(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、植物における少なくとも１つの縮合型タンニンの産生を調節するポリペプチド（ただし、％同一性は、配列番号１４の全体の長さに対して計算される）をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号４６〜５４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号１４および４６〜５４のいずれか１つの配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号１４の配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、植物における縮合型タンニン生合成経路における少なくとも１つの遺伝子を調節する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
ａ）配列番号１〜１３および５５〜６４の少なくとも１つまたはそれらの組合せ、
ｂ）ａ）の（１つまたは複数の）配列の相補体、及び
ｃ）ａ）またはｂ）の配列の少なくとも１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１、２、または５５、
ｂ）ａ）の（１つまたは複数の）配列の相補体、及び
ｃ）ａ）またはｂ）の配列の少なくとも１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体、
からなる群から選択される、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号１の配列を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号２の配列を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号５５の配列を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子における少なくとも１００の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブ。
【請求項１２】
配列番号１７に記載される３’配列モチーフをコードする核酸に結合することができる、請求項１１に記載のプローブ。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子における少なくとも１５の連続したヌクレオチド配列またはその相補配列を含むプライマー。
【請求項１４】
配列番号１７に記載される３’配列モチーフをコードする核酸に結合することができる、請求項１３に記載のプライマー。
【請求項１５】
配列番号１４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、植物における少なくとも１つの縮合型タンニンの産生を調節する単離されたポリペプチド（ただし、％同一性は、配列番号１４の全体の長さに対して計算される）。
【請求項１６】
ａ）配列番号４６〜５４のいずれか１つ、及び
ｂ）ａ）に列挙した配列の少なくとも１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、配列番号１４および４６〜５４のいずれか１つの配列を含む、請求項１５又は１６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号１４の配列を含む、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２１】
請求項１〜１０または２０のいずれか一項に記載されているヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項２２】
少なくとも１つのプロモーター、および
核酸分子
を含み、前記プロモーターが、核酸分子の発現を制御するために核酸分子に作動可能に連結されている、請求項２１に記載の構築物。
【請求項２３】
請求項１〜１０または２０のいずれか一項に記載されている核酸分子を含むように、野生型から変化された宿主細胞。
【請求項２４】
前記核酸が、請求項２１または２２に記載の遺伝子構築物の一部である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
植物細胞である、請求項２３または２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜１０または２０のいずれか一項に記載されている核酸分子で形質転換されている植物細胞または植物。
【請求項２７】
前記核酸が、請求項２１または２２に記載の遺伝子構築物の一部である、請求項２６に記載の植物の植物細胞。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の植物の種子。
【請求項２９】
縮合型タンニンを含む組成物の製造方法であって、前記縮合型タンニンが、請求項２６もしくは２７に記載の植物またはその一部分から得られる、方法。
【請求項３０】
植物または植物細胞を変化させるための、請求項１〜１０および２０のいずれか一項に記載されている核酸分子の使用。
【請求項３１】
植物または植物細胞を変化させるために、請求項１〜１０および２０のいずれか一項に記載されている核酸分子を使用する、変化した植物または植物細胞を産生する方法。
【請求項３２】
前記植物または植物細胞が、縮合型タンニンの産生、または縮合型タンニンの産生における中間体の産生において変化する、請求項３０に記載の使用または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記中間体が、少なくとも１つの縮合型タンニン単量体を含む、請求項３２に記載の使用または方法。
【請求項３４】
前記縮合型タンニンが、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、およびガロカテキンから選択される、請求項３２に記載の使用または方法。
【請求項３５】
前記植物または植物細胞が、縮合型タンニン生合成経路における少なくとも１つの酵素の発現において変化する、請求項３０に記載の使用または請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記酵素が、ＬＡＲおよびＡＮＲの少なくとも１つである、請求項３５に記載の使用または方法。
【請求項３７】
前記産生または発現の変化が、産生または発現の増加である、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項３８】
前記植物が飼料作物植物であり、または前記植物細胞が飼料作物植物細胞である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項３９】
前記植物がマメ科植物であり、または前記植物細胞がマメ科植物細胞である、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４０】
前記産生または発現の変化が、植物のすべての組織にある、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４１】
前記産生または発現の変化が、植物の葉組織にある、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４２】
前記産生または発現の変化が、植物の栄養部分にある、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４３】
前記産生または発現の変化が、植物の表皮組織にある、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４４】
前記フラボノイドまたは縮合型タンニンの産生の変化が、フラボノイドまたは縮合型タンニンが欠けている植物の組織にある、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４５】
核酸または構築物で植物を形質転換することによって植物が変化する、請求項３０〜４４のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４６】
対応する野生型植物またはその植物において産生されるものと比較して、植物またはその部分において増加または減少したレベルの核酸を発現するように植物のゲノムを操作することによって植物が変化する、請求項３０〜４５のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４７】
本発明によって変化したフラボノイドおよび／または縮合型タンニンのレベルが、治療上のまたは農学的な利益を提供するのに十分である、請求項３０〜４６のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項４８】
請求項３１〜４７のいずれか一項に記載の方法によって産生される植物。
【請求項４９】
請求項２１に記載の植物の一部分、種子、果実、収穫物、栄養繁殖体、または子孫であって、請求項１〜１０及び２０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸分子または請求項２１もしくは２２に記載の構築物を含むように遺伝子改変されている、植物の一部分、種子、果実、収穫物、栄養繁殖体、または子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生合成に関与する新規の遺伝子に関する。特に、本発明は、植物において、縮合型タンニンを含むフラボノイドの産生に関与する主要な遺伝子の発現を制御する調節因子をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子フェニルプロパノイド経路
フェニルプロパノイド経路（図１に示される）は、フラボン、アントシアニン、フラボノイド、縮合型タンニン、およびイソフラボノイドを含む一連の二次代謝産物を産生する（Dixon et al., 1996; 2005）。特に、縮合型タンニン（CT）生合成経路は、プロアントシアニジン生合成に分岐する前に、アントシアニン経路とその初期の工程を共有する。
【０００３】
アントシアニジンは、フラバン−３−オール（例えば（−）−エピカテキン）の前駆物質であり、これは、ＣＴのための重要な構成要素である。これらのシス−フラバン−３−オールは、アントシアニジンレダクターゼ（ANR）によってアントシアニジンから形成され、これは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａおよびＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａを含む多くの種からクローニングされている（Xie et al., 2003; 2004）。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて、（−）−エピカテキンは、唯一のＣＴ単量体であるが（Abrahams et al., 2002）、マメ科植物を含む、他の多くの種において、（＋）−および（−）−フラバン−３−オールの両方が重合されて、ＣＴになる。これらの代替の（＋）−フラバン−３−オール（カテキン）の生合成は、ロイコアントシアニジンレダクターゼ（LAR）によって触媒される。この酵素は、ＣＴが豊富なマメ科植物の木Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｕｎｃｉｎａｔｕｍを含むマメ科植物から（Tanner et al., 2003）ならびにブドウおよびリンゴなどの他の種から（Pfeiffer et al., 2006）クローニングされ、特徴づけられた。酵素は、ロイコペラルゴニジン、ロイコシアニジン、およびロイコデルフィニジンの、それぞれ、アフゼレキン、カテキン、およびガロカテキンへの還元を触媒する。ＬＡＲのホモログは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて見つかっておらず、この植物における（−）−エピカテキン由来のＣＴ構成要素の唯一の存在と一致している。
【０００４】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子におけるこの経路のＴＦ調節についての情報は、十分に定義されているが、Ｔｒｉｆｏｌｉｅａｅの連内の、葉ＣＴ生合成を制御するＴＦは、まだ同定されていない。ＴＦタンパク質の重要なファミリーであるＭＹＢファミリーは、植物におけるアントシアニン経路およびＣＴ経路などの二次代謝の調節を含む、多様な範囲の機能を制御する。ＭＹＢ  ＴＦ  ＡｔＴＴ２の発現は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて、後期構造遺伝子を協調的にオンまたはオフにし、最終的に、ＣＴ経路の発現を制御する。
【０００５】
一連のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの透明種皮（TT）突然変異体（Winkel-Shirley, 2002；Debeaujon et al., 2001）およびタンニン欠乏種子（TDS）突然変異体（Abrahams et al. 2002; 2003）が作製されており、すべて、種皮におけるＣＴ蓄積が欠乏している。これらの突然変異体の分子遺伝学研究から、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおけるアントシアニンおよびＣＴの両方の発現およびその合成の組織特異性を調節する多くの構造遺伝子および転写因子（TF）を同定することができた（Walker et al., 1999；Nesi et al., 2000; 2002）。
【０００６】
ＣＴ経路内のほとんどの構造遺伝子が、一連のマメ科植物において同定されてきたが、これらの個々の遺伝子の発現を工学的に操作することによって葉におけるＣＴ生合成を操作するための試みは、これまでに失敗してきた。この主な理由は、１つではない（または少数の）酵素が律速酵素となるが、縮合型タンニンなどの特定の最終産物への全体的な流れの増加を達成するために、経路における実質上すべての酵素の活性が増加されなければならないことである。
【０００７】
転写因子（TF）は、代謝経路の抑制因子または活性化因子として作用する調節タンパク質である。そのため、ＴＦは、植物における全代謝経路の操作のための有力なツールとして使用することができる。多くのＭＹＢ  ＴＦは、アントシアニン生合成および縮合型タンニン生合成の両方を含むフェニルプロパノイド経路の重要な調節因子である（Debaujon et al;, 2003；Davies and Schwinn, 2003）。例えば、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＴ２（AtTT2）遺伝子は、縮合型タンニン生合成が生じる場合、胚形成の初期のステージの間に種皮において単独で発現されるＲ２Ｒ３−ＭＹＢ  ＴＦ因子をコードする（Nesi et al., 2001）。ＴＴ２は、ＣＴの生合成および貯蔵の間に、フラボノイド後期生合成構造遺伝子ＴＴ３（DFR）、ＴＴ１８、ＴＴ１２（ＭＡＴＥタンパク質）、およびＡＮＲの発現を調節することが示された。ＡｔＴＴ２は、２つの他のＴＦ；すなわちＴＴ８（ｂＨＬＨタンパク質）およびＴＴＧ１（ＷＤ−４０反復タンパク質；Baudry et al., 2004）との組合せで、遺伝子のストリンジェントな空間的および時間的発現を部分的に決定する。
【０００８】
Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａにおける他のＭＹＢ  ＴＦ；ＣＴ生合成の調節に関与するブドウ（VvMYBPA1）Ｂｉｒｄｓｆｏｏｔ  ｔｒｅｆｏｉｌおよびＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（BnTT2）も最近報告された（Wei et al., 2007；Bogs et al., 2007；Yoshida et al., 2008）。
【０００９】
ＡｔＴＴ２遺伝子はまた、アントシアニン生合成を調節することが示された遺伝子であるイネ（Oryza sativa）ＯｓＭＹＢ３、トウモロコシ（Zea mays）ＺｍＣ１、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓに由来するＡｍＭＹＢＲＯＳＥＡ、およびＰｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａに由来するＰｈＭＹＢＡＮ２に対してある程度の類似性を共有することも示された（Stracke et al., 2001；Mehrtens et al., 2005）。
【００１０】
縮合型タンニン
プロアントシアニジン（PA）とも呼ばれる縮合型タンニン（CT）は、無色のポリマーであり、いくつかの二次植物代謝産物のうちの１つである。ＣＴは、加水分解による切断に対して感受性でない炭素−炭素結合によって結合する２〜５０個の（またはそれを超える）フラボノイド単位（下記の化合物（Ｉ）を参照されたい）のポリマーである。基本フラボノイド構造は、次の通りである。
【００１１】
【化１】
0005774478.tif 000002
【００１２】
縮合型タンニンは、一連の植物の部分、例えば葉、茎、花、根、木製品、樹皮、芽に位置する。ＣＴは、一般に、液胞においてまたは植物の表面表皮上に見つけられる。
【００１３】
飼料植物における縮合型タンニン
飼料のマメ科植物などの飼料植物は、それらが、動物の食餌の摂取および品質の両方を改善するので、牧草地をベースとする家畜システムにおいて有益である。さらに、牧草地の窒素（Ｎ）経済および反芻動物産生に対するそれらの価値は相当である（Caradus et al., 2000）。しかしながら、牧草地は、反芻動物を放牧するための食物の費用対効果が高い供給源を産生するが、ルーメン微生物相および動物自体の両方の栄養要求量を満たすということになると、最適とは言えないことが多い。したがって、食肉、ウール、またはミルク産生用の反芻動物を放牧することの遺伝的潜在性は、飼料食餌に対してめったに達成されない。
【００１４】
ニュージーランドの牧草地は、２０％までのシロツメクサを含有し、牧草地におけるシロツメクサのレベルの増加は、この不足に取り組むのを助けるが、それはまた、鼓脹の発病率を悪化させもする。シロツメクサ（Trifolium repens）、アカツメクサ（Trifolium pratense）、およびｌｕｃｅｒｎｅ（Medicago sativa）は、これらの種におけるＣＴなどの植物ポリフェノール化合物の欠乏による鼓脹の十分に立証された原因である。そのため、植物組織においてより高いレベルのタンニンを産生する飼料栽培品種の開発は、鼓脹の発病率を低下させるための、農業における重要な開発となるであろう（Burggraaf et al., 2006）。
【００１５】
特に、縮合型タンニンは、十分な量で存在する場合、鼓脹をなくすのを助けるだけでなく、飼料のマメ科植物の植物品質、おいしさ、および栄養価に強く影響を及ぼし、そのため、動物生産力を改善するのを助けることができる。ＣＴのレベルの増加から報告される、動物の健康および生産性の利益は、ヒツジにおける排卵率の増加、生体重増大、ウール産出、およびミルク産生の増加、ミルク組成の変化、ならびに胃腸の寄生生物に対する駆虫効果の改善を含む（Rumbaugh, 1985；Marten et al., 1987；Niezen et al., 1993; 1995；Tanner et al., 1994；McKenna, 1994；Douglas et al., 1995；Waghorn et al., 1998；Aerts et al,1999；McMahon et al., 2000；Molan et al., 2001；Sykes and Coop, 2001）。
【００１６】
より高いレベルの縮合型タンニンはまた、反芻動物を放牧することによって環境に放出される温室効果ガス（メタン、亜酸化窒素）を低下させるための実現可能な解決策をも示す（Kingston-Smith and Thomas, 2003）。反芻動物の家畜は、ニュージーランドの全メタン排出量の少なくとも８８％を産生し、温室効果ガス排出量の主な一因である（Clark, 2001）。家畜メタンの源の根源は、反芻動物の消化管における腸内発酵である。反芻動物の総エネルギー摂取の約３〜９％に対するエネルギー損失に相当するメタン産生は（Blaxter and Clapperton, 1965）、飼料品質を改善することによって５％も低下させることができる。ＣＴが高度な飼料は、動物の放牧に由来するメタン排出量を低下させることが示された（Woodward, et al 2001；Puchala, et al., 2005）。そのため、牧草植物のＣＴ含有量の増加は、家畜に由来するメタン排出量のレベルの低下に直接寄与し得る。
【００１７】
そのため、シロツメクサを含む飼料植物において中程度の量でさえ縮合型タンニンの蓄積を引き起こすことに由来し得る、環境的および農学的な利益は、反芻動物の保護および栄養において相当に重要である（Damiani et al., 1999）。
【００１８】
マメ科植物
経路との調節転写因子（TF）の相互作用を含む、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｅｓにおけるＣＴ葉特異的経路の調節が、未知のままであるというのが本発明者らの理解である。ＣＴ量に影響を及ぼす、この経路の改変または操作が探索されてきたが、プロセスが単純でないので、この経路の理解において、確固たる成果はほとんどなかった。
【００１９】
ｃｌｏｖｅｒ属のＴｒｉｆｏｌｉｕｍは、例えば、約２５５種を有する科Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ（D Fabaceae）における最大の属のうちの１つである（Ellison et al.,2006）。２つのＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種のみ；Ｔ．ａｆｆｉｎｅ（Trifolium preslianum Boiss. Isとしても知られている）およびＴ．ａｒｖｅｎｓｅ（hare-foot cloverとしても知られている）が、高レベルの葉ＣＴを蓄積することが知られている（Fay and Dale, 1993）。著しいレベルのＣＴが、シロツメクサ頭状花序において存在するが（Jones et al., 1976）、葉トリコームにおいて検出することができるのは微量のみである（Woodfield et al., 1998）。遺伝子プールスクリーニングおよびランダム突然変異誘発を含むいくつかのアプローチは、増加したレベルの葉ＣＴを有するシロツメクサ植物またはアカツメクサ植物を提供するのに失敗してきた（Woodfield et al., 1998）。
【００２０】
縮合型タンニンの遺伝子操作
本発明者らは、ＵＳ２００６／０１２５０８に関連して、ＴＴ２  ＭＹＢ調節遺伝子を使用して、トランスジェニックａｌｆａｌｆａ植物を作製し、驚いたことに根組織の全体にわたって恒常的にＣＴをなんとか産生した。しかしながら、重要なことには、本発明者らは、この飼料のマメ科植物の葉におけるＣＴ蓄積を達成することができなかった。ａｌｆａｌｆａ飼料においてプロアントシアニジン（CT）を誘発することができる、知られている状況が存在しないことが以前に報告された（Ray et al., 2003）。この論文の著者らは、とりわけ、トウモロコシに由来するＬＣ  ｍｙｃ様調節遺伝子（TF）またはトウモロコシに由来するＣ１  ｍｙｂ調節遺伝子（TF）が、ａｌｆａｌｆａの飼料および種皮においてフラボノイド経路を刺激することができるかどうかを評価した。この論文の著者らは、Ｃ１遺伝子ではなく、ＬＣ遺伝子だけが、ａｌｆａｌｆａ飼料において、アントシアニンおよびプロアントシアニジンの生合成を刺激することができたが、刺激が、未知のストレス応答性ａｌｆａｌｆａ因子の存在下で生じるのみであったことを発見した。
【００２１】
トウモロコシｂＨＬＨ調節遺伝子（TF）を使用する、Ｌｏｔｕｓ植物における縮合型タンニン産生を評価する研究は、Ｌｏｔｕｓ植物へのこのＴＦの形質転換が、葉における縮合型タンニンのレベルにおけるＣＴの非常に少ない（１％）増加のみをもたらしたことを発見した（Robbins et al., 2003）。
【００２２】
シロツメクサにおける農業的に重要な化合物を変化させ、増強するための以前の試みは、フェニルプロパノイド経路に由来するアントシアニン生合成を変化させることを含んだ。いくつかの異種のｍｙｃ  ＴＦおよびＭＹＢ  ＴＦを使用する、この経路を活性化するための試みにもかかわらず、トウモロコシｍｙｃ  ＴＦ  Ｂ−Ｐｅｒｕを使用する１つの成果のみが報告された（de Majnik et al., 2000）。調査されたすべての他のＴＦは、不十分な再生体をもたらしまたは再生体をもたらさず、それらの過剰発現に由来する有害な影響を暗示した。
【００２３】
より最近では、高度なＣＴのマメ科植物、Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓに由来するＴＴ２ホモログが報告された（Yoshida et al., 2008）。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ葉細胞の中へのこれらの遺伝子のボンバードメントにより、ＡＮＲの検出可能な発現およびＤＭＡＣＡによって検出される、わずかなＣＴ蓄積をもたらす一時的な発現が示された。しかしながら、これらの遺伝子は、いかなるマメ科植物種においても形質転換されず、分析されなかった。
【００２４】
トウモロコシＬｃ遺伝子の発現は、植物が非生物的ストレス下にあった場合のみ、ａｌｆａｌｆａにおいてＰＡ様化合物の蓄積をもたらした（Ray et al., 2003）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける３つの転写因子、ＴＴ２、ＰＡＰ１、およびＬｃの同時発現は、ＰＡの細胞型特異的発現を克服するために必要とされたが、ＰＡのこの恒常的な蓄積は、植物の死が伴った（Sharma and Dixon, 2005）。
【００２５】
ＭＹＢファミリー転写因子および（エピ）−フラバン−３−オールへのアントシアニジンの変換のためのアントシアニジンレダクターゼの組合せの発現による植物の中へのＰＡの導入はＸｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（2006）によって試みられた。
【００２６】
ＰＡＰ１（MYB TF）およびＡＮＲを同時発現することによってタバコの葉においてプロアントシアニジン（PA）のレベルを増加させるためのこの試みにより、ａｌｆａｌｆａに変えた場合、潜在的に鼓脹の保護を提供し得るＰＡのレベルをタバコにおいて有することが報告された（Xie et al., 2006）。ＭｔＡＮＲを恒常的に発現するトランスジェニックＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのアントシアニン含有葉は、発育の同じステージで、野生型植物よりも、３倍までのより多くのＰＡを含有し、これらの化合物は、ＰＡオリゴマーの特異的なサブセットであった。さらに、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａにおいて産生されるＰＡのこれらのレベルは、農学的な利益の改善に必要なものに及ばなかった。著者らは、さらなるどの生合成遺伝子および非生合成遺伝子が、化合物を自然に蓄積するあらゆる特定の植物組織におけるＰＡの工学的操作に必要とされるであろうかが不明瞭なままであったと述べている。
【００２７】
葉においてＣＴまたはＰＡを発現する際の同様の問題点はまた、ＴＴ２および／またはＢＡＮ遺伝子をａｌｆａｌｆａ中に入れて形質転換する場合にも遭遇し、これについては、ＵＳ２００４／００９３６３２およびＵＳ２００６／０１２３５０８を参照されたい。
【００２８】
自然健康製品において有用な縮合型タンニン
食品サプリメント、組成物、または医薬品を形成するための、プロアントシアニジンを含む任意のフラボノイドの使用も広く知られている。例えば、
・米国特許出願第２００３／０１８０４０６号は、認知機能を改善するために、特にココアに由来するポリフェノール組成物を使用する方法を記載する。
・特許公開ＷＯ２００５／０４４２９１は、脳卒中、脳振盪、ハンチントン病、ＣＪＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、および老年認知症を含む変性脳疾患を予防するためにブドウ種子（Vitus genus）の使用を記載する。
・特許公開ＷＯ２００５／０６７９１５は、認知症、アルツハイマー病、脳血管疾患、加齢性認知障害、およびうつ病などの疾患状態と関連する神経変性を低下させるための、フラボン、フラボノイド、プロアントシアニジン、およびアントシアニジン（合成または樹皮抽出物に由来）と組み合わせたフラボノイドおよびヒドロキシスチルベン（合成または緑茶に由来）の相乗的な組合せを開示する。
・ＵＳ５，７１９，１７８は、ＡＤＨＤを治療するためのプロアントシアニジン抽出物の使用を記載する。
・ＰＣＴ公開第０６／１２６８９５号は、ヒトの認知能力を改善するもしくはその衰退を予防するためまたはヒトにおける神経障害を改善するもしくはその症状を予防するための、Ｐｉｎｕｓ属に由来する樹皮抽出物を含有する組成物を記載する。
【００２９】
上記のいずれも、ＣＴの原料源としてのマメ科植物の使用を考慮していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
