−８６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８８のアミノ酸残基６７および／または７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４５］
ａ）配列番号８９のアミノ酸残基８６−１０７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８９のアミノ酸残基９４および／または１００に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号８９のアミノ酸残基８３−１１４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８９のアミノ酸残基９４および／または１００に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号８９のアミノ酸残基７９−１１９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８９のアミノ酸残基９４および／または１００に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号８９のアミノ酸残基６１−１２３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号８９のアミノ酸残基９４および／または１００に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４６］
ａ）配列番号９０のアミノ酸残基３６６−３７６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９０のアミノ酸残基３７１に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号９０のアミノ酸残基３６３−３７９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９０のアミノ酸残基３７１に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号９０のアミノ酸残基３６１−３８５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９０のアミノ酸残基３７１に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号９０のアミノ酸残基３５７−３９０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９０のアミノ酸残基３７１に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４７］
ａ）配列番号９０のアミノ酸残基４５６−４６７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９０のアミノ酸残基４６１に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号９０のアミノ酸残基４５２−４７０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９０のアミノ酸残基４６１に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号９０のアミノ酸残基４４６−４７４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９０のアミノ酸残基４６１に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号９０のアミノ酸残基４４３−４７９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９０のアミノ酸残基４６１に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４８］
ａ）配列番号９１のアミノ酸残基７１−８８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９１のアミノ酸残基７３および／または８７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号９１のアミノ酸残基６７−９４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９１のアミノ酸残基７３および／または８７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号９１のアミノ酸残基６４−９６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９１のアミノ酸残基７３および／または８７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号９１のアミノ酸残基５８−１０１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９１のアミノ酸残基７３および／または８７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［４９］
ａ）配列番号９１のアミノ酸残基１１３−１２８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９１のアミノ酸残基１２１および／または１２２に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号９１のアミノ酸残基１１０−１３１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９１のアミノ酸残基１２１および／または１２２に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号９１のアミノ酸残基１０８−１３５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９１のアミノ酸残基１２１および／または１２２に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号９１のアミノ酸残基１０３−１３９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号９１のアミノ酸残基１２１および／または１２２に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［５０］
ａ）配列番号８７のアミノ酸残基３６０−４８０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドと、
ｂ）配列番号８７のアミノ酸残基３８３−４６０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドと、
ｃ）配列番号８７のアミノ酸残基３９１−４３７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドと、
ｄ）配列番号８７のアミノ酸残基４０２−４２９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えるとともに、配列番号８７のフラグメントであることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［５１］
請求項１乃至５０に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［５２］
請求項５１に記載の核酸分子を含むベクター。
［５３］
請求項５２に記載のベクターを具える組み替え宿主細胞。
［５４］
細胞内でＰＰ１を阻害する方法であって、請求項５２に記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクションするステップと、ペプチドのコピーを生成するのに適した条件下で、トランスフェクションした宿主細胞を培養するステップと、を具えることを特徴とする方法。
［５５］
前記ポリヌクレオチドは、第１の制限エンドヌクレアーゼが開裂可能な配列によって一端でフランキングされ、前記ポリヌクレオチドは、第２の制限エンドヌクレアーゼが開裂可能な配列によって他端でフランキングされ、前記第１および第２の制限エンドヌクレアーゼが、不適合な付着端を生じさせることを特徴とする請求項５１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［５６］
前記ポリヌクレオチドが、一端でＮｇｏＭ  ＩＶが開裂可能な配列によってフランキングされ、前記ポリヌクレオチドが、他端でＸｍａＩおよびＣｌａＩが開裂可能な配列によってフランキングされることを特徴とする請求項５５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［５７］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドのコピーの少なくとも１つを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸３１に対応するアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸３４に対応するアミノ酸が、アスパラギン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。  
［５８］
配列番号１１２のアミノ酸３１に対応するアミノ酸がアラニンであり、配列番号１１２のアミノ酸３４に対応するアミノ酸がアラニンであることを特徴とする請求項５７に記載のＰＰ１インヒビタ。  
［５９］
配列番号２５と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を具える単離されたポリペプチドであって、位置１６のＸａａはグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、位置１７のＸａａはグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、位置３１のＸａａはアラニンであり、位置３４のＸａａはアラニンであることを特徴とする単離されたポリペプチド。
［６０］
１又はそれ以上の配列番号１３７−１６４と更に組み合わされ、かつ配列番号１３７−１６４中のＸａａとして示される少なくとも１のアミノ酸が、グルタミン酸またはアスパラギン酸のいずれかであることを特徴とする請求項５９に記載のポリペプチド。
［６１］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１３７−１６４から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％同一なポリペプチドのコピーの少なくとも１と、配列番号１１３−１３６から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％同一なポリペプチドのコピーの少なくとも１とを具え、Ｘａａとして示される少なくとも１のアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［６２］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸は、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸は、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸５１に対応するアミノ酸は、ロイシン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［６３］
配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸は、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸は、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸５０に対応するアミノ酸はメチオニン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［６４］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸は、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸４７に対応するアミノ酸はイソロイシン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［６５］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸４４に対応するアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［６６］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸４３に対応するアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［６７］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸４１に対応するアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［６８］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸４０に対応するアミノ酸がイソロイシン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［６９］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸３７に対応するアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［７０］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸３３に対応するアミノ酸がイソロイシン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［７１］
ＰＰ１インヒビタであって、配列番号１１２と少なくとも８０％同一なポリペプチドの少なくとも１のコピーを具え、配列番号１１２のアミノ酸１６に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸１７に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であり、配列番号１１２のアミノ酸３２に対応するアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［７２］
配列番号１１２のアミノ酸１６および１７に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであることを特徴とする請求項５７乃至７１に記載の各々のインヒビタ。
［７３］
ＰＰ１インヒビタであって、１又はそれ以上の配列番号１３７−１６４と少なくとも８０％同一なポリペプチドのコピーの少なくとも２を具え、配列番号１３７−１５６のアミノ酸１６および１７と対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外であり、配列番号１５７−１６０のアミノ酸７および８に対応するアミノ酸がセリンまたはスレオニン以外であり、配列番号１６１−１６４のアミノ酸６および７に対応するアミノ酸はセリンまたはスレオニン以外であることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［７４］
局在シグナルを更に具えることを特徴とする請求項７３に記載のインヒビタ。
［７５］