そのため、フラボノイド生合成および／または縮合型タンニン生合成に関与する代謝経路を研究するのに有用な核酸分子およびポリペプチドを提供することができれば有用であろう。
【００３１】
植物またはその部分においてフラボノイドおよび／または縮合型タンニンのレベルを変化させることができる核酸分子およびポリペプチドを提供することができれば、さらに有用であろう。
【００３２】
特に、植物またはその部分においてフラボノイドおよび／または縮合型タンニンを新規に産生するために使用することができる核酸分子を提供することができれば有用であろう。
【００３３】
そのため、本発明は、飼料のマメ科植物種の葉におけるＣＴレベルを増加させるための方法を提供することを目的とする。遺伝子の同定は、葉または種子において有害な高レベルのＣＴを産生するマメ科植物種においてＣＴ蓄積を予防するための方法をさらに提供する。
【００３４】
増強されたレベルのフラボノイドおよび／または縮合型タンニンを有する植物、特に飼料およびマメ科植物を産生するために、単独でまたは他の核酸分子と共に使用することができる核酸分子を提供することができれば、それはさらに有用であろう。
【００３５】
本発明は、これらの問題に対処し、または少なくとも公衆に有用な選択肢を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明は、本出願人らによって単離され、縮合型タンニンを含むフラボノイド化合物の産生に関与することが示されている、本発明者らによって「ＭＹＢ１４」と称されている新規のＭＹＢ遺伝子および関連するポリペプチドの同定および使用に関する。
【００３７】
本明細書の全体にわたって、本発明の核酸分子およびポリペプチドは、記述語ＭＹＢ１４によって示され得る。
【００３８】
本発明は、植物においてフラボノイド／縮合型タンニン生合成経路を操作するために独立してまたは他の核酸分子と共にＭＹＢ１４を使用することを企図する。
【００３９】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
一態様において、本発明は、本明細書において定義されるＭＹＢ１４ポリペプチドをコードする単離核酸分子またはその機能的変異体もしくは機能的断片を提供する。
【００４０】
一実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１５の配列を含む。
【００４１】
一実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１７の配列を含む。
【００４２】
一実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１５および配列番号１７の配列を含むが、配列番号１６の配列を欠く。
【００４３】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１４および４６〜５４のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。
【００４４】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１４に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。
【００４５】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１４および４６〜５４のいずれか１つの配列を含む。
【００４６】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１４の配列を含む。
【００４７】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、植物におけるフラボノイドの産生を調節する。
【００４８】
さらなる実施形態において、フラボノイドは、縮合型タンニンである。
【００４９】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、植物においてフラボノイド生合成経路における少なくとも１つの遺伝子を調節する。
【００５０】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、植物において縮合型タンニン生合成経路における少なくとも１つの遺伝子を調節する。
【００５１】
さらなる実施形態において、機能的断片は、ＭＹＢ１４ポリペプチドと同じ活性を実質的に有する。
【００５２】
さらなる実施形態において、機能的断片は、配列番号１７に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５３】
さらなる実施形態において、機能的断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、実質的に配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５５】
さらなる態様において、本発明は、実質的に配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、実質的に配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５７】
さらなる態様において、本発明は、実質的に配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は、配列番号１７に記載されている３’アミノ酸配列モチーフを含むポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。
【００５９】
ポリヌクレオチド
さらなる態様において、本発明は、
ａ）配列番号１〜１３および５５〜６４の少なくとも１つまたはその組合せ、
ｂ）ａ）における（１つまたは複数の）配列の相補体、
ｃ）ａ）またはｂ）における（１つまたは複数の）配列の機能的断片または変異体、
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）における（１つまたは複数の）配列のホモログまたはオーソログ、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）における配列から得られるＲＮＡ配列に対するアンチセンス配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を提供する。
【００６０】
一実施形態において、変異体は、特定の配列のコード配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００６１】
さらなる実施形態において、変異体は、特定の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００６２】
さらなる実施形態において、断片は、特定の配列のコード配列を含む。
【００６３】
さらなる態様において、本発明は、
ａ）配列番号１、２、または５５、
ｂ）ａ）における（１つまたは複数の）配列の相補体、
ｃ）ａ）またはｂ）における（１つまたは複数の）配列の機能的断片または変異体、
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）における（１つまたは複数の）配列のホモログまたはオーソログ、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）における配列から得られるＲＮＡ配列に対するアンチセンス配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を提供する。
【００６４】
一実施形態において、変異体は、特定の配列のコード配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００６５】
さらなる実施形態において、変異体は、特定の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００６６】
さらなる実施形態において、断片は、特定の配列のコード配列を含む。
【００６７】
さらなる実施形態において、単離核酸分子は、配列番号２の配列を含む。
【００６８】
さらなる実施形態において、単離核酸分子は、配列番号１の配列を含む。
【００６９】
さらなる実施形態において、単離核酸分子は、配列番号５５の配列を含む。
【００７０】
プローブ
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸に結合することができるプローブを提供する。
【００７１】
本発明の別の態様によれば、実質的に上記に記載されているＭＹＢ１４核酸分子の３’ドメインに結合することができるプローブがある。
【００７２】
一実施形態において、プローブは、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする核酸分子または核酸分子の相補体と結合することができる。
【００７３】
一実施形態において、プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸分子またはその相補体と結合することができる。
【００７４】
本発明のさらなる態様によれば、配列番号１７に記載されているモチーフをコードする３’配列に対するプローブが提供される。
【００７５】
プライマー
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸に結合することができるプライマーを提供する。
【００７６】
本発明の別の態様によれば、実質的に上記に記載されているＭＹＢ１４核酸分子の３’ドメインに結合することができるプライマーがある。
【００７７】
一実施形態において、プローブは、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする核酸分子または核酸分子の相補体と結合することができる。
【００７８】
一実施形態において、プローブは、ＰＣＲ条件下で、核酸分子またはその相補体と結合することができる。
【００７９】
本発明のさらなる態様によれば、配列番号１７に記載されているモチーフをコードする３’配列をコードする核酸に対するプライマーが提供される。
【００８０】
ポリペプチド
一態様において、本発明は、本明細書において定義されるＭＹＢ１４ポリペプチドまたはその機能的断片を提供する。
【００８１】
一実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１５および配列番号１７の配列を含むが、配列番号１６の配列を欠く。
【００８２】
さらなる態様において、本発明は、
ａ）配列番号１４および４６〜５４のいずれか１つ、
ｂ）ａ）に列挙した配列の機能的断片または変異体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを提供する。
【００８３】
さらなる実施形態において、変異体は、配列番号１４および４６〜５４のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。
【００８４】
さらなる実施形態において、変異体は、配列番号１４に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。
【００８５】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１４および４６〜５４のいずれか１つの配列を含む。
【００８６】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１４の配列を含む。
【００８７】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、植物におけるフラボノイドの産生を調節する。
【００８８】
さらなる実施形態において、フラボノイドは、縮合型タンニンである。
【００８９】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、植物においてフラボノイド生合成経路における少なくとも１つの遺伝子を調節する。
【００９０】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、植物における縮合型タンニン生合成経路を調節する。
【００９１】
さらなる実施形態において、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、植物において縮合型タンニン生合成経路における少なくとも１つの遺伝子を調節する。
【００９２】
さらなる実施形態において、機能的断片は、ＭＹＢ１４ポリペプチドと同じ活性を実質的に有する。
【００９３】
本発明の別の態様によれば、
ａ）配列番号１４、
ｂ）ａ）に列挙した配列の機能的断片または変異体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドが提供される。
【００９４】
本発明の別の態様によれば、配列番号１７に記載されている３’アミノ酸配列モチーフを含む単離ポリペプチドが提供される。
【００９５】
本発明の別の態様によれば、配列番号１７に記載されている３’アミノ酸配列モチーフを有する単離ポリペプチドが提供される。
【００９６】
本発明のさらなる態様によれば、単離ＭＹＢ１４ポリペプチドまたはその機能的断片であって、前記ＭＹＢ１４ポリペプチドが、配列番号１５に示されるサブグループ５のアミノ酸配列モチーフおよび配列番号１７に示されるアミノ酸配列３’モチーフを含むが、配列番号１６に示されるサブグループ６のアミノ酸配列モチーフを欠く単離ＭＹＢ１４ポリペプチドまたはその機能的断片が提供される。
【００９７】
本発明の別の態様によれば、配列番号１〜１３および５５〜６４のいずれか１つに記載されているものから選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる単離ポリペプチドが提供される。
【００９８】
本発明の別の態様によれば、配列番号１、２、または５５に記載されているヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる単離ポリペプチドが提供される。
【００９９】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０１００】
構築物
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記に記載されているヌクレオチド配列を含む構築物が提供される。
【０１０１】
本発明のさらなる態様によれば、
少なくとも１つのプロモーター、および
実質的に上記に記載されている核酸分子
を含む構築物であって、プロモーターが、核酸分子の発現を制御するために核酸分子に作動可能に連結されている構築物が提供される。
【０１０２】
好ましくは、構築物は、１つもしくは複数の所望の他の核酸分子および／またはとりわけターミネーター配列などの、１つもしくは複数のさらなる調節配列を含んでいてもよい。
【０１０３】
最も好ましくは、構築物における核酸分子は、配列番号１、２、または５５から選択されるヌクレオチド配列を有していてもよい。
【０１０４】
宿主細胞
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記に記載されている核酸分子を含むように、野生型から変化している宿主細胞が提供される。
【０１０５】
一実施形態において、核酸は、本発明の遺伝子構築物の一部である。
【０１０６】
一実施形態において、宿主細胞は、人間の一部を形成しない。
【０１０７】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、植物細胞である。
【０１０８】
植物細胞および植物
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記に記載されている構築物で形質転換されている植物または植物細胞が提供される。
【０１０９】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記に記載されている構築物で形質転換されている植物が提供される。
【０１１０】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記に記載されている核酸分子を含むように、野生型から変化している植物またはその一部分が提供される。
【０１１１】
本発明のさらなる態様によれば、対応する野生型植物またはその一部分よりも増加または減少したレベルのフラボノイドおよび／または縮合型タンニンを有するように、ＭＹＢ１４遺伝子の発現の変化を介して操作された植物細胞、植物、またはその一部分が提供される。
【０１１２】
本発明のさらなる態様によれば、対応する野生型植物細胞よりも増加または減少したレベルのフラボノイドおよび／または縮合型タンニンを有するように、ＭＹＢ１４遺伝子の発現の変化を介して操作された植物細胞、植物細胞が提供される。
【０１１３】
本発明のさらなる態様によれば、ＭＹＢ１４遺伝子の発現の変化を介して、対応する野生型植物またはその部分よりもフラボノイドおよび／または縮合型タンニンのレベルが増加した植物の葉が提供される。
【０１１４】
本発明のさらなる態様によれば、ＭＹＢ１４遺伝子の発現の変化を介して、対応する野生型植物細胞または植物よりもフラボノイドおよび／または縮合型タンニンのレベルが増加または減少した、実質的に上記に記載される植物細胞または植物の子孫が提供される。
【０１１５】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記に記載されるトランスジェニック植物の種子が提供される。
【０１１６】
組成物
本発明のさらなる態様によれば、植物および／またはその一部分であるまたはそれから得られる成分を含む組成物であって、前記植物またはその一部分が、対応する野生型植物またはその一部分と比較して増加または減少したレベルのフラボノイドおよび／または縮合型タンニンを有するようにＭＹＢ１４遺伝子の発現の変化を介して操作された組成物が提供される。
【０１１７】
ポリヌクレオチドを使用する方法
本発明のさらなる態様によれば、植物または植物細胞を変化させるための、実質的に上記に記載される核酸分子の使用が提供される。
【０１１８】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記に記載される核酸分子を使用して、変化した植物または植物細胞を産生するための方法が提供される。
【０１１９】
一実施形態において、植物または植物細胞は、フラボノイドまたはフラボノイドの産生における中間体の産生において変化する。
【０１２０】
さらなる実施形態において、フラボノイドは、少なくとも１つの縮合型タンニンを含む。
【０１２１】
さらなる実施形態において、縮合型タンニンは、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、およびガロカテキンから選択される。
【０１２２】
好ましい実施形態において、変化は、増加である。
【０１２３】
さらなる実施形態において、植物または植物細胞は、フラボノイド生合成経路における少なくとも１つの酵素の発現において変化する。
【０１２４】
一実施形態において、フラボノイド生合成経路は、縮合型タンニン生合成経路である。
【０１２５】
好ましい実施形態において、発現の変化は、発現の増加である。
【０１２６】
さらなる実施形態において、酵素は、ＬＡＲまたはＡＮＲである。
【０１２７】
さらなる実施形態において、植物は、ＬＡＲおよびＡＮＲの両方の発現において変化する。
【０１２８】
植物は任意の植物であってもよく、植物細胞は任意の植物に由来するものでもよい。
【０１２９】
一実施形態において、植物は、飼料作物植物である。
【０１３０】
さらなる実施形態において、植物は、マメ科植物である。
【０１３１】
一実施形態において、上記に記載されている産生または発現の変化は、植物の実質的にすべての組織にある。
【０１３２】
一実施形態において、上記に記載されている産生または発現の変化は、植物の葉組織にある。
【０１３３】
一実施形態において、上記に記載されている産生または発現の変化は、植物の栄養部分にある。
【０１３４】
一実施形態において、上記に記載されている産生または発現の変化は、植物の表皮組織にある。
【０１３５】
本明細書の目的で、表皮組織は、葉、茎、および根ならびに維管束植物の若い組織を含む細胞の外側の一層の群を指す。
【０１３６】
一実施形態において、上記に記載されているフラボノイド産生の変化は、フラボノイドが実質的に欠けている植物の組織にある。
【０１３７】
一実施形態において、上記に記載されている縮合型タンニン産生の変化は、縮合型タンニンが実質的に欠けている植物の組織にある。
【０１３８】
そのため、本発明のいくつかの実施形態において、フラボノイドまたは縮合型タンニンの産生は、新規産生である。
【０１３９】
一実施形態において、核酸は、本明細書において定義されるＭＹＢ１４タンパク質をコードする。
【０１４０】
さらなる実施形態において、核酸は、配列番号１〜１３および５５〜６４のいずれか１つまたはその断片もしくは変異体に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【０１４１】
さらなる実施形態において、核酸は、実質的に配列番号１〜１３および５５〜６４のいずれか１つまたはその断片もしくは変異体に記載されている配列を含む。
【０１４２】
さらなる実施形態において、核酸は、実質的に配列番号１、２、または５５またはその断片もしくは変異体に記載されている配列を含む。
【０１４３】
さらなる実施形態において、核酸は、実質的に上記に記載されている構築物の一部である。
【０１４４】
一実施形態において、植物は、核酸または構築物で植物を形質転換することによって変化する。
【０１４５】
さらなる実施形態において、植物は、対応する野生型植物またはその植物において産生されるものと比較して、植物において、増加または減少したレベルの核酸またはその断片もしくは変異体を発現するように、植物のゲノムを操作することによって変化する。
【０１４６】
本発明のさらなる態様によれば、他の関連するフラボノイドおよび／または縮合型タンニン調節遺伝子／ポリペプチドを同定するための、本発明の核酸分子またはポリペプチドの使用が提供される。
【０１４７】
本発明のさらなる態様によれば、植物または植物細胞を変化させるための、実質的に上記に記載されている核酸分子の使用であって、前記植物または植物細胞が、飼料作物に由来する使用が提供される。
【０１４８】
一実施形態において、植物は、縮合型タンニンの産生が変化する。
【０１４９】
一実施形態において、植物は、縮合型タンニンの増加した産生を有する。
【０１５０】
好ましくは、飼料作物は、飼料のマメ科植物であってもよい。
【０１５１】
本発明のさらなる態様によれば、マメ科植物またはマメ科植物細胞におけるフラボノイドまたは縮合型タンニンのレベルを変化させるための、実質的に上記に記載されている核酸分子の使用が提供される。
【０１５２】
好ましくは、縮合型タンニンのレベルが変化する。
【０１５３】
好ましくは、縮合型タンニンのレベルは、葉組織において変化する。
【０１５４】
本発明のさらなる態様によれば、植物体におけるフラボノイドまたは縮合型タンニン生合成経路を変化させるための、実質的に配列番号１〜１３および５５〜６４のいずれか１つに記載されている核酸配列情報の使用が提供される。
【０１５５】
本発明のさらなる態様によれば、植物体におけるフラボノイドまたは縮合型タンニン生合成経路を変化させるための、実質的に配列番号１、２、および５５のいずれか１つに記載されている核酸配列情報の使用が提供される。
【０１５６】
本発明のさらなる態様によれば、マメ科植物または植物細胞の栄養部分におけるフラボノイドおよび／または縮合型タンニンのレベルを変化させるように、マメ科植物または植物細胞を形質転換するための、実質的に上記に記載されている構築物の使用が提供される。
【０１５７】
本発明のさらなる態様によれば、マメ科植物またはその一部分内のフラボノイドおよび／または縮合型タンニン産生を変化させるための方法であって、対応する野生型植物またはその植物において産生されるものと比較して、植物において増加または減少したレベルのマメ科ＭＹＢ１４遺伝子またはその断片もしくは変異体を発現するように、植物のゲノムを操作する工程を含む方法が提供される。
【０１５８】
本発明のさらなる態様によれば、マメ科植物またはその一部分内のフラボノイドおよび／または縮合型タンニン産生を変化させるための方法であって、対応する野生型植物またはその植物において産生されるものと比較して、植物において増加または減少したレベルのマメ科ＭＹＢ１４遺伝子またはその断片もしくは変異体を発現するように、植物のゲノムを操作する工程を含む方法が提供される。
【０１５９】
本発明のさらなる態様によれば、マメ科植物またはその一部分における植物体においてフラボノイドまたは縮合型タンニンを新規に産生するための、核酸分子の使用が提供される。
【０１６０】
本発明のさらなる態様によれば、植物体におけるフラボノイドおよび／または縮合型タンニン生合成経路をマメ科植物またはその一部分において操作するための、実質的に上記に記載されている核酸分子の使用が提供される。
【０１６１】
本発明のさらなる態様によれば、植物体におけるフラボノイドおよび／または縮合型タンニン生合成経路を操作するための、実質的に上記に記載されている構築物の使用が提供される。
【０１６２】
本発明のさらなる態様によれば、植物体における生合成経路を操作するための、本発明の核酸分子に実質的に対応する核酸配列を有するＭＹＢ１４遺伝子の使用が提供される。
【０１６３】
本発明のさらなる態様によれば、フラボノイドおよび／もしくは縮合型タンニン、酵素、中間体、またはフラボノイドおよび／もしくは縮合型タンニン生合成経路と関連する他の化合物を産生するための、実質的に上記に記載されている核酸分子の使用が提供される。
【０１６４】
本発明のさらなる態様によれば、非機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を産生するために、実質的に上記に記載されている核酸を変化させる工程によって特徴づけられるフラボノイドおよび／または縮合型タンニン生合成経路を操作するための方法が提供される。
【０１６５】
別の態様によれば、マメ科植物または植物細胞内のＬＡＲおよび／またはＡＮＲのレベルを操作するための、植物体における本発明の単離核酸分子の使用が提供される。
【０１６６】
別の態様によれば、マメ科植物または植物細胞内のカテキンおよび／またはエピカテキンまたは他のタンニン単量体（エピガロカテキンもしくはガロカテキン）のレベルを操作するための、植物体における本発明の単離核酸分子の使用が提供される。
【０１６７】
本発明のさらなる態様によれば、他の関連するフラボノイドおよび／または縮合型タンニン調節遺伝子／ポリペプチドを同定するための、核酸分子またはポリペプチドの使用が提供される。
【０１６８】
一実施形態において、植物組織の全体を操作することができる。代替の実施形態において、植物の表皮組織を操作することができる。本明細書の目的で、表皮組織は、細胞、葉、茎、および根ならびに維管束植物の若い組織の外側の一層の群を指す。
【０１６９】
最も好ましくは、本発明によって変化するフラボノイドおよび／または縮合型タンニンのレベルは、変化したレベルのフラボノイドおよび／または縮合型タンニンを有する植物を消費する対象に対して治療上のまたは農学的な利益を提供するのに十分である。
【０１７０】
方法を介して産生される植物
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の方法によって産生される植物を提供する。
【０１７１】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の植物の一部分、種子、果実、収穫物、栄養繁殖体、または子孫を提供する。
【０１７２】
さらなる実施形態において、植物の一部分、種子、果実、収穫物、栄養繁殖体、または子孫は、本発明の少なくとも１つの核酸分子または本発明の構築物を含むように遺伝子改変される。
【０１７３】
本発明の核酸およびタンパク質の供給源
本発明の核酸およびタンパク質は、下記に記載されている任意の植物に由来するものでもよく、または合成でもしくは組換えで産生してもよい。
【０１７４】
植物
本発明の植物細胞および植物または本発明の方法および使用において形質転換もしくは操作されているものは、任意の種に由来し得る。
【０１７５】
一実施形態における、植物細胞または植物は、裸子植物植物種に由来する。
【０１７６】
さらなる実施形態において、植物細胞または植物は、被子植物植物種に由来する。
【０１７７】
さらなる実施形態において、植物細胞または植物は、双子葉植物種に由来する。
【０１７８】
さらなる実施形態において、植物細胞または植物は、単子葉植物種に由来する。
【０１７９】
好ましくは、植物は、双子葉植物種に由来する。
【０１８０】
他の好ましい植物は、以下の属を含むが、これらに限定されない群に由来する飼料植物種である：Ｌｏｌｉｕｍ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｐｈｅｌｅｕｍ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｌｏｔｕｓ、Ｐｌａｎｔａｇｏ、およびＣｉｃｈｏｒｉｕｍ。
【０１８１】
他の好ましい植物は、マメ科植物である。マメ科植物またはその一部分は、植物科ＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅまたはＦａｂａｃｅａｅにおける任意の植物を包含してもよい。例えば、植物は、ａｌｆａｌｆａ、ｃｌｏｖｅｒを含む飼料のマメ科植物；ｌｅｕｃａｅｎａ；マメ、レンズマメ、ルピナス、エンドウ、ピーナッツ、ダイズを含むマメ科植物の穀物；ルピナス、医薬の、または産業上のマメ科植物を含むマメ科植物の花；ならびに休閑または緑肥のマメ科植物種から選択することができる。
【０１８２】
特に好ましい属は、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍである。
【０１８３】
好ましいＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種は、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｆｆｉｎｅ、およびＴｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅを含む。
【０１８４】
特に好ましいＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種は、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓである。
【０１８５】
別の好ましい属は、Ｍｅｄｉｃａｇｏである。
【０１８６】
好ましいＭｅｄｉｃａｇｏ種は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａおよびＭｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａを含む。
【０１８７】
特に好ましいＭｅｄｉｃａｇｏ種は、ａｌｆａｌｆａとして一般に知られているＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。
【０１８８】
別の好ましい属は、Ｇｌｙｃｉｎｅである。
【０１８９】
好ましいＧｌｙｃｉｎｅ種は、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘおよびＧｌｙｃｉｎｅ  ｗｉｇｈｔｉｉ（Neonotonia wightiiとしても知られている）を含む。
【０１９０】
特に好ましいＧｌｙｃｉｎｅ種は、ダイズとして一般に知られているＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。
【０１９１】
特に好ましいＧｌｙｃｉｎｅ種は、多年生のダイズとして一般に知られているＧｌｙｃｉｎｅ  ｗｉｇｈｔｉｉである。
【０１９２】
別の好ましい属は、Ｖｉｇｎａである。
【０１９３】
好ましいＶｉｇｎａ種は、Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａを含む。
【０１９４】
特に好ましいＶｉｇｎａ種は、ササゲとして一般に知られているＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。
【０１９５】
別の好ましい属は、Ｍｕｃａｎａである。
【０１９６】
好ましいＭｕｃａｎａ種は、Ｍｕｃａｎａ  ｐｒｕｎｉｅｎｓを含む。
【０１９７】
特に好ましいＭｕｃａｎａ種は、ハッショウマメとして一般に知られているＭｕｃａｎａ  ｐｒｕｎｉｅｎｓである。
【０１９８】
別の好ましい属は、Ａｒａｃｈｉｓである。
【０１９９】
好ましいＭｕｃａｎａ種は、Ａｒａｃｈｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａを含む。
【０２００】
特に好ましいＡｒａｃｈｉｓ種は、多年生のピーナッツとして一般に知られているＡｒａｃｈｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａである。
【０２０１】
別の好ましい属は、Ｐｉｓｕｍである。
【０２０２】
好ましいＰｉｓｕｍ種は、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍを含む。
【０２０３】
特に好ましいＰｉｓｕｍ種は、エンドウとして一般に知られているＰｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍである。
【０２０４】
別の好ましい属は、Ｌｏｔｕｓである。
【０２０５】
好ましいＬｏｔｕｓ種は、Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｌｏｔｕｓ  ｐｅｄｕｎｃｕｌａｔｕｓ、Ｌｏｔｕｓ  ｇｌａｂａｒ、Ｌｏｔｕｓ  ｔｅｎｕｉｓ、およびＬｏｔｕｓ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｓを含む。
【０２０６】
特に好ましいＬｏｔｕｓ種は、Ｂｉｒｄｓｆｏｏｔ  Ｔｒｅｆｏｉｌとして一般に知られているＬｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓである。
【０２０７】
特に好ましいＬｏｔｕｓ種は、Ｎａｒｒｏｗ−ｌｅａｆ  Ｂｉｒｄｓｆｏｏｔ  Ｔｒｅｆｏｉｌとして一般に知られているＬｏｔｕｓ  ｇｌａｂａｒである。
【０２０８】
特に好ましいＬｏｔｕｓ種は、Ｂｉｇ  ｔｒｅｆｏｉｌとして一般に知られているＬｏｔｕｓ  ｐｅｄｕｎｃｕｌａｔｕｓである。
【０２０９】
特に好ましいＬｏｔｕｓ種は、Ｓｌｅｎｄｅｒ  ｔｒｅｆｏｉｌとして一般に知られているＬｏｔｕｓ  ｔｅｎｕｉｓである。
【０２１０】
別の好ましい属は、Ｂｒａｓｓｉｃａである。
【０２１１】
好ましいＢｒａｓｓｉｃａ種は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａを含む。
【０２１２】
特に好ましいＢｒａｓｓｉｃａ種は、飼料のケールおよびキャベツとして一般に知られているＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａである。
【０２１３】
本明細書において使用される用語「植物」は、植物全体およびその任意の一部分を指し、植物種子、苗条、葉、樹皮、さや、根、花、果実、茎などの、植物生活環の間の、植物の選択される部分を含んでいてもよいが、これらに限定されない。好ましい「その一部分」は、葉である。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
本発明のさらなる態様は、単に例として示した以下の説明から、かつ添付の図面を参照すると明らかとなるであろう。
【０２１５】
【図１】一般的な縮合型タンニン経路を示す図である。
【図２Ａ】成熟したＴ．ａｒｖｅｎｓｅ葉組織からクローン化されたＴａＭＹＢ１４の全長ｃＤＮＡ配列を表すｃＤＮＡ配列を例示する図である。
【図２Ｂ】ＴａＭＹＢ１４のアミノ酸翻訳を例示する図である。
【図３】同一のガラス温室条件で成長させたＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種および栽培品種に由来する様々な組織におけるＴａＭＹＢ１４の転写レベルを示す図である。レーン１、（ラダー）；レーン２、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟葉のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン３、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟根のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン４、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟走根のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン５、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟花のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種DC111）；レーン６、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ新生葉のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン７、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟葉のｃＤＮＡ（高アントシアニン栽培品種Isabelle）；レーン８、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ未成熟葉のｃＤＮＡ（栽培品種AZ2925）；レーン９、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ成熟葉のｃＤＮＡ（栽培品種AZ2925）；レーン１０、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織花のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１１、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織葉のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１２、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織トリコームのみのｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１３、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ成熟植物（葉、根、および走根）のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン１４、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟結節のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン１５、ＴＯＰＯ中のクローン化Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ  ＭＹＢ１４ｃＤＮＡクローン、レーン１６、ＴＯＰＯ中のクローン化Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ  ＭＹＢ１４ゲノムクローン、レーン１７、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅのゲノムＤＮＡ；レーン１７、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓのゲノムＤＮＡ；レーン１７、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのゲノムＤＮＡ；レーン２０（ラダー）。
【図４】同一のガラス温室条件で成長させたＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種および栽培品種に由来する様々な組織におけるＢＡＮＹＵＬＳ（Ａ）およびＬＡＲ（Ｂ）の転写レベルを示す図である。レーン１、（ラダー）；レーン２、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟葉のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン３、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟根のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン４、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟走根のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン５、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟花のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種DC111）；レーン６、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ新生葉のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン７、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟葉のｃＤＮＡ（高アントシアニン栽培品種Isabelle）；レーン８、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ未成熟葉のｃＤＮＡ（栽培品種AZ2925）；レーン９、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ成熟葉のｃＤＮＡ（栽培品種AZ2925）；レーン１０、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織花のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１１、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織葉のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１２、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織トリコームのみのｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１３、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ成熟植物（葉、根、および走根）のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン１４、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟結節のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン１５、ＴＯＰＯ中のクローン化Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのｃＤＮＡ  ＢＡＮまたはＬＡＲクローン、レーン１６、ＴＯＰＯ中のクローン化Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのＢＡＮまたはＬＡＲゲノムクローン、レーン１７、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅのゲノムＤＮＡ；レーン１７、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓのゲノムＤＮＡ；レーン１７、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのゲノムＤＮＡ；レーン２０（ラダー）。
【図５】形質転換されたシロツメクサ成熟葉組織のＤＭＡＣＡ染色の結果を示す図である。（Ａ）野生型、および（Ｂ）ＴａＭＹＢ１４遺伝子で形質転換された縮合型タンニンを同定する、成熟したシロツメクサ葉組織のＤＭＡＣＡ染色（薄灰色／濃灰色）。
【図６】植物の形質転換に使用されるプラスミドベクターＭ１４ＡｐＨＺＢａｒＰを示す図である。Ｅ１、Ｅ２およびＥ３は、ゲノム対立遺伝子ＴａＭＹＢ１４−１の３つのエキソンを示す。
【図７】類似性を薄灰色で強調した、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ＭＹＢ１４、上位ＢＬＡＳＴＮヒット、およびＡｔＴＴ２の全長ｃＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図８】類似性を薄灰色で強調し、モチーフを枠で囲んだ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅＴａＭＹＢ１４、上位ＢＬＡＳＴＮヒット、およびＡｔＴＴ２の翻訳されたオープンリーディングフレームのアライメントを示す図である。
【図９】差異を濃灰色／白色領域で強調し、欠失／挿入範囲を枠で強調した、ＴａＭＹＢ１４（発現されたTaMYB14FTaおよびサイレントTaMYB14-2S）、ＴｏＭＹＢ１４対立遺伝子、およびＴｒＭＹＢ１４対立遺伝子の全長タンパク質配列のアライメントを示す図である。
【図１０】エキソン（薄灰色）およびイントロン（濃灰色）の差異を強調した、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ  ＴａＭＹＢ１４対立遺伝子（TaM3、TaM4）と整列させた、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ  ＴｒＭＹＢ１４対立遺伝子（TRM*）の全長ゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１１】エキソン（薄灰色）およびイントロン（濃灰色）の差異を強調した、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ  ＴａＭＹＢ１４対立遺伝子（TaM3、TaM4）と整列させた、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ  ＴｏＭＹＢ１４対立遺伝子（To1、To6）の全長ゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１２】エキソン（薄灰色）およびイントロン（濃灰色）の差異を示した、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ  ＴａＭＹＢ１４対立遺伝子（Ta*）およびＴｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｆｆｉｎｅ  ＴａｆＭＹＢ１４対立遺伝子（Taf*）の全長ゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。
【図１３】ＭＹＢ１４ｐＨＡＮＮＩＢＡＬからのＮｏｔＩ断片を含有する構築物ｐＨＺｂａｒＳＭＹＢのベクターＮＴＩマップを示す図である。これは、ｐｄｋイントロンに隣接するセンス（SMYB14F）およびアンチセンス（SMYB14R）配向において、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ由来のＴａＭＹＢ１４  ｃＤＮＡのセグメントを含有する。
【図１４】形質転換されたと推定されるシロツメクサから単離されたゲノムＤＮＡに由来するＭ１４ＡｐＨＺＢＡＲの存在に関するＰＣＲ反応を示す図である。レーン；Ａ１、Ｂ１  ラダー；Ａ２〜１８およびＢ２〜Ｂ１５  形質転換されたクローバー、Ｂ１６  形質転換されていないシロツメクサ、Ｂ１７  プラスミド対照、Ｂ１８  水対照。プライマーは、３５Ｓ（プロモーター）およびＰＭＹＢＲ（遺伝子の３’末端側）であり、１，２４４ｂｐの断片を増幅した。
【図１５】ＴａＭＹＢ１４構築物で形質転換された、野生型（Ａ）およびトランスジェニック（Ｂ〜Ｄ）Ｔ．ｒｅｐｅｎｓの葉のＤＭＡＣＡスクリーニングの結果を示す図である。
【図１６】ＴａＭｙｂ１４Ａ遺伝子を発現する、ＤＭＡＣＡで染色されたトランスジェニック小葉のトリコーム（Ｅ〜Ｇ）、表皮細胞（Ｈ）および葉肉細胞（Ｉ〜Ｋ）の油浸顕微鏡観察を示す図である。
【図１７】グレープ種子抽出物の単量体を示す図である。グレープ種子抽出物中の単量体のＳＲＭクロマトグラムは、下に示されている。トレースＡは、２９１．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１２３、１３９、および１６５ｍ／ｚの合計である（カテキン（C）およびエピカテキン（EC））。トレースＢは、３０７．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１３９および１５１ｍ／ｚの合計である（ガロカテキン（GC）およびエピガロカテキン（EGC））。
【図１８】グレープ種子抽出物の二量体および三量体を示す図である。グレープ種子抽出物中の二量体および三量体のＳＲＭクロマトグラムは、下に示されている。トレースＡは、５７９．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、４０９、および４２７ｍ／ｚの合計である（PC：PC二量体）。トレースＢは、５９５．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、３０７、４２７、および４４３ｍ／ｚの合計である（PC：PD二量体）である。トレースＣは、８６７．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、５７７、および５７９ｍ／ｚの合計である（3PC三量体）。ＰＣ：ＰＣ二量体、ＰＣ：ＰＤ二量体、および２つの３ＰＣ三量体のＭＳ２スペクトルは、これらの代謝産物の同定の証拠として提供されている。
【図１９】対照（シロツメクサ -ve）およびＭＹＢ１４を発現するトランスジェニック（シロツメクサ +ve）植物の単量体のＳＲＭクロマトグラムを示す図であり、後者は下に示されている。トレースＡは、２９１．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１２３、１３９、および１６５ｍ／ｚの合計である（PC；カテキンおよびエピカテキン）。トレースＢは、３０７．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１３９および１５１ｍ／ｚの合計である（PD；ガロカテキンおよびエピガロカテキン）。クロマトグラムのスケールは、改変された植物中の単量体の出現を示すために固定されている。対照植物中に単量体はまったく検出されなかった。エピカテキン（EC）およびエピガロカテキン（EGC）のＭＳ２スペクトルは、これらの代謝産物の同定の証拠として、改変された植物から提供されている。
【図２０】対照（シロツメクサ -ve）およびＭＹＢ１４を発現するトランスジェニック（シロツメクサ +ve）植物の二量体のＳＲＭクロマトグラムを示す図であり、後者は下に示されている。トレースＡは、５７９．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、４０９、および４２７ｍ／ｚの合計である（PC：PC二量体）。トレースＢは、５９５．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、３０７、４２７、および４４３ｍ／ｚの合計である（PC：PD二量体）。トレースＣは、６１１．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン３０７および４４３ｍ／ｚの合計である（PD：PD二量体）。クロマトグラムのスケールは、改変された植物中の二量体の出現を示すために固定されている。対照植物中に二量体はまったく検出されなかった。３つのＰＤ：ＰＤ二量体（１〜３）、および１つのＰＣ：ＰＤ混合二量体（４）のＭＳ２スペクトルは、これらの代謝産物の同定の証拠として、改変された植物から提供されている。
【図２１】対照（シロツメクサ -ve）およびＭＹＢ１４を発現するトランスジェニック（シロツメクサ +ve）植物の三量体のＳＲＭクロマトグラムを示す図であり、後者は下に示されている。トレースＡは、８６７．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、５７７、および５７９ｍ／ｚの合計である（3PC三量体）。８８３．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、３０７、４２７、４４３、５７７、５７９、５９３、５９５、および７５７ｍ／ｚの合計である（PC：PD二量体）。トレースＣは、８９９．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、３０７、４４３、５９３、５９５、６１１、７３１、７５７、および７７３ｍ／ｚの合計である（1PC：2PD三量体）。トレースＤは、９１５．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン３０７、４４３、６０９、６１１、７４７、７７３、および７８９ｍ／ｚの合計である（3PD三量体）。クロマトグラムのスケールは、改変された植物中の三量体の出現を示すために固定されている。対照植物中に三量体はまったく検出されなかった。３ＰＤ三量体および１ＰＣ：２ＰＤ混合三量体のＭＳ２スペクトルは、これらの代謝産物の同定の証拠として、改変された植物から提供されている。
【図２２】形質転換されたと推定されるタバコ小植物から単離されたゲノムＤＮＡに由来するＭ１４ＡｐＨＺＢＡＲの存在に関するＰＣＲ反応を示す図である。レーン；Ａ１、ラダー；Ａ２〜１０  形質転換されたタバコ、Ａ１３、１４、タバコ対照、Ａ１５  プラスミド対照。プライマーは、３５Ｓ（プロモーター）およびＰＭＹＢＲ（遺伝子の３’末端側）であり、１，２４４ｂｐの断片を増幅した。
【図２３】Ｍ１４ＡｐＨＺＢＡＲ構築物で形質転換された、トランスジェニック（Ａ〜Ｇ）タバコ（Nicotiana tabacum）の葉のＤＭＡＣＡスクリーニングの結果を示す。
【図２４】対照（野生型）およびＭＹＢ１４を発現する改変（トランスジェニック）植物のＳＲＭクロマトグラムを示す図であり、後者は下に示されている。トレースＡは、２９１．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１２３、１３９、および１６５ｍ／ｚの合計である（PC；カテキンおよびエピカテキン）。トレースＢは、３０７．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１３９および１５１ｍ／ｚの合計である（PD；ガロカテキンおよびエピガロカテキン）。トレースＣは、５７９．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、４０９、および４２７ｍ／ｚの合計である（PC：PC二量体）。トレースＤは、８６７．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１、５７７、および５７９ｍ／ｚの合計である（PC：PC：PCタイマー）。クロマトグラムのスケールは、改変された植物中の単量体、二量体、および三量体の出現を示すために固定されている。混合されたＰＣ：ＰＤ、または１００％のＰＤの二量体もしくは三量体はまったく検出されなかったことに留意されたい。
【図２５】エピカテキン（EC）、ガロカテキン（GC）、エピガロカテキン（EGC）、ＰＣ：ＰＣ二量体１および２、ならびにＰＣ：ＰＣ：ＰＣ三量体のＭＳ２スペクトルを示す図であり、これらのスペクトルは、これらの代謝産物の同定の証拠として、ＭＹＢ１４を発現する改変された（トランスジェニック）植物から提供されている。
【図２６】形質転換されたと推定されるＴ．ａｒｖｅｎｓｅから単離されたゲノムＤＮＡ中のＭ１４ｐＨＡＮＮＩＢＡＬの存在に関するＰＣＲ反応を示す図である。レーン；Ａ１  ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ陰性対照ベクター、Ａ２  １，２４４ｂｐの断片を増幅する対照である、３５Ｓおよびゲノム遺伝子構築物を含有するＭ１４ＡｐＨＺＢＡＲ；Ａ３  ｈｐＲＮＡ構築物を含有するＭ１４ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ陽性プラスミド対照、Ａ４  ｏｃｓターミネーター（陰性対照）の上流のアンチセンス配向でのＭＹＢ断片を含有するｐＨＡＮＮＩＢＡＬ、Ａ５  ｐＨＺＢＡＲＳＭＹＢ陽性プラスミド対照、Ａ６  ラダー、Ａ７〜１８  形質転換されたＴ．ａｒｖｅｎｓｅ、Ａ１９  ゲノムＤＮＡ野生型Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ、Ａ２０  水対照。  Ｂ：Ｂ１  ラダー、Ｂ２〜Ｂ１１  形質転換されたＴ．ａｒｖｅｎｓｅ、Ｂ１２  Ｍ１４ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ陽性プラスミド対照。プライマーは、３５Ｓ（プロモーター）およびＰＨＭＹＢＲ（遺伝子の３’末端）であり、３９３ｂｐの断片を増幅した。
【図２７】野生型Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのカルス（Ａ）、および組織培地上で再生された小植物（Ｂ〜Ｄ）のＤＭＡＣＡスクリーニングの結果を示す図である。カルス、および組織培地上で再生されたトランスジェニック（Ｅ〜Ｌ）Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ小植物のＤＭＡＣＡスクリーニングにおいて、ＤＭＡＣＡ染色はまったく起こらなかった。染色は、野生型植物と比較して大いに減少した。