筋小胞体（小胞体）局在シグナルを更に具えることを特徴とする請求項７３に記載のインヒビタ。
［７６］
配列番号１６５、配列番号１６９または配列番号１７３から選択されることを特徴とする単離されたポリペプチド。
［７７］
請求項５７乃至７６のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも１のコピーをコードするポリヌクレオチド配列を具えることを特徴とする核酸分子。
［７８］
請求項７７に記載の核酸分子を具えることを特徴とするベクター。
［７９］
請求項７８に記載のベクターを具えることを特徴とする組み替え宿主細胞。
［８０］
細胞内でＰＰ１を阻害する方法であって、請求項７８に記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクションするステップと、ポリペプチドの少なくとも１のコピーを生成するのに適した条件下でトランスフェクションした宿主細胞を培養するステップとを具えることを特徴とする方法。
［８１］
少なくとも２のモノマーリガンドを具える組成物であって、前記リガンドの各々の少なくとも一部がＰＰ１によって認識可能であり、前記リガンドの少なくとも１がリン酸化可能アミノ酸残基を含まないことを特徴とする組成物。
［８２］
前記組成物がホモポリマーリガンドであることを特徴とする請求項８１に記載の組成物。
［８３］
少なくとも２の前記モノマーリガンド間にスペーサーアミノ酸を更に具えるを特徴とする請求項８２に記載の組成物。
［８４］
局在シグナル、エピトープタグまたはレポーターを更に具えることを特徴とする請求項８２に記載の組成物。
［８５］
前記組成物は、ヘテロポリリマーリガンドであることを特徴とする請求項８１に記載の組成物。
［８６］
少なくとも２の前記モノマーリガンド間にスペーサーアミノ酸を更に具えることを特徴とする請求項８５に記載の組成物。
［８７］
局在シグナル、エピトープタグまたはレポーターを更に具えることを特徴とする請求項８６に記載の組成物。
［８８］
局在シグナルを具え、ＰＰ１活性を阻害することを特徴とする単離されたポリペプチドホモポリリガンド。
［８９］
局在シグナルを具え、ＰＰ１活性を阻害することを特徴とする単離されたポリペプチドヘテロポリリガンド。
［９０］
請求項５７乃至８９に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［９１］
請求項９０に記載のポリヌクレオチドを具えるベクター。
［９２］
請求項９１に記載のベクターを具える宿主細胞。
［９３］
細胞内でＰＰ１を阻害する方法であって、請求項９１に記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクションするステップと、ポリペプチドの少なくとも１のコピーを生成するのに適した条件下でトランスフェクションした宿主細胞を培養するステップとを具えることを特徴とする方法。
［９４］
前記ポリヌクレオチドが、一端で第１の制限エンドヌクレオーゼが開裂可能な配列によってフランキングされ、前記ポリヌクレオチドが、他端で第２の制限エンドヌクレアーゼが開裂可能な配列によってフランキングされ、前記第１および第２の制限エンドヌクレアーゼが、不適合な付着端を生じさせることを特徴とする請求項９０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［９５］
前記ポリヌクレオチドが、一端でＮｇｏＭ  ＩＶが開裂可能な配列によってフランキングされ、前記ポリヌクレオチドが、他端でＸｍａＩおよびＣｌａＩが開裂可能な配列によってフランキングされることを特徴とする請求項９４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［９６］
配列番号１７７または配列番号１８１または配列番号１８５または配列番号１８９または配列番号１９３または配列番号１９７に少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を具える単離されたポリペプチド。
［９７］
配列番号２１２−２２３のいずれかから選択される２またはそれ以上のポリペプチドを具え、Ｘａａとして示される少なくとも１のアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であることを特徴とする単離された融合ポリペプチド。
［９８］
配列番号２１２−２１９から選択される２またはそれ以上のポリペプチドを具え、Ｘａａとして示される少なくとも１のアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であることを特徴とする単離された融合ポリペプチド。
［９９］
配列番号２２０−２２３から選択される２またはそれ以上のポリペプチドを具え、Ｘａａとして示される少なくとも１のアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸であることを特徴とする単離された融合ポリペプチド。
［１００］
単離されたポリペプチドホモポリリガンドであって、そのモノマーが、配列番号２１２−２２３の任意の１つに少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を具えるポリペプチドからなる群から選択され、Ｘａａが任意のアミノ酸であることを特徴とする単離されたポリペプチドホモポリリガンド。
［１０１］
単離されたポリペプチドヘテロポリリガンドであって、そのモノマーが、配列番号２１２−２２３の任意の１つに少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を具えるポリペプチドからなる群から選択され、Ｘａａが任意のアミノ酸であることを特徴とする単離されたポリペプチドヘテロポリリガンド。
［１０２］
ａ）配列番号２０３のアミノ酸残基６９−７９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０３のアミノ酸残基７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号２０３のアミノ酸残基６８−８１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０３のアミノ酸残基７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号２０３のアミノ酸残基６１−８３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０３のアミノ酸残基７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号２０３のアミノ酸残基６０−８８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０３のアミノ酸残基７５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［１０３］
ａ）配列番号２０３のアミノ酸残基９４−１０４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０３のアミノ酸残基９９に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号２０３のアミノ酸残基９３−１０６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０３のアミノ酸残基９９に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号２０３のアミノ酸残基９０−１０９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０３のアミノ酸残基９９に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号２０３のアミノ酸残基８６−１１４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０３のアミノ酸残基９９に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［１０４］