【図２８】Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ対照およびノックアウト植物に関する４つの単量体のＳＲＭクロマトグラムを示す図である：トレースＡは、対照植物についての、２９１．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１２３、１３９、および１６５ｍ／ｚの合計である（PC；カテキンおよびエピカテキン）。Ｂは、ノックアウト植物についての、２９１．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１２３、１３９、および１６５ｍ／ｚの合計である（PC；カテキンおよびエピカテキン）。Ｃは、対照植物についての、３０７．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１３９および１５１ｍ／ｚの合計である（PD；ガロカテキンおよびエピガロカテキン）。Ｄは、ノックアウト植物についての、３０７．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１３９および１５１ｍ／ｚの合計である（PD；ガロカテキンおよびエピガロカテキン）。ＭＳ２スペクトルは、対照植物中のカテキンおよびガロカテキンの証拠として対照植物から提供されている。トレースＡ、Ｂ、ＣおよびＤのクロマトグラムのスケールは、ノックアウト植物中のカテキンおよびガロカテキンの消滅を示すために固定されている。
【図２９】対照およびノックアウトＴ．ａｒｖｅｎｓｅ植物に関する二量体のＳＲＭクロマトグラムを示す図である。トレースＡは、５７９．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン２９１および４２７ｍ／ｚの合計である（PC：PC二量体）。トレースＢは、５９５．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン３０７、４２７、および４４３ｍ／ｚの合計である（PC：PD二量体）。トレースＣは、６１１．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン３０７および４４３ｍ／ｚの合計である（PD：PD二量体）。クロマトグラムのスケールは、ノックアウト植物中の二量体の消滅を示すために固定されている。ＭＳ２スペクトルは、対照中の３つの型の二量体すべての証拠として対照植物から提供されている。
【図３０】形質転換されたと推定されるアルファルファから単離されたゲノムＤＮＡに由来するｐＴａＭｙｂ１４Ａの存在に関するＰＣＲ分析を示す図である。レーンＬ；ラダー；１〜３、形質転換されていないもの、４〜１０  形質転換されたもの、１１  野生型、１２  水対照、１３  プラスミド対照。プライマーは、３５ＳおよびＰＭＹＢＲ（遺伝子の３’末端側）であった。
【図３１】形質転換されたと推定されるｂｒａｓｓｉｃａ小植物から単離されたゲノムＤＮＡに由来するＭ１４ＡｐＨＺＢＡＲの存在に関するＰＣＲ分析を示す図である。レーン８、ｂｒａｓｓｉｃａ対照；レーン１８  ラダー；レーン１〜７および９〜１７  形質転換されたｂｒａｓｓｉｃａ。プライマーは、３５Ｓ（プロモーター）およびＰＭＹＢＲ（遺伝子の３’末端側）であり、１，２４４ｂｐの断片を増幅した。
【図３２】野生型ｂｒａｓｓｉｃａ（Brassica oleracea）（Ａ）およびＭ１４ＡｐＨＺＢＡＲＰ構築物で形質転換されたトランスジェニック（Ｂ〜Ｄ）葉のＤＭＡＣＡスクリーニングの結果を示す図である。
【図３３】２つの対照、およびＭＹＢ１４を発現するトランスジェニックｂｒａｓｓｉｃａ中の、２９１．３ｍ／ｚのＳＲＭのプロダクトイオン１２３、１３９、および１６５ｍ／ｚ（カテキン（C）およびエピカテキン（EC））のＳＲＭクロマトグラムを示す図である。緑色対照およびトランスジェニック＋ｖｅ試料中で検出されたエピカテキンのＭＳ２スペクトルが、これらの代謝産物の同定の証拠として提供されている。赤色対照試料中では、エピカテキンはまったく検出されなかった。
【図３４】出願人によって同定されたすべてのＴｒｉｆｏｌｉｕｍ  ＭＹＢ１４タンパク質配列のアライメントを示す図である。
【図３５】図３４中に整列された配列同士間のパーセント同一性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０２１６】
本明細書において、特許明細書、他の外部文書、または他の情報源に対して参照がなされているが、これは、概して、本発明の特徴について論じるための背景を提供する目的のためにある。特に別記しない限り、そのような外部文書に対する参照は、そのような文書またはそのような情報源が、あらゆる権限において、先行技術となるまたは当技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという許可として解釈されないものとする。
【０２１７】
本明細書および特許請求の範囲において使用される用語「含むこと（comprising）」は、「〜から少なくとも部分的になること（consisting at least in part of）」を意味する、すなわち、「含むこと」を含む本明細書および特許請求の範囲における記述を解釈する場合、それぞれの記述においてこの用語で始まる特徴はすべて、存在する必要があるが、他の特徴もまた存在することができる。「含む（comprise）」および「含まれる（comprised）」などの関連する用語は、同様に解釈されることとする。しかしながら、好ましい実施形態において、含むことは、〜からなることと交換することができる。
【０２１８】
用語「ＭＹＢ１４ポリペプチド」は、Ｒ２Ｒ３クラスＭＹＢ転写因子を指す。
【０２１９】
好ましくは、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１４および４６〜５４のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。
【０２２０】
好ましくは、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１５の配列モチーフを含む。
【０２２１】
好ましくは、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１７の配列モチーフを含む。
【０２２２】
より好ましくは、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１５および配列番号１７の配列を含むが、配列番号１６の配列を欠く。
【０２２３】
好ましくは、ＭＹＢ１４ポリペプチドは、配列番号１４に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。
【０２２４】
「ＭＹＢ１４遺伝子」は、ＭＹＢ１４ポリペプチドをコードする、遺伝子の標準的な定義による遺伝子である。
【０２２５】
用語「ＭＹＢ転写因子」は、単一のまたは多数の不完全な反復からなる、構造上保存されたＤＮＡ結合ドメインによって特徴づけられる転写因子のクラスを指すことが当業者らによって十分に理解される用語である。
【０２２６】
用語「Ｒ２Ｒ３転写因子」または「Ｒ２Ｒ３  ＤＮＡ結合ドメインを有するＭＹＢ転写」は、２反復クラスのＭＹＢ転写因子を指すことが当業者らによって十分に理解される用語である。
【０２２７】
用語「プロアントシアニジン」および「縮合型タンニン」は、明細書の全体にわたって区別なく使用することができる。
【０２２８】
本明細書において使用される用語「配列モチーフ」は、アミノ酸またはヌクレオチドのストレッチを意味する。好ましくは、アミノ酸またはヌクレオチドのストレッチは隣接している。
【０２２９】
「産生が変化した」または「発現が変化した」植物に関する用語「変化した」は、非形質転換状態の同じ植物または同じ種類の植物と比較して変化していることを意味する。
【０２３０】
用語「変化した」は、増加したまたは減少したことを意味し得る。好ましくは、変化した、とは、増加した、である。
【０２３１】
ポリヌクレオチドおよび断片
本明細書において使用される用語「（１つまたは複数の）ポリヌクレオチド」は、任意であるが、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さの一本鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、非限定的な例として、遺伝子のコード配列および非コード配列、センス配列およびアンチセンス配列の相補体、エキソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリペプチド、単離精製自然発生ＤＮＡ配列または単離精製自然発生ＲＮＡ配列、合成ＲＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマー、ならびに断片を含む。
【０２３２】
用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸分子」と区別なく使用することができる。
【０２３３】
本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列の「断片」は、好ましくは長さが少なくとも１５のヌクレオチドである、隣接ヌクレオチドの部分配列である。本発明の断片は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも２０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０のヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも６０の隣接ヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド配列の断片は、アンチセンス技術、遺伝子サイレンシング技術、トリプルヘリックス技術、もしくはリボザイム技術においてまたはマイクロアレイにおいて含まれるプライマー、プローブとして使用することができ、またはポリヌクレオチドベースの選択法において使用することができる。
【０２３４】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチド配列の断片は、少なくとも２５、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００、より好ましくは少なくとも６００、より好ましくは少なくとも７００、より好ましくは少なくとも８００、より好ましくは少なくとも９００、より好ましくは少なくとも１０００の、特定のポリヌクレオチドの隣接ヌクレオチドを含む。
【０２３５】
用語「プライマー」は、鋳型にハイブリダイズし、鋳型に対して相補的なポリヌクレオチドの重合を開始するために使用される、通常は遊離３’ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドを指す。そのようなプライマーは、長さが好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１１、より好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１４、より好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１７、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも１９、より好ましくは少なくとも２０のヌクレオチドである。
【０２３６】
用語「プローブ」は、ハイブリダイゼーションベースのアッセイにおいて、プローブに対して相補的であるポリヌクレオチド配列を検出するために使用される、短いポリヌクレオチドを指す。プローブは、本明細書において定義されるポリヌクレオチドの「断片」からなっていてもよい。好ましくは、そのようなプローブは、長さが、少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも４００、最も好ましくは少なくとも５００のヌクレオチドである。
【０２３７】
ポリペプチドおよび断片
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、全長タンパク質を含む、任意の長さであるが、好ましくは少なくとも５のアミノ酸のアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は、ペプチド共有結合で連結している。ポリペプチドは、精製天然産物であってもよく、または組換え技術もしくは合成技術を使用して部分的にもしくは全体的に産生してもよい。用語は、ポリペプチド、二量体もしくは他の多量体などのポリペプチドの集合体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはその誘導体を指し得る。
【０２３８】
ポリペプチドの「断片」は、生物学的活性に必要とされる機能を果たす、および／またはポリペプチドの三次元構造を提供する、ポリペプチドの部分配列である。用語は、上記の活性を果たすことができるポリペプチド、二量体もしくは他の多量体などのポリペプチドの集合体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはその誘導体を指す。
【０２３９】
本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対して適用される用語「単離」は、それらの自然の細胞環境から取り出される配列を指すように使用される。単離分子は、任意の方法または生化学的技術、組換え技術、および合成技術を含む方法の組合せによって得ることができる。
【０２４０】
特定の属または種に由来するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に関しての用語「〜に由来する」は、配列が、その属または種において自然に見つけられるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と同じ配列を有することを意味する。そのため、特定の属または種に由来する配列は、合成でまたは組換えで産生してもよい。
【０２４１】
変異体
本明細書において使用されるように、用語「変異体」は、特異的に同定される配列と異なるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を指し、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失し、置換され、または付加されている。変異体は、自然発生対立遺伝子変異体または非自然発生変異体であってもよい。変異体は、同じ種または他の種に由来するものでもよく、ホモログ、パラログ、およびオーソログを包含してもよい。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同じまたはそれに類似している生物学的活性を有する。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関しての用語「変異体」は、本明細書において定義されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドのすべての形態を包含する。
【０２４２】
ポリヌクレオチド変異体
変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも５２％、より好ましくは少なくとも５３％、より好ましくは少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６１％、より好ましくは少なくとも６２％、より好ましくは少なくとも６３％、より好ましくは少なくとも６４％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも６７％、より好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも６９％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の、特定のポリヌクレオチド配列に対する同一性を示す。同一性は、少なくとも２０のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも５０のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも１００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも２００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも３００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも４００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも５００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも６００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも７００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも８００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも９００のヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも１０００のヌクレオチド位置、最も好ましくは全長の特定のポリヌクレオチド配列の比較ウィンドウにわたって見つけられる。
【０２４３】
ポリヌクレオチド配列同一性は、以下の方法において決定することができる。対象ポリヌクレオチド配列は、ｂｌ２ｓｅｑ（Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden（1999）, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）におけるＢＬＡＳＴＮ（BLASTプログラムスイート、バージョン2.2.5[2002年11月]からの）を使用して、候補ポリヌクレオチド配列と比較され、これは、ＮＣＢＩから公的に入手可能である（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）。低複雑性部分のフィルタリングをオフにするべき以外は、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターが利用される。
【０２４４】
ポリヌクレオチド配列の同一性は、以下のｕｎｉｘコマンド系パラメーターを使用して調べることができる。
【０２４５】
ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１  −ｊ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２  −Ｆ  Ｆ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ
【０２４６】
パラメーター−Ｆ  Ｆは、低複雑性セクションのフィルタリングをオフにする。パラメーター−ｐは、対の配列に適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、行「Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝」において同一のヌクレオチドの数および割合の両方で配列同一性を報告する。
【０２４７】
ポリヌクレオチド配列同一性はまた、グローバル配列アライメントプログラムを使用して、候補および対象ポリヌクレオチド配列の間のオーバーラップの全長にわたって計算することができる（例えばNeedleman, S. B. and Wunsch, C. D.（1970）J. Mol. Biol. 48, 443-453）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムの完全な実装は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／から得ることができるＥＭＢＯＳＳパッケージにおけるｎｅｅｄｌｅプログラムにおいて見つけられる（Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277）。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサーバーもまた、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で、オンラインで、２つの配列間のＥＭＢＯＳＳ−ｎｅｅｄｌｅグローバルアライメントを実行するための設備を提供する。
【０２４８】
その代わりに、ターミナルギャップにペナルティーを課すことなく２つの配列の最適なグローバルアライメントを計算するＧＡＰプログラムを、配列同一性を計算するために使用することができる。ＧＡＰは、以下の論文において記載されている：Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０，２２７−２３５。
【０２４９】
配列同一性はまた、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用するＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩバージョン９．０を使用して比較される配列をアライメントし（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 24, 4876-4882）、次いで、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩバージョン９．０を使用して、アライメントされた配列の間の配列同一性の割合を計算すること（Sept 02, 2003（著作権）1994-2003 InforMax, licenced to Invitrogen）によって計算することができる。
【０２５０】
本発明のポリヌクレオチド変異体はまた、それらの配列の機能的同等性を保存する可能性が高い、１つまたは複数の特異的に同定される配列に対して類似性を示し、偶然によって生じたと合理的に期待することができないものをも包含する。ポリヌクレオチドに関してのそのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのＢＬＡＳＴプログラムスイート（バージョン2.2.5[2002年11月]）から公的に入手可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定することができる。
【０２５１】
ポリヌクレオチド配列の類似性は、以下のｕｎｉｘコマンド系パラメーターを使用して調べることができる。
【０２５２】
ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１  −ｊ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２  −Ｆ  Ｆ  −ｐ  ｔｂｌａｓｔｘ
【０２５３】
パラメーター−Ｆ  Ｆは、低複雑性セクションのフィルタリングをオフにする。パラメーター−ｐは、対の配列に適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列の間の類似性の領域を見つけ、それぞれのそのような領域について、ランダム配列を含有する固定参照サイズのデータベースにおいて、偶然、そのようなマッチを認識することを期待することができる期待回数である「Ｅ値」を報告する。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムにおいてデフォルトで設定されている。１よりもはるかに小さなＥ値について、Ｅ値は、およそ、そのようなランダムマッチの可能性となる。
【０２５４】
変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、特異的に同定される配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０−１０未満、より好ましくは１×１０−２０未満、より好ましくは１×１０−３０未満、より好ましくは１×１０−４０未満、より好ましくは１×１０−５０未満、より好ましくは１×１０−６０未満、より好ましくは１×１０−７０未満、より好ましくは１×１０−８０未満、より好ましくは１×１０−９０未満、最も好ましくは１×１０−１００未満のＥ値を示す。
【０２５５】
その代わりに、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、特定のポリヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズする。
【０２５６】
用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」またその文法上の等価物は、規定される温度条件および塩濃度下で、標的ポリヌクレオチド分子（サザンブロットまたはノーザンブロットなどのＤＮＡブロットまたはＲＮＡブロット上に固定された標的ポリヌクレオチド分子など）にハイブリダイズするポリヌクレオチド分子の能力を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力は、それほどストリンジェントでない条件下で最初にハイブリダイズし、次いで、望ましいストリンジェンシーまでストリンジェンシーを増加させることによって決定することができる。
【０２５７】
長さが約１００塩基よりも大きなポリヌクレオチド分子に関して、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然の二重鎖の融解温度（Tm）より低い２５〜３０℃以下（例えば１０℃）である（一般に、Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing,を参照されたい）。約１００塩基よりも大きなポリヌクレオチド分子についてのＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋）によって計算することができる。（Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390）。長さが１００を超える塩基のポリヌクレオチドについての典型的なストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液中での予洗；一晩、６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳでのハイブリダイズ；その後に続いて、６５℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でのそれぞれ３０分間の２回の洗浄および６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でのそれぞれ３０分間の２回の洗浄などのハイブリダイゼーション条件となる。
【０２５８】
１００塩基未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関して、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより低い５〜１０℃である。平均では、１００ｂｐ未満の長さのポリヌクレオチド分子のＴｍは、約（500/オリゴヌクレオチド長）℃ずつ低下する。
【０２５９】
ペプチド核酸（PNA）として知られているＤＮＡ模倣物に関して（Nielsen et al., Science. 1991 Dec 6;254（5037）:1497-500）、Ｔｍ値は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドについてよりも高く、Ｇｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｎｏｖ  １；２６（２１）：５００４−６において記載される式を使用して計算することができる。１００塩基未満の長さを有するＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドについての例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより低い５〜１０℃である。
【０２６０】
発現されるタンパク質をコードする本発明の構築物におけるものなどの変異体ポリヌクレオチドはまた、特定の配列と異なるが、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに類似した活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない配列変化は、「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、同じアミノ酸についての他のコドンは、例えば、特定の宿主生物におけるコドン発現を最適化するために、当技術分野に認識される技術によって変化させてもよい。
【０２６１】
生物学的活性を著しく変化させることなく、コードされるポリペプチド配列において１つまたはいくつかのアミノ酸の保存的置換をもたらすポリヌクレオチド配列変化もまた企図される。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するための方法を知っているであろう（例えばBowie et al., 1990, Science 247, 1306を参照されたい）。
【０２６２】
コードされるポリペプチド配列におけるサイレント変異および保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、以前に記載されるｔｂｌａｓｔｘアルゴリズムを介してＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのＢＬＡＳＴプログラムスイート（バージョン2.2.5[2002年11月]）から公的に入手可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定することができる。
【０２６３】
ポリペプチド変異体
ポリペプチドに関しての用語「変異体」は、自然発生のポリペプチド、組換えで産生されたポリペプチド、および合成で産生されたポリペプチドを包含する。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも５２％、より好ましくは少なくとも５３％、より好ましくは少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６１％、より好ましくは少なくとも６２％、より好ましくは少なくとも６３％、より好ましくは少なくとも６４％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも６７％、より好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも６９％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を、本発明の配列に対して示す。同一性は、少なくとも２０のアミノ酸位置、好ましくは少なくとも５０のアミノ酸位置、より好ましくは少なくとも１００のアミノ酸位置、最も好ましくは本発明のポリペプチドの全長の比較ウィンドウにわたって見つけられる。
【０２６４】
ポリペプチド配列同一性は、以下の方法で決定することができる。対象ポリペプチド配列は、ｂｌ２ｓｅｑにおけるＢＬＡＳＴＰ（BLASTプログラムスイート、バージョン2.2.5[2002年11月]からの）を使用して、候補ポリペプチド配列と比較され、これは、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）から公的に入手可能である。低複雑性領域のフィルタリングをオフにするべき以外は、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターが利用される。
【０２６５】
ポリペプチド配列同一性はまた、グローバル配列アライメントプログラムを使用して、候補および対象ポリヌクレオチド配列の間のオーバーラップの全長にわたって計算することができる。上記で論じたＥＭＢＯＳＳ−ｎｅｅｄｌｅ（http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/で入手可能）およびＧＡＰ（Huang, X.（1994）On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.）もまた、ポリペプチド配列同一性を計算するのに適したグローバル配列アライメントプログラムである。
【０２６６】
配列同一性はまた、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用するＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩバージョン９．０を使用して比較されるように配列をアライメントし（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 24, 4876-4882）、次いで、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩバージョン９．０を使用して、アライメントされたポリペプチド配列の間の配列同一性の割合を計算すること（Sept 02, 2003（著作権）1994-2003 InforMax, licenced to Invitrogen）によって計算することができる。
【０２６７】
本発明のポリペプチド変異体はまた、それらの配列の機能的同等性を保存する可能性が高い、１つまたは複数の特異的に同定される配列に対して類似性を示し、偶然によって生じたと合理的に期待することができないものをも包含する。ポリペプチドに関してのそのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのＢＬＡＳＴプログラムスイート（バージョン2.2.5[2002年11月]）から公的に入手可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定することができる。ポリペプチド配列の類似性は、以下のｕｎｉｘコマンド系パラメーターを使用して調べることができる。
【０２６８】
ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１  −ｊ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２  −Ｆ  Ｆ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ
【０２６９】
変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、特異的に同定される配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０−６未満、より好ましくは１×１０−９未満、より好ましくは１×１０−１２未満、より好ましくは１×１０−１５未満、より好ましくは１×１０−１８未満、より好ましくは１×１０−２１未満、より好ましくは１×１０−３０未満、より好ましくは１×１０−４０未満、より好ましくは１×１０−５０未満、より好ましくは１×１０−６０未満、より好ましくは１×１０−７０未満、より好ましくは１×１０−８０未満、より好ましくは１×１０−９０未満、最も好ましくは１×１０−１００のＥ値を示す。
【０２７０】
パラメーター−Ｆ  Ｆは、低複雑性セクションのフィルタリングをオフにする。パラメーター−ｐは、対の配列に適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列の間の類似性の領域を見つけ、それぞれのそのような領域について、ランダム配列を含有する固定参照サイズのデータベースにおいて、偶然、そのようなマッチを認識することを期待することができる期待回数である「Ｅ値」を報告する。１よりもはるかに小さなＥ値について、これは、およそ、そのようなランダムマッチの可能性となる。
【０２７１】
その生物学的活性を著しく変化させることのない、記載されるポリペプチド配列において１つまたはいくつかのアミノ酸の保存的置換もまた、本明細書において含まれる。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法を知っているであろう（例えばBowie et al., 1990, Science 247, 1306を参照されたい）。
【０２７２】
構築物、ベクター、およびその構成成分
用語「遺伝子構築物」は、ポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指し、これは、その中に、これらに限定されないが、ｃＤＮＡ分子などの別のポリヌクレオチド分子が挿入されていてもよい（挿入ポリヌクレオチド分子）。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、任意選択により、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な要素を含むプロモーターポリヌクレオチドを含有していてもよい。挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞に由来するものでもよく、または異なる細胞もしくは生物に由来するものでもよく、および／または合成ポリヌクレオチドもしくは組換えポリヌクレオチドであってもよい。宿主細胞の内部に入ると、遺伝子構築物は、宿主染色体ＤＮＡ中に組み込まれ得る。遺伝子構築物は、ベクターに連結することができる。
【０２７３】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指し、これは、宿主細胞に遺伝子構築物を輸送するために使用される。ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの少なくとも１つのさらなる宿主系において複製が可能であり得る。
【０２７４】
用語「発現構築物」は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、任意選択により、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な要素を含む遺伝子構築物を指す。
【０２７５】
発現構築物は、典型的には、５’から３’方向に、
ａ）構築物が形質転換される宿主細胞において機能的なプロモーター、
ｂ）発現されるポリヌクレオチド、および
ｃ）構築物が形質転換される宿主細胞において機能的なターミネーター
を含む。
【０２７６】
用語「コード領域」または「オープンリーディングフレーム」（ORF）は、適切な調節配列の制御下で、転写産物および／またはポリペプチドを産生することができる、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コード配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳終止コドンの存在によって同定される。遺伝子構築物に挿入される場合、それが、プロモーター配列およびターミネーター配列に対して作動可能に連結される場合、「コード配列」は発現することができる。
【０２７７】
用語「作動可能に連結される」は、発現される配列が、プロモーター、組織特異的調節エレメント、時間的な調節エレメント、エンハンサー、抑制因子、およびターミネーターを含む調節エレメントの制御下に置かれることを意味する。
【０２７８】
用語「非コード領域」は、翻訳開始部位の上流および翻訳終止部位の下流にある非翻訳配列を含む。これらの配列はまた、それぞれ、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲとも呼ばれる。これらの配列は、転写開始および終結ならびに翻訳効率の調節に必要とされるエレメントを含んでいてもよい。用語「非コード」はまた、ゲノムクローン内のイントロン配列をも含む。
【０２７９】
ターミネーターは、転写を終結する配列であり、翻訳配列の下流の遺伝子の３’非翻訳末端において見つけられる。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性の重要な決定因子であり、いくつかの場合において、空間的な調節機能を有することが分かった。
【０２８０】
用語「プロモーター」は、細胞または無細胞転写系において、プロモーターが作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を調節するまたは駆動することができるポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、転写開始部位およびＴＡＴＡボックスなどの保存ボックスおよび転写因子が結合するモチーフを特定するシスイニシエーターエレメントを含んでいてもよい。
【０２８１】
ポリヌクレオチドを単離するまたは産生するための方法
本発明のポリヌクレオチド分子は、当業者らに知られている様々な技術を使用することによって単離することができる。例として、そのようなポリヌクレオチドは、参照によって本明細書において組み込まれるＭｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．１９９４  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒにおいて記載されるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用を通して単離することができる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド配列に由来する、本明細書において規定されるプライマーを使用して増幅することができる。
【０２８２】
本発明のまたは本発明の方法において有用なポリヌクレオチドを単離するためのさらなる方法は、ハイブリダイゼーションプローブとして本明細書において記載されるポリヌクレオチドのすべてまたは部分の使用を含む。ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜などの固体支持体上に固定されたポリヌクレオチドに標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズするための技術を、ゲノムをスクリーニングするために使用することができる。例示的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、５．０×ＳＳＣ、０．５％硫酸ドデシルナトリウム、１×デンハルト溶液中６５℃での２０時間のハイブリダイゼーション、１．０×ＳＳＣ、１％（w/v）硫酸ドデシルナトリウム中での洗浄（５５℃でのそれぞれ20分間の3回の洗浄）、および任意選択により、６０℃での、０．５×ＳＳＣ、１％（w/v）硫酸ドデシルナトリウム中での１回洗浄（20分間）である。任意選択のさらなる洗浄（20分間）は、６０℃で、０．１×ＳＳＣ、１％（w/v）硫酸ドデシルナトリウムの条件下で行うことができる。
【０２８３】
本発明のポリヌクレオチド断片は、制限エンドヌクレアーゼ消化、オリゴヌクレオチド合成、およびＰＣＲ増幅などの当技術分野においてよく知られている技術によって産生してもよい。
【０２８４】
部分的なポリヌクレオチド配列は、対応する全長ポリヌクレオチド配列および／または全遺伝子／および／またはプロモーターを同定するための、当技術分野においてよく知られている方法において使用することができる。そのような方法は、ＰＣＲベースの方法、５’ＲＡＣＥ（Frohman MA, 1993, Methods Enzymol. 218: 340-56）およびハイブリダイゼーションベースの方法、コンピューター／データベースベースの方法を含む。さらに、例として、インバースＰＣＲは、知られている領域に基づくプライマーから始めて、本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列の側面に位置する未知の配列の獲得を可能にする（参照によって本明細書において組み込まれるTriglia et al., 1998, Nucleic Acids Res 16, 8186）。方法は、ポリヌクレオチドの知られている領域において適した断片を生成するためにいくつかの制限酵素を使用する。次いで、断片は、分子内ライゲーションによって環状化され、ＰＣＲ鋳型として使用される。異なるプライマーは、知られている領域から設計される。プロモーターおよびフランキング配列はまた、メーカーの指示に従ってＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）（Clontech、Mountain View、California）キットを使用してＰＣＲ遺伝子ウォーキングによって単離されてもよい。全長クローンを物理的に組み立てるために、標準的な分子生物学アプローチを利用することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987）。
【０２８５】
その種に由来する配列（複数可）でそのような植物を形質転換することは、特定の種からトランスジェニック植物を産生する場合、有益となり得る。その利益により、トランスジェニック生物を生成する際の、異種間形質転換に関する公衆の懸念を和らげることができる。さらに、遺伝子のダウンレギュレーションが望ましい結果である場合、発現の低下が望ましい植物と同一の（または少なくとも高度に類似した）配列を利用することが必要となり得る。とりわけこれらの理由で、いくつかの異なる植物種において特定の遺伝子のオーソログを同定し、単離することができることは望ましい。変異体（オーソログを含む）は、記載される方法によって同定することができる。
【０２８６】
変異体を同定するための方法
物理的方法
変異体ポリヌクレオチドは、ＰＣＲベースの方法を使用して同定することができる（Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser）。
【０２８７】
その代わりに、当業者らによく知られているライブラリースクリーニング法を使用することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987）。プローブ配列の変異体を同定する場合、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーは、典型的には、正確な配列マッチが求められる場合と比べて低下するであろう。
【０２８８】
コンピューターベースの方法
ポリヌクレオチド変異体およびポリペプチド変異体はまた、配列データベースを検索するために公的なドメイン配列アライメントアルゴリズムおよび配列類似性検索ツールを使用して、当業者らによく知られているコンピューターベースの方法によって同定することができる（公的なドメインデータベースは、Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR、および他を含む）。オンラインリソースの例については、例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：１−１０  ａｎｄ  １１−１６，２００１を参照されたい。類似性検索は、分析される配列（つまりクエリー配列）と比較するために、標的配列を検索し、アライメントする。配列比較アルゴリズムは、アライメントのそれぞれに対して全体的なスコアを割り当てるためにスコアリングマトリックスを使用する。
【０２８９】
配列データベースにおける変異体を同定するのに有用なプログラムの例示的なファミリーは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、およびｔＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴプログラムスイート（バージョン2.2.5[2002年11月]）であり、これは、（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（NCBI）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ、Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４  ＵＳＡから公的に入手可能である。ＮＣＢＩサーバーはまた、多くの公的に入手可能な配列データベースをスクリーニングするためのプログラムを使用するための設備をも提供する。ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列を比較する。ＢＬＡＳＴＰは、タンパク質配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較する。ＢＬＡＳＴＸは、タンパク質配列データベースに対して、すべてのリーディングフレームにおいて翻訳されたヌクレオチドクエリー配列を比較する。ｔＢＬＡＳＴＮは、すべてのリーディングフレームにおいて動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対してタンパク質クエリー配列を比較する。ｔＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳に対して、ヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳を比較する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトパラメーターで使用することもでき、またはスクリーニングを厳密にするのに必要とするとき、パラメーターを変更することもできる。
【０２９０】
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＢＬＡＳＴＸを含むアルゴリズムのＢＬＡＳＴファミリーの使用は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７の刊行物において記載されている。
【０２９１】
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、ｔＢＬＡＳＴＸ、または類似するアルゴリズムによって産生される、クエリー配列による１つまたは複数のデータベース配列に対する「ヒット」は、配列の類似した部分をアライメントし、同定する。ヒットは、類似性の程度および配列オーバーラップの長さの順に配置される。データベース配列に対するヒットは、一般に、クエリー配列の配列長のごく一部分にわたるオーバーラップに相当する。
【０２９２】
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、およびｔＢＬＡＳＴＸアルゴリズムはまた、アライメントに対する「期待」値をも産生する。期待値（E）は、ランダムな隣接配列を含有する同じサイズのデータベースを検索する場合、偶然認識することが「期待され」得るヒットの数を示す。期待値は、データベースに対するヒットが真の類似性を示すかどうかを決定することについての有意閾値として使用される。例えば、ポリヌクレオチドヒットに対して割り当てられた０．１のＥ値は、スクリーニングされたデータベースのサイズのデータベースにおいて、類似したスコアを有する配列のアライメント部分に対して、単に偶然、０．１のマッチを認識することが期待され得ることを意味すると解釈される。アライメント部分およびマッチ部分に対して０．０１またはそれ未満のＥ値を有する配列について、そのデータベースにおいて偶然、マッチを見つける可能性は、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、またはｔＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使用して、１％またはそれ未満となる。
【０２９３】
関連する配列の群の複数配列アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J.（1994）CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html）またはＴ−ＣＯＦＦＥＥ（Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol.（2000）302: 205-217））または累進ペアワイズアライメントを使用するＰＩＬＥＵＰ（Feng and Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 25, 351）を用いて実行することができる。パターン認識ソフトウェアアプリケーションは、モチーフまたはシグネチャー配列（signature sequence）を見つけるために利用可能である。例えば、ＭＥＭＥ（Multiple Em for Motif Elicitation）は、配列のセットにおいてモチーフおよびシグネチャー配列を見つけ、ＭＡＳＴ（Motif Alignment and Search Tool）は、クエリー配列において類似したまたは同じモチーフを同定するためにこれらのモチーフを使用する。ＭＡＳＴの結果は、適切な統計データおよび見つけられたモチーフの視覚的な全体図と共に一連のアライメントとして提供される。ＭＥＭＥおよびＭＡＳＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏで開発された。
【０２９４】
ＰＲＯＳＩＴＥ（Bairoch and Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583; Hofmann et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27, 215）は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列から翻訳された、特徴づけられていないタンパク質の機能を同定するための方法である。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース（www.expasy.org/prosite）は、タンパク質の知られているファミリーに新しい配列を割り当てるために、または（1つまたは複数の）どの知られているドメインが配列中に存在するかを決定するために、生物学的に重要なパターンおよびプロフィールを含有し、適切なコンピューターツールと共にそれを使用することができるように設計されている（Falquet et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, 235）。Ｐｒｏｓｅａｒｃｈは、所与の配列パターンまたはシグネチャーを用いてＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースおよびＥＭＢＬデータベースを検索することができるツールである。
【０２９５】
変異体の機能
本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの濃縮型タンニン産生の誘導における機能は、本明細書において提供される方法を使用して試験することができる。特に、実施例７を参照されたい。
【０２９６】
構築物およびベクターを産生するための方法
本発明の遺伝子構築物は、１つまたは複数の、本発明ポリヌクレオチド配列および／または開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、例えば細菌、菌類、昆虫、哺乳動物、または特に植物の生物を形質転換するのに有用であり得る。本発明の遺伝子構築物は、本明細書において定義される発現構築物を含むように意図される。
【０２９７】
遺伝子構築物およびベクターを産生および使用するための方法は、当技術分野においてよく知られており、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７）において記載されている。
【０２９８】
構築物およびベクターを含む宿主細胞を産生するための方法
本発明は、本発明の遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば細菌、菌類、昆虫、哺乳動物、または植物の生物に由来するものでもよい。
【０２９９】
本発明の、発現構築物などの遺伝子構築物を含む宿主細胞は、ポリペプチドの組換え産生について、当技術分野においてよく知られている方法において有用である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987）。そのような方法は、本発明のポリペプチドの発現に適したまたはそれを促す条件の適切な培地における宿主細胞の培養を含んでいてもよい。発現組換えポリペプチドは、任意選択により培養物中に分泌させることができ、次いで、当技術分野においてよく知られている方法によって培地、宿主細胞、または培養培地から分離することができる（例えばDeutscher, Ed, 1990, Methods in Enzymology, Vol 182, Guide to Protein Purification）。
【０３００】
構築物およびベクターを含む植物細胞および植物を産生するための方法
本発明は、本発明の遺伝子構築物を含む植物細胞およびポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させるように改変された植物細胞をさらに提供する。そのような細胞を含む植物もまた、本発明の態様を形成する。
【０３０１】
ポリヌクレオチドを用いて、植物細胞、植物、およびその部分を形質転換するための方法は、Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．３６５；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｕｒｇ，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ．；およびＧｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｎｕａｌ．Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄ．Ｐｕｂ．Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ．において記載されている。形質転換技術を含むトランスジェニック植物の総説は、Ｇａｌｕｎ  ａｎｄ  Ｂｒｅｉｍａｎ，１９９７，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎにおいて提供される。
【０３０２】