ａ）配列番号２０４のアミノ酸残基９８２−９９４に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０４のアミノ酸残基９８８に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号２０４のアミノ酸残基９７９−９９７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０４のアミノ酸残基９８８に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号２０４のアミノ酸残基９７６−１０００に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０４のアミノ酸残基９８８に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号２０４のアミノ酸残基９７１−１００３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０４のアミノ酸残基９８８に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。
［１０５］
ａ）配列番号２０５のアミノ酸残基５３０−５４２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０５のアミノ酸残基５３５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号２０５のアミノ酸残基５２８−５４５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０５のアミノ酸残基５３５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号２０５のアミノ酸残基５２５−５４８に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０５のアミノ酸残基５３５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号２０５のアミノ酸残基５１６−５５１に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０５のアミノ酸残基５３５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。  
［１０６］
ａ）配列番号２０６のアミノ酸残基１１４−１４３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０６のアミノ酸残基１４０に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号２０６のアミノ酸残基１２０−１４３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０６のアミノ酸残基１４０に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号２０６のアミノ酸残基１２７−１４３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０６のアミノ酸残基１４０に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号２０６のアミノ酸残基１３０−１４２に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０６のアミノ酸残基１４０に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。  
［１０７］
ａ）配列番号２０７のアミノ酸残基１５８３−１５９６に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０７のアミノ酸残基１５８９に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号２０７のアミノ酸残基１５８０−１６００に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０７のアミノ酸残基１５８９に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号２０７のアミノ酸残基１５７７−１６０５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０７のアミノ酸残基１５８９に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号２０７のアミノ酸残基１５７５−１６１０に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０７のアミノ酸残基１５８９に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。  
［１０８］
ａ）配列番号２０７のアミノ酸残基１７４８−１７５９に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０７のアミノ酸残基１７５５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｂ）配列番号２０７のアミノ酸残基１７４４−１７６３に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０７のアミノ酸残基１７５５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｃ）配列番号２０７のアミノ酸残基１７４１−１７６７に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０７のアミノ酸残基１７５５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
ｄ）配列番号２０７のアミノ酸残基１７３８−１７７５に対応するアミノ酸残基を具えるペプチドに少なくとも８０％同一なペプチドであって、配列番号２０７のアミノ酸残基１７５５に対応するアミノ酸が、セリンまたはスレオニン以外のアミノ酸残基に変異される、ペプチドと、
からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１のコピーを具えることを特徴とするＰＰ１インヒビタ。  
［１０９］
局在シグナルまたはエピトープタグまたはレポーターに結合した請求項９６乃至１０８に記載の各々のポリリガンド。
［１１０］
少なくとも２のモノマーリガンドを具える組成物であって、前記リガンドの各々の少なくとも一部がＰＰ１によって認識可能であり、前記リガンドの少なくとも１がＰＰ１によって脱リン酸化可能なアミノ酸を含んでいないことを特徴とする組成物。
［１１１］
前記組成物が、ホモポリマーリガンドまたはヘテロポリマーリガンドであることを特徴とする請求項１１０に記載の組成物。
［１１２］
少なくとも２の前記モノマーリガンド間にスペーサーアミノ酸を更に具えることを特徴とする請求項１１１に記載の組成物。
［１１３］
局在シグナルまたはエピトープタグまたはレポーターを更に具えることを特徴とする請求項１１１に記載の組成物。
［１１４］
請求項９６乃至１１３に記載のポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［１１５］
請求項１１４に記載の核酸分子を具えるベクター。
［１１６］
請求項１１５に記載のベクターを具える組み替え宿主細胞。
［１１７］
細胞内でＰＰ１を阻害する方法であって、請求項１１５に記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクションするステップと、前記ペプチドの少なくとも１のコピーを生成するのに適した条件下で、トランスフェクションした宿主細胞を培養するステップとを具えることを特徴とする方法。