以下は、以下の植物種を遺伝的に形質転換するために使用することができる遺伝子形質転換プロトコールを開示する代表的な刊行物である：イネ（Alam et al., 1999, Plant Cell Rep. 18, 572）；リンゴ（Yao et al., 1995, Plant Cell Reports 14, 407-412）；トウモロコシ（米国特許第５，１７７，０１０号および第５，９８１，８４０号）；コムギ（Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep. 15, 1996, 877）；トマト（米国特許第５，１５９，１３５号）；ジャガイモ（Kumar et al., 1996 Plant J. 9, : 821）；キャッサバ（Li et al., 1996 Nat. Biotechnology 14, 736）；レタス（Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep. 6, 439）；タバコ（Horsch et al., 1985, Science 227, 1229）；ワタ（米国特許第５，８４６，７９７号および第５，００４，８６３号）；多年生のドクムギ（Bajaj et al., 2006, Plant Cell Rep. 25, 651）；イネ科草本（米国特許第５，１８７，０７３、第６．０２０，５３９号）；ペパーミント（Niu et al., 1998, Plant Cell Rep. 17, 165）；柑橘類の植物（Pena et al., 1995, Plant Sci.104, 183）；カラウェー（Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, 39）；バナナ（米国特許第５，７９２，９３５号）；ダイズ（米国特許第５，４１６，０１１号；第５，５６９，８３４号；第５，８２４，８７７号；第５，５６３，０４４５５号、および第５，９６８，８３０号）；パイナップル（米国特許第５，９５２，５４３号）；ポプラ（米国特許第４，７９５，８５５号）；概して単子葉植物（米国特許第５，５９１，６１６号および第６，０３７，５２２号）；アブラナ（米国特許第５，１８８，９５８号；第５，４６３，１７４号、および第５，７５０，８７１号）；ならびに穀類（米国特許第６，０７４，８７７号）；セイヨウナシ（Matsuda et al., 2005, Plant Cell Rep. 24（1）:45-51）；サクラ属（Ramesh et al., 2006, Plant Cell Rep. 25（8）:821-8; Song and Sink 2005, Plant Cell Rep. 2006; 25（2）:117-23; Gonzalez Padilla et al., 2003, Plant Cell Rep. 22（1）:38-45）；イチゴ（Oosumi et al., 2006, Planta.; 223（6）:1219-30; Folta et al., 2006, Planta. 2006 Apr 14; PMID: 16614818）、バラ（Li et al., 2003, Planta. 218（2）:226-32）、キイチゴ（Graham et al., 1995, Methods Mol Biol. 1995;44:129-33）、クローバー（Voisey et al., 1994, Plant Cell Reports 13: 309-314、ならびにＭｅｄｉｃａｇｏ（Bingham,1991, Crop Science 31: 1098）。他の種の形質転換もまた、本発明によって企図される。他の種の形質転換に適した方法およびプロトコールは、科学文献において入手可能である。
【０３０３】
植物の遺伝子操作のための方法
遺伝的に植物を操作するための多くの戦略が、入手可能である（例えばBirch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, 297）。例えば、戦略は、それが通常発現される植物細胞、器官において、および／もしくは特定の発育ステージでポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を増加させるようにまたはそれが通常発現されない細胞、組織、器官において、および／もしくは特定の発育ステージでポリヌクレオチド／ポリペプチドを異所的に発現するように設計することができる。戦略はまた、環境刺激などの外部刺激に応じてポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を増加させるように設計することができる。環境刺激は、機械的（食植性活性など）、脱水、塩分、および熱ストレスなどの環境ストレスを含んでいてもよい。発現ポリヌクレオチド／ポリペプチドは、形質転換される植物種に由来するものでもよく、または異なる植物種に由来するものでもよい。
【０３０４】
形質転換戦略は、それが通常発現される植物細胞、組織、器官において、もしくは特定の発育ステージでポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を低下させるようにまたは外部刺激に応じてポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を低下させるように設計することができる。そのような戦略は、遺伝子サイレンシング戦略として知られている。
【０３０５】
トランスジェニック植物における遺伝子の発現のための遺伝子構築物は、典型的には、１つまたは複数のクローニングポリヌクレオチドの発現を駆動するための、本発明のプロモーターポリヌクレオチドなどのプロモーター、ターミネーター、および形質転換植物における遺伝子構築物の存在を検出するための選択マーカー配列を含む。
【０３０６】
植物形質転換遺伝子構築物において一般に使用される例示的なターミネーターは、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）３５Ｓターミネーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼターミネーターまたはオクトピンシンターゼターミネーター、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｚｉｎ遺伝子ターミネーター、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼターミネーター、およびＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  ＰＩ−ＩＩ  ターミネーターを含む。
【０３０７】
植物形質転換において一般に使用される選択マーカーは、カナマイシン抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（NPT II）、スペクチノマイシン抵抗性およびストレプトマイシン抵抗性を付与するａａｄＡ遺伝子、Ｉｇｎｉｔｅ（AgrEvo）抵抗性およびＢａｓｔａ（Hoechst）抵抗性のためのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（bar遺伝子）、ならびにハイグロマイシン抵抗性のためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hpt）を含む。
【０３０８】
植物および植物組織においてプロモーター発現分析に使用できるレポーター遺伝子（宿主に対して外来性の活性、通常、酵素活性および／または可視シグナル（例えばルシフェラーゼ、GUS、GFP）を発現するコード配列）を含む遺伝子構築物の使用も企図される。レポーター遺伝子の文献は、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０３，２０９およびＳｃｈｒｏｔｔ，１９９５，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Potrykus, T., Spangenberg. Eds）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ．Ｂｅｒｌｉｎｅ，ｐｐ．３２５−３３６において総説されている。
【０３０９】
遺伝子サイレンシング戦略は、コードポリペプチドの発現を達成する遺伝子自体または調節エレメントに焦点を置いてもよい。「調節エレメント」は、できるだけ広い意味で本明細書で使用され、所望の遺伝子と相互作用する他の遺伝子を含む。
【０３１０】
ポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を減少させるまたはサイレンシングするように設計された遺伝子構築物は、ポリヌクレオチドのアンチセンスコピーを含んでいてもよい。そのような構築物において、ポリヌクレオチドは、プロモーターおよびターミネーターに関してアンチセンスの向きに置かれる。
【０３１１】
「アンチセンス」ポリヌクレオチドは、産生された転写物が遺伝子のｍＲＮＡの転写物に対して相補的になるように、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセグメントを反転することによって得られる。例えば、
５’ＧＡＴＣＴＡ３’（コード鎖）３’ＣＴＡＧＡＴ５’（アンチセンス鎖）
３’ＣＵＡＧＡＵ５’ｍＲＮＡ  ５’ＧＡＵＣＵＣＧ３’アンチセンスＲＮＡ
【０３１２】
遺伝子サイレンシング用に設計された遺伝子構築物はまた、反転反復を含んでいてもよい。「反転反復」は、反復され、反復の後半が相補鎖にある配列である。例えば、
５’−ＧＡＴＣＴＡ．．．．．．．．．ＴＡＧＡＴＣ−３’
３’−ＣＴＡＧＡＴ．．．．．．．．．ＡＴＣＴＡＧ−５’
【０３１３】
形成された転写物は、相補的塩基対形成を受けて、ヘアピン構造を形成し得る。通常、反復領域の間の少なくとも３〜５ｂｐのスペーサーが、ヘアピン形成を可能にするために必要とされる。
【０３１４】
別のサイレンシングアプローチは、ｍｉＲＮＡに等価な転写物を標的とする小さなアンチセンスＲＮＡの使用を含む（Llave et al., 2002, Science 297, 2053）。本発明のポリヌクレオチドに対応するそのような小さなアンチセンスＲＮＡの使用が明らかに企図される。
【０３１５】
本明細書において使用される用語遺伝子構築物はまた、小さなアンチセンスＲＮＡおよび遺伝子サイレンシングを達成するのに有用な他のそのようなポリヌクレオチドを含む。
【０３１６】
本明細書において定義される発現構築物を用いる形質転換はまた、センスサプレッションとして知られているプロセスを通して遺伝子サイレンシングをもたらすことができる（例えばNapoli et al., 1990, Plant Cell 2, 279; de Carvalho Niebel et al., 1995, Plant Cell, 7, 347）。いくつかの場合において、センスサプレッションは、全体コード配列または部分的なコード配列の過剰発現を含んでいてもよいが、イントロンまたは５’もしくは３’非翻訳領域（UTR）などの、遺伝子の非コード領域の発現を含んでいてもよい。キメラ部分的センス構築物は、複数の遺伝子を協調的にサイレンシングするために使用することができる（Abbott et al., 2002, Plant Physiol. 128（3）: 844-53; Jones et al., 1998, Planta 204: 499-505）。本発明のプロモーターと作動可能に連結された配列の発現をサイレンシングするためのそのようなセンスサプレッション戦略の使用も企図される。
【０３１７】
遺伝子サイレンシング用に設計された遺伝子構築物におけるポリヌクレオチド挿入物は、プロモーターおよび／またはイントロンおよび／または５’もしくは３’ＵＴＲ配列または対応する遺伝子などのコード配列および／または非コード配列に対応し得る。
【０３１８】
他の遺伝子サイレンシング戦略は、優性ネガティブアプローチおよびリボザイム構築物の使用を含む（McIntyre, 1996, Transgenic Res, 5, 257）。
【０３１９】
転写前サイレンシングは、遺伝子自体またはその調節エレメントの突然変異を通して引き起こすことができる。そのような突然変異は、点突然変異、フレームシフト、挿入、欠失、および置換を含んでいてもよい。
【０３２０】
植物
用語「植物」は、植物全体または植物の任意の一部分、栄養繁殖体、および植物の子孫を含むように意図される。
【０３２１】
本明細書において使用される用語「子孫」は、本発明の細胞またはトランスジェニック植物から得られたまたはそれに由来する任意の細胞、植物、またはその一部分を指す。したがって、子孫という用語は、種子、種子、植物、もしくはその一部分から得られるまたは植物組織培養技術もしくはクローニング技術に由来する植物を含むが、これらに限定されない。
【０３２２】
用語「栄養繁殖体」は、球根およびさし木を含む、有性または無性の再生または増殖において使用できる植物の任意の一部分を意味する。
【０３２３】
「トランスジェニック」または「形質転換」植物は、遺伝子操作または形質転換の結果として、新しい遺伝物質を含有する植物を指す。新しい遺伝物質は、生じるトランスジェニック植物または形質転換植物と同じ種または異なる種の植物に由来するものでもよい。形質転換植物は、新しい遺伝物質で安定してまたは一時的に形質転換された植物を含む。
【０３２４】
本発明の植物は、成長させ、自家受粉させてもよくまたは異なる植物種と交雑させてもよく、望ましい表現型の特徴を有する、生じるハイブリッドを同定することができる。２またはそれ以上の世代を成長させてもよい。そのような標準的な育種アプローチから生じる植物もまた、本発明の一部を形成する。
【０３２５】
これから本発明を、以下の非限定的実施例を参照して例示する。
【実施例１】
【０３２６】
本発明のＭＹＢ１４遺伝子／核酸／タンパク質の同定および発現プロファイルの分析。
緒言
マメ科植物種のＭＹＢドメインに対して設計されたプライマーを使用して、本出願人は、様々なＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種から単離されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ（gDNA）によって、新規ＭＹＢ転写因子（TF）をコードする配列を増幅させた。これらの種は、成熟葉組織中にＣＴを蓄積するその能力が異なる。シロツメクサは、葉組織中でＣＴ遺伝子を発現しないので、本出願人らは、代替戦略を使用し、これは、葉の寿命にわたって葉組織のすべての細胞中にＣＴを確かに蓄積する、近縁のＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種（T.arvense;T affine）から、発現されたＭＹＢ  ＴＦを単離することを可能にした。これは、様々なＴｒｉｆｏｌｉｕｍの葉型における；すなわち、（ａ）ＣＴ遺伝子発現が、葉の出芽前の分裂組織発生の間に、葉トリコームに制限されている、シロツメクサ（T. repens）葉組織内；（ｂ）その全寿命の間に葉のほとんどの細胞内に見出される（トリコーム毛を除く）近縁種（T.arvense）内；（ｃ）ＣＴ生合成が既に終わっているシロツメクサ成熟葉組織で、ＭＹＢ  ＴＦの差次的発現パターンを調査することによって実現した。そのような特異的な時間的および空間的な発現は、ＣＴ分岐経路に特異的な、様々なＭＹＢ  ＴＦによる差次的調節を必要とする。各葉型に由来するＭＹＢ  ＴＦを比較することにより、ＣＴ生合成以外の機能を有する共通のＭＹＢ要因を排除した。残りの単離ＭＹＢ  ＴＦを分析することにより、ＣＴを蓄積する組織に独特のＭＹＢ  ＴＦを同定することが可能になった。
【０３２７】
ＰＣＲ産物を配列決定して、いくつかのＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種から以前に同定されていないＭＹＢ  ＴＦを同定した。これらのＭＹＢ遺伝子の全長配列決定により、公開されたＡｔＴＴ２配列（NP_198405）と比較した場合、様々なＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種に由来する遺伝子中の塩基のいくつかの欠失および挿入の存在を含む、高度に異なったタンパク質コードが明らかになった（図７および８）。ｃＤＮＡ配列を翻訳することにより、このＭＹＢ  ＴＦによってコードされるタンパク質も、相当な数のアミノ酸欠失、挿入、および交換を有することが明らかになった（図９）。本出願人らは、この遺伝子をＴａＭＹＢ１４と命名した。２つの異なるＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種に由来する全長ｇＤＮＡ配列を分析すると、すべてのＴａＭＹＢ１４アイソフォーム／対立遺伝子において、様々なサイズの３つのエキソンおよび２つのイントロンが存在することが明らかになった（図１０〜１２）。
【０３２８】
４つのＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種に由来する様々な遺伝子型を代表するいくつかのアクセションからの種子をそれぞれガラス温室内で成長させ、ＣＴの存在または非存在を、ＤＭＡＣＡ染色を使用して葉中で決定した。ＴａＭＹＢ１４に特異的なプライマーを設計し、様々な組織中での転写レベルをＰＣＲによって決定した。ＴａＭＹＢ１４の発現は、葉組織中のＣＴ蓄積と相関した。その発現は、ＣＴを含まない組織では検出不可能であった。ＴａＭｙｂ１４は、ＣＴを活発に蓄積している組織中で非常に高度に発現され、ＣＴ生合成に特異的に関与する２つの酵素、すなわちＡＮＲおよびＬＡＲの検出可能な発現と一致した。
【０３２９】
シロツメクサ中のＴａＭＹＢ１４の形質転換および過剰発現により（実施例２を参照）、通常ＣＴを欠いている組織中でＣＴのレベルが増大した。これは、ＴａＭＹＢ１４の発現がＣＴの蓄積にとって極めて重要であることを示す。したがって、遺伝子組換えによってＴ．ｒｅｐｅｎｓ中でＴａＭＹＢ１４を過剰発現させることにより、様々な植物種の葉組織中に有意なレベルのＣＴを蓄積することが可能になり、それによって、家畜用牧草地の質を改善する手段が提供される。
【０３３０】
材料および方法
植物材料、および縮合型タンニンレベルの分析
葉のＣＴレベルが異なる４種のマメ科植物種のいくつかの栽培品種からの種子を、ガラス温室内で成長させた。Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ（Huia）；Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ（AZ2925；AZ4755；AZ1353）；Ｔ．ａｆｆｉｎｅ（AZ925）、およびＴ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ（AZ4270）。様々な齢数および型の植物材料を収穫し、この材料を直ちに液体窒素中で凍結させ、引き続いて粉砕し、ＤＮＡまたはＲＮＡの単離に使用した。
【０３３１】
植物物質のＤＭＡＣＡ染色
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（1996）によって本質的に記載されている酸性化ＤＭＡＣＡ（４−ジメチルアミノ−シンナムアルデヒド）法を使用して、ＣＴを組織化学的に分析した。この方法は、急速な組織化学的染色剤として、ＤＭＡＣＡ（ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド）試薬を使用し、これにより、ＣＴ蓄積が非常に低い植物材料を特異的にスクリーニングすることが可能になる。ＤＭＡＣＡ−ＨＣｌプロトコールは、プロアントシアニジンに高度に特異的である。この方法をバニリン検定に対して選択的に使用した。アントシアニンは、バニリンアッセイにひどく干渉するためである。様々な齢数の組織を試料採取し、試験した。
【０３３２】
ＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３候補の選択方法
２つの方法、すなわち隠れマルコフモデル（HMM）およびプロファイルを使用することによって、ＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３  ＤＮＡ−結合ドメインを含有するマメ科植物の配列を同定した。両方法は、既知のＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３  ＤＮＡ結合ドメインタンパク質配列に由来するドメインの「モデル」を最初に作り出すことに依存し、次いでこの配列は、探索の基礎として使用される。ＨＭＭおよびプロファイルモデルは、以下の表１に示した既知の植物ＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３ドメインを使用して作り出した。これらは、Ｍｉｙａｋｅ  ｅｔ．ａｌ．（2003）中の図２、およびＮｅｓｉ  ｅｔ．ａｌ．（2001；図４Ｃ中のヒトＭＹＢ配列は除外した）中の図４Ｃから採用した。以下のようなモデルを構築するのに使用した配列の種分布：
【０３３３】
【表１】
0005774478.tif 000003
【０３３４】
探索したマメ科植物の配列セットを、以下の表２に列挙する。探索する前にすべてのＥＳＴおよびＥＳＴコンティグセットを６つのフレーム中で翻訳し、ＨＭＭ／プロファイル分析に適したタンパク質配列を生成した。Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａタンパク質配列はそのまま使用した（これらは、TIGRから得られるFGENESH遺伝子予測物である）。
【０３３５】
ＨＭＭＥＲプログラムｈｍｍｂｕｉｌｄを使用することによって、モデルＤＮＡ結合ドメインからＨＭＭを作り出し、これは、ＨＭＭＥＲプログラムｈｍｍｓｅａｒｃｈを使用してマメ科植物配列セットに対して探索した（E値カットオフ＝０．０１）。ＥＭＢＯＳＳプログラムｐｒｏｐｈｅｃｙを使用することによって、同じドメインからプロファイルを作り出し、これも、ＥＭＢＯＳＳプログラム  ｐｒｏｆｉｔを使用してマメ科植物配列に対して探索した（スコアカットオフ＝５０）。配列の各セットにおいて各方法によって同定されたヒット数を、以下の表２に列挙する：
【０３３６】
【表２】
0005774478.tif 000004
【０３３７】
ＨＭＭ法は、プロファイル法より感度がよいように思われ、すべてのプロファイルのヒットならびに多くの追加のヒットを同定した。この理由で、ＨＭＭ法を選択方法として選択し、ＨＭＭでヒットしたタンパク質を使用することによってアライメントを作成し、系統発生分析に送った。プロファイルのヒットは、依然としてかなり有用である：プロファイル法はよりストリンジェントであり、したがって、プロファイルの候補が真のヒットを表す可能性がより高い。
【０３３８】
アライメントの生成
ＤＮＡ結合ドメイン配列を、上記で同定した１６６のマメ科植物ＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３候補から抽出した。タンパク質ドメインは、元のＨＭＭモデルにおける情報を使用してドメインを整列させる、ＨＭＭＥＲアライメントプログラムｈｍｍａｌｉｇｎを使用して整列させた。ヌクレオチドのアライメントは、タンパク質アライメント上に対応するヌクレオチド配列を重ね合わせることによって生成し、それによってタンパク質レベルでアライメントの構造を保存した。これを行うことによって、ドメイン構造をより良好に表す、より正確なアライメントを得た。
【０３３９】
系統発生分析
系統発生分析を、植物ＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３  ＤＮＡ結合ドメインに対して実施することによって、得られたツリーノードが、ＴＴ２転写因子に関係するＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３サブタイプを同定するのに使用することができるかどうかを調べた。１０９の全長ＤＮＡ結合ドメインを、本研究で同定された１６６のマメ科植物ＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３候補から抽出し、これらを、Ｎｅｓｉ  ｅｔ．ａｌ．（2001）およびＭｉｙａｋｅ  ｅｔ．ａｌ．（2003）からの既知のＭＹＢ  Ｒ２Ｒ３遺伝子と合わせ、合計で１３０のＤＮＡ結合ドメインを得た。これらの１３０ドメインのタンパク質のアライメントを、ｈｍｍａｌｉｇｎを使用して作成し、対応するヌクレオチドドメイン配列を、これに基づいて整列させた。ヌクレオチドのアライメントを、コンセンサスツリーを作成するのにかなったプログラムのｆａｓｔＤＮＡｍｌおよびＰｈｙｌｉｐプログラムを使用して、最大尤度解析にかけることによって、１００のブートストラップ反復推定値に基づいて系統樹を作成した。この情報を使用することによって、マメ科植物ＭＹＢＲ２Ｒ３ドメインに対する３つのプライマーを設計した。
【０３４０】
ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ならびにｃＤＮＡ合成
ゲノムＤＮＡは、製造者の指示に従って、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉキット（Qiagen）を使用して、新鮮な、または凍結した植物組織（１００ｍｇ）から単離した。ＤＮＡ標本をＲＮＡｓｅ  Ｈ（Sigma）で処理することによって、試料からＲＮＡを取り出した。トータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉキット（Qiagen）を使用して、新鮮な、または凍結した組織から単離した。製造者の指示に従って、単離トータルＲＮＡ（１００μｇ）を、ＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅ  Ｉで処理することによって、単離の間に試料からＤＮＡを取り出した。ＤＮＡおよびＲＮＡ試料の濃度および純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１００分光光度計を使用して、２６０および２８０ｎｍでの吸光度の比を決定することによって評価した。トータルＲＮＡ（１μｇ）は、製造者の指示にしたがって、ＳＭＡＲＴ（商標）ＣＤＳプライマーＩＩＡおよびＳＭＡＲＴ  ＩＩ（商標）Ａオリゴヌクレオチドを使用して、ＳＭＡＲＴ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Clontech）を使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。
【０３４１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＰＣＲ産物のＴＯＰＯクローニング
標準的なＰＣＲ反応は、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Applied Biosystems）で実施し、ＤＮＡ  約５ｎｇまたはｃＤＮＡ  １μｌの量を鋳型として使用した。熱サイクル条件は以下の通りであった：９４℃で３０秒間の初期反応、それぞれ、９４℃で３０秒間、５０〜６４℃で３０秒間（プライマーのTmに応じて）、および７２℃で１〜２分（１分／ｋｂ）の３５サイクル、ならびに７２℃で１０分間の最終反応。
【０３４２】
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。対象とするバンドを切り出し、引き続いてＤＮＡを、製造者の指示に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen）を使用して、ゲルスライスから抽出した。抽出したＰＣＲ産物を、製造者の指示に従って、ＴＯＰＯ  ２．１ベクター（Invitrogen）中にクローン化し、化学的形質転換によってＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換した。引き続いて細菌を、５０μｇ  ｍｌ−１のカナマイシンおよび４０ｍｇ  ｍｌ−１のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｘ−Ｄ−ガラクトピラノシド；Invitrogen）４０μｌを含有する、予熱したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（LB；Invitrogen）寒天プレート（１％のトリプトン、０．５％の酵母エキス、１．０％のＮａＣｌ、および１．５％の寒天）上に蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。陽性コロニーは、抗生物質選択と組み合わせて、白色−青色選択を使用して選択した。コロニーを選び、５０μｇ  ｍｌ−１のカナマイシンを含有するＬＢブロス（１％のトリプトン、０．５％の酵母エキス、１．０％のＮａＣｌ）６ｍｌ中に接種し、３７℃で、振盪インキュベーターによって２００ｒｐｍでインキュベートした。
【０３４３】
細菌培養物を、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Qiagen）を使用して、ＬＢブロス培養物から抽出および精製した。
【０３４４】
ＤＮＡ配列決定
単離プラスミドＤＮＡは、Ｂｉｇ−Ｄｙｅ（バージョン3.1）化学反応（Applied Biosystems）を使用して、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法（Sanger et al., 1977）を使用して配列決定した。Ｍ１３順方向および逆方向プライマー、または特定の遺伝子プライマーを使用した。産物をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Applied Biosystems）で分離し、配列データを、ＡｌｉｇｎＸ（Invitrogen）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ（NCBI）に公開されている配列情報と比較した。
【０３４５】
結果
ＴａＭＹＢ１４の同定および配列決定
トータルＲＮＡおよびゲノムＤＮＡ（gDNA）は、発育中および成熟したＴ．ａｒｖｅｎｓｅ葉組織から単離し、トータルＲＮＡは、ｃＤＮＡ中に逆転写した。最初に、コード配列の一般的なＭＹＢ領域に対してプライマーを設計し、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。様々なサイズのバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出、精製し、ＴＯＰＯベクター中にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換した。クローニング事象から２００の形質転換体を無作為に選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、引き続いて配列決定した。必要な場合、追加のプライマーを設計することによってＮ末端領域を配列決定した（表４）。
【０３４６】
部分的なＭＹＢのアレイを、単離ｃＤＮＡの配列決定によって同定した；５０％超が未知であり、既知のＭＹＢタンパク質への実質的なヒットをまったく生じなかった。残りは、非生物的ストレス、水欠乏に対する応答、光刺激、塩分ストレス、エチレン刺激、オーキシン刺激、アブシシン酸刺激、ジベレリン酸刺激、サリチル酸刺激、ジャスモン酸刺激、カドミウム、光、気孔開閉および制御、調節、ｍｉｘｔａ様（表皮細胞成長）、コーヒー酸Ｏ−メチル−トランスフェラーゼのダウンレギュレーション、および分裂組織制御の間に発現されるＭＹＢのオーソログとして同定された。
【０３４７】
２つの部分的なＭＹＢ  ｃＤＮＡは、メンバーにアントシアニンまたはＣＴ生合成を活性化することが知られているものが含まれる、正しいＭＹＢクレード（NO8およびNO9）に入るタンパク質をコードした。プライマーを、遺伝子の３’末端に対して設計することによって、残りの５’末端、したがって全ｃＤＮＡクローンを単離した。全長のＴａＭＹＢ１４は、３１４アミノ酸のタンパク質をコードする９４２ｂｐのコード領域を含有する。それに対し、ＡｔＴＴ２は、２５８アミノ酸のタンパク質をコードする。
【０３４８】
ＴａＭＹＢ１４についてのｂｌａｓｔ結果
Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ遺伝子型ＡＺ２９２５に由来するＴａＭＹＢ１４のｃＤＮＡ配列を、公共のデータベースに対してｂｌａｓｔにかけた。ＢｌａｓｔＮは、以下の上位５ヒットを返した：
ＡＢ３０００３３．１「Ｒ２Ｒ３−ＭＹＢ転写因子のＬｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  ＬｊＴＴ２−１  ｍＲＮＡ」、（e値  ３ｅ−６９）
ＡＢ３０００３５．１「Ｒ２Ｒ３−  ＭＹＢ  転写因子のＬｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  ＬｊＴＴ２−３  ｍＲＮＡ」、（e値  ４ｅ−６２）
ＡＢ３０００３４．１「Ｒ２Ｒ３−  ＭＹＢ転写因子のＬｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  ＬｊＴＴ２−２  ｍＲＮＡ」、（e値  ４ｅ−５９）
ＡＦ３３６２８４．１  Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＧｈＭＹＢ３６  ｍＲＮＡ、（e値  １ｅ−４０）
ＡＢ２９８５０６．１  転写因子のＤａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  ＤｃＭＹＢ３−１  ｍＲＮＡ、（e値  ７ｅ−３９）
【０３４９】
一方、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ遺伝子型ＡＺ２９２５に由来するＴａＭＹＢ１４の翻訳配列のＢｌａｓｔＸは、以下の５つの上位ヒットを返した：
ＢＡＧ１２８９３．１「Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｒ２Ｒ３−ＭＹＢ転写因子ＬｊＴＴ２−１」、（e値  ２ｅ−８１）
ＡＡＫ１９６１５．１ＡＦ３３６２８２＿１「Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＧｈＭＹＢ１０」、（e値  ３ｅ−７６）；
ＢＡＧ１２８９５．１「Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｒ２Ｒ３−ＭＹＢ転写因子ＬｊＴＴ２−３」、（e値  ８ｅ−７４）；
ＢＡＧ１２８９４．１「Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｒ２Ｒ３−ＭＹＢ転写因子ＬｊＴＴ２−２」、（e値  ２ｅ−７２）；
ＡＡＺ２０４３１．１「ＭＹＢ１１」［Ｍａｌｕｓ  ｘ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ］、（e値  ２ｅ−６６）
【０３５０】
ＡｔＴＴ２および他のＢＬＡＳＴのヒットに対するＴａＭＹＢ１４  ｃＤＮＡのアライメントを図７に示し、最高の類似性を黄色で示す。オープンリーディングフレームの翻訳も、アミノ酸組成において相当な差異を示し、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＴ２と５２％の相同性を共有した（図８）。さらに、ＴａＭＹＢ１４は、既知のＣＴ  ＭＹＢアクチベーター（N09）と共通のモチーフを共有する。
【０３５１】
ＡｔＴＴ２および他のＢＬＡＳＴのヒットに対するＴａＭＹＢ１４  ｃＤＮＡのアライメントを図７に示し、類似性を黄色および青色で強調する。オープンリーディングフレームの翻訳（図８）も、アミノ酸組成において相当な差異を示し、主にＭＹＢドメイン領域内で、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＴ２と５２％の相同性を共有した。
【０３５２】
ＴａＭＹＢ１４は、以前に知られているＣＴ  ＭＹＢアクチベーターと共通である、Ｓｔｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１による亜群５（DExWRLxxT）のモチーフと同様のモチーフを含む。
【０３５３】
ＴａＭＹＢ１４は、以前に知られているアントシアニンＭＹＢアクチベーターと共通である、Ｓｔｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１による亜群６（ＫＰＲＰＲ［Ｓ／Ｔ、配列番号１６に示されている）のモチーフを欠く。
【０３５４】
さらに、このアライメントにより、新規のＭＹＢモチーフ（VI／VRTKAxR／KxSK）を同定した。この新しいモチーフ（図８に強調されている）は、ＣＴ経路を調節するいくつかの新規のＭＹＢ１４  ＴＦに関連すると思われる。
【０３５５】
ＴａＭＹＢ１４転写レベル
ＣＴ蓄積は、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ種およびＴ．ａｆｆｉｎｅ種において起こり、背軸および向軸の表皮層における葉のラミナ全体、ならびに小葉柄領域を除く葉柄にわたって検出可能であった。ＣＴは、背軸の表皮表面上の葉トリコームでは、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓおよびＴ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅにおいてのみ検出可能であった。ＴａＭＹＢ１４に特異的なプライマーを使用する転写物分析により、この遺伝子は、ＣＴを活発に蓄積する組織においてのみ発現されることが明らかになった。ＴａＭＹＢ１４は、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅの成熟および未成熟葉組織において発現されたが、カルス（CTを合成しない）においては発現されなかった。ＴａＭＹＢ１４に対して設計されたプライマーも、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓにおいてＭＹＢ１４を増幅し、ＭＹＢ１４は、ＣＴが活発に蓄積している分裂組織葉および初期分裂組織トリコームにおいて発現されたが、成熟または新生葉組織、走根、節間部、根、および葉柄において検出されなかった。ＭＹＢ１４は、ＣＴが葉トリコーム中にのみ存在する、成熟したＴ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ組織においても検出されなかった。分析結果を以下の表３に示す：
【０３５６】
【表３】
0005774478.tif 000005
【０３５７】
図３および４にも、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ種中の様々な組織における転写レベルの比較を示した。；図３は、同一のガラス温室条件で成長させたＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種および栽培品種に由来する様々な組織におけるＴａＭＹＢ１４の転写レベルを示す。；レーン１、（ラダー）；レーン２、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟葉のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン３、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟根のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン４、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟走根のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン５、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟花のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種DC111）；レーン６、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ新生葉のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン７、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟葉のｃＤＮＡ（高アントシアニン栽培品種Isabelle）；レーン８、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ未成熟葉のｃＤＮＡ（栽培品種AZ2925）；レーン９、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ成熟葉のｃＤＮＡ（栽培品種AZ2925）；レーン１０、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織花のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１１、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織葉のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１２、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織トリコームのみのｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１３、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ成熟植物（葉、根、および走根）のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン１４、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟結節のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン１５、ＴＯＰＯ中のクローン化Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ  ＭＹＢ１４ｃＤＮＡクローン、レーン１６、ＴＯＰＯ中のクローン化Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ  ＭＹＢ１４ゲノムクローン、レーン１７、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅのゲノムＤＮＡ；レーン１７、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓのゲノムＤＮＡ；レーン１７、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのゲノムＤＮＡ；レーン２０（ラダー）。
【０３５８】
一方、図４は、同一のガラス温室条件で成長させたＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種および栽培品種に由来する様々な組織におけるＢＡＮＹＵＬＳ（Ａ）およびＬＡＲ（Ｂ）の転写レベルを示す。レーン１、（ラダー）；レーン２、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟葉のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン３、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟根のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン４、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟走根のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン５、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟花のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種DC111）；レーン６、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ新生葉のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン７、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟葉のｃＤＮＡ（高アントシアニン栽培品種Isabelle）；レーン８、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ未成熟葉のｃＤＮＡ（栽培品種AZ2925）；レーン９、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ成熟葉のｃＤＮＡ（栽培品種AZ2925）；レーン１０、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織花のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１１、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織葉のｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１２、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ分裂組織トリコームのみのｃＤＮＡ（栽培品種Huia）；レーン１３、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ成熟植物（葉、根、および走根）のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン１４、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ成熟結節のｃＤＮＡライブラリー（栽培品種Huia）；レーン１５、ＴＯＰＯ中のクローン化Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのｃＤＮＡ  ＢＡＮまたはＬＡＲクローン、レーン１６、ＴＯＰＯ中のクローン化Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのＢＡＮまたはＬＡＲゲノムクローン、レーン１７、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅのゲノムＤＮＡ；レーン１７、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓのゲノムＤＮＡ；レーン１７、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのゲノムＤＮＡ；レーン２０（ラダー）。
【０３５９】
Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ、Ｔ．ａｆｆｉｎｅ、Ｔ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ、およびＴ．ｒｅｐｅｎｓのｇＤＮＡに由来するＭＹＢ１４の同定および配列決定
ＴａＭＹＢ１４の開始および停止領域に対して設計したプライマーを使用して（表４を参照）、本発明者らは、様々ないくつかのＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種、すなわちＴ．ａｒｖｅｎｓｅ、Ｔ．ａｆｆｉｎｅ、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓおよびＴ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅから単離したｃＤＮＡおよびｇＤＮＡのＰＣＲによって、ＴａＭＹＢ１４のホモログを増幅した。ゲノムＤＮＡ配列の単離およびクローン化ＰＣＲ産物の全長配列決定により、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅは、この遺伝子の２つのアイソフォームまたは対立遺伝子を有することが示された。そのうちの一方は、発現されたｃＤＮＡ配列に対応し、他方は、ＴａＭＹＢ１４の以前に同定されていなかったアイソフォーム／対立遺伝子変異体に対応する。
【０３６０】
これらのアイソフォームまたは対立遺伝子変異体のアライメントにより、ＴａＭＹＢ１４のｃＤＮＡ配列と比較して、塩基のいくつかの欠失および挿入の存在が明らかになった（図１０を参照）。想定されるｃＤＮＡ配列の翻訳により、このアイソフォームまたは対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質も、アミノ酸の欠失、挿入、および交換を有することが明らかになった（図９を参照）。本発明者らは、この対立遺伝子変異体をＴａＭＹＢ１４−２と命名した。
【０３６１】
この遺伝子についての対応する全長ｇＤＮＡ配列も、３つの他のＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種、すなわちＴ．ａｆｆｉｎｅ、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ、およびＴ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅから単離した。すべてのＭＹＢ１４対立遺伝子は、様々なサイズの３つのエキソンおよび２つのイントロンを有していた（図１０〜１２を参照）。Ｔ．ａｆｆｉｎｅおよびＴ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅはともに、１つの対立遺伝子を有する一方で、Ｔ．ｒｅｐｅｎｓは２つの対立遺伝子を有する。様々な種に由来するＭＹＢ１４の翻訳配列は、アミノ酸組成の変化を伴って、ＴａＭＹＢ１４と９５％相同であった。アミノ酸の差異の大多数は、ＭＹＢドメインの下流の３’のユニーク領域に位置する。
【０３６２】
【表４】
0005774478.tif 000006
【０３６３】
【表５】
0005774478.tif 000007
【０３６４】
【表６】
0005774478.tif 000008
【０３６５】
要約すると、本出願人らは、以下の表５にまとめたように、１０個の新規ＭＹＢ１４タンパク質／遺伝子を同定および単離した。この表は、配列リスト中の各配列に関連する配列番号も示す：
【０３６６】
【表７】
0005774478.tif 000009
【０３６７】
これらのＭＹＢ１４配列のアライメントを図３４に示す。本出願人らは、ＭＹＢ１４タンパク質配列のすべてに共通の２つの配列モチーフを同定した。
【０３６８】
第１のモチーフはＤＤＥＩＬＫＮ（配列番号１５）である。
【０３６９】
第２のモチーフはＸ１ＶＶＲＴＸ２ＡＸ３ＫＣＳＫ（配列番号１７）であり、Ｘ１＝Ｎ、ＹまたはＨ、Ｘ２＝ＫまたはＲ、およびＸ３＝ＴまたはＩである。
【０３７０】
これらのモチーフのいずれか、または両方の存在は、特に、配列番号１６のモチーフの欠如に関連する場合、ＭＹＢ１４タンパク質に特徴的であると思われる。
【０３７１】
図３５は、図３４で整列されたＭＹＢ１４タンパク質のそれぞれの間のパーセント同一性を示す。
【０３７２】
本出願人らは、ＴａＭＹＢ１４の空間的および時間的発現パターンは、インビボで、植物中のＣＴの産生に一貫して相関することをも示した。
【実施例２】
【０３７３】
シロツメクサ（Trifolium repens）中で縮合型タンニンを産生させるための、本発明のＭＹＢ１４核酸配列の使用
材料および方法
形質転換プロトコールにおいて使用される遺伝子構築物
植物形質転換ベクターであるｐＨＺＢａｒは、ｐＡＲＴ２７から得られる（Gleave 1992）。ｐｎｏｓ−ｎｐｔＩＩ−ｎｏｓ３’選択カセットを、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターから発現されるｂａｒ遺伝子（除草剤のアンモニウムグルホシネートに対する耐性を付与する）を有するＣａＭＶ３５Ｓ−ＢＡＲ−ＯＣＳ３’選択カセットで置換した。このバイナリーベクター中への発現カセットのクローニングは、ユニークなＮｏｔＩ制限部位、およびβ−ガラクトシダーゼの青色／白色スクリーニングによる組換え体の選択によって促進される。シロツメクサを、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅに由来する発現された対立遺伝子を含有するＭ１４ＡｐＨＺＢａｒＰを使用して形質転換した。Ｍ１４ＡｐＨＺＢａｒＰについての過剰発現カセットは、ｐＡＲＴ７中で最初にクローン化した。次いでこの構築物を、ＮｏｔＩ断片としてｐＨＺＢａｒへと動かした。クローン化遺伝子の方向を示す、遺伝子構築物のＴ−ＤＮＡを、図６にグラフで表す。
【０３７４】
ｐＨＺＢａｒ中の遺伝子構築物を、凍結融解形質転換法（Ditta et al 1980）を使用して、プラスミドＤＮＡとしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＧＶ３１０１中に移した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で維持される構築物の構造は、細菌培養物から調製したプラスミドＤＮＡの制限消化によって確認した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物は、グリセロール中で調製し、長期貯蔵のために−８０℃に移した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＧＶ３１０１中に維持された遺伝子構築物を、１００ｍｇ／Ｌの濃度でスペクチノマイシンを含有するＭＧＬブロス２５ｍｌ中に接種する。培養物は、ロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で、２８℃で一晩（１６時間）成長させる。細菌培養物を遠心分離（３０００×ｇ、１０分）によって収集する。上清を取り出し、１０ｍＭのＭｇＳＯ４溶液５ｍＬ中に再懸濁する。
【０３７５】
子葉外植片の形質転換
Ｖｏｉｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（1994）の改良法を使用して、クローバーを形質転換した。約４００〜５００枚の子葉（すなわち２００〜２５０個の種子）を提供して切り離すため、種子を秤量した（０．０６ｇｍ＝１００個の種子）。遠心管中で、７０％のエタノールで１分間、種子をすすぐ。漂白剤（５％の利用可能な塩素）中で、円形ミキサー上で１５分間振盪することによって種子を表面滅菌し、その後、滅菌水で４回洗浄する。４℃で一晩、種子に水分を吸収させる。解剖顕微鏡を使用して、子葉を種子から切り離す。最初に、種皮および胚乳を取り除く。メスを用いて、子葉同士間に刃を入れ、残りの柄を突き通すことによって子葉を根元から分離する。子葉外植片を、ＣＲ７培地上の滅菌フィルターディスク上に収集する。
【０３７６】
形質転換するために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液のアリコート３μｌを、切り離した各子葉上に分注する。プレートを密閉し、１６時間の明期下で、２５℃で培養する。７２時間の共培養期間の後、形質転換された子葉を、アンモニウムグルホシネート（２．５ｍｇ／Ｌ）およびチメンチン（３００ｍｇ／Ｌ）を補充したＣＲ７培地を含有するプレートに移し、培養室に戻す。苗条が再生した後、アンモニウムグルホシネート（２．５ｍｇ／Ｌ）およびチメンチン（３００ｍｇ／Ｌ）を補充したＣＲ５培地に外植片を移す。再生中の苗条は、３週間毎に選択物を含有する新鮮なＣＲ５培地へと継代培養する。根が形成する際に、小植物を、アンモニウムグルホシネート選択物を含有するＣＲ０培地を含有するタブに移す。この段階で、再生体の大きな塊を、個々の小植物に分割する。次いで、選択物下で成長中の根付いた植物全体を、滅菌したピートプラグ中に鉢植えする。
【０３７７】
ＨＰＬＣ分析のためのＬＣＭＳＭＳ法
ＨＰＬＣ分析用にフラボノイドを抽出するために、葉組織（０．５ｇの新鮮重量）を液体Ｎ２中で凍結させ、粉砕して微粉にし、酢酸：メタノール（８０：２０ｖ／ｖ）を用いて４℃で３０分間抽出した。植物の残骸を、微量遠心機で、１３Ｋ  ｒｐｍで１０分間ペレット化した。上清を取り出し、−２０℃で３０分間置いた。アリコートをＨＰＬＣ分析に使用した。Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱイオントラップ質量分析計システムで、ＵＶ−ＰＤＡおよびＭＳ／ＭＳ検出の両方を使用してＨＰＬＣによってアリコートを分析した。移動相系として０．１％のギ酸を用いて、水とアセトニトリルでの勾配溶出によって、Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８逆相カラムで抽出物を分離した。アントシアニンは、５５０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出し、他の代謝産物は、質量分析計によるＭＳ１またはＭＳ２検出によって推定した。
【０３７８】
使用した計測器は、Ｔｈｅｒｍｏフォトダイオードアレイ（PDA）検出器を備えた、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣシステムに連結した線形イオントラップ質量分析計（Thermo LTQ）（ともにSan Jose、CA、USA）であった。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン2.0）を、データ取得および処理のために使用した。
【０３７９】
試料のアリコート５μＬを、一定の２５℃に維持した１５０×２．１ｍｍのＬｕｎａ  Ｃ１８（２）カラム（Phenomenex、Torrance、CA）上に注入した。使用したＨＰＬＣ溶媒は、溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ中０．１％のギ酸；溶媒Ｂ＝アセトニトリル中０．１％のギ酸であった。流速は２００μＬ  ｍｉｎ−１であった。使用した溶媒勾配を以下の表６に示す。ＰＤＡデータは、全体のクロマトグラムに対して２２０ｎｍ〜６００ｎｍの範囲にわたって収集した。
【０３８０】
【表８】
0005774478.tif 000010
【０３８１】
質量分析計は、正モードでエレクトロスプレーイオン化に設定した。スプレー電圧は４．５ｋＶであり、キャピラリー温度は２７５℃であり、シースガス、補助ガス、およびスイープガスの流速は、それぞれ、２０、１０、および５に設定した（任意単位／分で）。最初の４分および最後の１１分のＨＰＬＣからの流れは、廃棄へとそらした。ＭＳは、１５０〜２０００ｍ／ｚ（MS1スキャン）からスキャンし、次いで最も強いＭＳ１イオンに対してデータ依存ＭＳ３を実施するようにプログラムした。データ依存ＭＳ３法についての分離ウィンドウは２μ（整数質量単位）であり、ＭＳ１スペクトルからの最も強いイオンを断片化（３５％のCE（相対衝突エネルギー）した後、ＭＳ２スペクトルからの最も強いイオンを分離（２μ）および断片化（３５％のCE）した。次いで質量分析計により、以下の表７中の質量に対して選択反応モニタリング（SRM）を順次実施し、各ＳＲＭについての分離ウィンドウは２．５μであり、断片化ＣＥは３５％であった。列挙したこれらの質量は、最大三量体までのプロシアニジン（カテキンおよび／またはエピカテキン）およびプロデルフィニジン（ガロカテキンまたはエピガロカテキン）の質量の様々な組合せを網羅する。