［１１８］
前記ポリヌクレオチドが、一端で第１の制限エンドヌクレアーゼが開裂可能な配列によってフランキングされ、前記ポリヌクレオチドは、他端で第２の制限エンドヌクレアーゼが開裂可能な配列によってフランキングされ、前記第１および第２の制限エンドヌクレアーゼが不適合な付着端を生じさせることを特徴とする請求項１１４に記載の各々のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［１１９］
前記ポリヌクレオチドが、一端でＮｇｏＭ  ＩＶが開裂可能な配列によってフランキングされ、前記ポリヌクレオチドが、他端でＸｍａＩおよびＣｌａＩが開裂可能な配列によってフランキングされることを特徴とする請求項１１４に記載の各々のポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［１２０］
ＰＰ１の活性を調節することを特徴とする単離されたポリペプチドヘテロポリリガンド。
［１２１］
配列番号２２４または配列番号２２７または配列番号２３０または配列番号２３３または配列番号２３６または配列番号２３９または配列番号２４２または配列番号２４５または配列番号２４８と少なくとも８０％同一なアミノ酸を具えることを特徴とする請求項１２０に記載の単離されたポリペプチド。
［１２２］
配列番号２６６−２６８の１又はそれ以上のフラグメントを具えることを特徴とする請求項１２０に記載の単離されたポリペプチド。
［１２３］
配列番号２５１−２６２から選択された１又はそれ以上のポリペプチドを具える単離された融合ポリペプチド。
［１２４］
配列番号２５１−２６２から選択された２又はそれ以上のポリペプチドを具えることを特徴とする請求項１２３に記載された単離された融合ポリペプチド。
［１２５］
スペーサーを更に具えることを特徴とする請求項１２３に記載の単離された融合ポリペプチド。
［１２６］
前記スペーサーが配列番号２６３または配列番号２６４または配列番号２６５を具えることを特徴とする請求項１２５に記載の単離された融合ポリペプチド。
［１２７］
配列番号２６６−２６８の１又はそれ以上のフラグメントを具えることを特徴とする単離された融合タンパク質。
［１２８］
少なくとも１のフラグメントが置換変異であることを特徴とする請求項１２７に記載の単離された融合タンパク質。
［１２９］
前記置換変異が、スレオニン残基でおこることを特徴とする請求項１２８に記載の単離された融合タンパク質。
［１３０］
ＰＰ１活性を調節することを特徴とする単離されたポリペプチドホモポリリガンド。
［１３１］
配列番号２５１−２６２からなる群から選択されるモノマーを具えることを特徴とする請求項１３０に記載の単離されたポリペプチドホモポリリガンド。
［１３２］
局在シグナル、エピトープタグまたはレポーターの１又はそれ以上と結合することを特徴とする請求項１２０に記載の単離されたヘテロポリリガンド。
［１３３］
請求項１２０に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を具えることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
［１３４］
請求項１３３に記載のポリヌクレオチドを具えるベクター。
［１３５］
請求項１３３に記載のポリヌクレオチドを具える宿主細胞。
［１３６］
請求項１３３に記載のポリヌクレオチドを具えるヒト以外の生物体。
［１３７］
プロモータに操作可能に結合していることを特徴とする請求項１３３に記載のポリヌクレオチド。
［１３８］
前記プロモータに操作可能に結合したポリヌクレオチドであって、前記プロモータは誘導可能プロモータであることを特徴とする請求項１３７に記載のポリヌクレオチド。
［１３９］
前記ポリヌクレオチドが、一端でＮｇｏＭ  ＩＶが開裂可能な配列によってフランキングされ、前記ポリヌクレオチドが、他端でＸｍａＩおよびＣｌａＩが開裂可能な配列によってフランキングされることを特徴とする請求項１３３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［１４０］
配列番号２２５または配列番号２２６または配列番号２２８または配列番号２２９または配列番号２３１または配列番号２３２または配列番号２３４または配列番号２３５または配列番号２３７または配列番号２３８または配列番号２４０または配列番号２４１または配列番号２４３または配列番号２４４または配列番号２４６または配列番号２４７または配列番号２４９または配列番号２５０を具えることを特徴とする請求項１３３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［１４１］
細胞内でＰＰ１を阻害する方法であって、請求項１３４に記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクションするステップと、前記ポリペプチドの少なくとも１のコピーを産生するのに適した条件下でトランスフェクションした宿主細胞を培養するステップと、を具えることを特徴とする方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
0005675345.tif 000004
【図３】
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【図４】
0005675345.tif 000006
【図５】
0005675345.tif 000007
【図６】
0005675345.tif 000008
【図７】
0005675345.tif 000009
【図８】
0005675345.tif 000010
【図９】
0005675345.tif 000011
【図１０Ａ】
0005675345.tif 000012
【図１０Ｂ】
0005675345.tif 000013
【図１０Ｃ】
0005675345.tif 000014
【図１０Ｄ】
0005675345.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0005675345.tif 000019
【図１５】
0005675345.tif 000020
【図１６】
0005675345.tif 000021
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
0005675345.tif 000024
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
0005675345.tif 000033
【図２９】
0005675345.tif 000034
【図３０】
0005675345.tif 000035
【図３１】
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【図３２】
0005675345.tif 000037
【図３３】
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【図３４】
0005675345.tif 000039
【図３５−１】
0005675345.tif 000040
【図３５−２】
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【図３６】
0005675345.tif 000042
【図３７】
0005675345.tif 000043
【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
0005675345.tif 000048
【図４３】
0005675345.tif 000049
【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
0005675345.tif 000053
【図４８】
0005675345.tif 000054
【配列表】
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