【０３８２】
【表９】
0005774478.tif 000011
【０３８３】
結果
Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのｇＤＮＡに由来するＭＹＢ１４を用いたシロツメクサのＤＭＡＣＡ分析
シロツメクサの子葉は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下で、発現されたｃＤＮＡ配列に対応するＴ．ａｒｖｅｎｓｅ対立遺伝子で形質転換し、方法に記載されたように再生した。すべての再生された小植物からの葉を、実施例１に記載したように、ＤＭＡＣＡ染色を用いてＣＴ産生についてスクリーニングした。いくつかのこれらの形質転換された植物は、ＣＴ産生について陽性であり、ＤＭＡＣＡで染色したとき、青色染色を生じた。そのような染色は、葉トリコームの６個の中間細胞を含む、葉組織のほとんどの表皮細胞で起こった。それに対し、形質転換されていない野生型シロツメクサ植物は、背軸の葉側上のトリコームは別として、ＣＴについて陰性であった（図５）。ＣＴは、一部の植物の一部の根細胞および葉柄細胞内にも存在した。これは、ＴａＭＹＢ１４の構成的発現により、シロツメクサ植物中のＣＴ蓄積の時間的および空間的パターン形成が変化することを示す。
【０３８４】
トランスジェニックシロツメクサの分子分析、ＤＭＡＣＡスクリーニング、および生化学
シロツメクサの分子分析
トランスジェニックシロツメクサ植物から抽出したＤＮＡを、Ｍ１４ＡｐＨＺＢＡＲベクターの組込みについて試験した。ＰＣＲ反応は、３５Ｓプロモーターの一部、およびＴａＭＹＢ１４遺伝子の大多数を含む産物を増幅するように設計されたプライマーセットを使用して実施した。この分析の結果は、ＴａＭｙｂ１４Ａ遺伝子を含有するバイナリーベクターの、シロツメクサゲノム中への組込みを示した（図１４）。
【０３８５】
シロツメクサのＤＭＡＣＡ分析
シロツメクサの葉組織をＤＭＡＣＡ染色して達成した結果を示す（図１５）。ＣＴ特異的な染色剤であるＤＭＡＣＡは、野生型シロツメクサの葉（Ａ、Ｅ、Ｆ）と比較して、トランスジェニッククローバーの葉の葉身および葉柄（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）を激しく染色した。
【０３８６】
さらに（図１６）、トリコーム層細胞および成長点細胞は、野生型の葉（Ｅ）において通常見られるより、はるかに強く染色された（Ｆ、Ｇ）。気孔の孔辺細胞も強く染色した（Ｈ）。柄のトリコーム細胞中と同様に、表皮細胞の核において染色は明確であった。表皮細胞は通常より均一に染色され、ロゼットの基底細胞も強く染色された（Ｇ）。どの特定の細胞がＤＭＡＣＡ染色を有するかを確かめるのに役立てるために、葉の引き裂きを実施した（Ｉ〜Ｋ）。この場合、より底部の表皮（一番上の外表面）を、葉肉層から分離した。表皮細胞（気孔およびトリコームなどの特殊な細胞は別として）は、葉肉細胞層と比較して活性はほとんどなかった。葉肉細胞は、特定の液胞様小器官中への明確な亜局在化を伴って、細胞全体にわたって明確な強い染色を示した。これは、細胞当たりで明らかに多様である。したがって、葉肉細胞内でＤＭＡＣＡ染色の区分化が存在する。
【０３８７】
シロツメクサのＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ分析
Ｍ１４ＡｐＨＺＢＡＲで形質転換されたトランスジェニック組織の本出願人による生化学的分析は、ＴａＭＹＢ１４の過剰発現により、シロツメクサおよびタバコにおける葉組織中に縮合型タンニンの単量体、二量体、および三量体が蓄積されるという議論の余地のない証拠をもたらした。より長い鎖のタンニンが存在することもあり得るが、これらを分解することは、本発明者らの装置の限界を超えている。
【０３８８】
精製グレープ種子抽出物を、すべてのＬＣＭＳＭＳ  ＨＰＬＣ測定の標準物質として使用したが、それはそのタンニンプロファイルがよく特徴づけられているためであり、これを図１７および１８に示す。この抽出物により、カテキン（C）、エピカテキン（EC）、ガロカテキン（GC）、およびエピガロカテキン（EGC）の明確な同定、ならびにＰＣ：ＰＣ二量体、ＰＣ：ＰＤ二量体、および２つの３ＰＣ三量体の検出が可能になる。
【０３８９】
４つの単量体すべてのＭＳ２スペクトルを、これらの代謝産物の同定の証拠として提供する。
【０３９０】
フラボノイドを、トランスジェニックおよび野生型対照シロツメクサ植物から抽出し、ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳによって処理した。これらの分析の結果により、トランスジェニッククローバー試料からの葉の抽出物中にＣＴが存在することが確認された。検出された単量体の大多数はエピカテキンおよびエピガロカテキンであり、ガロカテキンは微量であった。クローバーのタンニンはデルフィニジンに由来するので、これは一致している。野生型シロツメクサの葉組織中に単量体はまったく検出されなかった（図１９）。二量体および三量体も検出された（図２０、２１）。
【実施例３】
【０３９１】
タバコ（Nicotiana tabacum）中に縮合型タンニンを産生させるための、本発明のＭＹＢ１４核酸配列の使用
材料および方法
形質転換プロトコールにおいて使用した遺伝子構築物
プラスミドＭ１４ＡｐＨＺＢＡＲ（図６）に由来するＮｏｔＩ断片を単離し、ｐＡＲＴ２７（Gleave, 1992）中にクローン化し、タバコを形質転換した。このバイナリーベクターは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下でのカナマイシン耐性に関するｎｐｔＩＩ選択遺伝子を含有する。
【０３９２】
タバコの形質転換
葉ディスク形質転換−再生法（Horsch et al.1985）によってタバコを形質転換した。滅菌した野生型Ｗ３８タバコ植物に由来する葉ディスクに、バイナリーベクターを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株を接種し、３日間培養した。次いで葉ディスクを、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび３００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含有するＭＳ選択培地に移した。苗条再生が１カ月にわたって起こり、葉の外植片を、カナマイシンを含有する、ホルモンを含まない培地上に配置し、根を形成させた。
【０３９３】
結果
トランスジェニックタバコの分子分析、ＤＭＡＣＡスクリーニング、および生化学
タバコの分子分析
トランスジェニックタバコ植物から抽出したＤＮＡを、Ｍ１４ＡｐＨＺＢＡＲバイナリーベクターの組込みについて試験した。ＰＣＲ反応は、３５Ｓプロモーターの一部、および遺伝子の大多数を増幅するように設計されたプライマーセットを使用して実施した。この分析の結果は、ＴａＭｙｂ１４Ａ遺伝子を含有するバイナリーベクターの、シロツメクサゲノム中への組込みを示した（図２２）。
【０３９４】
タバコのＤＭＡＣＡ分析
ＤＭＡＣＡ分析を、実施例１においてクローバーについて記載したように、タバコ植物に対して実施した。ＴａＭＹＢ１４Ａを発現する（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）トランスジェニックタバコ小植物は、野生型植物と比較して、成長の有意な差をまったく示さなかった。さらに、植物組織中でＣＴを蓄積しない、野生型の形質転換されていないタバコと比較して、野生型またはトランスジェニックタバコ（アントシアニンを既に蓄積している）の細胞に由来するトランスジェニックタバコ小植物の葉組織中にＣＴが検出された。これは、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ  ＭＹＢ１４遺伝子は、そのままで、タバコ中のＣＴ経路のすべての遺伝子を活性化することができることを示す。トランスジェニックタバコの葉のＤＭＡＣＡ染色の例を示す（図２３）。ＣＴ特異的な染色剤であるＤＭＡＣＡは、常にＣＴを欠いている野生型の葉と比較して、トランスジェニックタバコの葉の葉身を激しく染色した（Ａ〜Ｇ）。
【０３９５】
タバコのＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ分析
ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ分析を、実施例２においてクローバーについて記載したように、タバコについて実施した。フラボノイドを、トランスジェニックおよび野生型対照タバコ植物から抽出し、ＨＰＬＣによって処理した。これらの分析の結果により、トランスジェニックタバコ試料からの葉の抽出物中にＣＴが存在することが確認された。タバコ対照試料は、ＣＴ単位を欠いていた。検出された単量体の大多数は、エピカテキンであり、エピガロカテキンおよびガロカテキン単量体は少量であった（図２４）。二量体および三量体も検出された（図２５）。
【実施例４】
【０３９６】
Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ中の縮合型タンニン産生を低減するための、本発明のＭＹＢ核酸配列の使用
材料および方法
サイレンシングプロトコールにおいて使用した遺伝子構築物
ヘアピンＲＮＡｉ植物ベクターである、ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ（Helliwell and Waterhouse, 2003）を、ＴａＭＹＢ１４のｃＤＮＡの一部と相同である配列の自己相補性部分を発現する構築物でＴ．ａｒｖｅｎｓｅの子葉を形質転換するのに使用した。ＭＹＢ１４についての全ｃＤＮＡ（葉のライブラリーから以前に単離された）を、遺伝子の３’末端からのｃＤＮＡの長さが２９９ｂｐの断片を増幅するのに使用した（caatgctggttgatggtgtggctagtgattcaatgagtaacaacgaaatggaacacggttatggatttttgtcattttgcgatgaagagaaagaactatccgcagatttgctagaagattttaacatcgcggatgatatttgcttatctgaacttttgaactctgatttctcaaatgcgtgcaatttcgattacaatgatctattgtcaccttgttcggaccaaactcaaatgttctctgatgatgagattctcaagaattggacacaatgtaactttgctgatgagacaaatgtgtcc − 配列番号６５）。プライマーは、サイレンシングベクターｐＨＡＮＮＩＢＡＬ中への断片のクローニングを可能にするように設計した（表５）。ｐｄｋイントロンの前にセンス方向でＸｈｏＩ部位中に、またはアンチセンス方向でｐｄｋイントロンの後にＸｂａＩ部位中に断片をクローン化した。クローニングの方向をＰＣＲにより決定することによって、断片が正しい配向にあることを保証した。ｈｐＲＮＡカセットを含有するＭＹＢ１４ｐＨＡＮＮＩＢＡＬに由来するＮｏｔＩ断片を、ｐＨＺＢａｒ中にサブクローニングし（pHZBARSMYB（図１３）と命名）、形質転換実験において使用した。
【０３９７】
【表１０】
0005774478.tif 000012
【０３９８】
Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅの形質転換：
Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅの栽培品種を、本質的にＴ．ｒｅｐｅｎｓについて記載したように、いくらかの軽微な改変とともに（Voisey et al., 1994）、ｐＨＺｂａｒＳＭＹＢサイレンシングバイナリーベクターで形質転換した。アンモニウムグルホシネートレベルは１．２５ｍｇ／Ｌに減少した。植物を、２週間だけＣＲ５培地上に配置した後、ＣＲ０培地に配置し、根を再生させた。
【０３９９】
結果
トランスジェニックＴｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅの分子分析、ＤＭＡＣＡスクリーニング、および生化学
Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅの分子分析
トランスジェニックＴ．ａｒｖｅｎｓｅ植物から抽出したＤＮＡを、Ｍ１４ｐＨＡＮＮＩＢＡＬバイナリーベクターの組込みについて試験した。ＰＣＲ反応は、３５Ｓプロモーターの一部、およびｃＤＮＡ遺伝子断片の３’末端を増幅するように設計されたプライマーセットを使用して実施した。この分析の結果は、ｈｐＲＮＡ遺伝子構築物を含有するバイナリーベクターの、ゲノム中への組込みを示した（図２６）。
【０４００】
Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのＤＭＡＣＡ分析
対照Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅおよびいくつかの形質転換された小植物に由来する植物材料を、実施例１に記載したようにＤＭＡＣＡを使用して染色した（図２７）。形質転換された植物を、やはり組織培養を通じて再生された野生型成熟葉と比較した。組織培養は、種子から派生した自然に土壌で成長した植物と比較して、葉の再生およびタンニン産生の開始に影響するためである。野生型Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのカルスはタンニンを産生しないが（Ａ）、細胞は葉に類似する組織中でタンニンを蓄積し始める（Ｂ〜Ｄ−紫色）。トランスジェニック植物もカルス中でタンニンを産生しないが、ＤＭＡＣＡで同様に染色された葉組織は、薄青色染色のみを示し（Ｅ〜Ｌ）、ＣＴのレベルは、サイレンシング構築物を発現する植物中で劇的に低減したことを示した。
【０４０１】
Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ分析
フラボノイドを、実施例２において記載したように、トランスジェニックおよび野生型対照Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ植物から抽出し、ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳによって処理した。野生型（形質転換されていない）Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅ小植物は、高い検出可能なレベルのＣＴ単量体を有していた。これらの単量体の大多数はカテキンであり、ガロカテキン単量体は少量であった（図２８）。二量体も検出された（図２９）。対照的に、仮にあったとしても、ほんの微量のこれらの化合物が、形質転換された小植物中で検出された。したがって、サイレンシングされたＴ．ａｒｖｅｎｓｅ小植物のＨＰＬＣ分析により、ＣＴ蓄積が有意に低減されたことが確認された。これらの結果により、トランスジェニックＴ．ａｒｖｅｎｓｅ植物からの葉の抽出物中にＣＴが存在しないことは、ＴａＭＹＢ１４の発現をサイレンシングするように設計されたベクターの存在と関連することが確認される。
【実施例５】
【０４０２】
アルファルファ（Medicago sativa）中で縮合型タンニンを産生させるための、本発明のＭＹＢ１４核酸配列の使用
材料および方法
微粒子銃によるアルファルファの形質転換
栽培品種Ｒｅｇｅｎ−ＳＹを、すべての形質転換実験に使用した（Bingham 1991）。形質転換プロトコールは、Ｓａｍａｃ  ｅｔ  ａｌ（1995）から適応させた。カルスの培養は、葉柄外植片から開始し、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびキネチンを補充したＳｃｈｅｎｋ  ａｎｄ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ培地（Schenk and Hildebrandt, 1972）（SHDK）上で、暗所で成長させた。発育中の培養物は、４週間間隔で新鮮な培地上に定期的に継代培養することによって継代した。８〜１２週間経ったＲｅｇｅｎ  Ｓｙカルスを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰＤＳ１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）粒子送達システム装置で、微粒子銃によって形質転換した。カルス培養物を、０．７Ｍの濃度のソルビトールおよびマンニトールを補充したＳＨＤＫ培地上で、最低限４時間インキュベートすることによって、細胞の原形質分離を誘導した。製造者によって記載されたように、ｐ３５ＳＴａＭｙｂ１４Ａ（M14ApHZBARに由来するNotI断片を含有する）およびｐＣＷ１２２（抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与するためのｎｐｔＩＩ遺伝子を含有する；Walter et al, 1998）のプラスミドＤＮＡ（１μｇ／μｌ）を、タングステン粒子（M17、Bio-Rad）へと沈殿させた。取扱説明書に従って、標準的なパラメーター（２７”Ｈｇの真空、１１００ｐｓｉの破壊、および１００ｍｍの標的距離）を形質転換に使用した。形質転換された組織を一晩静置した後、ＳＨＤＫ培地に移した。２日後に、抗生物質選択物（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＳＨＤＫ培地に培養物を移し、形質転換細胞を選択した。この材料を、３週間間隔で最大３回継代した後、ホルモンを含まないＳＨ培地またはＢｌａｙｄｅｓ培地（Blaydes, 1966）に移し、明所に配置して再生させた。出芽中の体細胞胚をカルスの塊から切り離し、強度が半分のＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ培地（Murashige and Skoog, 1962）に移し、根および苗条を発生させた。
【０４０３】
目的
形質転換実験を行うことによって、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で、ＴａＭｙｂ１４遺伝子を含有するプラスミドをアルファルファ中に導入した。目的は、ＴａＭｙｂ１４を発現する植物を生成すること、および葉組織中の縮合型タンニンの蓄積についてスクリーニングすることであった。
【０４０４】
結果
トランスジェニックアルファルファの分子分析、ＤＭＡＣＡスクリーニング、および生化学
アルファルファの分子分析
トランスジェニックアルファルファから抽出したＤＮＡを、ｐ３５ＳＴａＭｙｂ１４Ａベクターの組込みについて試験した。ｎｐｔＩＩ遺伝子またはＴａＭｙｂ１４遺伝子に由来する産物を増幅するように設計されたプライマーセットを使用した。この分析の結果は、両プラスミド構築物の、アルファルファゲノム中への組込みを示した（図３０）。
【０４０５】
アルファルファのＤＭＡＣＡ分析
縮合型タンニンの蓄積を試験するために、実施例１においてクローバーについて記載したように、アルファルファ植物についてＤＭＡＣＡ分析を行うことができる。
【０４０６】
アルファルファのＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ分析
上記実施例２においてクローバーについて記載したＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ分析を使用することによって、トランスジェニックアルファルファ中のタンニンの単量体、二量体、および三量体の存在を正確に検出することができる。分析を行うために、クローバーについて記載したように、トランスジェニックおよび野生型対照アルファルファ植物からフラボノイドを抽出する。野生型アルファルファは、主にシアニジン由来のタンニン、および少量のデルフィニジン由来のタンニンを蓄積する（種皮中に）（Pang et al., 2007）。ＴａＭＹＢ１４を発現するトランスジェニックｍｅｄｉｃａｇｏ系統の葉は、エピカテキン、カテキン、およびエピガロカテキン、およびガロカテキン単量体、ならびにこれらの基礎単位の二量体および三量体の組合せについての産生について試験することができる。
【実施例６】
【０４０７】
ｂｒａｓｓｉｃａ（Brassica oleracea）中で縮合型タンニンを産生させるための、本発明のＭＹＢ１４核酸配列の使用
材料および方法
Ｂｒａｓｓｉｃａ系統の形質転換
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａ  ｃｖ．Ｃｏｌｅｏｒ（赤葉飼料ケール）およびＧｒｕｎｅｒ（緑葉飼料ケール）の種子を、Ｃｈｒｉｓｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（1997、2006）において記載されているようにインビトロで出芽させた。播種して４〜５日の胚軸および子葉葉柄外植片を、抗生物質を含有するＬＢ培地中で一晩成長させたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの培養物とともに短時間共培養した後、抗生物質を含まない最少培地（７．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．７ｍＭのクエン酸ナトリウム、７８．７ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、０．３３ＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２％のスクロース）中で１：１０に希釈し、さらに４時間成長させた。外植片は、Ｂ５ビタミンおよび２．５ｍｇ／ＬのＢＡを含む、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（MS、Murashige and Skoog, 1962）に基づく培地上で培養し、１０ｇｍ／ＬのＤａｎｉｓｃｏ標準寒天を用いて固体化させた。３日間共培養した後、外植片を、３００ｍｇ／Ｌのチメンチン（SmithKline Beecham）および１５／Ｌのカナマイシンを添加した同じ培地に移した。外植片は、３〜４週間毎に新鮮な選択培地に移した。緑色苗条は、これらが発生した際に、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する、ホルモンを含まないＬｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇに基づく培地（LS、Linsmaier and Skoog, 1965）に移し、１０ｇｍ／ＬのＤａｎｉｓｃｏ標準寒天を用いて固体化させた。外植片は、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ（３Ｍ）外科用テープで密閉した高いペトリ皿（直径９ｃｍ、高さ２ｃｍ）中で培養した。苗条は、透明なプラスチックタブ（９８ｍｍ、２５０ｍｌ、Vertex）中で培養した。すべての植物培養操作は、Ｃｏｏｌ  Ｗｈｉｔｅ蛍光灯、２０ｕＥ／ｍ２／ｓによって提供された１６時間／日の明期とともに、２５℃で行った。
【０４０８】
結果
トランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａの分子分析、ＤＭＡＣＡスクリーニング、および生化学
Ｂｒａｓｓｉｃａの分子分析
トランスジェニックｂｒａｓｓｉｃａ植物から抽出したＤＮＡを、Ｍ１４ＡｐＨＺＢＡＲバイナリーベクターの組込みについて試験した。ＰＣＲ反応は、３５Ｓプロモーターの一部、および遺伝子の大多数を増幅するように設計されたプライマーセットを使用して実施した。この分析の結果は、ＴａＭｙｂ１４Ａ遺伝子を含有するバイナリーベクターの、ｂｒａｓｓｉｃａゲノム中への組込みを示した（図３１に示す）。
【０４０９】
ＢｒａｓｓｉｃａのＤＭＡＣＡ分析
実施例１においてクローバーについて記載したように、ＤＭＡＣＡ分析をＢｒａｓｓｉｃａ植物に対して実施した。（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下で）ＴａＭＹＢ１４Ａを発現するトランスジェニックｂｒａｓｓｉｃａ小植物は、野生型植物と区別不能であった。植物組織中にＣＴを自然に蓄積しないいずれの栽培品種の、野生型の形質転換されていないキャベツは、染色されないままであった。しかしＣＴは、陽性のＤＭＡＣＡ染色によって証明されたように、アントシアニン蓄積栽培品種に由来するトランスジェニックｂｒａｓｓｉｃａ小植物の葉組織中に検出された。染色は、タバコおよびクローバーについて確認されたほど強くはなかった。対照的に、野生型緑色栽培品種に由来するトランスジェニック小植物は、ＤＭＡＣＡで決して染色されなかった。
【０４１０】
これは、Ｔ．ａｒｖｅｎｓｅのＭＹＢ１４遺伝子は、ｂｒａｓｓｉｃａ中のＣＴ経路の遺伝子の一部を活性化することができるが、ＣＴ産生のために活性なアントシアニン経路を必要とする場合があることを示す。トランスジェニックｂｒａｓｓｉｃａの葉のＤＭＡＣＡ染色の例を以下の写真に示す（図３２）。ＣＴ特異的染色剤であるＤＭＡＣＡは、常にＣＴを欠いている野生型の葉（Ａ）と比較して、トランスジェニックｂｒａｓｓｉｃａの葉身を染色した（Ｂ〜Ｄ）。
【０４１１】
ＢｒａｓｓｉｃａのＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ分析
フラボノイドを、実施例２においてクローバーについて記載したように、トランスジェニックおよび野生型対照Ｂｒａｓｓｉｃａ植物から抽出し、ＨＰＬＣによって処理した。これらの分析の結果により、１つのトランスジェニックｂｒａｓｓｉｃａ試料からの葉の抽出物中にＣＴが存在することが確認された。ｂｒａｓｓｉｃａの形質転換は、正常な緑色ｂｒａｓｓｉｃａ、ならびにアントシアニンを蓄積するｂｒａｓｓｉｃａ系統の両方で行った。ＨＰＬＣ分析により、緑色ｂｒａｓｓｉｃａにおいてエピカテキンが検出されたが、アントシアニン蓄積系統においてタンニン単量体はまったく検出されなかった。葉中にＣＴを蓄積したＴａＭＹＢ１４を過剰発現するトランスジェニックｂｒａｓｓｉｃａは、アントシアニン蓄積系統に由来した。図３３に示すように、エピカテキン単量体のみがこのトランスジェニック系統において検出された。
【０４１２】
実施例７
ＭＹＢ１４変異体による縮合型タンニン産生の改変を実証すること
本明細書に記載される方法によって同定することができる任意の変異体ＭＹＢ配列を、実施例２〜５に記載した方法を使用して、植物中の縮合型タンニンを変化させるその能力について試験することができる。
【０４１３】
簡単に言えば、変異体配列のコード配列（それだけに限らないが、配列番号５６〜６４のものなど）を、適当な発現コンシステント（例えば、実施例２に記載したようなｐＨＺＢａｒ）中にクローン化し、植物細胞または植物中に形質転換することができる。特に好都合で比較的単純な手法は、実施例３に記載したように、試験植物としてタバコを使用することである。ＤＭＡＣＡ分析は、実施例１に記載したような縮合型タンニン産生の交代についての迅速で好都合な試験として使用することができる。
【０４１４】
このようにして、縮合型タンニン産生の調節におけるＭＹＢ１４変異体の機能を迅速に確認することができる。
【０４１５】
縮合型タンニンのより詳細な分析は、実施例２に記載したように、ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ分析を使用しても実施することができる。
【０４１６】
実施例の要約
本発明のＭＹＢ１４遺伝子は、フラボノイド、具体的には、タバコ（Nicotiana tabacum；Solanaceae科）を含めた様々な植物属、およびマメ科植物のシロツメクサ（Trifolium repens；Fabaceae科）およびｂｒａｓｓｉｃａ（Brassica oleracea、Brassicaceae科）における縮合型タンニンの産生を操作するのに有用であることが明らかに実証された。
【０４１７】
本出願人らは、本発明の方法およびポリヌクレオチドを使用した、縮合型タンニンの産生の増大および減少の両方を実証した。
【０４１８】
本発明の範囲を上述した実施例のみに限定することは意図していない。当業者によって理解されるように、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変形が可能である。
【０４１９】
参考文献
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【配列表フリーテキスト】
【０４２０】
【表１１】
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【０４２１】
【表１２】
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【０４２２】
【表１３】
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【０４２３】
【表１４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５】
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【図１５】
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【配列表】
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